(57)【要約】多能性幹細胞（ＰＳＣ）からの、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）及びオリゴデンドロサイトの効率的かつ安定的な生成を説明する。提供したプロトコルは、過去のプロトコルに必要な１２０〜１５０日間より大幅に短い期間で、神経幹細胞からＯＬＩＧ２＋前駆細胞へ、その後、Ｏ４＋ＯＰＣへと至るオリゴデンドロサイト分化の主要な段階を反復する。更に、Ｏ４＋ＯＰＣは、インビトロでＭＢＰ＋成熟オリゴデンドロサイトに分化することができ、かつ、免疫無防備状態のシバラーマウスに注射されるとインビボで軸索をミエリン化することができ、それによって、再ミエリン化のためのＰＳＣ由来細胞の移植が技術的に実現可能であるという概念の証拠が提供される。2017524340.tif 000008
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＬＩＧ２＋オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の生成方法であって、
ａ．以下によって多能性幹細胞（ＰＳＣ）コロニーを調製する段階：
ｉ．ＰＳＣを低密度で表面上に播種すること；及び
ｉｉ．前記ＰＳＣを１〜２日間、接着培養することであって、それによりＰＳＣコロニーが調製される、こと；
ｂ．前記ＰＳＣコロニーを、低濃度レチノイン酸（ＲＡ）と、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）シグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤とを含む培地中でコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記培養の初日を０日目とする、段階；ならびに
ｃ．コンフルエントな前記細胞を、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）及び低濃度ＲＡを含む培地中でオーバーコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記細胞がＯＬＩＧ２を発現する、段階；
を含み、それによりＯＬＩＧ２＋ＯＰＣが生成される、前記方法。
【請求項２】
Ｏ４＋オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の生成方法であって、
ａ．ＯＬＩＧ２＋ＯＰＣの三次元細胞凝集体を、ＳＡＧ及び低濃度ＲＡを含む培地中で約８日間、懸濁培養する段階；
ｂ．前記細胞凝集体を、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）及びニューロトロフィン３（ＮＴ３）を含む培地中で約１０日間、懸濁培養する段階；
ｃ．前記細胞凝集体を、スフィア２個／ｃｍ２の密度でプレートに再播種する段階；ならびに
ｄ．前記細胞凝集体を、（ｉ）アスコルビン酸（ＡＡ）または（ｉｉ）ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で、細胞がＯ４＋になるまで接着培養する段階；
を含み、それによりＯ４＋ＯＰＣが生成される、前記方法。
【請求項３】
オリゴデンドロサイトの生成方法であって、請求項２に記載の方法に従ってＯ４＋ＯＰＣを生成する段階；ならびに前記Ｏ４＋ＯＰＣをＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３の非存在下で約３週間培養する段階；を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成され、前記オリゴデンドロサイトがミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）＋である、前記方法。
【請求項４】
オリゴデンドロサイトの生成方法であって、
ａ．以下によってＰＳＣコロニーを調製する段階：
ｉ．ＰＳＣを低密度で表面上に播種すること；及び
ｉｉ．前記ＰＳＣを１〜２日間、接着培養することであって、それによりＰＳＣコロニーが調製される、こと；
ｂ．前記ＰＳＣコロニーを、低濃度ＲＡと、ＴＧＦβシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と、ＢＭＰシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤とを含む培地中でコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記培養の初日を０日目とする、段階；
ｃ．コンフルエントな前記細胞を、ＳＡＧ及び低濃度ＲＡを含む培地中でオーバーコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記細胞がＯＬＩＧ２＋ＯＰＣである、段階；
ｄ．前記細胞を前記表面から剥離する段階であって、それにより三次元細胞凝集体が形成される、段階；
ｅ．前記細胞凝集体を、ＳＡＧ及び低濃度ＲＡを含む培地中で約８日間、懸濁培養する段階；
ｆ．前記細胞凝集体を、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で約１０日間、懸濁培養する段階；
ｇ．前記細胞凝集体を、スフィア２個／ｃｍ２の密度でプレートに再播種する段階；
ｈ．前記細胞凝集体を、（ｉ）ＡＡまたは（ｉｉ）ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で、細胞がＯ４＋になるまで接着培養する段階であって、それによりＯ４＋ＯＰＣが生成される、段階；ならびに
ｉ．前記Ｏ４＋ＯＰＣを、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない培地中で、細胞がＭＢＰ＋になるまで培養する段階；
を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される、前記方法。
【請求項５】
オリゴデンドロサイトの生成方法であって、
ａ．ＰＳＣを、（ｉ）０日目〜８日目は二重ＳＭＡＤ阻害下で、（ｉｉ）８日目〜１２日目はソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）またはスムーズンドアゴニストの存在下で、低濃度ＲＡを含む培地中で単層接着培養する段階であって、それによりＯＬＩＧ２＋細胞が生成される、段階；
ｂ．段階（ａ）の細胞を、（ｉ）１２日目〜２０日目はＳＨＨまたはスムーズンドアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中で、（ｉｉ）２０日目〜３０日目はＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で懸濁培養することにより、ＯＬＩＧ２＋細胞を濃縮する段階；
ｃ．段階（ｂ）の細胞を、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で３０日目〜７５日目まで接着培養する段階であって、それによりＯ４＋ＯＰＣが生成される、段階；ならびに
ｄ．前記Ｏ４＋ＯＰＣを、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない培地中で７５日目〜９５日目まで接着培養する段階；
を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される、前記方法。
【請求項６】
オリゴデンドロサイトの生成方法であって、：
ａ．ＰＳＣを、（ｉ）０日目〜８日目は二重ＳＭＡＤ阻害下で、（ｉｉ）８日目〜１２日目はＳＨＨまたはスムーズンドアゴニストの存在下で、低濃度ＲＡを含む培地中で単層接着培養する段階であって、それによりＯＬＩＧ２＋細胞が生成される、段階；
ｂ．段階（ａ）の細胞を、（ｉ）１２日目〜２０日目はＳＨＨまたはスムーズンドアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中で、（ｉｉ）２０日目〜３０日目はＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で懸濁培養することにより、ＯＬＩＧ２＋細胞を濃縮する段階；ならびに
ｃ．段階（ｂ）の細胞を、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない培地中で３０日目〜６０日目まで接着培養する段階；
を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される、前記方法。
【請求項７】
前記ＰＳＣが胚性幹細胞である、請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＳＣが誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｉＰＳＣが多発性硬化症患者由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＳＣがヒト細胞である、請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記表面が基底膜マトリックスを含む、請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＳＣが、約１０，０００細胞／ｃｍ２で前記表面上に播種される、請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＳＣコロニーの直径が約１００μｍ〜約２５０μｍである、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＳＣが、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤を含む培地中で培養される、請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＡの前記濃度が１００ｎＭである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＧＦβシグナル伝達の前記阻害剤がＳＢ４３１５４２である、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１７】
ＢＭＰシグナル伝達の前記阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１８】
二重ＳＭＡＤ阻害がＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９による、請求項５または６に記載の方法
【請求項１９】
コンフルエントな前記細胞がＰＡＸ６＋である、請求項１または４に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が８日目までにＰＡＸ６＋になる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＡＧ及びＲＡを含む前記培地がＳＨＨを含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
低濃度ＲＡを含む前記培地がスムーズンドのアゴニストを含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項２３】
前記スムーズンドのアゴニストがＳＡＧである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が機械的に前記表面から剥離される、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が酵素的に前記表面から剥離される、請求項４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞凝集体をプレートに再播種する段階が、細胞外マトリックスタンパク質及び正荷電ポリアミノ酸を含む表面上で行われる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞外マトリックスタンパク質がラミニンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリアミノ酸がポリオルニチンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
段階（ｃ）の前記細胞が、細胞外マトリックスタンパク質及び正荷電ポリアミノ酸を含む表面上で培養される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞外マトリックスタンパク質がラミニンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリアミノ酸がポリオルニチンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地が更にインスリンを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地が更にトリヨード‐Ｌ‐サイロニン（Ｔ３）を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地が更にビオチンを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地が更にｃＡＭＰを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地が塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まない、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地が上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含まない、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＡＡを含む前記培地が更にインスリンを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＡＡを含む前記培地が更にＴ３を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ＡＡを含む前記培地が更にビオチンを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＡＡを含む前記培地が更にｃＡＭＰを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＳＡＧ及びＲＡを含む前記培地中で培養する前記段階が８日目に開始される、請求項１または４に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が１２日目までにオーバーコンフルエントになる、請求項１または４に記載の方法。
【請求項４４】
