(57)【要約】本発明は、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象におけるＳ．アウレウス疾患の予測のための方法に関し、前記の方法は、標準または参照対照と比較した場合の前記の対象の生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを決定する工程を含み、ここで、高められたアルファ溶血素レベルまたは活性は、Ｓ．アウレウス疾患の発症を示している。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象におけるＳ．アウレウス疾患の予測のための方法であって、該方法が、標準または参照対照と比較して該対象の生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを決定する工程を含み、ここで、高められたアルファ溶血素レベルがＳ．アウレウス疾患の発症を示す、上記方法。
【請求項２】
対象が、気管支炎、特に人工呼吸器関連気管気管支炎（ＶＡＴ）、肺炎、特に人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、敗血症、特に重症の敗血症、または慢性創傷感染症の診断につながる臨床症状のいずれかであるＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルファ溶血素レベルが、気管支炎、特にＶＡＴ、肺炎、特にＶＡＰ、敗血症、特に重症の敗血症、または慢性創傷感染症からなる群より選択されるＳ．アウレウス疾患の発症を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
対象が、Ｓ．アウレウスを示す細菌もしくは細菌マーカーの存在を決定する方法により、好ましくは該マーカーを発現している遺伝子、該遺伝子の発現産物を決定する方法により、または標準的な微生物学的技法の使用により決定されるように、Ｓ．アウレウスによりコロニー形成されている、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
対象が鼻または鼻咽頭においてコロニー形成されており、かつ対象が挿管を受けている、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
対象が、機械式人工呼吸されている患者であり、かつ下気道においてＳ．アウレウスにより重度にコロニー形成されている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生物学的試料が、好ましくは、血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および、気管内吸引物、胸膜液、肺タップ、鼻スワブまたは痰のような呼吸気管標本からなる群より選択される体液または組織試料である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アルファ溶血素レベルの決定が、アルファ溶血素の発現または活性の半定量的または定量的測定を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アルファ溶血素のレベルが、免疫アッセイ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、好ましくは、ディプスティック検査のようなラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ、およびウェスタンブロットのいずれか、質量分析、ＮＭＲ、またはアルファ溶血素を示す対応するＤＮＡもしくはＲＮＡを好ましくは核酸ハイブリダイゼーションアッセイもしくは核酸増幅アッセイを用いて決定する方法により決定される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
標準または参照対照が、Ｓ．アウレウス疾患の発症もしくは疾患進行を示す予め決定されたアルファ溶血素レベル、または、低い、中程度のもしくは高いアルファ溶血素を発現するＳ．アウレウス株から得られた予め決定されたアルファ溶血素レベルである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
標準または参照対照が、アルファ溶血素を発現していない、または低レベルのアルファ溶血素を発現しているＳ．アウレウスにより発現されるアルファ溶血素レベルよりも高い予め決定されたアルファ溶血素の量または活性である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
Ｓ．アウレウスのコロニー形成を示す少なくとも１種類の追加のマーカーの測定をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１種類の追加のマーカーの測定が、アルファ溶血素以外のいずれかのＳ．アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはいずれかのＳ．アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物の決定を含み、それが好ましくは以下：
ｉ）Ｓ．アウレウスプロテインＡ；
ｉｉ）Ｓ．アウレウス抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともＰＢＰ２ａ、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物のいずれか；
ｉｉｉ）Ｓ．アウレウスの細胞毒、好ましくはＰＶＬ／ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＧＨ、ガンマ溶血素、ＬｕｋＥＤ、を含むあらゆる他のＳ．アウレウス抗原；Ｓ．アウレウス病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質；またはリポテイコ酸のようなあらゆるＳ．アウレウス特異的化合物、ならびに
ｉｉｉ）好ましくは追加のマーカーとして少なくともＳ．アウレウスプロテインＡおよびＰＢＰ２ａを決定する、ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ；
からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の発症に関するインビトロマーカーとしてのアルファ溶血素の使用。
【請求項１５】
Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の疾患発症を決定するためのアルファ溶血素に関する特異的検出分子を含む診断組成物の使用。
【請求項１６】
検出分子が、抗体、抗体断片、細胞受容体もしくはリガンド、またはアルファ溶血素遺伝子もしくは前記の遺伝子の発現産物にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる群より選択されるアルファ溶血素結合剤である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法におけるアルファ溶血素診断キットの使用であって、該キットがアルファ溶血素に関する特異的検出分子を含む、上記使用。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法におけるアルファ溶血素診断キットの使用であって、該診断キットがＳ．アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる１種類以上の試薬および／またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的検出分子を含み、それが貯蔵安定形態で、好ましくは包装された単位として提供される、上記使用。
【請求項１９】
診断キットが、以下：
ａ）Ｓ．アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる１種類以上の試薬および／またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的検出分子を含むキット；ならびに
ｂ）アルファ溶血素以外のＳ．アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはＳ．アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物を決定するのに適した試薬および／または特異的検出分子を含むキットであって、それが好ましくは以下：
ｉ）Ｓ．アウレウスプロテインＡ；
ｉｉ）Ｓ．アウレウス抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともＰＢＰ２ａ、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物のいずれか；
ｉｉｉ）Ｓ．アウレウスの細胞毒、好ましくはＰＶＬ／ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＧＨ、ガンマ溶血素、ＬｕｋＥＤを含むあらゆる他のＳ．アウレウス抗原；Ｓ．アウレウス病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質；またはリポテイコ酸のようなあらゆるＳ．アウレウス特異的化合物、ならびに
ｉｉｉ）好ましくは追加のマーカーとして少なくともＳ．アウレウスプロテインＡおよびＰＢＰ２ａを決定する、ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ；
からなる群より選択されるキット；
を含む診断組み合わせキットである、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）によりコロニー形成されているがまだ疾患の症状を示していない対象においてＳ．アウレウス疾患を予測するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、通常は人々およびいくつかの動物種の皮膚上または鼻中で共生種として見付かる。それらの共生的特徴により暗示されるには、Ｓ．アウレウスの無症候性保有は一般に無害であると考えられるが、典型的な感染症は比較的軽微な皮膚疾患から生命を危うくする侵襲性感染症にまで及び得る。
【０００３】
歴史的に、感染症は、広域スペクトル抗生物質、例えばメチシリンにより処置される。抗生物質の広範な使用により、標準治療の療法、例えばメチシリンならびに他のベータラクタム系抗生物質、例えばペニシリンおよびセファロスポリン類を用いた処置に耐性である特定の多剤耐性株が出現してきた。それらは、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（多剤耐性スタフィロコッカス・アウレウスまたは“ＭＲＳＡ”としても知られている）と呼ばれ、メチシリン感受性株（ＭＳＳＡ）から分化した。
【０００４】
Ｓ．アウレウス感染症は、ＭＲＳＡを含め、皮膚、軟組織、骨、関節、手術創、血流、心臓弁、肺、または他の器官を含む広い範囲の体の部位に影響を及ぼす生命を危うくする可能性のある疾患の原因となる。従って、Ｓ．アウレウス感染症は、結果としてそれと関係する疾患状態をもたらす可能性があり、それは、致命的である可能性のある疾患、例えば壊死性筋膜炎、心内膜炎、敗血症、毒素性ショック症候群、および壊死性肺炎を含む様々な形態の肺炎、ならびにフルンケル症およびカルブンケル症における毒素生成である。Ｓ．アウレウス感染症は、患者がしばしば免疫無防備であり、（外傷）手術または侵襲性デバイス、例えばカテーテル、ドレナージおよび気管チューブの使用を伴う他の処置を受ける病院または三次治療施設設定では、管理するのが特に困難である。そのような患者は、一般大衆よりもはるかに大きい感染症に関するリスクがある。
【０００５】
機械式人工呼吸されている患者は、気管気管支炎（ＶＡＴ）または肺炎（ＶＡＰ）として顕在化する人工呼吸器関連呼吸器感染症へと進行し得る細菌コロニー形成の高いリスクがある。両方の病気は、長引く人工呼吸および集中治療室（ＩＣＵ）における滞在、増大した健康管理の費用に寄与し、そしてＶＡＰは死亡率の増大と関係している［１−４］。最近、疾患管理への新規のアプローチが、気管内吸引物（ＥＴＡ）の一連の微生物分析を用いて実行されており、それは、下気道にコロニー形成している細菌を同定および定量化するために実施される。呼吸器病原体（単数または複数）の半定量的気管内吸引物（ＳＱ−ＥＴＡ）における＋＋＋（または３＋）の増殖または１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ以上の定量的ＥＴＡとして定義される重度のコロニー形成は、ＶＡＴおよび／またはＶＡＰへの進行に関するリスク因子である［４−６］。特定の細菌病原体の検出は、より早い標的化された抗生物質処置および抗生物質管理の努力の助けになる［７］。
【０００６】
Ｓ．アウレウスの病毒性および発病は、動物モデルにおいて広範囲にわたって研究されてきたが、ヒトの疾患の発病における病毒性因子の役割は、よく理解されていない［８、９］。関連する病毒性因子およびバイオマーカーの同定は、より有効な予防戦略および高リスク患者のより早期の療法の開始を支持するであろう。
【０００７】
Ｓ．アウレウスの発病の特徴の１つは、赤血球、好中球、顆粒球および他の免疫細胞、ならびに肺または皮膚の上皮細胞を含むいくつかの異なる細胞型を殺し得る多数の分泌される毒素（外毒素、細胞毒または細胞溶解素）の産生である。さらに、これらの毒素のほとんどは、免疫細胞を活性化し、強力な炎症促進性シグナルとして作用する。Ｓ．アウレウスの細胞毒の有名なメンバーは、アルファ溶血素（Ｈｌａ、アルファ毒素、α−溶血素、α−毒素とも呼ばれる）であり、それは、ヒトの気管支および肺胞上皮細胞ならびにマクロファージおよびリンパ球の溶解において非常に強力であり、炎症促進性プロセスの誘導に関わっていることが示されている［１０］。Ｓ．アウレウス肺炎の発病におけるその有力な役割が、いくつかの異なる動物モデルにおいて実証されている［１０］。Ｈｌａは、いくつかのＳ．アウレウス疾患の概念実証動物モデルにおけるワクチン抗原およびモノクローナル抗体標的としての有望性も示しており、現在能動免疫処置および受動免疫処置の両方のヒトの試験において評価されている［１１−１４］。
【０００８】
国際公開第２０１３／１５６５３４  Ａ１号は、Ｓ．アウレウスのアルファ毒素および２構成要素毒素の少なくとも１つに対して交差反応結合性であるＳ．アウレウス抗体を記載している。
