(57)【要約】本発明は、ジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は治療用薬学組成物、前記薬学組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む、子宮頸癌の予防又は治療方法、ジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶを有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は改善用機能性食品組成物、及びジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶを有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は改善用飼料組成物に関する。
2017534578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）で表されるジペノサイド(Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ) ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は治療用薬学組成物。
【化１】
2017534578.tif 000004
【請求項２】
ジペノサイド(Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ) ＬＸＸＶは、ジンセノサイドＲｂ１（ginsenoside Rb1）から脱グリコシル化（deglycosylated）されて得られたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む、子宮頸癌の予防又は治療方法。
【請求項５】
下記化学式（１）で表されるジペノサイド(Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ) ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は改善用機能性食品組成物。
【化２】
2017534578.tif 000005
【請求項６】
前記ジペノサイド(Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ) ＬＸＸＶは、ジンセノサイドＲｂ１（ginsenoside Rb1）から脱グリコシル化（deglycosylated）されて得られたものである、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は治療用薬学組成物、前記薬学組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む、子宮頸癌の予防又は治療方法、ジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶを有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は改善用機能性食品組成物、及びジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶを有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は改善用飼料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジペノサイド（gypenoside; Gyp）は、アマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum）に主に含まれるトリテルペンサポニンであり、ジンセノサイドとその構造及び生理活性作用が非常に類似することが知られている。これまでにＧｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＬＸＸＶ及びＧｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩを含む約１００種のジペノサイドが公知となっている。
【０００３】
このようなジペノサイドの薬理学的用途を明らかにするための多くの努力がなされており、ツルアマチャ抽出物から分離されたジペノサイドの皮膚美白又は発毛促進効果（特許文献１）、アマチャヅル抽出物から分離されたジペノサイドの２型糖尿病、肥満又は脂質異常症の治療又は予防効果（特許文献２）、ジペノサイドの大腸炎治療又は予防効果（特許文献３）などが公知となっているが、子宮頸癌に対する前記ジペノサイドの薬理活性効果は明らかにされていない現状である。
【０００４】
一方、子宮頸癌は、世界的に癌による女性死亡原因の２位を占めており、世界保健機関の推定によれば、毎年子宮頸癌と診断される女性が約５１万人に達し、そのうち約５６％となる約２８万人が死亡する。子宮癌患者の約９０％以上が子宮頸癌患者であり、子宮頸癌は発生頻度及びそれによる死亡頻度が最も高い悪性腫瘍である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００８−００８５２９２号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１３−００６９４３０号公報
【特許文献３】韓国公開特許第１０−２０１２−０００５８９６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cui, C. H. et al., Appl. Microbiol. Biotech., 2013, 97, 649-659.
【非特許文献２】Lee, J. Y. et al., Molecular cancer therap., 2013, 12, 274-85.
【非特許文献３】Poon, P. Y. et al., Drug Metabol. Dispo., 2012, 40, 120-129.
