(57)【要約】  部位特異的ヌクレアーゼを用いてアンドロゲン由来のハプロイド細胞株を形質転換するための方法が開示される。いくつかの実施形態では、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株は、トウモロコシ小胞子由来植物組織培養物である。さらに、本開示は、例えば、ハプロイドまたはジハプロイド組織ゲノムの特定の遺伝子座を突然変異する、またはハプロイドまたはジハプロイド組織ゲノムの特定の遺伝子座を標的化し、それにドナーＤＮＡを組み込むことによって修飾するための方法を提供する。本開示は、本開示から得ることができる、特定のゲノム遺伝子座での突然変異または特定のゲノム遺伝子座内に組み込まれたドナーＤＮＡのいずれかを含有するハプロイドまたはジハプロイド組織から全植物体を再生するための方法をさらに提供する。
2017513506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシゲノムを修飾するための方法であって、
（ａ）ハプロイド組織ゲノムを含むトウモロコシ小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織を準備するステップと、
（ｂ）部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを、前記形質転換受容性ハプロイド組織に送達するステップと、
（ｃ）前記ハプロイド組織ゲノムが、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって修飾されていることを確認するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記形質転換受容性ハプロイド組織が、胚またはカルス組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを、前記形質転換受容性ハプロイド組織に、微粒子銃形質転換法、アグロバクテリウム形質転換法、リン酸カルシウム形質転換法、ポリブレン形質転換法、エレクトロポレーション形質転換法、超音波形質転換法、リポソーム形質転換法、マイクロインジェクション形質転換法、裸のＤＮＡ形質転換法、プラスミドベクター形質転換法、ウイルスベクター形質転換法、シリコンカーバイド媒介性形質転換法、エアゾールビーミング形質転換法およびＰＥＧ形質転換法からなる群から選択される植物形質転換法によって送達するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼをコードする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）ドナーポリヌクレオチドを送達し、前記ドナーポリヌクレオチドを修飾された前記ハプロイド組織ゲノム中に安定に組み込むステップ
をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナーポリヌクレオチドが、１つまたは２つのドメインを含み、各ドメインが、ハプロイド組織ゲノムのゲノムＤＮＡ標的領域中の配列に対して少なくとも８５％同一である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記小胞子由来形質転換受容性組織が、優良性能特性を有するトウモロコシに由来する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記小胞子由来形質転換受容性組織が、優良トウモロコシ系統を、高い小胞子培養応答を有する異なるトウモロコシ系統と交雑することによって得られたハイブリッドトウモロコシに由来する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ハプロイド組織ゲノムが修飾されていることを、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたは次世代配列決定アッセイを実施することによって確認するステップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｄ）修飾された前記ハプロイド組織ゲノムを含むハプロイド組織を、染色体倍加剤で処理するステップと、
（ｅ）修飾されたジハプロイドトウモロコシゲノムを含むジハプロイドトウモロコシ組織を製造するステップと、
（ｆ）ジハプロイドトウモロコシ組織を、ホモ接合性の修飾されたジハプロイドトウモロコシゲノムを含むジハプロイドトウモロコシ植物体に再生させるステップと
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織が、
（ｉ）トウモロコシから小胞子を含有する雄穂を収穫するステップと、
（ｉｉ）前記雄穂を約４〜１２℃の温度でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）前記雄穂から小胞子を含有する葯を単離するステップと、
（ｉｖ）葯培養培地中で葯を培養して、小胞子由来胚を作製するステップと、
（ｖ）前記小胞子由来胚をカルス培地中で培養し、それによって、前記小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織を作製するステップと
を含む方法によって作製される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｂ’）ドナーポリヌクレオチドを送達し、前記ドナーポリヌクレオチドを前記修飾されたハプロイド組織ゲノム中に安定に組み込むステップと、
（ｂ’’）前記ドナーポリヌクレオチドを前記ハプロイド組織ゲノムの標的領域中に安定に組み込むステップと、
（ｃ）前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ハプロイド組織ゲノムの前記標的領域中に組み込まれていることを確認するステップと
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組み込まれた前記ドナーポリヌクレオチドが、トウモロコシハプロイド組織内で発現される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
組み込まれた前記ドナーポリヌクレオチドが、農学的形質を付与する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｂ）前記部位特異的ヌクレアーゼを発現させ、トウモロコシの前記ハプロイドゲノム中に突然変異を導入するステップと、
（ｃ）前記ハプロイドトウモロコシゲノムが突然変異を含むことを確認するステップと
をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の修飾されたハプロイド組織ゲノムを含む組織から再生したトウモロコシ植物体。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の修飾されたジハプロイド組織から再生したトウモロコシ植物体であって、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入されたゲノム修飾を含む、トウモロコシ植物体。
【請求項１８】
請求項１０に記載の修飾されたジハプロイド組織ゲノムから再生されたジハプロイドトウモロコシ植物体であって、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含む、トウモロコシ植物体。
【請求項１９】
コードされた部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含むトウモロコシ後代植物を製造する方法であって、
（ａ）請求項１７に記載のトウモロコシ植物体を、異なる親トウモロコシ系統の植物体と交雑して、Ｆ１後代植物を製造するステップと、
（ｂ）コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入されたゲノム修飾を有する１種または複数のＦ１後代植物を選択して、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含む１種または複数のトウモロコシ後代植物を製造するステップと、
（ｃ）任意選択で、（ｉ）Ｆ１後代植物を、請求項１８に記載のトウモロコシ植物体または異なる親トウモロコシ系統と戻し交雑して、戻し交雑後代植物を製造するステップと、（ｉｉ）コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入されたゲノム修飾を含む戻し交雑後代植物を選択するステップと、（ｉｉｉ）さらに任意選択で、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を反復して、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含む１種または複数のトウモロコシ後代植物を製造するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含むトウモロコシ後代植物を製造する方法であって、
（ａ）請求項１８に記載のトウモロコシ植物体を、異なる親トウモロコシ系統の植物体と交雑してＦ１後代植物を製造するステップと、
（ｂ）コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入されたゲノム修飾を有する１種または複数のＦ１後代植物を選択して、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含む１種または複数のトウモロコシ後代植物を製造するステップと、
（ｃ）任意選択で、（ｉ）Ｆ１後代植物を、請求項１８に記載のトウモロコシ植物体または異なる親トウモロコシ系統と戻し交雑して、戻し交雑後代植物を製造するステップと、（ｉｉ）コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入されたゲノム修飾を含む戻し交雑後代植物を選択するステップと、（ｉｉｉ）さらに任意選択で、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を反復して、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含む１種または複数のトウモロコシ後代植物を製造するステップと
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法に従って製造された、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含むトウモロコシ後代植物から得られた穀粒。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法に従って製造された、コードされた前記部位特異的ヌクレアーゼによって導入された修飾を含むトウモロコシ後代植物から得られた穀粒。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、植物、植物組織および細胞株、植物を再生することならびにそれに核酸を導入および／または再編成するための方法に関する。トウモロコシアンドロゲン由来のハプロイド細胞における、外因性ＤＮＡの部位特異的挿入を含めた形質転換および遺伝子編集のための方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
トランスジェニックトウモロコシ製造は、通常、アグロバクテリウム同時培養または微粒子銃による導入遺伝子の、未熟接合体胚の胚盤領域などの２倍体体細胞組織への送達を含む。これらの手順は、通常、一次形質転換体（Ｔ０）において「ヘミ接合性」である組み込まれた導入遺伝子につながり、Ｔ１植物世代において分離する。導入遺伝子をその他の遺伝的背景に動かすことは、戻し交配による遺伝子移入を必要とする。したがって、２倍体体細胞組織または細胞のゲノム中に導入遺伝子を送達し、導入遺伝子をその他の遺伝的背景中に動かすためのこのような方法は、骨の折れることであり、資源集約的であり、時間のかかるものであり得る。
【０００３】
部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用する２倍体植物の、ゲノム中の１つまたは複数の所定の位置への導入遺伝子の部位特異的送達（ゲノム編集）は、相同染色体の２つの対応するセットを有する２倍体ゲノムおよびこれらのコードされる部位特異的ヌクレアーゼは、相同対の一方または両方の染色体のいずれかの切断によって標的部位を修飾するという事実によって、さらなるセットの課題を示し得る。切断された部位の不完全な修復に起因する突然変異は、珍しくはない。さらに、ゲノム修復プロセスは、鋳型ベースであるので、修復プロセスは、対応する相同染色体上の入ってくるドナーポリヌクレオチドまたは対立遺伝子配列のいずれかを鋳型として使用し得る。したがって、２倍体細胞では、対応する相同染色体上の対立遺伝子配列は、入ってくるドナーポリヌクレオチドと競合し得る。このプロセスが、対応する相同染色体に基づいて（ドナーポリヌクレオチドの代わりに）、切断された染色体の望ましくない修復をもたらす場合には、ターゲッティングされる導入遺伝子組込みの効率が、それによって低減される。
【０００４】
トウモロコシのハプロイドゲノムへの導入遺伝子のランダム組込みをもたらす、いくつかの植物形質転換法が記載されている。これらの方法は、ハプロイドプロトプラストのポリエチレングリコール処理（Sukhapinda et al., 1993, Plant Cell Reports, 13:63-68、Jardinaud et al., 1995）、小胞子由来胚様構造の微粒子銃Protoplasma, 187:138-143）および母系由来胚のアグロバクテリウム同時培養（米国特許第７，５７２，６３５号明細書）による導入遺伝子のランダム組込みを含む。しかし、トウモロコシのハプロイドゲノム中の選択された位置の安定な部位特異的（ターゲッティングされた）修飾は、未開拓のままである。
【０００５】
したがって、トウモロコシにおけるハプロイドゲノムの安定なターゲッティングされた修飾の作製方法が望まれている。
【０００６】
さらに、ハプロイド細胞では、単一セットの染色体のみがある、すなわち、各所与の遺伝子の対応する対立遺伝子配列はなく、入ってくるドナーポリヌクレオチドは、修復鋳型として働く対応する相同染色体からの干渉を伴わない相同性組換え修復の容易に利用可能な鋳型であり、突然変異は、容易に明らかにされる。多数の突然変異、例えば、ノックアウトの表現型は、２倍体組織では観察されず、ハプロイドにおいて見られ得るように劣性である。したがって、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株内の部位特異的ヌクレアーゼによる形質転換および突然変異誘発とハプロイドゲノムＤＮＡのその後の切断と、任意選択で、ドナーポリヌクレオチドのターゲッティングされた組込みまたは特定の配列のターゲッティングされた修飾、例えば、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株、例えば、小胞子由来植物組織培養物のハプロイドゲノム内の突然変異のための組成物および方法は依然として必要である。
【０００７】
したがって、本開示は、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株、例えば、小胞子由来植物組織培養物のハプロイドゲノム内の形質転換および部位特異的ヌクレアーゼの送達のための新規組成物および方法を提供する。小胞子由来植物組織培養形質転換法の適用は、植物ゲノム内の部位特異的ヌクレアーゼ組込みの効率の増大、それによる、多数の形質転換事象のスクリーニングの必要性の低減およびその後のこれらの種類の実験の完了に伴われる費用および人員の時間の低減をもたらし得る。例えば、小胞子由来植物のハプロイドゲノムの形質転換の配置を使用して、何万もの植物事象の高価な骨の折れるスクリーニングを必要とすることなく、特定のゲノム部位内にドナーＤＮＡを組み込み、ホモ接合型植物を得ることができる。さらに、部位特異的ヌクレアーゼ媒介性のターゲッティングされた突然変異誘発のためのアンドロゲン性ハプロイド細胞株の使用は、劣性突然変異の効率的な同定および単離を可能にする。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、幾分かは、トウモロコシハプロイド組織または細胞における部位特異的突然変異誘発またはドナー導入遺伝子組込みによるハプロイドゲノムの安定なターゲッティングされた修飾のための方法の予期しない発見に基づいている。ゲノム修飾の開示される方法は、部位特異的突然変異または導入遺伝子を、完全に固定された遺伝的背景において即時的にホモ接合性にするよう染色体倍加するための方法とともに使用できる。さらに、ハプロイド組織または細胞における安定なゲノム修飾の開示される方法は、２倍体組織におけるその他の方法よりも効率的であり得る。２倍体組織では、第１の染色体上の各ゲノム配列は、第２の染色体上に対応する対立遺伝子配列を有し、これは、第１の染色体中に挿入された任意の突然変異または導入遺伝子を修復するよう進化した相同性組換え修復において鋳型として働く。対照的に、ハプロイド組織または細胞は、第２の対応する染色体を欠いており、すなわち、それらは、新規に導入された突然変異または導入遺伝子を除去するために相同性組換え修復によって使用される修復鋳型を欠く。いくつかの場合には、入ってくるドナーポリヌクレオチドは、相同性組換え修復の最も容易に利用可能な鋳型であり得、したがって、所望のターゲッティングされた修飾が、ハプロイドゲノム中に安定に組み込まれることを確実にするよう役立つ。さらに、開示される方法はまた、劣性表現型を有する、安定なゲノム修飾突然変異、例えば、ノックアウトおよび遺伝子不活性化を明らかにすることにとっても有用である。２倍体組織では、劣性表現型は現れないが、ハプロイド組織では、劣性表現型につながるこのようなターゲッティングされたゲノム修飾が観察され得る。
【０００９】
一態様では、本開示は、トウモロコシゲノムを修飾するための方法であって、ハプロイド組織ゲノムを含むトウモロコシ小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織を準備するステップと、部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを、形質転換受容性ハプロイド組織に送達するステップと、ハプロイド組織ゲノムが、コードされた部位特異的ヌクレアーゼによって修飾されていることを確認するステップとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、形質転換受容性ハプロイド組織は、胚またはカルス組織である。開示される方法では、部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドが、形質転換受容性ハプロイド組織に植物形質転換法によって送達される。特定の実施形態では、植物形質転換法は、微粒子銃形質転換法、アグロバクテリウム形質転換法、リン酸カルシウム形質転換法、ポリブレン形質転換法、エレクトロポレーション形質転換法、超音波形質転換法、リポソーム形質転換法、マイクロインジェクション形質転換法、裸のＤＮＡ形質転換法、プラスミドベクター形質転換法、ウイルスベクター形質転換法、シリコンカーバイド媒介性形質転換法、エアゾールビーミング形質転換法およびＰＥＧ形質転換法からなる群の任意の方法を含む。開示される方法のいずれかでは、部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む、選択されたヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ハプロイドトウモロコシゲノムのゲノムＤＮＡ標的領域を優先的に切断する。特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡの２つの鎖が切断される。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの単一鎖が切断される。さらなる実施形態では、前記の方法のいずれかは、ドナーポリヌクレオチドを送達し、ドナーポリヌクレオチドを修飾されたハプロイド組織ゲノム中に安定に組み込むことをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、各ドナーポリヌクレオチドは、ハプロイド組織ゲノムのゲノムＤＮＡ標的領域に対して少なくとも８５％同一である少なくとも１つのドメインを含む。さらなる実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ハプロイド組織ゲノムのゲノムＤＮＡ標的領域中の２つの異なる配列に対して少なくとも８５％同一である２つのドメインを含む。ハプロイドトウモロコシゲノムを修飾するための本明細書に開示される方法のいずれかのさらなる実施形態では、小胞子由来形質転換受容性組織は、優良性能特性を有するトウモロコシに由来する。例えば、小胞子由来形質転換受容性組織は、優良トウモロコシ系統を、高い小胞子培養応答を有する異なるトウモロコシ系統と交雑することによって得られたハイブリッドトウモロコシに由来し得る。さらに、開示される方法のいずれかでは、ハプロイド組織ゲノムが修飾されていることを確認することは、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたは次世代配列決定アッセイを実施することを含む。
【００１０】
開示される方法のいずれかのトウモロコシ小胞子に由来する形質転換受容性ハプロイド組織は、トウモロコシから小胞子を含有する雄穂を収穫するステップと、雄穂を約４〜１２℃の温度でインキュベートするステップと、雄穂から小胞子を含有する葯を単離するステップと、葯培養培地中で葯を培養して、小胞子由来胚を作製するステップと、小胞子由来胚をカルス培地中で培養し、それによって、小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織を作製するステップとによって得ることができる。
【００１１】
別の実施形態では、修飾されたハプロイド組織ゲノムを含むハプロイド組織は、染色体倍加剤でさらに処理され得、それによって、修飾されたジハプロイドトウモロコシゲノムを含むジハプロイドトウモロコシ組織を製造する。ジハプロイドトウモロコシ組織は、培養され、修飾されたジハプロイドトウモロコシゲノムを含むジハプロイドトウモロコシ植物体に再生され得る。さらに、このようなジハプロイドトウモロコシ植物体は、ハプロイド組織のゲノム修飾についてホモ接合性である。
【００１２】
さらに別の態様では、本開示は、ドナーのターゲッティングされた組込みのための方法であって、ハプロイド組織ゲノムを含むトウモロコシ小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織を準備するステップと、１種または複数のドナーポリヌクレオチドおよび部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを、形質転換受容性ハプロイド組織に送達するステップと、１種または複数のドナーポリヌクレオチドがハプロイド組織ゲノム中に組み込まれていることおよびハプロイド組織ゲノムがそれによって修飾されていることを確認するステップとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、形質転換受容性ハプロイド組織は、胚またはカルス組織である。これらの方法では、１種または複数のドナーポリヌクレオチドおよび部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを、形質転換受容性ハプロイド組織に送達するステップは、植物形質転換法によって行われ得る。いくつかの実施形態では、植物形質転換法は、微粒子銃形質転換法、アグロバクテリウム形質転換法、リン酸カルシウム形質転換法、ポリブレン形質転換法、エレクトロポレーション形質転換法、超音波形質転換法、リポソーム形質転換法、マイクロインジェクション形質転換法、裸のＤＮＡ形質転換法、プラスミドベクター形質転換法、ウイルスベクター形質転換法、シリコンカーバイド媒介性形質転換法、エアゾールビーミング形質転換法およびＰＥＧ形質転換法を含む。さらなる実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドは、ハプロイド組織ゲノムのゲノムＤＮＡ標的領域を優先的に切断する。さらなる実施形態では、本明細書において開示される方法のいずれかは、ハプロイド組織ゲノム内の１種または複数のドナーポリヌクレオチドの安定な組込みをさらに含む。例えば、１種または複数のドナーポリヌクレオチドは、相同性組換え修復によって、または非相同末端結合修復によって標的領域内に組み込まれ得る。ハプロイドトウモロコシゲノムを修飾するための本明細書において開示される方法のいずれかでは、小胞子由来形質転換受容性組織は、優良性能特性を有するトウモロコシに由来する。例えば、小胞子由来形質転換受容性組織は、優良トウモロコシ系統を、高い小胞子培養応答を有する異なるトウモロコシ系統と交雑することによって得られたハイブリッドトウモロコシに由来する。ハプロイドトウモロコシゲノムを修飾するための本明細書において開示される方法のいずれかでは、ハプロイド組織ゲノムは、ハプロイド組織ゲノム中への組込みを確認するステップが、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたは次世代配列決定アッセイを実施するステップを含むことを含む。開示される実施形態のいずれかでは、１種または複数のドナーポリヌクレオチドは、ハプロイド組織ゲノム中に農学的形質を付与し得る（例えば、発現されると、農学的形質を有するトウモロコシを提供する遺伝子をコードする）。例えば、農学的形質は、殺虫剤耐性形質、除草剤許容性形質、窒素使用効率形質、水使用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質および選択マーカー形質から選択され得る。開示される実施形態のいずれかでは、ドナーポリヌクレオチドは、トウモロコシ植物体内で安定に発現され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドがハプロイド組織ゲノムに組み込まれる開示される方法のいずれかは、ハプロイド組織を染色体倍加剤で処理して、組み込まれたドナーポリヌクレオチドを含み、それについてホモ接合性である倍加されたハプロイド組織を製造することをさらに含み得る。
【００１３】
別の態様では、本開示は、ドナーポリヌクレオチドを含む植物体に関する。一実施形態では、植物体は、ハプロイドゲノムを含む。さらなる実施形態では、植物体は、ジハプロイドゲノムを含む。このような植物体は、本明細書に開示される方法のいずれかの修飾されたハプロイド組織ゲノムまたは修飾されたジハプロイド組織ゲノムを含む組織から再生され得る。
【００１４】
別の態様では、本開示は、トウモロコシのハプロイドゲノム内に突然変異を導入するための方法であって、ハプロイド組織ゲノムを含むトウモロコシ小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織を準備するステップと、部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを、形質転換受容性ハプロイド組織に送達するステップと、ハプロイドトウモロコシゲノムが、コードされる部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドによって導入される突然変異を含むことを確認するステップとを含む、方法に関する。形質転換受容性ハプロイド組織は、胚またはカルス組織であり得る。部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドは、植物形質転換法によって形質転換受容性ハプロイド組織に送達され得る。植物形質転換法は、微粒子銃形質転換法、アグロバクテリウム形質転換法、リン酸カルシウム形質転換法、ポリブレン形質転換法、エレクトロポレーション形質転換法、超音波形質転換法、リポソーム形質転換法、マイクロインジェクション形質転換法、裸のＤＮＡ形質転換法、プラスミドベクター形質転換法、ウイルスベクター形質転換法、シリコンカーバイド媒介性形質転換法、エアゾールビーミング形質転換法およびＰＥＧ形質転換法から選択され得る。開示される方法のいずれかでは、部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含めたヌクレアーゼをコードする。コードされる部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドは、ハプロイドトウモロコシゲノムの標的領域でゲノムＤＮＡを優先的に切断するものであり得る。開示される方法のいずれかでは、小胞子由来形質転換受容性組織は、優良性能特性を有するトウモロコシに由来し得る。例えば、小胞子由来形質転換受容性組織は、優良トウモロコシ系統を、高い小胞子培養応答を有する異なるトウモロコシ系統と交雑することによって得られたハイブリッドトウモロコシに由来し得る。開示される方法のいずれかでは、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドが、突然変異をゲノム中に導入することを確認するステップは、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたは次世代配列決定アッセイによって行われ得る。開示される方法のいずれかでは、ハプロイドトウモロコシゲノムが修飾されていることを確認するステップは、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたは次世代配列決定アッセイを実施するステップを含む。開示される方法に従って導入される突然変異は、内因性遺伝子の発現を下方制御し得る。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子の下方制御は、変更された代謝経路をもたらす。さらに、ドナーポリヌクレオチドがハプロイド組織ゲノム中に組み込まれる開示される方法のいずれかは、ハプロイド組織を、染色体倍加剤で処理して、組み込まれたドナーポリヌクレオチドを含み、それについてホモ接合性である倍加されたハプロイド組織を生成することをさらに含み得る。
【００１５】
一態様では、本開示は、導入された突然変異を含む植物体に関する。いくつかの実施形態では、植物体は、ハプロイド組織ゲノムを含む。その他の実施形態では、植物体は、ジハプロイド組織ゲノムを含む。このような植物は、本明細書に開示される方法に従って生成された、修飾されたハプロイド組織またはジハプロイド組織から再生され得る。
【００１６】
一態様では、本開示は、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株中に導入するための方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、形質転換受容性アンドロゲン由来ハプロイド細胞株を準備するステップと、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを形質転換受容性アンドロゲン由来ハプロイド細胞株に送達するステップと、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドが、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株のゲノムを修飾することを確認するステップとを含む。一実施形態では、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株は、ハプロイド小胞子細胞株である。別の実施形態では、ハプロイド小胞子細胞株は、胚またはカルス組織に増殖される。さらなる実施形態では、方法は、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株に植物形質転換法によって送達するステップを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、微粒子銃（biolistic）形質転換法、アグロバクテリウム形質転換法、リン酸カルシウム形質転換法、ポリブレン形質転換法、エレクトロポレーション形質転換法、超音波形質転換法、リポソーム形質転換法、マイクロインジェクション形質転換法、裸のＤＮＡ形質転換法、プラスミドベクター形質転換法、ウイルスベクター形質転換法、シリコンカーバイド媒介性形質転換法、エアゾールビーミング形質転換法およびＰＥＧ形質転換法などの植物形質転換法によって送達され得る。部位特異的ヌクレアーゼポリヌクレオチドの各々は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから選択されるヌクレアーゼをコードし得る。さらに別の実施形態では、方法は、ゲノムのゲノムＤＮＡ標的領域を優先的に修飾する部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを送達するステップを含む。特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡ標的領域の単一鎖２種の鎖が切断される。その他の実施形態では、ゲノムＤＮＡ標的領域の単一鎖が切断される。１種または複数のドナーポリヌクレオチドを送達するステップを含む開示される方法のいずれかでは、１種または複数のドナーポリヌクレオチドは、修飾されたゲノム内に安定に組み込まれ得る。特定の実施形態では、各ドナーポリヌクレオチドは、ゲノムのゲノムＤＮＡ標的領域に対して少なくとも８５％同一である少なくとも１つのドメインを含む。さらなる実施形態では、各ドナーポリヌクレオチドは、ゲノムのゲノムＤＮＡ標的領域中の２つの異なる配列に対して少なくとも８５％同一である２つのドメインを含む。ドナーポリヌクレオチドは、相同性組換え修復によって、または非相同末端結合修復によってゲノムＤＮＡ標的領域内に組み込まれ得る。別の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドがゲノムを修飾することを確認するステップは、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたは次世代配列決定アッセイによって実施される。別の実施形態では、１種または複数のドナーポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ標的領域中に組み込まれていることを確認するステップは、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたは次世代配列決定アッセイを実施するステップを含む。
【００１７】
