(57)【要約】  多形膠芽腫（ＧＢＭ）の対象者を健常者対照から９８％を超える正確さで識別する３３種類の細胞表面タンパク質を含む、ＧＢＭ組織に存在するタンパク質のシグネチャー（ＧＢＭＳｉｇ）が記載される。さらに、本シグネチャーのメンバーのうちの４種類は、血液中ＧＢＭマーカーとして特に有用である。本シグネチャーの特定の他のメンバーは、この病態の治療におけるＴＧＦ−β１阻害剤の使用の潜在的有効性の指標となる。ＧＢＭＳｉｇタンパク質に基づいてＧＢＭを治療し、層別化する方法もまた開示される。【選択図】図４
2017522555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者が多形膠芽腫（ＧＢＭ）に罹患している可能性を評価するための方法であって：
ａ）被験者の血液又はその画分中のＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦ−βＩからなる群より選択される少なくとも１種類のタンパク質のレベルを評価すること；
ｂ）前記少なくとも１種類の該タンパク質のレベルを、健常者の血液又はその画分中の該タンパク質のレベルと比較すること；
を含み、
ここで、健常者と比較して該被験者における、ＣＤ４４レベルの減少、及び／又は、ＨＭＯＸ１レベルの増加、及び／又は、ＶＣＡＭ１レベルの減少、及び／又は、ＴＧＦＢＩレベルの減少は、該被験者がＧＢＭに罹患している可能性があることを示す、方法。
【請求項２】
少なくとも２種類の前記タンパク質のレベルが被験者において評価され、健常者と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２種類のタンパク質がＣＤ４４とＨＭＯＸ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ａ）の評価が、ＳＲＭ質量分析法又はイムノアッセイにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質ＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦＢＩの各々を検出するための試薬が並べられてアレイに結合されている、固相支持体。
【請求項６】
被験者がＧＢＭに罹患している可能性を評価するための方法であって：
ａ）該被験者の血液又はその画分のサンプルを請求項５に記載の並べられたアレイに接触させること；
ｂ）該アレイ中の対応する試薬に結合した、ＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１及びＴＧＦＢＩの少なくとも１種類の量を評価すること；
ｃ）該量を、健常者の血液又はその画分について実施された同様のアッセイで観測された量と比較すること；
を含み、
ここで、健常者と比較して該被験者における、ＣＤ４４のレベルの減少、及び／又は、ＨＭＯＸ１レベルの増加、及び／又は、ＶＣＡＭ１レベルの減少、及び／又は、ＴＧＦＢＩレベルの減少は、該被験者がＧＢＭに罹患している可能性があることを示す、方法。
【請求項７】
ＧＢＭに罹患した被験者がＴＧＦ−β１阻害剤による治療に応答性であるかどうかを判定する方法であって、該被験者の血液もしくはその画分中の又はＧＢＭ組織中のＴＧＦＢＩ、ＩＴＧＡ７、ＴＮＣ、ＤＤＲ２、ＭＲＣ２、ＭＧＳＴ１、ＣＬＣＣ１、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＲＴＡＰ、ＣＤ１０９、及びＳＬＣ１６Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種類のタンパク質のレベルを評価すること、及び該レベルを健常者におけるレベルと比較することを含み、ここで、該被験者における該タンパク質のレベルの亢進がＴＧＦ−β１阻害剤による治療への感受性を示す、方法。
【請求項８】
前記被験者の血液中のＣＤ４７、ＭＹＯＦ、ＡＢＣＡ１、Ｓ１００Ａ１０、ＣＡ１２、及びＳＬＣ１６Ａ３からなる群より選択される少なくとも１種類のタンパク質のレベルを評価することをさらに含み、ここで、少なくとも１種類の該タンパク質のレベルが高いことがＴＧＦ−β１阻害剤による治療への感受性を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＧＢＭに罹患した被験者がＴＧＦ−β１阻害剤による治療に応答性であるかどうかを判定する方法であって、該被験者由来の血液もしくはその画分中又はＧＢＭ組織中のＨＭＯＸ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＣＤ４７、及びＭＲＣ２からなる群より選択される少なくとも１種類のタンパク質のレベルを評価すること、及び該レベルを健常組織におけるレベルと比較することを含み、ここで、健常組織と比較して該ＧＢＭ組織中の該タンパク質のレベルの亢進がＴＧＦ−β１阻害剤による治療への感受性を示す、方法。
【請求項１０】
対象者におけるＧＢＭの治療に使用するための組成物であって、血液又は組織中のＨＭＯＸ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＣＤ４７、ＭＲＣ２、ＴＧＦＢＩ、ＩＴＧＡ７、ＴＮＣ、ＤＤＲ２、ＭＲＣ２、ＭＧＳＴ１、ＣＬＣＣ１、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＲＴＡＰ、ＣＤ１０９、及びＳＬＣ１６Ａ１からなる群より選択されるタンパク質の発現レベル又は濃度を低下させる有効成分を含む組成物。
【請求項１１】
ＧＢＭ組織を分類する方法であって、組織中の少なくとも１種類のＧＢＭＳｉｇタンパク質のレベルを評価すること、及び該レベルを健常組織中のレベルと比較することを含み、ここで、該ＧＢＭ組織中のＡＳＰＨ、ＳＣＡＭＰ３、ＣＬＣＣ１、及び／又はＣＡＤＭ１のレベルの亢進は、該組織が前神経性であることを示し、該ＧＢＭ組織中のＣＤ４４、ＴＴＧ４７、及び／又はＥＧＦＲのレベルの亢進は、該ＧＢＭ組織が古典的であることを示し、該組織中のＣＡＶ及び／又はＴＧＦＢＩのレベルの亢進は、該組織が間葉系であることを示す、方法。
【請求項１２】
ヒト被験者が多形膠芽腫（ＧＢＭ）に罹患している可能性を評価するための方法であって、被験者の脳組織、腫瘍細胞、若しくは血液、又はそれらの画分中のＧＢＭＳｉｇの３３種類のタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種類のタンパク質のレベルを評価すること、及び該タンパク質のレベルを健常者の脳組織、腫瘍細胞、若しくは血液、又はそれらの画分中の該タンパク質のレベルと比較することを含み、それにより、健常者と比較した該被験者におけるレベルの差が、該被験者がＧＢＭに罹患している可能性があることを示し、
ここで、該３３種類のタンパク質は、ＡＢＣＡ１、ＡＳＰＨ、ＣＡ１２、ＣＡＤＭ１、ＣＡＶ１、ＣＤ１０９、ＣＤ１５１、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＬＣＣ１、ＣＲＴＡＰ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＭＯＸ１、ＩＴＧＡ７、ＭＧＳＴ１、ＭＲＣ２、ＭＹＯＦ、ＮＲＰ１、ＰＤＩＡ４、ＰＴＧＦＲＮ、ＲＴＮ４、Ｓ１００Ａ１０、ＳＣＡＭＰ３、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＭＸ１、ＴＮＣ、及びＶＣＡＭ１である、方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種類のタンパク質が、ＤＤＲ２、ＰＤＩＡ４、ＣＡＤＭ１、ＩＴＧＡ７、ＭＲＣ２、ＭＹＯＦ、ＮＲＰ１、ＲＴＮ４、ＴＮＣ、ＳＣＡＭＰ３、及びＣＤ４７からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＢＣＡ１、ＡＳＰＨ、ＣＡ１２、ＣＡＤＭ１、ＣＡＶ１、ＣＤ１０９、ＣＤ１５１、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＬＣＣ１、ＣＲＴＡＰ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＭＯＸ１、ＩＴＧＡ７、ＭＧＳＴ１、ＭＲＣ２、ＭＹＯＦ、ＮＲＰ１、ＰＤＩＡ４、ＰＴＧＦＲＮ、ＲＴＮ４、Ｓ１００Ａ１０、ＳＣＡＭＰ３、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＭＸ１、ＴＮＣ、及びＶＣＡＭ１からなる群より選択される少なくとも３種類のタンパク質を検出するための試薬が、並べられたアレイに結合されている、固相支持体。
【請求項１５】
被験者がＧＢＭに罹患している可能性を評価するための方法であって：
ａ）該被験者の血液、脳組織、腫瘍組織、又はそれらの画分のサンプルを請求項１４に記載の並べられたアレイに接触させること；
