(57)【要約】  本発明は、インビボイメージング用の放射性医薬品、特に18Ｆ標識アミノオキシ官能化生体ターゲティング部分を含む放射性トレーサーの精製方法に関する。本発明は、トレーサーの放射線防護剤含有放射性医薬組成物並びに関連する自動化方法及びカセットを提供する。【選択図】図２
2017501152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性トレーサーの精製方法であって、
（ａ）18Ｆ標識アミノオキシ官能化生体ターゲティング部分を含む放射性トレーサーを用意するステップと、
（ｂ）放射性トレーサーに放射線防護剤を添加して、有機溶媒含有量５〜２５ｖ／ｖ％の１種以上の水混和性有機溶媒水溶液中に放射性トレーサーを含む放射性トレーサー溶液を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の放射性トレーサー溶液を逆相ＳＰＥカートリッジに流して、放射性トレーサーをＳＰＥカートリッジに保持するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のＳＰＥカートリッジを、有機溶媒含有量１５〜２５ｖ／ｖ％の放射線防護剤の水混和性有機溶媒水溶液を含む洗浄溶液で１回以上洗浄するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）のＳＰＥカートリッジを水又は水性緩衝液で１回以上洗浄するステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）又は（ｅ）の洗浄済みＳＰＥカートリッジを、エタノール含有量３５〜８０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液中に放射線防護剤を含む溶出溶媒で溶出して、溶出溶媒中に精製放射性トレーサーを含む溶出液を得るステップと
を含んでおり、各放射線防護剤が独立にアスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸及びゲンチシン酸並びにこれらと生体適合性陽イオンとの塩の１種以上を含む、方法。
【請求項２】
放射性トレーサー溶液の水混和性有機溶媒がアセトニトリルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の放射性トレーサー溶液が０．５〜５ｖ／ｖ％のエタノールを含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＳＰＥカートリッジがＣ１８  ＳＰＥカートリッジである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｆ）の溶出溶媒が３５〜７０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｆ）の溶出溶媒が４０〜６０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
放射性トレーサー溶液、洗浄溶液及び溶出溶媒で用いる放射線防護剤が同一である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
放射線防護剤が４−アミノ安息香酸又はその生体適合性陽イオンとの塩を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ＢＴＭが、単一アミノ酸、３〜１００量体ペプチド、酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト、酵素阻害剤又は受容体結合化合物を含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ＢＴＭがＡｆｆｉｂｏｄｙ（商標）を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＢＴＭが、以下で定義されるペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣ及びペプチドＤから選択される３〜１００量体ペプチドを含む、請求項９記載の方法。
（ｉ）ペプチドＡ＝Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド、
（ｉｉ）ペプチドＢ＝次式のフラグメントを含むＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド、
【化１】
2017501152.tif 000018
（ｉｉｉ）ペプチドＣ＝次のアミノ酸配列を含むｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチド、
−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、
Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、
Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、
Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、
Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、
Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａとｂ及び残基ｃとｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成する。）
（ｉｖ）ペプチドＤ＝次式のランチビオティックペプチド、
Ｃｙｓa−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒb−Ｃｙｓc−Ｓｅｒd−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒc−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓb−（ＨＯ−Ａｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒa−Ｌｙｓd
（式中、
ＸａａはＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｃｙｓa−Ｔｈｒa、Ｓｅｒb−Ｃｙｓb及びＣｙｓc−Ｔｈｒcはチオエーテル結合を介して共有結合しており、
Ｓｅｒd−Ｌｙｓdはリシノアラニン結合を介して共有結合しており、
ＨＯ−Ａｓｐはβ−ヒドロキシアスパラギン酸である。）。
【請求項１２】
放射性医薬組成物の調製方法であって、該組成物が、
（ｉ）請求項１又は請求項９乃至請求項１１のいずれか１項で定義した放射性トレーサーと、
（ｉｉ）請求項１又は請求項８で定義した１種以上の放射線防護剤と、
（ｉｉｉ）エタノール含有量０．１〜１０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を含む生体適合性担体と
を哺乳類への投与に適した形態で含んでおり、当該方法が、
請求項１乃至請求項１１のいずれか１項で定義したステップ（ａ）〜（ｆ）の放射性トレーサー精製方法を実施することと、
（ｇ）任意には、ステップ（ｆ）の精製［18Ｆ］−放射性トレーサーを生体適合性担体で希釈するステップと、
（ｈ）任意には、ステップ（ｇ）の希釈溶液を無菌濾過して［18Ｆ］放射性医薬組成物を得るステップと
を含んでいる、方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）〜（ｆ）又は（ｂ）〜（ｈ）の少なくとも１つが自動化される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
自動化が自動合成装置を使用して実施される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
自動合成装置が単回使用カセットを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
単回使用カセットが、
（ｉ）精製すべき［18Ｆ］−放射性トレーサー溶液を収容する容器と、
（ｉｉ）１以上の逆相ＳＰＥカートリッジと、
（ｉｉｉ）請求項１で定義した洗浄溶液の供給源と、
（ｉｖ）請求項１又は請求項６で定義した溶出溶媒の供給源と
を備えている、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
（ｊ）ステップ（ｈ）の［18Ｆ］−放射性トレーサー放射性医薬組成物を１以上の注射器に分注するステップ
をさらに含む、請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４又は請求項１５記載の自動化方法を実施するための、請求項１５で定義した単回使用カセットであって、
（ｉ）精製すべき［18Ｆ］−放射性トレーサー溶液を収容するのに適した容器と、
（ｉｉ）１以上の逆相ＳＰＥカートリッジと、
（ｉｉｉ）請求項１で定義した洗浄溶液の供給源と、
（ｉｖ）請求項１又は請求項７で定義した溶出溶媒の供給源と
を備える単回使用カセット。
【請求項１９】
請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の精製方法又は請求項１２乃至請求項１７のいずれか１項記載の調製方法を実施するための、請求項１４乃至請求項１６のいずれか１項で定義した自動合成装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボイメージング用の放射性医薬品、特に18Ｆ標識アミノオキシ官能化生体ターゲティング部分を含む放射性トレーサーの精製方法に関する。本発明は、放射線防護剤を含有するトレーサーの放射性医薬組成物並びに自動化方法及びカセットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２００４／０８０４９２号には、以下の式（Ｉ）の化合物と式（ＩＩ）の化合物との反応又は式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＩＶ）の化合物との反応によってそれぞれ以下の式（Ｖ）又は（ＶＩ）のコンジュゲートを得ることを含む生体ターゲティングベクターの放射性フッ素化法が開示されている。
【０００３】
【化１】
2017501152.tif 000003
【０００４】
【化２】
2017501152.tif 000004
【０００５】
式中、
Ｒ１は、アルデヒド基、ケトン基、アセタールのような保護アルデヒド、ケタールのような保護ケトン、或いは酸化剤を用いてアルデヒド又はケトンに迅速かつ効率的に酸化することのできる官能基（例えばジオール又はＮ末端セリン残基）であり、
Ｒ２は、第一アミン、第二アミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジドから選択される基であり、
Ｒ３は、第一アミン、第二アミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ、フェニルヒドラジン、セミカルバジド又はチオセミカルバジドから選択される基であり、
