(57)【要約】  本発明は、網膜色素上皮細胞を生成する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）多能性細胞を第１のＳＭＡＤ阻害剤および第２のＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ＢＭＰ経路活性化剤の存在下ならびに第１および第２のＳＭＡＤ阻害剤の非存在下で培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を再播種するステップと
を含む、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において、細胞を単層として培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）において、細胞を単層として培養する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）において、細胞を懸濁培養で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）において、細胞を懸濁培養で培養する、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
多能性細胞が胚性幹細胞または人工多能性幹細胞から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
多能性細胞がヒト細胞である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
多能性細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
多能性細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
多能性細胞を、ヒト胚の破壊を必要としない手段によって得る、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１のＳＭＡＤ阻害剤がＢＭＰ１型受容体ＡＬＫ２の阻害剤である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第１のＳＭＡＤ阻害剤がＢＭＰ１型受容体ＡＬＫ２およびＡＬＫ３の阻害剤である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第１のＳＭＡＤ阻害剤が、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５および／またはＳｍａｄ８のリン酸化を妨げる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
第１のＳＭＡＤ阻害剤がドルソモルフィン誘導体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第１のＳＭＡＤ阻害剤が、ドルソモルフィン、ノギン、またはコーディンから選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第１のＳＭＡＤ阻害剤が、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン（ＬＤＮ１９３１８９）、またはその塩もしくは水和物である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度が０．５ｎＭ〜１０μＭである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度が５００ｎＭ〜２μＭである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度が約１μＭである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第２のＳＭＡＤ阻害剤がＡＬＫ５の阻害剤である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
第２のＳＭＡＤ阻害剤がＡＬＫ５およびＡＬＫ４の阻害剤である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第２のＳＭＡＤ阻害剤がＡＬＫ５およびＡＬＫ４およびＡＬＫ７の阻害剤である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
第２のＳＭＡＤ阻害剤が、
４−（４−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド；
２−メチル−５−（６−（ｍ−トリル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］イミダゾール−５−イル）−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール；
２−（６−メチルピリジン−２−イル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）キナゾリン−４−アミン；
２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン；
４−（２−（６−メチルピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル）フェノール；
２−（４−メチル−１−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）チエノ［３，２−ｃ］ピリジン；
４−（５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ベンズアミド；
２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）プテリジン−４−アミン；
６−メチル−２−フェニルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン；
３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ  ８３−０１）；２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン（ＳＢ−５０５１２４）；
７−（２−モルホリノエトキシ）−４−（２−（ピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル）キノリン（ＬＹ２１０９７６１）；
４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン（ＬＹ３６４９４７）；もしくは
４−（４−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド（ＳＢ−４３１５４２）
またはその塩もしくは水和物から選択される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第２のＳＭＡＤ阻害剤が４−（４−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド（ＳＢ−４３１５４２）である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度が０．５ｎＭ〜１００μＭである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度が１μＭ〜５０μＭである、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度が約１０μＭである、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）において、多能性細胞を少なくとも１日間培養する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）において、多能性細胞を少なくとも２日間培養する、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）において、多能性細胞を２〜１０日間培養する、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）において、多能性細胞を３〜５日間培養する、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）において、多能性細胞を約４日間培養する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）の前に、細胞を単層として少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の初期密度で培養する、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ａ）の前に、細胞を単層として細胞１０００００〜５０００００個／ｃｍ２の初期密度で培養する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＢＭＰ経路活性化剤がＢＭＰを含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＢＭＰ経路活性化剤が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、またはＢＭＰ１５から選択されるＢＭＰを含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＢＭＰ経路活性化剤がＢＭＰホモ二量体である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＢＭＰ経路活性化剤がＢＭＰヘテロ二量体である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＢＭＰ経路活性化剤が、ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体、ＢＭＰ４／７ヘテロ二量体、またはＢＭＰ３／８ヘテロ二量体である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ＢＭＰ経路活性化剤がＢＭＰ４／７ヘテロ二量体である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｂ）において、ＢＭＰ経路活性化剤の濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｂ）において、ＢＭＰ経路活性化剤の濃度が５０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬである、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｂ）において、ＢＭＰ経路活性化剤の濃度が約１００ｎｇ／ｍＬである、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｂ）において、前記細胞を少なくとも１日間培養する、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｂ）において、前記細胞を２日間〜２０日間培養する、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）において、前記細胞を約３日間培養する、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｃ）において、前記細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｃ）において、前記細胞を細胞１０００００〜１００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｃ）において、前記細胞を細胞約５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｃ）において、前記細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に再播種する、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で培養するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を培養するステップと
をさらに含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ステップ（ｄ）において、細胞を少なくとも１日間培養する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ（ｄ）において、細胞を少なくとも３日間培養する、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
ステップ（ｄ）において、細胞を３〜２０日間培養する、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ステップ（ｄ）において、アクチビン経路活性化剤の濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ステップ（ｄ）において、アクチビン経路活性化剤の濃度が約１００ｎｇ／ｍＬである、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ステップ（ｄ）において、アクチビン経路活性化剤がアクチビンＡである、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ｄ）において、細胞をｃＡＭＰの存在下で培養する、請求項５１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ステップ（ｄ）において、ｃＡＭＰの濃度が約０．５ｍＭである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項５１から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ステップ（ｅ）において、前記細胞を細胞２００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項５１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ステップ（ｅ）において、前記細胞を細胞約２０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項５１から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ステップ（ｅ）において、前記細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に再播種する、請求項５１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも５日間培養する、請求項５１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも１４日間培養する、請求項５１から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ステップ（ｆ）において、細胞を１０〜３５日間培養する、請求項５１から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
ステップ（ｆ）において、細胞を約２８日間培養する、請求項５１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ステップ（ｆ）において、細胞をｃＡＭＰの存在下で培養する、請求項５１から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
ステップ（ｆ）において、ｃＡＭＰの濃度が約０．５ｍＭである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ステップ（ｂ）は、細胞をＢＭＰ経路活性化剤の存在下で培養した後、細胞を少なくとも１０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養することをさらに含み、
ステップ（ｃ）は、敷石状の形態を有するステップ（ｂ）の細胞を再播種することを含み、前記方法は、
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞を培養するステップ
をさらに含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
ステップ（ｂ）において、細胞を少なくとも２０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ステップ（ｂ）において、細胞を３０〜５０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
ステップ（ｂ）において、細胞を約４０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ステップ（ｃ）において、細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ステップ（ｃ）において、細胞を細胞５００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ステップ（ｃ）において、細胞を細胞約２０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項７０から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
ステップ（ｃ）において、前記細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に再播種する、請求項７０から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
ステップ（ｄ）において、細胞を少なくとも５日間培養する、請求項７０から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
ステップ（ｄ）において、細胞を１０〜４０日間培養する、請求項７０から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
ステップ（ｄ）において、細胞を約１４日間培養する、請求項７０から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
ステップ（ｄ）において、細胞をｃＡＭＰの存在下で培養する、請求項７０から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ステップ（ｄ）において、ｃＡＭＰの濃度が約０．５ｍＭである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
以下の追加のステップ：
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を培養するステップと
をさらに含む、請求項７０から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ステップ（ｅ）において、細胞を細胞５００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
ステップ（ｅ）において、細胞を細胞約２０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項８３から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
ステップ（ｅ）において、前記細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に再播種する、請求項７０から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも１０日間培養する、請求項７０から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
ステップ（ｆ）において、細胞を１５〜４０日間培養する、請求項７０から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
ステップ（ｆ）において、細胞を約２８日間培養する、請求項７０から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
ＲＰＥ細胞を回収するステップをさらに含む、請求項１から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
ＲＰＥ細胞を精製するステップをさらに含む、請求項１から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によってＲＰＥ細胞を精製するステップをさらに含む、請求項１から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＲＰＥ細胞を精製するステップが、
