(57)【要約】  本発明は、出血の予防的および「オンデマンド」処置のための、および先天性または後天性出血障害を有する患者における手術中または後の出血エピソードを予防するための半減期延長型第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）での投与レジメンに関する。本発明は、大出血の状況における、すなわち、外傷または手術による出血障害を有さない患者における失血を処置するまたは予防するための半減期延長型ＦＶＩＩａの使用にさらに関する。本発明の別の態様は、後天性血友病の処置である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における出血を予防する方法における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質であって、該半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が少なくとも１日１回の投与間隔で、血液１ｍｌあたり少なくとも約３０ＩＵのＣｍａｘにつながる用量で対象に投薬され、該活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される前記半減期延長型第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質。
【請求項２】
用量が血液１ｍｌあたり約３０〜１６０ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３】
用量が血液１ｍｌあたり約３５〜１３０ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１または請求項２に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４】
用量が血液１ｍｌあたり約４０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５】
用量が血液１ｍｌあたり約４６〜９２ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６】
用量が血液１ｍｌあたり約３０〜７０ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１または請求項２に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項７】
用量が血液１ｍｌあたり約３６〜５６ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１、２または６のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項８】
用量が血液１ｍｌあたり約４１〜５１ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項９】
用量が血液１ｍｌあたり約７０〜１１０ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１０】
用量が血液１ｍｌあたり約８０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１〜３、または９のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１１】
用量が血液１ｍｌあたり約８２〜１０２ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１〜３、９または１０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１２】
用量が血液１ｍｌあたり約８７〜９７ＩＵのＣｍａｘにつながる、請求項１〜３、または９〜１１のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１３】
対象における出血を予防する方法における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が少なくとも１日１回の投与間隔で、約２００〜８００μｇ／ｋｇである前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１４】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約３００〜７００μｇ／ｋｇである、請求項１３に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１５】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約３２０〜６５０μｇ／ｋｇである、請求項１３または請求項１４に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１６】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約３１０〜３３０μｇ／ｋｇである、請求項１３または請求項１４に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１７】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約６３０〜６５０μｇ／ｋｇである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１８】
対象における出血を予防する方法における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が少なくとも１日１回の投与間隔で、約１７５０〜８０００ＩＵ／ｋｇであり、該活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項１９】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約１８００〜７０００ＩＵ／ｋｇである、請求項１８に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２０】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約２５００〜６５００ＩＵ／ｋｇである、請求項１８または請求項１９に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２１】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約３２００〜５８００ＩＵ／ｋｇである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２２】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約２８００〜３２００ＩＵ／ｋｇである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２３】
ＦＶＩＩａポーションの用量が約５８００〜６２００ＩＵ／ｋｇである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２４】
投与間隔が約１から５日に１回である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２５】
投与間隔が約２から４日に１回である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２６】
投与間隔が約２から３日に１回である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２７】
投与間隔が約１日おきに１回である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２８】
対象における出血エピソードを処置する方法（「オンデマンド処置」）における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、該半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が血液１ｍｌあたり少なくとも約３０ＩＵのＣｍａｘにつながる用量で対象に投薬され、該活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項２９】
対象における出血エピソードを処置する方法（「オンデマンド処置」）における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約２００〜８００μｇ／ｋｇである前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３０】
対象における出血エピソードを処置する方法（「オンデマンド処置」）における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約１７５０〜８０００ＩＵ／ｋｇであり、該活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３１】
第１の投薬が患者の３０％における出血の終結につながる、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３２】
半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の第２の投薬が約５〜１０時間、好ましくは約６〜８時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に投薬される、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３３】
第２の投薬が患者の６０％における出血の終結につながる、請求項３２に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３４】
対象における出血エピソードが外傷の結果である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３５】
少なくとも２０％の輸血必要量（赤血球（ＲＢＣ）および／または新鮮凍結血漿（ＦＦＰ））の減少が投薬後２４時間以内に達成される、請求項３４に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３６】
手術中または後に対象における出血エピソードを予防する方法における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、該半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が血液１ｍｌあたり少なくとも約３０ＩＵのＣｍａｘにつながる用量で手術前、中および／または後に対象に投薬され、該活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３７】
手術中または後に対象における出血エピソードを予防する方法における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、該半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が手術前、中および／または後に対象に投薬され、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約２００〜８００μｇ／ｋｇである前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３８】
手術中または後に対象における出血エピソードを予防する方法における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、該半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が手術前、中および／または後に対象に投薬され、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約１７５０〜８０００ＩＵ／ｋｇであり、該活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項３９】
半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が約５〜１０時間、好ましくは約６〜８時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に再投薬される、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４０】
止血能が全投与間隔に関して少なくとも１％のトラフ値で維持される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４１】
前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の半減期が約５時間よりも大きい、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４２】
半減期増強部分（ＨＬＥＭ）がポリアルキレングリコール部分、好ましくはＰＥＧである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４３】
半減期増強部分（ＨＬＥＭ）が半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４４】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）である、請求項４３に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４５】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がＦｃＲｎ結合パートナーである、請求項４３に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４６】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がアルブミンまたは抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を有さない免疫グロブリンである、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４７】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がアルブミンである、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４８】
用量が少なくとも約５００μｇ／ｋｇである、請求項４７に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項４９】
用量が約５００〜２５００μｇ／ｋｇである、請求項４７または請求項４８に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５０】
用量が約７５０〜２０００μｇ／ｋｇである、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５１】
用量が約１０００〜１５００μｇ／ｋｇである、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５２】
用量が約１２００〜１５００μｇ／ｋｇである、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５３】
用量が約７４０〜７６０μｇ／ｋｇである、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５４】