なおさらなる実施形態では、開示される方法のいずれかは、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株の修飾されたゲノムを含むハプロイド組織を得るステップと、ハプロイド組織を、染色体倍加剤で処理するステップと、修飾されたジハプロイドゲノムを含むジハプロイド組織を製造するステップと、ジハプロイド組織を、修飾されたジハプロイドゲノムを含むジハプロイド植物体に栽培するステップとをさらに含み得る。さらなる実施形態では、アンドロゲン由来のハプロイド細胞株は、トウモロコシ植物体から得られる。開示された実施形態のいずれかでは、修飾されたジハプロイドゲノムは、ゲノムの切断に起因する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＤＡＢ１１１８７９のプラスミドマップを提供する図である。このプラスミドマップは、ターゲッティングされたゲノム修飾のためのＺＦＮ構築物のものである。
【図２】ｐＤＡＢ１１１８４５のプラスミドマップを提供する図である。このプラスミドマップは、ハプロイドプロトプラストにおけるターゲッティングされた組込みのためのドナー構築物のものである。
【図３】ｐＤＡＢ１１８７８３のプラスミドマップを提供する図である。このプラスミドマップは、ハプロイドカルス細胞の特定のゲノム遺伝子座内のターゲッティングされたａａｄ−１組込みのためのドナー構築物のものである。
【図４】ターゲッティングされた突然変異誘発と、それに続くハプロイドカルスの照射を実証する、ＰＰＬ１切断部位での挿入および欠失を示す配列アラインメントの例示を提供する図である。配列は、配列番号３３〜配列番号４５として欠失および挿入を例示するアラインメントで提供される。これらの変更された配列は、ジンクフィンガーヌクレアーゼが結合し、切断するよう設計されたゲノムＤＮＡ標的配列を提供する配列番号３２に対して比較される。
【図５】有効な染色体倍加を実証するコルヒチン処理後の２倍体化されたカルスから得た核のヒストグラムを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、トウモロコシ小胞子由来の形質転換受容性ハプロイド組織においてトウモロコシゲノムを修飾するための方法を提供する。方法は、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを、形質転換受容性ハプロイド組織に送達するステップと、１種または複数のコードされた部位特異的ヌクレアーゼが、ハプロイドトウモロコシゲノム修飾することを確認するステップとを含む。
【００２０】
アンドロゲン由来細胞株は、小胞子由来植物組織培養物として維持され得る。小胞子由来植物組織培養物は、１セットのみの染色体を含有するハプロイド組織培養物をもたらす。アンドロゲン由来のハプロイド細胞株は、小胞子および花粉などのアンドロゲン性組織もしくは胞子体組織（例えば、父系ハプロイド胚）から作製されるか、または胚もしくはカルス、懸濁液もしくはプロトプラスト培養物として維持され得る。トウモロコシでは、雄性発生およびハプロイド植物生成の報告は、１９７０年代に遡る（Ku et al., 1978, Proc. Symp. Plant Tissue Cult. 35-42）が、アンドロゲン性胚の低い生成頻度ならびに植物再生および染色体倍加と関連する困難性が、応用育種における葯または小胞子由来植物培養物の一般的な使用を妨げる。これらの基本的な問題の多くは、高度に反応性の生殖質の開発（Petolino et al., 1988, Theor. Appl. Genet. 76:157-159）および染色体倍加のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術（Wan et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 77:889-892）で克服されたが、トウモロコシにおいては、大部分について、この技術はほとんど放棄された。
【００２１】
本開示はまた、トウモロコシ小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織におけるハプロイドトウモロコシゲノム中へのドナーポリヌクレオチドのターゲッティングされた組込みのための方法を提供する。方法は、１種または複数のドナーポリヌクレオチドおよび部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを、形質転換受容性ハプロイド組織中に送達するステップと、１種または複数のドナーポリヌクレオチドが、トウモロコシのハプロイドゲノム中に組み込まれていることを確認するステップとを含む。
【００２２】
本開示は、トウモロコシ小胞子由来の形質転換受容性ハプロイド組織においてハプロイドトウモロコシゲノム内に突然変異を導入し、１種または複数の部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを、形質転換受容性ハプロイド組織に送達し、１種または複数のコードされた部位特異的ヌクレアーゼがハプロイドトウモロコシゲノムを修飾することを確認するための方法であって、ハプロイドトウモロコシゲノムが、ゲノムＤＮＡ内の挿入または欠失の存在によって示されるような切断によって突然変異される、方法をさらに提供する。
【００２３】
別の態様では、本開示は、形質転換受容性アンドロゲン由来ハプロイド細胞株のゲノムを修飾するための方法を提供する。方法は、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを、形質転換受容性アンドロゲン由来ハプロイド細胞株に送達するステップと、コードされた部位特異的ヌクレアーゼが、アンドロゲン由来ハプロイド細胞株のゲノムを修飾することを確認するステップとを含み、アンドロゲン由来ハプロイド細胞株のゲノムは、切断によって修飾される。
【００２４】
定義
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本願が支配する。文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許およびその他の参考文献は、特許または特許公報の特定の節のみが、参照により組み込まれると示されない限り、個々の刊行物または特許出願が各々、具体的に、個別に、参照により組み込まれるよう示されるように、すべての目的のために参照によりその全文が組み込まれる。
【００２５】
この開示をさらに明らかにするために、以下の用語、略語および定義を提供する。
【００２６】
本明細書において使用される場合、用語「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」、「有する（has）」、「有している（having）」、「含有する（contains）」または「含有している（containing）」またはその任意のその他の変形は、非排他的である、または制約がないものとする。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明確に列挙されていないか、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置に特有ではないその他の要素を含み得る。さらに、逆の意味が明確に記載されない限り、「または」とは、包含的またはを指し、排他的またはを指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれによっても満たされる：Ａが真であり（または存在し）、Ｂは偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）、Ｂは真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
【００２７】
また、本開示の実施形態の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」は、要素または成分の例の数、すなわち、出現の数に関して非制限的であるものとする。したがって、「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」は、１つまたは少なくとも１つのを含むと読み取られなくてはならず、要素または成分の単数形の語形はまた、数が単数形であると明白に意図されない限り複数形を含む。
【００２８】
用語「発明」または「本発明」は、本明細書において、非制限的用語であり、特定の発明のいずれか単一の実施形態を指すものではなく、本願において開示されるようなすべての可能性ある実施形態を包含する。
【００２９】
本明細書において、用語「植物（体）」とは、全植物体および任意の子孫、細胞、組織または植物体の一部を含む。用語「植物の部分」は、例えば、限定するものではないが、種子（成熟種子および未熟種子を含む）、植物を切り取ったもの、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、シュート、葉、根、茎、および外植片）を含めた植物の任意の部分（単数または複数）を含む。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルスまたは構造的もしくは機能的単位に組織されている植物細胞の任意のその他の群であり得る。植物細胞または組織培養物は、細胞または組織が得られた植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生可能およびその植物と実質的に同一の遺伝子型を有する植物を再生可能であり得る。対照的に、いくつかの植物細胞は、植物体を生成するよう再生され得ない。植物細胞または組織培養物中の再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、成長点細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、トウモロコシの毛、花、穀粒、穂、トウモロコシの穂軸、外皮または柄であり得る。
【００３０】
植物の部分は、収穫可能な部分および後代植物の増殖にとって有用な部分を含む。増殖にとって有用な植物部分は、例えば、限定するものではないが、種子、果実、切り取ったもの、実生、塊茎、台木が挙げられる。植物の収穫可能な部分は、例えば、限定するものではないが、花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子および根を含めた植物の任意の有用な部分であり得る。
【００３１】
植物細胞は、植物の構造的および生理学的単位であり、細胞壁を有さないプロトプラスト細胞および細胞壁を有する植物細胞を含む。植物細胞は、単離された単細胞または細胞の凝集体（例えば、もろいカルスおよび培養細胞）の形態であり得、より高度に組織化された単位（例えば、植物組織、植物器官および植物）の一部であり得る。したがって、植物細胞は、全植物体に再生できる、プロトプラスト、生殖体生成細胞、または細胞もしくは細胞の集合であり得る。このようなものとして、複数の植物細胞を含み、全植物体に再生可能である種子が、本明細書における実施形態において「植物細胞」と考えられる。
【００３２】
本明細書において使用される場合、用語「単離された」とは、分離され、成分が天然に生じる生物の細胞中のその他の生物学的成分（すなわち、その他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡならびにタンパク質）から離れて製造された生物学的成分（核酸またはタンパク質を含む）を指す。
【００３３】
本明細書において使用される場合、核酸分子に関連して用語「精製された」は、絶対的な純度（均一な調製物など）を必要とせず、代わりに、その天然の細胞環境においてよりも相対的に純粋である（天然レベルと比較して、このレベルは、例えば、濃度または遺伝子発現レベルの点で少なくとも２〜５倍大きい）という指標に相当する。特許請求されるＤＮＡ分子は、全ＤＮＡから、または全ＲＮＡから直接的に得られる。さらに、ｃＤＮＡクローンは、天然に存在せず、むしろ、部分精製された天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作によって得られることが好ましい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築は、ライブラリーの作製を含む。個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリーを保持する細胞のクローン選択によってライブラリーから製造され得る。したがって、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築およびそれぞれのｃＤＮＡクローンの選択を含むプロセスは、天然のメッセージのおよそ１０６倍の精製をもたらす。同様に、プロモーターまたは遺伝子ＤＮＡ配列は、プラスミド中にクローニングされ得る。ゲノムＤＮＡライブラリーなどのこのようなクローンは、天然に存在せず、むしろ、部分精製された、天然に存在する物質の操作によって得られることが好ましい。したがって、これらの技術では、少なくとも１桁の、好ましくは、２または３桁の、より好ましくは、４または５桁の精製が好ましい。
【００３４】
同様に、合成は、成分ＤＮＡ配列の化学的または機能的変更が起こったという指標に相当する。「合成された」核酸分子およびタンパク質として、ＰＣＲ増幅によって、または組換え法によって作製される核酸分子およびタンパク質が挙げられ、ここで、精製されたポリヌクレオチドは、プラスミドまたはベクター内の組込みによってさらに修飾される。用語「合成」はまた、宿主細胞（例えば、植物細胞）において組換えＤＮＡ法によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドを包含する。
【００３５】
植物における発現のための遺伝子の操作では、予定宿主植物（単数または複数）のコドンバイアスが、例えば、植物ゲノムのコドン分布または種々の植物遺伝子のタンパク質コーディング領域に関する情報を見出すための公的に入手可能なＤＮＡ配列データベースの使用によって決定され得る。ひとたび、最適化された（例えば、植物最適化された）ＤＮＡ配列が、理論上で、またはコンピュータで設計されると、実際のＤＮＡ分子が、設計された配列に正確に対応するよう実験室で合成され得る。このような合成核酸分子は、クローニングされ得るか、そうでなければ、自然のまたは天然供給源に由来するかのように正確に操作され得る。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、同義的に使用され、単数形の核酸、複数形の核酸、核酸断片、その変異体または誘導体および核酸構築物（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を包含し得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非翻訳５’および／または３’配列およびコード配列を含む全長ｃＤＮＡ配列またはその断片のヌクレオチド配列を含有し得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非修飾リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含み得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなり得る。例えば、ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡからなり得る。ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子は、一本鎖、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る。前記の用語はまた、ポリヌクレオチドまたは核酸の、化学的に、酵素によって、および代謝によって修飾された形態も包含する。
【００３７】
特定のＤＮＡは、配列がデオキシリボヌクレオチド塩基対合のルールに従って決定されるその補体も指すということは理解される。
【００３８】
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子」とは、機能的生成物（ＲＮＡまたはポリペプチド／タンパク質）をコードする核酸を指す。遺伝子は、機能的生成物をコードする配列に先行する（５’非コード配列）および／またはそれに続く（３’非コード配列）を含み得る。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。「調節配列」とは、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼす、コード配列の上流（例えば、５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（例えば、３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指す。調節配列として、例えば、限定するものではないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が挙げられる。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数形のポリペプチド、複数形のポリペプチドおよびその断片を含む。この用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結しているモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指し、特定の長さまたは大きさの生成物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖または２個以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される任意のその他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、前記の用語は、本明細書における「ポリペプチド」と同義的に使用される。ポリペプチドは、自然の生物学的供給源から精製されてもよく、組換え技術によって製造されてもよいが、特定のポリペプチドは、必ずしも特定の核酸から翻訳されない。ポリペプチドは、例えば、限定するものではないが、化学合成によってを含め、任意の適当な方法で作製され得る。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「天然の」とは、存在する場合には、その自身の調節配列とともに天然に見られるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの形態を指す。用語「内因性」とは、生物においてその自然の位置にある、または生物のゲノム中にあるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの天然形態を指す。
【００４２】
対照的に、用語「異種」とは、参照（宿主）生物においてその位置に普通見られない、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを指す。例えば、異種核酸は、異なるゲノム位置で参照生物中に普通見られる核酸であり得る。さらなる例によって、異種核酸は、参照生物において普通見られない核酸であり得る。異種ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを含む宿主生物は、異種ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを宿主生物中に導入することによって製造され得る。特定の例では、異種ポリヌクレオチドは、対応する天然ポリヌクレオチドとは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然コード配列またはその一部を含む。特定の例では、異種遺伝子は、対応する天然遺伝子とは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然コード配列またはその一部を含む。例えば、異種遺伝子は、天然宿主中に再導入される非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード配列を含み得る。特定の例では、異種ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチドとは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然ポリペプチドである。
【００４３】
異種遺伝子またはポリペプチドは、キメラもしくは融合ポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子を製造するために、別の遺伝子またはポリペプチドと融合している、機能的ポリペプチドまたは機能的ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、遺伝子またはポリペプチドであり得る。特定の実施形態の遺伝子およびタンパク質は、具体的に例示される全長配列およびこれらの配列の部分、セグメント、断片（隣接する断片ならびに全長分子と比較した内部および／または末端欠失を含む）、変異体、突然変異体、キメラおよび融合物を含む。
【００４４】
「内因性」とは、生物または細胞内に起因する材料を指す。
【００４５】
「外因性」とは、生物または細胞の外側に起因する材料を指す。本明細書において使用される場合、外因性は、同様の（同一ではない）核酸が、レシピエント細胞または組織中にすでに存在し得るか否かに関わらず、レシピエント細胞または組織以外の供給源に由来する任意の核酸指すものとする。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語「修飾」は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの低減された、実質的に排除されたまたは排除された活性をもたらす、特定の参照ポリヌクレオチドにおける変化を指し得る。あるいは、用語「修飾」は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの増大されたまたは増強された活性をもたらす参照ポリヌクレオチドの変化および参照ポリペプチドの増大されたまたは増強された活性をもたらす参照ポリペプチドの変化を指し得る。部位特異的ヌクレアーゼの活性を説明するために使用される場合には、修飾は、参照分子の一部を切断すること（例えば、ゲノムＤＮＡの切断、ゲノムＤＮＡの二本鎖または一本鎖切断のいずれか）を意味し得る。前記のものなどの変化は、例えば、限定するものではないが、参照分子の一部を欠失すること、参照分子を突然変異すること（例えば、自発的突然変異誘発による、ランダム突然変異誘発による、突然変異誘発遺伝子によって引き起こされる突然変異誘発による、およびトランスポゾン突然変異誘発による）、参照分子の一部を置換すること、参照分子中に要素を挿入すること、参照分子の発現を下方制御すること、参照分子の細胞位置を変更すること、参照分子の状態を変更すること（例えば、参照ポリヌクレオチドのメチル化による、および参照ポリペプチドのリン酸化またはユビキチン化による）、参照分子の補因子を除去すること、参照分子をターゲッティングするアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡの導入、参照分子をターゲッティングする干渉ＲＮＡ／ＤＮＡの導入、参照分子の化学的修飾、参照分子の共有結合による修飾、ＵＶ照射もしくはＸ線を用いる参照分子の照射、参照分子を変更する相同組換え、参照分子を変更する有糸分裂組換え、参照分子のプロモーターの置換および／または前記のいずれかの組合せをもたらし得る。
【００４７】
特定の実施例においてどのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が修飾され得るかを調べることにおける手引きは、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を、相同（例えば、相同酵母または細菌）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものと比較するおよび高い相同性の領域（保存された領域）またはコンセンサス配列において行われる修飾数を最大化することによって見い出され得る。
【００４８】
用語「プロモーター」とは、配列をコードする核酸の発現を制御可能なＤＮＡ配列または機能的ＲＮＡを指す。実施例において、制御されたコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体として天然遺伝子に由来し得、プロモーターは、本来見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなり得るか、またはプロモーターは、合成ＤＮＡセグメントをさらに含み得る。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞種における、または異なる発達段階での、または異なる環境条件もしくは生理学的条件に応じた遺伝子の発現に向けることができるということは当業者によって理解される。前記のプロモーターのすべての例は、公知であり、当技術分野において、異種核酸の発現を制御するために使用される。ほとんどの時点でのほとんどの細胞種において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。さらに、当業者は（多くの場合、不成功であるが）、調節配列の正確な境界を説明するよう試みたが、種々の長さのＤＮＡ断片が同一プロモーター活性を有し得ると理解されるようになった。特定の核酸のプロモーター活性は、当業者が精通する技術を使用してアッセイされ得る。
【００４９】
用語「作動可能に連結された」とは、単一核酸での核酸配列の結合を指し、ここで、一方の核酸配列の機能が、もう一方によって影響を受ける。例えば、プロモーターは、プロモーターが、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（例えば、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合にコード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列と作動可能に連結され得る。
【００５０】
用語「発現」または「発現している」とは、本明細書において使用される場合、ＤＮＡに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指し得る。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指し得る。本明細書において使用される場合、用語「過剰発現」とは、同一遺伝子または関連遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。したがって、異種遺伝子は、その発現が、匹敵する内因性遺伝子のものよりも高い場合に「過剰発現される」。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「形質転換」または「形質転換する」とは、遺伝的に安定な継承をもたらす、宿主生物への核酸またはその断片の転移および組込みを指す。形質転換核酸を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。形質転換の既知方法として、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）媒介性形質転換、リン酸カルシウム形質転換、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡを用いる形質転換、プラスミドベクターを用いる形質転換、ウイルスベクターを用いる形質転換、微粒子銃（biolistic）形質転換（微粒子銃形質転換）、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ媒介性形質転換、エアゾールビーミングおよびＰＥＧ媒介性形質転換が挙げられる。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「導入された」（核酸を細胞中に導入することに関連して）とは、細胞への形質転換ならびに従来の植物育種技術を利用して実施されるように、核酸を含む植物を第２の植物と掛け合わせ、その結果、第２の植物が核酸を含有することを含む。このような育種技術は、当業者に知られている。植物育種技術の考察については、Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4th Edition, AVI Publication Co., Westport CTを参照のこと。
【００５３】
戻し交配法を使用して、植物に核酸を導入してもよい。この技術は、植物に形質を導入するために数十年使用されてきた。戻し交配（およびその他の植物育種方法論）の説明の一例は、例えば、Poehlman(1995)、前掲およびJensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NYに見い出すことができる。例示的戻し交雑プロトコールでは、対象とする元の植物（「反復親」）を、導入される核酸を保持する第２の植物（「非反復親」）と交配する。この交配種から得られた後代を、次いで、反復親と再度交配し、非反復親に由来する核酸に加えて、反復親の所望の形態的および生理学的特徴の本質的にすべてが、変換された植物において回収される変換された植物が得られるまでこのプロセスを反復する。
【００５４】
本明細書において使用される場合、用語「同系の」とは、実質的に同一遺伝子型を有する（例えば、１種以下の遺伝子が個体間で異なっている）２種の個々の植物（またはその一部、例えば、種子、細胞）を指す。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「安定な組込み」または「安定な形質転換」、「遺伝子的に安定な遺伝」または「安定に」とは、核酸またはポリヌクレオチドセグメントの、その核酸もしくはポリヌクレオチドセグメントをこれまでは含有していなかった、植物、植物組織、植物オルガネラ（すなわち、プラスチドまたは葉緑体）または植物細胞などの生物のゲノム（一般的に、異種核酸配列または遺伝子）内への導入を指す。得られた組込みは、植物のゲノムに追加され、後代植物に伝達され得る。好ましくは、形質転換は、核酸配列の、植物のゲノムへの安定な組込みをもたらす。本明細書において使用される場合、用語「ゲノム」は、核ゲノム、プラスチドゲノムおよびミトコンドリアゲノムを包含する。比較上、「一時的形質転換」とは、遺伝子的に安定な遺伝を伴わない遺伝子発現をもたらす、核酸断片の、宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラへの導入を指す。
【００５６】
「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質および核酸間）の配列特異的、非共有結合相互作用を指す。全体としての相互作用が、配列特異的である限り、結合相互作用のすべての成分が、配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。このような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指し、結合親和性の増大は、より低いＫｄと相関している。
【００５７】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、それだけには限らないが、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含めた種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ゲノムＤＮＡが修飾されるようなターゲッティングされた二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
【００５８】
用語「プラスミド」および「ベクター」とは、本明細書において使用される場合、細胞の中央代謝の一部ではない１種または複数の遺伝子を保持し得る染色体外要素を指す。プラスミドおよびベクターは、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子である。しかし、プラスミドおよびベクターは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの線形または環状核酸であり得、いくつかのヌクレオチド配列が、プロモーター断片およびコーディングＤＮＡ配列を、任意の適当な３’非翻訳配列とともに細胞中に導入可能である独特の構築物に結合または組換えられている任意の供給源に由来し得る。実施例では、プラスミドおよびベクターは、自立複製配列、ゲノム組込み配列および／またはファージもしくはヌクレオチド配列を含み得る。
【００５９】
用語「融合タンパク質」は、タンパク質が、２種以上の親タンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むことを示す。通常、融合タンパク質は、１種のタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームで付加され、任意選択で、異なるタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列からリンカーによって離れている融合遺伝子から発現される。次いで、融合遺伝子は、単一タンパク質として組換え宿主細胞によって発現され得る。
【００６０】
「ハプロイド」とは、１セットの染色体（ｎ）を有する植物細胞、組織または植物を指す。
【００６１】
「ジハプロイド」または「倍加されたハプロイド」または「２倍体」とは、ハプロイドに由来する植物細胞、組織または植物を指す。ジハプロイドは、２セットの染色体（２ｎ）を有し、通常、ホモ接合性である。しかし、突然変異、欠失または挿入またはＤＮＡ中の修飾のようなその他のものは、ジハプロイドにおいて通常観察される絶対的なホモ接合性からの幾分かの逸脱につながり得ることがあり得る。同様に、当業者は、ランダムまたはターゲッティングされた突然変異、欠失、挿入を行うことによって、またはＤＮＡまたはその一部をシャッフルすることによってジハプロイドＤＮＡを意図的に修飾できる。このような「修飾されたジハプロイド」は、開示内容によって包含される。ポリプロイドはまた、必要に応じて本開示の方法を使用して得ることができる。ポリプロイドは、３セット以上の染色体を有し、上記で論じられる修飾を除いてホモ接合性でなくてはならない。
【００６２】
「染色体倍加剤」とは、細胞中の染色体の数を倍加する（例えば、ハプロイドから２倍体または２倍体から４倍体など）化学物質を指す。このような薬剤は、通常、コルヒチン、プロナミドまたはＡＰＭ（アミプロホス−メチル）などの抗微小管剤である。亜酸化窒素は、倍加剤であると報告されている（参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００３／０００５４７９号）。当業者は、染色体倍加を引き起こし得る（例えば、正常な細胞周期分裂などを阻止することによって）化合物に精通している。