−細胞を、蛍光体とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＦＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＲＰＥ細胞を精製するステップが、
−細胞を、磁気粒子とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＭＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
すべてのステップにおいて、細胞を単層として培養する、請求項１から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
−ＲＰＥ細胞を再播種することと、
−再播種したＲＰＥ細胞を培養することと
を含む方法によってＲＰＥ細胞を拡大する、請求項１から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
細胞を細胞１０００〜１０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
細胞を細胞１００００〜３００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
細胞を細胞約２００００個／ｃｍ２の密度で再播種する、請求項９７から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に再播種する、請求項９７から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
細胞を少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、または少なくとも４２日間培養する、請求項９７から１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞を約４９日間培養する、請求項９７から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
細胞をＳＭＡＤ阻害剤、ｃＡＭＰまたはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下で培養する、請求項９７から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記薬剤が、アデニルシクラーゼ活性化剤、好ましくはフォルスコリン、またはホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、好ましくはＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ１０および／もしくはＰＤＥ１１阻害剤から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細胞をｃＡＭＰの存在下で培養する、請求項１０４または１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
ｃＡＭＰの濃度が０．０１ｍＭ〜１Ｍである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
ｃＡＭＰの濃度が約０．５ｍＭである、請求項１０６または１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
（ａ）ＲＰＥ細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で播種するステップと、
（ｂ）前記ＲＰＥ細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤、ｃＡＭＰ、またはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下で培養するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を拡大する方法。
【請求項１１０】
ステップ（ａ）において、細胞を細胞５０００〜１０００００個／ｃｍ２の密度で播種する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
ステップ（ａ）において、細胞を細胞約２００００個／ｃｍ２の密度で播種する、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
ステップ（ａ）において、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に播種する、請求項１０９から１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
ステップ（ｂ）において、細胞を少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、または少なくとも４２日間培養する、請求項１０９から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
ステップ（ｂ）において、細胞を約４９日間培養する、請求項１０９から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記薬剤が、アデニルシクラーゼ活性化剤、好ましくはフォルスコリン、またはホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、好ましくはＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ１０および／もしくはＰＤＥ１１阻害剤から選択される、請求項１０９から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
ステップ（ｂ）において、細胞をｃＡＭＰの存在下で培養する、請求項１０９から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
ｃＡＭＰの濃度が０．０１ｍＭ〜１Ｍである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
ｃＡＭＰの濃度が約０．５ｍＭである、請求項１１６または１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ステップ（ｂ）において、細胞をＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養する、請求項１０９から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
ＳＭＡＤ阻害剤が、２−（６−メチルピリジン−２−イル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）キナゾリン−４−アミン、６−（１−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン、または４−メトキシ−６−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）キノリンである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
生成されたＲＰＥ細胞が敷石状の形態を有しており、色素性であり、以下のＲＰＥマーカー、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１およびＺＯ−１のうちの少なくとも１つを発現する、請求項１から１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
生成されたＲＰＥ細胞がＶＥＧＦおよびＰＥＤＦを分泌する、請求項１から１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
すべてのステップを、異種成分を含まない条件下で実施する、請求項１から１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
請求項１から１２３のいずれか一項に記載の方法によって得られたＲＰＥ細胞。
【請求項１２５】
請求項１から１２３のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるＲＰＥ細胞。
【請求項１２６】
請求項１２４または１２５に記載のＲＰＥ細胞を含む医薬組成物。
【請求項１２７】
請求項１２４もしくは１２５に記載のＲＰＥ細胞または請求項１２６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象において網膜疾患を処置する方法。
【請求項１２８】
ａ）多能性細胞の集団を提供するステップと、
ｂ）多能性細胞のＲＰＥ細胞への分化を誘導するステップと、
ｃ）細胞集団を、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を生成する方法。
【請求項１２９】
ステップｃ）が、
−細胞を、蛍光体とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＦＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
ステップｃ）が、
−細胞を、磁気粒子とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＭＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
ａ）ＲＰＥ細胞および非ＲＰＥ細胞を含む細胞集団を提供するステップと、
ｂ）細胞集団を、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮することによって、細胞集団中のＲＰＥ細胞のパーセンテージを増加させるステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を精製する方法。
【請求項１３２】
ステップｂ）が、
−細胞集団を、蛍光体とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＦＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
ステップｂ）が、
−細胞集団を、磁気粒子とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＭＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
非ＲＰＥ細胞が多能性細胞またはＲＰＥ前駆体である、請求項１３１から１３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性細胞から網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生成する方法に関する。また、本発明は、そのような方法によって得られたまたは得ることができる細胞、ならびに網膜疾患の処置におけるその使用にも関する。また、本発明は、ＲＰＥ細胞を拡大するためのプロセスにも関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜色素上皮とは、下にある脈絡膜（網膜の後ろにある血管の層）と上にある網膜視細胞（たとえば、光受容器、桿体、および錐体）との間の神経感覚網膜の外にある色素細胞層である。網膜色素上皮は、光受容器および網膜の機能および健康にとって重大である。網膜色素上皮は、光色素を再循環させること、ビタミンＡを送達、代謝、および保管すること、桿体光受容器外節を貪食すること、鉄および低分子を網膜と脈絡膜との間で輸送すること、ブルッフ膜を維持すること、ならびに迷光を吸収してより良好な画像解像度を可能にすることによって、光受容器の機能を維持する。網膜色素上皮の変性は、脈絡膜欠如、糖尿病性網膜症、黄斑変性症（加齢黄斑変性症が含まれる）、網膜色素変性症、およびスタルガルト病などの、光受容器の損傷および盲目をもたらすいくつかの視力を変化させる病気に関連づけられている網膜剥離、網膜異形成、または網膜萎縮を引き起こす場合がある。
【０００３】
そのような疾患の潜在的な処置は、ＲＰＥ細胞を、疾患を患っている者の網膜内に移植することである。網膜色素上皮細胞を移植することによってそれを補充することで、変性が遅延、停止、または逆転される、網膜の機能が改善される、およびそのような状態から生じる盲目が予防される場合があると考えられている。動物モデルにおいて、光受容器の救出および視覚的機能の維持をＲＰＥ細胞の網膜下移植によって達成できることが実証されている（たとえば、Ｃｏｆｆｅｙ，ＰＪら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００２：５、５３〜５６、Ｓａｕｖｅ，Ｙら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００２：１１４、３８９〜４０１を参照）。したがって、網膜疾患の処置のための細胞移植の供給源として、ＲＰＥ細胞を、たとえば多能性細胞から生成する方法を見つけることに高い興味が持たれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
マウスおよび非ヒト霊長類の胚性幹細胞の、ＲＰＥ細胞へと分化する潜在性、ならびに移植後に生存して網膜変性症を減弱させる潜在性が実証されている。ヒト胚性幹細胞のＲＰＥ細胞への自発的分化が示されている（たとえばＷＯ２００５／０７００１１を参照）。しかし、そのようなプロセスの効率および再現性は低かった。したがって、良好に制御されており、再現性があり、効率的であり、ならびに／またはスケールアップに適しており、薬物スクリーニング、疾患モデリングおよび／または治療的使用のためにＲＰＥ細胞を生成することに適している、ＲＰＥ細胞を生成する方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明はＲＰＥ細胞を生成する方法に関する。これらの方法は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの多能性細胞の頑強かつ再現性がある分化を提供してＲＰＥ細胞を生じさせることが実証されている。さらに、本明細書中に提供する方法は容易にスケールアップ可能であり、高収率のＲＰＥ細胞を与える。本明細書中に開示する方法は、たとえば、それだけには限定されないが、異種成分を含まない条件下でｈＥＳＣなどの多能性細胞を再現性よくかつ効率的にＲＰＥ細胞へと分化させるために使用することができる。
【０００６】
ＲＰＥ細胞を生成する方法を本明細書中に提供する。一部の実施形態では、方法は、
（ａ）多能性細胞を第１のＳＭＡＤ阻害剤および第２のＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）経路活性化剤の存在下ならびに第１および第２のＳＭＡＤ阻害剤の非存在下で培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を再播種するステップと
を含む。
【０００７】
前記方法の一部の実施形態では、方法は、
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で培養するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を培養するステップと
をさらに含む。
【０００８】
前記方法の別の実施形態では、
ステップ（ｂ）は、細胞をＢＭＰ経路活性化剤の存在下で培養した後、細胞を少なくとも１０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養することをさらに含み、
ステップ（ｃ）は、敷石状の形態を有するステップ（ｂ）の細胞を再播種することを含み、前記方法は、
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞を培養するステップ
をさらに含む。
【０００９】
また、ＲＰＥ細胞を拡大する方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、
（ａ）ＲＰＥ細胞を細胞１０００〜１０００００個／ｃｍ２の密度で播種するステップと、
（ｂ）前記ＲＰＥ細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤、ｃＡＭＰ、またはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下で培養するステップと
を含む。
【００１０】
また、
ａ）ＲＰＥ細胞および非ＲＰＥ細胞を含む細胞集団を提供するステップと、
ｂ）細胞集団を、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮することによって、細胞集団中のＲＰＥ細胞のパーセンテージを増加させるステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を精製する方法も提供する。
【００１１】
また、本明細書中に開示する方法によって得られたまたは得ることができるＲＰＥ細胞も提供する。
【００１２】
また、医薬組成物も提供する。医薬組成物は、網膜疾患を患っている対象の眼内への移植に適したＲＰＥ細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＲＰＥ細胞を支持するのに適した構造を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は多孔性膜およびＲＰＥ細胞を含む。一部の実施形態では、膜の孔は直径が約０．２μｍ〜約０．５μｍであり、孔の密度は約１×１０７〜約３×１０８個の孔／ｃｍ２である。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を支持したコーティングで膜の片側をコーティングする。一部の実施形態では、コーティングは糖タンパク質を含み、好ましくはラミニンまたはビトロネクチンから選択される。一部の実施形態では、コーティングはビトロネクチンを含む。一部の実施形態では、膜はポリエステル製である。
【００１３】
また、対象において網膜疾患を処置する方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、本発明のＲＰＥ細胞を、網膜疾患を患っているまたはその危険性がある対象に投与することによって、網膜疾患を処置することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】早期および後期再播種方法の具体例の略図である。
【図１Ｂ】ＳＭＡＤ阻害剤を用いた処理中の様々な時点で免疫細胞化学によって測定した、ＰＡＸ６およびＯＣＴ４を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。図１Ｂ：ＬＤＮ／ＳＢで誘導した試料。
【図１Ｃ】ＳＭＡＤ阻害剤を用いた処理中の様々な時点で免疫細胞化学によって測定した、ＰＡＸ６およびＯＣＴ４を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。図１Ｃ：ＬＤＮ／ＳＢで誘導していない試料。
【図１Ｄ】２日間（ＬＤＮ／ＳＢ  ２Ｄ）または５日間（対照＋）のＳＭＡＤ阻害剤を用いた処理の後に、免疫細胞化学によって測定した、ＰＡＸ６（上のグラフ）およびＯＣＴ４（下のグラフ）を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図２Ａ】様々な条件下でｑＰＣＲによって測定した、Ｍｉｔｆ（上のグラフ）およびＳｉｌｖ（ＰＭＥＬ１７）（下のグラフ）の相対的発現を示すグラフである。図２Ａおよび２Ｂは、ステップ（ａ）後のＢＭＰ経路活性化剤を用いた処理がＭＩＴＦおよびＰＭＥＬ１７の発現の誘導に重大であることを示す。
【図２Ｂ】免疫細胞化学によって測定した、ＭＩＴＦ（上のグラフ）およびＰＭＥＬ１７（下のグラフ）を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。図２Ａおよび２Ｂは、ステップ（ａ）後のＢＭＰ経路活性化剤を用いた処理がＭＩＴＦおよびＰＭＥＬ１７の発現の誘導に重大であることを示す。
【図３】様々なＢＭＰ経路活性化剤を用いた処理の後に免疫細胞化学（上のグラフ）またはｑＰＣＲ（下のグラフ）によって測定した、ＭＩＴＦを発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。図３は、様々なＢＭＰ経路活性化剤を本明細書中に開示する方法のステップ（ｂ）において使用できることを示している。
【図４Ａ】様々な条件下で免疫細胞化学によって測定した、ＣＲＡＬＢＰを発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図４Ｂ】様々な条件下で免疫細胞化学によって測定した、ＭＥＲＴＫを発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図４Ｃ】様々な条件下でｑＰＣＲによって測定した、Ｒｌｂｐ１（ＣＲＡＬＢＰ）（上のグラフ）およびＭｉｔｆ（下のグラフ）の相対的発現を示すグラフである。
