(57)【要約】  本明細書において、試料溶液中の標的ポリヌクレオチドと、マイクロアレイのプローブ等の、表面に結合されたプローブとの間の、ハイブリダイゼーションを解析するための方法が提供される。前記方法は、前記試料溶液を、少なくとも２つのプローブセットと接触させることを含み、前記少なくとも２つのプローブセットは、各プローブセット内のプローブは固定長のハイブリダイゼーション配列を有し、異なるプローブセットのプローブは異なる長さのハイブリダイゼーション配列を有することを特徴とする。異なるプローブセットについて得られたデータ間の比較は、ハイブリダイゼーション法のダイナミックレンジを増加させることを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中の標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの存在を判定するための方法であって、
（ｉ）  前記試料溶液を、第一プローブセット、第二プローブセットおよび所望により一つまたは複数のさらなるプローブセットと接触させること、ここで、
前記第一プローブセットは前記標的配列長と一致する均一な長さのコア配列をそれぞれ含む第一の複数の異なるプローブを含み、前記コア配列は前記標的配列に対する異なる相補性によって特徴づけられ；
前記第二プローブセットは、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドで一方または両方の末端においてそれぞれ同一に伸長された、第二の複数の異なるプローブを含み；
並びに、前記第一、第二および所望により一つまたは複数のさらなるプローブセットについての前記試料溶液のハイブリダイゼーション強度を得ること；
（ｉｉ）  前記第一プローブセットおよび前記第二プローブセットの前記プローブについて検出されたハイブリダイゼーション強度の組合せに基づいて前記標的ポリヌクレオチドの存在を判定すること、を含み、前記プローブセットのうちの一つまたは複数についてのハイブリダイゼーション強度は、前記プローブセットの対応するプローブ間のハイブリダイゼーション強度の差異を補正するために尺度変更される、
前記方法。
【請求項２】
段階（ｉ）が、前記試料溶液を、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドで一方または両方の末端においてそれぞれ同一に伸長された、一つまたは複数のさらなる複数の異なるプローブを含む少なくとも一つまたは複数のさらなるプローブセットと接触させることをさらに含み、前記固定数のヌクレオチドの少なくとも１つが、前記複数のプローブセットの他のあらゆるプローブセットの前記固定ヌクレオチドと異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一、第二または一つまたは複数のさらなるプローブセットの前記プローブのそれぞれがマイクロアレイの別々のスポットに与えられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｉｉ）が、
（ｉｉ）（ａ）  ハイブリダイゼーション強度が使用された装置のダイナミックレンジ内である、前記第一プローブセットのプローブ、前記第二プローブセットのプローブおよび前記一つまたは複数のさらなるプローブセットのプローブを特定すること；
（ｉｉ）（ｂ）  前記プローブセットのうちの一つまたは複数についてのハイブリダイゼーション強度を尺度変更して、前記プローブセットの対応するプローブ間のハイブリダイゼーション強度の差異を補正し、それにより、尺度変更されたデータセットの組合せを得ること；並びに
（ｉｉ）（ｃ）  前記尺度変更されたデータセットの組合せに基づいて前記標的ポリヌクレオチドの存在を判定すること、
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｉｉ）が、前記第一、第二、および所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットの前記プローブのハイブリダイゼーション強度を、
前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度；および／または
前記標的ポリヌクレオチドと前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブとの
間のハイブリダイゼーションにおいてのハイブリダイゼーション自由エネルギー
の関数として解析することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブセットのそれぞれについて、ハイブリダイゼーション強度の対数が、前記ハイブリダイゼーション自由エネルギーおよび／または前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度の対数の関数における線形領域に従う、プローブを特定すること；並びに
前記線形領域のそれぞれに含まれるプローブのデータを組み合わせること、
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
単一プローブセット内のプローブの個々のハイブリダイゼーション強度に同一の尺度変更因数を乗じることにより、前記プローブセットのうちの一つまたは複数についてのハイブリダイゼーション強度が尺度変更さる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｉ）が、前記試料溶液を、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドで一方または両方の末端においてそれぞれ同一に伸長された、複数の異なるプローブを含む少なくとも第三プローブセットと接触させることをさらに含み、ここで、前記固定数のヌクレオチドの少なくとも１つは前記第二プローブセットにおける前記固定数のヌクレオチドと異なり；
段階（ｉｉ）が、前記第一プローブセット、前記第二プローブセット、および前記第三プローブセットの前記プローブについて検出されたハイブリダイゼーション強度に基づいて前記標的ポリヌクレオチドの存在を判定することを含む、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとは前記標的配列の一つまたは複数のヌクレオチドにおいて異なる、試料溶液中の変異ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であり、
（ｉ）  前記試料溶液を、前記第一、第二および所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットのプローブと接触させ、前記プローブのそれぞれについてのハイブリダイゼーション強度を得ること；
（ｉｉ）  所望により、前記標的ポリヌクレオチドを含み、前記変異ポリヌクレオチドを本質的に含まない参照溶液を、前記第一、第二および所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットの前記プローブと接触させ、前記プローブのそれぞれについてのハイブリダイゼーション強度を得ること；
並びに、
（ｉｉｉ）  前記試料について得られた、前記第一、第二、および所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットの前記プローブの前記ハイブリダイゼーション強度を、
前記標的ポリヌクレオチドと前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブとの間のハイブリダイゼーションにおいてのハイブリダイゼーション自由エネルギー；または
前記参照試料について得られた、前記第一、第二、および所望による 一つもしくは
複数のさらなるプローブセットの前記プローブのハイブリダイゼーション強度
と比較すること、
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一プローブセットのプローブの前記コア配列がそれぞれ、前記標的配列に対する２つ以下のミスマッチを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一、第二、および所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットがそれぞれ、前記標的配列に対する完全一致プローブを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項１２】
前記第二プローブセットのそれぞれのプローブが、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列を含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドで両末端においてそれぞれ同一に伸長されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一、第二、および所望による一つまたは複数のプローブセットのそれぞれが少なくとも１００の異なるプローブを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一プローブセットの前記プローブの前記コア配列が１５〜２５ヌクレオチドの固定長を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第一プローブセット、第二プローブセットおよび所望により一つまたは複数のさらなるプローブセットを形成するプローブをそれぞれ含む複数のマイクロアレイスポットを含むマイクロアレイであって、
前記第一プローブセットが、標的ポリヌクレオチド内の標的配列に対応する均一な長さのコア配列をそれぞれ含む第一の複数の異なるプローブを含み、前記コア配列は前記標的配列に対する異なる相補性によって特徴づけられ；
前記第二プローブセットが、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドでそれぞれ同一に伸長された、第二の複数の異なるプローブを含み；
前記所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットが、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドでそれぞれ同一に伸長された、一つまたは複数のさらなる複数の異なるプローブを含み；前記所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットにおけるこれらの固定ヌクレオチドの少なくとも１つが、第二プローブセットの前記固定ヌクレオチドと異なり、且つ他のあらゆるプローブセットの前記固定ヌクレオチドと異なり；
前記第一、第二および所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットのそれぞれが少なくとも１００の異なるプローブを含む、
前記マイクロアレイ。
【請求項１６】
コンピュータデバイス上で実行された際に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の、試料溶液中の標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの存在を判定するための方法を実行するための、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションに基づいて標的ポリヌクレオチドを検出するための方法、並びに関連するキットおよびコンピュータプログラムに関する。本発明は、ハイブリダイゼーションに基づく方法のダイナミックレンジの増加を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
