(57)【要約】  ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とＭＥＴの両方に結合し、それらの活性を阻害し、且つ、癌およびＥＧＦＲとＭＥＴが発病に介在する他の疾患、障害、または体調の治療に有効である多機能性抗体および／または抗原結合断片を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖、および
（ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）ＥＧＦＲに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチド
を含む多機能性抗体。
【請求項２】
ＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖが
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項１に記載の多機能性抗体。
【請求項３】
前記ｓｃＦｖポリペプチドが
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項１または請求項２に記載の多機能性抗体。
【請求項４】
前記重鎖が配列番号５３のアミノ酸配列を含み、且つ、前記軽鎖が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項３の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項５】
前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合する、請求項１から請求項３の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項６】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む請求項１から請求項５の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項７】
前記重鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、且つ、前記軽鎖が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項６の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項８】
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ａ）各々がそれぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｂ）各々がそれぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、請求項１から請求項７の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項９】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）ＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項８に記載の多機能性抗体。
【請求項１０】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項９に記載の多機能性抗体。
【請求項１１】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の多機能性抗体。
【請求項１２】
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ｉ）各々が配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）各々が配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、請求項１１に記載の多機能性抗体。
【請求項１３】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合し、且つ、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合する、請求項１２に記載の多機能性抗体。
【請求項１４】
２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２７であり、且つ、両方の第２ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３３である、請求項１３に記載の多機能性抗体。
【請求項１５】
前記多機能性抗体によって細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲの内部移行および／または分解が誘導される、請求項１から請求項１４の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項１６】
ＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖが
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項１に記載の多機能性抗体。
【請求項１７】
前記ｓｃＦｖポリペプチドが
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項１６に記載の多機能性抗体。
【請求項１８】
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖、および
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１６から請求項１７の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項１９】
前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合する、請求項１６から請求項１８の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項２０】
配列番号２６のアミノ酸配列を含む請求項１６から請求項１９の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項２１】
（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列、および
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列
を含む請求項１６から請求項２０の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項２２】
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ａ）両方ともそれぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｂ）両方ともそれぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、請求項２１に記載の多機能性抗体。
【請求項２３】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項２２に記載の多機能性抗体。
【請求項２４】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項２３に記載の多機能性抗体。
【請求項２５】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の多機能性抗体。
【請求項２６】
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ｉ）両方とも配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）両方とも配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、請求項２５に記載の多機能性抗体。
【請求項２７】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合し、且つ、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合する、請求項２６に記載の多機能性抗体。
【請求項２８】
２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２９であり、且つ、両方の第２ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３３である、請求項２７に記載の多機能性抗体。
【請求項２９】
請求項１から請求項２８の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３０】
治療に使用するための請求項１から請求項２８の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
【請求項３１】
癌の治療に使用するための請求項１から請求項２８の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
【請求項３２】
ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌の治療に使用するための請求項１から請求項２８の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
【請求項３３】
ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌であって、１つ以上のＫＲＡＳ突然変異を有する細胞を含むことを特徴とする前記癌の治療に使用するための請求項１から請求項２８の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
【請求項３４】
癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項１から請求項２８の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片の有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項３５】
前記癌がヒトにおけるＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍が１つ以上のＫＲＡＳ突然変異を有する細胞を含むことを特徴とする、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
【請求項３８】
配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
【請求項３９】
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むＤＮＡ分子。
【請求項４０】
請求項３７から請求項３９の何れか一項に記載のＤＮＡ分子によって形質転換された哺乳類細胞であって、配列番号２７のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチドおよび配列番号３３のアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドを含む多機能性抗体を発現することが可能である前記細胞。
【請求項４１】
前記哺乳類細胞がＣＨＯである、請求項４０に記載の哺乳類細胞。
【請求項４２】
アミノ酸配列が配列番号２７である第１ポリペプチドとアミノ酸配列が配列番号３３である第２ポリペプチドを含む多機能性抗体の生産方法であって、（１）前記多機能性抗体が発現するような条件下で請求項４０または請求項４１に記載の哺乳類細胞を培養すること、および（２）発現した前記多機能性抗体を回収することを含む前記方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法によって生産された、ＭＥＴとＥＧＦＲに結合する多機能性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＭＥＴに結合する多機能性抗体、それらの製造方法、それら多機能性抗体を含む医薬組成物、およびそれらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲはタイプ１チロシンキナーゼファミリー増殖因子受容体のメンバーであり、細胞の増殖、分化、および生存に重要な役割を果たす。これらの受容体の活性化は典型的には特異的なリガンド結合と後続のチロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を経て生じる。この活性化によって細胞の増殖と生存の両方に関わる細胞内シグナル伝達経路のカスケードが始動する。
【０００３】
ＥＧＦＲを標的とし、且つ、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を遮断する様々な癌治療戦略が確立している。小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブとエルロチニブは細胞内チロシンキナーゼ領域でのＥＧＦＲの自己リン酸化を妨害することによって下流のシグナル伝達事象を阻害する。抗ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の臨床使用の主要な課題のうちの１つはこのクラスの治療薬に対する癌の先天的および後天的な耐性である。他方、ある特定の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はＥＧＦＲの細胞外部分を標的とし、それによってリガンド結合を妨げることで下流事象を阻害して細胞増殖を抑制する。キメラマウス／ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｃ２２５（またはセツキシマブ）と完全ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるパニツムマブは転移性大腸癌と頭頚部癌の治療用に認可されており、それらはＥＧＦＲの外側部分を標的とする。しかしながら、ＫＲＡＳ突然変異を含有する腫瘍を有する患者はセツキシマブ療法またはパニツムマブ療法から利益を受けないことが多い。ＫＲＡＳ突然変異はＥＧＦＲが阻害されていても増殖シグナルを絶えず送り続けることで腫瘍細胞におけるシグナル伝達特性を変化させる。
【０００４】
チロシンキナーゼスーパーファミリーのメンバーであるＭＥＴはヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のヒト受容体である。ＭＥＴへのＨＧＦの結合によって受容体の二量体化または多量体化、細胞内領域内の複数のチロシン残基のリン酸化、触媒活性化、および下流シグナル伝達が起こる。ＭＥＴは受容体の過剰発現、増幅、および突然変異をはじめとするリガンド非依存的な機構によっても活性化される。ＭＥＴ活性化によって細胞の増殖、移動、形態形成、および生存が増進し、それらは侵襲性細胞形質および臨床転帰不良と関係する。したがって、ＭＥＴも抗癌治療の標的である。例えば、当技術分野においてワン・アームド（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ）５Ｄ５、ＯＡ５Ｄ５またはＭｅｔＭＡｂとしても知られているオナルツズマブは癌の有望な治療用に開発され、且つ、ＭＥＴ刺激性モノクローナル抗体５Ｄ５から派生したヒト化一価拮抗性抗ＭＥＴ抗体である（例えば、Ｓｐｉｇｅｌ，  Ｄ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎｏｎ  Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ３１（３２）：４１０５−４１１４  （２０１３年１１月）  および  Ｘｉａｎｇ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ  （ＭｅｔＭＡｂ）：  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  −  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｄａｔａ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  （２０１３）を参照されたい）。オナルツズマブはＭＥＴに結合し、ＭＥＴと共に細胞表面に居続けてＨＧＦ結合とその後のＭＥＴリン酸化ならびに下流シグナル伝達活性および細胞応答を妨害する。
【０００５】
国際公開第２０１０／０５９６５４号パンフレットは、ＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合し、且つ、ＨＧＦの存在下または不在下で、および既知のＭＥＴアンタゴニストに対して概ね耐性である機能獲得型突然変異を特徴とする腫瘍においてＭＥＴの内部移行および／または分解を誘導する高親和性拮抗性抗体をはじめとする様々なＭＥＴ抗体について記載している。国際公開第２０１０／０５９６５４号パンフレットにおいて開示されているＭＥＴ抗体のうちの１つであるＬＹ２８７５３５８はＭＥＴに対してアゴニスト活性を全く持たないか、または無視できるほどにしか持たないことが報告されている（例えば、Ｚｅｎｇ，  Ｗ．ら、第１０４回、ＡＡＣＲ年次大会、ポスター番号５４６５（２０１３年４月）を参照されたい）。
【０００６】
米国特許第７７２３４８４号明細書はＥＧＦＲの活性化を阻害するヒト化および親和性最適化ＥＧＦＲ特異的抗体とそれらの抗原結合部分について記載している。より具体的には、この特許は室温で実施されるＳａｐｉｄｙｎｅ  ＫＩＮＥＸＡによって測定されるとピコモーラー以下の結合親和性（Ｋｄ）でヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する完全長モノクローナル抗体について特に記載している。
【０００７】
ＭＥＴおよびＥＧＦＲは多くの腫瘍で共発現する。一方の受容体の阻害によってしばしば他方の受容体が上方制御される傾向があり、単剤処理に対してすぐに耐性になることが多い（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＭＥＴ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＥＲＢＢ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００７；  ３１６：１０３９−４３）。逆に、ＭＥＴ阻害剤に対して長期にわたって曝露されたＭＥＴ増幅肺癌細胞はＥＧＦＲ経路を介して耐性を発達させる（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＭＥＴ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｗｉｔｃｈ  ｔｏ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２０１０；  ７０（４）：１６２５−３４）。ＭＥＴ抗体とＥＧＦＲ抗体の共投与には２つの別個の製品の注射または２つの異なる抗体の共製剤の単回注射が必要である。２回の注射は投与量と投与タイミングを自由にすることができるが、コンプライアンスと痛みの両方の点で患者にとって不都合である。共製剤も投与量についていくらかの自由度を提供することができるが、それら２つの異なる抗体の異なる分子特性のために両方の抗体が化学的および物理的に安定であることを可能にする製剤条件を見つけることは多くの場合に非常に難しく、または不可能である。
【０００８】
国際公開第１９９５０９９１７号パンフレットは、異なる特異性を有する完全抗体に融合した単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）抗体を作製することにより組換えＤＮＡ技術を用いて二特異的四価抗体を作製するための方法について開示している。この遺伝子融合体は形質移入により発現して二重特異性を有する四価抗体を生じる。しかしながら、当業者が有用な二特異的抗体を作製しようとして国際公開第１９９５０９９１７号パンフレットを含む当技術分野の教示に従うと、それにより生じる二特異的抗体の化学的および物理的安定性に関連する重大な問題にしばしば出くわすことが当技術分野において一般に認識されている。しばしば、これらの問題を充分に克服するためにそれにより生じる二特異的抗体においてアミノ酸を変更する必要がある。当技術分野においてはそれにより生じる問題を克服するアミノ酸の変更の必要性も実際の変更も示唆されていない。さらに、必要な変更は日常的なものでも共通一般知識に由来するものでもないことが非常に多い。同様に、既知の抗体から作製された二特異的抗体は親抗体自体と比較すると少なくとも１つの重要な機能的薬物動態特性または機能的薬力学特性の点であまり望ましくないとわかることが多い。
【０００９】
ＰＣＴ国際公開第２０１０／１１５５５１号パンフレットは三価二特異的抗ヒトＥＧＦＲおよびＭＥＴ抗体（ＢｓＡＢ０１）を開示しており、その中で単鎖Ｆａｂ断片、すなわち、ワン・アームド５Ｄ５がセツキシマブの２本の重鎖のうちの１本のカルボキシル末端に融合した。ＢｓＡＢ０１は単一特異的一価親ＭＥＴ抗体によって誘導されるＭＥＴの内部移行と比較してＭＥＴの内部移行を減少させることが報告されている。ＯＶＣＡＲ−８増殖アッセイにおいて、ＢｓＡＢ０１はセツキシマブとオナルツズマブの混合物による２％阻害に対して８％阻害を誘発した。ＨＧＦの存在下でＢｓＡＢ０１はセツキシマブとオナルツズマブの混合物による１０％阻害に対して１５％阻害を誘発した。
【００１０】
さらに、還元条件下で２つの親抗体（この事例ではＥＧＦＲまたはＭＥＴのどちらかに対する特異性を有するもの）を混合し、続いて再酸化することを伴う過程である制御Ｆａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）を用いるＥＧＦＲとｃＭＥＴの両方を標的とする二特異的抗体であるＥＭ１−ｍＡｂの作製が開示されている（Ｍｏｏｒｅｓ，  Ｓ．ら、ＥＯＲＴＣ年次大会、ポスター番号Ｂ２４１（２０１３年１０月））。ＥＭ１−ｍＡｂは少なくとも１種類のインビトロＥＲＫリン酸化アッセイにおいて一価対照抗体の混合物と比較して優れた活性を特に示すことが報告された。
