(57)【要約】  上皮表面のタイトジャンクションを開くための配列及び任意に細胞浸透配列を含むペプチド；及び任意にさらなる医薬品を含む関連組成物；及び関連する方法。【選択図】図１
2017528417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式２の配列を含むペプチド、
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
式２（配列番号：２）
ここで：
Ｘ５は、任意のアミノ酸残基であり;
Ｘ６は、Tyrであり;
Ｘ７は、Glnであり;そして
Ｘ８は、Tyrである、
いくつかの態様では：
Ｘ５は、正に荷電したアミノ酸残基であり;
Ｘ６は、Tyrであり;
Ｘ７は、Glnであり;そして
Ｘ８は、Tyrである、
または、式１の配列を含むペプチド：
Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
式１（配列番号：１）
ここで：
Ｘ４は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluであり;
Ｘ５は、小さな疎水性アミノ酸残基、例えばVal又はAlaであり;
Ｘ６は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばLys又はArgであり;
Ｘ７は、親水性アミノ酸残基、例えばTyr、Phe、Thr又はSerであり;そして
Ｘ８は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluである、
または、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、式１又は式２の配列のレトロインベルソ形態を含むペプチド。
【請求項２】
細胞浸透ペプチドＣＰＰ配列をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
式１の配列を含む請求項１又は請求項２に記載のペプチド、
ここで：
Ｘ４は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluであり;
Ｘ５は、小さな疎水性アミノ酸残基、例えばVal又はAlaであり;
Ｘ６は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばLys又はArgであり;
Ｘ７は、親水性アミノ酸残基、例えばTyr、Phe、Thr又はSerであり;そして
Ｘ８は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluである、
ここで、Ｘ４はAsp又はGluであり; Ｘ５はValであり;Ｘ６はLysであり;Ｘ７はTyrであり；そしてＸ８はAsp又はGluであり;又はここで、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であり、ペプチド配列の順序が逆である。
【請求項４】
式１ａによる配列を含む請求項１に記載のペプチド、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０
式１ａ（配列番号:５）
ここで：
Ｘ１は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ２は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ３は、欠失又は疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘ４は、負に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、小さな疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘ６は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ７は、疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘ８は、負に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ９は、正に荷電したアミノ酸残基であり；そして
Ｘ１０は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；又はここで、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である。
【請求項５】
Ｘ１がLys又はArgであり；Ｘ２がLys又はArgであり；Ｘ３がAla又はValであり；Ｘ４がAsp又はGluであり；Ｘ５がValであり；Ｘ６がLysであり；Ｘ７がTyrであり；Ｘ８がAsp又はGluであり；Ｘ９がLys又はArgであり；そしてＸ１０がLys又はArgであり；又はここで、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、請求項４の記載のペプチド。
【請求項６】
式２による配列を含む、請求項１又は請求項２に記載のペプチド、
ここで、
Ｘ５は、任意のアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；そして
Ｘ８は、Tyrである、
ここで、Ｘ５はLys又はArgであり；Ｘ６はTyrであり；Ｘ７はGlnであり；そしてＸ８はTyrであり、又はここで、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である。
【請求項７】
式２ａの配列を含む、請求項１に記載のペプチド、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２
式２ａ（配列番号:１２）
ここで：
Ｘ１は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ２は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ３は、Ala又はValであり；
Ｘ４は、欠失又はAla又は１、２、３若しくは４個の正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；
Ｘ８は、Tyrであり；
Ｘ９は、欠失又はAla又は１、２、３若しくは４個の正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ１０は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ１１は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ１２は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；又はここで、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である。
【請求項８】
Ｘ１がArgであり；Ｘ２がLysであり；Ｘ３がAlaであり；Ｘ４は欠失しており；Ｘ５がLysであり；Ｘ６がTyrであり；Ｘ７がGlnであり；Ｘ８がTyrであり；Ｘ９は欠失しており；Ｘ１０がArgであり；Ｘ１１がArgであり；そしてＸ１２がLysであり；又はここで、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、配列の順序が逆である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
配列  Arg-Arg-Val-Glu-Val-Lys-Tyr-Asp-Arg-Arg-NH２（配列番号：３）；又は配列  Arg-Lys-Ala-Lys-Tyr-Gln-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH２（配列番号：４）；又はここで、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であり、配列順序が逆である配列、を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
第２の治療剤をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記第２の治療薬が、インスリン、ＧＬＰ−１又はそれらの誘導体、類似体又は模倣体である請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、経口投与に適しており、任意に、前記ペプチド及び／又は前記第２の治療剤を胃における分解から保護するための腸溶コーティングを含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
医薬として使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド又は請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド又は請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド又は請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物の有効量を上皮に投与することを含む、上皮表面のタイトジャンクションを開く方法。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドと共に、又は請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物の一部として、前記薬剤を投与することを含む、薬剤を、上皮表面を横切って送達する方法。
【請求項１８】
前記方法がインビトロで行われる、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
上皮細胞は、薬物送達（drug delivery）に対するバリアを構成する。例えば、経口投与された治療薬（therapeutics）の吸収は、消化管の上皮によって、制限され得るし、吸入により送達された治療薬の吸収は、肺上皮によって、制限され得る。同様に、例えば直腸腔、口腔、膣腔、鼻腔等の他の上皮部位に送達された、又は皮膚へ局所投与された、治療薬の吸収は、上皮バリアによって、同様に制限され得る。このバリアは、小分子、ペプチド、タンパク質、ワクチン及び核酸を含む広範な薬物の送達に対する課題を提起する。上皮により供される薬物吸収に対するバリアの影響を軽減するための様々な試みがなされてきた。しかし、これらの試みの多くは、故意に又は意図しない副作用として上皮を損傷する薬剤の使用を伴う。このような損傷により、物質が制御されることなく上皮を横切って通過する結果を招くことがあり、細胞損傷に起因する免疫学的危険信号との考え得る組み合わせにおいて、上皮の望ましくない炎症をもたらし得る。したがって、好ましくは制御され、一時的でも、許容できない細胞損傷を生じないような方法で、上皮表面を横切る治療剤の通過を助ける改良された技術が必要とされている（Brayden & Maher (2000) Therapeutic Delivery 1 (1): 5-9。
【０００２】
上皮によって提起された薬物吸収への課題により、例えば皮下注射による、上皮を横切る経路以外の経路によって送達される必要があるいくつかの薬物がもたらされた。これは、患者の受容性の低下、患者のコンプライアンスの低下、液体製剤の使用及び貯蔵、注入装置の提供及び使用済み注入装置の安全かつ確実な廃棄に関連するコストの増加を含む多くの欠点をもたらす。
【０００３】
上皮は薬物の吸収に対するバリアをもたらす。なぜなら、それは、多くの物質に対する封鎖をもたらしながらも過渡的に開くことができるタイトジャンクション（tight junctions）によって互いに連結された細胞の層を含むからである。治療薬の送達を助けるために、タイトジャンクションの開口をより良好に制御することが可能である必要がある。タイトジャンクションの開口の問題に対する多くの解決策が提案されている。これらの試みにより、非天然の拡張アミノ酸（NEAAs）および短鎖脂肪酸（SCFAs）の２組の分子の同定を導いた。NEAAsは主にEmisphere社によって開発された。同社は、薬物摂取量の限界の改善を提示したが、新薬の規制承認申請はまだ提出していない。アンピシリンの取り込みを改善するために、１つのSCFAであるカプリン酸ナトリウムが、承認された直腸坐薬製品中に、使用されている。しかしながら、粘膜上皮の局所的な損傷を通じて吸収メカニズムが改善されるものであると疑われている（Maher et al. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61:1427-1449）。
【０００４】
糖尿病、肥満、食欲の抑制及び炭水化物代謝の改善の治療のためのインスリン、グルカゴン様ペプチド１（GLP-1）及び他の関連分子の経口送達については、特に関心が存在する。このような化合物は、典型的には、数ヶ月、数年又はそれ以上の間投与されるので、特に経口送達経路が必要であり、このことは、注射を避けることで患者の受容性を上昇させるであろうこと、及び潜在的にコストを低下させるであろうことを意味し、又、これらの消化管ホルモンは、本来、肝の門静脈を介して患者の血流に入るため、腸バリアを横切る送達は、生理学的送達経路に、より倣ったものと考えられるからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Brayden & Maher (2000) Therapeutic Delivery 1 (1): 5-9
