(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus  crispatus）262-1および該菌株を含む微生物接種剤およびその応用を開示し、前記ラクトバチルス・クリスパタス262-1は、ラクトバチルス・クリスパタス属に属する新規菌株であり、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心での寄託番号がCGMCCNo.6469であり、具体的には前記ラクトバチルス・クリスパタス262-1は膣の主要菌であり、比較的強い酸、H2O2の生成能力、および膣上皮細胞への付着能力を有し、細菌性膣症や各種膣感染に対する抵抗効果が顕著であり、且つ安全無毒で、安定性がよく、長期保存が可能である。さらに、婦人科疾患の予防および/または治療に用いる医薬品の調製における用途、女性サプリメント製品例えば医療機器、消毒製品または化粧品における応用に関する。  【選択図】      図３Ｄ
2017501741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・クリスパタス  262-1と命名されることを特徴とし、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心での寄託番号がCGMCCNo.6469であるラクトバチルス・クリスパタス。
【請求項２】
請求項１のラクトバチルス・クリスパタス 262-1から抽出されるDNAは，BLASTプログラムでその塩基配列の配列類似性を比較分析し、GenBankデータベース内のラクトバチルス・クリスパタスの塩基配列との相同性が最も高い値は98％より大きいことを特徴とする分離されたDNA分子。
【請求項３】
膣の病原菌の抑制に用いる薬剤の製造における請求項１に記載のラクトバチルス・ クリスパタス  262-1の応用。
【請求項４】
前記病原菌がガルドネレラ、モニリア・アルビカンス、atopobium、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌またはサルモネラ菌を含むことを特徴とする請求項３に記載の応用。
【請求項５】
膣疾患の予防および/または治療に用いる医薬品の製造における請求項１に記載のラクトバチルス・ クリスパタス  262-1の応用。
【請求項６】
前記膣疾患は、外陰膣カンジダ・アルビカンス、トリコモナス膣炎、老人性膣炎、非特異性膣炎または混合感染の膣炎であることを特徴とする請求項５に記載の応用。
【請求項７】
膣内細菌叢のバランスを調節する医薬品の製造における請求項１に記載のラクトバチルス・クリスパタス  262-1の作用。
【請求項８】
膣上皮細胞への付着機能を有する医薬品の製造における請求項１に記載のラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用。
【請求項９】
婦人科用医療機器における請求項１に記載のラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用。
【請求項１０】
前記医療機器は、膣鏡（colposcope）、婦人科用セルフチェックミラー、膣拡張器、膣鏡（vaginal speculum）、婦人科骨盤内炎症性疾患の治療機器、婦人科用洗浄機または婦人外用静菌器を含むことを特徴とする請求項９に記載の応用。
【請求項１１】
婦人科用消毒製品における請求項１に記載のラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用。
【請求項１２】
前記消毒製品は、粘膜の消毒液、粘膜の消毒軟膏、婦人科用消毒保護パット、婦人科用消毒ティッシュ、婦人科用外用静菌ジェル、婦人科用外用静菌軟膏または婦人科用消毒剤を含むことを特徴とする請求項１１に記載の応用。
【請求項１３】
女性陰部用化粧品における請求項１に記載のラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用。
【請求項１４】
前記化粧品は、女性陰部ケア液、女性陰部ケアクリーム、女性陰部ケア軟膏、女性陰部ケア膜またはボディーシャンプーを含むことを特徴とする請求項１３に記載の応用。
【請求項１５】
微生物接種剤の有効成分がラクトバチルス・クリスパタス  262-1であることを特徴とする請求項１に記載のラクトバチルス・クリスパタス  262-1で製造される微生物接種剤。
【請求項１６】
前記微生物接種剤の形態が液状、固体またはゲル状であることを特徴とする請求項１５に記載の微生物接種剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス属の新しい菌株およびその応用に関し，具体的にはラクトバチルス・クリスパタスに関し、膣のマイクロ環境を調節し、膣のガルドネレラ（BV病原菌）を抑制すると同時に、著しいモニリア・アルビカンスおよび病原菌の抑制作用を有し、臨床上最もよく見られる真菌感染を合併する細菌性膣炎の治療薬品および日常女性ケア製品の製造における応用において大きな優位性と潜在力を秘めている。
【背景技術】
【０００２】
健康な女性の膣内には種々な微生物が存在し、それらは宿主、環境と互いに制約し、互いに調和し、動的なバランスが取れた膣内マイクロ生態系を構成する。健康な女性の膣内細菌叢は、主にラクトバチルスで構成され，ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・イエンセンとラクトバチルス・ガセリ等を含む。正常な場合にラクトバチルスは膣の保護作用を果たすが、ラクトバチルスが多数を占める膣内マイクロ生態系の乱れは膣炎を引き起こす恐れがある。
【０００３】
細菌性膣炎（BV）は、膣内細菌叢のバランスが崩れ，寄主自身のラクトバチルスの減少によって他の条件性病原性微生物、例えばガルドネレラ、各種の嫌気性菌、ビブリオ菌等の大量繁植を引き起こし，実際に、BVはガルドネレラを主とする混合感染である。抗生物質治療を応用することで、一時的にBVの症状を緩和することはできるが、すでに少なくなっているラクトバチルスがさらに減少し，膣内のマイクロ生態バランスが一層崩れ，それによりBVは再発を繰り返す。どのようにして再発を制御し、細菌性膣炎を根治できるかは産婦人科医師にとって一刻も早く解決しなければならない難題である。
【０００４】
同様に、女性の膣は非常に感染しやすいため，多数の女性は日常的に婦人科消毒製品、ケア製品および保護製品を使って、疾患を予防し、衛生を維持し、ケアするが、さまざまな問題が頻繁に現れる。正常な場合，膣内には大量の人に有益な細菌が生存し、膣表皮細胞に貯存された糖元素を乳酸に分解して、膣の酸性を維持することにより、膣内での病原菌繁殖を防ぐ自然防御を構成する。消毒剤で洗浄または腰浴することは，膣の防御機能を破壊する恐れがあり、各種の病原菌が膣内に侵入し、多く繁殖することは多くの婦人科疾患の原因となる。陰部用の化粧品は，同じく上記問題があり、ケアが不適切である場合、細菌の温床になりやすく、かゆみ、炎症、婦人科炎症の原因になる。
【０００５】
