(57)【要約】本開示は、ハプロタイプフェージング及びコピー数変異アッセイの方法、組成物、及び系に関する。複数の独立したパーティションにおいてビーズを含むバーコードを試料と組み合わせるための方法及び系、ならびにバーコード化された試料を処理、配列決定、及び分析する方法が本開示内に含まれる。本開示は、遺伝物質の特徴付けに大きな進歩をもたらすのに有用であり得る方法及び系を提供する。これらの方法及び系は、例えば、ハプロタイプフェージング、構造的変異、例えば、欠失、重複、コピー数変異体、挿入、反転、転座、長縦列型反復（ＬＴＲ）、短縦列型反復（ＳＴＲ）、及び様々な他の有用な特徴付けの特定を含む、一般的に利用可能な技術の使用が実質的に困難であり得る遺伝的特徴付けを提供するのに有用であり得る。【選択図】図１３Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸における１つ以上の変異の特定方法であって、
（ａ）前記核酸の第１の断片であって、１０キロベース（ｋｂ）を超える長さを有する、前記第１の断片を提供することと、
（ｂ）前記第１の断片の複数の第２の断片を配列決定して、共通のバーコード配列を共有する、複数の断片配列を提供することと、
（ｃ）前記共通のバーコード配列の存在により、前記複数の断片配列を前記第１の断片に帰属させることと、
（ｄ）前記複数の断片配列を用いて前記第１の断片の核酸配列を決定することであって、前記核酸配列が１％未満の誤差率で決定される、前記決定することと、
（ｅ）（ｄ）で決定された前記第１の断片の前記核酸配列における前記１つ以上の変異を特定し、それにより前記核酸内の前記１つ以上の変異を特定することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第１の断片が複数の別個のパーティションの中の１つの別個のパーティション内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記別個のパーティションがエマルジョン中の液滴である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記特定が、前記第１の断片の前記核酸配列から前記核酸におけるフェーズ化変異体を特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記特定が、前記第１の断片の前記核酸配列から前記核酸における１つ以上の構造的変異を特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の断片が１５ｋｂを超える長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の断片が２０ｋｂを超える長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記決定が、前記複数の断片配列を参照にマッピングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記決定が、前記共通のバーコード配列を有する前記複数の断片配列をアセンブリングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
長さが少なくとも１０ｋｂである前記核酸の複数の第１の断片を提供することを更に含み、前記特定が、前記複数の第１の断片の各々から核酸配列を決定し、前記複数の第１の断片の各々からの前記核酸配列から前記核酸における前記１つ以上の変異を特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列を、前記２つ以上の核酸配列の重複する核酸配列に基づいて、推測コンティグに連結することを更に含み、最大推測コンティグ長が少なくとも１０ｋｂである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも２０ｋｂである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも４０ｋｂである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも５０ｋｂである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンティグ長が少なくとも１００ｋｂである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも２００ｋｂである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも５００ｋｂである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも７５０ｋｂである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも１メガベース（Ｍｂ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも１．７５Ｍｂである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記最大推測コンティグ長が少なくとも２．５Ｍｂである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列を、前記複数の第１の断片の前記２つ以上の核酸配列内の重複するフェーズ化変異体に基づいて、フェーズブロックに連結することを更に含み、最大フェーズブロック長が少なくとも１０ｋｂである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも２０ｋｂである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも４０ｋｂである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも５０ｋｂである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも１００ｋｂである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも２００ｋｂである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも５００ｋｂである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも７５０ｋｂである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも１Ｍｂである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも１．７５Ｍｂである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも２．５Ｍｂである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列を、前記２つ以上の核酸配列の重複する核酸配列に基づいて、推測コンティグに連結し、それにより推測コンティグの集団を作ることを更に含み、前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも１０ｋｂである、請求項１０に記載の方法。
【請求項３４】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも２０ｋｂである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも４０ｋｂである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも５０ｋｂである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも１００ｋｂである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも２００ｋｂである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも５００ｋｂである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも７５０ｋｂである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも１Ｍｂである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも１．７５Ｍｂである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記推測コンティグの集団のＮ５０が少なくとも２．５Ｍｂである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列を、前記複数の第１の断片の前記２つ以上の核酸配列内の重複するフェーズ化変異体に基づいて、フェーズブロックに連結し、それによりフェーズブロックの集団を作ることを更に含み、前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも１０ｋｂである、請求項１０に記載の方法。
【請求項４５】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも２０ｋｂである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも４０ｋｂである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも５０ｋｂである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも１００ｋｂである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも２００ｋｂである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも５００ｋｂである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも７５０ｋｂである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも１Ｍｂである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも１．７５Ｍｂである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記フェーズブロックの集団のＮ５０が少なくとも２．５Ｍｂである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
核酸の構造的変異の存在の決定方法であって、
（ａ）前記核酸の複数の第１の断片分子を提供することであって、前記複数の第１の断片分子の所与の第１の断片分子が前記構造的変異を含む、前記提供することと、
（ｂ）前記複数の第１の断片分子の各々の複数の第２の断片分子を配列決定して複数の断片配列を提供することであって、所与の第１の断片分子に対応する前記複数の断片配列の各々が共通のバーコード配列を共有する、前記提供することと、
（ｃ）（ｉ）前記複数の断片配列を参照配列にマッピングすること、（ｉｉ）前記共通のバーコード配列を共有する前記複数の断片配列を特定すること、及び（ｉｉｉ）前記所与の第１の断片分子の長さよりも更に離れている位置の前記参照配列にマッピングする、前記共通のバーコード配列を共有する上昇した量の前記複数の断片配列の存在に基づき前記構造的変異を特定することであって、前記上昇した量が前記構造的変異を欠如する配列に対してである、前記特定することにより、前記構造的変異の存在を決定することと、を含む、前記方法。
【請求項５６】
前記上昇した量が、前記構造的変異を有する前記核酸の領域に由来する前記第１の断片分子の総数に対して１％以上である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記上昇した量が、前記構造的変異を有する前記核酸の領域に由来する前記第１の断片分子の総数に対して２％以上である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記位置が少なくとも約１００塩基離れている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記位置が少なくとも約５００塩基離れている、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記位置が少なくとも約１キロベース（ｋｂ）離れている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記位置が少なくとも約１０ｋｂ離れている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記複数の断片配列から前記所与の第１の断片分子のアセンブリを作ることにより前記構造的変異を特定することを更に含み、前記複数の断片配列が前記共通のバーコード配列の存在に基づいて前記アセンブリの入力として選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記アセンブリが、前記複数の断片配列からコンセンサス配列を生成することにより作られる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記構造的変異が転座を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
変異体核酸配列の特徴付け方法であって、
（ａ）変異体核酸を断片化して１０キロベース（ｋｂ）を超える長さを有する複数の第１の断片を提供することと、
（ｂ）前記複数の第１の断片を別個のパーティションに分離することと、
（ｃ）各第１の断片からそのそれぞれのパーティション内に複数の第２の断片を作ることであって、前記複数の第２の断片がそれに付加されるバーコード配列を有し、所与のパーティション内の前記バーコード配列が共通のバーコード配列である、前記作ることと、
（ｄ）前記複数の第２の断片及びそれに付加される前記バーコード配列を配列決定して複数の第２の断片の配列を得ることと、
（ｅ）少なくとも部分的に前記共通のバーコード配列の存在に基づき、前記第２の断片の配列を元の第１の断片に帰属させて、前記第２の断片の配列のための第１の断片の配列環境（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ）を提供することと、
（ｆ）前記第１の断片の配列環境から前記変異体核酸の変異体部分を特定し、それにより前記変異体核酸配列を特徴付けることと、を含む、前記方法。
【請求項６６】
前記帰属が、少なくとも部分的に前記共通のバーコード配列の存在に基づき、前記複数の第２の断片の配列から前記複数の第１の断片からの個々の断片の配列の少なくとも一部をアセンブリングすることを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記帰属が、少なくとも部分的に前記共通のバーコード配列に基づき、前記複数の第２の断片の配列を前記複数の第１の断片からの個々の第１の断片にマッピングすることを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記複数の第１の断片のうちの２つ以上を、前記複数の第１の断片のうちの前記２つ以上の間の重複する配列に基づき、推測コンティグに連結することを更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記特定が、前記第１の断片の配列環境から１つ以上のフェーズ化変異体を特定することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記複数の第１の断片のうちの２つ以上を、前記複数の第１の断片のうちの前記２つ以上の間の重複するフェーズ化変異体に基づき、フェーズブロックに連結することを更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記特定が、前記第１の断片の配列環境から１つ以上の構造的変異を特定することを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記１つ以上の構造的変異が、挿入、欠失、転座、レトロトランスポゾン、反転、及び重複から独立して選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記構造的変異が挿入または転座を含み、前記第１の断片配列環境が前記挿入または転座の存在を示す、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
核酸の配列における変異体の特定方法であって、
前記核酸の複数の個々の断片分子の核酸配列であって、各々少なくとも１キロベース（ｋｂ）の長さを有する、前記複数の個々の断片分子の核酸配列を得ることと、
前記複数の個々の断片分子のうちの１つ以上の配列を、１つ以上の推測コンティグに連結することと、
前記１つ以上の推測コンティグから１つ以上の変異体を特定することと、を含む、前記方法。
【請求項７５】
前記得ることが、長さが１０ｋｂを超える複数の断片分子の前記核酸配列を得ることを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記得ることが、
前記複数の個々の断片分子の各個々の断片分子の複数のバーコード化された断片を提供することであって、所与の個々の断片分子の前記バーコード化された断片が共通のバーコードを有する、前記提供することと、
前記複数の個々の断片分子の前記複数のバーコード化された断片を配列決定することであって、前記配列決定が１％未満の配列決定誤差率を提供する、前記決定することと、
前記複数のバーコード化された断片の配列及びそれらの関連バーコードから前記複数の個々の断片分子の配列を決定することと、を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記連結が、２つ以上の個々の断片分子間における１つ以上の重複配列を特定して、前記２つ以上の個々の断片分子を前記１つ以上の推測コンティグに連結することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記連結が、２つ以上の個々の断片分子間における１つ以上の共通の変異体を特定して、前記２つ以上の個々の断片分子を前記１つ以上の推測コンティグに連結することを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記１つ以上の共通の変異体がフェーズ化変異体であり、前記１つ以上の推測コンティグが少なくとも１００ｋｂの最大フェーズブロック長を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記特定において特定された前記１つ以上の変異体が構造的変異を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
前記構造的変異が、挿入、欠失、転座、レトロトランスポゾン、反転、及び重複から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
核酸の特徴付け方法であって、
少なくとも１０キロベース（ｋｂ）の長さを有する複数の断片分子の核酸配列を得ることと、
前記複数の断片分子の前記核酸配列における１つ以上のフェーズ化変異体の位置を特定することと、
少なくとも第１の断片分子の前記核酸配列を少なくとも第２の断片分子に、前記第１及び第２の断片分子内の１つ以上の共通のフェーズ化変異体位置の存在に基づいて連結して、少なくとも１０ｋｂの最大フェーズブロック長のフェーズブロックを提供することと、
前記少なくとも１０ｋｂの最大フェーズブロック長の前記フェーズブロックから１つ以上のフェーズ化変異体を特定することと、を含む、前記方法。
【請求項８３】
前記フェーズブロックから１つ以上の追加のフェーズ化変異体を特定することを更に含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記複数の断片分子が別個のパーティション内にある、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記別個のパーティションがエマルジョン中の液滴である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記複数の断片分子の前記長さが少なくとも５０ｋｂである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記複数の断片分子の前記長さが少なくとも１００ｋｂである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも５０ｋｂである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも１００ｋｂである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも１Ｍｂである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも２Ｍｂである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記最大フェーズブロック長が少なくとも２．５Ｍｂである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
方法であって、
ａ）第１の核酸であって、生物の第１の染色体に由来する標的配列を含む、前記第１の核酸を第１のパーティションに分配することと、
ｂ）第２の核酸であって、前記生物の第２の染色体に由来する標的配列を含む、前記第２の核酸を第２のパーティションに分配することと、
ｃ）前記第１のパーティションにおいて、第１のバーコード配列を前記第１の核酸の断片または前記第１の核酸の一部のコピーに付加して、第１のバーコード化された断片を提供することと、
ｄ）前記第２のパーティションにおいて、第２のバーコード配列であって、前記第１のバーコード配列とは異なる、前記第２のバーコード配列を前記第２の核酸の断片または前記第２の核酸の一部のコピーに付加して、第２のバーコード化された断片を提供することと、
ｅ）前記第１及び第２のバーコード化された断片の前記核酸配列を決定し、前記第１及び第２の核酸の核酸配列をアセンブリングすることと、
ｆ）前記第１及び第２の核酸の前記核酸配列を比較して、それぞれ、第１及び第２の染色体に由来するとして前記第１及び第２の核酸を特徴付けることと、を含む前記方法。
【請求項９４】
前記第１のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドが前記第１の核酸と共分配され（ｃｏ−ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｄ）、前記第２のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドが前記第２の核酸と共分配される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記第１のバーコード配列を含む前記オリゴヌクレオチドが第１のビーズに放出可能に付加され、前記第２のバーコード配列を含む前記オリゴヌクレオチドが第２のビーズに放出可能に付加され、前記共分配が、それぞれ、前記第１及び第２のビーズを前記第１及び第２のパーティションに共分配することを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１及び第２のパーティションがエマルジョン中の液滴を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１の染色体が父方染色体であり、前記第２の染色体が母方染色体である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記第１の染色体及び前記第２の染色体が相同染色体である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が１つ以上の変異を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
方法であって、
ａ）第１の核酸であって、生物の第１の染色体に由来する標的配列を含む、前記第１の核酸を第１のパーティションに分配することと、
ｂ）第２の核酸であって、前記生物の第２の染色体に由来する標的配列を含む、前記第２の核酸を第２のパーティションに分配することと、
ｃ）前記第１のパーティションにおいて、第１のバーコード配列を前記第１の核酸の断片または前記第１の核酸の一部のコピーに付加して、第１のバーコード化された断片を提供することと、
ｄ）前記第２のパーティションにおいて、第２のバーコード配列であって、前記第１のバーコード配列とは異なる、前記第２のバーコード配列を前記第２の核酸の断片または前記第２の核酸の一部のコピーに付加して、第２のバーコード化された断片を提供することと、
ｅ）前記第１及び第２のバーコード化された断片の前記核酸配列を決定し、前記第１及び第２の核酸の核酸配列をアセンブリングすることと、
ｆ）前記第１及び第２の核酸の前記核酸配列を比較して、前記第１及び第２の核酸の前記核酸配列間の任意の変異を特定することと、を含む、前記方法。
【請求項１０１】
前記第１のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドが前記第１の核酸と共分配され、前記第２のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドが前記第２の核酸と共分配される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第１のバーコード配列を含む前記オリゴヌクレオチドが第１のビーズに放出可能に付加され、前記第２のバーコード配列を含む前記オリゴヌクレオチドが第２のビーズに放出可能に付加され、前記共分配が、それぞれ、前記第１及び第２のビーズを前記第１及び第２のパーティションに共分配することを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第１及び第２のパーティションがエマルジョン中の液滴を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１の染色体が父方染色体であり、前記第２の染色体が母方染色体である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第１の染色体及び前記第２の染色体が相同染色体である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が１つ以上の変異を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第１及び第２の染色体が胎児に由来する、請求項９３または請求項１００に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第１及び第２の核酸が妊婦から採取した試料から得られる、請求項９３または請求項１００に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１の染色体が染色体２１、１８、または１３である、請求項９３または請求項１００に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第２の染色体が染色体２１、１８、または１３である、請求項９３または請求項１００に記載の方法。
【請求項１１１】
前記第１または第２の染色体の相対量を決定することを更に含む、請求項９３または請求項１００に記載の方法。
【請求項１１２】
参照染色体に対する前記第１または第２の染色体の量を決定することを更に含む、請求項９３または請求項１００に記載の方法。
【請求項１１３】
前記第１の染色体もしくは第２の染色体またはその両方のコピー数が増加する、請求項９３または請求項１００に記載の方法。
【請求項１１４】
前記コピー数の増加が癌または異数体の結果である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記第１の染色体もしくは第２の染色体またはその両方のコピー数が減少する、請求項９３または請求項１００に記載の方法。
【請求項１１６】
前記コピー数の減少が癌または異数体の結果である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
胎児核酸配列の特徴付け方法であって、
（ａ）母方核酸配列を決定することであって、前記母方核酸が、胎児の妊娠中の母親に由来し、
（ｉ）母方核酸を断片化して複数の第１の母方断片を提供すること、
（ｉｉ）前記複数の第１の母方断片を母方パーティション内に分離すること、
（ｉｉｉ）前記第１の母方断片の各々からそれらのそれぞれの母方パーティション内に複数の第２の母方断片を作ることであって、前記複数の第２の母方断片がそれに付加される第１のバーコード配列を有し、前記母方パーティションの所与の母方パーティション内で、前記第２の母方断片がそれに付加される第１の共通のバーコード配列を含む、前記作ること、
（ｉｖ）前記複数の第２の母方断片を配列決定して複数の母方断片配列を提供すること、
（ｖ）少なくとも部分的に前記第１の共通のバーコード配列の存在に基づき、前記母方断片配列を元の第１の母方断片に帰属させて前記母方核酸配列を決定することにより、前記決定することと、
（ｂ）父方核酸配列を決定することであって、前記父方核酸が、前記胎児の父親に由来し、
（ｉ）父方核酸を断片化して複数の第１の父方断片を提供すること、
（ｉｉ）前記複数の第１の父方断片を父方の別個のパーティション内に分離すること、
（ｉｉｉ）各第１の父方断片からそのそれぞれのパーティション内に複数の第２の父方断片を作ることであって、前記複数の第２の父方断片がそれに付加される第２のバーコード配列を有し、所与の父方パーティション内で、前記第２の父方断片がそれに付加される第２の共通のバーコード配列を含む、作ること、
（ｉｖ）前記複数の第２の父方断片及びそれに付加される前記第２のバーコード配列を配列決定して複数の父方断片配列を提供すること、
（ｖ）少なくとも部分的に前記第２の共通のバーコード配列の存在に基づき、前記父方断片配列を元の第１の父方断片に帰属させて前記父方核酸配列を決定することにより、前記決定することと、
（ｃ）前記妊娠中の母親から胎児核酸を得、前記母方核酸配列及び前記父方核酸配列を使用して、前記胎児核酸の配列及び／または前記胎児核酸の前記配列の１つ以上の遺伝的変異を決定することと、を含む、前記方法。
【請求項１１８】
