(57)【要約】本発明は、例えば前立腺癌細胞のような単一細胞に由来するオルガノイド、ならびにその製造および使用に係る方法および組成物に関し、オルガノイドを産生するための細胞培養培地、および前立腺癌の個別化された治療の方法を含む。本発明はさらに、患者の前立腺細胞に由来する前立腺オルガノイドを含むヒト化マウスを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで哺乳類組織からオルガノイドを作製する方法であって：単離された細胞を提供するために、哺乳類組織から細胞を単離すること；前記単離された細胞を、分化を誘導するのに十分な時間、分化培地中で培養すること；およびオルガノイドを産生するのに十分な時間、オルガノイド培地中の細胞外マトリックス中で培養することによって前記細胞を増幅させることを含む、方法。
【請求項２】
前記分化培地が、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）およびエピネフリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オルガノイド培地が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびヒドロコルチゾンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分化培地が、インスリン、ヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン、アンホテリシン、トランスフェリン、トリヨードサイロニン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、およびレチノイン酸のうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記オルガノイド培地が、ＢＰＥ、インスリン、ヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン、アンホテリシン、トランスフェリン、トリヨードサイロニン、エピネフリン、ＥＧＦ、およびｂＦＧＦのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類組織が、ヒト組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト組織が、ヒト前立腺組織である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト前立腺組織が、原発性前立腺癌組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記オルガノイドが、上皮細胞および間葉細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞を増幅する前記工程が、低酸素状態で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記分化を誘導するのに十分な時間が、約１４日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記分化培地が、７日後に交換される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オルガノイドを産生するのに十分な時間が、約１４日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記オルガノイド培地が、一日おきに交換される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＢＰＥが、約１〜１００ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｂＦＧＦが約１〜５０ｎｇ／Ｌの濃度で存在し、前記ＥＧＦが約１〜５０ｎｇ／Ｌの濃度で存在し、および前記ヒドロコルチゾンが約０．１〜１０μＭの濃度で存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離された細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４４、Ｅｒｇ、およびＡＭＡＣＲからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの存在について選別される、請求項１に記載に記載の方法。
【請求項１８】
上皮細胞および間葉細胞を含む、前立腺オルガノイド。
【請求項１９】
原発性前立腺癌組織からインビトロで生成された前立腺オルガノイドであって、上皮細胞および間葉細胞を含み、前立腺特異抗原を産生する、オルガノイド。
【請求項２０】
ＢＰＥおよびエピネフリンが添加された、細胞培養培地。
【請求項２１】
ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびヒドロコルチゾンが添加された、細胞培養培地。
【請求項２２】
請求項２０に記載の細胞培養培地および請求項２１に記載の細胞培養培地を含む、キット。
【請求項２３】