【非特許文献２】Maher et al. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61:1427-1449
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上皮のタイトジャンクションの開口制御に有用な化合物の発見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の側面によれば、式１の配列を含むペプチド：
Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
式１（配列番号：１）
ここで：
Ｘ４は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、小さな疎水性アミノ酸残基、例えばVal又はAlaであり；
Ｘ６は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばLys又はArgであり；
Ｘ７は、親水性アミノ酸残基、例えばTyr、Phe、Thr又はSerであり；そして
Ｘ８は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluである、
または、式２の配列を含むペプチド：
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
式２（配列番号：２）
ここで：
Ｘ５は、任意のアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；そして
Ｘ８は、Tyrである、
または、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、式１又は式２の配列のレトロインベルソ形態を含むペプチド、
が提供される。
【０００８】
本発明の第２の側面によれば、式１の配列を含むペプチド
Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
式１（配列番号：１）
ここで：
Ｘ４は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、小さな疎水性アミノ酸残基、例えばVal又はAlaであり；
Ｘ６は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばLys又はArgであり；
Ｘ７は、親水性アミノ酸残基、例えばTyr、Phe、Thr又はSerであり；そして
Ｘ８は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluである、
及び／又は、式２の配列を含むペプチド
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
式２（配列番号：２）
ここで：
Ｘ５は、任意のアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；そして
Ｘ８は、Tyrである；
または、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、式１及び／又は式２の配列のレトロインベルソ配置であるペプチド、
並びに、薬学的に許容される担体、
を含む医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明の第３の側面によれば、医薬として使用するための、本発明の第１の側面によるペプチド又は本発明の第２の側面による医薬組成物が提供される。
【００１０】
本発明の第４の側面によれば、医薬の製造のための、本発明の第１の側面によるペプチド又は本発明の第２の側面による医薬組成物の使用が提供される。
【００１１】
本発明の第５の側面によれば、本発明の第１の側面によるペプチド又は本発明の第２の側面による医薬組成物の有効量を、上皮に投与することを含む、上皮表面のタイトジャンクションを開く方法が提供される。
【００１２】
本発明の第６の側面によれば、本発明の第１の側面によるペプチドと共に、又は本発明の第２の側面による医薬組成物の一部として、薬剤を投与することを含む、上皮表面を横切って薬剤を送達する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ミオシン軽鎖（MLC）のリン酸化状態を調節することが知られているホスファターゼ及びキナーゼの構成。MLCをリン酸化することができるミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）は、細胞質カルシウム（Ca２＋）−カルモジュリンレベルの増加によって活性化される。MLCKの活性化形態は、小さな膜透過性のキナーゼのペプチド阻害剤（PIK）によって阻害され得る。ミオシン軽鎖ホスファターゼ（MLCP）複合体の活性は、CPI-17及びMYPT1として知られる２つの調節サブユニットによって制御される。これらの制御サブユニットの作用は、その順に、プロテインキナーゼＣ活性及びRhoキナーゼ活性によって、それぞれ制御される。
【図２】タイトジャンクション（TJ）の開／閉及びMLCのリン酸化／脱リン酸化の動的調節。本来の（native）状態では、MLCPは活性であり;これは、MLCを脱リン酸化状態に及びTJ構造を閉鎖状態に維持し、そこには細胞間隙（paracellular）（隣接する上皮細胞の間）の溶質の最小限の流れ（flux）がある。MLCKの持続的活性化又はMLCPの抑制は、MLCリン酸化状態の増加及び細胞間隙の溶質流の増加を導くであろう。
【図３】MYPT1の残基1-299は一方の表面でPP1と相互作用し、CPI-17は他方の表面と相互作用する。結晶構造のリボン描写は、MYPT1及びCPI-17が、平滑筋細胞において、どのように相互作用すると予測されるかを描写する。これらの相互作用は、分極した上皮細胞のそれらとは異なる可能性がある。
【図４】[Ａ]RRVEVKYDRR（ペプチド640、配列番号：３）の１mM及び５mMにおけるCaco-２細胞単層のTEER（経上皮電気抵抗）に対する作用の時間経過を、ペプチド無しのコントロールと比較した。[Ｂ]５mMまでのペプチド細胞毒性の欠如−MMTアッセイ、カスパーゼ活性化など。
【図５】RRVEVKYDRR（ペプチド640、配列番号：３）及びRKAKYQYRRK（ペプチド250、配列番号：４）のTEER [左]と４kDaフルオレセイン標識デキストラン（４FD）の輸送[右]に対する作用を、コントロールペプチドと比較した（すべて５mMで添加）。測定は、０、１５、３０、４５、６０、７５、９０及び１２０分で行った。４５分で、すべてのアピカル側の内側（apical medial）が４FDに置換されたが、ペプチドは置換されなかった。７０分で、すべてのアピカル側の媒体（apical media）に、４FDと洗い出し（washout）の前に存在するのと同じペプチドとを補充した。各時点の値は、２つのCaco-２単層の平均を表す。統計分析は行われなかった。
【図６】ペプチド250又はペプチド640の適用後のCaco-２単層を横切る絶対値TEER（Ａ）及び初期TEER％（Ｂ）。矢印は、ペプチドを洗浄し、ＰＢＳで置換した時点を表す。コントロールは、ペプチドを含まないＰＢＳである。コントロール群についてはｎ＝６であり、すべてのペプチド群についてはｎ＝５である。示されたデータは平均値±ＳＤである。
【図７】デキストランとペプチド250又はペプチド640との適用後に基底外側（baso-lateral）区画に見出された４kDaデキストラン（Ａ）及び７０kDaデキストラン（Ｂ）の累積量。コントロール群についてはｎ＝６であり、すべてのペプチド群についてはｎ＝５である。示されたデータは平均値±ＳＤである。
【図８】（Ａ）雄性Wistarラットにおけるインスリンの皮下注射後の初期血糖％。３０IU/kgインスリンとペプチド250（Ｂ）及びペプチド640（Ｃ）とを腸内注入後の初期血糖％レベル。すべてのデータセットについてｎ＝３。示されたデータは平均値±ＳＤである。
【図９】PIPペプチドの管腔内腸内注入は、pMLC含量を一時的に増加させ、インビボで非糖尿病ラット腸組織におけるインスリンの細胞間隙（paracellular）摂取を増強する。（Ａ）総MLC含量に対するSer１９（pMLC-Ser１９）でリン酸化されたミオシン軽鎖（MLC）の程度の変化を評価するために使用される代表的な半定量的ウェスタンブロット分析。（Ｂ）PIPペプチドのILI注入は、pMLC含量を増加させる。指定濃度でのPIPペプチドのアピカル（apical）への適用後の選択された時点でのラット腸組織におけるpMLC-Ser１９レベルに対するMLCの比。* p＜０．０５。（Ｃ）ILI注入後にPIPペプチドによって増強された蛍光（Cy3-標識）インスリンの細胞間隙輸送。核はDAPI-染色されている（青色）。
【図１０】PIPペプチド250及び640は、非糖尿病ラットの腸管腔からの異なる動態でのヒトインスリンの取り込みを増強する。（Ａ）インスリン３０IU/kgとPIPペプチドのILI注入後の門静脈から採取した血液からの血清試料中のインスリンの時間−濃度プロファイル。一方向分散分析（One-way ANOVA）は、データセットが互いに有意に異なることを示す（p＜０．０１）。Bonferroniのポストテストは、インスリンとペプチド250（p＜０．０１）及びインスリンとペプチド640（p＜０．０５）は、インスリン単独とは有意に異なることを示している。（Ｂ）インスリン３０IU/kgとPIPペプチドのILI注入後に尾静脈から採取した血清試料中のインスリンの時間−濃度プロファイル。一方向分散分析を用いて比較した場合、群間に有意差はなかった。（Ｃ）３IU/kgのヒトインスリンのＳＣ注射後の非糖尿病マウスの尾静脈および門静脈から採取した血液の血清試料中のインスリンの時間−濃度プロファイル。データは、各処置群についてｎ＝３の平均値±ＳＤである。
【図１１】PIPペプチド250及び640は、非糖尿病ラットの腸管腔からの異なる動態でのヒトインスリンの取り込みを増強する。（Ａ）インスリン３０IU/kgとPIPペプチドのILI注入後の門静脈から採取した血液からの血清試料中のインスリンの時間−濃度プロファイル。一方向分散分析（One-way ANOVA）は、データセットが互いに有意に異なることを示す（p＜０．０１）。Bonferroniのポストテストは、インスリンとペプチド250（p＜０．０１）及びインスリンとペプチド640（p＜０．０５）は、インスリン単独とは有意に異なることを示している。（Ｂ）インスリン３０IU/kgとPIPペプチドのILI注入後に尾静脈から採取した血清試料中のインスリンの時間−濃度プロファイル。一方向分散分析を用いて比較した場合、群間に有意差はなかった。（Ｃ）３IU/kgのヒトインスリンのＳＣ注射後の非糖尿病マウスの尾静脈および門静脈から採取した血液の血清試料中のインスリンの時間−濃度プロファイル。データは、各処置群についてｎ＝３の平均値±ＳＤである。
【００１４】
定義
ポリペプチド：モノマーがアミド結合を介して一緒に結合しているアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がα-アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のいずれかを使用することができる。本発明は、Ｌ−異性体及びＤ−異性体の両者に関する。好ましくは、本発明は、ペプチドが式１又は２に特定されたものと逆の配列を含む場合に、特に排他的ではないが、Ｄ−異性体に関する。このようなペプチドは、「レトロ−インベルソ」形態であると称される。本明細書で使用される「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を包含し、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸を用いた糖タンパク質及び配列などの修飾された配列を含む。用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質、並びに組換え又は合成によって産生されるもの、並びにポリペプチドの塩、溶媒和物及び誘導体を包含する。本発明のペプチドは、好ましくは、そのＣ末端がアミド化されている。
【００１５】
本発明のペプチドの塩及び溶媒和物は、好ましくは、対イオン又は付随する溶媒が薬学的に許容されるものであるものである。しかしながら、薬学的に許容されない対イオン又は付随する溶媒を有する塩および溶媒和物は、例えば中間体として使用するために、本発明の範囲内である。
【００１６】
ペプチド活性
本発明のすべての側面に関連するペプチドは、好ましくは、細胞間隙輸送を増強する能力において活性である。これは、本明細書に詳述されている方法（特に実施例）の１つに従って測定することができる。
【００１７】
塩及び溶媒和物
本発明による好適な塩としては、有機又は無機の酸又は塩基で形成された塩が包含される。薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びイセチオン酸で形成されるものが包含される。シュウ酸などの他の酸は、それ自体薬学的に許容されるものではないが、本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩を得る際の中間体として有用であり得る。塩基を有する薬学的に許容される塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばカリウム塩及びナトリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩及びマグネシウム塩、及び有機塩基を有する塩、例えばジシクロヘキシルアミン及びＮ−メチル−Ｄ−グルコミン（N-methyl-D-glucomine）が包含される。