ｂ）該アレイ中の対応する試薬に結合した、ＡＢＣＡ１、ＡＳＰＨ、ＣＡ１２、ＣＡＤＭ１、ＣＡＶ１、ＣＤ１０９、ＣＤ１５１、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＬＣＣ１、ＣＲＴＡＰ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＭＯＸ１、ＩＴＧＡ７、ＭＧＳＴ１、ＭＲＣ２、ＭＹＯＦ、ＮＲＰ１、ＰＤＩＡ４、ＰＴＧＦＲＮ、ＲＴＮ４、Ｓ１００Ａ１０、ＳＣＡＭＰ３、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＭＸ１、ＴＮＣ、及びＶＣＡＭ１から選択される少なくとも３種類のタンパク質の量を評価すること；
ｃ）該量を、健常者の血液、脳組織、腫瘍組織、又はそれらの画分について実施された同様のアッセイで観測された量と比較すること；を含み、
それにより、健常者と比較した該被験者における該少なくとも３種類のタンパク質のレベルの差は、該被験者がＧＢＭに罹患している可能性があることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究のもとで行われた発明に対する権利の陳述
この研究は、米国国立衛生研究所／国立がん研究所（ＮＩＨ／ＮＣＩ）のＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒグラント（ｇｒａｎｔ）Ｕ５４ＣＡ１５１８１９Ａ（ＬＨ）、及び、ＮＩＨ／ＮＣＩのＨｏｗａｒｄ  Ｔｅｍｉｎ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  Ａｗａｒｄ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＤＰ）によって一部支援されたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、成人において最もよく見られる悪性の原発性脳腫瘍である、多形膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ：ＧＢＭ）に関する。特に、本発明は、この病態の血液中のマーカー及び可能性のある治療法による生存率の指標となるマーカーの同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
多形膠芽腫（ＧＢＭ）は、全ての成人脳腫瘍の中で最も侵襲的で悪性である。腫瘍細胞は、脳室下帯及び基底膜を通って脳の局所及び遠隔領域に浸潤し得る。このようなＧＢＭ病理は、頭蓋内圧の発生、認知機能障害及び関連症状をもたらし、必ず死に至る。
【０００４】
長年に亘り、他の癌種が治療成績と生存転帰において顕著に改善されたのに比べ、ＧＢＭの生存期間中央値は治療を受けていてもわずか１．５年であり、この数字は数十年間ほとんど変わっていない。米国だけでも、毎年９，５００件の新しいＧＢＭ症例と１３，０００人の死亡が登録されている［１］。
【０００５】
ＧＢＭ患者の生存期間が短いため、患者を救い得る治療法を見い出すべく複数の治療法を試験するにも非常に短い治療期間（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）しかない。治療期間をより長く広げ、かつ、治療への分子応答に関するより良い評価法を提供するため、効果的な血液ベースの診断法が切望されている。
【０００６】
近年、オミックス（ｏｍｉｃｓ）技術の進歩により、高感度で高スループットの分析データの作成が可能となった。ＧＢＭ疾患により乱されたネットワークを明らかにすることにより疾患メカニズムが深く洞察され、診断方法が提供され始めている。Ｐｈｉｌｌｉｐｓら［２］が報告した星状細胞腫サンプル（Ｎ＝７６）のＤＮＡマイクロアレイ分析からのＧＢＭの分子サブクラスと、その後のＣｌｏｍａｎら［３］による追跡調査研究は、３８遺伝子の生存セット及び予後不良に関連した９遺伝子のセットを示す結果となった。最近、癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ：ＴＣＧＡ）プロジェクトは、遺伝子発現、全ゲノムコピー数アレイ及び染色体転座、エピゲノミクス、全エクソーム（ｅｘｏｍｅ）配列決定、ならびにマイクロＲＮＡ発現アレイを組み込んだＧＢＭの異常なゲノム全体像の多次元オミックスビューを提供した［４］。この研究は、臨床的に明確に特定された腫瘍試料（＞５００）と非腫瘍サンプルの大規模なコホートで行われ、３つの重要な疾患により乱された経路に関する新しい洞察を提供した［５］。
【０００７】
非常に有益な研究であるにもかかわらず、これらの研究は、免疫不全マウスにおいて腫瘍を形成することができるＧＢＭ癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在を正しく認識することができていない［６，７］。ＣＳＣは非分裂及び非増殖状態で長期間存在するので、ＣＳＣ上に発現した本物の細胞表面タンパク質を慎重に選択してこれらの細胞を物理的に分離することにより、これらの集団をより良く特徴付けることができる。細胞表面膜貫通タンパク質ＣＤ１３３を標的とする抗体は、バルク腫瘍集団からＣＳＣを単離するために使用されてきたが、いくつかの最近の研究から、ＣＤ１３３は単独のＣＳＣマーカーとして用いるには限界があることが示唆されており、さらなる細胞表面マーカーの必要性が強調されている［８〜１１］。
【発明の概要】
【０００８】
ＧＢＭがもたらす治療期間が非常に短いという観点から、早期診断の必要性が明らかであり、今日まで、早期診断できる十分に非侵襲性で簡便な優れたアッセイ法は存在していない。さらに、ＧＢＭに対する従来の治療法の失敗から、特定のタイプの治療に応答する個体を識別する必要性が示唆されている。特に、本発明は、直接的なＧＢＭの診断方法、ならびにＧＢＭと診断された個体がＴＧＦ−β１阻害剤に応答するか否かを評価するための基礎を提供する。
【０００９】
発明の開示
本発明は、被験者がＧＢＭに罹患している可能性を評価するための、血液サンプルをアッセイすることによって利用できる、タンパク質マーカーのセットを提供する。よって、一態様では、ヒト被験者が多形膠芽腫（ＧＢＭ）に罹患している可能性を評価するための方法であって、該方法は、：
ａ）  被験者の血液又はその画分中のＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦＢＩからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のレベルを評価すること；
ｂ）  前記少なくとも１つの該タンパク質のレベルを、健常者の血液又はその画分中の該タンパク質のレベルと比較すること；
を含んでなり、
ここで、健常者と比較して、該被験者におけるＣＤ４４レベルが減少し、及び／又は、ＨＭＯＸ１レベルが増加し、及び／又は、ＶＣＡＭ１レベルが減少し、及び／又は、ＴＧＦＢＩレベルが減少することは、該被験者がＧＢＭに罹患している可能性があることを示す。
【００１０】
これらのタンパク質は血液中で容易にアッセイされるが、脳組織及び腫瘍細胞中のそれらのレベルもまたマーカーとして使用することができる。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ヒト被験者が多形膠芽腫（ＧＢＭ）に罹患している可能性を評価するための方法であって、該方法は：
被験者の脳組織、腫瘍細胞、若しくは血液、又はそれらの画分中のＡＢＣＡ１、ＡＳＰＨ、ＣＡ１２、ＣＡＤＭ１、ＣＡＶ１、ＣＤ１０９、ＣＤ１５１、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＬＣＣ１、ＣＲＴＡＰ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＭＯＸ１、ＩＴＧＡ７、ＭＧＳＴ１、ＭＲＣ２、ＭＹＯＦ、ＮＲＰ１、ＰＤＩＡ４、ＰＴＧＦＲＮ、ＲＴＮ４、Ｓ１００Ａ１０、ＳＣＡＭＰ３、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＭＸ１、ＴＮＣ、及びＶＣＡＭ１からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質のレベルを評価すること；及び
前記少なくとも１つの該タンパク質のレベルを、健常者の脳組織、腫瘍細胞、若しくは血液、又はそれらの画分中の該タンパク質のレベルと比較すること；
を含んでなり、
ここで、健常者におけるレベルと比較した該被験者におけるレベルの差は、該被験者がＧＢＭに罹患している可能性があることを示す、に関する。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、これらのタンパク質及び被験者におけるＧＢＭの存在を示すものとして以下に記載されるように同定されたさらなるタンパク質を検出するように設計された、試薬が並べられたパネルに関する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、被験者がＴＧＦ−β１の阻害剤を投与することによるＧＢＭの治療に応答するか否かを評価する方法に関する。これは、ＧＢＭを正常組織から区別して同定することに使用できるタンパク質の一部は、ＴＧＦ−β１の侵襲性促進力が増強することによりもたらされる異常を示す、という理解から得られる。
【００１４】
