(57)【要約】  特に転移性癌に骨吸収との疾病関連の扱い(予防)のために使用することができる医薬組成物が述べられる。ある様相では、組成は、人間のIgG1蛋白のFc部分が後続する人間のオステオプロテゲリンの主要な215のアミノ酸を含んでいるポリペプチドに基づく。皮下および静注ルートによって霊長類へ医薬組成物を投与するのにふさわしい医薬製剤が提供される。
2017508792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人間のRANKLを禁じる医薬組成物、ポリペプチドを含むことを含む組成は言った: 
人間のオステオプロテゲリンのアミノ酸1〜215を含む最初のアミノ酸配列順序、そして 
ヒト免疫グロブリンγのアミノ酸103〜329を含む別のアミノ酸配列順序 - 1つのFc;そして 
そこでは、前述のポリペプチドは人間のRANKLにKd価値を結び付ける、わずか、5x10-13Mに関して。 
【請求項２】
クレーム1の医薬組成物、そこで、配列番号1のアミノ酸配列順序を含む前述のポリペプチド。 
【請求項３】
治療の組成(人間のRANKLに拘束するポリペプチドを含む組成)は、人間のオステオプロテゲリンの生物学上活発な部分およびヒト免疫グロブリンγ-1のFc部分を含むポリペプチドを言った、前述のポリペプチドは、そこでに人間のRANKLにKd価値を結び付けるか、わずか、5x10-13Mに関して。 
【請求項４】
約20〜約25のmM塩酸L-アルギニンからの、約50 mMから約100のmM NaClまでさらに約25のmMリン酸ナトリウムを含み、約6.3から約6.8までpH値を持っているクレーム3の治療の組成。 
【請求項５】
約10mg/mLの精製白糖をさらに含むクレーム4の治療の組成。 
【請求項６】
約10mg/mLから約25mg/mLのマンニトールまでさらに含むクレーム4の治療の組成。 
【請求項７】
クレーム3の治療の組成、そこで、半分-服量3mg/kgの皮下投与の後のカニクイザル中の体循環中の前述のポリペプチドの生命は、少なくとも48時間である。 
【請求項８】
クレーム3の治療の組成、そこで、半分-服量10mg/kgの皮下投与の後のカニクイザル中の体循環中の前述のポリペプチドの生命は、少なくとも38時間である。 
【請求項９】
物質に骨再構築(配列番号1のアミノ酸配列順序を含むポリペプチドを含む物質)に関連した処置か疾病予防のための薬物の製造に使用してください。 
【請求項１０】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は癌腫である)。 
【請求項１１】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は乳癌である)。 
【請求項１２】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は前立腺癌である)。 
【請求項１３】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は多発性骨髄腫である)。 
【請求項１４】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は骨肉腫である)。 
【請求項１５】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は固形腫瘍による骨転移である)。 
【請求項１６】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は骨粗鬆症である)。 
【請求項１７】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は慢性関節リウマチである)。 
【請求項１８】
クレーム9に記載の使用(そこでは前述の疾病は乾癬性関節炎である)。 
【請求項１９】
骨再構築に関連した病気か症状を治療するか予防する方法、治療する必要中の患者に処理することを含む方法あるいは病気の予防は、骨再構築に配列番号1のシーケンスを含むポリペプチドを含む治療上有効な量の医薬組成物を関連させた。 
【請求項２０】
クレーム19の方法(そこでは前述の疾病は転移性癌である)。 
【請求項２１】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は癌腫である)。 
【請求項２２】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は乳癌である)。 
【請求項２３】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は前立腺癌である)。 
【請求項２４】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は多発性骨髄腫である)。 
【請求項２５】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は骨肉腫である)。 
【請求項２６】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は固形腫瘍による骨転移である)。
【請求項２７】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は骨粗鬆症である)。 
【請求項２８】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は慢性関節リウマチである)。 
【請求項２９】
クレーム19に記載の使用(そこでは前述の疾病は乾癬性関節炎である)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般に、その発明は、腫瘍内科学の中で骨吸収に関連した状態でのそれらの使用にも生物学の調合薬のフィールドにも例えば関する。より具体的には、発明は、NFのレセプタ活性化体に拘束する、オステオプロテゲリンを派生した組成に関する-kappaB配位子(RANKL)。
【背景技術】
【０００２】
この切開に述べられていたアプローチを追求することができるかもしれないし、必ずしも以前に想像されたか追求されたアプローチではない。したがって、もし他の方法で示されなかったならば、この切開に述べられていたアプローチのうちのどれでも単にこの切開の中へのそれらの封入体によって、先行技術としての資格を得ることを当然のことと思われているべきでない。 
【０００３】
骨転移は、多発性骨髄腫を持った患者の中に固形腫瘍およびほぼ100%の患者の中に15-75%の発生率を備えた、固形腫瘍および血液の癌の両方の共通の合併症である。硬骨に転移する可能性が最もありそうな癌は胸、肺、前立腺、甲状および腎癌を含んでいる。次のものに続くように、異なるタイプの癌の中の骨転移の割合はある: 
- 多発性骨髄腫 - 70 - 95% - 乳癌-65-75%- - 前立腺癌-65-75%- - 肺癌-30-40%- - 腎癌-40%- - 膀胱癌 - 20 - 25% - 黒色腫 - 14 - 45%。 
【０００４】
骨転移の骨格の合併症は、疼痛、病的骨折、脊髄圧迫および他の神経圧迫症候群により重要な罹患率を説明する。 
【０００５】
骨転移は骨溶解性かもしれないし、あるいは骨芽細胞かもしれないか、混合することができることができる。正常な骨再構築はバランスのとれたシーケンスの骨芽細胞および破骨細胞によってコントロールされる。核要因κΒ(RANK)配位子(RANKL)(腫瘍壊死因子ファミリーのメンバー)のレセプタ活性化体は、骨芽細胞の表面上で表現される。RANKLは、破骨細胞前駆物質のレセプタRANKを拘束する。それはTNFのレセプタに関連する要因(TRAF)によってシグナリングに結びつく、そして結局、核の中の核要因κΒの賦活、硬骨を下げるか再び吸収する成熟した破骨細胞へ分化を引き起こすこと他の破骨細胞刺激因子は副甲状腺ホルモン関連たんぱく、インターロイキンおよびケモキネスを含んでいる。RANKLのためのおとりレセプタ(オステオプロテゲリン(OPG))は骨髄の中にあり、骨芽細胞によって分泌される。また、骨芽細胞と破骨細胞の間のバランスとして働く。 
【０００６】
癌の中の骨転移の設定では、RANKLとRANKおよびOPGの間のクロストークは分裂する。転移がインターロイキン、副甲状腺ホルモン関連たんぱくおよび他の要因をリリースする場合、破骨細胞賦活は増強される、を上へ、RANKL表現を規制する。これらの要因はさらにOPGを禁じるかもしれない。さらに、骨病変から放された発育因子は、腫瘍細胞の増殖を刺激する、硬化、悪循環(Roodma n GD. Mechanisms of bone metastasis. N Engl J Med 2004; 350:1655-64; Vallet S, smith MR, Rage N. Novel bone-targeted strategies in oncology. Clin Cancer Res 2010;16:4084-93; Marathe A, Peterson MC, Mager DE. Integrated cellular bone homeostasis model for denosumab pharmacodynamics in multiple myeloma patients. J Pharmacol Exp Ther 2008; 326:555-562; George S, Brenner A, Sarantopoulos J, Bukowski RM. RANK ligand: effects of inhibition. Curr Oncol Rep 2010;12: 80-86)。 
