(57)【要約】  本発明は、パッセンジャー鎖、ＲＩＳＣ複合体に取り込み可能なガイド鎖、ならびに（ｉ）ガイド鎖中の３’末端またはヌクレオチド間生物不可逆的基；または（ｉｉ）パッセンジャー鎖中の５’末端、３’末端、またはヌクレオチド間生物不可逆的基、およびガイド鎖またはパッセンジャー鎖中の５’末端、３’末端、またはヌクレオチド間ジスルフィド生物可逆的基を含有するハイブリダイズポリヌクレオチド構築物を特徴とする。本発明はまた、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物を用いて、ポリヌクレオチドを細胞に送達する方法を特徴とする。本発明はさらに、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物を用いて、細胞内のポリペプチドの発現を低下させる方法を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッセンジャー鎖、ＲＩＳＣ複合体に取り込み可能なガイド鎖、ならびに
（ｉ）前記ガイド鎖中の３’末端またはヌクレオチド間生物不可逆的基；または
（ｉｉ）前記パッセンジャー鎖中の５’末端、３’末端、またはヌクレオチド間生物不可逆的基、および前記ガイド鎖または前記パッセンジャー鎖中の５’末端、３’末端、またはヌクレオチド間ジスルフィド生物可逆的基
を含むハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２】
前記ジスルフィド生物可逆的基を含み、前記ジスルフィド生物可逆的基が、−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂを含み、
式中、
リンクＡが、Ｂに結合されたｓｐ３混成炭素原子および−Ｓ−Ｓ−に結合された炭素原子を含む二価または三価リンカーであり、ここで、リンクＡが三価リンカーである場合、リンクＡの第３の原子価が、−Ｓ−Ｓ−と結合して、任意選択的に置換されるＣ３〜９ヘテロシクリレンを形成し、
Ｂが、５’末端リン（Ｖ）基、３’末端リン（Ｖ）基、またはヌクレオチド間リン（Ｖ）基である、請求項１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３】
パッセンジャー鎖およびＲＩＳＣ複合体に取り込み可能なガイド鎖を含むハイブリダイズポリヌクレオチド構築物であって、前記パッセンジャー鎖および前記ガイド鎖のそれぞれが、下式：
５’−Ｄ−（Ｎｕｃ−Ｅ）ｎ−Ｎｕｃ−Ｆ、またはその塩
で表される構造を有し、式中、
各ｎが、独立して、１０〜１５０の整数であり、
各Ｎｕｃが、独立して、ヌクレオシドであり；
前記ガイド鎖のＤが、ヒドロキシル、リン酸塩、またはジスルフィド生物可逆的基であり；
前記パッセンジャー鎖のＤが、Ｈ、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、保護されたヒドロキシル基、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩、５’キャップ、ホスホチオール、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、アミノ含有基、ビオチン含有基、ジゴキシゲニン含有基、コレステロール含有基、色素含有基、クエンチャー含有基、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、生物不可逆的基、またはジスルフィド生物可逆的基であり；
各Ｅが、独立して、リン酸塩、ホスホロチオエート、生物不可逆的基、またはジスルフィド生物可逆的基であり；
各Ｆが、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、保護されたヒドロキシル基、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩、ホスホチオール、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、アミノ含有基、ビオチン含有基、ジゴキシゲニン含有基、コレステロール含有基、色素含有基、クエンチャー含有基、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、生物不可逆的基、またはジスルフィド生物可逆的基であり；
ここで、前記ジスルフィド生物可逆的基の少なくとも１つが、−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂを含み、
式中、
リンクＡが、独立して、Ｂに結合されたｓｐ３混成炭素原子および−Ｓ−Ｓ−に結合された炭素原子を含む二価または三価リンカーであり、ここで、リンクＡが三価リンカーである場合、リンクＡの第３原子価が、−Ｓ−Ｓ−と結合して、任意選択的に置換されるＣ３〜９ヘテロシクリレンを形成し；
Ｂが、独立して、５’末端リン（Ｖ）基、３’末端リン（Ｖ）基、またはヌクレオチド間リン（Ｖ）基であり；
ここで、前記ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物が、前記ガイド鎖中の少なくとも１つの生物不可逆的基を含み、または前記ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物が、−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂおよび少なくとも１つの生物不可逆的基を含むハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４】
少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基を含み、前記ジスルフィド生物可逆的基が、以下の構造：
（Ｒ１）ｑ−（リンクＣ）−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂ
を有し、式中、
各ｑが、独立して、１〜１０の整数であり；
各リンクＣが、独立して、結合または１２Ｄａ〜１００００Ｄａの分子量を有する多価リンカーであり；
各Ｒ１が、独立して、Ｈ、アジド、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、またはエンドソームエスケープ部分である、請求項２または３に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５】
第２のパッセンジャー鎖または第２のガイド鎖をさらに含み、リンクＣが、前記第２のパッセンジャー鎖または前記第２のガイド鎖の−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂにさらに結合された多価リンカーである、請求項４に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６】
リンクＣが、１つまたは複数のモノマーを含み、前記モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；イミノ；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項４または５に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７】
リンクＣが、１つまたは複数のモノマーを含み、前記モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；イミノ；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項６に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８】
リンクＣが、１つまたは複数のモノマーを含み、前記モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項７に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９】
リンクＣが、１〜５００の前記モノマーを含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０】
リンクＣが、１〜３００の前記モノマーを含む、請求項９に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１１】
リンクＣが、１つまたは複数のＣ１〜６アルキレンオキシ基を含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１２】
リンクＣが、１００個未満のＣ１〜６アルキレンオキシ基を含む、請求項１１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１３】
リンクＣが、１つまたは複数のポリ（アルキレンオキシド）を含む、請求項４〜１２のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１４】
前記ポリ（アルキレンオキシド）が、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリ（トリメチレンオキシド）、ポリブチレンオキシド、ポリ（テトラメチレンオキシド）、およびそのジブロックまたはトリブロックコポリマーから選択される、請求項１３に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１５】
前記ポリ（アルキレンオキシド）が、ポリエチレンオキシドである、請求項１３または１４に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１６】
リンクＣが、
【化１】
2017522046.tif 000287
、およびその組合せからなる群から独立して選択される１つまたは複数の基を含む、請求項４〜１５のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１７】
第２のパッセンジャー鎖または第２のガイド鎖をさらに含み、前記パッセンジャー鎖が、前記生物不可逆的基によって前記第２のパッセンジャー鎖に連結され、または前記ガイド鎖が、前記生物不可逆的基によって前記第２のガイド鎖に連結される、請求項２〜１６のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１８】
少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基を含み、リンクＡが、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、各ｍが、独立して、０、１、または２である）からなる群から独立して選択される１つ、２つ、または３つのモノマーを含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１９】
リンクＡが、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、各ｍが、独立して、０、１、または２である）からなる群から独立して選択される１つ、２つ、または３つのモノマーを含む、請求項１８に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２０】
リンクＡが、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；またはＯからなる群から独立して選択される１つ、２つ、または３つのモノマーを含む、請求項１９に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２１】
リンクＡが、２つまたは３つのモノマーを含み、前記モノマーのうちの１つが、構造：
【化２】
2017522046.tif 000288
を有し、
式中、
Ｚ１が−Ｓ−Ｓ−への結合であり；
Ｚ２が、リンクＡの別のモノマーへの結合であり；
Ｑ１が、ＮまたはＣＲ２であり；
Ｑ２が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ３、または−Ｃ（Ｒ５）＝Ｃ（Ｒ６）−であり；
Ｑ３が、Ｒ４に結合されるＮまたはＣであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のそれぞれが、独立して、Ｈ、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；または−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）であり；またはＲ５およびＲ６が、それぞれが結合される前記原子と一緒に、結合して、Ｃ６アリール、Ｃ２〜７ヘテロアリール、およびＣ２〜７ヘテロシクリルからなる群から選択される環式基を形成し、ここで、前記環式基が、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜
１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換される、請求項２０に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２２】
Ｑ１がＣＲ２である、請求項２１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２３】
Ｒ２が、Ｈ、ハロ、またはＣ１〜６アルキルである、請求項２１または２２に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２４】
Ｑ２が、Ｏまたは−Ｃ（Ｒ５）＝Ｃ（Ｒ６）−である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２５】
Ｑ２が、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｃ（Ｒ６）−である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２６】
Ｒ５が、Ｈ、ハロ、またはＣ１〜６アルキルである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２７】
Ｒ６が、Ｈ、ハロ、またはＣ１〜６アルキルである、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２８】
Ｒ５およびＲ６が、それぞれが結合される前記原子と一緒に、結合して、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換されるＣ２〜５ヘテロアリールを形成する、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項２９】
前記Ｃ２〜５ヘテロアリールが、２個の窒素原子を含む、請求項２８に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３０】
前記Ｃ２〜５ヘテロアリールが、Ｃ１〜６アルキルで置換される、請求項２８または２９に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３１】
Ｑ２がＯである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３２】
Ｑ３がＣＲ４である、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３３】
Ｒ４が、Ｈ、ハロ、またはＣ１〜６アルキルである、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３４】
少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基を含み、リンクＡおよび−Ｓ−Ｓ−が結合して、構造：
【化３】
2017522046.tif 000289
を形成し、
式中、
各Ｒ７が、独立して、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；または−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）であり；または２つの隣接するＲ７基が、各前記Ｒ７が結合される前記原子と一緒に、結合して、Ｃ６アリール、Ｃ２〜５ヘテロシクリル、またはＣ２〜５ヘテロアリールからなる群から選択される環式基を形成し、ここで、前記環式基が、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０
アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換され；
ｑが、０、１、２、３、または４であり；
ｓが、０、１、または２である、請求項２〜２０のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３５】
Ｒ７が、ハロまたは任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキルである、請求項３４に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３６】
リンクＡおよび−Ｓ−Ｓ−が結合して、式（ｖｉ）の構造を形成し、ｓが、０または１である、請求項３４または３５に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３７】
ｓが０である、請求項３６に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３８】
リンクＡおよび−Ｓ−Ｓ−が結合して、式（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、または（ｘ）の構造を形成し、ｑが、０、１、または２である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項３９】
ｑが、０または１である、請求項３８に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４０】
２つの隣接するＲ７基が、各前記Ｒ７が結合される前記原子と一緒に、結合して、１つ、２つ、または３つのＣ１〜６アルキル基で任意選択的に置換されるＣ２〜５ヘテロアリールを形成する、請求項３９に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４１】
リンクＡおよび−Ｓ−Ｓ−が結合して、構造：
【化４】
2017522046.tif 000290
を形成し、
点線が、ただ１つの二重結合を表し、
Ｒ８が、空の原子価を有する前記窒素原子に結合され、Ｈ、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；または−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）である、請求項２１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４２】
Ｒ８が、ＨまたはＣ１〜６アルキルである、請求項４１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４３】
少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基を含み、前記少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基が、１つまたは複数のモノマーを含み、前記モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；イミノ；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基が、１つまたは複数のモノマーを含み、前記モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；イミノ；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項４４に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４５】
前記少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基が、１つまたは複数のモノマーを含み、前記モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項４５に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４６】
前記モノマーの少なくとも１つがＳ（Ｏ）ｍであり、ｍが２である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４７】
前記生物可逆的基が、２〜５００の前記モノマーを含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基が、２〜３００の前記モノマーを含む、請求項４７に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基が、２〜２００の前記モノマーを含む、請求項４８に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基が、１つまたは複数のＣ１〜６アルキレンオキシ基を含む、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基が、１００個未満のＣ１〜６アルキレンオキシ基を含む、請求項５０に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基が、１つまたは複数のポリ（アルキレンオキシド）を含む、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５３】
前記ポリ（アルキレンオキシド）が、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリ（トリメチレンオキシド）、ポリブチレンオキシド、ポリ（テトラメチレンオキシド）、およびそのジブロックまたはトリブロックコポリマーから選択される、請求項５２に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５４】
前記ポリ（アルキレンオキシド）が、ポリエチレンオキシドである、請求項５２または５３に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５５】
前記生物不可逆的基の少なくとも１つが、炭水化物を含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５６】
前記炭水化物が、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはＤ−グルシトールである、請求項５５に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５７】
前記生物不可逆的基の少なくとも１つが、標的化部分を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５８】
前記標的化部分が、葉酸塩リガンド、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、小胞体標的化基、またはアルブミン結合基である、請求項５７に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項５９】
前記生物不可逆的基の少なくとも１つが、ポリペプチドを含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６０】
前記ポリペプチドが、細胞透過性ペプチドまたはエンドソームエスケープ部分である、請求項５９に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６１】
少なくとも１つの生物可逆的基を含み、前記生物可逆的基の少なくとも１つが、炭水化物を含む、請求項１〜６２のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６２】
前記炭水化物が、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはＤ−グルシトールである、請求項６１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６３】
少なくとも１つの生物可逆的基を含み、前記生物可逆的基の少なくとも１つが、標的化部分を含む、請求項１〜６２のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６４】
前記標的化部分が、葉酸塩リガンド、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、小胞体標的化基、またはアルブミン結合基である、請求項６３に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６５】
少なくとも１つの前記生物可逆的基が、ポリペプチドを含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６６】
前記ポリペプチドが、細胞透過性ペプチドまたはエンドソームエスケープ部分である、請求項６５に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６７】
前記ガイド鎖が、前記生物不可逆的基を含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６８】
１つの前記生物不可逆的基が、前記ガイド鎖の第２のヌクレオシドおよび第３のヌクレオシドを連結する、請求項７７に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項６９】
１つの前記生物不可逆的基が、前記ガイド鎖の第５のヌクレオシドおよび第６のヌクレオシドを連結する、請求項６７または６８に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７０】
１つの前記生物不可逆的基が、前記ガイド鎖の第１７のヌクレオシドおよび第１８のヌクレオシドを連結する、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７１】
前記ガイド鎖が、１〜５つの前記生物不可逆的基を含む、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７２】
前記ガイド鎖が、１つの前記生物不可逆的基を含む、請求項７１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７３】
前記パッセンジャー鎖が、少なくとも１つの前記生物不可逆的基を含む、請求項１〜７２のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７４】
前記生物不可逆的基が、前記パッセンジャー鎖の２つのヌクレオシドを連結し、前記ヌクレオシドが、５’方向において天然ＲＩＳＣを介した切断部位から離れて少なくとも１つのヌクレオシドに配置される、請求項７３に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７５】
前記生物不可逆的基が、前記パッセンジャー鎖の第１および第２のヌクレオシドを連結する、請求項７４に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７６】
前記ガイド鎖が、少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基を含む、請求項１〜７５のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７７】
前記ジスルフィド生物可逆的基が、前記ガイド鎖の３つの５’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結する、請求項７６に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７８】
前記ジスルフィド生物可逆的基が、前記ガイド鎖の３つの３’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結する、請求項７６または７７に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項７９】
前記パッセンジャー鎖が、少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基を含む、請求項１〜７８のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８０】
前記ジスルフィド生物可逆的基が、前記パッセンジャー鎖の３つの５’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結する、請求項７９に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８１】
前記ジスルフィド生物可逆的基が、前記パッセンジャー鎖の３つの３’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結する、請求項７９または８０に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８２】
前記生物不可逆的基が、前記パッセンジャー鎖の５’末端基である、請求項１〜８１のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８３】
前記生物不可逆的基が、前記ガイド鎖または前記パッセンジャー鎖の３’末端基である、請求項１〜８２のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８４】
前記生物不可逆的基が、前記ガイド鎖の３’末端基である、請求項８３に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８５】
前記生物不可逆的基が、前記パッセンジャー鎖の３’末端基である、請求項８３または８４に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８６】
前記生物不可逆的基が、１つまたは複数のモノマーを含み、前記モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項１〜８５のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８７】
前記１つまたは複数のモノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項８６に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８８】
前記１つまたは複数のモノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である、請求項８７に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項８９】
少なくとも１つの前記モノマーがＳ（Ｏ）ｍであり、ｍが、０または２である、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９０】
ｍが２である、請求項８９に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９１】
前記生物不可逆的基が、独立して、１〜２００の前記モノマーを含む、請求項８６〜９０のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９２】
前記生物不可逆的基が、独立して、１〜１５０の前記モノマーを含む、請求項９１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９３】
前記生物不可逆的基が、独立して、１〜１００の前記モノマーを含む、請求項９２に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９４】
前記生物不可逆的基が、独立して、１〜３の前記モノマーを含む、請求項９３に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９５】
前記生物不可逆的基が、独立して、１つの前記モノマーを含む、請求項９４に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９６】
前記生物不可逆的基が、独立して、任意選択的に置換されるＣ３〜６アルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜６アルケニル；任意選択的に置換されるＣ３〜６アルキニル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニル；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリール；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリール；Ｎ、Ｏから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリル（ここで、前記ヘテロシクリルは、Ｓ−Ｓ結合を含まない）；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル（ここで、前記ヘテロシクリルは、Ｓ−Ｓ結合を含まない）からなる群から独立して選択される置換基で置換されるリン酸塩またはホスホロチオエートである、請求項１〜９５のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９７】
前記ハイブリダイズポリヌクレオチドが、前記ジスルフィド生物可逆的基を含み、前記ジスルフィドを、ヌクレオチド間リン（Ｖ）基、５’末端基、または３’末端基に連結する原子の最も短い鎖が３である、請求項１〜９６のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９８】
前記ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物が、前記ジスルフィド生物可逆的基を含み、前記ジスルフィドを、ヌクレオチド間リン（Ｖ）基、５’末端基、または３’末端基に連結する原子の最も長い鎖が６である、請求項１〜９７のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項９９】
前記ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物が、前記ジスルフィド生物可逆的基を含み、前記ジスルフィド生物可逆的基が、前記ジスルフィドに近接する少なくとも１つの嵩高い基を含む、請求項１〜９８のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１００】
前記ガイド鎖が、１９以上のヌクレオシドを含む、請求項１〜９９のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０１】
前記ガイド鎖が、１００未満のヌクレオシドを含む、請求項１〜１００のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０２】
前記ガイド鎖が、５０未満のヌクレオシドを含む、請求項１０１に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０３】
前記ガイド鎖が、３２未満のヌクレオシドを含む、請求項１０２に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０４】
前記パッセンジャー鎖が、１９以上のヌクレオシドを含む、請求項１〜１０３のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０５】
前記パッセンジャー鎖が、１００未満のヌクレオシドを含む、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０６】
前記パッセンジャー鎖が、５０未満のヌクレオシドを含む、請求項１０５に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０７】
前記パッセンジャー鎖が、３２未満のヌクレオシドを含む、請求項１０６に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０８】
前記生物不可逆的基の少なくとも１つが、
【化５】
2017522046.tif 000291
、またはその塩からなる群から選択される、請求項１〜１０７のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記生物不可逆的基の少なくとも１つが、ポリペプチド、炭水化物、標的化部分、または送達ドメインを、
【化６】
2017522046.tif 000292
、またはその塩からなる群から選択される部分に結合することによって形成され、前記部分が、前記ガイド鎖または前記パッセンジャー鎖の５’末端内または５’末端に結合された２つの連続ヌクレオシドを連結する、請求項１〜１０７のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物。
【請求項１１０】
ポリヌクレオチド構築物を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項１〜１０９のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物と接触させる工程を含み、前記接触の後、前記ポリヌクレオチド構築物が、前記細胞内に存在する方法。
【請求項１１１】
細胞内のポリペプチドの発現を低下させる方法であって、前記細胞を、請求項１〜１０９のいずれか一項に記載のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物と接触させる工程を含み、前記接触の後、前記細胞内の前記ポリペプチドの発現が低下される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞をトランスフェクトするための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロおよびインビボの両方での細胞への核酸送達は、様々な組み換えウイルスベクター、脂質送達系、およびエレクトロポレーションを用いて行われている。このような技術は、遺伝子発現のノックアウトにより様々な疾患および障害を治療しようとして、遺伝子治療のための、または様々な生物系を研究するための遺伝的構築物を提供してきた。
【０００３】
ポリヌクレオチドなどのポリアニオン性ポリマーは、細胞膜を越えて容易に拡散しない。培養細胞についてのこの問題を克服するために、カチオン性脂質が、典型的に、取り込みを促進するためにアニオン性ポリヌクレオチドと組み合わされる。残念ながら、この複合体は、一般に、細胞に対して毒性を有し、これは、生存細胞のトランスフェクションを確実にするために、カチオン性脂質の曝露時間および濃度の両方が、注意深く制御されなければならないことを意味する。
【０００４】
ｍＲＮＡを選択的に分解する細胞機構としてのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見は、細胞培養物における細胞表現型の標的化された操作および指向性治療（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の開発の可能性の両方を可能にする（Ｂｅｈｌｋｅ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３，６４４−６７０，２００６；Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １１，６７−７３，２００６）。しかしながら、それらのサイズおよび負（アニオン性）荷電の性質のため、ｓｉＲＮＡは、細胞に侵入する能力のない巨大分子である。実際に、ｓｉＲＮＡは、膜拡散性分子の細胞送達についてのリピンスキーの「ルールオブファイブ（Ｒｕｌｅ  ｏｆ  ５ｓ）」（一般にサイズを５００Ｄａ未満に限定する）の２５倍過剰である。その結果、送達ビヒクルまたはトランスフェクション剤の非存在下で、裸のｓｉＲＮＡは、ミリモル濃度でも細胞に侵入しない（Ｂａｒｑｕｉｎｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ３−９，２００４）。ｓｉＲＮＡ送達の問題を解決するために、ｓｉＲＮＡを凝縮し、かつ細胞膜を穿孔するカチオン性脂質の使用に大きな注目が集まっている。広く使用されているが、トランスフェクション試薬は、多くの細胞型、特に、初代細胞および造血細胞系統（ＴおよびＢ細胞、マクロファージ）への効率的な送達を達成することができない。さらに、リポフェクション試薬は、腫瘍細胞における軽度から初代細胞における高度までの様々な程度の細胞毒性を引き起こすことが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、細胞をトランスフェクトする向上した能力を有するポリヌクレオチド構築物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一般に、本発明は、生物不可逆的（ｎｏｎ−ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）基または生物不可逆的基と生物可逆的（ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）基との組合せを有するハイブリダイズポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を有するハイブリダイズポリヌクレオチド構築物を特徴とし、ここで、ガイド鎖は、生物不可逆的基を含む。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、パッセンジャー鎖、ＲＩＳＣ複合体に取り込み可能なガイド鎖、ならびに
（ｉ）ガイド鎖中の３’末端またはヌクレオチド間生物不可逆的基；または
（ｉｉ）パッセンジャー鎖中の５’末端、３’末端、またはヌクレオチド間生物不可逆的基、およびガイド鎖またはパッセンジャー鎖中の５’末端、３’末端、またはヌクレオチド間ジスルフィド生物可逆的基
を含むハイブリダイズポリヌクレオチド構築物を提供する。
【０００８】
特定の実施形態において、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物は、少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基を含む。
【０００９】
ある実施形態において、ジスルフィド生物可逆的基は、−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂを含み、
式中、
リンクＡが、Ｂに結合されたｓｐ３混成炭素原子および−Ｓ−Ｓ−に結合された炭素原子を含む二価または三価リンカーであり、ここで、リンクＡが三価リンカーである場合、リンクＡの第３の原子価が、−Ｓ−Ｓ−と結合して、任意選択的に置換されるＣ３〜９ヘテロシクリレンを形成し、
Ｂが、５’末端リン（Ｖ）基、３’末端リン（Ｖ）基、またはヌクレオチド間リン（Ｖ）基である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物は、パッセンジャー鎖およびＲＩＳＣ複合体に取り込み可能なガイド鎖を含み、ここで、パッセンジャー鎖およびガイド鎖のそれぞれが、下式：
５’−Ｄ−（Ｎｕｃ−Ｅ）ｎ−Ｎｕｃ−Ｆ、またはその塩
で表される構造を有し、式中、
各ｎが、独立して、１０〜１５０の整数であり、
各Ｎｕｃが、独立して、ヌクレオシドであり；
ガイド鎖のＤが、ヒドロキシル、リン酸塩、またはジスルフィド生物可逆的基であり；
パッセンジャー鎖のＤが、Ｈ、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、保護されたヒドロキシル基、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩、５’キャップ、ホスホチオール、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、アミノ含有基、ビオチン含有基、ジゴキシゲニン含有基、コレステロール含有基、色素含有基、クエンチャー含有基、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、生物不可逆的基、またはジスルフィド生物可逆的基であり；
各Ｅが、独立して、リン酸塩、ホスホロチオエート、生物不可逆的基、またはジスルフィド生物可逆的基であり；
各Ｆが、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、保護されたヒドロキシル基、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩、ホスホチオール、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、アミノ含有基、ビオチン含有基、ジゴキシゲニン含有基、コレステロール含有基、色素含有基、クエンチャー含有基、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、生物不可逆的基、またはジスルフィド生物可逆的基であり；
例えば、ここで、ジスルフィド生物可逆的基の少なくとも１つが、−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂを含み、
式中、
リンクＡが、独立して、Ｂに結合されたｓｐ３混成炭素原子および−Ｓ−Ｓ−に結合された炭素原子を含む二価または三価リンカーであり、ここで、リンクＡが三価リンカーである場合、リンクＡの第３原子価が、−Ｓ−Ｓ−と結合して、任意選択的に置換されるＣ３〜９ヘテロシクリレンを形成し；
Ｂが、独立して、５’末端リン（Ｖ）基、３’末端リン（Ｖ）基、またはヌクレオチド間リン（Ｖ）基であり；
ここで、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物が、ガイド鎖中の少なくとも１つの生物不可逆的基を含み、またはハイブリダイズポリヌクレオチド構築物が、ジスルフィド生物可逆的基および少なくとも１つの生物不可逆的基を含む。
【００１１】
特定の実施形態において、ジスルフィド生物可逆的基は、以下の構造：
（Ｒ１）ｑ−（リンクＣ）−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂ
を有し、式中、
各ｑが、独立して、１〜１０の整数であり；
各リンクＣが、独立して、結合または１２Ｄａ〜１００００Ｄａの分子量を有する多価リンカーであり；
各Ｒ１が、独立して、Ｈ、アジド、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、またはエンドソームエスケープ部分である。
【００１２】
ある実施形態において、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物は、第２のパッセンジャー鎖または第２のガイド鎖をさらに含有し（例えば、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物は、２つのパッセンジャー鎖および２つのガイド鎖を含有する）、ここで、リンクＣは、第２のパッセンジャー鎖または第２のガイド鎖の−Ｓ−Ｓ−（リンクＡ）−Ｂにさらに結合される多価リンカーである（例えば、リンクＣは、２つのガイド鎖または２つのパッセンジャー鎖に結合される）。
【００１３】
他の実施形態において、リンクＣは、１つまたは複数のモノマーを含み、ここで、モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；イミノ；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。さらに他の実施形態において、リンクＣは、１つまたは複数のモノマーを含み、ここで、モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；イミノ；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。さらに他の実施形態において、リンクＣは、１つまたは複数のモノマーを含み、ここで、モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。
【００１４】
ある実施形態において、リンクＣは、１〜５００のモノマー（例えば、１〜３００のモノマー、１〜２００のモノマー、１〜１５０のモノマー、または１〜１００のモノマー）を含む。いくつかの実施形態において、リンクＣは、１つまたは複数のＣ１〜６アルキレンオキシ基（例えば、１００個未満のＣ１〜６アルキレンオキシ基）を含む。特定の実施形態において、リンクＣは、１つまたは複数のポリ（アルキレンオキシド）（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリ（トリメチレンオキシド）、ポリブチレンオキシド、ポリ（テトラメチレンオキシド）、およびそのジブロックまたはトリブロックコポリマー（例えば、ポリ（アルキレンオキシド）は、ポリエチレンオキシドである）を含む。
【００１５】
特定の実施形態において、リンクＣは、
【化１】
2017522046.tif 000002
、およびその組合せからなる群から独立して選択される１つまたは複数の基を含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物は、第２のパッセンジャー鎖または第２のガイド鎖をさらに含有し（例えば、ハイブリダイズポリヌクレオチド構築物は、２つのパッセンジャー鎖および２つのガイド鎖を含有する）、ここで、パッセンジャー鎖またはガイド鎖は、生物不可逆的基によって第２のパッセンジャー鎖または第２のガイド鎖に共有結合される（例えば、２つのパッセンジャー鎖または２つのガイド鎖は、生物不可逆的基によって共有結合される）。
【００１７】
いくつかの実施形態において、リンクＡは、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、各ｍが、独立して、０、１、または２である）からなる群から独立して選択される１つ、２つ、または３つのモノマーを含む。他の実施形態において、リンクＡは、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、各ｍが、独立して、０、１、または２である）からなる群から独立して選択される１つ、２つ、または３つのモノマーを含む。さらに他の実施形態において、リンクＡは、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；またはＯからなる群から独立して選択される１つ、２つ、または３つのモノマーを含む。
【００１８】
ある実施形態において、リンクＡは、２つまたは３つのモノマーを含み、モノマーのうちの１つは、構造：
【化２】
2017522046.tif 000003
を有し、
式中、
Ｚ１が−Ｓ−Ｓ−への結合であり；
Ｚ２が、リンクＡの別のモノマーへの結合であり；
Ｑ１が、ＮまたはＣＲ２であり；
Ｑ２が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ３、または−Ｃ（Ｒ５）＝Ｃ（Ｒ６）−であり；
Ｑ３が、Ｒ４に結合されるＮまたはＣであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のそれぞれが、独立して、Ｈ、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；または−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）であり；またはＲ５およびＲ６が、それぞれが結合される原子と一緒に、結合して、Ｃ６アリール、Ｃ２〜７ヘテロアリール、およびＣ２〜７ヘテロシクリルからなる群から選択される環式基を形成し、ここで、環式基が、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリ
ール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、Ｑ１がＣＲ２である。特定の実施形態において、Ｒ２が、Ｈ、ハロ、またはＣ１〜６アルキルである。他の実施形態において、Ｑ２が、Ｏまたは−Ｃ（Ｒ５）＝Ｃ（Ｒ６）−である。さらに他の実施形態において、Ｑ２が、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｃ（Ｒ６）−である。さらに他の実施形態において、Ｒ５が、Ｈ、ハロ、またはＣ１〜６アルキルである。ある実施形態において、Ｒ６が、Ｈ、ハロ、またはＣ１〜６アルキルである。
【００２０】
さらに他の実施形態において、Ｒ５およびＲ６が、それぞれが結合される原子と一緒に、結合して、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換されるＣ２〜５ヘテロアリールを形成する。いくつかの実施形態において、Ｃ２〜５ヘテロアリールは、２個の窒素原子を含む（例えば、Ｃ２〜５ヘテロアリールは、Ｃ１〜６アルキルで任意選択的に置換される）。
【００２１】
特定の実施形態において、Ｑ２がＯである。いくつかの実施形態において、Ｑ３がＣＲ４である。ある実施形態において、Ｒ４が、Ｈ、ハロ、またはＣ１〜６アルキルである。
【００２２】
他の実施形態において、リンクＡおよび−Ｓ−Ｓ−が結合して、構造：
【化３】
2017522046.tif 000004
を形成し、
式中、
各Ｒ７が、独立して、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；または−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）であり；または２つの隣接するＲ７基が、各Ｒ７が結合される原子と一緒に、結合して、Ｃ６アリール、Ｃ２〜５ヘテロシクリル、またはＣ２〜５ヘテロアリールからなる群から選択される環式基を形成し、ここで、環式基が、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−
Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換され；
ｑが、０、１、２、３、または４であり；
ｓが、０、１、または２である。
【００２３】
さらに他の実施形態において、Ｒ７が、ハロまたは任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキルである。さらに他の実施形態において、ｓが、０または１である（例えば、ｓが０である）。いくつかの実施形態において、ｑが、０、１、または２である（例えば、ｑが、０または１である）。
【００２４】
特定の実施形態において、２つの隣接するＲ７基が、各Ｒ７が結合される原子と一緒に、結合して、１つ、２つ、または３つのＣ１〜６アルキル基で任意選択的に置換されるＣ２〜５ヘテロアリールを形成する。
【００２５】
ある実施形態において、リンクＡおよび−Ｓ−Ｓ−が結合して、構造：
【化４】
2017522046.tif 000005
を形成し、
式中、点線が、ただ１つの二重結合を表し、
Ｒ８が、空の原子価を有する窒素原子に結合され、Ｈ、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；または−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、Ｒ８が、ＨまたはＣ１〜６アルキルである。
【００２７】
他の実施形態において、ジスルフィド生物可逆的基の少なくとも１つが、１つまたは複数のモノマーを含み、ここで、モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；イミノ；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。さらに他の実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、１つまたは複数のモノマーを含み、ここで、モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；イミノ；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。さらに他の実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、１つまたは複数のモノマーを含み、ここで、モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。特定の実施形態において、モノマーの少なくとも１つがＳ（Ｏ）ｍであり、ｍが２である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、２〜５００のモノマー（例えば、２〜３００のモノマー、２〜２００のモノマー、２〜１５０のモノマー、または２〜１００のモノマー）を含む。ある実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、１つまたは複数のＣ１〜６アルキレンオキシ基を含む（例えば、生物可逆的基の少なくとも１つが、１００個未満のＣ１〜６アルキレンオキシ基を含む）。特定の実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、１つまたは複数のポリ（アルキレンオキシド）（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリ（トリメチレンオキシド）、ポリブチレンオキシド、ポリ（テトラメチレンオキシド）、およびそのジブロックまたはトリブロックコポリマー）を含む。他の実施形態において、ポリ（アルキレンオキシド）は、ポリエチレンオキシドである。
【００２９】
さらなる実施形態において、生物不可逆的基の少なくとも１つが、１つまたは複数の補助部分を含み、１つまたは複数の補助部分のそれぞれが、独立して、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、およびエンドソームエスケープ部分である。
【００３０】
ある実施形態において、生物不可逆的基の少なくとも１つが、炭水化物を含む（例えば、炭水化物は、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはＤ−グルシトールである）。
【００３１】
特定の実施形態において、生物不可逆的基の少なくとも１つが、標的化部分を含む（例えば、標的化部分は、葉酸塩リガンドであり、標的化部分は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）であり、標的化部分は、小胞体標的化基であり、または標的化部分は、アルブミン結合基である）。
【００３２】
他の実施形態において、生物不可逆的基の少なくとも１つが、ポリペプチドを含む（例えば、ポリペプチドは、細胞透過性ペプチドであり、またはポリペプチドは、エンドソームエスケープ部分である）。
【００３３】
さらに他の実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、炭水化物を含む（例えば、炭水化物は、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはＤ−グルシトールである）。特定の実施形態において、少なくとも１つのＲ１が炭水化物である（例えば、炭水化物は、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはＤ−グルシトールである）。
【００３４】
さらに他の実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、標的化部分を含む（例えば、標的化部分は、葉酸塩リガンドであり、標的化部分は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）であり、標的化部分は、小胞体標的化基であり、または標的化部分は、アルブミン結合基である）。ある実施形態において、少なくとも１つのＲ１が標的化部分である（例えば、標的化部分は、葉酸塩リガンドであり、標的化部分は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）であり、標的化部分は、小胞体標的化基であり、または標的化部分は、アルブミン結合基である）。
【００３５】
特定の実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、ポリペプチドを含む（例えば、ポリペプチドは、細胞透過性ペプチドであり、ポリペプチドは、エンドソームエスケープ部分であり、またはガイド鎖は、生物不可逆的基を含む）。ある実施形態において、少なくとも１つのＲ１がポリペプチドである（例えば、ポリペプチドは、細胞透過性ペプチドであり、ポリペプチドは、エンドソームエスケープ部分であり、またはガイド鎖は、生物不可逆的基を含む）。
【００３６】
他の実施形態において、生物可逆的基の少なくとも１つが、ポリペプチドを含む（例えば、ポリペプチドは、細胞透過性ペプチドであり、またはポリペプチドは、エンドソームエスケープ部分である）。特定の他の実施形態において、少なくとも１つのＲ１がポリペプチドである（例えば、ポリペプチドは、細胞透過性ペプチドであり、またはポリペプチドは、エンドソームエスケープ部分である）。
【００３７】
他の実施形態において、少なくとも１つのＲ１が、アジド、ポリペプチド、炭水化物、標的化部分、またはエンドソームエスケープ部分である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、生物不可逆的基のうちの１つが、ガイド鎖の第２のヌクレオシドおよび第３のヌクレオシドを連結する。特定の実施形態において、生物不可逆的基のうちの１つが、ガイド鎖の第５のヌクレオシドおよび第６のヌクレオシドを連結する。他の実施形態において、生物不可逆的基のうちの１つが、ガイド鎖の第１７のヌクレオシドおよび第１８のヌクレオシドを連結する。さらに他の実施形態において、生物不可逆的基のうちの１つが、ガイド鎖の３’末端基である。
【００３９】
特定の実施形態において、ガイド鎖は、１〜５つの生物不可逆的基を含む（例えば、ガイド鎖は、１つの生物不可逆的基を含む）。
【００４０】
ある実施形態において、パッセンジャー鎖は、少なくとも１つの生物不可逆的基を含む（例えば、パッセンジャー鎖は、１〜５つの生物不可逆的基（例えば、１つの生物不可逆的基））を含む。
【００４１】
他の実施形態において、生物不可逆的基は、パッセンジャー鎖の２つのヌクレオシドを連結し、ここで、ヌクレオシドは、５’方向において天然ＲＩＳＣを介した切断部位から離れて少なくとも１つのヌクレオシドに配置される。さらに他の実施形態において、生物不可逆的基は、パッセンジャー鎖の第１および第２のヌクレオシドを連結する。さらに他の実施形態において、ガイド鎖は、ジスルフィド生物可逆的基の少なくとも１つを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、ジスルフィド生物可逆的基の少なくとも１つを含む。特定の実施形態において、ジスルフィド生物可逆的基は、ガイド鎖の３つの５’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結する（例えば、Ｂは、ガイド鎖の３つの５’末端ヌクレオチドから選択される２つの連続ヌクレオチドを連結するヌクレオチド間リン（Ｖ）基である）。ある実施形態において、特定の実施形態において、ジスルフィド生物可逆的基は、ガイド鎖の３つの３’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結する。
【００４３】
他の実施形態において、生物可逆的基は、パッセンジャー鎖の５’末端基である（例えば、パッセンジャー鎖のＤは、ジスルフィド生物可逆的基である）。特定の他の実施形態において、生物可逆的基は、ガイド鎖の５’末端基である（例えば、ガイド鎖のＤは、ジスルフィド生物可逆的基である）。さらに他の実施形態において、生物可逆的基は、ガイド鎖の３’末端基である（例えば、ガイド鎖のＦは、ジスルフィド生物可逆的基である）。さらに他の実施形態において、生物可逆的基は、パッセンジャー鎖の３’末端基である（例えば、パッセンジャー鎖のＦは、ジスルフィド生物可逆的基である）。
【００４４】
特定の実施形態において、ジスルフィド生物可逆的基は、パッセンジャー鎖の３つの５’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結する（例えば、Ｂは、パッセンジャー鎖の３つの５’末端ヌクレオチドから選択される２つの連続ヌクレオチドを連結するヌクレオチド間リン（Ｖ）基である）。
【００４５】
ある実施形態において、ジスルフィド生物可逆的基は、パッセンジャー鎖の３つの３’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結する（例えば、Ｂは、パッセンジャー鎖の３つの３’末端ヌクレオシドから選択される２つの連続ヌクレオシドを連結するヌクレオチド間リン（Ｖ）基である）。
【００４６】
他の実施形態において、生物不可逆的基は、パッセンジャー鎖の５’末端基である（例えば、パッセンジャー鎖のＤは、生物不可逆的基である）。さらに他の実施形態において、生物不可逆的基は、ガイド鎖の３’末端基である（例えば、ガイド鎖のＦは、生物不可逆的基である）。さらに他の実施形態において、生物不可逆的基は、パッセンジャー鎖の３’末端基である（例えば、パッセンジャー鎖のＦは、生物不可逆的基である）。
【００４７】
いくつかの実施形態において、生物不可逆的基は、１つまたは複数のモノマーを含み、モノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。特定の実施形態において、１つまたは複数のモノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。他の実施形態において、１つまたは複数のモノマーのそれぞれが、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；またはＳ（Ｏ）ｍ（ここで、ｍが、０、１、または２である）である。さらに他の実施形態において、モノマーの少なくとも１つが、Ｓ（Ｏ）ｍであり、ｍが、０または２である（例えば、ｍが２である）。
【００４８】
特定の実施形態において、生物不可逆的基は、独立して、１〜２００のモノマーを含む。ある実施形態において、生物不可逆的基は、独立して、１〜１５０のモノマーを含む。他の実施形態において、生物不可逆的基は、独立して、１〜１００のモノマーを含む。さらに他の実施形態において、生物不可逆的基は、独立して、１〜３つのモノマーを含む。さらに他の実施形態において、生物不可逆的基は、独立して、１つのモノマーを含む。
【００４９】
ある実施形態において、生物不可逆的基は、独立して、任意選択的に置換されるＣ３〜６アルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜６アルケニル；任意選択的に置換されるＣ３〜６アルキニル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニル；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリール；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリール；Ｎ、Ｏから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリル（ここで、ヘテロシクリルは、Ｓ−Ｓ結合を含まない）；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル（ここで、ヘテロシクリルは、Ｓ−Ｓ結合を含まない）からなる群から独立して選択される置換基で置換されるリン酸塩またはホスホロチオエートである。
【００５０】
いくつかの実施形態において、−Ｓ−Ｓ−を、ヌクレオチド間リン（Ｖ）基、５’末端基、または３’末端基に連結する原子の最も短い鎖は３である。他の実施形態において、−Ｓ−Ｓ−を、ヌクレオチド間リン（Ｖ）基、５’末端基、または３’末端基に連結する原子の最も長い鎖は６である。さらに他の実施形態において、少なくとも１つのジスルフィド生物可逆的基は、独立して、ジスルフィドに近接する少なくとも１つの嵩高い基（ｂｕｌｋｙ  ｇｒｏｕｐ）を含む。
【００５１】
他の実施形態において、ガイド鎖は、１９以上のヌクレオシドを含む（例えば、ガイド鎖のｎは、１７以上である）。さらに他の実施形態において、ガイド鎖は、１００未満のヌクレオシドを含む（例えば、ガイド鎖のｎは、９８以下である）。さらに他の実施形態において、ガイド鎖は、５０未満のヌクレオシドを含む（例えば、ガイド鎖のｎは、４８以下である）。特定の実施形態において、ガイド鎖は、３２未満のヌクレオシドを含む（例えば、ガイド鎖のｎは、３０以下である）。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、１９以上のヌクレオシドを含む。
【００５２】
他の実施形態において、パッセンジャー鎖は、１９以上のヌクレオシドを含む（例えば、パッセンジャー鎖のｎは、１７以上である）。さらに他の実施形態において、パッセンジャー鎖は、１００未満のヌクレオシドを含む（例えば、パッセンジャー鎖のｎは、９８以下である）。さらに他の実施形態において、パッセンジャー鎖は、５０未満のヌクレオシドを含む（例えば、パッセンジャー鎖のｎは、４８以下である）。特定の実施形態において、パッセンジャー鎖は、３２未満のヌクレオシドを含む（例えば、パッセンジャー鎖のｎは、３０以下である）。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、１９以下のヌクレオシドを含む。
【００５３】
第２の態様において、本発明は、ポリヌクレオチド構築物を細胞に送達する方法であって、細胞を、上記の態様のいずれかの実施形態のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物と接触させる工程を含む方法を提供する。
【００５４】
第３の態様において、本発明は、細胞内のポリペプチドの発現を低下させる方法であって、細胞を、第１の態様のいずれかの実施形態のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物と接触させる工程を含む方法を提供する。
【００５５】
特定の実施形態において、上記の態様のいずれかの生物可逆的または生物不可逆的基は、式（ＩＩ）または
【化５】
2017522046.tif 000006
の基、またはその塩であり、
式中、ｕが、０または１であり；
Ａ１が、任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；Ｓ；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキレンのうちの１つまたは複数を含有するかまたはそれらである結合またはリンカーであり、ただし、Ａ１が、任意選択的に置換されるＮ、Ｏ、およびＳのうちの１つまたは複数を含む場合、任意選択的に置換されるＮ、Ｏ、またはＳは、ジスルフィドに直接結合されず；各Ａ２が、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；またはＡ１およびＡ２が、−Ｓ−Ｓ−と一緒に結合して、任意選択的に置換される５〜１６員環を形成し；
Ａ３が、結合、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；Ｏ；任意選択的に置換されるＮ；およびＳからなる群から選択され；
Ａ４が、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；
Ｌが存在しないか、または１つまたは複数の共役部分を含むかまたはそれらからなる共役基であり；
各Ｒ４が、独立して、水素、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、親水性官能基、または小分子、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、およびそれらの組合せからなる群から選択される補助部分を含む基であり；
ｒが、独立して、１〜１０の整数である。
【００５６】
生物不可逆的基の場合、ｕが０である。
【００５７】
ある実施形態において、生物可逆的基は、式（ＩＩ）の基またはその塩であり、式中、ｕが１である。
【００５８】
他の実施形態において、生物可逆的基は、式（ＩＩ）の基またはその塩であり、式中、ｕが０である。
【００５９】
特定の実施形態において、生物可逆的基が、式
【化６】
2017522046.tif 000007
の基またはその塩である場合、式中、Ａ２、Ａ３、およびＡ４が結合して、Ｃ４〜５アルキレンを形成する。
【００６０】
特定の実施形態において、生物可逆的基が、式
【化７】
2017522046.tif 000008
の基またはその塩である場合、式中、Ａ２、Ａ３、およびＡ４が結合して、Ｃ４〜５アルキレンを形成する。
【００６１】
他の実施形態において、生物可逆的基が、式
【化８】
2017522046.tif 000009
の基またはその塩である場合、基−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｘ−は、リン酸塩、アミド、エステル、またはアルケニレンを含まない。
【００６２】
いくつかの実施形態において、各ＸがＯである。特定の実施形態において、各ＺがＯである。
【００６３】
本発明のいずれかの態様のいくつかの実施形態において、全てのヌクレオシドが、リボヌクレオシドであり、例えば、ここで、各リボヌクレオチドの２’位が、Ｆ、−ＯＭｅ、または−Ｏ−Ｅｔ−Ｏ−Ｍｅのいずれかで置換される。
【００６４】
定義
本明細書において使用される際の「約」という用語は、記載される値の±１０％の値を表す。
【００６５】
本明細書において使用される際の「活性化カルボニル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ（式中、ＲＡが、ハロゲン、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、任意選択的に置換されるＣ６〜１０アリールオキシ、任意選択的に置換されるＣ２〜９ヘテロアリールオキシ（例えば、−ＯＢｔ）、任意選択的に置換されるＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリルオキシ（例えば、−ＯＳｕ）、任意選択的に置換されるピリジニウム（例えば、４−ジメチルアミノピリジニウム）、または−Ｎ（ＯＭｅ）Ｍｅである）の式で表される官能基を表す。
【００６６】
本明細書において使用される際の「活性化リン中心」という用語は、置換基の少なくとも１つが、ハロゲン、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、任意選択的に置換されるＣ６〜１０アリールオキシ、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、任意選択的に置換されるピリジニウム（例えば、４−ジメチルアミノピリジニウム）、または任意選択的に置換されるアンモニウムである、三価リン（ＩＩＩ）または五価リン（Ｖ）中心を表す。
【００６７】
本明細書において使用される際の「活性化ケイ素中心」という用語は、置換基の少なくとも１つが、ハロゲン、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、またはアミノである、四置換ケイ素中心を表す。
【００６８】
本明細書において使用される際の「活性化硫黄中心」という用語は、置換基の少なくとも１つが、ハロゲン、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、任意選択的に置換されるＣ６〜１０アリールオキシ、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、任意選択的に置換されるピリジニウム（例えば、４−ジメチルアミノピリジニウム）、または任意選択的に置換されるアンモニウムである、四価硫黄を表す。
【００６９】
本明細書において使用される際の「アルカノイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合された水素またはアルキル基（例えば、ハロアルキル基）を表し、ホルミル（すなわち、カルボキシアルデヒド基）、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリルなどによって例示される。例示的な非置換アルカノイル基は、１〜７個の炭素を含む。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載される１つ、２つ、３つ、または４つの置換基でさらに置換される。
【００７０】
本明細書において使用される際の「（Ｃｘ１〜ｙ１アリール）−Ｃｘ２〜ｙ２−アルキル」という用語は、ｘ２〜ｙ２個の炭素原子のアルキレン基を介して親分子基に結合されたｘ１〜ｙ１個の炭素原子のアリール基を表す。例示的な非置換（Ｃｘ１〜ｙ１アリール）−Ｃｘ２〜ｙ２−アルキル基は、７〜１６個の炭素である。ある実施形態において、アルキレンおよびアリールはそれぞれ、それぞれの基について本明細書において定義される１つ、２つ、３つ、または４つの置換基でさらに置換され得る。「アルキル」が後ろに続く他の基が同様に定義され、ここで、「アルキル」は、特に断りのない限り、Ｃ１〜６アルキレンを指し、結合される化学構造は、本明細書において定義されるとおりである。
【００７１】
本明細書において使用される際の「アルケニル」という用語は、１つ、２つ、または３つの炭素−炭素二重結合を含有する非環式一価直鎖状または分枝鎖状炭化水素基を表す。アルケニル基の非限定的な例としては、エテニル、プロパ−１−エニル、プロパ−２−エニル、１−メチルエテニル、ブタ−１−エニル、ブタ−２−エニル、ブタ−３−エニル、１−メチルプロパ−１−エニル、２−メチルプロパ−１−エニル、および１−メチルプロパ−２−エニルが挙げられる。アルケニル基は、本明細書において定義されるアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、およびアルキルについて記載される置換基からなる群から独立して選択される１つ、２つ、３つ、または４つの置換基で任意選択的に置換され得る。さらに、アルケニル基が、本発明の生物可逆的基中に存在する場合、それは、本明細書において定義される共役部分、親水性官能基、または補助部分に結合されるチオエステルまたはジスルフィド基で置換され得る。
【００７２】
本明細書において使用される際の「アルケニレン」という用語は、１個の水素が除去され、それによって二価になった直鎖状または分枝鎖状アルケニル基を指す。アルケニレン基の非限定的な例としては、エテン−１，１−ジイル；エテン−１，２−ジイル；プロパ−１−エン−１，１−ジイル、プロパ−２−エン−１，１−ジイル；プロパ−１−エン−１，２−ジイル、プロパ−１−エン−１，３−ジイル；プロパ−２−エン−１，１−ジイル；プロパ−２−エン−１，２−ジイル；ブタ−１−エン−１，１−ジイル；ブタ−１−エン−１，２−ジイル；ブタ−１−エン−１，３−ジイル；ブタ−１−エン−１，４−ジイル；ブタ−２−エン−１，１−ジイル；ブタ−２−エン−１，２−ジイル；ブタ−２−エン−１，３−ジイル；ブタ−２−エン−１，４−ジイル；ブタ−２−エン−２，３−ジイル；ブタ−３−エン−１，１−ジイル；ブタ−３−エン−１，２−ジイル；ブタ−３−エン−１，３−ジイル；ブタ−３−エン−２，３−ジイル；ブタ−１，２−ジエン−１，１−ジイル；ブタ−１，２−ジエン−１，３−ジイル；ブタ−１，２−ジエン−１，４−ジイル；ブタ−１，３−ジエン−１，１−ジイル；ブタ−１，３−ジエン−１，２−ジイル；ブタ−１，３−ジエン−１，３−ジイル；ブタ−１，３−ジエン−１，４−ジイル；ブタ−１，３−ジエン−２，３−ジイル；ブタ−２，３−ジエン−１，１−ジイル；およびブタ−２，３−ジエン−１，２−ジイルが挙げられる。アルケニレン基は、アルケニル基について記載されるように非置換であってもまたは置換されていてもよい（例えば、任意選択的に置換されるアルケニレン）。
【００７３】
本明細書において使用される際の「アルコキシ」という用語は、特に規定されない限り、式−ＯＲ（式中、Ｒが、Ｃ１〜６アルキル基である）の化学置換基を表す。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書において定義される１つ、２つ、３つ、または４つの置換基でさらに置換され得る。
【００７４】
本明細書において使用される際の「アルキル」という用語は、特に規定されない限り、１〜１２個の炭素を有する非環式直鎖状または分枝鎖状飽和炭化水素基を指す。アルキル基は、メチル；エチル；ｎ−およびイソ−プロピル；ｎ−、ｓｅｃ−、イソ−およびｔｅｒｔ−ブチル；ネオペンチルなどによって例示され、（１）アルコキシ；（２）アルキルスルフィニル；（３）アミノ；（４）アリールアルコキシ；（５）（アリールアルキル）アザ；（６）アジド；（７）ハロ；（８）（ヘテロシクリル）オキシ；（９）（ヘテロシクリル）アザ；（１０）ヒドロキシ；（１１）ニトロ；（１２）オキソ；（１３）アリールオキシ；（１４）スルフィド；（１５）チオアルコキシ；（１６）チオール；（１７）−ＣＯ２ＲＡ（ここで、ＲＡが、（ａ）アルキル、（ｂ）アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢＲＣ（ここで、ＲＢおよびＲＣのそれぞれが、独立して、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリール−アルキレンからなる群から選択される）；（１９）−ＳＯ２ＲＤ（ここで、ＲＤが、（ａ）アルキル、（ｂ）アリール、および（ｃ）アリール−アルキレンからなる群から選択される）；（２０）−ＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリールおよび（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２１）シリル；（２２）シアノ；および（２３）−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）からなる群から独立して選択される１つ、２つ、３つ、または、２個以上の炭素のアルキル基の場合、４つの置換基で任意選択的に置換され得る。ある実施形態において、これらの基のそれぞれが、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。いくつかの実施形態において、親分子基に結合するアルキル炭素原子は、オキソ置換されない。
【００７５】
