(57)【要約】  本開示は、例えば、高い育種価を有する選択候補を特定するために、倍加半数体を生成する目的で、植物の育種価を見積もるための方法に関係する。
2017501731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物組織を選択する方法であって、
分離している植物を用意するステップと、
前記分離植物の複数のゲノムセグメントについて、各半数体ゲノムセグメント中の目的の形質の半数体価（ＨＶ）を決定するステップであって、組合せ半数体価（ＣＨＶ）が、植物から生成された倍加半数体の各半数体ゲノムでのＨＶを組み合わせた値であり、最適半数体価（ＯＨＶ）が、植物から生成することのできる最良のＣＨＶである、ステップと、
前記分離植物の最適半数体価（ＯＨＶ）を決定するステップと、
前記分離植物から、倍加半数体植物を作製するのに適した少なくとも１つの倍加半数体植物または半数体組織を生成するステップと、
前記倍加半数体植物または組織のＣＨＶが、それぞれ前記ＯＨＶに接近している場合に、前記倍加半数体植物または半数体組織を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記倍加半数体植物を生成および選択するステップ
を含み、前記選択された倍加半数体植物が、育種プログラムにおいて前進するか、または、新しいエリート植物品種として利用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の倍加半数体植物または半数体組織を生成するステップと、
前記ＯＨＶに接近しているＣＨＶを有する前記複数から、倍加半数体植物または半数体組織を選択するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択された植物または組織のＣＨＶが、前記ＯＨＶと同一であるか、前記選択された植物または組織のＣＨＶが、前記ＯＨＶと実質的に同一であるか、または、前記選択された植物または組織のＣＨＶが、前記分離植物から生成された他の倍加半数体植物または半数体組織のＣＨＶよりも前記ＯＨＶに近い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記半数体組織を選択するステップと、前記半数体組織から倍加半数体植物を生成するステップとを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記倍加半数体植物が、新しいエリート植物品種として利用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
商品生成物が、新しいエリート植物品種として利用される前記選択された植物から生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
後代植物を生成する方法であって、
目的の形質についての複数の植物中の各植物の最適半数体価（ＯＨＶ）を決定するステップと、
前記複数から第１の植物を選択するステップであって、前記第１の植物のＯＨＶが、前記複数の中の植物の最も高いＯＨＶである、ステップと、
前記第１の植物を１つまたは複数の他の植物と交雑させることによって、または前記第１の植物を自殖させることによって、前記後代植物を生成するステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記目的の形質についての前記後代植物の組合せ半数体価（ＣＨＶ）を決定し、前記ＣＨＶが前記第１の植物のＯＨＶに接近している場合に、後代植物を選択するステップと、
前記選択された後代植物から倍加半数体を生成するステップと
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記選択された後代植物のＯＨＶを決定するステップと、
前記倍加半数体を生成した前記選択された後代植物のＯＨＶに接近しているＣＨＶを有する前記倍加半数体の１つを選択するステップと
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
育種集団内で１回または複数回繰り返され、それによって、育種集団内の遺伝的多様性を保持しつつ遺伝獲得量を増加させる、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝獲得量が、ゲノム選択による選択と比較した際に、約０．６遺伝ベース標準偏差分増加する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝的多様性が、ゲノム選択による選択と比較した際に、２世代後に約２倍増加する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記後代植物のゲノムが、多倍体ゲノムである、請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記後代植物のゲノムが、２倍体ゲノムである、請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＯＨＶを決定するステップが、第１の親および第２の親における複数のゲノムセグメントのそれぞれで最も高いＨＶを決定するステップと、ゲノムセグメントのそれぞれについて最も高いＨＶを合計するステップとを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
それぞれの選択された植物または半数体組織が、遺伝子マーカーに連鎖した望ましい形質を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記望ましい形質が、伴性形質、植物の破壊後にのみ検出可能である形質、病害抵抗性形質、または遺伝性の低い形質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
それぞれの選択された植物が、遺伝子マーカーに連鎖した望ましい形質を含み、前記望ましい形質が、前記第１の植物、および前記第１の植物と交雑させた前記他の植物のうち１つのみに存在する、請求項８から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記望ましい形質が、トランスジェニック事象である、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
エリート倍加半数体植物を生成する方法であって、
第１の親植物を第２の親植物と交雑させて、Ｆ１植物の集団を生成するステップと、
少なくとも１つの前記Ｆ１植物から倍加半数体の集団を生成するステップと、
前記集団からエリート倍加半数体植物を選択するステップであって、前記選択された倍加半数体が、育種交雑から生成することのできる個体を分離するためのありうる最も高い最適半数体価（ＯＨＶ）に接近している組合せ半数体価（ＣＨＶ）を有する、ステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記選択された植物が、前記倍加半数体の集団の平均ＣＨＶよりも大きなＣＨＶを有する、請求項１から８および２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の親植物が、目的の対立遺伝子を含み、前記第２の親植物が、目的の対立遺伝子を含まず、前記選択された植物もまた、目的の対立遺伝子を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的の対立遺伝子が、トランスジェニック事象である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
エリート倍加半数体植物を生成する方法であって、
第１の２倍体親植物および複数の第２の候補２倍体親植物を用意するステップと、
前記第１の親植物と前記候補親植物のそれぞれの間の交雑から生成しうる遺伝子型を予測するステップと、
前記予測された遺伝子型のそれぞれの最適半数体価（ＯＨＶ）を決定するステップと、
前記第１の親植物との交雑にて予測された前記第２の候補親植物を選択して、最も高いＯＨＶを有する遺伝子型を生成するステップと、
前記第１の親植物を前記選択された第２の親植物と交雑させて、Ｆ１植物を生成するステップと、
前記Ｆ１植物から半数体植物または組織を生成するステップと、
前記半数体植物または組織のそれぞれの組合せ半数体価（ＣＨＶ）を決定するステップと、
前記Ｆ１植物のＯＨＶに接近しているＣＨＶを有する少なくとも１つの半数体植物または組織を選択するステップと、
前記選択された半数体植物または組織のそれぞれから、倍加半数体の集団を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
所望の形質をエリート植物品種に導入する方法であって、
（ａ）エリート植物品種の第１の親植物を、所望の形質を含む異なる品種の第２の親植物と交雑させて、Ｆ１植物を生成するステップと、
（ｂ）前記Ｆ１植物の最適半数体価（ＯＨＶ）を決定するステップと、
（ｃ）前記Ｆ１植物から半数体を生成するステップと、
（ｄ）前記最適半数体価（ＯＨＶ）に接近している組合せ半数体価（ＣＨＶ）を有する半数体を選択するステップであって、前記ＣＨＶが、前記植物中の複数のゲノムセグメントのそれぞれ、および前記所望の形質の半数体価の合計である、ステップと、
（ｅ）前記選択された半数体から倍加半数体の集団を生成するステップと、
（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）までを連続して１回または複数回実施して、前記所望の形質を含む前記選択されたまたはより高度な戻し交雑後代植物を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
１つまたは複数の所望の形質をエリート植物品種に導入する方法であって、
（ａ）エリート植物品種の第１の親植物を、１つまたは複数の所望の形質を含む異なる品種の第２の親植物と交雑させて、Ｆ１植物を生成するステップであって、前記第１および第２の親植物ゲノムが、多数（ｎ）の対立遺伝子ｘｎ上にいくつかの所望の形質を含み、一連の対立遺伝子が、（ｘ１、ｘ２、・・・ｘｎ）である、ステップと、
（ｂ）対立遺伝子ｘｎのそれぞれの遺伝子移入に重みｗｎを割り当てるステップであって、その結果、それぞれの対立遺伝子についての一連の重みが、（ｗ１、ｗ２、・・・ｗｎ）となる、ステップと、
（ｃ）遺伝子移入で重み付けされた前記Ｆ１植物の最適半数体価（ＯＨＶｉ）を決定するステップであって、前記ＯＨＶｉが、前記対立遺伝子の組み合わされた遺伝子移入に置かれた重み全体（ｉＥｍｐｈａｓｉｓ）を含み、
ＯＨＶｉ＝ＯＨＶ＋ｉＥｍｐｈａｓｉｓ（ｗ１ｘ１、ｗ２ｘ２、・・・ｗｎｘｎ）
として算出される、ステップと、
（ｄ）前記Ｆ１植物から１つまたは複数の半数体を生成するステップと、
（ｅ）前記ＯＨＶｉに接近している組合せ半数体価（ＣＨＶ）を有する少なくとも１つの半数体を選択するステップであって、前記ＣＨＶが、前記植物中の複数のゲノムセグメントのそれぞれ、および前記所望の形質の半数体価の合計である、ステップと、
（ｆ）前記１つまたは複数の選択された半数体のそれぞれから、１つまたは複数の倍加半数体を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
Ｆ１後代植物から複数の半数体を生成するステップと、前記半数体のそれぞれから倍加半数体の集団を生成するステップと、前記ＯＨＶｉに接近しているＣＨＶを有する少なくとも１つの倍加半数体を選択するステップとを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
各ｗｎ＝［前記遺伝子移入対立遺伝子の所望の頻度（ｘｎ）］−［前記遺伝子移入対立遺伝子の実際の頻度（ｘｎ）］である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記植物が、アルファルファ、リンゴ、バナナ、マメ、ブロッコリー、トウゴマ、柑橘類、クローバー、ココナッツ、コーヒー、キュウリ、ベイマツ（Douglas fir）、ユーカリノキ属植物（Eucalyptus）、テーダマツ（Loblolly pine）、アマニ、メロン、オーツムギ、オリーブ、ヤシ、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、ポプラ、ラジアータマツ（Radiata pine）、モロコシ、ダイオウマツ（Southern pine）、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、モミジバフウ、茶、タバコ、トマト、芝、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、オオムギ、トウモロコシ、ワタ、ナタネ／カノーラ、イネ、ライムギ、ダイズまたはコムギ植物である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記植物が、コムギ植物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記植物が、トウモロコシ植物である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年１２月３０日出願の米国非仮特許出願第１４／５８６，４８８号、２０１３年１２月３１日出願の米国仮特許出願第６１／９２２，１４８号、２０１４年２月１３日出願の米国仮特許出願第６１／９３９，５９９号および２０１４年１２月１６日出願の米国仮特許出願第６２／０９２，７３７号の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、植物分子遺伝学および育種に関する。いくつかの実施形態は、好適な交配対について育種集団の中で選択を行うための方法に関する。いくつかの実施形態は、エリート系統としての使用および／または前進のための後代植物を選択するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
植物育種プログラムで倍加半数体を作出することは、非近交系の植物から完全なホモ接合性の個体を作出することを可能にし、それによって、新しい品種の開発を促進する。最も良い倍加半数体の選択は、個々の植物およびその近縁の表現型の記録を利用して、人工的な表現型選択の時間のかかる高コストなプロセスによって達成される。いくつかの場合では、表現型選択はまた、後代検定を含みうる。さらに、表現型と系統とを組み合わせる方法は、個体の推定育種価（ＥＢＶ）を予測するために使用することができる。これらのＥＢＶは、個体の複数回の交配から、後代の性能に関する情報を含む場合がある。例えば、Schaeffer (2006) J. Anim. Breed. Genet. 123:218-23を参照されたい。概して、近縁から得られる情報によって見積りの信頼性が増すことから、最良線形不偏予測（ＢＬＵＰ）を用いて算出されるＥＢＶに基づく選択は、表現型のみの使用と比べた際には好都合である。Henderson (1975) Biometrics 31:423-447。
【０００４】
ゲノム選択（ＧＳ）は、現在、植物選択効率を高めるために実施されている。それは、表現型データ（例えば、病害抵抗性や品質特性などの形質観察）とゲノムデータとの両方を使用する統計学的な遺伝的評価法である。Meuwissen et al. (2001) Genetics 157:1819-29。ＧＳの結果、特定の集団で全てのマーカーについて形質効果の見積りがもたらされる。ＧＳでは、形質効果の見積りを、個体についてゲノム推定育種価（ＧＥＢＶ）を生成するために追加することができる。マーカー効果が見積もられている表現型および遺伝子型を有する対照集団は、「予測方程式」を引き出すために使用される。この予測方程式を、次いで、遺伝子型判定された個体に適用して、ＧＥＢＶを予測することができる。
【０００５】
通常のゲノム選択の実施には、マーカー効果が見積もられている表現型および遺伝子型を有する対照集団、いわゆる予測方程式が必要である。しかし、特定のマーカーが選択に使用されることになる各ファミリーについて、マーカーとＱＴＬの間の連鎖相を確立しなければならないため、異型交配種での低密度のマーカーマップから得られるＧＳのための情報は限られている。しかも、高密度のマーカーマップ中のいくつかのマーカーは、ＱＴＬに非常に近くなり、それゆえ、ＱＴＬと連鎖不均衡となる。Hastbacka et al. (1992) Nat. Genet. 2:204-11。さらに、マーカーマップには、遺伝分散のない（すなわち分離していない）多くの遺伝子座があり、遺伝分散を示すものを数で大きく凌駕している。
【０００６】
ＧＳ法では、新しい完全なゲノム（例えば、集団中で最も良い染色体を全て含む「究極の動物」）を生成するために、染色体ハプロタイプ全体か個々の対立遺伝子のどちらかを選択し、必要に応じて組み合わせることができることを前提とすることによって、集団に用いる選択限界を見積もっている。Cole and VanRaden (2011) J. Anim. Breed. Genet. 128:446-55。さらに、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの選択プログラムにより、遺伝アルゴリズムを同様に使用して、最もよく知られている染色体セグメントを含有する「究極の乳牛」を育種しうる。Kemper et al. (2012) J. Dairy Sci. 95:4646-56。