【０００７】
人間のOPG(GenBank: U94332.1)は、21のアミノ酸(それは380のアミノ酸の成熟した可溶の蛋白を生じさせるグルタミン酸22の前に開裂される)のシグナルペプチドを含んでいる401のアミノ酸蛋白である。OPGは、そのN末端部分中の領域のような4つのシステインに富んだTNFRを含む腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)ファミリーのメンバーである。OPGは硬骨の開発における役割を持つと示された。また、OPG遺伝子を欠くハツカネズミには骨粗鬆症の表現型および総体の骨格異常があった。 
【０００８】
OPG(それは骨芽細胞および骨髄間質細胞によって生産される)は明白な直接のシグナリング機能のない分泌されたおとりレセプタとして働く。OPGはその自然な配位子に拘束することにより作用する-破骨細胞分化抑制因子リガンド(OPGL)(さらに、それはRANKLとして知られている)。OPGとRANKLの間の結合は、RANKLがその同系統のレセプタRANKを活性化するのを防ぐ。それは、破骨細胞分化、賦活および生存には重大な破骨細胞レセプタである。 
【０００９】
組み換えのOPGは、約55 kDaおよび約110 kDaの明白な分子量のモノマー・二量体のフォームでそれぞれ存在する。残渣システイン185へのN末端領域の打切りは、TNFRのような領域のジスルフィド結合を分裂させることにより、OPG不活性化を結果的に推測上もたらす。しかし、残渣194への蛋白のC末端部分の打切りは、生物活性を変更しない。 
【００１０】
遺伝子組み換えのハツカネズミ中のOPGの過剰発現は、ハツカネズミ中の破骨細胞の近い完全な不足が特徴だった深刻な大理石骨病に結びつく。反対に、OPG遺伝子の剥離は、ハツカネズミの重症の骨粗鬆症を引き起こし、骨吸収を規制する際にOPGの重要な生理的な役割を示す。骨芽細胞と間質細胞からのOPGおよびRANKLの分泌は、多数のホルモンおよびサイトカインによって規制される。OPGおよびRANKL生産の相対レベルは骨吸収の範囲をコントロールすると思われる:RANKLの表現は骨吸収を増加させる。しかし、超過OPGには逆効果がある。組み換えのOPGは、生体外・生体内である破骨細胞を刺激する要因の大部分の影響を閉鎖する。OPGは、さらに卵巣切除、引き起こされた骨粗鬆症、悪性高Ca血症および実験の骨転移を含む、様々な家畜病モデル中の骨吸収を禁じる。したがって、OPGは、過度の破骨細胞アクティビティ(Kostenuik PJ, Shalhoub V., Curr Pharm Des. 2001 May;7(8):613-35)に関連した疾病に対する有効な治療のオプションを表わすかもしれない。 
【００１１】
RANK/RANKL経路は、骨転移のための有効な治療であると分かった、有名なターゲットである。Denosumabは、このように人間のRANKLに拘束し、RANKを備えたその相互作用を禁じる高親和性単クローン抗体である、持っていること、1つの、アクションのOPG方法に似ているDenosumabは、2つの重鎖から成るIgG2亜綱の短縮していない人間の単クローン反RANKL抗体、およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の中で生産されたカッパ亜綱の2つの軽鎖である。商品名Proliaの下のDenosumabは閉経後の女性の中の骨粗鬆症の予防および治療のためにアメリカ食品薬品局(FDA)によって承認された。商品名Xgevaの下のDenosumabは、固形腫瘍からの骨転移を持った患者の中の骨格のことに関連する出来事の予防のためにアメリカ食品薬品局(FDA)によって承認された。さらに、他の骨再構築用のdenosumabの臨床試験は条件を関連づけた、現在進行中である、つまり、癌(Lipton A et al. Randomized Active-Controlled Phase II Study of Denosumab Efficacy and Safety in Patients With Breast Cancer-Related Bone MetastasesJ Clin Oncol 25 :4431-4437 (2007); Neville-Webbe HL, Coleman RE. Bisphosphonates and RANK ligand inhibitors for the treatment and prevention of metastatic bone disease. Eur J Cancer 2010; 46:1211- 1222; Santini D, Galluzzo S, Zoccoli A, Pantano F, Fratto ME, et al. New molecular targets in bone metastases. Cane Treat Rev 2010; 36S3:S6-10)の他のフォームからの骨転移のために。 
【００１２】
したがって、RANKLに拘束することができ、自然発生のOPG分子(それは、受理可能な薬理学的特性がある間、より広い治療の可能性がある)に基づく治療の組成を持っていることは望ましいだろう。 
【発明の概要】
【００１３】
このサマリーは詳述にさらに下に述べられている、単純化されたフォームの概念の淘汰を導入するために提供される。このサマリーは、要求された主題の重要な特徴か本質的な特徴を識別するようには意図されない。また、それではない、要求された主題の範囲の決定における援助として使用されるつもりだった 
【００１４】
ある様相では、現在の発明は、人間のRANKLにKd価値を結び付けるポリペプチドを含んでいる医薬組成物に備える、わずか、5x10-13Mに関して。ポリペプチドは、人間のオステオプロテゲリン(GenBank: U94332.1)のアミノ酸1〜215を含む最初のアミノ酸配列順序を含む。ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンγのアミノ酸103〜329を含む別のアミノ酸配列順序をさらに含む-1つのFc(GenBank:J00228.1)。ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列順序を含むかもしれない。 
【００１５】
ある様相では、現在の発明は治療の組成に備える。組成は、人間のRANKLに拘束するポリペプチドを含む。ポリペプチドは、人間のオステオプロテゲリンの生物学上活発な部分およびヒト免疫グロブリンγのFc部分を含む-1．ポリペプチドは人間のRANKLにKd価値を結び付ける、わずか、5x10-13Mに関して。 
【００１６】
ポリペプチドは、服量3mg/kgで治療の組成の皮下投与の後に少なくとも48時間のカニクイザル中の体循環中の半減期を示すかもしれない。ポリペプチドは、服量10mg/kgで治療の組成の皮下投与の後に少なくとも38時間のカニクイザル中の体循環中の半減期を示すかもしれない。 
【００１７】
1. 約6.3から約6.8までpH値を持っている間、治療の組成はさらに約20〜約25のmM塩酸L-アルギニンから、約50 mMから約100のmM NaClまで約25のmMリン酸ナトリウムを含んでいるかもしれない。治療の組成はさらに約10mg/mLの精製白糖を含んでいるかもしれない。治療の組成はさらに含んでいるかもしれない、約10mg/mLから約25mg/mLのマンニトールまで 
【００１８】
ある様相では、現在の発明は、骨吸収または再造形に関連した処置か疾病予防のための薬物の製造のための物質の使用に備える。物質は、人間のRANKLに拘束するポリペプチドを含む。ポリペプチドは、人間のオステオプロテゲリンのアミノ酸1〜215を含む最初のアミノ酸配列順序を含む。ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンγのアミノ酸103〜329を含む別のアミノ酸配列順序をさらに含む-1つのFc。ポリペプチド中の最初のアミノ酸配列順序は第2のアミノ酸配列順序に先行するかもしれない。ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列順序を含むかもしれない。骨吸収または再造形に関連した疾病は、癌腫、乳癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、固形腫瘍による骨転移、骨粗鬆症、慢性関節リウマチあるいは乾癬性関節炎かもしれない。 
【００１９】
ある様相では、現在の発明は、骨吸収または再造形に関連した病気を治療するか予防する方法に備える。方法は骨吸収に関連したか、人間のRANKLに拘束するポリペプチドを含む治療上有効な量の医薬組成物を改造する病気を治療するか予防する必要中の患者に処理することを含む。ポリペプチドは、人間のオステオプロテゲリンのアミノ酸1〜215を含む最初のアミノ酸配列順序を含む。ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンγ-1 Fcのアミノ酸103〜329を含む別のアミノ酸配列順序をさらに含む。ポリペプチド中の最初のアミノ酸配列順序は第2のアミノ酸配列順序に先行するかもしれない。ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列順序を含むかもしれない。骨吸収または再造形に関連した疾病は、癌腫、乳癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、固形腫瘍による骨転移、骨粗鬆症、慢性関節リウマチあるいは乾癬性関節炎かもしれない。 
