(57)【要約】強固な体液性及び／または細胞媒介応答の誘導が、感染症の予防及び治療の成功のために重要であり得る、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及び単純ヘルペスウイルス、マラリア、抗生物質耐性細菌などの感染性疾患微生物に対する改善されたワクチンを含む、ワクチンへの必要性が存在する。対象において強固な免疫応答を誘導する、改善された二重免疫化計画のための組成物及び方法が本明細書において提供される。したがって、記載される方法は、体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答の誘導が所望され、有益である、癌及び感染性疾患などの異なる疾患、障害、ならびに病態を治療及び／または予防する（すなわち、発生の可能性またはリスクを低下させる）ために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において免疫応答を誘導するための方法であって、（ａ）前記対象に、（ｉ）少なくとも１つの免疫原またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを含む、第１の免疫原性組成物の少なくとも２用量を投与することであって、前記少なくとも１つの免疫原が、第１の指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することができ、前記レンチウイルスベクターが、ベクター粒子中に組み込まれ、かつ前記レンチウイルスベクター粒子が、樹状細胞に優先的に結合する外被糖タンパク質で偽型化されている、投与することと、（ｂ）後続して、前記対象に、前記少なくとも１つの免疫原及びＴＬＲ４アゴニストを含む、第２の免疫原性組成物の少なくとも２用量を、順次かつ前記第１の免疫原性組成物の更なる２用量と交互に投与し、それにより、前記第１の指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の免疫原性組成物の前記少なくとも２用量がそれぞれ、単回注射として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも２用量が、皮内または皮下投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の免疫原性組成物の前記少なくとも２用量がそれぞれ、各三角筋に２回の注射と各四頭筋に２回の注射とに分割された、８回の皮内注射として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の免疫原性組成物の前記少なくとも２用量が、２〜３週間離して投与され、前記第２の免疫原性組成物の少なくとも１つの用量が、前記第１の免疫原性組成物の第２の用量の２〜３週間後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が癌を有し、前記第１の指定抗原が腫瘍抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質２、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＷＮＴ、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、前立腺の６回膜貫通エポイセリアル（ｅｐｏｉｔｈｅｌｉａｌ）抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異ｐ５３、野生型ｐ５３、チトクロムＰ４５０  １Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児抗原、メルケル細胞ウイルスＴ−抗原腫瘍性タンパク質、及びアルファ−胎児タンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の免疫原性組成物の前記少なくとも２用量のそれぞれが、約５×１０８〜約５×１０１０個のベクターゲノムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の免疫原性組成物の前記少なくとも２用量のそれぞれが、約５×１０９〜約１×１０１０個のベクターゲノムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の免疫原性組成物の前記少なくとも２用量のそれぞれが、約１×１０１０個のベクターゲノムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記レンチウイルスベクターが、組み込み能欠損である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記レンチウイルスベクターが、組み込み能がある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記レンチウイルスベクターが、以下の特徴、（ａ）配列番号１と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含む外被で偽型化されており、配列番号１の残基１６０が欠けているか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であるかのいずれかであり、かつ前記Ｅ２糖タンパク質が、シンドビスウイルスＥ３タンパク質を含む融合タンパク質の部分ではないこと、（ｂ）任意で、パッケージング細胞をマンノシダーゼ阻害剤中で培養することによって取得可能である、高度にマンノシル化された外被タンパク質を有すること、（ｃ）Ｖｐｘタンパク質、任意でＳＩＶｍａｃ  Ｖｐｘを含むこと、（ｄ）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子中にＤ６４Ｖインテグラーゼ変異を含むこと、（ｅ）ベクターゲノム中にｃＰＰＴ欠失を有すること、及び（ｆ）任意で、ｒｅｖ非依存性ｇａｇ／ｐｏｌ系を含むパッケージング細胞を使用して調製されること、のうちの任意の１つ以上または全てを更に特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、及び乳癌からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＬＲ４アゴニストが、以下の構造の化合物であり、
【化３】
2017522312.tif 000007
式中、Ａ１及びＡ２が独立して、水素、ホスフェート、及びリン酸塩の群から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が独立して、Ｃ３−Ｃ２３によって表される、３〜２３個の炭素を有するヒドロカルビルの群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Ａ１がホスフェートまたはリン酸塩であり、Ａ２が水素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６がウンデシルであり、Ｒ２及びＲ４がトリデシルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が、安定な水中油型乳濁剤中に配合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の免疫原性組成物が、約５ｕｇのＧＬＡ〜約１０ｕｇのＧＬＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の免疫原性組成物の前記少なくとも２用量のそれぞれが、約１×１０１０個のベクターゲノムを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物において癌を治療する方法であって、樹状細胞に優先的に結合する外被糖タンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターを含む組成物の少なくとも第１の用量を投与することを含み、前記レンチウイルスベクターが、腫瘍抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、前記少なくとも第１の用量が、単回注射として投与され、前記第１の用量の前記レンチウイルスベクターを単回注射として投与した後に誘発される前記腫瘍抗原に特異的な免疫応答が、複数回の注射に分割された前記第１の用量を投与した後に誘発される前記腫瘍抗原に特異的な免疫応答よりも大きい、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙複写物の代わりにテキスト形式で提供され、これにより参照によって本明細書に組み込まれる。この配列表を含有するテキストファイルの名称は、４８８３１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔである。このテキストファイルは１６０，１８４バイトであり、２０１５年７月１４日に作製され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
背景
（技術分野）
【０００２】
本開示は一般に、少なくとも２つの組成物で対象を免疫化し、免疫原に対する体液性及び細胞性免疫応答を誘導することによって、免疫原に対する特異的免疫応答を亢進するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
宿主の免疫系は、病原微生物に対する保護反応を迅速かつ特異的に開始するための手段、及び悪性腫瘍の拒絶に寄与するための手段を提供する。免疫応答は一般に、抗原に特異的な抗体が分化したＢリンパ球によって産生される体液性応答、及び様々な種類のＴリンパ球が様々な機構によって抗原を除去する細胞媒介応答を含むものとして説明されている。例えば、特定の抗原を認識することができるＣＤ４（ＣＤ４＋とも呼ばれる）ヘルパーＴ細胞は、サイトカインなどの可溶性メディエーターを放出して、免疫系の追加の細胞を動員して免疫応答に関与させることによって、応答し得る。ＣＤ８（ＣＤ８＋とも呼ばれる）細胞傷害性Ｔ細胞もまた、特定の抗原を認識することができ、抗原担持細胞または粒子に結合し、それらを破壊または損傷させ得る。特に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を含む細胞媒介免疫応答は、腫瘍細胞、及びウイルス、細菌、または寄生虫などの微生物に感染した細胞を除去するために重要であり得る。
【０００４】
癌は幅広い範囲の疾患を含み、世界中で約４人に１人の個人がそれを発症している。ＣＴＬ応答は、有効な癌ワクチンの重要な特徴であり、有効なＣＤ４Ｔ細胞の援助もまた、生産的なＣＤ８Ｔ細胞活性化において非常に重要な役割を果たし、故に、臨床的利益を提供する可能性が高い。自己樹状細胞（ＤＣ）系ワクチンＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標））は近年、転移性去勢抵抗性前立腺癌の治療のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されたが、この治療に関連する延命効果はわずか４．１ヶ月であり、改善への著しい必要性を残している（例えば、Ｋａｎｔｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３（５）：４１１（２０１０）を参照されたい）。ポックスウイルス−ベクター系ワクチンＰｒｏｓｔＶａｃ（登録商標）ＶＦもまた、第ＩＩ相において著しい延命効果を示す（例えば、Ｋａｎｔｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８（７）：１０９９（２０１０）を参照されたい）。Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ及びＰｒｏｓｔＶａｃ（登録商標）ＶＦなどの活性免疫療法は一般に、去勢抵抗性疾患の治療の現在標準を構成する化学療法レジメンよりも良好に許容されている（例えば、Ｐｅｔｒｙｌａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５１（１５）：１５１３（２００４）、Ｓｙｌｗｅｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２（５）：６７３（２００５）を参照されたい）。これらの臨床的成功は、癌状況において免疫応答を利用して、改善された患者治療成績及び延命を提供し得ることを実証する。
【０００５】
微生物感染症に関して、マラリア、結核、ＨＩＶ−ＡＩＤＳ、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症（世界中で外陰潰瘍の主要原因）などの他のウイルス感染症は、世界的健康懸念に寄与している。ＨＳＶ−２有病率は、世界中で驚くべき速度で増加している（例えば、Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．３５：４３５（２００４）を参照されたい）。米国において、全体的なＨＳＶ−２血清有病率は２０％を超え、発展途上国では、ＨＳＶ−２有病率は３０％〜５０％であると推定される。成人におけるＨＳＶ−２感染症の深刻な負荷に加えて、新生児ＨＳＶ−２感染症の発生率が増加している。治療された症例ですら、ＨＳＶ−２感染症による新生児脳炎は１５％超の死亡率を有し、ＨＳＶ−２に感染した乳幼児における神経学的罹患率は、生存した場合のうちの更に３０〜５０％である。ＨＳＶ−２の蔓延には、ＨＳＶ−２感染症がＨＩＶ−１感染及び伝染のリスクを実質的に増加させるという明確な理解が付随する。アフリカからのデータは、ＨＳＶ−２感染症がＨＩＶ伝染のリスクを最大７倍増加させ得ること、及び新たに感染したＨＩＶの症例のうちの最大半数はＨＳＶ−２感染症が直接的原因であることを示す（例えば、Ａｂｕ−Ｒａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ３（５）：ｅ２２３０（２００８）を参照されたい）。全体的に見て、ＨＩＶ感染の相対的リスクは、ＨＳＶ−２に感染した個体において２倍超増加する。
【０００６】
薬理学的介入が広範に使用されているにも関わらず、成人及び小児集団におけるＨＳＶ−２の有病率の増加は持続している。感染の初期に高い用量で抗ウイルス薬剤を与えると、ＨＳＶ伝染を低下させることができるが、これは潜伏感染症を予防することはない（例えば、Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｘ  Ｔｒａｎｓｍ．Ｄｉｓ．１２：２１５（１９８５）を参照されたい）。近年の研究において、バラシクロビルによる連続的抑制投与は、初期介入にも関わらず、ＨＳＶ伝染を５０％未満だけ低下させた（例えば、Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１１（２００４）を参照されたい）。局所殺菌剤などの抗ウイルス薬物に対する代替物は、臨床的には証明されてない。これらの理由から、多くの主要当局は、ＨＳＶ−２疾患の健康影響を減少させるためにはワクチン接種が必須であると考えている。
強固な体液性及び／または細胞媒介応答の誘導が、感染症の予防及び治療の成功のために重要であり得る、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及び単純ヘルペスウイルス、マラリア、抗生物質耐性細菌などの感染性疾患微生物に対する改善されたワクチンを含む、ワクチンへの必要性が存在する。更に、癌を有する患者の生存に対する正の影響にも関わらず、ワクチン誘導腫瘍特異的免疫と患者の利益との間の明白な関係性は決定的には実証されておらず、改善された癌ワクチン効力への甚大な潜在性及び必要性が存在することを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｎｔｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３（５）：４１１（２０１０）
【非特許文献２】Ｋａｎｔｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８（７）：１０９９（２０１０）
【非特許文献３】Ｐｅｔｒｙｌａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５１（１５）：１５１３（２００４）
【非特許文献４】Ｓｙｌｗｅｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２（５）：６７３（２００５）
【非特許文献５】Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．３５：４３５（２００４）
【非特許文献６】Ａｂｕ−Ｒａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ３（５）：ｅ２２３０（２００８）
【非特許文献７】Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｘ  Ｔｒａｎｓｍ．Ｄｉｓ．１２：２１５（１９８５）
【非特許文献８】Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１１（２００４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、（ａ）対象に、（ｉ）少なくとも１つの免疫原またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを含む、第１の免疫原性組成物の少なくとも２用量を投与することであって、少なくとも１つの免疫原が、第１の指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することができ、レンチウイルスベクターが、ベクター粒子中に組み込まれ、かつレンチウイルスベクター粒子が、樹状細胞に優先的に結合する外被糖タンパク質で偽型化されている、投与することと、（ｂ）後続して、対象に、少なくとも１つの免疫原及びＴＬＲ４アゴニストを含む、第２の免疫原性組成物の少なくとも２用量を、順次かつ追加の２用量の第１の免疫原性組成物と交互に投与し、それにより、第１の指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することと、を含む、方法を提供する。本明細書の方法の一実施形態において、第１の免疫原性組成物の少なくとも２用量はそれぞれ、単回注射として投与される。本方法の特定の実施形態において、少なくとも２用量は、皮内または皮下投与される。別の実施形態において、第１の免疫原性組成物の少なくとも２用量はそれぞれ、各三角筋に２回の注射と各四頭筋に２回の注射とに分割された、８回の皮内注射として投与される。更なる一実施形態において、第２の免疫原性組成物の少なくとも２用量は、第１の免疫原性組成物の少なくとも２用量の後に投与され、少なくとも１つの追加用量の第１の免疫原性組成物とは異なる時間に順次投与される。特定の一実施形態において、第１の免疫原性組成物の少なくとも２用量は、２〜３週間離して投与され、第２の免疫原性組成物の少なくとも１つの用量は、第２の用量の第１の免疫原性組成物の２〜３週間後に投与される。別の実施形態において、後続する用量の第１の免疫原性組成物及び第２の免疫原性組成物は、異なる時間に連続的に投与される。本明細書の方法の特定の実施形態において、少なくとも２用量は、皮内または皮下投与される。
【０００９】
本明細書に記載される方法の別の実施形態において、少なくとも２用量は、約５×１０８〜約５×１０１０個のベクターゲノムを含むか、または少なくとも２用量は、約５×１０９〜約１×１０１０個のベクターゲノムを含む。一実施形態において、少なくとも１つの第１の用量は、約１×１０１０個のベクターゲノムを含む。
【００１０】
本方法の一実施形態において、レンチウイルスベクターは、組み込み能欠損である。他の実施形態において、レンチウイルスベクターは、組み込み能がある。本明細書に記載される方法の特定の一実施形態において、レンチウイルスベクターは、以下の特徴、（ａ）配列番号１と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含む外被で偽型化されており、配列番号１の残基１６０が欠けているか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であるかのいずれかであり、かつＥ２糖タンパク質が、シンドビスウイルスＥ３タンパク質を含む融合タンパク質の部分ではないこと、（ｂ）任意で、パッケージング細胞をマンノシダーゼ阻害剤中で培養することによって取得可能である、高度にマンノシル化された外被タンパク質を有すること、（ｃ）Ｖｐｘタンパク質、任意でＳＩＶｍａｃ  Ｖｐｘを含むこと、（ｄ）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子中にＤ６４Ｖインテグラーゼ変異を含むこと、（ｅ）ベクターゲノム中にｃＰＰＴ欠失を有すること、及び（ｆ）任意で、ｒｅｖ非依存性ｇａｇ／ｐｏｌ系を含むパッケージング細胞を使用して調製されること、のうちの任意の１つ以上または全てを更に特徴とする。
【００１１】
本明細書に記載される方法の特定の実施形態において、対象はヒトである。他の実施形態において、対象は哺乳動物であり、ネコ、イヌ、マウス、ウマ、またはウシなどの獣医学的に重要な哺乳動物であってもよい。本明細書に記載される方法を使用して治療され得る非ヒト動物としては、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びゴリラなど）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ類、ブタ類（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ類、イヌ類、ネコ類、ウシ類、ならびに他の飼育動物、家畜、及び動物園の動物が挙げられる。
【００１２】
本明細書に記載される方法の特定の実施形態において、対象は癌を有し、第１の指定抗原は腫瘍抗原である。この点に関して、腫瘍抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質２、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸、前立腺（ＳＴＥＡＰ）の６回膜貫通エポイセリアル（ｅｐｏｉｔｈｅｌｉａｌ）抗原、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異ｐ５３、野生型ｐ５３、チトクロムＰ４５０  １Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児抗原、メルケル細胞ウイルスＴ−抗原腫瘍性タンパク質、及びアルファ−胎児タンパク質からなる群から選択される。一実施形態において、癌は、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、及び乳癌からなる群から選択される。
【００１３】
本明細書に記載される方法の一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：
【化１】
2017522312.tif 000002
式中、Ａ１及びＡ２が独立して、水素、ホスフェート、及びリン酸塩の群から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が独立して、Ｃ３−Ｃ２３によって表される、３〜２３個の炭素を有するヒドロカルビルの群から選択される、構造、の化合物である。特定の一実施形態において、Ａ１はホスフェートまたはリン酸塩であり、Ａ２は水素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はウンデシルであり、Ｒ２及びＲ４はトリデシルである。特定の実施形態において、化合物は、安定な水中油型乳濁剤中に配合される。別の実施形態において、本明細書の方法の第２の免疫原性組成物は、約５μｇのＧＬＡ〜約１０μｇのＧＬＡを含む。別の実施形態において、本明細書の方法の第２の免疫原性組成物は、約５μｇのＧＬＡ〜約１０μｇのＧＬＡを含み、第１の免疫原性組成物の少なくとも２用量のそれぞれは、約１×１０１０個のベクターゲノムを含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、材料がその本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然環境）から取り除かれることを意味する。例えば、天然に存在する核酸または生きている動物中に存在するポリペプチドは単離されないが、天然系において共存する材料のいくつかまたは全てから分離された同一の核酸またはポリペプチドは単離される。そのような核酸は、ベクターの一部であり得る。ベクターの一部であり得る核酸は、核酸がその核酸の天然環境の一部ではないという点で、依然として単離されてもよい。単離されたポリペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの断片は、組成物の構成成分であってもよく、組成物がそのポリペプチドの天然環境の一部ではないという点で、依然として単離されてもよい。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、遺伝子は、コード領域の前後に続く領域「リーダー及びトレーラー」、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。アミノ酸は、本明細書において１文字及び３文字のコードに従って呼ばれ得、これは当該技術分野における一般的な教科書知識であるため、当業者が精通しているものである。本明細書で使用される「融合ポリペプチド」という用語はまた、「融合タンパク質」と互換的に使用され得、別段具体的に示さない限り、２つの用語は、識別可能な特性または特徴を有する分子を示すことが意図されない。
【００１５】
本開示の一実施形態において、癌を患う哺乳動物を治療する方法が提供され、該方法は、哺乳動物に、樹状細胞に優先的に結合するアルファウイルス外被で偽型化されたレンチベクターを含む第１の用量の組成物であって、レンチベクターが、腫瘍抗原を外因性ポリヌクレオチドを含む第１の用量の組成物と、（ａ）のレンチベクターを含む第２の用量の組成物と、任意で、（ａ）のレンチベクターを含む第３の用量の組成物とを投与することを含み、レンチベクターを含む組成物は、皮内注射によって投与され、第１の用量は、５×１０８〜５×１０１０個のベクターゲノムを含み、第２の用量は、５×１０８〜５×１０１０個のベクターゲノムを含み、第３の用量は、５×１０８〜５×１０１０個のベクターゲノムを含む。別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００１６】
別の実施形態において、第１及び第２の用量、ならびに／または第２及び第３の用量が、１、２、３、４、５、または６週間からなる群から選択される時間だけ分離される、上述の方法が提供される。
【００１７】
更に別の実施形態において、腫瘍抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質２、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸、前立腺（ＳＴＥＡＰ）の６回膜貫通エポイセリアル抗原、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異ｐ５３、野生型ｐ５３、チトクロムＰ４５０  １Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児抗原、メルケル細胞ウイルスＴ−抗原腫瘍性タンパク質、及びアルファ−胎児タンパク質からなる群から選択される、上述の方法が提供される。
【００１８】
更に別の実施形態において、第１の用量、第２の用量、及び第３の用量が、８回の皮内注射に分けられる、上述の方法が提供される。別の実施形態において、第１の用量、第２の用量、及び第３の用量は、皮内注射の各部位間、少なくとも３ｃｍで投与される。
【００１９】
別の実施形態において、レンチベクターが、組み込み能欠損である、上述の方法が提供される。更に別の実施形態において、レンチベクターが、組み込み能がある、上述の方法が提供される。
【００２０】
更に別の実施形態において、レンチベクターが、以下の特徴、（ａ）配列番号３０の外被で偽型化されていること、（ｂ）任意で、パッケージング細胞をマンノシダーゼ阻害剤中で培養することによって取得可能である、高度にマンノシル化された外被タンパク質を有すること、（ｃ）Ｖｐｘタンパク質、任意で配列番号４４のＳＩＶｍａｃ  Ｖｐｘを含むこと、（ｄ）ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子中にＤ６４Ｖインテグラーゼ変異を含むこと、（ｅ）ベクターゲノム中にｃＰＰＴ欠失を有すること、及び（ｆ）任意で、ｒｅｖ非依存性ｇａｇ／ｐｏｌ系を含むパッケージング細胞を使用して調製されること、のうちの任意の１つ以上または全てを更に特徴とする、上述の方法が提供される。
【００２１】
更に別の実施形態において、癌が、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、及び乳癌からなる群から選択される、上述の方法が提供される。本開示において企図される追加の癌としては、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、脳癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、腹膜偽粘液腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。特定の他の関連する実施形態において、癌細胞は、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、形質細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、または他の癌から選択される癌から生じる。
【００２２】
本開示はまた、２つの特徴、（ａ）高度にマンノシル化されたアルファウイルス糖タンパク質で偽型化されていること、及び（ｂ）Ｖｐｘタンパク質を含むこと、を呈するレンチウイルスベクター粒子を使用した癌の治療も企図し、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞の形質導入効率を予想外に改善した。これらの粒子は、これら２つの特徴のうちの１つのみを有するレンチウイルスベクター粒子よりも著しく効率的に、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞、特に樹状細胞を感染させる。特定の例において、Ｖｐｘタンパク質と、対象となる配列を含むレンチウイルスゲノム（例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド）とを含む、高度にマンノシル化され、偽型化されたレンチウイルスベクター粒子が提供される。
【００２３】
本開示の一態様は、哺乳動物において癌を治療する方法であって、樹状細胞に優先的に結合する外被糖タンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターを含む、少なくとも第１の用量の組成物を投与することであって、レンチウイルスベクターが、腫瘍抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、少なくとも第１の用量が、単回注射で投与される、投与することを含む、方法を提供する。本方法の一実施形態において、哺乳動物はヒトである。本方法の別の実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、またはそれ以上などの複数用量のレンチウイルスベクター粒子が投与される。いくつかの実施形態において、各用量は、１週間に１回〜３週間に１回投与される。他の実施形態において、各用量は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、または８週間に１回投与される。本明細書の方法の特定の実施形態において、少なくとも第１の用量は、約５×１０８〜約５×１０１０個のベクターゲノムを含むか、または他の実施形態において、少なくとも第１の用量は、約５×１０９〜約１×１０１０個のベクターゲノムを含む。一実施形態において、少なくとも１つの第１の用量は、約１×１０１０個のベクターゲノムを含む。
【００２４】
本方法の特定の実施形態において、第１の用量のレンチウイルスベクターを単回注射として投与した後に誘発される腫瘍抗原に特異的な免疫応答は、複数回の注射に分割された第１の用量を投与した後に誘発される腫瘍抗原に特異的な免疫応答よりも大きい。一実施形態において、別個の部位に分割された第１の用量の投与は、２〜４つの部位に分離される。特定の実施形態において、少なくとも第１の用量は、皮内または皮下投与される。
【００２５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの」、「及び」、ならびに「その」は、別段文脈が明白に指示しない限り、複数の指示対象を含む。故に、例えば、「１つの抗原」に対する言及は複数のそのような抗原を含み、「１つの細胞」または「その細胞」に対する言及は、１つ以上の細胞及び当業者に既知であるその等価物（例えば、複数の細胞）に対する言及を含む、などである。同様に、「１つの化合物」または「１つの組成物」に対する言及は複数のそのような化合物または組成物を含み、別段文脈が明白に指示しない限り、それぞれ１つ以上の化合物または組成物を指す。ある方法のステップが記載または主張されるとき、そのステップは、ある特定の順序で起こるものとして記載され、第２のステップの「前に」（すなわち、以前に）起こる第１のステップという記載は、第２のステップは、第１のステップに「後続して」起こる（または実行される）と述べるように書き直された場合と同一の意味を有する。「約」という用語は、数または数値範囲を指すとき、言及されるその数または数値範囲がおよそ実験可変性以内（または統計的実験誤差以内）であることを意味し、故に、その数または数値範囲は、述べられた数または数値範囲から１％〜１５％変動し得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの関連する用語）は、他の特定の実施形態、例えば、任意の物質の組成物の一実施形態において、本明細書に記載される組成物、方法、またはプロセスなどが、記載される特徴「からなり得る」または「から本質的になり得る」ことを除外することは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】免疫化後、ＩＤ−ＶＰ０２に対する中和抗体の応答が検出され得る。（ａ）ＩＤ−ＶＰ０２（ＩＤ−ＶＰ０２−ＧＦＰ）で免疫化したマウスから、または示される用量のＨＢＳＳもしくはＶＳＶ−Ｇ偽型化されたベクター（ＶＳＶ−Ｇ−ＧＦＰ）を注射した対照マウスからの血清の１０倍の希釈物を、レポーターベクター（ＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２）とともに１時間プレインキュベートした。その後、この血清−ベクター混合物を、２９３Ｔ．ｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ標的細胞を利用するＧＦＰ形質導入アッセイにおいて、試験物品として使用した。形質導入の２日後、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを分析した。結果を、１群当たり３匹のマウスの平均±標準偏差として示す。（ｂ）マウスの群を、まずＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２の７．５×１０１０、３．０×１０９、もしくは１．２×１０８個のベクターゲノム、ＧＦＰをコードするＶＳＶ−Ｇ偽型化されたレンチベクターの７．５×１０１０個のベクターゲノム、またはＨＢＳＳのうちのいずれかで免疫化した。一次免疫化の２８日後、動物を、代替的な抗原カセットであるＬＶ１ｂをコードする３．０×１０９個のＩＤ−ＶＰ０２で免疫化した。第２の免疫化の１２日後、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって、脾臓におけるＯＶＡ２５７特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を測定した。
【図２】ＢＡＬＢ−ｃマウスにおける、ＣＭＢ３０５の中心的安全性−毒性研究に使用した免疫化レジメンの略図である。（Ｌ）または（Ｇ）で標識される矢印はそれぞれ、ＩＤ−ＬＶ３０５（Ｌ）及びＩＤＣ−Ｇ３０５（Ｇ）での投薬事象を示す。（Ｎ）で標識される矢印は、５７、６７、及び８５日目の、末期、中等度の回復、及び最終回復剖検を示す。
【図３−１】免疫化後の２つの時点での、反復−用量安全性／毒性研究における、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける７用量ＣＭＢ３０５研究レジメンの免疫原性。ＢＡＬＢ／ｃマウス（治療群及び剖検当たり、Ｎ＝１０匹のメス及び１０匹のオス）を、尾の付け根で、１、１５、２９、及び４３日目にＬＶ３０５の２．５×１０８個のゲノムで皮下に、ならびに２２、３６、及び５０日目にＧ３０５（５μｇのＧＬＡ−ＳＥ中、５μｇのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質）で筋肉内に、免疫化した。５７及び６７日目、Ｈ−２Ｄｄ拘束性ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープＲＧＰＥＳＲＬＬ（ＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８）でのエクソビボ再刺激後、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、及びＩＬ−２についてインターフェロンガンマエリスポット（パネルａ）または細胞内サイトカイン染色によって、脾臓ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を測定した（パネルｂ、ｃ）。ビヒクル対照で免疫化したマウス、ＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８で再刺激したマウスからの脾細胞が、負の対照としての役割を果たした。ＩＦＮ−γ（図３Ａ、図３Ｂ）、または示されるサイトカインの各組み合わせ（図３ｃ）を産生するＣＤ８Ｔ細胞の中央値パーセンテージを、各群について描写する。これらの結果は、この投薬レジメンが、標本抽出した時点で、検出可能なレベルの抗ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬ応答を誘発したことを実証した。ＣＭＢ３０５を投与したオスのマウスの群は、９匹の動物で構成されることに留意されたい。垂直の破線バーは、５７及び６７日目の応答が別個にアッセイされたことを示し、故に、これらの図は、別個の実験から生成されたデータを表すことを示す。図３Ｃにおいて、１群＝ビヒクル、２群＝ＣＭＢ３０５である。パネルａ及びｂの水平バーは算術平均を表し、誤差バーが１つの標準偏差を表す。パネルｃの誤差バーは、各個体群の平均値の標準誤差を表す。
【図３−２】免疫化後の２つの時点での、反復−用量安全性／毒性研究における、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける７用量ＣＭＢ３０５研究レジメンの免疫原性。ＢＡＬＢ／ｃマウス（治療群及び剖検当たり、Ｎ＝１０匹のメス及び１０匹のオス）を、尾の付け根で、１、１５、２９、及び４３日目にＬＶ３０５の２．５×１０８個のゲノムで皮下に、ならびに２２、３６、及び５０日目にＧ３０５（５μｇのＧＬＡ−ＳＥ中、５μｇのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質）で筋肉内に、免疫化した。５７及び６７日目、Ｈ−２Ｄｄ拘束性ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープＲＧＰＥＳＲＬＬ（ＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８）でのエクソビボ再刺激後、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、及びＩＬ−２についてインターフェロンガンマエリスポット（パネルａ）または細胞内サイトカイン染色によって、脾臓ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を測定した（パネルｂ、ｃ）。ビヒクル対照で免疫化したマウス、ＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８で再刺激したマウスからの脾細胞が、負の対照としての役割を果たした。ＩＦＮ−γ（図３Ａ、図３Ｂ）、または示されるサイトカインの各組み合わせ（図３ｃ）を産生するＣＤ８Ｔ細胞の中央値パーセンテージを、各群について描写する。これらの結果は、この投薬レジメンが、標本抽出した時点で、検出可能なレベルの抗ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬ応答を誘発したことを実証した。ＣＭＢ３０５を投与したオスのマウスの群は、９匹の動物で構成されることに留意されたい。垂直の破線バーは、５７及び６７日目の応答が別個にアッセイされたことを示し、故に、これらの図は、別個の実験から生成されたデータを表すことを示す。図３Ｃにおいて、１群＝ビヒクル、２群＝ＣＭＢ３０５である。パネルａ及びｂの水平バーは算術平均を表し、誤差バーが１つの標準偏差を表す。パネルｃの誤差バーは、各個体群の平均値の標準誤差を表す。
【図４】５匹のメスのＢ６Ｄ２Ｆ１マウスの群を、示されるＩＤ−ＬＶ３０５の１．２５×、２．５×、５×、１０×、または２０×１０８個のベクターゲノムで免疫化した。マウスを、上背部（バー２〜６、「１Ｕ」と標識）に１回、下背部（バー７〜１１、「１Ｌ」と標識）に１回、または４つの部位（バー１２〜１４、３つの最高投与量レベルのみ）で免疫化した。免疫化の１４日後、動物を屠殺し、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドによる再刺激を使用し、その後ＩＣＳ及びフローサイトメトリーによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＤ８細胞応答について脾細胞を分析した。バーは、サイトカイン産生ＣＤ８陽性Ｔ細胞のパーセンテージを表す。ＭＨＣ  Ｉ結合対照ペプチドによる刺激は、０．１％未満の応答レベルをもたらした（図示せず）。免疫化の１２日後、ＡＨ１Ａ５及びＡＨ１特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを、ＩＣＳによって測定した。
【図５】ＣＭＢ３０５組み合わせ療法において使用される、ＩＤ−ＬＶ３０５（レンチウイルスベクター発現ＮＹ−ＥＳＯ−１）及びＩＤＣ−Ｇ３０５（ＧＬＡ−ＳＥと組み合わせた組み換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質）が異なる時間に順次投与される、ＣＭＢ３０５の計画された臨床レジメンを示す図である。具体的には、０日目及び２１日目にＬＶ３０５を投与し、その後、３５日目にＧ３０５を投与する。４９日目に別の用量のレンチウイルスベクターを与え、その後、６３日目にＧ３０５の別の投与を行う。７７日目に第４の用量のＬＶ３０５を与え、その後、９１日目に第３の用量のＧ３０５を与える。
【図６】本明細書に記載される、免疫応答を誘導するための免疫原性組成物を使用して用いられ得る、いくつかの例示的な免疫化レジメンを示す。
【図７】ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群）を、ＩＤ−ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１の４×１０９または２×１０１０個のベクターゲノムで免疫化した。免疫化の２１日後、免疫化した対照マウス及び治療していない対照マウスの右側腹部に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中７．５×１０５個のＣＴ２６−ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍細胞、または負の対照として、単独でＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を皮下注射した。注射の９日後、移植片を切除し、秤量して、腫瘍増殖を評価した。
【図８】４匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、５×１０８個のベクターゲノムでのＧＦＰをコードするＶＰ０２、または示される１．２５×１０８〜５×１０８個の間のベクターゲノムの２倍の増大投与量レベルでのＩＤ−ＬＶ３０５のうちのいずれかで、２週間離して２回免疫化した。追加免疫の９日後、Ｈ−２Ｄｄ拘束性ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープＲＧＰＥＳＲＬＬ（ＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８）でエクソビボ再刺激した後、ＮＹ−ＥＳＯ−１脾臓ＣＤ８Ｔ細胞応答を、ＣＤ１０７ａの表面染色、ならびにＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、及びＩＬ−２の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定した。ＨＢＳＳビヒクル対照で免疫化したマウスからの脾細胞、及びＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８で再刺激したマウスからの脾細胞が、負の対照としての役割を果たした。サイトカインの各組み合わせを産生するＣＤ８Ｔ細胞の平均パーセンテージを、各群について描写する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
感染性疾患などの疾患及び病態に対するワクチン接種は、対象を、１つの組成物（プライミング組成物）で免疫化し、後続して異なる組成物（追加免疫組成物）で免疫化する計画を含んでいる。しかしながら、現在の二重ワクチン接種計画は、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答の両方、ならびに多くの疾患及び病態に対する十分な保護を提供する体液性免疫を適切には誘導していない。
【００２８】
対照において、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔリンパ球免疫応答の両方を含む免疫応答を誘導し、１つ以上の抗原に対する完全な適応免疫応答を提供する、改善された二重免疫化計画のための組成物及び方法が本明細書において提供される。したがって、本明細書に記載される組成物は、ワクチンとして開発され、配合されてもよい。したがって、記載される方法は、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方の誘導が、臨床成績を改善するか、または最適な利益のために必要とされる、癌及び感染性疾患などの異なる疾患、障害、ならびに病態を治療し、予防する（すなわち、生物学的、臨床的、及び／または統計的に有意な様式で、発生及び再発の可能性またはリスクを低下させる）ために有用である。
【００２９】
それを必要とする対象に、同時または任意の順序で順次投与される２つの免疫原性組成物が本明細書において提供される。免疫原性組成物のうちの少なくとも１つは、免疫原に対する特異的体液性（すなわち、抗体応答）及び／または特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答（メモリーＣＤ４Ｔ細胞応答を含み得る）を誘導し、免疫原性組成物のうちの少なくとも１つは、免疫原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を含み得る特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導する。特定の実施形態において、２つの免疫原性組成物のうちの一方は、特異的体液性及び／または特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答を誘導するのにより有効であってもよく、２つの免疫原性組成物のうちの他方は、特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導するのにより有効であってもよい。
【００３０】
一方の免疫原性組成物は、対象となる指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することができる、少なくとも１つの免疫原を含む。この免疫原性組成物は、免疫原及び指定抗原に特異的な免疫応答の誘導を亢進するか、またはそのために必要とされ得るアジュバントを更に含んでもよい。第２の免疫原性組成物は、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む。組み換え発現ベクターは、免疫原をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結された少なくとも１つの制御配列を更に含み、故に、組み換え発現ベクターは、免疫原の発現を指示することができる。特定の具体的な実施形態において、組み換え発現ベクターは、ベクター粒子（例えば、ウイルスベクター粒子）中に組み込まれる。本明細書に更に記載するように、免疫原は、指定抗原の免疫原性断片であってもよく、全長指定抗原（もしくはその免疫原性バリアント）または１つ以上の免疫原性断片を含むか、あるいは全長指定抗原（もしくはその免疫原性バリアント）を含む融合タンパク質であってもよい。
【００３１】
本明細書において提供される他の特定の実施形態において、第２の免疫原は、いずれかの免疫原性組成物中に含まれる。第２の免疫原は、第１の免疫原が特異的免疫応答を誘導する指定抗原と同一であっても、異なってもよい指定抗原に対する、免疫応答を誘導することができる。別の特定の実施形態において、第１の免疫原は、特異的ＣＤ４Ｔ細胞免疫応答を誘導し、特異的抗体応答も誘導してもよく、第２の免疫原は、少なくとも１つのＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を誘導する。特定の具体的な実施形態において、免疫化される対象は、組み換え発現ベクターによる第２の免疫原の発現を介して、第２の免疫原のみで免疫化されることが意図される。したがって、第１の免疫原を含む（アジュバントを更に含み得る）免疫原性組成物は、第２の免疫原を欠き、組み換え発現ベクターは、第１の免疫原をコードし、第２の免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
