(57)【要約】生物活性エンティティのマルチサブユニット構造への標的特異的送達のための、マルチサブユニット構造のサブユニットと1個の生物活性エンティティとのコンジュゲートの使用を、本明細書において報告する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性エンティティのマルチサブユニット構造への標的特異的送達のための、マルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインと1個の生物活性エンティティとのコンジュゲートの使用。
【請求項２】
サブユニットの結合ドメインが、マルチサブユニット構造と可逆的に会合し解離することができることを特徴とする、請求項1記載の使用。
【請求項３】
結合ドメインが、マルチサブユニット構造の2番目に大きいサブユニットまたはマルチサブユニット構造の最も小さいサブユニットであるサブユニットに由来することを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項記載の使用。
【請求項４】
マルチサブユニット構造が、2サブユニット構造または3サブユニット構造または4サブユニット構造であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
マルチサブユニット構造が、少なくともそのサブユニットまたは全ての個々のサブユニットが非共有結合で相互に会合しているマルチサブユニットタンパク質であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
生物活性エンティティが、治療活性ポリペプチドであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
コンジュゲートが、組換えコンジュゲートであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
コンジュゲートが、N末端からC末端への方向に生物活性エンティティおよびマルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
コンジュゲートが、抗体Fc領域をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
マルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインがビトロネクチンのSMBドメインであり、かつ生物活性エンティティがPAI-1の反応中心ループ（RCL）であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
コンジュゲートが、N末端からC末端への方向にビトロネクチンのSMBドメインと1個のPAI-1の反応中心ループ（RCL）と抗体Fc領域とを含むことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
薬学的活性ポリペプチドの作用部位がマルチサブユニットタンパク質上にあり、かつ1個の薬学的活性ポリペプチドがマルチサブユニットタンパク質のサブユニットの結合ドメインにコンジュゲートされていることを特徴とする、薬学的活性ポリペプチドのその作用部位への標的特異的送達のための方法。
【請求項１３】
サブユニットの結合ドメインが、マルチサブユニットタンパク質と可逆的に会合し解離することができることを特徴とする、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
サブユニットが、マルチサブユニットタンパク質の2番目に大きいサブユニットまたはマルチサブユニットタンパク質の最も小さいサブユニットであることを特徴とする、請求項12〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
マルチサブユニットタンパク質が、2サブユニットタンパク質または3サブユニットタンパク質または4サブユニットタンパク質であることを特徴とする、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
マルチサブユニットタンパク質の少なくともそのサブユニットまたは全ての個々のサブユニットが非共有結合で相互に会合していることを特徴とする、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
コンジュゲートが、組換えコンジュゲートであることを特徴とする、請求項12〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
コンジュゲートが、N末端からC末端への方向に薬学的活性ポリペプチドおよびマルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項12〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
コンジュゲートが、抗体Fc領域をさらに含むことを特徴とする、請求項12〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
マルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインがビトロネクチンのSMBドメインであり、かつ薬学的活性ポリペプチドがPAI-1の反応中心ループ（RCL）であることを特徴とする、請求項12〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
コンジュゲートが、N末端からC末端への方向にビトロネクチンのSMBドメインと1個のPAI-1の反応中心ループ（RCL）と抗体Fc領域とを含むことを特徴とする、請求項12〜20のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
マルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインを標的指向およびペイロード送達のためのエンティティとして使用することによって、薬学的活性エンティティをマルチサブユニット構造上の作用部位へ、直接、標的特異的に送達する方法が、本明細書において報告される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
WO 2002/24219（特許文献1）には、増殖因子、増殖因子結合タンパク質、およびビトロネクチンを含む単離されたタンパク質複合体が報告されている。創傷治癒、皮膚修復、および組織補充療法のため、タンパク質複合体を投与することによって、細胞の増殖および／または遊走をモジュレートする方法も報告されている。
【０００３】
WO 2009/033095（特許文献2）には、PAI-1をその潜在型に変換するヒト化抗PAI-1抗体およびその抗原結合断片の組成物が報告されている。報告された別の局面は、PAI-1に結合し、PAI-1をその潜在型に変換するかまたはタンパク質分解を増加させることによってPAI-1を中和する抗体に関する。報告された別の局面は、PAI-1に関連した疾患または状態の検出、診断、もしくは処置、またはそれらの組み合わせのための、PAI-1を阻害するかまたは中和するヒト化抗体の使用に関する。
【０００４】
WO 2009/131850（特許文献3）には、PAI-1発現またはPAI-1活性を阻害する薬剤を含む組成物を、有効量、患者へ投与することを含む、患者における緑内障またはIOP上昇を処置する方法が報告されている。
【０００５】
標的特異的送達のアプローチの全てではないにしても多くが、種制限という欠点を有しており、即ち、例えば、実験動物における代理研究のための、種間交差反応アプローチは、ほとんど知られていない。
【０００６】
標的特異的送達のアプローチの全てではないにしても多くが、特定の標的に対して特異的である。
【０００７】
