(57)【要約】  本発明は、対象中の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはＵＣ関連異形成を検出およびモニタリングするための方法であって、対象からの検体をｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２についてアッセイすることを含む方法を提供する。対照試料と比較して、検体中に存在する増大した量のｍｉＲ−２１４、あるいは減少した量のＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２はＵＣまたはＵＣ関連異形成を表す。本発明はさらに、ｍｉＲ−２１４の阻害剤を投与することによって対象中のＵＣまたは大腸炎関連大腸癌を治療する方法を提供する。【選択図】図２０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の検出、診断、または予後予測のための方法であって、
（ａ）前記対象から採取した検体をマイクロＲＮＡ−２１４（ｍｉＲ−２１４）についてアッセイするための試薬と接触させることと、
（ｂ）前記検体中に存在するｍｉＲ−２１４の量を対照試料と比較して測定することと、
（ｃ）前記対照試料と比較して前記検体中に増大した量のｍｉＲ−２１４が存在する場合ＵＣの存在またはリスクを決定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記検体が腸生検組織または腸液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腸生検組織が大腸を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定することがポリメラーゼ連鎖反応アッセイまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬が配列番号１に特異的に結合するプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象にＵＣまたはＵＣ関連異形成のための治療的処置を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象中のＵＣの治療の効果をモニタリングするための方法であって、
（ａ）初回の時点で前記対象から採取した検体をｍｉＲ−２１４についてアッセイするための試薬と接触させることと、
（ｂ）２回目の時点で前記対象から採取した検体をｍｉＲ−２１４についてアッセイするための試薬と接触させることであって、前記対象が前記２回目の時点の前にＵＣのための治療を受けていることと、
（ｃ）前記初回の時点および前記２回目の時点で採取した検体中に存在するｍｉＲ−２１４の量を測定することと、
（ｄ）前記初回の時点で採取した検体と比較して２回目の時点で採取した検体中に減少した量のｍｉＲ−２１４のが存在するかどうかを決定することと
を含み、減少した量のｍｉＲ−２１４がＵＣの有効な改善を表す、方法。
【請求項８】
前記検体が腸生検組織または腸液である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腸生検組織が大腸を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定することがポリメラーゼ連鎖反応アッセイを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬がＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号１）に特異的に結合するプローブを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
対象中のＵＣを治療する方法であって、前記対象に治療有効量のｍｉＲ−２１４の阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記投与することが大腸内投与または静脈内投与である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍｉＲ２１４の阻害剤がアンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオアート結合を含むロックト核酸アンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
レンチウイルスベクターを介して前記アンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドが投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
炎症性腸疾患に罹患している患者がＵＣを有するかどうかを決定する方法であって、請求項１または請求項７に記載の方法を実施することを含み、対照試料に比して増大した量のｍｉＲ−２１４がＵＣを表す、方法。
【請求項１８】
対象中の大腸癌を治療する方法であって、前記対象に治療有効量のロックト核酸アンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドを投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記投与することが大腸内投与、腫瘍内投与、または静脈内投与である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｍｉＲ−２１４の阻害剤がアンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
対象中の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の検出、診断、または予後予測のための方法であって、
（ａ）前記対象から採取した検体をマイクロＲＮＡ−２１４（ｍｉＲ−２１４）、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２についてアッセイするための試薬と接触させることと、
（ｂ）前記検体中に存在するｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２の量を対照試料と比較して測定することと、
（ｃ）前記対照試料と比較して前記検体中に増大した量のｍｉＲ−２１４が存在する場合、あるいは前記対照試料と比較して前記検体中に減少した量のＰＴＥＮ量および／またはＰＤＬＩＭ２が存在する場合ＵＣの存在またはリスクを決定することと
を含む、方法。
【請求項２２】
潰瘍性大腸炎またはクローン病の診断が未だ決定されていない、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
対象中の潰瘍性大腸炎の状態を決定するための方法であって、
（ａ）前記対象から採取した検体をマイクロＲＮＡ−２１４（ｍｉＲ−２１４）についてアッセイするための試薬と接触させることと、
（ｂ）前記検体中に存在するｍｉＲ−２１４の量を対照試料と比較して測定することと、
（ｃ）前記対照試料と比較して前記検体中に増大した量のｍｉＲ−２１４が存在する場合活動性潰瘍性大腸炎の存在を決定し、前記検体中に存在するｍｉＲ−２１４の量が前記対照試料と有意に異ならない場合寛解を決定することと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般的には、潰瘍性大腸炎および大腸炎関連大腸癌の検出、診断、およびモニタリングに関する。本発明は、より具体的には、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびＵＣ関連異形成を診断、予後予測、およびモニタリングするマーカーとしてのｍｉＲ−２１４の使用、ならびにｍｉＲ−２１４の化学的阻害剤の使用によるなど、ＵＣおよびＵＣ関連異形成の治療標的としてのｍｉＲ−２１４の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＵＣは、可能性として西洋型の生活様式、食事および環境変化を理由に、発生率が増大しつつある。ＵＣには寛解期と再燃期がみられるが、疾患活動性と相関する信頼できるバイオマーカーはない。疾患が長期間にわたり広範囲に及ぶと、結腸直腸癌が発現するリスクが高くなる。ＴＮＦαを調節する薬剤を含む医学的治療により寛解がもたらされるが、副作用、リンパ腫、無応答、または耐性発現による制約を受けることが多い。多くの場合、医学療法の甲斐なく外科的介入が必要となり、患者の生活の質が低下する。全ゲノム関連研究（ＧＷＡＳ）により、疾患のリスクに影響を及ぼす感受性の遺伝子座および経路が明らかにされているが、特異的な原因的役割を解明するには不十分にすぎず、ＵＣの病理発生には他の遺伝的変化および／またはエピジェネティックな変化が寄与していることが示唆される。マイクロＲＮＡは、主に標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲでの結合を介して遺伝子発現の主要な調節因子として作用する低分子非コードＲＮＡであり、ＩＢＤを含む炎症性疾患の病理発生に寄与するシグナル伝達経路に不可欠な調節因子である。マイクロＲＮＡシグナル伝達経路は、乳房および肝臓で慢性炎症から悪性形質転換への橋渡しをするが、ＵＣ発症に果たす役割についてはほとんど検討されていない。
【０００３】
さらに、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および過敏性腸症候群（ＩＢＳ）などの消化器障害のよく似た症状を区別するのが困難なことがある。ＩＢＳは、慢性の腹痛または腹部不快感と下痢および便秘がみられるか、この２つが交互に起こる症状群である。ＩＢＳの患者は大腸癌のリスクが高いわけではなく、ＩＢＤをはじめとする消化器疾患を発症する可能性も低い。
【０００４】
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはＵＣ関連異形成の検出および治療のための改善された方法を明らかにする必要がある。ＵＣとクローン病または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）とを区別する必要もある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、対象中の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を検出する方法を提供する。典型的な実施形態では、この方法は、対象から採取した検体を、ｍｉＲ−２１４をアッセイする試薬と接触させることを含む。この方法は、検体中に存在するｍｉＲ−２１４の量を対照試料と比較して測定することをさらに含む。この方法は、ＵＣ関連異形成の検出にも用いることができる。対照試料と比較して検体にｍｉＲ−２１４量の増大が認められる場合、潰瘍性大腸炎（またはＵＣ関連異形成）の存在が決定される。本発明はさらに、ｍｉＲ−２１４、ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）のレベルならびにＰＤＺおよびＬＩＭドメインタンパク質２（ＰＤＬＩＭ２）をアッセイすることによる、炎症性疾患を検出またはモニタリングする方法を提供する。対照試料と比較して検体にｍｉＲ−２１４量の増大が認められる場合、あるいは対照試料と比較して検体にＰＴＥＮ量および／またはＰＤＬＩＭ２量の増大が認められる場合、炎症性疾患の存在またはリスクが決定される。この方法は、潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別するのに用いることができる。
【０００６】
一実施形態では、検体は腸生検組織、例えば、大腸組織または腸液などである。典型的な実施形態では、測定は、リアルタイムＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを含む。あるいは、測定はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。別の実施形態では、測定はイムノアッセイ（例えば、ＰＴＥＮまたはＰＤＬＩＭ２の）を含む。