本明細書に記載される免疫原性組成物及び方法は、感染性疾患、特に満足の行くワクチンまたは感染後治療が利用可能ではない感染性疾患（例えば、ＨＩＶ及びＨＳＶ−２などのウイルス感染症、ならびにマラリアなどの寄生虫感染症）を予防または治療するために有用であり得る。他の実施形態において、本明細書に記載される免疫原性組成物及び方法は、癌及び悪性腫瘍を治療するため、かつ／またはその発生の可能性を低下させるために使用され得る。
【００３３】
免疫原性組成物、該免疫原性組成物を含む調製物、及び該調製物及び組成物を使用する方法の様々な実施形態を、以下に詳細に記載する。
【００３４】
免疫原性組成物
協調免疫化計画において使用されるとき、特異的な適応免疫応答を誘導するために有用である、異なる免疫原性組成物が本明細書に記載される。一方の免疫原性組成物は、少なくとも１つの免疫原を含み、生理学的に好適な（すなわち、薬学的に許容されるか、または好適な）アジュバントを更に含んでもよい。この第１の免疫原性組成物中に含まれる免疫原は、典型的には単離された免疫原であり、これはその天然環境から単離されたものであっても、組み換え産生されたものであってもよい。参照を容易にするため、第１の免疫原性組成物中に存在する免疫原は、本明細書では単離された／組み換え免疫原と呼ぶ。第２の異なる組成物は、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む。第２の免疫原性組成物もまた、アジュバントを更に含んでもよい。第１の組成物及び第２の組成物の両方がアジュバントを含む場合、各組成物中に含まれるアジュバントは同一であっても、異なってもよい。
【００３５】
対象への２つの異なる組成物の投与は、少なくとも１つの免疫原に対する、及びそれぞれの対象となる抗原（本明細書では指定抗原とも呼ばれる）に対する特異的免疫応答を誘導する。特異的免疫応答としては、体液性免疫応答（すなわち、特異的抗体応答）ならびに細胞性免疫応答（ＣＤ４Ｔ細胞応答及びＣＤ８Ｔ細胞応答を含む）が挙げられ、各応答は、免疫原に特異的なものであるため、対象となる指定抗原に特異的なものとなる。本明細書で言及される免疫原性調製物は、これらの２つの免疫原性組成物を含み、これらは、本明細書では便宜上、第１の免疫原性組成物及び第２の免疫原性組成物と呼ばれ得る。したがって、一実施形態において、免疫原性調製物は、（ａ）指定抗原に特異的な免疫応答を誘発することができる少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む、少なくとも１つの免疫原性組成物と、（ｂ）少なくとも１つの免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む、少なくとも１つの第２の免疫原性組成物とを含む。この調製物の免疫原性組成物は、対象に、同時または任意の順序で順次投与されて、免疫原に特異的な免疫応答及びそれぞれの指定抗原に特異的な免疫応答を誘導し得る。免疫原性組成物及びこの組成物の使用のそれぞれは、本明細書に詳細に記載される。
【００３６】
各免疫原性組成物は、少なくとも１つの生理学的に（もしくは薬学的に）許容されるか、または好適な賦形剤を更に含んでもよい。薬学的組成物における使用が当業者に既知である、任意の生理学的もしくは薬学的に好適な賦形剤または担体（すなわち、活性成分の活性と干渉しない無毒性材料）が、本明細書に記載される免疫原性組成物中に用いられ得る。例示的な賦形剤としては、タンパク質の安定性及び統合性を維持する希釈剤及び担体が挙げられる。治療的使用のための賦形剤は周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ，２１ｓｔＥｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２００５））に記載され、本明細書に詳細に記載される。
【００３７】
免疫原は指定抗原と同一であってもよく、つまり、免疫原は指定抗原の例示的な全長アミノ酸配列を含むか、または該例示的な全長指定抗原と高パーセントの同一性を共有し、指定抗原の機能的特徴（例えば、特異的免疫応答を誘導する能力）を保持する、そのバリアントを含んでもよい。あるいは、免疫原は、指定抗原の免疫原性断片であってもよい。指定抗原のバリアントまたは断片である免疫原は、対象において、統計的、臨床的、及び／または生物学的に有意な様式で、免疫応答（例えば、体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）もしくは細胞媒介応答（すなわち、Ｔ細胞応答（細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む））または体液性応答及び細胞媒介応答の両方を誘導する能力を呈する。対象となる指定抗原ならびにそれらの指定抗原の免疫原性断片及び免疫原性バリアントは、本明細書に詳細に記載される。
【００３８】
少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物に関して、免疫原は、宿主細胞中で組み換え産生され、その後、分子生物学及びタンパク質単離の技術分野において通例実施される方法に従って、宿主細胞から単離された、もしくは宿主細胞培養物から単離された（すなわち、本来の宿主細胞環境から取り除かれた）ポリペプチドまたはペプチドであってもよい。免疫原が、本明細書及び当該技術分野において記載される方法、ならびに当業者が精通している方法に従って組み換え産生されるとき、免疫原は組み換え免疫原と呼ばれ得る。あるいは、免疫原は、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、または腫瘍細胞などの天然源から単離されても、取り除かれてもよい。１つ以上の免疫原及び抗原を天然源から単離させるための方法は当該技術分野において記載され、また、当該技術分野において通例実施される方法及び技術を使用して、当業者によって容易に経験的に決定され得る。
【００３９】
本明細書に記載するように、第２の免疫原性組成物中に含まれる組み換え発現ベクターは、少なくとも１つの免疫原をコードするヌクレオチド配列（本明細書ではポリヌクレオチド配列とも呼ばれる）を含む。組み換え発現ベクターは、ベクターが免疫原の発現を指示することができるように、コードするヌクレオチド配列に作動的に連結された少なくとも１つの制御配列を更に含む。組み換え発現ベクターによってコードされ、発現される免疫原は指定抗原と同一であってもよく、つまり、免疫原は指定抗原の例示的な全長アミノ酸配列を含むか、または該例示的な全長指定抗原と高パーセントの同一性を共有し、指定抗原の機能的特徴（例えば、特異的免疫応答を誘導する能力）を保持する、そのバリアントを含んでもよい。あるいは、コードされた免疫原は、指定抗原の免疫原性断片であってもよい。指定抗原のバリアントまたは断片である免疫原は、対象において、統計的、臨床的、及び／または生物学的に有意な様式で、免疫応答（例えば、体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）もしくは細胞媒介応答（すなわち、Ｔ細胞応答（細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む））または体液性応答及び細胞媒介応答の両方を誘導する能力を呈する。対象となる指定抗原ならびにそれらの指定抗原の免疫原性断片及び免疫原性バリアントは、本明細書に詳細に記載される。
【００４０】
特定の実施形態において、組み換え発現ベクターは、ベクター粒子（例えば、ウイルスベクター粒子または細胞粒子）中に組み込まれる。組み換え発現ベクターまたはベクターを含むベクター粒子は、粒子が標的細胞に導入される（すなわち、送達される）ことを可能にする様式で構築される。特定の実施形態において、標的細胞は抗原提示細胞である。より具体的な実施形態において、標的細胞は、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞である。その後、免疫原は標的細胞中で発現され、その免疫原または断片が抗原提示細胞の表面上に提示され、免疫原に特異的な免疫応答、及びそれによりそれぞれの指定抗原に特異的な免疫応答を誘導する。
【００４１】
他の実施形態において、少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む（アジュバントを更に含み得る）免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の免疫原（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の免疫原とも換言され得る、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の免疫原））を更に含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、多価の免疫原性組成物を形成する、２つ以上の単離された／組み換え免疫原（すなわち、少なくとも２つの免疫原）を含み得る。２つ以上の免疫原がアジュバントと組み合わされる例において、免疫原性組成物は、アジュバントとともに別個に配合された各免疫原を含んでもよく、その後、アジュバント化された免疫原が組み合わされて、免疫原性組成物を形成する。あるいは、２つ以上の免疫原が、アジュバントとともに配合されてもよい。特定の具体的な実施形態において、追加の免疫原のうちのそれぞれ（例えば、第２、第３などの免疫原）は、第１の免疫原と同一の指定抗原に対する免疫応答を誘導し得る。他の特定の実施形態において、追加の免疫原のうちのそれぞれ（例えば、第２、第３などの免疫原）は、それぞれ異なる（例えば、第２、第３などの）指定抗原に特異的な免疫応答を誘導し得る。
【００４２】
特定の代替的実施形態において、多価の免疫原性組成物は、少なくとも２つの免疫原を含む細胞可溶化物、細胞小器官、または細胞上清を含み得る。例えば、微生物から取得された免疫原などの、それらの本来の環境から取り除かれた免疫原は、２つ以上の免疫原が免疫原性組成物中に提示されるように、微生物から部分的に単離され得る。同様に、腫瘍細胞から取得された免疫原は、２つ以上の腫瘍関連抗原が免疫原性組成物中に提示されるように、腫瘍細胞から部分的に単離され得る。
【００４３】
組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物に関して、ヌクレオチド配列は、１つよりも多い免疫原、例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の免疫原（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の免疫原）をコードし得る。特定の具体的な実施形態において、追加の免疫原のうちのそれぞれ（例えば、第２、第３などの免疫原）は、第１の免疫原と同一の指定抗原に対する免疫応答を誘導し得る。他の特定の実施形態において、追加の免疫原のうちのそれぞれ（例えば、第２、第３などの免疫原）は、それぞれ異なる（例えば、第２、第３などの）指定抗原に特異的な免疫応答を誘導し得る。
【００４４】
特定の実施形態において、少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む一方の免疫原性組成物（第１の免疫原性組成物とも呼ばれる）（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）は、免疫原に特異的であるため、指定抗原に特異的である、ＣＤ４Ｔ細胞応答を誘導することができ、免疫原及び指定抗原に対する体液性応答（すなわち、特異的抗体応答または抗原特異的抗体応答）もまた誘導し得る。免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む、他方の免疫原性組成物（または第２の免疫原性組成物）は、免疫原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができ、故に、指定抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができる。本明細書に詳細に記載するように、免疫原は、免疫原に特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答及びＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができるエピトープ（複数可）を含む、１つ以上の免疫原性領域を有する。
【００４５】
他の特定の実施形態において、免疫原性調製物が提供され、少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原（便宜上、第１の免疫原と呼ばれる）を含む第１の免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の単離された／組み換え免疫原を更に含み得る。他の実施形態において、第２の異なる免疫原性組成物中に含まれる組み換え発現ベクターは、第１の免疫原をコードしてもよく、少なくとも１つの追加の免疫原をコードしてもよい。更なる他の代替的実施形態において、第１の免疫原性組成物は、少なくとも２つの単離された／組み換え免疫原を含み、第２の免疫原性組成物は、第１の免疫原及び少なくとも１つの追加の免疫原をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む。
【００４６】
２つ以上の免疫原に特異的な免疫応答の誘導が所望される特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫原が、少なくとも１つの特異的体液性及び／またはＣＤ４Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導することができ、少なくとも１つの追加の免疫原が、少なくとも１つの特異的ＣＤ８Ｔ細胞免疫反応を含む免疫応答を誘導することができる。したがって、一実施形態において、（ａ）第１の単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（第１の免疫原性組成物とも呼ばれ得る）（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）と、（ｂ）第１の免疫原及び第２の免疫原の発現をコードし、指示する組み換え発現ベクターを含む第２の免疫原性組成物とを含む、免疫原性調製物が本明細書において提供され、少なくとも第２の免疫原は、特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができる。特定の実施形態において、少なくとも２つの免疫原のうちのそれぞれは、同一の指定抗原に対する免疫応答を誘導する能力を有する。あるいは、少なくとも２つの免疫原のうちのそれぞれは、異なる指定抗原（便宜上、それぞれ第１及び第２の指定抗原などとも呼ばれる）に特異的な免疫応答を誘導する能力を有する。
【００４７】
免疫原及び指定抗原
本方法において使用される、及び本明細書に記載される用途のための、一方の免疫原性組成物中に含まれる単離された免疫原及び／もしくは組み換え免疫原であり得る免疫原、ならびに／または第２の免疫原性組成物中に含有される組み換え発現ベクターによってコードされる免疫原は、特異的免疫応答の誘導が所望される任意の免疫原を含む。特定の実施形態において、免疫原は、対象となる指定抗原の例示的な全長アミノ酸配列を含むか、または免疫原は、それぞれの指定抗原の免疫原性断片であってもよい。他の特定の実施形態において、免疫原は指定抗原のバリアントを含んでもよく、このバリアントは例示的な全長指定抗原と高パーセントの同一性を共有し、例示的なアミノ酸配列を含む指定抗原と実質的に同一のレベルの免疫原性を呈する（すなわち、バリアントは、例示的な抗原または野生型抗原の免疫原性と比較して、統計的、臨床的、及び／または生物学的に有意な程度まで、免疫原性のレベルを保持する）。具体的には、指定抗原の免疫原性断片またはバリアントである免疫原は、統計的、臨床的、または生物学的に有意な様式で、対象において、体液性免疫応答（すなわち、特異的抗体の発現をもたらすＢ細胞応答）または細胞媒介応答（すなわち、ＣＤ４Ｔ細胞応答及び／もしくはＣＤ８Ｔ細胞応答であり、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む））、あるいは体液性応答及び細胞媒介応答の両方を誘導する能力を保持する。対象となる指定抗原、ならびにそれらの免疫原性断片及び免疫原性バリアントは、本明細書に詳細に記載される。
【００４８】
本明細書に詳細に記載するように、免疫原は、対象において、指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することができる、少なくとも１つの免疫原性領域または免疫原性エピトープを含む。特定の一実施形態において、免疫原は、免疫原が、抗体応答、ＣＤ４Ｔ細胞応答、及びＣＤ８Ｔ細胞応答のうちの任意の１つ以上を誘導することができるような１つ以上の免疫原性領域を含み、各応答は免疫原に特異的なものであるため、それぞれの指定抗原に特異的なものとなる。したがって、免疫原性領域は、抗体応答、ＣＤ４Ｔ細胞応答、及びＣＤ８Ｔ細胞応答のうちの１つ以上を誘導する、少なくとも１つのエピトープ（すなわち、１つ以上のエピトープ）を含む。
【００４９】
細胞媒介免疫応答としては、細胞傷害性Ｔリンパ球応答が挙げられ、この応答は、細胞（例えば、腫瘍細胞、細菌細胞、ウイルス、寄生虫、もしくは真菌細胞）、あるいは免疫原またはそれぞれの指定抗原を産生もしくは発現する感染性粒子（例えば、ウイルス粒子）を破壊または損傷させ得る。体液性応答もしくは細胞媒介免疫応答、またはその両方が免疫化された対象にとって有益である、疾患または障害に関連する任意の抗原を、免疫原として使用することができる。
【００５０】
多くの疾患及び障害に関連する抗原は、当該技術分野において周知である。対象となる抗原（すなわち、指定抗原）は、疾患もしくは障害に関連することが既知であっても、当該技術分野において既知であり、実施される任意の方法によって疾患もしくは障害に関連する抗原として特定されていてもよい。例えば、ある患者が患っているある種類の癌に関連する抗原（腫瘍関連抗原など）は既知であり得、当該技術分野において実施される様々な方法のうちのいずれかによって腫瘍自体から特定され得る。特定の実施形態において、指定抗原は、癌細胞（すなわち、腫瘍細胞）に由来する腫瘍関連抗原（本明細書では、腫瘍抗原とも呼ばれる）であり、１つ以上のそのような腫瘍抗原は、癌の免疫療法治療にとって有用であり得る。非限定的な例として、腫瘍関連抗原は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、中皮腫、卵巣癌、または黒色腫に由来し得る。これら及び追加の腫瘍関連抗原は、本明細書及び当該技術分野において記載される。
【００５１】
特定の実施形態において、免疫原は指定抗原であり、腫瘍または悪性腫瘍に由来する全長タンパク質を含む。他の特定の実施形態において、免疫原は、そのようなタンパク質からの１つ以上のエピトープを含有する１つ以上の免疫原性断片を含む。更なる他の実施形態において、免疫原は、全長指定抗原を含むか、または腫瘍細胞に由来する指定抗原の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。他の実施形態において、２つ以上の指定抗原に対する免疫応答の誘導において使用するために免疫原性組成物が調製されるとき、融合ポリペプチドは、２つ以上の指定抗原のうちのそれぞれについて、全長抗原またはその１つ以上の免疫原性断片の任意の組み合わせを含み得る。例として、融合ポリペプチドは、１つの腫瘍関連抗原から取得された１つ以上の免疫原性断片を含んでもよく、第２の異なる腫瘍関連抗原取得された１つ以上の免疫原性断片を更に含んでもよい。融合タンパク質は、免疫原性ポリペプチドまたはペプチドに加えて、対象となる免疫原に対する免疫応答を亢進する、少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチド（免疫学の技術分野において担体タンパク質と呼ばれることもある）を含んでもよい。
【００５２】
例示的な腫瘍関連抗原または腫瘍細胞由来抗原としては、ＭＡＧＥ１、３、及びＭＡＧＥ４（または国際特許出願公開第９９／４０１８８号に開示されるものなどの他のＭＡＧＥ抗原）；ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ，Ｌａｇｅ（ＮＹ  ＥＳＯ１としても知られる）；ＳＡＧＥ；及びＨＡＧＥが挙げられる（例えば、国際特許出願公開第９９／５３０６１号、またはＧＡＧＥ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６２８−３６（１９９６）、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｒｅｓ．２７：８１−８６（１９９７）、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：６４８−９３（１９９７）、Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８９：２９３（１９９７）を参照されたい）。腫瘍抗原のこれらの非限定的な例は、黒色腫、肺癌、肉腫、及び膀胱癌などの幅広い腫瘍型において発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号も参照されたい。前立腺癌腫瘍関連抗原としては、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸、ＮＫＸ３．１、及び前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）（Ｈｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６  １４５２３−２８，１９９９）が挙げられる。例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１７３５−４０，１９９８、Ｎｅｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：３１１４−１９（１９９９）、国際公開第９８／１２３０２号、米国特許第５，９５５，３０６号、同第５，８４０，８７１号、及び同第５，７８６，１４８号、国際特許出願公開第９８／２０１１７号、同第００／０４１４９号、同第９８／１３７４１８号も参照されたい。
【００５３】
他の腫瘍関連抗原としては、Ｐｌｕ−１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１５６３３−４５，１９９９）、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ（Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１９９，２１：６１−７０、米国特許第５，６５４，１４０号）、及びＣｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５，９８１，２１５号）が挙げられる。更に、腫瘍抗原は、全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ、国際特許出願公開第９５／２０６００号）などの自己ペプチドホルモン、多くの癌の治療において有用である短鎖１０アミノ酸長ペプチドであってもよい。
【００５４】
腫瘍抗原としては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現などの腫瘍関連抗原発現を特徴とする癌に由来する腫瘍抗原が挙げられる。対象となる腫瘍関連抗原としては、メラニン細胞−黒色腫系列抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、及びチロシナーゼ関連タンパク質などの系列特異的腫瘍抗原が挙げられる。例示的な腫瘍関連抗原としては、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、細胞質セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、−２、−８、ＧＡＧＥ−３、−４、−５、−６、−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃファミリー、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、転写ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＳＴＡＴ６のシグナルトランスデューサー及びアクチベーター、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２α）、核内因子−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）、ノッチ受容体（例えば、ノッチ１−４）、ｃ−Ｍｅｔ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴタンパク質（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６を含む、分泌脂質修飾シグナリング糖タンパク質のファミリー）、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、及びそれらの制御サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞癌−５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）及びＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテアーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、Ｅ��ｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ｆｏｓ関連抗原１、ならびにイディオタイプのうちの任意の１つ以上に由来するか、またはそれ（ら）を含む腫瘍抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
免疫原はまた、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異もしくは野生型ｐ５３、チトクロムＰ４５０  １Ｂ１、及び異常発現したイントロン（Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖなど）などの、腫瘍細胞中で変異した遺伝子、または正常な細胞と比較して、腫瘍細胞中で異なるレベルで転写された遺伝子に由来するエピトープペプチドのエピトープ領域を含む腫瘍抗原；骨髄腫及びＢ−細胞リンパ腫において特有のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン再構成；ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６及びＥ７などの、オンコウイルスのプロセスに由来するエピトープペプチドのエピトープ領域を含む腫瘍抗原；エプスタイン・バーウイルスタンパク質ＬＭＰ２；癌胎児抗原及びアルファ−胎児タンパク質などの、腫瘍選択的発現を有する非変異癌胎児性タンパク質も含む。例えば、Ｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７−６５（１９９４）、Ｒｅｎｋｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：３−１５（２００１）も参照されたい。
【００５６】
他の実施形態において、免疫原は、ウイルス、真菌、寄生虫、及び細菌などの、病原微生物もしくは日和見病原微生物（本明細書では感染性疾患微生物とも呼ばれる）から取得されるか、またはそれに由来する。特定の実施形態において、そのような微生物に由来する免疫原は、選択された指定抗原である全長タンパク質を含む。他の特定の実施形態において、免疫原は、そのようなタンパク質からの１つ以上のエピトープを含有する１つ以上の免疫原性断片を含む。更なる他の実施形態において、免疫原は、微生物に由来するタンパク質の１つ、２つ、またはそれ以上の免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。更なる他の実施形態において、免疫原は、全長指定抗原を含むか、または微生物に由来する指定抗原の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の免疫原性断片を含む融合ポリペプチドを含む。他の実施形態において、感染性疾患微生物の２つ以上の指定抗原に対する免疫応答の誘導において使用するために免疫原性組成物が調製されるとき、融合ポリペプチドは、２つ以上の指定抗原のうちのそれぞれについて、全長抗原またはその１つ以上の免疫原性断片の任意の組み合わせを含み得る。例として、融合ポリペプチドは、１つの微生物抗原（すなわち、ウイルス、細菌、寄生虫、または真菌性抗原）から取得された１つ以上の免疫原性断片を含んでもよく、第２の異なる微生物抗原（すなわち、第２の異なるウイルス、細菌、寄生虫、または真菌性抗原）取得された１つ以上の免疫原性断片を更に含んでもよい。融合タンパク質は、免疫原性ポリペプチドまたはペプチドに加えて、対象となる免疫原に対する免疫応答を亢進する、少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチド（免疫学の技術分野において担体タンパク質と呼ばれることもある）を含んでもよい。
【００５７】
抗原が、本明細書に記載される免疫原性組成物において指定抗原及び免疫原としての使用が企図され、本明細書に記載されるベクター及びベクター粒子によってコードされる例示的な病原生物としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型インフルエンザ、水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌種、ならびに肺炎連鎖球菌を含む連鎖球菌種が挙げられる。当業者によって理解されるように、本明細書に記載される免疫原として使用される、これら及び他の病原微生物に由来するタンパク質は当該技術分野において既知であり、そのようなタンパク質（及びそれらの種）のアミノ酸配列ならびにタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、出版物及びＧＥＮＢＡＮＫ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、及びＴｒＥＭＢＬなどの公共データベースにおいて特定することができる。
【００５８】
免疫原であり得、本明細書に記載するように使用され得る、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原は、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、またはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、及びｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のうちのいずれかを含む。ＨＩＶタンパク質及びそれらの免疫原性断片は当業者に周知であり、いくつかの公共データベースのうちのいずれかに見出すことができる（例えば、Ｖｉｄｅｒ−Ｓｈａｌｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ２３（１１）：１３１１−１８（２００９）、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ  Ｃｒｕｚ．１０３（２）：１１９−２９（２００８）、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（４Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１６１−６８（２００４）を参照されたい）。（例えば、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１２０２２−３２、Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２７６：９３−１０３（２０００）、Ｂｙｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３４９−５６（１９９８）、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１３（５）：３８３−９２（１９９７）、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（４）：１６７−１８１（１９９８）も参照されたい。
【００５９】
本明細書に記載される組成物において免疫原としての使用が企図され、本明細書に記載されるベクター及びベクター粒子によってコードされる、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１及びＨＳＶ２）に由来する抗原としては、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子の後期群は、主にビリオン粒子を形成するタンパク質をコードする。そのようなタンパク質としては、ウイルスカプシドを形成する（ＵＬ）からの５つのタンパク質、ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８、ならびに主要カプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５、及びＵＬ２７が挙げられ、これらのうちのそれぞれが、本明細書に記載される免疫原として使用され得る（例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１１７：９０−１０４（２００６）、Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４２３−２９（２００６）を参照されたい）。本明細書において免疫原としての使用が企図される他の例示的なＨＳＶタンパク質としては、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、及び糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タンパク質が挙げられる。ＨＳＶゲノムは少なくとも７４個の遺伝子を含み、それぞれが、Ｔ細胞応答（ＣＴＬ応答を含む）、Ｂ細胞応答、またはＣＴＬ応答及びＢ細胞応答の両方を誘導するための免疫原として潜在的に使用され得るタンパク質をコードする。
【００６０】
ヒトにおける（例えば、Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｈｅｒｐｅｓ，”，Ｓｅｘｕａｌｌｙ  Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）２８５−３１２を参照されたい）及び動物モデルにおける（例えば、Ｐａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２６７７（１９９８）を参照されたい）ＨＳＶ−２に対する保護免疫応答は、適切なＨＳＶ−２ワクチン配合物が望ましく、取得可能な目的であることを示唆する。過去４０年間、不活性化全ＨＳＶ調製物及びアジュバントとともに配合されたサブユニットＨＳＶタンパク質を使用する一連のＨＳＶワクチンヒト治験が、米国及び欧州において行われている。いくつかの短期研究において、これらのワクチンによる中程度の治療効果が観察されたものの、より長い経過観察ウィンドウでの適切な対照治験からの結果は、ほとんどが残念なものであった（例えば、Ｒａｊｃａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）５１：６７（２００６）を参照されたい）。
【００６１】
欧州では、１９６０年代及び１９７０年代、ホルムアルデヒド不活性化ＨＳＶ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ治験）または熱不活性化ＨＳＶ（Ｌｕｐｉｄｏｎ  Ｈ治験）による大規模な臨床治験が行われた。重症度及びＨＳＶ再発の頻度の改善が報告されたものの、プラセボ対照及び二重盲検であったのは、これらの治験の小部分集合のみであった。更に、これらのワクチンは、長期的な治療効果は与えなかった。１９８０年代の母胎−胎児ＨＳＶ−２伝染研究は、ＨＳＶ−２血清陽性の女性の乳幼児が、出産前にＨＳＶ−２に感染した女性に対して、より低い伝染リスクを持つことを実証し、これはＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＤ及びｇＢに対する中和抗体（ｎＡｂ）が保護を与え得ることを示唆した（例えば、Ｋｏｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６：９６（２００３）を参照されたい）。これらのＨＳＶ−２糖タンパク質に対してｎＡｂを生成するように設計され、１９９０年代の米国でのＧｌａｘｏ−ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ及びＣｈｉｒｏｎによる治験は、ｇＤを単独で有するか、または３つの異なるアジュバント（ミョウバン、ＭＦ−５９（水中油型）、及びモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ））とともに配合されたｇＢを有する、組み換えサブユニットワクチンを試験した。これらのワクチンは、血清陰性の個体においてＨＳＶ−２特異的ｎＡｂを、ＨＳＶ−１血清陽性の個体おいて交差反応性ｎＡｂを、誘発または追加免疫した（例えば、Ｂｕｒｋｅ，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３Ｓｕｐｐｌ１１：Ｓ９０６−Ｓ９１１（１９９１）を参照されたい）。しかしながら、標的レベルの体液性免疫原性に到達したにも関わらず、これらのワクチンは男性において治療効果を示さず、女性における有効性は一過性にすぎず、これは抗ＨＳＶ  ｎＡｂが不十分であること、及びＨＳＶワクチンの成功には、強力なＴ細胞免疫を生成する必要がある可能性が高いことを示唆した（例えば、Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ２８２：３３１（１９９９）、Ｓｔａｎｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４７：１６５２（２００２）を参照されたい）。
【００６２】
既に行われたＨＳＶワクチン治験は、ｎＡｂがＨＳＶ−２感染症からヒトを保護するのに十分ではない可能性があることを示し、データは、ＨＳＶ−２特異的Ｔ細胞がウイルス感染、伝染、及び再活性化を低下させる上で非常に重要な役割を果たすことを示唆した（例えば、上記のＣｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ（１９９９）を参照されたい）。例えば、Ｔ細胞機能を欠損する個体は、ＨＳＶ−２感染症の延長したより重度のエピソード、及びＨＳＶ−２病変の縦断的生検研究において、ＣＤ８Ｔ細胞の浸潤と相関するウイルスクリアランスを有する（例えば、Ｋｏｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１５００（１９９８）を参照されたい）。追加のＨＳＶ研究は、動物モデルにおいて、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）応答が保護的であったこと（例えば、Ｋｏｅｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４０４９（２００１）、Ｚｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：５９５（２００７）を参照されたい）、重症度及びＨＳＶ−２再活性化の頻度がＨＳＶ特異的Ｔ細胞の頻度に逆相関したこと、ならびに性器病変へのＨＳＶ−２特異的ＣＴＬの浸潤がウイルスクリアランスと相関したこと（例えば、Ｋｏｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６９：９５６（１９９４）、Ｋｏｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：５３７（２００２）、上記のＫｏｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９８）を参照されたい）を示している。これらの発見は、ＣＤ８及びＴｈ１ＣＤ４Ｔ細胞応答を粘膜ＨＳＶ−２クリアランスと関係付けたサブユニットワクチン研究からのデータと一貫するものである（例えば、Ｐｏｓａｖａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３８１（１９９８）を参照されたい）。更に、ＨＳＶ−２特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、性器ヘルペスの回復後、長期にわたって真皮−上皮接合部で検出されている（例えば、Ｃａｔｔａｍａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１６３８（２００８）を参照されたい）。
【００６３】
本明細書に記載される本免疫原性組成物及び方法の特定の実施形態において、使用が企図されるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原としては、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の最初期相及び初期相中に発現されるウイルス抗原、糖タンパク質Ｉ及びＩＩＩ、カプシドタンパク質、コートタンパク質、低マトリクスタンパク質ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１及びＩＥ２（ＵＬ１２３及びＵＬ１２２）、ＵＬ１２８−ＵＬ１５０からの遺伝子クラスターからのタンパク質産生物（Ｒｙｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６Ｊａｎ；８０（２）：７１０−２２）、外被糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ、及びｐｐ１５０が挙げられる。当業者によって理解されるように、本明細書に記載される免疫原として使用するためのＣＭＶタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、及びＴｒＥＭＢＬなどの公共データベースにおいて特定され得る（例えば、Ｂｅｎｎｅｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｊ．Ｍｅｄ．７１（２）：８６−９３（２００４）、Ｌｏｅｗｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２６７（５）：４８３−５０１（２０１０）、Ｍａｒｓｃｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：７３１−４２（２００９）を参照されたい）。
【００６４】
特定の実施形態おいて、使用が企図されるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に由来する抗原としては、ＥＢＶ溶解性タンパク質ｇｐ３５０及びｇｐ１１０；エプスタイン・バー核内抗原（ＥＢＮＡ）−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡ−リーダータンパク質（ＥＢＮＡ−ＬＰ）を含む潜伏周期感染中に産生されるＥＢＶタンパク質；ならびに潜伏膜タンパク質（ＬＭＰ）−１、ＬＭＰ−２Ａ、及びＬＭＰ−２Ｂ（例えば、Ｌｏｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：５９１６−２７（２００８）を参照されたい）が挙げられる。
【００６５】
本明細書に記載される免疫原としての使用が企図される呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する抗原としては、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１のタンパク質のうちのいずれか、つまり、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ（マトリクスタンパク質）ＳＨ、Ｇ及びＦ（ウイルスコートタンパク質）、Ｍ２（第２のマトリクスタンパク質）、Ｍ２−１（伸長因子）、Ｍ２−２（転写制御）、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにリン酸化タンパク質Ｐ、またはそれらの免疫原性断片が挙げられる。
【００６６】
免疫原としての使用が企図される水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する抗原としては、ＶＳＶゲノムによってコードされる５つの主要タンパク質のうちのいずれか１つ、つまり、大型タンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、及びマトリクスタンパク質（Ｍ）、ならびにそれらの免疫原性断片が挙げられる（例えば、Ｒｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．（２００９）（９）：４９９−５０９、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（１９９９）５３：３０１−１９を参照されたい）。
【００６７】
特定の実施形態において、使用が企図されるインフルエンザウイルスに由来する抗原としては、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリクスタンパク質Ｍ１及びＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ならびにＰＢ２が挙げられる。例えば、Ｎａｔｕｒｅ４３７（７０６２）：１１６２−６６を参照されたい。
【００６８】
ウイルス抗原である免疫原の例としては、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（Ｂ型肝炎コア抗原または表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＥ１もしくはＥ２糖タンパク質、コア、または非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（本明細書に論じるもの、及び単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルソミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、赤血球凝集素及びノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、ならびにロタウイルスポリペプチドも挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
特定の実施形態において、細菌抗原が指定抗原として選択されてもよく、細菌抗原またはその免疫原性断片もしくはバリアントが免疫原として使用されてもよい。特定の実施形態において、対象となる細菌抗原は分泌ポリペプチドであり得る。他の特定の実施形態において、免疫応答を誘導するための免疫原として有用であり得る細菌抗原としては、細菌の外細胞表面上に露出されるポリペプチドの部分（複数可）を有する抗原が挙げられる。細胞表面上に露出されるポリペプチド免疫原の部分は、宿主中の免疫細胞及び／または抗体にとって到達可能であり、故に、組み換え発現ベクターによってコードされ、本明細書に記載される免疫原を含む免疫原性組成物（アジュバントを更に含み得る）中に含まれる、有用な免疫原であり得る。
【００７０】
免疫原としての使用が企図される、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌種に由来する抗原としては、Ａｇｒ系、Ｓａｒ及びＳａｅ、Ａｒｌ系、Ｓａｒ相同体（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺ、及びＴｃａＲ）、Ｓｒｒ系、ならびにＴＲＡＰなどの病原性制御因子が挙げられる。免疫原としての役割を果たし得る他のブドウ球菌タンパク質としては、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡ、及びＣｆｖＢが挙げられる（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄ．Ｊｏｄｉ  Ｌｉｎｄｓａｙを参照されたい）。黄色ブドウ球菌の２つの種（Ｎ３１５及びＭｕ５０）のゲノムは配列決定されており、例えば、ＰＡＴＲＩＣ（ＰＡＴＲＩＣ：Ｔｈｅ  ＶＢＩ  ＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００７）３５：４０１−４０６）などで公的に入手可能である。当業者によって理解されるように、免疫原としての使用のためのブドウ球菌タンパク質はまた、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、及びＴｒＥＭＢＬなどの他の公共データベースおいても特定され得る。
【００７１】