【図４Ｄ】様々な条件下でｑＰＣＲによって測定した、Ｍｅｒｔｋ（上のグラフ）およびＢｅｓｔ１（下のグラフ）の相対的発現を示すグラフである。
【図４Ｅ】様々な条件下でｑＰＣＲによって測定した、Ｓｉｌｖ（ＰＭＥＬ１７）（上のグラフ）およびＴｙｒ（下のグラフ）の相対的発現を示すグラフである。
【図５】様々な条件下で免疫細胞化学によって測定した、Ｄ９−１９でのＣＲＡＬＢＰを発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。図５は、アクチビンＡが本明細書中に開示する方法において使用するために適切なアクチビン経路活性化剤であり、アクチビンＡへの短時間の曝露がＲＰＥマーカーの発現を誘導するために十分であることを示す。
【図６】細胞を異なるプレート上に異なる播種密度で再播種し（早期再播種の実施形態のステップ（ｅ））、ｃＡＭＰを含んでいてもよい培地中で培養した場合に、免疫細胞化学によって測定した、９６ウェルプレート中、Ｄ９−１９−２０でのＰＭＥＬ１７（上のグラフ）およびＣＲＡＬＢＰ（下のグラフ）を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。図６および７は、とりわけ、ステップ（ｅ）において様々な播種密度を使用できることを示している。
【図７】細胞を異なるプレート上に異なる播種密度で再播種し（早期再播種の実施形態のステップ（ｅ））、ｃＡＭＰを含んでいてもよい培地中で培養した場合に、免疫細胞化学によって測定した、３８４ウェルプレート中、Ｄ９−１９−２０でのＰＭＥＬ１７（上のグラフ）およびＣＲＡＬＢＰ（下のグラフ）を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。図６および７は、とりわけ、ステップ（ｅ）において様々な播種密度を使用できることを示している。
【図８Ａ】ＳＭＡＤ阻害剤、ＢＭＰ経路活性化剤を用いた処理、および４９日目まで基本培地中で培養した後の、後期再播種の実施形態の４９日目（ステップ（ｂ））での細胞を示す図である。
【図８Ｂ】再播種後に１２日間の培養（ステップ（ｄ））の後の細胞を示す図である。
【図８Ｃ】再播種後に１５日間の培養の後の、免疫細胞化学によって測定した、ＰＭＥＬ１７（上のグラフ）およびＣＲＡＬＢＰ（下のグラフ）を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図９Ａ】定方向分化によって生じた７つのＲＰＥ試料の主成分分析（ＰＣＡ）プロットを、自発的分化および脱分化対照によって生じたＲＰＥ細胞と共に示す図である。
【図９Ｂ】試験した遺伝子のそれぞれの、試料のクラスター形成への貢献を示す、ＰＣＡに使用したローディングプロットを示す図である。
【図９Ｃ】定方向分化によって得られたＲＰＥ細胞（実施例１および８中に開示した早期および後期再播種の両方）、自発的分化によって得られたＲＰＥ細胞、ならびにｈＥＳ細胞の全ゲノム転写物プロファイリングの比較を示す図である。
【図１０Ａ】１０週目における、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の上および下のチャンバーの使用済み培地中のＶＥＧＦの濃度対ＰＥＤＦの濃度の比を示すグラフである。図１０Ａは、本発明の方法によって得られる細胞がＲＰＥ細胞であるという結論と一致している。
【図１０Ｂ】再播種ステップ（ｃ）の後に培養した細胞の使用済み培地中のＰＥＤＦおよびＶＥＧＦの増加を示すグラフである。図１０Ｂは、本発明の方法によって得られる細胞がＲＰＥ細胞であるという結論と一致している。
【図１１Ａ】ＲＰＥ細胞の拡大中に起こる上皮間葉転換および間葉上皮転換の略図である。
【図１１Ｂ】様々な条件下でＲＰＥ細胞の拡大後に得られた細胞数（画像処理したフレームあたりのヘキスト陽性核）を示すグラフである。図１１Ｂは、ｃＡＭＰまたはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の使用が拡大ステップの収率を増加させることを示す。
【図１１Ｃ】任意選択でｃＡＭＰの存在下でＲＰＥ細胞の拡大後に免疫細胞化学によって測定した、ＰＭＥＬ１７を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１１Ｄ】任意選択でフォルスコリンなどの細胞内ｃＡＭＰを増加させる薬剤の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後に免疫細胞化学によって測定した、ＰＭＥＬ１７を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１１Ｅ】ｃＡＭＰの存在下で拡大したＲＰＥ細胞における、ＥｄＵの取り込みのパーセンテージを示すグラフである。
【図１１Ｆ】ｃＡＭＰの存在下でＲＰＥ細胞の拡大後に得られた細胞数／ｃｍ２を示すグラフである。
【図１１Ｇ】任意選択でｃＡＭＰの存在下でＲＰＥ細胞の拡大後に免疫細胞化学によって測定した、Ｄ１４でのＫｉ６７を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１１Ｈ】任意選択でｃＡＭＰの存在下でＲＰＥ細胞の拡大後に免疫細胞化学によって測定した、Ｄ１４でのＰＭＥＬ１７を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１１Ｉ】任意選択でｃＡＭＰの存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、５週目でのＭｉｔｆの発現を示すグラフである。
【図１１Ｊ】任意選択でｃＡＭＰの存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、５週目でのＳｉｌｖの発現を示すグラフである。
【図１１Ｋ】任意選択でｃＡＭＰの存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、５週目でのＴｙｒの発現を示すグラフである。
【図１２Ａ】ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で拡大したＲＰＥ細胞におけるＥｄＵの取り込みのパーセンテージを示すグラフである。
【図１２Ｂ】任意選択でＳＭＡＤ阻害剤の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、５週目でのＢｅｓｔ１の発現を示すグラフである。
【図１２Ｃ】任意選択でＳＭＡＤ阻害剤の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、５週目でのＲｌｂｐ１の発現を示すグラフである。
【図１２Ｄ】任意選択でＳＭＡＤ阻害剤の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、５週目でのＧｒｅｍ１の発現を示すグラフである。
【図１３Ａ】ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する抗体の存在下で拡大したＲＰＥ細胞における、１４日目でのＥｄＵの取り込みのパーセンテージを示すグラフである。
【図１３Ｂ】任意選択でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する抗体の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後に免疫細胞化学によって測定した、Ｄ１４でのＰＭＥＬ１７を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１３Ｃ】任意選択でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する抗体の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、Ｂｅｓｔ１を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１３Ｄ】任意選択でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する抗体の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、Ｍｅｒｋｔを発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１３Ｅ】任意選択でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する抗体の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、Ｇｒｅｍ１を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１３Ｆ】任意選択でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する抗体の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、ＰＭＥＬを発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１３Ｇ】任意選択でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する抗体の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、Ｌｒａｔを発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１３Ｈ】任意選択でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する抗体の存在下でＲＰＥ細胞の拡大後にｑＰＣＲによって測定した、Ｒｐｅ６５を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１４Ａ】フローサイトメトリーによって選別した抗ＣＤ５９抗体で染色した細胞における、ｑＰＣＲによって測定したｈＥＳＣマーカーの相対的発現を示すグラフである。
【図１４Ｂ】フローサイトメトリーによって選別した抗ＣＤ５９抗体で染色した細胞における、ｑＰＣＲによって測定したＲＰＥマーカーの相対的発現を示すグラフである。
【図１５Ａ】ＲＰＥ細胞におけるｉＰＳＣの分化中に免疫細胞化学によって測定した、Ｄ２、Ｄ９でのＯＣＴ４を発現する細胞のパーセンテージを示す図である。
【図１５Ｂ】ＲＰＥ細胞におけるｉＰＳＣの分化中に免疫細胞化学によって測定した、Ｄ２、Ｄ９でのＬＨＸ２を発現する細胞のパーセンテージを示す図である。
【図１５Ｃ】ＲＰＥ細胞におけるｉＰＳＣの分化中に免疫細胞化学によって測定した、Ｄ２、Ｄ９でのＰＡＸ６を発現する細胞のパーセンテージを示す図である。
【図１５Ｄ】ＲＰＥ細胞におけるｉＰＳＣの分化中に免疫細胞化学によって測定した、Ｄ２、Ｄ９およびＤ９−１９でのＣＲＡＬＢＰを発現する細胞のパーセンテージを示す図である。
【図１５Ｅ】ｉＰＳＣを出発物質として使用した定方向分化プロトコルにおいて、２回目の再播種（Ｄ９−１９−４５）の後にｑＰＣＲによって測定した、Ｂｅｓｔ１を発現する細胞のパーセンテージを示す図である。ＥＳＤＤとは、ｈＥＳＣを出発物質として使用した定方向分化によって得られるＲＰＥ細胞を意味する。ＩＰＳＤＤとは、ｉＰＳＣを出発物質として使用した定方向分化によって得られるＲＰＥ細胞を意味する。
【図１５Ｆ】ｉＰＳＣを出発物質として使用した定方向分化プロトコルにおいて、２回目の再播種（Ｄ９−１９−４５）の後にｑＰＣＲによって測定した、Ｍｅｒｔｋを発現する細胞のパーセンテージを示す図である。ＥＳＤＤとは、ｈＥＳＣを出発物質として使用した定方向分化によって得られるＲＰＥ細胞を意味する。ＩＰＳＤＤとは、ｉＰＳＣを出発物質として使用した定方向分化によって得られるＲＰＥ細胞を意味する。
【図１５Ｇ】ｉＰＳＣを出発物質として使用した定方向分化プロトコルにおいて、２回目の再播種（Ｄ９−１９−４５）の後にｑＰＣＲによって測定した、Ｓｉｌｖを発現する細胞のパーセンテージを示す図である。ＥＳＤＤとは、ｈＥＳＣを出発物質として使用した定方向分化によって得られるＲＰＥ細胞を意味する。ＩＰＳＤＤとは、ｉＰＳＣを出発物質として使用した定方向分化によって得られるＲＰＥ細胞を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一部の実施形態では、用語「多能性細胞」とは、適切な条件下で３つの胚葉の細胞種へと分化することができる細胞をいう（たとえば、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の細胞種へと分化することができる）。また、多能性細胞は、未分化状態で長期間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養を維持することもできる。好ましい実施形態では、多能性細胞は、脊椎動物、特に哺乳動物、好ましくはヒト、霊長類、またはげっ歯類起源のものである。好ましい多能性細胞はヒト多能性細胞である。多能性細胞の例は胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である。一部の実施形態では、多能性細胞は、ヒト胚の破壊を含まない方法によって得る。
【００１６】
一部の実施形態では、多能性細胞は胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。
【００１７】
一部の実施形態では、ＥＳＣとは、胚に由来する幹細胞をいう。一部の実施形態では、胚は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精させた胚から得る。
【００１８】
一部の実施形態では、ＥＳＣとは、細胞系として連続継代された胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する細胞をいう。一部の実施形態では、前記胚盤胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精させた胚から得る。一部の実施形態では、前記胚盤胞は、単為発生的に活性化されて胚盤胞段階へと分割および発生する不受精卵母細胞から得る。
【００１９】
ＥＳＣは当業者に知られている方法によって得られ得る（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれているＵＳ５８４３７８０を参照）。
【００２０】
たとえば、胚盤胞からのｈＥＳＣの単離には、透明帯を除去し、栄養外胚葉細胞を溶解して穏やかなピペット操作によって無傷の内部細胞塊から取り去る内部細胞塊を免疫手術によって単離する。その後、内部細胞塊を、その成長を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコ内に播種する。９〜１５日間の後、内部細胞塊に由来する成長物を機械的解離または酵素消化のいずれかによって凝集塊へと解離し、その後、細胞を新鮮な組織培養培地に再播種する。未分化の形態を示すコロニーをマイクロピペットによって個別に選択し、凝集塊へと機械的に解離し、再播種する。その後、生じるＥＳＣを１〜２週間毎にルーチン的に分割する。
【００２１】
一部の実施形態では、用語ＥＳＣとは、胚の１つまたは複数の割球を、好ましくは胚の残りの部分を破壊せずに単離した細胞をいう（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれているＵＳ２００６０２０６９５３またはＵＳ２００８００５７０４１を参照）。
【００２２】
好ましい実施形態では、多能性細胞はヒト胚性幹細胞である。好ましい実施形態では、多能性細胞は、胚を破壊せずに得られたヒト胚性幹細胞である。好ましい実施形態では、多能性細胞は、ＭＡ０１、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４、ＷＡ２５、ＷＡ２６、ＷＡ２７、Ｓｈｅｆ−１、Ｓｈｅｆ−２、Ｓｈｅｆ−３、Ｓｈｅｆ−４、またはＡＣＴ３０胚性幹細胞などの十分に確立された細胞系に由来するヒト胚性幹細胞である。
【００２３】
一部の実施形態では、ＥＳＣは、その供給源またはそれらを生成するために使用した具体的な方法にかかわらず、（ｉ）３つすべての胚葉の細胞へと分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ−４およびアルカリホスファターゼの発現、ならびに（ｉｉｉ）免疫無防備状態の動物内に移植した場合に奇形腫を生じる能力に基づいて同定することができる。
【００２４】
一部の実施形態では、多能性細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【００２５】
一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、たとえば成体体細胞などの非多能性細胞から、たとえば因子の組合せを発現させるまたはその発現を誘導することにより前記体細胞を再プログラミングすることによって導かれる多能性細胞である。ＩＰＳＣは、市販されているか、または当業者に知られている方法によって得ることができる。ＩＰＳＣは、たとえば、胎児、出産後、新生児、若年性、または成体の体細胞を使用して作製することができる。特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用できる因子には、たとえば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４とも呼ばれる）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組合せが含まれる。他の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用できる因子には、たとえば、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組合せが含まれる（たとえばその全体で本明細書中に参照により組み込まれているＥＰ２１３７２９６を参照）。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、低分子化合物の組合せを使用して体細胞を再プログラミングすることによって得られる（たとえばその全体で本明細書中に参照により組み込まれているＳｃｉｅｎｃｅ、３４１巻、６１４６号、６５１〜６５４頁を参照）。
【００２６】
好ましい実施形態では、多能性細胞はヒト人工多能性幹細胞である。好ましい実施形態では、多能性細胞はヒト成体体細胞に由来する人工多能性幹細胞である。
【００２７】
ＩＰＳＣは、たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれている、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９００４７２６３、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２０１０００６２５３３、ＵＳ２０１３００５９３８６、ＷＯ２００８１１８８２０、またはＷＯ２００９００６９３０中に開示されている方法を使用して得ることができる。
【００２８】
一部の実施形態では、用語「ＳＭＡＤ阻害剤」とは、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤をいう。
【００２９】
一部の実施形態では、用語「第１のＳＭＡＤ阻害剤」とは、ＢＭＰ１型受容体ＡＬＫ２の阻害剤をいう。一部の実施形態では、第１のＳＭＡＤ阻害剤は、ＢＭＰ１型受容体ＡＬＫ２およびＡＬＫ３の阻害剤である。一部の実施形態では、第１のＳＭＡＤ阻害剤は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５および／またはＳｍａｄ８のリン酸化を妨げる。一部の実施形態では、第１のＳＭＡＤ阻害剤はドルソモルフィン誘導体である。一部の実施形態では、第１のＳＭＡＤ阻害剤は、ドルソモルフィン、ノギン、コーディン、または４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン（ＬＤＮ１９３１８９）から選択される。好ましい実施形態では、第１のＳＭＡＤ阻害剤は４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン（ＬＤＮ１９３１８９）、またはその塩もしくは水和物である。
【００３０】
ＬＤＮ１９３１８９は以下の式の市販の化合物である。
【００３１】
【化１】
2017504311.tif 000002
【００３２】
一部の実施形態では、用語「第２のＳＭＡＤ阻害剤」とは、トランスフォーミング成長因子−βスーパーファミリーＩ型アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体の阻害剤をいう。一部の実施形態では、第２のＳＭＡＤ阻害剤はＡＬＫ５の阻害剤である。一部の実施形態では、第２のＳＭＡＤ阻害剤はＡＬＫ５およびＡＬＫ４の阻害剤である。一部の実施形態では、第２のＳＭＡＤ阻害剤はＡＬＫ５およびＡＬＫ４およびＡＬＫ７の阻害剤である。一部の実施形態では、第２のＳＭＡＤ阻害剤は４−（４−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド（ＳＢ−４３１５４２）、またはその塩もしくは水和物である。