【０００９】
国際公開第２０１２／１０９２８５  Ａ２号は、キット、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において用いられることができる、Ｓ．アウレウスのアルファ毒素に特異的に結合する抗体を記載している。
【００１０】
国際公開第２０１１／０１８２０８  Ａ１号は、Ｓ．アウレウスのアルファ毒素に対するヒトのモノクローナル抗体および膿瘍形成の処置または予防におけるその使用を記載している。
【００１１】
国際公開第２０１０／１２１２９８  Ａ１号は、Ｓ．アウレウスのｏｒｆｘ遺伝子の核酸中の配列に相補的なプライマーおよびＳ．アウレウスのｏｒｆｘ遺伝子の核酸中の配列に相補的でありＳ．アウレウスのＳＣＣｍｅｃカセットの核酸中の配列にも相補的である別のプライマーを用いてメチシリン感受性（ＭＳＳＡ）および／またはメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）を検出する方法を記載している。
【００１２】
国際公開第２０１０／０８９５６９  Ａ１号は、質量分光分析、特にバイオマーカープロフィール、例えばＳ．アウレウスに関するバイオマーカープロフィールの質量分光分析を利用した細菌感染症またはコロニー形成の検出または診断のための方法を記載している。
【００１３】
Ｓ．アウレウスによる気道コロニー形成は、しばしばＭＲＳＡまたはＭＳＳＡに誘導される人工呼吸器関連気管気管支炎（ＶＡＴ）および／または肺炎（ＶＡＰ）の発症に関する前兆である。しかし、コロニー形成から肺炎への進行を促進するＳ．アウレウスの病原体関連因子に関してはほとんど知られていない。ＶＡＰを引き起こす高い傾向を有するＳ．アウレウス分離株の検出および簡単、好感度かつ特異的なバイオマーカーの同定は、ＶＡＴおよびＶＡＰに関する予防またはより早期の抗生物質療法の開始を大きく支援するであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１５６５３４  Ａ１号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１０９２８５  Ａ２号
【特許文献３】国際公開第２０１１／０１８２０８  Ａ１号
【特許文献４】国際公開第２０１０／１２１２９８  Ａ１号
【特許文献５】国際公開第２０１０／０８９５６９  Ａ１号
【発明の概要】
【００１５】
本発明の目的は、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されている対象において疾患の症状を示す前にＳ．アウレウス疾患の発生のリスクを評価するための新規のバイオマーカーを発見することであった。具体的には、疾患の発症前に適切な療法を開始するためにリスクを示すマーカーを決定する試験を提供することが、目的であった。
【００１６】
その目的は、本発明の態様の提供により達成される。
本発明によれば、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象におけるＳ．アウレウス疾患の予測のための方法が提供され、前記の方法は、標準または参照対照と比較した前記の対象の生物学的試料中のアルファ溶血素のレベルを決定する工程を含み、ここで、高められたアルファ溶血素のレベルは、Ｓ．アウレウス疾患の発症、特に、疾患または疾患の進行の診断につながる症状の速い出現を示している。
【００１７】
具体的には、対象は、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されており、かつ無症状であるかまたは全身性疾患の症状を示していない。そのような症状は、特にＳ．アウレウス感染症または疾患、特にＳ．アウレウス疾患、例えば肺炎、特に人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、気管支炎、特に人工呼吸器関連気管気管支炎（ＶＡＴ）、敗血症、特に重症の敗血症、または慢性創傷感染症の診断につながる臨床症状の１以上である。
【００１８】
Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成された対象におけるＳ．アウレウス疾患の診断につながる典型的な臨床症状は、本明細書においてＳ．アウレウス疾患特異的症状とも呼ばれ、特にＶＡＴおよびＶＡＰに関して、白血球増加、発熱または低体温、化膿性気道分泌物、胸部Ｘ線写真またはＣＴスキャンにおける新規または進行性の浸潤の存在を含む。急性感染症の一般的な症状は、急性感染症の全ての重要な側面を含むＡＰＡＣＨＥ−ＩＩスコア（すなわち、年齢、直腸温、平均動脈圧、心拍数、動脈ｐＨ、呼吸数、ナトリウムおよびカリウム、クレアチニンの血清レベル、ヘマトクリット、白血球数ならびにグラスゴーコーマスケール）により定義される。その症状は、Ｓ．アウレウスにより、例えば標準的な微生物学的方法または培養により決定されるようなＳ．アウレウスのコロニー形成により引き起こされる場合、Ｓ．アウレウス特異的であると考えられる。
【００１９】
Ｓ．アウレウス疾患特異的症状は、Ｓ．アウレウスにコロニー形成された患者が患い得る他の非特異的な基礎となる生理学的状態とは区別される。例えば、ＩＣＵ中の人口呼吸されている患者は、結果として無防備な免疫系をもたらす病気、例えば悪性病変を患っている可能性があり、または臓器移植を受けている可能性があり、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されていると同定された場合、Ｓ．アウレウス疾患／感染症を発現するリスクがあると考えられ得る。
【００２０】
具体的には、アルファ溶血素のレベルは、Ｓ．アウレウス疾患の発症の可能性を示しており、その疾患は、気管支炎、特にＶＡＴ、肺炎、特にＶＡＰ、敗血症、特に重症の敗血症、または慢性創傷感染症からなる群より選択される。特に、アルファ溶血素のレベルは、そのようなＳ．アウレウス疾患の診断につながる１以上の症状の速い出現を示している。
【００２１】
アルファ溶血素のレベルは、特に、機能的アッセイもしくは細胞ベースのアッセイにおいて決定されるようなアルファ溶血素活性のレベル、またはアルファ溶血素の遺伝子発現もしくは発現産物のレベル、例えば翻訳もしくは転写産物、例えばｍＲＮＡ、もしくはセンスもしくは相補的アンチセンスにおいてそのような発現産物のヌクレオチド配列に相補的であるもの、もしくはアルファ溶血素タンパク質もしくはアルファ溶血素の一部／断片もしくはアルファ溶血素のあらゆる天然もしくは人工試薬との反応産物のレベルである。特に、アルファ溶血素のレベルは、生体外で対象の試料において、従って適切なインビトロアッセイにより決定される。
【００２２】
そのレベルは、適切にはアルファ溶血素の含有量もしくは濃度（ｗ／ｖまたはｗ／ｗ）または活性（単位／ｖまたは単位／ｗ）として決定される。そのような決定の数値結果に対する代替として、アルファ溶血素のレベルは、例えば半定量的アッセイにおけるカットオフ値または閾値もしくは参照値より上の特定のスコアまたは特定のレベルとして決定されることもできる。
【００２３】
特定の側面によれば、対象は、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されており、それは特に、標準的な微生物学的試験により決定されるような前記の対象の生物学的試料中の１０５ＣＦＵ／ｍＬ以上のレベルおよび／または生物学的試料、例えばＥＴＡ流体試料中のＳ．アウレウスの中程度もしくは重度（＋＋＋（３＋）または＋＋＋＋（４＋））の細菌増殖により定められる。
【００２４】
具体的には、対象は、Ｓ．アウレウスによりコロニー形成されており、場合により、Ｓ．アウレウスを示す細菌もしくは細菌マーカーの存在、またはおそらくＳ．アウレウス疾患の発症を決定する方法により、好ましくは前記のマーカーを発現している遺伝子、前記の遺伝子の発現産物を決定する方法により、または標準的な微生物学的技法を用いて決定されるように、Ｓ．アウレウス疾患を患っているリスクがある。標準的な微生物学的技法の典型的な方法は、アルファ溶血素活性を実証する血液寒天アッセイである。
【００２５】
特定の側面によれば、患者は、Ｓ．アウレウス、特にＭＳＳＡまたはＭＲＳＡ、好ましくはＭＳＳＡによりコロニー形成されており、および／またはそれに感染している。
具体的には、対象は、鼻または鼻咽頭においてコロニー形成されており、そして対象は挿管を受けている。本明細書で記載されるアルファ溶血素レベルの決定に基づいて、高度に溶血性の株が、挿管の前に鼻または鼻咽頭において検出されることができ、それは、疾患進行のリスク評価および挿管の際の下気道におけるコロニー形成を予防する特異的な前処置手段を可能にする。そのようなコロニー形成は、通常は無症候性に鼻または鼻咽頭にコロニー形成しているであろうが、細菌は、挿管の際に下気道中に持ち込まれて対象を重度の下気道コロニー形成および関連疾患を発症するリスクに晒す可能性がある。同様に、本方法は、既に挿管されている対象の鼻または鼻咽頭における本明細書で記載されるアルファ溶血素レベルの決定および高度に溶血性の株の検出を提供し、疾患進行のリスク評価を可能にする。
【００２６】
具体的には、対象は、人工呼吸されており場合により人工呼吸器関連感染症、例えばＶＡＴもしくはＶＡＰのリスクがある集中治療室（ＩＣＵ）患者、または皮膚および軟組織感染症（ＳＳＴＩ）のリスクがある患者である。具体的には、対象は、機械式人工呼吸されている患者であり、かつ下気道において、例えば気管または肺においてＳ．アウレウスにより重度にコロニー形成されている。
【００２７】
特定の側面によれば、生物学的試料は、体液または組織試料、好ましくは血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸気管標本、例えば気管内吸引物、胸膜液、肺タップ（ｌｕｎｇ  ｔａｐ）、鼻スワブまたは痰からなる群より選択されるあらゆる試料である。
【００２８】
具体的には、生物学的試料は、その生物学的試料に由来するＳ．アウレウス分離株を生成するために処理され、その分離株は、そのＭＳＳＡまたはＭＲＳＡの遺伝子型または表現型、および／またはアルファ溶血素発現のレベルに関してさらに特性付けられることができる。細菌分離株を生成するための好ましい試料調製法は、細菌の富化および培養工程を利用している。
【００２９】
具体的には、生物学的試料は、試料においてアルファ溶血素レベルを直接決定するために処理され、場合によりその後マトリックス効果を低減するためおよび試験の特異性および感度を増大させるための富化または精製の予備工程が行われる。予備工程は、標準的な培養手順に従う生物学的標本の培養を含み、それは例えば、排他的にそうであるわけではないが、ルーチン的な微生物実験室において実施されるような標準的な細菌増殖培地中での血液培養ならびに標本の固体寒天上での培養（表現型決定−すなわちアンチバイオグラム（ａｎｔｉｂｉｏｇｒａｍ）を含む）である。細菌は、病毒性因子の発現を増進するため（例えば、鉄の含有量が低く高栄養培地よりも正確にインビボ条件に似ており、従って外毒素および他の細菌性病毒性因子の発現を増進するＲＰＭＩ−ＣＡＳ）の異なる増殖培地（標準的な培地および／または化学的に定められた培地；高栄養、低栄養、限定増殖培地組成）中でのＣＦＵの拡張のために継代培養されることができる。細菌懸濁液は、可能性のあるマトリックス効果を除去するために、標準的な緩衝溶液中で調製および洗浄されることができる。
【００３０】
別の特定の側面によれば、前記のアルファ溶血素レベルの決定は、アルファ溶血素の発現または活性の半定量的または定量的測定を含む。
具体的には、参照または対照は、予め決定されたアルファ溶血素のレベルであるか、または参照もしくは対照値（例えばカットオフ値または閾値または参照値）を、生物学的物質、例えば予め決定されたＳ．アウレウス疾患のリスクを有する対象の比較可能な生物学的試料から得られた、もしくは特定のレベルのアルファ溶血素を発現するＳ．アウレウス株から得られた予め決定されたアルファ溶血素のレベルに対して較正することにより得られる。
【００３１】
特定の側面によれば、前記の参照は、疾患もしくは疾患進行を示す予め決定されたアルファ溶血素のレベルであり、または低い、中程度の、もしくは高いアルファ溶血素を発現するＳ．アウレウス株から得られる。
【００３２】
具体的には、前記の標準または参照対照は、Ｓ．アウレウス疾患の発症もしくは疾患の進行を示す予め決定されたアルファ溶血素のレベルであり、または低い、中程度の、もしくは高いアルファ溶血素を発現するＳ．アウレウス株から得られる。
【００３３】
具体的には、標準または参照対照は、アルファ溶血素を発現していない、または低レベルのアルファ溶血素を発現しているＳ．アウレウス株により発現されるアルファ溶血素のレベルよりも高い予め決定されたアルファ溶血素の量または活性である。
【００３４】
好ましくは、特定の株が、参照を提供するために用いられ、それは、低発現株である、または低レベルの溶血を示す溶血プロフィールを有することが決定されている。試験を較正するための参照または手段の役目を果たすことができるであろうアルファ溶血素を発現しない、もしくは低レベルのアルファ溶血素を発現する、または溶血活性を発現しない典型的な株は、以下の株である：アルファ溶血素の非発現：ＭＲＳＡ２５２と名付けられたＳ．アウレウス株（ＡＴＣＣから入手可能、カタログ参照番号ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１７２０）。低レベルのアルファ溶血素（１＋）：Ｎｅｗｍａｎ  Ｄ２Ｃと名付けられたＳ．アウレウス株（英国公衆衛生庁細菌コレクションから入手可能、カタログ参照番号ＮＣＴＣ  １０８３３）。
【００３５】
Ｓ．アウレウス株を、本発明の方法に対する参照として、または本発明の方法を較正するために用いることが好ましい。具体的には、生物学的試料中のアルファ溶血素のレベルが低発現株の参照よりも高い場合、そのようなレベルは、Ｓ．アウレウス疾患の発症を示している。生物学的試料中のアルファ溶血素のレベルが低発現株または非溶血性株の参照よりも少なくとも２倍高い場合、強い疾患の徴候が存在する。決定されたレベルが参照よりも少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍高い場合、徴候はさらに強く、急速に発症および進行している疾患の高いリスクを示している。
【００３６】