【００１８】
有機化学分野の当業者であれば、多くの有機化合物が反応しているか又はそれらが沈殿又は結晶化している、溶媒との錯体を形成することができることを理解するであろう。そのような複合体は「溶媒和物」として知られている。例えば、水との複合体は「水和物」として知られている。本発明は、本発明の化合物の溶媒和物を提供する。
【００１９】
ペプチド合成
本発明のペプチドは、例えば、個々のアミノ酸からの合成、特に自動ペプチド合成機を用いた段階的合成；天然ペプチドの修飾；又は組換え製造技術等の従来の方法を含むがこれに限定されない、ペプチドを作製するための任意の適切な技術によって作製することができる。
【００２０】
本発明のペプチドを単独で投与することは可能であるが、それが医薬組成物中に存在することが好ましい。従って、本発明は、本発明のペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、以下に記載されるような医薬製剤の形態をとり得る。
【００２１】
医薬製剤
本発明に関連する医薬製剤は、経口、非経口吸入（種々のタイプの計量用量、加圧エアロゾル、ネブライザー又は吸入器によって生成され得る微粒子粉末又はミストを含む）、直腸及び局所（皮膚、経皮、経粘膜、頬側、舌下、及び眼内を含む）の投与のために適切な製剤を包含するが、最も適切な経路は、例えば、レシピエントの状態及び疾患に依存し得る。
【００２２】
製剤は、単位投薬形態で、便利に提供されることができ、又薬学の分野で周知の任意の方法によって調製されることができる。全ての方法は、有効成分を、1つ以上の補助成分を構成する医薬担体と結合（association）させる工程を含む。一般に、製剤は、有効成分を、液体担体又は微粉化した固体担体又はそれらの両方と、均一かつ密接に結合させ、次いで必要に応じて生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。
【００２３】
経口投与に適した本発明の製剤は、各々が所定量の有効成分を含有するカプセル剤、カシェ剤又は錠剤のような別個の単位として提供されることができ；粉末又は顆粒として;水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として;又は水中油型液体エマルション又は油中水型液体エマルションとして、提供されることができる。有効成分はまた、ボーラス（bolus）、舐剤又はペーストとして提供されてもよい。種々の薬学的に許容される担体及びそれらの調合は、標準的な製剤の全書、例えばE. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。また、Wang, Y. J. and Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S, 1988も参照のこと。
【００２４】
錠剤は、任意に１種以上の補助成分と共に、圧縮又は成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒のような自由流動性形態の有効成分を、任意に、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、潤滑剤、界面活性剤又は分散剤と混合して、適当な機械中で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適当な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は、任意に、コーティングしても又は刻み目をつけてもよく、その中の有効成分の放出を遅くしたり又は制御するように製剤化してもよい。本化合物は、例えば、即時放出又は長期放出に適した形態で投与することができる。即時放出又は長期放出は、本化合物を含む適切な医薬組成物の使用によって達成することができる。該化合物は、細胞膜特に小腸中の細胞膜を横切って、治療用高分子及び高度に荷電した化合物の輸送を促進する送達剤（delivery agents）又は担体と共に、経口投与のために、製剤化することができる。このような送達剤又は担体は、さらに、胃腸（GI）管を通過する間のペプチドの酵素的分解を阻害することができ、及び／又は、その製剤は、このような分解を防ぐさらなる添加剤を含み得る。本化合物は、リポソームで投与することもできる。
【００２５】
経口投与のための典型的な組成物としては、例えば、バルク（bulk）を付与するための微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、粘度増強剤としてのメチルセルロース、及び当該技術分野で公知の甘味料又は香味料を含むことができる懸濁液；例えば、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウム及び／又は乳糖及び／又は当該技術分野で公知の他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び潤滑剤を含むことができる即時放出錠剤を、包含する。本発明のペプチドは、舌下及び／又は頬側投与によって、口腔を介して送達されることもできる。成型錠剤、圧縮錠剤又は凍結乾燥錠剤は、使用され得る典型的な形態である。典型的な組成物には、マンニトール、ラクトース、スクロース及び／又はシクロデキストリンなどの速溶性希釈剤を用いて本化合物を製剤化する組成物が含まれる。このような製剤には、セルロース（アビセル）又はポリエチレングリコール（PEG）などの高分子量賦形剤も含まれ得る。このような製剤はまた、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（SCMC）、無水マレイン酸コポリマー（例えば、Gantrez）のような粘膜接着を促進する賦形剤、及びポリアクリル酸コポリマー（例えば、Carbopol 934）のような放出を制御する添加剤を含有することができる。製造及び使用を容易にするために、潤滑剤、滑剤、香味料、着色剤及び安定剤を添加することもできる。
【００２６】
含まれ得る賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミン又は血漿製剤のようなタンパク質である。所望であれば、医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤などの少量の非毒性補助物質、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含んでいてもよい。
【００２７】
鼻エアロゾル又は吸入投与用の典型的な組成物は、生理食塩水中の溶液を含み、それは、例えば、ベンジルアルコール又は他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、及び／又は当該技術分野で公知の他の可溶化剤又は分散剤を含むことができる。好都合には、鼻エアロゾル又は吸入投与用の組成物において、本発明の化合物は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスを用いて、加圧容器又はネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態の提供で、送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するための弁を設けることによって決定することができる。吸入器又は注入器での使用のための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、該化合物と適切な粉末基剤、例えばラクトース又はデンプンとの粉末混合物を含有するように調合することができる。１つの特定の非限定的な例において、本発明の化合物は、計量投与弁から、アクチュエータとしても知られているエアロゾルアダプターを介して、エアロゾルとして投与される。任意に、安定化剤も含まれ、及び／又は肺深部送達のための多孔質粒子が含まれる（例えば、米国特許第6,447,743号参照）。
【００２８】
直腸投与のための製剤は、通常の担体、例えばココアバター、合成グリセリドエステル又はポリエチレングリコールを有する保持注腸又は座薬として提供することができる。そのような担体は、一般的に、常温では固体であるが、直腸腔において液化及び／又は溶解して薬物を放出する。
【００２９】
口腔内、例えば頬側又は舌下への局所投与のための製剤には、スクロース及びアカシア又はトラガカントのような香味ベース中に有効成分を含むロゼンジ（lozenges）、及びゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアのような基剤中に有効成分を含むサブロー錠剤（pastilles）が包含される。局所投与のための典型的な組成物は、プラスチベース（Plastibase）（ポリエチレンでゲル化した鉱油）のような局所用担体を含む。
【００３０】
好ましい単位投与製剤は、有効成分の前述の有効量又はその適切な分画を含むものである。
【００３１】
上記で特に言及した各成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤のタイプを考慮して当該技術分野において慣用の他の添加剤を含むことができることを理解されるべきである。例えば、経口投与に適したものは香味料を含むことができる。
【００３２】
本発明のペプチドはまた、持続放出系として好適に投与される。本発明の持続放出系の適切な例には、適切なポリマー材料、例えば成形品の形態での半透過性ポリマーマトリックス、例えばフィルム又はマイクロカプセル；適切な疎水性材料、例えば許容される油中のエマルション；又はイオン交換樹脂；及び難溶性の本発明化合物の誘導体、例えば難溶性塩を含有する。持続放出系は、経口的に；直腸に；非経口的に；槽内に（intracistemally）；膣内に；腹腔内に；例えば粉末、軟膏、ゲル、ドロップ又は経皮パッチとして局所的に；頬内に；又は口スプレー又は鼻スプレーとして、投与することができる。
【００３３】
投与のための製剤は、本発明化合物の制御された放出をもたらすように適切に調合することができる。例えば、医薬組成物は、１つ以上の生分解性ポリマー、多糖ゼリー化ポリマー及び／又は生体接着性ポリマー、両親媒性ポリマー、本発明のペプチドの粒子の界面特性を改変できる添加剤を含む粒子状の形態であってもよい。これらの組成物は、有効物質の制御された放出を可能にするある程度の生体適合性特徴を示す。米国特許第5,700,486号を参照されたい。
【００３４】
本発明のペプチド又は医薬組成物の治療有効量は、単一パルス用量として、ボーラス用量として、又は経時的に投与されるパルス用量として投与され得る。従って、パルス用量では、本発明のペプチド又は組成物のボーラス投与が供給され、時間の経過後に第２のボーラス投与が続く。特定の非限定的な例において、本発明化合物のパルス用量は、１日の内に、１週間の内に、又は１ヶ月の内に投与される。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、内因性制御機構を利用することによって、タイトジャンクションの動的な開閉を制御することによって、上皮内の隣接する細胞間の細胞間隙経路（paracellular route）を開くための方策の開発に基づいている。その方策は、特異的な細胞標的を標的とするために及びそれらの標的に対する特異的作用を有するために、新規に設計されたペプチド化合物の供給に関連する。
【００３６】
最近の研究は、腸や気道のような単純な粘膜表面で起こる慢性炎症事象が、これらの部位における上皮バリアの透過性の増加と結びついていることを示唆している（4,13）。この増加した透過性の基礎は、ミオシン軽鎖（MLC）として知られるタイトジャンクション（TJ）関連サイトゾルタンパク質のリン酸化状態の増加であると決定された。このメカニズムは、MLCリン酸化を選択的に阻害するアミノ酸９個の膜透過性ペプチドの同定及びインビボ試験によって確認された。MLCリン酸化の腸細胞調節の内因性メカニズムの知識を用いて、ミオシンホスファターゼ標的サブユニット１（MYPT1）又は17KDaのＬ−キナーゼ増強プロテインホスファターゼ−１インヒビター（CPI-17）タンパク質の作用を選択的に変化させるために、２つのクラスのペプチドを設計した。これら２つのタンパク質は、MLCリン酸化を低減するように機能し、そして、本発明は、一時的に上皮の細胞間隙透過性を増加させるように、それらの機能の一過性の阻害に関連する。２つの標的タンパク質は、異なる速度でMLCリン酸化を調節し、これらの２つの異なるタンパク質を選択的に標的化する薬剤及び方法を提供することにより、タイトジャンクションの開口及び再閉鎖の時間経過を最終的に制御することが可能である。
【００３７】
本発明の第１の側面によれば、式１の配列を含むペプチド：
Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
式１（配列番号：１）
ここで：
Ｘ４は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、小さな疎水性アミノ酸残基、例えばVal又はAlaであり；
Ｘ６は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばLys又はArgであり；
Ｘ７は、親水性アミノ酸残基、例えばTyr、Phe、Thr又はSerであり；そして
