(57)【要約】寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託されたBacillus subtilis株、および、真菌の侵襲および細菌の侵襲から、植物、植物の一部分、植物の根、もしくは植物の種子を、保護する、または植物を処理する方法であり、当該方法は、寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株を含んでいる組成物、または、寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株の培養液から得られた上清、または、寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託されたBacillus subtilis株から単離された抽出物を、上記植物、植物の一部分、植物の根、または植物の種子に適用することを含んでいる、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託されたBacillus subtilis株。
【請求項２】
真菌の侵襲、および細菌の侵襲から、植物、植物の一部分、植物の根、または植物の種子を、保護する方法、または処理する方法であり、
−寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株を含んでいる組成物、または
−寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株の培養液から得られた上清、または
−寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託されたBacillus subtilis株から単離された抽出物を、
上記植物、植物の一部分、植物の根、または植物の種子に適用することを含んでいる、方法。
【請求項３】
上記真菌の侵襲が、Sclerotineaceae科の一員によって引き起こされることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記真菌の侵襲、または細菌の侵襲が、Erwinia amylovora、Macrophomina phaseolinaおよびBotrytis cinereaによって構成される群から選択された真菌または細菌によって引き起こされることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
上記真菌の侵襲が、上記植物の葉を攻撃する、葉の真菌の病原体によって引き起こされることを特徴とする、請求項２〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記真菌の侵襲が、植物の根を攻撃する、土壌の真菌の病原体によって引き起こされることを特徴とする、請求項２〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
生物農薬または化学農薬が、上記植物、植物の一部分、植物の根、または植物の種子にさらに適用されることを特徴とする、請求項２〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株が、培養液全体として適用されることを特徴とする、請求項２〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株が、上記植物の根を取り囲んでいる上記土壌に適用されることを特徴とする、請求項２〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株が、水和剤、粒剤、水性懸濁液、乳剤またはマイクロカプセル封入として適用されることを特徴とする、請求項２〜９の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、バイオ農薬の分野に属する。より具体的に言うと、この発明は、防除することが困難な、真菌のおよび細菌の植物病害の全般を阻害する、Bacillus subtilisの新規の株、ＣＥＣＴ８２５８に関する。本発明はまた、この新規のBacillus株、およびこの株により生産された代謝産物を、単独および組み合わせの両方で含む、殺真菌性および殺菌性の組成物単独、または、他の化学農薬および生物農薬と組み合わせた組成物に関する。
【０００２】
本発明の背景
先般来、特定の微生物が、植物病害の防除において有用である生物活性を保有することが、知られている。生物農薬を同定すること、および開発することにおいて、プロセスが作られているが、使用中の農薬の大部分は、引き続き合成化合物である。これらの多くは、食品に農薬が残留した結果、多くの消費者が避けたがるだけでなく、非対象の生物、環境、これらの農薬の使用者に対して、好ましからざる副作用も有する。