用量が約１４９０〜１５１０μｇ／ｋｇである、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５５】
約２から４日に１回の投与間隔で対象における出血を予防する方法における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む半減期延長型第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質。
【請求項５６】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）である、請求項５５に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５７】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がＦｃＲｎ結合パートナーである、請求項５５に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５８】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がアルブミンまたは抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を有さない免疫グロブリンである、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項５９】
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）がアルブミンである、請求項５５、５７または５８のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６０】
投与間隔が約２から３日に１回である、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６１】
投与間隔が約１日おきに１回である、請求項６０に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６２】
半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の配列が配列番号１に示された配列を有する、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６３】
方法が予防的投与レジメンに関与する、請求項１〜２７または５５〜６１のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６４】
対象がヒトである、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６５】
ヒトが血友病Ａまたは血友病Ｂに罹患している、請求項６４に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６６】
ヒトが後天性血友病に罹患している、請求項６４に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６７】
用量が静脈内に投薬される、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６８】
対象がＦＶＩＩＩおよび／またはＦＩＸに対する阻害抗体を有する、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【請求項６９】
対象がインヒビター保有先天性血友病（ＣＨｗＩ）を有する、請求項６８に記載の使用のための半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、２０１４年４月１１日に出願された米国特許出願第６１／９７８２１８号からの、２０１４年５月９日に出願された欧州特許出願第１４１６７６１２．２号からのおよび２０１４年５月１５日に出願された欧州特許出願第１４１６８３８９．６号からの優先権を主張する。全ての出願の全内容は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、電子的形態の配列表と共に出願される。配列表の全内容は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００３】
本発明は、出血の予防的および「オンデマンド」処置のための、および先天性または後天性出血障害を有する患者における手術中または後の出血エピソードを予防するための半減期延長型第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）での投与レジメンに関する。本発明は、大出血の状況における、すなわち、外傷または手術による出血障害を有さない患者における失血を処置するまたは予防するための半減期延長型ＦＶＩＩａの使用にさらに関する。本発明の別の態様は、後天性血友病の処置である。
【背景技術】
【０００４】
血友病Ａは、遺伝性凝固障害である。血友病Ａは血液凝固第ＶＩＩＩ因子の染色体Ｘ連鎖性欠損症から生じることから、ほとんど排他的に男性に影響をおよぼし、その発生率は１０，０００個体あたり１〜２個体である。Ｘ染色体欠損は、女性の保因者によって伝染され、彼女ら自身は臨床的に症候性ではない。血友病Ａの臨床症状は、出血傾向の増加である。第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤での補充療法が導入される前、重度の血友病を有する人の平均寿命は、２０歳未満であった。血漿から産出された第ＶＩＩＩ因子の濃縮製剤や後に第ＶＩＩＩ因子の組換え型を使用することにより、血友病患者の状況が相当に改善され、平均寿命が大きく延ばされ、患者の大部分がほぼ普通の生活を送れるとの見込みが得られた。血友病Ａの１／５の蔓延率である血友病Ｂは、非機能性第ＩＸ因子またはこの因子の欠損によって引き起こされ、血漿からの第ＩＸ因子濃縮製剤または第ＩＸ因子の組換え型で処置される。
【０００５】
血友病の療法の目標は、大出血を処置するかまたは予防し、それによって、身体障害性関節および組織損傷を減少させ、クオリティオブライフ（ＱｏＬ）を改善することである。血友病Ａと血友病Ｂの両方において、疾患を処置することにおける最も重大な医学的問題は、補充因子に対する阻害同種抗体の産出である。全ての血友病Ａ患者の最大３０％が第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を発達する。免疫寛容導入療法への感受性がより低く、ＦＩＸに結合した場合、アレルギー反応をトリガーする潜在性がより高いので、第ＩＸ因子に対する阻害抗体は程度はより少ないが、より重度の結果をもたらす。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害抗体（特に高力価インヒビター）を発達した血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ欠損症）または血友病Ｂ（ＦＩＸ欠損症）を有する患者（インヒビター保有先天性血友病（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、ＣＨｗＩ）の処置は、第ＶＩＩＩ因子またはＩＸでの通常の補充が効果的ではないため、困難である。
【０００６】
第ＶＩＩＩ因子もしくはＦＩＸ活性または機能を阻害する自己抗体の形成につながる第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子への別の免疫反応は、それぞれ、後天性血友病Ａまたは後天性血友病Ｂと称される。この状態は、通常、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子におけるいかなる欠損症も有さない患者において生じる。後天性血友病は、人口百万人あたりの年間発生率が０．２〜１．０であるまれな状態である。症例の大部分は第ＶＩＩＩ因子に対する自己抗体が原因であり、後天性血友病Ｂの症例の報告はわずかである。自己抗体は、主に、凝固因子に結合し、それらの活性化または機能を部分的または完全に中和するまたはそれらのクリアランスを促進するＩｇＧ４抗体である。これは、高比率の冒された患者において重篤な大出血をもたらす。出血の共通部位は、関節および筋肉に主に出血する遺伝性血友病を有する患者とは対照的に、皮膚、粘膜、筋肉および後腹膜である。ＣＨｗＩと同様に、後天性血友病を活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤または組換え活性化第ＶＩＩ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標），Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）で処置して、出血エピソードを制御することができる。
【０００７】
凝固の現在のモデルは、凝固の生理学的トリガーが脈管構造の外に通常位置するＴＦ発現細胞の表面上での組織因子（ＴＦ）と第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）間の複合体の形成であると述べている。これは、一部のトロンビンを最終的に産出する第ＩＸ因子および第Ｘ因子の活性化につながる。正のフィードバックループでは、トロンビンは、いわゆる血液凝固カスケードの「内因性」アームである第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を活性化し、したがって、完全な止血を達成するための完全なトロンビンバーストの産出に必要である第Ｘａ因子の産出を増幅する。第ＶＩＩａ因子の超生理学的濃度を投薬することによって、止血が第ＶＩＩＩａ因子および第ＩＸａ因子の必要性を迂回して達成されることが示された。第ＶＩＩ因子（特許文献１）に関するｃＤＮＡのクローニングにより、医薬品としての活性化第ＶＩＩ因子を開発することが可能になった。第ＶＩＩａ因子は、１９８８年に初めて投薬に成功した。
【０００８】
ＦＶＩＩは、約５０ｋＤａの分子量を有する単鎖糖タンパク質であり、肝細胞によって４０６アミノ酸の不活性酵素前駆体として血流中に分泌される。ＦＶＩＩは、タンパク質のＮ末端Ｇｌａドメインに局在化した１０のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基（６、７、１４、１６、１９、２０、２５、２６、２９、および３５位）を含有する。Ｇｌａ残基は、それらの生合成にビタミンＫを必要とする。トリプシン型セリンプロテアーゼドメインが後に続く２つの上皮性増殖因子ドメインがＧｌａドメインに対しＣ末端に位置している。ＦＶＩＩのさらなる翻訳後修飾には、ヒドロキシル化（Ａｓｐ６３）、Ｎ−（Ａｓｎ１４５およびＡｓｎ３２２）およびＯ型グリコシル化（Ｓｅｒ５２およびＳｅｒ６０）が包含される。
【０００９】
ＦＶＩＩは、Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３での単一ペプチド結合のタンパク質分解によってその活性型第ＶＩＩａ因子に転換され、これは、２つのポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（２４ｋＤａ）およびＣ末端重鎖（２８ｋＤａ）の形成につながり、これらは、１つのジスルフィド架橋によって一緒に保持される。他のビタミンＫ依存性凝固因子とは対照的に、これらの他のビタミン−Ｋ依存性凝固因子の活性化中に切断される活性化ペプチドは、ＦＶＩＩに関して報告されていない。Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３切断部位および一部の下流アミノ酸は、他のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化切断部位との相同性を示す。
【００１０】
Ｉｌｅ１５３とＡｓｐ３４３間の活性化切断後に塩橋の形成が第ＶＩＩａ因子の活性コンホメーションを達成するのに必須である。第ＶＩＩ因子の活性化切断は、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩａ因子、第７因子活性化プロテアーゼ（Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｅｖｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）（ＦＳＡＰ）およびトロンビンによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成することができる。非特許文献１は、一部の切断がＡｒｇ２９０および／またはＡｒｇ３１５で重鎖においても生じることを報告した。
【００１１】
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、ＣＨｗＩにおける出血を処置することが米国と欧州の両方において承認されている組換え第ＶＩＩａ因子生成物である（非特許文献２）。しかしながら、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、極度に短い半減期（非出血状況において２．８９時間および出血エピソードにおいて２．３０時間）を有するので、ｒＦＶＩＩａが急性出血エピソードの最初の処置中に２時間の間隔で注入されることが推奨される（非特許文献３）。
【００１２】
ｒＦＶＩＩａの臨床的使用は、その極度に短い半減期によって妨げられてきた。頻繁な静脈内（ＩＶ）注入の必要性は、患者およびそれらの障害を処置する医師の著しい負担を有する。特により幼い子供では、このようなレジメンは、しばしば（常にではないが）、感染性合併症を回避し、ラインにおける血餅の発達を予防するために極度に清潔に保たれなければならない静脈アクセスデバイスの挿入を必要とする。このようなデバイスに関連するリスクおよび病的状態は、ＣＨｗＩを有する一部の非常に幼い子供が十分なケアを受けるのを妨害し得る。
【００１３】
ＣＨｗＩのための予防的薬剤としてｒＦＶＩＩａを使用するいくつかの試みがあった（非特許文献４；非特許文献５）。延ばされた半減期およびより良い回復率を有するＦＶＩＩａ生成物は、患者がより少ない注入で十分な止血を達成するのを可能にする。予防法の多くの利点の１つは、関節出血の年間数の低下、その結果、深刻な関節疾患の発生率の減少である。様々な研究がＦＶＩＩａの半減期延長型バージョンを提供するために試みられた（特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６を参照されたい）。
【００１４】
特許文献３は、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子アルブミン結合ポリペプチドに関する。これらのアルブミン融合物は、第ＶＩＩ／ＦＶＩＩａ因子生物活性を保持することが示され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子の機能的血漿半減期の著しい延長を示した。特許文献７もＦＶＩＩａ−アルブミン融合タンパク質に関する。
【００１５】
非特許文献６は、ｒＦＶＩＩａと比較して延ばされた半減期を有する４０Ｋ糖ペグ化組換え第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）バイパス剤（Ｎ７−ＦＰ）の複数用量がＣＨｗＩを有する患者においてよく許容され、重大な有害作用が観察されなかったことを示した。しかしながら、出血イベント数の全体的な減少が見られたが、用量−応答関連性は、決定されず、すなわち、高用量の効能は、最も低い用量と区別されず、出血イベントが全ての試験された用量で起こり続けた。結果的に、インヒビター患者の予防法におけるＮ７−ＧＰの臨床開発は中断された。
【００１６】
非特許文献７は、高凝血促進性活性およびより長い作用に関して開発された変異ヒト組換え第ＶＩＩａ因子変異体（ＢＡＹ８６−６１５０）の単一用量が、インヒビターを有するまたは有さない中程度のまたは重度の血友病ＡまたはＢを有する非出血男性において安全性への懸念を示さなかったことを発表した。ＢＡＹ８６−６１５０の半減期は、ｒＦＶＩＩａに関するものより長い５〜７時間であった。しかしながら、第ＩＩ／ＩＩＩ相試験は、変異ｒＦＶＩＩａに対する中和抗体が試験において検出されたため、中断された。
