(57)【要約】  本発明は、脳の外傷性損傷（外傷性脳損傷、ＴＢＩ）または脊髄の外傷性損傷（脊髄損傷、ＳＣＩ）から生じる神経外傷性障害の処置における、直接的第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）インヒビターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳の外傷性損傷（外傷性脳損傷）または脊髄の外傷性損傷（脊髄損傷）から生じる神経外傷性障害の処置の使用のための第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）の直接的インヒビターであって、Ｃ１エステラーゼインヒビターではない前記第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）の直接的インヒビター。
【請求項２】
（ｉ）野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号１）または
（ａ）配列番号１のＮ末端アミノ酸２〜１３位の外側に１〜５のアミノ酸突然変異を含むように改変された配列番号１；
および／または
（ｂ）配列番号１との少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の相同性および配列番号１由来の６つの保存されたシステイン残基の保持を含むポリペプチド配列、
（ｉｉ）野生型ＳＰＩＮＫ−１ポリペプチド配列（配列番号２）または
（ａ）Ｎ末端アミノ酸２〜１３位を配列番号１のＮ末端アミノ酸２〜１３と置き換えるように突然変異され；場合により、配列番号１の配列とのポリペプチド配列の相同性を増加する１〜５の追加のアミノ酸突然変異を含むようにさらに改変された配列番号２；
および／または
（ｂ）配列番号２との少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の相同性および配列番号２由来の６つの保存されたシステイン残基の保持を含むポリペプチド配列
（ｉｉｉ）ＳＰＩＮＫ−１突然変異体Ｋ１、Ｋ２またはＫ３（配列番号３、４または５）の１つ；
および／または
（ｉｖ）抗ＦＸＩＩ抗体
を含む、請求項１に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項３】
抗ＦＸＩＩ抗体が、
（ｉ）（ａ）配列番号８で示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示される重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２で示される重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、
および／または
（ｂ）配列番号１３で示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１６で示される軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域、
または
（ｉｉ）（ａ）配列番号８で示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示される重鎖ＣＤＲ２および配列番号１１で示される重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、
および／または
（ｂ）配列番号１３で示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１５で示される軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域、
または
（ｉｉｉ）配列番号６を含むＶＨ領域および配列番号７を含むＶＬ領域、
を含む、請求項２に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項４】
抗ＦＸＩＩ抗体がＩｇＧ抗体である、請求項２〜３のいずれか１項に記載のＦＸＩＩインヒビター。
【請求項５】
少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターが、ＰＥＧまたはアルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、ヒトアルブミン、免疫グロブリンおよびＩｇＧのＦｃから選択される半減期強化ポリペプチドを含む融合パートナーと連結される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項６】
半減期強化ポリペプチドが、リンカーを介してＦＸＩＩインヒビターと連結される、請求項５に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項７】
リンカーペプチドを介してＦＸＩＩインヒビターと接合されたヒトアルブミンを含む融合タンパク質である、請求項５〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項８】
静脈内、皮下、または随腔内に投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項９】
（ｉ）注射もしくは注入として単回用量で、（ｉｉ）それぞれを注射もしくは注入として複数回用量で、または（ｉｉｉ）連続注入もしくは塗布として投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項１０】
約０．０１から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、優先的には約１から約５００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度で投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項１１】
外傷性損傷後に投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項１２】
ＦＸＩＩインヒビターの最初の投与が、外傷損傷の直後、または外傷損傷の２４時間後まで、好ましくは１２時間後まで、より好ましくは６時間後までに行われる、請求項１１に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項１３】
少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのＦＸＩＩインヒビター。
【請求項１４】
脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害の処置に使用するためのキットであって、
（ａ）少なくとも１種の直接的ＦＸＩＩインヒビター；
（ｂ）脳の外傷性損傷（外傷性脳損傷）または脊髄の外傷性損傷（脊髄損傷）から生じる神経外傷性障害の処置におけるキットの使用に関する取扱い説明書；および
（ｃ）場合により、少なくとも１種のさらなる治療用活性化合物または薬物
を含み、
ＦＸＩＩインヒビターもさらなる治療用活性化合物または薬物もＣ１エステラーゼインヒビターではない、前記キット。
【請求項１５】
さらなる治療用活性化合物または薬物が、ステロイド、特にコルチゾンである、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、脊髄損傷（ＳＣＩ）および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）から選択される神経外傷性障害の処置における直接的第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）インヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脈管系の「外因性」（血管壁）または「内因性」（血液伝搬性）成分のいずれかにより誘発される、凝固に関する２つの輻湊する経路が存在する。「内因性」または接触活性化経路は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ、ハーゲマン因子）が、高分子量キニノーゲンおよび血漿カリクレインが関与する反応において負に帯電した表面と接触した場合に開始される。第ＸＩＩ因子はセリンプロテアーゼであり、ひとたび活性化されると（ＦＸＩＩａ）、（直接またはプレカリクレインの活性化を介して）ポジティブフィードバック反応で循環するＦＸＩＩをさらに活性化する。ＦＸＩＩａは第ＸＩ因子も活性化し、血液凝固はトロンビンの生成を最高にする限定的なタンパク質分解による、さらなる因子の活性化が関与する反応カスケードにおいて進行し、トロンビンが血漿フィブリノーゲンをフィブリンに変換して、血小板を活性化する。
【０００３】
カリクレイン−キニン系（ＫＫＳ）はまた、血液凝固第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ、ハーゲマン因子）により開始され、血管透過性および浮腫形成の制御において重要な役割を果たす（非特許文献１）。ＫＫＳの活性化は近年、脳卒中患者においても証明された（非特許文献２）。キニン（例えば、ブラジキニン、カリジン）はＫＫＳの最終生成物を構成する。キニンは、脳虚血を含むさまざまな種類の組織損傷の間に、カリクレインによりそれらの前駆体のキニノーゲンから放出される高度に活性な炎症誘発性ペプチドホルモンである。キニンの細胞効果は、２つの異なるブラジキニン受容体、Ｂ１ＲおよびＢ２Ｒにより媒介される。これらの受容体の活性化は、標的器官において、炎症誘発性サイトカインの放出または免疫細胞の誘引ならびに血管透過性の増加のような炎症過程を誘発する。
【０００４】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、壊滅的な神経学的状態であり、頭蓋骨内での脳の急速な動きもしくは脳組織／神経根の即時型の機械的途絶および遅延型の病原性事象を引き起こす外傷性事象による脳ならびに／または神経根への直接的損傷から生じる脳損傷として定義することができる。外傷性脳損傷は、脳損傷のタイプ、脳損傷の分布、および損傷の機序で異なり得る、不均質な障害である。外傷性事象は、交通事故またはスポーツ事故により引き起こされることが多く、青年期の男性および若い男性において死および身体的障害の主因である（非特許文献３）。ＴＢＩは、全ての外傷のおよそ２０％を占め、疾患関連費用が非常に高い（２０００年のアメリカ合衆国で６００億ドル）。さらに、ＴＢＩの治療選択肢は非常に限られており（非特許文献４；非特許文献５）、現時点では、重症なＴＢＩを処置する唯一の有効な方法は、その発生を予防することである。いくつかのフェーズＩＩ臨床試験が、治療用化合物の好ましい効果を示しているが（非特許文献６）、残念ながらフェーズＩＩＩ試験において、すべての化合物が効能をはっきりと示すことができていない（非特許文献７）。多くの臨床試験にもかかわらず、安全かつ有効な神経保護剤を見出す試みは全て失敗した（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００５】
外力によって生じる一次脳損傷は、脳組織の不可逆的な機械的途絶を引き起こす。その後、二次損傷過程は外傷性脳損傷の悪化の一因となる。一次脳組織損傷は、びまん性または限局性であり得、これにより、損傷の状況はそのびまん性および限局性の外傷発生の相対的な程度を決める。限局性の外傷は、虚血を伴う脳組織の挫傷、血管損傷、および出血に関連し、びまん性の脳損傷はびまん性の軸索損傷により特徴付けられる。脳損傷の主な要因は炎症、代謝障害、および脳血管機能障害であり、これらは血液脳関門（ＢＢＢ）の破締による損傷誘導性の組織虚血および脳浮腫をさらに進行する（非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００６】
興奮毒性、炎症、および血液脳関門損傷のような十分に特徴付けられた損傷過程以上に、脳の微小循環のおける血栓形成は、おそらく、挫傷周囲の虚血を引き起こすこと、および局部的な脳血流を減少することによる二次脳損傷の一因となる（非特許文献１２）。臨床のＴＢＩにおいて、続いて起こる虚血を伴う脳内血管閉塞は転帰を悪くする（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。しかし、ＴＢＩ患者における従来の抗凝血剤を使用する可能性は議論を伴う。血栓塞栓性事象のリスクを減少すること（非特許文献１７；非特許文献１８）、および転帰のパラメーターを改善すること（非特許文献１９；非特許文献２０）により、ＴＢＩ後の抗凝血の純便益的な効果を支持する研究があるが、一方で、ＴＢＩ後にも頻繁に起こる頭蓋内出血のリスクの増加よる抗凝血の有害な効果を報告する研究もある（非特許文献２１）。
【０００７】
カリクレイン−キニン系（ＫＫＳ）は、多様な病理に関係があり（非特許文献１）、ＴＢＩにおける魅力的な治療標的となる。カリクレインにより遊離されたキニンは、２つのＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、キニン受容体Ｂ１（Ｂ１Ｒ）およびＢ２（Ｂ２Ｒ）の活性化によりそれらの効果を媒介する炎症誘発性ペプチドである（非特許文献１；非特許文献２２）。キニンは、血管透過性、浮腫形成、経内皮細胞遊走、損傷後の異なる器官における炎症（非特許文献１）の制御において重要な役割を果たす。さらに、ＫＫＳは、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ、ハーゲマン因子）による血漿の凝固カスケードに関連する。ＫＫＳの全ての構成要素が、齧歯動物およびヒトの脳で同定されており（非特許文献２２）、それらの発現は脳損傷後、上方制御される（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。近年、マウスにおける、限局性の脳虚血（非特許文献２６）および外傷性脳損傷（非特許文献２７；非特許文献２４）の実験モデルにおいて、Ｂ２ＲではなくＢ１Ｒの遮断が、血液脳関門損傷および浮腫形成を減少することが示され、虚血性脳卒中および外傷性脳損傷の急性期における脳浮腫形成へのＫＫＳの機能的関連性を示唆している（非特許文献２２）。
【０００８】
負に帯電した表面と接触した場合に生理学的に活性化される（接触活性化）、ＦＸＩＩの阻害によるＫＫＳの活性化を予防する研究において、急性実験的卒中後の神経病理学的な転帰が調べられた（非特許文献２８；非特許文献２９）。
【０００９】
特許文献１は、異常な出血（止血）と関係しない静脈血栓または動脈血栓の処置または予防におけるＦＸＩＩインヒビターの使用を一般に初めて開示する。
【００１０】
非特許文献２８は、止血を完全に保ったまま、組換えヒトアルブミンインフェスチン−４、ＦＸＩＩインヒビターによる閉塞性動脈血栓形成の処置および予防を開示する。さらに、ｒＨＡ−インフェスチン−４は虚血性脳卒中のマウスモデルにおいて保護的であった。
【００１１】
特許文献２は、神経炎症性障害の処置のためのＦＸＩＩインヒビターを開示する。「神経炎症性疾患」という用語は、脳または脊髄の１つまたはそれ以上の領域の炎症を伴う状態を指し、この障害は外傷性脳損傷または脊髄損傷と関連しない。
【００１２】
特許文献３は、遠隔虚血再灌流障害（ＩＲＩ）の処置および／または予防に使用するための、Ｃ１エステラーゼインヒビター、カリクレインインヒビター、およびＦＸＩＩインヒビターから選択される接触活性化系を開示する。そのような遠隔ＩＲＩは、血液脳関門の途絶、上述の疾患および効果（脳浮腫、卒中、頭蓋内圧の増加、および神経組織の炎症）を含む可能性があり、ならびに遠隔ＩＲＩ自体は外傷性脳損傷または脊髄損傷に明確に関連しない。
【００１３】
特許文献４は、ホスファチジルセリン結合剤、すなわちＦＸＩＩの活性化因子のインヒビター、を投与することによるＦＸＩＩ活性化と関係する疾患または状態の処置を開示する。ＦＸＩＩ活性化の阻害は、例えば脊髄外傷によって引き起こされる（神経性）ショックを予防および処置することに有用であり得ることが述べられている。特許文献４はまた、ホスファチジルセリン結合剤が抗ＦＸＩＩ抗体と組み合わせることができるが、脊髄外傷または外傷性脳損傷において直接的ＦＸＩＩインヒビター（単独または組み合わせて）の効能は証明されていないことも簡単に述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０６６８７８
【特許文献２】ＥＰ２６２３１１０Ａ１
【特許文献３】ＷＯ２０１４／１３５６９４（２０１４年９月１２日発行）
【特許文献４】ＷＯ２０１１／０６９０９０
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｌｅｅｂ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、（２００５）Ｐｈａｒａｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．；５７１：２７〜７７頁
【非特許文献２】Ｗａｇｎｅｒら、（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．；２０２：７５〜７６頁
【非特許文献３】Ｔａｇｌｉａｆｅｒｒｉら、２００６、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ（Ｗｉｅｎ）、１４８（３）：２５５〜６８頁
【非特許文献４】Ｆａｕｌら、２００７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａ−Ｉｎｊｕｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ、６３（６）、１２７１〜８頁
【非特許文献５】Ｓｔｅｕｄｅｌら、２００５、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ（Ｗｉｅｎ）、１４７（３）：２３１〜４２頁
【非特許文献６】Ｎａｒａｙａｎら、２００２、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１９（５）：５０３〜５７頁
【非特許文献７】Ｄｏｐｐｅｎｂｅｒｇら、２００４、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．、１６（１）：８７〜９４頁
【非特許文献８】Ｋａｂａｄｉら、２０１４、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １５：１２１６〜１２３６頁
【非特許文献９】Ｍｅｎｏｎら、２０１５、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １１：７１〜７２頁
【非特許文献１０】Ｓｃｈｌｏｓｂｅｒｇら、（２０１０）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ．；６：３９３〜４０３頁
【非特許文献１１】ＤｏｎｋｉｎおよびＶｉｎｋ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．；２３：２９３〜２９９頁
【非特許文献１２】Ｓｃｈｗａｒｚｍａｉｅｒら、２０１０、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２７：１２１〜１３０頁
【非特許文献１３】Ｓｔｅｉｎら、２００２、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ９７：１３７３〜１３７７頁
【非特許文献１４】Ｓｔｅｉｎら、２００４、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ５４：６８７〜６９１頁
【非特許文献１５】Ｈａｒｈａｎｇｉら、２００８、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ（Ｗｉｅｎ）１５０：１６５〜１７５頁
【非特許文献１６】Ｍａｅｇｅｌｅ、２０１３、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５３  Ｓｕｐｐｌ  １：２８Ｓ〜３７Ｓ
【非特許文献１７】Ｄｕｄｌｅｙら、２０１０、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２７：２１６５〜２１７２頁
【非特許文献１８】Ａｌｂｒｅｃｈｔら、２０１４、ＪＡＭＡ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７４：１２４４〜１２５１頁
