(57)【要約】  走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（ＳＩＣＭ）を用いて、電解液に浸された試料の表面を調べる方法は、イオン電流を前記電解液内に誘導するために、前記電解液に浸された第１電極と第２電極との間の電位を制御する工程を含む。前記第１電極の電解液に浸された部分は、マイクロピペット内に含まれ、前記第２電極は、前記マイクロピペットの外部にある。前記方法は、さらに、試料を支持するステージに対してマイクロピペットが動くように制御しながら前記イオン電流を記録する工程と、イオン電流及び較正データから、前記試料の表面高さの分析結果を決定する工程を含む。前記電位は、スペクトル拡散変調信号によって制御することができる。前記マイクロピペットの動作は、前記マイクロピペットと、前記第１電極と、前記マイクロピペットのＺ軸方向の動作を制御する第１圧電アクチュエータとの組み合わせの共振周波数より大きい変調周波数を有するＡＣモードのパターンに従うことができる。
2017508161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法を用いて、電解液に浸された試料の表面を調べる方法であって、
スペクトル拡散変調信号を用いてイオン電流を前記電解液内に誘導するために、マイクロピペット内で前記電解液に浸された第１電極と、前記マイクロピペット外の第２電極との間の電位を制御し、
前記試料を支持するステージに対して前記マイクロピペットが動くように制御している間の前記イオン電流を記録し、
前記記録されたイオン電流を復調し、
復調されたイオン電流及び較正データから、前記試料の表面高さプロファイルを決定する、方法。
【請求項２】
前記スペクトル拡散変調は、複数の信号を、時間または周波数領域で多重化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スペクトル拡散変調は、二位相偏移変調（ＢＰＳＫ）、四位相偏移変調（ＱＰＳＫ）、ｎ直角位相振幅変調（ｎ-ＱＡＭ）、周波数変調（ＦＭ）、振幅変調（ＡＭ）のいずれかにより実行される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
スペクトル拡散変調は、所定の搬送周波数で行なわれ、前記搬送周波数は、任意で、１００Ｈｚよりも大きい、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記スペクトル拡散変調は、直交拡散符号を用いて行なわれ、任意で、ウォルシュ符号または、直交可変拡散率（ＯＶＳＦ）符号を用いて行なわれる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記スペクトル拡散変調は、２つまたは３つの異なる拡散符号を用いて行なわれる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記スペクトル拡散変調は、疑似ランダムスクランブル符号を用いて行なわれ、任意で、ゴールド符号系列またはｍ系列を用いて行なわれる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
記録したイオン電流をフィルタリングすることをさらに含み、任意で、バンドパスフィルタを用いる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記試料表面の追跡のために前記マイクロピペットの動作を制御するために、表面高さの分析結果データをフィードバックすることをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
表面追跡信号が、短相関器を用いて得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スペクトル拡散変調は、少なくとも表面追跡のための第１拡散符号と撮像のための第２拡散符号とを用いて行なわれ、前記第２符号は前記第１符号より長い、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記復号は、長相関器を用いて行なわれる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
マイクロピペットの動きによる画像ぶれを減少させるために逆畳み込みアルゴリズムを実行することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記決定は、前記試料表面を下底とし、前記マイクロピペットの開口を上底とする円錐台によって、復調されたイオン電流の逆畳み込みを行なうことを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
走査型電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）の第３電極からデータを収集することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記第１電極との直流電流（ＤＣ）オフセット電圧を前記第３電極に印加することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１圧電アクチュエータが、前記マイクロピペットのＺ軸方向の動作を比較的細かく制御するために用いられ、第２圧電アクチュエータが、前記試料ステージのＺ軸方向の動作を比較的大まかに制御するために用いられる、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記マイクロピペットの動作は、ホッピングモードのパターンに従う、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロピペットの動作は、交流電流（ＡＣ）モードのパターンに従う、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＣモードのパターンは、前記マイクロピペットと前記第１電極と前記マイクロピペットのＺ軸方向の動作を制御する第１圧電アクチュエータとの組み合わせの共振周波数より大きい変調周波数を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＣモードの走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（ＳＩＣＭ）を用いて、電解液に浸された試料の表面を調べる方法であって、
前記試料を支持するステージに対して、前記電解液に浸された第１電極の一部を含むマイクロピペットの高さを変動させるために、第１圧電アクチュエータを制御し、
前記第１電極と、マイクロピペットの外で電解液に浸された第２電極との間の電解液内にイオン電流を誘導するために、第１圧電アクチュエータと前記マイクロピペットと前記第１電極との組み合わせの共振周波数よりも大きい変調周波数の交流電流（ＡＣ）を用い、
前記試料ステージに対して、前記マイクロピペットが、前記ＡＣ高さ変動に垂直の成分を有する動作を行うよう制御しながら、前記イオン電流を記録し、
記録された前記イオン電流及び較正データから、前記試料の表面高さの分析結果を決定する、方法。
【請求項２２】
前記ＡＣ変調周波数は、前記共振周波数の少なくとも２０倍である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＣ変調周波数は、約６０ｋＨｚである、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記記録に先行して、前記ＡＣモードの動作は、前記ＡＣ変調周波数よりも低い初期のＡＣ周波数に設定され、前記初期のＡＣ周波数は、ランプ関数に従い所定の期間にわたって、徐々に前記ＡＣ変調周波数まで上昇される、請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記ランプ関数は、前記組み合わせの共振の複素包絡線の逆である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記所定の期間は、約３ｍｓである、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記記録されたイオン電流の複素包絡線の大きさにより復調された信号に従い、前記試料ステージのＺ軸方向の動作を制御するために、第２圧電アクチュエータを駆動することをさらに含む、請求項２０〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
電圧補正が、前記試料ステージのＺ軸方向の動作を制御する第２圧電アクチュエータに適用され、前記電圧補正は、検出されたイオン電流に対して直線的に増加する、請求項２０〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記増加の比例定数は、較正処理を介して、及び／又は、電解液に関連する所定の定数から決定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料ステージのＺ軸方向の動作を制御する第２圧電アクチュエータの駆動信号の帯域幅は、前記第２圧電アクチュエータと、前記マイクロピペット、試料ステージ、試料容器、電解質、および試料の組み合わせとの共振周波数よりも狭い、請求項２０〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
スペクトル拡散変調信号を用いて、前記第１電極と前記第２電極との間の電位を制御することをさらに含み、
前記決定は、前記記録されたイオン電流を復調することを含む、請求項２１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記スペクトル拡散変調は、複数の信号を、時間または周波数領域で多重化することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記スペクトル拡散変調は、二位相偏移変調（ＢＰＳＫ）、四位相偏移変調（ＱＰＳＫ）、ｎ直角位相振幅変調（ｎ-ＱＡＭ）、周波数変調（ＦＭ）、振幅変調（ＡＭ）のいずれかにより実行される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
スペクトル拡散変調は、所定の搬送周波数で行なわれ、前記搬送周波数は、任意で、１００Ｈｚよりも大きい、請求項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記スペクトル拡散変調は、直交拡散符号を用いて行なわれ、任意で、ウォルシュ符号または、直交可変拡散率（ＯＶＳＦ）符号を用いて行なわれる、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記スペクトル拡散変調は、２つまたは３つの異なる拡散符号を用いて行なわれる、請求項３１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記スペクトル拡散変調は、疑似ランダムスクランブル符号を用いて行なわれ、任意で、ゴールド符号系列またはｍ系列を用いて行なわれる、請求項３１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