前立腺癌細胞に対する抗癌活性を有する薬剤を同定する方法であって、少なくとも１つの試験薬剤を選択すること、前立腺癌細胞に由来する複数の前立腺オルガノイドを前記試験薬剤と接触させること、前記試験薬剤の存在下および前記試験薬剤の非存在下における前立腺オルガノイドの数を測定すること、ならびに前立腺癌細胞に由来するオルガノイドの数が前記薬剤の非存在下よりも前記薬剤の存在下で少ない場合には抗癌活性を有する薬剤であると同定すること、を含む、方法。
【請求項２４】
被験体における前立腺癌の個別化された治療方法であって：少なくとも１つの治療の形態を選択すること、複数の前立腺オルガノイドを前記治療の形態が含むと接触させること、ただし、前記オルガノイドは前記被験体からの前立腺癌細胞に由来し、前記治療の存在下および前記治療の非存在下における前立腺オルガノイドの数を測定すること、ならびに前立腺オルガノイドの数が前記治療の非存在下よりも前記治療の存在下で少ない場合に前記治療を選択すること、を含む、方法。
【請求項２５】
前記選択された治療で前記被験体を治療することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
患者の免疫系の要素が移植されたヒト化マウスであって、前記患者の前立腺細胞に由来し前記マウスの前立腺に移植された前立腺オルガノイドを含む、マウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月２０日に出願された米国仮出願第６２／０１５，０２０号の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）組織を増殖させることができないことは、再生のメカニズムおよび成体生物における分化細胞と幹細胞とのバランスを理解する上での大きな障害となる。腫瘍発生のような原発性ヒト病理学的障害を、よりよく理解する必要性が存在する。癌研究については、現在の癌モデルは、ヒト癌の分子的および細胞的多様性を適切に表さない。既存のヒト癌細胞株は、癌の臨床的様相に関する明確かつ詳細な情報を欠き、治療抵抗性のメカニズムを解釈するためには内在的な制限を有する。したがって、癌についての原発性組織を維持するための新規な方法および癌を治療するための新しい医薬発見手法が必要とされている。
【０００３】
正常分化細胞と、前駆または幹細胞とのバランスを維持することは複雑である。成体幹細胞は、増殖、分化およびアポトーシスの間のバランスを調節する信号に応答することを通じて、様々な組織、器官の再生または腫瘍性成長をもたらす。遺伝的指示からは独立しているが各細胞分裂において遺伝性であるエピジェネティックな変化は、疾患の開始または進行の原動力となり得る。組織幹細胞は、その増殖し、自己複製し、分化する能力において不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）であり、ストレス条件下において異なるサブタイプ間を可逆的に切り替えることができる。組織幹細胞は、多系統分化へと向かう傾向を有する複数のサブタイプを収容する（ｈｏｕｓｅ）。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、例えば、３つの増殖状態を可逆的に獲得することができる：細胞が細胞周期の休止期にある休眠状態、細胞が組織分化を維持するために周期的にサイクルする恒常的状態、および細胞が連続的にサイクルしている活性化状態。多くの成体幹細胞プールの増殖および再生は、ニッチな相互作用および間質フィードバックシグナルを通じて分泌された成長因子およびサイトカインからの調節シグナルに対するこれらの遺伝的および／またはエピジェネティックな応答によって、厳密に制御される。
【０００４】
前立腺癌は、最も一般的な悪性腫瘍であり、西洋人男性の癌死の２番目に多い原因である。その有病率にもかかわらず、前立腺癌はインビトロで増殖させることが非常に困難であることが証明されている。前立腺癌は、その生存および機能が、前立腺癌細胞と、実質性線維芽細胞（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、内皮細胞、免疫細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分との動的相互作用に依存する、複雑な器官様多細胞構造を呈する。ＥＣＭおよび前立腺癌の細胞多様性を再現する前立腺癌モデルの欠如は、疾患の進行および精彩を欠いた（ｌａｃｋｌｕｓｔｅｒ）治療応答を理解することに向けた進歩を妨げている。例えば、単層で成長した細胞株および遺伝的に操作されたマウスモデルは、前立腺癌微小環境の複雑さを模倣したり、治療抵抗性の多様なメカニズムを再現したりすることができない。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
一実施形態では、本発明は、インビトロで哺乳類組織からオルガノイドを作製する方法であって：単離された細胞を提供するために、哺乳類組織から細胞を単離すること；幹細胞を増やし分化を誘導するのに十分な時間、単離された細胞を分化培地中で培養すること
；およびオルガノイドを産生するのに十分な時間、オルガノイド培地中の細胞外マトリックス中で培養することによって細胞を増幅させることを含む方法を提供する。