【０００３】
生物学的防除は、合成の化学殺真菌剤に対して魅力的な代替物を提供する。バイオ農薬は、環境及び使用者に対してより安全であり得、より速く分解することが可能であり、処理された作物上に、化学的に残留するという結果にならないだろう。微生物から開発されたバイオ農薬は、一体化した害虫管理プログラムに対して極めて有用であり、そして、合成化学物質に対する害虫の耐性進化に対抗するための道具として、極めて有用である。さらに、バイオ農薬は、合成農薬よりも、より短い期間の中で、より少ない費用で開発されることが可能である。
【０００４】
先般来、有利な条件下において、培養液中のいくつかの細菌が、乳酸および酢酸、シアン化物、並びに抗生物質のような植物毒性の代謝産物を、生産するということが知られている。生産された代謝産物は、細菌が置かれた環境の状況に依存する。従って、細菌によって生産された二次代謝産物は、環境、および特定の酵素複合体の利用可能性、に依存する。
【０００５】
二次代謝産物は、主要な代謝産物の副産物であり、そして細菌に対して必ずしも必須ではないけれども、細菌の生存を保証するためにいくつかの利点を生み出す場合がある。細菌は、環境の状況によって影響を及ぼされた、細菌の二次代謝産物合成を有している。スクリーニングプログラムにより抗真菌活性を示すBacillus属の株を同定した。これらの株は、ツヴィッターマイシンＡおよび／またはカノサミンを生産することが示され、当該二つの複合抗生物質は、Phytophthora属またはSclerotinia minorによって引き起こされた土壌伝染病、立枯病に対して効果的である。
【０００６】
Handelsmanらの米国特許番号５，０４９，３７９には、ツヴィッターマイシンＡが、アルファルファおよび大豆において、どのように立枯病を軽減するのかが記載されている。B.cereus  ＡＴＣＣ５３５２２と共に種子を被覆した結果、立枯病真菌による感染が軽減された。さらに、B.cereus株に由来する調剤に基づいた芽胞を、大豆種子または大豆種子を取り囲んでいる土壌のいずれかに適用することにより、実地調査において大豆収穫高が改善することを実証された。バイオ農薬を適用する方法は、公知の技術であり、当該技術は、水和剤、乾燥流動剤、活性剤のマイクロカプセル封入、培養物からの抗生物質画分の液体調剤または固形調剤、を含む（例えばRossallの米国特許番号５，０６１，４９５またはHandelsmanの米国特許番号５，０４９，３７９を参照）。
【０００７】
Bacillus subtilisは、拮抗的なバクテリアであり、寄生によって、並びに空間および栄養物に対する競合によって作用するだけでなく、抗生物質の生産を通しても作用する。抗生物質を通して作用する微生物は、一般的に、広範囲の作用、特に広範囲の真菌阻害を有する。このやり方は、他の抗真菌剤の作用機構より、より効果的である。
【０００８】
キュウリ綿腐病を引き起こす土壌カビ菌、Pythium aphanidermatum、の活性は、B.cereus株ＵＷ８５が生産するツヴィッターマイシンを使用して、抑えられることが可能であるということが、開示されている。二つのBacillus株、B.subtilis  ＣＬ２７およびB.pumilus  ＣＬ４５による、抗Botrytis抗生物質および抗Alternaria抗生物質の生産は、報告されている。培養液全体、および無細胞濾液の両方で実証されたインビトロ試験は、BotrytisおよびAlternariaに対して活性があった。Leifertらの米国特許番号５，５９７，５６５は、B.subtilis、B.pumilus、およびB.polymyxaは、ポストハーベスト病を引き起こす真菌を阻害することにおいて、効果的であるということを開示する。Leifertらはまた、無細胞培養濾液において生産された抗生物質の存在、および当該抗生物質の活性を、特定しないが、開示する。
【０００９】
Rossallの米国特許番号５，３４４，６４７は、広範な抗真菌活性を有するB.subtilis株を開示する。当該技術分野における多数の研究者は、Bacillus属およびBacillus subtilisの使用、特に、真菌の植物病原体の生物学的防除剤としての使用を開示しており、当該使用は、収穫後の果実腐敗の防除のための使用を含んでいる。Puseyの米国特許番号５，０４７，２３９は、桃（収穫前）、リンゴ（収穫後）、およびブドウ（収穫後）において、赤腐れ、灰色の糸状菌、および苦腐れ病を阻害するための、B.subtilis Ｂ−３の使用を開示する。Leifertらの米国特許番号５，７８０，０８０は、キャベツにおいて、ポストハーベスト病を引き起こす、真菌Botrytis cinereaおよびAlternaria brassicicolaの生物の成長を阻害するための、B.subtilis  ＮＣＩＭＢ４０４９１の使用を開示する。Heinsらの米国特許番号６，２０３，２２８は、殺虫活性、抗真菌活性、および抗細菌活性を示すB.subtilis  ＡＱ７１３を開示する。Heinsらはまた、この株によって生産された抗細菌剤化合物および抗真菌剤化合物について議論する。Lehmanらの米国特許番号６，２４５，５５１は、抗真菌活性を示すが、抗細菌活性を示さない、新規のBacillus pumilus株を開示する。