【００１７】
ＦＶＩＩａポリペプチドも、正常な凝固系を有する対象における手術前後のおよび外傷性失血に関連する出血を処置するための治療薬として使用することができる。例えば、ＦＶＩＩａポリペプチドを患者に投薬して、凝固を促進し、外傷および手術に関連する失血を減少させ、さらに、輸血の必要量を減少させることができる。
【００１８】
ＦＶＩＩａポリペプチドは、凝固を促進し、傷害の結果として出血を有する対象における失血を予防するためにも使用することができる。これらの患者は、遺伝性または後天性血友病を有し得るまたは有し得ない。しかしながら、深刻な外傷における直接的止血への補助剤としてのｒＦＶＩＩａの効能および安全性を評価する第３相臨床試験は、早期に終結された（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】ＵＳ４，７８４，９５０
【特許文献２】ＷＯ２００４／１０１７４０
【特許文献３】ＷＯ２００７／０９０５８４
【特許文献４】ＷＯ２００７／０２２５１２
【特許文献５】ＷＯ２０１０／０９１１２２
【特許文献６】ＷＯ２０１１／０９２２４２
【特許文献７】ＵＳ２０１４／０００４０９５
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｍｏｌｌｅｒｕｐら，１９９５（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：５０１〜５０５）
【非特許文献２】Ａｕｅｒｓｗａｌｄ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒｆｉｎｉ  Ｍ，２０１０，ＪＣＤ；２：（１）：１〜８
【非特許文献３】Ｂｒａｃｋｍａｎｎ  Ｈ−Ｈら，２０００（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．１１（ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ３９〜Ｓ４４
【非特許文献４】Ｂｉａｎｃｏ  ＲＰら，２０１０．Ｍｅｄｉｃｉｎａ（Ｂｕｅｎｏｓ  Ａｉｒｅｓ）．７０：２０９〜２１４
【非特許文献５】Ａｕｅｒｓｗａｌｄ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒｆｉｎｉ  Ｍ，２０１０．ＪＣＤ．２（１）：１〜８
【非特許文献６】Ｌｊｕｎｇ  Ｒら，２０１３（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１１：１２６０〜１２６８
【非特許文献７】Ｍａｈｌａｎｇｕ  ＪＮら，２０１２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１０：７７３〜７８０）
【非特許文献８】Ｈａｕｓｅｒ  ＣＪら，２０１０．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＴＲＡＵＭＡ（登録商標）  Ｉｎｊｕｒｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ．６９（３）：４８９〜５００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
半減期が延ばされたＦＶＩＩａ変異体での効果的な投与レジメンの必要性が存続し、特に、このような変異体を用いる予防的投与レジメンは、非常に有利であろう。
【００２２】
本発明は、対象における出血を予防すること（「予防的処置」）、外傷後を含めた対象における出血エピソードを処置すること（「オンデマンド処置」）、および先天性または後天性出血障害を有するまたは有さない患者における手術中または後の出血エピソードを予防することにおける使用のための、ＦＶＩＩａポーションおよび半減期増強部分（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）（ＨＬＥＭ）を含む半減期延長型第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）（例えば、ｒＦＶＩＩａ−アルブミン）での投与レジメンに関する。
【００２３】
特に、本発明は、半減期延長型ＦＶＩＩａを使用した予防的処置に関する。このような予防的処置は、患者の不快感を軽減し、医療従事者への必要な訪問回数を減少させる。これらの利点は、患者コンプライアンス、したがって、血友病のための予防的療法の有効性に良い方に影響することになる。効果的な予防法は、関節出血の年間回数の低下をもたらし、結果として、深刻な関節疾患の発生率を減少させ得るかつ／または発症を遅延させ得る。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の重要な態様は、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質での出血の予防的処置に関するレジメンを提供することである。
【００２５】
本発明は、対象における出血を予防する方法（「予防的処置」）における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が少なくとも１日１回の投与間隔で、血液１ｍｌあたり少なくとも約３０ＩＵのＣｍａｘにつながる用量で対象に投薬され、活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質に関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜１６０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３５〜１３０ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４６〜９２ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜７０ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３６〜５６ＩＵのＣｍａｘにつながる。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４１〜５１ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約７０〜１１０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８２〜１０２ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８７〜９７ＩＵのＣｍａｘにつながる。
【００２６】
本発明は、対象における出血を予防する方法（「予防的処置」）における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が少なくとも１日１回の投与間隔で、約２００〜８００μｇ／ｋｇである半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質にも関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３００〜７００μｇ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２０〜６５０μｇ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３１０〜３３０μｇ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約６３０〜６５０μｇ／ｋｇである。
【００２７】
本発明は、対象における出血を予防する方法（「予防的処置」）における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が少なくとも１日１回の投与間隔で、約１７５０〜８０００ＩＵ／ｋｇであり、活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質にさらに関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１８００〜７０００ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２５００〜６５００ＩＵ／ｋｇである。さらなる好ましい実施形態では、ＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２００〜５８００ＩＵ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２８００〜３２００ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約５８００〜６２００ＩＵ／ｋｇである。
【００２８】
上記の実施形態の任意の１つでは、投与間隔は、１から４日に１回、１から３日に１回を含めた約１から５日に１回、好ましくは約２から４日に１回または約２から３日に１回とすることができる。投与間隔は、最も好ましくは、約１日おきに１回（すなわち、２日に１回）である。
【００２９】
上記の実施形態では、方法は、予防的投与レジメンに好ましくは関与する。
【００３０】
本発明は、対象における出血エピソードを処置する方法（「オンデマンド処置」）における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が血液１ｍｌあたり少なくとも約３０ＩＵのＣｍａｘにつながる用量で対象に投薬され、活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質に関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜１６０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３５〜１３０ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４６〜９２ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜７０ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３６〜５６ＩＵのＣｍａｘにつながる。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４１〜５１ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約７０〜１１０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８２〜１０２ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８７〜９７ＩＵのＣｍａｘにつながる。好ましい実施形態では、第１の投薬は、患者の少なくとも３０％における出血の終結につながる。場合により、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の第２の投薬は、約５〜１０時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に投薬される。投与間隔は、好ましくは約６〜８時間である。好ましい実施形態では、第２の投薬は、患者の少なくとも６０％における出血の終結につながる。
【００３１】
本発明は、対象における出血エピソードを処置する方法（「オンデマンド処置」）における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約２００〜８００μｇ／ｋｇである半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質にも関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３００〜７００μｇ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２０〜６５０μｇ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３１０〜３３０μｇ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約６３０〜６５０μｇ／ｋｇである。好ましい実施形態では、第１の投薬は、患者の少なくとも３０％における出血の終結につながる。場合により、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の第２の投薬は、約５〜１０時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に投薬される。投与間隔は、好ましくは約６〜８時間である。好ましい実施形態では、第２の投薬は、患者の少なくとも６０％における出血の終結につながる。
【００３２】
本発明は、対象における出血エピソードを処置する方法（「オンデマンド処置」）における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約１７５０〜８０００ＩＵ／ｋｇであり、活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質にさらに関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１８００〜７０００ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２５００〜６５００ＩＵ／ｋｇである。さらなる好ましい実施形態では、ＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２００〜５８００ＩＵ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２８００〜３２００ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約５８００〜６２００ＩＵ／ｋｇである。好ましい実施形態では、第１の投薬は、患者の少なくとも３０％における出血の終結につながる。場合により、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の第２の投薬は、約５〜１０時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に投薬される。投与間隔は、好ましくは約６〜８時間である。好ましい実施形態では、第２の投薬は、患者の少なくとも６０％における出血の終結につながる。
【００３３】
本発明は、外傷の結果である対象における出血エピソードを処置する方法における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が血液１ｍｌあたり少なくとも約３０ＩＵのＣｍａｘにつながる用量で対象に投薬され、活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質に関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜１６０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３５〜１３０ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４６〜９２ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜７０ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３６〜５６ＩＵのＣｍａｘにつながる。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４１〜５１ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約７０〜１１０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８２〜１０２ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８７〜９７ＩＵのＣｍａｘにつながる。好ましい実施形態では、第１の投薬は、投薬後２４時間以内に少なくとも２０％の赤血球（ＲＢＣ）および／または新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）の輸血必要量の減少につながる。