【非特許文献４】Cao, B. et al., Int. J. Cancer., 2013, 132, 1277-1287.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
こうした背景の下、本発明者らは、ジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶの新たな薬理活性効果を解明すべく鋭意研究を重ねた結果、ジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶが子宮頸癌を予防又は治療する効果を発揮することを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、化学式（１）で表されるジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、前記薬学組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む、子宮頸癌の予防又は治療方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、化学式（１）で表されるジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は改善用機能性食品組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、化学式（１）で表されるジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は改善用飼料組成物を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶは、癌の予防及び治療に安全かつ効果的に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣを用いて精製されたジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ（ＧｙｐＬＸＸＶ）のＨＰＬＣ結果を示すクロマトグラムである。Ｇｌｃはグルコース部分（glucose moiety）を意味する。
【図２】ＨｅＬａ細胞の生存能によりＧｙｐＬＸＸＶ、Ｒｇ３（Ｓ）、ＧｙｐＸＶＩＩ及びＲｂ１の抗癌活性を示すグラフである。ＨｅＬａ細胞は、様々な濃度のジペノサイド及びジンセノサイドを含む培養培地で４８時間培養された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
前記目的を解決するために、本発明の一態様は、化学式（１）で表されるジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【００１４】
本発明における「ジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ（ＧｙｐＬＸＸＶ）」とは、ジペノサイド（gypenoside; Gyp）の一種を意味し、下記化学式（１）で表される化学構造を有する。前記ＧｙｐＬＸＸＶの子宮頸癌に対する治療効果は、これまで全く知られておらず、本発明者によって最初に究明されたものである。
【００１５】
【化１】
2017534578.tif 000003
本発明における「ジペノサイド（gypenoside; Gyp）」とは、トリテルペノイドサポニン（triterpenoid saponin）を意味する。前記ジペノサイドの種類としては、ＧｙｐＬＸＸＶをはじめとして、ＧｙｐＸＶＩＩ、ＧｙｐＸＬＩＸ、ＧｙｐＬＸＸＩＶ、ＧｙｐＸＬＶ、ジペノサイドＵＬ１、ジペノサイドＵＬ２、ジペノサイドＵＬ３、ジペノサイドＵＬ４、ジペノサイドＵＬ５、ジペノサイドＵＬ６、ジペノサイドＵＬ７などが知られている。
【００１６】
本発明のジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶは、公知の方法によりジンセノサイドＲｂ１から脱グリコシル化（deglycosylated）して得ることもでき、商業的に入手したものを用いることもできる。
【００１７】
本発明における「脱グリコシル化（deglycosylated）」とは、グリコシド（glycoside）が結合していた化合物から除去されることを意味する。前記「グリコシド（glycoside）」とは、配糖体とも呼ばれ、グリコシド結合（glycosidic bond）により他の官能基に結合している糖分子を意味する。本発明の目的上、前記脱グリコシル化とは、ジンセノサイド化合物内の配糖体が加水分解されて除去されることを意味し、前記配糖体は、グルコース部分（glucose moiety）と同じ意味に解釈される。
【００１８】
本発明における「薬学的に許容される塩」とは、陽イオンと陰イオンが静電気的引力により結合している物質である塩のうち薬学的に用いられる形態の塩を意味するが、通常は金属塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などである。例えば、金属塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アルミニウム塩などが挙げられ、有機塩基との塩としては、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられ、無機酸との塩としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられ、有機酸との塩としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられ、塩基性アミノ酸との塩としては、アルギニン、リシン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【００１９】
また、本発明による化合物は、キラル中心を有するので、Ｒ又はＳ異性体、ラセミ体、ジアステレオマー混合物及びそれぞれのジアステレオマーとして存在し、これら全ての異性体及び混合物は本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
本発明における「子宮頸癌」とは、膣に続く子宮頸部に発生する悪性腫瘍を意味する。子宮頸癌は全世界の女性に２番目に多く発生する癌であり、子宮頸癌の約８０％はアジア、南米、アフリカなどの開発途上国で発生することが知られている。韓国において、子宮頸癌は４番目に多く発生する癌であり、年平均の女性癌患者全４６，４７６人のうち子宮頸癌患者が４，３９４人と約９．５％を占めている。