【００１０】
Liuらの米国特許番号５，４０３，５８３は、Bacillus megaterium  ＡＴＣＣ５５０００、および、真菌の植物病原体、Rhizoctonia solaniを防除するための方法、を開示する。Drechslera oryzae、Alternaria alternate、およびFusarium roseumに対するB.megateriumのインビトロ拮抗効果は、開示されている。培養濾液の中の構成要素の最も活性のあるものは、ポリオキシン様リポペプチドであることが証明された、水およびメタノールにおいて可溶であることを強調する、抗生物質であった。
【００１１】
Bacillus属は、先般来、抗真菌性および抗細菌性の二次代謝産物を生産することが知られている。Bacillus属によって生産された、殺真菌性の化合物ツヴィッターマイシンＡ、および化合物カノサミンは、先行技術において同定されている。
【００１２】
Bacillusの代謝産物の別の群は、イツリン（ｉｔｕｒｉｎ）類の環状リポペプチドであり、それらの内のいくつかは、強力な殺真菌剤である。これらのリポペプチドの作用様式は、生体イオンの放出を許容する膜貫通チャネルを作り出す真菌膜との相互作用に起因していることが報告されている。
【００１３】
アミノ酸鎖の長さにおいて異なっている多数の類同体を合成することによって、イツリンの構造／活性の関係が、研究されている。イツリンの活性は、脂肪酸側鎖の長さおよび末端の分岐の長さに伴って増加した（Blandら“Iturin-A, and antifungal peptide produced by Bacillus subtilis” Proc. Plant Growth Regulation Soc. Am. 22:102-107 (1995)）。
【００１４】
B.cereusから単離されたリポペプチドの別の群は、プリパスタチンである。これらの化合物は、もともとは豚の膵臓のホスホリパーゼＡ２の阻害剤の研究において同定されたが、その後の研究から、それらがまた、Botrytis、Pyricularia、およびAlternariaを含む、いくつかの植物病原体の真菌を阻害することを発見した（Yamadaら “Biological activity of antifungal substances produced by Bacillus subtilis” J. Pesticide Sci. 15(1):95-96 (1990)）。Yamadaはまた、両方ともに同じB.cereus株によって生成されるイツリンＡおよびプリパスタチンの間で観察された、相乗作用の効果を報告した。
【００１５】
B.subtilisによって生産された別の環状リポペプチドは、サーファクチンであり、当該サーファクチンは、非常に優れた界面活性剤の活性を保有する。新規の微生物B.subtilis  ＡＱ７１３は、Ａイツリン、プリパスタチン、およびサーファクチンを生産する。リポペプチドのこの組み合わせの生産は、生物学的防除剤としてのその有用性に対して重要である。
【００１６】
Sclerotinia sclerotiorumは、重要な植物病原体の土壌真菌であり、レタス、ジャガイモ、穀物、および幅広く多数の他の重要な農作物において、経済的損失を引き起こす。S.sclerotiorumによって引き起こされた兆候および症状は、宿主に依存して変化する。しかし、最も明らかな兆候は、白い綿毛の菌糸の成長の出現であり、当該菌糸の成長は、後に菌核を形成するだろう。真菌は、植物の基部において感染し且つ菌糸を生産し、当該菌糸は、最終的に茎を上方へ移動し、植物の腐敗を引き起こすだろう。菌核は、食物の蓄えを含んでいる、硬くなった真菌の菌糸の小型の塊である。菌核の一つの役割は、環境の危機を切り抜けて生きることであり、これがこの病気の防除を挑戦的にしている。
【００１７】
防除が存在しない場合には、Sclerotiniaは、病気に対して有利な条件下で、最大で６０パーセントまでの損失を引き起こすことが可能である。菌核が、少しの宿主も存在しない中で、または発達に対して有利な条件の中で、数年間、土壌の中で生存することが可能であるように、病原体の防除および根絶は、困難である。主要な化学的防除方法は、土壌の燻蒸消毒を含んでいるが、これらの化合物（例えば、臭化メチル）は、高い毒性、並びに、環境に対する、および非対象生物に対する潜在的な不都合な効果のために、極度の規制圧力下にある。効果的な防除方法を用いても、病気を引き起こすための、十分な菌核がまだある場合がある、ということが報告されている。Sclerotiniaに対するBacillus属の可能性を評価するための研究は、植物宿主によって生産された根の滲出物に大いに依存する結果を示している。