WO 2009/089059（特許文献4）には、PAI-1機能の治療的阻害剤およびその使用法が報告されている。WO 2012/085076（特許文献5）は、uPARアンタゴニストおよびその使用を報告している。WO 2012/035034（特許文献6）には、セルピンフィンガーポリペプチドと、第二のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とを含む融合ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの使用が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2002/24219
【特許文献２】WO 2009/033095
【特許文献３】WO 2009/131850
【特許文献４】WO 2009/089059
【特許文献５】WO 2012/085076
【特許文献６】WO 2012/035034
【発明の概要】
【０００９】
マルチサブユニット構造、例えば、マルチサブユニットタンパク質のサブユニットの結合ドメインを、治療活性エンティティ、例えば、阻害性ポリペプチドのマルチサブユニット構造への標的特異的送達のために使用することができることが見出された。
【００１０】
マルチサブユニット構造のサブユニットに由来する結合ドメインの特異的な結合相互作用を、結合ドメインにコンジュゲートされた治療活性エンティティの標的特異的送達のために使用することができることが見出された。
【００１１】
本明細書において報告される使用および方法は、マルチサブユニット構造の個々のサブユニット間に存在する特異的な結合相互作用、特に、特異的な認識特徴の活用に基づく。治療活性エンティティを完全サイズのサブユニットにコンジュゲートすることは可能であろうが、組換え作製および許容される用量による適用を可能にするためには、コンジュゲートのサイズを低下させることが有利である。従って、マルチサブユニット構造の他のサブユニットへの適切な認識および標的指向のため、サブユニットの結合ドメインのみを使用することが好ましい。
【００１２】
本明細書において報告される一つの局面は、生物活性エンティティのマルチサブユニット構造への標的特異的送達のための、マルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインと（正確に）1個の生物活性エンティティとのコンジュゲートの使用である。
【００１３】
一つの態様において、サブユニットの結合ドメインは、マルチサブユニット構造と可逆的に会合し解離することができる。
【００１４】
一つの態様において、結合ドメインは、マルチサブユニット構造の2番目に大きいサブユニットまたはマルチサブユニット構造の最も小さいサブユニットであるサブユニットに由来する。
【００１５】
一つの態様において、マルチサブユニット構造は、2サブユニット構造または3サブユニット構造または4サブユニット構造である。
【００１６】
一つの態様において、マルチサブユニット構造は、少なくともそのサブユニットまたは全ての個々のサブユニットが非共有結合で相互に会合しているマルチサブユニットタンパク質である。
【００１７】
一つの態様において、生物活性エンティティは薬学的活性エンティティである。一つの態様において、生物活性エンティティは治療活性ポリペプチドである。
【００１８】
一つの態様において、コンジュゲートは組換えコンジュゲートである。
【００１９】
一つの態様において、コンジュゲートは半減期延長エンティティをさらに含む。一つの態様において、半減期延長エンティティは、ポリ(エチレングリコール)、ヒト血清アルブミンまたはその断片、および抗体Fc領域から選択される。
【００２０】
一つの態様において、結合ドメインと治療活性ポリペプチドと半減期延長エンティティとは、相互に独立に、直接またはペプチドリンカーを介して相互にコンジュゲートされている。
【００２１】
本明細書において報告されるコンジュゲートにおいて、単一の生物活性エンティティの効力がPAI-1の潜在を誘導するのに十分であることが見出された。
【００２２】
一つの態様において、コンジュゲートは、N末端からC末端への方向に生物活性エンティティとマルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインとを含む。
【００２３】
一つの態様において、コンジュゲートは抗体Fc領域をさらに含む。一つの態様において、抗体Fc領域はコンジュゲートのC末端にある。
【００２４】
コンジュゲート内の生物活性エンティティの効力は、ヒトIgG重鎖Fc領域が、IgG1サブクラスのものであり、（SEQ ID NO:01〜SEQ ID NO:12の1位に相当する）221位でアスパラギン酸により始まる時、例えば、（ヒトIgG1のKabat EUインデックスによってナンバリングされた）217位でプロリンにより始まるヒトIgG重鎖Fc領域と比較して、改善されることが見出された。一つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Asp221から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。一つの好ましい態様において、重鎖Fc領域は、SEQ ID NO:01〜SEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２５】
一つの態様において、マルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインはビトロネクチンのSMBドメインであり、かつ生物活性エンティティはPAI-1の反応中心ループ（RCL）である。
【００２６】
一つの態様において、コンジュゲートは、N末端からC末端への方向にビトロネクチンのSMBドメインと1個のPAI-1の反応中心ループ（RCL）と抗体Fc領域とを含む。
【００２７】
本明細書において報告される一つの局面は、以下のことを特徴とする、非共有結合で会合したマルチサブユニットタンパク質のサブユニットの結合ドメインと生物活性ポリペプチドとの組換え作製されたコンジュゲートである。
・マルチサブユニットタンパク質が2サブユニットタンパク質であり、サブユニットが、マルチサブユニットタンパク質の小さい方のサブユニットであるか、または
・マルチサブユニットタンパク質が3サブユニットタンパク質であり、サブユニットが、マルチサブユニットタンパク質の最も小さいかもしくは2番目に大きいサブユニットであるか、または
・マルチサブユニットタンパク質が4サブユニットタンパク質であり、サブユニットが、マルチサブユニットタンパク質の最も小さいかもしくは2番目に小さいかもしくは2番目に大きいサブユニットである。
【００２８】
本明細書において報告される一つの局面は、生物活性ポリペプチドの作用部位がマルチサブユニットタンパク質上にあり、かつ（正確に）1個の生物活性ポリペプチドがマルチサブユニットタンパク質のサブユニットの結合ドメインにコンジュゲートされていることを特徴とする、生物活性ポリペプチドのその作用部位への標的特異的送達の方法である。
【００２９】
一つの態様において、サブユニットの結合ドメインは、マルチサブユニットタンパク質と可逆的に会合し解離することができる。
【００３０】
一つの態様において、サブユニットは、マルチサブユニットタンパク質の2番目に大きいサブユニットまたはマルチサブユニットタンパク質の最も小さいサブユニットである。
【００３１】
一つの態様において、マルチサブユニットタンパク質は、2サブユニットタンパク質または3サブユニットタンパク質または4サブユニットタンパク質である。
【００３２】
一つの態様において、マルチサブユニットタンパク質の少なくともそのサブユニットまたは全ての個々のサブユニットは、非共有結合で相互に会合している。
【００３３】
一つの態様において、生物活性ポリペプチドは治療活性ポリペプチドである。
【００３４】
一つの態様において、コンジュゲートは組換えコンジュゲートである。
【００３５】