【００３３】
ＳＢ−４３１５４２は以下の式の市販の化合物である。
【００３４】
【化２】
2017504311.tif 000003
【００３５】
一部の実施形態では、第２のＳＭＡＤ阻害剤は、
４−（４−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド；
２−メチル−５−（６−（ｍ−トリル）−１Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］イミダゾール−５−イル）−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール；
２−（６−メチルピリジン−２−イル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）キナゾリン−４−アミン；
２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン；
４−（２−（６−メチルピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル）フェノール；
２−（４−メチル−１−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）チエノ［３，２−ｃ］ピリジン；
４−（５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ベンズアミド；
２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）プテリジン−４−アミン；もしくは
６−メチル−２−フェニルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン
またはその塩もしくは水和物から選択される。
【００３６】
上記化合物は市販されているか、または当業者に知られている方法によって調製することができる（たとえばＳｕｒｍａｃｚら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０１２；３０：１８７５〜１８８４を参照）。
【００３７】
一部の実施形態では、第２のＳＭＡＤ阻害剤は、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ８３−０１）、２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン（ＳＢ−５０５１２４）、７−（２−モルホリノエトキシ）−４−（２−（ピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル）キノリン（ＬＹ２１０９７６１）、または４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン（ＬＹ３６４９４７）から選択される。
【００３８】
一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、またはＢＭＰ１５から選択されるＢＭＰを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰホモ二量体、好ましくはＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、またはＢＭＰ１５のホモ二量体である。一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰホモ二量体、好ましくはＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、またはＢＭＰ８のホモ二量体である。一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰヘテロ二量体であり、好ましくは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、またはＢＭＰ１５から選択されるＢＭＰを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰヘテロ二量体であり、好ましくは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、またはＢＭＰ８から選択されるＢＭＰを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤は、ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体、ＢＭＰ４／７ヘテロ二量体、またはＢＭＰ３／８ヘテロ二量体である。一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰ４／７ヘテロ二量体である。
【００３９】
一部の実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰシグナル伝達の低分子活性化剤である（たとえばその全体で本明細書中に参照により組み込まれているＰＬＯＳ  ＯＮＥ、２０１３年３月、８巻（３）、ｅ５９０４５を参照）。
【００４０】
一部の実施形態では、用語「網膜色素上皮細胞」または「ＲＰＥ細胞」とは、成体ＲＰＥ細胞、好ましくは成体ヒトＲＰＥ細胞の形態的および機能的特質を有する細胞をいう。
【００４１】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞は、成体ＲＰＥ細胞、好ましくは成体ヒトＲＰＥ細胞の形態的特質を有する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞は敷石状の形態を有する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞は色素性である。ＲＰＥ細胞の形状、形態、および色素沈着は視覚的に観察することができる。
【００４２】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞は、以下のＲＰＥマーカーのうちの少なくとも１つを発現する：ＭＩＴＦ、Ｓ１７、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１およびＺＯ−１。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞は、以下のＲＰＥマーカーのうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つを発現する：ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１およびＺＯ−１。一部の実施形態では、ＲＰＥマーカーの発現は免疫細胞化学によって測定する。一部の実施形態では、ＲＰＥマーカーの発現は、実施例セクションに詳述するように、免疫細胞化学によって測定する。一部の実施形態では、マーカーの発現は定量的ＰＣＲによって測定する。一部の実施形態では、ＲＰＥマーカーの発現は、実施例セクションに詳述するように、定量的ＰＣＲによって測定する。
【００４３】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞はＯｃｔ４を発現しない。
【００４４】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞は、成体ＲＰＥ細胞、好ましくは成体ヒトＲＰＥ細胞の機能的特質を有する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞はＶＥＧＦを分泌する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞はＰＥＤＦを分泌する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞はＰＥＤＦおよびＶＥＧＦを分泌する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞によるＶＥＧＦおよび／またはＰＥＤＦの分泌は、定量的免疫アッセイによって測定する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞によるＶＥＧＦおよび／またはＰＥＤＦの分泌は、実施例中に開示するように測定する。
【００４５】
好ましい実施形態では、ＲＰＥ細胞は、敷石状の形態を有しており、色素性であり、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１およびＺＯ−１のうちの少なくとも１つを発現する。好ましい実施形態では、ＲＰＥ細胞は、敷石状の形態を有しており、色素性であり、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１およびＺＯ−１のうちの少なくとも２つを発現する。好ましい実施形態では、ＲＰＥ細胞は、敷石状の形態を有しており、色素性であり、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１およびＺＯ−１のうちの少なくとも２つを発現し、ＶＥＧＦおよびＰＥＤＦを分泌する。
【００４６】
パラメータを「低い値と高い値との間」として定義する場合、そのような低い値および高い値は、定義した範囲の一部としてみなされるべきである。
【００４７】
早期再播種
一実施形態では（早期再播種の実施形態）、本発明は、
（ａ）多能性細胞を第１のＳＭＡＤ阻害剤および第２のＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ＢＭＰ経路活性化剤の存在下ならびに第１および第２のＳＭＡＤ阻害剤の非存在下で培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を再播種するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を生成する方法に関する。
【００４８】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、多能性細胞を少なくとも１日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、多能性細胞を少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間または少なくとも４日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、多能性細胞を２〜１０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、多能性細胞を２〜６日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、多能性細胞を３〜５日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、多能性細胞を約４日間培養する。
【００４９】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は０．５ｎＭ〜１０μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は１ｎＭ〜５μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は１ｎＭ〜２μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は５００ｎＭ〜２μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第１のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は約１μＭである。好ましい実施形態では、第１のＳＭＡＤ阻害剤はＬＤＮ１９３１８９である。
【００５０】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は０．５ｎＭ〜１００μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は１００ｎＭ〜５０μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は１μＭ〜５０μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は５μＭ〜２０μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は少なくとも５μＭである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、第２のＳＭＡＤ阻害剤の濃度は約１０μＭである。好ましい実施形態では、第２のＳＭＡＤ阻害剤はＳＢ−４３１５４２である。
【００５１】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＢＭＰ経路活性化剤の濃度は１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＢＭＰ経路活性化剤の濃度は５ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＢＭＰ経路活性化剤の濃度は５０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＢＭＰ経路活性化剤の濃度は約１００ｎｇ／ｍＬである。好ましい実施形態では、ＢＭＰ経路活性化剤はＢＭＰ４／７ヘテロ二量体である。
【００５２】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を少なくとも１日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間または少なくとも４日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を少なくとも３日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を２〜２０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を２〜１０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を２〜６日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を２〜４日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を約３日間培養する。
【００５３】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に、細胞を単層として少なくとも細胞２００００個／ｃｍ２の初期密度で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に、細胞を単層として少なくとも細胞１０００００個／ｃｍ２の初期密度で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に、細胞を単層として細胞２００００〜１００００００個／ｃｍ２の初期密度で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に、細胞を単層として細胞１０００００〜５０００００個／ｃｍ２の初期密度で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に、細胞を単層として細胞約２４００００個／ｃｍ２の初期密度で培養する。
【００５４】
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を少なくとも細胞１００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を少なくとも細胞２００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を少なくとも細胞１０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を細胞２００００〜５００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を細胞１０００００〜１００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を細胞約５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞をフィブロネクチン、ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に再播種する。
【００５５】
一部の実施形態では、本発明は、上記に開示したステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含み、
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で培養するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を培養するステップと
をさらに含む、ＲＰＥ細胞を生成する方法に関する。
【００５６】
一部の実施形態では、アクチビン経路活性化剤はアクチビンＡ経路活性化剤である。一部の実施形態では、アクチビン経路活性化剤はアクチビンＡまたはアクチビンＢを含む。好ましい実施形態では、アクチビン経路活性化剤はアクチビンＡである。
【００５７】
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で少なくとも１日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で少なくとも３日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で１〜５０日間、３〜３０日間または３〜２０日間培養する。
【００５８】
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で少なくとも１日間培養し、細胞をアクチビン経路活性化剤なしで少なくとも３日間さらに培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で少なくとも３日間培養し、細胞をアクチビン経路活性化剤なしで少なくとも４日間さらに培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で１〜１０日間培養し、細胞をアクチビン経路活性化剤なしで５〜３０日間さらに培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をアクチビン経路活性化剤の存在下で約３日間培養し、細胞をアクチビン経路活性化剤なしで５〜３０日間さらに培養する。
【００５９】
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、アクチビン経路活性化剤の濃度は１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、アクチビン経路活性化剤の濃度は１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、アクチビン経路活性化剤の濃度は１０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、アクチビン経路活性化剤は約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のアクチビンＡである。
【００６０】
一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞２００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞１０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を細胞２００００〜５００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を細胞２００００〜１００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を細胞２００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を細胞約２０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞をフィブロネクチン、ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）上に再播種する。
【００６１】
