(57)【要約】本明細書では、免疫原性ポリペプチドおよびそれを含む組み換え型リステリア菌株に融合された腫瘍抗原をコードする組み換え型核酸、それを調製する方法、および免疫応答を誘発する方法、およびその投与を含む、ガンまたは腫瘍を治療、阻害、または抑制する方法が開示されている。一実施形態では、組み換え型ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸分子が本明細書に開示されており、前記組み換え型ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原を含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え型ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸分子であって、前記組み換え型ポリペプチドが、Ｎ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原を含み、前記異種抗原がサバイビンであり、前記核酸がさらに、第１のプロモーター配列に動作可能にリンクされたグラム陰性複製起点配列と、グラム陽性複製起点配列と、第２のプロモーター配列に動作可能にリンクされた代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームとを含む、組み換え型核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子がＤＮＡプラスミドである、請求項1に記載の組み換え型核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子が配列番号：４１を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組み換え型核酸分子。
【請求項４】
前記グラム陰性複製起点配列がｐ１５配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み換え型核酸分子。
【請求項５】
前記グラム陽性複製起点配列がＲｅｐ  Ｒ配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換え型核酸分子。
【請求項６】
前記第１のプロモーター配列がｈｌｙプロモーター配列である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み換え型核酸分子。
【請求項７】
前記代謝酵素がＤ−アラニンラセマーゼ酵素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組み換え型核酸分子。
【請求項８】
前記第２のプロモーター配列がｐ６０プロモーター配列である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み換え型核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、組み換え型リステリア。
【請求項１０】
前記リステリアが前記内因性ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子での突然変異を含む、請求項９に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１１】
前記リステリアが前記内因性ａｃｔＡ遺伝子での突然変異を含む、請求項８〜１０に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１２】
前記突然変異が欠失または不活性化である、請求項８〜１１に記載の組み換え型リステリア。
【請求項１３】
前記組み換え型リステリア株が前記ファゴリソソームを逃れる能力を持つ、請求項９〜１２に記載の組み換え型リステリア株。
【請求項１４】
前記ｄａｌ／ｄａｔ突然変異が、前記核酸分子によりコードされる前記代謝酵素によって補完される、請求項９〜１３に記載の組み換え型リステリア株。
【請求項１５】
前記組み換え型リステリア株が動物宿主を通して継代されてきた、請求項９〜１４に記載の組み換え型リステリア株。
【請求項１６】
前記組み換え型リステリア株が組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である、請求項９〜１５に記載の組み換え型リステリア株。
【請求項１７】
請求項９〜１６に記載の前記組み換え型リステリア株と、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはその組合せとを含む、免疫原性組成物。
【請求項１８】
被験者における抗サバイビン免疫応答を誘発する方法であって、前記方法が、請求項９〜１６に記載の組み換え型リステリア、または請求項１７に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記組み換え型リステリア株または前記免疫原性組成物が経口または静脈内で投与される、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項９〜１６に記載の組み換え型リステリア、または前記請求項１５に記載の免疫原性組成物の投与を含む、被験者における腫瘍またはガンを治療、抑制、または阻害する方法。
【請求項２１】
前記腫瘍またはガンが、乳房の腫瘍またはガン、卵巣の腫瘍またはガン、脳の腫瘍またはガン、肺の腫瘍またはガン、胃腸の腫瘍またはガン、肉腫、膵臓の腫瘍またはガン、リンパ腫またはその組合せである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記組み換え型リステリアまたは前記免疫原性組成物またはその代替形態のブースター投与量を投与する手順をさらに含む、請求項２０〜２１の方法。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物の前記代替形態が、Ｎ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、もしくはＰＥＳＴペプチドに融合されたサバイビン抗原か、Ｎ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、もしくはＰＥＳＴペプチドに融合された前記抗原を含む組み換え型ポリペプチドか、または前記組み換え型ポリペプチドをコードするウイルスベクターを含む、組み換え型ポリペプチドをコードするＤＮＡワクチンである、請求項２２の方法。
【請求項２４】
被験者における抗サバイビン免疫応答を誘発するための、または被験者におけるサバイビンを発現するガンの治療、抑制、または阻害のための、または被験者におけるサバイビンを発現する腫瘍の治療、抑制、または阻害のための、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の組み換え型リステリアまたは免疫原性組成物の使用。
【請求項２５】
前記リステリアまたは前記免疫原性組成物が経口または静脈内で投与される、請求項２４の使用。
【請求項２６】
前記腫瘍またはガンが、乳房の腫瘍またはガン、卵巣の腫瘍またはガン、脳の腫瘍またはガン、肺の腫瘍またはガン、胃腸の腫瘍またはガン、肉腫、膵臓の腫瘍またはガン、リンパ腫またはその組合せである、請求項２５の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書では、免疫原性ポリペプチドおよびそれを含む組み換え型リステリア菌株に融合された腫瘍抗原をコードする組み換え型核酸、それを調製する方法、および免疫応答を誘発する方法、およびその投与を含む、ガンまたは腫瘍を治療、阻害、または抑制する方法が開示されている。
【背景技術】
【０００２】
多くの前臨床証拠および早期治験データが、免疫系の抗腫瘍の能力が、ガンが確定した患者の治療に利用できることを示唆している。ワクチン戦略は、様々なタイプのガンに関連性のある腫瘍抗原を利用する。腫瘍との関連性のある抗原を発現するウイルスまたは細菌ベクターなどの生ワクチンでの免疫化は、腫瘍に対する強いＣＴＬ応答を誘発するための一つの戦略である。
【０００３】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、主としてリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の孔形成活性によって、マクロファージおよび樹状細胞といった抗原提示細胞の細胞質を直接利用できるグラム陽性の通性細胞内細菌である。ＬＬＯは、細胞による呑食の後にＬｍによって分泌され、ファゴリソソーム膜に孔をあけ、細菌が空胞を逃れて細胞質に入るようになる。ＬＬＯは、免疫系に対してＭＨＣクラスＩ分子を介して非常に効果的に提示される。その上、Ｌｍ由来ペプチドは、ファゴリソソームを介してＭＨＣクラスＩＩ提示を利用することもできる。
【０００４】
アポトーシスタンパク質の阻害剤であるサバイビンは、ほとんどのガンで発現性が高く、化学療法耐性、腫瘍再発の増加、および患者生存期間の短縮との関連性がある。ガンに対して効果的な治療法を見つける継続的必要性がある。例えば、乳ガンや大腸ガン、リンパ腫、白血病、およびメラノーマといった数多くのタイプのガン腫瘍内でのその存在から、サバイビンは抗ガン剤免疫療法のための万能標的抗原としての役割を果たしうる。
【０００５】
本発明は、サバイビン抗原を含む融合タンパク質をコードする組み換え型核酸と、それを含む組み換え型リステリア菌株と、サバイビン発現ガンの治療および予防法でのその使用方法とを提供することにより、上述の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、組み換え型ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸分子が本明細書に開示されており、前記組み換え型ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原を含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【０００７】
関連する態様では、組み換え型ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸分子が本明細書に開示されており、前記組み換え型ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原を含み、ここで前記異種抗原はサバイビンであり、ここで前記核酸はさらに、第１のプロモーター配列に動作可能にリンクされたグラム陰性複製起点配列、グラム陽性複製起点配列、および第２のプロモーター配列に動作可能にリンクされた代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【０００８】
関連する別の態様では、本明細書に開示されている組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株が本明細書で開示されている。
【０００９】
一態様では、組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株の投与を含む、被験者内の抗原に対する免疫応答を誘発する方法が、本明細書に提供されているが、前記核酸分子は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴペプチドを含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【００１０】
関連する態様では、組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株の投与を含む、被験者内のガンを治療、抑制、または阻害する方法が、本明細書に提供されているが、前記核酸分子は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴペプチドを含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【００１１】
別の関連する態様では、組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株の投与を含む、被験者内にある少なくとも１つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法が、本明細書に提供されているが、前記核酸分子は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴペプチドを含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【００１２】
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が明らかとなるので、この詳細な説明および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示としてのみ与えられることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）ｋｌｋ３統合およびＡｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した、それぞれの構築体からの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲでは、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４  ｂｐの帯域が増幅され、野生型タンパク質の分泌シグナル配列が欠失している。
【００１４】
【図２】（A）ｐＡｄｖ１３４プラスミドのマップを示す。（Ｂ）ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清からのタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＬＬＯ−Ｅ７タンパク質が抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより検出された。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモータープロモーター、切断ＬＬＯのためのＯＲＦおよびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）から構成される。（C）ｐＡｄｖ１４２プラスミドのマップである。（Ｄ）抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用してＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示したウエスタンブロットである。
【００１５】
【図３】（Ａ）選択圧のある場合とない場合とで培養した場合の、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビトロでのプラスミド安定性を示す（Ｄ−アラニン）。株および培養条件が先にリストされ、ＣＦＵ決定に使用されたプレートが後でリストされている。（Ｂ）インビボでのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの除去、およびこの間の潜在的なプラスミド損失を評価したものである。細菌は静脈内に注入され、示された時点で脾臓から隔離された。ＣＦＵは、ＢＨＩおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニンの各プレート上で決定された。
【００１６】
【図４】（Ａ）１０８のＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した後での、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでの除去を示す。ＣＦＵの数は、ＢＨＩ／ｓｔｒプレート上でのプレーティングにより決定された。この方法での検出限界は１００  ＣＦＵであった。（Ｂ）１０４０３Ｓ、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＸＦＬ７菌株を用いたＪ７７４細胞の細胞感染アッセイ。
【００１７】
【図５】（Ａ）ブースター投与後６日目における無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＰＳＡ四量体特異的な細胞を示す。（Ｂ）無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色が、ＰＳＡペプチドで５時間にわたり刺激された。異なるエフェクター／標的比での、カスパーゼをベースにしたアッセイ（Ｃ）およびユーロピウムをベースにしたアッセイ（Ｄ）を使用して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスおよび無処置マウスからのインビトロで刺激したエフェクターＴ細胞を含むＰＳＡペプチドでパルスしたＥＬ４細胞の特異的溶解である。ＰＳＡペプチドの存在下またはペプチドなし（Ｅ）で、刺激後２４時間にわたり取得した、無処置および免疫化の脾細胞内のＩＦＮγスポット数。
【００１８】
【図６】ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化が、Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退行を誘発することを示す。マウスは、未処置のまま（ｎ＝８）（Ａ）または７日目、１４日目および２１日目にＬｍｄｄＡ−１４２（１×１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）（Ｃ）で腹腔内で免疫化した。腫瘍のサイズが個別の各腫瘍について測定され、および値はミリメートル単位での平均直径で表現している。それぞれの線は個別のマウスを示す。
【００１９】
【図７】（Ａ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内のＰＳＡ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析を示す。（Ｂ）未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内での、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義されたＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の分析。
【００２０】
【図８】（Ａ）ｋｌｋ３統合およびＡｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子はＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した各構築体からの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲでは、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７６０  ｂｐの帯域が増幅されている。
【００２１】
【図９】（Ａ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を分泌することを示す。細菌培養上清からのタンパク質を沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロットにより検出したＬＬＯおよびＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質。（Ｂ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３により生成されたＬＬＯでは溶血活性が保持された。ヒツジ赤血球が細菌培養上清の段階希釈で培養され、溶血活性が５９０ｎｍでの吸光度により測定された。（Ｃ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がマクロファージ様のＪ７７４細胞内部で成長した。Ｊ７７４細胞が、ゲンタマイシン治療によって細胞外細菌を殺した後１時間にわたり、細菌と共に培養された。表示した時点で獲得したＪ７７４溶菌液の段階希釈のプレーティングにより、細胞内増殖が測定された。これらの実験でＬｍ  １０４０３Ｓが対照として使用された。
【００２２】
【図１０】Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３でのマウスの免疫化がＰＳＡ特異的な免疫応答を誘発することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３またはＬｍｄｄＡ−１４２で１週間間隔で２回免疫化され、７日後に脾臓が収穫された。脾細胞が、モネンシンの存在下で、１  μＭのＰＳＡ６５−７４ペプチドで、５時間にわたり刺激された。細胞はＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌおよび細胞内ＩＦＮ−γについて染色され、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器で分析された。
【００２３】
【図１１】前もってマップされ予測されたＨＬＡ−Ａ２エピトープの位置に基づき明確なＨＭＷ−ＭＡＡ断片を発現する３つのＬｍベースのワクチンがデザインされたことを示す（Ａ）。Ｌｍ−ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＭＡ２１６０−２２５８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃともいう）株は、ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８融合タンパク質に対応する〜６２  ｋＤａ帯域を分泌する（Ｂ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１５）が、Ｂ１６Ｆ１０細胞の皮下接種を受け、３日目、１０日目および１７日目にＬｍ−ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８（ｎ＝８）で腹腔内に免疫化されるか、または未処置のまま（ｎ＝７）のいずれかであった。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１６）が、ＲＥＮＣＡ細胞の皮下接種を受け、３日目、１０日目および１７日目にＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（ｎ＝８）、または当量の投与量の対照ＬｍＬｍワクチンのいずれかで腹腔内に免疫化された。Ｌｍ-LLO-HMW-MAA-Cで免疫化したマウスは、画定した腫瘍の増殖が妨げられた（C）。ＦＶＢ／Ｎマウス（ｎ＝１３）が、ＮＴ−２腫瘍細胞の皮下接種を受け、７日目、１４日目および２１日目にＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（ｎ＝５）または当量の投与量の対照ＬｍＬｍワクチン（ｎ＝８）のいずれかで腹腔内で免疫化された。マウスをＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫化することで、Ｂ１６Ｆ１０、ＲＥＮＣＡおよびＮＴ−２など、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するようには改変されていない腫瘍の増殖が著しく低下した（Ｄ）。腫瘍のサイズが個別の各腫瘍について測定され、および値はミリメートル単位±ＳＥＭでの平均直径で表現している。＊、Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定。
【００２４】
【図１２】Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでの免疫化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍の浸潤を促進し、また血管内の周皮細胞数を減少させることを示す。（A）ＮＴ−２腫瘍が除去され、免疫蛍光のために切断された。染色群に番号が付与され（１〜３）、各染色は右に表示されている。連続した組織が、潜在的なＴＩＬについての抗ＣＤ８αと併せて、ＨＭＷ−ＭＡＡマウス相同体ＡＮ２についてｐａｎ−ｖｅｓｓｅｌマーカー抗ＣＤ３１または抗ＮＧ２抗体のいずれかで染色された。群３は、上記の抗体についてのアイソタイプ対照、および核マーカーとして使用したＤＡＰＩ染色を示す。合計５つの腫瘍が分析され、各群から一つ代表的画像が示されている。血管の周りのＣＤ８+細胞が矢印で示されている。（Ｂ）連続的切断部を、抗ＮＧ２および抗α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）抗体を使用して、周皮細胞について染色された。これら２つの抗体の二重染色/共存（結合した画像内で黄色）は、周皮細胞染色（上）を示す。周皮細胞共存が、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量化され、共存した物体の数がグラフ中に示されている（下）。合計３つの腫瘍が分析され、各群から一つ代表的画像が示されている。＊、Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定。グラフは平均±SEMを示す。
【００２５】
【図１３】マウスサバイビンについてオリゴ５５４／５５５を、菌株のｍ−ＲＮＡ配列をテンプレートとして使用して取得したヒトサバイビン断片についてオリゴ５５２／５５３を使用した、ＰＣＲ生成物のサイズを示すゲルを示す。
【００２６】
【図１４】プラスミドｐＡｄｖ２６６．７（Ａ）およびｐＡｄｖ２６５．５（Ｂ）の概略マップを示す。プラスミドは、リステリアおよびＥ．  ｃｏｌｉの両方の複製起点を含む。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーター、短縮ＬＬＯ用のＯＲＦおよびヒトまたはマウスのサバイビン遺伝子で構成される。
【００２７】
【図１５】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−サバイビン上清からのウエスタンブロットが、染色体ＬＬＯタンパク質の発現がモノクローナルである抗体抗Ｂ３−１９を使用して検出され、短縮ＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質および分解されたｔ−ＬＬＯタンパク質の発現がポリクローナル抗体である抗ＰＥＳＴを使用して検出され、またｔＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質の発現がモノクローナル抗体である抗サバイビン抗体を使用して検出されたことを示す。
【００２８】
【図１６】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−サバイビン上清からのウエスタンブロットが、抗サバイビン抗体を使用した第２のインビボ継代後のｔＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質の発現および分泌を示すことを示す。
【００２９】
【図１７】サバイビンを発現するリステリアをベースにした免疫療法での治療後のＮＴ−２腫瘍増殖の低減を示す。
【００３０】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
一実施形態では、組み換え型ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸分子が本明細書に開示されており、前記組み換え型ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原を含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【００３２】
別の実施形態では、本明細書で開示されている組み換え型核酸分子は、ＤＮＡベクターであり、別の実施形態ではプラスミドである。
【００３３】
別の実施形態では、本明細書で開示されているグラム陰性複製起点配列は、当該技術で入手可能な任意のグラム陰性複製起点（Ｏｒｉ）である。別の実施形態では、グラム陰性ＯｒｉはＥ．  ｃｏｌｉ  Ｏｒｉである。別の実施形態では、グラム陰性Ｏｒｉはｐ１５配列である。
【００３４】
別の実施形態では、本明細書で開示されているグラム陽性複製起点配列は、当該技術で入手可能な任意のグラム陰性複製起点（Ｏｒｉ）である。別の実施形態では、グラム陰性ＯｒｉはＲｅｐ  Ｒ配列または領域である。
【００３５】
別の実施形態では、「短縮ＬＬＯ」または「ΔＬＬＯ」は推定ＰＥＳＴアミノ酸配列を含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語は推定ＰＥＳＴドメインを含むＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、「短縮ＬＬＯ」および「Ｎ末端ＬＬＯ」という用語は本明細書で互換的使用される。
【００３６】
別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸分子が本明細書に開示されており、前記組み換え型ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原を含み、ここで前記異種抗原はサバイビンであり、ここで前記核酸はさらに、第１のプロモーター配列に動作可能にリンクされたグラム陰性複製起点配列、グラム陽性複製起点配列、および第２のプロモーター配列に動作可能にリンクされた代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００３７】
別の実施形態では、本明細書に開示されている組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株が本明細書で開示されている。
【００３８】
本発明は、一実施形態では、組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株に関連するが、前記核酸分子は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴペプチドを含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【００３９】
別の実施形態では、組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株の投与を含む、被験者内の抗原に対する免疫応答を誘発する方法が、本明細書に提供されているが、前記核酸分子は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴペプチドを含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【００４０】
別の実施形態では、組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株の投与を含む、被験者内のガンを治療、抑制、または阻害する方法が、本明細書に提供されているが、前記核酸分子は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴペプチドを含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【００４１】
別の実施形態では、組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株の投与を含む、被験者内にある少なくとも1つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法が、本明細書に提供されているが、前記核酸分子は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、前記ポリペプチドはＮ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチドに融合された異種抗原、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴペプチドを含み、ここで前記異種抗原はサバイビンである。
【００４２】
一実施形態では、前記異種抗原はサバイビンである。本明細書で例示されているとおり、ｔＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質をコードする組み換え型核酸を含む組み換え型リステリアは、腫瘍増殖を、対照と比較して予想外に長い期間のあいだ低減できる（本明細書の実施例１６および図１７を参照）。
【００４３】
一実施形態では、Ｎ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ポリペプチド、およびＮ末端ＡｃｔＡポリペプチドは、ＰＥＳＴ配列を含む。
【００４４】
一実施形態では、核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドをコードする内因性核酸配列を持つオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。一実施形態では、核酸分子は、ＬＬＯをコードする核酸配列を持つオープンリーディングフレームとして、リステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は、ＡｃｔＡをコードする核酸配列を持つオープンリーディングフレームとして、リステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。
【００４５】
一実施形態では、前記組み換え型リステリア内のプラスミド中に核酸分子が存在する。
【００４６】
一実施形態では、核酸分子は、ＬＬＯをコードする内因性核酸配列を持つオープンリーディングフレームとして、リステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。一実施形態では、統合はＬＬＯの機能性を除去しない。別の実施形態では、統合はＡｃｔＡの機能性を除去しない。一実施形態では、ＬＬＯまたはＡｃｔＡの機能性は、その未変性機能性である。一実施形態では、ＬＬＯ機能性は、生物体がファゴリソソームから逃れるようにし、また別の実施形態では、ＬＬＯ機能性はそれが融合されているポリペプチドの免疫原性を高める。
【００４７】
一実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内にある病毒性遺伝子に動作可能に組み込まれる。別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ＡｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、またはｉｎｌＣなどのインターナリン遺伝子、ｐｒｆＡ遺伝子、またはＬＬＯ遺伝子を含む。別の実施形態では、病毒性遺伝子への統合は、病毒性遺伝子の未変性機能を妨害する。別の実施形態では、統合は病毒性遺伝子を不活性化する。別の実施形態では、病毒性遺伝子への統合は、病毒性遺伝子の未変性機能を妨害しない。一実施形態では、本発明の組み換え型リステリアはＬＬＯ機能を保持するが、これは一実施形態では溶血性機能であり、別の実施形態では抗原性機能である。ＬＬＯのその他の機能は、ＬＬＯ機能性を評価するための方法であり、またそのためのアッセイとして、当該技術分野で既知である。一実施形態では、本発明の組み換え型リステリアは野生型病毒性を持ち、別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリアは弱毒化病毒性を持つ。別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリアは非病毒性である。一実施形態では、本発明の組み換え型リステリアは、ファゴリソソームを逃がれ、サイトゾルに入り込むのに十分に病毒性である。一実施形態では、本発明の組み換え型リステリアは、融合した抗原−LLOタンパク質を発現する。こうして、一実施形態では、第１の核酸分子をリステリアゲノムに統合しても、内因性PEST含有遺伝子の構造を崩壊せず、別の実施形態では、内因性PEST含有遺伝子の機能を妨害しない。一実施形態では、第１の核酸分子をリステリアゲノムに統合しても、ファゴリソソームを逃れる前記リステリアの能力を妨害しない。
【００４８】
別の実施形態では、核酸分子は前記組み換え型リステリア内のプラスミド内に存在し、内在性のＰＥＳＴ含有ポリペプチドまたはＰＥＳＴ配列に動作可能にリンクされた異種抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、異種抗原性ポリペプチドおよび内因性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内に翻訳され、別の実施形態では、異種抗原性ポリペプチドおよび内因性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、別々に翻訳された後で融合される。
【００４９】
一実施形態では、リステリアゲノムは、一実施形態では病原性因子である内在性ＡｃｔＡ遺伝子の欠失を含む。一実施形態では、かかる欠失は、より弱毒化し、ひいてはヒトの使用のためにより安全なリステリア株を提供する。一実施形態では、リステリアは、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子について栄養要求性である。別の実施形態では、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子は、リステリアゲノム内で変異している。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は栄養要求性ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体である。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、内因性ＡｃｔＡ遺伝子を欠失した栄養要求性ｄａｌ／ｄａｔ変異体リステリアである。
【００５０】
一実施形態では、異種抗原は、フレーム内でリステリア染色体内にＬＬＯと統合される。別の実施形態では、統合核酸分子は、ＡｃｔＡ遺伝子座へと統合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする染色体の核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。
【００５１】
一実施形態では、核酸分子は、リステリアゲノムへの部位特異的な相同組換えのためにデザインされたベクターである。別の実施形態では、構築体または異種遺伝子は、相同組換えを使用してリステリアｌ染色体に統合される。
【００５２】
相同組換えの技法は、当該技術で周知であり、および例えば、Ｆｒａｎｋｅｌ，ＦＲ、Ｈｅｇｄｅ，Ｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ、およびＹ  Ｐａｔｅｒｓｏｎに記載がある。リステリア・モノサイトゲネスを生ワクチンベクターとして使用した、ＨＩＶ  ｇａｇに対する細胞媒介性免疫応答。Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：４７６６  −  ４７７４．  １９９５；Ｍａｔａ、Ｍ、Ｙａｏ、Ｚ、Ｚｕｂａｉｒ、Ａ、Ｓｙｒｅｓ、ＫおよびＹ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ、マウスをウイルス攻撃から保護するＨＩＶタンパク質を発現する組み換え型リステリア・モノサイトゲネスの評価。ワクチン１９：１４３５−４５、２００１；Ｂｏｙｅｒ，ＪＤ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＴＭ、Ｍａｃｉａｇ，ＰＣ、Ｐｅｎｇ，Ｘ、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＳ、Ｐａｖｌａｋｉｓ，Ｇ、Ｌｅｗｉｓ，ＭＧ、Ｓｈｅｎ，Ａ、Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ，Ｒ、Ｂｒｏｗｎ，ＣＲ、Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ、およびＹ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ．ＤＮＡプライムリステリアブーストは、ＳＩＶ２３９ウイルス複製の抑制を制限する能力を持つアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ）モデルにおいてＳＩＶ抗原に対する細胞免疫応答を誘発する。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ３３３：８８−１０１，２００５．別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。各々の技法は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００５３】