【００６３】
「カルス」とは、細胞または組織の脱分化した増殖塊を指す。
【００６４】
「Ｉ型カルス」とは、形態学的に緻密なトウモロコシカルスであるカルスを指し、それから、器官発生、胚発生または２者の組合せによって全植物体が再生され得る。
【００６５】
「ＩＩ型カルス」とは、形態学的にもろい、高度に胚発生性のトウモロコシカルスを指す（Armstrong and Green, Planta. 164:207-214. 1985）。
【００６６】
「成熟胚」とは、受粉後およそ１５日以上で得ることができる接合体胚を指し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された場合に、通常、再生可能なカルスを生成しない。
【００６７】
「未熟胚」とは、受粉後およそ１５日以下で得ることができる接合体胚を指し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された場合に、通常、再生可能なカルスを生成する。
【００６８】
用語「接合体胚」は、発芽可能である種子、成熟胚または未熟胚から抽出される種子、成熟胚を包含するよう使用される。
【００６９】
「胚発生培養物」または「胚発生細胞」または「胚発生組織」または「胚」または「胚様構造」とは、植物体に再生できる培養された植物細胞および組織を指す。
【００７０】
「植物成長調節物質または植物ホルモン」とは、植物成長に影響を及ぼす化合物を指す。植物成長調節物質として、それだけには限らないが、オーキシン、サイトカイン、ＡＢＡ、ジベレリン、エチレン、ブラシノステロイドおよびポリアミンが挙げられる。オーキシンは、低濃度ではシュートおよび根の伸長に影響を及ぼすが、高レベルでは成長を阻害する。よく使用されるオーキシンとして、ピクロラム（４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸）、２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、ＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、ＮＡＡ（α−ナフタレン酢酸）およびジカンバ（３，６−ジクロロアニス酸）が挙げられる。サイトカインは、細胞分裂、細胞分化およびシュート分化を引き起こす。よく使用されるサイトカインとして、カイネチン、ＢＡ（６−ベンジルアミノプリン）、２−ｉｐ（２−イソペンテニルアデニン）、ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）、チジアズロン（ＴＤＺ）、ゼアチンリボシドおよびゼアチンが挙げられる。
【００７１】
「単子葉植物」または「単子葉の」とは、単一子葉を有する植物を指す。例として、トウモロコシ、イネ、コムギ、カラスムギおよびオオムギのような穀類が挙げられる。
【００７２】
「表現型」とは、生物のゲノム（プラスミドおよび人工染色体などの非ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡを含む）および／またはオルガネラ中の核酸の発現（または発現の欠如）に起因する生物によって示される形質を指す。
【００７３】
「再生」とは、植物細胞または組織から植物を成長させるプロセスを指す。
【００７４】
「選択マーカー」または「スクリーニング可能なマーカー」とは、発現が、核酸配列を含有する細胞、組織または植物の同定を容易にする表現型を与える核酸配列を指す。
【００７５】
「胞子体の」とは、２倍の染色体数を有することを特徴とする生活環の相中にある植物を指す。これは、小胞子および花粉を含む「配偶体の」とは対照的である。
【００７６】
アンドロゲン由来のハプロイド細胞株由来の組織
一般に、ゲノムの倍数性レベルは、細胞の核内に存在する染色体セットの数に関する。倍数性レベルは、生物を構成する細胞の種類および／または細胞の供給源に応じて変わり得る。ハプロイド数（ｎ）は、１セットのみの染色体が生物内に存在するという指標である。ジハプロイドまたは２倍体数（２ｎ）は、２セットの染色体が生物内に存在するという指標である。さらに大きな数のセットの染色体、例えば、３倍体（３ｎ）、４倍体（４ｎ）、５倍体（５ｎ）および６倍体（６ｎ）を含有することは、いくつかの生物、特に、植物種にはよくある。増大されたセットの染色体、例えば、３倍体またはそれ以上のこのような例は、一般に、ポリプロイドとして知られている。
【００７７】
通常、２倍体（２ｎ）多細胞段階は、生物の生活環を通じて、ハプロイド（ｎ）多細胞段階と交互に起こる。生物の生活環のハプロイド（ｎ）段階は、配偶体段階、例えば、配偶子生成と見なされる。比較上、生物の生活環の２倍体（２ｎ）段階は、胞子体段階、例えば、胞子生成と見なされる。胞子体段階の間に、生物は、減数分裂と呼ばれるプロセスによってハプロイド（ｎ）である小胞子（すなわち、胞子）を生成する。得られた小胞子は、配偶子、例えば、精核を生成でき、これは、受精の際に、大胞子によって生成されるその他の配偶子、例えば、卵核と融合して、２倍体接合子を作製する。
【００７８】
植物では、小胞子は、雄性生殖器において生成される。雄性生殖器は、葯として知られている。葯は、精核を含有する花粉に成熟するハプロイド小胞子を生成する。花粉は、その間に、２つの精核が、２重の受精と、その後の胚および胚乳形成のために胚珠の胚嚢に送達される、植物生活環の短命の雄性配偶体相の始まりを表す。高等植物生活環のこの段階は、通常、２、３の細胞分裂のみからなるが、特定の実験条件下では、小胞子は、介在する受精を伴わずに胚様構造の生成につながる発達の変更を受けるよう誘導され得る。そのようなものとして、これらの胚様構造は、ハプロイド（ｎ）である。このプロセスは、雄性発生と呼ばれ、葯または小胞子培養として知られるｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術の生物学的機序である。
【００７９】
一実施形態では、形質転換受容性アンドロゲン由来細胞株が提供される。その後の実施形態では、形質転換受容性アンドロゲン由来細胞株からハプロイド小胞子細胞株が得られる。さらなる実施形態では、形質転換受容性ハプロイド組織は、トウモロコシ小胞子に由来する。葯由来培養物は、育種系統の製造にとって興味深い植物においてホモ接合性を誘導する迅速な方法を提供する。葯培養は、植物から未熟葯を単離すること、およびこの葯を、花粉粒になるよう運命づけられる葯内の細胞、小胞子を、分裂し始め、それから植物が再生され得る細胞培養物を形成するよう誘導する培地上に置くことを含む。葯培養の一般的な議論については、J. M. Dunwell, "Anther and Ovary Culture", In S. W. J. Bright and M. G. K. Jones, (eds.), Cereal Tissue and Cell Culture, Martinus Nijhoff Publisher, 1985, Dordrecht, pp. 1-44を参照のこと。得られた培養物は、ハプロイドであり、元の植物に由来する単一セットの染色体のみを含有する。これらの培養物に由来する植物は、自発的にか、誘導によってのいずれかで染色体倍加が起こって、２倍加されたハプロイドが生成されない限り不稔であり、２倍加されたハプロイドは十分に稔性であり、完全に近交である。
【００８０】
ここ数十年の間に、ハプロイド植物を製造することを目的とした配偶体細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養に関する多数の研究が報告されている。同様に、多数の概説、本の章およびシンポジウムの要旨が公開されてきた（全般的に、Chu, "Haploids in Plant Improvement", In I. K. Vasil, W. R. Scowcroft, K. J. Frey (eds.), Plant Improvement and Somatic Cell Genetics, New York: Academic Press, 1982, pp. 129-158、Heberle-Bors, 1985, "In Vitro Haploid Formation of Pollen: A Critical Review", Theor. Appl. Genet. 71:361-374、およびHu and Yang, "Haploids of Higher Plants in Vitro." Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag, 1986を参照のこと）。
【００８１】
葯培養は、理論的には、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで多数のハプロイド個体が、葯および／または小胞子から直接的に製造され得る方法に相当する。Keller et al., "Haploids from gametophytic cells--recent developments and future prospects", In C. E. Green, D. A. Somers, W. P. Hackett, D. D. Biesoer (eds.), Plant Tissue and Cell Culture, Alan R Liss, New York, pp 223-241, 1986を参照のこと。ハプロイドは、葯、小胞子、子房および胚珠の培養によって雄性および雌性配偶体細胞の両方から再生され得る。陽性のｉｎ−ｖｉｔｒｏ反応は、植物が再生できる胚および／またはカルスの発生につながる。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養の間の初期事象は、細胞学的、超微細構造的および生化学的レベルで特性決定されてきた（Chen et al., 1984, "Segmentation Patterns and Mechanisms of Genome Multiplication in Cultured Microspores of Barley", J. Can、Genet. Cytol., 26:475-483、Raghavan, 1984, "Protein Synthetic Activity during Normal Pollen Development and During Induced Pollen Embryogenesis in Hyoscyamus niger", J. Can Bot., 62:2493-2513、Huang, "Ultrastructural Aspects of Pollen Embryogenesis in Hordeum, Triticum and Paeonia", 1986)。
【００８２】
さらなる実施形態では、アンドロゲン由来の細胞株、例えば、トウモロコシ小胞子に由来するハプロイド組織は、胚またはカルス組織である。さらなる実施形態では、提供される方法は、カルス形成段階を経る場合もそれを経ない場合もある。ハプロイド胚は、「非カルス促進培地」上に置かれ得る。用語「非カルス促進培地」とは、細胞または組織の脱分化した塊の増殖を支持しない培地を指す。好ましい「非カルス促進培地」は、胚救出のために使用され、当技術分野で周知の通常の塩およびビタミン処方を含有する。このような胚救出または胚培養、培地は、オーキシンをほとんど含有しないか、全く含有しない（概説については、Raghaven, V., 1986, Biol. Rev., 41:1-58を参照のこと）。いくつかの実施形態では、胚成熟培地はまた、別の好ましい「非カルス促進培地」に相当する。胚成熟培地は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養された胚の発達を促進し、早熟発芽を防止するために使用され、通常、標準塩／ビタミン処方（種に応じて）、増大した糖レベルおよび／または外因的に添加されるアブシジン酸を含有し、オーキシンはほとんどまたは全く有さない。シュート培養または複数のシュート増殖のために、別の種類の培地が使用される。この複数シュート培地は、やはり、オーキシンをほとんど含有しないか、または低減されたオーキシンを含有し得るが、代わりに、上昇したレベルの、成長点増殖および成長を促進するサイトカインを含有する。
【００８３】
葯培養は、２００をはるかに上回る種において、小胞子由来カルス、胚および植物体を得るために使用されてきた（Maheshwari et al., 1982, "Haploids from Pollen Grains-Retrospect and Prospect", Amer. J. Bot., 69:865-879）。しかし、葯培養応答性は、種間で相当に変わる。応答性葯の最高収率（置かれた１００個の葯あたりの、胚および／またはカルスを形成する葯）は、コムギにおいて８７パーセント（A. M. Wei, 1982, "Pollen Callus Culture in Triticumaertivum", Theor. Appl. Genet., 63,pp. 71-73）、イネにおいて６７パーセント（S. L. Lin and H. S. Tsay, 1983, J. Agr. Res., China, cited in Dunwell, 1985）、トウモロコシにおいて１７パーセント（Ting et al., 1981, "Improved Anther Culture of Maize" (Zea mays L.), Plant Science Lett., 23,pp. 139-145）およびオオムギにおいて１パーセント（Z. H. Xu and N. Sunderland, 1982, "Innoculation Density in the Culture of Barley Anthers", Scient. Sinic., 25, pp. 961-968）であるとわかった。ライムギでは、１００個の葯あたり４３個の発達構造が観察された（G. Wenzel et al., 1977, "Increased Induction and Chromosome Doubling of Androgenetic Haploid Rye", Theor. Appl. Genet., 51, pp. 81-86）。１００個の培養された葯あたりのカルス生成緑色植物の頻度は、コムギでは、７２パーセント（J. W. Ouyang et al., 1983, "The Response of Anther Culture to Temperature in Triticum Aestivum", Theor. Appl. Genet., 66, pp. 101-109）、イネでは、１２パーセント（L. J. Chen et al., "Medium Evaluation for Rice Anther Culture", in A. Fujiwara (ed.), "Plant Tissue Culture", pp. 551-551. Jap. Assoc. Plant Tissue Culture Tokyo, 1982）およびオオムギでは、１０パーセント（K. N. Kao, "Plant Formation from Barley Anther Cultures with Ficoll Media", Z. Pflanzenzuchtg., 103, 1981, pp. 437-443）である。
【００８４】
さらなる実施形態では、小胞子は、優良性能特性を有するトウモロコシに由来する。実施形態の一態様では、小胞子は、優良トウモロコシ系統を、高い小胞子培養応答を有する異なるトウモロコシ系統と交雑することによって得られたハイブリッドトウモロコシに由来する。米国特許第５，３０６，８６４号明細書（その全文が参照により本明細書に組み込まれる）および米国特許第５，６０２，３１０号明細書（その全文が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、トウモロコシ（トウモロコシ（Zea mays L.））におけるハプロイド育種の手段としての葯培養の使用は、優良性能系統を含めた、種々のトウモロコシ遺伝子型に容易に適用可能である。葯培養に対して増強された応答を示すトウモロコシ生殖質を同定することを可能にするプロセスは、伝達可能であり、その他の選択遺伝子型において葯培養能を増大し得る。このようなプロセスは、当技術分野で容易に知られ、優良性能系統を含めたトウモロコシ生殖質を、培養された葯および／または小胞子から高レベルのハプロイドおよび／またはジハプロイド組織培養物を生成する植物に変換するために利用され得る。
【００８５】
染色体倍加
一実施形態では、修飾されたハプロイド組織ゲノムを有するハプロイド植物組織を製造する開示される方法のいずれかは、修飾されたハプロイド組織を染色体倍加剤で処理して、ジハプロイド植物組織を製造することをさらに含む。特定の実施形態では、このように製造されたジハプロイド組織は、ハプロイドゲノムにおいて作製された修飾（例えば、組み込まれたドナーポリヌクレオチドまたは突然変異）についてホモ接合性であるゲノムを含む。さらなる実施形態では、修飾されたジハプロイドゲノムを含むトウモロコシ組織は、ゲノム修飾についてホモ接合性である成熟植物に増殖される。
【００８６】
染色体倍加の方法は、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Antoine-Michard, S. et at, Plant cell, tissue organ cult., Cordrecht, the Netherlands, Kluwer Academic Publishers, 1907, 48(3):203-207、Kato, A., Maize Genetics Cooperation Newsletter 1897, 38-37、およびWan, Y. et al., Theor. Appl. Genet., 1980, 77:889-892、Wan, Y, et al., Theor. Appl. Genet., 1991, 81:205-211に開示されている。通常の方法は、細胞をコルヒチン、抗微小管剤または抗微小管除草剤、プロナミド、亜酸化窒素または任意の有糸分裂阻害薬と接触させて、ホモ接合性倍加ハプロイド細胞を作製することを含む。その他の薬剤を、有糸分裂阻害剤とともに使用して、倍加効率を改善してもよい。このような薬剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アジュバント、界面活性剤などであり得る。
【００８７】
さらなる染色体倍加剤は、当技術分野で公知であり、その全文が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８６６，５１３号明細書に列挙される化学物質が、ジハプロイド植物の作製において使用するために適用可能である。さらに、表１に種々に既知の染色体倍加剤を列挙する。
【００８８】
【表１−１】
2017513506.tif 000003
【００８９】
【表１−２】
2017513506.tif 000004
【００９０】
一実施形態では、本明細書において開示される実生浸漬法のための染色体倍加剤の適した投与量として、例えば、０．０１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１２５μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、５００μＭおよび１０００μＭが挙げられる。適した範囲としてまた、例えば、０．１〜１０μＭ、１〜１００μＭ、５〜１２５μＭ、２５〜２００μＭ、５０〜５００μＭ、１５〜１５０μＭおよび１〜１０，０００μＭが挙げられる。
【００９１】
別の実施形態では、染色体倍加剤は、実生浸漬法において使用される溶液の０．０１％〜０．５％の範囲であり得る。例えば、染色体を倍加するために、０．０１％、０．０２％、０．０２５％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．１２５％、０．１５％、０．１７５％、０．２％、０．２２５％、０．２５％、０．２７５％、０．３％、０．３２５％、０．３５％、０．３７５％、０．４％、０．４２５％、０．４５％、０．４７５％または０．５％の染色体倍加剤が使用され得る。
【００９２】
さらなる実施形態では、本明細書において開示される染色体倍加剤の低い実生死滅率は、コルヒチン（例えば、０．０２５％での）と比較すると、例えば、処理された実生または植物細胞の総数の１０％未満〜約４０％または約５％未満〜約２０％または約１５％未満〜約２５％または５０％未満の範囲であり得る。
【００９３】
その他の実施形態では、本明細書において開示される実生葉適用法のための染色体倍加剤の適した投与量として、例えば、３．５ｇ  ａｉ／ｈａ、７０ｇ  ａｉ／ｈａ、１４０  ｇ  ａｉ／ｈａ、２８０  ｇ  ａｉ／ｈａが挙げられる。適した適用率として、例えば、５ｇ  ａｉ／ｈａ〜１１２０ｇ  ａｉ／ｈａ、より好ましくは、〜２，８００ｇ  ａｉ／ｈａが挙げられる。
【００９４】
語句「接触すること」は、「直接接触」および「間接接触」への言及を含む。例えば、倍加剤を含む培地は、ハプロイド細胞との直接接触を有する場合も、または倍加剤を含む培地は、濾紙、植物組織またはその他の細胞などの障壁によってハプロイド細胞から離れている場合もあり、したがって、倍加剤は、濾紙または細胞または組織を通ってハプロイド細胞に移動される。接触は、任意の適した方法、例えば、根の水耕栽培処理、噴霧、注入、浸潤、浸漬および湿潤で達成される。
【００９５】
ハプロイド細胞、ハプロイド胚、ハプロイド種子、ハプロイド実生またはハプロイド植物は、染色体倍加剤で処理され得る。ハプロイド胚細胞などのハプロイド細胞を染色体倍加剤と接触させることによって、ハプロイド細胞からホモ接合性植物を再生できる。ハプロイド細胞は、倍加剤と任意の時間量の間接触し得る。一実施形態では、ハプロイド細胞は、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４５分間、１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間または４８時間、倍加剤と接触する。
【００９６】
ハプロイド胚は、単離されてもよい。穀粒、胚珠または種子内に含有され得、トウモロコシの穂（ears）中の穂（ear）に、または、コムギなどのその他の穀物の場合におけるように穂（spike）にもあり得る。ハプロイド胚を含む穂は、植物にある場合も、植物から単離される場合もある。穂はまた、切片にされてもよい。染色体倍加後、倍加されたハプロイド胚は、母系由来染色体の２コピーを含有することとなる。ハプロイド胚から倍加されたハプロイド植物を得るためのプロセスの効率は、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超えるものであり得る。
【００９７】
植物形質転換
開示内容の開示される方法は、植物形質転換法を含む。開示内容の方法において使用され得る植物形質転換法として、それだけには限らないが、部位特異的微粒子銃、アグロバクテリウム形質転換法、リン酸カルシウム形質転換法、ポリブレン形質転換法、エレクトロポレーション形質転換法、超音波形質転換法、リポソーム形質転換法、マイクロインジェクション形質転換法、裸のＤＮＡ形質転換法、プラスミドベクター形質転換法、ウイルスベクター形質転換法、シリコンカーバイド媒介性形質転換法、エアゾールビーミング形質転換法またはＰＥＧ形質転換法が挙げられる。一般に、ＤＮＡまたは任意のその他のポリヌクレオチド配列を、宿主細胞のゲノム中に挿入するために、任意の植物形質転換法が使用され得る。したがって、効率的な形質転換／トランスフェクションを提供する任意の方法が使用され得る。
【００９８】
双子葉植物および単子葉植物のための植物形質転換のために、生物学的および物理的形質転換プロトコールを含めた多数の方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999);Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson、J. E.、Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)）。さらに、遺伝子発現カセットを含むベクターおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)において入手可能である。
【００９９】
遺伝子発現カセットを含むＤＮＡを植物宿主細胞中に挿入するために多数の技術が利用可能である。それらの技術は、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用する武装解除したＴ−ＤＮＡを用いる形質転換、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃（biolistic）（微粒子銃（microparticle bombardment））、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介性形質転換、エアゾールビーミングまたはポリエチレングリコール媒介性形質転換およびその他の可能性ある方法を含む。
【０１００】
例えば、遺伝子発現カセットを含むＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡ中に直接的に導入され得る。このような植物形質転換法として、例えば、塩化カルシウム沈殿によるプロトプラスト形質転換、ＤＮＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション媒介性取り込み（Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722、Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177、Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828およびShimamoto (1989) Nature 338:274-276を参照のこと）および植物組織のエレクトロポレーション（D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505）が挙げられる。
【０１０１】
ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ微粒子銃などの微粒子銃（biolistic）法を使用して植物組織に直接的に導入され得る（例えば、Klein et al. (1987) Nature 327:70-73を参照のこと）。微粒子銃（biolistic）法は、ＤＮＡが微粒子（microprojectile）の表面上に保持される微粒子（microprojectile）媒介性形質転換を含む。この方法では、発現ベクターは、微粒子（microprojectiles）を、植物細胞壁および細胞膜を透過するのに十分な速度に加速させる微粒子銃（biolistic）装置を用いて、植物組織中に導入される。Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。
【０１０２】
植物細胞形質転換のためのさらなる方法として、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介性ＤＮＡ取り込みによるマイクロインジェクション（Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418）が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換によって植物細胞中に導入され得る（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／２４５，６８５号明細書を参照のこと）。
【０１０３】
遺伝子発現カセットを含むベクターを植物中に導入するために利用されている方法は、アグロバクテリウムの天然形質転換システムに基づいている。Horsch et al. Science 227:1229 (1985)。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換するのに有用であることが知られている植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換に関与する遺伝子を保持する。Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム媒介性遺伝子導入のための方法の記載はまた、例えば、Gruber et al., 前掲、Miki et al., 前掲、Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)および米国特許第４，９４０，８３８号明細書および同５，４６４，７６３号明細書において入手可能である。
【０１０４】
アグロバクテリウムが植物形質転換に使用される場合には、挿入されるべきＤＮＡは、中間体ベクターと呼ばれる特定のプラスミド中に、またはバイナリーベクター中にクローニングされ得る。中間体ベクターは、ヘルパープラスミド（コンジュゲーション）の不在下ではアグロバクテリウムにおいて複製できない。日本たばこスーパーバイナリー系は、このような系の一例である（Komari et al., (2006) In: Methods in Molecular Biology No. 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) (K. Wang、ed.) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41；およびKomori et al. (2007) Plant Physiol. 145:1155-60による総説を参照のこと）。
【０１０５】
バイナリーベクターは、大腸菌（e. coli）およびアグロバクテリウムの両方において複製できる。バイナリーベクターは、右および左のＴ−ＤＮＡ境界領域によって囲まれている、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。バイナリーベクターは、アグロバクテリウム中に直接的に形質転換され得る（Holsters, 1978）。アグロバクテリウムは、プラスミド、例えば、通常、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞中に転移するために必要であるｖｉｒ領域を保持するＴｉまたはＲＩプラスミドを含む宿主細胞として使用され得る。
【０１０６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主の病原性を使用して、、アグロバクテリウムバイナリーＴ  ＤＮＡベクター技術（Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721）または同時培養手順（Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231）により感染したハプロイド組織または細胞中への、ドナーＤＮＡを含有するＴ鎖の挿入を指示できる。一般に、アグロバクテリウム形質転換系は、双子葉植物を操作するために使用される（Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384;Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641）。アグロバクテリウム形質転換系はまた、単子葉植物および植物細胞を形質転換するため、ならびに単子葉植物および植物細胞にＤＮＡを転移するために使用され得る。米国特許第５，５９１，６１６号明細書；Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041;Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179;Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40；およびGould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434を参照のこと。
【０１０７】
植物形質転換による遺伝子発現カセットを含む遺伝構築物の導入後に、植物細胞を成長させてもよく、シュートおよび根などの組織の分化が出現すると、成熟した植物が生成され得る。いくつかの実施形態では、複数の植物が生成され得る。植物を再生するための方法論は、当業者に公知であり、例えば、Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishersにおいて、およびPlant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)において見出すことができる。一般に、本明細書において記載される修飾された植物は、発酵培地において培養し、土壌などの適した培地において成長させてもよい。いくつかの実施形態では、高等植物の適した成長培地は、それだけには限らないが、土壌、砂、根成長または水耕培養を支持する任意のその他の粒状培地（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）ならびに高等植物の成長を最適化する適した光、水および栄養補助物質を含めた、植物のための任意の成長培地を含み得る。
【０１０８】
上記の植物形質転換技術のいずれかによって製造される形質転換された植物細胞を、培養して、形質転換された遺伝子型、ひいては、所望の表現型を有する全植物体を再生できる。このような再生技術は、組織培養成長培地中の特定の植物ホルモンの操作に頼るものであり、通常、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入されている殺生物剤および／または除草剤マーカーに頼る。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans, et al., "Protoplast Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはその一部からも得られ得る。このような再生技術は、Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486に全般的に記載されている。
【０１０９】