記録したイオン電流をフィルタリングすることをさらに含み、任意で、バンドパスフィルタを用いる、請求項３１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記試料表面の追跡のために前記マイクロピペットの動作を制御するために、表面高さの分析結果データをフィードバックすることをさらに含む、請求項３１〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
表面追跡信号が、短相関器を用いて得られる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記スペクトル拡散変調は、少なくとも表面追跡のための第１拡散符号と撮像のための第２拡散符号とを用いて行なわれ、前記第２符号は前記第１符号より長い、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記復号は、長相関器を用いて行なわれる、請求項３１〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
マイクロピペットの動きによる画像ぶれを減少させるために逆畳み込みアルゴリズムを実行することをさらに含む、請求項３１〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記決定は、前記試料表面を下底とし、前記マイクロピペットの開口を上底とする円錐台によって、復調されたイオン電流の逆畳み込みを行なうことを含む、請求項３１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
走査型電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）の第３電極からデータを収集することをさらに含む、請求項３１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記第１電極との直流電流（ＤＣ）オフセット電圧を前記第３電極に印加することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第１圧電アクチュエータが、前記マイクロピペットのＺ軸方向の動作を比較的細かく制御するために用いられ、第２圧電アクチュエータが、前記試料ステージのＺ軸方向の動作を比較的大まかに制御するために用いられる、請求項３１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記較正データはイオン電流が記録されるＸＹ位置それぞれの合成接近曲線を含み、前記合成接近曲線は、トレーニングシーケンス中に測定される複数の較正接近曲線から決定される、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記合成接近曲線は、前記複数の較正曲線の各ＸＹ位置からのＸＹ位置の直線距離によって重み付けされた前記複数の較正曲線の線形結合である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記複数の較正曲線は、前記試料ステージに対して前記マイクロピペットが動くように制御する間に前記イオン電流を記録する前記ステップに先行して、及び／又は、前記ステップ中に、及び／又は、前記ステップ後に、収集される、請求項４８または４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｉｏｎ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＩＣＭ）、及び、例えば、細胞及び複雑なマトリクス構造の柔らかい表面や界面などを含む柔らかい表面や界面の研究等における、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法の使用時に、効率及び精度を向上させることに関する。また、例えば、硬い表面上での化学反応の研究に使用するための、ＳＩＣＭと走査型電気化学顕微鏡法（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＣＭ）とを組み合わせた技術の改良についても開示する。
【背景技術】
【０００２】
柔らかい表面は、細胞膜や非混合液滴などを含み、特に、液体に浸した場合の、多くの自然現象の特徴である。動物であれ、植物であれ、その細胞は、生体の最も基礎的な単位である。細胞の構造や組成、及び、細胞の様々な構成要素がどのように機能するかを研究することが、一体的な生体系で起こる複雑な過程についての貴重な見識をもたらす。これには、実時間で、非侵襲的に、そして、細胞機能を保つよう生理学的条件を模した溶液中で、細胞試料を調査可能とする技術が求められる。
【０００３】
（可視光を用いた）光学顕微鏡法が、生細胞の研究に広く利用されている。しかしながら、その解像度は、回折により約２００〜２５０ｎｍに限定されている。その他の撮像測定技術の多くには、観察中の表面を変形させてエラーを誘発しかねない力がかかる表面探査方法、もしくは、観察できるように事前に表面を改良する必要がある表面探査方法が用いられる。
【０００４】
例えば、一般的に用いられる方法の一つに電子顕微鏡法がある。電子顕微鏡法では、解像度１０ｎｍの画像を得ることができる。しかしながら、真空もしくは低圧ガスが必要となるため、撮像前に表面を安定させ、液体を除去することが必要となり得る。よって、通常、生細胞の研究に電子顕微鏡を用いることはできない。
【０００５】
その他の高解像度技術としては、走査型プローブ顕微鏡法（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＰＭ）の使用に基づくものが考えられる。そのような高解像度技術では、尖ったプローブ先端を研究対象の試料に極めて接近させた状態で走査する。結果として起こる相互作用が、延いては、試料の化学的／物理的特徴が、試料に対するプローブ先端位置の関数として示され、測定された相互作用の分析結果が生成される。一般的に生物学的な撮像に利用されるＳＰＭの範疇に分類されるものとしては、原子間力顕微鏡法（ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＡＦＭ）や走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｉｏｎ-ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＩＣＭ）がある。
【０００６】
ＡＦＭは、一般的に、機械的な力または機械的な圧力に対する表面の反応を研究する為に使用される。ＡＦＭは、標本の表面を走査するための尖った先端部（プローブ）が末端に付いたカンチレバーからなる。先端部が試料表面に接近する際に、先端部と試料との間の力により、カンチレバーがたわむ。しかしながら、先端部のカンチレバーばね定数が、計測処理または検出処理によって研究対象の表面がどの程度変位するかに影響を与え、研究対象とすることができる表面の柔らかさを制限する。さらに、ＡＦＭの難点として、接触モードまたはタッピングモードで使用する場合、表面がプローブ先端に付着し、プローブ先端を引き離す間に測定値が変わってしまったり、先端部が汚れてしまったり、表面に機械的な損傷を与えたりしかねない。
【０００７】
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｉｏｎ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＩＣＭ）は、走査型プローブ顕微鏡法（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＰＭ）の一形態であり、いかなる接触相互作用も力の相互作用もなく、観察対象が存在する通常の液体環境で、柔らかい表面を高解像度撮像できる。ＳＩＣＭでは、電解質で満たされた（典型的には、ガラス、石英、または、炭素系）マイクロピペットで、電解液に浸された試料の表面を走査する。ＳＩＣＭ は、このようなプローブの位置を制御することにより、生細胞の表面を走査する場合などに、有効活用される。イオン電流が２つの電極間（電解液中のピペット内部の電極と外部の電極）に誘導される。
【０００８】
イオン電流信号は、マイクロピペットの抵抗（Ｒｐ）と電解槽からマイクロピペット開口部への収束経路に沿ったアクセス抵抗（ＲＡＣ）との組み合わせに依存する。Ｒｐは、マイクロピペットの先端部直径と円錐角とに依存する一方、ＲＡＣは、電解槽と試料との電気化学的な特徴、幾何学的配置、及び、プローブからの離隔距離に対する複雑な依存性を示す。
【０００９】
マイクロピペットが試料の表面に近づくと、イオン電流量が比較的一定した定常状態から変化し、急速に減少し始める。イオン電流を減少させるためにマイクロピペットが試料から取るべき距離は、マイクロピペットの内径の二倍から半分の領域である。ガラス製マイクロピペットの場合、この内径は、５０ｎｍほどの大きさしかなく、水晶マイクロピペットの場合は、その内径が２０ｎｍほどの大きさしかない。
【００１０】
微細な表面を非接触分析する方法としてＳＩＣＭを成立させる最適な先端部−試料間の離隔距離は、先端部直径の約２分の１である。ＳＩＣＭを用いて達成し得る空間分解能は、マイクロピペット先端開口の大きさに依存し、典型的には５０ｎｍと１．５μｍとの間である。
【００１１】
マイクロピペットを、表面に近い位置で、繰り返し表面に接近させることにより、表面の３Ｄ立体図や３Ｄ画像を形成することができる。
【００１２】
ＳＩＣＭシステムは、ホッピングモード、交流電流（ＡＣ）モード、マニュアルモードなど、多数のモードで動作することができる。
【００１３】
最も一般的な走査方法の一つに、ホッピングモードラスター走査と呼ばれるものがある。典型的には、この方法では、マイクロピペットをＸ、Ｙ、Ｚ次元で正確に操作できる圧電フレクシャ（ｆｌｅｘｕｒｅ）ステージに信号を送る制御部によって、マイクロピペットの位置及び高さが制御される。制御部はイオン電流を、典型的には低ノイズヘッドステージを介して、監視する。
【００１４】