ヒツジ血液ＣＯＳ寒天プレート法（図１）に基づいて、非溶血性分離株と比較した場合の２＋以上の半定量的評価の溶血プロフィールが用意されることができ、それは、中程度の（２＋）〜高いＨｌａ（３＋、４＋）発現に関する指標および可能性のあるＳ．アウレウス疾患の発症の強いマーカーの役目を果たすことができるであろう。
【００３７】
参照物質、例えば参照対照は、アッセイ中に、例えば参照標準、例えばアルファ溶血素の定められた含有量または濃度を有する標準アルファ溶血素調製物として好都合に含められることができ、その標準は、比較のための内部もしくは外部対照として、または参照値、参照読み出しもしくは参照曲線として用いられる。標準アルファ溶血素調製物は、精製された（例えばＳ．アウレウス株または分離株から精製された）アルファ溶血素または組み換えアルファ溶血素調製物を含有する、または本質的にそれからなることができる。
【００３８】
具体的には、アルファ溶血素のレベルは、免疫アッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、特にラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ（例えばディプスティック検査）、ウェスタンブロットのいずれか、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはアルファ溶血素もしくはアルファ溶血素レベルを示す対応するＤＮＡもしくはＲＮＡを好ましくは核酸ハイブリダイゼーションアッセイもしくは核酸増幅アッセイを用いて決定する方法の少なくとも１つにより決定される。
【００３９】
特定の態様によれば、その方法はさらに、Ｓ．アウレウスまたはＳ．アウレウスのコロニー形成もしくは感染を示す少なくとも１種類の追加のマーカーの測定を含む。
具体的には、前記の少なくとも１種類の追加のマーカーの測定は、アルファ溶血素以外のいずれかのＳ．アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはいずれかのＳ．アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物の決定を含み、それは好ましくは以下：
ｉ）Ｓ．アウレウスプロテインＡ；
ｉｉ）Ｓ．アウレウスの抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともＰＢＰ２ａ、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物のいずれか；
ｉｉｉ）Ｓ．アウレウスの細胞毒、好ましくはパントン・バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ／ＬｕｋＳＦ）、ＬｕｋＧＨ（ＬｕｋＡＢ）、ガンマ溶血素、ＬｕｋＥＤを含むあらゆる他のＳ．アウレウス抗原；Ｓ．アウレウス病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質；またはあらゆるＳ．アウレウス特異的化合物、例えばリポテイコ酸、ならびに
ｉｉｉ）好ましくは追加のマーカーとして少なくともＳ．アウレウスプロテインＡおよびＰＢＰ２ａを決定する、ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ；
からなる群より選択される。
【００４０】
具体的には、前記の少なくとも１種類の追加のマーカーの測定は、いずれかの細胞毒、Ｓ．アウレウスの病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質を発現する遺伝子のいずれか、またはいずれかのＳ．アウレウス特異的化合物、またはそれぞれの遺伝子の発現産物、特にＳ．アウレウスの病毒性因子、Ｓ．アウレウスの抗生物質耐性マーカーおよびＳ．アウレウス特異的細菌構成要素、ならびに好ましくは少なくともＰＢＰ２ａ、ｍｅｃＡ遺伝子もしくはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物もしくはＳ．アウレウス特異的プロテインＡタンパク質もしくはこのタンパク質をコードする遺伝子のいずれかの決定を含む。
【００４１】
好ましいアッセイの組み合わせは、以下：
ａ）疾患バイオマーカー、特にアルファ溶血素；ならびに
ｂ）Ｓ．アウレウスの検出（プロテインＡ）および耐性マーカー（例えばＰＢＰ２ａ）；ならびに場合によりさらなるマーカー；
に関する試験を含む。
【００４２】
具体的には、定量的もしくは定性的免疫アッセイまたは質量分析が、アルファ溶血素マーカーを含む１以上のマーカーを決定するために用いられることができる。Ｓ．アウレウスのさらなるマーカー、Ｓ．アウレウス疾患もしくは疾患の進行、または病原体の同定もしくは耐性のマーカーが、アルファ溶血素マーカーの他に決定される場合、定性的、半定量的または定量的アッセイが、用いられることができる。そのような決定は、アルファ溶血素レベルの決定と連続的、並行、または同時であることができ、従って別々の生物学的試料中または同じ試料、反応混合物もしくは格納容器中であることができる。
【００４３】
具体的には、定量的ＰＣＲアッセイまたは半定量的ＰＣＲアッセイ、場合により多重化されたアッセイが、アルファ溶血素のレベル、特に遺伝子または遺伝子発現のレベル、および疾患もしくは疾患の進行の少なくとも１種類のさらなるマーカーまたは試料中のＳ．アウレウスの特性付け（例えば抗生物質耐性プロフィール、Ｓ．アウレウスの存在の確証）を決定するために用いられることができる。
【００４４】
好ましくは、ＭＳＳＡまたはＭＲＳＡと関係するＳ．アウレウスのさらなるマーカーが決定される。そのようなさらなるマーカーは、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）、またはその同族遺伝子（ｍｅｃＡ）もしくはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物からなる群より選択され、それはＭＲＳＡに関する決定要因である。
【００４５】
好ましくは、Ｓ．アウレウスの同定と関係するＳ．アウレウスのさらなるマーカーが決定される。そのようなさらなるマーカーは、細胞壁構成要素、例えばリポテイコ酸もしくは細胞壁テイコ酸、または細胞表面タンパク質、例えばＳ．アウレウス特異的プロテインＡからなる群より選択される。
【００４６】
特定の側面によれば、本発明はさらに、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の発症に関するインビトロマーカーとしてのアルファ溶血素の使用を提供する。
【００４７】
別の特定の側面によれば、本発明はさらに、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の疾患発症を決定するための診断組成物の調製のためのアルファ溶血素に関する特異的な検出分子の使用を提供する。
【００４８】
特定の側面によれば、本発明は、Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の疾患発症を決定するためのアルファ溶血素に関する特異的な検出分子を含む診断組成物の使用を提供する。
【００４９】
そのような診断組成物は、生物学的試料との反応混合物において使用準備済の試薬、またはそのような試薬の保存された形態、例えば貯蔵安定形態、例えば凍結乾燥形態；（例えば液体窒素中での）急速凍結形態、超低温貯蔵（例えば−７０℃および−８０℃）、冷蔵（例えば−２０℃〜５℃）および制御された室温（例えば１５℃〜２７℃）；例えばグリセロールストック、組織パラフィンブロック、（バッカル）スワブおよび他の標準的な生物学的試料貯蔵法のような標準的な試料貯蔵であることができ、その試薬の保存された形態は、使用準備済の試薬を得るために再構成または調製されることができる。そのような試薬は、典型的には水溶液、特に（生理学的）緩衝条件（例えばＥＤＴＡで緩衝されたもの、リン酸緩衝液、ＨＢＳＳ、クエン酸緩衝液等）の形態である。
【００５０】
具体的には、検出分子は、抗体、抗体断片、細胞受容体もしくはリガンド、またはアルファ溶血素遺伝子もしくは前記の遺伝子の発現産物にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる群より選択されるアルファ溶血素結合剤である。この点に関して、ハイブリダイゼーション条件は、従来のプロトコルに従って確立されることができる。
【００５１】
別の特定の側面によれば、本発明はさらに、本発明の方法におけるアルファ溶血素診断キットの使用を提供する。例えば、例えば血液寒天プレートを含む標準的な微生物学技法によりアルファ溶血素レベルを決定するためのキットが、本発明に従って用いられることができる。
【００５２】
アルファ溶血素診断キットは、好ましくは、アルファ溶血素レベルを決定するのに適したアルファ溶血素に関する特異的な検出分子を用いている。
本発明によれば、貯蔵安定形態である新規のアルファ溶血素診断キットがさらに提供される。そのようなキットは、好ましくは生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを決定するための全ての必須の構成要素を、場合により一般的または非特異的な物質または構成要素、例えば水、緩衝剤または賦形剤を除いて含む。貯蔵安定なキットは、好ましくは少なくとも６ヵ月間、より好ましくは少なくとも１または２年間貯蔵されることができる。それは、乾燥した（例えば凍結乾燥された）構成要素で構成されていることができ、および／または保存剤を含むことができる。
【００５３】
具体的には、アルファ溶血素診断キットは、Ｓ．アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる１種類以上の試薬および／またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的な検出分子を含み、それは、貯蔵安定形態で、好ましくは包装された単位として提供される。
【００５４】
好ましいアルファ溶血素診断キットは、包装された、または予め包装された単位として提供され、例えばここで、その構成要素は、１つのみの包装中に収容されており、それはルーチン的な実験を促進する。そのような包装は、例えば一連の生物学的試料の試験を実施するのに適した１以上の試験に必要な試薬を含むことができる。そのキットはさらに、標準または参照対照としてＨｌａ調製物を含有することができる。
【００５５】
具体的には、本発明は、本発明に従う方法におけるアルファ溶血素診断キットの使用を提供し、ここで、その診断キットは、Ｓ．アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる１種類以上の試薬および／またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的な検出分子を含み、それは、貯蔵安定形態で、好ましくは包装された単位として提供される。
【００５６】
具体的には、診断キットは、本発明の方法に従って用いられ、ここで、その診断キットは、本明細書でさらに記載される診断組み合わせキットである。
別の特定の側面によれば、本発明はさらに、生物学的試料中のアルファ溶血素レベルの決定のための診断キットを提供し、それは、前記の生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを定量化するためにアルファ溶血素特異的検出分子およびアルファ溶血素参照物質、例えば標準アルファ溶血素調製物を含む。
【００５７】
具体的には、本発明は、アルファ溶血素を含有することが疑われる生物学的試料中のアルファ溶血素のレベルを検出する方法に言及し、それは、以下の工程を含む：
−基質を含む反応混合物を提供し、ここで、その基質は、少なくとも１種類のアルファ溶血素結合剤を含み；
−生物学的試料を反応混合物と接触させ；そして
−結合剤により認識されたアルファ溶血素の量に対応する検出信号を検出する。
【００５８】
具体的には、陰性対照または参照対照組成物が、本発明に従うキットにおいて用いられることができる。そのような場合、検出信号は、対照組成物により生成される信号の量に対応する対照信号に対して標準化され、それにより生物学的試料中のアルファ溶血素の存在またはレベルを検出することができる。検出信号の標準化は、対照信号を検出信号から減算することを含むことができる。
【００５９】
別の特定の側面によれば、本発明はさらに、アルファ溶血素レベルの決定のための診断キットを含み、かつさらにさらなるＳ．アウレウスマーカーを決定するためのキットを含む診断組み合わせキットを提供する。
【００６０】
具体的には、本発明は、特にアルファ溶血素レベルおよびＳ．アウレウス、またはＳ．アウレウスのコロニー形成もしくは感染を示す少なくとも１種類の追加のマーカーを同じ対象の同じまたは別々の生物学的試料（単数または複数）において決定するための診断組み合わせキットを提供し、それは以下を含む：
ａ）Ｓ．アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる１種類以上の試薬および／またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的な検出分子を含むキット；ならびに
ｂ）好ましくは以下：
ｉ）Ｓ．アウレウスプロテインＡ；
ｉｉ）Ｓ．アウレウス抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともＰＢＰ２ａ、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物のいずれか；
ｉｉｉ）Ｓ．アウレウス細胞毒、好ましくはＰＶＬ／ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＧＨ（ＬｕｋＡＢ）、ガンマ溶血素、ＬｕｋＥＤ；Ｓ．アウレウス病毒性因子、分泌および表面タンパク質；またはあらゆるＳ．アウレウス特異的化合物、例えばリポテイコ酸を含むあらゆる他のＳ．アウレウス抗原、ならびに
ｉｉｉ）好ましくは追加のマーカーとして少なくともＳ．アウレウスプロテインＡおよびＰＢＰ２ａを決定する、ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ；
からなる群より選択される、アルファ溶血素以外のＳ．アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはＳ．アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物を決定するのに適した試薬および／または特異的な検出分子を含むキット。
【００６１】