一つの態様において、コンジュゲートは半減期延長エンティティをさらに含む。一つの態様において、半減期延長エンティティは、ポリ(エチレングリコール)、ヒト血清アルブミンまたはその断片、および抗体Fc領域から選択される。
【００３６】
一つの態様において、結合ドメインと治療活性ポリペプチドと半減期延長エンティティとは、相互に独立に、直接またはペプチドリンカーを介して相互にコンジュゲートされている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】PAI-1の反応中心ループ（RCL）とビトロネクチンのSMBドメインとヒトFc領域とを含むコンジュゲートの一般的な構造；1：PAI-1の反応中心ループ、2：ペプチドリンカー、3：SMBドメイン、4：Fc領域。
【図２】PAI-1の反応中心ループ（RCL）とビトロネクチンのSMBドメインとヒトFc領域とを含むコンジュゲートにより例示された本明細書において報告されるコンジュゲートの作用の様式、ならびにPAI-1およびビトロネクチンのジサブユニット構造。
【図３】非グリコシル化ヒトPAI-1に関する効果についての用量応答曲線。
【図４】グリコシル化ヒトPAI-1に関する効果についての用量応答曲線。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
本明細書において報告される使用および方法は、マルチサブユニット構造の個々のサブユニット間に存在する特異的な結合相互作用、特に、特異的な認識特徴の活用に基づく。治療活性エンティティを完全サイズのサブユニットにコンジュゲートすることは可能であろうが、組換え作製および許容される用量による適用を可能にするためには、コンジュゲートのサイズを低下させることが有利である。従って、マルチサブユニット構造の他のサブユニットへの適切な認識および標的指向のため、サブユニットの結合ドメインのみを使用することが好ましい。
【００３９】
冠詞「一つの（a）」および「一つの（an）」は、冠詞の文法上の対象物の1または複数（即ち、少なくとも1）をさすために本明細書において使用される。例えば、「一つの抗体（an antibody）」とは、1つの抗体または複数の抗体を意味する。
【００４０】
「少なくとも1」という用語は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上を示す。「少なくとも2」という用語は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上を示す。
【００４１】
「生物活性エンティティ」という用語は、細胞株およびウイルスを使用したバイオアッセイのような人工的な生物系、またはトリもしくはヒトを含む哺乳動物を含むがこれらに限定されないインビボの動物へ投与された時に生物学的効果を引き起こす有機分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ヌクレオプロテイン、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチド、または合成タンパク質のような生物学的高分子を示す。この生物学的効果は、酵素の阻害または活性化、結合部位またはその周辺のいずれかにおける受容体またはリガンドとの結合、シグナル誘発またはシグナルモジュレーションであり得るが、これらに限定されない。生物活性ポリペプチドは、非限定的に、例えば、免疫グロブリンまたはホルモンまたはサイトカインまたは増殖因子または受容体リガンドまたはアゴニストまたはアンタゴニストまたは細胞毒または抗ウイルス剤または造影剤または酵素阻害剤、酵素活性化剤、またはアロステリック物質のような酵素活性モジュレーターである。一つの態様において、生物活性エンティティは生物活性ポリペプチドである。一つの態様において、生物活性ポリペプチドは治療活性ポリペプチドである。一つの態様において、治療活性ポリペプチドは、直鎖状のポリペプチドであり、10〜250アミノ酸残基の長さを有する。一つの態様において、治療活性ポリペプチドは10〜100アミノ酸残基の長さを有する。一つの態様において、治療活性ポリペプチドは10〜50アミノ酸残基の長さを有する。一つの態様において、生物活性エンティティは、完全抗体の軽鎖もしくは重鎖またはscFvまたはscFabまたはシングルドメイン抗体または単鎖抗体である。
【００４２】
生物活性エンティティの結合ドメインへの「コンジュゲーション」は、化学的手段および組換えによってなされ得る。組換えコンジュゲーションの場合には、生物活性エンティティおよび結合ドメインのコード核酸を、直接、またはリンカーペプチドをコードする介在配列によって、連続的にリーディングフレーム内で接合する。化学的コンジュゲーションの場合には、化学結合または特異的結合対を介した結合のような異なる方法によって、生物活性エンティティと結合ドメインとをコンジュゲートすることができる。一つの態様において、化学的コンジュゲーションは、N末端および／もしくはεアミノ基（リジン）、異なるリジンのεアミノ基、複合体の一部のアミノ酸配列のカルボキシ官能基、スルフヒドリル官能基、ヒドロキシル官能基、および／もしくはフェノール官能基、ならびに／または複合体の炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学結合によって実施される。一つの態様において、生物活性エンティティは、特異的結合対を介して結合ドメインにコンジュゲートされる。
【００４３】
「Fc領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部分を含有している免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語には、ネイティブ配列Fc領域およびバリアントFc領域が含まれる。一つの好ましい態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Asp221から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端のリジン（Lys447）または末端のグリシン（Gly476）およびリジン（Lys477）は存在してもよいしまたは存在しなくてもよい。本明細書において他に特記されない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242に記載されているような、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムによる。「Fc領域」は、周知の用語であり、抗体重鎖のパパイン切断に基づき定義され得る。本明細書において報告されるコンジュゲートは、一つの態様において、ヒトFc領域またはヒト起源に由来するFc領域を含んでいてよい。さらなる態様において、Fc領域は、Fcγ受容体（例えば、FcγRIIIa）結合および／またはC1q結合が検出され得ないよう修飾された、サブクラスIgG4のヒト抗体のFc領域、またはサブクラスIgG1、IgG2、もしくはIgG3のヒト抗体のFc領域のいずれかである。一つの態様において、Fc領域は、ヒトFc領域であり、具体的には、ヒトIgG4サブクラスに由来するか、またはヒトIgG1サブクラスに由来する変異型Fc領域のいずれかである。一つの態様において、Fc領域は、変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1サブクラスに由来する。IgG4は、低下したFcγ受容体（FcγRIIIa）結合を示し、他のIgGサブクラスの抗体は、強力な結合を示す。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc炭水化物の損失）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、または／およびHis435は、改変された場合、低下したFcγ受容体結合を提供する残基である（Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.,et al.,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434）。