別の実施形態では、構築体または異種遺伝子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、とりわけ以下のＳｕｎらの文献  ＤＰ−Ｌ９６７の構造における（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：  ３７７０−３７７８）に記載されている。一実施形態では、トランスポゾン突然変異誘発は、安定したゲノム挿入変異体が形成されうるという利点を持つ。別の実施形態では、トランスポゾン突然変異誘発によって外来性遺伝子が挿入されたゲノム内の位置は不明である。
【００５４】
別の実施形態では、構築体または異種遺伝子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，  Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ＬＭ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：  ４１７７−８６）。別の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３‘端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。各々の可能性は本明細書で開示した別個の実施形態を表す。
【００５５】
別の実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物の核酸配列は、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。一実施形態では、プロモーター／調節性配列は前記核酸配列を含むエピソームプラスミド上に存在する。一実施形態では、内因性リステリアプロモーター／調節性配列は、本発明の方法および組成物の核酸配列の発現を制御する。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００５６】
別の実施形態では、本明細書で開示されている核酸配列は、リステリア株内でコードされたペプチドの発現を促進するプロモーター、調節性配列、またはその組合せに動作可能にリンクされる。遺伝子の構造性の発現を駆動するために有用なプロモーター、調節性配列およびその組み合わせが当該技術分野で周知であり、これらとしては、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、ｈｌｙプロモーター、ａｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書で開示したペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘発性の調節性配列、プロモーター、およびその組み合わせの実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘発性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド、およびこれに類するものなどの誘発剤に応答して誘発されたプロモーターが利用される。こうして、本発明は、既知または未知のいずれかで、かつこれらに動作可能にリンクする所望のタンパク質の発現を駆動する能力を有する、任意のプロモーターまたは調節性配列の使用を含むことが理解されるであろう。一実施形態では、調節性配列はプロモーターであり、また別の実施形態では、調節性配列はエンハンサー、また別の実施形態では、調節性配列は抑制因子、また別の実施形態では、調節性配列はリプレッサー、また別の実施形態では、調節性配列はサイレンサーである。
【００５７】
当業者にとって当然のことながら、統合に使用される核酸構築体は統合部位を含む。一実施形態では、リステリアゲノムへの統合に使用される時、部位は、ＰｈＳＡ（Ｓｃｏｔｔ  Ａ由来のファージ）ａｔｔＰＰ’統合部位である。ＰｈＳＡは、別の実施形態では、Ｌ．  モノサイトゲネス株ＳｃｏｔｔＡのプロファージであり（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、Ｍ．  Ｊ．，Ｉ．  Ｂ．  Ｋｒａｕｓｅ、Ｔ．  Ｈｅｎｌｅ、およびＳ．  Ｓｃｈｅｒｅｒ．  １９９４．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  １４  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｔｙｐｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：７０１-７１０、参照により本明細書に組み込まれる）、これはヒトリステリア症の流行時に単離された血清型４ｂ株である。別の実施形態では、部位は当該技術で既知の別の任意の統合部位である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００５８】
別の実施形態では、核酸構築体はインテグラーゼ遺伝子を含む。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子はＰｈＳＡインテグラーゼ遺伝子である。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は、当該技術で既知のその他任意のインテグラーゼ遺伝子である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００５９】
一実施形態では、核酸構築体はプラスミドである。別の実施形態では、核酸構築体はシャトルプラスミドである。別の実施形態では、核酸構築体は組込み型ベクターである。別の実施形態では、核酸構築体は部位特異的な組込み型ベクターである。別の実施形態では、核酸構築体は、当該技術で既知のその他任意のタイプの核酸構築体である。各々の可能性は本明細書に提供される方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００６０】
本明細書で提供された方法および組成物の組込み型ベクターは、別の実施形態では、ファージベクターである。別の実施形態では、組込み型ベクターは部位特異的な組込み型ベクターである。別の実施形態では、ベクターはさらにａｔｔＰＰ’部位を含む  各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００６１】
別の実施形態では、組込み型ベクターはＵ１５３ベクターである。別の実施形態では、組込み型ベクターはＡ１１８ベクターである。別の実施形態では、組込み型ベクターはＰｈＳＡベクターである。
【００６２】
別の実施形態では、ベクターはＡ５１１ベクター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号  Ｘ９１０６９）である。別の実施形態では、ベクターはＡ００６ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ５４５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはB０５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ０２０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５００ベクター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号  Ｘ８５００９）である。別の実施形態では、ベクターはＢ０５１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０５６ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ１０１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ１１０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ１ｌｌベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ１５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＤ４４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５３８ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ６５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５１３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５０２ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５０５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５１９ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ６０４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＣ７０３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０２５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ５２８ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０２４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０１２ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０３５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＣ７０７ベクターである。
【００６３】
別の実施形態では、ベクターはＡ００５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ６２０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＡ６４０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＢ０２１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨＳＯ４７ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１０Ｇベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ８／７３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１９ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ２１ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ４３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ４６ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１０８ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１１０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ１６３／８４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ３１２ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ３４０ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ３８７ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ３９１／７３ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ６８４／７４ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＨ９２４Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターはｆＭＬＵＰ５ベクターである。別の実施形態では、ベクターはｓｙｎ（＝Ｐ３５）ベクターである。別の実施形態では、ベクターは００２４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは００６１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは０２９７１Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターは０２９７１Ｃベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／４７６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／９１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／９３９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／１１３０２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／１１６０５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５／１１７０４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１８４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５７５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは６３３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは６９９／６９４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは７４４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９００ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１０９０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１３１７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１４４４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１６５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１８０６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１８０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／９５９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１１３６７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１１５００ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１１５６６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１２４６０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９２１／１２５８２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１９６７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは２３８９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは２４２５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは２６７１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは２６８５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは３２７４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは３５５０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは３５５１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは３５５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２７６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２７７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２９２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４４７７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３３７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３４８／１１３６３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３４８／１１６４６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３４８／１２４３０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは５３４８／１２４３４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１００７２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１１３５５Ｃベクターである。別の実施形態では、ベクターは１１７１１Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターは１２０２９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１２９８１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは１３４４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９０６６６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９０８１６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９３２５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９０７５１５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは９１０７１６ベクターである。別の実施形態では、ベクターはＮＮ−リステリアベクターである。別の実施形態では、ベクターはＯ１７６１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは４２８６ベクターである。
【００６４】
別の実施形態では、組込み型ベクターは、リステリアを感染する能力を持つ当該技術で既知のその他任意の部位特異的な組込み型ベクターである。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物の組込み型ベクターまたはプラスミドは、リステリアワクチン株に対する抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、組込み型ベクターまたはプラスミドは、抗生物質抵抗性遺伝子を含まない。
【００６５】
別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドをコードする孤立核酸を本発明は提供する。一実施形態では、孤立核酸は少なくとも７０％の相同性を本明細書で提供した組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも７５％の相同性を本明細書で提供した組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも８０％の相同性を本明細書で提供した組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも８５％の相同性を本明細書で提供した組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９０％の相同性を本明細書で提供した組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９５％の相同性を本明細書で提供した組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９７％の相同性を本明細書で提供した組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９９％の相同性を本明細書で提供した組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。
【００６６】
一実施形態では、本明細書に提供されている異種抗原を発現する組み換え型リステリアを生成する方法が本明細書には提供されている。別の実施形態では、方法は、前記組み換え型リステリアを前記異種抗原をコードする核酸を含むエピソーム発現ベクターで形質転換する工程を含む。別の実施形態では、方法は、前記組み換え型リステリア株内で抗原発現を助長する条件下（当該技術分野で既知である）で、前記抗原を発現させる工程を含む。
【００６７】
一実施形態では、抗原は融合タンパク質としてＬＬＯで発現されるが、これは一実施形態では非溶血性ＬＬＯ、および別の実施形態では短縮ＬＬＯである。別の実施形態では、抗原は、融合タンパク質としてＮ末端ＡｃｔＡタンパク質で発現されるが、これは一実施形態では短縮ＡｃｔＡである。
【００６８】
別の実施形態では、本明細書に提供されている組み換え型リステリア株は、それによって発現される抗原に対する免疫応答を誘発することにより、腫瘍を標的とする。
【００６９】
別の実施形態では、本明細書で提供された方法および組成物のエピソーム発現ベクターは、フレーム内でＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列をコードする核酸配列に融合される抗原を含む。一実施形態では、抗原はサバイビンである。別の実施形態では、抗原はサバイビン断片である。別の実施形態では、抗原はサバイビン断片の免疫原性断片である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号：１）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号：２）である  別の実施形態では、本明細書に列挙されているＰＥＳＴ  ＡＡ配列のうちの１つを含む任意のＬＬＯ配列への抗原の融合は、サバイビンに対する細胞媒介性免疫を強化することができる。
【００７０】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列はリステリアＡｃｔＡタンパク質からのＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：３）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：４）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：５）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：６）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ｌｓｏ遺伝子によってコードされるリステリア・シーリゲリ細胞溶解素由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号：７）である  別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３５〜５１においてＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：８）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３８〜５４においてＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：９）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は配列番号：３〜９から選択される配列を有する  別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は配列番号：１〜９から選択される配列を有する  別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ  ＡＡ配列である。
【００７１】
ＰＥＳＴ配列の同定は当該技術で周知であり、例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｔｈｅ  ＰＥＳＴ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８、参照により本明細書に組み込まれる）およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（ＰＥＳＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９６；２１（７）：２６７−７１、参照により本明細書に組み込まれる）に記載がある。「ＰＥＳＴ配列」は、別の実施形態では、プロリン（Ｐ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、セリン（Ｓ）残基、およびスレオニン（Ｔ）残基が豊富な領域を指す。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、いくつかの正に荷電したアミノ酸を含有する１つ以上のクラスターが脇にある。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はこれを含有するタンパク質の急速な細胞内分解を媒介する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｏｇｅｒｓらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は１つ以上の内部リン酸化部位を含有し、これらの部位におけるリン酸化はタンパク質の分解を進める。一実施形態では、本明細書でＰＥＳＴ配列と言及している配列は、ＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＰＥＳＴペプチド配列または単にＰＥＳＴペプチドである。
【００７２】
一実施形態では、原核生物のＰＥＳＴ配列は、例えば、ＬｍについてのＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２１：２６７−２７１）、ならびにＲｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）に記述されているものなどの方法に従って同定することができる。あるいは、この方法に基づいて原核生物由来のＰＥＳＴ  ＡＡ配列を同定することもできる。ＰＥＳＴ  ＡＡ配列を含むことが期待される他の原核生物は、他のリステリア種に限定されない。一実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｏｇｅｒｓらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ−ｆｉｎｄプログラムを使用してＰＥＳＴ配列が同定される。
【００７３】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの同定は、特異的なタンパク質配列の中の正に荷電したアミノ酸Ｒ、Ｈ、およびＫに対する初期のスキャンによって達成される。正に荷電した側の間のすべてのアミノ酸が計数され、これらのモチーフのみがさらに考慮され、これらはウィンドウサイズのパラメータと等しいかそれより大きい多数のアミノ酸を含有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、少なくとも１つのＰ、１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含有する必要がある。
【００７４】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの質は、重要なアミノ酸ならびにモチーフの疎水性の局所的な濃縮に基づいてパラメータをスコアリングする手段によって洗練される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴの濃縮は、質量パーセント（ｗ／ｗ）で表現され、ＤまたはＥと等価な１つに対して、Ｐと等価な１つに対して、およびＳまたはＴと等価な１つに対して修正される。別の実施形態では、疎水性の計算はＪ．  ＫｙｔｅおよびＲ．Ｆ．  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  （Ｋｙｔｅ，  ＪおよびＤｏｏｔｌｉｔｔｌｅ，  ＲＦ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７，  １０５  （１９８２）の方法の原理に従い、参照により本明細書に組み込まれる。計算を簡略化するために、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性指標は、もともとはアルギニンについて−４．５からイソロイシンについて＋４．５までの範囲であるが、次の一次変換を使用して正の整数に変換され、アルギニンについて０からイソロイシンについて９０までの値が得られる。
【００７５】
疎水性指標  ＝  １０  ＊  Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性指標  ＋  ４５
【００７６】
別の実施形態では、潜在的なＰＥＳＴモチーフの疎水性は、各々のアミノ酸種に対するモルパーセントおよび疎水性指数の産物にわたる合計として計算される。以下の式で表現される場合、望ましいＰＥＳＴスコアは局所濃縮項および疎水性項の組合せとして得られる。
【００７７】
ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指数。
【００７８】
別の実施形態では、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ配列」または「ＰＥＳＴペプチド」という用語は互換的に使用され、上記のアルゴリズムを使用して少なくとも+5のスコアを持つペプチドを意味する。別の実施形態では、この用語は少なくとも６のスコアを有するペプチドを指す。別の実施形態では、ペプチドは少なくとも７のスコアを有する。別の実施形態では、スコアは少なくとも８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１３である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４５である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００７９】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他の方法またはアルゴリズム、例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ＨＭ，  Ｏｃｃｈｉｕｃｃｉ  ＪＭ，  Ａｌｖｅｓ  Ｊ，  Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ  ＪＥ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００５  Ｊｕｎ；２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を使用して同定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される。
【００８０】
ＰＥＳＴ指数は、１の値をアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、適切な長さ（例えば、３０〜３５アミノ酸ストレッチ）の各々のストレッチに対して計算される。ＰＥＳＴ残基の各々に対する係数値（ＣＶ）は、１であり、また他のアミノ酸（非ＰＥＳＴ）の各々に対する係数値は０である。
【００８１】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴ配列である。
【００８２】
一実施形態では、本発明は融合タンパク質を提供するが、一実施形態ではリステリアによって発現される。一実施形態では、こうした融合タンパク質は、ＰＥＳＴ配列に融合されるが、これは一実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むタンパク質断片への融合を意味する。別の実施形態では、この用語は、タンパク質断片がＰＥＳＴ配列以外に周辺配列を含む事例を含む。別の実施形態では、タンパク質断片はＰＥＳＴ配列から構成される。したがって、別の実施形態では、「融合」は、それぞれの端部で一つにリンクされているか、またはそれぞれの内部に互いに埋め込まれるかのいずれかである２つのペプチドまたはタンパク質断片を意味する。
【００８３】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質断片は、本明細書で開示されている組成物および方法で利用される。別の実施形態では、本明細書で提供されている組成物および方法の組み換え型リステリア株は、完全長ＬＬＯポリペプチドを含み、一実施形態では溶血性である。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、非溶血性ＬＬＯポリペプチドを含む。一実施形態では、溶血性ＬＬＯポリペプチドがリステリア染色体から発現されるのに対して、非溶血性ＬＬＯポリペプチドはエピソームプラスミドから発現され、リステリアの細胞質内に、融合タンパク質の形態で抗原と共に存在する。
【００８４】
別の実施形態では、ＬＬＯポリペプチドはＬＬＯポリペプチドの断片である。別の実施形態では、ＬＬＯポリペプチドはＮ末端ＬＬＯ断片である。別の実施形態では、ポリペプチドは米国特許公開番号第２００９／００８１２４８号に記述されるように解毒ＬＬＯであり、これもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、オリゴペプチドは完全ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、ポリペプチドは、当該技術で既知の任意の本明細書に開示されているＬＬＯタンパク質またはその断片である。
【００８５】
一実施形態では、短縮ＬＬＯタンパク質は、ポリペプチドを発現する本明細書で開示されているエピソーム発現ベクターによってコードされ、すなわち、一実施形態では抗原、別の実施形態では血管形成因子、また別の実施形態では抗原および血管形成因子の両方である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＮ末端断片である。
【００８６】
別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
【００８７】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ  （配列番号：１０）。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１０に示される配列を含む  別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１０の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１０の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１０の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１０のアイソフォームである。
【００８８】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
【００８９】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号：１１）。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１１に示される配列を含む  別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１１の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１１の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１１の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１１のアイソフォームである。
【００９０】
本明細書で開示されている組成物および方法で使用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、次の配列を含む：
【００９１】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１３１２８、配列番号：１２、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１５１２７に示される）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本明細書に開示されているワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１２に示される配列を含む  別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１２の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１２の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１２の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１２のアイソフォームである。
【００９２】
本明細書で開示されている組成物および方法で使用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、次の配列を含む：
【化１】
2017522027.tif 000003
別の実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１３に示される配列を含む  別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１３の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１３の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１３の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は配列番号：１３のアイソフォームである。