【非特許文献１９】Ｓｔｕｔｚｍａｎｎら、２００２、ＣＮＳ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ  ８：１〜３０頁
【非特許文献２０】Ｋｉｍら、２０１４、Ｊ  Ｅｍｅｒｇ  Ｔｒａｕｍａ  Ｓｈｏｃｋ  ７：１４１〜１４８頁
【非特許文献２１】Ｐｅｃｋら、２０１４、Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｃａｒｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ７６：４３１〜４３６頁
【非特許文献２２】Ａｌｂｅｒｔ−Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、（２０１３）Ｐｒｏｇｒ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．；１０１〜１０２：６５〜８２頁
【非特許文献２３】Ｏｎｇａｌｉら（２００６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ２３、６９６〜７０７頁
【非特許文献２４】Ｒａｓｌａｎら、（２０１０）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．３０、１４７７〜１４８６頁
【非特許文献２５】Ｔｒａｂｏｌｄら、（２０１０）、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．３０、１３０〜１３９頁
【非特許文献２６】Ａｕｓｔｉｎａｔら（２００９）Ｓｔｒｏｋｅ；４０：２８５〜２９３頁
【非特許文献２７】Ａｌｂｅｒｔ−Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇｅｒら（２０１２）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．；３２：１７４７〜５６頁
【非特許文献２８】Ｈａｇｅｄｏｍら（２０１０）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ；１２１：１５１０〜１５１７頁
【非特許文献２９】Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚら（２００６）ＪＥＭ；２０３（３）：５１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
要約すると、特に血栓性の適応症または炎症性疾患、神経学的状態のいずれかにおけるＦＸＩＩインヒビターの使用を開示する現況技術がある。しかし、これらの参考文献のいずれも、神経外傷性障害に関係する病理機序を伴う疾患に関連しない。さらに、外傷性脳損傷に対する特定の治療的介入は現況技術において欠けており、有効な治療のための革新的な病理機序に基づく概念、特に、ＴＢＩ患者における抗凝血処置の論争中の議論を考慮して同定する強い要求が依然としてある。
【００１７】
それゆえ、外傷性脳損傷において、外傷性脳損傷の処置のための改善された薬物治療の必要性が依然としてあることは明らかである。したがって、本発明の目的はそのような必要性を満たすことである。したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、外傷性脳損傷の処置のための基礎を形成するか、またはより満足な治療法の開発を可能にし得る、外傷性脳損傷を標的とするのに成功する代替のおよび／または改善された手段および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
この技術的な問題の解決策は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態を提供することにより達成される。
【００１９】
したがって、少なくとも１種の直接的第ＸＩＩ因子インヒビター（ＦＸＩＩインヒビター）の、神経外傷性障害の処置における使用を含む療法を本明細書において開示する。神経外傷性障害は、中枢神経系の外傷性損傷から生じ、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択することができ、療法は、有効量の少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビター（例えば、ｒＨＡ−インフェスチン−４または抗ＦＸＩＩ抗体）を投与することを含むことができる。
【００２０】
言い換えると、本発明者らは、中枢神経系の初期の外傷性損傷後に生じる外傷性脳損傷または脊髄損傷、特に外傷性浮腫が、直接的ＦＸＩＩインヒビターの投与によって処置および／または予防できることを発見した。したがって、一般に、本発明は、対象において外傷性損傷を処置し、ならびに／または中枢神経系（ＣＮＳ）の一次浮腫の形成を処置ならびに／もしくは予防し、および／もしくはそのサイズを減少する方法で使用するための直接的ＦＸＩＩインヒビターに関し、ここで対象、好ましくはヒト対象は、外傷性脳損傷および脊髄損傷からなる群から選択される少なくとも１種の障害を有するまたは有していた対象である。
【００２１】
本発明者らは、直接的ＦＸＩＩインヒビターによるＦＸＩＩの薬理学的阻害が、外傷性脳損傷後、外傷誘導性の微小血管の血栓形成を最小限にし、より良好な運動機能のような機能的転帰を改善し、異常な脳内出血のリスクを増加することなく、脳病変容積の減少、および神経変性の減少を見出した。
【００２２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列（配列番号１）または配列番号１のＮ末端アミノ酸２〜１３位の外側に１〜５のアミノ酸突然変異を含有する、および／または配列番号１と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相同であり、配列番号１由来の６個の保存されたシステイン残基を保持するインフェスチン−４配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、野生型ＳＰＩＮＫ−１ポリペプチド配列（配列番号２）またはＮ末端アミノ酸２〜１３位が配列番号１のＮ末端アミノ酸２〜１３と置き換えられており、場合によりさらに、配列番号１の配列に対するポリペプチド配列の相同性が増加する１〜５の追加のアミノ酸突然変異を含む、および／または配列番号２に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相同であり、配列番号２由来の６個の保存されたシステイン残基を保持するように改変された野生型ＳＰＩＮＫ−１ポリペプチド配列を含むことができる。特定の実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、抗ＦＸＩＩ抗体を含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、融合パートナー（例えば、半減期強化ポリペプチド）と、直接またはリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩａおよび／またはＦＸＩＩの活性化に特異的である。
【００２３】
さまざまな実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、患者の神経外傷性損傷直後、または患者が神経外傷性障害を発症した後に投与され、またはこれらは、予防的に投与される。ＦＸＩＩインヒビターは一度に投与してもよく、または複数回投与することもできる（例えば、反復予防的処置として、または神経外傷性障害をもたらす外傷性損傷の間または後の反復処置として）。
【００２４】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビター、神経外傷性障害の処置におけるキットの使用に関する取扱い説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）および場合により、少なくとも１種のさらなる治療用活性化合物または薬物を含むキットであって、さらなる治療用活性化合物がＣ１インヒビターではない前記キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】外傷誘導の２４時間後、ＮａＣｌ処置またはＷＴ対照とそれぞれ比較した、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置野生型（ＷＴ）マウスまたはＦＸＩＩ−／−マウスにおける、病変サイズの減少を示す図である。雄および雌のマウスから得られた脳スライスのＴＴＣ染色により、それらの病変容積を分析した。ＦＸＩＩの欠損または阻害により、外傷誘導の２４時間後、病変サイズが減少した。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】ＷＴ対照と比較したＦＸＩＩ−／−マウスにおける、外傷誘導の２４時間後の血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性の保存を示す図である。ＢＢＢの完全性は、測光および病変半球における脳浮腫の指標として脳の含水量により決定した、病変半球におけるエバンスブルー溢出の範囲によって分析した。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３−１】ＮａＣｌ処置対照と比較したｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおける、外傷誘導の２４時間後の血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性の保存を示す図である。ＢＢＢの完全性は、測光およびＢＢＢ構造タンパク質オクルディンの相対的なタンパク質発現により決定した、病変半球におけるエバンスブルー溢出の範囲によって分析した。脳の含水量は、病変半球における脳浮腫の指標である。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４−１】外傷誘導の２４時間後の、血栓形成の減少および弱まった血栓性過程を示す図である。フィブリン／フィブリノーゲンの相対的なタンパク質発現をウェスタンブロッティングにより分析し、それらはＷＴ対照と比較してＦＸＩＩ−／−マウスにおいて減少した。病変半球における開放血管に対する閉塞血管の比を脳組織のＨ＆Ｅ染色により組織学的に分析し、ＮａＣｌ処置対照と比較してｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおける開放血管に対する閉塞血管の比の減少が見出された。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５−１】外傷誘導の２４時間後の、ＦＸＩＩ−／−マウスにおける炎症過程からの保護を示す図である。病変半球へのマクロファージ浸潤の定量は、免疫組織化学染色により分析した；炎症誘発性サイトカインＴＮＦαおよびインターロイキン−１βの相対的な遺伝子発現は、ＷＴ対照および偽手術されたマウスと比較してＦＸＩＩ−／−マウスにおいて測定した。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】外傷誘導の２４時間後、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置動物における炎症過程が弱まることを示す図である。炎症誘発性サイトカインＴＮＦαおよびインターロイキン−１βの相対的な遺伝子発現は、ＮａＣｌ処置および偽手術されたマウスと比較してｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおいて測定した。
【図７】外傷誘導の３日後、ＷＴ対照と比較したＦＸＩＩ−／−マウスにおける病変サイズの減少を示す図である。病変容積は、ＴＴＣ染色した脳スライスにおいて測定し、雄および雌のＦＸＩＩ−／−マウス両方について組織損傷からの保護を示す。
【図８】外傷誘導の３日後、ＷＴ対照と比較したＦＸＩＩ−／−マウスにおける、血液脳関門（ＢＢＢ）損傷の減少を示す図である。ＢＢＢの完全性は、測光により決定した病変半球におけるエバンスブルー溢出の範囲によって分析した。
【図９−１】外傷性脳損傷（重量ドロップ（ｗｅｉｇｈｔ  ｄｒｏｐ）損傷および低温障害（ｃｒｙｏｌｅｓｉｏｎ）後）の病理的特徴として、脳内の血小板集積および血栓症を示す図である。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０−１】ＦＸＩＩ−／−マウスにおける重量ドロップ損傷後７日目の脳内の血小板集積の減少を示す図である。
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１１−１】ＦＸＩＩ−／−マウスにおける低温障害後１日目および３日目の脳内の血小板集積の減少を示す図である。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２】野生型マウスおよび脳の外傷の拡散後３日目および７日目にヒトＦＸＩＩを戻したＦＸＩＩ−／−マウスよりも著しく低い神経学的な重症度を発症するＦＸＩＩ−／−マウスによる重量ドロップ損傷後の転帰におけるＦＸＩＩ欠損の改善を示す図である。
【図１３−１】ＷＴマウスと比較して著しく減少した病変容積を示すＦＸＩＩ−／−マウスによる低温障害後の転帰において、ＦＸＩＩ欠損の改善を示す図であり、ＷＴ対照と比較した場合ＦＸＩＩ−／−マウスにおけるアポトーシス性神経の数が著しく減少していることを示している。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１３−３】図１３−２の続き。
【図１４−１】脳内の血小板集積の減少およびｒＨＡ−インフェスチン−４でのＦＸＩＩの薬理学的阻害による重量ドロップ脳外傷後の転帰の改善を示す図である。
【図１４−２】図１４−１の続き。
【図１５−１】脳内の血小板集積の減少およびｒＨＡ−インフェスチン−４でのＦＸＩＩの薬理学的阻害による限局性脳外傷からの保護を示す図である。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６】遺伝的欠損およびＦＸＩＩの薬理学的阻害が低温障害後に出血をもたらさないことを示す図である。
【図１７】損傷誘導の２４時間および３日後の免疫細胞浸潤の減少を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本出願の実施形態は、直接的第ＦＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）インヒビターを患者に投与して、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害を処置することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、この療法は、処置される疾患、例えば、血栓炎症、細胞毒性および血管脳浮腫、血管攣縮および微小血栓形成による微小血管灌流欠損、微小血管内皮および血液脳関門の構成成分への損傷などの病態生理の根底にある複数の経路と相互作用でき、先行技術における処置療法と比べて、潜在的に、より有効な処置を広範囲の患者集団に提供することができる。
【００２７】
定義
本出願において、（「１つの（ａ）」または「その（ｔｈｅ）」のような）単数形は、特に他のことが明記されない限り複数形を含む。さらに本出願において、「または」の使用は、特に他のことが明記されない限り「および／または」を意味する。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」のような他の形態の使用を限定するものではない。本明細書に記載の任意の範囲は、エンドポイントおよびエンドポイントの間のすべての値を含むことは理解されるべきである。
【００２８】
項の見出しは、単なる組織化目的であり、記載の主題を限定するものと解釈するべきではない。限定するものではないが特許、特許出願、論文、書籍および条約を含む本出願に引用のすべての参考文献または参考文献の一部を、どのような目的のためにも、参照によってその全体を本明細書に明白に組み入れる。参照によって組み入れる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる発明と矛盾する範囲において、本明細書は任意の矛盾材料に優先する。
【００２９】
本明細書において使用する場合、「ＦＸＩＩインヒビター」は、第ＸＩＩ因子（活性化前、すなわちそのチモーゲン）および活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれかまたは両方のインヒビター、ならびにＦＸＩＩの活性化を指す。ＦＸＩＩインヒビターは、野生型インヒビターの機能性変異体および断片を包含する。機能性変異体または断片は、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩａ、またはＦＸＩＩの活性化を阻害する野生型分子の能力の少なくとも５０％（例えば、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％またはこの間の任意の百分率）を保持する分子である。
【００３０】
「直接的ＦＸＩＩインヒビター」という用語は、本明細書において使用される場合、ＦＸＩＩ（またはＦＸＩＩａ）との接触（例えば結合）によって作用する、すなわちＦＸＩＩインヒビターがＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａと結合し、その活性および／または活性化を阻害するインヒビターを指す。対照的に、間接的インヒビターは、ＦＸＩＩ（またはＦＸＩＩａ）タンパク質と接触することなく作用し得る。例えば、アンチセンスＲＮＡがＦＸＩＩ遺伝子の発現を減少させるために使用され、または低分子が、第ＸＩ因子のようなＦＸＩＩａ反応パートナーの下流との相互作用によってＦＸＩＩａの効果を阻害でき；これらはＦＸＩＩタンパク質と直接相互作用しない。したがって、間接的インヒビターは、直接的インヒビターとは対照的に、ＦＸＩＩタンパク質の上流または下流に作用する。直接的インヒビターのいくつかの例は下記に提示される。いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは非内因性インヒビターであり；すなわち、ヒトまたは動物の体内に自然に発生するインヒビターではない。いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、ＦＸＩＩまたはＦＸＩＩａに特異的であり、特に、以下に議論するようにヒトＦＸＩＩまたはＦＸＩＩａに特異的である。
【００３１】
「神経外傷性障害」は、本明細書において使用される場合、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される中枢神経系（ＣＮＳ）の外傷性損傷を指す。好ましくは、神経外傷性障害は、一次外傷性脳浮腫であり、これは初期の侵襲の間、または侵襲のすぐ後または直後（すなわち数分以内）に生じる浮腫である。したがって、神経外傷性障害またはＣＮＳの浮腫は、任意の直接的な脳または脊髄腫脹、すなわち初期損傷直後に生じる腫脹を指す。はじめは、損傷した血液脳関門の水拡散の増加から生じる血管原生浮腫であるが、後に、損傷した脳細胞による異常な水の取り込みから生じる細胞毒性浮腫でもある。神経外傷性障害は、直接的神経損傷（アポトーシス、軸索損傷）、微小血管損傷ならびに侵襲直後および一か月後に生じる血栓炎症過程により引き起こされる局所脳組織のエネルギー欠損をさらに含む。
【００３２】
好ましくは、本発明による神経学的障害は、はじめは初期損傷後（すなわち、外力がＣＮＳを損傷するとき）数時間以内に生じ、数週間持続することができる。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの神経学的障害は初期侵襲後３０分以内または１、２、３、４、５、６、１２、または２４ｈ以内またはこの間の任意の時間に現れる。
【００３３】
好ましくは、本発明による神経外傷性障害は、はじめは初期損傷後（すなわち、外力がＣＮＳを損傷するとき）数時間以内に生じ、数週間持続することができる。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの神経外傷性障害は初期侵襲後３０分以内または１、２、３、４、５、６、１２、または２４ｈ以内またはこの間の任意の時間に現れる。