一つの態様において、本明細書において報告されるコンジュゲートは、Fcγ受容体結合に関して、IgG4サブクラスのものであるか、またはL234、L235、および／もしくはD265に変異を有するIgG1サブクラスもしくはIgG2サブクラスのものであり、かつ／またはPVA236変異を含有している。一つの態様において、変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、および／またはPVA236である（PVA236とは、IgG1のアミノ酸233〜236位の（1文字アミノ酸コードで与えられた）アミノ酸配列ELLGまたはIgG4のEFLGが、PVAに交換されていることを示す）。一つの態様において、変異は、IgG4のS228PならびにIgG1のL234AおよびL235Aである。抗体のFc領域は、ADCC（抗体依存性細胞傷害）およびCDC（補体依存性細胞傷害）に直接関与している。Fcγ受容体および／または補体因子C1qに結合しない複合体は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）を誘発しない。
【００４４】
IgG1アイソタイプの野生型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000002
。
【００４５】
変異L234A、L235Aを有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000003
。
【００４６】
T366S、L368A、およびY407V変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000004
。
【００４７】
T366W変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000005
。
【００４８】
L234A、L235AおよびT366S、L368A、Y407V変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000006
。
【００４９】
L234A、L235A、およびT366W変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000007
。
【００５０】
P329G変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000008
。
【００５１】
L234A、L235A、およびP329G変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000009
。
【００５２】
P239GおよびT366S、L368A、Y407V変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000010
。
【００５３】
P329GおよびT366W変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000011
。
【００５４】
L234A、L235A、P329GおよびT366S、L368A、Y407V変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000012
。
【００５５】
L234A、L235A、P329G、およびT366W変異を有するIgG1アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000013
。
【００５６】
IgG4アイソタイプの野生型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000014
。
【００５７】
S228PおよびL235E変異を有するIgG4アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000015
。
【００５８】
S228P、L235E、およびP329G変異を有するIgG4アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000016
。
【００５９】
S228P、L235E、P329GおよびT366S、L368A、Y407V変異を有するIgG4アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000017
。
【００６０】
S228P、L235E、P329G、およびT366W変異を有するIgG4アイソタイプのバリアントヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
2017501970.tif 000018
。
【００６１】
「ペプチドリンカー」という用語は、天然および／または合成起源のアミノ酸配列を示す。それは、20種の天然に存在するアミノ酸が単量体ビルディングブロックである直鎖状のアミノ酸鎖からなる。ペプチドリンカーは、1〜50アミノ酸、一つの態様において、1〜28アミノ酸、さらなる態様において、2〜25アミノ酸の長さを有する。ペプチドリンカーは、反復アミノ酸配列または天然に存在するポリペプチドの配列を含有していてもよい。リンカーは、エンティティが適切に提示されることを可能にすることによって、相互にコンジュゲートされたエンティティがその生物学的活性を実施し得ることを確実にする機能を有する。一つの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン残基、グルタミン残基、および／またはセリン残基に富んでいる。これらの残基は、例えば、
2017501970.tif 000019
のような5アミノ酸までの小さい反復単位で配置される。小さい反復単位は、1〜5回繰り返されてよい。多量体単位のアミノ末端および／またはカルボキシ末端には、6個までの付加的な天然に存在するアミノ酸が任意で付加されてもよい。他の合成ペプチドリンカーは、10〜20回繰り返される単一のアミノ酸から構成され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に、6個までの付加的な天然に存在するアミノ酸を任意で含んでいてもよい。全てのペプチドリンカーが、核酸分子によってコードされ得、従って、組換え発現され得る。リンカー自体がペプチドであるため、リンカーによって接続されるポリペプチドは、2個のアミノ酸の間に形成されるペプチド結合を介してリンカーに接続される。
【００６２】
「ポリ(エチレングリコール)」という用語は、必須部分としてポリ(エチレングリコール)を含有している非タンパク質性の残基を示す。そのようなポリ(エチレングリコール)残基は、結合反応のために必要であるか、分子の化学合成に起因するか、または分子の部分の最適の距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含有していてもよい。これらのさらなる化学基は、ポリ(エチレングリコール)残基の分子量の計算のために使用されない。さらに、そのようなポリ(エチレングリコール)残基は、共有結合で共に連結された1本以上のポリ(エチレングリコール)鎖からなっていてもよい。複数のPEG鎖を含むポリ(エチレングリコール)残基は、マルチアーム型または分岐型のポリ(エチレングリコール)残基と呼ばれる。分岐型ポリ(エチレングリコール)残基は、例えば、グリセロール、ペンタエリスリオール、およびソルビトールを含む様々なポリオールへのポリエチレンオキシドの付加によって調製され得る。分岐型ポリ(エチレングリコール)残基は、例えば、EP 0 473 084、US 5,932,462に報告されている。一つの態様において、ポリ(エチレングリコール)残基は、20kDa〜35kDaの分子量を有し、直鎖状のポリ(エチレングリコール)残基である。別の態様において、ポリ(エチレングリコール)残基は、35kDa〜40kDaの分子量を有する分岐型ポリ(エチレングリコール)残基である。
