(57)【要約】  本発明はヒトＦｃ受容体に結合する多量体タンパク質に関する。本発明は、このタンパク質を含む治療組成物、並びに免疫及び他の障害の治療におけるその使用にも関する。
2017513481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上のポリペプチド単量体単位を含む多量体タンパク質であって；
それぞれのポリペプチド単量体単位が、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含み；
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３０９位に、単量体単位を集合させて多量体にするシステイン残基を含み；そして
それぞれのポリペプチド単量体単位が、ＣＨ１ドメインもテイルピースも含まない、
上記多量体タンパク質。
【請求項２】
抗体ＦｃドメインがＩｇＧに由来する、請求項１に記載の多量体タンパク質。
【請求項３】
重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１又は請求項２に記載の多量体タンパク質。
【請求項４】
重鎖Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、並びにＩｇＭに由来するＣＨ４ドメインを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項５】
それぞれの重鎖Ｆｃ領域がそのＮ末端にヒンジ領域を有する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項６】
重鎖Ｆｃ領域及びヒンジ領域がＩｇＧ４に由来し、ヒンジ領域が突然変異配列ＣＰＰＣを含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項７】
３１０位及び／又は４３５位にヒスチジン残基を含む、請求項１から６までに記載の多量体タンパク質。
【請求項８】
３１０位及び／又は４３５位にヒスチジン以外の任意のアミノ酸残基を含む、請求項１から６までに記載の多量体タンパク質。
【請求項９】
そのＦｃ受容体結合プロファイルを変化させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項１０】
ＦｃＲｎへのその結合を増加させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項１１】
Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｖ３０８Ｃ、Ｖ３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｐ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｒ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、及びＮ４３４Ｙからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１０に記載の多量体タンパク質。
【請求項１２】
ＦｃγＲＩＩｂへのその結合を増加させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項１３】
Ｅ２５８Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｅ、及びＬ３２８Ｆからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１２に記載の多量体タンパク質。
【請求項１４】
ＦｃγＲへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項１５】
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、及びＬ３２８Ｒからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１４に記載の多量体タンパク質。
【請求項１６】
Ｃ１ｑへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項１７】
Ｋ３２２Ａ、Ｐ３３１Ａ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１６に記載の多量体タンパク質。
【請求項１８】
ＦｃドメインがＩｇＧ４に由来し、ＦｃγＲ結合を増加させる１つ又は複数の突然変異をさらに含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項１９】
Ｆｃドメインが、３０８位のバリン残基をシステイン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｃ）突然変異している、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項２０】
ヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合が、コアヒンジ配列ＣＰＰＣをＳＰＰＳに突然変異させることにより除去されている、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項２１】
ＣＨ２ドメイン中のグリコシル化部位が、２９７位のアスパラギン残基をアラニン残基（Ｎ２９７Ａ）又はグルタミン残基（Ｎ２９７Ｑ）で置換することにより除去されている、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項２２】
サイトカイン放出を調節する１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項２３】
それぞれのポリペプチド単量体単位が、それぞれのポリペプチド鎖が配列番号２４〜３０のうちのいずれか１つに与えられる配列を含む又はそれからなる２つの同一なポリペプチド鎖を含む又はそれからなる、請求項１に記載の多量体タンパク質。
【請求項２４】
二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体、若しくは十二量体である、又は主に二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体、若しくは十二量体である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項２５】
精製された二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体、又は十二量体である、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項２６】
１よりも多い多量体形態で請求項１から２３までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質を含む混合物であって、多量体タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体、又は十二量体形態について濃縮されている上記混合物。
【請求項２７】
融合パートナーをさらに含む、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
【請求項２８】
融合パートナーがｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、操作ＳＨ３ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ、抗原、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、薬物、リガンド、受容体、サイトカイン又はケモカインである、請求項２７に記載の多量体タンパク質。
【請求項２９】
単一ドメイン抗体がｖＬ、ｖＨ、ｖＨＨ、サメＶＮＡＲ、又はラクダ科ｖ領域である、請求項２８に記載の多量体タンパク質。
【請求項３０】
抗原がアレルゲンペプチド又は腫瘍抗原である、請求項２８に記載の多量体タンパク質。
【請求項３１】
請求項１から３０までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖、又はその成分部分をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項３２】
請求項３１に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載の１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
請求項１から３０までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質の産生のための工程であって、請求項３３に記載の宿主細胞をタンパク質発現及び多量体への集合に適した条件下で培養することと、多量体タンパク質を単離し、場合によって精製することとを含む、上記工程。
【請求項３５】
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて、請求項１から３０までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項３６】
治療において使用するための、請求項１から２６まで若しくは１から３０までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質又は請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
免疫不全の治療において使用するための、請求項１から２６まで若しくは１から３０までに記載の多量体タンパク質又は請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
がんの治療において使用するための、請求項１から２６まで若しくは１から３０までに記載の多量体タンパク質、又は請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ワクチンとして使用するための、請求項１から２６まで若しくは１から３０までに記載の多量体タンパク質、又は請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
免疫不全の治療のための医薬を調製するための、請求項１から２６まで又は１から３０までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質の使用。
【請求項４１】
がんの治療のための医薬を調製するための、請求項１から２６までの又は１から３０までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質の使用。
【請求項４２】
ワクチンを調製するための、請求項１から２６までの又は１から３０までのいずれか一項に記載の多量体タンパク質の使用。
【請求項４３】
免疫不全が免疫性血小板減少症、ギラン・バレー症候群、川崎病、及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーから選択される、請求項３７に記載の多量体タンパク質若しくは医薬組成物、又は請求項４０に記載の使用。
【請求項４４】
がんが、結腸直腸がん、肝細胞腫（肝臓がん）、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、甲状腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん若しくは肺がん、皮膚がん、白血病、神経膠芽腫、髄芽腫若しくは神経芽細胞腫、神経内分泌がん、又はホジキン若しくは非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項３８に記載の多量体タンパク質若しくは医薬組成物、又は請求項４１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトＦｃ受容体に結合する多量体タンパク質に関する。本発明は、多量体タンパク質を含む治療組成物並びに免疫及び他の障害の治療におけるその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫不全は、異なる兆候、症状、原因及び発症機序を有する多種多様な疾患を包含する。これらの疾患の多くは、病原性抗体及び／又は病原性免疫複合体の積極的関与を特徴とする。ＩＴＰ（免疫性血小板減少症、免疫性血小板紫斑病、特発性血小板減少症紫斑病と不定に呼ばれる）などの一部の疾患では、病原性抗体の標的抗原（Hoemberg, Scand HJ Immunol, Vol 74(5), p489-495, 2011）及び疾患過程はある程度はよく理解されている。そのような免疫不全は多くの場合、様々な従来の薬剤を単独療法として又は組み合わせて治療されている。そのような薬剤の例は、多数の副作用に関連している副腎皮質ステロイド、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）及び抗Ｄである。
【０００３】
抗体は、多くの場合、免疫グロブリンと呼ばれるが、２つの同一な重（Ｈ）鎖及び２つの同一な軽（Ｌ）鎖を含み、鎖間ジスルフィド結合により共に保持されているＹ字型の分子である。それぞれの鎖は、配列が異なり抗原結合の原因となる１つの可変ドメイン（Ｖ）からなる。それぞれの鎖は少なくとの１つの定常ドメイン（Ｃ）からもなる。軽鎖では、単一の定常ドメイン（ＣＬ）がある。重鎖には、アイソタイプ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）に応じて少なくとも３つ、時に４つの定常ドメインがある。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤは３つの重鎖定常ドメインを有し、ＩｇＭ及びＩｇＥは４つの重鎖定常ドメインを有する。
【０００４】
ヒトでは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭと呼ばれる５つの異なるクラス又はアイソタイプの免疫グロブリンがある。これらのクラスすべてが基本的な４鎖Ｙ字型構造を有しているが、その重鎖は異なり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２と呼ばれる２つのサブクラスにさらに細区分することができる。ＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４と呼ばれる４つのサブクラスがある。