例えばＰＢＰ２ａ、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物のいずれかであるＭＲＳＡマーカーは、ＭＲＳＡまたはＭＳＳＡの存在または非存在を示すと考えられ、従って、さらなる結論が、疾患または疾患進行の予測および患者に与えられるべき処置計画に対して引き出され得る。
【００６２】
例えばＳ．アウレウスプロテインＡであるＳ．アウレウス特異的細菌マーカーは、Ｓ．アウレウスの存在または非存在を示すと考えられ、従って、さらなる結論が、他の特異的な細菌同定試験の非存在下で、疾患または疾患進行の予測および患者に与えられるべき処置計画に対して引き出され得る。
【００６３】
具体的には、キットは、本発明の方法を実施するための１種類以上の試薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１．ヒツジ血液寒天プレート上でのＳ．アウレウス分離株の溶血性表現型。Ｓ．アウレウス株が、ヒツジ血液寒天プレート上にまかれ、分離株が、半定量的評価に基づいてコロニーの周囲の透明なハローの直系に従って、アルファ溶血素発現に特徴的な強い〜弱いベータ溶血またはベータ溶血なし（４＋から−まで）に分類された。コロニーの周囲の濁ったハローは、ベータ溶血素（Ｈｌｂ）を発現しているコロニーに関して考えられた。
【図２】図２．Ｓ．アウレウス培養上清によるヒト肺胞上皮細胞の細胞溶解は、アルファ溶血素により媒介される。Ａ５４９細胞が、Ｓ．アウレウス株の培養上清と共にインキュベートされ、細胞毒性が、方法において記載されたように測定された。同じ分離株の独立した生物学的複製を用いて得られた平均値＋／−ＳＥＭが、示されている。Ａ：ＵＳＡ３００  ＴＣＨ１５１６野生型および同質遺伝子的Δｈｌａ株；Ｂ：高Ｈｌａ活性を有する４つの分離株に関する培養上清が、６６．７ｎＭのＨｌａ中和モノクローナル抗体および対応するイソ型の対照ｍＡｂの存在または非存在下での中毒のために用いられた。パーセント細胞生存度が、モック処理された細胞に対して比較して決定された。
【図３】図３：Ｈｌａに誘導されるヒツジ血液寒天溶血プロフィールは、ヒト肺胞上皮細胞に対するインビトロでの検出可能な細胞毒性と相関している。Ａ：ヒツジ血液寒天プレートにおけるそれらの溶血プロフィール（図１）に基づいて選択されたＳ．アウレウス分離株が、方法において記載されているように決定されるそれらのＡ５４９細胞に対する細胞毒性に関して試験された。Ｂ．ＭＳＳＡ分離株の細胞毒性指数が、示されているような異なる患者の群において示されている。それぞれの患者は、最初の入手可能な分離株により表されている。横線は、群の中央値を示している。個々の群は、ウィルコクソンの順位検定により統計的に比較された（ｐ値として示されている）。
【図４】図４：Ｓ．アウレウス毒素配列：ＵＳＡ３００  ＴＣＨ１５１６株（Ｇｅｎｂａｎｋ、受入番号ＣＰ０００７３０）から得られた代表的なアルファ溶血素配列。他の株は、１以上の点変異を含み得る。
【００６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  １：ＵＳＡ３００  ＴＣＨ１５１６株（Ｇｅｎｂａｎｋ、受入番号ＣＰ０００７３０）のｈｌａヌクレオチド配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ２：ＵＳＡ３００  ＴＣＨ１５１６株のＨｌａアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
用語“アルファ溶血素”は、本明細書で用いられる際、Ｓ．アウレウスのアルファ毒素を指すものとし、それは、アルファ毒素タンパク質（例えば、図４において示されているアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ２、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列により同定されるその天然存在もしくは非天然存在もしくは人工バリアントを有する）またはそのようなタンパク質の診断的に関連する部分もしくは断片、アルファ溶血素の天然もしくは人工試薬もしくは反応産物との複合体、ｈｌａ遺伝子（例えば図４において示されている核酸、ＳＥＱ  ＩＤ  １）またはタンパク質性もしくは遺伝性分子、例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはＤＮＡ（一本鎖もしくは二本鎖、センスもしくはアンチセンス核酸もしくはポリヌクレオチド、またはそれに対する相補的核酸もしくはポリヌクレオチドのどれでもよい）であり得る遺伝子発現産物として理解されている。核酸分子またはポリヌクレオチドは特に、単離された形態で決定される。例えば、単離されたＲＮＡ分子は、ＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物を含む。
【００６７】
用語“生物学的試料”は、本明細書で用いられる際、対象、例えばヒトから得られるあらゆる物質を指すものとし、それは、Ｓ．アウレウスを含有し得る生物学的物質を含有するか、または含有する可能性がある。生物学的試料は、組織、流体または細胞培養試料であることができる。本発明に従う使用のための試料の例は、患者試料、例えば組織または体液、特に呼吸気管標本、例えば気管内吸引物、胸膜液、肺タップ、鼻スワブもしくは痰、血液試料、便試料、皮膚および尿試料または脳脊髄液を含むが、それらに限定されない。
【００６８】
生物学的試料は、典型的には複合的な生物学的マトリックス、例えば多数のタイプの生物学的な小さい有機分子を含有する複合的な粘性の生物学的流体、例えばタンパク質物質に富む粘液性滲出液を含む。適切な添加剤または抽出手順が、試料中のマトリックスと関係している可能性のある非特異的な結合を低減するために、ならびに／または試料マトリックスの粘性もしくは固体構成要素を可溶化および／もしくは分解することによりマトリックスの粘性を低下させるために用いられることができる。マーカーを有機体から遊離させる、ならびに／またはマトリックスを分解および／もしくは液化する試料調製法が、用いられることができる。分析されることができる生物学的マトリックスは、粘液含有試料、例えば鼻分泌物、痰、喀痰、咽頭滲出液、尿道または膣分泌物、およびそのような膜表面の洗浄液を含む。
【００６９】
適切な試料調製法は、アッセイにおける生物学的マトリックスの作用を低減するための方法工程を含む。そのような方法工程は、例えば捕捉、クロマトグラフィー、遠心分離および透析を含み得るが、それらに限定されない。
【００７０】
対象から得られた物質は、細菌分離株の形態、例えば分離されたＳ．アウレウスを培養するための細胞培養物または細胞培養生成物の形態であることもできる。培地は、Ｓ．アウレウス集団のみを富化するために選択的であることができ、または非選択的であることもできる。
【００７１】
細菌分離株の調製は、典型的には、Ｓ．アウレウスの増殖を増進し、それにより試料中のＳ．アウレウス集団を富化する条件で試料を維持する培養工程を含む。
一度分離株が得られたら、細菌は、例えばＭＳＳＡまたはＭＲＳＡのタイプ、および発現されるアルファ溶血素のレベルを決定するために、生化学的および／または血清学的試験によりさらに調べられることができる。いくつかのタイピング法が、Ｓ．アウレウス株を研究するために利用可能である。これらの方法は、典型的には、血清型分類、毒素型分類、多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）、ｓｐａタイピング、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を含む遺伝的関係／系統発生に関する標準的なタイピングを含む。他のタイピング法は、病毒性因子および他の重要なブドウ球菌性因子の、例えばＰＣＲ、多重ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザン／サザンブロッティングによる遺伝子型分類、ならびにタンパク質ベースの方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび質量分析を含む。典型的には、抗生物質耐性プロフィールは、アンチバイオグラムを用いて調べられる。
【００７２】
用語“アルファ溶血素結合剤”は、本明細書で用いられる際、アルファ溶血素のあらゆる有用な結合剤を指すものとする。特に、アルファ溶血素結合剤は、アルファ溶血素タンパク質（Ｈｌａ）またはｈｌａ遺伝子もしくはその発現産物、例えばペプチドもしくはポリペプチド、ＲＮＡもしくはＤＮＡを認識する。それは、アルファ溶血素および試薬（天然または人工試薬のどちらでもよい）の複合体の形態で存在するアルファ溶血素への結合のように、直接的または間接的に結合することができる。
【００７３】
結合剤は、直接標識されることができ、または結合剤は間接的に標識されることもできる。間接標識は、アルファ溶血素に対する結合剤と複合体を形成する標識された結合剤を含むことができる。
【００７４】
ある態様において、結合剤または検出分子は、検出可能な標識にコンジュゲートしており、それは、それら自体が検出可能である分子（例えば蛍光性部分、電気化学的標識、金属キレート剤等）ならびに検出可能な反応産物の生成により（例えば酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、またはそれ自体が検出可能であることができる特異的結合分子により（例えばビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルアルセネート、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ等）間接的に検出されることができる分子を含むことができる。
【００７５】
用語“アルファ溶血素結合剤”は、特に選択的または特異的アルファ溶血素試薬および／または検出分子を包含するように理解されている。
一態様において、結合剤は、検出分子である。
【００７６】
特異的なアルファ溶血素結合剤または検出分子は、合成により生成されることができ、または細胞もしくは細菌由来であることもでき、または例えば単離および部分的もしくは実質的に精製された生物学的試料中に存在することもできる。そのような単離された構成要素は、典型的にはその天然環境から分離されている。特異的なアルファ溶血素結合剤は、機能アッセイにおいてアルファ溶血素と反応する細胞または細胞性構成要素である。
【００７７】
一態様において、結合剤は、反応混合物中のアルファ溶血素を認識する。結果として生じる結合剤−アルファ溶血素複合体は、次いで複合体に結合する別の検出分子と接触させられることができる。その検出分子は、結合剤および／またはアルファ溶血素を介して複合体に結合することができる。
【００７８】
適切なアルファ溶血素結合剤には、例えば抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または単鎖抗体、抗体様骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）があり、ここで、骨格は、典型的には、定常部分および標的抗原またはそのエピトープの構造に相補的である可変部分からなる（例えばアプタマー）。アルファ溶血素結合剤のさらなる例は、細胞受容体、例えば疾患の発病に関わる細胞受容体、例えばタンパク質性および非タンパク質性毒素特異的受容体（例えばＡＤＡＭ−１０）、リガンド、例えば疾患の発病に関わる可溶性リガンド、例えば（脱落した）膜小胞、アルファ溶血素遺伝子もしくは前記の遺伝子の発現産物に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、例えばオリゴヌクレオチドもしくはプローブ、特に発現産物と反応するためのプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはプローブ、またはそれぞれの発現産物を捕捉するプローブである。
【００７９】
当業者は、アルファ溶血素に特異的な核酸配列の増幅のためのプライマーを、公開された文献から、または公的なデータベースから設計することができる。検出分子として用いられ得る核酸分子は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの形態、または例えば標準的なＤＮＡ調製法、クローニングにより得られる、もしくは合成により生成されるＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖または一本鎖であることができる。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知られているコード鎖であることができ、またはそれはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であることもできる。
【００８０】
本発明の実施は、別途示されない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学および組み換えＤＮＡの従来の技法を用い、それは当該分野の技術の範囲内である。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版(1989)を参照。
【００８１】
特異的にのみハイブリダイズする配列の検出は、通常はストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件、例えば６５℃における０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを必要とするであろう。当該技術で周知であるように、決定されるべきヌクレオチド配列の長さおよび核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメーターを構成する。
【００８２】
“特異的結合”または“選択的結合”は、本明細書で用いられる際、結合剤、例えば抗体またはその抗原結合断片が、不均質な分子の集団においてアルファ溶血素またはそれぞれのエピトープもしくはヌクレオチド配列に関する感知できる程の親和性を示すことを意味する。従って、示された条件（例えば免疫アッセイまたはハイブリダイゼーション条件）下では、結合剤は、標的アルファ溶血素に特異的に結合し、試料中に存在する他の分子には有意な量では結合しない。特異的結合は、結合が、選択されたような標的同一性、高い、中程度の、または低い結合親和性または結合活性に関して選択的であることを意味する。選択的結合は、通常は、別の標的と比較した場合に結合定数または結合力学が少なくとも１０倍異なる（少なくとも１対数の差として理解される）場合に達成され、好ましくはその差は少なくとも１００倍であり（少なくとも２対数の差として理解される）、より好ましくは少なくとも１０００倍である（少なくとも３対数の差として理解される）。