本明細書に記載される特定の実施形態において、免疫原としての使用が企図される肺炎連鎖球菌に由来する抗原としては、ニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔ、及びピリンタンパク質（ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、ＲｒｇＣ）が挙げられる。肺炎連鎖球菌の免疫原性タンパク質もまた、当該技術分野において既知であり、免疫原としての使用が企図される（例えば、Ｚｙｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０００  ６８（６）：３７４０−４３を参照されたい）。肺炎連鎖球菌の毒性株の完全なゲノム配列は配列決定されており（例えば、Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９３（５５２９）：４９８−５０６を参照されたい）、当業者によって理解されるように、本明細書に記載される組成物中に使用するための肺炎連鎖球菌タンパク質はまた、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、及びＴｒＥＭＢＬなどの他の公共データベースにおいても特定され得る。本開示に従う免疫原にとって特に対象となるタンパク質としては、肺炎球菌の表面に露出されることが予想される病原性因子及びタンパク質が挙げられる（例えば、上記のＴｅｔｔｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１０）Ｊｕｌ１２；１０：１９０、Ｒｉｇｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）３８（２）：１４３−６８、Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００１）６５（２）：１８７−２０７を参照されたい）。
【００７２】
免疫原として使用され得る細菌抗原の例としては、アクチノミセスポリペプチド、バチルスポリペプチド、バクテロイデスポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡ）、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、キャプノサイトファーガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、コリネバクテリウムポリペプチド、コクシエラポリペプチド、デルマトフィルスポリペプチド、エンテロコッカスポリペプチド、エーリキアポリペプチド、エシェリキアポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フソバクテリウムポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド（例えば、Ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザエ外膜タンパク質）、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、Ｌ型細菌ポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリアポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド（すなわち、肺炎連鎖球菌ポリペプチド）（本明細書の記載を参照されたい）、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロシャリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、シゲラポリペプチド、ブドウ球菌ポリペプチド、Ａ群連鎖球菌ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌Ｍタンパク質）、Ｂ群連鎖球菌（ストレプトコッカス・アガラクチア）ポリペプチド、トレポネーマポリペプチド、及びエルシニアポリペプチド（例えば、エルシニア・ペスチスＦ１及びＶ抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
免疫原であり得る真菌性抗原の例としては、アブシジアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、バシジオボラスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コクシジオイデスポリペプチド、コニディオボラスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、クルバラリア（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）ポリペプチド、エピデルモフィトンポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラズマポリペプチド、マヅレラポリペプチド、マラセチアポリペプチド、ミクロスポルムポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルチエレラポリペプチド、ムコールポリペプチド、ペシロマイセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィアロフォラポリペプチド、プロトテカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、シュードミクロドキウムポリペプチド、フィチウムポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、リゾプスポリペプチド、スコレバシジウムポリペプチド、スポロトリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、トリコフィトンポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、及びキシロヒファポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
寄生原虫抗原の例としては、バベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、エイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、エントアメーバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンジアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポーラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、微胞子虫ポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノゼマポリペプチド、腸トリコモナスポリペプチド、プラスモジウムポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。寄生蠕虫抗原の例としては、アカントケイロネマポリペプチド、アエルロシトロンギルスポリペプチド、アンシロストーマポリペプチド、アンギオストロンギルスポリペプチド、アスカリスポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムムポリペプチド、キャピラリアポリペプチド、カベルチアポリペプチド、クーペリアポリペプチド、クレノソマポリペプチド、ディクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィーマポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、ジフィロボスリウムポリペプチド、ジプリジウムポリペプチド、ジロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイデスポリペプチド、ヘモンクスポリペプチド、ラゴキルアスカリスポリペプチド、ロアポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、ナノフィエタスポリペプチド、ネカトールポリペプチド、ネマトジルスポリペプチド、エソファゴストムポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタギアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、パラゴニムスポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、スピロセルカポリペプチド、スピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイデスポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、トリキネラポリペプチド、トリコストロンギルスポリペプチド、トリチュリスポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、及びウケレリアポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。（例えば、スポロゾイト周囲熱帯熱マラリア原虫（ＰｆＣＳＰ））、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓ステート抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ−ｔｅｒｍ）、及び輸出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスチスポリペプチド、サルコシスティスポリペプチド、シストソーマポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、ならびにトリパノソーマポリペプチド。
【００７５】
外寄生虫抗原の例としては、ノミ；マダニ（カタダニ及びヒメダニを含む）；ユスリカ、蚊、スナバエ、ブヨ、ウシアブ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ幼虫症を引き起こすハエ、ヌカカなどのハエ；アリ；クモ、シラミ；ダニ；ならびにトコジラミ及びサシガメなどのナンキンムシからのポリペプチド（保護抗原及びアレルゲンを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）もしくは細胞媒介応答（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を含む）のいずれか、またはその両方の免疫応答の誘導はまた、緑膿菌、結核菌、ライ菌、及びリステリア・イノキュアなどの追加の生物の食菌または殺菌に寄与し得る。ＣＴＬ免疫応答は、緑膿菌、結核菌、ライ菌、及びリステリア・イノキュアの殺菌に寄与する（例えば、２０１０年６月２３日にインターネット上で公開されたＯｙｋｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０：２４９４８２）を参照されたい）。したがって、本明細書に記載される免疫原性組成物に有用であり、組み換え発現ベクター及びベクターを含むベクター粒子によってコードされ得る免疫原はまた、これらの細菌に由来し得る。細菌種のうちのいずれか１つの細菌ゲノムによってコードされ、細菌によって発現される多数のポリペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野及び公的に利用可能なタンパク質配列データベースにおいて容易に特定され得る。（例えば、Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４０６：９５（２０００）も参照されたい）。
【００７７】
本明細書に記載される免疫原は、真菌または寄生虫から取得されても、それらに由来してもよい。ＣＴＬ免疫応答を含む免疫応答を誘導する例示的な寄生虫としては、マンソン住血吸虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ原虫、及び熱帯熱マラリア原虫（例えば、上記のＯｙｋｈｍａｎを参照されたい）が挙げられる。したがって、これらの寄生虫に由来するか、またはそれらから取得されるタンパク質抗原は、それぞれの寄生虫に対する免疫応答を誘導するための免疫原として有用であり得る。免疫原はまた、クリプトコッカス・ネオフォルマンス及びカンジダ・アルビカンス（例えば、上記のＯｙｋｈｍａｎを参照されたい）を非限定的に含む真菌種から取得されても、それらに由来してもよい。
【００７８】
免疫原性ポリペプチド（例えば、本明細書及び／もしくは当該技術分野において記載される腫瘍関連抗原または微生物抗原のうちのいずれか）のうちの少なくとも１つの免疫原性断片を含むポリペプチドが免疫原として使用されてもよく、本明細書に記載される組み換え発現ベクターによってコードされてもよい。免疫原性断片は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたは少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。免疫原性断片は、少なくとも６、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれ以上の隣接アミノ酸の免疫原性ポリペプチドからなり得る。免疫原性断片は、上述の範囲内の任意の数の隣接アミノ酸を含み得るため、例えば、免疫原性断片は、６〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００の間、またはそれ以上の隣接アミノ酸の免疫原性ポリペプチドとなる。免疫原性断片は、直鎖状エピトープを形成する十分な数の隣接アミノ酸を含んでもよく、かつ／または断片が、その断片が由来する全長ポリペプチドと同一の（もしくは十分に類似した）３次元の立体構造で折り畳まれて、非直鎖状エピトープ（複数可）（当該技術分野において、立体構造エピトープとも呼ばれる）を呈することを可能にする十分な数の隣接アミノ酸を含んでもよい。免疫原性断片が全長ポリペプチドと同等の立体構造に折り畳まれるかどうかを評価するためのアッセイとしては、例えば、タンパク質が天然エピトープもしくは折り畳まれていないエピトープに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応する能力、他のリガンド結合機能の保持、及びプロテアーゼによる消化に対するポリペプチド断片の感受性または抵抗性（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）を参照されたい）が挙げられる。したがって、例として、ポリペプチド断片の３次元立体構造は、全長ポリペプチドに特異的に結合する抗体の結合能力及び結合レベルが、断片についても全長ポリペプチドについても実質的に同一である（すなわち、例示的な全長抗原または野生型の全長抗原の免疫原性と比較して、統計的、臨床的、及び／もしくは生物学的に十分な程度、結合レベルが保持されている）とき、全長ポリペプチドに十分に類似している。
【００７９】
対象となるポリペプチドまたはその免疫原性断片の３次元構造の決定は、その免疫原性断片が全長ポリペプチド中に見出されるアミノ酸の空間的位置付けを保持するかどうかを決定するための通例の方法論によって実行され得る。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０９：１８６８−７１（２００５）、Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０：６３８（２００５）、Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３：１２４４（２００６）、Ｄｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５０：１７６（２００７）、Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５０：２５９（２００７）を参照されたい。細胞膜を横断することが既知であるか、または考えられる、ポリペプチドの膜貫通セグメント及び膜トポロジーを予想するために有用であるソフトウェアツール、例えば、ＰＳＯＲＴまたはＰＳＯＲＴ  ＩＩ、及びＳｐｓｃａｎ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）もまた、当該技術分野において利用可能である（例えば、Ｎａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：３４−３６（１９９９）を参照されたい）。
【００８０】
上記の技術とは別個に、またはそれと組み合わせて、対象となる指定抗原の例示的なアミノ酸配列を考慮して、当業者は、ポリペプチド抗原の潜在的なエピトープを特定することができる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８１−８６（１９８８）を参照されたい）。別の例として、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓは、ポリペプチド領域の親水性とそれらの抗原性との間の密接した相関性の経験的実証に基づく親水性法を記載する（例えば、Ｈｏｐｐ，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６：１８３−９０（１９９３）、Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ４６：８５５−６６（１９８７）を参照されたい）。Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープを特定するためのコンピュータプログラムも利用可能である。ＥＰＩＰＬＯＴと呼ばれるＢＡＳＩＣプログラムは、１３の異なる尺度を使用して、柔軟性、親水性、及び抗原性プロファイルを計算し、プロットすることによって、それらの一次構造からタンパク質中のＢ細胞抗原部位を予想する（例えば、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：１０１−１０５（１９９０）を参照されたい）。Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９：４６５−４７２（１９９６）、Ｐｅｌｌｅｑｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｇ．Ｂ．Ｗｉｓｄｏｍ），ｐｐ．７−２５；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９４）、Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ”，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ（ｅｄ．Ｍ．Ｈ．Ｖ．Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ），Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１−２７．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９２）なども参照されたい。
【００８１】
免疫原として使用され得る指定抗原のＴ細胞エピトープはまた、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ５０：２１３−２１９（１９９９））、もしくはＰａｒｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（上記）によって開発されたアルゴリズムに基づくペプチドモチーフ検索プログラムを使用しても、またはＤｏｙｔｃｈｉｎｏｖａ  ａｎｄ  Ｆｌｏｗｅｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８０（３）：２７０−９（２００２）、Ｂｌｙｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１８：４３４−４３９（２００２）、Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２：６３−６６（２００３）、Ｆｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１：１６７−１７６（２００２）、Ｍａｌｌｉｏｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：９４２−４８（２００１）、Ｓｃｈｉｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５７：１−１６（２００１）に記載されるものなどの方法を使用しても特定することができる。
【００８２】
本明細書に記載される免疫原及び方法において、免疫原として使用され得る指定微生物抗原または指定腫瘍抗原のエピトープ領域はまた、当該技術分野において記載される。例として、例えば、Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｍａｒ−Ａｐｒ：Ｓｕｐｐｌ２：ｓ４４３−４４７（１９８９）、Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１２４５−４９（１９８７）、Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｐｒ．Ｒｅｖ．Ｓｕｐｐｌ２：１３１−３７（１９８６）、Ｍｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０１３−２７（１９８６）、Ｈｏｒｓｆａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１２：２１１−１３（１９９１）、Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１４３−５２（１９９０）、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：１２３６−３７（２００１）、ＤｅＧｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１９：４３８５−９５（２００１）、ＤｅＬａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１７２５−２９（１９９９）、Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４７３１−４１（２０００）、Ｃｏｎｓｏｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０３９−４４（２００３）、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１２：５９３−６１０（１９９６）、Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５８３−８８（２００１）、Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６６６５−７０（２００１）を参照されたい。
【００８３】
エピトープ領域を特定するための追加の方法としては、Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ２９：２７０−２８１（２００３）、Ｍａｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５５：２７−４０（２００１）に記載される方法が挙げられる。エピトープを特定するためのアッセイは、本明細書に記載され、当業者にとって既知であり、それらには、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）に記載されるものが挙げられる。
【００８４】
対象となる指定抗原の免疫原性領域及び／またはエピトープの特定は、当業者によって通例実施される方法及び技術を使用して、当業者によって、ならびに／またはコンピュータ分析及びコンピュータモデル化によって容易に経験的に決定され得る。例として、経験的方法としては、特定の長さの隣接アミノ酸のタンパク質を含むポリペプチド断片を合成すること、または１つ以上のプロテアーゼを使用することによって断片を生成して、その後、当該技術分野において通例実施される多数の結合アッセイもしくは免疫アッセイ法のうちのいずれか１つを使用して、その断片の免疫原性を決定することが挙げられる。ある断片に特異的に結合する抗体（ポリクローナル、モノクローナル、またはその抗原結合断片）の能力を決定するための例示的な方法としては、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、免疫ブロット、競合的結合アッセイ、蛍光標示式細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）、及び表面プラズモン共鳴が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープの配列は、公的に利用可能なデータベースから取得することができる。例えば、Ｔ細胞定義腫瘍抗原を含むペプチドデータベースは、インターネット上で、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙによって出資され、定期的に更新されるペプチドデータベースにおいて見出すことができる（ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅｄａｔａｂａｓｅ／Ｔｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｈｔｍを参照されたい）。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓによって支援される別の利用可能なデータベースは、Ｂ細胞及びＴ細胞エピトープを検索するためのツールを提供し、エピトープ分析ツールを提供する（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ａｔ  ｉｍｍｕｎｏｅｐｉｔｏｐｅ（ｄｏｔ）ｏｒｇを参照されたい）。
【００８６】
抗原特異的Ｔ細胞株またはクローン、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ウイルス特異的もしくは細菌特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が入手可能である特定の例において、これらの細胞を使用して、特定の抗原によって調製された標的細胞を使用して関連するエピトープの存在をスクリーニングすることができる。そのような標的は、ＣＴＬによる溶解について標的細胞を感作させるのに使用される、ランダムまたは選択された合成ペプチドライブラリーを使用して調製され得る。Ｔ細胞株またはクローンが入手可能である場合に、関連するエピトープを特定するための別のアプローチは、組み換えＤＮＡ方法論を使用することである。ＣＴＬ感受性標的からの遺伝子またはｃＤＮＡライブラリーがまず調製され、非感受性標的細胞へとトランスフェクトされる。これは、ＣＴＬエピトープを含有するペプチドのタンパク質前駆体をコードする遺伝子の特定及びクローニングを可能にする。このステップにおける第２のステップは、関連するクローニングされた遺伝子から切断された遺伝子を調製して、少なくとも１つのＣＴＬエピトープをコードする領域を狭めることである。遺伝子が大きすぎない場合、このステップは任意である。第３のステップは、例えば、５〜１０個の残基だけ重複する、約１０〜２０アミノ酸長の合成ペプチドを調製することであり、これらを使用して、標的をＣＴＬについて感作させる。ペプチド（複数可）が関連するエピトープを含有することが示されるとき、所望される場合には、そのエピトープを含有する最小サイズのペプチドを確立するために、より小さなペプチドが調製されてもよい。これらのエピトープは、典型的には、ＣＴＬエピトープについて９〜１０個の残基中、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープについて最大２０または３０残基中に含有されるが、必ずしもそうではない場合もある。
【００８７】
あるいは、エピトープは、特定の主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子によって非共有結合されるペプチドの直接的溶出、その後、溶出したペプチドのアミノ酸配列決定によって定義され得る（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２０００Ｍａｙ；６Ｓｕｐｐｌ３：Ｓ２７２−８０を参照されたい）。簡潔に述べると、溶出したペプチドはＨＰＬＣなどの精製法を使用して分離され、個々の画分が、ＣＴＬ溶解の標的を感作させるか、またはＨＴＬ中のサイトカイン分泌の増殖を誘導する、それらの能力について試験される。画分がペプチドを含有すると特定された場合、それは更に精製され、配列分析へと提出される。ペプチド配列はまた、タンデム質量分析を使用しても決定することができる。その後、合成ペプチドが調製され、ＣＴＬまたはＨＴＬとともに試験されて、正確な配列及びペプチドが特定されていることが実証される。
【００８８】
エピトープはまた、Ｔｈ応答を誘発する潜在性を有するペプチドモチーフを検索する、Ｔｓｉｔｅｓプログラムなどのコンピュータ分析を使用しても特定することができる（例えば、Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：９３−１００，１９８８、Ｄｅａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５−１５５，１９９６を参照されたい）。マウス及びヒトのクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣに結合するのに適切なモチーフを有するＣＴＬペプチドは、ＢＩＭＡＳ（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４）及び他のＨＬＡペプチド結合予想分析に従って特定され得る。簡潔に述べると、例えば、微生物構成成分もしくは抗原、または腫瘍細胞構成成分もしくは腫瘍抗原からのタンパク質配列が、ＭＨＣ結合モチーフの存在について試験される。各ＭＨＣ対立遺伝子について存在するこれらの結合モチーフは、典型的には９〜１０残基長であるＭＨＣクラスＩ結合ペプチドについて、通常２（または３）及び９（または１０）の位置で保存されたアミノ酸残基である。その後、ＭＨＣ結合モチーフを担持する配列を含む合成ペプチドが調製され、後続して、そのようなペプチドは、ＭＨＣ分子に結合するそれらの能力について試験される。ＭＨＣ結合アッセイは、多数の空の（非占有の）ＭＨＣ分子を発現する細胞（細胞性結合アッセイ）を使用するか、または精製されたＭＨＣ分子を使用するかのいずれかで実施され得る。その後、最後に、ＭＨＣ結合ペプチドは、インビトロでヒトリンパ球を使用するか、またはインビボでＨＬＡ遺伝子導入動物を使用するかのいずれかで、ナイーブ個体においてＣＴＬ応答を誘導するそれらの能力について試験される。これらのＣＴＬは、ペプチド感作された標的細胞、及びウイルス感染した細胞または腫瘍細胞などの抗原を天然処理する標的を使用して試験される。免疫原性を更に確認するために、ペプチドは、ＨＬＡ  Ａ２遺伝子導入マウスモデル及び／または様々なインビトロ刺激アッセイのいずれかを使用して試験されてもよい。
【００８９】
特定の実施形態において、免疫原は、それぞれの免疫原について当該技術分野において既知であり、入手可能であるアミノ酸配列中に、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する指定抗原のポリペプチド種を含む。アミノ酸の保存的置換は周知であり、ポリペプチド中に天然に存在し得るか、またはポリペプチドが組み換え産生されるときに導入され得る。アミノ酸置換、欠失、及び付加は、周知であり、かつ通例実施される変異原性法を使用してポリペプチド中に導入され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ２００１）を参照されたい）。オリゴヌクレオチド指定部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順を用いて、所望される置換、欠失、または挿入に従って変化した特定のコドンを有する変化したポリヌクレオチドをもたらすことができる。免疫原として使用され得る指定抗原の欠失または切断バリアントはまた、所望される欠失に隣接する、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することによっても構築することができる。制限に後続して、オーバーハングが充填され、ＤＮＡが再連結され得る。あるいは、アラニンスキャニング変異誘発、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、及びオリゴヌクレオチド特異的変異誘発などのランダム変異誘発技術を使用して、免疫原ポリペプチドバリアントを調製してもよい（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。特定の指定抗原（またはそのポリペプチド断片）の種（またはバリアント）は、当該技術分野において既知である例示的なアミノ酸配列のうちのいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド免疫原を含む。
【００９０】
これらのポリペプチド免疫原バリアントは、それぞれの指定抗原の１つ以上の生物活性または機能を保持する。具体的には、指定抗原のバリアントである免疫原は、統計的、臨床的、または生物学的に有意な様式で、対象において、免疫応答（例えば、体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）、細胞媒介応答（すなわち、Ｔ細胞応答（細胞傷害性Ｔリンパ球応答を含む））、または体液性応答及び細胞媒介応答の両方を誘導する能力を保持する。当該技術分野において、ポリペプチド中に変異を導入するために通例実施される多くの分子生物学、タンパク質発現、ならびにタンパク質単離技術及び方法を考慮すると、ポリペプチド断片の調製、断片及びバリアントの単離、ならびに所望される生物活性を有するそれらの免疫原ポリペプチドバリアント及び断片の分析は、過度の実験法なしで容易に行われ得る。
【００９１】
当業者に既知である様々な判断基準は、ペプチドまたはポリペプチド中の特定の位置で置換されているアミノ酸が保存的である（または類似している）かどうかを示す。例えば、類似したアミノ酸または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似したアミノ酸は、以下のカテゴリ、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するベータを有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）に含まれ得る。分類がより困難であると考えられるプロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、及びアラニン）と特性を共有する。特定の状況において、グルタミン酸についてのグルタミンの置換及びアスパラギン酸についてのアスパラギンの置換は、グルタミン及びアスパラギンがそれぞれグルタミン酸及びアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点で、類似した置換であると考えられる。当該技術分野において理解されるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列、及びそれに対する保存されたアミノ酸置換物を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって（例えば、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、または本明細書に記載され、当該技術分野において実施される他のアルゴリズムを使用して）決定される。
【００９２】
天然免疫原性断片について本明細書に記載するように、それぞれのバリアントが非バリアントポリペプチドまたは断片と同等の立体構造に折り畳まれるかどうかを評価するためのアッセイとしては、例えば、タンパク質が天然エピトープもしくは折り畳まれていないエピトープに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応する能力、リガンド結合機能の保持、及びプロテアーゼによる消化に対する変異体タンパク質の感受性または抵抗性が挙げられる（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。そのようなバリアントは、本明細書に記載される方法、または当業者によって通例実施される当該技術分野において既知の他の方法に従って特定、特性評価、及び／または作製され得る。
【００９３】
本明細書に記載される免疫原性組成物中に含まれる単離された／組み換え免疫原は、分子生物学及び／またはポリペプチド精製の技術分野において通例実施される様々な方法及び技術に従って産生され、調製され得る。対象となる免疫原を組み換え産生するために使用される発現ベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９ａｎｄ２００１ｅｄｉｔｉｏｎｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）及びＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）を参照されたい）に記載される、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、及びＤＮＡ配列決定の標準技術を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知である多数の好適な分子生物工学技術のうちのいずれかを使用して達成することができる。効率的な転写及び翻訳を取得するために、各組み換え発現構築物中のポリヌクレオチド配列は、リーダー配列、及び特に免疫原をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーターなどの少なくとも１つの適切な発現制御配列（制御配列とも呼ばれる）を含む。
【００９４】
宿主細胞が組み換え発現ベクターで遺伝子操作されて、組み換え技術によって、免疫原（複数可）またはそれ（ら）の断片もしくはバリアントが産生される。本明細書に記載されるポリペプチド及び融合ポリペプチドのうちのそれぞれは、適切なプロモーターの制御下、哺乳類細胞、酵母菌、細菌、昆虫、または他の細胞中で発現され得る。細胞を含まない翻訳系を用いても、ＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を産生することができる。原核生物宿主及び真核生物宿主とともに使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００１）によって記載される。
【００９５】
一般に、対象となる免疫原を産生するために有用な組み換え発現ベクターは、複製の起点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー（例えば、大腸菌のアンピシリン抵抗性遺伝子及び出芽酵母ＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流構造配列の転写を指示する、高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含む。プロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖酵素、α因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列及び終了配列によって適切な相において組み立てられる。
【００９６】
任意で、所望される特徴（例えば、発現された組み換え産生物の精製を単純化する特徴）を与えるペプチドまたはポリペプチドをもたらすために、免疫原をコードするヌクレオチド配列を有するフレーム中に異種配列を挿入してもよい。そのような特定ペプチドは、ポリヒスチジンタグ（ｈｉｓタグ）もしくはＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＧＳＴ、またはＸＰＲＥＳＳ（商標）エピトープタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）など（例えば、米国特許第５，０１１，９１２、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４（１９８８）を参照されたい）を含む。親和性配列は、例えば、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてもたらされるヘキサ−ヒスチジンタグなどのベクターによって供給されてもよい。あるいは、親和性配列は、合成的に追加されるか、または核酸コード配列を組み換え生成するために使用されるプライマー中に（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して）操作されるかのいずれかであり得る。
【００９７】
記載される組み換え発現構築物を含有する宿主細胞は、発現構築物（例えば、クローニングベクター、シャトルベクター、または発現構築物）で遺伝子操作（形質導入、形質転換、またはトランスフェクト）され得る。ベクターまたは構築物は、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、必要に応じて、プロモーターを活性化させるか、形質転換を選択するか、またはコード−ヌクレオチド配列を増幅するために修飾された従来の栄養培地中で培養され得る。温度、ｐＨなどの特定の宿主細胞のための培養条件の選択及び維持は、当業者にとって容易に明らかとなるであろう。好ましくは、宿主細胞は培養中で持続的に増殖するように適合されて、ポリペプチドの産生のための当該技術分野で確立された方法論に従って、細胞株をもたらし得る。特定の実施形態において、細胞株は不死細胞株であり、これは、対数期増殖に従って、培養中で反復して（生存可能でありながら少なくとも１０回）継代培養され得る細胞株を指す。
【００９８】
有用な細菌発現構築物は、発現ベクターに、機能性プロモーターを用いて操作可能な読み取り相に、好適な翻訳開始シグナル及び終了シグナルとともに、所望される免疫原をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。構築物は、１つ以上の表現型選択可能マーカー及び１つの複製の起点を含んで、ベクター構築物の維持、及び望ましい場合、宿主内の増幅の提供を確保し得る。形質転換のための好適な原核生物宿主としては、大腸菌、バチルス・スブチリス、サルモネラ・チフィリウム、及びシュードモナス属、ストレプトマイセス属、及びブドウ球菌属内の様々な種が挙げられるが、他のものもまた、選択次第で用いられてもよい。任意の他のプラスミドまたはベクターは、それらが宿主中で複製可能かつ生存可能である限り、使用されてもよい。故に、例えば、対象となる免疫原または指定抗原をコードするヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発現させるための様々な組み換え発現構築物のうちのいずれか１つに含まれ得る。そのようなベクター及び構築物としては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列、例えば、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母菌プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び仮性狂犬病などのウイルスＤＮＡが挙げられる。しかしながら、それが宿主中で複製可能かつ生存可能である限り、任意の他のベクターを使用して、組み換え発現構築物を調製してもよい。
【００９９】
適切なＤＮＡ配列（複数可）は、様々な手順によってベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該技術分野において既知の手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅、及び精製のための標準技術、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどに関与する酵素反応ための標準技術、ならびに様々な分離技術は当業者に既知であり、彼らによって一般的に用いられているものである。多数の標準技術が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３））、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ２００１））、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２））、及び他に記載される。
【０１００】
発現ベクター中でポリペプチド免疫原をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、プロモーターまたは制御されたプロモーター）に作動的に連結されて、ｍＲＮＡ合成を指示する。そのような発現制御配列の代表的な例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーター、及び原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが既知である他のプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコール転移酵素）ベクターまたは選択可能なマーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望される遺伝子から選択され得る。特定の細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ５、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ、及びｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択、ならびに少なくとも１つの免疫原をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結された、少なくとも１つのプロモーターまたは制御されたプロモーターを含む特定の組み換え発現構築の調製は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【０１０１】
誘導可能な制御されたプロモーター及び／または厳密に制御されたプロモーターの設計及び選択は、当該技術分野において既知であり、特定の宿主細胞及び発現系（例えば、Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７７：４１２１−３０（１９９５）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６９３１−３３（１９７８）、Ｈｉｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１１：５４５−５０（１９７７）に記載される、大腸菌アラビノースオペロン（ＰｂａｄまたはＰａｒａ）を参照されたい、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から入手可能なＰＥＴ発現系（米国特許第４．９５２，４９６号を参照されたい）、ｔｅｔ制御発現系（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７−５１（１９９２）、Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：１７６６−６９（１９９５））に依存し、ｐＬＰ−ＴＲＥ２受容体ベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＣｒｅａｔｏｒ（商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔとともに使用するために設計される）、例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ１４：３８１−９２（１９９８）、Ｆｕｒｔｈ，Ｊ．Ｍａｍｍ．Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓ．２：３７３（１９９７）も参照されたい）、例えば、Ｃａｓｃｉｏ，Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ２５：５２９（２００１）を参照されたい）。
【０１０２】
免疫原をコードする核酸配列は、バキュロウイルスシャトルベクターへとクローニングされ得、これがその後、バキュロウイルスと組み換えられて、例えば、Ｓｆ９宿主細胞を感染させるのに使用される組み換えバキュロウイルス発現構築物を生成する（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３９，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ１９９５）、Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ，Ｃｈａｐｔｅｒ１６，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄＥｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９２）を参照されたい）。
【０１０３】
単離され、精製する組み換え免疫原のために使用され得る方法としては、例として、培養培地に組み換え免疫原を分泌する好適な宿主／ベクター系から上清を取得し、その後、商業的に入手可能なフィルタを使用してその培地を濃縮することが挙げられ得る。濃縮後、濃縮物は、親和性マトリクスまたはイオン交換樹脂などの、単一の好適な精製マトリクスまたは一連の好適なマトリクスに適用され得る。１つ以上の逆相ＨＰＬＣステップを用いて、組み換えポリペプチドを更に精製してもよい。これらの精製方法はまた、免疫原または指定抗原をその天然環境から単離させるときにも用いることができる。
【０１０４】