【０００７】
ウシでは、染色体全体のＧＥＢＶを使用して、好適な交配相手を特定しうる［Cole and VanRaden (2010) J. Dairy Sci. 93:2727-40］が、一方、魚類では、ある特定の倍加半数体の組合せ（「最高位の遺伝子型」）を対照集団で開拓することによって予測の正確性を増すために、シミュレーションが有用である場合がある［Nirea et al. (2012) Genetics Selection Evolution 44:30］。しかし、主要なＱＴＬと軽微なＱＴＬの両方の間にある拮抗的な関係が、算出された選択限界にＧＥＢＶが到達することを妨げる。例えば、前掲のCole and VanRaden (2011)を参照されたい。さらに、推定育種価に基づく選択によって、遺伝的多様性を代償に、次世代の遺伝獲得量が最大になる。前掲のKemper at al. (2012)。このように、全体のＧＥＢＶに基づく選択は、最も高度な応答を次世代に与えるものの、複数世代にわたって獲得量が最大となることを保証されてはいない。
【０００８】
個体のゲノム育種価は、全ての対立遺伝子の効果の合計であり、複合的な形質を高めるには、多数の別個の遺伝子座について対立遺伝子頻度を好ましく変化させることが必要である。しかし、植物育種プログラムで生成される倍加半数体は、各個体が異なるハプロタイプの組合せを遺伝するがゆえに、様々なものとなる。
【発明の概要】
【０００９】
既存の植物の品種を育種して新しい品種を生成する目的では、個々の植物中で最も良い対立遺伝子を組み合わせた場合に、ある特定のハプロタイプの組合せが、他のものを凌ぐことになる。本明細書中の実施形態では、新規の植物育種戦略を利用するが、戦略では、エリート倍加半数体個体を生成および選択するためのプロセスに、最適なまたは最適に近いハプロタイプ（例えば、ゲノムセグメントハプロタイプ）の選択を組み込む。実施形態では、分離植物から生成されうる最良の半数体ゲノムの値であるゲノム最適半数体価（ＯＨＶ）が、分離個体について、または掛け合わせ対（もしくは潜在的な掛け合わせ対）の候補である個体について決定される。いくつかの例では、個々の半数体ゲノムセグメントについてゲノム予測を行い、２倍体の各セグメント対について最も良い半数体ゲノムセグメント（すなわち、最も高い予測値を有するセグメント）を特定し、かつこれらの最良のセグメントの値をセグメント全体にわたって組み合わせて（例えば、合計する）、それによって、最良のゲノムセグメントの組合せを有した半数体個体の育種価、すなわちＯＨＶに到達することにより、ＯＨＶが決定される。例として、最良の各ゲノムセグメントを２コピー有する倍加半数体個体の総合育種価は、２倍（２×）のＯＨＶである。
【００１０】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の半数体植物または半数体組織は、分離植物から生成される。組合せ半数体価（ＣＨＶ）は、半数体植物または半数体組織のそれぞれについて決定され、ここで、ＣＨＶは、半数体ゲノムのセグメントに対する育種価（「半数体価」、ＨＶ）（例えば、定量的な目的の形質についての）の合計である。特定の実施形態では、各半数体植物または組織のＣＨＶは、分離植物のＯＨＶと比べられる。いくつかの例では、ＣＨＶがＯＨＶに接近している場合に、半数体植物または組織が選択され、ここで、選択された半数体植物または組織は、次いで、倍加半数体を作製するために使用されうる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、複数の植物のうちの各植物のＯＨＶは、複数のうちの他の植物（複数可）のＯＨＶと比べられ、「最適な」交雑の選択に用いる基準として使用される。ゆえに、倍加半数体の産出に使用することができる最良の半数体の染色体セットを生成しうる潜在性に基づき、他よりも大きなＯＨＶを有する１つまたは複数の個体が、掛け合わせのために選択されるが、このことによって、倍加半数体集団を掛け合わせるまたは産出する前に選択ステップが導入される。いくつかの実施形態では、選択された個体（複数可）は、別の植物と交雑されて、後代植物（例えば、Ｆ１、Ｆ２またはＦ３の後代植物）を生成し、少なくとも１つの後代植物のＯＨＶが決定される。後代植物のＯＨＶが他よりも大きい場合には、後代植物は、自殖のために、または半数体を生成するために選択されうる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、半数体植物または半数体組織が、選択された後代植物から生成され、半数体植物または組織のＣＨＶは、選択された後代植物のＯＨＶと比べられる。いくつかの例では、ＣＨＶがＯＨＶに接近している場合に、半数体植物または組織がさらに選択され、そこでは、さらに選択された半数体植物または組織は、次いで、倍加半数体植物を作製するために使用されてもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、先述の選択の方法は、ＧＳと比べると、遺伝獲得量および遺伝的多様性を増加させる。それゆえ、ＯＨＶ選択は、ＧＳによって獲得することができるものと比べると、育種プログラムでの複数世代にわたる遺伝獲得量を増加させることを可能にする。
【００１４】
本明細書のいくつかの実施形態は、エリート倍加半数体植物を生成するためのＯＨＶ選択方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、個々の植物のゲノムＯＨＶを決定するステップと、個体から半数体（および／またはその倍加半数体）の集団を生成するステップと、ＯＨＶに等しいかまたは接近しているＣＨＶについて、集団からエリート植物を選択するステップとを含む。
【００１５】
また、本明細書のいくつかの実施形態で提供されるのは、エリート倍加半数体を生成する系統間交雑の潜在性を評価するステップを含む、ＯＨＶ選択植物育種方法であり、エリート倍加半数体は、望ましい対立遺伝子またはＧＭ事象を含有する可能性があり、次いで、別の掛け合わせのために選択されうる。いくつかの実施形態では、本方法は、第１および少なくとも第２の植物の潜在的な後代について、ゲノム最適ＯＨＶを決定するステップと、最適ＯＨＶが選択基準を満たす場合には、第１および第２の植物を交雑させるステップとを含む。特定の実施形態では、基準は、最適ＯＨＶが、第１の植物と複数の追加の植物との潜在的な後代について決定されたもののうち、最も高いものであるという状態である。そのため、いくつかの例では、本方法は、第１の植物と複数の追加の植物のそれぞれとの潜在的な後代について、ありうる最も高いゲノムＯＨＶを決定するステップと、複数のうち、第１の植物との潜在的な交雑においてありうる最も高いＯＨＶを産生するメンバーに、第１の植物を交雑させるステップとを含む。
【００１６】
また、本明細書のいくつかの実施形態で提供されるのは、エリート倍加半数体植物を生成するためのＯＨＶ選択方法であり、本方法は、第１および第２の植物を交雑させて、後代植物の集団を生成するステップと、少なくとも１つの後代植物から、半数体（および任意選択でその倍加半数体）の集団を生成するステップと、倍加半数体のエリート植物、または倍加半数体のエリート植物を生成するための半数体を選択するステップとを含む。いくつかの例では、半数体の集団は、育種交雑に最適なＯＨＶに接近しているＯＨＶについて選択された後代植物から生成される。いくつかの例では、エリート倍加半数体植物を生成するための半数体は、ＯＨＶに接近しているＣＨＶについて、半数体の集団から選択される。特定の実施形態では、第１の植物は、対立遺伝子またはトランスジェニック事象を含み、それは、エリート倍加半数体植物内、またはエリート倍加半数体植物を生成するための半数体内に遺伝子移入される。
【００１７】
本明細書のいくつかの実施形態では、エリート倍加半数体植物を生成するための方法は、植物育種プログラムの中で複数のステップにわたって実施される。例えば、第１の植物系統は、ＯＨＶ選択を使用してエリート倍加半数体を生成するために使用されうるが、ここで、エリート倍加半数体は第２の植物系統となる。第２の植物系統は、次いで、交雑に再度使用されうる。これらの交雑の後代は、次いで、ＯＨＶに基づき再度選択されて、第２のエリート倍加半数体を生成しうる。このプロセスは、新しい望ましいエリート植物系統を得るために、当業者の裁量によるような回数で繰り返されうる。
【００１８】
いくつかの実施形態での植物育種プログラムでＯＨＶを利用することによって、ＧＳを上回って遺伝獲得量が増加し［例えば、０．６遺伝ベース標準偏差（ＳＤ）まで］、一方で、ＧＳと比べた際に、遺伝的多様性もまた増加する。遺伝獲得量のさらに大きな増加は、生成されてそれぞれの交雑対につき遺伝子型判定される後代の数が増加することによって、認識されうる。ＯＨＶの利点は、追加のコストがない点に理解することができ、ＤＨ生成の規模は不変のままであって、それゆえ、植物育種家にとってＯＨＶ選択を魅力的な新しいツールとするものと想定される。
【００１９】
また、本明細書に記載されるのは、１つまたは複数の植物の遺伝子型（複数可）を決定するためのキットと、データベースと、遺伝子型（複数可）からＯＨＶを決定するための手段と、ユーザが遺伝子型情報を入力することを可能にするユーザインターフェースとを含み、１つまたは複数の植物のＯＨＶを決定する植物選択系である。特定の実施形態では、キットは、ポリヌクレオチドが結合した固体支持体を含み、各ポリヌクレオチドは、ゲノムセグメントハプロタイプに密に連鎖した多型遺伝子マーカーにハイブリダイズする。特定の実施形態では、キットは、ＰＣＲに基づくアッセイを含む。特定の実施形態では、キットは、半粒種子もしくは非常に若い植物、および／または半数体植物由来の材料を遺伝子型判定するために使用される。いくつかの例では、遺伝子型（複数可）からＯＨＶを決定するための手段は、解析プログラミングである。いくつかの例では、遺伝子型（複数可）からＯＨＶを決定するための手段は、一覧表である。
【００２０】
先述または他の特徴は、添付の図面を参照して進められる、以下のいくつかの実施形態の詳細な記載からさらに明らかになってゆくことになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】新しいコムギ品種の開発でＯＨＶ選択を適用する一例を含む図である。この例の最初のステップでは、所望の形質についてのＨＶが、望ましい形質（すなわち、星印によって表されるＧＭ事象）を有する第１の植物系統中の、および第１の植物の掛け合わせ相手である第２の植物系統中の、各半数体ゲノムセグメントについて見積もられる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、最適半数体価（ＯＨＶ；この場合は交雑種の後代である分離植物から生成されうる、最良の倍加半数体）を決定する。図説される例では、ＯＨＶが、２つの後代植物について決定され、最も高いＯＨＶは、５＋４＋４＝１３である。次のステップでは、形質についてのＣＨＶが、最も高いＯＨＶを有する交雑種の分離後代から生成される半数体について決定される。この例では、最も高いＯＨＶに接近しているＣＨＶ（すなわちＣＨＶ＝１２）を有する半数体植物が選択される。３番目のステップでは、この半数体植物から倍加半数体が作出され、ここでは、倍加半数体は、新しいエリート品種として選択される。
【図２】ＯＨＶ選択を利用した、例示的な育種プログラムの全体構造を含み、ここで、交雑がｎ世代の間繰り返されてもよく、各世代でエリート固定系統が作出されてもよい。
【図３】ＧＳの代わりにＯＨＶを使用して、より良い遺伝獲得量を含めて、ＧＳを超えるＯＨＶ選択の優位性を図示すグラフ表示を含む図である（２世代から１０世代の遺伝的基盤ＳＤ）。縦軸は、非近交系交雑当たりの子孫の数（ｎＯｆｆ）が様々である（図３ａ）、エリート植物当たりに生成される倍加半数体の数（ｎＤＨ）が様々である（図３ｂ）、ＤＥＦＡＵＬＴシナリオが２０世代続けられる（ｎＧｅｎ）（図３ｃ）、および倍加半数体の生成に取り上げられるエリート個体の数（ｎＥｌｉｔｅＩｎｄ）が様々である（図３ｄ）際の、ＯＨＶとＧＳの間の遺伝獲得量の差（デルタＧ）を示す。
【図４】選択が、ＤＥＦＡＵＬＴおよびｎＤＨ５００シナリオについてのＯＨＶまたはゲノム育種価（ＧＳ）であった際の、各世代での真の遺伝分散を図示したグラフ表示を含む図である（ＳＥ＜３．６４）。
【図５】ＱＴＬの数が変化する（ｎＱＴＬ）（図５ａ）、または染色体当たりのハプロタイプセグメントの数が変化する（ｎＳｅｇ）（図５ｂ）の際のＯＨＶとＧＳの間の遺伝獲得量（デルタＧ）の差を図示したグラフ表示を含む図である。
【図６】生来の遺伝的バックグラウンドを取り戻すための、従来の遺伝子移入を超える、ＯＨＶに基づく遺伝子移入の優位性（遺伝獲得量の増加を含めて）を図示したグラフ表示を含む図である。
【図７】「流れ１」用に設計されたトウモロコシでの汎用ゲノム育種プログラムを図示したグラフ表示を含む図であり、ここで、ＤＨは倍加半数体であり、ｎは世代数である。選択は、最適半数体価とゲノム推定育種価とのどちらかに基づく。エリート倍加半数体は、作出後の第２世代中の交雑集団内に戻して周回されうる。
【図８】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットを利用して、交雑当たりの子孫の数（ｎＯｆｆ）が様々である（１０、５０、１００、２００、５００および１０００）際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、初期から後期の世代でそれぞれ０．１４から０．２８である。
【図９】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットを利用して、エリート植物当たり生成される倍加半数体の数（ｎＤＨ）ｎＯｆｆ）が様々である（１０、５０、１００、２００、５００および１０００）際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、初期から後期の世代でそれぞれ０．１２から０．１９である。
【図１０】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットを利用して、育種プログラム内へ戻して周回させたエリート倍加半数体の数（ｎＤＨｃｙｃｌｅｄ）ｎＯｆｆ）が様々である（０、１０、５０、１００、２００）際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、初期から後期の世代でそれぞれ０．１２から０．１９である。
【図１１】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットを利用して、染色体当たりのハプロタイプセグメントの数（ｎＳｅｇ）が様々である（１、２、３および６）際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、初期から後期の世代でそれぞれ０．１２から０．１８である。
【図１２】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットを利用して、ＯＨＶおよびＧＳ育種プログラムの世代当たりの真の遺伝分散を図示したグラフ表示を含む図である。
【図１３】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットにおける雑種強勢群１のＳＮＰ効果を使用して、交雑当たりの子孫の数（ｎＯｆｆ）が様々である（１０、５０、１００、２００、５００および１０００）際の、ＯＨＶとＧＳの間の遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、０．０４から０．０９である。
【図１４】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットにおける雑種強勢群１のＳＮＰ効果を使用して、エリート植物当たり生成される倍加半数体の数（ｎＤＨ）が様々である際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、０．０４から０．０９である。
【図１５】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットにおける雑種強勢群１のＳＮＰ効果を使用して、染色体当たりのハプロタイプセグメントの数（ｎＳｅｇ）が様々である（１、２、３および６）際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、０．０４から０．０９である。
【図１６】ＯＨＶおよびＧＳ育種プログラムの世代当たりの真の遺伝分散を図説し、かつトウモロコシ由来の経験的なマーカーセットにおける雑種強勢群１のＳＮＰ効果を使用したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、０．０から０．０３である。
【図１７】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットにおける雑種強勢群１のＳＮＰ効果を使用して、交雑当たりの子孫の数（ｎＯｆｆ）が様々である（１０、５０、１００、２００、５００および１０００）際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、０．０４から０．１１である。