【０００７】
対象中の潰瘍性大腸炎（またはＵＣ関連異形成）の治療の効果をモニタリングする方法は通常、初回の時点で対象から採取した検体を、ｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮおよび／またはＰＤＬＩＭ２をアッセイする試薬と接触させることと；２回目の時点で対象から採取した検体を、ｍｉＲ−２１４ＰＴＥＮおよび／またはＰＤＬＩＭ２をアッセイする試薬と接触させることとを含み、対象は、２回目の時点の前に潰瘍性大腸炎（またはＵＣ関連異形成）の治療を受けている。この方法は、初回の時点および２回目の時点で採取した検体中に存在するｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮおよび／またはＰＤＬＩＭ２の量を測定することと；初回の時点で採取した検体と比較して２回目の時点で採取した検体中でｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮおよび／またはＰＤＬＩＭ２の量の増大または減少が認められるかどうかを決定することとをさらに含み、ｍｉＲ−２１４量の減少あるいはＰＴＥＮ量および／またはＰＤＬＩＭ２量の増大は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはＵＣ関連異形成の有効な改善を表す。一実施形態では、上記の方法を改変して、任意選択で治療を実施せずに、２つの時点で得た測定値を比較することによって、対象の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはＵＣ関連異形成の進行をモニタリングする。初回の時点と比較して２回目の時点でｍｉＲ−２１４量の増大（あるいはＰＴＥＮおよび／またはＰＤＬＩＭ２の量の減少）が認められることは疾患進行を表す。
【０００８】
検体は、血液もしくは腹水などの他の体液、または組織検体であり得る。通常、検体は腸液または腸組織である。検体の例としては、大腸生検などの腸生検組織が挙げられる。測定は通常、ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、またはイムノアッセイを含む。
【０００９】
本発明はさらに、対象中の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）もしくはＵＣ関連異形成、または大腸炎関連大腸癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、対象に治療有効量のｍｉＲ−２１４阻害剤を投与することを含む。一実施形態では、投与は大腸内投与または静脈内投与である。ｍｉＲ−２１４阻害剤の例としては、アンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一例として、ロックト核酸およびホスホロチオアート結合などを有することによって、より安定な形態で提供できる。この方法は、アンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドを直接、またはレンチウイルスベクターを介して投与すること含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａ〜図１Ｅは、阻害剤のハイコンテンツスクリーニングによって潰瘍性大腸炎におけるＮＦκＢを制御するマイクロＲＮＡを特定することを示す図である。図１Ａ〜１Ｂはスクリーニングのワークフローおよびデータである。図１Ａ：３４８種類のマイクロＲＮＡ阻害剤からなるライブラリーを大腸上皮細胞に三重反復でトランスフェクトし、ＩＬ−６で処理した後、ＮＦκＢの活性化を測定し、（図１Ｂ）スクリーニングのデータをスクランブル配列対照（効果無し、値＝１．３４）と比較して、リン酸化ＮＦＫＢ（Ｓ５３６）の絶対レベル（ｘ軸）およびスチューデントｔ検定（ｙ軸）のＰ値としてプロットした。囲みの部分に示すのは、ＮＦＫＢリン酸化に対する影響が５０％を上回るマイクロＲＮＡ阻害剤である。図１Ｃ〜１Ｅは、ヒト活動性潰瘍性大腸炎試料の大腸上皮でｍｉＲ−２１４がアップレギュレートされることを示している。図１Ｃ：定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって示されるように、ｍｉＲ−２１４はＵＣ患者の大腸組織で特異的に過剰発現する。ＩＢＳは炎症性腸症候群、ＣＤはクローン病、ＵＣは潰瘍性大腸炎を表す。データは平均±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表されている。＊＊＊は対照との比較でＰ＜０．００１、＃はＵＣとの比較でＰ＜０．００１である（スチューデントｔ検定）ことを表す。図１Ｄ：大腸上皮ＵＣ患者および対照でのｍｉＲ−２１４発現（青）を示す、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。対比染色にＮｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｄを用いた。スケールバーは５０μｍを表す。図１Ｅ：定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって示されるように、ｍｉＲ−２１４発現が潰瘍性大腸炎の活動性と相関する。データは平均±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表されている。＊＊＊は、活動性のＵＣ患者からの大腸組織ではＵＣ寛解期の患者と比較してＰ＜０．００１である（スチューデントｔ検定）ことを表す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｊは、ｍｉＲ−２１４が大腸上皮のＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮを直接標的とし、フィードバックループ回路を活性化することを示す図である。ａ、ｂ、ｃは、ＮＦＫＢを調節するｍｉＲ−２１４標的を特定し検証する戦略である。（ａ）４つの異なる予測ソフトウェアによって予測されたｍｉＲ−２１４標的（ｎ＝２８０）を、ｍｉＲ−２１４処理したヒト大腸上皮細胞（ＮＣＭ３５６）での定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により分析した。検証済みのｍｉＲ−２１４標的（ｎ＝７１、５０％超が阻害され、スチューデントｔ検定で＊＊Ｐ＜０．０１）をＮＦκＢとの関係、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（配列番号３、４）のアライメントおよびｍｉＲ−２１４（配列番号２）配列に基づいてふるい分け、第二の大腸上皮細胞系（ＮＣＭ４６０）でのルシフェラーゼアッセイにより確認した。（ｂ）ウエスタンブロット解析から、ｍｉＲ−２１４がＮＣＭ３５６中のＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮのタンパク質レベルを調節することが明らかになった。（ｃ）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって示されるように、ＵＣ患者からの大腸組織中でＰＤＬＩＭ２（Ｐ＜０．０１）およびＰＴＥＮ（Ｐ＜０．０５）の発現が減少する。ｄ、ＥＬＩＳＡによって示されるように、ｍｉＲ−２１４はＮＦκＢのＳ５３６のリン酸化を調節する。ｅ、ｆ、炎症性シグナルはＳＴＡＴ３を介してｍｉＲ−２１４を転写的に活性化する。ＩＬ６はＭＩＲ２１４遺伝子のプロモーター上のＳＴＡＴ３の結合を誘導し（ｅ）、ＳＴＡＴ３結合部位の変異誘発（Ｍ）によってＩＬ６によるプロモーター活性化が打ち消される（ｆ）。ＷＴはＭＩＲ２１４遺伝子プロモーター上の野生型ＳＴＡＴ３結合部位を表し、Ｍは変異した同部位を表す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊は未処理細胞および対照（プレｍｉＲスクランブル）処理細胞との比較でＰ＜０．０１であることを表し、＊＊＊は同じ比較でＰ＜０．００１であることを表し；＃はＩＬ６誘導性ＷＴプロモーター活性との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。ｇは、考えられるモデルの略図である。ｈ、ｉ、ｊ、化学的阻害剤はＵＣ患者からの大腸組織に対するｍｉＲ−２１４の効果を逆転させ、大腸炎の実験マウスモデルで疾患活動性を改善する。大腸内視鏡検査時に単離した新鮮な大腸生検試料を２つに分け、ｍｉＲ−２１４に対する化学的阻害剤または陰性対照（ＮＣ）で処理し、ｍｉＲ−２１４（ｈ）、ＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮのｍＲＮＡレベル（ｉ）の解析に供した。ｍｉＲ−２１４に対する化学的阻害剤が大腸炎の慢性ＤＳＳマウスモデルでの疾患活動性に及ぼす効果。＊＊＊は未処理組織およびＮＣ処理組織との比較でＰ＜０．００１であることを表し；＊＊は未処理組織およびＮＣ処理組織との比較でＰ＜０．０１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図３】図３Ａ〜図３Ｊは、ヒト大腸細胞のｍｉＲ−２１４回路が腫瘍原性である可能性を示す図である。図３Ａ〜３Ｂ：マウス（図３Ａ）およびヒト（図３Ｂ）で慢性大腸炎症はｍｉＲ−２１４発現を調節する。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊は対照マウスおよび対照（無ＵＣ）組織との比較でＰ＜０．０１であることを表し、＊＊＊は同じ比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。図３Ｃ〜３Ｄ：ｑＰＣＲ（図３Ｃ）およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（図３Ｄ）によって示されるように、ｍｉＲ−２１４は大腸炎関連結腸直腸癌（ＣＡＣ）では過剰発現するが、孤発性結腸直腸癌（ＣＲＣ）では過剰発現しない。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊＊は対照組織との比較でＰ＜０．００１であることを表し；＃はＣＡＣとの比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。図３Ｅ〜３Ｈ：ＩＬ−６はｍｉＲ−２１４を介して大腸癌細胞の腫瘍原性を調節する。ＩＬ６によって誘導される軟寒天での大腸癌細胞コロニー形成（図３Ｅ）およびマトリゲルへの浸潤（図３Ｆ）は、ｍｉＲ−２１４過剰発現によって増大するが、ｍｉＲ−２１４阻害によって逆転する。ＩＬ６は用量依存的にｍｉＲ−２１４の発現を誘導し（図３Ｇ）、ｍｉＲ−２１４阻害はＡｋｔのリン酸化に対するＩＬ６の効果を抑制する（図３Ｈ）。図３Ｉ、ＣＡＣでＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮのｍＲＮＡが抑制され、図３Ｊ、ｍｉＲ−２１４は腫瘍ステージと正の相関がある。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊は早期ＣＡＣステージ（ＩおよびＩＩ）との比較でＰ＜０．０５であることを表し；＊＊は未処理細胞および対照（ｍｉＲスクランブル）処理細胞との比較でＰ＜０．０１であることを表し、＊＊＊は同じ比較でＰ＜０．００１であることを表し；＃はアンチｍｉＲ−陰性対照（ＮＣ）処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図４】図４Ａ〜図４Ｌは、ｍｉＲ−２１４の化学的阻害剤がｉｎ  ｖｉｖｏで大腸炎関連結腸直腸癌を効率的に抑制することを示す図である。図４Ａ：マウスＡＯＭ−ＤＳＳ大腸炎関連結腸直腸癌モデルでのアンチｍｉＲ−２１４療法のプロトコル。図４Ｂ〜４Ｄ：ｍｉＲ−２１４−阻害剤の大腸内投与の、大腸炎関連結腸直腸癌のＡＯＭ−ＤＳＳマウスモデルに形成される腫瘍の数（図４Ｂ）およびサイズ（図４Ｃ）、ならびに切断カスパーゼ３のレベル（図４Ｄ）に対する治療的可能性の評価。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊＊は未処理マウスおよび対照（ｍｉＲ−ＮＣ阻害剤）投与マウスとの比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。図４Ｅ〜４Ｌ：化学的ｍｉＲ−２１４阻害剤または陰性対照（ＮＣ）で処理したマウスからの大腸組織切片のヘマトキシリン／エオシン（図４Ｅ〜４Ｆ）、ｐＮＦＫＢ（Ｓ５３６）（図４Ｇ〜４Ｈ）、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）（図４Ｉ〜４Ｊ）およびＫｉ６７（図４Ｋ〜４Ｌ）での染色。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、潰瘍性大腸炎患者およびクローン病患者でのｍｉＲ−２１４発現を示す棒グラフである。ＭｉＲ−２１４発現はｑＲＴ−ＰＣＲによって評価し、（図５Ａ）ｍｉＲ−２１４の発現はＵＣ患者では性別と相関せず、ＣＤ患者では疾患位置（図５Ｂ）によっても性別（図５Ｃ）によっても差がない。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。