ホッピングモードラスター走査は、典型的には、以下のように行われる。マイクロピペットをある原点から動かし始め、試料のいかなる表面特性よりも高いと推測される高さ（Ｚ軸）まで上昇させる。そして、制御部でイオン電流を監視しながら、試料の表面に近いことを示す電流の小幅な低下が検出されるまで、マイクロピペットを降下させる。電流の低下は変化し得るが、典型的には、ごくわずかな定常電流の０．１〜１０％の範囲内である。制御部は、降下したポイントのＸ、Ｙ、Ｚ位置を記録し、ピペットを安全な高さまで戻した後、ラスター走査の次のＸ、Ｙ位置に移動させる。そして、マイクロピペットをもう一度、表面まで降下させ、制御部がＸ、Ｙ、Ｚ測定値を記録する。この処理を、試料の所定の範囲の走査が完了するまで続けることができる。典型的には、１０μｍ平方の領域の試料面積を範囲として、１２８個のＸ位置と１２８個のＹ位置との配列を対象とするラスター走査が行われる。
【００１５】
走査アルゴリズムの様々な改良が提案されている。例えば、ラスター走査の第一行目は、（表面特性を避けるように）高い位置で行うことができ、以降の走査は、直前に走査した行で測定された高さに基づいて、より低い高さで行われる。もしくは、一行ずつ走査するのではなく、制御部が四角形の頂点を選択しても良い。その四角形の表面のざらつきの測定結果（延いては、行なわれる予定の実験に対して推測されるそのざらつきの重要さ）に応じて、他の四角形が選択されるか、最初に選択された四角形内の数ポイントが選択され、調べられる。
【００１６】
ＡＣモードでは、ピペットのＺ軸方向の位置を制御する圧電装置に、正弦波電流が印加される。ピペットは、試料の表面上で小さい振幅で発振する。ピペットが試料の表面に近づくと、イオン電流は、ピペットのＡＣ変調と比例する速度で変化し始める。ロックイン増幅器は、Ｚ方向のピペットの変調の周波数に位相固定するために用いることができる。こういった増幅器を用いることは、変調信号の周波数帯外のノイズを除去する観点から、とても有効である。
【００１７】
このＡＣモードを用いてピペットの動きを変調しながら、ＡＣ電流の包絡線を検出して、表面の検出に用いることができる。通常、表面からのピペットの平均的な位置は、ピペットが試料から近い一定の距離で保たれるよう、検出された電流の包絡線を用いて調節される。このやり方で、ホッピングモードと同様に、試料の表面形状をラスター走査機構によって走査することができる。
【００１８】
これら全ての操作モードにおいて、ピペットは、同様の手順に従う。
１.  あるＸＹ位置に移動
２.  マイクロピペットの機械的な発振が減衰するまで短時間待機
３.  電流を監視しながら、試料表面に向けてゆっくりマイクロピペットを降下させる
４.  マイクロピペットの機械的な発振が減衰するまで短時間待機
５.  イオン電流の安定したサンプルが得られるよう同じＸＹ位置でステップ３及び４を繰り返す
６.  適切で安全な高さにマイクロピペットを上昇させ、次のＸＹ位置に移動させ、ステップ１から繰り返す
【００１９】
概要を上述した手順により、試料の３Ｄ表面形状を測定する方法が非常に正確になるが、機械的な発振を減衰させるため、及び、マイクロピペットを昇降させるために、遅延が多くある。１ポイントから画像を得るためには、数十ミリ秒もかかることが多く、これにより、やや複雑な画像を複数得るためには、合計走査時間が数十分に至る。画像の早急な変化が求められる場合、この走査時間は許容されない長さである。例えば、生体細胞は、表面の構造が時折変化する。従来のＳＩＣＭにより得られた画像では、走査した生細胞の表面上の近接領域同士の間で、ドリフト（ｄｒｉｆｔｓ）やスティッチ（ｓｔｉｔｃｈ）の影響が見られた。
【００２０】
プローブが表面に向かって進む間に、電流があらかじめ設定された閾値より初めて低くなった後、プローブの動作は、一定時間、もしくは、一定数の試料が測定される間、停止しても良い。このような追加の測定により、表面から近い範囲内での、イオン電流とプローブから表面までの距離との関係についての情報が得られる。この関係をグラフで表したものを、一般的に、接近曲線と呼ぶ。この関係は、ざらつき、周囲の溶液に対する伝導性、プローブ軸に対する角度などの表面の特性を示し得る。
【００２１】
ピペット（プローブ）が表面に接近する際のイオン電流の減少は、その接近ポイントでの、表面の湾曲や試料の機械的な特性についての情報を判断するために用いることができる。電流の減少が表す形状は、表面形状だけではなく、表面のこれら追加の特性についての情報を含む。例えば、表面が柔らかい場合、ピペットが接近すると、ピペットが表面に近づく時に生じる力により表面が遠ざかるので、イオン電流を同じように減少させるためには、ピペットをより降下させなければならない。表面の湾曲が大きい場合も、ピペットをより降下させなければならない。接近の曲線を分析し、任意で、同じ箇所で違う印加電圧で接近することにより、かかる力を変化させ、追加の情報を得ることができるので、これら追加の特性も同時にマッピングすることができる。よって、試料の表面形状だけではなく、表面の他の特性もマッピングすることができる。これにより、得られる画像のコントラストがより鮮明になり、例えば、細胞膜の下の下層の細胞骨格など、対象となる特性がより簡単に検出され得る。
【００２２】
ＳＩＣＭプローブは、研究対象の表面に近接させた時、プローブを介した液体の調整流を用いて、局所的で制御された圧力や力を測定表面にかけることができるように、構成しても良い。この印加圧力は、印加圧力とその印加圧力による表面の動きとの関係を監視することにより、表面の柔軟性や弾性を測定するために用いることができる。また、この印加圧力は、機械受容イオンチャネルなどの細胞表面の構成要素を刺激するためにも用いることができる。続いて、その後の電気生理学的信号もしくは化学的信号の変化を監視することにより、この刺激の測定が行われる。
【００２３】
表面に印加された圧力は、表面が十分に柔軟な場合、表面を動かす。正圧は、つまり、プローブを介した表面への流れは、表面をプローブから遠ざける効果を有し、表面とプローブ先端との距離を拡げる。負圧は、表面をプローブ先端に引き寄せ、距離を狭める。したがって、印加圧力とその印加圧力による表面の動きとの関係から、表面構造の弾性を示す情報が得られる。
【００２４】
ＳＩＣＭシステムは、他に、走査型電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）として知られる処理によりイオン電流情報を収集する際の補助として応用される。ＳＥＣＭは、物質の特性と物質からの距離に基づき、試料の電子化学反応性を電子分析測定するために幅広く用いられる手段である。
【００２５】
従来、ＳＥＣＭは、電解液中の試料に対して、３電極システムを用いる。作用電極が試料に、参照電極が電解液中に、対極電極がプローブ構造内に、接続される。ＳＥＣＭシステム内にある対象物は、対極電極と作用電極との間の表面活動電流を測定することにより試料の酸化還元活性を測定する間、作用電極と参照電極との間で一定の既知の電位を保つ。典型的には、表面活動電流を収集する間、必要とされる電位を管理するためにポテンシオスタットが用いられる。
【００２６】
近年、ＳＥＣＭでは、プローブと試料表面との既知の距離を測定し維持するＡＦＭやＳＩＣＭなどの追加の技術を用いて、試料とマイクロピペットまたはプローブとの間の酸化還元反応の測定を容易にするためにマイクロピペットを使用することが注目されている。
【００２７】
ＳＩＣＭとＳＥＣＭとの組み合わせを実装する手段の一つは、シータ毛細管から製造される二連ピペットを用いることである。レーザーピペットプラーを用いれば、１００ｎｍの範囲内の開口サイズを実現でき、これらマイクロピペットの開口の寸法をとても小さくすることができる。ＳＩＣＭシステムは、試料の表面からのピペットの位置を監視するために、ピペットの２連部分の間のメニスカス層を通る電流を利用する。そして、ピペット内の対極電極と作用電極からの電流の流れが記録され、試料の酸化還元活性の測定値となる。ＳＩＣＭとＳＥＣＭとを組み合わせることにより、試料のＳＥＣＭ分析結果を試料の特性と空間的に統合することが可能になる。このＳＩＣＭシステムは、試料の表面形状を生成するために用いられ、対象となる位置にＳＥＣＭマイクロピペットを誘導し、ＳＥＣＭシステムがさらに分析を行なうためのイオン電流を収集するために用いられる。
【００２８】
従来、ＳＩＣＭとＳＥＣＭとの組み合わせには、典型的には、並行に配置された２つのマイクロピペットが必要とされていた。この構成は頻繁に用いられ、その際、マイクロピペットの配置と、互いに近接したマイクロピペットを実現することとが問題となった。
【発明の概要】
【００２９】
上記に説明した通り、ＳＩＣＭの単独使用であれ、ＳＥＣＭとの併用であれ、求められるのは、ＳＩＣＭ技術の速度、効率、正確さのいずれか一つ以上を向上させた改良されたＳＩＣＭ方法およびシステムである。
【００３０】
第１の態様によれば、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（ＳＩＣＭ）を用いて、電解液に浸された試料の表面を調べる方法が提供され、その方法は、スペクトル拡散変調信号を用いて、電解液中にイオン電流を誘導するように、電解液に浸された第１、第２電極の間の電位を制御する工程と、試料を支持するステージに対してマイクロピペットが動くように制御する間のイオン電流を記録する工程と、記録されたイオン電流を復調する工程と、復調されたイオン電流と較正データから、試料の表面高さの分析結果を決定する工程と、を含む。第１電極の電解液に浸された部分はマイクロピペットに含まれ、第２電極はマイクロピペットの外部にある。
【００３１】
前記スペクトル拡散変調は、複数の信号を、時間または周波数領域で多重化する工程を含み得る。
【００３２】
前記スペクトル拡散変調は、二位相偏移変調（ＢＰＳＫ）により実行され得る。前記スペクトル拡散変調は、四位相偏移変調（ＱＰＳＫ）により実行され得る。前記スペクトル拡散変調は、ｎ直角位相振幅変調（ｎ-ＱＡＭ）により実行され得る。前記スペクトル拡散変調は、 周波数変調（ＦＭ）により実行され得る。前記スペクトル拡散変調は、振幅変調（ＡＭ）により実行され得る。
【００３３】
前記スペクトル拡散変調は、所定の搬送周波数で行われ得る。前記搬送周波数は、１００Ｈｚよりも大きい周波数であり得る。
【００３４】
前記スペクトル拡散変調は、直交拡散符号を用いて行なわれ得る。前記直交拡散符号は、ウォルシュ符号であり得る。前記直交拡散符号は、直交可変拡散率（ＯＶＳＦ）符号であり得る。
【００３５】
前記スペクトル拡散変調は、２つの異なる拡散符号を用いて行なわれ得る。前記スペクトル拡散変調は、３つの異なる拡散符号を用いて行なわれ得る。
【００３６】
前記スペクトル拡散変調は、疑似ランダムスクランブル符号を用いて行なわれ得る。前記疑似ランダムスクランブル符号は、ゴールド符号系列であり得る。前記疑似ランダムスクランブル符号は、ｍ系列であり得る。
【００３７】
前記方法は、記録したイオン電流をフィルタリングする工程をさらに含み得る。前記フィルタリングは、バンドパスフィルタを用いて行なわれ得る。
【００３８】
前記方法は、試料表面の追跡のため、前記マイクロピペットの動作を制御するための表面高さの分析結果データをフィードバックする工程をさらに含み得る。
【００３９】
表面追跡信号は、短相関器を用いて得られ得る。
【００４０】