【図１８】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットにおける雑種強勢群１のＳＮＰ効果を使用して、エリート植物当たり生成される倍加半数体の数（ｎＤＨ）が様々である（１０、５０、１００、２００、５００および１０００）際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、０．０４から０．０８である。
【図１９】トウモロコシ由来の経験的なマーカーセットにおける雑種強勢群２のＳＮＰ効果を使用して、染色体当たりのハプロタイプセグメントの数（ｎＳｅｇ）が様々である（１、２、３および６）際の、ＯＨＶとＧＳの間の世代当たりの遺伝獲得量の差を図示したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、０．０３から０．０８である。
【図２０】ＯＨＶおよびＧＳ育種プログラムの世代当たりの真の遺伝分散を図説し、かつトウモロコシ由来の経験的なマーカーセットにおける雑種強勢群２のＳＮＰ効果を使用したグラフ表示を含む図である。標準誤差の範囲は、０．０から０．１１である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
本明細書の実施形態では、個々の半数体ゲノムセグメント（系統間交雑の半数体または配偶子に見出されることがあるものなど）について値予測を使用し、目的の形質についての各対に最も良いゲノムセグメントを特定し、これらを合計して、最適な倍加半数体（すなわち、「ＯＨＶ」に接近している半数体価を有する）が決定される。系統間交雑のありうる最も高いＯＨＶは、交雑のＧＥＢＶとは異なる値測定である。例えば、系統間交雑が、所与の染色体対に、１つの非常に良好な半数体染色体と１つの非常に不良な半数体染色体とを産生する。そのような例では、ＧＥＢＶは、これらの値の平均を与えることになるが、一方、本明細書に記載されるようなＯＨＶは、非常に良好な半数体対立遺伝子を組み合わせた値を反映する。
【００２３】
ＧＥＢＶは、全ての対立遺伝子効果の合計であり、そのため、個体が望ましくない対立遺伝子を保有している場合、そのＧＥＢＶを減少させることになる。ＧＳは、集団中で、ハプロタイプの総頻度を増加させる方へ向かう傾向になる（すなわち、ホモ接合性）。それに対して、ＯＨＶは、各セグメントの最も良いハプロタイプ価のみを合計しており、それゆえ、そのセグメントで他方のハプロタイプが優れていれば、価値の低い対立遺伝子は考慮されない。個体のＯＨＶは同じままとなることから、２つの好ましいハプロタイプを保持することに追加の利益はない。このことは、育種集団でさらに多様性のある一連のハプロタイプを維持し、ＯＨＶ選択に由来する多様性を本質的にかつ著しく増加させることにつながる。数多くの望まないＱＴＬ対立遺伝子を保持しているために、維持されるハプロタイプは、質に劣る場合があるが、そのようなハプロタイプはまた、１つまたは複数の好ましい対立遺伝子を含みうる。時間をかけて、組換えによって、そのような好ましい対立遺伝子が平均的なまたは好ましいバックグラウンド内に「放出」されることがあり、次いで、これらのハプロタイプは、選択によって頻度が増加しうる。
【００２４】
本明細書で実証するのは、ＯＨＶ選択は、単独で、例えば、ＧＳを上回る追加の遺伝獲得量において０．６遺伝ＳＤまでを提供するだけではなかったという驚くべき結果である。ＯＨＶ選択はまた、育種集団にさらに多くの遺伝的多様性を保持し、このことは、さらに大きな適応性を提供し、かつ長期に渡ってさらに多くの遺伝獲得を可能にする。例えば、特定の実施形態のＯＨＶ選択は、何周回かの選択後に遺伝分散が失われることによって、形質のいっそうの改善が妨害または制限される（すなわち、遺伝上の「袋小路」）シナリオへと、育種集団が導かれる可能性を低下させる。
【００２５】
ＯＨＶ選択のさらに別の利点は、好ましい（例えば最良の）倍加半数体を生成するその潜在性に基づきエリート植物が選ばれうることであり、このことは、倍加半数体が作出される前に追加の選択ステップを導入することから、コストの節減および性能上の利点につながる。この新機軸は、最適化された遺伝的バックグラウンドで、望ましい対立遺伝子またはトランスジェニック事象を有する栽培品種の開発を加速する。ＯＨＶ選択の特定の利点は、表現型を示す前に（例えば、幼若植物、胚、または組織）および／または植物を交雑させる前に、育種プログラムにおける個体の実際の価値を正確に予測することができることである。質に劣る個体が、貴重なリソースを費やす前に特定され排除されうることから、育種プログラムで早期に選択決定することは、時間および成長コストの大きな削減をもたらす。
【００２６】
いくつかの実施形態で、ＯＨＶ選択では、相加的または上位性の効果を考慮に入れる。対象のゲノム中にわたって膨大な数の一塩基多型のありうる対の組合せがあるために、新しい優れた植物品種を育種する際に上位性交互作用を評価することは、現在のところ極めて非現実的である。本明細書の特定の実施形態では、供試される上位性交互作用の数を低減させることによって、上位性交互作用を評価することがかなり容易になる。例えば、半数体ゲノムセグメントを使用し、ＨＶ、ＣＨＶ、およびＯＨＶを決定するのに使用するなどして、遺伝子座と遺伝子座との交互作用が試験されうる。別の例としては、より長いゲノム距離での交互作用が、全体の半数体ゲノムセグメントのうち最も共通するハプロタイプの交互作用を試験することによって評価されうる。前述の戦略による上位性効果を含めることによって、特定の実施形態では、植物育種に際して好ましい交互作用および遺伝的バックグラウンドの選択を改善することが可能になる。
【００２７】
本発明者らは、エリート倍加半数体をもたらす系統の選択を最適化するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの新しい育種の枠組み（ＯＨＶ）を、記載および供試している。ＯＨＶ選択は、ＧＳよりも多くの遺伝獲得量をもたらし、この利点は、時間と共に増大する。ハプロタイプ選択に焦点を合わせることで、ＯＨＶ選択によって、実質的にさらに多くの遺伝的多様性を育種集団に持ち込むことが可能になる。
【００２８】
ＩＩ．略語
ＢＬＵＰ  最良線形不偏予測
ｃＭ  センチモルガン
ＣＨＶ  組合せ半数体価
ＥＢＶ  推定育種価
ＧＥＢＶ  ゲノム推定育種価
ＧＭ  遺伝子改変の
ＧＳ  ゲノム選択
ＨＶ  半数体価
ＬＤ  連鎖不均衡
ＯＣＶ  最適細胞質価
ＯＨＶ  最適半数体価
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＱＴＬ  量的形質遺伝子座
ＳＤ  標準偏差
【００２９】
ＩＩＩ．用語
最適な：ハプロタイプ価の文脈で本明細書に使用されるとき、用語「最適な」は、分離植物について得ることができる最も高いＣＨＶ（すなわちＯＨＶ）の予測を指す。いくつかの例では、半数体は、分離植物から作出され（例えば、交雑の後代）、ＨＶは、結果として得られる半数体中のゲノムセグメントについて決定されるが、ここで、ＨＶは、合計されてＣＨＶを産生する。いくつかの例では、ＯＨＶに接近しているＣＨＶを有する個々の半数体が選択される。例えば、ＯＨＶと同じまたは実質的に同じＣＨＶを有する個体が選択されうる。さらに別の例として、ＯＨＶに接近しているＣＨＶは、集団の中で決定されるＯＨＶに最も近いＣＨＶであってもよい。いくつかの実施形態では、熟練の実務者の見積りで選択される根拠となるのに充分にＯＨＶに近いＣＨＶを有する個体が特定されない場合は、個体が特定および選択されるまで、特定の交雑からさらに別の後代を生成することがある。
【００３０】
集団：本明細書で使用されるとき、用語「集団」は、次世代に遺伝的に寄与するように、互いに掛け合わせる可能性がある個体の群を指し、植物育種プログラムの個体類が挙げられるが、それらに限定されない。そのような群は、任意のサイズでありうる［例えば、種、品種、系統、栽培種、または単独もしくは複数の交雑（複数可）の後代］。
【００３１】
育種価：本明細書で使用されるとき、用語「育種価」は、育種プログラムでの親としての個体の遺伝価と、単離物または組合せ（すなわち「総合育種価」）で選択の基準（複数可）に対し性能を考慮される際の、個体の遺伝子または遺伝子マーカーの効果とを指す。
【００３２】
遺伝獲得量：本明細書で使用されるとき、用語「遺伝獲得量」は、ある世代から次世代への遺伝的形質または遺伝的形質の組合せの平均的な変化を指し、予測される遺伝獲得量および／または実際の遺伝獲得量が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝獲得量は、１つもしくは複数の選択標的の方向に、遺伝的形質についての値を進めるか、または、大きな負の遺伝獲得量（すなわち、選択基準への悪影響）を少なくとも回避する。
【００３３】
非近交系：本明細書で使用されるとき、用語「非近交系」は、遺伝的に似ていない親の間で繁殖させることによって生成される個体を指す。これに対して、用語「近交系」は、遺伝的に同様または同一の親の間で繁殖させることによって生成される個体を指す。実際には、非近交系集団を概ね利用している植物育種家は、個体の遺伝的特性について、有する情報が限られている（例えば、それらが何の遺伝子を保有するか、またはそれらがどのようなヘテロ接合性であるか）。さらに、バックグラウンドの遺伝データは、急速に変化しうることから、多くの場合に信頼できない。
【００３４】
交雑：用語「育種交雑」、「交雑」および「交雑すること」は、本明細書では互換的に使用され、植物育種プログラムにおける熟慮された掛け合わせなど、離れて関連するかまたは接近して関連する、個体の異種交配（例えば、戻し交雑、近親交配、または自殖）を指す。交雑の後代は、交雑の１つまたは複数の末裔を指し、例えば、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびそれに続く世代の後代が挙げられうる。
【００３５】
戻し交雑：戻し交雑法は、核酸配列を植物内に導入するために使用されうる。戻し交雑の手法は、植物内に新しい形質を導入するために、何十年もの間広く使用されてきた。Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。典型的な戻し交雑のプロトコールでは、目的の本来の品種（反復親）を、目的の導入される遺伝子を保持した第２の品種（非反復親）と交雑させる。この交雑から結果として得られる後代を、次いで、反復親と再び交雑させるが、非反復親から導入された遺伝子に加えて、反復植物の所望の形態学的および生理学的特性の殆ど全てを、変換植物に取り戻した植物が得られるまで、そのプロセスを繰り返す。本明細書のいくつかの実施形態では、戻し交雑育種プログラムは、ＯＨＶ選択を組み込んで、例えば、好適な反復親を特定するための追加的な選択ステップを提供する。
【００３６】
遺伝子座：本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子座」は、認識可能または測定可能な特性（例えば形質）に対応するゲノム上の位置を指す。ＳＮＰ遺伝子座は、その遺伝子座内に含有されるＤＮＡにハイブリダイズするプローブによって規定される。
【００３７】
上位性：本明細書で使用されるとき、用語「上位性」（または「上位性の」）は、２つ以上の遺伝子座間の交互作用を指す。上位性交互作用は、一遺伝子の発現が、１つまたは複数の追加の遺伝子の存在に依存するものである。例えば、２つの上位性遺伝子「Ａ」および「Ｂ」を変異させた場合、各変異がそれ自体で独特の表現型を生成するが、２つの変異が共に遺伝子Ａ変異と同じ表現型を示すところ、そうであれば、遺伝子Ａは、遺伝子Ｂに対し上位にある。
【００３８】
対立遺伝子：本明細書で使用されるとき、用語「対立遺伝子」は、単一の遺伝子座にある遺伝子またはＤＮＡ配列の異なる形態のいずれか１つを指す。
【００３９】
マーカー：本明細書で使用されるとき、マーカーは、特定の対立遺伝子を有するおよび／または特定の形質または表現型を示す可能性がある植物（例えば半数体および２倍体）を特定するのに使用することができる、遺伝子またはヌクレオチド配列を指す。マーカーは、所与のゲノム遺伝子座でのバリエーションとして記載されてもよい。遺伝子マーカーは、単塩基対の変化の周辺の配列（一塩基多型または「ＳＮＰ」）などの短いＤＮＡ配列であっても、長い配列、例えばミニサテライト／単純反復配列（「ＳＳＲ」）であってもよい。「マーカー対立遺伝子」は、特定の植物に存在するマーカーのバージョンを指す。本明細書で使用されるときのマーカーという用語は、植物染色体ＤＮＡのクローン化されたセグメントを指すことがあり、さらに、またはあるいは、植物染色体ＤＮＡのクローン化されたセグメントに相補的なＤＮＡ分子を指すことがある。特定の実施形態では、植物内のマーカーを特定することによって、特定のゲノムセグメントについて育種価を決定することが容易になり、この値は、他の値と組み合わされて、ＨＶを産生しうる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、植物内のマーカーの存在は、核酸プローブの使用を介して検出されうる。プローブは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子でありうる。ＲＮＡプローブは、当技術分野に公知の手段によって合成することができ、例えば、ＤＮＡ分子鋳型を使用して行う。プローブは、マーカーのヌクレオチド配列および植物ゲノム由来の追加の隣接したヌクレオチド配列の全てまたは一部を含有しうる。これは、「隣接プローブ」と本明細書ではよばれる。追加の隣接ヌクレオチド配列は、従来理解されているように、植物染色体由来のその隣接ヌクレオチド配列が本来のマーカーの５’側にあるか３’側にあるかに応じて、本来のマーカーの「上流」または「下流」とよばれる。当業者に認識されるように、マーカーに含めるための追加の隣接ヌクレオチド配列を得るプロセスは、ほぼ無限に繰り返され（染色体の長さによってのみ制限される）、それによって、追加のマーカーが染色体に沿って特定される。特定の例で利用されるプローブの数は、熟練の実務者の判断に従って、例えば、スクリーニングされる遺伝子座またはＱＴＬの数に応じて、決定されうる。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプローブ配列は、合成で、またはクローニングによって調製されうる。適切なクローニングベクターは、当業者に周知である。オリゴヌクレオチドプローブは、標識されていても非標識であってもよい。核酸分子については幅広い種類の標識および標識化手法が存在し、例えば、以下に限定されないが、放射性同位体標識法（例えば、ニックトランスレーション法、ランダムプライミング法、およびターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いたテイリング法）、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、および酵素阻害剤がある。
【００４２】
プローブは、本来のマーカーのものと隣接していないヌクレオチド配列を含有していてもよく、このプローブは、本明細書では「非隣接プローブ」とよばれる。非隣接プローブの配列は、その非隣接プローブが、本来のマーカーと同じマーカーまたは遺伝子に遺伝的に連鎖するように、染色体上の本来のマーカーの配列に充分に近くに位置する。例えば、いくつかの実施形態では、非隣接プローブは、染色体上に本来のマーカーの１００ｃＭ、９５ｃＭ、９０ｃＭ、８５ｃＭ、８０ｃＭ、７５ｃＭ、７０ｃＭ、６５ｃＭ、６０ｃＭ、５５ｃＭ、５０ｃＭ、４５ｃＭ、４０ｃＭ、３５ｃＭ、３０ｃＭ、２５ｃＭ、２０ｃＭ、１５ｃＭまたは１０ｃＭ以内に位置する。いくつかの例では、非隣接プローブは、本来のマーカーの約５０ｃＭ以内に位置する。
【００４３】
プローブは、検出されるマーカーの正確なコピーであってもよい。プローブはまた、検出されるマーカーを含む染色体ＤＮＡのクローン化されたセグメントに実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むかそれからなる、核酸分子であってもよい。
【００４４】
プローブはまた、検出されるマーカー（「ＤＮＡ標的」）の正確なコピーに「特異的にハイブリダイズ可能な」または「特異的に相補的な」核酸分子でありうる。「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）とＤＮＡ標的の間で、安定かつ特異的な結合が発生するのに充分な程度の相補性があることを示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能である標的配列に１００％相補的である必要はない。特異的な結合が望ましい条件、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、核酸と非標的配列との非特異的な結合を回避するのに充分な程度の相補性がある際に、核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００４５】
