(57)【要約】本発明は、脂肪前駆細胞及び脂肪細胞を多能性幹細胞、特に誘導多能性幹細胞からインビトロで作製するための方法と、そうして得た脂肪前駆細胞及び脂肪細胞の、治療又はスクリーニングを目的とした使用とに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの脂肪前駆細胞作製のための方法であって、
多能性幹細胞を接着培養系において無血清培養培地中で培養するステップと、
前記多能性幹細胞を、中胚葉分化培地に、中胚葉前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
前記中胚葉前駆細胞を、脂肪細胞分化培地に、脂肪前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
任意的に、このようにして取得した前記脂肪前駆細胞を収集するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞は誘導多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中胚葉分化培地は、好ましくはアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ−４タンパク質、ＢＭＰ−２タンパク質、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する１以上のモルフォゲンを含む無血清培養培地である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記中胚葉分化培地は、
（ｉ）アクチビンＡ及びアクチビンＢからなる群より選択されるモルフォゲン、好ましくはアクチビンＡと、
（ｉｉ）ＢＭＰ−４タンパク質、ＢＭＰ−２タンパク質、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択されるモルフォゲン、好ましくはＢＭＰ−４タンパク質と、を含有する無血清培養培地である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記無血清培養培地は造血細胞培養に適した培地である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞は、細胞が約５０％〜約９０％コンフルエントに達するときに前記中胚葉分化培地に接触させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記脂肪細胞分化培地は、インスリン、その類似体の１つ、又はＩＧＦ−１と、グルココルチコイドと、細胞内環状アデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）を増加させる薬剤とを含有する培養培地である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記脂肪細胞分化培地は、インスリン、デキサメタゾン、及び３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪細胞分化培地はインドメタシンをさらに含有する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の方法により取得した前記脂肪前駆細胞を、脂肪細胞成熟培地に、脂肪細胞を取得するまで接触させるステップを含む、インビトロでの脂肪細胞作製のための方法。
【請求項１１】
前記脂肪細胞成熟培地はインスリンを含む培養培地である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リポジストロフィーの処置に使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により取得した脂肪前駆細胞、又は請求項１０若しくは１１に記載の方法により取得した脂肪細胞。
【請求項１３】
空腹時高血糖症、耐糖能異常（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、特に２型糖尿病である糖尿病、及びインスリン抵抗性からなる群より好ましくは選択される血糖コントロール異常の処置、又は肥満若しくはリポジストロフィー症候群と任意的に関連した脂質異常症の処置に使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により取得した脂肪前駆細胞、又は請求項１０若しくは１１に記載の方法により取得した脂肪細胞。
【請求項１４】
インビトロでの前記脂肪前駆細胞又は前記脂肪細胞の作製に用いられる前記多能性幹細胞は、処置される対象の体細胞、好ましくは線維芽細胞から取得した誘導多能性幹細胞である、請求項１２又は１３に記載の使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により取得した脂肪前駆細胞、又は請求項１０若しくは１１に記載の方法により取得した脂肪細胞。
【請求項１５】
インビトロでの脂肪前駆細胞又は脂肪細胞の作製のためのキットであって、
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する１以上のモルフォゲンを含有する第１の容器と、
（ｉ）インスリン、その類似体のうちの１つ、又はＩＧＦ−１、（ｉｉ）グルココルチコイド、及び（ｉｉｉ）細胞内環状アデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）を増加させる薬剤を含有する第２の容器と、
任意的に、インスリンを含有する第３の容器と、を含むキット。
【請求項１６】
前記第１の容器はアクチビンＡ及び／又はＢＭＰ−４を含有し、
前記第２の容器はインスリン、デキサメタゾン、及びＩＢＭＸ、並びに任意的にインドメタシンを含有する、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によるインビトロでの脂肪前駆細胞作製、又は請求項１０若しくは１１に記載の方法によるインビトロでの脂肪細胞作製のための、請求項１５又は１６に記載のキットの使用。
【請求項１８】
脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子をスクリーニングするための方法であって、
請求項１０又は１１に記載の方法により取得した前記脂肪細胞を１以上の候補分子に接触させるステップと、
前記脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子を選択するステップと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪前駆細胞及び脂肪細胞のインビトロでの作製のための新規の方法と、そのように作製された細胞を用いた治療的使用及びスクリーニング方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己再生及びインビトロで分化する能力を有する細胞として定義される。胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ、ＥＳ）細胞と誘導多能性幹（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ、ｉＰＳ）細胞とからなる多能性幹細胞は、理論上は無限に増殖可能であり、インビトロでほぼすべての細胞型を生じることができる。
【０００３】
誘導多能性幹細胞は、山中氏のチームにより、ヒト線維芽細胞から２００７年に作製された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、２００７年）。この細胞型は、体細胞に多能性遺伝子（Ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４など）を導入することで作製される。そして、これらの細胞は、多能性に関わる２つのタンパク質であるＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧを発現するその能力について選択される（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、２００７年；Ｙｕ他、２００７年）。ｉＰＳ細胞は、その形態、遺伝子発現、及びエピジェネティックな状態について、ＥＳ細胞と同様の特性を有する。ｉＰＳ細胞は、インビトロ及びインビボにおいて、内胚葉、外胚葉、中胚葉の３胚葉に分化可能である。
【０００４】
ｉＰＳ細胞は、患者細胞の初代培養由来の既存のモデルとは異なり、発生の初期段階を再現できるという有利性がある。さらに、ｉＰＳ細胞は、ドナー患者の遺伝的背景全体を有し、従って遺伝的疾患の生理病理学の研究に優れたモデルとなる。実際に、それらの病態の要因となる異常性は、インビトロでのｉＰＳ細胞分化の種々の段階において、細胞レベルで示されることが可能である。最後に、種々の分化段階のｉＰＳ細胞は、インビトロでの新規の治療用分子のテストに使用可能であり（Ｙａｍａｎａｋａ、２０１０年）、再生医療の文脈における新規の細胞治療の発展について期待されている。
【０００５】
ゆえに、これらの細胞は、正常又は病的細胞機能の研究材料の実質的に無限のソースを成す。しかしながら、これらの機構の理解にあたって、対象の成熟細胞を作製するための堅固で効果的なプロトコルを確立することが主な障害になっている。
【０００６】
脂肪細胞は、トリグリセリド形態でエネルギーを貯蔵することに特化した器官である脂肪組織の機能的ユニットとして定義される。脂肪組織は、長期的に動かされることができるエネルギーの唯一の蓄えをなし、哺乳類のエネルギーバランスの制御において重要な役割を果たす。ゆえに、脂肪組織内の脂肪貯蔵の欠陥は重大な代謝障害をもたらすものであり、その有病率は一定して増加している。さらに、脂肪細胞は、インシュリン感受性、炎症、免疫機能、及び血圧の調節など、全身性調節に関わる多くの因子を産生する内分泌細胞でもある。
【０００７】
ヒト脂肪組織の取得は比較的たやすいが、患者は侵襲的処置を受ける必要がある。さらに、このようにして取得されたヒト成熟脂肪細胞を増殖することはできず、数日間のみ培養液で保持可能である。
【０００８】
骨髄由来間葉系幹細胞、又は脂肪組織の間質血管細胞群由来細胞からの脂肪生成の研究のため、様々なグループがヒト細胞モデルを発展させてきている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９年；Ｚｕｋ他、２００１年）。しかしながら、これらの細胞系には、継代培養時の増殖能力の低いこと、分化能力の低いこと、及び分化可能性の変化などの所定の制限がある。これらの技術的課題を解決するため、ｉＰＳ細胞から脂肪細胞を分化する種々の方法が開発されてきている。しかし、これらのプロトコルは、効果が限定的である胚様体（３胚葉からなる３次元構造）又は間葉系細胞に分化する準備段階を必要とすることを考慮すると長く複雑なものである（Ｔａｕｒａ他、２００９年；Ｘｉｏｎｇ他、２０１３年；Ｎｏｇｕｃｈｉ他、２０１３年；Ａｈｆｅｌｄｔ他、２０１２年）。細胞分化効率は脂肪細胞転写因子の異所的発現によって増大可能である（Ａｈｆｅｌｄｔ他、２０１２年）が、そうしたプロトコルは、脂肪細胞分化時に起こる生理的機構の研究を可能にはしない。
【０００９】
従って、胚様体又は間葉系幹細胞を事前に作製する必要なく、脂肪細胞の、即ち中胚葉からのインビボにおける生理的分化を再現するための、簡易で、迅速、そして効率的なプロトコルの発展が必要であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許出願第２１８２０５２号
【特許文献２】国際特許出願第９７／０３３９７８号
【特許文献３】米国特許第５，９４５，３３７号
【特許文献４】国際公開第９１／１０４２５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、脂肪前駆細胞及び脂肪細胞のインビトロでの作製のための新規の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はまず、インビトロでの脂肪前駆細胞作製のための方法に関し、該方法は、
接着培養系において無血清培養培地中で多能性幹細胞を培養するステップと、