本明細書において使用される際の「アルキレン」という用語は、少なくとも２個の水素原子の除去によって直鎖状または分枝鎖状飽和炭化水素から誘導される飽和二価、三価、または四価炭化水素基を指す。アルキレンは、任意選択の置換基ではない１つのアザ基に結合される場合、三価であり得；アルキレンは、任意選択の置換基ではない２つのアザ基に結合される場合、三価または四価であり得る。本明細書において定義されるアルキレンの原子価は、任意選択の置換基を含まない。アルキレン基の非限定的な例としては、メチレン、エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル、プロパン−１，３−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−１，１−ジイル、プロパン−２，２−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ブタン−１，３−ジイル、ブタン−１，２−ジイル、ブタン−１，１−ジイル、およびブタン−２，２−ジイル、ブタン−２，３−ジイルが挙げられる。「Ｃｘ〜ｙアルキレン」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキレン基を表す。ｘの例示的な値は、１、２、３、４、５、および６であり、ｙの例示的な値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２である。ある実施形態において、アルキレンは、アルキル基について本明細書において定義される１つ、２つ、３つ、または４つの置換基でさらに置換され得る。同様に、「エン（ｅｎｅ）」という接尾辞は、本明細書において定義される対応する一価基の二価基を示す。例えば、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アリールアルキレン、シクロアルキレン、シクロアルキルアルキレン、シクロアルケニレン、ヘテロアリーレン、ヘテロアリールアルキレン、ヘテロシクリレン、およびヘテロシクリルアルキレンが、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキルシクロアルケニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリルアルキルの二価形態である。アリールアルキレン、シクロアルキルアルキレン、ヘテロアリールアルキレン、およびヘテロシクリルアルキレンの場合、この基における２つの原子価は、非環式部分のみに位置するか、または１つは環式部分におよび１つは非環式部分に位置し得る。さらに、アルキルもしくはアルキレン、アルケニルもしくはアルケニレン、またはアルキニルもしくはアルキニレン基が、生物可逆的または生物不可逆的中に存在する場合、それは、本明細書において定義される共役部分、親水性官能基、または補助部分に結合されるエステル、チオエステル、またはジスルフィド基で置換され得る。例えば、アリール−Ｃ１−アルキレンまたはヘテロシクリル−Ｃ１−アルキレンのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基が得られる。
【００７６】
本明細書において使用される際の「アルキレンオキシ」という用語は、二価基−Ｒ−Ｏ−（ここで、Ｒがアルキレンである）を指す。
【００７７】
本明細書において使用される際の「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する２〜６個の炭素原子の一価直鎖状または分枝鎖状炭化水素基を表し、エチニル、１−プロピニルなどによって例示される。アルキニル基は、本明細書において定義されるアリール、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、およびアルキルについて記載される置換基から独立して選択される１つ、２つ、３つ、または４つの置換基で任意選択的に置換され得る。
【００７８】
本明細書において使用される際の「アルキニレン」という用語は、１つまたは２つの炭素−炭素三重結合を含み、非置換である場合、ＣおよびＨのみを含有する直鎖状または分枝鎖状二価置換基を指す。アルケニレン基の非限定的な例としては、エチン−１，２−ジイル；プロパ−１−イン−１，３−ジイル；プロパ−２−イン−１，１−ジイル；ブタ−１−イン−１，３−ジイル；ブタ−１−イン−１，４−ジイル；ブタ−２−イン−１，１−ジイル；ブタ−２−イン−１，４−ジイル；ブタ−３−イン−１，１−ジイル；ブタ−３−イン−１，２−ジイル；ブタ−３−イン−２，２−ジイル；およびブタ−１，３−ジイン−１，４−ジイルが挙げられる。アルキニレン基は、アルキニル基について記載されるように非置換であってもまたは置換されていてもよい（例えば、任意選択的に置換されるアルキニレン）。
【００７９】
本明細書において使用される際の「アミノ」という用語は、−Ｎ（ＲＮ１）２または−Ｎ（ＲＮ１）Ｃ（ＮＲＮ１）Ｎ（ＲＮ１）２を表し、式中、各ＲＮ１が、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アリール−アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、ヘテロシクリルアルキル（例えば、ヘテロアリールアルキル）であり、または２つのＲＮ１が結合して、ヘテロシクリルを形成し、各ＲＮ２が、独立して、Ｈ、アルキル、またはアリールである。一実施形態において、アミノは、−ＮＨ２、または−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１が、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、またはアリールであり、各ＲＮ２が、Ｈ、アルキル、またはアリールであり得る。各ＲＮ１基は、独立して、本明細書に記載されるように非置換であってもまたは置換されていてもよい。さらに、アミノ基が、本発明の生物可逆的基中に存在する場合、それは、本明細書において定義される共役部分、親水性官能基、または補助部分に結合されるエステル、チオエステル、またはジスルフィド基で置換され得る。
【００８０】
本明細書において使用される際の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、単一のモノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する抗体組成物、一本鎖抗体、および抗体の断片（例えば、抗原結合断片またはＦｃ領域）を包含する。本明細書において使用される際の「抗体」は、それらが、抗原を認識し、および／または本明細書に記載される所望のアゴニストまたはアンタゴニスト特性のいずれかを示す限り、インタクトな免疫グロブリンまたは抗体分子、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（すなわち、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される二重特異性抗体）および免疫グロブリン断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖなど）を含む。抗体または断片は、ヒト化、ヒト、またはキメラ抗体または断片であり得る。
【００８１】
本明細書において使用される際の「アリール」という用語は、１つまたは２つの芳香環を有する単環式、二環式、または多環式炭素環系を表し、フェニル、ナフチル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどによって例示され、（１）アルカノイル（例えば、ホルミル、アセチルなど）；（２）アルキル（例えば、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アミノアルキル、アジドアルキル、アシルアルキル、ハロアルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシアルキル、ニトロアルキル、またはチオアルコキシアルキル）；（３）アルケニル；（４）アルキニル；（５）アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ）；（６）アルキルスルフィニル；（７）アリール；（８）アミノ；（９）アリールアルキル；（１０）アジド；（１１）シクロアルキル；（１２）シクロアルキルアルキル；（１３）シクロアルケニル；（１４）シクロアルケニルアルキル；（１５）ハロ；（１６）ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）；（１７）（ヘテロシクリル）オキシ；（１８）（ヘテロシクリル）アザ；（１９）ヒドロキシ；（２０）ニトロ；（２１）チオアルコキシ；（２２）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、（ａ）アルキル、（ｂ）アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２３）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２４）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、（ａ）アルキル、（ｂ）アリール、および（ｃ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２５）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２６）チオール；（２７）アリールオキシ；（２８）シクロアルコキシ；（２９）アリールアルコキシ；（３０）ヘテロシクリルアルキル（例えば、ヘテロアリールアルキル）；（３１）シリル；（３２）シアノ；および（３３）−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）からなる群から独立して選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの置換基で任意選択的に置換され得る。ある実施形態において、これらの基のそれぞれが、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。さらに、アリール基が、本発明の生物可逆的基中に存在する場合、それは、本明細書において定義される共役部分、親水性官能基、または補助部分に結合されるエステル、チオエステル、またはジスルフィド基で置換され得る。
【００８２】
本明細書において使用される際の「アリールアルキル」という用語は、アリール基で置換されたアルキル基を表す。アリールおよびアルキル部分は、本明細書に記載されるように、個々の基として置換され得る。
【００８３】
「補助部分」という用語は、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に結合され得る、小分子、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、およびそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない任意の部分を指す。一般に、ただし必ずしも当てはまるわけではないが、「補助部分」は、ジスルフィド生物可逆的基または生物不可逆的基上に存在する１つまたは複数の共役基に対する１つまたは複数の共有結合を形成することによって、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に連結または結合される。しかしながら、代替的な実施形態において、「補助部分」は、ヌクレオチド糖分子の２’、３’、もしくは５’位などのジスルフィド生物可逆的基、または核酸塩基の任意の部分に存在する共役基に加えて、ヌクレオチド構築物の任意の部分に対する１つまたは複数の共有結合を形成することによって、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に連結または結合され得る。特定の補助部分の名称が、遊離分子を意味することがあるが、このような遊離分子が、ヌクレオチド構築物に結合されることが理解されよう。当業者は、ヌクレオチド構築物に対する特定の補助部分の適切な結合点を容易に理解するであろう。
【００８４】
本明細書において使用される際の「アザ」という用語は、二価−Ｎ（ＲＮ１）−基または三価−Ｎ＝基を表す。アザ基は、ＲＮ１がＨであるかもしくは存在しない場合、非置換であってもよく、またはＲＮ１が「アミノ」について定義されるとおりである場合、置換されていてもよい。アザは、「Ｎ」、例えば、「任意選択的に置換されるＮ」と呼ばれることもある。２つのアザ基は、連結されて、「ジアザ」が形成され得る。
【００８５】
本明細書において使用される際の「アジド」という用語は、Ｎ３基を表す。
【００８６】
本明細書において使用される際の「生物可逆的基」という用語は、例えば、１つまたは複数の細胞内酵素（例えば、細胞内レダクターゼ）の作用を介して細胞内で能動的に切断され得るか、またはこの基を、細胞内環境もしくは細胞内に存在する条件（例えば、ｐＨ、還元もしくは酸化環境、またはグルタチオンなどの細胞内種との反応）に曝露することなどによって、細胞内で受動的に切断され得る官能基を含む部分を表す。生物可逆的基は、その中に、ポリヌクレオチドのリン酸塩またはホスホロチオエートを組み込む。例示的な生物可逆的基としては、ジスルフィドが挙げられる。他の例示的な生物可逆的基としては、チオエステルが挙げられる。
【００８７】
本明細書において使用される際の「嵩高い基」という用語は、本明細書において定義される任意の置換基または置換基の群を表し、嵩高い基のラジカルは、ラジカルがｓｐ３混成炭素である場合、１個以下の水素原子を保有し、ラジカルがｓｐ２混成炭素である場合、水素原子を保有しない。ラジカルは、ｓｐ混成炭素ではない。嵩高い基は、炭素原子を介してのみ別の基に結合する。例えば、「ジスルフィド結合に結合された嵩高い基」、「ジスルフィド結合に結合された嵩高い基」、および「ジスルフィド結合に連結された嵩高い基」という表現は、嵩高い基が、炭素ラジカルを介してジスルフィド結合に結合されることを示す。
【００８８】
本明細書において使用される際の「カルベン」という用語は、６個の価電子および構造＝Ｃ：または−Ｃ（ＲＢ）を有する二価炭素種である官能基を表し：式中、ＲＢが、Ｈ、任意選択的に置換されるＣ１〜１２アルキル、任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリール、任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜１２−アルキレン、または任意選択的に置換されるカルボニルから選択され；Ｃが、共有結合の一部ではない２つの電子を有する炭素である。２つの電子は、対形成していても（例えば、一重項カルベン）または対形成していなくてもよい（例えば、三重項カルベン）。
【００８９】
本明細書において使用される際の「炭素環式」という用語は、任意選択的に置換されるＣ３〜１２単環式、二環式、または三環式構造を表し、ここで、環（芳香族または非芳香族であり得る）は、炭素原子によって形成される。炭素環式構造としては、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびアリール基が挙げられる。
【００９０】
本明細書において使用される際の「炭水化物」という用語は、酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された少なくとも５個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状または環状であり得る）を有する１つまたは複数の単糖単位を含む化合物を表す。したがって、「炭水化物」という用語は、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖を包含する。代表的な炭水化物としては、糖類（約４〜９つの単糖単位を含有する単糖、二糖、三糖およびオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖類が挙げられる。具体的な単糖としては、Ｃ５〜６糖が挙げられ；二糖および三糖としては、２つまたは３つの単糖単位（例えば、Ｃ５〜６糖）を有する糖が挙げられる。
【００９１】
本明細書において使用される際の「カルボニル」という用語は、Ｃ（Ｏ）基を表す。「カルボニル」を含む官能基の例としては、エステル、ケトン、アルデヒド、無水物、塩化アシル、アミド、カルボン酸、およびカルボン酸塩が挙げられる。
【００９２】
本明細書において使用される際の、ポリヌクレオチドに関連する「相補的」という用語は、ワトソン・クリック相補的を意味する。
【００９３】
本明細書において使用される際の「カップリング反応の成分」という用語は、カップリング反応に関与することができる分子種を表す。カップリング反応の成分としては、ヒドリドシラン、アルケン、およびアルキンが挙げられる。
【００９４】
本明細書において使用される際の「環状付加反応の成分」という用語は、環状付加反応に関与することができる分子種を表す。結合形成が［４ｎ＋２］個のπ電子（ここで、ｎが１である）を必要とする環状付加反応において、１つの成分が、２π電子を提供し、別の成分が、４π電子を提供する。２π電子を提供する環状付加反応の代表的な成分としては、アルケンおよびアルキンが挙げられる。４π電子を提供する環状付加反応の代表的な成分としては、１，３−ジエン、α，β−不飽和カルボニル、およびアジドが挙げられる。
【００９５】
本明細書において使用される際の「共役基」という用語は、１つまたは複数の共役部分を含有する二価以上の原子価の基を表す。共役基は、１つまたは複数の補助部分を、生物可逆的基（例えば、ジスルフィド部分を含有する基）に連結する。
【００９６】
本明細書において使用される際の「共役部分」という用語は、適切な条件下で、別の基（例えば、求核剤、求電子剤、環状付加反応における成分、またはカップリング反応における成分である官能基）に対する１つまたは複数の共有結合を形成することができる官能基を表す。この用語は、結合反応の残基、例えば、アミド基も指す。このような基の例が、本明細書に示されている。
【００９７】
本明細書において使用される際の「カップリング反応」という用語は、１つの成分がＳｉ−ＨまたはＣ−Ｈなどの非極性σ結合を含み、第２の成分がアルケンまたはアルキンなどのπ結合を含む、２つの成分の反応であって、Ｃ−Ｈ、Ｓｉ−Ｃ、もしくはＣ−Ｃ結合を形成するπ結合を介したσ結合の正味付加または２つの成分間の単一の共有結合の形成のいずれかをもたらす反応を表す。１つのカップリング反応は、アルケンを介したＳｉ−Ｈの付加（ヒドロシリル化としても知られている）である。他のカップリング反応としては、スティルカップリング、鈴木カップリング、薗頭カップリング、檜山カップリング、およびヘック反応が挙げられる。カップリング反応を促進するために、触媒が使用され得る。典型的な触媒は、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ）、Ｎｉ（０）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｐｄ（０）、Ｐｄ（ＩＩ）、Ｐｄ（ＩＶ）、Ｐｔ（０）、Ｐｔ（ＩＩ）、またはＰｔ（ＩＶ）を含むものである。
【００９８】
本明細書において使用される際の「環状付加反応」という用語は、活性化がないか、化学触媒による活性化、または熱エネルギーを用いた活性化のいずれかがあり、ｎが、１、２、または３であるとき、［４ｎ＋２］個のπ電子が結合形成に関与する、２つの成分の反応を表す。環状付加反応はまた、［４ｎ］個のπ電子が関与し、光化学活性化があり、ｎが、１、２、または３である、２つの成分の反応である。望ましくは、［４ｎ＋２］個のπ電子が結合形成に関与し、ｎ＝１である。代表的な環状付加反応としては、１，３−ジエンとのアルケンの反応（ディールス・アルダー反応）、α，β−不飽和カルボニルとのアルケンの反応（ヘテロディールス・アルダー反応（ｈｅｔｅｒｏ  Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ））、およびアジド化合物とのアルキンの反応（ヒュスゲン環状付加）が挙げられる。
【００９９】
本明細書において使用される際の「シクロアルケニル」という用語は、特に規定されない限り、３〜１０個の炭素を有する非芳香族炭素環式基（例えば、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキレン）を指す。シクロアルケニルの非限定的な例としては、シクロプロパ−１−エニル、シクロプロパ−２−エニル、シクロブタ−１−エニル、シクロブタ−１−エニル、シクロブタ−２−エニル、シクロペンタ−１−エニル、シクロペンタ−２−エニル、シクロペンタ−３−エニル、ノルボルネン−１−イル、ノルボルネン−２−イル、ノルボルネン−５−イル、およびノルボルネン−７−イルが挙げられる。シクロアルケニル基は、シクロアルキルについて記載されるように非置換であってもまたは置換されていてもよい（例えば、任意選択的に置換されるシクロアルケニル）。
【０１００】
本明細書において使用される際の「シクロアルケニレン」という用語は、特に規定されない限り、３〜１０個の炭素を有する二価炭素環式非芳香族基（例えば、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニレン）を指す。シクロアルケニレンの非限定的な例としては、シクロプロパ−１−エン−１，２−ジイル；シクロプロパ−２−エン−１，１−ジイル；シクロプロパ−２−エン−１，２−ジイル；シクロブタ−１−エン−１，２−ジイル；シクロブタ−１−エン−１，３−ジイル；シクロブタ−１−エン−１，４−ジイル；シクロブタ−２−エン−１，１−ジイル；シクロブタ−２−エン−１，４−ジイル；シクロペンタ−１−エン−１，２−ジイル；シクロペンタ−１−エン−１，３−ジイル；シクロペンタ−１−エン−１，４−ジイル；シクロペンタ−１−エン−１，５−ジイル；シクロペンタ−２−エン−１，１−ジイル；シクロペンタ−２−エン−１，４−ジイル；シクロペンタ−２−エン−１，５−ジイル；シクロペンタ−３−エン−１，１−ジイル；シクロペンタ−１，３−ジエン−１，２−ジイル；シクロペンタ−１，３−ジエン−１，３−ジイル；シクロペンタ−１，３−ジエン−１，４−ジイル；シクロペンタ−１，３−ジエン−１，５−ジイル；シクロペンタ−１，３−ジエン−５，５−ジイル；ノルボルナジエン−１，２−ジイル；ノルボルナジエン−１，３−ジイル；ノルボルナジエン−１，４−ジイル；ノルボルナジエン−１，７−ジイル；ノルボルナジエン−２，３−ジイル；ノルボルナジエン−２，５−ジイル；ノルボルナジエン−２，６−ジイル；ノルボルナジエン−２，７−ジイル；およびノルボルナジエン−７，７−ジイルが挙げられる。シクロアルケニレンは、シクロアルキルについて記載されるように非置換であってもまたは置換されていてもよい（例えば、任意選択的に置換されるシクロアルケニレン）。
【０１０１】
本明細書において使用される際の「シクロアルキル」という用語は、特に規定されない限り、３〜１０個の炭素を有する環状アルキル基（例えば、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）を指す。シクロアルキル基は、単環式または二環式であり得る。二環式シクロアルキル基は、ビシクロ［ｐ．ｑ．０］アルキルタイプのものであってもよく、ここで、ｐおよびｑのそれぞれが、独立して、１、２、３、４、５、６、または７であり、ただし、ｐおよびｑの和が、２、３、４、５、６、７、または８である。あるいは、二環式シクロアルキル基は、架橋シクロアルキル構造、例えば、ビシクロ［ｐ．ｑ．ｒ］アルキルを含んでもよく、ここで、ｒが、１、２、または３であり、ｐおよびｑのそれぞれが、独立して、１、２、３、４、５、または６であり、ただし、ｐ、ｑ、およびｒの和が、３、４、５、６、７、または８である。シクロアルキル基は、スピロ環式基、例えば、スピロ［ｐ．ｑ］アルキルであってもよく、ここで、ｐおよびｑのそれぞれが、独立して、２、３、４、５、６、または７であり、ただし、ｐおよびｑの和が、４、５、６、７、８、または９である。シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、１−ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル、２−ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル、５−ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル、７−ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル、およびデカリニルが挙げられる。シクロアルキル基は、本明細書において定義されるように非置換であってもまたは置換されていてもよい（例えば、任意選択的に置換されるシクロアルキル）。本開示のシクロアルキル基は、（１）アルカノイル（例えば、ホルミル、アセチルなど）；（２）アルキル（例えば、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アミノアルキル、アジドアルキル、アシルアルキル、ハロアルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシアルキル、ニトロアルキル、またはチオアルコキシアルキル）；（３）アルケニル；（４）アルキニル；（５）アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ）；（６）アルキルスルフィニル；（７）アリール；（８）アミノ；（９）アリールアルキル；（１０）アジド；（１１）シクロアルキル；（１２）シクロアルキルアルキル；（１３）シクロアルケニル；（１４）シクロアルケニルアルキル；（１５）ハロ；（１６）ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）；（１７）（ヘテロシクリル）オキシ；（１８）（ヘテロシクリル）アザ；（１９）ヒドロキシ；（２０）ニトロ；（２１）チオアルコキシ；（２２）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、（ａ）アルキル、（ｂ）アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２３）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２４）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、（ａ）アルキル、（ｂ）アリール、および（ｃ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２５）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）；（２６）チオール；（２７）アリールオキシ；（２８）シクロアルコキシ；（２９）アリールアルコキシ；（３０）ヘテロシクリルアルキル（例えば、ヘテロアリールアルキル）；（３１）シリル；（３２）シアノ；および（３３）−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリールアルキルからなる群から選択される）で任意選択的に置換され得る。ある実施形態において、これらの基のそれぞれが、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。
【０１０２】
本明細書において使用される際の「シクロアルキルアルキル」という用語は、シクロアルキル基で置換されたアルキル基を表す。シクロアルキルおよびアルキル部分は、本明細書に記載されるように、個々の基として置換され得る。
【０１０３】
本明細書において使用される際の「求電子剤」または「求電子基」という用語は、電子が豊富な中心に求引され、１つまたは複数の共有結合を形成するように、１つまたは複数の求核剤から電子対を受け取ることができる官能基を表す。求電子剤としては、限定はされないが、カチオン；分極中性分子；ニトレン；アジドなどのニトレン前駆体；カルベン；カルベン前駆体；活性化ケイ素中心；活性化カルボニル；ハロゲン化アルキル；擬ハロゲン化アルキル；エポキシド；電子不足アリール；活性化リン中心；および活性化硫黄中心が挙げられる。典型的に見られる求電子剤としては、Ｈ＋およびＮＯ＋などのカチオン、ＨＣｌなどの分極中性分子、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル、アルデヒドなどのカルボニル含有化合物、ならびにメシレート、トリフレートおよびトシレートなどの良好な脱離基に連結される原子が挙げられる。
【０１０４】
本明細書において使用される際の「エンドソームエスケープ部分」という用語は、エンドソーム内容物の放出を促進し、またはエンドソームなどの内部細胞コンパートメントからの分子の脱出を可能にする部分を表す。
【０１０５】
本明細書において使用される際の「ハロ」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素、およびフッ素から選択されるハロゲンを表す。
【０１０６】
本明細書において使用される際の「ハロアルキル」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）で置換される、本明細書において定義されるアルキル基を表す。ハロアルキルは、１個、２個、３個、または、２個以上の炭素のアルキル基の場合、４個のハロゲンで置換されてもよく、または、ハロゲン基がＦである場合、ハロアルキル基は、ペルフルオロアルキルであり得る。ある実施形態において、ハロアルキル基は、アルキル基について記載されるように、１つ、２つ、３つ、または４つの置換基でさらに任意選択的に置換され得る。
【０１０７】
本明細書において使用される際の「ヘテロアリール」という用語は、芳香族である、本明細書において定義されるヘテロシクリルのサブセット（すなわち、それらは、単環式または多環式環系内に４ｎ＋２個のπ電子を含有する）を表す。一実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロシクリル基について定義されるように、１つ、２つ、３つ、または４つの置換基で置換される。
【０１０８】
本明細書において使用される際の「ヘテロアリールアルキル」という用語は、ヘテロアリール基で置換されたアルキル基を表す。ヘテロアリールおよびアルキル部分は、本明細書に記載されるように、個々の基として置換され得る。
【０１０９】
本明細書において使用される際の「ヘテロシクリル」という用語は、特に規定されない限り、窒素、酸素、および硫黄を含む群から独立して選択される１個、２個、３個、または４個のヘテロ原子を含有する、５員、６員または７員環を表す。５員環は、０〜２個の二重結合を有し、６員および７員環は、０〜３個の二重結合を有する。特定のヘテロシクリル基は、２〜９個の炭素原子を含む。他のこのような基は、最大で１２個の炭素原子を含み得る。「ヘテロシクリル」という用語はまた、１つまたは複数の炭素および／またはヘテロ原子が、単環式環、例えば、キヌクリジニル基の２つの隣接していないメンバーを架橋する架橋多環式構造を有する複素環化合物を表す。「ヘテロシクリル」という用語は、上記の複素環のいずれかが、１つ、２つ、または３つの炭素環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、またはインドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニルなどの別の単環式複素環に縮合された、二環式、三環式、および四環式基を含む。縮合ヘテロシクリルの例としては、トロパンおよび１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環式基としては、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソインダゾイル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、プリニル、チアジアゾリル（例えば、１，３，４−チアジアゾール）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニルなどが挙げられる。さらに他の例示的なヘテロシクリルとしては、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−オキサゾリル；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−イミダゾリル；２，３，４，５−テトラヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−フェニル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル）；２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１Ｈ−イミダゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−５−メチル−５−フェニル−１Ｈ−イミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１，３，４−オキサジアゾリル（例えば、２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−５−フェニル−１，３，４−オキサジアゾリル）；４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル（例えば、４，５−ジヒドロ−３−メチル−４−アミノ５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３，３−ジエチルピリジニル）；２，６−ジオキソ−ピペリジニル（例えば、２，６−ジオキソ−３−エチル−３−フェニルピペリジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソピリジミニル（ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｍｉｎｙｌ）；１，６−ジヒドロ−４−オキソピリミジニル（例えば、２−（メチルチオ）−１，６−ジヒドロ−４−オキソ−５−メチルピリミジン−１−イル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリミジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３−エチルピリミジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−ピリダジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−６−オキソ−３−エチルピリダジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−５−イソプロピル−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル（例えば、３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリルおよび２，３−ジヒドロ−２−オキソ−３，３’−スピロプロパン−１Ｈ−インドール−１−イル）；１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１Ｈ−ベンゾピラゾリル（例えば、１−（エトキシカルボニル）−１Ｈ−ベンゾピラゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル（例えば、３−エチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル（例えば、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル；２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラニル；１，４−ベンゾジオキサニル；１，３−ベンゾジオキサニル；２，３−ジヒドロ−３−オキソ，４Ｈ−１，３−ベンゾチアジニル；３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル（例えば、２−メチル−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル（例えば、１−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−１，３−ジメチル−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−３，７−ジメチル−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル）；２−オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル；１，１−ジオキソ−２Ｈ−ナフト［１，８−ｃ，ｄ］イソチアゾリル；および１，８−ナフチレンジカルボキサミドが挙げられる。複素環式基は、式
【化９】
2017522046.tif 000010
の基も含み、式中、
Ｆ’が、−ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−および−Ｏ−からなる群から選択され、Ｇ’が、−Ｃ（Ｏ）−および−（Ｃ（Ｒ’）（Ｒ”））ｖ−からなる群から選択され、ここで、Ｒ’およびＲ”のそれぞれが、独立して、水素または１〜４個の炭素原子のアルキルからなる群から選択され、ｖが１〜３であり、１，３−ベンゾジオキソリル、１，４−ベンゾジオキサニルなどの基を含む。本明細書に記載されるヘテロシクリル基のいずれも、（１）アルカノイル（例えば、ホルミル、アセチルなど）；（２）アルキル（例えば、アルコキシアルキレン、アルキルスルフィニルアルキレン、アミノアルキレン、アジドアルキレン、アシルアルキレン、ハロアルキレン（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシアルキレン、ニトロアルキレン、またはチオアルコキシアルキレン）；（３）アルケニル；（４）アルキニル；（５）アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシ）；（６）アルキルスルフィニル；（７）アリール；（８）アミノ；（９）アリール−アルキレン；（１０）アジド；（１１）シクロアルキル；（１２）シクロアルキル−アルキレン；（１３）シクロアルケニル；（１４）シクロアルケニル−アルキレン；（１５）ハロ；（１６）ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）；（１７）（ヘテロシクリル）オキシ；（１８）（ヘテロシクリル）アザ；（１９）ヒドロキシ；（２０）オキソ；（２１）ニトロ；（２２）スルフィド；（２３）チオアルコキシ；（２４）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、（ａ）アルキル、（ｂ）アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）アリール−アルキレンからなる群から選択される）；（２５）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリール−アルキレンからなる群から選択される）；（２６）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、（ａ）アルキル、（ｂ）アリール、および（ｃ）アリール−アルキレンからなる群から選択される）；（２７）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリール−アルキレンからなる群から選択される）；（２８）チオール；（２９）アリールオキシ；（３０）シクロアルコキシ；（３１）アリールアルコキシ；（３１）ヘテロシクリル−アルキレン（例えば、ヘテロアリール−アルキレン）；（３２）シリル；（３３）シアノ；および（３４）−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）アリール、および（ｄ）アリール−アルキレンからなる群から選択される）からなる群から独立して選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの置換基で任意選択的に置換され得る。ある実施形態において、これらの基のそれぞれが、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、アリール−Ｃ１−アルキレンまたはヘテロシクリル−Ｃ１−アルキレンのアルキレン基は、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を得るように、オキソ基でさらに置換され得る。さらに、ヘテロシクリル基が、本発明の生物可逆的基中に存在する場合、それは、本明細書において定義される共役部分、親水性官能基、または補助部分に結合されるエステル、チオエステル、またはジスルフィド基で置換され得る。
【０１１０】
本明細書において使用される際の「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリル基で置換されたアルキル基を表す。ヘテロシクリルおよびアルキル部分は、本明細書に記載されるように、個々の基として置換され得る。
【０１１１】
本明細書において使用される際の「親水性官能基」という用語は、水に対する親和性を与え、アルキル部分の水溶性を高める部分を表す。親水性官能基は、イオン性または非イオン性であり得、正に荷電した、負に荷電した、および／または水素結合相互作用に関与することができる部分を含む。例示的な親水性官能基としては、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、カルボニル、チオール、リン酸塩（例えば、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩）、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）、およびヘテロシクリルが挙げられる。
【０１１２】
本明細書において同義的に使用される「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨ基を表す。
【０１１３】
本明細書において使用される際の「イミン」という用語は、炭素と窒素との間に二重結合を有する基を表し、これは、「Ｃ＝Ｎ」と表すことができる。陽子がイミン官能基に対してαである特定の実施形態において、イミンはまた、互変異性エナミンの形態であってもよい。あるタイプのイミン結合は、イミン結合の窒素が、三価窒素に共有結合されたヒドラゾン結合（例えば、Ｃ＝Ｎ−Ｎ（Ｒ）２）である。ある実施形態において、各Ｒが、独立して、Ｈ、ＯＨ、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、または任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキルであり得る。
【０１１４】
本明細書において使用される際の「ヌクレオチド間基」という用語は、２つの連続ヌクレオシドを共有結合する基を表す。ヌクレオチド間基は、本明細書において定義される生物不可逆的または生物可逆的基であり得る。ヌクレオチド間リン（Ｖ）基は、リン酸塩またはホスホロチオエートである。ヌクレオチド間基の１個の酸素原子が、１つのヌクレオシドの３’位にあり、ヌクレオチド間基の別の酸素原子が、別の隣接するヌクレオシドの５’位にある。
【０１１５】
本明細書において使用される際の「ＲＩＳＣ複合体に取り込み可能な」という用語は、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれるガイド鎖の能力およびガイド鎖にハイブリダイズされるパッセンジャー鎖のＲＩＳＣを介した分解の能力を指す。したがって、このポリヌクレオチドは、ガイド鎖の５’位における生物不可逆的ヌクレオチド間基または天然ＲＩＳＣを介した切断部位を含む３つの連続するヌクレオチドを含まない。好ましい天然ＲＩＳＣを介した切断部位は、ガイド鎖の第１０および第１１のヌクレオチドに相補的な２つのヌクレオシド間のパッセンジャー鎖に位置する。
【０１１６】
本明細書において使用される際の「ニトレン」という用語は、６つの価電子および構造＝Ｎ：または−ＮＲＡを有する一価窒素種を表し：式中、ＲＡが、任意選択的に置換されるＣ１〜１２アルキル、任意選択的に置換されるＣ６〜１２アリール、任意選択的に置換される（Ｃ６〜１２アリール）−Ｃ１〜１２−アルキレン、または任意選択的に置換されるカルボニルから選択され；Ｎが、４つの価電子を有する窒素であり、そのうちの少なくとも２つが、対形成している。２つの残りの電子は、対形成していても（すなわち、一重項ニトレン）または対形成していなくてもよい（すなわち、三重項ニトレン）。
【０１１７】
本明細書において使用される際の「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２基を表す。
【０１１８】
本明細書において使用される際の「生物不可逆的基」という用語は、生物可逆的基ではない官能基を含む部分を指す。生物不可逆的基は、その中に、ポリヌクレオチドのリン酸塩またはホスホロチオエートを組み込む。例えば、生物不可逆的基は、ポリヌクレオチドに対する１つまたは複数の結合点に応じて、ヌクレオチド間生物不可逆的基または末端生物不可逆的基であり得る。ヌクレオチド間生物不可逆的基は、ポリヌクレオチドの２つのヌクレオチドを連結するリン酸塩またはホスホロチオエートの酸素または硫黄原子に結合される官能基を含む部分を含有する。末端生物不可逆的基は、ポリヌクレオチドの末端リン酸塩またはホスホロチオエートの１個または２個の酸素および／または硫黄原子に結合される官能基を含む部分を含有する。生物不可逆的基は、リン酸塩またはホスホロチオエート、または本明細書に記載される任意の他の連結基の酸素または硫黄原子に結合される、Ｃ３〜６アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アリールアルキレン、シクロアルキレン、シクロアルキルアルキレン、またはシクロアルケニレンを含み得る。
【０１１９】
「非天然アミノ酸」は、天然に産生されないかまたは哺乳動物中に見られないアミノ酸である。
【０１２０】
「非極性σ結合」とは、ポーリングの目盛りにしたがって測定した際に、１．０単位以下だけ異なる電気陰性度値を有する２つの元素間の共有結合を意味する。非極性σ結合の非限定的な例としては、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｈ、Ｓｉ−Ｈ、Ｓｉ−Ｃ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−Ｂ、およびＣ−Ｓｎ結合が挙げられる。
【０１２１】
本明細書において使用される際の「核酸塩基」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの糖部分の１’位に見られる窒素含有複素環を表す。核酸塩基は、非修飾であるかまたは修飾され得る。本明細書において使用される際、「非修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃまたはｍ５ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（擬ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されているもの；およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９  ３０２（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）によって開示されているものが挙げられる。５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）を含むいくつかの核酸塩基が、本発明のポリマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されている。（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐａｇｅｓ  ２７６−２７８）。これらは、特定の実施形態において、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾物と組み合わせられてもよい。これらの修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のいくつかの調製を教示する米国特許としては、限定はされないが、上述される米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０２号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９４，１２１号明細書；同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；および同第５，６８１，９４１号明細書が挙げられる。本開示の趣旨では、本明細書において使用される際の「修飾核酸塩基」は、本明細書に記載される１つまたは複数の保護基を含む、天然または非天然の核酸塩基をさらに表す。
【０１２２】
本明細書において使用される際の「求核剤」という用語は、電子対またはπ結合から電子を供与することによって、共有結合の形成に関与する任意選択的に置換される官能基を表す。求核剤は、アルケン、アルキン、アリール、ヘテロアリール、ジアザ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基、チオ基、およびチオフェノキシ基から選択され得る。
【０１２３】
本明細書において使用される際の「ヌクレオシド」という用語は、糖−核酸塩基の組合せを表す。糖は、アノマー炭素における核酸塩基を含有する修飾糖またはアノマー炭素における核酸塩基ならびに各位置３および５における別の基への結合を含有する３，５−ジデオキシペンタフラノース（ｄｉｄｅｏｘｙｐｅｎｔａｆｕｒａｎｏｓｅ）である。ペンタフラノースは、３，５−ジデオキシリボースまたは２，３，５−トリデオキシリボースまたはその２位修飾形態（ここで、２位が、ＯＲ、Ｒ、ハロ（例えば、Ｆ）、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮで置換され、Ｒが、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル（例えば、（Ｃ１〜６アルコキシ）−Ｃ１〜６−アルキル）または任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキルである）であり得る。修飾糖は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノースなどの非リボース糖、４−チオリボース、および他の糖、複素環、または炭素環である。ある実施形態において、「ヌクレオシド」という用語は、以下の構造：
【化１０】
2017522046.tif 000011
を有する二価基を指し、式中、Ｂ１が核酸塩基であり；Ｙが、Ｈ、ハロゲン（例えば、Ｆ）、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシまたはメトキシエトキシ）、または保護されたヒドロキシル基であり；３’および５’のそれぞれが、別の基に対する結合の位置を示す。
【０１２４】
本明細書において使用される際の「ヌクレオチド」という用語は、二価基の３’または５’位に共有結合されたヌクレオチド間または末端リン（Ｖ）基あるいは生物可逆的または生物不可逆的基をさらに含むヌクレオシドを指す。ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリセロール核酸、モルホリノ核酸、およびトレオース核酸も含む。
【０１２５】
本明細書において同義的に使用される「オキサ」および「オキシ」という用語は、２つの基に連結された二価酸素原子を表す（例えば、オキシの構造は、−Ｏ−として示され得る）。
【０１２６】
本明細書において使用される際の「オキソ」という用語は、１つの基に連結された二価酸素原子を表す（例えば、オキソの構造は、＝Ｏとして示され得る）。
【０１２７】
本明細書において使用される際の「リン（Ｖ）基」という用語は、構造−Ｏ−Ｐ（＝ＺＡ）（−ＺＢ）−Ｏ−（式中、ＺＡが、ＯまたはＳであり、ＺＢが、ＯＨ、ＳＨ、またはアミノである）を有する二価基、またはその塩を指す。
【０１２８】
本明細書において使用される際の「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド間リン（Ｖ）、生物可逆的、または生物不可逆的基の任意の組合せによって一緒に共有結合された１１以上の連続ヌクレオシドを含有する構造を表す。ポリヌクレオチドは、直鎖状または環状であり得る。
【０１２９】
本明細書において使用される際の「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸残基を表す。さらに、本開示の趣旨では、「ポリペプチド」という用語および「タンパク質」という用語は、本明細書において全ての文脈において同義的に使用される。様々なポリペプチドが、本明細書において提供される方法および組成物の範囲内で使用され得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体または抗体の断片またはその抗原結合断片を含む。合成により作製されたポリペプチドは、ＤＮＡによって天然にコードされないアミノ酸の置換（例えば、非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇまたはｕｎｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸）を含み得る。
【０１３０】
本明細書において使用される際の「Ｐｈ」という用語は、フェニルを表す。
【０１３１】
本明細書において使用される際の「光分解活性化」または「光分解」という用語は、光との反応の照射による化学反応の促進または開始を表す。光分解活性化に好適な光の波長は、２００〜５００ｎｍの範囲であり、２００〜２６０ｎｍおよび３００〜４６０ｎｍの範囲の波長を含む。他の有用な範囲としては、２００〜２３０ｎｍ、２００〜２５０ｎｍ、２００〜２７５ｎｍ、２００〜３００ｎｍ、２００〜３３０ｎｍ、２００〜３５０ｎｍ、２００〜３７５ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、２００〜４３０ｎｍ、２００〜４５０ｎｍ、２００〜４７５ｎｍ、３００〜３３０ｎｍ、３００〜３５０ｎｍ、３００〜３７５ｎｍ、３００〜４００ｎｍ、３００〜４３０ｎｍ、３００〜４５０ｎｍ、３００〜４７５ｎｍ、および３００〜５００ｎｍが挙げられる。
【０１３２】
本明細書において使用される際の「保護基」という用語は、官能基（例えば、ヒドロキシル、アミノ、またはカルボニル）が、化学合成（例えば、ポリヌクレオチド合成）中に１つまたは複数の望ましくない反応に関与することから保護することが意図される基を表す。本明細書において使用される際の「Ｏ−保護基」という用語は、酸素含有（例えば、フェノール、ヒドロキシルまたはカルボニル）基が、化学合成中に１つまたは複数の望ましくない反応に関与することから保護することが意図される基を表す。本明細書において使用される際の「Ｎ−保護基」という用語は、窒素含有（例えば、アミノまたはヒドラジン）基が、化学合成中に１つまたは複数の望ましくない反応に関与することから保護することが意図される基を表す。一般的に使用されるＯ−およびＮ−保護基は、参照により本明細書に援用される、Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示されている。例示的なＯ−およびＮ−保護基としては、アルカノイル、アリーロイル、またはカルバミル基（ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル、４，４’−ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジノ、および４−ニトロベンゾイルなど）が挙げられる。
【０１３３】
カルボニル含有基を保護するための例示的なＯ−保護基としては、限定はされないが：アセタール、アシラール、１，３−ジチアン、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、および１，３−ジチオランが挙げられる。
【０１３４】
他のＯ−保護基としては、限定はされないが：置換アルキル、アリール、およびアリール−アルキレンエーテル（例えば、トリチル；メチルチオメチル；メトキシメチル；ベンジルオキシメチル；シロキシメチル；２，２，２，−トリクロロエトキメチル；テトラヒドロピラニル；テトラヒドロフラニル；エトキシエチル；１−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］エチル；２−トリメチルシリルエチル；ｔ−ブチルエーテル；ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、およびニトロベンジル）；シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル；トリエチルシリル；トリイソプロピルシリル；ジメチルイソプロピルシリル；ｔ−ブチルジメチルシリル；ｔ−ブチルジフェニルシリル；トリベンジルシリル；トリフェニルシリル；およびジフェニルメチルシリル）；炭酸塩（例えば、メチル、メトキシメチル、９−フルオレニルメチル；エチル；２，２，２−トリクロロエチル；２−（トリメチルシリル）エチル；ビニル、アリル、ニトロフェニル；ベンジル；メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；およびニトロベンジル）が挙げられる。
【０１３５】
他のＮ−保護基としては、限定はされないが、保護または非保護Ｄ、ＬまたはＤ，Ｌ−アミノ酸（アラニン、ロイシン、フェニルアラニンなど）などのキラル補助基；スルホニル含有基（ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなど）；カルバメート形成基（ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２，−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど）、アリール−アルキレン基（ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなど）およびシリル基（トリメチルシリルなど）が挙げられる。有用なＮ−保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
【０１３６】
本明細書において使用される際の「立体障害型」という用語は、分子間もしくは分子内求核剤または求電子剤の存在下で、少なくとも２４時間の半減期を有する化学基を表す。
【０１３７】
本明細書において使用される際の「被験体」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を表す。
【０１３８】
本明細書において使用される際の「スルフィド」という用語は、二価−Ｓ−または＝Ｓ基を表す。
【０１３９】
本明細書において使用される際の「標的化部分」という用語は、所与の標的細胞集団と関連する受容体または他の受容性部分と特異的に結合する、またはそれらと反応的に会合もしくは複合体形成する任意の部分を表す。
【０１４０】
本明細書において使用される際の「末端基」という用語は、ポリヌクレオチドにおける最初または最後のヌクレオシドに位置する基を指す。５’末端基は、ポリヌクレオチド中の最初のヌクレオシドの５’−炭素原子に結合された末端基である。３’末端基は、ポリヌクレオチド中の最後のヌクレオシドの３’−炭素原子に結合された末端基である。
【０１４１】
本明細書において使用される際の「治療有効用量」という用語は、疾患または障害の症状を改善し、治療し、または少なくとも部分的に停止させる（例えば、細胞の増殖を阻害する）のに必要な本発明に係るｓｉＲＮＡ、またはポリヌクレオチドの量を表す。この用途に有効な量は、当然ながら、疾患の重症度および被験体の体重および全身状態に応じて決まる。典型的に、インビトロで使用される投与量は、医薬組成物のインビボ投与に有用な量において有用な指針を提供することができ、具体的な障害の治療に有効な投与量を決定するために、動物モデルが使用され得る。
【０１４２】
本明細書において使用される際の「チオカルボニル」という用語は、Ｃ（＝Ｓ）基を表す。「チオカルボニル」を含有する官能基の非限定的な例としては、チオエステル、チオケトン、チオアルデヒド、チオ無水物、塩化チオアシル、チオアミド、チオカルボン酸、およびチオカルボキシレートが挙げられる。
【０１４３】
本明細書において使用される際の「チオール」という用語は、−ＳＨ基を表す。
【０１４４】
本明細書において使用される際の「障害」という用語は、「疾患」、「症候群」、および「病態」（病状と同様）という用語とほぼ同義語であることが意図され、それらと同義的に使用される。これらは全て、正常な機能を損ない、典型的に、特徴的な兆候および症状によって発現される、被験体、またはその部分の１つによって示される異常な状態を示すためである。
【０１４５】
被験体における障害に関して使用される際の「治療する」という用語は、治療薬（例えば、本発明のヌクレオチド構築物）を被験体に投与することによって、障害の少なくとも１つの症状を軽減することを指すことが意図される。
【０１４６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形（「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈上特に明記されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「標的化部分（ａ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）」への言及は、複数のこのような標的化部分を含み、「細胞（ｔｈｅ  ｃｅｌｌ）」への言及は、当業者に公知の１つまたは複数の細胞への言及を含むなどである。
【０１４７】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または均等な方法および材料を、開示される方法および組成物の実施に使用することができるが、例示的な方法、装置および材料が本明細書に記載されている。
【０１４８】
同様に、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は同義的に使用され、限定的であることは意図されていない。
【０１４９】
様々な実施形態の説明に「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの具体例において、一実施形態が、代わりに、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という文言を用いて説明され得ることを理解することがさらに理解されるべきである。
【０１５０】
本開示の趣旨では、当該技術分野において存在する任意の用語が、本開示において明確に定義されるいずれかの用語と同じである場合、本開示に示される用語の定義が全ての点で優先されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１Ａは２つの鎖を含む本発明のｓｉＲＮＡを示し、ここで、鎖の一方が、本発明のジスルフィド結合を含む。図１Ｂは２つの鎖を含む本発明のｓｉＲＮＡを示し、ここで、両方の鎖が、本発明のジスルフィド結合を含む。
【図２】本発明の代表的なポリヌクレオチド構築物および同じポリヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣトレースを示す。
【図３】本発明のポリヌクレオチドの粗混合物の質量スペクトルを示し、その構造が図２に示される。
【図４】本発明の精製ポリヌクレオチドの質量スペクトルを示し、その構造が図２に示される。
【図５】図５Ａは１つまたは３つのＡＤＳ共役部位を有する本発明の一本鎖ＲＮＡ構築物の構造を示す。図５Ｂは本発明の一本鎖ＲＮＡ構築物のゲル分析の写真を示す。この構築物の構造が、図６Ａ、６Ｂ、および８に記載される。図５Ｃは本発明の一本鎖ＲＮＡ構築物のゲル分析の写真を示す。この構築物の構造が、図６Ａ、６Ｂ、および７Ａに記載される。図５Ｄは本発明の一本鎖ＲＮＡ構築物のゲル分析の写真を示す。この構築物の構造が、図６Ａ、６Ｂ、および７Ｂに記載される。
【図６Ａ】本発明の代表的なｓｉＲＮＡ構築物の一般的構造を示す。
【図６Ｂ】図６Ａに示されるｓｉＲＮＡ構築物に組み込まれるＡＤＳ共役基を示す。
【図７Ａ】代表的な共役部分に連結された代表的な標的化部分（葉酸塩）の構造を示す。
【図７Ｂ】代表的な共役部分に連結された代表的な標的化部分（ＧａｌＮＡｃ）の構造を示す。
【図８】代表的な共役部分に連結された代表的な標的化部分（マンノース）の構造を示す。
【図９Ａ】いくつかの例示的な生物可逆的および生物不可逆的基を示すグラフである。
【図９Ｂ】表７に列挙されるポリヌクレオチドの調製に使用されるいくつかの化合物を示すグラフである。
【図１０】［３＋２］環状付加の前の２つの例示的なｓｉＲＮＡ構造を示す。
【図１１】ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの一覧を示す。
【図１２】実施例２に記載される手順にしたがって決定される際のインビトロトランスフェクションデータを示す。鎖１は、パッセンジャー鎖であり、鎖２は、ガイド鎖である。各文字によって示される棒グラフは、表９に記載されるｓｉＲＮＡ構造の１つのＩＣ５０（ｐＭ）を示す。ＳＢ−０１６５は対照である。各文字は、５’から３’への順序におけるヌクレオチド間生物不可逆的基の位置に対応する（例えば、鎖１のＡは、第１および第２のヌクレオシドを連結する生物不可逆的基を含む化合物ＳＢ−０１６６についての、２４時間および４８時間の時点でのＩＣ５０データを示す）。
【図１３Ａ】Ｃ５７／ＢＩ６マウスからの初代マウス肝細胞においてＡｐｏＢ遺伝子発現をインビトロで阻害する際の、表５〜７に列挙される例示的なｓｉＲＮＡ化合物の効力を示すグラフである。決定されたＩＣ５０値が、各グラフ下の表に示される。
【図１３Ｂ】Ｃ５７／ＢＩ６マウスからの初代マウス肝細胞においてＡｐｏＢ遺伝子発現をインビトロで阻害する際の、表５〜７に列挙される例示的なｓｉＲＮＡ化合物の効力を示すグラフである。決定されたＩＣ５０値が、各グラフ下の表に示される。
【図１４Ａ】ＫＢ細胞に結合する本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲート（（葉酸塩）３−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３）についての用量曲線を示す。
【図１４Ｂ】本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲート（（葉酸塩）３−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３または（葉酸塩）１−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３）およびＫＢ細胞の解離定数（Ｋｄ）を決定するグラフを示す。
【図１５Ａ】ＨｅｐＧ２細胞に結合する本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲート（（ＧａｌＮＡｃ）９−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３）についての用量曲線を示す。
【図１５Ｂ】本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲート（（ＧａｌＮＡｃ）９−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３または（ＧａｌＮＡｃ）３−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３）およびＨｅｐＧ２細胞の解離定数（Ｋｄ）を決定するグラフを示す。
【図１６Ａ】初代腹腔マクロファージに結合する本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲート（マンノース）１８−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３についての用量曲線を示す。
【図１６Ｂ】本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲート（（マンノース）１８−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３または（マンノース）６−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３）および初代腹腔マクロファージの解離定数（Ｋｄ）を決定するグラフを示す。
【図１７】腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の腹腔内投与から４時間後のＮＦκＢ−ＲＥ−Ｌｕｃマウスの画像である。比較は、陰性対照に対して提供される。本発明のｓｉＲＮＡで処置されたマウスは、陰性対照マウスと比較して減少したレベルのルシフェラーゼを示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】Ｃ５７ＢＩ６マウスにおいてＡｐｏＢ遺伝子発現をインビボで阻害する際の、表５に列挙される例示的なｓｉＲＮＡ化合物の効力を示すグラフである。図１８Ａは、ビヒクルのみの投与と比べた、インビボでのβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子発現に対して正規化された肝臓ＡｐｏＢ遺伝子発現によって測定される７２時間の時点での用量反応関数を示すグラフである。図１８Ｂは、ビヒクルのみの投与と比べた、インビボでのＢ２Ｍ遺伝子発現に対して正規化されたｓｉＲＮＡ（ＳＢ００９７、表５を参照）の投与の９６、７２、４８、および２４時間後のインビボでの肝臓ＡｐｏＢ遺伝子発現の経時変化を示すグラフである。
【図１９Ａ−１９Ｂ】ビヒクルに対する、本発明のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物の正規化されたＡｐｏＢ発現レベルの比較を示すグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ｂ中のデータについての陽性対照の構造を示す。陽性対照（ＳＢ−０１６５）は、４つの生物可逆的基（ｏ−（ｔ−ブチルジチオ）フェネチルホスフェート）および１つの生物不可逆的基（２つのヌクレオシドを連結するホモプロパルギルホスフェート）を含む。
【図２０Ｂ】図２０Ａに示される陽性対照および生物不可逆的トリエステルＥまたはＱを有するもののＡｐｏＢ遺伝子発現レベルの比較を示し、文字の表記は、図１２と一致している。トリエステルＥを有する陽性対照は、ＳＢ０１９０であり、トリエステルＱを有する陽性対照は、ＳＢ０２０２である。
【図２１Ａ−２１Ｂ】ハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化されたＧａｐＤＨ発現を示すグラフである。対照（例えば、ビヒクル）または本発明のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物を腹腔内に投与されたマウスから単離されたマクロファージにおいて、ＧａｐＤＨ発現を測定した。
【図２２】ハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化されたＧａｐＤＨ発現を示すグラフである。ビヒクルまたは本発明のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物を投与されたマウスから単離されたマクロファージにおいて、ＧａｐＤＨ発現を測定した。
【図２３Ａ−２３Ｂ】マウス初代骨髄細胞実験からの結果を示す。図２３Ａは、マクロファージにおけるマンノース受容体発現の正規化された量を経時的に示す。図２３Ｂは、表５に列挙される例示的なｓｉＲＮＡ化合物での４８時間の処理による処置後のＢ２Ｍに対して正規化されたＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのグラフを示す。図２３Ｂは、本発明のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物の投与後のＧａｐＤＨ  ｍＲＮＡレベルの用量依存的減少を示す。
【図２４Ａ−２４Ｂ】本発明のハイブリダイズポリヌクレオチドについてのＧａｐＤＨ発現の用量依存性および関連するＩＣ５０データを示すグラフである。ＧａｐＤＨの発現を、ハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化した。
【図２５】インキュベーションの開始時（０時間）およびマウス血清中で、３７℃で２４時間または４８時間後の２’修飾ｓｉＲＮＡのバンドを示す、臭化エチジウムで染色された１５％の変性ゲル（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｅｌ）の写真である。ゲルの右の３つのレーンは、本発明のハイブリダイズポリヌクレオチド構築物について得られたバンドを示し、左の３つのレーンは、対照のレーンである（ホスホトリエステル基を有さないｓｉＲＮＡ）。
【発明を実施するための形態】
【０１５２】
特定の生物活性物質を細胞の内部に送達する能力は、細胞原形質膜の選択的透過性のために問題がある。細胞の原形質膜は、分子の細胞内取込みを、十分に極性でかつ約５００ダルトン未満のサイズであるものに限定するバリアを形成する。タンパク質の細胞内在化を促進する過去の取り組みは、受容体リガンドとタンパク質の融合（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１０７０６−１１，２００２）またはタンパク質をケージ化リポソーム担体へとパッケージングすることによるもの（Ａｂｕ−Ａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３０４９９−５０３，２００１）に焦点を合わせていた。しかしながら、これらの技術は、不十分な細胞の取込みおよびエンドサイトーシス経路への細胞内隔離につながり得る。それらのアニオン電荷および約１４，０００ダルトンの大きなサイズのため、ｓｉＲＮＡの送達は、ヒトを含む哺乳動物において、非常に困難な課題である。しかしながら、カチオン性荷電ペプチドおよびタンパク質は、ポリヌクレオチド送達の向上をもたらした。例えば、ペプチド形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を核酸に連結することは、ポリヌクレオチド送達のいくらかの向上をもたらした。
【０１５３】
本発明は、パッセンジャー鎖およびガイド鎖を含むハイブリダイズポリヌクレオチド構築物を提供し、ここで、パッセンジャー鎖は、５’末端、３’末端、またはヌクレオチド間生物不可逆的基を含有し、および／またはガイド鎖は、３’末端またはヌクレオチド間生物不可逆的基を含有する。これらのハイブリダイズポリヌクレオチド構築物は、生物不可逆的基の非存在のみが異なるハイブリダイズポリヌクレオチド構築物と比べて、遺伝子サイレンシングにおいて優れた有効性を示し得る。理論によって制約されるわけではないが、優れた有効性は、ＲＩＳＣ複合体ローディングの速度の向上またはハイブリダイズポリヌクレオチド構築物の安定性の向上に起因し得る。
【０１５４】
本発明は、１つまたは複数の生物可逆的基（例えば、ジスルフィド）を含むヌクレオチド構築物も提供する。立体障害型ジスルフィドは、特に有利である。少なくとも１つの嵩高い基に結合されたジスルフィドは、少なくとも１つの嵩高い基に結合されていないジスルフィドと比較して、ヌクレオチド構築物合成中により高い安定性を示す。これは、後者が、ヌクレオチド構築物のリン（ＩＩＩ）原子と反応して、ジスルフィド結合を切断し得るためである。
【０１５５】
比較的大きな部分、例えば、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの組合せは、生物可逆的基が細胞内で切断される能力に影響を与えずに、生物可逆的基に含まれ得る。本発明は、疎水性または親水性官能基を有する生物可逆的基、および／または共役部分を含むヌクレオチド構築物も提供し、ここで、これらの共役部分は、ヌクレオチド間または末端リン酸塩またはホスホロチオエートに対する、ポリペプチド、小分子、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの任意の組合せの結合を可能にする。本発明は、１つまたは複数の疎水性または親水性官能基を含む１つまたは複数の生物可逆的基、および／またはヌクレオチド構築物に対する、補助部分、例えば、ポリペプチド、小分子、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの任意の組合せの結合を可能にする１つまたは複数の共役部分を有する１つまたは複数の共役基を含むヌクレオチド構築物をさらに提供する。一実施形態において、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物は、構築物の総負電荷を低減し、それによって、細胞による構築物の取込みを可能にするかまたは促進する特定の数の生物可逆的基を含有する。本明細書に記載されるヌクレオチド構築物は、ポリヌクレオチド自体、または結合された補助部分、例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの組合せに連結されたポリヌクレオチドの細胞内輸送を可能にするか、または促進することができる。細胞内酵素（例えば、細胞内タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、チオレドキシン、もしくはチオエステラーゼ）の作用または細胞内環境への曝露は、ジスルフィドまたはチオエステル結合の切断をもたらし、それによって、補助部分を放出し、および／またはポリヌクレオチドをアンマスクし得る（ｕｎｍａｓｋ）。次に、アンマスクされたポリヌクレオチドは、例えば、アンチセンスまたはＲＮＡｉ−媒介性応答を開始することができる。さらに、本発明のヌクレオチド構築物はまた、リポソーム、またはカチオン性脂質などの担体を必要とせずに、ポリヌクレオチド、またはジスルフィドまたはチオエステル結合を介して、結合された補助部分、例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの組合せに連結されたポリヌクレオチドの細胞内送達を可能にするか、または促進する。好ましくは、補助部分とポリヌクレオチドとの結合は、ジスルフィド結合を含む。これらの特徴のそれぞれが、本明細書にさらに説明される。
【０１５６】
本発明は、アニオン性荷電ポリヌクレオチドに関連する電荷を低減または中和し、任意選択的に、分子、例えば、カチオン性ペプチド、標的化部分、および／またはエンドソームエスケープ部分にさらなる官能基を加えることによって、ポリヌクレオチドの細胞の取込みを促進し、向上させるための方法および組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明の組成物は、カチオン電荷を有するヌクレオチド構築物を生成することによって、ポリヌクレオチドの取込みを促進し得る。
【０１５７】
本発明は、ヒトの障害を選択的に治療し、研究を促進するのに有用な配列特異的ポリヌクレオチドの送達のための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、既存の核酸送達方法の欠点なしに、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡを含むポリヌクレオチドを、被験体および細胞に有効に送達する。本発明は、ＲＮＡｉ構築物を細胞に送達し難くするか、または構築物を送達不可能にするサイズおよび電荷の制限を克服する組成物および方法を提供する。核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）のアニオン電荷を可逆的に中和することによって、本発明に係る生物可逆的基を含むヌクレオチド構築物は、核酸をインビトロおよびインビボで細胞に送達することができる。
【０１５８】
本発明は、電荷中和部分（例えば、生物不可逆的基、生物可逆的基；またはヌクレオチド間または末端リン（Ｖ）基の保護基として使用される成分（ｉ）、式（ＩＩ）の基、または式（ＩＩａ）の基）を含むヌクレオチド構築物を提供する。構築物は、細胞のトランスフェクションおよび細胞の調節に有用な補助部分をさらに含み得る。このような補助部分としては、小分子、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１５９】
本発明は、特定の細胞（例えば、表面にアシアロ糖タンパク質受容体を有する細胞（例えば、肝細胞）、腫瘍細胞（例えば、表面に葉酸塩受容体を有する腫瘍細胞）、マンノース受容体を保有する細胞（例えば、マクロファージ、樹枝状細胞、および皮膚細胞（例えば、線維芽細胞またはケラチノサイト）））への標的化された送達のための１つまたは複数の標的化部分を含むヌクレオチド構築物の送達のための組成物および方法を提供する。マンノース受容体スーパーファミリーの非限定的な例としては、ＭＲ、Ｅｎｄｏ１８０、ＰＬＡ２Ｒ、ＭＧＬ、およびＤＥＣ２０５が挙げられる。本発明のヌクレオチド構築物の標的化された送達は、受容体媒介性内在化を含み得る。ある実施形態において、標的化部分は、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、または葉酸塩リガンドを含み得る。
【０１６０】
本明細書において実証されるように、核酸への１つまたは複数の除去可能な（例えば、可逆的に結合された）電荷中和部分の付加により、細胞トランスフェクションを促進することができる。配列組成にかかわらず、いずれの核酸も修飾することができる。したがって、本発明は、いずれかの特定の配列（すなわち、いずれかの特定のｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡなど）に限定されない。
【０１６１】
本発明は、ある実施形態において、細胞膜透過ならびにエキソ−およびエンドヌクレアーゼ分解に対する耐性を促進する化学的および生物物理学的特性に寄与する１つまたは複数の生物可逆的部分を有するヌクレオチド構築物を提供する。本発明は、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物の合成のための試薬、例えば、ホスホラミダイト試薬をさらに提供する。さらに、これらの生物可逆的基は、合成プロセス中安定している。
【０１６２】
細胞内で、生物可逆的部分は、特定の内因性核酸とハイブリダイズし、および／またはそれに対する親和性を有することが可能な生物学的に活性なポリヌクレオチド化合物を得るために、酵素（例えば、チオレダクターゼ活性を有する酵素（例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼまたはチオレドキシン））の作用、または細胞内条件（例えば、酸化または還元環境）または反応剤（例えば、グルタチオンまたは他の遊離チオール）への曝露によって除去され得る。