一方、医療機器は近代科学技術の製品として疾患の予防、診断、治療、保健およびリハビリ過程に幅広く応用され、現代医療分野における重要な診療手段となる。しかし、医薬品と同様で、医療機器は設計要素、材料要素、臨床応用要素等による制限を受けるため，一定のリスクがある。婦人科疾患の検査や治療過程において，検査用機器の材料の成分配合は合理的でなく、洗浄されなくまたは利用者層が敏感すぎる場合，感染しやすい。したがって、婦人科用医療機器の材料、成分、人体との接触面の成分を改善することにより、生体適合性を向上し、感染を引き起こす確率を低下させ、検査の安全性を保障することがより重要になる。
【０００６】
健康な女性膣内には複数種類のラクトバチルスが存在し，個体差があり，且つ病原菌に対する各ラクトバチルスの抵抗能力には明らかな差異がある。ラクトバチルス・プロバイオティクスを選択した場合、ラクトバチルスの種類、その酸とH2O2の生成能力、および膣上皮細胞への付着能力を総合的に考慮する必要があり、そのうちラクトバチルスが膣に定植できるかどうかは、ラクトバチルスおよびラクトバチルスを活性成分とする微生物接種剤が継続的に作用する基礎であり、ラクトバチルスが治療効果を発揮する肝心な要素である。研究によると、H2O2を生成させるラクトバチルスは健康な女性膣内の主要菌で、女性膣を病原体の感染から保護する重要な要素であり、また、ラクトバチルスの代謝によって生成された酸と一部の静菌要素も他の細菌の成長と繁植を効果的に抑制することができる。現在、市販の製品は中国女性膣の主要細菌叢ではなく、定植能力が比較的低く、安定した生菌含有量も維持できなく、婦人科の臨床上のニーズを満たすことができない。
【０００７】
以上の説明のように，中国女性膣に適す健康な細菌叢を分離させて選別して、対応する医薬品、サプリメント、化粧品および医療機器を研究・開発することは、中国女性に有益である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明が解決した技術的問題は、人の健康に有利で、アクティブで安定した生物学的特性を有し、静菌能力が強いラクトバチルス・クリスパタスおよびその応用を提供することである。
【０００９】
前記技術的問題を解決するために，本発明は以下のような技術的解決手段を採用する。
【００１０】
分離されたラクトバチルス・クリスパタスであって、前記ラクトバチルス・クリスパタスをラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）262-1と命名し、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心での寄託番号はCGMCCNo.6469である。
【００１１】
上記ラクトバチルス・クリスパタス262-1は、中国の健康な出産適齢期女性の膣分泌物から選別され、2012年8月22日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心（CGMCCと略称）に寄託されており、寄託機関の住所は、北京市朝陽区北辰北西路1番院3号、中国科学院微生物研究所であり、寄託登録番号はCGMCCNo.6469であり、該菌株の分類名はラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus  crispatus）である。
【００１２】
前記分離されたラクトバチルス・クリスパタス 262-1  CGMCC No. 6469から抽出されたDNAは、BLASTプログラムでその塩基配列に対して配列類似性を比較分析し、GenBankデータベース内のLactobacillus crispatusの塩基配列との相同性が最も高い値は98％より大きい。
【００１３】
膣の病原菌の抑制に用いる医薬品の製造におけるラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用である。
【００１４】
膣疾患の予防および/または治療に用いる医薬品の製造におけるラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用である。
【００１５】
膣内細菌叢のバランスを調節する医薬品の製造におけるラクトバチルス・クリスパタス  262-1の作用である。
【００１６】
膣上皮細胞への付着機能を有する医薬品の製造におけるラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用である。
【００１７】
婦人科用医療機器におけるラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用である。
【００１８】
婦人科用消毒製品におけるラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用である。
【００１９】
女性陰部用化粧品におけるラクトバチルス・クリスパタス  262-1の応用である。
【００２０】
本発明の菌株ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus  crispatus）262-1は、中国の健康な出産適齢期女性の膣分泌物から選別され、大量の実験によって検証されるように、それはより強い酸とH2O2の生成能力、および膣上皮細胞への付着能力を有し、上記膣病原菌の抑制に用いる医薬品、膣疾患の予防および/または治療に用いる医薬品、膣内細菌叢のバランスを調節する医薬品、膣上皮細胞への付着機能を有する医薬品、婦人科サプリメント例えば婦人科用医療機器、婦人科用消毒製品、女性陰部用化粧品において、いずれの場合も自体の特性による機能を果たせる。
【００２１】
上記ラクトバチルス・クリスパタス  262-1で調製される微生物接種剤であって、前記微生物接種剤の活性成分はラクトバチルス・クリスパタス  262-1である。
【００２２】
ラクトバチルス・クリスパタス  262-1を活性成分として調製された微生物接種剤であって、前記微生物接種剤の形態は液体、固体またはゲル状であり、そのうち、固体状微生物接種剤の形状はカップセルまたは錠剤または粉剤であり、対応的に、該微生物接種剤もラクトバチルス・クリスパタス  262-1と同じまたは類似する様々用途を有する。
【００２３】
上記技術的解決手段の利点は、（１）本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1菌株は長期保存することができ、且つ細菌性膣症と各種膣感染症に抵抗でき、モニリア・アルビカンス性膣炎、淋病、ウイルス性膣炎および尿路感染症等を含む。（2）本発明の菌株は健康な人体から直接採取され、アクティブで安定した生物学的特性を有し、馴養と再生プロセスを必要とせず、直接製剤プロセスに進み、製剤を凍結して乾燥粉末にして4℃で6ヶ月保存しても生菌率が高い。（3）本発明の菌株および微生物接種剤の活性成分は、前記病原菌がガルドネレラ、atopobium、モニリア・アルビカンス、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌またはサルモネラ菌を抑制する作用があり、市販の対照菌と比べ、その膣上皮細胞への付着力、霊長類の膣への定植能力がより優れており、婦人科用医療機器、婦人科用消毒製品、女性陰部用化粧品において巨大な応用可能性を秘めている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1A、1Bは、それぞれ本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1コロニー形態の表面、裏面の写真である。
