(57)【要約】単一の装置においてタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと吸着サブユニットを併用した生体分子の精製のための方法及び装置。サブユニットは、独立に又は連続して操作することができ、装置及び方法は、事前の緩衝剤平衡のない汚染試料における生体分子の精製のための吸着サブユニットを用いたプロセスステップの実施などのクロマトグラフィプロセスに必要な条件とは異なる広範囲の形式における使用に適している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的生成物を調製物から精製するプロセスであって、
装置を用意するステップであって、
前記生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１個以上の吸着サブユニットとを含む複数の精製サブユニットと、
前記複数の精製ユニットと付随するポンプ及び弁とを連結し、それによって、
（ｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第１の構成、及び
（ｉｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が、前記１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第２の構成、及び、場合によっては、
（ｉｉｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が、前記第２の構成において選択される前記吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットに対する入力に（前記第２の構成において選択される前記吸着サブユニットを通らずに）接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第３の構成、
を含めた複数の代替構成に従って前記装置を介した前記生物学的生成物の循環を可能にする複数の導管と、
前記装置への、好ましくは前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力への前記調製物の供給のための導管と、
を備えた、装置を用意するステップ、
前記生物学的生成物の濃度を高くし、前記生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、前記生物学的生成物を前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットを通って１回以上循環することができるように、前記第１の構成に従って前記装置を操作することを含むステップＡを実施するステップ、
前記生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、前記生物学的生成物を前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び前記１個以上の吸着サブユニットから選択される前記吸着サブユニットを通って１回以上循環することができるように、前記第２の構成に従って前記装置を操作することを含むステップＢを実施するステップ、
及び、場合によっては、前記生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、前記生物学的生成物を前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び前記第２の構成において選択される前記吸着サブユニットとは異なる前記吸着サブユニットを通って１回以上循環することができるように、前記第３の構成に従って前記装置を操作することを含むステップＣを実施するステップ、
を含むプロセス。
【請求項２】
前記装置は前記第１の構成、前記第２の構成及び前記第３の構成をもたらし、ステップＡ、ステップＢ及びステップＣの各々が実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記装置は前記第１の構成及び前記第２の構成をもたらし、さらに、ステップＡ、続いてステップＢが実施され、前記精製された生物学的生成物が前記リサイクル分から得られる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記装置は前記第１の構成及び前記第２の構成をもたらし、さらに、ステップＡ、続いてステップＢが実施され、次いでステップＡが再度実施され、前記精製された生物学的生成物が前記リサイクル分から得られる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記精製された生物学的生成物を含む前記リサイクル分はクロマトグラフィプロセスによる更なる精製に供される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記精製された生物学的生成物を含む前記リサイクル分は追加の吸着ユニットに流れ、かかる追加の吸着ユニットを出た前記生物学的生成物が、前記装置を出る前に前記タンジェンシャルフローユニットに戻らない、請求項４に記載のプロセス。
【請求項７】
ステップＡはステップＢとステップＣの間でも実施される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項８】
前記精製された生物学的生成物を含む前記リサイクル分はクロマトグラフィプロセスによる更なる精製に供される、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記精製された生物学的生成物を含む前記リサイクル分は追加の吸着ユニットに流れ、かかる追加の吸着ユニットを出た前記生物学的生成物が、前記装置を出る前に前記タンジェンシャルフローユニットに戻らない、請求項７に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記用意された装置は、前記生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えた第２のタンジェンシャルフロー濾過精製ユニットと第２の吸着ユニットとを含み、前記複数の導管によって、さらに、前記第１の構成、前記第２の構成、並びに、
（ｉｖ）前記第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、前記第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第４の構成、及び
（ｖ）前記第２のタンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が前記第２の吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第５の構成、
を含めて、複数の代替構成に従って前記装置を介した前記生物学的生成物の循環が可能になり、
前記プロセスは、さらに、
前記生物学的生成物の濃度を高くし、前記生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、前記生物学的生成物を前記第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを通って１回以上循環することができるように、前記第４の構成に従って前記装置を操作することを含むステップＤを実施するステップ、
前記生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、前記生物学的生成物を前記第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び前記第２の吸着サブユニットを通って１回以上循環することができるように、前記第５の構成に従って前記装置を操作することを含むステップＥを実施するステップ、
を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記装置は前記第１の構成、前記第２の構成、前記第４の構成及び前記第５の構成をもたらし、ステップＡ、ステップＢ、ステップＤ及びステップＥの各々が実施される、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
ステップＢの一部の間の化学的条件は、以下、すなわち（ｉ）前記調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を可能にする条件の１つ以上を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
ステップＢの一部の間の化学的条件は、以下、すなわち（ｉ）前記調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を可能にする条件の２つ以上を含む、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
ステップＣの一部の間の化学的条件は、以下、すなわち（ｉ）前記調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を可能にする条件の２つ以上を含む、請求項２、７〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
ステップＥの一部の間の化学的条件は、以下、すなわち（ｉ）前記調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を可能にする条件の２つ以上を含む、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
ステップＥの一部の間の化学的条件は、以下、すなわち（ｉ）前記調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を可能にする条件の１つ以上を含む、請求項１０〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
ステップＢの一部の間の化学的条件は、以下、すなわち（ｉ）前記調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）前記生物学的生成物の吸着を可能にする条件の２つ以上を含む、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
ステップＡの間、化学的条件は、前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介した前記調製物の透析濾過によって変わる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記タンジェンシャルフローサブユニットの空隙率は、前記プロセス中に前記生物学的生成物の実質的に全体を前記残留分中に保持しながら実質的にできるだけ大きい、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの前記膜は実質的に同じである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの前記膜は異なる化学組成及び実質的に類似した空隙率を有する、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの前記膜は異なる化学組成及び異なる空隙率を有する、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項２３】
一方の膜は、０．２ミクロンの細孔を有するポリエーテルスルホン膜であり、他方の膜は、質量３０ｋＤａの球状タンパク質に相当する孔径を有するセルロース膜である、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
１個以上の前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニット内の１個以上の膜は、吸着クロマトグラフィを実施するのに適切であるように吸着性表面特性を有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニット内の前記膜の物理的形態は、シート、巻かれた（ロール）シート、中空繊維及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記吸着サブユニットの物理的形態は、吸着性粒子が充填されたカラム；モノリス、１個以上の吸着性膜、１個以上のシート又は１個以上の中空繊維、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記吸着サブユニットによって利用される吸着機構は、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、金属親和性、生物学的親和性及びそれらの組合せからなる群から独立に選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２８】
ステップＢに使用される前記吸着ユニットは、アニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
ステップＢに使用される前記吸着ユニットは、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
ステップＢに使用される前記吸着ユニットは、カチオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３１】
ステップＢに使用される前記吸着ユニットは、ＳＯ３成分によって付与されるカチオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項３０に記載のプロセス。
【請求項３２】
ステップＣに使用される前記吸着ユニットは、アニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３３】
ステップＣに使用される前記吸着ユニットは、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項３２に記載のプロセス。
【請求項３４】
ステップＥに使用される前記吸着ユニットは、アニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３５】
ステップＥに使用される前記吸着ユニットは、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項３６】
ステップＣに使用される前記吸着ユニットは、疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３７】
ステップＣに使用される前記吸着ユニットは、フェニル成分によって付与される疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである、請求項３６に記載のプロセス。
【請求項３８】
ステップＥに使用される前記吸着ユニットは、疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３９】
ステップＥに使用される前記吸着ユニットは、フェニル成分によって付与される疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４０】
ステップＢはフロースルーモードで実施され、ステップＣは結合−溶出モードで実施される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４１】
ステップＢはフロースルーモードで実施され、ステップＥは結合−溶出モードで実施される、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記生物学的生成物の流体力学的直径は１０ｎｍから１００ミクロンである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４３】
前記生物学的生成物は、ＤＮＡプラスミド、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、細胞小器官、細胞、抗体及び非抗体タンパク質からなる群から選択される、請求項４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記調製物の供給源は、細胞培養収集物、又は血清、血漿、乳、及び組織ホモジネート由来の流体からなる群から選択される自然の体液を含む、請求項４２に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記調製物はステップＡの前に分画又は浄化プロセスに供される、請求項１から４４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４６】
ステップＡの前の前記分画又は浄化プロセスによって、前記調製物中のクロマチンの量は少なくとも約９５％減少する、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４７】
前記調製物が、前記調製物が得られた原料試料中に存在するクロマチンの５％未満の形態で供給される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４８】
生物学的生成物を調製物から精製する装置であって、
前記生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えた第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１個以上の吸着サブユニットとを含む複数の精製サブユニット、
前記複数の精製ユニットを連結する複数の導管、
前記複数の導管を介して流れを導き、前記複数の精製ユニットの１個以上を互いに分離することができる弁、
流れを生じ、前記装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプ、
及び、前記装置への、好ましくは前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力への前記調製物の供給のための導管、
を備え、
前記複数の導管並びに付随するポンプ及び弁によって、
（ｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第１の構成、
（ｉｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が、前記１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第２の構成、及び、
（ｉｉｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が、前記第２の構成において選択される前記吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットに対する入力に（前記第２の構成において選択される前記吸着サブユニットを通らずに）接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第３の構成、
を含めた複数の代替構成に従って前記装置を介した前記生物学的生成物の循環が可能になる、装置。
【請求項４９】
さらに、前記生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えた第２のタンジェンシャルフロー濾過精製ユニットと第２の吸着ユニットとを含み、前記複数の導管によって、さらに、前記第１の構成、前記第２の構成、前記第３の構成並びに、
（ｉｖ）前記第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、前記第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第４の構成、及び、
（ｖ）前記第２のタンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が前記第２の吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第５の構成、
を含めて、複数の代替構成に従って前記装置を介した前記生物学的生成物の循環が可能になる、請求項４８に記載の装置。
【請求項５０】
生物学的生成物を調製物から精製する装置であって、
平均孔径が約２．５ｎｍから約５０００ｎｍである少なくとも１個の多孔質膜を備えた第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１個以上の吸着サブユニットとを含む複数の精製サブユニット、
前記複数の精製ユニットを連結する複数の導管、
前記複数の導管を介して流れを導き、前記複数の精製ユニットの１個以上を互いに分離することができる弁、
流れを生じ、前記装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプ、
及び、前記装置への、好ましくは前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力への前記調製物の供給のための導管、
を備え、
前記複数の導管並びに付随するポンプ及び弁によって、
（ｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第１の構成、
（ｉｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が、前記１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第２の構成、及び、
（ｉｉｉ）前記タンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が、前記第２の構成において選択される前記吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットに対する入力に（前記第２の構成において選択される前記吸着サブユニットを通らずに）接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第３の構成
を含めた複数の代替構成に従って前記装置を介した前記生物学的生成物の循環が可能になる、装置。
【請求項５１】
さらに、平均孔径が約２．５ｎｍから約５０００ｎｍである少なくとも１個の多孔質膜を備えた第２のタンジェンシャルフロー濾過精製ユニットと第２の吸着ユニットとを含み、前記複数の導管によって、さらに、前記第１の構成、前記第２の構成、前記第３の構成並びに、
（ｉｖ）前記第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、前記第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第４の構成、及び、
（ｖ）前記第２のタンジェンシャルフロー濾過の前記残留分ライン出力が前記第２の吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、前記第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第５の構成、
を含めて、複数の代替構成に従って前記装置を介した前記生物学的生成物の循環が可能になる、請求項５０に記載の装置。
【請求項５２】
前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの前記多孔質膜の平均孔径は約５ｎｍから約１０００ｎｍである、請求項５０〜５１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５３】
前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの前記多孔質膜の平均孔径は約１０ｎｍから約５００ｎｍである、請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの前記多孔質膜の平均孔径は約２５ｎｍから約１００ｎｍである、請求項５３に記載の装置。
【請求項５５】
前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの前記多孔質膜は、その流体力学的半径に基づいて前記所望の生物学的生成物の少なくとも９９％を保持するように選択された平均孔径を有する、請求項５０〜５１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５６】
前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの前記多孔質膜は、前記所望の生物学的生成物の平均流体力学的半径を超えるように選択された平均孔径を有する、請求項５０〜５１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５７】
前記第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの前記膜は実質的に同じである、請求項４９又は５１に記載の装置。
【請求項５８】
前記第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの前記膜は異なる化学組成及び実質的に類似した空隙率を有する、請求項４９又は５１に記載の装置。
【請求項５９】
前記第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの前記膜は異なる化学組成及び異なる空隙率を有する、請求項４９又は５１に記載の装置。
【請求項６０】
一方の膜は、０．２ミクロンの細孔を有するポリエーテルスルホン膜であり、他方の膜は、質量３０ｋＤａの球状タンパク質に相当する孔径を有するセルロース膜である、請求項５９に記載の装置。
【請求項６１】
１個以上の前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニット内の１個以上の膜は、吸着クロマトグラフィを実施するのに適切であるように吸着性表面特性を有する、請求項４８〜６０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６２】
前記タンジェンシャルフロー濾過サブユニット内の前記膜の物理的形態は、シート、巻かれた（ロール）シート、中空繊維及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４８〜６１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６３】
前記吸着サブユニットの物理的形態は、吸着性粒子が充填されたカラム；モノリス、１個以上の吸着性膜、１個以上のシート又は１個以上の中空繊維、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６４】
前記吸着サブユニットによって利用される吸着機構は、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、金属親和性、生物学的親和性及びそれらの組合せからなる群から独立に選択される、請求項４８〜６３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６５】
前記第２の構成に使用される前記吸着ユニットは、アニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項６４に記載の装置。
【請求項６６】
前記第２の構成に使用される前記吸着ユニットは、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項６５に記載の装置。
【請求項６７】
前記第２の構成に使用される前記吸着ユニットは、カチオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項６４に記載の装置。
【請求項６８】
前記第２の構成に使用される前記吸着ユニットは、ＳＯ３成分によって付与されるカチオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項６７に記載の装置。
【請求項６９】
前記第３の構成に使用される前記吸着ユニットは、アニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項６４に記載の装置。
【請求項７０】
前記第３の構成に使用される前記吸着ユニットは、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項６９に記載の装置。
【請求項７１】
前記第５の構成に使用される前記吸着ユニットは、アニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項６４に記載の装置。
【請求項７２】
前記第５の構成に使用される前記吸着ユニットは、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである、請求項７１に記載の装置。
【請求項７３】
前記第３の構成に使用される前記吸着ユニットは、疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである、請求項６４に記載の装置。
【請求項７４】
前記第３の構成に使用される前記吸着ユニットは、フェニル成分によって付与される疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである、請求項７３に記載の装置。
【請求項７５】
前記第５の構成に使用される前記吸着ユニットは、疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである、請求項６４に記載の装置。
【請求項７６】
前記第５の構成に使用される前記吸着ユニットは、フェニル成分によって付与される疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである、請求項７５に記載の装置。
【請求項７７】
さらに、前記ポンプ及び弁を制御して、前記調製物が流路指示に従って流路を通過するようにコンピュータ読み取り可能な指示によって構成された１個以上のプロセッサを備え、前記流路指示は一連の精製ユニットを規定する、請求項４８〜７６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７８】
さらに、使用者による流路指示の入力又は選択を受けるように構成されたインターフェースを備える、請求項７７に記載の装置。
【請求項７９】
前記インターフェースは、コンピュータ、メモリ、ネットワーク、無線又はそれらの組合せである、請求項７８に記載の装置。
【請求項８０】
前記装置はマルチミリグラムスケールで実施するような規模である、請求項４８〜７６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８１】
前記装置はマルチグラムスケールで実施するような規模である、請求項４８〜７６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８２】
前記装置はマルチキログラムスケールで実施するような規模である、請求項４８〜７６のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、その開示を参照によりその全体を本明細書に援用する、２０１４年３月７日に出願された米国仮特許出願第６１／９４９，９４４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本明細書に開示した実施形態は、タンパク質、ポリヌクレオチド及びウイルス粒子の精製に適切な装置及びプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質、例えば、ＩｇＧモノクローナル抗体の精製は、所望のタンパク質をクロマトグラフィカラムで捕捉する効率が低いことによって阻害される可能性がある。多孔質粒子クロマトグラフィ媒体の流速が遅く、容量が少ないと、カラム体積が増加し、それによってプロセス緩衝剤量が増加し、それによってプロセス時間が増加する可能性がある。フロースルークロマトグラフィ法は一代替法と考えられ、クロマトグラフィ媒体は混入物のみに結合するが、かかる場合においては、カラムに充填された多孔質粒子媒体を用いても、やはり容量が制限され、かかる方法はそれでもなお遅い。膜及びモノリスを用いたクロマトグラフィは、遅さの問題を克服できることもあるが、それらの容量は、多孔質粒子カラムが充填されたカラムよりも何倍も小さく、それらは最終的に効率の低いことが判明した。沈殿技術及び濾過技術は公知であるが、分画性能が同等ながらより高効率であるカラム代替法を提供できないことが判明した。逐次多段階精製プロセスは、個々に非効率的である上に、プロセスステップ間の不連続性から効率が更に低下し、最終的に、余分な水消費、より多くの材料費、及びより長いプロセス時間という負担を負う。同じ制限は、ウイルス粒子の精製、及びＤＮＡの精製にも当てはまる。