本明細書に記載される単離された／組み換え免疫原のうちの１つ以上の大規模な産生のための方法としては、適切な培養条件を維持するために監視され、制御される、バッチ細胞培養が挙げられる。免疫原の精製は、本明細書及び当該技術分野に記載され、国内外の規制当局の法及びガイドラインに適合する方法に従って実行され得る。
【０１０５】
アジュバント及びアジュバント組成物
本明細書に記載するように、免疫原性組成物は、免疫原に対する、及びそのそれぞれの指定抗原に対する免疫応答を亢進する（または改善する、増大する）（すなわち、アジュバントの投与の不在下での特異的免疫応答のレベルと比較して、統計的、生物学的、または臨床的に有意な様式で、免疫原及び指定抗原に対する特異的免疫応答のレベルを増加させる）ことが意図される少なくとも１つのアジュバントを更に含み得る。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、単離され得る、かつ／または組み換えられ得る少なくとも１つの免疫原と、少なくとも１つのアジュバントとを含む。
【０１０６】
他の特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫原をコードする組み換え発現ベクターを含み、免疫原の発現を指示することができる免疫原性組成物は、アジュバントを更に含む。他の特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物及び組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の両方は、アジュバントを更に含む。更なる他の実施形態において、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物とアジュバントを組み合わせる代わり、またはこの免疫原性組成物と同時にアジュバントを投与する代わりに、アジュバントはより後の時間に投与され、ベクターを含む免疫原性組成物とは異なる経路及び／または異なる部位によって投与されてもよい。アジュバントが、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の投与後に投与される場合、アジュバントは、免疫原性組成物の投与の１８時間後、２４時間後、３６時間後、７２時間後、または１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、または７日（１週間）後に投与される。免疫応答のレベルを決定するための方法及び技術は、本明細書に詳細に論じられ、当該技術分野において通例実施されるものである。
【０１０７】
免疫原性組成物中に含まれ、本明細書に記載される方法において使用され得る例示的なアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに必ずしも限定されない。これらの方法において使用され得るアジュバントとしては、免疫原（複数可）及びそれぞれの指定抗原（複数可）に特異的な、体液性応答、細胞性応答、または体液性応答及び細胞性応答の両方を亢進するために有用なアジュバントが挙げられる。細胞性免疫応答は、免疫原及びそのそれぞれの指定抗原に特異的な、ＣＤ４Ｔ細胞応答（メモリーＣＤ４Ｔ細胞応答を含み得る）及びＣＤ８Ｔ細胞応答を含む。細胞性応答はまた、免疫原に対する（あるいは免疫原（複数可）を担持または発現する細胞もしくは粒子に対する）細胞傷害性Ｔ細胞応答（ＣＴＬ応答）を含み得る。所望されるアジュバントは、応答の定性的形態に悪影響を与え得る免疫原の立体構造的変化を引き起こすことなく、免疫原に対する応答を増大させる。好適なアジュバントとしては、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）などのアルミニウム塩、もしくは他のアルミニウム含有アジュバント；非限定的な例として、無毒性モノホスホリルリピドＡなどの無毒性リピドＡ関連アジュバント（例えば、Ｔｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．６：９９−１０７（１９８７）、Ｐｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：ｓ３２−ｓ３７（２００２）を参照されたい）；本明細書に記載されるＧＬＡ；３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（例えば、英国特許出願第ＧＢ２２２０２１１号を参照されたい）；ＱＳ２１及びＱｕｉｌＡなどの、南米において見られるキラヤ・サポナリア・モリナ木の樹皮から単離されたトリテルペングリコシドまたはサポニンを含むアジュバント（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）内のＫｅｎｓｉｌら、米国特許第５，０５７，５４０を参照されたい）が挙げられる。他の好適なアジュバントとしては、任意でモノホスホリルリピドＡなどの免疫刺激剤と組み合わせた、水乳濁剤中の油（スクアレンまたはピーナツ油など）（例えば、Ｓｔｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７）を参照されたい）が挙げられる。別の好適なアジュバントは、ＣｐＧ（例えば、Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（３−４）：１３５−５４（２００６）、米国特許第７，４０２，５７２号、欧州特許第７７２  ６１９号を参照されたい）である。
【０１０８】
本明細書に記載するように、好適なアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、または硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩である。そのようなアジュバントは、ＭＰＬもしくは３−ＤＭＰ、ＱＳ２１、重合体もしくは単量体アミノ酸（ポリグルタミン酸もしくはポリリジンなど）などの他の特定の免疫刺激剤あり、またはなしで使用することができる。別のクラスの好適なアジュバントは、水中油型乳濁剤配合物（本明細書では安定な水中油型乳濁剤とも呼ばれる）である。そのようなアジュバントは、任意で、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−  −グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル（ｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトイルプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））などの他の特定の免疫刺激剤、または他の細菌細胞壁構成成分とともに使用することができる。水中油型乳濁剤は、（１）モデル１１０Ｙマイクロ流動化装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）などのマイクロ流動化装置を使用してサブミクロンの粒子中に配合された、５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、及び０．５％のＳｐａｎ８５（任意で様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有）を含有するＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）と、（２）サブミクロンの乳濁剤へとマイクロ流動化されるか、ボルテックスされて、より大きい粒径の乳濁剤が生成されるかのいずれかである、１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦと、（３）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁構成成分を含有するＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）とを含む。また、上記のように、好適なアジュバントは、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ２１，Ａｑｕｉｌａ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）、またはそれから生成された粒子（ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）及びＩＳＣＯマトリクスなど）などのサポニンアジュバントを含む。他のアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（非ヒト用途にとっては好適であるが、ヒト用途には不適である）及びフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。他のアジュバントとしては、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインが挙げられる。
【０１０９】
本明細書に記載するように、アジュバントは、無毒性リピドＡ関連（またはリピドＡ誘導体）アジュバントであり得る。特定の一実施形態において、アジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとしての役割を果たすその能力に基づいて選択される。例として、ＴＬＲ４アゴニストとしての役割を果たし、本明細書に記載される組成物中で使用され得る無毒性リピドＡ関連アジュバントは、ＤＳＬＰとして特定されるものである。ＤＳＬＰ化合物は、それらが、グルコース及びアミノ置換グルコースから選択される２つの単糖基の連結によって形成される二糖（ＤＳ）基を含有するという特徴を共有し、二糖は、リン酸（Ｐ）基及び複数のリピド（Ｌ）基の両方に化学結合される。より具体的には、二糖は、それぞれが６個の炭素を有する２つの単糖単位から形成されるものとして可視化され得る。二糖において、単糖のうちの一方が還元末端を形成し、他方の単糖が非還元末端を形成する。便宜上、従来の炭水化物の番号付け命名法に従って、還元末端を形成する単糖の炭素は、位置１、２、３、４、５、及び６に位置するものとして表される一方で、非還元末端を形成する単糖の炭素の対応する炭素は、１’、２’、３’、４’、５’、及び６’に位置するものとして表される。ＤＳＬＰにおいて、非還元末端の位置１の炭素は、エーテル（−Ｏ−）基またはアミノ（−ＮＨ−）基のいずれかを通して、還元末端の位置６’の炭素に連結される。リン酸基は、好ましくは非還元末端の４’炭素を通して、二糖に連結される。リピド基のうちのそれぞれは、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）連結鎖またはエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）連結鎖のいずれかを通して、二糖に連結され、そこでカルボニル基がリピド基に連結される。二糖は、アミド基またはエステル基、すなわち非還元末端の位置２’、３’、及び６’、ならびに還元末端の位置１、２、３、及び４に連結され得る位置７を有する。
【０１１０】
リピド基は、少なくとも６個の炭素、好ましくは少なくとも８個、及びより好ましくは少なくとも１０個の炭素を有し、いずれの場合も、リピド基は、２４個以下の炭素、２２個以下の炭素、または２０個以下の炭素を有する。一実施形態において、リピド基はまとめて、６０〜１００個の炭素、好ましくは７０〜９０個の炭素を提供する。リピド基は炭素及び水素原子のみからなってもよく、すなわち、それはヒドロカルビルリピド基であってもよく、あるいはそれは１個のヒドロキシル基を含有してもよく、すなわち、それはヒドロキシル置換リピド基であってもよく、あるいはそれは、転じて、エステル基のカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）を通してヒドロカルビルリピド基またはヒドロキシル置換リピド基に連結されるエステル基を含有してもよく、すなわち、エステル置換リピドである。ヒドロカルビルリピド基は、飽和されても、不飽和であってもよく、ヒドロカルビルリピド基は、隣接する炭素原子との間に１つの二重結合を有する。
【０１１１】
ＤＳＬＰは、３個、または４個、または５個、または６個、または７個のリピド基を含む。一態様において、ＤＳＬＰは３〜７個のリピド基を含む一方で、別の態様において、ＤＳＬＰは４〜６個のリピドを含む。一態様において、リピド基は独立して、ヒドロカルビルリピド、ヒドロキシル置換リピド、及びエステル置換リピドから選択される。一態様において、位置１、４’、及び６’は、ヒドロキシルで置換される。一態様において、単糖単位はそれぞれ、グルコサミンである。ＤＳＬＰは、遊離酸形態または塩形態、例えば、アンモニア塩であってもよい。
【０１１２】
特定の実施形態において、ＤＳＬＰ上のリピドは以下によって記載され、位置３’は−Ｏ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒａ）（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ）で置換され、位置２’は−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒａ）（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ）で置換され、位置３は−Ｏ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）（Ｒａ）で置換され、位置２は−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）（Ｒａ）で置換され、Ｒａ及びＲｂのそれぞれはデシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシルから選択され、これらの用語のそれぞれは飽和ヒドロカルビル基を指す。一実施形態において、Ｒａはウンデシルであり、Ｒｂはトリデシルであり、このアジュバントは、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号において「ＧＬＡ」として記載されるものである。Ｒａがウンデシルであり、Ｒｂがトリデシルである化合物は、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  ＬｉｐｉｄからＰＨＡＤ（商標）アジュバントとして入手可能なもののように、立体化学的に定義された形態で使用され得る。
【０１１３】
一態様において、ＤＳＬＰは、３Ｄ−ＭＰＬとして知られる天然由来の化合物の混合物である。３Ｄ−ＭＰＬアジュバントは、医薬品等級で、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  ＣｏｍｐａｎｙからそれらのＭＰＬ（商標）アジュバントとして商業的に生産される。３Ｄ−ＭＰＬは、科学及び特許文献において詳細に記載されており、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ  Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ２１Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ：ｐａｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｕｌｒｉｃｈ，Ｊ．Ｔ．ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）及び米国特許第４，９１２，０９４を参照されたい。
【０１１４】
別の態様において、ＤＳＬＰアジュバントは、（ｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソサミン位置１と還元末端グルコサミンのヘキソサミン位置６との間のエーテル連結鎖を通して還元末端グルコサミンに連結した、還元末端グルコサミンを有するジグルコサミン骨格と、（ｉｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソサミン位置４に結合したＯ−ホスホリル基と、（ｉｉｉ）最大６個の脂肪酸アシル鎖とを含むものとして記載することができ、脂肪酸アシル鎖のうちの１つは、エステル連結鎖を通して還元末端グルコサミンの３−ヒドロキシに結合され、脂肪酸アシル鎖のうちの１つは、アミド連結鎖を通して非還元末端グルコサミンの２−アミノに結合され、エステル連結鎖を通して１２個超の炭素原子のアルカノイル鎖に連結されたテトラデカノイル鎖を含み、かつ脂肪酸アシル鎖のうちの１つは、エステル連結鎖を通して非還元末端グルコサミンの３−ヒドロキシに結合され、エステル連結鎖を通して１２個超の炭素原子のアルカノイル鎖に連結されたテトラデカノイル鎖を含む。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号を参照されたい。
【０１１５】
別の態様において、アジュバントは、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号に記載されるような、６個のリピド基を有する合成二糖であってもよい。
【０１１６】
別の態様において、ＤＳＬＰアジュバントは化学式（Ｉ）によって記載され、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）と呼ばれ、
【化２】
2017522312.tif 000003
式中、部分Ａ１及びＡ２は独立して、水素、ホスフェート、及びリン酸塩の群から選択される。ナトリウム及びカリウムは、リン酸塩の例示的な対イオンである。部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は独立して、Ｃ３−Ｃ２３によって表される、３〜２３個の炭素を有するヒドロカルビルの群から選択される。更なる明瞭さのため、ある部分が、複数の構成員を有する特定の群「から独立して選択される」とき、第１の部分に選択される構成員は、いかなる場合でも第２の部分に選択される構成員の選択に影響を与えたり、限定したりしないことが理解されるべきであることが説明される。Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６が連結される炭素原子は不斉であり、故に、ＲまたはＳ立体化学のいずれかで存在し得る。一実施形態において、それらの炭素原子の全てがＲ立体化学である一方で、別の実施形態において、それらの炭素原子の全てがＳ立体化学である。「ヒドロカルビル」とは、もっぱら水素及び炭素から形成された化学部分を指し、炭素原子の配置は直鎖または分岐鎖、非環式または環式であり得、隣接する炭素原子間の結合は、もっぱら単結合であり得、つまり、飽和ヒドロカルビルを提供し、あるいは、任意の２つの隣接する炭素原子の間に存在する二重または三重結合が存在して、すなわち、不飽和ヒドロカルビルを提供し得、ヒドロカルビル基中の炭素原子の数は、３〜２４個の炭素原子である。ヒドロカルビルはアルキルであり得、代表的な直鎖アルキルとしては、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシルなどを含む、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられる一方で、分岐鎖アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環式ヒドロカルビルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる一方で、不飽和環式ヒドロカルビルとしては、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルなどが挙げられる。不飽和ヒドロカルビルは、隣接する炭素原子（ヒドロカルビルが非環式である場合、それぞれ「アルケニル」または「アルキニル」と呼ばれ、ヒドロカルビルが少なくとも部分的に環式である場合、それぞれシクロアルケニ（ｃｙｃｌｏａｌｋｅｎｙ）及びシクロアルキニルと呼ばれる）との間に少なくとも１つの二重または三重結合を含有する。代表的な直鎖及び分岐鎖アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられる一方で、代表的な直鎖及び分岐鎖アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが挙げられる。式（Ｉ）のアジュバントは、当該技術分野において既知である合成方法、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２００９／０３５５２８号、及びそのそれぞれもまた参照によって本明細書に組み込まれる第２００９／０３５５２８号において特定される出版物において論じられる合成方法論によって取得することができる。アジュバントのうちの特定のものはまた、商業的にも取得することができる。
【０１１７】
ＤＳＬＰアジュバントは、当該技術分野において既知である合成方法、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２００９／０３５５２８号、及びそのそれぞれもまた参照によって本明細書に組み込まれる第２００９／０３５５２８号において特定される出版物において論じられる合成方法論によって取得することができる。化学的に合成されたＤＳＬＰアジュバント、例えば、式（Ｉ）のアジュバントは実質的に均一な形態で調製することができ、これは、存在するＤＳＬＰ分子、例えば、式（Ｉ）の化合物に関して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％純粋である調製物を指す。所与のアジュバント調製物の純度の決定は、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析、及び／または核磁気共鳴分析などによって、適切な分析化学方法論に精通している者によって容易に行われ得る。天然源から取得されるＤＳＬＰアジュバントは典型的には、化学的に純粋な形態では容易に作製されず、故に、合成的に調製されたアジュバントが、本明細書に記載される組成物及び方法における使用にとって好ましいアジュバントである。既に論じたように、アジュバントのうちの特定のものは商業的に取得することができる。１つのそのようなＤＳＬＰアジュバントは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ  ＡＬのカタログにおいて特定される、製品番号６９９８００であり、以下、Ｅ１０との組み合わせでＥ１を参照されたい。
【０１１８】
様々な実施形態において、アジュバントは、式（Ｉ）の化学構造を有するが、部分Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、これらの部分について既に提供された選択肢の部分集合から選択され、それらの部分集合は、以下、Ｅ１、Ｅ２などによって特定される。
Ｅ１：Ａ１はホスフェートまたはリン酸塩であり、Ａ２は水素である。
Ｅ２：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はＣ３−Ｃ２１アルキルであり、Ｒ２及びＲ４はＣ５−Ｃ２３ヒドロカルビルである。
Ｅ３：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はＣ５−Ｃ１７アルキルであり、Ｒ２及びＲ４はＣ７−Ｃ１９ヒドロカルビルである。
Ｅ４：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はＣ７−Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２及びＲ４はＣ９−Ｃ１７ヒドロカルビルである。
Ｅ５：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はＣ９−Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２及びＲ４はＣ１１−Ｃ１５ヒドロカルビルである。
Ｅ６：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はＣ９−Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２及びＲ４はＣ１１−Ｃ１７ヒドロカルビルである。
Ｅ７：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はＣ７−Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２及びＲ４はＣ９−Ｃ１５ヒドロカルビルである。
Ｅ８：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はＣ１１−Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２及びＲ４はＣ１２−Ｃ２０ヒドロカルビルである。
Ｅ９：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はＣ１１アルキルであり、Ｒ２及びＲ４はＣ１３ヒドロカルビルである。
Ｅ１０：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６はウンデシルであり、Ｒ２及びＲ４はトリデシルである。
【０１１９】
特定の実施形態において、Ｅ２〜Ｅ１０までのうちのそれぞれは、実施形態Ｅ１と組み合わされ、かつ／またはＥ２〜Ｅ９までのヒドロカルビル基は、アルキル基、好ましくは直鎖アルキル基である。ＤＳＬＰアジュバント、例えば、式（Ｉ）のアジュバントは、任意でコアジュバントとともに薬学的組成物中に配合され得、これらのそれぞれは以下に論じられる。この点に関して、米国ＧＬＡアジュバントのための水性配合物（ＡＦ）及び安定乳濁剤配合物（ＳＥ）などの配合物を提供する、米国特許公開第２００８／０１３１４６６号への言及がなされ、これらの配合物は、式（Ｉ）のアジュバントのうちのいずれにも使用することができる。特定の具体的な実施形態において、免疫原性組成物はＧＬＡを含み、ＧＬＡアジュバント（式Ｉを参照されたい）は、安定な水中油型乳濁剤（ＳＥ）（ＧＬＡ／ＳＥまたはＧＬＡ−ＳＥ）中に配合され、その後、少なくとも１つの免疫原と組み合わされる。
【０１２０】
任意で、以下及び本明細書に詳細に記載するように、非限定的な例として、アルミニウム塩及びＤＳＬＰアジュバント、アルミニウム塩及びＱＳ２１、ＤＳＬＰアジュバント及びＱＳ２１、ならびにアルムナ（ａｌｕｍｎａ）アルミニウム塩、ＱＳ２１、及びＭＰＬまたはＧＬＡを一緒になどの、２つ以上の異なるアジュバントが同時に使用されてもよい。また、任意でアルミニウム塩、ＱＳ２１、及びＭＰＬ、ならびにこれらの全ての組み合わせのうちのいずれかと組み合わせて、フロイント不完全アジュバント（例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ３２，１７３−１８６（１９９８）を参照されたい）が使用されてもよい。
【０１２１】
特定の実施形態において、ＤＳＬＰアジュバント、例えば、式（Ｉ）のアジュバントは、任意でコアジュバントとともに、医薬品（またはアジュバント組成物）中に配合されてもよく、これらのそれぞれは以下に論じられるか、または本明細書に記載されるか、もしくは当該技術分野において入手可能である任意の他のアジュバントである。この点に関して、米国ＧＬＡアジュバントのための水性配合物（ＡＦ）及び安定乳濁剤配合物（ＳＥ）などの配合物を提供する、米国特許公開第２００８／０１３１４６６号への言及がなされ、これらの配合物は、式（Ｉ）のアジュバントのうちのいずれに関しても使用することができる。
【０１２２】
本明細書において提供するように、式（Ｉ）のアジュバントなどのＤＳＬＰアジュバントは、本明細書でコアジュバントと呼ばれる第２のアジュバントと組み合わせて使用することができる。３つの例示的な実施形態において、コアジュバントは送達系であってもよく、それは免疫増強剤であってもよく、それは送達系及び免疫増強剤の両方として機能する組成物であってもよい（例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１（９）：１５１９−３０（２００４）を参照されたい）。コアジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体ファミリー生体分子の構成員を介して機能する免疫増強剤であってもよい。例えば、コアジュバントは、その一次作用様式について、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストのいずれかとして選択されてもよい。あるいはまたは追加で、コアジュバントは、その担体特性について選択されてもよく、例えば、コアジュバントは、乳濁剤、リポソーム、微粒子、またはミョウバンであってもよい。
【０１２３】
一実施形態において、コアジュバントはミョウバンであり、この用語はリン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）及び水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）などのアルミニウム塩を指す。ミョウバンがコアジュバントとして使用される場合、ミョウバンは、免疫原性組成物（または免疫原性組成物を含む調製物）の１用中量に、約１００〜１，０００μｇ、または２００〜８００μｇ、または３００〜７００μｇ、または４００〜６００μｇの量で存在し得る。式（１）のアジュバントは典型的には、ミョウバンの量未満の量で存在し、様々な特定の実施形態において、式（１）のアジュバントは、重量に基づいて、ミョウバンの重量に対して０．１〜１％、または１〜５％、または１〜１０％、または１〜１００％で存在する。
【０１２４】
特定の一実施形態において、アジュバントは、ワクチンまたは免疫原性組成物中で使用するのに十分なアジュバント化特性を有する乳濁剤である。そのような乳濁剤としては、水中油型乳濁剤が挙げられる。フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）は、１つのそのようなアジュバントである。別の好適な水中油型乳濁剤は、スクアレンと、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ（商標）８０界面活性剤としても知られる）と、ソルビタントリオレートとを含有するＭＦ−５９（商標）アジュバントである。スクアレンは、本来サメの肝油から取得される天然の有機化合物であるが、アマランス種、米糠、コムギ胚芽、及びオリーブを含む植物源（主に野菜油）からも入手可能である。他の好適なアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５０Ｖ（鉱物油系アジュバントである）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ２０６、及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＭＳ１３１２を含む、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  ＮＪ）である。鉱物油がコアジュバント中に存在し得るものの、一実施形態において、本明細書に記載される免疫原性組成物の油構成成分（複数可）は、全て代謝可能な油である。
【０１２５】
本明細書に記載される方法の実施においてコアジュバントとして使用され得る免疫増強剤の例としては、ＭＰＬ（商標）、ＭＤＰ及び誘導体、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、代替的な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、サポニン、小分子免疫増強剤（ＳＭＩＰ）、サイトカイン、ならびにケモカインが挙げられる。
【０１２６】
一実施形態において、コアジュバントは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから商業的に入手可能な（当初ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴによって開発された）ＭＰＬ（商標）アジュバントである。例えば、Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ２１ｆｒｏｍ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，ｅｄｓ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照されたい。ＭＰＬ（商標）アジュバントに関連して、本明細書に記載される組成物及び方法においてコアジュバントとしての使用に好適であるのは、ＡＳ０２（商標）アジュバント及びＡＳ０４（商標）アジュバントである。ＡＳ０２（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（商標）アジュバント及びＱＳ−２１（商標）アジュバント（本明細書において他で論じるサポニンアジュバント）の両方を含有する水中油型乳濁剤である。ＡＳ０４（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（商標）アジュバント及びミョウバンを含有する。ＭＰＬ（商標）アジュバントは、ＬＰＳを弱酸及び塩基加水分解で処理し、その後、修飾されたＬＰＳを精製することによって、サルモネラ・ミネソタＲ５９５のリポ多糖（ＬＰＳ）から調製される。
【０１２７】
別の実施形態において、コアジュバントは、キラヤ・サポナリア木種の樹皮に由来するものなどのサポニン、または修飾サポニン（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号、同第５，２７３，９６５号、同第５，３５２，４４９号、同第５，４４３，８２９号、及び同第５，５６０，３９８号を参照されたい）である。Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡによって販売される製品ＱＳ−２１（商標）アジュバントは、式（Ｉ）のアジュバントとともに使用され得る、例示的なサポニン含有コアジュバントである。サポニンに関連した代替的なコアジュバントは、当初Ｉｓｃｏｔｅｃ（Ｓｗｅｄｅｎ）によって開発され、典型的には、全てが蜂巣様構造へと形成された、キラヤ・サポナリアまたは合成類似体に由来するサポニン、コレステロール、及びリン脂質から形成される、ＩＳＣＯＭ（商標）ファミリーのアジュバントである。
【０１２８】
更に別の実施形態において、コアジュバントは、コアジュバントとして機能するサイトカインである（例えば、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１（６）：１４３９−４９（１９９５）、Ｔａｙｌｏｒ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３（９）：３２４１−４４（１９９５）、及びＥｇｉｌｍｅｚ，Ｃｈａｐ．１４，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００７）を参照されたい）。様々な実施形態において、サイトカインは、例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（例えば、Ｃｈａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ９（３）：２０７−１５（２００４）、Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８８：１４７−５４（２００２）、及び米国特許第５，６７９，３５６号を参照されたい）；あるいはＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）もしくはインターフェロン−β（ＩＦＮ−β））またはＩＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）（例えば、Ｂｏｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：７４９−９５（１９９７）、及びＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３０７−３６（２００５）を参照されたい）などのインターフェロン；インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（７）：３９８３−８８（２００４）を参照されたい）を特に含むインターロイキン；インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（例えば、Ｐｏｒｔｉｅｌｊｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２（３）：１３３−４４（２００３）、及びＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（２）：１３３−４６（２００３）を参照されたい）；インターロイキン−１５（Ｉｌ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）；胎児肝チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）であってもよい。式（Ｉ）のアジュバントなどのＤＳＬＰアジュバントは、ワクチン抗原と組み合わせる前にサイトカインとともに共配合されてもよく、抗原、ＤＳＬＰアジュバント（例えば、式（Ｉ）のアジュバント）、及びサイトカインコアジュバントは、別個に配合されてから組み合わされてもよい。
【０１２９】
特定の実施形態において、（単離され得る、かつ／または組み換えられ得る）免疫原を含む免疫原性組成物、及びアジュバントがともに配合される。他の特定の実施形態において、免疫原性組成物が２つ以上の免疫原を含む場合、アジュバントが各免疫原と別個に配合されても、２つ以上の免疫原がアジュバントとともに配合されて、単一免疫原性組成物を形成してもよい。２つ以上の免疫原が対象に投与されることが意図され、かつ免疫原がアジュバントと別個に配合される場合、各組成物が組み合わされて、単一免疫原性組成物を形成してもよい。
【０１３０】
他の特定の実施形態において、免疫原を含む免疫原性組成物、または免疫原をコードする組み換え発現ベクターもしくはベクターを含むベクター粒子を含む組成物は、アジュバントを含有するバイアルとは別個のバイアルにパッケージングされ、供給される。免疫原性組成物及びアジュバントのそれぞれは、本明細書に詳細に記載される、薬学的に許容される（すなわち、生理学的に好適または許容される）賦形剤（複数可）と組み合わされてもよい。典型的には、意図される治療用途を示す適切な標識が、各組成物とともにパッケージングされる。アジュバント及び／または賦形剤の選択は、免疫原、組み換え発現ベクター、及び／もしくはベクター粒子の安定性；投与経路；投薬スケジュール；ワクチン接種される種に対するアジュバントの有効性に依存する。ヒトにおける投与について、薬学的に許容されるアジュバントは、関係する規制機関によってヒト投与が承認されているか、承認可能なものである。例えば、本明細書に論じられ、当該技術分野において既知であるように、フロイント完全アジュバントはヒト投与には好適ではない。
【０１３１】
免疫学的組成物及び本明細書に記載される方法における使用に有用であるアジュバントは、アジュバントが投与される対象にとって生理学的または薬学的に好適なアジュバントである。アジュバント組成物は、少なくとも１つのアジュバント（すなわち、１つ以上のアジュバント）と、任意で、少なくとも１つの生理学的または薬学的に好適な（または許容される）賦形剤とを含む。薬学的組成物における使用が当業者に既知である、任意の生理学的または薬学的に好適な賦形剤または担体（すなわち、活性成分の活性と干渉しない無毒性材料）を、本明細書に記載されるアジュバント組成物中に用いることができる。例示的な賦形剤としては、アジュバントの構成成分（複数可）の安定性及び統合性を維持する希釈剤及び担体が挙げられる。治療的使用のための賦形剤は周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ，２１ｓｔＥｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２００５））に記載され、本明細書に詳細に記載される。
【０１３２】
組み換え発現ベクター
一実施形態において、免疫原に対する、及びそのそれぞれの指定抗原に対する免疫応答を誘導する少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターが提供される。免疫原の効率的な転写及び翻訳を取得するために、各ベクター中のコードするポリヌクレオチド配列は、コードするポリヌクレオチド配列（複数可）に作動的に連結される、少なくとも１つの適切な発現制御配列（制御発現配列または特徴とも呼ばれる）（例えば、プロモーター、エンハンサー、リーダー）を含み、これは本明細書に詳細に記載される。故に、これらの組み換え発現ベクターは、組み換え発現ベクターまたは組み換え発現ベクターを含有するベクター粒子で形質転換、形質導入、またはトランスフェクトされている任意の適切な宿主細胞中での免疫原の発現を指示するため、または少なくとも２つの免疫原の同時発現を指示するために提供される。
【０１３３】
本明細書に記載される組み換え発現ベクターは、１つ以上の免疫原（すなわち、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つの免疫原など）をコードしてもよく、これらの免疫原は、本明細書に詳細に記載される。特定の実施形態において、感染性微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫）からの少なくとも１つ、２つ、もしくは３つ、またはそれ以上の免疫原が、組み換え発現ベクターによってコードされ得る。感染性疾患微生物から取得される免疫原及び指定抗原は、本明細書に詳細に記載される。例として、免疫原は、ＵＬ１９もしくはｇＤ（またはこれらの免疫原性バリアント）などのＨＳＶ−２タンパク質であっても、ＨＳＶ−２タンパク質の免疫原性断片または領域であってもよい。別の特定の実施形態において、本明細書に記載される組み換え発現ベクターは、少なくとも１つ、２つ、３つ、もしくはそれ以上の腫瘍関連抗原またはそれらの免疫原性をコードしてもよい。これらの腫瘍関連抗原は、本明細書に詳細に記載され、例えば、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原（例えば、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、及び前立腺特異的膜抗原）、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、結腸直腸癌抗原、肺癌抗原、卵巣癌抗原、または本明細書または当該技術分野において記載される任意の癌もしくは腫瘍関連抗原からの腫瘍関連抗原であってもよい。
【０１３４】
組み換え発現ベクターは、本明細書に記載される免疫原のうちのいずれか１つ以上の発現のために使用され得る。特定の実施形態において、組み換え発現ベクターは、免疫応答（すなわち、特異的体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）ならびに／または特異的細胞薬用免疫応答（これは免疫原特異的ＣＤ４及び／もしくはＣＤ８Ｔ細胞応答を含み得、このＣＤ８Ｔ細胞応答は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を含み得る）の誘導）を誘導する、適切な細胞（例えば、抗原提示細胞、すなわち、樹状細胞などの、その細胞表面上にペプチド／ＭＨＣ複合体を呈する細胞）または組織（例えば、リンパ組織）に送達される。したがって、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、または樹状細胞特異的ＴＲＥなどのリンパ組織特異的転写制御要素（ＴＲＥ）もまた含み得る。リンパ組織特異的ＴＲＥは、当該技術分野において既知である（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，１０４３−５３（１９９２）、Ｔｏｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７，１６６３−７４（１９９３）、Ｐｅｎｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１４８３−９６（１９９３）を参照されたい）。
【０１３５】
特定の一実施形態において、組み換え発現ベクターは、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡである。本明細書に記載される免疫原をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有するプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡは、当該技術分野において周知である標準技術を使用して容易に構築される。ベクターゲノムは、典型的には、プラスミド形態で構築され得、これはその後、パッケージングまたは産生細胞株へとトランスフェクトされ得る。プラスミドは一般に、細菌中でのプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、当該技術分野において周知である。更に、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が薬物抵抗性などの検出可能または選択可能なマーカーを与える遺伝子を含み得る。典型的な細菌薬物抵抗性産生物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を与えるものである。正確なヌクレオチド配列がプラスミド中に組み込まれていることを確認するための分析のために、プラスミドが大腸菌中で複製され、精製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され得る、かつ／またはそのヌクレオチド配列が従来の方法によって決定され得る。
【０１３６】
他の特定の実施形態において、組み換え発現ベクターはウイルスベクターである。例示的な組み換え発現ウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、及びアルファウイルスベクターゲノムが挙げられる。ウイルスベクターは、生きたもの、弱毒化されたもの、複製条件的なもの、または複製欠損のものであってもよく、典型的には、非病原性（不完全）複製能があるウイルスベクターである。
【０１３７】
例として、特定の一実施形態において、ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターゲノムである場合、対象となる免疫原をコードするポリヌクレオチドは、ワクシニアウイルスベクターの非必須部位に挿入され得る。そのような非必須部位は、例えば、Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５２：２８５（１９８６）、Ｈｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：３４１１（１９８３）、Ｗｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５３０（１９８３）に記載される。ワクシニアウイルスとの使用が好適なプロモーターとしては、Ｐ７．５（例えば、Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：３０（１９８５）を参照されたい）、Ｐ１１（例えば、Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：２０９６（１９８５）を参照されたい）、及びＣＡＥ−１（例えば、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：９４３１（１９８８）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。高度に弱毒化されたワクシニア株は、ヒトにおける使用がより許容され、それらには、Ｌｉｓｔｅｒ、特定のゲノム欠失を含有するＮＹＶＡＣ（例えば、Ｇｕｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：９８５−９８（２００６）、Ｔａｒｔａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ８：１４４５−４７（１９９２）を参照されたい）、またはＭＶＡ（例えば、Ｇｈｅｒａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２９２５−３６（２００５）、Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ３：６−１４（１９７５）を参照されたい）が挙げられる。Ｈｕら（癌療法のためのベクターとしての、ヤバ様疾患ウイルスの使用を記載する、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０３００−３０８（２００１））、米国特許第５，６９８，５３０号及び同第６，９９８，２５２号も参照されたい。例えば、米国特許第５，４４３，９６４号も参照されたい。それぞれの全体が参照によって組み込まれる、米国特許第７，２４７，６１５号及び同第７，３６８，１１６号も参照されたい。
【０１３８】
特定の実施形態において、アデノウイルスベクターまたはアデノウイルス関連ウイルスベクターが、対象となる免疫原を発現させるために使用され得る。いくつかのアデノウイルスベクター系及び該ベクターを投与する方法が記載されている（例えば、Ｍｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８３５８−６１（１９９８）、Ｎａｒｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：９３６−４１（１９９８）、Ｍｅｒｃｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：６１８８−９３（２００４）、米国特許第６，１４３，２９０号、同第６，５９６，５３５号、同第６，８５５，３１７号、同第６，９３６，２５７号、同第７，１２５，７１７号、同第７，３７８，０８７号、同第７，５５０，２９６号を参照されたい）。