【００８３】
用語“特異性”または“特異的結合”は、１種類以上の分子に結合する結合剤、例えば交差特異性結合剤にも適用されることが理解されている。少なくとも２種類の異なる標的もしくはそのような標的のエピトープもしくはヌクレオチド配列を標的とする、または少なくとも２種類の異なる標的上の交差反応性エピトープもしくはヌクレオチド配列を標的とする好ましい交差特異性（多特異性または交差反応性とも呼ばれる）結合剤は、実質的に類似の結合親和性で、例えば１００倍未満の差またはさらには１０倍未満の差で標的に特異的に結合する。
【００８４】
用語“検出分子”は、本明細書で用いられる際、特異的な特徴または標識を通して、例えばアルファ溶血素に対する特異的結合反応において検出可能である分子または分子の複合体を指すものとする。検出分子によるそのような結合反応は、直接的かつ即時であることができ、または別個のアルファ溶血素結合剤により媒介されることもできる。標識は、典型的にはアッセイにおいて検出され得る分子または分子の一部である。典型的な標識は、発色団、蛍光色素、または放射性分子である。
【００８５】
検出分子は、それ自体が特異的なアルファ溶血素結合剤であることができ、またはそのアルファ溶血素結合剤との結合反応を通してアルファ溶血素を検出する分子であることもでき、例えばアルファ溶血素またはそれぞれの結合剤またはアルファ溶血素−結合剤複合体を捕捉することができる。検出分子は、両方（アルファ溶血素結合剤および検出分子）が１分子中にあることができる。標識は、アルファ溶血素結合剤の一部であることができ、または別々の標識として、もしくはアルファ溶血素結合剤とは分離した検出分子上で用いられることもできる。
【００８６】
好ましい検出分子は、内因性標識により、または例えばその分子にコンジュゲートしている別個の標識により標識されている特異的アルファ溶血素結合剤である。
用語“診断キット”は、本明細書で用いられる際、キットまたは部分のセットを指し、それは、組み合わせまたは混合物で、１種類以上の分析物もしくはマーカーの測定／検出を実施して疾患もしくは疾患状態を決定する、または疾患および特に疾患の発症もしくは疾患の進行を予測するために用いられることができる。特に、キットは、少なくとも検出分子および／または結合剤を含有し、ここで、検出分子および／または結合剤は、分析物もしくはマーカーまたはそのような分析物もしくはマーカーの反応産物を特異的に認識する。加えて、様々な試薬またはツールが、キット中に含まれることができる。診断キットは、マイクロビーズまたは平面状のアレイもしくはウェルのような支持体、バイオマーカーの単離のための試薬、特異的な標的に向けられた検出分子、核酸の配列決定または増幅のためのプライマーのような試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒または緩衝剤等、様々なリンカー、様々なアッセイ構成要素、ブロッキング剤等を含め、対象の方法を実施するためのあらゆる有用な試薬を含むことができる。
【００８７】
キットは、診断法における使用のための説明書も含むことができる。そのような説明書は、例えば、キット中に含まれるデバイス、例えば診断目的のために生物学的試料を調製する、例えばマーカーを決定する前に細胞および／またはタンパク質含有画分を分離するためのツールまたはデバイス上で提供されることができる。キットは、貯蔵安定形態で好都合に提供されることができる（例えば少なくとも６ヵ月間の貯蔵寿命を有する商業的なキット）。
【００８８】
特定の診断キットは、対象のマーカーに対して向けられた検出分子を含む、または検出分子の固定されたパターン化されたアレイを有する、好ましくは第１マーカーに対して向けられた第１結合試薬を含有する第１領域および第２マーカーに対して向けられた第２結合試薬を含有する第２領域を含む固体支持体も含む。
【００８９】
特に、サンドイッチ形式が用いられることができる。例えば、１種類以上の結合剤が、生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしている。１種類以上の結合剤は、検出分子の役目を果たすために検出可能標識にコンジュゲートしていることができる。他の態様において、１種類以上の結合剤は、検出可能標識にコンジュゲートしている。この構成において、１種類以上の結合剤は、捕捉剤の役目を果たすために生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしていることができる。さらに、１種類以上の結合剤は、生物学的試料との接触の前に支持体にコンジュゲートしていることができ、および／または１種類以上の結合剤は、検出可能標識にコンジュゲートしている。そのような場合、１種類以上の結合剤は、捕捉剤および検出剤のどちらかまたは両方の役目を果たすことができる。
【００９０】
１種類より多くの分析物またはマーカーが検出される場合、キットは、診断組み合わせキットとして提供されることができ、それは、全ての分析物またはマーカーを１つのキットで測定するのに適した試薬およびツールを組み合わせることが理解されている。そのような組み合わせキットは、１より多くの部分からなることができ、ここで、第１部分は、第１分析物またはマーカーを測定するのに適した検出分子を含むことができ、そして追加の部分（単数または複数）は、追加の分析物またはマーカーを測定するのに適した検出分子を含むことができる。
【００９１】
診断キットは、特に免疫アッセイにおける使用のために提供され、ここで、検出分子は、免疫反応により分析物またはマーカーに結合する特異的な結合剤である。そのような結合剤は、標的抗原に結合する抗体または抗体断片または抗体様骨格であることができる。
【００９２】
適切な免疫アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ（例えばディプスティックアッセイ）およびウェスタンブロットのいずれかである。特異的なＳ．アウレウス表面抗原の存在によりＳ．アウレウスを同定するための商業的な凝集アッセイが、例えば一夜培養試料に関して利用可能であり、それはクランピング因子またはプロテインＡ（例えばＤｒｙ  Ｓｐｏｔ  Ｓｔａｐｈｙｔｅｃｔ  Ｐｌｕｓ、Ｏｘｏｉｄ；Ｐａｓｔｏｒｅｘ  Ｓｔａｐｈ  Ｐｌｕｓ検査、Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｓｌｉｄｅｘ  Ｓｔａｐｈ−ＫｉｔおよびＳｌｉｄｅｘ  Ｓｔａｐｈ  Ｐｌｕｓ検査、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）およびＭＲＳＡ特異的タンパク質ＰＢＰ２ａ（例えばＭＲＳＡラテックス検査、Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；ＭＲＳＡスクリーニング検査、Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｋｅｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ）の検出を含む。
【００９３】
当業者には、アルファ溶血素レベルに関する測定のためのそのようなアッセイおよび試験系は、容易に得られる、または生成されることができることは、明らかである。対応する試験系およびアッセイは、その試験を高められたアルファ溶血素レベルの測定に関して標準化するための対応する調整および評価を必要とする。
【００９４】
標的分析物がタンパク質またはポリペプチドを含む態様において、標的の測定は、質量分析ベースのスクリーニング法または質量分析（ＭＳ）、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ；タンパク質フィンガープリンティング）、配列決定、Ｎ末端アミノ酸分析、Ｃ末端アミノ酸分析、エドマン分解、クロマトグラフィー、電気泳動、（二次元）ゲル電気泳動（２Ｄゲル）、ＮＭＲ、抗体アレイ、および免疫アッセイの使用を含むことができる。
【００９５】
特定の診断キットは、関連するオリゴもしくはポリヌクレオチドまたは核酸のレベルを決定するのに適している分子遺伝学アッセイにおける使用のために提供される。一態様において、標的分析物またはマーカーに対応する、またはそれに特異的な核酸配列の増幅は、遺伝子チップマイクロアレイまたはＰＣＲによる。別の態様において、増幅は、ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによるか、またはイムノＰＣＲによる。別の態様において、増幅は、カスケード増幅による。別の態様において、増幅は、リガーゼ連鎖反応による。
【００９６】
特定の態様において、増幅産物の検出は、ゲル電気泳動、例えばアガロースゲル電気泳動による。別の態様において、増幅産物の検出は、核酸プローブまたは他のプローブを用いたハイブリダイゼーションによる。ハイブリダイゼーションは、固相または液相であることができる。ハイブリダイゼーションは、核酸プローブまたは他のプローブを用いたドットハイブリダイゼーションであることができる。ドットハイブリダイゼーションは、放射性ドットブロットまたは非放射性ドットブロットであることができる。ドットハイブリダイゼーションは、ドットブロット微量法または別の方法であることができる。
【００９７】
別の特定の態様において、増幅産物の検出は、リアルタイム蛍光測定による。別の態様において、増幅産物の検出は、抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体を用いる免疫酵素アッセイによる。別の態様において、増幅産物の検出は、蛍光色素を用いる核酸プローブアッセイおよび／または蛍光色素測光法による。別の態様において、増幅産物の検出は、固定された核酸プローブの使用による。核酸プローブが固定されることができる支持体の例は、マイクロプレート、膜フィルター、細片（ｓｔｒｉｐ）、チューブまたはマイクロチップを含む。一態様において、ＤＮＡプローブは、固相またはキャリヤーに結合している。次いで、標識された増幅産物を、ＤＮＡプローブに結合させる。増幅産物は、例えばビオチン、比色定量プローブまたは蛍光色素により標識されることができる。次いで、増幅産物の存在が、標識の検出により、または適用可能である場合は標識された増幅産物に結合するかもしくはそれと反応する二次標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、標識された抗ビオチン抗体（ストレプトアビジン）、アビジン、アビジン−ビオチン複合体またはアビジン−ストレプトアビジン複合体）の検出により、検出されることができる。
【００９８】
マーカーまたはアルファ溶血素マーカーに関連する用語“レベル”は、本明細書において、好都合には標準レベル、すなわち標準により生成されるレベル、または参照対照レベル、すなわち参照対照により生成されるレベルである参照値よりも大きい生物学的試料中のそのようなマーカーのレベルとして理解され、そのような参照値は、マーカーのカットオフ値であることができる。
【００９９】
高められたレベルは、例えば参照値より有意に高い。本明細書で用いられるアルファ溶血素マーカーの過剰発現に関する用語“有意な”は、標準偏差の少なくとも２倍高い量、好ましくは少なくとも３倍の差を指すものとする。好ましい定量的決定法において、マーカーの発現は、例えば内部対照として用いられる１以上の参照遺伝子の発現の中央値に対して標準化される。
【０１００】
例えば標準、トレーニングデータまたは閾値に由来する特定の参照値に関して、有意に高められた、または増大した量は、少なくとも１．５倍高い量、好ましくは少なくとも２または３倍の差を指すことが理解されている。
【０１０１】
本明細書で用いられる際、用語“カットオフ値”は、疾患または疾患状態を患っている対象をその疾患または疾患状態を患っていない患者および／または対象から区別する、特に疾患または疾患進行の高いリスクのある対象をそのような疾患または疾患進行の高いリスクのない患者および／または対象と区別する閾値を指す。
【０１０２】
Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されている対象におけるＳ．アウレウス疾患または疾患の発症の予測の状況において、アルファ溶血素の高められたレベルは、典型的にはカットオフ値より大きく、アルファ溶血素の高められていないレベルは、カットオフ値未満であるかそれに等しく、それは例えば比較可能な設定において非溶血性株（低発現株も含む）により発現されるアルファ溶血素を反映した値である。
【０１０３】
本明細書で用いられる際、用語“参照”または“対照”は、結論が観察された差または類似性に基づいて合理的に引き出されることができるようなそのような診断アッセイの結果に対する比較を可能にする因子または値であることができる。適切な値は、例えば疾患または疾患進行に関する予測可能性の予め決定されたレベル、例えば後に重篤な疾患の症状または疾患進行を発現した患者の生物学的試料から得られたレベルである。これに関して、陽性の予測値または陰性の予測値が、参照値として用いられることができる。
【０１０４】
本発明に従って用いられる参照または対照は、特に、無症候性であるがＳ．アウレウスにより重度にコロニー形成されている（そして抗生物質処置を施される前に経験していた可能性のある）Ｓ．アウレウス（特定の場合ではＭＳＳＡ）によりコロニー形成されている患者からの生物学的試料中のアルファ溶血素のレベルおよび／または濃度を指し、そのような患者は、症候性疾患、特にＶＡＴまたはＶＡＰを発症しないことが決定されている。そのような参照または対照の決定は、どれが適切な参照値かを決定するための一連の試料および患者の病歴の評価を含むことができる。対照は、好都合には内部対照または外部対照であることができる。
【０１０５】
レベルは、定量的または半定量的アッセイにおいて決定されることができる。そのようなアッセイは、典型的には濃度（（ｗ／ｗ）または（ｗ／ｖ））またはその代わりに参照と比較した結果を示す値、例えば百分率、もしくは“＋”、“＋＋”、もしくは“＋＋＋”である読み出しを有し、より高い“＋”の数は、より高い値を示す。
【０１０６】