Ｘ８は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluである、
または、式２の配列を含むペプチド
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
式２（配列番号：２）
ここで：
Ｘ５は、任意のアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；そして
Ｘ８は、Tyrである、
または、全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、式１又は式２の配列のレトロインベルソ形態を含むペプチド、
が提供される。
【００３８】
式１は、PP1−CPI-17相互作用を標的とする配列を定義する。式２は、PP1−MYPT1相互作用を標的とする配列を定義する。両方の配列の統一的な特徴は、それら両者とも、MLCのリン酸化を減少させるように作用することであり、従ってそれらの阻害が、MLCのリン酸化の増加及び上皮のタイトジャンクションの開口をもたらすことである。
【００３９】
本発明の全ての側面のいくつかの実施態様によれば、MLCリン酸化を減少させる機能的特徴は、特許請求される発明の特徴であり得る。
【００４０】
式１の配列
式１によるペプチドは、PP1−CPI-17相互作用を阻害する。式１によって包含される配列による本発明の様々な側面のいくつかの実施態様によれば、
Ｘ４は、pTyr、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、Val又はAlaであり；
Ｘ６は、Lys又はArgであり；
Ｘ７は、Tyr、Phe、Thr又はSerであり；そして
Ｘ８は、pTyr、Asp又はGluである。
【００４１】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ４は、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、Val又はAlaであり；
Ｘ６は、Lys又はArgであり；
Ｘ７は、Tyr、Phe又はThrであり;そして
Ｘ８は、Asp又はGluである。
【００４２】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ４は、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、Valであり；
Ｘ６は、Lysであり；
Ｘ７は、Tyrであり；そして
Ｘ８は、Asp又はGluである。
【００４３】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ４は、Gluであり；
Ｘ５は、Valであり；
Ｘ６は、Lysであり；
Ｘ７は、Tyrであり；そして
Ｘ８は、Aspである。
【００４４】
式１の様々な実施態様による配列は、PP1−CPI-17ターゲティングモチーフを規定する。本発明のいくつかの実施態様において効果的に機能するために、式１による配列を含むペプチドはまた、その標的を有する上皮細胞の細胞質ゾルへのその送達を確実にする配列を含む。このような配列は、細胞浸透促進配列であっても、又は上皮細胞への細胞表面結合を促進した後にその細胞への食作用を引き起こす配列であってもよい。ある好ましい実施態様によれば、式１による配列は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号：５）、又は
Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号:６）、又は
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号:７）、最も好ましくは
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号:５）（式１ａ）であり、
ここで：
Ｘ１は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ２は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ３は、欠失又は疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘ４は、負に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、小さな疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘ６は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ７は、疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘ８は、負に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ９は、正に荷電したアミノ酸残基であり；そして
Ｘ１０は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；又は全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である。
【００４５】
直上に与えられた式の代替的なある実施態様によれば、本発明の全ての側面に関連して、
Ｘ１は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ２は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ３は、Val、Ala、Leu又はIleであり；
Ｘ４は、pTyr、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、Val又はArgであり；
Ｘ６は、Lys又はArgであり；
Ｘ７は、Tyr、Phe、Thr又はSerであり；
Ｘ８は、pTyr、Asp又はGluであり；
Ｘ９は、正に荷電したアミノ酸残基であり；そして
Ｘ１０は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；又は全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば：
Ｘ１は、Lys又はArgの１０残基までであり；
Ｘ２は、Lys又はArgであり；
Ｘ３は、Ala又はValであり；
Ｘ４は、pTyr、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、Val又はArgであり；
Ｘ６は、Lys又はArgであり；
Ｘ７は、Tyr、Phe、Thr又はSerであり；
Ｘ８は、pTyr、Asp又はGluであり；
Ｘ９は、Lys又はArgであり；そして
Ｘ１０は、Lys又はArgの10残基までである。
【００４７】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ１は、Lys又はArgであり；
Ｘ２は、Lys又はArgであり；
Ｘ３は、Ala又はValであり；
Ｘ４は、Asp又はGluであり；
Ｘ５は、Valであり；
Ｘ６は、Lysであり；
Ｘ７は、Tyrであり；
Ｘ８は、Asp又はGluであり；
Ｘ９は、Lys又はArgであり；そして
Ｘ１０は、Lys又はArgである。
【００４８】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ１は、Lys又はArgであり；
Ｘ２は、Lys又はArgであり；
Ｘ３は、Valであり；
Ｘ４は、Gluであり；
Ｘ５は、Valであり；
Ｘ６は、Lysであり；
Ｘ７は、Tyrであり；
Ｘ８は、Aspであり；
Ｘ９は、Lys又はArgであり；そして
Ｘ１０は、Lys又はArgである。
【００４９】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０は、
Arg１-Arg２-Val３-Glu４-Val５-Lys６-Tyr７-Asp８-Arg９-Arg１０（配列番号：３）である。
【００５０】
本発明はまた、ある実施態様では、上記の配列のレトロインベルソ形態を含む。
【００５１】
式２の配列
式２によるペプチドは、PP1−MYPT1相互作用を阻害する。式２によって包含される配列による本発明の様々な側面のいくつかの実施態様によれば：
Ｘ５は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；そして
Ｘ８は、Tyrである。
【００５２】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ５は、Lys又はArgであり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；そして
Ｘ８は、Tyrである。
【００５３】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ５は、Lysであり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；そして
Ｘ８は、Tyrである。
【００５４】
本発明はまた、ある実施態様では、上記の配列のレトロインベルソ形態を含む。
【００５５】
式２の様々な実施態様による配列は、PP1−MYPT1ターゲッティングモチーフを規定する。本発明のいくつかの実施態様において効果的に機能するために、式２の配列を含むペプチドは、その標的を有する上皮細胞の細胞質ゾルへのその送達を確実にするための配列も含む。そのような配列は、細胞浸透促進配列であっても、又は上皮細胞への細胞表面結合を促進した後にその細胞への食作用が引き続く配列であってもよい。
【００５６】
ある好ましい実施態様によれば、式２による配列は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２（配列番号:９）、又は
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号:１０）、又は
Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２（配列番号:１１）、好ましくは
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２（配列番号:９）式２ａである。
ここで：
Ｘ１は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ２は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ３は、Ala又はValであり；
Ｘ４は、欠失又はAla又は１、２、３若しくは４個の正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；
Ｘ８は、Tyrであり；
Ｘ９は、欠失又はAla又は１、２、３若しくは４個の正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ１０は、正に荷電したアミノ酸残基であり；
Ｘ１１は、正に荷電したアミノ酸残基であり；そして
Ｘ１２は、１０個までの正に荷電したアミノ酸残基であり；又は全てのアミノ酸残基がＤ−配置であって、配列の順序が逆である。
【００５７】
式２ａの直上に与えられた代替的な式のある実施態様によれば、本発明の全ての側面に関連して、
Ｘ１は、任意の組合せで、Lys及び／又はArgの１０残基までであり；
Ｘ２は、Lys又はArgであり；
Ｘ３は、Ala又はValであり；
Ｘ４は、欠失、Ala、Lys又はArgであり；
Ｘ５は、Lys又はArgであり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；
Ｘ８は、Tyrであり；
Ｘ９は、Ala又はLys又はArgであり；
Ｘ１０は、Lys又はArgであり；
Ｘ１１は、Lys又はArgであり；そして
Ｘ１２は、任意の組合せで、Lys及び／又はArgの１０残基までであり；又は全てのアミノ酸残基がＤ−配置であり、配列の順序が逆である。
【００５８】
いくつかの実施態様によれば：
Ｘ１は、Lys又はArgであり；
Ｘ２は、Lys又はArgであり；
Ｘ５は、Alaであり；
Ｘ４は、欠失しており；
Ｘ５は、Lysであり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；
Ｘ８は、Tyrであり；
Ｘ９は、欠失しており；
Ｘ１０は、Lys又はArgであり；
Ｘ１１は、Lys又はArgであり；そして
Ｘ１２は、Lys又はArgである。
【００５９】
いくつかの実施態様によれば、
Ｘ１は、Argであり；
Ｘ２は、Lysであり；
Ｘ３は、Alaであり；
Ｘ４は、欠失しており；
Ｘ５は、Lysであり；
Ｘ６は、Tyrであり；
Ｘ７は、Glnであり；
Ｘ８は、Tyrであり；
Ｘ９は、欠失しており；
Ｘ１０は、Argであり；
Ｘ１１は、Argであり；そして
Ｘ１２は、Lysであり；
すなわち、配列は、Arg１-Lys２-Ala３-Lys５-Tyr６-Gln７-Tyr８-Arg１０-Arg１１-Lys１２（配列番号：４）である。
【００６０】
本発明はまた、ある実施態様では、上記の配列のレトロインベルソ形態を含む。
【００６１】
レトロインベルソ配列
式１及び式２の配列は、天然に存在する配列に由来する。それらが由来する天然に存在する配列は、Ｌ−立体配置のアミノ酸残基を有する。従って、このような状況では、いくつかの実施態様によれば、アミノ酸はＬ−配置である。
【００６２】