さらに他の態様において、本発明は、ＴＧＦ−β刺激時に侵襲性を促進するものとして同定されたタンパク質の発現又は活性を調節することによってＧＢＭを治療する方法、ならびにＧＢＭを分類する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＧＢＭ（ｎ＝２２８）及び関連疾患、すなわち、星状細胞腫（ｎ＝１４８）と乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｍａ）（ｎ＝６７）、から得られた組織アレイを用いたショットガンプロテオミクスにより同定された細胞表面タンパク質の交差トランスクリプトーム（ｃｒｏｓｓ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ）特性解析を示す。これらの同定は、３３の細胞表面タンパク質（ＣＳＰ）を含むＧＢＭ特異的膜シグネチャー（ＧＢＭＳｉｇ）を開発するために用いられた。ヒートマップの各列は、平均ｌｏｇ２［腫瘍／非腫瘍］比として示される。
【図２ａ】図２ａは、ＧＢＭＳｉｇタンパク質（ｎ＝３３）を用いたＲＥＭＢＲＡＮＤＴ  ＧＢＭトランスクリプトームアレイの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。赤色の点は非腫瘍分離物を表し、灰色の点はＧＢＭを表す。
【図２ｂ】図２ｂは、ＧＢＭＳｉｇタンパク質（ｎ＝３３）を用いたＴＣＧＡ  ＧＢＭトランスクリプトームアレイのＰＣＡを示す。赤色の点は非腫瘍分離物を表し、灰色の点はＧＢＭを表す。
【図２ｃ】図２ｃは、ＴＣＧＡにおける異なるＧＢＭ組織アレイ（ｎ＝５４７のＧＢＭ及びｎ＝１０の非腫瘍）を用いたＧＢＭＳｉｇ（ｎ＝２８）の感度及び特異度分析を示し、ＧＢＭ集団を同定する際の高度の特異性を示した。
【図２ｄ】図２ｄは、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ組織アレイを用いたＧＢＭＳｉｇ（ｎ＝３３）の感度及び特異度分析を示す。
【図３ａ】図３ａは、癌幹細胞（ＣＳＣ）（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ社）と健常な神経幹細胞（ＮＳＣ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を区別することができるユニークなＧＢＭＳｉｇを同定するために使用されたｄ−ＳＲＭアッセイの結果を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、ＧＢＭＳｉｇ発現のＳＲＭによる結果を代替法であるフローサイトメトリーにより検証した結果を示す。ＧＢＭ患者から得られた個々の原発性癌幹細胞は、健常な神経幹細胞と比較して、ＨＭＯＸ１、ＳＬＣ１６Ａ１ではより高い発現を示したが、ＳＬＣ１６Ａ３ではより低い発現を示した。
【図４】図４は、非腫瘍分離物（ｎ＝２）と比較した、個々の患者腫瘍（ｎ＝４）からの組織ホモジネート中の２１種類のＧＢＭＳｉｇの蓄積パターンを示すヒートマップである。
【図５ａ】図５ａは、ＧＢＭＳｉｇタンパク質とＴＧＦ−β１シグナル伝達ネットワークとの関連を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、ＧＢＭＳｉｇタンパク質と癌浸潤との関連の効果を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、ＧＢＭＳｉｇタンパク質が過剰発現された場合のＲＥＭＢＲＡＮＤＴリポジトリからのＧＢＭ患者（ｎ＝１００）の低い生存率（ｐ＜０．００３）を示す。
【図６ａ】図６ａは、示されたＧＢＭＳｉｇタンパク質であるＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦＢＩについて、２１人の健常人と２１人のＧＢＭの血漿をＥＬＩＳＡアッセイした結果を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、血液分析からＧＢＭを診断するための基礎となる、ＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦＢＩのＥＬＩＳＡ結果のＲＯＣ分析（１０，０００×１０分割交差検証）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、正常組織と対照的にＧＢＭに特徴的である表面タンパク質の性質及びレベルに基づく診断及び治療法の選択に有用な方法及び組成物、ならびにＧＢＭを治療する方法に関する。
【００１７】
本発明は、１）転写産物レベル及びプロテオームレベルの両方でＧＢＭ組織を健常組織から正確に識別することができる細胞表面ＧＢＭＳｉｇ分類指標（ＡＢＣＡ１、ＡＳＰＨ、ＣＡ１２、ＣＡＤＭ１、ＣＡＶ１、ＣＤ１０９、ＣＤ１５１、ＣＤ２７６、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＬＣＣ１、ＣＲＴＡＰ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＭＯＸ１、ＩＴＧＡ７、ＭＧＳＴ１、ＭＲＣ２、ＭＹＯＦ、ＮＲＰ１、ＰＤＩＡ４、ＰＴＧＦＲＮ、ＲＴＮ４、Ｓ１００Ａ１０、ＳＣＡＭＰ３、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＭＸ１、ＴＮＣ及びＶＣＡＭ１などの、３３の細胞表面タンパク質）、２）ＧＢＭＳｉｇタンパク質の中の血液バイオマーカー（そのサブセットはｄ−ＳＲＭ及びＥＬＩＳＡによって検証された）、３）ＧＢＭにおける主要なＧＢＭＳｉｇタンパク質によって代表される、破壊されたＴＧＦ−βネットワーク成分、及び４）ＧＣＳＣの代表的な細胞表面マーカーに関する。
【００１８】
細胞表面タンパク質の異常な発現及び活性は、ほとんどの癌の顕著な特徴である。これらのタンパク質は、該細胞とその微小環境との間の戦略的位置を占めており、膜の外表面と細胞質の両端から発するシグナルを感知することができる。よって、細胞表面上のこれらのタンパク質の異常な発現は、細胞の正常な活動を破壊して、新生物形質転換に影響を及ぼす。健常組織と癌性組織との間の細胞表面タンパク質の発現の差は、癌マーカーとして役立ち、かつ標的療法を開発するための情報を提供することができる。切断されて血液中に流出する細胞表面タンパク質は、診断用血液マーカーとして有用である。
【００１９】
本発明者らは、代表的なＧＢＭ  ＣＳＣ、健常ＮＳＣ、ならびにＵ８７及びＴ９８細胞株により例示されるバルク腫瘍細胞集団の比較解析により、ＧＢＭにおける細胞表面タンパク質を分析した。細胞表面プロテオミクスデータを、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ及びＴＣＧＡ腫瘍一覧の大規模なＧＢＭ組織トランスクリプトームアレイ解析と組み合わせた。この統合的アプローチにより、ＧＢＭ組織を特徴付ける３３種類の細胞表面タンパク質を含むＧＢＭＳｉｇを得た。
【００２０】
ＧＢＭに関連する４つの細胞株の細胞表面タンパク質を分析した。これらの細胞株には、バルク腫瘍集団を代表する２つの細胞株Ｕ−８７及びＴ−９８、代表的な健常ＮＳＣ株（推定幹細胞マーカーｔｕｂ  ｉｉｉ、ｏｃｔ−４、ｓｏｘ−２及びＣＤ１３３について陽性）、及びＧＢＭ  ＣＳＣ株（ＣＤ１３３発現について陽性）が含まれる。一般的に低存在量の細胞表面タンパク質を濃縮するために、膜不透過性スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン法を用いて、インタクトな細胞から細胞表面タンパク質を捕捉した。各細胞株の細胞表面組成は他とは著しく異なっており、このことはこれら４つの細胞株が同様に機能的に異なることを示唆するか、あるいは、異種性は単に全ての癌の基礎となる増大した突然変異プロセスを反映しているにすぎないことを示唆している。
【００２１】
捕捉された細胞表面タンパク質をトリプリケートで高分解能質量分析法にかけ、Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ［（ＧＰＭ）（ｔｈｅＧＰＭ．ｏｒｇでＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上にある）］を用いて＜１０−３の最小対数期待値スコアによりタンパク質を同定した。合計８６８、８１３、５４１及び５６４の非重複タンパク質がそれぞれＵ８７、Ｔ９８、ＮＳＣ及びＣＳＣ集団から同定された。全細胞表面タンパク質調製物からこれらの膜貫通（ＴＭ）タンパク質を同定するために膜貫通予測アルゴリズムＴＭＨＭＭを用いたところ、Ｕ−８７、Ｔ−９８、ＮＳＣ及びＣＳＣにおいて、それぞれ１５７、１５４、９８及び８０のＴＭタンパク質が同定された。全体で２７３の異なるＴＭタンパク質が全４種類の細胞株から同定された。同定されたＴＭタンパク質の中には５３種類のＣＤマーカー、９８種類のマルチＴＭドメイン含有細胞表面タンパク質が確認され、後者は、それらの疎水性及び限られた細胞存在量のため、全細胞プロテオームデータセットでは実際より少なく示される。
【００２２】