前記スペクトル拡散変調は、少なくとも表面追跡のための第１拡散符号と撮像のための第２拡散符号とを用いて行なわれ得る。前記第２拡散符号は、前記第１拡散符号よりも長い符号であり得る。
【００４１】
前記復号は、長相関器を用いて得られ得る。
【００４２】
前記方法は、マイクロピペットの動きによる画像ぶれを減少させるために逆畳み込みアルゴリズムを実行する工程をさらに含み得る。
【００４３】
前記決定は、試料表面を下底とし、マイクロピペット開口を上底とする円錐台によって、復調されたイオン電流の逆畳み込みを行なう工程を含み得る。
【００４４】
前記方法は、走査型電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）の第３電極からデータを収集する工程をさらに含み得る。
【００４５】
前記方法は、第１電極との直流電流（ＤＣ）オフセット電圧を前記第３電極に印加する工程をさらに含み得る。
【００４６】
第１圧電アクチュエータが、マイクロピペットのＺ軸方向の動作を比較的細かく制御するために用いられ得る。第２圧電アクチュエータが、試料ステージのＺ軸方向の動作を比較的大まかに制御するために用いられ得る。
【００４７】
前記マイクロピペットの動作は、ホッピングモードのパターンに従い得る。
【００４８】
前記マイクロピペットの動作は、交流電流（ＡＣ）モードのパターンに従い得る。
【００４９】
前記ＡＣモードのパターンは、マイクロピペットと第１電極と前記マイクロピペットのＺ軸方向の動作を制御する第１圧電アクチュエータとを組立てたものの共振周波数より大きい変調周波数を有し得る。
【００５０】
第２の態様によれば、ＡＣモードの走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法（ＳＩＣＭ）を用いて、電解液に浸された試料の表面を調べる方法が提供され、その方法は、第１電極とマイクロピペットの外部にあり電解液に浸された第２電極との間の電解液にイオン電流を誘導するために、 第１圧電アクチュエータとマイクロピペットと第１電極とを組立ものの共振周波数より大きい変調周波数の交流電流（ＡＣ）を用いて、試料を支持するステージに対して電解液に浸された第１電極の部分を含むマイクロピペットの高さを変えるよう前記第１圧電アクチュエータを制御する工程と、試料ステージに対してマイクロピペットが動くように制御する間のイオン電流を記録する工程と、記録されたイオン電流と較正データから、試料の表面高さの分析結果を決定する工程と、を含む。前記動作は、ＡＣの高さ変化に垂直である成分を有する。
【００５１】
前記ＡＣ変調周波数は、少なくとも前記共振周波数の２０倍であり得る。
【００５２】
前記ＡＣ変調周波数は、約６０ｋＨｚであり得る。
【００５３】
前記記録に先行して、前記ＡＣモードの動作は、前記ＡＣ変調周波数よりも低い初期のＡＣ周波数に設定され得、初期のＡＣ周波数は、ランプ関数に従い所定の期間にわたって、だんだん前記ＡＣ変調周波数まで上昇される。
【００５４】
前記ランプ関数は、前記組立てたものの共振の複素包絡線の逆であり得る。
【００５５】
前記所定の期間は、約３ｍｓであり得る。
【００５６】
前記方法は、記録されたイオン電流の複素包絡線の大きさにより復調された信号に従い、前記試料ステージのＺ軸方向の動作を制御するために、第２圧電アクチュエータを駆動する工程をさらに含み得る。
【００５７】
電圧補正が、前記試料ステージのＺ軸方向の動作を制御する第２圧電アクチュエータに適用され得る。前記電圧補正は、検出されたイオン電流に対して直線的に増加し得る。
【００５８】
前記増加の比例定数は、較正処理を介して、及び／又は、電解液に関連する所定の定数から決定され得る。
【００５９】
前記試料ステージのＺ軸方向の動作を制御する第２圧電アクチュエータの駆動信号の帯域幅は、第２圧電アクチュエータと、マイクロピペット、試料ステージ、試料容器、電解質、試料を組み立てたものとの共振周波数よりも狭い幅であり得る。
【００６０】
前記方法は、スペクトル拡散変調信号を用いて、前記第１電極と前記第２電極との間の電位を制御する工程をさらに含み得る。前記決定は、記録したイオン電流を復調する工程を含み得る。
【００６１】
前記スペクトル拡散変調は、複数の信号を、時間または周波数領域で多重化する工程を含み得る。
【００６２】
前記スペクトル拡散変調は、二位相偏移変調（ＢＰＳＫ）により実行され得る。前記スペクトル拡散変調は、四位相偏移変調（ＱＰＳＫ）により実行され得る。前記スペクトル拡散変調は、ｎ直角位相振幅変調（ｎ-ＱＡＭ）により実行され得る。前記スペクトル拡散変調は、 周波数変調（ＦＭ）により実行され得る。前記スペクトル拡散変調は、振幅変調（ＡＭ）により実行され得る。
【００６３】
前記スペクトル拡散変調は、所定の搬送周波数で行なわれ得る。前記搬送周波数は、１００Ｈｚより大きい周波数であり得る。
【００６４】
前記スペクトル拡散変調は、直交拡散符号を用いて行なわれ得る。前記直交拡散符号は、ウォルシュ符号であり得る。前記直交拡散符号は、直交可変拡散率（ＯＶＳＦ）符号であり得る。
【００６５】
前記スペクトル拡散変調は、２つの異なる拡散符号を用いて行なわれ得る。前記スペクトル拡散変調は、３つの異なる拡散符号を用いて行なわれ得る。
【００６６】
前記スペクトル拡散変調は、疑似ランダムスクランブル符号を用いて行なわれ得る。前記疑似ランダムスクランブル符号は、ゴールド符号系列であり得る。前記疑似ランダムスクランブル符号は、ｍ系列であり得る。
【００６７】
前記方法は、記録したイオン電流をフィルタリングする工程をさらに含み得、任意で、バンドパスフィルタを用いて行なわれ得る。
【００６８】
前記方法は、試料表面の追跡のため、前記マイクロピペットの動作を制御するための表面高さの分析結果データをフィードバックする工程をさらに含み得る。
【００６９】
表面追跡信号は、短相関器を用いて得られ得る。
【００７０】
前記スペクトル拡散変調は、少なくとも表面追跡のための第１拡散符号と撮像のための第２拡散符号とを用いて行なわれ得、前記第２符号は前記第１符号より長い。
【００７１】
前記復号は、長相関器を用いて得られ得る。
【００７２】
前記方法は、マイクロピペットの動きによる画像ぶれを減少させるために逆畳み込みアルゴリズムを実行する工程をさらに含み得る。
【００７３】
前記決定は、試料表面を下底とし、マイクロピペット開口を上底とする円錐台によって、復調されたイオン電流の逆畳み込みを行なう工程を含み得る。
【００７４】
前記方法は、走査型電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）の第３電極からデータを収集する工程をさらに含み得る。
【００７５】
前記方法は、第１電極との直流電流（ＤＣ）オフセット電圧を前記第３電極に印加する工程をさらに含み得る。
【００７６】
第１圧電アクチュエータが、マイクロピペットのＺ軸方向の動作を比較的細かく制御するために用いられ得る。第２圧電アクチュエータが、試料ステージのＺ軸方向の動作を比較的大まかに制御するために用いられ得る。
【００７７】
前記較正データは、イオン電流が記録されるＸＹ位置それぞれの合成接近曲線を含み得る。前記合成接近曲線は、トレーニングシーケンス中で測定される複数の較正接近曲線から決定され得る。
【００７８】
前記合成接近曲線は、前記複数の較正曲線の各ＸＹ位置からのＸＹ位置の直線距離によって重み付けされた前記複数の較正曲線の線形結合であり得る。
【００７９】
前記複数の較正曲線は、試料ステージに対してマイクロピペットが動くように制御する間にイオン電流を記録する前記ステップに先行して、及び／又は、前記ステップ中に、及び／又は、前記ステップ後に、収集され得る。
【００８０】
以下に、添付の図面を参照し、実施例として、本発明の態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、ＳＩＣＭシステムの一例を示す図である。
【図２】図２は、ラスター走査のホッピングモードを示す図である。
【図３】図３は、拡散システム、スクランブルシステム、及び、変調システムを示す概略図である。
【図４】図４は、復調器の一例を示す概略図である。
【図５】図５は、追跡モードを示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、接近曲線の一例を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、接近曲線の一例を示す図である。
【図７】図７は、ＳＥＣＭとＳＩＣＭとの統合システムの一例を示す図である。
【図８】図８は、ラスター走査のＡＣモードを示す図である。
【図９】図９は、ＡＣモードでの反応を示す図である。
【図１０Ａ】１０Ａは、ＡＣモードでの反応を示す図である。
【図１０Ｂ】１０Ｂは、ＡＣモードでの反応を示す図である。
【００８２】
以下の説明は、あらゆる当業者がシステムを製造、使用できるよう提示され、特定の応用の態様で示される。開示の実施形態に対する様々な変更が当業者に対して簡潔に明示されるであろう。
【００８３】
本明細書で定義される一般原理は、本発明の精神と範囲から逸脱することのない範囲で、他の実施例や応用に利用しても良い。よって、本発明は、下記の実施形態に限定されるものではなく、本明細書に開示される原理や特性と矛盾しない、最も広い範囲が認められる。
【００８４】
「調べる」（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）という用語は、例えば、単一の位置における表面上または表面における構造的変化、または、プローブが表面を走査する際の表面上または表面における構造的変化を検出するために、構造体の表面における変化を監視する能力、もしくは、構造体の高さを測定する能力のことを指すための用語である。ある状況において、その表面が柔軟で、例えば、細胞の下の細胞骨格など、その表面下の構造体の撮像が可能であるかもしれない。この撮像は、「調べる」という用語に含まれる。この用語は、構造的変化の検出に限定されることはなく、例えば、電気生理学的または化学的変化の監視も「調べる」という用語に含まれる。
【００８５】
本明細書で用いられる「画素」（ｐｉｘｅｌ）という用語は、特定の位置の測定及び加工されたデータポイントを示す。一回の走査における画素数は、システムのユーザが選択することができる。
【００８６】
図１に例示されるＳＩＣＭシステム１００は、走査ヘッド１０１、制御部１０２、及び、ＰＣ１０３を備える。走査ヘッドは、弱いイオン電流を増幅し、ピペット１０８と試料容器（例えば、ペトリ皿）１１１の両方を動かすための電子機器及びモータを備えることが好ましい。走査ヘッドは、圧電アクチュエータ及びモータ１０４を備えることができる。ピエゾアクチュエータは、１ｎｍ以上の動き分解能、及び、典型的には、１００μｍの移動範囲で、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸上で動作しても良い。モータ（例えば、直流電流（ＤＣ）モータ）を、粗位置決め装置として用いることができ、１μｍのオーダの精度、及び、２０ｍｍのオーダの移動範囲で、ピペット１０８と試料容器１１１との両方が位置決めされる。