Ｄ−アミノ酸を含むペプチドは、胃又は細胞内で、タンパク質分解によって分解されにくい傾向があるので、薬物としてより魅力的であり得る。従って、それらは経口投与により適している傾向があり、又より長期間有効である傾向がある。
【００６３】
本発明は、その様々な側面において、全てのアミノ酸がＤ−配置にあり、そして式１及び式２のペプチド配置順序（及び式１又は２の範囲内にあって、上記で特定された、より狭く定義された配列）を逆にする。
【００６４】
例えば、本発明は、残基が好ましくはＬ−立体配置である配列RRVEVKYDRR-NH２（配列番号：３）及び残基がＤ−立体配置であるレトロインベルソ配列NH２-rrdykvevrr（配列番号：２０）を有するペプチドに関する。その場合の小文字の１文字のアミノ酸コードは、レトロインベルソ配置の略語である。ある実施態様によれば、レトロインベルソ配置が好ましい。
【００６５】
医薬組成物
本発明の第２の側面によれば、本発明の第１の側面の様々な実施態様のいずれかによるペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００６６】
ある実施態様によれば、医薬組成物は、標的上皮細胞の細胞質ゾルへのペプチドの浸透を促進する添加剤、例えばリポソーム形成剤を含む。そのような添加剤の存在は、ペプチド自体が細胞浸透配列を欠く場合、例えばそれが式１ａ又は２ａの細胞透過性ペプチド配列を欠いている場合に、特に有利である。しかし、いくつかの実施態様によれば、細胞浸透を助ける添加剤は、本発明の第１の側面によるペプチドにおけるそのような配列の有無にかかわらず存在し得る。ある実施態様によれば、本発明による医薬組成物は、式１のペプチド又はそのレトロインベルソ類似体を、式２に従うペプチド又はそのレトロインベルソ類似体と組み合わせて含むことができる。
【００６７】
腸溶性コーティング
医薬組成物は、腸溶性コーティングを有する剤形を含み得る。腸溶性コーティングは、吸収が小腸で起こるように制御するために、経口医薬組成物、例えば錠剤、カプレット及びカプセルに適用されるコーティングである。腸溶性コーティングは、典型的には、それらが胃の高度に酸性のｐＨにおいて安定した表面を提供するが、小腸の比較的より塩基性の環境下において急速に崩壊するように、剤形の表面に適用される。腸溶性コーティングに使用される材料には、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチック及び植物繊維が含まれる。
【００６８】
本発明が、経口剤形中の第２の治療剤の小腸の上皮を横切る送達のコンテキストで使用される場合、もしも、さもなくば、胃環境において治療剤が分解される場合に、腸溶性コーティングが使用され得る。このようなコーティングは、第２の治療剤が胃に対して刺激性である場合、それが酸に不安定である場合（例えば、エソメプラゾールなどのある種のアゾールが酸不安定である）、又は第２の治療薬が、胃に存在する酵素によって分解されると予想されるタンパク質又はペプチドである場合（例えば、インスリン、ＧＬＤ−１又はその誘導体、又はそれらの類似体）に、特に有用であり得る。
【００６９】
従って、本発明の第２の側面による医薬組成物は、腸溶性コーティングを有する固体剤形を含むことができ、そして本発明の他の側面はまた、このようなコーティングを、利用するか、又は関連させることができる。
【００７０】
第２の治療薬
本発明のペプチド及び第２の治療剤に関連する本発明の様々な側面によれば、例えば本発明の第２の側面による医薬組成物によれば、２つの成分は、それらが同時に上皮表面に存在するように、好ましくは、例えば医薬組成物中で共混合される。本発明のペプチドは、広範囲の治療剤を送達するために使用され得る。それらは、小分子である治療剤の送達に対して、及びペプチド又はタンパク質又は核酸である治療剤の送達においても、特に適切であり得る。例えば、治療剤は、インスリン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、エリスロポエチン、ＧＭ−ＳＦ又は成長ホルモン、又はsiＲＮＡ若しくは遺伝子療法剤であり得る。本発明はまた、抗体又は抗体誘導体である治療剤の送達にも関連する。抗体分子全体が本発明に従って効果的に送達されるには大きすぎることが判明した場合、例えばscＦｖ分子、ラクダ抗体、単一変化（single change）抗体のフラグメント及びドメインなどの抗体ベースの技術のより小さなバージョンが特に有用であり得る。本発明のペプチドによるタイトジャンクション開口に従い、これらの治療剤の全ては、単独で又は他の治療剤と組み合わせて投与することができる。例えば、インスリン及びＧＬＰ−１は、本発明のペプチドと同じ剤形で送達することができる。
【００７１】
医薬担体
医薬担体（又は「薬物担体」）は、薬物の送達、製剤、投与又は有効性を改善するために、又はその保存、混合、調製又は処理を助けるために、医薬組成物中に存在する物質である。
【００７２】
上皮
その様々な側面における本発明は、上皮（「上皮表面」）に関連する。これは、インビトロ又はインビボの表面であり得る。非限定的な例としては、大腸、小腸、直腸、肛門、子宮頸部、膣、気道（例えば、気管、細気管支、気管支梢又は喉頭）、鼻、口及び角膜の上皮が包含され、インビボ及びインビトロの両方に存在する。
【００７３】
上皮細胞の不死化細胞株、例えば直上に記載した上皮細胞型の細胞株が特に予期される。
【００７４】
医薬
本発明の第３の側面によれば、医薬（medicament）としての使用のための、本発明の第１の側面のペプチド又は本発明の第２の側面による医薬組成物が提供される。本発明の第３及び第４の側面の両方は、「医薬」を指す。 該医薬は、本発明のペプチドを、又は本発明のペプチドと本発明の他の側面に関連して本明細書に記載の第２の治療薬とを、含み得る。この第２の治療薬は、ペプチド、小分子実体（small molecular entity）、核酸又は他の化合物であってもよい。医薬は、本明細書の他の箇所に記載されている疾患障害又は非医学的状態（non-medical condition）の治療のための本発明の他の側面や本明細書の他の箇所に記載されている対象を参照して、本明細書に記載されているように処方することができる。
【００７５】
治療対象
ある実施態様によれば、本発明は、すべての側面において、対象の治療に関連する。そのような対象は、タイトジャンクションを有する上皮を有する任意の種であり得る。ある好ましい実施態様によれば、本発明は、全ての側面において、哺乳動物対象の治療に関連する。最も好ましくは、本発明は、全ての側面において、両性別及び任意の年齢（例えば、出生から１歳、出生から５歳、出生から１２歳、出生から６０歳、出生から８０歳、２〜６０歳、５〜８０歳、１２〜８０歳、又は１６歳若しくは１８歳以上）のヒトの治療に関連する。
【００７６】
ある実施態様によれば、本発明は、すべての側面において、粘膜を横切って送達される治療剤を必要とするヒト対象の治療に関連する。治療剤は、本明細書の他の箇所に記載されている薬剤の１つであってもよい。本発明の全ての側面のある実施態様によれば、ヒト対象は、上記の治療剤を、同時に又は１５、１０、５、２又は１分の時間窓内に、本発明のペプチド又は薬学的組成物を投与されたいずれかの側の対象であり得る。
【００７７】
治療に適した病気
第１の側面によるペプチド、第２の側面による医薬組成物、又は第３の側面による医薬は、疾患又は障害又は他の状態の治療用であり得る。ある実施態様によれば、疾患又は肺疾患は、本発明による低吸収性薬物の送達は、注射による投与と同様の効果を有し得る。重要なことに、治療剤を別個の上皮部位に送達する能力はまた、粘膜下腔への局所送達をもたらすであろう。これらの理由から、本発明は、全身状態及び疾患（例えば、関節炎、低身長など）の両者を、そして又治療剤（例えば、クローン病、喘息など）の局所的ターゲティングから利益を得る状態及び疾患を、治療するのに特に好適であり得る。
【００７８】
非治療的処置
ある実施態様によれば、本発明の様々な側面は、美容的な皮膚状態などの状態の非治療的処置、又は医学的には肥満ではないが美容目的のために体重を減らす（又は健康な体重を維持する）ことを望む人の処置に、関連している。
【００７９】
医療の方法
医療方法が特許可能な主題を構成する管轄区域に関して、本発明は、本発明の第２の側面による医薬組成物を前記被験体に投与することを含む、被験体における疾患の治療方法を提供する。ここで、第２の治療剤は疾患の治療のためのものであり、本発明の第１の側面によるペプチドの医薬組成物中の存在が、第２の治療剤の被験体の上皮を横切る送達を改善する。本発明のこの側面のある好ましい実施態様によれば、対象、投与速度、医薬組成物の特徴、本発明のペプチド、第２の治療薬、又は治療される疾患は、本発明の他の側面に関連して本明細書に記載されている通りである。
【００８０】
タイトジャンクションを開く方法
本発明の第４の側面によれば、本発明の第１の側面によるペプチド又は本発明の第２の側面による医薬組成物の有効量を、上皮に投与することを含む、上皮表面のタイトジャンクションを開く方法が提供される。
【００８１】
この方法は、インビボ又はインビトロの方法であり得る。インビボの方法は、例えば、被験体の上皮の細胞間隙の投与速度を開放することによって被験体の循環への第２の治療剤の送達を促進することによって、被験体の医学的治療に向けられた方法を含み、そして治療すべき疾患は、本発明の他の側面に関連して本明細書に記載した通りであり得る。
【００８２】
代替的に、本発明のこの側面の方法は、実験動物又はヒトのボランティア又は患者において、上皮を横切る薬剤の送達をインビボで試験することに関連することができる。例えば、本発明の他の側面に関連して定義される第２の治療剤は、疾患の治療における第２の治療剤の有効性を測定するために、又はその後の薬物動態学的（ＰＫ）パラメータの測定を助けるために、上皮を横切って送達され得る。これに関して、本発明のこの側面の方法は、前記上皮を横切るマーカー分子（例えば、放射性標識マーカー又は他の画像化剤若しくは造影剤）の測定に関連し得る。
【００８３】
代替的に、本発明のこの側面は、上皮の特性又は上皮を横切る分子（例えば、薬物候補）の通過を研究するために、例えばヒト又は動物の上皮の細胞培養単層などの細胞培養における上皮のタイトジャンクションのインビボでの開口に関連し得る。
【００８４】
送達の方法
本発明の第６の側面によれば、本発明の第１の側面によるペプチドと組み合わせて、又は本発明の第２の側面による医薬組成物の一部として、前記薬剤を投与することを含む、上皮表面を横切る薬剤の送達方法が提供される。
【００８５】
本発明のこの側面の様々な局面において、上皮表面、ペプチド及び医薬組成物は、本発明の様々な他の側面に関連して記載された様であり得る。この方法は、インビトロ又はインビボで行うことができる。該薬剤は、診断薬、造影剤又はある好ましい実施態様によれば、「第２の治療薬」の見出しの下に本明細書に記載の治療薬であり得る。
【実施例】
【００８６】
本発明の様々な側面は、以下の非限定的な実施例及び図面を参照して、以下に記載される
【００８７】
実施例
材料及び方法
ペプチド合成
ペプチドは、Sigma Aldrichから入手したイソロイシンを除いて、Nova Biochemから得た各アミノ酸を用いて、（Fmoc）-SPSS（ActivoSynペプチド合成機）によって、合成した。第１のアミノ酸を、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミドを用いて、Rink Amide MBHA樹脂（１００〜２００メッシュ；Nova Biochem）にカップリングさせた。その後のカップリングは、PyBopを用いて、Activo P-11ペプチド合成機で行った。脱保護は、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを用いて行った。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（TFA）、トリイソプロピルシラン及び水（９５：２．５：２．５）の混合物を用いて、樹脂から切断し、次いでジエチルエーテル中で沈殿させた。粗生成物を、Phenomenex Gemini C18カラム（２５０×１０ｍｍ、孔径５μｍ）を用い、流速２．５ｍｌ／分を用いる０．１％ＴＦＡを含む水及び０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルのグラジエント移動相を用いて、ＨＰＬＣにより精製した。高分解能飛行時間型質量スペクトルは、Bruker Daltonics micrOTOF質量分析計で、エレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いて得られ、ペプチドの同一性を確認した。精製ペプチドを凍結乾燥により乾燥させ、−８０℃で保存した。
【００８８】
細胞培養
不死化ヒト腸上皮細胞株（Caco-2）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Gibco）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Gibco）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Gibco、Paisley、UK）中で、維持した。Caco-2細胞を、Transwell（登録商標）（Corning、NY）のポリエステルメンブランフィルター（直径１２ｍｍ、孔径０．４μｍ）上に、７×１０４／ウェルの密度で播種した。２日毎に、ＤＭＥＭ（Life Technologies、Paisley、UK）による再摂取を行った。経上皮電気抵抗（TEER）＞３５０Ω・ｃｍ２のCaco-2単層を、コンフルエントと見なし、輸送アッセイに使用した。固定パドル電極を用いてＴＥＥＲ（World Precision Instruments、UK）を測定した。