Ｒ４はアルデヒド基、ケトン基、アセタールのような保護アルデヒド、ケタールのような保護ケトン、或いは酸化剤を用いてアルデヒド又はケトンに迅速かつ効率的に酸化することのできる官能基（例えばジオール又はＮ末端セリン残基）である。
【０００６】
【化３】
2017501152.tif 000005
【０００７】
式中、Ｘは−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＳＮＨ−であって、好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−又は−Ｏ−であり、ＹはＨ、アルキル又はアリール置換基であり、
式（ＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）のリンカー基は以下のものから選択される。
【０００８】
【化４】
2017501152.tif 000006
【０００９】
式中、ｎは０〜２０の整数であり、ｍは１〜１０の整数であり、ｐは０又は１の整数であり、ＺはＯ又はＳである。
【００１０】
Ｐｏｅｔｈｋｏ他［Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４５（５），８９２−９０２（２００４）］には、放射性同位体18Ｆによるペプチドの放射性標識法であって、以下に示すように、アミノオキシ官能化ペプチドを［18Ｆ］−フルオロベンズアルデヒドと縮合させてオキシムエーテル結合を有する標識ペプチドを得る方法が開示されている。
【００１１】
【化５】
2017501152.tif 000007
【００１２】
Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ他［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１９（６），１２５６−１２６８（２００８）］には、Ｐｏｅｔｈｋｏ他の方法の発展法が記載されている。Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ他は、アミノオキシ基のアミンをＮ−Ｂｏｃ（Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）保護基で保護したアミノオキシ官能化ペプチドを用いている。所望のアミノオキシ官能化ペプチドは、［18Ｆ］−フルオロベンズアルデヒドの存在下、酸性ｐＨ（ｐＨ＝２）、７５℃でのＮ−Ｂｏｃ基の脱保護によってインサイチュで生成する。Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ他では、脱保護が反応条件下で定量的ではなかったので、５倍モル過剰のＢｏｃ保護前駆体を使用している。
【００１３】
Ｍｅｚｏ他［Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，１７，３９−４６（２０１０）］には、Ｂｏｃ保護アミノオキシ官能化ペプチドの上述のオキシムライゲーション化学に関する幾つかの問題について記載されている。例えば、Ｂｏｃ−アミノオキシ試薬は、生成したＢｏｃ保護アミノオキシペプチドをアシル化して、不都合な副生物を生じかねないことが知られている。また、官能化ペプチドの遊離アミノオキシ基のカルボニル化合物に対する反応性が高いことも知られている。その結果、不要な縮合が起こるおそれがあり、反応混合物又は後段の精製工程でアルデヒド又はケトンが紛れ込んでしまうおそれがある。かかるアルデヒド又はケトンとして、使用した溶媒中に存在する痕跡量のアセトン、又はホルムアルデヒド（例えば可塑剤に由来するもの）がある。Ｍｅｚｏ他の関心は、抗癌剤及び［18Ｆ］−フルオロベンズアルデヒドとペプチドとの連結反応のためにこの問題を解決することである。Ｍｅｚｏ他では、この問題を解決するため、「カルボニル捕獲剤」としての１０倍モル過剰の遊離（アミノオキシ）酢酸（Ａｏａ）の存在下でＢｏｃ−アミノオキシペプチドの脱保護を行っている。次いで、脱保護アミノオキシペプチドと過剰のＡｏａを凍結乾燥し、４℃で保存する。オキシムライゲーション反応の直前に、凍結乾燥混合物を再構成し、過剰のＡｏａをＨＰＬＣ又はＳｅｐ−ＰａｋプラスＣ１８カートリッジで分離する。Ｍｅｚｏ他には、この技術を用いて非放射性（19Ｆ）４−フルオロベンズアルデヒドをアミノオキシ官能化ソマトスタチンペプチドとコンジュゲートした例が記載されている。Ｍｅｚｏ他には、18Ｆ−放射性標識に関するデータは記載されていない。
【００１４】
国際公開第２０１２／０２２６７６号には、以下の式Ｉの18Ｆ放射性標識１８〜３０量体ｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチドを含んでなるイメージング剤が開示されている。
Ｚ1−［ｃＭＢＰ］−Ｚ2      （Ｉ）
式中、
ｃＭＢＰは次の式ＩＩのものであり、
−（Ａ）x−Ｑ−（Ａ'）y−      （ＩＩ）
（式中、Ｑは次のアミノ酸配列（配列番号１）であり、
−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａとｂ及び残基ｃとｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）
Ａ及びＡ’は独立にＣｙｓ以外の任意のアミノ酸であって、Ａ及びＡ’の少なくとも一方が存在してＬｙｓであることを条件とし、
ｘ及びｙは独立に０〜１３の値を有する整数であって、［ｘ＋ｙ］＝１〜１３となるように選択される。）
Ｚ1はｃＭＢＰのＮ末端に結合していて、Ｈ又はＭIGであり、
Ｚ2はｃＭＢＰのＣ末端に結合していて、ＯＨ、ＯＢc（式中、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＭIGであり、
各ＭIGは独立に、ｃＭＢＰペプチドのインビボ代謝を阻害又は抑制する生体適合性基である代謝阻害基であり、
ｃＭＢＰはＡ又はＡ’基のＬｙｓ残基において18Ｆで標識されている。
【００１５】
国際公開第２０１２／０２２６７６号には、上記イメージング剤を医薬組成物として使用できることも開示されており、標記組成物は、好ましくは１種以上の放射線防護剤、好ましくはエタノール、アスコルビン酸、ｐ−アミノ安息香酸（即ち、４−アミノ安息香酸又はｐＡＢＡ）、ゲンチシン酸（即ち、２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及びかかる酸と生体適合性陽イオンとの塩から選択される放射線防護剤を含む。
【００１６】
国際公開第２０１２／０７２７３６号には、官能化生体分子のアミノオキシ基のための別の保護基化学の使用が開示されている。保護アミノオキシ基は、次式のものである。
【００１７】
【化６】
2017501152.tif 000008
【００１８】
式中、Ｒ1及びＲ2は独立にＣ1-3アルキル、Ｃ1-3フルオロアルキル又はＣ4-6アリールから選択される。
【００１９】
Ｌｅｍａｉｒｅ他［Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，４２，６３−７５（１９９９）］には、18Ｆ−アルタンセリンの固相抽出（ＳＰＥ）精製について記載されている。
【００２０】
【化７】
2017501152.tif 000009
【００２１】
この報文には、18Ｆ−アルタンセリンは放射線分解を受け易いと記載されており、エタノール及び０．１％アスコルビン酸を含む食塩水のカラムコンディショニング溶液を使用している。カラムの洗浄は、食塩水／アスコルビン酸混合物で実施されている。18Ｆ−アルタンセリンは未希釈のエタノール中に溶出され、次いでカラムコンディショニング溶液で希釈される。
【００２２】
米国特許出願公開第２０１３／０２０９３５８号には、18Ｆ−フルシクラチドが、高い放射能濃度で放射線分解を受けるおそれがあると開示されている。
【００２３】
【化８】
2017501152.tif 000010
【００２４】
米国特許出願公開第２０１３／０２０９３５８号には、18Ｆ−フルシクラチドはエタノールでは安定化されないこと、アスコルビン酸は自動放射性合成に理想的ではないが、４−アミノ安息香酸（又はその塩）が有効であると報告されている。米国特許出願公開第２０１３／０２０９３５８号には、最初に18Ｆ−フルシクラチドを調製し、次いで放射線防護剤を添加することが教示されている。米国特許出願公開第２０１３／０２０９３５８号には、18Ｆ−フルシクラチドと放射線防護剤４−アミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）を含む放射性医薬組成物も教示されている。
【００２５】
国際公開第２０１３／１７４９０９号には、ＳＰＥ（固相抽出）を用いた18Ｆ−フルシクラチドの精製方法が記載されている。国際公開第２０１３／１７４９０９号には、ＳＰＥカラムからいったん溶出されれば、18Ｆ−フルシクラチドを生体適合性担体（４−アミノ安息香酸であってもよい。）で希釈できると教示されている。
【００２６】
そこで、アミノオキシ官能化生体ターゲティング部分の改良調製及び精製法であって、インビボ放射性医薬品用途に適した高純度組成物を与える方法に対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】国際公開番号国際公開第２０１３／１７４９０９号
【発明の概要】
【００２８】
本発明では、18Ｆ標識アミノオキシ官能化生体ターゲティング部分に存在する放射化学的不純物を同定し、かかる不純物レベルが経時的にどのように変動するかを分析した。そうした検討の結果、精製の際のインプロセス放射線分解がＲＣＰ（放射化学的純度）の問題の根本原因であったとの知見が得られた。
【００２９】
これは以下のように理解することができる。例えば、本発明の放射性トレーサーは、精製してインビボ用に製剤化する際、約５００〜７００ＭＢｑ／ｍＬ（０．５〜０．７ＧＢｑ／ｍＬ）の放射能濃度（ＲＡＣ）で存在する。放射性トレーサーは、かかるＲＡＣ条件下で十分な安定性又は最小限の分解を示す。ただし、それは、ＲＡＣが約１０〜１５ＧＢｑ／ｍＬの範囲内にある粗反応混合物から得られる。さらに、本発明者らは、精製時（つまり放射性合成の最後）に、クロマトグラフィーカラムの容積１ｍＬ未満の密なバンドに約４５ＧＢｑの放射能が濃縮されるという知見を得た。これは精製時に＞４５ＧＢｑ／ｍＬのインプロセスＲＡＣを招く。精製は最大２０分かかるので、インプロセス放射線分解のリスクは高い。
【００３０】
本発明は、精製を実施しながら放射性トレーサーを安定化する方法を提供し、向上した放射能収率及び組成物も提供する。本発明は、18Ｆ−アミノオキシ官能化生体ターゲティング部分を含む放射性トレーサーの精製方法を提供する。実際には、本方法は精製方法であるとともに放射線安定化（つまり放射能分解に対する安定化）方法でもある。例えば、精製時のインプロセス放射線分解の防止によって、不純物の生成が抑制されるので、本発明は放射化学的純度も向上させる。本方法は、クロマトグラフィーの際のインプロセス損失が最小限に抑制されるので、放射化学的収率も向上させる。例えば、インプロセス放射線安定化のないＨＰＬＣ精製と比較して、本発明は６５％もの収率増加をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
第１の態様では、本発明は、放射性トレーサーの精製方法であって、