【００６３】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸からなるポリマーであり、天然に生成されたものであってもよいしまたは合成的に作製されたものであってもよい。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」とも呼ばれ、2個以上のポリペプチドからなるかまたは100アミノ酸残基を越える1個のポリペプチドを含む分子は「タンパク質」とも呼ばれる。ポリペプチドは、炭水化物基、金属イオン、またはカルボン酸エステルのような非アミノ酸成分も含む場合がある。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが発現される細胞によって付加され得、細胞の型によって変動し得る。ポリペプチドは、アミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸に関して本明細書において定義される。炭水化物基のような付加は、一般に明示されないが、にも関わらず存在していてもよい。
【００６４】
一つの態様において、生物活性エンティティは、治療活性ポリペプチドである。「治療活性ポリペプチド」という用語は、ヒト治療薬としての承認のため臨床研究において試験され、疾患の処置のため個体へ投与され得るポリペプチドを示す。
【００６５】
当業者に公知であるように、核酸および／またはポリペプチドの多数の誘導体を作製するため、組換えDNAテクノロジーを使用することができる。そのような誘導体は、例えば、置換、改変、交換、欠失、または挿入によって個々のまたはいくつかの位置において修飾されていてよい。例えば、部位特異的変異誘発によって、修飾または誘導体化を実施することができる。当業者はそのような修飾を容易に実施することができる（例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA(1999)を参照すること）。組換えテクノロジーの使用によって、当業者は、外因性（異種）核酸によって様々な宿主細胞を形質転換することができる。異なる細胞の転写および翻訳、即ち、発現の機構は、同一の要素を使用するが、異なる種に属する細胞は、とりわけ、異なるいわゆるコドン使用頻度を有する場合がある。そのため、（アミノ酸配列に関して）同一のポリペプチドが、異なる核酸によってコードされる場合がある。また、遺伝暗号の縮重のため、異なる核酸が同一のポリペプチドをコードする場合がある（例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA(1999)；Hames,B.D.,and Higgins,S.J.,Nucleic acid hybridization - a practical approach,IRL Press,Oxford,England(1985)を参照すること）。
【００６６】
遺伝子の発現は、一過性発現または持続性発現のいずれかとして実施される。関心対象のポリペプチドは、一般に、分泌ポリペプチドであり、従って、細胞壁を通した細胞外培地へのポリペプチドの輸送／分泌のために必要な（シグナル配列としても公知の）N末端延長部分を含有している。一般に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする遺伝子に由来することができる。異種シグナル配列が使用される場合、それは、好ましくは、宿主細胞によって認識され処理される（即ち、シグナルペプチターゼによって切断される）ものである。酵母における分泌のためには、例えば、発現される異種遺伝子のネイティブシグナル配列を、酵母インベルターゼシグナル配列、αファクターリーダー（サッカロマイセス（Saccharomyces）、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、ピキア（Pichia）、およびハンゼヌラ（Hansenula）のαファクターリーダーを含む。2番目はUS 5,010,182に記載されている）、酸性ホスファターゼシグナル配列、またはC.アルビカンス（albicans）グルコアミラーゼシグナル配列（EP 0 362 179）のような分泌遺伝子に由来する相同酵母シグナル配列に置換することができる。哺乳動物細胞発現においては、関心対象のタンパク質のネイティブシグナル配列が十分であるが、同一種または近縁種の分泌ポリペプチド、例えば、ヒトまたはマウスの起源に由来する免疫グロブリンに由来するシグナル配列のような他の哺乳動物シグナル配列、およびウイルス分泌シグナル配列、例えば、単純ヘルペス糖タンパク質Dシグナル配列も適当であり得る。そのようなプレセグメントをコードするDNA断片は、関心対象のポリペプチドをコードするDNA断片と、インフレームでライゲートされる、即ち、機能的に連結される。
【００６７】
CHO細胞、HEK細胞、および大腸菌(E. coli)のような真核細胞および原核細胞において、ポリペプチドを組換え作製することができる。ポリペプチドが原核細胞において作製される場合、それは一般に不溶性の封入体の形態で入手される。封入体は、原核細胞および培養培地から、容易に回収され得る。封入体内の不溶性の形態で入手されたポリペプチドは、精製および／または再折り畳みの手法を実施する前に、可溶化されなければならない。
【００６８】
微生物タンパク質によるアフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインAまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィ）、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、陽イオン交換（スルホプロピル樹脂もしくはカルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合型イオン交換）、（例えば、βメルカプトエタノールおよびその他のSHリガンドによる）チオール親和性吸着、（例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸による）疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィ、（例えば、Ni(II)親和性材料およびCu(II)親和性材料による）金属キレートアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ならびに（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動のような）電気泳動法のような、タンパク質精製のための種々の方法が、十分に確立され、広範囲に使用されている（例えば、Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102を参照すること）。
【００６９】
マルチサブユニット構造、例えば、マルチサブユニットタンパク質のサブユニットの結合ドメインを、治療活性エンティティ、例えば、阻害性ポリペプチドのマルチサブユニット構造への標的特異的送達のために使用することができることが見出された。
【００７０】
マルチサブユニット構造のサブユニットに由来する結合ドメインの特異的な結合相互作用を、結合ドメインにコンジュゲートされた治療活性エンティティの標的特異的送達のために使用することができることが見出された。
【００７１】
本明細書において報告される一つの局面は、生物活性エンティティのマルチサブユニット構造への標的特異的送達のための、マルチサブユニット構造のサブユニットの結合ドメインと生物活性エンティティとのコンジュゲートの使用である。