細胞表面プロテオミクスデータをＲＥＭＢＲＡＮＤＴ組織源からのトランスクリプトーム一覧と統合することにより、脳の腫瘍領域と非腫瘍領域との間に示差的に発現された転写産物の存在を評価した［１２］。細胞表面プロテオミクス研究により同定された２７０種類の細胞表面ＴＭタンパク質のうち、２０２種類（５３２種類の独立したプローブ）の情報がＲＥＭＢＲＡＮＤＴ中の対応する転写産物として見つかった。これらの転写産物の発現値をｌｏｇ２変換し、非腫瘍脳組織と比較して最小で２倍の平均発現（ＦＤＲ＜０．０５）を発現解析におけるカットオフ値として使用した。２０２種類の細胞表面タンパク質の転写産物のうち、１５５種類は制御されておらず、４７種類は脳の２２８の腫瘍領域と９の非腫瘍領域の間でダウンレギュレーションされていた。ＧＢＭ関連の細胞表面タンパク質の発現変化を特定するために、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴに記載される星状細胞腫（Ｎ＝１４８腫瘍）及び乏突起膠腫（Ｎ＝６７腫瘍）などの他の脳疾患でも示差的に発現される転写産物を取り除いた。図１に示すように、３３種類の細胞表面タンパク質からなるＧＢＭ膜固有のシグネチャー（ＧＢＭＳｉｇ）が得られた。
【００２３】
多様なＧＢＭ被験者におけるＧＢＭＳｉｇの能力を試験するために、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴとは異なるＧＢＭ試料（Ｎ＝５４７のＧＢＭ腫瘍サンプル及び１０の健常脳組織）上に構築されたＴＣＧＡ遺伝子発現アレイを評価した。ＴＣＧＡでは、３３種類のＧＢＭＳｉｇ転写産物のうち２８種類がＧＢＭと脳の非腫瘍領域との間で示差的に発現した。
【００２４】
ＧＢＭＳｉｇの識別力を評価するために、分類指標（すなわち、ＧＢＭＳｉｇの３３種類のタンパク質）をサポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅ：ＳＶＭ）教師あり学習モデルによって評価した。１０分割交差検証（ＣＶ）及びトレーニングデータセット（ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ）への該モデルのフィッティング後、ハイパーパラメーター（１０分割ＣＶ後に調整されたパラメーター）を同定し、検証セット（ＴＣＧＡデータセット）に対する分類指標の識別能力を予測した。これにより、分類指標は、９９．８５％の感度、７５％の特異度、９９．５４％の陽性予測値、及び９０．６９％の陰性予測値であるとの結果が得られた。分類指標の主成分分析（ＰＣＡ）、及び試験セットと検証セットの両方に対する個々の特異度と感度を図２ａ〜２ｄに示す。ＧＢＭＳｉｇは、ＧＢＭを非腫瘍対応物から効果的に識別する。
【００２５】
腫瘍を個別のサブタイプに層別化するためのＧＢＭＳｉｇの有用性を検証するために、古典的（Ｎ＝６４）、間葉系（Ｎ＝５９）、前神経性（Ｎ＝５９）及び神経性（Ｎ＝３４）として予め分類されたＴＣＧＡの腫瘍組織（Ｎ＝２１６）を追加セットとして試験した。予め層別化されたＧＢＭ組織（Ｎ＝２１６）にわたる各遺伝子の相対的順位を、それぞれのＺスコアから決定した。与えられたＧＢＭサブタイプにおいて最高のＺスコアを有する各ＧＢＭＳｉｇ遺伝子は、優勢なＧＢＭサブクラスを同定する識別能力についてＲＯＣ分析を行い評価した。１９種類のＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわち、ＡＳＰＨ、ＳＣＡＭＰ３、ＣＬＣＣ１及びＣＡＤＭが前神経性について；ＣＤ４４、ＩＴＧＡ７及びＥＧＦＲが古典的について；ＣＡＶ１及びＴＧＦＢＩが間葉系サブタイプについて、高い特異度（＞８０％）を示した。
【００２６】
実施例の考察：
最初に、Ｕ８７、Ｔ９８、ＣＤ１３３＋  ＣＳＣ（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ社）及びＮＳＣ株（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を含む種々のＧＢＭ細胞株の細胞表面組成を、高分解能質量分析法によって試験し、これにより細胞表面タンパク質、特に膜貫通ドメインを有するものが同定された。ペプチドの配列は、ＳＲＭアッセイのセットアップに必要とされるペプチドの質量分析適合性を示した。総合的細胞表面プロテオミクスデータは、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ（２２８のＧＢＭと９の非腫瘍）及びＴＣＧＡ（５４７のＧＢＭと１０の非腫瘍）リポジトリ中の大規模ＧＢＭ組織トランスクリプトームリポジトリと統合された。これらの統合分析から、ＧＢＭ膜シグネチャー（ＧＢＭＳｉｇ）が開発された。それは、トレーニングデータセット（ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ、腫瘍＝２２８、非腫瘍＝９）において高い感度（９７．３０％、１０分割ＣＶ）、特異度（９５％、１０分割ＣＶ）、及び精度（９９．５６％、１０分割ＣＶ）で正常な組織からＧＢＭ腫瘍を正確に識別することができる、３３種類の細胞表面膜貫通タンパク質からなる。ＳＶＭモデルをトレーニングデータセット（ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ）にフィッティングさせ、ハイパーパラメーターをロックダウン（ｌｏｃｋ  ｄｏｗｎ）した後、１０回の独立した反復から、高い感度（９９．８５％、１０分割ＣＶ）及び特異度（７５％、１０分割ＣＶ）が、９９．５４％の陽性予測値及び９０．６９％の陰性予測値と共に検証データセット（ＴＣＧＡ、腫瘍＝５４７；非腫瘍＝１０）から得られた。
【００２７】
ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ及びＴＣＧＡデータセットにおける腫瘍と非腫瘍との間の異なるＧＢＭＳｉｇ発現に基づくＰＣＡ分析もまた、図２ａ〜２ｄ（複数のデータセットに沿ってＧＢＭを診断する際のＧＢＭＳｉｇパネルの強力な予測能力を強調している）に示すように、同等の分離度を示した。ｄ−ＳＲＭ標的化プロテオミクスアッセイを開発することにより、サンプル分析において多重化能及びより高い処理能力を使えることに加え、他の方法では少ない存在量としてしか検出できない生物学的分離物中のＣＳＰの検出が可能になった。全体として、Ｓｐｅａｒｍａｎクラスタリング及び代表的なＰＣＡ分析においてさらに実証されるように、３３種類のＧＢＭＳｉｇのうちの２１種類の濃縮パターンは、一意的にＧＢＭ組織を表した。血漿中に放出された４つのＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわち、ＶＣＡＭ１、ＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、及びＴＧＦ−βＩの、ＥＬＩＳＡによる２１のＧＢＭ血漿と２１の健常血漿（年齢と性別を一致させた）を用いた代替検証もまた、健常者に対してＧＢＭに高い感度と特異度を示した。
【００２８】
組織ＳＲＭ分析は、おそらく疾患の結果として無秩序となった、多数のＧＢＭＳｉｇタンパク質が、ＴＧＦ−β誘導性タンパク質であるＴＧＦＢＩと共に過剰発現されたことを示し、このことから、これらのＧＢＭＳｉｇタンパク質がＴＧＦ−βシグナル伝達を介して調節されることが推定される。新規なＴＧＦ−β応答要素が、実験的検証によってＧＢＭＳｉｇ中に同定された。Ｕ８７細胞株を用いたインビトロ分析によって、ＴＧＦ−β応答性における１９種類のＧＢＭＳｉｇタンパク質のモジュラー役割（ｍｏｄｕｌａｒ  ｒｏｌｅ）が実証された。Ｕ８７細胞を、ＴＧＦ−β１もしくはその阻害剤単独で処理するか、又は阻害剤とその後にＴＧＦ−β１で連続的に処理した。このような処理の後のＧＢＭＳｉｇタンパク質の発現の変化をＳＲＭアッセイによって測定した。その結果は、ＧＢＭＳｉｇタンパク質のサブセットとＴＧＦ−β１シグナル伝達との関連を示し、こうした関連はこれまで開示されていなかった。これらの結果を図５ａに示す。
【００２９】
これらの新規なＴＧＦ−β応答性タンパク質のサブセット、すなわち、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２、ＣＤ４７、ＳＬＣ１６Ａ３、及びＣＤ９７は、図５ｂに示すように、健常ＮＳＣと比較してＧＢＭ細胞間のＴＧＦ−βに応答性を示す特徴があるかについてさらに研究された。示されたタンパク質に対するｓｉＲＮＡで処理したＵ８７細胞を、基底膜（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を介したＴＧＦ−β１勾配に向かって浸潤させた。浸潤した細胞を比色アッセイにより分析した。３つの独立した実験からの結果を平均して、非標的化（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ｓｉＲＮＡプール（スクランブルド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ））で正規化した。ＳＬＣ１６Ａ１、ＭＲＣ２、及びＨＭＯＸ１のｓｉＲＮＡによる阻害後の細胞移動の消失は、既知の浸潤マーカーＣＤ４７の結果と類似している。
【００３０】