さらなる態様は、アルファ溶血素レベルを測定するための機能アッセイを指す。そのようなアッセイは、標準的な微生物学の方法を用いてヒツジ血液寒天プレート上で培養されたＳ．アウレウス分離株の溶血パターンを測定することを含み得ると考えられ、ヒツジ血液寒天プレート上での高いベータ溶血パターン（２＋、３＋または４＋）は、ベータ溶血なしまたは低いベータ溶血（１＋）と比較して高いＨｌａ活性を示す。
【０１０７】
アルファ溶血素レベルの決定は、典型的には定性的アッセイのみによるのではなく、これは、その発現レベルの決定を伴わないアルファ溶血素遺伝子の存在または非存在の検出は、疾患または疾患進行の予測にならないと考えられるためである。従って、生物学的試料中またはＳ．アウレウス分離株中のｈｌａ遺伝子の存在のみを決定するためのアッセイだけでは、患者の疾患または疾患進行のリスクを予測するために十分ではないであろう。しかし、遺伝子産物の発現または過剰発現（すなわち、参照よりも高い発現）は、結果として定量的または半定量的方法により決定されることができそのような予測を示すアルファ溶血素タンパク質レベルをもたらすと考えられ、従って重度にＳ．アウレウスによりコロニー形成されている患者における疾患発症を予測するであろう。
【０１０８】
“バイオマーカー”とも呼ばれる本明細書における用語“マーカー”は、疾患の状態または発現を反映する生物学的指標を指すものとするが、必ずしも疾患プロセス自体に含まれない可能性がある。ある早期のＳ．アウレウス患者において、抗細菌療法は、非常に有効であり、有意に向上した疾患の治癒を提供することができる。そのような療法から最も利益を得られるであろう患者の亜集団を同定するのを助けることができるマーカーを同定および検証するための研究努力がなされている。そのような予測マーカーの利点に加えて、マーカーは、Ｓ．アウレウス療法の開発、臨床評価およびモニタリングにおいて重要な役割を果たしている。マーカーは、そのようなマーカーの存在または程度に基づいて層別化およびリスク評価を可能にすることにより患者の選択を助けることができ、処置応答を予測することができる可能性がある。本発明のアルファ溶血素マーカーは、リスクのある患者を可能な限り早期に同定するために好都合に用いられることができる。
【０１０９】
本発明のアルファ溶血素マーカーは、予測マーカーとして、例えば独立した診断手段として、またはさらなる診断手段、例えば（例えば診断組み合わせキット中の）さらなるマーカーの決定との組み合わせで用いられることができる。
【０１１０】
特に、本発明のアルファ溶血素マーカーは、モニタリングまたは監視のために用いられることができる。例えば、アルファ溶血素マーカーは、医師が疾患の進行を予測またはモニターするのを支援する監視目的のために用いられることができる。
【０１１１】
アルファ溶血素マーカーは、アルファ溶血素マーカーおよびさらなるＳ．アウレウスマーカー、例えばＰｂｐ２ａおよび／またはＳｐＡの決定を用いる診断組み合わせキットにおいて用いられることもでき、それは独立した診断として提供される（すなわち、それはさらなる診断手段を用いない診断を提供する）。
【０１１２】
試験試料中のアルファ溶血素レベルがより高いほど、疾患の速い発症の可能性がより高い。例えば、驚くべきことに、（ベースライン値と比較して）より高いアルファ溶血素発現は、ＶＡＰまたはＶＡＴのより急速な発症と明確に相関していることが分かった。本発明の別の重要な基礎は、アルファ溶血素レベルおよび疾患の発症の相関は、ＭＳＳＡによりコロニー形成されている患者において高度に有意であるようであることである。従って、本発明の方法は、特にＳ．アウレウスクローンがＭＳＳＡであることが（予め）決定されている、またはさらなるＭＳＳＡの指標もしくはマーカーもしくはＭＲＳＡの指標もしくはマーカーの非存在を示す患者に適用される。
【０１１３】
用語“疾患の発症”は、特に、対象が診断につながる疾患の症状を発現する時点として理解されている。疾患の発症を予測することにより、対象が疾患が診断される前にすらそれぞれの療法を受けることができるような、高いリスクを有する疾患にかかりやすい対象を同定する当業者の能力を提供するリスク決定が提供される。
【０１１４】
マーカーは、マーカーレベルを決定し得るアッセイにより標的とされる分析物として直接決定されることができる。アルファ溶血素は特に、特にＭＳＳＡによりコロニー形成されている患者におけるＳ．アウレウス疾患発症のインビトロマーカーとして理解されている。そのようなインビトロマーカーは、好都合にはインビトロの方法により、例えば患者の生物学的試料において生体外で決定される。
【０１１５】
アルファ溶血素マーカーの他に、定性的、半定量的または定量的アッセイにより、例えば診断組み合わせ法またはキットによりさらに決定される、処置を助けるためのＳ．アウレウスまたは関係する疾患の発症もしくは疾患の特性付けの他のマーカーが存在することができる。他のマーカーには、病毒性因子、例えば外毒素、内毒素もしくは表面タンパク質、抗生物質耐性マーカー、例えばＳＣＣｍｅｃによりコードされるメチシリン、主に可動遺伝要素、例えばベータラクタマーゼ、カナマイシン耐性、エリスロマイシン耐性等の（水平）遺伝子伝播由来の他の耐性遺伝子、特定の細菌構成要素、非タンパク質性因子、例えばＷＴＡおよびＬＴＡ、莢膜多糖、細胞毒、病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質のいずれかを発現する遺伝子、またはそれぞれの遺伝子発現産物がある。
【０１１６】
Ｓ．アウレウスの病毒性は、数多くの病毒性因子の組み合わせにより、それは、細菌が真核細胞膜に接着することを可能にする表面関連タンパク質、莢膜多糖およびそれをオプソニン化貪食作用から保護する表面タンパク質Ａ（ＳｐＡ）、ならびにいくつかの外毒素を含む。Ｓ．アウレウスは、主に分泌型病毒性因子、例えば溶血素、エンテロトキシンおよびトキシックショック症候群毒素の産生により疾患を引き起こす。これらの（分泌型）病毒性因子は、宿主中の多くの細胞性および体液性免疫機序を不活性化することにより免疫応答を抑制し、細胞および組織の破壊を引き起こし、感染の確立を助ける。後者は、例えば一群の孔形成毒素により成し遂げられ、その最も有名なものがＨｌａである。
【０１１７】
Ｓ．アウレウスは、多種多様なさらなる病毒性因子および毒素を産生し、それはこの細菌が異なる種類の免疫細胞、特に体の主要な防御系を構成する白血球の亜集団による攻撃を中和し、それに抵抗することを可能にする。これらの病毒性因子および毒素の産生は、Ｓ．アウレウスが病原性状態を維持することを可能にする。これらの病毒性因子の中で、Ｓ．アウレウスはいくつかの２構成要素ロイコトキシンを産生し、それは、（例えば栄養素の獲得のために）宿主の防御細胞および赤血球の膜を２つの関連しないタンパク質またはサブユニットの相乗作用により傷害する。これらの２構成要素毒素の中で、ガンマ溶血素（ＨｌｇＡＢおよびＨｌｇＣＢ）、ＬｕｋＧＨ（ＬｕｋＡＢ）およびＬｕｋＳＦ／ＰＶＬが、最もよく特性付けられている。
【０１１８】
ロイコシジン類の哺乳類細胞に対する毒性は、２つの構成要素の作用を含む。第１サブユニットは、クラスＳ構成要素と名付けられており、第２サブユニットは、クラスＦ構成要素と名付けられている。ＳおよびＦサブユニットは、相乗的に作用して例えば（まとめて食細胞として知られている）単球、マクロファージ、樹状細胞および好中球を含む白血球上に孔を形成する。Ｓ．アウレウスにより産生される２構成要素ロイコトキシンのレパートリーは、ＦおよびＳ構成要素の同族および非同族の対を含むことが知られており、それは例えばＨＩｇＡＢ、ＨＩｇＣＢ、ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＧＨ、ＬｕｋＳ−ＨｌｇＢ、ＬｕｋＳＤ、ＨＩｇＡ−ＬｕｋＤ、ＨＩｇＡ−ＬｕｋＦ、ＬｕｋＧ−ＨｌｇＡ、ＬｕｋＥＦ、ＬｕｋＥ−ＨｌｇＢ、ＨＩｇＣ−ＬｕｋＤまたはＨＩｇＣ−ＬｕｋＦを含むガンマ溶血素、ＰＶＬ毒素およびＰＶＬ様毒素である。
【０１１９】
一態様において、アルファ溶血素レベルが決定され、加えてＭＳＳＡを示す、またはＭＲＳＡの非存在を示す別のマーカーが決定される。例えば、他のマーカーは、ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）、またはその同族遺伝子（ｍｅｃＡ）もしくはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物であることができると考えられ、それはＭＲＳＡの決定因子である。そのような他のマーカーの非存在は、患者がＭＳＳＡによりコロニー形成されていることを示しているであろう。従って、アルファ溶血素レベルが疾患発症の指標として測定され、他のマーカーがＳ．アウレウスがＭＳＳＡであることを示している場合、抗細菌療法の必要が強く示されるであろう。さらなる態様は、生物学的試料中のコロニー形成している細菌がＳ．アウレウスであることを確証するための、特定のＳ．アウレウスマーカー、例えばＳ．アウレウスプロテインＡの別個の検出または並行検出を含む。アルファ溶血素自体がＳ．アウレウス特異的タンパク質であるが、さらなるＳ．アウレウスマーカー、例えばＳ．アウレウスプロテインＡを含めることは、アルファ溶血素に関する陽性信号の非存在下でコロニー形成している細菌としてのＳ．アウレウスの存在を確証するための‘陽性対照’または‘代替マーカー’の役目を果たすであろう。
【０１２０】
用語“Ｓ．アウレウス感染”は、以下のように理解されている：スタフィロコッカス・アウレウスは、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のメンバーであるグラム陽性球菌であり、ヒトの呼吸気管中および皮膚上で高頻度で見付かる。それはカタラーゼおよび硝酸還元に関して陽性である。Ｓ．アウレウスによる無症候性の鼻コロニー形成は一般的であるが、Ｓ．アウレウスの保有は院内感染の重要な決定因子である。（ＭＡＳＳＡおよびＭＲＳＡを含む）Ｓ．アウレウスの拡散は、一般に人同士の接触による。病原体の伝染は、医療従事者の衛生または消毒／汚染除去戦略のどちらかが不十分である医療設定において促進される。細菌の血流中への導入は、心内膜炎、髄膜炎、そしてそれが広範囲に及ぶ場合は敗血症を含むがそれらに限定されない様々な合併症をもたらし得る。
【０１２１】
ＶＡＴは、４８時間以上挿管および機械式人工呼吸されている患者における肺実質組織を含まない気管気管支樹の急性感染症として定義されている。２つの条件が存在しなければならない：（ｉ）Ｓ．アウレウスの１０５ＣＦＵ／ｍＬ以上に関する陽性ＥＴＡ培養物または中程度もしくは重度（＋＋＋（３＋）または＋＋＋＋（４＋））の細菌増殖ならびに（ｉｉ）以下の感染の臨床徴候および症状の少なくとも２つ：白血球増加、発熱または低体温、および化膿性呼吸器分泌物。
【０１２２】
ＶＡＰは、最低４８時間挿管および機械式人工呼吸されている患者における肺実質の急性感染症を表す。３つの条件が存在しなければならない：（ｉ）Ｓ．アウレウスの１０５ＣＦＵ／ｍＬ以上に関する陽性ＥＴＡ培養物または中程度もしくは重度（＋＋＋（３＋）または＋＋＋＋（４＋））の細菌増殖、（ｉｉ）以下の感染の臨床徴候および症状の少なくとも２つ：白血球増加、発熱または低体温、および化膿性気道分泌物、ならびに（ｉｉｉ）胸部Ｘ線写真またはＣＴスキャンにおける新規の進行性の浸潤の存在。
【０１２３】
Ｓ．アウレウス疾患は、特にＳ．アウレウス感染により引き起こされる疾患として理解されている。ＶＡＴおよびＶＡＰに加えて、そのような疾患は、局所性および全身性疾患を含む。疾患の重篤な症例は、例えば菌血症、敗血症および敗血症性ショック、肺炎および慢性創傷感染症である。
【０１２４】
一般に、Ｓ．アウレウスにより引き起こされる菌血症は、既知の従来の抗細菌療法、例えば抗生物質、ステロイド系および非ステロイド系の炎症の阻害剤、ならびに／または免疫療法、例えば１種類以上のＳ．アウレウス毒素を特異的に認識する抗体を用いる免疫療法、抗細菌もしくは抗炎症剤を用いた処置によりうまく処置されることができる。Ｓ．アウレウス感染を有する患者を処置するために用いられる典型的な抗生物質は、チゲサイクリン、リネゾリド、メチシリンおよび／またはバンコマイシンである。
【０１２５】
しかし、最近の抗生物質耐性細菌の株の出現により、この性質の菌血症の処置は、著しくより難しくなっている。Ｓ．アウレウス疾患を発症する患者は、より長い病院およびＩＣＵ滞在、高い死亡率、およびＳ．アウレウス疾患を有しない患者よりも大きい医療コストを有する。患者がＳ．アウレウスにより重度にコロニー形成されている場合にＳ．アウレウス疾患を（処置するよりむしろ）予防することにより、患者のケアが向上する可能性があり、院内感染が低減する可能性がある。
【０１２６】
用語“対象”は、本明細書で用いられる際、温血哺乳類、特にヒトまたは非ヒト動物を指すものとする。Ｓ．アウレウスは、決定的に重要なヒトの病原体であり、それは獣医学においても懸念になりつつある。それは、広い範囲の非ヒト動物種に存在する。従って、用語“対象”は、特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタおよび家禽を含む動物も指し得る。特に、本発明またはそれぞれの処置の方法の医学的使用は、Ｓ．アウレウス感染と関係する疾患状態の予防または処置を必要とする対象に適用される。対象は、Ｓ．アウレウス感染のリスクのある、または早期もしくは後期の疾患を含む疾患を患っている患者であることができる。用語“患者”は、予防的または療法的処置のどちらかを受けるヒトおよび他の哺乳類の対象を含む。従って、用語“処置”は、予防および療法的処置の両方を含むことを意味する。
【０１２７】
対象は、例えばＳ．アウレウス疾患状態の予防または療法のために処置される。特に、感染もしくはそのような疾患の発現もしくは疾患の再発のいずれかのリスクのある対象、またはそのような感染および／もしくはそのような感染と関係する疾患を患っている対象が、処置される。
【０１２８】
具体的には、用語“予防”は、発病の開始の防止を包含することが意図されている防止手段または発病のリスクを低減するための予防手段を指す。
具体的には、処置は、病気の起因としてのＳ．アウレウスの病態形成を妨げることによることができ、ここで、発病は、対象の細胞膜上に例えば特定の病毒性因子または毒素により孔を形成する工程を含む。
【０１２９】