【００３４】
本発明は、外傷の結果である対象における出血エピソードを処置する方法における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約２００〜８００μｇ／ｋｇである半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質にも関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３００〜７００μｇ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２０〜６５０μｇ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３１０〜３３０μｇ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約６３０〜６５０μｇ／ｋｇである。好ましい実施形態では、第１の投薬は、投薬後２４ｈ以内に２０％の輸血必要量（ＲＢＣおよび／またはＦＦＰ）の減少につながる。
【００３５】
本発明は、外傷の結果である対象における出血エピソードを処置する方法における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約１７５０〜８０００ＩＵ／ｋｇであり、活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質にさらに関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１８００〜７０００ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２５００〜６５００ＩＵ／ｋｇである。さらなる好ましい実施形態では、ＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２００〜５８００ＩＵ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２８００〜３２００ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約５８００〜６２００ＩＵ／ｋｇである。好ましい実施形態では、第１の投薬は、投薬後２４ｈ以内に２０％の輸血必要量（ＲＢＣおよび／またはＦＦＰ）の減少につながる。
【００３６】
本発明は、手術中または後に対象における出血エピソードを予防する方法における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が血液１ｍｌあたり少なくとも約３０ＩＵのＣｍａｘにつながる用量で手術前、中および／または後に対象に投薬され、活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質に関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜１６０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３５〜１３０ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４６〜９２ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜７０ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３６〜５６ＩＵのＣｍａｘにつながる。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４１〜５１ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約７０〜１１０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８２〜１０２ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８７〜９７ＩＵのＣｍａｘにつながる。半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、約５〜１０時間、好ましくは約６〜８時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に再投薬してもよい。代わりに、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、手術中の連続的輸注において使用してもよい。
【００３７】
本発明は、手術中または後に対象における出血エピソードを予防する方法における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が手術前、中および／または後に対象に投薬され、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約２００〜８００μｇ／ｋｇである半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質にも関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３００〜７００μｇ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２０〜６５０μｇ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３１０〜３３０μｇ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約６３０〜６５０μｇ／ｋｇである。好ましくは、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、約５〜１０時間、好ましくは約６〜８時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に再投薬される。代わりに、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、手術中の連続的輸注において使用してもよい。
【００３８】
本発明は、手術中または後に対象における出血エピソードを予防する方法における使用のための、
ａ）第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーション、および
ｂ）半減期増強部分（ＨＬＥＭ）
を含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質が手術前、中および／または後に対象に投薬され、対象に投薬される前記半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量が約１７５０〜８０００ＩＵ／ｋｇであり、活性（ＩＵ）がＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質にさらに関する。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１８００〜７０００ＩＵ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２５００〜６５００ＩＵ／ｋｇである。さらなる好ましい実施形態では、ＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２００〜５８００ＩＵ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２８００〜３２００ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約５８００〜６２００ＩＵ／ｋｇである。好ましくは、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、約５〜１０時間、好ましくは約６〜８時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に再投薬される。代わりに、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、手術中の連続的輸注において使用してもよい。
【００３９】
好ましい実施形態では、止血能（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は、全投与間隔に関してベースラインよりも少なくとも約１％、好ましくは少なくとも約２％大きい、より好ましくは全投与間隔に関してベースラインよりも５〜１５％大きいトラフ値で維持される。
【００４０】
本発明の半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、約５時間を超える半減期を好ましくは有する。
【００４１】
上記の実施形態の任意の１つでは、半減期増強部分（ＨＬＥＭ）は、ポリアルキレングリコール部分、好ましくはＰＥＧとすることができる。代わりに、半減期増強部分（ＨＬＥＭ）は、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）である。一実施形態では、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）である。別の実施形態では、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、ＦｃＲｎ結合パートナーである。好ましくは、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）ＦｃＲｎ結合パートナーは、アルブミンまたは抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を有さない免疫グロブリンである。
【００４２】
最も好ましくは、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、アルブミンである。本実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、少なくとも約５００μｇ／ｋｇである。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約５００〜２５００μｇ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約７５０〜２０００μｇ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１０００〜１５００μｇ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１１００〜１６００μｇ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１２００〜１５００μｇ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１３００〜１５００μｇ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１４００〜１５００μｇ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約７４０〜７６０μｇ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１４９０〜１５１０μｇ／ｋｇである。対象における出血を予防する方法（「予防的処置」）における使用に関して、投与間隔は、１から４日に１回、１から３日に１回、好ましくは約２から４日に１回または約２から３日に１回、最も好ましくは約１日おきに１回（すなわち、２日に１回）を含めた約１から５日に１回とすることができる。対象における出血エピソードを処置する方法（「オンデマンド処置」）における使用に関して、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の第２の投薬は、約５〜１０時間、好ましくは約６〜８時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象に投薬することができる。手術中または後に対象における出血エピソードを予防する方法における使用に関して、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、約５〜１０時間、好ましくは約６〜８時間の投与間隔で、第１の用量と等しい用量で対象再投薬することができる。
【００４３】
上記のように、ＦＶＩＩａ変異体の投薬に関して処置間隔を延長することは、特定の利点がある。したがって、別の態様では、本発明は、約２から４日に１回の投与間隔で対象における出血を予防する方法における使用のための、
ａ）ＦＶＩＩａポーション、および
ｂ）半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
を含む半減期延長型第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質に関する。一実施形態では、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）である。別の実施形態では、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、ＦｃＲｎ結合パートナーである。好ましくは、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）ＦｃＲｎ結合パートナーは、アルブミンまたは抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を有さない免疫グロブリンである。より好ましい実施形態では、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）は、アルブミンである。投与間隔は、１から４日に１回、１から３日に１回を含めた約１から５日に１回とすることができる。好ましくは、延長された投与間隔は、約２から４日に１回または約２から３日に１回である。投与間隔は、最も好ましくは約１日おきに１回（すなわち、２日に１回）である。本実施形態では、方法は、予防的投与レジメンに好ましくは関与する。
【００４４】
本発明の目的に関して、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質を投薬される好ましい対象は、ヒトである。血友病Ａまたは血友病Ｂに罹患しているヒト、特に、ＦＶＩＩＩおよび／またはＦＩＸに対するインヒビター（抗体）を発達した血友病Ａまたは血友病Ｂ患者（すなわち、インヒビター保有先天性血友病、ＣＨｗＩ）が特に好ましい。別の好ましい実施形態では、ヒトは、後天性血友病に罹患している。後天性血友病は、後天性血友病ＡまたはＢとすることができる。さらに別の実施形態では、ヒトは、遺伝性第ＶＩＩ因子欠損症に罹患している。特に好ましい実施形態では、用量は、静脈内に投薬される。
【００４５】
本発明の処置方法のいずれかでは、対象は、ＦＶＩＩＩおよび／またはＦＩＸに対する阻害抗体を好ましくは有する。対象は、インヒビター保有先天性血友病（ＣＨｗＩ）を好ましくは有する。本発明による半減期延長型ＦＶＩＩａの使用は、このような患者において特に有利である。
