(57)【要約】  対象が心房細動（ＡＦ）を有することに起因して起こり得る潜在的帰結を軽減させるための療法を対象に投与することが適切であり得るか否かを決定するための方法であって、対象からの体液の試料において、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルを検出することと、検出されたｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルに基づいて、対象がＡＦを有することに起因して起こり得る帰結を軽減させるための療法を対象に投与することが適切であり得るか否かを決定することとを含む、方法に関する。抗凝固療法またはその他のＡＦ療法、および、抗凝固薬または別のＡＦ療法を投与する方法も提供される。
2017524129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が心房細動（ＡＦ）を有することに起因して起こり得る潜在的帰結を軽減させるための療法を対象に投与することが適切であり得るか否かを決定するための方法であって、前記対象からの体液の試料において、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルを検出することと、検出されたｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルに基づいて、対象がＡＦを有することに起因して起こり得る帰結を軽減させるための療法を前記対象に投与することが適切であり得るか否かを決定することとを含む、方法。
【請求項２】
ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のレベルが、対照、参照、および／または閾値のレベルと比較して減少して、ＡＦ療法が適応となるか、または、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のレベルが、対照、参照、および／または閾値のレベルと比較して上昇して、ＡＦ療法が適応とならない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象がＡＦを有することに起因して起こり得る帰結を軽減させるためのＡＦ療法で前記対象を処置することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＦ療法は抗凝固療法である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＡＦ療法は、心拍率調節薬物療法、抗不整脈薬、および／またはカテーテル焼灼術である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＡＦを有する対象を治療することにおける使用ための、抗凝固療法またはその他のＡＦ療法であって、前記対象は、前記対象から得られた体液試料において同定されるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルに基づいてＡＦを有すると同定された対象である、療法。
【請求項７】
対象において心筋梗塞または卒中をもたらし得る血塊を予防する方法における使用のための抗凝固薬であって、前記方法が、
参照レベルまたは所定の閾値レベルと比較して、対象からの体液試料においてｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルの減少を示す対象に抗凝固薬を投与することを含む、
抗凝固薬。
【請求項８】
抗凝固薬または臨床的必要性に応じて別のＡＦ療法を投与する方法であって、
対象からの体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルが参照レベルと比較して減少していることを検出することにより、対象が心房細動を有するか否かを同定する工程；ならびに
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現レベルが減少している対象に抗凝固薬を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）心拍率調節療法を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）抗不整脈薬を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）カテーテル焼灼術もしくは特定タイプのカテーテル焼灼術を適用する工程
を含む、方法。
【請求項９】
ＡＦが発作性、持続性、または永続性のＡＦである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１０】
ＡＦが発作性ＡＦである、請求項９に記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１１】
試料が、尿、唾液、血液、および血漿のような血液画分、血清、痰、精液、粘液、涙液、膣スワブ、直腸スワブ、子宮頸部スメア、組織生検、および尿道スワブの試料である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１２】
試料が、尿、唾液、血液、または痰の試料である、請求項１１に記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１３】
ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルが、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような免疫アッセイ、フローサイトメトリ−、電子化学発光アッセイ、プラズモン、または表面増強共鳴アッセイにより検出される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１４】
ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルが、好ましくは固相抗体、ＥＬＩＳＡ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用した競合的または非競合的免疫アッセイにより検出される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法における使用のためのアッセイであって、
対象からの体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のレベルに関係するデータを提供するためにｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現レベルを測定する測定装置を含む、
アッセイ。
【請求項１６】
測定装置からのｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現レベルのデータを獲得して、データ変換を行って、その決定されたレベルが、体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現レベルについての対照、参照、または正常値より低いか否かを計算する、データ変換装置をさらに含む、請求項１５に記載のアッセイシステム。
【請求項１７】
データをユーザーに出力するユーザーインターフェース出力装置のような、出力インターフェース装置をさらに含む、請求項１６に記載のアッセイシステム。
【請求項１８】
治療情報のデータベースをさらに含み、前記装置は、決定されたｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルについてのデータベースにおける治療情報を同定して、その治療情報をユーザーインターフェース出力装置へと出力する、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項１９】
ユーザーインターフェース出力装置は、例えば対象であるユーザーへ、
その者のｃｃｌ２１またはｄｄｉｔ４の発現レベルが対照、閾値、または参照値よりも低く、ユーザーまたは対象は抗凝固療法のような適切な療法を対象に投与すべきである
という出力を提供する、請求項１７または１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法において使用するためのキットであって、
ｃｃｌ２１またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはそのタンパク質断片に特異的に結合することができる、少なくとも１つの抗体またはプローブ（例えば受容体または受容体断片）を含む、
キット。
【請求項２１】
前記抗体が例えば蛍光または発光標識で標識されている、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象が発作性ＡＦのような心房細動（atrial fibrillation：ＡＦ）を発症する素因を有し得る、および／またはそれに罹患しているか否かを確かめるために、対象から得られた試料において１つ以上のマーカーを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心房細動（ＡＦ）は、欧州で、そして世界中で、卒中、死亡、心不全、および入院のありふれた原因である。しかし、ＡＦは人口の１〜２％に発症する一方で、最初の併発症（多くの場合卒中）の前には多くの場合検出されない。さらに、慢性型のＡＦは単純なＥＣＧにより見つかり得るが、発作性、自己終結型のＡＦは検出が難しいことで悪名高い（例えば、１２日間のホルターＥＣＧモニタリングが１年に渡り適用された場合でさえも偽陰性率が５０〜７０％である。Ｋｉｒｃｈｈｏｆ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．３０：２９６９−２９７７ｃ（２００９））。発作性ＡＦは、卒中生存者の任意抽出コホートにおいて、１５％までの卒中の原因となっている（例えば、Ｇｒｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｏｋｅ．４４：３３５７−３３６４（２０１３）；Ｓａｎｎａ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７０：２４７８−２４８６（２０１４））。ＡＦの時宜を得た診断および抗凝固薬開始は、虚血性の防止を劇的に助けるであろう。
【０００３】
発作性ＡＦのスクリーニング検査は、経口抗凝固剤の適時開始を通して卒中を防止することにより、保健医療システムにおいて数十億ポンドの節約をもたらすであろう（Ｋｉｒｃｈｈｏｆ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．３４：１４７１−１４７４（２０１３））。現在、発作性ＡＦの検出のための「ゴールドスタンダード」となっている皮下ＥＣＧ記録計の移植（Ｓａｎｎａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７０：２４７８−２４８６（２０１４））は、高価であり（およそ３０００ポンド）、患者にとって１〜２％のリスクを伴う侵襲的手法であるため、発作性ＡＦを有する患者を同定するためのよりシンプルなおよび／またはより優れた検査が緊急に必要とされている。
【０００４】