【００８７】
走査ヘッド１０１は、例えば、信号を増幅しフィルタリングする増幅器およびフィルタなどの入出力（ＩＯ）電子機器１０５を備える。
【００８８】
ピペット１０８は、ピペット先端のＸ、Ｙ、Ｚ位置をピエゾステージ及び粗モータステージ１０４の両方により制御できるやり方で、走査ヘッドに取り付けることができる。好適な実施形態では、ピエゾステージと粗モータステージは、試料容器１１１及びピペット１０８の位置を測定するサーボシステムをさらに備える。ピペットと試料容器の位置を正確に把握することを確実にするために、サーボで測定された位置及び実際に指示された位置をフィードバックシステムで用いることができる。ピペットは、電解液１０９で満たされ、ＩＯステージ１０５に接続された電極１０６を備える。
【００８９】
試料容器１１１内に、測定対象である試料１１３、第２電極１１０、及び、電解質液１１２がある。試料容器は、試料容器及び試料を細かく動かすことも大まかに動かすこともできるピエゾアクチュエータとモータとを備えるＸＹＺステージ１１８の上に配置することができる。ＸＹＺ試料ステージ１１８は、走査ヘッド１０１を介して制御部１０２から送られる信号１１９により制御される。
【００９０】
ピエゾステージ及びモータステージは、試料上、もしくは、試料ステージ内に配置される単一のステージとして統合され得る。
【００９１】
制御部は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）及び中央処理装置（ＣＰＵ）１１４、及び、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）及びデジタルアナログ変換器（ＤＡＣ）１１５を備え得る。デジタル信号処理部（ＤＳＰｓ）をさらに備えても良い。処理の一部又は全部をＰＣ１０３で行なっても良い。制御部の目的は、定義されたやり方で走査ヘッドの動作を容易にするためには、どの信号を走査ヘッド１０１に送るべきか計算することである。ＦＰＧＡ及びＣＰＵは、走査ヘッドを制御するタスクを分割することができる。典型的には、ＦＰＧＡは、スピードが重視されるタスクを、ＣＰＵは、大規模な数値を扱うタスクを行なう。走査ヘッド及び制御部１１６は多数の配線で接続される。これらの配線は、イオン電流を制御、検出し、ピエゾステージ及びモータステージを動かすためのデジタル信号またはアナログ信号を搬送する。例えば、ピエゾアクチュエータは、アナログ信号で、粗モータは、デジタル信号で、制御することができる。
【００９２】
イオン電流は、制御部内で発生する電圧により起すことができ、ＩＯ部１０５及びピペット内の電極１０６に送られ、電極１１０を介して、ＩＯ部１０５に戻る、試料電解質１１２を介するイオン電流を誘発する。もしくは、イオン電流の発生及びイオン電流の検出は、走査ヘッド１０１またはＰＣ１０３で行われ得る。
【００９３】
図２は、ラスター走査のホッピングモードを示す。ホッピングモードでは、ピペット２０８が試料２１３から離れた位置にあるスタート位置２０１から動き始める。走査ヘッドを介して制御部が、ピペット及び試料容器内の電解質を介して流れるイオン電流を監視する。走査開始時に、制御された降下速度で、試料の表面へのピペットの接近２０２がある。降下は、例えば、個別の小さいステップで構成することができる。もしくは、線形の下降とすることもできる。ピペットが試料表面２０３に接近すると、イオン電流は減少し始める。電流が、あらかじめ定義された量だけ減少すると、制御部は、接近を停止する。Ｘ、Ｙ、Ｚ軸上のピペットの位置が記録され、安全な高さ２０１までピペットの引き戻し２０４が行なわれる。
【００９４】
ＳＩＣＭシステムの実施形態を実施する場合に、下記のように、設計に追加の安全装置を含むことができる。安全な高さ２０１において、ＸＹステージは、走査の開始位置として、もしくは、現在行なわれている走査の次のポイントとして、新しいＸＹ位置に移動しても良い。ＸＹステージが動くことにより、その推進力が、ピペット及びピペットに取り付けられた動作ステージに、もしくは、試料容器及びその試料容器に取り付けられた動作ステージに与えられる。そのＸＹ位置に達すると、移動が止まり、その移動質量の推進力が発振を誘発する。この発振が、走査される試料にノイズを発生させる。結果、ピペットまたは試料容器の共振または振動を減衰させるため、短い一時停止または遅延を走査先頭位置２０１で含ませても良い。一時停止の長さは、数ｍｓのオーダであり、ピペットの動作システムまたは試料容器の動作システムの質量に依存する。ピペットの動作システムは、（求められる動きに従って、Ｘ及び／又はＹ及び／又Ｚ軸上で）ピペットを動かすために必要な要素を全て含み、試料容器の動作システムは、試料容器と試料容器２１１を動かすために必要な動作ステージとを含む。
【００９５】
試料への下降、つまり、接近２０２は、ある制御された速度で行なうことができる。速い接近速度が指示される場合、ピペット先端が破損したり、ピペットの動作システムで過剰な動作量が発生したりする恐れがある。しかしながら、接近速度が遅いほど、走査を完了させるのに時間がかかってしまう。接近速度は、ピペットの特性、電解液２０９、２１２の特性に基づく実験により選択することができる。表面２０３へ到達した時、ピペット及び試料容器の機械的な構成要素の発振を減衰させるため、また、動作によって誘発されたイオン電流の変動を安定させるために、一時停止または遅延を追加することができる。
【００９６】
表面への接近は何度も行なうことができ、イオン電流の平均またはイオン電流の最終的な値のどちらかをとる。前もって定義されたイオン電流の減少を正確に予測しながら、遅延を最短に抑え、表面に到達することが目的である。
【００９７】
表面２０３の位置が特定された後、ピペットの引き戻し２０４が行なわれる。引き戻しの速度は、接近の速度より速くできる。２回目以降の接近が行なわれる前に、ピペットを安全な高さ２０１に引き戻すことができる。
【００９８】
最初の行のラスター走査は、高い安全な高さ２０１で行なわれるが、以降の行の走査では、試料の特性の高さについて取得された知識に基づいて選択された初回よりも低い安全な高さを用いることができる。この方法で、ピペットの移動距離が減少するので、合計走査時間を減らすことができる。
【００９９】
要約すると、ラスター走査のホッピングモードの典型的な動作は、遅延や一時停止を招き、試料の合計走査時間が延びる。
【０１００】
拡散システム、スクランブルシステム、及び、変調システムの一例が図３に示される。ピペット及び試料容器の電解液を通るイオン電流を発生させるために、通常のＤＣに代わって、スペクトル拡散変調電流が用いられる。
【０１０１】
スペクトル拡散変調方式は、拡散機能３０２、スクランブル機能３０３、フィルタリング及び変調機能３０４を含む。以下、これら要素の組み合わせを、変調システム３０６と呼ぶ。変調システムにより、時間領域で多重化された多重信号を生成する方法が提供される。もしくは、多重化は、周波数領域で行なわれ得る。周波数領域では、多重化されているが独立した周波数信号を用いることができ、時間領域では、時間多重化信号を用いることができる。
【０１０２】
変調システム３０６への入力３０１は、少なくとも対応する符号数を伴うＤＣオフセットである。ＤＣオフセットは、変調システムの出力３０５に現れる特定の符号チャネルに印加されるＤＣレベルを定義し、符号数は、特定の入力に適用される拡散符号の数を定義する。
【０１０３】
拡散符号は、ウォルシュ符号や直交可変拡散率符号などの直交２進符号の集合から生成することができる。選択された特定の符号及びその符号の長さが符号数によって定義される。制御部は、異なるチャネルにどの符号を用いるか選択することに関与する。
【０１０４】
ＳＩＣＭの単独使用では、２つの符号を用いることができ、ＳＩＣＭとＳＥＣＭとの併用には、３つ以上の符号が用いられる。その他の例では、ＳＩＣＭが単独で用いられる場合にも、ＳＩＣＭとＳＥＣＭとが併用される場合にも、単一の符号が用いられ得る。
【０１０５】
ＳＩＣＭの単独使用には、短符号を、長符号と共に選択することができる。これら符号の長さは、例えば、短符号を１２８シンボルとし、長符号を１０２４シンボル以上とし、制御部により選択することができる。異なる条件と走査速度では、異なる長さの符号を選ぶ必要がある。短符号は試料表面上のピペットの高さを追跡するために用いることができ、長符号は、表面の詳細を撮像するのに用いられる。
【０１０６】
スクランブル符号は、拡散システムから送られてくるデータ符号をスクランブルするのに用いられる。スクランブル符号は、ゴールド符号系列やｍ系列などの疑似ランダム系列であり得る。スクランブル符号は、拡散符号の構成を無作為化すること、及び、周波数領域における合成信号を規則化することが目的である。
【０１０７】
フィルタリング及び変調ステージ３０４は、拡散及びスクランブル化したデータ符号を受信する。フィルタリングは、変調後に行なっても良い。変調方式には、多くの選択肢があり、例えば、二位相偏移変調（ＢＰＳＫ）、四位相偏移変調（ＱＰＳＫ）、ｎ直角位相振幅変調（ｎ-ＱＡＭ、ここで、「ｎ」は、例えば、４、８、１６、６４など、変調の次数を特定する偶数の整数である）、周波数変調（ＦＭ）、振幅変調（ＡＭ）などを用いる。拡散システム及びスクランブルシステムからの入力は、信号の位相を変調するための極性信号である。拡散符号及びＤＣレベルは、極性信号の振幅に影響し、したがって、変調器から送られてくる位相成分の大きさに影響する。
【０１０８】
ＩＱ変調器は、公称搬送周波数上の信号を生成するために用いることができる。搬送周波数を加える利点は、ノイズや干渉が多いと予測される（例えば、ＤＣ〜１００Ｈｚの）周波数から変調信号を遠ざけるために搬送周波数を利用できることである。
【０１０９】
変調の後でフィルタリングを行なっても良い。フィルタは、信号の不要な高次成分を取り除くローパスフィルタであっても良い。もしくは、低次周波数や、高次と低次周波数との両方をそれぞれ取り除くハイパスフィルタやバンドフィルタであっても良い。フィルタは、バターワースやチェビシェフといったフィルタ特性を持つＦＩＲデジタルフィルタやＩＩＲデジタルフィルタを用いてＦＰＧＡに実装することができる。
【０１１０】
変調システムの出力３０５において、信号が生成され、ピペットの電極に印加される。信号は、電解液を介するイオン電流を誘発し、そのイオン電流はＩＯシステムを介して制御部で監視される。
【０１１１】
復調器４０６が図４に例示される。復調器４０６は、多数のブロック：フィルタリング機能４０２、取得及びスクランブル解析機能４０３、相関器及び逆拡散機能４０４を備える。その他の例として、ブロックの順番を入れ替えたり、ブロック同士を組み合わせたり、さらには、１つ以上のブロックを取り除いても良い。復調器４０６は、ＦＰＧＡ、ＣＰＵ、ＤＳＰ、または、ＰＣに実装することができる。
【０１１２】