一塩基多様性（ＳＮＶ）および体細胞変異等のＤＮＡ配列多様性の正確な検出は、様々な研究領域において多大な関心を受けている。例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）は、単一のヌクレオチド差異を特徴とする同種のメンバー間のＤＮＡ配列多様性であり、前記種の個体間のゲノム多様性の大部分を占める。ＳＮＰは機能的に特に重要であり、それらの検出は、ゲノムワイド関連研究、個別化分子診断学および法鑑定を含む多数の研究領域および応用領域にとって重要である。
【０００３】
ＳＮＰ等の配列多様性を検出するための手法は、主に、ハイブリダイゼーションに基づく手法、またはＰＣＲおよび配列決定等の酵素に基づく手法のいずれかに分類することができる。ハイブリダイゼーションに基づく手法の使用は、それらに特有の単純さから、魅力的である。これらの手法は、典型的には、完全一致するＤＮＡ標的には高効率でハイブリダイズするが、一塩基多様性を含有する標的に対しては低い効率を有する、核酸プローブを準備することを含む。ＷＯ２０１１／０３５８０１には、ハイブリダイゼーション自由エネルギーの関数としての様々なプローブについてのハイブリダイゼーション強度の解析を含む、ハイブリダイゼーションを解析するための方法が記載されている。
【０００４】
しかし、最適な特異性を得るためのプローブ設計および実験条件を見つけることが、課題となる場合がある。ある特定のプローブに対する標的のハイブリダイゼーションの程度は、典型的には、蛍光マーカー等のマーカーの強度によって測定され、そのため、「ハイブリダイゼーション強度」と呼ばれる場合がある。いかなる系で測定されるハイブリダイゼーション強度も、標的の濃度およびプローブ−標的親和性に依存し、プローブ−標的親和性はハイブリダイゼーション自由エネルギーΔＧによって決定される。強度スペクトルの低い方の端では、シグナル強度は検出限界Ｉ０を下回る可能性があり（標的にハイブリダイズするプローブが不十分）、高い方の端では、強度は飽和している場合がある（実質的に全てのプローブがハイブリダイズしている）。飽和強度と検出限界との間の比（の対数）は「ダイナミックレンジ」として知られている。
【０００５】
Suzuki et al.(BMC Genomics, 2007, 8:373)では、様々なプローブ長（１４〜２５塩基長）および全ての可能な単一ヌクレオチドミスマッチを有する特注設計のアレイに基づいて、単一ヌクレオチドミスマッチを検出するのに最適なプローブ長が研究され、これには、人工的な２５塩基長のオリゴＤＮＡを標的として用いたハイブリダイゼーションが記述されている。前記著者らにより各プローブ長における平均強度がプロットされ、プローブが長くなるほど、シグナル強度の飽和リスクの増加をもたらすことが観察された。フォローアップ研究において、Ono et al. (Bioinformatics, 2008, 24: 1278-1285)は、人工的な標的配列に完全に相補的な、様々な長さの完全一致プローブを用いた特注のマイクロアレイを使用する、測定のダイナミックレンジを向上させるための、ハイブリダイゼーションの拡張型熱力学的モデルを導入した。
【０００６】
ＵＳ２００８０１３１８９２には、プローブが例えば異なるプローブ長を有し、プローブ混合物の合計ハイブリダイゼーション強度が測定される、２つ以上のプローブを含むプローブ試薬を用いてダイナミックレンジを拡張する方法が開示されている。
【０００７】
１つの実験において、試料の様々な潜在的ハイブリダイゼーション強度を信頼性をもって測定するには、可能な限り高いダイナミックレンジを得ることが重要であり、従って、試料濃度およびハイブリダイゼーション条件の変動に対する感受性が低い、より信頼性の高い検出法を有することが重要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、ダイナミックレンジの増加を与える、ヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づく検出法を提供することである。プローブのハイブリダイゼーション配列の長さが異なる、２つ以上のプローブセットの使用によってこれを達成できることを、本発明者らは発見した。より具体的には、前記方法は、標的配列に対し異なる相補性を有する固定長のハイブリダイゼーション配列を有するプローブを含むプローブセットを利用し、異なるプローブセット中のハイブリダイゼーション配列は、一つまたは複数のヌクレオチドによって伸長されている。より具体的には、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの検出は、前記標的ポリヌクレオチド配列に基づいて設計された２つ以上のプローブセットを用いて提供され、それぞれのプローブセットは、前記標的配列（の一部）に対応する均一な長さのコア配列をそれぞれ含む複数の異なるプローブを含み、前記プローブの前記コア配列は前記標的配列に対する異なる相補性によって特徴づけられ、前記第二および所望によりさらなるプローブセットは、プローブセット中のそれぞれのプローブが、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドで一方または両方の末端において同一に伸長されていることを特徴とする（それにより、前記固定数は前記第二およびさらなるプローブセットのそれぞれの間で異なる）。典型的には、前記方法は、標的配列を含むと考えられる試料を２つ以上のプローブセットと接触させ、異なるプローブセットについてのハイブリダイゼーション強度を検出することを含む。
【０００９】
具体的には、試料溶液中の標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの存在を判定するための方法が提供され、前記方法は、（ｉ）  前記試料溶液を、第一プローブセットおよび第二プローブセットおよび所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットと接触させることを含み、第一プローブセットは前記標的配列と一致する均一な長さのコア配列をそれぞれ含む第一の複数の異なるプローブを含み、前記コア配列は前記標的配列に対する異なる相補性によって特徴づけられ；第二プローブセットは、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドで一方または両方の末端においてそれぞれ同一に伸長された、第二の複数の異なるプローブを含み；前記方法はさらに、前記第一、第二および所望による一つまたは複数のさらなるプローブセットについての前記試料溶液のハイブリダイゼーション強度を得ることを含み、並びに、（ｉｉ）  前記第一プローブセットおよび前記第二プローブセットの前記プローブについて検出されたハイブリダイゼーション強度の組合せに基づいて前記標的ポリヌクレオチドの存在を判定することを含み、前記プローブセットのうちの一つまたは複数についてのハイブリダイゼーション強度が、前記プローブセットの対応するプローブ間のハイブリダイゼーション強度の差異を補正するために尺度変更されて、前記ハイブリダイゼーション強度の組合せが得られる。
【００１０】
本方法の特定の実施形態では、検出段階は、（ａ）ハイブリダイゼーション強度が使用された装置のダイナミックレンジ内である、第一プローブセットのプローブおよび第二プローブセットのプローブを特定すること；（ｂ）前記プローブセットのうちの一つまたは複数のプローブのそれぞれについてのハイブリダイゼーション強度を尺度変更して、前記プローブセットの対応するプローブ間のハイブリダイゼーション強度の差異を補正し、それにより、尺度変更されたデータセットを得ること；並びに、（ｃ）前記尺度変更された
データセットに基づいて前記標的ポリヌクレオチドの存在を判定すること、を含む。特定の実施形態では、前記第一プローブセットは参照プローブセットであり、前記方法は、前記第二および所望によるさらなるプローブセットと、前記第一プローブセットの、対応するプローブ間のハイブリダイゼーション強度の差異を尺度変更することを包含する。
【００１１】
本方法のある実施形態では、段階（ｉｉ）は、前記第一、第二、および所望によるさらなるプローブセットの前記プローブのハイブリダイゼーション強度を、前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度；および／または、前記標的ポリヌクレオチドと前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブとの間のハイブリダイゼーションにおいてのハイブリダイゼーション自由エネルギーの関数として、解析することを含む。
【００１２】
ある実施形態では、本方法は、前記プローブセットのそれぞれについて、ハイブリダイゼーション強度の対数が、前記ハイブリダイゼーション自由エネルギーおよび／または前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度の対数の関数における線形領域に従う、プローブを特定すること；並びに、前記線形領域のそれぞれに含まれるプローブのデータを組み合わせることをさらに含む。
【００１３】
本方法の特定の実施形態では、前記プローブセットのうちの一つまたは複数についてのハイブリダイゼーション強度は、単一プローブセット内のプローブの個々のハイブリダイゼーション強度に同一の尺度変更因数を乗じることにより、尺度変更さる。
【００１４】
本方法のある実施形態では、段階（ｉ）は、前記試料溶液を、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドで一方または両方の末端においてそれぞれ同一に伸長された、複数の異なるプローブを含む少なくとも第三プローブセットと接触させることをさらに含み、前記固定数のヌクレオチドの少なくとも１つは前記第二プローブセットにおける前記固定数のヌクレオチドと異なり；段階（ｉｉ）は、前記第一プローブセット、前記第二プローブセット、および前記第三プローブセットの前記プローブについて検出されたハイブリダイゼーション強度に基づいて前記標的ポリヌクレオチドの存在を判定することを含む。
【００１５】
ある実施形態では、本方法は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとは前記標的配列の一つまたは複数のヌクレオチドにおいて異なる、試料溶液中の変異ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であり；前記方法は、前記試料溶液を、前記第一および第二のプローブセットのプローブと、並びに所望により第三またはさらなるプローブセットのプローブと接触させ、前記プローブのそれぞれについての第一ハイブリダイゼーション強度を得ること；所望により、前記標的ポリヌクレオチドを含み、前記変異ポリヌクレオチドを本質的に含まない参照溶液を、前記第一および第二のプローブセットのプローブと、並びに所望により第三またはさらなるプローブセットのプローブと接触させ、前記プローブのそれぞれについてのハイブリダイゼーション強度を得ること；並びに、前記試料について得られた、前記第一、第二、および所望による第三もしくはさらなるプローブセットの前記プローブの前記ハイブリダイゼーション強度を、前記標的ポリヌクレオチドと前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブとの間のハイブリダイゼーションにおいてのハイブリダイゼーション自由エネルギーと；または、前記参照試料について得られた、前記第一、第二、および所望による第三もしくはさらなるプローブセットの前記プローブのハイブリダイゼーション強度と、比較すること、を含む。