【００２０】
これら、およびここに述べられた発明の他の様相および利点は、下に図と詳述の考察で明白になるだろう。 
【００２１】
次の図面および記載が発明についての理解を援助するために提供される: 
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図1は、BIAcore X100によって生成された様々なrshRANKL濃度でDenosumabの関連および解離曲線を示す;
【図２】図2は、BIAcore X100によって生成された異なるRANKL濃度で配列番号1のポリペプチドの関連および解離曲線を示す;
【図３】図3は、0日の時間点(パネルA)、67日の時間点(パネルB)および176日の時間点(パネルC)で配列番号1のポリペプチドのHPLCクロマトグラムが分析した代表サイズ排他(SEC)を示す;
【図４】配列番号1の霊長類の単一のポリペプチドを示された図4は、皮下の投与経路用の0.3、3、10および30mg/kgの投薬量用のCmaxおよびAUClastのための線形性に投薬する;そして
【図５】配列番号1の霊長類の単一のポリペプチドを示された図5は、Cmaxのための線量、および皮下の投与経路用の0.3、3、10および30mg/kgの投薬量用のAUClastによって訂正された研究結果に投薬する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ここに示された教えは、人間のIgGのFc部分に融合されるOPGの生物学上活発なN末端部分を含む蛋白質分子のエンジニアリングに、一部分基づく。そのようなOPG誘導蛋白質分子の組み換えの生産を可能にするために、DNA発現ベクトルは、異種の蛋白発現系での蛋白質分子の過剰生産のために構築された。また、哺乳動物細胞は高い発現レベルに安定して蛋白質分子を表現して準備されている。現在の教えの合成物のデザイン、準備および予備特性記述は、国際特許出願出版で、一部分少しもなく示される。WO/2013/147899、2013年10月3日に公表された、それは言及によって全体でここに組み入れられる。 
【００２４】
組み換えの出所からの蛋白質分子は、溶液での同性愛者調光器および同性愛者四量体を形成した。蛋白浄化方法は、蛋白質分子の生理学上適切な本質的に純粋な同性愛者二量体の準備を得ることを可能にして考案された。不意に、浄化された蛋白質分子は、生体外の結合アッセイ中のRANKLのための例外的に高度の結合能を実証する。医薬製剤は、霊長類の中への蛋白質分子の皮下および静脈内投与を許可して考案された。したがって、公式化された蛋白質分子は、霊長類の中への皮下および静脈内投与の上の受理可能な薬物動態学プロフィールを示す。さらに、このように公式化された蛋白質分子は、人間の中への皮下投与上の本質的な全身性の露出を示す。 
【００２５】
期間がそれぞれ使用される場合、この詳説の中で一般に使用される期間は、芸術で、この発明のコンテキスト内に、および特定のコンテキスト中でそれらの通常の意味を持っている。ある期間は議論される、以下に、あるいは、他のところに、詳説中で、発明、およびそれらを作り使用する方法の組成および方法について述べることの中の開業医への補足ガイダンスを提供するために期間に任意に役に立つ範囲か意味は期間が使用される特定のコンテキストから明白になる。「に関して」そして「ほぼ」量のための受理可能な程度の誤差が測定の性質か精度を与えられて測定したことを一般に意味するものとする。典型的には、誤差の典型的な程度は、できれば10%、およびより好ましくは与えられた値か値域の5%以内に20パーセント(%)以内にある。生物系で二者択一でそして特に、期間「に関して」そして「ほぼ」だろう、できれば5-の内にオーダ内にある平均値は折り重なる、そして与えられた値の2倍以内に、より好ましくは。ここに与えられた数の量は近似である、でないならば、述べた、そうでなければ、次のことを意味すること、期間「に関して」あるいは「ほぼ」推論することができる、いつ、明らかにではなく述べた。 
【００２６】
発明の方法は、1つ以上の突然変異体(シーケンス変種)への野生型のシーケンスを含めて、シーケンスを互いと比較するステップを含んでいるかもしれない。そのような比較は、典型的にはポリマー・シーケンスの配列を含む、例えば、配列アラインメント・プログラムおよび(または)当技術(例えばBLAST、FASTA、MEGALIGN、少数を指定するために)において有名なアルゴリズムの使用。熟練した職人は、そのような配列(ここで突然変異は残渣挿入か欠失を含んでいる)では、挿入されているか削除された残渣を含んでいないポリマー・シーケンスで配列アラインメントが「ギャップ」(典型的にダッシュ、あるいは「A」によって表わされた)を導入するだろうということを容易に認識することができる。 
【００２７】
発明の方法は統計計算(例えばIC50またはEC50の価値などの決定)を含んでいるかもしれない。熟練した職人は、様々な市販のソフトウェアを使用して、そのようなものを行なうことができることを容易に認識することができる、例えば、PRISM(GraphPadソフトウェア社(ラ・ホーヤ(CA))およびアメリカ)あるいは類似した 
【００２８】
「同族の」、そのすべての文法のフォームおよびスペリングの異形で、有機体の異なる種からの相同蛋白質と同様に、有機体の同じ種の中の上科からの蛋白を含む「共通の進化の起源」を所有する2つの蛋白の関係を参照する。パーセント同一性の点から、あるいは特定の残渣あるいはモチーフおよび保存された位置の存在によっても、それらのシーケンス類似性によって反映されるように、そのような蛋白(またそれらのコード化する核酸)には配列相同性がある。しかしながら、一般的慣習、および即時の出願で、期間、副詞で修正された時「同族である」のように「高度に、類似性を順番に並べるために参照するかもしれないし」、共通の進化の起源に関係があるか、関係がないかもしれない。 
【００２９】
期間「シーケンス類似性」は、そのすべての文法のフォームで、同一性あるいは共通の進化の起源を共有するか、共有しないかもしれない核酸あるいはアミノ酸配列順序の間の対応の程度を指す。 
【００３０】
「蛋白」、「ポリペプチド」という期間は交換できて使用される。一般に、哺乳動物で使用される現在の教えのOPG誘導蛋白質は、他の哺乳類発現細胞株が同様に有用であると予想されるがCHOまたはHEK293の細胞系統のような適切な翻訳後修飾を可能にする哺乳動物細胞中で表現される。したがって、OPG誘導蛋白質が本質的にそれらの生体機能を達成せずに、翻訳後に修正されるかもしれないことは予想される。 
【００３１】
ある様相では、現在の教えのOPG誘導蛋白質分子の機能的な変種は、少なくとも人間のOPGおよび1つ以上の融合領域の生物学上活発な部分がある融合蛋白質を含んでいる。そのような融合領域の有名な例は含んでいる、しかし制限されない、polyhistidine、グルタミン酸グルタミン酸、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、プロテインA、Gタンパク質、免疫グロブリン重鎖不変部領域(例えばFc)、麦芽糖結合蛋白質(MBP)、あるいはヒト血清アルブミン。融合領域は希望の特性を与えるように選択されるかもしれない。例えば、OPGポリペプチド部分は、適切なペプチド・リンカーによってOPGポリペプチドを安定させる生体内の(「スタビライザ」領域)領域で任意に融合されるかもしれない。期間「安定すること」何でも意味する、それは増加する、体循環中のポリペプチドの半減期、にかかわらず、これは減少した破壊、減少したクリアランスあるいは他の薬物動態学の効力のためか。免疫グロブリンのFc部分を備えた融合はある蛋白上で望ましい薬物動態学の特性を与えると知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は所要性質を与えることができる。選択されるかもしれない他のタイプの融合領域は、補足生体機能(例えば、ターゲットとされた作用部位で生体内で蓄積を促進して)を与えるmultimerizing(例えば、四部分にして二量化して)領域および機能的な領域を含んでいる。 
【００３２】
ある様相では、現在の発明は、人間のIgγ-1(GenBank: J00228.1)のFc部分の227のアミノ酸を後に続けて、人間のOPG(GenBank: U94332.1)の主要な215のアミノ酸を含むポリペプチドに備える。例具体化では、現在の発明の蛋白質分子は、配列番号1のアミノ酸配列順序を含む。 
【００３３】
hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド(配列番号1) 
【化１】
2017508792.tif 000003
【００３４】
ある様相では、現在の発明は、柔軟なリンカーによって任意に接続されて、人間のIgγ-1のFc部分の227のアミノ酸が後続する人間のOPGの主要な215のアミノ酸を含むポリペプチドのための読取枠コーディングをしている組換えDNA分子に備える。例具体化では、現在の発明の組換えDNA分子は、配列番号2のヌクレオチド配列を含む。 
【００３５】
hOPG-hIgG1-Fc DNA(配列番号2) 
【化２】
2017508792.tif 000004
【００３６】