【００１８】
本発明の説明
用語「細菌(bacteria)」または「細菌(bacterium)」は、明確な核を有しない任意の原核生物を含む。
【００１９】
用語「真菌(fungus)」または「真菌(fungi)」は、クロロフィルが欠けており、有核胞子を生む広範に多様な生物を含む。例えば、酵母、糸状菌、白カビ、さび菌、およびキノコが挙げられる。
【００２０】
「殺真菌性」は、真菌の死亡率を増加させる、あるいは真菌の増殖速度を阻害するための、物質の能力を意味する。
【００２１】
「抗生物質」は、微生物を殺す、あるいは阻害することが可能である、任意の物質を含む。抗生物質は、微生物によって生産される場合があるか、または合成過程によってもしくは半合成過程によって生産される場合がある。用語は、ツヴィッターマイシンＡまたはカノサミンのような、真菌を阻害する、または真菌を殺す物質を含む。
【００２２】
「抗真菌剤」は、真菌を殺す、あるいは、真菌の増殖を阻害することが可能である、任意の物質を含む。
【００２３】
「抗細菌剤」は、細菌を殺す、あるいは、細菌の増殖を阻害することが可能である、任意の物質を含む。
【００２４】
用語「培養すること」は、様々な種類の培地の上の、または様々な種類の培地の中の、生物の増殖を指す。
【００２５】
「培養液全体」は、細胞および培地の両方を含んでいる液体培養液を指す。「上清」は、培養液の中で増殖した細胞が、遠心分離法、濾過、沈殿法、または他の公知の手段によって取り除かれた場合に残っている液体培養液を指す。
【００２６】
用語「溶媒」は、溶液の中に他の物質を保持する任意の液体を含む。「溶媒抽出物」は、溶媒の中に溶解し、そしてその後溶媒から単離される場合がある、任意の化合物を指す。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様は、寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託されたBacillus subtilis株であり、これに加えて本発明の株である。
【００２８】
本発明の、Bacillus subtilis株は、２０１２年１２月１８日に、Parc Cientific Universitat de Valencia, Catedratico Agustin Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia, Spain)に設置されたColeccion Espanola de Cultivos Tipo（ＣＥＣＴ）上に、Edificio ceeim, Campus Universitario, S/N, 30100 Murcia(Spain)にいる、寄託者Symborg, S.Lよって寄託された。
【００２９】
Bacillus subtilisの株は、引例ＳＢ０００３と共に、寄託者によって同定され、そして国際寄託当局が、生存可能だと株を言明した後に、受託番号ＣＥＣＴ８２５８でＣＥＣＴに受け入れられた。
【００３０】
株は、分子の特徴、物理的およびプロテオミクスの研究の活用に基づいて同定された。顕微鏡観察で同定された株は、グラム陽性桿菌によって形成されており、胞子形成の能力があり、従って、Bacillus属に属している。サンプルは、様々な液体培地および様々な固体培地を用いて播種され、３０℃と３７℃との間での培養後、この培地にて増殖が見られた。株から単離されたコロニーは、次いで、生化学的試験にかけられた。当該試験の結果は、以下の表の中に記載される。
【００３１】
ＣＥＣＴ８２５８のより広範囲な特徴決定は、ＣＥＣＴによって実施された。
【００３２】
単離され、提示された株：Bacillus属、ＳＢ０００３株。
【００３３】
単離同定：ＡＰＩ５０ＣＨギャラリー(gallery)を補完するためにＡＰＩ２０Ｅギャラリーの使用を勧める製品の説明書（Biomerieux）に従って、ＡＰＩストリップ、具体的に言うとＡＰＩ５０ＣＨＥを使用した。そして３７℃において培養を行った。好気的環境下で、株の最適の増殖温度にて２４時間および４８時間培養した後に、読み込みが実施された。
【００３４】
細胞の形態学：運動性の細胞は、端近くの領域の上に形成された二つの内生胞子とともに、単一で見出された。細胞は、グラム陽性に一様に染色される。
【００３５】
コロニー形態学：コロニーは、低い凸状の隆起、キラキラ輝いている外観、および滑らかな外観を有し、不透明であり且つ、完全である。縁は、白く、且つ規則正しい。