【図２】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1のグラム染色の顕微鏡検査写真である。
【図３】図3A、3B、3C、3Dは、異なる倍率で拡大した本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1の電子顕微鏡写真である。
【図４】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1のT0、T30、T50の16SrDNA遺伝子のPCR増幅生成物の電気泳動図である。
【図５】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1の過酸化水素を生成させる反応の0min、5min、10minの結果の写真である。
【図６】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1のT0、T30、T50コロニー形態の表面、裏面の写真である。
【図７】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1のT0、T30、T50のグラム染色の顕微鏡検査写真である。
【図８】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1のT0、T30、T50の過酸化水素を生成させる反応の0min、5min、10minの結果の写真である。
【図９】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1（左）とラクトバチラス・デルブリッキー（デルブリュック乳酸杆菌）（右）とが膣ガルドネレラに対する静菌効果写真である。
【図１０】異なる濃度の本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1とラクトバチラス・デルブリッキー（デルブリュック乳酸杆菌）（OD600がそれぞれ0.05、0.1、0.2、0.3である）とがatopobiumに対する静菌効果写真であり、そのうち、各濃度の実験培養皿において、右列の2つはラクトバチルス・クリスパタス  262-1の静菌効果写真であり、左列の１つがラクトバチラス・デルブリッキー（デルブリュック乳酸杆菌）の静菌効果写真である。
【図１１】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1（左）とラクトバチラス・デルブリッキー（右）とがモニリア・アルビカンスに対する静菌効果写真である。
【図１２】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1が赤毛猿の膣に定植した後、赤毛猿膣微生物領域の一部菌株の16SrDNA断片のPCR増幅した生成物の電気泳動図である。
【図１３】本発明のラクトバチルス・クリスパタス  262-1が被検動物に定植した後、検出されるラクトバチルス・クリスパタス  262-1の数量であり、そのうち、縦軸はラクトバチルス・クリスパタス  262-1のCFU値であり、横軸は各動物の5つのサンプル時点を示しており、Day1は定植後の1日目を代表し、以降同様である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（寄託情報）
本発明のラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus  crispatus）262-1は、2012年8月22日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心（CGMCCと略称）に寄託されており、寄託機関の住所は、北京市朝陽区北辰北西路1番院3号、中国科学院微生物研究所であり、寄託登録番号はCGMCCNo.6469であり、該菌株の分類名称はラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus  crispatus）である。
【００２６】
以下の例において、特別な説明がない限り、一般的な実験方法を使用し、市販の材料、試薬を買って使い、T0、T30、T50はそれぞれ第0代、第30代、第50代のラクトバチルス・クリスパタスを表す。
【００２７】
<細菌培地の調製>
1. ラクトバチルス・クリスパタス262-1の選択性培地（Rogosa  SL）の調製：
（1）1.5 g/100mlの比率で寒天粉を脱イオン水に入れて溶液を調製し、密封する。
（2）圧力鍋に入れ、1.0MPaで20分間蒸し、スーパークリーン作業台を開き、紫外線で20分以上照射する。
（3）圧力鍋に圧力がなくなった後、寒天溶液を取り出し、5.97g /100mlの比率でラクトバチルス選択性培地（Rogosa  SL  Broth）を寒天溶液に加える。
（4）0.132ml/100mlの比率で氷酢酸を寒天溶液に加え、密封した後に電子レンジに入れて2.3分間沸騰させる。
（5）培地の温度が室温になった後、培養皿の大きさに応じて約10ml/または20ml/を培養皿に注ぐ。
（6）スーパークリーン作業台内でステップ（3）−（5）の操作を行う。冷却後に寒天状になり、培地の名称および調製日をマークして、4℃の冷蔵庫に入れて、使用に備える。
【００２８】
2. 肉汁固形培地（MRS）の調製：
（1）脱イオン水100mlあたりに1.59gの寒天粉を入れて溶液を調製する。
（2）寒天溶液100mlあたりにMRS  Brothを17.91g加え、均一に混合する。
（3）圧力鍋に入れ、1.0MPaで20分間蒸す。
（4）前記ステップ（5）、（6）と同様である。
【００２９】
3. 肉汁液体培地（MRS）の調製：
（1）脱イオン水100mlあたりにMRS  Brothを17.9lg加える。
（2）圧力鍋に入れ、1.0MPaで20分間蒸す。
（3）圧力鍋に圧力がなくなった後、EP管に装入し、各管に入れる量は1.0mlである。培地の名称および調製日をマークして、4℃の冷蔵庫に入れて、使用に備える。
【００３０】
4.過酸化水素（H2O2）検出用培地の調製：
（1）肉汁固形培地（MRS）の調製ステップ（1）−（4）と同じである。
（2）圧力鍋に圧力がなくなった後、少し冷却さて、液体状態であるうちにスーパークリーン作業台内にTMB（終濃度0.25mg/m1）、HRP（終濃度0.01mg/m1）を入れ、均一に混合する。
（3）培地の温度が室温になった後に培養皿に注ぎ、冷却後に寒天状になり、培地の名称および調製日をマークして、4℃の冷蔵庫に入れて、使用に備える。
【００３１】
<実施例1>ラクトバチルス・クリスパタス262-1細菌叢の分離および接種、精製、集積培養