【０００５】
抗体のＦｃドメインは典型的には、それぞれの重鎖のうち二量体化してＦｃドメインを形成する少なくとも最後の２つの定常ドメインを含む。Ｆｃドメインは、主にＦｃＲｎへの結合を通じて抗体半減期を決定すること、身体全体への分布、補体を固定する能力、及び細胞表面Ｆｃ受容体への結合を含む、抗体エフェクター機能を提供する原因である。
【０００６】
抗体アイソタイプ間の違いはＦｃドメインが最も明白であり、これにより抗原に結合すると異なるエフェクター機能が始動される。構造の違いは抗体の重合状態の違いももたらす。したがって、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＤは一般に単量体であり、ＩｇＭは五量体と六量体の両方として存在し、ＩｇＡは主に血清中では単量体として漿粘液性分泌物中では二量体として存在する。
【０００７】
静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、何千人もの健常な血液ドナー由来のプールされた免疫グロブリンである。ＩＶＩＧは、低ＩｇＧレベルの患者において日和見感染を予防するためのＩｇＧ補充療法として最初に使用された（Baerenwaldt, Expert Rev Clin Immunol, Vol 6(3), p425-434, 2010に概説されている）。ＩＴＰを抱えた小児におけるＩＶＩＧの抗炎症特性の発見後（Imbach, Helv Paediatri Acta, Vol 36(1), p81-86, 1981）、ＩＶＩＧは現在、ＩＴＰ、ギラン・バレー症候群、川崎病、及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーの治療に認可されている（Nimmerjahn, Annu Rev Immunol, Vol 26, p513-533, 2008）。
【０００８】
病原性免疫複合体に関連している疾患では、成分免疫グロブリン画分のわずかな部分が不釣り合いに効果的であることが提唱されてきた。微量（典型的には１〜５％）のＩｇＧがＩＶＩＧ内に多量体形態で存在していることが観察されている。この多量体画分の大多数は二量体であり、三量体及びさらに高次の形態はもっと少量であると考えられている。レシピエント抗イディオタイプ抗体の結合による注入後に追加の二量体が形成される可能性があることも提唱されてきた。１つの説は、これらの多量体形態が、増強されたその結合力のせいで、低親和性Ｆｃγ受容体への結合をめぐって免疫複合体と競合するというものである（Augener, Blut, Vol 50, p249-252, 1985; Teeling, Blood Vol 98(4), p1095-1099, 2001; Machino, Y., Clin Exp Immunol, Vol 162(3), p415-424, 2010; Machino, Y. et al., BBRC, Vol 418, p748-753, 2012）。別の説は、ＩＶＩＧ内のＩｇＧのシアル酸グリコフォーム、特にさらに高いレベルのα２−６シアル酸形態の存在がＦｃγ受容体活性化状態の変化を引き起こすというものである（Samuelsson, Science, Vol 291, p484-486, 2001; Kaneko, Science, Vol 313, p670-673, 2006; Schwab, European J Immunol Vol 42, p826-830, 2012; Sondermann, PNAS, Vol 110(24), p9868-9872, 2013）。
【０００９】
病原性抗体に関連している疾患では、ヒトに投与された極めて大用量のＩＶＩＧ（１〜２ｇ／ｋｇ）がＦｃＲｎにより遂行される正常なＩｇＧ恒常性機序を効果的に無効にすることが提唱されてきた。実際上、ドナーＩＶＩＧによりレシピエントＩｇＧを大量希釈すると、異化反応が増強され患者の病原性抗体の血清半減期が短くなる。その有効性について提唱されている他の機序には、病原性抗体の抗イディオタイプ中和及び補体因子の一過的減少が含まれる（Mollnes, Mol Immunol, Vol 34, p719-729, 1997; Crow, Transfusion Medicine Reviews, Vol 22(2), p103-116, 2008; Schwab, I. and Nimmerjahn, F. Nature Reviews Immunology, Vol 13, p176-189, 2013）。
【００１０】
ＩＶＩＧの臨床利用には著しい不都合がある。ＩＶＩＧは、製造方法及びドナープールの固有の違いのせいで製造業者間で製品品質が変わりやすい（Siegel, Pharmacotherapy Vol 25(11) p78S-84S, 2005）。ＩＶＩＧは、典型的には１〜２ｇ／ｋｇの桁で極めて大用量で与えられる。この大用量は長期の注入期間を必要とし（４〜８時間、複数日にわたる場合もある）、これは患者には不快になることがあり、注入関連有害事象をもたらすことがある。重篤有害事象が起こることがあり、ＩｇＡ欠損個体での反応はよく理解されている。ＩＶＩＧを受けている患者でサイトカイン放出が観察されることもあるが、これは用量及び注入速度を慎重に制御することにより大部分が最小化する。患者あたりの大量使用及びヒトドナーへの依存の結果として、ＩＶＩＧの製造は高価であり世界的な供給は非常に制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
まとめると、ＩＶＩＧの不都合は、病原性抗体及び病原性免疫複合体の疾患生物学を妨害することができる分子の臨床供給、投与及び有効性の点から改善の必要性が存在することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＩｇＭ又はＩｇＡのいずれか由来のカルボキシル末端テイルピースが全ＩｇＧ３分子定常領域のカルボキシル末端に付加され、組換えＩｇＭ様ＩｇＧ３を産生する先行技術において重合体タンパク質が記載されている（Sorensen V. et al, J Immunol, Vol 156, p2858-2865, 1996）。ＩｇＧ３分子は、３０９位のロイシン残基をシステイン残基で置換することによって（Ｌ３０９Ｃ）さらに改変した。いくつかの実験では、テイルピースは省き、ＩｇＧ３分子はＬ３０９Ｃのみで改変した。研究されたＩｇＧ３分子はインタクトな免疫グロブリン分子であった。これとは対照的に、本発明の多量体タンパク質は第１の重鎖定常ドメイン、ＣＨ１を含まない。
【００１３】
本発明では、ＩＶＩＧの不都合の多くを解決する、改良多量体タンパク質を提供する。このタンパク質は、慎重に制御された条件下で大量に産生することができ、供給が制限され品質が変化しやすいという問題をなくす。さらに、本発明の改善された多量体タンパク質は、本明細書に記載される他の障害に治療的応用がある。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の多量体タンパク質は集合的に「Ｆｃ多量体」と名付けられており、この２つの用語は本明細書では互換的に使用される。
【００１５】
他の方法で定義されなければ、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で言及される出版物及び特許はすべて参照により組み込まれる。
【００１６】
本明細書に記載される実施形態のいずれでも組み合わせることができることは認識されるであろう。
【００１７】
本明細書では、他の方法で明記されていなければ、ＥＵ付番方式を使用して抗体ドメイン中の残基に言及する。この方式は最初、Edelman et al, 1969により考案され、Kabat et al, 1987に詳細に説明されている。
Edelman et al, 1969；「全γＧ免疫グロブリン分子の共有結合構造（Ｔｈｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｔｉｒｅ  γＧ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、PNAS Biochemistry Vol.63 pp78-85．
Kabat et al, 1987；「免疫学的に興味深いタンパク質の配列において（ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、US Department of Health and Human Services, NIH, USA.
【００１８】
当業者には既知であるように、特定の抗体アイソタイプについて位置番号及び／又はアミノ酸残基が与えられている場合、他の任意の抗体アイソタイプにおける対応する位置及び／又はアミノ酸残基に適用できることが意図されている。
【００１９】
本発明は、２つ以上のポリペプチド単量体単位を含む多量体タンパク質であって、
それぞれのポリペプチド単量体単位が、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含み、
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３０９位に、単量体単位を集合させて多量体にするシステイン残基を含み、
それぞれのポリペプチド単量体単位が、ＣＨ１ドメインもテイルピースも含まない、
上記多量体タンパク質を提供する。
【００２０】
ＣＨ１ドメインとは、第１の抗体重鎖定常ドメインのことである。
【００２１】
本発明者らは、抗体Ｆｃドメインを、３０９位のシステイン残基の存在を操作することにより多価形態に多量化することが可能であることを見出した。本発明者らは、より高次の結合価形態であるほどＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対しより高い結合活性で結合し、ヒト全血中でのサイトカイン放出のレベルも上昇することを観察した。ＩＴＰ、ＧＢＳ及びＣＩＤＰなどのある種の免疫徴候では、病原性抗体及び免疫複合体からのＦｃγＲの効果的遮断を達成するのにより高次の結合価が望ましい。上昇したサイトカイン放出は、意図する臨床使用及び分子標的に応じて、有用になる場合もあれば有害になる場合もある。がん及び他の増殖性障害などの標的にされた細胞死滅適用では、上昇したサイトカインレベルは有利になる場合がある。本発明の多量体タンパク質のＮ末端又はＣ末端に、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ｖＬ、ｖＨ、ｖＨＨ、サメＶＮＡＲ、ラクダ科ｖ領域）、操作ＳＨ３ドメイン、又はＤＡＲＰｉｎなどの抗原ターゲティング部分を融合すれば、多量体Ｆｃタンパク質を標的細胞にターゲティングし、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰなどの十分に説明されているエフェクター機能を通じて死滅を誘発することが可能になる。これらの機能は、ＦｃγＲ結合の結合活性が増加することにより増強することが可能である。さらに、細胞毒性効果のあるＩＦＮγ及びＴＮＦαなどのサイトカインの高い局所レベルは細胞死滅を増大させることが可能である。局所サイトカインは免疫細胞浸潤も誘発し、したがって抗標的応答を増大させることができる。ワクチン適用では、本発明の多量体タンパク質のＮ末端又はＣ末端に、アレルゲンペプチド、腫瘍抗原又は類似のものなどの抗原部分を融合すれば、多量体Ｆｃタンパク質を抗原提示に関与する標的細胞にターゲティングすることが可能になる。樹状細胞、マクロファージ、単核球及び好中球はすべて抗原取込み、消化及びＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩを通じたＴ細胞への提示が可能である。したがって、ＲｃγＲへの結合の結合活性の増加を通じて抗原提示細胞への抗原のターゲティングが増強されるのは望ましい。さらに、局所サイトカインの産生が増加すれば、免疫細胞の活性化又は活性化された免疫細胞の浸潤のせいで免疫応答がさらに増加する可能性がある。細胞死滅及びワクチンアプローチにおけるターゲティングは、ＦｃγＲ又はＦｃＲｎ結合に影響を及ぼすＦｃ多量体によりさらに改善することができる。
【００２２】
したがって、一例では、本発明の多量体タンパク質は融合パートナーをさらに含む。用語「融合パートナー」とは、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ｖＬ、ｖＨ、ｖＨＨ、サメＶＮＡＲ、ラクダ科ｖ領域）、操作ＳＨ３ドメイン、又はＤＡＲＰｉｎを含む群から選択される抗原ターゲティング部分のことであってもよい。代わりに、融合パートナーは、抗原（例えば、アレルゲンペプチド又は腫瘍抗原）、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、薬物、リガンド、受容体、サイトカイン又はケモカインでもよい。
【００２３】
腫瘍抗原の例には、
・Ｍａｇｅ遺伝子産物、例えば、ＭＡＧＥ腫瘍抗原、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、ＭＡＧＥ  ５、ＭＡＧＥ  ６、ＭＡＧＥ  ７、ＭＡＧＥ  ８、ＭＡＧＥ  ９、ＭＡＧＥ  １０、ＭＡＧＥ  １１又はＭＡＧＥ  １２。これらのＭＡＧＥ抗原をコードする遺伝子は染色体Ｘ上に位置しており、互いに６４〜８５％のコード配列相同性を共有している（De Plaen, 1994）。これらの抗原はＭＡＧＥ  Ａｌ、ＭＡＧＥ  Ａ２、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＡＧＥ  Ａ５、ＭＡＧＥ  Ａ６、ＭＡＧＥ  Ａ７、ＭＡＧＥ  Ａ８、ＭＡＧＥ  Ａ９、ＭＡＧＥ  Ａ１０、ＭＡＧＥ  Ａｌ  １及び／又はＭＡＧＥ  Ａ１２（ＭＡＧＥ  Ａファミリー）として知られることもある。一実施形態では、抗原はＭＡＧＥであり、並びに／又は２つの追加のＭＡＧＥファミリー：ＭＡＧＥ  Ｂ及びＭＡＧＥ  Ｃグループのうちの１つ由来の抗原を使用してもよい。ＭＡＧＥ  ＢファミリーにはＭＡＧＥ  Ｂ１（ＭＡＧＥ  Ｘｐ  １及びＤＡＭ  １０としても知られている）、ＭＡＧＥ  Ｂ２（ＭＡＧＥ  Ｘｐ２及びＤＡＭ  ６としても知られている）、ＭＡＧＥ  Ｂ３及びＭＡＧＥ  Ｂ４が含まれ、ＭＡＧＥ  Ｃファミリーには現在、ＭＡＧＥ  Ｃｌ及びＭＡＧＥ  Ｃ２が含まれる。
・ＰＲＡＭＥ、ＬＡＧＥ  １、ＬＡＧＥ  ２などのがん精巣抗原