【００９３】
一実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法のＬＬＯポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＺＰ＿０１９４２３３０、ＥＢＡ２１８３３に記載のあるリステリア・モノサイトゲネス１０４０３Ｓ株に由来するか、またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＺ＿ＡＡＲＺ０１００００１５またはＡＡＲＺ０１００００１５．１に記載のある核酸配列によってコードされる。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法で使用するためのＬＬＯ配列は、リステリア・モノサイトゲネス由来であり、  これは一実施形態では、４ｂ  Ｆ２３６５株（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＹＰ＿０１２８２３）、ＥＧＤ−ｅ株（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿４６３７３３）、または当該技術で既知のその他任意のリステリア・モノサイトゲネス株である。
【００９４】
別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法で使用するためのＬＬＯ配列は、フラボバクテリウム属細菌ＨＴＣＣ２１７０（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＺＰ＿０１１０６７４７またはＥＡＲ０１４３３；一実施形態では、ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＺ＿ＡＡＯＣ０１０００００３）由来である。一実施形態では、アルベオリシンなどの他の種のＬＬＯと相同的なタンパク質は、一実施形態では、パエニバチルス・アルベイ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｐ２３５６４またはＡＡＡ２２２２４；一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ６２７０９によってコードされる）で見られるが、本明細書で開示されている組成物および方法で使用されうる。こうしたその他の相同性タンパク質は当該技術分野で既知である。
【００９５】
別の実施形態では、既知のリシンを含めた他の種に由来するＬＬＯの相同体、またはその断片は、ＬＬＯと本明細書で開示されている組成物および方法の抗原との融合タンパク質を生成するために使用されうるが、一実施形態ではＨＭＷ−ＭＡＡであり、別の実施形態ではＨＭＷ−ＭＡＡの断片である。
【００９６】
別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物のＬＬＯ断片はＰＥＳＴドメインである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片は、組成物の一部として、または本明細書で開示されている方法で利用される。
【００９７】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はカルボキシ末端に活性化ドメインを含まない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はシステイン４８４を含まない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は非溶血性断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、米国特許公開番号第２００９／００８１２４８号に記述されるとおり、ＬＬＯ配列はコレステロール結合ドメイン内の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ配列は、別の場所における欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【００９８】
一実施形態では、本発明はリステリオシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質を含む組み換え型タンパク質またはポリペプチドを提供し、前記ＬＬＯタンパク質は前記ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、またはこれらの組み合わせの突然変異を含む。一実施形態では、前記Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２残基は、配列番号：１２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２であるが、別の実施形態では、当業者には既知のように、これらは配列アラインメント使用して推測することができるような対応する残基である。一実施形態では、残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２は突然変異している。一実施形態では、突然変異は置換であり、別の実施形態では、欠失である。一実施形態では、ＣＢＤ全体が突然変異しており、一方で別の実施形態では、ＣＢＤの部分が突然変異しており、一方で別の実施形態では、ＣＢＤ内の特異的な残基のみが突然変異している。
【００９９】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質と、（ｂ）対象となる異種ペプチドとを含む組み換え型のタンパク質またはポリペプチドを提供し、変異型ＬＬＯタンパク質は内部欠失を含有し、内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインを含む。別の実施形態では、コレステロール結合ドメインの配列はＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲであり、配列番号：４２で示される。別の実施形態では、内部欠失は、１１〜５０アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、内部欠失は、組み換え型タンパク質またはポリペプチドの溶血活性に関して不活性である。別の実施形態では、組み換え型タンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに関する溶血活性の減少を呈する。
【０１００】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質と、（ｂ）対象となる異種ペプチドとを含む組み換え型タンパク質またはポリペプチドを提供し、変異型ＬＬＯタンパク質は内部欠失を含有し、内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインの断片を含む。別の実施形態では、内部欠失は、１〜１１アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、コレステロール結合ドメインの配列は配列番号：４２で示される  別の実施形態では、内部欠失は、組み換え型タンパク質またはポリペプチドの溶血活性に関して不活性である。別の実施形態では、組み換え型タンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに関する溶血活性の減少を呈する。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、融合ペプチドである。別の実施形態では、「融合ペプチド」はペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結した２つ以上のタンパク質を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では、タンパク質はペプチドまたは他の化学結合によって互いに直接的に連結している。別の実施形態では、タンパク質は、２つ以上のタンパク質の間の１つ以上のＡＡ（例えば、「スペーサー」）によって互いに連結している。
【０１０２】
本発明の方法および組成物の内部欠失の長さは、別の実施形態では１〜５０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは４〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは５〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは６〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは７〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは８〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは９〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１０〜１１  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜２  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜３  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜４  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜６  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜７  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜８  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜９  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１〜１０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜３  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜４  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜６  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜７  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜８  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜９  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２〜１０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３〜４  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３〜５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３〜６  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３〜７  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３〜８  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３〜９  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３〜１０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜５０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１２〜５０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜１５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜２０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜２５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜３０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜３５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜４０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜６０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜７０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜８０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜９０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜１００  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１１〜１５０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜２０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜２５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜３０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜３５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜４０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜６０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜７０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜８０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜９０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは１５〜１００  ＡＡである。別の��施形態では、長さは１５〜１５０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜２５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜３０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜３５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜４０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜６０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜７０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜８０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜９０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜１００  ＡＡである。別の実施形態では、長さは２０〜１５０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３０〜３５  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３０〜４０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３０〜６０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３０〜７０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３０〜８０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３０〜９０  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３０〜１００  ＡＡである。別の実施形態では、長さは３０〜１５０  ＡＡである。
【０１０３】
別の実施形態では、内部欠失を含む本発明の変異型ＬＬＯタンパク質は、内部欠失を除いて完全長である。別の実施形態では、変異型ＬＬＯタンパク質は追加的な内部欠失を含む。別の実施形態では、変異型ＬＬＯタンパク質は複数の追加的な内部欠失を含む。別の実施形態では、変異型ＬＬＯタンパク質はＣ末端部から切断される。別の実施形態では、変異型ＬＬＯタンパク質はN末端部から切断される。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の内部欠失は配列番号：１２の残基Ｃ４８４を含む。別の実施形態では、内部欠失は相同ＬＬＯタンパク質の対応するシステイン残基を含む。別の実施形態では、内部欠失は配列番号：１２の残基Ｗ４９１を含む。別の実施形態では、内部欠失は相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。別の実施形態では、内部欠失は配列番号：１２の残基Ｗ４９２を含む。別の実施形態では、内部欠失は相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。相同タンパク質の対応する残基を同定するための方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、配列アライメントを含む。
【０１０５】
別の実施形態では、内部欠失は残基Ｃ４８４およびＷ４９１を含む。別の実施形態では、内部欠失は残基Ｃ４８４およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、内部欠失は残基Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、内部欠失は残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。
【０１０６】
一実施形態では、本発明は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片を含む組み換え型タンパク質またはポリペプチドを提供し、変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片の突然変異領域に対する非ＬＬＯペプチドの置換を含み、突然変異領域はＣ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２から選択された残基を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＮ末端ＬＬＯ断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は少なくとも４９２アミノ酸（ＡＡ）長である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は４９２〜５２８ＡＡ長である。別の実施形態では、非ＬＬＯペプチドは１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態では、突然変異領域は１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態では、非ＬＬＯペプチドは突然変異領域と同一の長さである。別の実施形態では、非ＬＬＯペプチドは突然変異領域と異なる長さである。別の実施形態では、置換は溶血活性に関する不活化突然変異である。別の実施形態では、組み換え型タンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに関する溶血活性の減少を呈する。別の実施形態では、組み換え型のタンパク質またはポリペプチドは非溶血性である。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤを含む。例えば、配列番号：１２の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０−５００から構成される内部欠失は、そのＣＢＤ（残基４８３−４９３）を含む。別の実施形態では、内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤの断片である。例えば、残基４８４〜４９２、４８５〜４９０、および４８６〜４８８はすべて配列番号：１２のＣＢＤの断片である  別の実施形態では、内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤに重複する。例えば、配列番号：１２の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００または４８６〜５１０から構成される内部欠失はそのＣＢＤを含む。
【０１０８】
「溶血性」は、別の実施形態では、真核生物細胞を溶解する能力を意味する。別の実施形態では、真核生物細胞は赤血球である。別の実施形態では、真核細胞は当該技術分野で既知の任意の他のタイプの真核細胞である。別の実施形態では、溶血活性は酸性ｐＨで測定される。別の実施形態では、溶血活性は生理的ｐＨで測定される。別の実施形態では、溶血活性はｐＨ５．５で測定される。別の実施形態では、溶血活性はｐＨ７．４で測定される。別の実施形態では、溶血活性は当該技術で既知のその他任意のｐＨで測定される。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組み換え型タンパク質またはポリペプチドは、野生型ＬＬＯと比較して100倍を超える溶血活性の減少を示す。別の実施形態では、組み換え型タンパク質またはポリペプチドは５０倍を超える溶血活性の減少を示す。別の実施形態では、減少は３０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は４０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は６０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は７０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は８０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は９０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は１２０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は１５０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は２００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は２５０倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は３００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は４００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は５００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は６００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は８００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は１０００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は１２００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は１５００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は２０００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は３０００倍よりも大きい。別の実施形態では、減少は５０００倍よりも大きい。
【０１１０】
別の実施形態では、減少は少なくとも１００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも５０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも３０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも４０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも６０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも７０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも８０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも９０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１２０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１５０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも２００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも２５０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも３００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも４００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも５００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも６００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも８００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１０００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１２００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１５００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも２０００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも３０００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも５０００倍である。
【０１１１】
溶血活性を決定する方法は、当該技術で周知であり、例えば、本明細書の例、ならびにＰｏｒｔｎｏｙ  ＤＡら、（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｖｏｌ  １６７：１４５９−１４７１、１９８８）およびＤａｎｃｚ  ＣＥら（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８４：５９３５-５９４５、２００２）に記述されている。
【０１１２】
溶血活性と関連した「突然変異の不活性化」は、別の実施形態では、検出可能な溶血活性を消滅させる突然変異を意味する。別の実施形態では、この用語はｐＨ５．５で溶血活性を消滅させる突然変異を意味する。別の実施形態では、この用語はｐＨ７．４で溶血活性を消滅させる突然変異を意味する。別の実施形態では、この用語はｐＨ５．５で溶血活性を著しく減少させる突然変異を意味する。別の実施形態では、この用語はｐＨ７．４で溶血活性を著しく減少させる突然変異を意味する。別の実施形態では、この用語はｐＨ５．５で溶血活性を著しく減少させる突然変異を意味する。別の実施形態では、この用語は、溶血活性に関連するその他任意のタイプの突然変異の不活性化を意味する。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のコレステロール結合ドメインの配列は、配列番号：４２に記載されている。別の実施形態では、ＣＢＤは当該技術分野で既知の任意の他のＬＬＯ  ＣＢＤである。
【０１１４】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、５２９  ＡＡ完全長のＬＬＯタンパク質のうち最初のおよそ４００〜４４１  ＡＡを含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書に開示されたＬＬＯタンパク質のうちＡＡ  １〜４４１に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書に開示されたＬＬＯタンパク質のうちＡＡ  １〜４２０に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ２０〜４４２  ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書に開示されたＬＬＯタンパク質のうちＡＡ  ２０〜４４２に対応する。別の実施形態では、システイン４８４を含む活性化ドメインを持たない、また特にシステイン４８４を持たない任意のΔＬＬＯは、本明細書で開示した方法および組成物に適している。
【０１１５】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のうち最初の４００  ＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のうち最初の３００  ＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のうち最初の２００  ＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のうち最初の１００  ＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質のうち最初の５０  ＡＡに対応し、これは一実施形態では１つ以上のＰＥＳＴ配列を含む。
【０１１６】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用するＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合のように、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はない。
【０１１７】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＡｃｔＡ配列とともに動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるエピソーム発現ベクターは、ＡｃｔＡまたは短縮ＡｃｔＡに融合された抗原を含む融合タンパク質を含む。
【０１１８】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＡｃｔＡ配列とともに動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、ＡｃｔＡまたは短縮ＡｃｔＡに融合される抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の発現ベクターを含む。一実施形態では、抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、またこれはＡｃｔＡ（短縮ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜２３３アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５５，２３８号に記述されるように、短縮ＡｃｔＡは野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態では、米国特許公開番号第２０１４／０１８６３８７号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり、この中でＰＥＳＴモチーフを欠失しており、非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含有する。
【０１１９】
一実施形態では、抗原はサバイビンであり、また別の実施形態では、サバイビンの免疫原性断片である。別の実施形態では、これは、サバイビンのエピトープである。別の実施形態では、サバイビンエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２サバイビンエピトープであり、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬに記載された配列を持つ（配列番号：１４）。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書で開示された方法および組成物の抗原はＡｃｔＡタンパク質に融合されるが、これは一実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片であり、これは一実施形態では、ＡｃｔＡの最初の３９０  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の４１８  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の５０  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の１００  ＡＡを含むかそれにより構成されるが、これは一実施形態では、配列番号：２に提供されているものなどのＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、ＡｃｔＡの最初の１５０  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初のおよそ２００  ＡＡを含むかそれにより構成されるが、これは一実施形態では、本明細書に記述されるとおり２つのＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、ＡｃｔＡの最初の２５０  ＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の３００  ＡＡを含むかそれにより構成される。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。残基番号は、別の実施形態では、上記に列挙した残基番号ときっちりと対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書で利用したＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を持つ場合には、残基番号は当業者にとって日常的であるとおり、それに従い、当該技術で周知のＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴなどの配列整列ツールを使用して調節できる。
【０１２１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端部分は、１つ、２つ、３つ、または４つのＰＥＳＴ配列を含み、これは一実施形態では、本明細書に記述されているとおり、本明細書で言及したＰＥＳＴ配列またはそれらの相同体であるか、または本明細書に記述されている方法およびアルゴリズムを使用して、または当該技術で既知の代替的方法の使用によって決定されうるその他のＰＥＳＴ配列である。
【０１２２】
本明細書に開示されている方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、配列番号：１５で示される配列を有する。
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号：１５）  別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１５に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５のアイソフォームである。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５の相同体の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５の変異型の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１５のアイソフォームの断片である。
【０１２３】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号：１６に示される配列を含む。ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：１６）  別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：１６に示される配列を有する。別の実施形態では、本発明で開示する組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。
【０１２４】
本明細書に開示されている方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、配列番号：１７で示される配列を有する。ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＭＲＥＴＡＰＳＬＤＳＳＦＴＳＧＤＬＡＳＬＲＳＡＩＮＲＨＳＥＮＦＳＤＦＰＬＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号：１７）、これは、一実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス、株１０４０３Ｓ由来のＡｃｔＡのうち最初の３９０  ＡＡである。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１７に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７のアイソフォームである。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７の相同体の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７の変異型の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は配列番号：１７のアイソフォームの断片である。