【０００６】
別の実施形態において、本発明は、上皮細胞および間葉細胞を含むインビトロ前立腺オルガノイドを提供する。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、原発性前立腺癌組織に由来するインビトロ前立腺オルガノイドであって、上皮細胞および間葉細胞を含み、且つ前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を産生するオルガノイド、を提供する。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）およびエピネフリンが添加された細胞培養培地を提供する。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびヒドロコルチゾンが添加された細胞培養培地を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、ＢＰＥおよびエピネフリンが添加された細胞培養培地、ならびにｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびヒドロコルチゾンが添加された細胞培養培地を含む、キットを提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、前立腺癌細胞に対する抗癌活性を有する薬剤を同定する方法であって、少なくとも１つの試験薬剤を選択すること、患者の前立腺癌細胞に由来し患者特異的な複数の前立腺オルガノイドを試験薬剤と接触させること、試験薬剤の存在下および試験薬剤の非存在下における前立腺オルガノイドの数を測定すること、ならびにオルガノイドの数が薬剤の非存在下よりも薬剤の存在下で少ない場合には抗癌活性を有する薬剤であると同定することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本方法は、患者特異的オルガノイドに対して抗癌活性を有するが、正常オルガノイドに対しては抗癌活性を有しないと同定された薬剤で、患者を治療する工程を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、移植された患者特異的前立腺オルガノイドを有する免疫ヒト化マウス、およびこのようなマウスを使用して前立腺癌の個別化された治療法を同定する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
ある実施形態では、本発明は、正常および癌性組織からインビトロで生成された前立腺オルガノイド、およびそのようなオルガノイドを作製し使用する方法、ならびに細胞培養培地およびキットを提供する。本明細書の一実施形態で開示されるように、３次元培養装置における細胞外マトリックス分子を含有するインビトロ環境中の特定の成長因子は、オルガノイドを作製するために使用され得る。
【００１４】
オルガノイドは、インビトロで作り出される組織の小型形態であり、内在性の三次元臓器構造を呈する。例えば、Ｃａｎｔｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋｕｏ（２０１５）Ｇｅｎｏｍｅ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：３２−３４を参照。本発明のオルガノイドは、例えば：ａ）腫瘍内のゲノム標的、ならびに前臨床および臨床試験における治療に対する応答の予測の決定；  ｂ）治療後の生存オルガノイドの数を調べることによる抗癌剤の活性の検出；  ｃ）各オルガノイド内の増殖細胞の数を決定し、関連するパスウェイの遺伝子発現プロファイリングを決定することによる、増殖剤の活性の検出；  ｄ）オルガノイド内の様々な細胞型を標的とする薬剤の特異性の検査；  ｅ）化学療法および放射線の効果の決定；  ｆ）インビボでのオルガノイドの移植によるマウスモデルの作出；  ｇ）インビトロおよび
インビボの両方での治療応答および創薬を試験するための前臨床モデルの創出；ならびに
ｈ）クローン的に標的化する抗癌療法の決定、に使用され得る。
【００１５】
したがって、一実施形態では、本発明は、インビトロで哺乳類組織からオルガノイドを作製する方法であって：単離された細胞を提供するために、哺乳類組織から細胞を単離すること；幹細胞を増やし分化を誘導するのに十分な時間、単離された細胞を分化培地中で培養すること；およびオルガノイドを産生するのに十分な時間、オルガノイド培地中の細胞外マトリックス中で培養することによって細胞を増幅させることを含む方法を提供する。当業者は、分化に関連する形態学的変化を調べることによって、分化を誘導するのに十分な時間を決定することができる。１つの好ましい実施形態では、分化を誘導するのに十分な時間は、約５〜約１５日間である。別の好ましい実施形態では、分化を誘導するのに十分な時間は約１４日間である。１つの好ましい実施形態において、オルガノイドを産生するのに十分な時間は、約５〜約１５日間である。別の好ましい実施形態では、オルガノイドを産生するのに十分な時間は約１４日間である。
【００１６】