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、操作された植物材料を、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について選択またはスクリーニングすることによって同定および単離され得る。例えば、選択は、形質転換遺伝子構築物がそれに対する抵抗性を付与する抗生物質または除草剤の阻害量を含有する培地で、操作された植物材料を成長させることによって実施され得る。さらに、形質転換された植物および植物細胞はまた、組換え核酸構築物上に存在し得る、任意の目に見えるマーカー遺伝子（例えば、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたはｇｆｐ遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって同定され得る。選択およびスクリーニング方法論は、当業者には周知である。
【０１１０】
用語トランスジェニック「事象」とは、形質転換および異種ＤＮＡ、例えば、対象の導入遺伝子を含む発現カセットを有する単一植物細胞の再生によって生成した組換え植物を指す。用語「事象」とは、異種ＤＮＡを含む、元の形質転換体および／または形質転換体の後代を指す。用語「事象」はまた、形質転換体と別の植物間の有性交雑によって生成した後代を指す。反復親への反復戻し交雑後でさえ、形質転換された親に由来する、挿入されたＤＮＡおよびそれぞれの両端に位置するＤＮＡは、同一染色体位置に交雑の後代中に存在する。普通、植物組織の形質転換は、各々が植物細胞のゲノム中の異なる位置へのＤＮＡ構築物の挿入を表す、複数の事象をもたらす。導入遺伝子の発現またはその他の望ましい特徴に基づいて、特定の事象が選択される。本開示の実施形態では、特定の事象は、ターゲッティングされたゲノム遺伝子座内に挿入されたドナーＤＮＡポリヌクレオチドを含む。
【０１１１】
本明細書において、「挿入ＤＮＡ」とは、植物材料を形質転換するために使用された遺伝子発現カセットを含み得るドナーＤＮＡポリヌクレオチド内の導入遺伝子などの異種ＤＮＡを指し、一方、「それぞれの両端に位置するＤＮＡ」または「接合部ＤＮＡ」は、植物などの生物中に天然に存在するゲノムＤＮＡまたは元の挿入ＤＮＡ分子に対して外来性である、形質転換プロセスによって導入された外来（異種）ＤＮＡ、例えば、形質転換事象と関連している断片のいずれかを含み得る。「接合部」または「それぞれの両端に位置する領域」または「それぞれの両端に位置する配列」とは、本明細書において、元の外来挿入ＤＮＡ分子のすぐ上流に、およびそれと連続して、またはそのすぐ下流のいずれかに局在している少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、４００、１０００、１５００、２０００、２５００または５０００塩基対またはそれ以上の配列を指す。
【０１１２】
上記の形質転換技術のいずれかによって得られる形質転換されたハプロイド胚を培養して、形質転換された遺伝子型を有する全植物体を再生できる。このような再生技術は、胚救出と呼ばれる。胚救出培地は、特定の植物ホルモンおよびエネルギー供給源またはエネルギー供給源だけを含み得る。成長培地はまた、殺生物剤および／または除草剤などの選択剤を含有し得る。この選択剤は、形質転換プロセスによって導入されているマーカーを示すよう使用され得る。トウモロコシの形質転換および再生は、例えば、Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2:603-618 (1990)に記載されている。
【０１１３】
植物への胚の発生は、当技術分野で周知である。未熟倍加ハプロイド胚を植物体に発生させるために使用され得る胚救出技術もまた公知である（Recent Research Developments in Genetics & Breeding. Vol. 1, Part II, 237-303 2004）。その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
ベクターおよびドナーポリヌクレオチド
一実施形態では、本開示は、ターゲッティングされたゲノム遺伝子座内に挿入される１種または複数のドナーＤＮＡポリヌクレオチドの導入に関する。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、コード配列を含む。コード配列は、例えば、農学的形質を付与する遺伝子（例えば、導入遺伝子）をコードし得る。さらなる実施形態では、農学的形質は、殺虫剤耐性形質、除草剤許容性形質、窒素使用効率形質、水使用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質および選択マーカー形質を含む群から選択される。さらなる実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、植物内で発現される。本開示の一実施形態は、１種または複数のドナーポリヌクレオチドを含む植物を含む。実施形態の一態様では、植物は、ハプロイドゲノムを含む。実施形態の別の態様では、植物は、ジハプロイドゲノムを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、遺伝子発現カセットを含む。ここで使用されるような遺伝子発現カセットの構築のための標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)によって；またSilhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984)によって；またAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)によって記載されている。
【０１１６】
植物において遺伝子の発現を指示するいくつかのプロモーターがドナーポリヌクレオチドで使用され得る。このようなプロモーターは、構成的、化学調節性、誘導性、組織特異的および種子優先プロモーターから選択され得る。核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、個々の適用に応じて変わる。例えば、宿主細胞に適している強力な構成的プロモーターが、発現したタンパク質の発現および精製のために通常使用される。
【０１１７】
植物プロモーターの限定されない例として、シロイヌナズナ（A.thaliana）ユビキチン−１０（ubi-10）（Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493）；Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）マンノピンシンターゼ（Δmas）（Petolino et al.、米国特許第６，７３０，８２４号明細書）；および／またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）に由来するプロモーター配列が挙げられる。別の構成的プロモーターとして、例えば、コアカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-812)；イネアクチンプロモーター（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171）；トウモロコシユビキチンプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号明細書;Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632およびChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689）；ｐＥＭＵプロモーター（Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号明細書）；トウモロコシヒストンプロモーター（Chaboute et al. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)）などが挙げられる。
【０１１８】
有用な別の植物プロモーターは、組織特異的および誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導物質に応じて１種または複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化できるものである。誘導物質の不在下で、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。通常、誘導性調節エレメントと特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し、これは、次いで、誘導物質によって、直接的または間接的に活性形態に変換される。誘導物質は、熱、冷温、塩または毒性要素によって直接的に、またはウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用によって間接的に課せられる、タンパク質、代謝生成物、成長調節物質、除草剤またはフェノール系化合物などの化学物質または生理学的ストレスであり得る。通常、誘導性調節エレメントと特異的に結合して、転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し、これは、次いで、誘導物質によって、直接的または間接的に活性形態に変換される。誘導性調節エレメントを含有する植物細胞は、噴霧、灌水、加熱または同様の方法によってなど、細胞または植物に誘導物質を外的に適用することによって誘導物質に曝露され得る。
【０１１９】
本開示の実施形態では、任意の誘導プロモーターが使用され得る。Ward et al., Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993)を参照のこと。例示的な誘導プロモーターとして、エクジソン受容体プロモーター（米国特許第６，５０４，０８２号明細書）；銅に反応するＡＣＥ１系に由来するプロモーター（Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 4567-4571 (1993)）；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に反応するトウモロコシ由来のＩｎ２−１およびＩｎ２−２遺伝子（米国特許第５，３６４，７８０号明細書；Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991)およびGatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)）；Ｔｎ１０由来のＴｅｔレプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991)；転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導される、ステロイドホルモン遺伝子に由来するプロモーター、Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991)およびMcNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257；発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（米国特許第５，９６５，３８７号明細書および国際特許出願公開第９３／００１２９４号パンフレット）；およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーター（Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System", Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9):1796-800）が挙げられる。その他の化学物質によって調節される対象とするプロモーターとして、テトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237および米国特許第５，８１４，６１８号明細書および同５，７８９，１５６号明細書を参照のこと）が挙げられる。
【０１２０】
対象とするその他の調節可能なプロモーターとして、転写が、それぞれ、冷温または熱に対する曝露に応じて達成され得る、冷温反応性調節エレメントまたは熱ショック調節エレメント（Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992）；嫌気性条件によって誘導可能な、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982);Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)）；エンドウマメｒｂｃＳ遺伝子またはエンドウマメｐｓａＤｂ遺伝子に由来する光誘導性プロモーター（Yamamoto et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265）；光誘導性調節エレメント（Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991;Lam and Chua, Science 248:471, 1990;Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590;Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138）；植物ホルモン誘導性調節エレメント（Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990）などが挙げられる。誘導性調節エレメントはまた、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシＩｎ２−１またはＩｎ２−２遺伝子のプロモーター（Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994）およびトランスポゾンＴｎ１０のＴｅｔレプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991）であり得る。ストレス誘導性プロモーターとして、Ｐ５ＣＳなどの塩／水ストレス誘導性プロモーター（Zang et al., (1997) Plant Sciences 129:81-89）；ｃｏｒ１５ａなどの冷温誘導性プロモーター（Hajela et al., (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252）、ｃｏｒ１５ｂ（Wilhelm et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077）、ｗｓｃ１（Ouellet et al., (1998) FEBS Lett. 423-324-328）、ｃｉ７（Kirch et al., (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909）およびｃｉ２１Ａ（Schneider et al., (1997) Plant Physiol. 113:335-45）；Ｔｒｇ−３１（Chaudhary et al., (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57）およびｒｄ２９（Kasuga et al., (1999) Nature Biotechnology 18:287-291）などの乾燥誘導性プロモーター；Ｒａｂ１７などの浸透圧誘導性プロモーター（Vilardell et al., (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93）およびオスモチン（Raghothama et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28）；熱ショックタンパク質などの熱誘導性プロモーター（Barros et al., (1992) Plant Mol. 19:665-75;Marrs et al., (1993) Dev. Genet. 14:27-41）、ｓｍＨＳＰ（Waters et al., (1996) J. Experimental Botany 47:325-338）；およびパセリユビキチンプロモーターに由来する熱ショック誘導性エレメント（国際公開第０３／１０２１９８号パンレット）が挙げられる。その他のストレス誘導性プロモーターとして、ｒｉｐ２（米国特許第５，３３２，８０８号明細書および米国特許公開第２００３／０２１７３９３号明細書）およびｒｄ２９ａ（Yamaguchi-Shinozaki et al., (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340）が挙げられる。アグロバクテリウムｐＭＡＳプロモーター（Guevara-Garcia et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505）およびアグロバクテリウムＯＲＦ１３プロモーター（Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343）を含めた特定のプロモーターは、創傷によって誘導可能である。
【０１２１】
組織優先プロモーターは、特定の植物組織内での増強された転写および／または発現を標的とするために利用され得る。優先発現を指す場合には、意味されることは、特定の植物組織における、その他の植物組織においてよりも高レベルでの発現である。これらの種のプロモーターの例として、ファゼオリンプロモーターによって提供されるものなどの種子優先発現（Bustos et al., (1989) The Plant Cell Vol. 1, 839-853）およびトウモロコシグロブリン−１遺伝子、(Belanger, et al. (1991) Genetics 129:863-972）が挙げられる。双子葉植物について、種子優先プロモーターとして、それだけには限らないが、マメβ−ファゼオリン、ナピン（napin）、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられる。単子葉植物について、種子優先プロモーターとして、それだけには限らないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤゼイン、２７ｋＤａゼイン、γ−ゼイン、ワキシー（waxy）、シュランケン（shrunken）１、シュランケン（shrunken）２、グロブリン１などが挙げられる。種子優先プロモーターとしてまた、例えば、γ−ゼインの胚乳優先プロモーターなどの種子内の特定の組織に遺伝子発現を主に向けるプロモーター、タバコ由来の隠れた（cryptic）プロモーター（Fobert et al., (1994) T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577）、トウモロコシ由来のＰ遺伝子プロモーター（Chopra et al., (1996) Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteinss with C-terminal replacements.Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell.1997, 1:109）、トウモロコシ由来のグロブリン−１プロモーター（Belenger and Kriz (1991) Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972）および種子皮またはトウモロコシ穀粒の殻に発現を向けるプロモーター、例えば、果皮特異的グルタミンシンセターゼプロモーター（Muhitch et al., (2002) Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872）が挙げられる。
【０１２２】
プロモーターに加えて、発現カセット（例えば、ベクターにあってもよい）は、通常、原核生物または真核生物いずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要なさらなる要素のすべてを含有する転写単位または発現カセットを含有する。したがって、通常の発現カセットは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターを含有する。発現カセットはまた、当技術分野で公知の方法に従って作動可能に連結されているさらなる要素：転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結に必要なシグナルを含み得る。さらに、発現カセットは、エンハンサーおよび／または異種スプライシングシグナルを含み得る。
【０１２３】
ドナーポリヌクレオチドの意図される使用に応じて、ドナーポリヌクレオチドまたはベクターのその他の成分も含まれ得る。例として、選択マーカー、ターゲッティングまたは調節配列、最適化された輸送ペプチド配列などの輸送ペプチド配列（米国特許第５，５１０，４７１号明細書を参照のこと）ＲＢ７  ＭＡＲなどの安定化配列（Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687-692および国際特許公開第９７２７２０７号パンフレットを参照のこと）またはリーダー配列、イントロンなどが挙げられる。植物発現ベクターおよびリポーター遺伝子の一般的な説明および例は、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al eds; CRC Press pp. 89-119 (1993)中のGruber, et al., "Vectors for Plant Transformation"に見出すことができる。適当な発現ベクターの選択は、宿主および発現ベクターを宿主に導入する方法に応じて変わる。発現カセットはまた、対象とする異種ヌクレオチド配列の３’末端に、植物において機能的である転写および翻訳終結領域を含むこととなる。終結領域は、本開示の実施形態のプロモーターヌクレオチド配列に関して生来的である場合も、対象とするＤＮＡ配列に関して生来的である場合も、または別の供給源に由来する場合もある。オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ（nos）終結領域などの好都合な終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（tumefaciens）のＴｉプラスミドから入手可能である（Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982)およびShaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)）;Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991);Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991);Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991);Mogen et al.Plant Cell 2:1261-1272 (1990);Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990);Ballas et al., Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987)も参照のこと。
【０１２４】
発現カセットは、５’リーダー配列をさらに含有し得る。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するよう作用し得る。翻訳リーダーは、当技術分野で公知であり、例として、ピコルナウイルスリーダー、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コーディング領域）、Elroy-Stein et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）Carrington and Freed Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990)、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）、Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、Macejak et al., Nature 353:90-94 (1991)；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）、Jobling et al., Nature 325:622-625 (1987)；タバコモザイクウイルスリーダー（TMV）、Gallie et al., (1989) Molecular Biology of RNA、237-256頁；およびトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（Maize chlorotic mottle virus leader）（ＭＣＭＶ）Lommel et al., Virology 81:382-385 (1991)が挙げられる。Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987)も参照のこと。
【０１２５】
発現カセット構築物はまた、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列を含有し得る。例として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１のイントロンがある。Chaubet et al., Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992)。
【０１２６】
発現カセットにとって、特定のオルガネラ、特に、プラスチド、アミロプラストに向けられた、または小胞体に向けられた、または細胞の表面でもしくは細胞外に分泌される遺伝子産物を発現することが望ましい場合には、発現カセットは、輸送ペプチドのコード配列をさらに含み得る。このような輸送ペプチドは、当技術分野で周知であり、それだけには限らないが、アシル担体タンパク質の輸送ペプチド、ＲＵＢＩＳＣＯ、植物ＥＰＳＰシンターゼおよびヒマワリ（Helianthus annuus）の小サブユニット（米国特許第５，５１０，４１７号明細書）、トウモロコシＢｒｉｔｔｌｅ−１葉緑体輸送ペプチド（Nelson et al., Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan et al., Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004）などが挙げられる。さらに、最適化された輸送ペプチドなどのキメラ葉緑体輸送ペプチドは、当技術分野で公知である（米国特許第５，５１０，４７１号明細書）。さらなる葉緑体輸送ペプチドが、米国特許第５，７１７，０８４号明細書、および米国特許第５，７２８，９２５号明細書において、これまでに記載されている。当業者ならば、特定のオルガネラへ産物を発現させることにおいて利用可能な多数の選択肢を容易に理解する。例えば、オオムギアルファアミラーゼ配列は、発現を小胞体に向けるために使用されることが多い（Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)）。
【０１２７】
当業者には、組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、核酸分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率および翻訳後修飾の効率を操作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善し得るということは理解される。さらに、プロモーター配列は、天然プロモーターと比較して、発現のレベルを改善するよう遺伝子操作され得る。核酸分子の発現の制御に有用な組換え技術として、それだけには限らないが、１種または複数の宿主細胞染色体中への核酸分子の安定な組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用に対応するための核酸分子の修飾および転写物を不安定化する配列の欠失が挙げられる。
【０１２８】
形質転換された細胞または組織または植物部分または植物の選択のためのリポーターまたはマーカー遺伝子が、形質転換ベクター中に含まれ得る。選択マーカーの例として、除草剤または抗生物質などの代謝拮抗剤に対する抵抗性を付与するもの、例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994;Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, (1983);Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, (1991)）；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン（paromycin）に対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983およびFraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)）およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Marsh, Gene 32:481-485, (1984);Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, (1985);Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, (1995)も参照のこと）；細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, (1988)）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（国際特許出願第９４／２０６２７号パンフレット）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する抵抗性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ（DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）；およびブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与する、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, (1995)）が挙げられる。
【０１２９】
さらなる選択マーカーとして、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を付与する突然変異体アセト乳酸シンターゼ（Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, (1988)）、アトラジンに対する抵抗性を付与する突然変異体ｐｓｂＡ（Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, (1993)）または突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第５，７６７，３７３号明細書を参照のこと）またはグルホシネートなどの除草剤に対する抵抗性を付与するその他のマーカーが挙げられる。適した選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、クロラムフェニコール（Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, (1983)）；ストレプトマイシン（Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, (1987)）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, (1996)）；ブレオマイシン（Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, (1990)）；スルホンアミド（Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, (1990)）；ブロモキシニル（Stalker et al., Science 242:419-423, (1988)）；グリホサート（Shaw et al., Science 233:478-481, (1986)）；ホスフィノトリシン（DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, (1987)）に対する抵抗性をコードする遺伝子などが挙げられる。
【０１３０】
選択遺伝子の使用のための１つの選択肢は、グルホシネート抵抗性をコードするＤＮＡであり、一実施形態では、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターの制御下の、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子またはｂａｒ遺伝子である。これらの遺伝子は、ビアラホスに対する抵抗性を付与する（Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37);Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., Biotechnology 11:835, 1993;White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062、1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990；およびAnzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492、1989を参照のこと）を参照。ｐａｔ遺伝子の１つのバージョンとして、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子があり、米国特許第６，０９６，９４７号明細書に記載されている。
【０１３１】