入力信号４０１は１つ以上の電極から復調器に届く。入力信号は、フィルタリングサブシステム４０２でフィルタリングされ、不要なノイズや干渉が除去される。フィルタは、例えば、高周波のノイズや干渉だけでなく、（例えば、ＤＣ〜１００Ｈｚの）低周波のノイズや干渉を除去することができるバンドパスフィルタであり得る。遮断周波数や除去割合は、システムの動作を最適化するために選択することができるが、変調システムが搬送波信号を使用するかどうかによって異なって良い。フィルタは、デジタルフィルタによって、もしくは、スイッチドキャパシタフィルタ、能動フィルタ、または、多数の異なるタイプの受動フィルタなど、他の技術を用いて実現することができる。
【０１１３】
フィルタリングされた信号は取得及びスクランブル解析機能４０３に送られる。取得システムは、他のスペクトル拡散システムで用いられる検索と同様のやり方で、受信した信号を取得し、同期化する。スクランブル解析システムは、受信した信号からスクランブル符号を取り除く。これら機能は、例えば、ＦＰＧＡで実装される。
【０１１４】
スクランブル解析機能４０３からの出力は、相関器及び逆拡散ブロック４０４に送られる。このブロックへのその他の入力は、変調器サブシステムのＤＣレベル及び符号と同様のＤＣレベル及び符号数４０７である。ＳＩＣＭだけのシステムには、２つの符号のみが存在し、ＤＣレベルは存在しない。ＳＩＣＭ／ＳＥＣＭの統合システムには、３つ以上の符号及び異なるいくつかのＤＣレベルが存在する。いずれのＤＣレベルも、相関器／逆拡散ブロックに送られる前に取り除くことができる。適切な符号が相関器／逆拡散ブロックに適用されて、符号は個別に合成受信信号から抽出することができる。変調システムで直交符号を用いた結果、相関器／逆拡散部のそれぞれから抽出された信号は完全に分離しているはずである。符号ごとに単一の相関器／逆拡散部を用いることができる。もしくは、符号領域信号の多重化遅延バージョンを保存するためにレイク（Ｒａｋｅ）受信機を用いることができる。相関器／逆拡散部４０４は、ＦＰＧＡで実装することができる。
【０１１５】
復調器から抽出される複数の信号４０５を、制御部のＣＰＵに送ることができる。これら信号に基づき、制御部は、接近、引き戻し、信号抽出、試料からの撮像を行なうことができる。
【０１１６】
ＳＩＣＭシステムの一例において、その構造は、制御部１０２のＦＰＧＡ１１４の変調システム及び復調システムを伴う図１と同様である。
【０１１７】
この例では、単一の電極１１０があるが、別の例では、追跡符号と撮像符号とを分割する追加の電極を備えても良い。
【０１１８】
ラスター走査のホッピングモードと同様のやり方で、ピペットが試料１１３の表面に接近する。変調器サブシステムは、例えば、長さ１２８シンボルの追跡符号と、例えば、長さ１０２４シンボルの撮像符号との、２つの符号を用いる。符号は、直交可変拡散率（ＯＶＳＦ）符号などの可変長直交符号の集合から選択することができる。
【０１１９】
復調器は、構造に応じて、単一の電極１１０または２つの電極１１０のいずれかに取り付けられる。電極が単一の場合、復調器は、同一の信号から２つの符号を抽出する。電極が２つの構造では、２つの復調器を用いることができる。電極ごとに１つの復調器だが、復調器同士は同期している。
【０１２０】
相関器／逆拡散部は、符号の長さに正比例して、拡散信号の帯域幅を狭める。この逆拡散は、信号の有効帯域幅を狭め、従って、ＳＮ比を改善する。１２８シンボル、つまり、対数的に表現するところの２１ｄＢ、の追跡符号には、ＳＮ比（ＳＮＲ）を１２８倍改良する。より長い走査符号は、１０２４倍、すなわち３０ｄＢ倍、ＳＮ比を改良する。より長い符号とより短い符号を含む他の例は、実験に基づく実施で示されるＳＮＲに基づき、想定することができる。
【０１２１】
より短い追跡符号は、相関器で逆拡散された場合、より長い符号より、イオン電流のより速い反応を起こすが、より短い符号から得られる処理利得が低いため、ノイズフロアが増加する原因になる。
【０１２２】
イオン電流の変化を検出する機構は、接近曲線を参照した場合のイオン電流の直接変化、もしくは、接近曲線を参照した場合の差動電流の変化のいずれかに基づくことができる。
【０１２３】
制御部は、ピペット１０８または試料ステージ１１８のＺ高さの調節のために、復調器の相関器から得られる逆拡散信号を使用する。ピペットの質量の方が少ないので、ピペットは、微調整のために移動してもよく、試料ステージは、大幅な調節のために移動しても良い。
【０１２４】
追跡符号から検出されたイオン電流の出力の一例が図５の５０１に示され、比較するために、試料５１３の表面も共に示されている。１行のラスター走査が行なわれてＸＹ方向で移行する際も、ピペット５０８はＺ方向で継続的に移行することができる。もしくは、逆拡散追跡符号からの多数の試料に基づき、Ｚ方向で段階的に移行することができる。
【０１２５】
この方法でＺ軸の動きを制御するために追跡符号を用いることの利点は、ラスター走査のホッピングモードと比較した場合、不連続な方向変化を避け、その結果、効果を高めるために導入されていた遅延／一時停止が不要になることである。試料の表面上の安全な高さをスムーズに追跡することにより、不連続な飛び跳ねを避け、その結果、ピペット動作ステージ、及び／又は、試料動作ステージの振動や発振が避けられる。これにより、システムのノイズが大幅に削減され、システムの走査時間が速くなる。
【０１２６】
試料上のピペットの位置を管理するための追跡符号と共に、ピペットの下の画像を生成するために撮像符号を用いることができる。撮像符号は、より長い符号であり、より多くの試料をとって相関されるが、ＳＮＲを改善し、従って、ピペットの下の試料の高さの予測を改善する。
【０１２７】
撮像手順の最後の段階は、試料の下層の表面形状の正確な反応を得るための撮像信号の逆畳み込みである。撮像処理は、シンボルごとに少なくとも一度撮られる試料を用いる離散時間システムである。ピペットがＸＹ平面で動く速度は、（例えば、＋／-１０ｎｍのウィンドウ内の）あるＸＹ位置で、撮像符号の有限数の試料があることを意味する。ピペットが横方向に（及びそれよりは小さい程度で垂直方向に）移動すると、合成検出画像は、実際の画像の形状とピペットの下の電流収集包絡線の形状との畳み込みである。典型的には、電流収集包絡線の断面は、台形であり、台形の平行する辺の短い方がピペットの先端開口の直径であり、平行する辺の長い方が試料表面の近くにある。電流収集包絡線の完全な３次元（３Ｄ）形状は、その台形をピペットのＺ軸を中心に１８０度回転させたものであり、つまり、円錐台である（３Ｄ電流収集包絡線の正確な構造は、実験的測定と較正により定義することができる。）
【０１２８】
３Ｄ電流収集包絡線の形状を想定することにより、試料の下層画像を予測するために逆畳み込みアルゴリズムを用いることができる。３Ｄ電流収集包絡線の先行知識を用いるもの、用いないもの（ブラインド２Ｄ逆畳み込み）のいずれかで、画像の２Ｄ逆畳み込みには多くの方法がある。例えば、ウィナーフィルタや線形予測符号化などを含む様々なアルゴリズムが用いられ得る。２Ｄ逆畳み込みは、制御部のＦＰＧＡ１１４内で実現することができる。
【０１２９】
接近曲線の一例が図６Ａに示される。Ｘ軸は、ある任意の参照ポイントから数ミクロン内のピペットの位置を定義する。Ｙ軸は、ピペットを通るｎＡ内のイオン電流を示す。ピペットが試料に接近すると、イオン電流は下がり始める。試料の表面は、開始ポイントから４８０ｎｍの範囲内のある箇所、つまり、電流が急激にゼロまで落ちる箇所にあることが、図６Ａで確認できる。
【０１３０】
図６Ｂは、追跡符号相関器の出力において見られ得るような１２８つの平均化要素を伴う同一の接近曲線を示す。図６Ｂでは、接近開始時に電流が０に標準化され、最後の１２８つの試料は、終了時に、平均化するためには不十分なデータしかないので、省略される。図６Ｂから明確になることは、図６Ａで見られる接近曲線のノイズが減少しているということである。
【０１３１】
図６Ｂのものと同様の接近曲線を、復調器から得られる表面の検出の基準として用いることができる。走査が行われる前に、試料周辺の領域で接近曲線を多数収集することができ、特定のポイントの合成接近曲線を作成することができる。
【０１３２】
このような合成接近曲線は、曲線からの直線距離に基づき他のポイントからの接近曲線の線形結合により作成できる。以下が、試料の周辺の任意の数のポイントの合成接近曲線を作成する式である。
【０１３３】
【数１】
2017508161.tif 000003
（１）
【０１３４】
式（１）において、（ＸＹ座標の）Ｍ１は、接近曲線を計算する必要があるポイントであり、Ｐ１、Ｐ２、Ｐｎは、それらの接近曲線が分かっているポイントであり、Ｋ１、Ｋ２、Ｋｎは、接近曲線の値である。計量距離｜Ｍ１-Ｐ１｜は、ＸＹ平面上のポイントＭ１とＰ１との間のユークリッド距離の絶対数である。
【０１３５】
式（１）は、測定ポイント（Ｍ１）が特定の較正接近曲線（Ｐ１、Ｐ２など）からどれくらい離れているかに基づき、接近曲線の線形結合を行なうものである。測定ポイントが較正ポイントと同じ（つまり、Ｍ１＝Ｐ１）になる場合があるので、式の漸近線は注意して管理するべきである。こういった事例は、デジタルコンピュータにおけるゼロ除算の問題をさけるために、個別に取り扱うべきである。この場合、接近曲線は、単にＫ１となるべきである。全てのポイントが測定ポイントから等距離である（つまり、｜Ｍ１-Ｐ１｜＝｜Ｍ１-Ｐ２｜…＝｜Ｍ１-Ｐｎ｜である）場合、合成接近曲線は、全てのＫｎ較正曲線の平均となるべきである。
【０１３６】
その他の合成接近曲線を、例えば、測定ポイントと較正ポイントとの間の距離の２乗をとることで、構成することができる。実際には、曲線のスムーズな変化を得るように、較正曲線から接近曲線を抽出する適切な計量距離を用いることができる。
【０１３７】
走査の前に接近曲線を構成することに加えて、走査中も追加の接近曲線を構成すると有益である。これら追加の接近曲線のポイントは、現在の走査領域内の位置に基づく。構成される追加の接近曲線の数は、制御部によって調節される。追加の接近曲線のそれぞれが 合計走査時間を延ばすので、合計走査時間と撮像の解像度は相殺されてしまう。
【０１３８】
走査が完了すると、システムは、捜査中に構成されたものと同じポイントの接近曲線特性を予測することができる。これらの最終的なポイントを走査中にピペットで起こり得た磨耗を示すために用いることができる。表面トポロジを最も正確な予測するために、走査後の接近曲線を撮像符号に用いる。走査前の合成接近曲線のみを用いて画像を計算するか、もしくは、その後、走査後の接近曲線を加えて、修正した合成接近曲線を用いて画像を計算するかは、実行時に決定される。
【０１３９】
走査前の接近曲線、走査中の接近曲線、走査後の接近曲線を組み合わせる方法は多数ある。最も簡潔な方法は、遅延時間の重み付けを用いることであり、例えば、測定時間（ｔ１）と、同じポイントでの各接近曲線の時間（ｔ２）に基づき、特定の接近曲線を重み付けするために｜ｔ１-ｔ２｜に基づく要素を用いることができ、時間にもっとも近い較正接近曲線に、時間にもっとも遠い接近曲線より、大きい重みがつけられる。式の正確な形は変更することができるが、例えば、上記式（１）に非常に類似し得る。だが、計量距離として、距離ではなく時間差が用いられるものである。