該多能性幹細胞を、中胚葉分化培地に、中胚葉前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
該中胚葉前駆細胞を、脂肪細胞分化培地に、脂肪前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
任意的に、このように取得した脂肪前駆細胞を収集するステップとを含む。
【００１３】
多能性幹細胞は好ましくは誘導多能性幹細胞である。
【００１４】
中胚葉分化培地は、好ましくは、特にアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ−４タンパク質、ＢＭＰ−２タンパク質、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３、並びにそれらの任意の組合せから選ばれるＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する１以上のモルフォゲンを含む無血清培養培地である。所定の実施形態では、中胚葉分化培地は、（ｉ）アクチビンＡ及びアクチビンＢからなる群から選ばれるモルフォゲン、好ましくはアクチビンＡと、（ｉｉ）ＢＭＰ−４タンパク質、ＢＭＰ−２タンパク質、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選ばれるモルフォゲン、好ましくはＢＭＰ−４タンパク質と、を含む無血清培養培地である。
【００１５】
無血清培養培地は好ましくは、造血細胞の培養に適した培地である。
【００１６】
多能性幹細胞は、好ましくは、細胞が約５０％〜約９０％コンフルエントに達するときに、中胚葉分化培地に接触させる。
【００１７】
一実施形態において、脂肪細胞分化培地は、インスリン、その類似体の１つ、又はＩＧＦ−１と、グルココルチコイドと、細胞内環状アデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）とを増大させる薬剤を含む培養培地、好ましくは、インスリン、デキサメタゾン、及び３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含む培養培地である。好ましくは、脂肪細胞分化培地はインドメタシンをさらに含む。
【００１８】
本発明はまた、インビトロでの脂肪細胞作製のための方法にも関し、該方法は、本発明の方法によって得られた脂肪前駆細胞を、脂肪細胞成熟培地に、脂肪細胞を取得するまで接触させるステップを含む。脂肪細胞成熟培地は、好ましくはインスリンを含む培養培地である。
【００１９】
他の態様において、本発明は、リポジストロフィー、又は空腹時高血糖症、耐糖能異常（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、特に２型糖尿病である糖尿病、及びインスリン抵抗性からなる群より好ましくは選ばれる血糖コントロール異常、又は肥満若しくはリポジストロフィー症候群と任意的に関連した脂質異常症の処置に使用するための、本発明の方法によって得られた脂肪前駆細胞又は脂肪細胞にも関する。
【００２０】
脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞は、処置される対象者からの体細胞、好ましくは線維芽細胞から得られた誘導多能性幹細胞から好ましくは取得される。
【００２１】
また本発明はインビトロでの脂肪前駆細胞又は脂肪細胞の作製のためのキットにも関し、該キットは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する１以上のモルフォゲンを含有する容器と、インスリン、その類似体の１つ、又はＩＧＦ−１、グルココルチコイド、及び細胞内環状アデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）を増加させる薬剤を含有する容器と、任意的に、インスリンを含有する容器とを含む。
【００２２】
特に、該キットは、アクチビンＡ及び／又はＢＭＰ−４を含有する第１の容器と、インスリン、デキサメタゾン、及びＩＢＭＸ、並びに任意的にインドメタシンを含有する第２の容器とを含み得る。
【００２３】
また本発明は、本発明の方法によるインビトロでの脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞の作製のための本発明のキットの使用にも関する。
【００２４】
他の態様において、本発明はまた、脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子をスクリーニングするための方法にも関し、該方法は、
本発明の方法によって得られた脂肪細胞を候補分子に接触させるステップと、
脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子を選択するステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ｉＰＳ細胞からの２次元での脂肪細胞分化である本発明の方法の実施形態を示す概略図である。中胚葉前駆体へのｉＰＳ細胞の分化は、アクチビンＡ（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下でＳＴＥＭＰｒｏ３４（＋ＧｌｕｔａＭＡＸ＋アスコルビン酸）からなる分化培地によって、０日目〜４日目に誘導される。脂肪細胞への分化は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＣＳ、インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、イソブチルメチルキサンチン（０．５ｍＭ）、デキサメタゾン（１μＭ）及びインドメタシン（５０μＭ）において中胚葉前駆細胞を成長させることで、４日目及び８日目に誘導される。そして、脂肪細胞は、成熟させるために、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＣＳ、１μｇ／ｍＬインスリンにおいて保持される。
【図２】図２は、ｉＰＳ細胞の多能性特性を示す。（Ａ）は多能性ｉＰＳコロニーの位相コントラスト画像（１０×）を示す。（Ｂ）はアルカリホスファターゼ染色後のｉＰＳ細胞コロニーの写真を示す（左パネル：広視野、右パネル：倍率１０）。（Ｃ）は、多能性マーカーＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ３／４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の免疫蛍光標識を示す。（Ｄ）は、ｉＰＳ細胞とＨ９胚性幹細胞との、多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２の遺伝子発現の比較を示す（ｎ＝３）。
【図３ａ】図３ａは、中胚葉及び脂肪前駆細胞へのｉＰＳ細胞の分化を示す。分化の０、２、４、及び６日目における、特定の多能性マーカーＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＯＣＴ４（ｎ＝３）（Ａ）、中胚葉、即ちブラキウリ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）（Ｔボックス）、及びＭＥＳＰ１（ｎ＝３）（Ｂ）のリアルタイム定量ＰＣＲにより測定された相対的発現レベル（任意単位）を示す。抗体ＭＥＳＰ１とブラキウリとを用いた脂肪前駆細胞免疫蛍光標識を示す（Ｃ）。間葉系幹細胞へのｉＰＳ細胞の分化時の、ブラキウリ（Ｔボックス）とＭＥＳＰ１とのリアルタイム定量ＰＣＲにより測定された相対的発現レベル（任意単位）を示す（ｎ＝３）（Ｄ）。
【図３ｂ】図３ｂは、図３ａの（Ａ）から（Ｄ）に続き、ＰＤＧＦＲα、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ４４、ＣＤ２９、及びＣＤ２４のリアルタイム定量ＰＣＲによって測定された相対的発現レベル（任意単位）を示す。＊ｐ＜０．０５、ｐはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアによるマン・ホイットニーのノンパラメトリックテストにより測定した（ｎ＝３）（Ｅ）及びＣＤ４４、ＰＤＧＦＲα、ＣＤ２９、及びＫｉ６７抗体を用いた脂肪前駆細胞の免疫蛍光標識を示す（Ｆ）。
【図４】図４は、脂肪細胞への中胚葉前駆細胞の分化を示す。脂肪細胞分化時における、（Ａ）Ｃ／ＥＢＰβ（ｎ＝３）、（Ｂ）Ｃ／ＥＢＰδ（ｎ＝３）、（Ｃ）Ｃ／ＥＢＰα（ｎ＝３）、及び（Ｄ）ＰＰＡＲγ（ｎ＝３）の４つの脂肪細胞転写因子のリアルタイム定量ＰＣＲによって測定された相対発現レベル（任意単位）が示される。
【図５】図５は、分化２０日後の脂肪細胞の特性を示す。（Ａ）は、オイルレッドＯ染色後の脂肪細胞の写真である（左：広視野、中央：２０×、右：４０×）。（Ｂ）は、分化２０日目の脂肪細胞におけるマーカーＣ／ＥＢＰα（上）及びＧＬＵＴ４（下）の免疫蛍光標識である。脂肪滴はナイルレッドで、核はＤＲＡＱ５で染色された。（Ｃ）は、０日目、１０日目、及び２０日目のｉＰＳ細胞におけるＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２、Ｃ／ＥＢＰα  ｐ３０／４２、インスリン受容体β−サブユニット（ＩＲ−β）、ペリリピン１、並びにカベオリン１のタンパク質発現を示す。β−アクチンを対照として用いる（ｎ≧３）。（Ｄ）では、リン酸化部位特異的抗体と全抗体とを用いて、分化２０日後のｉＰＳ細胞におけるインスリンでの短時間処理後に、インスリン受容体β−サブユニット（ＩＲ−β）とＡＫＴ／ＰＫＢとのリン酸化を評価した。
【図６ａ】図６ａは、ベージュ脂肪細胞の作製を示す。従来の褐色脂肪細胞のマーカー、（Ａ）ＰＧＣ１α（ｎ＝３）、ＰＲＤＭ１６（ｎ＝３）、及びＵＣＰ１（ｎ＝３）の相対的遺伝子発現を示す。（Ｂ）分化０日目、１０日目、２０日目におけるウエスタンブロットによるＵＣＰ１発現の検出を示す。β−アクチンは内在性対照として示される。（Ｃ）分化時の、ベージュ脂肪細胞特異的マーカーＴＭＥＭ２６、ＣＩＴＥＤ１、ＣＤ１３７、及びＨＯＸＣ９の相対的遺伝子発現を示す（ｎ≧３）。＊ｐ＜０．０５対４日目。（Ｄ）分化２０日目の脂肪細胞におけるベージュ脂肪細胞マーカーＣＩＴＥＤ１の免疫蛍光標識を示す。脂肪滴をナイルレッドで、核をＤＲＡＱ５で染色した。
【図６ｂ】図６ｂは、図６ａの（Ａ）から（Ｄ）に続き、（Ｅ）基本条件下又は６時間の１０−５Ｍイソプロテレノール後の、ウエスタンブロットによるＵＣＰ１発現の検出を示す。β−アクチンは内在性対照として示される。（Ｆ）基本条件下（上）と４８時間の８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ後（下）との、ミトトラッカー及びＢＯＤＩＰＹでのベージュ脂肪細胞の染色を示す。（Ｇ）基本条件下（未処理）及び４８時間の８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ後における、分化２０日後のｉＰＳ細胞の、熱産生に関わる遺伝子ＰＧＣ１α、ＰＰＡＲα、ＰＲＤＭ１６、及びＤＩＯ２の遺伝子発現を示す。＊ｐ＜０．０５対基本。
【図７】図７は、ヌードマウスにｉＰＳ細胞由来の脂肪細胞を移植した後の、インビボにおける脂肪組織形成を示す。（Ａ）ヌードマウスにおけるｉＰＳ細胞由来脂肪細胞移植の概略図を示す。（Ｂ）ｉＰＳ細胞由来の脂肪細胞から形成された脂肪層の巨視図である。（Ｃ）ｉＰＳ細胞（左）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（右）由来の脂肪細胞から形成された脂肪層のヘマトキシリン及びエオシン染色を示す。スケールバーは５００μｍである。（Ｄ）ｉＰＳ細胞（左）及びＭＳＣ（右）由来の脂肪細胞から形成された脂肪層のヘマトキシリン及びエオシン染色を高倍率で示す。スケールバーは２００μｍ（上）、１００μμｍ（下）である。矢印は血管を示す。（Ｅ）種々の倍率における、ｉＰＳ細胞（左）及びＭＳＣ（右）由来の脂肪細胞から形成された脂肪層の、抗ペリリピン１抗体での標識を表す。スケールバーは２００μｍ（上）、１００μｍ（下）である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明者等は、多能性幹細胞、好ましくは誘導多能性幹細胞から多数の脂肪細胞を２０日のみで作製するための、簡易で、迅速、そして効率的な方法を開発した。実際に、幹細胞は、中胚葉分化誘導剤を含む培地の存在下で中胚葉前駆細胞に直接的に、つまり胚様体又は間葉系幹細胞を最初に形成することなく分化可能であり、中胚葉前駆細胞は、続いて脂肪生成混合物の存在下で脂肪前駆細胞及び脂肪細胞を作製可能である、ということを発明者等は示した。