【図６】ｍｉＲ−２１４が大腸上皮細胞中のＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮの発現を調節することを示す棒グラフである。ＮＣＭ４６０細胞でのＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮの発現に及ぼすｍｉＲ−２１４の効果をｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊＊は未処理細胞および対照（スクランブル）ｍｉＲ処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図７】ｍｉＲ−２１４が大腸上皮細胞中のＩＬ６発現を調節することを示す棒グラフである。ＮＣＭ４６０細胞でのＩＬ６発現に対するｍｉＲ−２１４の効果をｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊＊は未処理細胞および対照（スクランブル）ｍｉＲ処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、炎症性シグナルがＳＴＡＴ３を介してｍｉＲ−２１４を転写的に活性化することを示す図である。（図８Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した、ｍｉＲ−２１４発現に対するＩＬ６の効果。＊＊＊は未処理細胞および対照（スクランブル）ｍｉＲ処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。図８Ｂは、ＭＩＲ２１４遺伝子のプロモーター上のＳＴＡＴ３結合部位の予測に用いたＬｅｖｅｒアルゴリズムおよびＰｈｙｌＣＲＭアルゴリズムの結果を示している。
【図９】ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）のリン酸化が対照およびＵＣ患者からの大腸組織でのｍｉＲ−２１４発現と正の相関があることを示すグラフである。大腸組織での、ＥＬＩＳＡにより評価したＳＴＡＴ３リン酸化、およびｑＲＴ−ＰＣＲにより評価したｍｉＲ−２１４レベルとのその相関（ｒはピアソン相関係数を表す）。
【図１０】ＩＬ６がｍｉＲ−２１４を介して大腸細胞中のＰＤＬＩＭ２発現を抑制することを示す棒グラフである。ＩＬ６誘導性ＰＤＬＩＭ２抑制に対するｍｉＲ−２１４阻害の効果をｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。＊＊＊未処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表し、＠は陰性対照ｍｉＲ処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図１１】ＩＬ６がｍｉＲ−２１４を介して大腸細胞中のＰＴＥＮ発現を抑制することを示す棒グラフである。ＩＬ６誘導性ＰＴＥＮ抑制に対するｍｉＲ−２１４阻害の効果をｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。＊＊＊は未処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表し、＃は陰性対照ｍｉＲ処理細胞との比較でＰ＜０．０１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図１２】ＩＬ６がｍｉＲ−２１４を介して大腸細胞中のＡｋｔリン酸化を誘導することを示す棒グラフである。ＩＬ６誘導性Ａｋｔリン酸化（Ｓ４７３）に対するｍｉＲ−２１４阻害の効果をＥＬＩＳＡにより評価した。＊＊は未処理細胞との比較でＰ＜０．０１であることを表し、＊＊＊は同じ比較でＰ＜０．００１であることを表し、＃は陰性対照ｍｉＲ処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図１３】化学的阻害剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏで大腸細胞中のｍｉＲ−２１４発現を効率的に抑制することを示す棒グラフである。ＮＣＭ３５６大腸細胞を用いて、ｍｉＲ−２１４特異的化学的阻害剤の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討した。ｍｉＲ−２１４化学的阻害剤で処理（３０分間）した細胞を２４時間後にｑＲＴ−ＰＣＲによって評価し、ｍｉＲ−２１４レベルを解析した。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは、慢性ＤＳＳマウスモデルに適用した治療プロトコルを示す図である。ｍｉＲ−２１４阻害の治療的可能性を探るため、慢性大腸炎のマウスモデルを用いた。このモデルでは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の反復経口投与によって大腸炎を誘発する。（図１４Ａ）第８日からＤＳＳ処理マウスにｍｉＲ−２１４阻害剤または陰性対照を（２日毎に）４サイクル大腸内投与した。（図１４Ｂ）各マウス群（未処理、ｍｉＲ−２１４阻害剤またはｍｉＲ−ＮＣ阻害剤）の疾患活動性スコアの評価に用いた基準。第２０日に、マウスを屠殺し、大腸の長さを測定した。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＭｉＲ−２１４が大腸癌細胞の腫瘍原性能を誘導し、ＩＬ６の腫瘍原性効果を媒介することを示す棒グラフである。大腸癌細胞について、ＭｉＲ−２１４過剰発現によって腫瘍原性能が増強され、ｍｉＲ−２１４の阻害によってＩＬ６の腫瘍原性効果が逆転する。ｍｉＲ−２１４過剰発現およびｍｉＲ−２１４阻害の、ＩＬ６によって誘導されるＳＷ４８０細胞の軟寒天でのコロニー形成（図１５Ａ）および浸潤（図１５Ｂ）に及ぼす効果。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊は未処理細胞および対照（ｍｉＲスクランブル）処理細胞との比較でＰ＜０．０１であることを表し、＊＊＊は同じ比較でＰ＜０．００１であることを表し、＃はアンチｍｉＲ−陰性対照（ＮＣ）処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｂは、炎症性シグナルがＳＴＡＴ３を介して大腸癌細胞中でｍｉＲ−２１４を転写的に活性化することを示す棒グラフである。（図１６Ａ）ＣｈＩＰおよびｑＰＣＲにより評価した、ＩＬ６処理に応答するＭＩＲ２１４遺伝子のプロモーター上へのＳＴＡＴ３の結合。（図１６Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異型（Ｍ）のＳＴＡＴ３結合部位を有するＭＩＲ２１４遺伝子プロモーターのルシフェラーゼ活性。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊＊は未処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す。＠は各治療条件下でのＷＴプロモーター活性との比較でＰ＜０．０１であることを表し、＃は同じ比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｂは、ＩＬ６がｍｉＲ−２１４を介して大腸癌細胞中でＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮの発現を抑制することを示す棒グラフである。ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞で、ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した、ＩＬ６およびｍｉＲ−２１４阻害がＰＤＬＩＭ２のｍＲＮＡ（図１７Ａ）およびＰＴＥＮのｍＲＮＡ（図１７Ｂ）の発現に及ぼす効果。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊＊は未処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表し、＠はアンチｍｉＲ−陰性対照（ＮＣ）処理細胞との比較でＰ＜０．０１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、ＭｉＲ−２１４が大腸癌細胞中でＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮの発現ならびにＮＦＫＢのリン酸化を調節することを示す棒グラフである。ＨＣＴ１１６細胞で、ｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した、ＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮのｍＲＮＡ発現に及ぼすｍｉＲ−２１４の効果（図１８Ａ）、ＥＬＩＳＡにより評価した、リン酸化に及ぼすＮＦＫＢ（Ｓ５３６）の効果（図１８Ｂ）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。＊＊＊は未処理細胞および対照（スクランブル）ｍｉＲ処理細胞との比較でＰ＜０．００１であることを表す（スチューデントｔ検定）。
【図１９】ＡＯＭ−ＤＳＳマウスモデルに適用した治療プロトコルを示す図である。ｍｉＲ−２１４阻害の治療的可能性を探るため、大腸炎関連結腸直腸癌のマウスモデルを用いた。このモデルでは、アゾキシメタン（ＡＯＭ）を投与した後、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を反復経口投与することによって、結腸直腸癌を誘発する。ＡＯＭ−ＤＳＳ処理マウスに化学的マイクロＲＮＡ陰性対照（ｍｉＲ−ＮＣ）またはｍｉＲ−２１４阻害剤を週１回、４サイクル大腸内投与した。第９１日に、マウスを屠殺し、腫瘍量を評価した。
【図２０】１８ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ−２１４阻害剤の大腸内投与によって、ＵＣマウスモデルで潰瘍性大腸炎の疾患活動性が８０％減少したことを示す棒グラフである。
【図２１】ｍｉＲ−２１４阻害剤は無作為に選択した他のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１）の発現レベルに影響を及ぼすことはなく、ｍｉＲ−２１４のみを標的とするその特異性が確認されたことを示す棒グラフである。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｃは、１８ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ−２１４で処理したマウス（マウス３匹／グループ）中で毒性が認められないことを示す棒グラフである。治療から４８時間後に、肝酵素ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを尿素レベルとともに測定した。未処理マウス（対照）、ｍｉＲ−ＮＣ阻害剤処理マウスおよびｍｉＲ−２１４阻害剤処理マウスの間でＡＬＴ（図２２Ａ）、ＡＳＴ（図２２Ｂ）および尿素（図２２Ｃ）のレベルに統計的有意差はみられなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載される本発明は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）にｍｉＲ−２１４が予想外にも特異的に発現することに基づく。本発明はさらに、アンチセンスｍｉＲ−２１４の大腸内投与によってＵＣが減少し、その効果および特異性は高レベルであり、毒性も認められないことが明らかになったことに基づく。データは、ｍｉＲ−２１４がＵＣにおける重要なメディエーターであり、治療標的であることを示す。本発明は、潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別するのに用いることができる方法を提供するという点で特に有利である。