【００１６】
本方法の特定の実施形態では、前記第一プローブセットのプローブの前記コア配列はそれぞれ、前記標的配列に対する２つ以下のミスマッチを含む。
【００１７】
本方法のある実施形態では、前記第一、第二、および所望によるさらなるプローブセットはそれぞれ、前記標的配列に対する完全一致プローブを含む。本方法特定の実施形態では、前記第二プローブセットのそれぞれのプローブは、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列を含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドで両末端においてそれぞれ同一に伸長されている。
【００１８】
本方法のある実施形態では、前記第一、第二および第三またはさらなるプローブセットのそれぞれは、少なくとも１００のプローブを含む。
【００１９】
本方法の特定の実施形態では、プローブセットのプローブのコア配列は、１５〜２５ヌクレオチドの固定長を有する。
【００２０】
本方法ある実施形態では、前記第一、第二、および第三またはさらなるプローブセットの前記プローブのそれぞれは、マイクロアレイの離れたスポットに与えられる。より具体的には、マイクロアレイはスポットにつき１種類のみのプローブを含む。
【００２１】
さらに、本明細書において、第一プローブセット、第二プローブセットおよび所望により第三またはさらなるプローブセットを形成するプローブをそれぞれ含む複数のマイクロアレイスポットを含むマイクロアレイが提供され、前記第一プローブセットは、標的ポリヌクレオチド内の標的配列に対応する均一な長さのコア配列をそれぞれ含む複数の異なるプローブを含み、前記コア配列は前記標的配列に対する異なる相補性によって特徴づけられ；前記第二プローブセットは、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドでそれぞれ同一に伸長された、複数の異なるプローブを含み；前記所望による第三プローブセットは、前記第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な固定数の一つまたは複数のヌクレオチドでそれぞれ同一に伸長された、複数の異なるプローブを含み；第三プローブセットの一つまたは複数のヌクレオチドの固定数（および／または位置）は、第二プローブセットにおける固定数の一つまたは複数のヌクレオチドと異なる。
【００２２】
さらに、コンピュータデバイス上で実行された際に、本明細書に記載の、ハイブリダイゼーションを解析するための方法および／または試料溶液中の標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの存在を判定するための方法を実行するためのコンピュータプログラム製品が、本明細書において提供される。
【００２３】
増加したダイナミックレンジを提供することにより、本方法は、ハイブリダイゼーション解析実験のダイナミックレンジを増加させることができ、従って、ハイブリダイゼーションを解析するための従来法と比較して、より厳密さの低い条件下での試料の解析を可能にし得る。実際には、あらゆるハイブリダイゼーション解析実験において、温度、試料濃度および緩衝液組成のような所与の一連の実験パラメータ、プローブ−標的間相互作用のアフィニティウィンドウ（affinity window）は、常に制限されており、高度な並列化が
目的とされる場合は特に、実験設計に強い境界条件が課せられ得る。逆もまた同じで、所与の設計において、実験条件の変化は、測定値を検出範囲から容易に逸脱させ得る。従って、検出範囲（ダイナミックレンジ）を増加させることにより、より広いパラメータ範囲を用いて実験を行うことができる。例えば、本方法は、標的ポリヌクレオチドが広い濃度範囲を有する試料の解析に使用され得る。
【００２４】
本方法はさらに、特定の標的ポリヌクレオチドを解析するためのハイブリダイゼーション実験に使用できる、広範囲のハイブリダイゼーション配列長の使用を可能にし得る。本明細書に記載される概念の上記および他の特徴、特色および利点は、本発明の原理を一例として説明する、以下の発明を実施するための形態から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本明細書に記載される方法および機器の特定の実施形態の図面の以下の説明は、事実上単なる例示に過ぎず、本教義、それらの適用または用途の限定を意図していない。図面の全体を通じて、一致した符号は類似または一致した部分および特色を示す。
【図１】ハイブリダイゼーション実験に使用したプローブ設計の図示。プローブは固体表面（６）に結合しており、プローブによって異なる可変の中心領域すなわちコア配列（ｓｅｑα）を有する。それぞれのプローブは、３つの長さ表示物（length representation）Ｌ２１（１）、Ｌ２３（２）、およびＬ２５（３）を有する。これらの表示物は、全てのプローブにおいて同一の境界ヌクレオチドの数のみにおいて互いに異なる。プローブは標識（５）を備え得る標的ポリヌクレオチド（４）にハイブリダイズすることができる。
【図２】親和性ΔＧ、ΔＧ−、およびΔＧ＋を有する配列からの強度シグナルがそれぞれＩ、Ｉ−、およびＩ＋で表される、３つ全てのプローブセットについての式１に従うラングミュア理論式のプロット。
【図３】強度シグナルＩ−およびＩ＋をＩに向けて距離Δ−およびΔ＋だけシフトさせた後の、図２のラングミュアの理論式のプロット。線形領域が広げられ、これは、特定の配列についての様々な長さのプローブからの強度シグナルの組合せが、測定のダイナミックレンジの増加を可能にすることを示している。
【図４】Ｉ−〜Ｉ、およびＩ＋〜Ｉの線形データ間の垂直距離の可視化を与える、Ｉに対するＩ−、Ｉ、およびＩ＋のプロット。これらの垂直距離は、Δ−およびΔ＋の推定を与える。
【図５】強度Ｉ−およびＩ＋がＩに向けて距離Δ−およびΔ＋だけシフトされている、Ｉに対するＩ−、Ｉ、およびＩ＋のプロット。これは、曲線における捻れの推定位置（点ａ、ｂ、ｃ、およびｄ）の可視化を与える。
【図６】本発明の方法を検査するための、マイクロアレイハイブリダイゼーション実験から得られたデータのプロット。強度シグナルＩ−、Ｉ、およびＩ＋がＩに対してプロットされる。最大強度は１０５未満であり、一方、最小強度は１００よりわずかに高いのみである。この図から、距離Δ−およびΔ＋を推定することができる。
【図７】シグナルＩ−およびＩ＋をＩに向けてそれぞれ距離Δ−およびΔ＋だけシフトさせた、図６と同じデータのプロット。
【図８】推定ΔΔＧに対する全ての強度のプロット。
【図９】不要なデータを除去した後の、図８のプロットと同一のプロット。線形領域を特徴とするダイナミックレンジが増加している。
【図１０Ａ】図１０Ａ、Ｂ、Ｃ：それぞれ２１、２３、および２５ヌクレオチドの長さを有するプローブを使用した、野生型のみを含む溶液についての対応するプローブについての強度データ（Ｘ軸）に対する、野生型および変異型を含む溶液についての強度データ（Ｙ軸）のプロット。
【図１０Ｂ】図１０Ａ、Ｂ、Ｃ：それぞれ２１、２３、および２５ヌクレオチドの長さを有するプローブを使用した、野生型のみを含む溶液についての対応するプローブについての強度データ（Ｘ軸）に対する、野生型および変異型を含む溶液についての強度データ（Ｙ軸）のプロット。
【図１０Ｃ】図１０Ａ、Ｂ、Ｃ：それぞれ２１、２３、および２５ヌクレオチドの長さを有するプローブを使用した、野生型のみを含む溶液についての対応するプローブについての強度データ（Ｘ軸）に対する、野生型および変異型を含む溶液についての強度データ（Ｙ軸）のプロット。
【図１１】本方法の特定の実施形態による、異なる長さのプローブの強度データが組み合わされた、図１０の強度データのプロット。
【図１２】本発明の方法の特定の実施形態の略図。図１２．Ａは、標的配列（白い囲み）および標的配列に隣接している標的ポリヌクレオチドの２つのヌクレオチド（○）を示す、標的ポリヌクレオチドを示している。図１２．Ｂは、３つのプローブセット（１）、（２）および（３）のハイブリダイゼーション配列を示しており、それぞれのセットは複数のプローブ配列を含み；プローブセット（１）は、標的配列と同じ長さであり、標的配列に対する異なる相補性を有する、ハイブリダイゼーション配列（灰色の囲み）を有するプローブを含み、すなわち、少なくとも１つのプローブハイブリダイゼーション配列が標的配列と完全一致しており、一方、プローブセット内の他のプローブハイブリダイゼーション配列は１つまたは２つのミスマッチ（矢印で表される）を有する。プローブセット（２）および（３）は、それぞれ複数のプローブから成り、個々のプローブは、標的配列に隣接する標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド（○）に相補的な、同一の１つ［プローブセット（２）］または２つ［プローブセット（３）］のヌクレオチド（●）で伸長された、プローブセット（１）のプローブのハイブリダイゼーション配列（灰色の囲み）から成るハイブリダイゼーション配列（灰色の囲み）を有する。図１２．Ｃは、ΔΔＧに対する、またはプローブセット（２）とのハイブリダイゼーションについてのハイブリダイゼーション強度に対する、試料溶液中の一つまたは複数のポリヌクレオチドの、異なるプローブセットのプローブとのハイブリダイゼーションについてのハイブリダイゼーション強度の線形領域のプロットを示している。図１２．Ｄは、（１）および（３）のプロットをシフト［すなわち、（１）および（３）を尺度変更］し、それをプロット（２）と組合せた後、ダイナミックレンジの増加を伴って、組み合わされたデータセットが得られることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
理解の指針として機能し得るが、本明細書および特許請求の範囲で使用されるいかなる引用符号も、その範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって特に明示されない限り、単数の指示対象および複数の指示対象の両方が含まれる。
【００２８】
本明細書で使用される用語「〜を含む（comprising）」、「〜を含む（comprises）」
および「〜から構成される（comprised of）」は、「〜を包含する（including）」、「
を包含する（includes）」または「〜を含有する（containing）」、「〜を含有する（contains）」と同義であり、包括的または開放型であり、追加の非記載の部材、要素または方法段階を排除しない。  用語「〜を含む（comprising）」、「〜を含む（comprises）
」および「〜から構成される（comprised of）」は、記載された成分、要素または方法段階を言及している場合、前記の記載された成分、要素または方法段階「から成る（consist of）」実施形態も包含する。
【００２９】
さらに、明細書および特許請求の範囲における第一、第二、第三等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、明記されない限りは必ずしも連続したまたは経時的な順番を記述するためのものではない。そのように使用された用語が適切な状況下では可換であること、および、本明細書に記載の実施形態が本明細書に記載または例示された順序とは異なる順序で施行可能であることを理解されたい。
【００３０】
本明細書で使用される値は、パラメータ、含量、持続時間等の測定可能な値に関しての場合、特定の値の、および特定の値からの、＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変動を