【００２７】
発明者等は、本発明の方法で得られた脂肪細胞が特定の脂肪細胞マーカーを発現し、この細胞型の形態特性を有するということを観察した。また発明者等は、得られた細胞が、現在までヒトモデルについては記載されていないベージュ型脂肪細胞特性を有することを示した。
【００２８】
このように、第１の態様によると、本発明は、インビトロでの脂肪前駆細胞作製のための方法に関し、該方法は、
接着培養系において無血清培養培地中で多能性幹細胞を培養するステップと、
該多能性幹細胞を中胚葉分化培地に、中胚葉前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
該中胚葉前駆細胞を脂肪細胞分化培地に、脂肪前駆細胞を取得するまで接触させるステップとを含む。
【００２９】
本明細書において用いられるように、「多能性幹細胞」という用語は、胚性幹細胞と、初期化体細胞（又は誘導多能性幹細胞）とを含む。好ましくは、この用語は、哺乳動物の細胞、特にマウス、ラット、又は霊長動物の細胞、より好ましくはヒトの細胞に関する。
【００３０】
胚性幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来し、生殖系細胞を含む、生体のすべての組織（中胚葉、内胚葉、外胚葉）を生じる能力を有する。胚性幹細胞の多能性は、転写因子ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２などのマーカー、並びにＳＳＥＡ３／４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１などの表面マーカーの存在によって評価可能である。この多能性は、マウスにおける奇形腫形成によりインビボで確認可能でもある（Ｒｏｓｓａｎｔ他、１９８２年）。胚性幹細胞は、例えばＣｈｕｎｇ他（２００８年）が記載した技術を用いて、胚性幹細胞が由来する胚を壊すことなく取得可能である。所定の実施形態において、法律或いは倫理上の理由から、胚性幹細胞は非ヒト胚性幹細胞である。
【００３１】
本明細書において用いられるように、「初期化体細胞」、「誘導多能性幹細胞」、「ｉＰＳＣ」、又は「ｉＰＳ」という用語は、分化体細胞の遺伝子的な初期化により取得される多能性細胞に関する。ｉＰＳＣは、胚性幹細胞のものと類似するその形態、自己再生性、及び多能的潜在性に加えて、胚性幹細胞のものと非常に近似する、全体的なヒストンメチル化を伴うエピジェネティックな初期化や遺伝子発現プロファイルも示す。ｉＰＳＣは、多能性マーカー、特にアルカリホスファターゼ染色と、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＳＳＥＡ３／４タンパク質発現とに、特に陽性である。
【００３２】
ｉＰＳＣ作製のための方法は当業者には既知であり、特にＹｕ他（２００７年）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ他（２００７年）、及びＮａｋａｇａｗａ他（２００８年）による文献に記載される。特に、ｉＰＳＣは、転写因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、２００７年）、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８（Ｙｕ他、２００７年）、又はＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４遺伝子（Ｎａｋａｇａｗａ他、２００８年）で形質移入したヒト体細胞から取得可能である。ｉＰＳＣは、線維芽細胞、Ｂ−リンパ球、ケラチノサイト、又は髄膜細胞（Ｐａｔｅｌ他、２０１０年）などの広範な種々の細胞から取得可能である。好ましくは、本発明の方法に用いられるｉＰＳＣは、線維芽細胞、特にヒト線維芽細胞から取得される。所定の実施形態において、ｉＰＳＣはリポジストロフィー患者の線維芽細胞から取得される。
【００３３】
本発明の方法は、上記規定のような多能性幹細胞を、接着培養系において無血清培養培地中で培養するステップを含む。これらの培養条件は、幹細胞を凝集させるため非接着培養系の使用を必要とする胚様体の形成に用いられるものとは異なる。
【００３４】
本発明の方法における使用に適切な接着培養系は、接着単層培養系、又はフィーダー細胞における培養系であり得る。
【００３５】
培養系は、本発明の方法に適する任意の形態、特にフラスコ、複数ウェルプレート、又はディッシュの形態であってよい。
【００３６】
一実施形態において、接着培養系は、増殖を促進するか、及び／又は共培養される細胞の分化を制御するフィーダー細胞における培養系である。好ましくは、これらフィーダー細胞は、分化を誘導することなく培養細胞の増殖を促進する。フィーダー細胞は、その増殖と対象培養の侵襲とを防ぐため、しばしば照射される。本発明の方法における使用に適するフィーダー細胞は、マウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＥＦ）又はヒト包皮細胞など種々の既知のタイプから、当業者により容易に選択され得る（特許文献１参照）。
【００３７】
好ましい実施形態において、接着培養系は接着単層培養系である。この系は、細胞接着性を促進するマトリクス又は基質で通常はコーティングされた、例えばガラス又はプラスチックである固体サポートを含む。
【００３８】
基質は、接着因子からなり且つサポートへの細胞接着を促進するタンパク質基質であるとよい。これらの接着因子は、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、又はゼラチンから特に選択されるとよい。
【００３９】
細胞外マトリクスを再現し、本発明の方法における使用に適するマトリクスは、当業者には既知であり、多くの種類が市販で入手可能である。これらのマトリクスは、例として、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）タイプのマトリクス、又は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、アミノグリカン、若しくはビトロネクチンなどの１以上のアンカータンパク質を含有するその他のマトリクスを含む。３次元ヒドロゲルタイプのマトリクスも用いられ得る。好ましい実施形態において、マトリクスはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）タイプのものである。
【００４０】
多能性幹細胞は、増殖可能にし、且つ細胞を未分化状態に維持可能にする無血清培地で培養される。このタイプの多くの培地は、市販で入手可能であり、当業者に既知である（例としてＣｈｅｎ他による文献（２０１１年）参照）。無血清培養培地は、例として、ｍＴＥＳＲ（登録商標）１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｅ８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、又はｈＰＳＣ培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）であってよい。好ましい実施形態において、用いられる培養培地は動物由来血清を含まない。
【００４１】
細胞がコンフルエントに達する、即ち利用可能な表面全体が被覆されることを防ぐため、細胞は好ましくは定期的に継代培養される。実際に、コンフルエントは増殖の中断や不要な代謝変化を導く。細胞は、当業者には既知の標準的技術を用いて継代培養されるとよい。細胞は、コラゲナーゼＩＶなどの酵素の作用によって、又は、ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ若しくは他の任意の無酵素溶液（例えばＲｅｌｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））における機械的継代によって、マトリクス又はサポートから特に剥離され、遠心分離によって収集され、機械的に解離され、そして新しい培養系に再播種されるとよい。
【００４２】
本発明の方法において、接着培養系において無血清培地中で培養された多能性幹細胞は、中胚葉分化培地に、中胚葉前駆細胞を取得するまで接触させる。
【００４３】
任意的に、幹細胞を中胚葉分化培地に接触させる前に、細胞のコンフルエントが測定又は評価されるとよい。好ましくは、幹細胞は、細胞培養が約５０％〜約９０％コンフルエントに達するときに中胚葉分化培地に接触させる。当業者は細胞のコンフルエントの概念についてよく知るところであり、任意の既知の方法によってこれを評価することができる。一例として、「９０％コンフルエント」という用語は、表面領域全体の約１０％に相当する空間がコロニー間において占有されずに残りながら、コロニーが他のコロニーと接触する、という状態として規定され得る。本明細書において用いられるように、「約」という用語は、特定値の±１０％の値範囲に関する。例として、「約２０」とは２０±１０％又は１８〜２２を含む。
【００４４】
所定の実施形態において、幹細胞は、接着培養系の無血清培地において培地に配置された後、中胚葉分化培地に、１〜３日間、好ましくは２日間接触させる。
【００４５】
好ましくは、接触は、培地を単に変えることでおこなわれる。代替的に、中胚葉分化培地を含む、上述のような接着培養系における継代培養によって接触がおこなわれてもよい。
【００４６】
一実施形態において、接着培養系は、上述のようなフィーダー細胞における培養系である。使用可能なフィーダー細胞は、好ましくは化合物ＳＵ５４０２などのＦＧＦシグナル経路阻害物質の存在下で（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ他、１９９７年）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）又はヒト包皮細胞（特許文献１参照）などの種々の既知の型から、当業者によって容易に選択され得る。
【００４７】
細胞は、上述のような当業者には既知の標準的技術を用いて継代培養されるとよく、特に、コラゲナーゼＩＶなどの酵素作用によって、ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ若しくは他の任意の無酵素溶液（例えばＲｅｌｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））における機械的継代によって、又は、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などの市販の細胞剥離培地の作用によって、マトリクス又はサポートから剥離され、遠心分離によって収集され、機械的に解離され、そして新しい培養系に再播種されるとよい。
【００４８】
代替的に、幹細胞は、接着培養系の培地に約４日間配置されて、中胚葉分化培地に接触させるとよい。
【００４９】
中胚葉分化培地は、細胞の生存と増殖とを可能にし、しかも中胚葉前駆細胞への細胞分化を誘導又は促進する培地である。好ましくは、この培地により、他の細胞型への、特に内胚葉若しくは外胚葉前駆細胞への細胞分化が妨害又は制限される。
【００５０】
所定の実施形態において、中胚葉分化培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する１以上のモルフォゲンを含む無血清基本培地である。
【００５１】
好ましくは、無血清基本培地は、ヒト造血細胞（ＣＤ３４＋）の増殖に適する培地である。この培地は、細胞に必須の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類、及び炭素源、並びにｐＨを調節する緩衝系を特に含む最小培地であってよい。好ましくは、この培地は、ウシ血清アルブミン；トランスフェリン若しくは鉄；セレニウム；インスリン若しくはその類似体；及び／又は、ヒドロコルチゾン若しくはデキサメタゾンなどのグルココルチコイドをさらに含む。