【００１２】
定義
本願で使用される科学用語および技術用語はいずれも、特に明記されない限り、当該技術分野で一般的に用いられる意味を有する。以下の語および語句については、本願で使用する場合、明記する意味を有する。
【００１３】
本明細書で使用される、対象からの「検体」は、対象から採取した検体であって、血液もしくは血液由来細胞、それ以外の体液、例えば腸液または生検組織を含有する検体を意味する。生検組織の例としては、大腸生検組織などの腸組織が挙げられる。
【００１４】
本明細書で使用される「対照試料」は、正常で健常な状態を示す検体を意味する。検体は、血液、血清または当業者によって適切な対照となると理解されている他の体液もしくは組織であり得る。健常患者から採取した正常な大腸組織または腸液の試料が対照試料の典型的な例である。
【００１５】
本明細書で使用される「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を包含する。「非ヒト動物」という用語は、あらゆる脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、ニワトリ、および他の獣医学対象などを包含する。
【００１６】
本明細書で使用される「ａ」または「ａｎ」は、別途明記されない限り、少なくとも１つを意味する。
【００１７】
潰瘍性大腸炎および大腸炎関連癌の検出法および治療法
本発明は、対象中の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはＵＣ関連異形成を検出する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、対象から採取した検体を、配列：５’−ＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１）を有するオリゴヌクレオチドであるｍｉＲ−２１４についてアッセイすることを含む。さらなる実施形態では、この方法は、ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）ならびにＰＤＺおよびＬＩＭドメインタンパク質２（ＰＤＬＩＭ２）を含む２つ、３つ、またはそれより多いマーカーについて検体をアッセイすることを含む。アッセイは通常、検体をｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２に特異的な試薬と接触させることと、検体中に存在するｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２の量を測定することとを含む。このようなアッセイに適した代表的な試薬については、のちの実施例に記載する。例えば、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて発現レベルを決定できる。のちの実施例では、ｍｉＲ−２１４発現レベルをＵ６低分子核ＲＮＡ（２０３９０４；Ｅｘｉｑｏｎ社）のレベルに対して正規化した。当業者であれば、発現レベルの正規化に用い得る適切な代替法を理解できるであろう。
【００１８】
この方法で検出される疾患としては、大腸癌および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはＵＣ関連異形成が挙げられる。この方法は特に、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を検出し、かつＵＣをクローン病または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）などの他の病態から区別することに用いることができる。したがって、本発明はさらに、ＵＣを特異的に検出する方法を提供する。この方法は特に、ＵＣまたはクローン病の診断が決定されていない場合に有用である。本発明はさらに、患者におけるＵＣの状態（活動性または不活動性／寛解）を決定する方法を提供し、この方法では、対照試料と比較して上昇したｍｉＲ−２１４レベルを検出することは疾患活動を表す。ｍｉＲ−２１４レベルが同じ患者の以前の測定値に比して減少しているか、対照試料よりも有意には高くないことは疾患の消退または寛解を表す。
【００１９】
次いで、検体中に存在するｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２の量を、対照試料中に存在するその量と比較する。対照試料と比較して検体中にｍｉＲ−２１４量の増大、あるいはＰＴＥＮ量および／またはＰＤＬＩＭ２量の減少が認められることは炎症性疾患を表す。通常、炎症性疾患を有する対象から採取した検体では、正常対照試料と比較してマーカー（ｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮおよび／またはＰＤＬＩＭ２）の存在量の増大または減少に統計的有意差が認められる。
【００２０】
一実施形態では、対象から採取した検体中のｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２の量は、正常対照の２倍に増大し、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２の量は正常対照の約半分に減少する。いくつかの実施形態では、その差は、正常対照に比して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、または１００％の増大（ｍｉＲ−２１４の場合）または減少（ＰＴＥＮおよび／またはＰＤＬＩＭ２の場合）である。
【００２１】
ｍｉＲ−２１４の測定またはアッセイは、検体からマイクロＲＮＡを単離すること、かつ／またはリアルタイムＰＣＲもしくは当該技術分野で公知の他の適切なＰＣＲアッセイなどの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを実施することを含み得る。あるいは、アッセイはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイであり得る。ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２のアッセイは、ＰＣＲまたはイムノアッセイ、例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティング、ラジオイムノアッセイ、または当該技術分野で公知の他のイムノアッセイなどであり得る。このようなアッセイを生検組織試料に対して実施し得る。
【００２２】
ｍｉＲ−２１４、ＰＴＥＮ、および／またはＰＤＬＩＭ２を検出するプローブを検出可能なように標識できる。一実施形態では、プローブを放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質またはビオチンで標識する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端をレポーター蛍光色素で標識し、同プローブの３’末端を消光色素で標識する。いくつかの実施形態では、プローブは抗体であり、検出可能な標識は、ＰＴＥＮおよび／またはＰＤＬＩＭ２を結合する抗体、あるいは一次抗体を結合する二次抗体である。代表的な抗体については、のちの実施例に記載する。試薬およびキットは、抗体、プローブ、ＰＣＲプライマーおよび関連材料を含み、市販のものである。
【００２３】
検体は通常、腸液または生検組織などの腸組織である。治療を実施する医師の判断に従って、他の検体を採取してもよい。検体は、従来の手段を用いて対象から採取することができる。
【００２４】
当業者であれば、検体中のｍｉＲ−２１４の検出が疾患活動性および治療に対する奏効を評価するモニタリングの手段となることから、この検出によりＵＣまたはＵＣ関連異形成を検出する方法に適したほかの変形形態が理解されよう。この方法はまた、治療を受けている患者からの試料中のｍｉＲ−２１４レベルのモニタリングに用いることもできる。この方法を用いてｍｉＲ−２１４レベルをモニタリングすることによって、初期治療または継続治療の治療レジメンが適切であるかどうかを決定できる。所与の患者または検体中にｍｉＲ−２１４がどの程度存在するのかが、治療戦略を導く予後予測の指標をもたらし得る。したがって、対象中に存在するｍｉＲ−２１４のレベルに関する情報を用いて、しかるべき治療プロトコルの選択を補助できる。例えば、持続する疾患活動性のレベルを定量的に測定するための代理バイオマーカーとしてのｍｉＲ−２１４によって、潰瘍性大腸炎のメサラミン治療をモニタリングできる。疾患活動性が許容レベルを超えて持続する場合、臨床医は、治療用量を増大させるか、異なる治療剤に変更することを考慮するであろう。
【００２５】
本発明は、対象において潰瘍性大腸炎（ＵＣ）もしくはＵＣ関連異形成、または癌を治療する方法をさらに提供する。一実施形態では、この方法は、対象に治療有効量のｍｉＲ−２１４阻害剤を投与することを含む。治療有効量とは、特に限定されないが炎症およびＩＬ−８発現を含む疾患の症状を改善するのに十分な量である。一実施形態では、投与は大腸内投与または静脈内投与である。別の実施形態では、投与は腫瘍内投与である。ｍｉＲ−２１４阻害剤の例としては、配列番号１（５’−ＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧ−３’）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一例として、ロックト核酸およびホスホロチオアート結合を含むアンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドなどの、より安定な形態で提供できる。このような修飾は分子を安定化させかつそれをエンドヌクレアーゼによる切断から保護し、それによりｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害剤の安定性および効果を増大させるのに役立つ。この方法は、アンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドを直接、またはレンチウイルスベクターを介して投与することを含み得る。例えば、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターなどの、適切な送達ベクターの使用を選択して静脈内投与の効果を増大させ得る。
【００２６】
対象におけるＵＣまたは大腸癌の治療は、対象に治療有効量のｍｉＲ−２１４阻害剤、例えばアンチセンスｍｉＲ−２１４オリゴヌクレオチドを投与することを含む。治療有効量とは、疾患の症状、例えば腫瘍の成長および／またはサイズ、ならびにＩＬ−８発現などの疾患の症状などを改善するのに十分な量である。投与は、静脈内投与、大腸内投与、および／または腫瘍内投与であり得る。一実施形態では、生検および／または腫瘍切除時にｍｉＲ−２１４阻害剤を術中投与する。のちの実施例には、マウスモデルでのＵＣ治療に対する代表的な用量として１２ｍｇ／ｋｇおよび１８ｍｇ／ｋｇを記載し、それが特異的で、有効でありかつ非毒性であることを示す。当業者であれば、この情報を用いて、その他の対象に有効な投与量および計画の選択を導くことができる。
【００２７】