さらに、ポリヌクレオチドをコードするマーカーを含有する植物細胞の同定を容易にするマーカーが使用され得る。配列の存在が、測定可能な産物をもたらし、植物細胞の破壊を伴わずに産物をもたらし得る場合には、スコア化可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは有用である。例として、種々の発色基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（例えば、米国特許第５，２６８，４６３号明細書および同５，５９９，６７０号明細書）；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907）；およびアルカリホスファターゼが挙げられる。好ましい実施形態では、使用されるマーカーは、ベータ−カロテンまたはプロビタミンＡ（Ye et al., Science 287:303-305-(2000)）である。この遺伝子は、イネの栄養を増強するために使用されてきたが、この例では、代わりに、スクリーニング可能なマーカーとしてとして使用され、対象とする遺伝子と連結している遺伝子の存在は、提供される金色によって検出される。遺伝子が、植物へのその栄養的な貢献のために使用される状況とは異なり、マーキング目的には、少量のタンパク質で十分である。その他のスクリーニング可能なマーカーとして、例えば、中でも、植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の製造を調節する生成物をコードする、Ｒ−遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)）；トウモロコシＣ１遺伝子（Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179;Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48）およびトウモロコシＣ２（Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207）などのフラボノイド色素の生合成を制御する遺伝子；Ｂ遺伝子（Chandler et al., Plant Cell(1989) 1:1175-1183）、ｐ１遺伝子（Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591;Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553;Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19）；ｂｒｏｎｚｅ遺伝子座遺伝子（Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197;Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049）を含めた、全般的に、アントシアニン／フラボノイド遺伝子が挙げられる（Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127での考察を参照のこと）。
【０１３２】
適したマーカーのさらなる例として、シアン蛍光タンパク質（ＣＹＰ）遺伝子（Bolte et al., (2004) J. Cell Science 117: 943-54およびKato et al., (2002) Plant Physiol 129: 913-42）、黄色蛍光タンパク質遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ製のＰＨＩＹＦＰ（商標）；Bolte et al., (2004) J. Cell Science 117: 943-54を参照のこと）；ルシフェラーゼをコードし、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション計数、蛍光分光光度測定、微光ビデオカメラ、光子計数カメラまたはマルチウェルルミノメトリーを使用してその存在が検出され得る、ｌｕｘ遺伝子（Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84）；およびマーカー遺伝子で形質転換された植物細胞が、赤色であり、したがって、視覚的に選択可能である、ＤｓＲｅｄ２（Dietrich et al., (2002) Biotechnologys 2(2):286-293）が挙げられる。さらなる例として、種々の発色基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）が公知である酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737）；発色性カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101）；α−アミラーゼ遺伝子（Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241）およびチロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化でき、順に、これが縮合して、容易に検出可能な化合物メラニンを形成する酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703）が挙げられる。明確に、多数のこのようなマーカーが利用可能であり、当業者に公知である。
【０１３３】
特定の実施形態では、発現カセット中に遺伝子産物をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は、任意選択で、カセットおよび／または植物中で対象の別のヌクレオチド配列と組み合わされ得る。用語「対象とするヌクレオチド配列」とは、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする、転写されたＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子であり得る核酸分子（ポリヌクレオチドとも呼ばれ得る）を指し、必ずしもポリペプチドまたはタンパク質をコードしない、全遺伝子を構成しない核酸分子（例えば、プロモーター）も指し得る。例えば、特定の実施形態では、導入遺伝子は、グリホサートもしくは別の除草剤に対するさらなる抵抗性もしくは耐性、および／または選定された昆虫または疾患に対する抵抗性および／もしくは栄養強化および／もしくは改善された農学的特徴、および／またはタンパク質もしくは食餌、食物、工業的用途、医薬的用途もしくはその他の用途において有用なその他の生成物を提供する別の対象とするヌクレオチド配列と組み合わされ、または「積み重ねられ」得る。植物ゲノム内の対象とする２種以上の核酸配列の「スタッキング」は、例えば、２以上の事象、対象とする配列を含有する構築物を用いる植物の形質転換、トランスジェニック植物トランスジェニック植物の再形質転換または相同組換えを介した標的組込みによる新規形質の付加を使用する従来の植物育種によって達成され得る。
【０１３４】
対象のこのようなヌクレオチド配列として、それだけには限らないが、（１）有害生物または疾患に対する耐性、（２）除草剤に対する耐性および（３）以下に提供される付加価値のある形質を付与する遺伝子またはコード配列の例が挙げられる。
【０１３５】
１．有害生物または疾患に対して抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物疾患抵抗性遺伝子。植物防御は、植物中の疾患抵抗性遺伝子（Ｒ）の生成物と、病原体中の対応する病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化されることが多い。ある植物の種類が、クローニングされた抵抗性遺伝子を用いて形質転換され、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に操作できる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvu）に対する抵抗性のための、トマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、トマト斑葉細菌病に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードする、トマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262:1432）およびシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のための、アラビドプシス属（Arabidopsis）ＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089）が挙げられる。
【０１３６】
（Ｂ）Ｂｔ  δ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および栄養型殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照のこと）。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）からＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下で購入できる。
【０１３７】
（Ｃ）いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などの、レクチン（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。
【０１３８】
（Ｄ）昆虫有害生物に対する殺うじ剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などの、ビタミン結合タンパク質。米国特許第５，６５９，０２６号明細書を参照のこと。
【０１３９】
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。
このような遺伝子の例として、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）およびα−アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が挙げられる。
【０１４０】
（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその変異体、それをベースとしたミメティックまたはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。
【０１４１】
（Ｇ）発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ディプロプテラ・プンクタータ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（allostatin）（Pratt,1989）および昆虫特異的、麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号明細書）が挙げられる。
【０１４２】
（Ｈ）蛇、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド（Pang, (1992) Gene 116:165）。
【０１４３】
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素
【０１４４】
（Ｊ）生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成に関わらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、ｃａｌｌａｓ遺伝子（ＰＣＴ公開出願第９３／０２１９７号パンフレット）、キチナーゼをコードする配列（例えば、ＡＴＣＣから受託番号３９９９６３７および６７１５２の下で入手できる）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., (1993) Insect Molec. Biol. 23:691）およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673）が挙げられる。
【０１４５】
（Ｋ）シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757）およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467）が挙げられる。
【０１４６】
（Ｌ）疎水性モーメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号明細書および同５，６０７，９１４号明細書を参照のこと；後者は、疾患抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。
【０１４７】
（Ｍ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., (1993) Plant Sci. 89:43）。
【０１４８】
（Ｎ）ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される疾患発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照のこと。
【０１４９】
（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al., (1994) Abstract #497、Seventh Intl. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。
【０１５０】
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al., (1993) Nature 266:469を参照のこと。
【０１５１】
（Ｑ）病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する(Lamb et al., (1992) Biotechnology 10:1436)。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、(Toubart et al., (1992) Plant J. 2:367)に記載されている。
【０１５２】
（Ｒ）植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌疾患に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子(Longemann et al., (1992). Biotechnology 10:3305)。
【０１５３】
（Ｓ）ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドが、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、ＲＮＡ干渉。一例では、ＲＮＡ分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、ｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡへの切断をもたらし、次いで、これが、相同ｍＲＮＡを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al.、米国特許第６，５０６，５５９号明細書;Graham et al.、米国特許第６，５７３，０９９号明細書を参照のこと。
【０１５４】
２．除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列
（Ａ）成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン（imidazalinone）、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体ＡＬＳ酵素をコードし（Lee et al., (1988) EMBOJ. 7:1241）、これは、ＡＨＡＳ酵素としても知られている（Miki et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449）。
【０１５５】
（Ｂ）突然変異体ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子によって、またはＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子およびグルホシネート（ｐａｔおよびｂａｒ遺伝子；ＤＳＭ−２）などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする１種または複数のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照のこと。突然変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，７６９，０６１号明細書に開示されている。欧州特許出願第０３３３０３３号明細書および米国特許第４，９７５，３７４号明細書には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願第０２４２２４６号明細書に提供されている。De Greef et al., (1989) Biotechnology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラｂａｒ遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシホップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435に記載される、Ａｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子がある。
【０１５６】
（Ｃ）光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）。Przibilla et al., (1991) Plant Cell 3:169には、クラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８号明細書に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＤＮＡコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al., (1992) Biochem. J. 285:173に記載されている。
【０１５７】
（Ｄ）ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール（欧州特許第４１８１７５号明細書、欧州特許第４７０８５６号明細書、欧州特許第４８７３５２号明細書、欧州特許第５２７０３６号明細書、欧州特許第５６０４８２号明細書、欧州特許第６８２６５９号明細書、米国特許第５，４２４，２７６号明細書）、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（欧州特許第４９６６３０号明細書、および欧州特許第４９６６３１号明細書）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（欧州特許第６２５５０５号明細書、欧州特許第６２５５０８号明細書、米国特許第５，５０６，１９５号明細書）、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号明細書および同６，２４５，９６８号明細書および米国特許出願公開第２００３００６６１０２号明細書に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のＨＰＰＤを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。
【０１５８】
（Ｅ）遺伝子。フェノキシオーキシン除草剤、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も付与する遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第７，８３８，７３３号明細書に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が挙げられる。
【０１５９】
（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、国際公開第２００７／０５３４８２  Ａ２号パンフレットに記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が挙げられる。
【０１６０】
（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許公開第２００３０１３５８７９号明細書を参照のこと）。
【０１６１】
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号明細書を参照のこと）。
【０１６２】
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳ  ＩＩ）のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照のこと。
【０１６３】
３．価値が付加された形質を付与するか、またはそれに貢献する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素を用いて、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝(Knultzon et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624)。
【０１６４】
（Ｂ）減少したフィチン酸含量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入（Van Hartingsveldt et al., (1993) Gene 127:87）は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
（２）フィチン酸含量を低下させる遺伝子は、導入され得る。トウモロコシでは、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体と関連している単一の対立遺伝子と関連しているＤＮＡを再導入することによって達成され得る（Raboy et al., (1990） Maydica 35:383）。
【０１６５】
（Ｃ）例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素の遺伝子コーディングを用いて形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス（Streptococcus mucus）フルクトース転移酵素遺伝子(Shiroza et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810)、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., (1985) Mol. Gen. Genel. 200:220）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ（Pen et al., (1992) Biotechnology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al., (1993）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480）およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ（Fisher et al., (1993) Plant Physiol. 102:10450）が挙げられる。
【０１６６】
部位特異的ヌクレアーゼ
実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、１種または複数の部位特異的ヌクレアーゼを使用する。開示される方法は、部位特異的ヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを、トウモロコシ小胞子由来形質転換受容性ハプロイド組織に送達することを含む。これらの部位特異的ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断することまたは二本鎖切断または一本鎖切断であり得るＤＮＡ切断を誘導することによってゲノムＤＮＡを修飾し得る。部位特異的ヌクレアーゼの実施形態は、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
【０１６７】
一実施形態では、開示される方法において使用される部位特異的ヌクレアーゼは、遺伝子操作された（天然に存在しない）ＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。例えば、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照のこと。ザントモナス（Xanthomonas）属の植物病原菌は、重要な作物において多数の疾患を引き起こすことが知られている。ザントモナス（Xanthomonas）属の病原性は、かなり異なるエフェクタータンパク質を植物細胞中に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）システムに応じて変わる。これらの中でも、注入されるタンパク質は、植物転写アクチベーターを模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写アクチベーター様（ＴＡＬＥＮ）エフェクターである（Kay et al (2007) Science 318:648-651を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最も十分に特性決定されたＴＡＬ−エフェクターの１種として、ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestgris）病原型ベシカトリア（Vesicatoria）由来のＡｖｒＢｓ３がある（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136および国際公開第２０１００７９４３０号パンフレットを参照のこと）。ＴＡＬ−エフェクターは、各リピートがおよそ３４個のアミノ酸を含有するタンデムリピートの集中ドメインを含有し、これが、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要である。さらに、それらは、核局在性配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Schornack S、et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照のこと）。植物病原菌青枯病菌（Ralstonia solanacearum）では、青枯病菌（R.solanacearum）次亜種株ＧＭＩ１０００において、および次亜種４株ＲＳ１０００において、ザントモナス属（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同である、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と表される２種の遺伝子が見出されている（Heuer et al (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列では互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメイン中の１，５７５ｂｐの欠失によって異なる。しかし、両遺伝子産物は、ザントモナス属（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全文が参照により組み込まれる、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照のこと。
【０１６８】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートドメインの配列に応じて変わる。特定の実施例では、反復される配列は各々、およそ１０２ｂｐを含み、リピートは、通常、互いに９１〜１００％相同である（Bonas et al、同書）。リピートは、通常、多型を含み、これは、普通、１２および１３位に局在し、１２および１３位の超可変二残基の同一性と、ＴＡＬ−エフェクターの標的配列中の連続ヌクレオチドの同一性の間の１対１の対応であると思われる（Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501およびBoch et al (2009) Science 326:1509-1512を参照のこと）。実験的に、これらのＴＡＬ−エフェクターのＤＮＡ認識の天然のコードは、１２および１３位のＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）との結合につながり、ＮＧがＴと、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴと結合し、ＮＮが、ＡまたはＧと結合し、ＩＮＧがＴと結合するように決定された。これらのＤＮＡ結合リピートは、リピートの新規組合せおよび数を有するタンパク質にアセンブルされ、植物細胞において、新規配列と相互作用し、非内因性リポーター遺伝子の発現を活性化できる人工転写因子が作製された（Boch et al、同書）。遺伝子操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインと連結され、酵母リポーターアッセイ（プラスミドベースの標的）において活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）が得られた。
【０１６９】
別の実施形態では、本開示の方法において使用される部位特異的ヌクレアーゼは、（天然に存在しない）メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとしても記載される）を含むよう遺伝子操作され得る。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号明細書；同６，８３３，２５２号明細書；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388；Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118;Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127；Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228;Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180；Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位と結合するよう遺伝子操作され得る。例えば、Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962；Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659；Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許公開第２００７０１１７１２８号明細書を参照のこと。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合性ドメインは、全体として（すなわち、ヌクレアーゼが同族切断ドメインを含むような）ヌクレアーゼとの関連で変更され得るか、または異種切断ドメインと融合され得る。
【０１７０】
さらなる実施形態では、開示される方法において使用される部位特異的ヌクレアーゼは、遺伝子操作された（天然に存在しない）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic repeats）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系は、ゲノムエンジニアリングに使用され得る細菌系をベースとする最近遺伝子操作されたヌクレアーゼ系である。それは多数の細菌および古細菌の適応免疫応答の部分をベースとする。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入する場合に、「免疫」応答によって侵入者のＤＮＡのセグメントが、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。このｃｒＲＮＡは、次いで、部分相補性の領域によって、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合し、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ中のｃｒＲＮＡと相同な領域に案内する。Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有されるガイド配列によって特定される部位のＤＳＢで平滑末端を作製する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。この系は、ここで、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが１分子（「単一ガイドＲＮＡ」）に組み合わされ得るよう遺伝子操作され、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的の任意の望ましい配列に案内するよう遺伝子操作され得る（Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471およびDavid Segal, (2013) eLife 2:e00563を参照のこと）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム中の所望の標的で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するよう遺伝子操作され得、ＤＳＢの修復は、エラープローン修復の増大を引き起こす修復阻害剤の使用によって影響を受け得る。