【０１２５】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号：１８に示される配列を含む。ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔａｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｃｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｃａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａｇｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔｇａｇｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａａａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇｃａａａａｇｃａｇａｇａａａｇｇｔｃｃｇａａｔａａｃａａｔａａｔａａｃａａｃｇｇｔｇａｇｃａａａｃａｇｇａａａｔｇｔｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｔｃｇａｃｃｇａｃｃａａｃｔｃｔｇｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇｔｃｔｇｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａａａｇｃｃａｔａｇｃｇｔｃｇｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃａｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｃａａａｔａａｇａｇａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｔｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｃｇａｇｔｃｔａｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｔｃａａａａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃｇａｔｇｃｔｔｃｔｃｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔａｃｔｃｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｔａｔｇｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｃｃｔｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇｃｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａｇｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｃｇａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｔａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号：１８）、ここで一実施形態では、最初の１１７０ヌクレオチドがリステリア・モノサイトゲネス１０４０３Ｓ株内でＡｃｔＡをコードする。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：１８に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。
【０１２６】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術で既知の別のＡｃｔＡ断片であり、これは一実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む任意の断片である。こうして、一実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１〜１００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１〜２００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸２００〜３００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸３００〜４００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡ配列のアミノ酸１〜３００である。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは全ＡｃｔＡタンパク質をコードする任意の他の配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、（ａ）ＡｃｔＡのアミノ酸１〜５９、（ｂ）宿主細胞の細胞骨格をａｃｔａ媒介制御するための少なくとも１つのドメインでの突然変異不活性化、そのドメインの欠失、またはそのドメインに先立つ切断を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡの最初の５９を超えるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、改変されたＡｃｔＡは、米国特許公開番号第２００７／０２０７１７０号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるａｃｔＡ−Ｎ１００である。
【０１２７】
一実施形態では、本明細書に提供されている組成物および方法で使用するためのＡｃｔＡ配列はリステリア・モノサイトゲネス由来のものであり、これは一実施形態では、ＥＧＤ株、１０４０３Ｓ株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００２株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ  ５３４８株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００６株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６４）、または当該技術で既知のリステリア・モノサイトゲネスその他任意の株である。
【０１２８】
一実施形態では、株ＬｍｄｄΔＡｃｔＡ内で欠失されたＡｃｔＡ領域の配列は、次のとおりである。
【０１２９】
【化２−１】
2017522027.tif 000004
【化２−２】
2017522027.tif 000005
一実施形態では、下線の領域は、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内に存在するａｃｔＡ配列要素を含有する。一実施形態では、太字の配列ｇｔｃｇａｃは、Ｎ−Ｔ配列およびＣ−Ｔ配列の結合部位を表す。
【０１３０】
一実施形態では、本明細書で提供されている組成物および方法の組み換え型リステリア株は、サバイビン抗原を、または別の実施形態では、サバイビンの断片をコードする核酸分子を含む。
【０１３１】
別の実施形態では、マウスのサバイビンタンパク質は、次のアミノ酸（ＡＡ）配列を持つ。ＭＧＡＰＡＬＰＱＩＷＱＬＹＬＫＮＹＲＩＡＴＦＫＮＷＰＦＬＥＤＣＡＣＡＰＥＲＭＡＥＡＧＦＩＨＣＰＴＥＮＥＰＤＬＡＱＣＦＦＣＦＫＥＬＥＧＷＥＰＤＤＮＰＩＥＥＨＲＫＨＳＰＧＣＡＦＬＴＶＫＫＱＭＥＥＬＴＶＳＥＦＬＫＬＤＲＱＲＡＫＮＫＩＡＫＥＴＮＮＫＱＫＥＦＥＥＴＡＫＴＴＲＱＳＩＥＱＬＡＡ（配列番号：２０）  
【０１３２】
別の実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物のサバイビンアミノ酸配列は配列番号：２０に示される配列を含む。別の実施形態では、サバイビン配列は配列番号：２０の相同体である。別の実施形態では、サバイビンＡＡ配列は配列番号：２０の変異体である。別の実施形態では、サバイビンＡＡ配列は配列番号：２０の断片である。別の実施形態では、サバイビンＡＡ配列は配列番号：２０のアイソフォームである。
【０１３３】
別の実施形態では、ヒトのサバイビンタンパク質は、次のアミノ酸配列を持つ。
【０１３４】
ＧＡＰＴＬＰＰＡＷＱ  ＰＦＬＫＤＨＲＩＳＴ  ＦＫＮＷＰＦＬＥＧＣ  ＡＣＡＰＥＲＭＡＥＡ  ＧＦＩＨＣＰＴＥＮＥＰＤＬＡＱＣＦＦＣＦＫＥＬＥＧＷＥＰＤＤＤＰＩＥＥＨＫＫＨＳＳＧＣＡＦＬＳＶＫＫＱＦＥＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬＤＲＥＲＡＫＮＫＩＡＫＥＴＮＮＫＫＫＥＦＥＥＴＡＫＫＶ  ＲＲＡＩＥＱＬＡＡＭ  Ｄ（配列番号：２１）  別の実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物のサバイビンアミノ酸配列は配列番号：２１に示される配列を含む。別の実施形態では、サバイビン配列は配列番号：２１の相同体である。別の実施形態では、サバイビンＡＡ配列は配列番号：２１の変異体である。別の実施形態では、サバイビンＡＡ配列は配列番号：２１の断片である。別の実施形態では、サバイビンＡＡ配列は配列番号：２１のアイソフォームである。
【０１３５】
別の実施形態では、マウスのサバイビンタンパク質は、次の核酸配列でコードされる。
【化３】
2017522027.tif 000006
別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：２２に示される配列を有する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物のサバイビンをコードするヌクレオチドは配列番号：２２に示される配列を含む。別の実施形態では、サバイビンをコードするヌクレオチドは、配列番号：２２の相同体である。別の実施形態では、サバイビンをコードするヌクレオチドは、配列番号：２２の変異体である。別の実施形態では、サバイビンをコードするヌクレオチドは、配列番号：２２の断片である。別の実施形態では、サバイビンをコードするヌクレオチドは、配列番号：２２のアイソフォームである。
【０１３６】
別の実施形態では、ヒトのサバイビンタンパク質は、次の核酸配列でコードされる。
ＧＧＴＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＧＡＧＡＡＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＡＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧＡ      （配列番号：２３）  別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：２３に示される配列を有する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物のサバイビンをコードするヌクレオチドは配列番号：２３に示される配列を含む。別の実施形態では、サバイビンをコードするヌクレオチドは、配列番号：２３の相同体である。別の実施形態では、サバイビンをコードするヌクレオチドは、配列番号：２３の変異体である。別の実施形態では、サバイビンをコードするヌクレオチドは、配列番号：２３の断片である。別の実施形態では、サバイビンをコードするヌクレオチドは、配列番号：２３のアイソフォームである。
【０１３７】
別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物のサバイビンタンパク質は、ＡＡＸ２９１１８．１、１Ｆ３Ｈ＿Ａ、およびＣＡＧ４６５４０．１およびＮＰ＿０３３８１９．１から選択される受入番号を持つＧｅｎＢａｎｋエントリに記載されているＡＡ配列を持つ。別の実施形態では、サバイビンタンパク質は、上述のＧｅｎＢａｎｋエントリの１つに記載されているヌクレオチド配列によりコードされる。別の実施形態では、サバイビンタンパク質は、上述のＧｅｎＢａｎｋエントリの１つに記載されている配列を含む。別の実施形態では、サバイビンタンパク質は、上述のＧｅｎＢａｎｋエントリの１つに記載されている配列の相同体である。別の実施形態では、サバイビンタンパク質は、上述のＧｅｎＢａｎｋエントリの１つに記載されている配列の変異体である。別の実施形態では、サバイビンタンパク質は、上述のＧｅｎＢａｎｋエントリの１つに記載されている配列の断片である。別の実施形態では、サバイビンタンパク質は、上述のＧｅｎＢａｎｋエントリの１つに記載されている配列のアイソフォームである。
【０１３８】
別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法の組み換え型リステリアは、組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含み、すなわち、一実施形態では血管原性、また別の実施形態では抗原性である。一実施形態では、ポリペプチドはサバイビンであり、別の実施形態では、ポリペプチドはサバイビン断片である。別の実施形態では、プラスミドはさらに、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物のサバイビン断片はＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドに融合される。一実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドは、それに融合された時に抗原性または血管原性のポリペプチドの免疫原性を促進する。別の実施形態では、サバイビン断片は、ＰＥＳＴ配列を含むペプチド内に埋め込まれる。別の実施形態では、サバイビン由来ペプチドは、ＬＬＯ断片、ＡｃｔＡタンパク質または断片、またはＰＥＳＴ配列に組み込まれる。
【０１３９】
ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドは、一実施形態では、リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチドである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドはＡｃｔＡオリゴペプチドである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドはＰＥＳＴオリゴペプチドである。一実施形態では、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ配列およびその断片への融合により、抗原の細胞媒介性免疫原性が促進される。一実施形態では、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ配列およびその断片への融合により、多様な発現系での抗原の細胞媒介性免疫原性が促進される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドは、当該技術で既知のＰＥＳＴ配列を含むその他任意の免疫原性ポリペプチドである。
【０１４０】
一実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法の組み換え型リステリア株は腫瘍細胞によって発現される異種抗原性ポリペプチドを発現する。一実施形態では、本明細書で提供されている組成物および方法の組み換え型リステリア株は、それぞれが短縮ＬＬＯ、短縮ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴペプチドなどの、ＰＥＳＴ含有配列に融合された異種抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第１および第２の核酸分子を含む。
【０１４１】
別の実施形態では、本明細書に提供される異種抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原といった腫瘍抗原のうちの１つである。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組合せである。
【０１４２】
別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＣＥＡである。別の実施形態では、抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態では、抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ＳＣＣＥ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、アポトーシス反復含有のバキュロウイルス阻害剤５（ＢＩＲＣ５）、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、PSA（前立腺特異的抗原）またはこれらの組み合せから選択される。
【０１４３】
一実施形態では、本発明のリステリアによって発現されるポリペプチドは神経ペプチド成長因子拮抗薬でもよく、一実施形態では、これは［Ｄ−Ａｒｇ１、Ｄ−Ｐｈｅ５、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、Ｌｅｕ１１］サブスタンスＰ、［Ａｒｇ６、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、ＮｍｅＰｈｅ８］サブスタンスＰ（６−１１）である。これらの実施形態および関連する実施形態は当業者に理解される。
【０１４４】
別の実施形態では、抗原は感染性疾病抗原である。一実施形態では、抗原は自己抗原（auto  antigen）または自己抗原（self-antigen）である。
【０１４５】
別の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５ヒトパピローマウイルスからのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、またはこれらの組み合せから選択される。
【０１４６】
他の実施形態では、抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳３、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【０１４７】
本明細書に開示される方法および組成物によって誘発される免疫応答は、別の実施形態ではＴ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【０１４８】
別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法の組み換え型リステリアは、血管原性のポリペプチドを含む。別の実施形態では、ガン療法に対する抗血管形成アプローチは大変有望であり、また一実施形態では、かかる抗血管形成療法の１つのタイプは周皮細胞を標的にする。別の実施形態では、血管内皮細胞および周皮細胞上の分子標的は、抗腫瘍療法のために重要な標的である。別の実施形態では、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲ−β）シグナル伝達は周皮細胞を新たに形成される血管に採用するために重要である。したがって、一実施形態では、本明細書に開示されるような血管形成ポリペプチドは周皮細胞シグナル伝達に関与する分子を阻害し、これは一実施形態ではＰＤＧＦＲ−βである。
【０１４９】
一実施形態では、本発明の組成物は血管形成因子またはその免疫原性断片を含み、一実施形態では、免疫原性断片は宿主免疫系によって識別される１つ以上のエピトープを含む。一実施形態では、血管形成因子は新たな血管の形成に関与する分子である。一実施形態では、血管形成因子はＶＥＧＦＲ２である。別の実施形態では、本発明の血管形成因子は、アンギオジェニン；アンジオポイエチン−１；Ｄｅｌ−１；線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）；ホリスタチン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；レプチン；ミッドカイン；胎盤成長因子；血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；スルビビン；形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）；形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）；腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）である。別の実施形態では、血管形成因子は血管形成タンパク質である。一実施形態では、成長因子は血管形成タンパク質である。一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用する血管形成タンパク質は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲおよびニューロピリン１（ＮＲＰ−１）；アンジオポイエチン１（Ａｎｇ１）およびＴｉｅ２；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；ＢＢホモ二量体）およびＰＤＧＦＲ；形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、エンドグリンおよびＴＧＦ−β受容体；単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）；インテグリンαＶβ３、αＶβ５およびα５β１；ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１；エフリン；プラスミノーゲン活性化因子；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）およびＣＯＸ−２；ＡＣ１３３；またはＩｄ１／Ｉｄ３である。一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用する血管形成タンパク質はアンジオポイエチンであり、一実施形態では、これはアンジオポイエチン１、アンジオポイエチン３、アンジオポイエチン４、またはアンジオポイエチン６である。一実施形態では、エンドグリンはＣＤ１０５；ＥＤＧ；ＨＨＴ１；ＯＲＷ；またはＯＲＷ１としても知られる。一実施形態では、実施形態エンドグリンはＴＧＦベータ共受容体である。
【０１５０】
一実施形態では、本明細書に開示ガンワクチンは、腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を破壊し、そして疾患を撲滅することができるエフェクターＴ細胞を生成する。一実施形態では、自然に生じる腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、結腸、卵巣、およびメラノーマなどのいくつかの腫瘍ではより良い予後に関連付けられる。結腸ガンでは、微小転移巣の兆候を有しない腫瘍は免疫細胞の浸潤およびＴｈ１発現プロファイルの増加を有し、これは患者の生存の改善と相関する。さらに、Ｔ細胞による腫瘍の浸潤は、前臨床試験と人体試験との両方で免疫療法アプローチの成功に関連付けられた。一実施形態では、リンパ球の腫瘍部位の中への浸潤は、腫瘍血管系の内皮細胞内の接着分子の上方調節に依存し、一般的にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１などの炎症促進性のサイトカインによる。細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、血管内皮細胞接着分子１（Ｖ−ＣＡＭ−１）、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）およびＥ−セレクチンを含む腫瘍内へのリンパ球の浸潤のプロセス中にいくつかの接着分子が暗示される。しかしながら、これらの細胞接着分子は腫瘍血管系内で一般に下方調節される。したがって、一実施形態では、本明細書に開示されるガンワクチンはＴＩＬ、上方調節接着分子（一実施形態では、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＶＡＰ−１、Ｅ−セレクチン、またはこれらの組み合せ）、上方調節炎症促進性のサイトカイン（一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、またはこれらの組み合せ）、またはこれらの組み合せを増加する。
【０１５１】
一実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法は、抗血管形成療法を提供するが、これは一実施形態では免疫療法戦略を改善しうる。一実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法は、インビボでの内皮の細胞アネルギーを、腫瘍血管内の接着分子を上方制御し、白血球−血管の相互作用を高めることにより回避させるが、これがＣＤ８＋Ｔ細胞などの腫瘍の浸潤性白血球数を増加させる。興味深いことに、抗腫瘍保護の促進は、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋腫瘍潤滑性Ｔ細胞数の増加と、ＶＥＧＦ遮断に伴う腫瘍内の制御性Ｔ細胞数の明白な減少と相関性がある。
【０１５２】
一実施形態では、抗血管形成抗原を腫瘍との関連性のある抗原と、本明細書で説明した腫瘍に罹患した宿主に同時に送達することで、腫瘍増殖およびより強力な治療有効性に影響を及ぼすにあたり相乗効果がある。
【０１５３】
別の実施形態では、ワクチン接種による周皮細胞の標的化は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）浸潤、周皮細胞の破壊、血管の不安定化および脈管炎症につながり、これは別の実施形態では、リンパ球の接着および遊出にとって重要である内皮細胞内の接着分子の上方制御に関連し、最終的に腫瘍組織を浸潤するリンパ球の能力を高める。別の実施形態では、腫瘍特異的抗原が付随的に送達されることにより、腫瘍部位に侵入し腫瘍細胞を殺すことができるリンパ球が生成される。
【０１５４】
一実施形態では、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲ−β）シグナル伝達は周皮細胞を新たに形成される血管に採用するために重要である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２およびＰＤＧＦＲ−βを同時に抑制することで、内皮細胞のアポトーシスおよび腫瘍血管の退行（一実施形態では、腫瘍血管のおよそ４０％）が誘発される。
【０１５５】
別の実施形態では、前記組み換え型リステリア株は栄養要求性リステリア株である。別の実施形態では、前記栄養要求性リステリア株は、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体である。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、核酸分子は組み換え型細菌性株内で安定して維持される。
【０１５６】
一実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病原性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または切断ＬＬＯ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。
【０１５７】
別の実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄａである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｒｆＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＡである。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的な特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はＥＧＤリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では、本発明で使用される株は非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。なお別の実施形態では、リステリア株はｐｒｆＡ変異体、ＡｃｔＡ変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの両方を欠失した二重変異体である。これらすべてのリステリア株は、本明細書に提供される方法での使用が意図されている。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１５８】
一実施形態では、リステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これはプロセスに関与するので、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。
【０１５９】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ａｃｔＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちの任意の単一遺伝子または遺伝子の組み合せの不活性化突然変異を含む。
【０１６０】
一実施形態では、ワクチンベクターとして有用な栄養要求性変異体は、数多くの方法で生成されうる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン栄養要求性変異体は、一実施形態では、ｄａｌ遺伝子およびｄａｔ遺伝子の両方を破壊してリステリアの弱毒化栄養要求性株を生成することで生成されうるが、これには、増殖のためにＤ−アラニンを外因的に追加する必要がある。別の実施形態では、栄養要求性は、プラスミドまたはエピソームからのｄａｌ遺伝子の発現によって補完されうる。
【０１６１】
別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性Ｄ−アラニンラセマーゼ（Ｄａｌ）遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性Ｄ−アミノ酸転移酵素（Ｄａｔ）遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性のＤａｌ遺伝子およびＤａｔ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性のＤａｌ／Ｄａｔ遺伝子およびａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性のＤａｌ／Ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子およびｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ｐｒｆＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性のＤａｌ／Ｄａｔ遺伝子、ａｃｔＡ遺伝子およびｐｒｆＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、不活性化突然変異は欠失突然変異である。別の実施形態では、不活性化突然変異は短縮である。別の実施形態では、不活性化突然変異は置換突然変異である。
【０１６２】
一実施形態では、突然変異をつくる方法は当該技術分野で既知であり、本発明での使用が意図されている。
【０１６３】
一実施形態では、Ｄ−アラニンを欠損したリステリアのＡＡ株の生成は、例えば、欠失突然変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の発生の結果として生じる突然変異生成、タンパク質の中途終始を生じる突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節性配列の突然変異を含む、当業者には周知の数多くの方法で達成されうる。別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ技法を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射、およびそれに続く突然変異体の選択を使用する従来の突然変異生成技術を使用して突然変異生成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰をともなう可能性が低いため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異体は、単純な実験室の培養アッセイでＤ−アラニンの非存在下で成長する能力を試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で成長することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
【０１６４】
別の実施形態では、本明細書に開示されるように、リステリアの突然変異生成のための標的として上述のＤ−アラニンに関連する遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子が使用されてもよい。
【０１６５】
一実施形態では、前記栄養要求性リステリア株は、前記栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソームの発現ベクターを含む。別の実施形態では、「エピソーム」という用語およびそれと文法的に同等な用語は、宿主細胞の細胞質内で自律的に複製できる染色体外ＤＮＡを意味する。別の実施形態では、エピソームはプラスミドである。別の実施形態では、エピソームは発現ベクターである。
【０１６６】
別の実施形態では、プラスミドは組み込みプラスミドであり、宿主の染色体にそれが組み込まれるようにする配列を含む。
【０１６７】
別の実施形態では、本明細書で提供されている構成物はエピソームの様式でリステリア株内に含有される。別の実施形態では、外来抗原は組み換え型リステリア株が抱えるベクターから発現される。別の実施形態では、前記エピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。一実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の抗原はＰＥＳＴ配列を含むオリゴペプチドに遺伝学的に融合される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む前記内因性ポリペプチドはＬＬＯである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む前記内因性ポリペプチドはＡｃｔＡである。
【０１６８】
別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型細菌株の染色体の残りのものに欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。一実施形態では、内在性代謝遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、内在性代謝遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、前記代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、前記代謝酵素は前記組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、前記代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、前記代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【０１６９】
別の実施形態では、前記代謝酵素は、細胞壁合成で使用されるアミノ酸（ＡＡ）の形成を触媒する。別の実施形態では、前記代謝酵素は、細胞壁合成で使用されるＡＡの合成を触媒する。別の実施形態では、前記代謝酵素は、細胞壁合成で使用されるＡＡの合成に関与する。別の実施形態では、ＡＡは細胞壁生物発生に使用される。
【０１７０】
別の実施形態では、代謝酵素は細胞壁の構成要素であるＤ−グルタミン酸のための合成酵素である。
【０１７１】
別の実施形態では、代謝酵素はアラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）によりコードされる。別の実施形態では、ｄａｌ遺伝子はアラニンラセマーゼをコードし、これがＬ−アラニン←→Ｄ−アラニン反応を触媒する。
【０１７２】
本明細書で開示されている方法および組成物の方法および組成物のｄａｌ遺伝子は、別の実施形態では、次の配列によりコードされる。
【０１７３】
ａｔｇｇｔｇａｃａｇｇｃｔｇｇｃａｔｃｇｔｃｃａａｃａｔｇｇａｔｔｇａａａｔａｇａｃｃｇｃｇｃａｇｃａａｔｔｃｇｃｇａａａａｔａｔａａａａａａｔｇａａｃａａａａｔａａａｃｔｃｃｃｇｇａａａｇｔｇｔｃｇａｃｔｔａｔｇｇｇｃａｇｔａｇｔｃａａａｇｃｔａａｔｇｃａｔａｔｇｇｔｃａｃｇｇａａｔｔａｔｃｇａａｇｔｔｇｃｔａｇｇａｃｇｇｃｇａａａｇａａｇｃｔｇｇａｇｃａａａａｇｇｔｔｔｃｔｇｃｇｔａｇｃｃａｔｔｔｔａｇａｔｇａｇｇｃａｃｔｇｇｃｔｃｔｔａｇａｇａａｇｃｔｇｇａｔｔｔｃａａｇａｔｇａｃｔｔｔａｔｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔｇｇｔｇｃａａｃｃａｇａａａａｇａａｇａｔｇｃｔａａｔｃｔｇｇｃａｇｃｃａａａａａｃｃａｃａｔｔｔｃａｃｔｔａｃｔｇｔｔｔｔｔａｇａｇａａｇａｔｔｇｇｃｔａｇａｇａａｔｃｔａａｃｇｃｔａｇａａｇｃａａｃａｃｔｔｃｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａａｇｔａｇａｔａｇｃｇｇｔａｔｇｇｇｇｃｇｔｃｔｃｇｇｔａｔｔｃｇｔａｃｇａｃｔｇａａｇａａｇｃａｃｇｇｃｇａａｔｔｇａａｇｃａａｃｃａｇｔａｃｔａａｔｇａｔｃａｃｃａａｔｔａｃａａｃｔｇｇａａｇｇｔａｔｔｔａｃａｃｇｃａｔｔｔｔｇｃａａｃａｇｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｇａａａｃｔａｇｔｔａｔｔｔｔｇａａｃａａｃａａｔｔａｇｃｔａａｇｔｔｃｃａａａｃｇａｔｔｔｔａａｃｇａｇｔｔｔａａａａａａａｃｇａｃｃａａｃｔｔａｔｇｔｔｃａｔａｃａｇｃｃａａｔｔｃａｇｃｔｇｃｔｔｃａｔｔｇｔｔａｃａｇｃｃａｃａａａｔｃｇｇｇｔｔｔｇａｔｇｃｇａｔｔｃｇｃｔｔｔｇｇｔａｔｔｔｃｇａｔｇｔａｔｇｇａｔｔａａｃｔｃｃｃｔｃｃａｃａｇａａａｔｃａａａａｃｔａｇｃｔｔｇｃｃｇｔｔｔｇａｇｃｔｔａａａｃｃｔｇｃａｃｔｔｇｃａｃｔｃｔａｔａｃｃｇａｇａｔｇｇｔｔｃａｔｇｔｇａａａｇａａｃｔｔｇｃａｃｃａｇｇｃｇａｔａｇｃｇｔｔａｇｃｔａｃｇｇａｇｃａａｃｔｔａｔａｃａｇｃａａｃａｇａｇｃｇａｇａａｔｇｇｇｔｔｇｃｇａｃａｔｔａｃｃａａｔｔｇｇｃｔａｔｇｃｇｇａｔｇｇａｔｔｇａｔｔｃｇｔｃａｔｔａｃａｇｔｇｇｔｔｔｃｃａｔｇｔｔｔｔａｇｔａｇａｃｇｇｔｇａａｃｃａｇｃｔｃｃａａｔｃａｔｔｇｇｔｃｇａｇｔｔｔｇｔａｔｇｇａｔｃａａａｃｃａｔｃａｔａａａａｃｔａｃｃａｃｇｔｇａａｔｔｔｃａａａｃｔｇｇｔｔｃａａａａｇｔａａｃｇａｔａａｔｔｇｇｃａａａｇａｔｃａｔｇｇｔａａｃａｃｇｇｔａａｃａｇｃａｇａｔｇａｔｇｃｃｇｃｔｃａａｔａｔｔｔａｇａｔａｃａａｔｔａａｔｔａｔｇａｇｇｔａａｃｔｔｇｔｔｔｇｔｔａａａｔｇａｇｃｇｃａｔａｃｃｔａｇａａａａｔａｃａｔｃｃａｔｔａｇ（配列番号：２４  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３８）  別の実施形態では、ヌクレオチドをコードするｄａｌは、配列番号：２４の相同体である。別の実施形態では、ヌクレオチドをコードするｄａｌは配列番号：２４の変異体である。別の実施形態では、ヌクレオチドをコードするｄａｌは、配列番号：２４の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のｄａｌ遺伝子によりコードされる。
【０１７４】
別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は次の配列を持つ。
【０１７５】
ＭＶＴＧＷＨＲＰＴＷＩＥＩＤＲＡＡＩＲＥＮＩＫＮＥＱＮＫＬＰＥＳＶＤＬＷＡＶＶＫＡＮＡＹＧＨＧＩＩＥＶＡＲＴＡＫＥＡＧＡＫＧＦＣＶＡＩＬＤＥＡＬＡＬＲＥＡＧＦＱＤＤＦＩＬＶＬＧＡＴＲＫＥＤＡＮＬＡＡＫＮＨＩＳＬＴＶＦＲＥＤＷＬＥＮＬＴＬＥＡＴＬＲＩＨＬＫＶＤＳＧＭＧＲＬＧＩＲＴＴＥＥＡＲＲＩＥＡＴＳＴＮＤＨＱＬＱＬＥＧＩＹＴＨＦＡＴＡＤＱＬＥＴＳＹＦＥＱＱＬＡＫＦＱＴＩＬＴＳＬＫＫＲＰＴＹＶＨＴＡＮＳＡＡＳＬＬＱＰＱＩＧＦＤＡＩＲＦＧＩＳＭＹＧＬＴＰＳＴＥＩＫＴＳＬＰＦＥＬＫＰＡＬＡＬＹＴＥＭＶＨＶＫＥＬＡＰＧＤＳＶＳＹＧＡＴＹＴＡＴＥＲＥＷＶＡＴＬＰＩＧＹＡＤＧＬＩＲＨＹＳＧＦＨＶＬＶＤＧＥＰＡＰＩＩＧＲＶＣＭＤＱＴＩＩＫＬＰＲＥＦＱＴＧＳＫＶＴＩＩＧＫＤＨＧＮＴＶＴＡＤＤＡＡＱＹＬＤＴＩＮＹＥＶＴＣＬＬＮＥＲＩＰＲＫＹＩＨ（配列番号：２５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４２８）  別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は配列番号：２５の相同体である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は配列番号：２５の変異型である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は配列番号：２５の異性体である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は配列番号：２５の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は配列番号：２５の相同体の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は配列番号：２５の変異型の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は配列番号：２５の異性体の断片である。