（ａ）18Ｆ標識アミノオキシ官能化生体ターゲティング部分を含む放射性トレーサーを用意するステップと、
（ｂ）放射性トレーサーに放射線防護剤を添加して、有機溶媒含有量５〜２５ｖ／ｖ％の１種以上の水混和性有機溶媒水溶液中に放射性トレーサーを含む放射性トレーサー溶液を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の放射性トレーサー溶液を逆相ＳＰＥカートリッジに流して、放射性トレーサーをＳＰＥカートリッジに保持するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のＳＰＥカートリッジを、有機溶媒含有量１５〜２５ｖ／ｖ％の放射線防護剤の水混和性有機溶媒水溶液を含む洗浄溶液で１回以上洗浄するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）のＳＰＥカートリッジを水又は水性緩衝液で１回以上洗浄するステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）又は（ｅ）の洗浄済みＳＰＥカートリッジを、エタノール含有量３５〜８０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液中に放射線防護剤を含む溶出溶媒で溶出して、溶出溶媒中に精製放射性トレーサーを含む溶出液を得るステップと
を含んでおり、各放射線防護剤が独立にアスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸及びゲンチシン酸並びにこれらと生体適合性陽イオンとの塩の１種以上を含む方法を提供する。
【００３２】
「放射性トレーサー」という用語は、その通常の意味を有し、生理学的又は生物学的プロセスに影響を与えずにそれらを追跡するために使用される放射性医薬品をいう。「放射性医薬品」という用語は、その通常の意味を有し、イメージング又は治療のため哺乳類の身体にインビボで投与される放射性標識化合物をいう。クロマトグラフィー精製の際、例えばＳＰＥカラムの上にロードされて小さな体積に濃縮される際、放射性トレーサーは一時的に非常に高い放射能濃度（「ＲＡＣ」）に曝露されることがある。そのため、放射線安定性とみえる放射性トレーサーであっても、精製を試みる際に不安定を示し、放射化学的純度（「ＲＣＰ」）及び／又は放射化学的収率が損なわれかねない。
【００３３】
「アミノオキシ官能化」という用語は、アミノオキシ基で官能化された生体ターゲティング部分を意味する。「アミノオキシ基」という用語は、その通常の意味を有し、式−Ｏ−ＮＨ2の置換基、好ましくは−ＣＨ2Ｏ−ＮＨ2をいう。
【００３４】
「生体ターゲティング部分」（ＢＴＭ）という用語は、投与後に、インビボで哺乳類の身体の特定の部位に選択的に取り込まれるか或いは局在化する化合物を意味する。かかる部位は、例えば、特定の病態に関係していることもあるし、臓器又は代謝過程がいかに機能しているかの指標となることもある。
【００３５】
「逆相」という用語は「逆相クロマトグラフィー精製」をいい、この用語はその通常の意味を有し、固定相が親油性で移動相が親水性（通例、水性媒体を含むもの）であるクロマトグラフィーをいう。本発明のクロマトグラフィー技術は、ＳＰＥカラム（「ＳＰＥカートリッジ」ともいう。）を用いた固相抽出（ＳＰＥ）である。かかるＳＰＥカラムは、単回使用（つまり使い捨て）であり、放射性トレーサーの相互汚染のリスクがないという利点を有する。
【００３６】
「有機溶媒含有量５〜２５ｖ／ｖ％の水混和性有機溶媒水溶液」という用語は、水溶液（例えば、水自体、生理食塩水、水性緩衝液又はこれらの混合物）を１種以上（２種以上であってもよい）の水混和性有機溶媒と混合したものいう。したがって、５〜２５ｖ／ｖ％び有機溶媒含有量は、１種類の有機溶媒又は２種以上の有機溶媒に基づくものである。水混和性有機溶媒は当技術分野で公知であり、アセトニトリル、Ｃ1-4アルコール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジオキサン、アセトン、２−メトキシエタノール、ＴＨＦ及びエチレングリコールが挙げられる。
【００３７】
「放射線防護剤」という用語は、水の放射線分解で生じる含酸素フリーラジカルのような反応性の高いフリーラジカルを捕捉することによって、酸化還元反応のような分解反応を抑制する化合物を意味する。本発明の放射線防護剤は、好適には、アスコルビン酸、パラ−アミノ安息香酸（つまり４−アミノ安息香酸）、ゲンチシン酸（つまり２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及びそれらの生体適合性陽イオンとの塩から選択される。「生体適合性陽イオン」という用語は、イオン化した負荷電基と塩を形成する正荷電の対イオンを意味するが、正荷電対イオンも無毒性であって哺乳類の身体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの具体例としては、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンが挙げられる。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００３８】
本発明の方法は、ＳＰＥカラムに結合した状態で残る化学種、例えば非常に親油性の化学種又は粒状物を除去する。本発明の方法は、ＳＰＥカラムの固定相に対する親和性の低い親水性不純物を最小限に抑制又は除去し、これらは、ローディングステップ及び洗浄ステップで除去される。かかる親水性不純物としては、塩又はイオン種（フッ素イオンなど）、触媒（アニリン又はＫｒｙｐｔｏｆｉｘなど）並びに放射性トレーサー溶液由来の水混和性有機溶媒が挙げられる。
【００３９】
放射性トレーサーは通常、18Ｆ−フルオロベンズアルデヒド（又は類似体）とアミノオキシ官能化生体ターゲティング部分前駆体との連結反応で得られ、連結したフルオロベンズアルデヒド基は、コンジュゲートに追加の親油性をもたらす。そのため、放射性トレーサーは、逆相ＳＰＥカラムに保持される傾向があるが、非放射性前駆体自体（もっと親水性である）は、第１の態様のローディングステップ（ｃ）並びに洗浄ステップ（ｄ）及び（ｅ）で除去される傾向がある。洗浄ステップ（ｄ）及び（ｅ）は、ステップ（ｂ）の水混和性有機溶媒の除去にも重要である。このようにして放射性トレーサー溶液は精製され、生体ターゲティング部分に基づく不要な非放射性不純物が除去されるが、かかる非放射性不純物が存在していると、インビボで問題とする生体部位に対して放射性トレーサーと競合しかねない。さらに親水性の18Ｆ標識放射性不純物も、同様に除去される傾向にある。したがって、調製時の化合物２の初期レベルは５ｍｇであったが、精製放射性トレーサーでは約２００μｇ（０．２ｍｇ）に低下していた。
【００４０】
好ましい特徴
第１の態様の方法において、放射性トレーサー溶液及び／又は洗浄溶液の水混和性有機溶媒は、好ましくはアセトニトリル、Ｃ2-4アルコール、ＤＭＦ、２−メトキシエタノール、ＴＨＦ及びエチレングリコールから選択される。水混和性有機溶媒は、さらに好ましくは、アセトニトリル及びエタノールから選択される。
【００４１】
アセトニトリルは、広範な放射性トレーサーに対する良好な溶媒であり、酸性でも塩基性でもなく、比較的非反応性であり、そのため広範な官能基と適合性であり、水との混和性が高く、方法のステップ（ｄ）及び（ｅ）におけるＳＰＥカラムの洗浄で容易に除去されるという利点を有する。アセトニトリルは、アニリンを始めとする放射性トレーサー中の不純物の除去に最も効率的な溶媒であることが判明した。放射性トレーサー溶液及び洗浄溶液のアセトニトリル含有量は好ましくは２５ｖ／ｖ％以下であり、それよりも高レベルでは、ＳＰＥカラムからの溶出による放射性トレーサー生成物の損失を招くおそれがある。洗浄溶液中のアセトニトリル含有量は、好ましくは１８〜２２ｖ／ｖ％、さらに好ましくは２０〜２１ｖ／ｖ％である。
【００４２】
放射性トレーサー溶液、洗浄溶液及び溶出溶媒の水性成分のｐＨは好ましくは７．５〜８．５である。これは、好ましくは緩衝液、さらに好ましくはリン酸緩衝液を使用して達成される。
【００４３】
ステップ（ｂ）の放射性トレーサー溶液は好ましくはエタノールを含んでおり、さらに好ましくはアセトニトリルとエタノールを共に含む。エタノールは潜在的に複数の機能を有しており、水混和性有機溶媒（上述）、放射線防護剤又は放射線安定剤、「生体適合性担体」（後述）及び抗菌保存剤（後述）として作用し得る。本発明者らは、「放射線防護剤」（上述）とエタノールとの組合せが、本発明の放射性トレーサーを放射線分解から安定化するのに最も有効であるという知見を得た。放射性トレーサー溶液のエタノール含有量は好ましくは０．５〜５ｖ／ｖ％エタノールである。
【００４４】
添加ステップ（ｂ）は、好ましくは、ステップ（ｄ）について定義した洗浄溶液を添加することによって達成される。
【００４５】
ステップ（ａ）で用意する放射性トレーサー及び／又はステップ（ｂ）の放射性トレーサー溶液は、使用前、特にＳＰＥカラムへのローディングの前に、好ましくは１２〜３０℃、さらに好ましくは１５〜２５℃、最も好ましくは１６〜２２℃の範囲内の温度に冷却する。
【００４６】
ステップ（ｄ）の洗浄溶液は好ましくはエタノールを含んでおり、さらに好ましくはアセトニトリルとエタノールを共に含む。放射性トレーサー溶液中のエタノール含有量は、好ましくは１．０〜３％、さらに好ましくは１．５〜２．５％、最も好ましくは２％ｖ／ｖエタノールである。
【００４７】
第１の態様の逆相ＳＰＥカートリッジは、好ましくは２．７〜１７％の炭素量を有するもの、さらに好ましくはＣ８又はＣ１８  ＳＰＥカートリッジ、最も好ましくはｔＣ１８  ＳＰＥカートリッジである。
【００４８】
ステップ（ｆ）の溶出溶媒は、好ましくは３５〜７０ｖ／ｖ％エタノール水溶液、さらに好ましくは４０〜６０％、最も好ましくは４８〜５２％エタノール水溶液を含み、特に好ましくは５０％エタノール水溶液を含む。
【００４９】
第１の態様の方法において、放射性トレーサー溶液、洗浄溶液及び溶出溶媒に用いられる放射線防護剤は同一であっても異なっていてもよいし、或いは同一であるが、異なる濃度で使用してもよい。好ましくは、放射性トレーサー溶液、洗浄溶液及び溶出溶媒で使用する放射線防護剤は同一である。すると、精製放射性トレーサーに複数の異なる不揮発性成分が存在することがなくなり、インビボ用途により適したものとなる。第１の態様の放射線防護剤は、好ましくは４−アミノ安息香酸又はその生体適合性陽イオンとの塩、さらに好ましくは４−アミノ安息香酸ナトリウムを含む。
【００５０】
放射線防護剤が４−アミノ安息香酸ナトリウムである場合、放射性トレーサー溶液中の好ましい濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、洗浄溶液及び溶出溶媒中の好ましい濃度は２．５ｍｇ／ｍＬである。特に好ましい放射性トレーサー溶液は、５ｍｇ／ｍＬの４−アミノ安息香酸ナトリウム、７９ｇのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ６〜９、好ましくは７〜８．５）及び１６．５ｇのアセトニトリルの混合物中２％のエタノールを含む。特に好ましい洗浄溶液は、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ６〜９、好ましくは７〜８．５）中５ｍｇ／ｍＬの４−アミノ安息香酸ナトリウムを含む。