【００３４】
「外傷性脳損傷」（「ＴＢＩ」）という用語は、脳組織の即時型の機械的途絶および遅延型の病原性事象を引き起こす外傷性事象による、頭蓋骨内での脳の急速な動きから生じる脳損傷を指す。それは、脳損傷のタイプ、脳損傷の分布および損傷の機序で異なり得る、不均質な障害である。非常によく現れるＴＢＩの症状は、外傷性脳浮腫である。外傷性事象は、交通事故またはスポーツ事故により引き起こされることが多い。
【００３５】
「脊髄損傷」（ＳＣＩ）という用語は、本明細書において使用される場合、疾患ではなく外傷によって引き起こされる脊髄への任意の損傷を指す。脊髄および神経根が損傷された場所に応じて、症状は、痛みから麻痺、失禁まで幅広く異なり得る。脊髄損傷は「不完全」のさまざまなレベルで記載され、それは患者に効果がないものから、神経学的／器官機能の全損を意味する「完全」損傷まで異なり得る。脊髄損傷は脊髄浮腫に関連することが多い。脊髄損傷には多くの原因があるが、典型的には、例えば自動車事故、転倒、スポーツ損傷、および暴力などからの主要な外傷に関連する。
【００３６】
「外傷性脳浮腫」または「脳浮腫」という用語は、任意の脳の損傷後腫脹、すなわちＣＮＳの初期損傷後の短期間内に生じる腫脹を指す。「外傷性脊髄浮腫」または「脊髄浮腫」という用語は、任意の脊髄の損傷後腫脹、すなわち初期損傷後の短期間内に生じる腫脹を指す。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「処置する」および「処置すること」という用語は、障害または疾患の少なくとも１つの兆候、症状または態様を、予防、阻害、除去、発症を遅延、遅延、低減、重症度の低下または緩和することを包含する。処置することは、処置が「治癒する」または「治癒すること」を包含するが等価ではないという点で症状の完全な除去を必要としない。いくつかの実施形態において、患者は障害を予防するために処置され、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害を発症するリスクがある事が知られている対象に療法を投与することを意味している。いくつかの実施形態において、「処置」または「処置すること」は、障害または疾患の効果を緩和することも含むことができる。「緩和すること」および「効果を緩和すること」という用語は、１つまたはそれ以上の患者の機能の損傷を生み出す障害または疾患のいくつかの態様を改善することを意味する。例えば、外傷性脳損傷の処置としては、（例えば、神経学的機能または脳画像により測定して）外傷性脳損傷の予防、外傷性脳損傷の効果の緩和、または外傷性脳損傷の重症度の減少を挙げることができる。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「患者」は、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害を有する、有していた、またはこの発症の可能性があり、ＦＸＩＩインヒビターの投与から利益を受ける任意のヒトまたは動物である。ＦＸＩＩインヒビターの投与は、限定するものではないが、非経口投与（例えば、硬膜下、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、鼻腔内、気管内、吸入および／または腹腔内注射）、経口および／または直腸投与ならびに点滴注入、スプレーの適用および／または注入技術による投与を含む、医薬品または治療剤を患者に送達する任意の公知の方法によるものである。特定の実施形態において、投与は、静脈内、皮下または髄腔内で行われる。
【００３９】
本明細書において使用する場合、「抗体」は、機能性抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含み、免疫グロブリンおよびこれらの抗原結合部または断片を含む。機能性抗原結合部または断片は、完全長抗体の抗原に結合する能力および抗原を阻害する能力の少なくとも５０％（例えば、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９もしくは１００％またはこれらの間の任意の百分率）を保持する分子である。抗体という用語は、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多重特異的、非特異的、ヒト化、完全ヒト、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、復帰突然変異およびＣＤＲグラフト化抗体を含む。抗体という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＶＨＨ（ナノボディとも称される）のような抗体断片および二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む抗原結合機能を保持する他の抗体断片もしくは変異体をさらに含む。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む任意のアイソタイプである。本明細書において使用する場合、「抗原」は、抗体により結合される標的分子である。本明細書において使用する場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原の一部またはすべてと結合できる、またはこれに相補的な抗体分子の一部を指す。
【００４０】
Ｉ．神経外傷性障害
いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターが開示され、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される中枢神経系の外傷性損傷から生じる、神経外傷性障害を処置する方法において使用することができる。本方法は、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターを、それを必要としている患者に投与することを含み得る。したがって、本発明はさらに、中枢神経系の外傷性損傷から生じ、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される、医薬として許容される賦形剤または担体中に少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターを含む、神経外傷性障害の処置に使用するための１つまたはそれ以上の医薬組成物を提供する。同様に、本発明はさらに、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害を処置するための薬剤の製造における、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターを含む１つまたはそれ以上の組成物の使用を提供する。少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、単独で使用してもよく、または追加の治療用化合物がさらに投与してもよい。
【００４１】
本明細書において開示の方法および組成物を使用して処置される神経外傷性障害は、脊髄損傷（ＳＣＩ）または外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を含み得る。好ましくは、本明細書において開示の方法および組成物を使用して処置される神経外傷性障害は、ＴＢＩである。
【００４２】
本発明による外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、頭蓋内損傷としても知られ、外力が脳に外傷を負わせる場合に生じる。ＴＢＩは、重症度、機序（閉鎖性頭部損傷または穿通性頭部損傷）、または他の特徴（例えば、特定の位置または広範な領域において生じている）に基づいて分類され、宿主の身体の、認識の、社会の、感情の、および行動の効果を引き起こすことができ、転帰は完全な回復から恒久的な障害または死に及び得る。外傷性脳損傷は、急加速または急減速、衝突、衝撃波、または投射体による貫通のような機械的な外力から生じる脳への損傷として定義される。脳機能は、一時的または永久的に損なわれ、構造損傷は現在の技術で検出できるまたは検出できない。
【００４３】
ＴＢＩの最も多い原因としては、暴力、輸送事故、工事、およびスポーツ事故が挙げられる。オートバイ事故は重大性の高い主な原因である。２〜４歳の子供では転倒がＴＢＩの最も多い原因であるが、それより年長の子供では交通事故がこの位置で転倒と張り合う。ＴＢＩは、児童虐待から生じる３番目に多い損傷である。虐待は小児科の脳外傷事例の１９％を引き起こし、死亡率はこれらの事例のなかで高い。
【００４４】
力のタイプ、方向、強度、および期間全てが、ＴＢＩの特徴ならびに重症度の一因となる。ＴＢＩの一因となり得る力としては、角度方向の力、回転性の力、せん断力、および並進力が挙げられる。頭部の衝突、著しい加速または減速がない場合でさえも、ＴＢＩを引き起こし得る；しかしほとんどの場合、おそらく衝突および加速の組み合わせのせいである。頭部殴打または何かにより殴打されることを含む力は、接触または衝突負荷と呼ばれ、ほとんどの限局性損傷の原因であり、頭蓋内での脳の移動は、非接触または慣性負荷と呼ばれ、通常びまん性損傷を引き起こす。損傷は、衝突の部位下で直接起こる可能性があり、または衝突の反対側の部位で起こる可能性がある。本発明によるＴＢＩは、びまん性損傷および／または限局性損傷によって引き起こされる。
【００４５】
少なくとも一種のＦＸＩＩインヒビターによる処置は、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害を予防するため、予防的に行われる。多くの場合、処置は、外傷性損傷後に行われ、すなわち処置は、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害をもたらす中枢神経系の外傷性損傷が起こった直後またはその後のいくつかの時点において投与される。例えば、処置は、外力が中枢神経系を損傷した直後、または損傷後約１時間まで、約２時間まで、２４時間まで、もしくは３日までに初めて投与される。
【００４６】
好ましい実施形態において、処置は、神経外傷性障害の初期発生直後、または初期発生後約１２時間未満で開始される。いくつかの実施形態において、処置は、約３０分まで、または約１時間まで、約２時間まで、約２４時間までに開始される。いくつかの実施形態では、処置は、脳または脊髄を外傷により損傷する外力の発生直後、または外力の発生後約５、１０、２０、３０、４０、もしくは５０分、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間（またはこの間の任意の時間）に投与される。いくつかの実施形態において、処置は、初期損傷の発生後できる限り早く、好ましくは損傷後１時間未満、６時間未満または２４時間未満に投与される。いくつかの実施形態において、処置は、初期損傷の後約２４時間以内に、または損傷後約６時間以内または損傷後１時間以内に行われる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターの投与は、神経外傷性障害のリスクがある患者において初期損傷を予防するために、予防的に行うことができる。予防的処置は、単回用量または反復用量で行うことができる。周期的な用量は、特定された継続期間の間、例えば治療過程の継続期間にわたって投与される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターの投与は、例えば神経外傷性障害のリスクがある患者を処置するため、またはより効果的に患者を処置するために反復して行うことができる。このような処置は、複数回用量、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の用量で、１時間ごと、２時間ごと、４時間ごと、６時間ごと、１２時間ごとまたはこの間の任意の期間の用量のような反復方法で行われる。
【００４９】
少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターの（例えば、処置を必要とする患者への）投与は、単回用量または反復投与で、さまざまな生理学的に許容される塩形態のいずれかで、および／または許容される医薬品担体と共に、および／または医薬組成物の一部としての添加剤と共に行われてよい。したがって、特定の実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、（ｉ）１回、それぞれを個別の注射または注入として、または単一の組合せ注射または注入で、（ｉｉ）複数回用量、例えば２、３、４、５もしくはそれ以上の用量でそれぞれを注射または注入として、または（ｉｉｉ）注入または塗布として、投与される。注入／塗布は、一定期間にわたって、好ましくは１分から２４時間、または１０分から１２時間、または１０分から６時間、または１０分から５時間、または１０分から４時間、または１０分から３時間、または１０分から２時間、または１０分から１時間の期間（またはこの間の任意の期間）にわたって投与される。投与は、侵襲後、神経外傷性損傷の症状がなくなるまで反復して行うことができ、すなわち、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターの投与は、数日から数カ月の間、例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、４週間、２カ月間の反復投与で行う。
【００５０】
少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターを含む組成物は、治療有効量で患者に投与される。概して、治療有効量は、対象の年齢、全体状態および性別ならびに対象の医学的状態の重症度により変動し得る。投薬量は医師により決定され、必要に応じて観察された処置の効果に合わせて調整される。
【００５１】
少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターの治療有効用量は、例えば正確な適応症、製剤または投与の様式のような数多くの因子に依存すると思われ、各個別の適応症に関する前臨床試験および臨床試験で決定される。例えば、一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターの用量は、約０．０１、０．１、１、５０、１００、２００、５００もしくは１０００ｍｇ／ｋｇ体重もしくはこの間の任意の用量または約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、約１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、約１〜５００ｍｇ／ｋｇ、約１０〜２００ｍｇ／ｋｇ、約１０〜１００ｍｇ／ｋｇ、約５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、約５０〜２００ｍｇ／ｋｇもしくは約１００〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲もしくはこの間の任意の用量である。特定の実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、ｒＨＡ−インフェスチン−４である。いくつかの実施形態において、ｒＨＡ−インフェスチン−４が使用される場合、用量は、約０．０１から１０００ｍｇ／ｋｇ体重の間、または約１から１０００ｍｇ／ｋｇの間または約１から５００ｍｇ／ｋｇの間または約５０から５００ｍｇ／ｋｇの間の範囲（もしくはこの間の任意の用量）である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは抗ＦＸＩＩ抗体である。抗ＦＸＩＩ抗体の治療有効用量を伴う実施形態において、治療有効用量は、処置を必要とする患者または対象において正の治療効果をもたらす用量である。治療有効用量は、約０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０１から１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から５ｍｇ／ｋｇ、約０．１から２ｍｇ／ｋｇもしくは約０．１から１ｍｇ／ｋｇの範囲またはこれらの間の任意の用量範囲であってよい。例えば、治療有効用量は、ＦＸＩＩａ活性を、対象において少なくとも約５０％または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％（またはこれらの間の任意の百分率）阻害する用量であってよい。
【００５３】
ＦＸＩＩインヒビターの正確な治療有効用量は、通常の実験により、驚くような工程を含まずに当業者によって決定することができる。
【００５４】
特定の実施形態において、神経外傷性障害の少なくとも１種の症状における減少をもたらす濃度で、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターを投与する。
【００５５】
投与される医薬組成物は、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターを単独の活性化合物として含んでもよく、または１つもしくはそれ以上の追加の化合物、組成物もしくは生物学的材料と組み合わせて送達してもよい。追加の化合物の例としては、ステロイド、特にコルチゾンが挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、神経外傷性障害に対する少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターによる処置の効果は、組織損傷および／または浮腫の範囲を測定することによってモニターされる。組織損傷の範囲を測定するための方法としては、例えば、組織学、生化学的、比色分析、および免疫学的アッセイ（炎症仲介物質のエバンスブルー溢出、ＴＴＣ染色、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ）、神経学的機能の測定または脳の画像化（ＭＲＴ、ＣＴ、ＰＥＴ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、組織損傷は、神経学的機能の評価（Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅ）を用いて測定することができる神経学的機能の喪失を引き起こす。
【００５７】
開示された方法の特定の実施形態において、患者は、彼らの臨床症状に対するケアの確立された基準に従って処置されなければならない。
【００５８】
ＩＩ．第ＸＩＩ因子インヒビター
上記のように、「第ＸＩＩ因子」および「ＦＸＩＩ」という用語は、それぞれ、第ＸＩＩ因子（例えば、チモーゲンまたはペプチドの前駆形態）および活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれかまたは両方を指す。したがって、「ＦＸＩＩインヒビター」は、ＦＸＩＩａ切断産物のＦＸＩＩａアルファおよびＦＸＩＩａベータ（ＦＸＩＩｆとも呼ばれる）を含むＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａ（αＦＸＩＩａとも呼ばれる）ならびにＦＸＩＩの活性化のいずれかまたは両方のインヒビターを含み得る。さらに、抗ＦＸＩＩ抗体としては、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａのいずれかまたは両方と結合し、阻害する抗体が挙げられる。「ＦＸＩＩインヒビター」という用語は、半減期延長ポリペプチドに連結されたＦＸＩＩのインヒビターもまた意味し、これは、いくつかの実施形態においてリンカーを含む。使用可能なＦＸＩＩインヒビターの例としては、ｒＨＡ−インフェスチン−４、ＳＰＩＮＫ−１、抗ＦＸＩＩ抗体が挙げられ、ＦＸＩＩの活性化を阻害する能力を保持するこれらのタンパク質の改変型／断片も含む。一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターはＳＰＩＮＫ−１または改変ＳＰＩＮＫ−１である。一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、インフェスチン−４もしくは改変インフェスチン−４または抗ＦＸＩＩ抗体である。
【００５９】