ｐｉｔｘ２遺伝子に近いありふれた遺伝子バリアントが、ＡＦの患者に見出される。ＡＦは、特に若い患者において、強い家族性要素を有することが長い間知られてきた。最近の全ゲノム相関解析は、心房細動と顕著に連関する少なくとも３つの独立したありふれた遺伝子バリアントを染色体４ｑ２５付近に同定した（Ｅｌｌｉｎｏｒ  ＰＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．４４：６７０−６７５（２０１２）；Ｇｕｄｂｊａｒｔｓｓｏｎ  ＤＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．４４８：３５３−３５７（２００７））。これらのバリアントと最も近い遺伝子は、二ドメイン性転写因子ＰＩＴＸ２をコードする。心臓および肺の出生前発生におけるＰＩＴＸ２の役割はよく調べられているが、成体の心臓におけるＰＩＴＸ２の生理的役割は最近まで知られていなかった。
【０００５】
ＰＩＴＸ２は左心房（left atrium）において発現され、ｐｉｔｘ２の減少は対象をＡＦになりやすくする。ｐｉｔｘ２が成体の左心房に存在すること、および心臓におけるｐｉｔｘ２のレベルの減少は対象をＡＦになりやすくすることが実証された（Ｋｉｒｃｈｈｏｆ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｇｅｎｅｔ．４：１２３−１３３（２０１１））。ＰＩＴＸ２発現が減少した心房におけるＡＦの発生は他研究者らによっても確認された（Ｗａｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．０７：９７５３−９７５８（２０１０）；Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｇｅｎｅｔ．４：２６９−２７９（２０１１））。この背景的研究の一つの重要かつ驚くべき発見は、ＰＩＴＸ２発現が左心房組織に限定されていることであり、これはＰＩＴＸ２が正常な左心房遺伝子発現を維持することにおいて生理的役割を有していることを示唆している。
【０００６】
Ｋａｈｒ  ＰＣ，ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．６：ｅ２６３８９（２０１１））は、マウスおよびヒトの心房組織からの左心房（left atrium）と右心房（right atrium）の間の、遺伝子アレイを使用した遺伝子発現差の系統的解析の結果を開示している。１０個の遺伝子が、左心房において差次的発現しているものとして同定されたが、それらの遺伝子の半数が、ｐｉｔｘ２のヘテロ接合欠損を有するマウスからの左心房において減少した発現を示し、それらの発現がｐｉｔｘ２によって制御されていることが強く示唆された。その著者らは、正常なｐｉｔｘ２発現および減少したｐｉｔｘ２発現を有するマウスから採られた遺伝子アレイの間接的比較に基づいて、ｃｃｌ２１の発現がＡＦの発生に関連しているかもしれないと推測している。しかしながら、いくつかの重要な測定、すなわち、これらの遺伝子のいずれかがマウスの左心房において実際にｐｉｔｘ２依存的態様で発現されていることの適切な確認（例えばｒｔＰＣＲによるもの）、これら同定された遺伝子のいずれかの発現レベルの減少が心房細動を有する患者の心房組織において見られることの確認、上述した遺伝子の発現の減少が実際に遺伝子産物の発現の減少につながることの証拠提示、そして最後に、これを左心房へのアクセスが制約された患者においていかに測定するかの示唆が欠けている。さらに、ｃｃｌ２１が左心房において発現される際、その発現の検出は左心房組織試料に限定されると予測され、そのことはＡＦ発生についてのマーカーとしてのｃｃｌ２１の使用を著しく制限する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的には、上述した問題点の１つ以上を除去および／または緩和することが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、心房組織へのアクセスが制限されている対象において発作性ＡＦのようなＡＦを検出するために使用できるマーカーを同定する発明者らの研究に基づく。
【０００９】
第１の側面において、対象が心房細動（ＡＦ）を有することに起因して起こり得る潜在的帰結を軽減させるための療法を対象に投与することが適切であり得るか否かを決定するための方法が提供され、その方法は、その対象からの体液の試料において、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルを検出することと、検出されたｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルに基づいて、対象がＡＦを有することに起因して起こり得る帰結を軽減させるための療法を対象に投与することが適切であり得るか否かを決定することを含む。同じ方法は、例えば、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の高いレベルを実証することによって心房細動の存在を「除外する」ことにも使用され得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象がＡＦを有することに起因して起こり得る帰結を軽減させるための療法を用いて対象を治療することをさらに含み得る。その療法は抗凝固療法であってもよいが、心拍率調節薬物療法、抗不整脈薬、またはカテーテル焼灼術のような、ＡＦ患者において使用される他のあらゆる療法も採用され得る。抗凝固療法は血液が凝固する能力を低減させ、従って、卒中または心臓発作のような状態につながり得る血塊形成の可能性を減少させる。典型的な療法としてはワルファリン、ヘパリン、リバーロキサバン、ダビガトラン、およびアピキサバンのような既知の抗凝固薬が挙げられるが、このリストは完全ではない。βブロッカー、カルシウム拮抗薬、またはジギタリスのような心拍率調節薬物療法は、ＡＦの際に心拍率を遅らせ、従って心臓がより効果的に働くこと、および患者の気分が改善することを助ける。抗不整脈薬は、ＡＦの発作を防止することができる薬物療法である。典型的な薬剤は、アミオダロン、ドロネダロン、フレカイニド、プロパフェノン、およびソタロールである。カテーテル焼灼術は、ＡＦ再発を防止することができる侵襲的手法である。