前記懸濁培養する段階が１２日目に開始される、請求項４に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞の少なくとも５０％が１２日目までにＯＬＩＧ２＋になる、請求項１、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞の少なくとも６０％が１２日目までにＯＬＩＧ２＋になる、請求項１、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞の少なくとも７０％が１２日目までにＯＬＩＧ２＋になる、請求項１、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞凝集体が、２０日目から、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で培養される、請求項４に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞凝集体が３０日目にプレートに播種される、請求項４に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞凝集体が、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない前記培地中で３０日目から培養され、前記細胞の少なくとも２５％が５５日目までにＯ４＋になる、請求項４または６に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞凝集体が、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない前記培地中で３０日目から培養され、前記細胞の少なくとも３０％が５５日目までにＯ４＋になる、請求項４または６に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞凝集体が、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない前記培地中で３０日目から培養され、前記細胞の少なくとも４５％が６３日目までにＯ４＋になる、請求項４または６に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞凝集体が、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない前記培地中で３０日目から培養され、前記細胞の少なくとも６０％が７５日目までにＯ４＋になる、請求項４または６に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞凝集体がＡＡを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも２５％がＡＡを含む前記培地中での２５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞凝集体がＡＡを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも３０％がＡＡを含む前記培地中での２５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞凝集体がＡＡを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも４０％がＡＡを含む前記培地中での４５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞凝集体がＡＡを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも５０％がＡＡを含む前記培地中での４５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞凝集体がＡＡを含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも６０％がＡＡを含む前記培地中での４５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞凝集体が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で３０日目から培養され、前記細胞の少なくとも４０％が７５日目までにＯ４＋になる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞凝集体が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で３０日目から培養され、前記細胞の少なくとも５０％が７５日目までにＯ４＋になる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞凝集体が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で３０日目から培養され、前記細胞の少なくとも６０％が７５日目までにＯ４＋になる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞凝集体が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で３０日目から培養され、前記細胞の少なくとも７０％が７５日目までにＯ４＋になる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞凝集体が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも４０％が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中での４５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞凝集体が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも５０％が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中での４５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞凝集体が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも６０％が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中での４５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞凝集体が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中で培養され、前記細胞の少なくとも７０％が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む前記培地中での４５日間の培養後にＯ４＋になる、請求項２に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｏ４＋ＯＰＣの少なくとも２０％が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない前記培地中での２０日間の培養後にＭＢＰ＋になる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｏ４＋ＯＰＣの少なくとも２５％が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない前記培地中での２０日間の培養後にＭＢＰ＋になる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｏ４＋ＯＰＣの少なくとも３０％が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない前記培地中での２０日間の培養後にＭＢＰ＋になる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記Ｏ４＋ＯＰＣの少なくとも３５％が、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない前記培地中での２０日間の培養後にＭＢＰ＋になる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞の少なくとも２０％が６０日目にＭＢＰ＋になる、請求項６に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞の少なくとも２５％が６０日目にＭＢＰ＋になる、請求項６に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞の少なくとも３０％が６０日目にＭＢＰ＋になる、請求項６に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞の少なくとも２５％が６０日目にＭＢＰ＋になる、請求項６に記載の方法。
【請求項７５】
ミエリン化を促進する化合物の同定方法であって、
ａ．請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法によりオリゴデンドロサイトを生成する段階；
ｂ．前記オリゴデンドロサイトを候補化合物と接触させる段階；及び
ｃ．前記候補化合物がニューロンのミエリン化を促進するかどうかを判定する段階
を含む、前記方法。
【請求項７６】
ハイスループット法である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
対象における神経疾患または障害の治療方法であって、
ａ．請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法によりオリゴデンドロサイトを生成する段階；及び
ｂ．有効量の前記オリゴデンドロサイトを前記対象に投与する段階であって、前記オリゴデンドロサイトが前記対象の神経系においてミエリン形成を促進する、段階
を含み、それにより前記対象における前記神経疾患が治療される、前記方法。
【請求項７８】
前記神経疾患または障害が脱髄疾患またはミエリン形成不全疾患である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記脱髄疾患が一次進行型多発性硬化症である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記神経疾患または障害が神経変性疾患である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＰＳＣが前記対象の体細胞から生成された誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
請求項１または２に記載の方法により生成された、オリゴデンドロサイト前駆細胞。
【請求項８４】
請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法により生成された、オリゴデンドロサイト。
【請求項８５】
請求項１または２に記載の方法により生成されたオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む、非ヒト哺乳動物。
【請求項８６】
請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法により生成されたオリゴデンドロサイトを含む、非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月２２日付米国特許仮出願第６２／００２，０４８号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本特許文書の開示の一部は著作権保護の対象となる材料を含む。著作権者は、特許商標庁の特許ファイルまたは記録に示してあるように、特許文書または特許開示に関し、いかなる者による複写にも異議はないが、それ以外では、どのようなものでも全ての著作権を保有している。
【０００３】
配列表の援用
添付の配列表中の物質は、本明細書では参照により本出願中に取り込まれる。添付の配列を収載しているテキストファイル、ファイル名ＮＹＳＣ１２５０＿１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５は、２０１５年５月２２日に作成され、２ｋｂである。当該ファイルはＷｉｎｄｏｗｓのＯＳを使用したコンピューター上でＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用して評価することができる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
オリゴデンドロサイトは、脊椎動物に存在する中枢神経系細胞である。オリゴデンドロサイトは、積層された脂質に富むミエリン鞘を生成し、当該ミエリン鞘は、ニューロンの軸索を包んで電気絶縁用の規定のセグメントを形成し、活動電位の伝導速度を最大化する。ミエリンは軸索の完全性及び生存にも重要であり、オリゴデンドロサイトの代謝に影響を与える小さな変化でさえも神経変性を招くことが分かっている。Ｋａｓｓｍａｎｎ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３９：９６９〜９７６（２００７年）（非特許文献1）。ヒトの脳はミエリン化したニューロン（白質）の含有量が高く、また出生後から生涯を通じてミエリン化が継続することから、ミエリン形成プロセスはヒトにおいて特に重要である。Ｂａｒｔｚｏｋｉｓ，Ｇ.，Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔ．２９：５５〜９６（２００５年）（非特許文献2）。このことは、オリゴデンドロサイトは単に不活性な絶縁体を提供している訳ではなく、むしろミエリン化は認知機能や行動にさえ影響を与える動的なプロセスであることを示唆している。
【０００５】
多発性硬化症（ＭＳ）、副腎白質ジストロフィー、白質消失疾患、ペリツェウス・メルツバッハー病及び白質ジストロフィーは脱髄またはミエリン形成不全障害の例である。また、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病及び統合失調症などの他の多数の神経障害及び神経変性状態において、オリゴデンドロサイトの重要な役割が注目されつつある。Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｈ．Ｇ．ら、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ．Ｒｅｓ．１６１：４〜１８（２０１５年）（非特許文献3）；Ｂｅｈｒｅｎｄｔ，Ｇ．ら、Ｇｌｉａ  ６１：２７３〜２８６（２０１３年）（非特許文献4）；Ｋａｎｇ，Ｊ．ら、Ａｎｎ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ.  ２７：４８７〜４９６（２０１３年）（非特許文献5）；Ｆｅｎｎｅｍａ‐Ｎｏｔｅｓｔｉｎｅ，Ｃ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６３：９８９〜９９５（２００４年）（非特許文献6）。ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）は、インビトロのミエリン化アッセイの開発、ミエリン形成化合物のスクリーニングに用いることが可能であり、最終的には自家細胞補充療法の源になる可能性がある。特に、自家細胞療法のための誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から患者特異的細胞を生成することは、近年、有望なコンセプトとして注目されつつある。Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２：２５２〜２６４（２０１３年）（非特許文献7）；Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８：４９１〜４９５（２０１２年）（非特許文献8）。
【０００６】
ヒトオリゴデンドロサイトの生物学及びヒトミエリン化の研究は、生検または剖検から得られる初代細胞の利用の制限によって妨げられてきた。この２０年間、任意の所望の細胞型を生成することが可能な代替的かつ有用な起源として多能性幹細胞（ＰＳＣ）が使用されてきた。これは、胚発生の基本的な段階をインビトロで反復することによって達成された。Ｉｒｉｏｎ，Ｓ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍ．７３：１０１〜１１０（２００８年）（非特許文献9）。特に、分化系列決定の重要な経路のほとんどがマウスとヒトの間で高度に保存されており、従って、マウス発生生物学から得られた見識は、ヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）からオリゴデンドロサイトなどの多数の細胞型を生成することに十分に利用されている。Ｍｕｒｒｙ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ  １３２：６６１〜６８０（２００８年）（非特許文献10）。
【０００７】