【０１３９】
レトロウイルスベクターゲノムとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、エコトロピックレトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及び組み合わせ（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２４（１９９１）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０）、Ｋｏｌｂｅｒｇ，ＮＩＨ  Ｒｅｓ．４：４３  １９９２、Ｃｏｒｎｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２１５（１９９１）を参照されたい）に基づくものを挙げることができる。
【０１４０】
より具体的な一実施形態において、組み換え発現ウイルスベクターはレンチウイルスベクターゲノムである。ゲノムは、ヒト遺伝子両方用途のために特定されているものを含む、多数の好適な入手可能なレンチウイルスゲノム系ベクターのうちのいずれかに由来し得る（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２：１７７−２１１（２００１）を参照されたい）。好適なレンチウイルスベクターゲノムとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、及びマエディ／ビスナウイルスに基づくものが挙げられる。レンチウイルスの望ましい特徴は、それらが分裂細胞及び非分裂細胞の両方を感染させ得ることであるが、標的細胞は分裂細胞及である必要も、分裂が刺激される必要もない。一般に、ゲノム及び外被糖タンパク質は異なるウイルスに基づくため、結果として得られるウイルスベクター粒子は偽型化されている。ベクターゲノムの安全性特徴が、望ましく組み込まれる。安全性特徴は、自己不活性化ＬＴＲ及び非組み込みゲノムを含む。例示的なベクターは、パッケージングシグナル（ｐｓｉ）、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）、スプライス供与体、スプライス受容体、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、及びＷＰＲＥ要素を含有する。特定の例示的な実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、ＨＩＶ−１ゲノムまたはＳＩＶゲノムなどのレンチウイルスゲノムからの配列を含む。ウイルスゲノム構築物は、レンチウイルスの５’及び３’ＬＴＲからの配列を含み得、特にレンチウイルスの５’ＬＴＲ、ならびにレンチウイルスの不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲからのＲ及びＵ５配列を含み得る。ＬＴＲ配列は、任意の種の任意のレンチウイルスからのＬＴＲ配列であり得る。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶからのＬＴＲ配列であってもよい。典型的には、ＬＴＲ配列はＨＩＶ  ＬＴＲ配列である。
【０１４１】
ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含み得る（例えば、これらの両方の全体が組み込まれる、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３，１９９８、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０，１９９８を参照されたい）。自己不活性化ベクターは一般に、ベクター組み込み中に５’ＬＴＲ中に複写される、３’長末端反復（ＬＴＲ）からのエンハンサー配列及びプロモーター配列の欠失を有する。一例において、３’ＬＴＲのＵ３要素は、そのエンハンサー配列の欠失、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１及びＮＦ−カッパＢ部位を含有する。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、侵入及び逆転写に続いて生成されるプロウイルスは不活性化５’ＬＴＲを含むであろう。理論的根拠は、ベクターゲノムの可動化のリスク及び付近の細胞性プロモーターに対するＬＴＲの影響を低下させることによって、安全性を改善することである。自己不活性化３’ＬＴＲは、当該技術分野において既知である任意の方法によって構築され得る。
【０１４２】
任意で、レンチウイルス５’ＬＴＲからのＵ３配列は、異種プロモーター配列などのウイルス構築物中のプロモーター配列で置換されてもよい。これは、パッケージング細胞株から回収されるウイルスの力価を増加させることができる。エンハンサー配列もまた、含まれてもよい。パッケージング細胞株中でウイルスＲＮＡゲノムの発現を増加させる、任意のエンハンサー／プロモーターの組み合わせが使用され得る。一例において、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（例えば、米国特許第５，３８５，８３９号及び同第５，１６８，０６２号を参照されたい）。
【０１４３】
特定の実施形態において、挿入変異誘発のリスクは、レンチウイルスベクターゲノムを組み込みが不完全であるように構築することによって最小化される。非組み込みベクターゲノムを産生するための様々なアプローチが探究され得る。これらのアプローチは、変異（複数可）を、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素構成成分へと操作して、それが不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするようにすることを必要とする。ベクターゲノム自体が修飾されて、例えば、一方もしくは両方の結合部位を変異または欠失させること、あるいは欠失または修飾を通して３’ＬＴＲ近位ポリプリントラクト（ＰＰＴ）を非機能性にすることによって、組み込みが予防され得る。更に、非遺伝子的アプローチが利用可能であり、これらは、インテグラーゼの２つ以上の機能を阻害する薬理学的薬剤を含む。アプローチは相互排他的ではなく、つまり、それらのうちの２つ以上を同時に使用することができる。例えば、インテグラーゼ及び結合部位が非機能性であってもよく、インテグラーゼ及びＰＰＴ部位が非機能性であってもよく、結合部位及びＰＰＴ部位が非機能性であってもよく、それらの全てが非機能性であってもよい。
【０１４４】
インテグラーゼは、ウイルス二本鎖平滑末端化ＤＮＡの切断に関与し、その末端を、染色体標的部位の二本鎖中の５’−リン酸に連結させる。インテグラーゼは、３つの機能ドメイン、つまり、亜鉛結合モチーフ（ＨＨＣＣ）を含有するＮ−末端ドメインと、触媒コア及び保存されたＤＤ３５Ｅモチーフ（ＨＩＶ−１中のＤ６４、Ｄ１１６、Ｅ１５２）を含有する中央ドメインコアと、ＤＮＡ結合特性を有するＣ−末端ドメインとを有する。インテグラーゼ中に導入された点変異は、正常な機能を妨害するのに十分である。多くのインテグラーゼ変異が構築され、特性評価されている（例えば、Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ａｎｄ  Ｔｈｒａｓｈｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１８：４８３，２００７、Ａｐｏｌｏｎｉａ，Ｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ，Ａｐｒｉｌ２００９，ｐｐ，８２−９７、Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２７２９，１９９５、Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：１１２１，２００６を参照されたい）。インテグラーゼタンパク質をコードする配列を欠失または変異させて、好ましくは逆転写酵素活性または核内標的化を有意には損なわずに、タンパク質を不活性にし、それにより、標的細胞ゲノムへのプロウイルスの組み込みのみを予防してもよい。許容される変異は、インテグラーゼ触媒作用、鎖転移、ａｔｔ部位への結合、宿主染色体ＤＮＡへの結合、及び他の機能を低下させ得る。例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶインテグラーゼの残基３５でのアスパラギン置換に対する単一のアスパラギン酸は、ウイルスＤＮＡ組み込みを完全に消失させる。インテグラーゼの欠失は、一般にＣ−末端ドメインに限定される。残基２３５〜２８８のコード配列の欠失は、有用な非機能性インテグラーゼをもたらす（例えば、Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２７２９，１９９５を参照されたい）。更なる例として、変異、例えば、Ａｓｐ６４（残基数はＨＩＶ−１のものが与えられるが、他のレンチウイルスまたはレトロウイルスからのインテグラーゼの対応する残基数は当業者によって容易に決定され得る）（例えば、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ）、Ａｓｐ１１６（例えば、Ｄ１１６Ｎ）、Ａｓｎ１２０（例えば、Ｎ１２０Ｋ）、Ｇｌｕ１５２、Ｇｌｎ１４８（例えば、Ｑ１４８Ａ）、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１５９、Ｔｒｐ２３５（例えば、Ｗ２３５Ｅ）、Ｌｙｓ２６４（例えば、Ｋ２６４Ｒ）、Ｌｙｓ２６６（例えば、Ｋ２６６Ｒ）、Ｌｙｓ２７３（例えば、Ｋ２７３Ｒ）が生成され得る。他の変異が構築され、組み込み、導入遺伝子発現、及び任意の他の望ましいパラメータについて試験され得る。これらの機能のためのアッセイは、周知である。変異は、部位特異的変異誘発及び核酸配列の化学合成を含む様々な技術のうちのいずれかによって生成され得る。１つの変異が作製されても、インテグラーゼ中にこれらの変異のうちの１つ以上が存在してもよい。例えば、インテグラーゼは、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸などで変異を有し得る。
【０１４５】
あるいはまたはインテグラーゼ変異体（複数可）の使用と組み合わせて、Ｕ３及びＵ５における結合部位（ａｔｔ）もまた、変異されてもよい。インテグラーゼはこれらの部位に結合し、３’−末端ジヌクレオチドはベクターゲノムの両末端で切断される。ＣＡジヌクレオチドは後退した３’末端に位置し、ＣＡはプロセシングのために必要とされ、ヌクレオチドの変異は宿主染色体への組み込みを遮断する。ＣＡジヌクレオチドのＡは組み込みに最も重要なヌクレオチドであり、ゲノムの両末端での変異は最良の結果をもたらす（例えば、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９０１１（１９９９）を参照されたい）。一例証において、各末端のＣＡはＴＧに変化する。他の例証において、各末端のＣＡは、一方の末端でＴＧに、及び他方の末端でＧＴに変化する。他の例証において、各末端のＣＡは欠失され、他の例証において、ＣＡのＡは各末端で欠失される。
【０１４６】
組み込みはまた、３’ＬＴＲの近位に位置する、ポリプリントラクト（ＰＰＴ）の変異または欠失によっても阻害され得る（例えば、国際公開第２００９／０７６５２４号を参照されたい）。ＰＰＴは、プラス鎖ＤＮＡ合成ためのプライマー結合部位としての役割を果たし得る約１５個のヌクレオチドのポリプリン配列である。この例において、ＰＰＴの変異または欠失は、逆転写プロセスを標的化する。特定の機構によって拘束されることを望むものではないが、ＰＰＴを変異または欠失させることによって直鎖状ＤＮＡの産生は急激に低下し、本質的に１−ＬＴＲ  ＤＮＡ環のみが産生される。組み込みは直鎖状二本鎖ＤＮＡベクターゲノムを必要とし、組み込みはそれなしでは本質的に除去される。本明細書に述べるように、ＰＰＴは、変異または欠失によって非機能性にされてもよい。典型的には、約１５ｎｔのＰＰＴ全体が欠失されるが、いくつかの実施形態において、１４ｎｔ、１３ｎｔ、１２ｎｔ、１１ｎｔ、１０ｎｔ、９ｎｔ、８ｎｔ、７ｎｔ、６ｎｔ、５ｎｔ、４ｎｔ、３ｎｔ、及び２ｎｔのより短い欠失が作製されてもよい。変異が作製される場合、典型的には、特にＰＰＴの５’半分において複数の変異が作製される（例えば、ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１１５０，２００３を参照されたい）が、最初の４つの塩基における一重及び二重変異も依然として転写を低下させる。ＰＰＴの３’末端で作製された変異は一般に、より劇的な影響を有する（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２８８，１９９６を参照されたい）。
【０１４７】
ベクターゲノムを非組み込み性にするためのこれらの異なるアプローチは、個々でも、組み合わせでも使用することができる。１つ以上のアプローチの使用は、重複した機構を通して絶対安全なベクターを構築するために使用され得る。故に、ＰＰＴ変異または欠失は、ａｔｔ部位変異もしくは欠失と、またはインテグラーゼ変異と組み合わせることができるか、あるいはＰＰＴ変異もしくは欠失は、ａｔｔ部位変異もしくは欠失及びインテグラーゼ変異の両方と組み合わせることができる。同様に、ａｔｔ部位変異もしくは欠失及びインテグラーゼ変異は、互いに、またはＰＰＴ変異もしくは欠失と組み合わせることができる。
【０１４８】
本明細書に記載するように、レンチウイルスベクター構築物は、哺乳類細胞中での発現のためのプロモーターを含有する。本明細書に詳細に論じられるプロモーターとしては、例えば、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。Ｕ３領域は、すぐ上流にＰＰＴ（ポリプリントラクト）配列を含み得る。特定の具体的な実施形態において、少なくとも３つの異なる（３’末端での）Ｕ３領域のうちのいずれか１つが、レンチウイルスベクター中に含まれ得る（米国第２０１２０３２８６５５号の配列番号２１〜２３を参照されたい）。構築物は、Ｕ３領域中に欠失を含有する。ＳＩＮ構築物は、Ｕ３中に約１３０ヌクレオチドの欠失を有し（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０，１９９８、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：３１９４，１９８６を参照されたい）、これがＴＡＴＡボックスを取り除き、それにより、ＬＴＲプロモーター活性を消失させる。構築物７０３及び７０４中の欠失は、レンチウイルスベクターからの発現を増加させる（例えば、Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ１６：１９６８，２００８を参照されたい）。更に、構築物７０４は、ベクターの組み込みを減少させる３’ＰＰＴの欠失を含有する（例えば、国際公開第２００９／０７６５２４号を参照されたい）。それぞれの全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願第１２／８４２，６０９号及び国際特許出願公開第２０１１／０１１５８４号（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４２８７０号）も参照されたい。
【０１４９】
制御発現配列
本明細書に記載するように、組み換え発現ベクターは、少なくとも１つの制御発現配列を含む。特定の実施形態において、組み換え発現ベクターがウイルスベクターゲノムを含む場合、特定の標的細胞中で、少なくとも１つの免疫原の発現が所望される。典型的には、例えば、レンチウイルスベクターにおいて、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列は、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置する。更に、コードするヌクレオチド配列（複数可）は、好ましくは、特定の様式で免疫原の発現を制御する他の遺伝子もしくは制御配列または特徴、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを含む転写制御配列と、機能的な関係性で、作動的に連結される。特定の例において、有用な転写制御配列は、時間的及び空間的の両方で、活性に関して高度に制御されるものである。コードされたポリペプチドの発現の制御に使用され得る発現制御要素は当該技術分野において既知であり、誘導性プロモーター、恒常性プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、及び他の制御配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
免疫原をコードするポリヌクレオチド及び任意の他の発現可能配列は、典型的には内部プロモーター／エンハンサー制御配列と機能的関係性にある。レンチウイルスベクター構築物に関して、「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルスベクター中、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置し、対象となるコードするポリヌクレオチド配列に作動的に連結されるものである。内部プロモーター／エンハンサーは、それが機能的関係性にある遺伝子の発現を増加させることが既知である、任意のプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーの組み合わせであり得る。「機能的関係性」及び「作動的に連結」とは、プロモーター及び／またはエンハンサーが適切な分子に接触すると対象となる配列が発現されるように、配列が、プロモーター及び／またはエンハンサーに関して正確な位置及び配向にあることを非限定的に意味する。
【０１５１】
内部プロモーター／エンハンサーの選択は、免疫原の所望される発現パターン及び既知のプロモーター／エンハンサーの特定の特性に基づく。故に、内部プロモーターは恒常活性型である。使用され得る恒常性プロモーターの非限定的な例としては、ユビキチンのためのプロモーター（例えば、米国特許第５５１０４７４号、国際公開第９８／３２８６９号を参照されたい）、ＣＭＶ（例えば、Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６５９，１９８４、米国特許第５１６８０６２号を参照されたい）、ベータ−アクチン（Ｇｕｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４８３１−４８３５）、ならびにｐｇｋ（例えば、Ａｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９８７Ｇｅｎｅ６０：６５−７４、Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．１９８４Ｇｅｎｅ３２：４０９−４１７、及びＤｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８２Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：２６３５−２６３７を参照されたい）が挙げられる。
【０１５２】
あるいは、プロモーターは組織特異的プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは標的細胞特異的プロモーターである。例えば、プロモーターは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＴＬＲ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＢＤＣＡ−３、ＤＥＣ−２０５、ＤＣＩＲ２、マンノース受容体、デクチン−１、Ｃｌｅｃ９Ａ、ＭＨＣクラスＩＩを含む樹状細胞によって発現された任意の産生物由来のものであってもよい。更に、プロモーターは、免疫原の誘導性発現を可能にするように選択され得る。テトラサイクリン応答系、ｌａｃオペレーター−リプレッサー系を含む、いくつかの誘導性発現のための系、ならびにヒートショック、金属イオン（メタロチオネインプロモーターなど）、インターフェロン、低酸素、ステロイド（プロゲステロンもしくはグルココルチコイド受容体プロモーターなど）、放射線（ＶＥＧＦプロモーター）を含む様々な環境的または生理学的変化に対して応答性であるプロモーターが当該技術分野において既知である。プロモーターの組み合わせを使用して、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれの所望される発現を取得してもよい。当業者は、対象となる生物または標的細胞におけるポリヌクレオチド配列の所望される発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができるであろう。
【０１５３】
ウイルスベクターゲノムを含む組み換え発現ベクターは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ応答プロモーターを含み得る。このプロモーターは、対象となるポリヌクレオチド配列に作動的に連結され得、終了配列にも連結され得る。更に、１つ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターが組み込まれてもよい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＩＩＩプロモーターは、当業者に周知である。好適な範囲のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、例えば、Ｐａｕｌｅ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ１２８３−１２９８（２０００）に見出すことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩに下流ＲＮＡコード配列の転写を指示し得る、任意または操作されたＤＮＡ断片の合成も含み得る。更に、ウイルスベクターゲノムの一部として使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩ）プロモーター（複数可）は、誘導性であり得る。任意の好適な誘導性ＰｏｌＩＩまたはＩＩＩプロモーターを、本明細書に記載される方法とともに使用することができる。特に適したＰｏｌＩＩまたはＩＩＩプロモーターとしては、Ｏｈｋａｗａ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：５７７−５８５（２０００）及びＭｅｉｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：１６７２−１６８２（２００１）に提供されるテトラサイクリン応答プロモーターが挙げられる。
【０１５４】
対象となるポリヌクレオチド配列の発現を増加させる内部エンハンサーもまた、ウイルスベクターゲノムを含む組み換え発現ベクター中に存在し得る。例えば、ＣＭＶエンハンサー（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ４１：５２１，１９８５）が使用され得る。ＨＩＶ、ＣＭＶなどのウイルスゲノム中、及び哺乳類ゲノム中の多くのエンハンサーは特定され、特性評価されている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的に利用可能なデータベースを参照されたい）。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者は、所望される発現パターンに基づいて、適切なエンハンサーを選択することができるであろう。
【０１５５】
ウイルスベクターゲノムを含む組み換え発現ベクターの、特定の標的細胞への送達を標的化する場合、ベクターゲノムは通常、標的細胞によって認識され、対象となる配列に作動的に連結されるプロモーターと、ウイルス構成成分（ベクターがウイルスベクターである場合）と、本明細書に論じる他の配列とを含有する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の発生を可能にする核酸配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、誘導性であっても、恒常性であっても、一時的に活性であっても、組織特異的であってもよい。誘導性プロモーターの活性は、生物因子または非生物因子の存在または不在によって誘導される。誘導性プロモーターは、それらが作動的に連結される遺伝子の発現が、生物の発達、その製造特定の段階、または特定の組織においてオンまたはオフに切り替えられ得るため、遺伝子操作において有用なツールであり得る。誘導性プロモーターは、化学的に制御されたプロモーター及び物理的に制御されたプロモーターとしてグループ化され得る。典型的には、化学的に制御されたプロモーターとしては、アルコール制御されたプロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン制御されたプロモーター（例えば、テトラサイクリン応答プロモーター）、ステロイド制御されたプロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）系プロモーター、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）系プロモーター、ガ・エクジソン受容体系プロモーター、及びステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター）、金属制御されたプロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子系プロモーター）、ならびに病態形成関連プロモーター（例えば、シロイヌナズナ及びトウモロコシ病原体関連（ＰＲ）タンパク質系プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、物理的に制御されたプロモーターの例としては、温度制御されたプロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）及び光制御されたプロモーター（例えば、ダイズＳＳＵプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なプロモーターは、他に、例えば、米国特許商標局のデータベースを検索することによって特定され得る特許及び公開特許出願において記載される。
【０１５６】
当業者は、特定の状況に基づいて、適切なプロモーターを選択することができるであろう。多くの異なるプロモーター、及び発現されるポリヌクレオチド配列にプロモーターを作動的に連結させるための方法が、当該技術分野において周知である。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を使用して、パッケージング細胞及び標的細胞における発現を指示することができる。異種プロモーターは典型的には、天然プロモーターと比較して、それらが一般に所望されるタンパク質のより大きな転写及びより高い収率を可能にするために使用される。
【０１５７】
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトルウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから取得されてもよい。プロモーターはまた、例えば、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーター、または通常天然配列に関連するプロモーター（但し、そのようなプロモーターが標的細胞と適合することを条件とする）であってもよい。一実施形態において、プロモーターは、ウイルス発現系において天然に存在するウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、樹状細胞特異的プロモーターである。樹状細胞特異的プロモーターは、例えば、ＣＤ１１ｃプロモーターであり得る。
【０１５８】
転写は、ベクター（複数可）にエンハンサー配列を挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、典型的には、プロモーターにその転写を増加させるように作用する、通常約１０〜３００塩基対長のＤＮＡのシス作用性要素である。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−胎児タンパク質、及びインスリン）から、ならびに真核生物細胞ウイルスからの多くのエンハンサー配列が既知である。例としては、複製起点の後期側上のＳＶ４０エンハンサー（塩基対１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、位置５’または３’で、ベクター中、抗原特異的ポリヌクレオチド配列にスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターからの部位５’に位置する。
【０１５９】
発現ベクターはまた、転写の終了のため、及びｍＲＮＡの安定化のために必要とされる配列も含有し得る。これらの配列は、５’、及び時折３’、真核生物の未翻訳領域、またはウイルスＤＮＡもしくはｃＤＮＡにおいてしばしば見出され、当該技術分野において周知である。
【０１６０】
ウイルスベクターゲノムを含む組み換え発現構築物はまた、追加の遺伝要素を含有してもよい。構築物に含まれ得る要素の種類は決して限定されず、特定の結果を達成するように選択され得る。例えば、標的細胞中への組み換え発現ベクターまたはウイルスゲノムの核内侵入を促進するシグナルが含まれてもよい。そのようなシグナルの一例は、ＨＩＶ−１フラップシグナルである。標的細胞中のプロウイルス組み込み部位の特性評価を促進する、追加の制御配列が含まれてもよい。例えば、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列が構築物中に含まれてもよい。例えば、ニワトリβ−グロビンからのインスレーター配列もまた、ウイルスゲノム構築物中に含まれてもよい。この要素は、メチル化及びヘテロクロマチン化効果のため、標的細胞中に組み込まれたプロウイルスをサイレンシングする確率を低下させる。更に、インスレーターは、内部エンハンサー、プロモーター、及び外因性ポリヌクレオチド配列を、染色体上の組み込み部位の周囲のＤＮＡからの正または負の位置的効果から遮蔽し得る。更に、ベクターゲノムを含む組み換え構築物は、対象となる遺伝子の発現を亢進するように設計された１つ以上の遺伝要素を含有してもよい。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素（ＷＲＥ）が、構築物中に置かれてもよい（例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３６６８−８１、Ｄｅｇｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７９−９０を参照されたい）。
【０１６１】
組み換え発現ベクターがウイルスベクターゲノムである場合、ウイルスベクターゲノムは典型的には、ウイルスベクターゲノム構築物を産生するためのパッケージングまたは産生細胞株へとトランスフェクトされ得る、プラスミド形態で構築される。プラスミドは一般に、細菌中でのプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、当該技術分野において周知である。更に、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が薬物抵抗性などの検出可能または選択可能なマーカーを与える遺伝子を含み得る。典型的な細菌薬物抵抗性産生物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を与えるものである。
【０１６２】
特定の構成において、組み換え発現ベクターは、１つ以上の刺激因子または免疫調節因子をコードするポリヌクレオチド配列を含有する。例示的な刺激分子または免疫調節分子としては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬物誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）などが挙げられる。これらのポリヌクレオチドは典型的には、樹状細胞中でのコード配列の発現を指示する１つ以上の制御要素の制御下にある。特定の他の実施形態において、免疫原と免疫調節因子または免疫刺激因子との両方をコードするヌクレオチド配列の発現を指示し、それを含む、組み換え発現ベクターが含まれる。一実施形態において、免疫原と、例えばＧＭ−ＣＳＦとの両方をコードするヌクレオチド配列の発現を指示し、それを含む、組み換え発現ベクターが含まれる。
【０１６３】
樹状細胞の成熟は、ワクチン接種の成功に寄与する（例えば、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６（２００５）、Ｓｃｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−１４７（２００３）、Ｆｉｇｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：４７５−４８０（２００４）を参照されたい）。成熟は、抗原捕獲に能動的に関与する細胞からのＤＣを、Ｔ細胞プライミングに特化した細胞へと形質転換させ得る。例えば、ＣＤ４−ヘルパーＴ細胞上のＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の会合は、ＤＣ成熟にとって非常に重要なシグナルであり、ＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な活性化をもたらす。そのような刺激分子はまた、成熟因子または成熟刺激因子とも呼ばれ得る。
【０１６４】
免疫チェックポイントは、癌において機能的な細胞性免疫の活性化に対する著しい障壁を呈し、ＣＴＬＡ４及びプログラム死−１（ＰＤ−１）を含むＴ細胞上の阻害リガンドに特異的なアンタゴニスト抗体は、診療所において評価されている標的剤の例である。慢性感染症及び癌における著しい耐性機構は、抗レベルのＰＤ−１を発現させる抗原特異的Ｔ細胞の機能的消耗である。治療的免疫化の効力が、免疫チェックポイント制御と組み合わせることによって著しく亢進されることが示されているため、非限定的な例として、免疫チェックポイントを阻害するための代替的なアプローチは、プログラム死（ＰＤ）リガンドの１または２（ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２）の発現または活性を阻害することであることが当業者によって認識され得る。阻害を達成するための１つの方法は、レンチウイルスベクターゲノムなどの、１つ以上の関連する分子をコードするウイルスベクターゲノムで形質導入されたＤＣにおける、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２の発現を阻止するＲＮＡ分子（本明細書に記載されるものなど）の発現によるものである。ＤＣの成熟、または免疫チェックポイント、例えば、ＰＤ−１リガンドなどの特定の要素の発現は、ＭＨＣ  ＩＩなどの表面マーカーの上方制御のフローサイトメトリー分析によって、ならびに、例えば、本明細書に記載される技術及び方法を実行することによる、発現されたケモカイン及びサイトカインのプロファイリングによって、特性評価され得る。
【０１６５】
所望される免疫原を発現する細胞の特定を可能にするために、検出可能な産生物、通常タンパク質をコードする配列が含まれてもよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカータンパク質が、対象となる（すなわち、少なくとも１つの免疫原をコードする）ポリヌクレオチド配列とともに、組み換え発現構築物中に組み込まれる。他の例において、タンパク質は抗体によって検出可能であり得るか、あるいはタンパク質は基質に作用して、検出可能な産生物をもたらす酵素であり得るか、またはトランスフェクトもしくは形質導入された標的細胞の選択を可能にする、例えば、ハイグロマイシン抵抗性などの薬物抵抗性を与える、タンパク質産生物であり得る。典型的な選択遺伝子は、当該技術分野において既知であるものの中でもとりわけ、例えば、ネオマイシン、メトトレキサート、ブラスティサイジンなどの真核生物細胞における使用が好適である抗生物質もしくは他の毒素に対する抵抗性を与えるか、栄養素要求欠損を補うか、あるいは培地に与えられていない非常に重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択可能なマーカーは、任意で別個のプラスミド上に存在し、コトランスフェクションによって導入され得る。
【０１６６】
本明細書に記載されるベクター粒子に関して、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列、及び本明細書に記載される外被分子をコードする配列のうちの２つ以上、または１つ以上のＤＣ成熟因子、パッケージング細胞における所望されるベクター粒子の産生に必要とされる免疫調節因子もしくは刺激因子を含む、１つ以上の多シストロン発現単位が使用されてもよい。多シストロンベクターの使用は、必要とされる核酸分子の総数を低下させ、故に、複数のベクターゲノムからの協調発現に関連する可能性のある困難を回避し得る。多シストロンベクターにおいて、発現される様々な要素は、１つ以上のプロモーター（及び必要に応じて他の発現制御要素）に作動的に連結される。いくつかの構成において、多シストロンベクターは、対象となる少なくとも１つ（すなわち、１つ以上）の免疫原をコードする配列と、レポーター産生物をコードする配列と、１つ以上のベクター粒子構成成分をコードする配列とを含む。組み換え構築物が免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む特定の実施形態において、構築物は任意でＤＣ成熟因子をコードする。特定の他の実施形態において、多シストロンベクターは、免疫原、ＤＣ成熟因子、及び発現ベクターがウイルス発現ベクターである場合、任意でウイルス構成成分のうちのそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列を含む。更なる他の実施形態において、多シストロンベクターは少なくとも２つ以上の免疫原の発現を指示し、それらをコードする。
【０１６７】
多シストロン発現ベクター中で発現される各構成成分は、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素またはウイルス２Ａ要素によって分離されて、様々なタンパク質が同一のプロモーターから別個に発現することを可能にしてもよい。ＩＲＥＳ要素及び２Ａ要素は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第４，９３７，１９０号、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ５：６１６−６２６を参照されたい）。一実施形態において、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、馬鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、及びゾセア・アシグナウイルス（ＴａＶ）（例えば、Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９−５９４を参照されたい）からの２Ａ様配列と連結されたフューリン切断部位配列（ＲＡＫＲ）（例えば、Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：５８４−５９０を参照されたい）などのオリゴヌクレオチドが、多シストロンベクター中の遺伝要素を分離させるために使用される。特定の多シストロンベクターの有効性は、標準プロトコルを使用して、遺伝子のそれぞれの発現を検出することによって容易に試験され得る。
【０１６８】
特定の一例証において、ウイルスベクターゲノムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター配列；ＨＩＶ５’ＬＴＲからのＲ及びＵ５配列；パッケージング配列（ψ）；ＨＩＶ−１フラップシグナル；内部エンハンサー；内部プロモーター；対象となる遺伝子；ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素；ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列；そのエンハンサー配列が欠失したＵ３要素；ニワトリβ−グロビンインスレーター；ならびに３’ＨＩＶ  ＬＴＲのＲ及びＵ５配列を含む。いくつかの例証において、ベクターゲノムは、インタクトなレンチウイルス５’ＬＴＲ及び自己不活性化３’ＬＴＲ（例えば、Ｉｗａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５：１２０，１９９９を参照されたい）を含む。
【０１６９】
ベクターゲノムの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９ａｎｄ２００１ｅｄｉｔｉｏｎｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、Ｃｏｆｆｉｎら（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９７））、及び“ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００）（上述のそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、及びＤＮＡ配列決定の標準技術を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知である任意の好適な遺伝子工学技術を使用して達成することができる。
【０１７０】
哺乳類細胞中での一過性発現のために構築されたベクターもまた、使用することができる。一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くの複写を蓄積し、転じて、発現ベクター中の免疫原特異的ポリヌクレオチドによってコードされる高レベルのポリペプチドを合成するように、宿主細胞中で効率的に複製することができる発現ベクターの使用を伴う。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．１６．１７−１６．２２，１９８９を参照されたい。ポリペプチドの発現への適応に好適な他のベクター及び方法は当該技術分野において周知であり、特定の状況に容易に適合される。
【０１７１】
本明細書において提供される教示及び当該技術分野における知識を使用することによって、当業者は、特定の発現系の有効性が、パッケージング細胞に、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターをトランスフェクトし、好適な技術を使用して発現を測定すること、例えば、緑色蛍光タンパク質接合体からの蛍光を測定することによって試験され得ることを認識することができるであろう。他の好適なレポーター遺伝子は、当該技術分野において周知である。
【０１７２】
免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターは、免疫原を産生するために使用され得る。組み換え発現ベクターは、プロモーターまたはエンハンサーなどの、免疫原をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結された少なくとも１つの制御発現配列を含む。発現ベクターのそれぞれは、それぞれの免疫原の組み換え産生のために、適切な宿主細胞を形質転換、トランスデューサー、またはトランスフェクトするために使用され得る。免疫原の産生のために好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母菌、及び高等真核生物細胞（例えば、ＣＨＯ及びＣＯＳ）が挙げられる。免疫原はそれぞれ、タンパク質の技術分野において既知であり、通例実施される様々な単離方法（例えば、濾過、ダイアフィルトレーション、クロマトグラフィー（親和性クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィーを含む）、及び分取電気泳動）のいずれか１つを使用して、それぞれの宿主細胞または宿主細胞培養物から単離され得る。特定の実施形態において、本明細書に記載するように、その後、単離された免疫原は、薬学的に好適な賦形剤と配合されて、免疫原性組成物をもたらし得る。
【０１７３】
ポリペプチドを組み換え産生するための特定の方法は一般に周知であり、通例使用される。例えば、分子生物学の手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００１）も参照されたい）に記載される。ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３（１９７７））ならびにＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ配列決定ハンドブック（及びそれに対する改善を含む）において記載されるように実行され得る。
【０１７４】
ベクター粒子
別の実施形態において、ベクター粒子が提供される。ベクター粒子は、少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載される組み換え発現ベクターのうちのいずれか１つを含む。特定の他の実施形態において、ベクター粒子は、特異的免疫応答を誘導する少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つの組み換え発現ベクター（第１の組み換え発現ベクターとも呼ばれる）を含む組み換え発現系を含む。（本明細書に記載される）少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達するための方法もまた、本明細書において提供される。特定の実施形態において、標的細胞は抗原提示細胞である免疫細胞であり、より具体的な実施形態において、及び本明細書に記載する場合、標的細胞は樹状細胞である。そのような方法は、標的細胞を、ポリヌクレオチドを送達するビヒクルと接触させること（すなわち、相互作用を可能にすること）を含む。本明細書に記載するように、組み換え発現ベクターは、少なくとも２つの免疫原をコードし、それらの発現を指示する多シストロンであってもよい。本明細書に詳細に記載する特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを送達するための方法は、対象に、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組み換え発現ベクターを含むベクター粒子を投与することによって、細胞を接触させることを含む。ベクター粒子、組み換え発現ベクター、ポリヌクレオチド、及び免疫原は、本明細書に詳細に記載される。
【０１７５】
特定の実施形態において、ベクター粒子はウイルスベクター粒子であり、他の特定の実施形態において、ベクター粒子は、例えば、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ菌種、マイコバクテリウム・ボビス、大腸菌、赤痢菌種、及びエルシニア菌種などの細菌に由来する粒子である（例えば、Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）２２：１８３、Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００４）４：１５７、Ｄａｕｄｅｌ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００７）６：９７を参照されたい）。例示的なウイルスベクター粒子としては、レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子、ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子、ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子、アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子、アデノウイルス関連ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス関連ウイルスベクター粒子、ヘルペスウイルスベクターゲノム（例えば、単純ヘルペスウイルスＩもしくはＩＩ）を含むヘルペスウイルスベクター粒子、またはアルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子が挙げられる。
【０１７６】
より具体的な一実施形態において、ベクター粒子は、（上記に詳述する）レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子である。特に、少なくとも１つの免疫原をコードする配列を樹状細胞（ＤＣ）に送達するためのレンチウイルスベクター粒子（ビリオン、レンチウイルス粒子とも呼ばれ得る）を使用することによって、細胞を標的化し、ＤＣを標的化するための方法及び組成物が本明細書において提供される。レンチウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルスＥ２に由来する外被糖タンパク質バリアントと、対象となる配列を含むゲノムを含む組み換え発現構築と、任意で他の構成成分とを含む。糖タンパク質バリアントは、基準シンドビスウイルス株であるＨＲからの糖タンパク質と比較して、ヘパラン硫酸塩に対する結合の低下を呈する。外被糖タンパク質は、レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進する。感染を「促進する」とは、本明細書で使用される場合、形質導入を促進することと同一であり、単独で、または他の分子と協調して作用する、偽型化されたレトロウイルスまたはレンチウイルス粒子の、標的細胞への受容体媒介侵入の促進または亢進における、外被糖タンパク質の役割を指す。
【０１７７】