【００１１】
すなわち、さらなる側面において、ＡＦを有する対象の治療用の抗凝固薬が提供され、その対象は、その対象から得られた体液試料において同定されたｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４発現のレベルに基づいてＡＦを有すると同定された対象である。
【００１２】
抗凝固薬または、臨床的必要性に応じて、別のＡＦ療法を投与する方法も提供され、その方法は、
対象からの体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルが参照レベルと比較して減少していることを検出することにより、対象が心房細動を有するか否かを同定する工程；ならびに
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現レベルが減少している対象に抗凝固薬を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）心拍率調節療法を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）抗不整脈薬を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）カテーテル焼灼術もしくは特定タイプのカテーテル焼灼術を適用する工程
を含む。
【００１３】
さらなる一側面において、抗凝固薬または、臨床的必要性に応じて、別のＡＦ療法を投与する方法が提供され、その方法は、
対象からの体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルが参照レベルと比較して減少していることを検出することにより、対象が心房細動を有するか否かを同定する工程；ならびに
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現レベルが減少している対象に抗凝固薬を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）心拍率調節療法を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）抗不整脈薬を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）カテーテル焼灼術もしくは特定タイプのカテーテル焼灼術を適用する工程
を含む。
【００１４】
本発明に従って、ＡＦは、発作性、持続性、または永続性のＡＦを意味すると解され得る。好ましい一実施形態において、本発明は、対象が発作性ＡＦに罹患し得るか否か、もしくは発作性ＡＦに罹患する素因を有し得るか否かを検出すること、および／または発作性ＡＦを有する対象の治療に特に適している。
【００１５】
対象において心筋梗塞または卒中をもたらし得る血塊を予防するための抗凝固薬を投与する方法がさらに提供され、その方法は、
参照レベルまたは所定の閾値と比較して、対象からの体液試料においてｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現のレベルの減少を示す対象に抗凝固薬を投与すること
を含む。
【００１６】
本発明は、対象からの体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４の発現の検出に関する。好ましくは、発現は、体液試料において検出されるタンパク質またはタンパク質断片に関して表され得るが、他の発現産物も同等に当業者によって想定され得る。本開示の以下の部分では、タンパク質および／またはタンパク質断片の検出について述べるが、これは決して限定と解されるべきではなく、代わりに他の発現産物が検出されてもよい。
【００１７】
好都合なことに、その生物学的試料は、対象から得られるあらゆる適切な体液試料であり得る。例えば、体液試料は、尿、唾液、血液および例えば血漿のような血液画分、血清、痰、精液、粘液、涙液、膣スワブ、直腸スワブ、子宮頸部スメア、組織生検、および尿道スワブのうちの少なくとも１つを含み得る。適切なことに、生物学的試料は、尿、唾液、血液、および痰のような、個人から容易に得ることができるものであり、これらは個人が補助の必要なく自分自身から採取することができ得る。好ましい一実施形態では、生物学的試料は、血液、または血漿のような血液画分である。本発明は、生検により得られ得る固形組織の試料のような、非体液試料にまでは拡張されず、特に心臓組織の試料である試料にまでは拡張されないことが理解されるべきである。
【００１８】
同様に、検査されている対象におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現のレベルが、「正常」あるいは治療を必要としていないおよび／またはＡＦを示していない対象からのものと実質的に同じか、より高いか、より低いか否かを決定することに使用するために決定または提供される、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現の参照レベル、あるいはｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現の「正常」レベルを提供するために、治療の必要を有していないおよび／またはＡＦを有していない対象からの体液試料を、本技術分野で知られるあらゆる方法によって得ることができる。
【００１９】