ある様相では、現在の発明は、柔軟なリンカーによって任意に接続されて、人間のIgγ-1のFc部分の227のアミノ酸が後続する人間のOPGの主要な215のアミノ酸を含むポリペプチドの高い表現用の組み換えのmamalian表現プラスミドに備える。このプラスミドは、bGHポリアデニル化および転写終始配列を後に続けて、前述のポリペプチドのための遺伝子コーディングの転写を駆り立てるためにサイトメガロウィルス(CMV)プロモータを含む。プラスミドは、さらにバクテリアの中でプラスミド増殖および淘汰を支援するために、複製およびβ- lactamase遺伝子(それはアンピシリン抵抗性を与える)のpUC起源を含んでいる。プラスミドは、さらにグルタミン合成酵素用の遺伝子、安定したCHOK1の確立のために広く使用された選択可能なマーカー、およびNSO細胞系統を含んでいる。 
【００３７】
例具体化では、現在の発明の哺乳類の表現プラスミドは、配列番号3のヌクレオチド配列を含む。 
【００３８】
hOPG-hIgG1-Fc表現プラスミド(配列番号3) 
【化３−１】
2017508792.tif 000005
【化３−２】
2017508792.tif 000006
【化３−３】
2017508792.tif 000007
【化３−４】
2017508792.tif 000008
【化３−５】
2017508792.tif 000009
【００３９】
ある様相では、現在の発明は、柔軟なリンカーによって任意に接続されて、人間のIgγ-1のFc部分の227のアミノ酸が後続する人間のOPGの主要な215のアミノ酸を含むポリペプチドの生産用の哺乳類の発現系に備える。現在の発明の発現系は、柔軟なリンカーによって任意に接続されて、人間のIgγ-1のFc部分の227のアミノ酸が後続する人間のOPGの主要な215のアミノ酸を含むポリペプチドの高い表現用の組み換えのmamalian表現プラスミドを保護する哺乳動物細胞を含む。 
【００４０】
例具体化では、現在の発明の哺乳類の発現系は、配列番号3のヌクレオチド配列を含むプラスミドを保護するチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1)を含む。 
【００４１】
ある様相では、現在の発明は、骨吸収または再造形に関連した病気によって達成された哺乳動物の治療法に備える。 
【００４２】
例 
次の例は断念する側面および現在の発明の他の側面を示す。これらの制限しない例は化合物、組成、品物、デバイスおよび(または)ここに要求された方法がどのように作られ評価されるかに関して芸術の通常の技術のものに実例となる具体化を供給するように出される。例は、発明に純粋に典型的になるように意図され、制限するようには意図されない、範囲、何の、発明者、彼の発明として尊重する。数(例えば量、温度など)に関して精度を保証する努力がなされた。しかし、いくつかの誤差および偏差が説明されるべきである。
【００４３】
例1:現在の発明のポリペプチドの準備。 
配列番号1のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドは、当技術中で既知の、CHO-K1使用する分子生物学、細胞培養および蛋白生化学テクニック中で表現され、PCT出版WO/2013/147899について述べた。本質的に、ポリペプチドを発現するCHO-K1細胞はよく確立しているプロトコルを利用して、収穫され溶解された。細胞溶解産物清澄化の後、含んでいる上澄みは、hOPG-hIgG1-FcポリペプチドがプロテインAアフィニティカムに最初に適用されることということを表現した。pHを調整されたプロテインAカラム溶出液は、Qセファロース樹脂を利用する陰イオン交換クロマトグラフィー(AIEX)によってさらに浄化された。適切なように、AIEX flowthroughは、サイズ排他HPLC(SEC - HPLC)、SDS-PAGEおよび他の解析技法によって分析された。 
【００４４】
後の研究については、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドを含む治療の組成は1%の精製白糖、100のmM塩化ナトリウム、20のmM塩酸L-アルギニンおよび25のmMリン酸ナトリウムpH 6.3をさらに含んでいる4のmLで40mgのhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドを含むために公式化された。単一のガラス瓶は多くの4mLで約40mgのhIgG1-Fcポリペプチドを含んでいる。したがって、ガラス瓶中のタンパク質濃度は10±1 mg/mLである。 
【００４５】
例2;表面プラズモン共鳴(SPR)分析を使用するRANKLへの現在の教え親和性結合のポリペプチドの評価。 
核要因カッパ-B配位子(rshRANKL)の組み換えの可溶の人間のレセプタ活性化体への配列番号1の準備したhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの結合能は特に設計された表面プラズモン共鳴(SPR)分析を使用して測定された。分析(hOPG)中で- hIgG1-Fcポリペプチドは、異なる濃度のrshRANKLのA解決策が投薬された組換え型タンパク質によってSPRセンサ表面上で捕らえられた、群集と解離のセンサ表面および動力学がモニターされた。親和性はデータに1:1ラングミュア結合モデルを適合させることにより計算される。 
【００４６】
材料、試薬および機器: 
Biacore CM5センサチップ(Geヘルスケア);アミン・カップリング・キット(Geヘルスケア);50mM水酸化ナトリウム(GEのヘルスケア);10mM NaAcetate PH 4.5(Geヘルスケア);Surfactance P20(Geヘルスケア);グリシン(シグマ - オールドリッチ);10x PBSのバッファー(Geヘルスケア) 
バッファー: 
バッファーを動かすこと:PBS+0.05%のSurfactance P20(pH7.26) 
再生バッファ:10mMグリシン・バッファー4.6+mlの10mMグリシン・バッファー(pH 1.7)の5.4ml 
材料: 
Denosumab(Prolia、商品、アムジェン)濃度60mg/mL 
例1に先行することについてhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド準備 
rshRANKL濃度0.76mg/mL(13μΜ) 
機器: 
Biacore X100道具(Geヘルスケア) 
Biacore X100評価ソフトウェアV2.0.1(Geヘルスケア) 
【００４７】
方法: 
組換え型タンパク質Aは0.025mg/mlの終末濃度へのpH4.5 10mM NaAcetateバッファーを使用して薄められた。プロテインAはカップリング・キットおよび次のパラメーターを使用して、フロー・セル1-2上で動けなくされた:a) 1:1 EDCの7分の注射:NH;b) 10μL/minの10mM NaAcetate pH4.5の中の薄められたプロテインAの5分の注射;c) 1MエタノールアミンpH8.5の7分の注射。rshRANKL(MW 57.9 kDa)はBIAcoreを動かすバッファーを備えた希望の濃度に薄かった。5つの異なるrshRANKL希釈が親和性測定に使用された:1.0415 nM、2.083 nM、4.166 nM、8.333 nM、16.666 nM。6つの異なるrshRANKL希釈がDenosumab親和性測定に使用された:0.7359nM、1.4719 nM、2.94375 nM、5.8875 nM、11.775 nM、23.55 nM。Denosumabは、0.8μΜの終末濃度へのBIAcoreを動かすバッファーを使用して薄められた。hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド・サンプルは、37 nMの終末濃度へのBIAcoreを動かすバッファーを使用して薄められた。 
【００４８】
分析プロトコル: 
分析はメーカーのプロトコル・サンプル区画温度によって行なわれた、25Cだった;データ収集レート - 1Hz;流量 - 30μL/min;rshRANKLの異なる5つの濃度が、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド評価(4.166のnM希釈は測定された2回だった)に使用された;rshRANKL配位子の異なる6つの濃度がDenosumab評価に使用された。測定はすべて以下のように行なわれた:180年代の接触時間を備えたDenosumab/hOPG-hIgG1-Fc捕獲;180年代の接触時間を備えたrshRANKL捕獲;作動するバッファーを3600年代に使用する解離;再生バッファを70年代に使用する再生。 
【００４９】
Biacore X100評価ソフトウェアは各サンプルのために速動性の群集(ka)および解離(kd)定数、平衡解離定数(KD)および最大のRANKL結合レベル(Rmax)を評価するために使用される。モデルパラメータは、データに1:1ラングミュア結合モデルを適合させることにより、各サンプルのために個々に評価される。 
【００５０】
異なるRANKL濃度のDenosumabの協会および解離曲線は図1で示される。各カーブの関連データは、テーブル1でリストされる。Biacore XI 00評価softwareareによって評価された、Denosumab-RANKL結合のモデルパラメータは、テーブル2でリストされる。 
【００５１】
RANKLへの反RANKL抗体Denosumab結合の親和性(KD)は、2.6のX 10-11Mである。それはメーカーからの報告されたデータと一致している。 
【００５２】
表1は、Denosumab-rshRANKL結合のためのデータを関連させた。 
【表１】
2017508792.tif 000010
【００５３】
表2 Denosumab-RANKL結合の評価のために使用されたモデルパラメータ 