【００５２】
本発明の方法において使用可能な培地は、例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）若しくは特許文献２に記載の他の任意の培地、ＴｅＳＲ（登録商標）−Ｅ６培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、特許文献３に記載の培地、又はＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
使用する培地に応じて、グルタミン（このアミノ酸は不安定であり、通常その場で添加する必要がある）、ビタミンＣ（すぐに酸化する）、及び／又は１つ以上の抗生剤を添加することが必要であるか又は所望され得る。
【００５４】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するモルフォゲンは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ−４タンパク質、ＢＭＰ−２タンパク質、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３、並びにそれらの任意の組合せからなる群より好ましくは選択される。
【００５５】
一実施形態において、中胚葉分化培地は、（ｉ）アクチビンＡ及びアクチビンＢからなる群から選択されるモルフォゲン、並びに（ｉｉ）ＢＭＰ−４タンパク質、ＢＭＰ−２タンパク質、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択されるモルフォゲンを含有する。
【００５６】
他の実施形態において、中胚葉分化培地は、アクチビンＡとＢＭＰ−４タンパク質とを含有する。
【００５７】
好ましくは、培地は、１〜２５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４を含有する。
【００５８】
好ましくは、培地は、５〜１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、より好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含有する。
【００５９】
特に好ましい実施形態において、中胚葉分化培地は約１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４と約２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡとを含有する。
【００６０】
所定の実施形態において、中胚葉分化培地は、グルタミンを豊富化した完全無血清培地ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）又は同等の培養培地、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４、好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び任意的にアスコルビン酸、を含む。
【００６１】
多能性幹細胞は、中胚葉前駆細胞を取得するまで分化培地中に保持される。この期間、従来の方法で、培養培地は定期的に、好ましくは毎日又は１日置きに取り変えられるとよい。
【００６２】
本明細書に用いられるように、「中胚葉前駆細胞」又は「中胚葉前駆体」という用語は、多くの中胚葉組織、特に内皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨形成細胞、軟骨細胞、間葉系細胞、及び造血細胞に（予備的な脱分化又は初期化をすることなく）分化可能な細胞、好ましくはヒト細胞に関する。これらの細胞は、初期中胚葉に特異的な２つの遺伝子である、ブラキウリ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）（Ｔボックス）（遺伝子ＩＤ：６８６２）及びＭＥＳＰ１（遺伝子ＩＤ：５５８９７）遺伝子の発現によって特性評価される。この特性により、ブラキウリとＭＥＳＰ１遺伝子とを発現しない間葉系幹細胞又は脂肪組織間質血管細胞群由来細胞から区別される（図３Ｄ）。
【００６３】
中胚葉前駆細胞の出現は、ブラキウリとＭＥＳＰ１遺伝子との発現をモニタリングすることで、当業者により容易に検出可能である。実際に、実験の項と図３Ｂで示されるように、これらの遺伝子は多能性幹細胞には発現されない。またこの発現は、多能性マーカーＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２の発現減少にも相関する（図３Ａ）。
【００６４】
ブラキウリとＭＥＳＰ１とのタンパク質発現は、実験の項と図３Ｃに示されるような免疫蛍光法によって当業者が容易に測定できる。
【００６５】
このように、任意的に、本発明の方法は、ブラキウリ遺伝子及び／又はＭＥＳＰ１遺伝子の発現を測定又は評価することからなるさらなるステップを含み得る。これらマーカーの発現は、当業者には既知の任意の技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲによってモニタリングされるとよい。
【００６６】
所定の実施形態において、多能性幹細胞は、２〜５日間、好ましくは３〜４日間、より好ましくは４日間、中胚葉分化培地に接触させられる。
【００６７】
このように取得された中胚葉前駆細胞は、脂肪前駆細胞を取得するまで脂肪細胞分化培地に接触させられる。
【００６８】
前述のように、この接触は、培養培地を単に変えることで、又は脂肪細胞分化培地を含む接着培養系において継代培養することでおこなわれるとよい。
【００６９】
一実施形態において、接着培養系は、上述のようなフィーダー細胞における培養系である。使用可能なフィーダー細胞は、好ましくは化合物ＳＵ５４０２などのＦＧＦシグナル経路阻害物質の存在下で（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ他、１９９７年）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）又はヒト包皮細胞（特許文献１参照）などの種々の既知の型から、当業者によって容易に選択され得る。
【００７０】
細胞は、上述のような当業者には既知の標準的技術を用いて継代培養されるとよく、特に、コラゲナーゼＩＶなどの酵素作用によって、ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ若しくは他の任意の無酵素溶液（例えばＲｅｌｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））における機械的継代によって、又は、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などの市販の細胞剥離培地の作用によって、マトリクス又はサポートから剥離され、遠心分離によって収集され、機械的に解離され、そして新しい培養系に再播種されるとよい。好ましくは、中胚葉前駆細胞は、培養培地を単に変えることで脂肪細胞分化培地に接触させられる。
【００７１】
脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）分化培地とも呼称される脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ）分化培地は、中胚葉前駆細胞の生存と増殖とを可能にし、しかもこれらの細胞の脂肪前駆細胞への分化を誘導又は促進する培地である。
【００７２】
一実施形態において、脂肪細胞分化培地は、インスリン、インスリン類似体、又はＩＧＦ−１、グルココルチコイド、及び細胞内環状アデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）を増加させる薬剤を含む培養培地である。好ましくは、脂肪細胞分化培地は、インスリン又はその類似体、及びグルココルチコイド、及び細胞内環状アデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）を増加させる薬剤を含む。
【００７３】
インスリン類似体は、ＮＰＨインスリン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社）、リスプロ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社）、アスパルト（ａｓｐａｒｔ）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社）、及びグルリジン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ社）からなる群から例えば選択されるとよい。
【００７４】
グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、コルチバゾール、及びヒドロコルチゾンからなる群から例えば選択されるとよい。好ましくは、グルココルチコイドはデキサメタゾンである。
【００７５】
細胞内環状アデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）を増加させる薬剤は、ｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させることが知られる任意の化合物であり得る。この薬剤は、ホスホジエステラーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼＡの直接活性剤（又はｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ）、及びアデニル酸シクラーゼ活性剤からなる群より特に選択されるとよい。
【００７６】
ホスホジエステラーゼ阻害剤は、メチル化キサンチン、及び３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）などのその誘導体、カフェイン、アミノフィリン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、及びテオフィリンを含むがこれらに限定されない。
【００７７】
タンパク質キナーゼＡ直接活性剤は、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、アドレナリン、グルカゴン、及び８−ブロモ−ｃＡＭＰなどのｃＡＭＰ類似体を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
アデニル酸シクラーゼ活性剤は、ホルスコリン、グルカゴン、プロスタグランジンＤ２、Ｅ１、及びＩ２、カルバサイクリン、ドーパミン、エンドセリン１、Ｌ−エピネフリン、並びに副甲状腺ホルモンを含むがこれらに限定されない。
【００７９】
好ましい実施形態において、脂肪細胞分化培地は、インスリン、デキサメタゾン、及び３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含む培養培地である。
【００８０】
好ましくは、培地は１〜２０μｇ／ｍＬインスリン、より好ましくは約１０μｇ／ｍＬインスリンを含む。
【００８１】
好ましくは、培地は０．０００１〜５００ｍＭのＩＢＭＸ、より好ましくは０．０１〜１０ｍＭのＩＢＭＸ、さらにより好ましくは０．１〜１ｍＭのＩＢＭＸを含む。
【００８２】
所定の実施形態において、培地は約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭのＩＢＭＸ、好ましくは約０．５ｍＭのＩＢＭＸを含む。
【００８３】
好ましくは、培地は０．２５〜１００μＭのデキサメタゾン、より好ましくは、約1μＭのデキサメタゾンを含む。所定の実施形態において、脂肪細胞分化培地は、約１０μｇ／ｍＬのインスリン、約１μＭのデキサメタゾン、及び約０．５ｍＭのＩＢＭＸを含む培養培地である。
【００８４】