【００７２】
天然に存在するサブユニットを本明細書において報告されるコンジュゲートに交換するため、好ましくは、サブユニットが可逆的に会合し解離することができるマルチサブユニット構造を標的とすることができる。従って、一つの態様において、サブユニットの結合ドメインは、マルチサブユニット構造と可逆的に会合し解離することができる。
【００７３】
マルチサブユニット構造の全体的な会合に干渉しないよう、結合ドメインが由来するサブユニットを可能な限り小さく選択することが有利である。一つの態様において、結合ドメインは、マルチサブユニット構造の2番目に大きいサブユニットまたはマルチサブユニット構造の最も小さいサブユニットであるサブユニットに由来する。
【００７４】
患者の循環血中の本明細書において報告されるコンジュゲートの治療的に適切なレベルを確立するため、数日または数週間の範囲の半減期を有することが望ましい。従って、一つの態様において、コンジュゲートは半減期延長エンティティをさらに含む。一つの態様において、半減期延長エンティティは、ポリ(エチレングリコール)、ヒト血清アルブミンまたはその断片、および抗体Fc領域から選択される。
【００７５】
本明細書において報告される一つの局面は、以下のことを特徴とする、非共有結合で会合したマルチサブユニットタンパク質のサブユニットの結合ドメインと生物活性ポリペプチドとの組換え作製されたコンジュゲートである。
・マルチサブユニットタンパク質が2サブユニットタンパク質であり、サブユニットが、マルチサブユニットタンパク質の小さい方のサブユニットであるか、または
・マルチサブユニットタンパク質が3サブユニットタンパク質であり、サブユニットが、マルチサブユニットタンパク質の最も小さいかもしくは2番目に大きいサブユニットであるか、または
・マルチサブユニットタンパク質が4サブユニットタンパク質であり、サブユニットが、マルチサブユニットタンパク質の最も小さいか、2番目に小さいか、もしくは2番目に大きいサブユニットである。
【００７６】
本明細書において報告される一つの局面は、生物活性ポリペプチドの作用部位がマルチサブユニットタンパク質上にあり、かつ生物活性ポリペプチドがマルチサブユニットタンパク質のサブユニットの結合ドメインにコンジュゲートされていることを特徴とする、生物活性ポリペプチドのその作用部位への標的特異的送達の方法である。
【００７７】
治療活性ポリペプチドとしてのPAI-1の反応中心ループと、結合ドメインとしてのビトロネクチンのSMBドメインと、半減期増加のためのFc領域とを含むコンジュゲートによって、以下に本発明を例示する。この例は、本明細書において報告された方法の範囲を限定するものではなく、本明細書に提示される概念の一例として存在するに過ぎない。
【００７８】
PAI-1は、プラスミノーゲン活性化カスケードに関与する2つの型のセリンプロテアーゼ、即ち、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）を不可逆的に阻害する分泌50kDa糖タンパク質である。この機能において、PAI-1は、止血（血液凝固および繊維素溶解）ならびに組織リモデリング（細胞外マトリックスのターンオーバーおよび分解）を調節する。さらに、ビトロネクチン（VN）に結合した時、PAI-1は、トロンビン活性化カスケードに干渉することによって強力な抗凝固剤として機能する別のセリンプロテアーゼである活性化プロテインC（APC）も阻害する。抗凝固活性に加えて、APCは、炎症の抑制、細胞アポトーシスの防止、および内皮バリアー機能の安定化を含む広範囲の細胞保護作用を発揮する。
【００７９】
正常な生理学において、PAI-1は、腎組織に低レベルで発現される。しかしながら、病理学的条件の下では、常在腎細胞および浸潤炎症細胞の両方によるPAI-1合成が、急性および慢性のヒト腎疾患において起こる。本発明者らは、PAI-1活性上昇の薬理学的阻害が、二通りの利点を提供すると仮定した：（i）慢性繊維性腎疾患における細胞外マトリックスのより動的なターンオーバーを誘導するプラスミノーゲン活性化の抑制解除、ならびに（ii）特に、急性腎損傷における、抗炎症機能および細胞保護機能を促進するPAI-1によって媒介されるAPC不活化の防止。
【００８０】
PAI-1によって媒介される疾患の処置のための一般的な基本概念は、潜在状態の形成を促進することによって、活性型の阻害性PAI-1の量を低下させること、および／またはビトロネクチン（VN）のPAI-1への結合を阻害することである。
【００８１】
潜在状態の形成を促進するため、PAI-1の反応中心ループ（RCL）と、ビトロネクチンのSMBドメインと、ヒトFc領域とを含むコンジュゲートを生成した。このコンジュゲートの一般構造は図1に示され、作用の様式は図2に示される。
【００８２】
本明細書において報告される本発明によるコンジュゲートのインビトロ／インビボの効力を査定するため、PAI-1潜在誘導抗体を使用した（例えば、US 2009/0081239を参照すること）。抗体に関連したエフェクター機能は、必要とされない／望ましくないため、使用された抗体は、変異SPLE（S228P L235E）を有するヒトIgG4サブクラスのものであった。参照抗体を、以後、マウスIgG1 Fc領域の場合にはPAI1-0001、ヒトIgG4 SPLE Fc領域の場合にはPAI1-0046と呼ぶ。
【００８３】
抗体重鎖のアミノ酸配列は以下の通りである：
2017501970.tif 000020
。
【００８４】
抗体軽鎖のアミノ酸配列は以下の通りである：
2017501970.tif 000021
。
【００８５】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:22の重鎖可変ドメインの重鎖CDRを含み、かつSEQ ID NO:23の軽鎖可変ドメインの軽鎖CDRを含む潜在誘導抗ヒトPAI-1抗体である。
【００８６】
一つの態様において、抗体は、SEQ ID NO:22の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:23の軽鎖可変ドメインを含む。
【００８７】
一つの態様において、抗体は、変異L234A、L235Aを有し、任意で、P329Gを有するヒトサブクラスIgG1のFc領域を有する。
【００８８】
一つの態様において、抗体は、変異S228P、L235Eを有し、任意で、P329Gを有するヒトサブクラスIgG4のFc領域を有する。
【００８９】
本明細書において報告される一つの局面は、ヒトビトロネクチンのSMBドメインとPAI-1潜在誘導ポリペプチドとの組換え作製されたコンジュゲートである。
【００９０】
一つの態様において、潜在誘導ポリペプチドは、
2017501970.tif 000022
のアミノ酸配列を有する。
【００９１】
好ましい態様において、潜在誘導ポリペプチドは、
2017501970.tif 000023
のアミノ酸配列を有する。
【００９２】
一つの態様において、SMBドメインは、
2017501970.tif 000024
のアミノ酸配列を有する。
【００９３】
一つの態様において、コンジュゲートは、潜在誘導ポリペプチドとSMBドメインとの間にペプチドリンカーを含む。
【００９４】
一つの態様において、ペプチドリンカーは25〜35アミノ酸残基の長さを有する。
【００９５】
一つの態様において、ペプチドリンカーは(GGGGS)6（SEQ ID NO:27）である。
【００９６】
一つの態様において、コンジュゲートは抗体Fc領域をさらに含む。
【００９７】
一つの態様において、抗体Fc領域は、変異L234A、L235Aを有し、任意で、P329Gを有するヒトサブクラスIgG1のものである。
【００９８】
一つの態様において、抗体Fc領域は、変異S228P、L235Eを有し、任意で、P329Gを有するヒトサブクラスIgG4のものである。
【００９９】
一つの態様において、コンジュゲートは、N末端からC末端への方向に、
・SEQ ID NO:24または25のPAI-1潜在誘導ポリペプチド、