本明細書において使用される、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現についての「参照レベル」は、その所定値よりも低いｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現レベルを有する対象（その対象は抗凝固療法に適合しているおよび／または適している可能性が高い）を決定することができるように決定または提供される。本発明によれば、正常よりも低いｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現レベルを有する対象は、本発明に従って本明細書で定義される抗凝固療法を用いて処置することに適合しているおよび／または適しているとみなされることになる。
【００２０】
タンパク質またはタンパク質断片の「より低い」（あるいは低減された）発現とは、対照試料または参照レベル（例えば正常洞調律を示し従ってＡＦを有していない対象またはそのような対象群の平均からのもの）におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現レベルと比較して減少した発現を表す。従って、一側面では、対照試料または参照レベルは、非疾患対象もしくは対象群から採取／決定され、または、予測される正常なｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現についての公表文献の値である。一側面では、より低い差次的発現は、対照試料、参照レベル、または公表された値における発現レベルより、約０．５倍、１倍、１．５倍、またはそれに代えて約２．０倍、またはそれに代えて約３．０倍、またはそれに代えて約５倍、またはそれに代えて約１０倍、またはそれに代えて約５０倍低くてよい。あるいは、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現が「過少発現されている」あるいは「下方調節されている」と表され得る。
【００２１】
ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片の発現レベルの減少は、本明細書に記述されるように処置を選択するための基礎として使用され得る。発現レベルは、処置の前および／または最中に測定され得、得られた値は、臨床医によって、対象が抗凝固療法または別のＡＦ療法を受けることの適合性および／または適切さを評価することに使用され得る。本発明は、将来において卒中または心停止をもたらし得る血塊で対象が苦しむ可能性を最小限にするように設計されていることが理解される。従って、本発明により想定される療法は、状態を治癒するというよりは防止するように設計されるため、一般的な用語で予防的療法として見ることができる。それに加えて、想定される療法は、患者において特定の効果を有することが知られているゆえに選択され得る。
【００２２】
本発明に従って、決定されるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のレベルは、体液の試料におけるタンパク質またはタンパク質断片のレベルに関係するものである。タンパク質またはタンパク質断片とは、体液試料内に見出され得るタンパク質またはその断片のあらゆる形態を意味する。この用語は従って、全長野生型タンパク質またはその断片だけでなく、本技術分野で知られる、または将来発見され得る、変異型、対立遺伝子型、スプライスバリアント、および翻訳後修飾形態を包含する。多くの適切なタンパク質／ペプチド検出方法が当業者に知られている。例としては、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ：radioimmunoassay）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）、フローサイトメトリ−、電子化学発光アッセイ、プラズモンおよび表面増強共鳴アッセイ、または、ｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルを測定するあらゆる他の高感度定量的方法が挙げられる。好ましい一実施形態において、発現レベルは、例えば、好ましくは固相抗体、ＥＬＩＳＡ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用した競合的または非競合的免疫アッセイのような免疫学的方法により決定される。
【００２３】
本発明に従って、アッセイシステムが提供される。これらのアッセイシステムは、対象からの体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルに関係するデータを提供するためにｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルを測定する測定装置を含む。このシステムはまた、測定装置からのｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルのデータを獲得して、データ変換を行って、その決定されたレベルが、体液試料におけるｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルについての対照、参照、または正常値より低いか否かを計算する、データ変換装置を含む。
【００２４】