【００５１】
放射線防護剤が４−アミノ安息香酸ナトリウムである場合、精製ステップと精製ステップの間に、ＳＰＥカートリッジを、窒素ではなく空気でフラッシュするのが好ましい。本発明者らは、酸素が除外される状況とは対照的に、空気の存在下で放射線防護剤４−アミノ安息香酸がより効率的に機能するという知見を得た。
【００５２】
ステップ（ｆ）の精製放射性トレーサーは、好ましくは放射線防護剤として４−アミノ安息香酸又はその生体適合性陽イオンとの塩を３５〜７０％エタノール水溶液中に含む。第２及び第３の態様（後述）で記載する通り、放射性医薬品用途向けには、好ましくは、放射性医薬品は水性生体適合性担体で希釈して、最終エタノール含有量０．１〜１０ｖ／ｖ％とする。
【００５３】
第１の態様のＳＰＥカートリッジは、好ましくは、使用前にまず水混和性有機溶媒、次いでコンディショニング溶液で処理することによってコンディショニングされる。水混和性有機溶媒は、好ましくはエタノールであり、コンディショニング溶液は好適には水性／水混和性有機溶媒混合物、好ましくはステップ（ｄ）の洗浄溶液である。
【００５４】
第１の態様の方法は、好ましくは第３及び第５の態様（後述）に記載の自動合成装置を使用して実施される。
【００５５】
第１の態様の方法において、ＢＴＭは、好ましくは単一アミノ酸、３〜１００量体ペプチド、酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト、酵素阻害剤又は受容体結合化合物を含む。ＢＴＭは、合成したものでも、天然のものでもよいが、好ましくは合成品である。「合成品」という用語とは、その通常の意味を有しており、天然の起源（例えば哺乳類の身体）から単離したものとは対照的に、人工のものを意味する。かかる化合物は、その製造及び不純物プロファイルを十分に制御できるという利点を有する。したがって、天然起源のモノクローナル抗体及びそのフラグメントは、本明細書で用いる「合成品」には属さない。ＢＴＭの分子量は、好ましくは３００００ダルトン以下である。さらに好ましくは、分子量は２００〜２００００ダルトン、最も好ましくは３００〜１８０００ダルトンであり、４００〜１６０００ダルトンが特に好ましい。ＢＴＭが非ペプチドである場合、ＢＴＭの分子量は好ましくは３０００ダルトン以下であり、さらに好ましくは２００〜２５００ダルトン、最も好ましくは３００〜２０００ダルトンであり、４００〜１５００ダルトンが特に好ましい。
【００５６】
さらに好ましくは、ＢＴＭは、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）又は単一アミノ酸、３〜１００量体ペプチド、酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト、酵素阻害剤又は受容体結合化合物を含む。
【００５７】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（つまり、あるアミノ酸のアミンと別のアミノ酸のカルボキシルとを連結するアミド結合）で連結した２以上のアミノ酸（以下で定義）を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物活性を模倣するが、化学的性状がペプチドでない（つまり、ペプチド結合（アミノ酸間のアミド結合）を含まない）生物活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広義に用いられ、性状が完全にはペプチドでない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。「ペプチド類似体」という用語は、以下に記載する１種以上のアミノ酸類似体を含むペプチドをいう。“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ”，  Ｍ．  Ｇｏｏｄｍａｎ他，  Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｅ２２ｃ，  Ｔｈｉｅｍｅ参照。
【００５８】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）又はアミノ酸模倣体を意味し、天然のものでも純粋な合成品であってもよく、光学的に純粋つまり単一の鏡像異性体（したがってキラルなもの）であってもよいし、鏡像異性体の混合物であってもよい。本明細書では、アミノ酸の慣用三文字略語又は一文字略語を用いる。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（つまり、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者に周知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールが挙げられる［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７，（１９８５）参照］。チロシン、ヒスチジン又はプロリンのような放射性標識アミノ酸は有用なインビボイメージング剤として知られている。
【００５９】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）分子は、ブドウ球菌プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインの１つから誘導された５８アミノ酸残基ドメインに基づく。Ａｆｆｉｂｏｄｙは単量体又は二量体の形態で使用でき、Ｎｙｇｒｅｎ［ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７５，２６６８−２６７６（２００８）］及びＮｉｌｓｓｏｎ他［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１０，１６７−１７５（２００７）］による総説がある。これらのＡｆｆｉｂｏｄｙはサイズが比較的小さいので、１０〜２０倍も大きい抗体（〜１５０ｋＤａ）と比べて標的組織浸透及び血液クリアランスに優れているはずである。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、あるｐＨ域条件（ｐＨ５．５〜１１）で安定であるという利点も有する。本発明の好ましいＡｆｆｉｂｏｄｙは、ＨＥＲ２をターゲティングするものである。以下に述べる通り、好ましいＨＥＲ２ターゲティングＡｆｆｉｂｏｄｙは、Ａｆｆｉｂｏｄｙ１を含む。
【００６０】
ＢＴＭが、酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト、酵素阻害剤又は受容体結合化合物である場合、ＢＴＭは好ましくは非ペプチド、さらに好ましくは合成品である。「非ペプチド」という用語は、ペプチド結合（２つのアミノ酸残基間のアミド結合）を全く含まない化合物を意味する。好適な酵素基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は阻害剤には、グルコース及びグルコース類似体、脂肪酸、又はエラスターゼ、アンジオテンシンＩＩ又はメタロプロテイナーゼ阻害剤がある。好適な合成受容体結合化合物には、エストラジオール、エストロゲン、プロゲスチン、プロゲステロンその他のステロイドホルモン、ドーパミンＤ−１又はＤ−２受容体リガンド、及びトロパンのようなドーパミン輸送体用リガンド、並びにセロトニン受容体用リガンドがある。
【００６１】
ＢＴＭは、最も好ましくは３〜１００量体ペプチド又はペプチド類似体である。ＢＴＭがペプチドである場合、好ましくは４〜３０量体ペプチド、最も好ましくは５〜２８量体ペプチドである。
【００６２】
ＢＴＭが酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト又は酵素阻害剤である場合、本発明の好ましいかかる生体ターゲティング分子は合成薬物様低分子（即ち、医薬品分子）である。好ましいのは、トロパンのようなドーパミン輸送体リガンド、脂肪酸、ドーパミンＤ−２受容体リガンド、ベンズアミド類、アンフェタミン類、ベンジルグアニジン類、イオマゼニル、ベンゾフラン（ＩＢＦ）又は馬尿酸である。
【００６３】
ＢＴＭがペプチドである場合、好ましいかかるペプチドとしては、後で定義するペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣ及びペプチドＤの他に、以下のものがある。
・ソマトスタチン、オクトレオチド及び類似体。
・ＳＴ受容体に結合するペプチド（ＳＴとは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）その他の微生物によって産生される耐熱性毒素をいう。）。
・ボンベシン。
・血管作用性小腸ペプチド。
・ニューロテンシン。
・ラミニンフラグメント、例えば、ＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＩＫＶＡＶ、ＬＲＥ及びＫＣＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＰＱＧ。
・白血球集積部位をターゲティングするためのＮ−ホルミル走化性ペプチド。
・血小板第４因子（ＰＦ４）及びそのフラグメント。
・α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのペプチドフラグメント。α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのアミノ酸配列は、以下の参考文献に見出すことができる。α2−抗プラスミン前駆体［Ｍ．Ｔｏｎｅ他，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１０３３（１９８７）］、β−カゼイン［Ｌ．Ｈａｎｓｓｏｎ他，Ｇｅｎｅ，１３９，１９３（１９９４）］、フィブロネクチン［Ａ．Ｇｕｔｍａｎ他，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０７，１４５（１９９６）］、トロンボスポンジン１前駆体［Ｖ．Ｄｉｘｉｔ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３，５４４９（１９８６）］、Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，１９５（１９８４）。
・アンジオテンシンＩＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ他，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，Ｖｏｌ  ２２，９，１０３８−１０４４）及び［Ｓａｒ，Ｉｌｅ］アンジオテンシンＩＩ：Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（Ｒ．Ｋ．Ｔｕｒｋｅｒ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７２，１７７，１２０３）のようなアンジオテンシンの基質又は阻害剤であるペプチド。
・アンジオテンシンＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ。
【００６４】
さらに好ましいＢＴＭペプチドは以下の通り定義されるペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣ及びペプチドＤから選択される。
（ｉ）ペプチドＡ＝Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド。
（ｉｉ）ペプチドＢ＝次式のフラグメントを含むＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド。
【００６５】
【化９】
2017501152.tif 000011
【００６６】
（ｉｉｉ）ペプチドＣ＝以下のアミノ酸配列を含むｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチド。
−Ｃｙｓa−Ｘ1−Ｃｙｓc−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−
（式中、Ｘ1はＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＴｙｒであり、
Ｘ2はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＡｓｎであり、
Ｘ3はＴｈｒ又はＡｒｇであり、
Ｘ4はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、
Ｘ5はＳｅｒ又はＴｈｒであり、
Ｘ6はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
Ｃｙｓa-dの各々はシステイン残基であって、残基ａとｂ及び残基ｃとｄは環化して２つの独立したジスルフィド結合を形成している。）。
（ｉｖ）ペプチドＤ＝次式のランチビオティックペプチド。
Ｃｙｓa−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒb−Ｃｙｓc−Ｓｅｒd−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒc−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓb−（ＨＯ−Ａｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒa−Ｌｙｓd
（式中、
ＸａａはＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｃｙｓa−Ｔｈｒa、Ｓｅｒb−Ｃｙｓb及びＣｙｓc−Ｔｈｒcはチオエーテル結合を介して共有結合しており、
Ｓｅｒd−Ｌｙｓdはリシノアラニン結合を介して共有結合しており、
ＨＯ−Ａｓｐはβ−ヒドロキシアスパラギン酸である。）。
【００６７】
「リシノアラニン結合」という用語は、Ｌｙｓ残基のεアミン基が、Ｓｅｒのヒドロキシ官能基の脱水で生じるＳｅｒ残基とアミン結合として結合し、これらのアミノ酸残基の２つのα炭素原子をつなぐ−（ＣＨ2）−ＮＨ−（ＣＨ2）4−結合を与えるものをいう。
【００６８】
特に好ましいＢＴＭペプチドはペプチドＢ、ペプチドＣ及びペプチドＤである。
【００６９】
かかるペプチドＢとして最も好ましいペプチドは次の式（Ａ）のものである。
【００７０】
【化１０】
2017501152.tif 000012
【００７１】
式中、Ｘ1は−ＮＨ2又は次式のものである。
【００７２】
【化１１】
2017501152.tif 000013
【００７３】
式中、ａは１〜１０の整数である。
【００７４】
式Ａにおいて、ａは好ましくは１である。
【００７５】
好ましいｃ−Ｍｅｔ結合環状ペプチドは以下の配列を有する。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓa−Ｔｙｒ−Ｃｙｓc−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓd−Ｔｒｐ−Ｃｙｓb−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ。
【００７６】
ＢＴＭがペプチドである場合、ペプチドの一端又は両端（好ましくは両端）に代謝阻害基（ＭIG）が結合している。このように両方のペプチド末端を保護することは、インビボイメージング用途で重要である。さもないと、急速な代謝が起こって、ＢＴＭペプチドに対する選択的結合親和性が失われてしまうと予想されるからである。「代謝阻害基（ＭIG）」という用語は、アミノ末端又はカルボキシ末端でのＢＴＭペプチドの酵素（特にカルボキシペプチダーゼのようなペプチダーゼ）代謝を阻害又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基はインビボ用途で特に重要であり、当業者に周知であり、好適には、ペプチドアミン末端に関してはＮ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲG（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲGは、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-10アリールから選択されるＲGを有しているか或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックを含む。）から選択される。かかるアミノ末端ＭIG基として好ましいのはアセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００７７】
ペプチドカルボキシル末端に適した代謝阻害基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックがある。ＢＴＭペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基に適したＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンをＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化したものである。かかるＭIG基として好ましいのはカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましい基はカルボキサミドである。
【００７８】
本発明での使用に適した逆相ＳＰＥカートリッジは、Ｗａｔｅｒｓ社（英国、ハートフォードシャー、エスストリー、センテニアル・パーク、センテニアル・コート７３０−７４０）から入手できる。
【００７９】
アミノオキシ官能化ペプチドは、Ｐｏｅｔｈｋｏ他［Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４５，８９２−９０２（２００４）］，Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ他［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１８，２０８５−２０８９（２００７）］、Ｉｎｄｒｅｖｏｌｌ他［Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ，１６，６１９０−６１９３（２００６）］、Ｇｌａｓｅｒ他［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１９，９５１−９５７（２００８）］又はＤａｌｌ’Ａｎｇｅｌｏ他［Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１，４５５１−４５５８（２０１３）］に記載の方法で調製できる。アミノオキシ基は、適宜２段階でコンジュゲートすることができる。第１段階で、Ｎ−保護アミノオキシカルボン酸又はＮ−保護アミノオキシ活性化エステルを、（例えばＬｙｓ残基のアミン基へのコンジュゲート或いは従来の固相合成によって）ペプチドにコンジュゲートする。第２段階で、中間体のＮ−保護アミノオキシ官能化ペプチドを脱保護し、所望の生成物を得る［上掲のＳｏｌｂａｋｋｅｎ及びＧｌａｓｅｒ参照］。Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸［Ｂｏｃ−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ］及びＥｅｉ−Ｎ−Ｏ−ＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）ＯＨのようなＮ−保護アミノオキシカルボン酸は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社及びＩＲＩＳ社から市販されている。
【００８０】
「保護」とは保護基の使用をいう。「保護基」という用語は、その通常の意味を有し、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度の穏和な条件下で問題の官能基から脱離させるのに十分な反応性をもつように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者に周知であり、好適にはＢｏｃ（Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｅｅｉ（Ｅｅｉはエトキシエチリデンである。）、Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである。）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［即ち１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］又はＮｐｙｓ（即ち３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）から選択される。その他の保護基の使用については、‘Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９１）に記載されている。好ましいアミン保護基は、Ｂｏｃ及びＥｅｉであり、最も好ましくはＥｅｉである。
【００８１】
さらに、アミノオキシ官能化マレイミド  Ｍａｌ−ＡＯについては、Ｐａｄｉｌｌａ  ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ他［米国特許第７９０２３３２号及びＭｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌ．，１０，１７７−１８１（２００８）］に記載されている、
【００８２】
【化１２】
2017501152.tif 000014
【００８３】
二官能性リンカーＭａｌ−ＡＯは、Ｍａｌ−ＡＯのマレイミド官能基とチオールとの選択的反応によって、チオール含有ＢＴＭにアミノオキシ官能基を結合させるのに使用することができる。Ｐａｄｉｌｌａ  ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ（上掲）では、この方法をＭａｌ−ＡＯとＨＥＲ２選択的Ａｆｆｉｂｏｄｙとの連結反応に応用している。