特定のストリンジェンシーの程度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選んだハイブリダイゼーション方法の性質と、ハイブリダイズしている核酸配列の組成および長さとに応じて、変化することになる。概して、ハイブリダイゼーションの温度と、ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）とが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定することになるが、洗浄時間もまた、ストリンジェンシーに影響を与える。特定のストリンジェンシーの程度を達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11；およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に議論されている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらに詳細な指示および手引きは、例えば、Tijssen, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993；およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出されうる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間に２５％未満のミスマッチがある場合のみに、ハイブリダイゼーションが起こることになる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、さらに特定のレベルのストリンジェンシーを含む。ゆえに、本明細書で使用されるとき、「適度なストリンジェンシー」条件は、２５％超の配列ミスマッチを持つ分子がハイブリダイズすることがない条件であり、「中程度のストリンジェンシー」の条件は、１５％超のミスマッチを持つ分子がハイブリダイズすることがない条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件は、１０％超のミスマッチを持つ配列がハイブリダイズすることがない条件である。「非常に高いストリンジェンシー」の条件は、６％超のミスマッチを持つ配列がハイブリダイズすることがない条件である。
【００４７】
特定の実施形態では、ストリンジェントな条件とは、６×生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液、５×デンハルト（Denhardt's）溶液および１００μｇの剪断サケ精子ＤＮＡ中６５℃でのハイブリダイゼーションと、それに続く１５〜３０分間の連続的な洗浄が２×ＳＳＣ緩衝液および０．５％ＳＤＳ中６５℃で、続いて１×ＳＳＣ緩衝液および０．５％ＳＤＳ中６５℃で、最後に０．２×ＳＳＣ緩衝液および０．５％ＳＤＳ中６５℃である。
【００４８】
上記に議論された前掲の全てのプローブに関して、プローブは、追加の核酸配列、例えば、プロモーター、転写シグナルおよび／またはベクター配列を含んでいてもよい。
【００４９】
連鎖している：連鎖している、密に連鎖している、および極めて密に連鎖している遺伝子マーカーは、マーカー支援育種プログラムに有用であり得、例えば、以下に限定されないが、望ましい形質および表現型を植物品種に遺伝子移入するために、ならびに個体もしくは理論上の個体（例えば、親植物の交雑によって生成されることが予測されるような、ありうる個体の後代）の染色体中のゲノムセグメントについてハプロタイプを決定する（例えば、ＨＶの決定）ために有用でありうる。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、遺伝子間またはマーカー間の連鎖は、染色体上の遺伝子またはマーカーが次世代の個体に共に受け渡しされることの、測定可能な蓋然性を示す現象を指す。２つの遺伝子またはマーカーが互いに近いほど、（１）この蓋然性はより近くなってゆく。そのため、用語「連鎖している」は、第２の遺伝子またはマーカーに０．５超の蓋然性（マーカー／遺伝子が異なる染色体上に位置する独立した取り合わせから予想される）で共に受け渡しされる、１つまたは複数の遺伝子またはマーカーを指すことがある。染色体上の２つの遺伝子またはマーカーの近接性は、遺伝子またはマーカーが次世代の個体に共に受け渡しされる蓋然性に直接的に関連付けられていることから、用語「連鎖している」はまた、同じ染色体上で互いに接近した１つまたは複数の遺伝子またはマーカーを指すこともある。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、マーカーと望ましい形質または表現型との間の連鎖は、無作為の機会（０．５）から予想されるよりも高い蓋然性で、形質または表現型と共にそれぞれ受け渡しされる、１つまたは複数のマーカーを指すことがある。例えば、以下に限定されないが、１つまたは複数のマーカーが共に受け渡しされる蓋然性は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、少なくとも約０．９１、少なくとも約０．９２、少なくとも約０．９３、少なくとも約０．９４、少なくとも約０．９５、少なくとも約０．９６、少なくとも約０．９７、少なくとも約０．９８、少なくとも約０．９９、および／またはほぼ１でありうる。マーカーは、いくつかの例で、特定の形質または表現型を決定する遺伝子内に含まれうる一方で、殆どの場合、マーカーは、同じ染色体上のそのような遺伝子から短い距離で隔たっていることが理解されよう。さらに、大抵の形質または表現型は、複合しており（すなわち、多遺伝子性である）、それゆえ、形質または表現型に連鎖しているマーカーは、いくつかの例で、多遺伝子性の形質の基となっているＱＴＬ内かまたはＱＴＬに連鎖して存在しうる。
【００５２】
用語「連鎖不均衡」（ＬＤ）は、個別の対立遺伝子またはマーカーについて予想されるよりも高い頻度で関連し、その結果、ハプロタイプとして現れる、対立遺伝子または遺伝子座を指す。例えば、２つの遺伝子座のバリアントが、強い連鎖不均衡にある場合、個々の染色体上で、一方の遺伝子座のバリアントは、他方の遺伝子座のバリアントを予測するものである。
【００５３】
マーカー支援育種：本明細書で使用されるとき、用語「マーカー支援育種」は、直接的に１つまたは複数の形質（例えば、多遺伝子性の形質）についての育種へのアプローチを指しうる。マーカー支援育種は、植物品種を改善するために、時間およびコスト効率の良いプロセスを提供する。本願のマーカー支援育種のいくつかの例には、アイソザイムマーカーの使用が含まれる。例えば、Tanksley and Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevierを参照されたい。
【００５４】
現状の実践では、植物育種家は、花の色、種子の被覆の外観や、アイソザイムのバリアントなど、農学上所望の形質に連鎖した、簡単に検出可能な形質を特定しようと試みている。植物育種家は、次いで、簡単に検出可能な形質の分離を辿ることによって、分離された育種集団での農学上の形質を辿る。しかし、目的の形質と、植物育種での使用に利用できる検出可能な形質との間に、これらの連鎖関係は殆どない。本発明のいくつかの実施形態では、マーカー支援育種は、望ましい形質と連鎖しかつＨＶを単位として表現される１つまたは複数の遺伝子マーカー（例えば、ＳＮＰマーカー）を特定するステップと、１つまたは複数のマーカーを分離することによって、分離された育種集団中の望ましい形質を辿るステップとを含んで、例えば、交雑において特定のＣＨＶ／ＯＨＶを生成する。いくつかの例では、１つまたは複数の遺伝子マーカーの分離は、１つまたは複数の遺伝子マーカーの存在について後代植物由来の遺伝子試料をアッセイすることによって、１つまたは複数の遺伝子マーカーのプローブを利用して決定されうる。
【００５５】
一塩基多型（ＳＮＰ）：本明細書で使用されるとき、用語「一塩基多型」は、ゲノム中の単独のヌクレオチド（または他の共有配列）が、種のメンバー間または個体の対の染色体間で異なる際に発生する、ＤＮＡ配列のバリエーションを指す。集団内で、ＳＮＰは、少ない対立遺伝子頻度、すなわち、特定の集団で観察される遺伝子座において最も低い対立遺伝子頻度を割り当てられうる。このことは単に、一塩基多型には、２つの対立遺伝子頻度のうち少ない方ということである。
【００５６】
一塩基多型は、遺伝子のコード配列内、遺伝子の非コード配列内、または遺伝子間の遺伝子間領域に位置する。遺伝子コードに縮重性があるために、コード配列内のＳＮＰは、生産されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させることにはならない。双方の形態が同じポリペプチド配列を生じるＳＮＰは、「同義的」とよばれる（時としてサイレント変異という）。異なるポリペプチド配列が生成する場合には、それらは「非同義的」とよばれる。非同義的な変化は、ミスセンスとナンセンスのどちらかでありうるが、ここで、ミスセンス変化は、異なるアミノ酸をもたらし、ナンセンス変化は、早発の終止コドンをもたらす。タンパク質コード領域にはないＳＮＰは、さらに、遺伝子のスプライシング、転写因子の結合、または非コードＲＮＡの配列に影響を与えうる。ＳＮＰは、通常、二対立遺伝子性であり、それゆえ、容易にアッセイされる。Sachidanandam (2001) Nature 409:928-33。
【００５７】
推論：遺伝子型、ハプロタイプ、ＱＴＬ、マーカー、または他の遺伝子要素に関して、本明細書で使用されるとき、用語「推論」は、入手可能な情報から得られる対立遺伝子の形態の推測を指す。個体のゲノム中の任意の１つまたは複数のマーカー（例えば、特定の遺伝子座またはゲノムセグメント）に関する、失われた対立遺伝子の形態などの失われた情報は、推論されうる。例えば、祖先についての失われた遺伝子型は、祖先への系譜を介して関係のある集団内の個体の遺伝子型のデータを使用して推論されうる。さらに、集団の個体の失われた遺伝子型は、個体への系譜を介して関連がある祖先の遺伝子型データを使用して、例えば、１つまたは複数の統計的手段を採用することによって、推論されうる。
【００５８】
選択：本明細書で使用されるとき、用語「選択」（または選択するもしくは選択される）は、次世代に寄与するための集団中の１つまたは複数の個体を決定する（または、育種の終点を規定する）、１つまたは複数の系、プロセス、ステップ、またはステップの組合せを指し、天然の選択および人工的な選択が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＯＨＶは、集団内の各植物とドナー植物とのありうる交雑について決定される。交雑について最も高いＯＨＶを産生する植物は、次いで、ドナー植物と実際に交雑されるが、一方で、集団内の他の植物は、なおざりにされるかまたは処分されることがあり、それによって、その交雑で最も高いＯＨＶを産生しうる潜在性を有する植物が選択される。
【００５９】
選択「基準」は、選択の決定のための根拠を形成する特性を指し、例えば、以下に限定されないが、ＯＨＶ；１つまたは複数の遺伝子の有無：ならびに特定の遺伝子、遺伝子の組合せ、ＨＶ、形質、および形質またはＨＶの組合せに関連付けられた１つまたは複数の遺伝子マーカーが挙げられる。選択指標は、それらの推定育種価による選択基準の序列を指す。選択強度は、育種家が育種用の特定の個体の選択についての決定を遵守する、統計学的に表現される程度を指す。統計的には、選択強度は、次世代に寄与するために選択された個体の選択基準の平均と、潜在的な全ての親の選択基準の平均との差として表現されてもよく、標準偏差の単位で表現されてもよい。
【００６０】
形質または表現型：用語「形質」および「表現型」は、本明細書では互換的に使用される。本開示の目的では、特定の目的の望ましい形質は、例えば、穀物植物に発現されるような、農学的に重要な形質を含む。望ましい形質は、１つまたは複数の対立遺伝子および／またはＱＴＬに連鎖しうる。いくつかの例では、望ましい形質は、特定の対立遺伝子の存在（例えば、ＧＭ事象）である。いくつかの例では、望ましい形質は、育種集団中の複数のゲノムセグメントについてＨＶが決定されている形質である。いくつかの例では、望ましい形質は、複合的かつ上位性のある形質である。
【００６１】
理想型：用語「理想型」は、本明細書で使用されるとき、望ましい形質または望ましい形質の組合せを有する、理想化された個体を指す。育種プログラムでは、理想型の標準に接近している後代、近交系の親品種よりもさらに近く理想型に類似している後代、および／またはさらに別の親品種との掛け合わせを介して理想型を生成するために使用されうる後代を生成することを目標として、選択的な育種が実施されうる。
【００６２】
ＩＶ．（最適）半数体価の特定
本発明の実施形態では、各分離個体（例えば、２つの異なるまたは近交系の個体間の育種交雑）に特異的な決定可能な値を利用する。この値は、最適半数体価（ＯＨＶ）とよばれる。半数体価（ＨＶ）は、特定の半数体ゲノムセグメントの育種価（例えば少なくとも１つの目的の形質について）を反映する。実施形態では、半数体個体の組合せ半数体価（ＣＨＶ）は、半数体個体のＨＶの関数である。特定の実施形態では、ＣＨＶは、半数体個体のＨＶの合計である。ＯＨＶは、特定の個体、例えば、特定の交雑から産出される個体に見出されうる最適なハプロタイプから得ることのできる、最も高いＨＶを反映する。ＯＨＶ（またはＯＨＶに接近しているＣＨＶ）を含めるために特定された半数体個体から倍加半数体を生成することによって、最適な（または最適により近い）２倍体個体が作出される。
【００６３】
ＨＶは、ハプロタイプまたはハプロタイプの複数のセグメント（例えば、ｃＭで規定されうるような）について決定可能な値である。特定の例では、個体は、２つのハプロタイプを保持し、それらはゲノム全体を見積もると考えられる。いくつかの例では、染色体の分離が独立していることから、個体は、それぞれがゲノム中の染色体に対応する、多数のハプロタイプを保持していると考えられる。しかし、ハプロタイプの長さをさらに低減することによって、選択の決定を追加的に最適化することが可能になる。そのため、いくつかの実施形態では、個体のゲノムは、セグメントに区分けされ、そのそれぞれは、特定のＨＶを有するハプロタイプであると考えられる。例えば、セグメントは、最大の遺伝獲得量をもたらす長さ（例えば、全染色体または染色体のサブセットであり、１００ｃＭ、９５ｃＭ、９０ｃＭ、８５ｃＭ、８０ｃＭ、７５ｃＭ、７０ｃＭ、６５ｃＭ、６０ｃＭ、５５ｃＭ、５０ｃＭ、４５ｃＭ、４０ｃＭ、３５ｃＭ、３０ｃＭ、２５ｃＭ、２０ｃＭ、１５ｃＭ、および１０ｃＭの染色体セグメントが挙げられるがこれらに限定されない）を有するように規定されうる。いくつかの実施形態では、ハプロタイプセグメントは、物理的な長さ（例えば、キロベース、および制限酵素消化によって産出される別個の断片）を単位として規定される。
【００６４】
個体の倍数性レベルは、任意の所与の位置／セグメントで保持されるハプロタイプの数を決定する。いくつかの実施形態では、個体は２倍体である。いくつかの実施形態では、個体は多倍体（例えば、３倍体、４倍体など）である。本明細書で提供される２倍体の例についてのＯＨＶ計算を、そのような多倍体の個体に拡張することは、直截的であり、当業者が過度の実験なく実施することができる。
【００６５】
ＯＨＶの概念を多倍体に拡張することは、事実上２倍体として扱うことができるサブゲノムＳＮＰが特定された場合に、最も単純である。特定の実施形態では、サブゲノム特異的なＳＮＰが存在しない同質４倍体の種では、ＯＨＶを適応させるには、親から子へと受け渡しされて増加される、潜在的なハプロタイプの数が必要とされうる。例えば、同質６倍体では、それは３となる。さらに、非近交系の異質多倍体および同質多倍体についてハプロタイプを同調させることが、いくつかの例では望ましいことがある。特定の例では、ハプロタイプは、近交系基礎集団から始まる世代を通じて追跡されうる。
【００６６】
望ましい倍加半数体植物を生成するための従来のアプローチは、ゲノム選択（ＧＳ）を使用してより良い倍加半数体を選択することである。前掲のMeuwissen et al. (2001)。本明細書の実施形態では、ＯＨＶ選択を代わりに利用し、親系統および／またはその後代をゲノム的に選択して、エリート栽培種を作出する。選択する育種価を算出するために各選択系に使用される方法によって、ＯＨＶとＧＳとは大きく区別される。ＧＳでは、ゲノム推定育種価（ＧＥＢＶ）は、以下のように算出される。
ＧＥＢＶ＝Ｆ（ｘ，β）
式中、遺伝子座の数（Ｎｌｏｃｉ）について、ｘは、遺伝子座（１：Ｎｌｏｃｉ）（例えば、０、１または２の値をとる）での個体の遺伝子型に関するベクトル含有指標変数であり、βは、遺伝子座（１：Ｎｌｏｃｉ）に関するマーカー対立遺伝子効果のベクトルである。大抵の場合、Ｆ（ｘ，β）は、線形関数
ＧＥＢＶ＝ｘ・β
に相当する。
上式で、・は、ドット積演算子である。
【００６７】
ＧＳの典型的な例では、ＧＥＢＶは、以下のように算出される。
【００６８】
【数１】
2017501731.tif 000003
式中、ｘｉは、遺伝子座ｉ（例えば、０、１または２の値をとる）での個体の遺伝子型であり、βは、遺伝子座ｉでのマーカー対立遺伝子効果である。Cole and VanRaden (2011), supra, at 447。
【００６９】
本明細書の実施形態では、ＨＶは、選択の目的で、育種価として（ＧＥＢＶの代わりに）利用される。一般化ＨＶは、セグメント中の双方のハプロタイプについて
ＨＶｉ＝Ｆ（ｈ，βｈ）
として算出される。
式中、ｈは、遺伝子座（１：ＳｅｇＬ）での個体のハプロタイプについてのベクトル含有指標変数であり、ＳｅｇＬは、セグメント内にある、ならびにハプロタイプ遺伝子座間（ＳｅｇＬ＋１：ＳｅｇＬ＋２ＳｅｇＬ；各セグメントで２つのハプロタイプのみを仮定する）およびハプロタイプセグメントにわたって（Ｎｓｅｇ＋１：Ｎｓｅｇ＋２ＮＳｅｇ）ありうる全ての交互作用内にある、遺伝子座の数であり、ＮＳｅｇは、ゲノムセグメントの数であり、βｈは、指標変数に相当するハプロタイプとハプロタイプとの交互作用効果のベクトルである。