、そのような変動が本明細書において企図される技術的効果のうちの一つまたは複数を保証するのに適切である限り、包含することが意図される。本明細書で使用されるそれぞれの値がそれ自体明確に、且つ好ましいものとして、開示されていることを理解されたい。典型的には、用語「約」がこの文脈においては読まれるべきである。
【００３１】
端点による数値範囲の列挙は、それぞれの範囲に含まれる全ての数および端数、並びに記載された端点を包含する。
【００３２】
本明細書において引用された全ての文書は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。
【００３３】
別途定義がない限り、専門用語および科学用語を含む、本明細書に記載の概念の開示において使用される全ての用語は、当業者が一般に理解する通りの意味を有する。さらなる指針により、本明細書において使用される用語の定義が、本開示の教義をより深く理解するために含まれる。本明細書で使用される用語または定義は、単に、本明細書において提供される教義の理解の助けのためにのみ提供される。
【００３４】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドを包含する場合があり、典型的には少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有する、ヌクレオチド単量体から構成される重合体を指す。典型的には、本明細書において言及される標的ポリヌクレオチドおよびプローブ等のポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を包含し得る。
【００３５】
本明細書で使用される用語「平衡」は、熱力学平衡を指し、通常の標的−プローブ間結合の数が経時的に実質的に変化しないような定常状態が得られた状況を表す。用語「非平衡」または「非平衡効果」とは、経時的に変化し得る標的−プローブ間結合状態の発生を指す。
【００３６】
本明細書で使用される用語「自由エネルギー」は、ギブズ自由エネルギー（ΔＧ）または化学ポテンシャルを指す。実施形態において、解析がハイブリダイゼーション自由エネルギーの関数として実行される場合、これは、完全一致ハイブリダイゼーションと、プローブ配列が一つまたは複数の内部ミスマッチを有するハイブリダイゼーションとの間の自由エネルギー差である、ΔΔＧの関数としての解析を含む。
【００３７】
使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸ハイブリダイゼーションを指す。これは、単一ハイブリッドへの、２つ以上の核酸相補鎖間の非共有結合性配列特異的相互作用を確立するプロセスである。相補体に結合し得る核酸鎖は、例えば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであり得る。ヌクレオチドは核酸鎖の基礎成分を形成する。ハイブリダイゼーションは、２つの完全相補鎖の結合を含む（ワトソン・クリック塩基対形成の意味で）が、非完全相補鎖の結合も含む。非完全相補鎖とは、少数の非相補的な要素、例えば、１つ、２つまたはそれより多い非相補的な要素、好ましくは１つまたは２つの非相補的な要素、を有する鎖を指し得る。原則として、非相補的な要素の数には制限は無いが、非相補的な要素が多くなるほど、それらはより容易に検出可能となる。
【００３８】
本明細書の全体にわたる、「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、その実施形態と関連して記載された特定の特色、構造、または特徴が、本明細書において企図される少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書の全体にわたる、様々な場所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を言及しているわけではないが、言及している場合
もある。さらに、本開示から当業者には明らかであろうが、一つまたは複数の実施形態において、特定の特色、構造または特徴があらゆる適切な様式で組み合わせることができる。さらに、当業者には理解されることであろうが、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、いくつかの特色を含み、他の実施形態に含まれる他の特色は含まないが、異なる実施形態の特色の組合せも本明細書においては企図されており、異なる実施形態を形成する。例えば、添付の特許請求の範囲では、特許請求された実施形態のいかなる特色も、あらゆる組合せで使用され得る。
【００３９】
ハイブリダイゼーションを解析するための方法が、本明細書において提供される。より具体的には、本方法は、プローブと標的ポリヌクレオチドおよび／またはその変異型との間のハイブリダイゼーションの解析を可能にし得る。標的ポリヌクレオチドは、特定のヌクレオチドの種類には限定されず、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを含み得る。
【００４０】
本明細書は試料溶液中に最初から存在する鎖と、表面に結合した鎖との間の相互作用に焦点を当てているが、本法がそれに限定されないということを留意されたい。従って、ハイブリダイゼーションは溶液中に共に存在する核酸鎖の間で生じ得る。
【００４１】
試料溶液中に存在する鎖は、典型的には、当該技術分野においては「標的」と称され、一方、標的（またはその変異型）にハイブリダイズするよう与えられる鎖は「プローブ」と称される。従って、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチドおよびその変異型は、「標的」と見なされ得る。プローブは、例えば、試料溶液中に存在し得る標的に相補的な、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ（部分的）の鎖であり得る。特定の実施形態では、標的プローブが表面に結合する。
【００４２】
本明細書で使用される用語「変異ポリヌクレオチド」または「変異型」は、標的ポリヌクレオチドの配列と、一つまたは複数のヌクレオチドにおいて異なる配列を有するポリヌクレオチドを指す。用語「変異型」が、特定の生物、組織または細胞における標的ポリヌクレオチド内の変化の結果である配列に限定されず、自然発生的な（すなわち、進化的な）配列異型も含まれることは、当業者には理解されよう。典型的には、これらの差異または変異は、本明細書において「標的配列」とも称される、標的ポリヌクレオチドのある特定の部分配列内に位置する。繰り返しになるが、本発明のある実施形態では、「標的配列」は参照配列として使用される配列であると理解される。特定の実施形態では、変異ポリヌクレオチドは、標的配列内の一つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的ポリヌクレオチドと異なるのみである。変異ポリヌクレオチドは、限定された数のヌクレオチドにおいて、好ましくは多くて２つのヌクレオチドにおいて、例えば１つのヌクレオチドのみにおいて、標的ポリヌクレオチドと異なることが好ましい。
【００４３】
本明細書に記載の方法は、様々なハイブリダイゼーション配列長を有するプローブを特徴とする２つ以上のプローブセットと、試料溶液との間の、ハイブリダイゼーションの程度を測定することを含む。プローブのハイブリダイゼーション配列は「プローブ配列」とも称される。しかし、プローブが、プローブを固体表面に結合するための尾部配列（後述）および／またはリンカー等の他の部分を含有していてもよいことに留意されたい。
【００４４】
２つ以上のプローブセットのハイブリダイゼーション強度データを組み合わせることにより、ハイブリダイゼーション実験のダイナミックレンジを有意に増加させることができる。より具体的には、第一態様において、本出願は、試料溶液中の標的配列を含む標的ポリヌクレオチド（またはその変異型）と、プローブとの間の、ハイブリダイゼーションを解析するための方法を提供する。本方法は以下を含む：
（ｉ）  試料溶液を、第一プローブセット、第二プローブセットおよび所望により第三またはさらなるプローブセットを含む対応するプローブセットと接触させること、ここで、
異なるプローブセットのプローブはハイブリダイゼーション配列長において互いに異なる；
並びに、
（ｉｉ）  試料溶液中の一つまたは複数のポリヌクレオチドの、第一プローブセット、第二プローブセット、および所望により第三またはさらなるプローブセットのプローブとのハイブリダイゼーションについて、ハイブリダイゼーション強度を入手および解析すること；より具体的には、第一プローブセットおよび第二プローブセットのプローブについて検出されたハイブリダイゼーション強度に基づいて、標的ポリヌクレオチドの存在を判定すること。
【００４５】
従って、本方法は、試料溶液を少なくとも第一および第二プローブセットと接触させることを含む。試料溶液は第三プローブセットを含有していてもよく、またはさらには、さらなるプローブセットを含有していてもよい。本明細書で使用される場合、用語「プローブセット」は、第一および第二のプローブセットのみを指す場合があり；または、実験の全てのプローブセットを指す場合がある。好ましい実施形態では、試料溶液は、異なるプローブセットと同時に接触される。例えば、プローブセットは、単一のマイクロアレイ上に与えられる場合があり、より具体的には、前記第一、第二、第三またはさらなるプローブセットの前記プローブのそれぞれは、マイクロアレイの別々のスポット上に与えられる。しかし、ある実施形態では、試料溶液が異なるプローブセットと同時に接触しないことが企図される。
【００４６】
試料溶液のプローブセットへの接触は、典型的には、標的ポリヌクレオチドの前記プローブへのハイブリダイゼーションに適切な条件下で実行される。これらの条件は、典型的には、標的ポリヌクレオチドと変異ポリヌクレオチドとの間の類似性を考えると、変異型のプローブへのハイブリダイゼーションにも適している。ハイブリダイゼーションを最適化するための関連パラメータにハイブリダイゼーション時間、温度、およびハイブリダイゼーション配列長が含まれることは、当業者が理解するところである。特定の実施形態では、第一プローブセットのプローブのハイブリダイゼーション配列は、１５〜２５ヌクレオチドの固定長を有する。
【００４７】
プローブはそれぞれ「ハイブリダイゼーション配列」を含有することから、プローブは標的ポリヌクレオチドまたは変異型にハイブリダイズすることができる。これは、所望により一つまたは複数のミスマッチを除外して、標的ポリヌクレオチドの標的配列に相補的な、ポリヌクレオチド配列である。１つのプローブセットのプローブは、それらのハイブリダイゼーション配列の全てが同一の長さを有することを特徴とし、すなわち、ハイブリダイゼーション配列内のヌクレオチド数はそれぞれのプローブセット内で均一（固定）である。プローブセットのそれぞれは、プローブの異なるハイブリダイゼーション配列長を特徴とする。
【００４８】
本方法において、第一プローブセットのプローブのハイブリダイゼーション配列は、他のプローブセットのハイブリダイゼーション配列よりも短い。第一プローブセットのプローブのハイブリダイゼーション配列は、本明細書においては「コア配列」とも称される。コア配列は、標的配列と同じ長さ（すなわち同数のヌクレオチド）を有し、標的配列に対する異なる相補性を与えるように選択される。
【００４９】
本方法において、第二プローブセットのプローブのハイブリダイゼーション配列長は、コア配列長よりも少なくとも１つのヌクレオチドだけ長い。同様に、図１２に模式的に示されるように、第三プローブセット（存在する場合）のプローブのハイブリダイゼーション配列長は、コア配列よりも少なくとも１つのヌクレオチドだけ長く、好ましくは、第二プローブセットのプローブのハイブリダイゼーション配列長と比較しても少なくとも１つ