【００８４】
第２の態様では、本発明は放射性医薬組成物の調製方法を提供するが、本組成物は、
（ｉ）第１の態様で定義した放射性トレーサーと、
（ｉｉ）第１の態様で定義した１種以上の放射線防護剤と、
（ｉｉｉ）エタノール含有量０．１〜１０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を含む生体適合性担体と
を哺乳類への投与に適した形態で含んでおり、当該方法は、
第１の態様で定義したステップ（ａ）〜（ｆ）の放射性トレーサー精製方法を実施することと、
（ｇ）任意には、ステップ（ｆ）の精製［18Ｆ］−放射性トレーサーを生体適合性担体で希釈するステップと、
（ｈ）任意には、ステップ（ｇ）の希釈溶液を無菌濾過して［18Ｆ］放射性医薬組成物を得るステップと
を含む。
【００８５】
第２の態様における放射性トレーサー及び放射線防護剤の好ましい実施形態は、第１の態様（上述）に記載した通りであるである。
【００８６】
「生体適合性担体」とは、放射性コンジュゲートを懸濁又は好ましくは溶解できる流体、特に液体であって、組成物が生理学的に認容できるもの、つまり毒性も耐え難い不快感も伴わずに哺乳類の身体に投与することができるようなものである。生体適合性担体は好適には注射可能な担体液であり、例えば、パイロジェンフリーの注射用滅菌水、食塩液のような水溶液（これは注射用の最終製剤が等張性となるように調整するのに都合がよい）、生体適合性緩衝剤を含む水性緩衝液（例えばリン酸緩衝液）、１種以上の張度調節物質（例えば血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えばグルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えばソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えばグリセロール）その他の非イオン性ポリオール材料（例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液である。好ましくは、生体適合性担体はパイロジェンフリーの注射用水又は等張食塩水又はリン酸緩衝液である。
【００８７】
「哺乳類への投与に適した形態」という記載は、無菌でパイロジェンフリーであり、毒性又は有害作用を生じる化合物を含まず、生体適合性ｐＨ（約ｐＨ４．０〜１０．５）で製剤化される組成物を意味する。かかる組成物は、インビボで塞栓を生じる危険性のある粒状物質を含んでおらず、しかも体液（例えば、血液）と接触しても沈殿を生じないように製剤化される。かかる組成物は、生物学的に適合性の賦形剤のみを含み、好ましくは等張性である。
【００８８】
放射性トレーサー及び生体適合性担体は各々、無菌健全性及び／又は放射能安全性、さらに適宜ヘッドスペースの不活性ガス（例えば、窒素又はアルゴン）を維持できるとともに、注射器又はカニューレでの溶液の添加及び吸引も行うことのできる密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。かかる容器として好ましいのは、セプタムシールバイアルであり、気密蓋をオーバーシール（通常はアルミニウム製）と共にクリンプオンする。蓋は、無菌健全性を維持したまま皮下注射針で１回又は複数回穿刺するのに適したもの（例えば、クリンプオン式セプタムシール蓋）である。かかる容器は、所望に応じて（例えばヘッドスペースガスの交換又は溶液の脱気のため）真空に蓋が耐えるとともに、酸素や水蒸気のような外部雰囲気ガスを侵入させずに減圧のような圧力変化に耐えるという追加の利点がある。
【００８９】
好ましい多用量用容器は、患者の複数回分の用量を収容した単一バルクバイアルからなり、臨床症状に応じて製剤の有効期間中様々な時間間隔で１回分の用量を臨床グレードの注射器に吸引することができる。プレフィルド型注射器は患者の１回分の用量つまり「単位用量」を収容するように設計され、そのため好ましくは使い捨てその他臨床用に適した注射器である。
【００９０】
放射性医薬組成物は、抗菌保存剤、ｐＨ調整剤、充填剤、可溶化剤又はモル浸透圧濃度調整剤のような追加の添加剤を適宜含んでいてもよい。
【００９１】
「充填剤」という用語は、製造及び凍結乾燥時における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容される増量剤を意味する。好適な充填剤には、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性の糖又は糖アルコールがある。
【００９２】
「可溶化剤」という用語は、組成物に存在する添加剤であって、溶媒中での薬剤の溶解度を高める添加剤を意味する。かかる溶媒として好ましいのは水性媒質であり、従って可溶化剤は好ましくは水中での溶解度を高める。かかる可溶化剤として適したものとしては、Ｃ1-4アルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）ブロック共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標））、シクロデキストリン（例えば、α−、β−又はγ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン或いはヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン）及びレシチンがある。
【００９３】
「抗菌保存剤」という用語は、細菌、酵母又はカビなどの有害微生物の増殖を阻害する薬剤を意味する。抗菌保存剤は、使用する用量に応じてある程度の殺菌作用を示すこともある。本発明の抗菌保存剤の主な役割は、医薬組成物におけるかかる微生物の増殖を阻止することである。ただし、抗菌保存剤は、投与に先立って組成物の製造に使用されるキットの１種以上の成分における有害微生物の増殖の防止にも適宜使用できる。好適な抗菌保存剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌保存剤はパラベン類である。
【００９４】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳類への投与のための許容範囲（約ｐＨ４．０〜１０．５）内に確実に収まるようにするのに有用な化合物又は化合物混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［つまりトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容される緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容される塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、キットのユーザーが多段操作の一部としてｐＨを調整できるように、ｐＨ調整剤を適宜別個のバイアル又は容器に入れて供給してもよい。
【００９５】
第２の態様の方法は、次のような様々な方法で実施し得る。
１）クリーンルーム環境で各工程を実施する無菌製造技術、
２）無菌製造を用いずに第１の態様の工程（ａ）〜（ｇ）を実施し、最後の工程として滅菌する［例えば、ガンマ線照射、オートクレーブ、乾式加熱又は化学的処理（例えばエチレンオキシド）］最終滅菌、
３）自動合成装置を用いて各工程を実施する無菌製造技術。
【００９６】
方法（３）が好ましい。そこで、第３の態様の方法では、ステップ（ｂ）〜（ｆ）又は（ｂ）〜（ｈ）の少なくとも一方は好ましくは自動化される。さらに好ましくは、自動化は、自動合成装置を使用して実施される。さらに好ましくは、自動合成装置は、単回使用カセットを含む。
【００９７】
「自動合成装置」という用語は、Ｓａｔｙａｍｕｒｔｈｙ他［Ｃｌｉｎ．Ｐｏｓｉｔｒ．Ｉｍａｇ．，２（５），２３３−２５３（１９９９）］に記載されているような単位操作の原理に基づく自動化モジュールを意味する。「単位操作」という用語は、複雑なプロセスが一連の簡単な操作又は反応に集約されることを意味し、広範な材料に適用できる。かかる自動合成装置は、本発明の方法、特に放射性医薬組成物が所望される場合の本発明の方法に好ましい。これらは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＣＴＩ社．、Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社（ベルギー国、Ｂ−１３４８ルヴァン・ラ・ヌーブ、シュマン・デュ・シクロトロン３）、Ｒａｙｔｅｓｔ社（ドイツ）及びＢｉｏｓｃａｎ社（米国）を始めとする様々な供給業者から市販されている［Ｓａｔｙａｍｕｒｔｈｙ他、上掲］。
【００９８】
市販の自動合成装置は、放射性医薬品の製造で生じる液体放射性廃棄物用の適当な容器も提供する。自動合成装置は、適切に設計された放射能作業セル内で使用するように設計されているので、通例、放射線遮蔽が設けられていない。放射能作業セルは、潜在的な放射線量からオペレーターを保護するのに適した放射線遮蔽をもたらすとともに、化学薬品蒸気及び／又は放射性蒸気を除去するための換気装置を与える。自動合成装置は、好ましくはカセットを備える。
【００９９】
「カセット」という用語は、合成装置の可動部材の機械的運動がカセットの外側から（つまり外部から）カセットの動作を制御するように、自動合成装置（上述）に着脱自在かつ交換可能に装着できるように設計された装置の単位部品を意味する。好適なカセットは直線状に並んだ弁の列を含み、その各々は倒立セプタムシールバイアルの針穿刺又は気密連結継手によって試薬又はバイアルを装着することができるポートに結合している。各弁は、自動合成装置の対応する可動アームとかみ合うはめ込み型継手を有している。カセットを自動合成装置に装着した場合、アームの外部回転が弁の開閉を制御する。自動合成装置の追加の可動部材は、注射器のプランジャー先端をつかみ、注射器外筒を上昇又は降下させるように設計されている。
【０１００】
カセットは汎用性であって、通例は試薬を装着することができる複数の位置、及び試薬のシリンジバイアル又はクロマトグラフィーカートリッジ（例えば、固相抽出（ＳＰＥ））を装着するのに適した複数の位置を有している。カセットは常に反応容器を含んでいる。かかる反応容器は好ましくは１〜１０ｃｍ3、最も好ましくは２〜５ｃｍ3の容積を有しており、カセットの様々なポートから試薬又は溶媒を移送できるように、カセットの３以上のポートが反応容器に連結されるように構成されている。好ましくは、カセットは直線状に並んだ１５〜４０個の弁、最も好ましくは２０〜３０個の弁を有しており、２５個の弁が特に好ましい。カセットの弁は好ましくは各々同一であり、最も好ましくは三方弁である。本発明のカセットは放射性医薬品の製造に適するように設計され、医薬グレードの材料であって理想的には放射線分解にも耐える材料で製造される。
【０１０１】