【０１４０】
ＳＥＣＭとＳＩＣＭとを組み合わせた走査のためのシステムのアーキテクチャが、図１と同様であるが、追加の電極、例えば、７１２を伴う図７を参照し、定義される。この例では、ＳＩＣＭシステム用に２つの電極７０７、７０３、ＳＥＣＭシステム用に１つ以上の電極、例えば、７１２、７０３がある。それぞれの電極用の復調器システムがある。
【０１４１】
他の例で、同時に表面に接近可能な方法で接続される複数のピペット７０２があっても良い。１つのピペットをＳＩＣＭの表面形状を測定し、撮像するために割り当てることができ、１つ以上のピペットがＳＥＣＭの測定用に割り当てられる。ＳＥＣＭの電極内の電解質７０５に加えて、測定されている特定の電気化学的効果を促進させるために、ＳＥＣＭの１つ以上のピペットの内側または外側に追加でコーティングしても良い。示される例で、ピペット１つに１つの電極７１２があるが、他の例では、ピペットごとに複数の電極を用いても良い。用いられる各電極は、個別の復調器サブシステムに取り付けることができる。
【０１４２】
上記の通り、２つの符号をＳＩＣＭシステムに割り当てることができる。ＳＥＣＭシステム用には、１つ以上の符号を割り当てることができ、割り当ては、柔軟に行うことができる。いつくかの実験において、単体または複数の電極７１２と共に、ピペットごとに複数のＳＥＣＭ符号が必要になる場合がある。
【０１４３】
割り当てられる符号の全てを、上述のＯＶＳＦ符号などの可変長直交符号の同一の集合から選択することができる。ＳＥＣＭ符号の長さは、測定要件に基づいて選択することができる。より長い符号により、より正確な電流の予測ができるが、走査時間が延びる。一方、より短い符号は、高速の走査を可能にするが、システム内に導入されるノイズや干渉への耐性が減少する。符号の長さは、行われる実験に基づき選択することができるが、制御部が符号の割り当てを管理することにより、直交性が確実に維持される。
【０１４４】
符号数（長さ及び固有性）に加えて、追加の電気化学的効果を誘発するためにＤＣオフセットをＳＥＣＭシステムに印加することができる。ＤＣオフセットはピペット７０２ごとに印加することができる。各復調器は、各ピペットに印加されるＤＣオフセットの情報を有し、（例えば、取得システムでの測定値に基づきＤＣ成分の大きさを引くことにより）復調処理中にＤＣオフセットを補償することができる。他の例では、ＤＣオフセットを処理せず、以降の処理や評価のためにＤＣオフセットの大きさや変動を記録しても良い。
【０１４５】
一般的に、ＤＣオフセットは、システムに対する干渉として作用する。しかし、拡散及びスクランブル符号を用いる事により、符号長が十分であれば、ＤＣオフセットの影響を減衰させる効果がある。制御部は、ＤＣオフセットがシステムに与え得る効果を予測し、ＤＣオフセットの大きさを制限する、もしくは、ＰＣを介してユーザに、干渉がＳＥＣＭによる測定及び／又はＳＩＣＭによる撮像に障害を与えかねないことを通知することに関与することができる。
【０１４６】
要約すると、例えば、直交拡散符号をスクランブル符号と結合できるシステムが説明されている。これら符号は、ＳＩＣＭシステムまたはＳＩＣＭ／ＳＥＣＭシステムで、複数の電圧と電流とを相互作用を制限する方法で確立することができる。
【０１４７】
ＳＩＣＭシステムで複数の符号を用いることができる。（ピペットを試料上の比較的一定の高さで維持するよう調節するための）範囲追跡ループ用の符号と、ピペットを介し、（例えば、参照テーブルに保存された）接近曲線較正により、電流をもっと正確に測定できるより長い符号とを用いて、試料からの距離を予測し、従って、試料のトポロジを予測する。
【０１４８】
システム内で複数のピペットと複数の電極とを用いることができる。ピペット及び電極への符号の割り当ては、柔軟に行なわれ、調査中の特定の効果に依存する。このやり方で、お互いの干渉を制限しながら、ＳＩＣＭによる測定とＳＥＣＭによる測定とを両立させることができる。
【０１４９】
拡散符号およびスクランブル符号は、そもそも、ノイズにも干渉にも耐性がある。ＡＣ主信号、典型的には、５０〜６０Ｈｚの干渉が特に深刻である。システムは、この干渉を取り除くために、障害がある（例えば、ＤＣ〜１００Ｈｚの）周波数を直接フィルタリングするか、もしくは、逆拡散及びスクランブル解析の間接的な作用により減衰させる、符号内での干渉除去を行なうことができる。
【０１５０】
加えて、信号の変調が搬送周波数で行なわれる場合、（例えば、ＤＣ〜１００Ｈｚの）低周波数を避けるために、搬送の中心となる周波数及び帯域幅を明確に定義することができる。
【０１５１】
追跡符号を用いることにより、試料からの距離を測定し、それに従って、距離を調節しながらピペットが試料の輪郭をスムーズになぞることが可能になる。この表面追跡により、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸のいずれかで不連続にジャンプする必要性が減る。不連続性の減少により、ピペットと試料容器との双方における動作量が大幅に変化し、測定の間にシステムを安定させるために必要となる時間を減少させる。この結果、走査速度を速めることができ、よって、走査速度が２０倍を上回って改善される。
【０１５２】
単一の測定画素よりも大きい距離にわたり撮像する撮像符号により起こる可能性があるぶれは、（行ごとの）１Ｄモードまたは２Ｄモードでの逆畳み込み技術を用いて補償することができる。
【０１５３】
従来のラスター走査のホッピングモードのシステムは、２４分内に１２８×１２８画素（測定ポイント）での測定を行なう。これをベースラインとした場合、これに相当する、本明細書で定義される符号長例の、定義されたサンプリングレートの、走査時間、もしくは、異なる長さの符号の走査時間を計算することができる。
【０１５４】
１２８シンボルの追跡符号と１０２４シンボルの撮像符号を想定する。通常の操作時間は、典型的には、１６，３８４画素で１，４４０秒（最初の行で長くかかる可能性を考慮しなければ、画素ごとに平均で約８８ｍｓ）である。毎秒１００，０００サンプル（１００ｋｓａｍｐｓ／ｓ）と想定した場合、画素間に約８，７８９個のサンプルが存在する。画素間に少なくとも４つの追跡符号長（つまり、画素間に５１２個のサンプル）が必要であると想定した場合、合計走査時間を１７倍速く、２４分から８４秒にまで短縮するよう走査速度を上げることができる。
【０１５５】
もしくは、サンプリング回数を毎秒４００，０００サンプル（４００ｋｓａｍｐｓ／ｓ）に増加し、画素間の追跡符号長の数を同じに保った場合、走査時間は、６９倍速くなり、合計走査時間は、２４分から２１秒にまで短縮される。
【０１５６】
どちらの場合においても、想定された長さ１０２４シンボルの撮像符号により、撮像符号が２つの画素に重複し、従って、元の画像を回復するための逆畳み込みが必要となる。撮像符号は、画素の重複を防ぐために追跡符号の４倍(５１２シンボルに相当する)にまで減少され得るが、これは、ノイズの減少を相殺する。
【０１５７】
本明細書では、ＳＩＣＭを用いて表面を調べる方法の一例が提供され、その方法には、以下のステップが含まれる。
（ａ）制御部が、例えば、直交拡散符号、及び／又は、疑似ランダムスクランブル符号の使用に基づくスペクトル拡散変調方式を用いて変調されるイオン電流を発生させる
（ｂ）制御部は、試料の表面の近くまで移動し、イオン電流を記録する
（ｃ）制御部は、試料範囲内のイオン電流の狭帯域表示を生成するために、複数の相関器の内の１つを用いて、記録したイオン電流のフィルタリング、逆拡散及びスクランブル解析を行なう
（ｄ）制御部は、イオン電流から直接、もしくは、イオン電流の差（試料の現在のイオン電流サンプルから直前の位置における試料の直前のイオン電流サンプルを引いたもの）から、トレーニング期間中に発生する試料の接近曲線の保存されたバージョンに基づき、表面からのマイクロピペットの距離を推定する
（ｅ）短相関器が、表面追跡信号を提供するために、表面からの位置を生成するために用いられる
（ｆ）表面追跡信号は、表面からのマイクロピペットの高さを、予期せぬ特性を避けるために十分高くするようにしながら、正確な高さ情報を収集するために十分な電流変動を発生させるため十分低くするよう継続的に調節するために用いることができる
（ｇ）第２相関器である長相関器は、記録されたイオン電流の逆拡散およびスクランブル解析を行なうために用いることができる（長相関器は、さらに、長相関器から利用できるより大きい処理利得により、イオン電流信号のあらゆるノイズを減少することができる）
（ｈ）接近曲線は、測定されたイオン電流を試料の表面からの高さの予測値に変換するために再度用いられる。
【０１５８】
イオン電流を収集する間に、マイクロピペットの動きにより起こる画像ぶれの一部を除去するために、制御部で逆畳み込みアルゴリズムを用いることができる。
【０１５９】
複数のイオン電流の流れを同時に収集できるように、以下のステップにより、複数の直交拡散符号をシステム内で割り当てることができる。
（ａ）ＳＩＣＭトポロジ撮像システムは、表面追跡に適した長さの直交拡散符号が割り当てられる
（ｂ）ＳＩＣＭトポロジ撮像システムは、表面の３Ｄ撮像に適した長さの直交拡散符号が割り当てられる
（ｃ）ＳＥＣＭ測定システムは、ＳＥＣＭシステムのイオン電流検出に適した長さの直交拡散符号が割り当てられる
（ｄ）制御部は、異なる複数のスペクトル拡散変調電流信号を生成し、収集する（信号の信号経路は同一である必要はないが、配置を簡潔にするために、全ての信号が同一のマイクロピペットを使用し得る）
（ｅ）試料容器内の電解質に浸された追加の電極を用いることができる（例えば、ＳＩＣＭ電極とＳＥＣＭ電極とは異なっても良く、続いて、２つの異なる入力コネクタを介して制御部へイオン電流が流れる）
（ｆ）２つの異なるＳＩＣＭ直交符号は、試料容器内の電解質に浸された異なる電極を介し、収集されても良い
（ｇ）適切な長さの追加直交拡散符号を、イオン電流の独立した測定が求められるＳＩＣＭ、ＳＥＣＭ、その他の応用において、追加のイオン電流の流れを収集するために用いることができる。
【０１６０】
ＳＩＣＭシステムがＡＣモードで作動する場合のための更なる改善もなされている。
【０１６１】
本明細書では、ＳＩＣＭを用いて表面を調べる方法が記載され、その方法には、以下のステップが含まれる。
（ａ）制御部は、表面上でピペットの位置を変化させるＡＣのＺ方向ピペット変調用電流を発生させ、変調信号の周波数は、ピペットとピエゾフレクシャステージとの自然共振周波数を超える
（ｂ）制御部は、Ｚ軸上でピペットを試料の表面の近くに移動させ、検出されたイオン電流を記録する
（ｃ）制御部は、ロックイン増幅器を実装し、検出した電流のフィルタリングと増幅を行なう
（ｄ）制御部は、検出されたイオン電流を、試料からのピペットの位置をほぼ一定に保つように、試料ステージのＺ方向の位置を変調するために用いる。