ＵＣまたは癌の治療は、単回投与で、または時間をかけて実施する一連の投与として実施できる。用量および治療レジメンは、治療を実施する医師が疾患の重症度、患者の状態、および他の因子を考慮に入れて決定できる。
【００２８】
キット
本明細書に記載される診断用途に使用されるものとして、キットも本発明の範囲内に含まれる。このようなキットは、それぞれがこの方法に使用する別個の要素のうちの１つを含む１つまたは複数の容器、例えばバイアル、チューブなどが入るよう区切られた運搬容器、包装または容器を含み得る。キットの抗体、プローブ、プライマー、および他の試薬は、凍結形態、凍結乾燥形態、またはＴＢＳもしくはＰＢＳなどの薬学的に許容される緩衝液中を含む任意の適切な形態で提供され得る。キットはまた、試薬をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用するのに必要な他の試薬、例えば緩衝液（すなわち、ＴＢＳ、ＰＢＳ）、ブロッキング剤（脱脂粉乳、正常血清、Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤、ＢＳＡ、またはカゼインを含む溶液）、および／または検出試薬（すなわち、ヤギ抗マウスＩｇＧビオチン、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート、アロフィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ペルオキシダーゼ、蛍光物質（すなわち、ＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）、ならびに／あるいは染色キット（すなわち、Ｐｉｅｒｃｅ社のＡＢＣ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ））を含み得る。ヌクレオチドプローブは検出用に標識されていてよい。キットはまた、他の試薬および／または上記のよく用いられるアッセイ、例えばフローサイトメトリー解析、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（すなわち、ウエスタンブロット）、ｉｎ  ｓｉｔｕ検出、免疫細胞化学、免疫組織化学などで抗体および他の試薬を使用するための説明書を含み得る。
【００２９】
一実施形態では、キットは、精製形態で試薬を提供する。別の実施形態では、試薬は、単独でまたはアビジンコンジュゲート検出試薬（すなわち、抗体）とともにビオチン化形態で提供される免疫試薬である。別の実施形態では、キットは、抗原を直接検出するのに使用し得る蛍光標識免疫試薬を含む。上記のいずれかのシステムを用いるのに必要な緩衝液などは当該技術分野で周知であり、末端使用者が調製し得るか、キットの構成要素として提供され得る。キットはまた、陽性対照および陰性対照のタンパク質および／または組織試料を含む固体担体を含み得る。例えば、スポット型またはウエスタンブロット型のアッセイを実施するためのキットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用する対照細胞または対照組織溶解物もしくは実験試料用の追加スペースを有し予め固定化した対照試料を含むナイロンまたは他の膜を含み得る。
【００３０】
本発明のキットは通常、上記の容器および、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明が記された添付文書を含む、商業的観点および使用者の観点からみて望ましい材料を含む１つまたは複数の他の容器を含む。さらに、容器にラベルを張り付けて、組成物が特定の用途に使用されることを示すことができ、上記のような使用の指示を示すこともできる。指示および／または他の情報が挿入物に含まれてもよく、これはキットに含まれる。
【００３１】
本発明の代表的な用途
本明細書に記載される材料および方法を用いることによって、ＮＦＫＢ活性を調節する新規な標的および化合物を特定できる。具体的には、本発明では、ヒト大腸細胞でＮＦＫＢ活性を調節している新規なマイクロＲＮＡ標的および阻害剤を特定する。ＮＦＫＢ経路は、多数の様々な種類の癌ならびに自己免疫疾患および炎症性疾患で活性化されることが見出されており、これらの阻害剤を用いてＮＦＫＢリン酸化を抑制することにより、上記の疾患を治療できる。
【００３２】
ｍｉＲ−２１４は、潰瘍性大腸炎患者に特異的な診断バイオマーカーである。数件の研究でＩＢＤのバイオマーカーが特定されているが、そのほとんどはＵＣに対する特異性は高くはなく、クローン病および他のＧＩ疾患のバイオマーカーでもある。特定されたバイオマーカーはほとんどが一般的な炎症性バイオマーカーである。本明細書に記載される所見は、患者の３つの異なるコホートの解析から導かれたｍｉＲ−２１４バイオマーカーの特異性を裏付ける。ｍｉＲ−２１４レベルの検査は、臨床医がＵＣの患者を診断し、しかるべき治療法を選択する一助となり得る。このことは、利用可能な臨床検査でＵＣとクローン病をはじめとする消化器疾患とを区別できない場合に特に有用である。
【００３３】
ｍｉＲ−２１４は、ＵＣ疾患活動性の予後予測バイオマーカーである。活動性のＵＣ患者では、寛解期の患者よりもｍｉＲ−２１４レベルが高い。ｍｉＲ−２１４レベルの評価を用いて、症状の不在下であっても疾患状態をモニタリングし、治療的介入が必要かどうかを評価できる。ｍｉＲ−２１４は、ＵＣに対する特異性が高くＵＣ疾患活動性と相関し、潰瘍性大腸炎患者に大腸癌が発現するリスクの予測にも用いることができる。
【００３４】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるヒトＦＦＰＥ組織中のマイクロＲＮＡレベルの評価。患者試料からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片での免疫組織化学（ＩＨＣ）によってタンパク質レベルを検査することも可能であるが、同じ組織でマイクロＲＮＡレベルを評価するプロトコルを開発するのが好ましい。本発明は、至適化したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロトコルを提供し、その効果および特異性を改善する。このプロトコルは、のちの実施例に記載する。
【００３５】
ｍｉＲ−２１４レベルは、大腸癌を発現するリスクの高いＵＣ患者を特定するバイオマーカーを提供する。ＵＣ患者に用いることができるものは皆無であることから、このことは大きな利点である。大腸内視鏡検査法で大腸組織が正常に見える場合でも、ｍｉＲ−２１４レベルの評価を用いて分子の初期の発癌性の変化を明らかにし、臨床医が外科手術によってこの領域を除去するのに適した時期を決定するのを助け得る。大腸炎に罹患して１０年を超える患者では大腸癌のリスクが増大しており、唯一の解決法は外科手術である。ｍｉｒ−２１４は、ＵＣ病歴のある大腸癌患者に対して１００％の特異性を示し孤発性大腸癌の患者に対して０％の特異性を示す最初のバイオマーカーである。大腸炎関連結腸直腸癌（ＣＡＣ）患者ではｍｉＲ−２１４が約３０倍増大し、これは、予後検査でＰＣＲによって容易かつ特異的に確認できる差である。
【００３６】
ｍｉＲ−２１４（配列番号１）に対する阻害剤の開発。本発明では、ｍｉＲ−２１４発現を効率的に標的とするのに適した配列を特定する。
【００３７】
ｍｉＲ−２１４阻害剤がｅｘ  ｖｉｖｏ（ＵＣ患者由来の新鮮な大腸外植片）で大腸炎を抑制する効果。これは、マイクロＲＮＡの標的化がｅｘ  ｖｉｖｏで治療をもたらす可能性を初めて明らかにしたものである。
【００３８】
潰瘍性大腸炎患者に対する新規な治療法としてのｍｉＲ−２１４の標的化。実験的大腸炎のマウスモデルでは、注腸によるｍｉＲ−２１４の阻害が大腸炎を軽減する。治療プロトコルは図１４に詳述する。
【００３９】
疾患に関連するマイクロＲＮＡ下流の標的を特定するための戦略。本発明では、バイオインフォマティクス、発現および３’ＵＴＲ解析を組み合わせることによってｍｉＲ−２１４標的を特定する。
【００４０】
ｍｉＲ−２１４によって調節される遺伝子サインの特定（表３を参照されたい）。本発明では、ｍｉＲ−２１４の直接下流の標的を特定する。これらの遺伝子は、ｍｉＲ−２１４阻害の特異性および効果を評価するためのマーカーを提供する。
【００４１】
ＵＣ患者では、ＰＴＥＮおよびＰＤＬＩＭ２のレベルがバイオマーカーとなる（図２ｃを参照されたい）。ＵＣ患者でのＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルが健常対照に比して減少していることを確認することは、ＵＣを検出およびモニタリングする方法を提供する。
【００４２】
ｍｉＲ−２１４は大腸癌の新規な発癌遺伝子である。のちの実施例では、ｍｉＲ−２１４過剰発現の発癌特性を検証する広範囲にわたる解析を記載する。
【００４３】
ｍｉＲ−２１４は、大腸炎の病歴のある患者における大腸癌進行のバイオマーカーを提供する（図３ｊ）。大腸癌が進行期（ステージＩＩＩ、ＩＶ）にある患者では、初期段階（Ｉ、ＩＩ）の患者に比してｍｉＲ−２１４の発現レベルが増大していた。したがって、本発明は、大腸癌をステージ分類する方法を提供し、ここでは、ｍｉＲ−２１４の１０〜２０倍の増大を検出することがステージＩ〜ＩＩの大腸癌を表し、ｍｉＲ−２１４の４０倍超の増大を検出することがステージＩＩＩ〜ＩＶの大腸癌を表す。
【００４４】
本発明は、動物モデルによって示すように、大腸癌に対して注腸によってマイクロＲＮＡを投与する方法を提供する（図４ａを参照されたい）。マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む核酸の静脈内注射による送達は、複数の副作用を生じ、特異性および効果を増大させる担体（例えば、ナノ粒子）が必要である。本発明では、ＵＣおよび大腸癌を含むＧＩ疾患を有する患者に対し、マイクロＲＮＡの大腸内（注腸）送達が極めて効率的であることを明らかにする。この方法は、様々な副作用（例えば、免疫応答）を引き起こす可能性のあるマイクロＲＮＡの粒子担体が必要ないため、副作用が最小限に抑えられる。
【００４５】
ｍｉＲ−２１４阻害は、潰瘍性大腸炎の病歴のある大腸癌患者に対する治療戦略を提供する。ｍｉＲ−２１４阻害は大腸癌の成長をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制する。具体的なプロトコルの説明は図１９に示す。
【００４６】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明し、当業者が本発明を製造し使用する際の一助となるよう提供するものである。これらの実施例は、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【００４７】
実施例１：潰瘍性大腸炎および大腸炎関連癌におけるｍｉＲ−２１４回路の治療的標的化
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病（ＣＤ）とからなる炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、炎症性応答の活性化を特徴とし、罹患が長期間にわたる患者では結腸直腸癌が発現するリスクが高い。このため、ＵＣおよびＵＣ関連異形成に対する治療的可能性のある新規な分子標的を特定することは極めて重要である。潰瘍性大腸炎ではマイクロＲＮＡは調節解除されているが、その機構的役割および治療上の価値については未だ推測の域を出ていない。本実施例では、ヒトマイクロＲＮＡｏｍｅのハイスループットな機能的抑制因子スクリーニングを用いて、ｍｉＲ−２１４が核因子カッパベータ（ＮＦ−κＢ）の主要な調節因子であることを明らかにした。ｍｉＲ−２１４は、活動性で長期間にわたるＵＣの患者の大腸組織で特異的に増幅され、大腸炎関連結腸直腸癌（ＣＡＣ）では過剰発現する。バイオインフォマティクスおよび全ゲノムプロファイリングによる解析を統合することにより、ｍｉＲ−２１４は、フィードバックループ回路を介して、ＰＤＺおよびＬＩＭドメイン２（ＰＤＬＩＭ２）ならびにホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）遺伝子を抑制することによって増幅されることが明らかになった。ＵＣ患者からの大腸生検では化学的阻害剤がｅｘ  ｖｉｖｏでこの回路を障害し、マウスでは大腸内投与がＵＣおよびＣＡＣを治療的に抑制した。以上を考え合わせると、ｍｉＲ−２１４は疾患活動性および結腸直腸癌への進行と相関し、その阻害は、ＵＣ患者にもＣＡＣ患者にも新規な治療選択肢を提供する。