【０００４】
吸着クロマトグラフィと単一流タンジェンシャルフロー濾過の組合せを含むある種の装置及びプロセスが知られている。Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓは、連続クロマトグラフィを実施するための単一パスタンジェンシャルフロー濾過クロマトグラフィと同じ媒体が充填された複数のカラムとを連結した製品文書を発表した。ここで、単一パスタンジェンシャルフローアセンブリは、生成物を濃縮する機能を果たす（非特許文献１）。Ｏ．シンカズ（Ｓｈｉｎｋａｚｈ）ら（特許文献１、特許文献２）は、やはり連続処理のための、タンジェンシャルフロー濾過システムを介してポンプ注入された流動化吸着クロマトグラフィ粒子を含む装置及びプロセスについて記述した。
【０００５】
クロマチン含有量を特に減少させる収集物浄化方法が知られている（非特許文献２；非特許文献３）。それらは、精製の全体的質を向上させ、ある場合には、必要な純度を得るためのカラムクロマトグラフィステップ数を減少させるが、精製プロセスの生産性は低下したままであり、複数のカラムクロマトグラフィステップが依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７９８８８５９号
【特許文献２】米国特許第７９４７１７５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍ．スコフィールド（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ）ら、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１４年、アプリケーションノートＵＳＤ３０２、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉ−ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
【非特許文献２】Ｈ．Ｔ．ガン（Ｇａｎ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＡ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ）１９１（２０１３）３３〜４０
【非特許文献３】Ｐ．ガニオン（Ｇａｇｎｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＡ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ）１３４０（２０１４）６８〜７８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある態様においては、本発明は、生物学的生成物を調製物から精製するプロセスであって、（ａ）生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１個以上の吸着サブユニットとを含む複数の精製サブユニットと、（ｂ）複数の精製ユニットと付随するポンプ及び弁とを連結し、それによって、（ｉ）タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第１の構成、及び（ｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第２の構成、及び、場合によっては、（ｉｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、第２の構成において選択される吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットに対する入力に（第２の構成において選択される吸着サブユニットを通らずに）接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第３の構成を含めた複数の代替構成に従って装置を介した生物学的生成物の循環を可能にする複数の導管と、（ｃ）装置への、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力への調製物の供給のための導管とを備えた装置を用意するステップを含むプロセスを提供する。ある態様においては、かかるプロセスは、さらに、生物学的生成物の濃度を高くし、生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、生物学的生成物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを通って１回以上循環することができるように、第１の構成に従って装置を操作することを含むステップＡを実施するステップ、生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、生物学的生成物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットを通って１回以上循環することができるように、第２の構成に従って装置を操作することを含むステップＢを実施するステップ、及び、場合によっては、生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、生物学的生成物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び第２の構成において選択される吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットを通って１回以上循環することができるように、第３の構成に従って装置を操作することを含むステップＣを実施するステップを含む。
【０００９】
ある態様においては、本発明は、生物学的生成物を調製物から精製する装置であって、（ａ）生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えた第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１個以上の吸着サブユニットとを含む複数の精製サブユニット、（ｂ）複数の精製ユニットを連結する複数の導管、（ｃ）複数の導管を介して流れを導き、複数の精製ユニットの１個以上を互いに分離することができる弁、（ｄ）流れを生じ、装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプ、及び（ｅ）装置への、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力への調製物の供給のための導管を備え、複数の導管並びに付随するポンプ及び弁によって、（ｉ）タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第１の構成、（ｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第２の構成、及び（ｉｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、第２の構成において選択される吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットに対する入力に（第２の構成において選択される吸着サブユニットを通らずに）接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第３の構成を含めた複数の代替構成に従って装置を介した生物学的生成物の循環が可能になる、装置を提供する。
【００１０】
以下の図は、開示した装置の特徴及びその適用例の明確な説明を裏づけるものである。これらの図は、単なる説明のためのものであって、装置の具体的構成及び適用例を全体として何ら限定するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の装置のある機能的特徴すべてを有する一構成を示す図である。番号０１で示した容器は、精製される生成物調製物を含む。番号０２で示した容器は、吸着サブユニットを平衡にするのに使用することができる緩衝剤を含む（１個の緩衝剤含有容器しか示されていないが、０２に関して示したように複数の緩衝剤を供給することができる）。０３は再循環容器である。０４は濾液（廃棄物）容器である。１０は、再循環容器の重量を任意の時点において含まれる液体の量の指標として知ることができるようなはかりである。２０は、流れを導くための弁である。５０、５１、５２及び５３はポンプである。３０は圧力センサである。１００はタンジェンシャルフロー濾過サブユニットである。２００は吸着サブユニットである。図中の吸着サブユニットは、クロマトグラフィ粒子が充填されたカラム、又はモノリス、又はいわゆる膜吸着装置を用いた例などの軸流を採用した物理的構成である。かかる装置に独特なプロセスを支援するために、制御器を使用して、圧力シグナルと他のセンサシグナルを統合し、装置の様々な部分を介して差圧を制御できることが明らかになるはずである。図１〜図９のいずれかに対して記述された番号付けされた特徴は、図１〜図９のすべてにおいて同じ番号を有する特徴に当てはまる。
【図２】図２は、生成物調製物がタンジェンシャルフロー濾過サブユニットによって濃縮されている間の流路を強調した図である。濃縮中、小さい混入物は、タンジェンシャルフロー濾過モジュールの細孔を介して除去される。濃縮の選択は任意であり、濃縮度は任意であるが、生成物を濃縮する能力は装置の一態様である。
【図３】図３は、緩衝剤組成がタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介した透析濾過（緩衝剤交換）によって変化している間の流路を示す図である。透析濾過の選択は任意であり、透析濾過の程度は任意であり、エンドポイント緩衝剤の化学特性は任意であるが、調製物を透析濾過する能力は装置の一態様である。
【図４】図４は、インラインのタンジェンシャルフロー濾過と吸着サブユニットの両方を有する流路を強調した図である。この流路は、任意に選択できる緩衝剤交換の前、間又は後に開始することができる。所望の生成物を保持するタンジェンシャルフロー濾過モジュールの能力によって、調製物を吸着サブユニットを介して２回以上循環させることができる。これによって、吸着サブユニットを緩衝剤交換と調和した結合状態に平衡化することができる。それによって、混入物と吸着サブユニットの結合を防止する条件下で、調製物を最初に吸着サブユニットにさらすこともでき、それらをタンジェンシャルフロー濾過モジュールの細孔を介して除去することができる。これによって、緩衝条件がかかる結合を後で促進するときに、混入物と結合する吸着サブユニットの容量が維持される。小さい可溶性混入物は、タンジェンシャルフロー濾過膜の細孔を介して、吸着サブユニットがインラインである全期間連続して除去される。生成物濃度は、タンジェンシャルフロー濾過モジュールを介して緩衝剤入力と流体流束のバランスを制御することによってプロセス全体を通して所望のレベルに維持される。
【図５】図５は、所望の生成物を回収するために吸着サブユニットを不純物のない緩衝剤でリンスしている間の流路を強調した図である。生成物濃度は、タンジェンシャルフロー濾過モジュールを通る入力緩衝剤と流体流束のバランスを制御することによってプロセス全体を通して所望のレベルに維持される。
【図６】図６は、所望の生成物を回収するためにタンジェンシャルフロー濾過モジュールを不純物のない緩衝剤でリンスしている間の吸着サブユニットがオフラインである流路を示す図である。場合によっては、緩衝剤をこのステップで交換することができる。
【図７】図７は、別個のクロマトグラフィシステム上で別個のステップを実施する必要なしに、調製物を更に精製することができるように、外部の吸着クロマトグラフィ（２０１）を含む図１の変形を示す図である。システムは、精製された生成物の収集容器（５）も含む。流路は、吸着サブユニットの機外にセンサ又はセンサアレイを装着することもできる。
【図８】図８は、追加のタンジェンシャルフロー濾過モジュールを含む図１の変形を示す図である。かかるモジュールは、第１のタンジェンシャルフロー濾過モジュールを用いて調製物の初期濃縮を実施し、第１の吸着ステップ中に生成物を保持し、次いで第２のタンジェンシャルフロー濾過モジュールに切り換えて、第１のタンジェンシャルフローモジュールに吸着した混入物がその後のプロセス段階において調製物中に浸出する可能性がないようにすることができる。２個のタンジェンシャルフロー濾過モジュール内の膜の組成及び空隙率は、同じでも異なってもよい。
【図９】図９は、３個の軸流吸着サブユニット２００、２０１、２０２を含む点で異なる図１に基づいたより複雑な装置を示す図である。別の構成は、２又は４又は４個以上の吸着サブユニットを備えることができ、個々の吸着サブユニットは、すべて軸流形式を採用することができ、又はすべてタンジェンシャルフロー形式、若しくは形式の組合せを採用することができる。０５、０６及び０７は、任意に選択できる追加の緩衝剤又は別の所望の材料である。
【図１０】図１０は、単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び単一の吸着クロマトグラフィサブユニットを含む装置からの部分的流路を示す図である。吸着クロマトグラフィサブユニットは、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットと直列に配置することができるように配管されている。０１は、緩衝剤、試料及び／又はリサイクル分からの流体入力である。０２は、リサイクル分への流体出力である。０３は透過分（ｐｅｒｍｅａｔｅ）である。１０は、流れ分布を制御する弁である。１００はタンジェンシャルフロー濾過サブユニットである。２００は吸着サブユニットである。図１０〜図１４のいずれかに対して記述された番号付けされた特徴は、図１０〜図１４のすべてにおいて同じ番号を有する特徴に当てはまる。図１０〜図１４に示した特徴に対する参照番号は、図１〜図１０及び図１５とは異なる。図１０に示したこの構成は、実施例１、２、５、８〜１３及び１５〜２２に記載のものなどの適用例を裏づけるのに適した一実施形態である。
【図１１】図１１は、単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び２個の吸着クロマトグラフィサブユニットを含む装置からの部分的流路を示す図である。吸着クロマトグラフィユニットは、互いに並行して配管設置されているが、どちらか一方を任意の時間においてタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと直列にすることができ、又は両方をタンジェンシャルフロー濾過サブユニットに対してオフラインにすることができる。０１は、緩衝剤、試料及び／又はリサイクル分からの流体入力である。０２は、リサイクル分への流体出力である。０３は透過分である。１０は、流れ分布を制御する弁である。１００はタンジェンシャルフロー濾過サブユニットである。２００は吸着サブユニットである。２０１は第２の吸着サブユニットである。この構成によって、装置は、２つの異なる吸着法の適用を媒介して、各吸着剤が異なる操作条件を必要とする状況において混入物を除去することができる。図１１に示したこの構成は、実施例３、４、６、７、２４及び２５に記載のものなどの適用例を裏づけるのに適した一実施形態である。
【図１２】図１２は、単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び２個の吸着クロマトグラフィサブユニットを含む装置からの部分的流路を示す図である。吸着クロマトグラフィユニットは、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットと直列に一緒に配置することができるように互いに直列に配管されている。０１は、緩衝剤、試料及び／又はリサイクル分からの流体入力である。０２は、リサイクル分への流体出力である。０３は透過分である。１０は、流れ分布を制御する弁である。１００はタンジェンシャルフロー濾過サブユニットである。２００は吸着サブユニットである。２０１は第２の吸着サブユニットである。この構成によって、装置は、２つの異なる吸着法の適用を媒介して、両方の吸着剤を同じ操作条件によって収容することができる状況において混入物を除去することができる。図１２に示したこの構成は、実施例１４に記載のものなどの適用例を裏づけるのに適した一実施形態である。
【図１３】図１３は、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び単一の吸着クロマトグラフィユニットを含む装置からの部分的流路を示す図である。２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、互いに並行して配管設置されているが、どちらかを吸着クロマトグラフィサブユニットと直列にすることができる。０１は、緩衝剤、試料及び／又はリサイクル分からの流体入力である。０２は、リサイクル分への流体出力である。０３は透過分である。１０は、流れ分布を制御する弁である。１００はタンジェンシャルフロー濾過サブユニットである。１０１は、第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットである。２００は吸着サブユニットである。この構成によって、装置は、調製物を吸着クロマトグラフィサブユニットを介して処理する前に、調製物を一方のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して濃縮及び／又は緩衝剤交換し、次いで調製物を吸着クロマトグラフィサブユニットを介して処理した後に、又は処理中及び処理後に、異なるタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して濃縮及び／又は緩衝剤交換することができる。この構成の利点は、調製物と最初に接触するタンジェンシャルフロー濾過ユニットが汚染され、次いで吸着ステップ後に混入物が調製物中に浸出して戻る可能性があることである。２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを備えることによって、汚染された第１のかかるサブユニットをオフラインにして、高度に精製された調製物中に混入物が浸出して戻る可能性を抑制することができる。
【図１４】図１４は、単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、単一の吸着クロマトグラフィユニットと、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットからの透過分ライン上の末端非再循環吸着クロマトグラフィサブユニットとを含む装置からの部分的流路を示す図である。０１は、緩衝剤、試料及び／又はリサイクル分からの流体入力である。０２は、リサイクル分への流体出力である。０３は透過分である。１０は、流れ分布を制御する弁である。１００はタンジェンシャルフロー濾過サブユニットである。２００は吸着サブユニットである。３００は末端非循環吸着サブユニットである。この構成によって、装置は、調製物が透過分ラインを通って装置から流出する際に末端混入物吸着ステップを実施することができる。
【図１５】図１５は、統合緩衝剤配合を含む別の代替構成を示す図である。０１と表示した箱は、水入力を示す。０２、０３及び０４と表示した箱は、緩衝剤又は緩衝剤濃縮物の入力を示す。０５と表示した箱は、未精製タンパク質調製物の入力を示す。０６と表示した黒丸は、ポンプ０７ｂによってシステムに入る入力源を制御する切り換え弁である。ポンプ０７ａを通って許容される水の量は、特に、緩衝剤濃縮物を希釈する能力を裏づける。７ｃと表示したポンプは、ポンプ０７１及び０７ｂと合わせて、０７ａ／０７ｂと０７ｃの間の操作圧力を制御する。０８と表示した黒三角形の群は３方弁である。０９と表示した黒三角形の対は、閉じていても開いていてもよい２位置弁である。１０と表示した箱は、残留分再循環容器である。１１と表示した箱は、廃棄物タンクである。１２と表示した箱は、精製タンパク質を収集することができるタンクである。１３と表示したラインは、再循環ループである。１００と表示した箱は、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットである。２００と表示した箱は、吸着サブユニットである。点線で囲まれ、２０１と表示した箱は、任意に選択できる追加の吸着サブユニットである。１０００と表示した白丸は、混合機である。１００１と表示した箱は、圧力センサである。１００２と表示した箱は、ガス交換装置又は気泡トラップである。白三角形は、装置の様々な流路における流れ方向を示す。図１５に示した特徴の参照番号は、図１〜図１４とは異なる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１〜図１５を参照し、記述される実施形態は、装置及びプロセス構成におけるある個々の変形形態を説明するものであるが、場合によっては個々の特徴のすべてを含めて、様々な組合せを単一の装置構成に含み得ることは当業者に明らかなはずである。
【００１３】
ある態様においては、本発明は、生物学的生成物を調製物から精製するプロセスであって、（ａ）生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１個以上の吸着サブユニットとを含む複数の精製サブユニットと、（ｂ）複数の精製ユニットと付随するポンプ及び弁とを連結し、それによって、（ｉ）タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第１の構成、及び（ｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第２の構成、及び、場合によっては、（ｉｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、第２の構成において選択される吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットに対する入力に（第２の構成において選択される吸着サブユニットを通らずに）接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第３の構成を含めた複数の代替構成に従って装置を介した生物学的生成物の循環を可能にする複数の導管と、（ｃ）装置への、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力への調製物の供給のための導管とを備えた装置を用意するステップを含むプロセスを提供する。ある態様においては、かかるプロセスは、さらに、生物学的生成物の濃度を高くし、生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、生物学的生成物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを通って１回以上循環することができるように、第１の構成に従って装置を操作することを含むステップＡを実施するステップ、生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、生物学的生成物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットを通って１回以上循環することができるように、第２の構成に従って装置を操作することを含むステップＢを実施するステップ、及び、場合によっては、生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、生物学的生成物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び第２の構成において選択される吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットを通って１回以上循環することができるように、第３の構成に従って装置を操作することを含むステップＣを実施するステップを含む。
【００１４】
ある態様においては、前述の実施形態は、装置が第１の構成、第２の構成及び第３の構成をもたらし、ステップＡ、ステップＢ及びステップＣの各々を実施するプロセスを提供する。
【００１５】
ある態様においては、前述の実施形態は、装置が第１の構成及び第２の構成をもたらし、さらに、ステップＡ、続いてステップＢが実施され、精製された生物学的生成物がリサイクル分から得られるプロセスを提供する。
【００１６】
ある態様においては、前述の実施形態は、装置が第１の構成及び第２の構成をもたらし、さらに、ステップＡ、続いてステップＢが実施され、次いでステップＡが再度実施され、精製された生物学的生成物がリサイクル分から得られるプロセスを提供する。ある種のかかる実施形態においては、精製された生物学的生成物を含むリサイクル分をクロマトグラフィプロセスによる更なる精製に供する。別のかかる実施形態においては、精製された生物学的生成物を含むリサイクル分が追加の吸着ユニットに流れ、かかる追加の吸着ユニットを出た生物学的生成物は、装置を出る前にタンジェンシャルフローユニットに戻らない。
【００１７】
ある態様においては、前述の実施形態は、ステップＡをステップＢとステップＣの間でも実施するプロセスを提供する。ある種のかかる実施形態においては、精製された生物学的生成物を含むリサイクル分をクロマトグラフィプロセスによる更なる精製に供する。別のかかる実施形態においては、精製された生物学的生成物を含むリサイクル分が追加の吸着ユニットに流れ、かかる追加の吸着ユニットを出た生物学的生成物は、装置を出る前にタンジェンシャルフローユニットに戻らない。
【００１８】
ある態様においては、前述の実施形態は、用意された装置が、生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えた第２のタンジェンシャルフロー濾過精製ユニットと第２の吸着ユニットとを含み、複数の導管によって、さらに、第１の構成、第２の構成、並びに（ｉｖ）第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第４の構成、及び（ｖ）第２のタンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が第２の吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第５の構成を含めて、複数の代替構成に従って装置を介した生物学的生成物の循環が可能になるプロセスを提供する。ある態様においては、かかるプロセスは、さらに、生物学的生成物の濃度を高くし、生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、生物学的生成物を第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを通って１回以上循環することができるように、第４の構成に従って装置を操作することを含むステップＤを実施するステップ、生物学的生成物に付随する混入物のレベルを低くしながら、生物学的生成物を第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び第２の吸着サブユニットを通って１回以上循環することができるように、第５の構成に従って装置を操作することを含むステップＥを実施するステップを含む。ある種のかかる実施形態においては、装置が第１の構成、第２の構成、第４の構成及び第５の構成をもたらし、ステップＡ、ステップＢ、ステップＤ及びステップＥの各々を実施する。
【００１９】
ある態様においては、前述の実施形態は、ステップＢの一部の間の化学的条件が、以下、すなわち（ｉ）調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）生物学的生成物の吸着を可能にする条件の１つ以上を含むプロセスを提供する。ある種のかかる実施形態においては、ステップＢの一部の間の化学的条件が、以下、すなわち（ｉ）調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）生物学的生成物の吸着を可能にする条件の２つ以上を含む。
【００２０】
ある態様においては、ステップＣを含む前述の実施形態は、ステップＣの一部の間の化学的条件が、以下、すなわち（ｉ）調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）生物学的生成物の吸着を可能にする条件の１つ以上を含むプロセスを提供する。ある種のかかる実施形態においては、ステップＥの一部の間の化学的条件が、以下、すなわち（ｉ）調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）生物学的生成物の吸着を可能にする条件の２つ以上を含む。
【００２１】
ある態様においては、ステップＥを含む前述の実施形態は、ステップＥの一部の間の化学的条件が、以下、すなわち（ｉ）調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）生物学的生成物の吸着を可能にする条件の１つ以上を含むプロセスを提供する。ある種のかかる実施形態においては、ステップＢの一部の間の化学的条件が、以下、すなわち（ｉ）調製物の成分の大部分の吸着を防止する条件、（ｉｉ）生物学的生成物の吸着を防止又は中断する条件、及び（ｉｉｉ）生物学的生成物の吸着を可能にする条件の２つ以上を含む。
【００２２】
ある態様においては、前述の実施形態は、ステップＡの間、化学的条件が、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介した調製物の透析濾過によって変わるプロセスを提供する。
【００２３】
ある態様においては、前述の実施形態は、タンジェンシャルフローサブユニットの空隙率が、プロセス中に生物学的生成物の実質的に全体を残留分中に保持しながら実質的にできるだけ大きいプロセスを提供する。
【００２４】
ある態様においては、第１と第２の両方のタンジェンシャルフローサブユニットを含む前述の実施形態は、第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの膜が実質的に同じであるプロセスを提供する。別のかかる実施形態においては、第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの膜が、異なる化学組成及び実質的に類似した空隙率を有する。更に別のかかる実施形態においては、第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの膜が、異なる化学組成及び異なる空隙率を有する。ある種のかかる実施形態においては、一方の膜が、０．２ミクロンの細孔を有するポリエーテルスルホン膜であり、他方の膜が、質量３０ｋＤａの球状タンパク質に相当する孔径を有するセルロース膜である。
【００２５】
ある態様においては、前述の実施形態は、１個以上のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット内の１個以上の膜が、吸着クロマトグラフィを実施するのに適切であるように吸着性表面特性を有するプロセスを提供する。
【００２６】
ある態様においては、前述の実施形態は、タンジェンシャルフロー濾過サブユニット内の膜の物理的形態が、シート、巻かれた（ロール）シート、中空繊維及びそれらの組合せからなる群から選択されるプロセスを提供する。
【００２７】
ある態様においては、前述の実施形態は、吸着サブユニットの物理的形態が、吸着性粒子が充填されたカラム；モノリス、１個以上の吸着性膜、１個以上のシート又は１個以上の中空繊維、及びそれらの組合せからなる群から選択されるプロセスを提供する。
【００２８】