任意的に、分化培地は、インドメタシン、ピオグリタゾン若しくはロシグリタゾンなどのチアゾリジンジオン族化合物、成長因子ＦＧＦ２１、イリシン、トリヨードチロニン、レチノイン酸、ＢＭＰ７、及び／又はＢＭＰ８などの脂肪細胞分化を促進する１つ以上のさらなる化合物を含んでもよく、特にインドメタシン、ピオグリタゾン若しくはロシグリタゾンなどのチアゾリジンジオン族化合物、成長因子ＦＧＦ２１、イリシン、トリヨードチロニン、及び／又はレチノイン酸である脂肪細胞分化を促進する１つ以上のさらなる化合物を含んでもよい。脂肪細胞分化を促進する１つ以上のさらなる化合物を含んでもよい。分化培地は好適には、インドメタシン、好ましくは０．０１〜０．５ｍＭのインドメタシン、より好ましくは約０．１ｍＭのインドメタシンをさらに含む。所定の実施形態において、分化培地は５０μＭのインドメタシンをさらに含む。このように、好ましい実施形態において、脂肪細胞分化培地は、好ましくは１０μｇ／ｍＬのインスリン、好ましくは約１μＭのデキサメタゾン、好ましくは約０．５ｍＭのＩＢＭＸ、及び好ましくは約０．１ｍＭのインドメタシンを含む培養培地である。他の好ましい実施形態において、脂肪細胞分化培地は、好ましくは約１０μｇ／ｍＬのインスリン、好ましくは約１μＭのデキサメタゾン、好ましくは約０．５ｍＭのＩＢＭＸ、及び好ましくは約０．０５ｍＭのインドメタシンを含む培養培地である。
【００８５】
脂肪細胞分化培地に使用される基本培養培地は、細胞に必須の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類、及び炭素源、並びにｐＨを調節する緩衝系を特に含む、好ましくは基本合成最小培地である。本発明の方法に使用可能な培地は、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ハムＦ１２培地、ＩＭＤＭ培地、及びＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を包含するがこれらに限定されない。
【００８６】
培地は、２〜２０％、好ましくは５〜１５％血清、特にウシ胎児血清で、好ましくは補完される。
【００８７】
中胚葉前駆細胞は、脂肪前駆細胞を取得するまで脂肪細胞分化培地に保持される。この期間、従来の方式で、培養培地は定期的に、好ましくは１日置き又は２日置きに取り変えられるとよい。
【００８８】
本明細書において用いられるように、「脂肪前駆細胞」、「前脂肪細胞」又は「脂肪細胞幹細胞」という用語は、ＣＤ４４（遺伝子ＩＤ：９６０）、ＣＤ２９（遺伝子ＩＤ：３６８８）、ＰＤＧＦＲα（遺伝子ＩＤ：５１５６）、及びＬＹ６Ｅ（遺伝子ＩＤ：４０６１）を含む脂肪組織幹細胞マーカー（Ｚｕｋ、２０１３年）を発現する増殖性細胞、即ち、細胞増殖マーカー、好ましくはＫｉ６７を発現する細胞に関する。好ましくは、これらの細胞は、抗原ＣＤ３１（遺伝子ＩＤ：５１７５）及びＣＤ３４（遺伝子ＩＤ：９４７）に陰性である。脂肪生成混合物の存在下において、これらの細胞は（予備的な脱分化又は初期化をすることなく）脂肪細胞に分化することが可能である。
【００８９】
脂肪前駆細胞の出現は、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＰＤＧＦＲα、及びＬＹ６Ｅなどの脂肪組織幹細胞マーカーの発現をモニタリングすることで、当業者により容易に検出され得る。実際に、実験の項並びに図３Ｅ及び図３Ｆに示されるように、これらのマーカーは中胚葉前駆細胞では非常に弱く発現されるのみである。発現の違いは、脂肪前駆細胞における発現レベルが中胚葉前駆細胞のものより約８倍高いマーカーＰＤＧＦＲαについて特に大きい。これらマーカーの発現は、当業者に既知の任意の技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲによってモニタリングされるとよい。
【００９０】
このように、任意的に、本発明の方法は、マーカーＣＤ４４、ＣＤ２９、ＰＤＧＦＲα、及びＬＹ６Ｅのうちの１つ以上の発現を測定又は評価することからなるさらなるステップを含むとよい。
【００９１】
所定の実施形態において、中胚葉前駆細胞は、２〜５日間、好ましくは３〜４日間、さらに好ましくは４日間、脂肪細胞分化培地に接触させられる。
【００９２】
本発明の方法は、取得した脂肪前駆細胞を収集するステップを含むとよい。収集は当業者には既知の標準的技術を用いておこなわれるとよい。前駆細胞は、特に、コラゲナーゼＩＶなどの酵素の作用によって、又は、ＴｒｙＰＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などの市販の細胞剥離溶液によって、マトリクス又はサポートから剥離されるとよい。そして前駆細胞は、例えばＣＤ４４又はＣＤ２９などの種々のマーカーに基づいて単離され得る。
【００９３】
そして、脂肪前駆細胞は、当業者には既知の、上述のような細胞外マトリクスを再現するマトリクスに再播種されるとよい。市販において多種のものが入手可能である。これらのマトリクスは、好ましくは化合物ＳＵ５４０２などのＦＧＦシグナル経路阻害物質（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ他、１９９７年）の存在下で、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）又はヒト包皮細胞（特許文献１参照）などのフィーダー細胞を含むとよい。使用される培養系は好ましくは接着単層培養系である。この系は、細胞接着性を促進するマトリクス又は基質で通常はコーティングされた、例えばガラス又はプラスチックである固体サポートを含む。基質は、接着因子からなり且つサポートへの細胞接着を促進するタンパク質基質であるとよい。これらの接着因子は、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、又はゼラチンから特に選択されるとよい。
【００９４】
代替的に、本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞は、脂肪細胞を取得するまで脂肪細胞成熟培地に接触させるとよい。
【００９５】
このようにまた、本発明は、インビトロでの脂肪細胞作製のための方法にも関し、該方法は、本発明の方法で得られた脂肪前駆細胞を、脂肪細胞を取得するまで、脂肪細胞成熟培地に接触させることを含む。
【００９６】
前述のように、この接触は、培養培地を単に変えることで、又は脂肪細胞成熟培地を含む上述のような接着培養系において継代培養することでおこなわれるとよい。好ましくは、脂肪前駆細胞は、培養培地を単に変えることで脂肪細胞成熟培地に接触する。
【００９７】
脂肪細胞成熟培地は、脂肪前駆細胞の生存と増殖とを可能にし、しかもこれらの細胞の脂肪細胞への分化を誘導又は促進する培養培地である。
【００９８】
一実施形態において、脂肪細胞成熟培地に使用される基本培養培地は、脂肪細胞分化培地に用いられるものと同様の基本培養培地であってよい。代替的に異なるものであってよい。
【００９９】
一実施形態では、脂肪細胞成熟培地に使用される基本培養培地は、細胞に必須の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類、及び炭素源、並びにｐＨを調節する緩衝系を特に含む、基本合成最小培地である。本発明の方法に使用可能な培地は、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ハムＦ１２培地、ＩＭＤＭ培地、及びＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を包含するがこれらに限定されない。
【０１００】
この培地は、２〜２０％、好ましくは５〜１５％血清、特にウシ胎児血清で、好ましくは補完される。
【０１０１】
好ましい実施形態では、脂肪細胞成熟培地は、インスリンで補完された、且つ任意的に血清で補完された、基本培養培地を含む又は実質的に該培地からなる。好ましくは、培地は、０．１〜５μｇ／ｍＬインスリン、より好ましくは約１μｇ／ｍＬインスリンを含有する。
【０１０２】
脂肪前駆細胞は、脂肪細胞を取得するまで脂肪細胞成熟培地に保持される。この期間、従来の方式で、培養培地は定期的に、好ましくは１日置き又は２日置きに取り変えられるとよい。
【０１０３】
本明細書に用いられるように、「脂肪細胞」という用語は、Ｃ／ＥＢＰβ（遺伝子ＩＤ：１０５１）、Ｃ／ＥＢＰδ（遺伝子ＩＤ：１０５２）、Ｃ／ＥＢＰα（遺伝子ＩＤ：１０５０）、及びＰＰＡＲγ（遺伝子ＩＤ：５４６８）の遺伝子発現によって、及び、オイルレッド染色により検出可能な脂肪滴の形態における中性脂質の蓄積によって特徴づけられる細胞に関する。また、脂肪細胞は、インスリン受容体（遺伝子ＩＤ：３６６７）、ペリリピン１（遺伝子ＩＤ：５３４６）、カベオリン１（遺伝子ＩＤ：８５７）又はグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４（遺伝子ＩＤ：４４２９９２）の発現によっても特徴づけられ得る。
【０１０４】
さらに、本発明の方法により取得された脂肪細胞が、ＰＧＣ１（遺伝子ＩＤ：１０８９１）、ＰＲＤＭ１６（遺伝子ＩＤ：６３９７６）、及びＵＣＰ１（遺伝子ＩＤ：７３５０）遺伝子などの褐色脂肪細胞のマーカーや、またＴＭＥＭ２６（遺伝子ＩＤ：２１９６２３）、ＣＩＴＥＤ１（遺伝子ＩＤ：４４３５）、ＣＤ１３７（遺伝子ＩＤ：３６０４）、及びＨＯＸＣ９（遺伝子ＩＤ：３２２５）などのベージュ脂肪細胞の特異的マーカーも発現することを、本発明者らは観察した。
【０１０５】
脂肪細胞の出現は、上記のような、脂肪細胞、褐色脂肪細胞、及びベージュ脂肪細胞に特異的なマーカーの発現をモニタリングすること、好ましくはマーカーＣ／ＥＢＰδ、ＰＰＡＲγ、ＣＩＴＥＤ１、及びＰＧＣ１αをモニタリングすることにより、当業者が容易に検出し得る。これらマーカーの発現は、当業者に既知の任意の技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲによりモニタリングされるとよい。代替的に、脂肪細胞の出現は、オイルレッドで細胞を染色することで容易に検出され得る。
【０１０６】
このように、任意的に、本発明の方法は、マーカーＣ／ＥＢＰδ、ＰＰＡＲγ、ＣＩＴＥＤ１、及びＰＧＣ１αのうちの１つ以上の発現を測定若しくは評価すること、及び／又は、オイルレッドで細胞を染色することで脂肪細胞出現をモニタリングすること、からなるさらなるステップを含むとよい。
【０１０７】
所定の実施形態において、脂肪前駆細胞は、５〜２０日間又は５〜１５日間、好ましくは１０〜１２日間、さらに好ましくは１２日間、脂肪細胞成熟培地に接触させられる。
【０１０８】
本発明はまた、本発明の方法で取得された脂肪前駆細胞と脂肪細胞とにも関する。
【０１０９】
本発明はまた、本発明の方法で取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞と、１以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物にも関する。
【０１１０】
薬学的に許容される賦形剤は、細胞に適合する必要があり、例として、培養培地、緩衝液、又は生理食塩水であるとよい。特に、組成物はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又は同等の賦形剤を含み得る。
【０１１１】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、好ましくは皮下経路による非経口投与、特に脂肪組織における直接投与に適する。医薬組成物は、当業者に既知の標準的薬務に従って製剤化されるとよい。
【０１１２】
所定の実施形態において、医薬組成物は、生体適合性マトリクスに内包化された、本発明の方法による取得の脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞を含む。特に特許文献４に記載されたものなど、多くの内包化技術が用いられ得る。
【０１１３】
また、医薬組成物は、例えば細胞生存性若しくは増殖性向上、又は汚染防止で知られる化合物など、１以上のさらなる活性化合物も含有し得る。
【０１１４】
さらに他の態様では、本発明は、特にリポジストロフィー又は代謝障害の処置のための、本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞の治療的使用に関する。
【０１１５】