一、ラクトバチルス・クリスパタス262-1細菌叢の分離と接種
サンプルの収集は米国BD社のPort.A-Cdシステムを採用する。2つの無菌綿棒で被験者膣側壁の上部1/3処の分泌物を収集し、24時間以内に、異なる濃度で調製済みのRogosaSL培地がある培養皿に接種し、且つ情報をマークし、培養皿を入れた嫌気タンクをCO2ガス生成バッグに入れ，37℃の培養器において，48h以上培養する。
【００３２】
二、ラクトバチルス・クリスパタス262-1菌株の精製、集積培養
コロニーの異なる形態（表面、エッジ等）、大きさに基づいてそれぞれカウントし、形態が同じで、大きさが一致するものを同じ種類と記入し、接種ループは一つのコロニー中の細菌を少し取って、「斜線法」に従ってMRS固形培地に接種することにより、分離精製された単一コロニーを得る。爪楊枝でMRS固形培地の単一コロニーの細菌を若干取って、MRS液体培地に接種し、37℃の培養器に入れて，24h-72h間嫌気培養する。選別された新しい菌株をラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus  crispatus）262-1と命名する。
【００３３】
<実施例2>ラクトバチルス・クリスパタス262-1菌種の同定および寄託
一、培養特性、染色の顕微鏡検査および形態学的特徴：
培養後に得られたコロニーは図1に示され、コロニーは灰白色の円状を呈し、中間が膨満し、周囲が拡散して、不規則である。該菌の純粋培養物を塗抹した標本を取って、グラム染色を行った結果は図2に示され、グラム陽性を呈し、短棒状であり、長鎖に連結することができる。電子顕微鏡解析の結果は図3に示され、電子顕微鏡で見ると、該菌株は芽胞、鞭毛、被膜がなく、菌株の大きさは26.824×6.667umである。結果からわかるように、分離された菌株がラクトバチルス属であると初期判定する。
【００３４】
二、16SrDNA遺伝子配列の同定
細菌ゲノムDNA抽出キットでDNAを抽出し、プライマー対8F（5’-AGA  GTT  TGATCC  TGG  CTC  AG-3’）、926R（5’-CCG  TCAATT  CCTTTR  AGTTT-3’）を用いてPCR増幅を行い、そのうち、RはGまたはAを代表し、PCR生成物を取ってゲル電気泳動を行い、16SrDNA遺伝子断片を確定し、好ましい結果は950bpの所で単一で鮮明なPCR生成物バンドを取得することであり、図4のT0列は、好ましいPCR生成物に対して精製およびDNA配列測定を行い、Sanger配列測定法を用いて、配列測定用プライマー対は8F/926Rであり、配列測定機器はABI3730であり、GenBankデータベースのBLASTプログラムを介して配列類似性比較分析を行い、相同性が最も大きい値は98%より大きく、ラクトバチルス属であると判断する。16SrDNAの一部の配列は配列表SEQ  ID  NO：1を参照し、8F配列は配列表SEQ  ID  NO：4を参照し、926R配列は配列表SEQ  ID  NO：5を参照する。
【００３５】
三、生理学的および生化学的特徴：
エスクリンの加水分解試験、メチルレッド試験（MR試験）、フォゲス・プロスカウエルテスト（VP試験）、インドール試験、トリプルシュガー鉄試験、Kligler disaccharide iron試験、ウレアーゼ試験、フェニルアラニンデアミナーゼ試験、アミノ酸脱炭酸酵素試験、ゼラチン液化試験、マロン酸ナトリウム試験、クエン酸塩実験（クエン酸実験）、硝酸塩還元試験、リトマスミルク試験、細菌の運動性試験を介して菌株の生理学的および生化学的反応を測定して以下のような結果を得た。ラクトバチルス・クリスパタス262-1は、エスクリンを加水分解してグルコースおよびエスシンを生成でき、MR試験が陽性を呈することはグルコースを代謝して有機酸を生成することを説明し、VP試験が陰性を呈することはグルコースを代謝いてもピルビン酸が生成されないことを説明し、インドール試験の試験結果は該菌がポリペプトンのトリプトファンを分解せずにインドールを生成することを説明し、トリプルシュガー鉄試験は乳糖・グルコースを代謝してもH2Sを生成しないことを説明し、Kligler disaccharide iron試験は乳糖の代謝ではH2Sが発生しないことを説明し、ウレアーゼ試験、フェニルアラニンデアミナーゼ試験、アミノ酸脱炭酸酵素試験、ゼラチン液化試験はいずれも陰性を呈し、該菌が尿素酵素、フェニルアラニンデアミナーゼ、アミノ酸脱炭酸酵素、ゼラチン酵素を発生しないことを説明し、マロン酸ナトリウム試験、クエン酸塩実験（クエン酸実験）、硝酸塩還元試験はいずれも陰性を呈し、該菌はマロン酸ナトリウムを炭素源としなく、クエン酸塩を窒素源および炭素源として利用しなく、硝酸塩を亜硝酸塩に還元しないことを説明し、リトマスミルク試験によって該菌は牛乳を発酵させるが、凝固させないこと発見し、該菌が活発に成長し、レンネットを生成しないことを説明し、細菌の運動性試験は陰性を呈する。フランスリューメリェックス会社のAPI  50  CHLラクトバチルス同定システムを用いて菌株の生化学同定を行い、同定結果は、24h、48hの時，ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、N-アセチル-グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、スクロース、澱粉を発酵させることができ、反応中に陽性を呈する。グリセリン、エリトリット、D-アラビノース、L-アラビノース、リボース、D-キシロース、L-キシロース、アドナイト、β-メチル-D-キシロシド、ソルボース、ラムノース、evonoside、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、α-メチル-D-マンノシド、α-メチル-D-グルコシド、メリビオース、イヌリン、メレジトース、キシリトール、ゲラニオール、D-ツラノース、D-リキソース、D-タガトース、D-フコース、L-フコース、D-アラビトール、L-アラビトール、グルコン酸、2-ケト-グルコン酸、５-ケト-グルコン酸は発酵しなく、反応中に陰性を呈する。トレハロース、ラフィノース、グリコーゲンは弱陽性を呈し、そのうち、基質がブランクである時反応はいずれも陰性であり、これにより生化学的マップに基づいて菌株の生化学的特徴がラクトバチルス・クリスパタスの生化学的特徴を満たすと判定する。
【００３６】
四、ラクトバチルス・クリスパタス262-1の寄託
本発明のラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus  crispatus）262-1は、2012年8月22日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物中心（CGMCCと略称する）に寄託されており、寄託機関の住所は、北京市朝陽区北辰北西路1番院3号、中国科学院微生物研究所であり、寄託登録番号はCGMCCNo.6469であり、該菌株の分類名称はラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus  crispatus）である。