Ｕ８７の同系（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）細胞株であって、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲＶＩＩＩなどの重要な増殖性遺伝子が単独で、又はＰＴＥＮとの組み合わせで過剰発現している細胞株を用いて、ＴＧＦ−β処理に対する同系細胞株の分子応答性について試験した。ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲＶＩＩＩ同系細胞株では、ＴＧＦ−β処理に応答してＳＬＣ１６Ａ１及びＨＭＯＸ１の表面発現が上昇した。しかし、ＰＴＥＮ発現はこの効果を阻害した。このことから、腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮがＧＢＭにおけるこれらのタンパク質の表面発現のモジュレートに関与している可能性が示された。一方、ＭＲＣ２及びＣＤ４７は、ＰＴＥＮが過剰発現された場合、ＴＧＦ−β処理に応答してアップレギュレーションされた。
【００３１】
ＳＮ１４３腫瘍由来のＧＣＳＣ集団は、Ｕ８７由来の同系細胞株とは異なるＴＧＦ−β応答性を示した。それらは、ＴＧＦ−β処理と比べてＴＧＦ−β阻害剤処理に応答してＨＭＯＸ１の表面発現が３０％増加したが、ＴＧＦ−β阻害剤と比べてＴＧＦ−β処理に応答してＭＲＣ２の発現が増加したことは、Ｕ８７細胞株と同様であった。ＨＭＯＸ１は、酸化的損傷の間に細胞を保護することが知られており、したがって、このタンパク質の発現を調節することにより、ＧＣＳＣは治療薬による損傷を免れる可能性がある。増殖しているＳＮ１４３細胞上に多く見られることが見出された細胞表面タンパク質である、ＨＭＯＸ１の発現増加は、この防御応答に関連し得る。
【００３２】
本実施例の結果は、癌細胞の弾性（ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）が相補的な活性を有する複数の細胞表面タンパク質の動員によって維持されることを示している。ＴＧＦ−βに対するＮＳＣの応答性は、ＧＢＭ細胞株の応答性と、また、ＳＮ１４３腫瘍由来ＧＣＳＣの応答性とは顕著に異なっていた。ＮＳＣでは、ＴＧＦ−β処理に応答して、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２、ＣＤ４７、ＳＬＣ１６Ａ３、及びＣＤ９７の細胞表面発現に顕著な変化はなかった。本実施例の結果は、以前の報告に記載されるように、神経発生及び増殖能力を抑制する態勢にある、健常ＮＳＣにおける不活性型・非摂動ＴＧＦ−βネットワークに有利に働く。さらに、ＮＳＣのＴＧＦ−β阻害剤処理は、ＭＲＣ２、ＣＤ４７、ＳＬＣ１６Ａ３、及びＣＤ９７、すなわちＴＧＦ−β阻害剤処理後にＧＢＭ細胞において阻害されたＧＢＭＳｉｇタンパク質の発現を増加させた。原発性ＳＮ１４３細胞のＴＧＦ−β阻害剤応答性が、ＨＭＯＸ１の過剰発現によって媒介される可能性が高い一方、ＮＳＣにおいて同様の効果を示すのはＭＲＣ２であった。本実施例の結果は、ＳＬＣ１６Ａ１、ＭＲＣ２、及びＨＭＯＸ１が癌細胞におけるＴＧＦ−βシグナル伝達の重要なメディエーターであり、その調節は健常ＮＳＣの分子応答性とは異なることを示しており、これはおそらく健常細胞と癌細胞におけるＴＧＦ−βネットワークが作動する枠組みの違いに起因している。本実施例の結果はまた、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、及びＭＲＣ２のｓｉＲＮＡ媒介阻害が、既知の浸潤マーカーＣＤ４７のものと同様の細胞浸潤の減少（スクランブルｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して＞５０％）をもたらしたことを示し、ＧＢＭ浸潤及びＴＧＦ−β応答性におけるこれらのタンパク質の直接関与を示唆している。したがって、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＣＤ４７、及びＭＲＣ２の侵襲的性質ならびにＧＣＳＣ上でのこれらのタンパク質の過剰発現は、これらの細胞がＴＧＦ−β１に応答して転移に寄与することを可能とし、それゆえに患者の生存に悪影響を与えると思われる。よって、これらのタンパク質の発現を特徴付けること、又はそれらの活性を阻害することは、効果的な治療となり得る。ＴＣＧＡデータセットの生存率分析はこの見解を支持しており、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットにおいて、５種類のＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわちＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２、ＣＤ４７、及びＳＬＣ１６Ａ３を共発現する患者は３０％低い生存率（ｐ＜０．０８）を示し、一方１０種類のＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわちＣＡ１２、ＭＲＣ２、ＣＤ４４、ＴＮＣ、ＳＬＣ１６Ａ１、Ｓ１００Ａ１０、ＨＭＯＸ１、ＩＴＧＡ７、ＳＬＣ１６Ａ３、及びＣＬＣＣ１は、５０％低い生存率（ｐ＜０．００３）を示した。図５ｃは、ＧＢＭＳｉｇタンパク質が過剰発現している場合、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴリポジトリからのＧＢＭ患者（ｎ＝１００）が低い生存率（ｐ＜０．００３）であることを示す。
【００３３】
これらの実験の結果は、以下の進歩をもたらす。第１に、非侵襲性であって、血液検査に基づくＧＢＭの早期診断法が初めて利用可能となった。以下の結果は、ＧＢＭＳｉｇタンパク質のメンバーのうちの４種類、すなわちＣＤ４４、ＨＭＯＸ１、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦＢＩが、健常者とは対照的に、ＧＢＭ対象者の血漿中に変化したレベルで存在することを示す。また、ＧＢＭＳｉｇタンパク質の残りのメンバーも、健常者と比較してＧＢＭ対象者の血液中の濃度が変化すると考えられ、これも本発明の一部である。これらの血液マーカーの各々を検出するための試薬が並べられたアレイ（ｏｒｄｅｒｅｄ  ａｒｒａｙ）を有するパネルは、パッケージ化され、またキットとして使用することができ、これもまた診断に役立つ。
【００３４】
血液中に存在し得る追加のマーカーには、ＤＤＲ２、ＰＤＩＡ４、ＣＡＤＭ１、ＩＴＧＡ７、ＭＲＣ２、ＭＹＯＦ、ＮＲＰ１、ＲＴＮ４、ＴＮＣ、ＳＣＡＭＰ３、及びＣＤ４７が含まれる。
【００３５】
第２に、多くのＧＢＭＳｉｇタンパク質は、ＴＧＦ−β刺激によってアップレギュレーションされることが同定された。これらのタンパク質は、浸潤性を促進することでＴＧＦ−βの効果を増強する。したがって、これらのタンパク質を高レベルで有する対象者から得られたＧＢＭ腫瘍組織は、その対象者がＴＧＦ−β阻害剤の投与に基づく治療の有望な候補であることを示す。これらのタンパク質には、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２、及びＣＤ４７が含まれる。
【００３６】
第３に、ＴＧＦ−βに対して応答性が亢進していることを示すタンパク質が浸潤性を促進することから、これらのタンパク質の発現の低下又はそれらの活性の阻害をもたらす治療法は、ＧＢＭを治療するのに有用である。このような方法には、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス構築物などの発現阻害剤の使用が含まれ、活性を阻害する方法には、抗体、アプタマー、抗体模倣物などの、タンパク質そのものに対する結合剤を投与することが含まれる。
【００３７】
第４に、ＧＢＭＳｉｇタンパク質のいくつかは、さまざまな形態のＧＢＭに特徴的であることが示されている。したがって、実施例６に示すように、ＧＢＭの間葉系、古典的／増殖性、及び前神経性のサブタイプを、これらのタンパク質の特定のサブセットの発現パターンに基づいて識別することが可能である。
【００３８】
準備Ａ
ＧＢＭＳｉｇのＳＲＭアッセイの開発
ＧＢＭ組織及び血液中のタンパク質バイオマーカーとしてのＧＢＭＳｉｇの役割を評価するために、ＳＲＭアッセイ［１３］を開発した。３３種類のＧＢＭＳｉｇタンパク質を代表する合計７０種類の細胞表面タンパク質（ＣＳＰ）ペプチドをｄ−ＳＲＭアッセイの開発（各タンパク質につき約２つ）に使用した。内在性ペプチドのサロゲート（代用物）として働く、Ｃ末端がリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）のいずれかで標識（１３Ｃ１５Ｎ）された合成ペプチドの代表的なものを、コリジョンエネルギー（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：ＣＥ）の最適化に供し、各ペプチド結合からのトラップエネルギー（ｔｒａｐｐｅｄ  ｅｎｅｒｇｙ）の放出を最大にした。ペプチドの３つの親（Ｑ１）電荷（＋２、＋３、＋４）及び２つの娘（Ｑ３）イオン電荷（＋１、＋２）を、アッセイの最適化のために、全ての実行可能な組み合わせで試験した；最高の存在量を示しかつ妨害イオンの影響を最小限に抑えたＱ１／Ｑ３トランジション−ＣＥ組み合わせを、アッセイ検証のために最終的に選択した。最終的なＳＲＭ法では、最低３トランジションを有する最も性能の高いペプチドを定量に使用した。この標的化アプローチは、これらの生物学的分離物中の典型的には少ない存在量であるＣＳＰの検出の感度及び特異度を改善した。