【００７０】
雑種穀物については、一般化ＨＶは、過去の雑種の実績が与えられている潜在的な被験体ｔのそれぞれについて算出することができる。
ＨＶｉｔ＝Ｆ（ｈ，βｈｔ）
式中、βｈｔは、所与の被験体ｔについてのハプロタイプとハプロタイプとの交互作用効果のベクトルである。交互作用効果が、予測される性能に大きく寄与しない（すなわち、上位性がない）場合、対応する効果βｈまたはβｈｔは、ゼロに設定される。
【００７１】
ＯＨＶを決定するために、ありうる全てのハプロタイプの組合せにわたって最大化する一般化計算を行うことができる。
ＯＨＶ＝最大（ＨＶ）
式中、ＨＶは、ありうる全てのＨＶｉまたはＨＶｉｔを含有するベクトルである。例として、このＯＨＶに２を乗じることは、ＧＥＢＶとの比較を可能にし、また、ＯＨＶを使用して選択される倍加半数体の育種の全潜在能力に相当する。上記に議論されたように、ＯＨＶによって選択された後代の育種価は、ＧＥＢＶを使用して選択されたものと等しいかまたはそれより大きい。
【００７２】
本明細書のいくつかの実施形態では、ＨＶは、選択の目的で利用され、ここで、ＨＶは、例えば、関数
【００７３】
【数２】
2017501731.tif 000004
に従って、セグメント中の双方のハプロタイプについて決定され、
式中、ｊは、セグメント内の遺伝子座であり、ｈｊは、遺伝子座ｊでのその個体のハプロタイプである。ＣＨＶは、個体で決定されたＨＶを合計することによって、その個体について決定されうる。
【００７４】
【数３】
2017501731.tif 000005
式中、ＮＳｅｇは、ゲノムセグメントの数であり、ｋは、ゲノムセグメントである。例として、最良の（最適な）ＨＶが、各セグメントについて決定され、それらをセグメント中にわたって合計して、ＯＨＶを産生する。
【００７５】
【数４】
2017501731.tif 000006
【００７６】
いくつかの実施形態では、最も高いＯＨＶを有する個体は、最も高い平均ゲノム育種価を有する植物ではない。そのため、ＯＨＶを使用する結果、従来のＧＳに基づく方法とは異なる個体が選択される。当業者が前記を考慮した後に認識することになるように、個体のＯＨＶは常に、そのＧＥＢＶと等しいかまたはそれよりも大きい。ＯＨＶによる選択は、融通が利き、既にＧＳが採用された任意の方法と置き換えうる。例えば、ＯＨＶは、育種プログラムで遺伝子移入と組み合わされてもよく、そのような育種プログラムでは、追加のコストを招くことなく、ＧＳを超える利益を提供しうる。
【００７７】
Ｖ．ＯＨＶと上位性との組合せ
上位性（１つまたは複数の遺伝子座の間の交互作用）は、コムギなどの穀物の性能に寄与しうる。Holland (2001) “Epistasis and Plant Breeding,” In Plant Breeding Reviews, John Wiley & Sons, Inc., pp.27-92; Wang et al. (2012) Heredity 109:313-9。しかし、一塩基多型の全てのありうる対の組合せを考慮すると、上位性交互作用を見積もることは、現在では極めて非現実的である。例えば、現在コムギの育種に利用されているおよそ９０，０００個のＳＮＰを考えると、それぞれの交互作用を試験することは、４０億の上位性効果を見積もることを含むことになり、統計的検出力とコンピュータのリソースに関して重大な問題が提起される。
【００７８】
交互作用効果を見積もる公知の方法は、個体の交互作用を連続的に見積もることと、全ての効果を同時に見積もるベイズのゲノム選択法とを含む。De los Campos et al. (2013) Genetics 193:327-45; Erbe et al. (2012) J. Dairy Sci. 95:4114-29; Habier et al. (2011) BMC Bioinform. 12:186; Meuwissen et al. (2001) Genetics 157:1819-29。連続的な見積りでは、交互作用は、一度につき１つ見積もられる。この方法は、ゲノムワイド関連分析（ＧＷＡＳ）のように、準最適であることが予想され、ゲノム育種価を予測するのに適するとは考えられない。連続的な見積りは、対立遺伝子効果を過剰に見積もることになりかねず、重大な多重検定上の問題に悩まされる可能性がある。
【００７９】
ベイズのゲノム選択法は、種々の事前の共変量をマーカー効果の分布へ割り当てる線形回帰モデルである。このことによって、ベイズ選択法は、全ての対立遺伝子効果を一様に縮小させるリッジ回帰法と比べて、いくつかの遺伝子座が大きな効果を有する遺伝的構造を、さらに効率良く順応させることを可能にする（すなわち、そのような遺伝子座の効果に印加される収縮量を低減することによって）。上位性を含めたベイズのゲノム選択法の特定のモデルは、
【００８０】
【数５】
2017501731.tif 000007
であり、式中、ｌは、遺伝子座の数であり、ｙｉは、個体ｉの表現型であり、μは、平均であり、γは、遺伝子座と交互作用のどちらが効果を有するかを指定する指標変数であり、ｘｉｑは、遺伝子座ｑにおける個体ｉの遺伝子型であり、ａｑは、遺伝子座ｑの追加の効果であり、ｂｑ１ｑ２は、遺伝子座ｑ１およびｑ２の交互作用効果であり、ｅは、残差である。Yi et al. (2003) Genetics 165:867-83。
【００８１】
表１は、本明細書のいくつかの実施形態による方法を使用して調べられうる交互作用の空間の実例である。例えば、遺伝子型と遺伝子型との交互作用は、遺伝子座の対当たりに見積もられてもよく、ここで、Ａは、遺伝子座１であり、Ｂは、遺伝子座２である。この図説では、簡単にするために、ＡａはａＡと同じであるものと仮定する。
【００８２】
【表１】
2017501731.tif 000008
【００８３】
いくつかの実施形態では、方法は、倍加半数体のみを使用する育種プログラムでの交互作用効果を見積もる。倍加半数体ではヘテロ接合性の遺伝子型が発生しないことから、それらの交互作用効果を見積もる必要はない。そのため、表１に図説された遺伝子座対当たりの交互作用効果は、９から４に低減される。
【００８４】
本明細書の特定の方法の利点は、選択プログラムでの上位性交互作用の複雑性を低減するという重大な利益を提供する。例えば、コムギには、現在育種選択に使用されているおよそ９０，０００個のＳＮＰマーカーがある。全９０，０００マーカーについてホモ接合体およびヘテロ接合体を評価する育種プログラムでは、９０，０００＊（８９９９９／２）＊９＝３６４億のありうる交互作用がある。交互作用の数は、本明細書の方法では、倍加半数体のＯＨＶ選択を利用して、大きく（２００億超）低減され、そこでは、同じ例として、９０，０００＊（８９９９９／２）＊４＝１６２億の交互作用がある。
【００８５】
本明細書のいくつかの実施形態は、計算に必要な交互作用の数をさらに低減するために使用されてもよい。特定の実施形態では、ハプロタイプ内のみで上位性効果が算出され、続いて、ＯＨＶ値に添加されて、ハプロタイプおよびＯＨＶ内の上位性効果の関数（例えば合計）である「ＯＨＶｅ」値を、個体について生成する。さらに、ＯＨＶセグメント全体にわたる潜在的な交互作用が、ある特定の実施形態で、さらに大きなゲノム距離での交互作用を説明するために算出されうる。例えば、ＯＨＶセグメント内で上位性を有する個体のハプロタイプの値は、
【００８６】
【数６】
2017501731.tif 000009
のように算出することができ、式中、ｍは、ＯＨＶセグメントを有する遺伝子座の数であり、ｐは、ＯＨＶセグメント内の交互作用の数であり（例えば、
【００８７】
【数７】
2017501731.tif 000010
のように算出される）、ｈｈｑは、ｑｔｈ遺伝子型と遺伝子型との交互作用であり（例えば、ＡＡＢＢ、ＡＡｂｂ、ａａＢＢ、またはａａｂｂの形をとりうる）、εｑは、ｑｔｈ交互作用における上位性効果である。そのため、いくつかの例では、ＯＨＶｅは、以下のように算出される。
【００８８】
【数８】
2017501731.tif 000011
【００８９】
ある特定の実施形態では、異なるＯＨＶセグメントにわたって算出される上位性効果は、最も共通するハプロタイプを優先される。例えば、異なるＯＨＶセグメントにわたって上位性効果を含むＯＨＶｅは、
【００９０】
【数９】
2017501731.tif 000012
のように算出され、式中、ｎは、ＯＨＶセグメントの数であり、γは、セグメントにわたる交互作用の総数であって、ＯＨＶセグメントの数ｍに依存し、Ｈｓは、ｓｔｈ共通ハプロタイプと共通ハプロタイプとの交互作用であり、δｓは、ｓｔｈ交互作用についての上位性効果である。説明のために、共通ハプロタイプの数が１０であるものと仮定される場合には、γは、（ｎ＊１０）（（ｎ＊１０−１）／２）として算出することができる。いくつかの実施形態では、セグメントにわたる上位性交互作用の合計は、セグメント内のＨＶｅよりも大きいものとなる。
【００９１】
ＶＩ．植物ＯＨＶ選択のための方法
本明細書のいくつかの実施形態は、例えば、新しい望ましい植物系統の生成を容易にするために使用されうる植物選択に用いる方法を提供する。本明細書の実施形態は、倍加半数体を産出することが可能な任意の適切な植物（またはその組織）を選択するために利用されうる方法を含む。適切な植物としては、異系交雑とは異なる自家交雑または「自殖」に適したものも挙げられる。倍加半数体の生成および／または自殖が可能である適切な植物としては、例えば、以下に限定されないが、アルファルファ、リンゴ、バナナ、マメ、ブロッコリー、トウゴマ、柑橘類、クローバー、ココナッツ、コーヒー、キュウリ、ベイマツ（Douglas fir）、ユーカリノキ属植物（Eucalyptus）、テーダマツ（Loblolly pine）、アマニ、メロン、オーツムギ、オリーブ、ヤシ、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、ポプラ、ラジアータマツ（Radiata pine）、モロコシ、ダイオウマツ（Southern pine）、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、モミジバフウ、茶、タバコ、トマト、芝、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、オオムギ、トウモロコシ、ワタ、ナタネ／カノーラ、イネ、ライムギ、ダイズおよびコムギが挙げられる。特定の実施形態では、開示された方法は、オオムギ、トウモロコシ、ワタ、ナタネ／カノーラ、イネ、ライムギ、ダイズ、および／またはコムギの倍加半数体の生成のためのＨＶ、ＣＨＶ、および／またはＯＨＶを決定するために使用することができる。倍加半数体植物の産出に適する組織は、例えば、以下に限定されないが、種子、胚、または胚形成組織（例えば、胚形成カルス、葯、花粉粒培養物）でありうる。
【００９２】
特定の実施形態による方法は、現在実践されているような、例えば、表現型選択および／またはゲノム選択などの、植物選択法を超えるいくつかの利点のうちいずれかをもたらす。いくつかの実施形態では、ＯＨＶ選択法は、例えば、以下に限定されないが、何世代もの植物の開発にわたって、植物育種家へのコストおよびリソースの節減、ならびに遺伝獲得量および／または遺伝的多様性の増加を提供する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の親植物と第２の親植物との交雑から結果として得られる後代植物から生成されうるなどの、個々の半数体植物／組織（またはその倍加半数体）のゲノムＣＨＶを決定するステップと、植物のＣＨＶを、後代植物に決定されたＯＨＶと比較するステップと、ＣＨＶがＯＨＶに接近している場合に、その半数体植物／組織（またはその倍加半数体）を選択するステップとを含む。特定の実施形態では、倍加半数体植物は、選択された半数体植物／組織から生成される。倍加半数体植物は、次いで、新しいエリート系統として栽培されてもよいし、さらに別の植物育種のステップに利用されてもよい。
【００９４】
例としては、ＣＨＶがＯＨＶと同一である際に、ＣＨＶが実質的にＯＨＶと同一である際に、ＣＨＶが後代集団中で決定された全てのＣＨＶのうちＯＨＶに最も近い際に、および／またはより近い同一性が必要ではないものと当業者が決定するほどに、ＣＨＶがＯＨＶに充分に近い際に、ＣＨＶはＯＨＶに接近している。例えば、ＣＨＶが、ＯＨＶの少なくとも１００％、９９％、９８％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％および／または８０％である場合に、ＣＨＶはＯＨＶに接近している可能性がある。いくつかの例では、分離植物由来の複数の半数体が、分析されて最も高いＣＨＶを決定され、選択された半数体のＣＨＶは、分析された他の半数体の特定のパーセンテージ（例えば、９９％、９８％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％）のＣＨＶよりも分離植物のＯＨＶに近い。
【００９５】
ＨＶは、半数体もしくは倍加半数体個体またはそれらの組織について、例えば、個体または組織を遺伝子型判定するステップ（例えば、本明細書の系に提供されるキットを使用して）と、目的の形質についての１つまたは複数のゲノムセグメントの育種価に連鎖するマーカーを特定するステップとによって、決定されてもよい。合計した際に、そのようなＨＶは、個々の半数体または半数体組織のＣＨＶを産生する。特定の実施形態では、ゲノムＯＨＶもまた、分離個体について決定され（例えば、親植物の遺伝子型を参照することによって）、ＣＨＶがＯＨＶに等しいか接近している場合に、エリート倍加半数体植物を生成するために、個体から生成された半数体が選択される。
【００９６】
いくつかの実施形態は、エリート倍加半数体（望ましい対立遺伝子またはＧＭ事象を含有する可能性がある）を生成する、系統間交雑の潜在性を評価するための方法を提供し、エリート倍加半数体は、次いで、さらに別の育種に用いるために選択される。例えば、ありうる最も高いＯＨＶは、第１の植物の候補と１つまたは複数の第２の植物との理論上の交雑から生成される後代について決定されうる。第１の植物の理論上の交雑で生成された後代についての、決定されたありうる最も高いＯＨＶが、予め決定された基準を満たす場合に、第１および第２の植物（複数可）は、交雑されてＦ１後代を生成する。いくつかの例では、基準とは、第１の植物の候補が、理論上の交雑に用いる複数の植物候補から生成されうる後代のうち、ありうる最も高いＯＨＶを有する後代を生成することができる状態である。例えば、ＯＨＶは、トランスジェニック植物と複数の候補植物のそれぞれとの理論上の交雑の後代について決定されてもよく、トランスジェニック植物は、第１の植物との理論上の交雑において最も高いＯＨＶ（複数の植物のそれぞれから交雑で生成されうるもののうちから）を有する後代を産生する複数のうちの植物と、交雑されてもよい。
【００９７】
特定の実施形態では、第１および少なくとも第２の植物の後代についてＯＨＶを決定するステップと、後代植物から半数体の集団を生成するステップと、後代について決定されたＯＨＶに接近しているＣＨＶについて、少なくとも１つの半数体を選択するステップと、選択された後代植物（複数可）のそれぞれから倍加半数体を生成するステップとを含む。特定の実施形態では、第１の植物は、エリート倍加半数体植物に遺伝子移入された対立遺伝子またはトランスジェニック事象を含む。
【００９８】
本明細書のいくつかの実施形態では、ＯＨＶ選択は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半数体誘導を使用する育種プロセスに組み込まれる。そのようなプロセスは、例えば、以下に限定されないが、選択された系統を相互交雑させるステップ、新しい遺伝的バリエーションを作出するステップ；Ｆ１世代（またはそれに続くＦ２、Ｆ３もしくはそれ以降などの世代）でのｉｎ  ｖｉｖｏ半数体誘導；半数体実生の染色体倍加；倍加半数体後代の生成；倍加半数体植物（Ｄ０世代）の移植および自殖；Ｄ１系統の評価（例えば、単一列観測値プロット）および任意選択で、併行して、自殖による繁殖；検定交雑の評価（例えば、多環境試験）；ならびに実験雑種の強化を含んでいてもよい。
【００９９】
選択から予想される獲得量は、式
ΔＧ＝ｉｈｘρＧσｙ
によって記載することができ、式中、ｉは、選択強度であり、ｈｘは、選択基準の遺伝率の平方根であり、ρＧは、選択基準と獲得量基準の間の遺伝相関であり、σｙは、獲得量基準の標準偏差である。長期の育種プログラムでは、選択の進行を評価するために典型的に使用される獲得量基準は、改善された系統の一般組合せ能力（ＧＣＡ）である。試験単位は、育種サイクルの開始時では、倍加半数体系統それ自体である。サイクルの後期では、試験単位は、検定交雑である。
【０１００】
強い選択（大きなｉ）は、小さな効果を持った集団サイズを導くことが予想され、結果として、無作為なドリフトのために遺伝分散が失われる。この損失をある特定の制限内に保つために、各育種サイクルの後には、最も少ない数の系統を組換えに供さねばならない。この数は、候補系統の近親交配係数（Ｆ）に依存する。Ｆの値は、非近交系の遺伝子型についてのものよりも近交系が２倍大きいことが、概して理解される。Ｓ２系統（Ｆ＝０．７５）が従来の育種で組み合わされることを仮定すると、倍加半数体系統（Ｆ＝１）の数は、それゆえ１：０．７５＝１．３３倍増加して、等価のレベルの遺伝的バリエーションを保存することになる。そのため、選択強度は、倍加半数体系統を使用する際に、その分低減されうる。