好ましい一実施形態では、分化培地は、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）およびエピネフリンを含む。分化培地中に存在するＢＰＥの濃度は、約０．１〜１００ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。分化培地中に存在するエピネフリンの濃度は、約０．１〜１００μＭの範囲であり得る。さらなる実施形態では、分化培地は、以下のうちの１つ以上を含む：インスリン（１〜１０ｍｇ／Ｌ）、ヒドロコルチゾン（０．１〜１０μＭ）、ゲンタマイシン（５〜５０μｇ／Ｌ）、アンホテリシン（１〜３０μｇ／Ｌ）、トランスフェリン（０．５〜２５ｍｇ／Ｌ）、トリヨードサイロニン（０．１〜１０μＭ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）（５〜５０ｎｇ／ｍＬ）、およびレチノイン酸（０．１〜１０μＭ）。最も好ましい実施形態では、分化培地は以下の濃度を含む：前立腺上皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＰｒＥＢＭ（商標）、Ｌｏｎｚａ）（約１倍）；ウシ下垂体抽出物（約５２ｍｇ／Ｌ）；インスリン（約５ｍｇ／Ｌ）；ヒドロコルチゾン（約１μＭ）；ゲンタマイシン（約３０μｇ／Ｌ）；アンホテリシン（約１５μｇ／Ｌ）；トランスフェリン（約５ｍｇ／Ｌ）；トリヨードサイロニン（約０．１〜１０μＭ）；エピネフリン（約１倍）；ｒｈＥＧＦ（約２０ｎｇ／ｍＬ）；レチノイン酸（０．１〜１０μＭ）。分化培地は、他の添加剤、成長因子、抗生物質、ビタミン代謝産物、およびホルモン、当該分野で公知の同様の特性を有する合成または天然のものを、さらに含むかまたはこれらで置換され得る。好ましい実施形態では、分化培地は、上記の成分が添加された、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ａｄｖａｎｃｅｄ−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの市販の細胞培養である。最も好ましい実施形態では、分化培地は、上記の成分が添加された、ＰｒＥＢＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ）のような市販の前立腺上皮細胞増殖培地である。
【００１７】
好ましい実施形態では、オルガノイド培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびヒドロコルチゾンを含む。オルガノイド培地中に存在するｂＦＧＦの濃度は約０．１〜１０μＭの範囲であり得、オルガノイド培地中に存在するヒドロコルチゾンの濃度は約１〜５０ｎｇ／Ｌの範囲であり得る。さらなる実施形態では、オルガノイド培地は、以下のうちの１つ以上を含んでもよい、ＢＰＥ（１０〜１００ｍｇ／Ｌ）、インスリン（０．５〜２５ｍｇ／Ｌ）、ヒドロコルチゾン（０．１〜５μＭ）、ゲンタマイシン（５〜５０μｇ／Ｌ）、アンホテリシン（１〜３０μｇ／Ｌ）、トランスフェリン（１〜２５ｍｇ／Ｌ）、トリヨードサイロニン（０．１〜１０μＭ）、エピネフリン（０．１〜５倍）、ＥＧＦ（１〜５０ｎｇ／ｍＬ）、およびｂＦＧＦ（１〜５０ｎｇ／ｍＬ）。最も好ましい実施形態では、オルガノイド培地は、以下の濃度を含む：ＰｒＥＢＭ培地（約１倍）；ウシ下垂体抽出物（約５２ｍｇ／Ｌ）；インスリン（約５ｍｇ／
Ｌ）；ヒドロコルチゾン（約１μＭ）；ゲンタマイシン（約３０μμｇ／Ｌ）；アンホテリシン（約１５μｇ／Ｌ）；トランスフェリン（約５ｍｇ／Ｌ）；トリヨードサイロニン（０．１〜１０μＭ）；エピネフリン（約１倍）；ｒｈＥＧＦ（約２０ｎｇ／ｍＬ）；およびｂＦＧＦ（約２０ｎｇ／ｍＬ）。以下の追加の３成分が、１日おきに（例えば、１４日間の培養期間中に７回）添加される、ヒドロコルチゾン（約１μＭ）；ｒｈＥＧＦ（約２０ｎｇ／ｍＬ）；およびｂＦＧＦ（約２０ｎｇ／ｍＬ）。オルガノイド培地は、他の添加剤、成長因子、抗生物質、ビタミン代謝産物、およびホルモン、当該分野で公知の同様の特性を有する合成または天然のものを、さらに含むかまたはこれらで置換され得る。好ましい実施形態では、オルガノイド培地は、上記の成分が添加された、ＰｒＥＢＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ）などの市販の前立腺上皮細胞増殖培地である。
【００１８】
ある実施形態において、細胞は、哺乳類癌組織、ヒト組織、ヒト癌組織、ヒト前立腺組織、およびヒト原発性前立腺癌組織に由来する。ある実施形態では、オルガノイドを作製するために使用され得る細胞は、ヒト前立腺幹細胞である。このような細胞は本分野で公知であり、例えば前立腺インテグリンα２β１、ＣＤ４４、およびＣＤ１３３（プロミニン−１）１０、およびＣＫ６ａ（サイトケラチン６ａ）のようなマーカーを用いて、同定されおよび単離され得る。
【００１９】