【０１７１】
特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓヌクレアーゼの「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する質的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」として、それだけには限らないが、対応する天然配列ポリペプチドと共通するヌクレアーゼ活性を有するという条件で、天然配列の断片および天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片を含む。本明細書において考慮されるヌクレアーゼ活性は、機能的誘導体の、ＤＮＡ基質とハイブリダイズして断片になる能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合修飾およびその融合物の両方を包含する。Ｃａｓヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼ断片の適した誘導体として、それだけには限らないが、Ｃａｓタンパク質またはそのヌクレアーゼ断片の突然変異体、融合物、共有結合修飾が挙げられる。Ｃａｓヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は、細胞から得ることができる、または化学的に、もしくはこれら２種の手順の組合せによって合成され得る。細胞は、Ｃａｓヌクレアーゼを天然に産生する細胞、またはＣａｓヌクレアーゼを天然に産生し、内因性Ｃａｓヌクレアーゼを高発現レベルで産生するよう、もしくは外因的に導入された、内因性Ｃａｓと同一であるかもしくは異なっているＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸からＣａｓヌクレアーゼを産生するよう遺伝子的に操作される細胞であり得る。いくつかの場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓヌクレアーゼを産生するよう遺伝子的に操作される。Ｃａｓヌクレアーゼは、ＣａｓヌクレアーゼをガイドＲＮＡと同時発現することによって哺乳類細胞中に（推定的に、植物細胞内に）配置される。Le Cong, F., et al., (2013) Science 339(6121):819-823に開示されるように、Ｃａｓ媒介性ゲノム切断を促進するために、２種の形態のガイドＲＮＡが使用され得る。
【０１７２】
特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎ  ｖｉｖｏ切断および／またはターゲッティングされた切断のために使用される１種または複数のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は天然に存在せず、選択の標的部位と結合するよう遺伝子操作される。例えば、参照によりその全文が、すべて本明細書に組み込まれる、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141；Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340；Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660；Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637；Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；同６，５３４，２６１号明細書；同６，５９９，６９２号明細書；同６，５０３，７１７号明細書；同６６８９，５５８号明細書；同７，０３０，２１５号明細書；同６，７９４，１３６号明細書；同７，０６７，３１７号明細書；同７，２６２，０５４号明細書；同７，０７０，９３４号明細書；同７，３６１，６３５号明細書；同７，２５３，２７３号明細書；および米国特許公開第２００５／００６４４７４号明細書；同２００７／０２１８５２８号明細書；同２００５／０２６７０６１号明細書を参照のこと。
【０１７３】
遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。操作する方法は、それだけには限らないが、合理的設計および種々の種類の選択を含む。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、これでは、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列と結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合される。例えば、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号明細書および同６，５３４，２６１号明細書を参照のこと。
【０１７４】
標的部位；ＺＦＰの選択および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者には公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号明細書；同７８９，５３８号明細書；同６，４５３，２４２号明細書；同６，５３４，２６１号明細書；同５，９２５，５２３号明細書；同６，００７，９８８号明細書；同６，０１３，４５３号明細書；同６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット  国際公開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレット；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットに詳細に記載されている。
【０１７５】
さらに、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５個以上のアミノ酸の長さのリンカーを含めた任意の適したリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６個以上のアミノ酸の長さの例示的リンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同６，９０３，１８５号明細書；および同７，１５３，９４９号明細書も参照のこと。本明細書において記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適したリンカーの任意の組合せを含み得る。
【０１７６】
したがって、本明細書において開示されるドナーポリヌクレオチドを組み込むための方法において、部位特異的ヌクレアーゼは、ドナーＤＮＡポリヌクレオチド（少なくとも１種の導入遺伝子を含み得る）を挿入するよう望まれる、トウモロコシゲノム中の遺伝子座の標的部位と特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０１７７】
任意の適した切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインと作動可能に連結され、ヌクレアーゼ融合タンパク質を形成し得る。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦＮ、つまり、その遺伝子操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインによって、その意図される核酸標的を認識でき、ＤＮＡを、ヌクレアーゼ活性によってＺＦＰ結合部位の近くで切断されるようにする機能的実体を作製するために、ヌクレアーゼドメインと融合されている。例えば、Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160を参照のこと。より最近は、ＺＦＮは、種々の生物におけるゲノム修飾のために使用された。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号明細書；同２００５０２０８４８９号明細書；同２００５００２６１５７号明細書；同２００５００６４４７４号明細書；同２００６０１８８９８７号明細書；同２００６００６３２３１号明細書；および国際公開公報第０７／０１４２７５号パンフレットを参照のこと。同様に、ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥＮを作製するためにヌクレアーゼドメインと融合された。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照のこと。
【０１７８】
上記のように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインにとって異種であり得る、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼに由来する切断ドメインまたはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼに由来する切断ドメインまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼに由来する切断ドメイン。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが由来し得る例示的エンドヌクレアーゼとして、それだけには限らないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２−２００３カタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linn et al. (eds.) Nuclease, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照のこと）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうち１種または複数が、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用され得る。
【０１７９】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量化を必要とする、上記で示されるような、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が、切断ハーフドメインを含む場合には、その切断のために２種の融合タンパク質が必要である。あるいは、２種の切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２種の切断ハーフドメインは、同一エンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２種の融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、２種の融合タンパク質の、そのそれぞれの標的部位との結合が、切断ハーフドメインが、例えば、二量化によって機能的切断ドメインを形成するのを可能にする、互いに対する空間的方向に切断ハーフドメインを置くよう、互いに関して配置される。したがって、特定の実施形態では、標的部位の近位端部が、５〜８ヌクレオチドによって、または１５〜１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２種の標的部位の間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断部位は、標的部位の間にある。
【０１８０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多数の種に存在し、ＤＮＡと配列特異的に（認識部位で）結合でき、結合の部位で、または結合の付近でＤＮＡを切断できる。特定の制限酵素（例えば、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ）は、ＤＮＡを、認識部位から除かれた部位で切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ酵素Ｆｏｋ  Ｉは、一方の鎖の認識部位から９ヌクレオチドで、またもう一方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号明細書；同５，４３６，１５０号明細書および同５，４８７，９９４号明細書；ならびにLi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768；Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887；Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982を参照のこと。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子操作されている場合も、遺伝子操作されていない場合もある、少なくとも１種のＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１種または複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０１８１】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素として、Ｆｏｋ  Ｉがある。この特定の酵素は、二量体として活性である。Bitinaite et al.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575。したがって、本開示の目的上、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋ  Ｉ酵素の一部は、切断ハーフドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合物を使用する細胞配列のターゲッティングされる二本鎖切断および／またはターゲッティングされる置換について、触媒的に活性な切断ドメインを再構築するために、各々、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２種の融合タンパク質が使用され得る。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２種のＦｏｋ  Ｉ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子も使用され得る。ジンクフィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合物を使用するターゲッティングされる切断およびターゲッティングされる配列変更のパラメータは、本開示中の別の場所に提供されている。
【０１８２】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量化（例えば、二量化）して、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の一部であり得る。
【０１８３】
例示的ＩＩＳ型制限酵素は、その全文が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第０７／０１４２７５号パンレットに記載されている。さらなる制限酵素も、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは、本開示によって考慮される。例えば、Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420を参照のこと。
【０１８４】
特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、そのすべての開示内容が参照によりその全文で本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号明細書；同２００６０１８８９８７号明細書；同２００７０３０５３４６号明細書および同２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体化を最小化または防ぐ、１種または複数の遺伝子操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。Ｆｏｋ  Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は、すべてＦｏｋ  Ｉ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
【０１８５】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ  Ｉの例示的な遺伝子操作された切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインが、Ｆｏｋ  Ｉの４９０および５３８位にアミノ酸残基の突然変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に突然変異を含む対を含む。
【０１８６】
したがって、一実施形態では、４９０での突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；５３８での突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；４８６での突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し；４９９位での突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的には、本明細書に記載された遺伝子操作された切断ハーフドメインは、一方の切断ハーフドメイン中で４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と表される遺伝子操作された切断ハーフドメインを製造することによって、および別の切断ハーフドメイン中で４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と表される遺伝子操作された切断ハーフドメインを製造することによって調製された。本明細書において記載された遺伝子操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化または消滅される偏性ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、その開示内容が、すべての目的のために全文で組み込まれる米国特許公開第２００８／０１３１９６２号明細書を参照のこと。特定の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされた）に突然変異を、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）置換する突然変異を含む。その他の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされた）に突然変異を、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）置換する突然変異を含む。その他の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされた）に突然変異を、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）置換する突然変異を含む（米国特許公開第２０１１０２０１０５５号明細書を参照のこと）。その他の実施形態では、遺伝子操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ」突然変異を含む（Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107を参照のこと）。
【０１８７】
本明細書において記載された遺伝子操作された切断ハーフドメインは、任意の適した方法を使用して、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号明細書；同２００８０１３１９６２号明細書；および同２０１１０２０１０５５号明細書に記載されるような、野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ  Ｉ）の部位特異的突然変異誘発によって調製され得る。
【０１８８】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号明細書を参照のこと）を使用して、核酸標的部位でｉｎ  ｖｉｖｏでアセンブルされ得る。このようなスプリット酵素の構成成分は、別個の発現構築物で発現され得るか、または例えば、個々の構成成分が、自己切断性２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分かれている１つのオープンリーディングフレームに連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１８９】
ヌクレアーゼは、例えば、国際公開第２００９／０４２１６３号パンフレットおよび第２００９００６８１６４号パンフレットに記載されるような酵母ベースの染色体系において、使用に先立って活性についてスクリーニングされ得る。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野で公知の方法を使用して容易に設計され得る。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号明細書；同２００５０２０８４８９号明細書；同２００５００２６１５７号明細書；同２００５００６４４７４号明細書；同２００６０１８８９８７号明細書；同２００６００６３２３１号明細書；および国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットを参照のこと。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下であり得る。
【０１９０】
「標的」または「標的部位」または「ターゲッティングされるゲノム遺伝子座」または「ゲノムＤＮＡ標的領域」は、結合存在のための十分な条件のときに、結合分子（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ）が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。
【０１９１】
一実施形態では、ゲノム遺伝子座配列は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、人工染色体ならびに例えば、増幅された配列、二重微小染色体および内因性または感染性細菌およびウイルスのゲノムなどの細胞中に存在する任意のその他の種類の核酸中に存在するものを含む。ゲノム遺伝子座配列は、正常（すなわち、野生型）または突然変異体であり得；突然変異体配列は、例えば、挿入（例えば、これまでに挿入された外因性ポリヌクレオチド）、欠失、転位置、再編成および／または点突然変異を含み得る。ゲノム遺伝子座配列はまた、いくつかの異なる対立遺伝子のうち１種も含み得る。
【０１９２】
また、ドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列をゲノム遺伝子座内に挿入する方法も本開示の実施形態として本明細書において記載される。ターゲッティングされたゲノム修飾の報告された、観察された頻度は、植物内のゲノム遺伝子座をターゲッティングすることは、相対的に効率が悪いことを示す。このような方法の成功率は、幾分かは、相同組換えの不十分な効率および高頻度の、ドナーＤＮＡの、標的部位以外のゲノムの領域への非特異的挿入のために低い。本開示は、ターゲッティングされたゲノム遺伝子座内のドナーＤＮＡポリヌクレオチドを同定する方法を提供する。
【０１９３】
部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、遺伝子操作された、切断ドメインに融合されたジンクフィンガー結合ドメイン）を使用して、細胞ＤＮＡにおいて１つまたは複数のターゲッティングされた二本鎖切断を作製する方法が、本明細書において開示される。開示される方法は、特定の作用機序に左右されないが、細胞ＤＮＡにおける二本鎖切断は、切断部位の近くで細胞修復機序を数千倍刺激し、このようなターゲッティングされた切断によって、ゲノム中の実質的に任意の部位での配列の変更または置換（相同性組換え修復による）が可能になることがわかっている。
【０１９４】
選択されたゲノム配列におけるターゲッティングされた置換（またはそれへの挿入）はまた、本明細書に記載される部位特異的ヌクレアーゼの使用に加えて、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの導入を必要とする。ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、部位特異的ヌクレアーゼ（複数可）の発現に先立って、それと同時に、それに続いて細胞中に導入され得る。ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、ゲノム配列に対して、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドと相同ゲノム配列との間での相同組換え（または相同性によって指示される修復）を支持するのに十分な相同性を含有する。ドナーＤＮＡポリヌクレオチドおよびゲノム遺伝子座間のおよそ２５、５０  １００、２００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００ヌクレオチドまたはそれ以上の配列相同性（または１０から２，０００ヌクレオチドの間またはそれ以上の任意の整数値）が、それらの間の相同組換えを支持する。ドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列は、１０から５，０００ヌクレオチド（または任意の整数値のそれらの間のヌクレオチド）またはそれ以上の長さの範囲であり得る。ドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列は、置き換わるゲノム配列と同一である必要はない。例えば、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの配列は、染色体配列との十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して、１つまたは複数の単一塩基変更、挿入、欠失、逆位または再編成を含有し得る。あるいは、ドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列は、２つの相同性の領域が両側に位置する非相同配列を含有し得る。さらに、ドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列は、細胞クロマチン中の対象の領域と相同ではない配列を含有するベクター分子を含み得る。全般的に、ドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列の相同領域（複数可）は、組換えが望まれるゲノム遺伝子座に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列は、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドとゲノム遺伝子座間の配列相同性の２５以上、５０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、７５０以上、１，０００以上、１，５００以上または２，０００以上のヌクレオチドのスパンにわたって６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．９％の配列同一性を有する。
【０１９５】
ドナーＤＮＡポリヌクレオチド分子は、細胞クロマチンに対して相同性の２以上の非連続領域を含有し得る。例えば、対象のゲノム領域中に普通は存在しない導入遺伝子配列のターゲッティングされた挿入のために、このような導入遺伝子配列は、ドナーＤＮＡポリヌクレオチド中の対象のゲノム領域に対して相同性の領域が両側に位置し得る。
【０１９６】
その他の実施形態では、選択されたゲノム配列のターゲッティングされた置換はまた、非相同末端結合機序（ＮＨＥＪ）による、ターゲッティングされたゲノム遺伝子座内への置換またはドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列の導入を必要とする。その後、ドナー鎖は、ドナーポリヌクレオチド配列の組込みのために相同アームを必要としない。ターゲッティングされたゲノム遺伝子座内の二本鎖切断の結果として、ドナーポリヌクレオチド配列が、染色体内に組み込まれる。ＮＨＥＪ修復経路は、ドナーポリヌクレオチドをゲノム内に組み込むための別の代替機序を提供する。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１６９８０２号パンフレットを参照のこと。
【０１９７】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖であり得、線形または環状形態で細胞中に導入され得る。線形形態で導入される場合には、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法によって保護され得る（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）。例えば、１種または複数のジデオキシヌクレオチド残基が、線形分子の３’末端に付加される、および／または自己相補性オリゴヌクレオチドが、末端の一方もしくは両方にライゲーションされる。例えば、Chang et al., (1987) Proc. Natl Acad. Sd. USA 84:4959-4963；Nehls et al., (1996) Science 272:886-889を参照のこと。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法として、それだけには限らないが、末端アミノ基（複数可）の付加および例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用が挙げられる。
【０１９８】
ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞中に導入され得る。さらに、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームもしくはポロクサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として導入され得るか、または細菌もしくはウイルスによって送達され得る（例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）種、リゾビウム（Rhizobium）種ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizoboium meliloti）、メゾリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスX、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルス。例えば、Chung et al. (2006) Trends Plant Sd. 11(1): 1-4を参照のこと）。さらなる実施形態では、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような微粒子銃形質転換法によって細胞中（例えば、アンドロゲン性カルス組織中）に導入され得る。
【０１９９】
本出願人らの方法は、遺伝子操作されたＺＦＰの強力なターゲッティング能力を、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と組み合わせて、二本鎖切断を、外因性配列の挿入が望まれるゲノムの領域に特異的にターゲッティングすることができる。本出願人らの方法によって必要とされないが、細胞配列中の二本鎖切断の存在は、切断に隣接するか、切断の周囲の領域に対して相同性を有する外因性ＤＮＡ分子の存在と相まって、ドナー分子から細胞性（例えば、ゲノムまたは染色体）配列への配列情報の転移によって、すなわち、「遺伝子変換」としても知られる相同性組換え修復のプロセスによって切断を修復する細胞機序を活性化すると思われる。
【０２００】
染色体配列の変更のために、所望の配列変更を達成するためにドナー配列の十分な部分がコピーされる限り、ドナーの全配列が、染色体中にコピーされる必要はない。
【０２０１】
相同組換えによるドナー配列の挿入の効率は、二本鎖切断と、組換えが望まれる部位の間の細胞ＤＮＡ中の距離と逆相関している。通常、二本鎖切断が、組換えが望まれる部位に近い場合に、より高い相同組換え効率が観察される。組換えの正確な部位が要求されない（例えば、所望の組換え事象が、ゲノム配列の一定区間中で起こり得る）場合には、ドナー核酸の長さおよび配列は、切断部位（複数可）と一緒に、所望の組換え事象を得るよう選択され得る。所望の事象が、ゲノム配列中の単一ヌクレオチドの配列を変更するよう設計される場合には、細胞クロマチンは、そのヌクレオチドのいずれかの側の１０，０００ヌクレオチド内で切断される。例えば、切断は、ヌクレオチドのいずれかの側で２から１，０００の間の任意の整数値のヌクレオチド内で起こり得る。特定の実施例では、切断は、ゲノム配列中で変更されるヌクレオチドのいずれかの側で１，０００、５００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５または２つのヌクレオチド内で起こる。
【０２０２】
上記で詳述されるように、各々、ジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２種の融合タンパク質の結合部位は、その他の結合部位に最も近い各結合部位の端から測定されるように５〜８または１５〜１８ヌクレオチド離れて局在し得、切断は結合部位の間で起こる。切断が、結合部位間の単一部位または複数の部位で起こるかどうかは、切断されたゲノム配列がドナー配列によって置換されるので重要ではない。したがって、ターゲッティングされた組換えによる、単一ヌクレオチド対の配列の効率的な変更のためには、結合部位間の領域の中間点は、そのヌクレオチド対の１０，０００ヌクレオチド内、好ましくは、１，０００ヌクレオチドまたは５００ヌクレオチドまたは２００ヌクレオチドまたは１００ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドまたは２ヌクレオチド内、または１ヌクレオチドであるか、または対象のヌクレオチド対である。