【００３７】
<実施例3>ラクトバチルス・クリスパタス262-1の代謝生成物の測定
一、ラクトバチルス・クリスパタス262-1代謝生成物における乳酸含有量の測定
D-乳酸検出用試薬キットで当該菌株のD-乳酸の生成量を測定し、測定結果は6.213g/Lであり、センサー分析装置で測定したL-乳酸の含有量は3.789g/Lであり、その結果は下記表1のT0のデータである。
【００３８】
【表１】
2017501741.tif 000003
【００３９】
二、ラクトバチルス・クリスパタス262-1代謝生成物における過酸化水素含有量の測定
Mcgroarty等のペルオキシダーゼ法で過酸化水素の半定量測定を行い、分離・同定ずみのラクトバチルス・クリスパタスをMRS-TMBプレートに接種し、37℃で24時間嫌気培養した後、プレートを取り出し、菌体を空気中に露出させる。H2O2を生成するラクトバチルスコロニーは青色になるが、H2O2を生成しないコロニーは変色しなく、変色時間に基づいて、生成されたH2O2に対して半定量を行い、結果を図5に示し、図を見ると、5minの時、すでにコロニーに青色が出始め、10minの時に顕著な青色になり，表2に示す判定基準に従って、該菌株の代謝によって過酸化水素が生成され、半定量レベルは+++級である。
【００４０】
以上の結果が示すように、本発明のラクトバチルス・クリスパタス262-1は乳酸と過酸化水素を生成することができ，膣のマイクロ生態バランスの維持に有利である。
【００４１】
【表２】
2017501741.tif 000004
【００４２】
<実施例4>抗生物質の感受性試験
2010年バージョンの薬局方の第三部マイクロ生態生菌製品総論中の抗生物質の感受性試験の要件に従って、寒天ペーパーディスク拡散法で抗生物質に対する菌株の感受性を測定し、静菌領域の大きさに基づいて抗生物質に対する菌株の感受性レベルを判断し、測定結果を下記表3に示し、薬剤の感受性試験紙法の静菌範囲の解釈標準に基づいて該ラクトバチルス・クリスパタス菌株は、フラジール（メトロニダゾール）、ゲンタマイシン、バシトラシンおよびカナマイシンに対して薬剤耐性があり、アンピシリン、セフトリアキソン、クロロマイセチン、クリンダマイシン、イミペネム、エリスロマイシン、ピペラシリン、テトラサイクリン、アジスロマイシン、アモキシシリンおよびバンコマイシンに対して敏感し、ペニシリンおよびオキサシリンに対する仲介が判定される。
【００４３】
【表３】
2017501741.tif 000005
2017501741.tif 000006
【００４４】
<実施例5>毒性試験
5匹のSPFレベル昆明種のマウスで試験を行い、一匹のマウスあたりに腹腔へ0.3mlの新鮮なラクトバチルス・クリスパタス262-1の懸濁菌液（1×109CFU/匹以上）を注射する。2010バージョンの中国薬局方の要件に従って、毎日各マウスの体重を測定、観察し、注射前後の行動と生理等の変化を記録する。結果は、すべての動物は7日以内に体重が増加し、著しい中毒症状が見られなく、行動に異常がなく、死亡した動物もないため、該菌株は無毒系菌株であると判断する。
【００４５】
<実施例6>ラクトバチルス・クリスパタス262-1の継代の安定性試験
当実施例は、成長特性、形態学、生化学的特徴、代謝物成分、抗生物質敏感特性、遺伝的特性および毒性検査等様々な側面から該ラクトバチルス・クリスパタス菌株262-1が30代（T30）、50世代（T50）へ継代の安定性を考察する。
【００４６】
一、ラクトバチルス・クリスパタス262-1の分離・精製、コロニー形態観察、染色の顕微鏡検査および生化学特性検査方法は、実施例1および実施例2の第一部分と同じである。結果が示すように、繁殖を経たコロニーの形態を図6に示し、著しい変化がなく、繁殖が安定的である。グラム染色はグラム陽性桿菌を現し、染色の顕微鏡検査の写真を如図7に示す。生化学的同定の24h、48hの結果からわかるように、各世代の生化学的反応特性は一致し、ラクトバチルス・クリスパタスの生化学的特性を満たす。以上の結果は、菌株生化学的特性はラクトバチルス・クリスパタスの生化学的特性を満たし、各世代の生化学的反応特性が一致することを示す。
【００４７】
二、遺伝的特徴の分析
実施例2の第二部分の方法と同じである。それぞれラクトバチルス・クリスパタス262-1の第0代（T0）、第30代（T30）、第50代（T50）菌株に対して16SrDNA断片PCR増幅を行い、PCR増幅生成物に対する気泳動分析を図4に示し、ターゲットバンドは明確且つ単一で、大きさは950bpで、増幅が正しく、T0、T30、T50等3回のPCR増幅結果は一致する。T0、T30、T50のPCR増幅生成物の配列を測定し、その配列それぞれを配列表SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3に示す。測定した序列をNCBIのBLASTツールでGenBankデータベースの既知配列と比較分析してラクトバチルス・クリスパタスとする。
【００４８】
三、代謝生成物の測定
実施例3と同じ方法で、乳酸の測定結果を表1に示し、過酸化水素の測定結果を図8に示し、図中の各世代コロニーは、5minの時にいずれも少量の青色が現れ，10minの時には大量の青色が顕著に現れ、菌株の代謝は過酸化水素を生成することを証明し、半定量レベルは+++である。
【００４９】
四、抗生物質の感受性試験：
実施例4と同じ方法で、寒天ペーパーディスク拡散法により抗生物質に対する菌株の感受性を測定し、薬剤の感受性試験紙法の静菌範囲の解釈標準に基づいて該ラクトバチルス・クリスパタス菌株は、メトロニダゾール、ゲンタマイシン、バシトラシンおよびカナマイシンに対して薬剤耐性があり、クロロマイセチン、クリンダマイシン、イミペネム、エリスロマイシン、ピペラシリン、テトラサイクリンおよびアジスロマイシンに対して敏感し、アンピシリン、セフトリアキソン、ペニシリン、オキサシリン、アモキシシリンおよびバンコマイシンに対する仲介が判定されており、表３に示す。
【００５０】
五、毒性試験
実施例5と同じ方法で、マウス腹腔への注射法で当該ラクトバチルス・クリスパタス262-1のT0、T30、T50世代の菌株に対して毒性試験を行い、そのうち、テスト濃度>109CFU/匹である。結果は、被験のマウス全部は7日以内に中毒症状がなく、いずれも体重が増加し、死亡したものがない。上記結果に基づいて、「新薬薬理、毒理研究技術要求補充説明」に従い、該菌株は無毒系菌株に属する。
【００５１】
総合すると、本実施例はラクトバチルス・クリスパタス262-1をMRS培地で培養して複数回継代させ、形態学、生化学、代謝物特徴および遺伝的特徴、抗生物質の感受性特徴、毒性試験等の側面からラクトバチルス・クリスパタス262-1に対する継代の影響について検討した。結果は、MRSで培養して継代すると、50代以内でその形態学、生化学、遺伝的特徴、代謝物および抗生物質の感受性特徴は最初に分離された菌株と一致し、伝達が安定的であることを示す。
【００５２】
<実施例7>ラクトバチルス・クリスパタス262-1菌株の薬力学的実験