マウスでは、オリゴデンドロサイト前駆体は運動ニューロン前駆細胞（ｐＭＮ）ドメイン内で発生する。マウス胚発生時にｐＭＮドメインを規定する上で、レチノイン酸（ＲＡ）経路及びソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路が重要である。この知見は、インビトロ培養において、神経上皮細胞を、転写因子ＯＬＩＧ２を発現するｐＭＮドメインの前駆細胞に変えるのに活用されてきた。Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ  １１０：３８５〜３９７（２００２年）（非特許文献11）。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をオリゴデンドロサイトに分化させる方法のほとんどで１０μＭの濃度のＲＡが使用されてきた。Ｉｚｒａｅｌ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４：３１０〜３２３（２００７年）（非特許文献12）；Ｎｉｓｔｏｒ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｇｌｉａ  ４９：３８５〜３９６（２００５年）（非特許文献13）。Ｚｈａｎｇ研究室では、ＯＬＩＧ２＋  ＮＫＸ２．２＋前駆細胞の誘導と、当該細胞のＳＯＸ１０、ＰＤＧＦＲα、最終的にはＯ４を発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）への移行にＳＨＨが必要であることを実証した。Ｈｕ，Ｂ．Ｙ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６：１４４３〜１４５２（２００９年ａ）（非特許文献14）。ヒトモデルでは、マウスモデルと比較してインビトロでのＯＰＣの出現は大幅に緩徐であり；ヒトモデルではＯＬＩＧ２＋前駆細胞のピークとＯＰＣのピークとの間に１０週間もの長い期間がある。Ｈｕ，Ｂ．Ｙ．ら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４：１６１４〜１６２２（２００９年ｂ）。（非特許文献15）
【０００８】
ＰＳＣをＯＰＣに分化させるためのプロトコルを考案したグループもいくつかある。Ｎｕｍａｓａｗａ‐Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ら；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２：６４８〜６６１（２０１４年）（非特許文献16）；Ｓｔａｃｐｏｏｌｅ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１：４３７〜４５０（２０１３年）（非特許文献17）；Ｗａｎｇら、（２０１３年）；Ｌｉｕ，Ｙ．ら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．６：６４０〜６５５（２０１１年）（非特許文献18）;Ｓｉｍ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：９３４〜９４１（２０１１年）（非特許文献19）。しかし、これらの分化プロトコルは長く、非効率的であり；その実用的な用途には、Ｏ４抗原を発現するＯＰＣを得るのに１２０日を超える培養期間が必要になるという制限がある。更に、報告されたＯ４＋細胞の取得効率は４％〜４７％の範囲である。また、多くの分化プロトコルは１種または２種のｈＥＳＣ株のみを用いて最適化しており、ｉＰＳＣ株でのその再現性は議論の的になっている。Ａｌｓａｎｉｅ，Ｗ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖｅｌ．２２：２４５９〜２４７６（２０１３年）（非特許文献20）。
【０００９】
従って、比較的短期間で大量の精製ＯＰＣを生成する改良されたオリゴデンドロサイト分化プロトコルが非常に望ましい。更に、このプロトコルは、様々なＰＳＣ株に再現性があるべきであり、かつ非常に効率的であるべきである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋａｓｓｍａｎｎ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３９：９６９〜９７６（２００７年）
【非特許文献２】Ｂａｒｔｚｏｋｉｓ，Ｇ.，Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔ．２９：５５〜９６（２００５年）
【非特許文献３】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｈ．Ｇ．ら、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ．Ｒｅｓ．１６１：４〜１８（２０１５年）
【非特許文献４】Ｂｅｈｒｅｎｄｔ，Ｇ．ら、Ｇｌｉａ  ６１：２７３〜２８６（２０１３年）
【非特許文献５】Ｋａｎｇ，Ｊ．ら、Ａｎｎ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ.  ２７：４８７〜４９６（２０１３年）
【非特許文献６】Ｆｅｎｎｅｍａ‐Ｎｏｔｅｓｔｉｎｅ，Ｃ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６３：９８９〜９９５（２００４年）
【非特許文献７】Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２：２５２〜２６４（２０１３年）
【非特許文献８】Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８：４９１〜４９５（２０１２年）
【非特許文献９】Ｉｒｉｏｎ，Ｓ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍ．７３：１０１〜１１０（２００８年）
【非特許文献１０】Ｍｕｒｒｙ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ  １３２：６６１〜６８０（２００８年）
【非特許文献１１】Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ  １１０：３８５〜３９７（２００２年）
【非特許文献１２】Ｉｚｒａｅｌ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４：３１０〜３２３（２００７年）
【非特許文献１３】Ｎｉｓｔｏｒ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｇｌｉａ  ４９：３８５〜３９６（２００５年）
【非特許文献１４】Ｈｕ，Ｂ．Ｙ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６：１４４３〜１４５２（２００９年ａ）
【非特許文献１５】Ｈｕ，Ｂ．Ｙ．ら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４：１６１４〜１６２２（２００９年ｂ）。
【非特許文献１６】Ｎｕｍａｓａｗａ‐Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ら；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２：６４８〜６６１（２０１４年）
【非特許文献１７】Ｓｔａｃｐｏｏｌｅ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１：４３７〜４５０（２０１３年）
【非特許文献１８】Ｌｉｕ，Ｙ．ら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．６：６４０〜６５５（２０１１年）
【非特許文献１９】Ｓｉｍ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：９３４〜９４１（２０１１年）
【非特許文献２０】Ａｌｓａｎｉｅ，Ｗ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖｅｌ．２２：２４５９〜２４７６（２０１３年）
【発明の概要】
【００１１】
本発明の主な態様のいくつかを以下にまとめている。更なる態様は、本開示の発明の詳細な説明、実施例、図面、及び特許請求の範囲の項で説明している。本開示の各項における説明は、他の項と併せて読むように意図されている。更に、本開示の各項で説明した様々な実施形態は多様な異なる方法で組み合わせることが可能であり、全てのこのような組み合わせは本発明の範囲内に収まるように意図されている。
【００１２】
本発明は、７５日以内に４０％〜７０％のＯ４＋ＯＰＣを生成する安定的な分化プロトコルを提供する。Ｄｏｕｖａｒａｓ，Ｐ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．３：２５０〜２５９（２０１４年）（その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。また、大幅なコスト削減をもたらす、分化のわずか５５日後に約３０％のＯ４＋ＯＰＣを得るための戦略も提供する。Ｄｏｕｖａｒａｓ，Ｐ．ら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．（２０１５年）（その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。精製されるとＯ４＋細胞は移植可能になり、シバラー（ｓｈｉ／ｓｈｉ）マウスモデルへの短期間（１６週）移植研究では、ヒト胎児ＯＰＣに匹敵するミエリン化能力を示している。ＰＤＧＦＲαよりむしろＯ４を発現する段階で蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によりＯＰＣを精製し、それにより混入細胞が除かれて腫瘍形成の可能性が最小限になる。本発明者らのプロトコルは９株を超えるｈＰＳＣ株を用いて検証され、各株で非常に一貫した結果が見られた。従って、本発明は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及びｉＰＳＣを含むＰＳＣからＯＰＣ及び成熟オリゴデンドロサイトを効率的に誘導する再現性の高いプロトコルを提供する。
【００１３】
一態様では、本発明はＯＬＩＧ２＋ＯＰＣを生成する方法を提供するものであり、該方法は、（ａ）（ｉ）ＰＳＣを低密度で表面上に播種すること、及び（ｉｉ）前記ＰＳＣを１〜２日間接着培養することにより、ＰＳＣコロニーを調製する段階；（ｂ）前記ＰＳＣコロニーを、低濃度ＲＡと、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）シグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤とを含む培地中でコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記培養の初日を０日目とする、段階；（ｃ）コンフルエントな前記細胞を、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ；３‐クロロ‐Ｎ‐［（１ｒ，４ｒ）‐４‐（メチルアミノ）シクロヘキシル］‐Ｎ‐［３‐（ピリジン‐４‐イル）ベンジル］ベンゾ［ｂ］チオフェン‐２‐カルボキシアミド）及び低濃度ＲＡを含む培地中でオーバーコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記細胞がＯＬＩＧ２を発現する、段階；を含み、それによりＯＬＩＧ２＋ＯＰＣが生成される。
【００１４】
別の態様では、本発明はＯ４＋ＯＰＣを生成する方法を提供するものであり、該方法は、（ａ）ＯＬＩＧ２＋ＯＰＣの３次元細胞凝集体を、スムーズンドのアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中で約８日間、懸濁培養する段階；（ｂ）前記細胞凝集体を、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）を含む培地中で約１０日間、懸濁培養する段階；（ｃ）該細胞凝集体をスフィア２個／ｃｍ２の密度でプレートに再播種する段階；（ｄ）該細胞凝集体を（ｉ）アスコルビン酸（ＡＡ）または（ｉｉ）ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で、細胞がＯ４＋になるまで接着培養する段階；を含み、それによりＯ４＋ＯＰＣが生成される。Ｏ４＋ＯＰＣをＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３の非存在下で約３週間培養することにより成熟オリゴデンドロサイトを生成することができ；それによりミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ＋）を発現するオリゴデンドロサイトが生成される。
【００１５】
更なる態様では、本発明はオリゴデンドロサイトを生成する方法を提供するものであり、該方法は、（ａ）（ｉ）ＰＳＣを低密度で表面上に播種すること、及び（ｉｉ）前記ＰＳＣを１〜２日間接着培養することにより、ＰＳＣコロニーを調製する段階；（ｂ）前記ＰＳＣコロニーを、低濃度ＲＡと、ＴＧＦβシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と、ＢＭＰシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤とを含む培地中でコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記培養の初日を０日目とする、段階；（ｃ）コンフルエントな前記細胞を、スムーズンドアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中でオーバーコンフルエントになるまで培養する段階であって、前記細胞がＯＬＩＧ２＋ＯＰＣである、段階；（ｄ）前記細胞を前記表面から剥離する段階であって、それにより３次元細胞凝集体が形成される、段階；（ｅ）前記細胞凝集体を、スムーズンドのアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中で約８日間、懸濁培養する段階；（ｆ）前記細胞凝集体を、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で約１０日間、懸濁培養する段階；（ｇ）前記細胞凝集体をスフィア２個／ｃｍ２の密度でプレートに再播種する段階；（ｈ）前記細胞凝集体を（ｉ）ＡＡまたは（ｉｉ）ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で、細胞がＯ４＋になるまで接着培養する段階であって、それによりＯ４＋ＯＰＣが生成される、段階；ならびに（ｉ）Ｏ４＋ＯＰＣを、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない培地中で、細胞がＭＢＰ＋になるまで培養する段階；を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される。
【００１６】
本発明の別の態様は、オリゴデンドロサイトを生成する方法であり、該方法は、（ａ）ＰＳＣを、（ｉ）０日目〜８日目は二重ＳＭＡＤ阻害下で、（ｉｉ）８日目〜１２日目はＳＨＨまたはスムーズンドアゴニストの存在下で、低濃度ＲＡを含む培地中で単層接着培養する段階であって、それによりＯＬＩＧ２＋細胞が生成される、段階；（ｂ）段階（ａ）の細胞を、（ｉ）１２日目〜２０日目はＳＨＨまたはスムーズンドアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中で、（ｉｉ）２０日目〜３０日目はＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で懸濁培養することにより、ＯＬＩＧ２＋細胞を濃縮する段階；（ｃ）段階（ｂ）の細胞を、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で３０日目〜７５日目まで接着培養する段階であって、それによりＯ４＋ＯＰＣが生成される、段階；ならびに（ｄ）Ｏ４＋ＯＰＣを、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない培地中で７５日目〜９５日目まで接着培養する段階；を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される。
【００１７】