【００３６】
【表１】
2017501742.tif 000002
2017501742.tif 000003
【００３７】
【表２】
2017501742.tif 000004
更なるタンパク質の解析は、エタノール／ギ酸の抽出による、Bruker Daltroniksによって推奨された手順に従って、測定された。分光写真は、この株と、既知のB.subtilis株との間の密接な相関関係を示した。
【００３８】
最終的に、Bacilllus Subtilis株ＣＥＣＴ８２５８の遺伝子の配列は完成され、そして、４０よりも多い異なるB.subtilis株と、９９％よりも大きい類似性で一致することが分かった。この解析に基づいて、株ＣＥＣＴ８２５８はBacillus subtilisの一員であるということが、断定された。加えて、２次元（２Ｄ）電気泳動を通して、株ＣＥＣＴ８２５８のペプチド指紋は、ＮＣＢＩデータバンクにおいて、タンパク質含有率に関しては、他の種と異なる。
【００３９】
すべての入手可能な、生理学的および生化学的データに基づいて、株ＣＥＣＴ８２５８は、Bacillus subtilisと最も酷似している。
【００４０】
別の態様において、本発明は、真菌の侵襲、および細菌の侵襲から、植物、植物の一部分、植物の根、または植物の種子を、保護する方法、または処理する方法を包含し、本発明の方法は、
−寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株を含んでいる組成物、または
−寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株の培養液から得られた上清を、
上記植物、植物の一部分、植物の根、または植物の種子、に適用することを含んでいる。      
【００４１】
特定の実施形態は、本発明の方法であり、ここでは、上記真菌の侵襲は、Sclerotineaceae科の一員によって引き起こされる。
【００４２】
特定の実施形態は、本発明の方法であり、ここでは、上記真菌の侵襲、または細菌の侵襲は、Erwinia amylovora、Macrophomina phaseolinaおよびBotrytis cinereaによって構成される群から選択された真菌または細菌によって引き起こされる。
【００４３】
特定の実施形態は、本発明の方法であり、ここでは、上記真菌の侵襲は、上記植物の葉を攻撃する、葉の真菌の病原体によって引き起こされる。
【００４４】
特定の実施形態は、本発明の方法であり、ここでは、上記真菌の侵襲は、植物の根を攻撃する、土壌の真菌の病原体によって引き起こされる。
【００４５】
本発明の株は、他の知られた農薬と組み合わせられることが可能である。したがって、特定の実施形態は、本発明の方法であり、ここでは、生物農薬または化学農薬が、上記植物、植物の一部分、植物の根、または植物の種子にさらに適用される。
【００４６】
特定の実施形態は、本発明の方法であり、ここでは、寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株は、培養液全体として適用される。
【００４７】
特定の実施形態は、本発明の方法であり、ここでは、寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株は、上記植物の根を取り囲んでいる上記土壌に適用される。
【００４８】
特定の実施形態は、本発明の方法であり、ここでは、寄託番号ＣＥＣＴ８２５８にて寄託された上記Bacillus subtilis株は、水和剤、粒剤、水性懸濁液、乳剤またはマイクロカプセル封入として適用される。
【００４９】
本発明の株は、適切な培地または類似の調剤において、水和剤、粒剤、および他の類似の調剤として調剤されることが可能であるか、あるいはマイクロカプセル封入されることが可能である。調剤の具体例は、水溶性粉剤、水和性粒剤、乾燥流動剤、水性流動剤、水和性分散性粒剤、乳剤、および水性懸濁液を含むが、これらに限定されない。他の適切な調剤は、当事者に知られているだろう。
【００５０】
図面の簡単な説明
図１．治療的処理のために、７０日間生物抗真菌剤で処理したレタス植物、および未処理のレタス植物に対する影響率(Rate impact)。
図２．予防的処理のために、７０日間生物抗真菌剤で処理したレタス植物、および未処理のレタス植物に対する影響率。
図３．西洋ナシにおける、葉の、および土壌の処理に続く、Erwinia amylovora病の発達に対する、Bacillus subtilis株ＣＥＣＴ８２５８の効果。
【００５１】
本発明の実施例
実施例１．Sclerotinia sclerotiorumおよびMacrophomina phaseolinaに対するBacillus subtilis  ＣＥＣＴ８２５８のインビトロ活性