【０１０１】
選択強度とは対照的に、倍加半数体系統を使用する際に、具体的には最初の検定交雑の段階で、ｈｘおよびρＧは、典型的には増加する。近交系系統では上位性を考慮しない。
ΔＧＣＡ＝１／２Ｆσ２Ａ
式中、σ２Ａは、基礎集団の追加の分散である。そのため、倍加半数体系統のＧＣＡ分散は、Ｓ２系統のそれよりも１：０．７５＝１．３３倍大きい。このことは、検定交雑間でのより良い差別化につながり、その結果、より高い遺伝率につながる。例えば、３セットのＳ２およびＳ３系統が、同じ交雑に由来する倍加半数体系統にそれぞれ比較されて、同じ環境の同じ被験体を用いて評価される際に、穀物収量についての検定交雑の推定遺伝分散は、５０ｂｕ／ａｃｒｅ（Ｓ２）、９４ｂｕ／ａｃｒｅ（Ｓ３）、および１２４ｂｕ／ａｃｒｅ（ＤＨ）に達した。
【０１０２】
選択と獲得量基準の間の遺伝相関（ρＧ）はまた、供試系統が近交系である度合いに応じて増加する。例えば、Ｓｔ系統とそれらのホモ接合性後代の間のＧＣＡについての相関は、√Ｆｔに等しく、一方、倍加半数体系列については、相関は１である。そのため、Ｓ２系統に比べると、倍加半数体系統の相関は、１：√０．７５＝１．１５倍強い。
【０１０３】
獲得量基準の遺伝標準偏差（σｙ）は、集団のパラメーターであり、それゆえ、基礎集団に依存する（すなわち、育種の手順に依存しない）。
【０１０４】
本明細書の実施形態は、植物を遺伝子型判定するステップを含んでいてもよく、ここで、半数体および倍加半数体植物の遺伝子型は、個体のハプロタイプでもある。遺伝子型判定は、個体由来の試料中の１つまたは複数のマーカー（例えば、ＳＮＰ）を検出するステップと、得られた結果を分析して、対象の対立遺伝子の形態を決定するステップとを含んでいてもよい。いくつかの例では、個体由来の試料は、核酸（例えば、ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡ）を含む。例えば、植物は、植物の任意の部分（例えば、葉、花器官および種子）由来の試料を試験することによって、遺伝子型判定されてもよい。試料は、組織学的分析用に固体マトリックス上に調製されてもよいし、適切な液体、例えば、以下に限定されないが、抽出緩衝液や懸濁緩衝液などで調製されてもよい。
【０１０５】
ＯＨＶ選択を組み込む育種プログラムは、無作為な親の交配を含んでいてもよい。しかし、いくつかの実施形態では、強いゲノムセグメントを全て保持する子孫がいる可能性を増やすために、ＯＨＶ選択を通じて、異なるゲノムセグメント中の強度を用いて親を組み合わせようと試みるプログラムが設計される。例えば、理想上の植物のハプロタイプ組成は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで産出されてもよく、育種プログラムは、ＯＨＶ選択を使用して１つまたは複数の系統を利用可能なライブラリーから選択することによってそれを達成するよう、考案されてもよい。そのような育種プログラムは、特定の望ましい形質の強度を有する植物の育種の加速をもたらす。
【０１０６】
本明細書のいくつかの実施形態では、ＯＨＶ選択を通じて得ることができる利益は、マーカー支援ＥＢＶ（ＭＥＢＶ）選択を使用して得られる結果との関連で表現される。ＭＥＢＶは、ゲノムワイドＤＮＡマーカーから、３つのステップ、すなわち、マーカーを使用して、各ＱＴＬでの各個体の遺伝子型を推断するステップと、各ＱＴＬ遺伝子型が目的の形質に与える効果を見積もるステップと、選択候補についてのＱＴＬ効果を合計して、それらのゲノムＥＢＶ（ＭＥＢＶ）を得るステップとからなるプロセスによって算出される。
【０１０７】
ＱＴＬ遺伝子型を推断するための最も単純な方法は、マーカーをＱＴＬとして特定すること、およびマーカー対立遺伝子が目的の形質に与える効果を見積もることである。マーカー（ｒ２）によって説明されるＱＴＬ分散の集団は、ＱＴＬとマーカーまたはマーカーの線形結合との間のＬＤに依存する。マーカーとＱＴＬの間の距離が増えるにつれて、平均ｒ２は低下する。単独マーカーの遺伝子型を使用することの代替は、いくつかのマーカーに基づいてハプロタイプを構築することである。任意の個々のマーカーと完全なＬＤにはないＱＴＬは、複数マーカーのハプロタイプと完全なＬＤにある場合がある。単独マーカーを超えるハプロタイプの利点は、隣接するマーカーの間のｒ２が増えるにつれて低下する。
【０１０８】
最小二乗法は、形質の各ＱＴＬのＭＥＢＶを見積もるために採用されることがある。最小二乗法の見積りは、無限に大きな分散を伴うＱＴＬ効果の事前分布を仮定することに相当する。最小二乗法を使用して、大きな効果を有するＱＴＬのみが、検出および使用されることになる。そのため、遺伝分散の全てが、マーカーによって把握される訳ではない。ＱＴＬ効果とは、染色体セグメントにわたって、一定の分散を伴って通常の分布から引き出されるものであると仮定することによって、ＢＬＵＰの見積りが得られるが、ここでは、全ての効果が同時に見積もられる。マーカー効果の見積りステップは、ゲノム選択およびＯＨＶ選択で同一であることから、マーカー効果を見積もる任意の方法を使用することができ、例えば、リッジ回帰ＢＬＵＰ、ＢａｙｅｓＡ、ＢａｙｅｓＣπ、またはＢａｙｅｓＲがある［Erbe et al. (2012) J. Dairy Sci. 95:4114-29; Habier et al. (2011) BMC Bioinformatics 12:186；前掲のMeuwissen et al. (2001)を参照されたい］。
【０１０９】
組換えの程度は、ＧＳを超えるＯＨＶの優位性に影響を与える主要な要因である場合がある。エリート倍加半数体を作出するには、良質なハプロタイプが１つの個体で組み合わされることが必要である。交雑と倍加半数性とのどちらかを介して組換えを蓄積することによって、異なるハプロタイプの組合せの数が増加し、そのうち最も良いものは、次いで、ゲノムツールを使用して選択されうる。コムギなど、天然の近親交配体を強制的に異系交配する際には、それに関わる多大なコストがある。しかし、これらのコストは、ＯＨＶの使用を通じた遺伝獲得量の増加によって、および複数形質選択指標アプローチを介して複数の形質について同時に選択することによって、埋め合わせられうる。第２の構成成分は、戻し交雑と形質スタッキングサイクルとに費やす時間を徹底的に低減することになる。
【０１１０】
天然に発生する組換えに依存することは、組換えがない傾向にあるゲノムの領域では制限因子となりうる。コムギには、例えば、Ｓｒ３６遺伝子移入の近傍［Cavanagh et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110(20):8057-62］やテロメアの近傍など、組換えの低い領域が存在することのいくつかの証拠がある。それに対して、染色体上の遠位端は、より高い組換え率を示す。Akhunov et al. (2003) Genome Res. 13:753-63。これらの組換えの差は、各方法に等しく影響を及ぼすことが予想される。しかし、異なる組換え率を説明するために、動的なハプロタイプ長を用いてＯＨＶの方法論を拡げることによって、その性能はさらに増大しうる。
【０１１１】
植物育種における最終目標とは、典型的には、優れた固定系統であり、このことは現在、倍加半数体を用いて大部分で達成されている。エリートの生殖細胞質を生成する潜在性を有する場合にのみ、系統は「固定される」。ＯＨＶは、そのような系統の潜在的な遺伝価をふまえて明示的に選択する。ＯＨＶ選択は、この究極の目標にＧＳよりも密に適合し、それゆえ、ＧＳよりも良好に機能する。ＯＨＶは、１サイクルの組換えで達成可能なもの（すなわち倍加半数性）に細かく調整される。ＯＨＶステップで考慮されるハプロタイプ長が実質的に低減される際に、ＯＨＶの性能の優位は低下することがあり、植物の潜在性ははるか未来に評価される。
【０１１２】
ＯＨＶ選択は、任意の近交系または非近交系の種で実施されうる。その利点は、倍加半数体が生成される際に、および生成環境での遺伝的特徴が育種集団から分離されるもののそれを由来とする際に、最も明確となりうる。ＯＨＶ選択によって遺伝的多様性の増加が起こりうるということは、総じて、育種集団のＧＥＢＶが、従来のＧＳを用いるよりも僅かに低くなることを意味する。しかし、ＯＨＶ選択がエリート倍加半数体を生成する能力は増加する。このことは、大抵の植物育種プログラムなど、エリート品種が栽培者に商品化される系では、特に好都合でありうる。ＯＨＶ選択の有用性は、他の育種プログラム（例えば、乳牛）からは単純には得られないか、または他の育種プログラムに持ち越されないが、なぜなら、遺伝分散が増加するために、長期の遺伝獲得量の増加が、短期の均一性の低下に値することが、それらの系では明確ではないためである。
【０１１３】
ＶＩＩ．植物ＯＨＶ選択の系
本明細書のいくつかの実施形態は、１つまたは複数の植物の遺伝子型（複数可）を決定するためのキット、データベース、遺伝子型（複数可）からＯＨＶを決定するための手段、およびユーザがハプロタイプ情報を入力することを可能にするユーザインターフェースを含み、本系は、１つまたは複数の植物のＯＨＶを決定する。特定の実施形態では、キットは、半粒種子または非常に若い植物（例えば、半数体植物または倍加半数体植物）を遺伝子型判定するために使用される。いくつかの例では、遺伝子型（複数可）からＯＨＶを決定するための手段は、分析プログラミングである。いくつかの例では、遺伝子型（複数可）からＯＨＶを決定するための手段は、一覧表である。
【０１１４】
特定の実施形態は、ハイスループットの植物ＯＨＶ選択系を提供し、本系は、１つまたは複数の植物の遺伝子型（複数可）を決定するためのキットを含み、ここで、キットは、ポリヌクレオチドを結合して有する固体支持体を含み、各ポリヌクレオチドは、目的の形質についての育種価に関連があるゲノムセグメントハプロタイプに連鎖した（例えば、密に連鎖した、および非常に密に連鎖した）、多型遺伝子マーカーにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーション媒体（例えば、マイクロ流体デバイスまたは均質なアッセイ媒体）を含む。例示的なマイクロ流体デバイスとしては、マイクロチャネルを備えた固体支持体を有するものが挙げられる。米国特許第５，３０４，４８７号、第５，１１０，７４５号、第５，６８１，４８４号および第５，５９３，８３８号を参照されたい。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、以下に限定されないが、約１０，０００〜１００，０００個のオリゴヌクレオチドがその表面に結合されている「チップ」を含み、オリゴヌクレオチドのそれぞれは、特定のＳＮＰに特異的にハイブリダイズする配列からなる。
【０１１５】
本明細書のある特定の実施形態の固体支持体に結合するポリヌクレオチドは、固体支持体に直接的または間接的に付加するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、核酸試料が得られる個体でのＨＶを決定するために使用されてもよく、固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドへ個体由来の核酸が特異的にハイブリダイゼーションすることによって、ＨＶに連鎖したマーカーの発生を決定することにより行う。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドが、固体基質の別個の領域に固相化され、ここで、基質の特定の領域への試料由来の核酸の結合は、試料中にマーカーが存在することを決定する。
【０１１６】
本明細書のある特定の実施形態のハイスループット系は、例えば、以下に限定されないが、ＵＨＴ  ＳＮＰ−ＩＴプラットフォーム（Ｏｒｃｈｉｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、プリンストン、ニュージャージー州、米国）、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）系（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）や組込み型ＳＮＰ遺伝子型判定系（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）などのプラットフォームを含んでいてもよい。
【０１１７】
特定の実施形態は、ＰＣＲベースのアッセイ［例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲベースアッセイ（ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）］を介した１つまたは複数の植物のハプロタイプ（複数可）を決定するためのキットを含む。いくつかの例のそのような実施形態は、自動化されているか、完全に自動化されているか、または手動（例えば、卓上の）のアッセイの手順および器具を含む。
【０１１８】
ＶＩＩＩ．遺伝子移入とＯＨＶ選択との組合せ
遺伝子移入は、植物系統の望ましい特性（複数可）を含まない植物に、その望ましい特性（複数可）を組み込むことである。いくつかの例にて遺伝子移入される特性は、単独の対立遺伝子、例えば、遺伝子改変事象である。本明細書のいくつかの実施形態では、ＯＨＶ選択のための方法および／または系は、殆どの好ましい特性を有する反復親植物に、目的の対立遺伝子（例えば、ＧＭ事象）を遺伝子移入することを容易にするために、利用される。特定の実施形態では、遺伝子移入は、目的の形質の望ましいレベルの発現を含む植物を生成することを目指す育種プログラムの状況内で実施され、目的の形質は、それについてＨＶ育種価が決定されかつＯＨＶ選択に採用される形質として使用されうる。
【０１１９】
新しい形質または遺伝子は、典型的には、ドナー系統から反復系統へ、交雑を介して遺伝子移入される。このプロセスでは、Ｆ１世代が作出され、次いで、反復系統と戻し交雑されて本来のバックグラウンドを取り戻すが、一方、新しい形質／対立遺伝子は存続される。例えば、Tanksley (1983) Plant Mol. Biol. Rep. 1(1):3-8；Visscher et al. (1996) Genetics 144:1923-32；Hospital (2001) Genetics 158:1969-79を参照されたい。ドナー系統が、遺伝子移入の標的である形質以外の形質について劣っている際に、反復系統のバックグラウンドが典型的には望まれる。概して、そのような戻し交雑戦略の有用性は、遺伝子移入された標的遺伝子座にできるだけ近い反復親由来のマーカーを有する後代を特定することに依存する。
【０１２０】
本明細書のＯＨＶ選択の方法および／または系は、遺伝獲得の速さを加速しおよび／または遺伝獲得の最大量を高めることができる、植物育種の特定の特性を開拓する。本明細書の実施形態は、育種価の平均、例えばドナー親のものの平均が、反復親よりも低いか否かに関わらず、両親由来の望ましいハプロタイプゲノムセグメントを含む後代を特定することによって、戻し交雑の有用性を高める。本来のバックグラウンドを回復する従来の遺伝子移入は、エリート系統の本来の遺伝レベルを達成するに過ぎないということになろう。ＯＨＶ遺伝子移入の大きな利点は、遺伝子移入が起こる間に、集団を選択することができることである。このことは、植物育種プログラムで遺伝獲得量の増加を可能にし、本来のエリートバックグラウンドを凌ぐ遺伝子移入事象を有するエリート系統をもたらすことになる。
【０１２１】
遺伝子移入プロセスにＯＨＶ選択を組み込んだ本明細書の実施形態は、理想型に到達するのに必要な時間を低減しうる。いくつかの実施形態では、目的の対立遺伝子を含む植物は、殆どの好ましい特性を含む第２の植物と交雑される。形質についての半数体価（ＨＶ）は、第１および第２の植物の各半数体ゲノムセグメントについて決定されてもよい。この決定を使用して、ＯＨＶは、次いで、交雑の後代から生成することができる最も良い倍加半数体として決定されうる。
【０１２２】
特定の実施形態では、目的の対立遺伝子、ＯＨＶ、またはＯＨＶに非常に近いＣＨＶを有する個体が作出されるまで、交雑の後代から倍加半数体を作出する。いくつかの実施形態では、目的の対立遺伝子と、ＯＨＶにほぼ匹敵するＣＨＶとを含む倍加半数体が、育種プログラムのさらに別のステップで利用するために選択される。例えば、選択された倍加半数体は、追加の１世代または複数世代の間、反復親植物に戻し交雑されてもよく、ここで、ＯＨＶ選択は、新しい品種を生成するように、各世代で実施されてもよく、そこでは、目的の対立遺伝子が、新しい品種の遺伝獲得量および遺伝的多様性を最適化する方式で、反復親に遺伝子移入されている。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、ＯＨＶ選択を組み込んだ遺伝子移入プログラムは、例えば、以下に限定されないが、コムギ系統またはイネ科植物、遺伝子改変（例えば、植物老化の遅延およびグリホサート耐性について）、ゲノム編集、および遺伝子座での導入遺伝子のスタッキングからなる群から選択される１つまたは複数の供給源から、１つまたは複数の所望の対立遺伝子を同時に遺伝子移入するために使用される。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、ＯＨＶ選択を組み込んだ遺伝子移入プログラムは、選択の決定を通知するためのＯＨＶのゲノム予測に適用される。そのようなプログラムの選択サイクルは、バリエーションの供給源を含んでいてもよく、例えば、以下に限定されないが、ＯＨＶのゲノム予測（例えば、無作為のＧＭ事象と、遺伝子座での導入遺伝子のスタッキングとが挙げられる）と、以降続く世代で望ましい対立遺伝子を連続的に遺伝子移入することとが挙げられる（例えば、倍加半数体生成の反復サイクルが挙げられる）。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、ＯＨＶ選択を組み込んだ遺伝子移入プログラムは、植物育種での新しい選択の入り口点を特定する。例えば、いくつかの実施形態での新しい入り口点としては、例えば、以下に限定されないが、異質細胞質効果および上位性の予測、ならびに核ハプロタイプを伴う細胞質の相互作用（例えば、ミトコンドリア−コンドリオーム、葉緑体−プラストーム）が挙げられ、例えば、最適細胞質価（ＯＣＶ）の予測に繋がり、そのようなものとしては、異質細胞質系統でのｍｔＤＮＡおよび葉緑体集団の効果の予測が挙げられる。