ある態様においては、前述の実施形態は、吸着サブユニットによって利用される吸着機構が、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、金属親和性、生物学的親和性及びそれらの組合せからなる群から独立に選択されるプロセスを提供する。ある種のかかる実施形態においては、ステップＢに使用される吸着ユニットが、アニオン交換吸着機構を有するモノリスである。ある種のかかる実施形態においては、ステップＢに使用される吸着ユニットが、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである。別のかかる実施形態においては、ステップＢに使用される吸着ユニットが、カチオン交換吸着機構を有するモノリスである。ある種のかかる実施形態においては、ステップＢに使用される吸着ユニットが、ＳＯ３成分によって付与されるカチオン交換吸着機構を有するモノリスである。
【００２９】
ある態様においては、ステップＣ又はステップＥを含む前述の実施形態は、ステップＣに使用される吸着ユニットが、アニオン交換吸着機構を有するモノリスであるプロセスを提供する。ある種のかかる実施形態においては、ステップＣに使用される吸着ユニットが、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである。別のかかる実施形態においては、ステップＥに使用される吸着ユニットが、アニオン交換吸着機構を有するモノリスであり、ある種のかかる実施形態においては、ステップＥに使用される吸着ユニットが、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである。別のかかる実施形態においては、ステップＣに使用される吸着ユニットが、疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスであり、ある種のかかる実施形態においては、ステップＣに使用される吸着ユニットが、フェニル成分によって付与される疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである。別のかかる実施形態においては、ステップＥに使用される吸着ユニットが、疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスであり、ある種のかかる実施形態においては、ステップＥに使用される吸着ユニットが、フェニル成分によって付与される疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである。
【００３０】
ある態様においては、ステップＣを含む前述の実施形態は、ステップＢがフロースルーモードで実施され、ステップＣが結合−溶出モードで実施されるプロセスを提供する。ある態様においては、ステップＥを含む前述の実施形態は、ステップＢがフロースルーモードで実施され、ステップＥが結合−溶出モードで実施されるプロセスを提供する。
【００３１】
ある態様においては、前述の実施形態は、生物学的生成物の流体力学的直径が１０ｎｍから１００ミクロンであるプロセスを提供する。ある態様においては、前述の実施形態は、生物学的生成物が、ＤＮＡプラスミド、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、細胞小器官、細胞、抗体及び非抗体タンパク質から選択されるプロセスを提供する。別のかかる実施形態においては、調製物の供給源は、細胞培養収集物、又は血清、血漿、乳、及び組織ホモジネート由来の流体からなる群から選択される自然の体液である。
【００３２】
ある態様においては、前述の実施形態は、調製物がステップＡの前に分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）又は浄化プロセスに供されるようなプロセスを提供する。ある種のかかる実施形態においては、ステップＡの前の分画又は浄化プロセスによって、調製物中のクロマチンの量が少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９５％超減少する。ある態様においては、前述の実施形態は、調製物が、調製物が得られた原料試料中に存在するクロマチンの２５％、２０％、１５％、１０％又は５％未満の形態で供給されるようなプロセスを提供する。
【００３３】
ある態様においては、前述の実施形態は、装置が２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び少なくとも１個の吸着ユニットを備え、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットが並行して配管設置され、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットのどちらかを第２の構成において吸着ユニットと組み合わせることができるようなプロセスを提供する。かかる実施形態の利点は、精製プロセスを１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを用いて開始することができ、プロセスのその後の段階で第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの汚染の影響を回避するために第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットを用いて完了できることである。かかる実施形態の例示的構成を図８及び図１３に示す。例えば、ある種のかかる実施形態においては、ステップＡを第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを用いて開始することができ、第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを用いて（すべての後続ステップと一緒に）完了することができる。別のかかる実施形態においては、ステップＡを第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを用いて実施することができ、（その後のステップＡの実行を含めて）すべての後続ステップを第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを用いて完了することができる。更に別のかかる実施形態においては、ステップＡ及びＢを第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを用いて実施することができ、ステップＣ及び（その後のステップＡの実行を含めて）任意の後続ステップを第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを用いて完了することができる。
【００３４】
ある態様においては、本発明の前述の実施形態は、緩衝剤平衡がかかる精製ステップの一部又はすべての過程中に実施されるように、ステップの実行前に緩衝剤平衡のない形式に従って実施されるプロセス、好ましくは多段階プロセスを提供する。かかる実施形態の利点としては、試料の取扱い及び処理に必要な量が減少する、より効率的な緩衝剤及び他の資源の使用が挙げられる。
【００３５】
装置又はかかる装置を使用する方法に関する本発明のある態様においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの膜は、選択されたサイズを超える流体力学的直径を有する非吸着溶質の少なくとも最小割合がサイズに基づいて保持されるが、選択されたサイズ未満の流体力学的直径を有する非吸着溶質が膜を通過することができるように選択される空隙率を有する。ある実施形態においては、最小割合を５０％から１００％の任意の量とすることができ、ある種のかかる実施形態においては、最小割合は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％である。ＩｇＧ抗体の精製を対象とするものなどのある種のこれらの実施形態においては、選択されたサイズを約１０ｎｍから１５ｎｍの任意の量とすることができ、ある種のかかる実施形態においては、選択されたサイズを約１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ又は１５ｎｍとすることができる。
【００３６】
装置又はかかる装置を使用する方法に関する本発明のある態様においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの膜は、平均孔径約３ｎｍから約６ｎｍ、又は約６ｎｍ、又は約５ｎｍ、又は約４ｎｍ、又は約３ｎｍを有すると特徴づけられる空隙率を有する。装置又はかかる装置を使用する方法に関する本発明のある態様においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの膜は、最大孔径約９ｎｍ以下、又は約８ｎｍ以下、又は約７ｎｍ以下、又は約６ｎｍ以下、又は約５ｎｍ以下を有すると特徴づけられる空隙率を有する。その最長寸法に従って測定されるＩｇＧ抗体の流体力学的直径は、約１０〜１５ｎｍである傾向にあり、局所的条件に応じて多少変動する。抗体の柔軟性及びそのサイズ変動を考慮すると、抗体を保持する孔径の選択は、一般に、目的抗体の流体力学的直径よりもかなり小さい孔径を必要とする。例えば、約９ｎｍの最大孔径は、より大きいＩｇＧの実質的にすべてを保持し得るが、一部のより小さい又はより柔軟なＩｇＧは、約５ｎｍなどのより小さい最大孔径を必要とし得る。さらに、膜の孔径は、平均孔径が最大孔径よりもかなり小さいような分布を有すると予想することができる。例えば、最大孔径が約９ｎｍの膜は、平均孔径が６ｎｍであり得る。同様に、最大孔径が約５ｎｍの膜は、平均孔径が３ｎｍであり得る。当業者は、上記考察に合わせて、他の所望の生物学的生成物に適切な膜空隙率をその近似流体力学的直径の知識に基づいて選択する方法を理解するはずである。
【００３７】
ある態様においては、本発明は、生物学的生成物を調製物から精製する装置であって、（ａ）生物学的生成物のほぼ全部（又は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９５％超）を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えた第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１個以上の吸着サブユニットとを含む複数の精製サブユニット、（ｂ）複数の精製ユニットを連結する複数の導管、（ｃ）複数の導管を介して流れを導き、複数の精製ユニットの１個以上を互いに分離することができる弁、（ｄ）流れを生じ、装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプ、及び（ｅ）装置への、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力への調製物の供給のための導管を備え、複数の導管並びに付随するポンプ及び弁によって、（ｉ）タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第１の構成、（ｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第２の構成、及び（ｉｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、第２の構成において選択される吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットに対する入力に（第２の構成において選択される吸着サブユニットを通らずに）接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第３の構成を含めた複数の代替構成に従って装置を介した生物学的生成物の循環が可能になる装置を提供する。
【００３８】
ある態様においては、前述の実施形態は、生物学的生成物のほぼ全部を保持するのに十分な空隙率を有する細孔を有する少なくとも１個の多孔質膜を備えた第２のタンジェンシャルフロー濾過精製ユニットと第２の吸着ユニットとを含み、複数の導管によって、さらに、第１の構成、第２の構成、第３の構成、並びに（ｉｖ）第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第４の構成、及び（ｖ）第２のタンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が第２の吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第５の構成を含めて、複数の代替構成に従って装置を介した生物学的生成物の循環が可能になる装置を提供する。
【００３９】
ある態様においては、本発明は、生物学的生成物を調製物から精製する装置であって、（ａ）平均孔径が約２．５ｎｍから約５０００ｎｍである少なくとも１個の多孔質膜を備えた第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１個以上の吸着サブユニットとを含む複数の精製サブユニット、（ｂ）複数の精製ユニットを連結する複数の導管、（ｃ）複数の導管を介して流れを導き、複数の精製ユニットの１個以上を互いに分離することができる弁、（ｄ）流れを生じ、装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプ、及び（ｅ）装置への、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力への調製物の供給のための導管を備え、複数の導管並びに付随するポンプ及び弁によって、（ｉ）タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第１の構成、（ｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、１個以上の吸着サブユニットから選択される吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第２の構成、及び（ｉｉｉ）タンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が、第２の構成において選択される吸着サブユニットとは異なる吸着サブユニットに対する入力に（第２の構成において選択される吸着サブユニットを通らずに）接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、タンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第３の構成を含めた複数の代替構成に従って装置を介した生物学的生成物の循環が可能になる装置を提供する。ある態様においては、前述の実施形態は、さらに、平均孔径が約２．５ｎｍから約５０００ｎｍである少なくとも１個の多孔質膜を備えた第２のタンジェンシャルフロー濾過精製ユニットと第２の吸着ユニットとを含み、複数の導管によって、さらに、第１の構成、第２の構成、第３の構成、並びに（ｉｖ）第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの残留分ライン出力をリサイクル分として収集し、第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第４の構成、及び（ｖ）第２のタンジェンシャルフロー濾過の残留分ライン出力が第２の吸着サブユニットに対する入力に接続し、かかる吸着ユニットの出力をリサイクル分として収集し、第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットの入力に戻すことができるような連続流のための第５の構成を含めて、複数の代替構成に従って装置を介した生物学的生成物の循環が可能になる装置を提供する。ある種のかかる実施形態においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの多孔質膜は、平均孔径が約５ｎｍから約１０００ｎｍ、又は約１０ｎｍから約５００ｎｍ、又は約２５ｎｍから約１００ｎｍである。ある前述の実施形態においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの多孔質膜は、その流体力学的半径に基づいて所望の生物学的生成物の少なくとも９９％を保持するように選択された平均孔径を有する。
【００４０】
ある前述の実施形態においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの多孔質膜は、所望の生物学的生成物の平均流体力学的半径を超えるように選択された平均孔径を有する。ある態様においては、前述の実施形態は、第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの膜が実質的に同じような装置を提供する。別のかかる実施形態においては、第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの膜が、異なる化学組成及び実質的に類似した空隙率を有する。更に別のかかる実施形態においては、第１と第２のタンジェンシャルフローサブユニットの膜は、異なる化学組成及び異なる空隙率を有し、ある種のかかる実施形態においては、一方の膜が、０．２ミクロンの細孔を有するポリエーテルスルホン膜であり、他方の膜が、質量３０ｋＤａの球状タンパク質に相当する孔径を有するセルロース膜である。
【００４１】
ある態様においては、前述の実施形態は、１個以上のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット内の１個以上の膜が、吸着クロマトグラフィを実施するのに適切であるように吸着性表面特性を有する装置を提供する。
【００４２】
ある態様においては、前述の実施形態は、タンジェンシャルフロー濾過サブユニット内の膜の物理的形態が、シート、巻かれた（ロール）シート、中空繊維及びそれらの組合せからなる群から選択される装置を提供する。ある別の実施形態においては、吸着サブユニットの物理的形態は、吸着性粒子が充填されたカラム；モノリス、１個以上の吸着性膜、１個以上のシート若しくは１個以上の中空繊維、又はそれらの組合せである。
【００４３】
ある態様においては、前述の実施形態は、吸着サブユニットによって利用される吸着機構が、独立に、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、金属親和性、生物学的親和性又はそれらの組合せのいずれかである装置を提供する。ある種のかかる実施形態においては、第２の構成に使用される吸着ユニットが、アニオン交換吸着機構を有するモノリスであり、ある種のかかる実施形態においては、第２の構成に使用される吸着ユニットが、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである。別のかかる実施形態においては、第２の構成に使用される吸着ユニットが、カチオン交換吸着機構を有するモノリスであり、ある種のかかる実施形態においては、第２の構成に使用される吸着ユニットが、ＳＯ３成分によって付与されるカチオン交換吸着機構を有するモノリスである。
【００４４】
ある態様においては、前述の実施形態は、第３の構成に使用される吸着ユニットがアニオン交換吸着機構を有するモノリスである装置を提供する。ある種のかかる実施形態においては、第３の構成に使用される吸着ユニットが、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである。
【００４５】
ある態様においては、前述の実施形態は、第５の構成に使用される吸着ユニットがアニオン交換吸着機構を有するモノリスである装置を提供する。ある種のかかる実施形態においては、第５の構成に使用される吸着ユニットが、第四級アミン成分によって付与されるアニオン交換吸着機構を有するモノリスである。
【００４６】
ある態様においては、前述の実施形態は、第３の構成に使用される吸着ユニットが疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである装置を提供する。ある種のかかる実施形態においては、第３の構成に使用される吸着ユニットが、フェニル成分によって付与される疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである。
【００４７】
ある態様においては、前述の実施形態は、第５の構成に使用される吸着ユニットが疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである装置を提供する。ある種のかかる実施形態においては、第５の構成に使用される吸着ユニットが、フェニル成分によって付与される疎水性相互作用吸着機構を有するモノリスである。
【００４８】
ある態様においては、前述の実施形態は、さらに、ポンプ及び弁を制御して、調製物が流路指示に従って流路を通過するようにコンピュータ読み取り可能な指示によって構成された１個以上のプロセッサを備え、流路指示が一連の精製ユニットを規定する、装置を提供する。ある種のかかる実施形態においては、装置は、さらに、使用者による流路指示の入力又は選択を受けるように構成されたインターフェースを備える。ある種のかかる実施形態においては、インターフェースは、コンピュータ、メモリ、ネットワーク、無線又はそれらの組合せである。
【００４９】
ある態様においては、前述の実施形態は、マルチミリグラムスケール又はマルチグラムスケール又はマルチキログラムスケールで実施するような規模である装置を提供する。
【００５０】
ある態様においては、前述の実施形態は、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び少なくとも１個の吸着ユニットを備え、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットが並行して配管設置され、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットのどちらかを第２の構成において吸着ユニットと組み合わせることができる装置を提供する。かかる実施形態の利点は、精製プロセスを１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを用いて開始することができ、プロセスのその後の段階で第１のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの汚染の影響を回避するために第２のタンジェンシャルフロー濾過ユニットを用いて完了できることである。かかる実施形態の例示的構成を図８及び図１３に示す。
【００５１】
一部の実施形態においては、装置及び装置を使用する方法であって、装置が所望の生物学的生成物の調製物を含む容器を備え、該容器は、膜を有する少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと統合され、場合によっては、生成物を沈殿状態で又は複数の粒子に付随する状態で保持する膜を備えた第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを備えることができる。該膜は、所望の生成物を調製物から可溶状態で保持し、さらに少なくとも１個の吸着サブユニットを統合し、場合によっては第２又は第３又は追加の吸着サブユニットを備えることができる。開示した装置及びプロセスの開発及び使用を通して、精製を行う公知の装置及びプロセスの能力を大きく驚くほど上回る多数の利点が発見された。
【００５２】
図（例えば、図１、図１０又は図１５）は、浄化された細胞培養収集物からＩｇＧモノクローナル抗体などの所望のタンパク質を精製する装置構成を示す。所望のタンパク質は、プロセス全体を通して可溶性のままである。タンジェンシャルフローサブユニット（１００）は、ＩｇＧの容認できない損失を防止するのに十分小さいが、より小さい混入物を通過させるのに十分大きい細孔径分布を有する不活性膜を備える。実際には、この要件は、約５０ｋＤａまでの質量の仮想球状タンパク質に相当する平均サイズの細孔を有する膜によって満たすことができる。かかる膜における孔径範囲は、一般に平均を中心にしたガウス分布において、そのサイズの半分以下までの細孔及びそのサイズの２倍以上までの細孔を含むと理解される。その結果、平均孔径がより大きいが、孔径範囲がより狭い膜が、適切に又はより良好に機能し得ることも理解される。概して、ＩｇＧの容認できない損失がない最大孔径の膜は、膜材料が試料成分に対して不活性である限り、最も望ましい。再生セルロース膜は、極めて不活性であり、したがって、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜よりも好ましい。ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜は、疎水性がより高く、混入物の除去を制限し、生成物回収率を低下させ得る非特異的化学相互作用に関与する傾向がより高い。図の吸着サブユニット（２００）は、膜吸着装置、モノリス、多孔質粒子が充填されたカラムなどの固定層アニオン交換装置とすることができる。概して、吸着サブユニットは、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットに関連したサイズとすることができ、吸着サブユニットは、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットによって維持される流量を制限しない。図に示したように、装置は、必要に応じてポンプ、弁、管及びモニター装置を備えて、装置を経由する流れを所望のとおりに通し、場合によっては、制御器を備えて、部分的又は完全に自動化された操作を必要に応じて支援する。
【００５３】
図の装置構成を採用した１つ以上の実施形態においては、第１ステップは、入力タンパク質調製物を濃縮して全プロセス量を減らすことである。ＩｇＧモノクローナル抗体の場合、第１ステップは、抗体を１０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ若しくは１００ｇ／Ｌ又はそれ以上、それ以下若しくは中間の濃度に濃縮することであり得る。プロセス量を減らすと、後続の処理ステップを通して水の消費が減少し、化学物質の消費及び処理時間が同じ増分で減少することは当業者に明らかであるはずである。
【００５４】
１つ以上の図に係る装置構成を採用した１つ以上の実施形態においては、第２のステップは、濃縮抗体のウイルス不活性化を行うことである。かかる一例においては、緩衝剤は、タンジェンシャルフロー濾過サブユニット（１００）を介して、抗体が導入された最初の緩衝剤から例えば１００ｍＭ酢酸、１．７Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝剤、ｐＨ３．５に交換される。抗体濃度は、このプロセス中に比較的一定に保持され、低処理量の利点を維持し、余分なタンク容量を必要としない。
【００５５】
１つ以上の図に係る装置構成を採用した１つ以上の実施形態においては、第３のステップは、所望のタンパク質調製物を少なくとも１個の吸着サブユニットと接触させることである。かかる一例においては、アニオン交換モノリス（２００）が置かれ、最初に１００ｍＭ酢酸、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５で緩衝されたタンパク質調製物がモノリスと接触する。緩衝剤は、タンジェンシャルフロー濾過サブユニット（１００）を介して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含む緩衝剤、ｐＨ８．０と交換される。緩衝剤交換中、ＩｇＧ調製物及びモノリスは、ｐＨ３．５からｐＨ８．０、及び１．７Ｍ  ＮａＣｌから名目上ＮａＣｌがない条件を経る。ＩｇＧ調製物が５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に達する点では、酸性混入物がアニオン交換モノリスに結合する。この点においては、流路は、モノリスを不純物のない５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝剤でリンスすることができる形状に変わり、モノリス並びにそれに至るライン及びそれからのラインから抗体を回収する。これらのステップは、システムのある種の実施形態の実施形態の多数の独特の可能性を強調するものであり、その最初のものを概念的な例によって説明する。ポリヌクレオチドＤＮＡは、電気陰性が高い。タンパク質のリゾチームは、電気陽性が高い。低ＮａＣｌ又はＮａＣｌのない緩衝剤中に一緒に置くと、ＤＮＡはリゾチームに結合し、それらは共沈する。十分なＮａＣｌを添加すると、それらは再可溶化し、互いに独立したままである。目的がＤＮＡをアニオン交換クロマトグラフィ法によって所望の生成物リゾチームから除去することであれば、この２種が可溶性であり、互いに独立している試料を利用することが理想的である。ただし、塩濃度が高いと、アニオン交換体上の正電荷がＤＮＡに結合できなくなり、それによってそれをリゾチームから除去できなくなる制限が課される。開示した装置及びプロセスでは、ＤＮＡとリゾチームは、１００ｍＭ酢酸、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５中で可溶性であり、互いに独立していると考えられる。塩濃度が下がり始めると、ＤＮＡは、リゾチームよりもアニオン交換モノリスにより強く誘引される。というのは、それはその表面にリゾチームの数百万倍の電気陽性基を有するからである。一方、リゾチームは、アニオン交換モノリスの電気陽性表面から反発される。塩濃度が低下するほど、アニオン交換体に対するＤＮＡの誘引が強くなり、したがってリゾチームからのその効果的な除去が強化される。イオン交換クロマトグラフィの領域全体においては、１つを除いて、すべての他の方法及び変形法は、試料がアニオン交換体と接触する前に試料が結合状態に平衡化される必要があることに特に留意されたい。１つの例外は、ボイド排除モード（ｖｏｉｄ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｏｄｅ）と呼ばれるアニオン交換クロマトグラフィのモードであるが（ニアン（Ｎｉａｎ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＡ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ）（２０１２）１２７〜１３２）、このモードでさえ、試料体積は、充填粒子のカラムの体積の約４０％以下に限定される。試料を必要な結合状態に平衡にする別途の事前のステップなしに、任意のｐＨ又は塩濃度において、制限のない試料量を利用することができる開示した方法の能力を支援するアニオン交換クロマトグラフィの公知の変形はこれまで記述されていない。開示した装置及び方法は、その可能性を裏づけるものである。第２の独特の特徴は、システムのある種の実施形態が、アニオン交換体に結合する混入タンパク質の大部分を除去し、最終的に、それらが結合する条件下でタンパク質調製物がアニオン交換体と接触する前に、アニオン交換体からかかる混入物の大きな負荷を除去する高容量を必要とすることである。大部分のかかる混入物は、ＩｇＧ濃縮及びウイルス不活性化段階中に、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットの細孔を介して除去される。それによって、膜及びモノリスのような一般に高速であるが低容量の対流吸着クロマトグラフィ材料の使用を可能にする重要な可能化ステップである、アニオン交換体の容量は比較的問題にならない（ｕｎｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。アニオン交換体がライン中に置かれるときに一部のかかる混入物が調製物中に残り得る程度に、初期の塩濃度が高いと、それらが結合せず、それらがタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの細孔を介して除去される更なる機会を与えることができる。本発明のある実施形態の第３の独特の特徴は、緩衝剤を交換しながらタンパク質調製物がアニオン交換モノリスを介して何度も循環することに関する。固定層吸着クロマトグラフィの実質的にすべての公知の方法は、アニオン交換体などのカラムを経由した試料の１回の通過に基づく。任意の特定の理論に帰するものではないが、アニオン交換体を複数回通過することは、混入物のより効果的な結合を支援すると考えられる。本発明のある実施形態の第４の独特の特徴は、より良好なプロセス制御に関する。イオン交換体にかけられる試料は、一般に、特にわずかに異なる、通常はより高い、塩濃度を含めて、それらの組成が、交換体が平衡化される緩衝剤とはわずかに異なる。ＮａＣｌなどの塩由来の塩化物イオンは、アニオン交換体表面の水酸化イオンを置換し、緩衝剤のｐＨを、無制御に、やはり制御されない期間、上昇させる。かかる現象は、ｐＨ変移（ｐＨ  ｅｘｃｕｒｓｉｏｎｓ）としてよく知られている。アニオン交換体は、同時に、ＩｇＧが存在する同じ条件に平衡化されるので、ｐＨ変移は、開示した方法によって解消される。本発明のある実施形態の第５の独特の特徴も、プロセス制御に当てはまる。アニオン交換体にかけられる大部分のＩｇＧ試料は、事前のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィステップ、又は事前のカチオン交換クロマトグラフィステップ、又は別のクロマトグラフィステップから溶出する。いずれにしても、ＩｇＧ調製物は過剰の塩を含む。別途の装置を必要とする緩衝剤交換ステップを回避するために、大部分のプロセスは、試料を希釈及びｐＨ滴定によって平衡化する必要がある。このため、試料量が増加し、それが手作業で実施されるので、異なる製造ロットにわたって高度の再現性を維持することが困難である。ある実施形態の開示した装置を用いて、タンパク質調製物を正確に各々すべての運転の目標条件に緩衝剤交換し、それによって再現性を高める。本発明のある実施形態の第６の独特の特徴は、カラムクロマトグラフィに典型的な複数の異なるステ���プの代わりに、クロマトグラフィ媒体平衡、試料調製、試料適用及び混入物除去を一段階で行うことによって可能になるプロセス量の減少である。他の精製システムでこれを可能にすることはできない。この特徴は、所望のＩｇＧの初期濃縮によって成される量の減少、並びに対応する水、化学物質消費及びプロセス時間の減少を増す。本発明のある実施形態の第７の独特の特徴は、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ若しくは５０ｇ／Ｌ又はそれ以上など、プロセスの単一ステップごとにＩｇＧを高濃度で維持する能力である。他の精製システムでは、この能力又はこの能力の組合せを可能にすることはできない。