【００３９】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１
ＧＢＭ診断のための血液分泌型ＧＢＭＳｉｇタンパク質
４つのＧＢＭ血漿を、ＳＲＭ質量分析によって循環ＧＢＭＳｉｇについて分析した。３３種類のＧＢＭＳｉｇタンパク質のうちの１４種類を、トリプリケートＳＲＭランにおいて独立して検出した。４種類の循環ＧＢＭＳｉｇタンパク質ＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦＢ１もまた、ＥＬＩＳＡによって評価した。４２個の血漿サンプル（２１人の健常及び２１人のＧＢＭ、年齢と性別を一致させた）を用いて、統計的に有意な差異がこれらのタンパク質の濃度に観察された。健常血漿とＧＢＭ血漿を比較すると、濃度は以下の通りであった：
ＣＤ４４について：１４９．３１の健常対７５．０９ｎｇ／ｍｌのＧＢＭ  （ｐ＜３．６９Ｅ−０８、両側検定）；
ＨＭＯＸ１について：１０．７０の健常対１７．５２ｎｇ／ｍｌのＧＢＭ  （ｐ＜９．２１Ｅ−０５、両側検定）；
ＶＣＡＭ１について：５８３．２２の健常対４３６．４０ｎｇ／ｍｌのＧＢＭ  （ｐ＜０．０２、両側検定）；及び
ＴＧＦＢ１について：２４８２．５１の健常対９３１．７４ｎｇ／ｍｌのＧＢＭ  （ｐ＜５．６８Ｅ−１０）。
したがって、ＧＢＭ血漿において、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦＢＩの濃度は減少し、ＨＭＯＸ１は増加する。
【００４１】
これらの結果を図６ａに示す。図６ｂは、ＨＭＯＸ１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ１、及びＴＧＦＢＩのＥＬＩＳＡ結果のＲＯＣ分析（１０，０００×１０分割交差検証）を示し、これは血液分析によりＧＢＭを診断するための基礎となる。
【００４２】
各サンプルはデュプリケートで分析した。ＲＯＣ分析により、ＣＤ４４について０．９３４、ＨＭＯＸ１について０．８３１、ＶＣＡＭ１について０．６８５、及びＴＧＦＢ１について０．９８２の曲線下面積（ＡＵＣ）が明らかとなった。ＣＤ４４及びＨＭＯＸ１について１０，０００×１０分割ＣＶで０．９９の総合平均ＡＵＣが見出された。ＥＬＩＳＡの結果は、現行の手法について、効果量（＞｜０．８｜）とサンプリング法（力＞０．８）との間で良好な一致を示した。
【００４３】
実施例２
ＧＢＭＳｉｇタンパク質間の共通のＴＧＦ−β応答
ＧＢＭ組織又は正常組織をアッセイすると、多くのＧＢＭＳｉｇタンパク質が、ＴＧＦＢＩの高レベルの共発現と中等度から高度の相関を示した。ＴＧＦＢＩは、癌浸潤に重要な役割を果たすＴＧＦ−β誘導性タンパク質である。ＴＧＦ−β１は、上皮から間葉への移行（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：  ＥＭＴ）の誘導因子であり、腫瘍細胞の局所転移、癌幹細胞ニッチの維持、及び癌細胞の治療抵抗性を含むＧＢＭ生物学のいくつかの局面において基本的な役割を果たす。対象者においてＴＧＦ−β１による刺激と相関するＧＢＭＳｉｇタンパク質レベルは、ＴＧＦ−β１の阻害剤がそのような対象者におけるＧＢＭの治療に有益であり得ることを示している。
【００４４】
この治療から恩恵を受ける可能性がある対象者のマーカーを同定するために、星状細胞腫細胞株Ｕ８７を一晩血清飢餓状態にし、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で４０時間処理した。ＴＧＦ−β処理は、無血清培地で増殖させた細胞と比較してＳＭＡＤ２のＣ末端リン酸化を増加させたが、これはＴＧＦ−β１シグナル伝達の活性化を示唆する。しかし、血清には多くの必須要素及び増殖因子が含まれているため、細胞への血清飢餓の影響は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害に特異的ではない可能性がある。したがって、本発明者らは、ＳＭＡＤ２のＣ末端リン酸化を妨げることが知られているＴＧＦ−β阻害剤（ＳＢ  ４３１５４２）を使用した。ＴＧＦ−β１阻害剤を補充した標準培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）中で増殖させた細胞は、無血清培地中で増殖させた細胞について観察されたものと同様に、ＳＭＡＤ２のＣ末端リン酸化を抑制又は減少させた。したがって、その後のＳＲＭ分析では、血清飢餓の代わりにＴＧＦ−β阻害剤を使用した。
【００４５】
Ｕ８７細胞株を用いて実施された３１のｄ−ＳＲＭアッセイのうち、ＴＧＦＢＩを含む１１のＧＢＭＳｉｇタンパク質は、ＴＧＦ−β阻害剤単独で処理した細胞と比較して、ＴＧＦ−β処理後に少なくとも２倍高い発現を示した。これらのタンパク質は以下の通りである：
ＴＧＦＢＩ  （１０．５４倍±３．０１  ＳＥＭ）、
ＩＴＧＡ７  （９．４５倍±５．３３  ＳＥＭ）、
ＴＮＣ  （６．５５倍±１．１９  ＳＥＭ）、
ＤＤＲ２  （３．５３倍±０．８３  ＳＥＭ）、
ＭＲＣ２  （３．０６倍±０．１６４  ＳＥＭ）、
ＭＧＳＴ１  （２．７７倍±０．３２  ＳＥＭ）、
ＣＬＣＣ１  （２．２６倍±０．４６８  ＳＥＭ）、
ＰＴＧＦＲＮ  （２．１８倍±０．１８４  ＳＥＭ）、
ＣＲＴＡＰ  （２．１２倍±０．４５２  ＳＥＭ）、
ＣＤ１０９  （２．０９倍±０．６１  ＳＥＭ）、及び
ＳＬＣ１６Ａ１  （２．０５倍±０．２０  ＳＥＭ）。
これらの１１のタンパク質はまた、ＴＧＦ−β阻害剤で処理された細胞をＴＧＦ−βで再処理したとき、過剰発現された。これら１１のタンパク質とＳＭＡＤ２依存性ＴＧＦ−βシグナル伝達との関連は、これまでに開示されていない。
【００４６】
８つの追加のＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわち、ＣＤ４７、ＶＣＡＭ１、ＭＹＯＦ、ＡＢＣＡ１、ＣＤ４４、Ｓ１００Ａ１０、ＣＡ１２及びＳＬＣ１６Ａ３は、ＴＧＦ−β阻害剤処理に対してＴＧＦ−β処理にポジティブな富化（阻害剤処理に対して＞１．３倍）を示したが、４つのＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわち、ＡＳＰＨ、ＮＲＰ１、ＣＤ２７６及びＨＭＯＸ１は、ＴＧＦ−β処理後に発現が比較的減少し、また、８つのＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわち、ＣＤ９７、ＳＣＡＭＰ３、ＰＤＩＡ４、ＣＤ９９、ＡＢＣＡ１、ＴＭＸ１、ＲＴＮ４及びＣＤ１５１は、阻害剤処理と比較して、ほとんど変化しなかった。
【００４７】
別のアッセイでは、６つのＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわち、  ＳＬＣ１６Ａ１、ＭＲＣ２、ＣＤ４７、ＳＬＣ１６Ａ３、ＨＭＯＸ１及びＣＤ９７を、ＴＧＦ−βシグナル伝達の下流因子としてフローサイトメトリーにより試験した。ＴＧＦ−β又はＴＧＦ−β阻害剤で処理した無傷のＵ−８７細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ＴＧＦ−β阻害剤と比べたＴＧＦ−β１に応答する各ＧＢＭＳｉｇ発現の比率を得た。ＴＧＦ−β阻害剤と比べたＴＧＦ−βに応答する細胞表面上のタンパク質の比率は、それぞれの場合に以下の量だけ増加することが見出された。
ＣＤ４７：４０％（ｐ＜３．６８Ｅ−０８）、
ＳＬＣ１６Ａ３：３０％（ｐ＜４．７２Ｅ−０９）、
ＭＲＣ２：２５％（ｐ＜６．４３Ｅ−０８）、
ＳＬＣ１６Ａ１：２０％（ｐ＜４．４４Ｅ−０６）、
ＨＭＯＸ１：２０％（ｐ＜５．４５Ｅ−０６）、
ＣＤ９７：本質的に変化しない（１．１倍増加）。
ＨＭＯＸ１発現の食い違いは、個々のタンパク質に特有であり、全内部プールと比較して細胞表面上のタンパク質の示差的分配に関連し得る。こうして、ＴＧＦ−βシグナル伝達を増強するＧＢＭＳｉｇ分子のサブセット、すなわち、ＣＤ４７、ＳＬＣ１６Ａ３、ＭＲＣ２、ＳＬＣ１６Ａ１及びＨＭＯＸ１が同定された。
【００４８】
実施例３
ＴＧＦ−β１媒介浸潤応答における特定のＧＢＭＳｉｇタンパク質の役割
ＴＧＦ−β１はＥＭＴプロセスの誘導因子であるので、ＴＧＦ−β１応答因子として実施例２で同定されたＧＢＭＳｉｇのサブセットは、星状細胞腫細胞の浸潤性に寄与し得る。ＴＧＦ−β応答性ＧＢＭＳｉｇ遺伝子をＵ８７細胞においてｓｉ−ＲＮＡによりサイレンシングし、これらの遺伝子をサイレンシングされた細胞が細胞外マトリックスから侵入する能力を評価した。ｓｉＲＮＡは、個々にＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２及びＣＤ４７に対するものであるか、又は組み合わせ（ＳＬＣ１６Ａ１＋ＨＭＯＸ１及びＣＤ４７＋ＨＭＯＸ１）に対するものであった。ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの効率は、転写レベルでのｑＰＣＲ及び細胞表面上のフローサイトメトリーの両方によって評価した。非標的化ＲＮＡと比較して、標的遺伝子の２倍を超える発現低下が見出された。ｓｉＲＮＡ処理の前後での細胞生存率への影響を把握するために、生存率をカルセインＡＭアッセイで試験した。細胞生存率に何の変化も見られなかった。