ＦＸＩＩインヒビターはＦＸＩＩの直接的インヒビターである。「直接的」インヒビターという用語は、ＦＸＩＩ（またはＦＸＩＩａ）との接触（例えば結合）を介して作用する、すなわち、ＦＸＩＩインヒビターがＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａと結合し、その活性および／または活性化を阻害するインヒビターを意味する。対照的に、間接的インヒビターは、ＦＸＩＩ（またはＦＸＩＩａ）タンパク質と接触することなく作用する。例えば、アンチセンスＲＮＡがＦＸＩＩ遺伝子の発現を減少させるために使用され、または低分子が、第ＸＩ因子のようなＦＸＩＩａ反応パートナーの下流との相互作用を介してＦＸＩＩａの効果を阻害できる；これらはＦＸＩＩタンパク質と直接相互作用しない。したがって、間接的インヒビターは、直接的インヒビターとは対照的に、ＦＸＩＩタンパク質の上流または下流に作用する。直接的インヒビターのいくつかの例は下記に提示される。いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、非内因性インヒビターであり；すなわち、それらはそれぞれヒトまたは動物の体内に自然に（内因性に）発生するインヒビターではない。いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、例えばＣ１インヒビターなどのＦＸＩＩインヒビターではない。
【００６０】
一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは特異的ＦＸＩＩインヒビター、好ましくは特異的ＦＸＩＩａインヒビターである。
【００６１】
特異的ＦＸＩＩインヒビターは、モル比１：１で使用される場合、血漿セリンプロテアーゼまたはＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａ以外の他の内因性タンパク質を２５％以下阻害するインヒビターを指す。言い換えれば、特異的ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａインヒビターは、前記インヒビターが、個別の血漿セリンプロテアーゼと前記インヒビターとがモル比１：１で使用される場合、ＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａ以外の血漿セリンプロテアーゼを２５％以下阻害する。好ましくは、ＦＸＩＩインヒビターは、モル比１：１で使用される場合、ＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａ以外の血漿セリンプロテアーゼを２０％以下、好ましくは１５％以下、好ましくは１０％以下、好ましくは５％以下、好ましくは１％以下阻害する。例えば、特異的ＦＸＩＩ  ｍＡｂは、ＦＸＩａ対前記ｍＡｂのモル比が１：１である場合、血漿セリンプロテアーゼＦＸＩａをわずか５％しか阻害しないが、同じＦＸＩＩ  ｍＡｂは、ＦＸＩＩａを少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％阻害する。
【００６２】
本発明の一実施形態において、モル比１：１で個別の血漿セリンプロテアーゼ対前記インヒビターが使用される場合、１つの他の血漿セリンプロテアーゼは５０％を超えて阻害される。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、モル比１：１で個別の血漿セリンプロテアーゼ対前記インヒビターが使用される場合、２種の他の血漿セリンプロテアーゼは５０％を超えて阻害される。
【００６４】
さらに別の実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、ヒト化モノクローナル抗体、好ましくは完全ヒトモノクローナル抗体を含むヒトＦＸＩＩインヒビターである。
【００６５】
「相同性」は、本明細書において使用する場合、同一であるか、または保存的置換を構成するアミノ酸の百分率数を指す。相同性は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、３８７〜３９５頁）のような配列比較プログラムを使用して決定され、このプログラムは参照によって本明細書に組み入れる。このようにして、本明細書に引用された配列と同様または実質的に異なる長さの配列は、ギャップのアライメントへの挿入によって比較され、このようなギャップは、例えばＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【００６６】
一実施形態において、投与される医薬製剤は、唯一の活性物質としてＦＸＩＩインヒビターを含み、すなわち、ＦＸＩＩインヒビターは別の活性薬剤と組み合わせて使用しない。好ましくは、ＦＸＩＩインヒビターは、ホスファチジルセリン結合剤、例えば改変アネキシンＶ組成物と組み合わせて使用しない。
【００６７】
Ａ．インフェスチン−４
一実施形態において、本出願は、インフェスチンドメイン４（「インフェスチン−４」と称される）を含むＦＸＩＩインヒビターを提供する。インフェスチンは、シャーガス病を引き起こすことが公知である寄生生物トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）に対する主要なベクターである、吸血昆虫、トリアトーマ・インフェスタンス（Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の中腸に由来する１種のセリンプロテアーゼインヒビターである（Ｃａｍｐｏｓ  ＩＴＮら、３２  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．９９１〜９９７頁  ２００２；Ｃａｍｐｏｓ  ＩＴＮら、５７７  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１２〜５１６頁、２００４；国際公開第２００８／０９８７２０号）。この昆虫は、これらのインヒビターを使用して摂取された血液の凝固を防止する。インフェスチン遺伝子は、凝固経路中の異なる因子を阻害するタンパク質をもたらす４ドメインをコードする。特に、ドメイン４は、ＦＸＩＩａの強力なインヒビターであるタンパク質（インフェスチン−４）をコードする。インフェスチン−４は、出血性合併症をもたらすことなくマウスに投与されている（国際公開第２００８／０９８７２０号；Ｈａｇｅｄｏｒｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；１２１：１５１０〜１７頁）。
【００６８】
さまざまな実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、インフェスチン−４を含む。「インフェスチン−４」という用語は、本明細書において使用する場合、ＦＸＩＩを阻害する能力を保持する、野生型ペプチドの変異体または断片を包含する。いくつかの実施形態において、インフェスチン−４は、ＦＸＩＩａを阻害するその能力に関して選択される。特定の実施形態において、インフェスチン−４はインフェスチン−４の変異体を含み、該変異体はインフェスチンドメイン４および場合によりインフェスチンドメイン１、２および／または３を含む。一実施形態において、インフェスチン−４は（Ｈｉｓ）６−タグ付インフェスチン−４構築物である。別の実施形態において、インフェスチン−４は、インフェスチン−４に結合された、半減期強化ポリペプチド（例えば、アルブミン、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＰＥＧ）のような融合パートナーを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、リンカーが融合パートナーとインフェスチン−４とを連結する。さまざまな実施形態において、インフェスチン−４はＨａｇｅｄｏｒｎら、（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；１１７：１１５３〜６０頁）に記載のｒＨＡ−インフェスチン−４タンパク質である。一実施形態において、組成物は、柔軟なリンカーによりＨａｇｅｄｏｒｎら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；１１７：１１５３〜６０頁）に記載のｒＨＡ−インフェスチン−４に結合されたアルブミンを含む。特定の実施形態において、ＦＸＩＩの他のインフェスチン−４インヒビターが使用され、これらの例は、国際公開第２００８／０９８７２０号およびＨａｇｅｄｏｒｎら、（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１０；１１７：１１５３〜６０頁）に記載されており、これらは両方とも参照によってその全体を組み入れる。
【００６９】
野生型インフェスチン−４配列の例は配列番号１：ＥＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶＰＶＣＧＳＤＧＫＴＹＧＮＰＣＭＬＮＣＡＡＱＴＫＶＰＧＬＫＬＶＨＥＧＲＣで提示される。
【００７０】
本明細書において使用する場合、インフェスチン−４の「変異体」という用語は、１またはそれ以上のアミノ酸の突然変異を有するポリペプチドを指し、「突然変異」は野生型インフェスチン−４配列（配列番号１）に対する置換、欠失または付加として定義される。「インフェスチン−４」という用語は、これらのインフェスチン−４変異体を包含する。インフェスチン−４の「変異体」は、野生型または突然変異インフェスチン−４配列の断片もまた含む。さまざまな実施形態において、野生型インフェスチン−４配列に対する１つまたはそれ以上の突然変異は、ＦＸＩＩを阻害するポリペプチドの機能性能力を実質的に改変しない。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の突然変異は、ＦＸＩＩを阻害するポリペプチドの能力を完全にまたは実質的に除去しない（例えば、変異体は、野生型インフェスチン−４の阻害能力の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上を保持する）。このような変異体のさらなる例を下記に提供する。
【００７１】
一実施形態において、インフェスチン−４変異体は、野生型インフェスチン−４配列のアミノ末端由来のアミノ酸配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ（配列番号２０、これらは配列番号１の残基２〜１３である）を含む。特定の実施形態において、変異体は、配列番号１の残基２〜１３を含んでよく、野生型インフェスチン−４配列と比較して少なくとも１つ、場合により５つまでのアミノ酸突然変異を、配列番号１の残基２〜１３の外側にさらに含む。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型インフェスチン−４配列由来の６つの保存されたシステイン残基および／または野生型インフェスチン−４配列との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を保持する。いくつかの実施形態において、インフェスチン−４の変異体は、野生型インフェスチン−４配列の保存されたＮ末端領域アミノ酸２〜１３を含み、少なくとも１つ、場合により５つまでのアミノ酸突然変異をこれらの保存されたＮ末端アミノ酸の外側に含み、野生型インフェスチン−４配列との違いをもたらす。本明細書において使用する場合、インフェスチン変異体の「Ｎ末端アミノ酸の外側」という用語は、配列番号１由来のアミノ酸２〜１３である配列番号２０：ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶの配列を含むアミノ酸の連続する伸長以外の、変異体のポリペプチド鎖に沿った任意のアミノ酸を指す。
【００７２】
別の実施形態において、インフェスチン−４変異体は、６つの保存されたシステイン残基および／または野生型インフェスチン−４配列との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を含む。一実施形態において、６つの保存されたシステイン残基は、野生型インフェスチン−４配列、配列番号１の６、８、１６、２７、３１および４８位のアミノ酸である。一実施形態において、変異体は、最後の保存されたシステインを４８位に含む。他の実施形態において、システイン残基の正確な位置および相互の相対的な位置は、インフェスチン−４変異体における挿入または欠失のため野生型インフェスチン−４配列の６、８、１６、２７、３１および４８位から変化することがある。それにもかかわらず、これらの実施形態において、インフェスチン−４変異体は６つすべてのシステインを含む、および／または野生型インフェスチン−４配列との７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはこれらの間の任意の百分率の相同性を共有することができる。いくつかの実施形態において、インフェスチン−４変異体は、配列番号１由来のアミノ酸２〜１３および６つすべてのシステイン残基を保持し、野生型インフェスチン−４配列との７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはこれらの間の任意の百分率の相同性を共有する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、インフェスチン−４変異体は、配列番号２１：ＤＳＬＧＲＥＶＲＮＰＣＡを含む。いくつかの実施形態において、この配列は、野生型インフェスチン−４配列の断片または完全長のＮ末端またはその近くに付加され、ヒトタンパク質ＳＰＩＮＫ−１に由来する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、インフェスチン−４変異体は、野生型インフェスチン−４または変異体インフェスチン−４と、ヒトアルブミン（「ＨＡ」と称される）との間の融合構築物を含む。いくつかの実施形態において、ＨＡは組換えタンパク質である（「ｒＨＡ」と称される）。特定の実施形態において、インフェスチン−４およびＨＡタンパク質は直接接合されるか、またはリンカーポリペプチドを介して接合される。
【００７５】
一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、野生型インフェスチン−４ポリペプチド配列の変異体を含み、該変異体は、配列番号１のＮ末端アミノ酸２〜１３；Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１つ、場合により５つまでのアミノ酸突然変異；６つの保存されたシステイン残基；および／または野生型インフェスチン−４配列との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を含む。
【００７６】
さまざまな実施形態において、ＦＸＩＩを阻害する能力を保持するインフェスチン−４の変異体が提供される。機能性阻害活性は、例えば、ＦＸＩＩ酵素活性の阻害を試験する直接アッセイ、凝固時間の延長（例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間、ａＰＴＴ）、凝固の内因性経路を扱う臨床的凝固試験または凝固を評価するｉｎ  ｖｉｖｏ方法を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏの特徴付けにより評価される。
【００７７】
インフェスチン−４変異体のさらなる例は、ＳＰＩＮＫ−１突然変異体であり、これらは以下に記載される。
【００７８】
Ｂ．ＳＰＩＮＫ−１突然変異体
さまざまな実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、インフェスチン−４との高い類似性を有するヒトタンパク質を含み得る。インフェスチン−４との高い類似性を有するヒトタンパク質の一例は、ＳＰＩＮＫ−１、膵臓において発現されたカザール（Ｋａｚａｌ）タイプセリンプロテアーゼインヒビター（膵臓分泌性トリプシンインヒビター、ＰＳＴＩとしても公知）である。カザールタイプセリンプロテアーゼインヒビターファミリーは、公知のセリンプロテアーゼインヒビターの数多くのファミリーの１つである。さまざまな種に由来する多くの類似のタンパク質が記載されている（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ  ＭおよびＫａｔｏ  Ｉ、４９  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９３〜６２６頁、１９８０）。
【００７９】
野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の一例は配列番号２  ＤＳＬＧＲＥＡＫＣＹＮＥＬＮＧＣＴＫＩＹＤＰＶＣＧＴＤＧＮＴＹＰＮＥＣＶＬＣＦＥＮＲＫＲＱＴＳＩＬＩＱＫＳＧＰＣで提示される。
【００８０】
さまざまな実施形態において、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列（例えば配列番号２）はＦＸＩＩインヒビターとして使用される。「ＳＰＩＮＫ−１」という用語は、ＦＸＩＩを阻害する能力を実質的に保持するＳＰＩＮＫ−１の機能性変異体および断片もまた包含し、いくつかの実施形態において、これらのＳＰＩＮＫ−１変異体はＦＸＩＩインヒビターとして使用される。例えば、野生型配列のさまざまな変異体は、インフェスチン−４に対するＳＰＩＮＫ−１配列の相同性を増加させるために作製することができる。一実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１は、配列番号１のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように突然変異される。
【００８１】
一実施形態において、変異体ＳＰＩＮＫ−１は、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端部分（例えば、配列番号１のアミノ酸２〜１３）を含み、場合により、野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加する少なくとも１、２、３、４または５つの追加のアミノ酸突然変異をＮ末端アミノ酸の外側に含む。別の実施形態において、変異体ＳＰＩＮＫ−１は、６つの保存されたシステイン残基を含み、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有し、場合により、野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させるように突然変異されている。いくつかの実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１変異体はまた、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端部分（例えば、配列番号１のアミノ酸２〜１３）を含む。突然変異は、置換、欠失および／または付加を含む。「Ｎ末端アミノ酸の外側」にある突然変異は、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ（配列番号２０）、すなわち配列番号１のアミノ酸２〜１３を含むアミノ酸の連続する伸長以外の、変異体のポリペプチド鎖に沿った任意のアミノ酸における１つまたはそれ以上の突然変異を指す。「変異体」という用語は、ＳＰＩＮＫ−１の断片または突然変異ＳＰＩＮＫ−１配列を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１の６つの保存されたシステイン残基は、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列（例えば配列番号２）の９、１６、２４、３５、３８および５６位のアミノ酸である。一実施形態において、変異体は、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の最後のシステイン（すなわち、配列番号２の５６位のシステイン）を含む。いくつかの実施形態において、６つのシステインは突然変異されないが、システインの正確な位置および相互の相対的な位置は、ＳＰＩＮＫ−１変異体におけるどこか他の所の挿入および／または欠失のため、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の９、１６、２４、３５、３８および５６位から変化することがある。それにもかかわらず、これらの実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１変異体は６つすべてのシステインを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１の６つのシステインは突然変異されないが、ＳＰＩＮＫ−１は、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端部分（例えば、配列番号１のアミノ酸２〜１３）を含み、および／または野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有し、および／またはＮ末端アミノ酸の外側のＳＰＩＮＫ−１配列中の１、２、３、４または５つの突然変異を含むように突然変異される。例えば、ＳＰＩＮＫ−１変異体は、配列番号１のＮ末端アミノ酸２〜１３；野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、Ｎ末端アミノ酸外側の少なくとも１つおよび５つまでのアミノ酸突然変異；野生型ＳＰＩＮＫ−１配列由来の６つの保存されたシステイン残基；および／または野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１の変異体は、ＦＸＩＩを阻害するそれらの能力を実質的に保持する（例えば、変異体は、野生型ＳＰＩＮＫ−１の阻害活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上を保持する）。本明細書に開示の方法に使用されるＳＰＩＮＫ−１変異体の例としては、
Ｋ１：ＤＳＬＧＲＥＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶＰＶＣＧＴＤＧＮＴＹＰＮＥＣＶＬＣＦＥＮＲＫＲＱＴＳＩＬＩＱＫＳＧＰＣ；
Ｋ２：ＤＳＬＧＲＥＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶＰＶＣＧＴＤＧＮＴＹＧＮＥＣＭＬＣＡＥＮＲＫＲＱＴＳＩＬＩＱＫＥＧＰＣ；
および
Ｋ３：ＤＳＬＧＲＥＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶＰＶＣＧＴＤＧＮＴＹＧＮＥＣＭＬＮＣＡＥＮＲＫＲＱＴＳＩＬＩＱＫＥＧＰＣ
（それぞれ、配列番号３、４および５）が挙げられる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、さらなるアミノ酸置換が、インフェスチン−４との相同性を増加させるためにＫ１に対してＮ末端の外側で行われる。ＳＰＩＮＫ−１変異体Ｋ３の場合、５つのアミノ酸置換が、インフェスチン−４との相同性を増加させる。特定の実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１変異体は、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（またはこれらの間の任意の百分率）の相同性を共有する。
【００８６】
Ｃ．ＦＸＩＩ抗体
さまざまな実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、ＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａと結合し、ＦＸＩＩの活性化および／または活性を阻害または低下させる抗ＦＸＩＩ抗体である。「抗第ＸＩＩ因子抗体」という用語は、完全長抗体およびこれらの機能性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＦｖおよびｓｃＦｖのような抗原結合断片）を包含する。この用語はまた、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＥのようなアイソタイプのいずれかの抗体ならびにＩｇＧ１のようなこれらの任意のサブクラスを包含する。抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスターまたはサルのような哺乳動物種に由来する。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化またはＣＤＲグラフト化される。いくつかの実施形態において、抗体は、免疫原性、半減期を改変するように突然変異または改変されるか、および／または治療用抗体に関連する他の有利な特性をもたらすように突然変異または改変される。一実施形態において、抗体は、中和エピトープのようなＦＸＩＩの重鎖または軽鎖のエピトープに結合する抗ＦＸＩＩ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ポリペプチド、核酸または小分子にコンジュゲートされる。「抗ＦＸＩＩ抗体」はまた、ＦＸＩＩａアルファおよびＦＸＩＩａベータの切断断片を含む、ＦＸＩＩのチモーゲンおよび活性化タンパク質（ＦＸＩＩａ）のいずれかまたは両方と結合する、および／またはこれを阻害する抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＦＸＩＩａまたはＦＸＩＩａのアルファ鎖もしくはベータ鎖断片に特異的に結合する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体は、ＦＸＩＩａと結合してその活性化および／または活性を阻害する。抗ＦＸＩＩ抗体は、例えば、国際公開第２００６／０６６８７８号およびＲａｖｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  ８６：４１３４〜４３頁（１９９５）に記載されており、これらの開示は参照によってそれらの全体を組み入れる。ヒト第ＸＩＩ因子に対する他のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）としては、Ｐｉｘｌｅｙら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８７；２６２、１０１４０〜４５頁）により記載されたＢ７Ｃ９  ｍＡｂ；Ｓｍａｌｌら（Ｂｌｏｏｄ  １９８５；６５：２０２〜１０頁）により記載されたｍＡｂ；Ｎｕｉｊｅｎｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：１２９４１〜４９頁）により記載れたモノクローナル抗体Ｆ１およびＦ３；国際公開第８９／１１８６５号に記載のＦＸＩＩの軽鎖に対するＢ６Ｆ５、Ｃ６Ｂ７およびＤ２Ｅ１０モノクローナル抗体；国際公開第９０／０８８３５号に記載のＦＸＩＩよりＦＸＩＩａ−βに選択的に結合するモノクローナル抗体；ならびに国際公開第９１／１７２５８号に記載の抗ＦＸＩＩ抗体ＯＴ−２が挙げられ、これらの開示は、参照によってそれらの全体を本明細書に組み入れる。
【００８８】
追加の抗第ＸＩＩ因子モノクローナル抗体は、国際公開第２０１３／０１４０９２号に記載され、これは参照によってその全体を本明細書に組み入れる。いくつかの実施形態において、該抗体は、ヒト第ＸＩＩａ因子−ベータに対して不活性化ヒトＦＸＩＩより２倍を超えて高い結合親和性を有し、ヒト第ＸＩＩａ因子のアミド分解活性を阻害可能である。
【００８９】
【表１】
2017524675.tif 000002
【００９０】
特定の実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体は、表１に提示される重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体は、表１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、および／またはＶＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２およびＶＣＤＲ３を含む。国際公開第２０１３／０１４０９２Ａ１号に記載の抗体３Ｆ７は、このような抗体の例である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、抗体は、以下の特徴：（ａ）ヒトＦＸＩＩに結合する；（ｂ）配列番号６の配列と８５％を超えて同一、９０％、９５％、９８％または９９％を超えて同一であるような重鎖可変（ＶＨ）領域を含む；（ｃ）配列番号７の配列と８５％を超えて同一、９０％、９５％、９８％または９９％を超えて同一であるような軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む；（ｄ）配列番号８の配列と少なくとも８０％同一、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を超えて同一であるような重鎖ＣＤＲ１および／または配列番号９と少なくとも６０％同一、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を超えて同一であるような重鎖ＣＤＲ２および／または配列番号１１の配列と少なくとも８０％同一、８５％、９０％、９５％、９８％，または９９％同一であるような重鎖ＣＤＲ３を含む；（ｅ）配列番号１３と少なくとも５０％同一、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるような軽鎖ＣＤＲ１および／または配列番号１４と少なくとも５０％同一、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を超えて同一であるような軽鎖ＣＤＲ２と、および／または配列Ａ−Ｘ１−Ｗ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｒ−Ｘ６−Ｘ７（配列番号１６）
（式中、Ｘ１はＡまたはＳであり、Ｘ５はＬまたはＶであり、他のＸｎは任意のアミノ酸である）と少なくとも５０％同一、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を超えて同一であるような軽鎖ＣＤＲ３を含む；（ｆ）ＫＤが１０−８Ｍより優れているヒト第ＸＩＩａ因子−ベータを結合する；（ｇ）ヒト第ＸＩＩａ因子−ベータとの結合に関してインフェスチン−４と競合する；または（ｈ）ヒトＩｇＧもしくはこれらの機能性変異体、好ましくはヒトＩｇＧ４もしくはこれらの機能性変異体である、の１つまたはそれ以上を有する。
【００９２】
特定の実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体は、ヒトＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａと結合するＩｇＧ抗体であり、（ａ）配列番号８で示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示される重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２で示される重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および／または（ｂ）配列番号１３で示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１６で示される軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。重鎖ＣＤＲ２は、配列ＧＩＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＶＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）（式中、Ｘ１はＲ、ＮまたはＤであり、Ｘ２はＰ、Ｖ、ＩまたはＭであり、Ｘ３はＳ、ＰまたはＡであり、Ｘ４はＧ、Ｌ、ＶまたはＴであり、Ｘ５は任意のアミノ酸であってよく、好ましくは、Ｘ５はＧ、Ｙ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＭであり、およびＸ６はＴ、ＧまたはＳである）を含むことができる。重鎖ＣＤＲ３は、配列ＡＬＰＲＳＧＹＬＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＹＹＹＡＬＤＶ（配列番号１２）（式中、Ｘ１はＩ、ＭまたはＶであり、Ｘ２はＳまたはＫであり、Ｘ３はＰ、Ｋ、ＴまたはＨであり、およびＸ４は、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＱである）を含むことができる。軽鎖ＣＤＲ３は、配列ＡＸ１ＷＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＲＸ６Ｘ７（配列番号１６）（式中、Ｘ１はＡまたはＳであり、Ｘ２はＤ、Ｙ、Ｅ、Ｔ、Ｗ、ＥまたはＳであり、Ｘ３はＡ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、ＱまたはＥであり、Ｘ４はＳ、Ｄ、Ｐ、Ｅ、ＱまたはＲであり、Ｘ５はＬまたはＶであり、Ｘ６はＧ、ＬまたはＫであり、およびＸ７はＶ、Ａ、Ｄ、Ｔ、ＭまたはＧである）を含むことができる。
【００９３】
他の実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体は、ヒトＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａと結合するＩｇＧ抗体の断片であり、（ａ）配列番号８で示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号９で示される重鎖ＣＤＲ２および配列番号１１で示される重鎖ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および／または（ｂ）配列番号１３で示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１５で示される軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【００９４】
さまざまな実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体は、親和性が成熟した、キメラ、ＣＤＲグラフト化もしくはヒト化された抗体またはこれらの機能性抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体は、（３Ｆ７と比較して）親和性が成熟した抗体ＶＲ１１５、ＶＲ１１２、ＶＲ２４、ＶＲ１１０およびＶＲ１１９から選択される（これらの抗体のＨＣＤＲ１〜３およびＬＣＤＲ１〜３に関する配列番号を、下記の表２に示す）。
【００９５】
【表２】
2017524675.tif 000003
【００９６】
上記のように、配列番号１０は縮重配列である。ＶＲ１１９は、配列番号１０（式中、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＹであり、およびＸ６はＧである）を含む。ＶＲ１１２は配列番号１０（式中、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＶであり、Ｘ５はＱであり、およびＸ６はＧである）を含む。ＶＲ１１５は配列番号１０（式中、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＩであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＴであり、Ｘ５はＫであり、およびＸ６はＧである）を含む。ＶＲ１１０は配列番号１０（式中、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＭであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＴであり、Ｘ５はＫであり、およびＸ６はＧである）を含む。ＶＲ２４は特有のＬＣＤＲ１：ＳＧＳＳＥＭＴＶＨＨＹＶＹ（配列番号１７）を含む。
【００９７】
抗体のＣＤＲに関する実施形態において、ＣＤＲはＫＡＢＡＴナンバリングシステムにしたがって定義される。（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１））。
【００９８】
いくつかの実施形態において、抗体は抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＦＸＩＩａアミド分解活性アッセイ（国際公開第２０１３／０１４０９２号）において１：０．２のモル比でＦＸＩＩａ−アルファ対抗体を使用した場合に、ヒトＦＸＩＩａ−アルファを、４０％を超えて、５０％を超えて、６０％を超えて阻害するこれらの抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗体またはこれらの抗原結合断片は、１：０．５のモル比でＦＸＩＩａ−アルファ対抗体を使用した場合に、ヒト第ＸＩＩａ因子−アルファを、８０％を超えて、８５％を超えて、または９０％を超えて阻害する。一実施形態において、抗体は、１：０．５のモル比で使用した場合、ヒトＦＸＩＩａ−アルファの完全、またはほぼ完全（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて）な阻害を達成する。一実施形態において、抗体またはこれらの抗原結合断片は、抗体３Ｆ７の親和性と少なくともほぼ同等なヒトＦＸＩＩａに対する親和性を有する。
【００９９】
Ｄ．ＨＥＬＰと連結されたＦＸＩＩインヒビター
本出願の別の態様は、半減期強化ポリペプチド（ＨＬＥＰ）のような融合パートナーまたはＰＥＧのような分子と連結されたＦＸＩＩインヒビターを提供する。一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは小タンパク質である。したがって、（他の小タンパク質に関して観察されるように）急速な腎クリアランスが予想される（Ｗｅｒｌｅ  ＭおよびＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ  Ａ、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ２００６；３０：３５１〜３６７頁）。ポリペプチド化合物の短い血漿半減期に対処するための１つの方法は、反復的にまたは連続注入を介して注射することである。別の取り組みは、ポリペプチドそれ自体の内因性血漿半減期を増加させることである。例えば、一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、半減期延長タンパク質と連結される。
【０１００】
「半減期強化ポリペプチド」は、患者または動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏのＦＸＩＩインヒビターの半減期を増加できるポリペプチド融合パートナーである。例としては、アルブミンならびに免疫グロブリンおよびＦｃドメインまたは誘導体のようなこれらの断片が挙げられ、これらは、ＦＸＩＩインヒビターと直接、または切断性もしくは非切断性のリンカーを介して融合される。Ｂａｌａｎｃｅら（国際公開第２００１／７９２７１号）は、ヒト血清アルブミンと融合された多数のさまざまな治療用ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを記載した。
【０１０１】
「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語は、ヒトアルブミン（ＨＡ）およびこれらの変異体を包含し、この完全成熟型（配列番号１９）ならびに他の種由来のアルブミンおよびこれらの変異体を本明細書に開示する。本明細書において使用する場合、「アルブミン」は、アルブミンのポリペプチドもしくはアミノ酸配列またはアルブミンの１つまたはそれ以上の機能活性（例えば、生物活性）を有するアルブミン変異体を指す。特定の実施形態において、アルブミンは、ＦＸＩＩインヒビターの治療活性を安定化または延長するために使用される。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジまたはブタに由来する。非哺乳動物性アルブミンもまた使用でき、限定するものではないが、トリおよびサケ由来のアルブミンを含む。アルブミン連結ポリペプチドのアルブミン部分は、治療用ポリペプチド部分とは異なる動物に由来してもよい。アルブミン融合タンパク質の例のために国際公開第２００８／０９８７２０号を参照されたく、その全体は参照によって本明細書に組み入れる。
【０１０２】