【００５６】
図（例えば、図１、図１０又は図１５）の装置構成を採用した１つ以上の実施形態においては、吸着サブユニットをリンスし、オフラインにした後に、ＩｇＧ調製物を緩衝剤交換する。開示した装置及び方法を用いてこのステップを実施する特別な利点は、前のステップと同じ装置内でそれを行うことである。一部の実施形態においては、精製ＩｇＧ調製物をシステムから収集することができる。別の実施形態においては、システムに配管設置された追加の吸着サブユニットを通過することによって調製物を更に精製することができる。調製物は図７に示すようにシステムから出る。これらの状況は、本発明のある実施形態の開示した装置及び方法の別の独特の利点を強調するものである。通常、損失は、プロセスの各操作ステップにおいて生じる。これらの損失は、生成物が装置内の表面に結合するので生じるときもあれば、流体を装置から十分に回収することができないので生じるときもあり、未回収体積内に存在する所望の抗体が失われる。回収率が各ステップで９０％であっても、３ステッププロセスでは生成物の２７％が失われる（回収率７３％）。本方法では、複数の分画機構を採用したプロセス全体は、残りの所望の生成物をシステムから洗い流す能力を有する単一の装置内で行われる。予備データの示すところによれば、本システムは、複数の分画機構を含む統合プロセスにもかかわらず、９０％を超える回収率を保持する。すべての前のステップと同様に、生成物濃度は、これらの最終ステップを通してほぼ一定に維持される。これは、それが結合及び溶出したり、又は単に吸着サブユニットを通過したりするので、生成物濃度が各ステップで高い値から低い値にまで及び、各ステップの各段階に適応したタンク容量を必要とする伝統的なクロマトグラフィプロセスよりも極めて有利である。
【００５７】
図９は、浄化された細胞培養収集物からＩｇＧモノクローナル抗体などの所望のタンパク質を精製するより複雑な構成を示す。装置は、３個の吸着サブユニットを備える。濃縮及びウイルス不活性化ステップは、上述したように実施することができる。次に、フェニル吸着膜サブユニットがインラインにされ、最初に１００ｍＭ酢酸、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５中でＩｇＧ調製物にさらされる。フェニル膜サブユニットがインラインのままの状態で、緩衝剤をタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して５０ｍＭリン酸ナトリウム、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に交換する。システムがこれらの条件に達した後、フェニル膜並びにそれに至るライン及びそれからのラインをリンスして、抗体を回収する。アニオン交換モノリスがインラインにされ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０においてＩｇＧ調製物と接触する。次いで、調製物を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝剤交換する。ＩｇＧ調製物がこれらの条件に達した後、アニオン交換モノリス並びにそれに至るライン及びそれからのラインを不純物のない５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０でリンスする。一部の実施形態においては、第３の吸着サブユニットは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８に平衡化中又は後にインライン配置することができるＳＯ３（カチオン交換）モノリスからなり得る。ステップの順序は、任意の所望の順序で行うことができる。吸着ステップ完了後、調製物を最終又は最終前配合に緩衝剤交換することができ、ステップを前述したように実施する。この例は、合計１０種類を超える緩衝剤を必要とし得るＩｇＧ捕捉、中間精製、最終精製及び配合に対して、ＩｇＧ濃縮、ウイルス不活性化、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ及び最終配合のプロセス全体が４種類の緩衝剤しか必要としないというシステムの別の独特の特徴を強調するものである。これは、緩衝剤調製に付随する労力を大いに削減し、タンク容量要件を緩和し、それを行うのに必要なプロセス及び装置の複雑さを減らす。この構成の別の変形実施形態においては、第４の（外部）吸着サブユニットを装置に配管設置することができる。
【００５８】
一部の実施形態においては、システムは、上述したように、少なくとも１個の吸着サブユニット及び少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットで構成することができ、第２の吸着サブユニット（末端吸着サブユニット）を、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び末端吸着サブユニットを含む再循環が起こらないように、装置の出口に配管設置することができる。かかる実施形態においては、既に使用された第１の吸着サブユニットを用いて所望の生成物をラインからリンス後、調製物を末端吸着サブユニットによる混入物除去に適切な緩衝剤に緩衝剤交換する。次いで、末端吸着サブユニットをインラインにし、所望のタンパク質調製物が末端吸着サブユニットを通過するときに出口でタンパク質調製物を収集する。このシステムの更なる変形実施形態においては、システムは、それぞれのプロセス段階において、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと流体接触している第１及び第２の吸着サブユニットで構成することができ、第３の吸着サブユニット（末端吸着サブユニット）ユニットを、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び末端吸着サブユニットを含む再循環が起こらないように、装置の出口に配管設置することができる。このシステムの別の変形実施形態においては、それぞれのプロセス段階において、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと流体接触しているより多くの吸着サブユニットを備えることができ、最終吸着サブユニット（末端吸着サブユニット）を、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び末端吸着サブユニットを含む再循環が起こらないように、装置の出口に配管設置することができる。上記実施形態のいずれにおいても、末端吸着サブユニットを、膜、又はモノリス、又は充填粒子のカラムを含めた物理的形態とすることができる。
【００５９】
本発明のある実施形態は、図（例えば、図１、図１０又は図１５）に例示されたものなどのシステムによって可能になる別の利点を支持する。所望のタンパク質は、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットによってシステムに含まれるので、それは、吸着サブユニット（単数又は複数）によって保持を不可能にする塩を許容するだけでなく、所望のタンパク質及び１種以上の混入物を含むその他の点では安定な複合体の存在を維持する非特異的相互作用を分離するその能力で特に知られている高濃度の塩も許容する。これは、所望のタンパク質調製物を分離緩衝剤に緩衝剤交換する分離洗浄ステップの適用を可能にし、十分小さいサイズの分離混入物がタンジェンシャルフロー濾過サブユニットにおける膜を通過することによって除去される。かかる洗浄ステップを上述したウイルス不活性化の代わりに実施することができ、又は上述したウイルス不活性化をかかるステップと考えることができる。あるいは、かかる洗浄ステップをウイルス不活性化ステップに加えて実施することができる。１つ以上の実施形態においては、カオトロピック塩は、塩酸グアニジン、酢酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム又は別のカオトロピック塩からなる群からの１種以上を含むことができ、カオトロピック塩の１種又は組合せの濃度は、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ若しくは中間値とすることができ、又は濃度が所望のタンパク質の恒久的な変性をもたらさない限りより高い濃度とすることができる。同様に、他の分離剤と組み合わせたＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸Ｋ又はＮａなどの中性塩の組合せも可能である。１つ以上のかかる実施形態においては、中性塩に追加される分離剤としては、尿素；ソルビトール若しくはキシリトール；アルギニン、リジン若しくはヒスチジン；システイン、グルタチオン、システインなどの還元剤；ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、ＴＲＥＮなどのキレート化剤；ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアリルアミンなどの多価カチオン；エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ブタノール、プロパノール、エタノール、メタノール、フェノキシエタノールなどの有機溶媒；Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒｉｊ、オクタグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯなどの界面活性剤；又は追加の分離剤の組合せからなる群からの１種以上が挙げられる。当業者は、開示した分離洗浄の原理を適用する多数の方法が存在することを認識するはずである。
【００６０】
本発明のある実施形態は、図（例えば、図１、図１０又は図１５）に例示されたものなどのシステムによって可能になる別の利点を生じる。所望のタンパク質を保持する空隙率を有する膜によるタンジェンシャルフロー濾過の技術は、より小さい混入物を減少させることが知られているが、減少度は、緩衝剤の量を目標緩衝剤水準に達するのに必要な最小値にする通常の手法によって制限される。本装置及び方法を用いた完全な精製の過程においては、複数の緩衝剤交換ステップに関連した緩衝剤の量が大きくなると、膜を介した小さい混入物の減少度が増加する。これは、さらに、タンパク質調製物がさらされる緩衝剤環境の多様性によって増強され、その各々が異なるサブセットの混入物の溶解性を増加させる可能性があり、それによって全体としてプロセスによって除去することができる混入物の多様性が増加すると理解される。
【００６１】
一部の実施形態においては、多孔質粒子が充填されたカラムを吸着サブユニットとして採用することができる。これは、効率を低下させ得る。というのは、その使用には、粒子を用いたカラムクロマトグラフィシステムにおいて拡散物質移動を妨害すると理解される粘度を最小化するためにタンパク質の濃度が制限される必要があり得るからであり、体積流量の低下を必要とし得るが、必要に応じて、例えば、所望の界面化学を欠く膜又はモノリスが利用不可能又は不経済である状況において、効果的に使用することができる。一部のかかる実施形態においては、直径が大きく層高さの短い粒子充填カラムを採用することができる。従来のクロマトグラフィにおいては、これは、一般に、しばしば極度に、容量及び混入物除去効率を制限するが、本システムにおいては、緩衝剤交換−カラム平衡との併用を含めて、調製物をカラムを介して複数回循環させる能力によって、その負担を軽減又は克服し、モノリス及び膜を用いた吸着クロマトグラフィ装置に比べて多孔質粒子媒体の一般的により高容量の利点をプロセスが得ることができる。
【００６２】
一部の実施形態においては、吸着サブユニットは、タンジェンシャルフロー濾過膜の物理的形態とすることができ、開示した装置は、細胞、細胞小器官などのマイクロ粒子生成物の精製に使用することができ、並びにウイルス粒子などのナノ粒子生成物、又はタンパク質、ポリヌクレオチドなどの可溶性生成物、又は複合糖質に使用することができる。
【００６３】
一部の実施形態においては、装置をＩｇＧよりも大きいタンパク質に適合させることができる。システムをより大きいタンパク質に適用すると、必要に応じて、細孔径分布がより大きいタンジェンシャルフロー濾過膜を使用する機会が得られ、上述したようにタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを通過することによって減少し得る混入物種の多様性を増加させる可能性がある。
【００６４】
一部の実施形態においては、装置をＩｇＧよりも小さいタンパク質に適合させることができる。システムをより小さいタンパク質に適用するには、細孔径分布がより小さい膜の使用を必要とし得る。
【００６５】
一部の実施形態においては、異なる界面化学を利用した異なる吸着サブユニットを、必要に応じて異なる選択性を実現し、特定の精製プロセスの目的を果たすために採用することができる。
【００６６】
一部の実施形態においては、システムは、結合−溶出モードで吸着を行うのに使用することができ、カチオン交換ステップをＩｇＧ濃縮後又はウイルス不活性化後に適用する場合のように、所望のタンパク質は、吸着剤に結合し、次いで吸着剤から溶出する。これも追加の緩衝剤を必要とし、システムの複雑さをやや増加させ、プロセス量を増加させ、それによってプロセス時間も増加させるが、それでも全体として装置の統合範囲内の結合−溶出モードステップの組み込みによって、伝統的な逐次クロマトグラフィ操作に比べて水量が劇的に減少する。
【００６７】
先の実施形態の幾つかにおいては、基本的に、タンパク質の精製に使用される同じ構成をＤＮＡの精製に使用することができる。一部のかかる実施形態においては、緩衝条件及び吸着界面化学の選択は、必要に応じて異なり得る。かかる一実施形態においては、吸着サブユニットの１つをカチオン交換体とすることができ、操作ｐＨを混入タンパク質を吸着する約ｐＨ４に設定する。別のかかる一実施形態においては、対流吸着サブユニットの１つを、タンパク質を保持し、ＤＮＡを保持しないように十分高い塩濃度で操作される疎水性相互作用媒体とすることができる。
【００６８】
先の実施形態の幾つかにおいては、基本的に、タンパク質の精製に使用される同じ構成をウイルス又はウイルス様粒子の精製に使用することができる。一部のかかる実施形態においては、緩衝条件及び吸着界面化学の選択は、必要に応じて異なり得る。
【００６９】
１つ以上の実施形態においては、装置の規模は、数ｍｇの所望の生成物の精製を支援するように小型化することができる。１つ以上の実施形態においては、装置の規模は、１〜１００ｍｇの所望の生成物の精製を支援するように設定することができる。１つ以上の実施形態においては、装置の規模は、１００ｍｇから数グラムの所望の生成物の精製を支援するように設定することができる。１つ以上の実施形態においては、装置の規模は、数グラムから数百グラムの所望の生成物の精製を支援するように設定することができる。１つ以上の実施形態においては、装置の規模は、数百グラムから１キログラムの所望の生成物の精製を支援するように設定することができる。１つ以上の実施形態においては、装置の規模は、１ｋｇを超える所望の生成物、又は１０ｋｇを超える、又は１００ｋｇを超える所望の生成物の精製を支援するように設定することができる。１つ以上の実施形態においては、装置の規模は、より少量、中間量又はより多量の所望の生成物の精製を支援するように設定することができる。
【００７０】
一部の実施形態においては、図１〜図１５のいずれかに示したものなどの本発明の装置及びプロセスの変形を採用して、沈殿ステップ、例えば、ポリエチレングリコールなどの非イオン性有機ポリマーを用いた沈殿、又は硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウムなどの沈殿塩を用いた沈殿を含む、統合多段階精製プロセスの実施を含むこともでき、沈殿ステップは１つの吸着ステップと統合される。細胞培養収集物の浄化後、収集物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニットに通して所望の量に濃縮することができる。ＩｇＧよりも小さい混入物は、タンジェンシャルフロー濾過膜を通過することによって除去される。このステップは、後続の沈殿ステップの再現性に重要である指定濃度にＩｇＧを濃縮することができる利点も支持する。ＩｇＧは、適切なｐＨ及びシステムの選択性を所望のとおりに調節するのに適切な条件において、入力緩衝剤を目標濃度の所望の沈殿剤を含むものに変えることによって沈殿する。かかる一実施形態においては、ＩｇＧ沈殿緩衝剤を１．３クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０とすることができる。沈殿タンパク質を保持するが、可溶性タンパク質を保持しない膜を備えた追加のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを経由する流れを導くように装置構成を変える。沈殿しない混入物をタンジェンシャルフロー濾過膜を介して除去する。沈殿を洗浄する効果を有する１．３クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０をシステムに連続してポンプ注入し、可溶性混入物をタンジェンシャルフロー濾過ユニットの膜に連続して通す。装置構成を戻し、流れを最初のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットに導く。入力緩衝剤を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０など、所望の生成物を沈殿状態で維持することができず、それによってそれを再可溶化させる配合に変える。抗体が再可溶化するとすぐに、例えばアニオン交換モノリス又は膜からなる、吸着サブユニットをインライン配置し、システムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に十分に緩衝剤交換する。吸着サブユニットユニットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０でリンスし、ラインから外し、次いでシステムを場合によっては配合前緩衝剤（ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）に緩衝剤交換し、次いでシステムをリンスして、ＩｇＧのすべてを回収する。関連する一実施形態においては、２個の吸着サブユニットを含むシステムを採用する。どちらのシステム構成においても、それによってすべてのステップが１個の装置で実施される単一の単位操作に統合されるように、ウイルス不活性化及び／又は非特異的相互作用の分離などの追加の任意に選択できるステップを統合することができると認識される。
【００７１】
一部の実施形態においては、所望の生成物を可溶状態で保持する膜を備えた第１のタンジェンシャルフローサブユニットと、所望の生成物を保持しないが、統合多段階プロセスの少なくとも１段階の間に生成物が結合し得る懸濁粒子を保持する能力を有する膜を備えた第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットとを含む装置の一変形を採用することができる。例えばアニオン交換クロマトグラフィ粒子などのかかる粒子は、第１の吸着サブユニットの代替の物理的形態をもたらす。各限外濾過サブユニットはそれ自体の濾液ポートを含み、少なくとも１個の限外濾過サブユニットは、さらに、操作者が望む場合、廃棄物又は生成物が異なる容器に導かれるように濾液ポートに弁を備えることができると認識される。装置は、場合によっては、例として若しくは図を参照して示し、記載したように、又は本明細書に別段の記載がなされたように、構成された１個以上の追加の吸着サブユニットを備えることができる。さらに、ある実施形態においては、本発明は、簡略化して、固定層吸着サブユニットを省略し、可溶性生成物を保持する膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを省略して、流動化粒子からなる少なくとも１個の吸着サブユニット及びクロマトグラフィ粒子を保持するが、可溶性種を保持しない多孔質膜を備えた１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの本質的な核を残すことができる、流動化粒子上で吸着ステップを実施するための装置を提供すると認識される。ある実施形態においては、タンジェンシャル濾過フローサブユニットは、所望の生物学的生成物を保持するのに十分な空隙を有することができ、空隙のサイズは、生物学的生成物単独とは対照的に生物学的生成物が結合した粒子に関連して決定される。
【００７２】
本明細書に記載の本発明の実施形態のいずれにおいても、装置又はプロセスは、処理中に材料の組成を評価し、記録することができるように、２点以上におけるモニタリングを含むことができる。かかるモニタリングは、ＵＶ光吸光度監視装置、濁度監視装置、伝導率監視装置、ｐＨ監視装置、圧力監視装置及び／又は重量監視装置などによって実施することができる。一部の実施形態においては、装置を２点を超える点でモニターすることができる。一部のかかる実施形態においては、制御器を、システムを通過する液体の組成を２つの特定の点で連続的にモニターするように設定し、その比較に基づいて事象を自動的に起動するように設定することができる。かかる一例においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットを出た溶液のｐＨ及び伝導率が入力溶液の伝導率に一致したときに、緩衝剤交換が完了したと判断され、一連のステップにおける次の事象を開始する。関連した一例においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットを出た溶液が入力溶液と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％同一、又は操作者によって設定された別の一致度であるときに、事象を開始することができる。一般にモニターされるパラメータとしては、ｐＨ、伝導率、及び１つ以上の波長におけるＵＶ吸光度が挙げられる。
【００７３】
一部の実施形態においては、装置は、処理液に溶解した気体を含めて、過剰の気体を流体の流れから除去する能力を備える。一部のかかる実施形態においては、気体除去装置は、通常の気泡トラップからなることができる。一部のかかる実施形態においては、システムにおいて膜を通る圧力を生じるのに使用されるポンプの直後に気泡トラップを配置するのが有利である。というのは、脱ガスは、システム中の液体がポンプ入口側の加圧状態からポンプ出口側の比較的加圧されていない状態に移った直後に起こる傾向があるからである。一部の実施形態においては、気体除去装置は、ヘリウム、アルゴンなどの貴ガスが供給されるガス交換膜からなり得る。貴ガスは、一般に水と非混和性であるため、膜を通して液体から気体を吸収するが、それ自体は液体の流れに入らない。
【００７４】
一部の実施形態においては、１個以上の吸着サブユニットを結合−溶出モードで操作し、所望の生成物が１個以上の吸着サブユニットに結合するように少なくとも１種の操作緩衝剤を配合する。この手法は、もっぱらフロースルーモードで使用するとシステムの利点の多くを提供しないが、それでも伝統的なクロマトグラフィシステムよりも実質的に良好な又はより経済的な性能を与えることができる。
【００７５】
一部の実施形態においては、試料は、細胞培養収集物、細胞培養上清、細胞培養物由来のタンパク質含有溶液、細胞培養物由来の抗体含有溶液、細胞培養物由来のウイルス含有若しくはウイルス様粒子含有溶液、又は前の精製段階からの目標種含有溶液である。一部の実施形態においては、試料は、血清、血漿、別の体液、組織ホモジネートなどの画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）である生成物を含む天然流体である。
【００７６】
一部の実施形態においては、所望のタンパク質の精製に備えて細胞培養物を浄化する方法が、最良の結果を得る装置及び方法の能力に実質的に影響を及ぼすことが予想外に発見された。
【００７７】
先の実施形態の１つ以上においては、試料は、浄化された細胞培養上清（ＣＣＳ：ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を含む。かかる一実施形態においては、ＣＣＳは、遠心分離、凝集、濾過又はこれら若しくは他の技術のある組合せによって浄化することができる。特に、クロマチン及び付随する異化産物の少なくとも９０％を除去する浄化方法の能力は、高い精製を達成するシステムの能力を不相応に増加させる。一部の実施形態においては、開示した装置及び方法によって処理される所望の生成物調製物は、細胞を含まない細胞培養収集物とすることができる。かかる一実施形態においては、遠心分離、濾過などの物理的方法によって収集物を浄化することができる。別のかかる一実施形態においては、１つ以上の正に帯電した表面との接触によって収集物を浄化することができる。別のかかる一実施形態においては、クロマチン及びクロマチン異化産物の９０％以上を除去する方法によって収集物を浄化することができる。別のかかる一実施形態においては、浄化方法は、所望の生成物調製物を可溶性及び／又は不溶性多価有機イオンと接触させるステップを含む。
【００７８】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機多価イオンを用いたタンパク質調製物の調節は、試料を電気陽性有機添加剤と接触させることを含む。一部のかかる実施形態においては、電気陽性有機添加剤は、エタクリジン、メチレンブルー、臭化セチルトリメチルアンモニウムからなる群からの少なくとも１種を含む。一部のかかる実施形態においては、かかる種の濃度、又は種の組合せの凝集体濃度は、０．００１から１％、又は０．０１から０．１％、又は０．０２から０．０５％の範囲である。一部のかかる実施形態においては、調製物のｐＨは、所望のタンパク質の回収率をさほど減少させないアルカリ値まで調節することができる。所望のタンパク質がＩｇＧモノクローナル抗体であるかかる一実施形態においては、ｐＨを抗体等電点の半ｐＨ単位のｐＨ値まで調節することができ、又は抗体回収が許容されるが、かかる調節が一般に不要であることを実験結果が示す場合はそれを超えて調節することができる。任意のｐＨ調節が成される程度に、タンパク質等電点の１ｐＨ単位以内、又は１．５ｐＨ単位以内、及びある場合には２ｐＨ単位以上以内の値が十分である。
【００７９】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機多価イオンを用いたタンパク質調製物の調節は、試料を電気陰性有機添加剤と接触させることを含む。一部のかかる実施形態においては、電気陰性有機添加剤は、ヘプタン酸、ヘプテン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸、メチルブルーからなる群からの少なくとも１種を含む。一部のかかる実施形態においては、かかる種の濃度、又は種の組合せの全濃度は、０．００１から１０％、又は０．０１から１％、又は０．１から０．５％の範囲である。一部のかかる実施形態においては、調製物のｐＨは、所望のタンパク質の回収率をさほど減少させない酸性値まで調節することができる。一部のかかる実施形態においては、調製物のｐＨを３．５から６．５、４．０から６．０、４．５から５．５、５．０から５．３、５．１５から５．２５の範囲、又は５．２、又は別の中間値に調節することができる。
【００８０】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機多価イオンを用いたタンパク質調製物の調節は、試料を不溶アラントインと接触させることを含む。一部のかかる実施形態においては、タンパク質調製物中に存在する添加アラントインは、約０．６％から５０％、又は０．７から２０％、又は０．８から１０％、又は０．９から５％、又は１から２％、又は中間値の量とすることができる。前述の実施形態の１つ以上においては、無水アラントインの平均粒径は、過飽和溶液中の不溶アラントインの最大全表面積を得る目的で、利用可能な最小サイズであるように選択される。かかる一実施形態においては、アラントインを顆粒化して、より小さい粒径にする。
【００８１】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機多価イオンを用いたタンパク質調製物の調節は、試料を非イオン性又は両性イオン性界面活性剤とその臨界ミセル濃度よりも低い濃度で接触させることを含む。
【００８２】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機多価イオンを用いたタンパク質調製物の調節は、（ｉ）電気陰性表面を有する第１の固体基質である第１の成分を用意すること、（ｉｉ）タンパク質調製物を第１の成分と接触させること、ここで操作条件は、所望のタンパク質と第１の成分の結合を実質的に防止する、及び（ｉｉｉ）クロマチン含有量の減少した所望のタンパク質を第１の成分から分離することを含む。一部のかかる実施形態においては、第１の電気陰性表面は、第２の電気陰性表面を伴うことができる。
【００８３】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機多価イオンを用いたタンパク質調製物の調節は、（ｉ）電気陽性表面を有する第１の固体基質である第１の成分を用意すること、（ｉｉ）タンパク質調製物を第１の成分と接触させること、ここで操作条件は、所望のタンパク質と第１の成分の結合を実質的に防止する、及び（ｉｉｉ）クロマチン含有量の減少した所望のタンパク質を第１の成分から分離することを含む。一部のかかる実施形態においては、第１の電気陽性表面は、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）の残基を有する。一部のかかる実施形態においては、第１の電気陽性表面は、ＴＲＥＮの複数の層を表面に合成することによって生成されるＴＲＥＮデンドリマーなど、又はそのアミノ酸残基に結合した疎水性残基を有するＴＲＥＮなどのＴＲＥＮ誘導体を有する。一部のかかる実施形態においては、疎水性残基は、アルキル若しくはアリール組成物とすることができ、又は組合せ組成物とすることができる。一部のかかる実施形態においては、アルキル残基は、３又は５又は６又は７又は８又は９又は１０個の炭素原子からなることができる。一部の実施形態においては、炭素原子の範囲は４から８である。一部のかかる実施形態においては、第１の電気陽性表面は、第２の電気陽性表面を伴うことができる。