【００４６】
特に、外傷の処置では、対象が先天性または後天性出血障害を有することは必須ではない。外傷を処置することに関して、本発明は、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質を自動車事故犠牲者または戦闘において損傷をうけた兵士などの既存の出血障害を有さない患者に投薬することを企図する。
【００４７】
本発明の半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、配列番号１に示された配列を好ましくは有する。ＦＶＩＩがＦＶＩＩａに活性化された場合、太字の配列中の下線付きのアミノ酸配列ＲＩは、アミノ酸Ｒの後ろで切断される（分子は、ジスルフィド架橋によってなお一緒に保持されている）。ＦＶＩＩａパート（太字での）は、ＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（３１アミノ酸可動性リンカーである）が後ろに続き、次いで、ＤＡＨＨＫからＣ末端終端までヒトアルブミン（全長）が続く。
【化１】
2017513831.tif 000002
【００４８】
代わりに、融合タンパク質の配列は、配列番号１に示された配列との少なくとも７０％の同一性を有する。融合タンパク質の配列は、配列番号１に示された配列との少なくとも７５％の同一性を有し得る。融合タンパク質の配列は、配列番号１に示された配列との少なくとも８０％のパーセント同一性を有し得る。融合タンパク質の配列は、配列番号１に示された配列との少なくとも８５％のパーセント同一性を有し得る。融合タンパク質の配列は、配列番号１に示された配列との少なくとも９０％のパーセント同一性を有し得る。融合タンパク質の配列は、配列番号１に示された配列との少なくとも９５％のパーセント同一性を有し得る。融合タンパク質の配列は、配列番号１に示された配列との少なくとも９８％のパーセント同一性を有し得る。融合タンパク質の配列は、配列番号１に示された配列との少なくとも９９％のパーセント同一性を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】研究を通した研究参加者の流れおよび割当を示すＣＯＮＳＯＲＴダイヤグラムである。
【図２】用量群毎の経時的にｒＶＩＩａ−ＦＰを受けている対象におけるベースライン補正ＦＶＩＩａ血漿レベルを示す図である。
【図３】血液希釈、処置、実験的腎臓外傷に関する研究手順および止血効果の評価を示す図である。略称：ＨＥＳ、ヒドロキシエチルデンプン；ｒＶＩＩａ−ＦＰ（ＣＳＬ６８９（配列番号１））、ヒトアルブミンを有する融合タンパク質結合活性化第ＶＩＩａ因子；ｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））、活性化組換え第ＶＩＩ因子。
【図４】生理食塩水（正の対照）、ＣＳＬ６８９（配列番号１）（ｒＶＩＩａ−ＦＰ）またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ｒＦＶＩＩａ）での処置後の血液希釈ウサギにおける標準腎臓傷害後の総失血を示す図である。
【図５】生理食塩水（正の対照）、ＣＳＬ６８９（配列番号１）（ｒＶＩＩａ−ＦＰ）またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ｒＦＶＩＩａ）での処置後の血液希釈ウサギにおける標準腎臓傷害後の止血までの時間を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、ＨＬＥＰアルブミンを好ましくは含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質であって、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポーションが、３１アミノ酸ポリグリシン−セリン（ＧＳ）非切断可能なペプチドリンカーを通してアルブミンに結合している半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質に関する予防的、「オンデマンド」および外科的投与レジメンを提供する。投与間隔は、１日おきなどの少なくとも１日１回とすることができるが、３、４または５日に１回などの予防的投与の以前考えられていたよりも長い期間さえも達成される。
【００５１】
他の既知のＦＶＩＩａ生成物と比較して、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質（例えば、ｒＶＩＩａ−アルブミン）のより長い半減期および延ばされた生物活性は、驚いたことに、ｒＦＶＩＩａに関する従来技術（例えば、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））によって示唆されたよりも著しく長い投与間隔での血友病の予防的処置を可能にする。
【００５２】
ＣＳＬ６８９（配列番号１）（本明細書で「ｒＶＩＩａ−アルブミン」または「ｒＶＩＩａ−ＦＰ」とも称される）は、３１アミノ酸ポリグリシン−セリン（ＧＳ）リンカーペプチドによってヒトアルブミンに結合しているその活性化型（ＦＶＩＩａ）においてヒト凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）を含む精製組換えタンパク質である。評価された一部の他の分子とは異なり、アミノ酸が、効力を増加させるためにまたはＦＶＩＩａの半減期を延ばすために交換されなかったので、それは、本質的に、非切断可能なリンカーを通してヒトアルブミンに融合している野生型ＦＶＩＩａである。ワルファリンで抗凝固剤処置された健常成人男性対象におけるＣＳＬ６８９の単一用量を試験した第Ｉ相試験が完了した（Ｇｏｌｏｒ  Ｇら，２０１３．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１１：１９７７〜１９８５）。結果は、ＦＶＩＩａの半減期と生物活性の両方が延ばされることを実証している。それは、６．１から９．７ｈの延長された半減期（３〜４倍の増加）を有する。
【００５３】
本発明の技術的利点は、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質（例えば、ｒＶＩＩａ−アルブミン／ｒＶＩＩａ−ＦＰ）が他の既知のＦＶＩＩａ生成物よりも長い半減期と延ばされた生物活性の両方を有するということである。これは、驚いたことに、ｒＦＶＩＩａに関する従来技術によって示唆されたよりも著しく長い投与間隔での血友病の予防および処置を可能にする。より少ない頻度の投薬が患者における同じＦＶＩＩａピークおよびトラフ活性レベルを達成するために必要である。
【００５４】
好ましい実施形態では、止血能は、全投与間隔に関してベースラインよりも少なくとも約０．５％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約４％大きい、好ましくは全投与間隔に関してベースラインよりも５から１５％大きいトラフ値で維持される。
【００５５】
半減期延長型ＦＶＩＩａの改善された性質は、外傷後、ｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））と比較して、「オンデマンド処置」の効能も改善する。これらの患者は、先天性または後天性出血障害を有し得るまたは有し得ない。この利点は、外傷のウサギモデルにおける実験によって実証された（実施例３を参照されたい）。
【００５６】
半減期延長型ＦＶＩＩａの改善された性質は、ｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））と比較して、後天性血友病の処置に関する効能も改善する。これは、サルモデルにおける実験によって支持される（実施例４を参照されたい）。本明細書で提供された半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、より大きい効能で、より低い用量、より低い頻度で、かつ／またはより少ない潜在的有害反応で外傷後にまたは後天性血友病を処置するために投薬することができる。
【００５７】
定義
本明細書では、「予防的処置」は、時間の経過にわたって半減期延長型第ＶＩＩａ因子タンパク質を複数用量で対象に投薬して、対象の血漿における第ＶＩＩａ因子活性のレベルを増加させることを意味する。好ましくは、増加したレベルは、自発的出血の発生率を低下させるまたは不測の傷害の場合に出血を予防するのに十分である。予防的処置は、出血エピソード、例えば、オンデマンド処置下で報告されたものを低下させるまたは予防する。予防的処置は、例えば、患者間の変動を補うために、「投与間隔」下で考察されるように固定するまたは個別化することができる。
【００５８】
予防法は、凝固因子レベル＞１ＩＵ／ｄｌ（＞１％）を有する中程度の血友病患者がめったに自発的出血を経験せず、関節機能のはるかに良い保存を有するという観察から考案された。したがって、出血および関節破壊を予防するために、療法の目標は、正常な筋骨格機能を保存することである（Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ（ＷＦＨ）の代わりにＴｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐによって作成されたＧＵＩＤＥＬＩＮＥＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＭＡＮＡＧＥＭＥＮＴ  ＯＦ  ＨＥＭＯＰＨＩＬＩＡ、第２版）。１％を超える止血能に相当する、患者におけるＦＶＩＩａ活性での予防法は、処置期間全体中ずっと維持されるべきである。１％を超える止血能は、欠損したまたは機能的に欠陥のある凝固因子のまたはそれに対する阻害抗体が存在する凝固因子の健常な人における正常なレベルを参照するものである。本発明では、機能的ＦＶＩＩＩまたは機能的ＦＩＸの１％の残留レベルまたは阻害抗体による患者における正常なＦＶＩＩＩもしくは正常なＦＩＸ活性の９９％の阻害は、１％の止血能に相当する。
【００５９】
本明細書では、「オンデマンド処置」は、半減期延長型第ＶＩＩａ因子タンパク質を投薬して、対象における出血エピソードを制御することを意味する。出血エピソードは、自発的に起こり得るまたは外傷の結果とすることができる。対象は、先天性または後天性出血障害を有し得るまたは有し得ない。好ましくは、投薬された半減期延長型第ＶＩＩａ因子タンパク質は、出血を低下させるのに十分である。第１の用量と等しい用量の第２の投薬または複数の投薬が出血を制御するために必要であり得る。オンデマンド処置は、例えば、患者間の変動を補うために、「投与間隔」下で考察されるように固定するまたは個別化することができる。
【００６０】
本明細書では、「投与間隔」は、対象に投薬される複数用量間に経過する時間の量を意味する。キメラＦＶＩＩａ−ＨＬＥＭ、例えば、ＦＶＩＩａ−ＨＥＬＰを使用した本発明の方法における投与間隔は、ＨＬＥＭ、例えば、アルブミンを有さない前記第ＶＩＩａ因子（すなわち、前記ＦＶＩＩａからなるポリペプチド）の同等の量（ＩＵ／ｋｇでの）に必要な投与間隔よりも少なくとも約１．５から８倍長くてもよい。例えば、本発明の半減期延長型第ＶＩＩａ因子タンパク質（例えば、ｒＶＩＩａ−アルブミン／ｒＶＩＩａ−ＦＰ）を投薬する場合、投与間隔は、ＨＬＥＭ、例えば、アルブミンを有さない前記第ＶＩＩａ因子の同等の量に必要な投与間隔よりも少なくとも約１．５倍から８倍長くてもよい。
【００６１】
投与間隔は、少なくとも１日１回、約１から５日に１回、約１から４日に１回、約１から３日に１回、好ましくは約２から４日に１回または約２から３日に１回とすることができる。特に、１日おきに１回（すなわち、２日に１回）の投与間隔が企図される。
【００６２】
投与間隔は、代わりに、その対象に関する薬物動態学的データまたは他の情報に基づいて各対象に関して決定される個別化された間隔とすることができる。個別化された用量／投与間隔組合せは、先行する段落における固定された間隔レジメンに関するものと同じとすることができる、または異なっていてもよい。レジメンは、最初、固定された投与間隔でとすることができ、次いで、それは、個別化された投与間隔に変化してもよい。レジメンは、最初、固定された用量（例えば、ＩＵ／ｋｇまたはμｇ／ｋｇ）および投与間隔でとすることができ、次いで、それは、固定された用量での個別化された投与間隔に変化してもよい。レジメンはまた、最初、固定された投与間隔および用量（例えば、ＩＵ／ｋｇまたはμｇ／ｋｇ）とすることができ、次いで、それは、同じ固定された投与間隔での個別化された用量に変化してもよい。
【００６３】
本明細書では、「用量中央値」は、研究対象の半分がその用量よりも高い用量を使用し、研究対象の半分がその用量よりも低い用量を使用したことを意味する。「用量平均値」は、平均用量（全ての用量を合計し、用量の総数で割ることによって計算される）を意味する。所与の用量に関して、「約」は、用量がその示された用量のプラスまたはマイナス１、２、５、１０、１５または２０％を示したことを意味する。約１から５日に１回の投与間隔に関して、「約」は、プラスまたはマイナス１２時間を意味する。約１から４日に１回または約２から４日に１回の投与間隔に関して、「約」は、プラスまたはマイナス１０時間を意味する。約１から３日に１回または約２から３日に１回の投与間隔に関して、「約」は、プラスまたはマイナス８時間を意味する。約１日おきに１回、または約１日１回の投与間隔に関して、「約」は、プラスまたはマイナス６時間を意味する。
【００６４】
本発明の目的に関して、ＦＶＩＩａ、または半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質を投薬する文脈における「半減期」は、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される、血漿におけるＦＶＩＩａの活性が半分減少するのに必要な時間の量と定義される。
【００６５】
「Ｃｍａｘ」は、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される、ＦＶＩＩａの投薬後に測定される最大血漿ＦＶＩＩａ活性と定義される。
【００６６】
「半減期延長型」は、組換えＦＶＩＩａ（すなわち、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））と比較して、より長い半減期を有するＦＶＩＩａタンパク質を表す。
【００６７】
本発明の方法において使用される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の治療用量は、少なくとも１日１回の投与間隔で血液１ｍｌあたり少なくとも約３０ＩＵのＣｍａｘにつながる。好ましくは、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜１６０ＩＵのＣｍａｘにつながる。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３５〜１３０ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。高度に好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４６〜９２ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３０〜７０ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約３６〜５６ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約４１〜５１ＩＵのＣｍａｘにつながる。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約７０〜１１０ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８０〜１０５ＩＵのＣｍａｘにつながる。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８２〜１０２ＩＵのＣｍａｘにつながる。さらに別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、血液１ｍｌあたり約８７〜９７ＩＵのＣｍａｘにつながる。半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の活性は、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される。