のヌクレオチドだけ長い；等である。
【００５０】
プローブセットはさらに、ある特定のプローブ配列を有する第一プローブセットのそれぞれのプローブについて、他のプローブセットのそれぞれに、同一のコア配列を有するプローブが存在することを特徴とし、このコア配列は、コア配列の一方または両方の末端において一つまたは複数の追加のヌクレオチドでさらに伸長されている。このようなプローブは本明細書において「対応するプローブ」と称される。追加のヌクレオチドはさらに、単一のプローブセット内の全てのプローブにおいて同一であり、標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的である。別の言い方をすれば、様々なプローブセットと標的ヌクレオチドとの間の非相補的成分またはミスマッチ成分は、コア配列においてのみ生じる。これは図１２に模式的に示される。
【００５１】
好ましい実施形態では、プローブセットは、プローブセット（ｎ）のハイブリダイゼーション配列のそれぞれについて、プローブセット（ｎ＋１）（存在する場合）に、（プローブセット（ｎ）の）ハイブリダイゼーション配列が（プローブセット（ｎ）の）ハイブリダイゼーション配列の一方または両方の末端において一つまたは複数の追加ヌクレオチドでさらに伸長されていることを以外は同一のハイブリダイゼーション配列を含有する対応するプローブが存在することを特徴とし、これらの追加ヌクレオチドは、プローブセット（ｎ＋１）内の全てのプローブにおいて同一であり、標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的である。追加ヌクレオチドの数および位置は１つのプローブセット内で固定であるが、第三、第四、第五またはさらなるプローブセット等のさらなるプローブセットが使用される場合、追加ヌクレオチドの数および／または位置は異なるプローブセット間で異なるはずであることは理解されよう。
【００５２】
上記を考慮して、プローブセットは以下を特徴とする：
第一プローブセットは標的配列と一致する均一な長さのコア配列をそれぞれ含む（第一の）複数の異なるプローブを含み、これらのコア配列は標的配列に対する異なる相補性によって特徴づけられる；
第二プローブセットは第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含み、第二プローブセットのそれぞれのプローブにおいて、コア配列は、標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な一つまたは複数の固定ヌクレオチドで同一に伸長されており；
（所望による）第三プローブセットは、第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含む（第三の）複数の異なるプローブを含み、第三プローブセットのそれぞれのプローブにおいて、コア配列は標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な一つまたは複数の固定ヌクレオチドで同一に伸長されており；これらの固定ヌクレオチドの少なくとも１つは、第二プローブセットの前記固定ヌクレオチドと異なっており、すなわち、これらの固定ヌクレオチドの数および／または位置（すなわちハイブリダイゼーション配列のどちらかの末端）は、第二プローブセットの前記固定ヌクレオチドと異なっている。
所望によるプローブセット（ｎ＋１）は、第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一のコア配列をそれぞれ含む第（ｎ＋１）の複数の異なるプローブを含み、プローブセット（ｎ＋１）のそれぞれのプローブにおいて、コア配列は標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な一つまたは複数の固定ヌクレオチドで同一に伸長されており；これらの固定ヌクレオチドの少なくとも１つは、第二または第三プローブセットを含む他のあらゆるプローブセットの前記固定ヌクレオチドと異なっており、すなわち、これらの固定ヌクレオチドの数および／または位置（すなわちハイブリダイゼーション配列のどちらかの末端）は、他のあらゆるプローブセットの前記固定ヌクレオチドと異なっている。
【００５３】
そのようなプローブセットの提供は、プローブセットの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度の比較を可能にし、ハイブリダイゼーション実験のダイナミックレンジを増加させるのに使用することができる（後述）。
【００５４】
従って、第二および（所望による）第三またはさらなるプローブセットのプローブのコア配列は、第一プローブセットの対応するプローブのコア配列と同一であり、第二および（所望による）第三またはさらなるプローブセットのコア配列は、それぞれのプローブセット内で固定の、一つまたは複数のヌクレオチドで伸長されている。この伸長はコア配列の一方または両方の末端において生じ得る。
【００５５】
従って、本明細書で使用される用語「ハイブリダイゼーション配列」は、（第一プローブセットのプローブにおいては）コア配列を指し、または、（第一プローブセット以外のプローブセットのプローブにおいては）一つまたは複数のヌクレオチドで伸長されたコア配列を指す。
【００５６】
特定の実施形態では、プローブセット（ｎ＋１）のそれぞれのプローブのハイブリダイゼーション配列は、プローブセット（ｎ）の対応するプローブのハイブリダイゼーション配列と同一であり、前記標的配列の対応するヌクレオチドに相補的な一つまたは複数の固定ヌクレオチドで両末端において伸長されている場合がある。
【００５７】
さらに、当業者には明らかなことであるが、ハイブリダイゼーション配列の外側のプローブのヌクレオチドは、標的配列の対応するヌクレオチドと一致していないことが好ましい。このようにすることで、標的ポリヌクレオチドに対する対応するプローブの異なる親和性が、ハイブリダイゼーション配列における差異のみから本質的に生じることを、確実にすることができる（後述、式４）。
【００５８】
上記の通り、プローブセットのハイブリダイゼーション配列は、異なる相補性を標的配列に与えるように、より具体的には、標的ポリヌクレオチドとプローブとの間のハイブリダイゼーションにおいての一連のハイブリダイゼーション強度を網羅するように、選択される。これは、標的ポリヌクレオチド（の標的配列）に対し異なる結合親和性を有する異なる（一本鎖）プローブを与えることにより得ることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、ハイブリダイゼーション配列（標的とのハイブリダイゼーションを目的とし、その配列は標的によって決定される）、および、プローブのタグ付け等のための、他の配列にハイブリダイズするのに使用され得る尾部配列、を含有し得る。典型的に、プローブセットは、１つまたは複数の、好ましくは２つ以下（すなわち１つまたは２つ）の、標的配列に対し非相補的なヌクレオチドを有する、コア配列またはハイブリダイゼーション配列を有する複数のミスマッチ（ＭＭ）プローブを含む。
【００５９】
従って、本方法のある実施形態（図１２）では、第一、第二および所望によるさらなるプローブセットはそれぞれ、
標的配列に対する完全一致（ＰＭ）プローブ；および
標的配列に対する種々のミスマッチ（ＭＭ）プローブ；
を含み、前記完全一致プローブおよび前記複数のプローブの前記のそれぞれは、空間的に離れたスポットに与えられることが好ましい。本明細書で使用される用語「完全一致プローブ」は、標的ポリヌクレオチドの標的配列に完全に相補的なハイブリダイゼーション配列を有するプローブを指す。本明細書で使用される用語「ミスマッチプローブ」は、ハイブリダイゼーション配列が標的配列に対する一つまたは複数の非相補的ヌクレオチドを含むことから、標的配列に対し非相補的なハイブリダイゼーション配列を有する、プローブを指す。好ましい実施形態では、ＭＭプローブは多くて２つの非相補的ヌクレオチドを含む。従って、ＭＭプローブは１つまたは２つの非相補的ヌクレオチドを含むことが好まし
い。
【００６０】
第一プローブセットのプローブのハイブリダイゼーション配列および標的配列は、典型的には同じ長さを有し、すなわち、同じ数のヌクレオチドを含有する。結果的に、第二および所望によるさらなるプローブセットのプローブのハイブリダイゼーション配列は標的配列よりも長くなり、ハイブリダイゼーション配列の「追加の」ヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的である。これらの対応するヌクレオチドが標的配列の一方または両方の末端に直接隣接して位置することは、当業者には理解されよう。
【００６１】
本方法は、試料中の変異ポリヌクレオチドの存在を判定するために特に重要である。これらの実施形態では、変異が生じていると予想される標的ポリヌクレオチド内の配列が、標的配列として使用される。ある実施形態では、第一プローブセットのプローブの１つは、変異ポリヌクレオチド内の標的配列に相補的となるように設計され得る。
【００６２】
試料溶液は、典型的には、標的ポリヌクレオチドおよび／または一つもしくは複数のその変異型を含み、当該技術分野において公知の標準方法を用いて調製され得る。
【００６３】
これには、目的の試料からのＤＮＡまたは他のポリヌクレオチドの抽出と、その後の抽出したＤＮＡ内のある特定の断片の増幅が含まれ得る。典型的に、増幅はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて行われる。しかし、これにより二本鎖ＤＮＡが得られるが、本方法には一本鎖ＤＮＡが好ましい。実際に、二本鎖ＤＮＡと核酸プローブとのハイブリダイゼーションは、相補的な非標的鎖とプローブとの間の競合によって妨害される。このような競合は、例えばλエキソヌクレアーゼを用いた相補鎖の分解によって回避することができる。λエキソヌクレアーゼは、５´から３´への方向に働き、二本鎖ＤＮＡからの５´モノヌクレオチドの除去を触媒する、前進型の酵素である。好ましい基質は５´−リン酸化二本鎖ＤＮＡである。従って、ある実施形態では、試料溶液の調製は以下の段階を含み得る：
目的の試料からのＤＮＡの抽出；
その５’末端にリン酸修飾を有するプライマーを用いた、前記ＤＮＡに含有される標的ポリヌクレオチドおよびその変異型の増幅；並びに
λエキソヌクレアーゼを用いた前記プライマーの消化。
【００６４】
本方法に必要とされるプローブの最適な数は、標的配列の長さ並びに試料中に存在し得ると予期される変異型の量および種類等の種々のパラメータに依存し得る。典型的に、第一、第二、および第三のプローブセットは、それぞれ、少なくとも１００の異なるプローブ、好ましくは少なくとも５００、少なくとも１０００、またはさらに多くの異なるプローブを含む。
【００６５】
本明細書において企図される方法では、プローブは固体表面上または溶液中に与えられ得る。好ましい実施形態では、プローブは表面上に与えられる。プローブはあらゆる種類の担体上に与えられ得るが、プローブはマイクロアレイ上に与えられることが好ましい。従って、本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、プローブセットのプローブは、マイクロアレイの離れたスポット上に与えられる。マイクロアレイは、ハイブリダイゼーションプラットフォームとして、固体表面上に固定化された多数のプローブを含有する。プローブは空間的に離れたスポットに与えられ、それぞれのスポットは１種類（且つ、１種類のみ）のプローブを含む。典型的に、それぞれのスポットはほんの数ピコモルの各プローブを含む。典型的なマイクロアレイは数百またはさらには数千のスポットを含む。本方法での使用に適した複数のマイクロアレイプラットフォームが市販されており、限定はされないが、アジレント社によって提供されるプラットフォーム、アフィメトリクス社製の