・SEQ ID NO:27のペプチドリンカー、
・SEQ ID NO:26のSMBドメイン、
・SEQ ID NO:07または15の抗体Fc領域
を含む。
【０１００】
一つの態様において、コンジュゲートは、
2017501970.tif 000025
のアミノ酸配列を有する。このコンジュゲートは、以後、PAI1-0004として示される。
【０１０１】
一つの態様において、コンジュゲートは、
2017501970.tif 000026
のアミノ酸配列を有する。このコンジュゲートは、以後、PAI1-0005として示される。
【０１０２】
一つの態様において、コンジュゲートは、
2017501970.tif 000027
のアミノ酸配列を有する。このコンジュゲートは、以後、PAI1-0036として示される。
【０１０３】
参照抗体および上に概説されたコンジュゲートを、実施例1に概説されるPAI-1阻害アッセイにおいて試験した。非グリコシル化ヒトPAI-1およびグリコシル化ヒトPAI-1に対する決定されたIC50値を、以下の表に示す。
2017501970.tif 000028
【０１０４】
見られるように、本発明の概念によるコンジュゲートは、参照抗体より強力な潜在誘導（阻害）化合物である。参照抗体は、グリコシル化ヒトPAI-1に対してより低い親和性（より高いIC50値）を示すが、本明細書において報告されるコンジュゲートは、ヒトPAI-1の両方の型、即ち、グリコシル化および非グリコシル化に対して比較可能な親和性を示した。
【０１０５】
対応する用量応答曲線は、図3および4に示される。
【０１０６】
さらに、特許請求の範囲において、「含む」という単語は他の要素または工程を除外せず、不定冠詞「一つの（a）」または「一つの（an）」は複数を除外しない。単一の単位は、特許請求の範囲に記載されたいくつかの特色の機能を果たし得る。具体的には、属性または値に関する「本質的に」、「約」、「およそ」等の用語も、それぞれ、属性を正確に定義するかまたは正確に値を定義する。特許請求の範囲における参照記号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【０１０７】
以下の実施例、配列、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲において示される。本発明の本旨から逸脱することなく、示された手法を修飾することが可能であることが理解される。
【実施例】
【０１０８】
実施例1
融合タンパク質の生成
組換えDNA技術
Sambrook,J.et al.,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されるような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。分子生物学的な試薬は、製造業者の説明書に従って使用された。
【０１０９】
遺伝子合成
遺伝子合成断片は、所定の仕様書に従って、Geneart（Regensburg,Germany）に注文された。真核細胞における分泌のためタンパク質を標的指向するリーダーペプチド
2017501970.tif 000029
をコードする5'末端DNA配列を含み、合成された遺伝子の5'末端および3'末端に独特の制限部位を含む、RCL-SMB-Fc融合タンパク質をコードする全ての遺伝子セグメントを合成した。
【０１１０】
DNA配列決定
Sequiserve GmbH（Vaterstetten,Germany）において実施された二本鎖配列決定によってDNA配列を決定した。
【０１１１】
DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
GCG（Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin）ソフトウェアパッケージバージョン10.2およびInfomax's Vector NT1 Advance suiteバージョン11.0を、配列作成、マッピング、分析、アノテーション、および図示のために使用した。
【０１１２】
発現ベクター
記載された融合分子の発現のため、CMVイントロンAプロモーターを含むcDNA編成に基づき、（例えば、HEK293-F細胞における）一過性発現のための発現プラスミドを使用した。
【０１１３】
抗体発現カセットの他に、ベクターは以下のものを含有していた：
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製開始点、および
・大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
【０１１４】
抗体遺伝子の転写単位は、以下の要素から構成される：
・5'末端の独特の制限部位
・ヒトサイトメガロウイルスに由来する前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・それに続く、イントロンA配列、
・ヒト抗体遺伝子の5'非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・RCL、SMB、ならびにヒト抗体IgG1のヒンジおよびドメインCH2およびCH3の融合タンパク質のための遺伝子、
・ポリアデニル化シグナル配列を含む3'非翻訳領域、ならびに
・3'末端の独特の制限部位。
【０１１５】
一過性トランスフェクションおよび安定的トランスフェクションのため、形質転換された大腸菌培養物からのプラスミド調製によって、大量のプラスミドを調製した（Nucleobond AX,Macherey-Nagel）。
【０１１６】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.(eds.),John Wiley & Sons,Inc.に記載されているような標準的な細胞培養技術を使用した。
【０１１７】
HEK293-F系における一過性トランスフェクション
製造業者の説明書（Invitrogen,USA）に従って、FreeStyle（商標）293発現系を使用して、ヒト胎児由来腎臓293-F細胞の一過性トランスフェクションによって、RCL-SMB-Fc融合タンパク質を発現させた。簡単に説明すると、懸濁FreeStyle（商標）293-F細胞を、37℃／8％CO2でFreeStyle（商標）293 Expression培地において培養し、トランスフェクションの日に1〜2×106生細胞/mlの密度で新鮮な培地に細胞を播種した。250mlの最終トランスフェクション体積で、325μlの293fectin（商標）（Invitrogen,Germany）および500μgのプラスミドDNAを使用して、DNA-293fectin（商標）複合体を、Opti-MEM（登録商標）I培地（Invitrogen,USA）において調製した。融合タンパク質を含有している細胞培養上清を、トランスフェクションの7日後に30分間の14000gでの遠心分離によって採集し、滅菌フィルター（0.22μm）でろ過した。精製まで-20℃で上清を保管した。
【０１１８】
タンパク質決定
精製された融合タンパク質のタンパク質濃度を、Pace et.al.,Protein Science,1995,4,2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmでの光学濃度（OD）を決定することによって決定した。
【０１１９】
上清中の融合タンパク質濃度決定
細胞培養上清中の融合タンパク質の濃度を、プロテインA-HPLCクロマトグラフィによって測定した。簡単に説明すると、Dionex HPLC-Systemにおいて、プロテインAに結合する融合タンパク質を含有している細胞培養上清を、50mM K2HPO4、300mM NaCl（pH7.3）で、HiTrap Protein Aカラム（GE Healthcare）に適用し、550mM酢酸（pH2.5）によってマトリックスから溶出させた。溶出したタンパク質を、UV吸光度およびピーク面積の積分によって定量化した。精製された標準IgG1抗体を、標準として用いた。