・ＳＳＸ−２；ＳＳＸ−４；ＳＳＸ−５；ＮＡ１７；ＭＥＬＡＮ−Ａ；チロシナーゼ；ＬＡＧＥ−Ｉ；ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ；ＰＲＡＭＥ；Ｐ７９０；Ｐ５１０；Ｐ８３５；Ｂ３０５Ｄ；Ｂ８５４；Ｃ１４９１；Ｃ１５８４；及びＣ１５８５。一実施形態では、抗原はＰ５０１Ｓ（プロステイン（prostein）としても知られている）を含む又はそれからなることがある。
・ウィルムス腫瘍遺伝子、又は約若しくはおおよそアミノ酸１〜２４９を含むそのＮ末端断片ＷＴ−ＩＦにより発現されるＷＴ−Ｉ
・Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子、又はその断片により発現される抗原
が含まれる。
【００２４】
前記融合パートナーは、存在している場合には、重鎖Ｆｃ領域又はそれぞれの重鎖Ｆｃ領域のＮ末端及び／又はＣ末端に融合している。融合パートナーは重鎖Ｆｃ領域のＮ末端及び／又はＣ末端に直接融合させることができる。代わりに、融合パートナーは、存在する場合にはヒンジを含んでいてもよい介在アミノ酸配列により間接的に融合させることができる。例えば、短いリンカー配列を融合パートナーと重鎖Ｆｃ領域の間に与えることができる。
【００２５】
免疫不全の治療などのある種の適用では、融合パートナーは必要ではない場合もある。したがって、一例では、本発明のタンパク質は融合パートナーを含まない。
【００２６】
本発明の多量体タンパク質のそれぞれのポリペプチド単量体単位は抗体Ｆｃドメインを含む。
【００２７】
本発明の抗体Ｆｃドメインは適切ないかなる種に由来していてもよい。一実施形態では、抗体ＦｃドメインはヒトＦｃドメインに由来している。
【００２８】
抗体Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）、及びＩｇＭを含む、抗体の適切ないかなるクラス由来でもよい。一実施形態では、抗体ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。一実施形態では、抗体ＦｃドメインはＩｇＧ１に由来する。一実施形態では、抗体ＦｃドメインはＩｇＧ４に由来する。
【００２９】
抗体Ｆｃドメインは、それぞれが重鎖Ｆｃ領域と呼ばれる２つのポリペプチド鎖を含む。この２つの重鎖Ｆｃ領域は二量体化して抗体Ｆｃドメインを作り出す。抗体Ｆｃドメイン内の２つの重鎖Ｆｃ領域は互いに異なっていてもよいが、これらのＦｃ領域は通常は互いに同一であることは認識されるであろう。したがって、用語「重鎖Ｆｃ領域」が下の本明細書で使用される場合、この用語は、同一の重鎖Ｆｃ領域と二量体化して抗体Ｆｃドメインを作り出す単一の重鎖Ｆｃ領域を指すのに使用される。
【００３０】
典型的にはそれぞれの重鎖Ｆｃ領域は２つ若しくは３つの重鎖定常ドメインを含む又はそれからなる。
【００３１】
天然の抗体では、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域は、２つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）で構成されており、ＩｇＥ及びＩｇＭの重鎖Ｆｃ領域は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）で構成されている。これらは二量体化してＦｃドメインを作り出す。
【００３２】
本発明では、重鎖Ｆｃ領域は、１つ又は複数の異なるクラスの抗体、例えば、１つ、２つ又は３つの異なるクラス由来の重鎖定常ドメインを含むことができる。
【００３３】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００３４】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００３５】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ３に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００３６】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４に由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【００３７】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＭに由来するＣＨ４ドメインを含む。ＩｇＭ  ＣＨ４ドメインは典型的にはＣＨ３ドメインのＣ末端に位置している。
【００３８】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来するＣＨ２及びＣＨ３ドメイン並びにＩｇＭに由来するＣＨ４ドメインを含む。
【００３９】
本発明の重鎖Ｆｃ領域を産生するのに使用するための重鎖定常ドメインは、上記の天然に存在する定常ドメインの変異体を含むことができることは認識されるであろう。そのような変異体は、野生型定常ドメインと比べて１つ又は複数のアミノ酸変異を含むことができる。一例では、本発明の重鎖Ｆｃ領域は、野生型定常ドメインとは配列が異なる少なくとも１つの定常ドメインを含む。変異定常ドメインは野生型定常ドメインと比べて長くても短くてもよいことは認識されるであろう。好ましくは、変異定常ドメインは野生型定常ドメインと少なくとも５０％同一である又は類似している。用語「同一性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置でもアミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。用語「類似性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置でもアミノ酸残基が配列間で類似する種類であることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンの代わりにロイシンを使ってもよい。多くの場合互いに置き換えることが可能である他のアミノ酸には、
フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びに
システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれるがこれらに限定されない。
【００４０】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することが可能である（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991）。一例では、変異定常ドメインは野生型定常ドメインに少なくとも６０％同一である又は類似している。別の例では、変異定常ドメインは少なくとも７０％同一である又は類似している。別の例では、変異定常ドメインは少なくとも８０％同一である又は類似している。別の例では、変異定常ドメインは少なくとも９０％同一である又は類似している。別の例では、変異定常ドメインは少なくとも９５％同一である又は類似している。
【００４１】
ＩｇＭ及びＩｇＡは、共通Ｈ２Ｌ２抗体単位の共有結合多量体としてヒトにおいて天然に存在している。ＩｇＭはＪ鎖を組み込んでいる場合は五量体として、又はＪ鎖を欠く場合は六量体として存在する。ＩｇＡは単量体及び二量体形態として存在する。ＩｇＭ及びＩｇＡの重鎖は、テイルピースとして知られる、Ｃ末端定常ドメインまでの１８アミノ酸伸長を有する。このテイルピースには、重合体中の重鎖間にジスルフィド結合を形成するシステイン残基が含まれ、重合において重要な役割を有すると考えられている。テイルピースはグリコシル化部位も含有する。本発明の多量体タンパク質はテイルピースを含まない。
【００４２】
本発明のそれぞれの重鎖Ｆｃ領域は、場合により、そのＮ末端に天然の又は改変されたヒンジ領域を有することができる。
【００４３】
天然のヒンジ領域は、天然に存在する抗体中のＦａｂとＦｃドメイン間に通常見出されると考えられるヒンジ領域である。改変されたヒンジ領域は天然のヒンジ領域とは長さ及び／又は組成が異なる任意のヒンジである。そのようなヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サメ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギヒンジ領域などの他の種由来のヒンジ領域を含むことが可能である。他の改変されたヒンジ領域は、重鎖Ｆｃ領域のクラス又はサブクラスとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含むことができる。代わりに、改変されたヒンジ領域は、天然のヒンジの一部又はリピート中のそれぞれの単位が天然のヒンジ領域に由来する反復単位を含むことができる。追加の代替物では、天然のヒンジ領域は、１つ若しくは複数のシステイン若しくは他の残基をセリン若しくはアラニンなどの中性の残基に変換することにより、又は適切に置かれた残基をシステイン残基に変換することにより改変することができる。そのような手段により、ヒンジ領域のシステイン残基の数を増やす又は減らすことができる。他の改変されたヒンジ領域は完全に合成的でもよく、長さ、システイン組成及び柔軟性などの所望の特性を有するように設計することもできる。
【００４４】
いくつかの改変されたヒンジ領域が既に、例えば、ＵＳ５６７７４２５、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ９８２５９７１及びＷＯ２００５００３１７１に記載されており、これらの特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
適切なヒンジ配列の例は表１に示されている。
【００４６】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域はそのＮ末端にインタクトなヒンジ領域を有する。
【００４７】
一実施形態では、重鎖Ｆｃ領域及びヒンジ領域はＩｇＧ４に由来し、ヒンジ領域は突然変異配列ＣＰＰＣ（配列番号９）を含む。ヒトＩｇＧ４のコアヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣを含有するＩｇＧ１と比べた場合、配列ＣＰＳＣ（配列番号１０）を含有する。ＩｇＧ４配列中に存在するセリン残基はこの領域の柔軟性を増加させ、したがって、ＩｇＧ分子内のもう一方の重鎖に架橋して鎖間ジスルフィドを形成するのではなく分子の部分が同一タンパク質鎖内でジスルフィド結合（鎖内ジスルフィド）を形成する（Angal S. et al, Mol Immunol, Vol 30(1), p105-108, 1993）。セリン残基をプロリンに変えてＩｇＧ１と同じコア配列を与えると、ＩｇＧ４ヒンジ領域における鎖間ジスルフィドの完全な形成が可能になり、したがって、精製された製品中の不均一性が減じられる。この改変されたアイソタイプはＩｇＧ４Ｐと名付けられる。
【表１】
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【００４８】
本発明の多量体タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２又はそれよりも多いポリペプチド単量体単位を含むことができる。そのようなタンパク質は代わりに、それぞれ、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体、十二量体、等と呼ばれることもある。
【００４９】
一実施形態では、多量体タンパク質は、一定範囲の数のポリペプチド単量体単位を有する、サイズが異なる多量体タンパク質の混合物を含む。
【００５０】
本発明のそれぞれのポリペプチド単量体単位は２つの個別のポリペプチド鎖を含む。特定のポリペプチド単量体単位内の２つのポリペプチド鎖は互いに同じでもよく、又は互いに異なっていてもよい。一実施形態では、２つのポリペプチド鎖は互いに同じである。
【００５１】
同様に、特定の多量体タンパク質内のポリペプチド単量体単位は互いに同じでもよく、又は互いに異なっていてもよい。一実施形態では、ポリペプチド単量体単位は互いに同じである。
【００５２】
一実施形態では、ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖は図１に提供されるアミノ酸配列を、場合によっては、代替のヒンジ配列と一緒に含む。
【００５３】
したがって、一例では、本発明は、２つ以上、ポリペプチド単量体単位を含む又はそれからなる多量体タンパク質であって；
それぞれのポリペプチド単量体単位が２つの同一なポリペプチド鎖を含み、それぞれのポリペプチド鎖が配列番号２４〜３０のいずれか１つに与えられる配列を含む又はそれからなり、
ポリペプチド単量体単位が抗体ＣＨ１ドメインを含まない、
多量体タンパク質も提供する。
【００５４】
ヒンジが配列番号２４〜３０に与えられる配列とは異なっていることがある一例では、本発明は、２つ以上ポリペプチド単量体単位を含む多量体タンパク質であって；
それぞれのポリペプチド単量体単位が、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含み、
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、配列番号２４〜２７及び３０のいずれか１つのアミノ酸６〜２２２又は配列番号２８若しくは２９のアミノ酸６〜３３３に与えられる配列を含み又はそれからなり、ポリペプチド単量体単位が抗体ＣＨ１ドメインを含まない、
上記多量体タンパク質を提供する。
【００５５】
典型的には、それぞれの重鎖Ｆｃ領域はＮ末端にヒンジ配列を含む。
【００５６】
本発明の多量体タンパク質は、本明細書の下に記載するように、タンパク質の機能的特性、例えば、ＦｃＲｎ若しくは白血球受容体などのＦｃ受容体への結合、補体への結合、改変されたジスルフィド結合構築又は変化したグリコシル化パターンを変化させる１つ又は複数の突然変異を含むことができる。これらの突然変異のいずれでも適切な任意の方法で組み合わせて所望の機能的特性を実現する、及び／又は他の突然変異と組み合わせてタンパク質の機能的特性を変化させることは認識されるであろう。
【００５７】
本発明の多量体タンパク質は、対応するポリペプチド単量体単位及び／又は天然の免疫グロブリンと比べて、１つ又は複数のＦｃ受容体（ＦｃＲ）への改変された結合を示すことができる。任意の特定のＦｃ受容体への結合は増加することもあれば減少することもある。一実施形態では、本発明の多量体タンパク質は、そのＦｃ受容体結合プロファイルを変える１つ又は複数の突然変異を含む。
【００５８】
本明細書で使用される用語「突然変異」は、１つ又は複数のアミノ酸の置換、付加又は欠失を含むことができる。
【００５９】