【００８９】
インビトロ輸送の研究
細胞間隙の透過性に対するＰＩＰペプチドの影響を評価するために、５０ｍｇ／ｍｌの４ｋＤａデキストラン又は５０ｍｇ／ｍｌの７０ｋＤａデキストラン（Sigma）のアピカルから基底へのフラックスを実施した。アピカル区画容積は２００μｌであった。設定時間毎に６００μｌの基底区画容量を収集し、新鮮なＨＢＳＳと交換した。アピカル及び基底区画（Apical and basal compartment）の蛍光は、Floustar Omegaマイクロプレートリーダー（BMG Labtech、Ortenburg、Germany）を用いて測定した。ＴＥＥＲ測定は、ＨＢＳＳ置換直後の各ウェルについて行った。３時間後、アピカル区画のデキストラン及びペプチド溶液を除去し、ＰＢＳで置き換え、ＴＥＥＲ値をさらに３０分間記録して、単層回収を評価した。
【００９０】
ホスホＭＬＣ分析
氷冷ＰＢＳですすいだ後、Caco-2単層又は単離された腸組織由来の上皮細胞を、３μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル及び２００μＬのＲＩＲＡ緩衝液中で溶解し（lysed）、氷上に１０分間放置した。単離された腸組織を、同様に氷冷ＰＢＳ中に１５分間置いた後、プロテアーゼ阻害剤カクテル及びＲＩＰＡ緩衝液中での浸軟（maceration）を１０分間氷上に放置した。すべての細胞及び組織の溶解物を、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を回収し、使用するまで−８０℃で保存した。ウェスタンブロット分析のために、溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により、２２０Ｖで４０分間泳動させて分離し、XCellＴＭ Blotモジュール（Invitrogen）を用いて３０Ｖで７０分間ＰＤＶＦメンブレン上に電気的に転写した。膜を、ＴＢＳ−Ｔ（２Ｍトリス、ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４Ｍ ＮａＣｌ及び０．１％Tween 20）中の５％ウシ血清アルブミンを用いて、１時間ブロックした。メンブレンを水で洗浄し、一次抗体（抗ミオシン軽鎖（ホスホＳ２０）抗体又は抗ミオシン軽鎖２）の抗体と共に、５℃で一夜インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いで二次西洋ワサビペルオキシド（ＨＲＰ）結合抗体と室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＨＲＰ活性をＥＣＬ（Santa Cruz）によって検出した。
【００９１】
細胞生存率測定
ＭＴＴアッセイ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ；Invitrogen、Paisley、UK）アッセイを用いて、細胞生存率を評価した。細胞をＣＰＰ複合体に７２時間曝露した後、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを培地に添加し、細胞と共に、さらに３時間インキュベートした。培地を除去し、ＤＭＳＯで置換して細胞を溶解させた。次いで、吸光度を５５０ｎｍで記録した。
【００９２】
顕微鏡検査
ローダミン標識ＢＳＡと複合体を形成したＣＰＰを添加する前に、ガラスカバースリップ上で細胞を培養した。細胞を複合体とともに２時間インキュベートした後、完全培地で数回洗浄して過剰の複合体を除去した後、４％パラホルムアルデヒドで固定した。標識ＢＳＡの細胞中への取り込みは、共焦点顕微鏡（Zeiss ＬＳＭ ５１０）によって測定した。ＢＳＡエントリーのレベルは、視野内の細胞数に対するローダミン標識の平均蛍光強度の測定により、評価した。
【００９３】
インビボ研究
屋内で飼育された雄性Wistarラットは、検討の際に２２５〜２７５ｇ（約６〜８週齢）であった。ラットは、１２／１２時間の明／暗サイクルで、１ケージあたり３〜５匹のグループで収容した。すべての実験は明の相の間に行い、連続イソフルラン麻酔を用いた非回復プロトコルを用いて行った。空腸の中央部を小腸の初期回腸領域に曝露し、カニューレの挿入のための門脈へのアクセスを供給するために、４〜５ｃｍの正中線の腹部切開を行った。インスリン（ヒト組換え体；Sigma）及びＰＩＰペプチドの各溶液を、局所タンパク質分解を減少させるために１０ｍＭクエン酸を含む０．９％生理食塩水中で調製し、注射前に１：１で混合し、２９ゲージの皮下注射針を用いて、２００μＬ／ｋｇ（又は２５０ｇのラット当り〜５０μＬ）の量で、注射した。注射部位には、永久マーカーが付けられた。切開部を手術用接着剤で閉じた。グルコース、血清インスリン及びエンドトキシンをモニターするために、血液引抜を、門脈及び全身循環から、次の２時間に渡って、行った。コントロールの処置群は、腸管腔内に送達されたインスリンのＳＣ注射並びにインスリンを含まないＰＩＰペプチドの腸内注入を含み、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のインスリンのみの処方が、すべての群に使用された。検討の終わりに、マークされた辺りの腸のセグメントの３〜５ｍｍの領域が分離された。この組織を、ＭＬＣのリン酸化状態の生化学的評価のために溶解し、又は固定化し、切片にし、ヘマトキシリン／エオシンで染色した後、認可された獣医病理学者によって分析した。皮下（ＳＣ）インスリン注射（２０μｌ／ｋｇ）を肩甲骨中央部で行い、同様に血糖を測定した。全ての実験は、１９８６年の英国動物学（科学的手順）法、１９８６年の欧州共同体理事会指令（８６／６０９／ＥＥＣ）、及びバース大学の倫理的レビュー手順に従って行われた。
【００９４】
インビボ毒性試験
細胞損傷及び毒性を誘導する細胞浸透性ペプチドの作用の可能性があり得るため（Carter, 2013＃109; Kilk, 2009＃110）、初期段階の細胞中毒の尺度としてのアポトーシスの誘導を、カスパーゼ−３製造者の指示書（Millipore, Watford, UK）に従って、APT165市販キットを用いて、カスパーゼ−３の酵素活性を測定することによって、評価した。直接腸管管腔内注入によって投与された試験薬剤に曝露してから４５分後に、腸組織を単離した。ハイグロマイシン（１５０μｇ／ｍＬ）をカスパーゼ−３活性化によりアポトーシスを誘発する陽性コントロールとして投与した。
【００９５】
ホスホＭＬＣ分析
ＰＩＰペプチド又はコントロール治療剤を除去するために氷冷ＰＢＳですすいだ後、単離した腸組織を氷冷ＰＢＳに１５分間入れ、次いで、２５μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Fisher）、２５μｌのホスファターゼ阻害剤カクテル（Fisher）及び５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（Sigma Aldrich）を加えた。氷上に置いて１０分後、溶解物を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を回収し、使用するまで−８０℃で保存した。ウェスタンブロット分析のために、溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により、２２０Ｖで４０分間泳動させて分離し、XCellＴＭ Blotモジュール（Invitrogen）を用いて３０Ｖで７０分間ＰＤＶＦメンブレン上に電気的に転写した。膜を、ＴＢＳ−Ｔ（２Ｍトリス、ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４Ｍ ＮａＣｌ及び０．１％Tween 20）中の５％ウシ血清アルブミンを用いて、１時間ブロックした。膜を水で洗浄し、一次抗体（抗ミオシン軽鎖（ホスホＳ１９）抗体（Cell Signalling Technologies）又は抗ミオシン軽鎖２抗体（Abcam））と共に５℃で一夜インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いで二次西洋ワサビペルオキシド（ＨＲＰ）結合抗体と室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＨＲＰ活性をＥＣＬ（Santa Cruz）によって検出した。
【００９６】
細胞生存率測定
初期段階の細胞中毒の尺度としてのアポトーシスの誘導を、カスパーゼ−３製造者の指示書（Millipore, Watford, UK）に従って、APT165市販キットを用いて、カスパーゼ−３の酵素活性を測定することによって、評価した。直接腸管管腔内注入によって投与された試験薬剤に曝露してから４５分後に、腸組織を単離した。ハイグロマイシン（１５０μｇ／ｍＬ）をカスパーゼ−３活性化によりアポトーシスを誘発する陽性コントロールとして投与した。
【００９７】
顕微鏡検査
ＰＩＰペプチド媒介性のＣｙ３−標識インスリン（Nancocs）の取り込みをインビボで評価し、露出させた腸のセグメントを、顕微鏡分析のために、投与１５分後に分離した。単離された組織を氷冷ＰＢＳ中で短時間すすぎ、次いで氷上で４％パラホルムアルデヒドで固定した後、Zeiss ＬＳＭ ５１０蛍光顕微鏡を用いて評価した。核染色剤として、ＤＡＰＩ（４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いた。
【００９８】
データ分析
ＴＥＥＲ値は、ブランクフィルターの読みを引いて計算し、その単層膜の初期ＴＥＥＲ値のパーセンテージとして基準化した。細胞間隙の透過性を計算するために使用される蛍光デキストランフラックスは、前述のように実施した。血糖値は、各動物のベースライングルコースレベルのパーセンテージとして表した。データは、対になっていないスチューデントの両側Ｔ−検定を用いてコントロール値と比較した。０．０５未満のｐ値は、有意差を示すと考えられた。
【００９９】
実施例１−タイトジャンクション（ＴＪ）の構造及び機能の動的制御に対する背景理論
ＴＪ構造は、健康及び疾患における上皮バリア特性を動的に調節するために収縮性及び足場要素と相互作用する不可欠な（integral）膜タンパク質から構成される（Turner（2009）Nat.Rev. Immunol. 9：799-809; Xiao et al.（2011）J. Aller. Clin. Immunol. 128：549-556）。生理的及び病理学的刺激は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＡ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ類、ホスホイノシチド３−キナーゼ等の多数のキナーゼ及びRhoシグナル伝達経路を介して、ＴＪバリア特性を変化させる（Gonzalez-Mariscal（2008）Biochim. Biophys. Acta 1778：729-756）。このキナーゼクロストークの中心的要素は、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）リン酸化の調節を含む（Woodsome et al.（2006）J. Cell Sci. 119:1769-1780）；図１。ＭＬＣリン酸化の増加とＴＪバリア機能の低下との間に直接的な関連が存在する。炎症誘発性（pro-inflammatory）サイトカイン類は、ＭＬＣリン酸化を促進し、ＭＬＣキナーゼ（ＭＬＣＫ）が中心的な役割を果たすＴＪの開口をもたらすことができる。本発明者は、以前に、腸及び肺における炎症誘発性のＴＪバリア機能の低下を矯正することができる、ＰＩＫ（図１の矢印）と呼ばれる膜透過性で安定なペプチドであるＭＬＣＫ阻害剤を同定した（Clayburgh et al.（2005）J. Clin. Invest. 115:2702-2715; Mirzapoiazava et al.（2011）Am. J. Respir. Cell Molec. Biol. 44:40-52）。ＭＬＣＫ機能は、おそらくＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）の作用によって、相殺される。このネットワーク内の標的に対する遺伝子ノックアウトを用いた研究は、バリア機能におけるそれらの役割についての洞察を提供することができるが、このネットワーク内の単一の標的を目標とする任意の分子による全システムに対する作用は、薬理学的研究によって決定されなければならない。これらのタンパク質表面接触部位は細胞内であり、これらの薬剤の関連試験のための主要部位は腸であり、好結果の阻害剤は、好ましくは、安定であり、膜透過性であるべきである。
【０１００】
実施例２−予備的研究
本発明者は、以前に、炎症事象のために開位置にあるＴＪ構造を閉鎖するＭＬＣＫの９残基ペプチド（ＰＩＫ）阻害剤を開発した。ＰＩＫは、ＭＬＣＫ機能にとって重要なタンパク質表面構造を模倣する。重要な界面接触の同定に続いて、このペプチドは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）機能を可能にし、代謝安定性を増加させるアミノ酸を組み込むように改変された。これらの同じ設計原理を適用して、本発明の様々な側面による薬剤及び方法が開発されている。ＭＬＣＰは、ＰＰ１アイソフォーム、ミオシン・ターゲティング・サブユニットＭＹＣＰ１−ＣＰＩ−１７調節複合体、及び２１ｋＤａアクセサリーサブユニットからなる三量体タンパク質ホスファターゼ−１（ＰＰ１）ホロ酵素である。潜在的なペプチドＭＬＣＰ阻害剤を同定するために、本発明者は、ＭＹＣＰ１又は１７ｋＤａタンパク質阻害剤ＣＰＩ−１７とＭＬＣＰ機能を直接調節するＰＰ１との相互作用に焦点を当てた（図３）。