【００８４】
１つ以上の実施形態においては、調製物の調節に使用される電気陽性固相は、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）などのアミノ系金属キレートリガンド、又はその誘導体の１種、又は別の電気陽性キレートリガンドを使用し、リガンドは鉄を担持し、固相を調製物の調節に使用する前に過剰の鉄を除去する。
【００８５】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機多価イオンを用いたタンパク質調製物の調節は、（ｉ）電気陽性表面を有する第１の固体基質である第１の成分を用意すること、（ｉｉ）電気陰性表面を有する第２の固体基質である第２の成分を用意すること、（ｉｉｉ）タンパク質調製物を第１及び第２の成分と接触させること、ここで第１及び第２の成分は、タンパク質調製物が両方の成分に同時に接触するように構成され、操作条件は、所望のタンパク質と第１又は第２の成分の結合を実質的に防止する、及び（ｉｖ）クロマチン含有量の減少した所望のタンパク質を第１及び第２の成分から分離することを含む。一部のかかる実施形態においては、第１の電気陽性表面は、トリス（２−アミノエチル）アミンの残基を有する。
【００８６】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機多価イオンを用いたタンパク質調製物の調節は、（ｉ）タンパク質調製物を、金属に結合可能な少なくとも１種の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と接触させること、ここで金属に結合可能な表面結合リガンドは、初期には実質的に金属がなく、操作条件は、所望のタンパク質と少なくとも１つの固体表面の結合を実質的に防止するように選択される、及び（ｉｉ）タンパク質調製物を少なくとも１種の表面結合リガンドから分離することを含む。
【００８７】
前述の実施形態の１つ以上においては、可溶性電気陽性若しくは電気陰性有機添加剤及び／又は電気陰性、電気陽性若しくは金属親和性リガンドを有する固体表面で既に処理されたタンパク質調製物を、続いて、その流体接触表面が正電荷を含む装置に流すことができる。
【００８８】
クロマチンを対象とした浄化方法の適用を説明する一実施形態においては、アラントインを細胞培養収集物に１％（ｖ／ｖ）の量で添加する。細胞培養物は細胞を含むことができ、又は細胞を前もって除去することができる。メチレンブルーを濃度０．０２５％（ｗ／ｖ）まで添加する。あるいは、エタクリジンを濃度０．０２５％まで添加することができる。あるいは、０．０２５％臭化セチルトリメチルアンモニウムを濃度０．０２５％まで添加することができる。あるいは、これら又は別の電気陽性有機添加剤の組合せを総濃度０．０２５％で使用することができる。次いで、混合物を２時間撹拌インキュベートする。電気陽性金属親和性リガンドのトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）を有する粒子を２〜５％ｖ：ｖの量で添加する。混合物を４時間撹拌インキュベートし、次いで固体を任意の適切な手段によって除去する。所望のタンパク質を含有する残りの溶液を、場合によっては、その流体接触表面に正電荷を有するデプスフィルタに通すことができる。一部の実施形態においては、ＴＲＥＮをその末端アミノ酸残基が疎水性残基を有するように化学修飾する。疎水性残基は、アリール、アルキル又は混合組成物とすることができ、アルキルの場合、炭素原子数は１から１０である。
【００８９】
クロマチンを対象とした浄化方法の適用を説明する別の一実施形態においては、アラントインを細胞培養収集物に約１％（ｖ／ｖ）の量で添加する。細胞培養物は細胞を含むことができ、又は細胞を前もって除去することができる。約０．６％ヘプタン酸を添加する。あるいは、約０．４％オクタン酸又は約０．４％オクテン酸を添加する。あるいは、約０．３％ペラルゴン（ノナン）酸又は約０．４％ノネン酸を添加する。あるいは、約０．２％カプリン酸を添加する。あるいは、約０．５％メチルブルーを添加する。あるいは、これら又は別の電気陰性有機添加剤の組合せを使用することができる。次いで、混合物を２時間撹拌インキュベートする。電気陽性金属親和性リガンドのトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）を有する粒子を約２から約５％ｖ：ｖの量で添加する。混合物を４時間混合インキュベートし、次いで固体を任意の適切な方法によって除去する。所望のタンパク質を含有する残りの溶液を、場合によっては、その流体接触表面に正電荷を有するデプスフィルタに通すことができる。一部の実施形態においては、ＴＲＥＮをその末端アミノ酸残基が疎水性残基を有するように化学修飾する。疎水性残基は、アリール、アルキル又は混合組成物とすることができ、アルキルの場合、炭素原子数は１から１０である。
【００９０】
先の実施形態の１つ以上においては、塩を浄化混合物に添加して、可溶性又は不溶性多価有機イオンとの過剰な相互作用による所望のタンパク質の損失を防止することができる。一部のかかる実施形態においては、ＩｇＭ抗体又は非抗体タンパク質がクロマチンを対象とした浄化システムの構成要素に結合するのを防止する目的で、ＮａＣｌを添加して、おおよその伝導率が約２０ｍＳ／ｃｍに等しい約２００ｍＭに相当するレベルに伝導率を増加させることができる。別のかかる実施形態においては、ＮａＣｌ濃度を多かれ少なかれ増加させて、特定の組換えタンパク質に対応させることができる。任意の特定のタンパク質に対応する適切な塩濃度は、所望のタンパク質の試料をカチオン交換体又はアニオン交換体に適用し、それらを漸増塩勾配で溶出させ、所望のタンパク質ピークの中央における伝導率を測定し、次いでその伝導率値を浄化プロセスに使用することによって迅速に容易に推定することができる。
【００９１】
一部の実施形態においては、所望の生物学的生成物は、タンパク質、抗体、凝固因子、細胞小器官、ウイルス、ウイルス様粒子、遺伝子療法ベクター、ポリヌクレオチド、細胞からなる群から選択される１つを含む。
【００９２】
一部の実施形態においては、所望の生物学的生成物は、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭのポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、又はＦｃ融合タンパク質などのその化合物組換え構築物、又は複合物などのその合成化合物構築物である。
【００９３】
一部の実施形態においては、所望の生物学的生成物は、葉緑体、ミトコンドリア、リボソーム、エキソソームなどの細胞小器官、又は別の細胞小器官である。
【００９４】
一部の実施形態においては、所望の生物学的生成物は、原核細胞、真核細胞、幹細胞又はウイルス粒子である。
【００９５】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質又はウイルスの沈殿に使用される薬剤は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、デンプン、セルロースの群から選択される１つとすることができる。
【００９６】
前述の実施形態の１つ以上においては、吸着サブユニットを膜吸着装置とすることができる。膜吸着装置という用語は、その表面が化学修飾されて、タンパク質調製物中に溶解又は懸濁する種との化学的相互作用にその表面が関与することができる微多孔膜を指す一般名であると理解される。膜吸着装置は、一般に、複数、例えば１５以上又は以下の層の膜材料で構成される。化学修飾の性質は、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合相互作用、金属親和性相互作用からなる群からの１つ以上に膜が関与する能力を残す性質とすることができる。静電相互作用のうち、膜の表面は、電気陽性、電気陰性又は両性イオン性とすることができる。
【００９７】
前述の実施形態の１つ以上においては、吸着サブユニットは、その表面がタンパク質調製物中に溶解又は懸濁する種との化学的相互作用に関与することができるようにその表面が化学修飾されたモノリスとすることができる。化学修飾の性質は、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合相互作用、金属親和性相互作用からなる群からの１つ以上にモノリスが関与する能力を残す性質とすることができる。静電相互作用のうち、膜の表面は、電気陽性、電気陰性又は両性イオン性とすることができる。
【００９８】
前述の実施形態の１つ以上においては、吸着サブユニットは、その表面がタンパク質調製物中に溶解又は懸濁する種との化学的相互作用に関与することができるようにその表面が化学修飾された充填粒子のカラムとすることができる。化学修飾の性質は、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合相互作用、金属親和性相互作用からなる群からの１つ以上に膜が関与する能力を残す性質とすることができる。静電相互作用のうち、膜の表面は、電気陽性、電気陰性又は両性イオン性とすることができる。
【００９９】
前述の実施形態の１つ以上においては、吸着サブユニットは、その表面がタンパク質調製物中に溶解又は懸濁する種との化学的相互作用に関与することができるようにその表面が化学修飾されたハイブリッド又は化合物構造とすることができる。かかる一実施形態においては、ハイブリッド又は化合物吸着サブユニットは、ヒドロゼラチン質（ｈｙｄｒｏｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ）相がその上に存在する構造骨格を含むことができる。化学修飾の性質は、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合相互作用、金属親和性相互作用からなる群からの１つ以上にモノリスが関与する能力を残す性質とすることができる。静電相互作用のうち、膜の表面は、電気陽性、電気陰性又は両性イオン性とすることができる。
【０１００】
前述の実施形態の１つ以上においては、吸着サブユニットの流体接触表面は電気陽性である。
【０１０１】
前述の実施形態の１つ以上においては、電気陽性吸着サブユニットはアニオン交換体である。
【０１０２】
前述の実施形態の１つ以上においては、電気陽性クロマトグラフィサブユニットは、水素結合、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、金属親和性からなる群からの１つ以上に関与する能力などの追加の化学官能性を示す。かかる実施形態の１つ以上においては、複数の化学的相互作用力を示すクロマトグラフィ媒体を混合モード又は多モード媒体と称する。
【０１０３】
前述の実施形態の１つ以上においては、吸着サブユニットの流体接触表面は電気陰性である。
【０１０４】
前述の実施形態の１つ以上においては、電気陰性吸着サブユニットはカチオン交換体である。
【０１０５】
前述の実施形態の１つ以上においては、電気陰性吸着サブユニットは、水素結合、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、金属親和性からなる群からの１つ以上に関与する能力などの追加の化学官能性を示す。かかる実施形態の１つ以上においては、複数の化学的相互作用力を示すクロマトグラフィ媒体を混合モード又は多モード媒体と称する。
【０１０６】
前述の実施形態の１つ以上においては、吸着サブユニットの流体接触表面は疎水性である。かかる一実施形態においては、疎水性は、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基などのアルキル化学部分によって付与される。別のかかる一実施形態においては、疎水性は、フェニル基、ベンジル基、ビフェニル基などのアリール又は芳香族部分によって付与することができる。
【０１０７】
前述の実施形態の１つ以上においては、電気陰性吸着サブユニットは、疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体である。
【０１０８】
前述の実施形態の１つ以上においては、疎水性クロマトグラフィサブユニットは、水素結合、静電相互作用、パイ−パイ結合、金属親和性からなる群からの１つ以上に関与する能力などの追加の化学官能性を示す。かかる実施形態の１つ以上においては、複数の化学的相互作用力を示すクロマトグラフィ媒体を混合モード又は多モード媒体と称する。
【０１０９】
前述の実施形態の１つ以上においては、試料、試薬、及び装置の反応混合物接触表面の任意の組合せは、容易に除去可能な、場合によっては使い捨ての材料を含む、又は該材料でライニングされている。
【０１１０】
前述の実施形態の１つ以上においては、分画剤（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、生物学的調製物、試薬及び反応混合物の任意の組合せと接触する複数のモジュラー精製部品は、使い捨てであり、精製モジュール部品は、配管セット、膜、混合機及び弁体のうち１個以上を含む。
【０１１１】
前述の実施形態の１つ以上においては、システムは、部分又は完全自動化されている。
【０１１２】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望の生物学的生成物はタンパク質である。かかる一実施形態においては、タンパク質は抗体である。
【０１１３】
先の実施形態の１つ以上においては、抗体はＩｇＧである。かかる一実施形態においては、抗体はモノクローナルＩｇＧである。
【０１１４】
先の実施形態の１つ以上においては、該方法を使用して、非ＩｇＧ抗体を精製する。かかる一実施形態においては、抗体はＩｇＭである。
【０１１５】
先の実施形態の１つ以上においては、該方法を使用して、非抗体タンパク質を精製する。かかる一実施形態においては、非抗体タンパク質は凝固タンパク質である。かかる一実施形態においては、非抗体タンパク質は第ＶＩＩＩ因子である。
【０１１６】
先の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質は、本明細書に開示した方法によって処理される前にある程度精製される。
【０１１７】
先の実施形態の１つ以上においては、所望の生成物はポリヌクレオチドである。かかる一実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。かかる一実施形態においては、ＤＮＡは遺伝子療法用プラスミドである。関連した一実施形態においては、所望の生成物はＲＮＡである。
【０１１８】
先の実施形態の１つ以上においては、所望の生成物は、ウイルス粒子又はウイルス様粒子である。かかる一実施形態においては、ウイルスは、抗ウイルス治療の試験を支援するのに使用される。別のかかる一実施形態においては、ウイルスをワクチンとして使用する。別のかかる一実施形態においては、ウイルス粒子を抗生物質の代わりに使用する。別のかかる一実施形態においては、ウイルス粒子を遺伝子療法ベクターとして使用する。
【０１１９】
先の実施形態の１つ以上においては、方法の一段階は、さらに、リン酸トリ（ｎ）ブチル、オクタン酸、メチレンブルー、エタクリジン、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、関連化合物などのウイルスを不活性化するように意図された薬剤を、特に有機溶媒及び界面活性剤を含めて、上記のものなどの別の薬剤と場合によっては組み合わせて、含むことができる。
【０１２０】
先の実施形態の１つ以上においては、操作ｐＨは、４から９、又は５から８、又は６から７、又は７から８の範囲、又は５、又は６、又は７、又は８、又は中間値とすることができる。
【０１２１】
一部の実施形態においては、（１）生物学的生成物を目標量で含むように構成された容器、（２）（ａ）少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを含む少なくとも１個の精製ユニット、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、生物学的生成物を保持するが、生物学的生成物の流体力学的半径の約５０％未満の流体力学的半径を有する混入物を通過させる１個以上の膜を備える、及び（ｂ）少なくとも１個の吸着サブユニットを含む少なくとも１個の精製ユニットを含む複数の精製ユニット、（３）容器と複数の精製ユニットを連結し、それによって装置を介した循環を可能にする複数の導管、（４）導管を経由する流れを導き、複数の精製ユニットのうち任意の１個以上を互いに、また容器から分離させる弁、及び（５）流れを生じ、装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプを含む装置を用意するステップを含むプロセスを提供する。該プロセスは、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと少なくとも１個の吸着サブユニットが、弁を介して、互いに流体連通するように構成されるときに、調製物を少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び少なくとも１個の吸着サブユニットと１回以上接触させるステップ、ここで、少なくとも１回接触させるステップは、混入物及び生物学的生成物と少なくとも１個の吸着サブユニットの結合を実質的に防止する条件下で実施される、次いで少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して条件を変更して、（１）生物学的生成物ではなく混入物と少なくとも１個の吸着サブユニットの結合を可能にする、又は（２）混入物及び生物学的生成物と少なくとも１個の吸着サブユニットの結合を可能にし、続いて混入物の少なくとも一部を保持しながら生物学的生成物を少なくとも１個の吸着サブユニットから遊離させるように条件を変更するステップを含む。一部の実施形態においては、接触させるステップを２回以上実施するときには、変更条件（１）を選択する。
【０１２２】
一部の実施形態においては、１個以上の膜を備える少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、生物学的生成物の少なくとも５０％を保持することができる。
【０１２３】
一部の実施形態においては、生物学的生成物の流体力学的半径の約５０％未満の流体力学的半径を有する混入物を通過させることは、生物学的生成物の流体力学的半径の約４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は１％未満の流体力学的半径を含むことができる。
【０１２４】
本明細書に開示したプロセスの実施においては、当業者は、本明細書に開示したプロセスにおいて採用される正確な「条件」は、とりわけ吸着サブユニット媒体及び生物学的標的の組成の選択に応じて、多数の変数に依存することを認識するはずである。当業者は、同様に、条件を特定の生成物に合わせて変更するプロセスは、伝統的な方法の条件をカスタマイズするのと同じ普通の原理に従い、基本的に同じであることを理解するはずである。したがって、操作者は、伝統的な吸着クロマトグラフィ法を用いて精製方法を開発するように開発した同じ技能で、開示した装置及び方法の利点を得ることができる。単なる例として、生物学的生成物をＩｇＧ抗体とすることができ、少なくとも１個の吸着サブユニットをカチオン交換体とすることができ、「条件」は、ＩｇＧ抗体及び混入物の結合を防止するのに十分な高い塩濃度を含むことができる。すなわち、この状況下で可能な条件は、０．１Ｍ  ＮａＣｌを超え得る。当業者は、適切な条件を選択するために媒体と生物学的生成物の両方に対するこの依存を理解するはずである。したがって、アニオン交換体を採用し、疎水性相互作用クロマトグラフィ、立体排除、ヒドロキシアパタイト及び任意の数の公知の多モードクロマトグラフィ技術を実施するときの適切な操作条件を選択することは慣行であることを理解されたい。
【０１２５】
一部の実施形態においては、本明細書に開示したプロセスは、さらに、少なくとも１個の吸着サブユニットを迂回しながら調製物を少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと１回以上接触させるステップ、及び場合によっては、調製物を１個以上の更なるタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと接触させるステップを、別の精製ユニットからは各々独立して、含むことができる。
【０１２６】
一部の実施形態においては、少なくとも１個の吸着サブユニットはイオン交換体であり、条件は、混入物の結合を防止するのに必要な濃度よりも約０．０５Ｍを超える増分から約２Ｍを超える増分だけ高い濃度の中性塩を含む。一部の実施形態においては、条件は、飽和塩に対応する濃度まで含むことができる。
【０１２７】
一部の実施形態においては、少なくとも１個の吸着サブユニットを疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体とすることができ、条件は、一部の混入物が結合するのに必要な濃度よりも約０．０５Ｍを超える増分から約２Ｍを超える増分だけ低い濃度の塩を含むことができる。一部の実施形態においては、ゼロ濃度の塩を採用することができる。
【０１２８】
一部の実施形態においては、装置は、単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び２個の吸着サブユニットを備えることができ、２個の吸着サブユニットの一方はアニオン交換体であり、他方は疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体である。
【０１２９】
一部の実施形態においては、装置は、単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット、１個の少なくとも１個の吸着サブユニット、及び１個の追加の吸着サブユニットを備えることができ、少なくとも１個の吸着サブユニットはアニオン交換体であり、１個の追加の吸着サブユニットは疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体である。
【０１３０】
一部の実施形態においては、装置は、単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット、１個の少なくとも１個の吸着サブユニット、及び１個の追加の吸着サブユニットを備えることができ、少なくとも１個の吸着サブユニットはアニオン交換体であり、追加の吸着サブユニットは疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体であり、疎水性相互作用クロマトグラフィサブユニットは、プロセスの少なくとも１段階中に少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと再循環流体接触（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｌｕｉｄ  ｃｏｎｔａｃｔ）するように配管設置され、アニオン交換吸着サブユニット（末端クロマトグラフィサブユニット）は、末端吸着サブユニットと少なくとも１個の吸着サブユニットの再循環流体接触が起こらないように装置の出口又はその付近に配管設置され、タンパク質調製物は、収集のために装置を出る際に末端吸着サブユニットを介して処理される。
【０１３１】
一部の実施形態においては、装置は、単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット、１個の少なくとも１個の吸着サブユニット、及び１個の追加の吸着サブユニット、すなわち、少なくとも２個の吸着サブユニット、ここで、少なくとも１個の吸着サブユニットはカチオン交換体であり、追加の吸着サブユニットは疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体であり、どちらもプロセスの少なくとも１段階中に少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットとそれぞれ再循環流体接触するように配管設置される、及び末端吸着サブユニットと少なくとも１個の吸着サブユニットの再循環流体接触が起こらないように装置の出口又はその付近に配管設置された、電気陽性表面を有するクロマトグラフィ媒体の形の第３の吸着サブユニット（末端クロマトグラフィサブユニット）を含むことができ、タンパク質調製物は、収集のために装置を出る際に末端吸着サブユニットを介して処理される。
【０１３２】
一部の実施形態においては、少なくとも１個の吸着サブユニットは、正電荷と過剰の水素結合残基、過剰の疎水性残基又は両方を結合する電気陽性クロマトグラフィ媒体を含むことができる。一部の実施形態においては、例示的な電気陽性クロマトグラフィ媒体は、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅである。
【０１３３】
一部の実施形態においては、装置は、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを備えることができ、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの１個は、流動化粒子に吸着した生物学的生成物を保持し、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの１個は、生物学的生成物を可溶状態で保持し、装置は、さらに、アニオン交換体である少なくとも１個の吸着サブユニットを備える。
【０１３４】
一部の実施形態においては、装置は、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを備えることができ、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの１個は、生物学的生成物を沈殿状態で保持し、２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの１個は、生物学的生成物を可溶状態で保持し、装置は、さらに、アニオン交換体である少なくとも１個の吸着サブユニットを備える。
【０１３５】
一部の実施形態においては、吸着サブユニットは、１個以上の膜、１個以上のモノリス、又は固定層若しくは流動層形式の粒子を含む。
【０１３６】
一部の実施形態においては、生物学的生成物は、ＤＮＡプラスミド、ウイルス粒子、タンパク質、組換えタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ＩｇＧ、ＩｇＭ、非抗体タンパク質、凝固因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子−フォンウィルブランド複合体及びフィブリノーゲンからなる群から選択される。
【０１３７】
一部の実施形態においては、調製物は、血清、血漿、乳、組織ホモジネート由来の流体、及び細胞培養収集物からなる群から選択される自然の体液を含むことができ、調製物を処理して物理的細片を除去する。
【０１３８】
一部の実施形態においては、それとは別に、又はそれに加えて、調製物を処理して、クロマチンの大部分を除去することができる。
【０１３９】
一部の実施形態においては、ウレイド、及び電気陽性イオン、及び電気陰性イオン、有機溶媒、有機ポリマー、界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の有機添加剤との接触によって、調製物を処理してクロマチンの大部分を除去する。一部のかかる実施形態においては、電気陽性イオンは可溶性である。一部のかかる実施形態においては、電気陽性イオンは、固体表面に共有結合することによって、不溶性である。一部のかかる実施形態においては、電気陰性イオンは可溶性である。一部のかかる実施形態においては、電気陰性イオンは、固体表面に共有結合することによって、不溶性である。
【０１４０】
一部の実施形態においては、生物学的生成物は、細胞培養収集物中の組換えタンパク質であり、プロセスは、接触させるステップの前に、細胞培養収集物を調節して、クロマチンの９０％以上（又は９５％以上）を調製物から除去するステップを含む。
【０１４１】
一部の実施形態においては、（１）生物学的生成物を目標量で含むように構成された容器、（２）（ａ）少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを含む少なくとも１個の精製ユニット、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、生物学的生成物を保持するが、生物学的生成物の流体力学的半径の約５０％未満の流体力学的半径を有する混入物を通過させる１個以上の膜を備える、及び（ｂ）少なくとも１個の吸着サブユニットを含む少なくとも１個の精製ユニットを含む複数の精製ユニット、（３）容器と複数の精製ユニットを連結し、それによって装置を介した循環を可能にする複数の導管、（４）導管を経由する流れを導き、複数の精製ユニットのうち任意の１個以上を互いに、また容器から分離させる弁、及び（５）流れを生じ、装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプを備える、生物学的生成物を調製物から精製する装置を提供する。
【０１４２】
一部の実施形態においては、少なくとも２個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットが存在し、第１のタンジェンシャルフロー濾過ユニットは、生物学的生成物を可溶状態で保持するように選択された空隙率を有する第１の膜を含み、第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、生物学的生成物が沈殿状態又は粒子結合状態であるときにのみ生物学的生成物を保持するように選択された空隙率を有する第２の膜を含む。
【０１４３】
一部の実施形態においては、容器は、さらに、混合機を含む。
【０１４４】
一部の実施形態においては、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、生物学的生成物を保持するように選択された空隙率を有する膜を含む。
【０１４５】
一部の実施形態においては、吸着サブユニットの表面は、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合、金属親和性、生物学的親和性及びそれらの組合せからなる群から選択される相互作用可能な機能的部分を有する。
【０１４６】
一部の実施形態においては、装置は、２個の吸着サブユニットを備える。一部のかかる実施形態においては、２個の吸着サブユニットの表面は、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合、金属親和性、生物学的親和性及びそれらの組合せからなる群から選択される相互作用可能な異なる機能的部分を有する。
【０１４７】
一部の実施形態においては、装置は、３個以上の吸着サブユニットを備える。一部のかかる実施形態においては、それぞれの吸着サブユニットの表面は、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合、金属親和性、生物学的親和性及びそれらの組合せからなる群から選択される相互作用可能な異なる機能的部分を有する。
【０１４８】
一部の実施形態においては、装置は、さらに、ポンプ及び弁を制御して、調製物が流路指示に従って流路を通過するようにコンピュータ読み取り可能な指示によって構成された１個以上のプロセッサを備えることができ、流路指示が一連の精製ユニットを規定する。一部のかかる実施形態においては、流路指示は、流路の末端として容器を指定する。
【０１４９】
一部の実施形態においては、装置は、さらに、使用者による流路指示の入力又は選択を受けるように構成されたインターフェースを備えることができる。一部のかかる実施形態においては、インターフェースは、コンピュータ、メモリ、ネットワーク、無線又はそれらの組合せである。
【０１５０】
一部の実施形態においては、装置は、マルチミリグラムスケールで実施するような規模である。一部の実施形態においては、装置は、マルチグラムスケールで実施するような規模である。一部の実施形態においては、装置は、マルチキログラムスケールで実施するような規模である。