従って、本発明は、専門家が、重度にコロニー形成されている患者がＳ．アウレウス感染症を発現しそうであるかどうか、そしてコロニー形成している細菌により引き起こされる疾患が速いか遅いか、またはＳ．アウレウスのコロニー形成が速いもしくは遅い疾患発症の可能性を有するかどうかを判定するための方法および診断ツールを提供する。生物学的試料およびＳ．アウレウス分離株のアルファ溶血素レベルは、病毒性を驚くほど予測することが分かった。これは、Ｓ．アウレウスによりコロニー形成された患者（ヒトならびにヒトではない患者）の医学的状態を改善するために取られる臨床的手段は、どのようにその疾患が発現または進行するであろうかの可能な限り早期の予測に依存するため、特に重要である。要するに、本発明は、アルファ溶血素レベル（および／またはＭＳＳＡの指標）およびＳ．アウレウスにより引き起こされる疾患の発症の間の明確かつ強い相関が引き出され得るという教示を提供する。
【０１３０】
Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されている人工呼吸されている患者の一連の試料採取により得られた気管内吸引物（ＥＴＡ）からのＳ．アウレウス分離株は、ＶＡＴまたはＶＡＰの発症を示し得ることが分かった。一例によれば、人工呼吸されている患者からの一連のＳ．アウレウスＥＴＡ分離株が分析され、アルファ溶血素活性が、血液寒天上での溶血の半定量的分析およびヒト肺上皮細胞の細胞溶解の定量的測定により決定された。
【０１３１】
ＶＡＰの症例の大部分は、ＭＳＳＡにより引き起こされており、ＭＲＳＡ分離株は、主にコロニー形成された患者から回収された。ＭＳＳＡ分離株における高いアルファ溶血素活性（ＭＲＳＡ分離株では高くない）は、Ｓ．アウレウス疾患または疾患のＶＡＰへの進行もしくはＶＡＰの存在に関するマーカーであった。ヒツジ血液寒天溶血試験は、ルーチン的な微生物学実験室においてアルファ溶血素活性を測定するために実施されることができる簡単なアッセイであり、ＭＳＳＡ分離株によりコロニー形成された人工呼吸されている患者におけるＶＡＰに関する予測因子の役目を果たす。これらの発見は、（ｉ）予防的手段を用いたＶＡＴもしくはＶＡＰの防止または（ｉｉ）症状の開始および従って疾患の発症におけるより早期の療法の開始ならびに抗生物質療法のより早期の使用を促進することができ、それは両方とも向上した患者の転帰、例えば全生存に変換されることができる。
【０１３２】
高いアルファ溶血素産生を有するＭＳＳＡ株による気道のコロニー形成は、ＶＡＰに関する価値のある予測因子である。本発明は、鑑別診断および患者の管理、例えば標的化された（狭いスペクトルの）抗生物質療法のより早期の使用を助けることができる。
【０１３３】
本発明の方法および診断キットは、例えば患者からの一連の生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを決定することによりＳ．アウレウス疾患または疾患の進行を予測および／またはモニタリングするために特に有用であることができる。時間の経過にわたるアルファ溶血素レベルの増大は、疾患または疾患進行のリスクの増大を示すであろう。
【０１３４】
以下の定義が、考えられる本発明の特定の態様である：
１．Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象におけるＳ．アウレウス疾患の予測のための方法であって、前記の方法が、標準または参照対照と比較して前記の対象の生物学的試料中のアルファ溶血素レベルを決定する工程を含み、ここで、高められたアルファ溶血素レベルが、Ｓ．アウレウス疾患の発症を示す、上記方法。
【０１３５】
２．定義１の方法であって、該対象が、気管支炎、特に人工呼吸器関連気管気管支炎（ＶＡＴ）、肺炎、特に人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、敗血症、特に重症の敗血症、または慢性創傷感染症の診断につながる臨床症状のいずれかであるＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない方法。
【０１３６】
３．定義１または２の方法であって、該アルファ溶血素レベルが、Ｓ．アウレウス疾患の発症を示しており、それが、気管支炎、特にＶＡＴ、肺炎、特にＶＡＰ、敗血症、特に重症の敗血症、または慢性創傷感染症からなる群より選択される方法。
【０１３７】
４．定義１〜３のいずれかの方法であって、該対象が、Ｓ．アウレウスを示す細菌もしくは細菌マーカーの存在を決定する方法により、好ましくは前記のマーカーを発現している遺伝子、前記の遺伝子の発現産物を決定する方法により、または標準的な微生物学的技法の使用により決定されるように、Ｓ．アウレウスによりコロニー形成されている方法。
【０１３８】
５．定義１〜４のいずれかの方法であって、該対象が、機械式人工呼吸されている患者であり、かつ下気道においてＳ．アウレウスにより重度にコロニー形成されている方法。
６．定義１〜５のいずれかの方法であって、該生物学的試料が、好ましくは血液試料、便試料、皮膚試料、尿試料、脳脊髄液、および呼吸気管標本、例えば気管内吸引物、胸膜液、肺タップ、鼻スワブまたは痰からなる群より選択される体液または組織試料である方法。
【０１３９】
７．定義１〜６のいずれかの方法であって、前記の該アルファ溶血素レベルの決定が、アルファ溶血素の発現または活性の半定量的または定量的測定を含む方法。
８．定義１〜７のいずれかの方法であって、アルファ溶血素のレベルが、免疫アッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＣＩＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、凝集アッセイ、免疫クロマトグラフィー、ラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ（例えばディプスティックアッセイ）およびウェスタンブロットのいずれか、質量分析、ＮＭＲ、またはアルファ溶血素を示す対応するＤＮＡもしくはＲＮＡを好ましくは核酸ハイブリダイゼーションアッセイもしくは核酸増幅アッセイを用いて決定する方法により決定される方法。
【０１４０】
９．定義１〜８のいずれかの方法であって、前記の標準または参照対照が、Ｓ．アウレウス疾患の発症もしくは疾患進行を示す、または低い、中程度のもしくは高いアルファ溶血素を発現するＳ．アウレウス株から得られた、予め決定されたアルファ溶血素レベルである方法。
【０１４１】
１０．定義９の方法であって、該標準または参照対照が、アルファ溶血素を発現していない、または低レベルのアルファ溶血素を発現しているＳ．アウレウスにより発現されるアルファ溶血素レベルよりも高い予め決定されたアルファ溶血素の量または活性である方法。
【０１４２】
１１．定義１〜１０のいずれかの方法であって、Ｓ．アウレウスのコロニー形成を示す少なくとも１種類の追加のマーカーの測定をさらに含む方法。
１２．定義１１の方法であって、前記の少なくとも１種類の追加のマーカーの測定が、アルファ溶血素以外のいずれかのＳ．アウレウス特異的細菌構成要素を発現する遺伝子またはいずれかのＳ．アウレウス特異的細菌構成要素のそれぞれの遺伝子発現産物の決定を含み、それが好ましくは以下：
ｉ）Ｓ．アウレウスプロテインＡ；
ｉｉ）Ｓ．アウレウスの抗生物質耐性マーカー、好ましくは少なくともＰＢＰ２ａ、ｍｅｃＡ遺伝子またはｍｅｃＡ遺伝子の発現産物のいずれか；
ｉｉｉ）Ｓ．アウレウスの細胞毒、好ましくはＰＶＬ／ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＧＨ（ＬｕｋＡＢ）、ガンマ溶血素、ＬｕｋＥＤを含むあらゆる他のＳ．アウレウス抗原；Ｓ．アウレウス病毒性因子、分泌タンパク質および表面タンパク質；またはあらゆるＳ．アウレウス特異的化合物、例えばリポテイコ酸、ならびに
ｉｉｉ）好ましくは追加のマーカーとして少なくともＳ．アウレウスプロテインＡおよびＰＢＰ２ａを決定する、ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の細菌構成要素のいずれかの組み合わせ；
からなる群より選択される方法。
【０１４３】
１３．Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の発症に関するインビトロマーカーとしてのアルファ溶血素の使用。
【０１４４】
１４．Ｓ．アウレウスにより重度にコロニー形成されているがＳ．アウレウス疾患の症状を一切示していない対象における人工呼吸器関連呼吸器感染症、気管気管支炎または肺炎の疾患発症を決定するための診断組成物の調製のためのアルファ溶血素に関する特異的検出分子の使用。
【０１４５】
１５．定義１４の使用であって、該検出分子が、抗体、抗体断片、細胞受容体もしくはリガンド、またはアルファ溶血素遺伝子もしくは前記の遺伝子の発現産物にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる群より選択されるアルファ溶血素結合剤である使用。
【０１４６】
１６．定義１〜１２のいずれかの方法におけるアルファ溶血素診断キットの使用であって、好ましくは該キットがアルファ溶血素に関する特異的検出分子を含む使用。
１７．Ｓ．アウレウスアルファ溶血素発現産物と特異的に反応することができる１種類以上の試薬および／またはアルファ溶血素のレベルを決定するのに適した特異的検出分子を含むアルファ溶血素診断キットであって、貯蔵安定形態で、好ましくは包装された単位として提供されるアルファ溶血素診断キット。
【０１４７】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明される（それに限定されない）。
【実施例】
【０１４８】
実施例１：メチシリン感受性Ｓ．アウレウスのアルファ溶血素活性は、人工呼吸器関連肺炎を予測する
ｈｌａ発現を欠く同質遺伝子的Ｓ．アウレウス遺伝子欠失変異体の生成
同質遺伝子的Ｓ．アウレウスｈｌａ遺伝子欠失変異体が、配列決定されたＵＳＡ３００  ＣＡ−ＭＲＳＡ株ＴＣＨ１５１６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ１７１７（商標）、ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、テディントン、英国）において、以前に公開された方法［１５］に基づく相同組み換えにより、表１において列挙されているプライマー対および以前に報告された大腸菌およびＳ．アウレウスに関するシャトルベクターであるｐＫＦＴ遺伝子欠失ベクター［１６］を用いて生成された。
【０１４９】
【表１】
2017524943.tif 000003
【０１５０】
血液寒天溶血試験
Ｓ．アウレウス分離株を、５％ヒツジ血液を含有するコロンビア寒天（ＣＯＳ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、マルシーレトワール、フランス）上で３７℃において１６時間培養した。溶血プロフィールを、その後の４℃において２４時間のインキュベーション後に評価した。この試験は、同じ分離株の３つの異なるクローンを用いて実施され、結果は異なる３人により評価された。
【０１５１】
ヒト肺胞上皮細胞株Ａ５４９を用いたＳ．アウレウス培養上清の細胞毒性の評価
細胞毒性アッセイを、ヒト肺胞上皮細胞株（Ａ５４９  ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１８５（商標）、ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、テディントン、英国）およびトリプチックソイブロス（ＴＳＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）中で一夜増殖させた細菌の細菌培養上清を用いて実施した。
【０１５２】
細胞を、１７５ｃｍ２組織培養処理済み細胞培養フラスコ中で、１×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（１０×ストック、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、パシング、オーストリア）および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補ったハムＦ１２−Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペイズリー、英国）中で接着培養として増殖させた。細胞毒性アッセイのために、２×１０４個の細胞を、実験の１６時間前に９６ウェルハーフエリアプレート中に細胞培養培地中でまいた。実験の日に、細胞培養培地を除去し、５０μｌの細菌培養上清（ＴＳＢ中での系列希釈）を添加した。細胞を培養（３時間、３７℃、５％ＣＯ２）した後培地を除去し、１００μｌの細胞培養培地で洗浄し、５０μｌの新しい細胞培養培地（Ｆ１２−Ｋ培地＋５％  ＦＣＳ）中で培養した（３時間、３７℃、５％ＣＯ２）。細胞生存度を、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ、ＢｉｏＴｅｋ、バート・フリードリヒスハル、ドイツ）において５９０／３５ｎｍで測定した（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）。アッセイデータを“細胞溶解性指数”として表し、これは、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国カリフォルニア州ラホヤ）ソフトウェアパッケージを用いて決定された力価測定曲線に基づいて計算された最大値の半分の細胞溶解に達するために必要とされる培養上清の希釈倍率を表す。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアパッケージを用いて実施された。クラスカル・ワオリス（ノンパラメトリック）検定を、有意性に関する包括的な検定として適用した。Ｐ＜０．０５が包括的な検定により得られた（ｐ値として示された）場合、個々の群を、ウィルコクソンの符号順位検定により統計的に比較した。Ｈｌａ阻害実験のために、細菌培養上清を細胞とのインキュベーションの前に一定濃度（１０μｇ／ｍｌ；６６．６７ｎＭ）の単一特異性モノクローナル抗Ｈｌａ抗体（Ａｒｓａｎｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウィーン、オーストリア；あるいは、いずれかの特異的な抗アルファ溶血素モノクローナル抗体または商業的に入手可能な、例えばＩＢＴからカタログ番号０４−００１０で入手可能な抗溶血素抗体が、用いられることができる）と共にプレインキュベートした。パーセント細胞生存度をモック処理した細胞と比較して計算し、組み換えＨｌａおよびイソ型を合わせた対照ｍＡｂがそれぞれ陽性および陰性アッセイ対照として含まれた。
【０１５３】
ヒツジ血液寒天溶血パターン