一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも５日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも７日間、少なくとも１４日間、または少なくとも２１日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも１４日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を５〜４０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を１０〜３５日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を２１〜３５日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を約２８日間培養する。
【００６２】
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をｃＡＭＰの存在下、好ましくは０．０１ｍＭ〜１Ｍの濃度で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を０．１ｍＭ〜５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を０．５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。
【００６３】
一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞をｃＡＭＰの存在下、好ましくは０．０１ｍＭ〜１Ｍの濃度で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を０．１ｍＭ〜５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を０．５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。
【００６４】
また、本開示には、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および／または（ｆ）の上記に開示した実施形態を組み合わせた方法も含まれる。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明は、
（ａ）ヒトＥＳＣまたはヒトｉＰＳＣを、５００ｎＭ〜２μＭのＬＤＮ１９３１８９および５μＭ〜２０μＭのＳＢ−４３１５４２の存在下で３〜５日間培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２／６ヘテロ二量体、ＢＭＰ４／７ヘテロ二量体、またはＢＭＰ３／８ヘテロ二量体の存在下ならびにＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ−４３１５４２の非存在下で２〜６日間培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を細胞１０００００〜１００００００個／ｃｍ２の密度で再播種するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞を、約１０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの存在下で３〜３０日間培養するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を細胞２００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を１０〜３５日間培養するステップと
を含む、網膜色素上皮細胞を生成する方法に関する。
【００６６】
後期再播種
代替実施形態では（後期再播種の実施形態）、ＲＰＥ細胞を生成する方法は、
（ａ）多能性細胞を第１のＳＭＡＤ阻害剤および第２のＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ＢＭＰ経路活性化剤の存在下ならびに第１および第２のＳＭＡＤ阻害剤の非存在下で培養し、その後、
前記細胞を少なくとも１０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養するステップと、
（ｃ）敷石状の形態を有するステップ（ｂ）の細胞を再播種するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞を培養するステップと
を含む。
【００６７】
また、早期再播種の実施形態のステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に関連して上記に開示した実施形態は、後期再播種の実施形態のステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の実施形態でもある。
【００６８】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を少なくとも２０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を少なくとも３０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を少なくとも４０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を１０〜６０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を３０〜５０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、細胞を約４０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養する。
【００６９】
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を少なくとも細胞２００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を少なくとも細胞１０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を細胞２００００〜５００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を細胞５００００〜１００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を細胞５００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、細胞を細胞約２０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。
【００７０】
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を少なくとも３日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を少なくとも５日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を少なくとも１０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を少なくとも１４日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を１０〜４０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を１０〜２０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を約１４日間培養する。
【００７１】
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞をｃＡＭＰの存在下、好ましくは０．０１ｍＭ〜１Ｍの濃度で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を０．１ｍＭ〜５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、細胞を０．５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。
【００７２】
一部の実施形態では、この方法は、以下の追加のステップをさらに含む：
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を培養するステップと。
【００７３】
一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞２００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を少なくとも細胞１０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を細胞２００００〜５００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を細胞５００００〜１００００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を細胞５００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）において、細胞を細胞約２０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。
【００７４】
一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも１０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも１４日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも２０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも２５日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を少なくとも４０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を１０〜６０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を１５〜４０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｆ）において、細胞を約２８日間培養する。
【００７５】
また、本開示には、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および／または（ｆ）の上記に開示した実施形態を組み合わせた方法も含まれる。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明は、
（ａ）ヒトＥＳＣまたはヒトｉＰＳＣを、５００ｎＭ〜２μＭのＬＤＮ１９３１８９および５μＭ〜２０μＭのＳＢ−４３１５４２の存在下で３〜５日間培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２／６ヘテロ二量体、ＢＭＰ４／７ヘテロ二量体、またはＢＭＰ３／８ヘテロ二量体の存在下ならびにＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ−４３１５４２の非存在下で２〜６日間培養し、その後、
前記細胞を３０〜５０日間、ＢＭＰ経路活性化剤の非存在下で培養するステップと
（ｃ）敷石状の形態を有するステップ（ｂ）の細胞を細胞５００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の再播種した細胞を１０〜２０日間培養するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞を細胞５００００〜５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の再播種した細胞を１５〜４０日間培養するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を生成する方法に関する。
【００７７】
本明細書中に開示する方法（早期再播種および後期再播種が含まれる）によって調製したＲＰＥ細胞は、当業者に知られている様々な方法によって回収することができる。たとえば、ＲＰＥ細胞は、機械的解体またはパパインもしくはトリプシンなどの酵素を用いた解離によって回収することができる。
【００７８】
本明細書中に開示する方法によって調製したＲＰＥ細胞は、たとえば、それだけには限定されないが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの技法によってさらに精製することができる。これらの技法には、ＲＰＥ特異的細胞表面タンパク質に対する抗体の使用（陽性選択）が含まれる。好ましい実施形態では、前記ＲＰＥ特異的細胞表面タンパク質はＣＤ５９である。ＦＡＣＳでは、ＲＰＥ細胞を、特定のＲＰＥ細胞表面マーカーを標的とする抗体とコンジュゲートさせた蛍光体で標識することができる。サイトメーターを使用してこれらの標識された細胞を精製して、いかなる汚染細胞種も含まない、高度に均質かつ精製されたＲＰＥ集団を生じることができる。同様に、ＭＡＣＳでは、磁気ナノ粒子とコンジュゲートさせた抗体でＲＰＥ細胞を標識し、磁場を適用することによってさらに精製することができる。また、潜在的な汚染細胞種を標的とする抗体を使用することによって陰性選択を提供することもでき、その結果これらは除去され、純粋なＲＰＥ集団の生成にも貢献する。
【００７９】
一部の実施形態では、本明細書中に開示するＲＰＥ細胞を生成する方法は、ＣＤ５９を発現する細胞中の細胞集団を濃縮するための精製ステップを含む。ＣＤ５９を発現する細胞中の細胞集団を濃縮することは、成熟ＲＰＥ細胞を濃縮し、最終ＲＰＥ細胞集団中に存在する可能性があり得る多能性細胞および／またはＲＰＥ前駆体などの残留汚染細胞を除去する手段である。
【００８０】
一部の実施形態では、本明細書中に開示するＲＰＥ細胞を生成する方法は、
−細胞を、蛍光体とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＦＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
を含む、精製ステップを含む。
【００８１】
好ましい実施形態では、抗ＣＤ５９抗体はカタログ＃５６０７４７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗体である。
【００８２】
一部の実施形態では、本明細書中に開示するＲＰＥ細胞を生成する方法は、実施例１３ｂに開示されている精製ステップを含む。
【００８３】
一部の実施形態では、本明細書中に開示するＲＰＥ細胞を生成する方法は、
−細胞を、磁気粒子とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＭＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
を含む、精製ステップを含む。
【００８４】
たとえばカタログ＃５６０７４７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗体などの市販の抗ＣＤ５９抗体を本発明において使用することができる。
【００８５】
一部の実施形態では、上記に開示した精製ステップを早期再播種方法のステップ（ｅ）の後に行う。一部の実施形態では、上記に開示した精製ステップを早期再播種方法のステップ（ｆ）の後に行う。一部の実施形態では、上記に開示した精製ステップを後期再播種方法のステップ（ｃ）の後に行う。一部の実施形態では、上記に開示した精製ステップを後期再播種方法のステップ（ｄ）の後に行う。
【００８６】
一部の実施形態では、本発明は、
ａ）多能性細胞の集団を提供するステップと、
ｂ）多能性細胞のＲＰＥ細胞への分化を誘導するステップと、
ｃ）細胞集団を、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を生成する方法に関する。
【００８７】
一部の実施形態では、本発明は、
ａ）多能性細胞の集団を提供するステップと、
ｂ）多能性細胞のＲＰＥ細胞への分化を誘導するステップと、
ｃ）−細胞を、蛍光体とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＦＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
によって、細胞集団を、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を生成する方法に関する。
【００８８】
一部の実施形態では、本発明は、
ａ）多能性細胞の集団を提供するステップと、
ｂ）多能性細胞のＲＰＥ細胞への分化を誘導するステップと、
ｃ）−細胞を、磁気粒子とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＭＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
によって、細胞集団を、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を生成する方法に関する。
【００８９】
ステップｂにおいて、ＲＰＥ細胞における多能性細胞の分化は、たとえば自発的分化または定方向分化の方法などの当業者に知られている任意の方法に従って行うことができる。具体的には、ステップｂにおいて、多能性細胞のＲＰＥ細胞への分化は、本明細書中に参照により組み込まれているＷＯ０８／１２９５５４、ＷＯ０９／０５１６７１、ＷＯ２０１１／０６３００５、ＵＳ２０１１２６９１７３、ＵＳ２０１３０１９６３６９、ＷＯ２０１３／１８４８０９、ＷＯ０８／０８７９１７、ＷＯ２０１１／０２８５２４、またはＷＯ２０１４／１２１０７７中に開示されている任意の方法に従って行うことができる。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明は、
ａ）ＲＰＥ細胞および非ＲＰＥ細胞を含む細胞集団を提供するステップと、
ｂ）細胞集団を、ＣＤ５９を発現する細胞について濃縮することによって、細胞集団中のＲＰＥ細胞のパーセンテージを増加させるステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を精製する方法に関する。
【００９１】
一部の実施形態では、本発明は、
ａ）ＲＰＥ細胞および非ＲＰＥ細胞を含む細胞集団を提供するステップと、
ｂ）−細胞集団を、蛍光体とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＦＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
によって、細胞集団中のＲＰＥ細胞のパーセンテージを増加させるステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を精製する方法に関する。
【００９２】
一部の実施形態では、本発明は、
ａ）ＲＰＥ細胞および非ＲＰＥ細胞を含む細胞集団を提供するステップと、
ｂ）−細胞集団を、磁気粒子とコンジュゲートさせた抗ＣＤ５９抗体と接触させるステップと、
−ＭＡＣＳを使用して、抗ＣＤ５９抗体と結合する細胞を選択するステップと
によって、細胞集団中のＲＰＥ細胞のパーセンテージを増加させるステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を精製する方法に関する。
【００９３】
一部の実施形態では、非ＲＰＥ細胞は多能性細胞またはＲＰＥ前駆体である。
【００９４】
一部の実施形態では、用語「ＲＰＥ前駆体」とは、ＲＰＥ細胞へと分化するように誘導されているが、分化プロセスが完全に完了していない、ｈＥＳＣなどの多能性細胞に由来する細胞をいう。一部の実施形態では、そのような「ＲＰＥ前駆体」は、成体ＲＰＥ細胞の１つまたは複数の形態的および機能的特質を含み、成体ＲＰＥ細胞の少なくとも１つの形態的および機能的特質を欠く。一部の実施形態では、ＲＰＥ前駆体は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＬＩＮ２８のうちの１つまたは複数を発現する。
【００９５】
本明細書中に開示する方法の一部の実施形態では、たとえばプレート培養などの接着条件下で二次元培養において細胞を培養する。好ましい実施形態では、細胞を単層として培養する。一部の実施形態では、細胞を、たとえばそれだけには限定されないが、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）、ＢＭＥ  ｐａｔｈｃｌｅａｒ（登録商標）、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）などの細胞支持物質上で培養する。一部の実施形態では、細胞を単層として、たとえば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）、ＢＭＥ  ｐａｔｈｃｌｅａｒ（登録商標）、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養する。好ましい実施形態では、細胞を単層としてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養する。好ましい実施形態では、細胞を単層としてフィブロネクチンまたはビトロネクチン上で培養する。