ヒト細胞は、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ及びグリカン受容体から選択されるいくつかの膜結合ＦｃＲを発現することが可能である。一部の細胞は可溶性（外部ドメイン）ＦｃＲを発現することもできる（概説は、Fridman et al., (1993) J Leukocyte Biology 54: 504-512）。ＦｃγＲは、ＩｇＧ結合の親和性（高／低）及び生物学的効果（活性化する／阻害する）によりさらに分割することが可能である。ヒトＦｃγＲＩは唯一の「高親和性」受容体であると広く考えられており、その他はすべて中程度〜低いと考えられている。ＦｃγＲＩＩｂはその細胞内ＩＴＩＭモチーフのおかげで「阻害」機能性を有する唯一の受容体であり、その他はすべてＩＴＡＭモチーフのおかげで「活性化する」又は共通のＦｃγＲ−γ鎖と対合すると考えられている。ＦｃγＲＩＩＩｂも、活性化性であるが、ＧＰＩアンカーを経て細胞と会合する点で独特である。全体では、ヒトは６つの「標準」ＦｃγＲ：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂを発現する。これらの配列に加えて、多数の配列又はアロタイプ変異体がこれらのファミリーに広がっている。これらの一部は重要な機能的結果を有することが見出されており、したがってそれ独自の受容体サブタイプであると考えられることもある。例には、ＦｃγＲＩＩａＨ１３４Ｒ、ＦｃγＲＩＩｂＩ１９０Ｔ、ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩｂＮＡ１、ＦｃγＲＩＩＩｂＮＡ２、ＦｃγＲＩＩＩｂＳＨが含まれる。それぞれの受容体配列はＩｇＧの４サブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に対して異なる親和性を有することが明らかにされている（Bruhns Blood (1993) Vol 113, p3716-3725）。他の種はいくらか異なる数及び機能性のＦｃγＲを有しており、マウス系は現在まで最もよく研究されており、４つのＦｃγＲ：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＶを含む（Bruhns, Blood (2012) Vol 119, p5640-5649）。細胞上のヒトＦｃγＲＩは通常は、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３／ＩｇＧ４に対するその親和性（約１０−８Ｍ）及び血清中のこれらＩｇＧの濃度（約１０ｍｇ／ｍｌ）のせいで正常な血清条件では単量体ＩｇＧにより「占有されている」と考えられている。したがって、その表面にＦｃγＲＩを抱えている細胞は、結合している多特異性のＩｇＧを通して代理的にその抗原性環境を「スクリーニングする」又は「試料採取する」ことができると考えられている。ＩｇＧサブクラスに対する親和性がもっと低い（約１０−５〜１０−７Ｍの範囲で）その他の受容体は通常は「占有されていない」と考えられている。したがって、低親和性受容体は、抗体関連免疫複合体の検出及びこれによる活性化に対して固有に感受性である。抗体免疫複合体中のＦｃ密度が増加すると、低親和性ＦｃγＲへの結合「力」の機能的親和性が増加する。これはいくつかの方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証されてきた（Shields R.L. et al, J Biol Chem, Vol 276(9), p6591-6604, 2001; Lux et al., J Immunol (2013) Vol 190, p4315-4323）。これは、ヒトにおいてＩＴＰを治療するための抗ＲｈＤの使用における主要な作用様式の１つとも含意されてきた（Crow Transfusion Medicine Reviews (2008) Vol 22, p103-116）。
【００６０】
多くの細胞型が複数種のＦｃγＲを発現しており、したがってＦｃγＲを抱えている細胞へのＩｇＧ又は抗体免疫複合体の結合は、生物学的文脈に応じて、複数の複雑な結果を有することが可能である。最も簡単には、細胞は活性化性、阻害性又は混合されたシグナルのいずれかを受けることが可能である。これにより、食作用（例えば、マクロファージ及び好中球）、抗原プロセッシング（例えば、樹状細胞）、減少したＩｇＧ産生（例えば、Ｂ細胞）又は脱顆粒（例えば、好中球、マスト細胞）などの事象が生じることがある。ＦｃγＲＩＩｂからの阻害性シグナルは活性化性シグナルのそれよりも優位に立つことが可能であることを支持するデータが存在する（Proulx Clinical Immunology (2010) 135:422-429）。
【００６１】
ＦｃＲｎは成人及び小児の血清中におけるＩｇＧの長い半減期を維持するのに重大な役割を有する。この受容体は酸性ベシクル（ｐＨ＜６．５）でＩｇＧに結合して、ＩｇＧ分子を分解から保護し、次にｐＨが７．４と高いとＩｇＧ分子を血液中に放出する。
【００６２】
ＦｃＲｎは白血球Ｆｃ受容体と似ておらず、それどころかＭＨＣクラスＩ分子に構造的類似性がある。ＦｃＲｎは、３つの細胞外ドメインを含む膜結合鎖に非共有結合しているβ２ミクログロブリン鎖で構成されているヘテロ二量体である。炭水化物鎖を含む、これらのドメインの１つは、β２ミクログロブリンと共に、ＦｃのＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の部位と相互作用する。相互作用はＩｇＧ上のｐＨ＜６．５で正に荷電しているヒスチジン残基に架けられた塩橋を含む。ｐＨがさらに高いと、Ｈｉｓ残基はその正の電荷を失い、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用は弱くなってＩｇＧが解離する。
【００６３】
一実施形態では、本発明の多量体タンパク質はヒトＦｃＲｎに結合する。
【００６４】
一実施形態では、本発明の多量体タンパク質は３１０位に、及び好ましくは４３５位にもヒスチジン残基を有する。これらのヒスチジン残基はヒトＦｃＲｎ結合に重要である。一実施形態では、３１０位及び４３５位のヒスチジン残基は天然の残基であり、すなわち、３１０位及び４３５位は突然変異していない。代わりに、これらのヒスチジン残基の１つ又は両方は突然変異の結果として存在していてもよい。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、２つ以上のポリペプチド単量体単位を含む多量体タンパク質であって；
それぞれのポリペプチド単量体単位が、２つの重鎖Ｆｃ領域を含む抗体Ｆｃドメインを含み；
それぞれの重鎖Ｆｃ領域が、３０９位に、単量体単位を集合させて多量体にするシステイン残基を、３１０位にヒスチジン残基を含み；そして
それぞれのポリペプチド単量体単位が、ＣＨ１ドメインもテイルピースも含まない、
上記多量体タンパク質を提供する。
【００６６】
本発明の多量体タンパク質は、ＦｃＲｎへのその結合を変化させる１つ又は複数の突然変異を含むことができる。変化した結合は、結合の増加であっても結合の減少であってもよい。
【００６７】
一実施形態では、多量体タンパク質は、対応する天然の免疫グロブリンよりも大きな親和性及び結合力でＦｃＲｎに結合するように１つ又は複数の突然変異を含む。
【００６８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５０位のスレオニン残基をグルタミン残基で置換することにより（Ｔ２５０Ｑ）突然変異している。
【００６９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５２位のメチオニン残基をチロシン残基で置換することにより（Ｍ２５２Ｙ）突然変異している。
【００７０】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５４位のセリン残基をスレオニン残基で置換することにより（Ｓ２５４Ｔ）突然変異している。
【００７１】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５６位のスレオニン残基をグルタミン酸残基で置換することにより（Ｔ２５６Ｅ）突然変異している。
【００７２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０７位のスレオニン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｔ３０７Ａ）突然変異している。
【００７３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０７位のスレオニン残基をプロリン残基で置換することにより（Ｔ３０７Ｐ）突然変異している。
【００７４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をシステイン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｃ）突然変異している。
【００７５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｆ）突然変異している。
【００７６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をプロリン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｐ）突然変異している。
【００７７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３１１位のグルタミン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｑ３１１Ａ）突然変異している。
【００７８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３１１位のグルタミン残基をアルギニン残基で置換することにより（Ｑ３１１Ｒ）突然変異している。
【００７９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは４２８位のメチオニン残基をロイシン残基で置換することにより（Ｍ４２８Ｌ）突然変異している。
【００８０】
一実施形態では、Ｆｃドメインは４３３位のヒスチジン残基をリシン残基で置換することにより（Ｈ４３３Ｋ）突然変異している。
【００８１】
一実施形態では、Ｆｃドメインは４３４位のアスパラギン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｎ４３４Ｆ）突然変異している。
【００８２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは４３４位のアスパラギン残基をチロシン残基で置換することにより（Ｎ４３４Ｙ）突然変異している。
【００８３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５２位のメチオニン残基をチロシン残基で、２５４位のセリン残基をスレオニン残基で、２５６位のスレオニン残基をグルタミン酸残基で置換することにより（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）突然変異している。
【００８４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をプロリン残基で、４３４位のアスパラギン残基をチロシン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ｙ）突然変異している。
【００８５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５２位のメチオニン残基をチロシン残基で、２５４位のセリン残基をスレオニン残基で、２５６位のスレオニン残基をグルタミン酸残基で、４３３位のヒスチジン残基をリシン残基で、４３４位のアスパラギン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）突然変異している。
【００８６】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＦｃＲｎ結合を変化させ得ることは認識されるであろう。
【００８７】
一実施形態では、多量体タンパク質は、対応する天然の免疫グロブリンよりも低い親和性及び結合力でＦｃＲｎに結合するように１つ又は複数の突然変異を含む。
【００８８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３１０位及び／又は４３５位にヒスチジン以外の任意のアミノ酸残基を含む。
【００８９】
本発明の多量体タンパク質は、ＦｃγＲＩＩｂへのその結合を増加させる１つ又は複数の突然変異を含むことができる。ＦｃγＲＩＩｂはヒトにおける唯一の阻害性受容体であり、Ｂ細胞上で見出される唯一のＦｃ受容体である。Ｂ細胞及びその病原性抗体は多くの免疫疾患の核心にあり、したがって、多量体タンパク質はこれらの疾患に対して改善された療法を提供することができる。
【００９０】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３８位のプロリン残基をアスパラギン酸残基で置換することにより（Ｐ２３８Ｄ）突然変異している。
【００９１】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５８位のグルタミン酸残基をアラニン残基で置換することにより（Ｅ２５８Ａ）突然変異している。
【００９２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２６７位のセリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｓ２６７Ａ）突然変異している。
【００９３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２６７位のセリン残基をグルタミン酸残基で置換することにより（Ｓ２６７Ｅ）突然変異している。
【００９４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３２８位のロイシン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｌ３２８Ｆ）突然変異している。
【００９５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２５８位のグルタミン酸残基をアラニン残基で、２６７位のセリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｅ２５８Ａ／Ｓ２６７Ａ）突然変異している。