一般に、レンチウイルスベクター粒子は、機能的ベクター粒子を生成するために必要とされる構成成分をともにコードする、１つ以上のプラスミドベクター及び／または組み込まれた要素を含有する細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は典型的には複製能がなく、すなわち、それらは単回の感染のみ可能である。ほとんどの場合、産生細胞染色体へと安定して組み込まれた、複数のプラスミドベクターまたは個々の発現カセットが、レンチウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝子構成成分を分離するために利用されるが、レンチウイルス構成成分の全てを有する単一のプラスミドベクターが使用されてもよい。一例証において、パッケージング細胞株は、ＬＴＲ、シス作用性パッケージング配列、及び対象となる配列（すなわち、１つの免疫原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターゲノムを含有する１つ以上のプラスミドと、ウイルスの酵素的及び構造的構成成分（例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ）をコードする少なくとも１つのプラスミドと、アルボウイルス外被糖タンパク質をコードする少なくとも１つのプラスミドとでトランスフェクトされる。ウイルス粒子は細胞膜を通して出芽し、典型的には対象となる配列を含有する２つのＲＮＡゲノムを含むコアと、樹状細胞を標的化するアルボウイルス外被糖タンパク質とを含む。特定の実施形態において、アルボウイルス糖タンパク質はシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質であり、糖タンパク質は、基準株ＨＲからのＥ２と比較して、ヘパラン硫酸塩に対する結合の低下を有するように操作される。これは通常、ＨＲ  Ｅ２糖タンパク質配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変化を伴う。同様に、Ｅ２糖タンパク質は、樹状細胞に対する標的化特異性を増加させるように操作されてもよい。
【０１７８】
理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞表面へのウイルス粒子の結合はエンドサイトーシスを誘導し、ウイルスをエンドソームへと運び、膜融合を引き起こし、ウイルスコアの細胞質ゾルへの侵入を可能にすると考えられる。レンチウイルスベクター粒子の組み込みを利用する特定の実施形態について、産生物の逆転写及びその核への遊走後、ウイルスのゲノムは標的細胞ゲノムへと組み込まれ、対象となる配列が標的細胞のゲノムへと組み込まれる。しかしながら、挿入変異誘発の確率を低下させ、指定免疫原（複数可）の一過性発現を促進するために、他の実施形態は、非組み込みレンチウイルスベクター粒子（すなわち、標的細胞ゲノムへと組み込まれないもの）を利用するが、代わりに、対象となる配列をエピソームから発現させる。いずれの例においても、その後、感染したＤＣは対象となる配列（例えば、免疫原及び任意で刺激分子）を発現させる。その後、免疫原は樹状細胞によってプロセシングされ、Ｔ細胞及びＢ細胞に提示され得、抗原特異的免疫応答を生成する。上記の特定のパスウェイは、樹状細胞が抗原特異的免疫応答を刺激することができる限り、必要とされない。
【０１７９】
ウイルス粒子を、本明細書に記載される免疫原性組成物において対象に投与して、予防的または治療的効果をもたらすことができる。樹状細胞の感染及び免疫原産生物の発現の後、産生物に対して免疫応答が生成される。
【０１８０】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始及び制御に必須である抗原提示細胞である。ＤＣは２つのパスウェイに沿って発達し得、１つのパスウェイは単球に依存せず、第２のパスウェイは単球に由来する（Ｍｏ−ＤＣ）。血中単球は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４とともに培養すると、樹状形態及び適応免疫を開始する強度の能力を得（例えば、Ｂｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１９６（２）：１２１（１９９６）、Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９（４），１１０９（１９９４）を参照されたい）、これは、ヒトにおけるインビボの場合も含む（例えば、Ｄｈｏｄａｐｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ１０４（２），１７３（１９９９）、Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（６）：３４９２（２０００）を参照されたい）。より有効な免疫原特異的Ｔ細胞応答は、ベクター粒子ワクチン、具体的には、エクソビボ細胞操作の必要なく、インビボで免疫原をＭｏ−ＤＣへと直接効率的に送達するレンチウイルスベクター粒子系を使用することによって達成され得る。ヒトＭｏ−ＤＣは、高レベルの２つのＣ型レクチン、マンノース受容体（ＭＭＲ）、及びＤＣ特異的細胞間接着分子−３結合ノンインテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）を発現する。本明細書に詳細に記載するように、免疫原の発現は、ＤＣ−ＳＩＧＮを標的化するように操作された組み換えレンチウイルスベクターを使用して、Ｍｏ−ＤＣに標的化され得る。
【０１８１】
ＤＣ−ＳＩＧＮに選択的に結合する、操作されたシンドビスウイルス（ＳＩＮ）糖タンパク質からなるＤＣ−ＳＩＧＮ標的化外被、ＳＶＧｍｕは、記載の通りに修飾されている（本明細書の記載及び米国特許出願第１２／８４２，６０９号、国際特許出願公開第２０１１／０１１５８４号を参照されたい）。レンチウイルスベクターは、マウスにおける単一免疫化後、高度に機能的なＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を誘導した（例えば、Ｄａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（２００９）、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（３），３２６（２００８）を参照されたい）。この原型は、２つの主要な修飾によって著しく進歩している。本明細書に記載されるレンチウイルスベクターは、天然ＳＩＮに基づく糖タンパク質外被（ＳＩＮｖａｒ１と呼ばれる）、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体によって真皮ＤＣを感染させることが既知であるアルボウイルス（例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２４），１１８４９（２０００）、Ｋｌｉｍｓｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（２２），１２０２２（２００３）を参照されたい）（遍在するヘパラン硫酸塩受容体への結合を予防するように修飾される（例えば、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（９），７３５７（１９９８）を参照されたい））を含む。ＳＩＮｖａｒ１外被は、親ＳＶＧｍｕ外被と比較して、増加した生産性及びインビボ機能を与える。ベクターはまた、それを非機能性にする変異体インテグラーゼ（ｐｏｌＤ６４Ｖ）（例えば、Ａｐｏｌｏｎｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５（１１），１９４７（２００７）を参照されたい）と、ＬＴＲのＵ３領域（最大ａｔｔまで）及び３’ＬＴＲポリプリントラクト（ＰＰＴ）が欠失したベクター骨格との組み合わせによって、重複的に組み込み能がない。故に、無能となったインテグラーゼに加えて、ベクター骨格の組成物が、染色体組み込みの鋳型ではない、感染したＤＣ中で単一ＬＴＲ逆転写エピソームｄｓＤＮＡ環をもたらす全長ベクターゲノム（自己不活性化変異）の転写を予防する（例えば、Ｂａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（１２）：１９６８（２００８）、Ｂｒｅｃｋｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０１０）、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０（１）：１３９（２００４）を参照されたい）。Ｒｅｖを除く、制御タンパク質及びアクセサリータンパク質の全てを含む親ＨＩＶゲノムの約７５％が、ＤＣ−ＮＩＬＶから取り除かれている。単回注射後、ＤＣ−ＮＩＬＶは、高度に強固な腫瘍抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導する。レンチベクターワクチン接種の効力は、少なくとも一部にはＴＬＲ３及びＴＬＲ７パターン認識受容体の会合に依存する（例えば、Ｂｅｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００９）、上記のＢｒｅｃｋｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。
【０１８２】
追加の実施形態において、レンチウイルスベクター粒子は、米国特許第８，３２３，６６２号に記載されるように産生され得る。具体的には、外被糖タンパク質が高度にマンノシル化されるように、パッケージング系を使用してレンチウイルスベクターが産生され得る。本開示の一態様は、（ａ）マンノシダーゼ阻害剤、好ましくはマンノシダーゼＩ阻害剤と、（１）外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノム、（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合するアルファウイルス糖タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（３）ＶｐｘなどのＳＡＭＨＤ１阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスパッケージング細胞とを含む培養培地中で培養することと、（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合する偽型化されたレンチウイルスベクター粒子を単離させることとを含む、偽型化されたレンチウイルスベクター粒子を生成する方法を提供する。本明細書に記載される実施形態のうちのいくつかまたはいずれかにおいて、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＩＶｍａｃ  Ｖｐｘと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１８３】
ウイルスベクター外被
節足動物媒介ウイルス（アルボウイルス）は、カなどの感染した節足動物ベクターによって、ヒト、ウマ、またはトリなどの宿主に伝染するウイルスである。アルボウイルスは、正極性の一本鎖ＲＮＡゲノム及び糖タンパク質含有外被を有する、アルファウイルス及びフラビウイルスを含むウイルス亜科に更に分けられる。例えば、デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、及びウエストナイルウイルスは、フラビウイルス科に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、及びベネズエラウマ脳炎ウイルスは、アルファウイルス科の構成員である（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，４９９２（１９９２）を参照されたい）。シンドビスウイルスの外被は、２つの膜貫通糖タンパク質（例えば、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３，１３（２００５）を参照されたい）、つまり、融合に対して応答性であると考えられるＥ１、及び細胞結合に対して応答性であると考えられるＥ２を含む。シンドビスウイルス外被糖タンパク質は、オンコレトロウイルス及びレンチウイルスを含む他のレトロウイルスを偽型化させることが既知である。
【０１８４】
本明細書に論じるように、アルボウイルス外被糖タンパク質を使用して、レンチウイルス系ベクターゲノムを偽型化させることができる。「偽型化された」レンチウイルスとは、レンチウイルスゲノムとは異なるウイルスによってコードされる１つ以上の外被糖タンパク質を有する、レンチウイルス粒子である。外被糖タンパク質は、本明細書に記載するように、修飾されても、変異されても、操作されてもよい。
【０１８５】
シンドビスウイルス及び他のアルファウイルスの外被は、ウイルス粒子膜のリピド二重層中に組み込まれ、典型的には２つの糖タンパク質Ｅ１及びＥ２の複数の複写を含む。各糖タンパク質は膜貫通領域を有し、Ｅ２は約３３個の残基細胞質ドメインを有する一方で、Ｅ１の細胞質側末端は非常に短い（約２個の残基）。Ｅ１及びＥ２の両方は、膜貫通領域中またはその付近に結合したパルミチン酸を有する。Ｅ２はまず、フューリンまたは他のＣａ２＋依存性セリンプロテアーゼによって、Ｅ２と、Ｅ３と呼ばれる小糖タンパク質とに切断される前駆体タンパク質として合成される。Ｅ２をコードする配列とＥ１をコードする配列との間に位置するのは、６Ｋと呼ばれるタンパク質をコードする配列である。Ｅ３及び６Ｋは、それぞれＥ２及びＥ１糖タンパク質を膜へと移動させる役割を果たすシグナル配列である。シンドビスウイルスゲノムにおいて、シンドビス外被タンパク質のコード領域は、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、及びＥ１をコードする配列を含む。本明細書で使用される場合、アルボウイルスウイルスの「外被」は少なくともＥ２を含み、Ｅ１、６Ｋ、及びＥ３もまた含んでもよい。株ＨＲであるシンドビスウイルスの例示的な外被糖タンパク質は、米国第２０１２０３２８６５５号に開示される。特定の具体的な代替的実施形態において、Ｅ３／Ｅ２糖タンパク質（米国第ＵＳ２０１２０３２８６５５号に開示されるように、Ｅ３配列は配列番号２０の残基１〜６５に対応する）またはそのバリアント（残基６２〜６５はＲＳＫＲである）が、偽型化されたウイルス外被中に組み込まれてもよい。他のアルボウイルスの外被糖タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的に利用可能なデータベースに見出すことができる。例えば、デング熱ウイルス糖タンパク質をコードする配列は、受入番号ＧＱ２５２６７７．１（とりわけＧｅｎＢａｎｋ）及びＮＣＢＩのウイルス変種データベースに見出すことができ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号及びウイルス変種データベースは、外被糖タンパク質配列について、参照により組み込まれる）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス外被糖タンパク質をコードする例示的な配列は、受入番号ＮＰ＿０４０８２４．１（外被糖タンパク質の配列について、参照により組み込まれる）に見出すことができる。
【０１８６】
アルファウイルス、及び特にシンドビスウイルスの、樹状細胞上の細胞受容体（複数可）は、現在のところ決定的には特定されていないものの、１つの受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮであるようである（例えば、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１２０２２，２００３を参照されたい）。「結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「標的化」などの用語の使用は互換的に使用され、シンドビスウイルス外被糖タンパク質と細胞構成成分との間の相互作用の機構を示すことは意図されない。ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３（細胞内接着分子３）−結合ノンインテグリン、ＣＤ２０９としても知られる）は、材料の急速な結合及びエンドサイトーシスが可能であるＣ型レクチン様受容体である（例えば、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３３−５４，２００４を参照されたい）。Ｅ２は、ＤＣ−ＳＩＧＮを通して、ウイルスを樹状細胞へと標的化するようである。本明細書に示すように、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない同質遺伝子細胞よりも良好に（少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍良好に）シンドビスウイルスＥ２で偽型化されたウイルスベクター粒子によって形質導入される。Ｅ２糖タンパク質がいかにウイルス感染を促進するのかについての機構は、可能性としてはＤＣ−ＳＩＧＮへの直接結合、または立体構造またはいくらかの他の機構を変化させることを通して、ＤＣ−ＳＩＧＮに関与しているようである。実際の機構に関わらず、Ｅ２による標的化は、ＤＣ−ＳＩＧＮ、すなわち樹状細胞を発現する細胞にとって、優先である。
【０１８７】
シンドビスウイルスまた、ヘパラン硫酸塩を介して結合するようである（例えば、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３５７，１９９８、Ｂｕｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３４９，１９９８を参照されたい）。ヘパラン硫酸塩及び他の細胞表面グルコサミノグリカンは、ほとんどの細胞型の表面上に見出されるため、ヘパラン硫酸塩とシンドビス外被糖タンパク質との間の相互作用を低下させることが望ましい。これは、シンドビスウイルス外被のヘパラン硫酸塩への結合を減少させること、もしくはシンドビスウイルス外被の樹状細胞への結合を増加させること、例えば、結合活性を増加させること、またはこれらの両方によって達成することができる。結果として、他の細胞型によって発現され得、外被がＤＣ−ＳＩＧＮに特異的な場合ですら発生し得る、他の分子に対する非特異的結合が低下し、改善された特異性は、所望される免疫応答を低下させ得る副作用、または他の細胞型の非特異的形質導入に関連する副作用などの所望されない副作用を回避する役割を果たし得る。あるいは、またはＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞の比較的特異的な形質導入の利点に加えて、シンドビスウイルス外被Ｅ２糖タンパク質で偽型化されたウイルス粒子は、ＶＳＶ−Ｇなどの糖タンパク質で偽型化されたウイルス粒子を超える他の利点をもたらし得る。そのような利点の例としては、補体媒介溶解の低下及び／または神経細胞標的化の低下が挙げられ、これらの両方は、ＶＳＶ−Ｇ偽型化ウイルス粒子の投与に関連するものと考えられている。
【０１８８】
様々な例証において、レンチウイルスベクター粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に特異的に結合し、低下または抑止されたヘパラン硫酸塩に対する結合を有する。つまり、シンドビスウイルス外被Ｅ２糖タンパク質は、他の細胞型に対して、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に、ウイルスを優先的に指示するように修飾されてもよい。糖タンパク質が外被タンパク質としてのそれらの機能を維持するが、所望される結合特異性、結合活性、または結合レベルを有するように、他の研究の中でもとりわけ、構造研究及び分子モデル化から取得された情報に基づいて、外被タンパク質、特にＥ２及びＥ１糖タンパク質のバリアント配列が設計され、生成される。各糖タンパク質について候補となるバリアント配列を作製し、後述する方法または当該技術分野において既知の他の方法を使用してアッセイして、最も望ましい特徴を有する外被糖タンパク質を特定することができる。
【０１８９】
シンドビスＥ２の特定のバリアント配列は、配列番号１と比較して、残基１６０で少なくとも１つのアミノ酸変化を有する。残基１６０は、欠失しているか、グルタミン酸以外のアミノ酸に変化している。変化は、最も一般的には少なくとも１つのアミノ酸の置換であるが、あるいは、１つ以上のアミノ酸の付加または欠失であってもよい。好ましくは、任意の追加のアミノ酸は数が少なく、安全性を損ない得る抗原エピトープ（例えば、赤血球凝集素タグ配列）を含まない。２つ以上の変化が存在する場合、それらは、ともに同一の種類（例えば、置換）であっても、異なる種類（例えば、置換及び欠失）であってもよい。複数の変化がタンパク質配列中に散在しても、隣接して位置してもよい。
【０１９０】
例として、バリアント配列は、配列番号１の約残基５０〜約残基１８０の領域に少なくとも１つのアミノ酸変化を含む。この領域内にあるのは、ヘパラン硫酸塩への結合に関与するアミノ酸である。Ｅ２の正味正電荷を低下させることによって、ヘパラン硫酸塩との静電相互作用を低下させ、ヘパラン硫酸塩への結合の減少をもたらすことができる。この領域内の候補となる正電荷のアミノ酸としては、残基６３、７０、７６、８４、９７、１０４、１２９、１３１、１３３、１３９、１４８、１４９、１５９のリジン及び残基６５、９２、１２８、１３７、１５７、１７０、１７２のアルギニンが挙げられる（例えば、Ｂｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３４７：１８３−１９０，２００６を参照されたい）（配列番号１を参照されたい）。これらのアミノ酸のうちの少なくともいくつかは、ヘパラン硫酸塩へのＥ２結合に直接関係付けられる。正味正電荷は、リジンもしくはアルギニンを欠失させること、またはリジンもしくはアルギニンを中性もしくは負電荷のアミノ酸で置換することによって低下させることができる。例えば、これらのリジン及びアルギニンのうちの１つ以上は、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されてもよい。特定の実施形態は、リジン７０、７６、または１５９の少なくとも１つの置換を有する。Ｅ２糖タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号３〜１６に説明される。Ｅ２がＥ３を有するポリタンパク質として発現される場合、天然Ｅ３／Ｅ２切断部位に隣接して位置するリジンは維持され、つまり、認識配列及び切断部位は変化しない。あるいは、天然エンドペプチダーゼ切断部位配列は、配列認識で異なるエンドペプチダーゼに置換される。
【０１９１】
Ｅ２の特定のバリアントはまた、樹状細胞への結合に正の影響を与える方法で修飾される。ＨＲ基準配列中の残基１６０に見出されるグルタミン酸の変化は、樹状細胞への結合改善させる（例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１８４９，２０００を参照されたい）。残基１６０欠失または残基１６０の置換などの変化は、特定のバリアント中に見出される。特定のバリアントにおいて、非荷電のアミノ酸がＧｌｕについて置換され、他のバリアントにおいて、非酸性アミノ酸がＧｌｕについて置換される。典型的には、Ｇｌｕ１６０が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンを含む小アミノ酸または脂肪族アミノ酸のうちの１つで置換される。
【０１９２】
他のバリアントは、２つ以上のアミノ酸変化を含む。典型的には、これらのバリアントにおいて、変化のうちの１つはＧｌｕ１６０であり、残りの変化（複数可）は、配列番号１の残基約５０〜約１８０にまたがる領域内のリジン及びアルギニンのうちの１つ以上の変化である。バリアントのうちの特定のものは、Ｇｌｕ１６０の非酸性残基への変化またはその欠失、及びリジン７０、リジン７６、もしくはリジン１５９の非塩基性アミノ酸での１つ以上の変化を含む。いくつかの特定のバリアントは、Ｇｌｙに対するＧｌｕ１６０、Ｇｌｕに対するＬｙｓ７０、及びＧｌｕに対するＬｙｓ１５９と、Ｇｌｙに対するＧｌｕ１６０、Ｇｌｕに対するＬｙｓ７０、７６、及び１５９と、Ｇｌｕ１６０の欠失ならびにＧｌｕに対するＬｙｓ７０及び１５９と、Ｇｌｕ１６０の欠失及びＧｌｕに対するＬｙｓ７０、７６、及び１５９とを含む。（例えば、配列番号３〜１６を参照されたい。）
【０１９３】
特定の実施形態において、Ｅ２タンパク質は、少なくともＥ３との融合、またはリーダー配列との融合において、まずポリタンパク質として発現される。リーダー配列がＥ３または別の配列であるかどうかに関わらず、ウイルス外被中のＥ２は、Ｅ３または他のリーダー配列を含まないべきである。換言すると、Ｅ２は、好ましくはＥ３／Ｅ２融合タンパク質（例えば、ＳＶＧｍｕと呼ばれるＥ３／Ｅ２融合タンパク質）ではない。特定の実施形態において、Ｅ２は、Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１ポリタンパク質の一部として発現される。シンドビスウイルスはポリタンパク質の一部としてＥ２を天然に発現し、Ｅ３／Ｅ２、Ｅ２／６Ｋ、及び６Ｋ／Ｅ１の接合部領域は、エンドペプチダーゼによって認識され、切断される配列を有する。通常、Ｅ３／Ｅ２接合部は、残基６５と残基６６との間のフューリンまたはフューリン様セリンエンドペプチダーゼによって切断される。フューリンは、２つのアミノ酸によって分離される対アルギニン残基に対する特異性を有する。フューリンによるＥ３／Ｅ２切断を維持するために、残基６２〜６６（ＲＳＫＲＳ、配列番号２６）は、２つのアミノ酸分離を有する２つのアルギニン残基及びセリン残基を維持するべきである。あるいは、Ｅ３／Ｅ２フューリン切断配列または他の切断配列のうちのいずれかの代わりに、異なる切断配列が使用されてもよい。認識部位及び切断部位は、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（例えば、カテプシンＤ、キモシン、ＨＩＶプロテアーゼ）、システインエンドペプチダーゼ（ブロメライン、パパイン、カルパイン）、メタロエンドペプチダーゼ（例えば、コラゲナーゼ、サーモリシン）、セリンエンドペプチダーゼ（例えば、キモトリプシン、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、トロンビン、トリプシン）、ストレプトキナーゼを非限定的に含む、エンドペプチダーゼについて組み込まれ得る。これらの酵素の認識部位配列及び切断部位配列は、周知である。
【０１９４】
既に言及したもの以外のＥ２中のアミノ酸もまた、変化され得る。一般に、バリアントＥ２配列は、基準Ｅ２配列に対して少なくとも８０％の配列アミノ酸同一性を有するか、またはそれは、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有してもよい。バリアント糖タンパク質は、Ｅ２を含む外被を有するウイルス粒子による樹状細胞の感染を促進する能力などの、生物学的機能を呈するべきである。実験により、ウイルス組み立て、細胞表面への結合、及び感染の様々な態様において重要な役割を有するようである外被糖タンパク質の領域が特定されている。バリアントを作製する場合、以下の情報をガイドラインとして使用することができる。Ｅ２の細胞質側末端（約残基４０８〜４１５）は、ウイルス組み立てにとって重要である（例えば、その全体が組み込まれる、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：４４５８−４４６８，２００６を参照されたい）。他の領域は、二次構造の形成に関与（約残基３３〜５３）し、輸送及びタンパク質安定性に関与（約残基８６〜１１９）する（例えば、その全体が組み込まれる、Ｎａｖａｒａｔｍａｒａｊａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３６３：１２４−１４７，２００７を参照されたい）。バリアントは、膜を貫通する領域、約残基３７０〜３８０の疎水性特徴を保持し得る。バリアントは、一方または両方のＮ−連結された糖鎖付加部位残基ＮＩＴ（残基１９６〜１９８）及びＮＦＴ（残基３１８〜３２０）を保持してもよく、パルミトイル化される部位（Ｃ−３９６、Ｃ４１６、及びＣ４１７）のうちの１つ以上を保持してもよい（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８，４９１−５６２，１９９４；ｐｐ．４９９−５０９を参照されたい）。他方、Ｅ２の多くの領域は有害事象なしで変化され得る。例えば、Ｅ２中の多くの異なる位置でのトランスポゾンの挿入は、依然として生ウイルスをもたらした（例えば、上記のＮａｖａｒａｔｍａｒａｊａｈを参照されたい）。
【０１９５】
特定の実施形態において、タグペプチドは、Ｅ３、６Ｋ、またはＥ１タンパク質中に組み込まれてもよい。いくつかの目的のために、タグはＥ２中に組み込まれてもよいが、タグは、ヒト患者への投与のための産生物における使用は望ましくない。短い配列（例えば、５〜３０個のアミノ酸）であるタグペプチドは、外被発現及びウイルス粒子中でのその存在の検出を促進するために使用することができる。検出目的のために、タグ配列は、典型的には抗体または化学物質により検出可能であるだろう。タグの別の用途は、ウイルス粒子の精製の促進である。タグの結合パートナーを含有する基質を使用して、ウイルスを吸着することができる。ウイルスの溶出は、結合パートナーからタグをずらす部分で処理することによって達成することができるか、またはタグ配列が切断可能配列を有する連結鎖にある場合、適切なエンドペプチダーゼで処理が、ウイルスの放出を簡便に可能にする。（例えば、ＱｉａＧＥＮ（登録商標）カタログ、第Ｘａ因子プロテアーゼ系を参照されたい）。タグペプチドを取り除くことは、動物対象におけるウイルス粒子の使用の安全性の目的のために、一般に望ましい。タグが取り除かれない場合、タグに対する免疫応答が発生し得る。
【０１９６】
好適なタグとしては、非限定的に、とりわけ、それに対する抗体が商業的に入手可能であるＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３５）（その全体が組み込まれる、米国特許第４，７０３，００４号）、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、ポリ（Ｈｉｓ）（その全体が組み込まれる、米国特許第４，５６９，７９４号）、チオレドキシン、ＨＡ（ヘマグルチニン）−タグが挙げられる。ポリ（Ｈｉｓ）は、ニッケルまたはコバルトなどの結合金属イオンを含有する親和性培地上に吸着され、低ｐＨ培地で溶出され得る。
【０１９７】
ベクター粒子を評価して、樹状細胞を標的化するウイルス中に組み込まれる外被糖タンパク質の特異性を決定することができる。例えば、骨髄細胞の混合個体群を対象から取得し、インビトロで培養してもよい。あるいは、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するか、または発現しない同質遺伝子細胞株を取得し、使用してもよい。組み換えウイルスを、骨髄細胞の混合個体群または同質遺伝子細胞株に投与し、培養された細胞中で、ウイルス中に組み込まれるレポーター遺伝子の発現をアッセイすることができる。特定の実施形態は、細胞の混合個体群が別個の部分に分割され、その後、減少する量のウイルス（例えば、各部分において、２倍、５倍、１０倍少ないウイルス）とともに別個にインキュベートされる、限界希釈分析を用いてもよい。いくつかの実施形態において、混合細胞個体群中の感染した細胞のうちの少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、７０％、８０％、もしくは９０％、または少なくとも約９５％が、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である。特定の実施形態において、感染した樹状細胞対感染した非樹状細胞（または非ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞）の比率は、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約５００：１、少なくとも約１０００：１、少なくとも約５０００：１、少なくとも約１０，０００：１、またはそれ以上である。限界希釈について、より大きな選択性は、典型的にはより高い希釈（すなわち、より少ない量）の投入ウイルスで見られる。
【０１９８】
偽型化されたウイルス粒子の活性は、様々な技術のいずれかによって決定することができる。例えば、感染効率（ＩＵ、感染単位）を測定するための好ましい方法は、細胞にウイルス粒子を投与し、ベクターゲノム中でコードされる産生物の発現を測定することによる。アッセイされ得る任意の産生物が使用され得る。１つの簡便な種類の産生物は、緑色を蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質である。使用され得る他の産生物としては、細胞表面（例えば、抗体結合による検出）上で発現されるタンパク質、酵素などが挙げられる。産生物が抗原であり、細胞が樹状細胞である場合、感染性／活性は、免疫応答を決定することによって評価することができる。更に、哺乳動物における副作用を確認することが可能である。樹状細胞を特異的に標的化する能力はまた、例えば、後述する細胞培養物において直接試験することができる。
【０１９９】
本明細書に記載されるウイルス粒子を含むベクター粒子も調製され、それらの選択性及び／または標的細胞膜の透過を促進するそれらの能力について試験され得る。修飾されていない糖タンパク質を有する外被を有するウイルス粒子を、比較のための対照として使用することができる。簡潔に述べると、外被糖タンパク質の受容体を発現する細胞は、標準感染アッセイを使用して、ウイルスによって感染される。指定の時間後、例えば、感染の４８時間後、細胞を採取し得、ウイルスによって感染した細胞のパーセンテージを、例えば、フローサイトメトリーによって決定し得る。選択性は、ウイルスによって感染した細胞のパーセンテージを計算することによって点数化され得る。同様に、バリアント外被糖タンパク質の、ウイルス力価に対する影響は、ウイルスによって感染した細胞のパーセンテージを、対応する野生型（未修飾）外被糖タンパク質を含むウイルスによって感染した細胞のパーセンテージで割ることによって定量化することができる。特に好適なバリアントは、選択性と感染性力価との最良の組み合わせを有するであろう。バリアントが選択されると、ウイルス濃縮アッセイを実行して、これらのウイルスが活性を損なわずに濃縮され得ることを確認し得る。ウイルス上清が採取され、超遠心分離法によって濃縮される。ウイルスの力価は、ウイルス原液の限界希釈、及び外被糖タンパク質の受容体を発現する細胞の感染によって、上記のウイルスによって発現される産生物の発現を測定して、決定することができる。
【０２００】
レンチウイルスベクター粒子の標的細胞への侵入は、別の種類の活性評価である。ＢｌａＭ−Ｖｐｒ（ベータ−ラクタマーゼＶｐｒ）融合タンパク質が、ＨＩＶ−１ウイルス透過を評価するために使用されており、ＢｌａＭとシンドビスウイルス外被糖タンパク質（Ｅ１またはＥ２／Ｅ１融合タンパク質など）との融合を使用して、標的細胞への融合及び透過を促進する上での外被タンパク質の有効性を評価することができる。例えば、パッケージング細胞に、ウイルス要素ＢｌａＭ−Ｖｐｒを含む１つ以上のベクター及び対象となるバリアント外被（及び適切な場合、親和性分）を一過的にトランスフェクトすることによって、ウイルス粒子が調製され得る。結果として得られるウイルスを使用して、分子を発現する細胞を感染させることができる標的化分子（または親和性分子）は遊離結合阻害剤（抗体など）の存在下または不在下で特異的に結合する。その後、細胞はＣＯ２非依存性培地で洗浄され、ＣＣＦ２顔料（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が充填され得る。室温でインキュベートして、切断反応を完了させた後、細胞はパラホルムアルデヒドによって固定され、フローサイトメトリー及び顕微鏡によって分析され得る。青色細胞の存在はウイルスの細胞質への透過を示し、遮断抗体が添加される場合、より少ない青色細胞が予想される（例えば、Ｃａｖｒｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１１５１−５４，２００２を参照されたい）。
【０２０１】
透過が低ｐＨに依存するものであるかどうかを調査するため、及び所望されるｐＨ依存性を有する外被糖タンパク質を特定するために、ＮＨ４ＣｌまたはｐＨを変化させる他の化合物が感染ステップに添加され得る（ＮＨ４Ｃｌは、エンドソームの酸性区画を中和する）。ＮＨ４Ｃｌの場合、青色細胞の消失は、ウイルスの透過が低ｐＨ依存性であることを示すであろう。更に、活性がｐＨ依存性であることを確認するために、塩化アンモニウム、クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシンＡｌ、モネンシン、ニゲリシンなどなどの向リソソーム剤が、インキュベーション緩衝液に添加されてもよい。これらの薬剤は、エンドソーム区画内のｐＨを上昇させる（例えば、Ｄｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２００，１−８，１９９７を参照されたい）。これらの薬剤の阻害効果は、ウイルス融合及び侵入に対するｐＨの役割を明らかにするであろう。異なる融合性分子を呈するウイルス間の異なる侵入動態が比較され、最も好適なものが特定の用途に選択され得る。
【０２０２】
ＰＣＲ系侵入アッセイを利用して、逆転写を監視し、ウイルス侵入の動態の指標としてウイルスＤＮＡ合成の動態を測定することができる。例えば、特定の外被タンパク質分子を含むウイルス粒子を、２９３Ｔ細胞、ＤＣ、及びその外被タンパク質分子の適切な結合パートナー（受容体）を発現するように操作されているか、またはそれを天然に発現する任意の他の細胞などの標的細胞とともにインキュベートする。直後または（感染を発生させるための）時間増分後のいずれかで、未結合のウイルスを取り除き、一定分量の細胞をウイルス核酸について分析する。これらの一定分量からＤＮＡを抽出し、一般に半定量的アッセイでの、ＬＴＲ特異的プライマーでプライミングされた増幅分析に供する。ＬＴＲ特異的ＤＮＡ産生物の出現は、ウイルス侵入の成功を示す。
【０２０３】
ウイルスベクター粒子でのウイルス感染後、免疫原が、標的樹状細胞によって発現される。エクソビボで接触させられた場合、標的樹状細胞は、例えば、注射によって患者に再度移され、そこで、所望される抗原に対する免疫応答を生成し得る免疫細胞と相互作用する。好ましい実施形態において、組み換えウイルスが患者に注射され、それはそこで、標的化された樹状細胞をインサイチュで形質導入する。その後、樹状細胞は、治療される疾患または障害に関連する特定の抗原を発現し、患者は疾患または障害に対する有効な免疫応答を開始することができる。
【０２０４】
ウイルスベクターゲノムは、１つ以上の免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含有し得、標的樹状細胞の形質導入時、細胞に送達される各免疫原に対する免疫応答を生成し得る。いくつかの実施形態において、免疫原は単一の疾患または障害に関連する。他の実施形態において、免疫原は複数の疾患または障害に関連する。
【０２０５】
ベクター粒子のうちのいくつかにおいて、ＤＣの成熟を活性化及び／または刺激するＤＣ成熟因子は、対象となる免疫原をコードする配列と組み合わせて送達される。特定の代替的実施形態において、ＤＣは、ベクター粒子の送達前、それと同時、またはその後のＤＣ成熟因子の送達によって活性化される。ＤＣ成熟因子は、ベクター粒子の投与とは別個に提供されてもよい。
【０２０６】
本明細書に記載するように、１つ以上の免疫調節因子またはＤＣ成熟因子は、ベクター粒子中に含有され、粒子が樹状細胞に侵入した後またはそれが樹状細胞を感染させた後に発現される１つ以上の配列によってコードされ得る。免疫調節因子をコードする配列はまた、パッケージング細胞株中で１つ以上の免疫原をコードするベクター粒子でコトランスフェクトされる別個のベクター中に提供されてもよい。
【０２０７】
本明細書に記載される方法は、対象における養子免疫療法に使用することができる。上記の通り、免疫応答が所望される免疫原が特定される。所望される免疫原（複数可）をコードするポリヌクレオチドが取得され、ベクター粒子中にパッケージングされる。標的樹状細胞が患者から取得され、所望される免疫原をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター粒子で形質導入される。その後、樹状細胞は患者に再度移される。
【０２０８】
ベクター粒子（例えば、本明細書に記載されるウイルスベクター粒子）は、インビボで注射されてもよく、そこで粒子は、ＤＣを感染させ、対象となる免疫原をコードするヌクレオチド配列を送達する。ウイルス粒子の量は、少なくとも３×１０６の感染単位（ＩＵ）であり、少なくとも１×１０７のＩＵ、少なくとも３×１０７のＩＵ、少なくとも１×１０８のＩＵ、少なくとも３×１０８のＩＵ、少なくとも１×１０９のＩＵ、または少なくとも３×１０９のＩＵであり得る。選択された間隔で、レシピエントのリンパ器官からのＤＣを使用して、ベクター粒子中に含まれる組み換え発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によって同時発現される場合、例えば、ＧＦＰまたはルシフェラーゼなどのマーカー発現を観察することによって、発現を測定することができる。核酸観察技術及び逆転写酵素（ＲＴ）活性の測定を使用して、ベクター粒子がレンチウイルスベクター粒子である場合、ベクター粒子の体内分布を分析することができる。ベクター粒子（レンチウイルスベクター粒子を含む）で治療されるレシピエントの、末梢血単核細胞、リンパ節、脾臓、または悪性もしくは標的病原体に感染した組織からのＴ細胞は、抗原刺激に対する応答の大きさ及び耐久性から測定され得る。上皮細胞及びリンパ球細胞などの、ＤＣ以外の組織細胞は、インビボ遺伝子送達の特異性について分析され得る。
【０２０９】
免疫応答
本明細書に記載するように、免疫原に対する免疫応答を誘導するための方法が提供される。免疫応答に関与する免疫系の細胞は一般に免疫細胞と呼ばれ、リンパ球及び非リンパ系細胞（アクセサリー細胞など）を含む。リンパ球は、外来性抗原を特異的に認識し、それらに応答する細胞であり、アクセサリー細胞は、特定の抗原に特異的ではないが、免疫応答の認知相及び活性化相に関与するものである。例えば、単核貪食細胞（マクロファージ）、他の白血球細胞（例えば、好中球、好酸球、好塩基球を含む顆粒球）、及び樹状細胞は、免疫応答の誘導においてアクセサリー細胞として機能する。外来性抗原によるリンパ球の活性化は、抗原を除去するように機能する多数の効果器機構の誘導または誘発をもたらす。効果器機構に影響を与えるか、またはそれらに関与する単核貪食細胞などのアクセサリー細胞はまた、効果器細胞とも呼ばれる。
【０２１０】
リンパ球の主要なクラスとしては、大型顆粒リンパ球である、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。Ｂ細胞は、抗体を産生することができる。Ｔリンパ球は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋（本明細書及び当該技術分野においてＣＤ４とも呼ばれる））及び細胞溶解性または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋（本明細書及び当該技術分野においてＣＤ８とも呼ばれる））に更に細分される。ヘルパー細胞は、Ｂ細胞及びマクロファージを含むＴ細胞及び他の細胞の増殖及び分化を促進するサイトカインを分泌し、動員し、炎症性白血球細胞を活性化させる。制御Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞と呼ばれるＴ細胞の別の亜群は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病理学的自己反応性、つまり自己免疫疾患を予防する。
【０２１１】
本明細書に記載される免疫応答を誘導するための方法は、様々な種類のＴ細胞（すなわち、Ｔリンパ球）に関与する細胞媒介免疫応答を誘導するために有用である。細胞媒介応答において、様々な種類のＴリンパ球が、いくつかの機構によって抗原を除去する役割を果たす。例えば、特定の抗原を認識することができるヘルパーＴ細胞は、サイトカインなどの可溶性メディエーターを放出して、免疫系の追加の細胞を動員して免疫応答に関与させることによって、応答し得る。また、細胞傷害性Ｔ細胞は、抗原を特異的に認識することができ、抗原担持細胞または粒子に結合し、それらを破壊または損傷させることによって、応答し得る。本明細書に記載される免疫応答を誘導するための方法はまた、本明細書及び当該技術分野においてＢ細胞応答とも呼ばれる体液性応答も誘導し得る。体液性応答は、抗原（または免疫原）に特異的に結合する抗体の産生を含む。抗体は、形質細胞として知られる分化したＢリンパ球によって産生される。
【０２１２】
免疫応答が誘導されるかどうか、及び宿主または対象において誘導される免疫応答の種類は、本明細書に記載され、当業者が精通しているであろう任意の数の周知の免疫学的方法によって決定され得る。本明細書に記載するように、免疫応答の存在及びレベルを決定するための方法及び技術としては、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光偏光、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移、シンチレーション近接アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光消光酵素基質、発色酵素基質及び電気化学ルミネセンス、免疫アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ、免疫ブロット、免疫組織化学など）、表面プラズモン共鳴、レポーター遺伝子を使用するものなどの細胞系アッセイ、ならびに機能性アッセイ（例えば、免疫機能及び免疫応答性を測定するアッセイ）が挙げられる。
【０２１３】
そのようなアッセイとしては、可溶性抗体、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、及びＴＧＦ−β）などの可溶性メディエーター、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子など、ならびに他の可溶性小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、及び／もしくは脂質メディエーターの存在ならびにレベルのインビボまたはインビトロ決定が挙げられるが、これらに限定される必要はない。免疫アッセイはまた、免疫系の細胞の機能的または構造的特性の変化、例えば、細胞増殖、運動性の変化、特異的遺伝子発現または細胞溶解性挙動などの特化した活性の誘導；刺激に応答した樹状細胞の成熟などの細胞成熟；Ｔｈ１応答とＴｈ２応答との間の関係性の変化；表面抗原発現プロファイルの変化またはアポトーシス（プログラムされた細胞死）の発生を含む免疫系の細胞による細胞分化を分析することによって、細胞活性化状態の変化を決定することも含む。これら及び類似したアッセイを実行するための手順は、例えば、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９８）に見出すことができる。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｗｅｉｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９８６）、Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｇｉｉ（ｅｄｓ．）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９７９）、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：１３０９（１９９８）、及びこれらの中で引用される参考文献もまた、参照されたい）。
【０２１４】
免疫原及び対象となるそれぞれの指定抗原に特異的に結合する抗体の存在ならびに／またはレベルを決定することは、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫ブロット、向流免疫電気泳動、放射免疫アッセイ、ドットブロットアッセイ、阻害または拮抗アッセイなど（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号及び同第４，４８６，５３０号、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照されたい）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において通例実施されるいくつかの免疫アッセイのうちのいずれか１つを使用して、決定することができる。免疫アッセイを実行して、免疫原に特異的に結合する抗体のクラス及びアイソタイプを決定することもできる。免疫原に特異的に結合し、免疫化した対象における抗体特異的免疫応答を検出する免疫アッセイにおいて、対照として使用され得る抗体（ポリクローナル及び／もしくはモノクローナル抗原、またはそれらの抗原結合断片）は一般に、当業者にとって既知である様々な技のうちのいずれかによって調製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ＩＬＡＲ  Ｊ．４６：３１４−１（２００５）、（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７６）、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−１９（１９７５）、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９１）、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、及び同第４，４１１，９９３号、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９８０）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照されたく、例えば、Ｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．７０：９８６−９２（２００４）、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：２５７−５９（２００４）も参照されたい。免疫原もしくはその免疫原性断片、あるいは免疫原もしくはその免疫原性断片を担持する細胞または粒子を使用して、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかの産生について動物を免疫化することができる。