培養培地のＣＥＣＴ８２５８株細菌懸濁液を、作製し、そして培養から２４時間および４８時間について、分光光度計（λ＝６２３においてＡ＝１．００２）によって較正した。細菌の培養培地によって分泌された代謝産物を評価することの目的として、選択された時間からの培養液を、１２０℃で４０分間オートクレーブ殺菌し、それによって微生物の増殖性細胞および芽胞の完全な除去を確実にした。
【００５２】
Sclerotinia sclerotiorumおよびMacrophomina phaseolinaに対する代謝産物の阻害活性を評価するために、ジャガイモのＤ−グルコース寒天培地（PDA）において、培養から２４時間および４８時間で、培地中の代謝産物の４つの濃度を、選択した（０％（コントロール）、５％、１５％および２０％）。菌糸盤（Mycelial discs）（直径５ｍｍ）を、Sclerotinia sclerotiorumおよびMacrophomina phaseolinaのプレートの中心に置き、そしてSclerotinia sclerotiorumに対しては２０℃で、およびMacrophomina phaseolinaに対しては３０℃で、コールドチャンバー内で培養した。菌糸成長を、培養から２４、４８、および７２時間において評価した。
【００５３】
【表３】
2017501742.tif 000005
【００５４】
【表４】
2017501742.tif 000006
真菌のコロニーの発達における有意差は、両方の種で観察された。代謝産物の濃度が増加するにつれて、真菌の発達の阻害は増加した。４８時間培養された培養培地からの代謝産物は、両方の種においてより大きな阻害を引き起こした。
【００５５】
実施例２．レタスにおける、Sclerotinia sclerotiorumに対するBacillus subtilis  ＣＥＣＴ８２５８のインビボ活性
研究された植物種は、９０日間周期で作付するLactuca sativa L “Iceberg”型であった。移植は、Sclerotinia sclerotiorumの感染に有利な粘土質土壌を含んでいる、サイズにおいて７５ｃｍ×１５ｃｍ×１５ｃｍの容器（ポット）の中に、３つの苗木／ポットで、植えることによって行った。
【００５６】
病気の防除を評価するために、２つの条件、予防的適用時期または治療的適用時期の何れかの条件にて研究した。両方の条件について、３つの適用の濃度および未処理のコントロール処理、合計で８処理について評価した。これは研究された別形である。
Ｔ１：コントロール未処理
Ｔ２：３ｌ／ｈａ
Ｔ３：４ｌ／ｈａ
Ｔ４：５ｌ／ｈａ
最終的に、生物抗真菌剤が使用される処理において、予防的条件の場合は、２ｌ／ｈａの投与量を適用し、且つ最初の投与量の後２０日間適用し、そして、治療的条件のために、最初の接種から３日ごとに、２ｌ／ｈａの２つの投与量を適用する。
【００５７】
葉の生体重量（ＦＦＷ）および乾燥重量（ＦＤＷ）、ならびに根の生体重量（ＲＦＷ）および乾燥重量（ＲＤＷ）を、培養９０日後に評価した。処理あたり１０の植物を、種々の器官へ切り離し、ザルトリウス天秤型上で重さを図った。乾燥重量を得るために、一定の重さのためにサンプルを８０℃におけるオーブンの中に置いた。葉の生物体量と乾燥生物体量との間の比率を計算した。
【００５８】
死亡率および病気の関係を計算し、最も確からしい微生物の数、根圏における細菌および真菌の濃度を決定するために、各々の植物および処理からの根圏土壌サンプルを連続希釈した。細菌の増殖のために培地を使用し、そして真菌のローズベンガルのために寒天培地を使用した。
【００５９】
【表５】
2017501742.tif 000007
【００６０】
【表６】
2017501742.tif 000008
治療的処理として適用した時、B.subtilis  ＣＥＣＴ８２５８の３つの比率のすべては、病気の感染を軽減した（図１）。研究の終点において、８０％より多い感染を伴う、未処理のコントロールと比較して、３Ｌ／ｈａの比率は、２０％より少ない感染を伴う最も良い予防という結果になった。予防的処理として適用した時、９０％の感染を伴う、未処理のコントロールと比較して、３つの比率のすべては、両方とも卓越した予防（２０％より少ない感染）を提供する３Ｌ／ｈａおよび４Ｌ／ｈａの処理を伴って、再び病気を軽減した（図２）。
【００６１】
実施例３．西洋ナシにおける、Erwinia amylovoraに対するBacillus subtilis  ＣＥＣＴ８２５８のインビボ活性
Erwinia amylovoraによって引き起こされた細菌の病気、火傷病に対する、Bacillus subtilis株ＣＥＣＴ８２５８の能力を評価するために、野外にて、西洋ナシの３つの品種、Ercolini、Castell、およびEtruscanを用いて、合計５つの試行を、実施した。すべての試行の場所において、木が３０％開花しており、且つ病気がすでに木の中に存在するとき、適用を行った。各々の試行において、処理あたり最低限８０の木を用いた。感染場所の最初の勘定は、処理の時点において行った。