前記父方断片配列及び前記母方断片配列が各々、配列を１つ以上の推測コンティグに連結するために使用される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記推測コンティグが、母方及び父方のフェーズブロックを構築するために使用される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記胎児核酸の前記配列が、胎児フェーズブロックを構築するために前記母方及び父方のフェーズブロックと比較される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記父方断片配列が前記複数の第１の父方断片の配列の少なくとも一部を生成するためにアセンブリングされ、それにより前記父方核酸配列を決定し、前記母方断片配列が前記複数の第１の母方断片の配列の少なくとも一部を生成するためにアセンブリングされ、それにより前記母方核酸配列を決定する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記父方核酸配列の前記決定が前記父方断片配列を父方参照にマッピングすることを含み、前記母方核酸配列の前記決定が前記母方断片配列を母方参照にマッピングすることを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記胎児核酸の前記配列が少なくとも９９％の精度で決定される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記胎児核酸の前記配列の前記１つ以上の遺伝的変異が少なくとも９９％の精度で決定される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記１つ以上の遺伝的変異が、構造的変異及び一塩基多型（ＳＮＰ）からなる群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２６】
前記１つ以上の遺伝的変異が、コピー数変異、挿入、欠失、転座、レトロトランスポゾン、反転、再編成、反復配列伸長、及び重複からなる群から選択される構造的変異である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
（ｃ）において、前記母方核酸配列及び前記父方核酸配列について決定された１つ以上の遺伝的変異を使用して、前記胎児核酸の前記配列の前記１つ以上の遺伝的変異を決定することを更に含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２８】
（ｃ）において、前記胎児核酸の１つ以上の新規突然変異を決定することを更に含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２９】
（ｃ）の間または後に、前記胎児核酸に関連する異数体を決定することを更に含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３０】
（ａ）の（ｖ）の間または後に、前記母方核酸配列をハプロタイプ分析（ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）してハプロタイプが解明された母方核酸配列を提供することと、（ｂ）の（ｖ）の間または後に、前記父方核酸配列をハプロタイプ分析してハプロタイプが解明された父方核酸配列を提供することと、を更に含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３１】
（ｃ）において、前記ハプロタイプが解明された母方核酸配列及び前記ハプロタイプが解明された父方核酸配列を使用して、前記胎児核酸の前記配列及び／または前記１つ以上の遺伝的変異を決定することを更に含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記母方核酸及び前記父方核酸のうちの１つ以上がゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３３】
（ｃ）において、前記胎児核酸が無細胞核酸を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３４】
（ａ）において、少なくとも９９％の精度で前記母方核酸配列を決定することを更に含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３５】
（ｂ）において、少なくとも９９％の精度で前記父方核酸配列を決定することを更に含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３６】
前記母方核酸配列及び／または前記父方核酸配列が１０キロベース（ｋｂ）を超える長さを有する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３７】
前記母方及び父方のパーティションがエマルジョン中の液滴を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３８】
（ａ）において、前記第１のバーコード配列が、第１の粒子に放出可能に付加された前記所与の母方パーティションにおいて提供される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３９】
（ｂ）において、前記第２のバーコード配列が、第２の粒子に放出可能に付加された前記所与の父方パーティションにおいて提供される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
試料核酸の特徴付け方法であって、
（ａ）生物学的試料であって、無細胞試料核酸を含む、前記生物学的試料を対象から得ることと、
（ｂ）液滴において、バーコード配列を前記無細胞試料核酸の断片または前記試料核酸の一部のコピーに付加してバーコード化された試料断片を得ることと、
（ｃ）前記バーコード化された試料断片の核酸配列を決定し、前記バーコード化された試料断片の前記核酸配列に基づき試料核酸配列を提供することと、
（ｄ）プログラム化されたコンピュータプロセッサを使用して前記試料核酸配列の参照核酸配列との比較を生成することであって、前記参照核酸配列が１０キロベース（ｋｂ）を超える長さ及び少なくとも９９％の精度を有する、前記生成することと、
（ｅ）前記比較を使用して前記試料核酸配列における１つ以上の遺伝的変異を特定し、それにより前記試料核酸を疾患と関連付けることと、を含む、前記方法。
【請求項１４１】
前記試料核酸配列における前記１つ以上の遺伝的変異が、構造的変異及び一塩基多型（ＳＮＰ）からなる群から選択される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記試料核酸配列の前記１つ以上の遺伝的変異が、コピー数変異、挿入、欠失、レトロトランスポゾン、転座、反転、再編成、反復配列伸長、及び重複からなる群から選択される構造的変異である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
（ｃ）において、前記試料核酸配列が少なくとも９９％の精度で提供される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４４】
（ｂ）において、前記バーコード配列が粒子に放出可能に付加された前記液滴に提供され、（ｂ）が、前記バーコード配列を前記付加する前に、前記粒子から前記液滴中に前記バーコード配列を放出することを更に含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４５】
（ｂ）において、前記バーコード配列が前記粒子に放出可能に付加されたプライマー配列の一部として提供され、前記プライマー配列がランダムＮ−ｍｅｒ配列も含み、（ｂ）が、前記バーコード配列を前記付加する前に、前記粒子から前記液滴中に前記プライマー配列を放出することを更に含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
（ｂ）において、前記プライマーを使用して、増幅反応において、前記バーコード配列を前記無細胞試料核酸の前記断片または前記無細胞試料核酸の一部の前記コピーに付加することを更に含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
（ｉ）追加の液滴において、追加のバーコード配列を参照核酸の断片または前記参照核酸の一部のコピーに付加してバーコード化された参照断片を提供すること、及び（ｉｉ）前記バーコード化された参照断片の核酸配列を決定し、前記バーコード化された参照断片の前記核酸配列に基づき前記参照核酸配列を決定することを更に含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４８】
前記参照記核酸配列の前記決定が、前記バーコード化された参照断片の前記核酸配列をアセンブリングすることを含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
粒子に放出可能に付加された前記追加の液滴に前記追加のバーコード配列を提供することと、前記追加のバーコード配列を前記付加する前に、前記粒子から前記追加のパーティション中に前記追加のバーコード配列を放出することと、を更に含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記粒子に放出可能に付加されたプライマー配列の一部として前記追加のバーコード配列を提供することであって、前記プライマー配列がランダムＮ−ｍｅｒ配列も含む、前記提供することと、前記追加のバーコード配列を前記付加する前に、前記粒子から前記追加の液滴中に前記プライマーを放出することと、を更に含む請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記プライマーを使用して、増幅反応において、前記追加のバーコード配列を前記参照核酸の前記断片または前記参照核酸の一部の前記コピーに付加することを更に含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記参照核酸配列において１つ以上の遺伝的変異を決定することを更に含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５３】
前記参照核酸配列における前記１つ以上の遺伝的変異が、構造的変異及び一塩基多型（ＳＮＰ）からなる群から選択される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記参照核酸配列における前記１つ以上の遺伝的変異が、コピー数変異、挿入、欠失、レトロトランスポゾン、転座、反転、再編成、反復配列伸長、及び重複からなる群から選択される構造的変異である、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５５】
前記参照核酸が生殖系列核酸配列を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５６】
前記参照核酸が癌核酸配列を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５７】
前記試料核酸配列が１０ｋｂを超える長さを有する、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１５８】
前記参照核酸が疾患状態の不在を示すゲノムに由来する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記参照核酸が疾患状態を示すゲノムに由来する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記疾患状態が癌を含む、請求項１５８または１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記疾患状態が異数体を含む、請求項１５８または１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記無細胞試料核酸が腫瘍核酸を含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１６３】
前記腫瘍核酸が循環腫瘍核酸を含む、請求項１６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０１７，８０８号、及び２０１４年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／０７２，２１４号に対して優先権を主張し、それらの各々は、すべての目的において参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
特定のヒトゲノムの基本認識は、突然変異などのある特定の遺伝的変異の存在または不在を単に特定する以上のことを要する場合がある。ある特定の遺伝的変異が同じまたは異なる染色体上に現れるか（フェージングとしても知られる）を決定することも重要である。遺伝子のコピー数についての情報と同様、ハプロタイプなどの遺伝的変異のパターンについての情報も重要である。
【０００３】
「ハプロタイプ」という用語は、連続ブロックに一緒に受け継がれるＤＮＡ配列変異体（対立遺伝子）の組を指す。一般に、ヒトゲノムは、母方コピーと父方コピーの各遺伝子の２つのコピーを含有する。各々が２つの可能な対立遺伝子、例えば遺伝子の対立遺伝子「Ａ」と「ａ」及び遺伝子の対立遺伝子「Ｂ」と「ｂ」を有する一対の遺伝子において、所与の個体のゲノムは、Ａ及びＢの対立遺伝子が同じ染色体上に存在する「ＡＢ／ａｂ」（「シス」構成）、またはＡ及びＢの対立遺伝子が異なる染色体上に存在する「Ａｂ／ａＢ」（「トランス」構成）の２つのハプロタイプのうちの１つを含む。フェージング方法またはアッセイは、指定の対立遺伝子の組が同じまたは異なる染色体上に存在するかを決定するために使用され得る。いくつかの場合では、ハプロタイプを定義するいくつかの連結対立遺伝子は特定の疾患の表現型と相関または関連する可能性があり、このような場合において、いずれか１つの特定の遺伝的変異体よりもむしろハプロタイプが、患者が疾患を呈するかに関して最も決定的な要因であり得る。
【０００４】
遺伝子コピー数もいくつかの疾患の表現型において役割を担う。大半の遺伝子は通常２つのコピーで存在するが、増幅遺伝子は２つを超える機能性コピーで存在する遺伝子である。いくつかの場合では、遺伝子は機能性コピーの減少を受ける場合もある。遺伝子コピー数の減少または増加は異常レベルのｍＲＮＡ及びタンパク質発現の生成につながる可能性があり、癌性状態または他の障害につながる可能性がある。癌及び他の遺伝的障害は、異常な（増加または減少した）染色体数（「異数体」）と相関することが多い。蛍光インサイツハイブリダイゼーションまたは比較ゲノムハイブリダイゼーションなどの細胞遺伝学的手法が異常遺伝子数または異常染色体コピー数の存在を検出するために使用され得る。遺伝的フェージングの情報、ハプロタイプ、またはコピー数変異を検出する改善された方法が当該技術分野において必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、遺伝物質の特徴付けに大きな進歩をもたらすのに有用であり得る方法及び系を提供する。これらの方法及び系は、例えば、ハプロタイプフェージング、構造的変異、例えば、欠失、重複、コピー数変異体、挿入、反転、転座、長縦列型反復（ＬＴＲ）、短縦列型反復（ＳＴＲ）、及び様々な他の有用な特徴付けの特定を含む、一般的に利用可能な技術の使用が実質的に困難であり得る遺伝的特徴付けを提供するのに有用であり得る。
【０００６】
本開示の態様は、核酸における１つ以上の変異を特定するための方法を提供し、ａ）核酸の第１の断片であって、１０キロベース（ｋｂ）を超える長さを有する、第１の断片を提供すること、（ｂ）第１の断片の複数の第２の断片を配列決定して、共通のバーコード配列を共有する、複数の断片配列を提供すること、（ｃ）共通のバーコード配列の存在により、複数の断片配列を第１の断片に帰属させること、（ｄ）複数の断片配列を使用して第１の断片の核酸配列を決定することであって、該核酸配列が１％未満の誤差率で決定される、決定すること、及び（ｅ）（ｄ）で決定された第１の断片の核酸配列における１つ以上の変異を特定し、それにより核酸内の１つ以上の変異を特定することを含む。
【０００７】
いくつかの場合では、第１の断片は複数の別個のパーティションの中の１つの別個のパーティション内にある。いくつかの場合では、別個のパーティションはエマルジョン中の液滴である。いくつかの場合では、特定は、第１の断片の核酸配列におけるフェーズ化変異体を特定することを含む。いくつかの場合では、特定は、第１の断片の核酸配列から核酸における１つ以上の構造的変異を特定することを含む。いくつかの場合では、第１の断片は１５ｋｂを超える長さを有する。いくつかの場合では、第１の断片は２０ｋｂを超える長さを有する。いくつかの場合では、決定は、複数の断片配列を参照にマッピングすることを含む。いくつかの場合では、決定は、共通のバーコード配列を有する複数の断片配列をアセンブリングすることを含む。
【０００８】
いくつかの場合では、１つ以上の変異を特定するための方法は、長さが少なくとも１０ｋｂである核酸の複数の第１の断片を提供することを更に含み、該特定は、複数の第１の断片の各々から核酸配列を決定し、複数の第１の断片の各々からの核酸配列から核酸における１つ以上の変異を特定することを含む。
【０００９】
いくつかの場合では、１つ以上の変異を特定するための方法は、２つ以上の核酸配列の重複する核酸配列に基づいて、複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列を推測コンティグに連結することを更に含み、最大推測コンティグ長は少なくとも１０ｋｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも２０ｋｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも４０ｋｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも５０ｋｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも１００ｋｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも２００ｋｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも５００ｋｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも７５０ｋｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも１メガベース（Ｍｂ）である。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも１．７５Ｍｂである。いくつかの場合では、最大推測コンティグ長は少なくとも２．５Ｍｂである。
【００１０】
いくつかの場合では、１つ以上の変異を特定するための方法は、複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列内の重複するフェーズ化変異体に基づいて、複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列をフェーズブロックに連結することを更に含み、最大フェーズブロック長は少なくとも１０ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも２０ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも４０ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも５０ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも１００ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも２００ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも５００ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも７５０ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも１Ｍｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも１．７５Ｍｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも２．５Ｍｂである。
【００１１】
いくつかの場合では、１つ以上の変異を特定するための方法は、２つ以上の核酸配列の重複する核酸配列に基づいて、複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列を推測コンティグに連結し、それにより推測コンティグの集団を作ることを更に含み、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも１０ｋｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも２０ｋｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも４０ｋｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも５０ｋｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも１００ｋｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも２００ｋｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも５００ｋｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも７５０ｋｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも１Ｍｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも１．７５Ｍｂである。いくつかの場合では、推測コンティグの集団のＮ５０は少なくとも２．５Ｍｂである。
【００１２】
いくつかの場合では、１つ以上の変異を特定するための方法は、複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列内の重複するフェーズ化変異体に基づいて、複数の第１の断片の２つ以上の核酸配列をフェーズブロックに連結し、それによりフェーズブロックの集団を作ることを更に含み、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも１０ｋｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも２０ｋｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも４０ｋｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも５０ｋｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも１００ｋｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも２００ｋｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも５００ｋｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも７５０ｋｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも１Ｍｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも１．７５Ｍｂである。いくつかの場合では、フェーズブロックの集団のＮ５０は少なくとも２．５Ｍｂである。
【００１３】
本開示の更なる態様は、核酸の構造的変異の存在を決定する方法を提供する。本方法は、（ａ）核酸の複数の第１の断片分子を提供することであって、複数の第１の断片分子の所与の第１の断片分子が構造的変異を含む、提供すること、（ｂ）複数の第１の断片分子の各々の複数の第２の断片分子を配列決定して複数の断片配列を得ることであって、所与の第１の断片分子に対応する複数の断片配列の各々が共通のバーコード配列を共有する、得ること、ならびに（ｃ）（ｉ）複数の断片配列を参照配列にマッピングすること、（ｉｉ）共通のバーコード配列を共有する複数の断片配列を特定すること、及び（ｉｉｉ）所与の第１の断片分子の長さよりも更に離れている位置で参照配列にマッピングする、共通のバーコード配列を共有する上昇した量の複数の断片配列の存在に基づき構造的変異を特定することであって、該上昇した量が構造的変異を欠如する配列に対してである、特定することにより、構造的変異の存在を決定することを含み得る。
【００１４】
いくつかの場合では、上昇した量は、構造的変異を有する核酸の領域に由来する第１の断片分子の総数に対して１％以上である。いくつかの場合では、上昇した量は、構造的変異を有する核酸の領域に由来する第１の断片分子の総数に対して２％以上である。いくつかの場合では、位置は少なくとも約１００塩基離れている。いくつかの場合では、位置は少なくとも約５００塩基離れている。いくつかの場合では、位置は少なくとも約１キロベース（ｋｂ）離れている。いくつかの場合では、位置は少なくとも約１０ｋｂ離れている。
【００１５】
いくつかの場合では、核酸の構造的変異の存在を決定する方法は、複数の断片配列から所与の第１の断片分子のアセンブリを作ることにより構造的変異を特定することを更に含み、複数の断片配列は、共通のバーコード配列の存在に基づいてアセンブリの入力として選択される。いくつかの場合では、アセンブリは複数の断片配列からコンセンサス配列を生成することにより作られる。いくつかの場合では、構造的変異は転座を含む。
【００１６】
本開示の更なる態様は、変異体核酸配列を特徴付ける方法を提供する。いくつかの場合では、本方法は、（ａ）変異体核酸を断片化して１０キロベース（ｋｂ）を超える長さを有する複数の第１の断片を得ること、（ｂ）複数の第１の断片を別個のパーティションに分離すること、（ｃ）各第１の断片からそのそれぞれのパーティション内に複数の第２の断片を作ることであって、複数の第２の断片がそれに付加されるバーコード配列を有し、所与のパーティション内のバーコード配列が共通のバーコード配列である、作ること、（ｄ）複数の第２の断片及びそれに付加されるバーコード配列を配列決定して複数の第２の断片の配列を得ること、（ｅ）少なくとも一部共通のバーコード配列の存在に基づき、第２の断片の配列を元の第１の断片に帰属させて、第２の断片の配列に関する第１の断片の配列環境（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ）を得ること、及び（ｆ）第１の断片の配列環境から変異体核酸の変異体部分を特定し、それにより変異体核酸配列を特徴付けることを含み得る。いくつかの場合では、帰属は、少なくとも一部共通のバーコード配列の存在に基づき、複数の第２の断片の配列から複数の第１の断片からの個々の断片の配列の少なくとも一部をアセンブリングすることを含む。いくつかの場合では、帰属は、少なくとも部分的に共通のバーコード配列に基づき、複数の第２の断片の配列を複数の第１の断片からの個々の第１の断片にマッピングすることを含む。
【００１７】
いくつかの場合では、変異体核酸配列を特徴付ける方法は、複数の第１の断片のうちの２つ以上の間の重複する配列に基づき、複数の第１の断片のうちの２つ以上を推測コンティグに連結することを更に含む。いくつかの場合では、特定は、第１の断片の配列環境から１つ以上のフェーズ化変異体を特定することを含む。いくつかの場合では、変異体核酸配列を特徴付けする方法は、複数の第１の断片のうちの２つ以上の間の重複するフェーズ化変異体に基づき、複数の第１の断片のうちの２つ以上をフェーズブロックに連結することを更に含む。いくつかの場合では、特定は、第１の断片の配列環境から１つ以上の構造的変異を特定することを含む。いくつかの場合では、１つ以上の構造的変異は、挿入、欠失、転座、レトロトランスポゾン、反転、及び重複から独立して選択される。いくつかの場合では、構造的変異は挿入または転座を含み、第１の断片の配列環境は挿入または転座の存在を示す。
【００１８】
本開示の更なる態様は、核酸の配列において変異体を特定する方法を提供する。いくつかの場合では、本方法は、核酸の複数の個々の断片分子の核酸配列を得ることであって、複数の個々の断片分子の核酸配列が各々、少なくとも１キロベース（ｋｂ）の長さを有する、得ることと、複数の個々の断片分子のうちの１つ以上の配列を１つ以上の推測コンティグに連結することと、１つ以上の推測コンティグから１つ以上の変異体を特定することとを含む。いくつかの場合では、得ることは、長さが１０ｋｂを超える複数の断片分子の核酸配列を得ることを含む。いくつかの場合では、得ることは、複数の個々の断片分子の各個々の断片分子の複数のバーコード化された断片を提供することであって、所与の個々の断片分子のバーコード化された断片が共通のバーコードを有する、提供することと、複数の個々の断片分子の複数のバーコード化された断片を配列決定することであって、該配列決定が１％未満の配列決定誤差率を提供する、配列決定することと、複数のバーコード化された断片の配列及びそれらの関連するバーコードから複数の個々の断片分子の配列を決定することと、を含む。
【００１９】
いくつかの場合では、連結は、２つ以上の個々の断片分子間の１つ以上の重複する配列を特定して、２つ以上の個々の断片分子を１つ以上の推測コンティグに連結することを含む。いくつかの場合では、連結は、２つ以上の個々の断片分子間の１つ以上の共通の変異体を特定して、２つ以上の個々の断片分子を１つ以上の推測コンティグに連結することを含む。いくつかの場合では、１つ以上の共通の変異体はフェーズ化変異体であり、１つ以上の推測コンティグは少なくとも１００ｋｂの最大フェーズブロック長を含む。いくつかの場合では、特定において特定された１つ以上の変異体は構造的変異を含む。いくつかの場合では、構造的変異は、挿入、欠失、転座、レトロトランスポゾン、反転、及び重複から選択される。
【００２０】
本開示の更なる態様は、核酸を特徴付ける方法を提供する。いくつかの場合では、本方法は、少なくとも１０キロベース（ｋｂ）の長さを有する複数の断片分子の核酸配列を得ることと、複数の断片分子の核酸配列における１つ以上のフェーズ化変異体の位置を特定することと、少なくとも第１の断片分子の核酸配列を少なくとも第２の断片分子に、第１及び第２の断片分子内の１つ以上の共通するフェーズ化変異体の位置の存在に基づいて連結して、少なくとも１０ｋｂの最大フェーズブロック長を有するフェーズブロックを提供することと、少なくとも１０ｋｂの最大フェーズブロック長を有するフェーズブロックから１つ以上のフェーズ化変異体を特定することと、を含む。いくつかの場合では、核酸を特徴付ける方法は、フェーズブロックから１つ以上の追加のフェーズ化変異体を特定することを更に含む。いくつかの場合では、複数の断片分子は別個のパーティションにある。いくつかの場合では、別個のパーティションはエマルジョン中の液滴である。いくつかの場合では、複数の断片分子の長さは少なくとも５０ｋｂである。いくつかの場合では、複数の断片分子の長さは少なくとも１００ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも５０ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも１００ｋｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも１Ｍｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも２Ｍｂである。いくつかの場合では、最大フェーズブロック長は少なくとも２．５Ｍｂである。