【００１１】
米国特許出願公開２０１４／０３０２０２９号明細書はＥＧＦＲとｃＭＥＴの両方を標的とする二特異的抗体の作製について記載しており、それらの抗体はｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体（すなわち、ＡｂＦ４６）の親和性成熟化およびヒト化誘導体のＩｇＧ２  ＦｃのＣ末端にセツキシマブの配列に基づく抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを融合することにより作製された。
【００１２】
したがって、ある特定の癌の有効な薬理学的介入として、高い親和性でＭＥＴとＥＧＦＲに結合し、ＨＧＦによるＭＥＴ活性化とＥＧＦファミリーリガンドによるＥＧＦＲ活性化を効果的に中和し、および／または単剤の混合物と比べてＭＥＴとＥＧＦＲ（野生型および変異体の両方）の内部移行および／または分解の点で優れた活性を提供する多機能性抗体が必要である。特に、ｉ）１つ以上のＫＲＡＳ突然変異を有することを特徴とする癌をより効果的に治療することができ、ｉｉ）単剤の適切な混合物と比較するとエルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブおよびベムラフェニブを含むがこれらに限定されない他のＭＥＴ阻害剤および／またはＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性の発生を防止または遅滞化する点で優れた活性を示し、ｉｉｉ）測定可能なアゴニスト活性を最小限にしか、または全く誘発せず、および／またはｉｖ）癌治療において開発および／または使用するために許容可能である熱安定性、溶解性、低自己会合性、ならびに薬物動態特性を含むがこれらに限定されないインビボ安定性、物理的安定性および化学的安定性を示すような抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ抗体が望ましい。しかしながら、本発明者らが国際公開第２０１０／０５９６５４号パンフレットに記載のある特定の抗ＭＥＴ抗体と米国特許第７７２３４８４号明細書に記載のある特定の抗ＥＧＦＲ抗体を含む四価多機能性抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ抗体を作製しようとして国際公開第９５／０９９１７号パンフレットの教示に概ね従うと、本発明者らは化学的および物理的安定性に関する重大な問題ならびに標的受容体であるＭＥＴとＥＧＦＲの一方または両方に対する所望の結合特性の喪失に出くわした。したがって、これらの問題を充分に克服するために多数のアミノ酸変更を伴う徹底的な技術的努力が必要であった。当技術分野においては変更の必要性も実際の変更も示唆されていない。さらに、幾つかの変更は日常的なものでも共通一般知識に由来するものでもない。同様に、親抗体自体はこれらの問題を有していなかった。このことは重要な領域の周りの局所的環境が多機能性抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ抗体の文脈では異なっていたことを示唆している。
【発明の概要】
【００１３】
したがって、本発明はＥＧＦＲとＭＥＴに結合する四価多機能性抗体を提供する。これらの多機能性抗体は細胞表面上でのＥＧＦＲとＭＥＴの共局在、ＭＥＴの内部移行および／または分解、および驚くべきことに高いＭＥＴ発現を有する腫瘍細胞においてセツキシマブと比較してずっと高い程度のＥＧＦＲの内部移行と分解を誘導する。また、これらの抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体は低程度から中程度のＭＥＴ発現を有する腫瘍細胞において親抗ＭＥＴ抗体よりも高いＭＥＴへの結合活性を示す。
【００１４】
したがって、本発明はＥＧＦＲとＭＥＴに結合する四価多機能性抗体を提供する。これらの多機能性抗体は細胞表面上でのＥＧＦＲとＭＥＴの共局在、ＭＥＴの内部移行および／または分解、および驚くべきことに高いＭＥＴ発現を有する腫瘍細胞においてセツキシマブと比較してずっと高い程度のＥＧＦＲの内部移行と分解を誘導する。また、これらの抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体は低程度から中程度のＭＥＴ発現を有する腫瘍細胞において親抗ＭＥＴ抗体よりも高いＭＥＴへの結合活性を示す。さらに、これらの多機能性抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ抗体は細胞培養ならびにマウス異種移植モデルにおける腫瘍細胞増殖の阻害の点で２つの個々の抗体の混合物と比較して優れた活性を示す。それらの抗体は、ＨＧＦおよび／またはＥＧＦの存在下でエルロチニブおよびＰＬＸ４０３２（すなわち、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤）をはじめとする様々な標的療法に対する腫瘍細胞感受性を復活させる点でも個々のＭＥＴ抗体とＥＧＦＲ抗体の組合せよりも優れた活性を有するようである。そのような抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ抗体は高ＥＧＦＲ発現腫瘍、または１種類以上の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブなど）および／もしくはＥＧＦＲの１種類以上の小分子阻害剤（例えば、エルロチニブ）に対して耐性である、または耐性になった腫瘍であって、ＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍を含むがこれらに限定されない腫瘍に対してより有効である可能性もある。本発明の様々な実施形態ではこれらの多機能性抗体はＭＥＴとＥＧＦＲに同時に結合し、ＨＧＦによるＭＥＴの活性化とＥＧＦによるＥＧＦＲの活性化を中和し、ＭＥＴとＥＧＦＲを発現する多くの種類の癌細胞のリガンド依存的およびリガンド非依存的細胞増殖を抑制し、細胞表面上でのＥＧＦＲとＭＥＴの共局在を誘導し、ＭＥＴの内部移行および／または分解を誘導し、且つ、驚くべきことに高いＭＥＴ発現を有する腫瘍細胞においてセツキシマブと比較してずっと高い程度のＥＧＦＲの内部移行と分解を誘導する。
【００１５】
本発明の実施形態は、
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖、および
（ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）ヒトＥＧＦＲに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチド
を含み、且つ、前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合している多機能性抗体である。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）各々がそれぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）各々がそれぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）各々がヒトＥＧＦＲに結合し、且つ、各々が
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチドである第１ｓｃＦｖポリペプチドと第２ｓｃＦｖポリペプチド
を含み、且つ、前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合しており、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合している多機能性抗体である。
【００１７】
本発明の追加の実施形態は、２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドが配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号５２または配列番号５３のアミノ酸配列を含み、且つ、両方の第２ポリペプチドが配列番号３３のアミノ酸配列を含む多機能性抗体であって、ＥＧＦＲとＭＥＴに結合する前記多機能性抗体である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物である。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、治療に使用するための前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片である。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、癌の治療に使用するための前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片である。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、患者の腫瘍がＭＥＴとＥＧＦＲの両方を発現している癌の治療に使用するための前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片である。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、患者の腫瘍が低レベル、中レベル、または高レベルでＭＥＴおよび／またはＥＧＦＲを発現している癌、ならびに／または１種類以上の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブなど）および／もしくはＥＧＦＲの１種類以上の小分子阻害剤（例えば、エルロチニブ）に対して耐性である、または耐性になった腫瘍であって、ＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍を含むがこれらに限定されない腫瘍の治療に使用するための前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片である。当該発明の様々な実施形態では患者の腫瘍が低レベル、中レベル、または高レベルでＭＥＴおよび／またはＥＧＦＲを発現している癌、ならびに／または１種類以上の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブなど）および／もしくはＥＧＦＲの１種類以上の小分子阻害剤（例えば、エルロチニブ）に対して耐性である、または耐性になった腫瘍であって、１つ以上のＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍を含むがこれらに限定されない腫瘍を治療するための多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片の使用は、本発明の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片を患者に投与するステップの前に癌の治療を必要とする患者を特定するステップをさらに含み得る。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、ブドウ膜黒色腫を含むがこれに限定されない黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌の治療に使用するための前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片である。
【００２４】
本発明の別の実施形態は癌を治療する方法であって、それを必要とするヒト患者に前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片の有効量を投与することを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９が癌細胞株Ｈ１９９３（ＮＳＣＬＣ）、ＭＫＮ４５（胃癌）、およびＨ４４１（ＮＳＣＬＣ）においてＥＧＦＲとＭＥＴの分解を誘導することを示しているウエスタンブロッティングの結果を図示している図である。それらの癌細胞株は１００ｎＭの抗体ＮＨ−ＹＫ、抗体ＮＨ−Ｈ９または対照抗体で処理された。ＥＧＦＲとＭＥＴの分解は細胞溶解物のウエスタンブロッティングによって決定された。抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はＥＧＦＲのかなりの分解を引き起こすが、セツキシマブまたは親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物はそうではなかった。レーン１：ｈＩｇＧ４；レーン２：抗ＭＥＴ抗体；レーン３：セツキシマブ；レーン４：抗ＭＥＴ抗体＋セツキシマブ；レーン５：ＮＨ−ＹＫ；レーン６：ＮＨ−Ｈ９。
【００２６】
【図２】Ｈ１９９３マウス異種移植モデルにおいて腫瘍体積がベヒクル対照または親抗Ｍｅｔ抗体とセツキシマブの混合物の投与と比較すると（８６．１％のＴ／Ｃ％）抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫの投与によって有意に減少する（２８．５％のＴ／Ｃ％、ｐ＜０．００１）ことを示しているグラフである。
【００２７】
【図３】Ｈ４４１マウス異種移植モデルにおいて腫瘍体積がベヒクル対照または親抗Ｍｅｔ抗体とセツキシマブの混合物の投与と比較すると抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫの投与によって有意に減少する（２８．５％のＴ／Ｃ％、ｐ＜０．００１）ことを示しているグラフである。
【００２８】
【図４】ＥＢＣ−１  ＮＳＣＬＣマウス異種移植モデルにおいて腫瘍体積がベヒクル対照の投与と比較すると抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫの投与によって有意に減少する（３２．９％のＴ／Ｃ％（ｐ＜０．００１））ことを示しているグラフである。
【００２９】
【図５】ＭＫＮ４５胃異種移植モデルにおいて親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物またはベヒクル対照の投与と比較すると抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫの投与によって同等の抗腫瘍作用（それぞれＴ／Ｃ％＝１７．４％、ｐ＜０．００１および１８．６％、ｐ＜０．００１）が生じることを示しているグラフである。
【００３０】
【図６】Ｈ１９９３  ＮＳＣＬＣ異種移植片を担持する免疫不全マウスにおいて抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体Ｈ９の２７ｍｇ／ｋｇでの投与によって他のあらゆる処理よりも有意に高い抗腫瘍作用が生じたことを示しているグラフである。マウス異種移植片は、連続５週間にわたって週に一度ベヒクル対照、抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体Ｈ９（４ｍｇ／ｋｇおよび２７ｍｇ／ｋｇ）、抗ＭＥＴのみ（３ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）、セツキシマブ（３ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ＭＥＴとセツキシマブの混合物（それぞれの抗体について３ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処理された。
【００３１】
【図７】Ｈ４４１異種移植片を担持する免疫不全マウスにおいて抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体Ｈ９の２７ｍｇ／ｋｇでの投与によって他のあらゆる処理よりも有意に高い抗腫瘍作用が生じたことを示しているグラフである。マウス異種移植片は、連続５週間にわたって週に一度ベヒクル対照、抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体Ｈ９（４ｍｇ／ｋｇおよび２７ｍｇ／ｋｇ）、抗ＭＥＴのみ（３ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）、セツキシマブ（３ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ＭＥＴとセツキシマブの混合物（それぞれの抗体について３ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処理された。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」、および「ＥＧＦ受容体」という用語はＥＧＦＲタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ００５３３を参照されたい）を指すために本明細書において互換的に使用される。本明細書において、「ＥＧＦＲ細胞外ドメイン」または「ＥＧＦＲ  ＥＣＤ」は細胞膜に固定されているか、または循環している細胞外にあるＥＧＦＲのドメインであって、その断片を含むものを指す。１つの実施形態ではＥＧＦＲの細胞外ドメインは、境界はおおよそのものであり、約１〜３アミノ酸変わり得るが、「ドメインＩ」（アミノ酸残基約１〜１５８）、「ドメインＩＩ」（アミノ酸残基１５９〜３３６）、「ドメインＩＩＩ」（アミノ酸残基３３７〜４７０）、および「ドメインＩＶ」（アミノ酸残基４７１〜６４５）の４つのドメインを含み得る。
【００３３】
「ＭＥＴポリペプチド」、「ＭＥＴ受容体」、「ＭＥＴ」、「ＨＧＦ受容体」または「ＨＧＦＲ」という用語は本明細書において互換的に使用され、別段の指示が無い限りヒト肝細胞増殖因子に結合するヒト受容体チロシンキナーゼならびにその機能的に活性である突然変異型を指すものとする。ＭＥＴの具体例には、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２４５で規定されるヌクレオチド配列によってコードされるヒトポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００２３６で規定されるポリペプチド配列によってコードされるヒトタンパク質が挙げられる。ＭＥＴの構造は模式的に次のように示される。
【化１】
2017504608.tif 000002
【００３４】
ヒトＭＥＴの細胞外ドメイン（本明細書においてはＭＥＴ−ＥＣＤ）は例えば配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する。しかしながら、配列番号３５のアミノ酸１〜２４はシグナル配列を含む。したがって、別段の指定が無い限り、本明細書において使用される場合の「ＭＥＴ−ＥＣＤ」という用語は配列番号３５のアミノ酸２５で始まりアミノ酸９３２で終わる成熟タンパク質（すなわち、配列番号３６）を意味する。ＳＥＭＡドメインはＭＥＴのＮ末端のおよそ５００アミノ酸残基から成り、α鎖（配列番号３５のアミノ酸残基２５〜３０７（すなわち、配列番号３７）とβ鎖の一部（配列番号３５のアミノ酸残基３０８〜５１９（すなわち、配列番号３８））を含む。
【００３５】
本明細書において使用される場合、腫瘍または細胞株についてＭＥＴまたはＥＧＦＲの細胞表面発現を言及するときの「低程度」、「中程度」、および「高程度」という用語はそれぞれ細胞あたり約３０万未満の数の受容体、約３０万を超える数の受容体、および約１００万を超える数の受容体を意味するものとする。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「多機能性抗体」は１つの抗原結合特異性を有する抗体および異なる抗原結合特異性を有する抗原結合断片を含む分子を指す。好ましくは、多機能性抗体はｉ）ＭＥＴに対する抗原結合特異性を有する抗体およびｉｉ）ＥＧＦＲに対する抗原結合特異性を有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む分子を指す。
【００３７】
別段の指示が無い限り、「抗体」という用語は本明細書において使用される場合にジスルフィド結合によって連結されている２本の重鎖（ＨＣ）と２本の軽鎖（ＬＣ）を含む免疫グロブリン分子を指すものとする。各鎖のアミノ末端部分はそこに含まれるＣＤＲを介した抗原認識に主に関与する約１００〜約１１０アミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。
【００３８】
別段の指示が無い限り、「ＮＨ−ＹＫ」という用語は本発明の多機能性抗体への言及で本明細書において使用される場合に２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドが配列番号２７のアミノ酸配列を含み、且つ、両方の第２ポリペプチドが配列番号３３のアミノ酸配列を含む多機能性抗体であって、ＥＧＦＲとＭＥＴに結合する前記多機能性抗体を指すものとする。
【００３９】
別段の指示が無い限り、「ＮＨ−Ｈ９」という用語は本発明の多機能性抗体への言及で本明細書において使用される場合に２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドが配列番号２９のアミノ酸配列を含み、且つ、両方の第２ポリペプチドが配列番号３３のアミノ酸配列を含む多機能性抗体であって、ＥＧＦＲとＭＥＴに結合する前記多機能性抗体を指すものとする。
【００４０】
別段の指示が無い限り、「Ｈ９」という用語は本発明の多機能性抗体への言及で本明細書において使用される場合に２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドが配列番号５２のアミノ酸配列を含み、且つ、両方の第２ポリペプチドが配列番号３３のアミノ酸配列を含む多機能性抗体であって、ＥＧＦＲとＭＥＴに結合する前記多機能性抗体を指すものとする。
【００４１】
別段の指示が無い限り、「ＹＫ」という用語は本発明の多機能性抗体への言及で本明細書において使用される場合に２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドが配列番号３１のアミノ酸配列を含み、且つ、両方の第２ポリペプチドが配列番号３３のアミノ酸配列を含む多機能性抗体であって、ＥＧＦＲとＭＥＴに結合する前記多機能性抗体を指すものとする。