【０２０３】
特定の実施形態では、相同染色体は、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドとして働き得る。したがって、例えば、ヘテロ接合体中の突然変異の訂正は、一方の染色体上の突然変異体配列と結合し、切断するが、相同染色体上の野生型配列は切断しない融合タンパク質を遺伝子操作することによって達成され得る。突然変異を保有する染色体上の二本鎖切断は、相同染色体に由来する野生型配列が、切断された染色体中にコピーされ、したがって、野生型配列の２つのコピーが回復される相同性をベースとする「遺伝子変換」プロセスを刺激する。
【０２０４】
例えば、それだけには限らないが、ＲＡＤ５２エピスタシス群のメンバー（例えば、Ｒａｄ５０、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、ＲａｄＳＩＣ、ＲａｄＳＩＤ、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ５４Ｂ、Ｍｒｅｌｌ、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３）などの相同組換えに関与する遺伝子、産物が前記遺伝子産物（例えば、ＢＲＣＡｌ、ＢＲＣＡ２）と相互作用する遺伝子および／またはＮＢＳｌ複合体中の遺伝子の発現を活性化するさらなるＺＦＰ機能性ドメイン融合物の使用を含めた、ターゲッティングされる組換えのレベルを増強し得る方法および組成物も提供される。例えば、Boyko et al. (2006) Plant Physiology 141 :488-497およびLaFarge et al. (2003) Nucleic Acids Res 31(4): 1148-1155を参照のこと。同様に、非相同性末端結合に関与する遺伝子（例えば、Ｋｕ７０／８０、ＸＲＣＣ４、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ４）の発現を抑制するために、ＺＦＰ機能性ドメイン融合物が、本明細書において開示される方法および組成物と組み合わせて使用され得る。例えば、Riha et al. (2002) EMBO 21 :2819-2826;Freisner et al. (2003) Plant J. 34:427-440；Chen et al. (1994) European Journal of Biochemistry 224:135-142を参照のこと。ジンクフィンガー結合ドメインおよび機能性ドメインの間の融合物を使用して、遺伝子発現を活性化および抑制するための方法は、例えば、同一所有者の米国特許第６，５３４，２６１号明細書；同６，８２４，９７８号明細書および同６，９３３，１１３号明細書に開示されている。さらなる抑制方法として、抑制されるべき遺伝子の配列にターゲッティングされる、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）の使用が挙げられる。
【０２０５】
検出アッセイ
特定の実施形態では、本開示は、ターゲッティングされたトウモロコシゲノムの切断、ターゲッティングされたトウモロコシゲノム内のドナーＤＮＡポリヌクレオチドの組込み、またはターゲッティングされたトウモロコシゲノム内に取り込まれた突然変異などのゲノムＤＮＡの修飾を確認することを含む方法に関する。特定の実施形態では、ゲノムのこのような修飾を確認する方法は、ＰＣＲベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたは次世代配列決定アッセイによる確認を含む。
【０２０６】
したがって、切断、組み込まれた導入遺伝子、またはゲノム中の突然変異などのゲノムＤＮＡの修飾は、配列のプライマーまたはプローブを使用することを含めた、種々の方法で確認され得る。特定の実施形態では、安定に組み込まれた導入遺伝子は、植物のいくつかの組織における、もしくはいくつかの発達段階での導入遺伝子の構成的または選択的発現に基づいて検出され得るか、または導入遺伝子は、実質的にすべての植物組織において、実質的にその全生活環に沿って発現され得る。
【０２０７】
ターゲッティングされたゲノム修飾、組み込まれた導入遺伝子または突然変異の確認は、任意の適した増幅方法によって行われ得る。全般的に、Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8、14-25 (1990)を参照のこと。適した増幅技術の例として、それだけには限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅（全般的に、G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992)；G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)を参照のこと）、転写ベースの増幅（D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)）、自家持続配列複製法（または「３ＳＲ」）（J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)）、Ｑβレプリカーゼ系（P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202(1988)）、核酸配列ベースの増幅（または「ＮＡＳＢＡ」）（R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)参照のこと）、修復連鎖反応（または「ＲＣＲ」）（R. Lewis、前掲を参照のこと）およびブーメランＤＮＡ増幅（または「ＢＤＡ」）（R. Lewis、前掲を参照のこと）が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応が、一般に好ましい。
【０２０８】
「増幅」は、鋳型特異性を含む核酸複製の特別な場合である。非特異的鋳型複製と対比される（すなわち、鋳型依存性であるが、特定の鋳型には依存しない複製）。鋳型特異性は、本明細書では、複製の忠実性（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性から区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性の用語で記載されることが多い。
【０２０９】
本明細書において、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＰＣＲ」は、一般に、クローニングまたは精製することなく、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増大する方法を指す（米国特許第４，６８３，１９５号明細書；同４，６８３，２０２号明細書；および同４，９６５，１８８号明細書；参照により本明細書に組み込まれる）。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物中に入れること、続いて、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での正確な順序の温度サイクリングを含む。２種のプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖と相補的である。増幅を達成するには、混合物が変性され、次いで、プライマーが、標的分子内のその相補的配列とアニーリングされる。アニーリング後に、プライマーをポリメラーゼを用いて伸長して、相補鎖の新規対を形成する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長のステップは、所望の標的配列の高濃度の増幅されたセグメントを得るために、多数回反復され得る（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長は、１「サイクル」を構成し；多数の「サイクル」があり得る）。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、プライマーの互いに関する相対位置によって決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。プロセスの反復態様によって、方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（本明細書において以下、「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅されたセグメントは、混合物中で優性の（濃度の点で）配列になるので、それらは、「ＰＣＲ増幅された」といわれる。
【０２１０】
用語「逆転写酵素」または「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、出発材料がｍＲＮＡであるＰＣＲの種類を指す。出発ｍＲＮＡは、逆転写酵素を使用して相補的ＤＮＡまたは「ｃＤＮＡ」に酵素的に変換される。次いで、ｃＤＮＡは、「ＰＣＲ」反応の「鋳型」として使用される。
【０２１１】
一実施形態では、増幅反応は、定量される。その他の実施形態では、増幅反応は、シグネチャープロファイルを使用して定量化され、これでは、シグネチャープロファイルは、融解温度および蛍光シグネチャープロファイルを含む群から選択される。
【０２１２】
本開示の実施形態の核酸分子またはそのセグメントは、ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得る。ＰＣＲ増幅の実施では、プライマーおよび鋳型間で特定のミスマッチ度が許容され得る。したがって、例示されたプライマーの突然変異、欠失および挿入（特に、５’または３’末端へのヌクレオチドの付加）は、本開示の範囲内に入る。当技術分野に公知の方法によって、所与のプライマー中に突然変異誘発、挿入および欠失が生じ得る。
【０２１３】
分子ビーコン（Molecular Beacons）は、配列検出における使用のために記載されている。手短には、それぞれの両端に位置するゲノムおよび挿入部分ＤＮＡ接合部分と重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが、設計される。ＦＲＥＴプローブの独特の構造が、蛍光および消光部分を極近接して維持する二次構造を含有するものをもたらす。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入部分ＤＮＡ配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。成功したＰＣＲ増幅後、ＦＲＥＴプローブ（複数可）の標的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブ二次構造の除去および蛍光および消光部分の空間的分離をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによって、それぞれの両端に位置するゲノム／導入遺伝子挿入部分配列の存在を示す。増幅反応の検出のためのこのような分子ビーコンアッセイは、本開示の実施形態である。
【０２１４】
加水分解プローブアッセイは、別に、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Life Technologies、Foster City、Calif.）としても知られる、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量化する方法である。手短には、事象特異的検出のために導入遺伝子内に１つのオリゴおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中に１つを有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入部分ＤＮＡ配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションが、ＦＲＥＴプローブ上の消光部分から蛍光部分の切断および放出をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによって、それぞれの両端に位置する／導入遺伝子挿入部分配列の存在を示す。増幅反応の検出のためのこのような加水分解プローブアッセイは、本開示の実施形態である。
【０２１５】
ＫＡＳＰａｒアッセイは、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量化する方法である。手短には、ターゲッティングされるゲノム遺伝子座を含むゲノムＤＮＡサンプルは、ＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイ系として知られるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイを使用してスクリーニングされる。本開示の実施において使用されるＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイは、複数のプライマーを含有するＫＡＳＰａｒ（登録商標）ＰＣＲアッセイ混合物を使用し得る。ＰＣＲアッセイ混合物中で使用されるプライマーは、少なくとも１種のフォワードプライマーおよび少なくとも１種のリバースプライマーを含み得る。フォワードプライマーは、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの特定の領域に対応する配列を含有し、リバースプライマーは、ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。さらに、ＰＣＲアッセイ混合物中で使用されるプライマーは、少なくとも１種のフォワードプライマーおよび少なくとも１種のリバースプライマーを含み得る。例えば、ＫＡＳＰａｒ（登録商標）ＰＣＲアッセイ混合物は、２種の異なる対立遺伝子に対応する２種のフォワードプライマーおよび１種のリバースプライマーを使用し得る。フォワードプライマーのうち１種は、内因性ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。第２のフォワードプライマーは、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの特定の領域に対応する配列を含有する。リバースプライマーは、ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。増幅反応の検出のためのこのようなＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイは、本開示の実施形態である。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、蛍光シグナルまたは蛍光色素は、ＨＥＸ蛍光色素、ＦＡＭ蛍光色素、ＪＯＥ蛍光色素、ＴＥＴ蛍光色素、Ｃｙ３蛍光色素、Ｃｙ３．５蛍光色素、Ｃｙ５蛍光色素、Ｃｙ５．５蛍光色素、Ｃｙ７蛍光色素およびＲＯＸ蛍光色素を含む群から選択される。
【０２１７】
その他の実施形態では、増幅反応は、フローサイトメトリーによって検出可能な濃度範囲で細胞ＤＮＡを染色でき、リアルタイムサーモサイクラーによって検出可能である蛍光発光スペクトルを有する適した第２の蛍光ＤＮＡ色素を使用して実施される。その他の核酸色素は公知であり、継続的に同定されていることは、当業者によって理解されるべきである。ＹＯ−ＰＲＯ−１（登録商標）、ＳＹＴＯＸ緑色（登録商標）、ＳＹＢＲ緑色Ｉ（登録商標）、ＳＹＴＯ１１（登録商標）、ＳＹＴＯ１２（登録商標）、ＳＹＴＯ１３（登録商標）、ＢＯＢＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）およびＴＯＴＯ（登録商標）などの適当な励起および発光スペクトルを有する任意の適した核酸色素が使用され得る。一実施形態では、第２の蛍光ＤＮＡ色素は、１０μＭ未満、４μＭ未満または２．７μＭ未満で使用されるＳＹＴＯ１３（登録商標）である。
【０２１８】
さらなる実施形態では、ゲノム修飾の確認のために次世代配列決定（ＮＧＳ）が使用され得る。Brautigma et al., 2010によって記載されるように、単離され、増幅された断片のヌクレオチド配列を決定するために、ＤＮＡ配列分析が使用され得る。増幅された断片は、単離され、ベクター中にサブクローニングされ、鎖ターミネーター法（サンガー配列決定とも呼ばれる）または色素ターミネーター配列決定を使用して配列決定され得る。さらに、アンプリコンは、次世代配列決定を用いて配列決定され得る。ＮＧＳ技術は、サブクローニングステップを必要とせず、複数のシーケンシングリードが、単一反応において完了され得る。３種のＮＧＳプラットフォームが市販されている、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ製のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ、Ｓｏｌｅｘａ製のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＡｎａｌｙｓｅｒおよびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」のアクロニム）。さらに、現在開発中である２種の単一分子配列決定法がある。これらとして、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＳｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＳＭＲＴ）が挙げられる。
【０２１９】
４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅによって市販されているＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ＦＬＸは、ロングリードＮＧＳであり、これは、シーケンシングリードを作製するためにエマルジョンＰＣＲおよびピロシーケンシングを使用する。３００〜８００ｂｐのＤＮＡ断片または３〜２０ｋｂｐの断片を含有するライブラリーが使用され得る。反応は、２５０〜４００メガ塩基の総収量のために、実施あたり約２５０〜４００塩基の１００万個を超えるリードを生成し得る。この技術は、最長リードをもたらすが、実施あたりの総シーケンスアウトプットは、その他のＮＧＳ技術と比較して低い。
【０２２０】
Ｓｏｌｅｘａによって市販されているＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒは、ショートリードＮＧＳであり、蛍光色素標識された可逆的ターミネーターヌクレオチドを用いる合成アプローチによるシーケンシングを使用し、固相架橋ＰＣＲに基づいている。最大１０ｋｂのＤＮＡ断片を含有するペアエンドシーケンシングライブラリーの構築が使用され得る。反応は、３５〜７６塩基の長さの１億を超えるショートリードを生成する。このデータは、実施あたり３〜６ギガ塩基を生成し得る。
【０２２１】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって市販されているＯｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）システムによるシーケンシングは、ショートリード技術である。このＮＧＳ技術は、最大１０ｋｂｐの長さの断片化された二本鎖ＤＮＡを使用する。このシステムは、色素標識されたオリゴヌクレオチドプライマーの連結によるシーケンシングおよび実施あたり最大３０ギガ塩基の全シーケンスアウトプットをもたらす１０億のショートリードを作製するエマルジョンＰＣＲを使用する。
【０２２２】
Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのｔＳＭＳおよびＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴは、シーケンス反応のために単一ＤＮＡ分子を使用する異なるアプローチを適用する。ｔＳＭＳ  Ｈｅｌｉｃｏｓシステムは、最大８億のショートリードを生成し、これは、実施あたり２１ギガ塩基をもたらす。これらの反応は、「合成によるシーケンシング」アプローチとして記載されている蛍光色素標識されたバーチャルターミネーターヌクレオチドを使用して完了される。
【０２２３】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって市販されているＳＭＲＴ次世代配列決定システムは、合成によってリアルタイムシーケンシングを使用する。この技術は、可逆的ターミネーターによって制限されていない結果として最大１０００ｂｐの長さのリードを生成し得る。この技術を使用して、１日あたり、２倍体ヒトゲノムの１倍のカバー度に相当する生リードリードスループットが生成され得る。
【０２２４】
別の実施形態では、ゲノム修飾の確認は、ウエスタンブロット、ノーザンブロットおよびサザンブロットを含めたブロッティングアッセイを使用して完了され得る。このようなブロッティングアッセイは、生物学的サンプルの同定および定量化のために生物学的研究においてよく使用される技術である。これらのアッセイは、まず、電気泳動手段によるゲルにおけるサンプル成分の分離と、それに続く、電気泳動によって分離された成分の、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）またはナイロンなどの材料からできているトランスファーメンブランへの移動を含む。分析物はまた、これらの支持体上に直接的にスポッティングされるか、または真空、毛細血管作用または圧力を適用することによって支持体上の特定の領域に向けられる。次いで、トランスファーメンブランは、一般的に、分析物が互いに区別され、視覚的にまたは自動化リーダーによってのいずれかで検出される能力を増強するためにトランスファー後処理に付される。
【０２２５】
さらなる実施形態では、ゲノム修飾の確認は、液体サンプルまたは湿潤サンプル中の物質、通常、抗原の存在を検出するために、固相酵素イムノアッセイを使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用して完了され得る。サンプルに由来する抗原は、プレートの表面に結合される。次いで、さらなる特異的抗体が表面上に適用され、そのようにして抗原と結合し得る。この抗体は、酵素に連結され、最終ステップにおいて、酵素の基質を含有する物質が添加される。その後の反応は、検出可能なシグナル、最も一般的には、基質における色の変化をもたらす。
【０２２６】
後代植物への導入遺伝子の遺伝子移入
本開示は、後代植物へのアンドロゲン性カルス誘導性ジハプロイド植物に由来する導入遺伝子を含むドナーポリヌクレオチドの遺伝子移入のための方法を提供する。導入遺伝子についてホモ接合性であるジハプロイド植物を含めたジハプロイド植物の製造が、本明細書において記載されている。一実施形態では、方法は、
ｉ）雌性親植物を雄性親植物と交雑するステップであって、雄性親植物がジハプロイド植物であり、雌性親植物が稔性親植物である、ステップと、
ｉｉ）（ａ）の交雑種から後代種子を収穫するステップと、
ｉｉｉ）後代種子を植えるステップと、
ｉｖ）後代種子を成長させるステップであって、後代種子が、導入遺伝子を含むドナーポリヌクレオチドを含む、ステップと
を含む。
【０２２７】
方法の特定の実施形態では、雌性および雄性親植物は、トウモロコシ植物体である。さらなる実施形態では、雌性親植物は、優良トウモロコシ植物体である。
【０２２８】
後代種子を作製するためのこのような交雑は、従来の植物育種技術を使用して行われ得る。植物育種技術の考察については、Poehlman (1995) Breeding Field Crops. AVI Publication Co., Westport Conn, 4th Editを参照のこと。戻し交配法は、植物中に遺伝子を導入するために使用され得る。この技術および植物中に形質を導入するためのその他の植物育種方法論の説明は、Poehlman、前掲およびPlant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988)などの参考文献中に見い出され得る。通常の戻し交雑プロトコールでは、対象とする元の変種（反復親）を、導入されるべき対象とする単一遺伝子を保持する第２の変種（非反復親）と交配する。次いで、この交雑から得られた後代を、反復親と再度交雑し、非反復親に由来する単一の導入された遺伝子に加えて、反復親の所望の形態的および生理学的特徴の本質的にすべてが、変換された植物において回収される植物が得られるまでこのプロセスを反復する。
【０２２９】
したがって、本開示は、本明細書における方法に従って製造されたジハプロイド植物を使用する交雑を含むトウモロコシ植物体を作製するプロセスを提供する。例えば、本開示は、ドナーポリヌクレオチドを含有するジハプロイド植物（本明細書において開示される方法に従って作製された）を、第２の遺伝子的に異なる植物（例えば、近交系親）と交雑し、得られた後代種子を収穫し、リアルタイムＰＣＲなどの方法を使用して組み込まれたドナーポリヌクレオチドを検出して接合状態を調べることによって後代種子を製造するための方法を含む。
【０２３０】
トウモロコシ植物は、（ｉ）導入遺伝子を含むドナーポリヌクレオチドを含有する系統の種子から成長した第１の親のトウモロコシ植物体を、第２の親のトウモロコシ植物体と有性交雑し、それによって、複数の第１の後代植物を製造するステップと、（ｉｉ）次いで、導入遺伝子を含むドナーポリヌクレオチドを含有する第１の後代植物を選択するステップと、（ｉｉｉ）第１の後代植物を自殖させ、それによって、複数の第２の後代植物を製造するステップと、次いで、第２の後代植物から、農学的形質を含むドナーポリヌクレオチド含有する植物を選択するステップとによって育種され得る。これらのステップは、（ｉｖ）第１の後代植物または第２の後代植物を、第２の親のトウモロコシ植物体または第３の親のトウモロコシ植物体と戻し交雑するステップをさらに含み得る。
【０２３１】
本開示のトウモロコシ植物体が、別の育種植物体と交雑されて、後代またはハイブリッドが得られる場合には、元親は、ハイブリッドにおいて基本的に同一の特徴を有する母系または父系植物のいずれかとして働き得る。時折、母系的に遺伝された特徴は、雌性として使用する親の決定に応じて異なって発現し得る。しかし、最適な種子の大きさおよび品質または雄穂除去の容易さなどの増大された種子収量および好ましい製造特徴のために、親植物の一方が母系植物として好ましいことが多い。いくつかの植物は、より堅固な穂外皮を生成し、例えば、腐敗によるより多くの損失につながり、または穂外皮が堅固であり、トウモロコシの毛が完全に先端から押し出ることができず、完全な受粉を妨げ、その結果より低い種子収量となることもある。トウモロコシの毛の形成の遅延があり、これが、親の近交系の対の生殖周期のタイミングに有害に影響を及ぼすことがあり得る。種皮特徴は、一方の植物において好ましいものであり得、これは、ハイブリッド種子製品の有効期間に影響を及ぼし得る。花粉が飛散し得、一方の植物によってより良好であり、したがって、その植物をより好ましい雄性親にし得る。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、雌性親植物を雄性ジハプロイド親植物と「交雑する」という第１のステップは、第１のトウモロコシ植物体および第２の別個の雌性近交系トウモロコシ植物体の種子を、好ましくは、受粉する近さに植えることを含む。いくつかの実施形態では、雄性および雌性親を交雑するために、人工授粉が使用されることもある。その他の実施形態では、雄性および雌性親を交雑するために使用される人工授粉は、ツールを用いて、または機械的手段によって実施される。さらなる実施形態では、雄性および雌性親を交雑するために使用される人工授粉は、雄性植物から花粉を得ることおよび花粉を雌性植物の柱頭に適用すること（花粉管によって）実施される。
【０２３３】
さらなるステップは、雌性親植物および花をつける雄性親植物の種子を栽培することまたは成長させることを含む。親植物が成熟期のタイミングが異なる場合には、適当な切れ目を得るために、すなわち、雌性と指定された親トウモロコシ植物体上のトウモロコシの毛が花粉を受容性である時間に、雄性と指定された親トウモロコシ植物体から花粉を入手することを確実にするために、技術が使用され得る。所望の切れ目を得るために使用され得る方法として、より速く成熟する種子の植え付けを遅延させること、より速く成熟する植物の頂葉を切断することもしくは燃やすこと（植物を死滅させずに）などのより速く成熟する植物体の開花を遅延させること、または発芽および成長を加速するよう設計されたフィルムでより遅く成熟する植物を覆うこともしくはトウモロコシの毛を露出させるよう若い穂シュートの先端を切断することなどによってより遅く成熟する植物の開花をスピードアップさせることとが挙げられる。
【０２３４】
特定の実施形態では、雌性親植物および雄性親植物は、栽培者によって適当と考えられる１種または複数の農業用化学物質を用いて処理される。
【０２３５】
さらなるステップは、花粉を受け取った植物の穂から成熟付近または成熟で種子を収穫することを含む。特定の実施形態では、種子は雌性親植物から収穫され、望ましい場合には、収穫された種子は、後代または第１世代（Ｆ１）ハイブリッドトウモロコシ植物体を生成するよう成長され得る。
【０２３６】
さらに別のステップは、乾燥させることならびに、種子の処理、サイズ分け（または等級づけ）および穀物または飼料の製造のために栽培者に販売するためのパッケージングを含めた、種子を条件付けすることを含む。近交系種子と同様に、ハイブリッド種子を、種子および実生を、悪条件に曝された場合により頑健にそれから成長させる組成物を用いて処理することが望ましいことがある。得られた後代またはハイブリッド種子は、穀物および飼料の製造のために、育種または種子製造のためではなく栽培者に販売され得る。
【０２３７】
さらに、本開示は、雌性親植物で製造された収穫された種子を成長させることによって製造される後代トウモロコシ植物体ならびに後代トウモロコシ植物体によって製造された穀物を提供する。
【０２３８】
その後の実施形態では、本開示は、所望の形質を後代植物中に付与するドナーポリヌクレオチドを導入する方法を提供する。実施形態の一態様では、所望の形質は、殺虫剤耐性形質、除草剤許容性形質、疾患抵抗性形質、収量増大形質、栄養価形質、農学的増大形質およびそれらの組合せを含む群から選択される。所望の形質のその他の例として、例えば、植物のステアリン酸含量を増大するために、植物をステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素のアンチセンス遺伝子を用いて形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝が挙げられる。Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624 (1992)を参照のこと。フィチン酸含量の減少；（ｉ）フィチン酸をコードする遺伝子の導入は、フィチン酸の分解を増強し、形質転換された植物により多くの遊離リン酸を付加する。例えば、クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示については、Van Hartingsveldt et al., Gene 127: 87 (1993)を参照のこと。（ｉｉ）フィチン酸含量を低下させる遺伝子が導入され得る。トウモロコシでは、これは、例えば、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体に関与する単一の対立遺伝子と関連しているＤＮＡをクローニングすること、次いで、再導入することによって達成され得る。Raboy et al., Maydica 35: 383 (1990)を参照のこと。（ｉｉｉ）例えば、植物をデンプンの分岐パターンを変更する酵素をコードする遺伝子を用いて形質転換することによって達成される、修飾された炭水化物組成物。Shiroza et al., J. Bacteriol. 170: 810 (1988)（ミュータンス菌フルクトース転移酵素遺伝子のヌクレオチド配列）、Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet. 200: 220 (1985)（枯草菌（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Pen et al., Bio/Technology 10: 292 (1992)（バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の製造）、Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21: 515 (1993)（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Sogaard et al., J. Biol. Chem. 268: 22480 (1993)（オオムギα−アミラーゼ遺伝子の部位特異的突然変異誘発）およびFisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993)（トウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ）を参照のこと。望まれる可能性のある特徴のさらなる例として、より多い収量、より良好な柄、より良好な根、作物成熟までの時間の低減、より良好な農学的品質、より高い栄養価、より高いデンプン抽出性またはデンプン発酵性、殺虫剤、除草剤、害虫、熱および渇水および疾患に対する耐性および／または許容性ならびに発芽時間、苗立ち、成長速度、成熟度および穀粒の大きさの均一性が挙げられる。
【０２３９】
農学的形質を含むドナーポリヌクレオチドを含有するトウモロコシ種子を含むトウモロコシ作物またはその後代は、接合状態を調べるためのリアルタイムＰＣＲアッセイを含めた方法を使用して迅速に検出され、次いで、植えられ得る。接合状態を調べるためのリアルタイムＰＣＲアッセイを含む方法は、このプロセスの効率を改善し得る。
【０２４０】
接合状態を調べるためのリアルタイムＰＣＲアッセイを含む本方法は、例えば、トウモロコシ育種プログラムならびに特に、トウモロコシ種子の商業的製造のための品質管理において有用である。この方法はまた、製品登録およびプロダクト・スチュワードシップに恩恵をもたらす。この方法は、育種遺伝子移入戦略の加速のために使用され得る。本開示の検出技術は、農学的形質を後代に付与しようとして、事象を含有する親植物が別の植物系統と交雑された後に、どの後代植物が、農学的形質を含むドナーポリヌクレオチドを含むかを調べるために、植物育種遺伝子移入とともに特に有用である。接合状態を調べるためのリアルタイムＰＣＲアッセイを含む開示される方法は、トウモロコシ育種遺伝子移入プログラムならびに特に、商業化されたトウモロコシ種子のための品質管理に恩恵をもたらす。