一実施形態では、細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４４、Ｅｒｇ、およびＡＭＡＣＲからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに対して陽性である。別の実施形態では、細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｂ、およびＣＤ４４に対して陽性である。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４４、Ｅｒｇ、およびＡＭＡＣＲに対して陽性である。別の実施形態では、細胞は、ＥｒｇおよびＡＭＡＣＲに対して陽性である。このような細胞は、当技術分野で公知の細胞選別方法によって同定されおよび単離され得る。例えば、一実施形態において、細胞は、ＳｍａｒｔＦｌａｒｅ（商標）ｐｒｏｂｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＥＭＯ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して選別され得る。
【００２０】
１つの好ましい実施形態において、細胞は、外科的に切除された組織から、組織を機械的解離、コラゲナーゼ処理、および濾過することによって得られる。
【００２１】
記載された方法を実施し、幹細胞を増やすために分化を誘導し、次いで幹細胞維持を調節する転写因子の応答を介して幹細胞パスウェイのエピジェネティックな活性化を誘導するプロセスを逆行させることにより、オルガノイド由来の幹細胞は培養条件下で長期間維持されることができる。ある実施形態では、分化工程は、約１４日間細胞を培養することを含む。好ましい実施形態では、分化培地は７日後に交換される。この方法の好ましい実施形態では、増幅工程は、当該分野で知られるような、低酸素条件下で実施される。いくつかの実施形態において、増幅工程は、単離された細胞を約１４日間培養することを含む。ある実施形態では、オルガノイド培地は１日おきに交換される。
【００２２】
ある実施形態において、前立腺癌細胞は、間質細胞と共培養される。
【００２３】
ある実施形態において、前立腺癌細胞は、内皮細胞と共培養される。
【００２４】
ある実施形態では、本方法は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のような市販の細胞外マトリックスを用いて実施される。他の細胞外マトリックスは、細胞培養についての技術分野で公知である。一般に、細胞外マトリックスは、ラミニン、エンタクチンおよびコラーゲンを含む。好ましい実施形態では、本方法は、細胞の培養のためのインビボ環境を模倣する３次元培養装置（チャンバー）を使用して実施され、このとき好ましくは、細胞外マトリックスは、低酸素状態で幹細胞の増殖を誘導することができるプレートの内側に形成され
る。そのような３次元装置は、当技術分野で知られている。そのような装置の例は、Ｂａｎｓａｌ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ７４，１８７−２００に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明によれば、オルガノイドの作製方法における３次元培養装置の使用が、表１に示すように、他の形式よりも驚くべき利点を有することが発見された。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
別の態様では、本発明は、前立腺オルガノイドを提供する。前立腺は、間質および上皮細胞の両方に対するアンドロゲン作用により性成熟時に加速された成長を伴う、ホルモン調節される腺器官である。ヒトの前立腺は、３つの解剖学的領域：周辺部、移行部および中心部、に分けられた管状−腺房腺（ｄｕｃｔａｌ−ａｃｉｎａｒ  ｇｌａｎｄ）であり、これらは密度の高い連続した線維筋肉の間質に囲まれている。ヒト前立腺基底細胞は連続層を構成し、お互いの間に密着結合を形成する。組織学的レベルでは、ヒト前立腺は、上皮細胞および間質細胞と呼ばれる２つの型の細胞を主に含む。本発明の前立腺オルガノイドは、原発性組織の構造に類似する。組織学的および免疫蛍光分析の際に、当業者は、オルガノイドが、上皮マーカーＥ−カドヘリンおよび高分子量サイトケラチンを発現し、ＰＳＡを分泌し得る上皮細胞の内層から形成されることを決定し得る。オルガノイドの外層は、ビメンチンを発現し得る間葉系の細胞からなり、前立腺組織の特徴である厚い基底膜によって取り囲まれている。
【００２７】
別の側面では、本発明は、原発性前立腺癌組織からインビトロで生成された前立腺オルガノイドを提供する。最も頻度の高い前立腺癌は腺房腺癌である。腫瘍の不均一性は、各患者生検試料から診断優性クローンおよび腫瘍サブクローンをマッピングし、各クローン由来のオルガノイドを作り出し、ならびに各クローンの遺伝子特徴を定義することによって、オルガノイドを作製するために記載された方法を用いて効率的にモデル化され得る。原発性前立腺癌組織由来の前立腺オルガノイドは、一般に分泌機能を有し、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を産生する；前立腺の主要な細胞集団（すなわち基底細胞、管腔細胞および間質細胞）に似た特異的な表現型マーカーを発現し、６ヶ月以上連続して伝播可能（ｐｒｏｐｏｇａｔａｂｌｅ）であり、元の原発性組織の遺伝的プロファイルおよび特徴的な融合配列を維持する。