【００４２】
「抗原結合断片」という用語は本明細書において使用される場合に抗原に結合する能力を保持するあらゆる抗体断片を意味するものとする。そのような「抗原結合断片」はＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片およびディアボディからなる群より選択され得る。抗体の抗原結合断片は典型的には少なくとも１つの可変領域を含む。好ましくは、抗原結合断片は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。より好ましくは、抗原結合断片はＭＥＴとＥＧＦＲの両方に対する抗原結合特異性を付与するＨＣＶＲとＬＣＶＲを含む（すなわち、「ＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片」）。
【００４３】
「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は本明細書において使用される場合に抗体またはその抗原結合断片のＨＣポリペプチドとＬＣポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続的な抗原結合位置を意味するものとする。これらの特定の領域はＫａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９０：３８２−９３  （１９７１）、  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：６６０９−６６１６  （１９７７）；  Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版、米国保険福祉省、ＮＩＨ文書番号９１−３２４２（１９９１年）、Ｃｈｏｔｈｉａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）、  ＭａｃＣａｌｌｕｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６２：７３２−７４５  （１９９６）、  および  Ｎｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４０６，  ２２８−２５６  （２０１１）を含む他の文書に記載されており、相互に比較すると重複するアミノ酸残基または部分集合になっているアミノ酸残基が定義に含まれる。
【００４４】
ＣＤＲにはフレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれるよりよく保存されている領域が点在する。ＬＣＶＲとＨＣＶＲの各々がアミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成されている。軽鎖の３つのＣＤＲは「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と呼ばれ、重鎖の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と呼ばれる。それらのＣＤＲは抗原との特異的な相互作用を形成する残基の大半を含む。ＬＣＶＲ領域内およびＨＣＶＲ領域内でのＣＤＲアミノ酸残基の番号付けと位置付けは公知の慣習（例えば、 Kabat (1991)、 Chothia (1987), および/または North (2011)）に従う。本発明の様々な実施形態では前記抗体および／または抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）のＦＲはヒト生殖系列配列と同一であっても自然にまたは人工的に修飾されていてもよい。
【００４５】
「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖポリペプチド」はリンカー分子を介して連結されているＬＣＶＲドメインとＨＣＶＲドメインを含む単一折畳みポリペプチドを指す。そのようなｓｃＦｖポリペプチドではＨＣＶＲドメインとＬＣＶＲドメインはＨＣＶＲ−リンカー−ＬＣＶＲの順序またはＬＣＶＲ−リンカー−ＨＣＶＲの順序のどちらかであり得る。そのリンカーは、抗原を認識するための機能的単量体単位としてＨＣＶＲドメインとＬＣＶＲドメインが折りたたまれることを可能にする柔軟なペプチドリンカーであり得る。ｓｃＦｖのＬＣＶＲドメインの３つのＣＤＲは本明細書において「ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３」と呼ばれ、ｓｃＦｖのＨＣＶＲドメインの３つのＣＤＲは本明細書において「ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３」と呼ばれる。
【００４６】
「表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）」という用語は本明細書において使用される場合に例えばBIAcore（商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス・ディビジョン、ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を使用してバイオセンサーマトリックス内でタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイムでの相互作用分析を可能にする光学的現象を指す。
【００４７】
「ＫＤ」という用語は本明細書において使用される場合に特定の抗体抗原間相互作用または抗体断片抗原間相互作用の平衡解離定数を指すものとする。
【００４８】
「特異的に結合する」という用語またはそのような用語は抗体またはその抗原結合断片が生理的条件下で抗原と比較的に安定な複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するか決定するための方法は当技術分野においてよく知られており、それらには、例えば、平衡透析、ＳＰＲなどが含まれる。例えば、ＭＥＴまたはＥＧＦＲに「特異的に結合する」抗体は、本発明の文脈で使用される場合、ＳＰＲアッセイで測定すると約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．３ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満のＫＤでＭＥＴ−ＥＣＤ（またはその一部）および／またはＥＧＦＲ−ＥＣＤ（またはその一部）に結合する抗体を含む（例えば、本明細書中の実施例１を参照されたい）。好ましくは、本発明の多機能性抗体はＳＰＲアッセイで測定すると約１０ｎＭと約０．１ｎＭの間、約５ｎＭと約０．１ｎＭの間、約２ｎＭと約０．１ｎＭの間、約１ｎＭと約０．１ｎＭの間、約０．７５ｎＭと約０．１ｎＭの間、約０．５ｎＭと約０．１ｎＭの間のＫＤでＭＥＴ−ＥＣＤ（またはその一部）およびＥＧＦＲ−ＥＣＤ（またはその一部）に特異的に結合する。
【００４９】
「エピトープ」という用語はパラトープとして知られる抗体分子の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原性決定因子を指す。単一の抗原が１つより多くのエピトープを有することがあり得る。したがって、異なる抗体が一抗原上の異なる領域に結合することもあれば、異なる生物学的効果を有することもある。エピトープは立体的または直鎖状のどちらかであり得る。立体構造エピトープは直鎖状ポリペプチド鎖の様々な区分に由来する空間的に並置されているアミノ酸によって形成される。直鎖状エピトープはポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基により形成されるものである。ある特定の状況ではエピトープは抗原上の多糖、ホスホリル基、またはスフホニル基の部分を含み得る。
【００５０】
「リンカー分子」または「リンカー」という用語は本発明内で使用される場合に好ましくはペプチドリンカーを表す。本発明のある特定の実施形態で活用されるペプチドリンカーは、抗体、抗原結合部位、および／または様々な抗原結合部位を含む抗体断片（例えばｓｃＦｖ、完全長抗体、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン）を結合して本発明に従う多機能性抗体を形成するために使用される。好ましくは、それらのペプチドリンカーは少なくとも５アミノ酸を有する、好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなる、より好ましくは１０アミノ酸と５０アミノ酸の間の高グリシンペプチドである。本発明の幾つかの実施形態では前記高グリシンペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３およびｎ＝３、４、５または６）または（ｘ＝４およびｎ＝２、３、４または５）である。例えば、本発明の幾つかの実施形態では前記高グリシンペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｘ＝４およびｎ＝２、３、４または５である（すなわち、それぞれＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４９）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５０）。本発明のある特定の実施形態では追加のグリシンまたはトレオニン、例えば、ＧＳＴＧ、ＴＧ、ＧＧ、またはＧＧＧＴを（ＧｘＳ）ｎ形式の高グリシンペプチドリンカーのどちらかの末端に付加することができる。例えば、本発明の幾つかの実施形態では前記高グリシンペプチドリンカーはＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＴＧ（配列番号５１）である。
【００５１】
「Ｃ末端」という用語、およびカルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端、Ｃ終端、またはＣＯＯＨ末端を含むがこれらに限定されないその用語の文法的変形は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）によって終了することがあり得るアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終端を表すために本明細書において使用される。タンパク質がメッセンジャーＲＮＡから翻訳されるとき、そのタンパク質はＮ末端からＣ末端に向かって作製される。ペプチド配列を表すための習慣によると、Ｃ終端は右側に示され、Ｎ末端からＣ末端に向かって配列が記載される。
【００５２】
「Ｎ末端」という用語、およびアミノ末端、ＮＨ２末端、Ｎ終端またはアミン末端を含むがこれらに限定されないその用語の文法的変形は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終了するアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の開始点を表すために本明細書において使用される。ペプチド配列を表すための習慣によると、Ｎ末端は左側に配置され、Ｎ末端からＣ末端に向かって配列が記載される。
【００５３】
「ヒト型操作抗体」または「ヒト化抗体」という語句は本明細書において開示される抗体化合物、ならびに本明細書において開示される抗体化合物と類似の結合特性および機能特性を有し、且つ、非ヒト抗体に由来するＣＤＲの周囲に実質的にヒト型または完全にヒト型であるフレームワーク領域を有する抗体およびそれらの抗原結合断片を指す。「フレームワーク領域」または「フレームワーク配列」はフレームワーク領域１〜４のいずれか１つを指す。本発明によって包含されるヒト型操作抗体および抗原結合断片にはフレームワーク領域１〜４のいずれか１つ以上が実質的または完全にヒト型である化合物、すなわち、それぞれ実質的または完全にヒト型であるフレームワーク領域１〜４の可能な組合せのうちのいずれかが存在する化合物が含まれる。例えば、これにはフレームワーク領域１とフレームワーク領域２、フレームワーク領域１とフレームワーク領域３、フレームワーク領域１、２、および３、などが実質的または完全にヒト型である抗原結合化合物が含まれる。実質的にヒト型のフレームワークは公知のヒト生殖系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するフレームワークである。それらの実質的にヒト型のフレームワークは公知のヒト生殖系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、または約９５％の配列同一性を有することが好ましい。
【００５４】
完全にヒト型のフレームワークは公知のヒト生殖系列フレームワーク配列と同一のフレームワークである。ヒトフレームワーク生殖系列配列は当技術分野において知られており、それらの配列はＩＭＧＴ（登録商標）、すなわち、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（例えば、 Marie-Paule Lefranc, et al., Nucleic Acid Research, volume 37, Database issue, D1006-D1012を参照されたい）を含む様々な情報源から、またはMarie-Paule Lefranc および Gerard Lefranc著、The Immunoglobulin Facts Book 、Academic Press, 2001年, ISBN 012441351から入手可能である。例えば、Ａｌ１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、ＬＩ、Ｌ１Ｉ、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、およびＯ８からなる群より生殖系列軽鎖フレームワークを選択することができ、およびＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨＩ−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨＩ−１８、ＶＨＩ−６９、ＶＩ−１３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、およびＶＨ５−５Ｉからなる群より生殖系列重鎖フレームワーク領域を選択することができる。
【００５５】
本明細書において開示される抗体化合物と類似の機能特性を示すヒト型操作抗体は幾つかの異なる方法を用いて作製され得る。本明細書において開示される特定の抗体化合物を鋳型または親抗体化合物として使用して追加の抗体化合物を調製することができる。１つのアプローチでは親抗体化合物のＣＤＲを親抗体化合物フレームワークと高い配列同一性を有するヒトフレームワークに融合させる。概して、その新しいフレームワークの配列同一性は親抗体化合物中の対応するフレームワークの配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一である。この融合により、親抗体の結合親和性と比較して低下した結合親和性が生じ得る。この場合はＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：２８６９によって開示された特別の基準に基づいてある特定の位置でそのフレームワークを突然変異させて親フレームワークに戻すことができる。マウス抗体のヒト化に有用な方法について記載しているその他の参照文献には米国特許第４８１６３９７号明細書、第５２２５５３９号明細書、および第５６９３７６１号明細書；Ｌｅｖｉｔｔ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６８：５９５−６２０  （１９８３）に記載されるコンピュータープログラムであるＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ、およびＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２７  （１９８８）、  および、  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）が含まれる。
【００５６】
本発明の教示の適用に当たって、当業者は本開示のＣＤＲ配列およびフレームワーク配列内のアミノ酸を置換し、それによって本配列に由来する可変領域アミノ酸配列をさらに作製するために一般的技術、例えば、部位特異的突然変異形成を用いることができる。特定の置換部位において最大で１９種類全ての代替的天然アミノ酸を導入することができる。その後、表示されているインビボ機能を有する配列を特定するために本明細書において開示されている方法を用いてこれらの追加の可変領域アミノ酸配列をスクリーニングすることができる。このように本発明に準ずるヒト型操作抗体およびそれらの抗原結合部分の調製に適切な追加の配列を特定することができる。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は本明細書において開示される３つの軽鎖フレームワーク領域および／または重鎖フレームワーク領域のいずれか１つ以上の中の１つ、２つ、または３つの位置に限定される。好ましくは、それらのＣＤＲ内のアミノ酸置換はそれら３つの軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上の中の１つ、２つ、または３つの位置に限定される。上で記載されたこれらのフレームワーク領域およびＣＤＲ内の様々な変更の組合せも本明細書において企図されている。
【００５７】
下の表１および２は本明細書において開示される好ましいヒト型操作抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とコンセンサスアミノ酸配列、および本明細書において開示される好ましいヒト型操作抗体またはそれらの抗原結合断片のＨＣＶＲポリペプチドとＬＣＶＲポリペプチドのアミノ酸配列の配列番号を示している。
【表１】
2017504608.tif 000003
【表２】
2017504608.tif 000004
【００５８】
本発明の実施形態は、
（ａ）次のもの：
（ｉ）ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号３９）、
（ｉｉ）ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４０）、
（ｉｉｉ）ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ（配列番号４１）、および
（ｉｖ）ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４２）
からなる群より選択されるアミノ酸配列においてＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合する抗体、および
（ｂ）ＥＧＦＲに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチド
を含む多機能性抗体であって、細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲの内部移行および／または分解を誘導する前記多機能性抗体である。
【００５９】
当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体はアミノ酸配列ｉ）ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号３９）、ｉｉ）ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４０）、ｉｉｉ）ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ（配列番号４１）、および／またはｉｖ）ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４２）においてＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合する。当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体は次のもの：
（ｉ）ＤＴＹＹＤＤ（配列番号４３）、
（ｉｉ）ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４４）、
（ｉｉｉ）ＦＩＮＦ（配列番号４５）、および
（ｉｖ）ＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４６）
からなる群より選択されるアミノ酸配列においてＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合し得る。
【００６０】
当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体はアミノ酸配列ＤＴＹＹＤＤ（配列番号４３）、ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４４）、ＦＩＮＦ（配列番号４５）、およびＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４６）の全てを特徴とする立体構造エピトープに結合し得る。さらに、当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体は細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲのそれぞれＨＧＦ非依存的およびＥＧＦ非依存的な内部移行および／または分解を誘導する。当該発明の他の実施形態ではＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖポリペプチドは、
ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、およびｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメインを含む。当該発明の他の実施形態ではＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖポリペプチドは、ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、およびｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメインを含み、且つ、前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合している。