【０１６３】
生物可逆的部分は、特に発現を阻止または下方制御するように設計された、遺伝子またはｍＲＮＡに属する標的配列に対する相補的配列の合成ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは混合分子のアンチセンスポリヌクレオチドとともに使用され得る。これらの阻害性ポリヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に対して、あるいは標的ＤＮＡ配列に対して指向され、それらが相補的な核酸とハイブリダイズすることによって、転写または翻訳を阻害し得る。したがって、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物は、遺伝子発現を有効に阻止または下方制御することができる。
【０１６４】
本発明のヌクレオチド構築物はまた、特定のビカテナリー（ｂｉｃａｔｅｎａｒｙ）ＤＮＡ領域（ホモプリン／ホモピリミジン配列またはプリン／ピリミジンが豊富な配列）に対して指向され、したがって、三重螺旋を形成し得る。特定の配列における三重螺旋の形成は、得られるポリヌクレオチドが反応性官能基を有するように作製される場合、遺伝子発現を調節または他の方法で制御し、および／または特定の核酸部位に導入される不可逆的な損傷を促進し得るタンパク質因子の相互作用を阻止することができる。
【０１６５】
ポリヌクレオチド
本発明は、ヌクレオチド間または末端リン（Ｖ）基に結合された１つまたは複数の電荷中和基（例えば、生物可逆的基、生物不可逆的基；または成分（ｉ）、式（ＩＩ）の基、または式（ＩＩａ）の基））を有するポリヌクレオチド（「ポリヌクレオチド構築物」）を含有するヌクレオチド構築物を提供する。１つまたは複数の電荷中和基は、ジスルフィドまたはチオエステル結合などの生物可逆的基を含有し得る。好ましくは、１つまたは複数の電荷中和基は、ジスルフィド結合を含む。１つまたは複数の電荷中和基は、ヌクレオチド間リン（Ｖ）基または末端リン（Ｖ）基（例えば、ジスルフィドまたはチオエステル結合；好ましくは、ジスルフィド結合を有する生物可逆的基）に連結された１つまたは複数の補助部分を含有し得る。このような補助部分の例としては、小分子、共役部分、親水性官能基、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。生物可逆的基は、非修飾ヌクレオチド間架橋基または末端ヌクレオチド基を脱離させるために、例えば、分子内で、別個の反応に供することができる。本明細書において提供されるヌクレオチドの定義に記載されるように、様々な糖および骨格が用いられ得るが、ポリヌクレオチドは、典型的に、リボース、デオキシリボース、またはＬＮＡ糖およびリン酸塩またはチオホスフェートヌクレオチド間リン（Ｖ）基を用いる。単一のポリヌクレオチドにおけるこれらの糖および架橋基の混合物も考えられる。
【０１６６】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築物は、（例えば、受動的環境、酵素の作用、または他の反応剤への曝露によって）細胞内で選択的に切断され得、それによって、細胞へのポリヌクレオチドの細胞内送達を促進する生物可逆的基を特徴とする。例示的な生物可逆的基は、ジスルフィド結合を含む。
【０１６７】
例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築物は、チオレダクターゼ活性を有する細胞内酵素によって切断され得るジスルフィド結合を含み得る。細胞内への侵入の際、これらのジスルフィド結合（例えば、式（ＩＩ）のＡ１基およびＡ２基の間に含まれるもの）は、核酸をアンマスクするために、酵素によって選択的に切断され得る。本明細書に記載されるジスルフィド結合は、１つまたは複数の補助部分（例えば、１つまたは複数の標的化部分）および他のコンジュゲートで、または核酸の物理化学的特性を調節する基（例えば、ヒドロキシ（−ＯＨ）基などの疎水性基）で核酸を官能化するための有用な手段を提供することもできる。この手法は、別個の送達物質を使用せずに、標的化細胞送達を可能にするために、いくつかの構造的および機能的に異なる核酸に容易に一般化することができる。
【０１６８】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築物は、例えば、１〜４０個の独立した生物可逆的基または生物不可逆的基を含み得る。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物は、１〜３０、１〜２５、１〜２０、２〜１５、２〜１０、または１〜５個の独立した生物可逆的または生物不可逆的基を含み得る。特定の実施形態において、構成ヌクレオチドの７５％以下が、生物可逆的基を含む（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％以下が、生物可逆的基を含む）。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物中の最大で９０％のヌクレオチドが、生物可逆的基を有し得る。さらに別の実施形態において、生物可逆的基の半分以下が、疎水性末端、例えば、アルキル基を含む（例えば、（Ｒ４）ｒ−Ｌ−Ａ１が結合して、疎水性基を形成するとき）。いくつかの実施形態において、構成ヌクレオチドの７５％以下が、生物不可逆的基を含む（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％以下が、生物可逆的基を含む）。本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物は、例えば、共役部分、親水性官能基、ポリペプチド、小分子、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの任意の組合せを含む生物可逆的基の任意の組合せを特徴とし得る。ポリヌクレオチド構築物は、一般に、最大で１５０ヌクレオチド長さである。ある実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、５〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜２５、８〜４０、１０〜３２、１５〜３０、または１９〜２８ヌクレオチド長さからなる。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、１つまたは複数の成分（ｉ）または式（ＩＩ）の基を含有し、成分のそれぞれが、独立して、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、またはエンドソームエスケープ部分を含有し；ここで、成分（ｉ）および式（ＩＩ）の基のそれぞれが、ポリヌクレオチド構築物のヌクレオチド間架橋基に対するリンカーを含み、このリンカーは、ジスルフィドまたはチオエステル（好ましくは、ジスルフィド、例えば、リンカーは、−Ｌ−Ａ１−Ｓ−Ｓ−Ａ２−Ａ３−Ａ４−である）と、ジスルフィド基に近接し、ジスルフィド基を立体障害にする１つまたは複数の嵩高い基とを含有する。
【０１７０】
ある実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、１つまたは複数の成分（ｉ）を含有し、成分のそれぞれが、独立して、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、またはエンドソームエスケープ部分を含有する。
【０１７１】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物内の生物可逆的基の位置は、得られる構築物の安定性を向上させるように（例えば、ジスルフィド結合を切断するのに関与する試薬（例えば、酸化または還元環境）の非存在下でポリヌクレオチド構築物の半減期を増加させるように）選択される。特に、二本鎖ポリヌクレオチドの場合、生物可逆的基の位置は、哺乳動物の生理的温度で安定な二本鎖分子が形成されるようなものである。
【０１７２】
他の実施形態において、各生物可逆的基の性質は、好ましい溶解度および送達特性を生み出すように選択され得る。こうした変動は、例えば、ヌクレオチド間架橋基または末端ヌクレオチド基とジスルフィド基との間、および／またはジスルフィド基と任意の共役部分、親水性官能基、または補助部分との間のリンカー長さを調節することを含み得る。疎水性生物可逆的基によって引き起こされる溶解度の低下は、ポリヌクレオチド中の他の場所の１つまたは複数の疎水性生物可逆的基の使用によって、部分的に相殺され得る。特定の実施形態において、生物可逆的基に結合されたヌクレオシドは、２’ＯＨ基を含まず、代わりに、例えば、２’ＦまたはＯＭｅ基を含む。
【０１７３】
例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築物のいくつかは、式Ｉ
【化１１】
2017522046.tif 000012
で表される構造、またはその塩を含むことができ、
式中、ｎが、０〜１５０の数であり；
各Ｂ１が、独立して、核酸塩基であり；
各Ｘが、独立して、存在しないか、Ｏ、Ｓ、および任意選択的に置換されるＮからなる群から選択され；
各Ｙが、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロ、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、および保護されたヒドロキシル基からなる群から選択され；
各Ｙ１が、独立して、Ｈまたは任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル（例えば、メチル）であり；
各Ｚが、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｒ１が、Ｈ、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、保護されたヒドロキシル基、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩、５’キャップ、ホスホチオール、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、アミノ含有基、ビオチン含有基、ジゴキシゲニン含有基、コレステロール含有基、色素含有基、クエンチャー含有基、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、およびオリゴヌクレオチドに連結するリンカーに対する結合、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され、またはＲ１が、
【化１２】
2017522046.tif 000013
またはその塩であり；
Ｒ２が、Ｈ、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、保護されたヒドロキシル基、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、アミノ含有基、ビオチン含有基、ジゴキシゲニン含有基、コレステロール含有基、クエンチャー含有基、ホスホチオール、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され、またはＲ２が、
【化１３】
2017522046.tif 000014
またはその塩であり；
各Ｒ３が、独立して、存在しないか、水素、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、または式ＩＩ：
【化１４】
2017522046.tif 000015
の構造を有する基であり、
式中、各Ａ１が、独立して、任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；Ｓ；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキレンのうちの１つまたは複数を含有するかまたはそれらである結合またはリンカーであり、ただし、Ａ１が、任意選択的に置換されるＮ、Ｏ、およびＳのうちの１つまたは複数を含む場合、任意選択的に置換されるＮ、Ｏ、またはＳは、ジスルフィドに直接結合されず；各Ａ２が、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；またはＡ１およびＡ２が、−Ｓ−Ｓ−と一緒に結合して、任意選択的に置換される５〜１６員環を形成し；
各Ａ３が、独立して、結合、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；Ｏ；任意選択的に置換されるＮ；およびＳからなる群から選択され；
各Ａ４が、独立して、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；
各Ｌが、独立して、存在しないか、または１つまたは複数の共役部分を含むかまたはそれらからなる共役基であり；
各Ｒ４が、独立して、水素、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、親水性官能基、または小分子、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、およびそれらの組合せからなる群から選択される補助部分を含む基であり；
各ｒが、独立して、１〜１０の整数であり；
各ｕが、独立して、０または１であり；
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つにおいて、Ａ２、Ａ３、およびＡ４が結合して、−Ｓ−Ｓ−およびＸを連結する最も短い鎖内に少なくとも３個の原子を有する基を形成し；
ここで、少なくとも１つのＲ３が、式（ＩＩ）の構造を有する。
【０１７４】
ある実施形態において、Ｌが、別のポリヌクレオチド（例えば、式（Ｉ）の別のポリヌクレオチド）に対する結合を含む。特定の実施形態において、Ｙ１がＨである。
【０１７５】
本発明のポリヌクレオチドおよびヌクレオチドにおけるジスルフィド結合は、別の生物可逆的基、例えば、チオエステル部分で置換され得る。例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、または（ＶＩＩＩａ）の基は、式（ＩＩｂ）：
【化１５】
2017522046.tif 000016
の基で置換され得る。
【０１７６】
本明細書に記載される合成方法は、このようなポリヌクレオチドおよびヌクレオチドを調製するように構成され得る。したがって、チオエステル含有基は、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１７７】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態は、ＸおよびＺが両方ともＯであるもの（例えば、リン酸塩）を含む。ある実施形態において、本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物は、主に、式（Ｉ）の構造を含むが、式（Ｉ）の示されるヌクレオチド間リン（Ｖ）基が、本明細書に記載される別のヌクレオチド間リン（Ｖ）基（例えば、修飾ポリヌクレオチド骨格）で置換される。代替的な実施形態において、本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物は、主に、式（Ｉ）の構造を含むが、式（Ｉ）の示される基Ｒ１および／またはＲ２が、基Ｒ３を有する末端ヌクレオチド基で置換される。本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物は、修飾ポリヌクレオチド骨格を有し得る。修飾ポリヌクレオチド骨格の例としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスオロジチオエート、アミノアルキル−ホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、および逆転極性を有するものが挙げられ、ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、結合される（５’−３’に対して３’−５’または５’−２’に対して２’−５’）。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９６号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３０６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；および同第５，６２５，０５０号明細書が挙げられ、これらのそれぞれが、参照により本明細書に援用される。リン原子を含まない修飾ポリヌクレオチド骨格を有する本明細書に開示されるヌクレオチド構築物は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオチド間架橋基、混合型ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオチド間架橋基、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオチド間架橋基によって形成される骨格を有してもよい。これらとしては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他の骨格を有するものが挙げられる。上記のポリヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，２６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；および５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらのそれぞれが、参照により本明細書に援用される。
【０１７８】
例示的な−Ａ１−Ｓ−Ｓ−Ａ２−Ａ３−Ａ４−または−Ｓ−Ｓ−Ａ２−Ａ３−Ａ４−基が以下のとおりであり：
【化１６】
2017522046.tif 000017
式中、
各Ｒ９が、独立して、ハロ、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニル；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニル；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリール；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリール；窒素、酸素から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；アミノ；または任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシであり；または２つの隣接するＲ９基が、各Ｒ９が結合される原子と一緒に、結合して、Ｃ６アリール、Ｃ２〜５ヘテロシクリル、またはＣ２〜５ヘテロアリールからなる群から選択される環式基を形成し、ここで、環式基が、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換され；
ｑが、０、１、２、３、または４であり；
ｓが、０、１、または２である。
【０１７９】
本発明の生物可逆的基に含まれる例示的な基は、以下のもの：
【化１７】
2017522046.tif 000018
であり、
式中、
各Ｒ７が、独立して、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；または−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）であり；または２つの隣接するＲ７基が、各Ｒ７が結合される原子と一緒に、結合して、Ｃ６アリール、Ｃ２〜５ヘテロシクリル、またはＣ２〜５ヘテロアリールからなる群から選択される環式基を形成し、ここで、環式基が、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−
Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換され；
ｑが、０、１、２、３、または４であり；
ｓが、０、１、または２である。
【０１８０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド構築物を製造するための方法をさらに提供する。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの調製のための方法が、当該技術分野において公知である。例えば、ポリヌクレオチドを調製するためのホスホラミダイト化学の実施が、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅａｕｃａｇｅおよびその他の公開論文から公知である。例えば、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許第４，４５８，０６６号明細書；同第４，５００，７０７号明細書；同第５，１３２，４１８号明細書；同第４，４１５，７３２号明細書；同第４，６６８，７７７号明細書；同第４，９７３，６７９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書、同第５，１５３，３１９号明細書；同第５，２１８，１０３号明細書；同第５，２６８，４６４号明細書；同第５，０００，３０７号明細書；同第５，３１９，０７９号明細書；同第４，６５９，７７４号明細書；同第４，６７２，１１０号明細書；同第４，５１７，３３８号明細書；同第４，７２５，６７７号明細書；およびＲＥ３４，０６９号明細書には、ポリヌクレオチド合成の方法が記載されている。さらに、ホスホラミダイト化学の実施が、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３−２３１１，１９９２；およびＢｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９：６１２３−６１９４，１９９３、ならびにこれらの文献に引用される参照文献によって体系的に概説されており、これらの全てが、参照により本明細書に援用される。
【０１８１】
核酸合成装置は、市販されており、それらの使用は、所望され得る妥当な長さのほぼあらゆるポリヌクレオチドを生成するのに有効であると当業者によって一般に理解される。
【０１８２】
ホスホラミダイト化学を実施する際、有用な５’ＯＨ糖遮断基は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルおよびトリメトキシトリチル、特に、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）である。ホスホラミダイト化学を実施する際、有用な亜リン酸塩活性化基は、ジアルキル置換窒素基および窒素複素環である。一手法は、ジ−イソプロピルアミノ活性化基の使用を含む。
【０１８３】
ポリヌクレオチドは、Ｍｅｒｍａｄｅ−６固相自動ポリヌクレオチド合成装置または任意の市販の自動ポリヌクレオチド合成装置によって合成され得る。トリエステル、ホスホラミダイト、またはリン酸水素カップリング化学（例えば、Ｍ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｐ．７−２４，Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ，ｅｄ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４；およびＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１に記載されている）が、これらの合成装置によって用いられて、所望のポリヌクレオチドが得られる。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１１２：１２５３−１２５５，１９９０に記載されているようなＢｅａｕｃａｇｅ試薬、またはＢｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６２，１９８１に記載されているような硫黄元素が、ホスホラミダイトまたはリン酸水素化学とともに使用されて、置換ホスホロチオエートポリヌクレオチドが得られる。
【０１８４】
例えば、本明細書に記載される保護基を含有する試薬は、保護が所望される多くの用途に使用することができる。このような用途としては、限定はされないが、固相および液相、ポリヌクレオチド合成などが挙げられる。
【０１８５】
例えば、構造基が、リボースの２’−Ｏ位置にメチル、プロピルまたはアリル基、または２’−Ｏ基を置換するフルオロ基、またはリボヌクレオシド塩基にブロモ基などの、ポリヌクレオチドへの組み込みのためのヌクレオシドのリボースまたは塩基に任意選択的に付加される。ホスホラミダイト化学とともに使用するために、２’−デオキシホスホラミダイト、２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−ヒドロキシルホスホラミダイトを含む様々なホスホラミダイト試薬が市販されている。このような合成のための任意の他の手段も用いられてもよい。ポリヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の技能の範囲内である。ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびアルキル化誘導体などの他のポリヌクレオチドを調製するための類似の技術を使用することも周知である。蛍光標識、ビオチン化または他の結合ポリヌクレオチドを合成するのに、類似の技術ならびにビオチン、Ｃｙ３、フルオレセイン、アクリジンまたはソラーレンで修飾されたホスホラミダイトおよび／またはＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｖａ．）から入手可能）などの、市販の修飾ホスホラミダイトおよび制御多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）製品を使用することも周知である。
【０１８６】
式（Ｉａ）：
【化１８】
2017522046.tif 000019
、またはその塩，
Ｂ１が核酸塩基であり；
Ｘが、Ｏ、Ｓ、または任意選択的に置換されるＮであり；
Ｙが、水素、ヒドロキシル、ハロ、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、または保護されたヒドロキシル基であり；
Ｙ１が、独立して、Ｈまたは任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル（例えば、メチル）であり；
Ｚが存在せず；
Ｒ１が、保護ヒドロキシル（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ））であり；
Ｒ２が、−Ｎ（Ｒ３）Ｒ４または−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２（例えば、−Ｎ（ｉＰｒ）２）であり；
Ｒ３が、式（ＩＩａ）：
【化１９】
2017522046.tif 000020
の構造を有する基であり、
式中、Ａ１が、任意選択的に置換されるＮ、Ｏ、Ｓ、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；窒素、酸素から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；および窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキレンの１つまたは複数を含有するかまたはそれからなる結合またはリンカーであり、ただし、Ａ１が、アミノ、Ｏ、およびＳの１つまたは複数を含む場合、アミノ、Ｏ、およびＳのいずれもジスルフィドに直接結合せず；Ａ２が、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；および窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；またはＡ１およびＡ２が、−Ｓ−Ｓ−と一緒に結合して、任意選択的に置換される５〜１６員環を形成し；
Ａ３が、結合、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；Ｏ；任意選択的に置換されるＮ；およびＳからなる群から選択され；
Ａ４が、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；および窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；
Ｌが、結合、または１つまたは複数の共役部分を含むかまたはそれらからなる共役基であり；
Ｒ５が、水素、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、親水性官能基、または小分子、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、およびそれらの組合せからなる群から選択される補助部分を含む基であり；
ｒが、１〜１０の整数であり；
ここで、Ａ２、Ａ３、およびＡ４が結合して、−Ｓ−Ｓ−およびＸを連結する最も短い鎖内に少なくとも３個の原子を有する基を形成し；
各Ｒ４およびＲ６が、独立して、水素；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル；任意選択的に置換されるＣ２〜７アルカノイル；ヒドロキシル；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニル；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリール；任意選択的に置換されるＣ６〜１５アリーロイル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリル；および窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ３〜１０（複素環）オイルからなる群から選択される。
【０１８７】
本発明は、本明細書に開示される製造方法を用いることによって合成されるポリヌクレオチド構築物を処理するための方法をさらに提供する。例えば、ポリヌクレオチド構築物の合成後、核酸塩基が、１つまたは複数の保護基を含有する場合、保護基は除去されてもよく；および／または保護基によって保護される親水性官能基または共役部分を含有する任意の−Ｌ−Ａ１−Ｓ−Ｓ−Ａ２−Ａ３−Ａ４−の場合、保護基は除去されてもよい。
【０１８８】
さらに、ポリヌクレオチド構築物の合成後、小分子、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、およびエンドソームエスケープ部分の１つまたは複数を含有する基が、１つまたは複数の生物可逆的基の１つまたは複数の共役部分に連結され得る。
【０１８９】
ヌクレオチド
本発明は、単一のヌクレオチドを含有する化合物（「本発明の化合物」）を用いることができる。このような化合物は、式（ＶＩＩ）：
【化２０】
2017522046.tif 000021
で表される構造、またはその塩を有してもよく、
式中、
Ｂ１が核酸塩基であり；
Ｘが、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ４であり；
Ｙが、水素、ヒドロキシル、ハロ、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、または保護されたヒドロキシル基であり；
Ｙ１が、独立して、Ｈまたは任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル（例えば、メチル）であり；
Ｚが、存在しないか、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ１が、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、保護されたヒドロキシル基、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、および五リン酸塩、５’キャップ、ホスホチオール、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、アミノ含有基、ビオチン含有基、ジゴキシゲニン含有基、コレステロール含有基、色素含有基、クエンチャー含有基、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの任意の組合せであり；
Ｒ２が、Ｈ、ヒドロキシル、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ、保護されたヒドロキシル基、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩、およびアミノ、５’キャップ、ホスホチオール、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、アミノ含有基、ビオチン含有基、ジゴキシゲニン含有基、コレステロール含有基、色素含有基、クエンチャー含有基、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの任意の組合せであり；
Ｒ３が、式（ＶＩＩＩ）：
【化２１】
2017522046.tif 000022
の構造を有する基であり、
式中、
Ａ１が、任意選択的に置換されるＮ；Ｏ；Ｓ；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキレンのうちの１つまたは複数を含有するかまたはそれからなる結合またはリンカーであり、ただし、Ａ１が、任意選択的に置換されるＮ、Ｏ、およびＳのうちの１つまたは複数を含む場合、任意選択的に置換されるＮ、Ｏ、またはＳは、ジスルフィドに直接結合されず；Ａ２が、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；またはＡ１およびＡ２が、−Ｓ−Ｓ−と一緒に結合して、任意選択的に置換される５〜１６員環を形成し；
Ａ３が、結合、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；Ｏ；任意選択的に置換されるＮ；およびＳからなる群から選択され；
Ａ４が、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；およびＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；
Ｌが、存在しないか、または１つまたは複数の共役部分を含むかまたはそれらからなる共役基であり；
Ｒ５が、存在しないか、水素、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、親水性官能基、または小分子、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される補助部分を含む基であり、ここで、親水性官能基が、任意選択的に、保護基で保護され；
ｒが、１〜１０の整数であり；
ここで、Ａ２、Ａ３、およびＡ４が結合して、−Ｓ−Ｓ−Ａ１−Ｒ５および−Ｘ−を連結する最も短い鎖内に少なくとも３個の原子を有する基を形成し；
各Ｒ４およびＲ６が、独立して、水素；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル；任意選択的に置換されるＣ２〜７アルカノイル；ヒドロキシル；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニル；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリール；任意選択的に置換されるＣ６〜１５アリーロイル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリル；および窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ３〜１０（複素環）オイルからなる群から選択される。
【０１９０】
式（ＶＩＩ）の化合物の他の実施形態は、以下のものを含み：Ｚが存在せず；
Ａ１が、結合、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニレン；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；窒素、酸素から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキレン；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；および窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキレンからなる群から選択され；Ａ２が、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；および窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；またはＡ１およびＡ２が、−Ｓ−Ｓ−と一緒に結合して、任意選択的に置換される５〜１６員環を形成し；
Ａ３が、結合、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニレン；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリーレン、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリーレン；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレン；Ｏ；ＮＲ６；およびＳからなる群から選択され；
Ａ４が、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキレン；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキレン；および窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリレンからなる群から選択され；
Ｌが、結合、または１つまたは複数の共役部分を含むかまたはそれらからなる共役基であり；
Ｒ５が存在しないか、水素、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル、親水性官能基、または小分子、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、およびそれらの組合せからなる群から選択される補助部分を含む基であり；
ｒが、１〜１０の整数であり；
ここで、Ａ２、Ａ３、およびＡ４が結合して、−Ｓ−Ｓ−およびＸを連結する最も短い鎖内に少なくとも３個の原子を有する基を形成し；
各Ｒ４が、独立して、水素；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル；任意選択的に置換されるＣ２〜７アルカノイル；ヒドロキシル；任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシ；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニル；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリール；任意選択的に置換されるＣ６〜１５アリーロイル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ２〜９ヘテロシクリル；または窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ３〜１０（複素環）オイルである。
【０１９１】
式（ＶＩＩ）の化合物のさらに他の実施形態において、−Ａ１−Ｓ−Ｓ−Ａ２−Ａ３−Ａ４−または−Ｓ−Ｓ−Ａ２−Ａ３−Ａ４−基は、以下のもの：
【化２２】
2017522046.tif 000023
のうちの１つであり、
式中、
各Ｒ９が、独立して、ハロ、任意選択的に置換されるＣ１〜６アルキル；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルケニル；任意選択的に置換されるＣ２〜６アルキニル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されるＣ３〜８シクロアルケニル；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；任意選択的に置換される（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；任意選択的に置換されるＣ６〜１４アリール；任意選択的に置換される（Ｃ６〜１４アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロアリール；窒素、酸素から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換されるＣ１〜９ヘテロシクリル；窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する任意選択的に置換される（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；アミノ；または任意選択的に置換されるＣ１〜６アルコキシであり；または２つの隣接するＲ９基が、各Ｒ９が結合される原子と一緒に、結合して、Ｃ６アリール、Ｃ２〜５ヘテロシクリル、またはＣ２〜５ヘテロアリールからなる群から選択される環式基を形成し、ここで、環式基が、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換され；
ｑが、０、１、２、３、または４であり；
ｓが、０、１、または２である。
【０１９２】
さらに他の実施形態において、生物可逆的基は、以下の構造：
【化２３】
2017522046.tif 000024
のうちの１つを含有し、
式中、
各Ｒ７が、独立して、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；または−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）であり；または２つの隣接するＲ７基が、各Ｒ７が結合される原子と一緒に、結合して、Ｃ６アリール、Ｃ２〜５ヘテロシクリル、またはＣ２〜５ヘテロアリールからなる群から選択される環式基を形成し、ここで、環式基が、Ｃ２〜７アルカノイル；Ｃ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル；Ｃ２〜６アルキニル；Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；Ｃ６〜１０アリール；アミノ；（Ｃ６〜１０アリール）−
Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルキル；（Ｃ３〜８シクロアルキル）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜８シクロアルケニル；（Ｃ３〜８シクロアルケニル）−Ｃ１〜４−アルキル；ハロ；Ｃ１〜９ヘテロシクリル；Ｃ１〜９ヘテロアリール；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）オキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）アザ；ヒドロキシ；Ｃ１〜６チオアルコキシ；−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＡが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢＲＣ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＢおよびＲＣが、独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＤが、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥＲＦ（ここで、ｑが、０〜４の整数であり、ＲＥおよびＲＦのそれぞれが、独立して、水素、アルキル、アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）；チオール；アリールオキシ；シクロアルコキシ；アリールアルコキシ；（Ｃ１〜９ヘテロシクリル）−Ｃ１〜４−アルキル；（Ｃ１〜９ヘテロアリール）−Ｃ１〜４−アルキル；Ｃ３〜１２シリル；シアノ；および−Ｓ（Ｏ）ＲＨ（ここで、ＲＨが、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、および（Ｃ６〜１０アリール）−Ｃ１〜４−アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される１つ、２つ、または３つの置換基で任意選択的に置換され；
ｑが、０、１、２、３、または４であり；
ｓが、０、１、または２である。
【０１９３】
特定の実施形態において、補助部分は、共役基に見られる共役部分に対する１つまたは複数の共有結合を形成することによって、ジスルフィド結合を含有する基に結合され得る。
【０１９４】
コンジュゲート
本発明のヌクレオチド構築物は、１つまたは複数の共役部分を有する１つまたは複数の共役基を含有し得る。共役部分はまた、様々な他の補助部分、例えば、小分子、ポリペプチド、炭水化物、中性有機ポリマー、正荷電ポリマー、治療剤、標的化部分、エンドソームエスケープ部分、またはそれらの組合せを、ヌクレオチド構築物に結合するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、２種以上の共役部分が、ヌクレオチド構築物中に存在し、それによって、ヌクレオチド構築物に対する補助部分の選択的および／または連続的カップリングが可能になる。ポリヌクレオチド構築物における結合の位置は、ポリマーの合成における適切なヌクレオチド構築物の使用によって決定される。もう１つの共役部分を含有するヌクレオチド構築物が、適切な条件下で、補助部分における１つまたは複数の対応する共役部分と反応する。補助部分は、ペプチドまたはポリペプチド中に、共役部分、例えば、末端またはリジンアミン基およびチオール基を本質的に有してもよく、または共役部分を導入するために、小さい連結基を含むように修飾され得る。このような連結基の導入は、当該技術分野において周知である。本発明のヌクレオチド構築物に結合された補助部分が、任意の必要な連結基を含むことが理解されよう。
【０１９５】
多様な結合形成方法が、補助部分を本明細書に記載されるヌクレオチド構築物に結合するのに使用され得る。例示的な反応としては、トリアゾールを形成するためのアジドとアルキンとのヒュスゲン環状付加；ジエノフィルとジエン／ヘテロ−ジエンとのディールス・アルダー反応；エン反応などの他のペリ環状反応を介した結合形成；アミドまたはチオアミド結合形成；スルホンアミド結合形成；アルコールまたはフェノールアルキル化（例えば、ジアゾ化合物を用いる）、オキシム、ヒドラゾン、またはセミカルバジド基を形成するための縮合反応、求核剤（例えば、アミンおよびチオール）によるコンジュゲート付加反応、ジスルフィド結合形成、およびカルボン酸官能基における求核置換（例えば、アミン、チオール、またはヒドロキシル求核剤による）が挙げられる。結合形成の他の例示的な方法は、本明細書に記載され、当該技術分野において公知である。
【０１９６】
求核剤／求電子剤反応
求核剤および求電子剤は、限定はされないが、Ｃ−Ｈ結合への求電子剤による挿入、Ｏ−Ｈ結合への求電子剤による挿入、Ｎ−Ｈ結合への求電子剤による挿入、アルケンにわたる求電子剤の付加、アルキンにわたる求電子剤の付加、求電子性カルボニル中心への付加、求電子性カルボニル中心における置換、ケテンへの付加、イソシアネートへの求核付加、イソチオシアネートへの求核付加、活性化ケイ素中心における求核置換、ハロゲン化アルキルの求核置換、擬ハロゲン化アルキルにおける求核置換、活性化カルボニルにおける求核付加／脱離、α，β−不飽和カルボニルへの求核剤の１，４−コンジュゲート付加、エポキシドの求核開環、電子不足芳香族化合物の芳香族求核置換、活性化リン中心への求核付加、活性化リン中心における求核置換、活性化硫黄中心への求核付加、および活性化硫黄中心における求核置換から選択される結合形成反応に関与することができる。
【０１９７】
求核性共役部分は、任意選択的に置換されるアルケン、任意選択的に置換されるアルキン、任意選択的に置換されるアリール、任意選択的に置換されるヘテロシクリル、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基、およびチオ基から選択され得る。
【０１９８】
求電子性共役部分は、ニトレン、アジドなどのニトレン前駆体、カルベン、カルベン前駆体、活性化ケイ素中心、活性化カルボニル、無水物、イソシアネート、チオイソシアネート、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、マレイミド、ハロゲン化アルキル、擬ハロゲン化アルキル、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、電子不足アリール、活性化リン中心、および活性化硫黄中心から選択され得る。
【０１９９】
例えば、共役は、ヒドラゾン結合である結合を形成する縮合反応を介して起こり得る。
【０２００】
アミド結合の形成を介した共役は、カルボキシルベースの共役部分の活性化と、それに続く、第一級アミンベースの共役部分との反応によって媒介され得る。活性化剤は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＥＤＡＣ（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＣＭＣ（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）またはウッドワード試薬（Ｗｏｏｄｗａｒｄ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）Ｋ（Ｎ−エチル−３−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホネート）のような様々なカルボジイミドであり得る。第一級アミンベースの共役部分との活性化ＮＨＳ−エステルベースの共役部分の反応も、アミド結合の形成をもたらす。
【０２０１】
ヌクレオチド構築物は、カルボニルベースの共役部分を含有し得る。第二級アミンの形成による共役は、アミンベースの共役部分を、アルデヒドベースの共役部分と反応させた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのような水素化物供与体を用いて還元することによって行うことができる。アルデヒドベースの共役部分は、例えば、糖部分の酸化またはＳＦＢ（スクシンイミジル−ｐ−ホルミルベンゾエート）もしくはＳＦＰＡ（スクシンイミジル−ｐ−ホルミルフェノキシアセテート）との反応によって導入され得る。
【０２０２】
エーテル形成はまた、補助部分を本発明のヌクレオチド構築物と共役させるのに使用され得る。エーテル結合を介した共役は、エポキシドベースの共役部分と、ヒドロキシベースの共役部分との反応によって媒介され得る。
【０２０３】
チオールはまた、共役部分として使用され得る。例えば、ジスルフィド結合の形成を介した共役は、ピリジルジスルフィドに媒介されるチオール−ジスルフィド交換によって行うことができる。スルフヒドリルベースの共役部分の導入は、例えば、トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（２−イミノチオラン）ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート、ＳＡＴＰ（スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、ＳＡＭＳＡ（Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物）、ＡＭＢＨ（２−アセドアミド−４−メルカプト酪酸ヒドラジド）、およびシスタミン（２，２’−ジチオビス（エチルアミン）によって媒介される。
【０２０４】
チオエーテル結合の形成を介した共役は、スルフヒドリルベースの共役部分を、マレイミド−またはヨードアセチルベースの共役部分と反応させることによって、またはエポキシドベースの共役部分と反応させることによって行うことができる。マレイミドベースの共役部分は、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−スルホヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＧＭＢＳ（Ｎ−α−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル）、スルホＧＭＢＳ（Ｎ−α−マレイミドブチリル−オキシスルホスクシンイミドエステル）によって導入することができる。
【０２０５】
チオールベースの共役部分は、ヨードアセチルベースの共役部分とも反応することができる。ヨードアセチルベースの共役部分は、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スルホＳＩＡＢ（スルホ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエート）、ＳＩＡＸ（スクシンイミジル６−［（ヨードアセチル−アミノ］ヘキサノエート）、ＳＩＡＸＸ（スクシンイミジル６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）−ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート）、ＳＩＡＣ（スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＩＡＣＸ（スクシンイミジル６−（（（（４−（ヨードアセチル）アミノ）メチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサノエート）、およびＮＰＩＡ（ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート）とともに挿入され得る。
【０２０６】
カルバメート結合の形成を介した共役は、ヒドロキシベースの共役部分と、ＣＤＩ（Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール）またはＤＳＣ（Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメートとの反応と、それに続く、アミンベースの共役部分との反応によって行うことができる。
【０２０７】
光溶解性および熱分解性共役
あるいは、共役部分は、所望の共有結合を形成するために、光分解または熱分解活性化を用いることができる。アジド官能基を含む共役部分が一例である。したがって、共役は、光反応性共役部分の導入によって行うこともできる。光反応性共役部分は、アリールアジド、ハロゲン化アリールアジド、ベンゾフェノン、特定のジアゾ化合物およびジアジリン誘導体である。それらは、アミノベースの共役部分または活性化水素結合を有する共役部分と反応する。
【０２０８】
アジドベースの共役部分は、ＵＶ不安定性であり、光分解の際に、アリールベースの共役部分またはアルケニルベースの共役部分などの求核性共役部分と反応し得るニトレン求電子剤の形成をもたらし得る。あるいは、これらのアジド化合物の加熱も、ニトレン形成をもたらし得る。
【０２０９】
環状付加反応
環状付加反応は、所望の共有結合を形成するのに使用され得る。代表的な環状付加反応としては、限定はされないが、アルケンベースの共役部分と、１，３−ジエンベースの共役部分との反応（ディールス・アルダー反応）、アルケンベースの共役部分と、α，β−不飽和カルボニルベースの共役部分との反応（ヘテロディールス・アルダー反応）、およびアルキンベースの共役部分と、アジドベースの共役部分との反応（ヒュスゲン環状付加）が挙げられる。環状付加反応のための反応剤を含む共役部分の選択される非限定的な例は、アルケン、アルキン、１，３−ジエン、α，β−不飽和カルボニル、およびアジドである。例えば、アジドとアルキンとのヒュスゲン環状付加（クリック反応）は、多様な生物学的実体の官能化のために使用されている。
【０２１０】
カップリング反応
共役部分は、限定はされないが、ヒドロシリル化のための反応剤、オレフィン交差メタセシス、コンジュゲート付加、スティルカップリング、鈴木カップリング、薗頭カップリング、檜山カップリング、およびヘック反応も含む。これらの反応のための共役部分としては、ヒドリドシラン、アルケン（例えば、エノンまたはエノエートなどの活性化アルケン）、アルキン、ハロゲン化アリール、擬ハロゲン化アリール（例えば、トリフレートまたはノナフレート）、ハロゲン化アルキル、および擬ハロゲン化アルキル（例えば、トリフレート、ノナフレート、およびホスフェート）が挙げられる。クロスカップリング反応のための触媒は、当該技術分野において周知である。このような触媒は、有機金属錯体または金属塩（例えば、Ｐｄ（０）、Ｐｄ（ＩＩ）、Ｐｔ（０）、Ｐｔ（ＩＩ）、Ｐｔ（ＩＶ）、Ｃｕ（Ｉ）、またはＲｕ（ＩＩ））であり得る。リガンド（例えば、ＰＰｈ３、ＰＣｙ３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ＳＩＭｅｓ、またはＳＩＰｒ）および金属塩（例えば、ＬｉＣｌ）などの添加剤が、クロスカップリング反応を促進するのに加えられてもよい。
【０２１１】
共役のための補助部分
様々な補助部分が、本発明のヌクレオチド構築物（例えば、ｓｉＲＮＡ）に共役され得、補助部分はいくつもの生物学的または化学的効果を有し得る。生物学的効果としては、限定はされないが、細胞内在化（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）の誘導、細胞表面への結合、特定の細胞型の標的化、エンドソームエスケープの許容、インビボでのポリヌクレオチドの半減期の改変、および治療効果の付与が挙げられる。化学的効果としては、限定はされないが、溶解度、溶解、および反応性の変化が挙げられる。
【０２１２】
小分子
小分子ベースの補助部分（例えば、約１０００Ｄａ以下の分子量を有する有機化合物）は、本発明のヌクレオチド構築物に共役され得る。このような小分子の例としては、限定はされないが、置換もしくは非置換アルカン、アルケン、またはアルキン、例えば、ヒドロキシ−置換、ＮＨ２−置換、モノ−、ジ−、もしくはトリアルキルアミノ置換、グアニジノ置換、ヘテロシクリル置換、およびそれらの保護形態が挙げられる。他の小分子としては、ステロイド（例えば、コレステロール）、他の脂質、胆汁酸、およびアミノ酸が挙げられる。中性もしくは正電荷を与えるために、またはポリヌクレオチドの親水性または疎水性を改変するために、小分子が、ポリヌクレオチドに加えられてもよい。
【０２１３】
ポリペプチド
ポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）は、モノマーがアミド結合によって一緒に結合されたアミノ酸残基であるポリマーを指す。アミノ酸が、α−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれも使用され得る。ポリペプチドは、アミノ酸配列を包含し、糖タンパク質、レトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ポリペプチド、Ｄ−アミノ酸など修飾配列を含む。ポリペプチドは、天然タンパク質、ならびに組み換えまたは合成により合成されたものを含む。ポリペプチドは、ポリペプチドの特定の断片または部分に起因し得る機能を有する２つ以上のドメインを含み得る。あるドメインは、例えば、少なくとも１つの有用なエピトープまたは機能ドメインを示すポリペプチドの一部を含む。２つ以上のドメインが、各ドメインがその機能を保持するが、単一のペプチドまたはポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）を含むように機能的に連結され得る。例えば、ＰＴＤの機能性断片は、形質導入活性を保持する断片を含む。生物学的に機能性の断片は、例えば、抗体分子に結合することができるエピトープ程度の小さい断片から、細胞内の表現型変化の特徴的誘導またはプログラミングに関与することができる大きいポリペプチドまでサイズが変動し得る。
【０２１４】
ある実施形態において、レトロ−インベルソポリペプチドが使用される。「レトロ−インベルソ」は、１つまたは複数のアミノ酸におけるアミノ−カルボキシ反転ならびにエナンチオマー変化（すなわち、左旋性（Ｌ）から右旋性（Ｄ）への変化）を意味する。本発明のポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列のアミノ−カルボキシ反転、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含有するアミノ−カルボキシ反転、および１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含有する非反転配列を包含する。安定し、生物活性を保持するレトロ−インベルソペプチド模倣薬が、Ｂｒｕｇｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１４（２）：６８５−６９３，１９９５）およびＣｈｏｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（１０）：４３８−４４５，１９９５）によって記載されているように、考案され得る。レトロ−インベルソポリペプチドの全体的な構造的特徴は、親Ｌ−ポリペプチドのものと類似している。しかしながら、これらの２つの分子は、キラル二次構造要素を本質的に共有するため、ほぼ鏡像である。ペプチド結合逆転およびキラリティーの反転に基づく主鎖ペプチド模倣薬は、ペプチドおよびタンパク質についての重要な構造的変化を表し、生物工学にとって非常に有意義である。抗原性および免疫原性は、天然の抗原ペプチドおよびポリペプチドの全ての−Ｄ−およびレトロ−インベルソ−異性体などの代謝的に安定した抗原によって達成され得る。いくつかのＰＴＤ由来のペプチド模倣薬が、本明細書に示される。
【０２１５】
ポリペプチドおよび断片は、天然由来のポリペプチドまたはドメインと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を有し得る。「実質的に同一」は、アミノ酸配列が、完全にではないが、ほぼ同じであるが、それが関連する配列の機能的活性を保持することを意味する。機能的活性の一例は、断片が、形質導入が可能であるか、またはＲＮＡに結合することが可能であることである。例えば、形質導入活性を有する完全長ＴＡＴの断片が本明細書に記載されている。一般に、２つのペプチド、ポリペプチドまたはドメインは、それらの配列が少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である場合、または配列中に保存的変異がある場合、「実質的に同一」である。ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）などのコンピュータプログラムが、配列同一性を比較するのに使用され得る。
【０２１６】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわち、ペプチド等電子体によって互いに結合されたアミノ酸から構成することができ、２０遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当該技術分野において周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾され得る。このような修飾は、基本的なテキストおよびより詳細な研究論文、ならびに大量の研究文献に十分に記載されている。修飾は、骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのいずれの場所で行うこともできる。同じタイプの修飾が、所与のペプチドまたはポリペプチドにおけるいくつかの部位において同じかまたは様々な程度で存在し得ることが理解されよう。また、所与のポリペプチドが、多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、分岐を有するかまたは有さない、環状であってもよい。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスによって生じるものであってもよく、または合成方法によって作製され得る。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加（アルギニル化など）、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照）。
【０２１７】
本発明のポリペプチドドメインまたは融合ポリペプチドは、α−アミノ基のｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護を含むものなどの一般的に使用される方法によって合成され得る。いずれの方法も、単一のアミノ酸が、ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端から開始する各工程で加えられる段階的合成を含む（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，Ｕｎｉｔ  ９を参照）。本発明のポリペプチドは、ポリマーのｇ当たり０．１〜１．０ｍＭｏｌのアミンを含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いて、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９，１９６２；およびＳｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９、ｐｐ．２７−６２に記載されているものなどの周知の固相ペプチド合成方法によって合成することもできる。化学合成の完了時に、ポリペプチドは、脱保護され、０℃で約１／４〜１時間にわたって液体のＨＦ−１０％のアニソールによる処理によってポリマーから切断され得る。試薬の蒸発の後、ポリペプチドは、１％の酢酸溶液でポリマーから抽出され、次に、それが、凍結乾燥されて、粗材料が得られる。ポリペプチドは、溶媒として５％の酢酸を用いたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５におけるゲルろ過などの技術によって精製され得る。カラム溶出液の適切な画分の凍結乾燥により、均質なペプチドまたはポリペプチドが得られ、次に、それが、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル旋光度、または溶解度測定などの標準的な技術によって特性評価され得る。必要に応じて、ポリペプチドは、固相エドマン分解によって定量され得る。
【０２１８】
炭水化物
本発明のヌクレオチド構築物に結合され得る炭水化物ベースの補助部分は、単糖、二糖、および多糖を含む。例としては、アロース、アルトロース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリトルロース、フルクトース、Ｄ−フシトール、Ｌ−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトサミニトール、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−６−リン酸グロースグリセルアルデヒド、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノス−ヘプロース、グリセロール、グリセロン、グロースイドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−６−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロースおよびキシルロースが挙げられる。単糖は、Ｄ−またはＬ−立体配置であり得る。単糖はさらに、デオキシ糖（アルコールのヒドロキシ基が、水素で置換される）、アミノ糖（アルコールのヒドロキシ基が、アミノ基で置換される）、チオ糖（アルコールのヒドロキシ基が、チオールで置換されるか、またはＣ＝Ｏが、Ｃ＝Ｓで置換されるか、または環状形態の環酸素が、硫黄で置換される）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素が、窒素で置換される）、イミノ糖（環酸素が、窒素で置換される）、ホスファノ糖（環酸素が、リンで置換される）、ホスファ糖（環炭素が、リンで置換される）、Ｃ−置換単糖（非末端炭素原子における水素が、炭素で置換される）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基が、ＣＨＯＨ基で置換される、例えば、グルシトール）、アルドン酸（アルデヒド基が、カルボキシ基で置換される）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などであり得る。アミノ糖としては、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコスミン、キナボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、ホロサミン、ガロサミン、カノサミン、カノサミン、ミカミノース、ミオサミン、ペルソサミン、プノイモサミン、プルプロサミン、ロードスミンなどのアミノ単糖が挙げられる。単糖などがさらに置換され得ることが理解される。二糖および多糖としては、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、チャコトリオース、チャルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコースジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース、フルクトオリゴ糖、ガラクト−オリゴ糖、ゲンチアノース、ゲニチオビオース、グルカン、グルイコーゲン（ｇｌｕｉｃｏｇｅｎ）、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトース、マルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレジトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ミゲロース、ノジリマイコン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロドン、ルチノース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソフォロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α−トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロースなどが挙げられる。炭水化物は、本発明のポリヌクレオチド構築物において１つまたは複数の機能を果たすことができ、例えば、炭水化物は、標的化部分（例えば、マンノース）であり得、または水性媒体へのポリヌクレオチド構築物の溶解度を高めることができる（例えば、グルシトール）。
【０２１９】
ポリマー
本明細書に記載されるヌクレオチド構築物は、共有結合された中性または荷電（例えば、カチオン性）ポリマーベースの補助部分も含み得る。正荷電ポリマーの例としては、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、スペルミン、スペルミジン、およびポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）が挙げられる。中性ポリマーとしては、ポリ（Ｃ１〜６アルキレンオキシド）、例えば、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）ならびにそれらのコポリマー、例えば、ジ−およびトリブロックコポリマーが挙げられる。ポリマーの他の例としては、エステル化ポリ（アクリル酸）、エステル化ポリ（グルタミン酸）、エステル化ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（アルキルアクリレート）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（カプロラクトン）、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、ポリホスファジンおよびポリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド）が挙げられる。例示的なポリマー補助部分は、１００、３００、５００、１０００、または５０００未満の分子量を有してもよい。他のポリマーは、当該技術分野において公知である。
【０２２０】
治療剤
診断／イメージング剤を含む治療剤は、補助部分として、本発明のヌクレオチド構築物に共有結合され得るか、または本明細書に記載されるように、共同療法（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）として投与され得る。それらは、天然化合物、合成有機化合物、または無機化合物であり得る。例示的な治療剤としては、限定はされないが、抗生物質、抗増殖剤、ラパマイシンマクロライド、鎮痛薬、麻酔薬、血管新生抑制剤、血管作用剤、抗凝固剤、免疫調節剤、細胞毒性薬、抗ウイルス剤、抗血栓薬、抗体、神経伝達物質、精神作用薬、およびそれらの組合せが挙げられる。治療剤のさらなる例としては、限定はされないが、細胞周期制御剤；サイクリンタンパク質産生を阻害する薬剤；インターロイキン１〜１３および腫瘍壊死因子を含むがこれらに限定されないサイトカイン；抗凝固剤、抗血小板剤；ＴＮＦ受容体ドメインなどが挙げられる。典型的に、治療剤は、中性または正荷電である。場合によっては、治療剤が負荷電である場合、さらなる電荷中和部分（例えば、カチオン性ペプチド）が使用され得る。
【０２２１】
治療薬部分は、補助部分として、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に連結されて、診断アッセイ／イメージングを可能にし得る。このような部分の例としては、限定はされないが、同位体、放射性イメージング剤、マーカー、トレーサ、蛍光標識（例えば、ローダミン）、およびレポーター分子（例えば、ビオチン）などの検出可能な標識が挙げられる。
【０２２２】
例示的な診断薬としては、限定はされないが、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）、単一光子放射断層撮影、Ｘ線、蛍光透視法、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に使用されるものなどのイメージング剤が挙げられる。ＭＲＩにおける造影剤として使用するのに好適な材料としては、限定はされないが、ガドリニウムキレート、ならびに鉄、マグネシウム、マンガン、銅、およびクロムキレートが挙げられる。ＣＡＴおよびＸ線に有用な材料の例としては、限定はされないが、ヨウ素系材料が挙げられる。
【０２２３】
好適であり得る放射線を放出する放射性イメージング剤（検出可能な放射性標識）の例は、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、または低線量ヨウ素−１３１によって例示される。補助部分として、本発明のヌクレオチド構築物とともに使用するためのまたはこれに結合される検出可能な標識、またはマーカーは、放射性標識、蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、発色団標識、ＰＥＴスキャナー用の陽電子放出同位体、化学発光標識、または酵素標識であってもよい。蛍光標識としては、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フルオレセイン、およびローダミンが挙げられる。標識は、例えば限定はされないが、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３および−１３１、タリウム−２０１、ガリウム−６７、フッ素−１８、インジウム−１１１などの例えば医療用同位体であり得る。
【０２２４】
当該技術分野において公知の他の治療剤が同様に、補助部分として、本発明のヌクレオチド構築物とともに使用されるか、またはこれに結合され得る。
【０２２５】
標的化部分
本発明は、補助部分として、例えば、標的化補助部分として、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に結合され得る１つまたは複数の標的化部分を提供する。標的化部分（例えば、細胞外標的化部分）は、本発明の構築物を、選択された標的化部分についての対応する結合パートナー（例えば、対応する受容体またはリガンド）を発現する所望のまたは選択された細胞集団に標的化させるその能力に基づいて選択される。例えば、本発明の構築物は、標的化部分として選択された上皮増殖因子（ＥＧＦ）によって上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する細胞に標的化され得る。あるいは、標的化部分（例えば、細胞内標的化部分）は、本発明の構築物を、細胞内の所望の部位（例えば、小胞体、ゴルジ体、核、またはミトコンドリア）に標的化させることができる。細胞内標的化部分の非限定的な例としては、表３の化合物Ｐ３８およびＰ３９ならびにそのペプチド断片（すなわち、それぞれ、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＦＳＳＡＹＳ（配列番号５６）およびＭＩＲＴＬＬＬＳＴＬＶＡＧＡＬＳ（配列番号５７））が挙げられる。
【０２２６】
したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物は、細胞内標的化部分、細胞外標的化部分、およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の標的化部分を含み得る。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物に、１つまたは複数の細胞外標的化部分（例えば、葉酸塩、マンノース、ガラクトサミン（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）、および前立腺特異的膜抗原からなる群から独立して選択される各細胞外標的化部分）ならびに１つまたは複数の細胞内標的化部分（例えば、小胞体、ゴルジ体、核、もしくはミトコンドリアを標的にする部分）を含めることにより、特定の細胞集団内の特定の部位へのポリヌクレオチドの送達を促進することができる。ある実施形態において、標的化部分は、１つまたは複数のマンノース炭水化物を含有する。マンノースは、類洞肝細胞および抗原提示細胞（例えば、マクロファージおよび樹枝状細胞）内で発現される１７５  ＫＤａ膜結合受容体であるマンノース受容体を標的にする。それは、マンノシル化された病原体およびタンパク質に結合し、それを内在化する非常に有効なエンドサイトーシス／リサイクリング受容体である（Ｌｅｎｎａｒｔｚ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９９４２−９９４４，１９８７；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２１５６−６２，１９９０）。
【０２２７】
本発明の細胞外標的化部分のいくつかが、本明細書に記載される。一実施形態において、標的化部分は、受容体結合ドメインである。別の実施形態において、標的化部分は、インスリン、インスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦ１Ｒ）、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ；例えば、ＩＧＦ  １または２）、上皮間葉転換因子受容体（ｃ−ｍｅｔ；肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）としても知られている）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、葉酸塩受容体（ＦＯＬＲ）、葉酸塩、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、メソテリン、Ｆｃ受容体、ｃ−ｋｉｔ受容体、ｃ−ｋｉｔ、インテグリン（例えば、α４インテグリンまたはβ−１インテグリン）、Ｐ−セレクチン、スフィンゴシン−１−リン酸受容体−１（Ｓ１ＰＲ）、ヒアルロン酸受容体、白血球機能抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８５、ＣＤ９５（Ｆａｓ受容体）、ＣＤ１０６（血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、ＣＤ１６６（活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ））、ＣＤ１７８（Ｆａｓリガンド）、ＣＤ２５３（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ））、ＩＣＯＳリガンド、ＣＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＸＣＬ１２（間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１））、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＣＴＬＡ−４、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−１、エフリン（Ｅｐｈ）受容体、エフリン細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ−１）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＴＡＧ−７２抗原、およびこれらの断片を含む群から選択されるタンパク質であるか、またはそれに特異的に結合する。さらなる実施形態において、標的化部分は、赤芽球性白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ（ＥｒｂＢ）受容体（例えば、ＥｒｂＢ１受容体；ＥｒｂＢ２受容体；ＥｒｂＢ３受容体；およびＥｒｂＢ４受容体）である。他の実施形態において、標的化部分は、アシアロ糖タンパク質受容体、マンノ受容体、または葉酸塩受容体に選択的に結合し得る。特定の実施形態において、標的化部分は、１つまたは複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、マンノース、または葉酸塩リガンドを含有する。いくつかの実施形態において、葉酸塩リガンドは、構造：