ＧｅｎｅＣｈｉｐｓプラットフォーム、またはアマシャムバイオサイエンス社製のＣｏｄｅＬｉｎｋ  Ｂｉｏａｒｒａｙプラットフォームが挙げられる。好ましい実施形態では、異なるプローブセットは全て、同一のマイクロアレイ上に与えられる。これにより、種々のプローブセットについてのハイブリダイゼーション強度の比較が容易となる。他の実施形態では、プローブは溶液中に与えられ得る。そのような実施形態では、各プローブは別々の溶液中に与えられ得る。
【００６６】
ハイブリダイゼーションに基づく方法において、ハイブリダイゼーション強度は、ハイブリダイズされたある特定のプローブの割合を表す値である。本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション強度」は、実験中に測定される、所与の個々のプローブの強度を指す。従って、ハイブリダイゼーション強度は、特異的結合からの寄与を含み得る（後述、式１）。
【００６７】
本明細書に記載の方法では、ハイブリダイゼーション強度の検出は、例えば、蛍光マーカーもしくは放射性マーカー、または当該技術分野において公知の他のマーカー等の、形成されたハイブリッドと結合したマーカーを用いて実行され得る。
【００６８】
典型的に、ハイブリダイゼーション実験では、マーカーによって与えられる放射線または蛍光の強度が検出され、形成されたハイブリッドの数を示すものとなる。従って、ある実施形態では、ハイブリダイゼーション強度は、標的ポリヌクレオチドまたはその変異型とプローブとの結合により形成されたハイブリッドに結合された標識の放出によって、誘導され得る。本方法に適した蛍光マーカーとしては、限定はされないが、シアニン色素ファミリーの色素であるＣｙ３およびＣｙ５が挙げられる。
【００６９】
マーカーまたは標識は、ハイブリダイゼーションの前または後に標的または変異ポリヌクレオチドに結合され得る。いくつかの実施形態では、蛍光色素または他のマーカー化合物が、標的またはその変異型に直接結合され得る。他の実施形態では、マーカー化合物は、標的またはその変異型に間接的に、例えば、目的の変異ポリヌクレオチド上および標的ポリヌクレオチド上に存在する尾部配列に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する鎖である「バーコード」を介して、結合される場合があり、これによって、バーコードと標的（またはその変異型）との間のハイブリダイゼーション、およびそれによる蛍光マーカーまたは他のマーカーの標的への間接的な結合が可能となる。より具体的には、鎖は、標的とプローブとの間のハイブリダイゼーションを有意に妨げないように、標的ポリヌクレオチドの標的配列の外側の尾部配列にハイブリダイズする。
【００７０】
しかし、ハイブリダイゼーション強度の検出は、当業者に知られているように、マーカーを用いずに行うこともできる。例えば、プローブ−標的ハイブリダイゼーションは、質量測定、表面プラズモン共鳴測定、インピーダンス測定等に基づいても、検出され得る。従って、本方法は、マーカーを用いたハイブリダイゼーション強度の検出に限定されない。
【００７１】
本方法の解析段階（ｉｉ）において、試料溶液中の一つまたは複数のポリヌクレオチドの、様々なプローブセットのプローブとのハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション強度が解析される。より具体的には、様々なプローブセットの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度の解析によって、ハイブリダイゼーション実験のダイナミックレンジの増加が可能となる。
【００７２】
ダイナミックレンジを増加させるための具体的な方法を、ＤＮＡハイブリダイゼーションの熱力学に基づく理論を用いて説明する。これが、必要な変更を加えて、ＤＮＡ以外のヌクレオチドにも当てはまることは、当業者に理解される。より具体的には、様々なプロ
ーブセットのハイブリダイゼーション強度を組み合わせて、アッセイのダイナミックレンジを増加させることができる方法が、本明細書に詳述される。
【００７３】
マイクロアレイデータ解析において、それぞれのプローブ強度（ハイブリダイゼーション強度）はスポットからのシグナルに関連付けられる。スポットは、プローブセット中のある特定の種類のプローブに対応する多数の同一の配列を含有する、マイクロアレイスライド上の局所的空間である。従って、各スポットは一種類のプローブを表す。スポット内のこれらの同一の配列のそれぞれは、２つの配列間の親和性に基づいて、浮遊する標的配列にハイブリダイズされる。この親和性は配列依存的であり、スポット内にハイブリダイズされるプローブの割合を決定する。
【００７４】
核酸標的が固定化された表面プローブにハイブリダイズする場合、平衡状態はラングミュアの式によって記述することができる（Hooyberghs et al., Nucleic Acids Res. 2009, 37, e53）。マイクロアレイスポット内のハイブリダイズされたプローブの割合が検出
されるスポット強度に比例すると仮定すると、熱力学的平衡にあるＤＮＡ二重らせんについて、等温式は以下のように記載することができ、
Ｉ＝ｍａｘ［Ｉ０，Ａ．（ｃ．ｅ-ΔＧ／ＲＴ）／（１＋ｃ．ｅ-ΔＧ／ＲＴ）］    （１）
式中、Ｉは所与のスポットについての総検出強度であり、Ｉ０は読み取りの検出下限であり、Ａはスポットが標的分子（デバイス依存的な因子である）によって飽和している場合の最大強度であり、ｃは溶液中の標的濃度であり、Ｒは理想気体定数であり、Ｔは実験温度であり、ΔＧは配列依存的に標的−プローブ二本鎖の親和性を決定するハイブリダイゼーション自由エネルギーである。マイクロアレイ実験において温度は固定であるため、スポット強度は、試料標的の濃度および標的−プローブ二本鎖の自由エネルギーに依存したままである。標的濃度が高過ぎる場合、または二本鎖親和性が強過ぎる場合、すなわち、ｃ．ｅ-ΔＧ／ＲＴ≫１である場合、シグナルは飽和限界に達し、従ってＩ≒Ａとなる。
濃度が低すぎる場合、または親和性が弱過ぎる場合、すなわち、Ａ．ｃ．ｅ-ΔＧ／ＲＴ
≪Ｉ０である場合、シグナルはバックグラウンドノイズを上回ることができず、従ってＩ≒Ｉ０となる。これらの限界
Ｉ０≪Ａ．ｃ．ｅ-ΔＧ／ＲＴ≪Ａ    （２）
が、あらゆるハイブリダイゼーションセンサーの「ダイナミックレンジ」を定める。この範囲内で、デバイスはその作動領域（working regime）内にあり、式１は以下によって近似することができる：
Ｉ≒Ａ．ｃ．ｅ-ΔＧ／ＲＴ    （３）
【００７５】
試料溶液中の標的ポリヌクレオチド（および／またはその変異型）の所与の濃度ｃにおいて、式３における唯一の変数は、プローブによって異なる自由エネルギーΔＧである。最も高い親和性（および、結果的に、強度Ｉ）が、標的（存在する場合）と完全一致するＰＭプローブによって得られることは明らかである。従って、自由エネルギー尺度の起点をＰＭプローブにシフトすることができ、すなわち、以下のように定められ：
−ΔΔＧ（α）＝−ΔＧ（α）＋ΔＧＰＭ      （４）
式中、項αおよびＰＭはそれぞれ、ある特定のプローブ配列ｓｅｑαおよびＰＭプローブを表す。この表記法により、ラングミュアの式（１）は、実際的な値を変数に使用して作成された理論上の図である、図２における中心線の形態をとる。なお、ＰＭプローブは、このシフトを行うために、実際にプローブセット中に存在している必要はない。
【００７６】
上記の通り、本方法は、ハイブリダイゼーション配列長が互いに異なる２つ以上のプローブセットの使用を含む。図１は、プローブの３つの長さ表示物（length representation）、より具体的には、それぞれ２１、２３、および２５ヌクレオチドの長さを有するハ
イブリダイゼーション配列を有する、３つのプローブセットからの対応するプローブ（１
、２、３）を示す。３つのプローブのそれぞれは、２１ヌクレオチドの長さを有する同一のコア配列ｓｅｑαを含む。従って、２１ヌクレオチドの長さを有するプローブ（１）は上記の第一プローブセットの一部である。他のプローブ（２、３）は、第二および第三プローブセットの一部であると見なすことができる。
【００７７】
以下において、中央の長さは基準長さと見なされ、すなわち、式４は２３ヌクレオチドの長さを有するプローブについてのものである（表３参照）。しかし、いずれの長さを基準としてもよいことは、当業者には理解されよう。
【００７８】
異なる長さを有するプローブの自由エネルギーは、基準長さと比較して、より高くなるかより低くなる。しかし、上記で説明したように、異なるプローブセットの対応するプローブ間の自由エネルギーの差異は、固定された境界ヌクレオチドによって生じ、従って、中心のプローブ配列またはコア配列（ｓｅｑα）に非依存的である。それ故、式４を以下により補完することができ、
−ΔΔＧ−（α）＝［−ΔＧ（α）−δ−］＋ΔＧＰＭ
−ΔΔＧ＋（α）＝［−ΔＧ（α）＋δ＋］＋ΔＧＰＭ    （５）
式中、下付き文字プラス（＋）は、長い方のプローブ（Ｌ２５）に使用され、下付き文字マイナス（−）は短い方の（Ｌ２１）プローブに使用され、δ’は基準に対する（固定）自由エネルギーシフトを表す正の定数である。測定強度に対する影響は図２から明らかであり、図２は、ラングミュアの式の線形領域において、自由エネルギーの定数シフトが強度における定数因数に対応することを示している。実際に、線形領域式３から以下が得られる：
Δ−＝ｅ−δ−／ＲＴ 
Δ＋＝ｅδ＋／ＲＴ      （６）
図２のグラフをＩ、Ｉ−／Δ−、およびＩ＋／Δ＋を使用して再プロットすると、図３を得ることができる。基本的に、再プロットは、Ｉ−（最も短いプローブＬ２１について測定された強度）およびＩ＋（最も長いプローブＬ２５について測定された強度）のＩ（基準プローブＬ２３について測定された強度）へ向けたシフトをもたらし、これにより、３つのプローブセットのデータの併用が可能となる。
【００７９】
実際に、図３は、高強度領域においてシグナルＩ−／Δ−を、および低強度領域においてＩ＋／Δ＋を用いた場合に、プロットの線形領域が拡張されていることを示している。この線形領域の拡張は、ダイナミックレンジの増加を効果的にもたらし、量的にΔ＋／Δ−に対応する。図３に示される実験データにおいて、これは、係数２５のダイナミックレンジＩの増加をもたらす。
【００８０】
従って、図３は、ＤＮＡハイブリダイゼーション測定のダイナミックレンジを、本方法による、異なる長さを有するプローブのデータを組み合わせることにより、増加することができることを示している。なお、図３が−ΔΔＧの関数における強度のプロットを示す一方で、実際の実験はＩのみの検出を含み得るが、ΔＧまたはΔΔＧは実験によって直接的には与えられない。ΔＧまたはΔΔＧの推定値を使用することは可能であるが、これらの値は統計誤差を含有する場合があり、ΔＧまたはΔΔＧの推定値の使用によるさらなる誤差の導入は望ましくない場合がある。
【００８１】
以下では、測定された強度シグナルに依存しながら、ダイナミックレンジの増加が可能であることが示される。図４は、Ｉに対するＩ−、Ｉ、およびＩ＋のプロットを示している。式６を用いることにより、以下のようにして、強度データからΔ−およびΔ＋を推定することができる：
Δ−＝Ｉｌ−／Ｉｌ
Δ＋＝Ｉｌ＋／Ｉｌ    （７）