【００９６】
一部の実施形態では、本明細書中に開示する方法の一部のステップは、懸濁培養などの非接着条件下で三次元培養において行い得る。懸濁培養では、細胞の大多数が液体培地中に単一細胞、細胞クラスターおよび／または細胞凝集体として自由に浮遊している。細胞を、当業者に知られている方法に従って、三次元系において培養することができる（たとえば、Ｋｅｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７巻（６）、８６２〜８６９（１９９５）またはＷａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８、２８８〜２９６（２００５）を参照）。
【００９７】
一部の実施形態では、本明細書中に開示する方法の一部のステップをたとえばそれだけには限定されないが懸濁培養などの三次元培養で実施し、一部のステップを二次元培養（たとえば細胞を単層として培養する）で実施する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）および／または（ｂ）を懸濁培養で実施し、以下のステップを二次元培養（たとえば細胞を単層として培養する）で実施する。
【００９８】
一部の実施形態では、細胞を播種する前にＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤と共にインキュベートする。一部の実施形態では、細胞をステップ（ａ）の前にＲＯＣＫ阻害剤と共にインキュベートする。ＲＯＣＫ阻害剤は、解離したヒト胚性幹細胞の生存を許可する物質である（Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２５：６８１〜６８６（２００７）を参照）。本発明の方法において使用することができるＲＯＣＫ阻害剤の例は、それだけには限定されないが、Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２、Ｙ−３０１４１、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、およびＳＢ−７７２０７７−Ｂである。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ−２７６３２である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の前に、多能性細胞をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で播種する。一部の実施形態では、細胞をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で、播種後１または２日間培養する。一部の実施形態では、本発明の方法の１回目の再播種をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で実施する。一部の実施形態では、細胞をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で１回目の再播種後１または２日間培養する。
【００９９】
本発明の方法では、細胞を、多能性細胞、好ましくはヒト多能性細胞の培養に適切な任意の基本培地中で培養することができる。一部の実施形態では、細胞を、ヒト胚性幹細胞の培養に適切な基本培地中で培養する。
【０１００】
適切な基本培地の例には、それだけには限定されないが、ＩＭＤＭ培地、培地１９９、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ＡＭＥＭ培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＫＯ−ＤＭＥＭ、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、フィッシャー培地、グラスゴーＭＥＭ、ＴｅｓＲ１、ＴｅｓＲ２、エッセンシャル８、およびその混合物が含まれる。一部の実施形態では、培地は血清を含む。一部の実施形態では、培地は無血清である。好ましい実施形態では、基本培地はＴｅｓＲ１またはＴｅｓＲ２である。
【０１０１】
望ましい場合は、培地は、１つまたは複数の血清代替物、たとえば、アルブミン、トランスフェリン、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン先駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオール、グリセロール、Ｂ２７補充剤、およびＮ２補充剤、ならびに脂質、アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルベート、緩衝剤、および無機塩などの１つまたは複数の物質をさらに含有し得る。
【０１０２】
本発明の方法における細胞培養に使用する基本培地は、必要に応じて、たとえば、それだけには限定されないが、ＳＭＡＤ阻害剤、ＢＭＰ経路活性化剤、アクチビン経路活性化剤、および／またはｃＡＭＰを補充することができる。
【０１０３】
上記に開示した方法の一部の実施形態では、ステップ（ａ）で使用する細胞はｈＥＳＣまたはヒトＩＰＳｃであり、方法は、異種成分を含まない条件下、すなわちヒト以外の動物に由来するいかなる材料も使用せずに実施する。たとえば、方法を、異種成分を含まない条件下で実施する場合、培地および細胞支持物質は、ヒト以外の動物に由来するいかなる材料も含まない。
【０１０４】
一部の実施形態では、再播種は、播種した細胞を解離すること、好ましくは細胞の単層を解離することと、解離した細胞を播種することとを含む。好ましくは、たとえば、トリプシン、コラゲナーゼＩＶ、コラゲナーゼＩ、ディスパーゼ、または市販の細胞解離緩衝液などの酵素を使用して細胞を解離する。好ましくは、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）を使用して細胞を解離する。
【０１０５】
一部の実施形態では、本明細書中に開示する方法によって得られたまたは得ることができるＲＰＥ細胞をさらに拡大する。一部の実施形態では、拡大ステップを二次元培養にて、接着条件下で実施する。一部の実施形態では、拡大ステップは、
−ＲＰＥ細胞を再播種することと、
−再播種したＲＰＥ細胞を培養することと
を含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を細胞支持物質上に再播種する。適切な細胞支持物質には、たとえば、それだけには限定されないが、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、またはＢＭＥ  ｐａｔｈｃｌｅａｒ（登録商標）（ＢＭＥ  ＰａｔｈＣｌｅａｒ（登録商標）は、エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）腫瘍から精製した基底膜の可溶形であり、主にラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される）が含まれる。好ましい実施形態では、細胞支持物質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）から選択され、好ましくはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）である。
【０１０７】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を細胞１０００〜１０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を細胞５０００〜１０００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を細胞１００００〜４００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を細胞１００００〜３００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を細胞約２００００個／ｃｍ２の密度で再播種する。
【０１０８】
一部の実施形態では、再播種した細胞を少なくとも７日間培養する。一部の実施形態では、再播種した細胞を少なくとも１４日間培養する。一部の実施形態では、再播種した細胞を少なくとも２８日間培養する。一部の実施形態では、再播種した細胞を少なくとも４２日間培養する。一部の実施形態では、再播種した細胞を２１日間〜７０日間培養する。一部の実施形態では、再播種した細胞を３０日間〜６０日間培養する。一部の実施形態では、再播種した細胞を約４９日間培養する。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞をｃＡＭＰの存在下、好ましくは０．０１ｍＭ〜１Ｍの濃度で培養する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を０．１ｍＭ〜５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を約０．５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。
【０１１０】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を、ｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下で培養する。一部の実施形態では、前記薬剤はアデニルシクラーゼ活性化剤、好ましくはフォルスコリンである。一部の実施形態では、前記薬剤は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、好ましくはＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ１０および／またはＰＤＥ１１阻害剤である。一部の実施形態では、前記薬剤は、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７および／またはＰＤＥ８阻害剤である。
【０１１１】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下、好ましくは１ｎＭ〜１００μＭの濃度で培養する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を１０ｎＭ〜１０μＭのＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を約１０ｎＭ〜１μＭのＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養する。一部の実施形態では、前記ＳＭＡＤ阻害剤はＴＧＦβＩ型受容体（ＡＬＫ５）および／またはＴＧＦβＩＩ型受容体の阻害剤である。好ましい実施形態では、前記ＳＭＡＤ阻害剤はＡＬＫ５阻害剤である。一部の実施形態では、前記阻害剤は、２−（６−メチルピリジン−２−イル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）キナゾリン−４−アミン、６−（１−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン、または４−メトキシ−６−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）キノリンである。また、本発明において使用することができるＳＭＡＤ阻害剤の例は、たとえば、ＥＰ２４０９７０８Ａ１またはＹｉｎｇｌｉｎｇ  ＪＭら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、３巻：１０１１〜１０２２（２００４）中にも見つけることができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を、ｃＡＭＰまたはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤、好ましくはｃＡＭＰの存在下で培養し、拡大ステップの収率は、同様の条件下で前記薬剤またはｃＡＭＰなしと比較した場合に増加する。
【０１１３】
また、本発明は、前記ＲＰＥ細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤、ｃＡＭＰ、またはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下で培養するステップを含む、ＲＰＥ細胞を拡大する方法にも関する。一部の実施形態では、本発明は、
（ａ）ＲＰＥ細胞を少なくとも細胞１０００個／ｃｍ２の密度で播種するステップと、
（ｂ）前記ＲＰＥ細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤、ｃＡＭＰ、またはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下で培養するステップと
を含む、ＲＰＥ細胞を拡大する方法に関する。
【０１１４】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、ＲＰＥ細胞を、たとえば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、またはＢＭＥ  ｐａｔｈｃｌｅａｒ（登録商標）から選択される細胞支持物質上に播種する。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）において、細胞支持物質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）から選択され、好ましくはＣｅｌｌｓｔａｒｔ（登録商標）である。
【０１１５】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、ＲＰＥ細胞を細胞１０００〜１０００００個／ｃｍ２の密度で播種する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、ＲＰＥ細胞を細胞５０００〜１０００００個／ｃｍ２の密度で播種する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、ＲＰＥ細胞を細胞１００００〜４００００個／ｃｍ２の密度で播種する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、ＲＰＥ細胞を細胞１００００〜３００００個／ｃｍ２の密度で播種する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、ＲＰＥ細胞を細胞約２００００個／ｃｍ２の密度の密度で播種する。
【０１１６】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＲＰＥ細胞を少なくとも７日間培養する。一部の実施形態では、再播種した細胞を少なくとも１４日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、再播種した細胞を少なくとも２８日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、再播種した細胞を少なくとも４２日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、再播種した細胞を２１日間〜７０日間培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、再播種した細胞を３０日間〜６０日間培養する。一部の実施形態では、再播種した細胞を約４９日間培養する。
【０１１７】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＲＰＥ細胞をｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下で培養する。一部の実施形態では、前記薬剤はアデニルシクラーゼ活性化剤、好ましくはフォルスコリンである。一部の実施形態では、前記薬剤は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、好ましくはＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ１０および／またはＰＤＥ１１阻害剤である。一部の実施形態では、前記薬剤は、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、および／またはＰＤＥ８阻害剤である。
【０１１８】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＲＰＥ細胞をｃＡＭＰの存在下、好ましくは０．０１ｍＭ〜１Ｍの濃度で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＲＰＥ細胞を０．１ｍＭ〜５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＲＰＥ細胞を約０．５ｍＭのｃＡＭＰの存在下で培養する。
【０１１９】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＲＰＥ細胞をｃＡＭＰまたはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤、好ましくはｃＡＭＰの存在下で培養し、ＲＰＥ細胞を拡大する方法の収率は、前記薬剤またはｃＡＭＰなしの同じ方法と比較して増加する。
【０１２０】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において、ＲＰＥ細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下、好ましくは１ｎＭ〜１００μＭの濃度で培養する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を１０ｎＭ〜１０μＭのＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養する。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を約１０ｎＭ〜１μＭのＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養する。一部の実施形態では、前記ＳＭＡＤ阻害剤はＴＧＦβＩ型受容体（ＡＬＫ５）および／またはＴＧＦβＩＩ型受容体の阻害剤である。好ましい実施形態では、前記ＳＭＡＤ阻害剤はＡＬＫ５阻害剤である。一部の実施形態では、前記阻害剤は、２−（６−メチルピリジン−２−イル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）キナゾリン−４−アミン、６−（１−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン、または４−メトキシ−６−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）キノリンである。また、本発明において使用することができるＳＭＡＤ阻害剤の例は、たとえば、ＥＰ２４０９７０８Ａ１またはＹｉｎｇｌｉｎｇ  ＪＭら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、３巻：１０１１〜１０２２（２００４）中にも見つけることができる。
【０１２１】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する方法によって得られたＲＰＥ細胞に関する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する方法によって得ることができるＲＰＥ細胞に関する。
【０１２２】
本明細書中に開示する方法によって得られたまたは得ることができるＲＰＥ細胞を、研究ツールとして使用することができる。たとえば、ＲＰＥ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、その生存、再生、および／もしくは機能を促進する新規薬物の開発のために、またはＲＰＥ細胞に対して毒性もしくは再生効果を有する化合物の高スループットスクリーニングのために使用することができる。
【０１２３】
本明細書中に開示する方法によって得られたまたは得ることができるＲＰＥ細胞は治療において使用することができる。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞は網膜疾患の処置に使用することができる。
【０１２４】
一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を、網膜疾患を患っている対象の眼内への移植に適切な医薬組成物中に配合する。