【化２４】
2017522046.tif 000025
を有する。
【０２２８】
標的化部分はまた、ボンベシン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどの腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、およびワクシニアウイルス増殖因子（ＶＶＧＦ）から選択され得る。非ペプチジルリガンドは、標的化部分として使用することもでき、例えば、ステロイド、炭水化物、ビタミン、およびレクチンを含み得る。標的化部分はまた、ソマトスタチン（例えば、コア配列シクロ［Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ］（配列番号１０３）を有するソマトスタチン、ここで、例えば、ソマトスタチン類似体のＣ末端がＴｈｒ−ＮＨ２である）、ソマトスタチン類似体（例えば、オクトレオチドおよびランレオチド）、ボンベシン、ボンベシン類似体などのポリペプチド、またはモノクローナル抗体などの抗体から選択され得る。
【０２２９】
本発明のヌクレオチド構築物において標的化補助部分として使用するための他のペプチドまたはポリペプチドは、ＫｉＳＳペプチドおよび類似体、ウロテンシンＩＩペプチドおよび類似体、ＧｎＲＨ  ＩおよびＩＩペプチドおよび類似体、デプレオチド、バプレオチド、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ＲＧＤ含有ペプチド、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）ペプチド、ニューロテンシン、カルシトニン、抗腫瘍抗体の相補性決定領域由来のペプチド、グルタチオン、ＹＩＧＳＲ（配列番号１０４）（白血球結合（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ａｖｉｄ）ペプチド、例えば、血小板因子−４（ＰＦ−４）のヘパリン結合領域およびリジンリッチ配列を含むＰ４８３Ｈ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、β−アミロイドペプチド、δ−オピオイドアンタゴニスト（ＩＴＩＰＰ（ｐｓｉ）など）、アネキシン−Ｖ、エンドセリン、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、走化性ペプチド（例えば、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン−リジン（ｆＭＬＦＫ；配列番号１０５）、ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニスト（例えば、ＤＭＰ４４４）、ヒト好中球エラスターゼ阻害剤（ＥＰＩ−ＨＮＥ−２およびＥＰＩ−ＨＮＥ−４）、プラスミン阻害剤、抗微生物ペプチド、アプチシド（ａｐｔｉｃｉｄｅ）（Ｐ２８０およびＰ２７４）、トロンボスポンジン受容体（ＴＰ−１３００などの類似体を含む）、ビチスタチン、下垂体アデニリルシクラーゼＩ型受容体（ＰＡＣ１）、フィブリンα鎖、ファージディスプレイライブラリ由来のペプチド（例えば、配列番号１３および１４）、およびそれらの保存的置換物から選択され得る。
【０２３０】
本発明のヌクレオチド構築物において、標的化部分として使用するための免疫反応性リガンドは、抗原認識免疫グロブリン（「抗体」とも呼ばれる）、またはその抗原認識断片を含む。本明細書において使用される際、「免疫グロブリン」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどの、免疫グロブリンの任意の認識されたクラスまたはサブクラスを指す。典型的なものは、免疫グロブリンのＩｇＧクラスに含まれる免疫グロブリンである。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。しかしながら、典型的に、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、またはウサギ由来のものである。さらに、免疫グロブリンは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、典型的にモノクローナルである。
【０２３１】
本発明の標的化部分は、抗原認識免疫グロブリン断片を含み得る。このような免疫グロブリン断片は、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＦａｂ断片、単一ドメイン抗体、ＳｃＦｖ、または他の抗原認識免疫グロブリン断片を含み得る。また、Ｆｃ断片は、標的化部分として用いられてもよい。このような免疫グロブリン断片は、例えば、タンパク質分解酵素消化、例えば、ペプシンもしくはパパイン消化、還元的アルキル化、または組み換え技術によって調製され得る。このような免疫グロブリン断片を調製するための材料および方法は、当業者に周知である。Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３１，２８９５，１９８３；Ｌａｍｏｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，５６，２３５，１９８３を参照されたい。
【０２３２】
本発明の標的化部分は、当該技術分野において公知であるが、本開示に具体例として示されていない標的化部分を含む。
【０２３３】
エンドソームエスケープ
本発明は、補助部分として、例えば、エンドソームエスケープ補助部分として、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に結合され得る１つまたは複数のエンドソームエスケープ部分を提供する。例示的なエンドソームエスケープ部分としては、化学療法薬（例えば、クロロキンなどのキノロン）；融合性脂質（例えば、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ））；およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー；ポリ（β−アミノエステル）；ポリアルギニン（例えば、オクタアルギニン）およびポリリジン（例えば、オクタリジン）などのペプチドまたはポリペプチド；プロトンスポンジ、ウイルスキャプシド、および本明細書に記載されるペプチド形質導入ドメインが挙げられる。例えば、融合性ペプチドは、インフルエンザＡウイルスのＭ２タンパク質；インフルエンザウイルス赤血球凝集素のペプチド類似体；インフルエンザＣウイルスのＨＥＦタンパク質；フィロウイルスの膜貫通糖タンパク質；狂犬病ウイルスの膜貫通糖タンパク質；水疱性口内炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質（Ｇ）；センダイウイルスの融合タンパク質；セムリキ森林熱ウイルスの膜貫通糖タンパク質；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質；麻疹ウイルスの融合タンパク質；ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質；ビスナウイルスの融合タンパク質；マウス白血病ウイルスの融合タンパク質；ＨＴＬウイルスの融合タンパク質；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の融合タンパク質に由来し得る。エンドソームエスケープを促進するのに用いられ得る他の部分は、Ｄｏｍｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２３（８）：１１８３−１１８９，２０１０に記載されている。例示的なエンドソームエスケープ部分が、実施例１の表３に示される。
【０２３４】
送達ドメイン
本発明は、補助部分として、例えば、送達ドメイン補助部分として、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に結合され得る１つまたは複数の送達ドメイン部分を提供する。送達ドメインは、任意の機構によって、細胞への本発明のポリヌクレオチドの輸送を誘導する部分である。典型的に、本発明のヌクレオチド構築物は、マクロピノサイトーシス、食作用、またはエンドサイトーシス（例えば、クラスリン媒介性エンドサイトーシス、カベオラ媒介性エンドサイトーシス、および脂質ラフト依存性エンドサイトーシス）によって内在化される（例えば、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１１，４０，２３３−２４５を参照）。送達ドメインは、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、ペプチド形質導入ドメイン）、炭水化物（ヒアルロン酸）、および本明細書に記載される正荷電ポリマー（ポリ（エチレンイミン）を含み得る。
【０２３５】
ペプチド形質導入ドメイン
細胞送達は、ＴＡＴ（配列番号１）またはＡｒｇ８（配列番号２）（Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２，４３−５１）などのカチオン性ペプチド形質導入ドメイン（ＰＴＤ；細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）とも呼ばれる）への、「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」生物剤（この場合、ポリヌクレオチド）の高分子融合によって行うことができる。ＰＴＤは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む多種多様な高分子カーゴを送達するのに使用され得る（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，１５６９−１５７２；Ｅｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２６２０４−２６２１０；およびＫｏｐｐｅｌｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２，５１−６３）。カチオン性ＰＴＤは、マクロピノサイトーシス、すなわち、全ての細胞が行う流体相取込みの特殊化形態によって細胞に侵入する。
【０２３６】
モデル小胞体に関する生物物理学的研究は、カーゴが、マクロピノソーム小胞体から細胞質へと脱出し、したがって、ｐＨ低下が必要であることを示唆している（Ｍａｇｚｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，１４８９０−１４８９７）。ＰＴＤのカチオン電荷は、分子が細胞膜を通過するのに不可欠である。当然ながら、アニオン性ｓｉＲＮＡ（約４０の負電荷）とのカチオン性ＰＴＤ（６〜８の正電荷）の共役は、電荷中和およびＰＴＤの不活性化を引き起こし、ｓｉＲＮＡが細胞に侵入しなくなる（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．，３８（１）：１−７，２００７）。しかしながら、本明細書に記載されるヌクレオチド構築物（例えば、アニオン性ＲＮＡまたはＤＮＡ）とのカチオン性ＰＴＤの化学的共役では、ヌクレオチド構築物が、細胞によって取り込まれることがまだ可能であり、したがって、本明細書に開示される新規かつ非自明のヌクレオチド構築物では、他の類似の方法で見られる電荷中和の有害な影響がない。さらに、これらのＰＴＤの切断により、細胞内で、ポリヌクレオチドを、標的細胞に不可逆的に送達させることができる。
【０２３７】
真核細胞の原形質膜を効率的に通過することができるいくつかのタンパク質の発見が、ペプチド形質導入ドメインが由来するタンパク質のクラスの同定につながった。これらのタンパク質のうちで最良の特性評価をされるのは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオタンパク質であるアンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）（Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．３：１１２１−３４，１９９１；Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８６４−８，１９９１；Ｌｅ  Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：９１２０−４，１９９３）、単純ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３−３３，１９９７）、ＨＩＶ−１転写活性化因子ＴＡＴタンパク質（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９−１１８８，１９８８；Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９−１１９３，１９８８）、およびより最近ではプリオンタンパク質のカチオン性Ｎ末端ドメインである。例示的なＰＴＤ配列は、表１に示される。本発明は、補助部分として、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に共役されるべき、表１に列挙されるＰＴＤまたは当該技術分野において公知の他のＰＴＤの１つまたは複数をさらに提供する（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６（３）：１８９−１９６，２００４を参照）。共役のための手法は、細胞内酵素の作用によって切断され得る官能基を含む二官能性リンカーの使用を含む。
【０２３８】
【表１】
2017522046.tif 000026
【０２３９】
本明細書に記載されるヌクレオチド構築物のいずれかに共役され得るＴＡＴペプチドを含む例示的な補助部分が、表２に示される。
【０２４０】
【表２】
2017522046.tif 000027
【０２４１】
特定の実施形態において、表２に記載される補助部分は、Ｎ’末端にＺ’に対する共有結合を含み、ここで、Ｚ’が、アルデヒドに対するポリペプチドＲＺの６−ヒドラジノニコチン酸（ＨｙＮｉｃ）またはアミノ基の共役の残基である。
【０２４２】
さらなる例示的なカチオン性ＰＴＤ（ＣＰＰ）配列が、表３に示される。
【０２４３】
したがって、本発明のヌクレオチド構築物に共役され得るＰＴＤとしては、限定はされないが、ＡｎｔＨＤ、ＴＡＴ、ＶＰ２２、カチオン性プリオンタンパク質ドメイン、およびそれらの機能性断片が挙げられる。これらのペプチドが、細胞膜を通過することができるだけでなく、酵素β−ガラクトシダーゼなどの他のペプチドまたはポリペプチドの結合も、これらの複合体の細胞の取込みを刺激するのに十分である。このようなキメラタンパク質は、細胞質および核内に生物学的に活性な形態で存在する。このプロセスの特性評価は、これらの融合ポリペプチドの取込みが迅速であり、受容体とは無関係に、数分以内に起こることが多いことを示した。さらに、これらのタンパク質の形質導入は、細胞型に影響されないものと思われ、これらのタンパク質は、明らかな毒性なしに培養物中の約１００％の細胞を効率的に形質導入することができる（Ｎａｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２，１９９８）。完全長タンパク質に加えて、ペプチド形質導入ドメインを用いて、ＤＮＡ（Ａｂｕ−Ａｍｅｒ、前掲）、アンチセンスポリヌクレオチド（Ａｓｔｒｉａｂ−Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ，１９：７４４−５４，２００２）、小分子（Ｐｏｌｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１１：７６２−７１，２０００）およびさらには無機４０ｎｍの鉄粒子（Ｄｏｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５６：８９−１０５，２００１；Ｗｕｎｄｅｒｂａｌｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１３：２６４−８，２００２；Ｌｅｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４１０−４，２０００；Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．，Ｃｈｅｍ．１０：１８６−９１，１９９９）の細胞内取込みを誘導するのにも成功しており、このことは、このプロセスにおいて粒度のかなりの順応性があることを示唆している。
【０２４４】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、構築物の標的細胞内への標的化取込みおよび／または放出を促進するために、ＴＡＴおよびｐｏｌｙ−ＡｒｇなどのＰＴＤの使用を、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物と組み合わせる方法および組成物を提供する。したがって、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物は、補助部分として連結される治療または診断薬を、補助部分として連結される１つまたは複数のＰＴＤをさらに含むヌクレオチド構築物によって特定の細胞内に送達されるように標的化することができる方法を提供する。
【０２４５】
本発明のヌクレオチド構築物は、それ自体が治療または診断利益を提供するｓｉＲＮＡまたは他の阻害性核酸配列であり得る。しかしながら、場合によっては、治療薬としてさらなる補助部分を結合するかまたは取込みを促進することが望ましいことがある。ＰＴＤの場合、ＰＴＤは、さらなる電荷修飾部分として働いて、ヌクレオチド構築物上の電荷を中和するか、または典型的に、わずかな正味カチオン電荷をヌクレオチド構築物に与えることによって、ヌクレオチド構築物の取込みを促進する。ヌクレオチド構築物が、限定はされないが、標的化部分、生物学的に活性な分子、治療薬、小分子（例えば、細胞傷害剤）などの他の補助部分を含み得ることがさらに理解されよう。このような場合、このような補助部分を有するヌクレオチド構築物が、補助部分のサイズおよび電荷に応じて、中性荷電またはカチオン性荷電であり得る。補助部分がアニオン性荷電である場合、カチオン性荷電ペプチド（例えば、ＰＴＤ）の添加は、電荷をさらに中和するかまたは構築物の正味カチオン電荷を向上させることができる。
【０２４６】
一般に、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に連結される送達ドメインは、標的細胞への本明細書に開示される核酸構築物（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の細胞内送達に役立つほぼ全ての合成または天然アミノ酸配列であり得る。例えば、トランスフェクションは、本発明のヌクレオチド構築物の共役部分に共有結合される、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質またはその断片などのペプチド形質導入ドメインの使用によって、本発明にしたがって行うことができる。あるいは、ペプチド形質導入ドメインは、アンテナペディアホメオドメインまたはＨＳＶ  ＶＰ２２配列、プリオンタンパク質のＮ末端断片またはそれらの好適な形質導入断片（当該技術分野において公知のものなど）を含み得る。
【０２４７】
ＰＴＤのタイプおよびサイズは、所望のトランスフェクションの程度を含む複数のパラメータによって誘導される。典型的に、ＰＴＤは、少なくとも約２０％、２５％、５０％、７５％、８０％または９０％、９５％、９８％および最大で約１００％までの細胞をトランスフェクトすることができる。トランスフェクトした細胞のパーセンテージとして典型的に表されるトランスフェクション効率は、いくつかの従来の方法によって決定され得る。
【０２４８】
ＰＴＤは、標的細胞への少なくともピコモル量の本明細書に開示されるヌクレオチド構築物に有利な細胞への侵入および脱出速度（それぞれｋ１およびｋ２と呼ばれることがある）を示す。ＰＴＤおよび任意のカーゴの侵入および脱出速度は、検出可能に標識された融合分子を用いて、標準的な速度分析によって、容易に決定されるか、または少なくとも概算され得る。典型的に、侵入速度対脱出速度の比率は、約５〜約１００、最大で約１０００までの範囲であろう。
【０２４９】
一実施形態において、本発明の方法および組成物に有用なＰＴＤは、実質的なα螺旋性を特徴とするポリペプチドを含む。ＰＴＤが実質的なα螺旋性を示すとき、トランスフェクションが最適化されることが発見されている。別の実施形態において、ＰＴＤは、ペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つの面に沿って実質的にアラインメントされる塩基性アミノ酸残基を含有する配列を含む。本発明に有用なＰＴＤドメインは、天然ペプチドもしくはポリペプチドまたは合成ペプチドもしくはポリペプチドであり得る。
【０２５０】
別の実施形態において、ＰＴＤは、螺旋シリンダ（ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｙｌｉｎｄｅｒ）を下るアルギニン（Ａｒｇ）残基を有する強力なα螺旋構造を含むアミノ酸配列を含む。
【０２５１】
さらに別の実施形態において、ＰＴＤドメインは、以下の一般式：ＢＰ１−ＸＰ１−ＸＰ２−ＸＰ３−ＢＰ２−ＸＰ４−ＸＰ５−ＢＰ３によって表されるポリペプチドを含み、式中、ＢＰ１、ＢＰ２、およびＢＰ３がそれぞれ、独立して、同じかまたは異なる塩基性アミノ酸であり；ＸＰ１、ＸＰ２、ＸＰ３、ＸＰ４、およびＸＰ５がそれぞれ、独立して、同じかまたは異なるα螺旋促進アミノ酸である。
【０２５２】
別の実施形態において、ＰＴＤドメインは、以下の一般式：ＢＰ１−ＸＰ１−ＸＰ２−ＢＰ２−ＢＰ３−ＸＰ３−ＸＰ４−ＢＰ４によって表され、式中、ＢＰ１、ＢＰ２、ＢＰ３、およびＢＰ４がそれぞれ、独立して、同じかまたは異なる塩基性アミノ酸であり；ＸＰ１、ＸＰ２、ＸＰ３、およびＸＰ４がそれぞれ、独立して、同じかまたは異なるα螺旋促進アミノ酸である。
【０２５３】
さらに、ＰＴＤドメインは、塩基性残基、例えば、リジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）を含み、ドメインに「ねじれ（ｋｉｎｋ）」を導入するのに十分な少なくとも１つのプロリン（Ｐｒｏ）残基をさらに含み得る。このようなドメインの例としては、プリオンの形質導入ドメインが挙げられる。例えば、このようなポリペプチドは、ＫＫＲＰＫＰＧ（配列番号１５）を含有する。
【０２５４】
一実施形態において、ドメインは、以下の配列：ＸＰ−ＸＰ−Ｒ−ＸＰ−（Ｐ／ＸＰ）−（ＢＰ／ＸＰ）−ＢＰ−（Ｐ／ＸＰ）−ＸＰ−ＢＰ−（ＢＰ／ＸＰ）によって表されるポリペプチドであり、式中、Ｘが、アラニンなどの任意のα螺旋促進残基であり；Ｐ／ＸＰが、プロリンまたは既に定義されるＸＰのいずれかであり；ＢＰが、塩基性アミノ酸残基、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）またはリジン（Ｌｙｓ）であり；Ｒが、アルギニン（Ａｒｇ）であり、ＢＰ／ＸＰが、上に定義されるＢＰまたはＸＰのいずれかである。
【０２５５】
別の実施形態において、ＰＴＤは、カチオン性であり、７〜１０個のアミノ酸からなり、式ＫＸＰ１ＲＸＰ２ＸＰ１で表され、式中、ＸＰ１がＲであり、またはＫおよびＸＰ２が任意のアミノ酸である。このようなポリペプチドの一例は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含む。別の例において、ＰＴＤは、５〜１５個のアミノ酸にわたって５〜１０個のアルギニン（および／またはリジン）残基を有するカチオン性ペプチド配列である。
【０２５６】
本開示に係るさらなる送達ドメインは、少なくともアミノ酸４９〜５６のＴＡＴ（配列番号１）からほぼ完全長ＴＡＴ配列（例えば、配列番号１６を参照）までを含むＴＡＴ断片を含む。ＴＡＴ断片は、断片のα螺旋性を増大するのに十分な１つまたは複数のアミノ酸の変化を含み得る。場合によっては、導入されるアミノ酸の変化は、認識されるα螺旋促進アミノ酸を付加することを含む。あるいは、アミノ酸の変化は、α螺旋形成または安定性を妨害するＴＡＴ断片から１つまたは複数のアミノ酸を除去することを含む。より具体的な実施形態において、ＴＡＴ断片は、α螺旋促進アミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。典型的に、ＴＡＴ断片は、標準的なペプチド合成技術によって作製されるが、場合によっては、組み換えＤＮＡ手法が使用されてもよい。一実施形態において、ＴＡＴ断片中の少なくとも２つの塩基性アミノ酸残基が、該当するＴＡＴ断片の少なくとも１つの面に沿って実質的にアラインメントされるように置換が選択される。より具体的な実施形態において、ＴＡＴ  ４９〜５６配列（配列番号１）中の少なくとも２つの塩基性アミノ酸残基が、該当する配列の少なくとも１つの面に沿って実質的にアラインメントされるように置換が選択される。
【０２５７】
本発明の組成物および方法に使用され得るさらなる形質導入タンパク質（ＰＴＤ）は、配列中の少なくとも２つの塩基性アミノ酸が、ＴＡＴ断片の少なくとも１つの面に沿って実質的にアラインメントされるように、ＴＡＴ  ４９〜５６配列が修飾されたＴＡＴ断片を含む。例示的なＴＡＴ断片は、ＴＡＴの少なくともアミノ酸４９〜５６に少なくとも１つの特定されたアミノ酸置換を含み、この置換は、セグメントの少なくとも１つの面、典型的に、ＴＡＴ  ４９〜５６配列に沿って、４９〜５６配列の塩基性アミノ酸残基をアラインメントする。
【０２５８】
キメラＰＴＤドメインも含まれる。このようなキメラＰＴＤは、少なくとも２つの異なる形質導入タンパク質の一部を含む。例えば、キメラＰＴＤは、例えば、一方がＨＩＶ−１（配列番号１６）由来し、他方はＨＩＶ−２（配列番号１７）に由来するか、または１つがプリオンタンパク質（配列番号１８）に由来し、１つがＨＩＶに由来する２つの異なるＴＡＴ断片を融合することによって形成され得る。
【０２５９】
ＰＴＤは、ヌクレオチド間架橋基または３’もしくは５’末端において、ホスホロアミデートまたはホスホトリエステルリンカーを用いて、本発明のヌクレオチド構築物に、補助部分として連結され得る。例えば、３−炭素リンカーとともに３’−アミノ基を含有するｓｉＲＮＡ構築物が、ｓｉＲＮＡ構築物をＰＴＤに連結するのに用いられ得る。ｓｉＲＮＡ構築物は、ヘテロ二官能性クロスリンカーを介してＰＴＤに共役され得る。
【０２６０】
ＰＴＤは、生物可逆的基を介して、ヌクレオチド構築物に、補助部分として結合され得、それによって、生物可逆的基は、例えば、細胞内酵素（例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、チオレドキシン、またはチオエステラーゼ）によって細胞内で切断され得、それによって、ポリヌクレオチドを放出する。
【０２６１】
例えば、ＰＴＤが５’および３’末端の間で共役されることに加えて、ＰＴＤは、遊離チオール基を介して、５’および／または３’末端において、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物を含有するポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）に直接共役され得る。例えば、ＰＴＤは、ジスルフィド結合によって、ポリヌクレオチドに連結され得る。この手法は、任意のポリヌクレオチド長さに適用することができ、細胞内へのポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）の送達を可能にする。ポリヌクレオチドは、例えば、１つまたは複数の送達ドメインおよび／または塩基性基を含有する保護基も含み得る。細胞内に入ると、ポリヌクレオチドは、加水分解または他の酵素活性（例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、チオレドキシン、またはチオエステラーゼ活性）によって、細胞内条件、例えば、還元環境に基づいて、非保護ポリヌクレオチドに戻る。
【０２６２】
【表３】
2017522046.tif 000028
【０２６３】
【表４】
2017522046.tif 000029
【０２６４】
【表５】
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【０２６５】
本発明の構築物および方法に使用され得るペプチドリンカーは、典型的に最大で約２０または３０個のアミノ酸、一般的に、最大で約１０または１５個のアミノ酸、さらにより多くの場合、約１〜５個のアミノ酸を含む。リンカー配列は、一般に、融合分子を単一の固定の配座に保持しないように柔軟である。リンカー配列は、例えば、ＰＴＤドメインを核酸から隔てるのに使用され得る。例えば、ペプチドリンカー配列は、例えば、分子の柔軟性を与えるために、ペプチド形質導入ドメインと核酸ドメインとの間に配置され得る。リンカー部分の長さは、例えば、ＰＴＤドメイン融合構築物を含むペプチドまたはポリペプチドの生物学的活性を最適化するように選択され、過度の実験なしに経験的に決定され得る。リンカー部分の例は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０６）、（ＧＧＧＧＳ）Ｎ、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１０７）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１０８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１０９）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１１０）、またはＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１１１）である。ペプチドまたはポリペプチド連結部分が、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９，１９８８；Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９８９，１９９３；およびＮｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：５４５，１９９６に記載されている。他の好適なペプチドまたはポリペプチドリンカーは、参照により本明細書に援用される、米国特許第４，７５１，１８０号明細書および同第４，９３５，２３３号明細書に記載されているものである。
【０２６６】
医薬組成物
本発明のヌクレオチド構築物の送達は、当業者に公知の様々な方法を用いて、細胞を構築物と接触させることによって行うことができる。特定の実施形態において、本発明のヌクレオチド構築物は、本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、様々な担体、分散剤などとともに製剤化される。
【０２６７】
本発明に係る医薬組成物は、担体、賦形剤、および添加剤または補助剤を用いて、被験体への投与に好適な形態に、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物を含めるように調製され得る。よく使用される担体または補助剤としては、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油、ポリエチレングリコールならびに滅菌水、アルコール、グリセロール、および多価アルコールなどの溶媒が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤が挙げられる。防腐剤としては、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスが挙げられる。他の薬学的に許容できる担体としては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）、および２０１３年に公開されたＴｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ  ３６  ＮＦ３１）に記載されているように、塩、防腐剤、緩衝液などを含む、水溶液、非毒性賦形剤が挙げられる。医薬組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、当該技術分野において日常的な技術にしたがって調整される。Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを参照されたい。
【０２６８】
本発明に係る医薬組成物は、局所または全身に投与され得る。治療有効量は、被験体の感染の程度、個体の年齢、性別および体重などの要因に応じて変動する。投薬計画は、最適な治療反応をもたらすように調整され得る。例えば、数回の分割用量を、毎日投与することができ、または治療状況の必要性に示されるように、用量を比例的に減少させることができる。
【０２６９】
医薬組成物は、注入（例えば、皮下、静脈内、眼窩内など）、経口投与、点眼、吸入、経皮適用、局所適用、または直腸投与などによる好都合な方法で投与され得る。投与経路に応じて、医薬組成物は、酵素、酸、および医薬組成物を不活性化し得る他の天然条件の作用から、医薬組成物を保護する材料で被覆され得る。医薬組成物は、非経口的または腹腔内に投与することもできる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中で調製することもできる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有してもよい。
【０２７０】
注射用途に好適な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）または滅菌注射液もしくは分散液の即時調製のための分散液および滅菌粉末が挙げられる。組成物は、典型的に、滅菌であり、注射器が容易に通過できる程度まで流体である。典型的に、組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムが、組成物に使用される。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって、注射用組成物の長時間の吸収をもたらすことができる。
【０２７１】
滅菌注射液は、必要量の医薬組成物を、必要に応じて、上に列挙される成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に組み込んだ後、滅菌ろ過することによって調製され得る。一般に、分散液は、塩基性分散媒および上に列挙される成分からの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、医薬組成物を組み込むことによって調製される。
【０２７２】
医薬組成物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体とともに、経口投与され得る。医薬組成物および他の成分を、硬質または軟質ゼラチンカプセル中に封入し、錠剤に圧縮し、または被験体の食事に直接組み込むこともできる。経口治療薬投与の場合、医薬組成物は、賦形剤とともに組み込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウェハースなどの形態で使用され得る。このような組成物および調製物は、少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべきである。組成物および調製物のパーセンテージは、当然ながら、変動してもよく、好都合には、単位の約５重量％〜約８０重量％であり得る。錠剤、トローチ、丸薬、カプセル剤などは、以下のものも含有し得る：トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、もしくはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、冬緑油、もしくはサクランボ香味料などの香料。投与単位剤形がカプセル剤である場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、液体担体を含有し得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在してもよく、または投与単位の物理形態を他の形で改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセル剤は、シェラック、糖、またはその両方を用いて被覆され得る。シロップまたはエリキシル剤は、薬剤、甘味料としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料、およびサクランボまたはオレンジ香料などの香料を含有し得る。当然ながら、任意の投与単位剤形を調製するのに使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、用いられる量で実質的に非毒性であるべきである。さらに、医薬組成物は、徐放性調製物および製剤に組み込まれ得る。
【０２７３】
したがって、薬学的に許容できる担体は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、医薬組成物と不適合性でない限り、治療用組成物および治療方法におけるそれらの使用が考えられる。補助活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。
【０２７４】
投与しやすさおよび投与量の均一性のために、投与単位剤形中で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される際の投与単位剤形は、治療される被験体のための単一用量として適した物理的に個別の単位を指し；所定の量の医薬組成物を含有する各単位が、必要な医薬担体とともに所望の治療効果をもたらすように計算される。本発明の投与単位剤形の仕様は、医薬組成物の特徴および達成される特定の治療効果に関連する。主な医薬組成物は、許容できる投与単位中で、好適な薬学的に許容できる担体とともに有効量での好都合かつ有効な投与のために配合される。補助活性成分を含有する組成物の場合、投与量は、成分の通常の用量および投与方法を参考にして決定される。
【０２７５】
局所製剤の場合、基剤組成物は、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって一般に安全とみなされるもの（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ）（ＧＲＡＳ）などの任意の溶媒系とともに調製され得る。ＧＲＡＳ溶媒系としては、局所用途についてＦＤＡによって承認された送達ビヒクルとして、多くの短鎖炭化水素（ブタン、プロパン、ｎ−ブタン、またはそれらの混合物など）が挙げられる。局所用組成物は、任意の皮膚科学的に許容できる担体を用いて製剤化され得る。例示的な担体としては、アルミナ、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、もしくはタルクなどの固体担体；および／またはアルコール、グリコール、もしくは水−アルコール／グリコールブレンドなどの液体担体が挙げられる。化合物はまた、化合物が皮膚に入ることを可能にするリポソーム製剤中で投与されてもよい。このようなリポソーム製剤は、米国特許第５，１６９，６３７号明細書；同第５，０００，９５８号明細書；同第５，０４９，３８８号明細書；同第４，９７５，２８２号明細書；同第５，１９４，２６６号明細書；同第５，０２３，０８７号明細書；同第５，６８８，５２５号明細書；同第５，８７４，１０４号明細書；同第５，４０９，７０４号明細書；同第５，５５２，１５５号明細書；同第５，３５６，６３３号明細書；同第５，０３２，５８２号明細書；同第４，９９４，２１３；およびＰＣＴ公開番号国際公開第９６／４００６１号パンフレットに記載されている。他の適切なビヒクルの例は、米国特許第４，８７７，８０５号明細書、米国特許第４，９８０，３７８号明細書、米国特許第５，０８２，８６６号明細書、米国特許第６，１１８，０２０号明細書および欧州特許出願公開第０５８６１０６Ａ１号明細書に記載されている。本発明の好適なビヒクルは、鉱油、石油、ポリデセン、ステアリン酸、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ステアリルアルコール、または植物油も含み得る。
【０２７６】
局所用組成物は、任意の有用な形態で提供され得る。例えば、本発明の組成物は、組成物が使用され得る皮膚または他の組織への適用に使用される、溶液、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）、懸濁液、クリーム、フォーム、ローション、ゲル、粉末、バーム、または他の典型的な固体、半固体、もしくは液体組成物として製剤化されてもよい。このような組成物は、着色料、香料、増粘剤、抗菌剤、溶媒、界面活性剤、洗剤、ゲル化剤、酸化防止剤、充填剤、染料、粘度調節剤、防腐剤、保湿剤、軟化剤（例えば、天然または合成油、炭化水素油、ワックス、またはシリコーン）、水和剤、キレート剤、粘滑剤、可溶化賦形剤、補助剤、分散剤、皮膚浸透促進剤、可塑剤、防腐剤、安定剤、抗乳化剤、湿潤剤、日焼け止め剤（ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ）、乳化剤、保湿剤、収斂剤、防臭剤などの、このような製品に典型的に使用される他の成分を含有してもよく、任意選択的に、麻酔薬、痒み止め活性剤、植物抽出物、調整剤、暗色化もしくは明色化剤、光沢剤、保湿剤、マイカ、ミネラル、ポリフェノール、シリコーンまたはその誘導体、日焼け止め剤（ｓｕｎｂｌｏｃｋ）、ビタミン、および植物薬を含む。
【０２７７】
一部の製剤において、組成物は、点眼のために製剤化される。例えば、点眼用の医薬製剤は、水、緩衝液、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどの生理学的に許容できる眼科用担体媒体と混合された、例えば、最大で９９重量％の量で、本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築物を含み得る。眼への送達の場合、本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築物が、眼科的に許容できる防腐剤、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム、または水性、滅菌点眼懸濁液もしくは溶液を形成するための水と組み合わせられ得る。点眼液製剤は、ポリヌクレオチド構築物を、生理学的に許容できる等張水性緩衝液に溶解させることによって調製され得る。さらに、点眼液は、阻害剤を溶解させるのを助ける眼科的に許容できる界面活性剤を含み得る。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの粘度上昇剤（Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）が、化合物の保持を高めるために、本発明の組成物に加えられてもよい。
【０２７８】
局所用組成物は、例えば、１日１〜４回、または専門の臨床医の通常の判断にしたがって、毎日、毎週、隔週、毎月、もしくはより長い間隔などの長期の送達スケジュールで、眼の表面に送達することができる。製剤のｐＨは、約ｐＨ４〜９、または約ｐＨ４．５〜ｐＨ７．４の範囲であり得る。
【０２７９】
本発明のヌクレオチド構築物の場合、好適な薬学的に許容できる塩としては、（ｉ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどのカチオンにより形成される塩；（ｉｉ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩；（ｉｉｉ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸により形成される塩；ならびに（ｉｖ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩が挙げられる。
【０２８０】
本明細書に記載されるヌクレオチド構築物は、標的細胞への送達に担体の使用を必要としない場合もあるが、担体の使用は、ある実施形態において有利であり得る。したがって、標的細胞への送達のために、本発明のヌクレオチド構築物は、担体に非共有結合して、複合体を形成することができる。担体は、送達後の生体内分布を改変し、取込みを促進し、ポリヌクレオチドの半減期もしくは安定性を増大する（例えば、ヌクレアーゼ耐性を改善する）、および／または特定の細胞もしくは組織タイプへの標的化を増大するのに使用され得る。
【０２８１】
例示的な担体としては、縮合剤（例えば、イオンまたは静電相互作用により核酸を求引または核酸に結合することができる物質）；融合誘導剤（例えば、細胞膜に融合するかおよび／または細胞膜を介して輸送されることが可能な物質）；特定の細胞もしくは組織タイプを標的にするタンパク質（例えば、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、または任意の他のタンパク質）；脂質；リポ多糖；脂質ミセルまたはリポソーム（例えば、ホスホチジルコリン、脂肪酸、糖脂質、セラミド、グリセリド、コレステロール、またはそれらの任意の組合せなどのリン脂質から形成される）；ナノ粒子（例えば、シリカ、脂質、炭水化物、または他の薬学的に許容できるポリマーナノ粒子）；カチオン性ポリマーおよびアニオン性薬剤から形成されるポリプレックス（例えば、ＣＲＯ）（ここで、例示的なカチオン性ポリマーは、ポリアミン（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミン、およびポリエチレンイミン）を含む）；コレステロール；デンドリマー（例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー）；血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または低比重リポタンパク（ＬＤＬ））；炭水化物（例えば、デキストラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）；脂質；合成ポリマー、（例えば、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコール）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣薬ポリアミン、またはポリアミン）；カチオン性部分（例えば、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはα螺旋ペプチド）；多価糖（例えば、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコース）；ビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、葉酸、ビタミンＢ１２、リボフラビン、ビオチン、またはピリドキサール）；補因子；または細胞の細胞骨格を破壊して、取込みを増加させるための薬剤（例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン）が挙げられる。
【０２８２】
本明細書に記載される他の治療剤が、本発明のヌクレオチド構築物と組み合わせて、本発明の医薬組成物に含まれてもよい。
【０２８３】
ヌクレオチド構築物の細胞内活性
本発明は、本明細書に開示されるヌクレオチド構築物（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾塩基を含む核酸、他のアニオン性核酸など）を送達するための組成物および方法を提供する。したがって、本発明は、遺伝子またはタンパク質発現に調節効果を与える非コードヌクレオチド構築物の送達に有用な方法および組成物を提供する。
【０２８４】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖である場合、一方または両方の鎖が、１つまたは複数の生物可逆的基を含み得る。ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡとして作用する場合、パッセンジャー鎖は、ヌクレオチド間架橋基、例えば、Ｃ１〜６アルキルホスホトリエステルに不可逆的に結合される基を含み得る。典型的に、このような基は、３’末端からの第１または第２のヌクレオチドの後に位置する。不可逆的基は、パッセンジャー鎖がガイド鎖として作用するのを防止し、それによって、起こり得るオフターゲット効果を防止または低減する。
【０２８５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、抑制される標的遺伝子のものと同一であるかまたは酷似したヌクレオチド配列を含有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に由来する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって分解されるプロセスである。このプロセスは、転写後、翻訳前操作によって標的遺伝子によってコードされるタンパク質の産生を防止する。したがって、優性疾患遺伝子または他の標的遺伝子のサイレンシングを行うことができる。
【０２８６】
インビボＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡが、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれる酵素、ｄｓＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと切断され（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＆  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０；Ｍｅｉｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３１，３４３−９）、それによって、元の単一のｄｓＲＮＡから複数の分子を生成するプロセスによって発生する。ｓｉＲＮＡは、多量体ＲＮＡｉサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれて、触媒活性化およびｍＲＮＡ標的特異性の両方が得られる（Ｈａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３１，３７１−３７８，２００４；Ｎｏｖｉｎａ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３０，１６１−１６４，２００４）。ＲＩＳＣへのｓｉＲＮＡローディングの間、アンチセンスまたはガイド鎖は、ｓｉＲＮＡから分離され、アルゴノート−２（Ａｇｏ２）、すなわち、ＲＩＳＣ触媒サブユニット内にドッキングされたままになる（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．７，３１４−３２０，２００６）。小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、ＥＲ−ゴルジ中間コンパートメント（ＥＲＧＩＣ）などのいくつかの細胞コンパートメント、Ｐ体、および初期エンドソームには、Ａｇｏ２が豊富である。核から細胞質へと輸送されたｍＲＮＡは、リボソーム到着前に活性化ＲＩＳＣを通過するものと考えられ、それによって、遺伝子発現の、指向性の、転写後、翻訳前調節が可能になる。理論上、あらゆる細胞ｍＲＮＡは、選択的ＲＮＡｉ応答の誘導によって調節することができる。
【０２８７】
２１〜２３ｂｐのｓｉＲＮＡが、哺乳類細胞におけるＲＮＡｉ応答を効率的に誘導する能力は、現在ではありふれたものである（Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，１２７−１３８，２００５）。ｓｉＲＮＡのＩＣ５０は、１０〜１００ｐＭの範囲であり、ＩＣ５０値が１〜１０ｎＭの範囲である最良の薬剤を大幅に下回る。その結果、その優れた選択性のため、ＲＮＡｉは、細胞表現型の指向性操作、遺伝子経路のマッピング、治療標的の発見および確認のための基礎となり、かなりの治療可能性を有する。
【０２８８】
ＲＮＡｉの態様は、以下のものを含む。（１）一本鎖アンチセンスＲＮＡではなくｄｓＲＮＡが、干渉剤である；（２）このプロセスは、非常に特異的であり、著しく強力である（細胞当たり数個のｄｓＲＮＡ分子のみが、有効な干渉に必要とされる）；（３）干渉活性（およびおそらくｄｓＲＮＡ）は、導入部位から離れて除去された細胞および組織内に干渉を引き起こすことができる。しかしながら、ｄｓＲＮＡの有効な送達は困難である。例えば、１３，８６０ダルトンの分子量を有する２１ｂｐのｄｓＲＮＡは、（１）サイズおよび（２）ＲＮＡの極度の負（酸性）電荷のために、細胞膜を通過して細胞質に入ることができない。本発明によって提供される方法および組成物は、電荷中和および向上した取込みによって、細胞内へのｄｓＲＮＡなどのヌクレオチド構築物の送達を可能にする。
【０２８９】
標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なｓｉＲＮＡ配列を含むｄｓＲＮＡが、いくつもの方法において調製され得る。ｓｉＲＮＡ配列を同定するための方法および技術は、当該技術分野において公知である。ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイト（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｔ  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから入手可能）からの受託番号またはＧＩ番号を記入した後、ｓｉＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．（ｈｔｔｐ：［／／］ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／から現在入手可能；ハイパーリンクを除去するために括弧を追加したことに留意されたい）から取得することができる。あるいは、適切なｓｉＲＮＡ配列を含むｄｓＲＮＡは、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ（２００３）の手法を用いて確認することができる。市販のＲＮＡｉ設計アルゴリズムも存在する（ｈｔｔｐ：［／／］ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）。注文用のＲＮＡの調製物が市販されている。
【０２９０】
本発明のヌクレオチド構築物は、ｍＲＮＡの切断を誘導するように、ｍｉＲＮＡとしても作用し得る。あるいは、本発明のヌクレオチド構築物は、Ｒｎａｓｅによる切断を誘導するかまたは翻訳を立体的に遮断するために、ｍＲＮＡに結合するアンチセンス剤として作用し得る。
【０２９１】
本発明のヌクレオチド構築物を細胞内に輸送することができる例示的な方法が、本明細書に記載される。
【０２９２】
治療方法
様々な疾患および障害が、本発明のヌクレオチド構築物を用いて治療され得る。例えば、腫瘍細胞の増殖が、抗腫瘍ｓｉＲＮＡの送達後に、阻害され、抑制され、または破壊され得る。例えば、抗腫瘍ｓｉＲＮＡは、血管新生を促進するポリペプチドをコードする遺伝子に標的化されるｓｉＲＮＡであり得る。腫瘍増殖に関連する様々な血管新生タンパク質が、当該技術分野において公知である。したがって、本明細書に記載されるヌクレオチド構築物は、抗増殖性疾患（例えば、癌）、ウイルス感染、および遺伝病などの疾患の治療に使用され得る。本発明のポリヌクレオチドを用いて治療され得る他の疾患は、加齢性黄斑変性症などの眼疾患（例えば、米国特許第７，８７９，８１３号明細書および米国特許出願公開第２００９／００１２０３０号明細書に記載されているように）および乾癬などの局所疾患である。
【０２９３】
有効量を含有する組成物は、予防的または治療的処置のために投与され得る。予防的用途では、組成物は、臨床的に決定された素因または癌もしくは本明細書に記載される任意の疾患への高い罹患性を有する被験体に投与され得る。本発明の組成物は、臨床的疾患の発症を遅延、軽減、または予防するのに十分な量で、被験体（例えば、ヒト）に投与され得る。治療用途では、組成物は、その病態の症状およびその合併症を治癒するか、少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、疾患（例えば、白血病または骨髄異形成症候群などの癌）に既に罹患している被験体（例えば、ヒト）に投与される。
【０２９４】
この用途に有効な量は、疾患または病態の重症度および被験体の体重および全身状態に応じて決まるが、一般に、被験体毎の用量当たりの薬剤の当量の約０．０５μｇ〜約１０００μｇ（例えば、０．５〜１００μｇ）の範囲である。初回投与および追加投与のための好適な計画は、初回投与に続いて、後の投与による１時間または数時間毎、毎日、毎週、または毎月の間隔で反復される用量が典型的である。本発明の組成物中に存在する薬剤の総有効量は、単回用量として、ボーラスとしてもしくは比較的短期間にわたる注入によって哺乳動物に投与することができ、または分割治療プロトコルを用いて投与することができ、分割治療プロトコルでは、多数回用量が、より長期間にわたって（例えば、４〜６時間毎、８〜１２時間毎、１４〜１６時間毎、１８〜２４時間毎、２〜４日毎、１〜２週間毎、および月１回の用量）投与される。あるいは、血液中の治療的に有効な濃度を維持するのに十分な連続的静脈内注射が考えられる。
【０２９５】
本発明の組成物中に存在し、哺乳動物（例えば、ヒト）に適用される本開示の方法に使用される１つまたは複数の薬剤の治療有効量は、哺乳動物の年齢、体重、および病態の個体差を考慮して、当業者によって決定され得る。有効量を含む本発明の組成物の単回または複数回投与は、治療医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行うことができる。用量および投与スケジュールは、被験体の疾患または病態の重症度に基づいて決定および調整することができ、これは、臨床医によって一般的に実施される方法または本明細書に記載される方法にしたがって治療過程全体にわたってモニターされ得る。
【０２９６】
本発明の１つまたは複数のヌクレオチド構築物は、従来の治療方法もしくは療法のいずれかと組み合わせて使用されてもよく、または従来の治療方法もしくは療法と別個に使用されてもよい。
【０２９７】
本発明の１つまたは複数のヌクレオチド構築物が、他の薬剤との併用療法において投与されるとき、それらは、個体に連続してまたは同時に投与され得る。あるいは、本発明に係る医薬組成物は、本発明のヌクレオチド構築物と、本明細書に記載される薬学的に許容できる賦形剤、および当該技術分野において公知の別の治療薬または予防薬との組合せを含有し得る。
【０２９８】
以下の実施例は、本発明を例示することが意図される。実施例は、本発明を限定することは決して意図されない。
【実施例】
【０２９９】
実施例１．本発明のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成および精製
一般的合成手順
本発明のポリヌクレオチド構築物は、本明細書に記載される一般的および特定の方法およびスキームにしたがって調製され得る。例えば、チオールを含有する出発材料は、２，２’−ジピリジルジスルフィドとの反応を経て、対応するピリジルジスルフィド化合物（例えば、スキーム１を参照）を生じ、次に、それを、ヌクレオシドホスホロジアミダイトとの反応に供して、本発明のヌクレオチド構築物（例えば、スキーム１を参照）を生成した。次に、これらのヌクレオチド構築物を、標準的なオリゴヌクレオチド合成プロトコルで使用して、ポリヌクレオチド構築物を形成した。次に、これらのポリヌクレオチド構築物を脱保護し、ＨＰＬＣを用いて精製した。
【化２５】
2017522046.tif 000031
【０３００】
本発明のヌクレオチドの具体的な合成
本発明のヌクレオチドおよびその前駆体の例示的な合成が、後述される。
【０３０１】
前駆体
化合物Ｓ２
【化２６】
2017522046.tif 000032
４００ｍＬのエタノール中の４−メカプトール−ブタノール（１０．０ｇ、９４ｍｍｏｌ）およびジチオピリジン（２５．０ｇ、１１３ｍｍｏｌ）の溶液に、７．０ｍＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。５００ｍＬの酢酸エチルを粗生成物に加え、溶液を、１ＮのＮａＯＨ水溶液（２００ｍＬ）および塩水（２００ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜４０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１２．８ｇ（６４％）の生成物Ｓ２が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ８．４５（ｄ，Ｊ  ４．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．７０（ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．０６（ｍ，１Ｈ）、３．６５（ｔ，Ｊ  ６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．８３（ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．８０（ｍ，２Ｈ）、１．７０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、１．６５（ｍ，２Ｈ）．
【０３０２】
化合物Ｓ３
【化２７】
2017522046.tif 000033
３０ｍＬのメタノール中のＳ２（１．３ｇ、６．０ｍｍｏｌ）および４−スルファニルペンタン酸（０．６７ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の溶液に、３０μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌してから、減圧下で凝縮させた。酢酸エチル／ヘキサン／２％の酢酸溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜７０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．１３ｇ（９５％）の生成物Ｓ３が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ４．９５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、３．６８（ｔ，Ｊ  ６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．８８（ｍ，１Ｈ）、２．７１（ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．５０（ｍ，２Ｈ）、１．９８（ｍ，１Ｈ）、１．１８（ｍ，１Ｈ）、１．７５（ｍ，２Ｈ）、１．６５（ｍ，２Ｈ）、１．３２（ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、３Ｈ）．
【０３０３】
化合物Ｓ４
【化２８】
2017522046.tif 000034
２５．０ｍＬのジクロロメタン中のＳ３（１．１３ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（０．８４ｍＬ、７．７ｍｍｏｌ）および３．６ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ、１．５ｇ、７．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜１００％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．１７ｇ（７０％）の生成物Ｓ４が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．２２−７．３１（ｍ，５Ｈ）、６．５５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ、４．３５（ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．２０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、３．５５（ｍ，２Ｈ）、２．８０（ｍ，１Ｈ）、２．６０（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．２５（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．８５（ｍ，１Ｈ）、１．７５（ｍ，１Ｈ）、１．６５（ｍ，２Ｈ）、１．５５（ｍ，２Ｈ）、１．２５（ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、３Ｈ）．
【０３０４】
化合物Ｓ５
【化２９】
2017522046.tif 000035
４５．０ｍＬのメタノール中のＳ２（１．８２ｇ、８．４ｍｍｏｌ）および４−スルファニル−４−メチルペンタン酸（１．０４ｇ、７．０ｍｍｏｌ）の溶液に、３５μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン／２％の酢酸溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜７０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．８２ｇ（５０％）の生成物Ｓ５が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．２５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、３．６３（ｔ，Ｊ  ６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．６９（ｍ，２Ｈ）、２．４０（ｍ，２Ｈ）、１．８３（ｍ，２Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，２Ｈ）、１．２５（ｓ，６Ｈ）．
【０３０５】
化合物Ｓ６
【化３０】
2017522046.tif 000036
２０．０ｍＬのジクロロメタン中のＳ５（０．８２ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（０．５３ｍＬ、４．８８ｍｍｏｌ）および２．３ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ、０．９４ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜１００％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．８０ｇ（７３％）の生成物Ｓ６が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．２２−７．４０（ｍ，５Ｈ）、６．３０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．３７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．６０（ｍ，２Ｈ）、２．８０（ｍ，１Ｈ）、２．６８（ｍ，２Ｈ）、２．２５（ｍ，２Ｈ）、１．８５（ｍ，２Ｈ）、１．７５（ｍ，１Ｈ）、１．６５（ｍ，２Ｈ）、１．５５（ｍ，２Ｈ）、１．２５（ｓ，６Ｈ）．
【０３０６】
化合物Ｓ７
【化３１】
2017522046.tif 000037
２０．０ｍＬのメタノール中のＳ２（１．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）および２−プロパンチオール（０．５２ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）の溶液に、１５μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。粗混合物を１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、１ＮのＮａＯＨ水溶液（２００ｍＬ）および塩水（２００ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．４０ｇ（４０％）の生成物Ｓ７が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ３．６３（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８９（ｍ，１Ｈ）、２．７０（ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．８０（ｓ，１Ｈ）、１．７５（ｍ，２Ｈ）、１．６５（ｍ，１Ｈ）、１．２７（ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、６Ｈ）．
【０３０７】
化合物Ｓ８
【化３２】
2017522046.tif 000038
１００ｍＬのメタノール中のＳ２（６．０ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）および２−メチル−２−プロパンチオール（２．５ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）の溶液に、１００μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。粗混合物を４００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、１ＮのＮａＯＨ水溶液（２００ｍＬ）および塩水（２００ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、３．０ｇ（６０％）の生成物Ｓ８が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ３．６５（ｍ，２Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．７５（ｍ，２Ｈ）、１．６５（ｍ，２Ｈ）、１．３０（ｓ，９Ｈ）．
【０３０８】
化合物Ｓ９
【化３３】
2017522046.tif 000039
２５．０ｍＬのジクロロメタン中の３，４−ジスヒドロキシメチルフラン（１．０ｇ、７．８ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（２．３ｇ、８．６ｍｍｏｌ）の溶液に、四臭化炭素（２．８５ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３５％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．０９ｇ（７４％）の生成物Ｓ９が無色油として得られ、それを、次の反応のために、メタノールに素早く溶解させた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．５０（ｓ，１Ｈ）、７．４０（ｓ，１Ｈ）、４．６５（ｓ，２Ｈ）、４．４６（ｓ，２Ｈ）．
【０３０９】
化合物Ｓ１０
【化３４】
2017522046.tif 000040
１０．０ｍＬのメタノール中のＳ９（１．０９ｇ、５．７ｍｍｏｌ）およびチオ酢酸（０．５２ｇ、６．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨＣＯ３（０．５８ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌してから、１ＮのＨＣｌ溶液を用いてｐＨ７になるまで中和し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣を２００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）および塩水（５０ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．８０ｇ（７５％）の生成物Ｓ１０が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．３７（ｓ，１Ｈ）、７．３５（ｓ，１Ｈ）、４．５３（ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．００（ｓ，２Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、１．８８（ｔ，Ｊ  ５．５Ｈｚ、１Ｈ）．
【０３１０】
化合物Ｓ１１
【化３５】
2017522046.tif 000041
１５．０ｍＬのメタノール中のＳ１０（０．６０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（０．５３ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で少しずつ加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌してから、１ＮのＨＣｌ溶液を用いてｐＨ７になるまで中和し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣を１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３０ｍＬ）および塩水（３０ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗混合物を次の反応に直接使用した。
【０３１１】
化合物Ｓ１２
【化３６】
2017522046.tif 000042
１２．０ｍＬのエタノール中の粗生成物Ｓ１１（０．４６ｇ、３．２ｍｍｏｌ）およびジチオピリジン（０．８５ｇ、３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、２００μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で４５分間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．４０ｇ（５０％の収率）の生成物Ｓ１２が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ８．４６（ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．５６（ｍ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．３２（ｓ，２Ｈ）、７．０９（ｍ，１Ｈ）、４．６５（ｓ，２Ｈ）、３．９７（ｓ，２Ｈ）、１．６０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
【０３１２】
化合物Ｓ１３
【化３７】
2017522046.tif 000043
２０．０ｍＬのメタノール中のＳ１２（０．３９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（０．２１ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、５０μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で４０時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．３３ｇ（９５％）の生成物Ｓ１３が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．４０（ｓ，１Ｈ）、７．３７（ｓ，１Ｈ）、４．６０（ｓ，２Ｈ）、３．８２（ｓ，２Ｈ）、１．８４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、１．３４（ｓ，９Ｈ）．
【０３１３】
化合物Ｓ１４
【化３８】
2017522046.tif 000044
４８％の臭化水素酸（１５．０ｍＬ）の溶液に、１，２−ベンゼンジメタノール（４．０ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。１ＮのＮａＯＨ水溶液を反応混合物に加えて、溶液をｐＨ７になるまで中和した。得られた混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）によって連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、２．６ｇ（４５％）の生成物Ｓ１４が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．３０−７．４５（ｍ，４Ｈ）、４．８５（ｓ，２Ｈ）、４．６４（ｓ，２Ｈ）、１．８１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
【０３１４】
化合物Ｓ１５
【化３９】
2017522046.tif 000045
１０．０ｍＬのメタノール中のＳ１４（１．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）およびチオ酢酸（０．４６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨＣＯ３（０．５０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌してから、１ＮのＨＣｌ溶液を用いてｐＨ７になるまで中和し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣を２００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）および塩水（５０ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．９７ｇ（９９％）の生成物Ｓ１５が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．４０（ｍ，２Ｈ）、７．２５（ｍ，２Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．２４（ｓ，２Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、２．０５（ｔ，Ｊ  ５．５Ｈｚ、１Ｈ）．
【０３１５】
化合物Ｓ１６
【化４０】
2017522046.tif 000046
２０．０ｍＬのメタノール中のＳ１５（０．７５ｇ、３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（０．６４ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で少しずつ加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌してから、１ＮのＨＣｌ溶液を用いてｐＨ７になるまで中和し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣を１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３０ｍＬ）および塩水（３０ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物を次の反応に直接使用した。
【０３１６】
化合物Ｓ１７
【化４１】
2017522046.tif 000047
１５．０ｍＬのエタノール中の粗生成物Ｓ１６（０．５２ｇ、３．４ｍｍｏｌ）およびジチオピリジン（０．８９ｍｇ、４．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、０．３０ｍＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．５２ｇ（５０％）の生成物Ｓ１７が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ８．４２（ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．２５−７．５１（ｍ，７Ｈ）、４．８３（ｓ，２Ｈ）、４．１９（ｓ，２Ｈ）、３．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
【０３１７】
化合物Ｓ１８
【化４２】
2017522046.tif 000048
２０．０ｍＬのメタノール中のＳ１７（０．４２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（０．２１ｍＬ、１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、５０μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で４８時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．３２ｇ（９４％の収率）の生成物Ｓ１８が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．４０（ｍ，１Ｈ）、７．２６−７．３０（ｍ，３Ｈ）、４．８０（ｄ，２Ｈ、Ｊ  ４．０Ｈｚ）、４．０６（ｓ，２Ｈ）、１．９５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、１．３５（ｓ，９Ｈ）．
【０３１８】
化合物Ｓ１９
【化４３】
2017522046.tif 000049
２５．０ｍＬのエタノール中の５−メルカプトブタノール（０．８５ｇ、７．１ｍｍｏｌ）およびジチオピリジン（１．８７ｇ、８．５ｍｍｏｌ）の溶液に、０．２ｍＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌してから、減圧下で凝縮させた。５０．０ｍＬの酢酸エチルを粗生成物に加え、溶液を、１ＮのＮａＯＨ水溶液（５０ｍＬ）および塩水（３０ｍＬ）によって連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜４０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．２１ｇ（７５％）の生成物Ｓ１９が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ８．４５（ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．０７（ｍ，１Ｈ）、３．６２（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８１（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．７３（ｍ，２Ｈ）、１．５６（ｍ，２Ｈ）、１．４８（ｍ，２Ｈ）．