式中、下付き文字「ｌ」はプロットの線形領域を指す。従って、実際に、距離Δ−およびΔ＋は、直線的挙動を示すデータのサブセットを（統計学または他の方法によって）特定した後、これらのサブセットについて距離Δ−およびΔ＋を推定することによって、決定することができる。Ｉ−およびＩ＋をＩに向けてそれぞれ距離Δ−およびΔ＋だけシフトさせることにより、シフトされたプロットを、図５に示されるように得ることができる。
【００８２】
データを区分するための点は、強度曲線における捻れを見つけることによって推定することができる。例えば、４つの点（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を図５に示されるように定めることができる。点ａは、ＩがバックグラウンドＩ０に達しつつあるために、Ｉ＋／Δ＋が強く逸れ始める場所である。点ｂにおける捻れは、バックグラウンドに急速に達するＩ−／Δ−によるものである。点ｃはＩ＋／Δ＋が飽和し始める場所である。点ｄはＩが飽和し始める場所である。
【００８３】
実験の「低強度領域」は、ａ点より低いあらゆる強度領域と定義することができ、「高強度領域」は、ｄ点より高いあらゆる強度と定義することができる。従って、ａより低い領域では、Ｉ＋／Δ＋シグナルが使用され、ｄより高い領域では、Ｉ−／Δ−シグナルが使用され、ａとｄの間の領域ではＩシグナルが使用される。
【００８４】
従って、上記を考慮して、本明細書に記載の方法のある実施形態は、様々なプローブセットのプローブのハイブリダイゼーション強度を、以下の関数として解析することを含み得る：
様々なプローブセットのうちの１つである、参照プローブセットの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度；および／または
前記標的ポリヌクレオチドと前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブとの間のハイブリダイゼーションにおいてのハイブリダイゼーション自由エネルギー。
【００８５】
上記から、特にハイブリダイゼーション強度の対数がΔ−およびΔ＋の決定に関連していると言える。従って、本方法は、解析に使用される様々なプローブセットのうちの１つである、参照プローブセットの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度の対数の関数として、プローブセットのハイブリダイゼーション強度の対数を解析することを含み得る。例えば図４に示されるように、軸に対数目盛を使用しつつ、プロットに実際のハイブリダイゼーション強度を使用することで、同様の結果を得ることができることは、当業者には明らかである。
【００８６】
ある実施形態では、ハイブリダイゼーション強度の解析は以下をさらに含み得る：
プローブセットのそれぞれについて、ハイブリダイゼーション強度の対数が、ハイブリダイゼーション自由エネルギーおよび／または前記プローブセットのうちの１つの対応するプローブのハイブリダイゼーション強度の対数の関数における線形領域に従う、プローブを特定すること；並びに
前記線形領域のそれぞれに含まれるプローブの結果を組み合わせること。
【００８７】
より具体的には、プローブの結果を組み合わせることは、上記のように、第二（および所望によるさらなる）プローブセットのプローブのそれぞれの強度を、対応する参照プローブの強度に向けてシフトまたは尺度変更することを含み得る。特定の実施形態では、尺度変更は、参照プローブセットと比較して、プローブセットについての距離Δ−およびΔ＋（自由エネルギーのシフトに対応する）を決定する段階を含む。より具体的には、Δ−およびΔ＋は、直線的挙動を示すデータのサブセットを（統計学または他の方法によって）特定した後、これらのサブセットについて距離Δ−およびΔ＋を推定することによって、決定することができる。第二（および所望によるさらなる）プローブセットについて検出されたハイブリダイゼーション強度Ｉ−および／またはＩ＋を、Ｉに向けて、それぞれ
距離Δ−およびΔ＋シフトさせることにより、シフトされたプロットを得ることができる。
【００８８】
従って、特定の実施形態では、プローブのデータを組み合わせる段階は、前記プローブセットのうちの一つまたは複数についてのハイブリダイゼーション強度を補正（offset）または尺度変更することにより、前記プローブセットの対応するプローブ間のハイブリダイゼーション強度の差異を補正することを含む。好都合なことに、プローブのデータの組合せは、前記プローブセットのうちの一つまたは複数についてのハイブリダイゼーション強度が尺度変更されて、前記プローブセットの対応するプローブ間のハイブリダイゼーション強度の差異が補正された、様々なプローブのハイブリダイゼーション強度を含む複合データセットをもたらす。
【００８９】
なお、必要な場合、ΔＧまたはΔΔＧの値は様々な方法で決定することができる。例えば、前記値は実験または計算によって決定され得る。より具体的には、これらの値の良好な推定は、当業者に公知のニアレストネイバーモデル（nearest- neighbor model）（Hadiwikarta WW et al., Nucleic Acids Res. 2012, 40, e138；およびこれに引用される参
考文献を参照）によって得られ得る。
【００９０】
ある実施形態では、あるプローブまたはスポットのハイブリダイゼーション強度が解析から除外され得る。例えば、プローブまたはスポットは、対応するハイブリダイゼーション強度が低過ぎる（バックグラウンドシグナルを有意に上回っていない）か、または高過ぎる（飽和レベルを超えている）ことから、さらなる解析から除外され得る。
【００９１】
さらなる例として、あるプローブまたはスポットは、これらのスポットのハイブリダイゼーションが平衡に達していないために、さらなる解析から除外され得る。しかし、ハイブリダイゼーション実験は、例えば適切なプローブ長、温度、およびハイブリダイゼーション時間を選択することにより、ハイブリダイゼーションが平衡に達しているような条件下で実行されることが好ましい。どのプローブまたはスポットのハイブリダイゼーションが平衡に達しているかを判定するための方法は、その全体が参照によって本明細書に援用される、ＷＯ２０１１／０３５８０１に記載されている。
【００９２】
上記の通り、本方法は、試料中の変異ポリヌクレオチドの存在の判定のために特に重要である。特定の実施形態では、変異が生じていると予想される標的ポリヌクレオチド内の配列が標的配列として使用される。ある実施形態では、第一プローブセットのプローブの１つは、変異ポリヌクレオチド内の標的配列に相補的となるように設計され得る。
【００９３】
前記方法は、ＷＯ２０１１／０３５８０１に記載されるような、試料溶液について得られた様々なプローブセットのプローブのハイブリダイゼーション強度を、前記標的ポリヌクレオチドとプローブセットのうちの１つの対応するプローブとの間のハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション自由エネルギーと比較することを含み得る。より具体的には、プローブセットのうちの１つは、参照プローブセットと見なされ得る。試料について得られた様々なプローブセットのプローブについての、様々なプローブセットのハイブリダイゼーション強度の組合せ（例えば、Ｉ、Ｉ−／Δ−、およびＩ＋／Δ＋；後述）またはその対数は、次に、図９に示されるように、参照プローブセットの対応するプローブのハイブリダイゼーション自由エネルギーΔΔＧと比較され得る。試料が標的ポリヌクレオチドと変異型の組合せを含有する場合、プロットは、典型的には、どの変異型が試料中に存在するかを表す、様々な領域を示す。
【００９４】
さらにまたはあるいは、本方法は、標的ポリヌクレオチドを含み、前記変異ポリヌクレオチドを本質的に含まない参照溶液を、様々なプローブセットのプローブと接触させ、プ
ローブのそれぞれについてハイブリダイゼーション強度を得る、さらなる段階を含み得る。特定の実施形態では、参照溶液は前記標的ポリヌクレオチドのいかなる変異型も本質的に含まない。試料について得られたハイブリダイゼーション強度は次に、参照試料について得られたハイブリダイゼーション強度と比較され得る。繰り返しであるが、標的ポリヌクレオチドと変異型の組合せを含有する試料は、典型的には、どの変異型（複数可）が試料中に存在するかを表す、様々な領域を示す。より具体的には、試料溶液についての様々なプローブセットのハイブリダイゼーションエネルギーの組合せ（の対数）（例えば、Ｉ、Ｉ−／Δ−、およびＩ＋／Δ＋；後述）が、参照溶液についての様々なプローブセットのハイブリダイゼーションエネルギーの組合せ（の対数）と比較され得る。
【００９５】
ある実施形態では、変異ポリヌクレオチドの存在の判定は、参照溶液について得られたハイブリダイゼーション強度（の組合せ）の対数の関数としての、試料溶液について得られたハイブリダイゼーション強度（の組合せ）の前記対数の部分間で、２つ以上の平行直線関係が識別可能であるかどうかを判定することによって、確実にされる。典型的には、２つ以上の直線関係の存在は、標的ポリヌクレオチドの変異ポリヌクレオチドの存在を示すものである。さらなる特定の実施形態では、前記方法は、複数の候補変異ポリヌクレオチドのいずれが試料溶液中に存在しているかを判定することを含む。
【００９６】
さらに、本明細書において、本明細書に記載の方法における使用に適したマイクロアレイが提供される。より具体的には、前記マイクロアレイは、第一プローブセット、第二プローブセットおよび所望により第三またはさらなるプローブセットを形成するプローブをそれぞれ含む複数のマイクロアレイスポットを含み、
前記第一プローブセットは、均一な長さのハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む（第一の）複数の異なるプローブを含み、前記ハイブリダイゼーション配列は、標的ポリヌクレオチドとプローブとの間のハイブリダイゼーションにおいて一連のハイブリダイゼーション強度が網羅されるように選択され；
前記第二プローブセットは、前記第一プローブセットの対応するプローブのハイブリダイゼーション配列と同一のハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な一つまたは複数の固定ヌクレオチドでそれぞれ同一に伸長された、（第二の）複数の異なるプローブを含み；
前記所望による第三またはさらなるプローブセットは、前記第二プローブセットの対応するプローブのハイブリダイゼーション配列と同一のハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含み、前記標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的な一つまたは複数の固定ヌクレオチドでそれぞれ同一に伸長された、（第三またはさらなる）複数の異なるプローブを含む。
【００９７】
本方法のための上記のようなプローブおよびプローブセットの特徴は、マイクロアレイにも当てはまる。
【００９８】
さらに、コンピュータデバイス上で実行された際に、本明細書に記載の、ハイブリダイゼーションを解析するための方法、具体的には、標的ポリヌクレオチドの変異型の存在を判定するための方法、の少なくとも一部を実行するためのコンピュータプログラム製品が、本明細書において提供される。例えば、前記コンピュータプログラムは、本明細書に記載の方法に従ってハイブリダイゼーション強度を受信および解析するために構成され得る。例えば、前記コンピュータプログラムは、本明細書に記載されるような、プローブセットの対応するプローブの強度を比較するように、および、前記セットのそれぞれについて線形領域を特定するように、構成され得る。前記ソフトウェアはさらに、種々のプローブセットの線形領域と参照プローブセットの線形領域との間の距離を決定するように、および、例えば、プローブセットのデータを参照プローブセットに向けてシフトさせることにより、様々なプローブセットのデータを組み合わせるように、構成され得る。