他の実施形態では、アッセイシステムは、データをユーザーに出力するユーザーインターフェース出力装置のような、出力インターフェース装置も含む。他の好ましい実施形態では、アッセイシステムは、治療情報のデータベースをも含み、装置は、決定されたｃｃｌ２１および／またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルについてのデータベースにおける治療情報を同定して、その治療情報をユーザーインターフェース出力装置へと出力する。一実施形態では、そのユーザーインターフェース出力装置は、例えば対象であるユーザーへ、その者のｃｃｌ２１またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルが対照、閾値、または参照値よりも低く、抗凝固療法のような適切な療法を投与すべきであるという出力を提供し得る。このようにして、対象はそのｃｃｌ２１またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルをある期間に渡り連続的に監視して、そのｃｃｌ２１またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルが対照、閾値または参照値よりも低い場合にのみ、療法を投与するように指示を受けることができる。出力インターフェース装置は、入力装置のユーザーから離れていることも可能である。例えば、対象は自宅で体液試料を分析し得るが、その結果は、対象から離れた臨床医または医療従事者に（例えば無線方式、有線方式、またはその他のあらゆる適切な手段によって）提供される。臨床医または医療従事者は、その後、得られた検査結果に基づいて、特定の療法を投与すべきか否かを対象に通知し得る。
【００２５】
さらなる一側面において、本方法において使用するためのキットが提供される。キットは、ｃｃｌ２１またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはそのタンパク質断片に特異的に結合することができ例えば蛍光または発光標識で標識され得る、少なくとも１つの抗体、またはプローブ（例えば受容体または受容体断片）を含み得る。キットは、例えば本明細書に記述されたようなアッセイシステムと共に、使用説明書をさらに含み得る。
【００２６】
標識は、例えば蛍光標識の場合のように直接検出されるか、または間接的に検出され得る。間接的検出は、ビオチン・アビジン相互作用、抗体結合等を含め、当業者に知られるあらゆる検出方法を含み得る。抗体、あるいはその他のｃｃｌ２１またはｄｄｉｔ４タンパク質またはタンパク質断片結合剤、例えばｃｃｌ２１またはｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片に結合することができる精製された受容体または受容体断片は、表面に結合されていてもよい。一実施形態では、好ましい表面はシリカまたはガラスである。別の実施形態では、表面は金属電極である。
【００２７】
ここで、例を挙げて、そして図面を参照して、本発明をさらに説明する。図面は以下のことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】野生型（ｗｔ：wild-type）およびｐｉｔｘ２＋／−マウスの心房における「左心房遺伝子」の左・右遺伝子発現比。全てのデータは、１８対のｗｔおよびｐｉｔｘ２＋／−マウスにおいて測定された、ｒｔＰＣＲによるｍＲＮＡ発現分析に基づく。この分析は、全ての遺伝子がｐｉｔｘ２＋／−心房において数値的に減少した発現を示す一方、ｃｃｌ２１およびｄｄｉｔ４が統計学的に有意な差異を有する遺伝子として顕出することを図示している。平均およびＳＥＭが示されている。
【００２９】
【図２】心房細動を伴う、および伴わない、ヒトの左心房および右心房における、ＰＩＴＸ２、ｃｃｌ２１、およびｄｄｉｔ４のｍＲＮＡ発現の減少。Ｃｃｌ２１発現は、洞調律（sinus rhythm）であるもの（黒塗りつぶしカラム）と比較して、心房細動を伴う心房において明確に減少しており（縞模様カラム、発作性ＡＦ；灰色カラム、慢性ＡＦ）、図１に示されたマウス左心房におけるｐｉｔｘ２依存性ｃｃｌ２１発現の観察が確認された。平均とＳＥＭが示されている。
【００３０】
【図３】ａ）は、慢性および発作性ＡＦを有する患者からの左心房および右心房試料におけるＰｉｔｘ２レベルのウェスタンブロットの結果を、正常洞調律を有する患者と比較して示している。ｂ）は、ａ）の結果をグラフ形式で示している。
【００３１】
【図４】ａ）は、慢性ＡＦを有する患者からの左心房および右心房試料におけるｄｄｉｔ４レベルのウェスタンブロットの結果を、正常洞調律を有する患者と比較して示している。ｂ）は、ａ）の結果をグラフ形式で示しており、発作性ＡＦを有する患者からの結果もさらに含んでいる。
【００３２】
【図５】図５は、ｃｃｌ２１血漿レベルが、他の形態の心不整脈を有する患者と比較してＡＦ患者からの左心房および静脈試料では著しく低いことを示している。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３３】
材料および方法
マウスについては、３６匹のマウスからのＬＡ（左心房）およびＲＡ（右心房）を使用した（１８のＰｉｔｘ２ｃ＋／−、１８の同腹仔野生型、１４〜２０週齢）。ヒトについては、すべて直視下心臓手術（ＣＡＢＧまたは弁手術、年齢中央値７４）を経た、洞調律の患者（ｎ＝７）または慢性（ｎ＝１４）もしくは発作性ＡＦ（ｎ＝１２）と診断された患者からのＬＡおよびＲＡ組織を使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｆｉｂｒｏｕｓミニキットおよびＱｕｉａｇｅｎ  ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒカラムを用いてＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを生成させ、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ機器上で遺伝子特異的プライマーおよびＳＹＢＲグリーン（ライフテクノロジーズ）を使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。
【００３４】