【表２】
2017508792.tif 000011
【００５４】
異なるrshRANKL濃度のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの協会および解離曲線は、図2で示される。各カーブの関連データは、テーブル3でリストされる。Biacore X100評価ソフトウェアによって評価されたhOPG-hIgG1-フート燭-RANKL結合のモデルパラメータは、テーブル4でリストされる。 
【００５５】
RANKLへのhOPG-hIgG1-Fc結合の親和性(KD)は4.85のX 10-13Mである。 
【００５６】
表3は、hOPG-hIgG1-フート燭-RANKL結合の各カーブのデータを関連させた。 
【表３】
2017508792.tif 000012
【００５７】
Biacore X100によって評価されて拘束するhOPG-hIgG1-フート燭-RANKLの表4モデルパラメータ。 
【表４】
2017508792.tif 000013
【００５８】
したがって、rhsRANKLへの配列番号1結合のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの親和性(KD)は約4.9のX 10-13Mであると推測された。市販のDenosumab(それは本質的に同様の実験条件の下で約2.6のX 10-11Mであると推測された)のそれと比較して、それはおよそ50倍高い。 
【００５９】
例3:hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドに関する処方安定性研究。 
断念に述べられているように、配列番号1のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドは本質的に表現され浄化された。2 - 8Cの推定値生成物安定性へのhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドperfomormedの長期安定性試験。40CのhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド加速試験は異なる組成の処方バッファー中の生成物安定性を評価するために行なわれた。ポリペプチド安定性はSEC HPLCによって分析された。SEC HPLCクロマトグラムの統合は、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド・モノマー、総計および分解産物を評価し、かつタンパク質組成物の変化をモニターするために行なわれた。hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドはスクリューへ等分された、ガラス瓶をしのいだ。部分標本は要求される期間に指定の温度の暗黒で格納された。 
【００６０】
材料と機器: 
使用される試薬はすべて少なくともHPLCグレードだった:逆浸透水(あるいは等価物);塩化ナトリウム(JTパン屋);二塩基のリン酸ナトリウム、ヘプタハイドレード(Na2HPO4。7H2O、JTベイカー)あるいはリン酸ナトリウムの二塩基の無水(Na2HPO4、JTベイカー);6Nの塩酸(JTパン屋);水酸化ナトリウム6N NaOH(BDH);アジ化ナトリウム(シグマ・オールドリッチ);メタノール(JTパン屋);rhsRANKL(Alphamab社);ヤギ抗ヒトIgG:HRP共役(パーキン・エルマー)。 
【００６１】
pH計(コーニング頂上542);化学てんびん(メトラー・トレドXS603S);PDAを備えたウォータースHPLCシステム、またソフトウェアができるようにする;YMCパック・ジオール、6.0mm ID x 30cm(YMCカタログ番号DL06S053006WT)300、;G2000 SWxl(7.5 mmx300 mm(TOSOHバイオサイエンス));TSK警戒SW(7.5 mmx75 mm(TOSOHバイオサイエンス));2つのμmフリット(VWRカタログ番号21511- 442)を備えたインラインフィルタ;代わりの2μmフリット(VWRのカタログ番号21511-423);フィルタ、PES、1000 mL(Nalgene(カタログ番号567-0020));合計の回復ガラス瓶(PTFE/シリコーン隔膜(ウォータース)を備えたねじ蓋12×32mmのキャップ);キャップ/隔膜12×32は、接合したあらかじめ裂かれたPTFE/シリコーン隔膜(ウォータース)を備えた頚部をねじで留める。 
【００６２】
バッファー: 
移動相バッファー: 
100のmM NaPhosphate、YMCパック・ジオール300カラム用の200のmM NaCl pH 7.0(PBS) 
20のmM NaPhosphate、300のmM NaCl、pH 7.4バッファー。G2000SWxlカラムのためにろ過されガス抜きされた。 
薬処方バッファーに続くことが準備された: 
1. 25のmM NaPhosphate、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLの精製白糖、pH 6.3 
2. 25のmM NaPhosphate、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLの精製白糖、pH 6.8 
3. 20のmMヒスチジン、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLのマンニットール、pH 6.8 
4. 20のmMヒスチジン、50のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、25mg/mLのマンニットール、pH 6.8 
5. 20のmMヒスチジン、50のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、25mg/mLのマンニットール、0.1mg/mLのメチオニン、pH 6.8 
6. 20のmMヒスチジン、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLのマンニットール、pH 6.3 
7. 20のmMヒスチジン、50のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、25mg/mLのマンニットール、pH 6.3 
8. 20のmMヒスチジン、50のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、25mg/mLのマンニットール、0.1mg/mLのメチオニン、pH 6.3 
【００６３】
方法: 
1mg/mlあるいは2mg/mLのタンパク質濃度に達するために、サンプルは移動相で薄められた。 
クロマトグラフィー・パラメーター: 
流量:0.5 ml/min 
カラム温度:25 ±3C 
オートサンプラー温度:5 ±3C 
注射ボリューム:2mg/mLのポリペプチド濃度を備えたサンプル用の15μl 
1mg/mLのポリペプチド濃度を備えたサンプル用の25μl 
検出器波長:2mg/mLのポリペプチド濃度を備えたサンプル用の280nm 
1mg/mLのポリペプチド濃度を備えたサンプル用の214nm 
ランタイム:35min 
【００６４】
hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの2つのロット、個々の準備は、両方とも25のmM NaPhosphate(100のmM NaCl)の中で公式化された約10mg/mlの全蛋白濃度で、テストされた、25のmM L-アルギニンHCl、pH 6.3の10mg/mLの精製白糖。 
【００６５】
hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの2つの異なる準備ロット用の2 - 8Cの安定性研究の結果は、テーブル5およびテーブル6で下に要約される。 
【００６６】
表5 安定性研究時間点でのhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド組成物 
【表５】
2017508792.tif 000014
【００６７】
表6 安定性研究時間点でのhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド組成物 
【表６】
2017508792.tif 000015
【００６８】
準備ロット、2は様々な組成の処方バッファー中で安定度試験を40C加速されて従属させられなかった。2つの準備(25のmM NaPhosphate、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLの精製白糖、pH 6.3)が、交換されなかったロットの処方バッファー、断念する開示でリストされた薬処方バッファー。加速試験の結果は、テーブル7で下に要約される。 
【００６９】
表7 加速試験時間点(処方はF1-F8をバッファーする)でのhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド組成物 
F1 - 25のmM NaPhosphate、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLの精製白糖、pH 6.3 
【表７−１】
2017508792.tif 000016
F2 - 25のmM NaPhosphate、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLの精製白糖、pH 6.8 