【０３１９】
化合物Ｓ２０
【化４４】
2017522046.tif 000050
２０．０ｍＬのジクロロメタン中のＳ１９（１．２ｇ、５．３ｍｍｏｌ）の溶液に、メチルトリフルオロメタンスルホネート（０．８７ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１５分間撹拌した後、２−メチル−２−プロパンチオール（１．２ｍＬ、１０．６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（２．７ｍＬ、１５．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をさらに１時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．６７ｇ（６１％）の生成物Ｓ２０が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ３．６５（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．７０（ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．６７（ｍ，２Ｈ）、１．５７（ｍ，２Ｈ）、１．４５（ｍ，２Ｈ）、１．３２（ｓ，９Ｈ）．
【０３２０】
化合物Ｓ２１
【化４５】
2017522046.tif 000051
２５０ｍＬのトルエン中の４−シアノベンズアルデヒド（５．０ｇ、３８．１ｍｍｏｌ）、２，２−ジエチル−１，３−プロパンジオール（５．５ｇ、４１．９ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．２１ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の懸濁液を、１６時間にわたってディーン・スターク装置を用いて還流させた。反応混合物を室温に冷まし、揮発性物質を減圧下で除去した。粗混合物を３００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３０ｍＬ）および塩水（３０ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜２０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、８．７ｇ（９４％）の生成物Ｓ２１が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．６６（ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６１（ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．４（ｓ，１Ｈ）、３．９７（ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．６１（ｄ，Ｊ  １２．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．７９（ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．１５（ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、０．８９（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ  ｍ、３Ｈ）、０．８２（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ  ｍ、３Ｈ）．
【０３２１】
化合物Ｓ２２
【化４６】
2017522046.tif 000052
ＴＨＦ中の水素化アルミニウムリチウム（０．９４ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃℃に冷却し、それに、アルゴン雰囲気下で、２５．０ｍＬのＴＨＦ中のＳ２１（２．０ｇ、８．２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、３時間にわたってさらに撹拌した。懸濁液を氷浴によって０℃℃に冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液でクエンチし、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドに通してろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した。粗混合物を１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、粗中間体Ｓ２２が無色油として得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。
【０３２２】
化合物Ｓ２３
【化４７】
2017522046.tif 000053
２５．０ｍＬのジクロロメタン中のＳ５（２．８ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（２．５ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（７．６ｍＬ、４４．０ｍｍｏｌ）の溶液に、１０．０ｍＬのジクロロメタン中のＳ２２（２．８４ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜４０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、２．５ｇ（４７％）の生成物Ｓ２３が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．４５（ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．２６（ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、２Ｈ）、５．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、５．３７（ｓ，１Ｈ）、５．２９（ｓ，２Ｈ）、４．４１（ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．９３（ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．６０（ｍ，４Ｈ）、２．６９（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．２９（ｍ，２Ｈ）、１．９３（ｍ，２Ｈ）、１．８０（ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．７５（ｍ，２Ｈ）、１．６０（ｍ，２Ｈ）、１．２８（ｓ，６Ｈ）、１．１３（ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、０．８９（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、３Ｈ）、０．８１（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、３Ｈ）．
【０３２３】
化合物Ｓ２４
【化４８】
2017522046.tif 000054
トルエン（２５０ｍＬ）中の４−ホルミル安息香酸（１５．０１ｇ、１００ｍｍｏｌ）および２，２−ジエチル−１，３−プロパンジオール（１４．５４ｇ、１１０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．５７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、ディーン・スターク装置を用いて一晩還流させた。反応混合物を室温に冷ましたところ、大量の沈殿物が形成された。固体をろ過し、１００ｍＬの酢酸エチルとともに加熱し、冷却して、沈殿物を収集し、それを高真空下で乾燥させたところ、２０ｇの表題化合物Ｓ２４が得られた。ろ液を水および塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させたところ、白色の固体が得られ、それを酢酸エチルから再結晶化させたところ、さらに１．５ｇのＳ２４（合計２１．５ｇ、８１％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、７．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、５．４５（１Ｈ，ｓ）、３．９８（２Ｈ，ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ）、３．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ）、１．８３（２Ｈ，ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、１．１６（２Ｈ，ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、０．８３（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）．
【０３２４】
化合物Ｓ２５
【化４９】
2017522046.tif 000055
ジメチルホルムアミド（１５．０ｍＬ）中のＳ２４（１．３２ｇ、５．０ｍｍｏｌ）およびモノ−ＦｍｏｃエチレンジアミンＨＣｌ塩（１．７５ｇ、５．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（２．２８ｇ、６．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．３５ｍＬ、２５．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を３０分間撹拌し、揮発性物質を高真空下で除去したところ、褐色の固体が得られた。固体を酢酸エチルで３回洗浄したところ、１．９５ｇ（７４％）の純粋な化合物Ｓ２５が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．７４（２Ｈ，  ｄ、Ｊ  ７．５Ｈｚ）、７．５５（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、７．５３（２Ｈ、ｄ、Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．３７（２Ｈ、ｔ、Ｊ  ７．５Ｈｚ）、７．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、７．０７（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、５．４７（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、５．３８（１Ｈ，ｓ）、４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、４．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．９５（２Ｈ，ｄ，１１．５Ｈｚ）、３．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ）、３．５５−３．５０（２Ｈ，ｍ）、３．４３−３．３５（２Ｈ，ｍ）、１．８１（２Ｈ，ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、１．１４（２Ｈ，ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、０．８２（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）
【０３２５】
化合物Ｓ２６
【化５０】
2017522046.tif 000056
ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中の化合物Ｓ２５（１．９５ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、３ｍＬのピペリジンを加え、混合物を３０分間撹拌した。混合物をヘキサン（２０ｍＬ×２）で洗浄し、ジメチルホルムアミド層を高真空下で蒸発させたところ、粗化合物Ｓ２６が得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。
【０３２６】
化合物Ｓ２７
【化５１】
2017522046.tif 000057
ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中の化合物Ｓ２６およびＳ５（０．８７ｇ、３．４５ｍｍｏｌ）の混合物に、ＨＡＴＵ（１．６８ｇ、４．４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１時間撹拌し、揮発性物質を高真空下で除去したところ、褐色の固体が得られた。固体を酢酸エチルで数回洗浄し、高真空下で乾燥させたところ、０．９５ｇ（５１％）の表題化合物Ｓ２７が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、７．５７（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、７．１９（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、６．４２（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、５．４２（１Ｈ，ｓ）、３．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ  １１．０Ｈｚ）、３．６４−３．５５（６Ｈ，ｍ）、３．５３−３．４７（２Ｈ，ｍ）、２．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、２．３１−２．２６（２Ｈ，ｍ）、２．０５（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、１．９０−１．８５（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、１．７５−１．６６（２Ｈ，ｍ）、１．６３−１．５５（２Ｈ，ｍ）、１．２５（６Ｈ，ｓ）、１．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、０．８２（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）．
【０３２７】
化合物Ｓ２９
【化５２】
2017522046.tif 000058
エタノール（３００ｍＬ）中のイソプロピルチオール（７．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）の溶液に、ジチオジピリジン（２４．２ｇ、１１０ｍｍｏｌ）および酢酸（７．０ｍＬ）を加えた。混合物を一晩撹拌し、次に、蒸発させたところ、残渣が得られ、それを２００ｍＬの酢酸エチルに溶解させた。溶液を１ＮのＮａＯＨ（５０ｍＬ×３）および塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜２０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、１４．４ｇ（７７％）の表題化合物Ｓ２９が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ）、７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．６３（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ  ８．０、１．５Ｈｚ）、７．０６（１Ｈ，ｍ）、３．１３（１Ｈ，ｍ）、１．３３（６Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）．
【０３２８】
化合物Ｓ３０
【化５３】
2017522046.tif 000059
ジクロロメタン（５．０ｍＬ）中の化合物Ｓ２９（１．８６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆ（１．６４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、ヘキサン（１０ｍＬ×２）で洗浄した。ジクロロメタン層を蒸発させたところ、粗塩が黄色の油（Ｓ３０）として得られ、それを次の反応に直接使用した。
【０３２９】
化合物Ｓ３１
【化５４】
2017522046.tif 000060
ジクロロメタン中の４−メルカプト−４−メチルブタン−１−オール（０．３６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の溶液に、粗生成物Ｓ３０（１．２６ｇ、３．６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、揮発性物質を減圧下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ機器（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．５０ｇ（８５％）の表題化合物Ｓ３１が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．９６（１Ｈ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．８３（１Ｈ，ｍ）、１．７７−１．６７（３Ｈ，ｍ）、１．６３−１．５５（１Ｈ，ｍ）、１．３２（３Ｈ，ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、１．３０（６Ｈ，ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）．
【０３３０】
化合物Ｓ３２
【化５５】
2017522046.tif 000061
ジクロロメタン中の４−メルカプト−４−メチルペンタン−１−オール（０．１９ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、粗生成物Ｓ３０（０．５８ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、揮発性物質を減圧下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．２６ｇ（８９％）の表題化合物Ｓ３２が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ５．５Ｈｚ）、２．９４（１Ｈ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、１．７２−１．６０（４Ｈ，ｍ）、１．２９（６Ｈ，ｓ）、１．２９（６Ｈ，ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）．
【０３３１】
化合物Ｓ３３
【化５６】
2017522046.tif 000062
メタノール（５．０ｍＬ）中の４−メルカプト−４−メチルブタン−１−オール（０．１８ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジチオジピリジン（０．３５ｇ、１．６ｍｍｏｌ）および酢酸（３０μＬ）を加えた。混合物を３０分間撹拌し、次に、蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝１５％〜７０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．２７ｇ（７８％）の表題化合物Ｓ３３が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ）、７．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．６３（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ  ８．０、１．５Ｈｚ）、７．０７（１Ｈ，ｍ）、３．６４（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．９９（１Ｈ，ｍ）、１．８２−１．６０（４Ｈ，ｍ）、１．３４（３Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）．
【０３３２】
化合物Ｓ３４
【化５７】
2017522046.tif 000063
ジクロロメタン（５．０ｍＬ）中の化合物Ｓ３３（０．２７ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆ（０．１９ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、次に、２−メチル−２−プロパンチオール（０．２１ｇ、２．３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）を加えた。得られた混合物をさらに３０分間撹拌した。揮発性物質の蒸発により、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．１９ｇ（７９％）の表題化合物Ｓ３４が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．８４（１Ｈ，ｍ）、１．７５−１．６５（３Ｈ，ｍ）、１．６２−１．５５（１Ｈ，ｍ）、１．３２（９Ｈ，ｓ）、１．３１（３Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）．
【０３３３】
化合物Ｓ３５
【化５８】
2017522046.tif 000064
メタノール（５０．０ｍＬ）中の６−メルカプト−１−ヘキサノール（２．６８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ジチオジピリジン（６．６ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）および酢酸（１．０ｍＬ）を加えた。混合物を３０分間撹拌し、次に、蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝１５％〜７０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、４．３７ｇ（９０％）の表題化合物Ｓ３５が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ４．５Ｈｚ）、７．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．６４（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ  ８．０、１．５Ｈｚ）、７．０７（１Ｈ，ｍ）、３．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１．７２（２Ｈ，ｐ、Ｊ  ７．５Ｈｚ）、１．６０−１．５３（２Ｈ，ｍ）、１．４７−１．４０（２Ｈ，ｍ）、１．３９−１．３４（２Ｈ，ｍ）．
【０３３４】
化合物Ｓ３６
【化５９】
2017522046.tif 000065
ジクロロメタン（１５．０ｍＬ）中の化合物Ｓ３５（１．０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆ（０．６７ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、次に、２−メチル−２−プロパンチオール（０．９ｍＬ、８．２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．０ｍＬ）を加えた。得られた混合物をさらに３０分間撹拌した。揮発性物質の蒸発により、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜６０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．６１ｇ（６７％）の表題化合物Ｓ３６が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１．７０−１．６４（２Ｈ，ｍ）、１．６２−１．５５（２Ｈ，ｍ）、１．４５−１．３５（４Ｈ，ｍ）、１．３３（９Ｈ，ｓ）．
【０３３５】
化合物Ｓ３７
【化６０】
2017522046.tif 000066
ジクロロメタン（１０．０ｍＬ）中の化合物Ｓ２（０．４３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆ（０．３３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、次に、シクロヘキサンチオール（０．２３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）を加えた。得られた混合物をさらに３０分間撹拌した。揮発性物質の蒸発により、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜６０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．３６ｇ（８１％）の表題化合物Ｓ３７が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．７４−２．６８（１Ｈ，ｍ）、２．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．０５−２．００（２Ｈ，ｍ）、１．８１−１．７４（４Ｈ，ｍ）、１．７１−１．６５（２Ｈ，ｍ）、１．６５−１．５８（１Ｈ，ｍ）、１．４０−１．２０（６Ｈ，ｍ）．
【０３３６】
化合物Ｓ３８
【化６１】
2017522046.tif 000067
ジクロロメタン（１２．０ｍＬ）中の化合物Ｓ２（０．６５ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆ（０．４９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、次に、１−シクロヘキシルエタン−１−チオール（０．４２ｇ、３．６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）を加えた。得られた混合物をさらに３０分間撹拌した。揮発性物質の蒸発により、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜６０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．５８ｇ（７８％）の表題化合物Ｓ３８が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．７５−２．６５（１Ｈ，ｍ）、２．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１．８２−１．７２（６Ｈ，ｍ）、１．７０−１．６３（３Ｈ，ｍ）、１．５８−１．５２（１Ｈ，ｍ）、１．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１．３０−１．０５（５Ｈ、ｍ）．
【０３３７】
化合物Ｓ３９
【化６２】
2017522046.tif 000068
メタノール（５．０ｍＬ）中の化合物Ｓ２（０．４３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ベンジルエタン−１−チオール（０．２８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）および酢酸（３０μＬ）を加えた。得られた混合物を一晩撹拌した。揮発性物質の蒸発により、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜６０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．２４ｇ（５０％）の表題化合物Ｓ３９が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３８−７．３０（４Ｈ，ｍ）、７．２７−７．２３（１Ｈ，ｍ）、３．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１．６２−１．５１（４Ｈ，ｍ）．
【０３３８】
化合物Ｓ４０
【化６３】
2017522046.tif 000069
ジクロロメタン（１５．０ｍＬ）中の２−メルカプト−２−メチルプロパン−１−オール（０．５０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＴＢＤＭＳＣｌ（０．７５ｇ、４．９ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（０．４８ｇ、７．１ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌したところ、大量の白色の沈殿物が形成された。白色の固体をろ去し、１０ｍＬのジクロロメタンで洗浄した。ろ液を蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝０％〜３０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．６６ｇ（６４％）の表題化合物Ｓ４０が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．４７（２Ｈ，ｓ）、１．３２（６Ｈ，ｓ）、０．９２（９Ｈ，ｓ）、０．０７（６Ｈ，ｓ）．
【０３３９】
化合物Ｓ４１
【化６４】
2017522046.tif 000070
ジクロロメタン（１２．０ｍＬ）中の化合物Ｓ２（０．７８ｇ、３．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆ（０．５９ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、次に、Ｓ４０（０．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）を加えた。得られた混合物をさらに３０分間撹拌した。揮発性物質の蒸発により、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜６０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．８０ｇ（８２％）の表題化合物Ｓ４１が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．５８（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．４１（２Ｈ，ｓ）、２．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１．７０−１．６３（２Ｈ，ｍ）、１．６２−１．５５（２Ｈ，ｍ）、１．１７（６Ｈ，ｓ）、０．８１（９Ｈ，ｓ）、０．０３（６Ｈ，ｓ）．
【０３４０】
化合物Ｓ４２
【化６５】
2017522046.tif 000071
ＥｔＯＨ（３０．０ｍＬ）中のチアナフテン−２−ボロン酸（３．０９ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）の溶液に、過酸化水素（３０％、５．６ｍＬ）を滴下して加えた。一晩撹拌した後、反応混合物を減圧下で注意深く濃縮し、水（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（７０ｍＬ×３）で抽出した。組み合わされた有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝０％〜２０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、２．１７ｇ（８５％）の表題化合物Ｓ４２が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．３１−７．２８（２Ｈ，ｍ）、７．２２（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ  ８．０、１．０Ｈｚ）、３．９８（２Ｈ，ｓ）．
【０３４１】
化合物Ｓ４３
【化６６】
2017522046.tif 000072
ＴＨＦ（４０．０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（１．１ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中の化合物Ｓ４２（２．１６ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を一晩撹拌し、反応混合物を、０℃に冷却しながら注意深く水（２０ｍＬ）でクエンチした後、５０ｍＬの１ＮのＨＣｌを加えた。相を分離し、水層を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝１０％〜５０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．６９ｇ（３１％）の表題化合物Ｓ４３が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ７．５、１．５Ｈｚ）、７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ７．５、１．５Ｈｚ）、７．１６−７．０８（２Ｈ，ｍ）、３．９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．４１（１Ｈ，ｓ）、２．９８（１Ｈ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）．
【０３４２】
化合物Ｓ４４
【化６７】
2017522046.tif 000073
ジクロロメタン（５．０ｍＬ）中の化合物Ｓ４３（０．２３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジスルフィドピリジニウム塩Ｓ３０（０．７０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、揮発性物質を減圧下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜５０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．２９ｇ（８５％）の表題化合物Ｓ４４が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．２７−７．２３（１Ｈ，ｍ）、７．２１−７．１８（２Ｈ，ｍ）、３．９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．１０（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．０７−３．０３（１Ｈ，ｍ）、１．３０（６Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）．
【０３４３】
化合物Ｓ４８
【化６８】
2017522046.tif 000074
イソブチレンスルフィド（０．８８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）と、ピペリジン（０．８４ｍＬ、８．５ｍｍｏｌ）との混合物を８０℃に加熱し、４時間撹拌した。揮発性物質の蒸発により、粗生成物Ｓ４８が得られ、それを精製せずに次の工程に直接使用した。
【０３４４】
化合物Ｓ４９
【化６９】
2017522046.tif 000075
ジクロロメタン（１２．０ｍＬ）中の化合物Ｓ２（０．６５ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆ（０．４９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、次に、粗生成物Ｓ４８（０．４９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）を加えた。得られた混合物をさらに３０分間撹拌した。揮発性物質の蒸発により、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜６０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．５０ｇ（２工程で５２％）の表題化合物Ｓ４９が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．６９（２Ｈ，ｍ）、２．７２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．４９（４Ｈ，ｍ）、２．３７（２Ｈ，ｓ）、１．８０−１．７０（２Ｈ，ｍ）、１．７０−１．６２（２Ｈ，ｍ）、１．５５−１．４７（４Ｈ，ｍ）、１．４０−１．３４（２Ｈ，ｍ）、１．２７（６Ｈ，ｓ）．
【０３４５】
化合物Ｓ５６
【化７０】
2017522046.tif 000076
ＴＨＦ中の水素化アルミニウムリチウム（１．０３ｇ、２７．０ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃に冷却し、これに、アルゴン雰囲気下で、２５ｍＬのＴＨＦ中の３−イソクロマノンＳ５０（２．０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、３時間にわたってさらに撹拌した。懸濁液を、氷浴によって再度０℃に冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液でクエンチし、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドに通してろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した。粗混合物を１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０．０ｍＬ）および塩水（２０．０ｍＬ）で連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、中間体Ｓ５１が無色油（２．０１ｇ、９９％の収率）として得られ、それをさらに精製せずに次の工程に直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．３４−７．２２（ｍ，４Ｈ）、４．６５（ｓ，２Ｈ）、３．８９（ｔ，Ｊ  ６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．９６（ｔ，Ｊ  ６．０Ｈｚ、２Ｈ）
【０３４６】
【化７１】
2017522046.tif 000077
中間体Ｓ５１（４．０ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）に、４８％の臭化水素酸の溶液（２０．０ｍＬ）を滴下して加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌してから、氷水に注いだ。得られた混合物をエチルエーテル（２００ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０．０ｍＬ）および塩水（２０．０ｍＬ）で連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、中間体Ｓ５２が淡黄色の油（４．２ｇ、７２％の収率）として得られ、それをさらに精製せずに次の工程に直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．３７−７．１５（ｍ，４Ｈ）、４．５９（ｓ，２Ｈ）、３．９４（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．０３（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）
【０３４７】
【化７２】
2017522046.tif 000078
５０．０ｍＬのメタノール中のＳ５２（５．５ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）およびチオ酢酸（２．２４ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨＣＯ３（２．５８ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌してから、１ＮのＨＣｌ溶液を用いてｐＨ７になるまで中和し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣を３００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、塩水（５０．０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、生成物Ｓ５３が淡黄色の油（３．８ｇ、７１％の収率）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ）：δ７．３０−７．１８（ｍ，４Ｈ）、４．２０（ｓ，２Ｈ）、３．８７（ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．９２（ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）
【０３４８】
【化７３】
2017522046.tif 000079
５０ｍＬのメタノール中のＳ５３（３．８ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（３．０ｇ、２１．７ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で少しずつ加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌してから、１ＮのＨＣｌ溶液を用いてｐＨ７になるまで中和し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣を２００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、塩水（５０．０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、粗生成物Ｓ５４が淡黄色の油（２．８ｇ、９３％の収率）として得られ、それをさらに精製せずに次の工程反応に直接使用した。
【０３４９】
【化７４】
2017522046.tif 000080
５０．０ｍＬのエタノール中の粗生成物Ｓ５４（２．８ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）およびジチオピリジン（４．４ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、１．０ｍＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、生成物Ｓ５５が無色油（２．５ｇ、６０％の収率）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ）：δ８．４３（ｄ，Ｊ  ４．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．５８−７．５５（ｍ，２Ｈ）、７．２６−７．０７（ｍ，５Ｈ）、４．１４（ｓ，２Ｈ）、３．９６（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）
【０３５０】
【化７５】
2017522046.tif 000081
２５ｍＬのメタノール中のＳ５５（１．１４ｇ、４．１ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（５６０μＬ、４．９ｍｍｏｌ）の溶液に、１００μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で４８時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、生成物Ｓ５６が無色油として得られた（０．９０ｇ、９７％の収率、０．１４ｇのＳ５５を回収した）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ）：δ７．２９−７．２０（ｍ，４Ｈ）、４．０３（ｓ，２Ｈ）、３．９２（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．０１（ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．３６（ｓ，９Ｈ）
【０３５１】
化合物Ｓ５８
【化７６】
2017522046.tif 000082
アルゴン雰囲気下で、３０．０ｍＬのアセトニトリル中の４−スルファニル−４−メチルペンタン酸（５．０ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）および無水酢酸（３．５ｍＬ、３７．１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（９．４ｍＬ、６７．４ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰを加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、その時点で、１５．０ｍＬのアセトニトリル中の中間体Ｓ５７（１２．６ｇ、５０．５５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、生成物Ｓ５８が淡黄色の油（６．２ｇ、４９％の収率）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．３２（ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．２６（ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．７（ｂｒｓ，１Ｈ）、５．３７（ｓ，１Ｈ）、４．４１（ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．９４（ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．５８（ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．３７（ｍ，２Ｈ）、１．９３（ｍ，２Ｈ）、１．８１（ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｓ，６Ｈ）、１．１３（ｑ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、２Ｈ）、０．８９（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、３Ｈ）、０．８１（ｔ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、３Ｈ）、１．８３（ｍ，２Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，２Ｈ）、１．２５（ｓ，６Ｈ）
【０３５２】
化合物Ｓ５９
【化７７】
2017522046.tif 000083
１０．０ｍＬのメタノール中のＳ５５（０．５０ｇ、１．８ｍｍｏｌ）およびＳ５８（０．６８ｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、１００μＬの酢酸を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、生成物Ｓ５９が淡黄色の油（０．６０ｇ、６１％の収率）として得られた。Ｃ３０Ｈ４３ＮＯ４Ｓ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値５４５、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋５４６。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．４４（ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０−７．１８（ｍ，６Ｈ）、５．７８（ｂｒｓ，１Ｈ）、５．３６（ｓ，１Ｈ）、４．４１（ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．０７（ｓ，２Ｈ）、３．９３（ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８１（ｂｒｓ，２Ｈ）、３．５８（ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．０２（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８６（ｂｒｓ，１Ｈ）、２．３４（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｍ，２Ｈ）、１．８１（ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．３０（ｓ，６Ｈ）、１．１３（ｑ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、２Ｈ）、０．８９（ｔ，Ｊ  ８．０Ｈｚ、３Ｈ）、０．８１（ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ、３Ｈ）
【０３５３】
化合物Ｓ６０
【化７８】
2017522046.tif 000084
ＥｔＯＨ（１２０ｍＬ）中の化合物Ｓ６０Ａ（３０．０ｇ、１６８．５ｍｍｏｌ）の溶液に、３０％の過酸化水素（５０ｍＬ）を、４５分間にわたって滴下して加えた（注意：発熱）。反応混合物が、白色の沈殿物を含んで濁った。ＴＬＣが３時間で反応の完了を示し、その時点で、反応混合物を水（３００ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（２００ｍＬ×３）で注意深く抽出した。組み合わされた有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、粗生成物が得られた。ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、１５カラム体積にわたって０〜２０％）を用いたフラッシュシリカゲルカラム（２２０ｇ）によって、これを精製したところ、２３．５ｇ（９２％）の化合物Ｓ６０Ｂが淡黄色の油として得られ、それを、室温で静置すると固体になった。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．３１−７．２８（２Ｈ，ｍ）、７．２２（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ  ８．０、１．０Ｈｚ）、３．９８（２Ｈ，ｓ）
【０３５４】
【化７９】
2017522046.tif 000085
ジエチルエーテル（２００ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（７．４ｇ、２００．０ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、１時間にわたってジエチルエーテル中の化合物Ｓ６０Ｂ（１５．０ｇ、１００．０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた（注意：ガス発生および発熱）。反応混合物を室温に到達させ、撹拌を一晩続けた。ＴＬＣが反応の完了を示し、その時点で、ガス発生が停止し、かつ白色の沈殿物の形成が停止するまで、硫酸ナトリウム水溶液の添加によって、反応混合物を注意深くクエンチした。この混合物に、１００ｍＬの１０％のＨ２ＳＯ４を注意深く加え、層を分離した。水層を、３×７５ｍＬエーテルで抽出し、組み合わされた有機層を、水、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮したところ、化合物Ｓ６０Ｃ（１４．６ｇ、９５％）が無色油として得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ７．５、１．５Ｈｚ）、７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ７．５、１．５Ｈｚ）、７．１６−７．０８（２Ｈ，ｍ）、３．９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．４１（１Ｈ，ｓ）、２．９８（１Ｈ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）
【０３５５】
【化８０】
2017522046.tif 000086
室温でメタノール（２００ｍＬ）中のジチオジピリジン（５２．０ｇ、２３６．３ｍｍｏｌ）および酢酸（３．０ｍＬ）の溶液に、メタノール（５０ｍＬ）中の化合物Ｓ６０Ｃ（１４．６ｇ、９４．５ｍｍｏｌ）の溶液を加え、一晩撹拌した。揮発性物質を除去し、残渣に１００ｍＬのジエチルエーテルを加えた。分離された固体をろ過し、ジエチルエーテル（３×５０ｍＬ）で洗浄した。組み合わされたエーテル洗浄物を濃縮したところ、粗生成物が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、０〜５０％）を用いたフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、１４．１ｇ（５７％）の化合物Ｓ６０が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ）、７．６５−７．６０（３Ｈ，ｍ）、７．２５−７．１８（３Ｈ，ｍ）、７．１３−７．１０（１Ｈ，ｍ）、３．９６（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）
【０３５６】
化合物Ｓ６１
【化８１】
2017522046.tif 000087
３０．０ｍＬのジクロロメタン中の化合物Ｓ６０（４．５ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆを室温で滴下して加えた。反応混合物を１０分間撹拌してから、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（１．９ｍＬ、１７．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６．０ｍＬ、３４．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温でさらに３０分間撹拌してから、減圧下で濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、生成物Ｓ６１が無色油（２．５ｇ、６１％の収率）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．８４（ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．２５−７．１３（ｍ，３Ｈ）、３．９２（ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．１２（ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、２Ｈ）、１．３０（ｓ，９Ｈ）
【０３５７】
化合物Ｓ６２
【化８２】
2017522046.tif 000088
上に報告されるＡｃＯＨ活性剤を用いて、化合物Ｓ５５について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ６２を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４５（１Ｈ，ｓ）、７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．６４（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．０９−７．０４（１Ｈ，ｍ）、２．９０−２．８０（１Ｈ，ｍ）、２．０６−１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．８０−１．７３（２Ｈ，ｍ）、１．６３−１．５６（１Ｈ，ｍ）、１．４５−１．３５（２Ｈ，ｍ）、１．３３−１．１８（３Ｈ，ｍ）
【０３５８】
化合物Ｓ６３
【化８３】
2017522046.tif 000089
上に報告されるＭｅＯＴｆ活性剤を用いて、化合物Ｓ４１について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ６３を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．３０−７．２３（１Ｈ，ｍ）、７．２１−７．１７（２Ｈ，ｍ）、３．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．０９（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．８２−２．７０（１Ｈ，ｍ）、２．０６−１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．８０−１．７２（２Ｈ，ｍ）、１．６３−１．５５（１Ｈ，ｍ）、１．４１−１．１８（５Ｈ，ｍ）
【０３５９】
化合物Ｓ６４
【化８４】
2017522046.tif 000090
上に報告されるＭｅＯＴｆ活性剤を用いて、化合物Ｓ４１について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ６４を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．２６−７．２１（１Ｈ，ｍ）、７．１９−７．１３（２Ｈ，ｍ）、３．９３（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．１３（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．３８−２．３４（２Ｈ，ｍ）、１．９０−１．８６（２Ｈ，ｍ）、１．２７（１Ｈ，ｓ）
【０３６０】
化合物Ｓ６５
【化８５】
2017522046.tif 000091
ＤＭＦ（１２ｍＬ）中の、化合物Ｓ５７（１．１３ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）と、Ｓ６４（１．２４ｇ、４．１３ｍｍｏｌ）との混合物に、ＨＣＴＵ（２．５６ｇ、６．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．７６ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１時間撹拌し、揮発性物質を高真空下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、１０〜７０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、１．２８ｇ（５８％）の表題化合物Ｓ６５が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．４７（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．２１−７．１０（３Ｈ，ｍ）、７．０７（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、５．４０（１Ｈ，ｓ）、４．９２（１Ｈ，ｓ、ｂｒ）、４．２４（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ）、３．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ）、３．７３（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ  １１．５Ｈｚ）、２．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．１０−２．０２（２Ｈ，ｍ）、１．８４（２Ｈ，ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、１．８１−１．７６（２Ｈ，ｍ）、１．２９（６Ｈ，ｓ）、１．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、０．８２（３Ｈ、ｔ、Ｊ  ７．５Ｈｚ）
【０３６１】
化合物Ｓ６６
【化８６】
2017522046.tif 000092
アセトニトリル（１０．０ｍＬ）中の、２−メチル−２−メルカプトペンタン酸（０．７４ｇ、５．０ｍｍｏｌ）と、無水酢酸（０．５２ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）との混合物に、トリエチルアミン（１．３９ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５ｍｇ）を加えた。混合物を１時間撹拌し、次に、ベンジルアミン（１．３７ｍＬ、１２．５ｍｍｏｌ）を混合物に加え、撹拌を一晩続けた。揮発性物質を減圧下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、１０〜７０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．７０ｇ（５９％）の表題化合物Ｓ６６が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３６−７．３２（２Ｈ，ｍ）、７．３０−７．２６（３Ｈ，ｍ）、５．７３（１Ｈ，ｓ）、４．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ６．０Ｈｚ）、２．４３−２．３８（２Ｈ，ｍ）、１．９８−１．９４（２Ｈ，ｍ）、１．３９（６Ｈ，ｓ）
【０３６２】
化合物Ｓ６７
【化８７】
2017522046.tif 000093
上に報告されるＭｅＯＴｆ活性剤を用いて、化合物Ｓ４１について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ６７を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．３７−７．２６（３Ｈ，ｍ）、７．２１−７．１５（３Ｈ，ｍ）、７．０８−７．０２（２Ｈ，ｍ）、５．１４（１Ｈ，ｓ、ｂｒ）、４．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ）、３．８９（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．０８（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．１２−２．０５（２Ｈ，ｍ）、１．８７−１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．２９（６Ｈ，ｓ）
【０３６３】
化合物Ｓ６８
【化８８】
2017522046.tif 000094
アセトニトリル（１０．０ｍＬ）中の、２−メチル−２−メルカプトペンタン酸（０．７４ｇ、５．０ｍｍｏｌ）と、無水酢酸（０．５２ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）との混合物に、トリエチルアミン（１．３９ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５ｍｇ）を加えた。混合物を１時間撹拌し、次に、プロパルギルアミン（０．６９ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を混合物に加え、撹拌を一晩続けた。揮発性物質を減圧下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、５〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．７２ｇ（５９％）の表題化合物Ｓ６８が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ５．６６（１Ｈ，ｓ）、４．０６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ５．０、２．５Ｈｚ）、２．４１−２．３７（２Ｈ，ｍ）、２．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ２．５Ｈｚ）、１．９５−１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．３９（６Ｈ，ｓ）
【０３６４】
化合物Ｓ６９
【化８９】
2017522046.tif 000095
上に報告されるＭｅＯＴｆ活性剤を用いて、化合物Ｓ４１について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ６９を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．３０−７．１６（３Ｈ，ｍ）、５．０５（１Ｈ，ｓ）、３．９５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．８８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ５．５、２．５Ｈｚ）、３．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ２．５Ｈｚ）、２．１０−２．０４（２Ｈ，ｍ）、１．８３−１．７９（２Ｈ，ｍ）、１．２８（６Ｈ，ｓ）
【０３６５】
化合物Ｓ７２
【化９０】
2017522046.tif 000096
ジクロロメタン（２５．０ｍＬ）中の２−メルカプト−２−メチルブタン−１−オール（１．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ＴＢＤＭＳＣｌ（１．５８ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１．０２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を３０分間撹拌したところ、大量の白色の沈殿物が形成された。白色の固体をろ過し、３０．０ｍＬのジクロロメタンで洗浄した。ろ液を蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン０〜３０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、１．６３ｇ（７１％）の表題化合物Ｓ７２が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．３０−７．１６（３Ｈ，ｍ）、５．０５（１Ｈ，ｓ）、３．９５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．８８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ５．５、２．５Ｈｚ）、３．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ２．５Ｈｚ）、２．１０−２．０４（２Ｈ，ｍ）、１．８３−１．７９（２Ｈ，ｍ）、１．２８（６Ｈ，ｓ）
【０３６６】
化合物Ｓ７３
【化９１】
2017522046.tif 000097
上に報告されるＭｅＯＴｆ活性剤を用いて、化合物Ｓ４１について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ７３を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．３０−７．１２（３Ｈ，ｍ）、３．９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、１．８３（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、１．２８（６Ｈ，ｓ）、０．８７（９Ｈ，ｓ）、０．０３（６Ｈ，ｓ）
【０３６７】
化合物Ｓ７４
【化９２】
2017522046.tif 000098
ＤＭＦ（５．０ｍＬ）中のＴＢＤＭＳＣｌ（６．７ｇ、４４．６ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（６．３ｇ、９２．９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（１．５ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。混合物を水（１５．０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（３×１５．０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、０〜２０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、４．０ｇ（７０％）のＳ７４が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．４８（６Ｈ，ｓ）、０．８９（２７Ｈ，ｓ）、０．０４（１８Ｈ，ｓ）
【０３６８】
化合物Ｓ７５
【化９３】
2017522046.tif 000099
ＤＭＦ（１０．０ｍＬ）中の、化合物Ｓ６４（０．６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）と、Ｓ７４（１．１６ｇ、２．５ｍｍｏｌ）との混合物に、ＨＡＴＵ（１．１４ｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８５ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１時間撹拌し、その時点で、揮発性物質を高真空下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、１０〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．６０ｇ（４０％）の化合物Ｓ７５が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．２６−７．１２（３Ｈ，ｍ）、５．４５（１Ｈ，ｓ）、３．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．８０（６Ｈ，ｓ）、３．１１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．１４−２．１０（２Ｈ，ｍ）、１．９０−１．８６（２Ｈ，ｍ）、１．２３（６Ｈ，ｓ）、０．９０（２７Ｈ，ｓ）、０．０４（１８Ｈ，ｓ）
【０３６９】
化合物Ｓ７６
【化９４】
2017522046.tif 000100
ジクロロメタン（５０．０ｍＬ）中のＴＢＤＭＳＣｌ（７．２ｇ、４８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．０ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５０ｍｇ）の溶液に、２−アミノ−１，３−プロパン−ジオール（２．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩撹拌した。揮発性物質を高真空下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、２％のトリエチルアミンを含む５０〜１００％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、１．２ｇ（１７％）の化合物Ｓ７６は無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．７０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １０．０、５．５Ｈｚ）、３．６３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １０．０、５．５Ｈｚ）、３．０４（１Ｈ，ｍ）、０．９０（１８Ｈ，ｓ）、０．０７（１２Ｈ、ｓ）
【０３７０】
化合物Ｓ７７
【化９５】
2017522046.tif 000101
ＤＭＦ（１０．０ｍＬ）中の、化合物Ｓ６４（０．７７ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）と、Ｓ７６（０．８２ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）との混合物に、ＨＡＴＵ（１．１７ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８７ｍＬ、５．１２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１時間撹拌し、揮発性物質を高真空下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、１０％〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．５２ｇ（３４％）の表題化合物Ｓ７７が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、７．２６−７．１２（３Ｈ，ｍ）、５．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．９２−３．８２（１Ｈ，ｍ）、３．６８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １３．５、４．５Ｈｚ）、３．５０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ９．５、６．５Ｈｚ）、３．１２（２Ｈ、ｔ、Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．１６−２．１０（２Ｈ，ｍ）、１．９２−１．８４（２Ｈ，ｍ）、１．２６（６Ｈ，ｓ）、０．９０（１８Ｈ，ｓ）、０．０７（１２Ｈ，ｓ）
【０３７１】
化合物Ｓ７８
【化９６】
2017522046.tif 000102
上に報告されるＡｃＯＨ活性剤を用いて、化合物Ｓ５５について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ７８を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ４．５Ｈｚ）、７．７０−７．６０（２Ｈ，ｍ）、７．５２（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、７．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、７．１０（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．０Ｈｚ）、４．６７（２Ｈ，ｓ）
【０３７２】
化合物Ｓ７９
【化９７】
2017522046.tif 000103
上に報告されるＭｅＯＴｆ活性剤を用いて、化合物Ｓ４１について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ７９を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．５５（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、４．６７（２Ｈ，ｓ）、１．３１（９Ｈ，ｓ）
【０３７３】
化合物Ｓ８３
【化９８】
2017522046.tif 000104
上記のスキームに概説される手順にしたがって、化合物Ｓ８３を調製した。
【０３７４】
化合物Ｓ８４
【化９９】
2017522046.tif 000105
７−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン（０．７４ｇ、５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下でエーテルに溶解させ、溶液を０°に冷却した。０〜５℃の温度に維持しながら、ｎ−ブチルリチウム（２．０ｍｌの、ヘキサン中２．５Ｍ、５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０°で１０分間、次に、室温で４５分間撹拌した。次に、混合物を０°に冷却し、ホウ酸トリブチル（１．４７ｍｌ、５．５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。０°で１時間撹拌した後、混合物を室温に温め、一晩静置させ、その時点で、反応物を１Ｍの塩酸でクエンチした。水相をエーテルで抽出し、エーテル層を水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）で抽出した。塩基性の水層を、濃塩酸を用いてｐＨ２になるまで酸性化し、エーテル（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、粗生成物Ｓ８４（０．８０ｇ）が白色の固体として得られた。
【０３７５】
化合物Ｓ８５
【化１００】
2017522046.tif 000106
ＥｔＯＨ（１０．０ｍＬ）中の粗生成物Ｓ８４（０．８０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）の溶液に、過酸化水素（３０％、１．４ｍＬ）を滴下して加えた。一晩撹拌した後、反応混合物を減圧下で注意深く濃縮し、水（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。組み合わされた有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、０〜２０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．５１ｇ（７４％）の化合物Ｓ８５が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．１３（３Ｈ，ｓ）、４．００（２Ｈ，ｓ）、２．３１（３Ｈ，ｓ）
【０３７６】
化合物Ｓ８６
【化１０１】
2017522046.tif 000107
ＥｔＯＨ（５ｍＬ）中のＳ８５（０．５１ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＢＨ４（０．５９ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）を一度で加え、混合物を１５分間還流させ、室温に冷ました。揮発性物質を蒸発させたところ、白色のスラリーが得られ、それを水に溶解させ、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２になるまで酸性化した。混合物をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出し、組み合わされた有機層を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、粗化合物Ｓ８６が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．１１−７．０４（３Ｈ，ｍ）、３．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．３０（１Ｈ，ｓ）、３．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．３９（３Ｈ，ｓ）
【０３７７】
化合物Ｓ８７
【化１０２】
2017522046.tif 000108
ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のジチオジピリジン（１．７ｇ、７．８ｍｍｏｌ）および酢酸（０．０３ｍＬ）の溶液に、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の粗生成物Ｓ８６を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、蒸発させたところ、黄色の残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、０〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製にかけたところ、０．３８ｇ（４４％）の化合物Ｓ８７が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ）、７．６４−７．５８（２Ｈ，ｍ）、７．１９（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、７．１３（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．８３（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．５５（３Ｈ，ｓ）
【０３７８】
化合物Ｓ８８
１０．０ｍＬのジクロロメタン中の化合物Ｓ８７（０．５７ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＭｅＯＴｆ（０．３６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間撹拌し、その時点で、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（０．２３ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温でさらに３０分間撹拌してから、減圧下で濃縮した。ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、０〜５０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製を用いて、粗混合物を精製したところ、化合物Ｓ８８が無色油（０．４６ｇ、８７％）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、７．１１（ｍ，２Ｈ）、３．８９（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．６４（３Ｈ，ｓ）、１．２７（ｓ，９Ｈ）
【０３７９】
化合物Ｓ８９
【化１０３】
2017522046.tif 000109