一、ラクトバチルス・クリスパタス262-1菌株のインビトロ静菌実験
（1）ラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーとが体外で膣ガルドネレラを抑制する実験
37℃で、5%のCO2で培養して一晩置いたラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーをそれぞれ接種した菌液をMRS寒天平皿に各5μL取り、37℃の嫌気で48時間培養する。膣ガルドネレラを100μL取り、10mlのBHI液体培地に接種し、37℃の嫌気で48時間培養する。50mlのsoft BHI  agarを吸い取って、2.5ｍｌのウマ血清および1mlのガルドネレラ懸濁液を加えて均一に混合した後、5mlを吸い取り、48時間培養したラクトバチルスMRS寒天プレートに平坦に敷き、それぞれ番号を付けておき、ラクトバチルスの周囲に静菌領域が発生するまで、37℃の嫌気で培養する。結果を図9に示し、そのうち、左図はラクトバチルス・クリスパタス262-1の静菌領域効果で、ノギスで測定した静菌領域の直径は21.68mmであり、右図はラクトバチルス・デルブリッキーの静菌領域効果で，静菌領域の直径は19.32mmであり、結論は、膣ガルドネレラに対する静菌効果はラクトバチルス・クリスパタス262-1がラクトバチルス・デルブリッキーより強い。
【００５３】
（2）ラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーとが体外でatopobiumを抑制する実験
37℃で、5%のCO2で培養して一晩置いたラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーをそれぞれ接種した菌液をMRS寒天平皿に各5μL取り、37℃の嫌気で48時間培養する。37℃の嫌気で培養済みのatopobiumを異なる濃度の初期細菌懸濁液に調製し、そのOD600はそれぞれ0.05、0.1、0.2、0.3である。異なる濃度のatopobium液を取って、コロンビア血液寒天培地の表面全体に均一塗り、培養ずみのラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーは押されて打ち抜き、且つピンセットで細菌塊を取り出し、atopobiumが塗布されているコロンビア血液寒天培地に逆置き、37℃の嫌気で48時間培養した後、静菌領域を観察・記録する。結果を表4および図10にしめし、写真と測定された静菌領域の大きさに基づいて、atopobiumに対する静菌効果はラクトバチルス・クリスパタス262-1がラクトバチルス・デルブリッキーより明らかに強く、ラクトバチルス・クリスパタス262-1の抑制効果はatopobiumの濃度が高くなることに連れて変化しなく、静菌領域の直径は20mm程度であり、ラクトバチルス・デルブリッキーの静菌力はatopobiumの濃度が高くなるほど低下する結論を得た。
【００５４】
【表４】
2017501741.tif 000007
【００５５】
（3）ラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーとが体外でモニリア・アルビカンスを抑制する実験
5μLのラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーを接種した菌液をMRS寒天平皿に取り、37℃の嫌気で48時間培養する。100μLのモニリア・アルビカンスの新鮮な細菌懸濁液を取って5mLのsoft  YM  agar（0.4%寒天、50℃水浴）と均一に混合し、48時間培養したラクトバチルスMRS寒天に注ぐ。それが凝固した後、ラクトバチルスの周囲に静菌領域が現れるまで、37℃で、5%のCO2で培養する。結果を図11にしめし、結論は、モニリア・アルビカンスに対するクリンプラクトバチルス262-1の静菌領域が明確で、静菌効果はラクトバチルス・デルブリッキーより明らかに強い。
【００５６】
（4）ラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーとが体外で病原菌である黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌またはサルモネラ菌に対する抑制作用
研究方法：5μLのラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーを接種した菌液をMRS寒天平皿に取り、37℃の嫌気で48時間培養する。黄色ブドウ球菌、緑膿菌、サルモネラ菌または大腸菌の新鮮な細菌懸濁液を各100μL取り、5mLの栄養寒天（0.4%寒天、50℃水浴）と均一に混合し、48時間培養したラクトバチルスMRS寒天に注ぎ、それが凝固した後、ラクトバチルスの周囲に静菌領域が現れるまで、37℃で、5%のCO2で培養する。結果を表5に示し、結論は、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌または大腸菌に対する静菌効果はいずれもラクトバチルス・クリスパタス262-1がラクトバチルス・デルブリッキーより強く、ラクトバチルス・クリスパタス262-1とラクトバチルス・デルブリッキーの静菌効果は緑膿菌に対してもっとも著しく、静菌領域の直径が90mmより大きいことである。
【００５７】
【表５】
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【００５８】
二、細胞付着力実験：
膣上皮細胞の単細胞層に付着しているラクトバチルスの個数に基づいて、異なるラクトバチルスの付着機能を判断する。方法は、人の膣上皮細胞Vk2/E6E7と人の子宮頸癌上皮細胞Helaを取り、1ウェルの当たりに45万の密度で細胞を12ウェルプレートに接種し、48時間後にVK2/E6E7が単細胞層を形成する。各ウェルに異なる数のCFUで市販のラクトバチルスDJSとラクトバチルス・クリスパタス262-1をそれぞれ加え、4時間付着させ、付着過程において、シェーカーの上で軽く振動させ，各グループにはそれぞれ2つの平行実験が設けられている。付着が終了した後、1mlの0.05%tritonX-100解裂細胞を用い、細菌懸濁液を調製・希釈し、それぞれ100ulの菌液を取ってMRS寒天培地プレートに均一に接種する。嫌気で48時間培養した後、各プレートのクローン数を統計する。
【００５９】
結果は、ラクトバチルス・クリスパタス262-1の4h付着率がそれぞれ43.1%と69.4%であり、市販の同類ラクトバチルスDJS菌株の4h付着率は29.2%と26%であるため、ラクトバチルス・クリスパタス262-1の付着力が市販の同類ラクトバチルスDJS菌株より高い。
【００６０】
三、赤毛猿膣の定植実験
5匹の健康な動物を選択して、体重に従って、対照群に二匹（動物番号が1203、1204），実験群に三匹（動物番号が3211、3212、3222）と二つの群に無作為に分ける。そのうち、試験動物は、蘇州西山中科実験動物有限会社が提供した雌性中華赤毛猿[Chinese-origin  Rhesus  macaque（Macaca  mulatta）]である。試験方法は以下のとおりである。