本発明の好ましい自動合成装置は、放射性フッ素化された放射性医薬品の所定バッチの製造を実施するのに必要なすべての試薬、反応容器及び機器を含むディスポーザブルつまり使い捨てカセットを備える。かかるカセットは、単にカセットを交換するだけで、自動合成装置が相互汚染のリスクを最小限に抑えながら各種の放射性医薬品を製造できる柔軟性をもつことを意味する。カセット方式には、装置構成の単純化とそれに伴うオペレーターエラーのリスクの低減、ＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）コンプライアンスの向上、マルチトレーサー能力、生産作業間の迅速な変更、カセット及び試薬の作業前自動診断検査、実施すべき合成と化学試薬との自動バーコードクロスチェック、試薬のトレーサビリティ、使い捨てであり、そのため相互汚染のリスクがなく、改竄及び誤用を防ぐことができるという利点がある。
【０１０２】
第３の態様の単回使用カセット法は、好ましくは、
（ｉ）第１の態様で定義した精製すべき［18Ｆ］−放射性トレーサー溶液を収容する容器と、
（ｉｉ）１以上の逆相ＳＰＥカートリッジと、
（ｉｉｉ）第１の態様で定義した洗浄溶液の供給源と、
（ｉｖ）第１の態様で定義した溶出溶媒の供給源と
を備える。
【０１０３】
カセットにおける放射性トレーサー、ＳＰＥカートリッジ、洗浄溶液及び溶出溶媒の好ましい実施形態は、第１の態様（上述）で定義した通りである。
【０１０４】
第２の態様の方法は、好ましくは、
（ｊ）ステップ（ｈ）の［18Ｆ］−放射性トレーサー放射性医薬組成物を１以上の注射器に分注するステップ
をさらに含む。
ステップ（ｈ）に続くステップは、ローマ数字の１との混乱を避けるため、意図的に「（ｊ）」とした。
【０１０５】
第３の態様では、本発明は、第２の態様で定義した自動方法を実施するための単回使用カセットを提供するが、当該カセットは、
（ｉ）第１の態様で定義した精製すべき［18Ｆ］−放射性トレーサー溶液を収容するのに適した容器と、
（ｉｉ）第１の態様で定義した１以上ＳＰＥカートリッジと、
（ｉｉｉ）第１の態様で定義した洗浄溶液の供給源と、
（ｉｖ）第１の態様で定義した溶出溶媒の供給源と
を備える。
【０１０６】
カセット中の放射性トレーサー、ＳＰＥカートリッジ、洗浄溶液及び溶出溶媒の好ましい実施形態は、第１の態様（上述）で定義した通りである。
【０１０７】
第４の態様では、本発明は、第１の態様の調製方法又は第３の態様の放射標識方法を実施するための自動合成装置の使用を提供する。
【０１０８】
第４の態様における自動合成装置の好ましい実施形態は、第２の態様（上述）に記載した通りであるである。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＳＰＥカラムの側面を含めてＦａｓｔＬａｂカセット全体に複数の放射能検出器を配置して用いた、ローディング、洗浄及び溶出プロセスの際のＳＰＥカラムを通過する化合物３の放射能溶出プロファイルを示す図である。
【図２】化合物３の自動放射合成及び自動精製のためのＦａｓｔＬａｂカセットの構成を示す図である。
【実施例】
【０１１０】
以下に詳しく記載する非限定的な実施例で本発明を説明する。例１は、本発明のｃ−Ｍｅｔターゲティングペプチド（「ペプチド１」）の合成について提示する。例２は、アミノオキシ官能基を保護基（Ｅｅｉ）で保護したアミノオキシ官能化ペプチド１（「化合物１」）の合成とその後で化合物２を得るための脱保護について提示する。例３は、［18Ｆ］−フルオロベンズアルデヒドの放射性合成について提示する。例４は比較例であり、本発明の方法を用いない18Ｆ標識コンジュゲート化合物３の放射性合成について提示する。この場合のＲＣＰは合成終了時点で比較的低い（７９％）。
【０１１１】
例５は、例４に従って精製した低ＲＣＰ化合物３における放射化学的不純物の同定及び経時的変化について提示する。本例は、クロマトグラフィー精製の際のインプロセス放射線分解が低ＲＣＰの原因であることの証拠を示す。例５は、ＳＰＥ精製時のＳＰＥカラムを通過する放射能の動向に関する情報を与え、ＳＰＥプロセスの際のＲＡＣが４５ＧＢｑ／ｍＬを超えることを例証する。この極めて高いが、時間限定的なＲＡＣも、インプロセス放射線分解の指標である。
【０１１２】
例７は、自動合成装置及びカセットを使用した化合物３の自動合成及び精製について提示する。２．５ｍｇ／Ｎａ−ｐＡＢＡを含有するＭｅＣＮ／ＰＢＳ精製溶液の調合によって、ＥＯＳ収率は顕著な増加したが、ＥＯＳ  ＲＣＰは依然として低く、高ＲＡＣの影響を受けやすい（２５ｍＬの製剤で、ＲＡＣが６６０ＭＢｑ／ｍＬのときのＲＣＰ＝８９％、ＲＡＣが８４４ＭＢｑ／ｍｌのときのＲＣＰ＝８５％）。ＥＯＳ時の高いＲＡＣは、精製プロセスの後段でのカートリッジでさらに高いＲＡＣを示す。ＲＣＰは、放射性トレーサー溶液のＮａ−ｐＡＢＡ含有量を５ｍｇ／ｍＬに増加することによってさらに向上して８９〜９１％となった。エタノール（２％）を放射性トレーサー溶液及び洗浄溶液に添加することによって、ＲＣＰはさらに向上して＞９２％となった。例７のプロセスは、ペプチド関連不純物の８５％及び本質的にすべてのアニリンを除去する（精製前の粗生成物中に存在する１０００００μｇのアニリンのうち残存していたのは２０μｇであった）。ｐＡＢＡ及びエタノールの添加は、化学不純物の除去に関するＳＰＥ精製の性能に悪影響を与えなかった。
【０１１３】
例８は、二官能性アミノオキシマレイミドリンカー（化合物４）の合成について提示する。
【０１１４】
【表１】
2017501152.tif 000015
【０１１５】
略語
慣用の一文字又は三文字アミノ酸略語を使用する。
Ａｃ：アセチル
Ａｃｍ：アセトアミドメチル
ＡＣＮ又はＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＡｃＯＨ：酢酸
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＴＭ：生体ターゲティング部分
ｔＢｕ：第３級ブチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
Ｅｅｉ：エトキシエチリデン
Ｅｅｉ−ＡＯＡｃ−ＯＳｕ：Ｎ−（１−エトキシエチリデン）−２−アミノオキシ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル
ＥＯＳ：合成終了時
ＦＢＡ：４−フルオロベンズアルデヒド
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＭＷ：分子量
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ：１−メチル−２−ピロリジノン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＲＡＣ：放射能濃度
ＲＣＰ：放射化学的純度
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ：トリチル。
【０１１６】
例１：ペプチド１の合成。
【０１１７】
ステップ（ａ）：保護前駆体線状ペプチドの合成
前駆体線状ペプチドは、構造：Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有する。
【０１１８】
０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から出発してＦｍｏｃ化学を使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３Ａペプチド合成装置で、ペプチジル樹脂Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ψMe,Meｐｒｏ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーを構築した。カップリングステップでは、過剰の１ｍｍｏｌ予備活性化アミノ酸（ＨＢＴＵを使用）をアプライした。Ｇｌｕ−Ｔｈｒシュードプロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ０５−２０−１１２２）を配列に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した無水酢酸（１ｍｍｏｌ）及びＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）の溶液で６０分間処理した。無水物溶液を濾過により除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄し、窒素気流下で乾燥した。
【０１１９】
２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾール及び２．５％の水を含有するＴＦＡ（１０ｍＬ）中で、側鎖保護基の同時除去及び樹脂からのペプチドの切断を２時間３０分行った。樹脂を濾過により除去し、ＴＦＡを減圧除去し、残渣にジエチルエーテルを添加した。生じた沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、風乾して２６４ｍｇの粗ペプチドを得た。
【０１２０】
分取ＨＰＬＣ（勾配：２０〜３０％Ｂ、４０分間、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３０分）によって粗ペプチドを精製して、１００ｍｇの純粋なペプチド１線状前駆体を得た。分析ＨＰＬＣ（勾配：１０〜４０％Ｂ、１０分間、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍ、生成物の保持時間：６．５４分）によって、純粋な生成物を分析した。エレクトロスプレー質量分析を使用して、生成物の追加の特性確認を行った（ＭＨ22+計算値：１４６４．６、ＭＨ22+実測値：１４６５．１）。
【０１２１】
ステップ（ｂ）：単環式Ｃｙｓ４−１６ジスルフィド架橋の形成
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2
ステップ（ａ）の線状前駆体（１００ｍｇ）を５％ＤＭＳＯ／水（２００ｍＬ）に溶解し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ６に調整した。反応混合物を５日間撹拌した。次いで、ＴＦＡを使用してこの溶液をｐＨ２に調整し、真空中で蒸発によって溶媒の大半を除去した。生成物の精製のため、残留物（４０ｍＬ）を分取ＨＰＬＣカラムに少しずつ注入した。
【０１２２】
分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂで１０分間、次いで０〜４０％Ｂで４０分間、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍ、生成物の保持時間：４４分）によって残留物を精製して、７２ｍｇの純粋なペプチド１単環式前駆体を得た。分析ＨＰＬＣ（勾配：１０〜４０％Ｂ、１０分間、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍ、生成物の保持時間：５．３７分間（Ｐ１）；５．６１分間（Ｐ２）；６．０５分間（Ｐ３））によって、純粋な生成物（異性体Ｐ１〜Ｐ３の混合物）を分析した。エレクトロスプレー質量分析を使用して、生成物の追加の特性確認を行った（ＭＨ22+計算値：１４６３．６、ＭＨ22+実測値：１４６４．１  Ｐ１）；１４６４．４（Ｐ２）；１４６４．３（Ｐ３））。
【０１２３】
ステップ（ｃ）：第２のＣｙｓ６−１４ジスルフィド架橋（ペプチド１）の形成