【表７−２】
2017508792.tif 000017
F3 - 20のmMヒスチジン、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLのマンニットール、pH 6.8 
【表７−３】
2017508792.tif 000018
F4 - 20のmMヒスチジン、50のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLのマンニットール、pH 6.8 
【表７−４】
2017508792.tif 000019
F5 - 20のmMヒスチジン、50のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、25mg/mLのマンニットール、0.1mg/mLのメチオニン、pH 6.8 
【表７−５】
2017508792.tif 000020
F6 - 20のmMヒスチジン、50のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLのマンニットール、pH 6.3 
【表７−６】
2017508792.tif 000021
F7 - 20のmMヒスチジン、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、25mg/mLのマンニットール、pH 6.3 
【表７−７】
2017508792.tif 000022
F8 - 20のmMヒスチジン、50のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、25mg/mLのマンニットール、0.1mg/mLのメチオニン、pH 6.3 
【表７−８】
2017508792.tif 000023
【００７０】
表7で要約された結果から明白なように、処方の中へのマンニトールの追加、10mg/mL以内をバッファーする、しかしながら、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド組成物安定性を改善した、6.3から6.8までの処方バッファーのpH増加は生成物安定性にまた影響しなかった、NaCl濃度の変化を行った。 
【００７１】
2つの準備もテストされなかったロットの安定性、室温(RT)。その準備は、0.6、1.2および1.8mg/mLの全蛋白濃度をしている3つのサンプルの中への0.9%のNaClでそれぞれ薄められた。サンプルは24hに備えて室温で蓄えられ、0時間の時間点および24時間の時間点で分析された。RANKLへの標準品結合の70-130%の判定基準を備えたRANKLへのhOPG-hIgG1-Fcの結合を評価するために、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド組成物安定性は、SEC HPLC(それはタンパク質組成物とELISAの完全をモニターする)で分析された。研究の結果はテーブル8で要約される。 
【００７２】
表8 RT安定性研究時間点でのhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド組成物 
【表８】
2017508792.tif 000024
【００７３】
表8、0.6mg/mLまで薄められたhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド10mg/mlのストック、1.2mg/mLおよび1.8mg/mLで要約され、24時間に備えて室温で蓄えられた結果から明白なように、標準品に似ている組成および結合活性の完全を実証した。したがって、データは、薬準備および静脈内投与に十分な時間の間ポスト再構成されたhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド溶液の安定性を確認した。 
【００７４】
2つの準備が元なかったロットの長期安定性は2 - 8Cでテストした。研究の結果は表9で要約される。 
表9 hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド2 - 8C長期安定性試験結果 
【表９】
2017508792.tif 000025
【００７５】
として、結果から明白である、テーブル8で要約された、10mg/mlの配列番号1のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド、25のmM NaPhosphateの中で公式化された、100のmM NaCl、25のmM L-アルギニンHCl、10mg/mLの精製白糖、pH 6.3に、6か月の間構造安定性と比活性を少なくとも維持する。 
【００７６】
例4:霊長類の中のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの一回量薬物動態研究。 
薬物動態学のプロフィール、および皮下・静脈内である(ボーラス)投与に続くhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの最大耐用量は、12のカニクイザル(6匹のオスおよび6匹の雌)の中で研究された、0.3、3、10、30および100mg/kgの線量レベルの皮下投与によるhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドのその受信一回量、あるいは0.3、3および10mg/kgの線量レベルの静脈内投与によって。静脈内投与が2 mL/kgの線量ボリュームで行われていた一方、皮下の薬注は1mL/kgの線量ボリュームで行われた。テスト物質濃度はより高用量のために、9.73mg/mLだった、用量ボリュームを水平にする、標的線量レベル/sを達成するために調節された(動物錘に基づいた)。 
【００７７】
次の賦形剤は、要求される線量濃度への試験物質の準備に使用された;処方バッファー(1%のw/v精製白糖、100のmM塩化ナトリウム、20のmM塩酸L-アルギニン、25のmM炭酸水素ナトリウム、6.3の最終の調整されたpH)。賦形剤は準備の後に1週以内に冷却され使用されて格納された。 
【００７８】
動物はおよそ2-4年で、研究開始の時に重さ2-4kgだった。動物は、臨床的症状のために2度毎日観察された。体重は各段階的線量増加に先立って記録された。食料消費は、研究の間に視覚的に毎日評価された。血液学と臨床化学の臨床病理学臨床検査用血液サンプルは、以前集められた、事前審理、また各線量レベルの後の24h。 
【００７９】
動物は、2つの線量グループに当初は割り付けられ、以下のように扱われた: 
【表１０】
2017508792.tif 000026
【００８０】
動物は続いて以下のように線量だった: 
【表１１】
2017508792.tif 000027
* 以前に0.3mg/kg、**の素朴な動物でhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドを投薬された動物 
【００８１】
付加的、皮下、2匹の動物のために薬を飲むことは肝酵素アクティビティ(つまりアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼおよび乳酸脱水素酵素)を評価するために終わった、薬注は以下のとおりだった: 
【表１２】
2017508792.tif 000028
【００８２】
以前に皮下のルート経由で3.0mg/kgでhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドを投薬された***動物
【００８３】
2匹の動物が、2週のポスト線量観察期間が後続する100mg/kgの単一の皮下注射を受け取った。血液サンプルは肝酵素アクティビティのために集められた。 
【表１３】
2017508792.tif 000029
【００８４】
両方の動物は、皮下のルート経由の0.3および10mg/kg、および静注ルートによる0.3および3mg/kgで以前にhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドをそれぞれ投薬された。 
【００８５】
薬物動態学の臨床検査用血液サンプルは各段階的線量増加で指定の時間点で得られた。 
【００８６】
hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド血漿レベルでの薬物動態学の分析はフェニックスを使用して、仕切られていない方法を使用して試みられた?WinNonlinR(Pharsight株式会社からのバージョン6.1)のために。C0(IV投与用のT = 0の推定された濃度)、Cmax(SC投与用最高濃度)は観察された個体価値から得られた。AUClast(最後の測定点への曲線下面積)は混合対数の線形回帰によって決定された。 
【００８７】