【００９６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２６７位のセリン残基をグルタミン酸残基で、３２８位のロイシン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）突然変異している。
【００９７】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＦｃγＲＩＩｂ結合を増加させ得ることは認識されるであろう。
【００９８】
本発明の一実施形態では、ＦｃγＲへの減少した結合を示す多量体タンパク質を提供する。ＦｃγＲへの減少した結合は、病原性抗体に関連する免疫疾患の治療において使用するための改善された療法を提供することができる。
【００９９】
一実施形態では、本発明の多量体タンパク質はＦｃγＲへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む。
【０１００】
一実施形態では、ＦｃγＲへの結合を減少させる突然変異は、ＩｇＧ１に由来するＦｃドメインを含む本発明の多量体タンパク質において使用される。
【０１０１】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３４Ａ）突然変異している。
【０１０２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３５位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３５Ａ）突然変異している。
【０１０３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３６位のグリシン残基をアルギニン残基で置換することにより（Ｇ２３６Ｒ）突然変異している。
【０１０４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２９７位のアスパラギン残基をアラニン残基（Ｎ２９７Ａ）又はグルタミン残基（Ｎ２９７Ｑ）で置換することにより突然変異している。
【０１０５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２９８位のセリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｓ２９８Ａ）突然変異している。
【０１０６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３２８位のロイシン残基をアルギニン残基で置換することにより（Ｌ３２８Ｒ）突然変異している。
【０１０７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のロイシン残基をアラニン残基で、２３５位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）突然変異している。
【０１０８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のフェニルアラニン残基をアラニン残基で、２３５位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）突然変異している。
【０１０９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３６位のグリシン残基をアルギニン残基で、３２８位のロイシン残基をアルギニン残基で置換することにより（Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ）突然変異している。
【０１１０】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＦｃγＲ結合を減少させ得ることは認識されるであろう。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の多量体タンパク質は、ＦｃγＲＩＩへのその結合に影響を与えることなくＦｃγＲＩＩＩａへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む。
【０１１２】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３９位のセリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｓ２３９Ａ）突然変異している。
【０１１３】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２６９位のグルタミン酸残基をアラニン残基で置換することにより（Ｅ２６９Ａ）突然変異している。
【０１１４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２９３位のグルタミン酸残基をアラニン残基で置換することにより（Ｅ２９３Ａ）突然変異している。
【０１１５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２９６位のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより（Ｙ２９６Ｆ）突然変異している。
【０１１６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３０３位のバリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｖ３０３Ａ）突然変異している。
【０１１７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３２７位のアラニン残基をグリシン残基で置換することにより（Ａ３２７Ｇ）突然変異している。
【０１１８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３３８位のリシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｋ３３８Ａ）突然変異している。
【０１１９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３７６位のアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換することにより（Ｄ３７６Ａ）突然変異している。
【０１２０】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＦｃγＲＩＩＩａ結合を減少させ得ることは認識されるであろう。
【０１２１】
本発明の多量体タンパク質は、補体へのその結合を変化させる１つ又は複数の突然変異を含むことができる。変化された補体結合は結合の増加であってもよいし結合の減少であってもよい。
【０１２２】
一実施形態では、このタンパク質はＣ１ｑへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む。古典的な補体経路の開始は、抗原結合ＩｇＧ及びＩｇＭのＣＨ２ドメインへの六量体Ｃ１ｑタンパク質の結合から始まる。本発明の多量体タンパク質は抗原結合部位を持たず、したがって、Ｃ１ｑへの著しい結合を示すとは予想されないであろう。しかし、Ｃ１ｑ結合を減少させる１つ又は複数の突然変異の存在により、抗原会合の非存在下では補体を活性化しないことが保証され、したがって安全性がさらに大きな改善された療法が提供されることになる。
【０１２３】
したがって、一実施形態では、本発明の多量体タンパク質はＣ１ｑへのその結合を減少させる１つ又は複数の突然変異を含む。
【０１２４】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３４位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３４Ａ）突然変異している。
【０１２５】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３５位のロイシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｌ２３５Ａ）突然変異している。
【０１２６】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３５位のロイシン残基をグルタミン酸残基で置換することにより（Ｌ２３５Ｅ）突然変異している。
【０１２７】
一実施形態では、Ｆｃドメインは２３７位のグリシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｇ２３７Ａ）突然変異している。
【０１２８】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３２２位のリシン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｋ３２２Ａ）突然変異している。
【０１２９】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３３１位のプロリン残基をアラニン残基で置換することにより（Ｐ３３１Ａ）突然変異している。
【０１３０】
一実施形態では、Ｆｃドメインは３３１位のプロリン残基をセリン残基で置換することにより（Ｐ３３１Ｓ）突然変異している。
【０１３１】
一実施形態では、多量体タンパク質はＩｇＧ４に由来するＦｃドメインを含む。ＩｇＧ４はＩｇＧ１よりも天然に低い補体活性化プロファイルを有するが、ＦｃγＲのさらに弱い結合も有する。したがって、一実施形態では、ＩｇＧ４を含む多量体タンパク質は、ＦｃγＲ結合を増加させる１つ又は複数の突然変異も含む。
【０１３２】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせてＣ１ｑ結合を減少させ得ることは認識されるであろう。
【０１３３】
本発明の抗体Ｆｃドメインは、システイン残基を作り出す及び／又は除去する１つ又は複数の突然変異を含む。システイン残基は、ポリペプチド単量体単位の個々の対間にジスルフィド架橋を形成することにより、多量体タンパク質の自発的集合に重要な役割がある。したがって、システイン残基の数及び／又は位置を変えることにより、多量体タンパク質の構造を改変して改善された治療特性を有するタンパク質を産生することが可能である。
【０１３４】
本発明の多量体タンパク質は３０９位にシステイン残基を含む。一実施形態では、３０９位のシステイン残基は、突然変異、例えば、ＩｇＧ１に由来するＦｃドメインでは、３０９位のロイシン残基をシステイン残基で置換する（Ｌ３０９Ｃ）、ＩｇＧ２に由来するＦｃドメインでは、３０９位のバリン残基をシステイン残基で置換する（Ｖ３０９Ｃ）ことにより作り出される。
【０１３５】
一実施形態では、抗体Ｆｃドメインは３０８位のバリン残基をシステイン残基で置換することにより（Ｖ３０８Ｃ）突然変異している。
【０１３６】
一実施形態では、ヒンジ領域の２つのジスルフィド結合は、コアヒンジ配列ＣＰＰＣをＳＰＰＳに突然変異させることにより除去されている。
【０１３７】
本発明の一実施形態では、含むグリコシル化部位がもっと少なく、製造性が改善されている多量体タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、翻訳後グリコシル化パターンの複雑さが少なく、したがって、製造するのがもっと簡単であり費用も少なくなる。
【０１３８】
一実施形態では、ＣＨ２ドメイン中のグリコシル化部位は、２９７位のアスパラギン残基をアラニン残基（Ｎ２９７Ａ）又はグルタミン残基（Ｎ２９７Ｑ）で置換することにより除去されている。改善された製造性に加えて、これらのアグリコシル突然変異体は本明細書の上に記載されるＦｃγＲ結合を減少もさせる。
【０１３９】
上に収載される突然変異のいずれでも組み合わせられることは認識されるであろう。
【０１４０】
本発明は、本発明のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖、又はその成分部分をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。ＤＮＡ配列は、例えば、化学処理により産生される合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその任意の組合せを含むことができる。
【０１４１】
本発明のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列は当業者に周知である方法により得ることが可能である。例えば、ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の一部又はすべてをコードするＤＮＡ配列は、決定されているＤＮＡ配列から又は対応するアミノ酸配列に基づいて、望み通りに合成することができる。
【０１４２】
分子生物学の標準技法を使用して本発明のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成技法を使用して完全に又は一部合成することができる。部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を必要に応じて使用してもよい。
【０１４３】
本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明のポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖、又はその成分部分をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。
【０１４４】
ベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション法及び培養法は当業者には周知である。この点に関しては、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishingを参照する。
【０１４５】