本発明の更なる態様は、オリゴデンドロサイトを生成する方法であり、該方法は、（ａ）ＰＳＣを、（ｉ）０日目〜８日目は二重ＳＭＡＤ阻害下で、（ｉｉ）８日目〜１２日目はＳＨＨまたはスムーズンドアゴニストの存在下で、低濃度ＲＡを含む培地中で単層接着培養する段階であって、それによりＯＬＩＧ２＋細胞が生成される、段階；（ｂ）段階（ａ）の細胞を、（ｉ）１２日目〜２０日目はＳＨＨまたはスムーズンドアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中で、（ｉｉ）２０日目〜３０日目はＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中で懸濁培養することにより、ＯＬＩＧ２＋細胞を濃縮する段階；ならびに（ｃ）段階（ｂ）の細胞を、ＡＡを含むがＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない培地中で３０日目〜６０日目まで接着培養する段階；を含み、それによりオリゴデンドロサイトが生成される。
【００１８】
また、ミエリン化を促進する化合物を同定する方法も提供し、該方法は、（ａ）本発明の方法によりオリゴデンドロサイトを生成する段階；（ｂ）前記オリゴデンドロサイトを候補化合物と接触させる段階；及び（ｃ）前記候補化合物がニューロンのミエリン化を促進するかどうかを判定する段階；を含む。
【００１９】
別の実施形態は、対象の神経疾患または障害を治療する方法であり、該方法は、（ａ）本発明の方法によりオリゴデンドロサイトを生成する段階；（ｂ）有効量のオリゴデンドロサイトを対象に投与する段階；を含み、前記オリゴデンドロサイトが前記対象の神経系のミエリン形成を促進し、それにより前記対象の神経疾患が治療される。
【００２０】
本発明は、本発明の方法により生成されたオリゴデンドロサイト前駆細胞及びオリゴデンドロサイト、ならびにそれらを含む非ヒト哺乳動物も包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】選択肢Ａ（図１Ａ）及び選択肢Ｂ（図１Ｂ）に従ったオリゴデンドロサイト分化のタイムラインを示す。三角形は、段階特異的なマーカーの発現を免疫蛍光法により評価するために推奨する時点を表す。ＳＢ：ＳＢ４３１５４２；  ＬＤＮ：ＬＤＮ１９３１８９；  ＳＡＧ：スムーズンドアゴニスト；  Ｔ３：トリヨードチロニン；  ＲＡ：オールトランス型レチノイン酸；  ＰＤＧＦ：血小板由来増殖因子；  ＨＧＦ：肝細胞増殖因子；  ＩＧＦ‐Ｉ：インスリン様増殖因子‐１；  ＮＴ３：ニューロトロフィン３；  ＡＡ：アスコルビン酸。
【図２】ＯＬＩＧ２＋前駆細胞を誘導するためにＲＡ及びＳＨＨが必要であることを示す。図２Ａは、ＲＡ及びＳＨＨの種々の条件下での分化１４日目のＯＬＩＧ２‐ＧＦＰ細胞のライブイメージング及びフローサイトメトリーによる定量を示す。ＧＦＰ＋細胞の収率は、０日目から濃度１００ｎＭのＲＡを使用した場合に最も高い。図２Ｂは、最も良好なＲＡ条件について８日目からＳＨＨまたはＳＡＧを添加した場合のライブイメージング及びＦＡＣＳ分析による比較を示す。陰性対照：ｈＥＳＣ株ＲＵＥＳ１。図２Ｃは、最適なＲＡ及びＳＨＨ条件下でのＰＡＸ６、ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２の経時的な遺伝子発現プロファイルを示す。エラーバーはＳＥＭである（Ｎ＝３）。ＲＵＥＳ１細胞を使用した場合とＯＬＩＧ２‐ＧＦＰレポーター株を使用した場合に同等の結果が得られている。図２Ｄは、選別されていない細胞、選別されたＧＦＰ＋細胞、またはＧＦＰ−細胞のスフィア形成の評価を示す。ＧＦＰ＋細胞のみがスフィアを形成し、ＧＦＰ＋集団の濃縮をもたらしている。
【図３】ＯＬＩＧ２＋前駆細胞にはＳＨＨ及び二重ＳＭＡＤ阻害が必要であることを示す。図３Ａは、０日目からＲＡのみに曝露した細胞と、０日目からＲＡを添加し８日目からＳＨＨ／ＳＡＧを添加して培養した場合との間の、分化１４日目のＯＬＩＧ２、ＰＴＣＨ１及びＳＨＨのｍＲＮＡレベルの比較を示す。内因性ＳＨＨレベルは、ＳＨＨ／ＳＡＧに曝露しなかった試料の方が高い。エラーバーはＳＥＭである（Ｎ＝３）。図３Ｂは、分化の初めの１２日間、ＲＡのみに曝露した細胞とＲＡ及びＳＡＧに曝露した細胞との間の、分化７５日目のＯ４＋細胞に関するＦＡＣＳ分析を示す。分化の初期段階でＳＡＧを付与されなかった細胞において、Ｏ４＋集団は５６％減少していることが観察された。陰性対照：ＡＰＣ結合２次抗体のみ。図３Ｃは、異なるＳＭＡＤ阻害剤下での、分化１４日目のライブイメージング及びＦＡＣＳ分析を示す。ＧＦＰ＋細胞の実質的な集団はＳＭＡＤタンパク質の二重阻害下でのみ存在し、このことはＲＡとＳＭＡＤの二重阻害との相乗効果を示している。ＤＳｉ：二重ＳＭＡＤ阻害；  ＳＢ：ＳＢ４３１５４２；  ＬＤＮ：ＬＤＮ１８９１９３。
【図４】ヒト多能性幹細胞からのオリゴデンドロサイトの生成を示す。図４ＡはｈＰＳＣから成熟オリゴデンドロサイトへの分化プロトコルの概略図を示す。図４Ｂ〜４ＭはＲＵＥＳ１細胞のインビトロでのオリゴデンドロサイト分化の連続段階であり、８日目のＰＡＸ６＋神経幹細胞（Ｂ）、１２日目の多層構造の位相差像（Ｃ）、１８日目のＯＬＩＧ２＋ＮＫＸ２．２＋ｐｒｅ‐ＯＰＣ（Ｄ）、ＳＯＸ１０＋ＯＬＩＧ２＋初期ＯＰＣ（Ｅ）、Ｏ４＋後期ＯＰＣのライブイメージング（Ｆ）、Ｏ４＋細胞の分枝プロセスを強調するようトリミングされた画像（Ｇ）、ＯＬＩＧ２を共発現するＯ４＋ＯＰＣ（Ｈ）、ＳＯＸ１０を共発現するＯ４＋ＯＰＣ（Ｉ）、ＳＯＸ１０及びＮＧ２を共発現する、選別されたＯ４＋ＯＰＣ（Ｊ）、低倍率（Ｋ）及び高倍率（×６４）（Ｌ）で示す最終分化ＭＢＰ＋オリゴデンドロサイト、ならびにオリゴデンドロサイト培養におけるＭＡＰ２＋及びＧＦＡＰ＋細胞（Ｍ）を示す。ＰＳＣ：多能性幹細胞；  ＮＳＣ：神経幹細胞；  ＯＰＣ：オリゴデンドロサイト前駆細胞；  ＯＬ：オリゴデンドロサイト；  ｐＯ／Ｌ：ポリ‐Ｌ‐オルニチン／ラミニン。
【図５】増殖性オリゴデンドロサイト及び他の神経細胞型を示す。図５Ａは、５０日目のＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０及びＫｉ６７の代表的な免疫蛍光染色を示す。ＯＬＩＧ２とＳＯＸ１０はほぼ完全に共局在している。図５Ｂは、分化３０日目〜５０日目のＯＬＩＧ２＋及びＳＯＸ１０＋の前駆細胞の増殖割合を示すＫｉ６７＋細胞の経時的定量を示す。エラーバーはＳＥＭである（Ｎ＝２）。図５Ｃは、７３日目の免疫蛍光染色画像であり、多数のＯ４＋細胞を示しているが、Ｋｉ６７を共発現する細胞はほぼない。図５Ｄは、増殖因子除去から４週間後のＭＢＰを共発現するＯ４＋細胞の割合を示す（グリア培地）。エラーバーはＳＥＭである（Ｎ＝４）。図５Ｅは、分化の７８日目〜８８日目の３つの独立した実験における、細胞総数に対するＭＡＰ２＋ニューロン及びＧＦＡＰ＋アストロサイトの割合を示す。エラーバーはＳＥＭである（Ｎ＝３）。
【図６】選択肢Ｂのプロトコルに従った分化の５３日目（図６Ａ、６Ｄ）、６３日目（図６Ｂ、６Ｅ）及び７３日目（図６Ｃ、６Ｆ）のＯ４ライブイメージングである。図６Ａ〜６Ｃは低倍率での代表的な視野を示し；Ｏ４＋細胞の数は経時的に増加している。図６Ｄ〜６Ｆは、それぞれ図６Ａ〜６Ｃの高倍率画像であり、細胞の形態を強調している。図６Ｇは、選択肢Ｂ（「迅速」）プロトコル（５５日目、６３日目及び７５日目）及び選択肢Ａ（「オリジナル」）プロトコルを使用して異なる時点でフローサイトメトリーにより計算されたＯ４＋細胞の出現率の代表的な例を示す。スケールバー：５００μｍ（６Ａ〜６Ｃ）；  ２００μＭ（６Ｄ〜６Ｆ）。
【図７】ｈＰＳＣからオリゴデンドロサイトへの分化の基本的な段階を示す。図７Ａは、分化の８日目のＰＡＸ６＋神経幹細胞を示す（ＰＡＸ６、緑；  核はＤＡＰＩの青色で染色している）。図７Ｂは、３次元構造を表す１２日目の培養物の典型的な形態を示す。図７Ｃは、免疫蛍光分析によって示されている１２日目のＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２の発現を示す（ＯＬＩＧ２、緑；  ＮＫＸ２．２、赤；  核はＤＡＰＩの青色で染色している）。図７Ｄはスフィア選択を示し、矢印は、丸形で、金色／茶色で、中心は比較的濃く、直径は３００μｍ〜８００μｍである、良好なスフィアを示す。感嘆符は、穏やかにピペッティングすることにより単一のスフィアに分けることが可能な一対の接合スフィアを示す。避けるべき凝集体は、小型で透明であるか（矢頭）、または非常に大型で形状が不規則で、通常は機械的消化によって誘導される（星印）。図７Ｅは、ＮＫＸ２．２（緑）、ＳＯＸ１０（赤）及びＯＬＩＧ２（青）を共発現している５６日目の前駆細胞の免疫蛍光染色を示す。図７Ｆは、細胞の高度に分枝した形態を示すＯ４（緑）ライブ染色である。図７Ｇは、分化の最後のＭＢＰ＋（赤）オリゴデンドロサイトを示す（核はＤＡＰＩの青色で染色している）。図７Ｈは、ＭＢＰ＋（赤）オリゴデンドロサイトの形態を高倍率（６４×）で示す。当該培養物中には、ＭＡＰ２＋（緑）及びＧＦＡＰ＋（青）の細胞も存在する。図７Ｉは、選別から２４時間後の精製Ｏ４＋細胞が依然として典型的な分枝形態を維持していることを示している。スケールバー：５００μｍ（図７Ａ、７Ｂ、７Ｇ）；２００μｍ（図７Ｃ、７Ｅ、７Ｆ、７Ｉ）；１ｍｍ（図７Ｄ）。
【図８】ＰＰＭＳのｉＰＳＣ株の生成及び特性評価を示す。図８Ａは、ＰＰＭＳ株のｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡリプログラミングであり、代表的な、リプログラミングの７日目の皮膚線維芽細胞、１２日目の明白なｉＰＳＣ様コロニー、及び１５日目のＴＲＡ‐１‐６０＋コロニーを示す。図８Ｂは、ＰＰＭＳ‐ｉＰＳＣ１０２の多能性マーカーの免疫蛍光を示す。図８Ｃは、胚様体を経たインビトロでの自発的分化後の、内胚葉マーカーＡＦＰ、中胚葉マーカーαＳＭＡ、及び外胚葉マーカーβＩＩＩ‐チューブリンの免疫蛍光を示す。核はＤＡＰＩで染色している。図８Ｄは、免疫不全マウスにＰＰＭＳ  ｉＰＳＣを注入した後のインビボでのテラトーマ形成のＨ＆Ｅ染色切片であり、腺組織（内胚葉）、軟骨（中胚葉）、及び色素上皮（外胚葉）の代表的な構造を示す。図８Ｅは、ｈＥＳＣ株と比較した、未分化ＰＰＭＳ‐ｉＰＳＣ及び親線維芽細胞の多能性遺伝子発現を示す。ＡＮＰＥＰ遺伝子は線維芽細胞に特異的である。図８Ｆは、細胞遺伝学的解析を示し、全てのＰＰＭＳ‐ｉＰＳＣ株が正常な核型を示している。
【図９】ｉＰＳＣ株でのテラトーマ形成の特性評価を示す。ｉＰＳＣ株１０２の細胞を免疫不全マウスへ移植した後の、インビボでのテラトーマ形成の内胚葉（図９Ａ）、外胚葉（図９Ｂ）、及び中胚葉（図９Ｃ）の代表的な写真。
【図１０】ＰＰＭＳ‐ｉＰＳＣはインビトロでＯＰＣ及び成熟オリゴデンドロサイトを生成することを示す。図１０Ａ〜１０Ｉは、ＰＰＭＳ  ｉＰＳＣのインビトロでのオリゴデンドロサイト分化の連続段階であり、８日目のＰＡＸ６＋細胞（Ａ）、１２日目の多層構造の位相差像（Ｂ）、１２日目のＯＬＩＧ２＋及びＮＫＸ２．２＋の細胞（Ｃ）、ＳＯＸ１０＋ＯＬＩＧ２＋初期ＯＰＣ（Ｄ）、７３日目のＯ４＋後期ＯＰＣのライブイメージング（Ｅ）、Ｏ４＋細胞の分枝プロセスを強調するようトリミングされた画像（Ｆ）、低倍率（Ｇ）及び高倍率（×６４）（Ｈ）で示す最終分化ＭＢＰ＋オリゴデンドロサイト、ならびにオリゴデンドロサイト培養物中のＭＡＰ２＋細胞（Ｉ）を示す。図１０Ｊは、ＲＵＥＳ１及びＰＰＭＳ ｉＰＳＣからの分化から７５日後のＯ４＋細胞の、ＦＡＣＳ分析による定量を示す。ゲートは、Ｏ４染色については２次Ａｂ‐ＡＰＣのみに基づき、ＰＤＧＦＲα染色についてはＰＥ結合同位体対照に基づく（陰性対照）。総Ｏ４＋細胞出現率（Ｏ４＆＋＋）は括弧内に示す。
【図１１】インビボ試験のための移植の前の細胞の特性評価を示す。図１１Ａは、ＭＥＦ上で増殖したｉＰＳＣ株における多能性マーカーを示すＦＡＣＳプロットを示しており、同マーカーは分化の８１日目の細胞には存在しないことを示している。図１１Ｂは、インビボでの移植のための単離及び凍結保存の前にＯ４＋細胞を選別するために使用するよりストリンジェントなゲートを示すプロットである。図１１Ｃは、凍結保存後にプレートに播種した、４８時間の回復期中のＯ４＋選別細胞の明視野画像を示す。図１１Ｄは、選別したＯＰＣにおけるライブＯ４染色を示し、Ｏ４の保持及び適切な分枝形態を示す。
【図１２】インビボで生着し、ミエリン形成オリゴデンドロサイトに分化するＰＰＭＳ由来ＯＰＣを示す。図１２Ａは、新生仔シバラー／ｒａｇ２マウスに移植されたヒトＰＰＭＳ  ｉＰＳＣ由来Ｏ４＋ＯＰＣを示す。１６週時点でヒト細胞は検体脳梁で高密度の生着を示した（ｈＮＡ、赤）。多数がＭＢＰ発現オリゴデンドロサイトとして分化し（緑）、検体脳梁全体に拡散して分布した。図１２Ｂは、マウス軸索（神経フィラメント；ＮＦ、赤）及びＭＢＰ＋ヒトオリゴデンドロサイト（緑）の共局在を示す共焦点像である。図１２Ｃ及び図１２Ｄは、ミエリン化した軸索の電子顕微鏡写真であり、周期線（矢頭）及び周期間線が交互に存在する特徴的なコンパクトミエリンを示す。図１２Ｅから、移植されたヒト細胞は、約８０％のｈＮＡ＋細胞がＯＬＩＧ２（緑；１６週）を発現するという前駆細胞の特長を保持していたことが分かる。図１２Ｆは、１６週時点で個々のＮＧ２細胞が表層大脳皮質に移行し始めたことを示す。図１２Ｇは、ｉＰＳＣ由来のＯ４選別ＯＰＣによりインビボでの限定された両能性が実証されたことを示し、わずかなＧＦＡＰ＋アストロサイトだけが側脳室の近傍で見られた。
【図１３】ｉＰＳＣ株が由来するＭＳ患者及び健常な個人についての人口統計情報を示す。
【図１４】ｉＰＳＣへの皮膚線維芽細胞のリプログラミングを示す。図１４Ａは、形態が明らかに変化した線維芽細胞がリプログラミングの３日目で視認可能になることを示している。図１４Ｂは、ｎＧＦＰのｍＲＮＡを用いて評価した７日目のトランスフェクション効率を示す。図１４Ｃは、１２日目のｉＰＳＣ様コロニーを示す。図１４Ｄは、フィーダーフリー条件で増殖したｉＰＳＣクローンを示す。
【図１５】多能性に関するｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ解析によるｉＰＳＣ株の特性評価を示す。図１５Ａは、ＭＳ患者または健常対照由来の３種のｈＥＳＣ株、２種の線維芽細胞株及び５種のｉＰＳＣ株のｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ解析を示し、ｉＰＳＣ株はｈＥＳＣ株と区別できない。図１５Ｂは、インビトロでの自発的な胚様体分化により全胚葉由来の細胞が生じることを示している。左から右へ：ＡＦＰ＋内胚葉細胞、Ｔｕｊｉ１＋外胚葉細胞、ａＳＭＡ＋の中胚葉細胞。
【図１６】多発性硬化症の理解へのアプローチを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明者らは、増殖因子に富む化学的組成が明らかな培地を用いる、ＰＳＣからヒトオリゴデンドロサイトを生成する安定的で迅速かつ再現可能な分化プロトコルを開発した。本発明者らのプロトコルは発生中のオリゴデンドロサイト分化を模倣している。ＰＳＣは８日以内にＰＡＸ６＋神経幹細胞に分化し、該細胞から１２日目までにＯＬＩＧ２＋前駆細胞が発生する。ＯＬＩＧ２＋細胞は、１８日目前後に共発現ＮＫＸ２．２によってオリゴデンドロサイト系列にコミットされ、その後、４０日目前後にＳＯＸ１０及びＰＤＧＦＲαの上方制御により初期ＯＰＣに分化する。Ｏ４抗体（Ｏ４＋）に認識される硫酸化糖脂質抗原を発現する後期ＯＰＣが５０日目前後に出現し、それは分化の７５日目までに細胞集団の４０〜７０％に達する。Ｏ４＋オリゴデンドロサイト前駆細胞は、ミエリン化の研究のために細胞選別により単離することができ、または最終的にＭＢＰ＋の成熟オリゴデンドロサイトに分化することができる。本発明者らのオリゴデンドロサイト分化プロトコルのタイムラインを図１に示す。
【００２３】
オリゴデンドロサイトを生成するために本発明者らが操作するシグナル伝達経路は、齧歯類の脊髄胚発生の研究から得た知識に基づいて選択した。Ｈｕら、（２００９年ａ）。インビトロでは、ＲＡ及びＳＨＨシグナル伝達は、ＯＬＩＧ２前駆細胞へのＰＳＣの分化を誘導するｐＭＮ環境を模倣する。本発明者らの培養では、ＳＨＨシグナル伝達はヒト組換えＳＨＨタンパク質の代わりにスムーズンドアゴニストを介して活性化する。本発明者らは、（ＳＢ４３１５４２による）アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβの阻害及び（ＬＤＮ１９３１８９による）ＢＭＰ４阻害を、ＲＡ及びＳＨＨシグナル伝達と組み合わせることにより、ＯＬＩＧ２＋前駆細胞の収率が最大になることを見出した。ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９の相乗作用により、１２日目に７０％を超える細胞がＯＬＩＧ２を発現する。このことは、本発明者らのプロトコルとＷａｎｇら（２０１３年）のプロトコルとの間の重要な違いである。アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβシグナル伝達及びＢＭＰシグナル伝達両方の阻害は「二重ＳＭＡＤ阻害」とも呼ばれる。