【０２４１】
本開示は、マーカー関連育種（ＭＡＢ）法のために使用され得る。本開示は、農学的形質を含むドナーポリヌクレオチドン近接している遺伝子連結しているマーカーを同定するその他の方法と組み合わせて使用され得る（ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲなど）。接合状態を調べるためのリアルタイムＰＣＲアッセイを含む方法によって、植物育種交雑の後代における農学的形質を含むドナーポリヌクレオチドの追跡が可能となる。本開示の接合状態を調べるためのリアルタイムＰＣＲアッセイを含む方法は、農学的形質を含むドナーポリヌクレオチドを含有する任意のトウモロコシ変種を同定するために使用され得る。
【０２４２】
本明細書に記載される実施例および実施形態は、単に例示目的であって、それを考慮して種々の修飾または変更は、当業者に示唆され、本願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとするということは理解されなければならない。これらの実施例は、制限と解釈されてはならない。
【実施例１】
【０２４３】
小胞子由来ハプロイドカルスの作製
トウモロコシ(Zea mays)遺伝子型１３９／３９−０５（米国特許第５，３０６，８６４号明細書）の発芽前の雄花穂を、小胞子が発達の初期二核性段階にある時点（葯が約３ｍｍ長、明るい光沢のある黄色）で、温室で成長させたトウモロコシ植物体（約５〜６週齢）から収穫した。雄花の穂を湿ったペーパータオルおよびアルミホイルで包み、８℃に設定したインキュベーター中に７〜１４日間入れた。表面滅菌（０．０８％ｖ／ｖ  Ｃｈｌｏｒｏｘ（商標）中で１５分と、それに続く、滅菌水すすぎ）後、葯を無菌的に単離し、６ウェルディッシュ中の、液体「葯培養培地」（ｐＨ５．８に調整した、Ｎ６塩およびビタミン、６０ｇ／Ｌスクロース、５ｇ／Ｌ活性炭、５００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、０．１ｍｇ／Ｌ  ＴＩＢＡ）の表面上に、ウェルあたり６ｍＬ培地中６０個葯の密度で置き、暗所、２８℃でインキュベートした。１４〜２８日の間に現れる小胞子由来胚様構造を「カルス培地」（ｐＨ５．８に調整した、ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌスクロース、７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン、５００ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、１５ｍｇ／Ｌ  硝酸銀、３．３ｍｇ／Ｌジカンバおよび２．５ｇ／Ｌ  Ｇｅｌｒｉｔｅ（商標））に移した。１４日毎に結節状の胚発生カルスを、新鮮な「カルス培地」に継代培養して大きくし、その後、倍数性決定および形質転換した。
【０２４４】
前記のものは、トウモロコシ小胞子由来アンドロゲン性形質転換受容性ハプロイド組織の一例を提供し、これは、ハプロイドトウモロコシゲノムを修飾する開示される方法において使用され得る。
【実施例２】
【０２４５】
カルスの倍数性決定
細胞倍数性レベルを調べるために、実施例１で作製した１ｇのカルス組織を、滅菌Ｐｅｔｒｉ（商標）ディッシュ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に移した。「ＭＭＧ培地」（４ｍＭ  ＭＥＳ  ［ｐＨ６．０］、０．６Ｍマンニトール、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）および０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）とともに、１〜２ｍＬの濾過した氷冷Ｇａｉｌｂｒａｉｔｈバッファー（０．０１Ｍ  ＭｇＳＯ４、０．００５Ｍ  ＫＣｌ、０．０００５Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍＬ  ＤＴＴ）の存在下で、カルス組織を片刃カミソリを用いて切り刻むことによって核を放出させた。Ｐｅｔｒｉ（商標）ディッシュをさらに２ｍＬのバッファーを用いてすすぎ、これを最初の核抽出物と組み合わせて、約５ｍＬの最終スラリー容量を作製した。次いで、粗核抽出物を、ガラス組織ホモジナイザーに移し、プランジャーを上下に２、３回ポンピングすることによって穏やかにホモジナイズした。次いで、ホモジネートを茶漉し器を通して濾過し、得られた濾液を、４０μｍ  Ｓｔｅｒｉ−ｆｌｉｐ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）によって吸引して、核を単離した。単離した核を、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を用い、１０μＬ／２００μＬサンプルを使用して染色し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｑｕａｎｔａ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。各サンプルについて、少なくとも５０，０００個の核を集め、７５μＬのサンプルを対数目盛り表示を使用する分析のために血球計算器に供給した。フローサイトメーター結果は、大きなハプロイド（Ｇ０／Ｇ１）ピークおよび小さい２倍体（Ｇ２）２倍体ピークを示した。結果から、実施例１に従って作製されたカルス組織は、ハプロイドトウモロコシゲノムを修飾する開示される方法において使用するのに適しているハプロイド細胞からなっていたと確認された。
【実施例３】
【０２４６】
ハプロイドカルスから単離されたプロトプラストにおけるターゲッティングされたゲノム修飾のための構築物
ターゲッティングされたゲノム修飾のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）構築物、ｐＤＡＢ１１１８７９（図１に表される）を使用した。ＺＦＮの発現は、トウモロコシｕｂｉ１プロモーターによって駆動され、トウモロコシｐｅｒ５  ３’ＵＴＲで終結された。この発現カセットは、単一コーディング領域によってコードされ、発現される２つのジンクフィンガー単量体ドメイン（ｚｍＰＰＬ＿１３６０−ｒ２３ａ１およびｚｍＰＰＬ＿１３６０−３０ａ１）を含む「Ｔ２Ａ」構造を含有していた。発現された転写物は、翻訳の間に第１のポリペプチドを放出し、さらなる翻訳の際に、第１および第２のポリペプチドを等モル量で生成するよう設計されているリボソーマルスタッターを導入するためにＴ２Ａスタッターシグナル（Mattion et al., 1996, J. Virol., 70:8124-7）を含んでいた。核にターゲッティングするために両ＺＦ単量体中にｏｐａｑｕｅ２核局在性配列（ＮＬＳ）を含めた。２つのＮＬＳ−ＺＦドメイン融合物の各々は、表２に示されるトウモロコシゲノムの独特の配列に対する結合特異性を有する。ジンクフィンガー単量体はまた、単子葉植物が好むコドン表を使用してコドンバイアスをかけられたＦｏｋＩヌクレアーゼ機能的ドメインを含んでいた（Kim et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:1156-1160）。
【０２４７】
【表２】
2017513506.tif 000005
【０２４８】
ＺＦＮ構築物による部位特異的二本鎖切断およびその後のＤＮＡ修復によるハプロイドカルス由来プロトプラストへのターゲッティングされたＤＮＡ組込みのために、ドナーポリヌクレオチド構築物、ｐＤＡＢ１１１８４５（図２に表される）を使用した。この構築物は、２つのＺＦ単量体、ｚｍＰＰＬ＿１３６０−ｒ２３ａ１およびｚｍＰＰＬ＿１３６０−３０ａ１のＤＮＡ結合配列を含有する。さらに、この構築物は、イン／アウトＰＣＲによるターゲッティングされた挿入の下流分析、すなわち、プライマー部位設計において使用するための、「ＵＺＩ」と呼ばれる１１０ｂｐの配列を含有する。このプラスミドの、ｐＤＡＢ１１１８７９（ＺＦＮ構築物）との同時送達は、ＺＦＮ発現時に、独特のゲノム配列での、およびドナー構築物、ｐＤＡＢ１１８８４５内での切断をもたらし、これは、非相同末端結合ＤＮＡ修復および組換えによる、ゲノム切断部位へのドナー構築物のターゲッティングされた組込みを促進する。
【０２４９】
前記のものは、ハプロイドトウモロコシゲノムを修飾する開示される方法において使用できる構築物の例：部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼの送達のためにｐＤＡＢ１１１８７９およびドナーポリヌクレオチドのターゲッティングされた組込みのためにｐＤＡＢ１１１８４５を提供する。
【実施例４】
【０２５０】
ハプロイドカルスから単離されたプロトプラストにおけるターゲッティングされたゲノム修飾
ハプロイドカルス（約５グラム）を、滅菌Ｐｅｔｒｉ（商標）ディッシュに移し、５ｍＬの「ＭＭＧ培地」を添加した。片刃カミソリを使用して、クリーム状のスラリーが得られるまでカルスを小片に薄くスライスした。滅菌スパーテルを使用して、スラリーを滅菌５０ｍＬコニカルチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、２０ｍＬの「酵素溶液」（「ＭＭＧ培地」に溶解した、３％Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（商標）［Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ１０、Ｙａｋｕｌｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｊａｐａｎ］、０．３％Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ（商標）［ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ］）。チューブをＰａｒａｆｉｌｍ（商標）で包み、Ｖａｒｉ−Ｍｉｘ（商標）プラットフォームロッカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上に置き、暗所、２４℃で約１６〜１８時間の激しい振動で設定した。滅菌５０ｍＬコニカルチューブ中で、「酵素溶液」を１００μｍのセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を通してゆっくり濾過した。１００μｍのセルストレーナーを通して１０ｍＬの「Ｗ５＋培地」（１．８６ｍＭ  ＭＥＳ［ｐＨ６．０］、０．５ｍＬの０．２Ｍ  ＭＥＳ［ｐＨ６．０］、１９２ｍＭ  ＮａＣｌ、６．７ｍＬの１．５４Ｍ  ＮａＣｌ、１５４ｍＭ  ＣａＣｌ２、８．３ｍＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＬの０．２Ｍ  ＫＣｌおよび３７ｍＬの水）をピペッティングすることによってセルストレーナー（細胞を含む）をすすいだ。このステップを７０μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を使用して反復して、より小さい細片を捕らえた。次いで、濾液を４０μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を使用して篩にかけ、再度、１０ｍＬの「Ｗ５＋培地」を用いてすすぎ、その結果、４０ｍＬの最終濾液容量とした。次いで、チューブを穏やかに反転させ、８ｍＬの「重い勾配溶液」（５００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍＭ  ＭＥＳ［ｐＨ６．０］）を、チューブ中のプロトプラスト／「酵素溶液」／「Ｗ５＋」混合物の真下の濾液中にゆっくりと加えた。次いで、スイングアームバケットローター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）を用いてチューブを１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、プロトプラスト層（「重い勾配溶液」と「酵素溶液」／「Ｗ５＋培地」の間に見える）を、１０ｍＬの狭口径ピペットチップを使用してゆっくりと採取し、滅菌５０ｍＬコニカルチューブ中に入れた。次いで、チューブを「Ｗ５＋培地」を使用して３５ｍＬの容量にし、数回ゆっくりと反転し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、ペレットを乱さずに上清を除去した。次いで、プロトプラストを含有するペレットを５ｍＬの「ＭＭＧ培地」に再懸濁した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｑｕａｎｔａ（商標）フローサイトメーターを使用して、最初に、５ｍＬの「ＭＭＧ培地」にペレットを再懸濁し、次いで、９６ウェルプレートにおいて２７０μＬの「ＭＭＧ培地」に３０μＬを添加することによってｍＬあたりのプロトプラストの濃度を決定した。
【０２５１】
トランスフェクションのために、「ＭＭＧ培地」を使用して１ｍＬあたり１６７万個にプロトプラストを希釈した。３００μＬの各サンプル（約５００，０００個プロトプラスト）を、滅菌２ｍＬチューブ中に移した。各チューブに、合計４０μｇのプラスミドＤＮＡ（３６μｇのｐＤＡＢ１１１８４５［ドナーポリヌクレオチド］＋４μｇのｐＤＡＢ１１１８７［ＺＦＮをコードするポリヌクレオチド］）を添加し、チューブを反転することによってゆっくりと混合し、室温で５分間インキュベートした。プロトプラスト／ＤＮＡ混合物にＰＥＧ４０００（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をゆっくりと添加し（３００μＬ）、内容物が完全に混合するまでゆっくりと反転した。チューブを、時折、混合するために穏やかに反転しながら、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍＬの「Ｗ５＋培地」をゆっくりと添加し、チューブを５〜１０回穏やかに反転した。次いで、チューブを微小遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを乱さないことを確実にしながら、上清を注意深く除去した。上清を除去すると、各チューブに１ｍＬの「ＷＩ培地」（４ｍＭ  ＭＥＳ［ｐＨ６．０］、１ｍＬの０．２ｍＭ  ＭＥＳ［ｐＨ６．０］、０．６Ｍマンニトール、３０ｍＬの１Ｍマンニトール、２０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＬの０．２Ｍ  ＫＣｌおよび１４ｍＬの水）を添加し、穏やかに反転して、ペレットを再懸濁した。次いで、チューブをアルミホイルで覆って、照明を除去し、一晩のインキュベーションの間横向きに置き、その後、ゲノムＤＮＡを抽出し、ターゲッティングされたゲノム修飾について分析した。
【０２５２】
前記のものは、ターゲッティングされた修飾の開示された方法の一例、例えば、ドナーポリヌクレオチドおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換された小胞子由来カルスから単離されたプロトプラスト中へのハプロイドトウモロコシゲノムの部位特異的組込みを実証する。
【実施例５】
【０２５３】
ターゲッティングされたゲノム修飾を用いるハプロイドプロトプラストの分子分析
非対称ネステッドイン−アウトＰＣＲ（ＡＮＩＯ）米国特許仮出願第６１／８７３７１９号）を使用して、実施例４のトランスフェクトされたプロトプラストから抽出されたゲノムＤＮＡにおいてターゲッティングされたゲノム修飾を検出した。検出に使用されるプライマー対のセットは、表３に示されている。１つのプライマー対を、ゲノム配列と特異的に結合するよう設計し、その他のプライマー対をドナーポリヌクレオチドＤＮＡ配列と結合するよう設計した。最初の変性後、増幅プログラムは、ＥＸ−ＴＡＱ  ＨＳ（商標）ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用する、９８℃で１２秒間および６６℃で３０秒間の１５サイクル、次いで、７２℃で１０分間および最後の４℃での保持を含んでいた。次いで、最初のＰＣＲ産物を、ネステッド第２ＰＣＲ反応に使用した。第１ＰＣＲ産物の最初の変性後、増幅プログラムは、９８℃で１２秒間、６６℃で３０秒間、次いで、６８℃で１分間の３０サイクル、次いで、７２℃で１０分間と、それに続く、最後の４℃での保持を含んでいた。ＰＣＲ産物を、１％Ｅ−ｇｅｌ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用するゲル電気泳動によって分離した。電気泳動の結果は、ＰＣＲ産物の予測されたゲル断片の大きさ（５’および３’結合について、それぞれ、７００および１０５３ｂｐ）をもたらし、これは、ターゲッティングされた挿入の存在を示した。したがって、前記のものは、開示された方法が、トウモロコシハプロイドゲノムにおいてドナーポリヌクレオチド導入遺伝子のターゲッティングされた挿入をもたらしたことを示す。
【０２５４】
【表３】
2017513506.tif 000006
【０２５５】
前記のものは、トウモロコシ小胞子由来ハプロイド組織のゲノム中へのドナーポリヌクレオチドのターゲッティングされた組込みを確認するための開示される方法の一例を実証する。
【実施例６】
【０２５６】
ハプロイドカルスのターゲッティングされたゲノム修飾のための構築物
ハプロイドカルスへのターゲッティングされた導入遺伝子組込みのために、ドナー構築物、トウモロコシゲノム中の独特のｚｍＰＰＬ＿１３６０−ｒ２３ａ１およびｚｍＰＰＬ＿１３６０−３０ａ１認識配列のそれぞれの両端に位置するものに相同な約５００ｂｐの配列を含有するｐＤＡＢ１１８７８３を使用した（図３）。これらの配列は、「相同性アーム」と呼ばれる。このドナー構築物はまた、ハロキシホップ含有培地でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択のためにａａｄ−１発現カセットを含有する。ａａｄ−１遺伝子発現は、トウモロコシｕｂｉ１プロモーターによって制御され、トウモロコシｐｅｒ５  ３’ＵＴＲによって終結される。この構築物の、ｐＤＡＢ１１１８７９（ＺＦＮ構築物）との同時送達は、ＺＦＮ発現の結果として独特のゲノム配列で二本鎖ゲノムＤＮＡ切断をもたらす。「相同性アーム」は、相同性組換え修復の鋳型を提供し、それによって、ａａｄ−１発現カセットをゲノム切断部位中に組み込む。
【０２５７】
前記のものは、選択マーカー導入遺伝子、ａａｄ１を含み、導入遺伝子のハプロイドゲノムへのターゲッティングされた組込みによって、ハプロイドトウモロコシゲノムを修飾する開示される方法において使用するのに適しているドナーポリヌクレオチド（ｐＤＡＢ１１８７８３）の例を提供する。
【実施例７】
【０２５８】
ハプロイドカルスにおけるターゲッティングされたゲノム修飾
照射の３日前に、ハプロイドカルスを、使い捨てのメスを使用して約１〜２ｍｍの小片に刻み、新鮮な「カルス培地」の表面に置き、暗所、２８℃でインキュベートした。照射の約４時間前に、カルス片を、「浸透圧培地」（各４５．５ｇ／Ｌのソルビトールおよびマンニトールを添加した「カルス培地」）を含有する１００ｘ１５ｍｍ  Ｐｅｔｒｉ（商標）ディッシュの中心の１ｃｍの直径の円内に配置し、暗所、２８℃でインキュベートした。２．５ＭのＣａＣｌ２および０．１Ｍのスペルミジンを用いて９００ｐｓｉで１５０μｇの０．６μ金の表面に沈殿させた、合計０．５μｇのＤＮＡ（ｐＤＡＢ１１１８７９［ＺＦＮ］のみまたはｐＤＡＢ１１８７８３［ドナー］およびｐＤＡＢ１１１８７９［ＺＦＮ］の１０：１の組合せのいずれか）およびＰＤＳ−１０００  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ（商標）（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用する６ｃｍの飛行距離を用いてカルスを照射した。
【０２５９】
前記のものは、ＺＦＮおよびドナーポリヌクレオドを用いる小胞子由来ハプロイドカルスの微粒子銃によるハプロイドトウモロコシゲノムのターゲッティングされた修飾のための開示される方法の一例を実証する。
【実施例８】
【０２６０】
ターゲッティングされたゲノム修飾を有するハプロイドカルスの分子分析
実施例７において微粒子銃によってｐＤＡＢ１１１８７９（ＺＦＮ）のみを用いて形質転換されたカルス組織のサンプルを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商標）を製造業者の仕様書に従って使用するゲノムＤＮＡ抽出のために凍結乾燥した。ゲノムＤＮＡを２００μＬの水に再懸濁し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）によって濃度を調べた。０．８％アガロースＥ−ｇｅｌｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にすべてのサンプルを流すことによってＤＮＡの完全性を推定した。ＰＣＲ増幅のためにすべてのサンプルを正規化して（２５ｎｇ／μＬ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）由来のシステムを使用するシーケンシングのためにアンプリコンを作製した。
【０２６１】
分取ＰＣＲのために、各ｒｅｐに由来する５μＬをプールし、２４μＬの反応物中、０．２μＭの適当なバーコード付加プライマー、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２５ｎｇの鋳型ゲノムＤＮＡを使用して、各鋳型について５個体の小規模ＰＣＲ反応を実施した。サイクリングパラメータは、９５℃での最初の変性（５分）と、それに続く、変性（９５℃、１５秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長（６８℃、１分）の３５サイクルおよび最終伸長（７２℃、７分）を含んでいた。ＰＣＲ産物を一緒にプールし、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）ゲル抽出／精製キットを使用して４％アガロースゲルでゲル精製した。ゲル精製したアンプリコンの濃度を調べ、ＺＦＮターゲッティングされたものおよび対応する野生型対照からおよそ２００ｎｇのバーコード付加アンプリコンをプールすることによってＰＣＲアンプリコンサンプルを調製した（表４）。
【０２６２】
【表４】
2017513506.tif 000007
【０２６３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングを実施し、シーケンス分析スクリプトを使用して分析した。低クオリティーシーケンス（クオリティースコアカットオフ＜５を有するシーケンス）をフィルターにかけて除去し、残りのシーケンスをバーコードに従って解析した。次いで、バーコードディレクトリを参照シーケンスを用いてアラインし、挿入および／または欠失についてスコア化した。切断活性を、エラープローンＮＨＥＪ修復に起因する挿入および／または欠失を用いて高クオリティーシーケンスの関数として検出した。得られた欠失および付加を示すよう、変更された配列の代表的なセット（配列番号３３〜配列番号４５）を、ゲノムＤＮＡ標的配列（配列番号３２）に対するアラインメントとして提供する（図４）。頻度の概要は、表５に示されている。
【０２６４】
【表５】
2017513506.tif 000008
【０２６５】
したがって、前記のものは、開示される方法が、トウモロコシハプロイドゲノムのＰＰＬ１遺伝子座でターゲッティングされた突然変異誘発をもたらしたことを示す。前記のものはまた、ハプロイドゲノムのターゲッティングされた突然変異誘発を確認するための開示される方法の一例を実証する。
【実施例９】
【０２６６】
ハプロイドカルスの染色体倍加、選択および植物再生
ｐＤＡＢ１１８７８３（ドナー）およびｐＤＡＢ１１１８７９（ＺＦＮ）を同時照射した実施例７から得たカルスを、翌朝、新鮮な「カルス培地」を含有する１００ｘ２５Ｐｅｔｒｉ（商標）ディッシュの表面に置いた濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ４番）の表面に移し、１ｍＬの０．０２５％コルヒチン溶液を用いて浸漬し、暗所、２８℃でインキュベートした。４８時間後、１００μセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ３５２３６０）を使用し、４ｍＬの液体「カルス培地」を用いてコルヒチン処理カルスをすすぎ、滅菌濾紙上で吸い取り乾燥させ、新鮮な「カルス培地」を含有する１００ｘ２０ｍｍ  Ｐｅｔｒｉ（商標）ディッシュに移した。暗所、２８℃でさらに４日後（照射後８日）、カルスの２倍加ハプロイド性をフローサイトメーターによって確認し、その結果が図５に示されている。次いで、「選択培地」（１００μＭハロキシホップ（商標）を有する「カルス培地」）にカルスを移した。
【０２６７】
「選択培地」で１４日後、カルスをさらなる１４日間、新鮮な「選択培地」に移し、２８℃で微光中に置いた。「選択培地」で合計４週間後（照射から５週間）、カルスを「プレ再生培地」（ｐＨ５．８に調整した、ＭＳ塩およびビタミン、４５ｇ／Ｌスクロース、３５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン、２５０ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、２．５ｍｇ／Ｌ  ＡＢＡ、１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、０．５ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ硝酸銀、２．５ｇ／Ｌ  Ｇｅｌｒｉｔｅ（商標）および１００μＭハロキシホップ）を含有する１００ｘ２５ｍｍ  Ｐｅｔｒｉ（商標）ディッシュに移し、２８℃で微光中に置いた。７日後、カルスを「再生培地」（ｐＨ５．８に調整した、ｐＤＡＢ１１８８７３＋ｐＤＡＢ１１１８７９］のための、ＭＳ塩およびビタミン、６０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、２．５ｇ／Ｌ  Ｇｅｌｒｉｔｅ（商標）および１００μＭ  Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ（商標））を含有するＰｈｙｔａＴｒａｙ（商標）ＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）に移し、２８℃、明所（１６０μＭ）に置いた。１４〜２１日後、シュートを「シュート伸長培地」（ｐＨ５．８に調整した、ＭＳ塩、Ｎ６ビタミン、３０ｇ／Ｌスクロース、５００ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５．５ｇ／Ｌ寒天および１００μＭ  Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ（商標））に移し、２８℃、明所（１９０μＭ）に置いた。
【０２６８】
発根した植物を、Ｐｒｏ−Ｍｉｘ  ＢＸ（商標）（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｔｅｃｈ；Ｒｉｖｉｅｒｅ−ｄｕ−Ｌｏｕｐ、Ｃａｎａｄａ）を含有する１０ｃｍのプラスチックポットに移植し、成長チャンバー（Ｃｏｎｖｉｒｏｎ；Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｃａｎａｄａ）中に入れ、１６／８時間光周期および２７／２４℃の温度を用いた。次いで、植物を、９５％Ｐｒｏ−Ｍｉｘ  ＢＸ（商標）および５％粘度／ローム土壌の混合物を含有する５ガロンのポットに移植し、温室に移し、金属ハロゲン化物および高圧ナトリウムランプによって補助照明を提供し、１６／８時間光周期および３０／２０℃の温度を用いた。次いで、植物を成熟まで成長させ、自家受粉させた。
【０２６９】
前記のものは、ゲノム中に組み込まれたターゲッティングされた導入遺伝子を含む小胞子由来ハプロイドカルスから２倍加されたハプロイド植物を再生するための開示される方法の一例を実証する。
【実施例１０】
【０２７０】
２倍加ハプロイドトランスジェニック植物の分子分析
実施例９の２倍加ハプロイド植物の組織サンプルを、９６ウェルコレクションプレート中に集め、２日間凍結乾燥した。Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ  ２０１０（商標）（ＳＰＥＸサンプル調製）およびステンレス鋼ビーズを用いて組織マセレーションを実施した。組織マセレーション後、ゲノムＤＮＡを、ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ  ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）を製造業者によって提案されたプロトコールに従って使用してハイスループット形式で単離した。ゲノムＤＮＡをＱｕａｎｔ−ＩＴ  Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）によって定量化した。Ｂｉｏｍｅｋ  ＮＸＰ（商標）自動化リキッドハンドラー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；  Ｐａｓａｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して、加水分解プローブアッセイのために定量化したゲノムＤＮＡを２ｎｇ／μＬに調整した。
【０２７１】
ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡ）を使用するリアルタイムＰＣＲによって、加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子コピー数を決定を実施した。アッセイは、ａａｄ−１および内部参照遺伝子、インベルターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１６１２３．１）のためにＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブ設計ソフトウェア２．０を使用して設計した。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ容量マルチプレックス反応物中、１Ｘ最終濃度で調製した（表６）。ａａｄ−１／インベルターゼのために６０℃で４０秒間の延長を用いる２ステップ増幅反応を実施し、蛍光獲得した。リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対定量モジュールを使用するＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して実施し、ΔΔＣｔ法に基づいている。このために、各実施において、単一コピー標準物質からのｇＤＮＡのサンプルおよび既知２コピーチェックを含めた。
【０２７２】
【表６】
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【０２７３】
個々の「イン−アウト」ＰＣＲ反応を使用してターゲッティングされた導入遺伝子が挿入された事象の検出を実施した。プライマー対、それぞれの両端に位置するゲノム配列に対して特異的な一方と、検出に使用されたドナー構築物に対して特異的なもう一方が、表７に示されている。最初の変性後、増幅プログラムは、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分の３５サイクルと、それに続く７２℃で１０分間を含んでおり、その後、最後に、４℃で維持した。ＰＣＲ反応は、ＥＸ−ＴＡＱ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）を使用した。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルを使用して分離し、同定した。
【０２７４】
【表７】
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【０２７５】
ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するリアルタイムＰＣＲによる加水分解プローブアッセイによって切断部位のＺＦＮ媒介性破壊を調べた。アッセイは、ＺＦＮ結合部位および内部参照インベルターゼのそれぞれの両端に位置する配列に対してプライマーおよびプローブアニールを有するよう設計した。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒミックスを、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ容量のマルチプレックス反応物中、１Ｘ最終濃度で調製した（表８）。６０℃で３０秒間の延長を用いる２ステップ増幅反応を実施し、蛍光獲得した。リアルタイムＰＣＲデータの分析を、相対定量モジュールを使用し、標的を参照比に対して比較するＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を用いて実施した。非トランスジェニック対照植物から得たゲノムＤＮＡのサンプルを、各実施に含めた。
【０２７６】
【表８】
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【０２７７】
「イン−アウト」ＰＣＲおよび遺伝子座破壊ｑＰＣＲアッセイによって決定されたようなターゲッティングされたａａｄ−１構築物を含有していた２倍加ハプロイドトウモロコシ植物体を、サザンブロット分析のために選択した。サザンブロットを作製し、これまでに記載されるようにプロービングした。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して３７℃で一晩サンプルを消化した。「相同性アーム」の外側のゲノム配列と結合する、表９に示されるプライマーを使用してプローブを作製した。得られたサザンブロットによって、トランスジェニック事象は、ターゲッティングされたａａｄ−１構築物の全長コピーを含有していることが確認された。
【０２７８】
【表９】
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【０２７９】
前記のものは、２倍加されたハプロイド植物（小胞子由来ハプロイドカルスから再生した）が、ターゲッティングされた導入遺伝子組込みを示したことを確認するための開示される方法のいくつかの例を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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