【００６１】
定植用ラクトバチルス・クリスパタス262-1の調製：ラクトバチルス・クリスパタス262-1の冷凍乾燥菌粉を測って取り、定植量を108にさせる。対象にはラクトバチルス・クリスパタス262-1を加えてないブランク冷凍乾燥補助材料を使用し、無菌操作条件で、0.7mLのMRS液体培地をそれぞれ加え、均一に混合し、膣投与器で全部吸い取った後に膣に定植する。
【００６２】
定植用モデリングおよびサンプリング：正常な月経周期のサルが月経になったことを観察した後、連続して5日間アジスロマイシン坐剤（200mg/匹）を与え、さらに連続して５日間膣にモデリング菌を定植する。毎週一回動物の膣を観察し、膣の分泌物の色合い、形質と分泌量を検査し、膣分泌液のpHを測定し、二つの無菌ポリエステル綿棒でサンプルを取り、一つの綿棒は膣分泌物清潔度の顕微鏡検査に使用され、もう1つは細菌叢の分析に用いる。
【００６３】
膣菌の分離と精製培養：収集された膣分泌物を2mLのD-Hanks緩衝液で振って、リン酸緩衝液で勾配希釈を行い、コロンビア血液寒天、フェネチルアルコール血液寒天、MRS寒天およびカンジダ選択寒天プレートそれぞれに塗布し、且つ37℃で，嫌気条件で24〜48h培養する。単一コロニーの形質、数量、溶血等の情報を記録し、コロンビア血液寒天プレートを改修して精製したコロニーを取得し、生化学および分子同定を行う。
【００６４】
分子生物学的方法の同定（16SrDNA遺伝子配列解析）：分離・精製された菌株に対して16SrDNAの配列増幅、配列測定および分析を行い、先に接種ループで細菌を取って50μLのPrepMan  Ultra  Sample  Preparation  Reagentを含む遠心管に入れ、Dry  Block  Heaterの中で、100℃で15min解裂させた後に-20℃で凍結保存してDNAテンプレートとして使用し、続いてユニバーサルプライマー対8F/926Rで16SrDNA断片に増幅し、その配列番号はそれぞれSEQ  ID  NO：4、SEQ  ID  NO：5であり、そのうちRはGまたはAであり，50μLのPCR反応体系に各試薬を加え，各試薬の名称および体積は、5μLの10×PCR  Buffer、１μLのdNTP（10mM）、０．５μLのMgCl2（50mM）、0.２μLのPlatinum  Taq  DNA  Polymerase（5U）、１μLのPrimer  8F（10μM）、1μLのPrimer926R（10μM）、1μLのテンプレート（50ng/μL）、３９．３μLのDNase/RNase-Free脱イオン水であり、PCR反応条件は順番に94℃で2min予備変性、94℃で1min変性、55℃で1minアニール、72℃で2min延伸、72℃で10min延伸、循環回数を30と設定して、PCR反応を行わせる。得られたPCR生成物は1%のアガロースゲル電気泳動（PCR生成物で調製したローディング溶液にはすでに染色剤が含まれている）を経た後、紫外線分析装置で検出し、データを保存する。
【００６５】
16SrDNA断片と同定されたPCR増幅生成物をゲルカット回収方法でターゲット断片を精製してから配列する。測定された16SrDNA遺伝子配列をNCBIのBLASTツールを用いてGenBankデータベース中の既知配列と比較分析を行い、比較相同性が98%以上であるとき同じ種であると同定する。
実験結果および分析
膣粘膜および分泌物の一般的な観察：定植した後、毎週一回観察して、すべての試験動物の膣粘膜分泌物に明らかな異常が発見されなかった。
【００６６】
膣分泌物のpH値の測定：ラクトバチルス・クリスパタス262-1を定植した後、大部分の実験群動物の膣分泌液のpHは対照群よりも著しく低く，且つ定植前より著しく低下し、pH値の測定結果を表6に示す。
【００６７】
【表６】
2017501741.tif 000009
【００６８】
膣分泌液の清潔さ：定植前後を比べると、対照群の膣の雑菌数が明らかに増加し、清潔さが低下したが、ラクトバチルス・クリスパタス262-1を定植した後，実験群の膣分泌液の清潔さは対照群より明らかによく、数量が異なるグラム陽性膣細菌が見られ，清潔さが対照群より著しく高い。膣分泌液の清潔さの判定結果を表7に示す。
【００６９】
【表７】
2017501741.tif 000010
【００７０】
赤毛猿膣の微生物領域系：16SrDNA断片がPCR増幅を経た後の生成物を1%のアガロースゲル電気泳動で検査し、結果はほとんどの菌株から1本のバンドが増幅されることを示し、且つほとんどのサンプルの16SrDNAの増幅バンドは鮮明で，配列測定要件を満たしており、一部の菌株のPCR増幅生成物の電気泳動を図12に示し、MarkerはDL2000であり、断片サイズは2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bpの大きさの順であり、分析から16SrDNA断片の大きさが約950bpであることがわかる。測定された16SrDNA遺伝子を用いるNCBIのBLASTツールでGenBankデータベース内の既知配列と比較分析して、比較相同性の値が98％以上のものを同じ種だと同定する。
【００７１】
膣細菌コロニーの分析により、実験群の3匹動物全部の膣分泌物から試験用ラクトバチルス・クリスパタス262-1が発見され、分離された試験用ラクトバチルス・クリスパタス262-1の情報を図13に示す。図からが分かるように、いずれの試験用動物の膣分泌物からラクトバチルス・クリスパタス262-1が発見され、多くのラクトバチルス・クリスパタス262-1は定植してから8日目およびその以降の時間に現れるため、規則に合致し、且つその数量はいずれも107／綿棒以上であり、定植効果が非常に著しい。従って、ラクトバチルス・クリスパタス262-1を108の初期定植量で中華赤毛猿膣内に定植することができる。
【００７２】
四、マウス膣に対するモニリア・アルビカンスモデルの影響
清潔な雌性ICRマウスを選択して、ラクトバチルスとモニリア・アルビカンスとを用いてマウス膣で共生実験を行い、当該ラクトバチルス・クリスパタス262-1の抗モニリア・アルビカンス作用を観察する。動物のモデリング後の膣に菌液と膣用薬であるミコナゾール坐剤を毎日一回、計3日間注入する。観察結果は以下のとおりである。
【００７３】
（1）モデリング後の五日目、10日目に膣洗浄溶液を取り出し、モニリア・アルビカンスとラクトバチルス・クリスパタス262-1とのコロニーを計数して表8に示す。
【００７４】
【表８】
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【００７５】