このように、本発明は、リポジストロフィー又は代謝障害の処置に使用するための、本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞に関する。また本発明は、リポジストロフィー又は代謝障害の処置に使用するための、本発明の医薬組成物にも関する。
【０１１６】
本発明はまた、リポジストロフィー又は代謝障害の処置又は防止を目的とした薬剤の調製のための、本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞の使用にも関する。
【０１１７】
本発明は、リポジストロフィー又は代謝障害を処置するための方法にさらに関し、該方法は、治療有効量の、本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞を、処置対象に投与することを含む。好ましくは、処置対象はヒトである。
【０１１８】
本明細書で用いられるように、「代謝障害」という用語は、血糖コントロール異常、特に空腹時高血糖症、耐糖能異常（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、特に２型糖尿病である糖尿病、若しくはインスリン抵抗性に関するか、或いは肥満若しくはリポジストロフィー症候群と任意的に関連した脂質異常症に関する。患者は、そのＢＭＩが２５を超えると、好ましくは２８を超えると、より好ましくは３０を超えると、肥満と考えられ得る。
【０１１９】
リポジストロフィーは、身体の様々な領域から脂肪組織が選択的に欠損されることによって特徴づけられる障害である。脂肪欠損の程度は、非常に小さい領域から、身体全体における脂肪組織のほぼ全体的な欠乏までの範囲であり得る。患者が直面する問題は、一般に脂肪欠損の程度に比例して、まったく審美的なものであり得るか、又は重度の代謝合併症をもたらすものであり得る。
【０１２０】
リポジストロフィーは、脂肪欠損の一般的又は部分的特性や、既知の遺伝的因子が関連するかどうかに応じて分類される。遺伝的原因のリポジストロフィーは先天性又は遅延発症単一遺伝子障害である。遺伝子性リポジストロフィーの原因となるいくつかの遺伝子が特定されており、例として、Ａタイプラミン、ＡＧＰＡＴ２、カベオリン１、キャビン（ｃａｖｉｎ）−１、セイピン、ＰＰＡＲｇ、ペリリピン、ＣＩＤＥＣ、又はＡｋｔ２をコードする遺伝子などが挙げられる（Ｇｕｅｎａｎｔｉｎ他、２０１４年）。後天性リポジストロフィーは、薬剤処置（特に抗ウイルス治療又はインスリン注射又は他の薬剤）の結果であるか、又は通常は免疫不良（例えば、ローレンス及びバラケル−サイモンズ症候群）の結果であり得る。
【０１２１】
代謝障害をもたらす主要なリポジストロフィー（リポジストロフィー症候群に相当する）は、遺伝的原因の全身型リポジストロフィー（ＣＧＬ（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）先天性全身型リポジストロフィー）若しくはベラルディネリ−セイプ症候群；遺伝的原因の部分型リポジストロフィー（ＦＰＬＤ（Ｆａｍｉｌｉａｌ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）家族性部分型リポジストロフィー）；ローレンス型後天性全身型リポジストロフィー症候群、バラケル−サイモンズ部分型リポジストロフィー症候群、ＨＩＶ感染及び抗レトロウイルス治療関連リポジストロフィー；ＰＳＭＢ８遺伝子変異に関連したＣＡＮＤＬＥ型自己炎症性症候群（ＪＡＳＰ、ＪＭＰ、若しくは中條（Ｎａｋａｊｏ）症候群）、ラミンＡ／Ｃ若しくはＺＭＰＳＴＥ２４変異に関連した、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群及び下顎肢端異形成（ｍａｎｄｉｂｕｌｏａｃｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）を含む他の早老性症候群、ＷＲＮタンパク質変異に関連したウェルナー型プロジェリア、ＰＣＹＴ１Ａ（ホスフェートシチジリルトランスフェラーゼ１α）変異に関連した脂肪萎縮症を伴う症候性小人症、ＮＳＭＣＥ２変異に関連した小頭症小人症、などリポジストロフィーを含む多系統症候群、並びに未知の原因のリポジストロフィーを含む他の症候群、である。
【０１２２】
一実施形態では、処置患者の体細胞、好ましくは線維芽細胞は、ｉＰＳＣを作製するために初期化される。そして、脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞は、これらのｉＰＳＣから、本発明の方法により取得されて、好ましくは皮下注射により患者に投与される。所定の実施形態では、本発明の処置方法はこのように、処置患者の体細胞から取得された誘導多能性細胞から脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞を作製するステップと、このように得た脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞を患者に投与するステップとを含む。
【０１２３】
遺伝的変異によるリポジストロフィーの場合、特に先天性リポジストロフィーについて、リポジストロフィーの原因における変異が特定され、例えば相同組換え、又はＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく遺伝子改変法（Ｇａｊ他、２０１３年）など、当業者には既知の方法によって修正されるとよい。この修正は、ｉＰＳＣの増殖及び分化前に好ましくはおこなわれる。そして、これら「修正」ｉＰＳＣから本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞は、患者に投与される。
【０１２４】
本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞はリポジストロフィーの処置に用いられ、脂肪材の欠損により失われた身体領域に充填されるとよい。この場合、脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞は、好ましくは、充填領域に直接的に皮下注射される。
【０１２５】
本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞は、代謝障害の処置に用いられるとき、例えば熱産生刺激による誘導後に、熱産生活性を有する脂肪細胞の比率を増大させる又はこの活性を有し得るように、特に脂肪組織に直接的に、好ましくは皮下注射される。
【０１２６】
本発明は、リポジストロフィー又は代謝障害を処置するための方法にも関し、該方法は、対象、好ましくはヒトに、本発明の方法により取得された治療有効量の脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞を投与するステップを含む。
【０１２７】
本明細書で用いられるような「処置」という用語は、症状を改善又は消失すること、疾患進行を緩慢にすること、疾患進化を停止すること、又は疾患を消失させることに関する。この用語には予防的及び根治的処置もまた含まれる。
【０１２８】
本明細書で用いられるような「治療有効量」という用語は、リポジストロフィー又は代謝障害の、少なくとも１つの審美性症状（充填）又は代謝性症状に効果をもたらすのに十分な量に関する（脂肪組織の代謝活性を回復する）。
【０１２９】
本発明は、脂肪前駆細胞又は脂肪細胞のインビトロでの作製用キットにも関する。
【０１３０】
キットは、
上述のような中胚葉分化培地に存在する１以上の化合物、好ましくはＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する１以上のモルフォゲン、特に、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ−４タンパク質、ＢＭＰ−２タンパク質、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される１以上のモルフォゲン、を含有する第１の容器と、
上述のような脂肪細胞分化培地に存在する１以上の化合物、好ましくはインスリン、その類似体のうちの１つ、又はＩＧＦ−１、及びグルココルチコイド、及び細胞内環状アデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）を増加させる薬剤、さらに好ましくはインスリン、デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、及び任意的にインドメタシン、を含有する第２の容器と、
任意的に、上述のような脂肪細胞成熟培地に存在する１以上の化合物、好ましくはインスリンを含有する第３の容器と、を包含する。
【０１３１】
好ましくは、キットは、分化及び／又は成熟培地の再構成及び／又は使用を容易にし且つ本発明の方法の適用を容易にする濃度又は量の、１以上の化合物を含む各容器を包含する。
【０１３２】
また本発明のキットは、上述のような中胚葉分化培地に用いられる基本培地を含有する容器、上述のような脂肪細胞分化培地に用いられる基本培地を含有する容器、又は、上述のような脂肪細胞成熟培地に用いられる基本培養培地を含有する容器をも含む。
【０１３３】
所定の実施形態において、キットは、上述のような中胚葉分化培地を含有する容器、上述のような脂肪細胞分化培地を含有する容器、及び任意的に上述のような脂肪細胞成熟培地を含有する容器を含む。
【０１３４】
他の所定の実施形態では、キットは、
アクチビンＡ及び／又はＢＭＰ−４タンパク質、並びに任意的に、好ましくはヒト造血細胞の増殖に適した無血清基本培養培地、を含有する第１の容器と、
インスリン、デキサメタゾン、及びＩＢＭＸ、並びに任意的に基本培養培地、好ましくは血清を任意的に含む基本合成最小培地、を含有する第２の容器と、
インスリン、及び任意的に基本培養培地、好ましくは血清を任意的に含む基本合成最小培地、を含有する任意的な第３の容器と、を包含する。
【０１３５】
第２の容器はインドメタシンをさらに含有するとよい。
【０１３６】
本発明のキットは、特にフラスコ、複数ウェルプレート、又はディッシュの形態で、接着培養系をも含むとよい。
【０１３７】
キットは、本発明の方法によるインビトロでの脂肪前駆細胞又は脂肪細胞作製用の分化又は成熟培地を調製及び／又は使用する方法を示す指示書を含んでもよい。
【０１３８】
また本発明は、本発明の方法によるインビトロでの脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞作製のための、本発明のキットの使用にも関する。
【０１３９】
他の態様において、本発明は、治療的対象分子をスクリーニングするための、本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞の使用に関する。
【０１４０】
治療的対象分子は、特にベージュ脂肪細胞の表現型を活性化する分子、さらに特には脂肪組織の熱産生活性を増大させる分子であるとよい。これらの分子は、上述のような代謝障害の処置又は防止に特に有用であり得る。
【０１４１】
このように、本発明は対象分子をスクリーニングするための方法に関し、該方法は、
本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞を、候補分子に接触させるステップと、
所望の活性を有する分子を選択するステップとを含む。
【０１４２】
本発明は、脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子をスクリーニングするための方法にも特に関し、該方法は、
本発明の方法により取得された脂肪細胞を、１以上の候補分子に接触させるステップと、
脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子を選択するステップとを含む。
【０１４３】
脂肪細胞の熱産生活性は、例えば、細胞の酸素消費測定を含む非直接的評価方法（Ｏｘｏｐｌａｔｅ、又はＳｅａｈｏｒｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）など、当業者には既知の技術により評価されるとよい。
【０１４４】