一実施形態において、アルブミン変異体は、少なくとも１０、２０、４０、５０、６０または少なくとも７０アミノ酸長（またはこの間の任意の長さ）であるか、またはヒトアルブミン（ＨＡ）配列（例えば、配列番号１９）由来の１５、２０、２５、３０、５０またはそれ以上（またはこの間の任意の数）の連続するアミノ酸を含み得る、またはＨＡの特異的ドメインの一部もしくはすべてを含み得る。アルブミン変異体は、アミノ酸の置換、欠失または付加、保存的または非保存的置換のいずれかを含んでよく、このような変化は、半減期強化ポリペプチドの治療活性をもたらす活性部位または活性ドメインを実質的に改変しない。これらの変異体は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（またはこれらの間の任意の百分率）の相同性を共有できる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、アルブミン変異体は断片であり、アルブミンの少なくとも１つの全ドメインおよび／またはそれらのドメインの断片、例えば、ドメイン１（配列番号１９のアミノ酸１〜１９４）、２（配列番号１９のアミノ酸１９５〜３８７）、３（配列番号１９のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（配列番号１９の１〜３８７）、２＋３（配列番号１９の１９５〜５８５）または１＋３（配列番号１９のアミノ酸１〜１９４＋アミノ酸３８８〜５８５）を含むことができる。各ドメインはそれ自体、２つの相同なサブドメインすなわち、配列番号１９の残基１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１および５１２〜５８５と、残基Ｌｙｓ１０６からＧｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２からＶａｌ３１５およびＧｌｕ４９２からＡｌａ５１１を含む、柔軟なサブドメイン間リンカー領域とで構成される。したがって、いくつかの実施形態において、アルブミン変異体は、アルブミンの少なくとも１つの全サブドメインを含む。
【０１０４】
特定の実施形態において、限定するものではないがアルファ−フェトプロテイン（国際公開第２００５／０２４０４４号；ＢｅａｔｔｉｅおよびＤｕｇａｉｃｚｙｋ、２０  Ｇｅｎｅ  ４１５〜４２２頁、１９８２）、アファミン（ａｆａｍｉｎ）（Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎら、２６９（２７）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８１４９〜１８１５４頁、１９９４）およびビタミンＤ結合タンパク質（ＣｏｏｋｅおよびＤａｖｉｄ、７６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２４２０〜２４２４頁、１９８５）を含む、アルブミンと構造的または進化的に関連する他のタンパク質（「アルブミンファミリータンパク質」）がＨＬＥＰとして使用される。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、ヒト、マウスおよびラットの同じ染色体領域にマッピングされる構造的および機能的類似性を有する多重遺伝子クラスタを表す。アルブミンファミリーメンバーの構造的類似性は、これらがＨＬＥＰとして使用可能であることを示唆する。例えば、アルファ−フェトプロテインは、結合された治療用ポリペプチドの半減期をｉｎ  ｖｉｖｏで延長するために特許請求されている（国際公開第２００５／０２４０４４号）。したがって、いくつかの実施形態において、これらのタンパク質または治療活性を安定化または延長可能なこれらの変異体は、ＦＸＩＩもしくはＦＸＩＩａと連結されたＨＬＥＰとして使用され、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジもしくはブタまたは限定するものではないが、トリもしくはサケ由来を含む非哺乳動物性に由来する。いくつかの実施形態において、変異体は、１０もしくはそれ以上のアミノ酸長を含んでよく、または個別のタンパク質配列が由来する１５、２０、２５、３０、５０またはそれ以上の連続するアミノ酸を含んでもよく、または個別のタンパク質の特異的ドメインの一部もしくはすべてを含んでもよい。アルブミンファミリーメンバー融合タンパク質は、天然に存在する多形性変異体を含んでよい。
【０１０５】
特定の実施形態において、モノ−またはポリ−（例えば２−４）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分は融合パートナーとして使用され、ｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を延長できる。ペグ化は、利用可能なペグ化反応のいずれかにより実行される。ペグ化タンパク質生成物を製造する例示的方法は、（ａ）ポリペプチドと（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のような）ポリエチレングリコールとを、タンパク質が１つまたはそれ以上のＰＥＧ基と結合する条件下で反応させること、および（ｂ）（１つまたは複数の）反応生成物を得ること、を全体に含むことができる。いくつかのＰＥＧ結合方法が存在する。例えば、ＥＰ０４０１３８４；Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０：１０２８〜１０３５頁（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３（２）：４〜１０頁（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６；ＥＰ０４０１３８４；国際公開第９２／１６２２１号；国際公開第９５／３４３２６号；米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたく、これらの全体は参照によって本明細書に組み入れる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン（Ｉｇ）はＨＬＥＰとして使用される。「免疫グロブリン」という用語は、Ｆｃ領域または１つもしくはそれ以上のＩｇ定常ドメインのようなこれらの機能性断片および変異体を包含する。いくつかの実施形態において、Ｉｇは、（１つまたは複数の）免疫グロブリン定常ドメインのＦｃ領域または一部を含む。定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥ免疫グロブリンの定常領域である。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチド部分は、抗体のヒンジ領域または切断性ペプチドリンカーを介してＩｇと連結される。いくつかの特許および特許出願は、治療用タンパク質の半減期をｉｎ  ｖｉｖｏで延長するための、治療用タンパク質と免疫グロブリン定常領域との融合を記載しており（米国特許出願第２００４／００８７７７８号、国際公開第２００５／００１０２５号、国際公開第２００５／０６３８０８号、国際公開第２００３／０７６５６７号、国際公開第２００５／０００８９２号、国際公開第２００４／１０１７４０号、米国特許第６，４０３，０７７号）、これらは参照によって本明細書に組み入れる。したがって、いくつかの実施形態において、免疫グロブリン領域（例えば、Ｆｃドメイン、免疫グロブリンのＦｃ断片およびこれらの変異体）はＨＬＥＰとして使用される。いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩのインヒビターは、Ｆｃドメインまたは免疫グロブリン定常領域の一部と、ＨＥＬＰとして融合される。いくつかの実施形態において、これらの融合タンパク質は、細菌、酵母、植物、動物（昆虫を含む）またはヒト細胞系のような原核生物または真核生物の宿主細胞において、またはトランスジェニック動物において発現される組換え分子として製造される（国際公開第２００８／０９８７２０号、参照によって本明細書に組み入れる）。
【０１０７】
ＳＰＩＮＫ突然変異体−Ｆｃ融合タンパク質の例、ＳＰＩＮＫ−Ｋ２−Ｆｃ融合タンパク質は、国際公開第２００８／０９８７２０号に記載される。
【０１０８】
Ｅ．リンカー
さまざまな実施形態において、介在するペプチドリンカーは、治療用ポリペプチドとＨＬＥＰとの間に導入される。一実施形態において、特にＨＬＥＰが治療用ポリペプチドの特異的活性に、例えば立体障害により干渉する可能性を有する場合、切断性リンカーが導入される。特定の実施形態において、リンカーは、内因性、外因性もしくは共通の凝固経路の凝固プロテアーゼのような、凝固に関与する酵素により切断可能である。内因性経路の凝固プロテアーゼとしては接触活性化経路中のプロテアーゼ、例えばＦＸｌｌａ、ＦＸｌａまたはＦＩＸａが挙げられる。一実施形態において、リンカーは、ＦＸｌｌａにより切断される。外因性経路のプロテアーゼとしては、組織因子経路中のプロテアーゼ、例えばＦＶＩＩａが挙げられる、共通経路のプロテアーゼとしては、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換に関与するプロテアーゼ、例えばＦＸａ、ＦＩＩａ、およびＦＸＩＩＩａが挙げられる。
【０１０９】
ＩＩＩ．医薬組成物
本発明のさまざまな態様のいずれかにおいて、ＦＸＩＩインヒビターは、８０％を超える、または９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を超える純度を有することができる。一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、他のタンパク質および核酸のような巨大分子の混入に関して、９９．９％を超えて純粋である医薬品純粋状態を有することができ、感染性および発熱性作用物質は含まれない。
【０１１０】
特定の実施形態において、医薬組成物は、充填剤、増量剤、バッファー、安定剤または賦形剤のような少なくとも１種の添加剤を含んでよい。いくつかの例示的医薬製剤技術は、例えば、２００５  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２０００；Ｋｉｂｂｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０００に記載されている。医薬品添加剤としては、例えば、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。特定の実施形態において、医薬組成物は、ｐＨ緩衝化試薬および湿潤剤もしくは乳化剤をさらに含み得る。さらなる実施形態において、組成物は、防腐剤および／または安定剤を含み得る。医薬組成物は、凍結乾燥された、または安定な可溶性形態で製剤化される。ポリペプチドは、当分野において公知のさまざまな手順により凍結乾燥される。
【０１１１】
特定の実施形態において、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターを含む医薬組成物は、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害の処置における使用のために製造される。例えば、ＦＸＩＩインヒビターの（例えばフリーズドライによる）粉末または凍結乾燥型が提供され、水性医薬品が望ましい場合、粉末は医薬製剤の水性成分と混合し、ボルテックス混合または穏やかな撹拌のような適切な技術を使用して撹拌することによって溶解される。または、水性医薬品が望ましく、ＦＸＩＩインヒビターが既に水性形態である場合、これらの成分は、投与前に直接組み合わせることができる。特定の実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、凍結乾燥形態で提供され、投与前に水性医薬品成分（例えば、追加の活性成分または充填剤、安定剤、溶媒もしくは担体のような不活性成分）と組み合わされる。
【０１１２】
医薬組成物の製剤は、投与の意図される経路または他のパラメーターに依存して変動し得る（例えば、Ｒｏｗｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第４版、ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２００３を参照されたい）。いくつかの実施形態において、医薬組成物は凍結乾燥されたケーキまたは粉末であってよい。凍結乾燥組成物は、静脈内注射による投与のために、例えば注射用滅菌水、ＵＳＰにより再構成される。他の実施形態において、組成物は、滅菌の、非発熱性溶液であってよい。またさらなる実施形態において、組成物は、丸薬または錠剤で、粉末形態で送達される。
【０１１３】
ＦＸＩＩインヒビターの製剤は、投与の医薬として適切な手段により患者に送達される。例えば、組成物は、非経口または髄腔内のように全身に投与される。非経口製剤は、ボーラス型または注入のいずれかで、公知の手順に従って静脈内または皮下投与される。非経口使用のための周知の好ましい液体担体としては、滅菌水、食塩水、水性デキストロース、糖溶液、エタノール、グリコールおよび油が挙げられる。全身使用のために、治療用タンパク質（１つまたは複数の）は静脈ラインまたは動脈ライン用に製剤化される。製剤は、注入により連続的に、またはボーラス注射により投与される。
【０１１４】
経口または直腸投与のための錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤または湿潤剤などのような従来の賦形剤を含んでよい。経口または直腸用液体調製物は、水性もしくは油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤などの形態であってよく、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルにより再構成するための乾燥生成物として提示してもよい。このような液体調製物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび防腐剤のような従来の添加剤を含んでよい。いくつかの製剤は、パッチのような徐放系を包含する。
【０１１５】
脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害の処置のためのキットもまた開示される。特定の実施形態において、該キットは、（ａ）少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビター；（ｂ）脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害の処置において使用するための取扱い説明書、および場合により（ｃ）少なくとも１種のさらなる治療用活性物質、ここでさらなる治療用活性物質はＣ１インヒビターではない、を含む。
【０１１６】
キットの成分は、１つまたはそれ以上のバイアルのような１つまたは異なる容器に含まれる。少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、液体形態であっても、または（例えば、凍結乾燥後の）固体形態であってもよい。液体形態の場合、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターは、プロリン、グリシンもしくはスクロースなどの安定剤および／または防腐剤のような添加剤または他の添加剤を含んでよい。
【０１１７】
特定の実施形態において、キットは、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターの投与前、同時または投与後に投与される、治療用活性化合物または薬物のような追加の化合物を含んでよく、ここでさらなる治療用活性物質はＣ１インヒビターではない。このような化合物の例としては、ビタミン、抗生物質、抗ウイルス剤などが挙げられる。他の実施形態において、ステロイド、特にコルチゾンが、該キットに含まれる。
【０１１８】
さまざまな実施形態において、キットの使用に関する取扱い説明書は、脊髄損傷および外傷性脳損傷から選択される神経外傷性障害の処置におけるキット成分の使用のための指示を含んでよい。取扱説明書は、少なくとも１種のＦＸＩＩインヒビターの製造方法（例えば、フリーズドライタンパク質の場合、希釈または再構成）に関する情報をさらに含んでもよい。取扱説明書は、投薬量および／または投与の頻度に関するガイダンスをさらに含んでもよい。
【０１１９】
図は以下を示す：
図１は、外傷誘導の２４時間後、ＮａＣｌ処置または野生型（Ｂｌ／６）対照それぞれと比較した、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置またはＦＸＩＩ−／−マウスにおける、病変サイズの減少を示す。雄および雌のマウスから得られた脳スライスのＴＴＣ染色により、それらの病変容積を分析した。ＦＸＩＩの欠損または阻害により、外傷誘導の２４時間後の病変サイズが減少した。（Ａ）雄の野生型およびＦＸＩＩ−／−マウス（ｎ＝１９）における病変容積、（Ｂ）雌のマウス（Ｂｌ／６はｎ＝４、ＦＸＩＩ−／−はｎ＝５）、および（Ｃ）ｒＨＡ−インフェスチン−４処置動物および対照（ｒＨＡ−インフェスチン−４はｎ＝１４、対照はｎ＝１３）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない、スチューデントの両側ｔ検定、平均＋ＳＥＭ。
【０１２０】
図２は、野生型対照（Ｂｌ／６）と比較したＦＸＩＩ−／−マウスにおける、外傷誘導の２４時間後の血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性の保存を示す。（Ａ）測光により決定した病変半球におけるエバンスブルー溢出の範囲（ＦＸＩＩ−／−はｎ＝６、Ｂｌ／６はｎ＝８）。（Ｂ）病変半球における脳浮腫の指標としての脳の含水量（ＦＸＩＩ−／−はｎ＝８、Ｂｌ／６はｎ＝９）。＊Ｐ＜０．０５、対応のない、スチューデントの両側ｔ検定、平均＋ＳＥＭ。
【０１２１】
図３は、ＮａＣｌ処置対照と比較したｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおける、外傷誘導の２４時間後の血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性の保存を示す図である。ＢＢＢの完全性は、（Ａ）測光により決定した、病変半球におけるエバンスブルー（ＥＢ）溢出の範囲（ｎ＝５）および（Ｂ）病変半球における脳浮腫の指標としての脳の含水量（ｒＨＡ−インフェスチン−４はｎ＝８、対照はｎ＝９）によって分析した。（Ｃ）タイトジャンクション構成タンパク質オクルディンの相対的なタンパク質発現（ｎ＝５）＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、対応のない、スチューデントの両側ｔ検定、平均＋ＳＥＭ。
【０１２２】
図４は、外傷誘導の２４時間後の、血栓形成の減少および弱まった血栓性過程を示す。（Ａ）フィブリン／フィブリノーゲンの相対的なタンパク質発現をウェスタンブロッティングにより分析し、それらは野生型対照と比較してＦＸＩＩ−／−マウスにおいて減少した（Ｂｌ／６；ｎ＝３）。（Ｂ）病変半球における開放血管に対する閉塞血管の比をＨ＆Ｅ染色した脳スライスにおいて決定した（ｎ＝５、動物につき５スライス）。閉塞血管（矢印）および開放血管（星印）の代表的な染色（下のパネル）。ＮａＣｌ処置対照と比較してｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおいて改善された比が見出された。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、対応のない、スチューデントの両側ｔ検定、平均＋ＳＥＭ。
【０１２３】