本発明の多量体タンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。いかなる適切な宿主細胞／ベクター系でも本発明の多量体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用することができる。細菌、例えば、大腸菌（E.coli）系及び酵母類（Saccharomyces）若しくはピキア（Pichia）などの他の微生物系を使用することができる、又は真核、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系も使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ細胞が含まれる。本発明において使用するのに適した種類のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）には、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと一緒に使用することができるＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞などの、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、又はグルタミンシンセターゼ選択可能マーカーと一緒に使用することができるＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞を含む、ＣＨＯ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞が含まれうる。他の適切な宿主細胞にはＮＳＯ細胞及びＨＥＫ細胞が含まれる。
【０１４６】
本発明は、本発明に従った多量体タンパク質の産生のための工程であって、タンパク質の発現及び多量体への集合に適した条件下で本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養することと、多量体タンパク質を単離し、場合によって精製することとを含む、上記工程も提供する。
【０１４７】
本発明の多量体タンパク質は宿主細胞から良好なレベルで発現される。したがって、多量体タンパク質の特性は商業的処理に貢献する。
【０１４８】
本発明の多量体タンパク質は、任意の適切な方法を使用して作製することができる。一実施形態では、本発明の多量体タンパク質は、凝集を最小化する条件下で産生することができる。一例では、凝集は培養培地、培養液上清、又は精製培地に保存剤を添加することにより最小化することができる。適切な保存剤の例には、Ｎメチルマレイミド、ヨード酢酸、βメルカプトエタノール、βメルカプトエチルアミン、グルタチオン、又はシステインなどのチオールキャッピング剤が含まれる。他の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）などのジスルフィド阻害剤、又はｐＨ６．０より下への酸性化が含まれる。
【０１４９】
一実施形態では、本発明の多量体タンパク質を精製するための工程であって、不純物がカラム上に保持され多量体タンパク質は溶出されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーを非結合様式で実施するステップを含む上記工程が提供される。
【０１５０】
一実施形態では、精製はＦｃＲｎ、ＦｃγＲ又はＣ反応性タンパク質カラム上での親和性捕獲を用いる。
【０１５１】
一実施形態では、精製はプロテインＡを用いる。
【０１５２】
この工程において使用するのに適したイオン交換樹脂には、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給される）が含まれる。このステップは、例えば、ｐＨ約８で実施することができる。
この工程は、例えば、４．５などの約４〜５のｐＨで実施される、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる最初の捕獲ステップをさらに含むことができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給される）などの樹脂を用いることができる。次に、多量体タンパク質は、例えば、２００ｍＭの濃度で塩化ナトリウムなどのイオン食塩水を用いて樹脂から溶出させることが可能である。
【０１５３】
クロマトグラフィーステップ（単数又は複数）は、必要に応じて１回又は複数回の洗浄ステップを含むことができる。
【０１５４】
精製工程は、ダイアフィルトレーションステップなどの、１つ又は複数の濾過ステップも含むことができる。
【０１５５】
必要な数のポリペプチド単量体単位を有する多量体は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより、分子サイズに応じて分離することが可能である。
【０１５６】
したがって、一実施形態では、エンドトキシン及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡから実質的に精製された、特にエンドトキシン及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡがない或いは実質的にない本発明に従った精製された多量体タンパク質が提供される。
【０１５７】
上で使用される精製された形態は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれよりも純粋な、などの少なくとも９０％純度を指すことを意図されている。
【０１５８】
エンドトキシンが実質的にないことは一般的に、ｍｇ産物当たり０．５又は０．１ＥＵなどのｍｇ抗体産物当たり１ＥＵ又はそれよりも少ないエンドトキシン含有量を指すことを意図されている。
【０１５９】
宿主細胞タンパク質又はＤＮＡが実質的にないことは一般的に、必要に応じて、ｍｇ当たり１００μｇ又はそれよりも少ない、特にｍｇ当たり２０μｇなどの、ｍｇのタンパク質産物当たり宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含有量４００μｇ又はそれよりも少ないことを指すことを意図されている。
【０１６０】
本発明の多量体タンパク質は病態の治療及び／又は予防において有用なので、本発明は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて本発明の多量体タンパク質を含む医薬又は診断用組成物も提供する。したがって、医薬を製造するための本発明のタンパク質の使用が提供される。組成物は、通常は薬学的に許容される担体を含むことになる無菌の医薬組成物の一部として普通は供給されることになる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。
【０１６１】
本発明は医薬又は診断用組成物の調製のための工程であって、本発明の多量体タンパク質を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と一緒に添加し混合することを含む上記工程も提供する。
【０１６２】
多量体タンパク質は医薬又は診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、他の抗体成分又はステロイド若しくは他の薬物分子などの非抗体成分を含む他の活性成分を伴っていてもよい。
【０１６３】
医薬組成物は、治療的有効量の本発明の多量体タンパク質を適切に含む。本明細書で使用される用語「治療的有効量」とは、標的にされた疾患若しくは状態を治療する、寛解する若しくは予防するのに、又は検出可能な治療的若しくは予防的効果を示すのに必要な治療剤の量のことである。いかなる医療でも、治療的有効量は、最初は細胞培養アッセイにおいて又は動物モデルにおいて、通常は齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類においてのいずれかで評価することが可能である。動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定することが可能である。
【０１６４】
ヒト対象のための正確な治療的有効量は、疾患状態の重症度、対象の全体的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び頻度、複合薬（単数又は複数）、反応感受性並びに療法に対する耐性／応答に依拠することになる。この量は通例の実験法により決定することが可能であり、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療的有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／ｋｇなどの０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇになる。医薬組成物は、都合よく、用量当たり予め決められた量の本発明の活性剤を含有する単位用量形態で提供することができる。
【０１６５】
本開示に従った多量体タンパク質の治療用量は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは明らかな毒性学的効果は全く示していない。
【０１６６】
本発明に従った多量体タンパク質の一実施形態では、単一用量は循環ＩｇＧレベルの最大９０％の減少を提供することができる。
【０１６７】
組成物は患者に個別に投与してもよいし、他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、順次に又は別々に）投与してもよい。
【０１６８】
一実施形態では、本開示に従った多量体タンパク質は、ステロイド、特にプレドニゾンなどの免疫抑制剤療法と一緒に用いられる。
【０１６９】
一実施形態では、本開示に従った多量体タンパク質はリツキシマブ又は他のＢ細胞療法と用いられる。
【０１７０】
一実施形態では、本開示に従った多量体タンパク質は、任意のＢ細胞若しくはＴ細胞調節剤又は免疫調節剤と一緒に用いられる。例には、メトトレキサート、ミコフェノール酸及びアザチオプリンが含まれる。
【０１７１】
本発明の多量体タンパク質が投与される用量は、治療する状態の性質、存在する疾患の程度及び多量体タンパク質が予防的に使用されているのか既存の状態を治療するために使用されているのかどうかに依拠する。
【０１７２】
投与頻度は多量体タンパク質の半減期及びその効果の持続時間に依拠することになる。多量体タンパク質の半減期が短ければ（例えば、２〜１０時間）、１日当たり１回又は複数回の投与をする必要がある。代わりに、多量体タンパク質の半減期が長ければ（例えば、２〜１５日間）及び／又は持続性の薬力学的効果があれば、１日に１回、１週間に１回又は１若しくは２か月ごとに１回投与するだけでよい。
【０１７３】
一実施形態では、用量は隔週で、すなわち、月２回送達される。
【０１７４】
本明細書で用いられる半減期は、循環中、例えば、血清／血漿中の分子の持続時間を指すことが意図されている。
【０１７５】
本明細書で用いられる薬力学とは、本開示に従った多量体タンパク質の生物学的作用のプロファイル、特に持続時間のことである。
【０１７６】
薬学的に許容される担体はそれ自体が組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘発するべきではなく、毒性をもつべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子などの大きくゆっくり代謝される巨大分子であってもよい。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することが可能である。
【０１７７】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有することができる。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在していてもよい。そのような担体を使えば、医薬組成物は患者が経口摂取するための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方することが可能になる。
【０１７８】
投与のための適切な形態には、例えば、注射又は注入による、例えば、ボーラス注射又は持続注入による、非経口投与に適した形態が含まれる。産物が注射又は注入目的である場合、産物は、油性又は水性媒体中で懸濁液、溶液又は乳濁液の形態をとってもよく、懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有していてもよい。タンパク質はナノ粒子の形態であってもよい。代わりに、抗体分子は、使用前に適切な無菌液で再構成するために乾燥形態であってもよい。
【０１７９】
処方された後は、本発明の組成物は対象に直接投与することが可能である。治療される対象は動物でも可能である。しかし、１つ又は複数の実施形態では、組成物はヒト対象への投与のために適応される。
【０１８０】
適宜、本開示に従った製剤では、最終製剤のｐＨは多量体タンパク質の等電点の値には類似しておらず、例えば、タンパク質のｐＩが８〜９又はそれよりも上の範囲である場合、製剤ｐＨの７は適切であることがある。理論に縛られたくはないが、これにより最終的には、最終製剤に改善された安定性を与えることができ、例えば、多量体タンパク質が溶液のままであると考えられる。
【０１８１】
一例では、４．０〜７．０の範囲のｐＨでの医薬製剤は、１〜２００ｍｇ／ｍＬの本開示に従ったタンパク質分子、１〜１００ｍＭの緩衝液、０．００１〜１％の界面活性剤、ａ）１０〜５００ｍＭの安定化剤、ｂ）１０〜５００ｍＭの安定化剤と５〜５００ｍＭの等張化剤、又はｃ）５〜５００ｍＭの等張化剤を含む。
【０１８２】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮的（transdermal）、経皮的（transcutaneous）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸的、局所的、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれらに限定されない任意の数の経路により投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物は液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射液として調製することができる。注射に先立って液体媒体中の溶液又は懸濁液に適した固形形態も調製することができる。
【０１８３】
組成物の直接送達は一般に、皮下に、腹腔内に、静脈内に若しくは筋肉内に注射により達成される、又は組織の間質腔に送達されることになる。組成物は病変内に投与することも可能である。投薬治療は単一用量予定でも複数用量予定でもよい。
【０１８４】