【０１５１】
一部の態様においては、本明細書に開示した実施形態は、生物学的生成物を目標量で含むように構成された容器、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを含む少なくとも１個の精製ユニット、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、生物学的生成物を保持するが、生物学的生成物の流体力学的半径の約５０％未満の流体力学的半径を有する混入物を通過させる１個以上の膜を備える、及び少なくとも１個の吸着サブユニットを含む少なくとも１個の精製ユニットを含む複数の精製ユニット、容器と複数の精製ユニットを連結し、それによって装置を介した循環を可能にする複数の導管、導管を経由する流れを導き、複数の精製ユニットのうち任意の１個以上を互いに、また容器から分離させる弁、及び流れを生じ、装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプを含む装置を用意するステップを含むプロセスに関係する。該プロセスは、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと少なくとも１個の吸着サブユニットが、弁を介して、互いに流体連通するように構成されるときに、調製物を少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び少なくとも１個の吸着サブユニットと１回以上接触させるステップ、ここで、少なくとも１回接触させるステップは、混入物及び生物学的生成物と少なくとも１個の吸着サブユニットの結合を実質的に防止する条件下で実施される、次いで少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して条件を変更して、（１）生物学的生成物ではなく混入物と少なくとも１個の吸着サブユニットの結合を可能にするように、又は（２）混入物及び生物学的生成物と少なくとも１個の吸着サブユニットの結合を可能にし、続いて混入物の少なくとも一部を保持しながら生物学的生成物を少なくとも１個の吸着サブユニットから遊離させるように、条件を変更するステップを含む。
【０１５２】
一部の態様においては、本明細書に開示した実施形態は、生物学的生成物を目標量で含むように構成された容器、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを含む少なくとも１個の精製ユニット、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、生物学的生成物を保持するが、生物学的生成物の流体力学的半径の約５０％未満の流体力学的半径を有する混入物を通過させる１個以上の膜を備える、及び少なくとも１個の吸着サブユニットを含む少なくとも１個の精製ユニットを含む複数の精製ユニット、容器と複数の精製ユニットを連結し、それによって装置を介した循環を可能にする複数の導管、導管を経由する流れを導き、複数の精製ユニットのうち任意の１個以上を互いに、また容器から分離させる弁、及び流れを生じ、装置の１個以上の部分内の差圧を制御するように構成されたポンプを備える、生物学的生成物を調製物から精製する装置に関係する。
【０１５３】
用語は、実施形態がより容易に理解できるように定義される。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載されている。
【０１５４】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素、及び通常硫黄を含む複雑な有機巨大分子のグループのいずれかを指し、ペプチド結合によって連結された１個以上のアミノ酸鎖で主に構成される。タンパク質は、天然又は組換え起源とすることができる。タンパク質は、グリコシル化、ＰＥＧ化、別の化学部分との複合化などによって、非アミノ酸部分で修飾することができる。タンパク質の例としては、抗体、凝固因子、酵素及びペプチドホルモンが挙げられるが、それらだけに限定されない。
【０１５５】
「宿主混入物」又は「宿主細胞混入物」とは、目的生成物がその中で成長する細胞によって生成される生体分子を指す。この用語は、宿主タンパク質、宿主ＤＮＡなどの様々なクラスの宿主混入物を含み得る。
【０１５６】
「宿主タンパク質」又は「宿主細胞タンパク質」、すなわち「ＨＣＰ：Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ」とは、目的生成物がその中で成長する細胞によって生成されるタンパク質を指す。かかるタンパク質は、目的生成物から除去されなければならない混入物の１クラスである。
【０１５７】
「抗体」とは、天然形態、又はヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、移植、インビトロで産生された抗体などの遺伝子改変形態を含めて、ヒト又は他の哺乳動物細胞系から誘導されるクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥの免疫グロブリンを指す。抗体は、単一のクローンによって産生され得るが、その場合はモノクローナルと称され、又は１種を超えるクローンから産生され得るが、その場合はポリクローナルと称される。ＩｇＧ抗体とは、特に、サブクラスの１つ又は混合物としても存在し得る免疫グロブリンＧと称されるクラスの抗体を指し、例えば、ヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４、又はマウスにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ若しくはＩｇＧ３、又はラットにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃと称される。真核生物宿主において天然に又は組換えによって産生される抗体は、種々のグリコシル化形態で存在し得るが、非真核宿主において産生される抗体は、種々のグリコシル化及び非グリコシル化形態で存在し得る。「抗体」は、免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質、又はＩｇＧと別の抗体、酵素、蛍光団若しくは別の信号発生部分、ビオチン、薬物又は別の機能的部分を含めた別の機能的部分との合成連鎖（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ）によって生成される免疫複合体を含めて、ただしそれらだけに限定されない複合形態を含むこともできる。
【０１５８】
「非イオン性有機ポリマー」とは、荷電基がない連結繰り返し有機サブユニットで構成された天然又は合成炭化水素を指す。それは、線状、幾らかの枝分れを含む主に線状、又は主に分枝とすることができる。本明細書に開示した実施形態を実施するのに適切な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられるが、それらだけに限定されない。ＰＥＧの構造式はＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈである。例としては、平均ポリマー分子量が１００ダルトン未満から１０，０００ダルトンを超える範囲の組成物が挙げられるが、それらだけに限定されない。
【０１５９】
「タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ：Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」とは、１個以上の多孔質膜が接する空間を流体が押し進められる膜濾過法を指し、細孔を通過する十分小さい分子は濾液（時折、透過分）中で除去され、細孔によって拒絶される十分大きい分子は残留分中に残る。タンジェンシャルフローという名称は、特に、流体の流れ方向が膜に概略平行であることを指し、流れが膜に概略垂直であるいわゆるデッドエンド濾過とは対照的である。
【０１６０】
「タンジェンシャルフロー濾過膜」とは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の技術を実施するように構成された多孔質膜を指す。かかる膜は、一般に、積層して複数の膜ユニットにすることができる平坦なシート、又は渦巻膜と称される占有空間量を削減するために巻かれた拡大シート、又は液体が管腔を流れ、液体及び十分小さい溶質は細孔を通過するが、より大きい固体は保持され、その複数個が一般にカートリッジ形式で収容されて取扱いを容易にしたいわゆる中空繊維として構成される。標準用語では、微多孔膜及び超微多孔（ｕｌｔｒａｐｏｒｏｕｓ）膜と称する。微多孔膜の平均細孔径分布は、一般に公表されており、典型的には、０．２２ミクロン及び０．４５ミクロンの空隙率を含むが、１、２、５ミクロン及びそれ以上の空隙率を含むこともできる。超微多孔膜の平均細孔径分布は、一般に公表されていないが、球状タンパク質の想定等価サイズ（ａｓｓｕｍｅｄ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｓｉｚｅ）に基づく任意の用語で表される。完全に球形（球状）のタンパク質は、直径が約５ｎｍであり得るが、実際には、この分子量のタンパク質は、流体力学的サイズがその２倍を超えることが報告された（ＩｇＧ、１１ｎｍ流体力学的直径）。この基準が定まらないために、限外濾過膜は、時折、より正確にナノ濾過膜又はナノ多孔膜と記述される。厳密に言えば、それらは、平均空隙率１ミクロン未満のいわゆる微多孔膜を含むが、より一般的には、１００ｎｍ以下の空隙率、１０ｎｍ以下の空隙率を含むと考えられる。ナノ多孔膜と微多孔膜はどちらも、化学的に不活性とされた表面を有するものが一般に利用可能であるが、生物学的親和性をも含めて、静電若しくは疎水性相互作用、又は別のタイプ若しくは組み合わせの化学機構によって、溶解分子と相互作用可能な表面を形成するように化学修飾された膜も含む。ある実施形態においてＩｇＧ抗体を保持するのに適切なＴＦＦ膜としては、選択されたサイズを超える流体力学的直径を有する非吸着溶質の少なくとも５０％を保持するが、選択されたサイズよりも小さい流体力学的直径を有する非吸着溶質は通過させる空隙率を有する電気陽性膜が挙げられる。選択されたサイズは、約１０ｎｍから約１５ｎｍの間の任意の量であり得る。
【０１６１】
「タンジェンシャルフロー濾過モジュール」又はタンジェンシャルフロー濾過サブユニットとは、所望の生成物の少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％若しくはほぼ全部）を保持することができるが、より小さい混入物は膜の細孔を通過することができる細孔径分布を有するタンジェンシャルフロー濾過膜を採用した開示した装置及びプロセスの機能的構成要素を指す。開示した装置及び方法は、以下に明示するように膜分画を吸着機能と統合することによって、伝統的なタンジェンシャルフロー濾過とは基本的に異なる。
【０１６２】
「透析容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）」とは、（タンジェンシャルフロー濾過などの）操作中に添加される緩衝剤の総体積と残留分の体積の比を指す。
【０１６３】
「吸着サブユニット」又は吸着サブユニットとは、相補的性質の分子を保持することができ、調製物からのそれらの除去によって、ある程度の分画を行うことができる化学的相互作用表面を有する固相を採用した開示した装置及びプロセスの機能的構成要素を指す。開示した装置及びプロセスは、上で明示したように膜濾過機能を統合することによってサイズ分画機能を統合することによって、伝統的な吸着クロマトグラフィとは異なる。
【０１６４】
「吸着クロマトグラフィ」とは、生物学的生成物の精製のために一般に実施される２つの基本的タイプのクロマトグラフィのうち１つを指す。もう１つは、「非吸着クロマトグラフィ」である。非吸着クロマトグラフィは、実体をサイズによって分類する方法を含み、具体例としては、サイズ排除クロマトグラフィ、及び明確な細孔径分布を有する膜を通した濾過が挙げられる。非吸着クロマトグラフィにおいては、所与の調製物の内容物が、分画を媒介するのに使用される媒体の表面と化学的に相互作用しないことが理想的である。吸着クロマトグラフィを行うための物理的形態としては、多孔質粒子が充填されたカラム、モノリス、及び平坦なシート若しくは中空繊維の形の膜、又は組合せが挙げられる。吸着クロマトグラフィとしては、混合調製物内の一部の種と安定な結合を形成し、他とは形成しないように意図された特別なタイプの化学的性質を有する表面を活用する方法、及び／又は緩衝条件を変更することによる化学的環境の操作によって、成分の分画をそれらが吸着剤と相互作用する相対強度に従って可能にする方法が挙げられる。多数のタイプの吸着機構が当該技術分野で周知である。アニオンクロマトグラフィは、電気陰性の強い分子と結合し、電気陽性の強い分子を反発する電気陽性吸着剤を使用する。塩濃度の増加及び／又はｐＨの減少によって結合種間で更なる分画を行うことができる。同じ原理は、固相上の電荷が逆（電気陰性）であることを除いて、カチオン交換クロマトグラフィに関係し、吸着は電気陽性種に有利であり、電気陰性種は反発される傾向がある。疎水性相互作用クロマトグラフィは、疎水性吸着剤を使用する。「多モード」性の吸着剤は、負電荷、正電荷、様々なタイプの疎水性基、水素結合、及び別の機構の組合せを含む。
【０１６５】
伝統的な吸着クロマトグラフィは、２モードで実施される。「結合−溶出」モードは、目的生成物が吸着剤に結合する条件下で実施される。結合していない混入物は、吸着剤を通過し、それによって除去される。結合した生成物は、次いで、緩衝条件を変更することによって吸着剤から分離される。この分離ステップを「溶出」と称する。溶出条件は、通常、吸着剤に生成物よりも強力に結合した混入物が、生成物が溶出した後に結合したままであるように設定される。吸着クロマトグラフィのもう１つの操作モードは、「フロースルー」モードであり、これは、生成物が吸着剤を通過する一方で、吸着剤に結合した混入物は、通過生成物から分離されるという条件下で実施される。
【０１６６】
開示した装置及びプロセスはそうではないが、伝統的な従来の吸着クロマトグラフィ材料はすべて、それらの物理的形態や操作特性にかかわらず、同じ操作ステップを利用し、吸着剤は、調製物と接触する前に明確な状態に平衡化される。調製物は、吸着剤と接触する前に明確な状態に平衡化される。接触条件は、吸着剤に結合する調製物の成分（単数又は複数）と結合しない成分（単数又は複数）を表す「選択性」を規定している。結合−溶出モードにおいては、溶出条件は、溶出する種と結合したままの種の選択性を規定する。
【０１６７】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖状に共有結合された複数のヌクレオチドモノマーで構成される生体高分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）はポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは、水素結合を形成する傾向があり得る。
【０１６８】
「タンパク質調製物」とは、細胞含有細胞培養収集物、（実質的な）無細胞細胞培養上清、又は精製の段階から目的タンパク質を含有する溶液など、目的タンパク質を含有する任意の水溶液又は大部分が水溶液の溶液を指す。
【０１６９】
「ウイルス」又は「ビリオン」とは、生きている宿主、主に細菌、植物及び動物の細胞内でのみ複製する極微の（直径ほぼ２０から３００ｎｍ）代謝的に不活性な感染病原体を指し、ＲＮＡ又はＤＮＡコア、タンパク質外被、及びより複雑なタイプでは、周囲のエンベロープで構成される。
【０１７０】
本明細書に記載の実施形態は、未精製又はある程度精製された調製物からの生物学的生成物の精製に適した機器構成を有する種々の装置を提供する。吸着は、開示した装置及びプロセスにおいて起きるが、操作手法は異なる。というのは、システム中の生成物及び混入物の挙動は、吸着サブユニットとタンジェンシャルフローに基づくサイズ分画サブユニットの組合せによって制限されるからである。その組合せによって、伝統的なクロマトグラフィ機器又はプロセスを用いて行われる吸着クロマトグラフィでは不可能な能力、タンジェンシャルフロー濾過機器又はプロセスでは不可能な能力、及び吸着クロマトグラフィとタンジェンシャルフロー濾過の別の公知の組合せでは不可能な能力が可能になる。システムの独自性は、開示した処理形式が伝統的な従来のクロマトグラフィ装置では実行できず、伝統的なクロマトグラフィプロセスが、開示した装置では実施できないことによって更に強調される。伝統的なクロマトグラフ−クロマトグラフィと本発明の開示した装置及びプロセスの違いについては、下記実施例を含めて、本明細書の記述を通して説明した。実施例は、装置及びプロセスが未精製又はある程度精製された調製物を分画することができる本発明のある実施形態の独特の形式を説明するものである。装置及び方法の明瞭な理解を促進するために例示的プロセスにおける化学的性質の詳細を提供するが、本発明の多数の実施形態においては、かかる化学的詳細は、開示した装置又はかかる装置を用いて実施される方法を限定しない。
【０１７１】
本発明の多数の実施形態においては、開示した装置及びプロセスは、従来のクロマトグラフィに採用される装置及びプロセス形式とは異なるが、同じ吸着クロマトグラフィ構成要素の一部を使用することができる。本発明の開示した方法／プロセスのある実施形態の実施に使用される吸着クロマトグラフィ媒体の物理的形態は、モノリス、膜吸着装置、多孔質粒子が充填されたカラムなどの伝統的な吸着クロマトグラフィ法の実施に使用される物理的形態を含むことができるが、それらは異なる操作形式で適用される。吸着サブユニットに使用することができる吸着クロマトグラフィ媒体は、伝統的な吸着クロマトグラフィプロセスに使用される同じ種類の媒体を含むが、それらは異なる操作形式で適用される。ある実施形態において開示した方法／プロセスを実施するのに適した吸着クロマトグラフィ媒体としては、アニオン交換クロマトグラフィ、カチオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、多モードクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ用クロマトグラフィ媒体、又は任意の他の吸着機構用のクロマトグラフィ媒体が挙げられる。吸着クロマトグラフィ媒体の選択性の制御に利用される緩衝剤は、同様に、伝統的な吸着クロマトグラフィにおける選択性の制御に利用される緩衝剤に類似しているが、異なる処理形式で適用される。同様に、本明細書に開示したある実施形態の開示した方法／プロセスは、処理される生成物、タンパク質又は非タンパク質とは無関係に、伝統的な吸着クロマトグラフィとは異なる均一な処理形式を採用する。伝統的なクロマトグラフィと開示した装置及びプロセスの一部の構成要素との類似点にもかかわらず、開示した装置の構成、処理形式、及び結果は、伝統的な吸着クロマトグラフィで得られた装置、処理形式及び結果とは異なる。本発明の多数の実施形態の装置及びプロセスは、吸着クロマトグラフィ媒体のタイプ、吸着クロマトグラフィ媒体の物理的形態、吸着クロマトグラフィ媒体の選択性の制御に使用される緩衝剤、及び生物学的生成物又はそれが存在する調製物によってではなく、それらが許容する独特の処理形式及び能力、並びにそれらを生物学的生成物の精製に適用することによって得られる独特の結果によって規定される。
【０１７２】
ある実施形態の開示した装置及びプロセスは、従来のタンジェンシャルフロー濾過に採用された装置及びプロセス形式とは異なるが、同じタンジェンシャルフロー濾過構成要素の一部を採用することができる。開示した方法／プロセスの実施に使用されるタンジェンシャルフロー濾過媒体の物理的形態は、平膜、ロール（渦巻）、中空繊維などの伝統的なフロー濾過の実施に使用される物理的形態を含むが、それらは異なる操作形式で適用される。タンジェンシャルフロー濾過モジュールに使用することができるタンジェンシャルフロー濾過媒体は、セルロース系、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）系などの伝統的な吸着クロマトグラフィプロセスに使用される同じ種類の媒体を含み、又は別のポリマーを使用するが、それらは異なる操作形式で適用される。同様に、タンジェンシャルフロー濾過中に使用される緩衝剤は、伝統的なタンジェンシャルフロー濾過に使用される緩衝剤に類似していてもよいが、異なる処理形式で適用される。同様に、ある実施形態の開示した方法／プロセスは、処理される生成物、タンパク質又は非タンパク質とは無関係に、均一な処理形式を採用する。伝統的なタンジェンシャルフロー濾過と開示した装置及びプロセスの一部の構成要素との類似点にもかかわらず、開示した装置の構成、処理形式、及び結果は、伝統的なタンジェンシャルフロー濾過で得られた装置、処理形式及び結果とは異なる。装置及びプロセスは、タンジェンシャルフロー濾過媒体のタイプ、タンジェンシャルフロー濾過媒体の物理的形態、緩衝剤、及び生物学的生成物又はそれが存在する調製物によってではなく、それらが許容する独特の処理形式及び能力、並びにそれらを生物学的生成物の精製に適用することによって得られる独特の結果によって規定される。
【０１７３】
本発明のある態様においては、ＩｇＧモノクローナル抗体を精製する方法は、開示した実施形態が全体としてどのように機能するか、及び目標結果を得るために条件をどのように変更するかの有用な例を提供する。とりわけタンジェンシャルフロー膜空隙率、吸着サブユニットの数、界面化学及び物理的形態、並びに緩衝条件の具体的選択が目標生成物の性質によって決定され得るが、方法の実施がその他の点では同じ又は極めて類似している、別のＩｇＧモノクローナル抗体、別の抗体並びに非抗体タンパク質、ポリヌクレオチド及びウイルス粒子に類似の手法を適用できることが当業者に明らかなはずである。
【０１７４】
実験結果の示すところによれば、本発明のある実施形態の方法に関して、抗体調製物をまず浄化してクロマチン含有量を９０％以上削減したときに、有益な結果をもたらす。かかるクロマチン減少は、本明細書に記載のものなどのクロマチンを対象とした浄化方法によって達成することができる。かかる一方法は、アラントインを細胞含有又は無細胞細胞培養収集物に約１％ｖ／ｖに等しい量で添加することによって実施される。アラントイン添加に続いて、カプリル酸を最終濃度約０．４％まで添加し、操作ｐＨを約５．３に低下させる。混合物を室温で２時間撹拌インキュベートし、次いでカチオン性キレート化剤トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）を有する粒子を約５％ｖ／ｖの量で添加する。混合物を４時間撹拌インキュベートする。固体の大部分を遠心分離によって除去し、任意に選択できる深層濾過ステップによって残りを除去する。あるいは、脂肪酸処理後に、ＴＲＥＮ粒子を添加せずに、固体を除去することができる。ただし、固体を含まない調製物をＴＲＥＮ粒子が充填されたカラムに通し、カラム中のＴＲＥＮ粒子の体積は、約５％又は処理される調製物体積である。あるいは、ＴＲＥＮ粒子が充填されたカラムをＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ粒子が充填されたカラムと交換し、調製物を公知の空隙排除アニオン交換クロマトグラフィ法によって処理することができる。あるいは、カプリル酸を別の脂肪酸、又はエタクリジン、メチレンブルー、臭化セチルトリメチルアンモニウムなどの電気陽性疎水性薬剤と交換することができる。方法は、異なる化学的表面を有する粒子、又は膜、モノリスなどの代替の物理的形態を採用することもできる。アラントインは、場合によっては、本明細書に開示した方法から省略することができる。
【０１７５】
一部の実施形態においては、装置は以下の精製サブユニットを装着することができる：（ｉ）質量約３０ｋＤａの球状タンパク質を保持するのに十分な平均孔径を有する再生セルロース膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過サブユニット、（ｉｉ）アニオン交換クロマトグラフィ技術の実施に使用されるものなどの第四級アミノ基を有するモノリスからなる第１の吸着サブユニット。かかるモノリスの市販例は、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製ＣＩＭ  ＱＡモノリスである。モノリス表面の混入物の吸着条件は、すべての吸着クロマトグラフ方法に関しては、大部分の混入物は結合するが、ＩｇＧモノクローナル抗体は結合しない組合せを特定する通常の実験によって明らかにされる。概して、最適条件は、添加塩の非存在下で抗体が結合しない最高ｐＨである。条件は、どの抗体も各々が独特の電荷特性を有するので異なると理解されるが、多くのＩｇＧ１モノクローナル抗体の場合、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０によってもたらされる操作ｐＨ８．０が良好な出発点になる。吸着サブユニットに対する条件が確定したら、開示した装置を使用して、開示したプロセスにより調製物を分画することができる。調製物自体は、浄化された細胞培養収集物など、組成がかなり大まかであり得るが、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによる事前のプロセスステップにおける精製後のＩｇＧ画分など、高度に精製することもでき、又は何らかの別の事前の分画ステップ後の任意の他の純度とすることもできる。調製物は、抗体を損なわない任意の化学的条件下で装置に導入される。調製物は、初期にはＴＦＦサブユニット（オフラインの吸着サブユニット）のみと接触することができ、その間にＩｇＧの濃度を増加させ、緩衝条件を変更することができ、その間に膜の細孔を通過する十分小さい混入物がそれによって除去される。吸着サブユニットをあらかじめ平衡にする必要はなく、これは、調製物の接触前に吸着クロマトグラフィ媒体を平衡にする必要が厳格にある伝統的な吸着クロマトグラフィとは基本的に異なる。次のステップは、吸着サブユニットをインラインにすることであり、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットからのＩｇＧ含有残留分が吸着サブユニットを通過する。伝統的な吸着クロマトグラフィとの別の基本的な違いにおいては、調製物を吸着サブユニットと接触する前に平衡にする必要がない。調製物も吸着サブユニットも互いに接触する前に平衡にする必要がない。伝統的な吸着クロマトグラフィにおいては、これは、方法の失敗を招くと考えられる。開示した方法においては、これは、クロマトグラフィ吸着剤を調製物と合わせて平衡化することができ、緩衝剤体積及びプロセス時間を削減するので有利である。緩衝剤配合は、ＴＦＦサブユニットを介した透析濾過によって最終条件に向けて変更される。調製物及び吸着サブユニットが最終条件に近づくと、小さい混入物は、膜の細孔を介して連続して除去され、酸性混入物が吸着サブユニットに結合し始める。十分平衡化した試料が吸着サブユニットを少なくとも１回通過するとプロセスが終了する。全プロセス中に、小さい混入物は膜の細孔を介して除去される。これは、伝統的なタンジェンシャルフロー濾過では、プロセス時間又は量を増大させないようにプロセス期間が短縮されるので、より少ない程度に起こる。開示したシステムでは、吸着クロマトグラフィを備えることによって時間が延長され、より多くの小さい混入物を膜を介して除去することができるので、より効率的である。処理後、調製物をラインからリンスし、収集することができる。
【０１７６】
一部の実施形態においては、装置は、より複雑なプロセスを支援するように構成することができる。かかる一例においては、装置は、以下の精製サブユニットを装着する：（ｉ）質量約３０ｋＤａの球状タンパク質を保持するのに十分な平均孔径を有する再生セルロース膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過サブユニット、（ｉｉ）その表面にフェニル基を有する膜ベースの装置、その表面にブチル基を有するモノリスベースの装置などの芳香族疎水性基を有する第１の吸着サブユニット、（ｉｉｉ）アニオン交換クロマトグラフィ技術の実施に使用されるものなどの第四級アミノ基を有するモノリス又は膜からなる第２の吸着サブユニット、（ｉｖ）カチオン交換クロマトグラフィの実施に使用されるものなどのスルホ基を有する第３の吸着サブユニット。このより複雑なシステムの場合、吸着サブユニットの各々の条件は、単一のアニオン交換吸着サブユニットのみを有する先の単純な例と同じ様式で確立される。各場合において、かなりの量の抗体の結合なしに、最も多様な混入物が結合することができる条件を特定する。疎水性相互作用吸着サブユニットの条件は、一般に、高濃度のコスモトロピック塩、又は極めて低濃度の塩を含む。どちらにしても、特に凝集体を含めて、混入物は吸着サブユニットに結合するが、ＩｇＧの結合は最小であるように条件設定される。１種の特定のモノクローナル抗体の場合（実施例１〜８参照）、２つの適切な条件が確認された：０．４Ｍクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、及び１２．５ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０。カチオン交換クロマトグラフィモジュールの条件も確立することができる。この場合、アニオン交換及び疎水性相互作用と同様に、混入物に結合するが抗体には結合しないように条件設定した。ＳＯ３モノリス吸着サブユニットの詳細な条件は、約５ｍＭ  ＮａＣｌ、約５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、約ｐＨ８．０であった。アニオン交換ステップの条件は、先の例において記載されている通りである。吸着のケミストリ及び条件は、いわゆるフロースルーモードに使用される従来の吸着クロマトグラフィで使用されるものとほぼ同じであるが、開示した装置及び方法は、プロセスの全期間にわたるタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの細孔を介した小さい混入物の連続除去のために、より良好な結果が得られると認識される。複数の吸着ステップを採用したこの例は、本発明のある実施形態の別の独特な特徴、すなわち単一の単位操作の範囲内で単一の統合装置内の異なる吸着クロマトグラフィのケミストリの組合せを強調するものである。単一の単位操作という用語は、未精製調製物がシステムに導入され、試料をシステムから取り出したときにプロセスが完了しているとみなされる場合を指す。開示した装置及び方法は、すべてその間に混入物がタンジェンシャルフロー濾過膜を通過することによって除去される複数の異なる吸着法によって調製物を順次処理するその能力において、タンジェンシャルフロー濾過と吸着クロマトグラフィの組合せの中でも独特である。かかるプロセスを単一の単位操作で行う特別な利点は、それらがより高い生成物回収を支援することである。これは、一度に行われる１つの吸着法���か支援しないシステムにおいては、生成物を、次に導入できるようになる前に、各ステップ後に除去しなければならないからである。幾らかの生成物が各移送で常に失われ、かかる移送をなくすと生成物回収率が高くなる。
【０１７７】
単一の単位操作内で複数の吸着法を実施する目的で装置に複数の吸着サブユニットを装着した一部の実施形態においては、吸着法の順序を変えることができ、一部の順序は、別の順序よりも有利であると判明することもある。ある実施形態においては、提供される装置は、異なる吸着法をタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと別々に使用者が望む任意の順序で個々に組み合わせることができるように構成される。原理的には、所与の吸着ステップを妨害し得る混入物を吸着ステップ前に除去する順序が有利である。同じ論理で、所与の吸着ステップの容量制限を圧迫し得る混入物を吸着ステップ前に除去する順序が有利である。実際には、かかるステップの順序は、システムに導入される試料の混入物含有量に依存し、好ましい順序は、もしあれば、単純な実験によって確認することができる。
【０１７８】