結論：3つの実験群（モニリア・アルビカンス+ラクトバチルス・クリスパタス262-1、モニリア・アルビカンス対照群，モニリア・アルビカンス+ミコナゾール坐剤セット）のモニリア・アルビカンスによる菌量の変化を分散分析すると、結果は、第一時間（5d）では、モニリア・アルビカンス+ラクトバチルス・クリスパタス262-1セットとモニリア・アルビカンス対照群との差がP>0.05で、統計学的有意差ではなく、モニリア・アルビカンス+ミコナゾール坐剤セットとモニリア・アルビカンス+ラクトバチルス・クリスパタス262-1セットおよびモニリア・アルビカンス対照群との差はいずれもP<0.05で、統計学的有意差であり、且つモニリア・アルビカンス+ミコナゾール坐剤セットとモニリア・アルビカンス+ラクトバチルス・クリスパタス262-1セットとの差はP=0.033で、統計学的有意差である。しかし、第二期間（10d）では、モニリア・アルビカンス+ラクトバチルス・クリスパタス262-1セットとモニリア・アルビカンス+ミコナゾール坐剤セット間に統計学的有意差がなく、該ラクトバチルス・クリスパタス262-1がモニリア・アルビカンスを抑制する顕著な治療効果を表す。
【００７６】
（2）実験動物病理切片を過ヨウ素酸シッフ染色（PAS）してモニリア・アルビカンスを観察し、その結果を表9に示す。
【００７７】
【表９】
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【００７８】
組織病理特定の染色結果は、モニリア・アルビカンスを+ラクトバチルス・クリスパタス262-1セットとモニリア・アルビカンスを+ミコナゾール坐剤セットとの結果が近似する。本実験結果は、該ラクトバチルス・クリスパタス262-1をモニリア・アルビカンス膣症治療の補助手段として使えることを提示する。
【００７９】
<実施例8>ラクトバチルス・クリスパタス262-1の凍結乾燥保存および凍結乾燥粉末の安定性
発酵および凍結乾燥する時のラクトバチルス・クリスパタス262-1の生存率を検出するため、ラクトバチルス・クリスパタス262-1をpH6.0の改良MRS培地中で成長させ、1L規模のBioFlo  110発酵タンク（New  Brunswick  Scientific）を用いて発酵させる。安定期の早期に収集した菌体のうち、生菌数が1.0〜1.5×109CFU／mlに達し、生菌は総菌数の90%以上を占める。遠心分離で菌体を収集し、リン酸緩衝液で洗浄した後、凍結乾燥した保護剤（キシリトール、アスコルビン酸、α-トコフェロール、およびリン酸緩衝液などを含む）と混合する。続いて、混合物をVirtis  Advantage冷凍乾燥機に入れて冷凍乾燥する。サンプルを-40℃で1〜20時間冷凍した後、-40℃で2-60時間真空乾燥し、さらに25℃で10〜40時間乾燥する。乾燥粉末を乾燥剤のホイルバッグに分けて入れ、４℃および室温（25℃）で保存する。第0、30および１８０日の時、プレートカウントとcfu測定を介して総菌数と生菌数をそれぞれ測定する。初期、１ｇのラクトバチルス・クリスパタス262-1乾燥粉末あたりに340億生菌（3.4×1010cfu/g）を含有し、4℃で最適な貯蔵安定性を有する。4℃で6ヶ月保存した後、初期生菌数の70.6%が残り、表10に示す。
【００８０】
【表１０】
2017501741.tif 000013
【００８１】
<実施例9>ラクトバチルス・クリスパタス262-1のカプセル型微生物接種剤の調製ステップは、
（1）-70℃の凍結液体のラクトバチルス・クリスパタス262-1種子または起源種を取って、30mLのMRS液体培地に接種し、37℃で、5%のCO2で24時間培養し、
（2）（1）の菌液を適量取って、500mlの発酵培養液に入れ，37℃で、5%のCO2で24時間培養し、
（3）50Lの発酵タンクに適量の発酵培養液を加え、高圧で20分間滅菌し、
（4）菌液を発酵タンクにおける発酵培養液に接種し、最初菌液の濃度をOD600値で0.4程度に制御し、pH6.0、37℃で適量の窒素を加え、約8〜10時間発酵させ、
（5）発酵生成物を遠心収集し、微生物の凍結乾燥保護液を加え、細菌懸濁液を調製し、細菌濃度を測定し、1.0〜1.5×109CFU／mlに調製し、
（6）上記細菌懸濁液を冷凍乾燥機の冷凍プレートに移し、冷凍乾燥機を起動して、48時間真空乾燥し、乾燥が終了した後、粉砕してカプセルに入れる。
【００８２】
具体的に実施する場合、所定の生産量に応じて培養規模を拡大または縮小させることは可能である。
【００８３】
<実施例10>ラクトバチルス・クリスパタス262-1液体型微生物接種剤の調製
実施例9のステップ（1）−（5）と同じで、実施例9と異なる点は、ステップ（5）の発酵が完了した後、得られた養液をタンクから取り出して直接プラスチック包装バレルや包装ボトルで液体剤型に直接包装することである。
【００８４】
以上のデータからわかるように、ラクトバチルス・クリスパタス262-1は継代が安定で，各世代の形態学、生化学、遺伝的特性、代謝物および薬物感受性が一致し、乳酸および過酸化水素を生成でき、膣のマイクロ生態バランスを維持することに有利であり、無毒且つ安全で、生体適合性が良く、ガルドネレラ、atopobium、モニリア・アルビカンスおよび病原菌である黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌またはサルモネラ菌に対して良好な抑制効果があり、膣への定植能力が強く、且つ定植後、膣のマイクロ環境例えばpH、清潔さ等に対して良好な改善作用があり、明らかにモニリア・アルビカンスを抑制し、その治療効果はミコナゾール坐剤に近似し、該ラクトバチルス・クリスパタスをモニリア・アルビカンス膣症治療の補助手段として使えることを提示し、菌株を活性成分として調製した微生物接種剤は生菌率が高く，安定性に優れ，保存しやすい。
【００８５】
以上のデータにより、ラクトバチルス・クリスパタス262-1またはそれで調製される微生物接種剤を陰部用化粧品、または消毒品、および膣と接触する関連製品例えば医療機器の材料または被覆表層に添加すると、膣のマイクロ環境を改善且つ調整するラクトバチルス・クリスパタス262-1の作用、膣病原菌を抑制する作用を果たし、同時に生体適合性が良く、安全無毒で、女性之陰部衛生およびそのケアに重要な役割を果たし、さらに、衛生も確保でき、且つ女性健康に有益な製品の開発に大きな適用可能性を有する。
【図１Ａ】
2017501741.tif 000014
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
2017501741.tif 000022
【図６】
2017501741.tif 000023
【図７】
2017501741.tif 000024
【図８】
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【図９】
2017501741.tif 000026
【図１０】
2017501741.tif 000027
【図１１】
2017501741.tif 000028
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2017501741000001.app
【国際調査報告】
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2017501741.tif 000032
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