【０１０１】
実施例３−ＰＰ１−ＣＰＩ−１７相互作用のターゲティング
ＣＰＩ−１７によるＭＬＣＰの阻害は、ＰＫＣ刺激事象によって引き起こされ；ＣＰＩ−１７中の残基Ｔ３８（ｐＴ３８）のリン酸化は、ＭＬＣＰ阻害を、１０００倍を超えて増強し；Ｔ３８（２４）を含むＣＰＩ−１７内の最小阻害ドメインが同定され、ＰＰ１とのその相互作用に関与するＣＰＩ−１７におけるＲ３６ＶＴＶＫＹＤＲＲ４４（配列番号：１３）配列を模倣するペプチドの小さな構造（cadre）が合成された。最初のペプチドセットには、ｐＴ３８（グルタミン酸；Ｅ）を模倣する改変、及び膜透過性を増強するためにＣＰＰ配列を模倣するためのさらなる塩基性アミノ酸の導入があった（表１）。
【０１０２】
表１は、試験したＣＰＩ−１７誘導ペプチドの結果を示す。Ｒ３６ＶＴＶＫＹＤＲＲ４４（配列番号：８）を開始配列（エントリー１）として選択した。残基は、試験シリーズ（エントリー２〜６）において示されているように変化させた（太字、下線）。効力は、Caco-2細胞単層へのアピカル側への適用（apical application）後のＴＥＥＲ減少によって決定した。
【表１】
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【０１０３】
半透過性インサート（Rubus et al.（1996）J. Pharma. Sci 85：165-169）上で増殖させたコンフルエントな単層のCaco-2細胞に、５ｍＭの濃度でペプチドを、アピカル側に適用して、ＴＪ機能に影響する能力を評価した（Peterson & Mooseker（1992）J. Cell. Sci. 102（3）:581-600）。ＲＲＶＥＶＫＹＤＲＲ（ペプチド＃６；ペプチド６４０、配列番号：３）は、添加２５分以内に５０％の低下を伴ってCaco-2単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を減少させた（図４）。これらのペプチドは、ＭＴＴアッセイ（Mosman（1983）J. Immunol. Methods 65:55-63）によると、この濃度で、毒性は無かった。重要なことに、穏やかに洗浄した後、ＲＲＶＥＶＫＹＤＲＲ（配列番号：３）処理したCaco-2単層のＴＥＥＲ値は、２４時間以内に、元の値の８０％に回復した。リード候補であるペプチドＮＨ２−ｒｒｄｙｋｖｅｖｒｒ−ＮＨ２（配列番号：２０）は、ＲＲＶＥＶＫＹＤＲＲ（配列番号：３）配列に基づいて同定されたが、Ｄ−配置アミノ酸を有するレトロインベルソ配置を用いた。
【０１０４】
ＣＰＩ−１７は平滑筋で広く発現されているが（Eto（2009）J. Bid. Chem. 369:149-156）、このデータは分極された（polarized）上皮細胞におけるその機能的役割を示唆する最初のデータである。ｐＴ３８はＣＰＩ−１７自体の阻害機能に必須であるが、本知見は、本出願のために、適切な安定な模倣物（例えば、Ｅ残基）がｐＴ３８に取って代わることができることを示す。表１の各ペプチドのＮ及びＣ末端は、細胞浸透配列として提供されるが、細胞浸透を達成する他の方法が使用された場合には、不要にされ得る。
【０１０５】
実施例４−ＰＰ１−ＭＹＰＴ１相互作用のターゲティング
ＭＬＣＰ阻害は、残基Ｔ６９６及びＴ８５３でのＭＹＰＴ１のRho−キナーゼ媒介リン酸化の後に起こる（Murthy et al.（2003）Biochem. J. 374:145-155）。ＭＹＰＴ１は、ＲＶxＦ結合モチーフ、Ｎ末端アーム及びこのタンパク質のアンキリンリピートの第２群の３つの異なる領域を介して、ＰＰ１に結合する。Ｔ６９６及びＴ８５３の両方でのＭＹＰＴ１のリン酸化がＭＬＣＰ調節に関与すると思われるが、ＭＹＰＴ１の３００残基Ｎ末端ドメイン内のＫＶＫＦ配列は、そのＰＰ１との会合を促進する（Peti et al.（2013）FEB S.J. 280:596-611）。ＰＰ１に結合したＭＹＰＴの構造解析は、ＰＰ１のＥ３００〜Ｅ３０９がＭＹＰＴの２つのアンキリンリピートの間に位置することを示している。特に、アンキリンリピートはＹ３０５及びＹ３０７と結合し、ＰＰ１のＣ末端がアイソフォーム特異性を媒介する調節サブユニット相互作用に重要であることを示唆している。従って、この領域に対応するペプチドは、ＭＹＰＴがＰＰ１に結合するのを妨げ、よってＭＹＰＴ／ＰＰ１複合体のミオシン特異性を減少させることができると推測された。
【０１０６】
この仮説を試験するために、ＰＰ１のＣ末端領域の３０１ＫＡＫＹＱＹ３０６（配列番号：１９）の領域を組み込んだＲＫＡＫＹＱＹＲＲＫ（ペプチド２５０、配列番号：４）を合成した。標的化された界面接触の評価は、ＣＰＰ機能を促進する機能を妨害することなく、Ｒ残基及びトリペプチドＲＲＫをＮ末端及びＣ末端にそれぞれ付加することができることを示唆した。ポリカチオンは細胞の損傷及び毒性を誘発する可能性があるので（Wender et al.（2005）Org. Lett. 7:4815-4818）、このペプチドについての細胞傷害性の欠如がＭＴＴアッセイを用いて確認された（データ示さず）。５ｍＭペプチド２５０の分極Caco-2単層へのアピカル側付加を、５ｍＭ ＲＲＶＥＶＫＹＤＲＲ（ペプチド＃６；ペプチド６４０、配列番号：３）及びコントロールペプチドのそれと比較した（図５）。ペプチド２５０及び６４０は両方とも、コントロールと比較して、細胞間隙マーカーの輸送を増加させたが、それらは、ＴＥＥＲに対する異なる時間経過及び異なる影響でそのようにした。本発明者は、細胞間隙マーカーとして４ｋＤａの蛍光デキストラン（４ＦＤ）を選択したが、この分子の流体力学的半径がインスリン及びＧＬＰ−１のそれよりもわずかに大きいので、それらの輸送を予測するであろうからである。ＰＰ１−ＣＰＩ−１７相互作用を標的とするペプチド６４０は、ＴＥＥＲの初期値の約５０％まで急速に低下し、４ＦＤ輸送のほぼ即時の増加を引き起こした。これらの効果は、ペプチドに強く結合し、４５分で洗い出しされ、７０分で再添加した。ＰＰ１−ＭＹＰＴ１相互作用を標的とするペプチド２５０は、ペプチド６４０と比較して、ＴＥＥＲにより遅くより目立たない低下をもたらし、４ＦＤ輸送に顕著ではない初期増加をもたらした。興味深いことに、４５分でのペプチド２５０の除去はＴＥＥＲの回復を引き起こしたが、７０分でのペプチドの再添加はＴＥＥＲに影響を与えず、４ＦＤ輸送をさらに増強した。
【０１０７】
この情報に基づいて、レトロインベルソ配置及びＤ−アミノ酸を使用するリード候補、ペプチド２５０＝ＮＨ２−ｋｒｒｙｑｙｋａｋｒ−ＮＨ２（配列番号：２１）が同定された。
【０１０８】
これらの研究は、ＣＰＩ−１７又はＭＹＰＴ１とＰＰ１との相互作用を遮断するために合理的に設計されたペプチドが、ＴＥＥＲ及び細胞間隙輸送に関して明確な薬理学的結果を生じ得ることを示しており、ＴＪが範囲及び速度を変化させて動的に開口することを許容する、ＣＰＩ−１７及びＭＹＰＴ１を含む別個の調節メカニズムが存在することを、示唆している。
【０１０９】
インビトロ研究
ＰＩＰペプチド２５０及び６４０を適切に比較するために、ＴＥＥＲに基づく応答に基づいて２つを調和させようと試みた。これは、２つのペプチドがそれらの作用に対して重要な異なる特性を有する可能性がありそうであるため、直接的な用量比較を不適切なものとするいくつかの不確実性のために行われた：その特性には、（ＣＰＰ能力の違いによる）細胞内標的への接近可能性、それらのそれぞれのＭＬＣＰ関連標的についての結合親和性、標的外の作用、及び細胞内の安定性が含まれる。我々は、２０ｍＭのペプチド２５０が１０ｍＭのペプチド６４０に非常に匹敵する応答を提供することを確認した（図６）。これらの２つのＰＩＰペプチドのアピカル側用量を減少させることは、それぞれ発症率及び最大効果の両方に関してＴＥＥＲにおける各用量依存性変化が誘導されることを示した（図６）。ＰＩＰペプチド暴露の１８０分後、新鮮な媒体のアピカル区画への置換は、これらのＰＩＰペプチドの除去が、ペプチド２５０に曝露された細胞よりも、おそらく迅速に応答するペプチド６４０に暴露された細胞によりＴＥＥＲ低下の急速な逆転が開始されたことを示した（図６）。この観察は、ペプチド２５０によって誘発された細胞変化の回復が、ペプチド６４０によって影響された経路よりも動的ではないことを示唆している。ペプチド６４０は、ＭＬＣＰのＰＫＣ媒介調節因子に影響を及ぼすように設計されており、ペプチド２５０は、ＭＬＣＰのRho−キナーゼ媒介調節因子に影響を及ぼすように設計されているので、このような示唆は、ＴＪ構造／機能の迅速でより耐久性のある変化において、ＰＫＣ及びRho−キナーゼが果たすと認識されている役割と一致する。
【０１１０】
次に、我々は、ＴＥＥＲ値に対するＰＩＰペプチド６４０及び２５０の作用が細胞間隙透過性の変化に変換されるかどうかを尋ねた（図７）。曝露の１８０分後にＴＥＥＲにおいてほぼ５０％の損失を生じたにもかかわらず、５ｍＭのペプチド６４０は、Caco-2単層を横切る４ｋＤａデキストランの透過性に影響を与えなかった。１０ｍＭペプチド６４０のアピカル側適用は、４ｋＤａの透過速度を約３倍増加させる。興味深いことに、１０ｍＭペプチド６４０は、４ｋＤａ流速に関して、１０ｍＭペプチド２５０に等しい；にもかかわらず、この他のペプチドと比較して、ＴＥＥＲの変化に対してわずかに遅延し、より強い影響を及ぼさない。驚くべきことに、２０ｍＭペプチド２５０は、１０ｍＭペプチド６４０と比較して、ＴＥＥＲ変化プロファイルがこれらの処置についてほぼ同一であるのに、４ｋＤａデキストランについて２倍の流速（コントロールと比較して約６倍）をもたらした。また、ペプチド６４０は７０ｋＤａのデキストランのフラックスに影響を及ぼさなかったが、ペプチド２５０は２０ｍＭでこのフラックスを約３倍に増加させることができたことを観察した。これらの４ｋＤａデキストランの増強されたフラックスの直線性（図７）は、ＴＥＥＲ応答のプラトーを達成するのに必要な時間にもかかわらず、これらのＰＩＰペプチドによって誘導される透過性変化の作用が非常に迅速であることを示唆した（図６）。２０ｍＭペプチド２５０によって誘導される増加した７０ｋＤａのデキストラン輸送のわずかに遅れた誘導の形跡があった。全体として、これらの結果は、ペプチド６４０が、ペプチド２５０によって誘導される同等の作用（ＴＥＥＲに基づく）と比較して、細胞間隙経路のより動的で堅牢性の低い開口を誘導することを示唆している。
【０１１１】
インビボ研究
我々の焦点は、胃酸及び膵酵素を迂回することに関連する製剤の課題に取り組む前に、腸上皮の輸送を調べることであった。そのような課題は、確立された錠剤又は錠剤技術によって解決することができるが、げっ歯類よりも高次の動物モデルを必要とする。現在、我々は、小さな（５０μＬ）容量を小腸の管腔、特に遠位空腸から近位回腸に直接注入したラットモデルを使用した。我々は、インスリンの皮下（ＳＣ）注射による経口送達によって達成された応答を較正した；血糖値が用量依存的に低下して、約３０分でその最下点に達し、約９０分で回復し始めた。３ＩＵ／ｋｇのＳＣ注射は、血糖値の約５０％の減少を生じた（図８ａ）。３ＩＵ／ｋｇのラットの小腸（中間空腸から中間回腸）への直接管腔内注入は、血糖に影響を与えなかった（図８ｂ）。しかし、３ＩＵ／ｋｇインスリン＋ １０ｍＭペプチド２５０のＩＬＩは、３ＩＵのインスリンのＳＣ注射で観察されたものと同様の血糖降下及び回復プロファイルをもたらし、７０〜８０％の血糖回復が９０分で達成されたことが分かった（図８ａ，ｂ）。興味深いことに、ＩＬＩにより３ＩＵ／ｋｇと共に投与した２０ｍＭペプチド２５０は、３０分で４０％の血糖値の低下をもたらし、実験の残りの間、このレベルのままであった（図８ｂ）。１０ｍＭペプチド６４０と３０ＩＵ／ｋｇのインスリンの直接的なＩＬＩは、ＳＣ注射（図８ａ）又は１０ｍＭペプチド２５０（図８ｂ）と比較して、血糖変化プロファイルにおいて、大きく遅れた低下をもたらした（図８ｃ）。１０ｍＭペプチド２５０で観察されたのと同様の効果を生じるためには、２０ｍＭペプチド６４０のＩＬＩが必要であった。
【０１１２】
これらの結果は、これらのＰＩＰペプチドが、それらの応答の耐久性に関連する可能性のある異なるインビトロ及びインビボ応答プロファイルを有することを示唆するので興味深い。インビトロで、適用されたＰＩＰペプチドは、それが物理的に除去されるまで、存在し、機能している。しかし、インビボでは、管腔上皮表面でのＰＩＰペプチドの有効濃度は、管腔内洗浄及び全身吸収などの事象によって複雑になる。これらの事象は、ＰＩＰペプチドが小腸上皮細胞の細胞質中に存在する可能性のある量及び持続期間を変化させる可能性がある。我々は、ペプチド６４０が、ペプチド２５０よりも、ＴＥＥＲについてより動的な応答を誘導することを観察したが、これは、インビボでより耐久性のある応答をもたらすであろうことを示す。
【０１１３】
ＰＩＰペプチドの作用のメカニズム
これらのインビボ結果は、一般に、細胞間隙の透過性の動的変化を示唆するヒト腸管上皮細胞株Caco-2を用いて実施した我々のインビトロ研究と一致する（図６及び７）。予想されたように、インビボでのこれらのＰＩＰペプチドの作用は一時的であり、それらの作用の持続時間及び開始時間は用量依存的であった。ＰＩＰペプチド２５０及び６４０の違いは、それらの絶対濃度及び曝露持続時間を制御できるインビトロで、直ぐに明らかであった。我々は、血糖値測定の時間経過の間、ＰＩＰペプチドの曝露部位から単離されたラットの腸組織における全ＭＬＣに対するＭＬＣの位置１９のホスホセリン（ｐＭＬＣ）の程度を比較して、ＭＬＣのリン酸化状態を決定することにより、インビボでのＰＩＰペプチド２５０及び６４０の作用の開始及び持続時間を調べた（図８Ｂ及び８Ｃ）。