【００２１】
本発明の一実施例においては、子宮頸癌細胞ＨｅＬａに対して、化学式１で表される化合物であるＧｙｐＬＸＸＶの毒性影響を確認した。ＧｙｐＬＸＸＶは、より多くのグルコース部分が結合したＲｂ１及びＧｙｐＸＶＩＩより高い抗癌効果を発揮することが確認され、商業的に販売されて臨床にも用いられるＲｇ３（Ｓ）と同程度の抗癌効果を発揮することが確認された（図２）。
【００２２】
本発明における「予防」とは、本発明のＧｙｐＬＸＸＶを有効成分として含む薬学組成物の投与により子宮頸癌の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。
本発明における「治療」とは、前記薬学組成物の投与により子宮頸癌の発症個体及びその疑いのある個体の症状が好転又は有利に変化するあらゆる行為を意味する。
【００２３】
本発明の薬学組成物は、組成物の総重量に対して０．０００１〜５０重量％のＧｙｐＬＸＸＶを含んでもよく、具体的には、０．０１〜１０重量％のＧｙｐＬＸＸＶを含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００２４】
前記本発明の薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常用いられる薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよく、前記担体は、非天然担体（non-naturally occuring carrier）を含んでもよい。
【００２５】
本発明における「薬学的に許容される」とは、前記組成物に接触する細胞やヒトに毒性がないという特性を意味する。
具体的には、前記薬学組成物は、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エアゾール剤などの経口剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いられる。本発明において、前記薬学組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、少なくとも１つの賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム（calcium carbonate）、スクロース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も用いられる。経口用液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、液体パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられる。非経口用製剤としては、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
【００２６】
前記目的を解決するために、本発明の他の態様は、本発明の薬学組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む、子宮頸癌の予防又は治療方法を提供する。
本発明における「投与」とは、適切な方法で個体に所定の物質を導入することを意味する。
【００２７】
本発明における「個体」とは、子宮頸癌が発症したか、発症する可能性のあるヒトをはじめとする、ラット、マウス、家畜などのあらゆる動物を意味する。具体的な例として、ヒトを含む哺乳動物が挙げられる。
【００２８】
具体的に、本発明の子宮頸癌の予防又は治療方法は、ヒト以外の個体に化学式（１）で表されるジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は治療用薬学組成物を薬学的に有効な量で投与するステップを含んでもよい。
【００２９】
本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効用量レベルは、患者の性別、年齢、体重、健康状態、疾病の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、配合又は同時に用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により当業者が容易に決定することができる。
【００３０】
具体的には、本発明の組成物は、固形分を基準にして１日０．０００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、より具体的には０．００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇで投与してもよい。投与は、前記推奨投与量を１日１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
【００３１】
本発明の子宮頸癌の予防又は治療方法において、前記組成物を投与する投与経路及び投与方法は特に限定されるものではなく、目的とする該当部位に前記組成物を含む組成物が到達できるものであれば任意の投与経路及び投与方法を用いることができる。具体的には、前記組成物は、経口又は非経口の様々な経路で投与することができ、その投与経路の例としては、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入などで投与されることが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
前記目的を解決するために、本発明のさらに他の態様は、化学式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は改善用機能性食品組成物を提供する。
【００３３】
本発明における「改善」とは、治療される状態に関するパラメータ、例えば症状の程度を少なくとも減少させるあらゆる行為を意味する。
本発明の前記機能性食品組成物を食品添加物として用いる場合は、前記組成物をそのまま添加するか、他の食品又は食品成分と共に用いることができ、通常の方法で適宜用いることができる。
【００３４】
具体的には、前記機能性食品組成物は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料水、茶、機能水、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤のいずれかの形態であってもよい。
【００３５】