【０１２６】
したがって、いくつかの実施形態では、ＯＨＶは、遺伝子移入の間に集団の選択を提供して遺伝的バックグラウンドを改善し、遺伝的バックグラウンドには、選択された形質が遺伝子移入されている。この特定の実施形態は、反復（エリート）親のバックグラウンドとの交雑を反復することによって、（エリート）親のバックグラウンドを再構築することが意図される、従来の遺伝子移入とは異なる。それとは対照的に、植物育種プログラムでＯＨＶを使用することによって、遺伝子移入事象と、本来のエリートバックグラウンドより優れた遺伝的バックグラウンドとを用いて、エリート系統の改善につなげることができる。
【０１２７】
実施形態では、複数の所望の事象（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の所望の事象）を有する系統がエリート系統と交雑されて、複数の所望の事象をエリート系統の遺伝子型に遺伝子移入される際に、ＯＨＶ選択が使用されうる。いくつかの実施形態では、所望の事象を有する複数の系統が、１つまたは複数のエリート系統と交雑されて、複数の系統から所望の事象のそれぞれを、エリートのバックグラウンドの遺伝子型に遺伝子移入する。
【０１２８】
以下の実施例は、ある特定の具体的な特徴および／または実施形態を説明するために提供される。実施例は、例示された具体的な特徴または実施形態に開示を限定するものと解釈されるべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【０１２９】
ＧＳおよびＯＨＶ育種プログラムの比較
ＯＨＶ選択を利用する植物育種プログラムを、ＧＳを利用するプログラムと直接的に比較した。比較は、１１１０系統のコムギ由来の４，７８８個のＳＮＰマーカーについて経験的に決定された遺伝子型を持つ基礎集団を用いて実施し［経験的なＩｌｌｕｍｉｎａ  ｉＳＥＬＥＣＴ（商標）  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐ  ９Ｋアレイ遺伝子型（前掲のCavanagh et al. (2013)］、それによって、実際さながらの連鎖不均衡構造を確保した。
【０１３０】
これらのＳＮＰを２１個の染色体上に置き、それぞれが１５０モルガン（それぞれ３つのゲノムおよび７つの染色体）を測定した。次いで、ゲノムを等しい長さの５０ｃＭのセグメントに分割し、その結果、染色体当たりおよそ３つのセグメントを得た。
【０１３１】
配偶子を作出する間に、既存の子孫についてまたは倍加半数体を生成する間のどちらかで、ゲノム上にモルガン当たり１の比率で無作為に組換えを置いた。対立遺伝子置換効果を、５００遺伝子座について二重指数分布からサンプリングして、多数の原因バリアントによって影響を受ける定量的な形質を反映させた。
【０１３２】
２つの育種シナリオをシミュレーションした。すなわち、選択がＧＥＢＶに基づくＧＳと、ＯＨＶである。ＧＳおよびＯＨＶ選択を、次いで、まさに同じ育種プログラムで比較した。選択強度など、全てのパラメーターを、ＧＳとＯＨＶの間で同じとし、唯一の違いは、選択をＧＥＢＶとＯＨＶのどちらかにすることであった。連鎖する表現型に基づくマーカー効果を見積もる代わりに、真のマーカー効果を使用し、選択を真のマーカー効果に基づくものとした。
【０１３３】
遺伝育種プログラムは以下の通りであり、特定のシナリオを続けて記載した。初発の近交系１１１０系統のうち、最も良い３０％を、Ｆ１世代の親として使用し、５５，０００個体もの集団サイズを達成した。選択されたそれぞれの近交系統を、選ばれた他の全ての系統と交雑させた。交雑当たり１つの後代を（全てが同一であるものとして）、次いで遺伝子型判定し、最上位の個体を、次世代（Ｆ２）を生成するために選択した。種子に限りがあるため、非近交系のＦ２からＦ１０では、各個体は、他の一個体のみと交配することができるのみであると仮定した。全ての交配を無作為とした。非近交系の交雑当たりの子孫の数は様々であり、選択強度を変化させることによって、総育種集団を５５，０００個体で一定に保った。各世代で、最も優れたエリート植物を、倍加半数体を生成するために選択し、種々の数の倍加半数体を生成させた。最も優れたエリート倍加半数体を、任意選択で２世代後の育種に使用して、作出と倍加半数体の種子採集との時間差を埋めることができる。次いで、これを何世代かの間反復し、各世代でＯＨＶおよびＧＥＢＶを再計算して、それによって新しい組換え事象を把握した。
【０１３４】
ＤＥＦＡＵＬＴシナリオでは、非近交系の交雑当たり１００株の子孫を生成し、１０株のエリート個体を選択してそれぞれ１００株の倍加半数体を作出し、最も良い５０株の倍加半数体を育種プログラムに戻して周回させた。様々なシナリオで、近交系の交雑で生成される子孫の数（ｎＯｆｆ）、倍加半数体を生成するために選択されるエリート個体の数（ｎＥｌｉｔｅＩｎｄ）、エリート個体当たり生成される倍加半数体の数（ｎＤＨ）、２世代後の育種プログラムに戻して周回されるエリート倍加半数体の数（ｎＤＨｃｙｃｌｅｄ）、シミュレーションされたＱＴＬの数（ｎＱＴＬ）、染色体当たりのハプロタイプセグメントの数（ｎＳｅｇ）、および世代数（ｎＧｅｎ）を調査した。
【実施例２】
【０１３５】
ＯＨＶ選択を用いた遺伝獲得量と遺伝的バリエーションの増加
遺伝獲得量を増加させようとする際に重要であることが確定されている、育種サイクルのいくつかのポイントを、図２に示す。関連する考察としては、非近交系植物の対当たりの子孫の数と、エリート植物当たりに生成される倍加半数体の数とが挙げられる。これらの要因のいくつかのバリエーションを供試した。対当たりの子孫の数は、５、２０、１００、２００および１０００株の間で変えた。生成された倍加半数体の数は、２００、５００および１０００株の間で変えた。１００回の反復試験を各バリエーション毎に実行し、各反復試験内では、ＧＳおよびＯＨＶ選択については、マーカー効果および基礎集団は同一であった。全てのシナリオ群およびレベルを表２に列記した。それぞれのシナリオを１００回反復し、標準誤差（ＳＥ）を表および図に示す。遺伝獲得量の結果では、ＯＨＶとＧＳの間の基礎世代の遺伝標準偏差（ＳＤ）の差（すなわち、獲得量ＯＨＶ−獲得量ＧＳ）に焦点を当てている。遺伝的多様性を、世代の全ＧＥＢＶの分散として算出された、真の遺伝分散として報告する。
【０１３６】
【表２】
2017501731.tif 000013
【０１３７】
各世代で総計５０，０００株の後代を作出した。このことは、育種対当たり異なる数の子孫が生成されるシナリオにおける選択強度に密接な関係を持つ。対当たりの後代の数が上がった際に、次いで、育種対の数をその分低減して、世代内で集団サイズを一定に保たねばならない。
【０１３８】
各世代で、ＧＳおよびＯＨＶ選択を介して得られる結果を、以下の統計、すなわち、遺伝分散、育種集団の遺伝レベル平均値、最良の１０個体、および最良の倍加半数体を使用して比較した。
【０１３９】
ＯＨＶ対ＧＳに基づく選択では、１０世代までに０．５８遺伝ＳＤにまで遺伝獲得量を増加させることが見出された。本発明者らのシミュレートした育種プログラムでは、子孫および倍加半数体を作出する際に、組換えが発生した。本発明者らが組換えの機会を増加させる場合には、子孫の数と倍加半数体の数のどちらかを増やすことによって、本発明者らは、優れたハプロタイプが組み合わされる可能性を増やすことができることが見出された。どちらのプロセスも、育種集団のエリート生殖細胞質での組換えの数を増やすが、ＯＨＶ選択は、それにより良く乗じることができる。
【０１４０】
子孫の数が増えるにつれて、ＯＨＶの遺伝獲得量で明確なかつ増加している利点がある。図３ａ、表３。
【０１４１】
【表３】
2017501731.tif 000014
【０１４２】
植物から生成される倍加半数体の数は、遺伝獲得量に影響を及ぼすことが見出された別の要因であった。最良の１０個体から生成される倍加半数体の数が増加するにつれて、ＯＨＶとＧＳの間の差が増加する。図３ｂ、表４。さらに、生成される倍加半数体の数に関わらず、この要因から利益を得る点で、ＯＨＶ選択はＧＳよりも優れている。生成される倍加半数体の数が比較的小さな数で増加するにつれて（例えば、エリート植物当たり約１００株未満の倍加半数体が生成される際に）、ＯＨＶを達成する効率が向上する。
【０１４３】
【表４】
2017501731.tif 000015
【０１４４】
世代を通じて育種プログラムが進行するにつれて、ＯＨＶは、追加の遺伝獲得量を産生する上で次第にＧＳに打ち勝ち（すなわち、親対当たりの後代の数が増加した際に、および世代数が増加した際に、ＯＨＶの優位性が増加した）、このことは、組換えと選択事象とを蓄積し組み合わせる必要性をさらに際立たせ、遺伝獲得量を最大にした。選択が２０世代を超えるものであり、かつ漸近線を示し比較的一定のままでおよそ１６世代まで続いたというシナリオで、長期間に及ぶＯＨＶの潜在的な優位性をさらに調査した。図３ｃ、表５。早期の世代でさえ、達成された獲得量は大きく、１０世代までに、遺伝獲得量は、対当たり１０００の子孫を用いて、ＯＨＶ選択のほぼ３倍であった。繰り返すが、より多数の子孫を有することは有益であったとはいえ、育種対当たりの子孫を２００株から１０００株に動かす際に、遺伝獲得量全体について、利益の僅かな低減があったということがありうる。
【０１４５】
【表５】
2017501731.tif 000016
【０１４６】
倍加半数体を生成するために選ばれたエリート個体の数は、交雑当たりの子孫の数よりも少なくＯＨＶの優位性に影響を及ぼし、また、次点の最上位ランクの個体群に対する、選択された最上位の個体の相対的な優位性に依存していた。本発明者らは、エリート植物の数が増加した際に、ＯＨＶとＧＳの間の差が増加したことを見出した。図３ｄ、表６。最上位群は、遺伝的価値が同様であり、それらをより多数選択することによって、エリート個体のＯＨＶに近い遺伝的価値を倍加半数体が達成する可能性が（偶然に）増すことになる。
【０１４７】
【表６】
2017501731.tif 000017
【０１４８】
エリート倍加半数体を育種プログラムに戻して周回させることによって、ＯＨＶとＧＳの間の差に関して軽微な効果があった。表７。それは、全遺伝獲得量には実質的に影響を及ぼさなかった（データ示さず）。倍加半数体が育種プログラムに戻されて組み込まれうる前には時間差があるため、周回が遺伝獲得量に及ぼす効果は低減される。次世代の交雑に含めるのに充分に速やかには、それらの生成を完了することができないとき、それらは、２世代後に組み込むことができるのみである。その間に、交雑集団は、さらに選択を一巡し、そのエリート個体は、２世代前由来の倍加半数体と遺伝的価値が同等であったが、このことは、ＯＨＶが追加的に向上する傾向にあったことを示唆する。
【０１４９】
【表７】
2017501731.tif 000018
【０１５０】
集団内の遺伝分散は、集団内の多様性の測定値を提供するパラメーターである。遺伝分散はまた、選択を介してどれだけの遺伝獲得量が達成されうるかを示す。全ての選択の取り組みは、遺伝分散を低減することになる。しかし、いくつかの方法は、深刻な分散の減少をもたらし、将来の世代で選択を達成することをさらに困難にするため、長期間の遺伝獲得量を代償にして、短期間の獲得量を達成する。
【０１５１】
ＯＨＶ選択の鍵となる優位性は、集団内でＧＳよりも多くの遺伝的バリエーションまたは多様性を維持する能力である。このことは、図４および表８に強く実証される。真の遺伝分散は、非選択の基礎集団で最も高かった。まず、最上位の３０％の系統のみを使用して完全にヘテロ接合性のＦ１世代を生成したため、真の遺伝分散は急激に低下した。ホモ接合体の遺伝子型もその時に観察されたことから、次いで、Ｆ１を交雑することによって、追加の遺伝的バリエーションを放出した。３世代めでは、ＯＨＶ選択の真の遺伝分散は、ＧＳのほぼ２倍であった。さらに、それに続く世代で、ＯＨＶ選択によって、ＧＳよりもゆっくりとしたペースで遺伝分散が減少し、ＯＨＶの多様性は、１０世代までにほぼ２００％大きくなった。遺伝的基盤を大きく狭める結果をもたらす、厳しく選択された１０株のエリート体から生成された倍加半数体に、分離個体が置き換えられたため、５００株の倍加半数体を育種プログラムに戻して周回させることで、遺伝分散が、実質的に４世代目で低減したことに留意されたい。尚、このシナリオはまた、ＯＨＶとＧＳの間で遺伝獲得量に最小の差を示した。
【０１５２】
【表８】
2017501731.tif 000019
【０１５３】
この成り行きとなった１つの理由は、恐らくは極端な理由を用いて説明することができる。個体が、ゲノムの各セグメントで、優秀な１つのハプロタイプと、不良な別の１つとを保持することを想定されたい。ゆえに、それは、「高度に変動しうる」個体として分類することができよう。そのＯＨＶは非常に高いため、ＯＨＶ選択ではそれが選ばれることになる。しかし、そのＧＥＢＶは、全ての対立遺伝子効果の合計であるため、ＧＳでは、この個体は選ばれないことになる。この事実のために、ＧＳは、変動性の低い高価値の個体について選択するが、一方で、ＯＨＶは、個体内での変動性に関わらず選択することになる。
【０１５４】
集団の遺伝的多様性は、長期の遺伝獲得量に特に重要である。多様性または同系交配を問わない強力な選択圧の欠点の１つは、低頻度のバリアントが失われることである。Jannink (2010) Genet. Select. Evol. 42:35。低頻度の対立遺伝子またはハプロタイプを集団でより長く維持することは、それらがさらに大きな割合の遺伝分散を明らかにするまで、それらの頻度をゆっくりと増加させるように選択することを可能にする。ＯＨＶ選択は、２つのハプロタイプの合計で選択するよりも１つのハプロタイプで選択することを通す方が、低頻度のバリアントを長く維持する。より後期の世代でＯＨＶの優位性が増加するということは、長期の遺伝獲得量が増加したことの現れであり、この遺伝獲得量の増加は、交雑集団で保持されるさらに大きな遺伝分散に直接的に起因することが予想される。本発明者らの試験は、遺伝的多様性を持続させる明確な育種戦略が、さらに多くの長期の遺伝獲得量をもたらすことを実証している。
【０１５５】
ハプロタイプの合計から個々のハプロタイプへ選択圧を低減することはまた、さらに効率の良い複数形質の選択プログラムを可能にする。それは、好ましいハプロタイプがｉｎ  ｔｒａｎｓである時さえも、それらが維持されることを可能にし、それによって、穀物を改善するためのさらに多くの機会を提供する。例えば、同じゲノムセグメント内で、好ましい病害抵抗性の対立遺伝子を一方のハプロタイプに、好ましい収量性の対立遺伝子を他方のハプロタイプに保持し、かつＧＳ選択を受ける個体は、はっきりと競合する２つのセグメントがあるために、１つのみのハプロタイプが選択されるという結果をもたらしがちである。これに対して、ＯＨＶ選択は、双方のハプロタイプが、育種集団でさらに容易に維持されることを可能にし、それゆえ、やがて組換え事象が、同じハプロタイプにある両方の好ましい対立遺伝子を組み合わせる可能性を増す。
【０１５６】
ＧＳに対しＯＨＶに由来する関連の獲得量に遺伝的構造が及ぼす効果を調査するために、本発明者らは、１００、５００または１０００個のＱＴＬという３つの異なる遺伝的構造をシミュレーションした。ＯＨＶの使用は、形質に影響を及ぼすＯＴＬの数に関わらず、好都合であった。図５ａ、表９。１００個のＱＴＬでは、複数世代にわたって、ＯＨＶに伴う利点は小さく、一貫していた。５００個または１０００個のＱＴＬをシミュレーションした際には、ＧＳに対しＯＨＶの僅かな降下が観察され、その降下は５世代までに克服され、その後、ＯＨＶは再び一貫して、ＧＳよりも良好に機能した。形質がより多遺伝子性になってゆくにつれて、性能に受ける獲得量は大きなものとなった。
【０１５７】
【表９】
2017501731.tif 000020
【０１５８】
ハプロタイプまたはゲノムセグメントに対する結果の感度は、各染色体をそれ自体別個のセグメントとして試験することによって、またはそれぞれを２、３、６もしくは１２セグメントに分割することによって、考察した。セグメントの数を３以下とした際に、ＯＨＶ選択はＧＳよりも良好に機能した。基本シナリオは、染色体当たり３セグメントを有し、３、４および５世代では、ＯＨＶとＧＳの間の差に減少を示した。図５ｂ、表１０。この減少は、染色体が単に２つに分割されるかまたは無傷のままとされた際に回避された。
【０１５９】
【表１０】
2017501731.tif 000021
【０１６０】