【００６１】
本発明の実施形態は、
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖、および
（ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）ＥＧＦＲに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチド
を含む多機能性抗体である。
【００６２】
当該発明の他の実施形態ではＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖポリペプチドは、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む。
【００６３】
当該発明の他の実施形態ではＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖポリペプチドは配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメインと配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメインを含む。当該発明の他の実施形態ではＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖポリペプチドは、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含み、且つ、前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合している。
【００６４】
当該発明の他の実施形態では前記多機能性抗体は、
（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖、および
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【００６５】
本発明の実施形態は、
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖、および
（ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）ＥＧＦＲに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチド
を含む多機能性抗体である。
【００６６】
当該発明の他の実施形態ではＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖポリペプチドは、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む。
【００６７】
当該発明の他の実施形態ではＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖポリペプチドは、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含み、且つ、前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合している。
【００６８】
当該発明の他の実施形態では前記多機能性抗体は、
（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖、および
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【００６９】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）各々がそれぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）各々がそれぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）各々がヒトＥＧＦＲに結合し、且つ、各々が
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチドである第１ｓｃＦｖポリペプチドと第２ｓｃＦｖポリペプチド
を含み、且つ、前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合しており、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合している多機能性抗体である。
【００７０】
当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体は次のもの：
（ｉ）ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号３９）、
（ｉｉ）ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４０）、
（ｉｉｉ）ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ（配列番号４１）、および
（ｉｖ）ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４２）
からなる群より選択されるアミノ酸配列においてＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合する。
【００７１】
当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体はアミノ酸配列ｉ）ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号３９）、ｉｉ）ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４０）、ｉｉｉ）ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ（配列番号４１）、および／またはｉｖ）ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４２）においてＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合し得る。当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体はアミノ酸配列ＤＴＹＹＤＤ（配列番号４３）、ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４４）、ＦＩＮＦ（配列番号４５）、およびＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４６）の全てを特徴とする立体構造エピトープに結合し得る。当該発明の他の実施形態では前記多機能性抗体は
（ｉ）両方とも配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）両方とも配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む。
【００７２】
さらに、当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体は細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲのそれぞれＨＧＦ非依存的およびＥＧＦ非依存的な内部移行および／または分解を誘導する。
【００７３】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）各々がそれぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）各々がそれぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）各々がヒトＥＧＦＲに結合し、且つ、各々が
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチドである第１ｓｃＦｖポリペプチドと第２ｓｃＦｖポリペプチド
を含み、且つ、前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合しており、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合している多機能性抗体である。
【００７４】
当該発明の他の実施形態ではＥＧＦＲに結合する前記第１および第２ｓｃＦｖポリペプチドの各々が、ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、およびｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメインを含む。あるいは、ＥＧＦＲに結合する前記第１および第２ｓｃＦｖポリペプチドの各々が、ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、およびｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメインを含む。
【００７５】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）両方とも配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）両方とも配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）両方ともＥＧＦＲに結合し、且つ、両方とも
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチドである第１ｓｃＦｖポリペプチドと第２ｓｃＦｖポリペプチド
を含み、且つ、前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合しており、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合している多機能性抗体である。
【００７６】
当該発明の他の実施形態では前記第１および第２ｓｃＦｖポリペプチドは、ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、およびｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメインを含む。あるいは、両方のｓｃＦｖポリペプチドが、ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、およびｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメインを含む。
【００７７】
１つの実施形態では本発明は、
（ａ）２本の重鎖および２本の軽鎖を含み、且つ、次のもの：
（ｉ）ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号３９）、
（ｉｉ）ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４０）、
（ｉｉｉ）ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ（配列番号４１）、および
（ｉｖ）ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４２）
からなる群より選択されるアミノ酸配列においてＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合可能である抗体、および
（ｂ）ＥＧＦＲに結合可能であり、配列番号１７または配列番号１９の重鎖可変領域と配列番号１８または配列番号２０の軽鎖可変領域を含む２つのｓｃＦｖポリペプチド
を含む多機能性四価抗体であって、細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲの内部移行および／または分解を誘導する前記多機能性抗体を提供する。当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体はアミノ酸配列ｉ）ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号３９）、ｉｉ）ＩＳＣＧＳＶＮＲＧＴＣＱＲＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４０）、ｉｉｉ）ＡＬＧＡＫＶＬＳＳＶＫＤＲＦＩＮＦ（配列番号４１）、および／またはｉｖ）ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４２）においてＭＥＴのα鎖内のエピトープに結合し得る。当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体はアミノ酸配列ＤＴＹＹＤＤ（配列番号４３）、ＨＶＦＰＨＮＨＴＡＤＩＱＳ（配列番号４４）、ＦＩＮＦ（配列番号４５）、およびＫＥＴＫＤＧＦＭ（配列番号４６）の全てを特徴とする立体構造エピトープに結合し得る。さらに、当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体は細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲのそれぞれＨＧＦ非依存的およびＥＧＦ非依存的な内部移行および／または分解を誘導する。
【００７８】
本発明の１つの実施形態では、（ａ）各々がＥＧＦＲに結合可能である２つの同一のｓｃＦｖポリペプチド、および（ｂ）配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなるＭＥＴ−ＥＣＤに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）、およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに
それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
を含む前記抗体またはその抗原結合断片を含む多機能性四価抗体が提供される。
【００７９】
本発明の１つの実施形態では、（ａ）各々がＥＧＦＲに結合可能である２つの同一のｓｃＦｖポリペプチド、および（ｂ）２本の重鎖および２本の軽鎖を含み、且つ、ＭＥＴに結合可能であるＭＥＴ抗体を含む多機能性四価抗体であって、ＥＧＦＲに結合可能な前記２つの同一のｓｃＦｖポリペプチドがＣ末端でペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体にその完全長抗体の各重鎖のＣ末端で融合している前記多機能性四価抗体が提供される。本発明の幾つかの実施形態では両方とも抗ＭＥＴクローンＣ８−Ｈ２４１（国際公開第２０１０／０５９６５４号パンフレットに詳細が記載されている）に由来する配列番号２１の重鎖可変領域と配列番号２２の軽鎖可変領域を使用してＭＥＴに特異的に結合する前記ＭＥＴ抗体の抗原結合部位を形成することができる。
【００８０】
遺伝子合成および組換え分子生物学技術により配列番号１７のＨＣＶＲと配列番号１８のＬＣＶＲ、または配列番号１９のＨＣＶＲと配列番号２０のＬＣＶＲをｘ＝４、ｎ＝５である式（ＧｘＳ）ｎの高グリシンリンカーによって連結してＥＧＦＲに特異的に結合するｓｃＦｖを形成する。次にそのＥＧＦＲ結合性ｓｃＦｖを別の高グリシンリンカーによって抗ＭＥＴ抗体Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）の重鎖のＮ末端またはＣ末端に接続し、多機能性抗体ＮＨ−ＹＫ（抗ＥＧＦＲ  ＹＫｎ−ｓｃＦｖと抗Ｍｅｔ  ＨＣの融合体（すなわち、配列番号２７）を含む）、ＮＨ−Ｈ９（抗ＥＧＦＲ  Ｈ９ｎ−ｓｃＦｖと抗Ｍｅｔ  ＨＣの融合体（すなわち、配列番号２９）を含む）、ＹＫ（抗Ｍｅｔ  ＨＣと抗ＥＧＦＲ  ＹＫ−ｓｃＦｖの融合体（すなわち、配列番号３１）を含む）、およびＨ９（抗Ｍｅｔ  ＨＣと抗ＥＧＦＲ  Ｈ９−ｓｃＦｖの融合体（すなわち、配列番号５２）を含む）を作製する。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、（ａ）両方とも配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号５２、または配列番号５３のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチドである２つの第１ポリペプチド、および（ｂ）両方とも配列番号３３のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチドである２つの第２ポリペプチドを含み、ＭＥＴとＥＧＦＲに結合する多機能性抗体である。
【００８２】
本発明の別の実施形態は、（ａ）両方とも配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号５２、または配列番号５３のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチドである２つの第１ポリペプチド、および（ｂ）両方とも配列番号３３のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチドである２つの第２ポリペプチドを含み、ＭＥＴとＥＧＦＲに結合する多機能性抗体、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物である。
【００８３】
本発明の別の実施形態は癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に（ａ）両方とも配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号５２、または配列番号５３のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチドである２つの第１ポリペプチド、および（ｂ）両方とも配列番号３３のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチドである２つの第２ポリペプチドを含み、ＭＥＴとＥＧＦＲに結合する多機能性抗体の有効量を投与することを含む前記方法である。当該発明の幾つかの実施形態では前記癌はＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌である。当該発明の幾つかの実施形態では前記癌患者はヒトである。当該発明の他の実施形態ではその患者の腫瘍は１つ以上のＫＲＡＳ突然変異を有する細胞を含むことを特徴とする。本発明の他の実施形態では患者の腫瘍が低レベル、中レベル、または高レベルでＭＥＴおよび／またはＥＧＦＲを発現している癌、ならびに／または１種類以上の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブなど）および／もしくはＥＧＦＲの１種類以上の小分子阻害剤（例えば、エルロチニブ）に対して耐性である、または耐性になった腫瘍であって、ＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍を含むがこれらに限定されない腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする患者に薬学的有効量の前述の多機能性抗体のうちの１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片を投与することを含む前記方法を提供する。当該発明の様々な実施形態では患者の腫瘍が低レベル、中レベル、または高レベルでＭＥＴおよび／またはＥＧＦＲを発現している癌、ならびに／または１種類以上の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブなど）および／もしくはＥＧＦＲの１種類以上の小分子阻害剤（例えば、エルロチニブ）に対して耐性である、または耐性になった腫瘍であって、ＫＲＡＳ突然変異を有する腫瘍を含むがこれらに限定されない腫瘍を治療する前記方法は、ｓｅ前記多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片を患者に投与するステップの前に患者の腫瘍が発現するＭＥＴとＥＧＦＲのレベルを測定することによって、および／または患者の腫瘍が１つ以上のＫＲＡＳ突然変異を有する細胞を含んでいるか評価することによって癌の治療を必要とする患者を特定するステップをさらに含み得る。
【００８４】
下の表３は本発明のｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ融合体のアミノ酸配列の配列番号を示している。
【表３】
2017504608.tif 000005
上の表３に含まれているものを含み、本明細書においてｓｃＦｖに言及するときに使用される場合、下付き文字「ｎ」は抗ＥＧＦＲ  ＹＫ  ｓｃＦｖまたは抗ＥＧＦＲ  Ｈ９  ｓｃＦｖが前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合していることを表す。
【００８５】
本発明の追加の実施形態は、２つの同一の第１ポリペプチドと２つの同一の第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２７または配列番号２９であり、且つ、第２ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３３である多機能性抗体であって、ＥＧＦＲおよびＭＥＴに結合する前記多機能性抗体である。さらに、当該発明の様々な実施形態では前記多機能性抗体は細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲのそれぞれＨＧＦ非依存的およびＥＧＦ非依存的な内部移行および／または分解を誘導する。
【００８６】
標準的分子生物学技術を用いて組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、本発明の多機能性抗体を産生する単離宿主細胞株である形質転換体を選択し、これらの宿主細胞を培養し、その培地から前記抗体を回収する。