また、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤や天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド、増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができ、その他、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３６】
前記機能性食品組成物は食品添加物をさらに含んでもよく、「食品添加物」としての適否は、特に断らない限り、食品医薬品安全処の承認を得た食品添加物公典の総則及び一般試験法などに従って該当品目に関する規格及び基準により判定する。
【００３７】
前記「食品添加物公典」に収載された品目としては、例えばケトン類、グリシン、クエン酸カリウム、ニコチン酸、ケイ皮酸などの化学的合成品、柿色素、甘草抽出物、結晶セルロース、コウリャン色素、グアーガムなどの天然添加物、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム製剤、麺類添加アルカリ剤、保存料製剤、タール色素製剤などの混合製剤類が挙げられる。
【００３８】
ここで、機能性食品を製造する過程で飲料を含む食品に添加される本発明によるジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶは、必要に応じてその含有量を適切に加減することができ、具体的には食品１００重量％に０．０１〜１０重量％含まれるように添加することができるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
前記目的を解決するために、本発明のさらに他の態様は、化学式（１）で表されるジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶ又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、子宮頸癌の予防又は治療用飼料組成物を提供する。
【００４０】
本発明における「飼料」とは、家畜が食べて摂取し、消化させるための、又はそれに適した任意の天然又は人工の規定食、一食など、又は前記一食の成分を意味する。
前記飼料は、飼料添加剤又は補助飼料を含んでもよい。
【００４１】
前記飼料の種類は特に限定されるものではなく、当該技術分野において通常用いられる飼料を用いることができる。前記飼料の例としては、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、澱粉類、ミール類、穀物副産物類などの植物性飼料と、タンパク質類、無機物類、油脂類、ミネラル類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類、飲食物などの動物性飼料が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：  Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＬＸＸＶ（ジペノサイドＬＸＸＶ）の分離及び分析
Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＬＸＸＶ（ジペノサイドＬＸＸＶ，ＧｙｐＬＸＸＶ）、Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ ＸＶＩＩ（ジペノサイドＸＶＩＩ，ＧｙｐＸＶＩＩ）、ジンセノサイドＲｂ１（gynsenoside Rb1; Ｒｂ１）及び２０（Ｓ）−ジンセノサイド−Ｒｇ３（gynsenoside Rg3(S); Ｒｇ３（Ｓ））を公知の方法（非特許文献１）に従って準備し、前記化合物の分離のためにＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【００４３】
ＨＰＬＣ分析のために、ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｐｕｍｐ、ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒ、ｓｉｎｇｌｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ｍｏｄｅｌ ７３０Ｄ）を含むＨＰＬＣシステム（Younglin Co. Ltd, Korea）を用いた。ピークの確認及び統合にはＹｏｕｎｇｌｉｎ’ｓ ＡｕｔｏＣｈｒｏ ３０００ソフトウェアを用いた。ジンセノサイドの分離は、ｇｕａｒｄカラム（Eclipse XDB C18, 5 μm, 12.5 × 4.6 mm i.d.）と共にＰｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ（２）Ｃ１８カラム（5 μm, 150 × 4.6 mm ｉ.d.; Phenomenex, USA）で行った。移動相をアセトニトリル（acetonitrile）溶媒であるＡと、蒸留水溶媒であるＢとから構成した。Ｇｒａｄｉｅｎｔ溶出は３２％の溶媒Ａ及び６８％の溶媒Ｂから始め、０分から８分まではＡを３２％から６５％まで増加させ、８分から１２分まではＡを６５％から１００％まで増加させ、１２分から１５分まではＡを１００％で一定に維持し、１５分から１５．１分まではＡを１００％から３２％に減少させ、１５．１分から２５分まではＡを３２％で一定に維持するように条件を変更した。注入した体積は２５μｌであった。
【００４４】
その後、分離したＧｙｐＬＸＸＶに対してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により質量を分析して構造を確認した。陰イオンモード（mode）で三連四重極タンデム質量分析計（triple-quadrupole tandem mass spectrometer, API-2000, Applied Biosystems, Foster City, USA）により精製過程を行い、その後ＧｙｐＬＸＸＶのエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（electrospray ionization mass spectrum; ESI-MS）を測定した。用いたＥＳＩパラメータ（parameter）は次の通りである。
【００４５】
ionspray voltage, 24,200 V; ion source gas 1(GS1), 20; curtain gas(CUR), 20; collision gas(CAD), 2.