図５は、外傷誘導の２４時間後の、ＦＸＩＩ−／−マウスにおける炎症過程からの保護を示す。（Ａ）病変半球へのマクロファージ浸潤の定量は、１日目のＣＤ１１ｂ＋マクロファージ／ミクログリアに対する免疫組織化学染色により分析し、野生型対照（Ｂｌ／６；ｎ＝４）と比較した。炎症誘発性サイトカインＴＮＦα（Ｂ）およびインターロイキン−１β（Ｃ）の相対的な遺伝子発現は、野生型対照（Ｂｌ／６）および外傷誘導後、同側性皮質（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ  ｃｏｒｔｉｃｅｓ）（ｉｐｓｉ）において偽手術されたマウスと比較してＦＸＩＩ−／−マウスにおいて測定した（ｎ＝５）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、Ｂｌ／６と比較、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、偽手術された動物と比較、対応のない、スチューデントの両側ｔ検定（Ａ）、一元配置分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）に続くボンフェローニ  ポストホックテスト（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）、平均＋ＳＥＭ。
【０１２４】
図６は、ＮａＣｌ処置および偽手術されたマウスと比較してｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおける炎症誘発性サイトカインを示す。外傷誘導の２４時間後、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置動物において炎症過程が弱まる。同側性皮質（ｉｐｓｉ；ｎ＝３）における炎症誘発性サイトカインＴＮＦα（Ａ）およびインターロイキン−１β（Ｂ）の相対的な遺伝子発現を示す。＊Ｐ＜０．０５、偽手術された動物と比較、一元配置分散分析に続くボンフェローニ  ポストホックテスト、平均＋ＳＥＭ。
【０１２５】
図７は、外傷誘導の３日後、野生型対照（Ｂｌ／６）と比較したＦＸＩＩ−／−マウスにおける病変サイズの減少を示す。ＦＸＩＩ欠損マウスは、３日目に組織損傷から保護される。病変容積は、雄のマウス（ＦＸＩＩ−／−はｎ＝９、Ｂｌ／６はｎ＝１４）および雌のマウス（ｎ＝３）のＴＴＣ染色した脳スライスにおいて測定した。＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない、スチューデントの両側ｔ検定、平均＋ＳＥＭ。
【０１２６】
図８は、外傷誘導の３日後、野生型対照（Ｂｌ／６）と比較したＦＸＩＩ−／−マウスにおける、血液脳関門（ＢＢＢ）損傷の減少を示す。ＢＢＢの完全性は、外傷誘導の３日後のＦＸＩＩ−／−マウスにおいて保存される。病変半球におけるエバンスブルー溢出の範囲を測光により決定した（Ｂｌ／６はｎ＝４、ＦＸＩＩ−／−はｎ＝５）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、対応のない、スチューデントの両側ｔ検定、平均＋ＳＥＭ。
【０１２７】
図９は、脳内の血小板集積および血栓症が外傷性脳損傷の病理的特徴であることを示す。（Ａ）ヒトの外傷を与えた脳組織の血小板マーカー糖たんぱく質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）の代表的な免疫組織染色により、顕著な血管内血小板付着を示す（矢印；非閉塞血管は星印で示す；スケールバーは１００μｍを表す）。（Ｂ）重量ドロップ損傷後７日目、病変半球のマウス脳切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色は、閉塞血管を示す（矢印；スケールバーは１００μｍを表す）。（Ｃ）右頭頂皮質（衝突領域）の脳血流は７日以内に著しく減少した。（Ｅ）低温障害後１日目、病変半球のマウス脳切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色は閉塞血管を示す（矢印；スケールバーは１００μｍを表す）。
【０１２８】
図１０は、第ＸＩＩ因子欠損（ＦＸＩＩ−／−）マウスにおいて、重量ドロップ損傷後７日目の脳内の血小板集積が減少することを示す。（Ａ）ヘマトトキシンおよびエオシンで染色した脳切片からの血栓症の指標の計算により、野生型（ＷＴ）マウスおよびヒトＦＸＩＩを戻したＦＸＩＩ−／−マウス（ＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩ）と比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおける閉塞血管が減少したことを示す（群につきｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）糖たんぱく質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）およびＣＤ３１抗体を用いる、蛍光免疫染色の分析により、ＷＴマウスおよびＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩマウスと比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおける損傷誘導後７日目の脳内の血小板付着の顕著な減少が明らかである（群につきｎ＝４、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ＧＰＩｂ抗体を用いるウェスタンブロット分析により、ＷＴ対照または偽手術されたマウスと比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおけるより小さな範囲に血小板が集積することを確認する。β−アクチン対照に関する濃度測定によりバンドを定量化した。下のパネルは、各群の２つの代表的なブロットを示す（群につきｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１；ＡＵ＝任意単位）。
【０１２９】
図１１は、第ＸＩＩ因子欠損（ＦＸＩＩ−／−）マウスにおいて低温障害後１日目（ｄ１）および３日目（ｄ３）の脳内の血小板集積が減少することを示す。（Ａ）ヘマトトキシンおよびエオシンで染色した脳切片からの血栓症の指標の計算により、野生型（ＷＴ）マウスおよびヒトＦＸＩＩを戻したＦＸＩＩ−／−マウス（ＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩ）と比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおける閉塞血管が減少することを示す（群につきｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）糖たんぱく質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）抗体を用いるウェスタンブロット分析により、ＷＴ対照または偽手術されたマウス（Ｓｈａｍ）と比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおけるより小さな範囲に血小板が集積することを確かめる。β−アクチン対照に関する濃度測定によりバンドを定量化した（群につきｎ＝５、＊Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＧＰＩｂおよびＣＤ３１抗体を用いる、蛍光免疫染色の分析により、ＷＴマウスおよびＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩマウスと比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおける脳内の血小板付着の著しい減少が明らかである。
【０１３０】
図１２は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）欠損が重量ドロップ損傷後の転帰を改善することを示す。ＦＸＩＩ欠損（ＦＸＩＩ−／−）マウスは、野生型（ＷＴ）マウスおよび脳の外傷の拡散後３日目および７日目にヒトＦＸＩＩを戻したＦＸＩＩ−／−マウス（ＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩ）よりも著しく低い神経学的な重症度（ＮＳＳ）を発症する。外傷の１時間（０日）および１日後、動物は同様の神経障害を表した（群につきｎ＝１０〜１３、＊Ｐ＜０．０５）。
【０１３１】
図１３は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）欠損が低温障害後の転帰を改善することを示す。（Ａ）雄の野生型（ＷＴ）マウス、ＦＸＩＩ欠損（ＦＸＩＩ−／−）マウス、ヒトＦＸＩＩを戻したＦＸＩＩ−／−マウス（ＦＸＩＩ−／−＋ｈＦＸＩＩ）、雌の野生型（ＷＴ  ｆｅｍ）マウス、および雌のＦＸＩＩ−／−（ＦＸＩＩ−／−  ｆｅｍ）マウス由来の脳切片の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色後、病変容積測定を限局性脳外傷後１日目（ｄ１）および３日目（ｄ３）に実施した。雄および雌のＦＸＩＩ−／−マウスは、ＷＴマウスと比較した場合、病変容積が著しく減少したことを示す。ＦＸＩＩ欠損の有益効果は、ヒトＦＸＩＩ（ｈＦＸＩＩ）の適用により戻る（群につきｎ＝７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。（Ｂ）連続冠状断Ｔ２重み付け勾配エコーＭＲ画像は、ＷＴマウスおよびＦＸＩＩ−／−マウスにおける外傷誘導後ｄ１および７日目（ｄ７）に高信号の病変を示す。低信号領域は、両群において、脳内出血がないことを示している。下のパネルは群につき２つの代表的な脳スライスおよび時点を示す。ＭＲＩに基づく病変容積測定（上のパネル）により、ＦＸＩＩ−／−マウスにおけるより小さな病変の発症を確認した（群につきｎ＝８〜９、＊Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＦＸＩＩ−／−マウスにおいて神経のアポトーシスが減少した。パネルは、ｄ１およびｄ３の、損傷した半球における脳スライスごとのＴＵＮＥＬ陽性神経の数を示す。アポトーシス性神経の数は、ＷＴ対照と比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおいて著しく減少した（群につきｎ＝４、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５、スケールバーは５０μｍを表す）。
【０１３２】
図１４は、ｒＨＡ−インフェスチン−４での第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）の薬理学的阻害が脳内の血小板集積を減少し、重量ドロップ脳外傷後の転帰を改善することを示す。（Ａ）閉塞血管は、ｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウスと比較した場合、ビヒクル処置したマウスにおいてより豊富である。この発見は、ｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウスにおける閉塞血管の非常に著しい減少を示す７日目に、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した脳切片から血栓症の指標を計算することにより確認した（群につきｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）（Ｂ）糖たんぱく質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）およびＣＤ３１抗体を用いる、蛍光免疫染色の分析により、マウスをｒＨＡ−インフェスチン−４で処置した場合、損傷誘導後７日目の血管内血小板付着の顕著な減少が明らかである（群につきｎ＝４、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｃ）脳の外傷後３日目および７日目に、ｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウスはビヒクル処置した（Ｖｅｈｉｃｌｅ）マウスよりも著しく低い神経学的な重症度（ＮＳＳ）を発症する。脳外傷の１時間（０日目）および１日後、動物は同様の神経障害を表した（群につきｎ＝１３、＊Ｐ＜０．０５）。
【０１３３】
図１５は、ｒＨＡ−インフェスチン−４での第ＸＩＩ因子の薬理学的阻害が脳内の血小板集積を減少し、限局性脳外傷からの保護を提供することを示す。（Ａ）ビヒクル処置した動物における閉塞血管の非常に有意な増加を示す、損傷誘導後１日目（ｄ１）および３日目（ｄ３）に血栓症の指標を計算することにより決定すると、閉塞血管は、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスと比較した場合、ビヒクル処置したマウスにおいてより豊富である（群につきｎ＝４、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、スケールバーは１００μｍを表す）。（Ｂ）糖たんぱく質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）およびＣＤ３１抗体を用いる、蛍光免疫染色の分析により、マウスをｒＨＡ−インフェスチン−４で処置した場合、損傷誘導後ｄ１およびｄ３の血管内血小板付着の顕著な減少が明らかである（群につきｎ＝４、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ビヒクル処置したマウスおよびｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウスの脳切片の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色後、病変容積測定を限局性脳外傷後ｄ１およびｄ３に実施した。ｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウスは脳外傷から実質的に保護された（群につきｎ＝７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。（Ｄ）脳スライスごとのＴＵＮＥＬ陽性神経の数は、神経マーカーＮｅｕＮの免疫標識およびアポトーシスを検出するためのＴＵＮＥＬアッセイに供した後に評価した。アポトーシス性神経の数は、ｄ１およびｄ３のビヒクル処置した対象と比較した場合、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおいて著しく減少した（群につきｎ＝４、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。
【０１３４】
図１６は、遺伝的欠損および第ＸＩＩ因子の薬理学的阻害が低温障害後に出血をもたらさないことを示す。上のパネルは、偽手術されたマウス、ＦＸＩＩ欠損マウス、ｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウス、およびＦＸＩを欠損したマウスの、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）で染色した代表的な脳スライスを示す。下のパネルは、外傷誘導の１日後の、偽手術されたマウス（Ｓｈａｍ）、野生型（ＷＴ）マウス、ＦＸＩＩ欠損（ＦＸＩＩ−／−）マウス、ビヒクル処置（Ｖｅｈｉｃｌｅ）マウス、ｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウス、およびＦＸＩ欠損（ＦＸＩ−／−）マウスの病変半球におけるヘモグロビンの量を示す。ＦＸＩＩ阻害の群におけるヘモグロビン濃度は、偽手術された動物のレベルのままであり、ＦＸＩ−／−マウスは非常に著しいヘモグロビンの量の増加を示す（群につきｎ＝４〜５、ｎｓ＝顕著でない、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０１３５】
図１７は、損傷誘導の２４時間および３日目後の免疫細胞浸潤の減少を示す。Ｌｙ．６Ｂ．２陽性好中球の量は、ＷＴまたはＮａＣｌ処置対照とそれぞれ比較して、ＦＸＩＩ−／−マウスおよびｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウスにおいて免疫組織化学的に決定した。
【０１３６】
実施例は本発明を例示する。実施例は、例示を意図するものであり、決して本開示を制限するものではない。開示された組成物および方法の他の実施形態は、本明細書の考察および本明細書に開示の組成物および方法の実行から当業者に明らかであると思われる。
【実施例１】
【０１３７】
方法：
６週齢のＣ５７Ｂｌ／６野生型マウス（Ｂｌ／６）およびＦＸＩＩ欠損マウス（ＦＸＩＩ−／−）を、皮質の低温病変モデルを用いて実験的限局性ＴＢＩに供した。活性化ＦＸＩＩの薬理学的阻害のため、外傷誘導の１時間後に、野生型マウスをｒＨＡ−インフェスチン−４（２００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）で処置した。病変サイズは、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）で染色した脳スライスから容積測定により決定した。血液脳関門（ＢＢＢ）損傷を評価するため、脳内のエバンスブルー（ＥＢ）溢出を測光により測定し、脳の含水量（＝浮腫）の測定のため、乾湿重量比（ｗｅｔ−ｔｏ−ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｒａｔｉｏ）を計算した。ウェスタンブロット（ＷＢ）分析および免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を実施し、タイトジャンクションタンパク質およびフィブリン／フィブリノーゲンのタンパク質発現を評価した。ＴＢＩ後の局所炎症応答は、ＰＣＲおよび組織学によって分析した。
【０１３８】
結果：
外傷誘導の２４時間後、対象と比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスならびにｒＨＡ−インフェスチン−４処置野生型マウスにおいて、病変サイズの著しい減少を観察することができた。脳の血管系内でのより少ない血栓形成ならびにＢＢＢの完全性の保存が、根底にある機序として同定された。さらに、ＦＸＩＩ阻害がＴＢＩ後の局所炎症応答を弱めた。さらに、病変サイズの減少およびＢＢＢの完全性の保存が、対照と比較した場合に外傷誘導の３日後のＦＸＩＩ−／−マウスにおいて観察することができた。
【０１３９】
結論：
ＦＸＩＩの遮断は、「血栓炎症」を減少することにより、ＴＢＩから保護した。したがって、ＦＸＩＩの阻害は、ＴＢＩおよび他の神経学的な、好ましくは神経外傷性障害と戦う有望な戦略である。
【実施例２】
【０１４０】
材料および方法
動物
全部で１２４匹（雄１１０匹および雌１４匹）のＣ５７Ｂｌ／６Ｎ（野生型）マウス、５５匹（雄４１匹および雌１４匹）のＦＸＩＩ欠損（ＦＸＩＩ−／−）マウス（Ｐａｕｅｒら、２００４、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９２：５０３〜５０８頁）、および５匹の雄のＦＸＩ欠損（ＦＸＩ−／−）マウス（Ｇａｉｌａｎｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ
Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８：１３４〜１４４頁）を、本研究において使用した。マウスを５から９匹の群で、食物および水は自由に利用できるようにし、１２時間明／１２時間暗サイクルで飼育した。本研究において、すべての実験は、制度および規制機関により承認され、ＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵおよびＡＲＲＩＶＥ基準にしたがって実行した（Ｋｉｌｋｅｎｎｙら、２０１２、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ２０：２５６〜２６０頁）。
【０１４１】
皮質の低温障害モデル
皮質の低温障害は、先に記載したように誘導した（Ａｌｂｅｒｔ−Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、２０１４、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：２６９頁）。手短に言えば、６週齢のマウスを、ケタミン（０．１ｍｇ／ｇ）およびキシラジン（０．００５ｍｇ／ｇ）の腹腔内注射により麻酔した。マウスの頭部を定位フレーム（ＴＳＥ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に拘束し、頭皮切開により頭蓋骨を露出した後、右頭頂皮質上で手術を実施した。先端径２．５ｍｍの銅シリンダーを液体窒素（−１９６℃）で満たし、右頭頂皮質（前頂からの座標：１．５ｍｍ尾側、１．５ｍｍ外側）に９０秒間置いた。偽手術された動物は銅シリンダーの冷却なしに同じ手術手順を受けた。