組成物中の活性成分はタンパク質分子になることは認識されるであろう。したがって、活性成分は胃腸管中での分解に感受性になる。したがって、組成物を胃腸管を使用する経路により投与するつもりであれば、組成物は、タンパク質を分解から保護するが胃腸管により吸収された後はタンパク質を放出する薬剤を含有する必要がある。
【０１８５】
薬学的に許容される担体についての徹底的な考察はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)で入手可能である。一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０１８６】
適切な可吸入調製物には、可吸入粉末、推進用ガスを含有する計量エアロゾル又は推進用ガスのない可吸入液が含まれる。活性物質を含有する本開示に従った可吸入粉末は、活性物質のみから又は活性物質と生理的に許容される賦形剤の混合物からなっていてもよい。これらの可吸入粉末は、単糖類（例えば、グルコース又はアラビノーズ）、二糖類（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴ糖及び多糖類（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物を含むことができる。単糖類又は二糖類は適切に使用され、ラクトース又はグルコースの使用は、特にその水和物の形態であるが、水和物の形態だけに限るわけではない。
【０１８７】
肺における沈着のための粒子は、１〜９ミクロン、例えば、１〜５μｍなどの１０ミクロン未満の粒子サイズが必要である。活性成分（例えば、抗体又は断片）の粒子サイズは極めて重要である。
【０１８８】
可吸入エアロゾルを調製するために使用することが可能である推進用ガスは当技術分野では既知である。適切な推進用ガスは、ｎプロパン、ｎブタン又はイソブタンなどの炭化水素並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン若しくはシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロゲン化炭化水素の中から選択される。上記推進用ガスは単独で又はその混合物で使用してもよい。
【０１８９】
特に適した推進用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。ハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにその混合物が特に適切である。
【０１９０】
推進用ガス含有可吸入エアロゾルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤などの他の成分及びｐＨを調整するための手段も含有していてよい。これらの成分はすべて当技術分野では既知である。
【０１９１】
本発明に従った推進用ガス含有可吸入エアロゾルは最大５重量％の活性物質を含有することができる。本発明に従ったエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０１９２】
代わりに、肺への局所投与は、例えば、ネブライザー、例えば、圧縮機に接続されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．製のＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）圧縮機に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）などの装置を用いて液体溶液又は懸濁製剤の投与によるものでもよい。
【０１９３】
本発明のタンパク質は溶媒中に分散して、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することが可能である。本発明の多量体タンパク質は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬学的に許容される溶媒又は緩衝液に懸濁することが可能である。当技術分野で既知の緩衝液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、１ｍｌの水当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇ  ＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇ無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇクエン酸ナトリウムを含有することができる。懸濁剤は、例えば、凍結乾燥させたタンパク質を用いることが可能である。
【０１９４】
治療懸濁液又は溶液製剤は、１つ又は複数の賦形剤も含有することが可能である。賦形剤は当技術分野では周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び炭酸水素緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液はリポソーム又は生分解性マイクロスフェアに被包することが可能である。製剤は一般に、無菌製造工程を用いることから実質的に無菌で提供されることになる。
【０１９５】
これには、製剤のために使用される緩衝溶媒／溶液の濾過による生産及び無菌化、無菌緩衝溶媒溶液中のタンパク質の無菌懸濁液、及び当業者にはよく知られている方法による無菌容器内への製剤の分注が含まれ得る。
【０１９６】
本開示に従った噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包装された単一用量単位（例えば、密封プラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。それぞれのバイアルは、体積、例えば、２ｍＬの溶媒／溶液緩衝液に単位用量を含有する。
【０１９７】
本明細書に開示される多量体タンパク質は、噴霧療法による送達に適している場合もある。
【０１９８】
本発明のタンパク質は遺伝子治療の使用により投与できることも想定している。これを実現するためには、適切なＤＮＡ成分の制御下でタンパク質分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列は、ポリペプチド鎖がＤＮＡ配列から発現されてｉｎ  ｓｉｔｕで構築されるように、患者内に導入される。
【０１９９】
一実施形態では、治療において使用するために本発明の多量体タンパク質を提供する。
【０２００】
一実施形態では、免疫不全の治療において使用するために本発明の多量体タンパク質を提供する。
【０２０１】
一実施形態では、がんの治療において使用するための本発明の多量体タンパク質を提供する。
【０２０２】
一実施形態では、ワクチンとして使用するための本発明の多量体タンパク質を提供する。
【０２０３】
一実施形態では、免疫不全の治療のための医薬を調製するための本発明の多量体タンパク質の使用を提供する。
【０２０４】
一実施形態では、がんの治療のための医薬を調製するための本発明の多量体タンパク質の使用を提供する。
【０２０５】
一実施形態では、ワクチンを調製するための本発明の多量体タンパク質の使用を提供する。
【０２０６】
本発明の多量体タンパク質を使用して治療することができる免疫不全の例には、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、川崎病及びギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）が含まれる。
【０２０７】
本発明は、自己免疫疾患、例えば、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、ＡＮＣＡ関連血管炎、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫血管浮腫、自己免疫再生不良性貧血、自己免疫自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫高脂血症、自己免疫免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫蕁麻疹、軸索及び爪ニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋症、クレスト病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、拡張型心筋症、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性血管中心性線維症（Eosinophilic angiocentric fibrosis）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）ウェゲナー参照、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎（Hashimoto's encephalitis）、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性低補体血症性尿細管間質性腎炎（Idiopathic hypocomplementemic tubulointestitial nephritis）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連疾患、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、炎症性大動脈瘤、炎症性偽腫瘍、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、キュットナー腫瘍、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、ミクリッツ症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、結合組織増殖症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、オーモンド病（後腹膜線維症）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、異常タンパク性多発ニューロパチー（Paraproteinemic polyneuropathies）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群（Parry Romberg syndrome）、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、尋常性天疱瘡、大動脈周囲炎、動脈周囲炎、末梢神経障害、静脈周囲脳髄膜炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、１型、２型及び３型自己免疫多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、��発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症（オーモンド病）、リウマチ熱、関節リウマチ、リーデル甲状腺炎、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚炎、白斑、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、温特発性溶血性貧血（Warm idiopathic haemolytic anaemia）及びウェゲナー肉芽腫症（現在では、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれるの制御において使用するための多量体タンパク質（又は多量体タンパク質を含む組成物）も提供する。
【０２０８】
一実施形態では、本開示に従った多量体タンパク質及び断片は、癲癇又は発作の治療又は予防に用いられる。
【０２０９】
一実施形態では、本開示に従った多量体タンパク質及び断片は、多発性硬化症の治療又は予防に用いられる。
【０２１０】
実施形態では、本開示に従った多量体タンパク質及び断片は、
・抗ＨＬＡ抗体に起因する移植ドナーミスマッチ
・胎児及び新生児同種免疫性血小板減少症、ＦＮＡＩＴ（又は新生児同種免疫性血小板減少症、ＮＡＩＴＰ若しくはＮＡＩＴ若しくはＮＡＴ、又は胎児母体同種免疫性血小板減少症、ＦＭＡＩＴＰ若しくはＦＭＡＩＴ）
を含む同種免疫疾患／徴候に用いられる。
【０２１１】
追加の徴候には、ヒト患者及び多量体タンパク質療法と他の療法、ＩＶＩｇ、リツキサン、血漿交換療法の組合せからのＦｃ含有生物製剤薬の急速なクリアランスが含まれる。例えば、多量体タンパク質療法はリツキサン療法に続いて用いることができる。
【０２１２】
実施形態では、本開示の抗体及び断片は、
・慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）
・ギラン・バレー症候群
・異常タンパク性多発ニューロパチー
・視神経脊髄炎（ＮＭＯ、ＮＭＯスペクトル障害又はＮＭＯスペクトル疾患）、及び
・重症筋無力症
などの神経学障害において用いられる。
【０２１３】
実施形態では、本開示の抗体及び断片は、
・水疱性類天疱瘡
・尋常性天疱瘡
・ＡＮＣＡ関連血管炎
・拡張型心筋症
などの皮膚科障害において用いられる。
【０２１４】
一実施形態では、本開示のタンパク質は、
・特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
・血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
・温特発性溶血性貧血
・グッドパスチャー症候群
・抗ＨＬＡ抗体に起因する移植ドナーミスマッチ
などの免疫学又は血液学障害に用いられる。
【０２１５】
一実施形態では、障害は、重症筋無力症、視神経脊髄炎、ＣＩＤＰ、ギラン・バレー症候群、異常タンパク性多発ニューロパチー、難治性癲癇、ＩＴＰ／ＴＴＰ、溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、ＡＢＯミスマッチ、ループス腎炎、腎血管炎、強皮症、繊維性肺胞炎、拡張型心筋症、グレーブス病、１型糖尿病、自己免疫性糖尿病、天疱瘡、強皮症、ループス、ＡＮＣＡ血管炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群及び関節リウマチから選択される。
【０２１６】