【０２１５】
サイトカインのレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、エリスポット、細胞内サイトカイン染色、及びフローサイトメトリー、ならびにこれらの組み合わせ（例えば、細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリー）を含む、本明細書に記載され、当該技術分野において実施される方法に従って決定することができる。免疫応答の抗原特異的誘発または刺激の結果として得られる免疫細胞増殖及びクローン増殖は、脾臓細胞またはリンパ節からの細胞などのリンパ球を単離し、細胞を抗原で刺激し、トリチウム標識したチミジンの組み込みまたは非放射性アッセイ（ＭＴＴアッセイなど）などによって、サイトカイン産生、細胞増殖、及び／または細胞生存率を測定することによって決定することができる。Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答との間のバランスに対する本明細書に記載される免疫原の効果は、例えば、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−βなど）のレベル、ならびに２型サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３など）のレベルを決定することによって試験することができる。
【０２１６】
ＣＴＬ免疫応答のレベル及びメモリーＣＤ４Ｔ細胞応答のレベルは、本明細書に記載され、当該技術分野において通例実施される多数の免疫学的方法のうちのいずれか１つによって決定することができる。ＣＴＬ免疫応答のレベルは、本明細書に記載される組成物、ベクター、またはベクター粒子のいずれか１つの投与前に決定され、その後、メモリーＣＤ４Ｔ細胞に援助を提供する組成物、ベクター、またはベクター粒子の１つ以上の投与後の適切な時点でのＣＴＬ免疫応答のレベルと比較するために使用され得る。ＣＴＬ活性を決定するための細胞傷害性アッセイは、当該技術分野において通例実施されるいくつかの技術及び方法のうちのいずれか１つを使用して実行され得る（例えば、Ｈｅｎｋａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ（ｅｄ．）（２００３Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ），ｐａｇｅｓ１１２７−５０、及びこれらの中で引用される参考文献もまた、参照されたい）。
【０２１７】
本明細書で使用される場合、結合パートナーまたは抗体は、抗体が免疫原またはその免疫原性断片に検出可能なレベルで、好ましくは約１０４Ｍ−１以上、または約１０５Ｍ−１以上、または約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、または１０８Ｍ−１以上の親和定数（Ｋａ）で反応する場合、対象となる免疫原「に免疫特異的である」、「に特異的である」、または「も特異的に結合する」と言われる。その同族抗原に対する抗体の親和性はまた、一般に解離定数ＫＤとして表され、抗体は、それが１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する場合、対象となる免疫原に特異的に結合する。
【０２１８】
結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５１：６６０（１９４９））によって記載されるものを使用して、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、容易に決定することができる。表面プラズモン共鳴について、標的分子は固相上に固定化され、フローセルに沿って流れる移動相の結合パートナー（またはリガンド）に露出される。固定化された標的へのリガンド結合が発生した場合、局所的な屈折率が変化し、ＳＰＲ角度の変化をもたらし、これは、反射光の強度の変化を検出することによって実時間で監視することができる。ＳＰＲシグナルの変化の速度を分析して、結合反応の会合相及び解離相の見かけの速度定数をもたらすことができる。これらの値の比率は、見かけの平衡定数（親和性）をもたらす（例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５（１９９３）を参照されたい）。
【０２１９】
免疫原を含む免疫原性組成物、及び免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物などの、本明細書に記載される免疫原性組成物のうちのいずれか１つ以上を受けている対象、もしくは本明細書に記載される方法に従うアジュバントを含む１つ以上の組成物を含む両方の免疫原性組成物を受けている対象における免疫原及び／またはそれぞれの指定抗原に対する免疫応答の存在及びレベルを決定するために、生物学的試料が対象から取得されてもよい。「生物学的試料」とは、本明細書で使用される場合、（血清または血漿が調製され得る）血液試料、生検標本、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗浄液、滑液）、骨髄、リンパ節、組織外植片、器官培養物、または対象もしくは生物学源からの任意の他の組織もしくは細胞調製物であり得る。生物学的試料はまた、いかなる免疫原性組成物も受ける前に対象から取得されてもよく、この生物学的試料は、基線（すなわち、免疫化前）データを確立するための対照として有用である。
【０２２０】
本明細書に記載される免疫応答を決定するための全ての免疫アッセイ及び方法に関して、当業者は、これらの方法の実施時にどの対照が適切に含まれるかを容易に認識し、理解するであろう。反応構成成分の相互作用を可能にするのに十分な反応構成成分の濃度、緩衝液の種類、温度、及び期間は、本明細書に記載され、当業者が精通している方法に従って決定され、かつ／または調整され得る。
【０２２１】
免疫応答を誘導する方法
１つ以上の抗原に対する適応抗原特異的免疫応答を誘導するための、少なくとも２つの異なる免疫原性組成物を投与することを含む方法が本明細書において提供される。本明細書に記載される免疫原性組成物での対象の二重免疫化は、体液性免疫応答ならびに細胞性免疫応答（ＣＤ４Ｔ細胞応答及びＣＤ８Ｔ細胞応答を含む）の誘導をもたらす。２つの免疫原性組成物は、同時または任意の順序で順次投与される。したがって、体液性免疫応答ならびに（細胞傷害性Ｔ細胞応答を含み得る）ＣＤ４Ｔ細胞応答及びＣＤ８Ｔ細胞応答を含む細胞性応答を誘導するための方法が本明細書において提供され、免疫応答のそれぞれは免疫原（複数可）に特異的なものであるため、それぞれの指定抗原（複数可）に特異的なものとなる。これらの方法は、（単離される、かつ／または組み換え産生される）少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物を投与することと、免疫原の発現をコードし、指示する組み換え発現ベクターを含む第２の免疫原性組成物を投与することとを含む。
【０２２２】
一実施形態において、指定抗原（便宜上、本明細書では第１の指定抗原と呼ばれ得る）に対する特異的免疫応答を誘発することができる少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物を投与することによって、対象において１つ以上の指定抗原に特異的な免疫応答を誘導するための方法が提供される。本方法は、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む別の（すなわち、第２の異なる）免疫原性組成物を、同時投与または順次（すなわち、前または後続して）投与することを更に含む。組み換え発現ベクターは、免疫原をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結された少なくとも１つの制御配列を更に含み、故に、組み換え発現ベクターは、免疫原の発現を指示することができる。
【０２２３】
特定の実施形態において、免疫応答を誘導するためのこれらの方法に従って投与される組み換え発現ベクターは、ベクター粒子（例えば、ウイルスベクター粒子または細胞粒子）中に組み込まれる。組み換え発現ベクターまたはベクターを含むベクター粒子は、粒子が標的細胞に導入される（すなわち、送達される）ことを可能にする様式で構築される。特定の実施形態において、標的細胞は抗原提示細胞である。より具体的な実施形態において、標的細胞は、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞である。その後、免疫原（またはその断片）は標的細胞中で発現され、その免疫原または断片が抗原提示細胞の表面上に提示され、免疫原に特異的な免疫応答、及びそれによりそれぞれの指定抗原に特異的な免疫応答を誘導する。
【０２２４】
少なくとも１つの免疫原（第１の免疫原性組成物）を含む免疫原性組成物は、それを必要とする、免疫原性組成物が投与される対象に投与するのに薬学的または生理学的に好適である、少なくとも１つのアジュバントを更に含み得る。組み換え発現ベクター（第２の免疫原性組成物）を含む免疫原性組成物もアジュバントを含み得る。第１の組成物及び第２の組成物の両方がアジュバントを含む場合、アジュバントは同一であっても、異なってもよい。免疫原、それぞれの指定抗原、アジュバント、ならびに組み換え発現ベクター及びベクター粒子は、本明細書に詳細に論じられる。
【０２２５】
別の実施形態において、（アジュバントを更に含み得る）少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物がまず投与され、その後、（アジュバントを更に含み得る）少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物の投与と同時に組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物が投与される。換言すると、（アジュバントを更に含み得る）少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物は、第１またはプライミング免疫化であり、組み換え発現ベクター及び（アジュバントを更に含み得る）少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物の第２の用量を含む免疫原性組成物は、追加免疫組成物として同時投与される。
【０２２６】
他の実施形態において、少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物が少なくとも１つの追加の免疫原（または少なくとも１つの第２の免疫原）を更に含む、免疫応答を誘導するための方法が提供される。本明細書に記載される方法の他の実施形態において、免疫原をコードし、第２の免疫原性組成物中に含まれる組み換え発現ベクターはまた、少なくとも１つの追加の免疫原の発現もコードし、指示する。更に別の実施形態において、少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の免疫原を更に含み、他の（または第２の）免疫原性組成物中に含まれる組み換え発現ベクターは、少なくとも１つの追加の免疫原の発現をコードし、指示する。第１及び第２の免疫原性組成物中に含まれる免疫原は、同一であっても、異なってもよい。特定の実施形態において、第１の組成物中に含まれる少なくとも１つの追加の免疫原と、第２の免疫原性組成物中に含まれる組み換え発現ベクターによってコードされるものとは、同一である。本明細書で詳細に論じるように、１つ以上の免疫原が免疫原性組成物中に含まれるか、または組み換え発現ベクターによってコードされる場合、各免疫原は、同一の指定抗原または異なる指定抗原に対する特異的免疫応答を誘導し得る。
【０２２７】
したがって、特定の一実施形態において、少なくとも１つの免疫原を含む（アジュバントを更に含み得る）免疫原性組成物が、少なくとも１つの追加の免疫原（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の免疫原とも換言され得る、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれ以上の免疫原）を更に含む方法が提供される。特定の実施形態において、少なくとも２つの免疫原（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原）を含む免疫原性組成物は、多価の免疫原性組成物を形成する。２つ以上の免疫原がアジュバントと組み合わされる例において、免疫原性組成物は、アジュバントとともに別個に配合された各免疫原を含んでもよく、その後、アジュバント化された免疫原が組み合わされて、対象に投与される免疫原性組成物を形成する。あるいは、２つ以上の免疫原がアジュバントと組み合わされ、ともに配合されて、免疫原性組成物を形成してもよい。特定の具体的な実施形態において、各追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６の免疫原など）のうちの１つ以上は、第１の免疫原と同一の指定抗原に対する免疫応答を誘導し得る。他の特定の実施形態において、各追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５の免疫原など）はそれぞれ、異なる指定抗原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６などの指定抗原）に特異的な免疫応答を誘導し得る。
【０２２８】
上記の通り、特定の実施形態において、免疫原性組成物中の組み換え発現ベクターが多シストロンであり得、少なくとも１つの追加の免疫原（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原とも換言され得る、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれ以上の免疫原）をコードするヌクレオチド配列を含み得る方法が提供される。組み換え発現ベクターは、組み換え発現ベクターが導入される細胞中で各免疫原が発現されるように、それぞれのヌクレオチド配列が各免疫原をコードして、フレーム中に全ての適切な制御配列を含むように構築される。特定の具体的な実施形態において、各追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６の免疫原など）のうちの１つ以上は、第１の免疫原と同一の指定抗原に対する免疫応答を誘導し得る。他の特定の実施形態において、追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６の免疫原など）のそれぞれは、異なる指定抗原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６の指定抗原など）に特異的な免疫応答をそれぞれ誘導し得る。
【０２２９】
他の特定の実施形態において、免疫応答を誘導するための方法が提供され、第１の免疫原性組成物は、少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原（便宜上、第１の免疫原と呼ばれる）を含み、少なくとも１つの追加の単離された／組み換え免疫原を更に含み得る。他の実施形態において、本方法は、第１の免疫原をコードし、少なくとも１つの追加の免疫原をコードする組み換え発現ベクターを含む第２の免疫原性組成物を投与することを含む。特定の一実施形態において、第１の免疫原性組成物は、少なくとも２つの単離された／組み換え免疫原を含み、第２の免疫原性組成物は、少なくとも２つの免疫原をコードするヌクレオチド配列を含有する組み換え発現ベクターを含む。
【０２３０】
単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物中に２つ以上の免疫原が含まれる、かつ／または組み換え発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされる場合、各免疫原は、対象となる指定抗原の２つの異なる免疫原性領域またはエピトープを含むアミノ酸配列を含み得る。少なくとも１つの免疫原は、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んでも、Ｔ細胞エピトープを含んでも、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの両方を含むアミノ酸配列を含んでもよい。第２の異なる免疫原は、異なるＢ細胞及び／またはＴ細胞エピトープに対応するアミノ酸配列を含んでもよい。２つ以上の免疫原が免疫原性組成物中に含まれる（または組み換え発現ベクターによってコードされる）場合、少なくとも１つの免疫原は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ領域を含む。より具体的な実施形態において、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ領域は、免疫原及びそれぞれの指定抗原に対するＣＤ８Ｔ細胞特異的免疫応答を誘導することができる。
【０２３１】
２つ以上の免疫原に特異的な免疫応答の誘導が所望される特定の実施形態において、少なくとも１つの免疫原が、少なくとも１つの特異的体液性及び／またはＣＤ４Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導することができ、少なくとも１つの追加の免疫原が、少なくとも１つ特異的ＣＤ８Ｔ細胞免疫反応を含む免疫応答を誘導することができる。したがって、一実施形態において、（ａ）第１の単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（第１の免疫原性組成物とも呼ばれ得る）（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）と、（ｂ）第１の免疫原及び第２の免疫原の発現をコードし、指示する組み換え発現ベクターを含む第２の免疫原性組成物とを、それらを必要とする対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供され、少なくとも第２の免疫原は、特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができる。特定の実施形態において、少なくとも２つの免疫原のうちのそれぞれは、同一の指定抗原に対する免疫応答を誘導する能力を有する。あるいは、少なくとも２つの免疫原のうちのそれぞれは、異なる指定抗原（便宜上、それぞれ第１及び第２の指定抗原などとも呼ばれる）に特異的な免疫応答を誘導する能力を有する。
【０２３２】
本明細書に記載される特定の実施形態において、２つの異なる免疫原性組成物が、それらを必要とする対象に順次投与される。特定の一実施形態において、本方法は、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物を投与する前に、（アジュバントを更に含み得る）少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物を投与することを含む。換言すると、特定の実施形態において、本方法は、単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）の投与に後続して（すなわち、後に）、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物を投与することを含む。
【０２３３】
他の実施形態において、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物は、単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）の前に投与される。換言すると、特定の実施形態において、本方法は、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の投与に後続して（すなわち、後に）、（アジュバントを更に含み得る）少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物を投与することを含む。
【０２３４】
本明細書に記載される二重免疫化法及び免疫原性組成物を使用する免疫応答の誘導は、様々な異なる免疫化レジメンを用いることによって達成することができる。免疫化レジメンの例示的、非網羅的一覧を図６及び図５に示す。特に、ＣＭＢ３０５組み合わせ療法において使用される、ＩＤ−ＬＶ３０５（レンチウイルスベクターがＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する、樹状細胞を標的化するように修飾されたアルファウイルスで偽型化されている、本明細書に記載されるレンチウイルスベクター）及びＩＤＣ−Ｇ３０５（ＧＬＡ−ＳＥ（合成リピドＡ類似体ＴＬＲ４アゴニスト）と組み合わせた組み換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質）が異なる時間に順次投与される、ＣＭＢ３０５の計画された臨床レジメンが本明細書に記載される。具体的には、０日目及び２１日目にＬＶ３０５を投与し、その後、３５日目にＧ３０５を投与する。４９日目に別の用量のレンチウイルスベクターを与え、その後、６３日目にＧ３０５の別の投与を行う。７７日目に第４の用量のＬＶ３０５を与え、その後、９１日目に第３の用量のＧ３０５を与える。
【０２３５】
適応抗原特異的免疫応答を誘導するための方法のこれら及び追加の実施形態は、以下及び本明細書に詳細に記載される。
【０２３６】
特定の実施形態において、本方法は、単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（参照を容易にするため、第１の免疫原性組成物と呼ぶ）、及び／または組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物（参照を容易にするため、第２の免疫原性組成物と呼ぶ）を、対象に２回以上投与することを含む。特定の実施形態において、（アジュバントを更に含み得る）免疫原を含む免疫原性組成物は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、またはそれ以上の回数（例えば、二度（２回）、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数）対象に投与される。換言すると、第１の免疫原性組成物の複数の用量（すなわち、２、３、４、５、６、またはそれ以上の用量）が、対象に投与される。第１の免疫原性組成物が複数可（すなわち、二度（２回）、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数）投与される場合、第１の免疫原性組成物の各投与は順次であってもよく、第１の組成物の各投与及び全てが第２の組成物の前に投与される。他の特定の実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の１用量後かつ第１の組成物の後続用量前に投与される。例として、第１の組成物が対象に２回投与される場合、第２の組成物は、第１の免疫原性組成物の第１の投与（すなわち、第１の用量）に後続して、かつ免疫原性組成物の第２の投与（すなわち、第２の用量）の投与の前に投与されてもよい。第１の免疫原性組成物が３回投与される（すなわち、３用量が投与される）場合などの、別の特定の実施形態において、第２の組成物は、第１の用量の後かつ第２の用量の前、第２の用量の後かつ第３の用量の前、または第１の免疫原性組成物の３用量全ての後に投与されてもよい。第１の免疫原性組成物が４回投与される（すなわち、４用量が投与される）場合などの、更に別の特定の実施形態において、第２の組成物は、第１の用量の後かつ第２の用量の前、第２の用量の後かつ第３の用量の前、第３の用量の後かつ第４の用量の前、または第１の免疫原性組成物の４用量全ての後に投与されてもよい。当業者は、第１の免疫原性組成物５つ以上の用量が投与される場合、第２の組成物が第１の免疫原性組成物の複数の用量のいずれか１つに後続して、または第１の免疫原性組成物の全ての用量の投与に後続して投与され得ることを容易に認識することができる。代替的実施形態において、第２の免疫原性組成物は１回投与され、第１の免疫原性組成物の全ての投与前に投与される。
【０２３７】
更に別の実施形態において、第１の免疫原性組成物が複数回（すなわち、２回以上の回数）投与される場合、第１の免疫原性組成物の１用量は、第２の免疫原性組成物の投与と同時に投与されてもよい。例として、投薬レジメンが第１の免疫原性組成物の２用量の投与を含む場合、第１の用量は、第２の免疫原性組成物と第１の免疫原性組成物の第２の用量との同時投与の前に投与されてもよい。追加の例として、投薬レジメンが第１の免疫原性組成物の３以上の用量の投与を含む場合、３つの用量のうちの少なくとも１つは、第２の免疫原性組成物の投与と同時に投与され、第１の免疫原性組成物の追加の用量は、両方の組成物の同時投与前に投与されても、両方の組成物の同時投与に後続して投与されても、または特定の投薬レジメンに従って投与が意図される第１の免疫原性組成物の用量の総数によっては、１つ以上の用量が両方の組成物の同時投与前に投与され、第１の免疫原性組成物の残りの用量が両方の組成物の同時投与に後続して投与されてもよい。
【０２３８】
特定の具体的な実施形態において、第１の免疫原性組成物の投与は２回投与され、第２の免疫原性組成物は、（ａ）第１の免疫原性組成物の第１の投与に後続して、かつ第１の免疫原性組成物の第２の投与の前に、（ｂ）第１の免疫原性組成物の第２の投与に後続して、（ｃ）第１の免疫原性組成物の第１の投与の前に、または（ｄ）第１の免疫原性組成物の第１及び第２の投与と同時に投与される。別の特定の実施形態において、第１の免疫原性組成物は３回投与され、第２の免疫原性組成物は、（ａ）第１の免疫原性組成物の第１の投与に後続して、かつ第１の免疫原性組成物の第２の投与の前に、（ｂ）第１の免疫原性組成物の第２の投与に後続して、かつ第１の組成物の第３の投与の前に、（ｃ）第１の免疫原性組成物の第３の投与に後続して、（ｄ）第１の免疫原性組成物の第１の投与の前に、または（ｅ）第１の免疫原性組成物の第１、第２、もしくは第３の投与と同時に投与される。更に別の特定の実施形態において、第１の免疫原性組成物は４回投与され、第２の免疫原性組成物は、（ａ）第１の免疫原性組成物の第１の投与に後続して、かつ第１の免疫原性組成物の第２の投与の前に、（ｂ）第１の免疫原性組成物の第２の投与に後続して、かつ第１の組成物の第３の投与の前に、（ｃ）第１の免疫原性組成物の第３の投与に後続して、かつ第１の組成物の第４の投与の前に、（ｄ）第１の免疫原性組成物の第４の投与に後続して、（ｅ）第１の免疫原性組成物の第１の投与の前に、または（ｆ）第１の免疫原性組成物の第１、第２、第３、もしくは第４の投与と同時に投与される。
【０２３９】
更に他の特定の実施形態において、第２の組成物（すなわち、少なくとも１つの免疫原をコードする組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物）が２回投与され、第１の免疫原性組成物（すなわち、少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含み、アジュバントを更に含み得る免疫原性組成物）が１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数投与される方法が提供される。第２の組成物の２つの投与（すなわち、２用量）のうちのそれぞれ及び第１の免疫原性組成物の各投与（すなわち、第１、第２、第３、第４、または第５の投薬）は、任意の順序で順次投与され得る。他の特定の実施形態において、第２の免疫原性組成物の用量のうちの少なくとも１つは、第１の免疫原性組成物の１用量と同時に投与される。
【０２４０】
別の特定の実施形態において、第２の組成物（すなわち、レンチウイルスベクターなどの、少なくとも１つの免疫原をコードする組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物）が２回投与され、第１の免疫原性組成物（すなわち、少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含み、アジュバントを更に含み得る免疫原性組成物）が後続して１回投与され、その後、第２の免疫原性組成物が追加投与され、後続して、第１の免疫原性組成物が再度投与され、その後、第２の免疫原性組成物の別の投与及び第１の免疫原性組成物の追加の投与が再度なされる方法が提供される。特定の実施形態において、このレジメンには、追加免疫として第１の免疫原性組成物の追加の投与が続いてもよい。
【０２４１】
本明細書に記載するように、他の実施形態において、単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）、及び免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物は、少なくとも１回、同時に投与されてもよい。そのような一実施形態において、（１）免疫原を含む免疫原性組成物（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）を投与し、順次、任意の順序で、（２）免疫原をコードする組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物と同時に、免疫原を含む免疫原性組成物の第２の用量を投与することを含む方法が本明細書において提供される。特定の一実施形態において、免疫原を含む免疫原性組成物は、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物と免疫原を含む免疫原性組成物（すなわち、免疫原を含む免疫原性組成物の第２の用量）との同時投与の前に投与される。別の具体的な実施形態において、免疫原を含む免疫原性組成物は、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物と免疫原を含む免疫原性組成物との同時投与に後続して投与される。更により具体的な実施形態において、組み換え／単離された免疫原を含む免疫原性組成物（すなわち、第１の免疫原性組成物）の各用量は、免疫原をコードする組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物（すなわち、第２の免疫原性組成物）の１用量と同時に投与される。より具体的には、第１の免疫原性組成物の第１の用量が第２の免疫原性組成物の第１の用量と同時に投与され（プライミング免疫化とも呼ばれる）、その後、第１の免疫原の第２の用量及び第２の免疫原性組成物の第２の用量が同時投与される（追加免疫化とも呼ばれる）方法が提供される。特定の実施形態において、対象は、第１及び第２の免疫原性組成物の同時投与によって３回免疫化されてもよい。プライミング免疫化と追加免疫化（複数可）との間の時間間隔は本明細書に詳細に論じられ、前臨床研究及び／または臨床研究からの結果に基づいて選択される。
【０２４２】
免疫原性組成物の順次投与を含む、本明細書に記載される方法に関して、用量間の時間間隔は、臨床治験を実施する当業者によって容易に決定され得る。ヒト対象の投薬レジメンはまた、前臨床研究からの結果及び当該技術分野における知識によって知り得る。特定の実施形態において、免疫原性組成物の用量の投与間の時間間隔は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日、または１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、もしくは８週間であっても、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、もしくは１１ヶ月、または少なくとも１年、２年、３年、もしくは４年であってもよい。例として、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物（議論を容易にするため、第２の免疫原性組成物と呼ぶ）が、免疫原を含む免疫原性組成物（議論を容易にするため、第１の免疫原性組成物と呼ぶ）の少なくとも１つの用量に後続して投与される場合、第２の免疫原性組成物は、本明細書に記載される時間間隔のうちのいずれか１つ、または適切な前臨床研究及び臨床研究によって決定され得る時間間隔で、第１の免疫原性組成物の少なくとも１つの用量の投与に後続して投与される。
【０２４３】
同様に、組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物（議論を容易にするため、第２の免疫原性組成物と呼ぶ）が、免疫原を含む免疫原性組成物（議論を容易にするため、第１の免疫原性組成物と呼ぶ）の少なくとも１つの用量の前に投与される場合、第１の免疫原性組成物は、本明細書に記載される時間間隔のうちのいずれか１つ、または適切な前臨床研究及び臨床研究によって決定され得る時間間隔で、第２の免疫原性組成物の少なくとも１つの用量の投与に後続して投与される。例として、特定の一実施形態において、第２の免疫原性組成物は、０日目、２１日目または約２１日目（例えば、約１９日目〜約２３日目）、４９日目または約４９日目（例えば、約４７日目〜約５１日目）、及び７７日目または約７７日目（例えば、約７５日目〜約７９日目）に投与され得る一方で、第１の免疫原性組成物は、３５日目または約３５日目（例えば、約３３日目〜約３７日目）、６３日目または約６３日目（例えば、約６１日目〜約６５日目）、及び９１日目または約９１日目（例えば、約８９日目〜約９３日目）に再度投与され得る。
【０２４４】
特定の実施形態において、対象は、免疫原性組成物のうちの１つ以上で３回、４回、または５回免疫化されてもよい。第３の免疫化と第２の免疫化との間の時間間隔は、第１の免疫原性組成物の投与と第２の免疫原性組成物の投与との間の時間間隔と同一であっても、それとは異なってもよく、時間間隔は異なってもよい。同一または異なる免疫原性組成物の投与間の本明細書に記載される時間間隔は、本明細書に記載される投与レジメン（例えば、図６に示すレジメンを含む）のうちのいずれかに関係する。
【０２４５】
上記の方法に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物を投与することによって誘導される免疫応答は、各免疫原中に存在する各免疫原に特異的であるため、各免疫原それぞれの指定抗原に特異的なものである、体液性応答及び細胞性応答（ＣＤ４免疫応答及びＣＤ８免疫応答を含む）を含む適応免疫応答を含む。単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）、及び免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物は、順次投与され、第１に投与される少なくとも組成物（複数可）（プライミング組成物とも呼ばれ得る）は、免疫原及びそれぞれの指定抗原に特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導することができる。プライミング組成物によって誘導される免疫応答はまた、免疫原及びそれぞれの指定抗原に特異的な抗体応答も含み得る。第２に投与される免疫原性組成物（複数可）（追加免疫組成物とも呼ばれる）は、免疫原及び指定抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導する。追加免疫組成物の投与はまた、抗原特異的抗体応答及び／またはＣＤ４Ｔ細胞特異的免疫応答も誘導または追加免疫し得る。特定の具体的な実施形態において、かつ本明細書に記載するように、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物の投与は、免疫原及びそれぞれの指定抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞免疫応答の誘導を少なくとも含む、免疫応答を誘導することができる。
【０２４６】
本明細書に記載される免疫原性組成物の第１の投与（すなわち、第１の投薬）によって誘導される免疫応答は、それぞれが免疫原性組成物中に含まれる免疫原に特異的である、体液性免疫応答及びＣＤ４Ｔ細胞免疫応答を含み得る。第１の投薬は、（アジュバントを更に含み得る）単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物、または免疫原の発現をコードし、指示する組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物を投与することを含んでも、第１の投薬は、上述の免疫原性組成物のそれぞれの同時投与を含んでもよい。第２の免疫化（すなわち、追加免疫化）は、これらの免疫原性組成物のうちの１つ以上の投与を含み、特異的ＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を含む免疫応答を誘導することができる。
【０２４７】
特定の実施形態において、（アジュバントを更に含み得る）少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（第１の免疫原性組成物とも呼ばれる）は、免疫原に特異的であるため、それぞれの指定抗原に特異的である、ＣＤ４Ｔ細胞応答を含む免疫応答を誘導することができ、この免疫応答はまた、免疫原に対する体液性応答（すなわち、特異的抗体応答または抗原特異的抗体応答）の誘導も含み得る。免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む、他方の免疫原性組成物（または第２の免疫原性組成物）は、少なくとも免疫原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができ、故に、指定抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【０２４８】
したがって、少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物（この組成物は、アジュバントを更に含み得る）を、それを必要とする対象に投与することと、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物を順次及び／または同時に投与することとを含む、細胞傷害性Ｔ細胞応答（ＣＴＬ）を誘導するための方法が提供される。これらの方法は、複数投薬レジメンを含む、本明細書に記載する２つの免疫原性組成物の投与ステップのいずれかに従って実行することができる。ＣＴＬ応答は、免疫原及び／またはそれぞれの指定抗原を担持するか、または提示する細胞または粒子に特異的である。特定の具体的な実施形態において、かつ例として、免疫原が腫瘍関連抗原である場合、ＣＴＬ応答は、免疫原及び／または指定抗原を発現する腫瘍細胞に特異的である。免疫原及び／または指定抗原は、腫瘍細胞表面上に存在するため、細胞傷害性Ｔ細胞にとって到達可能であり得る。したがって、本明細書に詳細に記載される方法及び組成物は、腫瘍関連抗原を担持または発現する複数の腫瘍細胞を含む腫瘍の発生及び再発の可能性を低下させるために有用である。
【０２４９】
他の特定の実施形態において、免疫原及び指定抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫、または真菌などの感染性疾患微生物由来のものであってもよく、ＣＴＬ免疫応答は、免疫原及び／もしくは指定抗原を発現または担持する、ウイルス、細菌、寄生虫、または真菌にそれぞれ特異的である。したがって、本明細書に記載される方法は、それぞれの感染性疾患生物によって引き起こされる感染症を予防または治療するために有用である。
【０２５０】
また、本明細書に記載するように、特定の実施形態において、ＣＴＬ応答を誘導するためのこれらの方法は、多シストロンであり、少なくとも１つの追加の免疫原（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原とも換言され得る、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれ以上の免疫原）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを投与することを含み得る。特定の具体的な実施形態において、追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６の免疫原など）のそれぞれの発現時、それぞれが、第１の免疫原と同一の指定抗原に対する免疫応答を誘導し得る。他の特定の実施形態において、追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６の免疫原など）のそれぞれは、異なる指定抗原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６のものなど）に特異的な免疫応答をそれぞれ誘導し得る。他の特定の実施形態において、少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物は、少なくとも２つの単離された／組み換え免疫原（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の免疫原）を含んで、多価の免疫原性組成物を形成し得る。２つ以上の免疫原がアジュバントと組み合わされる例において、免疫原性組成物は、アジュバントとともに別個に配合された各免疫原を含んでもよく、その後、アジュバント化された免疫原が組み合わされて、対象に投与される免疫原性組成物を形成する。あるいは、２つ以上の免疫原がアジュバントと組み合わされ、ともに配合されて、免疫原性組成物を形成してもよい。特定の具体的な実施形態において、各追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６の免疫原など）は、第１の免疫原と同一の指定抗原に対する免疫応答を誘導し得る。他の特定の実施形態において、各追加の免疫原（例えば、第２、第３、第４、第５の免疫原など）はそれぞれ、異なる指定抗原（例えば、第２、第３、第４、第５、第６などのもの）に特異的な免疫応答を誘導し得る。
【０２５１】
本明細書に記載される方法及び用途を実施するためのより具体的な実施形態において、アジュバント、例えば、無毒性リピドＡ関連アジュバントが免疫原とともに配合されてもよい。他の特定の実施形態において、無毒性リピドＡ関連アジュバントなどのアジュバントは、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物と組み合わせて投与されてもよい。更により具体的な実施形態において、無毒性リピドＡ関連アジュバントはＧＬＡである。更により具体的な実施形態において、ＧＬＡは、ＳＥとともに配合されて、本明細書に記載される方法及び組成物において使用するための安定な水中油型乳濁剤（ＧＬＡ／ＳＥ）を形成する。
【０２５２】
少なくとも１つの単離された／組み換え免疫原を含む免疫原性組成物中にアジュバントが含まれる場合、アジュバント及び免疫原は、典型的には対象への投与前に組み合わされる（すなわち、ともに配合される、混合される）。代替的実施形態において、少なくとも１つの免疫原を含む免疫原性組成物及びアジュバントは、別個しかし同時に対象に投与されてもよい。免疫原を含む免疫原性組成物及びアジュバントが別個かつ同時に投与される場合、免疫原性組成物及びアジュバントのそれぞれは、同一の経路を介して同一の部位に投与されても、異なる経路を介して同一の部位に投与されても、同一または異なる投与経路によって対象の異なる部位に投与されてもよい。特定の実施形態において、アジュバントは、ＧＬＡ／ＳＥなどの無毒性リピドＡ関連アジュバントである。
【０２５３】
組み換え発現ベクターを含む免疫原性組成物中にアジュバントが含まれる場合、アジュバントは、組み換え発現ベクター（または組み換え発現ベクターを含むベクター粒子）と組み合わされて（すなわち、それとともに配合されて、それと混合されて）、免疫原性組成物を形成してもよい。他の実施形態において、組み換え発現ベクター（または組み換え発現ベクターを含むベクター粒子）を含む免疫原性組成物は、別個の組成物であり、同一の経路を介して同一の部位に投与されても、異なる経路を介して同一の部位に投与されても、同一または異なる投与経路によって対象の異なる部位に投与されてもよい。特定の実施形態において、アジュバントは、ＧＬＡ／ＳＥなどの無毒性リピドＡ関連アジュバントである。
【０２５４】
別の特定の実施形態において、特異的免疫応答を誘導するための本明細書に記載される免疫化法は、アジュバントＧＬＡ／ＳＥ及び指定抗原に特異的な免疫応答を誘導することができる免疫原を含む免疫原性組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。本明細書に記載するように、ＧＬＡはＴＬＲ４を標的化する。ＴＬＲ４は、下流飾シグナリングがＭｙＤ８８依存性パスウェイ及びＴＲＩＦ依存性パスウェイの両方を介して発生するという点において、ＴＬＲファミリーの中でも特有である。合わせて、これらのパスウェイは、ＤＣ成熟、抗原プロセシング／提示、Ｔ細胞プライミング、ならびにサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα／β、及びＴＮＦα）の産生を刺激する（例えば、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：９８７（２００４）を参照されたい）。
【０２５５】
特定の実施形態において、本明細書に記載するように、組み換え発現ベクターは、ベクター粒子中に組み込まれ、本明細書に記載される方法は、免疫原の発現をコードし、指示する組み換え発現ベクターを含むベクター粒子を含む免疫原性組成物を投与することを含む。より具体的な実施形態において、ベクター粒子はレンチウイルスベクター粒子などのウイルスベクター粒子である。本明細書に記載するように、レンチウイルスベクター粒子は、修飾シンドビスウイルス外被糖タンパク質を使用して、樹状細胞（ＤＣ）に選択的に侵入する、自己不活性化非組み込みレンチベクターであるＤＣ−ＮＩＬＶであってもよい。ベクターのＤＣへの侵入時、ベクターによってコードされる免疫原の活性転写及び翻訳を介して生成される抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ提示パスウェイへと導入される。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ＤＣ−ＮＩＬＶの使用は、強固なＣＤ８Ｔ細胞応答を生成する。
【０２５６】
一実施形態において、組み換え発現ベクターまたは組み換え発現ベクターを含むベクター粒子を含む免疫原性組成物は、対象に直接投与される。他の特定の実施形態において、標的細胞（複数可）は、免疫原性組成物が投与される対象から単離されて、ベクター粒子が標的細胞中にエクソビボで導入されてもよい。その後、ベクター粒子を含む標的化された細胞が、対象に導入される。
【０２５７】
更により具体的な実施形態において、二重免疫化法は、対象となる組み換え／単離された免疫原（複数可）がアジュバントＧＬＡ／ＳＥと組み合わされたを含む免疫原性組成物を投与することを含む。本方法は、免疫原（複数可）をコードし、発現するＤＣ−ＮＩＬＶを含む第２の免疫原性組成物を投与することを更に含む。これらの免疫原性組成物を使用するための例示的であるが非網羅的な免疫化レジメンを、以下の表１に示す。
【表１】
2017522312.tif 000004
【０２５８】
追加のレジメンを図５及び図６に示す。
【０２５９】
本明細書に記載される方法は、免疫原及びそのそれぞれの指定抗原のうちのいずれか１つに特異的な免疫応答を誘導するために有用である。本明細書に詳細に記載するように、対象となる指定抗原は、腫瘍関連抗原であっても、感染性微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫）由来の抗原であってもよい。特定の具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、及び卵巣癌抗原を含むが、これらに限定されない腫瘍関連抗原に特異的な免疫応答を誘導するために有用である。より具体的な実施形態において、対象となる指定抗原は、前立腺癌抗原、例えば、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である。
【０２６０】
別の特定の実施形態において、ＨＩＶ、ＣＭＶ、肝炎ウイルス、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＳＶ、インフルエンザ、もしくはＨＳＶ−２、または本明細書もしくは当該技術分野において記載される任意の他の感染性ウイルスなどのウイルスに対して対象を免疫化するための組成物及び方法が提供される。したがって、本明細書に記載される方法は、ウイルス抗原に特異的な免疫応答を誘導するために使用され得る。より具体的な実施形態において、対象となる指定抗原は、ｇＤ及びＵＬ１９などのＨＳＶ−２タンパク質である。
【０２６１】
特定の実施形態において、本明細書において提供される二重免疫化法は、対象においてＣＤ８Ｔ細胞免疫応答をプライミングし、追加免疫するための方法を提供する。本明細書において提供される二重免疫化法は、対象となる少なくとも１つの指定抗原を担持または発現する細胞、粒子、もしくは微生物に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導するために使用することができる。特定の実施形態において、対象となる少なくとも１つの指定抗原を発現する腫瘍細胞に対するＣＴＬ応答を誘導するための方法が本明細書において提供される。特定の実施形態において、指定抗原（またはその部分（複数可））は、腫瘍細胞の細胞外表面上に存在し、細胞外環境に露出されている。本明細書に記載される方法は、対象となる指定抗原である腫瘍関連抗原を担持、発現、もしくは分泌する腫瘍（複数の腫瘍細胞を含む）の発生または再発の可能性を低下させる（すなわち、統計的、臨床的、もしくは生物学的に有意な様式で、発生または再発の可能性を低下させる）ために有用である。
【０２６２】