【０１４２】
重量ドロップモデル
実験的な閉鎖性頭部損傷は、先に記載したように実施した（Ａｌｂｅｒｔ−Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、２０１２、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ３２：１７４７〜１７５６頁；Ａｌｂｅｒｔ−Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、２０１２、Ｅｘｐ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｍｅｄ  ４：１）。手短に言えば、イソフルラン麻酔の誘導後、自然に呼吸する１０〜１６週齢のマウスを定位フレームに置き、正中線縦方向の頭皮切開により頭蓋骨を露出した。衝突領域の同定後、シリコーンで被覆した丸い先端を有するおもりを、最終衝突０．０１Ｊで落とした。偽手術は、麻酔および頭蓋骨の曝露を含むが、重量ドロップ損傷なし。マウスの神経行動学的な状態を神経学的な重症度（ＮＳＳ）によって評価し、低い値を有する運動機能上のタスク、覚醒、および生理学的行動を含む集成値は欠損が少ないことを示している。重量ドロップ損傷の１時間、１日、３日、および７日後にマウスを評価した。機能アッセイを実施した研究員は、実験群に盲検であった。
【０１４３】
薬理学的処置
限局性低温障害またはびまん性重量ドロップ損傷誘導の１時間後に、野生型マウスは、２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、特異的ＦＸＩＩインヒビターであるｒＨＡ−インフェスチン−４（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｍａｒｂｕｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の単回静脈内注射を受けた。対照動物は同体積の０．９％塩化ナトリウム（ビヒクル）を受けた。損傷誘導の１時間後、および７２時間ごとに続けて、ヒトＦＸＩＩ（ｈＦＸＩＩ）（Ｓｅｋｉｓｕｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡＤＧ４１２Ｈ）２μｇ／ｇ体重を静脈内注射し、ＦＸＩＩ−／−マウスを再構成した。
【０１４４】
皮質の低温障害後の病変サイズの決定
低温障害の２４時間または３日後、マウスを屠殺した；脳を素早く取り出し、マウスの脳スライスマトリックス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて５つの厚さ１ｍｍの冠状切片に切断した。スライスは、ＰＢＳ中２％  ２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により２０分間、３７℃で染色し、病変を可視化した。病変容積は、盲検様式で容積測定（ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）により計算した。
【０１４５】
磁気共鳴画像法
ＭＲＩは低温障害の１日後および７日後に、ケタミン（０．１ｍｇ／ｇ）およびキシラジン（０．００５ｍｇ／ｇ）による麻酔下、３テスラ単位で（Ｖｉｓｉｏｎ；Ｓｉｅｍｅｎｓ）繰り返し実施した。プロトコールは、冠状断Ｔ２重み付けシーケンス（スライス厚さ２ｍｍ）、および血液感受性な冠状断Ｔ２重み付け勾配エコーＣＩＳＳシーケンス（定常状態で干渉を構成；スライス厚さ１ｍｍ）を含む。病変容積は、高解像度のＣＩＳＳ画像において高信号領域のプラニメトリーにより計算した。ＣＩＳＳ画像によりさらに、可能性のある脳内出血に関して調べた。
【０１４６】
レーザードップラー血流計
右頭頂皮質（衝突領域）の局部的脳血流をモニターするために、レーザードップラー血流計（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。脳血流は、ベースライン（損傷誘導前）、損傷誘導の１時間、３および７日後に連続的に測定した。
【０１４７】
組織学および免疫組織化学
低温包埋したマウス脳は、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ）を使用して厚さ１０μｍまたは厚さ１５μｍのスライスに切断した（それぞれ、皮質の低温障害モデルおよび重量ドロップモデル）。血栓症の指標の評価のため、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を標準的な手順に従って実施した。染色は盲検様式で調べ、病変半球内の閉塞した（Ｎｏｃｃ）および非閉塞（Ｎｏｐｅｎ）血管の数を２０倍の倍率下で１０番目の脳スライスごとに数えた。血栓症の指標は、以下の方程式を使用して計算した：（Ｎｏｃｃ／（Ｎｏｐｅｎ＋Ｎ
ｏｃｃ））×１００。ヒトの脳における血管内の血小板集積を評価するために、パラフィン包埋切片を糖たんぱく質Ｉｂ（ＧＰＩｂ；ａｂｃａｍ，ａｂ１０２６４７）に対して製造業者のプロトコールに従って染色し、次いで、全ての核を可視化するためにヘマトキシリンで対比染色した。蛍光免疫染色のため、以下の一次抗体を適用した：抗ＧＰＩｂ（１：１００、Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ教授、Ｒｕｄｏｌｆ−Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｚｅｎｔｒｕｍ，Ｗｕｒｚｂｕｒｇから譲渡）、抗ＣＤ３１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＣＡ２３８８ＧＡ、１：１００）、抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３７７、１：１０００）。二次抗体として、Ｃｙ２抗ラット（Ｄｉａｎｏｖａ、１２２−２２５−１６７、１：１００）、Ｃｙ３抗ラット（Ｄｉａｎｏｖａ、７１２−１６５−１５０、１：１００）、およびＤｙＬｉｇｈｔ４８８抗マウス（ａｂｃａｍ、ａｂ９６８７１、１：１００）を使用した。神経のアポトーシスを、製造業者の取扱い説明書に従ってＴＵＮＥＬ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ  ｄＵＴＰ  ニック末端標識（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ−ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ））ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて評価した。アポトーシス性神経の数は、ＤＳ−Ｕ３  ＤＳカメラ調節ユニットおよびＮＩＳ−エレメントソフトウェアを備えたニコン顕微鏡Ｅｃｌｉｐｓｅ５０ｉ（Ｎｉｋｏｎ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で、２つの脳スライスの病変半球から、４０倍の倍率で、３つの視野から決定した。血小板集積を評価するために、動物につき２つの脳スライスを定量した。定量分析のため、本研究者らは群間のよりよい比較のため、ほぼ同一の脳領域からの切片を使用した。
【０１４８】
ウェスタンブロット分析
病変皮質におけるＧＰＩｂ（抗ＧＰＩｂ、１：５００、Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ教授、Ｒｕｄｏｌｆ−Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｚｅｎｔｒｕｍ，Ｗｕｒｚｂｕｒｇから譲渡）の免疫反応性を、先に記載したようにウェスタンブロット分析により検出した（Ｌａｎｇｈａｕｓｅｒら、２０１２、Ｂｌｏｏｄ、１２０（１９）：４０８２〜９２頁）。ＧＰＩｂの濃度測定分析は、ＧＰＩｂ検出のレベルを正規化するため、付加対照としてβ−アクチン（Ｄｉａｎｏｖａ、Ａ５４４１、１：５０００００）を用い、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立保健研究所、ＵＳＡ）を用いて盲検法で実施した。
【０１４９】
脳内出血の定量
出血の範囲と関連する脳実質におけるヘモグロビン濃度は、分光光度的に決定した（Ｃｈｏｕｄｈｒｉら、１９９７、Ｓｔｒｏｋｅ  ２８：２２９６〜２３０２頁）。外傷の２４時間後、動物を屠殺し、脳を取り出した。病変半球は１．５ｍｌの氷冷水中で６０秒間超音波処理し（ｓｏｎｉｆｉｅｄ）、その後４℃で３０分間遠心分離した。ドラブキン溶液１ｍｌを上清２５０μｌに加え、室温で１５分間インキュベートした。吸光度を５４０ｎｍで測定した（ＭｕｌｔｉｓｋａｎＥＸ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。
【０１５０】
実験計画
標準化した効果、それぞれ皮質低温障害後１日目の病変容積のサイズ≧０．２または重量ドロップ損傷後１日目のＮＳＳ≧０．２を検出するために必要な動物の数は、仮定：α＝０．０５、β＝０．２、平均、および標準偏差（Ｇ＊Ｐｏｗｅｒ３．０．１０）での先験的サンプルサイズの計算により決定した。マウスは処置群にランダムに配置された（低温障害後ランダム化を遮断、重量ドロップ損傷後、ランダム化を階級に分けてバランスのとれた群を達成するため）。バイアスを避けるため、盲検様式で実験を実施し、分析した。
【０１５１】
統計
すべての結果は、中央値と文中に角括弧で示される２５％パーセンタイルおよび７５％パーセンタイルを含む散布図として表されるＮＳＳスケールを除き、平均±ＳＥＭとして表した。統計学的分析のため、ＰｒｉｓｍＧｒａｐｈ５．０ソフトウエアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した。データは、コルモグロフ−スミノフ検定によりガウス分布を検定し、２つの因子の効果を測定する場合には、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）と多変量分析のためのポストホックボンフェローニ補正により同時に分析し、ノンパラメトリックなデータ（ＮＳＳ）の場合には、クラスカル−ウォリス検定とポストホック  ダン（Ｄｕｎｎｓ）補正で分析した。１つの因子の効果を測定する場合には、一元配置分散分析とポストホックボンフェローニ補正を適用した。２つの群だけを比較した場合、対応のない、スチューデントの両側ｔ検定を実施した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると考えた。
【０１５２】
結果：
微小血管血栓症は外傷性脳損傷の一般的な病理学的特徴である
まず、本発明者らは、ＴＢＩの死亡症例後に得たヒトの脳サンプルを分析し、外傷を与えた脳の微小血管において血小板集積を示した（図９Ａ）。その結果、本発明者らは、重量ドロップモデルを用いてヒトのＴＢＩをマウスでほぼ模倣し、主にびまん性脳外傷を生じた。野生型マウスの損傷した脳組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色により、血管ルーメンの多くの閉塞を示した（図９Ｂ）。したがって、本発明者らは、血小板の血管内集積を見出した。興味深いことに、衝突領域における脳血流は、経時的にわずかに減少し、重量ドロップ損傷後７日目には脳血流が著しく減少した（図９Ｃ）。限局性脳外傷が皮質の低温障害によって誘導される場合、損傷誘導後１日および３日目に、多くの閉塞血管およびＧＰＩｂ陽性血小板の血管内集積が皮質の脳組織において見つかった（図１Ｄ）。これらの結果は、微小血管血栓症がＴＢＩの一般的な病理学的特徴であるという仮説を強く支持している。
【０１５３】
第ＸＩＩ因子は、外傷性脳損傷における微小血管血栓症の一因となる
ＴＢＩ後の脳内血栓形成におけるＦＸＩＩの影響を評価するため、本発明者らはまず、野生型マウスまたはｈＦＸＩＩ（ＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩ）の静脈内注射により再構成したＦＸＩＩ欠損マウスと比較して、ＦＸＩＩ欠損マウスの挫傷した脳組織を分析した。重量ドロップ損傷後７日目に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した脳切片の組織学的な分析により、野生型またはＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩマウスと比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおいて少ない閉塞した脳の微小血管を実証した（図１０Ａ）。本発明者らは、ＦＸＩＩ欠損マウスの脳において、より少ない血管内のＧＰＩｂ陽性血小板集積を一貫して検出した（図１０Ｂ）。さらに、ウェスタンブロット分析により、ＦＸＩＩ欠損マウスの脳組織において、血小板の量が著しく減少したことを確認した（図１０Ｃ）。重量ドロップ損傷と同様に、少ない血栓−閉塞脳血管（図１１Ａ）、脳の血管系におけるより少ない血小板集積（図１１Ｃ）、および脳組織における血小板の量の減少（図１１Ｂ）が、野生型マウスと比較した場合、ＦＸＩＩ−／−マウスにおける、限局性低温障害の１日および３日後に検出された。
【０１５４】
要約すると、本発明者らは、損傷誘導した微小血管血栓症および脳損傷が、ｈＦＸＩＩの投与により再構成したＦＸＩＩ欠損マウスにおいて再生成できることを観察した。このことは、ＦＸＩＩによる本質的な凝固経路の活性化が、外傷後脳血栓形成において役割を果たすことを初めて証明した。その結果、本発明者らは、ＴＢＩの性質に関係なく、ＦＸＩＩが微小血管血栓症の一因となると結論付けた。
【０１５５】
外傷性脳損傷後、第ＸＩＩ因子欠損はより良い転帰をもたらす
ＦＸＩＩ欠損マウスにおける脳内血栓症の減少の病理学的重要性を評価するために、本発明者らは次に、重量ドロップ損傷後の機能的転帰におけるＦＸＩＩ欠損の影響を調べた。初期（損傷誘導の１時間および１日後）の外傷重症度はすべての群において同等であり、重量ドロップ損傷の３日後、ＦＸＩＩ−／−マウスは、野生型またはＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩマウスよりも有意に回復した（中央値ＮＳＳ［２５番目のパーセンタイル、７５番目のパーセンタイル］：それぞれ、野生型マウスにおいて４．０［３．０、４．０］およびＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩマウスにおいて３．５［３．０、４．０］対ＦＸＩＩ−／−マウスにおいて２．０［１．０、３．０］、Ｐ＜０．０５；図１２）。重要なことに、ＦＸＩＩ−／−マウスにおけるより良い神経学的な転帰は、７日目まで持続した（中央値ＮＳＳ［２５番目のパーセンタイル、７５番目のパーセンタイル］：それぞれ、野生型マウスにおいて３．０［２．０、３．０］およびＦＸＩＩ−／−／ｈＦＸＩＩマウスにおいて２．５［２．０、３．０］対ＦＸＩＩ−／−マウスにおいて１．０［１．０、２．５．０］、Ｐ＜０．０５；図１２）。
【０１５６】
本研修者らは次に、低温障害後１日目および３日目の、皮質の病変容積および神経変性におけるＦＸＩＩ欠損の影響を評価した。雄のマウスにおいて、ＦＸＩＩ欠損は、脳切片のＴＴＣ染色によって評価したように、１日目および３日目の著しく減少した病変容積をもたらした（図１３Ａ）。性別が、ＴＢＩ後の臨床の転帰に重要な影響を有するため（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１４）、本発明者らは雌のマウスを低温障害に供した。雌のマウスにおけるＦＸＩＩ欠損もまた、野生型マウスと比較した場合、１日目および３日目に著しく小さい脳の病変をもたらした（図１３Ａ）。これらの観察は、ＦＸＩＩ欠損が、限局性脳損傷後に持続した病変サイズの減少をもたらすことを示す脳のＭＲＩを用いた研究により実証された（図１３Ｂ）。病変容積の減少は、対照マウスと比較した場合、低温障害後１日目にＦＸＩＩを欠損したマウスにおける著しく減少した神経のアポトーシスを伴った（図１３Ｃ）。アポトーシス細胞の量におけるさらに明白な違いが、低温障害後３日目に観察された（図１３Ｃ）。
【０１５７】
第ＸＩＩ因子の薬理学的阻害は微小血管血栓症の減少および外傷性脳損傷後のより良い転帰をもたらす
ＴＢＩにおける病理学的血栓症の処置のための薬理学的なＦＸＩＩ阻害の効能を試験するために、本発明者らは活性化ＦＸＩＩ、ｒＨＡ−インフェスチン−４の選択的インヒビター２００ｍｇ／ｋｇ体重を静脈内に投与し、重量ドロップ損傷または低温障害に供したマウスにおける微小血管血栓症、機能的転帰、および病変容積をモニターした。ヘマトキシリンおよびエオシン染色した脳切片ならびに免疫組織化学的に可視化した血小板および内皮の詳細な分析により、両ＴＢＩモデルにおいてビヒクル処置したマウスと比較した場合、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおいて、より少ない血栓により閉塞した脳の微小血管を示した（図１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａおよび１５Ｂ）。
【０１５８】
ｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおける血栓形成の減少は、より良い神経学的転帰と関連した。重量ドロップ損傷後、神経障害の初期の重症度（１時間および１日）は、外傷の３および７日後の処置群（Ｐ＞０．０５）間で同等であり、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスはビヒクル処置マウスよりも有意に回復した（３日：中央値ＮＳＳ［２５番目のパーセンタイル、７５番目のパーセンタイル］：ｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおいて２．０［２．０、３．０］対ビヒクル処置マウスにおいて３．０［３．０、３．０］、Ｐ＜０．０５；７日：中央値ＮＳＳ［２５番目のパーセンタイル、７５番目のパーセンタイル］：ｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおいて２．０［１．５、２．５］対ビヒクル処置マウスにおいて３．０［２．０、５．０］、Ｐ＜０．０５；図１４Ｃ）。低温障害後１日目および３日目の病変容積および神経変性が、ビヒクル処置マウスと比較した場合、ｒＨＡ−インフェスチン−４処置マウスにおいて減少した。両方の読み出しに関して、ｒＨＡ−インフェスチン−４の保護効果は、低温障害後１日目よりも３日目にさらに明白であった（図７Ｃおよび７Ｄ）。
【０１５９】
ＦＸＩＩ欠損と同様に、ｒＨＡ−インフェスチン−４によるマウスの急性処置は、両ＴＢＩモデルにおいて脳の微小血管における病理学的な血栓形成を防いだ。血栓形成の減少は、脳外傷後後期（３日、７日）に保存されたより良い神経学的転帰、それぞれ重量ドロップ損傷および低温障害後の少ない脳損傷、および少ない神経変性と関連した。脳外傷後に、ｒＨＡ−インフェスチン−４を単剤投与した場合、損傷の悪化に対する保護に十分であった。要約すると、ＦＸＩＩの薬理学的阻害は微小血管血栓症の減少、および実験的ＴＢＩ後のより良い転帰をもたらした。
【０１６０】
ＦＸＩＩ欠損または阻害は脳内出血のリスクを増加しない
異常な脳出血に関して、脳外傷後のＦＸＩＩ阻害の安全性を確証するため、本発明者らは、ＦＸＩＩ−／−マウス、ｒＨＡ−インフェスチン処置マウス、およびそれらのそれぞれの対照の病変脳半球において出血の範囲を決定した。低温障害後、ＦＸＩＩ欠損マウスもｒＨＡ−インフェスチン−４で処置したマウスも、出血レベルの増加を示さなかった（図１６）。この結果を確かめるために、本発明者らは、ＦＸＩ欠損がヒトにおける外傷後出血の増加と関連しているため（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、１９５５、Ｂｌｏｏｄ  １０：１２０〜１３１頁）、ＦＸＩ−／−マウスにおける出血の範囲も決定した。これらのマウスにおいて、本発明者らは、巨視的に見ることもできる病変脳半球における出血の増加を観察した（図１６）。さらに、ＦＸＩＩ欠損マウスおよび野生型対照のＭＲＩスキャンにより、いずれも出血の兆候を示さなかった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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