窒素雰囲気下で、工程（ｂ）の単環式前駆体（７２ｍｇ）を７５％ＡｃＯＨ／水（７２ｍＬ）に溶解した。１Ｍ  ＨＣｌ（７．２ｍＬ）及び０．０５Ｍ  Ｉ2のＡｃＯＨ（４．８ｍＬ）溶液をこの順に添加し、混合物を４５分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を添加して、無色の混合物を得た。溶媒の大半を真空中で蒸発させ、残留物（１８ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（４ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを使用して生成物を精製した。分取ＨＰＬＣ（勾配：０％Ｂで１０分間、次いで２０〜３０％Ｂで４０分間、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍ、生成物の保持時間：４３〜５３分）によって残留物を精製して、５２ｍｇの純粋なペプチド１を得た。分析ＨＰＬＣ（勾配：１０〜４０％Ｂ、１０分間、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）５０×２ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍ、生成物の保持時間：６．５４分）によって、純粋な生成物を分析した。エレクトロスプレー質量分析を使用して、生成物の追加の特性確認を行った（ＭＨ22+計算値：１３９１．５、ＭＨ22+実測値：１３９２．５）。
【０１２４】
例２：化合物２の合成、精製及び凍結乾燥
ペプチド１（０．７９７ｇ）及びＥｅｉ−ＡＯＡｃ−ＯＳｕ（ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；１２７ｍｇ）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（１００μＬ）を添加し、反応混合物を２６分間振盪した。ＤＩＰＥＡ（８０μＬ）の第２のアリコートを添加し、反応混合物を２時間振盪した。次いで、１０％ＡＣＮ／水／０．ｌ％酢酸アンモニウム（４０ｍＬ）で反応混合物を希釈し、Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水及びＢ＝ＡＣＮ（２０〜４０％Ｂ、４０分間の勾配溶出）を使用して分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な生成物を含有する画分（化合物１と化合物２の混合物が存在する）をフラスコにプールし、アルゴンでフラスコをフラッシュした。この溶液を一晩撹拌して、Ｅｅｉ保護基を完全に除去した。脱保護生成物を凍結乾燥して、５５０ｍｇ（収率６９％）の化合物２を得た。
【０１２５】
分析ＬＣ−ＭＳ（勾配：１０〜４０％Ｂ、５分間、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ  ＴＦＡ、流速：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍ、生成物の保持時間：３．００分）によって、純粋な生成物を分析した。ＭＨ22+計算値：１４２８．１、ＭＨ22+実測値：１４２７．９）。
例３：［18Ｆ］−フルオロベンズアルデヒド（18Ｆ−ＦＢＡ）の放射性合成
銀標的を有するＧＥＭＳ  ＰＥＴｔｒａｃｅサイクロトロンを用いた［18Ｏ］（ｐ，ｎ）［18Ｆ］核反応によって［18Ｆ］−フッ化物を生成させた。３．２〜４．８ｍＬの全目標体積を使用した。放射性フッ化物を（炭酸塩でプレコンディショニングした）Ｗａｔｅｒｓ  ＱＭＡカートリッジ上に捕捉し、水（８００μＬ）及びアセトニトリル（２００μＬ）中のＫｒｙｐｔｏｆｉｘ2.2.2.（５．１４ｍｇ）及び重炭酸カリウム（１．４０ｍｇ）の溶液でフッ化物を溶出した。この溶液を、窒素を使用してＱＭＡカートリッジから反応容器に移した。定常窒素気流及び真空下、［18Ｆ］−フッ化物を１２０℃で９分間乾燥させた。ＤＭＳＯ（２．０ｍＬ）中のトリメチルアンモニウムベンズアルデヒドトリフレート［前駆体１；Ｈａｋａ他，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｏｍｐ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，２７，８２３−８３３（１９８９）］（３．７ｍｇ）を乾燥［18Ｆ］−フッ化物に添加し、混合物を８０℃で２分間加熱して、４−［18Ｆ］−フルオロベンズアルデヒドを生成させた。
【０１２６】
例４：化合物３の放射性合成（比較例）
例２の化合物２を、例３の18Ｆ−ＦＢＡを使用して18Ｆで放射標識し、次いで本発明のインプロセス放射線安定化を使用せずに、ＭＣＸ＋ＳＰＥカラムを使用して精製して、ＲＣＰが７９％の化合物３を得た。
【０１２７】
例５：低ＲＣＰ化合物３における放射化学的不純物
例３の通り調製した化合物３のＲＣＰを時間の関数として調べた。ＲＣＰは、時間が経過しても（最大８時間）それ以上低下せず、
（ｉ）化合物３は、ＳＰＥプロセス終了時に存在するＲＡＣ条件で比較的放射線安定性であること、
（ｉｉ）ＲＣＰはＳＰＥプロセス終了時に既に低下していることを示していた。
【０１２８】
例４の化合物３（つまり本発明の放射線安定化方法を使用せず、低いＲＣＰ（７９％）を示すもの）の分析から、２種類の放射線分解生成物が低ＲＣＰの主な原因であることが判明した。これらは、分析ＨＰＬＣにおける保持時間及び非放射性アナログの基準試料の保持時間との比較によって同定された。これら２種類の放射線分解生成物は、［18Ｆ］４−フルオロベンズアルデヒド（ＦＢＡ）及び［18Ｆ］４−フルオロベンゾニトリル（ＦＰｈＣＮ）であり、これらは合計で、例４の低ＲＣＰの化合物３の標品に存在する放射能の１２％をなしていた。
【０１２９】
これらの時間が経過してもさほど増加しない主要な放射化学的不純物は、化合物３の放射線分解生成物及びひいてはインプロセス放射線分解を代表する。
【０１３０】
例６：化合物３の精製におけるＳＰＥ溶出プロファイル
ＦＡＳＴｌａｂカセットに沿って６個の放射能検出器を配置し、６番目の検出器は、例７による調製のＳＰＥカラムの底に配置した。こうして、ＳＰＥ精製プロセスのローディング、洗浄及び溶出ステップの際の放射能の動向を追跡した。
【０１３１】
結果を図１に示す。粗生成物は、ＳＰＥカートリッジの上端に捕捉されることが判明した。精製の進行に伴って、放射能はカートリッジを下って、検出器６に向かって移動し、シグナルが増大した。これは、放射能がカートリッジ全体に広がらずに、密なバンドに濃縮されることを示している。精製時、すべての放射能が１ｍＬ未満の体積に濃縮され、精製中（２０分まで）のＲＣＡは４５０００ＭＢｑ／ｍＬつまり４５ＧＢｑ／ｍＬであった。
【０１３２】
例７：化合物３の自動合成及び精製
カセット付きのＦＡＳＴｌａｂ自動合成装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用した。ｔＣ１８カートリッジはＷａｔｅｒｓ社（住所は上記の通り）から入手した。前駆体１はＦａｓｔｌａｂ上で例３に従って［18Ｆ］−フッ化物と反応させ、［18Ｆ］−ＦＢＡを得た。［18Ｆ］−ＦＢＡを次いでＦａｓｔＬａｂ上で化合物２（ペプチド１のアミノオキシ誘導体）と反応させて、粗化合物３を得た。
【０１３３】
精製
カセットの構成を図２に示す。３個の外部溶媒バイアルをＳＰＥ精製用カセットで使用した。
位置１７＝無水エタノール；
位置１８＝７９ｇＰＢＳ／１６．５ｇＭｅＣＮ中５ｍｇ／ｍＬのＮａ−ｐＡＢＡ及び２％ＥｔＯＨの洗浄溶液；
位置２０＝８０ｍｇのＮａ−ｐＡＢＡを含有する３４ｍＬＰＢＳの配合用緩衝液。
【０１３４】
他のカセット位置：
位置２１：位置２２のｔＣ１８カートリッジへの配管；
位置２２：ｔＣ１８カートリッジ；
位置２３：滅菌フィルター。
【０１３５】
ＦＡＳＴｌａｂ手順
以下、Ｐ１７などはカセットの位置１７をいう。Ｓ２及びＳ３は注射器２及び注射器３をいう。
（ｉ）精製プロセスの最初の部分は、Ｐ１７からエタノールを完全に充填したＳ２でコンディショニングし、次いでＰ１８からＭｅＣＮ／ＰＢＳ溶液を完全に充填したＳ２でコンディショニングすることであった。
（ｉｉ）連結ステップ由来のエタノール水溶液溶液中の粗化合物３を、Ｐ２０から配合用緩衝液で１：１に希釈した。これは２つの部分で実施した：反応容器の粗生成内容物の半分をＳ２に移し、次いでＰ２０からの同量の配合用緩衝液と混合した。この混合物を、次いで、ｔＣ１８カートリッジにゆっくりと捕捉した。初回の捕捉後、粗生成物の残りの半分に同じ手順を繰り返した。
（ｉｉｉ）Ｓ２を水で濯ぎ、次いでＰ１８からＭｅＣＮ洗浄溶液でＳ２を完全に充填した。ＭｅＣＮ洗浄溶液を、ｔＣ１８カートリッジを通してゆっくりと押出し、廃棄した。これをさらに５回繰返し、かかる洗浄を合計６回行った（この手順は洗浄が合計３回だけでも同様の結果が得られた）。
（ｉｖ）ｔＣ１８カートリッジのＭｅＣＮを溶媒交換により除去した。まずＰ２０から配合用緩衝液でＳ２を２回完全に充填し、その後ウォーターバッグからの水で１回Ｓ２を完全に充填した。
（ｖ）溶出液を、Ｐ１７からの３ｍＬのエタノールとＰ２０からの３ｍＬの配合用緩衝液とをＳ２で混合することによって調製した。溶出液の最初の１ｍＬをｔＣ１８に通して廃棄し、次いで４ｍＬの溶出液をｔＣ１８に通し、精製化合物３をＳ３に回収した。溶出後、生成物をＦＡＳＴｌａｂからＰ１９を通して製品バイアルに移動させた。
【０１３６】
この例での放射化学的純度（ＲＣＰ）は９２％であった。
【０１３７】
例８：二官能性リンカー（化合物４）の合成
【０１３８】
【化１３】
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【０１３９】
Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド  ＴＦＡ−塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；１５１ｍｇ）及びＥｅｉ−ＡＯＡｃ−ＯＳｕ（ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；７７ｇ）を、ＮＭＰ（２ｍＬ）中で周囲温度で撹拌した。トリメチルピリジン（８０μＬ）を添加し、反応混合物を周囲温度で７０分間撹拌した。反応は、０．１％酢酸（７ｍＬ）で希釈することによって停止させた。生成物を、分取ＨＰＬＣによって以下の通り精製した。
【０１４０】
【表２】
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【０１４１】
精製化合物４を凍結乾燥した。収率４３ｍｇ（７５％）、純度：＞９７面積％。
【０１４２】
分析ＬＣ−ＭＳ（勾配：Ｂ１０〜４０％、５分間、Ａ＝Ｈ2Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流速：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）２０×２ｍｍ、検出：ＵＶ  ２１４ｎｍ、生成物保持時間：１．９３分）によって純粋生成物を分析した（ＭＨ+計算値：２８４．１、ＭＨ+  実測値：２８４．１）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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