【００６８】
代わりに、本発明の方法において使用される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの治療用量は、少なくとも１日１回の投与間隔で、約２００〜８００μｇ／ｋｇである。本発明の目的に関して、μｇ／ｋｇでの用量は、対象の体重のｋｇあたりの半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のμｇを表す。好ましくは、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３００〜７００μｇ／ｋｇである。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２０〜６５０μｇ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約３１０〜３３０μｇ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約６３０〜６５０μｇ／ｋｇである。
【００６９】
さらなる選択肢として、本発明の方法において使用される半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの治療用量は、少なくとも１日１回の投与間隔で、約１７５０〜８０００ＩＵ／ｋｇである。好ましくは、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１８００〜７０００ＩＵ／ｋｇである。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２５００〜６５００ＩＵ／ｋｇである。さらなる好ましい実施形態では、ＦＶＩＩａポーションの用量は、約３２００〜５８００ＩＵ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約２８００〜３２００ＩＵ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約５８００〜６２００ＩＵ／ｋｇである。半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の活性は、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを用いて決定される。
【００７０】
さらなる選択肢として、本発明の方法において使用される半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）としてアルブミンを含む半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の治療用量は、約５００μｇ／ｋｇである。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約５００〜２５００μｇ／ｋｇである。好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約７５０〜２０００μｇ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１０００〜１５００μｇ／ｋｇである。別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１１００〜１６００μｇ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１２００〜１５００μｇ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１３００〜１５００μｇ／ｋｇである。さらに別の好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１４００〜１５００μｇ／ｋｇである。より好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約７４０〜７６０μｇ／ｋｇである。別のより好ましい実施形態では、半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量は、約１４９０〜１５１０μｇ／ｋｇである。
【００７１】
好ましい用量および投与間隔は、以下である：約１日おきに１回の投与間隔で血液１ｍｌあたり約４１〜５１ＩＵのＣｍａｘにつながる半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量；約１日おきに１回の投与間隔で血液１ｍｌあたり約８７〜９７ＩＵのＣｍａｘにつながる半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の用量；半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１日おきに１回の投与間隔で３１０〜３３０μｇ／ｋｇであり；半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１日おきに１回の投与間隔で６３０〜６５０μｇ／ｋｇであり；半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１日おきに１回の投与間隔で２８００〜３２００ＩＵ／ｋｇであり；半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａポーションの用量は、約１日おきに１回の投与間隔で５８００〜６２００ＩＵ／ｋｇである。
【００７２】
本出願において使用される「第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子」は、非活性化型（第ＶＩＩ因子）または活性化型（第ＶＩＩａ因子）またはその混合物からなる治療ポリペプチドを意味する。上記の定義内の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は、天然ヒト第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。それは、それらのポリペプチドが第ＶＩＩａ因子の生物活性を実質的に保持する限り、わずかに改変されたアミノ酸配列、例えば、末端アミノ酸欠失または付加を含む改変Ｎ末端またはＣ末端終端を有するポリペプチドも含む。上記の定義内の「第ＶＩＩ因子」は、ある個体から別の個体に存在し得るまたは起こり得る天然の対立遺伝子バリエーションも含む。上記の定義内の第ＶＩＩ因子は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの変異体をさらに含む。このような変異体は、野生型配列とは１つまたはそれ以上のアミノ酸残基において異なる。このような差の例は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基（例えば１から１０アミノ酸残基）によるＮ−および／またはＣ−終端のトランケーション、またはＮ−および／またはＣ−終端での１つまたはそれ以上の余分な残基の付加、および保存的アミノ酸置換、すなわち、類似した特徴を有するアミノ酸の群、例えば（１）少ないアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、および（６）芳香族アミノ酸内で行われる置換を含み得る。このような保存的置換の例は、以下の表に示されている。
【００７３】
【表１】
2017513831.tif 000003
【００７４】
一般に、末期半減期またはβ−半減期として決定される、本発明の半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、非融合ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期よりも、通常、少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは１００％を超えて高い。
【００７５】
半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のＦＶＩＩａ活性は、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）を使用して測定される。本明細書では、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイは、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）ＶＩＩａ−ｒＴＦ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ｆｒａｎｃｅ、以下を参照されたい：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｇｏ−ｃｎ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ／ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｆｉｃｈｅ−ｐｒｏｄｕｉｔ／ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ／ｔｙｐｅ−ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ／ｓｔａｃｌｏｔＲ−ｖｉｉａ−ｒｔｆ）である。
【００７６】
活性は、Ｍｏｒｉｓｓｅｙら，１９９３．Ｂｌｏｏｄ．８１：７３４〜７４４によって報告された方法に基づいて、ＥＬＩＳＡによって測定される第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子抗原の１００ＩＵあたりの国際単位（ＩＵ）での半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の活性化後にＳｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイにおいて測定される。
【００７７】
本明細書では、「ＦＶＩＩａポーション」または「ＦＶＩＩポーション」という用語は、そのパートが「ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ」下で定義された天然ヒト第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子のまたはその変異体のアミノ酸配列に完全に由来し、半減期を延長する部分に由来しない半減期延長型ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩ分子のパートを意味する。非限定的な例として、配列番号１では、「ＦＶＩＩａポーション」は、１位から４０６位まで（１および４０６位を含めた）のポリペプチド鎖である。
【００７８】
本明細書では、「ＦＶＩＩａポーションの用量」という用語は、その用量を受ける対象（例えば、人間）のｋｇ体重あたりの半減期延長型ＦＶＩＩａ分子の用量における「ＦＶＩＩポーション」の重量を意味する。例えば、ＣＳＬ６８９（配列番号１）では、ＣＳＬ６８９におけるＦＶＩＩａポーションは、５１０００Ｄａの分子量を有する。ＣＳＬ６８９のリンカーおよびアルブミンは、６８．６８９Ｄａの分子量を有する。したがって、ＣＳＬ６８９のＦＶＩＩａポーションは、４２，６％である。したがって、ＣＳＬ６８９の７５０μｇ／ｋｇの用量は、ＦＶＩＩａポーションに関する３２０μｇ／ｋｇに相当し、ＣＳＬ６８９の１５００μｇ／ｋｇの用量は、ＦＶＩＩａポーションに関する６４０μｇ／ｋｇに相当する。
【００７９】
ヒト第ＶＩＩａ因子の野生型形のｉｎ  ｖｉｖｏ機能的半減期は、ヒトにおいておよそ２時間である。本発明の第ＶＩＩａ因子結合アルブミンポリペプチドの機能的半減期は、通常、少なくとも約４時間、好ましくは少なくとも約６時間、より好ましくは少なくとも約１２時間である。
【００８０】
本出願では、「半減期増強部分」（ＨＬＥＭ）は、ＦＶＩＩａの半減期を延長する任意の部分を意味する。ＨＬＥＭは、ポリアルキレングリコール部分、好ましくはＰＥＧとすることができる。代わりに、ＨＬＥＭは、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）である。ＨＥＬＰは、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とすることができる。一実施形態では、本発明のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）ペプチドは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのアミノ酸１１２から１４５位のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、配列番号２（ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ）に示されたヒト絨毛性ゴナドトロピンのアミノ酸１１８から１４５位のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ配列は、１１２〜１１８位間の任意の位置からも開始し、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの１４５位で終結する。一部の実施形態では、ＣＴＰ配列ペプチドは、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４アミノ酸長であり、ＣＴＰアミノ酸配列の１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７または１１８位で開始する。
【００８１】
代わりに、ＨＥＬＰは、アルブミンまたは抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を有さない免疫グロブリンなどのＦｃＲｎ結合パートナーである。本発明の好ましいＨＥＬＰは、アルブミンである。
【００８２】
本明細書では、「アルブミン」は、アルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミンの１つまたはそれ以上の機能的活性（例えば、生物活性）を有するアルブミン断片もしくは変異体を集合的に表す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはその断片、特に、ヒトアルブミンの成熟型を表す。例えば、アルブミンは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、ＵＳ２００８２６０７５５Ａ１に報告された配列またはその変異体を有し得る。半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のアルブミンポーションは、ＨＡ配列の全長を含み得る、または治療活性を安定化するまたは延ばす能力がある１つまたはそれ以上のその断片を含み得る。このような断片は、長さが１０以上のアミノ酸のものとすることができるまたはＨＡ配列からの約１５、２０、２５、３０、５０、以上の近接するアミノ酸を含み得るまたはＨＡの特定のドメインのパートまたは全てを含み得る。
【００８３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書で互換的に使用される。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語は、より広く、ヒト血清アルブミン（ならびにその断片および変異体）および他の種からのアルブミン（ならびにその断片および変異体）を包含する。アルブミンの代わりに、限定することなく、ヒトアルファ−胎児タンパク質（ＷＯ２００５／０２４０４４に報告されている）およびそれらの機能的断片または変異体のような他のアルブミン様タンパク質も使用することができる。