PKデータからの結果は、hOPG-hIgG1-FcポリペプチドのCmaxが0.3、3、10および30mg/kgの線量レベルに皮下投与に続くおよそ6-8h、0.3、3および10mg/kgの線量レベルに静脈注射に続くおよそ1hであることを示した。hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドのクリアランスは、投与の静脈内・皮下のルートのためのおよそ168hのポスト線量だった。SCルートについては、低用量(0.3mg/kg)で、および動物0590(3mg/kg)のためにそれぞれ観察されて、1h 2hのTlagによって示されるように、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドは必ずしも直ちに吸収されるとは限らなかった。Thalf価値は、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの消失が、3および10mg/kgの線量価値に基づいて、IVおよびSCルートのために約55の手のThalfで比較的、45hそれぞれ遅いことを示した。IVのために、27.5hから57.8hに及ばれ、SCルート用に35.5hから53.3hに及ばれたThalfを送る。排出速度は、線量率の付随する増加を示さなかった。消失は両方のルートの場合類似していた。IVとSCのルートについては、CIとVdは投薬量に関係なく類似した。IVルートに向かって、CIとVdは、0.75から1.22 mL/h/kg、および48.3〜76.6 mL/kgの範囲にそれぞれ及んだ。対応する範囲は、SCルートに向かって、0.97〜1.69 mL/h/kg、および65.3〜94.6 mL/kgの間にあった。CIとVdは増加する線量につれて増加しなかった。これらの結果は、Thalf、CIおよびVdが投薬量に依存しなかったことを示した。hOPG-hIgG1-Fcのための露出の線形性は、単に線形回帰による、CmaxおよびAUClastから、SCルート用にグラフ式に決定された。また、これらは図4で示される。露出は直線的に増加した、AUClast(それぞれ)およびCmaxのための、R2= 0.96および0.98． 
【００８８】
SCルートについては、Cmax価値を基づかせた、線量比例数を示すことができるように(図5)見えた。線量によって訂正された中間のCmaxは6410だった、11309、10409、そして11739(ナノグラム/mL)/(mg/kg)それぞれ0.3、3、10および30mg/kgの線量のために。線量比例数は、3から0.3mg/kgの線量まで明白に実証された。その露出は、他に3つまで比較での0.3mg/kgの線量間の比例数以上に増加した。10のために、実際に、33.3のために、0.3〜3mg/kgの間の線量の増加を折り重ねる、0.3〜10mg/kgの間の増加を折り重ねて、100のために0.3〜30mg/kgの間の線量の増加を折り重ねる、17.6、54.1および183.1があった、Cmaxの増加をそれぞれ折り重ねる。用量比以上の約10の折り目のために露出が増加したことを示した、AUClastに対する対応する値は、それぞれ82.3、249.5および1095.1だった。 
【００８９】
3〜10mg/kg、相対的な線量比例数はCmax/DおよびAUClastDに基づいて、示され、理論的な用量比を止められていた用量比計算によって確認された。 
【００９０】
IVルートに向かって、露出は、3.3のために、線量比例数以上にわずかに増加した、そこに線量の増加を折り重ねる、4.3と4.1だった、AUClastとCmaxの中でそれぞれ増加した。 
【００９１】
したがって、AUClastとCmaxは、3からのみ30mg/kgまで比較的線量比例する露出につれて直線的に(R2~ 1.0)増加した。これらの結果は、全身性の露出が3から30mg/kgまで増加する線量につれてSC投与の後にほとんど比例して増加したことを示した。 
【００９２】
それぞれ、hOPG-hIgG1 -Fcポリペプチド生体有用性は、3および10mg/kgで得られた平均値を使用して、評価され、3および10mg/kgで88.6%および59.2%に相当した。hOPG-hIgG1 -Fcポリペプチドは10mg/kg(59.2%)に対して比較の中に3mg/kg(88.6%)でよりよいbioavialabilityを持っていたように見えた。 
【００９３】
したがって、研究の結果から明白なように、動物はすべて評価された両方の投与経路、およびすべての投薬量でhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドに露出された。SC投与の後、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド(AUClastとCmax)への全身性の接触は、3からのみ30mg/kgまで比較的線量比例する露出を備えた増加する線量につれて直線的に増加した。排出速度は増加する線量によって影響を受けず、両方のルートの場合類似していた。投与経路が何でも、CIとVdは投薬量に関係なく類似した。結果は、Thalf、CIおよびVdが投薬量に依存しなかったことを示した。結果は、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドが10mg/kg(59.2%)に対して比較の中に3mg/kg(88.6%)でよりよいbioavialabilityを持っていたことを示唆する。 
【００９４】
単一の後のhOPG-hIgG1 -Fcポリペプチド用の中間の血漿の薬物動態学のパラメーター、霊長類の中の皮下・静脈内の線量はテーブル9で要約される、以下に。 
【００９５】
中間の血漿の表9サマリー、霊長類の中の皮下の単一および静脈内の線量の後のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド用の薬物動態学のパラメーター 
【表１４】
2017508792.tif 000030
* NC - 計算された否定 
【００９６】
例5;霊長類の中のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの繰り返し線量薬物動態研究。 
繰り返し線量の薬物動態学の分析はCynomolgousな猿における毒素動態の研究の間に終わった。ここで3つの雄および3つの雌各々の4つのグループが、メインおよびリカバリ・グループから0、0.3、3および10mg/kg(1つのグループ当たりの1つの性当たりのn=3動物)の濃度で皮下注射によって2週連続間2度毎週扱われた。毒素動態の分析はhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドを処理された動物上でのみ試みられた。 
【００９７】
血漿レベルでの毒素動態の分析は、フェニックスを使用して、仕切られていない方法(動力学の毎日の間、最初、およびデイ13上の)を使用して試みられた?WinNonlin R(Pharsight株式会社からのバージョン6.1)のために。したがって、薬物動態学のパラメーターは、最初と13上で行われた投与の後にそれぞれ比較された。 
【００９８】
研究は下記を実証した。量れる濃度はそうではなかった、対照群(1をグループ化する)で検知された、さえ、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドはこのグループの1つの雄および1つの雌の中で測定された。動物はすべて、0.3、3および10mg/kgの線量で2週間hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドに2度毎週露出された。hOPG-hIgG1-Fcポリペプチド(AUC72を意味し、Cmaxを意味する)への全身性の接触は、雄と雌の両方の中の増加する線量につれて増加した。hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの中程度の蓄積は2週間の投与の後に観察された。管理期間は投薬量レベルに依存しなかった。デイ13とデイ1の間のAUC72の比によって示されるように、CmaxとAUC72は雄と雌の両方の中のすべての線量レベルに次の繰り返し投与を増加させた。この比はhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの適度の血漿蓄積を確認して、0.28〜2.50に及んだ。蓄積は投薬量レベルにつれて増加した。どのジェンダー結果も、intra-個体差より高く示されなかった。明瞭なジェンダーによる相違は終えることができない。また、雄と雌の間の差がなかったことが思われるかもしれない。ジェンダーによる相違に関して、露出は0.3から10mg/kgまで異なる線量を横切った、雄および雌の両方において類似した。1日目および13日目においては、線量比例して両方のジェンダー中の0.3〜10mg/kgの間で以上に、hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの全身性の血漿露出は増加した。線量比例数は、1日目の上の、AUC72のよろしくの中の中間物と低薬量の間の雌、およびCmaxに基づいた高いおよび低薬量の間の雄のための場合以外は観察されなかった。13日目においては、血漿露出の増加が、ハイ・レベルのターゲットとされた用量比以上の少なくとも5つの折り目だった。 
【００９９】
霊長類の中の繰り返し線量皮下投与の後のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド用の薬物動態学のパラメーターがそうである中間の血漿は、テーブル10を中へ下に要約した。 
【０１００】
中間の血漿の表10サマリー、2度毎週の後のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドのための雄および雌のCynomolgousな猿(線量グループについて1つの性当たりN=3)の中の薬物動態学のパラメーター、皮下、2週間薬を飲むこと 
【表１５】
2017508792.tif 000031
【０１０１】
例6;人間の中のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの一回量薬物動態研究。 