【０１７６】
別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のリステリアｄａｌタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のグラム陽性ｄａｌタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のｄａｌタンパク質である。
【０１７７】
別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物のｄａｌタンパク質は、その酵素活性を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の９０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の８０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の７０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の６０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の５０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の４０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の３０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の２０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の１０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の５%を保持する。
【０１７８】
別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）によりコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成は、部分的にｄａｔ遺伝子によって制御されるが、これは、Ｄ−ｇｌｕ  ＋  ｐｙｒのａｌｐｈａ−ケトグルタル酸塩  ＋  Ｄ−ａｌａへの変換、および逆反応に関与する。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明で利用されるｄａｔ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３９に記載されている配列を持つ。別の実施形態では、ｄａｔ遺伝子は、当該技術で既知の別の任意のｄａｔ遺伝子である。
【０１８０】
本明細書で開示されている方法および組成物の方法および組成物のｄａｔ遺伝子は、別の実施形態では、次の配列によりコードされる。
【０１８１】
ａｔｇａａａｇｔａｔｔａｇｔａａａｔａａｃｃａｔｔｔａｇｔｔｇａａａｇａｇａａｇａｔｇｃｃａｃａｇｔｔｇａｃａｔｔｇａａｇａｃｃｇｃｇｇａｔａｔｃａｇｔｔｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｔａｔａｔｇａａｇｔａｇｔｔｃｇｔｃｔａｔａｔａａｔｇｇａａａａｔｔｃｔｔｔａｃｔｔａｔａａｔｇａａｃａｃａｔｔｇａｔｃｇｃｔｔａｔａｔｇｃｔａｇｔｇｃａｇｃａａａａａｔｔｇａｃｔｔａｇｔｔａｔｔｃｃｔｔａｔｔｃｃａａａｇａａｇａｇｃｔａｃｇｔｇａａｔｔａｃｔｔｇａａａａａｔｔａｇｔｔｇｃｃｇａａａａｔａａｔａｔｃａａｔａｃａｇｇｇａａｔｇｔｃｔａｔｔｔａｃａａｇｔｇａｃｔｃｇｔｇｇｔｇｔｔｃａａａａｃｃｃａｃｇｔａａｔｃａｔｇｔａａｔｃｃｃｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｃｔｃｔａｇａａｇｇｃｇｔｔｔｔａａｃａｇｃａｇｃａｇｃｔｃｇｔｇａａｇｔａｃｃｔａｇａａａｃｇａｇｃｇｔｃａａｔｔｃｇｔｔｇａａｇｇｔｇｇａａｃｇｇｃｇａｔｔａｃａｇａａｇａａｇａｔｇｔｇｃｇｃｔｇｇｔｔａｃｇｃｔｇｔｇａｔａｔｔａａｇａｇｃｔｔａａａｃｃｔｔｔｔａｇｇａａａｔａｔｔｃｔａｇｃａａａａａａｔａａａｇｃａｃａｔｃａａｃａａａａｔｇｃｔｔｔｇｇａａｇｃｔａｔｔｔｔａｃａｔｃｇｃｇｇｇｇａａｃａａｇｔａａｃａｇａａｔｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａａａｃｇｔｔｔｃｔａｔｔａｔｔａａａｇａｔｇｇｔｇｔａｔｔａｔｇｇａｃｇｃａｔｇｃｇｇｃａｇａｔａａｃｔｔａａｔｃｔｔａａａｔｇｇｔａｔｃａｃｔｃｇｔｃａａｇｔｔａｔｃａｔｔｇａｔｇｔｔｇｃｇａａａａａｇａａｔｇｇｃａｔｔｃｃｔｇｔｔａａａｇａａｇｃｇｇａｔｔｔｃａｃｔｔｔａａｃａｇａｃｃｔｔｃｇｔｇａａｇｃｇｇａｔｇａａｇｔｇｔｔｃａｔｔｔｃａａｇｔａｃａａｃｔａｔｔｇａａａｔｔａｃａｃｃｔａｔｔａｃｇｃａｔａｔｔｇａｃｇｇａｇｔｔｃａａｇｔａｇｃｔｇａｃｇｇａａａａｃｇｔｇｇａｃｃａａｔｔａｃａｇｃｇｃａａｃｔｔｃａｔｃａａｔａｔｔｔｔｇｔａｇａａｇａａａｔｃａｃｔｃｇｔｇｃａｔｇｔｇｇｃｇａａｔｔａｇａｇｔｔｔｇｃａａａａｔａａ（配列番号：２６；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３９）  別の実施形態では、ヌクレオチドをコードするｄａｔは、配列番号：２６の相同体である。別の実施形態では、ヌクレオチドをコードするｄａｔは配列番号：２６の変異体である。別の実施形態では、ヌクレオチドをコードするｄａｔは、配列番号：２６の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のｄａｔ遺伝子によりコードされる。
【０１８２】
別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は次の配列を持つ。
【０１８３】
ＭＫＶＬＶＮＮＨＬＶＥＲＥＤＡＴＶＤＩＥＤＲＧＹＱＦＧＤＧＶＹＥＶＶＲＬＹＮＧＫＦＦＴＹＮＥＨＩＤＲＬＹＡＳＡＡＫＩＤＬＶＩＰＹＳＫＥＥＬＲＥＬＬＥＫＬＶＡＥＮＮＩＮＴＧＮＶＹＬＱＶＴＲＧＶＱＮＰＲＮＨＶＩＰＤＤＦＰＬＥＧＶＬＴＡＡＡＲＥＶＰＲＮＥＲＱＦＶＥＧＧＴＡＩＴＥＥＤＶＲＷＬＲＣＤＩＫＳＬＮＬＬＧＮＩＬＡＫＮＫＡＨＱＱＮＡＬＥＡＩＬＨＲＧＥＱＶＴＥＣＳＡＳＮＶＳＩＩＫＤＧＶＬＷＴＨＡＡＤＮＬＩＬＮＧＩＴＲＱＶＩＩＤＶＡＫＫＮＧＩＰＶＫＥＡＤＦＴＬＴＤＬＲＥＡＤＥＶＦＩＳＳＴＴＩＥＩＴＰＩＴＨＩＤＧＶＱＶＡＤＧＫＲＧＰＩＴＡＱＬＨＱＹＦＶＥＥＩＴＲＡＣＧＥＬＥＦＡＫ（配列番号：２７；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３９）  別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は配列番号：２７の相同体である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は配列番号：２７の変異型である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は配列番号：２７の異性体である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は配列番号：２７の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は配列番号：２７の相同体の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は配列番号：２７の変異型の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は配列番号：２７の異性体の断片である。
【０１８４】
別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のリステリアｄａｔタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、当該技術で既知のその他任意のグラム陽性ｄａｔタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のｄａｔタンパク質である。
【０１８５】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のｄａｔタンパク質は、その酵素活性を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の９０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の８０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の７０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の６０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の５０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の４０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の３０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の２０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の１０%を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の５%を保持する。
【０１８６】
別の実施形態では、代謝酵素はｄｇａによってコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成はまた、部分的にｄｇａ遺伝子によって制御され、またＤ−グルタミン酸合成のための栄養要求性変異体は、Ｄ−グルタミン酸の不在下では成長しない（Ｐｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９５、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７：３３６−３４２）。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、Ｄ−グルタミン酸について栄養要求性である。さらなる例には、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が含まれる。こうした合成遺伝子は、β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、また不活性化した時、この合成経路のために変異体を栄養要求性にする（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２９９−３０２）。別の実施形態では、ｄｇａタンパク質は当該技術分野で既知の任意の他のリステリアｄｇａタンパク質である。別の実施形態では、ｄｇａタンパク質は、当該技術で既知のその他任意のグラム陽性ｄｇａタンパク質である。
【０１８７】
別の実施形態では、代謝酵素はａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によりコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アラニン合成に関与する当該技術分野で既知の任意の他の酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、Ｌ−アラニン合成に関与する当該技術分野で既知の任意の他の酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、Ｄ−アラニン合成に関与する当該技術分野で既知の任意の他の酵素である。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、Ｄ−アラニンについて栄養要求性である。アラニン合成について栄養要求性の細菌は、当該技術で周知であり、例えば、大腸菌（Ｓｔｒｙｃｈら、２００２、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８４：４３２１−４３２５）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｔａｕｃｈら、２００２、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：７９−９１）、およびリステリア・モノサイトゲネス（Ｆｒａｎｋｅｌら、米国特許第６，０９９，８４８号））、ラクトコッカス属の種、および乳酸杆菌属の種、（Ｂｒｏｎら、２００２、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６８：５６６３−７０）に記述されている。別の実施形態では、当該技術で既知の任意のＤ−アラニン合成遺伝子が不活性化される。
【０１８８】
別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸アミノトランスフェラーゼである。
【０１８９】
別の実施形態では、代謝酵素はホスホセリン  アミノトランスフェラーゼであるｓｅｒＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は細胞壁成分ジアミノピメリン酸の合成に関与しているａｓｄ（アスパルテート-β-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタン酸塩からの５−アミノレブリン酸の形成を触媒するｇｓａＢ−  グルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタン酸塩からの５−アミノレブリン酸の形成を触媒するＨｅｍＬによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はL-アスパラギン酸塩および2-オキソグルタル酸塩からのオキザロ酢酸塩およびL-グルタミン酸塩の形成を触媒するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであるaspBによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアルギニン生合成に関連しているargF-1によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸生合成に関連しているａｒｏＥによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は３−デヒドロキナ酸塩生合成に関連しているａｒｏＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸生合成に関連しているａｒｏＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸生合成に関連しているａｒｏＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はヒスチジン生合成に関連しているｈｉｓＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はヒスチジン生合成に関連しているｈｉｓＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はヒスチジン生合成に関連しているｈｉｓＧによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はメチオニン生合成に関連しているｍｅｔＸによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はプロリン生合成に関連しているｐｒｏＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアルギニン生合成に関連しているａｒｇＲによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はアルギニン生合成に関連しているａｒｇＪによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はチアミン生合成に関連しているｔｈｉＩによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はトリプトファン生合成に関連しているＬＭＯｆ２３６５＿１６５２によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はトリプトファン生合成に関連しているａｒｏＡによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はバリンおよびイソロイシンの生合成に関連しているｉｌｖＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はバリンおよびイソロイシンの生合成に関連しているｉｌｖＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はロイシン生合成に関連しているｌｅｕＡによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はリジン生合成に関連しているｄａｐＦによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素はスレオニン生合成（全ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２９７３）に関連しているｔｈｒＢによってコードされる。
【０１９０】
別の実施形態では、代謝酵素はｔＲＮＡ合成酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素をコードするｔｒｐＳ遺伝子によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は当該技術分野で既知の任意の他のｔＲＮＡ合成酵素である。
【０１９１】
別の実施形態では、本明細書に開示される組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜株の普及を減少する。別の実施形態では、継代は株を弱毒化し、または別の実施形態では、株の病毒性を少なくする。組み換え型リステリア株を動物宿主を通して継代する方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、米国特許出願番号第１０／５４１，６１４号に記述されている。
【０１９２】
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、当該技術分野で既知の任意の他のリステリア種の組み換え型株である。各々の可能性は本明細書で開示した別個の実施形態を表す。別の実施形態では、本明細書で開示された方法および組成物で使用するためのリステリアタンパク質の配列は、上述の任意の菌株からのものである。
【０１９３】
一実施形態では、本明細書で開示されているリステリア・モノサイトゲネス株は、ＥＧＤ株、１０４０３Ｓ株、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００２株、Ｓ３株、ＮＣＴＣ  ５３４８株、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００６株、Ｍ７株、Ｓ１９株、または当該技術で既知のリステリア・モノサイトゲネスの別の株である。
【０１９４】
別の実施形態では、組み換え型リステリア株はワクチン株であり、これは一実施形態では細菌性ワクチン株である。
【０１９５】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株は凍結細胞バンク内で保存されている。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は凍結細胞バンクに保存されている。
【０１９６】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の細胞バンクはマスター細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクはワーキング細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクは製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクは臨床グレード材料の生産を目的としている。別の実施形態では、細胞バンクはヒトへの使用のための規制実施に適合する。別の実施形態では、細胞バンクは当該技術分野で既知の任意の他のタイプの細胞バンクである。
【０１９７】
別の実施形態では、「製造管理および品質管理に関する基準」は米国連邦規則集の（２１  ＣＦＲ  ２１０−２１１）によって定義される。別の実施形態では、「製造管理および品質管理に関する基準」は、臨床グレードの材料生産のため、またはヒトの摂取のための他の基準、例えば、米国以外の国の基準などによって定義される。
【０１９８】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株はワクチン用量のバッチ由来である。
【０１９９】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株は、本明細書で開示される方法によって生成される冷凍ストックからのものである。
【０２００】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株は、本明細書で開示される方法によって生成される凍結乾燥ストックからのものである。
【０２０１】
別の実施形態では、本発明の細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン投与量バッチは、解凍時に90%を越える生存能力を示す。別の実施形態では、解凍の後、凍結保存または冷凍保存のために２４時間保存する。別の実施形態では、保存は２日間である。別の実施形態では、保存は３日間である。別の実施形態では、保存は４日間である。別の実施形態では、保存は１週間である。別の実施形態では、保存は２週間である。別の実施形態では、保存は３週間である。別の実施形態では、保存は１か月である。別の実施形態では、保存は２か月である。別の実施形態では、保存は３か月である。別の実施形態では、保存は５か月である。別の実施形態では、保存は６か月である。別の実施形態では、保存は９か月である。別の実施形態では、保存は１年である。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明の細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン投与量バッチは、培養液中でリステリア株の菌株を培養する工程と、グリセロールを含む溶液中で菌株を凍結する工程と、リステリア株を-20℃より低い温度で保存する工程とを含む方法により凍結保存される。別の実施形態では、温度は約-70℃である。別の実施形態では、温度約-70〜-80℃である。
【０２０３】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、菌株（例えば、リステリアワクチン株の菌株で、リステリアワクチン投与量バッチを生成するために使用されたもの）は、細胞バンクから接種される。別の実施形態では、菌株は凍結ストックから接種される。別の実施形態では、菌株は種培養から接種される。別の実施形態では、菌株はコロニーから接種される。別の実施形態では、菌株は対数中期増殖期に接種される。別の実施形態では、菌株はほぼ対数中期増殖期に接種される。別の実施形態では、菌株は別の増殖期に接種される。
【０２０４】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、凍結に使用される溶液は、２〜２０％の量のグリセロールを含む。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は２０％である。別の実施形態では、量は１％である。別の実施形態では、量は１．５％である。別の実施形態では、量は３％である。別の実施形態では、量は４％である。別の実施形態では、量は５％である。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は７％である。別の実施形態では、量は９％である。別の実施形態では、量は１０％である。別の実施形態では、量は１２％である。別の実施形態では、量は１４％である。別の実施形態では、量は１６％である。別の実施形態では、量は１８％である。別の実施形態では、量は２２２％である。別の実施形態では、量は２５％である。別の実施形態では、量は３０％である。別の実施形態では、量は３５％である。別の実施形態では、量は４０％である。
【０２０５】
別の実施形態では、凍結に使用される溶液は、グリセロールの代わりに、別の束一的な添加物または凍結防止特性を備えた添加物を含む。別の実施形態では、凍結に使用される溶液は、グリセロールに加えて、別の束一的な添加物または凍結防止特性を備えた添加物を含む。別の実施形態では、添加物はマンニトールである。別の実施形態では、添加物はＤＭＳＯである。別の実施形態では、添加物はショ糖である。別の実施形態では、添加物はその他任意の束一的な添加物または当該技術で既知の凍結防止特性を備えた添加物である。
【０２０６】
一実施形態では、ワクチンはその組成物に晒された結果として、組成物内の抗原またはポリペプチドに対する免疫応答を誘発する組成物である。別の実施形態では、ワクチンは追加的にアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはその組合せを含む。別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は追加的に、一実施形態では自家性、また別の実施形態では被験者に対して異質遺伝子型の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。
【０２０７】
一実施形態では、「ワクチン」はその組成物に晒された結果として、組成物内の抗原またはポリペプチドに対する宿主内での免疫応答を誘発する組成物である。一実施形態では、免疫応答は、特定の抗原または抗原上の特定のエピトープに対するものである。一実施形態では、ワクチンはペプチドワクチン、別の実施形態ではＤＮＡワクチンとしうる。別の実施形態では、ワクチンは、細胞内に含められてもよく、また、別の実施形態では、細胞によって送達されてもよいが、これは一実施形態では細菌細胞であり、これは一実施形態ではリステリアである。一実施形態では、ワクチンは、被験者が疾患または状態を縮小または成長させるのを防止してもよく、別の実施形態では、ワクチンは疾患または状態を持つ被験者に対して療法的でもよい。一実施形態では、本発明のワクチンは、本発明の組成物およびアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはその組合せを含む。
【０２０８】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組み換え型リステリアを含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の免疫原性組成物は、本発明の組み換え型ワクチンベクターを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は本発明のプラスミドを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物はアジュバントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ワクチン組成物の一部として投与されうる。
【０２０９】
別の実施形態では、本発明のワクチンはアジュバントと共に送達される。一実施形態では、アジュバントは主にＴｈ１媒介の免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントはＴｈ１タイプの免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントはＴｈ１媒介の免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントは、抗体媒介の応答よりも細胞媒介性免疫応答を助ける。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のタイプのアジュバントであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は標的タンパク質に対するＴ細胞免疫応答の形成を誘発する。
【０２１０】
別の実施形態では、アジュバントはＭＰＬである。別の実施形態では、アジュバントはＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはＴＬＲ作動薬である。別の実施形態では、アジュバントはＴＬＲ４作動薬である。別の実施形態では、アジュバントはＴＬＲ９作動薬である。別の実施形態では、アジュバントはＲｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）である。別の実施形態では、アジュバントはイミキモドである。別の実施形態では、アジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはサイトカインまたはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはケモカインまたはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはＩＬ−１２またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはＩＬ−６またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはリポポリサッカリドである。別の実施形態では、アジュバントは、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  ｅｄ  （Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｐａｕｌ  （Ｅｄｉｔｏｒ）；  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４３：  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ＧＪＶ  Ｎｏｓｓａｌに記載があり、参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントである。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０２１１】
一実施形態では、本明細書には、組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む、被験者内の抗原に対する免疫応答を誘発する方法が提供されている。一実施形態では、本明細書には、組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む、被験者内の抗原に対する抗血管形成免疫応答を誘発する方法が提供されている。別の実施形態では、前記組み換え型リステリア株は、第１および第２の核酸分子を含む。別の実施形態では、それぞれの前記核酸分子は異種抗原をコードする。なお別の実施形態では、前記第１の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを持つオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。
【０２１２】
一実施形態では、本明細書には、被験者における少なくとも1つのガンを治療、抑制、または阻害する方法が提供されており、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、前記組み換え型リステリア株は、第１および第２の核酸分子を含む。別の実施形態では、それぞれの前記核酸分子は異種抗原をコードする。なお別の実施形態では、前記第一の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドをコードする核酸配列を持つオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作可能に組み込まれる。別の実施形態では、前記抗原のうち少なくとも1つは、前記ガン細胞の少なくとも1つの細胞によって発現される。
【０２１３】
一実施形態では、本明細書は、被験者におけるガンの発症を遅らせる方法を提供しており、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は、被験者におけるガンの進行を遅らせる方法を提供しており、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は、被験者におけるガンの寛解を延長させる方法を提供しており、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は、被験者における既存の腫瘍のサイズを縮小させる方法を提供しており、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は、被験者における既存の腫瘍の成長を防止する方法を提供しており、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は、被験者における新規もしくは追加的な腫瘍の成長を防止する方法を提供しており、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。
【０２１４】
一実施形態では、ガンまたは腫瘍は、特定のガンまたは腫瘍に対して影響を受けやすいことが分かっている特定の母集団で防止されうる。一実施形態では、こうした感受性は、一実施形態で、喫煙によってある母集団が肺ガンになりやすくなる場合があるなど、環境的因子による場合があり、一方で別の実施形態では、こうした感受性は遺伝的因子による場合があり、例えば、ＢＲＣＡ１／２突然変異を持つ母集団は、一実施形態では乳ガンに、また別の実施形態では卵巣ガンに対する影響を受けやすい場合がある。別の実施形態では、染色体８ｑ２４、染色体１７ｑ１２、および染色体１７ｑ２４．３での１つ以上の突然変異は、当該技術で既知のとおり、前立腺ガンに対する感受性を高めうる。ガン感受性に寄与するその他の遺伝的因子および環境的因子は当該技術分野で既知である。
【０２１５】
一実施形態では、組み換え型リステリア株を被験者に１×１０６〜１×１０７ＣＦＵの用量で投与する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株を１×１０７〜１×１０８ＣＦＵの用量で被験者に投与する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株を１×１０８〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量で被験者に投与する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株を１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量で被験者に投与する。別の実施形態では、用量は５〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１００〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１５×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜７０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜２０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜７×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜５×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜５×１０９ＣＦＵである。
【０２１６】
別の実施形態では、用量は１×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は６×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は７×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は８×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は１０×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は２．５×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は３．３×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０８生命体である。
【０２１７】
別の実施形態では、用量は１×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は６×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は７×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は８×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１０×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３．３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０１０生命体である。
【０２１８】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に提供されている組み換え型リステリア株を用いて被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法は本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含むワクチンのブースター用量を投与する工程を含む。
【０２１９】
「ブーストする」という用語が追加的なワクチンまたは免疫原性組成物または組み換え型リステリア株の用量を被験者に投与することを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。本発明の方法の別の実施形態では、２回のブースト（すなわち、合計３回の接種）が投与される。別の実施形態では、３回のブーストが投与される。別の実施形態では、４回のブーストが投与される。別の実施形態では、５回のブーストが投与される。別の実施形態では、６回のブーストが投与される。別の実施形態では、７回以上のブーストが投与される。
【０２２０】