２個の吸着サブユニットのみを採用した例をここで示す：クロマチン欠乏ＩｇＧ調製物をタンジェンシャルフロー濾過モジュールによって濃度約２０ｇ／Ｌに濃縮する。約１００ｋＤａより小さい大部分の混入物は、このステップでタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの膜を通過して除去される。濃縮ＩｇＧは、場合によっては、例えば、ＩｇＧ調製物を１００ｍＭ酢酸、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５中に緩衝剤交換することによって、残留する可能性があるウイルスを不活性化するように処理することができる。約１００ｋＤａより小さい残りの混入物の大部分は、このステップで除去されることになる。第１の吸着サブユニット（軸流フェニル膜吸着装置）をインライン配置し、ＩｇＧ調製物を２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中に緩衝剤交換する。吸着サブユニット並びにそれに入る配管及びそれから出る配管を２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２でリンスする。第１の吸着サブユニットをオフラインにし、第２の吸着サブユニット（軸流ＱＡモノリス）をインラインにする。ＩｇＧ調製物をタンジェンシャルフロー濾過モジュールを介して２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝剤交換する。第２の吸着サブユニットを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０でリンスし、ユニットをオフラインにする。ＩｇＧ調製物を最適な最終配合又は配合前緩衝剤中に緩衝剤交換する。ＩｇＧの本体を収集し、装置を最適な最終配合又は配合前緩衝剤でリンスして、装置内に残る抗体の収集を可能にする。
【０１７９】
上記条件は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎバイオシミラー抗体用に開発されたものであり、浄化された収集物の多段階精製を単一の単位操作として行うことができる。中間処理（緩衝剤交換）用ユニットから抗体を除去する必要はなく、第２の吸着ステップを行う必要もない。調製物を装置から取り出さずに、複数の処理ステップを装置内で実施することができる。
【０１８０】
ＩｇＧの精製は、適用可能な技術の多様性を理解するための基盤でもある。かかる一実施形態においては、アラントインを細胞含有又は無細胞細胞培養収集物に約１％ｖ／ｖに等しい量で添加することによって、クロマチンを対象とした浄化が実施される。アラントイン添加に続いて、メチレンブルーを濃度０．０２５％まで添加し、操作ｐＨを８．０に上昇させる。混合物を室温で２時間撹拌インキュベートし、次いでカチオン性キレート化剤トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）を有する粒子を５％ｖ／ｖの量で添加する。混合物を４時間撹拌インキュベートする。固体の大部分を遠心分離によって除去し、ＰＣ１デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いるなどの任意に選択できる深層濾過ステップによって残りを除去する。実際の使用においては、ウイルス濾過ステップをこの時点で適用することもできる。別のかかる一実施形態においては、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット中の膜は、質量約５０ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜である。別のかかる一実施形態においては、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット中の膜は、質量約３０ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有する再生セルロース膜である。一部の実施形態においては、統合された少なくとも１個の吸着サブユニットを用いて行われる単一の吸着ステップのみで十分な精製を得ることができる。一部のかかる実施形態においては、該サブユニットの調製物接触表面は正電荷を有することができ、イオン交換体として働く能力をそれに付与することができる。一部の実施形態においては、正電荷は、第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、第四級アミノ基又は前記の組合せによって付与することができる。一部のかかる実施形態においては、電気陽性吸着サブユニットの表面は、さらに、疎水性相互作用、水素結合及び／又は金属親和性などの別のタイプの化学的相互作用に関与する能力も示すことができる。一部のかかる実施形態においては、吸着サブユニットの表面は、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）による官能性を有する。一部の実施形態においては、追加の吸着サブユニットは、例えば調製物の凝集体含有量を削減する目的で、要求されることがある。かかるサブユニットの表面は、特に、水素結合に関与する残基に加えて疎水性残基を含むことができる。実施形態においては、記述したようにクロマチンを除去するように調節された収集物を装置と接触させ、質量３０ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有する再生セルロース膜を備えた少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットによって、ＩｇＧを約６０ｇ／Ｌに濃縮する。収集物のすべてを導入したらすぐに、入力緩衝剤を５０ｍＭ酢酸、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５に変更する。調製物がこれらの条件に達したら、疎水性フェニル基を有する膜装置からなる第１の吸着サブユニットを、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットとインラインに配置する。この点まで、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過における膜の細孔径分布より小さい混入物は、膜の細孔���通過することによって連続して除去される。高い塩形成は、全体として、混入物と所望のＩｇＧの間に、及び／又は混入物と装置の内部接触表面の間に生理的条件下で存在し得る非特異的相互作用に対して分離効果を媒介する可能性もあることが認識される。５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む緩衝剤を導入する。調製物が全体としてこれらの条件を満たすと、凝集体がフェニル膜吸着サブユニットの表面に結合することによって除去される。ユニットを５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０でリンスし、オフラインにする。同時に、第１の吸着サブユニットをオフラインにし、電気陽性電荷を有する第２の吸着サブユニットをインライン配置する。かかる一実施形態においては、第２の吸着サブユニットは、ＴＲＥＮを有するモノリスである。かかる一実施形態においては、第２の吸着サブユニットは、第四級アミノ基を有するモノリスである。かかる一実施形態においては、第２の吸着サブユニットは、エチレンジアミン基を有するモノリスである。かかる一実施形態においては、第２の吸着サブユニットは、第四級アミノ基を有する微多孔膜ベースの装置である。かかる一実施形態においては、第２の吸着サブユニットは、ポリアリルアミン基を有する微多孔膜ベースの装置である。かかる一実施形態においては、第２の吸着サブユニットは、第四級アミノ基を有するヒドロゼラチン質充填装置である。かかる一実施形態においては、第２の吸着サブユニットは、電気陽性基のネットワークを有する微多孔中空繊維膜ベースの装置である。一部の実施形態においては、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０からなる緩衝剤を導入し、調製物は徐々にその組成物に移行し、その間に小さい混入物は、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの膜を介して連続して除去される。調製物が全体として５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の条件に達した時点で、酸性混入物は、第２の吸着サブユニットの表面に結合し、そこで除去されたと理解される。この時点で、第２の吸着サブユニットをオフラインにする。場合によっては、精製ＩｇＧを収集することができ、又は配合前緩衝剤中に緩衝剤交換し、次いで収集することができる。開示した装置及び方法の本質的特徴及び機能から逸脱することなく、装置に多種多様なタンジェンシャルフローサブユニット及び／又はクロマトグラフィサブユニットを装着できることは明らかである。
【０１８１】
一部の実施形態においては、所望のＩｇＧの濃縮後の第１の分画ステップを沈殿ステップにすることができる。一部の実施形態においては、沈殿ステップは、分離ステップに続くことができる。後者は、一部の実施形態においては好ましい場合もある。というのは、沈殿ステップは、混入物と所望の生成物の間で、又は混入物と装置の内部接触表面の間で、さもないと過渡的な非特異的結合を安定化する固有のリスクを有するからである。かかる適用の原理を説明するのに特に選択された一実施形態においては、調節した調製物をまず少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して濃縮し、次いで１Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５．５などの分離緩衝剤を導入する。濃縮及び分離段階中に、混入物の大部分は、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの膜を介して除去される。１．３Ｍクエン酸ｐＨ６．０からなる一実施形態においては、沈殿緩衝剤を導入する。沈殿緩衝剤の割合が調製物において全体として増加すると、ＩｇＧが沈殿する。次いで、流路を切り換えて、沈殿を保持するが、可溶性タンパク質を保持しない適切な孔径の第２のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して調製物を導く。沈殿を１．３Ｍクエン酸、ｐＨ６．０で十分に洗浄して、十分な量の可溶性混入物が膜を介して除去されたと判断された後、引き続きより小さい混入物の通過及び除去をしながら、流路を戻して、ＩｇＧを可溶な形態で保持するのに適切な膜を有するタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して流れを導く。入力緩衝剤を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２に変え、導入する。沈殿が十分再可溶化した中間点において、第四級アミノ基を有するモノリスからなる一部の実施形態においては、少なくとも１個の吸着サブユニットをインライン配置する。所望の抗体と一緒に再可溶化し得る小さい混入物を、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過装置の膜を通過することによって除去する。調製物が全体として５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２中に存在する時点においては、残留酸性混入物は、少なくとも１個の吸着サブユニットに結合し、したがって除去されたと理解される。吸収クロマトグラフィサブユニットを不純物のない５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２でリンスして、所望のＩｇＧを回収し、吸着サブユニットをオフラインにする。場合によっては、精製ＩｇＧを収集することができ、又は配合前緩衝剤中に緩衝剤交換し、次いで収集することができる。どちらにしても、痕跡レベルの小さい混入物を、プロセスの全期間にわたって少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過装置を通過することによって連続して除去する。別のタンパク質、ウイルス及びウイルス様種を含めて、別の所望の生成物の沈殿に基づく分画は、場合によっては異なる膜及び吸着サブユニットを用いることもあるが、本質的に同じ様式で実施できることは明白である。
【０１８２】
ＩｇＧの精製は、開示した装置及び方法を伝統的なクロマトグラフィ装置及び方法と統合することができる方法を説明するための基盤としても役立つ。一部の実施形態においては、開示した装置及び方法だけで精製を行う必要はない。一部の精製ステップを開示した装置及び方法を用いて実施することができる一方で、別のステップを伝統的なクロマトグラフィ装置及び方法、又は別の新規のクロマトグラフィ装置及び／又は方法を用いて実施することができる。かかる一実施形態においては、ＩｇＧモノクローナル抗体の初期の精製を、カラムに充填された伝統的なプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ媒体を用いた伝統的なクロマトグラフによって行われるプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって実施する。次いで、プロテインＡクロマトグラフィに続いて、図１などの開示した装置で、開示した方法によってアニオン交換クロマトグラフィを実施することができる。これは、アニオン交換クロマトグラフィステップのみに制限されるにもかかわらず、伝統的なクロマトグラフィに優る幾つかの価値ある利点を生じる。例えば、伝統的なプロテインＡ後の試料（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓａｍｐｌｅ）は、一方を他方と接触させる前にアニオン交換条件に平衡化しなければならず、アニオン交換カラムも平衡化しなければならないが、開示した装置及び方法では、どちらも接触前に平衡化する必要がない。さらに、伝統的なプロテインＡ後の材料の平衡は、希釈によって行われることが多いが、これは試料量を増加させ、そのため、希釈は、可能な最低塩濃度に至らないことが多い。開示した装置では、塩濃度を希釈なしに必要なだけ低くすることができる。さらに、プロテインＡ後の材料中の多量の混入宿主タンパク質は、後続の伝統的なアニオン交換ステップの能力の重荷になるが、本装置及び方法では、これら混入物の大部分を、アニオン交換吸着サブユニットをインライン配置する前にタンジェンシャルフロー濾過モジュールの細孔を介して除去することができ、それによってアニオン交換体の容量を保持し、場合によってはアニオン交換体がより多量のＩｇＧをＩｇＧ１単位当たりより安価な材料費で処理できるようになる。さらに、ＩｇＧ精製が適用されるモードの伝統的なアニオン交換は、アニオン交換体に結合した混入物を除去するが、アニオン交換体に結合しなかった小さい混入物を除去しない。開示した装置及び方法は、両方とも除去する。酸性混入物は引き続きアニオン交換体に結合するが、小さい結合していない混入物は、タンジェンシャルフロー濾過モジュールの細孔を介して除去される。
【０１８３】
ＩｇＭの精製は、該方法を非ＩｇＧタンパク質に適合させる仕方を理解するための基盤である。かかる一実施形態においては、細胞培養収集物の伝導率は、ＮａＣｌの添加によって約２０ｍＳ／ｃｍに増加する。これは、調製物を装置と接触させる前に調節ステップとしてその後に添加される可溶性又は不溶性電気陽性又は電気陰性有機イオンとの相互作用に起因する偶然の結合及びＩｇＭ損失を防止するために行われる。同じ理由により、ｐＨを６．０に調節する。別の非ＩｇＧタンパク質では、所望のタンパク質の性質に従って、伝導率及びｐＨを異なる値、より高い又はより低い値に調節することができる。一部の実施形態においては、アラントインを収集物に１％ｖ：ｖの量で添加し、続いてエタクリジン又はメチレンブルーを０．０２５％で添加し、又は２つの組合せを混合濃度０．０２５％で添加し、又は臭化セチルトリメチルアンモニウムを０．０２５％の濃度で添加し、又は臭化セチルトリメチルアンモニウムとエタクリジン及び／又はメチレンブルーの組合せをそれらの組合せ濃度０．０２５％で添加し、６０〜１２０分間撹拌インキュベートする。一部の実施形態においては、ＴＲＥＮによる官能性を有する粒子などの官能性を持たせた粒子を例えば２〜５％ｖ：ｖの量で添加し、混合物を２〜４時間以上インキュベートし、次いで固体を任意の適切な方法によって除去する。調節した調製物を、図１に示したものなどの開示した装置と接触させる。第１ステップは、所望のタンパク質の固有の溶解性及び粘度が許せば、所望の生成物のおおよその濃度が２０ｇ／Ｌ、３０、４０若しくは５０ｇ／Ｌ又はより高い濃度になるように調製物の量を削減することである。ＩｇＭのサイズが大きいので、約百万ダルトン及び流体力学的直径２２〜２５ｎｍでは、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットに収容された膜は、ＩｇＧなどのより小さい所望のタンパク質の精製に必要な細孔よりも大きい細孔を有し得る。例えば、質量１００ｋＤａ又は３００ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有する膜を採用することができる。しかし、実験データによれば、質量５０ｋＤａ、３０ｋＤａ、更には１０ｋＤａの仮想球状タンパク質に相当する平均サイズを有する膜などのはるかに小さい細孔径分布を有する膜を用いて、それに劣らない結果を得ることができる。多くの場合、実験データによれば、再生セルロースで構成される膜は、ポリエーテルスルホンなどのポリマーで構成される膜よりも精製度が高い。濃縮後、次いで調製物を場合によっては処理してウイルス不活性化することができ、又は所望のタンパク質と非特異的に結合し得る混入物種を分離する薬剤を含むステップで処理することができる。混入物を少なくとも１個の吸着サブユニットに結合させる条件に調製物を前もって平衡化する必要なしに、調製物を少なくとも１個の吸着サブユニットと接触させる。一部の実施形態においては、少なくとも１個の吸着サブユニットは、その表面に正電荷を有することができる。次いで、少なくとも１個の吸着サブユニットと接触したまま、調製物を隣接する少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して、過剰な量の所望のタンパク質を結合させずに大部分の混入物を結合させる条件に緩衝剤交換する。次いで、所望のタンパク質をシステムから除き、収集する。あるいは、タンパク質を２個の吸着サブユニットを含む種類の装置中で精製することができる。かかる一実施形態においては、一方の吸着サブユニットは負電荷を有することができ、他方は正電荷を有する。この同じ一般的手法を任意の組換えタンパク質に適用できることは明白である。ここで、細胞培養収集物を調製する条件は、所望のタンパク質の性質に合わせて設定され、膜の空隙率は、所望のタンパク質のサイズに従って選択され、吸着サブユニット（単数又は複数）の化学的表面は、所望のタンパク質及び混入物種の性質に従って選択される。適切な組成及び空隙率の膜、吸着サブユニット、並びに精製プロセス全体の様々なステップを実施する化学的条件を選択することは当業者の理解の範囲内である。
【０１８４】
遺伝子療法などに使用される超大型ＤＮＡプラスミドの精製は、装置の適用を記述するための別の基盤を提供する。一部の実施形態においては、試料の調節は遠心分離及び／又は濾過による浄化を含むが、ＤＮＡはクロマチンの１成分であるので、クロマチンを除去する薬剤を通常は使用しない。調節は、場合によっては、電気陰性及び／又は疎水性を示す薬剤による処理を含むことができる。一部の実施形態においては、調製物を装置と接触させた直後の第１ステップはＤＮＡを濃縮することであり、その間に膜の細孔径分布より小さい混入物は、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの膜を介して除去される。膜は、ＤＮＡプラスミドを保持するのに十分な細孔径分布を有するように選択することができる。細孔径分布が大きいほど、通過することができる混入物の範囲は広くなるが、ＤＮＡプラスミドを保持するのに必要な細孔径分布より小さい細孔径分布を有する膜も十分な性能を示すことができる。収集物のすべてを導入したらすぐに、分離緩衝剤を導入し、調製物をシステムを介して連続循環させる。一部のかかる実施形態においては、分離緩衝剤は、ＤＮＡプラスミドをそれが非特異的に結合し得る混入物から分離し、及び／又は装置内部の表面に結合し得る混入物を分離し、それによって少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットの膜を通過することによるそれらの除去を容易にすることが意図された、高濃度の中性若しくはカオトロピック塩、及び／又は界面活性剤、及び／又は尿素、及び／又は別の分離剤を含むことができる。調製物が分離緩衝剤中に引き続き存在する状態で、少なくとも１個の吸着サブユニットをインライン配置することができる。吸着サブユニットの内部調製物接触表面が疎水性を増加させるように官能性を持った一連の実施形態においては、次いで、一部の実施形態においては中性から弱アルカリ性ｐＨにおいて、もしあれば、硫酸ナトリウム若しくはアンモニウム、クエン酸ナトリウム若しくはカリウム、又はリン酸カリウムのような沈殿塩を含む配合などのタンパク質混入物の疎水性相互作用を促進する配合に緩衝剤を交換する。調製物が全体としてこれらの条件に平衡化した時点で、吸着サブユニットに結合する混入物がそれによって除去される。吸着サブユニットを同じ配合の不純物のない緩衝剤でリンスして、ＤＮＡをユニットの内容積から回収し、少なくとも１個の吸着サブユニットをオフラインにし、第２の吸着サブユニットを場合によってはインライン配置する。吸着サブユニットの内部調製物接触表面が負電荷を有するように官能性を持った一連の実施形態においては、次いで、緩衝剤を０．０５Ｍ酢酸、ｐＨ４．０などの低ｐＨ、低伝導率緩衝剤に交換する。調製物が全体としてこれらの条件に平衡化した時点で、ＤＮＡよりも酸性の弱い混入物が第２の吸着サブユニットに結合し、それによって除去することができる。次いで、第２の吸着サブユニットを不純物のない０．０５Ｍ酢酸、ｐＨ４．５でリンスし、次いでサブユニットをオフラインにする。次いで、精製ＤＮＡプラスミドをシステムから収集することができ、又は場合によっては収集前に配合前又は最終配合緩衝剤に交換することができる。
【０１８５】
ウイルス又はウイルス様粒子の精製は、装置の機能的特徴を理解するための別の基盤を提供する。ＤＮＡと同様に、時には更に高度に、クロマチンを除去するように収集物を調節すると、所望のウイルスも除去するリスクが高くなる。特に、脂質に包まれたウイルスは、クロマチン除去に基づく調節方法によって不注意に除去される可能性が極めて高い。したがって、試料の調節は、しばしば、遠心分離及び／又は濾過などの物理的方法に限定されることもある。一部の実施形態においては、第１ステップは、ウイルスを保持するのに適切な細孔径分布を有する膜を備えた少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過ユニットによって、ウイルス調製物をより少ない量に濃縮することである。多くの実施形態においては、次のステップは、ＤＮＡ精製で上述したように、分離緩衝剤を導入することである。概して、ウイルスをその意図した用途に恒久的に不適当なものにしない最も強い分離配合が好ましい。ウイルスが分離緩衝剤中に引き続き存在する状態で、少なくとも１個の吸着サブユニットをインラインにすることができ、調製物内の状態を緩衝剤の状態に変換する緩衝剤を導入することができる。これらの条件は、少なくとも１個のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット中の膜の細孔を介してまだ除去されていない混入物を少なくとも１個の吸着サブユニットの表面に結合するようにも設計される。１グループとして、ウイルス及びウイルス様粒子は、組み合わせたタンパク質とＤＮＡよりも表面化学的特徴の多様性がはるかに広いが、負電荷、正電荷、疎水性残基、それらの組合せなどの一般的クロマトグラフィ表面を採用することができる。概して、培養中のウイルスによって死滅した細胞から遊離したＤＮＡによるウイルス調製物の汚染は、特にＤＮＡが所望のウイルス種に結合し得る程度に、重大な問題である。したがって、正電荷を有する吸着サブユニットが少なくとも１個の吸着サブユニットとして働くことが好ましい。
【０１８６】
図のほかに、開示した装置の本質的特徴を保持する多数の構成が考えられることは明白である。１つ以上のかかる実施形態においては、開示した装置の構成要素を切り離すことができ、ある種の機能を手動で段階的に実施することができる。
【実施例】
【０１８７】
実施例１  宿主タンパク質混入物２５９，２１８ｐｐｍ及び凝集体２１％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物からクロマチンを抽出した。クロマチンを１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２の添加によって抽出し、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の体積割合まで添加し、更に４時間混合インキュベートし、次いで調製物をデプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）に通して固体を除去した。宿主タンパク質は３０８ｐｐｍに減少し、凝集体は０．０５％未満に減少した。原型装置を単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び単一の吸着サブユニットで構成した。タンジェンシャルフロー濾過サブユニットは、５０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた。吸着サブユニットは、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）であった。調節した収集物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニットによって約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。吸着サブユニットはオフラインであった。吸着サブユニットをタンジェンシャルフロー濾過サブユニットとインラインに配置し、緩衝剤を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に交換した。システムを通過する緩衝剤が入力緩衝剤と同じｐＨ及び伝導率に達したら、吸着サブユニットラインを不純物のない５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０でリンスし、ＩｇＧを収集した。ヒト注射用抗体医薬の規制基準によれば、宿主タンパク質を１００ｐｐｍ以下、凝集体を１％以下に削減する必要がある。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ、カチオン交換クロマトグラフィ及びアニオン交換クロマトグラフィからなる三段階精製プロセスは、一般に、これらの要求を満たすことができるが、まれにかなりの差でそれらを超える。開示した方法によって、凝集体は０．０１％未満に減少し、宿主タンパク質は１１ｐｐｍに減少した。細胞培養収集物を遠心分離及び精密濾過のみを用いて調製した実験対照を実施した。それは、凝集体を２．１４％に、宿主タンパク質を７８，６９８ｐｐｍに削減し、開示した装置を用いて調製物を処理する前のクロマチン抽出の寄与を強調するものであった。
【０１８８】
実施例２  実施例１のクロマチン抽出した収集物を、実施例１と同じタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを備えた原型装置にかけた。ただし、吸着サブユニットをＳａｒｔｏｂｉｎｄフェニル膜吸着装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）と交換した。調節した収集物を、吸着サブユニットをインラインで用いて約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。フェニル吸着サブユニットをインラインにし、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に緩衝剤交換した。システムを通過する緩衝剤が入力緩衝剤と同じｐＨ及び伝導率に達したら、フェニル吸着サブユニットラインを不純物のない５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０でリンスし、吸着ユニットをオフラインにした。ＩｇＧを収集し、分析した。凝集体は０．０１％未満に減少し、宿主タンパク質は９ｐｐｍに減少した。
【０１８９】
実施例３  実施例１のクロマチン抽出した収集物を、同じタンジェンシャルフロー濾過サブユニット及び同じ吸着サブユニット（ＱＡモノリス）を備え、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄフェニル膜吸着装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）の形で追加の吸着サブユニットを備えた原型装置にかけた。調節した収集物を、インラインの吸着サブユニットなしで約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。フェニル吸着サブユニットをインラインにし、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に緩衝剤交換した。システムを通過する緩衝剤が入力緩衝剤と同じｐＨ及び伝導率に達したら、フェニル吸着サブユニットラインをリンスし、オフラインに切り換え、同時にＱＡモノリス吸着サブユニットをオンラインにした。緩衝剤を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に交換した。システムを通過する緩衝剤が入力緩衝剤と同じｐＨ及び伝導率に達したら、ＱＡモノリス吸着サブユニットラインをリンスし、ＩｇＧを収集した。凝集体は０．０１％未満に減少し、宿主タンパク質は１ｐｐｍに減少した。
【０１９０】
実施例４  実施例３の実験を、ＱＡモノリスの代わりに異なるアニオン交換吸着ユニットを用いた以外は、同じ装置、材料及び条件で実施した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜吸着装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）の置換の結果、宿主タンパク質が１ｐｐｍに減少した。耐塩性相互作用クロマトグラフィ膜吸着装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）の置換の結果、宿主タンパク質が１ｐｐｍに減少した。ＤＥＡＥモノリス（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）の置換の結果、宿主タンパク質が１ｐｐｍに減少した。ＥＤＡモノリス（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）の置換の結果、宿主タンパク質が１ｐｐｍに減少した。凝集体レベルは、すべての実験において０．０１％未満に減少した。
【０１９１】
実施例５  ３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有する膜を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えたタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを設置した以外は、実施例２の実験形式を再現した。精製ＩｇＧにおける宿主タンパク質混入は２ｐｐｍに減少した。凝集体は０．０１％未満であった。
【０１９２】
実施例６  第２の吸着サブユニットをＥＤＡモノリスの形で備えた以外は、実施例２の実験形式を再現した。宿主タンパク質は検出不可能であった。凝集体は０．０１％未満であった。
【０１９３】