【００８７】
本発明は本発明の多機能性抗体を発現する宿主細胞にも関する。原核生物（細菌）発現系および真核生物発現系（酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳類および他の動物細胞、遺伝子導入動物、およびハイブリドーマ細胞など）を含む当技術分野において知られている多種多様な宿主発現系を使用して本発明の抗体を発現させることができる。
【００８８】
本発明の多機能性抗体は宿主細胞中での免疫グロブリンの組換え発現によって調製され得る。組換え技術によって宿主細胞中で抗体を発現させるためにはその多機能性抗体の軽鎖および／またはｓｃＦｖ重鎖融合体をコードするＤＮＡ断片を有する１つ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞に対して形質転換、形質導入、感染などを行う。その重鎖と軽鎖は１つのベクター内でそれらに機能的に結合している異なるプロモーターから独立的に発現してよく、あるいは、その重鎖と軽鎖は、１つは重鎖を発現し、１つは軽鎖を発現する２つのベクター内でそれらに機能的に結合している異なるプロモーターから独立的に発現してよい。所望によりその重鎖と軽鎖は異なる宿主細胞内で発現してもよい。それらの宿主細胞を培養している培地中に組換え抗体が分泌されることが好ましく、そこからそれらの抗体を回収または精製することができる。
【００８９】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子にそのＨＣＶＲをコードするＤＮＡを機能的に結合させることにより完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒトならびに他の哺乳類の重鎖定常領域遺伝子の配列が当技術分野において知られている。例えば標準的ＰＣＲ増幅によってこれらの領域を包含するＤＮＡ断片を得ることができる。重鎖定常領域はＫａｂａｔ（上掲）に記載されるあらゆるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）またはサブクラスの定常領域およびあらゆるそれらのアロタイプ変異体であり得る。
【００９０】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子にそのＬＣＶＲをコードするＤＮＡを機能的に結合させることにより完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒトならびに他の哺乳類の軽鎖定常領域遺伝子の配列が当技術分野において知られている。標準的ＰＣＲ増幅によってこれらの領域を包含するＤＮＡ断片を得ることができる。軽鎖定常領域はκ定常領域またはλ定常領域であり得る。
【００９１】
本発明の組換え発現ベクターは抗体重鎖遺伝子および／または軽鎖遺伝子に加えて宿主細胞内での抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を有する。「制御配列」という用語は抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御配列（例えば、ポリアデニル化シグナル）を必要に応じて含むものとする。制御配列の選択をはじめとする発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルのような因子に依存し得る。哺乳類宿主細胞での発現にとって好ましい制御配列にはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））および／またはポリオーマウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳類細胞において高レベルでタンパク質を発現するように仕向けるウイルス性配列が含まれる。
【００９２】
さらに、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内でそれらのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）および１つ以上の選択マーカー遺伝子などの追加の配列を有してよい。選択マーカー遺伝子はそのベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。例えば、選択マーカー遺伝子は典型的にはそのベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬品に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子にはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅についてｄｈｆｒマイナス宿主細胞で使用される）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびＧＳ陰性細胞株（ＮＳ０など）での選択／増幅のためのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）が含まれる。
【００９３】
軽鎖および／または重鎖の発現のために標準的技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン形質移入、形質導入、感染などによって宿主細胞に重鎖および／または軽鎖をコードする発現ベクターを導入する。原核宿主細胞または真核宿主細胞のどちらでも本発明の抗体を発現させることが理論的に可能であるが、真核細胞が好ましく、哺乳類宿主細胞が最も好ましい。それは、そのような細胞は正確に折り畳まれ、且つ、免疫活性が有る抗体を組み立て、分泌する可能性が高いからである。本発明の組換え抗体の発現にとって好ましい哺乳類宿主細胞にはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）［例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９：６０１−２１，  １９８２に記載されるようにＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０，  １９８０に記載されるｄｈｆｒマイナスＣＨＯ細胞を含む］、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２／０細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入する場合、それらの宿主細胞内で抗体を発現させるのに、またはより好ましくはそれらの宿主細胞を培養している培地の中に抗体を分泌させるのに充分な期間にわたってそれらの宿主細胞を当技術分野において知られている適切な条件下で培養することによってそれらの抗体が産生される。標準的精製方法を用いてその宿主細胞および／または培地から抗体を回収することができる。
【００９４】
完全な抗体の部分または断片、例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子を従来技術によって産生するために宿主細胞を用いることもできる。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のどちらかをコードするＤＮＡを宿主細胞に形質移入することが望ましい場合が有り得る。ＥＧＦＲおよびＭＥＴへの結合に必要ではない軽鎖および重鎖の一方または両方をコードするＤＮＡの幾らか、または全てを除去するために組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。そのような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の抗体によって包含される。
【００９５】
本発明は本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明の宿主細胞は本発明の核酸分子を含む１つ以上のベクターまたはコンストラクトを含む。例えば、本発明の宿主細胞は、本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドおよび／または本発明のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含む本発明のベクターが導入された細胞である。本発明は、１つは本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、１つは本発明の抗体に存在するＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、それらの遺伝子の高レベルの転写を誘起するためにそれぞれのポリヌクレオチドが（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来する、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御配列またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御配列などの）エンハンサー／プロモーター制御配列に機能的に結合している本発明の２つのベクターが導入された宿主細胞も提供する。
【００９６】
一旦発現したところで硫安沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィー、親和性（例えば、プロテインＡ）カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などをはじめとする当技術分野の標準的手法によって本発明の完全抗体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形を精製することができる。医薬用途には少なくとも約９０％、約９２％、約９４％または約９６％の均一性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、約９８％から約９９％またはそれより高い均一性が最も好ましい。所望により部分的に、または均一になるまで精製されたところで次にそれらの無菌抗体を本明細書において指示されるように治療に使用することができる。
【００９７】
「単離ポリヌクレオチド」という用語は本明細書において使用される場合にゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、または合成起源、またはそれらのある組合せを起源とするポリヌクレオチドを意味し、単離ポリヌクレオチドはその起源によって（１）本来その単離ポリヌクレオチドが中に見出されるポリヌクレオチドの全体または一部と結合していないポリヌクレオチド、（２）本来その単離ポリヌクレオチドが結合していないポリヌクレオチドに結合しているポリヌクレオチド、または（３）本来より長い配列の一部として生じていないポリヌクレオチドである。
【００９８】
「単離」多機能性抗体は特定され、且つ、その抗体の天然環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その抗体の天然環境の汚染混入成分はその抗体の診断上の利用または治療上の利用を妨げる物質であり、それらの汚染混入成分には酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では抗体は（１）ローリー法によって測定すると９５重量％を超える抗体にまで精製され、最も好ましくは９９重量％を超える抗体にまで精製され、（２）スピニングカップシーケネーターを使用してＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分な程度まで精製され、または（３）クマシーブルー、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、または好ましくは銀染色を使用する還元条件または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離抗体にはその抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので組換え細胞内のその場の抗体が含まれる。
【００９９】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」は存在する優勢な種である（すなわち、モル基準で組成中の他のあらゆる個々の種よりも多い）化合物または種を意味する。ある特定の実施形態では実質的に精製された組成物は存在する全ての巨大分子種のうちの（モル基準で）少なくとも約５０パーセントをその種が構成する組成物である。ある特定の実施形態では実質的に純粋な組成物はその組成物中に存在する全ての巨大分子種のうちの約８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超を構成する。ある特定の実施形態ではその種はほぼ均一になるまで精製され（従来の検出方法によって組成物中に汚染混入種を検出することができない）、その組成物は基本的に単一の巨大分子種からなる。
【０１００】
別の実施形態では本発明は配列番号２７、２９、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０１０１】
別の実施形態では本発明は配列番号２７、２９、および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
【０１０２】
本発明は治療に使用するための前述の抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片も提供する。
【０１０３】
本発明は癌の治療に使用するための前述の抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片も提供する。
【０１０４】
本発明はＭＥＴとＥＧＦＲの両方が発現する癌の治療に使用するための前述の抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片も提供する。
【０１０５】
本発明はＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、ブドウ膜黒色腫を含むがこれに限定されない黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌の治療に使用するための前述の抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片も提供する。
【０１０６】
本発明は、癌を治療する方法であって、それを必要とするヒト患者に前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片の有効量を投与することを含む方法も提供する。
【０１０７】
「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」（または「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）という用語は症状、障害、体調、または疾患の進行または重症度を遅滞化すること、中断すること、阻止すること、制御すること、停止させること、軽減すること、逆転させることを指すが、疾患に関連する全ての症状、体調、または障害の完全消失を必ずしも伴わない。
【０１０８】
「癌」（または「一つの癌」）という用語は、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頚部癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、大腸癌（ＣＲＣ）、食道癌、ブドウ膜黒色腫を含むがこれに限定されない黒色腫、肝臓癌、子宮頸部癌、膀胱癌、腎尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、上記の癌のうちのいずれかの難治性のものを含む癌、または上記の癌のうちの１つ以上の組合せなどの増殖性疾患を指す。
【０１０９】
「有効量」という語句は本明細書において使用される場合には所望の治療成果を達成するために必要な（投与量および期間および投与手段についての）量を指す。前記多機能性抗体の有効量は個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、および個体において所望の反応を誘発する前記抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片の能力などの因子に応じて変わり得る。有効量は前記抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片のどの有害作用よりも治療上有益な作用が勝る量でもある。
【０１１０】
有効量は対象に治療利益を与えるために必要な活性薬剤の少なくとも最少量であって全体として有害な量に満たない量である。別の言い方をすると、本発明の抗体の有効量または治療有効量は、哺乳類動物、好ましくはヒトにおいて癌細胞の数を減らし、腫瘍サイズを縮小し、周辺組織器官への癌細胞浸潤を抑制（すなわち、ある程度まで遅滞化、または停止）し、腫瘍転移を抑制（すなわち、ある程度まで遅滞化、または停止）し、腫瘍増殖をある程度まで抑制し、および／または癌に関連する症状のうちの１つ以上をある程度まで軽減する量である。本発明の抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体の有効量は単回投与または複数回投与で投与され得る。さらに、本発明の抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体の有効量は、一回より多くの回数で投与されない場合に有効量未満である量の複数回投与で投与され得る。
【０１１１】
医療分野ではよく知られているように、どの１人の対象についてもその投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間と投与経路、一般健康状態、および同時に投与されている他の薬品をはじめとする多くの因子に依存する。用量は疾患の種類と重症度に応じてさらに変わり得る。例えば、典型的な用量は約１ｍｇから約１００ｍｇ、好ましくは約２ｍｇから約１００ｍｇ、より好ましくは約５ｍｇから約１００ｍｇ、さらにより好ましくは約５ｍｇから約５０ｍｇ、さらにより好ましくは約５ｍｇから約２５ｍｇ、さらにより好ましくは約５ｍｇから約２０ｍｇ、さらにより好ましくは約５ｍｇから約１５ｍｇの範囲内であり得るが、しかしこの例となる範囲より下または上の用量が特に前述の因子を考慮して想定されている。一日非経口性投与計画は約１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまでであり得る。定期的評価によって経過をモニターしてよく、それによって用量が調節される。
【０１１２】
本発明の幾つかの実施形態では成人の患者の癌を治療するために本発明の多機能性抗体の一用量が静脈内投与され得る。静脈内投与の典型的な一用量は、例えば、約１００ｍｇから約１２５０ｍｇ、好ましくは約２００ｍｇから約１２５０ｍｇ、より好ましくは約５００ｍｇから約１２５０ｍｇ、さらにより好ましくは約７５０ｍｇから約１２５０ｍｇ、さらにより好ましくは約８００ｍｇから約１２５０ｍｇ、さらにより好ましくは、または最も好ましくは約８００ｍｇから約１０００ｍｇの範囲内であり得るが、しかしこの例となる範囲より下または上の用量が特に前述の因子を考慮して想定されている。あるいは、本発明の多機能性抗体の静脈内投与に典型的な一用量は、例えば、体重に対して約１０ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、より好ましくは約１２ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇまで、またはさらにより好ましくは約１２ｍｇ／ｋｇから約１３ｍｇ／ｋｇまでであり得る。そのような用量は、例えば、一週間に一回、二週間に一回、三週間に一回、または一カ月に一回静脈内投与され得る。定期的評価によって経過をモニターしてよく、それによって用量が調節される。
【０１１３】
これらの示唆された抗体の量は治療に関する幅広い裁量の対象である。適切な用量の選択およびスケジュール設定の重要な因子は得られる結果である。この文脈での考慮される因子には治療されている特定の障害、個々の患者の臨床状態、障害の原因、抗体の送達部位、特定の種類の抗体、投与方法、投与スケジュール設定、および医療従事者に知られている他の因子が含まれる。
【０１１４】
本発明の抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体は様々な経路で投与されるヒト医療の医薬として使用され得る。したがって、本発明は、前述の多機能性抗体のうちのいずれか１つまたはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。そのような組成物は非経口投与用であることが最も好ましい。非経口という用語は本明細書において使用される場合に静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、膣内投与、または腹腔内投与を含む。静脈内投与または腹腔内投与または皮下投与による非経口送達が好ましい。静脈内投与が最も好ましい。そのような投与に適切なベヒクルは当技術分野においてよく知られている。
【０１１５】
前記医薬組成物は典型的には、例えば、密封バイアル瓶、注射筒、または他の送達装置、例えば、ペンをはじめとする提供された容器内において製造条件下および貯蔵条件下で無菌および安定でなければならない。したがって、製剤の作製後にその医薬組成物を無菌濾過するか、あるいは微生物の汚染混入が無いようにしてよい。
【０１１６】
本発明の抗体は単体で、または薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤と共にヒト対象に単回投与または複数回投与で投与され得る。そのような医薬組成物は選択した投与モードに対して適切であるように設計されており、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、および／または分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、溶解剤、塩化ナトリウムを含むがこれに限定されない等張化剤、安定化剤などのような賦形剤が必要に応じて使用される。前記組成物は、例えば、一般的に医師に知られている製剤技術の大要を提供する  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  第１９版、  Ｇｅｎｎａｒｏ編，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ペンシルバニア州（１９９５年）において開示される従来技術に準じて設計され得る。医薬組成物に適切な担体には本発明の抗体と混合されたときにその分子の活性を保持し、且つ、対象の免疫系と反応しないあらゆる材料が含まれる。