【００４８】
ＵＣ発症は、ＮＦ−κＢシグナル伝達を含む炎症性経路の活性化を特徴とする。ヒト大腸細胞でのＮＦ−κＢ活性を調節するマイクロＲＮＡを特定するため、ＩＬ６処理ＮＣＭ−４６０細胞中でヒトマイクロＲＮＡｏｍｅを標的にすることによりマイクロＲＮＡの機能的スクリーニングを実施した（図１ａ）。一次スクリーニングでは、２種類のマイクロＲＮＡ阻害剤（ｍｉＲ−２６ｂおよびｍｉＲ−１９９ａ）がＮＦ−κＢリン酸化を５０％超（Ｐ＜０．０５）誘導し、７種類の阻害剤（ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２１４）がＮＦ−κＢリン酸化を５０％超（Ｐ＜０．０５）抑制した（図１ｂ）。ｍｉＲ−２１４阻害剤が最も効果の高い抑制因子（＞９０％）であることが明らかになった。３つの異なるコホートのＵＣ（ｎ＝１２０）および対照（ｎ＝１０７）からの大腸組織でのｍｉＲ−２１４レベルを検討したところ（表１および２）、ＵＣではｍｉＲ−２１４レベルの有意な増大が認められたが、それ以外のＧＩ疾患である過敏性腸症候群（ＩＢＳ）（ｎ＝２２）およびＣＤ（ｎ＝６０）では有意な増大は認められなかった（図１ｃ）。ヒト大腸組織でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、上皮細胞がｍｉＲ−２１４過剰発現の起源であることが明らかになった（図１ｄ）。臨床的重要性を評価するため、ｍｉＲ−２１４発現と臨床病理学的パラメータとの相関を検討した。活動性のＵＣ患者での方が寛解期の患者よりもｍｉＲ−２１４レベルが有意に高かった（図１ｅ）が、ＵＣ患者の性別およびＣＤ患者での性別／疾患位置に関しては差がみられなかった（図５）。以上の結果から、ＭＩＲ２１４は、上皮に発現しＮＦ−κＢ活性を調節する遺伝子であり、ＵＣでは疾患活動性と相関して特異的に調節解除されることがわかる。
【００４９】
ｍｉＲ−２１４とＵＣ発症との間の関係を明らかにするため、ＮＦ−κＢ活性化を媒介している可能性のある下流遺伝子標的を特定することを目的とした。本発明者らの戦略は、５つの段階で構成された（図２ａ）。４つの異なるマイクロＲＮＡ標的予測ソフトウェアを用い、共通のｍｉＲ−２１４遺伝子標的を２８０種類特定した。ｍｉＲ−２１４処理大腸細胞を用いたｑＰＣＲにより、その発現を解析した。検証済みの７１（表３）の遺伝子（発現５０％未満、Ｐ＜０．０１）を、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路とのそれらの相関およびｍｉＲ−２１４との直接的相互作用について、二次大腸上皮細胞系で３’ＵＴＲルシフェラーゼアッセイを用いて検討した。この包括的解析から、核ユビキチンＥ３リガーゼ阻害因子であるＰＤＬＩＭ２（１５）、およびＮＦ−κＢ活性化を阻害することが既に明らかにされている（１７、１８）ＡＫＴシグナル伝達経路の抑制因子であるＰＴＥＮ（１６）が、ｍｉＲ−２１４によって調節される最も上位の遺伝子であることが明らかになった。ｍｉＲ−２１４の過剰発現は、３’ＵＴＲルシフェラーゼ活性を阻害し、ＰＴＥＮおよびＰＤＬＩＭ２のｍＲＮＡレベル（図６）およびタンパク質レベル（図２Ｂ）が抑制された。以上の所見をヒトでの関連に反映させると、ＵＣ大腸組織ではＰＴＥＮおよびＰＤＬＩＭ２のｍＲＮＡレベルが対照に比して減少しており（図２Ｃ）、したがって、ｍｉＲ−２１４発現と逆相関した。興味深いのは、ｍｉＲ−２１４の過剰発現がＮＦ−κＢ（ｓ５３６）リン酸化（図２Ｄ）を誘導し、その結果ＩＬ６の発現（図７）が誘導されたことであり、このことは、ＰＴＥＮおよびＰＤＬＩＭ２が、ＮＦ−κＢ炎症性応答の調節に関与するｍｉＲ−２１４の直接下流エフェクターであることを示唆している。
【００５０】
【表１】
2017534281.tif 000003
【００５１】
【表２】
2017534281.tif 000004
【００５２】
【表３】
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2017534281.tif 000006
2017534281.tif 000007
【００５３】
本発明者らは、ｍｉＲ−２１４がＮＦ−κＢを活性化しＩＬ６誘導性ＮＦ−κＢリン酸化を媒介することを考慮して、炎症性シグナルがｍｉＲ−２１４発現を調節するかどうかを検討した。ＱＰＣＲ解析から、ＩＬ６が用量依存性にｍｉＲ−２１４発現を誘導することがわかった（図８Ａ）。Ｌｅｖｅｒ／ＰｈｙｌＣＲＭアルゴリズム解析はＭＩＲ２１４遺伝子のプロモーターにＳＴＡＴ３結合部位が存在することを示し（図８Ｂ）、クロマチン免疫沈降解析は、ＩＬ６で処理するとＭＩＲ２１４プロモーター上のＳＴＡＴ３の富化が増大することを明らかにした（図２Ｅ）。同様に、ＩＬ６は用量依存性にＭＩＲ２１４プロモーター活性を誘導し、その効果はＳＴＡＴ３結合部位の変異によって打ち消された（図２Ｆ）。ホスホ−ＳＴＡＴ３レベルとｍｉＲ−２１４レベルとの相関関係（ｒ＝０．９７）によって、この相互作用の臨床的重要性が裏付けられた（図９）。ＮＣＭ３５６大腸細胞中で炎症性メディエーターとしてのｍｉＲ−２１４の役割を検討した。ＩＬ６は用量依存性にＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮの発現を抑制し、その効果はｍｉＲ−２１４の阻害によって逆転した（図１０、１１）。Ａｋｔリン酸化も一致して、ＩＬ６で処理すると増大し、ｍｉＲ−２１４阻害によって減少した（図１２）。以上の所見は、ＩＬ６がＳＴＡＴ３を介した転写活性化によってｍｉＲ−２１４を誘導し、正のフィードバックループ回路を生じさせることを示唆する（図２Ｇ）。
【００５４】
フィードバックループ回路の調節を介するＵＣでのｍｉＲ−２１４阻害の治療的可能性を評価するため、ｖｉｔｒｏでヒト大腸細胞中のｍｉＲ−２１４を極めて効率的に抑制する化学的に安定な阻害剤を用いた（図１３）。本発明者らは、活動性のＵＣ患者から新たに単離した大腸生検標本に対する化学的ｍｉＲ−２１４阻害剤のｅｘ  ｖｉｖｏでの効果を検討した。同阻害剤は、大腸外植片中のｍｉＲ−２１４を効率的に抑制し（図２Ｈ）、ＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮの両方の発現を増大させることによって炎症性応答を抑制した（図２Ｉ）。さらに、ｍｉＲ−２１４阻害剤は、実験的大腸炎の動物モデルにおいて疾患活動性を低下させた（図２Ｊおよび図１４）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏのデータを考え合わせると、活動性のＵＣ患者におけるｍｉＲ−２１４阻害の治療的可能性が示唆される。
【００５５】
ＵＣと結腸直腸癌との間の相関は１９２５１９に既に報告されているが、未だその分子生物学は検討されていない。本発明者らは、ＵＣから癌への移行中にｍｉＲ−２１４が担う役割を疑問視した。興味深いことに、ＤＳＳによって誘導される急性炎症ではなく慢性炎症を有するマウスでｍｉＲ−２１４がアップレギュレートされることがわかった（図３Ａ）。同様に、長期間に（１０年超）わたるＵＣの患者からの大腸組織では、１０年未満の患者と比較してｍｉＲ−２１４の増大が認められ（図３Ｂ）、ｍｉＲ−２１４がＵＣと結腸直腸癌発現との間の架け橋となっていることが示唆された。本発明者らは、ｑＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ＣＡＣ大腸癌患者と孤発性大腸癌（ＣＲＣ）患者からの腫瘍でのｍｉＲ−２１４レベルを比較した。この解析では、ＣＡＣではｍｉＲ−２１４の過剰発現が認められたが、ＣＲＣと対照との間に差は認められなかった（図３Ｃ、３Ｄ）。以上の所見をまとめると、ｍｉＲ−２１４は、ＵＣ発症時に増大し、結腸直腸癌に進行する過程で増幅されることが示唆される。
【００５６】
結腸直腸の発癌におけるｍｉＲ−２１４の重要性を検討するため、機能獲得試験および機能喪失試験を実施した。ｍｉＲ−２１４の過剰発現はヒト大腸癌細胞のコロニー形成能および侵襲性を誘導し、その発癌における役割を示唆した（図３Ｅ、３Ｆおよび図１５）。それに対して、ｍｉＲ−２１４の抑制はＩＬ６誘導性の腫瘍原性および侵襲性の表現型を阻害し、ＩＬ６の腫瘍原性効果がｍｉＲ−２１４に依存することを示唆した。次に、ｍｉＲ−２１４がフィードバックループ回路の調節を介して作用するかどうかを検討した。ＩＬ６は、大腸癌細胞中のｍｉＲ−２１４を用量依存性にアップレギュレートし（図３Ｇ）、それはＭＩＲ２１４プロモーター領域でのＳＴＡＴ３の結合を介した（図１６）。ＩＬ６誘導性のｍｉＲ−２１４発現はＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮの抑制（図１７）、Ａｋｔリン酸化（図３Ｈ）およびＮＦ−κＢ活性化（図１８）をもたらし、発癌過程でｍｉＲ−２１４フィードバックループ回路が過剰に活性化されることを示唆した。そのヒトでの関連を裏付けて、ＣＡＣ患者からの腫瘍では、対照に比してＰＤＬＩＭ２およびＰＴＥＮのレベルが減少した（図３Ｉ）。本発明者らは、ｍｉＲ−２１４が癌細胞の侵襲性を増大させることを考慮し、ｍｉＲ−２１４と大腸癌進行との相関を検討した。ヒト腫瘍の検討により、ＣＡＣ疾患が進行する過程でｍｉＲ−２１４が特異的にアップレギュレートされることが明らかになり（図３Ｊ）、ＵＣおよびＣＡＣにおけるｍｉＲ−２１４回路の特異性を示すさらなる証拠が得られた。本発明者らのデータによれば、ｍｉＲ−２１４の正のフィードバックループ回路が慢性炎症と大腸発癌との間の架け橋である。したがって、ｍｉＲ−２１４の標的化がＣＡＣの発現を抑制するのに十分であると考えられる。本発明者らは、ＡＯＭ−ＤＳＳマウスモデルにｍｉＲ−２１４の化学的阻害剤またはマイクロＲＮＡ陰性対照の大腸内投与からなる治療プロトコルを週１回、４サイクル適用した（図４Ａおよび図１９）。ｍｉＲ−２１４阻害剤は腫瘍の数（図４Ｂ）およびサイズ（図４Ｃ）を有意に減少した。機構的には、ｍｉＲ−２１４阻害剤は、アポトーシス誘導およびカスパーゼ−３の活性化を介して腫瘍成長を抑制した（図４Ｄ）。さらに、免疫組織化学解析はｍｉＲ−２１４阻害が、ｍｉＲ−２１４分子回路の抑制を示唆する、ＮＦ−κＢおよびＡｋｔリン酸化のレベルの低下を引き起こし（図４Ｅ）、かつ大腸癌細胞の増殖速度を低下させる（図４Ｅ）ことを明らかにした。
【００５７】
ｍｉＲ−２１４発現はＵＣの疾患活動性および疾患持続期間と相関があり、ＵＣの診断から８〜１０年後に大腸内視鏡検査による監視の実施を推奨する現行のガイドライン（２０）の分子的根拠を提供する。現在用いられている監視方法（２１）および新たな撮像技術（２２〜２４）が後期の発癌事象を確認するのであるならば、ｍｉＲ−２１４は、悪性形質転換のリスクのあるＵＣ患者を特定するバイオマーカーとしての役割を果たし得ると考えられる。さらに、ＵＣでもＣＤでも炎症性経路が活性化されることがわかっているが、ｍｉＲ−２１４はＵＣに特異的であるということも極めて重要である。マイクロＲＮＡ模倣物の静脈内投与が肝癌に対して効果があることが明らかにされており（８）、マイクロＲＮＡ阻害剤は第２相〜第３相臨床試験の段階にある（２５）。本実施例では、マイクロＲＮＡ治療薬のための新規で効率的な送達方法を示す。化学修飾したｍｉＲ−２１４阻害剤を大腸内投与するとＵＣおよびＣＡＣが抑制され、このような方法が大腸炎およびＵＣ関連異形成の患者に適用可能であることが示唆される。結論として、本発明者らは、ｍｉＲ−２１４のＵＣ特異的調節解除ならびにその疾患活動性および疾患持続期間との相関を示し、かつ大腸発癌の発生に関与するｍｉＲ−２１４駆動性の炎症性フィードバックループ回路を特定する。組織ｍｉＲ−２１４は、現在用いられている監視戦略に大きな変化をもたらす可能性があり、ｍｉＲ−２１４の抑制は、大腸炎および大腸炎関連大腸癌に対する治療的可能性を秘めているものと考えられる。
【００５８】
方法
この試験は、各研究施設の施設内審査委員によって承認されたものである。ＵＣＬＡで組織試料を採取した全患者が書面でのインフォームドコンセントを提出している。患者試料は、ライデン大学メディカルセンター（Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）にて、ＬＵＭＣ医療倫理委員会の指示およびガイドラインに従い、ヘルシンキ宣言に則り、採取したものである。