【００４９】
移動及び浸潤に対する遺伝子サイレンシングの影響を評価するために、ｓｉＲＮＡ又は非標的化ＲＮＡで処理した細胞をトランスウェルチャンバーに播種し、細胞浸潤の程度を、サイレンシングを受けていない細胞に対するサイレンシングを受けた細胞により浸潤された細胞のパーセンテージとして評価した。ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１及びＭＲＣ２のサイレンシングは、それぞれ、細胞浸潤の５２．８８％±９．７０  ＳＥＭ、４６．７６％±２．２７  ＳＥＭ及び４２．２６％±２．１９  ＳＥＭの減少をもたらし、既知の浸潤タンパク質ＣＤ４７がサイレンシングされた細胞（５７．７４％±６．３２  ＳＥＭ減少した細胞浸潤）と同様であった。
【００５０】
ＳＬＣ１６Ａ１＋ＨＭＯＸ１及びＨＭＯＸ１＋ＣＤ４７の組み合わせサイレンシングもまた、細胞浸潤への影響を示した（それぞれ５２．２８％±５．３５  ＳＥＭ及び４６．５５％±０．１８  ＳＥＭ）。
【００５１】
要約すると、これらの結果は、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１及びＭＲＣ２がＧＢＭ細胞の移動及び浸潤において重要な役割を果たすことを示している。これらはまた、ＧＢＭ癌幹細胞（商業的供給源由来のＧＣＳＣならびにＳＮ１４３組織由来のＧＣＳＣ）上にも発現される。
【００５２】
実施例４
ＧＢＭ細胞株ｖｓ．健常神経幹細胞におけるＴＧＦ−β１応答
よく変異を起こすＧＢＭ遺伝子には、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ及びＰＴＥＮが含まれる。これらの遺伝子が単独で、又はＥＧＦＲＶＩＩＩとＰＴＥＮ又はＥＧＦＲとＰＴＥＮの組み合わせで、安定して組み込まれたレトロウイルスベクターを介して発現される、Ｕ８７の４つの同系細胞株が使用された［１４］。
【００５３】
全てのＵ８７同系細胞株において、ＴＧＦ−βに応答してＣＤ４７、ＳＬＣ１６Ａ３、ＭＲＣ２、ＨＭＯＸ１及びＳＬＣ１６Ａ１の細胞表面発現の増加が、親細胞株のそれと同様に、見られた。しかし、ＥＧＦＲＶＩＩＩ又はＥＧＦＲを過剰発現するＵ８７同系細胞株では、親細胞株と比較して、それぞれ１．７５倍±０．０２９  ＳＥＭ及び１．５倍±０．０２８  ＳＥＭのＳＬＣ１６Ａ１発現の増加が観察され、ＨＭＯＸ１の増加は、それぞれ２．１３倍±０．０３及び２．６９倍±０．０６  ＳＥＭであった。両タンパク質の発現は、ＥＧＦＲＶＩＩＩ＋ＰＴＥＮ細胞において減少し（ＳＬＣ１６Ａ１については１．１９倍±０．０２０  ＳＥＭ及びＨＭＯＸ１については１．４８倍±０．０３  ＳＥＭ）、また、ＥＧＦＲ＋ＰＴＥＮ細胞においても減少する（ＳＬＣ１６Ａ１については０．７２４倍±０．００３  ＳＥＭ及びＨＭＯＸ１については１．０５８倍±０．０１  ＳＥＭ）ことが見出され、このことは、おそらく、これらのタンパク質の細胞表面発現がホスファターゼＰＴＥＮの発現を介して調節されるという事実を強調している。
【００５４】
ＥＧＦＲＶＩＩＩ単独（ＳＬＣ１６Ａ３については０．９７倍±０．０２７  ＳＥＭ及びＣＤ９７については０．７５倍±０．０１０  ＳＥＭ）と比較して、ＥＧＦＲＶＩＩＩ＋ＰＴＥＮでは、ＳＬＣ１６Ａ３  （１．３倍±０．０２５  ＳＥＭ）及びＣＤ９７  （１．５１倍±０．００７  ＳＥＭ）のより高い発現が見られた。
【００５５】
ＴＧＦ−βに応答性の選択されたＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわち、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２、ＳＬＣ１６Ａ３、ＣＤ４７及びＣＤ９７の発現はまた、ＴＧＦ−β又はその阻害剤の存在下で、フローサイトメトリーによってＳＮ１４３腫瘍組織からの原発性ＧＢＭ細胞において試験された。
【００５６】
原発性ＧＢＭ細胞（ＳＮ１４３組織から得られた）では、ＴＧＦ−β１で処理した場合にＳＬＣ１６Ａ１  （０．７９倍±０．００９  ＳＥＭ）及びＨＭＯＸ１  （０．７７倍±０．０１２  ＳＥＭ）のより低い発現、ＭＲＣ２  （１．６２倍±０．０１  ＳＥＭ）のより高い発現が、その阻害剤と比較して見出された。健常ＮＳＣは、ＴＧＦ−β１処理と比較して、ＴＧＦ−β阻害剤処理に応答してＭＲＣ２  （０．１９倍±０．０３４  ＳＥＭ）及びＣＤ４７  （０．６１倍±０．００３  ＳＥＭ）のより低い発現を示した。ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１及びＣＤ９７は、ＴＧＦ−β１又は阻害剤処理に対してほとんど又は全く影響を示さず、健常細胞におけるＴＧＦ−β１シグナル伝達の異なる応答性を強調する。これは、異なるＧＢＭ細胞と健常ＮＳＣとの間のＴＧＦ−β応答性には特殊性（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）があること、また、重要な遺伝子、すなわち、ＧＢＭで改変されたＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ及びＰＴＥＮが、さまざまなＧＢＭＳｉｇタンパク質の発現を通して観察されるように、ＴＧＦ−β応答性においてさらなる不均一性を生じ得ること、を示している。
【００５７】
実施例５
ＮＳＣ及びＧＣＳＣにおける細胞表面タンパク質の発現
次第に増えつつある証拠により、ＮＳＣ又はそれらの前駆細胞は、突然変異の変化を受けて、腫瘍増殖、薬剤耐性及び再発を促進する持続的な自己複製能力を有するＧＣＳＣを生み出し得る、ことが示される。ＮＳＣとＧＣＳＣとの間で示差的に発現されるＧＢＭＳｉｇタンパク質は、これらの集団を識別するための細胞表面マーカーとしての役割を果たす。
【００５８】
ＮＳＣ及びＧＣＳＣからの等量（５．７μｇ）の細胞溶解物を酵素消化して清澄化し、ＳＲＭ分析のために等量のＳＲＭペプチド標準（１３Ｃ１５Ｎ  Ｋ／ＲでＣ末端標識した）を加えた。細胞溶解物中のＧＢＭＳｉｇの検出の感度及び特異度を高めるために、本発明者らは、それぞれの細胞溶解物を用いた事前のランで各ペプチドのクロマトグラフィー保持時間（ＲＴ）を測定することによりダイナミックＳＲＭアッセイ（ｄ−ＳＲＭ）を開発した。内在性ペプチドと共溶出された該溶解物中のサロゲート標識ペプチド（Ｃ末端の１３Ｃ１５Ｎ  Ｋ／Ｒ）の存在は、アッセイの品質及び精度を確実にした。サロゲートペプチド及び内在性ペプチドのピーク面積は、スカイライン（ｓｋｙｌｉｎｅ）を介して定量化し、Ｈ（サロゲート）／Ｌ（内在性）の比として表した。各細胞タイプを４回分析し、これらのランの結果を平均して、図３に示した。
【００５９】
ｄ−ＳＲＭアッセイによって定量された３３のＧＢＭＳｉｇタンパク質のうち、２２の該タンパク質は、ＧＣＳＣとＮＳＣ細胞との間で異なった発現パターンを示した。
【００６０】
ＧＣＳＣとＮＳＣ細胞との間で異なった発現を示す４つのＧＢＭＳｉｇタンパク質、すなわち、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２及びＳＬＣ１６Ａ３は、フローサイトメトリーでさらに検証された。無傷のＮＳＣ及びＧＣＳＣ細胞を適切な一次抗体で標識し、結合した抗体をＦＩＴＣ−又はＰＥ−二次抗体コンジュゲートによって検出した。アイソタイプ減算後の各抗体タイプの４つの反復試料から平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出し、平均値±平均差のＳ．Ｅ．（ＳＥＭ）として表した。
【００６１】
上述したように、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２及びＳＬＣ１６Ａ３は全て、ＮＳＣと比較してＣＳＣ上で高度に発現されることが判明した。ＧＣＳＣ細胞は、ＮＳＣ細胞と比較して、ＳＬＣ１６Ａ１及びＨＭＯＸ１を、それぞれ２６倍及び８倍高いレベルで発現した（ｐ＜０．００１）。これらのデータは、ＮＳＣと比べてＧＣＳＣにおいてＳＬＣ１６Ａ１及びＨＭＯＸ１のより高い発現を示したｄ−ＳＲＭアッセイとよく一致する。ＧＣＳＣと比較して、ＮＳＣ表面上のＳＬＣ１６Ａ３及びＭＲＣ２の発現の減少は、フローサイトメトリー分析から明らかであった。
【００６２】
細胞溶解物及び細胞表面などの２つの代替供給源からの細胞表面タンパク質の定量的測定における特殊性は、ＧＣＳＣ細胞の表面上のこれらの分子の細胞内分配におけるさらなる調節に関連し得る。
【００６３】