【００８４】
本発明の半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質のアルブミンポーションは、天然または人工の正常なＨＡの変異体とすることができる。本発明の半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の治療ポリペプチドポーションは、本明細書に記載の相当する治療ポリペプチドの変異体ともすることができる。「変異体」という用語は、保存的または非保存的、天然または人工の挿入、欠失、および置換を含み、ここで、このような変化は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２００８２６０７５５Ａ１に報告されている、治療ポリペプチドの治療活性を与える活性部位、または活性ドメインを実質的に改変しない。
【００８５】
ＩｇＧおよびＩｇＧ−断片も、ＨＬＥＰ断片が非融合凝固因子と比較して少なくとも２５％の半減期延長を提供する限り、ＨＥＬＰとして使用することができる。治療ポリペプチドポーションは、リンカー、好ましくは非切断可能なリンカーを通してＩｇＧまたはＩｇＧ断片に連結していてもよい。
【００８６】
本発明の意味での「凝固関連アッセイ」は、凝固プロセスと関連があるまたは内因性もしくは外因性凝固カスケードが活性化されたことを決定することができる酵素または補助因子活性を決定する任意のアッセイである。したがって、「凝固関連」アッセイは、ａＰＴＴ、ＰＴ、またはトロンビン産出アッセイのような直接的な凝固アッセイとすることができる。しかしながら、例えば、特定の凝固因子に適用される発色性アッセイのような他のアッセイも含まれる。このようなアッセイまたは相当する試薬に関する例は、Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（登録商標）ＳＬ（ａＰＴＴアッセイ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）または相当する凝固因子欠損血漿（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）でのＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ（登録商標）Ｓ（プロトロンビン時間アッセイ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、例えば凝固因子欠損血漿を使用したトロンビン産出アッセイキット（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）、Ｂｉｏｐｈｅｎ第ＩＸ因子（Ｈｙｐｈｅｎ  ＢｉｏＭｅｄ）、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）ＦＶＩＩａ−ｒＴＦ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）第ＶＩＩＩ因子：Ｃ／４（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）などのような発色性アッセイである。
【００８７】
非活性化凝固因子に関する高いｉｎ  ｖｉｖｏ回収および長い半減期を有することが望ましいけれども、血栓形成促進性リスクを避けるために、その活性化またはその補助因子の活性化後に凝固因子の半減期を制限することが有利である。したがって、凝固プロセスが開始された後、活性凝固因子の半減期は、再び減少するべきである。これは、凝固関連モードにおける不活性化を増強することによってまたは凝固因子の排出によって達成することができる。
【００８８】
本発明による不活性化は、例えば、凝固因子および相当する凝固因子のインヒビターの複合体形成によってまたは例えば、ＦＶＩＩＩおよびＦＶの場合に既知であるさらなるタンパク質切断によって引き起こされる治療ポリペプチドの活性の低下を意味する。
【００８９】
活性化治療半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の不活性化速度は、例えば、インヒビターとの反応によってまたはタンパク分解性不活性化によって活性が低下する速度と定義される。不活性化速度は、この凝固因子のインヒビターの生理的量の存在下で経時的に活性化凝固因子のモル比活性を追跡することによって測定することができる。
【００９０】
代わりに、不活性化速度は、活性および抗原アッセイを使用した適切な時間枠での血漿サンプルの試験によって追跡される動物への活性化生成物の投薬後に決定することができる。
【００９１】
活性化治療半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の排出速度は、ポリペプチドがヒトまたは動物の循環から排出される速度と定義される。排出速度は、静脈内投薬後に活性化、治療半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の薬物動態を測定することによって決定することができる。抗原アッセイを使用して、循環からの直接的な除去による排出を決定することができる。さらに、活性アッセイを使用して、特定の除去および不活性化速度を決定することができる。
【００９２】
本明細書では、「後天性血友病」は、それぞれ、後天性血友病ＡまたはＢをもたらすＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの欠損症に以前罹患していない対象においてＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの活性または機能を阻害するまたはそれらのクリアランスを加速する自己抗体の産生から成人期において通常生じる血友病の型を表す。
【００９３】
半減期延長型ＦＶＩＩを手術前後の出血を減少させる治療薬として使用することができる外科的手順の非限定的な例は、心臓弁手術（Ａｌ  Ｄｏｕｒｉら，２０００．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．１１：Ｓ１２１−Ｓ１２７）、大動脈弁置換（Ｋａｓｔｒｕｐら，２００２．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．７４：９１０〜９１２）、再発性血管外皮腫の切除（Ｇｅｒｌａｃｈら，２００２．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９６：９４６〜９４８）、がん手術（Ｓａｊｄａｋら，２００２．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．２３：３２５〜３２６）、および十二指腸潰瘍の手術（Ｖｌｏｔら，２０００．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．１０８：４２１〜４２３）を含むが、これらに限定されない。手術を受けている対象に、手術の部位での凝固を増強することによって手術前後の失血を減少させるために、初期手術段階においてＦＶＩＩの治療量の静脈内急速投与を与えることができる。半減期延長型ＦＶＩＩａポリペプチドを手術の他の型を受けている正常な凝固を有する患者に投薬して、急速な止血をもたらし、失血を予防することができる。半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質での処置は、手術の部位での止血を促進し、失血を減少させるまたは予防し、それによって、輸血の必要性を減少させるまたは消滅させることができる。
【００９４】
「外傷」は、外因性媒介物による生きている組織への傷害と定義される。外傷は、鈍的外傷（内部圧迫、器官損傷および内部大出血をもたらす）または鋭的外傷（身体を貫通し、組織、血管および器官を破壊し、外部大出血をもたらす媒介物の結果）として分類される。外傷は、輸送機関事故（鈍的および／または鋭的外傷を引き起こす）、銃創（鋭的外傷を引き起こす）、刺し傷（鋭的外傷を引き起こす）、機械事故（鋭的および／または鈍的外傷を引き起こす）、およびかなりの高さからの落下（鋭的および／または鈍的外傷を引き起こす）を含むが、これらに限定されないいくつかのイベントによって引き起こされる。ＦＶＩＩａの治療量の投薬による処置は、外傷患者において凝固を促進し、失血を減少させ得る。例えば、大量失血を示す銃撃傷害を有する患者に、外科的介入に加えて、ＦＶＩＩａを投薬して、凝血異常出血を制御することができる。ＦＶＩＩａでの凝固療法は、鈍的および鋭的外傷を有する患者における失血および大出血を効果的に減少させ得る（Ｒｉｚｏｌｉら，２００６．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ．１０：Ｒ１７８）。
【００９５】
医薬組成物および投薬の様式
本発明の半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、投薬に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、タンパク質および薬学的に許容される担体を典型的に含む。本明細書では、「薬学的に許容される担体」は、医薬投薬と適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことが意図されている。適した担体は、参照によって本明細書に組み入れる、当分野における標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に報告されている。このような担体または希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルも使用することができる。薬学的に活性のある物質に関するこのような媒体および媒介物の使用は、当技術分野で既知である。任意の従来の媒体または媒介物が活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。補充性活性化合物も組成物に組み込んでもよい。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、投薬のその意図された経路に適合するように製剤化される。投薬の経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）；経粘膜、および直腸投薬を含む。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成成分：注入用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧の調節のための薬剤を含み得る。ｐＨは、酸または塩基；塩酸または水酸化ナトリウムなどで調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。静脈内注入としての投薬は、投薬の好ましい経路である。
【００９７】
注入使用に適した医薬組成物は、無菌注入溶液または分散液の即時調製のための無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌粉末を含む。静脈内投薬に関して、適した担体は、生理的食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、容易なシリンジ能力（ｓｙｒｉｎｇｅ  ａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、および適したその混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合、必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合では、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入組成物の延ばされた吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらすことができる。
【００９８】
無菌注入溶液は、上で列挙された成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒中で必要な量で活性化合物（例えば、ｒＶＩＩａ−アルブミン／ｒＶＩＩａ−ＦＰ）を組み込み、必要な場合、ろ過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を塩基性分散媒および上で列挙されたものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌注入溶液の調製物に関する無菌粉末の場合では、調製の方法は、活性成分プラスその以前無菌ろ過された溶液からの任意の追加の望ましい成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。
【００９９】
注入用組成物などの医薬組成物を、投薬の容易さおよび用量の均一性のために用量単位形で製剤化することが特に有利である。本明細書では、用量単位形は、処置される対象に関する単位用量として適した物理的に分離した単位を表し；各単位は、必要な医薬担体と関連して望ましい治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定の量を含有する。用量単位形に関する詳述は、活性化合物のユニークな特徴および達成される特定の治療効果によって規定され、これらに直接的に依存する。
【０１００】
医薬組成物を投薬に関する説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサーに含むことができる。
【０１０１】
本発明をここで詳細に記載したが、同じことが例示のみの目的のためにこれと共に含まれ、本発明を限定することが意図されていない以下の例への参照によってより明確に理解されることになる。本明細書で参照された全ての特許および刊行物は、明示的に参照によって組み入れられる。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、「ｒＶＩＩａ−ＦＰ」または「ＣＳＬ６８９」として既知の組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））およびアルブミンを含む半減期延長型第ＶＩＩａ因子タンパク質を用いて行われた。このタンパク質（ｒＶＩＩａ−ＦＰ／ＣＳＬ６８９）は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【実施例１】
【０１０３】
ワルファリンで抗凝固剤処置された４０人の健常男性対象における半減期延長型第ＶＩＩａ因子タンパク質の単一用量、プラセボ対照、用量増大安全性およびＰＫ研究
年齢が１８〜３５歳の合計１０３人の健常男性ボランティアをスクリーニングして、４０人の対象を本研究において登録した。スクリーニング失敗に関する最も関連性のある理由は、研究室安全性パラメーター内の定義された算入／除外基準、特に、上昇したホモシステイン、低下したプロテインＳおよび上昇したＬＦＴからの逸脱または相におけるワルファリンラン中に安定なＩＮＲに達することができないことであった。研究を通しての研究対象の流れを図１に示す。対象特徴を表２に示す。
【０１０４】
【表２】
2017513831.tif 000004
【０１０５】
安全性の評価（主要なエンドポイント）：
ｒＶＩＩａ−ＦＰの局所耐性は、全ての対象において良好であった。合計３４ＡＥが観察され、ＳＡＥは観察されなかった。３つのＡＥ（頭痛、輸注部位血腫および鼓腸）がプラセボ群において生じた。３１ＡＥが、どの用量レベルでも特定の蓄積なく、ｒＶＩＩａ−ＦＰ群において生じた。４つを除く全てのＡＥが軽度であり；４つのＡＥが中程度として報告された（鼻咽頭炎［２×］、靱帯捻挫および前腕でのいくつかの血管脂肪腫の出現）。１つのＡＥ（１０００μｇ／ｋｇの注入後の輸注部位での痛み）をｒＶＩＩａ−ＦＰと関連していると判断した。研究薬物投薬前、投薬後第８日、または第２８日に、抗薬物抗体またはインヒビターに陽性を示した対象はいなかった。