【００５９】
マイクロＲＮＡライブラリーのスクリーニング
既に記載されている通りに１２、９６ウェルプレートにＮＣＭ４６０不死化上皮細胞を播き、３４８種類のマイクロＲＮＡ阻害剤と２種類の陰性対照マイクロＲＮＡ（１００ｎＭ）からなるマイクロＲＮＡ阻害剤ライブラリー（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に、細胞をＩＬ６で２４時間処理し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲｅｌＡ／ＮＦＫＢ  ｐ６５（Ｓ５３６）Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  ＥＬＩＳＡ（ＫＣＢ７２２６、Ｒ＆Ｄ社）によりＮＦＫＢのリン酸化を評価した。ＮＦＫＢのリン酸化を５０％超阻害したマイクロＲＮＡ阻害剤を陽性ヒットとした。
【００６０】
バイオインフォマティクス解析
ＬｅｖｅｒアルゴリズムおよびＰｈｙｌＣＲＭアルゴリズムを用いて、マイクロＲＮＡの５ｋｂ上流および２ｋｂ下流の領域にＳＴＡＴ３結合モチーフを確認した。
【００６１】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるｍｉＲ−２１４検出用のＤｏｕｂｌｅ−ＤＩＧ標識ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎプローブ（３８４９４−１５、Ｅｘｉｑｏｎ社）を、修正を施して既に記載されている通りに８用いた。対照、潰瘍性大腸炎、および結腸直腸癌の切片をキシレンで脱パラフィンし（５分間、３回）、次いで、段階希釈のエタノールで処理し（１００％で３回、９６％で２回、７０％で３回）、ＤＥＰＣ−ＰＢＳを２回交換した。次いで、組織をプロテイナーゼＫ（１５ｍｇ／ｍｌ）で３０分間、３７℃で消化し、ＤＥＰＣ−ＰＢＳで３回洗浄した。切片を７０％、９６％、および１００％のエタノールで２回脱水し、空気乾燥させ、マイクロＲＮＡ  ＩＳＨ緩衝液で希釈したｈｓａ−ｍｉＲ−２１４（４０ｎＭ）（９００００、Ｅｘｉｑｏｎ社）と１時間、６０℃でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を５×ＳＳＣで２回、１×ＳＳＣで２回、０．２×ＳＳＣで３回、それぞれ６０℃で５分間洗浄し、ＰＢＳで洗浄した。スライドをブロッキング溶液（１１５８５７６２００１、Ｒｏｃｈｅ社）で１５分間、次いで２％ヒツジ血清中の抗ＤＩＧ抗体（１：８００）（０１３−０００−１２１、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）ブロッキング溶液で１時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した後、暗所にてスライドをＡＰ基質緩衝液（０．２ｍＭレバミソール［３１７４２、Ｆｌｕｋａ社］１０ｍｌ中のＮＢＴ−ＢＣＩＰタブレット［１１６９７４７１００１、Ｒｏｃｈｅ社］）で２時間、３０℃でインキュベートした。ＡＰ停止液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ）で２回洗浄し、水で２回洗浄して反応を停止させた。組織をＮｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄで１分間対比染色し、水で洗浄した。最後に、切片を７０％、９６％、および１００％のエタノールで２回脱水し、カバーガラスでＥｕｋｉｔｔ封入剤（３６１８９４Ｇ、ＶＷＲ社）中に封入した。Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔ  ＤＳ−Ｆｉ１カラーカメラを備えたＮｉｋｏｎ  ８０ｉ  Ｕｐｒｉｇｈｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像取得ソフトウェアを用いて画像を捕捉した。画像はいずれも、同じ設定を用いて捕捉および処理した。
【００６２】
免疫組織化学
ホスホ−ＮＦＫＢ、ホスホ−ＡｋｔおよびＫｉ６７の組織免疫染色には、化学的ｍｉＲ−２１４阻害剤または陰性対照で処理したＡＯＭ−ＤＳＳマウスからの大腸組織のＦＦＰＥ切片をキシレン（３×５分間）で脱パラフィンした後、段階希釈のエタノールで処理し（１００％、１００％、９５％および９５％でそれぞれ１０分間）、ｄｄＨ２Ｏを２回交換した。スライドを１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中で１０分間煮沸（９５〜９９℃）することにより、抗原のアンマスキングを実施した。切片をｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、３％Ｈ２Ｏ２に２０分間浸漬し、ｄｄＨ２Ｏで２回およびＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄し、ブロッキング溶液（ＴＢＳ−Ｔ中の５％正常ヤギ血清［５４２５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社］）で１時間ブロックした。ホスホ−Ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）（ＳＡＢ４３００００９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（４０６０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）およびＫｉ６７（１２２０２，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）抗体をＳｉｇｎａｌ  Ｓｔａｉｎ抗体希釈液（８１１２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）でそれぞれ１：２００、１：５０および１：４００に希釈し、切片と４℃で一晩インキュベートした。抗体とインキュベートした後、切片をＴＢＳ−Ｔで３回、それぞれ５分間洗浄し、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ  Ｂｏｏｓｔ（［ＨＲＰ、ウサギ］８１１４または［ＨＲＰ、マウス］８１２５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と室温で１時間インキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔで３回、それぞれ５分間洗浄し、ＤＡＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で３０分間染色し、洗浄し、ヘマトキシリンＱＳ（Ｈ−３４０４、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で対比染色した。最後に、組織を脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ封入剤中に封入した。ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像取得ソフトウェアを用いる、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔ  ＤＳ−Ｆｉ１カラーカメラを備えた顕微鏡。画像はいずれも、同じ設定を用いて捕捉および処理した。
【００６３】
定量的リアルタイムＰＣＲ解析
リアルタイムＰＣＲを実施して、ヒトの大腸癌および大腸組織中のｍｉＲ−２１４の発現レベルを決定した。Ｔｒｉｚｏｌ（１５５９６−０２６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを単離した。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃＤＮＡ合成キット（２０３３００）を用いて逆転写を実施した。ＣＦＸ３８４  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ社）でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（２０３４５０）およびｍｉＲ−２１４（２０４５１０、Ｅｘｉｑｏｎ社）のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを三重反復で実施した。ＭＩＲ２１４発現レベルをＵ６  ｓｎＲＮＡ（２０３９０７、Ｅｘｉｑｏｎ社）のレベルに対して正規化した。
【００６４】
リアルタイムＰＣＲを用いて、ＰＴＥＮおよびＰＤＬＩＭ２の発現レベルを決定した。Ｒｅｔｒｏｓｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔ（ＡＭ１７１０、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写を実施した。ＩＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎスーパーミックス（１７０−８８８２、ＢｉｏＲａｄ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。内部対照としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびΒ−ＡＣＴＩＮを用いた。用いたプライマーの配列は以下の通りである：
ＰＴＥＮ−Ｆ：５’−ｃｃｃａｇａｃａｔｇａｃａｇｃｃａｔｃ−３’（配列番号５）
ＰＴＥＮ−Ｒ：５’−ｔｃｔｇｃａｇｇａａａｔｃｃｃａｔａｇｃ−３’（配列番号６）
ＰＤＬＩＭ２−Ｆ：５’−ａｔｇｇｃｃａｃｇａｔｔａｔｇｔｃｔｃｃ−３’（配列番号７）
ＰＤＬＩＭ２−Ｒ：５’−ｇｃｃｃａｔｃａｔｇｇｔｇａｃｔａａｇｇ−３’（配列番号８）
Β−ＡＣＴＩＮ−Ｆ：５’−ｃｃｃａｇｃａｃａａｔｇａａｇａｔｃａａ−３’（配列番号９）
Β−ＡＣＴＩＮ−Ｒ：５’−ａｃａｔｃｔｇｃｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｃ−３’（配列番号１０）
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：５’−ａｔｇｔｔｃｇｔｃａｔｇｇｇｔｇｔｇａａ−３’（配列番号１１）
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：５’−ｇｇｔｇｃｔａａｇｃａｇｔｔｇｇｔｇｇｔ−３’（配列番号１２）
【００６５】
動物試験
マウス試験は、カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認され、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従った。大腸炎関連大腸癌（ＣＡＣ）のマウスモデルで、ｍｉＲ−２１４阻害の治療的可能性を検討した。第１日に１２．５ｍｇ／ｋｇアゾキシメタン（ＡＯＭ）を投与した後、第８日、２９日および５０日での３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の反復経口投与によってＣＡＣを誘導する。本発明者らの治療プロトコルに従って、ＡＯＭ−ＤＳＳ処理したマウスにｍｉＲ−ＮＣ阻害剤またはｍｉＲ−２１４化学的阻害剤（１２ｍｇ／ｋｇ）の大腸内投与を週１回、４サイクル（第６４日、７０日、７７日、８４日）実施した。第９１日に、マウスを屠殺し、腫瘍量を評価した。ｍｉＲ−２１４阻害剤はｍｉＲ−２１４配列５’−ＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１）を標的とした。
【００６６】
ＢｉｏＰｌｅｘ  ＥＬＩＳＡアッセイ