【００９９】
特定の実施形態では、コンピュータプログラム製品は、（ｉ）第一プローブセットについての、前記標的ポリヌクレオチドを含む試料溶液の第一ハイブリダイゼーション強度を受信し、（ｉｉ）第二および（所望による）第三またはさらなるプローブセットについての、前記試料溶液の第二および（所望による）第三またはさらなるハイブリダイゼーション強度を受信し；（ｉｉｉ）所望により、ハイブリダイゼーション強度が使用された装置のダイナミックレンジ内である、様々なプローブセット中のプローブを特定し；（ｉｖ）例えば、種々のプローブセットの線形領域間の距離を決定し、次いで種々のプローブセットのデータを設定距離だけシフトさせて、尺度変更され組み合わされたデータセットを得ることにより、前記プローブセットのうちの一つまたは複数についてのハイブリダイゼーション強度を尺度変更し；（ｖ）それに基づいて、前記試料溶液中の変異ポリヌクレオチドの存在を判定するように構成され得る。
【０１００】
ある実施形態では、前記コンピュータプログラムはさらに、標的配列および／またはその変異型の情報に基づいた、適切なプローブセットの設計用に構成され得る。
【０１０１】
ソフトウェアとしての実行または部分的実行の場合、このようなソフトウェアは、一つまたは複数のプロセッサに基づいた、適切なコンピュータまたはコンピュータプラットフォーム上での動作に適し得る。前記ソフトウェアは、あらゆる適切なオペレーティングシステムを用いた使用に適し得る。前記演算手段は、データを処理するための処理手段すなわちプロセッサを含み得る。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、特許請求された方法および適用の説明を目的として提供するものであり、本発明の範囲を限定することは決して意図しておらず、そのように解釈されるべきでもない。
【０１０３】
１．  単一の標的配列を含む試料
【０１０４】
１．１  実験準備
本発明者らは、オリゴヌクレオチド（本明細書において「オリゴ  とも称される）間のハイブリダイゼーション、より具体的には、溶液中に浮遊するユニークな一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）標的ポリヌクレオチドまたは「標的」と、特注のマイクロアレイスライド上に固定化されたプローブ配列との間のハイブリダイゼーションを含む、実験を行った。ハイブリダイゼーション実験は、製造業者のプロトコルに従って特注の８×１５ｋアジレント社製マイクロアレイを用いて行った。
【０１０５】
実験において、本発明者らは、プローブによって異なる自由エネルギーΔＧを唯一の変数として、固定濃度ｃの単一の標的配列を使用した。実験に使用した標的ポリヌクレオチドを表１に示す。太字のヌクレオチドは、標的配列、すなわち標的ポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイズし得る領域、を示す。
【０１０６】
間接標識法をハイブリダイゼーション検出に使用した。Ｃｙ３標識バーコードｓｓＤＮＡ（表１）を、標的ポリヌクレオチドと一緒に、ハイブリダイゼーション混合物に加えた。１つのハイブリダイゼーション実験の間、前記バーコードは標的にハイブリダイズし、標的はマイクロアレイプローブにハイブリダイズする。バーコードのハイブリダイゼーション領域またはハイブリダイゼーション配列（表１、下線）は、６５℃である実験温度を超える融解温度を有するように設計した。
【０１０７】
種々の濃度の標的およびバーコード（表２）を用いて、４つの実験を行った。
【０１０８】
【表１】
2017528167.tif 000002
【０１０９】
【表２】
2017528167.tif 000003
【０１１０】
【表３】
2017528167.tif 000004
【０１１１】
１．２  プローブセットの設計
図１に示される３つの長さ表示物（length representation）を有するプローブ配列（
１、２、３）を含有するマイクロアレイを準備した。マイクロアレイ上に与えられたプローブは、最も短いプローブ（１）のハイブリダイゼーション配列と一致する目的の可変中心領域すなわちコア配列（ｓｅｑα）を含み、可変ｓｅｑαのそれぞれはそれぞれの長さ表示物において生じる。より長いプローブの境界における伸長ヌクレオチドは可変ではなく、完全に固定である。従って、長さ表示物間のプローブ−標的親和性（自由エネルギーΔＧ）における差異は、ｓｅｑαに非依存的である。
【０１１２】
所与のプローブ長の異なるｓｅｑαプローブのそれぞれの集合、すなわちそれぞれのプローブセットは、標的のハイブリダイズ領域に完全一致（ＰＭ）しているプローブ配列を含有していた（表３）。余分な自由エネルギーペナルティを避けるために、２つのＭＭ間で、およびあらゆるＭＭとハイブリダイズ領域の境界との間で、同じヌクレオチド距離が維持されるという条件で、これらのＰＭプローブに基づいて、より多くのプローブ配列を設計し、標的ハイブリダイズ領域に対する全ての可能な単一または二重ミスマッチ（ＭＭ）を網羅した（Hadiwikarta WW et al., Nucleic Acids Res. 2012, 40, e138）。従って、３つのプローブセット（Ｌ２１、Ｌ２３、Ｌ２５）は、それらが同じものを測定しているように、且つ、ある数の追加の固定境界ワトソン・クリックヌクレオチド対合においてのみ異なるように、設計される。
【０１１３】
実験で使用した３つの長さ表示物は、合わせて１８３６のプローブを含んだ。１５ｋマイクロアレイを満たすために、これらのプローブのそれぞれに８つのテクニカルレプリケートを与え、８つのレプリケートの中央値をデータ解析に使用した。
【０１１４】
１．３．強度データの尺度変更
いくつかのマイクロアレイ実験を、異なる長さの３つのプローブセットを用いて、上記のように行った。以下において、実験１の結果（表２）をより詳細に考察する。
【０１１５】
図６は、対応するプローブ（すなわち同一のｓｅｑαを共有しているプローブ）についての、Ｉの関数におけるＩ−、Ｉ、およびＩ＋のプロットを示している。基準線Ｉ＝Ｉに対し統計的に等しい直線垂直距離を有するシグナルＩ−およびＩ＋のサブセットを特定し、これらの距離の平均値を求めた。これらの平均値は上記で定義したように距離Δ−およ
びΔ＋に対応する。Ｉ−およびＩ＋のサブセットを次に、基準線Ｉ＝Ｉに向けてそれぞれ距離Δ−およびΔ＋だけシフトさせて、図７に示されるグラフを得た。距離Δ−およびΔ＋はさらに、式６によりδ−およびδ＋の算出を可能にする。
【０１１６】
図８は、図７の「シフトされた」強度がニアレストネイバーモデル（nearest-neighbor
model）によって決定された自由エネルギーパラメータに対してプロットされた、ラングミュアの式を示している（Hadiwikarta WW et al., Nucleic Acids Res. 2012, 40, e138）。
【０１１７】
上記の低強度領域および高強度領域に基づいて、低強度領域に対してはＩ−／Δ−を、高強度領域に対してはＩ＋／Δ−を使用して、強度をさらに区分することによって、本来のバックグラウンドおよび飽和限界を超えた直線であるデータを得ることができる（図９）。ダイナミックレンジはおよそ２桁増加し、これは、４ヌクレオチド長異なるプローブセットについての予想と合致している。
【０１１８】
１．４．ミスマッチおよび濃度の許容度
ハイブリダイゼーションに基づく技術において、シグナルＩは、ハイブリダイズされたプローブの量に依存する。上記のように、ラングミュアの式（式１）から、シグナルＩは、ｃ．ｅ−ΔＧ／ＲＴ≫１である場合、Ｉ＝Ａへの飽和と見なすことができ、ｃ．ｅ−ΔＧ／ＲＴ≪Ｉ０である場合、シグナルＩはバックグラウンドＩ＝Ｉ０に達する。
【０１１９】
従って、意味ある有用なシグナルを有するために、濃度ｃは、シグナルがバックグラウンドを上回るように十分に高くあるべきであるが、飽和に達しないように十分低くあるべきである。また、プローブの自由エネルギーΔＧは十分に高くあるべきであり、これは、標的配列とプローブのハイブリダイゼーション配列との間に限られた量のミスマッチが存在するべきであることを意味する。しかし、これらは、ハイブリダイゼーション解析における唯一の関連パラメータではない。実際には、あらゆるハイブリダイゼーション解析実験において、温度、試料濃度および緩衝液組成のような所与の一連の実験パラメータ、プローブ−標的間相互作用のアフィニティウィンドウ（affinity window）は、常に制限さ
れており、高度な並列化が目的とされる場合は特に、実験設計に強い境界条件が課せられ得る。逆もまた同じで、所与の設計において、実験条件の変化は、測定値を検出範囲から容易に逸脱させ得る。従って、検出範囲（ダイナミックレンジ）を増加させることにより、より広いパラメータ範囲を用いて実験を行うことができる。
【０１２０】
結論として、飽和レベルおよびバックグラウンドレベルは、ハイブリダイゼーション実験において重要な因子であり、ハイブリダイゼーション配列および濃度の選択を制限する。上記の結果は、本明細書に記載の方法が、ダイナミックレンジの増加を可能にし、それにより、これら２つの面に対する有意に増加した許容度を与えることを示している。これにより、従来法で使用された濃度よりも低いまたは高い濃度の標的ポリヌクレオチドを含有する試料を用いた、ハイブリダイゼーション実験の実行が可能となり得る。増加したダイナミックレンジは、特定の標的ポリヌクレオチドの解析のためにハイブリダイゼーション実験に使用することが可能なハイブリダイゼーション配列の範囲を広げることもでき、配列多様性を必要とする適用の設計において選択肢の数を増やすことができる。
【０１２１】
２．  野生型および変異型の配列を含む試料
本明細書に記載の方法は、野生型配列および変異型配列の両方を含む試料の解析にも適用することができる。例えば、２つの試料に同一のプローブセットを用いて、野生型配列のみを含む参照試料を用いて得られた強度が、野生型配列および変異型配列の両方を含む試料を用いて得られた強度と比較され得る。
【０１２２】
そのような実験を、野生型配列として上記の表１の標的配列を、並びに、２１、２３、および２５ヌクレオチドのプローブ長を含む同一のプローブセット設計を用いて、行った。図１０は、野生型配列のみを含む試料の対応するプローブ強度（Ｘ軸）に対する、野生型配列および変異型配列を含む試料のプローブ強度（Ｙ軸）のプロットを示している。図１０Ａ、Ｂ、およびＣは、それぞれ２１、２３、および２５ポリヌクレオチドのプローブ長を有するプローブについての強度を示している。
【０１２３】
それぞれのプロットは、主枝、および変異型の存在を示す逸脱枝を示している。系が熱平衡の状態にあり、ダイナミックレンジ（dynamical range）内である場合、逸脱枝は主
枝と平行の直線となるはずである。しかし、プローブ長のいずれにおいても、良好な直線で平行な逸脱枝は得られない。
【０１２４】
本明細書に記載のダイナミックレンジ拡張法が適用され、３つのプローブ長の情報が組み合わされた場合、ダイナミックレンジの拡張および逸脱枝に対するその影響を明らかに示す、図１１のプロットが得られる。実際に、実験値は、ダイナミックレンジ内の平衡データの挙動に従う。変異の影響が最小化されることから、これは、データ解析をさらにより強力なものとする。
【符号の説明】
【０１２５】
図面において、以下の番号付けが使用される：１、２、３−プローブ；４−標的；５−標識；６−表面。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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