【００６２】
本研究において用いられた処理は、以下のとおりである：
１．未処理の植物
２．３リッター／ｈａで葉の処理
３．両方３リッター／ｈａで土壌および葉の処理。
【００６３】
適用後、感染した枝の数を数えた。Erwinia amylovoraと感染された枝の数における割合の変化を計算し、そして未処理と比較した。結果は、３つの品種すべてにおいて、コントロールとの比較において、病気の枝の数が、少なくとも５０％まで、軽減されたということを示す。この傾向は、低い病気の圧力下、およびとても高い病気の圧力下の両方で観察された。土壌および葉の両方の処理を受ける木は、Erwinia amylovora感染における割合の増加において最も大きい軽減を示した。病気の圧力がより低かった幾つかの場合は、土壌および葉の両方の処理を受ける木は、感染の割合における軽減があり、治療的活性を示している。感染した枝における、３つの処理に対する、割合の変化の比較は、図３において見られることが可能である。
【００６４】
実施例４．インビトロ培養（９６−ウェルプレート）における、植物病原体に対するＣＥＣＴ８２５８の活性
真菌、Phytophthora infestans、Collectotrichum geosporoide、Botrytis cinerea、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia minor、Alternaria solani、およびPythium属、ならびに細菌Erwinia amylovora、に対してＣＥＣＴ８２５８が効果的であるかどうかを決定すること。ＣＥＣＴ８２５８を、特定の培地において予め増殖させた。Bacillus subtilis接種材料を特定の培養培地において増殖させた。当該培養培地は、５％糖液、３％酵母抽出物、３０％炭水化物抽出物、および０．５％ＭｇＳＯ４  Ｘ  ７Ｈ２Ｏならびに塩（硝酸カルシウム（１Ｍ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）、硫酸鉄（１ｍＭ））が含まれている。１日古いストリーク培養物を、２５０ｍｌバッフル攪拌フラスコに接種するために使用した。フラスコを３６時間、３７℃において、１３０ｒｐｍで攪拌した。
【００６５】
培養液を使用できる状態にしたとき、続いて実験を行った。９６−ウェルプレート（平らな底、１ウェルあたり４００マイクロリッター）を、ジャガイモのＤ−グルコース寒天培地で満たした。Phytophthora infestans培養液を３日間、液体培地、ＹＰＧ培地（０．４ｇ酵母、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％ＭｇＳＯ４  Ｘ  ７Ｈ２Ｏ、１．５％グルコース）の中で増殖させ、そして、Erwinia amylovoraは同様に４８時間、栄養培地において増殖させた。他の真菌に対しては、ＰＤＡ培地において増殖させ、そして真菌の芽胞をペトリプレートの表面からすくい取り、それから、０．１−０．２ｍＬ分取の脱イオン水および病原体の芽胞懸濁液（濃度、約２  Ｘ  １０６芽胞／ｍＬ）を、寒天の上に薄く塗った。
【００６６】
上清を得るために、培養液全体を３０分間５，０００ｒｐｍで遠心分離した。微生物の植物病原体を９６−ウェルプレートの上にピペットした（８ウェル／病原体）。微生物の増殖の有無を、８ウェルのそれぞれについて記録した。ＣＥＣＴ８２５８の上清の約３５μＬまたは培養液全体の３５μＬを各々のウェルに加えた。点数の“１”は、微生物の増殖の完全な阻害を意味する。点数の“４”は、微生物の増殖の阻害がないことを意味する。
【００６７】
結果を表７に示す。
【００６８】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】治療的処理のために、７０日間生物抗真菌剤で処理したレタス植物、および未処理のレタス植物に対する影響率(Rate impact)を示す。
【図２】予防的処理のために、７０日間生物抗真菌剤で処理したレタス植物、および未処理のレタス植物に対する影響率を示す。
【図３】西洋ナシにおける、葉の、および土壌の処理に続く、Erwinia amylovora病の発達に対する、Bacillus subtilis株ＣＥＣＴ８２５８の効果を示す。
【受託番号】
【００７０】
ＣＥＣＴ８２５８
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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