【００２４】
本発明者らの方法と過去に発表されたプロトコルとの間には、他の重要な違いがいくつか存在する。例えば、本発明者らは、懸濁培養とは対照的に、接着培養下での二重ＳＭＡＤ阻害により神経誘導を開始した。Ｗａｎｇら（２０１３年）；Ｈｕら（２００９年ｂ）；Ｎｉｓｔｏｒら（２００５年）。このアプローチにより、本発明者らは、０日目にわずか１０，０００細胞／ｃｍ２で開始し、それにも関わらず神経前駆細胞の大幅な増殖を達成し、最終的に大量のＯＰＣ生成を達成した。また、本発明者らの実施におけるＲＡ最適濃度は約１００ｎＭであることが分かり、これは他のグループで使用された濃度の１００倍低い濃度である。Ｇｉｌ，Ｊ．Ｅ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８３：５６１〜５６７（２００９年）;Ｉｚｒａｅｌら（２００７年）；Ｎｉｓｔｏｒら（２００５年）。更に、外因性ＳＨＨを使用しないＲＡのみによる誘導は驚くほど大きなＯＬＩＧ２＋細胞集団を生成した。本発明者らは、スムーズンドのアゴニストはＳＨＨに対する効果的な代替物であり、実際に本発明者らの実施において優れた有効性を示すことを確認した（Ｓｔａｃｐｏｏｌｅら、２０１３年）。更に注目すべきことに、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達を使用しないＲＡによるＯＬＩＧ２誘導を示したのは本発明が最初である。ＲＡ及びＦＧＦシグナル伝達の組み合わせは、ニワトリの発生中にＯＬＩＧ２発現を促進することが知られており、ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣ両方のインビトロ分化に使用されてきた。Ｐｏｕｙａ，Ａ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２７９２５（２０１１年）；Ｎｉｓｔｏｒら（２００５年）；Ｎｏｖｉｔｃｈ，Ｂ．Ｇ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ４０：８１〜９５（２００３年）。近年の研究から、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は腹側前脳由来のオリゴデンドロサイトの特定に不可欠であるが、それは脊髄からのオリゴデンドロサイトの特定中に神経分化を阻害することが示唆された。Ｓｔａｃｐｏｏｌｅら（２０１３年）。それにもかかわらず、本発明者らはインビトロでの分化において、外因性ＦＧＦの非存在下で高収率のＯＰＣを達成した。最後に、１２日目の細胞スフィアの接着培養から懸濁培養への移行は、ＯＬＩＧ２＋細胞集団を増加させて本発明者らの培養物の分化をオリゴデンドロサイト系列に限定するための重要な段階であることが判明した。
【００２５】
本発明者らはまた、ＰＰＭＳ患者の皮膚線維芽細胞のリプログラミングを介してミエリン化オリゴデンドロサイトを誘導できるという最初の証拠も提供する。ＭＳ由来のｉＰＳＣに関する過去の唯一の報告は、１人の３５歳のＲＲＭＳ患者に由来する、レトロウイルスによってリプログラミングされた、遺伝子を組み込んでいるｉＰＳＣ株から、インビトロでオリゴデンドロサイトが分化され得ることを示していた。Ｓｏｎｇ，Ｂ．，ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．８：２５９〜２７３（２０１２年）。本発明者らは、５０〜６２歳の男女のＰＰＭＳ患者から得た４種の、遺伝子挿入のないｉＰＳＣ株に由来するＯＰＣによるインビボでのミエリン化を実証する。従って、本発明者らのｉＰＳＣ株がＰＰＭＳ患者に由来するという点で、本発明は、ｉＰＳＣ由来ＯＰＣを用いた近年の研究とは異なる。更に、分化能を最大限に制限するために、インビボでの移植に使用する細胞は、後期ＯＰＣマーカーＯ４を使用して選別した。これらの違いにもかかわらず、ＰＰＭＳ由来のＯ４＋で選別したＯＰＣは、過去に報告されたｉＰＳＣ由来の非選別ＯＰＣと比較して、同等の生着効率、同等の有糸分裂率、及び同等の割合の被鞘されたホスト軸索を示したが、ＧＦＡＰ＋アストロサイトの生成は少なかった。まとめると、本発明者らのデータは、ＰＰＭＳ由来のＯＰＣが少なくとも健常ｉＰＳＣ由来細胞（Ｗａｎｇら、２０１３年）と同じくらい効率的にインビボで作用することを示し、本発明者らのｉＰＳＣ誘導及びＯＰＣ誘導プロトコルは、１人の患者試料からミエリン形成性オリゴデンドロサイトを生成し、これをＭＳの自家細胞補充療法に使用可能にすることを確立している。
【００２６】
本発明の特定の実施形態は、最初にＰＳＣコロニーを調製することによりＯＬＩＧ２＋ＯＰＣを生成する方法である。ＰＳＣを低密度で（プレートに）播種し、約１〜２日間の接着培養で増殖させる。「低密度」とは、約８，０００〜約１１，０００細胞／ｃｍ２を意味する。細胞を、好ましくは約９，５００〜約１０，５００細胞／ｃｍ２、より好ましくは約１０，０００細胞／ｃｍ２で播種する。１〜２日後、ＰＳＣは、好ましくは直径約７５μｍ〜約３００μｍ、より好ましくは直径約１００μｍ〜約２５０μｍのコロニーを形成する。
【００２７】
用語「ＰＳＣ」は、当該技術分野における通常の意味を持ち、すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉細胞へと発生する能力を有する自己複製細胞である。ＰＳＣはｈＰＳＣであることが好ましい。ＰＳＣにはＥＳＣ及びｉＰＳＣ、好ましくはｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣが挙げられる。ＰＳＣは、ゲルまたは基底膜マトリックスなどのマトリックスを含む表面上に播種することができる。好ましいマトリックスは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ＣＵＬＴＲＥＸ（登録商標）及びＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）などの商品名で販売されている、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ‐Ｈｏｌｍ‐Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌されるタンパク質混合物である。他の適切なマトリックスとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、ポリリジン、ビトロネクチン及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
ＰＳＣを培養する培地は、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤、例えばＧＳＫ２６９９６２、ＧＳＫ４２９２８６、Ｈ‐１１５２、ＨＡ‐１０７７、ＲＫＩ‐１４４７、チアゾビビン、Ｙ‐２７６３２、またはこれらの誘導体を含むことが好ましい。
【００２９】
その後、ＰＳＣコロニーを、低濃度ＲＡと、ＴＧＦβシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と、ＢＭＰシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤とを含む培地中でコンフルエントになるまで単層培養する。ここでは、この培地中での培養の初日を０日目とする。「低濃度ＲＡ」とは約１０ｎＭ〜約２５０ｎＭである。ＲＡの濃度は、好ましくは約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、または約２５ｎＭ〜約１００ｎＭ、または約２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、及び好ましくは、約１００ｎＭ以下である。ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤には、例えばＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ２１５７２９９及びＬＹ３６４９４７が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達の好ましい阻害剤は小分子ＳＢ４３１５４２である。ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤には、例えばＤＭＨ１、ドルソモルフィン、Ｋ０２２８８及びノギンが挙げられる。ＢＭＰシグナル伝達の好ましい阻害剤は小分子ＬＤＮ１９３１８９である。
【００３０】
約８日目に細胞がコンフルエントに達してＰＡＸ６を発現すると、その時点で該コンフルエント細胞を、ＳＨＨまたはスムーズンドアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中で培養する。スムーズンドアゴニストには、例えば、ＳＡＧ及びパルモルファミンが挙げられる。ＳＨＨは組換えヒトＳＨＨとすることができる。培地にＳＨＨが含まれないことが好ましい。ＰＳＣからＯＬＩＧ２＋前駆細胞への移行には、培養物をオーバーコンフルエントにする大量増殖が伴い、その結果、理想としては約１２日までに細胞が三次元構造を形成する。「オーバーコンフルエント」とは、細胞全てが培養表面と完全に接触している訳ではなく、いくつかの細胞は培養表面とは全く接触せずに細胞同士のみが接触するように、細胞が互いに重なり合っていることを意味する。約１２日目までにオーバーコンフルエントな細胞の少なくとも約５０％、６０％または７０％がＯＬＩＧ２＋になることが好ましい。
【００３１】
ＯＬＩＧ２＋細胞を更にＯ４＋細胞に分化させる場合、オーバーコンフルエントな細胞を培養表面から剥離し、細胞凝集体またはスフィアを形成させる。ＯＬＩＧ２−細胞は凝集体を形成せず、したがって、このプロセスによりＯＬＩＧ２＋集団が濃縮され、ＯＬＩＧ２−細胞はその後の培地交換中に徐々に除かれる。本発明の目的では、用語「凝集体」及び「スフィア」は同じ意味で使用され、好ましくは、必要ではないが少なくとも約１００個の細胞の多細胞三次元構造を指す。
【００３２】
剥離は、セルスクレーパーもしくは他の好適な器具で機械的に、または化学的に行うことができる。化学的剥離は、タンパク質分解酵素、例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、トリプシン様プロティナーゼ、商品名ＴＲＹＰＬＥ（登録商標）で販売されているような組換え酵素、商品名ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）で販売されているような天然由来酵素、及びこれらの組み合わせを用いて行う。化学的剥離はまた、ＥＤＴＡのようなキレート剤、または尿素などの化合物を用いて行うこともできる。機械的な剥離（lifting）または剥離（detachment）は細胞死を最小限にするという利点をもたらすが、サイズが不均一な凝集体が生成され、従って好適なスフィアは手動の採取プロセスを介して選択する必要がある。良好なスフィアは、丸型で、金色／茶色で、中心が濃く、直径が約３００μｍ〜約８００μｍであるものとして定義される。酵素消化などの化学的方法を用いて細胞を剥離すると、その後の培養に適したスフィアが主に生成される。従って、スフィアの手動採取を必要とせず、剥離段階は自動化に適合し、ハイスループット試験に使用することが可能になる。しかし、酵素消化は細胞死を増加させ、結果としてスフィアの数を減少させる。
【００３３】
本発明者らは更に、ＯＬＩＧ２＋ＯＰＣからＯ４＋ＯＰＣを生成する方法を提供する。ＯＬＩＧ２＋ＯＰＣの三次元凝集体を、スムーズンドアゴニスト及び低濃度ＲＡを含む培地中で約８日間、懸濁培養する。ＯＬＩＧ２＋ＯＰＣは、例えば上述のような本発明の方法、または当技術分野で公知の他の方法により生成することができる。スムーズンドアゴニスト及びＲＡを含む培地に入れて約８日後、該培地を、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３、任意でインスリン（好ましくは約１０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約２５μｇ／ｍｌ）、Ｔ３（好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約６０ｎｇ／ｍｌ）、ビオチン（好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍl）、及び／またはｃＡＭＰ（好ましくは約１００ｎＭ〜約５μＭ、より好ましくは約１μＭ）を含む培地と交換する。培地にはｂＦＧＦ及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）が含まれないことが好ましい。ＯＬＩＧ２＋細胞を本発明の方法により生成する場合、懸濁培養は約１２日目に開始することが好ましく、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中での培養は約２０日目に開始することが好ましい。
【００３４】
ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地中での約１０日間の懸濁培養後、細胞凝集体をスフィア約２個／ｃｍ２の密度で接着培養に移す。（これは、前記方法における、ＲＡと、ＴＧＦβシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と、ＢＭＰシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤とを含む培地中でのＰＳＣの培養開始を０日目とした場合の、約３０日目であることが好ましい。）細胞凝集体の播種及び培養を行う表面は、細胞外マトリックスタンパク質（例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン）及び／または正に荷電したポリアミノ酸（例えばポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン）を含むことができる。表面はラミニン及び／またはポリオルニチンを含むことが好ましい。
【００３５】
細胞凝集体をプレートに播種する際、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地を引き続き使用することが可能であり（選択肢Ａ）、あるいはＡＡを含むが増殖因子（ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１、ＮＴ３、ｂＦＧＦ及び／またはＥＧＦ）を含まない培地を使用することができる（選択肢Ｂ）。ＡＡを含む培地は任意でインスリン、Ｔ３、ビオチン及び／またはｃＡＭＰを含むことができる。ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含む培地で培養した細胞は、プレートへの播種から約４５日後までにＯ４＋になることが好ましい。これらの細胞の少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％はプレートへの播種から約４５日後までにＯ４＋になることが好ましい（７５日目）。ＡＡを含む培地で培養した細胞はプレートへの播種から約２５日後までにＯ４＋になることが好ましい。これらの細胞の少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％または４０％はプレートへの播種から約２５日後までにＯ４＋になることが好ましい（５５日目）。これらの細胞の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％はプレートへの播種から約３３日後までにＯ４＋になることが好ましい（６３日目）。これらの細胞の少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％はプレートへの播種から約４５日後までにＯ４＋になることが好ましい（７５日目）。
【００３６】