別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型リステリア株は初期の「プライミング」接種で使用される株と同一である。別の実施形態では、ブースター株はプライミング株とは異なる。別の実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の代替形態である。別の実施形態では、プライミング接種とブースティング接種とでは同一の用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより大きい用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより小さい用量が使用される。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースターワクチン接種を実施する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースターワクチン接種は単一のプライミングワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後に単一のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、２回のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、３回のブースターワクチン接種を実施する。一実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンとの間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンとの間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブーストワクチンをプライムワクチンの８〜１０週間後に投与する。
【０２２１】
別の実施形態では、本発明の方法は、human被験者を本明細書に提供されている組み換え型リステリア株を用いてブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法は本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物のブースター用量を投与する工程を含む。別の実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の代替形態である。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースター免疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の単一のプライミング用量の後に続く。別の実施形態では、プライミング用量の後に単一のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に２回のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に３回のブースター投与量を投与する。一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、この用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム用量とブースト用量との間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト用量を免疫原性組成物のプライム用量の８〜１０週間後に投与する。
【０２２２】
異種「プライムブースト」戦略は免疫応答および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１２２６−３１（２００２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対する免疫応答を最大化するように思われる。ＤＮＡワクチンプライミングの後にアジュバント中のタンパク質用いたブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達が続くのが抗原特異的な抗体およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるようである。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：９５−１０２（２０００）；Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡをプライムでワクチン接種し、ＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）を用いたブーストを後に続けた場合、ＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％  ＰＯＥ）をＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えることがＴ細胞応答を強化することを示唆している。ＤＮＡ／ポロクサマーのプライムの後にＡｄ５−ｇａｇブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロクサマーを用いない）プライムの後に続くＡｄ５−ｇａｇブーストで、またはＡｄ５−ｇａｇのみで誘発される応答より大きい。Ｓｈｉｖｅｒ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許公開第ＵＳ２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、Ｂ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られる。さらに、米国特許第６，５００，４３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が０〜１０日間または３〜７日間であるのが好ましい。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（すべての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属からの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれに限定されない）のものが挙げられる��すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
一実施形態では、核酸分子がサバイビンをコードし、および方法はリンパ腫を治療、阻害または抑制するためである。別の実施形態では、核酸分子がサバイビンをコードし、および方法は、乳ガンまたは本明細書に提供されたその他任意のタイプのガンを治療、阻害または抑制するためである。別の実施形態では、核酸分子がサバイビンをコードし、方法は、リンパ腫の転移を治療、阻害、または抑制するためであり、これは一実施形態では骨への転移であり、また別の実施形態ではその他の器官への転移を含む。
【０２２４】
一実施形態では、リンパ腫はＢ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはその組合せである。
【０２２５】
本明細書で開示した方法および組成物の標的であるガンは、別の実施形態ではメラノーマである。別の実施形態では、このガンは肉腫である。別の実施形態では、このガンは悪性腫瘍である。別の実施形態では、このガンは中皮腫（例えば、悪性中皮腫）である。別の実施形態では、このガンは神経膠腫である。別の実施形態では、このガンは生殖細胞腫瘍である。別の実施形態では、このガンは絨毛ガンである。
【０２２６】
別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンはリンパ腫である。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、このガンは結腸直腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞性肺ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは肛門ガンである。別の実施形態では、このガンは食道ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。
【０２２７】
別の実施形態では、このガンは非小細胞性肺ガン（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、このガンは大腸ガンである。別の実施形態では、このガンは肺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮ガンである。別の実施形態では、このガンは甲状腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肝細胞ガンである。別の実施形態では、このガンは甲状腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肝臓ガンである。別の実施形態では、このガンは腎臓ガンである。別の実施形態では、このガンはカポジである。別の実施形態では、このガンは肉腫である。別の実施形態では、このガンは悪性腫瘍または肉腫である。
【０２２８】
一実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法は、本明細書に記述されている任意のガンに関連するか、またはそれに起因する固形腫瘍の治療に使用できる。別の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は線維形成性小円形細胞腫瘍である。
【０２２９】
別の実施形態では、ワクチンはヒト被験者で試験され、また例えば、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答を直接測定したり、例えば、腫瘍転移の数またはサイズを決定することにより疾患の進行を測定したり、疾患の症状（咳、胸痛、体重減少など）を監視したりするなど、当該技術で周知の方法を使用して有効性が監視される。ヒト被験者における前立腺ガンワクチンの有効性を評価するための方法は当該技術で周知であり、例えば、Ｕｅｎａｋａ  Ａら（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｚｅｄ  ｐｕｌｌｕｌａｎ  （ＣＨＰ）  ａｎｄ  ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００７  Ａｐｒ  １９；７：９）およびＴｈｏｍａｓ−Ｋａｓｋｅｌ  ＡＫら（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＰＳＣＡ  ａｎｄ  ＰＳＡ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＴＨ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００６  Ｎｏｖ  １５；１１９（１０）：２４２８−３４）に記述されている。
【０２３０】
一実施形態では、本明細書は、リステリアゲノムに動作可能に組み込まれた核酸分子を含む組み換え型リステリア株を提供している。別の実施形態では、前記核酸分子は、（a）ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドおよび（b）オープンリーディングフレーム内に抗原を含むポリペプチドをコードする。
【０２３１】
一実施形態では、本明細書には、被験者における少なくとも1つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法が提供されており、これは組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、前記組み換え型リステリア株は、第１および第２の核酸分子を含む。別の実施形態では、それぞれの前記核酸分子は異種抗原をコードする。別の実施形態では、前記第１の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む未変性ポリペプチドを持つオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作可能に組み込まれ、ここで前記抗原は前記腫瘍の少なくとも１つの細胞により発現される。別の実施形態では、第１および第２の両方の核酸分子がエピソームで発現される。
【０２３２】
一実施形態では、「抗原」という用語は、生物体と接触して配置された時に、その結果として生物体からの検出可能な免疫応答が生成される物質を意味する。抗原は、リピド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、またはその組み合わせおよび変形としうる。
【０２３３】
一実施形態では、「変異体」は、母集団の大半とは異なるが、なおもそれに属すると考えられる共通の形態（例えば、スプライスバリアント）と十分に類似した、アミノ酸または核酸配列（または他の実施形態では、生物体または組織）を意味する。
【０２３４】
一実施形態では、「アイソフォーム」は、例えば、同一のタンパク質の別のアイソフォームまたは異形と比較してわずかな差異しかないタンパク質など、分子の異形を意味する。一実施形態では、アイソフォームは、異なるが関連した遺伝子から生成されうるか、または別の実施形態では、同一の遺伝子から選択的スプライシングによって生じることがある。別の実施形態では、アイソフォームは単一のヌクレオチド多型によってもたらされる。
【０２３５】
一実施形態では、「断片」は、完全長のタンパク質またはポリペプチドよりも短いかまたは少ないアミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチドを意味する。別の実施形態では、断片は、完全長の核酸よりも短いかまたは少ないヌクレオチドを含む核酸を意味する。別の実施形態では、断片はＮ末端断片である。別の実施形態では、断片はＣ末端断片である。一実施形態では、断片はタンパク質、ペプチド、または核酸の配列内部分である。一実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性断片である。一実施形態では、断片は１０〜２０の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は５つの核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は１００〜２００の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は１００〜５００の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は５０〜２００の核酸またはアミノ酸を有し、また別の実施形態では、断片は１０〜２５０の核酸またはアミノ酸を有する。
【０２３６】
一実施形態では、「免疫原性」または「免疫原性」は、本明細書では、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体が動物に投与された時に、動物において免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の固有の能力を意味するために使用される。したがって、一実施形態では「免疫原性の促進」は、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体が動物に投与された時に、動物において免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の固有の能力を増大することを意味する。免疫応答を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体の能力の増大は、一実施形態では、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に対する抗体数の増加、抗原または生物体に対する抗体の多様性の増大、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に特異的なT細胞数の増加、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生物体に対する細胞毒性またはヘルパーＴ細胞の応答の増大、およびこれに類するものによって測定されうる。
【０２３７】
一実施形態では、「相同体」は特定の核酸またはアミノ酸配列と一定割合の配列同一性を共有する核酸またはアミノ酸配列を意味する。一実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法で有用な配列は、特定のＬＬＯ配列またはそのＮ末端断片、ＡｃｔＡ配列またはそのＮ末端断片、または本明細書で説明されているか、または当該技術で既知のＰＥＳＴ配列の相同体でもよい。一実施形態では、こうした相同体は維持する。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法で有用な配列は、抗原性ポリペプチドの相同体でもよく、これは一実施形態ではサバイビンまたはその断片である。一実施形態では、本発明のポリペプチドの相同体、また一実施形態では、こうした相同体をコードする核酸は、親ポリペプチドの機能性の特性を維持する。例えば、一実施形態では、本発明の抗原性ポリペプチドの相同体は、親ポリペプチドの抗原性の特性を維持する。別の実施形態では、本明細書で開示されている組成物および方法で有用な配列は、本明細書に記述されている任意の配列の相同体としうる。一実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも６８%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも７０%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも７２%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも７５%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも７８%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８０%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８２%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８３%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８５%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８７%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８８%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９０%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９２%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９３%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９５%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９６%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９７%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９８%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９９%の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも１００%の同一性を共有する。
【０２３８】
一実施形態では、当然のことながら、本明細書で開示されている、および/または本明細書に記述されている任意の配列の相同体は、本発明の一部であるとみなされる。
【０２３９】
一実施形態では、本発明の意味の範囲内で「機能性」は、本明細書では、タンパク質、ペプチド、核酸、断片またはその変異体が生物活性または機能を示す固有の能力を意味するために使用される。一実施形態では、こうした生物学的機能は、相互作用の相手（例えば、膜結合受容体）へのその結合特性であり、別の実施形態では、その三量体形成特性である。本発明の機能性断片および機能性変異体の場合には、これらの生物学的機能は、例えば、特異性または選択性に関しては実際には変化しうるが、基本的な生物学的機能は保持される。
【０２４０】
一実施形態では、「治療する」という用語は、療法的な治療および予防または防止手段の両方を意味するが、目的は本明細書に記述されるように、標的化された病理学状態または障害を予防または少なくすることである。したがって、一実施形態では、治療することは、疾患、障害、もしくは病状、またはこれらの組合せに直接的に影響するもしくはそれを治癒すること、抑制すること、阻害すること、防止すること、その重症度を減少すること、その発症を遅延すること、それに関連する症状を減少することを含む場合がある。したがって、一実施形態では、「治療する」ことは、とりわけ、進行を遅延すること、寛解を早めること、寛解を誘発すること、寛解を増強すること、回復を加速すること、代替治療に対する有効性を増加することもしくは耐性を減少すること、またはこれらの組合せを意味する。一実施形態では、「防止する」または「妨げる」ことは、とりわけ、症状の発症を遅延すること、疾患の再発を防止すること、再発の発症の数または頻度を減少すること、症候性の症状の発現の間の潜伏を増加すること、またはこれらの組合せを意味する。一実施形態では、「抑制する」または「阻害する」ことは、とりわけ、症状の重症度を減少すること、急性症状の発現の重症度を減少すること、症状の数を減少すること、疾患に関係した症状の発生率を減少すること、症状の潜伏を減少すること、症状を軽快すること、二次性症状を減少すること、二次感染を減少すること、患者の生存を延長すること、またはこれらの組合せを意味する。
【０２４１】
一実施形態では、症状は一次性であるが、一方で別の実施形態では、症状は続発性である。一実施形態では、「一次」は特定の疾患または障害の直接的な結果である症状を指すが、一方で一実施形態では、「続発性」は主因に由来する、その結果としての症状を指す。一実施形態では、本発明で使用するための化合物は、一次症状、または続発性症状、または二次合併症を治療する。別の実施形態では、「症状」は疾患または病的状態の何らかの兆候である場合がある。
【０２４２】
一実施形態では、本明細書で開示されている方法で使用するための組成物は、静脈内に投与される。別の実施形態では、ワクチンは経口投与され、また別の実施形態では、ワクチンは、非経口的（例えば、皮下、筋肉内、およびこれに類する方法）に投与される。
【０２４３】
さらに、別の実施形態では、組成物またはワクチンは、坐薬として、例えば、肛門坐剤または尿道坐剤として投与される。さらに、別の実施形態では、医薬組成物は、ペレットの皮下移植として投与される。さらなる実施形態では、ペレットはある期間にわたる薬剤の徐放を提供する。なお別の実施形態では、医薬組成物はカプセルの形態で投与される。
【０２４４】
一実施形態では、投与の経路は非経口的でもよい。別の実施形態では、経路は、眼内、結膜の、局所的、経皮的、皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、経膣、直腸、腫瘍内、傍癌、経粘膜、筋肉内、血管内、脳室内、頭蓋内、吸入（エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、鼻腔内（点滴薬）、舌下、経口、エアロゾルまたは坐薬またはその組合せとしうる。吸入による鼻腔内投与または適用では、化合物の溶液または懸濁液が、適切な担体の存在下で混合およびエアロゾル化または噴霧化される。こうしたエアロゾルは、本明細書に記述されている任意の薬物を含みうる。一実施形態では、本明細書に記載された組成物は、頭蓋内投与に適した形態としうるが、これは一実施形態では、くも膜下腔内および脳室内の投与である。一実施形態では、投与の方式は、治療対象の状態の正確な性質、状態の重篤度、患者の年齢および一般的健康状態、体重、および個別の患者の反応などの因子に基づき、熟練した臨床医によって決定されることになる。
【０２４５】
一実施形態では、特に適した非経口適用は注射用の無菌溶液、できれば油性溶液または水溶液であり、また懸濁液、エマルション、または坐薬および浣腸剤を含めた移植である。アンプルは、便利な単位用量である。こうした坐薬は、本明細書に記述されている任意の薬物を含みうる。
【０２４６】
一実施形態では、例えば、リポソームまたは有効化合物が差動的に分解可能なコーティング（例えば、微小カプセル化、複数コーティングなど）で保護されているものなど、持続放出性または指定放出性の組成物を調製できる。こうした組成物は即放または徐放用に調製されうる。新しい化合物を凍結乾燥して、得られた凍結乾燥物を、例えば、注射用の製品の調製物として使用することも可能である。
【０２４７】
一実施形態では、液剤用に、医薬的に許容される担体は水溶液または非水系の溶液、懸濁液、エマルションまたはオイルとしうる。非水系溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用の有機エステル（オレイン酸エチルなど）がある。水溶性の担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含めた、水、アルコール/水溶液、エマルションまたは懸濁液が含まれる。オイルの例としては、鉱物、動物、植物、または合成を起源とするオイル、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ひまわり油、および魚肝油がある。
【０２４８】
一実施形態では、本発明の組成物は医薬的に許容される。一実施形態では、「医薬的に許容される」という用語は、安全であり、かつ本発明で使用される有効量の少なくとも1つの化合物を望ましい投与経路で適切に送達する任意の製剤を意味する。この用語は、鑑賞化製剤の使用についても言及し、ここでｐＨは化合物の安定性および投与経路に基づきｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲の望ましい特定の値に維持される。
【０２４９】
一実施形態では、本発明の組成物または本発明の方法で使用される組成物は、単独で、組成物内に入れて投与されうる。別の実施形態では、本発明の組成物を従来型の賦形剤と混合したもの、すなわち、有効化合物と有害な反応をしない、非経口的、経腸的（例えば、経口的）または局所的適用に適した医薬的に許容される有機または無機の担体物質を使用しうる。一実施形態では、適切な医薬的に許容される担体には、水、食塩水、アルコール、アラビアゴム、植物オイル、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロースまたはデンプンなど）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、流動パラフィン、白パラフィン、グリセロール、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これに限定されない。別の実施形態では、製剤は殺菌することができ、また望ましい場合には、有効な化合物と有害な反応をしない助剤、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色剤、香味料および/または芳香剤およびこれに類するものと混合される。別の実施形態では、これらは、望ましい場合には、その他の有効な薬剤、例えば、ビタミンと混合することもできる。
【０２５０】
一実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物を使用するための組成物は、担体／希釈剤と共に投与されうる。固体担体／希釈剤には、ゴム、デンプン（例えば、コーンスターチ、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、ショ糖、デキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリル酸塩（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはその混合物が含まれるが、これに限定されない。
【０２５１】
一実施形態では、本明細書に開示されている方法および組成物を使用するための組成物は、本発明の組成物およびガンの予防または治療に有効な１つ以上の追加的化合物を含みうる。一部の実施形態では、追加的な化合物は、化学療法で有用な化合物を含みうるが、これは一実施形態ではシスプラチンである。別の実施形態では、イホスファミド、フルオロウラシル５−ＦＵ、イリノテカン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル、ゲムシタビン、トポテカンまたはその組合せを、本明細書で開示されている方法で使用するために本明細書に開示されている組成物と共に投与しうる。別の実施形態では、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはその組合せを、本明細書で開示されている方法で使用するために本明細書に開示されている組成物と共に投与しうる。
【０２５２】
別の実施形態では、本明細書に開示されている融合タンパク質は、適切な配列をサブクローニングした後で、その結果生じるヌクレオチドを発現させる工程を含むプロセスによって調製される。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。別の実施形態では、次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。別の実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産される。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’端は第２の断片の３’端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第３のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。次いでインサートをプラスミドへと連結する。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片が異種ペプチド内に埋め込まれたタンパク質を生成するために、類似した戦略が使用される。
【０２５３】
一実施形態では、本発明はまた、異種抗原性ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換え型リステリアを提供しており、ここで、前記核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを有するオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作できるように統合される。
【０２５４】
一実施形態では、本明細書は、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドまたはその断片を有するオープンリーディングフレームとして、ゲノムに動作できるように統合される抗原を含む異種抗原を発現する組み換え型リステリアを提供している。別の実施形態では、本明細書は、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドまたはその断片に融合されたエピソームプラスミドに由来する異種抗原を発現する組み換え型リステリアを提供している。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む抗原およびポリペプチドは、組み換え型リステリアの細胞質内に存在するエピソームベクターから発現される。別の実施形態では、前記ポリペプチドまたはその断片はＡｃｔＡ、またはＬＬＯである。別の実施形態では、前記抗原はサバイビン、または本明細書で提供されているその他任意の抗原である。別の実施形態では、前記断片は免疫原性断片である。なお別の実施形態では、前記エピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。
【０２５５】
別の実施形態では、遺伝子またはタンパク質の発現は当該技術で周知の方法により決定されるが、これは別の実施形態では、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、免疫ブロットなどを含む。別の実施形態では、前記第１または第２の抗原の発現は、誘発性系によって制御される一方、別の実施形態では、前記第１または第２の抗原の発現構造性プロモーターにより制御される。別の実施形態では、誘発性発現系が当該技術で周知である。
【０２５６】
細菌を形質転換する方法は当該技術分野で周知であり、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的、および物理的な形質転換技術（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９，  Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  ９：１９０−１９９；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ；  Ｍｉｌｌｅｒ，  １９９２，  Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本明細書で開示されているリステリアワクチン株は電気穿孔によって形質転換される。
【０２５７】
別の実施形態では、ガンの発症を抑制する方法が本明細書に提供されており、前記方法は、本明細書で提供されている異種抗原を発現し、前記ガンによって、またはその中で特異的に発現する、組み換え型リステリア組成物を投与する工程を含む。
【０２５８】
一実施形態では、本明細書は、被験者における腫瘍を治療する方法を提供しており、  前記方法は、本明細書に提供されている異種抗原を発現する組み換え型リステリア組成物を投与する工程を含む。
【０２５９】
別の実施形態では、本明細書は、被験者におけるガンに関連した症状を寛解する方法を提供しており、前記方法は、本明細書に提供されている異種抗原を発現する組み換え型リステリア組成物を投与する工程を含む。
【０２６０】
一実施形態では、本明細書は、ガンから被験者を保護する方法を提供しており、  前記方法は、本明細書に提供されている異種抗原を発現する組み換え型リステリア組成物を投与する工程を含む。
【０２６１】
別の実施形態では、本明細書は、ガンの発症を遅らせる方法を提供しており、  前記方法は、本明細書に提供されている異種抗原を発現する組み換え型リステリア組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は、転移性ガンを治療する方法を提供しており、  前記方法は、本明細書に提供されている異種抗原を発現する組み換え型リステリア組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書は、転移性ガンまたは微小転移巣を予防する方法を提供しており、  前記方法は、本明細書に提供されている異種抗原を発現する組み換え型リステリア組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア組成物は、経口的、静脈内、または非経口的に投与される。
【０２６２】
本明細書に開示されるように、方法および組成物の別の実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組み合せのストリングを指す。一実施形態では、この用語はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸高分子の単量体単位を指す。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態をとる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述される（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびそこに引用された参考文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態、またはこれらの群の誘導体であってもよい。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖であってもよい。別の実施形態では、この用語は他の種類のバックボーンであるが同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態では、この人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチドバックボーンおよびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に結合することができる。別の実施形態では、このヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は当該技術分野で既知の未変性の核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、また例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４．核酸の生産および使用は、当業者には既知であり、また例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記述される。
【０２６３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「組み換え型ペプチド」という用語は、別の実施形態では、任意の長さのペプチドまたはポリペプチドを意味する。別の実施形態では、本明細書に開示されているペプチドまたは組み換え型ペプチドは、サバイビン断片について上記で列挙されている長さの一つを有する。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。一実施形態では、「ペプチド」という用語は天然ペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチド、または組み換え型ペプチドのいずれか）、ならびに／またはペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドなどのペプチド模倣薬（典型的には、合成的に合成されたペプチド）を指し、これは、例えば、身体中にあるときペプチドをより安定される、または細胞の中へと浸透する能力をより高める修飾を有してもよい。かかる修飾としては、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨが挙げられるがこれに限定されない）、バックボーン修飾、および残基修飾、が挙げられるが、これに限定されない。ペプチド模倣薬化合物を調製するための方法は、当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の中で特定される。これに関するさらなる詳細が以下に提供される。
【０２６４】
一実施形態では、「抗原性ポリペプチド」という用語は、上述されるように、被験者の細胞内に存在し、宿主内に存在するとき、または、別の実施形態では、宿主によって検出されるとき、免疫応答の載置をもたらすＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上で加工および提示される、ポリペプチド、ペプチド、または組み換え型ペプチドを指すために本明細書で使用される。
【０２６５】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、＊−ａｚａ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）によって置換されてもよく、式中Ｒは、任意のアルキル、例えば、メチル、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）であり、Ｒは、炭素原子上に自然に存在する「通常の」側鎖である。
【０２６６】
これらの修飾はペプチド鎖に沿って結合のいずれかの上で生じる可能性があり、また同時にいくつか（２〜３）が生じる可能性さえある。天然の芳香族アミノ酸である、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（naphthylelanine）（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅのｒｉｎｇ−メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成非天然酸で置換されてもよい。
【０２６７】
上記に追加して、本明細書で開示されるペプチドは１つ以上の修飾アミノ酸または１つ以上の非アミノ酸単量体（例えば脂肪酸、複合糖質等）も含んでもよい。