【００２１】
本開示の更なる態様は、（ａ）生物の第１の染色体に由来する標的配列を含む、第１の核酸を第１のパーティションに分配すること、（ｂ）生物の第２の染色体に由来する標的配列を含む、第２の核酸を第２のパーティションに分配すること、（ｃ）第１のパーティションにおいて、第１のバーコード配列を第１の核酸の断片または第１の核酸の一部のコピーに付加して第１のバーコード化された断片を提供すること、（ｄ）第２のパーティションにおいて、第１のバーコード配列とは異なる第２のバーコード配列を第２の核酸の断片または第２の核酸の一部のコピーに付加して、第２のバーコード化された断片を提供すること、（ｅ）第１及び第２のバーコード化された断片の核酸配列を決定し、第１及び第２の核酸の核酸配列をアセンブリングすること、及び（ｆ）第１及び第２の核酸の核酸配列を比較して、それぞれ、第１及び第２の核酸を第１及び第２の染色体に由来すると特徴付けることを含む方法を提供する。いくつかの場合では、第１のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは第１の核酸と共分配され、第２のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは第２の核酸と共分配される。いくつかの場合では、第１のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは第１のビーズに放出可能に付加され、第２のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは第２のビーズに放出可能に付加され、共分配は、それぞれ、第１及び第２のビーズを第１及び第２のパーティションに共分配することを含む。いくつかの場合では、第１及び第２のパーティションはエマルジョン中の液滴を含む。いくつかの場合では、第１の染色体は父方染色体であり、第２の染色体は母方染色体である。いくつかの場合では、第１の染色体及び第２の染色体は相同染色体である。いくつかの場合では、第１の核酸及び第２の核酸は１つ以上の変異を含む。
【００２２】
いくつかの場合では、第１及び第２の染色体は胎児に由来する。いくつかの場合では、第１及び第２の核酸は、妊婦から採取した試料から得られる。いくつかの場合では、第１の染色体は、染色体２１、１８、または１３である。いくつかの場合では、第２の染色体は、染色体２１、１８、または１３である。いくつかの場合では、本方法は、第１または第２の染色体の相対量を決定することを更に含む。いくつかの場合では、本方法は、参照染色体に対する第１または第２の染色体の量を決定することを更に含む。いくつかの場合では、第１の染色体もしくは第２の染色体またはその両方のコピー数は増加する。いくつかの場合では、コピー数の増加は癌または異数体の結果である。いくつかの場合では、第１の染色体もしくは第２の染色体またはその両方のコピー数は減少する。いくつかの場合では、コピー数の減少は癌または異数体の結果である。
【００２３】
本開示の更なる態様は、（ａ）生物の第１の染色体に由来する標的配列を含む、第１の核酸を第１のパーティションに分配すること、（ｂ）生物の第２の染色体に由来する標的配列を含む、第２の核酸を第２のパーティションを分配すること、（ｃ）第１のパーティションにおいて、第１のバーコード配列を第１の核酸の断片または第１の核酸の一部のコピーに付加して第１のバーコード化された断片を提供すること、（ｄ）第２のパーティションにおいて、第１のバーコード配列とは異なる第２のバーコード配列を第２の核酸の断片または第２の核酸の一部のコピーに付加して、第２のバーコード化された断片を提供すること、（ｅ）第１及び第２のバーコード化された断片の核酸配列を決定し、第１及び第２の核酸の核酸配列をアセンブリングすること、及び（ｆ）第１及び第２の核酸の核酸配列を比較して、第１及び第２の核酸の核酸配列間の任意の変異を特定することを含む方法を提供する。いくつかの場合では、第１のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは第１の核酸と共分配され、第２のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは第２の核酸と共分配される。いくつかの場合では、第１のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは第１のビーズに放出可能に付加され、第２のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは第２のビーズに放出可能に付加され、共分配は、それぞれ、第１及び第２のビーズを第１及び第２のパーティションに共分配することを含む。いくつかの場合では、第１及び第２のパーティションはエマルジョン中の液滴を含む。いくつかの場合では、第１の染色体は父方染色体であり、第２の染色体は母方染色体である。いくつかの場合では、第１の染色体及び第２の染色体は相同染色体である。いくつかの場合では、第１の核酸及び第２の核酸は１つ以上の変異を含む。いくつかの場合では、第１及び第２の染色体は胎児に由来する。いくつかの場合では、第１及び第２の核酸は、妊婦から採取した試料から得られる。いくつかの場合では、第１の染色体は、染色体２１、１８、または１３である。いくつかの場合では、第２の染色体は、染色体２１、１８、または１３である。いくつかの場合では、本方法は、第１または第２の染色体の相対量を決定することを更に含む。いくつかの場合では、本方法は、参照染色体に対する第１または第２の染色体の量を決定することを更に含む。いくつかの場合では、第１の染色体もしくは第２の染色体またはその両方のコピー数は増加する。いくつかの場合では、コピー数の増加は癌または異数体の結果である。いくつかの場合では、第１の染色体もしくは第２の染色体またはその両方のコピー数は減少する。いくつかの場合では、コピー数の減少は癌または異数体の結果である。
【００２４】
本開示の更なる態様は、胎児核酸配列を特徴付けるための方法を提供する。いくつかの場合では、本方法は、（ａ）胎児の妊娠中の母親から得られる、母方核酸の配列を、（ｉ）母方核酸を断片化して複数の第１の母方断片を提供すること、（ｉｉ）複数の第１の母方断片を母方パーティションに分離すること、（ｉｉｉ）第１の母方断片の各々からそれらのそれぞれの母方パーティション内に複数の第２の母方断片を作ることであって、該複数の第２の母方断片がそれに付加される第１のバーコード配列を有し、母方パーティションの所与の母方パーティション内において、第２の母方断片がそれに付加される第１の共通のバーコード配列を含む、作ること、（ｉｖ）複数の第２の母方断片を配列決定して複数の母方断片配列を提供すること、（ｖ）少なくとも部分的に第１の共通のバーコード配列の存在に基づき母方断片配列を元の第１の母方断片に帰属させて母方核酸配列を決定することにより、決定すること、（ｂ）胎児の父親から得られる、父方核酸の配列を、（ｉ）父方核酸を断片化して複数の第１の父方断片を提供すること、（ｉｉ）複数の第１の父方断片を父方の別個のパーティションに分離すること、（ｉｉｉ）各第１の父方断片からそのそれぞれのパーティション内に複数の第２の父方断片を作ることであって、該複数の第２の父方断片がそれに付加される第２のバーコード配列を有し、所与の父方パーティション内において、第２の父方断片がそれに付加される第２の共通のバーコード配列を含む、作ること、（ｉｖ）複数の第２の父方断片及びそれに付加される第２のバーコード配列を配列決定して、複数の父方断片配列を提供すること、（ｖ）少なくとも部分的に第２の共通のバーコード配列の存在に基づき、父方断片配列を元の第１の父方断片に帰属させて父方核酸配列を決定することにより、決定すること、（ｃ）妊娠中の母親から胎児核酸を得、母方核酸配列及び父方核酸配列を使用して、胎児核酸の配列及び／または胎児核酸の配列の１つ以上の遺伝的変異を決定することを含む。
【００２５】
いくつかの場合では、父方断片配列及び母方断片配列は各々、配列を１つ以上の推測コンティグに連結するために使用される。いくつかの場合では、推測コンティグは母方及び父方のフェーズブロックを構築するために使用される。いくつかの場合では、胎児核酸の配列は、胎児フェーズブロックを構築するために母方及び父方のフェーズブロックと比較される。いくつかの場合では、父方断片配列は複数の第１の父方断片の配列の少なくとも一部を生成するためにアセンブリングされ、それにより父方核酸配列を決定し、母方断片配列は複数の第１の母方断片の配列の少なくとも一部を生成するためにアセンブリングされ、それにより母方核酸配列を決定する。いくつかの場合では、父方核酸配列の決定は父方断片配列を父方参照にマッピングすることを含み、母方核酸配列の決定は母方断片配列を母方参照にマッピングすることを含む。
【００２６】
いくつかの場合では、胎児核酸の配列は少なくとも９９％の精度で決定される。いくつかの場合では、胎児核酸の配列の１つ以上の遺伝的変異は少なくとも９９％の精度で決定される。いくつかの場合では、１つ以上の遺伝的変異は、構造的変異及び一塩基多型（ＳＮＰ）からなる群から選択される。いくつかの場合では、１つ以上の遺伝的変異は、コピー数変異、挿入、欠失、転座、レトロトランスポゾン、反転、再編成、反復配列伸長、及び重複からなる群から選択される構造的変異である。
【００２７】
いくつかの場合では、胎児核酸配列を特徴付けるための方法は、（ｃ）において、母方核酸配列及び父方核酸配列について決定された１つ以上の遺伝的変異を使用して、胎児核酸の配列の１つ以上の遺伝的変異を決定することを更に含む。いくつかの場合では、胎児核酸配列を特徴付けるための方法は、（ｃ）において、胎児核酸の１つ以上の新規突然変異を決定することを更に含む。いくつかの場合では、胎児核酸配列を特徴付けるための方法は、（ｃ）の間または後に、胎児核酸に関連する異数体を決定することを更に含む。
【００２８】
いくつかの場合では、胎児核酸配列を特徴付けるための方法は、（ａ）の（ｖ）の間または後に、母方核酸配列をハプロタイプ分析（ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）してハプロタイプが解明された母方核酸配列を提供することと、（ｂ）の（ｖ）の間または後に、父方核酸配列をハプロタイプ分析してハプロタイプが解明された父方核酸配列を提供することと、を更に含む。いくつかの場合では、胎児核酸配列を特徴付けるための方法は、（ｃ）において、ハプロタイプが解明された母方核酸配列及びハプロタイプが解明された父方核酸配列を使用して、胎児核酸の配列及び／または１つ以上の遺伝的変異を決定することを更に含む。いくつかの場合では、母方核酸及び父方核酸のうちの１つ以上はゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。いくつかの場合では、（ｃ）において、胎児核酸は無細胞核酸を含む。いくつかの場合では、胎児核酸配列を特徴付けるための方法は、（ａ）において、少なくとも９９％の精度で母方核酸配列を決定することを更に含む。いくつかの場合では、胎児核酸配列を特徴付けるための方法は、（ｂ）において、少なくとも９９％の精度で父方核酸配列を決定することを更に含む。
【００２９】
いくつかの場合では、母方核酸配列及び／または父方核酸配列は１０キロベース（ｋｂ）を超える長さを有する。いくつかの場合では、母方及び父方のパーティションはエマルジョン中の液滴を含む。いくつかの場合では、（ａ）において、第１のバーコード配列は、第１の粒子に放出可能に付加された所与の母方パーティションにおいて提供される。いくつかの場合では、（ｂ）において、第２のバーコード配列は、第２の粒子に放出可能に付加された所与の父方パーティションにおいて提供される。
【００３０】
本開示の更なる態様は、試料核酸を特徴付けるための方法を提供する。いくつかの場合では、本方法は、（ａ）無細胞試料核酸を含む、生物学的試料を対象から得ること、（ｂ）液滴において、バーコード配列を無細胞試料核酸の断片または試料核酸の一部のコピーに付加してバーコード化された試料断片を提供する、（ｃ）バーコード化された試料断片の核酸配列を決定し、バーコード化された試料断片の核酸配列に基づき、試料核酸配列を提供すること、（ｄ）プログラムされたコンピュータプロセッサを使用して試料核酸配列の参照核酸配列への比較を生成することであって、該参照核酸配列が１０キロベース（ｋｂ）を超える長さ及び少なくとも９９％の精度を有する、生成すること、及び（ｅ）該比較を使用して試料核酸配列における１つ以上の遺伝的変異を特定し、それにより試料核酸を疾患と関連付けることを含む。いくつかの場合では、試料核酸配列における１つ以上の遺伝的変異は、構造的変異及び一塩基多型（ＳＮＰ）からなる群から選択される。いくつかの場合では、試料核酸配列の１つ以上の遺伝的変異は、コピー数変異、挿入、欠失、レトロトランスポゾン、転座、反転、再編成、反復配列伸長、及び重複からなる群から選択される構造的変異である。いくつかの場合では、（ｃ）において、試料核酸配列は少なくとも９９％の精度で提供される。いくつかの場合では、（ｂ）において、バーコード配列は粒子に放出可能に付加された液滴に提供され、（ｂ）は、バーコード配列を付加する前に、粒子から液滴中にバーコード配列を放出することを更に含む。いくつかの場合では、（ｂ）において、バーコード配列は、粒子に放出可能に付加されたプライマー配列の一部として提供され、該プライマー配列はランダムＮ−ｍｅｒも含み、（ｂ）は、バーコード配列を付加する前に、粒子から液滴中にプライマー配列を放出することを更に含む。いくつかの場合では、（ｂ）において、プライマーを使用して、増幅反応において、バーコード配列を無細胞試料核酸の断片または無細胞試料核酸の一部のコピーに付加する。
【００３１】
いくつかの場合では、試料核酸を特徴付けるための方法は、（ｉ）追加の液滴において、追加のバーコード配列を参照核酸の断片または参照核酸の一部のコピーに付加してバーコード化された参照断片を提供すること、及び（ｉｉ）バーコード化された参照断片の核酸配列を決定し、バーコード化された参照断片の核酸配列に基づき参照核酸配列を決定することを更に含む。いくつかの場合では、参照核酸配列の決定は、バーコード化された参照断片の核酸配列をアセンブリングすることを含む。いくつかの場合では、試料核酸を特徴付けるための方法は、粒子に放出可能に付加された追加の液滴に追加のバーコード配列を提供することと、追加のバーコード配列を付加する前に、粒子から追加のパーティション中に追加のバーコード配列を放出することを更に含む。いくつかの場合では、試料核酸を特徴付けるための方法は、粒子に放出可能に付加されたプライマー配列の一部として追加のバーコード配列を提供することであって、該プライマー配列がランダムＮ−ｍｅｒ配列も含む、提供することと、追加のバーコード配列を付加する前に、粒子から追加の液滴中にプライマーを放出することとを更に含む。いくつかの場合では、試料核酸を特徴付けるための方法は、プライマーを使用して、増幅反応において、追加のバーコード配列を参照核酸の断片または参照核酸の一部のコピーに付加することを更に含む。いくつかの場合では、試料核酸を特徴付けるための方法は、参照核酸配列において１つ以上の遺伝的変異を決定することを更に含む。
【００３２】
いくつかの場合では、参照核酸配列における１つ以上の遺伝的変異は、構造的変異及び一塩基多型（ＳＮＰ）からなる群から選択される。いくつかの場合では、参照核酸配列における１つ以上の遺伝的変異は、コピー数変異、挿入、欠失、レトロトランスポゾン、転座、反転、再編成、反復配列伸長、及び重複からなる群から選択される構造的変異である。いくつかの場合では、参照核酸は生殖系列核酸配列を含む。いくつかの場合では、参照核酸は癌核酸配列を含む。いくつかの場合では、試料核酸配列は１０ｋｂを超える長さを有する。いくつかの場合では、参照核酸は疾患状態の不在を示すゲノムに由来する。いくつかの場合では、参照核酸は疾患状態を示すゲノムに由来する。いくつかの場合では、疾患状態は癌を含む。いくつかの場合では、疾患状態は異数体を含む。いくつかの場合では、無細胞試料核酸は腫瘍核酸を含む。いくつかの場合では、腫瘍核酸は循環腫瘍核酸を含む。
【００３３】
本開示の更なる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され、説明される以下の発明を実施するための形態から当業者には容易に明らかとなろう。理解されるように、本開示は他の及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく、様々な明らかな観点において修正が可能である。したがって、図面及び説明は性質上図示的であり、制限するものとみなされないものとする。
【００３４】
参照による組み込み
本明細書に言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されるのと同程度まで、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３５】
本発明の新規特徴は、付属の特許請求の範囲に詳細に記述される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される図示的な実施形態を記述する以下の発明を実施するための形態及び添付の図面を参照することにより得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】従来のプロセス対本明細書に記載される例示的プロセス及び系を用いたフェーズ化変異体の特定及び分析の模式図を提供する。
【図２】従来のプロセス対本明細書に記載される例示的プロセス及び系を用いた構造的変異の特定及び分析の模式図を提供する。
【図３】本明細書に開示される方法及び組成物を用いたコピー数またはハプロタイプを検出するためのアッセイを実施するための例示的なワークフローを図示する。
【図４】核酸試料をビーズと組み合わせ、核酸とビーズを別個の液滴に分配するための例示的なプロセスの模式図を提供する。
【図５】染色体核酸断片をバーコード化及び増幅するための例示的なプロセスの模式図を提供する。
【図６】配列データを個々の染色体に帰属させる際の染色体核酸断片のバーコード化の例示的な使用の模式図を提供する。
【図７】フェーズ化配列決定プロセスの例の模式図を提供する。
【図８】健康な患者（上のパネル）及びハプロタイプコピー数が増加した（中央のパネル）またはハプロタイプコピー数の減少（下のパネル）を有する癌患者のゲノムの例示的なサブセットの模式図を提供する。
【図９Ａ】図９Ａ及びＢは、（ａ）腫瘍ＤＮＡの相対的寄与を示す模式図、及び（ｂ）通常の配列決定法によるこのようなコピーの増加及び減少を検出する表示を提供する。
【図９Ｂ】図９Ａ及びＢは、（ａ）腫瘍ＤＮＡの相対的寄与を示す模式図、及び（ｂ）通常の配列決定法によるこのようなコピーの増加及び減少を検出する表示を提供する。
【図１０】単一変異体の位置（左のパネル）及び組み合わせた変異体の位置（右のパネル）を用いたコピーの増加及び減少を検出する例の模式図を提供する。
【図１１】コピー数の増加及び減少を特定するための記載される方法及び系の可能性の模式図を提供する。
【図１２】本明細書に記載される方法及び組成物を用いた染色体数及びコピー数変異の決定に基づく異数体試験を実施するための例示的なワークフローを図示する。
【図１３Ａ】図１３Ａ及びＢは、遺伝子試料における転座及び遺伝子融合などの構造的変異を特定するためのプロセスの例示的な概要を図示する。
【図１３Ｂ】図１３Ａ及びＢは、遺伝子試料における転座及び遺伝子融合などの構造的変異を特定するためのプロセスの例示的な概要を図示する。
【図１４】本明細書に記載される方法及び組成物を用いたコピー数変異の決定に基づく癌診断試験を実施するための例示的なワークフローを図示する。
【図１５】ＮＣＩ−Ｈ２２２８癌細胞系からのＥＭＬ−４−ＡＬＫ構造的変異の模式図を提供する。
【図１６Ａ】図１６Ａ及び１６Ｂは、陰性対照細胞系（図１６Ｂ）と比較したとき、癌細胞系（図１６Ａ）において、図１５に示されるＥＭＬ−４−ＡＬＫ変異体構造の存在を特定するための本明細書に記載される系を用いたバーコードマッピングデータを提供する。
【図１６Ｂ】図１６Ａ及び１６Ｂは、陰性対照細胞系（図１６Ｂ）と比較したとき、癌細胞系（図１６Ａ）において、図１５に示されるＥＭＬ−４−ＡＬＫ変異体構造の存在を特定するための本明細書に記載される系を用いたバーコードマッピングデータを提供する。
【図１７】本明細書に記載されるように父方核酸配列を分析する例示的なワークフローを模式的に示す。
【図１８】本明細書に記載されるように母方核酸配列を分析する例示的なワークフローを模式的に示す。
【図１９】本明細書に記載されるように胎児核酸配列を分析する例示的なワークフローを模式的に示す。
【図２０】本明細書に記載されるように参照核酸配列を分析する例示的なワークフローを模式的に示す。
【図２１】本明細書に記載されるように試料核酸配列を分析する例示的なワークフローを模式的に示す。
【図２２】例示的なコンピュータ制御システムを模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の様々な実施形態が本明細書において示され、説明されるが、このような実施形態が単に例として提供されることは当業者には明らかであろう。当業者は、多くの変形、変更、及び置換を、本発明から逸脱することなく想到し得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が利用され得ることを理解するべきである。
【００３８】
本明細書で使用される、「生物」という用語は、概して、継続する生体系を指す。生物の非限定的な例としては、動物（例えば、ヒト、他の種類の哺乳類、鳥、爬虫類、昆虫、本明細書の他の箇所に記載される他の例示的な種類の動物）、植物、菌類、及び細菌が挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用される、「コンティグ」という用語は、概して、所与の長さの連続する核酸配列を指す。連続する配列は、短いもしくは長い配列リードのいずれかの配列リードを含む個々の配列リード、またはリード内の重複する配列に基づき整合及びアセンブリングされる、もしくは他の既知の連鎖データ、例えば本明細書の他の箇所に記載される共通のバーコードによるタグ付けに基づき断片内で連結されると定義される配列リードのアセンブリから得ることができる。これらの重複する配列リードは、同様に、短いリード、例えば５００塩基未満、例えば、いくつかの場合では約１００〜５００塩基、及びいくつかの場合では１００〜２５０塩基を含むか、またはより長い配列リード、例えば５００塩基超、１０００塩基超、または更には１０，０００塩基超に基づく。
【００４０】
Ｉ．概要
本開示は、遺伝物質の特徴付けに大きな進歩をもたらすのに有用な方法及び系を提供する。いくつかの場合では、本方法及び系は、例えば、ハプロタイプフェージング、構造的変異、例えば、欠失、重複、コピー数変異体、挿入、反転、レトロトランスポゾン、転座、ＬＴＲ、ＳＴＲ、及び様々な他の有用な特徴付けの特定を含む、一般的に利用可能な技術の使用が非常に困難であるか、または更には不可能である遺伝的特徴付けを提供するのに有用であり得る。
【００４１】
一般に、本明細書に記載される方法及び系は、長い範囲の変異体情報の特定及び使用（例えば、他の変異を含有する配列セグメントを含む、異なる配列セグメントであって、発生元の配列においてかなりの距離、例えば短いリード配列決定技術によって提供されるよりも長い距離によって分離される、配列セグメントに変異を関連付ける）を可能にする長い個々の核酸分子の配列決定を提供することにより上記の目標を達成する。しかしながら、これらの方法及び系は、短いリード配列決定技術の非常に低い配列決定誤差率の利点を伴って、及び報告された長いリード長配列決定技術、例えばＳＭＲＴ配列決定及びナノ細孔配列決定技術などの単一分子配列決定のものよりもはるかに下回ってこれらの目的を達成する。
【００４２】
一般に、本明細書に記載される方法及び系は、高処理高精度の短いリード配列決定技術を使用して配列可能（ｓｅｑｕｅｎｃｅａｂｌｅ）であるより小さい断片に長い核酸分子を分割するが、より小さい断片から得られる配列情報を発生元のより長い個々の核酸分子に帰属させることを可能にする方法でこのような分割を行う。配列リードを発生元のより長い核酸分子に帰属させることにより、一般的に短い配列リードだけでは得ることができない、そのより長い核酸配列の有意な特徴付け情報を得ることができる。述べたように、このような特徴付け情報は、ハプロタイプフェージング、構造的変異の特定、及びコピー数変異の特定を含み得る。
【００４３】
本明細書に記載される方法及び系の利点は、いくつかの一般的な例に対して記載される。第１の例では、フェーズ化配列変異体は、本明細書に記載される方法及び系を使用して特定及び特徴付けされる。図１は、本明細書に記載される方法により提示されるフェーズ化変異体呼び出しの課題及び解決策を模式的に図示する。示されるように、パネルＩの核酸１０２及び１０４は、異なる染色体、例えば母方及び父方由来の染色体の同じ領域の２つの一倍体配列を表す。各配列は、各一倍体配列を特徴付ける異なる対立遺伝子で、一連の変異体、例えば核酸１０２上に変異体１０６〜１１４及び核酸１０４上に変異体１１６〜１２２を含む。それらの非常に短い配列リードのため、大半の配列決定技術は、同じ一倍体配列上の他の変異体に対して個々の変異体の環境を提供することができない。加えて、それらは個々の分子成分、例えば各一倍体配列を分離しない試料調製技術に依存するため、様々な変異体、例えば変異体が由来する一倍体配列のフェージングを特定することができない。結果として、これらの短いリード技術は、これらの変異体をそれらの発生元の分子に解明することができない。このアプローチによる問題は、パネルＩＩａ及びＩＩＩａに模式的に図示される。簡潔に、パネルＩＩａに示される両方の一倍体配列からのプールされた断片を配列決定して多数の短い配列リード１２４を得、得られた配列１２６がアセンブリングされる（パネルＩＩＩａに示される）。示されるように、パネルＩＩａにおいてより短い配列リードのいずれの相対的なフェージング環境も有しないため、アセンブリングプロセスにおいて２つの異なる一倍体配列との関係では変異体を解明することができないだろう。したがって、パネルＩＩＩａに示される得られたアセンブリは、変異体１０６〜１２２のすべてを含む単一のコンセンサス配列アセンブリ１２６をもたらす。
【００４４】
対照的に、及び図１のパネルＩＩｂに示されるように、本明細書に記載される方法及び系は、上述のアプローチのように、より長い核酸１０２及び１０４をより短い配列可能な断片に分解または分割するが、これらの断片を用いて、それらをそれらの発生元の分子環境に帰属させる能力を維持する。これは、異なる断片がそれらの発生元の分子環境により分類または「区画化」されるパネルＩＩｂに模式的に図示される。本開示の文脈において、この分類は、分子環境を維持する群に断片を物理的に分配すること、ならびにその環境を後に解明することを可能にするためにこれらの断片をタグ付けすることのうちの１つまたはその両方を通して達成され得る。
【００４５】
この分類は、それぞれ、核酸１０２及び１０４からの短い配列リードを表す群１２８及び１３０との関係ではより短い配列リードの割り付けとして模式的に図示される。発生元の配列環境は配列決定プロセスを通して維持されるため、それぞれ、配列１０２及び１０４との関係では様々な変異体１０６〜１１４及び１１６〜１２２の発生元の分子環境の解明、例えばフェージングの際に、その環境を利用することができる。
【００４６】
別の例示的な利点のある用途では、本方法及び系は、短いリード配列技術を使用して一般的に識別不可能である、または識別が少なくとも困難である構造変異体の特徴付けに有用である。
【００４７】
これは、図２において単純な転座事象に関して模式的に図示される。示されるように、ゲノム試料は、転座事象、例えば、配列２０２から配列２０４への遺伝要素２０６の転座を含む核酸を含む。このような転座は、例えば同じまたは異なる領域への異なる染色体間、同じ染色体の異なる領域間での転座を含む、様々な異なる転座の種類のいずれかであってよい。
【００４８】
再び、上記の図１に図示される例のように、従来の配列決定は、パネルＩの配列２０２及び２０４を小さい断片に分解し、パネルＩＩａに示されるように、これらの断片から短い配列リード２０８を生成することにより開始する。これらの配列断片２０８は比較的短いため、転座した配列２０６の環境は、すなわち、同じまたは異なる配列上の変異体の位置に由来するため、アセンブリングプロセス中に簡単に失われる。更に、それらの短いリード長のため、配列アセンブリは、その定義からして、構造的変異を反映しないであろう参照配列の使用を前提とすることが多い。そのため、短い配列リード２０８は、必然的に、転座した配列２０６の適切な位置を無視してアセンブリングされ、代わりに、パネルＩＩＩａに示されるように、非変異体配列２１０及び２１２がアセンブリングされるだろう。
【００４９】
対照的に、本明細書に記載される方法及び系を使用することにより、配列２０２及び２０４から得られる短い配列リードは、より小さい配列断片の元の分子分類を維持する群２１４及び２１６としてパネルＩＩｂに示されるように区画化により提供され、パネルＩＩＩｂに示される配列２１８及び２２０としてのそれらのアセンブリを可能にし、帰属を発生元の配列２０２及び２０４に戻し、パネルＩＩＩｂに図示されるように、正しい配列アセンブリ２１８及び２２０において、転座変異、例えば転座した配列断片２０６ａを特定することを可能にする。
【００５０】
上述のように、本明細書に記載される方法及び系は、より長い核酸の短い配列リードに対する個々の分子環境を提供する。本明細書で使用されるとき、個々の分子環境は、配列リード自体内に含まれず、そのため、一般的に、それらが短い配列リード、例えば約１５０塩基、または対のリードの約３００塩基のリード全体またはその一部に含まれないような特定の配列リードを超えた配列環境、例えば、隣接または近接する配列に対する関係を指す。いくつかの態様では、本方法及び系は、短い配列リードのために長い範囲の配列環境を提供する。そのような長い範囲の環境は、互いの距離が１キロベース（ｋｂ）より長い、５ｋｂより長い、１０ｋｂより長い、１５ｋｂより長い、２０ｋｂより長い、３０ｋｂより長い、４０ｋｂより長い、５０ｋｂより長い、６０ｋｂより長い、７０ｋｂより長い、８０ｋｂより長い、９０ｋｂより長い、もしくは更には１００ｋｂ以上長い範囲内である配列リードに対する所与の配列リードの関係または連結を含む。より長い範囲の個々の分子環境を提供することにより、本明細書に記載される方法及び系は、非常に長い推測分子環境も提供する。本明細書に記載されるように、配列環境は、例えば、短い配列リードを個々のより長い分子または連結した分子のコンティグにマッピングすることからの低分析能の環境、ならびに例えば、個々の分子の連続する決定された配列を有する（このような決定された配列は、１ｋｂより長い、５ｋｂより長い、１０ｋｂより長い、１５ｋｂより長い、２０ｋｂより長い、３０ｋｂより長い、４０ｋｂより長い、５０ｋｂより長い、６０ｋｂより長い、７０ｋｂより長い、８０ｋｂより長い、９０ｋｂより長い、または更には１００ｋｂより長い）、例えば、より長い個々の分子の大部分の長い範囲の配列決定からの高分析能の配列環境を含み得る。配列環境のように、短い配列の、より長い核酸、例えば、個々の長い核酸分子または連結された核酸分子もしくはコンティグの集合体の両方への帰属は、高レベルの配列環境を提供するためにより長い核酸伸長に対して短い配列をマッピングすること、ならびにこれらのより長い核酸を通して短い配列からアセンブリングされた配列を提供することの両方を含み得る。