【０１２５】
一部の実施形態では、眼内への移植に適切な医薬組成物は、ＲＰＥ細胞を支持するのに適した構造とＲＰＥ細胞とを含む。そのような医薬組成物の非限定的な例は、その全体で本明細書中に参照により組み込まれているＷＯ２００９／１２７８０９、ＷＯ２００４／０３３６３５、ＷＯ２０１２／００９３７７、またはＷＯ２０１２１７７９６８に開示されている。
【０１２６】
好ましい実施形態では、医薬組成物は多孔性膜およびＲＰＥ細胞を含む。一部の実施形態では、膜の孔は直径が０．２μｍ〜０．５μｍであり、孔の密度は１×１０７〜３×１０８個の孔／ｃｍ２である。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞を支持したコーティングで膜の片側をコーティングする。一部の実施形態では、コーティングは糖タンパク質を含み、好ましくはラミニンまたはビトロネクチンから選択される。好ましい実施形態では、コーティングはビトロネクチンを含む。一部の実施形態では、膜はポリエステル製である。
【０１２７】
代替実施形態では、医薬組成物は、対象の眼内への移植に適切な培地中の懸濁液中のＲＰＥ細胞を含む。そのような医薬組成物の例は、その全体で本明細書中に参照により組み込まれているＷＯ２０１３／０７４６８１に開示されている。
【０１２８】
本明細書中に開示する方法によって得られたＲＰＥ細胞は、対象の眼内の様々な標的部位に移植し得る。一実施形態に従って、ＲＰＥ細胞の移植は、眼の網膜下空間（光受容器外節と脈絡膜との間）への移植である。さらに、硝子体空間、網膜内層および網膜外層、網膜周辺部、ならびに脈絡膜内を含めた、さらなる眼球区画内への移植を検討することができる。
【０１２９】
ＲＰＥ細胞の眼内への移植は、当分野で知られている様々な技法によって行うことができる（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれている米国特許第５９６２０２７号、第６０４５７９１号、および第５，９４１，２５０号を参照）。
【０１３０】
一部の実施形態では、移植は、経扁平部硝子体切除手術、続いて小さな網膜の開口部から網膜下の空間内に細胞を送達することによって行う。一部の実施形態では、ＲＰＥ細胞は、適切なデバイスを使用して眼内に移植する（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれているＷＯ２０１２／０９９８７３またはＷＯ２０１２／００４５９２を参照）。
【０１３１】
一部の実施形態では、移植は、対象の眼内への直接注射によって行う。
【０１３２】
一部の実施形態では、本明細書中に開示する方法によって得られたＲＰＥ細胞は、網膜疾患の処置に使用することができる。一部の実施形態では、本発明は、対象における網膜疾患の処置に使用するための、本明細書中に開示する方法によって得られたもしくは得ることができるＲＰＥ細胞、またはそのような細胞を含む医薬組成物に関する。一部の実施形態では、本発明は、対象において網膜疾患を処置する医薬品を製造するための、本明細書中に開示する方法によって得られたもしくは得ることができるＲＰＥ細胞、またはそのような細胞を含む医薬組成物の使用に関する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示する方法によって得られたもしくは得ることができるＲＰＥ細胞、またはそのような細胞を含む医薬組成物を対象に投与することによって、対象において網膜疾患を処置する方法に関する。
【０１３３】
一部の実施形態では、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０１３４】
一部の実施形態では、網膜疾患は、網膜の機能不全、網膜の傷害、および／または網膜色素上皮の喪失もしくは劣化に関連する疾患である。一部の実施形態では、網膜疾患は、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、遺伝性もしくは後天性黄斑変性症、加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、脈絡膜欠如、パターンジストロフィーおよびＲＰＥ細胞の他のジストロフィー、糖尿病性網膜症、またはシュタルガルト病から選択される。好ましい実施形態では、網膜疾患は網膜色素変性症または加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）である。好ましい実施形態では、網膜疾患は加齢関連黄斑変性症である。
【実施例】
【０１３５】
（実施例１）
早期再播種を用いた定方向分化
すべての作業は無菌的な組織培養フード内で実施した。Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）上、ＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でルーチン的に培養した。ＷＡ２６  ｈＥＳＣ（Ｗｉｃｅｌｌ）は、エッセンシャル８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ヒトビトロネクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でルーチン的に培養した。培養物は、コロニーをより小さな凝集体へと解離するために０．５ｍＭのＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を使用して、週に２回継代し、その後、これを、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地に再播種した。培養培地は毎日交換した。
【０１３６】
Ｓｈｅｆ１またはＷＡ２６  ｈＥＳＣ（Ｗｉｃｅｌｌ）を１０μＭのＹ２７６３５２（ＲＯＣＫ阻害剤）と共に３５分間、３７℃でインキュベートした。培地を除去し、細胞を５ｍｌのＰＢＳ（−ＭｇＣｌ２、−ＣａＣｌ２）（本明細書中以降ＰＢＳ（−／−））で洗浄した。２ｍＬのＴｒｙｐＬＥ  ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）を加え、細胞を３７℃／５％のＣＯ２、加湿したインキュベーター内で６〜８分間インキュベートした。ＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地は以下のように調製した。
【０１３７】
【表１】
2017504311.tif 000004
【０１３８】
ＴｅｓＲ２完全培地（ＴｅｓＲ２）は以下のように調製した。
【０１３９】
【表２】
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【０１４０】
５ｍＬのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地を加え、ピペットで吸ったり吐いたりして単一細胞懸濁液を得た。懸濁液を１５ｍＬのファルコンチューブに移し、３００×ｇで４分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを５ｍＬのＴｅｓＲ２完全培地（登録商標）に再懸濁させた。細胞懸濁液を４０μｍの細胞ストレーナーに通して５０ｍＬのファルコンチューブに入れ、その後、細胞ストレーナーを１ｍＬのＴｅｓＲ２完全培地（登録商標）で洗浄した。細胞を１３００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを、５μＭのＹ２７６３５２を補充した３ｍＬのＴｅｓＲ２完全培地（登録商標）に再懸濁させた。Ｔ２５フラスコを所要のマトリックス、たとえばＭａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンでコーティングした。Ｍａｔｒｉｇｅｌを冷蔵庫内で終夜解凍し、使用前にノックアウトＤＭＥＭで１：１５に希釈した。フィブロネクチンをＰＢＳ（−／−）で１：１０に希釈した。２．５ｍｌの希釈したマトリックスを使用してＴ２５フラスコをコーティングし、３時間、３７℃でインキュベートした。細胞を計数し、コーティングした培養容器内に適切な密度で播種して単層を得た。Ｔ２５フラスコでは、細胞を細胞２４００００個／ｃｍ２の密度、１０ｍｌの総体積、５μＭのＹ２７６３５２を含むＴｅＳＲ２中で播種した。この時点を０日目として指定する。播種の２４時間後（１日目）、培地を吸引し、１０ｍＬ／フラスコのＴｅｓＲ２完全培地（Ｒｏｃｋ阻害剤なし）で置き換えた。播種の４８時間後（２日目）、培地を吸引し、１０ｍＬ／フラスコの、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２を含有するＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地で置き換えた。２つの阻害剤を含む培地を毎日補充した。６日目に、培地を吸引し、１０ｍＬ／フラスコの、１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４／７ヘテロ二量体を含有するＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦで置き換えた。ＢＭＰ４／７を含む新鮮な培地を毎日補充した。
【０１４１】
９日目に、以下のように細胞を再播種した（早期再播種１）。まず、培養容器、たとえば、Ｔ１２．５フラスコ、９６ウェルのＣｅｌｌＢｉｎｄプレート、または３８４ウェルのＣｅｌｌＢｉｎｄプレートを、所要のマトリックス、たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、フィブロネクチン、またはＣｅｌｌｓｔａｒｔでコーティングした。Ｍａｔｒｉｇｅｌを冷蔵庫内で終夜解凍し、使用前にＤＭＥＭで１：１５に希釈した。フィブロネクチンをＰＢＳ（−／−）で１：１０に希釈した。ＣｅｌｌｓｔａｒｔをＰＢＳ（＋ＭｇＣｌ２、＋ＣａＣｌ２）（本明細書中以降ＰＢＳ（＋／＋））で１：５０に希釈した。１．５ｍｌの希釈したマトリックスを使用してＴ１２．５フラスコをコーティングし、３時間、３７℃でインキュベートした。次に、１０μＭのＹ２７６３５２をそれぞれのＴ２５フラスコの細胞（分化プロトコルの９日目）に加え、３７℃で３５分間インキュベートした。培地を吸引し、細胞を５ｍＬのＰＢＳ（−／−）で２回洗浄した。２．５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ  ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）をそれぞれのフラスコに加え、細胞がフラスコから浮き上がるまで、フラスコを３７℃に１５〜２５分間移した。５ｍＬのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地をそれぞれのフラスコに加え、フラスコの表面を洗浄するために使用した。細胞懸濁液を４０μｍの細胞ストレーナーに通した。細胞を４００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを１０ｍＬのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地（＋５μＭのＹ２７６３５２）に再懸濁させた。上清を吸引し、ペレットを１０ｍＬのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地（５μＭのＹ２７６３５２）に再懸濁させた。細胞を計数し、コーティングした培養容器に細胞５０００００個／ｃｍ２の密度で播種した。再播種の２４時間後（すなわちＤ１０であり、分化プロトコルのＤ９−１ともいうことができる）、培地をＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡに変えた。週に３回、培地に新鮮なアクチビンＡを補充した。
【０１４２】
Ｄ９−１９の後（すなわちＤ２８日）、細胞を再播種してＲＰＥ細胞の均質集団が得られた（早期再播種２）。培地を吸引し、細胞を５ｍＬのＰＢＳ（−／−）で２×洗浄した。２．５ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅをそれぞれのフラスコに加え、細胞がフラスコから浮き上がるまで、３７℃で約３５分間インキュベートした。５ｍＬのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地をそれぞれのフラスコに加え、フラスコの表面を洗浄するために使用した後、７０μｍのストレーナーを介して内容物を５０ｍＬのファルコンチューブ内に移した。細胞を４００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを１０ｍＬのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地に再懸濁させた。血球計算器を使用して細胞を計数し、コーティングした培養容器（たとえばＰＢＳ（＋／＋）で１：５０に希釈したＣｅｌｌｓｔａｒｔ）内のＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地中に、様々な密度、たとえば１２００００／ｃｍ２で播種した。新鮮な培地を週に２回補充した。
【０１４３】
細胞の培養を１４日間維持した。生じたＲＰＥ細胞を、とりわけＲＰＥマーカー（ＰＭＥＬ１７、ＺＯ１、ＢＥＳＴ１、ＣＲＡＬＢＰ）の発現を免疫細胞化学およびｑＰＣＲによって試験することによって、特徴づけた。９０％を超える細胞がＲＰＥマーカーＰＭＥＬ１７を発現していた。
【０１４４】
このプロトコルは、ＲＰＥマーカーＰＭＥＬ１７ならびにＣＲＡＬＢＰおよびＭＥＲＴＫなどの他の成熟ＲＰＥマーカーを発現するＲＰＥ細胞の生成をもたらした。
【０１４５】
このプロトコルは、多能性細胞の単層をＳＭＡＤ阻害剤、好ましくはＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ−４３１５４２で処理すること、続いて、たとえば組換えＢＭＰ４／７ヘテロ二量体タンパク質を使用してＢＭＰ経路を活性化することを含む。ＬＤＮ１９３１８９／ＳＢ−４３１５４２およびＢＭＰ４／７の処置に続いて、細胞を再播種し（早期再播種１）、アクチビンＡで処理することができる。アクチビンＡを用いた処理に続いて、細胞の基本培地内への２回目の再播種を行うことができ（早期再播種２）、培養を維持して純粋なＲＰＥ細胞培養物が得られる。これにより、均質なＲＰＥ細胞培養物の生成がもたらされる。
【０１４６】
いかなる理論にも束縛されずに、ＳＭＡＤ阻害剤を使用したＴＧＦβシグナル伝達の阻害は、前方神経外胚葉（ＡＮＥ）に向かうｈＥＳＣの分化をもたらすと考えられている。続くＢＭＰ４／７などのＢＭＰ経路活性化剤を用いた処理は、眼分野に向かうＡＮＥの分化を誘導する。続く再播種およびアクチビンＡを用いた任意選択の処理は、ＲＰＥ運命に向かう分化をもたらした。
【０１４７】
したがって、本開示は、ｈＥＳＣを頑強かつ再現性をもって分化させて、純粋なＲＰＥ細胞を生じる方法を提供する。さらに、このプロトコルは容易にスケール変更可能であり、高収率を与える。上記方法は、異種成分を含まない条件下でｈＥＳＣをＲＰＥ細胞へと再現性よくかつ効率的に分化させるために使用することができる。
【０１４８】
（実施例２）
ＳＭＡＤ阻害剤を用いた処理
本実施例は、ｈＥＳＣに対するＳＭＡＤ阻害剤の効果を例示する。
【０１４９】
２．１．ＳＭＡＤ阻害剤を用いた処理はＡＮＥの形成をもたらす
Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした９６ウェルプレート上に細胞１２５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、細胞を１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２で処理し、試料を２日目、６日目、８日目、および１０日目に固定した。免疫細胞化学を、ＰＡＸ６（ＡＮＥのマーカー）の発現およびＯＣＴ４（多能性ｈＥＳＣのマーカー）の下方制御について実施した。ＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ−４３１５４２で誘導した試料において、分化の時間経過にわたるＰＡＸ６タンパク質の均一な誘導およびＯＣＴ４の均一な減少が見られた（図１Ｂ）。これは、９６ウェルプレートの１つのウェルの全表面上のみでなく、プレート内のすべてのウェル中で同様に観察され、このことは、プレート間／プレート内の変動が低い頑強な誘導であることを示している。対照的に、ＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ−４３１５４２で処理せず、培地単独中で維持した試料は、この時間経過の終わりに低レベルのＰＡＸ６およびより高いレベルのＯＣＴ４を発現し、このことは、ＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ−４３１５４２の非存在下でＡＮＥの効率的な誘導が起こらなかったことを示している（図１Ｃ）。
【０１５０】
２．２．２日間のＳＭＡＤ阻害剤を用いた処理
Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした９６ウェルプレート上に細胞１２５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、細胞を、表１に記載した様々な長さの時間の間、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２で処理した。
【０１５１】
【表３】
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【０１５２】
細胞をＰＡＸ６およびＯＣＴ４について免疫染色した。ＰＡＸ６の上方制御およびＯＣＴ４の下方制御のレベルは、試験したすべての条件において同様であった（図１Ｃ）。このことは、少なくとも２日間のＬＤＮ１９３１８９／ＳＢ−４３１５４２がＡＮＥの誘導をもたらすことを示している。
【０１５３】
（実施例３）
ＲＰＥマーカーの誘導
（実施例３．１）
ＢＭＰ経路の活性化によるＭＩＴＦの誘導
本実施例は、ＲＰＥマーカーの発現に対するＢＭＰ経路活性化剤の効果を例示する。Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした９６ウェルプレート上に細胞１２５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２を４日間施用した。未誘導の対照の細胞は未処理のままにした。６日目に、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７または１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ＋１０ｍＭのニコチンアミドを培地に３日間加えたか、何も加えなかった。９日目に、ＢＭＰ４／７またはアクチビンＡおよびニコチンアミドを取り除き、細胞をＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ単独中で４日間処理した。試料をＲＮＡ抽出およびｑＰＣＲ分析用に調製した。結果を図２Ａに要約する。
【０１５４】
ＢＭＰ４／７は、未誘導またはＬＤＮ１９３１８９／ＳＢ−４３１５４２のみで処理した対照と比較して、ＲＰＥ遺伝子、たとえばＭＩＴＦおよびＰＭＥＬ１７の発現を誘導した。さらに、アクチビンＡ＋ニコチンアミドは、ＢＭＰ４／７の代わりとなることはできなかった（図２Ａ）。また、免疫細胞化学を、ＬＤＮ１９３１８９／ＳＢ−４３１５４２、続いてＢＭＰ４／７で処理した試料にも行い、これにより、ＲＰＥマーカー、たとえばＭＩＴＦおよびＰＭＥＬ１７の発現が確認された（図２Ｂ）。これらの結果は、ＢＭＰ経路活性化剤がＭＩＴＦの発現およびＰＭＥＬ１７の発現を強力に誘導することを実証している。
【０１５５】
（実施例３．２）
Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣを、２日目から６日目に１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２で処理し、続いて６日目から９日目に１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７で処理した（誘導細胞）。未誘導の細胞はＬＤＮ／ＳＢおよびＢＭＰ４／７のどちらにも曝露せずに維持する。細胞が眼分野の運命に拘束された場合に発現されることが知られているマーカーである、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１１、およびＳＯＸ２について免疫細胞化学を行った。多能性のマーカーであるＯＣＴ４は、誘導細胞において２日目から９日目に下方制御される。ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１１、およびＳＯＸ２は２日目から９日目に上方制御され、この上方制御は未誘導の試料では達成されなかった。このことは、定方向分化プロトコルが細胞を眼分野の状態に向かって誘導し、その後これがＲＰＥ運命に向かって拘束されることを示している。
【０１５６】
（実施例４）
代替ＢＭＰ経路活性化剤の使用