【０１１７】
後続の非限定的な実施例は本多機能性抗体の様々な特性を例示する。
【実施例】
【０１１８】
参照例１
多機能性抗体ＮＨ−ＹＫの発現および精製
基本的に次のように多機能性抗体ＮＨ−ＹＫを発現および精製することができる。電気穿孔によりチャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ社、スラウ、英国）に形質移入するために（配列番号２７のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチドをコードする）配列番号２８と（配列番号３３の軽鎖アミノ酸配列をコードする）配列番号３４のＤＮＡを含むグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターを使用する。その発現ベクターはＳＶ早期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターとＧＳの遺伝子をコードする。ＧＳの発現によってＣＨＯＫ１ＳＶ細胞が必要とするアミノ酸であるグルタミン酸の生化学的合成が可能になる。形質移入後に５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシド（ＭＳＸ）を使用して細胞の一括選択を行う。選択強度を上昇させるためにＭＳＸによるＧＳの阻害を利用する。内在性レベルのＧＳを発現するＣＨＯＫ１ＳＶ野生型細胞に対して宿主細胞ゲノムの転写活性領域に発現ベクターｃＤＮＡが組み込まれている細胞を選択する。安定な発現細胞の近クローン性増殖を可能にするために形質移入されたプールを低密度で播種する。マスターウェルを多機能性抗体の発現についてスクリーニングし、次に必要に応じて無血清懸濁培養物にスケールアップしてよい。あるいは、一括選択した形質移入体を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または限界希釈のような単一細胞クローニング法の対象とし、多機能性抗体の発現についてスクリーニングすることができる。適切な細胞株が特定されたところでその細胞株を必要に応じて無血清懸濁培養物にスケールアップしてよい。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）またはトリス緩衝液（ｐＨ７．４）のような適合性緩衝液で平衡化されたプロテインＡ親和性カラムに多機能性抗体が分泌されている清澄化培地を負荷する。そのカラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。例えば、結合した多機能性抗体をｐＨ勾配（０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８から０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５〜３．０など）によって溶出する。例えば、多機能性抗体画分を２８０ｎｍでの吸光度カッティング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析サイズ排除によって検出および／または収集する。可溶性の凝集体および多量体は、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーをはじめとする一般的技術により効果的に除去され得る。一般的技術を用いてその多機能性抗体を濃縮および／または滅菌濾過することができる。これらのクロマトグラフィーステップの後のその多機能性抗体の純度は９０％より高く、好ましくは９８％より高い。その多機能性抗体をすぐに−７０℃で凍結してよく、または４℃で数か月間にわたって貯蔵してよい。
【０１１９】
多機能性抗体ＮＨ−Ｈ９の発現および精製
電気穿孔によりチャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ社、スラウ、英国）を形質移入するために（配列番号２９のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチドをコードする）配列番号３０および（配列番号３３の軽鎖アミノ酸配列をコードする）配列番号３４のＤＮＡを含むグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターを使用することを除いて基本的に上の参照例１．１において記載されるように多機能性抗体ＮＨ−Ｈ９を発現および精製することができる。
【０１２０】
多機能性抗体Ｈ９の発現および精製
電気穿孔によりチャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ社、スラウ、英国）を形質移入するために配列番号５２のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチドをコードするＤＮＡと（配列番号３３の軽鎖アミノ酸配列をコードする）配列番号３４のＤＮＡを含むグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターを使用することを除いて基本的に上の参照例１．１において記載されるように多機能性抗体Ｈ９を発現および精製することができる。
【０１２１】
多機能性抗体ＹＫの発現および精製
電気穿孔によりチャイニーズハムスター細胞株ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ社、スラウ、英国）ヲ形質移入スルタメニ配列番号３１ノアミノ酸配列ヲ有スル第１ポリペプチドヲコードスルＤＮＡト（配列番号３３ノ軽鎖アミノ酸配列ヲコードスル）配列番号３４ノＤＮＡヲ含ムグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターヲ使用スルコトヲ除イテ基本的ニ上ノ参照例１．１ニオイテ記載サレルヨウニ多機能性抗体Ｈ９ヲ発現オヨビ精製スルコトガデキル。
【０１２２】
実施例１：ＭＥＴとＥＧＦＲに対する多機能性抗体の結合分析
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス・ディビジョン、ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）のような表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して当技術分野において知られている方法に従って本明細書において開示される抗体などの抗体の結合カイネティクスおよび親和性を測定することができる。特記される場合を除き、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ社（ウプサラ、スウェーデン）から全ての試薬および材料を購入することができ、２５℃で測定を実施することができる。簡単に説明すると、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（重量／体積）の界面活性剤Ｐ−２０、および１０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．４）に試料を溶解することができる。捕捉方法論を活用するために４つ全てのフローセル（Ｆｃ）に固定化プロテインＡ（標準的ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを用いて作製され得る）を含むＣＭ５チップを使用することができる。最初に抗体試料をランニング緩衝液中に希釈して１ｍｃｇ／ｍＬに調製することができ、次に３０秒間にわたって１０μ／分の流速でそれらの試料の捕捉を試験することができる。捕捉された量に基づいて約７０ＲＵから９０ＲＵの間の捕捉量を標的とするように抗体濃度を調節することができる。ランニング緩衝液中に希釈することにより１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８、０．３９および０（ブランク）ｎＭの終濃度でＭＥＴ−ＥＣＤまたはヒトＥＧＦＲ−ＥＣＤを調製することができる。各分析サイクルは（１）別々のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３、およびＦｃ４）上での抗体試料の捕捉、（２）５０ｍｃＬ／分でのＦｃ全体への２５０ｍｃＬのＭＥＴ−ＥＣＤまたはＥＧＦＲ−ＥＣＤの注入（３００秒）、（３）解離相をモニターするための２０分間にわたる緩衝液流動への回帰、（４）２５ｍｃＬのグリシン、ｐＨ１．５の注入によるチップ表面の再生（３０秒）、（５）２５ｍｃＬのＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（すなわち、０．００５％の代わりに０．０５％（重量／体積）の界面活性剤Ｐ−２０を有するＨＢＳ−ＥＰ緩衝液）の注入によるチップ表面の平衡化（３０秒）から成り得る。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェア、バージョン２．０またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア、バージョン１．０を使用する二重参照と１：１結合モデルフィットを用いてデータを処理して結合速度（ｋｏｎ、Ｍ−１秒−１単位）、解離速度（ｋｏｆｆ、秒−１単位）、およびＲｍａｘ（ＲＵ単位）を決定することができる。平衡解離定数（ＫＤ）はＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎという関係から計算され得る。
【０１２３】
本発明の４種類の抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体を試験して基本的に上記のようにＭＥＴ−ＥＣＤおよびＥＧＦＲ−ＥＣＤに対するそれらの結合カイネティクスと結合親和性を決定した。それらの結果は下の表４および５に要約されている。抗体ＮＨ−ＹＫ、ＮＨ−Ｈ９、Ｈ９、およびＹＫは高い結合親和性（ＫＤ）でＭＥＴ−ＥＣＤ（表４）とＥＧＦＲ−ＥＣＤ（表５）の両方に結合する。
【表４】
2017504608.tif 000006
【表５】
2017504608.tif 000007
【０１２４】
実施例２：細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲの両方に対するＮＨ−ＹＫの結合
ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ４４１（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州；カタログ番号ＨＴＢ−１７４）は表面上にＭＥＴとＥＧＦＲの両方を発現する。Ｈ４４１細胞（６×１０６個）を１００ｍｍのポリ−Ｄ−リシン被覆組織培養ディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養してよい。その後、それらの細胞を１００ｎＭの対照ＩｇＧ４、１００ｎＭのセツキシマブと１００ｎＭの抗ＭＥＴ抗体の混合物、または１００ｎＭのＮＨ−ＹＫによって４℃で２０分間にわたって処理することができる。氷冷ＤＰＢＳでそれらの細胞を洗浄し、ＨＡＬＴプロテアーゼ・ホスファターゼ阻害剤（サーモ・サイエンティフィック社、ロックフォード、イリノイ州）を含むＣＨＡＰＳ溶解緩衝液を使用してそれらの細胞を溶解することができる。抗ＭＥＴアガロースまたは抗ＥＧＦＲセファロースを使用し、４℃で一晩インキュベートして６００μｇの各細胞溶解試料に対して免疫沈降（ＩＰ）を実施することができる。その樹脂を洗浄し、結合したタンパク質をその樹脂から溶出し、次に４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、ウェスタンブロット用のニトロセルロース膜にブロットすることができる。全ＭＥＴまたは全ＥＧＦＲについてその膜を探索することができる。
【０１２５】
基本的に上記のように実施された免疫沈降実験から、抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫによる処理の後にＭＥＴとＥＧＦＲが共沈降するが、抗ＭＥＴ抗体、セツキシマブ、またはさらに抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物のいずれかによる処理の後では共沈降しないことが示されている。これらのデータはＮＨ−ＹＫがＭＥＴとＥＧＦＲの両方に結合し得ることを表している（データは示されず）。
【０１２６】
実施例３：多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９は細胞表面のＭＥＴに対する上昇した結合活性を示す
ＮＳＣＬＣ癌細胞株ＨＣＣ８２７は高レベルのＭＥＴ発現を有する。簡単に説明すると、酵素フリー解離緩衝液を用いて細胞培養フラスコからＨＣＣ８２７細胞を外し、それらの細胞をウェル当たりおよそ５×１０５細胞の割合で９６ウェルプレートに添加することができる。その後、用量設定した非標識抗体（５００ｎＭから開始）がＡｌｅｘａ４８８標識抗ＭＥＴ抗体と細胞表面ＭＥＴへの結合について競合する能力を決定するためにそれらの非標識抗体を５ｎＭのその標識抗ＭＥＴ抗体と併用してそれらの細胞を４℃で１時間にわたって処理することができる。最終的には標識抗ＭＥＴ抗体の結合をＦＡＣＳにより検出することができる。
【０１２７】
基本的にこの実施例において説明されるように実施されるアッセイによって示されるように、抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はそれらの親抗ＭＥＴ抗体よりも明らかに高い結合活性を有する（表６）。
【表６】
2017504608.tif 000008
【０１２８】
実施例４：抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９は細胞表面のＥＧＦＲの内部移行と分解についてセツキシマブ投与よりも良好な活性を示す
パートＡ：ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ４４１は中レベルのＭＥＴとＥＧＦＲの両方をその細胞表面上に発現する。Ｈ４４１細胞から細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲを激減させる能力について抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体を試験することができる。簡単に説明すると、ウェル当たり２ｍＬの培地中の１．５×１０５細胞を６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養することができる。抗体ＮＨ−ＹＫ、ＮＨ−Ｈ９または対照抗体を５０ｎＭの濃度でＨ４４１細胞に添加することができる。終夜処理の後に酵素フリー解離緩衝液を使用してそれらの細胞をウェルから外し、次に（多機能性抗体処理または対照抗体処理とは異なるエピトープを認識する）標識したＥＧＦＲ抗体またはＭＥＴ抗体を使用してそれらの細胞を１時間にわたって染色することができる。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳにより標識化抗体染色について測定を行う。
【０１２９】
ＭＥＴとＥＧＦＲの分解をインビボで促進する抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９の能力を評価するため、基本的にこの実施例のパートＡに記載されているようにアッセイを実施した。これらの試験の結果から抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はその親抗ＭＥＴ抗体と同様にＨ４４１細胞から細胞表面ＭＥＴを激減させることが可能であることが示されている。しかしながら、驚くべきことに抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９は顕著なＥＧＦＲ分解を引き起こしたが、一方でセツキシマブまたは抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物はそうではなかった（表７）。
【０１３０】
パートＢ：ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ１９９３は高レベルのＭＥＴと中レベルのＥＧＦＲを発現し、胃癌細胞株ＭＫＮ４５は高レベルのＭＥＴと低レベルのＥＧＦＲを発現し、ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ４４１は中レベルのＭＥＴとＥＧＦＲの両方をその細胞表面上に発現する。簡単に説明すると、ウェル当たり２ｍＬの培地中の５×１０５細胞を６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養することができる。抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫ、ＮＨ−Ｈ９または対照抗体を１００ｎＭの濃度でそれらの細胞に添加することができる。終夜処理の後にそれらの細胞を溶解することができ、それぞれ１５μｇの各試料を４〜１２％のビストリスゲルに泳動し、ＰＶＤＦ膜にブロットすることができる。全ＥＧＦＲ、全ＭＥＴ、およびＧＡＰＤＨについて膜をウエスタンブロッティングにより探索することができる。
【０１３１】
ＭＥＴとＥＧＦＲの分解をインビトロで促進する抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９の能力を評価するため、基本的にこの実施例のパートＢに記載されているようにアッセイを実施した。これらの試験の結果から親抗ＭＥＴ抗体と同様に抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９によってＨ１９９３細胞、ＭＫＮ４５細胞、およびＨ４４１細胞からＭＥＴが分解されることが示されている。しかしながら、驚くべきことに抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９は顕著なＥＧＦＲ分解を引き起こすが、一方でセツキシマブまたは親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物はそうではなかった（図１）。
【表７】
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【０１３２】
実施例５：抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はＭＥＴとＥＧＦＲの両方の活性化を阻止する
パートＡ：ＮＳＣＬＣ癌細胞株Ｈ５９６はＨＧＦの存在下でＥＧＦＲ阻害剤の増殖阻害作用に対して耐性を有することが示されている。したがって、抗体がＨＧＦの存在下でＨ５９６細胞の増殖を阻害することができるか決定するためにこの細胞株を使用することができる。簡単に説明すると、ウェル当たり１００μＬの培地中の３×１０３細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養することができる。抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９または対照抗体を１００ｎＭ（終濃度）から始めて無血清培地中に１：３に希釈し、５０μＬ中の４倍濃度として５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（終濃度）と組み合わせてＨ５９６細胞に添加することができる。さらに６日の細胞増殖の最後にプレートを３０分間にわたって室温まで平衡化することができ、ウェル当たり１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、フィッツバーグ、ウィスコンシン州）を添加することができる。生物発光を測定することにより細胞生存度を決定することができる。
【０１３３】
基本的にこの実施例において説明されるように実施されたアッセイから抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はセツキシマブまたは親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物よりも良好にＨＧＦで刺激を受けたＨ５９６のインビトロ増殖を阻害することが示されている。
【表８】
2017504608.tif 000010
【表９】
2017504608.tif 000011
【表１０】
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【０１３４】
パートＢ：抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体が腫瘍細胞の増殖の阻害に関して２つの個々の抗体の混合物よりも優れた活性を有するかインビトロアッセイで決定するために他の腫瘍細胞株を使用してもよい。例えば、結腸癌細胞株ＧＥＯは中レベルのＭＥＴ発現を有しているにもかかわらず、ＥＧＦＲリガンド自己分泌活性化によって誘起されることが示されている。肺癌細胞株Ｈ１６６６はＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有し、その増殖はＥＧＦＲ活性化によって誘起されることが示されている。ＮＳＣＬＣ細胞株であるＨ１９９３とＥＢＣ−１の両方がＭＥＴ遺伝子の増幅に起因する高レベルのＭＥＴと中レベルのＥＧＦＲを発現する。
【０１３５】
基本的にこの実施例において説明されるように実施されたアッセイから抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はセツキシマブよりも良好に、驚くべきことにはそれらの親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物よりもさらに強力に結腸癌細胞株ＧＥＯのインビトロ増殖を阻害することが示されている（表９）。
【表１１】
2017504608.tif 000013