また、商業的供給源からの癌幹細胞とは異なる、原発性ＧＢＭ細胞上の潜在的なＧＣＳＣマーカーとしてのＧＢＭＳｉｇタンパク質の可能性も検討された。ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１、ＭＲＣ２、ＣＤ４７、ＳＬＣ１６Ａ３及びＣＤ９７を含むＧＢＭＳｉｇタンパク質のサブセットを、原発性ＧＢＭ細胞の幹様特性との関連で表面発現レベルについてさらに評価した。これらの細胞を、ＳＮ１４３組織（標的化した組織及び血清プロテオミクスにも使用された）から単離して、ＧＣＳＣ集団を富化するために幹細胞模倣条件で維持した。幹細胞富化培地で増殖させたＧＣＳＣでは、幹細胞マーカーであるネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）の発現の増加がＧＣＳＣ集団の８０％以上で観察された。ＧＣＳＣ上のネスチンの富化はＮＳＣのそれと同様であった。
【００６４】
並行実験において、幹細胞富化培地で増殖させた増殖性ＳＮ１４３細胞は、増殖因子を取り出すことによって分化させた。ＧＣＳＣ細胞の細胞分化は、既知の分化マーカーＧＦＡＰの発現の増加及び既知のＧＣＳＣマーカーＣＤ１３３の表面発現の減少から確認された。
【００６５】
分化後のＧＢＭＳｉｇ発現の定量的変化を検証するために、増殖性ＧＣＳＣと分化性ＧＣＳＣの両方をフローサイトメトリーによって分析した。増殖条件と比べて分化条件においてＭＲＣ２（アイソタイプに類似）、ＳＬＣ１６Ａ３  （３８．５％±４．１２  ＳＥＭ）、ＣＤ９７  （７０．７７％±４．５２  ＳＥＭ）及びＨＭＯＸ１  （２３．５％±１．９２  ＳＥＭ）の表面発現レベルの低下が観察されたが、ＣＤ４７の増強された発現（２１．４３％±１．３７  ＳＥＭ）は、増殖条件と比べて分化条件において観察された。フローサイトメトリーで測定したとき分化中のＳＬＣ１６Ａ１発現のレベルに有意な変化はなかったが、蛍光顕微鏡法では、増殖条件下でＳＬＣ１６Ａ１について陽性に染色され、分化後に減退する、ＧＣＳＣ細胞の小さな集団が検出された。
【００６６】
蛍光顕微鏡法で観察されるような、増殖条件でのＨＭＯＸ１（別の推定ＧＣＳＣマーカー）の発現の増加及びその後の分化条件での減少もまた、フローサイトメトリーデータとよく一致する。
【００６７】
したがって、ＳＬＣ１６Ａ１陽性細胞のフローサイトメトリー分析から生じた食い違いは、ＳＮ１４３由来ＧＣＳＣ集団の中のＳＬＣ１６Ａ１陽性細胞の希少性によるフローサイトメトリーにおけるＳＬＣ１６Ａ１シグナルの平均化に関連し得る。要するに、これらの結果から、ＭＲＣ２、ＳＬＣ１６Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＭＯＸ１及びＣＤ９７と、ＧＣＳＣ集団中で富化された増殖性原発性ＧＢＭ細胞との関連が実証された。
【００６８】
実施例６
腫瘍の層別化
ワシントン州シアトルのＳｗｅｄｉｓｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで手術を受けた４人の男性患者（ＳＮ１３２、ＳＮ１４３、ＳＮ１５４及びＳＮ１８６）からの脳組織と血液を使用した。外科的処置と検体採取の前に、適切な同意を得た。腫瘍起源及び非腫瘍起源の脳組織をホモジナイズし、酵素で消化し、Ｃ１８を用いて清澄化し、ＳＲＭ分析用に合成Ｃ末端標識（１３Ｃ１５Ｎ  Ｋ／Ｒ）ペプチドを加えた。上述したように、ｄ−ＳＲＭアッセイは、事前のランで対応する組織又は血清分離物の存在下に各サロゲートペプチドの保持時間を測定することによって開発されたものであり、したがって、異なる分離物間のペプチド保持時間の高い相関（Ｒ２＞０．９９）から明らかであるように、ＳＲＭラン中のペプチド保持時間ウィンドウが短縮され、かつ複数の分離物にわたるペプチド同定の信頼性が向上する。さらに、個々のペプチドについての複数のトランジション（Ｑ１−Ｑ３）の分析は、ＳＲＭ分析の精度と品質を改善した。
【００６９】
３３のＧＢＭＳｉｇタンパク質のうち２１の相対的発現が４つのＧＢＭ組織全てにおいて定量化された。非腫瘍脳組織の希少性のため、４つのＧＢＭ組織におけるＧＢＭＳｉｇ発現は、ＳＮ１３２及びＳＮ１５４対象者由来の２つの非腫瘍組織におけるものと比較できたにすぎなかった。６つの脳組織（４つのＧＢＭと２つの非腫瘍）にわたるＳＲＭトレース（内在性ペプチド対サロゲートペプチドの比）のＺスコア変換の後、４つのＧＢＭ組織全てにおいて過剰発現された１２のＧＢＭＳｉｇタンパク質が、両方の非腫瘍組織と比較して観察され、図４に示すヒートマップとして表される。
【００７０】
ＧＢＭＳｉｇタンパク質の大部分は、脳の腫瘍領域と非腫瘍領域との間で示差的発現を示したが、ＧＢＭＳｉｇ発現における腫瘍内不均一性が明々白々であった。これら４人のＧＢＭ患者間の不均一性のレベルを調べるために、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら［２］によって記載された３３の既知の遺伝子パネルについてｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、これらの腫瘍を層別化した。患者ＳＮ１５４は増殖性として、ＳＮ１８６は前神経性として、ＳＮ１４３は間葉系として、ＳＮ１３２は中間として層別化された。各ＧＢＭＳｉｇタンパク質（Ｎ＝２８）は、４つのＧＢＭ組織にわたってＺスコアに基づいてランク付けされ、その結果、２８のＧＢＭＳｉｇが３つのグループに分類された。ＴＣＧＡのＧＢＭＳｉｇ−トランスクリプトームをベースとした層別化と比較して、８つのＧＢＭＳｉｇタンパク質について同様のサブタイプ特異的発現が観察された。
【００７１】
ＣＡＶ１、ＴＧＦＢＩ及びＣＡ１２は、ＴＣＧＡデータセット中に下線を施された間葉系サブタイプと同様、神経膠肉腫ＳＮ１４３において比較的過剰発現されることが判明した。同様に、古典的／増殖性ＳＮ１５４では、ＥＧＦＲの相対的過剰発現及びＳ１００Ａ１０とＮＲＰ１の発現低下が観察され、前神経性ＳＮ１８６の場合には、トランスクリプトーム及びプロテオームの両レベルでＳＬＣ１６Ａ３とＳＣＡＭＰ３の相対的過剰発現が観察された。中間サブタイプＳＮ１３２では、ＣＡＶ１、ＴＧＦＢ１及びＣＡ１２タンパク質の過剰発現から明らかな間葉系と、ＥＧＦＲの過剰発現から明らかな増殖性との両方の発現パターンがはっきりと見られた。したがって、選択されたＧＢＭＳｉｇタンパク質の発現パターンは、ＧＢＭ層別化を可能にするように、トランスクリプトーム及びプロテオームの両レベルでＧＢＭの不均一性を暗示する。
【００７２】
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１２．  Ｍａｄｈａｖａｎ  Ｓ，  Ｚ．Ｊ．，  Ｋｏｔｌｉａｒｏｖ  Ｙ，  Ｓａｈｎｉ  Ｈ，  Ｆｉｎｅ  ＨＡ，  Ｂｕｅｔｏｗ  Ｋ．，  Ｒｅｍｂｒａｎｄｔ：  ｈｅｌｐｉｎｇ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｂｅｃｏｍｅ  ａ  ｒｅａｌｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ，  ２００９．  ７（２）：  ｐ．  １５７−６７．
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１４．  Ｇｉｎｉ  Ｂ，  Ｚ．Ｃ．，  Ｇｕｏ  Ｄ，  Ｍａｔｓｕｔａｎｉ  Ｔ，  Ｍａｓｕｉ  Ｋ，  Ｉｋｅｇａｍｉ  Ｓ，  Ｙａｎｇ  Ｈ，  Ｎａｔｈａｎｓｏｎ  Ｄ，  Ｖｉｌｌａ  ＧＲ，  Ｓｈａｃｋｅｌｆｏｒｄ  Ｄ，  Ｚｈｕ  Ｓ，  Ｔａｎａｋａ  Ｋ，  Ｂａｂｉｃ  Ｉ，  Ａｋｈａｖａｎ  Ｄ，  Ｌｉｎ  Ｋ，  Ａｓｓｕｎｃａｏ  Ａ，  Ｇｕ  Ｙ，  Ｂｏｎｅｔｔｉ  Ｂ，  Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ  ＤＳ，  Ｘｕ  Ｓ，  Ｒａｙｍｏｎ  ＨＫ，  Ｃａｖｅｎｅｅ  ＷＫ，  Ｆｕｒｎａｒｉ  ＦＢ，  Ｊａｍｅｓ  ＣＤ，  Ｋｒｏｅｍｅｒ  Ｇ，  Ｈｅａｔｈ  ＪＲ，  Ｈｅｇｅ  Ｋ，  Ｃｈｏｐｒａ  Ｒ，  Ｃｌｏｕｇｈｅｓｙ  ＴＦ，  Ｍｉｓｃｈｅｌ  ＰＳ．，  Ｔｈｅ  ｍＴＯＲ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，  ＣＣ２１４−１  ａｎｄ  ＣＣ２１４−２，  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｂｌｏｃｋ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ，  ２０１３．  １９（２０）：  ｐ．  ５７２２−３２．
【図１】
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【図２ａ】
2017522555.tif 000004
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
2017522555.tif 000009
【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【国際調査報告】
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