【００５１】
更に、長い個々の分子に関連する長い範囲の配列環境を利用することができるが、このような長い範囲の配列環境を有することにより、更に長い範囲の配列環境を推測することも可能にする。一例として、上述の長い範囲の分子環境を提供することにより、異なる発生元の分子からの長い配列の中で重複する変異体部分、例えば、フェーズ化変異体、転座された配列などを特定することができ、これらの分子間の推測される連結を可能にする。このような推測される連結または分子環境は、本明細書において「推測コンティグ」と称される。いくつかの場合では、フェーズ化配列の文脈において論じられる場合、推測コンティグは、一般にフェーズ化配列を表す場合があり、例えば重複するフェーズ化変異体に基づく場合、個々の発生元の分子よりも実質的に長い長さのフェーズ化コンティグを推測することができる。これらのフェーズ化コンティグは、本明細書において「フェーズブロック」と称される。
【００５２】
より長い単一分子リードを用いて開始することにより、短いリード配列決定技術またはフェーズ化配列決定に対する他のアプローチを使用してさもなければ達成可能であろうよりも長い推測コンティグまたはフェーズブロックを導くことができる。例えば、公表された米国特許公開第２０１３／０１５７８７０号（その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。特に、本明細書に記載される方法及び系を使用することにより、少なくとも約１０キロベース（ｋｂ）、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂのＮ５０（その長さ以上のすべてのフェーズブロックまたはコンティグの集合体がすべてのコンティグまたはフェーズブロックの長さの合計の少なくとも半分を含有し、その長さ以下のすべてのコンティグまたはフェーズブロックの集合体がすべてのコンティグまたはフェーズブロックの長さの合計の少なくとも半分も含有するコンティグまたはフェーズブロック長）、モード、平均、または中央値を有する推測コンティグまたはフェーズブロック長を得ることができる。いくつかの態様では、推測コンティグまたはフェーズブロック長は、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂのＮ５０、モード、平均、または中央値を有し、いくつかの場合では、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、いくつかの場合では、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約７５０ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、少なくとも約１．７５Ｍｂ、少なくとも約２．５Ｍｂ以上が達成される。また更に他の場合では、少なくとも２０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、７５０ｋｂ、１メガベース（Ｍｂ）、１．７５Ｍｂ、２Ｍｂ、もしくは２．５Ｍｂ、またはそれらを超えた最大推測コンティグまたはフェーズブロック長を得ることができる。また更に他の場合では、推測コンティグまたはフェーズブロック長は、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約４０ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、いくつかの場合では、少なくとも約５００ｋｂ、少なくとも約７５０ｋｂ、少なくとも約１Ｍｂ、いくつかの場合では、少なくとも約１．７５Ｍｂ、少なくとも約２．５Ｍｂ以上であってよい。
【００５３】
一態様では、本明細書に記載される方法及び系は、試料核酸またはその断片の、別個のコンパートメントまたはパーティション（本明細書において互換的にパーティションと称される）への区画化、堆積、または分配を提供し、各パーティションはその自身の内容物を他のパーティションの内容物から分離した状態を維持する。固有の識別子、例えばバーコードは、特徴、例えば核酸配列情報を、特定のコンパートメント内に含まれる試料核酸、具体的にはパーティション内に最初に堆積され得る連続する試料核酸の比較的長い伸長に後に帰属させることを可能にするために、区画化または分配した試料核酸を保持するパーティションに事前に、後に、または同時に送達され得る。
【００５４】
試料核酸は、連続する核酸分子の比較的長い断片または伸長で核酸がパーティションに存在するように分配され得る。これらの断片は、分析される全体的な試料核酸、例えば染色体全体、エクソーム、または他の大きなゲノム断片のいくつかの重複する断片を表し得る。これらの試料核酸は、全ゲノム、個々の染色体、エクソーム、アンプリコン、または様々な異なる関心の核酸のいずれかを含み得る。いくつかの場合では、試料核酸のこれらの断片は、１００塩基よりも長い、５００塩基より長い、１ｋｂより長い、５ｋｂより長い、１０ｋｂより長い、１５ｋｂより長い、２０ｋｂより長い、３０ｋｂより長い、４０ｋｂより長い、５０ｋｂより長い、６０ｋｂより長い、７０ｋｂより長い、８０ｋｂより長い、９０ｋｂより長い、または更には１００ｋｂより長くてよく、これは上述のより長い範囲の分子環境を可能にする。
【００５５】
試料核酸はまた、所与のパーティションが開始試料核酸の２つの重複する断片を含む確率が非常に低いレベルで分配され得る。これは、分配プロセス中、低入力量及び／または濃度で試料核酸を提供することにより達成され得る。結果として、いくつかの場合では、所与のパーティションは、いくつかの長いが重複しない開始試料核酸の断片を含み得る。次に、異なるパーティション中の試料核酸は、固有の識別子と関連し、任意の所与のパーティションに関して、その中に含有される核酸は同じ固有の識別子を有するが、異なるパーティションは異なる固有の識別子を含み得る。更に、分配は、試料成分を非常に少容積のパーティションまたは液滴に割り付けるため、上述のように割り付けを達成するために、高容積プロセス、例えばチューブまたは多重ウェルプレートのウェルに必要とされ得るように、試料の実質的な希釈を行う必要がないことを理解する。更に、本明細書に記載される系は、このような高レベルのバーコード多様性を利用するため、上記に提供されるように、多数のゲノム等価物の中で多様なバーコードを割り付けることができる。特に、前述のように、多重ウェルプレートアプローチ（例えば、米国特許公開第２０１３／００７９２３１号及び第２０１３／０１５７８７０号を参照、それらの全開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）は、百〜数百の異なるバーコード配列を用いて行うのみである可能性があり、バーコードを異なる細胞／核酸に帰属させることを可能にするために、それらの試料の限界希釈プロセスを利用する。そのため、それらは一般的に、約１：１０、及び確実に１：１００をゆうに上回るゲノム：（バーコードの種類）の比率を提供し得る１００細胞よりも大幅に少ない細胞を用いて行う。一方、本明細書に記載される系は、高レベルのバーコード多様性、例えば１０，０００、１００，０００、５００，０００などを超える多様なバーコードの種類のため、約１：５０以下、１：１００以下、１：１０００以下、または更には小さい比率のゲノム：（バーコードの種類）で行うことができ、同時にゲノム当たり大幅に改善されたバーコードの多様性を尚も提供しながら多数のゲノム（例えば、アッセイ当たり約１００ゲノムを超える、アッセイ当たり５００ゲノムを超える、アッセイ当たり１０００ゲノムを超える、または更にはそれ以上）の充填を可能にする。
【００５６】
多くの場合、試料は、分配の前にビーズに放出可能に付加される一組のオリゴヌクレオチドタグと組み合わされる。オリゴヌクレオチドは少なくとも第１及び第２の領域を含み得る。第１の領域は、所与のパーティション内のオリゴヌクレオチドとの関係では、実質的に同じバーコード配列であり得るが、異なるパーティションとの関係では、異なるバーコード配列であり得、大半の場合、そうである。第２の領域は、パーティション内の試料内の核酸をプライムするために使用され得るＮ−ｍｅｒ（例えば、ランダムＮ−ｍｅｒまたは特定の配列を標的とするように設計されたＮ−ｍｅｒのいずれか）であり得る。いくつかの場合では、Ｎ−ｍｅｒが特定の配列を標的とするように設計される場合、特定の染色体（例えば、染色体１、１３、１８、または２１）、または染色体の領域、例えばエクソームもしくは他の標的領域を標的とするように設計され得る。いくつかの場合では、Ｎ−ｍｅｒは、疾患もしくは障害（例えば、癌）に関連する遺伝子または領域など、特定の遺伝子または遺伝領域を標的とするように設計され得る。パーティション内で、増幅反応は、核酸の長さに沿った異なる場所で核酸試料をプライムするために第２のＮ−ｍｅｒを用いて行われ得る。増幅の結果として、各パーティションは、同一またはほぼ同一のバーコードに付加され、各パーティションにおける核酸の重複するより小さい断片を表し得る核酸の増幅された生成物を含有し得る。バーコードは、一組の核酸が同じパーティションに由来し、よって、同じ核酸の鎖に由来する可能性もあることを表すマーカーとして機能し得る。増幅後、核酸は、プールされ、配列決定され、配列決定アルゴリズムを使用して整合される。より短い配列リードは、それらの関連するバーコード配列により、試料核酸の単一の長い断片と整合され、それに帰属され得るため、その配列上の特定された変異体のすべては、単一の発生元の断片及び単一の発生元の染色体に帰属され得る。更に、複数の長い断片にわたって複数の共存変異体を整合することにより、その染色体寄与を更に特徴付けることができる。したがって、特定の遺伝子変異体のフェージングに関する結論がその後導かれ得る。このような情報は、一般的に、同じ核酸鎖または異なる核酸鎖上に存在する特定の組の遺伝子変異体であるハプロタイプの特定に有用であり得る。コピー数変異もこの方法で特定され得る。
【００５７】
記載される方法及び系は、現在の核酸配列決定技術及びそれらの関連する試料調製方法に対して大きな利点を提供する。ハプロタイプフェージング及びコピー数変異データは一般的に、細胞の集団から遺伝物質を抽出するために、生物学的試料（例えば、血液、細胞、または組織試料）がまとめて処理され、それを所与の配列決定技術用に特別に構成される配列決定ライブラリに変換するため、ゲノムＤＮＡを配列決定することにより入手できない。この集団試料処理アプローチの結果として、配列決定データは一般的に、遺伝的情報が同じまたは異なる染色体上に存在するかを決定することが不可能であるフェーズ化されない遺伝子型をもたらす。
【００５８】
遺伝的特徴を特定の染色体に帰属させることが不可能なことに加え、このような集団試料調製及び配列決定方法は、試料中の大部分の構成成分を主に特定及び特徴付けする傾向にもあり、少数の構成成分、例えば、抽出した試料中の全ＤＮＡの数パーセントを構成する１つの染色体によって、または１つもしくは２〜３つの細胞によって、または血流中に循環する断片化された腫瘍細胞ＤＮＡ分子によって寄与される遺伝物質を特定及び特徴付けするように設計されていない。記載される方法及び系は、より大きな試料中に存在する小集団を検出するための大きな利点も提供する。そのため、多くの場合、臨床試料のごく一部しかコピー数変異を有する組織を含有していないため、それらは試料中のコピー数変異を評価するのに有用であり得る。例えば、試料が妊婦からの血液試料である場合、試料のごく一部しか循環無細胞胎児ＤＮＡを含有していないだろう。
【００５９】
本明細書に開示されるバーコード化技法の使用は、所与の組の遺伝マーカーに個々の分子環境を提供する固有の能力を付与する、すなわち、所与の組の遺伝マーカー（単一マーカーとは対照的に）を個々の試料核酸分子に帰属させ、変異体協調アセンブリングを通して、複数の試料核酸分子の中で及び／または特定の染色体に対して広いまたは更には長い範囲の推測される個々の分子環境を提供する。これらの遺伝マーカーは、特定の遺伝子座、例えばＳＮＰなどの変異体を含み得るか、またはそれらは短い配列を含み得る。更に、バーコード化の使用は、試料から抽出した全核酸集団の少数構成成分と多数構成成分とを区別する能力、例えば、血流中の循環腫瘍ＤＮＡの検出及び特徴付けを容易にする更なる利点を付与し、また任意の増幅中の増幅の偏りも減少させるまたは排除する。加えて、マイクロ流体フォーマットでの実施は、非常に小さい試料体積及び低入力量のＤＮＡで作業する能力、ならびにゲノム全体のタグ付けを容易にするために多数の試料パーティション（例えば液滴）を迅速に処理する能力を付与する。
【００６０】
前述のように、本明細書に記載される方法及び系の利点は、普遍的に利用可能な短いリード配列決定技術の使用を通して結果を得ることができることである。このような技術は、十分に特徴付けされ、高度に有効であるプロトコル及び試薬系を用いて容易に利用可能であり、研究団体内に広く普及している利点を有する。これらの短いリード配列決定技術は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（例えば、ＧＸＩＩ、ＮｅｘｔＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ、Ｘ１０）、Ｔｈｅｒｍｏ−ＦｉｓｈｅｒのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ事業部（例えば、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ及びＩｏｎ  ＰＧＭ）、ピロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法、ならびにその他から利用可能なものを含む。
【００６１】
得に利点なのは、本明細書に記載の方法及び系がこれらの短いリード配列決定技術を利用し、それらの関連する低誤差率でそれを行うことである。特に、本明細書に記載される方法及び系は、上述のように個々の分子リード長または環境を得るが、１０００ｂｐより短い、５００ｂｐより短い、３００ｂｐより短い、２００ｂｐより短い、１５０ｂｐより短い、または更に短い個々の配列決定リード（交配対伸長を除く）を用いて、及びこのような個々の分子リード長において５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、または更には０．００１％未満の配列決定誤差率でそれらを得る。
【００６２】
ＩＩ．ワークフローの概要
１つの例示的な態様では、本開示に記載される方法及び系は、個々の試料（例えば核酸）を別個のパーティションに堆積または分配することを提供し、各パーティションはその自身の内容物を他のパーティション中の内容物から分離した状態を維持する。本明細書で使用されるとき、パーティションは、様々な異なる形態、例えばウェル、チューブ、マクロもしくはナノウェル、貫通孔などを含み得る容器または管を指す。しかしながら、いくつかの態様では、パーティションは流体の流れの中で流動性である。これらの管は、例えば内部の流体中心またはコアを包囲する外側バリアを有するマイクロカプセルまたは微小胞から構成され得るか、またはそれらはそのマトリックス内の物質を連行及び／または維持することが可能である多孔質マトリックスであり得る。しかしながら、いくつかの態様では、これらのパーティションは非水性連続相、例えば油相内の水性流体の液滴を含み得る。様々な異なる管は、例えば、２０１３年８月１３日に出願された米国特許出願第１３／９６６，１５０号に説明されている。同様に、非水性または油性連続相中に安定した液滴を作るためのエマルジョン系は、例えば、米国特許公開第２０１０／０１０５１１２号に詳細に説明されており、その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の場合では、マイクロ流体チャネルネットワークが本明細書に記載されるパーティションを生成するのに適している場合がある。このようなマイクロ流体デバイスの例としては、２０１４年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／９７７，８０４号に詳細に説明されているものが挙げられ、その全開示はすべての目的において参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。細胞の水性混合物が非水性流体中に押し出される多孔膜を含む、代替えの機構も個々の細胞の分配に利用され得る。このような系は、例えばＮａｎｏｍｉ，Ｉｎｃ．から一般的に入手可能である。
【００６３】
エマルジョン中の液滴の場合では、試料物質、例えば核酸の、別個のパーティション中への分配は、一般的に、水性の試料含有流を、水性液滴が流動流分配流体内に作られるように、非水性流の分配流体、例えばフッ素化油も流れる連結部に流すことにより達成され得、このような液滴は試料物質を含む。以下に説明されるように、パーティション、例えば液滴は、共分配されたバーコードオリゴヌクレオチドも含み得る。任意の特定のパーティション内の試料物質の相対量は、例えば、水性流中の試料の濃度、水性流及び／または非水性流の流量などを含む、系の様々な異なるパラメータを制御することにより調整され得る。本明細書に記載されるパーティションは、多くの場合、非常に小体積を有することを特徴とする。例えば、液滴系パーティションの場合では、液滴は、１０００ピコリットル（ｐＬ）未満、９００ｐＬ未満、８００ｐＬ未満、７００ｐＬ未満、６００ｐＬ未満、５００ｐＬ未満、４００ｐＬ未満、３００ｐＬ未満、２００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、５０ｐＬ未満、２０ｐＬ未満、１０ｐＬ未満、または更には１ｐＬ未満の総体積を有し得る。ビーズと共分配される場合、パーティション内の試料流体体積は、上述の体積の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または更には上述の体積の１０％未満であり得ることを理解する。いくつかの場合では、低反応体積パーティションの使用は、非常に少量の開始試薬、例えば入力核酸を用いた反応を行う際に有利であり得る。低入力核酸の試料を分析するための方法及び系は、２０１４年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０１７，５８０号に提示されており、その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６４】
試料がそれらのそれぞれのパーティションの中に導入されたら、本明細書に記載される方法及び系により、パーティション内の試料核酸は、一般的に、これらの核酸を特徴付けするときに、それらがそれらのそれぞれの起源に由来するとして帰属され得るように、固有の識別子と共に提供される。したがって、試料核酸は、固有の識別子（例えばバーコード配列）と共分配され得る。いくつかの態様では、固有の識別子は、これらの試料に付加され得る核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの形態で提供される。オリゴヌクレオチドは、所与のパーティションにおけるオリゴヌクレオチドとの関係では、その中に含まれる核酸バーコード配列は同じであるが、異なるパーティションとの関係では、オリゴヌクレオチドは異なるバーコード配列を有し得るように分配される。いくつかの態様では、１つの核酸バーコード配列のみが所与のパーティションと関連し得るが、いくつかの場合では、２つ以上の異なるバーコード配列が存在し得る。
【００６５】
核酸バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの配列内に６〜約２０以上のヌクレオチドを含み得る。これらのヌクレオチドは、完全に連続している、すなわち、隣接したヌクレオチドの単一列であり得るか、またはそれらは１つ以上のヌクレオチドによって分離される２つ以上の別個のサブ配列に分離され得る。いくつかの場合では、分離されたサブ配列は、長さが約４〜約１６のヌクレオチドであり得る。
【００６６】
共分配されたオリゴヌクレオチドは、分配した核酸の処理に有用な他の機能性配列も含み得る。これらの配列は、例えば、パーティション内の個々の核酸からゲノムＤＮＡを増幅するための標的またはランダム／汎用増幅プライマー配列を含む一方で、例えば、配列の存在を特定するため、またはバーコード化された核酸もしくはいくつかの他の潜在的な機能性配列のいずれかをプルダウンするために、関連バーコード配列、配列決定プライマー、ハイブリダイゼーションまたはプローブ配列が付加される。同様に、試料物質と共にオリゴヌクレオチド及び関連バーコードならびに他の機能性配列の共分配は、例えば、２０１４年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日に出願された第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日に出願された米国特許出願第１４／３１６，３８３号、ならびに２０１４年２月７日に出願された米国特許出願第１４／１７５，９３５号に記載されており、それらの全開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００６７】
簡潔に、例示的なプロセスの１つでは、各々がビーズに放出可能に付加される多数の上述のオリゴヌクレオチドを含み得るビーズが提供され、特定のビーズに付加されたオリゴヌクレオチドのすべてが同じ核酸バーコード配列を含み得るが、多数の多様なバーコード配列が使用されるビーズの集団にわたって示され得る。いくつかの場合では、ビーズの集団は、少なくとも１０００の異なるバーコード配列、少なくとも１０，０００の異なるバーコード配列、少なくとも１００，０００の異なるバーコード配列、またはいくつかの場合では、少なくとも１，０００，０００の異なるバーコード配列を含み得る多様なバーコード配列ライブラリを提供し得る。加えて、各ビーズは多数のオリゴヌクレオチド分子が付加されて提供され得る。特に、個々のビーズ上にバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの分子の数は、少なくとも約１０，０００オリゴヌクレオチド、少なくとも１００，０００オリゴヌクレオチド分子、少なくとも１，０００，０００オリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００，０００オリゴヌクレオチド分子、いくつかの場合では、少なくとも１０億のオリゴヌクレオチド分子であり得る。
【００６８】
オリゴヌクレオチドは、ビーズへの特定の刺激を適用するときに、ビーズから放出可能であり得る。いくつかの場合では、刺激は、例えばオリゴヌクレオチドを放出し得る感光性連結の切断を通した光刺激であり得る。いくつかの場合では、熱刺激が使用される場合があり、ビーズ環境の温度の上昇がオリゴヌクレオチドの連結の切断またはビーズからの他の放出をもたらし得る。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドのビーズへの連結を切断するか、ないしは別の方法でビーズからオリゴヌクレオチドの放出をもたらし得る化学刺激が使用され得る。
【００６９】
本明細書に記載される方法及び系によると、付加されたオリゴヌクレオチドを含むビーズは、単一のビーズ及び単一の試料が個々のパーティション内に含有されるように、個々の試料と共分配され得る。いくつかの場合では、単一のビーズパーティションが望ましい場合、流体の相対流量は、占有されるこれらのパーティションが主に単独で占有されることを確実にするために、平均して、パーティションが、パーティション当たり１つのビーズ未満を含有するように制御され得る。同様に、より高いパーセンテージのパーティションが占有されること、例えば占有されていないパーティションが数パーセントのみであることを可能にすることを提供するように流量を制御することを希望してもよい。いくつかの態様では、所望の数の単独占有パーティション、ある特定のレベル未満の占有されないパーティション、及びある特定のレベル未満の複数の占有されたパーティションを確実にするために、流れ及びチャネル構造が制御される。
【００７０】
図３は、コピー数変異またはハプロタイプアッセイに使用するためなど、試料核酸をバーコード化し、続いて配列決定するための例示的な方法を図示する。第１に、核酸を含む試料は供給源から得ることができ３００、一組のバーコード化されたビーズも得ることができる３１０。ビーズは、１つ以上のバーコード配列、ならびにランダムＮ−ｍｅｒまたは他のプライマーなどのプライマーを含有するオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの場合では、バーコード配列は、例えば、バーコードとビーズとの間の連結の切断を通して、もしくはバーコードを放出するために下部のビーズの分解を通して、またはこの２つの組み合わせで、バーコード化されたビーズから放出可能である。例えば、いくつかの態様では、バーコード化されたビーズは、バーコード配列を放出するために、還元剤などの薬剤により分解または溶解され得る。この例において、核酸を含む低量の試料３０５、バーコード化されたビーズ３１５、及びいくつかの場合では、他の試薬、例えば還元剤３２０が組み合わされ、分配を受ける。例として、このような分配は、マイクロ流体デバイス３２５などの液滴生成系に成分を導入することを伴う場合がある。マイクロ流体デバイス３２５の補助により、油中水型エマルジョン３３０が形成され得、エマルジョンは、試料核酸３０５、還元剤３２０、及びバーコード化されたビーズ３１５を含有する水性液滴を含有している。還元剤は、バーコード化されたビーズを溶解または分解し、それにより液滴内のビーズからバーコード及びランダムＮ−ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチドを放出することができる３３５。ランダムＮ−ｍｅｒは次に、試料核酸の異なる領域をプライムし、増幅後に試料の増幅されたコピーをもたらすことができ、各コピーはバーコード配列でタグ付けされている３４０。いくつかの場合では、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮ−ｍｅｒ配列を含有する一組のオリゴヌクレオチドを含有する。続いて、エマルジョンを破壊し３４５、更なる配列（例えば、特定の配列決定法に役立つ配列、追加のバーコードなど）が、例えば増幅法３５０（例えばＰＣＲ）を介して付加され得る。次に、配列決定が実施され得３５５、配列決定データを解釈するためにアルゴリズムが適用される３６０。配列決定アルゴリズムは一般的に、例えば、配列決定リードを整合し、かつ／または特定の配列リードが属する試料を特定するために、バーコードの分析を実施することができる。
【００７１】
上述のように、単一ビーズの占有が所望され得るが、複数の占有されたパーティション、または占有されていないパーティションが多くの場合存在し得ることを理解する。試料及びバーコードオリゴヌクレオチドを含むビーズを共分配するためののマイクロ流体チャネル構造の例が図４に模式的に図示される。示されるように、チャネルのセグメント４０２、４０４、４０６、４０８、及び４１０がチャネル連結部４１２で流体連通で提供される。個々の試料４１４を含む水性流は、チャネル連結部４１２に向かってチャネルセグメント４０２を流れる。本明細書の他の箇所に記載されるように、これらの試料は、分配プロセスの前に水性流体内に懸濁され得る。
【００７２】
同時に、バーコードを保有するビーズ４１６を含む水性流は、チャネル連結部４１２に向かってチャネルセグメント４０４を流れる。非水性分配流体は側方チャネル４０６及び４０８の各々からチャネル連結部４１２内に導入され、組み合わされた流れは、出口チャネル４１０に流れる。チャネル連結部４１２内で、チャネルセグメント４０２及び４０４からの２つの組み合わされた水性流が組み合わされ、共分配された試料４１４及びビーズ４１６を含む液滴４１８内に分配される。前述のように、チャネル連結部４１２で組み合わされる流体の各々の流れ特徴を制御すること、ならびにチャネル連結部の形状を制御することにより、生成されるパーティション４１８内のビーズ、試料、またはその両方の所望の占有レベルを得るために、組み合わせ及び分配を最適化することができる。
【００７３】
理解されるように、例えば、化学刺激、核酸伸長、転写、及び／または増幅試薬（ポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレオシド三リン酸、またはＮＴＰ類似体など）、プライマー配列、ならびに追加の補助因子（このような反応に使用される二価の金属イオンなど）、連結反応試薬（リガーゼ酵素及び連結配列など）、染料、標識、または他の標識化試薬を含む、いくつかの他の試薬が試料及びビーズと共に共分配され得る。
【００７４】
共分配されたら、ビーズに配備されたオリゴヌクレオチドは、分配された試料をバーコード化し、増幅するために使用され得る。試料の増幅及びバーコード化においてこれらのバーコードオリゴヌクレオチドを使用するための例示的なプロセスは、２０１４年２月７日に出願された米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日に出願された第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日に出願された米国特許出願第１４／３１６，３８３号に詳細に記載されており、それらの全開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。簡潔に、一態様では、オリゴヌクレオチドは、試料と共分配され、それらのビーズから試料を有するパーティションの中に放出されるビーズ上に存在する。オリゴヌクレオチドは、バーコード配列と共に、その５’端でプライマー配列を含み得る。このプライマー配列は、試料の多くの異なる領域をランダムにプライムするように意図されたランダムオリゴヌクレオチド配列であるか、または試料の特定の標的領域の上流をプライムすることを標的とする特異的プライマー配列であり得る。
【００７５】
放出されたら、オリゴヌクレオチドのプライマー部分は試料の相補領域にアニールすることができる。試料及びビーズとも共分配される伸長反応試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、補助因子（例えばＭｇ２＋またはＭｎ２＋など）は、次に、テンプレートとして試料を使用してプライマー配列を伸長して、プライマーがアニールされたテンプレートの鎖に対する相補的断片を生成し、相補的断片はオリゴヌクレオチド及びその関連するバーコード配列を含む。複数のプライマーのアニーリング及び試料の異なる部分への伸長は、試料の重複する相補的断片の大きなプールをもたらし得、各々、それが作られたパーティションを示すその自身のバーコード配列を保有する。いくつかの場合では、これらの相補的断片はそれら自体、パーティションに存在するオリゴヌクレオチドによりプライムされたテンプレートとして使用されて、再びバーコード配列を含む相補体の相補体を生成する。いくつかの場合では、この複製プロセスは、最初の相補体が複写されるとき、分子が更なる反復コピーを生成するための基盤となる能力を減少させるヘアピン構造または部分的なヘアピン構造の形成を可能にするために、その終端でまたはその付近で２つの相補的配列を生成するように構成される。この一例の模式図は図５に示される。