所望する分子の特性次第で、脂肪前駆細胞及び／又は脂肪細胞作製に使用される多能性幹細胞は、健康な対象、又は例えば上記規定のような代謝障害を有する対象など既定の病態を有する対象から取得されるとよい。
【０１４５】
本明細書において引用された文献すべては、言及によって本願に組み込まれる。本発明のその他の特徴や有用性は、非限定的例示として示される以下の実施例を閲覧することでより明白になる。
【実施例】
【０１４６】
［材料と方法］
−ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞培養−
ヒト線維芽細胞をｉＰＳ細胞に初期化するのに用いられる技術は、ウイルスベクター（センダイウイルス）を用いて改変した、山中他による記載のプロトコル（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、２００７年)からのものである。対照の対象からのｉＰＳ細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ｈＥＳＣ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号３５４２７７７）で培養し、増殖培地ｍＴＥＳＲ（登録商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号．０５８５０）を毎日取り変えた。細胞を、１ｍｇ／ｍＬの濃度のコラゲナーゼタイプＩＶ（Ｇｉｂｃｏ社）に、４日毎に供し（４５分、３７℃）、８００ｒｐｍで４分間遠心分離した。そして、細胞をｍＴＥＳＲ（登録商標）１に再懸濁し、５ｍＬピペットを用いてクローンを機械的に単離した。約２０細胞のクラスターを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で事前にインキュベートしたディッシュに播種した。
【０１４７】
−脂肪細胞分化−
図１に、本発明の実施形態の概略的図を示す。
【０１４８】
酵素分離と機械的解離との後、ｉＰＳ細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に播種した。ｍＴＥＳＲ（登録商標）１において１日又は２日培養し、７０％コンフルエントに達した後、０日目として定義されるときに、細胞を中胚葉前駆細胞作製のための分化培地：２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号３５０５００６１）で富化した完全ＳＴＥＭＰｒｏ３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号１０６３９０１１）、１０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ａ４４０３）、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号３１４‐ＬＰ）、及び２５ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号３３８‐ＡＣ）、に配置した。この中胚葉誘導培地を２日目に取り変えた。
【０１４９】
４日目に、１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｉ９２７８）、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｉ５８７９）、１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｄ４９０２）、及び５０μＭインドメタシン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｉ７３７８）で補完した分化培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＣＳを用いて、中胚葉前駆細胞の脂肪細胞分化を誘導した。７日目に、培養培地を同様の培地に取り変えた。そして、脂肪細胞を成熟させるために、１μｇ／ｍＬインスリンで補完したＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＣＳにおいて、細胞を２０日目まで培養した。
【０１５０】
−免疫蛍光法−
細胞を、３％ＰＦＡで、室温において１５分間固定した。非特異的部位を、３％ＰＢＳ−ＢＳＡにおいて細胞をインキュベートすることで遮断した。ＰＢＳ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００又は０．１％サポニン、３％ＢＳＡの溶液に希釈した、対象のタンパク質に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体（以下の表１）の存在下で、細胞の調製物をインキュベートした。このように形成されたタンパク質と抗体との複合体を、蛍光色素と共有結合し且つＰＢＳ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００又はサポニン、３％ＢＳＡの溶液に希釈した２次抗体で、光を避けて室温で１時間、細胞をインキュベートすることで検出した。抗ウサギＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧ２次抗体をＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１：１０００）に結合させた。調製物を２５ｎｇ／ｍＬナイルレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｎ−１１４２）と共に１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回すすいで、ＤＡＰＩ（４′−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ＶＷＲ）中で５分間インキュベートした。封入剤（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）の適用後に、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）を使用して細胞を観察した。
【０１５１】
表１は用いられた抗体を示す。
【０１５２】
【表１】
2017522889.tif 000002
【０１５３】
−アルカリホスファターゼ染色−
細胞を、９５％エタノールで、１５分間室温で固定した。細胞を、ＰＢＳで３回すすいだ後、ＳｉｇｍａＦＡＳＴ  ＢＣＰＩ／ＮＢＴ溶液（カタログ番号Ｂ５６５５）で、５分間、３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベートした。
【０１５４】
−中性脂質のオイルレッド染色−
分化２０日後に、脂肪細胞にオイルレッド染色をおこなった。細胞を、１×ＰＢＳですすいだ後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で１時間固定して、イソプロパノールにおいて希釈した「オイルレッドＯ」（Ｓｉｇｍａ社）溶液中で２時間インキュベートした。細胞を水道水で４回すすいだ。
【０１５５】
−リアルタイム定量ＰＣＲ−
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）を製造者の推奨に従って使用して、総ＲＮＡを抽出した。抽出した総ＲＮＡの濃度と、溶媒又は塩によるその汚染とを顕微分光測光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）によって評価した。高能力ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、逆転写をおこなった。そして、１０倍希釈のｃＤＮＡ２μＬ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ＰＣＲ混合物１０μＬ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光プローブを含む）、０．２μＭセンスプライマー、及び０．２μＭアンチセンスプライマー（以下の表２）を添加することで、定量ＰＣＲをおこなった。対象の遺伝子発現をノーマライズするために、参考遺伝子ＧＡＰＤＨを用いた。
【０１５６】
表２は用いられたプライマーを示す。
【０１５７】
【表２】
2017522889.tif 000003
2017522889.tif 000004
【０１５８】
−間葉系幹細胞（ＭＳＣ）へのｉＰＳＣの分化−
ｉＰＳＣを機械的に継代し、そしてＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２０％ＦＣＳ、１％非必須アミノ酸、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、５０μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１ｍＭのＡＡ２Ｐ（Ｓｉｇｍａ社）からなる分化培地のゼラチン（Ｓｉｇｍａ社）に播種した（Ｐ０）。１０〜１５日の培養後、細胞をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）で継代し、１/２に希釈した（Ｐ１）。９０％コンフルエントに達した時、細胞を継代し、１/３に希釈した（Ｐ２）。次の継代では、８０００細胞／ｃｍ２で細胞をゼラチンに播種した。６〜７継代後、均質で安定的なＭＳＣ個体群を得た。
【０１５９】
−脂肪細胞のβ−アドレナリン刺激−
脂肪細胞を、任意的に、１０−５Ｍイソプロテレノール（Ｓｉｇｍａ社）で６時間処理し、タンパク質試料を収集した。より長い刺激では、脂肪細胞を非代謝型ｃＡＭＰ類似体の８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ社）で４８時間処理した。
【０１６０】
−脂肪細胞のミトトラッカー染色−
分化２０日目の生細胞を、１μＭミトトラッカーＲｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とともに、３７℃、５％ＣＯ２において、暗所で４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２度すすいだ後、３％ＰＦＡで、室温において１５分間固定した。そして、調製物を、１ｎｇ／ｍＬのＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｄ−３９２２）とともに１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回すすいで、その後、ＤＡＰＩ（４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ＶＷＲ）中で５分間インキュベートした。封入剤（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）適用後、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）を用いて細胞を観察した。
【０１６１】
−ウエスタンブロット−
脂肪細胞を、適切な量の溶解緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．４、０．２７Ｍショ糖、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムｐＨ１０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭβ−グリセロリン酸、５０ｍＭのＮａＦ、５ｍＭピロリン酸、１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．１％（ｗ／ｖ）２−β−メルカプトエタノール、及びプロテアーゼ阻害剤）中で溶解した。全溶解物を遠心分離（１５，０００ｇ、４℃、１０分間）し、使用するまで−８０℃で保管した。タンパク質濃度を、標準物質としてのウシアルブミンとともに、ブラッドフォード法を用いて測定した。試料を、ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ／ＰＡＧＥ移動に供し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に移し、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク又はＢＳＡで補完したＴＢＳ−Ｔ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０）中で、２時間室温で遮断し、目的のタンパク質に特異的な種々の抗体とともにインキュベートした（上記表１）。