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、対照大腸組織および潰瘍性大腸炎患者および大腸炎関連癌患者からの試料におけるＳＴＡＴ３タンパク質のチロシン７０５のリン酸化状態、ＡＯＭ−ＤＳＳ処理マウス由来の大腸腫瘍における切断カスパーゼ−３のレベル、Ａｋｔタンパク質のセリン４７３のリン酸化状態、ＮＦＫＢタンパク質のセリン５３６のリン酸化状態および大腸細胞系でのＩＬ６分泌を評価した。ＢｉｏＰｌｅｘ  ＦｌｅｘＭａｐ３Ｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）分析器でＢｉｏＰｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを用いてデータを解析した。
【００６７】
ルシフェラーゼアッセイ
ＭＩＲ２１４のプロモーターを含むホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を大腸上皮細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼベクターをトランスフェクトした後、細胞をＩＬ６で２４時間処理した。２４時間後に、細胞抽出物を調製し、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州、米国）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。３’ＵＴＲアッセイには、ＰＴＥＮまたはＰＤＬＩＭ２の３’ＵＴＲを保有するレポーターベクターを細胞にトランスフェクトした。２４時間後に、細胞にｍｉＲ−２１４（またはｍｉＲスクランブル）をトランスフェクトし、４８時間後に、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６８】
浸潤アッセイ
ｍｉＲ−２１４もしくはアンチｍｉＲ−２１４またはそれぞれの対照をトランスフェクトしてから２４時間後に、大腸上皮細胞系で浸潤アッセイを実施した。ＢＤＢｉｏＣｏａｔ増殖因子減少マトリゲル浸潤チャンバ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）を標準化条件で用いることにより、マトリゲルでの浸潤を実施した。アッセイは、化学誘引物質として２％ＦＢＳを用い、製造業者のプロトコルの通りに実施した。播種から１６時間後に、浸潤せずに膜の上側にあった細胞を除去し、浸潤した細胞を固定して４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で染色した。いずれのアッセイでも、１インサート当たり１０個の視野をスコア化し、標準誤差を算出した。
【００６９】
コロニー形成アッセイ
大腸上皮細胞にｍｉＲ−２１４もしくはアンチｍｉＲ−２１４またはそれぞれの対照をトランスフェクトした。次いで、各細胞系の細胞１０５個の三つ組み試料を、増殖培地中の２．０％アガロースと４：１（ｖ／ｖ）で混合し、アガロースの最終濃度を０．４％にした。増殖培地中の０．８％アガロースの凝固層の上に細胞混合物を播いた。１２日後にコロニー数をカウントした。
【００７０】
クロマチン免疫沈降
クロマチン免疫沈降を既に記載されている通り８に実施した。簡潔に述べれば、未処理大腸上皮細胞およびＩＬ６処理大腸上皮細胞に由来するクロマチンフラグメントをＳＴＡＴ３に対する抗体６μｕｇで免疫沈降させた。ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてＤＮＡ抽出を実施した。以下のプライマー：順方向：５’−ＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＴＴ−３’（配列番号１３）および逆方向：５’−ＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＴＣＴＣＡ−３’（配列番号１４）（産物サイズ：９４ｂｐ）を用いて、ｍｉＲ−２１４プロモーター中のＳＴＡＴ３結合部位のリアルタイムＰＣＲ解析を実施した。
【００７１】
統計解析
特に明記されない限り、いずれの実験も三重反復で実施した。Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（バージョン８．６）およびＳＡＳ統計パッケージ（バージョン９．４）を用いて統計解析を実施した。スチューデントｔ検定を用いて、対照大腸組織と様々な腸病態から得た検体との間で、活動性ＵＣ検体と不活動性ＵＣ検体との間でおよび疾患継続期間に基づいて分類したＵＣ検体間について、ｍｉＲ−２１４発現の統計学的差を検討した。年齢の比較にクラスカル・ウォリス検定および多重検定用に有意レベルのボンフェローニ補正を加えた事後２標本ウィルコクソン検定を用い、雌雄間の比較にカイ二乗検定を用い、腫瘍ステージ間の比較にフィッシャー直接検定を用いた。スピアマンとパールソンの相関解析により相関有意性を決定した。処理の異なる細胞群およびマウス群の間の比較にはスチューデントｔ検定を用いた。Ｐ値が０．０５以下であれば統計的有意性があることを示すとみなした。
【００７２】
参考文献
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１４．Ｈａｔｚｉａｐｏｓｔｏｌｏｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ＴＥＭ  ２４，３６１−３７３（２０１３）．１５．Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８，５８４−５９１（２００７）．
１６．Ｐｏｌｙｔａｒｃｈｏｕ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１，４７２０−４７３１（２０１１）．
１７．Ｒｏｍａｓｈｋｏｖａ，Ｊ．Ａ．＆  Ｍａｋａｒｏｖ，Ｓ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，８６−９０（１９９９）．
１８．Ｄａｎ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２２，１４９０−１５００（２００８）．
１９．Ｃｒｏｈｎ，Ｕ．Ｂ．＆  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  １７０，２２０−２２８（１９２５）．
２０．Ｆａｒｒａｙｅ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３８，７４６−７７４，７７４  ｅ７４１−７４４；ｑｕｉｚ  ｅ７１２−７４３（２０１０）．
２１．Ｈｕｒｌｓｔｏｎｅ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ  ３７，１１８６−１１９２（２００５）．
２２．Ｋｉｅｓｓｌｉｃｈ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２４，８８０−８８８（２００３）．
２３．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ  ３９，２１６−２２１（２００７）．
２４．Ｈｕｒｌｓｔｏｎｅ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  ５７，１９６−２０４（２００８）．
２５．Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｈ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６８，１６８５−１６９４（２０１３）．
【００７３】
実施例２：１８ｍｇ／ｋｇで投与したｍｉＲ−２１４阻害剤がマウスで潰瘍性大腸炎を抑制する効果
上の実施例１に記載した通り、１２ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ−２１４阻害剤の大腸内投与が慢性ＤＳＳマウスモデルで潰瘍性大腸炎を抑制する効果を評価した（図２ｉ）。図１４Ａ〜１４Ｂは、慢性ＤＳＳマウスモデルに適用した治療プロトコルを示す。ｍｉＲ−２１４阻害の治療的可能性を探るため、慢性大腸炎のマウスモデルを用いた。このモデルでは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の反復経口投与によって大腸炎を誘発する。（図１４Ａ）第８日からＤＳＳ処理マウスにｍｉＲ−２１４阻害剤または陰性対照を（２日毎に）４サイクル大腸内投与した。（図１４Ｂ）各マウス群（未処理、ｍｉＲ−２１４阻害剤またはｍｉＲ−ＮＣ阻害剤）の疾患活動性スコアの評価に用いた基準。この実験デザインから、１２ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ−２１４阻害剤が潰瘍性大腸炎の疾患活動性を５０％減少することがわかった（図２ｉ）。
【００７４】
本発明者らは、同じ治療プロトコルを用い、ｍｉＲ−２１４阻害剤の用量を１８ｍｇ／ｋｇに増大させて、慢性ＤＳＳマウスモデルにおけるその治療的可能性を評価した。以下に示すように、１８ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ−２１４阻害剤の大腸内投与は、潰瘍性大腸炎の疾患活動性を８０％減少し、マウスでの大腸炎を抑えるこの濃度の効果が示唆された。その結果を図２０に示す。
【００７５】
実施例３：１８ｍｇ／ｋｇでマウスに投与したｍｉＲ−２１４阻害剤の特異性
ｍｉＲ−２１４発現レベルを抑えるｍｉＲ−阻害剤の特異性を評価するため、ｍｉＲ−２１４発現レベルを評価し、ｍｉＲ−２１４阻害剤（大腸内投与）がｍｉＲ−２１４発現レベルを９５％超抑えることを見出した。これらの所見の特異性を検討するため、他のマイクロ（ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１）の発現レベルを検討した。ｍｉＲ−２１４阻害剤は、上記の無作為に選択したマイクロＲＮＡの発現レベルに影響を及ぼさず、ｍｉＲ−２１４のみを標的とする特異性を有することがわかった。以上の結果を図２１に示す。
【００７６】
実施例４：マウスにおけるｍｉＲ−２１４阻害剤の毒性作用の評価
ｍｉＲ−２１４阻害剤の大腸内投与がマウスにおける肝機能および腎機能に何らかの毒性作用を有するかどうかを検討した。具体的には、マウス（マウス３匹／グループ）を１８ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ−２１４で処理し、治療から４８時間後に、肝酵素ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを尿素レベルとともに測定した。図２２Ａ〜２２Ｃのグラフに示すように、未処理マウス（対照）、ｍｉＲ−ＮＣ阻害剤処理マウスおよびｍｉＲ−２１４阻害剤処理マウスの間でＡＬＴ、ＡＳＴおよび尿素のレベルの統計的有意差はみられなかった。
【００７７】
本願全体を通じて様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、本発明と関係のある最新技術についてより十全に記載するため、その全体が参照により本願に組み込まれるものである。
【００７８】
上記のことから、説明を目的に本発明の具体的な実施形態が本明細書に記載されているが、本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく様々な修正を施し得ることが理解されよう。したがって、本発明は、添付の「特許請求の範囲」によってのみ限定される。
【図１】
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【図２−１】
2017534281.tif 000009
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月15日(2017.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017534281000001.app
【国際調査報告】
2017534281.tif 000033
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2017534281.tif 000036
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