ミエリン塩基性タンパク質を発現する成熟オリゴデンドロサイトは、細胞がＭＢＰ＋になるまでの約３週間、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３の非存在下でＯ４＋ＯＰＣを培養することにより生成できる。ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ‐１及びＮＴ３を含まない培地中での培養の約２０日後に、Ｏ４＋ＯＰＣの約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％がＭＢＰ＋になることが好ましい。このことは「選択肢Ａ」の細胞については約９５日目に、「選択肢Ｂ」の細胞については約６０日目に発生する。「選択肢Ｂ」の細胞を少なくとも約７５日目まで培養すると、ＭＢＰ＋発現細胞の収率が高まる。
【００３７】
本発明はまた、本発明の方法で生成されたＯＰＣ、オリゴデンドロサイト、及びミエリン生成細胞、ならびにそれらを含む非ヒト哺乳動物、好ましくはマウス及び／またはラットを包含する。ミエリン生成細胞は、ミエリンを生成する細胞であればどのような細胞でもよく、オリゴデンドロサイトが挙げられるがこれに限定するものではない。いくつかの実施形態では、ミエリン生成細胞はＰＳＣから分化し、このような実施形態では、ＰＳＣはｉＰＳＣとすることもできる。ｉＰＳＣは対象の体細胞から誘導することができる。一態様では、対象は脱髄またはミエリン形成不全疾患もしくは障害に罹患している。
【００３８】
一態様では、本発明は、ＭＳ、特にＰＰＭＳの患者からウイルスフリーで遺伝子挿入のないｉＰＳＣを生成する方法を提供する。シバラーマウスにおけるインビボでのミエリン化で実証されているように、そのようなｉＰＳＣをＯＰＣや機能的オリゴデンドロサイトへと効率的に分化させるために本発明者らの分化プロトコルを使用することができる。
【００３９】
本発明は、神経疾患、好ましくは脱髄またはミエリン形成不全疾患もしくは障害のためのモデル系も提供する。一態様では、当該モデル系は、脱髄またはミエリン形成不全状態の対象由来のｉＰＳＣから分化したミエリン生成細胞を含む。当該モデル系は、ミエリン生成細胞が移植された非ヒト哺乳動物を更に含むことができる。一実施形態では、非ヒト哺乳動物はマウスまたはラットである。本発明により提供されるモデル系を使用して、脱髄またはミエリン形成不全疾患もしくは障害を研究することが可能であり、この研究には、基礎となるメカニズムを理解し、治療標的を定義することも含まれる。
【００４０】
本発明はまた、本発明の方法に従ってＯＰＣまたはオリゴデンドロサイトを生成し；有効量の細胞を対象に投与することにより対象の神経疾患または障害を治療及び／または予防する方法も提供する。移植されると、オリゴデンドロサイト、またはインビボでオリゴデンドロサイトに分化したＯＰＣは、対象の神経系においてミエリン形成を促進する。従って、本発明は、対象の神経疾患または障害の治療及び／または予防における本発明のＯＰＣまたはオリゴデンドロサイトの使用を提供する。当該神経疾患または障害は、脱髄もしくはミエリン形成不全疾患、または神経変性疾患であってもよい。当該神経疾患または障害は、中枢神経系、末梢神経系、またはその両方に影響を与える可能性がある。いくつかの実施形態では、脱髄またはミエリン形成不全疾患は、炎症性脱髄疾患（多発性硬化症、視神経炎、デビック病、急性播種性脳脊髄炎及び横断性脊髄炎など）、ウイルス性脱髄、後天性代謝障害に起因する脱髄、白質ジストロフィー（ペリツェウス・メルツバッハー病及び遺伝性痙性対麻痺などのミエリン形成不全疾患）、プロテオリピド・タンパク質生成のＸ連鎖遺伝病、代謝性脱髄及びリソソーム貯蔵障害（異染性白質ジストロフィー‐ＭＬＤ、テイザックス病、サンドホフ及びクラッベ病など）、白質消失病、ならびに脳室周囲白質軟化症である。ＭＳ、特にＰＰＭＳはまた、本発明の方法によって治療または予防することが可能な状態でもある。好ましい実施形態では、本発明の方法によって生成したＯＰＣまたはオリゴデンドロサイトは、対象の体細胞から生成したｉＰＳＣに由来する。
【００４１】
ｉＰＳＣ技術は、その自家細胞移植の可能性と同時に、新薬を開発し、疾患の病因への見識を得るためのツールとして注目されつつある。Ｈａｎ，Ｓ．Ｓ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ．７０：６２６〜６４４（２０１１年）。本発明の方法及び細胞は、ミエリン化を促進する化合物についてのハイスループット・インビトロスクリーニングの開発を補助することになる。Ｌｅｅ，Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．８：７７１〜７８２（２０１３年）。その目的のため、本発明者らは、ミエリン化を促進する化合物を同定する方法を提供する。該方法は、本発明の方法によりミエリン生成細胞を生成する段階；ミエリン生成細胞を候補化合物と接触させる段階；候補化合物がニューロンのミエリン化を促進するかどうかを判定する段階を含む。一実施形態では、化合物は脱髄またはミエリン形成不全状態などの神経疾患または障害を治療するための候補治療薬であり、該方法には、候補治療薬がニューロンのミエリン化に有益な効果を与えるかどうかを判定することも含まれ、ここではこのような有益な効果は脱髄またはミエリン形成不全疾患もしくは障害を治療するための候補治療薬の指標である。有益な効果は、例えば、ニューロン脱髄の予防、ニューロンの脱髄の減少、ニューロン電導性の増加、及び／またはニューロンのミエリン化の促進であってもよい。好ましくは、該方法はハイスループット形式で行われる。
【００４２】
本発明の細胞、システム、及び方法は、神経疾患を研究するためにも有用である可能性がある。特に、本明細書で説明したＰＰＭＳ ｉＰＳＣ株は、特にＭＳにおける神経変性の過程を研究するための新たな情報源を提供する（図１６）。
【００４３】
本明細書及び添付の請求項で使用しているように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「１つの（ｔｈｅ）」は、その文脈が特段に明示していない限り複数の指示対照を包含する。用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）ならびに用語「１つまたは複数」及び「少なくとも１つ」は同じ意味で使用し得る。
【００４４】
更に、「及び／または」は、他のものが存在しても存在しなくても２種の特定の特長または各構成要素の特定の開示であると解するべきである。従って、「Ａ及び／またはＢ」などの文言で使用しているような用語「及び／または」は、Ａ及びＢ、ＡまたはＢ、Ａ（のみ）、ならびにＢ（のみ）を包含するように意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」などの文言で使用されているような用語「及び／または」は、Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；Ｃ（のみ）を包含するように意図されている。
【００４５】
特段に規定していない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第５版.  Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ編集、２０１３年），ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版．Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋら編集、２００８年），及びＴｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐ‐Ｓ．Ｊｕｏ，（第２版．２００２年）は本明細書で使用されるいくつかの用語の一般的な定義を当業者に提供することができる。
【００４６】
単位、接頭辞及び記号は、その国際単位系（ＳＩ）に承認された形式で表示されている。数値範囲は範囲を規定する数値を包含する。本明細書で提供される見出しは、本発明の多様な態様または実施形態を限定するものではなく、全体として明細書を参照することにより包含され得る。従って、下記に定義される用語はその全体が明細書を参照することによって、より完全に定義される。
【００４７】
いかなる状況で実施形態が語句「含む」で説明されていても、「からなる」及び／または「から本質的になる」の用語で記載された他の類似の実施形態も包含される。
【００４８】
「対象」、「個体」または「患者」が意味するものは、診断、予後診断または治療が必要な対象、特に哺乳動物対象であればどのような対象も含まれる。哺乳動物対象としては、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ブタ等を含むヒト、飼育動物、家畜、競争用動物及び動物園の動物が挙げられる。
【００４９】
「治療する」または「治療」または「治療すること」または「緩和する」または「緩和すること」などの用語は、診断された病理学的状態または障害の症状を治癒、鈍化、緩和し、かつ／あるいはその進行を停止させる治療措置を指す。従って治療を必要とする対象には、既に障害を有する対象も含まれる。特定の実施形態では、例えば疾患または障害に関連する症状の全体的、部分的または一時的緩和または消失が患者に見られた場合、対象は、本明細書に提供された方法に従って神経疾患または障害、特に脱髄またはミエリン形成不全疾患もしくは障害に対して良好に「治療された」ことになる。
【００５０】
「予防する」または「予防」は、標的とする病理学的状態または障害の発症を予防及び／または遅延させる予防（prophylactic or preventative）措置を指す。従って、予防が必要な対象には、該疾患または障害に罹患または感染しやすい対象も含まれる。特定の実施形態では、本発明の方法に供しなかった患者と比較して、例えば軽微であるか軽度である疾患もしくは障害に関連する症状を患者が過渡的または持続的に示すか、あるいは疾患または障害に関連する症状の開始が遅かった場合、疾患または障害、特に脱髄またはミエリン形成不全疾患もしくは障害は、本明細書で提供された方法に従って良好に予防されたことになる。
【００５１】
本発明は更に、以下の非限定的な実施例に説明されている。
【実施例】
【００５２】
実施例１．ｈＥＳＣ株からのオリゴデンドロサイトの分化
ＯＬＩＧ２‐ＧＦＰノックインｈＥＳＣレポーター株（Ｌｉｕら、２０１１年）を使用し、ライブ蛍光イメージングによりＯＬＩＧ２＋前駆細胞を追跡した。初めに、接着培養においてＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害を利用してＰＡＸ６＋細胞を誘導した。Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：２７５〜８０（２００９年）。次に、胚脊髄環境を模倣するために、様々な時間で様々な濃度のＲＡ及び／またはＳＨＨを使用し、フローサイトメトリーによりＯＬＩＧ２‐ＧＦＰ発現を定量した（図２Ａ）。誘導開始時から１００ｎＭのＲＡを使用したところ、４０．６％のＯＬＩＧ２＋前駆細胞が生成されたが、８日目からＳＨＨを１００ｎｇ／ｍｌ添加したところ、その収率は５７．７％に増加した（図２Ｂ）。興味深いことに、外因性ＳＨＨを含まない細胞は初めの１２日間でＳＨＨのｍＲＮＡの上方制御を示し（図３Ａ）、また、ＳＨＨで処置した細胞と比較して低い効率ではあったが、Ｏ４＋細胞に分化した（図３Ｂ）。
【００５３】
続いて、組換えヒトＳＨＨタンパク質の代わりにＳＡＧを用いたところ、ＯＬＩＧ２＋前駆細胞の収率は更に７０．１％に増加した（図２Ｂ）。１２日目に、細胞を剥離して低接着性プレートに入れ、スフィアへの凝集を促した。スフィアの形成に必要な細胞の最小数は少なくとも１００個であり、本発明者らはスフィア中の大部分を占める細胞がＧＦＰ＋であることに注目した。これをさらに調べるため、本発明者らが１２日目の培養物をＧＦＰに関して選別したところ、ＧＦＰ＋細胞だけが凝集体を形成していることが観察された（図２Ｃ）。このことは、凝集段階だけでＯＬＩＧ２＋集団の濃縮がもたらされたことを示唆している。
【００５４】
次に、第２のｈＥＳＣ株（ＲＵＥＳ１）を分化させてｑＲＴ‐ＰＣＲによりＰＡＸ６、ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２の転写レベルを比較することにより、ＯＬＩＧ２＋前駆細胞の生成までの初期段階を検証した。これらの転写因子の上方制御はＯＬＩＧ２‐ＧＦＰ株の上方制御と類似の経時的パターンに従っており、ＰＡＸ６誘導は７日目前後であり、ＯＬＩＧ２ピークは１３日目前後であり、ＮＫＸ２．２が持続的に高レベルになるのは１０日目以降であった（図２Ｄ）。これらの結果に基づき、遺伝子操作していないＲＵＥＳ１株を使用して、プロトコルの後続段階（ＯＬＩＧ２＋前駆細胞からＭＢＰ＋成熟オリゴデンドロサイトまで）を開発した（図４Ａ）。７日目にＰＡＸ６＋細胞が生じ、それらは１２日目までに多層構造の配置になった（図４Ｂ、４Ｃ）。１２日目〜３０日目に細胞はスフィア状に増殖し、その後、プロトコルの残りの段階のためにポリ‐Ｌ‐オルニチン／ラミニン（ｐＯ／Ｌ）被覆ディッシュに細胞を播種した。
【００５５】
Ｏ４＋段階へと成熟を促進するため、２０日目以降、ＰＤＧＦ‐ＡＡ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１及びＮＴ３を培養培地に添加した。ＯＬＩＧ２＋前駆細胞は、ＮＫＸ２．２が、次にＳＯＸ１０が上方制御されて、最終的に後期ＯＰＣへと成熟し、それはＯ４ライブ染色及び高度分枝プロセスによって同定された（図４Ｄ〜４Ｇ）。ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０及びＮＧ２（図４Ｈ〜４Ｊ）を発現するＯ４＋ＯＰＣは、５０日目という早期に出現し、その数は７５日目前後に劇的に増加した。Ｋｉ６７染色によって示されているように、分化中、前駆細胞の４０〜５０％が増殖性であった。しかし、高度に分枝状になったＯ４＋細胞はインビトロで分裂しなかった（図５Ａ〜５Ｃ）。また、少なくとも２週間、培地から増殖因子を除いた後、３４±４％のＯ４＋ＯＰＣがＭＢＰ＋成熟オリゴデンドロサイトに分化した（図４Ｋ〜４Ｌ、図５Ｄ）。これらの培養物はまた、他の細胞型、すなわち、それぞれ全細胞の１５±２％のＧＦＡＰ＋アストロサイト及び２０±２％のＭＡＰ２＋ニューロンからも構成されていた（図４Ｍ、図５Ｅ）。
【００５６】
本発明者らはまた、培養からわずか５５日後に約３０％のＯ４＋細胞を生成する代替戦略を利用して、分化にかかる期間とコストを大幅に削減した。３０日目という早期に培地からマイトジェンＰＤＧＦ、ＮＴ３、ＩＧＦ‐１及びＨＧＦを除いて、選択したスフィアを播種した。この結果、５５日目にＯ４＋細胞が出現した。培養を継続し、Ｏ４＋細胞の出現率を、長期プロトコルに匹敵するレベルまで増加させた（図６）。
【００５７】
表１に示すように、Ｏ４収率は９種の異なるＰＳＣ株で２８％〜８０％になり、平均は４株で６０％を上回っていた。細胞をＯ４抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。１種のｈＥＳＣ株（ＲＵＥＳ１）及び８種のｈｉＰＳＣ株を試験した。各株の種々のバッチを種々の継代で用いて技術的反復を実施した。結果は平均割合±ＳＥＭとしても表している。
【００５８】
（表１）分化から約７５日後のＯ４＋ＯＰＣの割合
2017524340.tif 000003
Ｎ＝技術的反復数
【００５９】
両戦略では、マイトジェンを除くことによって、ＭＢＰを発現するオリゴデンドロサイトへのＯＰＣの最終分化が促進されるが、これらの培養条件下ではＭＢＰ＋細胞は軸索線維に整列しない（図７Ｇ、７Ｈ）。ミエリン化の研究では、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によりＯ４＋ＯＰＣを精製し、インビボで移植することができる。Ｏ４＋細胞は、選別の直後に凍結保存し、移植の２４〜４８時間前に解凍することもできる。
【００６０】