【０２６８】
一実施形態では、「オリゴヌクレオチド」という用語は「核酸」という用語と互換的であり、また原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられる場合があるがこれに限定されない分子を指す場合がある。この用語は既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。
【０２６９】
別の実施形態では、「安定して維持される」とは、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失を伴わずに、核酸分子またはプラスミドを１０世代の間、維持することを指す。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。
【０２７０】
一実施形態では、「アミノ酸」または「アミノ酸」という用語は、２０の自然発生的なアミノ酸のほか、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトランスフェラーゼが含まれる、翻訳後にインビボで改変されることがよくあるアミノ酸、ならびに、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシンおよびオルニチンを含むがこれに限定されないその他の珍しいアミノ酸を含むものとして理解される。その上、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含みうる。
【０２７１】
「核酸」または「核酸配列」という用語は、一本鎖または二本鎖のどちらかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを意味する。この用語は、基準核酸として、望ましい目的のために類似したかまたは改善された結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを含む。この用語はまた、自然発生的なヌクレオチドと類似した方法で、または望ましい目的のためにそれよりも改善されたレートで代謝される核酸を含む。この用語はまた、合成バックボーンを持つ核酸様の構造を含む。本発明で提供されているＤＮＡバックボーン類似体には、リン酸ジエステル、ホスホロチオネート、ホスホロジチオアート、メチルホスホネート、ホスホラミダイト、アルキルホスホトリエステル、スルファミン酸塩、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−  Ｎ−カルバメート、モルフォリノ  カルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）；  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６００，  Ｅｄｓ．  Ｂａｓｅｒｇａ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ  （ＮＹＡＳ  １９９２）；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ  （１９９３）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３６：１９２３−１９３７；  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （１９９３，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）を参照。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位などの非イオン性バックボーンを含む。ホスホロチオエート結合については、例えば、第ＷＯ  ９７／０３２１１号；第ＷＯ  ９６／３９１５４号；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ａｐｐｉ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １４４：１８９−１９７に記述されている。この用語で含められるその他の合成バックボーンには、メチルホスホネート結合または交互のメチルホスホネートおよびリン酸ジエステル結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８６９２−８６９８）、およびベンジルホスホネート結合（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ６：１５３−１５６）が含まれる。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよび増幅生成物と互換的に使用される。
【０２７２】
本明細書で開示される方法および組成物の一実施形態では、「組み換え部位」または「部位特異的な組み換え部位」という用語は、組み換え部位に隣接する核酸区分の交換または切除を媒介するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連するタンパク質とともに）識別される核酸分子内の塩基の配列を指す。リコンビナーゼおよび関連するタンパク質は「組み換え型タンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３：６９９−７０７；１９９３）を参照のこと）。
【０２７３】
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書で開示されるような方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、任意の細胞（原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類の細胞を含む）内で構造的にまたは誘導的に発現する目的の任意のファージベースの組み換え型発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞内で再生すること、および適切な条件下でファージ粒子を生成することの両方を可能にすることができる。この用語は線形または円形の発現系を含み、またエピソームのまま、または宿主細胞ゲノムの中へと組込まれた両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０２７４】
一実施形態では、本明細書で使用される場合、「動作可能にリンクした」という用語は、転写および翻訳調節性核酸が、任意のコード配列に対して転写が開始されるような様式で位置することを意味する。一般的にこれは、プロモーターおよび転写開始配列または始動配列がコ−ド化領域に５’に位置されることを意味することになる。
【０２７５】
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。別の実施形態では、ＯＲＦの開始端および停止端はｍＲＮＡの端部と同等でないが、通常のｍＲＮＡ中に含まれる。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、一実施形態では、内因性のポリペプチドとともにオープンリーディングフレームとして動作可能にゲノムの中へと組込まれる核酸分子は、内因性のポリペプチドと同一のオープンリーディングフレーム内でゲノムの中へと組込まれた核酸分子である。
【０２７６】
一実施形態では、本発明はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。一実施形態では、「リンカー配列」は２つの異種ポリペプチドまたはその断片もしくはドメインを結合するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書で使用される場合、リンカーは融合ポリペプチドを形成するためにポリペプチドを共有的にリンクするアミノ酸配列である。リンカーは、典型的には、オープンリーディングフレームおよび表示タンパク質によってコードされたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を作り出すために、表示ベクターからのレポーター遺伝子の除去後の残りの組み換え型信号から翻訳されたアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、リンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。
【０２７７】
一実施形態では、本明細書で使用される場合、「内因性」は、参照生命体内で発生もしくは創出された、または参照生命体の中生じたものから発生してきた物品を記述する。別の実施形態では、内因性は、天然であることを指す。
【０２７８】
「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるであろう。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態では、天然ではないかもしくはリステリア株に対して内因性のリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されるポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株以外の供給源からのポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では、異種という用語は同一の種の中の異なる生命体に由来するものを記述するために使用される。別の実施形態では、異種抗原はリステリアの組み換え型株によって発現され、かつ哺乳類細胞の感染に際して組み換え型株によって細胞毒性Ｔ細胞に加工および提示される。別の実施形態では、リステリア種によって発現される異種抗原は、結果として哺乳類内に自然に発現される修飾されていない抗原またはタンパク質を識別するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染性薬剤の中で対応する修飾されていない抗原またはタンパク質に厳密に適合する必要はない。「異種抗原」という用語は、本明細書では「抗原性ポリペプチド」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」、およびこれに類するものを指す場合がある。
【０２７９】
「エピソーム性の発現ベクター」という用語が、直線状または円形状であってもよく、また通常二本鎖の形態であり、その中に細菌のゲノムまたは細胞のゲノムに組み込まれるのと反対に宿主細菌の細胞質または細胞内に存在する染色体外である核酸ベクターを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、エピソーム性の発現ベクターは対象となる遺伝子を含む。別の実施形態では、エピソーム性ベクターは細菌性の細胞質の中の複数のコピー内で持続し、結果として対象となる遺伝子の増幅をもたらし、また別の実施形態では、必要なときにウイルス性トランス作用因子が供給される。別の実施形態では、本明細書ではエピソーム性の発現ベクターはプラスミドと称される場合がある。別の実施形態では、「組み込みプラスミド」はその挿入または宿主ゲノムの中に担持される対象となる遺伝子の挿入を標的化する配列を含む。別の実施形態では、挿入された対象となる遺伝子は中断されない、または細胞ＤＮＡへの組み込みからしばしば生じる調節性の制約を受けない。別の実施形態では、挿入された異種遺伝子の存在は細胞自身の重要な領域の再配列または中断につながらない。別の実施形態では、安定したトランスフェクション手順で、エピソーム性ベクターの使用は、染色体を組み込むプラスミドの使用より高いトランスフェクション効率をしばしばもたらす（Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４８６１−４８６６；Ｍａｚｄａ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４，１４３−１５１）。一実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物のエピソーム性の発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために採用される様々な方法のいずれかによってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される場合がある。ベクターも単独でまたは被験者の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態で送達される場合がある。
【０２８０】
一実施形態では、「融合される」用語は共有結合による動作可能な連鎖を指す。一実施形態では、この用語は組み換え型融合（その核酸配列またはオープンリーディングフレームの）を含む。別の実施形態では、この用語は化学的結合を含む。
【０２８１】
一実施形態では「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために細菌細胞を改変することを指す。別の実施形態では、「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することを指す。
【０２８２】
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合の方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記述されている。
【０２８３】
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。
【０２８４】
一実施形態では、「弱毒化」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌が動物の中に疾患を生じさせる能力の減退を意味する。つまり、弱毒化されたリステリア株の病原性特徴は野生型リステリアと比較すると低下しているが、弱毒化されたリステリアは培養物中で成長および維持する能力を有する。実施例として弱毒化されたリステリアを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を使用すると、接種した動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ５０）は、野生型リステリアのＬＤ５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがってリステリアの弱毒化された株は、投与された動物を殺さないものであるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺すものである。弱毒化された細菌は、その成長のために必要な栄養素がその中に存在しないために一般的な環境内では複製する能力を有しないものを意味するとも解釈されるべきである。したがって、細菌は必要な栄養素がその中で提供される制御された環境に複製が限定される。したがって、本発明の弱毒化された株は制御されていない複製の能力がないという点で、環境的に安全である。
【０２８５】
一実施形態では、本明細書に開示されているリステリアは、本明細書で説明した通り、異種ポリペプチドを発現し、別の実施形態では、本明細書に開示されているリステリアは、本明細書で説明した通り、異種ポリペプチドを分泌し、また別の実施形態では、本明細書に開示されているリステリアは、本明細書で説明した通り、異種ポリペプチドを発現し分泌する。別の実施形態では、本明細書に開示されているリステリアは異種ポリペプチドを含み、また別の実施形態では、異種ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２８６】
一実施形態では、本明細書に開示されているリステリア菌株は、ワクチンの調製物内に使用されうる。一実施形態では、本明細書に開示されているリステリア菌株は、ペプチドワクチンの調製物内に使用されうる。ペプチドワクチンを調製する方法は、当該技術で周知であり、例えば、第ＥＰ１４０８０４８号、米国特許出願第２００７０１５４９５３号、および  ＯＧＡＳＡＷＡＲＡら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．  ８９、ｐｐ．  ８９９５−８９９９、Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９２）に記述されている。一実施形態では、より高い免疫原性を持つ抗原を生成するためにペプチドの進化技術が使用される。ペプチド進化のための技術は、当該技術で周知であり、例えば米国特許第6773900号に記述されている。
【０２８７】
一実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のワクチンは、哺乳類であることが好ましく、またヒトであることがより好ましい、宿主の脊椎動物に、単独または医薬的に許容される担体との組み合せのいずれかで、投与されてもよい。別の実施形態では、ワクチンは、リステリア株それ自体に、またはリステリア種が発現するように修飾された異種抗原に免疫応答を誘発するのに効果的な量で投与される。別の実施形態では、投与されるワクチンの量は、本開示を所持している時、当業者によって規定通りに決定されてもよい。別の実施形態では、医薬的に許容される担体としては、滅菌した蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、または重炭酸塩緩衝液が挙げられるがこれに限定されない。別の実施形態では、選択された医薬的に許容される担体および使用するべき担体の量は、投与のモード、リステリアの株、ならびにワクチン接種を受ける人の年齢および疾患の状態を含むいくつかの因子に依存することになる。別の実施形態では、ワクチンの投与は経口経路によってもよく、またはこれは、非経口的、鼻腔内、筋肉内、血管内、直腸内、腹腔内、または様々な周知の投与の経路のうちの任意の１つであってもよい。別の実施形態では、投与の経路は治療される感染性病原体または腫瘍のタイプに従って選択されてもよい。
【０２８８】
一実施形態では、本発明は、異種抗原性ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換え型リステリア株を提供しており、ここで、前記核酸分子は、内因性のＰＥＳＴ含有遺伝子を有するオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作できるように統合される。別の実施形態では、核酸分子はエピソームプラスミドから発現する。
【０２８９】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原性ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換え型リステリア株を投与する工程を含む、被験者内の抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供しており、ここで、前記核酸分子は、内因性のＰＥＳＴ含有遺伝子を有するオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作できるように統合される。別の実施形態では、核酸分子はエピソームプラスミドから発現する。
【０２９０】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原性ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換え型リステリア株を投与する工程を含む、被験者内においてガンを治療、抑制、または阻害する方法を提供しており、ここで、前記核酸分子は、内因性のＰＥＳＴ含有遺伝子を有するオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作できるように統合される。別の実施形態では、核酸分子はエピソームプラスミドから発現する。
【０２９１】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原性ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換え型リステリア株を投与する工程を含む、被験者内において少なくとも1つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法を提供しており、ここで、前記核酸分子は、内因性のＰＥＳＴ含有遺伝子を有するオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作できるように統合される。別の実施形態では、核酸分子はエピソームプラスミドから発現する。
【０２９２】
別の実施形態では、本発明は抗原を発現する組み換え型リステリア株を生成する方法を提供しており、方法は、抗原をオープンリーディングフレーム内のリステリアゲノム内にコードする核酸を内因性PEST含有遺伝子と遺伝学的に融合する工程と、前記抗原を前記組み換え型リステリア株内での抗原発現を助長する条件下で発現させる工程とを含む。別の実施形態では、核酸分子はエピソームプラスミドから発現する。
【０２９３】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原性ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換え型リステリア株を使用して本明細書で上述した任意の方法を提供しており、ここで、前記核酸分子は、内因性のＰＥＳＴ含有遺伝子を有するオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに動作できるように統合される。別の実施形態では、核酸分子は、内因性PEST含有遺伝子を持つオープンリーディングフレーム内のエピソームプラスミドから発現される。
【０２９４】
別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される方法を都合よく実践するためのキットを提供し、これは、本明細書で開示される１つ以上のリステリア株、アプリケーター、および本明細書で開示される方法を実践するためにキット構成要素を使用する方法を記述する取扱説明資料を含む。
【０２９５】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。
【０２９６】
「被験者」という用語は、一実施形態では、症状もしくはその後遺症の療法を必要とする、または症状もしくはその後遺症を受けやすい、ヒトを含む哺乳類を指す。被験者は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびペットマウス、ならびにヒトを含んでもよい。被験者には、家畜も含まれうる。一実施形態では、「被験者」という用語は、あらゆる点で健康であり、また疾患または障害の徴候を持ったり見せたりしない個体を除外しない。
【０２９７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【実施例】
【０２９８】
ｔＬＬＯ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）に融合されたＰＳＡを分泌する組み換え型Ｌｍが開発された。この株は、前立腺ガンについてマウスモデルにおける腫瘍の退行に関連した強力なＰＳＡ特異的な免疫応答を誘発するが、ここで、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現は、ｐＧＧ５５（表１）に基づき、プラスミドに由来し、これはベクターに抗生物質抵抗性を与える。我々は、最近、ｐＡｄｖ１４２プラスミドに基づき、ＰＳＡワクチン用の新株を開発したが、これは、抗生物質抵抗性マーカーを持たず、ＬｍｄｄＡ−１４２（表１）と呼ぶ。この新株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも１０倍弱毒化される。さらに、ＬｍｄｄＡ−１４２は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも、わずかに高い免疫原性があり、またＰＳＡを発現する腫瘍の退行において著しく大きな効果がある。
【表１】
2017522027.tif 000007
【０２９９】
プラスミドｐＡｄｖ１４２（６５２３  ｂｐ）の配列は次のとおりであった：
【０３００】
【化４−１】
2017522027.tif 000008
【化４−２】
2017522027.tif 000009
【化４−３】
2017522027.tif 000010
このプラスミドは、Ｇｅｎｅｗｉｚ施設にて大腸菌株から配列決定された。
［実施例１］  弱毒化リステリア菌株−ＬｍｄｄΔＡｃｔＡの構築、およびＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ菌株内のｈｌｙ遺伝子へのフレーム内のヒトｋｌｋ３遺伝子の挿入。
【０３０１】
Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、病毒性因子、ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化された。ａｃｔＡのＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンド内でのインフレーム欠失は、下流遺伝子発現上のあらゆる極性効果を避けるように構造化された。Ｌｍｄａｌ  ｄａｔΔａｃｔＡは、ＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によるＮ末端における最初の１９アミノ酸およびＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。
【０３０２】
ＡｃｔＡ欠失突然変異体は、ＡｃｔＡの上流部分（６５７  ｂｐ−ｏｌｉｇｏ’ｓ  Ａｄｖ  ２７１／２７２）および下流部分（６２５  ｂｐ−  ｏｌｉｇｏ’ｓ  Ａｄｖ  ２７３／２７４）に対応する染色体領域を増幅して、ＰＣＲによって結合することにより生成された。この増幅に使用されるプライマーの配列は表２の通りである。ＡｃｔＡの上流および顆粒のＤＮＡ領域が、ｐＮＥＢ１９３内でＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位でクローン化され、またこのプラスミドから、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩがさらに、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７内でクローン化され、その結果としてΔＡｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡｄｖ１２０）が得られた。
【表２】
2017522027.tif 000011
【０３０３】
その染色体位置からの遺伝子の欠失は、ＡｃｔＡ欠失領域に外部的に結合されるプライマーを使用して確認されたが、これは図１にプライマー３（Ａｄｖ  ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ、配列番号：３３）およびプライマー４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ、配列番号：３４）として示されている。ＰＣＲ解析をＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔＡｃｔＡから分離された染色体ＤＮＡ上で実施した。Ｌｍ−ｄｄ染色体のＤＮＡ内のプライマー対１／２および３／４の２つの異なるセットで増幅した後のＤＮＡ断片のサイズは、３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂとなると予想された。一方で、ＬｍｄｄΔＡｃｔＡについて、プライマーの対１／２および３／４を使用するＰＣＲの予想されるサイズは、１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂである。したがって、図１のＰＣＲ解析はａｃｔＡの１．８ｋｂ領域は、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内では除去されていることを確認する。ＤＮＡ配列決定を、ＬｍｄｄａｃｔＡ株内の領域を含有するΔａｃｔＡの欠失を確認するためにＰＣＲ産物上でも実施した。
［実施例２］  Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質独立的エピソーム発現系の構築。
【０３０４】
Ｌｍベクター（ｐＡｄｖ１４２）による抗原送達のための抗生物質独立的なエピソーム発現系は、次世代の抗生物質を含まないプラスミドｐＴＶ３である（Ｖｅｒｃｈら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２００４．  ７２（１１）：６４１８−２５、参照により本明細書に組み込まれる）。病毒性遺伝子転写活性化剤ｐｒｆＡ用の遺伝子は、リステリア株Ｌｍｄｄは、染色体内にｐｒｆＡ遺伝子の複製を含むため、ｐＴＶ３から除去された。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌ用のカセットは、ｐ６０−枯草菌ｄａｌにより置換され、その結果としてプラスミドｐＡｄｖ１３４が得られた（図２ａ）。リステリアとバシラスｄａｌ遺伝子の類似性は〜３０％であり、プラスミドとＬｍｄｄ染色体内のｄａｌ遺伝子の残りの断片との間での組み換えの可能性が実質的に除外される。プラスミドｐＡｄｖ１３４は、抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含んでいた。ＬｍｄｄＡ株は、ｐＡｄｖ１３４プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現がウエスタンブロットによって確認された（図２ｂ）。１０４０３Ｓ野生型株に由来するＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン耐性を除き、抗生物質抵抗性マーカーを欠失している。
【０３０５】
さらに、ｐＡｄｖ１３４がＸｈｏＩ／ＸｍａＩでクローンヒトＰＳＡ、ｋｌｋ３に制限され、その結果プラスミド、ｐＡｄｖ１４２が得られた。新しいプラスミド、ｐＡｄｖ１４２（図２Ｃ、表１）は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下でバシラスｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含む。シャトルプラスミド、ｐＡｄｖ１４２は、外因性Ｄ−アラニンの不在下で、大腸菌ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９とリステリア・モノサイトゲネス株Ｌｍｄｄの両方の増殖を補完した。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモータープロモーターおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から構成される（図２Ｃ）。
【０３０６】
プラスミドｐＡｄｖ１４２は、リステリア背景株ＬｍｄｄＡｃｔＡ株に形質転換され、その結果としてＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡが得られた。株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウエスタンブロットにより確認された（図２Ｄ）。インビボでの２継代後に株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌があった。
［実施例３］  株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビトロおよびインビボでの安定性
【０３０７】
プラスミドのインビトロでの安定性が、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡリステリア株を選択圧の存在下または不在下で８日間にわたり培養することにより検査された。株LmddA-LLO-PSAのための選択圧は、Ｄ−アラニンである。したがって、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）およびＢＨＩ＋  １００  μｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニンで継代培養された。ＣＦＵが、選択的（ＢＨＩ）および非選択的（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）培地でのプレーティング後に毎日決定された。非選択的培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）にプレーティングされた後で、プラスミドの損失が結果的により高いＣＦＵにつながることが予想された。図３ａに示すとおり、選択的および非選択的な培地でのＣＦＵ数には差異がなかった。これは、実験が終了した少なくとも５０世代までのあいだ、プラスミドｐＡｄｖ１４２が安定していたことを示唆する。
【０３０８】
インビボでのプラスミド維持が、５×１０７ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡをＣ５７ＢＬ／６  マウスに静脈内注入することにより決定された。生存可能な細菌がＰＢＳ中で均質化された脾臓から２４  ｈおよび４８時間の時点で分離された。各試料についてのＣＦＵが、ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ  ＋  １００  μｇ／ｍｌ  Ｄ−アラニンについて各時点で決定された。選択的および非選択的の培地への脾細胞のプレーティングの後、コロニーは２４時間後に回収された。この株はかなり高く弱毒化されているため、細菌負荷はインビボで２４時間でクリアされた。選択的および非選択的なプレートで有意なＣＦＵの差異は検出されず、これは分離されたすべての細菌内での組み換え型プラスミドの安定した存在を示している（図３Ｂ）。
［実施例４］  株ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）のインビボでの継代培養、病毒性およびクリアランス
【０３０９】
ＬｍｄｄＡ−１４２は、エピソーム的に発現されたｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する組み換え型リステリア株である。安全な投与量を決定するために、マウスが様々な投与量でのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化され、毒性効果が決定された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、最小限の毒性効果しかもたらさなかった（データ非表示）。結果は、１０８ ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの投与量が、マウスによって十分な耐容性を示すことを示唆するものであった。病毒性研究は、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは高度に弱毒化されたことを示す。
【０３１０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに安全な投与量１０８ＣＦＵを腹腔内投与した後での、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでのクリアランスが決定された。２日後、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの肝臓および脾臓内には、検出可能なコロニーはなかった。この株は高度に弱毒化されているため、インビボで４８時間の時点で完全にクリアされた（図４Ａ）。
【０３１１】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの弱毒化が、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのマクロファージに感染して細胞内で成長する能力を決定するために、細胞感染アッセイを実施した。マウスのマクロファージ様の細胞株（Ｊ７７４Ａ．１など）がリステリア構築体によってインビトロで感染され、細胞内増殖が定量化された。正の対照株の野生型リステリア株１０４０３Ｓは細胞内で成長し、およびｐｒｆＡ変異体である負の対照ＸＦＬ７は、ファゴリソソームを逃れることができず、Ｊ７７４細胞内で成長しない。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの細胞質内での増殖は、この株の細胞から細胞へと蔓延する能力の損失のため、１０４０３Ｓよりも遅かった（図４Ｂ）。結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、マクロファージに感染する能力を持ち、細胞質内で成長することを示す。
［実施例５］  Ｃ５７ＢＬ／６  マウスにおける株−ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの免疫原性
【０３１２】
Ｃ５７ＢＬ／６  マウス内で構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡにより誘発されたＰＳＡ特異的な免疫応答がＰＳＡ四量体染色を使用して決定された。マウスは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで１週間間隔で２回免疫化され、ブースト後６日目に脾細胞がＰＳＡ四量体について染色された。ＰＳＡ特異的な四量体での脾細胞の染色によって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＰＳＡ四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の２３％の誘発が示された（図５Ａ）。
【０３１３】
ＰＳＡペプチドでの５時間にわたる刺激後に、ＰＳＡ特異的なＴ細胞のＩＦＮ−γを分泌する機能性能力が、細胞内サイトカイン染色を使用して検査された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群でＰＳＡペプチドで刺激したＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＩＦＮ−γを分泌する細胞で、無処置マウスと比較して２００倍の増加があり（図５Ｂ）、これは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株は非常に免疫原性が高く、また脾臓内のＰＳＡに対して高いレベルの機能的に活性のＰＳＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を初期刺激することを示している。
【０３１４】
マウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化した後でＰＳＡに対して生成された細胞毒性Ｔ細胞の機能性活性を決定するために、ＰＳＡ特異的なＣＴＬの持つインビトロアッセイでＨ−２ＤｂペプチドによりパルスしたＥＬ４細胞を溶解する能力を試験した。ＦＡＣＳベースのカスパーゼアッセイ（図５Ｃ）およびユーロピウム放出（図５Ｄ）が、細胞溶解を測定するために使用された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの脾細胞は、標的抗原としてＰＳＡペプチドを示す細胞について高い細胞溶解活性を持つＣＴＬを含んでいた。
【０３１５】
抗原で２４  ｈ刺激した後、エフェクターＴ細胞の持つＩＦＮ−γを分泌する機能性能力を決定するためにＥＬＩＳｐｏｔが実施された。ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、特異的ペプチドで刺激したＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスからの脾細胞内で、無処置マウスの脾細胞と比較した時に、ＩＦＮ−γのスポット数に２０倍の増加があったことを観察した（図５Ｅ）。
［実施例６］  ＬｍｄｄＡ−１４２菌株による免疫化は、ＰＳＡを発現する腫瘍の退行およびＰＳＡ特異的なＣＴＬによる腫瘍の浸潤を誘発する。
【０３１６】