実施例７  宿主タンパク質混入物２７７，４３３ｐｐｍ及び凝集体２３％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによってある程度精製すると、宿主タンパク質含有量が１，０７４ｐｐｍに減少し、凝集体が１．１％に減少した。このステップは、クロマチンの大部分を除去する目的でも役立った。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、フェニル膜吸着装置及びＱＡモノリスからなる２個の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。プロテインＡステップからのある程度精製されたＩｇＧを装置にかけ、実施例２に記載のように更に精製した。宿主タンパク質は、収集したＩｇＧ中に検出不可能であり、凝集体は０．０１％未満であった。
【０１９４】
実施例８  宿主タンパク質混入物２４３，９９７ｐｐｍ及び凝集体２４％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を、１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２の添加によって処理してクロマチンを抽出し、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、更に４時間混合インキュベートし、次いで調製物をデプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）に通して固体を除去した。宿主タンパク質は３０５ｐｐｍに減少し、凝集体は０．０５％未満に減少した。抗体をカチオン交換クロマトグラフィによって更に精製すると、宿主タンパク質は５ｐｐｍに減少した。それを、３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとを備えた原型装置にかけた。宿主タンパク質は検出不可能であった。凝集体は０．０１％未満であった。
【０１９５】
実施例９  宿主タンパク質混入物２４３，９９７ｐｐｍ及び凝集体２４％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を、１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．６の添加によって処理してクロマチンを抽出し、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、更に４時間混合インキュベートし、次いで調製物をデプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）に通して固体を除去した。宿主タンパク質は３，５５１ｐｐｍに減少し、凝集体は０．５％未満に減少した。抗体を１．８Ｍ硫酸アンモニウムによる沈殿によって更に精製すると、宿主タンパク質は１，４２３ｐｐｍに減少した。それを、５０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するＰＥＳ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとを備えた原型装置にかけた。収集したＩｇＧ中の宿主タンパク質混入は１２ｐｐｍに減少した。凝集体は０．０５％未満であった。
【０１９６】
実施例１０  宿主タンパク質混入３６９，４２２ｐｐｍ、凝集体１１％及び遊離軽鎖約１０％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物をプロテインＡによって処理して、クロマチン負荷を削減し、抗体をある程度精製した。宿主タンパク質混入は１，８７３ｐｐｍに減少し、凝集体は１．１２％に減少し、遊離軽鎖は０．４％に減少した。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。調製物を最初に吸着サブユニットがオフラインの装置に通して処理した。その間の緩衝剤は５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０であった。これによって、宿主タンパク質混入は３５０ｐｐｍに減少し、遊離軽鎖は０．２％に減少したが、凝集体含有量は１．７０％に増加した。吸着サブユニットをインラインにし、緩衝剤を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に変更した。宿主タンパク質混入は８ｐｐｍに減少し、凝集体は０．５５％に減少し、遊離軽鎖は０．１９％に減少した。
【０１９７】
実施例１１  宿主タンパク質混入２９３，１５８ｐｐｍ、凝集体２３．３５％及び遊離軽鎖約１２％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．４で処理してクロマチンを抽出し、それを２時間インキュベートし、固体を精密濾過によって除去し、次いでそれを最初の細胞培養収集物の体積の５％の体積のＢｉｏ−Ｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ（ｈｉｇｈ）を充填したカラムに通した。宿主タンパク質混入は３，５６５ｐｐｍに減少し、凝集体は２．１％に減少し、遊離軽鎖は１．７２％に減少した。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。収集したＩｇＧにおける宿主タンパク質混入の量は５６３ｐｐｍであり、凝集体含有量は２．７％に増加した。遊離軽鎖は２．３７％に増加したようであった。調製物を別々の後続の処理のために３分割した。結合−溶出モードのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ（ＣＨＴタイプＩ、４０ミクロン、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で処理した部分は、宿主タンパク質が１１３ｐｐｍに減少し、凝集体が１．２２％に減少し、遊離軽鎖が１．７％に減少した。結合−溶出モードの電気陰性多モードクロマトグラフィ媒体（ＨＣＸ、Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填したカラム上のクロマトグラフィで処理した部分は、宿主タンパク質が１８ｐｐｍに減少し、凝集体が１．６１％に減少し、遊離軽鎖が０．４９％に減少した。結合−溶出モードの電気陽性多モードクロマトグラフィ媒体（Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のクロマトグラフィで処理した部分は、宿主タンパク質混入が３ｐｐｍに減少し、凝集体が０．４７％に減少し、遊離軽鎖が検出不可能なポイントまで減少した。
【０１９８】
実施例１２  ＱＡアニオン交換モノリスをＳＯ３カチオン交換モノリスと交換し、抗体がカチオン交換体にさほど結合しないように緩衝剤を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に変更した以外は、実施例１１と同様に構成された原型装置に実施例１１のクロマチン抽出した調製物をかけた。宿主タンパク質混入は３，５６５ｐｐｍから２，８５２ｐｐｍに減少し、凝集体は２．０１％から０．９６％に減少した。遊離軽鎖含有量は１．７２％から２．７５％に増加したようであった。調製物を別々の後続の処理のために３分割した。結合−溶出モードのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ（ＣＨＴタイプＩ、４０ミクロン、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で処理した部分は、宿主タンパク質が１，３５４ｐｐｍに減少し、凝集体が０．１５％に減少し、遊離軽鎖が２．８０％に減少した。結合−溶出モードの電気陰性多モードクロマトグラフィ媒体（ＨＣＸ、Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填したカラム上のクロマトグラフィで処理した部分は、宿主タンパク質が１４７ｐｐｍに減少し、凝集体が０．９６％に減少し、遊離軽鎖が０．４３％に減少した。結合−溶出モードの電気陽性多モードクロマトグラフィ媒体（Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のクロマトグラフィで処理した部分は、宿主タンパク質混入が７２ｐｐｍに減少し、凝集体が０．１６％に減少し、遊離軽鎖が検出不可能なポイントまで減少した。
【０１９９】
実施例１３  ＱＡアニオン交換モノリスを疎水性ブチルモノリスと交換した以外は、実施例１１と同様に構成された原型装置に実施例１１のクロマチン抽出した調製物をかけた。調製物を３分割した。１個の部分を装置上で２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０に緩衝剤交換した。その状態では、抗体は吸着剤に結合しなかった。収集した抗体の宿主タンパク質混入は３，５６５ｐｐｍから１，８９４ｐｐｍに減少した。凝集体含有量は２．０１％から２．１７％にわずかに増加したようであった。遊離軽鎖含有量は１．７２％から２．５１％に増加したようであった。１個の部分を装置上で２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に緩衝剤交換した。収集した抗体の宿主タンパク質混入は３，５６５ｐｐｍから２，５２５ｐｐｍに減少し、凝集体含有量は２．０１％から１．６１％に減少した。遊離軽鎖含有量は１．７２％から２．４３％に増加したようであった。１個の部分を装置上で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝剤交換した。収集した抗体の宿主タンパク質混入は３，５６５ｐｐｍから３，０９５ｐｐｍに減少し、凝集体含有量は２．０１％から０．８２％に減少した。遊離軽鎖含有量は１．７２％から３．１７％に増加したようであった。
【０２００】
実施例１４  宿主タンパク質混入３９３，０９３ｐｐｍ及び凝集体１０．９６を含むＩｇＧ含有哺乳動物細胞培養上清をプロテインＡのカラムにかけ、ＩｇＧを濃縮し、クロマチン含有量を減少させた。宿主タンパク質含有量は２，０５８ｐｐｍに減少し、凝集体は１．２２％に減少した。ＮａＣｌを最終濃度１Ｍまで溶解し、３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、それぞれ強アニオン交換モノリス及びヒドロキシル含有モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＣＩＭ  ＯＨ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓを備える直列に配管した２個の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。調製物をオフラインの吸着剤クロマトグラフィサブユニットを用いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝剤交換した。その間に、宿主タンパク質混入は更に１２４２ｐｐｍに減少し、凝集体は１．３３％に増加した。吸着剤クロマトグラフィサブユニットをインライン配置し、緩衝剤及び試料をシステムを通して再循環した。宿主混入物は８ｐｐｍに減少し、凝集体は０．４２％に減少した。
【０２０１】
実施例１５  宿主タンパク質混入２６０，１８４ｐｐｍ及び凝集体２６．０５％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．４で処理してクロマチンを抽出し、それを２時間インキュベートし、固体を精密濾過によって除去し、次いでそれを最初の細胞培養収集物の体積の５％の体積のＢｉｏ−Ｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ（ｈｉｇｈ）を充填したカラムに通した。宿主タンパク質混入は５，３７８ｐｐｍに減少し、凝集体は３．９８％に減少した。ＩｇＧ濃度は最初の０．７１ｍｇ／ｍＬから０．５９ｍｇ／ｍＬに減少した。調製物を電気陰性多モード粒子（ＨＣＸ、Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填したカラムにかけ、カラムを洗浄し、ＩｇＧを塩勾配によって溶出させると、宿主タンパク質含有量は４９０ｐｐｍに減少し、凝集体は２．０６％に減少した。ＩｇＧ濃度は５．６９ｍｇ／ｍＬであった。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置に、約０．７Ｍ  ＮａＣｌにおけるＨＣＸ溶出調製物をかけた。吸着サブユニットを最初にオフラインにした。調製物をＩｇＧ濃度３４ｍｇ／ｍＬに濃縮し、その間に宿主タンパク質濃度は２９７ｐｐｍに減少し、凝集体は２．１７％であった。吸着サブユニットをインラインにし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を注入して緩衝剤を交換する間に調製物を再循環させた。システムが平衡になると（緩衝剤交換が完了すると）、収集したＩｇＧ（２３．２ｍｇ／ｍＬ）中の宿主タンパク質混入の量は１５３ｐｐｍであり、凝集体含有量は２．２９％であった。
【０２０２】
実施例１６  異なる細胞培養収集物を用いた別の実験において、以下に示すことを除いて他の詳細を実施例１５のようにして、実施例１５の実験ステップを再現した。原型装置に入る調製物の宿主タンパク質含有量は１９６ｐｐｍであった（実施例１５における４９０ｐｐｍに対して）。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝剤交換後、宿主混入は１１０ｐｐｍに減少した。吸着サブユニット（ＱＡモノリス）をインラインにすると、宿主混入は１透析容量で４０ｐｐｍに、５透析容量後に２６ｐｐｍに減少した。
【０２０３】
実施例１７  異なる細胞培養収集物を用いた別の実験において、以下に示すことを除いて他の詳細を実施例１５のようにして、実施例１５の実験ステップを再現した。原型装置に入る調製物の宿主タンパク質含有量は２１５ｐｐｍであった（実施例１５における４９０ｐｐｍに対して）。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝剤交換後、宿主混入は１１６ｐｐｍに減少した。吸着サブユニット（ＱＡモノリス）をインラインにすると、宿主混入は１透析容量で２８ｐｐｍに、５透析容量後に１９ｐｐｍに減少した。吸着剤サブユニット（ａｄｓｏｒｂｅｎｔ  ｓｕｂｕｎｉｔ）中のＱＡモノリスを第四級アミン膜吸着装置（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）と交換した以外は、別の一定分量の同じクロマチン欠乏／ＨＣＸ処理抗体を用いて実験を繰り返した。宿主混入は１透析容量後に２８ｐｐｍに減少し、５透析容量後に１７ｐｐｍに減少した。吸着剤サブユニット中のＱＡモノリスを第四級アミンイオン交換クロマトグラフィ粒子を充填したカラム（Ｎｕｖｉａ  Ｑ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と交換した以外は、別の一定分量の同じクロマチン欠乏／ＨＣＸ処理抗体を用いて実験を繰り返した。宿主混入は１透析容量後に２０ｐｐｍに減少し、５透析容量後に１１ｐｐｍに減少した。
【０２０４】
実施例１８  宿主タンパク質混入２６０，１８３ｐｐｍ及び凝集体２６．０５％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．４で処理してクロマチンを抽出し、それを２時間インキュベートし、固体を精密濾過によって除去し、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０と平衡化したＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑカラム上のボイド排除アニオン交換クロマトグラフィによってそれを処理した。宿主タンパク質混入は２２８ｐｐｍに減少し、凝集体は２．４７％に減少した。調製物を電気陰性多モード粒子（ＨＣＸ、Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填したカラムにかけ、カラムを洗浄し、ＩｇＧを塩勾配によって溶出させると、宿主タンパク質含有量は３８ｐｐｍに減少し、凝集体は１．９３％に減少した。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。吸着サブユニットをタンジェンシャルフロー濾過サブユニットとインラインにし、緩衝剤を最初のＨＣＸに続く約０．７Ｍ  ＮａＣｌから５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に交換した。宿主タンパク質混入は３８ｐｐｍに減少し、凝集体は１．３７％に減少した。
【０２０５】
実施例１９  並列実験においては、宿主タンパク質３８０，４９２ｐｐｍ及び凝集体２５．８８％を最初に含む異なる細胞培養収集物を用いて実施例１８のステップを実施した。クロマチン抽出によって宿主タンパク質レベルは１１３４ｐｐｍに減少し、凝集体は０．６３％に減少した。ＨＣＸによって宿主タンパク質は１３５ｐｐｍに減少し、凝集体は０．８２％であった。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。吸着サブユニットをタンジェンシャルフロー濾過サブユニットとインラインにし、緩衝剤を最初のＨＣＸに続く約０．７Ｍ  ＮａＣｌから５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に交換した。宿主タンパク質混入は２５ｐｐｍに減少し、凝集体は０．８６％に減少した。
【０２０６】
実施例２０  宿主タンパク質混入２６０，１８４ｐｐｍ及び凝集体２６．０５％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．４で処理してクロマチンを抽出し、それを２時間インキュベートし、固体を精密濾過によって除去し、次いでそれをデプスフィルタ（ＰＢ１、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）と直列の最初の細胞培養収集物の体積の５％の体積のＢｉｏ−Ｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ（ｈｉｇｈ）を充填したカラムに通し、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０と平衡化したＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑカラム上のボイド排除アニオン交換クロマトグラフィによってそれを処理した。宿主タンパク質混入は５３ｐｐｍに減少し、凝集体は２．０２％に減少した。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。収集したＩｇＧ中の宿主タンパク質混入の量は３ｐｐｍであり、凝集体含有量は１．７６％であった。Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムに調製物をかけると、宿主タンパク質混入は検出レベル以下に減少し、凝集体は０．１％未満に減少した。
【０２０７】
実施例２１  宿主タンパク質混入２６０，１８４ｐｐｍ及び凝集体２６．０５％を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．４で処理してクロマチンを抽出し、それを２時間インキュベートし、固体を精密濾過によって除去し、次いでそれを最初の細胞培養収集物の体積の５％の体積のＢｉｏ−Ｗｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ（ｈｉｇｈ）を充填したカラムに通した。宿主タンパク質は４，１２２ｐｐｍに減少し、凝集体は３．３２％に減少した。調製物をＮｕｖｉａ  Ｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた従来のカチオン交換クロマトグラフィによって処理した。宿主タンパク質は３４ｐｐｍに減少し、凝集体は２．６９％に減少した。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。宿主タンパク質混入は６ｐｐｍに減少し、凝集体は１．７５％に減少した。Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムに調製物をかけると、宿主タンパク質混入は検出レベル以下に減少し、凝集体は０．１％未満に減少した。
【０２０８】
実施例２２  ＩｇＧ含有細胞培養収集物をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって処理して、抗体を濃縮し、クロマチン含有量を減少させる１組の実験を実施した。それは、宿主タンパク質混入７，６３３ｐｐｍを含んだ。ＮａＣｌを最終濃度１Ｍまで添加した。調製物を等分し、各々を、３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置にかけた。第１の実験においては、吸着サブユニットは、最初からタンジェンシャルフロー濾過サブユニットとインラインであった。第２の実験においては、調製物をタンジェンシャルフロー濾過サブユニットを介して５透析容量循環させた後に吸着サブユニットをインラインにした。特に第１の例においては、１Ｍ  ＮａＣｌは、混入物が吸着ユニットに結合するのを防止し、それによって膜の細孔を介した小さい混入物の代替の除去を促進すると理解される。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０に緩衝剤交換後、宿主タンパク質は第１の実験において３９９ｐｐｍに減少し、第２の実験において３６８に減少した。
【０２０９】
実施例２３  一部の実験においては、クロマチン欠乏ＩｇＧ含有細胞培養収集物を、吸着サブユニットがＩｇＧを保持するのに十分な空隙率を有する電気陽性膜である原型装置にかけた。かかる膜は商業的に入手不可能であるので、それらを国際特許出願公開第２００１８７９２Ａ２号、図２Ａに記載のヴァン  レイス（ｖａｎ  Ｒｅｉｓ）の方法に従って調製した。手短に述べると、３０ｋＤａセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  １４４５９−７６−Ｄ）を２Ｍ臭化３−ブロモプロピルトリメチルアンモニウムと室温で終夜反応させた。ヴァン  レイスとは異なり、次いで膜を１Ｍ  ＮａＣｌ、次いで水で洗浄して、残留反応物及び反応副生物を除去した。第四級アミノ基の固定化をアニオン染料メチルブルーの結合によって確認した。電気陽性膜の官能性を以下に手短に示す：ＩｇＧモノクローナル抗体を濃度約１．５ｇ／Ｌで含む哺乳動物細胞培養収集物を、ｐＨ５．４に調節し、１％アラントイン、続いて０．４％カプリル酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を添加し、２時間撹拌インキュベートすることによって浄化した。固体を精密濾過によって除去し、ＴＲＥＮで置換されたアガロースビーズ（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ  ４０  ＴＲＥＮ  Ｈｉｇｈ、ＢｉｏＷｏｒｋｓ、ウプサラ）を含むカラムに上清を流した。ＴＲＥＮカラムの体積は、細胞培養収集物の最初の体積の５％の体積であった。これによって、宿主タンパク質混入物は最初の２１９，５７０ｐｐｍから４４４１ｐｐｍに減少した。試料を平衡化せずに３０ｋＤ第四級アミン置換フィルタにかけ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に透析濾過した。宿主タンパク質混入物は６７９ｐｐｍに減少した。ＮａＣｌを、処理されたＩｇＧに最終濃度１Ｍまで添加し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に平衡化されたＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにかけた。Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅカラムを５０ｍＭ  ＭＥＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に段階的に溶出させた。溶出ＩｇＧのＨＣＰ含有量は１ｐｐｍ未満であり、ＤＮＡ１ｐｐｍ未満及び凝集体０．１％未満を含んだ。
【０２１０】
実施例２４  宿主タンパク質混入６４４，２５４ｐｐｍ及び凝集体混入２．９１％を含むＩｇＭ含有哺乳動物細胞培養収集物を、カプリル酸０．４％、アラントイン１％の添加によって処理して、クロマチンを除去し、次いでｐＨ５．４で２時間インキュベートした。ＴＲＥＮを含む粒子（ＴＲＥＮ−ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を５％の割合まで添加し、更に２時間インキュベートし、続いて固体を遠心分離によって除去し、５０ｍＭリン酸塩、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０と平衡化したＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑカラム上のボイド排除アニオン交換クロマトグラフィによって上清を処理した。これによって、９９％を超えるクロマチン及びすべての凝集体が除去され、宿主タンパク質混入が１３，８８１ｐｐｍに減少した。３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、強カチオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＳＯ３、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を有する単一の吸着サブユニットとで構成された原型装置に調製物をかけた。調製物をインラインのＳＯ３モノリスによって２５ｍＭ  ＭＥＳ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ５．５に緩衝剤交換し、ＩｇＭをモノリスに結合させ、小さい吸着しない混入物の大部分を膜の細孔に通した。次いで、調製物を２５ｍＭ  ＭＥＳ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．５に緩衝剤交換することによってモノリスを洗浄し、次いで調製物を２５ｍＭ  ＭＥＳ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５に緩衝剤交換することによってＩｇＭを溶出させた。ＳＯ３モノリスを不純物のない緩衝剤を用いてインラインでリンスし、次いでオフラインにした。調製物を５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に緩衝剤交換し、次いで宿主タンパク質混入３，１４６ｐｐｍ及び凝集体のない状態で装置から収集した。調製物を従来のクロマトグラフ上のＱＡモノリスにかけ、洗浄し、溶出させると、宿主タンパク質混入は２９ｐｐｍに減少した。
【０２１１】
実施例２５  バクテリオファージウイルスＭ１３、宿主タンパク質混入１７，０３４ｎｇ／ｍＬ及び宿主ＤＮＡ０．２４ｎｇ／ｍＬを含む大腸菌細胞培養収集物を、３０ｋＤａの流体力学的直径を有する仮想球状タンパク質に相当する平均孔径を有するセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた単一のタンジェンシャルフロー濾過サブユニットと、互いに並行して配管設置され、タンジェンシャルフロー濾過サブユニットに対して直列に配管され、所望のときにはそれらの一方又は両方をオフラインにすることができる弁を有する２個の吸着サブユニットとで構成された原型装置にかけた。吸着サブユニットは、強カチオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＳＯ３）及び強アニオン交換モノリス（ＣＩＭ  ＱＡ）を備えた。調製物をインラインのＳＯ３モノリスによって５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０に緩衝剤交換した。これらの条件下で、ウイルスはモノリスに結合しなかったが、膜によって保持された。一部の混入物はＳＯ３モノリスに吸着したが、小さい吸着しない混入物を膜の細孔に通した。調製物を緩衝剤交換して、吸着しないウイルスをＳＯ３モノリスから洗い流した。この時点で収集した試料は、宿主タンパク質混入２４３ｎｇ／ｍＬ及びＤＮＡ０．１１ｎｇ／ｍＬを含んだ。この時点のウイルス回収率は７３％であった。ＳＯ３モノリスをオフラインにし、同時にＱＡモノリスをインラインにした。緩衝剤を５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に交換し、その間にウイルスはＱＡモノリスに結合し、小さい吸着しない混入物は膜の細孔を通過したと理解される。緩衝剤を５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に交換して、ウイルスをＱＡモノリスから溶出させ、モノリスを不純物のない緩衝剤でリンスし、オフラインにした。ウイルスを宿主タンパク質９０ｎｇ／ｍＬ及びＤＮＡ０．０４ｎｇ／ｍＬを含むシステムから収集した。このプロセスセグメントのウイルス回収率は８６％であり、全プロセスのウイルス回収率は６３％であった。
【０２１２】
本明細書に開示した実施形態は、より高い精製レベルを得るために、他の精製方法と組み合わせることができる。一部のかかる実施形態は、ある別の分画方法を採用した後に、開示した方法を実施するステップを含むことができる。別のかかる実施形態は、ある別の分画を採用する前に、開示した方法を実施するステップを含むことができる。種々の別の方法に適切な条件を構築し、それらを本明細書に記載の実施形態と統合して、特定の生物学的生成物の必要な精製を行うことは当業者の理解の範囲内である。
【０２１３】
開示した装置及び方法の幾つかの利点は、タンジェンシャルフロー濾過サブユニット（単数又は複数）を吸着剤クロマトグラフィサブユニット（単数又は複数）から切り離すことを含めて、開示した装置及び方法の変更によって得ることができることを当業者は理解されたい。調製物又は他の材料が、装置の一部分から別の部分に操作者によって手作業で移されることを含めて、装置の部品間で導管以外の手段によって移送される、本明細書に記載の装置又はプロセス実施形態のいずれかなどのかかる切り離された応用例は、開示した発明の実施形態であると理解される。
【０２１４】
上記例は、最も一般的な変数のうちの一部の効果を説明するために設計されたものであり、開示した装置及び方法の必須要素から逸脱することなく多数の変形を実施できることを当業者は認識されたい。同様に、異なる細胞培養収集物は、異なる種を異なる関連調製物において含み、それによってかなりの可変性を課し、更なる可変性が、クロマチンが抽出される方法に従って所与の調製物の試料間で明らかになることを実施例から理解されたい。
【０２１５】
本明細書で引用する全ての参考文献は、個々の刊行物又は特許又は特許出願が参照によりその全体が援用されるように具体的かつ個々に示されたと同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に援用される。参照により援用する刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示に矛盾する範囲では、本明細書は、こうした矛盾を無効にし、及び／又は矛盾に優先するものとする。
【０２１６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する成分量、クロマトグラフィ条件などを表すすべての数値は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されることを理解されたい。したがって、それに反しない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本明細書に記載の実施形態によって得ようとする所望の性能に応じて変わり得る近似値である。
【０２１７】
当業者には明らかなように、本明細書に開示した実施形態の多数の改変及び変更をその精神及び範囲から逸脱することなく成すことができる。本明細書に記載した具体的実施形態は、単なる例示にすぎず、何ら限定することを意味するものではない。本明細書及び実施例は単なる例示と考えられるものであり、実施形態の正確な範囲及び精神は以下の特許請求の範囲によって示されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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