【００７６】
図が示すように、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、試料核酸５０４と共に、例えば、エマルジョン中の液滴５０２に共分配される。本明細書の他の箇所に記述されるように、オリゴヌクレオチド５０８は、パネルＡに示されるように、オリゴヌクレオチドがビーズ５０６から放出可能であり得る、試料核酸５０４と共分配されるビーズ５０６上に提供され得る。オリゴヌクレオチド５０８は、１つ以上の機能性配列、例えば、配列５１０、５１４、及び５１６に加えて、バーコード配列５１２を含む。例えば、オリゴヌクレオチド５０８は、バーコード配列５１２、ならびに所与の配列決定系の付加または固定化配列として機能し得る配列５１０、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉｓｅｑまたはＭｉｓｅｑ系のフローセルにおける結合に使用されるＰ５配列を含むように示される。示されるように、オリゴヌクレオチドは、試料核酸５０４の一部の複製をプライムするためのランダムまたは標的Ｎ−ｍｅｒを含み得るプライマー配列５１６も含む。配列決定系における合成反応によるポリメラーゼ媒介テンプレート指向配列決定をプライムするために使用される、「リード１」またはＲ１プライミング領域などの配列決定プライミング領域を提供し得る配列５１４もオリゴヌクレオチド５０８内に含まれる。いくつかの場合では、バーコード配列５１２、固定化配列５１０、及びＲ１配列５１４は、所与のビーズに付加されるオリゴヌクレオチドのすべてに共通してよい。プライマー配列５１６はランダムＮ−ｍｅｒプライマーにより変動し得るか、またはある特定の標的用途により所与のビーズ上のオリゴヌクレオチドに共通し得る。
【００７７】
プライマー配列５１６の存在に基づき、オリゴヌクレオチドは、パネルＢに示されるように試料核酸をプライムすることができ、これは、ビーズ５０６及び試料核酸５０４とも共分割されるポリメラーゼ酵素及び他の伸長試薬を用いてオリゴヌクレオチド５０８及び５０８ａの伸長を可能にする。パネルＣに示されるように、ランダムＮ−ｍｅｒプライマーに関して、試料核酸５０４の複数の異なる領域にアニールするだろうオリゴヌクレオチドの伸長後、複数の重複する相補体または核酸の断片、例えば断片５１８及び５２０が作られる。試料核酸の部分に相補的である配列部分、例えば配列５２２及び５２４を含むが、これらの構築物は一般的に、本明細書において、付加されたバーコード配列を有する試料核酸５０４の断片を含むと称される。理解されるように、上述のようにテンプレート配列の複製部分は、多くの場合、本明細書において、そのテンプレート配列の「断片」と称される。しかしながら、前述にも関わらず、「断片」という用語は、例えば酵素的、化学的、または機械的断片化による配列の所与の分子の実際の断片化など、テンプレート配列の部分を提供する他の機構により作られたものを含む、発生元の核酸配列の部分のいずれの表現、例えばテンプレートまたは試料核酸を包含する。しかしながら、いくつかの態様では、テンプレートまたは試料核酸配列の断片は、根底にある配列またはその相補体の複製された部分を示す場合がある。
【００７８】
バーコード化された核酸断片は、次に、例えば配列分析により特徴付けされるか、またはそれらは、パネルＤに示されるように、プロセスにおいて更に増幅されてよい。例えば、追加のオリゴヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチド５０８ｂもビーズ３０６から放出され、断片５１８及び５２０をプライムし得る。特に、同様に、オリゴヌクレオチド５０８ｂにおけるランダムＮ−ｍｅｒプライマー５１６ｂの存在に基づき（いくつかの場合では、所与のパーティションにおいて他のランダムＮ−ｍｅｒとは異なる場合がある、例えばプライマー配列５１６）、オリゴヌクレオチドは、断片５１８とアニールし、試料核酸配列の一部の重複を含む、配列５２８を含む断片５１８の少なくとも一部に相補体５２６を作るように伸長される。オリゴヌクレオチド５０８ｂの伸長は、断片５１８のオリゴヌクレオチド部分５０８を通して複製されるまで続く。本明細書の他の箇所に記述されるように、及びパネルＤに図示されるように、オリゴヌクレオチドは、例えば断片５１８内に含まれるオリゴヌクレオチド５０８の配列５１６及び５１４を通して複製された後、所望の地点でポリメラーゼによる複製の停止を促すように構成され得る。本明細書に記載されるように、これは、例えば使用されるポリメラーゼ酵素によって処理することが不可能な異なるヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の組み込みを含む、異なる方法によって達成され得る。例えば、これは、非ウラシル耐性ポリメラーゼがその領域の複製を中止するのを妨げるために配列領域５１２内のウラシル含有ヌクレオチドの包含を含み得る。結果として、バーコード配列５１２、付加配列５１０、Ｒ１プライマー領域５１４、及びランダムＮ−ｍｅｒ配列５１６ｂを含む、完全長オリゴヌクレオチド５０８ｂを一端に含む断片５２６が作られる。配列のもう一方の端に、第１のオリゴヌクレオチド５０８のランダムＮ−ｍｅｒに対する相補体５１６’ならびに配列５１４’として示されるＲ１配列のすべてまたは一部に対する相補体が含まれ得る。Ｒ１配列５１４及びその相補体５１４’は、次に、共にハイブリダイズして、部分的ヘアピン構造５２８を形成する。理解されるように、ランダムＮ−ｍｅｒは異なるオリゴヌクレオチドの間で異なるため、これらの配列及びそれらの相補体はヘアピン形成に関与するとは考えられず、例えば、ランダムＮ−ｍｅｒ５１６に対する相補体である配列５１６’はランダムＮ−ｍｅｒ配列５１６ｂに相補的であるとは考えられないだろう。これは、他の用途、例えばＮ−ｍｅｒが所与のパーティション内のオリゴヌクレオチドの中で一般的であろう標的プライマーに関しては、そうではないだろう。
【００７９】
これらの部分的なヘアピン構造を形成することにより、試料配列の第１レベルの重複を更なる複製から除去する、例えばコピーの反復コピーを妨げることを可能にする。部分的なヘアピン構造は、作られた断片、例えば断片５２６の後続処理に有用な構造も提供する。
【００８０】
次に、複数の異なるパーティションからの断片のすべては、本明細書に記載される高処理シーケンサーで配列決定するためにプールされ得る。各断片はその起源のパーティションについてコード化されるため、その断片の配列はバーコードの存在に基づきその起源に帰属し戻すことができる。これは図６に模式的に図示される。一例に示されるように、第１の供給源６００（例えば、個々の染色体、核酸の鎖など）に由来する核酸６０４及び異なる染色体６０２または核酸の鎖に由来する核酸６０６は各々、上述のようにそれら自体のバーコードオリゴヌクレオチドの組と共に分配される。
【００８１】
次に、各パーティション内で、各核酸６０４及び６０６は、第１の断片（複数可）の重複する第２の断片の組、例えば第２の断片の組６０８及び６１０を別個に提供するように処理される。この処理は、特定の第１の断片に由来する第２の断片の各々についても同じであるバーコード配列を有する第２の断も提供する。示されるように、第２の断片組６０８のバーコード配列は「１」と示される一方で、断片組６１０のバーコード配列は「２」と示される。多数の異なる断片組を示差的にバーコード化するために、バーコードの多様なライブラリが使用され得る。しかしながら、異なる第１の断片からの第２の断片組のすべてが異なるバーコード配列でバーコード化される必要はない。いくつかの場合では、複数の異なる第１の断片は同じバーコード配列を含むように同時に処理され得る。本明細書の他の箇所で、多様なバーコードライブラリが詳細に記載される。
【００８２】
次に、例えば断片組６０８及び６１０からのバーコード化された断片は、例えばＩｌｌｕｍｉｎａまたはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．のＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ事業部から入手可能な合成技術による配列を使用して、配列決定のためにプールされ得る。配列決定されたら、配列リード６１２は、少なくとも部分的に含まれるバーコードに基づき、いくつかの場合では、部分的に断片自体の配列に基づき、例えば集められたリード６１４及び６１６に示されるように、それらのそれぞれの断片に帰属され得る。次に、各断片組の帰属された配列リードがアセンブリングされて、各試料断片のアセンブリングされた配列、例えば配列６１８及び６２０を提供し、これは続いてそれらのそれぞれの元の染色体（６００及び６０２）に更に帰属し戻すことができる。ゲノム配列をアセンブリングするための方法及び系は、２０１４年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０１７，５８９号に記載されており、その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、ゲノム配列は、新規アセンブリング及び／または参照に基づくアセンブリングによりアセンブリングされる（例えば参照にマッピングする）。
【００８３】
ＩＩＩ．フェージング及びコピー数アッセイへの方法及び系の適用
本明細書に記載される系及び方法の一態様では、配列についてのフェーズ情報を決定する際に、配列リードをより長い発生元の分子に帰属させる能力が使用される。一例では、２つ以上の特定の遺伝子変異体配列（例えば、対立遺伝子、遺伝マーカー）を明らかにする配列と関連するバーコードが比較されて、その遺伝マーカーの組が試料において同じ染色体または異なる染色体上に存在するか否かが決定される。このようなフェージング情報は、試料においてある特定の標的染色体または遺伝子の相対的コピー数を決定するために使用され得る。記載される方法及び症状の利点は、フェージング及びコピー数情報を決定するために、複数の位置、遺伝子座、変異体などが、それらが由来する個々の染色体または核酸鎖を特定するために使用され得ることである。多くの場合、明細書に記載されるフェージング、ハプロタイプ、及びコピー数変異情報を決定するために、染色体に沿って複数の位置（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、１０００００、または５０００００を超える）が使用される。
【００８４】
例として、上述されるように、本明細書に記載される方法及び系は、上述の分配及び帰属態様により、比較的短い配列リードを提供し得る配列決定技術を利用するにも関わらず、個々の核酸断片、例えば個々の核酸分子から有効な長い配列リードを提供するときに有用であり得る。これらの長い配列リードは単一の開始断片または分子に帰属され得るため、配列における変異体の位置は、同様に、単一分子及び外挿により単一染色体に帰属させることができる。加えて、同じ染色体に由来すると推測され得る整合した配列を提供するために、隣接した断片の整合特徴として任意の所与の断片上の複数の位置を利用することができる。例として、第１の断片が配列決定され得、上述の帰属方法及び系により、その配列上に存在する変異体はすべて単一染色体に帰属され得る。次に、１つの染色体にのみ存在すると決定される複数のこれらの変異体を共有する第２の断片は、同じ染色体に由来すると仮定され、よって、２つの断片のフェーズ化整合を作るために、第１の断片と整合され得る。これを繰り返すことにより、長い範囲のフェーズ情報の特定を可能にする。単一染色体上の変異体の特定は、既知の参照、例えばＨａｐＭａｐ、または例えばさもなければ同一の配列伸長上で異なる変異体を示す、配列決定データの集計のいずれかから得ることができる。
【００８５】
図７はフェーズ化配列決定プロセスの例の模式図を提供する。示されるように、例えば染色体、染色体断片、エクソーム、または他の大きい単一核酸分子などの発生元の核酸７０２は、複数の大きい断片７０４、７０６、７０８に断片化され得る。発生元の核酸７０２は、特定の核酸分子、例えば染色体に特異的であるいくつかの配列変異体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ）を含み得る。本明細書に記載のプロセスによると、発生元の核酸は、関連する配列変異体のサブセットを含む複数の大きい重複する断片７０４、７０６、及び７０８に断片化され得る。次に、本明細書に記載されるように、各断片は分配され、サブ断片に更に断片化され、バーコード化されて、より大きい断片の複数の重複するバーコード化されたサブ断片を提供し、所与のより大きい断片のサブ断片は同じバーコード配列を有する。例えば、バーコード配列「１」及びバーコード配列「２」と関連するサブ断片は、それぞれ、パーティション７１０及び７１２に示される。次に、バーコード化されたサブ断片はプールされ、配列決定され、そして配列決定されたサブ断片がアセンブリングされて、長い断片配列７１４、７１６、及び７１７を提供することができる。長い断片配列７１４、７１６、及び７１７のうちの１つ以上は複数の変異体を含み得る。次に、長い断片配列は、配列７１４、７１６、及び７１７からの重複するフェーズ化変異体情報に基づき更にアセンブリングされて、フェーズ化位置が決定され得るフェーズ化配列７１８を提供する。
【００８６】
フェーズ化位置が決定されたら、様々な方法でその情報を更に利用することができる。例えば、ある特定の障害の遺伝的リスクを評価する、父方対母方の特徴を特定する、異数体を特定する、またはハプロタイプ分析情報を特定する際にフェーズ化変異体の知識を利用することができる。
【００８７】
本明細書に開示される系及び方法のいくつかの態様では、コピー数変異アッセイは、コピー数計数の精度を改善するために、２つ以上のフェーズ化遺伝マーカーの同時検出を使用して実施される。フェージングの情報を利用することにより、複数の遺伝子座に対する、及びハプロタイプにわたるリードの計数のみに基づく素朴な方法による変化と比較してシグナルの相対強度を増加させることができる。加えて、フェージングの情報を利用することにより、位置特異的偏りの正規化、シグナルを実質的に更に高めることを可能にする。コピー数変異（ＣＮＶ）の精度は、配列決定深度、ＣＮＶの長さ、コピーの数など）を含む無数の要因に依存し得る。本明細書に提供される方法及び系は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度でＣＮＶを決定し得る。いくつかの場合では、本明細書に提供される方法及び系は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率でＣＮＶを決定する。同様に、本明細書に提供される方法及び系は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度で２つ以上の遺伝子変異体のフェージング／ハプロタイプ情報を検出し得る。いくつかの場合では、本明細書に提供される方法及び系は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率でフェージングまたはハプロタイプ情報を決定する。本開示は、遺伝子座特異的偏りを取り除く方法も提供し、遺伝子座特異的変化は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、または１００００倍減少される。本明細書に提供される方法及び系は、コピー数の変化が染色体の数または染色体の一部の変化を反映するなど、コピー数の変動を検出するために使用され得る。いくつかの場合では、本明細書に提供される方法及び系は、同じ染色体上に存在する遺伝子のコピー数の変動を検出するために使用され得る。
【００８８】
図８（上のパネル）は、健康な患者のゲノムのサブセットの模式図である。この患者は、示される遺伝子座にヘテロ接合の遺伝子型、及び別個の染色糸上に位置する２つの別個のハプロタイプ（１及び２）８０５、８１０を有する。患者の天然に生じる変異（ＳＮＰまたはインデルなど）は丸として示される。図８は癌８１５を有する患者のゲノムも示す。ある特定の癌はハプロタイプのコピー数の増加と関連する。中央のパネルはハプロタイプ２、８１０の増加を示す。癌は、ハプロタイプ２、８２０の減少を示す図８の下のパネルに示されるように、ハプロタイプの数の減少と関連し得る。通常の配列決定技法は、ハプロタイプコピーのこの減少または増加を正確に決定することができない。図９ａに示されるように、これは一部、患者の血液中の腫瘍寄与ＤＮＡ９１０が全ＤＮＡのごく一部であり、その大部分が正常な組織９０５によって寄与されたＤＮＡであるという事実による。この低濃度の腫瘍ＤＮＡは、通常の配列決定技法を用いたコピー数の不正確な検出をもたらす。図９ｂを参照。コピー変動がない平均深度Ｄ  ９３５での予想される計数のピーク９２０とコピー減少９２５（９４０）及びコピー増加９３０（９４５）のピークにおける差は検出が困難である。任意の所与の個々のマーカーに関して、複製試験におけるコピー数アッセイの結果の分布は、ポアソン分布を近似する方法で正しい答えの周りに分布され得、分布の幅はアッセイにおける様々な偶然誤差源に依存する。所与の試料に関して、コピー数の変化は試料の比較的小さい部分であり得るため、単一遺伝マーカーを監視するための幅広い確率分布は正確な結果を隠す可能性がある。この問題は、図１０に示されるように（左側のパネル）、通常の配列決定技法が一度にハプロタイプの１つの変異体位置のみを検討するという事実による。このような技法を使用することにより、コピー減少１０２５、正常なコピー１０２０、及びコピー増加１０３０を表すピーク間で大幅に重複し得る。本明細書に開示される技法は、ハプロタイプ全体（または一部）の検出を可能にし、分析能を高め、ならびにコピー増加及び減少の検出を改善する。図１０（右側のパネル）。この改善は図１１に模式的に図示され、正常な検出１１００は広がった重複するピークをもたらすが、本明細書の技法１１１０は、より鋭いピーク及び改善されたコピー増加または減少の分析能を高める。２つ以上のフェーズ化遺伝マーカー、特に単一染色体上に共存することが知られ、したがって同期化されたランダムではない様式で、多いまたは少ない数で大概常に現れる可能性があるマーカーの同時監視を使用することにより、予想された結果分布の幅を狭小し、同時に計数の精度を改善する効果を有する。
【００８９】
癌を検出し、診断する際の利点に加えて、本明細書に提供される方法及び系は、胎児異数体を検出するためのより正確で高感度のプロセスも提供する。
【００９０】
胎児異数体は胎児染色体数における異常である。異数体は、一般的に、顕著な身体的及び神経性障害をもたらす。例えば、Ｘ染色体の数の減少はターナー症候群に関与する。染色体番号２１のコピー数の増加はダウン症候群を引き起こす。羊水穿刺または絨毛検査（ＣＶＳ）などの侵襲性試験は流産のリスクにつながる場合があり、母体血液を検査するあまり侵襲性ではない方法がここでは使用される。
【００９１】
本明細書に記載される方法は、胎児異数体を非侵襲的に検出する際に有用であり得る。例示的なプロセスは図１２に示される。異数体ゲノムを有する胎児を妊娠しているリスクにある妊婦が検査される１２００。胎児遺伝物質を含有する母体の血液試料を回収する１２０５。次に、遺伝物質（例えば無細胞核酸）を血液試料から抽出する１２１０。一組のバーコード化されたビーズも得ることができる１２１５。ビーズは、１つ以上のバーコード配列、ならびにランダムＮ−ｍｅｒまたは他のプライマーなどのプライマーを含有するオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの場合では、バーコード配列は、例えば、バーコードとビーズとの間の連結の切断を通して、もしくはバーコードを放出するために下部のビーズの分解を通して、またはこの２つの組み合わせで、バーコード化されたビーズから放出可能である。例えば、いくつかの態様では、バーコード化されたビーズは、バーコード配列を放出するために、還元剤などの薬剤により分解または溶解され得る。この例では、試料１２１０、バーコード化されたビーズ１２２０、及びいくつかの場合では、他の試薬、例えば還元剤が組み合わされ、分配が行われる。例として、このような分配は、マイクロ流体デバイス１２２５などの液滴生成系に成分を導入することを伴う場合がある。マイクロ流体デバイス１２２５の補助により、油中水型エマルジョン１２３０が形成され得、エマルジョンは、試料核酸１２１０、バーコード化されたビーズ１２１５、及びいくつかの場合では、還元剤を含有する水性液滴を含有する。還元剤は、バーコード化されたビーズを溶解または分解し、それにより液滴内のビーズからバーコード及びランダムＮ−ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチドを放出することができる１２３５。ランダムＮ−ｍｅｒは次に、試料核酸の異なる領域をプライムし、増幅後に試料の増幅されたコピーをもたらすことができ、各コピーはバーコード配列でタグ付けされている１２４０。いくつかの場合では、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮ−ｍｅｒ配列を含有する一組のオリゴヌクレオチドを含有する。他の実施形態では、個々の液滴は、固有のバーコード配列を含むか、またはいくつかの場合では、液滴の全集団のある特定の割合は固有の配列を有する。続いて、エマルジョンを破壊し１２４５、更なる配列（例えば、特定の配列決定法に役立つ配列、追加のバーコードなど）が、例えば増幅法（例えばＰＣＲ）を介して付加され得る。次に、配列決定は、任意の好適な種類の配列決定プラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＳＭＲＴ、Ｒｏｃｈｅ  ４５４配列決定  ＳＯＬｉＤ配列決定など）１２５０、及び配列決定データを解釈するために適用されるアルゴリズム１２５５を介して実施される。配列決定アルゴリズムは一般的に、例えば、配列決定リードを整合し、かつ／または特定の配列リードが属する試料を特定するために、バーコードの分析を実施することができる。整合された配列は、付加された固有のバーコードに基づき、それらのそれぞれの遺伝子起源（例えば染色体）に更に帰属させることができる。次に、染色体コピーの数は正常な二��体染色体のものと比較される１２６０。患者は、異なる染色体の任意のコピー数異常及び関連リスク／疾患を通知される１２６５。
【００９２】
フェージング、例えば、遺伝子変異体が関連するか、または異なる染色体上に存在するかの決定は、様々な用途に有用な情報を提供し得る。例として、フェージングは、疾患に関連するゲノムのある特定の転座が存在するかを決定するのに有用である。このような転座の検出は鑑別診断及び処置の修正を可能にする。ゲノムのどの対立遺伝子が関連するかの決定は、遺伝子がどのように受け継がれたかを考慮するのに有用である。
【００９３】
多くの場合、染色体対の各個々の染色体の対立遺伝子のパターンであるハプロタイプを知るために有用であり得る。例えば、１つの染色体上に存在する不活性化突然変異の２つのコピーは、限定的な結果のものであり得るが、２つの染色体間で分散された場合、例えばいずれの染色体も活性遺伝子産物を供給しない場合、大きな作用を有し得る。これらの作用は、例えば疾患のリスクの増加またはある特定の薬剤への応答の欠如で表される場合がある。
【００９４】
ＩＶ．構造的変異の特定／特徴付けへの方法及び系の適用
他の用途では、本明細書に記載される方法及び系は、広範囲の異なる遺伝子構造的変異の特定及び特徴付けに関する長い範囲の分子配列情報を得る際に高度に有用である。上述のように、これらの変異は、挿入、欠失、重複、レトロトランスポゾン、転座、反転、短縦列型反復及び長縦列型反復などを含む、多種多様な異なる変異体事象を含む。これらの構造的変異は、様々な多様な遺伝子疾患と関連すると考えられているため、大きな学術的関心のものである。
【００９５】
これらの変異における関心にも関わらず、これらの構造的変異を特定及び特徴付けする効果的かつ効率的な方法はあまりない。一部、これは、これらの変異が異常な配列セグメントの存在を特徴としないが、代わりに、正常な配列セグメントと考えられるであろう異常配列環境を伴うか、または単純に配列情報が欠落しているためである。それらの比較的短いリード長のため、大半の配列決定技術は、有意な環境、そして特にそれらが生成する配列リードの、例えばそれらのリード長を超えた長い範囲の配列環境を提供できず、よって、アセンブリングプロセスにおいてこれらの変異の特定を失う。これらの変異を特定する際の問題は、多くの分子、例えば複数の染色体が組み合わされて、変異を含む及び変異を含まない両方のゲノム物質を含み得るコンセンサス配列をもたらすこれらの技術の集合アプローチにより更に複雑化される。
【００９６】
しかしながら、ここに記載される方法及び系の文脈において、個々の発生元の核酸分子に帰属される長い範囲の配列情報を導くために短いリード配列決定技術を利用し、よって、これらの個々の分子全体または一部に含有される長い範囲の変異体領域の配列環境を維持することができる。
【００９７】
上述のように本明細書に記載される方法及び系は、個々の発生元の核酸分子に帰属される長い範囲の配列情報を提供し、更に、この長い範囲の配列情報を有する際に、これらのより長い配列情報の比較及び重複を通して更に長い範囲の配列環境を推測することができる。そのような長い範囲の配列情報及び／または推測される配列環境は、利用可能な技法を使用して容易に特定されない多数の構造的変異の特定及び特徴付けを可能にする。
【００９８】
図２に簡潔した様式で図示されるが、図１３Ａ及び１３Ｂは、本明細書に記載される方法及び系を使用して、ある特定の種類の構造的変異を特定するためのより詳細な例示的プロセスを提供する。示されるように、生物のゲノムまたは生物からの組織は、通常、図１３Ａに図示される第１の遺伝子型を含み得、第１の遺伝子１３０４を含む第１の遺伝子領域１３０２は、第２の遺伝子１２０８を含む第２の遺伝子領域１３０６から分離されている。この分離は、例えば同じエクソンにおける異なる領域、同じ染色体上の異なるエクソン、異なる染色体などを含む、遺伝子間の距離の範囲を反映し得る。しかしながら、図１３Ｂに示されるように、変異体配列１３１４において遺伝子融合１３１２として遺伝子１３０４と１３０８との間で遺伝子融合体を作るように遺伝子１３０８が遺伝子領域１３０４に挿入されることが生じた転座事象を反映する遺伝子型が示される。
【００９９】
大きなゲノム構造変異体（大きな反転または転座など）を検出するための現在の方法は、変異体の切断点（例えば、転座した部分が一緒に融合するゲノム遺伝子座）に及ぶリード対に依存する。そのようなリード対が配列決定実験中に観察されることを確実にするために、非常に詳細な配列決定が要求され得る。標的配列決定（エクソーム配列決定など）において、現在の配列決定技術を用いた構造変異体の検出は、切断点が標的指向された領域（例えばエクソン）内でない限り（この可能性はかなり低い）、ほぼ不可能である。
【０１００】
しかしながら、本明細書に記載されるバーコード方法及び系により提供される情報は、構造変異体を検出する能力を大幅に改善することができる。直観的に、切断点の左方及び右方への遺伝子座は、ゲノムＤＮＡの共通の断片上にある傾向にあり、したがって単一のパーティション内に維持され、よって共通のまたは共有のバーコード配列でバーコード化され得る。剪断の確率的性質により、バーコードのこの共有は、配列が切断点から遠くなるにつれて減少する。統計手法を使用して、２つのゲノム遺伝子座間でのバーコードの重複が偶然に予測されるであろうものよりも大幅に大きいかを決定することができる。そのような重複は切断点の存在を示唆する。重要なことは、バーコード情報は、このような情報が利用可能である場合、従来の配列決定（切断点に及ぶリードからの情報など）により提供される情報を補足する。
【０１０１】
本明細書に記載される方法の文脈において、適切な遺伝子領域を含む、生物からのゲノム物質は、上述のように比較的長い断片を含むように断片化される。これは、図１３Ａの非転座遺伝子型に関して図示される。示されるように、それぞれ、遺伝子領域１３０２及び１３０６を含む２つの長い個々の第１の分子断片１３１６及び１３１８が作られる。これらの断片は、それぞれ、パーティション１３２０及び１３２２に別個に分配され、第１の断片の各々は、パーティション内でそれぞれいくつかの第２の断片１３２４及び１３２６に断片化され、この断片化プロセスは、所与のパーティション内の第２の断片のすべてに共通である固有の識別子またはバーコード配列を第２の断片に付加する。タグまたはバーコードは、それぞれ、パーティション１３２０及び１３２２の各々に関して「１」または「２」により示される。結果として、完全に分離した遺伝子１３０４及び１３０８は、異なって分配され、異なってバーコード化される第２の断片群をもたらし得る。
【０１０２】
バーコード化されたら、次に、第２の断片はプールされ、第２の断片の配列ならびにその断片のバーコード配列の両方を提供することができる核酸配列決定プロセスを受けることができる。特定のバーコード、例えば１または２の存在に基づき、次に、第２の断片の配列は、バーコードを各配列に帰属させることにより示されるように、ある特定の発生元の配列、例えば、遺伝子１３０４または１３０８に帰属させることができる。いくつかの場合では、発生元の第１の断片配列を分離するようにバーコード化された第２の断片の配列のマッピングは、転座が生じなかったことを決定するために十分に決定的であり得る。しかしながら、いくつかの場合では、例えば、アセンブリングされた配列１３３０及び１３３２により示されるように、発生元の第１の断片の配列のすべてまたは一部についてアセンブリングされた配列を提供するために、第２の断片の配列をアセンブリングすることができる。
【０１０３】
図１３Ａに示される転座されなかった遺伝子型の例とは対照的に、図１３Ｂは転座含有遺伝子型に適用された同じプロセスの模式図を示す。示されるように、第１の長い核酸断片１３５２は変異体配列１３１４から生成され、転座変異体の少なくとも一部、例えば遺伝子融合体１３１２を含む。次に、第１の断片１３５２は別個のパーティション１３５４に分配される。パーティション１３５４内で、第１の断片１３５２は、同様にパーティション１３５４内のすべての第２の断片１３５６に関して同じである固有のバーコード（バーコード「１」として示される）を含む第２の断片１３５６に更に断片化される。上記のように、第２の断片をプールし、配列決定することにより、第２の断片の根底にある配列ならびにそれらの関連するバーコードを提供する。次に、これらのバーコード化された配列は、それらのそれぞれの遺伝子配列に帰属させることができる。しかしながら、示されるように、両遺伝子は同じバーコード配列を含む帰属された第２の断片の配列を反映し得、それらが同じパーティションに由来することを示し、同じ発生元の分子の可能性があり、遺伝子融合体であることを示す。これは、遺伝子融合体の少なくとも一部も含むが、異なるバーコードで異なるパーティションに処理されるいくつかの重複する第１の断片を提供することにより更に検証され得る。
【０１０４】
いくつかの場合では、もともと分離された遺伝子の各々に帰属する複数の異なるバーコード配列（及びそれらの根底にある断片配列）の存在は、遺伝子融合体または他の転座事象の存在を示し得る。いくつかの場合では、少なくとも２つのバーコード、少なくとも３つの異なるバーコード、少なくとも４つの異なるバーコード、少なくとも５つの異なるバーコード、少なくとも１０の異なるバーコード、少なくとも２０以上の異なるバーコードを、参照配列に基づき分離されたと予想されたであろう２つの遺伝子領域に帰属させることにより、これらの領域を互いに近位に、隣接して配置した、ないしは別の方法で一体化した転座事象の指標を提供し得る。いくつかの場合では、分配される断片のサイズは、変異体の連結を特定することができる感度を示し得る。特に、所与の液滴中の断片の長さが１０ｋｂである場合、その１０ｋｂサイズ範囲内である連結が検出可能であろうことが予想されるだろう。