【０１０６】
ｒＶＩＩａ−ＦＰの５００μｇ／ｋｇ用量での１人の対象は、左前腕および右上腕上のいくつかの皮下小結節の突然の出現を報告した。この対象は、両方の前腕上の複数の既存の脂肪腫を有した。新しく報告された小結節は、手動で移動可能な皮下小結節であり、炎症の徴候を示さなかった。生検を行い、組織学的検査は、個々の微小血栓を有する毛細管増殖によって交差された脂質細胞の結節性腫瘍を示した。これらの結果は、その年齢の男性に関して正常と考えられる血管脂肪腫（末梢血管拡張性脂肪腫）と一貫している。さらに、免疫組織化学的調査は、脂質細胞における増殖性活性（Ｋｉ−６７）を示さなかった。血管脂肪腫内の毛細管増殖の一部の内皮細胞における核発現があった（＜５％）。この結果は、対象によって報告された突然の出現をもたらす急速な増殖と一貫していない。ｒＶＩＩａ−ＦＰの投薬との関連性は、樹立されなかった。
【０１０７】
全てのＡＥが、サイズが減少したが研究の最後になお検出可能であった血管脂肪腫を除いて続発症なく解消した。
【０１０８】
安全性分析は、血栓塞栓性合併症に特別な焦点を置いた。血栓塞栓性イベントは、研究中に観察されなかった。１人の対象（１０００μｇ／ｋｇ用量でｒＶＩＩａ−ＦＰを与えられた）は、輸注部位での痛みを経験したが、これは、血栓性静脈炎または血栓性反応と関連していなかった。
【０１０９】
ｒＶＩＩａ−ＦＰの薬物動態学的プロファイルの評価（二次的エンドポイント）：
ｒＶＩＩａ−ＦＰの輸注の前に、ＦＶＩＩａ活性は、８．６ｍＵ／ｍＬのベースラインＦＶＩＩａ活性を有した１人を除く全ての対象において、アッセイの定量化のレベル（７．８ｍＵ／ｍＬ）未満であった。ＰＫパラメーターを表３に要約する。
【０１１０】
【表３】
2017513831.tif 000005
【０１１１】
１４０μｇ／ｋｇから１０００μｇ／ｋｇの単一ＩＶ輸注後、ＦＶＩＩａ活性は、輸注の終わり付近でピークになった（図２）。ｔｍａｘ中央値は、用量レベルにわたって０．２６７から０．５００時間であり、これは、対象のおよそ半分に関して輸注の終わりに相
当した。ＦＶＩＩａベースライン−補正平均Ｃｍａｘ（ＳＤ）値は、用量の７倍の増加に対してＣｍａｘのおよそ７倍の増加で、用量比例的に増加した（１４０μｇ／ｋｇ用量に関する９２４０（５１５）ｍＵ／ｍＬから１０００μｇ／ｋｇ用量に関する６３５２０（１３５１５）ｍＵ／ｍＬ）。したがって、ＩＲは、用量レベルにわたってかなり一貫しており、５００μｇ／ｋｇ用量レベルでの５６．３５［（ｍＵ／ｍＬ）／（μｇ／ｋｇ）］から３００μｇ／ｋｇ用量レベルでの７１．５８［（ｍＵ／ｍＬ）／（μｇ／ｋｇ）］にわたった。これは、ｒＦＶＩＩａの報告された挙動と一貫している（Ｌｉｎｄｌｅｙ  ＣＭら，１９９４．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．５５（６）：６３８〜４８）。
【０１１２】
ベースライン−補正平均ＦＶＩＩａ  ＡＵＣ０−ｔは、１４０μｇ／ｋｇ用量に関する４９５４６（７１０９）ｈ＊ｍＵ／ｍＬから１０００μｇ／ｋｇ用量に関する６１６６３８（１２５５２２）ｈ＊ｍＵ／ｍＬまで、用量範囲にわたって用量比例的様式をわずかに超えて増加した。
【０１１３】
平均半減期の個々の値を６．１から１３．５時間の範囲内で記述した。半減期に関するＣＶ％は、３００μｇ／ｋｇおよび５００μｇ／ｋｇ用量群に関して高かった（それぞれ、９２％および７０％）。これは、それらの用量群における他の対象と比較して長いｔ１／２を有する各コホートにおける１人の対象が原因であった。より低い３用量群のぞれぞれにおける１人の対象に関して、排出速度定数および関連するＰＫパラメーターは、ベースライン近くの最後のいくつかの時点の変動により推定されない。用量範囲にわたって、ｔ１／２中央値は、６．１時間から９．７時間にわたってかなり一貫していた。最も高い用量（１０００μｇ／ｋｇ）で、ｔ１／２中央値は、８．５時間であった。
【０１１４】
べき法則モデルを使用した用量比例性の評価は、ベースライン−補正および非補正Ｃｍａｘが１４０μｇ／ｋｇから１０００μｇ／ｋｇ用量レベルにわたって用量比例的に増加し；傾き推定値は、（０．８６０６〜１．００９５）の相当する９５％信頼区間で０．９３５１であったことを示した。対照的に、ＡＵＣ０−ｔは、ベースライン補正傾き推定値が（１．１２５０〜１．３１６０）の相当する信頼区間で１．２２０５であったので、用量比例的様式を超えて増加した。したがって、平均ＡＵＣ０−ｔの増加は、用量の相当する増加と比較して、予測されたよりも２２％高かった。
【０１１５】
ＣＬは、７．６２から１２．７４［ｍＬ／ｈ／ｋｇ］にわたり、用量レベルにわたって一貫していた。分布容積（Ｖｓｓ）も、８１．７０から９７．９７［ｍＬ／ｋｇ］にわたり、一貫していた。
【実施例２】
【０１１６】
半減期延長型第ＶＩＩａ因子タンパク質の予防的投薬
ＣＳＬ６８９オンデマンド研究に参加している対象は、予防法試験への参加を勧められた。予防法試験は、予防法下での年間出血速度をＣＳＬ６８９＿２００１研究において記述された年間出血速度と比較した。予防法試験を以下の表４に要約する。
【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
ＣＳＬ６８９の性質により、１．５ｍｇ／ｋｇの予防的用量が効果的であり得、投与間隔がｒＶＩＩａで以前達成されたよりも大きく、例えば、２日に１回（すなわち１日おきに１回）でもよいことが予測される。潜在的に、１ｍｇ／ｋｇまたは０．７５ｍｇ／ｋｇなどのより低い用量もこのような予防的投与レジメンにおいて効果的であり得る。
【実施例３】
【０１２０】
半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質は、希釈性凝血異常のウサギモデルにおける標準腎臓傷害（手術および外傷における出血に関するモデル）後に、ｒＦＶＩＩａと比較してより効果的に出血を制御する
材料および方法
動物
月齢３〜４ヶ月、体重２．０〜４．０ｋｇの雌のＣＨＢウサギ（Ｂａｕｅｒ，Ｎｅｕｅｎｔａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１２ｈ／１２ｈ明暗サイクル下で２１〜２３℃および５０％相対湿度でワイヤースチールケージにおいてケージあたり１匹で収容した。動物に水道水を適宜提供し、ウサギペレット（Ｄｅｕｋａｎｉｎ（登録商標），Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｔｉｅｒｎａｈｒｕｎｇ  Ｃｒｅｍｅｒ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を与えた。全てのウサギは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅに従ってケアを受け、研究は、組織倫理委員会によって承認された。
【０１２１】
血液希釈
全ての処置を麻酔下の動物において行った。麻酔をケタミンおよびキシラジンの組合せによって誘発し、吸入イソフルラン麻酔を通して維持した。次いで、動物に挿管し、人工呼吸装置（Ｈｅｙｅｒ  Ａｃｃｅｓｓ，Ｈｅｙｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ，Ｂａｄ  Ｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に配置した。
【０１２２】
動物を頸動脈からの３０ｍＬ・ｋｇ−１血液の回収および３７℃に予熱された３０ｍＬ・ｋｇ−１ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）２００／０．５（Ｉｎｆｕｋｏｌｌ  ６％、Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の輸注によって、相において血液希釈に供した（図３）。その手順を４５分で繰り返した。３０分で、血液回収およびＨＥＳ輸注の２サイクル間の間隔中に、動物に、８００×ｇで１０分間の遠心分離、通常の生理食塩水中での洗浄および乳酸リンゲル液への再懸濁によって回収されたウサギ全血から調製され、外頸静脈中に投与される１５ｍＬ・ｋｇ−１の回収された赤血球を与えた。
【０１２３】
腎臓傷害
血液希釈の開始後６０分で、標準腎臓傷害を外側腎臓極での１５ｍｍ長さおよび５ｍｍ深さメス切開の形で与えた（図３）。
【０１２４】
処置
動物をランダムに割り当てて、腎臓切開傷害直前に等張生理食塩水、０．７５ｍｇ／ｋｇもしくは１．５ｍｇ／ｋｇの用量でのｒＶＩＩａ−ＦＰ（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、または９０μｇ／ｋｇもしくは１８０μｇ／ｋｇの用量でのｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標），Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の静脈内投薬を与えた（図３）。実験群は、それぞれ５匹のウサギからなった。
【０１２５】
用量レベルを選択して、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイに基づくｒＶＩＩａ−ＦＰおよびｒＦＶＩＩａの比較可能なＦＶＩＩａ活性レベルを達成した。結果的に、０．７５ｍｇ／ｋｇ  ｒＶＩＩａ−ＦＰは、ＦＶＩＩａ活性に基づいて９０μｇ／ｋｇ  ｒＦＶＩＩａに相関する一方、１．５ｍｇ／ｋｇ  ｒＶＩＩａ−ＦＰは、ＦＶＩＩａ活性において１８０μｇ／ｋｇ  ｒＦＶＩＩａに相関する。
【０１２６】
エンドポイント
主要な研究エンドポイントは、止血までの時間および標準腎臓切開傷害後最大３０分に観察された失血であった（図３）。止血までの時間を腎臓切開から観察可能な出血または滲出の停止までの間隔と定義した。失血は、吸引によって切開部位から採取された血液の体積であった。失血に関する３０分観察期間および止血までの時間は、切開直後に開始した。
【０１２７】
結果
図４に示すように、９０および１８０μｇ／ｋｇの用量でのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、１１５ｍＬの平均（無処置；正の対照）から、それぞれ、７７および８０ｍＬまで標準腎臓傷害後に総失血を減少させることができ、したがって、いかなる明白な用量−応答も示さなかった。対照的に、ＣＳＬ６８９（ｒＶＩＩａ−ＦＰ）は、用量０．７５ｍｇ／ｋｇ（７６ｍＬの平均失血）で同様に効果的であり、４９ｍＬのみへの失血の減少につながった１．５ｍｇ／ｋｇのより高い用量でさらにより効果的であった。したがって、ＣＳＬ６８９は、血液希釈ウサギにおける出血回復に関して明らかな用量−応答効果を示し、ｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の比較可能な用量と比較してより効果的であった。
【０１２８】
さらに、ｒＶＩＩａ−ＦＰのみがこれらの動物における標準腎臓傷害後に完全な止血を達成するのに必要な時間を著しく減少させることができた（図５）。対照的に、ｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））での処置後に効果が観察されないかまたは小さい効果のみが観察され、急性外傷後の出血回復に関するＣＳＬ６８９の改善された効能を確認した。
【実施例４】
【０１２９】
後天性血友病のサルモデルにおける半減期延長型ＦＶＩＩａタンパク質の効能
導入／目的
研究を行って、後天性血友病Ａを有する患者の臨床状態を模倣する循環抗第ＶＩＩＩ因子抗体を有するカニクイザルにおけるヒトアルブミンを有する組換え融合タンパク質結合活性化第ＶＩＩ因子、すなわちｒＶＩＩａ−ＦＰ（ＣＳＬ６８９（配列番号１））の効能を評価した。さらに、効果的な出血予防法に必要な投与頻度に関するｒＶＩＩａ−ＦＰおよび組換え活性化第ＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩａ；ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））間の直接的な比較を含めた。
【０１３０】
材料および方法
動物管理
全ての生存中の実験的手順は、地域の動物福祉当局によって承認された。
【０１３１】
処置の開始時に少なくとも２歳の雌のカニクイザル（マカカファスシクラリス；パーパスブレッド）を処置の開始前に最大４週間、霊長類建屋において収容条件に慣れさせた。動物の健康状況を獣医職員が検証し、処置の開始前に受入可能であると確認した。動物（群あたりｎ＝４）を、およそ等しい平均体重およびＦＶＩＩＩ活性ベースラインレベルを有する群をもたらす擬似乱数体重およびベースライン血漿第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性層別化手順に基づいて処置群に割り当てた。動物にユニークな新しい識別番号を与えた。動物を１２時間の明、１２時間の暗照明を有する温度および湿度が制御された領域において１つがいで収容した。各動物に制限食（標準乾燥飼料およびビスケットおよび果実サプリメント２００ｇ）を提供し、水は自由に利用することができた。
【０１３２】
処置
カニクイザルを第１日にＦＶＩＩＩおよびアジュバントの混合物の皮下投薬によって免疫化した。血漿におけるＦＶＩＩＩ活性レベルによって示された後天性血友病表現型の発達時に、動物に、それぞれ、８および３時間の投与間隔で開始する橈側皮または伏在静脈中へのｒＶＩＩａ−ＦＰ（１．５ｍｇ／ｋｇ）またはｒＦＶＩＩａ（９０μｇ／ｋｇ）の静脈内急速投与用量を与えた。いったん良好な出血制御が少なくとも４８時間または２回の引き続く用量にわたって臨床的観察および血液学に基づいて達成されたら、どんなに長くとも、投与間隔を大きくした。以下の投与間隔を適用した：
ｒＶＩＩａ−ＦＰ：８、１２、１６、３２時間
ｒＦＶＩＩａ：３、６、１２、２４時間
【０１３３】
評価されたエンドポイント
連続的な観察には、臨床的観察、死亡率、体重（少なくとも週１回、剖検前）、摂食量、血漿におけるＦＶＩＩＩ活性レベル、ヘマトクリット、ヘモグロビン濃度、プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の決定を含めた血液学、血液化学、骨髄スミア、抗ＦＶＩＩＩ抗体；抗ＦＶＩＩ抗体；中和ＦＶＩＩＩ抗体；ＦＶＩＩａ活性（Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイ）；肉眼病変、組織病変を含めた。
【０１３４】
結果
カニクイザルを第ＶＩＩＩ因子とアジュバント間の混合物の皮下投薬によって免疫化した。その後、動物は、処置の非存在下での臨床的観察、血液学ならびに巨視的および微視的評価に基づいて、後天性血友病Ａを有する患者において観察される臨床的出血表現型を厳密に反映する出血表現型につながる内在性サル第ＶＩＩＩ因子に交差反応性である抗第ＶＩＩＩ因子抗体を産生した。結果は、血漿におけるＦＶＩＩＩ活性レベルがサルＦＶＩＩＩに交差反応性の抗ＦＶＩＩＩ抗体の出現とよく相関するこの後天性血友病Ａ表現型の成功的な誘発を予測する最も鋭敏なエンドポイントであることを確認した。したがって、ＦＶＩＩＩ活性レベルがいったん１０％（０．１ＩＵ／ｍ）未満に下落したら、予防的ｒＶＩＩａ−ＦＰまたはｒＦＶＩＩａ処置を開始した。
【０１３５】
全体的に、結果は、１．５ｍｇ／ｋｇの用量でのｒＶＩＩａ−ＦＰ処置に関するインヒビターの存在下で任意の出血症状を発達することから全ての動物を効果的に保護する最大投与間隔は、８時間であったことを確認した。比較すれば、処置された全ての動物を効果的に保護するために必要な９０μｇ／ｋｇの用量でのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に関する最大投与間隔は、３時間であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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