測定されたジンセノサイドにおいて、ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＤＰ）、ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＦＰ）、ｅｎｔｒａｎｃｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＥＰ）、ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｅｘｉｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＣＸＰ）及びｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）は異なる値であった。ＭＳ分析のために、４００から１，０００のｍ／ｚ範囲でスペクトルを記録した。
【００４６】
その結果、生産されたＧｙｐＬＸＸＶのエレクトロスプレー陰イオン質量スペクトルは７８３．８［Ｍ２Ｈ］２であることが確認された（図１）。
実施例２：  ＨｅＬａ細胞におけるジペノサイド（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ） ＬＸＸＶの細胞毒性効果
腫瘍細胞におけるＧｙｐＬＸＸＶの細胞毒性効果を立証するために、子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを用いて、細胞生存能に対するＲｂ１、ＧｙｐＸＶＩＩ、Ｒｇ３（Ｓ）及びＧｙｐＬＸＸＶの細胞毒性効果を比較した。
【００４７】
１０％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン（glutamine）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（penicillin）及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（streptomycin）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）において、３７℃の５％ＣＯ２を含む条件でＨｅＬａ細胞を培養した。ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）に含まれるＧｙｐＬＸＸＶを記載された最終濃度になるように適切な量で培養培地に添加した。
【００４８】
インビトロ（in vitro）での化学感受性（chemosensitivity）は、ＭＴＴ（dimethyl thiazolyl-2,5-diphenyltetrazolium bromide）アッセイ（CellTiter 96(R) Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit, Promega）により測定した。ＨｅＬａ細胞を１ウェル当たりの細胞数が１０４となる濃度で９６ウェル（well）プレートに１００μｌずつ分注して付着させ、その後２４時間培養した。ＧｙｐＬＸＸＶ、Ｒｇ３（Ｓ）、Ｒｂ１及びＧｙｐＸＶＩＩの抗増殖効果を測定するために、ＦＢＳを添加していない培地に２．５〜１００μＭの前記化合物を希釈し、その後各ウェルに添加した。その後、前記化合物で処理した細胞を３７℃で４８時間培養し、ＭＴＴを各ウェルに添加して４時間さらに培養した。培養培地を吸入させて除去し、その後ＭＴＴにより形成されたホルマザン（formazan）を１００μｌの可溶化／停止（Solubilization/Stop）液に溶解した。その後、各ウェルにおける光学密度（optical density）を５９５ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーにより測定した。結果はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５プログラムを用いて分析したＬＣ５０値で示した。
【００４９】
その結果、Ｒｇ３（Ｓ）及びＧｙｐＬＸＸＶによる処理は用量依存的に細胞分裂を減少させることが確認された。４８時間後に、ほとんど全てのＨｅＬａ細胞は５０μＭのＧｙｐＬＸＸＶ及びＲｇ３（Ｓ）により阻害された。図２から分かるように、ＨｅＬａ細胞に対するＲｇ３（Ｓ）及びＧｙｐＬＸＸＶのＬＣ５０は、それぞれ２３．４８±２．５４μＭ及び２９．９５±５．７５μＭであった。本発明により得られた前記結果はＧｙｐＬＸＸＶの抗癌効果を最初に確認したものであり、前記化合物は複数の公知の文献（非特許文献２及び３）によりＨｅＬａ細胞に対してインビトロ及びインビボ（in vivo）で強い抗癌効果を発揮することが知られているＲｇ３（Ｓ）と同程度の抗分裂活性を示すことが確認された（図２）。
【００５０】
ジンセノサイドＲｂ１から脱グリコシル化されて生産された希少ジンセノサイド（Ｆ２、Ｒｇ３（Ｓ）、Ｒｈ２（Ｓ）、ＣＫ及びＰＰＤ）の抗癌効果については多くの研究が行われており、様々な癌細胞株に対して強い活性を示すことが複数の文献により確認されている（非特許文献２及び４）。しかし、ＧｙｐＬＸＸＶの抗癌効果は本発明により初めて明らかにされたものである。また、商業的に販売されて臨床にも用いられるＲｇ３（Ｓ）と同程度の抗癌効果を発揮することが確認された。さらに、より多くのグルコース部分（moiety）が結合したＲｂ１又はＧｙｐＸＶＩＩより高い抗癌効果を発揮することが確認された（図２）。
【００５１】
このように、ＧｙｐＬＸＸＶは用量依存的に子宮頸癌治療効果を有することが確認された。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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