【０１６２】
ニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔ緩衝液中で５分３回すすぎ、ペルオキシダーゼと結合した２次抗体とともにインキュベートした。化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｐｅｒｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてオートラジオグラフィックフィルム（Ｋｏｄａｋ社）に曝露することで信号を検出した。
【０１６３】
−標準核型分析−
Ｇバンド及びＲバンドにより核型分析する標準的方法を用いて核型を作製した。
【０１６４】
−インビボでの脂肪細胞移植−
培養１８日目に、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、番号１２６０４０２１）を用いて細胞を収集し、１０μｇ／ｍＬインスリン、５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭデキサメタゾン、及び５０μＭインドメタシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｍａｔｒｉｇｅｌ培地に再懸濁した。１０７細胞を、生後６週のＦｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の背部に皮下注入した。またこれらのマウスには、ｉＰＳ細胞由来の３×１０７間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、又は対照としてＭａｔｒｉｇｅｌのみを、胸骨に注入した。移植３０日後にマウスを安楽死させる。
【０１６５】
−ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）染色−
新規形成ヒト脂肪層を切除し、４％ＰＦＡ中で固定し、パラフィンに包埋し、そして４μｍ部分に切り分けた。脱パラフィン後に、自動システムにてスライドを染色する。スライドをヘマトキシリン中で５分間インキュベートし、流水ですすぎ、エオシン溶液中で２分間インキュベートし、流水ですすぎ、一連の２回の無水アルコール浴、その後トルエンに浸漬し、樹脂で封入する。
【０１６６】
−抗ペリリピン１抗体での免疫標識：免疫組織化学−
脱パラフィン後に、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８若しくはｐＨ９）において水浴中で、又はクエン酸緩衝液（ｐＨ６）においてマイクロウェーブで加熱することで（１５分、９５℃）、抗原部位を１次抗体の官能基としてアンマスクする。過酸化水素（３％）の存在下で５分間インキュベーションすることで、内在性ペルオキシダーゼの阻害が可能になる。非特異的部位阻害は、スライドをＤａｋｏユニバーサル血清において２０分間インキュベートすることでおこなわれる。
【０１６７】
Ｂｏｎｄ１次抗体希釈剤（Ｄａｋｏ）において１：５００希釈の１次抗体（抗ペリリピン１、Ｐｒｏｇｅｎ社、ペリリピン／ＰＬＩＮ１のＭａｂ、カタログ番号６５１１５６）を室温で１時間インキュベートする。Ｄａｋｏ洗浄緩衝液で連続して数回すすいだ後、スライドをＨＲＰ２次抗体とともに３０分間インキュベートする（抗モルモット、抗体希釈剤において１：１００）。スライドをすすいだ後、ＡＥＣ試薬とともに５分３回のインキュベーションをして、免疫組織化学標識を発色させる(３−アミノ−９−エチルカルバゾールキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社)。スライドを流水に浸漬することで、この発色を停止する。そしてスライドをヘマラムで対比染色して、カバーガラスを水性封入剤で封じる（グリセルゲル封入剤、Ｄａｋｏ）。
【０１６８】
［結果］
−使用ｉＰＳ細胞株の多能性特性−
図２は、使用ｉＰＳ細胞が予期された多能性特性を有することを示す。細胞は、はっきりとした境界を有する、密なコロニーに形成される（図２Ａ、２Ｂ）。細胞は、アルカリホスファターゼ染色などの多能性マーカーに陽性であり（図２Ｂ）、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＳＳＥＡ３／４タンパク質を発現する（図２Ｃ）。さらに、これらの細胞は、Ｈ９株胚性幹細胞のものと同様のレベルでＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２を発現し、多能性特性を示す（図２Ｄ）。
【０１６９】
−中胚葉前駆細胞及び脂肪前駆細胞の作製−
図３は、分化時における多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２発現の下落（図３Ａ）と、ｉＰＳ細胞が特定の中胚葉分化培地に供されるときの、初期中胚葉を特徴づける２つの遺伝子ブラキウリとＭＥＳＰ１との遺伝子発現の誘導（図３Ｂ）とを示す。ブラキウリ（Ｔボックス）及びＭＥＳＰ１の遺伝子発現は分化４日後に７５倍増加し、中胚葉前駆細胞の効率的作製を示す。これらのマーカーのタンパク質発現を免疫蛍光法によって確認した（図３Ｃ）。予期されたように、これらの遺伝子発現は脂肪細胞分化誘導後に（６日目）減少する（図３Ｂ）。中胚葉前駆細胞におけるブラキウリ及びＭＥＳＰ１発現の所定の特徴を示すため、これらマーカーの発現をｉＰＳ細胞の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化時に分析した（図３Ｄ）。これらのマーカーはＭＳＣでは発現されず、本発明の方法により得られた中胚葉前駆細胞はＭＳＣとは異なる。
【０１７０】
そして、これらの中胚葉前駆細胞は、ヒト脂肪組織の幹細胞について記載された所定のマーカーを発現する脂肪前駆細胞に分化する。実際に、分化４〜１２日の間に、ＰＤＧＦＲα、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ４４、及びＣＤ２９遺伝子発現は増加する（図３Ｅ）。並行して、ＣＤ２４発現は、脂肪細胞に向かう分化時に減少する（図３Ｅ）。マーカーＣＤ４４、ＣＤ２９、及びＰＤＧＦＲαは、１２日目のタンパク質レベルで同時発現される（図３Ｆ）。さらに、同じこれらの細胞はマーカーＫｉ６７に陽性であり（図３Ｆ）、増殖性前駆個体群の存在を示す。
【０１７１】
−脂肪細胞分化−
特定の脂肪細胞遺伝子の発現は分化時に測定される。図４は、脂肪細胞分化時に誘導されたＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びＰＰＡＲγ転写因子の遺伝子発現が、脂肪生成分化混合物の添加後（４日目）、８〜１２日の間に徐々に増加することを示す。この高発現レベルが２０日目に維持される。同様に、脂肪細胞特異的アイソフォームＰＰＡＲγ２とＣ／ＥＢＰα  ｐ３０／４２とのタンパク質発現を分化１０日目から観察した（図５Ｂ及び図５Ｃ）。図５Ｃにおいて、インスリン受容体（ＩＲ）など脂肪細胞に重要な役割を果たすタンパク質、ペリリピン１やカベオリン１など脂肪滴に関連するタンパク質（図５Ｃ）、並びにグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４（図５Ｂ）の発現が脂肪細胞分化時に誘導されることが示される。
【０１７２】
−脂肪細胞作製−
図５Ａは、種々の倍率における脂肪細胞のオイルレッド染色を示す。脂質蓄積は培養ディッシュ全体で均質である。細胞はクラスターに形成され、円形を示し、いくつかの脂肪滴を含有する。これらの細胞はインビトロで脂肪細胞の形態特性を有する。
【０１７３】
図５Ｂは、核の同時標識を伴う、中性脂質標識の他の方法を示す。図は、脂肪細胞の中心から外れた核、及び脂肪滴の特徴的形成を示す。
【０１７４】
−分化効率−
図５Ａは、脂肪滴が中性脂質染色で標識された脂肪細胞の広範囲視野を示す。これらの画像により、６０％を超えるような分化効率を評価することが可能になる。
【０１７５】
実際に、分化の２０日後に、６２％（±２％ＳＥＭ）の細胞が核において脂肪細胞マーカＣ／ＥＢＰαを発現する。このように、得られた脂肪細胞は、インスリン受容体（ＩＲ）α-サブユニット及びその標的ＡＫＴ／ＰＫの強力なリン酸化を誘導することで短時間のインスリン処理に反応可能である（図５Ｄ）。
【０１７６】
−ベージュ脂肪細胞作製−
図６Ａにおいて、得られた脂肪細胞は、ＰＧＣ１α、ＰＲＤＭ１６、及びＵＣＰ１などの「従来の褐色」遺伝子を発現するが、ＭＹＦ５やＺＩＣ１などの前駆細胞や成熟褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子を発現しないことが示される。ＵＣＰ１タンパク質発現は、１０日目から検出可能である（図６Ｂ）。またこれらの細胞は、ＴＭＥＭ２６、ＣＩＴＥＤ１、ＣＤ１３７、及びＨＯＸＣ９などのベージュ（又は「ブライト」）脂肪細胞に特異的な遺伝子をも発現する（図６Ｃ）。ＣＩＴＥＤ１タンパク質発現は分化した脂肪細胞において観察可能である（図６Ｄ）。さらに、強力なＵＣＰ１タンパク質誘導がβ−アドレナリン刺激後に観察される。この強力な誘導はベージュ脂肪細胞の主要な特徴の１つである（図６Ｅ）。この結果に伴って、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰでの刺激は、４８時間後のベージュ脂肪細胞ミトコンドリア数（図６Ｆ）と、ＰＧＣ１α、ＰＲＤＭ１６、ＰＰＡＲα、及びＤＩＯ２などの熱産生に関わる遺伝子発現（図６Ｇ）とにおいて増加を示す。このように、これらすべての結果は、ヒトｉＰＳ細胞由来の脂肪細胞はベージュ型表現型を有することを示す。
【０１７７】
−インビボでの脂肪組織形成−
脂肪細胞分化培地の存在下におけるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）での培養の１８日後、生後６週の免疫不全マウスの背中に１０７細胞を皮下注入する（図７Ａ）。ＭＳＣ又はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のみを、対照として、同じマウスの胸骨に注入した（ｎ＝３）。３０日後、脂肪層が細胞注入部位に現れ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）注入部位には現れない。ヒトｉＰＳ細胞由来の脂肪細胞注入後に形成された脂肪層の組織学的分析は、完全に分化、組織化、及び血管新生化された脂肪組織を示す（図７Ｃ、Ｄ）。一方で、ｉＰＳ細胞由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の注入後に形成された組織は、広範囲領域に存在する線維芽細胞型細胞と少数の脂肪細胞とを含む不均質組成を有する（図７Ｃ、Ｄ）。ｉＰＳ細胞由来の脂肪細胞又はＭＳＣから形成された脂肪層を構成する細胞は、ペリリピン１標識で示される脂肪滴を有する（図７Ｅ）。こうして、これらのすべての結果は、本発明により取得された脂肪細胞がインビボで脂肪組織を形成可能であることを示す。
【０１７８】
[結論]
２次元での多能性幹細胞の分化により、脂肪生成混合物に供したときに脂肪前駆細胞、そして脂肪細胞に分化する能力を有する中胚葉前駆細胞を作製することが可能である。本発明の方法で取得された脂肪細胞は、この細胞型に特徴的な転写因子を発現し、トリグリセリド形態で脂質を蓄積する。これらの脂肪細胞は、一度移植されるとインビボで脂肪層を形成可能である。さらに、今までインビトロでは記載のなかったベージュ型ヒト脂肪細胞作製をこの方法が可能にすることを発明者等は示した。終わりに、この方法では、未分化多能性幹細胞から多くの脂肪細胞がたった２０日で作製可能である。
【０１７９】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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