Ｓ．アウレウス分離株をヒツジ血液寒天上で培養した際、我々は、広い範囲の溶血活性を検出した（図１）。分離株の大部分は、ベータ溶血を引き起こすアルファ溶血素（Ｈｌａ）に特徴的な溶血パターンおよびヒツジ血液寒天プレート上での透明なハローを示した。少数の分離株は、濁ったハローを伴う溶血を示し、それはＳ．アウレウスのベータ溶血素（Ｈｌｂ）産生に典型的である。これらの分離株における機能するｈｌｂ遺伝子の存在は、ＰＣＲにより確証された（データは示していない）。報告されたヒツジ血液寒天溶血試験は、アルファ溶血素活性を測定するためにルーチン的な微生物学実験室において実施されることができる簡単なアッセイである。
【０１５４】
Ｓ．アウレウス培養上清中のＨｌａ活性は、ヒト肺上皮細胞株を用いる細胞毒性アッセイにより特異的に決定されることができる
Ｈｌａのインビトロ活性を決定するため、我々は、Ｈｌａに関するＡ５４９細胞毒性アッセイの特異性を評価した。これは、以下：（ｉ）ｈｌａ遺伝子欠失変異体Ｓ．アウレウス株（ＴＣＨ１５１６、ＵＳＡ３００）による細胞溶解の喪失により（図２Ａ）、および（ｉｉ）ヒツジ血液寒天アッセイにより決定されるような種々の強くベータ溶解性のＳ．アウレウスクローンの培養上清を用いてＨｌａ中和モノクローナル抗体の存在下で（図２Ｂ）；の２つの方法で実証された。
【０１５５】
これらのデータは、Ｈｌａ活性に向けられたＡ５４９細胞毒性の特異性を反映しており、従って、それは、Ｓ．アウレウス分離株のＨｌａに誘導される病毒性に関するバイオマーカーとしてのＨｌａ活性の評価を支持することができる。
【０１５６】
Ｓ．アウレウスのＨｌａ活性は、ヒツジ血液寒天溶血アッセイおよびＡ５４９細胞毒性アッセイの両方により測定され、相互に関連付けられることができる。
ヒツジ血液寒天上でのベータ溶血プロフィールをアルファ溶血素活性と相互に関連付けるため、我々は、系列希釈されたＳ．アウレウス分離株からの一夜培養上清の細胞溶解能力を、ヒト肺胞上皮細胞株（Ａ５４９）を用いて決定した。
【０１５７】
血液寒天溶血に類似して、Ａ５４９生存度アッセイにおいて測定されたアルファ溶血素活性における大きなバリエーションが、Ｓ．アウレウス分離株の間で観察され、重要なことに、それは２種類のアッセイの間で良好な相関を有していた（図３Ａ）。
【０１５８】
ＶＡＰ患者から得られたＭＳＳＡ株は、群の中央値に基づいてＶＡＴ（Ｐ＝０．０３１３）またはコロニー形成された患者（図３Ｂ）から得られた株よりも細胞毒性が大きいことが分かり、後者に関して、ノンパラメトリッククラスカル・ワオリス検定により評価した場合、おそらく低い試料数のために統計的有意性に達していなかった。
【０１５９】
これらの結果は、高度に溶血性の株の保有は、ＶＡＰに関する強い相関因子であることの証拠を提供する。
ＶＡＰの診断は、ＶＡＴと明確に区別されていない。特にＶＡＰの診断（ＶＡＴに加えて胸部Ｘ線写真上の新規または進行性の浸潤の診断）は困難である可能性があり、時々強固な診断を見出すために数人の専門家による胸部Ｘ線写真の解釈を必要とする。さらに、それぞれのＶＡＰまたはＶＡＴの診断に関するデータの提供において地域差が存在する。従って、本発明の主題は、ＶＡＰおよび／またはＶＡＴに言及する。
【０１６０】
データは、さらに、Ｈｌａの活性が（ｉ）ヒツジ血液寒天溶血ならびにＡ５４９肺上皮細胞アッセイにより良好な相関を伴って決定されることができ、そして（ｉｉ）ＭＳＳＡ分離株によりコロニー形成された人工呼吸されている患者におけるＶＡＰに関する強力な予測因子の役目を果たすという発見を支持する。本結果は、（例えば重度のコロニー形成において）増進された疾患が、高度に溶血性のＭＳＳＡ株と強く関係しているという証拠を提供する。特定の症例において、ＭＲＳＡ株は高レベルの毒素（単数または複数）も発現している可能性がある。従って、本結果は、高度に溶血性のＭＲＳＡ株との相関をさらに支持するであろう。
【０１６１】
これらの発見は、標的化された抗生物質療法のより早期の使用による患者の転帰を向上させるためのより早期の療法の開始を促進することができ、それは向上した患者の転帰、例えば人工呼吸器日数およびＩＣＵ滞在の長さの短縮に変換され得る。
【０１６２】
検出可能な重度の気道コロニー形成は、疾患の発現に関する必要条件である。従って、対応する症状を示していない無症候性の患者でさえも、なおそのような症状および疾患を発現する高いリスクがある可能性がある。そのようなリスクが早い時点で検出されることができ、それは早期の診断および処置の開始を著しく支援する。
【０１６３】
実施例２：生物学的試料の調製
患者から得られた痰または気管内吸引物試料の評価の前に、試料をＮ−アセチルシステインを含有する緩衝液中で安定化してムコイドを低減する。ヒトの血液および血清試料は、標準的な採血手順により、場合により抗凝固剤、例えばＬｉ−ヘパリンまたはＫ２−ＥＤＴＡが補われた無菌の採取チューブ中に得られる。尿および便試料は、それらが患者から採取されたままで直接用いられることができる。アルファ溶血素の検出のため、試料は、下流の適用、例えばタンパク質検出および／またはヌクレオチド検出法に適した緩衝液中で希釈されることができる。
【０１６４】
実施例３：アルファ溶血素アッセイ
アルファ溶血素タンパク質のＥＬＩＳＡベースの検出
この手順は、細菌試料、例えば培養物（上清）および／またはヒトの生物学的試料、例えば気管内吸引物からのタンパク質（Ｈｌａ）としてのアルファ溶血素のＥＬＩＳＡベースの検出を例示する。
【０１６５】
Ｈｌａの検出のため、適切な平底９６ウェルプレート（例えばＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）、Ｎｕｎｃ）を、対応する試料物質の系列倍率希釈物および精製された組み換え発現されたＨｌａ（定量化のため）で２通りまたは３通りでコートする。希釈物は、コーティング緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製される。最適なコーティング効率を可能にするために、プレートを４℃でおおよそ１６時間インキュベートする。コーティング溶液を除去した後、プレートをブロッキング溶液（例えば２００ｕｌのＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））の添加および室温で少なくとも１時間のインキュベーションによりブロッキングする。３回の洗浄サイクル（例えば３回の２００μｌのＰＢＳ中０．００５％Ｔｗｅｅｎ）の後、プレートを抗Ｈｌａ  ｍＡｂ希釈液（例えば０．０５％Ｔｗｅｅｎを補った１％ＢＳＡ中で１μｇ／ｍｌで希釈したｍＡｂを１００μｌ）と共に室温で１時間インキュベートする。３回の洗浄サイクル（上記の手順と同じ手順）の後、二次検出抗体（抗Ｈｌａ  ｍＡｂ（例えば、あらゆる特異的な抗アルファ溶血素モノクローナル抗体または商業的に入手可能な、例えばＩＢＴからカタログ番号０４−００１０で入手可能な抗溶血素抗体）の定常ドメインに種が合っており、かつ例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または蛍光色素とコンジュゲートしている二次検出抗体；例えば０．０５％Ｔｗｅｅｎを補った１％ＢＳＡ中で１：５０００希釈したものを１００μｌ）を、室温で１時間のインキュベーションのために用いる。別の洗浄サイクル（上記の手順と同じ手順）の後、（ｉ）現像溶液（例えばＨＲＰとの酵素反応に関してＡＢＴＳ）を添加し、室温で暗所において２０分間インキュベートし、反応を硫酸で停止した後、４０５ｎｍにおける呈色反応の吸収を読み取るか、または（ｉｉ）蛍光強度を直接測定するか（吸収および発光スペクトルは、抗体コンジュゲーションのために用いられた蛍光色素に依存する）のどちらかを行う。用いられた組み換えＨｌａによる標準較正から得られた信号に線形回帰分析を適用して、試験試料中のＨｌａの量が定量化されることができる。
【０１６６】
アルファ溶血素遺伝子およびその発現の（定量的リアルタイムＲＴ−）ＰＣＲベースの検出
ｈｌａ（遺伝子および／または転写産物）の（定量的リアルタイムＲＴ−）ＰＣＲベースの検出のための鋳型として、ＤＮＡまたはＲＮＡを、Ｓ．アウレウスから単離する（コロニーＰＣＲを直接適用するか、または高品質精製法を適用した後鋳型をＰＣＲにかけることによる）。遺伝子特異的プライマー（当該技術で既知であるような分子生物学技法を用いて設計された、ｈｌａ遺伝子およびハウスキーピング遺伝子、例えば１６Ｓ  ＲＮＡを増幅するためのプライマー）をＰＣＲベースの増幅反応において用いて、ｈｌａ遺伝子が増幅されることができ、アンプリコンが（例えば反応をアガロースゲル上で進ませてインターカレートするＤＮＡ色素で染色することにより）可視化されることができる。定量的（ｑ）−ＰＣＲに関して、ｈｌａの転写産物（ＲＮＡ）が転写されてｃＤＮＡになり（逆転写、ＲＴ）、続いて増幅される。ｑ−ＰＣＲ工程における定量化のため、蛍光プローブ（例えばＳＹＢＲグリーン、ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、ここで、指数関数的増幅の間に得られる蛍光信号は、リアルタイムで増幅されているＤＮＡの量と相関している。この定量化は、異なる生物学的試料中のｈｌａ遺伝子の特異的発現プロファイリングを可能にするが、試験される可能性のあるＳ．アウレウスの異なる増殖相および異なる増殖条件におけるｈｌａ遺伝子の特異的発現プロファイリングも可能にする。
【０１６７】
アルファ溶血素タンパク質の検出のための機能アッセイ
Ｈｌａの発現を識別および半定量化する機能アッセイ試験は、血液寒天溶血の決定の詳細な記載に則している。このアッセイにおいて、Ｈｌａ活性が容易に測定されることができ、２＋、３＋、または４＋の読み出し（図１）は、高いＨｌａ活性を示しており、疾患進行に相互に関連付けられることができる。
【０１６８】
実施例４：診断組み合わせキット
診断組み合わせキットは、Ｓ．アウレウス感染および疾患と関係するタンパク質性および非タンパク質性細菌因子の検出のために用いられることができる。この診断キットは、例えば、以下のように例示されるラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ（例えばディップスティック試験）形式において用いられることができる。
【０１６９】
組み合わせられた形式において試験されるべき可能性のある細菌抗原標的は、（ｉ）重度にコロニー形成された患者におけるＳ．アウレウス感染症の重症度およびＳ．アウレウス疾患の発症に関する予測に関するバイオマーカーとしてのアルファ溶血素、（ｉｉ）ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ株の間の識別を可能にするメチシリン耐性マーカーであるＰＢＰ２ａ、ならびに（ｉｉｉ）採取された試料中で検出され得る他のグラム陽性病原体に同時感染している患者からのＳ．アウレウスのコロニー形成の確証および／またはＳ．アウレウスの特異的検出も可能にする細胞壁構成要素、例えばリポテイコ酸もしくは細胞壁テイコ酸、または細胞表面のＳ．アウレウス特異的プロテインＡであり得る。これらの抗原は、例えば集中治療室中の人工呼吸されている患者から気管支肺胞洗浄によりルーチン的に採取されているＥＴＡ試料中で検出される可能性がある。代わりの設定では、その抗原は、血液、血清、痰、尿および便を含む病院設定においてルーチン的に採取されている他の体液からも検出され得る。特異的なモノクローナル抗体が、上記で列挙された抗原の存在または非存在を検出するために単独または組み合わせのどちらかで用いられるであろう。
【０１７０】
ディップスティック形式において、試験細片は、検出されるべきＳ．アウレウス抗原と特異的に反応する物質または試薬、例えば単一特異性のモノクローナル抗体を含浸させたパッドを有する紙またはプラスチックで作られたリボンからなることができる。ラテラルフローアッセイが正しく機能していることを確証するために、分析されている体液に特異的な抗原の検出を可能にする陽性対照が含まれることができるであろう。ディップスティックは、Ｓ．アウレウス関連因子の存在または非存在のみを決定する定性的細片、または定性的な読み出しの提供に加えて呈色反応が試料中の試験されている物質の濃度におおよそ比例している定量的な結果の推定も提供する半定量的細片として用いられ得る。細片を、分析されている体液の十分に混合された試料中に部分的または完全に短時間浸し、容器から取り出し、細片の縁をその口の上で支えて過剰な試料を除去する。この後、室温で数分間インキュベートした後、その色を細片と一緒に提供されたカラースケールに対して比較することにより、結果を読み取る。半定量的な読み出しのため、例えば呈色反応の強度を細片と一緒に提供された標準化されたカラースケールに対して比較し、例えば微量、１＋、２＋、３＋および４＋ならびに／またはそれぞれの検出された因子の例えばミリグラム／デシリットルでの推定量として報告することができる。
【０１７１】
特定のアッセイ形式（例えばラテラルフロー形式）において、細片を、分析されている体液の十分に混合された試料中に部分的に短時間浸し、容器から取り出す。この後、試料が含浸させたパッドへと流れることを可能にするために室温で数分間インキュベートした後、結果を読み取る。結果は、操作者により読み取られ、Ｓ．アウレウスマーカーが、例えばアッセイ細片上の指定された位置における目に見えるバンドとして定性的に検出される。
【０１７２】
特定のアッセイ形式において、読み出しは、例えばアッセイの読み出しとしてデジタル化されたシステムを用いて自動化されることもでき、従って診療所において高度に標準化されることもできる。一例として、試験試料は、試験細片に吸収されて毛細管力により反応領域に輸送され−ここで反応（大抵は化学反応）が起こり、この反応により生成された電子が電気化学的に決定される（電流測定または比色分析）。
【０１７３】
あるいは、検出抗体は、“センサー”上に固定され、分析物を直接検出する。
参考文献
【０１７４】
【化１】
2017524943.tif 000004
【０１７５】
【化２】
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【図１】
2017524943.tif 000006
【図２】
2017524943.tif 000007
【図３】
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【図４】
2017524943.tif 000009
【国際調査報告】
2017524943.tif 000010
2017524943.tif 000011
2017524943.tif 000012
2017524943.tif 000013