【０１３６】
同様に、表１０に示されている結果から抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫ、ＮＨ−Ｈ９、およびＨ９はそれぞれセツキシマブよりも良好に、および親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物よりも強力にＨ１６６６増殖を阻害することが示されている。
【表１２】
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【表１３】
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【０１３７】
同様に、表１１に示されている結果から抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はそれぞれそれらの親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物と同等以上に良好にＨ１９９３（表１１）とＥＢＣ−１（表１２）の増殖を阻害することが示されている。
【表１４】
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【表１５】
2017504608.tif 000017
【表１６】
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【表１７】
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【０１３８】
実施例６：抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はアポトーシスを誘導する
抗体によって誘導されるアポトーシスをアッセイするために胃癌細胞株ＭＫＮ４５を使用することができる。簡単に説明すると、ウェル当たり８０μＬの培地中の３×１０３細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養することができる。ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバッド、カリフォルニア州）を細胞培養培地に希釈し、ウェル当たり１０μＬの割合で添加することができる。ＮＨ−ＹＫ抗体、ＮＨ−Ｈ９抗体または対照抗体を１０μＬで１００ｎＭの終濃度になるように１０倍濃度としてＭＫＮ４５細胞に添加した。ＩＮＣＵＣＹＴＥ（商標）キネティック・イメージング・システム（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、アナーバー、ミシガン州）により総計で１２０時間にわたって３７℃、５％ＣＯ２の条件でカスパーゼ３／７陽性細胞を３時間の間隔でリアルタイム測定することができる。
【０１３９】
基本的にこの実施例において説明されるようにアッセイを実施することで測定されると、抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫおよびＮＨ−Ｈ９はそれぞれ親ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物よりもＭＫＮ４５のアポトーシスをインビトロで誘導する（表１３）。加えて、基本的にこの実施例において説明されるように実施されるアッセイではＮＨ−ＹＫはワン・アームド５Ｄ５とエルロチニブの混合物（データは示されず）よりも高い程度にまでＭＫＮ４５のアポトーシスを誘導する。
【表１８】
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【表１９】
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【０１４０】
実施例７：抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫはＨＧＦの存在下で腫瘍細胞のエルロチニブ感受性を復活させる
ＮＳＣＬＣ癌細胞株ＨＣＣ８２７はＥＧＦＲ遺伝子増幅および高いＭＥＴ発現を有する。ＨＣＣ８２７細胞はエルロチニブ処理に対して感受性であるが、ＨＧＦの存在下ではエルロチニブ処理に耐性になる。簡単に説明すると、ウェル当たり１００μＬの培地中の３×１０３細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養することができる。ＮＨ−ＹＫ抗体または対照抗体（ｈＩｇＧ４）を１時間にわたって細胞に添加し、続いてエルロチニブおよび／またはＨＧＦを５０ｎＭの抗体、５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、および１μＭのエルロチニブの終濃度になるように添加することができる。３７℃、９５％の相対湿度および５％（体積／体積）ＣＯ２でのさらに３日の細胞増殖の最後にプレートを３０分間にわたって室温まで平衡化することができ、ウェル当たり１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加することができる。オービタルシェーカー上でプレートを２分間にわたって振盪して内容物を混合し、その後に１０分間にわたって放置して室温でインキュベートして生物発光シグナルを安定化させることができる。生物発光を測定することにより細胞生存度を決定することができる。
【０１４１】
基本的にこの実施例において説明されるようにアッセイを実施することで測定されると、抗体ＮＨ−ＹＫはセツキシマブと組み合わせた親抗ＭＥＴ抗体よりも良好にＨＧＦの存在下でのＨＣＣ８２７細胞のエルロチニブ感受性をインビトロで復活させることができる（表１４）。
【表２０】
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【表２１】
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【０１４２】
実施例８：抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体ＮＨ−ＹＫはＨＧＦおよびＥＧＦで処理されたＨＴ−２９細胞のＢ−Ｒａｆ阻害剤であるＰＬＸ４０３２に対する感受性を復活させる
結腸癌細胞株ＨＴ−２９はＢ−Ｒａｆ突然変異を有し、且つ、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤であるＰＬＸ４０３２に対して感受性である。ＨＧＦおよびＥＧＦで刺激されるとＨＴ−２９細胞はＰＬＸ４０３２処理または汎Ｒａｆ阻害剤処理に対して耐性になる。ＨＧＦおよびＥＧＦで処理されたＨＴ−２９細胞のＰＬＸ４０３２阻害剤感受性を復活させる能力について抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体を試験することができる。簡単に説明すると、ウェル当たり１００μＬの培地中の３×１０３細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養することができる。抗体ＮＨ−ＹＫ、ＰＬＸ４０３２、ＨＧＦ、ＥＧＦ、陽性対照、および陰性対照を無血清培地中に希釈し、４倍濃度として５０μＬ中のＨＴ−２９細胞に添加した。試薬の終濃度は抗体については５０ｎＭ、ＨＧＦおよびＥＧＦについては５０ｎｇ／ｍＬ、およびＰＬＸ４０３２については１μＭから始まる１：５希釈物であり得る。さらに５日の細胞増殖の最後にプレートを３０分間にわたって室温まで平衡化することができ、ウェル当たり１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加することができる。生物発光を測定することにより細胞生存度を決定することができる。
【０１４３】
基本的にこの実施例において説明されるようにアッセイを実施することで測定されると、抗体ＮＨ−ＹＫはＨＧＦおよびＥＧＦで処理されたＨＴ−２９細胞のＰＬＸ４０３２感受性を復活させることができる（表１５）。加えて、抗体ＮＨ−ＹＫはＦａＤｕ細胞のラパチニブ（すなわち、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−２阻害剤）感受性の復活に関して親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物よりも優れている（表１６）。
【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【０１４４】
実施例９：マウス異種移植モデルにおけるＭＥＴとＥＧＦＲの分解
ＭＥＴとＥＧＦＲの分解をインビボで促進する抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体の能力は、当技術分野においてよく知られている方法に従ってＨ４４１（ＮＳＣＬＣ）およびＭＫＮ４５（胃癌）異種移植腫瘍を担持するマウスにおいて評価され得る。
【０１４５】
２つの異なる用量レベル（１０ｍｇ／ｋｇと２７ｍｇ／ｋｇ）での抗体ＮＨ−ＹＫの投与によりＨ４４１異種移植片において投与から４８時間後に親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物（両方とも２０ｍｇ／ｋｇで投与）と同等のレベルでＭＥＴの分解が誘導された。対照的に、親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物（両方とも２０ｍｇ／ｋｇで投与）は同じ異種移植モデルにおけるＰＢＳ処置対照動物と比較するとＥＧＦＲ分解の誘導に失敗した。驚くべきことに、ＰＢＳで処置されたマウスまたは親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブ（両方とも２０ｍｇ／ｋｇで投与）で処置されたマウスのどちらかと比較すると、抗体ＮＨ−ＹＫの投与によって顕著なＥＧＦＲ分解が引き起こされた。同様に、ＭＫＮ４５胃異種移植片を担持する動物では抗体ＮＨ−ＹＫによって親抗ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物（両方とも２０ｍｇ／ｋｇで投与）と比較すると同等のＭＥＴの分解が引き起こされたが、驚くべきことにさらに増大したＥＧＦＲの分解が引き起こされた。
【０１４６】
実施例１０：ＮＳＣＬＣのマウス異種移植モデル（Ｈ１９９３、Ｈ４４１、ＥＢＣ−１）および胃癌における腫瘍増殖の阻害
６〜７週齢のメスの胸腺欠損ヌードマウスが、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（インディアナポリス、インディアナ州）のものを含み、市販されている。それらマウスを１週間にわたって順応させ、通常の低脂肪（４．５％）食を自由に食べさせ、その食餌を試験期間中にわたって継続することができる。腫瘍細胞はＡＴＣＣから購入可能であり、Ｌ−グルタミン、１０％のＦＢＳと１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが添加された２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などの細胞培養培地中に培養可能である。    細胞を脱着させ、無血清培地で洗浄し、その後で無血清ＲＰＭＩ１６４０中に５０×１０６細胞／ｍＬの終濃度で再懸濁することができる。無血清増殖培地とマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）の１：１混合物の中のおよそ５×１０６個の腫瘍細胞を対象マウスの横腹に皮下注射することができる。腫瘍重量と体重の測定を週に２回実施する。処理の前にランダム化アルゴリズムを用いて腫瘍サイズに基づいてマウスをランダム化することができる。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したところで処理を開始することができる。ランダム化マウスは異なる群に分けられ、週に１回尾静脈注射を介して抗体を投与された。
【０１４７】
投与前に全ての試験抗体または対照抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製する。カリパス測定によって腫瘍サイズを決定することができる。腫瘍体積（ｍｍ３）を式Ａ２×Ｂ×０．５３６から推定することができ、その式では直角をなしている直径のうちの小さい方がＡであり、大きい方がＢである。時間および処理群にわたる分散を一様にするために腫瘍体積データを対数スケールに変換することができる。ＳＡＳ  ＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ社、ケーリー、ノースカロライナ州）を使用して二要因反復測定ＡＮＯＶＡにより時間および処理に関して対数体積データを分析することができる。各時点で処理群を指定した対照群と比較する。
【０１４８】
パートＡ：Ｈ１９９３  ＮＳＣＬＣ異種移植片を担持する免疫不全マウスを上のこの実施例において説明されるように作製し、連続５週間にわたって週に一度ベヒクル対照、抗体ＮＨ−ＹＫ、または親ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物のいずれかで処理した。平均ベヒクル対照腫瘍体積で除算した平均処置腫瘍体積のパーセンテージ（Ｔ／Ｃ％）の値が親ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物（両方とも２０ｍｇ／ｋｇで投与）によって８６．１％になり、一方で等モル用量の抗体ＮＨ−ＹＫ（２７ｍｇ／ｋｇ）によって腫瘍体積が有意に著しく減少した（２８．５％のＴ／Ｃ％、ｐ＜０．００１）（図２）。Ｈ４４１異種移植片で試験したときも抗体ＮＨ−ＹＫはベヒクル対照または親ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物のどちらかと比較すると優れた効力を示した（図３）。
【０１４９】
パートＢ：ＥＢＣ−１  ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいて抗体ＮＨ−ＹＫを用いる処理（１０ｍｐｋ）によって３２．９％のＴ／Ｃ％が生じた（ｐ＜０．００１）（図４）。
【０１５０】
パートＣ：胃癌細胞株ＭＫＮ４５は高レベルのＭＥＴ遺伝子増幅を有し、且つ、ＭＥＴ阻害剤に対して非常に感受性である。ＭＫＮ４５胃異種移植モデルでは抗体ＮＨ−ＹＫは親ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物と同等の抗腫瘍効力を示した（それぞれＴ／Ｃ％＝１７．４％、ｐ<０．００１と１８．６％、ｐ<０．００１）（図５）。
【０１５１】
パートＤ：Ｈ１９９３  ＮＳＣＬＣ異種移植モデルでは異種移植片を担持する免疫不全マウスは、連続５週間にわたって週に一度ベヒクル対照、抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体Ｈ９（４ｍｇ／ｋｇおよび２７ｍｇ／ｋｇ）、抗ＭＥＴのみ（３ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）、セツキシマブ（３ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ＭＥＴとセツキシマブの混合物（それぞれの抗体について３ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処理された。２７ｍｇ／ｋｇの抗ＭＥＴ／ＥＧＦＲ多機能性抗体Ｈ９によって他のあらゆる処理よりも有意に高い抗腫瘍作用が生じた（ｐ＜０．００１）（図６）。
【０１５２】
Ｈ４４１異種移植片で試験したときも抗体Ｈ９は個々の処理または親ＭＥＴ抗体とセツキシマブの混合物と比較すると優れた効力を示した（図７）。
【０１５３】
実施例１１：大腸癌の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける腫瘍増殖の阻害
患者由来大腸癌試料を調達することができ、個々の患者に由来する腫瘍断片を一匹の免疫不全マウスに移植し、その腫瘍断片がおよそ１００〜２００ｍｍ３の体積に到達するまで増殖させることができる。ｋｇ当たり２７ｍｇの抗体ＮＨ−ＹＫまたはベヒクル対照を連続３〜４週間にわたって週に１回投与してよい。電気式カリパスにより腫瘍を週に２回測定してよい。体重も定期的に評価することができる。ベヒクル対照群は４回のサイクルにわたって週に１回のスケジュールで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与されるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって処置され得る。腫瘍体積を式Ａ２×Ｂ×０．５３６を用いて算出することができ、その式では直角をなしている直径のうちの小さい方がＡであり、大きい方がＢである。
【０１５４】
２人の患者に由来する大腸癌腫瘍試料を基本的に上の実施例１１において説明されているように２匹の異なる免疫不全マウスにそれぞれ移植した。表１７および１８に示されているように、ＰＤＸ腫瘍を有するベヒクル処置動物と比較すると毎週の抗体ＮＨ−ＹＫの投与によってＰＤＸ腫瘍のそれぞれの体積が著しく減少した。
【表２６】
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【表２７】
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【０１５５】
実施例１２：頭頚部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける腫瘍増殖の阻害
患者由来頭頚部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）試料を調達することができ、個々の患者に由来する腫瘍断片を一匹の免疫不全マウスに移植し、その腫瘍断片がおよそ１００〜２００ｍｍ３の体積に到達するまで増殖させることができる。ｋｇ当たり２７ｍｇの抗体ＮＨ−ＹＫまたはベヒクル対照を連続４週間にわたって週に２回投与してよい。電気式カリパスにより腫瘍を週に２回測定してよい。体重も定期的に評価することができる。ベヒクル対照群は４回のサイクルにわたって週に１回のスケジュールでｉ．ｐ．注射により投与されるＰＢＳと２８回のサイクルにわたって日に１回の強制経口（ｐ．ｏ．）投与される２０％ＰＥＧ４００／８０％［蒸留脱イオン水中の２０％キャプティソル］によって処置され得る。腫瘍体積は次の式を用いて算出され得る：腫瘍体積（ｍｍ３）＝幅２×長さ×０．５２。
【０１５６】
２人の患者に由来する頭頚部扁平上皮癌腫瘍試料を基本的に上の実施例１２において説明されているように２匹の異なる免疫不全マウスにそれぞれ移植した。表１９に示されているように、ＰＤＸ腫瘍を有するベヒクル処置動物と比較すると週に２回の抗体ＮＨ−ＹＫの投与によってＰＤＸ腫瘍の体積が著しく減少した。
【表２８】
2017504608.tif 000030
【０１５７】
実施例１３：エルロチニブ耐性ＮＳＣＬＣ（エルロチニブ耐性ＨＣＣ−８２７）のマウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖の阻害
６〜７週齢のメスの胸腺欠損ヌードマウスが、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（インディアナポリス、インディアナ州）のものを含み、市販されている。それらマウスを１週間にわたって順応させ、通常の低脂肪（４．５％）食を自由に食べさせ、その食餌を試験期間中にわたって継続することができる。ＨＣＣ−８２７腫瘍細胞はＡＴＣＣから購入可能であり、Ｌ−グルタミン、１０％のＦＢＳと１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが添加された２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０などの細胞培養培地中に培養可能である。細胞を脱着させ、無血清培地で洗浄し、その後で無血清ＲＰＭＩ１６４０中に５０×１０６細胞／ｍＬの終濃度で再懸濁することができる。無血清増殖培地とマトリゲルの１：１混合物の中のおよそ５×１０６個の生存腫瘍細胞をメス胸腺欠損ヌードマウスの横腹に皮下移植することができる。一旦腫瘍が構築されたところで耐性腫瘍がエルロチニブの存在下であっても再増殖し始めるまで日に２５ｍｇ／ｋｇの用量のエルロチニブでそれらのマウスを処置することができる。耐性腫瘍がおよそ１０００ｍｍ３の平均体積に達したところでそれらの腫瘍を切り出し、５０ｍｍ３の断片に分割し、且つ、対象メス胸腺欠損ヌードマウスに再移植することができる。再増殖をモニターするため、腫瘍重量と体重の測定を週に２回実施することができる。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したところでランダム化アルゴリズムを用いて動物をランダム化し、処理群に分けた。抗体をＰＢＳに希釈し、および週に１回尾静脈注射を介して投与した。腫瘍がエルロチニブ耐性であることを確実にするため、対照群の動物はＰＢＳベヒクルとｋｇ当たり２５ｍｇのエルロチニブを受容した。電気式カリパスにより腫瘍体積（ｍｍ３）を決定した。腫瘍体積を式Ａ２×Ｂ×０．５３６から推定することができ、その式では直角をなしている直径のうちの小さい方がＡであり、大きい方がＢである。
【０１５８】
エルロチニブ耐性ＨＣＣ−８２７  ＮＳＣＬＣ異種移植片を担持する免疫不全マウスを上のこの実施例において説明されるように作製し、（Ａ）ベヒクルと２５ｍｇ／ｋｇエルロチニブ（すなわち、対照群）、（Ｂ）２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブと２７ｍｇ／ｋｇの抗体ＮＨ−ＹＫの混合物、（Ｃ）２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブと２０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブの混合物、（Ｄ）２０ｍｇ／ｋｇで投与される親ＭＥＴ抗体と２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブの混合物、または（Ｅ）２０ｍｇ／ｋｇで投与される親ＭＥＴ抗体、２０ｍｇ／ｋｇで投与されるセツキシマブ、および２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブの混合物のいずれかで処理した。抗体ＮＨ−ＹＫとエルロチニブの混合物（すなわち、処理群（Ｂ））により、他の全ての処理群と比較すると同じ期間またはそれより長い期間の後に絶対腫瘍体積が著しく減少した（表２０）。したがって、エルロチニブ耐性腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖は、特にＰＢＳベヒクル、セツキシマブ、または親ＭＥＴ抗体と組み合わせてエルロチニブで処理された動物と比較すると、エルロチニブと組み合わせた抗体ＮＨ−ＹＫによる処理によって著しく低下する。エルロチニブと組み合わせた抗体ＮＨ−ＹＫ（Ｂ）はエルロチニブ、セツキシマブおよび親ＭＥＴ抗体の混合物（Ｅ）と比較すると優れた抗腫瘍作用も示した。