【０１６２】
図８は、ラスター走査のＡＣモードを示す。ＡＣモードの一例では、ピペット８０８が試料８１３から離れた位置にある開始位置８０１から動き始める。ピペットのＺ軸上の位置８０２のＡＣ変調が、制御部により、Ｚ軸上のピペットアクチュエータに適用される。ピペットが試料の表面に接近すると、ピペットのＡＣ変調がイオン電流のＡＣ変調を誘発する。
【０１６３】
イオン電流は、走査ヘッドを介して制御部に流れ、そこで、アナログデジタル変換器によりデジタル化される。そして、そのデジタル信号が、ロックイン増幅器を実装するＦＰＧＡ／ＣＰＵに流され、そのロックイン増幅器において、ＡＣ信号の周波数が所望のＡＣ成分のフィルタリング及び増幅、及び、対象の帯域幅以外のあらゆるノイズの除去に用いられる。
【０１６４】
ＡＣ変調されたイオン電流は、そのＡＣイオン電流の大きさと位相とを検出する複素包絡線検出器に流される。イオン電流の複素包絡線の大きさは、試料の表面の存在を特定するために用いられ、正確性を向上させるために、任意で、接近曲線データが用いられる。
【０１６５】
ピペットが表面に接近すると、ピペットを試料から一定距離に保つためにＺ軸方向でピペットピエゾアクチュエータを駆動しているＡＣ変調電圧にＤＣレベルを加えることにより、試料からの平均距離を調節することができる。システムの走査時間の性能は、通常、Ｚ軸方向のピペットの変調周波数により制限される。先行技術において、これら変調周波数は、典型的には、Ｚ軸上のピペットアクチュエータの共振周波数を下回り、１〜２ｋＨｚの範囲である。
【０１６６】
表面を検出するためにＡＣモード変調を用いることに加えて、ピペットを表面のＸ軸方向に横移動させる特性のあるラスター走査モードにおいて、表面を走査することができ、適切な画素位置で測定を行なった後、Ｙ軸位置をインクリメントし、Ｘ軸走査を繰り返す。その次のＹ位置は、直前のＹ位置の真上であっても良い（つまり、Ｘ位置は同一のままである）。もしくは、他の例において、各行を、毎回、同じ開始Ｘ座標（例えば、Ｘ＝０）から走査し始めても良い。形状の主な特性を予測するために、走査の最初の行では、低速の走査が行なわれてもよく、最初の開始ポイントに基づき、試料の形状の分析結果の記録を更新しながら、より高速の走査が行なわれても良い。
【０１６７】
Ｚ軸のピペット及びアクチュエータのモデルを２次共振システムであるとし、そのピペットとアクチュエータとにＡＣモード変調を適用し、ピペットの振幅の変動を記録すると、図９に示される波形と同様の波形が観測される。システムは、一時的な始動の直後に、安定した状態の動作へ移行する。ピペットの振幅は、（サーボシステムで計測される）ボルトによって示される。図の時間軸は、共振周波数が１Ｈｚとなるよう標準化されている。実際のシステムにおいては、実際の共振周波数は、３ｋＨｚにより近い。
【０１６８】
本明細書において、ＡＣ変調の周波数は、Ｚ軸方向のピペット及びピエゾアクチュエータの共振周波数の周波数を上回ることができることが確認される。
【０１６９】
図１０Ａは、（例では、２０Ｈｚだが、実際には６０ｋＨｚにより近い）共振周波数の周波数の２０倍のＡＣ変調の周波数が適用されたことに対するシステムの反応を示す。図では、システムの共振周波数に関連する速度で、初期に過渡信号が発生するが、時間と共に、これら過渡信号は減衰し、安定状態の値になる。
【０１７０】
その後を示す図１０Ｂでは、Ｚ軸方向のピペットの振幅は、安定状態に近づき、（複素包絡線の）ピーク変調の振幅が一定になる。なお、この例においては、２次システムにより導入される減衰により約一千倍、Ｚ軸方向のピペットの変調の最大振幅は減少する。振幅のこの減少は、Ｚ軸方向動作のわずかな偏差のみが必要とされるため問題にはならない。
【０１７１】
高周波のＡＣ変調の振幅は、図１０Ａで見られる過渡信号がピペットを不必要に損傷させないよう、ゆっくり増加させることができる。傾斜の形状は、直線には限らず、段階的でも良く、例えば、Ｚ軸方向のピペットとピエゾアクチュエータとの共振の複素包絡線の逆である。図１０Ａを参照すると、傾斜は、時間＝０での低い値から始まり、８秒の範囲内のある時間に最大安定状態値まで上昇する。なお、図１０は標準化されており、実際の時間及び振幅値は、Ｚ軸方向のピペット及びピエゾアクチュエータの共振周波数とＡＣ変調信号の周波数との正確な値に依存する（約３ｋＨｚの共振により、傾斜継続時間は、例えば、約３ｍｓである）。
【０１７２】
測定されたＡＣ変調イオン電流は、ＦＰＧＡ／ＣＰＵに送られ、そこで、ロックイン増幅器がノイズと干渉を除去し、複素包絡線検出処理が行なわれ、それにより、イオン電流の振幅と位相とを抽出することができる。
【０１７３】
測定されたイオン電流の複素包絡線の大きさにより、接近曲線較正技術を組み合わせた場合、試料表面からのピペットの位置を正確に測定できるようになる。
【０１７４】
試料表面上の定義された位置でピペットを保持するために、試料とピペットとの間の距離を調節しなければならない。しかしながら、Ｚ軸方向のピペットの高さを追加で変動させることにより、２次システムが過度に駆動され、不安定になりかねない。従って、変調信号の平均値を変化させる方法に代わる方法が好ましい。
【０１７５】
ピペットと試料との間の距離を変えるため、イオン電流の複素包絡線の大きさを用いて、Ｚ軸の試料ステージピエゾアクチュエータへの駆動信号を変調することができる。よって、例えば、イオン電流がある設定ポイントを下回ったら、ピペットが試料に近づき過ぎているとみなし、試料から一定の既知の距離を維持するためにＺ軸の試料ステージピエゾアクチュエータへの電圧を（例えば、接近曲線較正技術に基づいて）調節する。同等に、イオン電流が増加すると、電圧が、ピペットと試料との距離を縮めるように、調節される。検出されるイオン電流と印加された電圧の補正との関係は、較正ステップを介して決定された、もしくは、特定の電解液それぞれに対して決定された、ある比例定数による線形であり得る。
【０１７６】
Ｚ軸方向のアクチュエータとピペットのシステムの発振モードを測定し、特徴づけることができ、このモデル分析に基づき、ＡＣ信号の平均の適切な変動だけではなく、正しいＡＣモードの電流を誘導する駆動信号を定義できる。安定性を維持する適切な駆動信号を固有ベクトル／固有値に関するシステム全体の分析により発生させることができる。分析及び合成段階は、制御部内のＦＰＧＡ／ＣＰＵで行なうことができる。
【０１７７】
この態様では、図５の５０１が、ピペットが表面に沿って移動するとＺ軸の試料ステージピエゾがとり得る、典型的な曲線であると考えることができる。Ｚ軸の試料ステージ信号の観測可能な特徴は、駆動信号の変動速度がＺ軸のピペット及びピエゾの変動速度より、非常に低いことであり、結果、Ｚ軸の試料ステージピエゾの駆動信号の帯域幅が、Ｚ軸の試料ステージアクチュエータの共振周波数より低いことである。
【０１７８】
多数の測定ポイント（画素）に基づき、ラスター走査が行なわれると想定する。一例において、３２×３２画素の領域での走査を検討する。（例えば、ＦＰＧＡ／ＣＰＵで実装される）ロックイン増幅器がノイズと干渉をフィルタリングにより除去し、イオン電流の安定したサンプルを提供することにより、（例えば、６０ｋＨｚの範囲内の）ＡＣモード変調周波数の速度でイオン電流のサンプルがとられると想定される場合、走査完了にかかる時間は、１７ｍｓの範囲内である。（段階的なラスター走査によるＸまたはＹの）固定平均、もしくは、（継続的に移動するラスター走査によるＸまたはＹの）移動平均のいずれかをとることができる。例えば、イオン電流の大きさの６つのサンプルをとり、平均化することができ、その場合、合計走査時間は、約１００ｍｓまで減少される。なお、各行の終了位置でピペットを上昇させ、次の行の開始位置に移すために、追加時間が必要となるが、この追加時間要素は小さく、パフォーマンス全体に大きな影響を与えることはない。
【０１７９】
比較すると、この走査時間は、ＡＣモード変調の周波数がＺ軸方向のピペットとピエゾアクチュエータの共振周波数に近いシステムより、およそ２０倍速い。
【０１８０】
１００μｍの範囲内の移動範囲でＺ軸方向のピペットとピエゾアクチュエータを用いることができる。アクチュエータの共振周波数の２０倍である周波数を用いる場合に、ＡＣ変調信号による過度な駆動による変位を減衰させることは、結果として、振幅を千のオーダで減少させる。この結果、Ｚ軸方向のＡＣ変調の振幅は、１００ｎｍの範囲内であり、ＡＣ変調されたイオン電流を発生させるために適している。
【０１８１】
要約すると、記述されているシステムでは、Ｚ軸上で並べられたピペットとピエゾアクチュエータ、及び、Ｚ軸上で並べられた試料とピエゾアクチュエータを用いることにより、ピペットが試料の表面形状を追跡し、測定することが可能となる。Ｚ軸上で並べられたピペットとピエゾアクチュエータにより、制御部が発生させるＡＣ変調された電圧を用いて、アクチュエータの共振周波数を上回る（例えば、共振周波数の２０倍の）周波数でピペットの安定した変調が行なわれる。イオン電流変調は、ピペットのＡＣ変調の周波数に等しい変調された電流の周波数で、ピペットが試料に近づいた時に誘発される。高周波数ＡＣ変調に同調されたロックイン増幅器が、不必要なノイズや干渉をフィルタリングにより除去するために用いられる。ＡＣ変調されたイオン電流が、イオン電流の複素包絡線の大きさを抽出する制御部内の複素包絡線検出器に流れる。Ｚ軸上で並べられた試料とピエゾアクチュエータの位置が、駆動電圧としてイオン電流の包絡線の大きさを用いて試料の表面を追跡するために用いられる。Ｚ軸上で並べられたピペットとピエゾの速度を速めることにより、ラスター走査の速度が向上する。接近曲線較正は、表面形状の予測精度を向上させるために用いられる。３２×３２画素の画像が１００ｍｓ以内に走査され、２０倍以上の速さの走査が実現可能である。
【０１８２】
他の実施形態は、明細書を考慮し、明細書に開示の実施形態を実施することにより、当業者にとって、明白である。明細書と実施例は、単に例示として考えられることを意図している。
【０１８３】
加えて、本出願が特定の順番での方法もしくは手順のステップを列挙している場合、一部のステップが行なわれる順番を変更可能である、もしくは、ある環境において適切な方法とし得る。そして、本明細書に説明される方法もしくは手順の請求項の特定のステップは、請求項で、特定の順番についての明確な記載がない限り、特定の順番で行なわれると解釈されない。動作／ステップは、特に記載のない限り、いかなる順番で行なわれてもよく、実施形態は、追加の動作／ステップ、もしくは、本明細書に開示されるより少ない動作／ステップを含んでもよい。さらに、記載の実施形態に従い、他の動作の前、他の動作と同時に、もしくは、他の動作の後に、特定の動作／ステップが実行または施行されることも考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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