ＥｔＯＨ（１２．０ｍＬ）中の５−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン−２−ボロン酸（１．０ｇ、３．９０ｍｍｏｌ）の溶液に、過酸化水素（３０％、１．５ｍＬ）を滴下して加えた。一晩撹拌した後、反応混合物を減圧下で注意深く濃縮し、水（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。組み合わされた有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、０〜２０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．６４ｇ（７２％）の化合物Ｓ８９が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．４４（１Ｈ，ｓ）、７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、３．９６（２Ｈ，ｓ）
【０３８０】
化合物Ｓ９０
【化１０４】
2017522046.tif 000110
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のＳ８９（０．６４ｇ、２．８ｍｍｏｌ）の還流溶液に、ＮａＢＨ４（０．５３ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応混合物をさらに１５分間還流させ、室温に冷まし、揮発性物質を蒸発させたところ、白色のスラリーが得られ、それを水に溶解させ、溶液を、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２になるまで酸性化した。水層をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出し、組み合わされた有機層を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、粗化合物Ｓ９０が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３７（１Ｈ，ｓ）、７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、３．９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．４２（１Ｈ，ｓ）、２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）
【０３８１】
化合物Ｓ９１
【化１０５】
2017522046.tif 000111
ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のジチオジピリジン（１．８４ｇ、８．３４ｍｍｏｌ）および酢酸（０．０３ｍＬ）の溶液に、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の粗生成物Ｓ９０を加え、混合物を３０分間撹拌し、次に、蒸発させたところ、黄色の残渣が得られ、これを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、０〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．５０ｇ（２工程で５３％）の化合物Ｓ９１が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ）、７．６４−７．５８（３Ｈ，ｍ）、７．３１−７．２６（２Ｈ，ｍ）、７．１３（１Ｈ，ｍ）、３．９５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）
【０３８２】
化合物Ｓ９２
【化１０６】
2017522046.tif 000112
１０．０ｍＬのジクロロメタン中の化合物Ｓ９１（０．５０ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＭｅＯＴｆ（０．２４ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間撹拌し、その時点で、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（０．１８ｍＬ、１．６２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温でさらに３０分間撹拌し、減圧下で濃縮した。ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン溶媒、０〜５０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製を用いて、粗混合物を精製したところ、化合物Ｓ９２が無色油（０．３７ｇ、７８％）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、７．３４（２Ｈ，ｍ）、３．９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．０７（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１．２９（ｓ，９Ｈ）
【０３８３】
化合物Ｓ９３
【化１０７】
2017522046.tif 000113
４−メチルベンゾチオフェン（１．０ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下でエーテルに溶解させ、溶液を０℃に冷却した。０〜５℃の温度を維持しながら、ｎ−ブチルリチウム（２．７ｍＬの、ヘキサン中２．５Ｍ、６．７５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、０℃で１０分間、次に、室温で４５分間撹拌し、再度０℃に冷却し、ホウ酸トリブチル（１．９９ｍＬ、７．４３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、次に、室温に温め、一晩静置させた後、１Ｍの塩酸でクエンチした。水相をエーテル（２×３０ｍＬ）で抽出し、組み合わされた有機層を水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）で洗浄した。水性塩基性層を、濃塩酸を用いてｐＨ２になるまで酸性化し、エーテル（２×３０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、粗生成物Ｓ９３（１．０５ｇ、８１％）が白色の固体として得られ、それをさらに精製せずに次の工程に直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ７．９３（１Ｈ，ｓ）、７．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、７．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．６２（３Ｈ，ｓ）
【０３８４】
化合物Ｓ９４
【化１０８】
2017522046.tif 000114
ＥｔＯＨ（１０．０ｍＬ）中の粗生成物Ｓ９３（１．０５ｇ、５．５ｍｍｏｌ）の溶液に過酸化水素（３０％、１．０ｍＬ）を滴下して加えた。一晩撹拌した後、反応混合物を減圧下で注意深く濃縮し、水（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５〜１５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．８０ｇ（８９％）の表題化合物Ｓ９４が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．２３−７．１７（２Ｈ，ｍ）、７．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．８５（２Ｈ，ｓ）、２．２８（３Ｈ，ｓ）．
【０３８５】
化合物Ｓ９５
【化１０９】
2017522046.tif 000115
ＥｔＯＨ（２５ｍＬ）中のＳ９４（０．６９ｇ、４．２ｍｍｏｌ）の還流溶液に、ＮａＢＨ４（０．７９ｇ、２１ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物をさらに１５分間還流させ、次に、室温に冷ました。混合物を蒸発させたところ、白色のスラリーが得られ、それを水に溶解させた。混合物を、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２になるまで酸性化した。混合物をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝０〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．６７ｇ（９５％）の表題化合物Ｓ９５が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．１６（１Ｈ，ｍ）、７．００−６．９６（２Ｈ，ｍ）、３．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．４４（１Ｈ，ｓ）、３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．３５（３Ｈ，ｓ）
【０３８６】
化合物Ｓ９６
【化１１０】
2017522046.tif 000116
ＭｅＯＨ（６０ｍＬ）中のジチオジピリジン（２．６４ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）および酢酸（０．１ｍＬ）の溶液に、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中のＳ９５（０．６６ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を３０分間撹拌し、蒸発させたところ、黄色の残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝０〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、１．０９ｇ（１００％）の表題化合物Ｓ９６が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ４．５Ｈｚ）、７．６４−７．５８（２Ｈ，ｍ）、７．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ７．０、２．５Ｈｚ）、７．１１（１Ｈ，ｍ）、７．０８−７．０２（２Ｈ，ｍ）、３．９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．３８（３Ｈ，ｓ）
【０３８７】
化合物Ｓ９７
【化１１１】
2017522046.tif 000117
１０．０ｍＬのジクロロメタン中の化合物Ｓ９６（０．６９ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＭｅＯＴｆ（０．４１ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間撹拌し、その時点で、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（０．３４ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ）を加え、撹拌を室温でさらに３０分間続けた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン溶媒＝０〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製を用いて、粗混合物を精製したところ、化合物Ｓ９７が無色油（０．４５ｇ、７０％）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．１２（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、３．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．２１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．３７（３Ｈ，ｓ）、１．３０（ｓ，９Ｈ）
【０３８８】
化合物Ｓ９８
【化１１２】
2017522046.tif 000118
水素化ナトリウム（油中６０％）（１．８０ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルメチルエーテル（１５ｍＬ）を、０℃で、アルゴン雰囲気下で丸底フラスコに加えた。混合物に、ｔ−ブチルメチルエーテル（１５ｍＬ）中の２，５−ジメチルベンゼンチオール（４．０７ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた後、ｔ−ブチルメチルエーテル（１０ｍＬ）中のジメチルカルバモイルクロリド（３．０３ｍＬ、３３．０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を６０℃に加熱し、１．５時間撹拌し、出発材料の消失を確認した。混合物を氷浴中で冷却し、１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）を用いて中和した。水層をエーテル（２×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を組み合わせて、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液、水、および塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、ろ液を蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５〜５０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、表題化合物Ｓ９８が無色油（５．１５ｇ、８２％）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．３０（１Ｈ，ｓ）、７．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、３．１５−３．００（６Ｈ，ｂｒ  ｓ）、２．３６（３Ｈ，ｓ）、２．３０（３Ｈ，ｓ）
【０３８９】
化合物Ｓ９９
【化１１３】
2017522046.tif 000119
ｔ−ブチルメチルエーテル（３５ｍＬ）中のＬＤＡ（１２．５ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ、２５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ｔ−ブチルメチルエーテル（８ｍＬ）中のジメチル−チオカルバミン酸Ｓ−（２，３−ジメチルフェニル）エステル（Ｓ９８、２．０９ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を、６ｍＬの酢酸、続いて２ｍＬの３７％のＨＣｌ水溶液および水の添加によってクエンチし、温度をほぼ室温まで上昇させ、相を分離した。水層を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を組み合わせて、塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５〜２５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、表題化合物Ｓ９９が白色の固体（０．９８ｇ、６０％）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．１６（２Ｈ，ｓ）、７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、３．９２（２Ｈ，ｓ）、２．３６（３Ｈ，ｓ）
【０３９０】
化合物Ｓ１００
【化１１４】
2017522046.tif 000120
ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中のＳ９９（０．９８ｇ、６．０ｍｍｏｌ）の還流溶液に、ＮａＢＨ４（１．１３ｇ、３０ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物をさらに１５分間還流させ、室温に冷ました。混合物を蒸発させたところ、白色のスラリーが得られ、それを水に溶解させ、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２になるまで酸性化した。混合物をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、粗表題化合物Ｓ１００が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．１４（１Ｈ，ｓ）、７．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、３．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．３６（１Ｈ，ｓ）、２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．２８（３Ｈ，ｓ）
【０３９１】
化合物Ｓ１０１
【化１１５】
2017522046.tif 000121
ＭｅＯＨ（７０ｍＬ）中のジチオジピリジン（４．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）および酢酸（０．１ｍＬ）の溶液に、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の化合物Ｓ１００を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、蒸発させたところ、黄色の残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝０〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、１．５５ｇ（２工程で９３％）の表題化合物Ｓ１０１が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ４．５Ｈｚ）、７．６５−７．６１（２Ｈ，ｍ）、７．４５（１Ｈ，ｓ）、７．１３−７．１１（２Ｈ，ｍ）、７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、３．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、３．１３（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、２．２５（３Ｈ，ｓ）
【０３９２】
化合物Ｓ１０２
【化１１６】
2017522046.tif 000122
１０．０ｍＬのジクロロメタン中の化合物Ｓ１０１（０．６９ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、ＭｅＯＴｆ（０．４１ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１０分間撹拌し、その時点で、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（０．３４ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ）を加え、撹拌を室温でさらに３０分間続けた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン溶媒＝０〜４０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製を用いて、粗混合物を精製したところ、化合物Ｓ１０２が無色油（０．４９ｇ、７７％）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）：δ７．６４（１Ｈ，ｓ）、７．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、６．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、３．８９（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、３．０８（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．３６（３Ｈ，ｓ）、１．３０（ｓ，９Ｈ）．
【０３９３】
化合物Ｓ１０３
【化１１７】
2017522046.tif 000123
エタノール（１５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン（４．５ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液に、ジチオジピリジン（１２．１ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）および酢酸（３．５ｍＬ）を加えた。混合物を一晩撹拌し、蒸発させたところ、残渣が得られ、次に、それを１００ｍＬの酢酸エチルに溶解させた。溶液を１ＮのＮａＯＨ（５０ｍＬ×３）および塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン、５〜２０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、７．３ｇ（７３％）の表題化合物Ｓ１０３が無色油として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．０Ｈｚ）、７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．０Ｈｚ）、７．６３（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ  ８．０、１．５Ｈｚ）、７．０６（１Ｈ，ｍ）、１．３３（９Ｈ，ｓ）
【０３９４】
化合物Ｓ１０４
【化１１８】
2017522046.tif 000124
ヘキサン（３０ｍＬ）中のＳ１０３（１．８１ｇ、９．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＴｆ（１．４８ｇ、９．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、得られた沈殿物をろ過し、ヘキサン（１０ｍＬ×３）で洗浄した。単離された白色の固体を減圧下で乾燥させたところ、粗生成物Ｓ１０４が得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。
【０３９５】
化合物Ｓ１０５
【化１１９】
2017522046.tif 000125
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＳ１０４（９．０ｍｍｏｌ）の溶液に、２−メルカプトイミダゾール（０．９０ｇ、９．０ｍｍｏｌ）を加えて、黄色の混合物を形成した。混合物を３０分間撹拌し、その時点で、ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）および水（４ｍＬ）を加えた。水（２０ｍＬ）を加えると、沈殿物が形成され、それをろ過し、水、続いてヘキサンで洗浄し、減圧下で乾燥させたところ、１．１３ｇ（２工程で６７％）のＳ１０５が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．１１（１Ｈ，ｓ）、１．３３（９Ｈ，ｓ）
【０３９６】
化合物Ｓ１０６
【化１２０】
2017522046.tif 000126
０℃で、アルゴン下でＴＨＦ（５ｍＬ）中のＮａＨ（０．３８ｇ、鉱油中６０％、９．４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＴＨＦ（２ｍＬ）中のＳ１０５（０．８９ｇ、４．７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温に温め、１時間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、ＴＨＦ（３ｍＬ）中の炭酸エチレン（０．５０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を室温に温め、一晩撹拌した。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を加えて、反応物をクエンチし、得られた混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。組み合わされた有機層を塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ジクロロメタン、１０〜１００％）を用いたフラッシュシリカゲルカラムによって精製したところ、０．３９ｇ（３５％）の化合物Ｓ１０６が白色の固体として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ  １．０Ｈｚ）、７．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ  １．０Ｈｚ）、４．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ５．０Ｈｚ）、４．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ５．０Ｈｚ）、１．３６（９Ｈ，ｓ）
【０３９７】
化合物Ｓ１０７
【化１２１】
2017522046.tif 000127
窒素下で、磁気撹拌子および隔壁を備えた、フレームドライされた５００ｍＬのシュレンクフラスコに、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（２．６６ｇ、１０ｍｍｏｌ）、無水ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、混合物を０℃に冷却した。この溶液に、エチニルマグネシウムブロミド（ＴＨＦ中０．５Ｍ、１１ｍｍｏｌ）を、１５分間の期間にわたってシリンジを介して滴下して加え、反応混合物を０℃で１時間撹拌させた。混合物を室温に到達させ、窒素下でろ過し、溶液をロータリーエバポレータにおいて濃縮した。得られた粘性の油を無水ヘキサンで３回抽出し、その間に、油は固体に変化した。次に、この固体を最小体積の無水アセトニトリルに溶解させ、得られた溶液を無水ヘキサンで２回抽出した。ヘキサン画分を組み合わせて、減圧下で濃縮したところ、半透明の白色の油Ｓ１０７（２．３ｇ、９０％）が得られ、それをさらに精製せずに使用した。
【０３９８】
ジスルフィド結合に連結されたベンズイミダゾールの調製
【化１２２】
2017522046.tif 000128
Ｎ−メチル１−ヒドロキシエチル２−メルカプト４，５−ベンズイミダゾールリンカー（ＢＩＭ９）の調製：
市販の２−クロロ−４−ニトロ−トルエン（ＢＩＭ１）を、塩基性条件下でパラホルムアルデヒドとともにホモロゲート（ｈｏｍｏｌｏｇａｔｅ）させて、フェネチルアルコール（ＢＩＭ２）を得ることができる。他の塩基としては、限定はされないが、ＮａＯＥｔ、ＫＯｔＢｕ、ＤＩＥＡ、ＴＥＡ、ＤＢＵ、および無機塩基が挙げられる。４−ニトロ基の水素化およびホルミル化により、ＢＩＭ４が得られる。ＢＩＭ４からＢＩＭ５へのニトロ化の後、Ｎａ２Ｓによる処理によってチオール基を導入して、メルカプタン（ＢＩＭ６）を得ることができる。加熱しながらの還元鉄触媒による５−ニトロの還元により、同時に、２−メルカプトベンズイミダゾール（ＢＩＭ７）が得られる。チオピリジン（ＢＩＭ８）への転化後、ＭｅＯＴｆによる活性化およびｔ−ブチルメルカプタン（Ｒ＝ＨＳ−ｔＢｕ）による処理により、（ＢＩＭ９）を得ることができる。
【０３９９】
ジスルフィド結合に連結されたＰＥＧ鎖の調製
【化１２３】
2017522046.tif 000129
ジスルフィドＰＥＧ側鎖の合成の一般的な手順：室温で、無水ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）中のカルボン酸Ｓ５（１．９８ｍｍｏｌ）およびｍＰＥＧｎ−ＮＨ２（１．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（２．９７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．９７ｍｍｏｌ）をこの順で連続して加え、得られた混合物を２時間撹拌した。ＴＬＣが反応の完了を示した。ジメチルホルムアミドを減圧下で除去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１０．０ｍＬ）に溶解させた。混合物を塩水（１０ｍＬ×２）で洗浄し、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させたところ、粗化合物が得られた。ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（メタノール／塩化メチレン、０〜１０％）を用いたシリカゲルカラム精製により、化合物が高粘度のシロップとして得られた。
【０４００】
ホスホラミダイトおよび他のモノマー
化合物Ｕ１
【化１２４】
2017522046.tif 000130
２５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（３．９ｇ、５．６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍＬ、６．１６ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（１．６４ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を１時間維持しながら、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ８（１．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、１０分間撹拌してから、５．０ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（ＤＩＡＴ）（１．０ｇ、５．８８ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。粗混合物を２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）および塩水（５０ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、２．３２ｇ（４８％）の生成物Ｕ１（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ４４Ｈ５９ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８７２．０５、実測値８７１．０［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．７（ｄ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、１５０．０（ｄ，Ｊ  ９．３Ｈｚ）．
【０４０１】
化合物Ｃ１
【化１２５】
2017522046.tif 000131
２５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−シチジン（ｎ−ＰＡＣ）（３．８ｇ、５．６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍＬ、６．１６ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（１．６４ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ８（１．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、１０分間撹拌してから、５．０ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１．０ｇ、５．８８ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。粗混合物を２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）および塩水（５０ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．４３ｇ（２６％）の生成物Ｃ１（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ５２Ｈ６６ＦＮ４Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１００５．２、実測値１００４．０［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．６（ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、１５０．０（ｄ，Ｊ  ５．５Ｈｚ）．
【０４０２】
化合物Ａ１
【化１２６】
2017522046.tif 000132
２５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン（ｎ−ＰＡＣ）（４．０２ｇ、５．６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍＬ、６．１６ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（１．６４ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ８（１．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、反応混合物を１０分間撹拌してから、５．０ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１．０ｇ、５．８８ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。粗混合物を２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）および塩水（５０ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．９９ｇ（３５％）の生成物Ａ１（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ５４Ｈ６９Ｎ６Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０４１．２６、実測値１０４０．４［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．４、１４９．５．
【０４０３】
化合物Ｇ１
【化１２７】
2017522046.tif 000133
２０．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｎ−イソプロピル−ＰＡＣ）（３．２ｇ、４．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．７８ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（１．２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ８（０．７４ｇ、４．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．７４ｇ、４．３ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。粗混合物を１００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２５ｍＬ）および塩水（２５ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜１００％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．６０ｇ（１３％）の生成物Ｇ１（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ５７Ｈ７５Ｎ６Ｏ１０ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０９９．３４、実測値１０９８．２［Ｍ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．５、１４９．９．
【０４０４】
化合物Ｕ２
【化１２８】
2017522046.tif 000134
１０．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．３６ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１３ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、３．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．１９ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。３．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ１３（０．１５ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、３．０ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１１ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。粗混合物を５０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．１２ｇ（２０％）の生成物Ｕ２（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ４６Ｈ５７ＦＮ３Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９１０．０、実測値９０９［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５１．３（ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、１５１．２（ｄ，Ｊ  １０．５Ｈｚ）．
【０４０５】
化合物Ｕ３
【化１２９】
2017522046.tif 000135
１５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．７３ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２５ｍＬ、１．４５ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（０．３９ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ１８（０．３２ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、アセトニトリル中のエチルチオテトラゾールの溶液（０．２５Ｍ、３．２ｍＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で３時間さらに撹拌した。粗混合物を１００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（４０ｍＬ）および塩水（４０ｍＬ）で連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．１７ｇ（２０％）の生成物Ｕ３（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ４８Ｈ５９ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９２０．０、実測値９４３．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５６．３（ｄ，Ｊ  ７．３Ｈｚ）、１５５．６（ｄ，Ｊ  １１．３Ｈｚ）．
【０４０６】
化合物Ｕ４
【化１３０】
2017522046.tif 000136
２０．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（１．７７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６２ｍＬ、３．５４ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．９４ｇ、３．５４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ２０（０．６７ｇ、３．２２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、アセトニトリル中のエチルチオテトラゾールの溶液（０．２５Ｍ、７．７ｍＬ、１．９３ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で３時間さらに撹拌した。粗混合物を１００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３０ｍＬ）および塩水（３０ｍＬ）で連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．４８ｇ（５２％）の生成物Ｕ４（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ４５Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８８６．０８、実測値８８４．８［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５０．６（ｄ，Ｊ  ６．８Ｈｚ）、１４９．９（ｄ，Ｊ  ９．１Ｈｚ）．
【０４０７】
化合物Ｕ５
【化１３１】
2017522046.tif 000137
１０．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．６６ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２３ｍＬ、１．３２ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、３．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．３５ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。３．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ２３（０．５８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、アセトニトリル中のエチルチオテトラゾールの溶液（０．２５Ｍ、２．９ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で３時間さらに撹拌した。粗混合物を５０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜４０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．３５ｇ（２７％）の生成物Ｕ５（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ６１Ｈ８２ＦＮ４Ｏ１１ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１１６１．４２、実測値１１６２［Ｍ＋Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５４．８７（ｄ，Ｊ  ７．３Ｈｚ）、１５４．５３（ｄ，Ｊ  ９．０Ｈｚ）．
【０４０８】
化合物Ａ２
【化１３２】
2017522046.tif 000138
１５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン（ｎ−ＰＡＣ）（１．４８ｇ、２．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ、２．２８ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（０．６１ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ２３（１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．３５ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。粗混合物を７５．０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２５ｍＬ）および塩水（２５ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜６０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．０１ｇ（３７％）の生成物Ａ２（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ７１Ｈ９２Ｎ７Ｏ１２ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１３３０．６３、実測値１３３１．３［Ｍ＋Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５４．９３  ＆  １５４．２９．
【０４０９】
化合物Ｃ２
【化１３３】
2017522046.tif 000139
１５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−シチジン（ｎ−ＰＡＣ）（１．４ｇ、２．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ、２．２８ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．６１ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ２３（１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．３５ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。粗混合物を７５ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２５ｍＬ）および塩水（２５ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．７５ｇ（２９％）の生成物Ｃ２（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ６９Ｈ８９ＦＮ５Ｏ１２ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１２９４．５７、実測値１２９５．２［Ｍ＋Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５４．７７（ｄ，Ｊ  ５．６Ｈｚ）、１５４．６９（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）．
【０４１０】
化合物Ｕ６
【化１３４】
2017522046.tif 000140
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ６（０．３４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。次に、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。揮発性物質を減圧下で蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝２０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．５０ｇ（４９％）の化合物Ｕ６が無色の発泡体として得られた。Ｃ５３Ｈ６８ＦＮ４Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０１８．４、実測値１０１８．１（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．１５（ｄ，Ｊ  ６．９Ｈｚ）、１４９．６５（ｄ，Ｊ  ８．７Ｈｚ）．
【０４１１】
化合物Ｕ７
【化１３５】
2017522046.tif 000141
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ４（０．３３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、揮発性物質を減圧下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝２０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．１５ｇ（１５％の収率）の化合物Ｕ７が無色の発泡体として得られた。Ｃ５２Ｈ６６ＦＮ４Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１００４．４、実測値１００４．０（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  ５０．１６（ｄ，Ｊ  ７．９Ｈｚ）、１４９．６５（ｄ，Ｊ  １０．７Ｈｚ）．
【０４１２】
化合物Ｕ８
【化１３６】
2017522046.tif 000142
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ７（０．１８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．３０ｇ（３５％）の表題化合物Ｕ８が無色の発泡体として得られた。Ｃ４３Ｈ５７ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８５７．３、実測値８５６．９（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．７６（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５０．０３（ｄ，Ｊ  ９．３Ｈｚ）．
【０４１３】
化合物Ｕ９
【化１３７】
2017522046.tif 000143
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。２０．０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ２７（０．５４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ機器（アセトニトリル／ジクロロメタン＝３０％〜９０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．６８ｇ（５６％）の表題化合物Ｕ９が無色の発泡体として得られた。Ｃ６３Ｈ８５ＦＮ５Ｏ１２ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１２１７．５、実測値１２１７．２（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．１８（ｄ，Ｊ  ５．７Ｈｚ）、１４８．４０（ｄ，Ｊ  １１．１Ｈｚ）．
【０４１４】
化合物Ｕ１０
【化１３８】
2017522046.tif 000144
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．１６ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．３２ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１１ｍＬ、０．６１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ２８（０．１８ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１０ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、揮発性物質を減圧下で蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ機器（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．１５ｇ（２６％）の表題化合物Ｕ１０が無色の発泡体として得られた。Ｃ４９Ｈ７１ＦＮ３Ｏ９ＰＳ２ＳｉについてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９８７．４、実測値９８７．０（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．８８（ｓ）、１５０．０８（ｄ，Ｊ  ９．３Ｈｚ）．
【０４１５】
化合物Ｕ１１
【化１３９】
2017522046.tif 000145
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍｌ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ３１（０．１８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．３８ｇ（４４％）の表題化合物Ｕ１１が無色の発泡体として得られた。Ｃ４４Ｈ５９ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８７１．３、実測値８７０．８（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．８４（ｄ，Ｊ  ７．６Ｈｚ）、１５０．７３（ｄ，Ｊ  ７．６Ｈｚ）１５０．０６（ｄ，Ｊ  ９．１Ｈｚ）、１５０．０２（ｄ，Ｊ  ９．１Ｈｚ）．
【０４１６】
化合物Ｕ１２
【化１４０】
2017522046.tif 000146
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍｌ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中のＳ３２（０．１８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、２−エチルチオテトラゾールの溶液（２．４ｍＬ、アセトニトリル中０．２５Ｍ、０．６ｍｍｏｌ）を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．４７ｇ（５３％）の表題化合物Ｕ１２が無色の発泡体として得られた。Ｃ４５Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８８５．４、実測値８８４．７（Ｍ−１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．８８（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５０．０３（ｄ，Ｊ  ９．５Ｈｚ）．
【０４１７】
化合物Ｕ１３
【化１４１】
2017522046.tif 000147
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍｌ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２６ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中のＳ３４（０．１９ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１７ｍＬ、０．９７ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５０ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、２−エチルチオテトラゾールの溶液（ＥＴＴ）（２．６ｍＬ、アセトニトリル中０．２５Ｍ、０．６５ｍｍｏｌ）を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で蒸発させたところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．２９ｇ（３６％）の表題化合物Ｕ１３が無色の発泡体として得られた。Ｃ４５Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８８５．４、実測値８８５．２（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．９１（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５０．７６（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５０．０７（ｄ，Ｊ  ９．１Ｈｚ）、１５０．０２（ｄ，Ｊ  ９．５Ｈｚ）．
【０４１８】
化合物Ｕ１４
【化１４２】
2017522046.tif 000148
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ３６（０．２２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．３７ｇ（４１％）の表題化合物Ｕ１４が無色の発泡体として得られた。Ｃ４６Ｈ６３ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８９９．４、実測値９００．７（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５５．３２（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５４．７２（ｄ，Ｊ  ９．３Ｈｚ）．
【０４１９】
化合物Ｕ１５
【化１４３】
2017522046.tif 000149
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ３７（０．２２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．３４ｇ（３８％）の表題化合物Ｕ１５が無色の発泡体として得られた。Ｃ４６Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８９７．４、実測値８９６．７（Ｍ−１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．７３（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５０．０１（ｄ，Ｊ  ９．５Ｈｚ）．
【０４２０】
化合物Ｕ１６
【化１４４】
2017522046.tif 000150
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ３８（０．２５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（５％のメタノールを含む酢酸エチル／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．３８ｇ（４１％）の表題化合物Ｕ１６が無色の発泡体として得られた。Ｃ４８Ｈ６５ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９２５．４、実測値９２６．５（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．７８（ｄ，Ｊ  ６．９Ｈｚ）、１５０．０２（ｄ，Ｊ  ９．５Ｈｚ）．
【０４２１】
化合物Ｕ１７
【化１４５】
2017522046.tif 000151
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ３９（０．２４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（５％のメタノールを含む酢酸エチル／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．２４ｇ（２６％）の表題化合物Ｕ１７が無色の発泡体として得られた。Ｃ４８Ｈ５９ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９１９．３、実測値９２０．７（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５５．４１（ｄ，Ｊ  ７．１Ｈｚ）、１５４．７３（ｄ，Ｊ  ８．９Ｈｚ）．
【０４２２】
化合物Ｕ１８
【化１４６】
2017522046.tif 000152
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ４１（０．３２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．２５ｇ（２５％）の表題化合物Ｕ１８が無色の発泡体として得られた。Ｃ５０Ｈ７３ＦＮ３Ｏ９ＰＳ２ＳｉについてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１００１．４、実測値１００３．１（Ｍ＋２）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５５．６７（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５４．８１（ｄ，Ｊ  ９．７Ｈｚ）．
【０４２３】
化合物Ｕ１９
【化１４７】
2017522046.tif 000153
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ４４（０．２３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（（５％のメタノールを含む酢酸エチル）／ヘキサン＝１０％〜５５％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．２４ｇ（２７％）の表題化合物Ｕ１９が無色の発泡体として得られた。Ｃ４７Ｈ５７ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９０５．３、実測値９０７．０（Ｍ＋２）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．７４（ｄ，Ｊ  ８．９Ｈｚ）、１５４．５３（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）．
【０４２４】
化合物Ｕ２０
【化１４８】
2017522046.tif 000154
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．５７ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（１．１１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３７ｍＬ、２．１４ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。５．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ４５（０．７２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．３７ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２．５％のＭｅＯＨを含有する）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．４５ｇ（２３％）の表題化合物Ｕ２０が無色油として得られた。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．１３（ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、１４９．１３（ｄ，Ｊ  ９．１Ｈｚ）
【０４２５】
化合物Ｕ２１
【化１４９】
2017522046.tif 000155
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ４６（０．４４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（メタノール／ジクロロメタン＝１％〜８％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．３０ｇ（２７％）の表題化合物Ｕ２１が無色油として得られた。Ｃ５５Ｈ８０ＦＮ４Ｏ１３ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１１１８．５、実測値１１１８．３（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．１５（ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ）、１４９．２３（ｄ，Ｊ  ９．１Ｈｚ）．
【０４２６】
化合物Ｕ２２
【化１５０】
2017522046.tif 000156
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍｌ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．３８ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．７４ｇ、１．３４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２５ｍＬ、１．４１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ４７（０．７５ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、１０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．２４ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（メタノール／ジクロロメタン＝１％〜８％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．５６ｇ（３２％）の表題化合物Ｕ２２が無色油として得られた。Ｃ６３Ｈ９６ＦＮ４Ｏ１７ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１２９４．６、実測値１２９４．４（Ｍ＋）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．１５（ｄ，Ｊ  ７．１Ｈｚ）、１４９．２１（ｄ，Ｊ  ９．５Ｈｚ）．
【０４２７】
化合物Ｕ２３
【化１５１】
2017522046.tif 000157
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．２８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温に温め、１．５時間撹拌した。１．０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＳ４９（０．３２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌した。次に、８．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．１８ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に少しずつ加え、得られた混合物を一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ液を減圧下で濃縮したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（酢酸エチル／ヘキサン＝５％〜８０％）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．３４ｇ（３６％）の表題化合物Ｕ２３が無色の発泡体として得られた。Ｃ４９Ｈ６８ＦＮ４Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９５４．４、実測値９５５．９（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５５．５４（ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１５４．８０（ｄ，Ｊ  ８．３Ｈｚ）．
【０４２８】
化合物Ｕ２４
【化１５２】
2017522046.tif 000158
手順１／プロトコル１：２０．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（１．９３ｇ、３．５２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６８０μＬ、３．８７ｍｍｏｌ）の冷却溶液（−７８℃）に、アルゴン雰囲気下で、１０．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（１．０３ｇ、３．８７ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。この混合物に、５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ５６（０．９０ｇ、３．５２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．６６ｇ、３．８７ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。反応混合物を２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（４０．０ｍＬ）および塩水（４０．０ｍＬ）によって連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、生成物Ｕ２４が白色の粉末（１．１ｇ、３３％の収率）として得られた。Ｃ４９Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９３４．１、実測値９３４．９［Ｍ＋Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５５．３（ｄ，Ｊ  ８．７Ｈｚ）、１５４．７（ｄ，Ｊ  ８．９Ｈｚ）
【０４２９】
化合物Ｕ２５
【化１５３】
2017522046.tif 000159
手順２／プロトコル２：１０．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（０．６０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１１μＬ、１．２１ｍｍｏｌ）の冷却溶液（−７８℃）に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．３２ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ５９（０．６０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、アセトニトリル中のエチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）の溶液（０．２５Ｍ、２．６ｍＬ、０．６６ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を室温で３時間さらに撹拌した。粗混合物を５０．０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２５．０ｍＬ）および塩水（２５．０ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜５０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、生成物Ｕ２５が白色の粉末（０．７７ｇ、５８％の収率）として得られた。Ｃ６６Ｈ８４ＦＮ４Ｏ１１ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１２２３．５、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋１２２４．２。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５４．８（ｄ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、１５４．６（ｄ，Ｊ  ９．５Ｈｚ）
【０４３０】
化合物Ｕ２６
【化１５４】
2017522046.tif 000160
手順２を用いて、アルキルジスルフィド（化合物Ｓ５９について記載される手順にしたがって、化合物Ｓ６８およびＳ５５から調製された）および５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジンから化合物Ｕ２６を調製した。
【０４３１】
化合物Ｕ２７、Ｃ３、Ａ３、およびＧ２
【化１５５】
2017522046.tif 000161
プロトコル１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｓ６１から化合物Ｕ２７を４１％の収率で調製した。Ｃ４８Ｈ５９ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９２０．１、実測値９２０．９［Ｍ＋Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５４．７（ｄ，Ｊ  ８．９Ｈｚ）、１５４．５（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）
プロトコル１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｃ３を５９％の収率で調製した。Ｃ５６Ｈ６６ＦＮ４Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０５３．２、実測値１０５１．５［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５４．６（ｄ，Ｊ  ５．４５Ｈｚ）、１５４．４（ｄ，Ｊ  ８．３Ｈｚ）
プロトコル１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ａ３を３９％の収率で調製した。Ｃ５８Ｈ６９ＦＮ６Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０８９．３、実測値１０９０．２［Ｍ＋Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５４．８（ｓ）、１５４．６（ｓ）
本明細書に記載される方法にしたがって、例えば、化合物Ｓ６１から化合物Ｇ２を調製することができる。
【０４３２】
化合物Ｃ４
【化１５６】
2017522046.tif 000162
手順２（化合物Ｕ２５を参照）にしたがって、化合物Ｃ４を２２％の収率で調製した。Ｃ６１Ｈ７１ＦＮ５Ｏ１０ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１１４８．３、実測値１１４７．０［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １５４．７（ｄ，Ｊ  ５．０５Ｈｚ）、１５４．１（ｄ，Ｊ  １０．７Ｈｚ）
【０４３３】
化合物Ａ４
【化１５７】
2017522046.tif 000163
手順２（化合物Ｕ２５を参照）にしたがって、化合物Ａ４を１８％の収率で調製した。Ｃ６３Ｈ７４Ｎ７Ｏ１０ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１１８４．４、実測値１１８３．２  ［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１５４．７（ｓ）、１５４．１（ｓ）
【０４３４】
化合物Ｇ３
【化１５８】
2017522046.tif 000164
手順２（化合物Ｕ２５を参照）にしたがって、化合物Ｇ３を調製した。
【０４３５】
化合物Ｕ２８
【化１５９】
2017522046.tif 000165
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ２８を調製した。Ｃ５３Ｈ６４ＦＮ４Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０１５．２、実測値１０１６．２（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．７９（ｄ，Ｊ  ７．５Ｈｚ）、１５４．３８（ｄ，Ｊ  １０．５Ｈｚ）
【０４３６】
化合物Ｕ２９
【化１６０】
2017522046.tif 000166
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ２９を調製した。Ｃ５０Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９４６．１、実測値９４７．６（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．７４（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５４．５０（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）
【０４３７】
化合物Ｕ３０
【化１６１】
2017522046.tif 000167
手順２（化合物Ｕ２５を参照）にしたがって、化合物Ｕ３０を調製した。Ｃ６５Ｈ８２ＦＮ４Ｏ１１ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１２０９．５、実測値１２１０．６（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．７４（ｄ，Ｊ  ６．７Ｈｚ）、１５４．３４（ｄ，Ｊ  １０．３Ｈｚ）
【０４３８】
化合物Ｃ５、Ａ５、およびＧ４
【化１６２】
2017522046.tif 000168
手順２（化合物Ｕ２５を参照）にしたがって、化合物Ｃ５、Ａ５、およびＧ４を調製した。
【０４３９】
化合物Ｕ３１
【化１６３】
2017522046.tif 000169
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ３１を調製した。Ｃ５７Ｈ６８ＦＮ４Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０６７．３、実測値１０６５．６（Ｍ−１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．７６（ｄ，Ｊ  ７．４Ｈｚ）、１５４．４９（ｄ，Ｊ  １０．１Ｈｚ）
【０４４０】
化合物Ｕ３２
【化１６４】
2017522046.tif 000170
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ３２を調製した。Ｃ５９Ｈ８０ＦＮ４Ｏ１３ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１１６７．４、実測値１１６６．５（Ｍ−１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．７１（ｄ，Ｊ  ７．３Ｈｚ）、１５４．００（ｄ，Ｊ  １０．９Ｈｚ）
【０４４１】
化合物Ｕ３３
【化１６５】
2017522046.tif 000171
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ３３を調製した。Ｃ５５Ｈ６８ＦＮ６Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０７１．３、実測値１０７２．１（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １５５．０９（ｓ）、１５２．９８（ｄ，Ｊ  １４．９Ｈｚ）
【０４４２】
化合物Ｕ３４
【化１６６】
2017522046.tif 000172
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ３４を調製した。Ｃ５５Ｈ７５ＦＮ３Ｏ９ＰＳ２ＳｉについてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０６４．４、実測値１０６５．１（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．８１（ｄ，Ｊ  ８．９Ｈｚ）、１５４．５６（ｄ，Ｊ  ７．９Ｈｚ）
【０４４３】
化合物Ｕ３５
【化１６７】
2017522046.tif 000173
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ３５を調製した。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．６２（ｄ，Ｊ  ７．３Ｈｚ）、１５４．５０（ｄ，Ｊ  ９．２Ｈｚ）
【０４４４】
化合物Ｕ３６
【化１６８】
2017522046.tif 000174
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ３６を調製した。Ｃ６５Ｈ９６ＦＮ４Ｏ１１ＰＳ２Ｓｉ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１２７９．８、実測値１２７８．５（Ｍ−１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．７２（ｄ，Ｊ  ７．１Ｈｚ）、１５４．６０（ｄ，Ｊ  ９．１Ｈｚ）
【０４４５】
化合物Ｕ３７
【化１６９】
2017522046.tif 000175