【０１０５】
同様に、変異体及び野生型構造の両方が同じ１０ｋｂ断片内に入る場合、両方ともおそらく共通のまたは共有のバーコードを通して連結を示すため、その変異体の特定はより困難であろうことが予想されるだろう。そのため、断片サイズの選択は、野生型または変異体としてに関わらず、検出された連結された配列の相対的近接を調整するために使用され得る。しかしながら、一般に、１００塩基超、５００塩基超、１ｋｂ超、１０ｋｂ、２０ｋｂ超、３０ｋｂ超、４０ｋｂ超、５０ｋｂ超、６０ｋｂ超、７０ｋｂ超、８０ｋｂ超、９０ｋｂ超、１００ｋｂ超、２００ｋｂ超、または更にはそれ以上で通常分離される近位配列をもたらす構造変異体は、本明細書において、連結が共有のまたは共通のバーコードにより、及び／または記述されるように、切断点に及ぶ配列データにより示される変異体ゲノムにおけるこれらの連結されない配列セグメント間の連結を特定することにより容易に特定され得る。このような連結は一般的に、これらの連結された配列が５０ｋｂ未満、４０ｋｂ未満、３０ｋｂ未満、２０ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、５００塩基未満、２００塩基未満、または更にはそれ未満でゲノム配列内で分離されるとき、特定可能である。
【０１０６】
いくつかの場合では、通常、例えば、１０ｋｂ超、２０ｋｂ超、３０ｋｂ超、４０ｋｂ超、または５０ｋｂ以上で分離されるであろう、互いに近位に位置付けられた、または連結された２つの配列をもたらす構造的変異は、２つの配列部分に共通のバーコードを含むマッピング可能なバーコード化された配列の総数のパーセンテージにより特定され得る。
【０１０７】
理解されるように、いくつかの場合では、本明細書に記載されるプロセスは、ある特定の配列距離内の配列が、野生型または変異体配列としてに関わらず、単一パーティション内、例えば単一核酸断片として含まれることを確実にすることができる。例えば、共通のまたは重複するバーコード配列が２つの配列にマッピングされたバーコードの総数の１％を超える場合、２つの配列セグメントとの関係では、そして特に通常連結されないであろう２つの配列セグメント、例えば構造的変異との関係では、連結を特定するために使用され得る。いくつかの場合では、共有のまたは共通のバーコードは、ゲノム内の構造的変異を構成する構造連結を特定するために、２つの通常分離された配列に対して合計マッピング可能バーコードの２％超、３％超、４％超、５％超、６％超、７％超、８％超、及びいくつかの場合では、９％超、または更には１０％超であり得る。いくつかの場合では、共有のまたは共通のバーコードは、構造的変異を有しないと知られる対照ゲノムより統計的に有意に大きな割合または数で検出され得る。加えて、第２の配列の断片が、例えば第２の断片１３５８にあるような、変異体配列が「正常な」配列または「切断点」に接触する地点に及ぶ場合、この情報を遺伝子融合体の更なる証拠として使用することができる。
【０１０８】
再び、上記のように、第２の断片の配列をアセンブリングして、アセンブリングされた配列１３６０として示される遺伝子融合体１３１２のアセンブリングされた配列を得ることにより、遺伝子融合体１３１２の構造を更に解明することができる。
【０１０９】
更に、バーコード配列の存在は短い配列をより長い発生元の断片の配列にアセンブリングすることを可能にするが、これらのより長い断片は、異なる重複する発生元の長い断片からアセンブリングされた重複する長い断片から、より長い範囲の配列情報を推測することも可能にする。この得られたアセンブリは、より長い範囲の配列レベルの特定及び遺伝子融合体１３１２の特徴付けを可能にする。
【０１１０】
いくつかの場合では、上述の方法はレトロトランスポゾンの存在の特定に有用である。レトロトランスポゾンは、転写、続いてスプライスしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写、及びゲノムの新しい位置への挿入により作ることができる。よって、これらの構造変異体はイントロンを欠如し、多くの場合、染色体間であるが、そうでなければ多様な特徴を有する。レトロトランスポゾンが遺伝子の機能性コピーを導入する場合、それらは、ヒト及びショウジョウバエのゲノムに報告されているレトロ遺伝子と称される。他の場合では、レトロコピー（ｒｅｔｒｏｃｏｐｉｅｓ）は、全転写産物、特定の転写産物イソ型、または不完全な転写産物を含有し得る。加えて、代替の転写開始部位及びプロモーター配列は時折、転写産物内に存在し、そのためレトロトランスポゾンは時折、下流配列の発現を導く可能性があるゲノムの再挿入領域内にプロモーター配列を導入する。
【０１１１】
縦列重複と異なり、レトロトランスポゾンはエクソンまたはイントロン内の親の遺伝子から遠く離れて挿入される。遺伝子の近くに挿入される場合、レトロトランスポゾンは発現のために局所制御配列を利用することができる。遺伝子の近くに挿入することにより、受入れ遺伝子を不活性化するか、または新しいキメラ転写産物を作ることもできる。レトロトランスポゾン媒介キメラ遺伝子転写産物は、ヒト試料からのＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおいて報告されている。
【０１１２】
レトロトランスポゾンの重要性にも関わらず、それらの検出は、交配対ライブラリからの対合リード補助、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）におけるエクソン−エクソン接合部の発見、またはレトロトランスポゾンキメラのＲＮＡ−Ｓｅｑ認識に依存する直接的なアプローチに限定され得る。これらの方法のすべては、分析を複雑にする偽陽性を有する可能性がある。
【０１１３】
レトロトランスポゾンは、本明細書に記載される系及び方法を使用して全ゲノムライブラリから特定することができ、それらの挿入部位は上記に論じられるバーコードマッピングを使用してマッピングすることができる。例えば、Ｃｅｐｈ  ＮＡ１２８７８ゲノムはＳＫＡ３−ＤＤＸ１０キメラレトロトランスポゾンを有する。ＳＫＡ３イントロン無しの転写産物はＤＤＸ１０のエクソン１０と１１との間に挿入される。更に、ＣＢＸ３−Ｃ１５ＯＲＦ１７レトロトランスポゾンは、本明細書に記載される方法を使用して、ＮＡ１２８７８においても検出することができる。ＣＢＸ３のイソ型２はＣ１５ＯＲＦ１７のエクソン２と３との間に挿入される。このキメラ転写産物は、ＨａｐＭａｐプロジェクト（Ｄ．Ｒ．Ｓｃｈｒｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１３）からのヨーロッパ人ＲＮＡ−Ｓｅｑ試料の２０％において観察されている。
【０１１４】
レトロトランスポゾンは、本明細書に記載される方法及び系を使用して調製された全エクソームライブラリにおいても検出することができる。レトロトランスポゾンはエクソーム標的により容易に富化されるが、イントロンは捕捉中に除去されるため、転座事象とレトロトランスポゾンを区別することは困難であるか、または不可能である。しかしながら、本明細書に記載の系及び方法を使用して、疑われるレトロトランスポゾンのイントロンベイトを導入することにより、全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）ライブラリにおいてレトロトランスポゾンを特定することができる（例えば、２０１４年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／０７２，１６４号も参照、すべての目的において参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。イントロンシグナルの欠如はレトロトランスポゾン構造変異体を示す一方で、イントロンシグナルは転座を示し得る。
【０１１５】
理解されるように、上述の変異を特定及び特徴付ける際により長い範囲の配列環境を使用する能力は、バーコードを変異内の領域にマッピングする、及び／または変異に及ぶことにより、挿入、欠失、レトロトランスポゾン、反転などを含む他の構造的変異の範囲を特定するのに同じように適用可能である。
【０１１６】
Ｖ．コピー数変異から生じる疾患及び障害
本方法及び系は、広範囲の疾患及び障害の診断及び／または検出に対して高度に正確かつ感度が高いアプローチを提供する。コピー数変異と関連する疾患は、例えば、ディジョージ／口蓋心臓顔面症候群（２２ｑ１１．２欠失）、プラダー・ウィリー症候群（１５ｑ１１−ｑ１３欠失）、ウィリアムス・ボイレン症候群（７ｑ１１．２３欠失）、ミラー・ディーカー症候群（ＭＤＬＳ）（１７ｐ１３．３微小欠失）、スミス・マゲニス症候群（ＳＭＳ）（１７ｐ１１．２微小欠失）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）（１７ｑ１１．２微小欠失）、フェラン・マクアーミド症候群（２２ｑ１３欠失）、レット症候群（染色体Ｘｑ２８上のＭＥＣｐ２における機能損失突然変異）、メルツバッハー病（ＰＬＰ１のＣＮＶ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）（染色体５ｑ１３上のテロメアＳＭＮ１のホモ接合体不在）、ポトツキ・ラップスキー症候群（ＰＴＬＳ、染色体１７ｐ．１１．２の重複）を含み得る。ＰＭＰ２２遺伝子の更なるコピーは、シャルコー・マリー・トゥース病ＩＡ型（ＣＭＴ１Ａ）及び圧迫麻痺性遺伝性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）に関連し得る。疾患は、Ｌｕｐｓｋｉ  Ｊ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：Ｓ４３−Ｓ４７に記載される疾患であり得る。
【０１１７】
本明細書に提供される方法及び系は、広範囲の胎児異数体を正確に検出または診断することもできる。多くの場合、本明細書に提供される方法は、試料内の胎児核酸を評価するために、妊婦から採取した試料（例えば血液試料）を分析することを含む。胎児異数体は、例えば、１３番染色体トリソミー（パトー症候群）、１８番染色体トリソミー（エドワーズ症候群）、２１番染色体トリソミー（ダウン症候群）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、１つ以上の染色体のモノソミー（Ｘ染色体モノソミー、ターナー症候群）、Ｘ染色体トリソミー、１つ以上の染色体のトリソミー、１つ以上の染色体のテトラソミーまたはペンタソミー（例えば、ＸＸＸＸ、ＸＸＹＹ、ＸＸＸＹ、ＸＹＹＹ、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、ＸＸＸＹＹ、ＸＹＹＹＹ、及びＸＸＹＹＹ）、三倍体（各染色体が３本、例えばヒトにおいて６９染色体）、四倍体（各染色体が４本、例えばヒトにおいて９２染色体）、及び高次倍数体（ｍｕｌｔｉｐｌｏｉｄｙ）を含み得る。いくつかの実施形態では、異数体は部分異数体であり得る。部分異数体は、例えば、１ｐ３６重複、ｄｕｐ（１７）（ｐ１１．２ｐ１１．２）症候群、ダウン症候群、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ｄｕｐ（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２）症候群、及びネコ眼症候群を含み得る。いくつかの場合では、異常な遺伝子型、例えば胎児遺伝子型は、ネコ鳴き症候群、ウォルフ・ヒルショルン症候群、ウィリアムス・ボイレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、圧迫麻痺性遺伝性ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心臓顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損症、カルマン症候群、線状皮膚欠損を伴う小眼球症、副腎低形成症、グリセロールキナーゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、Ｙ染色体短腕上の精巣決定因子、無精子症（ａ因子）、無精子症（ｂ因子）、無精子症（ｃ因子）、または１ｐ３６欠失などの状態をもたらし得る性または常染色体の１つ以上の欠失による。いくつかの実施形態では、染色体数の減少はＸＯ症候群をもたらす。
【０１１８】
過剰なゲノムＤＮＡコピー数変異は、リ・フラウメニ癌素因症候群とも関連する（Ｓｈｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ  １０５：１１２６４−９）。ＣＮＶは、ＣＨＡＲＧＥ（欠損、心奇形、後鼻孔閉鎖、遅滞、性器、及び耳の異常）を含む奇形症候群、ピータース・プラス症候群（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｐｌｕｓ）、ピット・ホプキンス症候群、及び血小板減少−橈骨欠損症候群と関連する（例えば、Ｒｏｐｅｒｓ  ＨＨ  （２００７）  Ａｍ  Ｊ  ｏｆ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８１：  １９９−２０７を参照）。コピー数変異と癌との関係は、例えば、Ｓｈｌｉｅｎ  Ａ．ａｎｄ  Ｍａｌｋｉｎ  Ｄ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．１（６）：６２に記載されている。コピー数変異は、例えば、自閉症、統合失調症、及び特発性学習障害と関連する。例えば、Ｓｅｂａｔ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：４４５−９；Ｐｉｎｔｏ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．を参照。
【０１１９】
本明細書に記載されるように、本明細書に提供される方法及び系は、異なる種類の癌と関連するＣＮＶを検出するのにも有用である。例えば、本方法及び系は、非小細胞肺癌において増加し得るＥＧＦＲコピー数を検出するために使用され得る。
【０１２０】
本明細書に提供される方法及び系は、病原体（例えば、ウイルス、細菌、微生物、真菌など）からの感染に対する感受性を含む、特定の疾患または障害に対する対象の感受性のレベルを決定するためにも使用され得る。例えば、比較的高レベルのＣＣＬ３Ｌ１がＨＩＶ感染に対する低感受性と関連することを考えれば、本方法は、ＣＣＬ３Ｌ１のコピー数を分析することにより、対象のＨＩＶ感染の感受性を決定するために使用され得る（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：１４３４−１４４０）。別の例では、本方法は、全身性エリテマトーデスに対する患者の感受性を決定するために使用され得る。このような場合、例えば、本方法は、ＦＣＧＲ３Ｂ（ＣＤ１６細胞表面免疫グロブリン受容体）のコピー数を決定するために使用され得、これはこの分子の低コピー数が全身性エリテマトーデスに対する増加した感受性と関連するためである（Ａｉｔｍａｎ  Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：８５１−８５５）。本明細書に提供される方法及び系は、自閉症、統合失調症、特発性学習障害と関連するＣＮＶなど、他の疾患または障害と関連するＣＮＶを検出するためにも使用され得る（Ｋｉｎｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５４（９１９１）：１６７６−８１．）。同様に、本方法及び系は、染色体４ｐ１６のコピー数可変領域の５つの縦列コピーに関連する常染色体優性小耳症を検出するために使用され得る（Ｂａｌｉｋｏｖａ  Ｉ．（２００８）Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．８２：１８１−１８７）。
【０１２１】
ＶＩ．疾患及び障害の検出、診断、及び治療
本明細書に提供される方法及び系は、疾患または障害の検出、診断、及び治療を補助することもできる。いくつかの場合では、方法は、本明細書に記載される系または方法を使用して疾患または障害を検出し、疾患の検出に基づき対象に治療を更に提供することを含む。例えば、癌が検出された場合、対象は、外科的介入により、このような癌を治療するように設計された薬物を投与することにより、ホルモン療法を提供することにより、及び／または放射線もしくはより全身的な化学療法を施すことにより治療され得る。
【０１２２】
多くの場合、本方法及び系は鑑別診断も可能にし、標的療法で患者を治療することを更に含み得る。一般に、疾患または障害（またはその不在）の鑑別診断は、疾患または障害を有する疑いがある対象から得た試料核酸の配列を決定及び特徴付けし、それを、障害または疾患状態の存在（または不在）を示す参照核酸の配列及び／または配列の特徴付けと比較することにより、障害または疾患状態（またはその不在）の指標として試料核酸を更に特徴付けることにより達成され得る。
【０１２３】
参照核酸配列は、疾患または障害の不在を示すゲノム（例えば生殖系列核酸）から得ることができるか、または疾患または障害状態を示すゲノム（例えば、癌核酸、異数体を示す核酸など）から得ることができる。更に、参照核酸配列（例えば、１ｋｂより長い、５ｋｂより長い、１０ｋｂより長い、１５ｋｂより長い、２０ｋｂより長い、３０ｋｂより長い、４０ｋｂより長い、５０ｋｂより長い、６０ｋｂより長い、７０ｋｂより長い、８０ｋｂより長い、９０ｋｂより長い、または更には１００ｋｂより長い長さを有する）は、非限定的な例として、特定の配列の存在（または不在）の決定、特定のハプロタイプの存在（または不在）の決定、１つ以上の遺伝的変異（例えば、構造的変異（例えばコピー数変異、挿入、欠失、転座、反転、レトロトランスポゾン、再編成、反復配列伸長、重複など）、一塩基多型（ＳＮＰ）など）の存在（または不在）の決定、及びこれらの組み合わせを含む、１つ以上の点で特徴付けされ得る。更に、参照配列の任意の好適な種類及び数の配列特徴が、試料核酸の配列を特徴付けるために使用され得る。例えば、参照核酸配列の１つ以上の遺伝的変異（もしくはその欠如）または構造的変異（もしくはその欠如）は、障害または疾患状態の存在（または不在）の指標として参照核酸を特定するための配列記号として使用され得る。利用される参照核酸配列の特徴付けに基づき、試料核酸配列は類似する方法で特徴付けされ、参照核酸配列に類似する形質を表すか否かに基づき、障害または疾患を示す核酸に由来する（または由来しない）として更に特徴付け／特定され得る。いくつかの場合では、試料核酸配列及び／または参照核酸配列の特徴付けならびにそれらの比較は、プログラムされたコンピュータプロセッサの補助により完了し得る。いくつかの場合では、このようなプログラムされたコンピュータプロセッサは、本明細書の他の箇所に記載される例示的なコンピュータ制御システムなどのコンピュータ制御システムに含まれてよい。
【０１２４】
試料核酸は、本明細書の他の箇所に記載される試料供給源及び生物学的試料供給源を含む、任意の好適な供給源から得ることができる。いくつかの場合では、試料核酸は、無細胞核酸を含み得る。いくつかの場合では、試料核酸は、腫瘍核酸（例えば腫瘍ＤＮＡ）を含み得る。いくつかの場合では、試料核酸は、循環腫瘍核酸（例えば循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））を含み得る。循環腫瘍核酸は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）に由来してもよく、かつ／または例えば対象の血液、血漿、他の体液、または組織から得てもよい。
【０１２５】
図２０〜２１は、疾患の検出及び診断の文脈における試料核酸を特徴付けるための例示的な方法を図示する。図２０は、長い範囲の配列環境が、例えば図６に示されるものに類似する方法などで、より短いバーコード化された断片から参照核酸（例えば生殖系列核酸（例えば生殖系列ゲノムＤＮＡ）、特定の障害または疾患状態と関連する核酸）に関して決定され得る例示的な方法を示す。図２０に関して、参照核酸を得ることができ２０００、一組のバーコード化されたビーズも得ることができる２０１０。ビーズは、１つ以上のバーコード配列、ならびにランダムＮ−ｍｅｒまたは他のプライマーなどのプライマーを含有するオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの場合では、バーコード配列は、例えば、バーコードとビーズとの間の連結の切断を通して、もしくはバーコードを放出するために下部のビーズの分解を通して、またはこの２つの組み合わせで、バーコード化されたビーズから放出可能である。例えば、いくつかの態様では、バーコード化されたビーズは、バーコード配列を放出するために、還元剤などの薬剤により分解または溶解され得る。この例では、参照核酸２００５、バーコード化されたビーズ２０１５、及びいくつかの場合では、他の試薬、例えば還元剤２０２０が組み合わされ、分配が行われる。いくつかの場合では、参照核酸２０００は、分配前に断片化されてよく、得られた断片の少なくとも一部はバーコード化のために２００５として分配される。例として、このような分配は、マイクロ流体デバイス２０２５などの液滴生成系に成分を導入することを伴う場合がある。マイクロ流体デバイス２０２５の補助により、油中水型エマルジョン２０３０が形成され得、エマルジョンは、参照核酸２００５、還元剤２０２０、及びバーコード化されたビーズ２０１５を含有する水性液滴を含有している。還元剤は、バーコード化されたビーズを溶解または分解し、それにより液滴内のビーズからバーコード及びランダムＮ−ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチドを放出することができる２０３５。ランダムＮ−ｍｅｒは次に、参照核酸の異なる領域をプライムし、増幅後に参照核酸の増幅されたコピーをもたらすことができ、各コピーはバーコード配列でタグ付けされている２０４０。いくつかの場合では、増幅２０４０は、本明細書の他の箇所に記載されるものと類似する方法によって達成され得、図５に模式的に示される。いくつかの場合では、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮ−ｍｅｒ配列を含有する一組のオリゴヌクレオチドを含有する。続いて、エマルジョンを破壊し２０４５、更なる配列（例えば、特定の配列決定法に役立つ配列、追加のバーコードなど）が、例えば増幅法２０５０（例えばＰＣＲ）を介して付加され得る。次に、配列決定が実施され得２０５５、配列決定データを解釈するためにアルゴリズムが適用される２０６０。いくつかの場合では、配列決定データの解釈２０６０は、参照核酸の少なくとも一部の配列を提供することを含み得る。いくつかの場合では、参照核酸の長い範囲の配列環境は、例えば、参照核酸が疾患状態（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように１つ以上のハプロタイプの決定、１つ以上の構造的変異（例えばコピー数変異、挿入、欠失、転座、反転、再編成、反復配列伸長、重複、レトロトランスポゾン、遺伝子融合体など）の決定、１つ以上のＳＮＰの呼び出しなど）に由来する場合などにおいて得られ、特徴付けされる。いくつかの場合では、変異体は、図７に関して本明細書の他の箇所に記載されるなど、より長い範囲の配列環境を提供するために生成された供給源及び推測コンティグから得た様々な参照核酸について呼び出されてよい。
【０１２６】
図２１は、図２０に示されるように得た参照の２０６０特徴付けから試料核酸配列を特徴付ける例を示す。長い範囲の配列環境は、例えば図６に模式的に示される方法などを介して、本明細書の他の箇所に記載されるように、より短いバーコード化された断片の配列決定から試料核酸に関して得ることができる。図２１に示されるように、核酸試料（例えば循環腫瘍核酸を含む試料）は、障害または疾患（例えば癌）を有する疑いがある対象から得ることができ２１００、一組のバーコード化されたビーズも得ることができる２１１０。ビーズは、１つ以上のバーコード配列、ならびにランダムＮ−ｍｅｒまたは他のプライマーなどのプライマーを含有するオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの場合では、バーコード配列は、例えば、バーコードとビーズとの間の連結の切断を通して、もしくはバーコードを放出するために下部のビーズの分解を通して、またはこの２つの組み合わせで、バーコード化されたビーズから放出可能である。例えば、いくつかの態様では、バーコード化されたビーズは、バーコード配列を放出するために、還元剤などの薬剤により分解または溶解され得る。この例では、試料核酸２１０５、バーコード化されたビーズ２１１５、及びいくつかの場合では、他の試薬、例えば還元剤２１２０が組み合わされ、分配が行われる。いくつかの場合では、胎児試料２１００が分配前に断片化され、得られた断片の少なくとも一部はバーコード化のために２１０５として分配される。例として、このような分配は、マイクロ流体デバイス２１２５などの液滴生成系に成分を導入することを伴う場合がある。マイクロ流体デバイス２１２５の補助により、油中水型エマルジョン２１３０が形成され得、エマルジョンは、試料核酸２１０５、還元剤２１２０、及びバーコード化されたビーズ２１１５を含有する水性液滴を含有している。還元剤は、バーコード化されたビーズを溶解または分解し、それにより液滴内のビーズからバーコード及びランダムＮ−ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチドを放出することができる２１３５。ランダムＮ−ｍｅｒは次に、試料核酸の異なる領域をプライムし、増幅後に試料核酸の増幅されたコピーをもたらすことができ、各コピーはバーコード配列でタグ付けされている２１４０。いくつかの場合では、増幅２１４０は、本明細書の他の箇所に記載されるものと類似する方法によって達成され得、図５に模式的に示される。いくつかの場合では、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮ−ｍｅｒ配列を含有する一組のオリゴヌクレオチドを含有する。続いて、エマルジョンを破壊し２１４５、更なる配列（例えば、特定の配列決定法に役立つ配列、追加のバーコードなど）が、例えば増幅法２１５０（例えばＰＣＲ）を介して付加され得る。次に、配列決定が実施され得２１５５、配列決定データを解釈するためにアルゴリズムが適用される２１６０。いくつかの場合では、配列決定データの解釈２１６０は、試料核酸の配列を提供することを含み得る。いくつかの場合では、核酸試料の長い範囲の配列環境が得られる。試料核酸配列は、参照核酸配列の特徴付け２０６０を使用して、特徴付けされ得る２１６０（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように１つ以上のハプロタイプの決定、１つ以上の構造的変異（例えば、コピー数変異、挿入、欠失、転座、反転、再編成、反復配列伸長、重複、レトロトランスポゾン、遺伝子融合体など）の決定。試料核酸配列及びその特徴付けの、参照核酸の配列及び特徴付けとの比較に基づき、障害または疾患状態の存在（または不在）に関する鑑別診断２１７０を行うことができる。
【０１２７】
理解されるように、参照核酸及び試料核酸の分析は別個の分配分析として完了することができるか、または単一の分配分析の一部として完了することができる。例えば、図２０及び２１に従って、試料及び参照核酸は、同じデバイスに添加され、バーコード化された試料及び参照断片は液滴において生成され、エマルジョンは両種類の核酸の液滴を含んでいる。次に、本明細書の他の箇所に記載されるように、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物がプールされ、更に処理され（例えばＰＣＲを介した追加の配列のバルク添加）、配列決定され得る。バーコード化された断片からの個々の配列決定リードは、バーコード配列を介してそれらのそれぞれの試料配列に帰属され得る。試料核酸から得た配列は、参照核酸配列の特徴付けに基づき特徴付けされ得る。
【０１２８】
本明細書の方法及び系を利用することにより、本明細書に記載されるように、参照及び試料核酸配列の長い範囲の配列環境を含む、核酸の長い範囲の配列環境を決定する際の精度を改善することができる。本明細書に提供される方法及び系は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度で参照及び／または試料核酸の長い範囲の配列環境を決定することができる。いくつかの場合では、本明細書に提供される方法及び系は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率で参照及び／または試料核酸の長い範囲の配列環境を決定することができる。
【０１２９】
更に、本明細書の方法及び系は、１つ以上の態様において、参照核酸配列及び／または試料核酸配列を特徴付ける（例えば、配列の決定、１つ以上の遺伝的変異の決定、ハプロタイプの決定など）際の精度も改善することができる。したがって、本明細書に提供される方法及び系は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度で、１つ以上の態様において、参照核酸配列及び／または試料核酸配列を特徴付けることができる。いくつかの場合では、本明細書に提供される方法及び系は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率で、１つ以上の態様において、参照核酸配列及び／または試料核酸配列を特徴付けることができる。
【０１３０】
更に、上記に論じられるように、参照核酸の長い範囲の配列環境及びその特徴付けを決定する際の改善された精度は、試料核酸の配列決定及び特徴付け、ならびに後続の障害または疾患の鑑別診断における使用における改善された精度をもたらし得る。したがって、試料核酸配列（長い範囲の配列環境を含む）は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率で、参照核酸配列の分析から提供され得る。いくつかの場合では、試料核酸配列は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度で、参照核酸の配列と比較し、かつ／またはその配列を特徴付けることにより、障害または疾患（またはその不在）の鑑別診断に使用され得る。いくつかの場合では、試料核酸配列は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率で、参照核酸の配列と比較し、かつ／またはその配列を特徴付けることにより、障害または疾患（またはその不在）の鑑別診断に使用され得る。
【０１３１】
例において、本方法及び系は、肺癌がＥＧＦＲ遺伝子の変異と関連する非小細胞肺癌であるかを決定するために、肺癌の患者におけるコピー数変異を検出するために使用され得る。このような診断後、患者の治療レジメンは、鑑別診断と相関するように洗練され得る。標的療法または分子による標的療法は、癌の主な医療行為の様式（薬物療法）のうちの１つであり、他はホルモン療法及び細胞毒性化学療法である。標的療法は、すべての迅速に分裂する細胞に単純に干渉するよりも（例えば従来の化学療法）、むしろ発癌及び腫瘍成長に必要とされる特定の標的分子に干渉することにより癌細胞の成長を遮断する。