他の特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ウイルス、寄生虫、細菌、または真菌細胞などの微生物に対するＣＴＬ応答を誘導する。指定抗原は、典型的には微生物によって分泌される微生物抗原であっても、微生物の細胞表面上に存在するため露出しており、かつ対象の免疫系の分子及び細胞による認識ならびにそれとの相互作用に利用可能である、１つ以上の免疫原性領域を有する微生物抗原であってもよい。したがって、対象の二重免疫化を含む本明細書に記載される方法は、対象に対する本明細書に記載される免疫原性組成物の投与の不在下では悪化するか、もしくは発生する、微生物感染症を治療及び／または予防する（すなわち、統計的、臨床的、もしくは生物学的に有意な様式で、その発生の可能性を低下させる）ために有用である。
【０２６３】
医学の技術分野の当業者によって理解されるように、「治療する」及び「治療」という用語は、対象（すなわち、ヒトまたは非ヒト動物であり得る患者、宿主）の疾患、障害、または病態の医学的対応を指す（例えば、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙを参照されたい）。一般に、適切な用量及び治療レジメンは、治療的及び／または予防的利益をもたらすのに十分な量の、本明細書に詳述される免疫原及び任意でアジュバントを提供する。治療処置及び／または予防方法もしくは防止方法の結果として得られる治療的及び／または予防的利益としては、例えば、所望されない生理学的変化もしくは障害を予防もしくは緩徐化もしくは遅延（減少）させること、またはそのような疾患もしくは障害の重症度の増大を予防もしくは緩徐化もしくは遅延（減少）させることが目的である臨床成績の改善が挙げられる。対象の治療からの有益または所望される臨床結果としては、治療される疾患もしくは障害の結果として生じるか、またはそれに関連する症状の寛解、減少、もしくは軽減；症状の発生の減少；生活の質の改善；より長い無疾患状態（すなわち、対象が、それに基づいて疾患の診断がなされる症状を示す可能性または傾向を減少させること）；疾患程度の減少；疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態；疾患進行の遅延または緩徐化；疾患状態の寛解または緩和；及び検出可能または検出不能であるかに関わらず（部分的または全体的であるかに関わらず）緩解；ならびに／あるいは全体的な生存が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」とはまた、対象が治療を受けなかった場合に予想される生存と比較して、生存を延長することも意味し得る。本明細書に記載方法及び組成物を必要とする対象は、既に疾患もしくは障害を有している対象、及び疾患もしくは障害を有する傾向があるか、またはそれを発症するリスクにある対象を含む。予防的治療を必要とする対象は、疾患、病態、または障害が予防されるべきである（すなわち、疾患もしくは障害の発生または再発の可能性を減少させる）対象を含む。本明細書に記載される組成物（及び組成物を含む調製物）ならびに方法によってもたらされる臨床的利益は、組成物の投与が利益をもたらすことが意図される対象における、インビトロアッセイ、前臨床研究、ならびに臨床的研究の設計及び実行によって評価することができる。適切な前臨床研究ならびに臨床研究の設計及び実行は、関連する技術分野（複数可）の当業者によって容易に実行され得る。
【０２６４】
単離された／組み換え免疫原、組み換え発現ベクター、及び／またはベクター粒子は、薬学的もしくは生理学的に許容される賦形剤または担体で対象に投与され得る。薬学的に許容される賦形剤は、生物学的に適合するビヒクル、例えば、本明細書に詳細に記載され、ヒトまたは他の非ヒト対象（非ヒト哺乳類対象を含む）への投与が好適である、生理食塩水である。
【０２６５】
組み換え発現ベクターの投与に関して、治療的に有効な量は、治療されるヒトまたは非ヒト動物において、医学的に望ましい結果を産生することができる（すなわち、統計的、生物学的、及び／もしくは有意な様式で、免疫原に特異的な免疫応答（体液性及び／もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答を含む細胞媒介応答）を誘導または亢進するのに十分な量の免疫原が発現される）ポリヌクレオチドの量を提供する。医学の技術分野において周知であるように、任意の１人の患者への投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的健康、ならびに同時投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。用量は変動するが、組み換え発現ベクターを含むベクター粒子を投与するために好ましい用量は、ベクターポリヌクレオチド分子（ベクターゲノムとも呼ばれる）の約１０６〜１０１２個の複写を提供するのに十分である。
【０２６６】
本明細書に記載される免疫原性組成物及びアジュバント組成物を含む薬学的組成物は、医学の技術分野の当業者によって決定される、治療（または予防）される疾患または病態に適切な様式で投与され得る。適切な用量ならびに組成物の投与の好適な継続期間及び頻度は、患者の健康状態、患者の大きさ（すなわち、体重、質量、または体面積）、患者の疾患の種類及び重症度、活性成分の特定の形態、ならびに投与方法などの因子によって決定されるであろう。一般に、適切な用量及び治療レジメンは、治療的及び／または予防的利益（より頻繁な完全もしくは部分的緩解などの臨床成績の改善、より長い無疾患及び／もしくは全体的な生存、または症状重症度の減少を含む、本明細書に記載するようなもの）をもたらすのに十分な量の組成物（複数可）を提供する。予防的用途には、用量は、疾患もしくは障害に関連する疾患を予防、その発生を遅延、またはその重症度を減少するのに十分であるべきである。本明細書に記載される方法に従って投与される免疫原性組成物の予防的利益は、前臨床研究（インビトロ及びインビボ動物研究を含む）ならびに臨床研究を実行し、それらから取得されたデータを、適切な統計的、生物学的、及び臨床的方法ならびに技術（これらの全ては当業者によって容易に実施され得る）によって分析することによって決定することができる。
【０２６７】
一般に、１用量中に存在するか、または１用量中に存在するポリヌクレオチドをコードすることによってインサイチュで産生される、本明細書に記載する融合ポリペプチドを含む免疫原の量は、１ｋｇの宿主当たり約０．０１μｇ〜約１０００μｇの範囲である。有効な治療をもたらすのに十分である最小投与量の使用が、通常好ましい。患者は一般に、治療または予防される病態に好適なアッセイを使用して、治療的または予防的有効性について監視され得、これらのアッセイは、当業者が精通しており、本明細書に記載されるものであるだろう。液体形態で投与される場合、好適な用量サイズは患者の大きさとともに変動するが、典型的には１０〜６０ｋｇの対象について、約１ｍｌ〜約５００ｍｌ（１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１０００μｇを含む）の範囲であるだろう。最適な用量は一般に、実験モデル及び／または臨床治験を使用して決定することができる。最適な用量は、対象の体重、体面積、または血液量に依存し得る。本明細書に記載するように、適切な用量はまた、年齢、性別、及び体重、ならびに医学の技術分野の当業者が精通している他の因子だけでなく、患者の（例えば、ヒト）病態、つまり、疾患の段階、一般的健康状態にも依存し得る。
【０２６８】
薬学的組成物は、例えば、局所、経口、経腸、経鼻（すなわち、鼻腔内）、吸入、髄腔内、直腸、腟、眼内、結膜下、舌下、皮内、節内、腫瘍内、経皮、または非経口投与（皮下、経皮、静脈内、筋肉内、胸骨内、空洞内、外尿道口内、もしくは尿道内注射または注入を含む）を含む、任意の適切な投与様式で配合され得る。投与方法は、明細書に詳細に記載される。
【０２６９】
非経口投与について、担体は、好ましくは水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与について、上記の賦形剤のうちのいずれか、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、固体サッカリン、タルカム、セルロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、グルコース、スクロース、及び／または炭酸マグネシウムなどの固体賦形剤もしくは担体が用いられてもよい。
【０２７０】
組み換え／単離された免疫原を含む免疫原性組成物、及び組み換えベクター構築物またはベクター粒子を含む免疫原性組成物は、免疫原の有効用量を提供する任意の経路による送達のために配合され得る。そのような投与方法は、経口投与または注射による送達を含み、液体の形態であってもよい。液体薬学的組成物としては、例えば、以下、注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、等張食塩水、溶液もしくは懸濁培地としての役割を果たし得る不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒などの無菌希釈剤；抗菌剤；酸化防止剤；キレート剤；塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの浸透圧の調整のための緩衝液及び薬剤のうちの１つ以上が挙げられ得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数容量バイアルに封入され得る。生理食塩水の使用が好ましく、注射可能薬学的組成物は好ましくは無菌である。
【０２７１】
本明細書に記載される組み換え発現ベクターなどの核酸分子を含む薬学的組成物について、核酸分子は、当業者にとって既知である核酸、ならびに細菌、ウイルス、及び哺乳類発現系（例えば、本明細書において提供されるベクター粒子及び組み換え発現構築物など）を含む任意の種類の送達系内に存在し得る。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をそのような発現系内に組み込むために技術は、当業者にとって周知である。他の特定の実施形態において、典型的にはＤＮＡである組み換え発現ベクターはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−４９（１９９３）に記載され、Ｃｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１６９１−９２（１９９３）に概説されるように「ネイキッド」であり得る。ネイキッドＤＮＡの取り込みは、細胞中に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【０２７２】
核酸分子は、当該技術分野において記載されるいくつかの方法いずれか１つに従って、細胞中に送達され得る（例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２：１３９（１９９２）、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９−４０（１９９９）、Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３７：１６５−９２（１９９９）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４−９２（２０００）、米国特許第６，３９５，７１３号、国際特許出願公開第９４／０２５９５号）、Ｓｅｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８７：８５３−５９（２０００）、Ｓｅｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．２３：１０３−１２（２００２）、米国特許出願公開第２００１／０００７６６６号、及び同第２００３／０７７８２９号を参照されたい）。当業者にとって既知であるそのような送達方法としては、イオン導入による、または生分解性ポリマー；ヒドロゲル；シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：１０６８−７４（１９９９）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際出願公開第０３／４７５１８号及び同第０３／４６１８５号）；乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡ微粒子（ペプチド及びポリペプチドならびに他の物質の送達にも有用である）（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号、米国特許出願公開第２００２／１３０４３０号を参照されたい）；生分解性ナノカプセル；ならびに生体接着性微粒子などの他のビヒクル中への組み込みによる、あるいはタンパク質性ベクター（国際出願公開第００／５３７２２号）による、リポソーム中へのカプセル封入が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、核酸分子はまた、ポリエチレンイミン及びその誘導体（ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体など）とともに配合または複合されてもよい（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号も参照されたい）。
【０２７３】
本明細書に記載される方法の特定の実施形態において、対象はヒトまたは非ヒト動物である。本明細書に記載される治療を必要とする対象は、本明細書に記載される疾患、障害、または病態の症状または続発症を呈し得るか、または疾患、障害、または病態を発症するリスクにあり得る。治療され得る非ヒト動物としては、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びゴリラなど）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ類、ブタ類（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ類、イヌ類、ネコ類、ウシ類、ならびに他の飼育動物、家畜、及び動物園の動物が挙げられる。
【０２７４】
本明細書において提供される組成物は、例えば、固体、液体、粉末、水性、または凍結乾燥形態などの様々な形態であり得る。ウイルスベクター粒子及び細菌ベクター粒子を含むベクター粒子を投与するための好適な薬学的賦形剤及び担体、ならびに組み換え発現ベクター成物の例は、当該技術分野において既知である。そのような賦形剤、担体、及び／または添加剤は、従来の方法によって配合され、好適な用量で対象に投与され得る。本明細書に記載される組成物中に含まれ得るリピドなどの安定剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、及びキレート剤は、組成物及び組成物の構成成分を体内での分解から保存するのを補助し得る。
【０２７５】
本明細書において提供されるウイルスベクター粒子及び細菌ベクター粒子を含むベクター粒子、免疫原性組成物、アジュバント組成物、ならびに組み換え発現ベクターは、キットとしてパッケージングされてもよい。キットは、任意で使用説明書、デバイス、及び追加の試薬などの１つ以上の構成成分と、本方法を実施するためのチューブ、容器、及びシリンジなどの構成成分とを含む。例示的なキットは、任意で使用説明書、ベクター粒子を検出するためのデバイスもしくは試薬、組み換え発現ベクター、または対象中の免疫原と、組成物（複数可）を対象に投与するためのデバイスとを含んでもよい。
【０２７６】
免疫原をコードするポリヌクレオチドを含むキットもまた、本明細書に企図される。そのようなキットはまた、ウイルスパッケージング構成成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、及びシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質バリアントをコードするベクターも含んでもよい。いくつかのキットは、ウイルスパッケージング構成成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質バリアントをコードするベクター、及び少なくとも１つのＤＣ成熟因子をコードするベクターを含有するであろう。
【０２７７】
対象となる（典型的には抗原または免疫原をコードする）配列をコードするウイルスベクターを含むキット、及び任意でＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列もまた、本明細書に企図される。いくつかのキットにおいて、キットは、ウイルスパッケージング構成成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、及びシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質バリアントをコードするベクターを含む。
【０２７８】
キットはまた、説明書を含有してもよい。説明書は典型的には、組成物を投与するために、対象の適切な状態、適切な投与量、及び適切な投与方法を決定するための方法を含む投与のための方法を記載する。説明書はまた、治療時間の継続期間にわたって対象を監視するためのガイダンスも含んでもよい。
【０２７９】
本明細書において提供されるキットはまた、本明細書に記載される免疫原性組成物のうちのそれぞれを投与するための、及び／またはアジュバント組成物を対象に投与するためのデバイスを含んでもよい。薬剤、免疫原性組成物、及びワクチンを投与するための、当該技術分野において既知である様々なデバイスのうちのいずれも、本明細書において提供されるキットに含まれてもよい。例示的なデバイスの例としては、皮下針、静脈内針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、及び液体分注器（点眼器など）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、組成物を投与するためのデバイスは、キットの活性構成成分と適合する。例えば、高圧注射デバイスなどの無針注射デバイスが、高圧注射によって損傷されないベクター粒子、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドとともにキットに含まれてもよいが、典型的には、高圧注射によって損傷され得るベクター粒子、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドを含むキットには含まれない。
【０２８０】
他の実施形態及び用途は、本開示に照らして、当業者に明らかになるであろう。以下の実施例は、単に様々な実施形態の例示的なものとして提供されるにすぎず、いかなる方法でも本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２８１】
実施例１
ＩＤ−ＶＰ０２に対する中和抗体応答が、免疫化後に検出され得る
ＶＰ０２（他ではＤＣ−ＮＩＬＶとも呼ばれる）は、腫瘍抗原コード遺伝子をインビボでＤＣに送達するように操作された、レンチベクター（ＬＶ）系ワクチンプラットフォームである。このワクチンプラットフォームは、Ｃ型レクチン受容体ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する操作されたシンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）糖タンパク質での偽型化によって、ＤＣを形質導入することが示されている。結果として、ベクターは、マウスにおける単一免疫化後、大きな機能的ＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を誘導する。ＶＰ０２レンチウイルスベクタープラットフォームは、（ベクター産生中、ゲノム転写物の核内輸出を促進する）Ｒｅｖを除く全てのＨＩＶアクセサリータンパク質を欠き、ベクターは、Ｕ３領域（ΔＵ３）に延長した欠失を有する分割ゲノムによってコードされる。ΔＵ３欠失は、（１）感染した標的細胞中で、逆転写されたｄｓＤＮＡベクターからの全長ベクターゲノムの転写を予防し、（２）３’ＬＴＲが組み込み後にプロモーターとして機能し得るときに発生し得る、挿入活性化のリスクを最小化する、自己不活性化変異である。特異的変異は、（１）ヒトＤＣを形質導入するＶＰ０２の能力を亢進し、（２）インテグラーゼ酵素依存性組み込み事象を除去するための重複した安全性機構を提供するために、ベクター及び製造プロセスにおいて行われている。特に、ＶＰ０２プラットフォームは、ＤＣへの結合及び侵入を亢進するための２つの特異的修飾を含有する。第１のものは、ＤＣ−ＳＩＧＮ膜タンパク質に対する結合特異性を有するアルファウイルス外被糖タンパク質の使用である。この外被（ＳＩＮＶａｒ１）は、そのＤＣ向性を更に増加させ、遍在するヘパラン硫酸塩受容体への結合を予防するために、原型から遺伝子組み換えされている。これらの遺伝子組み換えに加えて、ＩＤ−ＶＰ０２がマンノシダーゼＩの小分子阻害剤の存在下で産生され、これは、末端高マンノース残基を有するＩＤ−ＶＰ０２外被糖タンパク質の生成をもたらす（例えば、国際公開第２０１３／１４９１６７号を参照されたい）。
【０２８２】
中和抗体応答は、ＣＤ８Ｔ細胞に対する提示のための抗原を送達するベクターの効力に影響を与え得る第１の投与後、ＩＤ−ＶＰ０２に対して生成されることが予想される。インビボ投与後に中和抗体がＩＤ−ＶＰ０２に対して生成されるかどうかを決定するために、ＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２の７．５×１０１０、３．０×１０９、もしくは１．２×１０８個のベクターゲノム、ＧＦＰをコードするＶＳＶ−Ｇ偽型化されたレンチベクターの７．５×１０１０個のベクターゲノム、またはＨＢＳＳのうちのいずれかで免疫化した３匹のマウスの群から血清を単離させた。その後、インビトロ形質導入アッセイによって、ＩＤ−ＶＰ０２に対する中和抗体の存在について血清を評価した。高用量または中用量のＩＤ−ＶＰ０２のいずれかを注射したマウスからの血清は、このアッセイにおいてベクターを中和することができた（図１Ａ）。中和抗体応答は用量依存性であり、最高のベクター用量（７．５×１０１０個のベクターゲノム）のＶＳＶ−Ｇ対照ベクターで免疫化したマウスからは血清中和が観察されなかったという点で、ＩＤ−ＶＰ０２のシンドビスウイルス由来外被に特異的であった。
【０２８３】
このアッセイにおいて抗ＩＤ−ＶＰ０２抗体が検出されたため、我々は、ＩＤ−ＶＰ０２免疫化マウス中に存在する中和抗体のレベルがベクターのインビボ効力に影響を与えるかどうかを決定することを望んだ。ナイーブＣＤ８Ｔ細胞を有効にプライミングするための免疫学的要求は、既存のメモリー細胞を追加免疫するための免疫学的要求よりも一層厳密なものであるため、我々は、中範囲用量のＩＤ−ＶＰ０２がナイーブＣＤ８Ｔ細胞をプライミングする能力を有意に損なうためには、どのレベルのＩＤ−ＶＰ０２への事前露出（すなわち、用量）が必要とされるのかを決定することを模索した。故に、ＧＦＰをコードする高容量、中用量、もしくは低容量のＩＤ−ＶＰ０２、ＧＦＰをコードする高用量のＶＳＶ−Ｇ偽型化レンチベクター、またはＨＢＳＳで免疫化された上記のマウスを、最小ＯＶＡ２５７ペプチド配列をコードする、ＬＶ１ｂと呼ばれる代替的な抗原カセットをコードするＩＤ−ＶＰ０２の３．０×１０９個のベクターゲノムで免疫化した。免疫化の１２日後、ＩＣＳによって脾臓におけるＯＶＡ２５７特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を測定した。対照マウスにおいて観察されたＣＤ８Ｔ細胞応答と比較して、ＧＦＰをコードする２５倍高用量（７．５×１０１０個のベクターゲノム）のＩＤ−ＶＰ０２に対する事前露出の文脈において、ＩＤ−ＶＰ０２の３．０×１０９個のベクターゲノムがナイーブＣＤ８Ｔ細胞応答をプライミングする能力の明白な低下が存在した（図１Ｂ）。しかしながら、この低下は、等しい（３．０×１０９）用量または２５倍低い（１．２×１０８）用量のＩＤ−ＶＰ０２−ＧＦＰに事前露出されていなかった動物においては観察されなかった。インビトロ中和アッセイにおける場合のように、ベクター効力の低下の原因となる機構は、ＶＳＶ−Ｇ偽型化対照ベクターの７．５×１０１０個のベクターゲノムで既に免疫化されたマウスにおいてはナイーブＣＤ８Ｔ細胞のプライミングの低下が観察されなかったという点で、ＩＤ−ＶＰ０２の外被に特異的であるようであった。
【０２８４】
これらのデータは、ベクター特異的免疫が高用量のＩＤ−ＶＰ０２に対して生成され得るものの、プライミング免疫化及び追加免疫化の両方に当量の中範囲用量が与えられる場合、ＩＤ−ＶＰ０２の適用は単回投与に制限されることを示す。
【０２８５】
実施例２
マウスにおけるＣＭＢ３０５のＧＬＰ安全性／毒性研究
ＣＭＢ３０５調査レジメンの公式のＧＬＰ安全性／毒性研究が、マウスにおいて行われている。「１７日間または５週間の回復期間での、８週間にわたるＢＡＬＢ／ｃマウスへの筋肉内注射及び皮下注射によって順次投与される、１３週間のＣＭＢ３０５の反復用量毒性研究（Ａ１３−ｗｅｅｋ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｓｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＣＭＢ３０５ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ８ｗｅｅｋｓ  ｔｏ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ１７−ｄａｙ  ｏｒ５ｗｅｅｋ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｐｅｒｉｏｄ）」と題したこの研究は現在進行中であり、予備的結果が以下に提供される。ＣＭＢ３０５は、癌の治療のための調査治療ワクチンである。調査治療レジメンは、２つの調査産生物、つまりＩＤ−ＬＶ３０５（ＮＹ−ＥＳＯ−１癌関連抗原を発現するＶＰ０２プラットフォームに基づくレンチウイルスベクター）及びＩＤＣ−Ｇ３０５（合成ＴＬＲ４アゴニストＧＬＡ−ＳＥと組み合わされた組み換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質）で構成され、これらは、順次、しかし異なる投与経路を介して投与される。この研究において、１回の剖検時点当たり、１０匹のオス及び１０匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、４用量のＩＤ−ＬＶ３０５を皮下（尾の付け根）に、及び３用量のＩＤＣ−Ｇ３０５を筋肉内に投与した（表２）。研究設計の略図を図２に示す。ＩＤ−ＬＶ３０５及びＩＤＣ−Ｇ３０５の投与レベルはそれぞれ、２．５×１０８個のベクターゲノム及び５μｇのＧＬＡ−ＳＥであった。この研究の対照群の動物は、代わりに注射ビヒクルを受けた。投与経路は、それらがワクチン免疫化のための一般的な経路であるため、及びこれらの経路が意図されるヒトへの投与（皮内及び筋肉内）のための支持を提供するために選択された。
【０２８６】
この研究の目的は、オス及びメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内注射及び皮下注射によって８週間の投薬期間にわたって投与されたときの、ＣＭＢ３０５の潜在的な局所及び全身毒性を評価すること、ならびに１７日間または５週間の回復期間後のＣＭＢ３０５の任意の効果の可逆性、持続性、または遅延した発生を評価することである。
【表２】
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【０２８７】
予備的結果
この研究は現在進行中であり、免疫化が完了し、２つの第１の剖検が実施されている。
【０２８８】
臨床病理学
血液学：いずれの性別においても、血液学的パラメータにおいて試験物品に関連した影響は存在しなかった。全ての平均値及び個々の値は、生物学的変動にとって許容される範囲内にあると考えられた。
【０２８９】
臨床化学：いずれの性別においても、臨床化学的分析物において試験物品に関連した影響は存在しなかった。ＭＰＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの歴史範囲外である時折の平均値に関わらず、全ての平均値及び個々の値は、生物学的変動にとって許容される範囲内にあると考えられた。これらは、それらの大きさの小ささ、変化の方向、及び対照ビヒクルを含む最小数の感染した動物に基づいて、有意義であるとは考えられなかった。
【０２９０】
死亡率／罹患率
３匹の動物を、研究中、死に際して安楽死させた。
●動物２００９（２群オス）及び２０１３（２群オス）−陰茎逸脱（乾燥、紅斑）、体重減少、軽度〜中程度に脱水。陰茎逸脱のため、１５日目に安楽死させた。
●動物２０２０（２群オス）−体重減少、活性の減少、せむし様の体位、触ると皮膚が冷たい。１４日目に安楽死させた。
【０２９１】
独立した毒性学コンサルタントは、動物が、順化期間中、プロトコルに指定される体重範囲未満であると結論付け、１匹の動物が死亡して見つかった。しかしながら、投薬の３日前、全ての動物は、低い正常範囲ではあるものの推奨される体重範囲内にあり、正常であると考えられていた。コンサルタントは、認定獣医師（ＭＳｃ、ＤＶＭ、ＤＡＣＶＰ）に連絡してこの所見を議論し、彼は、研究の完了時に全てのデータセットが入手可能となるまで試験物品に関連する事象を完全には退くことはできないものの、おそらく動物の不良な状態によるものであることに同意した。
【０２９２】
研究１５日目時点で入手可能なデータを審査し、コンサルタントは、以下の推奨及びコメントを出した：
１）体重及び摂食量の測定を、１週間に１回から１週間に２回に増加させることによって、動物をより頻繁に監視する。
２）所定の水システムに加えて、動物に水ボトルを提供する。契約者がヒドロゲルの形態の食餌濃縮物を全ての動物に提供したこと、この付加によって動物の一般的な状態が改善されたことが留意されたい。この付加により、摂食量データに影響があった。
３）第２の用量後、体重が減少し続けた場合、出資者はＧ３０５でのマウスの治療の延期を考えるべきである。出資者には、１６日目及び１７日目から体重データが提供された。オスのマウスは、ＬＶ−３０５の第２の用量後の両日に体重が増加していたため、Ｇ３０５の投薬の延期は必要ではなかった。
４）コンサルタントは、２匹の瀕死のマウスについて報告された臨床病理学的データの結果の解釈に関して、これらのデータはこれらの動物において非常に変動しやすいため、出資者を警告した。契約者から歴史的対照データが要求され、彼らは、臨床病理学者がこのデータを審査することに言及した。
５）陰茎逸脱の所見は、おそらくこれらの動物の不良な状態によるものであり、おそらく試験物品に関連するものではない。
【０２９３】
後続する臨床的所見及び体重測定は、全ての群の全てのマウスにおいて許容されるものであった。
【０２９４】
免疫原性結果
免疫応答レベルを、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて実施されるＣＭＢ３０５の中心的ＧＬＰ安全性／毒性研究上記及び表２を参照されたい）においてパラメータとして含めるために、脾細胞を研究剖検の時点で回収し、その後、我々の施設に新鮮なまま輸送して、処理し、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答について評価した。図３に見られるように、細胞内サイトカイン染色、その後のフローサイトメトリーは、ＣＭＢ３０５の組み合わせ投薬レジメンを受けたマウスにおいて有意な免疫応答が誘導された一方で、配合物ビヒクル単独で免疫化されたマウスは、そのような応答を呈さなかったことを実証する。
【０２９５】
実施例３：
１つまたは４つのリンパ節部位に様々な投与レベルで皮内投与された、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスにおけるＩＤ−ＬＶ３０５の免疫原性
１つ対４つのリンパ節ドレナージ部位に皮内投与した後、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＴ細胞応答を誘導することができるＩＤ−ＬＶ３０５の最低免疫原性投与レベルを決定するために、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスを、２倍の増分での１．２５×１０８〜２．０×１０９個のベクターゲノムの範囲の用量のＩＤ−ＬＶ３０５で免疫化した。使用した部位は、尾の付け根の近く、上背部及び下背部の左右の側の対側、外側に位置した（図４）。動物を１回免疫化し、１４日後に脾細胞におけるＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞応答を評価した。図４（下部パネル）に示すように、上部または下部皮内部位に単回ボーラス注射として投与される場合の最低免疫原性用量は、５．０×１０８個のベクターゲノムであった。投与レベルが増加するにつれて、増加する免疫応答レベルに向かう傾向が観察された。しかしながら、４つの別個の注射に分割されたＩＤ−ＬＶ３０５の投与後、最低免疫原性総用量は、２．０×１０９個のベクターゲノム（４つの注射部位のそれぞれに投与される５．０×１０８個のベクターゲノム）であった。より低い応答レベルではあるが、抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答（示さず）について類似した結果が見られた。複数の注射の効果は相加的であることが予想されていたため、これらの結果は驚くべきものであった。しかしながら、これらの結果は、複数の注射から予想される相加的効果を低下させる因子があるようであることを示す。この実験の結果は、複数の注射部位への投与が総注射量を増加させるために使用され得ることを示す。これらの結果は、単回注射として投与される場合、複数の投与が使用される場合よりも低い免疫原性用量が使用され得ることを示す。単回注射が関与するレジメンは、利便性を改善し、最良の臨床効果のために必要とされる用量を低下させることができる。これは、より少ない注射が必要とされるため、１回の治療当たりのより低い費用、及び患者経験の改善をもたらす。
【０２９６】
実施例４
ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する局所進行性癌または転移性癌を有する患者における、皮内投与されるＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１の安全性、耐容性、及び免疫原性の評価
提案されるファースト・イン・ヒューマンの研究の全体的な目標は、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する癌を有する患者における、反復用量のＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１投与の安全性及び免疫原性を評価することである。追加の目的としては、生検で取得される臨床的腫瘍応答及び腫瘍組織学的応答の評価が挙げられる。
【０２９７】
患者は、彼らが、ＲＴ−ＰＣＲ及び／またはＩＨＣ及び／またはＮＹ−ＥＳＯ−１に対する血清抗体の存在によって、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する局所進行性癌または転移性癌を有し、１つ以上の全身療法（ＮＳＣＬＣ及び乳癌については少なくとも２つ以上の全身療法）に対して好ましく応答していない場合にのみ、登録される。患者は、巨大腫瘤病変または急速進行性疾患を有するべきではない。以下の癌組織学、つまり乳癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、卵巣癌、腎細胞癌、または肉腫のうちの１つを有する患者が、登録され得る。これらの腫瘍型は、それらの既知のＮＹ−ＥＳＯ−１発現頻度（例えば、ｃｔａ．ｌｎｃｃ．ｂｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐのＣＴＤａｔａｂａｓｅウェブサイトを参照されたい）に基づいて選択され、免疫療法に対して応答性であることが既知である腫瘍を含む。多くの異なる種類の悪性腫瘍を有する患者のための承認された治療選択肢は増加し続けるものの、進行癌を有する患者は不良な予後を有し続け、現在の療法はほとんどが不満足なものである。患者は、提案される調査療法の潜在的なリスク及び利益に関して、完全に知らされる。適切な血液学的及び代謝的機能は、研究参加のために必要とされる判断基準であるだろう。
【０２９８】
臨床研究のためのワクチン及びベクター投薬の選択は、一般的に種にわたる非比例的スケーリングによる調整をせず、これはファースト・イン・ヒューマンの臨床治験であるため、提案されるヒト開始用量レベル（５×１０８個のゲノム）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスＧＬＰ毒性学研究において使用された最高用量とおよそ同一である。体重によって調整して、開始ヒト用量は、マウスＧＬＰ毒性学研究からの最高用量よりもおよそ２８００倍低い。提案される２対数用量増大範囲は、非ＧＬＰ動物毒性学研究からの安全域及び先行するベクター免疫療法臨床治験からの慣習の考慮を反映する。
【０２９９】
ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１は、３用量について３週間に１回、皮内注射により８つの部位に投与される。非臨床研究は、２〜４週間に１回の注射が最も耐久性があり、かつ最高の大きさの免疫応答を生成することを示唆する。
【０３００】
手順
ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１は、３＋３の順次用量増大設計において、０、２１、及び４２日目に投与される。ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１の全ての用量レベルは、１ｍＬで８×１２５μＬ皮内注射として、各三角筋に２回及び各四頭筋に２回、鼠径リンパ節に対して少なくとも１０ｃｍ遠位で投与される。皮内注射は、各部位で少なくとも３ｃｍ離して位置するべきである。
【０３０１】
３つの用量レベルのコホートを、ＤＬＴの不在及び先行する２つのコホートの許容される安全性データの審査を条件として治療する。
【表３】
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【０３０２】
実施例５
ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１投与の初期第１相データの要約
以下は、実施例４に概要を述べる第１相臨床治験の初期データの高レベルの要約である。
【０３０３】
ＬＶ３０５の３つの異なる用量レベルを評価する、この用量増大治験において治療された１２人の患者において観察された、グレード１または２の有害事象のみを有する好ましい安全性プロファイル。ＣＤ４またはＣＤ８特異的Ｔ細胞応答が、１１人中８人（７３％）の評価可能な患者において治療後に観察された。中用量レベルまたは高用量レベルのＬＶ３０５で治療された６人中４人の患者は、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する新規のＣＤ８Ｔ細胞応答を発生させた。予想通り、治療は、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体レベルには影響を有しなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する様々な種類の軟部組織肉腫を有する、登録され、治療された１２人の患者のうち、ＬＶ３０５治療前に腫瘍増殖の証拠を有する６人中４人の患者が最長で３４７＋日間、安定化し、進行が停止し、最大１３．８％の腫瘍退行が１人の患者において観察された。１２人中８人（６７％）の患者が、２０８日間の継続期間中央値（範囲：１３９〜３４７＋）で、安定な疾患（ＳＤ）の最良の応答を達成し、６ヶ月時点で、１２人全ての患者の無進行率（ＰＦＲ）は少なくとも４２％であった１。小研究であり、患者個体群における差異が存在するものの、観察された少なくとも４２％のＰＦＲは、Ｖａｎ  Ｇｌａｂｂｅｋｅらにより報告された大きな患者群の分析における歴史的ＰＦＲに好ましく匹敵し２、この報告では、第１の選択治療及び第２の選択治療のための活性剤はそれぞれ、３０〜５６％超（組織学に依存）、及び６ヶ月時点で１４％超のＰＦＲを呈した（重要なことに、ＬＶ３０５研究は、全てが少なくとも１つの事前治療を受けた患者からなった）。
【０３０４】
結論：ＬＶ３０５は、最大１０１０ｖｇまでの全ての用量で許容される安全性を実証した。最低用量では、ＬＶ３０５は、強度のＴ細胞応答及び抗腫瘍効果の予備的証拠を生成した。中用量及び高用量からのデータは、未決定のままである。これらの心強い結果の後、Ｇ３０５（ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質−ＴＬＲ４アゴニスト）及び抗ＰＤ−１治療でのプライム／ブーストで、単独でのＬＶ３０５（１０１０ｖｇ）の研究を続けた。
１ＬＶ３０５研究における総腫瘍負荷は１０ｃｍ未満に制限されたこと、及びＥＣＯＧ状態は２未満であったことに留意されたい。
２Ｖａｎ  Ｇｌａｂｂｅｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，，“Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｒａｔｅ  ａｓ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ｆｏｒ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌｓ  ｉｎ  ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａｓ”，２００２。
【０３０５】
実施例６
ＣＭＢ３０５組み合わせ臨床プロトコル
この臨床治験は、用量増大相（第１部）の後に行われ、黒色腫、卵巣癌（卵管癌腫を含む）、肉腫（具体的には、滑膜肉腫型または粘液性脂肪肉腫／円形細胞脂肪肉腫型）、及びＮＳＣＬＣを有する患者を登録して、ＩＤ−ＬＶ３０５単独またはＣＭＢ３０５（順次投与／ＩＤ−ＬＶ３０５とＩＤＣ−Ｇ３０５との組み合わせ）のいずれかを受けさせる。治験のＣＭＢ３０５部分において、図５に概要を述べるスケジュールを使用してＣＭＢ３０５を受けるように患者を割り当てる。ＩＤ−ＬＶ３０５の用量は、第１部の用量増大中に決定された確立された安全容量からなり、ＩＤＣ−Ｇ３０５の用量は、ＧＬＡの確立された安全容量及び２５０ｕｇのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質からなる。ＣＭＢ３０５において、４用量の皮内ＩＤ−ＬＶ３０５及び３用量の筋肉内ＩＤＣ−Ｇ３０５が投与される。
【０３０６】
ＧＬＡは完全合成ＴＬＲ４アゴニストであり、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を有し、インフルエンザワクチン中などのように感染病原体抗原を有するアジュバントとして、９００人を超える患者及び健康なボランティアにおいて試験されている。ＧＬＡは確立された安全性プロファイルを有し、数百人の患者または健康なボランティアにおいて５ｕｇ用量レベルが試験されている。進行中の別個のＩＤＣ−Ｇ３０５の第１相治験において、５ｕｇ用量のＧＬＡプラス２５０ｕｇのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質が中等度（中）用量レベルであり、既に安全であることが決定されている。より高い１０ｕｇ用量コホートが、現在この第１相治験において試験されている。
【０３０７】
ＣＭＢ３０５治療群において、ＧＬＡの用量は５ｕｇのＧＬＡからなり、２５０ｕｇのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質と組み合わせて配合される。その用量が別個の第１相ＩＤＣ−Ｇ３０５安全性研究において安全であると決定される場合、ＧＬＡの用量は１０ｕｇまで増加され得る。図５に示すように、ＣＭＢ３０５組み合わせ療法において使用される、ＩＤ−ＬＶ３０５及びＩＤＣ−Ｇ３０５は、異なる時間に順次投与される。各構成成分は、第１相研究において良好に許容されることが決定された。
【０３０８】
ＣＭＢ３０５では、まず３人の患者を登録する。順次の組み合わせの安全性を確立するために、ＣＭＢ３０５を受ける最初の３人の患者を、治療の最初の４９日間に生じる治療緊急ＤＬＴについて観察する。観察期間後、研究薬剤に潜在的に関連すると見なされた全てのＳＡＥ及びＤＬＴ安全性事象は、出資者及び独立したＤＭＣによって審査される。
【０３０９】
基線で、及びその後、ＩＤ−ＬＶ３０５またはＩＤＣ−Ｇ３０５での治療前のいくつかの時点で免疫原性アッセイのために末梢血を引き出し、その後、計画された全ての治療の完了の３週間後、１１２日目にＣＭＢ３０５のために末梢血を引き出す。基線で白血球除去を実行し、最終ＣＭＢ３０５投与（９８〜１１２日目以内）後、探索バイオマーカー及び免疫アッセイのために細胞を採取する。
【０３１０】
到達可能な腫瘍を有する同意する患者の亜個体群において、計画された全ての治療完了の３週間後に腫瘍生検を実行する。別の研究の一部としてＮＹ−ＥＳＯ−１発現について評価された標本を含む、いずれの事前研究からの腫瘍組織または腫瘍の外科標本も、基線生検として使用することができる。
【０３１１】
検診来院（基線）中、腫瘍撮像を実行する。患者は、ｉｒＲＣによって定義される疾患進行まで、およそ８週間に１回撮像及び臨床評価を継続する。初回注射後、ＩＤ−ＬＶ３０５の持続性を試験するためのアッセイのために血液試料を採取する。ＣＭＢ３０５中、基線で、及びその後１６８日目、２２４日目、１２ヶ月目、２４ヶ月目の来院で血液を採取する。ウイルスゲノムの存在について、ＰＣＲによって試料をアッセイする。１２ヶ月を通した結果によって、２回連続の試料がＩＤ−ＬＶ３０５持続性の証拠を示さなくなるまで年１回の評価が継続され得る。
【０３１２】
実施例７
マウスＣＴ２６−ＮＹ−ＥＳＯ−１皮下腫瘍モデルにおける、ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１での予防的ワクチン接種後の抗腫瘍応答
マウス腫瘍負荷モデルにおける、予防的に関連する抗腫瘍応答のために必要とされる最小必要用量は未知である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群）を、ＩＤ−ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１の４×１０９個または２×１０１０個のベクターゲノムで免疫化した。免疫化の２１日後、免疫化した対照マウス及び治療していない対照マウスの右側腹部に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中７．５×１０５個のＣＴ２６−ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍細胞、または負の対照として、単独でＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を皮下注射した。注射の９日後、移植片を切除し、秤量して、腫瘍増殖を評価した。これらの結果（図７）は、試験されたＩＤ−ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１の最低単回用量、つまり４×１０９個のゲノムが、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する腫瘍増殖の有意な拒絶を誘発するのに十分であることを実証した。
【０３１３】
実施例８
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける単回皮下注射後の、マウスにおけるＩＤ−ＶＰ０２−ＮＹ−ＥＳＯ−１の免疫原性
【０３１４】
ＣＤ１０７ａは、ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性のためのマーカーである。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２週間離して２回、１．２５×１０８個、２．５×１０８個、及び５×１０８個のベクターゲノムの投与レベルのＩＤ−ＬＶ３０５で免疫化する。第２の免疫化の９日後、Ｈ−２Ｄｄ拘束性ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープＲＧＰＥＳＲＬＬ（ＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８）でエクソビボ再刺激した後、ＮＹ−ＥＳＯ−１脾臓ＣＤ８Ｔ細胞応答を、ＣＤ１０７ａの表面染色、ならびにＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定した。ＨＢＳＳビヒクル対照で免疫化したマウスからの脾細胞、及びＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８で再刺激したマウスからの脾細胞が、負の対照としての役割を果たした。図８に見られるように、試験された最低用量、つまり１．２５×１０８個のベクターゲノムは、このプライム・ブーストレジメン後、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発するのに十分であった。
【０３１５】
上記の様々な実施形態を組み合わせて、更なる実施形態をもたらすことができる。本明細書で参照される、及び／または出願データシートに列挙される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、ならびに非特許出版物の全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。実施形態の態様を必要に応じて変更して、様々な特許、出願、及び出版物の概念を用いてそれ以上の更なる実施形態をもたらしてもよい。
【０３１６】
上記に詳述される記載に照らして、実施形態にこれら及び他の変更がなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は特許請求の範囲を本明細書及び特許請求の範囲において開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、むしろ、そのような特許請求の範囲に権利を与える等価物の完全な範囲とともに、全ての可能な実施形態を含むものとして解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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