一実施形態では、障害は、自己免疫性多腺性内分泌症候群１型（autoimmune polyendocrine syndrome types 1）（ＡＰＥＣＥＤ又はウィタカー症候群）及び２型（シュミット症候群）、汎発性脱毛症、筋無力症クリーゼ、甲状腺クリーゼ、甲状腺関連眼病、甲状腺眼障害、自己免疫性糖尿病、自己抗体関連脳炎及び／又は脳症、落葉状天疱瘡、表皮水疱症、疱疹状皮膚炎、シデナム舞踏病、急性運動性軸索型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、ミラー・フィッシャー症候群、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、眼球クローヌス、炎症性筋疾患、アイザック症候群（自己免疫性神経性筋強直症）、腫瘍随伴症候群並びに辺縁系脳炎から選択される。
【０２１７】
本発明の多量体タンパク質を使用して治療することができるがんの例には、結腸直腸がん、肝細胞腫（肝臓がん）、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、甲状腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん又は肺がんが含まれる。
【０２１８】
一実施形態では、がんはメラノーマなどの皮膚がんである。一実施形態では、がんは白血病である。一実施形態では、がんは神経膠芽腫、髄芽腫又は神経芽細胞腫である。一実施形態では、がんは神経内分泌がんである。一実施形態では、がんはホジキン又は非ホジキンリンパ腫である。
【０２１９】
本開示に従った多量体タンパク質は治療又は予防において用いることができる。
【０２２０】
本発明は、個体において望ましくない抗体の濃度を減少させる方法であって、個体に治療的有効用量の本明細書に記載される多量体タンパク質を投与するステップを含む上記方法も提供する。
【０２２１】
本発明の多量体タンパク質は診断、例えば、Ｂ細胞関連リンパ腫などのＦｃ受容体に関連する病状のｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び画像診断においても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１−１】ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、突然変異はボールド及び下線で示されている。随意のヒンジ領域は下線を施されている。
【図１−２】ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、突然変異はボールド及び下線で示されている。随意のヒンジ領域は下線を施されている。
【図１−３】ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、突然変異はボールド及び下線で示されている。随意のヒンジ領域は下線を施されている。
【図１−４】ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、突然変異はボールド及び下線で示されている。随意のヒンジ領域は下線を施されている。
【図１−５】ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、突然変異はボールド及び下線で示されている。随意のヒンジ領域は下線を施されている。ＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む構築物では、この領域はイタリック体で示されている。
【図１−６】ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、突然変異はボールド及び下線で示されている。随意のヒンジ領域は下線を施されている。ＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む構築物では、この領域はイタリック体で示されている。
【図１−７】ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図である。それぞれの配列では、突然変異はボールド及び下線で示されている。随意のヒンジ領域は下線を施されている。
【図２】は、ＣＨＯ細胞において一過性に発現されるＩｇＧ１−Ｆｃ−Ｌ３０９ＣについてＧ３０００サイズ排除ＨＰＬＣ後に得られた精製された画分の重ね合わせを示す図である。結果によれば、タンパク質は集合して一定範囲の数の単量体単位を有する多量体になることが実証されている。グラフは単量体、二量体、三量体、四量体、五量体及び五量体より高次の形態の存在を示している。Ｍ＝単量体Ｄｉ＝二量体Ｔｒｉ＝三量体Ｔｅｔ＝四量体Ｐｅｎｔ＋＝五量体及び五量体より高次
【図３】は、ヒトマクロファージによるＢ細胞の抗体依存性食作用に対する多量体タンパク質の効果を示す図である。結果によれば、多量体タンパク質はマクロファージによる食作用を阻害していることが実証されている。データによれば、増加する結合価（すなわち、単量体の数が増えていく多量体）と増加する効力の間には明白な正の相関があることが示されている。多量体により達成される効力及び最大レベルの阻害はヒトＩＶＩＧよりも有意に優れている。
【図４】は、多量体タンパク質によるサイトカイン放出の刺激を示す図である。
【実施例】
【０２２３】
（例１）分子生物学
ＰＣＲ、制限−ライゲーションクローニング、点突然変異誘発（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ）及びサンガー配列決定法を含む標準分子生物学的方法を使用した。発現構築物は、ＣＨＯ細胞において一過性発現と安定的発現の両方に適している発現ベクターにクローニングした。適切な発現ベクターの例はｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
合成配列の新規設計
ＤＮＡ配列は、隣接している制限部位、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ、コザック配列、シグナルペプチド並びに対象の遺伝子を含有するように設計された。配列はＤＮＡ２．０により合成した。
制限酵素クローニング
合成されたＤＮＡ配列は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩを使用して発現ベクター中にサブクローニングした。
突然変異誘発
Ｆｃ断片への突然変異は部位特異的突然変異誘発により導入した。オリゴは所望の突然変異を取り込むように設計し、Ｓｉｇｍａ社から購入した。ＰＣＲ反応は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ突然変異誘発キットを使用してアミノ酸を置換するように設定した。
【０２２４】
ポリペプチド単量体単位のポリペプチド鎖の例となるアミノ酸配列を示す図は、図１に提供されている。それぞれの配列では、突然変異はボールド及び下線で示されている。随意のヒンジ領域は下線を施している。ＩｇＭ由来のＣＨ４ドメインを含む構築物では、この領域はイタリック体で示されている。
【０２２５】
（例２）
発現
リポフェクタミン又は電気穿孔法を使用してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞の「一過性」発現を使用して小規模発現を実施した。培養物は、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｌｏｎｚａ）又はＰｒｏＣＨＯ５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地において５０〜２０００ｍｌの範囲のスケールで５〜１０日間、振盪フラスコ又は撹拌バッグ中で増殖させた。細胞は遠心分離により除去し、培養液上清は精製するまで４℃で保存した。細胞を除去した後、いくつかの培養物には保存剤を添加した。
【０２２６】
結果によれば、多量体タンパク質が十分発現されたことが実証された。
【０２２７】
（例３）
精製及び分析
Ｆｃ多量体は、ｐＨの点検／６．５以上への調整後プロテインＡクロマトグラフィーとともにｐＨ３．４緩衝液を使用する溶出ステップにより培養液上清から精製した。溶出液は１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５を使用して直ちにｐＨ約７．０まで中和し、その後４℃で保存した。分析的サイズ排除クロマトグラフィーを使用し、Ｓ２００カラム及び画分採取を使用して種々の多量体形態のＦｃドメインを分離した。画分は分析し、Ｇ３０００ＨＰＬＣ並びに還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後プールした。エンドトキシンはカブトガニアメボサイトライセート（ＬＡＬ）アッセイを使用して試験し、アッセイで使用した試料は１ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【０２２８】
保存剤の存在下で多量体タンパク質を精製すると凝集する傾向が減少し、さらに均一な構造を有する改善された調製物が産生された。効果的であることが明らかにされている保存剤の例には、Ｎエチルマレイミド（ＮＥＭ）及びグルタチオン（ＧＳＨ）などのチオールキャッピング剤；並びにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのジスルフィド阻害剤が含まれる。
【０２２９】
図２は、ＣＨＯ細胞において一過性に発現されるＩｇＧ１−Ｆｃ−Ｌ３０９ＣについてＧ３０００サイズ排除ＨＰＬＣ後に得られた精製された画分の重ね合わせを示す。結果によれば、タンパク質は集合して一定範囲の数の単量体単位を有する多量体になることが実証されている。グラフは単量体、二量体、三量体、四量体、五量体及び五量体より高次の形態の存在を示している。
【０２３０】
（例４）
Ｂ細胞標的のマクロファージ食作用
ヒトマクロファージによるＢ細胞の抗体依存性食作用を測定するアッセイを設計した。マクロファージを調製するため、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を先ず密度勾配遠心分離により新鮮血から単離した。次に、単核球は、ＰＢＭＣを６ウェル組織培養被覆プレートにおいて３７℃で１時間インキュベートし、それに続いて非付着性細胞を除去することにより選択した。付着性単核球は、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）での５日培養によりマクロファージに分化した。次に、ヒトＢ細胞は、ＰＢＭＣの単離とそれに続くＭＡＣＳを使用する負の選択によりＢ細胞を精製することにより、別々の（同種）ドナーから調製した（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。いくつかのアッセイで、Ｂ細胞はカルボキシフルオセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。分化したマクロファージとＢ細胞は抗ＣＤ２０  ｍＡｂ（リツキシマブ：Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）の存在下、１対５比で共培養し、Ｂ細胞の抗体依存性食作用を誘導した。多量体タンパク質又は対照は指示濃度で添加し、細胞は３７℃、５％ＣＯ２で１〜２４時間インキュベートした。それぞれの時点の終了時、細胞は遠心分離し４℃でＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁してそれ以上の食作用を停止し、Ｂ細胞はフローサイトメトリーによる分析前に抗ＣＤ１９アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で表面染色した。マクロファージはその自己蛍光／側方散乱性により、Ｂ細胞はそのＣＦＳＥ／ＣＤ１９標識化により識別した。ＣＤ１９標識化に対して陰性のＣＦＳＥ陽性マクロファージは貪食されたＢ細胞を含有すると仮定した。
【０２３１】
図３は、多量体タンパク質がヒトマクロファージによるＢ細胞の抗体依存性食作用を阻害することを示している。データによれば、増加する結合価（すなわち、単量体の数が増えていく多量体）と増加する効力の間には明白な正の相関があることが示されている。多量体により達成される効力及び最大レベルの阻害はヒトＩＶＩＧよりも有意に優れている。
【０２３２】
ＣＦＳＥ染色Ｂ細胞を使用するフローサイトメトリー分析により、その作用機序がマクロファージ食作用の阻害であり、Ｂ細胞死滅でも他の手段によるアポトーシスでもないことが確かめられた。
【０２３３】
（例５）
ヒト全血サイトカイン放出アッセイ
新鮮血をリチウムヘパリンバキュテナーにおいてドナーから採取した。対象のＦｃ多量体構築物又は対照は指示濃度まで無菌ＰＢＳ中に連続希釈した。１２．５μｌのＦｃ多量体又は対照をアッセイプレートに添加し、続いて２３７．５μｌの全血を添加した。プレートはＣＯ２補充なしで２４時間、３７℃でインキュベートした。プレートは１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、サイトカイン分析のために血清を除去した。サイトカイン分析はＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙサイトカインマルチプレックスにより、製造業者のプロトコルに従って実施し、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ６０００上で読み取った。
【０２３４】
結果は図４に示している。データによれば、多量体タンパク質中の単量体単位の数と放出されたサイトカインのレベルの間には正の相関があることが示された。本発明の四量体及びそれよりももっと高次な多量体により産生されるサイトカインレベルは、精製された六量体ＩｇＧ１  Ｆｃ／ＩｇＭテイルピースにより産生されるサイトカインレベルに類似していた。
【図１−１】
2017513481.tif 000004
【図１−２】
2017513481.tif 000005
【図１−３】
2017513481.tif 000006
【図１−４】
2017513481.tif 000007
【図１−５】
2017513481.tif 000008
【図１−６】
2017513481.tif 000009
【図１−７】
2017513481.tif 000010
【図２】
2017513481.tif 000011
【図３】
2017513481.tif 000012
【図４】
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【配列表】
2017513481000001.app
【国際調査報告】
2017513481.tif 000014
2017513481.tif 000015
2017513481.tif 000016