上述のとおり、プロトコルの様々な段階で、ｑＲＴ‐ＰＣＲまたは免疫蛍光法により、適当なマーカーの発現について培養物を確認した。ＰＡＸ６（図７Ａ）については８日目、ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２については１２日目（図７Ｃ）に、培養物の免疫蛍光分析を行うと、その出現率はＰＡＸ６＋細胞では９０％、ＯＬＩＧ２＋細胞では７０％、及びＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋細胞では３０％である可能性が高い。４０〜５０日目までに、ＳＯＸ１０が発現してＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２と共局在化する可能性が高い（図７Ｅ）。５０〜７５日目に、ライブＯ４染色を行い、Ｏ４＋細胞の出現及びその増殖を検出することができる（図６Ａ〜６Ｆ、図７Ｆ）。ヒトの発生では、ＯＰＣは、ＰＤＧＦＲα及びＮＧ２の発現と、その後のＯ４の発現が特長的である。Ｊａｋｏｖｃｅｖｓｋｉ，Ｉ．ら、Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．３：５（２００９年）。本発明者らの培養条件下では、７５日目までに、ほとんどのＯ４＋細胞がＰＤＧＦＲαを失ったが、ＮＧ２発現は維持していた。この段階では、培養物中に多能性細胞の残留は観察されなかった。
【００６１】
最終的に、Ｏ４＋細胞は、ＦＡＣＳを介して単離されるか、またはＭＢＰ＋オリゴデンドロサイトへと更に分化することができる（図７Ｇ、７Ｈ）。割合は低いが他の細胞型も７５日目の培養物中に存在する。全体として、全細胞集団に対して約１５％のＧＦＡＰ＋細胞及び約２０％のβＩＩＩ‐チューブリン＋細胞が見られる（図７Ｈ）。最終分化段階後、グリア培地中で２週間培養すると、Ｏ４＋細胞の約３５％はＭＢＰも発現する可能性が高い。
【００６２】
実施例２．ＰＰＭＳ‐ｉＰＳＣ株からのオリゴデンドロサイトの分化
本発明者らのプロトコルがｉＰＳＣ株に適用できることを示すため、４人のＰＰＭＳ患者から皮膚生検を取得した。生検から繊維芽細胞の培養物を樹立し、最も不応性の株のリプログラミング効率を改善するためにｍｉＲＮＡのクラスターと共に修飾ｍＲＮＡカクテル（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．７：６１８〜３０（２０１０年））を毎日トランスフェクションしてｉＰＳＣを生成した（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）。リプログラミングの１２日目〜１５日目に、ＴＲＡ‐１‐６０＋コロニー（図８Ａ）をライブ染色で同定し、選択し、増殖させ、多能性マーカーの免疫蛍光法により特徴付けした（図８Ｂ）。
【００６３】
７種の多能性遺伝子の発現プロファイリングにより、全４種のｉＰＳＣ株が参照ｈＥＳＣ株と同等で親繊維芽細胞とは異なるプロファイルを示すことが確認された（図８Ｃ）。全てのｉＰＳＣ株が正常な核型（図８Ｄ）を示し、（胚様体の自発的分化により）インビトロ（図８Ｅ）及び（テラトーマアッセイにより）インビボ（図８Ｆ；図９）の両方で３つの胚葉の細胞型へ分化することができた。
【００６４】
次に、プロトコルが本発明者らのＰＰＭＳ‐ｉＰＳＣ株で再現可能であるか否かを評価した。試験した全てのｉＰＳＣ株がＲＵＥＳ１株と同様に機能することが分かった（図１０Ａ〜１０Ｉ）。選別Ｏ４＋ＯＰＣ出現率で計算したところ、ＲＵＥＳ１からのＯ４＋細胞は最大７０％、ＰＰＭＳのｉＰＳＣ株からは４３．６％〜６２．１％であり、当該プロトコルは非常に再現可能でありかつ高効率であった。また、本発明者らは、Ｏ４＋画分にはＰＤＧＦＲαとの二重陽性を示す細胞の亜集団が含まれていることを見出した（図１０Ｊ）。Ｏ４＋細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により容易に精製し、その形態を喪失することなく凍結し、解凍することができた（図１１Ｄ）。
【００６５】
実施例３．ＰＰＭＳ由来後期ＯＰＣによるマウス脳軸索ミエリン化
本発明者らのプロトコルにより得たＯＰＣが機能的にミエリンを形成し得ることを検証するため、７５日目のＦＡＣＳ精製Ｏ４＋細胞（１０５細胞／匹）を免疫無防備状態のシバラーマウス新生仔の前脳に注射した（図１１Ａ）。フローサイトメトリーによる多能性マーカーＳＳＥＡ４及びＴＲＡ‐１‐６０の分析により示されるとおり、注入した細胞にはｉＰＳＣの混入はなかった（図１１Ｂ）。しかし、臨床試験に移行できる可能性を維持するため、インビボでの移植前に該培養物を精製した。細胞を凍結し、解凍し、移植の２４〜４８時間前に元の状態にした（図１１Ｃ）。ヒトｈＮＡ＋細胞が検体脳梁及び前脳白質全体に分布した時点の１２〜１６週目に動物を屠殺した。１２週目の検体脳梁内のｈＮＡ＋細胞の密度は３４，４００±３，０９０細胞／ｍｍ３であり、ヒト細胞数は１６週目までに１２週目のおよそ２倍になった。細胞クラスターの存在または明確な腫瘍形成は観察されず、生着したｈＮＡ＋細胞の増殖画分は１２週目で１７％であり、１６週目にはＫｉ６７＋はわずか８％まで減少し、このとき細胞の５％だけがＰＣＮＡ＋であった。重要なのは、検体脳梁中８０％を超えるｈＮＡ＋細胞がＯＬＩＧ２タンパク質を共発現したことであり、このことは生着細胞がオリゴデンドロサイト系列に限定されることを示唆していた（図１２Ｅ）。更に、１２及び１６週目に、ヒトＭＢＰ＋オリゴデンドロサイトは生着した検体脳梁全体に散見された（図１２Ａ）。１６週目に、生着したマウス検体脳梁内で３１±３％の宿主マウス軸索が被鞘されていた（図１２Ｂ）。
【００６６】
１６週齢の検体脳梁の透過型電子顕微鏡検査により、周期線と周期間線が交互に存在する成熟コンパクトミエリンが見られた（図１２Ｃ、１２Ｄ）；一方、注入していないシバラー／ｒａｇ２マウスのミエリンは薄く、被覆は緩かった。同様に、ｇ比（g-ratio）の測定によって評価されたように、いくつかの脳梁軸索においてミエリン被鞘の厚さは正常ミエリンの回復を反映していた。
【００６７】
１２週目では、検体脳梁において移植ｈＮＡ＋細胞はＮＧ２＋ＯＰＣのままであり（図１２Ｅ）、１６週までには表層大脳皮質に移行し始めた（図１２Ｆ）。ごく少数のＯ４選別細胞はｈＧＦＡＰ＋アストロサイトとして分化したが、ｈＧＦＡＰ＋細胞の大部分はＳＶＺや脳室周囲に局在しており（図１２Ｇ）、これらの領域では局所環境によりアストロサイト分化が誘導される可能性が示唆された。同様に、ｈＮＥＳＴＩＮ発現細胞は、検体脳梁ではほとんど見られなかったがＳＶＺでは高濃度であった。生着した動物のいずれにおいてもβＩＩＩチューブリン＋ニューロンが検出されなかったことは重要である。まとめると、本発明者らのデータから、ＰＰＭＳ由来のＯ４選別細胞は、インビボで成熟オリゴデンドロサイトに分化し、脳内で正常ミエリンに類似した高密度のコンパクトミエリンを形成できることが明らかになった。
【００６８】
実施例４．実施例１〜３の詳細な実験手順
細胞株
３種のｈＥＳＣ株及び４種のｈｉＰＳＣ株を使用した。ＲＵＥＳ１及びＨＵＥＳ４５は両方ともＮＩＨで承認されたｈＥＳＣ株であり；ＯＬＩＧ２‐ＧＦＰレポーター株はＢＧ０１のｈＥＳＣ株（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、ヒューストン）に由来する。４種のｉＰＳＣ株は、本発明者らの研究所において、ｍＲＮＡ/ｍｉＲＮＡ法（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）によりＰＰＭＳ患者の皮膚生検から誘導された。
【００６９】
ｈＰＳＣ培養条件
ＨＵＥＳＭ（ＨＵｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）層上でｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株を培養し増殖させた。オリゴデンドロサイト分化の場合は、細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングしたディッシュ上でのｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）での培養に移した。ＨＵＥＳＭは、ノックアウト‐ＤＭＥＭ、２０％ノックアウト血清、２ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、０．１ｍＭの１ＸＰ／Ｓ及びβ‐メルカプトエタノールから構成され、これらは全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（グランドアイランド、ニューヨーク州）から購入した。全段階で分化細胞は５％ＣＯ２インキュベーター中で培養する。
【００７０】
詳細な分化プロトコル
１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ‐２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社；ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を含むｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）中、１０×１０３細胞／ｃｍ２の密度でＰＳＣをＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；サンノゼ、カリフォルニア州）上に播種し、２４時間、平板培養した。播種したｈＰＳＣのこの密度は、分化の８日目までに十分にコンフルエントになるように、また分化の１２日目に多層構造になるように最適化したものである。この構成には、６ウェルプレートのうち１ウェル（８０％コンフルエント）だけで、少なくとも２×１０６個のオリゴデンドロサイトを分化及び単離するのに十分な細胞を含んでいるため、大幅なＰＳＣ増殖は必要ない。ｈＰＳＣコロニーが直径１００〜２５０μｍに達するまで細胞を１〜２日間インキュベートした。
【００７１】
分化誘導の当日（０日目）に、小分子として１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）及び２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、ならびに１００ｎＭのａｌｌ‐ｔｒａｎｓ‐ＲＡ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社；セントルイス、ミズーリ州）を含むｍＴｅＳＲ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）であるＮｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍに培地を変更した。ｍＴｅＳＲ  Ｃｕｓｔｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍは、市販のｍＴｅＳＲ‐１培地と同じ組成ではあるが、多能性を維持する５つの要素、すなわち塩化リチウム、ＧＡＢＡ、ピペコリン酸、ｂＦＧＦ、及びＴＧＦβ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）は含んでいない。ｍＴｅＳＲ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｍｅｄｉｕｍの代わりに、約２５μｇ／ｍｌのインスリンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用することができた。新鮮なＲＡ、ＳＢ４３１５４２、及びＬＤＮ１９３１８９を培地に毎日添加して、培地の交換を８日目まで毎日行った。
【００７２】
８日目までに細胞はコンフルエントになり、ＰＡＸ６発現がピークになる可能性が高い（図７Ａ）。８日目に培地を、１００ｎＭのＲＡ、１μＭのＳＡＧ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；ビルリカ、マサチューセッツ州）または１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＨＨ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；ミネアポリス、ミネソタ州）を含むＮ２培地に変更し、毎日新鮮なＲＡ及びＳＡＧを培地に添加して毎日交換した。
【００７３】
１２日目までにオーバーコンフルエントな細胞が積み重なり、三次元構造が明確に視認可能になった（図７Ｂ）；これは分化を進める前の重要なチェックポイントである。細胞はＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２を発現した（図７Ｃ）。１２日目に、機械的または酵素的に接着細胞を剥離してスフィアを形成させた。スフィアの形成により、ＯＬＩＧ２＋前駆細胞が濃縮された。ＯＬＩＧ２＋細胞だけが凝集してスフィアになったが、ＯＬＩＧ２−細胞は単一細胞のままであった。単層の機械的分散を利用した場合に最大数のＯ４＋細胞のスフィアが最終的に得られた。単層の酵素的分散を利用した場合は、より均一なスフィアが少数得られた。機械的剥離では、栄養素が凝集体内の全細胞に到達できるように、セルリフターを使用して細胞を剥離し、細胞の単層を破壊して小さな塊にした。接着したままの細胞を確実に残さないように、ウェルを顕微鏡下で検査した。酵素消化に関しては、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（１ｍｌ／２ｍｌＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）をウェルに添加し、培養物を単一細胞懸濁液に分離した。
【００７４】
１μＭのＳＡＧを含むＮ２Ｂ２７培地の超低接着プレートに凝集体を再播種し、１日おきにその培地を交換した。２０日目に、培地をＰＤＧＦ培地に変更し、２／３の培地の交換を１日おきに行った。培地交換中、穏やかにピペッティングを行い、互いに付着していた凝集体を全てばらばらにした。３０日目、ポリ‐Ｌ‐オルニチン臭化水素酸塩（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ‐Ａｒｄｒｉｃｈ社）及びラミニン（２０μｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でコーティングしたプレートに、スフィア２個／ｃｍ２（６ウェルプレートの１ウェル当り約２０個のスフィア）の密度でスフィアを播種した。この密度は、細胞がスフィアの外に移動して増殖し、継代を必要とせずにプロトコルの最後までにディッシュ全体に広がることができるように最適化されたものである。ｐ２００ピペットを用いて、丸形で、金色／茶色で、中心は濃く、直径は３００〜８００μｍである凝集体を選択した（図７Ｄ）。完全に透明なスフィアは、オリゴデンドロサイトに分化しないため避けた。
【００７５】
この段階では、プレートに播種したスフィアをマイトジェン含有培地（選択肢Ａ）またはマイトジェンを全く含まない培地（選択肢Ｂ）で培養した。選択肢Ａは、Ｏ４＋細胞の最高収率を得るために最適化されたものであり、選択肢Ｂは、より短期間で低コストの形式のプロトコルを提供するように開発されたものである。
【００７６】
選択肢Ａ
３０日目に、スフィアを上述のようにＰＤＧＦ培地中、ｐＯ／Ｌプレートに播種し、分化の７５日目まで１日おきにＰＤＧＦ培地の２／３を交換した。５５日目以降に、ライブＯ４染色によりＯ４＋細胞の出現を評価した（図６）。７５日目に、ＦＡＣＳによってＯ４＋ＯＰＣを単離することができた（図７Ｉ）。あるいは、最終オリゴデンドロサイト分化（図７Ｇ、７Ｈ）では、７５日目から細胞をグリア培地中で培養し、３日おきに２週間、培地の２／３を交換した。
【００７７】
選択肢Ｂ
３０日目に、スフィアを上述のようにグリア培地中、ｐＯ／Ｌプレートに播種し、分化の５５日目まで１日おきにグリア培地の２／３を交換した。５５日目に、ライブＯ４染色によりＯ４＋細胞が視認可能になり（図６Ａ〜Ｆ、図７Ｆ）、またはＦＡＣＳにより該細胞を単離した（図６Ｇ）。７５日目に、ＦＡＣＳによりＯ４＋ＯＰＣを単離することができた。あるいは、７５日目までグリア培地中で培養物を維持し、Ｏ４＋細胞の収率を高めた（図６）。約６０日目にＭＢＰ＋細胞が出現し始めたことが観察された。
【００７８】
選択肢Ａ及び選択肢Ｂの両プロトコルでは、分化の３０日目の凝集体及び終了時の細胞を生存率＞７０％で凍結保存できた。凝集体の生存率は、解凍後、ｐＯ／Ｌでコーティングしたディッシュに再接着する解凍スフィアの数に基づく。選別したＯ４＋細胞は選別の直後に凍結できた。選別したＯ４＋細胞の予測解凍後生存率は７０〜８０％である。
【００７９】
表２は、プロトコルに使用した培地組成のリストを提供する。
【００８０】
（表２）培養培地の詳細な組成
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【００８１】