【０１１４】
半定量的ウェスタンブロット分析によって、全ＭＬＣ対ｐＭＬＣの比を評価した（図９Ａ）。この分析は、２０ｍＭペプチド６４０によって誘導されたＭＬＣリン酸化率が１５分で有意に増加し、９０分で初期レベルに戻る前に４５分で上昇したままであることを示した。２０ｍＭペプチド２５０で達成されたＭＬＣ対ｐＭＬＣ比のプロファイルは、１５分で有意な変化を示さなかったが、９０分で基底レベルに戻る前に４５分で上昇した（図９Ｂ）。これらの結果は、これらのＰＩＰペプチドとインスリンとの同時投与によって誘発された血糖降下の時間経過とよく相関した（図８Ｂ及び８Ｃ）。腸上皮細胞のみからＭＬＣを単離するように注意が払われたが、使用された抽出手順は、これらの単離された腸組織に存在する他の細胞から単離されたいくらかのＭＬＣをもたらし得ることに留意することが重要である。
【０１１５】
我々は、ＩＬＩ注入後の蛍光標識形態のインスリンの運命を調べることにより、ＰＩＰペプチドの作用機序の仮説をさらに探求した。蛍光（ｃｙ３−標識）インスリンは、ＰＩＰペプチドと同時投与された場合にのみ、上皮の肉眼的解剖学的改変なしで、腸の細胞間隙空間で観察された（図９Ｃ）。これらの結果は、共に、ＰＩＰペプチドのアピカル側局所適用が、インビボでラットの腸上皮の細胞間隙透過性を増加させるために局所的に作用するという仮説を支持する。さらに、インスリンの細胞間隙透過性の増加の時間経過は、上皮細胞におけるｐＭＬＣ含量の一時的な増加の役割と一致していた。
【０１１６】
インスリンの取込みを増強するＰＩＰペプチドの運命
ＰＩＰペプチド及び１０ＩＵのインスリンのＩＬＩ注入後の全ＭＬＣ細胞含量に関連する血糖低下及びＭＬＣリン酸化の変化をモニターする時間経過の検討は、約３０〜６０分のインビボ事象窓を示唆する。これをさらに調べるために、我々は、門静脈（図１０Ａ）及び尾静脈（図１０Ｂ）からＩＬＩ後５〜９０分に採取した血液中の血清インスリン濃度を測定した。増加したインスリンレベルの発現及び門静脈におけるそれらの増加したレベルの持続期間は、ペプチド６４０が、ペプチド２５０と比較して、これらの２つのペプチドのリン酸化率変化の時間経過と一致して、作用のより迅速な開始及び作用持続時間の短縮を誘導することを示唆した（図９）。
【０１１７】
１０ＩＵ／ｋｇのＩＬＩ後の門脈及び全身（尾静脈）におけるＥＬＩＳＡによって検出されたインスリンの総量は、ここで試験した条件についてペプチド２５０対ペプチド６４０の取り込みの増強後にわずかに異なるプロファイルを示した。 加えて、我々は、ＳＣ注射後のインスリンの門脈及び全身濃度の時間−濃度プロファイルを決定した（図１０Ｃ）。非コンパートメント分析及びワグナー−ネルソンのデコンボリューションを用いて、ペプチド２５０対ペプチド６４０がＩＬＩによって投与された場合の門静脈で検出されたヒトインスリンの経口投与（ＳＣに対する）の相対バイオアベイラビリティは、それぞれ４％及び３％であった。興味深いことに、ペプチド２５０対ペプチド６４０のＩＬＩ投与後の全身循環に到達するヒトインスリンの相対バイオアベイラビリティは、それぞれ１．６％及び１．４％であった。これらの結果は、門静脈に送達されたヒトインスリンのかなりの部分が全身循環に到達しなかったことを示唆した。
【０１１８】
ＰＩＰペプチド曝露後の上皮細胞生存率
Caco-2細胞を用いた最初のインビトロ研究では、ＴＥＥＲ及び細胞間隙透過性を調節する濃度で試験したペプチド２５０及び６４０は、ミトコンドリア膜極性マーカーＭＴＳによって評価される細胞生存率に影響しなかったことが示唆された。インビボでのＰＩＰ作用の一過性の性質のために、我々は、細胞生存率の減少と相関し得る早期の細胞変化をよりよく定義し得る細胞シグナルに焦点を当てた；カスパーゼ酵素カスケードの活性化は、上皮細胞におけるアポトーシス事象の初期段階である。我々は、血糖の低下（図８）、ｐＭＬＣの程度の増加（図９）、及びインスリンの門静脈への取込みの増加（図１０）が示された濃度で、ペプチド２５０又は６４０のアピカル曝露の６０分後に単離したラット腸組織におけるカスパーゼ−３活性のレベルを測定した。腸組織は、２０ｍＭのＰＩＰペプチド２５０又は６４０の同様のアピカル曝露後のカスパーゼ−３酵素活性の誘導を示さなかったが、一方、カスパーゼ−３の誘導のためのポジティブコントロールとして使用した、ＩＬＩによって投与されたハイグロマイシン（１５０ｍｇ／ｍＬ）は、この酵素活性の増加をもたらした（図１１）。門静脈血中のエンドトキシン濃度を、インスリン及び２０ｍＭのＰＩＰペプチド２５０又は６４０、又はインスリン単独を注入した後に測定した。これらの処理の間に差は認められなかった。
【０１１９】
結論
バイオ医薬品の経口送達を高める目的で、腸管細胞間隙のフラックスを増加させるために多くの薬剤が探索されている。キラヤ（quillaja）サポニン、グリチルリジン酸ジカリウム、１８β−グリチルレチン酸、カプリン酸ナトリウム、タウリン、及びアルキルマルトシド類（alkylmaltosides）は、記載されている薬剤のうちのほんの一部に過ぎない。一般に、これらの薬剤は、典型的には、Caco-2単層又は単離された腸組織のようなインビトロ細胞系を用いてスクリーニングされる。パルミトイルカルニチンのようなこれらの薬剤のいくつかは、当初は有望であるが、最終的にはそれらの便益は細胞膜への溶解作用及び細胞生存率の低下と相関する。ヒト乳中に存在する中鎖脂肪酸であるカプリン酸ナトリウムは、直腸アンピシリン坐剤における吸収増強剤として承認されている。カプリン酸塩は、インビトロで細胞間隙透過性を高めるＴＪ拡張を引き起こすことが示されているが、ヒトでのその作用についてのインビボのカプリン酸塩の効能は、細胞間隙透過性改変よりも直腸粘膜に対する非特異的損傷と一層相関する。現在、経口送達後のバイオ医薬品の細胞間隙輸送を促進するように設計され、承認された薬剤は存在しない。
【０１２０】
主として作用（又は複数の作用）のメカニズムの不確実性に基づく毒性は、経口送達後のバイオ医薬品の細胞間隙輸送を安全に増強する薬剤の同定を制限する中心的な要素であると思われる。これを念頭に置いて、最近の研究では、カプリン酸塩がＴＪ成分のトリセルリン（tricelllulin）の発現を変化させ、上皮における三細胞性の収縮を介して細胞間隙の流れを増加させることができることが示唆されている。この所見は、ＴＪタンパク質のクローディン（claudin）１の細胞外ループドメインを模倣するペプチドによって誘発されたインビトロ及びインビボでの細胞間隙摂取の可能な増加と同様であるので、カプリン酸塩のインビトロの便益を説明することができる。従って、三細胞間のＴＪ接触を選択的に解体する方法は、細胞間隙透過性を安全かつ効果的に増加させる潜在的作用機序を提供し得る。我々は、バイオ医薬品の細胞間隙摂取を増強するために一時的に腸管ＴＪを開くことができる、明確にされた作用機序を有する薬剤を同定するためにそのようなアプローチを採った。我々のアプローチは、腸上皮表面が溶質の細胞間隙浸透を増加させる内因性の栄養活性化機構を有することを示したPapenheimerによって最初になされた知見に基づいている。その後の研究は、細胞間隙浸透のこの増加が、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）リン酸化の増加によるものであることを示した。
【０１２１】
ＴＪ媒介性溶質透過性の制御におけるＭＬＣリン酸化の確認は、慢性上皮炎症のモデルにおいて有効であることが示されたＭＬＣキナーゼ（ＰＩＫ）ペプチドの合理的に設計された、安定な膜透過性阻害剤を用いて、最初に確証された。現在、我々の目標は、残留ＭＬＣキナーゼ活性の作用を相殺する膜透過性の安定したＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）の選択的阻害剤を同定することであった（図１２）。我々は、ＭＬＣＰ調節タンパク質（ＣＰＩ−１７及びＭＹＰＴ）を含む界面接触を模倣する目的で、タンパク質−タンパク質相互作用を選択的に調節することができる短いペプチド配列を同定するためのよく確立された原理を使用した。これらの調節要素によるＭＬＣＰ調節は、上皮細胞に、ＭＬＣリン酸化を制御し、従ってＴＪ機能特性を変化させる少なくとも２つの異なるメカニズムを提供する。標的特異性を達成するのに十分な広範囲の界面接触部位を有するペプチドは、膜透過性が悪く、腸管腔及び上皮細胞の細胞質においてペプチダーゼを介した分解代謝がさらに制限される。我々は、特異性を高めるための内因性配列を模倣し、安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸から調製され、膜透過性を高めるために上昇した正／負の電荷比を有する、ペプチドのセットを設計し、試験した。
【０１２２】
最近の研究では、安定した膜透過性ペプチドを用いて界面接触部位を破壊し、生きた細胞中のプロテインホスファターゼ１を変化させるアプローチが検証されている。ＲＶxＦ型ＰＰ１結合モチーフ及び他の細胞膜透過性ペプチドを標的とするように設計された膜透過性ペプチドを用いたＭＬＣＰ調節について以前に示されたように、我々の研究で調べたＰＩＰペプチドは、インビトロ又はインビボで細胞毒性作用を示さなかった。これは、共通の部位に結合することによって、他のSer／Thrタンパク質ホスファターゼとともに、多数のPP1を阻害する環状ヘプタペプチドのヘパトトキシンの一種であるミクロシスチンとは著しく対照的である。ミクロシスチン中毒に関連する疾患は、多くのタンパク質のリン酸化の増加に起因する非特異的作用に関連している。我々の結果は、おそらくそれらの特異的作用によって、ＭＬＣＰと細胞毒性を誘発しない特異的調節タンパク質との間の界面接触を標的化することにより、ＭＬＣＰ活性を選択的に阻害することによってバイオ医薬品の経口摂取を高める可能性を実証する。
【０１２３】
過去２０年間の研究では、Rhoキナーゼ及びプロテインキナーゼＣがそれぞれＭＹＰＴ１及びＣＰＩ−１７を介してＭＬＣＰを調節する一方で、Ｃａ２＋／カルモジュリンがＭＬＣＫ活性を活性化することが実証されている。ＰＩＰペプチド２５０は、ペプチド６４０の作用と比較して、動的作用が少なくより大きな溶質を輸送するためにＴＪ構造を開いた。このデータは、Rhoキナーゼ関連機構によるＭＬＣＰの抑制が、ＣＰＩ−１７によって媒介されるものより、より耐久性があり、広範囲な改変をＴＪ機能にもたらすことを示唆する（図１２）。これらの研究は、Rho Aが、ＭＹＰＴ１に対する作用を介して、遅く、耐久性のあるＴＪ変化を媒介する可能性と一致し、ＣＰＩ−１７に対するＰＫＣの作用はＴＪ機能におけるより迅速かつ動的な変化のメカニズムを提供し得る。ＰＩＰペプチド２５０及び６４０の作用の差異は、それらの濃度及び継続的な曝露が制御され得るインビトロ研究において、より直ぐに明らかであった。インビボ研究は、ＰＩＰペプチド作用の動的性質に関してインビトロで行われた観察と一致したが、直ぐには明らかではなかった。これはおそらく、インビボで発生する条件のさらなる変動性のためであった。
【０１２４】
これらの研究で同定され、試験されたＰＩＰペプチドは、ＭＬＣリン酸化の調節に関するいくつかの概念を支持するための主な結果の証明を提供している。１）ＰＰ１とその調節タンパク質ＣＰＩ−１７及びＭＹＰＴ１との間のタンパク質−タンパク質相互作用を破壊するように設計されたペプチドは、一時的にＭＬＣリン酸化を増加させることができる。２）これらのペプチドによって誘発されたＭＬＣリン酸化の増加は、高分子の細胞間隙フラックスを増加させることができる。３）ＰＰ１とその調節タンパク質ＣＰＩ−１７及びＭＹＰＴ１との間のタンパク質−タンパク質相互作用を破壊するように設計されたこれらのペプチドによって誘導される細胞間隙透過性変化の調節は、迅速かつ可逆的である。４）細胞間隙バリア特性に対するこれらの動的効果に関連するＭＬＣリン酸化の変化は、細胞毒性と関連しないか、または細胞毒性をもたらす。この最後の点は、次のステップを考慮する上で重要である。ＰＩＰペプチド６４０及び２５０は、有効で、明らかに特異的であり、非毒性であるが、それらの機能に必要な濃度はｍＭ範囲内である。これは、バイオ医薬品が同時に位置決めされる局所、局所的適用においてこれらの濃度は容易に達成されるので、実際には重要な問題ではない。必要とされる濃度を減少させるためのこれらのＰＩＰペプチドの最適化は、将来の関心の１つの分野である。そのような努力は、標的特異性及び作用を保持しながら、又必要とされる細胞内標的に到達するための膜透過性の効率を増加させながら、ペプチド構造を最小化するための多くの反復的な努力を必要とするであろう。これらの努力は、これらの必要とされる機能的要素を模倣するために、負に荷電したアミノ酸の使用よりは、むしろ安定なリン酸−アミノ酸類似体の使用により、便益を得ることができる。
【０１２５】
全体として、我々の研究は、ＣＰＩ−１７又はＭＹＰＴ１とＰＰ１（ＭＬＣＰ）との相互作用を遮断するために合理的に設計されたペプチドが、ＴＥＥＲ及び細胞間隙輸送に関して明確な薬理学的成果を生じ得ることを示す。ＣＰＩ−１７は平滑筋に広く発現しているが、このデータは分極上皮細胞におけるその機能的役割を示唆する最初のデータである。さらに、我々の結果は、ＣＰＩ−１７とＭＹＰＴ１が多様な範囲と速度でＴＪを動的に開くことを可能にする個別の調節メカニズムが存在する可能性があることを示唆している。最後に、我々は、ＭＬＣＰ活性を増加させるように設計されたペプチドを用いたＭＬＣＰ機能の操作が、インスリンの経口バイオアベイラビリティを増加させる薬学的に関連する問題に適用できることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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