【０１２０】
融合タンパク質の精製
融合タンパク質を、Protein A-Sepharose（商標）（GE Healthcare,Sweden）を使用したアフィニティクロマトグラフィおよびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィによって、細胞培養上清から精製した。簡単に説明すると、滅菌ろ過された細胞培養上清を、PBS緩衝液（10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および2.7mM KCl（pH7.4））によって平衡化されたHiTrap ProteinA HP（5ml）カラムに適用した。未結合のタンパク質を平衡化緩衝液によって洗浄した。融合タンパク質を、0.1Mクエン酸緩衝液（pH2.8）によって溶出させ、タンパク質を含有している画分を、0.1mlの1Mトリス（pH8.5）によって中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、3mlの体積にまでAmicon Ultra centrifugal filter device（MWCO：30K,Millipore）によって濃縮し、20mMヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0）によって平衡化されたSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare,Sweden）にロードした。5％未満の高分子量凝集物を含む精製された融合タンパク質を含有している画分をプールし、-80℃で1.0mg/mlのアリコートとして保管した。
【０１２１】
SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲル系（Invitrogen）を、製造業者の説明書に従って使用した。具体的には、4〜20％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）TRIS-Glycine Pre-Castゲル、およびNovex（登録商標）TRIS-Glycine SDSランニング緩衝液を使用した。ゲルの実行前に、NuPAGE（登録商標）試料還元剤を添加することによって、試料の還元を達成した。
【０１２２】
分析用サイズ排除クロマトグラフィ
融合タンパク質の凝集およびオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィを、HPLCクロマトグラフィによって実施した。簡単に説明すると、プロテインAによって精製された融合タンパク質を、Agilent HPLC 1100系において、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4（pH7.5）で、Tosoh TSKgel G3000SWカラムに適用するか、またはDionex HPLC-Systemにおいて、2×PBSで、Superdex 200カラム（GE Healthcare）に適用した。溶出したタンパク質を、UV吸光度およびピーク面積の積分によって定量化した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準として用いた。
【０１２３】
質量分析
脱グリコシル融合タンパク質の全量を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）を介して決定し確認した。簡単に説明すると、100μgの精製された融合タンパク質を、2mg/mlまでのタンパク質濃度で、37℃で12〜24時間、100mM KH2PO4/K2HPO4（pH7）中の50mU N-グリコシダーゼF（PNGaseF,ProZyme）によって脱グリコシルし、その後、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）でのHPLCを介して脱塩した。還元された鎖の量を、脱グリコシルおよび還元の後にESI-MSによって決定した。簡単に説明すると、115μl中の50μgの抗体を、60μlの1M TCEPおよび50μlの8M塩酸グアニジンと共にインキュベートし、その後、脱塩した。全量および還元された鎖の量を、NanoMateソースが装備されたQ-Star Elite MS系でのESI-MSを介して決定した。
【０１２４】
実施例2
PAI-1阻害アッセイ
方法は、Lawrence et al.Eur.J.Biochem.186(1989)523-533によって記載されたアッセイ原理に基づく。明確な量の活性型PAI-1タンパク質を、活性型PAI-1によって不可逆的に阻止される明確な量のセリンプロテアーゼと混合する。セリンプロテアーゼによって加水分解され、吸光度または蛍光の増加をもたらす発色性ペプチドの添加によって、残存するセリンプロテアーゼ活性を定量的に決定する。明確な濃度の試験化合物との活性型PAI-1タンパク質のプレインキュベーションは、PAI-1の潜在誘導（阻害）をもたらすことができる。試験化合物によるPAI-1阻害の程度は、セリンプロテアーゼ活性の比例する増加（即ち、吸光度または蛍光の増加）を測定することによって決定される。このアッセイにおける試験化合物の段階希釈物の使用は、試験化合物の効力をIC50値として導出することができる用量応答曲線をもたらす。IC50値は、セリンプロテアーゼ活性の50％の増加として観察される、PAI-1活性の50％の阻害を引き起こす試験化合物の濃度を表す。典型的なPAI-1阻害アッセイは、1ウェル当たり100μlの体積で、黒色96穴平底マイクロタイタープレート（Costar 3915）において実施される。試験化合物、活性型PAI-1、セリンプロテアーゼ、および発色性ペプチドを含む全成分を、アッセイ緩衝液（150mM NaCl、0.01％トゥイーン80、および0.1mg/ml脂肪酸不含BSAを含有している50mMトリスHCl（pH7.5））で希釈する。各ウェルにおいて、60μlのアッセイ緩衝液を、10μlの10倍濃縮の試験化合物、および10μlの10倍濃縮の活性型ヒトPAI-1タンパク質（組換え非グリコシル化ヒトPAI-1、Rocheバッチ＃10_02、N末端6×Hisタグ付き融合タンパク質として大腸菌において作製されたもの、1μg/ml；または組換えグリコシル化ヒトPAI-1、Molecular Innovations製品＃GLYHPAI-A、昆虫細胞において作製されたもの、0.25μg/ml）と混合する。37℃での90分間のインキュベーションの後、10μlの10倍濃縮のセリンプロテアーゼを添加する（rPA＝tPA欠失バリアントBM 06.022、Rocheロット＃PZ0606P064、バッチ＃G366、150ng/ml）。37℃での30分間のインキュベーションの後、10μlの10倍濃縮発色性ペプチドを添加する（Spectrofluor tPA、American Diagnostica製品＃444F、100μM）。37℃での2時間の付加的なインキュベーションの直前および直後に、蛍光プレートリーダ（358nmでの励起および440nmでの放射）によって、各ウェル内の蛍光を測定する。t＝2時間における蛍光からt＝0時間における蛍光を差し引いた差から、蛍光強度の正味の増加を計算する。試験化合物なしの対照反応を、アッセイのダイナミックレンジを明確にするために含める。セリンプロテアーゼおよび活性型PAI-1タンパク質による反応が、下限（0％rPA活性、100％PAI-1活性）を表し；PAI-1タンパク質なしのセリンプロテアーゼによる反応が、上限（100％rPA活性、0％PAI-1活性）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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