パンチ生検からの皮膚繊維芽細胞の誘導
皮膚生検をＭＳ患者及び健常者から得た（図１３）。Ｔｉｓｃｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの４人の匿名患者が、標準的な診断基準に従ってＰＰＭＳと診断された。施設内倫理委員会の承認（ＢＲＡＮＹ）及びインフォームドコンセントの下に当該患者らの生検を得た。患者は全て白人である。患者１０２及び１０７は男性で、それぞれ５６歳及び６１歳であり；患者１０４及び１０９は女性で、それぞれ６２歳及び５０歳である。
【００８２】
３ｍｍの皮膚生検をＲＰＭＩ１４６０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び１×のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ‐Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）から構成される生検回収培地に回収した。生検をスライスして小片（＜１ｍｍ）にし、ＴＣ処理した３５ｍｍディッシュに５分間置いて乾燥させ、最後に、ノックアウトＤＭＥＭ、２ｍＭのＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、０．１ｍＭのβ‐メルカプトエタノール、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１×のペニシリン‐ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及び１％ヌクレオシド（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）から構成された生検平板培養培地中で５日間、または最初の繊維芽細胞が生検から増殖するまでインキュベートした。あるいは、１０００Ｕ／ｍｌのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ１Ａ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）で生検を３７℃で１．５時間消化し、洗浄し、回収し、生検平板培養培地中、１％ゼラチンでコーティングされた３５ｍｍディッシュで５日間平板培養した。その後、線維芽細胞を、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２ｍＭのＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、０．１ｍＭのβ‐メルカプトエタノール、１０％ＦＢＳ及び１×のＰ／Ｓから構成された培養培地中で増殖させ、１日おきに培地を交換した。
【００８３】
皮膚繊維芽細胞のリプログラミング
継代３〜５代目の皮膚繊維芽細胞をＳｔｅｍｇｅｎｔ社のｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡキットを使用してリプログラミングし、これによりＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ及びＬＩＮ２８の修飾ＲＮＡを介して、遺伝子挿入がないウイルスフリーのヒトｉＰＳＣが生成された（図１４）。特定のｍｉＲＮＡクラスターの添加によってリプログラミング効率が高まることが分かっている（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）。すなわち、線維芽細胞を、培養培地中５．５×１０３細胞／ｃｍ２の密度で、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ウェルまたは１２ウェルプレート上に播種した。翌日、培地を、Ｂ１８Ｒを含有するＮｕＦＦ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｐｌｕｒｉｔｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍと交換した。細胞は、ＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）を用いて、０日目はｍｉＲＮＡのみ、１日目〜３日目はｍＲＮＡカクテルのみ、４日目はｍＲＮＡを加えたｍｉＲＮＡカクテル、５日目〜１１日目はｍＲＮＡカクテルのみを用いて連続１１日間トランスフェクションされた。１１日目の後、ライブＴＲＡ‐１‐６０のために陽性染色された視認可能コロニーを選択し、ＨＵＥＳＭ培地を用いてＭＥＦ上に再播種した。
【００８４】
テラトーマアッセイ
実験はＣｏｌｕｍｂｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に承認されたプロトコルに従って行った。
【００８５】
ｉＰＳＣコロニーをＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて３７℃で１５分間かけて分離し、洗浄し、回収し、２００μｌのＨＵＥＳＭに再懸濁した。その後、細胞を氷上で２００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と混合し、免疫不全マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；バーハーバー、メイン州）に皮下注射した。テラトーマを９〜１２週間かけて増殖させ、切開により単離し、４％ＰＦＡ中、４℃で一晩固定した。固定した組織をパラフィンに包埋し、厚さ１０μｍの切片にし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００８６】
インビトロでの自発的分化
ｉＰＳＣをＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で３７℃、５分間かけて分離し、ｂＦＧＦを含まないＨＵＥＳＭ中、超低接着６ウェルプレートに播種し、一日おきに培地を交換した。培養から３週間後、胚様体（ＥＢ）を１％ゼラチンでコーティングしたＴＣ処理ディッシュ上で更に２週間平板培養した。ＥＢ及びそれらの派生物を４％ＰＦＡ中、ＲＴで８分間固定し、適当なマーカーで免疫染色した。
【００８７】
ＲＮＡ単離及びｑＲＴ‐ＰＣＲ
ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社; ヒルデン、ドイツ）を含むＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用してＲＮＡ単離を行った。すなわち、細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液に再懸濁した。その後、メーカーの使用説明書に従って更に処理するまで、試料を−８０℃で保存した。ＲＮＡを３０μｌのＲＮＡ分解酵素フリーｄｄＨ２Ｏ中に溶出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社;サマセット、ニュージャージー州）で定量した。
【００８８】
ｑＲＴ‐ＰＣＲでは、０．５μｇのＲＮＡ及びランダムプライマーを含むＧｏＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社；マジソン、ウィスコンシン州）を用いてｃＤＮＡを合成した。その後、２０ｎｇのｃＤＮＡを、１０μｌのＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及び１μｌの各プライマー（１０ｎＭ）を含む２０μｌの反応液と共に９６ウェル反応プレートにロードし、プレートをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００Ｐ  ｑＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社; サンタクララ、カリフォルニア州）中でＰＣＲに供した。表３はプライマー配列のリストである。
【００８９】
（表３）ｑＲＴ‐ＰＣＲに使用するプライマーの配列
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【００９０】
多能性に関するＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ解析
上述したように、未分化ｉＰＳＣ及びｈＥＳＣ  ＨＵＥＳ４５からＲＮＡを単離した。メーカーの使用説明書に従って、特定のＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｃｏｄｅ  Ｓｅｔ及びＣａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；シアトル、ワシントン州）を用いてハイブリダイゼーション用のＲＮＡ（１００ｎｇ／試料）をロードした。データは、以下のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＰＯＬＲ２Ａ、ＡＬＡＳ１に対して正規化した。データは、ｈＥＳＣ株（ＨＵＥＳ４５＝１）の発現に対する変化倍率として表した。図１５を参照されたい。
【００９１】
核型分析
正常な核型を確認するため、全ｉＰＳＣ株をＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによる細胞遺伝学的分析に供した。
【００９２】
免疫染色及び画像処理
細胞を、ＰＢＳ‐Ｔ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００を含むＰＢＳ）中で１０分間かけて３回洗浄し、ブロッキング血清（５％ヤギまたはロバ血清を含むＰＢＳ‐Ｔ）中で２時間インキュベートし、一次抗体を添加して４℃で一晩置いた（表４）。翌日、細胞をＰＢＳ‐Ｔ中で１５分間かけて３回洗浄し、室温（ＲＴ）で二次抗体と共に２時間インキュベートし、ＰＢＳ‐Ｔ中で１０分間かけて３回洗浄し、室温で１５分間ＤＡＰＩにより対比染色し、ＰＢＳで２回洗浄した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ二次抗体、ヤギまたはロバの抗マウス、ラット、ウサギ、ヤギ及びニワトリ４８８、５５５、５６８及び６４７を１：５００希釈して使用した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。
【００９３】
Ｏｌｙｍｐｕｓ社の蛍光用ＤＰ３０ＢＷ白黒デジタルカメラ及びＨ＆Ｅ染色用ＤＰ７２デジタルカラーカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ社のＩＸ７１倒立顕微鏡を用いて画像を取得した。Ｏｌｙｍｐｕｓ社のソフトウェアＤＰ  ＭａｎａｇｅｒまたはＩｍａｇｅＪを用いてデジタル処理で蛍光色を適用した。計数するために、少なくとも３つの重複していない領域をＩｍａｇｅＪに取り込ませ、閾値決定し、手動でスコアを付けた。
【００９４】
フローサイトメトリー
３７℃、２５分間のＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）処理により細胞を酵素的に回収し、単一細胞懸濁液を得た。次いで、適当な量の一次抗体または蛍光結合抗体のいずれかを含有する培地それぞれ１００μｌに細胞を再懸濁し、遮光して氷上で３０分間インキュベートした。二次抗体を使用する場合、一次抗体はＰＢＳで洗浄し、二次抗体は氷上に３０分間置いた。染色された細胞、またはＧＦＰを発現する細胞をＰＢＳで洗浄し、２０ｐｓｉの１００μｍのセラミックノズルを使用した５レーザーのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＡＲＩＡ‐ＩＩｕ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒで即時に選別した。死細胞を排除するためにＤＡＰＩを使用した。ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを分析した。
【００９５】
シバラー（ｓｈｉ／ｓｈｉ）×Ｒａｇ２−／−マウスへの移植
シバラー／ｒａｇ２マウス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ；Ｗｉｎｄｒｅｍ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２：５５３〜５６５（２００８年））を用いた全実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｔ  Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に承認されたプロトコルに従って行った。事前に凍結保存されていたＦＡＣＳ選別Ｏ４＋ＯＰＣを解凍し、ＰＤＧＦ培地中、ｐＯ／Ｌディッシュ上で平板培養することにより手術前の１〜２日間で回復させた。１μｌ当り１×１０５個で細胞を再懸濁することにより、細胞を注射用に調製した。
【００９６】
既述のとおりに注射を行った。Ｓｉｍ，Ｆ．Ｊ．ら（２０１１年）。仔動物を低体温法で麻酔し、５×１０４個の細胞を出生後２〜３日の仔動物の検体脳梁に、各部位両側に１．１ｍｍの深さで注射した。細胞はプルドガラスピペットにより注入し、仮定標的部位に頭蓋骨から直接挿入した。１２〜１６週目に動物を屠殺し、生理食塩水で灌流し、続いて４％パラホルムアルデヒドで灌流した。マウス前脳の凍結保存された冠状切片（１６μｍ）を切断し、１６０μｍごとに採取した。Ｓｉｍ，Ｆ．Ｊ．ら（２０１１年）。ヒト細胞をマウス抗ヒト核（ｈＮＡ）で同定し、ミエリン塩基性タンパク質発現オリゴデンドロサイトをＭＢＰで標識した。ヒトアストロサイト及びＯＰＣは、それぞれｈＧＦＡＰ及びｈＮＧ２に対するヒト特異的抗体で染色した。マウス神経フィラメント（ＮＦ）をＳＭＩ３１１及びＳＭＩ３１２の１：１混合物で染色した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ二次抗体、ヤギ抗マウス４８８、５９４及び６４７を１：５００に希釈して使用した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。透過型電子顕微鏡検査のため、組織を上述のように処理した。Ｓｉｍ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：６６９〜６８２（２００２年）。表４は使用する一次抗体のリストである。
【００９７】
（表４）一次抗体
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【００９８】
参考文献
本開示の他の項で引用された文献に加えて、以下の参考文献により更なる状況が提供され得る。本開示に引用された参考文献は全て、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。更に、本明細書に引用または言及されているあらゆる製品のメーカーの使用説明書またはカタログが、参照により取り込まれる。参照により本文書に取り込まれた文献またはその中のあらゆる教示を、本発明の実施において使用することができる。参照により本文書に取り込まれた文献は、先行技術であると認めたものではない。
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【００９９】
特定の実施形態の上述の説明は本発明の全体的な特性を完全に明らかにし、そうすることにより、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、多様な用途のために当業者がこのような特定の実施形態を容易に改変及び／または適合させる範囲内にある知識を、他者が不必要な実験をすることなく適用することが可能になる。従って、そのような適合及び改変は、本明細書に提示された教示及び指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味及び範囲内にあるように意図されている。本明細書の用語または表現が上記教示及び指針を鑑みて当業者によって解釈されるように本明細書の表現または用語は説明する目的であり、限定する目的ではないことは理解されているものとする。本発明は、以下の特許請求の範囲によってさらに説明される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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