配列番号1の次の皮下投与のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの薬物動態学のプロフィール、10mg、30mgおよび60mgの線量レベルに皮下投与によってhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの一回量を受け取った健康な男性ボランティア(19-39に年を取らせる)の中で研究された。hOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの製剤は使用した、25のmM NaPhosphate(100のmM NaCl)の中で公式化された約10mg/mlの全蛋白濃度にあった、25のmM L-アルギニンHCl、pH 6.3の10mg/mLの精製白糖。3つの様々な時間点ポスト投与のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドが、テストされて投薬する血中濃度は、テーブル11-13で要約される。結果は、人間の被験者の体循環中の研究の下の製剤原料の本質的なポスト皮下投与生体有用性を示す。 
【０１０２】
表11 一回の10mgの線量のSC投与の後の健康なボランティアの中のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの血中濃度 
【表１６】
2017508792.tif 000032
【０１０３】
表11 一回の30mgの線量のSC投与の後の健康なボランティアの中のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの血中濃度 
【表１７】
2017508792.tif 000033
【０１０４】
表13 SC administrsingle 60mgの線量の後の健康なボランティアの中のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドの血中濃度 
【表１８】
2017508792.tif 000034
【０１０５】
例7;ヒト組織結合特性はhOPG-hIgG1-Fcポリペプチドに勉強する。 
この免疫組織化学(IHC)研究の目的は、配列番号1のhOPG-hIgG1-Fcポリペプチド用の組織結合特性を決定し、製本見本を比較することである、に、1つの、市販、治療(Prolia)。市販のTNFアルファ結合の治療のetanercept(Enbrel)はアイソタイプ・コントロールとして使用された。 
【０１０６】
方法 
信号の最小のバックグラウンドおよび最大の検出に帰着する濃度を確立するために、滴定実験は、3つの蛋白治療学、hOPG-hIgG1-FcFITC、PROLIA、およびENBREL(コバンスによってperfmormedされたFITC(フルオレセインイソチオシアネート)ラベル化)で行なわれた。系列希釈は、LifeSpanによって供給された新鮮な凍ったヒト組織上で20μg/ml、10μg/ml、5μg mlおよび2.5μg/mlで行なわれた。さらに、ENBRELは、1.25μg ml、0.6μg/mlおよび0.3μg/mlでさらにtiteredされた。hOPG-hIgG1-FcFITC、PROLIA-FITCおよびアイソタイプは治療のENBRELをコントロールする- FITC、原発性の拘束力のある試薬および主要な検出法として使用された、反FITCマウスから成った、第2の抗体(シグマ・オールドリッチ(catalog# F5636))、反マウスの第2の抗体(進路、BA-2000)によって続いた、また赤い基質キット(進路、SK-5100)を備えたABC-APキット(AP =アルカリフォスファターゼ、第2、進路(AK-5000))、フクシャを生産するために使用された- 有色の預金。組織抗原が保存されており免疫組織化学法にはアクセス可能だったことを保証するために、組織も陽性対照抗体(CD31とビメンチン)で染色された。CD31およびビメンチン染色には陽性だった組織だけが研究の剰余に選ばれた。負の調節は、原発性の試薬がない状態、あるいは原発性の試薬および反FITCの第2の抗体(すべての場合の中で反マウス風切り羽および他のすべての下流の試薬を使用して)の両方がない状態での隣接した切開上で免疫組織化学方法全体を行なうことから成った。スライドは病理学者によって解釈された。また、試薬はそれぞれ、固有信号の存在、バックグラウンドのレベル、および文献の中で報告された表現結果を備えた一致のために評価された。強度を汚すことは、0-4規模(0の=否定、1つの=が赤くなる、2つの=失神、3つの=中程度、4つの強い=)に記録された。スライドは、ニコン顕微鏡につながれたDVC 1310Cのディジタルカメラで想像された。実験結果は、テーブル14で下に要約される。 
【０１０７】
表14 ヒト組織の中のIHC研究の結果 
【表１９】
2017508792.tif 000035
【０１０８】
hOPG-hIgG1-FcFITCを備えた結果: 
hOPG-hIgG1-FcFITCは、5-10μg/mlの濃度で、マントルゾーンを含む扁桃中のリンパ球、および胸腺中の胸腺細胞内の時々の中程度の染色に弱く見えた。中程度の染色もハッサルの小体で見られた。前立腺は大部分は陰性だったか、あるいは平滑筋の時々の赤色染色を示した。精巣内では、精原細胞および時々の精母細胞はまれな赤色染色を示した。また、ライディッヒ細胞は陰性だった。子宮は、子宮筋層の平滑筋の赤色染色を示した。また、子房は、間質細胞の赤色染色を示した。胎座は、合胞体栄養細胞の中程度の染色を示した、そして内皮および時々の間質細胞の中程度の染色に弱い小腸は、刷子縁および杯状細胞ムチンの中から強の染色を備えた上皮の赤色染色を示した。道管、粘膜下組織と筋の繊維芽細胞、ガングリオンおよび平滑筋は陰性だった。肝臓切開は、肝細胞の中程度の染色に弱く、シヌソイドの管壁細胞の時々の中程度の染色に弱く見えた。 
【０１０９】
PROLIA-FITCを備えた結果: 
PROLIA-FITCは、2.5-5の進路g/mlの濃度で、胸腺中の骨髄のリンパ球の時々の強い染色と共に、扁桃の中でリンパ球の部分集合内の時々の強い染色に中程度に見えて、特にリンパ濾胞のマントルゾーン内に、および胸腺細胞の中程度の染色に弱く示した。前立腺は染色には陰性だった。精巣は、精原細胞のまれな赤色染色を示したが、精母細胞とライディッヒ細胞において大部分は陰性だった。子宮は、子宮筋層の平滑筋の弱い染色を示した。また、子房切開は、血管平滑筋の弱い染色を示した。胎座は、内皮および時々の間質細胞の中程度の染色に合胞体栄養細胞と失神の中程度の染色を示した。小腸は、刷子縁の中から強の染色を備えた上皮の弱い染色を示した。道管、粘膜下組織と筋の繊維芽細胞、ガングリオンおよび平滑筋は陰性だった。肝臓切開は、肝細胞の弱い染色を示した。 
【０１１０】
ENBREL-FITCを備えた結果: 
ENBREL-FITCは、1.25μg/mlの濃度で、胸腺と扁桃の中でリンパ球の時々強い膜質の染色に中程度に見えた。前立腺は、上皮細胞の中程度の染色および平滑筋の弱い染色に弱く見えた。胎座は、間質細胞および時々の細胞栄養芽層の中程度の染色に弱い合胞体栄養細胞の部分集合の時々強い染色および内皮の弱い染色に中程度に見えた。子房は、間質細胞の弱い染色を示した。子宮サンプルは、子宮筋層の平滑筋の弱い染色、および大部分は血管内皮と血管平滑筋の媒質着色を示した。精巣内では、精原細胞および時々の精母細胞は中程度の染色を示した。また、ライディッヒ細胞は陰性だった。小腸は、上皮の中程度の染色、刷子縁の強い染色、および粘膜下の血管および繊維芽細胞の媒質着色を示した。 
【０１１１】
要約すると、5μg/mlのhOPG-hIgG1-FcFITCおよび2.5μg/mlのPROLIA-FITCは、脾赤色髄のシヌソイドの内皮の陽染色と共に、扁桃と胸腺のリンパ球内の陽染色を示した。両方の試薬は、さらに胎盤の栄養芽層および内皮(子宮の子宮筋層の平滑筋の弱い染色)の陽染色を示し、前立腺において大部分は陰性だった。さらに、肝細胞は両方の試薬に積極的だった。陽染色を示した細胞タイプはPROLIA-FITCとhOPG-hIgG1-FcFITCの間で非常に類似した。ENBREL-FITCはリンパ球、胎盤の栄養芽層および内皮の陽染色および子宮筋層の平滑筋をさらに示しただけでなく、他の2つの試薬とは対照的に、精巣の前立腺上皮および細精管の中で陽染色を示した。ENBREL-FITCの染色のパターンは、PROLIA-FITCと比較された違いおよびhOPG-hIgG1-FcFITCを示した。それは互いに、より似ていた。 
【０１１２】
「Prolia」、「Xgeva」および「Enbrel」はアムジェン(デラウェア株式会社)の登録商標である。 
【０１１３】
あたかも個々の出版あるいは特許がそれぞれ言及によって組込まれるために特に個々に示されるかのように、ここに言及された出版物および特許はすべて、言及によってそれらの全体でこれによって組み入れられる。 
【０１１４】
主題の特定の具体化は議論されているが、上記の仕様は実例となり限定的ではない。多くの変異が、下にこの仕様とクレームの調査上の当業者に明白になるだろう。発明の十分な範囲はそのような変異に加えて等価物のそれらの十分な範囲および仕様に加えてクレームへの言及によって決定されるべきである。
【図１】
2017508792.tif 000036
【図２】
2017508792.tif 000037
【図３】
2017508792.tif 000038
【図４】
2017508792.tif 000039
【図５】
2017508792.tif 000040
【配列表】
2017508792000001.app
【国際調査報告】
2017508792.tif 000041
2017508792.tif 000042