【表２９】
2017504608.tif 000031
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017504608.tif 000038
【配列表】
2017504608000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月20日(2016.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖、および
（ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）ＥＧＦＲに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）またはＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチド
を含む多機能性抗体。
【請求項２】
前記ｓｃＦｖポリペプチドが
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項１に記載の多機能性抗体。
【請求項３】
前記重鎖が配列番号５３のアミノ酸配列を含み、且つ、前記軽鎖が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項２の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項４】
前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合する、請求項１から請求項３の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項５】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む請求項１から請求項４の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項６】
前記重鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、且つ、前記軽鎖が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項５の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項７】
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ａ）各々がそれぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｂ）各々がそれぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、請求項１から請求項６の何れか一項に記載の多機能性抗体。
【請求項８】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）またはＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）ＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）またはＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項７に記載の多機能性抗体。
【請求項９】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、請求項８に記載の多機能性抗体。
【請求項１０】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の多機能性抗体。
【請求項１１】
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ｉ）各々が配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）各々が配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、請求項１０に記載の多機能性抗体。
【請求項１２】
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合し、且つ、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合する、請求項１１に記載の多機能性抗体。
【請求項１３】
２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２７であり、且つ、両方の第２ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３３である、請求項１２に記載の多機能性抗体。
【請求項１４】
請求項１から請求項１３の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
治療に使用するための請求項１から請求項１３の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
【請求項１６】
癌の治療に使用するための請求項１から請求項１３の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
【請求項１７】
ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌の治療に使用するための請求項１から請求項１３の何れか一項に記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
エルロチニブ耐性ＨＣＣ−８２７  ＮＳＣＬＣ異種移植片を担持する免疫不全マウスを上のこの実施例において説明されるように作製し、（Ａ）ベヒクルと２５ｍｇ／ｋｇエルロチニブ（すなわち、対照群）、（Ｂ）２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブと２７ｍｇ／ｋｇの抗体ＮＨ−ＹＫの混合物、（Ｃ）２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブと２０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブの混合物、（Ｄ）２０ｍｇ／ｋｇで投与される親ＭＥＴ抗体と２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブの混合物、または（Ｅ）２０ｍｇ／ｋｇで投与される親ＭＥＴ抗体、２０ｍｇ／ｋｇで投与されるセツキシマブ、および２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブの混合物のいずれかで処理した。抗体ＮＨ−ＹＫとエルロチニブの混合物（すなわち、処理群（Ｂ））により、他の全ての処理群と比較すると同じ期間またはそれより長い期間の後に絶対腫瘍体積が著しく減少した（表２０）。したがって、エルロチニブ耐性腫瘍を有するマウスにおける腫瘍増殖は、特にＰＢＳベヒクル、セツキシマブ、または親ＭＥＴ抗体と組み合わせてエルロチニブで処理された動物と比較すると、エルロチニブと組み合わせた抗体ＮＨ−ＹＫによる処理によって著しく低下する。エルロチニブと組み合わせた抗体ＮＨ−ＹＫ（Ｂ）はエルロチニブ、セツキシマブおよび親ＭＥＴ抗体の混合物（Ｅ）と比較すると優れた抗腫瘍作用も示した。
【表２９】
2017504608.tif 000039
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
（ａ）ＭＥＴに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖、および
（ｉｉ）それぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖
を含む抗体、および
（ｂ）ＥＧＦＲに結合し、且つ、
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、Ｘ１がＹまたはＷであり、且つ、Ｘ２がＫまたはＴであるＶＩＸ１ＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＸ２Ｇ（配列番号９）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、Ｘ１がＲまたはＹであり、Ｘ２がＫまたはＳであり、且つ、Ｘ３がＥまたはＲであるＸ１ＹＡＸ２Ｘ３ＳＩＳ（配列番号１０）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含むｓｃＦｖポリペプチド
を含む多機能性抗体。
［２］
ＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖが
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、［１］に記載の多機能性抗体。
［３］
前記ｓｃＦｖポリペプチドが
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、［１］または［２］に記載の多機能性抗体。
［４］
前記重鎖が配列番号５３のアミノ酸配列を含み、且つ、前記軽鎖が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、［１］から［３］の何れかに記載の多機能性抗体。
［５］
前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合する、［１］から［３］の何れかに記載の多機能性抗体。
［６］
配列番号２５のアミノ酸配列を含む［１］から［５］の何れかに記載の多機能性抗体。
［７］
前記重鎖が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、且つ、前記軽鎖が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、［１］から［６］の何れかに記載の多機能性抗体。
［８］
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ａ）各々がそれぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｂ）各々がそれぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、［１］から［７］の何れかに記載の多機能性抗体。
［９］
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＹＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＫＧ（配列番号２）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）ＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＲＹＡＫＥＳＩＳ（配列番号５）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、［８］に記載の多機能性抗体。
［１０］
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、［９］に記載の多機能性抗体。
［１１］
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々配列番号２３のアミノ酸配列を含む、［１０］に記載の多機能性抗体。
［１２］
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ｉ）各々が配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）各々が配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、［１１］に記載の多機能性抗体。
［１３］
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合し、且つ、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合する、［１２］に記載の多機能性抗体。
［１４］
２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２７であり、且つ、両方の第２ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３３である、［１３］に記載の多機能性抗体。
［１５］
前記多機能性抗体によって細胞表面のＭＥＴとＥＧＦＲの内部移行および／または分解が誘導される、［１］から［１４］の何れかに記載の多機能性抗体。
［１６］
ＥＧＦＲに結合する前記ｓｃＦｖが
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、［１］に記載の多機能性抗体。
［１７］
前記ｓｃＦｖポリペプチドが
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、［１６］に記載の多機能性抗体。
［１８］
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖、および
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、［１６］から［１７］の何れかに記載の多機能性抗体。
［１９］
前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記ＭＥＴ抗体重鎖のＮ末端に融合する、［１６］から［１８］の何れかに記載の多機能性抗体。
［２０］
配列番号２６のアミノ酸配列を含む［１６］から［１９］の何れかに記載の多機能性抗体。
［２１］
（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列、および
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列
を含む［１６］から［２０］の何れかに記載の多機能性抗体。
［２２］
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ａ）両方ともそれぞれＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１１）、ＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＡＮＷＬＤＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｂ）両方ともそれぞれＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨ（配列番号１４）、ＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１５）およびＱＶＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、［２１］に記載の多機能性抗体。
［２３］
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ｉ）それぞれＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨ（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＧ（配列番号７）、およびＡＲＡＬＤＹＹＤＹＤＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ２、およびｓｃＦｖ−ＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）それぞれＲＡＳＹＳＩＧＴＮＩＨ（配列番号４）、ＹＹＡＳＲＳＩＳ（配列番号８）、およびＱＱＮＮＡＷＰＴＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ  ＣＤＲであるｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ１、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ２、ｓｃＦｖ−ＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、［２２］に記載の多機能性抗体。
［２４］
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲドメイン
を含む、［２３］に記載の多機能性抗体。
［２５］
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドと前記第２ｓｃＦｖポリペプチドが各々配列番号２４のアミノ酸配列を含む、［２４］に記載の多機能性抗体。
［２６］
ＭＥＴに結合する前記抗体が
（ｉ）両方とも配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖である第１重鎖と第２重鎖、および
（ｉｉ）両方とも配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖である第１軽鎖と第２軽鎖
を含む、［２５］に記載の多機能性抗体。
［２７］
前記第１ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第１重鎖のＮ末端に融合し、且つ、前記第２ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端がペプチドリンカーを介して前記第２重鎖のＮ末端に融合する、［２６］に記載の多機能性抗体。
［２８］
２つの第１ポリペプチドと２つの第２ポリペプチドを含み、両方の第１ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２９であり、且つ、両方の第２ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３３である、［２７］に記載の多機能性抗体。
［２９］
［１］から［２８］の何れかに記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物。
［３０］
治療に使用するための［１］から［２８］の何れかに記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
［３１］
癌の治療に使用するための［１］から［２８］の何れかに記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
［３２］
ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌の治療に使用するための［１］から［２８］の何れかに記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
［３３］
ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌であって、１つ以上のＫＲＡＳ突然変異を有する細胞を含むことを特徴とする前記癌の治療に使用するための［１］から［２８］の何れかに記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片。
［３４］
癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に［１］から［２８］の何れかに記載の多機能性抗体またはそのＭＥＴおよびＥＧＦＲ結合断片の有効量を投与することを含む前記方法。
［３５］
前記癌がヒトにおけるＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、胃癌、大腸癌、胆管癌、食道癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸部癌、または頭頚部癌である、［３４］に記載の方法。
［３６］
前記腫瘍が１つ以上のＫＲＡＳ突然変異を有する細胞を含むことを特徴とする、［３４］または［３５］に記載の方法。
［３７］
配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
［３８］
配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
［３９］
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むＤＮＡ分子。
［４０］
［３７］から［３９］の何れかに記載のＤＮＡ分子によって形質転換された哺乳類細胞であって、配列番号２７のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチドおよび配列番号３３のアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドを含む多機能性抗体を発現することが可能である前記細胞。
［４１］
前記哺乳類細胞がＣＨＯである、［４０］に記載の哺乳類細胞。
［４２］
アミノ酸配列が配列番号２７である第１ポリペプチドとアミノ酸配列が配列番号３３である第２ポリペプチドを含む多機能性抗体の生産方法であって、（１）前記多機能性抗体が発現するような条件下で［４０］または［４１］に記載の哺乳類細胞を培養すること、および（２）発現した前記多機能性抗体を回収することを含む前記方法。
［４３］
［４２］に記載の方法によって生産された、ＭＥＴとＥＧＦＲに結合する多機能性抗体。
【国際調査報告】
2017504608.tif 000040
2017504608.tif 000041
2017504608.tif 000042