構築体ＬｍｄｄＡ−１４２  （ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）の治療上の有効性が、ＰＳＡを発現する前立腺腺ガン細胞株の改変を使用して決定された（Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）；Ｓｈａｈａｂｉら、２００８）。マウスに２×１０６のＴＰＳＡ細胞を皮下移植した。腫瘍接種後６日目に、腫瘍が４〜６ｍｍの触知可能なサイズに達した時、マウスは１週間間隔で３回、１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−１４２、１０７ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（正の対照）免疫化されたか、または未処置のままとした。無処置マウスは腫瘍を徐々に成長させた（図６Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２で免疫化したマウスは、すべて３５日目まで腫瘍がなく、８匹のうち３匹のマウスが腫瘍を徐々に成長させたが、無処置マウスと比較してずっと遅い速度で成長した（図６Ｂ）。８匹のうち５匹のマウスが７０日目まで腫瘍のないままであった。予想されたとおり、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種したマウスは、無処置の対照よりも腫瘍が少なく、腫瘍の成長は対照よりもさらに遅かった（図６Ｃ）。したがって、構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＴＰＳＡ細胞株によって確定された腫瘍の６０％を退行させることができ、また他のマウスでは腫瘍の増殖を遅らせた。治癒したマウスは腫瘍のないままであったが、６８日目にＴＰＳＡ腫瘍で再チャレンジした。
【０３１７】
ＬｍｄｄＡ−１４２によるマウスの免疫化は、増殖を制御でき、また無処置群（図６Ａ）で無かったのと比較して、６０％を越える実験動物（図６Ｂ）でＰＳＡを発現するよう改変された、確定されたＴｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍の７日目の退行を誘発できる。ＬｍｄｄＡ−１４２は、高度に弱毒化されたベクター（ＬｍｄｄＡ）およびプラスミドｐＡｄｖ１４２（表１）を使用して構築された。
【０３１８】
さらに、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築体によって生成されたＰＳＡ特異的なＣＤ８リンパ球の持つ腫瘍を浸潤する能力が、調査された。マウスには腫瘍およびマトリゲルの混合物が皮下移植された後、未変性または対照（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）リステリアで、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで、７日間隔で２回の免疫化がなされた。腫瘍は、２１日目に切除され、ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋と、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋の母集団で、腫瘍における制御性Ｔ細胞の浸潤性について分析された。
【０３１９】
無処置マウスおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７対照免疫化マウスの両方に存在したＰＳＡに特異的な、非常に少数のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が観察された。ところが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスでは、ＰＳＡ特異的なＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋  ＴＩＬの割合に１０〜３０倍の増加があった（図７Ａ）。興味深いことに、脾臓内のＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＰＳＡ四量体＋細胞の母集団は、腫瘍内よりも７．５倍少なかった（図７Ａ）。
【０３２０】
さらに、未処置マウスおよびリステリア免疫化マウスの腫瘍内でのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｓ）の存在が確認された。興味深いことに、リステリアでの免疫化によって、結果として、腫瘍内のＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇｓの数がかなり減少したが、脾臓内では減少しなかった（図７Ｂ）。ところが、構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、無処置およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化群と比較した時に、腫瘍内でのＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇｓの頻度の減少に強力な影響を及ぼした（図７Ｂ）。
【０３２１】
よって、ＬｍｄｄＡ−１４２ワクチンは、腫瘍部位を浸潤することができるＰＳＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発できる（図７Ａ）。興味深いことに、ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化は、腫瘍内での制御性Ｔ細胞数の減少に関連し（図７Ｂ）、おそらく、効率的な抗腫瘍ＣＴＬ活性について、より好ましい環境が創出される。
［実施例７］  Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＰＳＡ融合にもかかわらず、機能性ＬＬＯを分泌する。
【０３２２】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、完全長ヒトｋｌｋ３遺伝子を含み、これはＰＳＡタンパク質をコードし、相同組換えにより染色体内のｈｌｙ遺伝子の下流にインフレームで挿入される。これらの構築体は、ｐＫＳＶ７プラスミド（ＳｍｉｔｈおよびＹｏｕｎｇｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．  １９９２；７４（７−８）ｐ７０５−７１１）を使用して相同組換えにより作成されるが、これは温度感受性レプリコンを有し、ｈｌｙ−ｋｌｋ３−ｍｐｌ組み換えカセットを保有する。第２の組み換え事象後のプラスミド切除のため、統合選択に使用される抗生物質抵抗性マーカーは失われる。さらに、ＡｃｔＡ遺伝子は、ＬｍｄｄＡ−１４３株内で除去される（図８Ａ）。ｈｌｙとインフレームのｋｌｋ３の染色体への挿入が、ＰＣＲにより確認され（図８Ｂ）、両方の構築体で配列決定がなされた（データ非表示）。
【０３２３】
これらの染色体構築体の一つの重要な面は、ＬＬＯ−ＰＳＡが生成されても、リステリアが食胞、サイトゾル浸潤およびＬ．モノサイトゲネスによって生成された効率的な免疫から逃れるために必要とされるＬＬＯの機能が完全には消滅しないことである。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３培養上清からの分泌タンパク質のウエスタンブロットにより、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質に対応する〜８１  ｋＤａ帯域および予想されたＬＬＯのサイズである〜６０  ｋＤａ帯域（図９Ａ）が明らかにされるが、これは染色体内の融合遺伝子にもかかわらず、ＬＬＯがＬ．モノサイトゲネスによってＬＬＯ−ＰＳＡ融合から切断されたか、またはなおも単一のタンパク質から生成されたかのいずれかであることを示す。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によるＬＬＯ分泌により、野生型Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓと比較して、５０％の溶血活性が保持された（図９Ｂ）。これらの結果と一致して、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらも、マクロファージ様のＪ７７４細胞株内で、細胞内での複製ができた（図９Ｃ）。
［実施例８］  Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらもＰＳＡ抗原に対する細胞媒介性の免疫応答を誘発する。
【０３２４】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらも、ＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌できることを示した後、これらの菌株がＰＳＡ特異的な免疫応答をインビボで誘発できるかどうかを調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、未処置のままか、またはＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３またはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫化された。ＰＳＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＰＳＡ６５−７４ペプチドおよびＩＦＮ−γについての細胞内染色により脾細胞を刺激することで測定された。図１０に示すとおり、染色体およびプラスミドをベースにしたベクターにより誘発された免疫応答は同様であった。
［実施例９］  ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ融合タンパク質を分泌する組み換え型Ｌｍ株により、結果的に広範な抗腫瘍性応答がもたらされる。
【０３２５】
前もってマップされ予測されたＨＬＡ−Ａ２エピトープの位置に基づき明確なＨＭＷ−ＭＡＡ断片を発現する３つのＬｍベースのワクチンがデザインされた（図１１Ａ）。Ｌｍ−ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＭＡ２１６０−２２５８（別称Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ）は、非病毒性Ｌｍ  ＸＦＬ−７株およびｐＧＧ５５−ｂａｓｅｄプラスミドに基づくものである。この株は、ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８融合タンパク質に対応する〜６２  ｋＤａ帯域を分泌する（図１１Ｂ）。ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８の分泌は、おそらくこの断片の高い疎水性のために比較的弱く、これはＨＭＷ−ＭＡＡ膜貫通領域ドメインに対応する。完全長ＨＭＷ−ＭＡＡ遺伝子で形質移入されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を使用して、最大６２．５％のＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫化したマウスで、確定された腫瘍の増殖を妨げることができたことを観察した（図１１Ｃ）。この結果は、ＨＭＷ−ＭＡＡは、ワクチン接種戦略において標的抗原として使用されうることを示す。興味深いことに、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでのマウスの免疫化により、Ｂ１６Ｆ１０、ＲＥＮＣＡおよびＮＴ−２などのＨＭＷ−ＭＡＡを発現するように改変されていない腫瘍の増殖が著しく損なわれたことも観察したが（図１１Ｄ）、これは別個のマウス菌株由来であった。ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を発現する乳ガン細胞株であり、ＦＶＢ／Ｎトランスジェニックマウス由来である、ＮＴ−２腫瘍モデルにおいて、腫瘍接種後７日目のＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでの免疫化により、腫瘍増殖が損なわれただけでなく、５匹のうち１匹のマウスで腫瘍の退行も誘発された（図１１Ｄ）。
［実施例１０］  Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでのマウスの免疫化により、ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍間質の浸潤、および腫瘍血管系での周皮細胞の範囲著しい減少が誘発される。
【０３２６】
ＮＴ−２細胞はＨＭＷ−ＭＡＡ相同体ＮＧ２を発現しないが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣでのＦＶＢ／Ｎマウスの免疫化は、ＮＴ−２腫瘍の増殖を著しく損ない、最終的に腫瘍退行につながった（図１１Ｄ）。この腫瘍モデルは、腫瘍部位での免疫蛍光によるＣＤ８＋Ｔ細胞および周皮細胞の評価に使用された。ＣＤ８についてのＮＴ−２腫瘍切片の染色では、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃワクチンで免疫化したマウスでＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への、および血管周辺での浸潤が示されたが、対照ワクチンで免疫化したマウスでは示されなかった（図１２Ａ）。ＮＴ−２腫瘍における周皮細胞も、αＳＭＡおよびＮＧ２（マウスのＨＭＷ−ＭＡＡ相同体）抗体で二重染色法により分析された。３つの独立したＮＴ−２腫瘍からのデータ分析により、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫化したマウスで、対照と比較して周皮細胞数の著しい減少が見られた（Ｐ  ≦  ０．０５）（図１２Ｂ）。分析がワクチンによる標的ではないｔｏαＳＭＡについて染色された細胞に制限された時、同様な結果が得られた（データ非表示）。よって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃワクチン接種は、周皮細胞を標的化することで、腫瘍部位での血管形成に影響を及ぼす。
［実施例１１］  両方の異種抗原に対する免疫応答を引き出す、ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＴＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８融合タンパク質の同時発現および分泌による、抗腫瘍活性を強化した組み換え型Ｌ．モノサイトゲネスベクターの開発。
材料および方法：
【０３２７】
ｐＡＤＶ１６８プラスミドの構築  ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ断片は、ｐＣＲ２．１−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８プラスミドからＸｈｏＩおよびＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼでの二重消化によって切り離される。この断片はすでにＸｈｏＩおよびＸｍａＩを用いて消化されたｐＡＤＶ１３４プラスミド内でクローニングされてＥ７遺伝子を切り離す。ｐＡＤＶ１６８プラスミドは、ＲＦＬＰおよび配列解析のために、ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）大腸菌株ＭＢ２１５９およびスクリーニング陽性クローンをエレクトロコンピテントへと電気穿孔させる。
【０３２８】
Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８、ならびに対照株ＬｍｄｄＡ−１６８、Ｌｍｄｄ−１４３／１３４およびＬｍｄｄＡ−１４３／１３４の構築。Ｌｍｄｄ、Ｌｍｄｄ−１４３、およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ｐＡＤＶ１６８プラスミドまたはｐＡＤＶ１３４プラスミドのいずれかで形質転換される。形質転換細胞を、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）で補助し、Ｄ−アラニンを含まないブレインハートインフージョン寒天培養基（ＢＨＩｓ培地）プレート上で選択した。個別のクローンをＬＬＯ−ＰＳＡ、ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８、およびｔＬＬＯ−Ｅ７分泌のために、細菌培養上清の中でウエスタンブロットによって、抗ＬＬＯ、抗ＰＳＡ，または抗Ｅ７抗体を使用してスクリーニングした。各々の株から選択されたクローンは、インビトロおよびインビボでの病毒性について評価されることになる。各々の株は最も安定な組み換え型クローンを選択するためにインビボで２回継代される。簡潔に述べると、各々の構築体から選択されたクローンを、増殖し、１×１０８ＣＦＵ／マウスで４匹のマウスの群に腹腔内に注射した。１日目および３日目に脾臓を採取し、均質化し、ＢＨＩ−寒天培養基プレート上にプレーティングした。第１継代後、各々の株から１つのコロニーが選択され、インビボで２回目に継代された。ベクターがその生存能力を損なうレベルまでさらに弱毒化するのを防止するために、独特の弱毒化レベルを有する２つのベクター内の構築体（Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８）を生成した。
【０３２９】
Ｊ７７４細胞でのインビトロの病毒性決定。マクロファージによるＬｍの摂取に続き、首尾よい抗原送達およびＬｍベースのワクチンによる提示には、サイトゾルの浸潤および細胞内増殖が必要とされる。新しい組み換え型Ｌｍ株でこれらの特定を検査するために、マクロファージ様のＪ７７４細胞株を使用したインビトロ浸潤アッセイが使用された。手短に言えば、Ｊ７７４細胞を、対照野生型Ｌｍ株１０４０３Ｓまたは検査対象の新しいＬｍ株のいずれかで、抗生物質のない培地内で１時間にわたりＭＯＩ値１：１で感染させた。細胞外の細菌は、１０  μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの培地内での１時間の培養により殺された。試料が規則正しい間隔で収穫され、細胞が水で溶解された。溶解物の１０倍の段階希釈をＢＨＩプレート上に二重にプレーティングし、各々のサンプルでコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。
【０３３０】
インビボでの病毒性研究。４匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（生後７週）の群に、（１×１０８および１×１０９ＣＦＵ／回）の２つの異なる、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１６８、Ｌｍｄｄ−１４３／１３４、またはＬｍｄｄＡ−１４３／１３４株の投与量を腹腔内で注射した。マウスを生存性およびＬＤ５０推定について２週間の間追跡調査した。１×１０８より大きいＬＤ５０は、他のＬｍベースのワクチンでのそれまでの経験に基づいて許容可能な値を構造化する。
結果
【０３３１】
ｐＡＤＶ１６８プラスミドが順調に構造化されると、正しいＨＭＷ−ＭＡＡ配列の存在のために配列決定される。これらの新しい株の中のこのプラスミドは、各々の構築体に対して特異的なＬＬＯ融合タンパク質を発現および分泌する。これらの株を、ＡｃｔＡが不完全な（ＬｍｄｄＡ）株のために、少なくとも１×１０８ＣＦＵで、おそらく１×１０９ＣＦＵより高いＬＤ５０を用いて高度に弱毒化し、これはａｃｔＡ遺伝子を欠いていて、その結果として細胞間の拡散の能力を欠いている。構築体が検査され、弱毒化と治療上の有効性の間のバランスがよりとれているものが選択された。
［実施例１２］  Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８を用いた免疫化に際して引き出される免疫応答および抗腫瘍効果の検出。
【０３３２】
Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８株を用いた免疫化の際のマウスで、これらの抗原に対するＩＦＮ−γ産生の検出などの標準的な方法を使用して、ＰＳＡおよびＨＭＷ−ＭＡＡに対する免疫応答を研究した。デュアル発現ベクターの治療的な有効性をＴＰＳＡ２３腫瘍モデルで試験した。
【０３３３】
ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色  Ｃ５７ＢＬ／６  マウス（３  マウス／治療群）が、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８株で、１週間間隔で２回免疫化された。この実験の対照として、マウスは、Ｌｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４２、ＬｍｄｄＡ−１６８、Ｌｍｄｄ−１４３／１３４、ＬｍｄｄＡ−１４３／１３４で免疫化されるか、または未処置のまま（無処置群）であった。脾臓は、7日後に収穫され、脾細胞の単一の細胞懸濁液が調製された。これらの脾細胞は、丸底９６ウェルプレートに、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）を含む新たに調製したＲＰＭＩ完全培地内に、２×１０６細胞／ウェルでプレーティングされ、ＰＳＡ  Ｈ−２Ｄｂペプチド、ＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬ、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、またはＨＰＶ１６  Ｅ７  Ｈ−２Ｄｂ  対照ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号：３６、最終濃度１μＭ）のいずれかで刺激された。ＨＭＷ−ＭＡＡ−エピトープはＣ５７ＢＬ／６マウスでマップされていないため、ＨＭＷ−ＭＡＡ特異的な免疫応答は、２×１０６の脾細胞を２×１０５のＥＬ４−ＨＭＷ−ＭＡＡ細胞と共に培養することにより検出される。細胞は、細胞内での細胞内ＩＦＮ−γを保持するために、モネンシンの存在下で５時間にわたり培養される。培養後、細胞は抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ抗体で染色される。その後、ＩＦＮ−γＰＥについて透過処理および染色がなされ、４色ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析される。
【０３３４】
細胞毒性アッセイ  ワクチン接種に伴い生成されたＰＳＡおよびＨＭＷ−ＭＡＡ特異的Ｔ細胞のエフェクター活性を調査するために、分離された脾細胞が５日間にわたり、２０  Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−２（Ｓｉｇｍａ）を含む完全ＲＰＭＩ培地で、刺激細胞（ＰＳＡまたはＨＭＷ−ＭＡＡワクシニアのいずれかで感染された、マイトマイシンＣ処理されたＭＣ５７Ｇ細胞）の存在下で培養される。細胞毒性アッセイでは、ＥＬ４標的細胞が１５分間にわたりＤＤＡＯ−ＳＥ（０．６  μＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識化され、完全培地で２回洗浄された。標識化された標的細胞は、ＰＳＡ  Ｈ−２Ｄｂペプチド、またはＨＰＶ１６  Ｅ７  Ｈ−２Ｄｂ対照ペプチド（最終濃度５μＭ）のいずれかを用いて１時間にわたりパルスされる。ＨＭＷ−ＭＡＡ特異的な細胞毒性応答では、ＥＬ４−ＨＭＷ−ＭＡＡ細胞が標的として使用される。細胞毒性アッセイは、標的細胞（Ｔ）をエフェクター細胞（Ｅ）と共に、異なるＥ：Ｔ比で２〜３時間培養することにより、２時間にわたり実施される。細胞はホルマリンを用いて固定され、切断したカスパーゼ−３用に透過処理および染色がなされて、標的細胞におけるアポトーシスの誘発が検出される。
【０３３５】
抗腫瘍有効性  Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８株の抗腫瘍有効性が、Ｔ−ＰＳＡ２３腫瘍モデル（ＴｒａｍｐＣ−１／ＰＳＡ）を使用して、ＬｍｄｄＡ−１４２およびＬｍｄｄＡ−１６８のそれと比較された。８匹のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（生後６〜８週）の群は、２×１０６のＴ−ＰＳＡ２３細胞を皮下摂取され、７日後に、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４２およびＬｍｄｄＡ−１６８の０．１×ＬＤ５０の投与量で腹腔内免疫化される。対照として、マウスは、未処置のままであるか、またはＬｍ対照株（ＬｍｄｄＡ−１３４）で免疫化される。各群は7日間隔で２回の追加的なワクチン投与を受ける。腫瘍は、６０日間にわたり、またはサイズが２  ｃｍになるまで監視され、その時点で、マウスは犠牲にされる。
結果
【０３３６】
ＬｍｄｄＡ−１６８でのマウスの免疫化により、ＨＭＷ−ＭＡＡに対する特異的応答が誘発される。同様に、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８は、それぞれの抗原を個別に発現するＬ．  モノサイトゲネスベクターにより生成される免疫応答に匹敵する、ＰＳＡおよびＨＭＷ−ＭＡＡに対する免疫応答を誘発する。Ｔ−ＰＳＡ−２３を有するマウスのＬｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８での免疫化により、ＬｍｄｄＡ−１４２またはＬｍｄｄＡ−１６８のいずれかでの免疫化よりもすぐれた抗腫瘍治療有効性がもたらされる。
［実施例１３］  Ｌｍｄｄ−１４３／１６８またはＬｍｄｄＡ−１４３／１６８のいずれかでの免疫化により、周皮細胞の破壊、内皮細胞内の接着分子の上方制御、およびＰＳＡに特異的なＴＩＬの浸潤の改善がもたらされる。
【０３３７】
腫瘍浸潤性リンパ球および内皮細胞接着分子の特性付けが、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８またはＬｍｄｄＡ−１４３／１６８での免疫化に伴い誘発された。Ｌｍｄｄ−１４３／１６８またはＬｍｄｄＡ−１４３／１６８のいずれかで免疫化されたマウスからの腫瘍が、免疫蛍光により分析され、内皮細胞による接着分子の発現、腫瘍血管系での血液血管密度および周皮細胞の範囲、ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞を含む免疫細胞による腫瘍の浸潤が研究される。ＰＳＡ抗原に特異的なＴＩＬが、四量体分析および機能性検査により特性付けされる。
【０３３８】
腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の分析  マトリゲルに包埋されたＴＰＳＡ２３細胞が、マウス（ｎ＝３／群）に皮下摂取されるが、これが、７日目および１４日目に、抗腫瘍研究で得られた結果に基づきどちらがより効果的であるかに応じてＬｍｄｄ−１４３／１６８またはＬｍｄｄＡ−１４３／１６８のいずれかで免疫化される。比較のために、マウスは、ＬｍｄｄＡ−１４２、ＬｍｄｄＡ−１６８、対照ＬｍＬｍワクチンで免疫化されるか、または未処置のままとする。２１日目に、腫瘍は外科的に切除され、氷冷のＰＢＳで洗浄され、メスで細かく刻まれる。腫瘍はディスパーゼで処理されてマトリゲルが可溶化され、分析用に単一の細胞が放出される。ＰＳＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＰＳＡ６５−７４  Ｈ−２Ｄｂ四量体−ＰＥおよび抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ抗体で染色される。腫瘍内で調節性Ｔ細胞を分析するために、ＴＩＬは、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＣＤ２５−ＡＰＣで染色され、その後でＦｏｘＰ３染色（抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥ、Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）のために透過処理される。細胞は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析される。
【０３３９】
免疫蛍光  腫瘍接種後２１日目に、マトリゲルに包埋されたＴＰＳＡ２３腫瘍が、外科的に切除され、ＯＣＴ寒剤内に断片が直ちに凍結保存される。腫瘍断片が８〜１０μｍ厚の切片に冷凍切断される。免疫蛍光のために、サンプルが解凍され、４％のホルマリンを使用して固定される。ブロッキングの後、切片が加湿器内でブロッキング溶液中の抗体により３７℃で１時間染色される。製造業者の取扱説明書によりＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色が実施される。細胞内染色（αＳＭＡ）のために、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ／１％  ＢＳＡ溶液中で培養が実施される。退色防止剤入りの封入溶液（Ｂｉｏｍｅｄａ）を使用してスライドにカバーグラスをかけ、２４時間硬化させ、Ｓｐｏｔ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（２００６）およびＢＸ５１シリーズＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡を使用した撮像まで４℃にて保持される。ＣＤ８、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、αＳＭＡ、ＮＧ２、ＣＤ３１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＶＡＰ−１が免疫蛍光により評価される。
【０３４０】
統計的解析  ノンパラメトリックなＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定およびＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定が、異なる投与群間で腫瘍のサイズを比較するために適用された。腫瘍のサイズが最新の時点で各群で最高数のマウス（8マウス）と比較される。これらの解析では、０．０５未満のｐ値は統計的に有意であると考えられる。
結果
【０３４１】
ＴＰＳＡ２３を有するマウスをＬｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８で免疫化することで、多数のＰＳＡ特異的なエフェクターＴＩＬがもたらされ、また腫瘍血管系の周皮細胞の範囲が減少する。さらに、細胞接着マーカーは、免疫化マウス内で著しく上方制御される。
［実施例１４］  マウスおよびヒトのサバイビンを発現する弱毒化リステリア・モノサイトゲネスベースのワクチンの構築。
材料および方法
リステリア・モノサイトゲネス（ＬｍｄｄΔＡｃｔＡ）特異的プラスミド内でのサバイビン遺伝子のクローニング
【０３４２】
サバイビン遺伝子の出所は、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  ＨｏｐｅにあるＤｒ．  Ｄｏｎ  Ｄｉａｍｏｎｄラボである。マウスサバイビン（ｍ−サバイビン）およびヒトサバイビン（ｈ−サバイビン）ＤＮＡ配列が、マウスサバイビンについてはオリゴ（Ａｄｖ５５４−ａｔｃｔｃｇａｇｇｇａｇｃｔｃｃｇｇｃｇｃｔｇｃｃｃ（配列番号：３７）およびＡｄｖ５５５−ａｔｃｃｃｇｇｇｔｔａｇｇｃａｇｃｃａｇｃｔｇｃｔｃ（配列番号：３８））を使用して、ならびに菌株のｍ−ＲＮＡ配列をテンプレートとして使用して取得されたヒトサバイビン断片については、オリゴ（Ａｄｖ５５２−ａｔｃｔｃｇａｇｇｇｔｇｃｃｃｃｇａｃｇｔｔｇｃｃｃ（配列番号：３９）およびＡｄｖ５５３−ａｔｃｃｃｇｇｇ  ｔｃａａｔｃｃａｔｇｇｃａｇｃｃａｇｃ（配列番号：４０））を使用して、ＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ増幅後のＤＮＡ断片の予想されるサイズは、図１３に示すように、ｍ−サバイビンについては４２３ｂｐであり、ｈ−サバイビンについては４２６ｂｐであった。断片は生成され、およびＴＡ  ＴＯＰＯがｐＣＲ２．１プラスミド内にクローン化され、  その結果、プラスミドｐＡｄｖ２６１（ｍ−サバイビン／ｐＣＲ２．１）およびｐＡｄｖ２６２（ｈ−サバイビン／ｐＣＲ２．１）が得られた。いくつかのｈ−サバイビン／ｐＣＲ２．１およびｍ−サバイビン／ｐＣＲ２．１クローンがＰＣＲスクリーニングされ、陽性のクローンが配列検証により確認された。
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ−ｄｄＡ）ワクチンの構築
【０３４３】
さらに、ｐＡｄｖ２６１（ｍ−サバイビン／ｐＣＲ２．１）およびｐＡｄｖ２６２（ｈ−サバイビン／ｐＣＲ２．１）遺伝子断片が、ＸｈｏＩ／ＸｍａＩ制限酵素を使用して切除され、ｐＡｄｖ１４２リステリアベースのシャトルベクター（ＸｈｏＩ／ＸｍａＩ制限部位から切除されたヒトＰＳＡ  ｋｌｋ３）にクローン化され、その結果として、プラスミドｐＡｄｖ２６５．５（ｈ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）およびｐＡｄｖ２６６．７（ｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）が得られた。ｈ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２およびｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２のＤＮＡ連結が、大腸菌ＭＢ２１５９エレクトロコンピテント細胞に形質転換され、結果的な形質転換体が望ましい遺伝子断片のクローニングについて検査された。
【０３４４】
プラスミドｐＡｄｖ２６５．５内のヒトサバイビンＤＮＡ配列  
【０３４５】
【化５−１】
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【化５−２】
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【化５−３】
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凡例：
−通常の大文字配列：ｈｌｙプロモーター。
−イタリック体、大文字の配列：ｐ１５起源。
−太字、大文字の配列：ｔ−ＬＬＯ  ＯＲＦ。
−イタリック体、下線付き、大文字の配列：サバイビン。
−イタリック体、太字、下線付き、大文字の配列：Rep  R  ＯＲＦ.  
−小文字の配列：ｐ６０−Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｌ
【０３４６】
プラスミドｐＡｄｖ２６５．５およびｐＡｄｖ２６６．７について配列決定されたオリゴ領域およびＤＮＡ領域のリストが、下記の表に記載されている。
【表３】
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ＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質の発現および分泌
【０３４７】
新しいプラスミド、ｈ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２（ｐＡＤＶ  ２６５．５）（図１４Ｂ）およびｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２（ｐＡＤＶ  ２６６．７）（図１４Ａ）が、リステリアＬｍｄｄＡバックボーンに形質転換された。ＬｍｄｄＡ−２６５．５（ｈ−Ｓｕｖｉｖｉｎ／ｐＡｄｖ１４２）およびＬｍｄｄＡ−２６６．７（ｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）と名付けられたいくつかのリステリアクローンが選択され、モノクローナル抗体抗Ｂ３−１９を使用して検出された染色体ＬＬＯタンパク質、短縮ＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質およびポリクローナル抗体抗ＰＥＳＴを使用して検出された崩壊ｔ−ＬＬＯタンパク質、ならびにモノクローナル抗体抗サバイビンを使用して検出されたｔＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質の発現および分泌についてスクリーニングされた。ＬｍｄｄＡ−２６５．５（ｈ−Ｓｕｖｉｖｉｎ／ｐＡｄｖ１４２）およびＬｍｄｄＡ−２６６．７（ｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）構築体からのクローン＃１が、第１のインビボ継代に選択された。
［実施例１５］  株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−サバイビンのインビボでの継代培養
インビボでの２継代後のＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−サバイビンの発現
【０３４８】
ＬｍｄｄＡ−２６５．５（ｈ−Ｓｕｖｉｖｉｎ／ｐＡｄｖ１４２）およびＬｍｄｄＡ−２６６．７（ｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）ストックが第１のインビボ継代のために調製された。インビボ継代培養（Ｐ１）のために、１匹のマウスに１０８ＣＦＵの各構築体が腹腔内投与され、マウスの脾臓が注射後１日目に収穫された。脾臓で回収されたコロニー合計数は下記に示すとおりである。
【０３４９】
ＬｍｄｄＡ−２６５．５（ｈ−Ｓｕｖｉｖｉｎ／ｐＡｄｖ１４２）＝  ９．８×１０３  ＣＦＵ／脾臓。
【０３５０】
ＬｍｄｄＡ−２６６．７（ｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）＝  １．４２×１０４  ＣＦＵ／脾臓。
【０３５１】
ＬｍｄｄＡ−２６５．５（ｈ−Ｓｕｖｉｖｉｎ／ｐＡｄｖ１４２）およびＬｍｄｄＡ−２６６．７（ｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）ストックが第２のインビボ継代のために調製された。第２のインビボ継代培養（Ｐ２）のために、１匹のマウスに１０８ＣＦＵの各構築体が腹腔内に注入され、マウスの脾臓が注射後１日目に収穫された。脾臓で回収されたコロニー合計数は下記に示すとおりである。
【０３５２】
ＬｍｄｄＡ−２６５．５（ｈ−Ｓｕｖｉｖｉｎ／ｐＡｄｖ１４２）＝  １．４０×１０４  ＣＦＵ／脾臓。
【０３５３】
ＬｍｄｄＡ−２６６．７（ｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）＝  ６．３８×１０４  ＣＦＵ／脾臓。
【０３５４】
ＬｍｄｄＡ−２６５．５（ｈ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）およびＬｍｄｄＡ−２６６．７（ｍ−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）（Ｐ２、１日目）からの３つのコロニーが、タンパク質の発現のために選択された。これらの構築体からの３つのコロニーではすべて、第２のインビボ継代の後で、免疫ブロットにより、サバイビンに特異的なモノクローナル抗体を使用して検出されるｔＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質の発現および分泌が保持された（図１５）。
【０３５５】
これらの構築体ＬｍｄｄＡ−２６５．５（ヒト−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）およびＬｍｄｄＡ−２６６．７（マウス−サバイビン／ｐＡｄｖ１４２）では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるインビボでの２継代の後で、ｔＬＬＯ−サバイビン融合タンパク質の発現および分泌が保持された（図１６）。
［実施例１６］  サバイビンを発現するリステリアをベースにした免疫療法での治療後の腫瘍増殖の減少
【０３５６】
本研究では、マウスは、０日目に１×１０６のＮＴ−２腫瘍が移植され、６日目、１３日目および２０日目に２×１０８  ＣＦＵのＬｍｄｄＡ２６５．５（サバイビン）免疫療法で治療した。カリパスにより腫瘍増殖が測定され、研究は６５日目に終了した。このデータは、ＬｍｄｄＡ２６５．５がＦｖＢマウスにおいて確定されたＮＴ２腫瘍の増殖に影響を及ぼす証拠を提供する。ＬｍｄｄＡ２６５．５での治療は、ＮＴ２腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍増殖の安定化をもたらし、６５日目まで観察がなされた（図１７を参照）。
【０３５７】
添付の図面を参照して本発明の実施形態を記述してきたが、本発明は厳密に実施形態に限定されず、かつ添付の特許請求の範囲に定義されるように、当業者によって本発明の範囲または趣旨から逸脱することなくこれらに様々な変更および修正がなされてもよいことが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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