【００２８】
別の側面では、本発明は、組織病理学的な組織特異的マーカーおよび腫瘍形成マーカーを発現することが同定された外科的に切除された腫瘍の組織から、インビトロで生成された前立腺オルガノイドを提供する。これらの組織からの単一細胞は、既知の発現特徴を有する単一細胞オルガノイドを生成するために、非接触レーザー捕獲マイクロダイセクションによって、またはＲＮＡ選別によって、例えばＳｍａｒｔＦｌａｒｅ（商標）プローブを用いて、単離され得る。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、前立腺癌細胞に対する抗癌活性を有する薬剤を同定する方法であって、少なくとも１つの試験薬剤を選択すること、患者の前立腺癌細胞に由来し患者特異的な複数の前立腺オルガノイドを試験薬剤と接触させること、試験薬剤の存在下
および試験薬剤の非存在下における前立腺オルガノイドの数を測定すること、ならびにオルガノイドの数が薬剤の非存在下よりも薬剤の存在下で少ない場合には抗癌活性を有する薬剤であると同定すること、を含む方法を提供する。別の実施形態では、本方法は、患者特異的オルガノイドに対して抗癌活性を有すると同定された薬剤で、患者を治療する工程を提供する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、被験体における前立腺癌の個別化治療を選択する方法であって：少なくとも１つの治療の形態を選択すること、複数の前立腺オルガノイドを治療の形態と接触させること、ただし、オルガノイドは被験体からの前立腺癌細胞に由来し、治療の存在下および治療の非存在下における前立腺オルガノイドの数を測定すること、ならびに前立腺オルガノイドの数が治療の非存在下よりも治療の存在下で少ない場合には治療を選択すること、を含む方法を提供する。開始前に治療抵抗性を決定するため、オルガノイドにおける発癌性ドライバー発現に基づいて個々の患者のための治療を調整するため、ならびに再発の頻繁な原因である誘導クローン選択プロセスの更なる研究のため、次いで、様々な型の療法がオルガノイドを用いて調べられ得る。放射線、ホルモン、化学療法、生物学的およびビスホスホネート療法のような、治療の種々の形態、組み合わせおよび型が当該分野で公知である。「被験体」という用語は任意の動物（例えば、哺乳類）を指し、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などを含み、特定の治療のレシピエントとなる。典型的には、用語「被験体」および「患者」は、本明細書では、ヒト被験体に対する言及と互換的に使用される。「治療する」または「治療」または「治療すること」または「緩和する」または「緩和すること」などの用語は、診断された病的状態の症状を治し、緩徐化し、軽減し、および／または進行を停止させる治療手段を指す。
【００３１】
前述の方法は、同一患者からの癌細胞由来および正常細胞由来オルガノイドにおける治療効果を比較することによって促進され得る。例えば、癌特異的である遺伝的およびエピジェネティックな突然変異ならびに遺伝子発現プロファイルを決定し、それによって遺伝子−薬物関連性および治療の最適化の決定を可能にするため、同じ患者の細胞由来の正常オルガノイドおよび癌オルガノイドが評価され得る。そのような比較はまた、治療応答を予測し、特定の患者における治療を個別化することを可能にする。
【００３２】
この方法の別の側面では、患者からの腫瘍組織において同定された前立腺癌細胞の複数の異なるクローンに由来する複数のオルガノイドに対する治療剤の効果を試験し、同じ患者の正常細胞に由来するオルガノイドに対する治療剤の効果と比較することによって、クローン的に標的化された治療法が決定され得る。
【００３３】
別の側面では、本発明は、ＢＰＥおよびエピネフリンが添加された細胞培養培地を提供する。別の実施形態では、本発明は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびヒドロコルチゾンが添加された細胞培養培地を提供する。好ましい実施形態では、培地は、ＰｒＥＢＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ）のような、市販の前立腺上皮細胞増殖培地である。
【００３４】
別の態様では、本発明は、単一細胞からオルガノイドを作製するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、先に記載したような分化培地およびオルガノイド培地のための容器を含む。容器はまた、分化培地およびオルガノイド培地のための必要な添加剤（成長因子、抗生物質、ホルモン、ビタミン、アミノ酸、およびそれらの組合せ）を含んでもよい。キットは、３次元培養装置のための必要な要素、例えばプレート、および／または細胞外マトリックスのための材料、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を、さらに含んでもよい。キットは、前述したような単一細胞からオルガノイドを作製する方法を実施するための一連の指示書をさらに含んでもよい。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、移植された患者特異的な前立腺オルガノイドを有す