【０１３２】
図１４は、非小細胞肺癌を鑑別診断するための例示的なプロセスを示す。慢性咳、体重減少、及び息切れを有する患者が肺癌について検査される１４００。血液を患者から得１４０５、試料（例えば、循環腫瘍細胞、無細胞ＤＮＡ、循環核酸（例えば、循環腫瘍核酸）など）は血液に由来する１４１０。一組のバーコード化されたビーズも得ることができる１４１５。ビーズは、１つ以上のバーコード配列、ならびにランダムＮ−ｍｅｒまたは他のプライマーなどのプライマーを含有するオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの場合では、バーコード配列は、例えば、バーコードとビーズとの間の連結の切断を通して、もしくはバーコードを放出するために下部のビーズの分解を通して、またはこの２つの組み合わせで、バーコード化されたビーズから放出可能である。例えば、いくつかの態様では、バーコード化されたビーズは、バーコード配列を放出するために、還元剤などの薬剤により分解または溶解され得る。この例では、試料１４１０、バーコード化されたビーズ１４２０、及びいくつかの場合では、他の試薬、例えば還元剤が組み合わされ、分配が行われる。例として、このような分配は、マイクロ流体デバイス１４２５などの液滴生成系に成分を導入することを伴う場合がある。マイクロ流体デバイス１４２５の補助により、油中水型エマルジョン１４３０が形成され得、エマルジョンは、試料核酸１４１０、バーコード化されたビーズ１４１５、及びいくつかの場合では、還元剤を含有する水性液滴を含有している。還元剤は、バーコード化されたビーズを溶解または分解し、それにより液滴内のビーズからバーコード及びランダムＮ−ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチドを放出することができる１４３５。ランダムＮ−ｍｅｒは次に、試料核酸の異なる領域をプライムし、増幅後に試料の増幅されたコピーをもたらすことができ、各コピーはバーコード配列でタグ付けされている１４４０。いくつかの場合では、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮ−ｍｅｒ配列を含有する一組のオリゴヌクレオチドを含有する。続いて、エマルジョンを破壊し１４４５、更なる配列（例えば、特定の配列決定法に役立つ配列、追加のバーコードなど）が、例えば増幅法（例えばＰＣＲ）を介して付加され得る。次に、配列決定が実施され得１４５０、配列決定データを解釈するためにアルゴリズムが適用される１４５５。配列決定アルゴリズムは一般的に、例えば、配列決定リードを整合し、かつ／または特定の配列リードが属する試料を特定するために、バーコードの分析を実施することができる。
【０１３３】
次に、異なる遺伝子のＣＮＶを決定するために、分析した配列を既知のゲノム参照配列と比較する１４６０。ＤＮＡにおけるＥＧＦＲコピー数が通常より高い場合、患者は、小細胞肺癌の代わりに非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と鑑別診断され得る１４６５。非小細胞肺癌のＣＴＣは小細胞肺癌と更に区別され得る他のコピー数変異も有する。癌の病期により、外科手術、化学療法、または放射線療法が処方される１４７０。いくつかの場合では、ＮＳＬＣと診断された患者は、ＡＬＫ阻害剤（例えばクリゾチニブ）などの、このような癌を標的とする薬物を投与される。ＥＧＦＲにおける変異のいくつかの場合では、患者は、セツキシマブ、パニツムマブ、ラパチニブ、及び／またはカペシタビンを投与される。異なる状況では、標的はＥＲＢＢ２などの異なる遺伝子であってよく、療法はトラスツズマブ（ハーセプチン）を含む。（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ４６６：３６８−７２；Ｃｏｏｋ  Ｅ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｅｒ  Ｓ．Ｗ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：９１９−９２３。
【０１３４】
標的療法の主なカテゴリーは、小分子、小分子薬物複合体、及びモノクローナル抗体である。小分子は、メシル酸イマチニブ（グリベック、ＳＴＩ−５７１としても知られる）（慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、及び一部の他の種類の癌に認可されている）、ゲフィチニブ（イレッサ、ＺＤ１８３９としても知られる）（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼを標的とし、小細胞肺癌に対して米国で認可されている）、エルロチニブ（タルセバとして販売されている）、ボルテゾミブ（ベルケイド）（タンパク質に干渉することにより癌細胞に細胞死を起こさせるアポトーシス誘導プロテアソーム阻害剤薬物である）、タモキシフェン、ＪＡＫ阻害剤（例えばトファシチニブ）、ＡＬＫ阻害剤（例えばクリゾチニブ）、Ｂｃｌ−２阻害剤（例えば臨床試験中のオバトクラックス、ＡＢＴ−２６３、及びゴシポール）、ＰＡＲＰ阻害剤（例えばイニパリブ、臨床試験中のオラパリブ）、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば第ＩＩＩ相試験中のペリホシン）、アパチニブ（選択的ＶＥＧＦ受容体２阻害剤である）、［Ｄ−Ｌｙｓ（６）］−ＬＨＲＨに連結されたＡＮ−１５２（ＡＥＺＳ−１０８）ドキソルビシン、Ｂｒａｆ阻害剤（ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ＬＧＸ８１８）（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を保有する転移性黒色腫を治療するために使用される）、ＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ、ＭＥＫ１６２）、ＣＤＫ阻害剤、例えばＤ−０３３２９９１、臨床試験中のＬＥＥ０１１、Ｈｓｐ９０阻害剤、及びサリノマイシンなどのチロシン−キナーゼ阻害剤を含み得る。
【０１３５】
他の療法は、葉酸受容体を標的とする小分子の小分子薬物複合体であるビンタフォリドなどの小分子薬物複合体を含む。
モノクローナル抗体は本明細書に提供される方法の一部として投与され得る別の種類の療法である。モノクローナル薬物複合体も投与され得る。例示的なモノクローナル抗体は、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａまたはリツキサンとして販売されている）（Ｂ細胞上に見られるＣＤ２０を標的とし、非ホジキンリンパ腫を標的とする）、トラスツズマブ（ハーセプチン）（一部の種類の乳癌に発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２としても知られる）受容体を標的とする）、セツキシマブ（アービタックスとして販売されている）、及びパニツムマブ、ベバシズマブ（アバスチンとして販売されている）（ＶＥＧＦリガンドを標的とする）を含む。
【０１３６】
ＶＩＩ．親の核酸からの胎児核酸の特徴付け
本明細書の他の箇所に記述されるように、本明細書に記載される方法及び系は、対象の血液または血漿内の循環核酸を特徴付けするためにも使用され得る。このような分析は、患者における潜在的な疾患状態の特定に使用するための循環腫瘍ＤＮＡ、または非侵襲的な方法で、例えば羊水穿刺または他の侵襲性手順を通した直接試料採取に頼ることなく胎児ＤＮＡを特徴付けるために、妊娠している女性の血液または血漿内の循環胎児ＤＮＡの分析を含む。
【０１３７】
いくつかの場合では、本方法は、少なくとも部分的に親の核酸配列の分析に基づき、胎児核酸配列、例えば、循環胎児ＤＮＡを特徴付けるために使用され得る。例えば、長い範囲の配列環境は、本明細書に記載される方法及び系を使用して、より短いバーコード化された断片から父方及び母方の両方の核酸（例えば、１ｋｂより長い、５ｋｂより長い、１０ｋｂより長い、１５ｋｂより長い、２０ｋｂより長い、３０ｋｂより長い、４０ｋｂより長い、５０ｋｂより長い、６０ｋｂより長い、７０ｋｂより長い、８０ｋｂより長い、９０ｋｂより長い、または更には１００ｋｂより長い長さを有する）に関して決定され得る。長い範囲の配列環境は、父方及び母方核酸配列の両方における一塩基多型（ＳＮＰ）、構造的変異（例えば、コピー数変異、挿入、欠失、転座、反転、再編成、反復配列伸長、レトロトランスポゾン、重複、遺伝子融合など）を含む、１つ以上のハプロタイプ及び１つ以上の遺伝的変異を決定するために使用され得る。更に、父方及び母方核酸の長い範囲の配列環境ならびに任意の決定されたＳＮＰ、ハプロタイプ、及び／または構造的変異情報は、妊娠中の母親から得た胎児核酸（例えば、例えば無細胞胎児核酸などの循環胎児核酸）の配列を特徴付けるために使用され得る。いくつかの場合では、母方及び父方の配列との比較及び特徴付けによる胎児核酸の特徴付けは、プログラムされたコンピュータプロセッサの補助により完了することができる。いくつかの場合では、このようなプログラムされたコンピュータプロセッサは、本明細書の他の箇所に記載される例示的なコンピュータ制御システムなどのコンピュータ制御システムに含まれてよい。
【０１３８】
例えば、親及び／もしくは母方核酸の配列ならびに／または長い範囲の配列環境は、胎児核酸配列を含む胎児核酸を特徴付けることにより参照として使用され得る。実際、本明細書に記載される方法及び系により得られた長い範囲の配列環境は、胎児核酸配列が特徴付けされ得る父方及び母方核酸に関する改善された長い範囲の配列環境情報を提供し得る。いくつかの場合では、参照としての親の核酸からの胎児核酸配列の特徴付けは、胎児核酸の配列において、胎児核酸の少なくとも一部の配列を決定する、かつ／または胎児核酸配列の１つ以上のＳＮＰを呼び出す、胎児核酸配列の１つ以上の新しい突然変異を決定する、胎児核酸配列の１つ以上のハプロタイプを決定する、ならびに／または１つ以上の構造的変異を決定及び特徴付けるなどを含み得る。
【０１３９】
図１７〜１９は、より短いバーコード化された断片の配列決定を介して、父方及び母方核酸に関して得られたより長い範囲の配列環境から胎児核酸を特徴付けるための例示的な方法を図示する。図１７は、例えば、図６に示されるものに類似する方法などで、より短いバーコード化された断片からより長い範囲の配列環境が父方核酸試料（例えば、父方のゲノムＤＮＡ）に関して決定され得る例示的な方法を示す。図１７に関して、父方核酸を含む試料は胎児の父親から得ることができ１７００、一組のバーコード化されたビーズも得ることができる１７１０。ビーズは、１つ以上のバーコード配列、ならびにランダムＮ−ｍｅｒまたは他のプライマーなどのプライマーを含有するオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの場合では、バーコード配列は、例えば、バーコードとビーズとの間の連結の切断を通して、もしくはバーコードを放出するために下部のビーズの分解を通して、またはこの２つの組み合わせで、バーコード化されたビーズから放出可能である。例えば、いくつかの態様では、バーコード化されたビーズは、バーコード配列を放出するために、還元剤などの薬剤により分解または溶解され得る。この例では、核酸を含む父方の試料１７０５、バーコード化されたビーズ１７１５、及びいくつかの場合では、他の試薬、例えば還元剤１７２０が組み合わされ、分配が行われる。いくつかの場合では、父方の試料１７００は分配前に断片化され、得られた断片の少なくとも一部はバーコード化のために１７０５として分配される。例として、このような分配は、マイクロ流体デバイス１７２５などの液滴生成系に成分を導入することを伴う場合がある。マイクロ流体デバイス１７２５の補助により、油中水型エマルジョン１７３０が形成され得、エマルジョンは、父方の試料核酸１７０５、還元剤１７２０、及びバーコード化されたビーズ１７１５を含有する水性液滴を含有している。還元剤は、バーコード化されたビーズを溶解または分解し、それにより液滴内のビーズからバーコード及びランダムＮ−ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチドを放出することができる１７３５。ランダムＮ−ｍｅｒは次に、父方の試料核酸の異なる領域をプライムし、増幅後に父方試料の増幅されたコピーをもたらすことができ、各コピーはバーコード配列でタグ付けされている１７４０。いくつかの場合では、増幅１７４０は、本明細書の他の箇所に記載されるものと類似する方法によって達成され得、図５に模式的に示される。いくつかの場合では、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮ−ｍｅｒ配列を含有する一組のオリゴヌクレオチドを含有する。続いて、エマルジョンを破壊し１７４５、更なる配列（例えば、特定の配列決定法に役立つ配列、追加のバーコードなど）が、例えば増幅法１７５０（例えばＰＣＲ）を介して付加され得る。次に、配列決定が実施され得１７５５、配列決定データを解釈するためにアルゴリズムが適用される１７６０。いくつかの場合では、例えば、配列決定データの解釈１７６０は、父方核酸の少なくとも一部の配列を提供することを含み得る。いくつかの場合では、父方核酸試料の長い範囲の配列環境が得られ、特徴付けされ得る（例えば、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上のハプロタイプの決定、１つ以上の構造的変異（例えば、コピー数変異、挿入、欠失、転座、反転、再編成、反復配列伸長、重複、レトロトランスポゾン、遺伝子融合など）の決定、１つ以上のＳＮＰの呼び出し、１つ以上の他の遺伝的変異の決定など）。いくつかの場合では、変異体は、図７に関して本明細書の他の箇所に記載されるなど、より長い範囲の配列環境を提供するために生成された様々な父方核酸及び推測コンティグにいついて呼び出されてよい。
【０１４０】
図１８は、例えば、図６に示されるものに類似する方法などで、より短いバーコード化された断片から長い範囲の配列環境が母方核酸試料（例えば、母方のゲノムＤＮＡ）に関して決定され得る例示的な方法を示す。図１８に関して、母方核酸を含む試料は胎児の妊娠中の母親から得ることができ１８００、一組のバーコード化されたビーズも得ることができる１８１０。ビーズは、１つ以上のバーコード配列、ならびにランダムＮ−ｍｅｒまたは他のプライマーなどのプライマーを含有するオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの場合では、バーコード配列は、例えば、バーコードとビーズとの間の連結の切断を通して、もしくはバーコードを放出するために下部のビーズの分解を通して、またはこの２つの組み合わせで、バーコード化されたビーズから放出可能である。例えば、いくつかの態様では、バーコード化されたビーズは、バーコード配列を放出するために、還元剤などの薬剤により分解または溶解され得る。この例では、核酸を含む母方の試料１８０５、バーコード化されたビーズ１８１５、及びいくつかの場合では、他の試薬、例えば還元剤１８２０が組み合わされ、分配が行われる。いくつかの場合では、母方の試料１８００は分配前に断片化され、得られた断片の少なくとも一部はバーコード化のために１８０５として分配される。例として、このような分配は、マイクロ流体デバイス１８２５などの液滴生成系に成分を導入することを伴う場合がある。マイクロ流体デバイス１８２５の補助により、油中水型エマルジョン１８３０が形成され得、エマルジョンは、母方の試料核酸１８０５、還元剤１８２０、及びバーコード化されたビーズ１８１５を含有する水性液滴を含有している。還元剤は、バーコード化されたビーズを溶解または分解し、それにより液滴内のビーズからバーコード及びランダムＮ−ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチドを放出することができる１８３５。ランダムＮ−ｍｅｒは次に、母方の試料核酸の異なる領域をプライムし、増幅後に母方試料の増幅されたコピーをもたらすことができ、各コピーはバーコード配列でタグ付けされている１８４０。いくつかの場合では、増幅１８４０は、本明細書の他の箇所に記載されるものと類似する方法によって達成され得、図５に模式的に示される。いくつかの場合では、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮ−ｍｅｒ配列を含有する一組のオリゴヌクレオチドを含有する。続いて、エマルジョンを破壊し１８４５、更なる配列（例えば、特定の配列決定法に役立つ配列、追加のバーコードなど）が、例えば増幅法１８５０（例えばＰＣＲ）を介して付加され得る。次に、配列決定が実施され得１８５５、配列決定データを解釈するためにアルゴリズムが適用される１８６０。いくつかの場合では、例えば、配列決定データの解釈１８６０は、母方核酸の少なくとも一部の配列を提供することを含み得る。いくつかの場合では、母方核酸試料の長い範囲の配列環境が得られ、特徴付けされ得る（例えば、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上のハプロタイプの決定、１つ以上の構造的変異（例えば、コピー数変異、挿入、欠失、転座、反転、再編成、反復配列伸長、重複、レトロトランスポゾン、遺伝子融合など）の決定、１つ以上のＳＮＰの呼び出し、１つ以上の他の遺伝的変異の決定など。いくつかの場合では、変異体は、図７に関して本明細書の他の箇所に記載されるなど、より長い範囲の配列環境を提供するために生成された試料及び推測コンティグから得た様々な母方核酸について呼び出されてよい。
【０１４１】
図１９は、それぞれ、図１７及び図１８に示されるように得た父方１７６０及び母方１８６０の特徴付けから胎児試料配列を特徴付ける例を示す。図１９に示されるように、胎児核酸試料は、妊娠中の母親から得ることができる１９００。長い範囲の配列環境は、例えば図６に模式的に示される方法などを介して、本明細書の他の箇所に記載されるように、より短いバーコード化された断片の配列決定から胎児核酸について得ることができる。いくつかの場合では、胎児核酸試料は、例えば妊娠中の母親の血液、血漿、他の体液、または組織から得ることができる循環胎児ＤＮＡ及び／または無細胞ＤＮＡであってよい。一組のバーコード化されたビーズも得ることができる１９１０。ビーズは、１つ以上のバーコード配列、ならびにランダムＮ−ｍｅｒまたは他のプライマーなどのプライマーを含有するオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの場合では、バーコード配列は、例えば、バーコードとビーズとの間の連結の切断を通して、もしくはバーコードを放出するために下部のビーズの分解を通して、またはこの２つの組み合わせで、バーコード化されたビーズから放出可能である。例えば、いくつかの態様では、バーコード化されたビーズは、バーコード配列を放出するために、還元剤などの薬剤により分解または溶解され得る。この例では、核酸を含む胎児試料１９０５、バーコード化されたビーズ１９１５、及びいくつかの場合では、他の試薬、例えば還元剤１９２０が組み合わされ、１９０５として分配が行われる。いくつかの場合では、胎児試料１９００は分配前に断片化され、得られた断片の少なくとも一部はバーコード化のために１９０５として分配される。例として、このような分配は、マイクロ流体デバイス１９２５などの液滴生成系に成分を導入することを伴う場合がある。マイクロ流体デバイス１９２５の補助により、油中水型エマルジョン１９３０が形成され得、エマルジョンは、母方の試料核酸１９０５、還元剤１９２０、及びバーコード化されたビーズ１９１５を含有する水性液滴を含有している。還元剤は、バーコード化されたビーズを溶解または分解し、それにより液滴内のビーズからバーコード及びランダムＮ−ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチドを放出することができる１９３５。ランダムＮ−ｍｅｒは次に、胎児試料核酸の異なる領域をプライムし、増幅後に胎児試料の増幅されたコピーをもたらすことができ、各コピーはバーコード配列でタグ付けされている１９４０。いくつかの場合では、増幅１９４０は、本明細書の他の箇所に記載されるものと類似する方法によって達成され得、図５に模式的に示される。いくつかの場合では、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮ−ｍｅｒ配列を含有する一組のオリゴヌクレオチドを含有する。続いて、エマルジョンを破壊し１９４５、更なる配列（例えば、特定の配列決定法に役立つ配列、追加のバーコードなど）が、例えば増幅法１９５０（例えばＰＣＲ）を介して付加され得る。次に、配列決定が実施され得１９５５、配列決定データを解釈するためにアルゴリズムが適用される１９６０。一般に、胎児核酸試料のより長い範囲の配列環境は、配列決定されるより短いバーコード化された断片から得ることができる。いくつかの場合では、例えば、配列決定データの解釈１９６０は、胎児核酸の少なくとも一部の配列を提供することを含み得る。胎児核酸配列は、長い範囲の配列環境ならびに／または父方１７６０及び母方１８６０試料の特徴付けを使用して、特徴付けされ得る１９６０（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように１つ以上のハプロタイプの決定、１つ以上の構造的変異（例えば、コピー数変異、挿入、欠失、転座、反転、再編成、反復配列伸長、重複、レトロトランスポゾン、遺伝子融合体など）の決定、１つ以上の新しい突然変異の決定、１つ以上のＳＮＰの呼び出しなど）。いくつかの場合では、胎児核酸のフェーズブロックは、胎児核酸配列を母方及び父方のフェーズブロックと比較することにより決定され得る。
【０１４２】
理解されるように、父方核酸、母方核酸、及び／または胎児核酸の分析は、別個の分配分析の一部として完了することができるか、または１つ以上の組み合わされた分配分析の一部として完了することができる。例えば、図１７〜１９に従って、父方、母方、及び胎児の核酸は、同じデバイスに添加され、バーコード化された父方、母方、及び胎児の断片は液滴において生成され、エマルジョンは３つの種類の核酸の液滴を含んでいる。次に、本明細書の他の箇所に記載されるように、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物がプールされ、更に処理され（例えばＰＣＲを介した追加の配列のバルク添加）、配列決定され得る。バーコード化された断片からの個々の配列決定リードは、バーコード配列を介してそれらのそれぞれの試料配列に帰属され得る。
【０１４３】
いくつかの場合では、胎児ゲノムの配列を含む胎児核酸の配列、及び／または胎児核酸配列における遺伝的変異は、本明細書に記載される方法及び系を使用して得た長い範囲の父方及び母方の配列環境及び特徴付けから決定され得る。例えば、循環胎児核酸の配列決定と共に、父方及び母方ゲノムのゲノム配列決定は、対応する胎児ゲノム配列を決定するために使用され得る。親のゲノム及び無細胞胎児核酸の配列分析からゲノム胎児核酸の配列を決定する例は、Ｋｉｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２  Ｊｕｎｅ  ６）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．４（１３７）：１３７ｒａ７６に見出すことができ、参照により全体が本明細書に組み込まれる。胎児ゲノムの決定は、例えば胎児異数体を含む、胎児のゲノム障害の出生前決定及び診断に有用である。本明細書の他の箇所に論じられるように、本明細書に提供される方法及び系は、核酸配列におけるハプロタイプを解明する際に有用であり得る。ハプロタイプが解明された父方及び母方の配列は、父方及び母方のサンプル試料核酸配列に対して決定され得、そのそれぞれは、胎児ゲノムの配列の決定及び／またはその特徴付けをより正確に行うことに役立ち得る。
【０１４４】
本明細書の方法及び系を利用することにより、親の核酸配列（例えば、母方核酸配列、父方核酸配列）の長い範囲の配列環境を含む、核酸の長い範囲の配列環境を決定する際の精度を改善することができる。本明細書に提供される方法及び系は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度で、親の核酸の長い範囲の配列環境を決定することができる。いくつかの場合では、本明細書に提供される方法及び系は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率で、親の核酸の長い範囲の配列環境を決定することができる。更に、本明細書の方法及び系は、１つ以上の態様において、父方核酸配列を特徴付ける（例えば、配列の決定、１つ以上の遺伝的変異の決定、１つ以上の構造変異体の決定、ハプロタイプの決定など）際の精度も改善することができる。したがって、本明細書に提供される方法及び系は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度で、１つ以上の態様において、父方核酸配列を特徴付けることができる。いくつかの場合では、本明細書に提供される方法及び系は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率で、１つ以上の態様において、親の核酸配列を特徴付けることができる。
【０１４５】
更に、上記に論じられるように、親の核酸の長い範囲の配列環境及びその特徴付けを決定する際の改善された精度は、胎児核酸の配列決定及び特徴付けにおいて改善された精度をもたらし得る。したがって、いくつかの場合では、胎児核酸配列（長い範囲の配列環境を含む）は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度で、親の核酸配列の分析から提供され得る。いくつかの場合では、胎児核酸配列（長い範囲の配列環境を含む）は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率で、親の核酸配列の分析から提供され得る。いくつかの場合では、胎児核酸配列は、１つ以上の態様において、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％、または９９．９９９％の精度で、本明細書に記載される親の核酸配列の分析（例えば、配列の決定、１つ以上の遺伝的変異の決定、１つ以上の構造的変異の決定、ハプロタイプの決定など）を介して特徴付けされ得る。いくつかの場合では、胎児核酸配列は、１つ以上の態様において、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、または０．０００００５％未満の誤差率で、本明細書に記載される親の核酸配列の分析（例えば、配列の決定、１つ以上の遺伝的変異の決定、ハプロタイプの決定、１つ以上の構造的変異の決定など）を介して特徴付けされ得る。
【０１４６】
ＶＩＩＩ．試料
疾患または障害の検出は、患者から試料を得ることで開始し得る。本明細書で使用されるとき、「試料」という用語は、一般的に、生物学的試料を指す。生物学的試料の例としては、核酸分子、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂肪、またはウイルスを含む。例において、生物学的試料は、１つ以上の核酸分子を含む核酸試料である。例示的な試料としては、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、無細胞核酸（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ））、循環無細胞核酸、循環腫瘍核酸（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）核酸、核酸断片、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドポリヌクレオチド、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、リボソームＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどを挙げることができる。要約すると、使用される試料は、特定の処理ニーズにより変動し得る。
【０１４７】
核酸を含むいずれの物質が試料の供給源であり得る。物質は、流体、例えば生物学的流体であり得る。流体物質は、血液、臍帯血、唾液、尿、汗、血清、精液、膣液、胃液及び消化液、髄液、胎盤液、体腔液、眼液、血清、母乳、リンパ液、またはこれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。物質は、固体、例えば生物学的組織であり得る。物質は、正常な健康な組織、疾患組織、または健康な組織と疾患組織の混合を含み得る。いくつかの場合では、物質は腫瘍を含み得る。腫瘍は、良性（非癌性）または悪性（癌）であり得る。腫瘍の非限定的な例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃腸管系細胞癌、結腸細胞癌、膵癌、乳癌、泌尿生殖器系細胞腫、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、内分泌系細胞癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。物質は様々な種類の臓器と関連し得る。臓器の非限定的な例としては、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃腺を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、胃、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの場合では、物質は、真核細胞、原核細胞、菌細胞、心臓細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、膵細胞、生殖細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、胃腸細胞、血液細胞、癌細胞、菌体、ヒトのマイクロバイオーム試料から単離した菌体などを含むが、これらに限定されない様々な細胞を含み得る。いくつかの場合では、物質は、例えば、単一細胞の内容物または複数細胞の内容物などの細胞の内容物を含み得る。個々の細胞を分析するための方法及び系は、２０１４年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０１７，５５８号に記載されており、その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
試料は様々な対象から得ることができる。対象は生存対象または死亡対象であってよい。対象の例としては、ヒト、哺乳類、非ヒト哺乳類、ゲッ歯類、両生類、爬虫類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、メンドリ、鳥（ａｖｉｎｅｓ）、マウス、ウサギ、昆虫、ナメクジ、微生物、細菌、寄生虫、または魚を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合では、対象は、疾患または障害を有する、有する疑いがある、または発症するリスクにある患者であり得る。いくつかの場合では、対象は妊婦であり得る。いくつかの場合では、対象は正常な健康な妊婦であり得る。いくつかの場合では、対象は、ある特定の先天性欠損を有する乳児を有するリスクにある妊婦であり得る。