ＲＩＰＡタンパク質バッファーを用いてタンパク質溶解液を調製した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％分離（resolving）／４％濃縮（stacking））により分離し、メンブレンにブロットした。タンパク質のレベルはウエスタンブロット法により決定し、カルネキシンタンパク質発現に対して規準化した。
【００３５】
カテーテル焼灼術を経た患者（ＡＦを有する１９人、その他の形態の心不整脈を有する１９人）からのヒト血漿試料（左心房および静脈血の両方）を使用して、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ）によりＣＣＬ２１レベルを決定した。
【００３６】
結果
Ｋａｈｒらによって記述された先の研究では、左心房組織において優先的な発現を示すいくつかの遺伝子が明らかにされた。野生型マウスおよびｐｉｔｘ２＋／−マウスからのマウス心房において測定されたマウス遺伝子アレイデータの比較は、それらの発現がｐｉｔｘ２により制御され得ることを示唆していた。しかしながら、ｐｉｔｘ２＋／−マウス心房においてｍＲＮＡレベルは調べられておらず、いずれの発見もヒト心房において検証されておらず、さらに、その論文が強調しているように、ｍＲＮＡ濃度の違いがあってもいつもタンパク質濃度の違いに翻訳されるとは限らない。従って、Ｋａｈｒらの論文における発見は注意をもって見なければならない。
【００３７】
本発明者らは、左心房と右心房とのあいだで、およびｐｉｔｘ２発現との比較において、差次的に発現されているものとして以前にＫａｈｒらにおいて同定された１０の遺伝子について、マウス心房組織においてｒｔＰＣＲを行った。マウス心房分析の結果を図１に示す。興味深いことに、調べられた１０の遺伝子のうち、ｄｄｉｔ４とｃｃｌ２１の２つの遺伝子だけが、洞調律と比べてＡＦ患者におけるヒト左心房組織において統計学的に有意な差を有してｍＲＮＡレベルで減少していた。
【００３８】
さらに、ｄｄｉｔ４およびｃｃｌ２１の発現はどちらも、洞調律の患者と比べて、心房細動の患者からの採取されたヒト心房組織において減少していた。発作性ＡＦを有する患者（すなわち、ＡＦの期間が洞調律と交互に起こる）は、慢性ＡＦの患者と比較してｄｄｉｔ４およびｃｃｌ２１のレベルの減少がより抑えられていることが示された（図２）。
【００３９】
さらなる実験により、Ｐｉｔｘ２ｃ転写物は、すべての患者群においてＲＡと比べてＬＡでより多く発現されていることが示された（ＳＲ（洞調律）  ｐ＝０．０１；発作性  ｐ＝０．００；慢性  ｐ＝０．００）。すべてのＡＦ患者試料において、ＳＲ対照と比較してＰｉｔｘ２ｃ転写物の下方調節の全般的傾向があったが、いずれも有意ではなかった（図３参照）。
【００４０】
さらに、３つすべての患者群に渡り、Ｃｃｌ２１はＲＡと比べてＬＡにおいてより多く発現されていた（ＳＲ  ｐ＝０．００；発作性  ｐ＝０．０３；慢性  ｐ＝０．００）。Ｄｄｉｔ４ｌは、発作性ＡＦを有する患者においてＲＡと比べてＬＡにおいてより多く発現されていた（ｐ＝０．０１）（図４参照）。さらに、心房のＣｃｌ２１およびＤｄｉｔ４ｌのタンパク質レベルは、患者群のあいだでも、左心房と右心房とのあいだでも、異なっていない。しかしながら、Ｃｃｌ２１は、慢性ＡＦを有する患者と比較して、発作性ＡＦと診断された患者のＲＡにおいてより低かった（ｐ＝０．０５）。
【００４１】
ｃｃｌ２１は分泌されるケモカインであるため、心房組織におけるｃｃｌタンパク質レベルの差を見出すことは予測されず、心房組織においてそのような差を同定することはできなかった。従って、発明者らは、血液中のＣｃｌ２１血漿レベルを測定した。他の形態の心不整脈と診断された患者（ｎ＝１９）と比べてＡＦ患者（ｎ＝１９）のＣｃｌ２１レベルは、左心房試料において（ｐ＝０．００４）、そして、静脈試料において（ｐ＝０．００２）、有意に低かった（図５参照）。さらに、血漿では、静脈血ｃｃｌ２１レベルが、対照と比較してＡＦを有する患者で著しく減少していること（６１．４に対して１．５ｐｇ／ｍｌ）を発明者らは見出した（図５）。
【００４２】
結論として、本研究は、Ｃｃｌ２１およびＤｄｉｔ４ｌに関する左・右（Ｌ・Ｒ）転写物発現勾配が、Ｐｉｔｘ２ヘテロ接合マウスのＬＡにおいては低減していることを示している。Ｐｉｔｘ２、Ｃｃｌ２１、およびＤｄｉｔ４ｌはまた、大部分の患者試料のＬとＲＡとのあいだで差次的に発現されている。Ｐｉｔｘ２、Ｃｃｌ２１、およびＤｄｉｔ４ｌのタンパク質レベルは、患者群のＬＡおよびＲＡ組織試料のあいだで、あるいは患者群のあいだで、異ならない。しかしながら、Ｃｃｌ２１血漿レベルは、他の形態の心不整脈を有する患者と比べてＡＦを有する患者において有意に低い。本データは、Ｐｉｔｘ２、Ｃｃｌ２１、およびＤｉｔ４ｌのタンパク質レベルは転写物レベルを反映しないことを示唆している。さらに、血漿／血液のような体液のＣｃｌ２１およびｄｄｉｔ４のレベルは、心房細動を有する患者についてのマーカーとなり得る。
【図１】
2017524129.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月22日(2017.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が心房細動（ＡＦ）を有することに起因して起こり得る潜在的帰結を軽減させるための療法を対象に投与することが適切であり得るか否かを決定するための方法であって、前記対象からの体液の試料において、ｄｄｉｔ４の発現のレベルを検出することと、検出されたｄｄｉｔ４の発現のレベルに基づいて、対象がＡＦを有することに起因して起こり得る帰結を軽減させるための療法を前記対象に投与することが適切であり得るか否かを決定することとを含む、方法。
【請求項２】