るマウスを提供する。一実施形態では、マウスはヒト化マウスである。別の実施形態では、マウスは、ヒト免疫系（ＨＩＳ）−再構築マウスである。別の実施形態において、マウスは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）−Ｒａｇ（−）−γ鎖（−）（ＮＲＧ）マウスである。
【００３６】
ＨＩＳ−再構成マウスを作製する方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：２１５−２４、およびＨａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７４：４０２−４１３によって開示されている。本発明の一側面によれば、患者から、例えば診断骨髄試料またはＨＬＡ適合したものからのヒト幹細胞が、患者の免疫系の要素を生着させるために、新生児ＮＲＧマウスに移植される。マウスはその後、同じ患者の前立腺細胞由来の前立腺オルガノイドを用いて、前立腺内へ同所移植することに提供される。マウスは、新しい治療法を特定し、治療に対する反応を評価し、および併用療法を評価するのに有用である。
【００３７】
以下の非制限的な実施例は、本発明を説明するためのものである。
【実施例】
【００３８】
実施例１
上皮組織および間葉組織を含むオルガノイドが、単一の原発性前立腺癌細胞から作製された。幹細胞集団を増やし分化を誘導するための第１段階において、低酸素状態のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）チャンバーが、自己複製を促進する成長因子および分化を誘導する因子と共に、同時に１〜２週間使用された。成長因子の濃度および成長因子が添加された時点は、自己複製または細胞分化プログラムに対する細胞のコミットメントを決定した。第２段階は、自己複製を促進する追加の成長因子を含んだ。第２段階培養の１４日以内に、単一細胞に由来するオルガノイド構造が、１４を超える患者由来試料から形成された。
【００３９】
具体的には、外科的に切除した組織が、機械的に解離され、コラゲナーゼ処理され、濾過され、次いで分化培地中で１〜２週間増殖させられた。「分化期間」に続いて、細胞が収集され、洗浄され、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）チャンバーに単独で置かれた；チャンバーの大きさは細胞密度に応じて決定された。成長因子およびサイトカインを含むオルガノイド培地は、チャンバーから培地の上部を吸引することによって、細胞構造を乱すことなく、隔日で交換された。２週間以内に、原発性前立腺組織、正常組織および癌組織に由来するオルガノイドが形成された。これらのオルガノイドは、上皮および間葉組織を含む複数の細胞型を含んでいた。
【００４０】
使用された分化培地は、以下の市販の成分および最終濃度を含んでいた：ＰｒＥＢＭ培地（１倍）；ウシ下垂体抽出物（５２ｍｇ／Ｌ）；インスリン（５ｍｇ／Ｌ）；ヒドロコルチゾン（１μＭ）；ゲンタマイシン（３０μｇ／Ｌ）；アンホテリシン（１５μｇ／Ｌ）；トランスフェリン（５ｍｇ／Ｌ）；トリヨードサイロニン（１倍）；エピネフリン（１倍）；ｒｈＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）；レチノイン酸（０．１〜１０μＭ）。これらの成分を含む分化培地が、隔週（ｂｉｗｅｅｋｌｙ）で交換された。
【００４１】
次の工程／第二の工程において、細胞は、以下の成分および濃度のオルガノイド培地で１４日間培養された：ＰｒＥＢＭ培地（１倍）；ウシ下垂体抽出物（５２ｍｇ／Ｌ）；インスリン（５ｍｇ／Ｌ）；ヒドロコルチゾン（１μＭ）；ゲンタマイシン（３０μｇ／Ｌ）；アンホテリシン（１５μｇ／Ｌ）；トランスフェリン（５ｍｇ／Ｌ）；トリヨードサイロニン（１倍）；エピネフリン（１倍）；ｒｈＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）；およびｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）。以下の追加の３成分が１日おきに（１４日間の培養期間中７回）添加された、ヒドロコルチゾン（１μＭ）；ｒｈＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）；およびｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）。これらの成分を含むオルガノイド培地は隔日で交換され、こ
れら成長因子の活性のそれぞれの寿命に基づいて、オルガノイドに対するより高濃度の成長因子を反映した。
【００４２】
実施例２