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ３７を調製した。Ｃ４７Ｈ５７ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９０６．１、実測値９０６．７（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５６．３５（ｄ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、１５５．９８（ｄ，Ｊ  ８．７Ｈｚ）
【０４４６】
化合物Ｕ３８、Ｕ３９、Ｕ４０、およびＵ４１
【化１７０】
2017522046.tif 000176
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｕ３８、Ｕ３９、Ｕ４０およびＵ４１を調製した。
Ｕ３８：Ｃ４９Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９３４．１、実測値９３３．１（Ｍ−１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．７４（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５４．７０（ｄ，Ｊ  ７．９Ｈｚ）
Ｕ３９：Ｃ４９Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９３４．１、実測値８４４．８（Ｍ−ｔ−ＢｕＳ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．８１（ｄ，Ｊ  ８．７Ｈｚ）、１５４．５８（ｄ，Ｊ  ８．３Ｈｚ）
Ｕ４０：Ｃ４９Ｈ６１ＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９３４．１、実測値９３３．５（Ｍ−１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．６４（ｄ，Ｊ  ８．３Ｈｚ）、１５４．５３（ｄ，Ｊ  ７．９Ｈｚ）
Ｕ４１：Ｃ４８Ｈ５８ＢｒＦＮ３Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値９９９．０、実測値９９９．９（Ｍ＋１）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５５．４７（ｄ，Ｊ  ７．７Ｈｚ）、１５４．７４（ｄ，Ｊ  ８．７Ｈｚ）
【０４４７】
化合物Ｕ４２
【化１７１】
2017522046.tif 000177
手順１（化合物Ｕ２４を参照）にしたがって、化合物Ｓ８３から化合物Ｕ４２を調製した。
【０４４８】
化合物Ｇ５
【化１７２】
2017522046.tif 000178
化合物Ｇ５を明細書に記載されるように調製した。Ｃ５７Ｈ７５Ｎ６Ｏ１０ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０９９．３４、実測値［Ｍ−Ｈ］＋１０９８．２。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １５０．４８（ｓ）、１４９．８７（ｓ）
【０４４９】
化合物Ｕ４３、Ａ６、Ｇ６、およびＣ６
【化１７３】
2017522046.tif 000179
３−ブチン−１−オール、ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン、および対応する保護ヌクレオシドから、当該技術分野において公知の方法にしたがって、化合物Ｕ４３、Ａ６、Ｇ６、およびＣ６を調製した。
【０４５０】
化合物Ａ７
【化１７４】
2017522046.tif 000180
１００．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン（ｎ−Ｂｚ）（１４．２４ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．０ｍＬ、２２．７ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、２０．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（６．０７ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。１５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ６１（５．０ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を１０分間撹拌し、その時点で、ＥＴＴの０．２５Ｍのアセトニトリル溶液（５０．０ｍＬ、１２．４２ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。粗混合物を２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）および塩水（５０ｍＬ）で連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜３０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、８．７ｇ（４０％）の生成物Ａ７（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ５７Ｈ６７Ｎ６Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１０５９．２８、実測値１０５７．９［Ｍ−Ｈ］＋。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５４．８、１５４．０。
【０４５１】
化合物Ｃ７
【化１７５】
2017522046.tif 000181
本明細書に報告されるプロトコル（例えば、Ａ７について記載されるプロトコル）を用いて、化合物Ｃ７を調製することができる。
【０４５２】
化合物Ｇ７
【化１７６】
2017522046.tif 000182
１５．０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のブタ−３−イン−１−オール（０．５２ｇ、７．４６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．３５ｍＬ、７．７８ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下で、５．０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（２．０７ｇ、７．７８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。この溶液を、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｉＢｕ）（２．５ｇ、３．７３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１．２８ｇ、７．４６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）懸濁液に滴下して加え、室温で１６時間撹拌した。反応混合物を１５ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）および塩水（１０ｍＬ）で連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜６０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、２．１ｇ（６５％）の生成物Ｇ７（ジアステレオマー混合物）が白色の粉末として得られた。Ｃ４６Ｈ５７Ｎ６Ｏ９ＰについてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値８６８．９５、実測値８６８．０［Ｍ−Ｈ］＋；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５５．４、１５４．５．
【０４５３】
化合物Ｕ４４
【化１７７】
2017522046.tif 000183
化合物Ｕ２４について記載される手順にしたがって、Ｕ４４を調製した。Ｃ４５Ｈ５７ＦＮ５Ｏ８ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ；計算値９１０．１、実測値９１０．７（Ｍ＋１）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５１．７０（ｄ，Ｊ  ８．１Ｈｚ）、１５０．９０（ｄ，Ｊ  ９．５Ｈｚ）
【０４５４】
化合物Ｕ４５
【化１７８】
2017522046.tif 000184
２０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中のＳ１０７（１．２８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下で、１０ｍＬのジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（２．７４ｇ、５．０ｍｍｏｌ）および１Ｈ−テトラゾール（１３．３ｍＬ、０．４５Ｍ、６．０ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加え、１時間撹拌した。トリエチルアミン（５０μＬ）をゆっくりと加えて、反応混合物を中和し、揮発性物質を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで２０〜７０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、Ｕ４５が白色の粉末（２．６３ｇ、７５％）として得られた。Ｃ３８Ｈ４７ＦＮ３Ｏ７ＰについてのＥＳＩ  ＭＳ；計算値７０３．７、実測値７０２．８（Ｍ−１）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１０９．６５（ｄ，Ｊ  ５．１Ｈｚ）、１０６．２４（ｄ，Ｊ  １０．９Ｈｚ）．
【０４５５】
化合物Ａ８
【化１７９】
2017522046.tif 000185
Ｕ４５について記載されるのと同じプロトコルを用いて、Ａ８を調製した。Ｃ４８Ｈ５３Ｎ６Ｏ８ＰについてのＥＳＩ  ＭＳ；計算値８７２．９、実測値８７３．７（Ｍ＋１）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１０６．３７（ｓ）、１０５．９７（ｓ）．
【０４５６】
化合物Ｇ８
【化１８０】
2017522046.tif 000186
Ｕ４５について記載されるのと同じプロトコルを用いて、Ｇ８を調製した。Ｃ５１Ｈ５９Ｎ６Ｏ９ＰについてのＥＳＩ  ＭＳ；計算値９３１．０、実測値９３０．０（Ｍ−１）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１０６．５７（ｓ）、１０５．２７（ｓ）．
【０４５７】
化合物Ｕ４６
【化１８１】
2017522046.tif 000187
亜リン酸（１．６４ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（５ｍＬ）と３回同時蒸発させ、次に、加熱しながら１０ｍＬの無水ピリジンに溶解させた。この混合物に、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｆ−ウリジン（１．１０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌し、０℃に冷却し、次に、塩化ピバロイル（１．２３ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。混合物を室温に温め、一晩撹拌した。反応物を、重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（５ｍＬ、１Ｍ）でクエンチした後、酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈した。酢酸エチル（３×２０ｍＬ）での抽出後、組み合わされた有機層を重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（５ｍＬ、０．５Ｍ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。揮発性物質を減圧下で除去したところ、残渣が得られ、それを、ＩＳＣＯ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（１０％のメタノール／ジクロロメタン、１％のトリエチルアミンを含む）におけるフラッシュシリカゲルカラム精製にかけたところ、０．９６ｇ（６７％）のＵ４６が白色の固体として得られた。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ９．０８（ｓ）．
【０４５８】
化合物Ａ９
【化１８２】
2017522046.tif 000188
化合物Ｕ４６について記載されるプロトコルを用いて、Ａ９を調製した。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ４．３３（ｓ）、３．５１（ｓ）．
【０４５９】
化合物Ｇ９
【化１８３】
2017522046.tif 000189
化合物Ｕ４６について記載されるプロトコルを用いて、Ｇ９を調製した。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３．８９（ｓ）、３．２５（ｓ）．
【０４６０】
化合物Ｕ４７
【化１８４】
2017522046.tif 000190
アルゴン下で、３０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−ＭＯＥ−ウリジン（２．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６３ｍＬ、３．６ｍｍｏｌ）の冷却溶液（−７８℃）に、１０ｍＬのジクロロメタン中のビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−クロロホスフィン（０．９６ｇ、３．６ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。撹拌を維持しながら（１時間）、反応混合物を室温に温めた。この混合物に、５ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の化合物Ｓ６１（０．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、１０分間撹拌してから、５ｍＬのジクロロメタン中のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（ＤＩＡＴ、０．５６ｇ、３．３ｍｍｏｌ）の懸濁液を少しずつ加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌し、２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（４０ｍＬ）および塩水（４０ｍＬ）によって連続して洗浄し、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、酢酸エチル／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜７０％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、１．２８ｇの生成物Ｕ４７が白色の粉末（ジアステレオマー混合物として４０％の収率）として得られた。Ｃ５１Ｈ６６Ｎ３Ｏ１０ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ；計算値９７６．２、実測値［Ｍ−Ｈ］＋９７５．２；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １４８．９（ｓ）、１４８．６（ｓ）．
【０４６１】
化合物Ｃ８
【化１８５】
2017522046.tif 000191
上述される手順を用いて、化合物Ｃ８を調製した（ジアステレオマー混合物として２２％の収率）。Ｃ５８Ｈ７１Ｎ４Ｏ１０ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ；計算値１０７９．３、実測値［Ｍ−Ｈ］＋１０７８．６；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １４９．０（ｓ）、１４７．８（ｓ）．
【０４６２】
化合物Ｇ１０
【化１８６】
2017522046.tif 000192
上述される手順を用いて、化合物Ｇ１０を調製した（ジアステレオマー混合物として２７％の収率）。Ｃ５９Ｈ７３Ｎ６Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１１０５．４、実測値［Ｍ−Ｈ］＋１１０４．３；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １４９．４（ｓ）、１４８．８（ｓ）．
【０４６３】
化合物Ａ１０
【化１８７】
2017522046.tif 000193
上述される手順を用いて、化合物Ａ１０を調製した（ジアステレオマー混合物として５８％の収率）。Ｃ６８Ｈ８８Ｎ７Ｏ１３ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１３０６．６、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋１３０７．７；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ  １５４．７（ｓ）、１５４．１（ｓ）．
【０４６４】
化合物Ｕ４８
【化１８８】
2017522046.tif 000194
上述される手順にしたがって、化合物Ｕ４８を調製した（ジアステレオマー混合物として５４％の収率）。Ｃ５２Ｈ６６ＦＮ４Ｏ９ＰＳ２についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値１００５．２、実測値［Ｍ−Ｈ］＋１００３．８；３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １５４．７（Ｊ  Ｐ−Ｆ＝９．３Ｈｚ）、１５４．６（ｄ，Ｊ  Ｐ−Ｆ＝８．１Ｈｚ）．
【０４６５】
本明細書に記載される標準的な合成手順を用いて、表４に示されるホスホラミダイトモノマーを合成した。
【０４６６】
【表６】
2017522046.tif 000195
【０４６７】
【表７】
2017522046.tif 000196
【０４６８】
【表８】
2017522046.tif 000197
【０４６９】
【表９】
2017522046.tif 000198
【０４７０】
【表１０】
2017522046.tif 000199
【０４７１】
本明細書に記載される合成方法は、本発明のポリヌクレオチドの調製に使用され得る他のホスホラミダイトモノマーを調製するのに使用され得る。例えば以下のとおりである。
【化１８９】
2017522046.tif 000200
【化１９０】
2017522046.tif 000201
【化１９１】
2017522046.tif 000202
【化１９２】
2017522046.tif 000203
【０４７２】
さらに、マンノース、ＧａｌＮＡｃなどの標的化リガンドを有する以下のホスホラミダイトモノマーが、Ｍ２１に記載される手順を用いて合成され得る。同様の手法が、他の小分子／ペプチド標的化リガンド、例えば葉酸塩、ＰＳＭＡ、ＣＰＰなどのために用いられ得る。
【化１９３】
2017522046.tif 000204
上記のスキーム中、Ｘが、Ｆ、ＯＭｅ、２−メトキシエチル（ＭＯＥ）などであり得；塩基が、Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇであり得；Ｒが、Ａｃ、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、アリルなどであり得る。
【０４７３】
細胞透過性ペプチド（タンパク質形質導入ドメイン）の合成
ペプチド合成：
合成：リンク（Ｒｉｎｋ）アミドポリスチレン樹脂（０．０８０ｇ、０．６１ｍｍｏｌ／ｇ）を反応容器に加え、７分間にわたってジメチルホルムアミド（５体積）中で、毎回窒素バブリングしながら３回膨潤させ、次に排液した。以下のサイクルを用いて、かつ標準的なＦｍｏｃ化学を用いて、ペプチドのアセンブリを行った：
・ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％のピペリジンを用いたＦｍｏｃ脱保護、３×４分；
・樹脂をＤＭＦで洗浄、６×１分；
・カップリングには、５当量の保護アミノ酸、１５当量のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、および５当量のＨＣＴＵを使用した。カップリング溶液を加えた後、反応を２×２０分進行させた；
・カップリングの完了時に、樹脂をＤＭＦで６×１分洗浄した；
・最終的なアセンブリ工程では、５当量のＦｍｏｃ−６−ヒドラジノニコチン酸；ＤＭＦ中の５当量のＨＡＴＵおよび１５当量のＮＭＭを加え、Ｋａｉｓｅｒ（ニンヒドリン）試験によって確認されるように、反応が完了するまで（約１時間）混合することによって、Ｎ末端キャップした。Ｆｍｏｃを、ＤＭＦ中２０％のピペリジンによって３×４分除去した；
・完成した樹脂結合ペプチドを、ＤＭＦで３回、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄し、次に、減圧下で乾燥させた。
【０４７４】
切断：２時間撹拌しながら、以下の溶液：トリフルオロ酢酸／ジチオスレイトール／水／アセトン／トリイソプロピルシラン（１０ｍｌ、９０／３／２／３／２）を用いて、ペプチドを、樹脂から切断／脱保護した。樹脂を、シリンジフィルターであるミディアムフリット（ｍｅｄｉｕｍ  ｆｒｉｔ）に通してろ過し、非希釈トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で２回洗浄した。ろ液を組み合わせて、蒸発により体積を半分に減少させた。ＴＦＡ溶液を撹拌し、４体積の氷冷エーテルのゆっくりとした添加によって、粗ペプチドを沈殿させた。沈殿した粗ペプチドをろ過によって収集した。
【０４７５】
精製：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（１００×４．６ｍｍ  ５μ）カラムを用いて、２０分間にわたって、１５〜７５％のＢ（Ａ＝０．１％のトリフルオロ酢酸／水；Ｂ＝０．１％のトリフルオロ酢酸／アセトニトリル）を用いたＬＣ／ＭＳによって、粗材料を分析した。
【０４７６】
合成された細胞透過性ペプチド、エンドソーム溶解ペプチド、および特定の標的化部分の一覧が、表３に示される。
【０４７７】
標的化リガンドの合成
ＧａｌＮＡｃ（ＮＡＧ）リガンド合成：
【化１９４】
2017522046.tif 000205
五酢酸Ｄ−ガラクトサミン（ＮＡＧ２）の調製。Ｄ−ガラクトサミン（２５．０ｇ、１１６ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（２５０ｍＬ）中で懸濁させ、不活性雰囲気下で０℃に冷却した。無水酢酸（１２０ｍＬ、１１６０ｍｍｏｌ）を、２時間かけて加えた。一晩撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮した。メタノールを加えると、白色の固体が沈殿し、それをろ過によって収集したところ、所望の生成物（４２．１ｇ、９３％の収率）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００  ＭＨｚ）：δ  ５．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ９．０Ｈｚ）、５．４０（ｍ，１Ｈ）、５．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ３．０Ｈｚ）、５．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ  ３．０Ｈｚ、１１Ｈｚ）、４．４４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ  ９．５Ｈｚ、１１Ｈｚ）、４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、１１．５Ｈｚ）、４．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ  ７．０Ｈｚ、１１．５Ｈｚ）、４．０１（ｔ，１Ｈ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、２．１７（ｓ，３Ｈ）、２．１３（ｓ，３Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｓ，３Ｈ）、１．９４（ｓ，３Ｈ）、１．５７（ｓ，３Ｈ）．
【０４７８】
５−ヒドロキシペンタン酸ベンジル（ＮＡＧ５）の調製。水（１００ｍＬ）中のδ−バレロラクトン（１０．０ｇ、１００ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ（４．００ｇ、１００ｍｍｏｌ）の溶液を７０℃で一晩撹拌した。反応混合物を室温に冷まし、減圧下で濃縮したところ、白色の固体ＮＡＧ４が得られた。この固体を、アセトン（１００ｍＬ）中で懸濁させ、臭化ベンジル（２０．５ｇ、１２０ｍｍｏｌ）および臭化テトラブチルアンモニウム（１．６１ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）とともに一晩還流させた。アセトンを減圧下で除去したところ、油状の残渣が得られ、それをＥｔＯＡｃに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）および塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、ＮＡＧ５が油状の生成物（１７．１ｇ、８２％の収率）として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００  ＭＨｚ）：δ  ７．３５（ｍ，５Ｈ）、３．６４（ｑ，２Ｈ、Ｊ  ６Ｈｚ、１１．５Ｈｚ）、２．４１（ｔ，２Ｈ、Ｊ  ７．５Ｈｚ）、１．７５（ｍ，２Ｈ）、１．６０（ｍ，２Ｈ）、１．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ  ６Ｈｚ）．
【０４７９】
ベンジルオキシカルボニルブチル２−デオキシ２−Ｎ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ７）の調製−方法Ａ。不活性雰囲気下で、ＴＭＳＯＴｆ（８．５６ｇ、３８．４ｍｍｏｌ）を、周囲温度で、ＤＣＥ（１００ｍＬ）中のＮＡＧ２（１０．０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を５５℃で２時間撹拌し、熱から取り外し、一晩撹拌した。反応混合物を氷冷飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、シロップＮＡＧ６が得られた。ＤＣＥ（６０ｍＬ）中の溶液ＮＡＧ６に、アルコールＮＡＧ５（８．００ｇ、３８．４ｍｍｏｌ）および分子篩を仕込んだ。混合物を不活性雰囲気下に置き、ＴＭＳＯＴｆ（２．８５ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）で処理し、室温で一晩撹拌した。混合物を氷冷飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、シロップが得られた。この粗材料を、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、グリコシドＮＡＧ７（３．３ｇ、２４％の収率）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００  ＭＨｚ）：δ  ７．３５（ｍ，５Ｈ）、５．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ７．０Ｈｚ）、５．５７（ｍ，１Ｈ）、５．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ３．０Ｈｚ）、５．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ  ３．０Ｈｚ、１１Ｈｚ）、５．１０（ｓ，２Ｈ）、４．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、４．１１（ｍ，２Ｈ）、３．９５（ｍ，１  Ｈ）、３．８８（ｍ，２Ｈ）、３．４９（ｍ，１Ｈ）、２．３７（ｍ，２Ｈ）、２．１３（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）、１．９０（ｓ，３Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．６１（ｍ，２Ｈ）．
【０４８０】
ベンジルオキシカルボニルブチル２−デオキシ２−Ｎ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ７）の調製−方法Ｂ。ＤＣＥ（５０ｍＬ）中のＮＡＧ２（５．００ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）およびアルコールＮＡＧ５（５．３３ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｓｃ（ＯＴｆ）３（０．４４ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物を不活性雰囲気下に置き、３時間還流させた。冷却後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによる精製により、グリコシドＮＡＧ７（５．５３ｇ、８０％の収率）が得られた。
【０４８１】
カルボキシブチル２−デオキシ２−Ｎ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ８）の調製。ＥｔＯＨ（２５ｍＬ）中のグリコシドＮＡＧ７（１．５０ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）の溶液を真空の付加およびアルゴンでのバックフィルによって脱気した。パラジウム触媒（活性炭に担持されて１０重量％、０．５０ｇ）を一度に加え、混合物を真空の付加およびアルゴンでのバックフィルによって脱気した。この異種混合物に、シクロヘキセン（２５ｍＬ）を加え、６時間還流させた。冷却後、触媒をろ過によって除去し、母液を減圧下で濃縮した。粗生成物をＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、白色の発泡体ＮＡＧ８（０．７６ｇ、７０％の収率）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００  ＭＨｚ）：δ  ５．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ３．５Ｈｚ）、５．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ  ３．５Ｈｚ、１１．５Ｈｚ）、４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ  ６．５Ｈｚ、１１．５Ｈｚ）、４．１２（ｄｄ，１Ｈ，６．５Ｈｚ、１１．５Ｈｚ）、４．００（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ  ８．５Ｈｚ、１１．５Ｈｚ）、３．９２（ｍ，２Ｈ）、３．５３（ｍ，１Ｈ）、２．３９（ｍ，２Ｈ）、２．１５（ｓ，３Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、１．９７（ｓ，３Ｈ）、１．７１（ｍ，２Ｈ）、１．６５（ｍ，２Ｈ）．
【０４８２】
【化１９５】
2017522046.tif 000206
アミノプロピル６−ヒドラジノニコタミドアセトンヒドラゾン（ＮＡＧ１１）の調製。ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のＢｏｃ６−ヒドラジノニコチン酸（５２０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を、ＥＤＣＩ（４４０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；２６０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−ジアミン（６５０ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（１．１ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）で３時間処理した。反応混合物を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＮＡＧ１０（３６４ｍｇ、４３％の収率）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００  ＭＨｚ）：δ  ８．５５（ｂｒ，１Ｈ）、７．９３（ｄ，２Ｈ、Ｊ  ７．５Ｈｚ）、７．４５（ｂｒ，１Ｈ）、７．１２（ｂｒ，１Ｈ）、６．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ  ８．５Ｈｚ）、５．１７（ｂｒ，１Ｈ）、３．４２（ｍ，２  Ｈ）、３．１３（ｍ，２Ｈ）、１．６５（ｍ，２Ｈ）、１．４１（ｓ，１８Ｈ）．ＨｙＮｉｃアセトンヒドラゾンが、１時間にわたるＴＦＡ（９ｍＬ）およびアセトン（１ｍＬ）でのＮＡＧ１０（１６０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の処理によって形成された。反応混合物を減圧下で濃縮し、高真空下に置いたところ、ＮＡＧ１１が得られた。
【０４８３】
三価ＧａｌＮＡｃ−ＨｙＮｉｃの合成
【化１９６】
2017522046.tif 000207
トリス−（カルボキシエトキシメチル）−メチルアミド−ドデカンジオエートメチルエステル（ＮＡＧ１４）の調製。ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＨＡＴＵ（１２２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２１８μＬ、１．２５ｍｍｏｌ）で活性化されたドデカン二酸メチルエステル（２１１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリスリンカーＮＡＧ１２を加えた。１時間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＮＡＧ１３（２１４ｍｇ、７０％の収率）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ３８Ｈ６９ＮＯ１２：７３１．４８、実測値：７５５．１０［Ｍ＋Ｎａ］。トリスｔ−ブチルエステルＮＡＧ１３を、ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：ＤＣＭ（９：０．２５：１）混液（１０．２５ｍＬ）で４時間加水分解し、減圧下で濃縮したところ、トリス酸ＮＡＧ１４が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ２６Ｈ４５ＮＯ１２：５６３．２９、実測値：５６５．３３［Ｍ＋Ｈ］。
【０４８４】
トリス−（アミノプロパミド−エトキシメチル）−メチルアミド−ドデカンジオエートメチルエステル（ＮＡＧ１６）の調製。ＤＭＦ（４ｍＬ）中のＨＡＴＵ（５５７ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４７０μＬ、２．７０ｍｍｏｌ）で活性化されたトリス酸ＮＡＧ１４（２３０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液に、モノＢｏｃ１，３−ジアミノプロパン（２５０ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、反応物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＮＡＧ１５（３３５ｍｇ、７９％の収率）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ５０Ｈ９３Ｎ７Ｏ１５：１０３１．６７、実測値：１０５６．４０［Ｍ＋Ｎａ］。トリスＢｏｃリンカーＮＡＧ１５を、ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：ＤＣＭ（９：０．２５：１）混液（１０．２５ｍＬ）で１時間処理し、減圧下で濃縮したところ、トリスアミンＮＡＧ１６が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ３５Ｈ６９Ｎ７Ｏ９：７３１．５１、実測値：７３３．１８［Ｍ＋Ｈ］。
【０４８５】
トリス−ＧａｌＮＡｃ（ＮＡＧ１８）の調製：単糖ＮＡＧ８（１９２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＨＡＴＵ（１６３ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１５０μＬ、０．８６ｍｍｏｌ）で処理した。３０分後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮＡＧ１６（８０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を１時間撹拌した。粗混合物を、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＮＡＧ１７（８２ｍｇ、３７％の収率）が得られた。質量計算値  Ｃ９２Ｈ１５０Ｎ１０Ｏ３９：２０１９．００、実測値：２０４１．８５［Ｍ＋Ｎａ］。ペルアセチル化（ｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）三量体ＧａｌＮＡｃ（８２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（３：１）溶液（８ｍＬ）中のＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（３４ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）での処理により加水分解したところ、ＮＡＧ１８が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ７３Ｈ１３０Ｎ１０Ｏ３０：１６２６．８９、実測値：１６３４．５２［Ｍ＋Ｌｉ］。
【０４８６】
ＨｙＮｉｃ三量体ＧａｌＮＡｃ（ＮＡＧ１９）の調製。ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＧａｌＮＡｃ三量体ＮＡＧ１８（３２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）およびＨｙＮｉｃアミンＮＡＧ１１（２０．０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＥＤＣＩ（１６．２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（２．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２８μＬ、０．１６ｍｍｏｌ）で処理し、４時間撹拌した。減圧下で濃縮後、粗生成物をＤＭＳＯに溶解させ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＮＡＧ１９（１２．６ｍｇ、３５％の収率）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ８５Ｈ１４７Ｎ１５Ｏ３０：１８５８．０４、実測値：１８５９．８３［Ｍ＋Ｈ］。
【０４８７】
三価ＧａｌＮＡｃアジドの合成
【化１９７】
2017522046.tif 000208
アジド−Ｐｅｇ３−三量体ＧａｌＮＡｃ（ＮＡＧ２１）の調製。ＧａｌＮＡｃ三量体カルボン酸ＮＡＧ１８（６０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、アジド−Ｐｅｇ３−アミンＮＡＧ２０（４５．６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（２３．８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１．５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（３４ｕＬ）を、ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）に溶解させ、２時間撹拌した。塩基を減圧下で除去し、粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＮＡＧ２１（２４ｍｇ、４４％）が得られた。
ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ８１Ｈ１４６Ｎ１４Ｏ３２：１８２７．０２、実測値：９１４．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋
【０４８８】
ＧａｌＮＡｃアジドの合成
【化１９８】
2017522046.tif 000209
１−ブロモ２−デオキシ−２−アセトアミド３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ２２）の調製。アルゴンバルーン下で、氷浴中０℃で、ＤＣＭ（９０ｍｌ）中の五酢酸Ｄ−ガラクトサミン（ＮＡＧ２、１０．０ｇ、１当量、２５．８ｍｍｏｌ）懸濁液に、ブロモトリメチルシラン（４．１ｍｌ、１．２当量、３１ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら滴下して加えた。氷浴を１０分後に除去し、反応物を室温で一晩撹拌させた。反応の進行を、７５％のヘキサン：酢酸エチル中でのＴＬＣ（Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色）によって確認した。反応混合物を減圧下で濃縮し、シクロヘキサン（３×５０ｍＬ）と共沸混合し、高真空下で一晩乾燥させ、得られた生成物をそのまま使用した。
【０４８９】
１−アジド２−デオキシ−２−アセトアミド３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ２３）の調製。ＮＡＧ２２（１０．６ｇ、１．０当量、２５．８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１００ｍｌ）に溶解させた。この溶液に、水（１００ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（４．８６ｇ、２．９当量、７４．８ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（８．３２ｇ、０．９５当量、２４．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、１時間激しく撹拌した。反応の進行を、７５％のヘキサン：酢酸エチル中でのＴＬＣ（Ｈａｎｅｓｓｉａｎｓ染色）によって確認した。反応混合物をＤＣＭ（２×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。次に、この材料を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（３：１ヘキサン：酢酸エチル）によって精製した。単離された材料の１Ｈ  ＮＭＲは、公開された構造と一致していた。Ｍ＋Ｈ＝３７３．０
【０４９０】
１−アミノ２−アセトアミド１，２−ジデオキシ３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノース（ＮＡＧ２４）の調製。酢酸エチル（２５ｍＬ）に溶解されたＮＡＧ２３（０．２６ｇ、１当量、０．７ｍｍｏｌ）に、パラジウム炭素（約２６ｍｇ）を加えた。次に、水素バルーンおよび真空ラインを挿入した。反応混合物を３回排気し、各排気の後、水素でパージした。反応混合物を室温で１時間撹拌した。１時間後、ＬＣ／ＭＳにより、生成物の形成が確認された。反応混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）の床上でろ過し、それを３×１０ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。組み合わされたろ液を減圧下で濃縮し、さらに精製せずに次の工程に使用した。Ｍ＋Ｈ＝３４６．６
【０４９１】
１−アミノ（１５’−アジド−テトラエチレングリコールプロパノイル）２−アセトアミド１，２−ジデオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ２６）の調製。酢酸エチル（４５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．２４ｍＬ、２当量、１．４ｍｍｏｌ）に溶解されたＮＡＧ２４（０．２４ｇ、１当量、０．７ｍｍｏｌ）に、酢酸エチル（５ｍＬ）中のアジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳ（０．４１ｇ、１．５当量、１．０５ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、滴下して加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応の完了をＬＣ／ＭＳによって確認した。Ｍ＋Ｈ＝６１９．５。酢酸エチルを減圧下で除去し、得られた材料をさらに精製せずに次の工程に使用した。ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解されたＮＡＧ  ２５（０．４３ｇ、１当量、０．７ｍｍｏｌ）に、１００μＬの、メタノール中２５％のナトリウムメトキシド溶液を加えた。反応混合物を、アルゴン雰囲気下で、室温で１時間撹拌した。１時間後、ＬＣ／ＭＳにより、出発材料のみが示され、その時点で、５００μＬの、メタノール中２５％のナトリウムメトキシド溶液を加えた。１時間後、ＬＣ／ＭＳにより、生成物の形成および出発材料の消失が示された。Ｄｏｗｅｘ樹脂を、溶液のｐＨが約７に達するまで加えた。樹脂をろ過によって除去し、溶媒を減圧下で除去し、残渣を逆相ＨＰＬＣによって精製した。Ｍ＋Ｈ＝４９３．７。
【０４９２】
一価ＧａｌＮＡｃ  ＨｙＮｉｃの合成
【化１９９】
2017522046.tif 000210
［５−（２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチルアミノ）−５−オキソペンタノイル］２−デオキシ２−Ｎ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ２７）の調製。ＴＨＦ（８ｍＬ）中のＮＡＧ８（１．００ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＣ（０．５６ｇ、４．４８ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０．２５ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、白色の沈殿物が形成され、反応混合物を０℃に冷却した。ＴＨＦ（２ｍＬ）中のアジド−Ｐｅｇ３−アミン（０．６３ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応物をさらに１時間撹拌した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、ＮＡＧ２７の形成が示された。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値Ｃ２７Ｈ４５Ｎ５Ｏ１３：６４７．７、実測値：６４７．８［Ｍ＋Ｈ］。沈殿物をろ過によって除去し、反応混合物を減圧下で濃縮したところ、高粘度のシロップが得られた。
【０４９３】
［５−（２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチルアミノ）−５−オキソペンタノイル］２−デオキシ２−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ２８）の調製。粗ＮＡＧ２７を無水メタノール（１０ｍＬ）に溶解させ、ＭｅＯＨ（２５重量％、２５０μＬ）中のＮａＯＭｅで処理した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、ＮＡＧ２７の消費およびＮＡＧ２８の形成が示された。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値Ｃ２１Ｈ３１Ｎ５Ｏ１０：５２１．６、実測値：５２２．３［Ｍ＋Ｈ］。Ｄｏｗｅｘ  Ｈ＋樹脂を加えて、塩基を中和し、次に、樹脂をろ過によって除去し、溶液を減圧下で濃縮した。粗生成物ＮＡＧ２８をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、０．４２ｇ（２工程で３６％の収率）が得られた。
【０４９４】
（［３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブロピルアミノ］）−５−オキソペンタノイル］２−デオキシ２−Ｎ−アセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ２９）の調製。ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＮＡＧ８（０．２９ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を、ＨＡＴＵ（０．２５ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．３４ｍＬ、１．９５ｍｍｏｌ）で活性化した。１０分後、モノ−Ｂｏｃ保護１，３−ジアミノプロパン（０．１３ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィーによって精製したところ、ＮＡＧ２９（０．３０ｇ、７７％の収率）が得られた。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ２７Ｈ４５Ｎ３Ｏ１２：６０３．７、実測値：６２６．８［Ｍ＋Ｎａ］。
【０４９５】
（［３−（アミノ）ブロピルアミノ］）−５−オキソペンタノイル］２−デオキシ２−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ３１）の調製。無水メタノール中のＮＡＧ２９（０．３０ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＭｅＯＨ（２５重量％、５０μＬ）中のＮａＯＭｅで処理した。２０分後、ＴＬＣにより、ＮＡＧ２９の完全な消費が示された。Ｄｏｗｅｘ  ｓｔｒｏｎｇ  Ｈ＋樹脂を加えて、反応混合物を酸性化し、次に、それを３０分間撹拌した。樹脂をろ過によって除去し、ＭｅＯＨ中１％のＴＥＡおよび１ＭのＮａＯＨ（水溶液）で洗浄した。ろ液を１ＭのＨＣｌ（水溶液）で中和し、減圧下で濃縮したところ、ＮＡＧ３１（０．０５２ｇ、２８％の収率）が得られた。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ１６Ｈ３１Ｎ３Ｏ７：３７７．４、実測値：３７７．６［Ｍ＋Ｈ］。
【０４９６】
（｛３−［６−（イソプロピリデンヒドラジノ）−ニコチノイルアミノ］ブロピルアミノ｝−５−オキソペンタノイル）２−デオキシ２−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＡＧ３２）の調製。ＭＳＯ（１ｍＬ）中の溶液ＮＡＧ３１（０．００９ｇ、２２μｍｏｌ）を、ＨｙＮｉｃ−スルホ−ＮＨＳ（０．００７ｇ、１８μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．４μＬ、５４μｍｏｌ）で１時間処理し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＮＡＧ３２ＴＦＡ塩（０．０１０ｇ、６８％の収率）が得られた。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ２５Ｈ４０Ｎ６Ｏ８：５５２．６、実測値：５５４．０［Ｍ＋Ｈ］。
【０４９７】
グルシトール補助部分の合成：
ジ−グルシトールアジド補助部分の合成
【化２００】
2017522046.tif 000211
２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチルアミノＤ−グルシトール（ＰＯＨ２）の調製。メタノール（２ｍＬ）中のＤ−グルコース（０．０９３ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）およびアミノ−Ｐｅｇ３−アジド（０．１１ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の反応溶液を、室温で３時間撹拌した。１ｍＬのメタノール中のＮａＢＨ３ＣＮ（０．０３３ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた後、１滴の酢酸を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、その時点で、混合物を減圧下で濃縮し、分取ＨＰＬＣによって精製したところ、０．１１ｇの生成物ＰＯＨ２が油（５６％の収率）として得られた。Ｃ１４Ｈ３０Ｎ４Ｏ８についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値３８２．４、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋  ３８３．０。
【０４９８】
２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチルアミノ１，１−ビス（Ｄ−グルシトール）（ＰＯＨ３）の調製。メタノール（３ｍＬ）中のＤ−グルコース（０．１９ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）およびアミノ−Ｐｅｇ３−アジド（０．１１ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の反応溶液を室温で３時間撹拌した。１ｍＬのメタノール中のＮａＢＨ３ＣＮ（０．０６５ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた後、１滴の酢酸を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、その時点で、混合物を減圧下で濃縮し、分取ＨＰＬＣによって精製したところ、０．１３ｇの生成物ＰＯＨ３が油（４５％の収率）として得られた。Ｃ２０Ｈ４２Ｎ４Ｏ１３についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値５４６．６、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋  ５４７．０。
【０４９９】
ジ−グルシトールＨｙＮｉｃ補助部分の合成
【化２０１】
2017522046.tif 000212
（２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチルアミノ）｛６−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−カルボキシヒドラジノ］−３−ピリジル｝ホルムアルデヒド（ＰＯＨ４）の調製。ＤＭＦ（５ｍＬ）中の６−Ｂｏｃ−ヒドラジノニコチン酸（ＮＡＧ９、０．２５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、アミノ−Ｐｅｇ３−アジド（ＰＯＨ１、０．２２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（０．８３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ・Ｈ２Ｏ（０．３１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．７０ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）を室温で加えた。反応混合物を１６時間撹拌し、その時点で、混合物を減圧下で濃縮した。粗混合物を３０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）および塩水（１０ｍＬ）によって連続して洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、（酢酸エチル、５％のメタノール）／ヘキサン溶媒系（Ｃｏｍｂｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｒｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで０〜１００％の勾配）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗混合物を精製したところ、０．０９８ｇの中間体ＰＯＨ４が無色油（２２％の収率）として得られた。Ｃ１９Ｈ３７Ｎ７Ｏ６についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値４５３．５、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋  ４５４．０。
【０５００】
（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチルアミノ）｛６−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−カルボキシヒドラジノ］−３−ピリジル｝ホルムアルデヒド（ＰＯＨ５）の調製。４ｍＬのメタノール中の化合物ＰＯＨ４（０．０９８ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）および触媒量のＰｄ／炭素（１０％  ｗ／ｗ）を、室温で１時間にわたって水素雰囲気に曝した。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮したところ、０．０９０ｇのＰＯＨ５が油（９８％の収率）として得られ、それをさらに精製せずに次の反応に使用した。Ｃ１９Ｈ３３Ｎ５Ｏ６についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値４２７．５、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋  ４２８．０。
【０５０１】
｛２−［２−（２−｛２−［ビス（２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキシル）アミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エチルアミノ｝［６−（イソプロピリデンヒドラジノ）−３−ピリジル］ホルムアルデヒド（ＰＯＨ６）の調製。５ｍＬのメタノール中のＤ−グルコース（０．１６ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）および化合物ＰＯＨ５（０．０９ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の溶液を室温で３時間撹拌した。１ｍＬのメタノール中のＮａＢＨ３ＣＮ（０．０５４ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた後、１滴の酢酸を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。この懸濁液に、さらなる分量のＤ−グルコース（０．１６ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３時間撹拌し、その時点で、１ｍＬのメタノール中のＮａＢＨ３ＣＮ（０．０５４ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を加えた後、１滴の酢酸を加えた。反応混合物を室温で１６時間さらに撹拌した。分取ＨＰＬＣによる精製後、得られた生成物を、トリフルオロ酢酸／アセトン（９０：１０、ｖ／ｖ）で１５分間処理してから、その時点で、生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ画分の凍結乾燥により、３．０ｍｇの生成物ＰＯＨ６が油（２％の収率）として得られた。Ｃ２９Ｈ５３Ｎ５Ｏ１４についてのＥＳＩ  ＭＳ  計算値６９５．７、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋  ６９６．０。
【０５０２】
テトラ−グルシトールアジド補助部分の合成
【化２０２】
2017522046.tif 000213
３−｛Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル［４−（｛３−［３−（２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）プロピオニルアミノ］プロピル｝−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチル］アミノ｝ブロピルアミノ２，２−ジメチルプロピオネート（ＰＯＨ８）の調製。ＤＣＭ（３ｍＬ）中のＰＯＨ７（０．１８ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液を、ＮＨＳアジド−ＰＥＧ４カルボキシレート（０．１３ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．１２ｍＬ、０．６６ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を室温で１時間撹拌し、生成物の形成をＲＰ−ＬＣＭＳによって確認した。反応物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＯＨ８（０．２３ｇ、８９％の収率）が得られた。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ３６Ｈ６９Ｎ７Ｏ１１：７７５．５、実測値：７７６．０［Ｍ＋Ｈ］。
【０５０３】
１−｛３−［４−（３−アミノプロピルアミノ）ブチルアミノ］ブロピルアミノ｝−３−（２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）−１−プロパノン（ＰＯＨ９）の調製。ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中のトリ−Ｂｏｃ  ＰＯＨ８（０．２３ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１０ｍＬ）およびＴＩＰＳ（０．１０ｍＬ）で１時間処理し、減圧下で濃縮すると、ＰＯＨ９が定量的収率で得られた。ＰＯＨ９をさらに精製せずに次の工程に使用した。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ２１Ｈ４５Ｎ７Ｏ５：４７５．４、実測値：４７６．０［Ｍ＋Ｈ］。
【０５０４】
１−｛３−［４−（３−アミノプロピルアミノ）ブチルアミノ］ブロピルアミノ｝−３−（２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）−１−プロパノン（ＰＯＨ１０）の調製。ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の、トリ−アミンＰＯＨ９（０．２９ｍｍｏｌ）と、Ｄ−グルコース（１．４６ｇ、８．１１ｍｍｏｌ）と、ＮａＣＮＢＨ３（０．１５ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）との混合物を、４時間にわたって５０℃に加熱した。Ｄ−グルコースの３および４付加物の混合物が観察された。所望の付加物ＰＯＨ１０（０．０１６ｇ）を、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて単離した。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ４５Ｈ９３Ｎ７Ｏ２５：１１３２．３、実測値：１１３２．６［Ｍ＋Ｈ］。
【０５０５】
葉酸塩リガンドの合成：
【化２０３】
2017522046.tif 000214
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｐｅｇ１１葉酸塩（Ｆ２）の調製。ＤＭＳＯ（４ｍＬ）中の葉酸（２２５ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（８０μＬ、０．５１ｍｍｏｌ）を加えた。１．５時間撹拌した後、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｐｅｇ１１−ジアミン（２２０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応物を一晩撹拌した。水（３５ｍＬ）を加えると、沈殿物が形成され、それをろ過によって収集し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、Ｆ２（３６４ｍｇ、６７％の収率）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ４８Ｈ７７Ｎ９Ｏ１８：１０６７．５４、実測値：１０６９．８９［Ｍ＋Ｈ］。
【０５０６】
葉酸塩−ｐｅｇ１１−ＨｙＮｉｃアセトンヒドラゾン（Ｆ３）の調製。モノＢｏｃＦ２（２１０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（９ｍＬ）およびアセトン（１ｍＬ）で１．５時間処理し、得られた混合物を減圧下で濃縮し、残渣を高真空下で乾燥させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ４３Ｈ６９Ｎ９Ｏ１６：９６７．４８、実測値：９６９．８６［Ｍ＋Ｈ］。黄色がかった粗生成物固体をＤＭＳＯ（２００μＬ）に溶解させ、ＨｙＮｉｃ−ＮＨＳエステル（１０．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４０μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液で１．５時間処理した。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、Ｆ３（１．２ｍｇ、３．５％の収率）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量計算値Ｃ５２Ｈ７８Ｎ１２Ｏ１７：１１４２．５６、実測値：１１４４．０３［Ｍ＋Ｈ］。
【０５０７】
一価葉酸塩アジドの合成
【化２０４】
2017522046.tif 000215
アジド−Ｐｅｇ４−アミド−Ｐｅｇ１１葉酸塩（Ｆ６）の調製。ＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）中のアミノ−Ｐｅｇ１１葉酸塩Ｆ４（１１５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）中のＴＢＴＵ（４２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（６３μＬ、０．３６ｍｍｏｌ）で活性化されたアジド−Ｐｅｇ４酸（３８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。２時間後、塩基を減圧下で除去し、粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、Ｆ６（７５ｍｇ、５０％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ５４Ｈ８８Ｎ１２Ｏ２１：１２４０．６１、実測値：１２４１．７［Ｍ＋Ｈ］＋、６２１．５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
【０５０８】
ＰＳＭＡリガンドの合成
【化２０５】
2017522046.tif 000216
Ｃｂｚ−ＬｙｓウレイドＧｌｕトリス−ｔ−ブチルエステル（ＰＳＭＡ４）の調製。ＣＨ２Ｃｌ２（１０．０ｍＬ）中のグルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．０６ｇ、３．５８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２７ｍｇ）、およびＴＥＡ（１．２５ｍＬ、８．９５ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＣＤＩ（６３８ｍｇ、３．９４ｍｍｏｌ）を一度に加えた。３０分後、反応物を氷浴から取り出し、一晩撹拌した。反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）、水、および塩水で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた後、有機層を減圧下で濃縮し、高真空下で乾燥させたところ、ＰＳＭＡ２が得られた。ＤＣＥ（１０ｍＬ）中のＰＳＭＡ２の溶液を０℃に冷却し、ＭｅＯＴｆ（０．５９ｇ、３．５８ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．００ｍＬ、７．１６ｍｍｏｌ）で連続して処理した。４５分後、ＤＣＥ（２ｍＬ）中のＣｂｚ−Ｌｙｓ  ｔ−ブチルエステルＰＳＭＡ３（１．３４ｇ、３．５８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を４０℃に加熱した。２時間後、反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）、水、および塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮したところ、高粘度のシロップが得られた。粗材料をＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＳＭＡ４（１．７３ｇ、７８％）が白色の発泡体として得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３２Ｈ５１Ｎ３Ｏ９：６２１．３６、実測値：６２２．４［Ｍ＋Ｈ］＋、６４４．４［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０５０９】
ＬｙｓウレイドＧｌｕトリス−ｔ−ブチルエステル（ＰＳＭＡ５）の調製。ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中のＰＳＭＡ４（１．７３ｇ、２．７９ｍｍｏｌ）の溶液を真空の付加およびアルゴンでのバックフィルによって脱気した。パラジウム（活性炭に担持されて１０重量％、０．１５ｇ）を一度に加え、混合物を、真空の付加およびＨ２（ｇ）でのパージによって脱気し、６時間撹拌した。触媒をろ過によって除去し、母液を減圧下で濃縮したところ、ＰＳＭＡ５が定量的に得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ２４Ｈ４５Ｎ３Ｏ７：４８７．３２、実測値：４８８．４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５１０】
一価ＰＳＭＡアジド（ＰＳＭＡ７）の合成
【化２０６】
2017522046.tif 000217
アジド−Ｐｅｇ４−ＬｙｓウレイドＧｌｕトリス−ｔ−ブチルエステル（ＰＳＭＡ６）の調製。アジド−Ｐｅｇ４酸（１３３ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中のＴＢＴＵ（１４６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２１６μＬ、１．２４ｍｍｏｌ）で活性化した。１５分後、ＰＳＭＡ５（２０２ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液を供給し、反応物を室温で１．５時間撹拌した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、所望の生成物の形成が示された。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＳＭＡ６（２５７ｍｇ、８３％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３５Ｈ６４Ｎ６Ｏ１２：７６０．４６、実測値：７６１．５［Ｍ＋Ｈ］＋、７８３．５［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０５１１】
アジド−Ｐｅｇ４−ＬｙｓウレイドＧｌｕ（ＰＳＭＡ７）の調製。トリス−ｔｅｒｔ−ブチルエステルＰＳＭＡ６（２５７ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ：ＴＩＰＳ（１０ｍＬ、９７．５：２．５、ｖ／ｖ）の溶液で３０分間処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、所望の生成物への完全な転化が示された。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＰＳＭＡ７（１１２ｍｇ、５６％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ２３Ｈ４０Ｎ６Ｏ１２：５９２．２７、実測値：５９３．３［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５１２】
一価ＰＳＭＡ  ＨｙＮｉｃ（ＰＳＭＡ１０）の合成
【化２０７】
2017522046.tif 000218
Ｎ−Ｂｏｃ４−ヒドラジノ−ニコチンアミドＰｅｇ４酸（ＰＳＭＡ８）の調製。Ｎ−Ｂｏｃ４−ヒドラジノニコチン酸ＮＡＧ９（１３７ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵ（１２４ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（８３ｍｇ、０．５４ｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（１２８μＬ、０．７４ｍｍｏｌ）で２０分間処理した。活性化エステルに、アミノ−Ｐｅｇ４−酸（１３０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を２時間撹拌した。反応物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＳＭＡ８（１０７ｍｇ、４４％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ２２Ｈ３６Ｎ４Ｏ９：５００．２５、実測値：５０１．３［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５１３】
Ｎ−Ｂｏｃ４−ヒドラジノ−ニコチンアミドＰｅｇ４−ε−アミドｌｙｓ−α−ウレイド−ｇｌｕトリ−ｔ−ブチルエステル（ＰＳＭＡ９）の調製。ＰＳＭＡ８（１０７ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を、１時間にわたってＤＭＦ中のアミンＰＳＭＡ５（１０４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の存在下で、ＨＡＴＵ（８１ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９３μＬ、０．５３ｍｍｏｌ）で処理した。次に、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＳＭＡ９（８５ｍｇ、４２％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ４６Ｈ７９Ｎ７Ｏ１５：９６９．４６、実測値：７６０．６［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５１４】
ジメチル４−ヒドラゾノニコチンアミドＰｅｇ４−ε−アミドｌｙｓ−α−ウレイド−ｇｌｕ（ＰＳＭＡ１０）の調製。トリス−ｔ−ブチルエステルＰＳＭＡ９（８５ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ：アセトン（１０ｍＬ、９７．５：２．５、ｖ／ｖ）の溶液で３０分間処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、所望の生成物への完全な転化が示された。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＰＳＭＡ１０（５５ｍｇ、８４％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３２Ｈ５１Ｎ７Ｏ１３：７４１．３５、実測値：７４２．４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５１５】
二価ＰＳＭＡアジド（ＰＳＭＡ１８）の合成
【化２０８】
2017522046.tif 000219
Ｎ−Ｆｍｏｃビス−イミノ−（アセトアミド−Ｐｅｇ４  ｔ−ブチルエステル）（ＰＳＭＡ１３）の調製。Ｎ−Ｆｍｏｃイミノ二酢酸、ＰＳＭＡ１１、（１０７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を、２時間にわたってＤＭＦ中のＰＳＭＡ１２（２１２ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（１９３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（９２ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２０９μＬ、１．２０ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＳＭＡ１３（２５０ｍｇ、９１％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ４９Ｈ７５Ｎ３Ｏ１６：９６１．５１、実測値：９６２．６［Ｍ＋Ｈ］＋、９８４．６［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０５１６】
Ｎ−Ｆｍｏｃビス−イミノ−（アセトアミド−Ｐｅｇ４−ε−アミドｌｙｓ−α−ウレイド−ｇｌｕトリ−ｔ−ブチルエステル）（ＰＳＭＡ１５）の調製。ＤＣＭ（１ｍＬ）中のジ−ｔ−ブチルエステルＰＭＳＡ１３（２５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１０ｍＬ）およびＴＩＰＳ（１１１μＬ、０．５４ｍｍｏｌ）で処理した。３０分後、反応物を減圧下で濃縮したところ、シロップが得られ、それをヘキサンで洗浄したところ、二酸ＰＳＭＡ１４が高粘度のシロップとして得られた。ＰＳＭＡ１４を、１時間にわたってＤＭＦ中のＨＡＴＵ（１９８ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）、ＰＳＭＡ５（２９２ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（３６２μＬ、２．０８ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＳＭＡ１５（４０８ｍｇ、８８％）が得られた。ＰＳＭＡ１４：ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ４１Ｈ５９Ｎ３Ｏ１６：８４９．３９、実測値：８５０．５［Ｍ＋Ｈ］＋、８７２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋。ＰＳＭＡ１５：ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ８９Ｈ１４５Ｎ９Ｏ２８：１７８８．０２、実測値：８９５．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋、９１７．２［Ｍ＋２Ｎａ］２＋
【０５１７】
ビス−イミノ−（アセトアミド−Ｐｅｇ４−ε−アミドｌｙｓ−α−ウレイド−ｇｌｕトリ−ｔ−ブチルエステル）（ＰＳＭＡ１６）の調製。アセトニトリル（１０ｍＬ）中のＮ−Ｆｍｏｃ  ＰＭＳＡ１５（４０８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、ピペリジンで３０分間処理した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＰｈＭｅ（３×１０ｍＬ）と共沸混合し、ヘキサン（３×２０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で乾燥させたところ、ＰＳＭＡ１６が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ７４Ｈ１３５Ｎ９Ｏ２６：１５６５．９５、実測値：８９５．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋、９１７．２［Ｍ＋２Ｎａ］２＋
【０５１８】
アジド−Ｐｅｇ４−イミド−ビス−（アセトアミド−Ｐｅｇ４−ε−アミドｌｙｓ−α−ウレイド−ｇｌｕトリ−ｔ−ブチルエステル）（ＰＳＭＡ１７）の調製。アミンＰＭＳＡ１６（１７２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＨＡＴＵ（５２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１１６μＬ、０．６６ｍｍｏｌ）で活性化されたＮ３−Ｐｅｇ４−ＣＯＯＨ（４０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）に加えた。１時間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＳＭＡ１７（１９４ｍｇ、９１％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ８５Ｈ１５４Ｎ１２Ｏ３１：１８３９．０８、実測値：８９５．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋、９１７．２［Ｍ＋２Ｎａ］２＋
【０５１９】