ｄｄｉｔ４のレベルが、対照、参照、および／または閾値のレベルと比較して減少して、ＡＦ療法が適応となるか、または、ｄｄｉｔ４のレベルが、対照、参照、および／または閾値のレベルと比較して上昇して、ＡＦ療法が適応とならない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象がＡＦを有することに起因して起こり得る帰結を軽減させるためのＡＦ療法で前記対象を処置することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＦ療法は抗凝固療法である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＡＦ療法は、心拍率調節薬物療法、抗不整脈薬、および／またはカテーテル焼灼術である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＡＦを有する対象を治療することにおける使用ための、抗凝固療法またはその他のＡＦ療法であって、前記対象は、前記対象から得られた体液試料において同定されるｄｄｉｔ４の発現のレベルに基づいてＡＦを有すると同定された対象である、療法。
【請求項７】
対象において心筋梗塞または卒中をもたらし得る血塊を予防する方法における使用のための抗凝固薬であって、前記方法が、
参照レベルまたは所定の閾値レベルと比較して、対象からの体液試料においてｄｄｉｔ４の発現のレベルの減少を示す対象に抗凝固薬を投与することを含む、
抗凝固薬。
【請求項８】
抗凝固薬または臨床的必要性に応じて別のＡＦ療法を投与する方法であって、
対象からの体液試料におけるｄｄｉｔ４の発現のレベルが参照レベルと比較して減少していることを検出することにより、対象が心房細動を有するか否かを同定する工程；ならびに
参照レベルと比較して体液試料におけるｄｄｉｔ４の発現レベルが減少している対象に抗凝固薬を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）心拍率調節療法を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）抗不整脈薬を投与する工程；および／または
参照レベルと比較して体液試料におけるｄｄｉｔ４のタンパク質もしくはタンパク質断片の発現レベルが減少している対象に（臨床的必要性に応じて）カテーテル焼灼術もしくは特定タイプのカテーテル焼灼術を適用する工程
を含む、方法。
【請求項９】
ＡＦが発作性、持続性、または永続性のＡＦである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１０】
ＡＦが発作性ＡＦである、請求項９に記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１１】
試料が、尿、唾液、血液、および血漿のような血液画分、血清、痰、精液、粘液、涙液、膣スワブ、直腸スワブ、子宮頸部スメア、組織生検、および尿道スワブの試料である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１２】
試料が、尿、唾液、血液、または痰の試料である、請求項１１に記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１３】
ｄｄｉｔ４の発現のレベルが、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような免疫アッセイ、フローサイトメトリ−、電子化学発光アッセイ、プラズモン、または表面増強共鳴アッセイにより検出される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１４】
ｄｄｉｔ４の発現のレベルが、好ましくは固相抗体、ＥＬＩＳＡ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用した競合的または非競合的免疫アッセイにより検出される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法における使用のためのアッセイであって、
対象からの体液試料におけるｄｄｉｔ４のレベルに関係するデータを提供するためにｄｄｉｔ４の発現レベルを測定する測定装置を含む、
アッセイ。
【請求項１６】
測定装置からのｄｄｉｔ４の発現レベルのデータを獲得して、データ変換を行って、その決定されたレベルが、体液試料におけるｄｄｉｔ４の発現レベルについての対照、参照、または正常値より低いか否かを計算する、データ変換装置をさらに含む、請求項１５に記載のアッセイシステム。
【請求項１７】
データをユーザーに出力するユーザーインターフェース出力装置のような、出力インターフェース装置をさらに含む、請求項１６に記載のアッセイシステム。
【請求項１８】
治療情報のデータベースをさらに含み、前記装置は、決定されたｄｄｉｔ４のタンパク質またはタンパク質断片のレベルについてのデータベースにおける治療情報を同定して、その治療情報をユーザーインターフェース出力装置へと出力する、請求項１７に記載のアッセイシステム。
【請求項１９】
ユーザーインターフェース出力装置は、例えば対象であるユーザーへ、
その者のｄｄｉｔ４の発現レベルが対照、閾値、または参照値よりも低く、ユーザーまたは対象は抗凝固療法のような適切な療法を対象に投与すべきである
という出力を提供する、請求項１７または１８に記載のアッセイシステム。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法または方法における使用のためのＡＦ療法において使用するためのキットであって、
ｄｄｉｔ４のタンパク質またはそのタンパク質断片に特異的に結合することができる、少なくとも１つの抗体またはプローブ（例えば受容体または受容体断片）を含む、
キット。
【請求項２１】
前記抗体が例えば蛍光または発光標識で標識されている、請求項２０に記載のキット。
【国際調査報告】
2017524129.tif 000008
2017524129.tif 000009
2017524129.tif 000010