本発明者らは、モルガン当たり１の平均組換え率をシミュレーションした。多くの個体は、染色体当たりの組換えが何もない（またはほとんどない）ことになり、それゆえ、数少ないセグメントを用いたモデルは、殆ど同等となる。ハプロタイプは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでさらに細かく組み合わせてエリート植物を作出することができるため、セグメントの数を増加させることによって、具体的な個体のＯＨＶは増加する。しかし、このＯＨＶは、１世代の倍加半数性を達成することができない。本質的には、１２セグメントＯＨＶが、６世代以上の蓄積された組換えを達成しうる植物である。このことは、最も良い倍加半数体を達成することができる植物を１サイクルの選択で選び出すという選択目標から離れて、何世代か後に最も良い倍加半数体を生成しうる植物へとドリフトを引き起こし、ＧＳを超えるＯＨＶの利益を低下させる。
【実施例３】
【０１６１】
遺伝子移入中のＯＨＶ選択
５つの事象を含むエリートコムギ系統［すなわち、５つのＥＸＺＡＣＴ（商標）ゲノム改変を有した高度に形質転換可能な系統］を使用して、ＯＨＶと遺伝子移入とを組み合わせた育種プログラムをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実施し、コムギ系統は、実施例１に記載された同じエリートコムギの基礎集団と交雑させて、５つの事象の遺伝子座を同時に遺伝子移入した。次の５世代（遺伝子移入後に元の遺伝的バックグラウンドを取り戻すのにかかったおよその時間）については、最も高いＯＨＶを有し、また少なくとも１つの遺伝子移入された対立遺伝子を各遺伝子移入遺伝子座に保持する植物を、倍加半数体生成のために選択した。１００株の倍加半数体を生成した際に、選択された半数体系統の大多数が、全ての遺伝子移入で固定されたいくつの倍加半数体を生成した。
【０１６２】
図６は、従来の遺伝子移入（ＧＳ）と、ＯＨＶ選択を組み合わせた遺伝子移入の間の差を示す（１００回の反復試験の平均）。従来の遺伝子移入を使用した遺伝価が同じままであった一方で、ＯＨＶｉを使用して遺伝獲得量の増加が達成された。交雑および世代当たりの子の数が増加する際に、ＯＨＶｉ選択は、ＧＳｉによって生成されるものを超える遺伝獲得量を達成することが予想される。
【０１６３】
ＯＨＶについての値と、１つまたは複数の所望の事象が集団に遺伝子移入するスピードとを組み合わせた、関数（ＯＨＶｉ）を構築した。ＯＨＶｉは、ＯＨＶと、所望の遺伝子移入の重み付けされた値との合計である。ＯＨＶｉは、集団で具体的な対立遺伝子の頻度の遺伝子移入を増加させるために有用であり、一方で、集団でＯＨＶを最大化し、それによって、最大の遺伝獲得量を達成する。概して、ＯＨＶｉは、遺伝子移入事象を得る値と、ＯＨＶとの値とを釣り合わせ、以下のように表現することができる。
ＯＨＶｉ＝ＯＨＶ＋ｉＥｍｐｈａｓｉｓ（ｗ１ｘ１＋ｗ２ｘ２＋ｗ３ｘ３）
式中、ｉＥｍｐｈａｓｉｓは、遺伝子移入に置かれた重み全体であり、ｗｎ（例えば、ｗ１、ｗ２およびｗ３）は、遺伝子移入対立遺伝子ｎに置かれた重みに対応し、ｘｎ（例えば、ｘ１、ｘ２およびｘ３）は、遺伝子移入対立遺伝子の数である（例えば、２倍体での０、１または２）。各ｗｎ＝（遺伝子移入対立遺伝子の所望の頻度）−（遺伝子移入対立遺伝子の実際の頻度）である。
【０１６４】
このように、変数ｉＥｍｐｈａｓｉｓは、遺伝子移入のスピードを支配し、その値を調整することで、ＯＨＶの最大化と遺伝子移入との相補的なゴールが最もうまく出会うことが確保される。遺伝子移入対立遺伝子の重み（ｗｎ）は、所望の対立遺伝子頻度から最も離れている低頻度の対立遺伝子に最も重きを提供するために選択される。この適合関数は、上記に記載されたような個体のレベルで、または選択された群のレベルで適用することができよう。例えば、遺伝子アルゴリズムを適用して、次世代で親として使用する最も良い個体群を選択し、遺伝獲得量を最大化しかつ所望の遺伝子移入を達成することができる。
【実施例４】
【０１６５】
経験的なトウモロコシ遺伝子型におけるＯＨＶ選択
データ。使用したデータプールは、２つの雑種強勢群由来の９００系統のトウモロコシ近交系に用いられる２３，９８１個の一塩基多型（ＳＮＰ）についての経験的な遺伝子型を含んでいた。連鎖地図は、ゲノムでの順番および距離の情報をセンチモルガン（ｃＭ）で提供した。１０個の染色体があり、連鎖地図の全長は１７４８ｃＭであった。ＳＮＰ効果の見積りは、従来のゲノム選択法の試験から入手可能であった。前掲のHabier et al. (2011)；前掲のMeuwissen et al. (2001)。ＳＮＰ効果は、２つの雑種強勢群から入手可能であった。
【０１６６】
シミュレーション。２通りのシミュレーションの流れを実施した。すなわち、１）経験的なＳＮＰ遺伝子型を基礎集団として使用し、ＳＮＰ効果を二重指数分布からサンプリングした（流れ１）、２）経験的なＳＮＰ遺伝子型および経験的なＳＮＰ効果を分析にて使用した（流れ２）。
【０１６７】
基礎集団ゲノム。コンピュータシミュレーションを実施して、トウモロコシでのゲノム選択とＯＨＶ選択とを比較した。経験的なＳＮＰを、連鎖地図に従って１０個の染色体上に配置し、各染色体を、１７０ｃＭと測定した。従来の子においてまたは倍加半数体の作出の間とのどちらかで、配偶子の作出中に、モルガン当たり１の比率で、ゲノム上に無作為に交差が配置された。様々なハプロタイプまたはＯＨＶセグメントの長さを調査した。
【０１６８】
シミュレーションされた育種プログラム。２つの育種シナリオをシミュレーションした。選択がゲノム育種値（ＧＥＢＶ）に基づく、ＧＳと、選択が最適半数体価に基づく、ＯＨＶである。選択強度など、全てのパラメーターが、ＧＳとＯＨＶの間で同じであり、唯一の違いは、選択がＧＥＢＶまたはＯＨＶのどちらかをふまえるということであった。
【０１６９】
汎用の育種プログラムは、以下の通りである（特定のシナリオをその後に記載する）。流れ１では、初発の近交系９００系統のうち最も良い３０％をＦ１世代の親として使用して、３６，０００個体という集団サイズを達成した。図７。流れ２では、雑種強勢群由来の親を別々に実行し（群１は５０６株、群２は３９４株）、基礎世代個体の６０％を選択した。選択されたそれぞれの近交系統を、選択された他の全ての系統と交雑した。後代１株を、次いで、交雑当たり遺伝子型判定（全てが一致するように）し、最上位の個体を選択して次世代（Ｆ２）を生成した。非近交系のＦ２からＦ１０の世代では、種子の状態が制限された下にある際には、各個体を、他の一個体と交配させるのみとした。全ての交配は無作為とした。近交系交雑当たりの子孫の数を変え、選択強度を変えることによって、総育種集団を２７，０００から３６，０００個体（流れに応じて）で一定に保った。各世代では、倍加半数体を生成するために、最もエリートである植物を選択し、様々な数の倍加半数体を生成した。最もエリートである倍加半数体は、任意選択で、２世代後に掛け合わせて、作出と倍加半数体の種子採集との時間差を埋めるために使用することもできた。次いで、これを何世代かで反復し、各世代で、ＯＨＶおよびＧＥＢＶを再計算して、新しい組換え事象を捉えた。
【０１７０】
結果。ＤＥＦＡＵＬＴシナリオでは、非近交系交雑当たり１００株の子孫が生成され、１０株のエリート個体が選択されてそれぞれ１００株の倍加半数体を作出し、最も良い５０株の倍加半数体を育種プログラムに戻して周回させた。育種プログラムの期間は、１０世代であった。様々なシナリオでは、近交系交雑当たりの生成された子孫の数（ｎＯｆｆ）、エリート個体当たりの生成された倍加半数体の数（ｎＤＨ）、２世代後に育種プログラムに戻して周回されたエリート倍加半数体の数（ｎＤＨＣｙｃｌｅｄ）、および染色体当たりのハプロタイプセグメントの数（ｎＳｅｇ）を調査した。全てのシナリオおよびその内部のレベルを表１１に列記する。遺伝獲得量に関する結果は、基礎世代の遺伝標準偏差（ＳＤ）におけるＯＨＶとＧＳの間の差（すなわち、獲得量ＯＨＶ−獲得量ＧＳ）に焦点を当てている。遺伝分散は、基礎では実質的にさらに大きくなるため、これは控えめな測定値である。遺伝的多様性を、世代での真の育種価の分散として計算した、真の遺伝分散として報告する。
【０１７１】
【表１１】
2017501731.tif 000022
【０１７２】
流れ１については、全遺伝子座の１０パーセント（Ｎ＝２３８８）を量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）として選び、二重指数分布からサンプリングした効果を用いて無作為に選択した。ゲノム選択とＯＨＶ選択のどちらについても、マーカー効果が公知であるものと想定し、ゲノム選択とＯＨＶの間としてマーカー効果の見積りを変えなかった。本試験で達成された総遺伝獲得量の大きさは、実際のゲノム選択ベースの育種プログラムよりも高い可能性があり、ここで、マーカー効果の不正確性は、遺伝獲得量を低減しうる。各シナリオを１００回反復試験し、標準誤差（ＳＥ）を算出した。
【０１７３】
流れ２については、マーカー効果の２つの経験的な見積りのセットを使用し（雑種強勢群１および２）、それぞれの群由来の遺伝子型のみを使用した（群１は５０６受入数、群２は３９４受入数）。どちらの場合も、表１に略述した全てのシナリオを、ｎＤＨＣｙｃｌｅｄを除き実行した。組換えの位置を換えるシナリオで、１００回の反復試験を実行した。２セットのマーカー効果の分布をチェックし、ほぼ正常（ガウス型）であった。見積りを真の効果としてみなしたが、それらは、いくらかの誤差を含有することが予想される。さらに、見積りの間の試料サイズに応じて、それらはまた、それらの分布に影響を及ぼす平均へ回帰するものとなろう（すなわち、大きな効果が殆ど観察されなかった）。効果を何ももたらさないＳＮＰマーカーは、効果ゼロであるものと想定した。
【０１７４】
流れ１。この流れでは、経験的なトウモロコシ遺伝子型を使用し、ＳＮＰ効果を二重指数関数からサンプリングした。ＯＨＶ選択は、ゲノム選択と比較すると、遺伝獲得量の増加をもたらした。この優位性は、調査した全てのシナリオにわたって一貫していた。遺伝獲得量の増加は、ゲノム選択と比較すると、１．２遺伝標準偏差までであった（ｎＯｆｆ１０００、図８）。２つの方法の間の開きは、それぞれのそれに続く世代で増加し、非近交系交雑当たりさらに多くの子孫が生成された。
【０１７５】
エリート植物当たりに生成される倍加半数体の数が増加することもまた、ゲノム選択を超えてＯＨＶ選択の遺伝獲得量を増加させた（ｎＤＨ、図９）。
【０１７６】
様々な数のエリート倍加半数体を育種プログラムに戻して周回させたため、効果が観察されなかった（ｎＤＨｃｙｃｌｅｄ、図１０）。このことは、倍加半数体が追加で戻されて、エリート倍加半数体の遺伝的優位性に追い付くまでに、交雑集団が、追加の選択の世代を経たことに起因するようである。
【０１７７】
早期の世代では、染色体当たり１つ、２つまたは３つのセグメントが、依然としてＳＥ以内にあるとはいえ、６つのセグメントを凌ぐように思われた（ｎＳｅｇ、図１１）。後の世代では、染色体を２または３セグメントに分割することによって、最も良い結果が産生されることを、結果が示唆している。
【０１７８】
集団内に維持される遺伝的多様性は、達成することのできる長期の遺伝獲得量の重要な指標である。真の遺伝分散は、多様性の一指標である。図１２は、ＯＨＶ選択が、育種集団でゲノム選択よりも大きな遺伝分散を生成したことを明確に実証している。
【０１７９】
流れ２。この流れでは、経験的な遺伝子型および経験的なＳＮＰ効果を、シミュレーションで使用した。２セットのＳＮＰ効果があった（群１および群２）。
【０１８０】
概して、ＯＨＶ選択は、群１のＳＮＰ効果を使用した際に、ゲノム選択と比べて増加した遺伝獲得量を産生し、この差は、後の世代で上昇傾向にあった。ＧＳとＯＨＶとの差は、流れ１よりも小さかった。流れ１と同じシナリオについての結果を、図１３〜図１６に提示する。これらのシミュレーションでは、経験的なＳＮＰ効果は、サンプリング効果よりも比例的に遺伝分散を低下させるように思われた。図１６を参照されたい。しかし、ＯＨＶ選択は、依然としてゲノム選択よりも多くの遺伝的多様性を維持した。シミュレーションにあった群２での効果を使用して、ＧＳを超えるＯＨＶの比較優位性が再び立証された。図１７〜図２０を参照されたい。ＯＨＶとＧＳとの差は、これらのシナリオではさらに小さかったが、依然としてＯＨＶに僅かな優位性を示した。
【０１８１】
本試験の結果は、ゲノム選択と比べた際に、ＯＨＶ選択が、育種集団で遺伝獲得量を増加させ、より多くの遺伝的多様性を維持することを立証した。流れ１でのトウモロコシの分析は、種、染色体の数およびＳＮＰの数によって異なる、（本明細書でのコムギの試験に比べて）さらに大きなＯＨＶの利益を示した。流れ１では、コムギでのおよそ５，０００個のＳＮＰに比べると、２３，８８０個のＳＮＰが利用可能であった。種とは別に、現在の分析での優位性の増加は、ＳＮＰの数の増加に起因する可能性があり、このことは、さらに正確なハプロタイプのターゲティングを容易にしうる。
【０１８２】
ＧＳを超えるＯＨＶの増加は、流れ１よりも少なく、シグナルは、流れ１よりもずっと強かったものの、流れ２の結果は、流れ１の結果を立証した。このことは、平均へ回帰した経験的なＳＮＰ効果を使用したことに起因する可能性があり、この平均は、効果を見積もるために使用した比較的小さな参照集団と、使用した見積り方法とを反映する。より大きな参照を用いると、ＯＨＶの優位性はより大きくなろう（シミュレーションの結果によって示唆されたように）。平均への回帰は、ＳＮＰ効果間の差を低減し、それゆえ、ＧＳとＯＨＶの双方について選択の効率を低減する。
【０１８３】
３つの分析群の全てで、ＯＨＶ選択は、育種集団で実質的により多くの遺伝的多様性を維持した。このことは、将来遺伝獲得を達成するために集団でより大きな遺伝分散を保ちつつ、ＯＨＶ選択を用いて遺伝獲得が可能であることを立証する。
【実施例５】
【０１８４】
ＯＨＶと上位性との組合せ
ハプロタイプのみの内部の上位性効果を算出する方法論を使用し、続いてＯＨＶ値の効果を加えて追加のＯＨＶｅ値を生成させると、育種プログラムで見積もられた上位性効果の数は急激に減少する。表１２。減少の程度は、供試する本来の１６２億の交互作用のうち１．５％から０．２％の範囲に及び、一方で、最も高い確度のある交互作用がゲノム中にわたって依然として探索されている。
【０１８５】
【表１２】
2017501731.tif 000023
【０１８６】
セグメント内には、供試するための交互作用の数を低減する最適な数のＯＨＶセグメントがあり、セグメント中にわたる上位性効果の数を御し易く保ち続けることになる。しかし、供試する上位性効果の総計のうち最も少ない数を３０５０万で用いたとしても、それは依然として、遺伝子型判定されかつ表現型の特性が明らかにされた大規模なゲノム参照集団を要するという、重大な統計学的かつ計算処理上の難題である。セグメント全体にわたる上位性効果は、セグメント内で遺伝子座交互作用よりも非常に小さいが、最初にこの効果の見積りから開始することによって、上位性効果を、さらに有用な交互作用空間に効果的に優先順位付けする。最も共通したハプロタイプのセグメントの交互作用を試験して、より長いゲノム距離での交互作用を評価することによって、供試される上位性交互作用の数をさらに低減する。
【０１８７】
それゆえ、上位性効果を含めることによって、植物育種における好ましい交互作用および遺伝的バックグラウンドの選択が可能になる。
【実施例６】
【０１８８】
最適な植物の育種の加速
先述のスキームで親を無作為に交配する代わりに、異なるゲノムセグメントに強度（または所望の形質）を有する親を組み合わせて、所望のゲノムセグメントの全てを備えたセグメントを子孫が保持する可能性を増す交配スキームを考案する。理想的な植物のハプロタイプの組成をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成し、それを獲得するために育種スキームを考案する。次いで、そのような育種スキームを実施し、ＯＨＶに接近しているＣＨＶを有する植物の開発に繋げる。この育種スキームは、複数の望ましい強度または形質を有する植物の育種を加速する。
【図１】
2017501731.tif 000024
【図２】
2017501731.tif 000025
【図３】
2017501731.tif 000026
【図４】
2017501731.tif 000027
【図５】
2017501731.tif 000028
【図６】
2017501731.tif 000029
【図７】
2017501731.tif 000030
【図８】
2017501731.tif 000031
【図９】
2017501731.tif 000032
【図１０】
2017501731.tif 000033
【図１１】
2017501731.tif 000034
【図１２】
2017501731.tif 000035
【図１３】
2017501731.tif 000036
【図１４】
2017501731.tif 000037
【図１５】
2017501731.tif 000038
【図１６】
2017501731.tif 000039
【図１７】
2017501731.tif 000040
【図１８】
2017501731.tif 000041
【図１９】
2017501731.tif 000042
【図２０】
2017501731.tif 000043
【国際調査報告】
2017501731.tif 000044
2017501731.tif 000045
2017501731.tif 000046
2017501731.tif 000047