アジド−Ｐｅｇ４−イミド−ビス−（アセトアミド−Ｐｅｇ４−ε−アミドｌｙｓ−α−ウレイド−ｇｌｕ）（ＰＳＭＡ１８）の調製。ヘキサ−ｔ−ブチルエステルＰＳＭＡ１７（１９４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ：アセトン（１０ｍＬ、９７．５：２．５、ｖ／ｖ）の溶液で３０分間処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、所望の生成物への完全な転化が示された。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＰＳＭＡ１８（６９．４ｍｇ、４４％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ６１Ｈ１０６Ｎ１２Ｏ３１：１５０２．７０、実測値：７５２．５［Ｍ＋２Ｈ］２＋
【０５２０】
二価ＰＳＭＡ  ＨｙＮｉｃ（ＰＳＭＡ２０）の合成
【化２０９】
2017522046.tif 000220
Ｎ−Ｂｏｃ４−ヒドラジノ−ニコチンアミドＰｅｇ４−イミド−ビス−（アセトアミド−Ｐｅｇ４−ε−アミドｌｙｓ−α−ウレイド−ｇｌｕトリ−ｔ−ブチルエステル）（ＰＳＭＡ１９）の調製。アミンＰＭＳＡ１６（１７２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＨＡＴＵ（４６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１１６μＬ、０．６６ｍｍｏｌ）で活性化されたＰＳＭＡ８（６１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）に加えた。１時間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２ゲルクロマトグラフィーによって精製したところ、ＰＳＭＡ１９（２０１ｍｇ、８９％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ９６Ｈ１６９Ｎ１３Ｏ３４：２０４８．１９、実測値：１０２５．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋、６８４．０［Ｍ＋３Ｈ］３＋
【０５２１】
ジメチル４−ヒドラゾノ−ニコチンアミド−Ｐｅｇ４−イミド−ビス−（アセトアミド−Ｐｅｇ４−ε−アミドｌｙｓ−α−ウレイド−ｇｌｕ）（ＰＳＭＡ２０）の調製。ヘキサ−ｔ−ブチルエステルＰＳＭＡ１９（２０１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ：アセトン（１０ｍＬ、９：１、ｖ／ｖ）の溶液で６０分間処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、所望の生成物への完全な転化が示された。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＰＳＭＡ２０（６９．４ｍｇ、４４％）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ７０Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ３２：１６５１．７９、実測値：８２７．１［Ｍ＋２Ｈ］２＋
【０５２２】
マンノースリガンドの合成：
【化２１０】
2017522046.tif 000221
Ｌｙｓ６−Ｐｅｇ２４−ＨｙＮｉｃ（Ｍ５）の調製。ＨＣＴＵカップリンおよび２０％のピペリジン脱保護による、リンク（Ｒｉｎｋ）アミド樹脂（０．６１ｍｍｏｌ／ｇ）における標準的なＦｍｏｃ化学を用いて、ペプチド骨格を合成した。簡潔には、２５μｍｏｌスケールの自動合成装置でペプチドＭ１を調製した。Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）の脱保護の後、Ｐｅｇ２４アミノ（Ｍｔｔ）酸をカップリングして、Ｍ３を得た。Ｍｔｔ基およびの除去およびそれに続くＢｏｃＨｙＮｉｃのカップリングにより、Ｍ４が得られた。トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：水：アセトン：ジチオスレイトール（９０：２：２：３：３）を用いた樹脂からのペプチドの放出およびＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、Ｍ５（７．０ｍｇ）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ９６Ｈ１８５Ｎ１７Ｏ３２：２０８８．３３、実測値：１０４６ｍ／２ｚ、６９８ｍ／３ｚ、５２４ｍ／４ｚ。
【０５２３】
Ｍａｎ６−Ｌｙｓ６−Ｐｅｇ２４−ＨｙＮｉｃ（Ｍ６）の調製。ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のペプチド骨格Ｍ５（７．０ｍｇ）を、マンノースイソチオシアネート（８．０ｍｇ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ；２００μＬ）で処理した。反応物を３７℃で４時間撹拌し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、Ｍ６（１．２ｍｇ）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量計算値Ｃ１７４Ｈ２７５Ｎ２３Ｏ６８Ｓ６：３９６６．７０、実測値：３９８７．３９［Ｍ＋Ｎａ］。
【０５２４】
六価マンノースアジド（Ｍ９）の合成
【化２１１】
2017522046.tif 000222
Ｌｙｓ６−Ｐｅｇ２４−アジド（Ｍ８）の調製。ＨＣＴＵカップリングおよび２０％のピペリジン脱保護による、リンク（Ｒｉｎｋ）アミド樹脂（０．６１ｍｍｏｌ／ｇ）における標準的なＦｍｏｃ化学を用いて、ペプチド骨格を合成した。簡潔には、１００μｍｏｌスケールの自動合成装置でペプチドＭ１を調製した。Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）の脱保護の後、アジド−Ｐｅｇ２４酸をカップリングして、Ｍ７を得た。混液ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９２．５：２．５：５）を用いた樹脂からのペプチドの放出により、Ｍ８（１６７．０ｍｇ）が得られた。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  質量計算値  Ｃ８７Ｈ１７４Ｎ１６Ｏ３１：１９４０．４、実測値：１９４１．１
【０５２５】
Ｍａｎ６−Ｌｙｓ６−Ｐｅｇ２４−アジド（Ｍ９）の調製。ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中のペプチド骨格Ｍ４（１６７．０ｍｇ）を、マンノースイソチオシアネートおよびＮＭＭ（５００μＬ）で処理した。反応混合物を３７℃で撹拌し、所望の生成物への完全な転化が達成されるまでＭＡＬＤＩ  ＴＯＦによってモニターした（合計５８ｍｇのマンノースイソチオシアネートを加えた）。最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、Ｍ９（２２ｍｇ）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量計算値Ｃ１６５Ｈ２６４Ｎ２２Ｏ６７Ｓ６：３８２０．３７、実測値：３８４３．７９［Ｍ＋Ｎａ］。
【０５２６】
三価マンノースアジド（Ｍ１５）の合成
【化２１２】
2017522046.tif 000223
アジドトリ−マンノース（Ｍ１５）の調製：Ｄ−マンノースを、一晩、ピリジン中のＡｃ２Ｏによってペルアセチル化した。回転蒸発による濃縮、続いてＰｈＭｅとの共沸により、五酢酸塩（Ｍ８）が定量的収率で得られた。市販のアジド−Ｐｅｇ２アルコールの存在下におけるＳｃ（ＯＴｆ）３によるＭ８の活性化により、アジド−Ｐｅｇ２マンノシド（Ｍ９）が得られ、それを、定量的にアミン（Ｍ１０）へと水素化した。一方、トリスリンカーのメチルエステル（ＮＡＧ１３）を、酸（Ｍ１１）へと選択的に加水分解した。ＴＢＴＵ活性化による市販のアジド−Ｐｅｇ３アミンとＭ１１とのカップリングにより、アジドトリスリンカー（Ｍ１２）が得られた。ＴＦＡによるトリｔ−ブチルエステルＭ１２の処理により、トリ−酸Ｍ１３が得られた。Ｍ１０とＭ１３とのカップリングを、ＨＡＴＵによって媒介し、粗混合物を全体的に脱アセチル化したところ、アジドトリ−マンノース（Ｍ１５）が得られた。
【０５２７】
一価マンノースホスホラミダイト（Ｍ２１）の合成
【化２１３】
2017522046.tif 000224
マンノースジスルフィド２−フルオロウリジンホスホラミダイト（Ｍ２１）の調製：標準的な保護／脱保護化学によって、Ｍ９の酢酸塩を、脱アセチル化中間体Ｍ１６を経て、ｔ−ブチルシリル（ＴＢＳ）Ｍ１７に転化した。水素化によるアジドＭ１７のアミンＭ１８への還元により、ヒンダードチオラクトンによるＮ−アシル化が促進されて、チオールＭ１９が得られた。ジスルフィドＭ２０が、アリールメルカプト−チオピリジンの添加によってはっきりと形成され、ＭｅＯＴｆで予め活性化した。ホスホラミダイトＭ２１は、ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンによる２−フルオロウリジンの処理、続いて糖ジスルフィドＭ２０の添加によって、標準的な２工程ワンポット法で形成されるものであった。
【０５２８】
六価マンノースアジド（Ｍ３０）の合成
【化２１４】
2017522046.tif 000225
Ｎ−カルボベンジルオキシトリス−（ｔ−ブトキシカルボエトキシメチル）−メチルアミド（Ｍ２２）の調製：氷浴中で冷却されたＣＨ２Ｃｌ２（１２ｍＬ）中のＮＡＧ１２（３．５５ｇ、７．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｃｂｚ−Ｃｌ（ＰｈＭｅ中３５％、７．３ｍＬ）およびＴＥＡ（３．９ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温に温め、一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をＳｉＯ２クロマトグラフィーによって精製したところ、Ｍ２２（０．９８ｇ、２２％の収率）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３３Ｈ５３ＮＯ１１：６３９．４、実測値：６６２．４［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０５２９】
Ｎ−カルボベンジルオキシトリス−（（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｐｅｇ３−アミドエトキシメチル）−メチルアミド（Ｍ２４）の調製：ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のトリス−ｔ−ブチルエステルＭ２２（０．９７ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）およびＴＩＰＳ（０．９３ｍＬ、４．５５ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（２０ｍＬ）で５時間処理した。混合物を減圧下で濃縮し、油状の残渣をヘキサンで洗浄し、高真空下で乾燥させたところ、Ｍ２３が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ２１Ｈ２９ＮＯ１１：４７１．２、実測値：４９３．９［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０５３０】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の粗生成物Ｍ２３を、氷浴中で冷却し、ＨＡＴＵ（０．６２ｇ、１．６３）およびＤＩＥＡ（０．６５ｍＬ、３．７１ｍｍｏｌ）で処理した。２０分間撹拌した後、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＭ１０（０．８９ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を室温に温め、３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をＥｔＯＡｃに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。ＳｉＯ２クロマトグラフィーによる精製により、Ｍ２４（０．４９ｇ、６２％の収率）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量計算値  Ｃ８１Ｈ１２２Ｎ４Ｏ４４：１８５４．７４、実測値：１８５０．１４
【０５３１】
トリス−（（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｐｅｇ３−アミドエトキシメチル）−メチルアミン（Ｍ２５）の調製：Ｍ２４（０．４９ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液を、ＨＯＡｃ（０．２ｍＬ）を含むＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させ、真空の付加およびＡｒ（ｇ）でのバックフィルによって脱気した。活性炭に担持されたＰｄ（０．１６ｇ）を加え、混合物を排気し、次に、Ｈ２（ｇ）で３回パージした。反応混合物を２日間撹拌し、触媒をろ過によって除去し、母液を減圧下で濃縮したところ、Ｍ２５が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ７３Ｈ１１６Ｎ４Ｏ４２：１７２０．７、実測値：１７２３．４２
【０５３２】
【化２１５】
2017522046.tif 000226
アジド−Ｐｅｇ４−イミド−ビス−（アセトアミド−Ｐｅｇ４−ｔ−ブチルエステル）（Ｍ２７）の調製：ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ−Ｆｍｏｃ  ＰＳＭＡ１３（０．７２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を、ピペリジン（０．７５ｍＬ）で１時間処理した。ＨＰＬＣＭＳにより、Ｍ２６への完全な転化が示された。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３４Ｈ６５Ｎ３Ｏ１４：７３９．４、実測値：７４０．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０５３３】
混合物を減圧下で濃縮し、ＰｈＭｅと共沸混合した。粗生成物Ｍ２６を、１時間にわたってＤＭＦ（５ｍＬ）中のアジド−Ｐｅｇ４酸（０．４４ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．５７ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．５２ｍＬ）の溶液と反応させた。溶媒を減圧下で除去した後、粗生成物をＥｔＯＡｃに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。ＳｉＯ２クロマトグラフィーによる精製により、Ｍ２７（０．７１ｇ、９３％の収率、２工程）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ４５Ｈ８４Ｎ６Ｏ１９：１０１２．６、実測値：１０１３．６［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５３４】
アジド−Ｐｅｇ４−イミド−ビス−（三量体マンノース）（Ｍ３０）の調製：イミドリンカーＭ２７（０．６９ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を、ＴＩＰＳ（０．２８ｍＬ、１．３６ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（１０ｍＬ）で処理したところ、トリ酸Ｍ２８が得られた；ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３７Ｈ６８Ｎ６Ｏ１９：９００．５、実測値：９００．９［Ｍ＋Ｈ］＋、９２２．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。揮発性物質を減圧下で除去し、Ｍ２８を高真空下で乾燥させた。二酸Ｍ２８（８２．０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、０℃で、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＨＡＴＵ（７５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．２８ｍＬ）で活性化した。３０分後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＭ２５（０．２６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を室温に温め、２時間撹拌した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、Ｍ２９への完全な転化が示された；質量計算値  Ｃ１８３Ｈ２９６Ｎ１４Ｏ１０１：４３０５．８４。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  実測値：４３０３．３６  ＡＰ−ＥＳＩ＋  実測値：１４３６．１［Ｍ＋３Ｈ］３＋、１０７７．３［Ｍ＋４Ｈ］４＋。反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物Ｍ２９（５３８ｍｇ）を、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解させ、ＮａＯＭｅ（ＭｅＯＨ中２５重量％、０．５ｍＬ）で１時間処理した。ＲＰ−ＨＰＬＣＭＳにより、Ｍ３０への完全な転化が示された。反応物を、Ｄｏｗｅｘ  Ｈ＋樹脂の添加による中和によってクエンチした。粗材料をＨＰＬＣによって精製したところ、Ｍ３０（３８．１ｍｇ、３工程で１３％の収率）が得られた。質量計算値  Ｃ１３５Ｈ２４８Ｎ１４Ｏ７７：３２９７．５９、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  実測値：３３１８．６１［Ｍ＋Ｎａ］＋  ＡＰ−ＥＳＩ＋  実測値：１１００．０［Ｍ＋３Ｈ］３＋、８２５．３［Ｍ＋４Ｈ］４＋。
【０５３５】
ＡＢＬリガンド（ＡＢＬ）の合成
【化２１６】
2017522046.tif 000227
Ｎ−パルミトイルＬ−グルタミン酸α−ｔ−ブトキシエステル（ＡＢＬ３）の調製：ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のパルミチン酸ＡＢＬ１（１．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．９ｇ、７．６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルカルボジイミド（１．２ｍＬ、７．６ｍｍｏｌ）で一晩処理したところ、エステル（ＡＢＬ２）が得られた。沈殿物をろ過によって除去し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。得られた残渣をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解させ、グルタミン酸ｔ−ブチルエステル（０．７ｇ、３．４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．８ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）で処理した。２時間後、反応混合物を水で希釈し、所望の生成物をＥｔ２Ｏで抽出した。エーテル層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、粗生成物の塊をＳｉＯ２クロマトグラフィーによって精製したところ、オフホワイトの固体ＡＢＬ３（１．２ｇ、７４％の収率）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ２５Ｈ４７ＮＯ５：４４１．３、実測値：４６４．０［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０５３６】
Ｎ−パルミトイルδ−（アミドＰｅｇ３アジド）Ｌ−グルタミン酸α−ｔ−ブトキシエステル（ＡＢＬ４）の調製：ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＡＢＬ３（１．２４ｇ、２．８ｍｍｏｌ）の溶液に、１１−アジド−Ｐｅｇ３アミン（０．９２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルカルボジイミド（０．８７ｍＬ、５．６ｍｍｏｌ）を加えた。一晩撹拌した後、沈殿物をろ過によって除去し、母液を減圧下で濃縮し、粗生成物の塊をＳｉＯ２クロマトグラフィーによって精製したところ、オフホワイトの固体ＡＢＬ４（１．７ｇ、９４％の収率）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３３Ｈ６３Ｎ５Ｏ７：６４１．５、実測値：６４２．４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５３７】
Ｎ−パルミトイルδ−（アミドＰｅｇ３アジド）Ｌ−グルタミン酸（ＡＢＬ５）の調製：ＤＣＭ（２ｍＬ）中のｔ−ブチルエステルＡＢＬ４（１．７１ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）およびＴＩＰＳ（０．５４ｍＬ、２．６６ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＦＡ（１０ｍＬ）で処理した。１．５時間後、混合物を減圧下で濃縮した。油状の粗生成物をヘキサンで洗浄し、減圧下で乾燥させ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＡＢＬ５（９３０ｍｇ、６０％の収率）が得られた。
ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ２９Ｈ５５Ｎ５Ｏ７：５８５．４、実測値：５８６．０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５３８】
【化２１７】
2017522046.tif 000228
Ｎ−α−ＦｍｏｃＮ−イミダジル−トリチルα−（アミドＰｅｇ３アジド）Ｌ−ヒスチジン（ＡＢＬ７）の調製：ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＮ−α−Ｆｍｏｃ  Ｎ−イミダゾリル−トリチルＬ−ヒスチジン（１．００ｇ、１．６１ｍｍｏｌ）を、２０分間にわたってＴＢＴＵ（０．５７ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２７ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．８４ｍＬ、４．８４ｍｍｏｌ）で活性化した。ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の１１−アジド−Ｐｅｇ３アミン（０．３５ｇ、１．６１ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を３時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏで希釈し、Ｅｔ２Ｏで抽出した。エーテル層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、粗生成物の塊をＳｉＯ２クロマトグラフィーによって精製したところ、淡黄色の固体ＡＢＬ７（１．１７ｇ、８８％の収率）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ４８Ｈ４９Ｎ７Ｏ６：８１９．４、実測値：８１９．８［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５３９】
Ｎ−α−パルミトイルＮ−イミダゾリル−トリチルα−（アミドＰｅｇ３アジド）Ｌ−ヒスチジン（ＡＢＬ９）の調製：ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のＮ−Ｆｍｏｃ  ＡＢＬ７（１．１７ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を、ピペリジン（０．５６ｍＬ）で処理し、１時間撹拌したところ、許容できる純度のＡＢＬ８が得られた；ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３３Ｈ３９Ｎ７Ｏ４：５９７．３、実測値：５９７．９［Ｍ＋Ｈ］＋。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をヘキサンで洗浄した。粗生成物ＡＢＬ８をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解させ、パルミチン酸（０．７３ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（０．３６ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）、およびＮＨＳ（０．４３ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）で処理した。沈殿物をろ過によって除去し、粗生成物をＳｉＯ２クロマトグラフィーによって精製したところ、オフホワイトの固体ＡＢＬ９（０．７１ｇ、６０％の収率）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ４９Ｈ６９Ｎ７Ｏ５：８３５．５、実測値：８３５．９［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５４０】
Ｎ−α−パルミトイルα−（アミドＰｅｇ３アジド）Ｌ−ヒスチジン（ＡＢＬ１０）の調製：ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＮ−イミダゾリル−トリチルＡＢＬ９（０．７１ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）およびＴＩＰＳ（０．１７ｍＬ、０．８５ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＦＡ（１０ｍＬ）で処理した。１．５時間後、混合物を減圧下で濃縮した。油状の粗生成物をヘキサンで洗浄し、減圧下で乾燥させ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、ＡＢＬ１０（３９４ｍｇ、７９％の収率）が得られた。ＡＰ−ＥＳＩ＋  質量計算値  Ｃ３０Ｈ５５Ｎ７Ｏ５：５９３．４、実測値：５９４．３［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５４１】
オリゴヌクレオチド架橋補助部分の合成：
【化２１８】
2017522046.tif 000229
３−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛６−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−カルボキシヒドラジノ］−ニコチノイルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］プロピオン酸（ＢＩＬ１）の調製。Ｎ−Ｂｏｃ４−ヒドラジノニコチン酸、ＮＡＧ９、（０．３８ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＴＢＴＵ（０．４８ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２３ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．３９ｇ、３．００ｍｇ）で活性化した。２０分後、Ｐｅｇ８アミノ酸（０．４４ｇ、１．００ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨを用いたＳｉＯ２クロマトグラフィーによって精製したところ、ＢＩＬ１（０．３９ｇ、５８％の収率）が得られた。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ３０Ｈ７２Ｎ４Ｏ１３：６７６．４、実測値：６７７．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０５４２】
メチル（２Ｓ）−２，６−ビス｛３−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛６−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−カルボキシヒドラジノ］−ニコチノイルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］プロピオニルアミノ｝ヘキサノエート（ＢＩＬ２）の調製。ＢＩＬ１（０．３９ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＴＢＴＵ（０．１９ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０８９ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．２３ｍＬ、１．３０ｍｍｏｌ）で活性化した。１５分後、Ｌｙｓメチルエステル塩酸塩を、さらなるＤＩＥＡ（０．２３ｍＬ）とともに加えた。反応物を超音波で分解して、Ｌｙｓメチルエステルを完全に溶解させた。一晩撹拌した後、反応物を減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中５〜１５％のＭｅＯＨ）によって精製したところ、ＢＩＬ２（０．３８ｇ、９３％の収率）が得られた。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ６７Ｈ１１６Ｎ１０Ｏ２６：１４７６．８、実測値：１４７７．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０５４３】
（２Ｓ）−２，６−ビス｛３−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛６−［（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−カルボキシヒドラジノ］−ニコチノイルアミノ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］プロピオニルアミノ｝ヘキサン酸（ＢＩＬ３）の調製。ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のＢＩＬ２（０．３７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、水（２ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２ｍＬ）中のＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０３２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）による処理によってけん化した。反応物を室温で１時間撹拌し、その後、ＨＰＬＣＭＳにより、完全な転化が示された。混合物を、Ｄｏｗｅｘ  Ｈ＋樹脂で中和し、ろ液を減圧下で濃縮したところ、ＢＩＬ３（０．２５ｇ、６６％の収率）が得られた。この材料は、次の反応のために十分に純粋であった。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ６６Ｈ１１４Ｎ１０Ｏ２６：１４６２．８、実測値：７３２．０  ［Ｍ＋Ｈ］３＋  ｍ／３ｚ。
【０５４４】
（２Ｓ）−１−［３−（２−｛２−［２−（３−｛２−アザトリシクロ［１０．４．０．０４，９］ヘキサデカ−１（１６），４，６，８，１２，１４−ヘキサエン−１０−イン−２−イル｝−３−オキソプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）ブロピルアミノ］−２，６−ビス［３−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［６−（イソプロピリデンヒドラジノ）−ニコチノイルアミノ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］−エトキシ｝エトキシ）プロピオニルアミノ］−１−ヘキサノン（ＢＩＬ５）の調製。ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＢＩＬ３（０．１４ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、ＤＢＣＯ−ｐｅｇ４アミン（０．０４９ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）の存在下で、ＴＢＴＵ（０．０３３ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０１６ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（６５μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を室温で１時間撹拌し、減圧下で濃縮し、ＳｉＯ２クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中５％のＭｅＯＨ）によって精製したところ、ＢＩＬ４（０．０５１ｇ、２８％の収率）が得られた。ＥＳＩ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ９５Ｈ１４９Ｎ１３Ｏ３１：１９６８．０、実測値：８８４．７［Ｍ＋２Ｈ−２Ｂｏｃ］２＋。ＢＩＬ４（０．０５１ｇ）を、ＴＦＡ（９ｍＬ）および無水アセトン（１ｍＬ）で３０の間処理した。反応混合物を減圧下で濃縮し、高速ＲＰ−ＨＰＬＣ勾配によって精製したところ、ＢＩＬ５・２×ＴＦＡ塩（０．０５０ｇ、８５％の収率）が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ＋  質量計算値  Ｃ９１Ｈ１４１Ｎ１３Ｏ２７：１８４９．１６、実測値：１８５０．１４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０５４５】
ジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチド合成：
【化２１９】
2017522046.tif 000230
実験の詳細：
合成された全てのオリゴヌクレオチド配列を、血清安定性を向上させ、オフターゲット効果を最小限に抑えるために、２’−Ｆおよび２’−ＯＭｅ修飾で２’−リボース糖位置において修飾した。自動オリゴヌクレオチド合成（１μｍｏｌスケール）を、以下の試薬／溶媒を用いて行った：
酸化剤−ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ中０．０２ＭのＩ２（サイクル毎に６０秒の酸化）、
デブロック（Ｄｅｂｌｏｃｋ）−３％のトリクロロ酢酸（サイクル毎に２×４０秒のデブロック）、
Ｃａｐ  Ｍｉｘ  Ａ−ＴＨＦ／ピリジン／Ｐａｃ２Ｏ（サイクル毎に６０秒のキャッピング）、および
Ｃａｐ  Ｍｉｘ  Ｂ−ＴＨＦ中１６％のメチルイミダゾール（サイクル毎に６０秒のキャッピング）。
【０５４６】
標準的なオリゴヌクレオチド合成条件に対する例外は、以下のとおりであった：
−より軽度の脱保護のためのＱ−リンカー（ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸リンカーアーム）を有するＣＰＧ支持体を使用し；
−全てのジスルフィドホスホラミダイトを、合成前に、１００％の無水アセトニトリル中の１００ｍＭに再懸濁させ；
−ホスホラミダイト活性化を、２．５倍モル過剰の５−ベンジルチオ−１−Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）を用いて行った。活性化ホスホラミダイトを、挿入毎に２×３分のカップリング工程でカップリングした。
【０５４７】
ジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチド脱保護および精製プロトコル：
・自動オリゴヌクレオチド合成の後、ジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを切断し、室温で４時間にわたって、１ｍｌの、メタノール中１０％のジイソプロピルアミン（１０％のＤＩＡ／ＭｅＯＨ）中で脱保護した。４時間の脱保護の後、オリゴ試料を、遠心蒸発によって乾燥させた。
・標準的な保護基（ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、およびイソブチル（ｉＢｕ）など）を有するホスホラミダイトモノマーを用いたオリゴヌクレオチド合成において、得られたジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを切断し、室温で２時間にわたって１．０ｍＬのＡＭＡ（１：１の比率の３６％のアンモニア水溶液およびメタノール中４０％のメチルアミン）中で脱保護した後、遠心蒸発を行った。
・粗オリゴペレットを、１００μｌの５０％のアセトニトリル中で再懸濁させ、短時間で６５℃に加熱し、十分にボルテックスした。合計１００μｌの粗オリゴ試料を、以下の緩衝液／勾配を用いたＲＰ−ＨＰＬＣに注入した：
−緩衝液Ａ＝水中５０ｍＭのＴＥＡＡ；
−緩衝液Ｂ＝９０％のアセトニトリル；および
−流量＝１ｍｌ／分；
○勾配：
・０〜２分（１００％の緩衝液Ａ／０％の緩衝液Ｂ）、
・２〜４２分（０％〜６０％の緩衝液Ｂ）、および
・４２〜５５分（６０％〜１００％の緩衝液Ｂ）。
・ドミナントＲＰ−ＨＰＬＣピークにわたって、０．５ｍｌの画分を収集し、所望の質量の存在を確認するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。適正な質量を含む精製画分を凍結し、凍結乾燥させた。乾燥させたら、画分を再懸濁させ、対応する画分と組み合わせて、凍結し、凍結乾燥させて最終生成物を得た。
【０５４８】
さらなる脱保護を必要とするジスルフィド挿入物を、上述されるように、最初に単離した後、必要な二次脱保護工程を行った（以下を参照）：
アルデヒド−ジスルフィドホスホトリエステル二次脱保護：
ＲＰ−ＨＰＬＣ精製オリゴ生成物を、１００μｌの８０％のギ酸中で再懸濁させた。アルデヒド修飾毎に室温で約１時間にわたって反応を進行させた。反応を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によってモニターして、完全な脱保護を確認した。脱保護が完了したら、試料を凍結し、乾燥するまで凍結乾燥させた。次に、凍結乾燥された試料を、１ｍｌの２０％のアセトニトリル中で再懸濁させ、ゲルろ過して、最終オリゴ生成物を単離した。
【０５４９】
ヒドロキシル−ジスルフィドホスホトリエステル二次脱保護：
ＲＰ−ＨＰＬＣ精製オリゴ生成物を、２１９μｌの無水ＤＭＳＯ中で再懸濁させ、短時間で６５℃に加熱し、十分にボルテックスした。ＤＭＳＯ溶液に、３１μｌの６．１Ｍのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ．３ＨＦ）を加えて、０．７５Ｍの最終濃度を得た。ＴＢＤＭＳ保護されたヒドロキシル修飾毎に室温で約１時間にわたって反応を進行させた。反応を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によってモニターして、完全な脱保護を確認した。脱保護が完了したら、３５μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム、続いて１ｍｌのブタノールを加えた。試料を十分にボルテックスし、２時間にわたって−８０℃に置いた。２時間後、試料を遠心分離して、オリゴヌクレオチドをペレット化した。ブタノール層を除去し、オリゴペレットを、１ｍｌの２０％のアセトニトリル中で再懸濁させた。試料をゲルろ過して、最終オリゴ生成物を単離した。
【０５５０】
ホスホン酸メチル含有オリゴヌクレオチド合成：
市販のｐ−メチルホスホンアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄｉｔｅ）を用いて、本明細書に記載される標準的なオリゴ合成プロトコルを用いて、ホスホン酸メチルオリゴヌクレオチドを合成した。
【化２２０】
2017522046.tif 000231
【０５５１】
例えば、以下の市販のＰ−メチルホスホンアミダイトモノマーを、合成に使用した。
【化２２１】
2017522046.tif 000232
【０５５２】
ホスホロアミデート含有オリゴヌクレオチド合成：
以下の一般式のホスホロアミデートオリゴヌクレオチドを、対応するホスファイト（Ｈ−ホスホネート）およびアミンから合成した。
【０５５３】
【化２２２】
2017522046.tif 000233
【化２２３】
2017522046.tif 000234
【０５５４】
実験の詳細：
全ての調製されるオリゴヌクレオチドは、血清安定性を向上させ、オフターゲット効果を最小限に抑えるために、２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅ修飾リボースを含む。自動オリゴヌクレオチド合成（１μｍｏｌスケール）を、以下の工程を用いて行った：
脱保護−３％のトリクロロ酢酸（サイクル毎に２×４０秒のデブロック）
カップリング−無水アセトニトリル：ピリジン（１：１）中の１：１の塩化ピバロイル（０．５Ｍ）および３’−Ｈ−ホスホネート（０．１Ｍ）で２回
酸化工程−４．５：４．５：１のＣＣｌ４／ピリジン／ｎ−ブチルアミン（手動で、サイクル毎に２×１２０秒）
Ｃａｐ  Ｍｉｘ  Ａ−ＴＨＦ／ピリジン／Ｐａｃ２Ｏ（サイクル毎に６０秒のキャッピング）
Ｃａｐ  Ｍｉｘ  Ｂ−ＴＨＦ中１６％のメチルイミダゾール（サイクル毎に６０秒のキャッピング）。
【０５５５】
標準的なオリゴヌクレオチド合成条件に対する例外は、以下のとおりであった：
−より軽度の脱保護のためのＱ−リンカー（ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸リンカーアーム）を有するＣＰＧ支持体を使用した；
−保護された３’−Ｈ−ホスホネートを、合成前に、１：１の無水アセトニトリルおよびピリジン中の１００ｍＭに再懸濁させ；
−塩化ピバロイルを溶解させて、合成前に、１：１の無水アセトニトリルおよびピリジン中の５００ｍＭの溶液を得て、
−カップリング工程を手動で行い、保護された３’−Ｈ−ホスホネートの活性化を、５．０倍モル過剰の塩化ピバロイルを用いて行った。カップリング工程を、挿入毎に２×５分のカップリング工程で行った。
−ホスホロアミデート結合が、２×２分のサイクルで、９０：９０：２０μＬの無水ＣＣｌ４：ピリジン：ｎ−ブチルアミンを用いて酸化工程によって得られた。
【０５５６】
ジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチド脱保護および精製プロトコル：
・自動オリゴヌクレオチド合成の後、ジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを切断し、室温で４時間にわたって、１ｍｌの、メタノール中１０％のジイソプロピルアミン（１０％のＤＩＡ／ＭｅＯＨ）中で脱保護した。４時間の脱保護の後、オリゴ試料を、遠心蒸発によって乾燥させた。
・標準的な保護基（Ａ−Ｂｚ、Ｃ−ＡｃおよびＧ−ｉＢｕ（イソブチレート）など）を有するホスホラミダイトおよび３’−Ｈ−ホスホネートモノマーを用いたオリゴ合成において、ホスホロアミデートオリゴヌクレオチドを切断し、室温で２時間にわたって１．０ｍＬのＡＭＡ（１：１の比率の３６％のアンモニア水溶液およびメタノール中４０％のメチルアミン）中で脱保護した後、遠心蒸発を行った。
・粗オリゴペレットを、１００μｌの５０％のアセトニトリル中で再懸濁させ、短時間で６５℃に加熱し、十分にボルテックスした。合計１００の全ての粗オリゴ試料を、以下の緩衝液／勾配を用いたＲＰ−ＨＰＬＣに注入した：
−緩衝液Ａ＝水中５０ｍＭのＴＥＡＡ
−緩衝液Ｂ＝９０％のアセトニトリル
−流量＝１ｍｌ／分
○勾配：
・０〜２分（１００％の緩衝液Ａ／０％の緩衝液Ｂ）
・２〜４２分（０％〜６０％の緩衝液Ｂ）
・４２〜５５分（６０％〜１００％の緩衝液Ｂ）
・ドミナントＲＰ−ＨＰＬＣピークにわたって、０．５ｍｌの画分を収集し、所望の質量の存在を確認するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。適正な質量を含む精製画分を凍結し、凍結乾燥させた。乾燥させたら、画分を再懸濁させ、対応する画分と組み合わせて、凍結し、凍結乾燥させて最終生成物を得た。
【０５５７】
縮合反応によるジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチド共役−一般的なプロトコル（共役の一般的なスキーム１〜３を参照）：
・ジスルフィドホスホトリエステル二本鎖を、所望のパッセンジャーおよびガイド鎖オリゴの等モル混合によって作製した。５０ｍＭの最終濃度になるまで塩化ナトリウムを加えた後、試料を５分間にわたって６５℃に加熱し、室温に冷却させて、アニーリングを完了させた。
・アルデヒド修飾ジスルフィドホスホトリエステルオリゴの場合、ｓｉＲＮＡ二本鎖を、１×共役緩衝液中に希釈してから、所望のＨｙＮｉｃ共役部分を加えた。
共役緩衝液：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．５）、２０ｍＭのアニリン、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０％のアセトニトリル
・上記の反応物を混合してから、２倍モル過剰のＨｙＮｉｃ共役成分を混合物に加えた。反応を室温で１時間進行させた。
・１時間後、共役ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ゲルろ過、ＨＰＬＣ精製または遠心スピンろ過のいずれかによって単離して、細胞処理前の最終生成物を得た。
【０５５８】
クリック反応によるジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチド共役−一般的なプロトコル（共役の一般的なスキーム４〜９を参照）：
銅−ＴＨＰＴＡ複合体調製：
硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ）の５ｍＭの水溶液およびトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）の１０ｍＭの水溶液を、１：１（ｖ／ｖ）（１：２モル比）で混合し、室温で１時間静置させた。この複合体は、ヒュスゲン環状付加を触媒するのに使用され得る（例えば、一般的な共役スキーム４および５を参照）。
【０５５９】
クリック反応（１００ｎＭスケール）
１．７ｍＬのエッペンドルフチューブ中の７１０ｕＬの水および１００ｕＬのｔｅｒｔ−ブタノール（最終体積の１０％）の溶液に、６０ｕＬの銅−ＴＨＰＴＡ複合体、続いて、５０ｕＬの２ｍＭの、オリゴの溶液、６０ｕｌの２０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液および２０ｕＬの１０ｍＭの、ＧａｌＮＡｃ−アジドの溶液を加えた。十分に混合した後、溶液を室温で１時間静置させた。反応の完了をゲル分析によって確認した。
【０５６０】
反応混合物を、５〜１０倍モル過剰のＳｉｌｉａＭｅｔＳ（登録商標）ＴＡＡｃＯＮａ（樹脂結合ＥＤＴＡナトリウム塩）を含有するスクリューキャップバイアルに加える。混合物を１時間撹拌する。次に、この混合物を、ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）Ｎａｐ（商標）−１０  ｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）に通して溶離する。次に、溶液を、一晩、凍結し、凍結乾燥させた。
【０５６１】
金属フリーのクリック反応
また、［３＋２］環状付加を、銅を使用せずに、当該技術分野において公知の方法を用いて、ＤＢＣＯ部分を用いて行った（例えば、Ｊｅｗｅｔｔ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，３９：１２７２−１２７９，２０１０を参照）。
【０５６２】
【化２２４】
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【化２２５】
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【化２２６】
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【化２２７】
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【化２２８】
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【化２２９】
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【化２３０】
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【化２３１】
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【化２３２】
2017522046.tif 000243
【化２３３】
2017522046.tif 000244
【化２３４】
2017522046.tif 000245
【０５６３】
本明細書に記載される共役スキームは、生物不可逆的基にも適用可能であり、生物不可逆的基がジスルフィドを含まない点で、生物可逆的基を示す共役スキームと異なる。
【０５６４】
本発明のポリヌクレオチドの特定の合成
本発明のポリヌクレオチドを、本明細書に記載される方法にしたがって調製した。例示的なポリヌクレオチドは、図１Ａ中の配列または図１Ｂ中の配列（配列番号１１２および１１３）を有するｓｉＲＮＡ構築物である。配列番号１１３の例示的なＲＰ−ＨＰＬＣトレースが、図２に示される。配列番号１１３の配列を有するオリゴヌクレオチドを含有する粗反応混合物の質量スペクトルが、図３に示される。配列番号１１３の配列を有する精製オリゴヌクレオチドの質量スペクトルが、図４に示される。
【０５６５】
本発明の他のポリヌクレオチドを、本明細書に記載される方法にしたがって調製した。例えば、図５Ａは、配列番号１１２を有するｓｓＲＮＡを示し、単一ＡＤＳ共役ｓｓＲＮＡは、「ＡＤＳ共役」の構造を有する１つの５’末端ＡＤＳ共役部位を含有し、三重ＡＤＳ共役ｓｓＲＮＡは、それぞれが「ＡＤＳ共役」の構造を有する３つのＡＤＳ共役部位を含有する。図５Ｂ〜５Ｄは、ＡＤＳ共役構造のＺに含まれる共役標的化部分を含む１つまたは３つのヌクレオチドを有する本発明のポリヌクレオチドのいくつかのゲル分析を示す。
【０５６６】
標的化部分を含有する１つまたは３つの基を有するパッセンジャー鎖を含有する調製ｓｉＲＮＡ分子の一般的構造が、図６Ａおよび６Ｂに示される。図６Ａ中のガイド鎖は、５’末端Ｃｙ３部分を有する。本発明の２つの例示的なポリヌクレオチドは、図７Ａに示される１つまたは３つの葉酸塩−ＰＥＧ１１−ＨｙＮｉｃ基を含有する。（葉酸塩）１−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３は、５’末端Ｇのヌクレオチド間架橋基に共役された１つの葉酸塩−ＰＥＧ１１−ＨｙＮｉｃ基を含有する配列５’−ＧＣＵＡＣＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＣＡＵＡＵｔ（小文字ｔは、チミジンである；配列番号１１２）を有するポリヌクレオチド構築物である。（葉酸塩）３−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３は、５’−ＧＣＵの３つのヌクレオチド間架橋基に共役された３つの葉酸塩−ＰＥＧ１１−ＨｙＮｉｃ基を含有する配列５’−ＧＣＵＡＣＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＣＡＵＡＵｔを有するポリヌクレオチド構築物である。本発明の２つの例示的なポリヌクレオチドは、図７Ｂに示される１つまたは３つの（ＧａｌＮＡｃ）３−ＨｙＮｉｃ基を含有する。（ＧａｌＮＡｃ）３−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３は、５’末端Ｇのヌクレオチド間架橋基に共役された１つの（ＧａｌＮＡｃ）３−ＨｙＮｉｃ基を含有する配列５’−ＧＣＵＡＣＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＣＡＵＡＵｔを有するポリヌクレオチド構築物である。（ＧａｌＮＡｃ）９−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３は、５’−ＧＣＵの３つのヌクレオチド間架橋基に共役された３つの（ＧａｌＮＡｃ）３−ＨｙＮｉｃ基を含有する配列５’−ＧＣＵＡＣＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＣＡＵＡＵＴを有するポリヌクレオチド構築物である。本発明の２つの例示的なポリヌクレオチドは、図８に示される１つまたは３つのＭａｎ６−Ｌｙｓ６−ＰＥＧ２４−ＨｙＮｉｃ基を含有する。（マンノース）６−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３は、５’末端Ｇのヌクレオチド間架橋基に共役された１つのＭａｎ６−Ｌｙｓ６−ＰＥＧ２４−ＨｙＮｉｃ基を含有する配列５’−ＧＣＵＡＣＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＣＡＵＡＵＴを有するポリヌクレオチド構築物である。（マンノース）１８−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３は、５’末端生物可逆的基および５’−ＧＣＵ内の２つのヌクレオチド間生物可逆的基（生物可逆的基のそれぞれが、３つのヌクレオチド間基に共役されたＭａｎ６−Ｌｙｓ６−ＰＥＧ２４−ＨｙＮｉｃ基を含む）を含有する配列５’−ＧＣＵＡＣＡＵＵＣＵＧＧＡＧＡＣＡＵＡＵＴを有するポリヌクレオチド構築物である。
【０５６７】
本発明の他の調製ポリヌクレオチドは、生物不可逆的または生物可逆的基の一部として１〜１０個（例えば、１〜４つ）のヌクレオチド間基に共役された１〜３つのＧａｌＮＡｃモノマー（以下を参照）を含有する。
【化２３５】
2017522046.tif 000246
【０５６８】
例示的なｓｉＲＮＡトリエステルおよびコンジュゲートの一覧が、表５〜９ならびに図１０、１１、および２０Ａに示される。
【０５６９】
【表１１】
2017522046.tif 000247
【０５７０】
【表１２】
2017522046.tif 000248
【０５７１】
【表１３】
2017522046.tif 000249
【０５７２】
【表１４】
2017522046.tif 000250
【０５７３】
【表１５】
2017522046.tif 000251
【０５７４】
【表１６】
2017522046.tif 000252
【０５７５】
本発明の混合ｓｉＲＮＡコンジュゲートが、表６に示される。
【０５７６】
【表１７】
2017522046.tif 000253
【０５７７】
【表１８】
2017522046.tif 000254
【０５７８】
【表１９】
2017522046.tif 000255
【０５７９】
【表２０】
2017522046.tif 000256
【０５８０】
【表２１】
2017522046.tif 000257
【０５８１】
【表２２】
2017522046.tif 000258
【０５８２】
【表２３】
2017522046.tif 000259
【０５８３】
【表２４】
2017522046.tif 000260
【０５８４】
【表２５】
2017522046.tif 000261
【０５８５】
【表２６】
2017522046.tif 000262
【０５８６】
【表２７】
2017522046.tif 000263
【０５８７】
【表２８】
2017522046.tif 000264
【０５８８】
【表２９】
2017522046.tif 000265
【０５８９】
【表３０】
2017522046.tif 000266
【０５９０】
表７について、ＳＢ−０５３５は、第１のパッセンジャー鎖の３’末端を、第２のパッセンジャー鎖の５’末端に連結するＰＥＧ６スペーサを含む。第１のパッセンジャー鎖は、第１のガイド鎖にハイブリダイズされ、第２のパッセンジャー鎖は、第２のガイド鎖にハイブリダイズされる。２つのガイド鎖は、互いに直接共有結合されない。ＰＥＧ６スペーサを、以下のホスホラミダイトから形成した。
【化２３６】
2017522046.tif 000267
【０５９１】
ＳＢ−０６００は、上記の表に示される２つのガイド鎖に共役されたＮＡＧ２１−ＢＩＬ５リンカーを含む。第１のガイド鎖は、第１のパッセンジャー鎖にハイブリダイズされ、第２のガイド鎖は、第２のパッセンジャー鎖にハイブリダイズされる。２つのパッセンジャー鎖は、互いに直接共有結合されない。ＳＢ−０６３９およびＳＢ−０６４０は、第１のパッセンジャー鎖の３’末端を、第２のパッセンジャー鎖の５’末端に連結するＣ６ジスルフィドスペーサを含む。第１のパッセンジャーは、第１のガイド鎖にハイブリダイズされ、第２のパッセンジャー鎖は、第２のガイド鎖にハイブリダイズされる。２つのガイド鎖は、互いに直接共有結合されない。Ｃ６ジスルフィドスペーサを、以下のホスホラミダイトから形成した。
【化２３７】
2017522046.tif 000268
【０５９２】
【表３１】
2017522046.tif 000269
【０５９３】
【表３２】
2017522046.tif 000270
【０５９４】
【表３３】
2017522046.tif 000271
【０５９５】
【表３４】
2017522046.tif 000272
【０５９６】
本明細書に開示される基のいずれも、以下の非限定的な例示的な基の１つを介してヌクレオチド間架橋リン酸塩またはは末端リン酸塩に連結され得る。
【化２３８】
2017522046.tif 000273
【０５９７】
本発明の他のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される方法にしたがって調製され得る。このようなポリヌクレオチドは、以下のとおりであり得る。
【化２３９】
2017522046.tif 000274
【０５９８】
ジスルフィド結合に直接結合された補助部分を含有するポリヌクレオチドも調製されてもよく；例示的なポリヌクレオチドが、以下に示される。
【化２４０】
2017522046.tif 000275
【０５９９】
実施例２．インビトロ活性アッセイ
ルシフェラーゼの発現の抑制
ルシフェラーゼ遺伝子（ＧＬ３）を標的にするポリヌクレオチドを合成し、生物可逆的基（ジスルフィドホスホジエステルまたはジスルフィドホスホトリエステル）を有するポリヌクレオチド構築物を作製するのに使用した。
【０６００】
これらのジスルフィドホスホトリエステルのインビトロ活性を評価するために、ルシフェラーゼ（ＧＬ３）を安定的に発現するヒト卵巣ＳＫＯＶ−３細胞を用いた。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンが補充されたマッコイ（ＭｃＣｏｙ’ｓ）５Ａ培地（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を成長させた。細胞（１×１０４個／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で平板培養し、５％のＣＯ２下で、３７℃で一晩インキュベートした。
【０６０１】
対照：ルシフェラーゼ遺伝子または非標的対照遺伝子を標的にする対照ｓｉＲＮＡを、製造業者の推奨事項にしたがって、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、示される濃度（典型的に、０．０１〜３０ｎＭ）で細胞にトランスフェクトした。
【０６０２】
本発明のポリヌクレオチド構築物：ポリヌクレオチド構築物を細胞に加え、２時間インキュベートし、その後、４％のＦＢＳを含有する等体積のＯｐｔｉＭＥＭ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、細胞を２４〜４８時間インキュベートした。次に、細胞を溶解させ、ルシフェリン（Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ（商標）、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の添加後、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定し、Ｖｉｃｔｏｒ２（商標）ルミノメータ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光シグナルを捕捉した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＦｌｕｏｒ（商標）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞毒性を評価し、ルシフェラーゼ遺伝子のノックダウンを、細胞毒性について補正し、ビヒクル対照で処理したウェルのパーセントとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ルシフェラーゼノックダウンＥＣ５０値を得た。
【０６０３】
本発明のハイブリダイズポリヌクレオチド（配列番号１１２および１１３）についてのこのアッセイの結果が、表１０に示される（構造については、図１Ａを差参照）。表１０において、Ｒ４が、２−（ベンジルアミノカルボニル）エチルである。
【０６０４】
【表３５】
2017522046.tif 000276
【０６０５】
本発明のハイブリダイズポリヌクレオチドのＥＣ５０（４８時間の時点）（構造については、図１Ｂを参照）は、１．１ｎＭであると測定された。
【０６０６】
表１１は、本発明の他のハイブリダイズポリヌクレオチドについてのデータを示し（構造については、図１Ａを参照）、ここで、特定のウリジン（矢印で示される）が、表１１に示される構造を有するヌクレオチド間３’−ホスホトリエステルを有する。生物可逆的および生物不可逆的基を含むｓｉＲＮＡについてのインビトロトランスフェクションデータが、図１２に示される。
【０６０７】
ＳＫＯＶ−３−Ｌｕｃ細胞におけるトランスフェクションデータ：
【０６０８】
【表３６】
2017522046.tif 000277
【０６０９】
【表３７】
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【０６１０】
マウス初代肝細胞単離およびインビトロ実験：
標準的な２工程コラゲナーゼかん流技術（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６３３：１８５−１９６；２０１０；その開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される）を用いて、初代マウス肝細胞を単離した。簡潔には、６〜１０週齢の雌Ｃ５７／Ｂｌ６マウスを、ケタミン（８０〜１００ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（５〜１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹腔内注射によって麻酔した。次に、腹腔を露出させ、２２Ｇニードルを用いて内臓大動脈に挿管した。肝静脈を切断し、０．５ｍＭのＥＴＤＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液を用いて、５〜１０分間にわたって肝臓を直ちにかん流させた。この溶液を、さらに５〜１０分間にわたって、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）中のコラゲナーゼ（１００ＩＵ／ｍｌ）の溶液に直ちに交換した。かん流の終了時に、肝臓を取り出し、肝細胞を、４℃の１０％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中に収集した。次に、細胞を、７０μｍの滅菌フィルタに通してろ過し、同じ溶液中で３回洗浄し、トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）染色を用いて、細胞生存率を評価した。次に、０．１％のラット尾コラーゲンまたは２％のマトリゲルで被覆された９６ウェルプレートに細胞を播種し、５％のＣＯ２インキュベータ中で、３７℃で３〜４時間インキュベートした。次に、試験化合物を細胞に加え、５％のＣＯ２インキュベータ中で、３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、細胞を溶解さ、ｍＲＮＡを単離し、標的遺伝子の発現をｑＰＣＲによって測定し、標準的なプロトコルを用いて、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。結果が、図１３Ａおよび１３Ｂにグラフ化され、表１２に示される。
【０６１１】
【表３８】
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【０６１２】
【表３９】
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【０６１３】
【表４０】
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【０６１４】
実施例３．細胞結合実験
ジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチド−Ｃｙ３細胞結合の一般的なプロトコル：ジスルフィド生物可逆的基を含有する本発明のポリヌクレオチド構築物を、１０ｍＭの最終濃度で、Ｇ２’Ｍｏｄ−Ｃｙ３（ガイド鎖）にアニーリングした。
【０６１５】
細胞処理設定：４８ウェルプレートにおいてウェル当たり４０，０００個の細胞を平板培養し；細胞を一晩接着させた。次に、細胞を、５００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、次に、１５０μＬの処理剤を加えた（注記：遊離葉酸試料の場合、処理前の１時間にわたって２．３ｍＭの葉酸を含有する培地で細胞を処理した）。細胞を４時間処理し；４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン処理し、ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３細胞結合についてフローサイトメトリーによって分析した。
【０６１６】
これらの実験の結果が、図１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ａ、および１６Ｂに示される。図１４Ａは、ＫＢ細胞に結合する（葉酸塩）３−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３コンジュゲートについての用量曲線を示す。図１４Ｂは、（葉酸塩）３−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３および（葉酸塩）１−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３コンジュゲートについての解離定数（Ｋｄ）を決定するグラフを示す。図１５Ａは、ＨｅｐＧ２細胞に結合する（ＧａｌＮＡｃ）９−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３コンジュゲートについての用量曲線を示す。図１５Ｂは、（ＧａｌＮＡｃ）９−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３および（ＧａｌＮＡｃ）３−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３コンジュゲートについての解離定数（Ｋｄ）を決定するグラフを示す。図１６Ａは、初代腹腔マクロファージに結合する（マンノース）１８−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３コンジュゲートについての用量曲線を示す。図１６Ｂは、（マンノース）１８−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３および（マンノース）６−ｓｉＲＮＮ−Ｃｙ３コンジュゲートについての解離定数（Ｋｄ）を決定するグラフを示す。
【０６１７】
実施例４．インビボ活性アッセイ
雄ＮＦκＢ−ＲＥ−Ｌｕｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を用いて、ルシフェラーゼジスルフィドホスホトリエステル分子のインビボ活性を試験した。これらのマウスは、肝臓を含む全身にわたってルシフェラーゼ遺伝子（ＧＬ３）を発現し、ルシフェラーゼ活性は、ＴＮＦαなどのＮＦκＢ活性化因子によって誘導可能である。試験物質（ルシフェラーゼジスルフィドホスホトリエステル、野生型ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ配列、および非標的対照ｓｉＲＮＡ配列）を、製造業者の推奨事項にしたがって、Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２．０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と複合体化し、滅菌インスリン用シリンジを用いて、尾静脈に注射した（約２００μＬ、７ｍｇ／ｋｇ  体重）（ｎ＝１〜２匹のマウス／処置）。２匹のさらなるマウスに、同体積のビヒクルを注射し、偽処置対照として用いた。注射の２４時間後、マウスＴＮＦα（０．０３μｇ／ｇ）の腹腔内注射をマウスに行って、肝臓ルシフェラーゼ活性を誘導した。ＴＮＦα注射から４時間後、マウスに、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、Ｄ−ルシフェリン注射の約１０分後、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ全身撮像装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、肝臓ルシフェラーゼ活性を測定した。ｓｉＲＮＡ投与から３、６、および８日後にマウスを再度撮像して、上述されるように肝臓ルシフェラーゼ活性を評価した。このアッセイの結果が、図１７に示される。
【０６１８】
インビボ実験：
試験化合物を、皮下または静脈内（側方尾静脈）注射（２００μＬ；３匹のマウス／処置）のいずれかによって雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスに投与した。注射後の適切な時点で、マウスを殺処分し、血液試料を心穿刺によって採取した。約５０〜１００ｍｇの肝臓試料片を採取した直後に、液体窒素で凍結した。標準的なプロトコルを用いて、全ｍＲＮＡを肝臓ホモジネートから単離し、標的遺伝子の発現をｑＰＣＲによって定量し、標準的なプロトコルを用いて、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。
【０６１９】
結果が、図１８Ａ、１８Ｂ、１９Ａ、１９Ｂ、および２０Ｂに示される（図２０Ｂ中のデータを生成するのに使用されるｓｉＲＮＡ構造については、図２０Ａを参照）。
【０６２０】
マウス肝細胞の単離および培養のための例示的な手順については、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６３３：１８５−１９６；２０１０（その開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０６２１】
薬理学：
【０６２２】
【表４１】
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【０６２３】
【表４２】
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【０６２４】
【表４３】
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【０６２５】
【表４４】
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【０６２６】
【表４５】
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【０６２７】
ＧＡＰＤＨ−マンノースコンジュゲートが、用量依存的なインビボ活性を実証する
プロトコル１：雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、３％のチオグリコレート（２．５ｍＬ）の腹腔内（ＩＰ）注射を施した。チオグリコレート注射（３回投与）の６時間、２４時間、および４８時間後、ＩＰ注射によって試験化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腹腔マクロファージを、腹腔を氷冷ＰＢＳで洗浄することによって２４時間後に採取した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ中で再懸濁させ、３時間にわたって９６ウェルプレート中で平板培養して、マクロファージ接着を可能にした。次に、細胞を洗浄し、溶解させ、標準的な方法を用いて、全ｍＲＮＡを抽出した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を、ＲＴｑＰＣＲによって定量し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。結果が、図２１Ａに示される。
【０６２８】
プロトコル２：雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、３％のチオグリコレート（２．５ｍＬ）の腹腔内（ＩＰ）注射を施した。チオグリコレート注射（２回投与）の６時間および２４時間後、ＩＰ注射によって試験化合物を投与した。腹腔マクロファージを、腹腔を氷冷ＰＢＳで洗浄することによって２４時間後に採取した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ中で再懸濁させ、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で３時間にわたって９６ウェルプレート中で平板培養して、マクロファージ接着を可能にした。次に、細胞を洗浄して、非マクロファージ細胞を除去し、溶解させ、標準的な方法を用いて、全ｍＲＮＡを抽出した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を、ＲＴｑＰＣＲによって定量し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。結果が、図２１Ｂに示される。
【０６２９】
プロトコル３：雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、３％のチオグリコレート（２．５ｍＬ）の腹腔内（ＩＰ）注射を施した。チオグリコレート注射（単回投与）の２４時間後、ＩＰ注射によって試験化合物を投与した。腹腔マクロファージを、腹腔を氷冷ＰＢＳで洗浄することによって２時間後に採取した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ中で再懸濁させ、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で３時間にわたって９６ウェルプレート中で平板培養して、マクロファージ接着を可能にした。非マクロファージ細胞をＰＢＳによって洗い落とし、マクロファージを、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で４８時間にわたって、１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ中でインキュベートした。次に、細胞を溶解させ、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現を、ＲＴｑＰＣＲによって定量し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。結果が、図２２に示される。
【０６３０】
実施例５：マウス初代骨髄前駆細胞単離およびマクロファージを用いたインビトロ実験：
プロトコル１：マウス初代骨髄前駆細胞を、公開されたプロトコルにしたがって、雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスの大腿骨および脛骨から単離した。細胞を４℃のＰＢＳで直ちに洗浄し、１０％のウシ胎仔血清および２０ｎｇ／ｍｌの組み換えマウスＭ−ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ中で、２×１０６個の細胞／ｍｌで懸濁させた。細胞を９６ウェルプレートに播種し、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で７日間インキュベートして、マクロファージへの分化を可能にした。細胞を２４時間毎に洗浄して、潜在的な非マクロファージ細胞汚染を除去した。細胞を、マンノース受容体発現に基づいて７日目に使用した。経時的なマンノース受容体発現が、図２３Ａにグラフ化される。表５および７からの試験化合物を、無血清ｏｐｔｉＭＥＭ中で希釈し、４８時間にわたって細胞とともにインキュベートした。次に、細胞を溶解させ、全ｍＲＮＡを抽出し、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を、ＲＴｑＰＣＲを用いて定量し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。結果が、図２３Ｂに示される。
【０６３１】
プロトコル２：マウス初代骨髄前駆細胞を、公開されたプロトコルにしたがって、雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスの大腿骨および脛骨から単離した。細胞を４℃のＰＢＳで直ちに洗浄し、１０％のウシ胎仔血清および２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＣＳＦを含有するＲＰＭＩ中で、２×１０６個の細胞／ｍＬで懸濁させた。細胞を９６ウェルプレートに播種し、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で３日間インキュベートして、マクロファージへの分化を可能にした。４日目、組み換えマウスＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）を加え、細胞を、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。試験化合物をＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈し、４８時間にわたって細胞とともにインキュベートした。次に、細胞を溶解させ、全ｍＲＮＡを抽出し、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を、ＲＴｑＰＣＲによって定量し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。結果が、図２４Ａに示される。
【０６３２】
プロトコル３：マウス初代骨髄前駆細胞を、公開されたプロトコルにしたがって、ｂ−アクチン−ｌｕｃマウス（ＦＶＢ／ＮＴａｃ−Ｔｇ−Ａｃｔｂ−ｌｕｃ−４６Ｘｅｎ、Ｔａｃｏｎｉｃ）の大腿骨および脛骨から単離した。細胞を４℃のＰＢＳで直ちに洗浄し、１０％のウシ胎仔血清および２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＣＳＦを含有するＲＰＭＩ中で、２×１０６個の細胞／ｍｌで懸濁させた。細胞を９６ウェルプレートに播種し、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で３日間インキュベートして、マクロファージへの分化を可能にした。４日目、組み換えマウスＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）を加え、細胞を、５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。試験化合物をＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈し、４８時間にわたって細胞とともにインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の添加によって評価した。結果が、図２４Ｂに示される。
【０６３３】
実施例６：マウス血清安定性
オリゴヌクレオチド（一本鎖および二本鎖）を含有するトリエステルの血清安定性の評価を、後述されるように行った。
【０６３４】
プロトコル：２０μＬの２５０μＭのｄｓＲＮＡストックを作製し；それぞれから４μＬを取り出し、１６μＬの新鮮なマウス血清中に入れ；２０μＬの試料をＰＣＲプレートに入れ、３７℃で、サーモサイクラーにおいて加熱し；２μＬを指示される時点で取り出し、１８μＬのホルムアミドローディングバッファーに加え、ゲル分析前に凍結し；ゲル電気泳動（１５％の変性ゲル；臭化エチジウム染色）による分析のためにウェル当たり２μＬを充填した。結果が、図２５に示される。
【０６３５】
他の実施形態
記載される本発明および本発明の使用方法の様々な変更および変形が、本発明の範囲および趣旨を逸脱せずに、当業者に明らかであろう。本発明は、具体的な実施形態に関連して説明されているが、権利請求される本発明が、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載される形態の様々な変更は、本発明の範囲内であることが意図される。
【０６３６】
他の実施形態が、特許請求の範囲に記載されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９Ａ−１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ−２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ−２３Ｂ】
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【図２４Ａ−２４Ｂ】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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