前立腺癌組織は、前立腺切除標本から、施設内倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）承認プロトコールに基づいて単離された。非特定化された（Ｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）組織が手術の１５分以内に得られ、解離され、正常前立腺の基底板を模倣するマトリゲル（商標）の３Ｄ液滴チャンバー中で上記の実施例１に記載の条件を用いてオルガノイドを作製するために、利用された。このプロセスは、数ヶ月間生存する複数の前立腺オルガノイドを生成し、系列オルガノイドを再生するために再び作り出される（ｒｅｄｒｉｖｅｄ）ことができた。上記の実施例１に記載した条件が、試行された前立腺癌試料２４個のうち２１個からオルガノイドを、〜８７％の効率で作り出すために使用された。組織は、前立腺切除組織またはリンパ節生検を利用する高リスク前立腺癌および正常隣接組織（ＮＡＴ）細胞由来であった。
【００４３】
オルガノイドが細胞凝集の結果ではなく単一幹細胞からクローン化されたことを実証するために、患者由来の前立腺癌細胞が、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現させるためにレンチウィルスで操作され、３Ｄプレートで単一細胞として選別された。単一細胞由来オルガノイドは４日後に形成し、良好に形成された自己組織化オルガノイドを１４日後に完成させた。オルガノイド形成能力のパーセンテージは試料間で２〜３倍変動し、同じ患者からのＮＡＴに対して腫瘍の方が高かった。
【００４４】
前立腺癌オルガノイドは、成人の前立腺におけるように、厚い基底膜に囲まれた、丸い明確な多細胞構造を形成した。ＶＣａＰ細胞株からの細胞からのスフィアとは対照的に、単一の原発性細胞由来のオルガノイドは、鏡像生検におけるように、内部内皮細胞におけるＥ−Ｃａｄの発現、外間葉細胞におけるＶＩＭＥＮＴＩＮ、および周囲の膜を有するなど、その対応する原発性組織の保存された特徴を示した。単一オルガノイドからのアンドロゲン受容体（ＡＲ）痕跡（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を検出するための高感度Ｑ−ＰＣＲアッセイが開発された。ＡＲ発現およびＡＲ変異体／標的は、２４時間以内の培養条件によって調節された。
【００４５】
転移性の前立腺癌オルガノイドを開発する他者の試みは、上皮細胞のみからなるオルガノイドの低効率な産生をもたらしたが、原発性前立腺癌オルガノイドではなかった。Ｋａｒｔｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｃｅｌｌ  １５９：１６３−７５；  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｃｅｌｌ  １５９：１７６−８７。
【００４６】
対照的に、上記の実施例は、上皮および間葉組織の両方からなる３Ｄオルガノイドへの、単一幹細胞由来の良性前立腺肥大およびナイーブ前立腺癌の発生を実証する。
【００４７】
実施例３
以下の研究は、間質細胞共培養が、単一の腫瘍細胞３Ｄ培養と比較して、３Ｄオルガノイドとして成長した前立腺癌細胞の細胞増殖、移動および浸潤を増強するかどうかを決定するために行われた。上皮および間質細胞は、ルシフェラーゼおよび蛍光レポーターを発現する異なるレンチウィルスで標識された。ｍＣｈｅｒｒｙで標識された正常骨髄由来間質細胞とのＥＧＦＰ標識前立腺癌細胞の単層共培養による、腫瘍細胞の形態、移動、および増殖に対する効果が試験された。並行して、腫瘍開始細胞由来の標識前立腺癌オルガノイドの、ｍＣｈｅｒｒｙで標識した骨髄由来間質細胞との３Ｄ共培養の効果が、単層培養について試験されたものと同じパラメーターについて試験された。細胞生存率アッセイは、単培養（ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ）対照と比較した場合、増殖および細胞生存が３Ｄ共培養で〜３倍増加し、３Ｄ細胞が環境シグナルに対してより応答しやすいことを示した。
【００４８】
実施例４
ＧＦＰ−Ｌｕｃレンチウイルスに感染した細胞を使用して、上記実施例からのオルガノイドがマウス前立腺に移植され、ＩＶＩＳ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）インビボイメージングシステムを用いて生存マウスにルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を注入したときの生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって観察された。
【００４９】
前述の実施例および好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するものではなく、例示として取られるべきである。容易に理解されるように、上述した特徴の多くの変形および組み合わせが、請求項に記載された本発明から逸脱することなく利用され得る。そのような変形は、本発明の範囲からの逸脱と見なされず、そのような変形は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本明細書で引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】
2017524377.tif 000003
2017524377.tif 000004