【０１４９】
試料は様々なアプローチにより対象から得ることができる。例えば、試料は、循環系へのアクセス（例えば、注射器または他の装置を介して静脈内または動脈内）、分泌された生物学的試料を回収する（例えば、唾液、痰尿、糞便など）、外科的に（例えば、生検）生物学的試料を取得する（例えば、術中試料、術後試料など）、拭き取り（例えば、口腔内拭き取り、口腔咽頭拭き取り）、またはピペット操作により対象から得ることができる。
【０１５０】
ＣＮＶは療法の有効性と関連し得る。例えば、ＨＥＲ２遺伝子コピー数の増加は、進行した非小細胞肺癌におけるゲフィチニブ療法に対する応答を増強することができる。Ｃａｐｐｕｚｚｏ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：５００７−５０１８を参照。高ＥＧＦＲ遺伝子コピー数は、ラパチニブ及びカペシタビンに対する感受性の増加について予測することができる。Ｆａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８：１５ｓ（２０１０  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）を参照。高ＥＧＦＲ遺伝子コピー数は、セツキシマブ及びパニツムマブに対する感受性の増加と関連する。
【０１５１】
コピー数変異は、癌患者のある特定の治療に対する耐性と関連し得る。例えば、チミジル酸シンターゼの増幅は、転移性結腸直腸癌患者において５−フルオロウラシル治療に対する耐性をもたらし得る。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１６１５６−６１を参照。
【０１５２】
ＩＸ．コンピュータ制御システム
本開示は、本明細書に提供される方法、例えば、本明細書に記載される、遺伝的変異の核配列決定及び決定、参照核酸配列の保存、配列分析の実施、ならびに／または試料と参照核酸配列の比較のための方法を実施するようにプログラムされるか、ないしは別の方法でそのように構成されるコンピュータシステムを提供する。このようなコンピュータシステムの例は図２２に示される。図２２に示されるように、コンピュータシステム２２０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理用の複数のプロセッサであり得る中央処理装置（ＣＰＵ、また本明細書において「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」）２２０５を含む。コンピュータシステム２２０１は、メモリまたはメモリ場所２２１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子保存ユニット２２１５（例えばハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース２２２０（例えばネットワークアダプタ）、ならびにキャッシュメモリ、他のメモリ、データ保存、及び／または電子表示アダプタなどの周辺機器２２２５も含む。メモリ２２１０、保存ユニット２２１５、インターフェース２２２０、及び周辺機器２２２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を通してＣＰＵ２２０５と通信する。保存ユニット２２１５は、データを保存するためのデータ保存ユニット（またはデータ保管庫）であり得る。コンピュータシステム２２０１は、通信インターフェース２２２０の補助により、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）２２３０に動作可能に接続され得る。ネットワーク２２３０は、インターネット、インターネット、及び／もしくはエクストラネット、インターネットと通信するイントラネット及び／もしくはエクストラネットであり得る。いくつかの場合では、ネットワーク２２３０は、電気通信及び／またはデータネットワークである。ネットワーク２２３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る１つ以上のコンピュータサーバーを含み得る。ネットワーク２２３０は、いくつかの場合ではコンピュータシステム２２０１の補助により、コンピュータシステム２２０１に接続されたデバイスがクライアントまたはサーバーとして機能することを可能にし得るピア・ツー・ピアネットワークを実施することができる。
【０１５３】
ＣＰＵ２２０５は、プログラムまたはソフトウェアにおいて具現化され得る機械読み取り可能命令のシーケンスを実行することができる。命令はメモリ２２１０などのメモリ場所に保存され得る。ＣＰＵ２２０５により実施される動作の例としては、取り出し、解読、実行、及び書き戻しを含み得る。
【０１５４】
保存ユニット２２１５は、ドライバ、ライブラリ、及び保存済みプログラムなどのファイルを保存することができる。保存ユニット２２１５は、ユーザデータ、例えばユーザプリファレンス及びユーザプログラムを保存することができる。コンピュータシステム２２０１は、いくつかの場合では、イントラネットまたはインターネットを通してコンピュータシステム２２０１と通信するリモートサーバー上に位置するなど、コンピュータシステム２２０１の外部の１つ以上の追加のデータ保存ユニットを含み得る。
【０１５５】
コンピュータシステム２２０１は、ネットワーク２２３０を通して１つ以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム２２０１は、ユーザ（例えばオペレータ）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、アンドロイド使用可能デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が挙げられる。ユーザは、ネットワーク２２３０を介してコンピュータシステム２２０１にアクセスすることができる。
【０１５６】
本明細書に記載される方法は、コンピュータシステム２２０１の電子保存場所、例えばメモリ２２１０または電子保存ユニット２２１５上に保存された機械（例えばコンピュータプロセッサ）実行可能コードにより実施され得る。機械実行可能または機械読み取り可能コードはソフトウェアの形態で提供され得る。使用中、コードはプロセッサ２２０５によって実行され得る。いくつかの場合では、コードは、保存ユニット２２１５から検索され、プロセッサ２２０５によって容易にアクセスするためにメモリ２２１０上に保存され得る。いくつかの状況では、電子保存ユニット２２１５は除外されてよく、機械実行可能命令がメモリ２２１０上に保存される。
【０１５７】
コードは予めコンパイルされ、コードを実行するように適応されたプロセッサを有する機械で使用するために構成され得るか、または実行中にコンパイルされ得る。コードは、コードが予めコンパイルされたまたはコンパイルされてすぐの様式で実行することを可能にするように選択され得るプログラム言語で供給され得る。
【０１５８】
コンピュータシステム２２０１などの本明細書に提供されるシステム及び方法の態様はプログラミングにおいて具現化され得る。技術の様々な態様は、典型的には、一種の機械読み取り可能媒体において保有または具現化される機械（またはプロセッサ）実行可能コード及び／または関連データの形態で、「製品」または「製造物品」として考えられ得る。機械実行可能コードは、電子保存ユニット、このようなメモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）、またはハードディスク上に保存され得る。「保存」式媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリのいずれかもしくはすべて、またはそれらの関連モジュール（様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなど）を含み得、これは常にソフトウェアプログラミングの非一時的な保存を提供することができる。ソフトウェアのすべてまたは一部は、時折、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを通して通信され得る。例えば、このような通信は、１つのコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたはプロセッサに、例えば管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへの読み込みを可能にし得る。よって、ソフトウェア要素を有し得る別の種類の媒体は、有線及び光学地上通信ネットワークを通して、ならびに様々な無線リンク上で、ローカルデバイス間の物理インターフェースなどにわたって使用される光学波、電波、及び電磁波を含む。有線またはワイヤレスリンク、光学リンクなどのこのような波を運ぶ物理要素もソフトウェアを保有する媒体と考えられ得る。本明細書で使用されるとき、非一時的な有形「保存」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「読み取り可能媒体」などの用語は、実行のための命令をプロセッサに提供する際に関与する任意の媒体を指す。
【０１５９】
よって、コンピュータ実行可能コードなどの機械読み取り可能媒体は、有形保存媒体、搬送波媒体、または物理伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態を取ることができる。不揮発性媒体は、例えば、図面に示されるデータベースなどを実施するためなどに使用され得る任意のコンピュータ（複数可）などの保存デバイスのいずれかなどの光学または磁気ディスクを含む。揮発性保存媒体は、このようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどの動的メモリを含む。有形伝送媒体は、同軸ケーブル；コンピュータシステム内にバスを含むワイヤを含む、銅線及び光学ファイバを含む。搬送波伝送媒体は、電気もしくは電磁シグナル、または高周波（ＲＦ）赤外（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音もしくは光波の形態を取ることができる。したがって、コンピュータ読み取り可能媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理保存媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、搬送波輸送データもしくは命令、このような搬送波などを輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコード及び／もしくはデータを読むことができる任意の他の媒体を含む。コンピュータ読み取り可能媒体のこれらの形態の多くは、実行のためにプロセッサに対する１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスの保有に関与し得る。
【０１６０】
コンピュータシステム２２０１は、例えば、コンピュータシステム２２０１に接続された核酸配列決定計器の出力または読み出しを提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）を含む電子表示２２３５を含むか、またはそれと通信することができる。このような読み出しは、所与の核酸試料を含む核酸塩基の配列など、核酸配列決定読み出しを含み得る。ＵＩは、このような読み出しを利用する分析の結果を表示するためにも使用され得る。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースユーザインターフェースが挙げられるが、これらに限定されない。電子表示２２３５は、コンピュータのモニタ、または容量もしくは抵抗タッチスクリーンであり得る。
【実施例】
【０１６１】
実施例１：フェーズ化変異体の特定
ＮＡ１２８７８ヒト細胞系からのゲノムＤＮＡは、長さが約１０ｋｂの断片を回収するために、Ｂｌｕｅ  Ｐｉｐｐｉｎ  ＤＮＡサイジング法を用いて断片のサイズ基準分離を受けた。次に、マイクロ流体分配系を使用して（例えば、２０１４年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／９７７，８０４号を参照、すべての目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、フッ素化油連続相内の水性液滴中にサイズ選択された試料核酸をバーコードビーズと共分配し、水性液滴は、ｄＮＴＰ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び液滴内で増幅を行うための他の試薬、ならびにビーズからバーコードオリゴヌクレオチドを放出するための化学活性剤も含む。これは、１ｎｇの総ＤＮＡ投入量及び２ｎｇ総ＤＮＡ投入量の両方に対して繰り返された。７００，０００を超える異なるバーコード配列のバーコード多様性を表すストックライブラリのサブセットとしてバーコードビーズを得た。バーコード含有オリゴヌクレオチドは追加の配列成分を含み、一般構造式：
ビーズ−Ｐ５−ＢＣ−Ｒ１−Ｎｍｅｒ
を有し、式中、Ｐ５及びＲ１は、それぞれ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ付加及びリード１  プライマー配列を指し、ＢＣはオリゴヌクレオチドのバーコード部分を示し、Ｎ−ｍｅｒは、テンプレート核酸をプライムするために使用されたランダム１０塩基Ｎ−ｍｅｒプライミング配列を示す。例えば、２０１４年６月２６日に出願された米国特許出願第１４／３１６，３８３号を参照（その全開示はすべての目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６２】
ビーズの溶解後、各液滴内の試料核酸のテンプレートに対してバーコードオリゴのプライマー伸長を可能にするために、液滴を熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｄ）した。これは、上述の他の含まれた配列に加えて、発生元のパーティションを表すバーコード配列を含む試料核酸のコピー断片をもたらした。
【０１６３】
コピー断片のバーコード標識後、増幅されたコピー断片を含む液滴のエマルジョンが破壊され、追加のシーケンサー必要成分、例えばリード２プライマー配列及びＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサー用のＰ７付加配列が、コピー断片のもう一端にこれらの配列を付加した更なる増幅を通して、コピー断片に添加された。
【０１６４】
次に、配列決定ライブラリが１０Ｘ読み深度、２０Ｘ読み深度、及び３０Ｘ読み深度で、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑシステムで配列決定され、次に得られた配列リード及びそれらの関連バーコード配列が分析された。共通のバーコードを共有した近接マッピング配列はより大きいコンティグにアセンブリングされ、フェーズ化ＳＮＰを特定するために、それらの関連バーコード及び配列マッピングに基づき、一塩基多型が特定され、個々の開始分子と関連付けられた。次に、重複するフェーズ化ＳＮＰを含んだ配列は、重複するフェーズ化ＳＮＰに基づいてフェーズ化配列データのフェーズブロックまたは推測コンティグにアセンブリングされた。得られたデータは、比較のための細胞系の既知のハプロタイプマップと比較された。
【０１６５】
少なくとも１つのアプローチでは、一連のヘテロ接合変異体の各対立遺伝子は、２つのハプロタイプに対して２つのうちの１つに割り当てられる。一組の変異体と仮定すると、観察されたリード及びバーコードデータの対数尤度、ならびにヘテロ接合変異体のフェージング割り当てを返す対数尤度関数対数Ｐ（バーコード化されたリード｜フェージング割り当て、変異体）が定義される。対数尤度関数の形態は、バーコード化された配列リードデータについての２つの主な観測から導かれる：（１）１つのバーコードからのリードが一倍体ゲノムのごく一部を網羅するため、ゲノムの所与の領域における両ハプロタイプに関するリードを含有する１つのバーコードの確率は小さい。逆に、ゲノムの局所領域における１つのバーコードに関するリードは単一のハプロタイプに由来する可能性が高い；（２）観察された塩基が、それが由来したハプロタイプにおける真の塩基と異なる確率は、シーケンサーにより割り当てられた観察された塩基のＰｈｒｅｄ  ＱＶにより示される。
【０１６６】
次に、所与の一組のバーコード化されたリード及び変異体の対数尤度関数を最大限にするフェージング構成が報告される。次に、ハプロタイプ構成を点数化する最大尤度は、構造化探索方法により見出される。最初に、隣接変異体の小ブロック（例えば約５０の変異体）の最適なフェージング構成を見つけるために、ビーム探索が使用される。第２に、ブロックの相対的フェージングがブロック連結部にわたる掃引において決定される。この時点で、全体的な近最適フェージング構成が見出され、更なる最適化の開始点として使用される。次に、個々の変異体のハプロタイプ割り当てはフェージングに対する局所改善を見出すために反転され、交換した構成間の対数尤度における差はそのフェージング割り当ての信頼度の推定を提供する。最後に、フェージング構成は、内部的に正しい確率が高いフェーズブロックに分割される。次に、最適構成の対数尤度を、現在のＳＮＰの右のすべてのＳＮＰがそれらのハプロタイプの割り当てを反転させる構成と比較することにより、各ＳＮＰでフェーズブロックを破壊するかが試験される。
【０１６７】
下の表は、ＮＡ  １２８７８ゲノムに関して得られたフェージング計量を提供する。明らかなように、非常に長いフェーズブロックは、短いリード配列データから得られ、非常に低い短いまたは長いスイッチ誤差で、顕著なパーセンテージのフェーズ化ＳＮＰを正確に特定する。
【表１】
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【０１６８】
ＮＡ１２８７８三つ組（ＮＡ１２８７８、ＮＡ１２８８２、及びＮＡ１２８７７）、グジャラート人（ＮＡ２０８４７）、メキシコ人（ＮＡ１９６６２）、アフリカ人（ＮＡ１９７０１）細胞系試料を含むいくつかの追加の試料からフェーズ化ＳＮＰを更に実験する。約１ＭＢのＮ５０フェーズブロック長は、０．３％未満のスイッチ誤差で、９５％を超えるフェーズ化されたＳＮＰで達成された。同じ試料の全エクソーム配列決定、例えば、バーコード化に従った標的プルダウンは、同様に０．３％未満のスイッチ誤差で、約９０％の遺伝子ＳＮＰフェージングを示した。
【０１６９】
実施例２：ＥＭＬ−４／ＡＬＫ遺伝子反転／転座の特定
本明細書に記載される方法及びプロセスは、特徴付けされた癌細胞系から構造的変異を検出するために使用された。特に、ＮＣＩ−Ｈ２２２８肺癌細胞系は、そのゲノム内にＥＭＬ４−ＡＬＫ融合転座を有することで知られている。野生型と比較した変異の構造は図１５に図示される。上のパネルに示されるように、変異体構造において、ＥＭＬ−４遺伝子は、同じ染色体上にあるが、ＡＬＫ遺伝子から比較的離れているか、または距離があり、代わりに転座され、ＡＬＫ遺伝子に融合される（例えば、Ｃｈｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＭＬ４−ＬＫ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８：４９７１（Ｊｕｌｙ  ２００８）を参照）。転座と併せて、ＥＭＬ４遺伝子も反転される。転座は、野生型構造と比較したとき、パネルＩＩに更に図示され、転座は、ＥＭＬ−４のエクソン１〜６（黒のボックスとして示される）の、ＡＬＫのエクソン２０〜２９（白のボックスとして示される）への融合、ならびにＥＭＬ−４のエクソン１〜１９に融合したＡＬＫのエクソン７〜２３の融合をもたらす。
【０１７０】
この変異を特定するために、ＮＣＩ−Ｈ２２２８細胞系からのゲノムＤＮＡは、長さが約１０ｋｂの断片を選択するためにＢｌｕｅ  Ｐｉｐｐｉｎ（登録商標）システム（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してサイズ分離を受けた。
【０１７１】
次に、サイズ選択された試料核酸は、ＤＮＡが、バーコード化後及び配列決定前に、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｅｘｏｍｅ捕捉キットを使用してハイブリッド捕捉を受けたことを除き、実施例１に関して上述されるように、バーコードビーズで共分配され、増幅され、配列決定ライブラリに加工された。次に、配列決定ライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑシステムで、約８０Ｘ読み深度まで配列決定され、次に得られた配列リード及びそれらの関連バーコード配列が分析された。野生型と比較したとき、転座事象に及ぶゲノムの部分の間でのより高い数の共有バーコードが明らかに明白であり、野生型に存在しない融合成分間の構造的近接を示す。特に、及び図１６Ａに示されるように、融合構造は、ＥＭＬ−４エクソン１〜６とＡＬＫエクソン２０〜２９との間で１２バーコード、そしてＥＭＬ−４エクソン７〜２３とＡＬＫエクソン１〜１９との間で２０バーコードのバーコード重複を示し、これはヘテロ接合細胞系の野生型構築物の重複するバーコードに匹敵するものであった。
【０１７２】
対照的に、非変異体細胞系（ＮＡ１２８７８）を用いた陰性対照実行は、図１６Ｂに示されるように、実質的に、野生型対変異体構築物のバーコード重複のみを示し、配列読み深度は約１４０Ｘであり、３ｎｇの開始ＤＮＡを使用した。
【０１７３】
特に、様々な配列セグメントに対して多数の合計マッピングバーコードを示すが、非常に高い数の共通のまたは重複するバーコードを示した野生型構造と比較して、非常に小さいパーセンテージの重複するバーコードのみ、例えば合計マッピングバーコード配列の０．５％未満が融合構造に対して見られた。結果として、融合または転座切断点にわたって一般的なマッピングバーコードはこれらの転座事象を特定するための強力な基盤を提供する。
【０１７４】
最初に顕著なバーコード交差／重複を伴うゲノム遺伝子座のすべての対を検索し、この検索を効率的な疎行列乗算としてコードするＳＶ検出のためのアルゴリズムも利用された。次に、この第１段階からの候補は、リード対、分割リード、及びバーコードデータを組み込む確率モデルを利用してフィルタ処理される。ＮＡ１２８７８及びＮＡ２０８４７に対するＳＶ呼び出しは、複数の大規模な欠失及び反転の呼び出し、及び隣接するフェーズブロックに対するそれらのフェージングをもたらし、上述の核三つ組における遺伝パターンを有するフェージングの一貫性を示す。
【０１７５】
実施例３：ＣＮＶスクリーニングを介した狼瘡に対する増加した感受性の検出
患者は狼瘡に対する感受性について検査される。患者から血液を得る。無細胞ＤＮＡ試料は本明細書に列挙される技法を用いて配列決定される。次に、異なる遺伝子のＣＮＶを決定するために、この配列を既知のゲノム参照配列と比較する。ＦＣＧＲ３Ｂ（ＣＤ１６細胞表面免疫グロブリン受容体）の低コピー数は、全身性エリテマトーデスに対する増加した感受性を示す。患者は、任意のコピー数異常及び関連リスク／疾患を通知される。
【０１７６】
実施例４：ＣＮＶスクリーニングを介した増加した神経芽細胞腫の素因の検出
患者は神経芽細胞腫の素因について検査される。患者から血液を得る。無細胞ＤＮＡ試料は本明細書に列挙される技法を用いて配列決定される。次に、異なる遺伝子のＣＮＶを決定するために、この配列を既知のゲノム参照配列と比較する。１ｑ２１．１でのＣＮＶは増加した神経芽細胞腫の素因を示す。患者は、任意のコピー数異常及び関連リスク／疾患を通知される。
【０１７７】
実施例５：ＣＮＶスクリーニングを介した肺癌の鑑別診断
慢性咳、体重減少、及び息切れを有する患者が肺癌について検査される。患者から血液を得る。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または無細胞ＤＮＡ試料は本明細書に列挙される技法を用いて配列決定される。次に、異なる遺伝子のＣＮＶを決定するために、ＣＴＣ配列を既知のゲノム参照配列と比較する。ＤＮＡにおけるＥＧＦＲコピー数が通常より高い場合、患者は、小細胞肺癌の代わりに非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と鑑別診断され得る。非小細胞肺癌のＣＴＣは小細胞肺癌と更に区別され得る他のコピー数変異も有する。癌の病期により、外科手術、化学療法、または放射線療法が処方される。
【０１７８】
小細胞肺癌は、大半の場合、非小細胞肺細胞癌よりも迅速かつ広範囲に転移性である（よって、異なって病期分類される）。ＮＳＣＬＣは、通常、化学療法及び／または放射線にあまり感受性ではないため、早期で診断された場合、外科手術が選択治療であり、多くの場合、補助（付随的）化学療法はシスプラチンを伴う。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者に対しては、標的療法、例えばクリゾチニブなどのＡＬＫ阻害剤も利用可能である。標的療法は、すべての迅速に分裂する細胞に単純に干渉するよりも（例えば従来の化学療法）、むしろ発癌及び腫瘍成長に必要とされる特定の標的分子に干渉することにより癌細胞の成長を遮断する。
【０１７９】
実施例６：フェージングを介した胎児異数体の鑑別診断
胎児異数体は染色体数における異常である。異数体は、一般的に、顕著な身体的及び神経性障害をもたらす。Ｘ染色体の数の減少はターナー症候群に関与する。染色体番号２１のコピー数の増加はダウン症候群を引き起こす。羊水穿刺または絨毛検査（ＣＶＳ）などの侵襲性試験は流産のリスクにつながる場合があり、母体血液を検査するあまり侵襲性ではない方法がここでは使用される。
【０１８０】
ダウン症候群またはターナー症候群の家族歴を有する妊娠中の患者が検査される。胎児遺伝物質を含有する母体の血液試料を回収する。次に、異なる染色体からの核酸は、本明細書に記載されるように、バーコード化されたタグ分子と共に異なるパーティションに分離される。次に、試料を配列決定し、各染色体コピーの数を正常な二倍体染色体の配列と比較する。患者は、異なる染色体の任意のコピー数異常及び関連リスク／疾患を通知される。
【０１８１】
実施例７：バーキットリンパ腫の鑑別診断のためのフェージングを介した染色体転座の検出
バーキットリンパ腫は染色体のｔ（８；１４）転座を特徴とする。一般的にリンパ腫と診断された患者はバーキットリンパ腫について検査される。腫瘍生検組織はリンパ節から回収される。異なる染色体からの核酸は、本明細書に記載されるように、バーコード化されたタグ分子と共に異なるパーティションに分離される。次に、試料は、染色体転座を検出するために、配列決定され、対照ＤＮＡ試料と比較される。患者がバーキットリンパ腫を有すると診断される場合、ＣＨＯＰまたはＲ−ＣＨＯＰレジメンを含む、他の種類のリンパ腫よりも集中的な化学療法レジメンが必要とされる可能性がある。ＣＨＯＰは、ＤＮＡに結合し、架橋結合の形成をもたらすことによりＤＮＡを損傷するアルキル化剤であるシクロホスファミド、ＤＮＡ塩基間に自身を挿入することによりＤＮＡを損傷する挿入剤であるヒドロキシダウノルビシン（ダウノルビシンまたはアドリアマイシンとも呼ばれる）、タンパク質チューブリンに結合することにより細胞の重複を阻止するオンコビン（ビンクリスチン）、コルチコステロイドであるプレドニゾンまたはプレドニゾロンからなる。このレジメンは、バーキットリンパ腫がＢ細胞起源のものであるため、モノクローナル抗体リツキシマブとも併用され得、この併用はＲ−ＣＨＯＰと呼ばれる。
【０１８２】
実施例８：親のゲノムとの比較による無細胞ＤＮＡに由来する胎児ゲノム配列のフェージング
妊娠中の患者からの母方ＤＮＡを含む試料、及び胎児の父親からの父方ＤＮＡを含む試料が回収される。各試料からの核酸は、本明細書に記載されるように、分子バーコード化されたタグと共に異なるパーティションに分離される。次に、試料を配列決定し、分配された母方及び父方の断片の各々に関して推測コンティグを生成するために配列を使用する。推測コンティグは、母方及び父方の染色体の各々の部分についてのハプロタイプブロックを構築するために使用される。
【０１８３】
胎児遺伝物質を含有する母体の血液試料を回収する。無細胞ＤＮＡを配列決定して、母方循環ＤＮＡ及び胎児循環ＤＮＡの両方の配列を生成する。リードを上記で生成した父方及び母方のフェーズブロックと比較する。一部のフェーズブロックは減数分裂中に組換えを受けた。父方フェーズブロックと一致し、母方フェーズブロックと一致しない胎児物質が特定される。いくつかの場合では、胎児物質は父方フェーズブロックの全体と一致し、父方由来の染色体において、胎児がその父方フェーズブロックを有すると決定される。他の場合では、胎児物質はフェーズブロックの一部と一致し、次に第２のフェーズブロックと一致し、２つのフェーズブロックは父方ゲノムにおいて相同染色体領域上にある。減数分裂期組換え事象がこの領域で生じたことが決定され、組換えの可能性が高い地点が決定され、２つの父方フェーズブロックの組み合わせである新しい胎児フェーズブロックが生成される。
【０１８４】
循環ＤＮＡの配列を母方フェーズブロックと比較する。母方フェーズブロックにおけるヘテロ接合性部位は、母方由来の胎児染色体の可能性が高いフェーズを決定するために使用される。循環ＤＮＡ配列は、母方ゲノムのヘテロ接合部位でのコピー数を決定するために使用される。特定の母方フェーズブロックの上昇したコピー数は、母方由来の胎児の染色体が上昇したフェーズブロックの配列を含有することを示す。いくつかの場合では、父方の場合において記載されるものと類似して、最初は、相同領域の１つのフェーズブロックが上昇したように見え、その後、同じ領域の別のフェーズブロックの一部が上昇したように見え、減数分裂期組換えが生じたこを示す。これらの場合では、組換えの可能性が高い領域が決定され、新しい胎児フェーズブロックが２つの母方フェーズブロックから構築される。
【０１８５】
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、説明されるが、このような実施形態が単に例として提供されることは当業者には明らかであろう。本発明は本明細書内に提供される特定の実施例によって制限されることが意図されない。本発明は前述の明細書に関して説明されるが、本明細書の実施形態の説明及び図は、限定的な意味で解釈されるように意図されていない。ここで、当業者は、多くの変形、変更、及び置換を、本発明から逸脱することなく想到するだろう。更に、本発明のすべての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記述される特定の描写、構成、または相対的割合に限定されないことを理解するべきである。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が本発明を実践する際に利用され得ることを理解するべきである。したがって、本発明は任意のそのような代替、修正、変形、または等価物を網羅することも企図される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物はそれにより網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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