本実施例は、ＲＰＥマーカーの発現に対する様々なＢＭＰ経路活性化剤の効果を例示する。
【０１５７】
Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした９６ウェルプレート上に細胞１２５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２を４日間施用した。６日目に、５０〜２００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７ヘテロ二量体または２００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２／６を３日間の期間加えた。９日目に、ＢＭＰを取り除き、細胞をＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ単独中で４日間維持した。１３日目に、ＭＩＴＦの発現を免疫染色およびｑＰＣＲ分析によって試験した。ＢＭＰ４／７ヘテロ二量体または他のＢＭＰのいずれかによる処理は、同様のレベルまでのＭＩＴＦの発現を誘導した（図３）。このことにより、ＢＭＰ４／７を他のＢＭＰで置換できることが示された。
【０１５８】
これらの結果は、様々なＢＭＰ経路活性化剤を使用してＭＩＴＦの発現を誘導できることを実証している。
【０１５９】
（実施例５）
１回目の再播種ステップ
Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣを、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたＴ２５フラスコ上に細胞２４００００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２を４日間施用した。６日目に、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７を培地に３日間加えた。細胞を、分化プロトコルの６日目、９日目、または１２日目のいずれかに、ＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ単独または１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、０．５ｍＭのｃＡＭＰ、もしくは１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７のいずれかを補充したＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ中に、様々な密度で再播種した。６日目に再播種した細胞は、再播種後の３日間、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７を補充したＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ中で維持した後、アクチビンＡ、ｃＡＭＰ、またはＢＭＰ４／７に切り替えた。１２日目に再播種した細胞は、９日目から１２日目はＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ単独中で維持した後に再播種した。再播種した細胞はＢＭＰ４／７の存在下で生存せず、この条件は続く分析を放棄した。実施例１０（ａ）中に開示されているように自発的分化によって得られた成熟ＲＰＥ細胞試料は、定方向分化の１回目の再播種ステップの際に得られた集団と成熟ＲＰＥ細胞との間の類似度を比較するための対照として使用した。再播種の１９日後、細胞を免疫細胞化学のために固定し、試料をｑＰＣＲのために収集した。成熟ＲＰＥマーカー、たとえばＣＲＡＬＢＰおよびＭＥＲＴＫを用いた免疫細胞化学により、Ｄ９にアクチビンＡの存在下で再播種することが最適であり、高レベルのＲＰＥマーカーの発現を与えたことが示された（図４Ａおよび４Ｂ）。また、マーカーのパネルを用いたｑＰＣＲ分析も、９日目が再播種の最適な時であることを示した（図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅ）。細胞を再播種の前後に様々なマトリックス、たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ、またはフィブロネクチン上で培養した場合に同様の結果が得られた。
【０１６０】
（実施例６）
アクチビンＡへの曝露時間
本実施例は、ＲＰＥの分化に対するアクチビンＡの曝露期間の効果を例示する。
【０１６１】
ＷＡ２６  ｈＥＳＣ（Ｗｉｃｅｌｌ）を、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたＴ２５フラスコ上に細胞２４００００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２を４日間施用した。６日目に、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７を培地に３日間加えた。９日目に、細胞を、ＭａｔｒｉｇｅｌまたはＣｅｌｌｓｔａｒｔでコーティングした９６ウェルのＣｅｌｌＢｉｎｄプレート内に細胞５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種した。細胞を、様々な長さの時間、たとえば、３日間、５日間、１０日間または１８日間の間、ＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ単独または１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充したＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦのいずれかの中で維持した。Ｄ９−１８に、細胞を免疫染色のために固定し、ＲＰＥ細胞のマーカーであるＣＲＡＬＢＰについて染色した。ＣＲＡＬＢＰの発現のレベルは試験したすべてのアクチビンＡ処理において同様であった（図５）。これらの結果は、アクチビンＡへの短時間の曝露がＲＰＥ細胞の分化を誘導するために十分であることを実証している。
【０１６２】
（実施例７）
様々な密度での２回目の再播種ステップ
ＷＡ２６  ｈＥＳＣ（Ｗｉｃｅｌｌ）を、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたＴ２５フラスコ上に細胞２４００００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２を４日間施用した。６日目に、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７を培地に３日間加えた。９日目に、細胞を、ＭａｔｒｉｇｅｌまたはＣｅｌｌｓｔａｒｔのいずれかでコーティングしたＴ１２．５フラスコ内に細胞５０００００個／ｃｍ２の密度で再播種した。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充したＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ中で１９日間維持した。Ｄ９−１９に、細胞を、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔでコーティングした９６ウェルまたは３８４ウェルプレート内に様々な密度で再播種した（早期再播種２）。細胞を２０日間、培地単独または０．５ｍＭのｃＡＭＰを補充した培地中で維持した。Ｄ９−１９−２０に、細胞をＲＰＥマーカー用の免疫染色のために固定した。９６および３８４ウェルの様式はどちらも、＞９５％のＰＭＥＬ１７の発現および約６０％のＣＲＡＬＢＰの発現という同様の結果を与えた（図６および７）。さらに、成熟ＲＰＥ細胞の別のマーカーであるＺＯ１の発現が、免疫染色によって確認された。
【０１６３】
（実施例８）
後期再播種を用いた定方向分化
９日目までのプロトコル、実施例１中で上記に開示したプロトコルと同一であった。
【０１６４】
９日目に、培地を１０ｍｌのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ／フラスコで置き換えた。週に３回、新鮮な培地に変えながら、細胞を５０日目までこの培地中で維持した。５０日目前後に、敷石状の細胞がフラスコ内に見られ、異なる形態の他の細胞が散在していた。また、フラスコの中心領域は、いくつかの領域が高い密度で神経突起を有する独特な形態を有していた。
【０１６５】
再播種を実施するために、培地をフラスコから取り除き、細胞を５ｍＬのＰＢＳ（−／−）で１回洗浄した。５ｍｌのＰＢＳをフラスコに加え、細胞スクレーパーを使用して中心の高密度領域を掻爬して廃棄した。フラスコを５ｍｌのＰＢＳ（−／−）で再度洗浄した。５ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅをフラスコに加え、細胞がフラスコから浮き上がるまで、３７℃で約５０分間インキュベートした。５ｍＬのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地をそれぞれのフラスコに加え、フラスコの表面を洗浄するために使用した後、７０μｍのストレーナーを介して内容物を５０ｍＬのファルコンチューブ内に移した。細胞を４００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを１０ｍＬのＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地に再懸濁させた。血球計算器を使用して細胞を計数し、コーティングした培養容器（たとえばＰＢＳ（＋／＋）で１：５０に希釈したＣｅｌｌｓｔａｒｔ）内のＤＭＥＭ  ＫＳＲＸＦ培地中に、様々な密度、たとえば２０００００／ｃｍ２で播種した。新鮮な培地を週に２回補充した。
【０１６６】
細胞の培養を１４日間維持した。免疫細胞化学およびｑＰＣＲによってＲＰＥマーカー（ＰＭＥＬ１７、ＺＯ１、ＢＥＳＴ１、ＣＲＡＬＢＰ）の発現を試験することによって、生じたＲＰＥ細胞を特徴づけた。ＲＰＥ細胞の成熟度の指標であるＶＥＧＦおよびＰＥＤＦタンパク質の分泌を分析することによって、ＲＰＥ細胞の機能性を試験した。
【０１６７】
したがって、本開示は、ｈＥＳＣを頑強かつ再現性をもって分化させて、ＲＰＥ細胞を生じる方法を提供する。さらに、このプロトコルは容易にスケール変更可能であり、高収率を与える。上記方法は、異種成分を含まない条件下でｈＥＳＣをＲＰＥ細胞へと再現性よくかつ効率的に分化させるために使用することができる。
【０１６８】
（実施例９）
様々なコーティング上での後期再播種
Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣを、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたＴ２５フラスコ上に細胞２４００００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２を４日間施用した。６日目に、ＢＭＰ４／７を培地に３日間加えた。その後、細胞を培地単独中に５０日目まで維持した。５０日目に、敷石状の細胞が見られたフラスコの外縁（図８Ａ）を収集し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ、またはフィブロネクチンでコーティングしたプレート上に、９６ウェルまたは４８ウェルの様式で、細胞２０００００個／ｃｍ２の密度で播種した。敷石状が見られなかった、フラスコの内部の高密度領域を収集し、別で播種した（図８Ａ）。再播種した細胞を培地単独または０．５ｍＭのｃＡＭＰを補充した培地中に維持した。内部の高密度領域から再播種した細胞は高い割合のニューロンを生じさせ、これを廃棄した。外縁から培養した細胞は敷石状の細胞を生じさせ、これらはｃＡＭＰの存在下でより濃く色素性であった（図８Ｂ）。さらに、免疫染色によって観察して、細胞はＰＭＥＬ１７、ＺＯ−１、ＣＲＡＬＢＰ、ベストロフィン、およびＭＥＲＴＫなどのＲＰＥマーカーを発現した。再播種の１５日後でのＰＭＥＬ１７およびＣＲＡＬＢＰの免疫染色の定量により、どちらのマーカーも７０％を超える発現が示された（図８Ｃ）。同様の表現型が試験したすべてのコーティング上で得られた。
【０１６９】
（実施例１０）
定方向分化によって得られたＲＰＥ細胞は自発的に分化したＲＰＥ細胞に酷似している
ａ）自発的に分化したＲＰＥ細胞の調製
Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣをコロニーとして、２０％のＫＳＲ（ＧＩＢＣＯ）、１％の非必須アミノ酸溶液（ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、３０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ）、および４ｎｇ／ｍｌのヒト組換えｂＦＧＦを補充したノックアウトＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中の不活化マウス胚性線維芽細胞（ｉＭＥＦ）もしくは不活化ヒト真皮線維芽細胞（ｉＨＤＦ）上で、またはｍＴｅｓＲ１培地（ＳｔｅＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）上のいずれかでフィーダーフリーで培養した。超コンフルエントとなるまで（播種の約２週間後）すべての培養物に毎日供給した後、上述のノックアウトＤＭＥＭ培地と同じであるがｂＦＧＦを含まないものに変えた。ＲＰＥコロニーが出現し、切り出すのに十分大きくなるまで、フラスコに週に３回供給した。その後、コロニーをメスで切除し、ＰＢＳ（−／−）で洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ）を用いて１〜１．５時間、振盪水浴中でインキュベートした。解離したＲＰＥ細胞を、７０μｍの細胞ストレーナーを通して濾し、７００×ｇで５分間遠心分離し、上述のｂＦＧＦを含まない温かいノックアウトＤＭＥＭ培地中に再懸濁させた。ＲＰＥ細胞を計数し、（典型的には細胞３８０００〜５００００個／ｃｍ２で）細胞外基質（典型的には、細胞培養インキュベーター内で２時間コーティングした、ＰＢＳ（＋／＋）中に１：５０のＣｅｌｌＳｔａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でコーティングした４８ウェルプレート内に播種した。これらを、典型的には０．５ｍｌ／ウェルで週に２回供給しながら７または１６週間（細胞は０日目に播種）培養した後、ＲＮＡ抽出を行った。
【０１７０】
脱分化ＲＰＥ細胞試料を、上記と同じプロトコルであるが脱分化のために細胞を細胞２５００個／ｃｍ２で播種し、４または５週間培養することによって生成した。
【０１７１】
ｂ）定方向分化によって得られたＲＰＥ細胞と自発的分化からの試料の比較
定量的ＰＣＲによって、ＲＰＥ細胞および他のマーカーのパネルについて、実施例８に開示したように定方向分化から得られた試料を、自発的分化によって得られた試料と比較した。自発的に分化したＲＰＥ細胞は７または１６週間のいずれかの間培養したものである。脱分化試料は、上皮表現型を達成せず、その代わりに紡錘状かつ脱分化に保たれたため、これらを対照として使用した。これらは、ｑＰＣＲによって試験した遺伝子が上皮ＲＰＥ細胞と非ＲＰＥ様細胞との区別をつけることができるかどうかを見るために含めた。
【０１７２】
図９Ａは、定方向分化によって生じた７つのＲＰＥ細胞試料の主成分分析（ＰＣＡ）プロットを、自発的分化および脱分化対照によって生じたＲＰＥ細胞と共に示す。平均を中心とした、単位分散スケーリングしたｍＲＮＡ転写物データのＰＣＡモデルのローディングプロットも示し、これは、試験した遺伝子のそれぞれの、試料のクラスター形成への貢献を示している（図９Ｂ）。ＰＣＡを使用して、試料の全体的な変動を可視化した。最初の２つの成分のスコアプロットは、脱分化試料がホテリングのＴ２乗の楕円の外側にクラスター化し、ＲＰＥの表現型と陽性に相関するマーカー、ＭＥＲＴＫ、ＰＭＥＬ１７、チロシナーゼ、ベストロフィン、ＲＰＥ６５、およびＣＲＡＬＢＰのレベルがより低いことによって特徴づけられていることを明らかにし、このことは、これらが分化したＲＰＥ細胞と似ておらず、試験した遺伝子がＲＰＥと非ＲＰＥの表現型とを区別できたことを示している。さらに、定方向分化によって生成されたＲＰＥ細胞は自発的分化によって生成されたＲＰＥ細胞試料とクラスター形成し、したがって、分化したＲＰＥ細胞に関連する適切な特徴を保有する。
【０１７３】
次に、定方向分化によって得られたＲＰＥ細胞（実施例１および８中に開示した早期および後期再播種の両方）の全ゲノム転写物プロファイリングを行い、自発的分化によって得られたＲＰＥ細胞の転写物プロフィールと比較した。図９Ｃに示す主成分分析から明白な試料のクラスター形成は、実施例１および８に開示した早期および後期再播種プロトコルのどちらに由来する細胞も、自発的分化に由来するＲＰＥ細胞のものに類似しているが、ｈＥＳＣとは明白に異なる、ゲノムワイドな遺伝子発現プロフィールを有することを実証している。
【０１７４】
関連する研究では、自発的分化によって得られたＲＰＥ細胞が、その遺伝子発現シグネチャに関してネイティブＲＰＥ細胞に類似していたことが確認された。
【０１７５】
（実施例１１）
定方向分化によって得られたＲＰＥ細胞はＶＥＧＦおよびＰＥＤＦタンパク質を分泌する
ａ）早期再播種方法によって得られたＲＰＥ
実施例１中に開示した早期再播種プロトコルの再播種２（Ｄ９−１９−５０）の後に得られた細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）上に細胞１１６０００個／Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の密度で播種し、１０週間の期間培養した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の２つのチャンバーは別々のものとして維持し、培地を混合させなかった。培地を上および下のチャンバーから収集し、ＶＥＧＦおよびＰＥＤＦの分泌について分析した。図１０Ａに示すように、［ＶＥＧＦ］：［ＰＥＤＦ］の比は、下のチャンバーから収集した培地中でより高く、上のチャンバーからの培地中でより低く、これは、より高いＶＥＧＦの基底外側分泌およびより高いＰＥＤＦの頂端分泌を示している。このことは、本明細書中に開示した定方向分化方法によって得られたＲＰＥが極性かつ機能的であることを示している。
【０１７６】
ｂ）後期再播種方法によって得られたＲＰＥ
後期再播種では、Ｓｈｅｆ−１  ｈＥＳＣを、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたＴ２５フラスコ上に細胞２４００００個／ｃｍ２の密度で播種した。播種後の２日目に、１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２を４日間施用した。６日目に、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７を培地に３日間加えた。９日目以降では、細胞を培地単独中に維持し、６４日目にフラスコの外縁を収集し、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）上に細胞４０００００個／ｃｍ２の密度で再播種した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）はオーバーフローによって週に２回供給した。ＶＥＧＦおよびＰＥＤＦレベルを定量するために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）上への播種後の１２日目以降に一定間隔で使用済み培地を収集した。ＶＥＧＦおよびＰＥＤＦの測定は、「メソスケールディスカバー」（ＭＳＤ）に基づく多分析物手法を使用して、製造業者のプロトコルに従って行った。図１０Ｂに示すように、ＶＥＧＦおよびＰＥＤＦレベルは培養中に時間とともに増加し、これは、成熟度の指標であるＲＰＥ細胞による能動分泌を示している。これらの結果は、本明細書中に記載した方法によって得られた細胞がＲＰＥであることを実証している。
【０１７７】
（実施例１２）
ＲＰＥ細胞の拡大
ＲＰＥ細胞の増殖は分化した上皮形態の喪失に関連しており、その代わりに細胞は外見が細長く線維芽球様となる。この明らかな「脱分化」には、コンフルエントな細胞の単層が立方形の色素性ＲＰＥ細胞という特徴的な表現型となる「再分化」の段階が続く（Ｖｕｇｌｅｒら、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００８年１２月；２１４（２）：３４７〜６１）。拡大中に起こるこの脱分化と再分化のパラダイムは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、続いて間葉上皮転換（ＭＥＴ）として記載されている（Ｔａｍｉｙａら、ＩＯＶＳ、２０１０年５月、５１巻、５号）（図１１Ａ）。
【０１７８】
ａ）ｃＡＭＰまたはｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる薬剤の存在下での拡大はＲＰＥ細胞の収率および成熟度を増加させる
自発的分化によって生成したＲＰＥ細胞を培地単独中に細胞４００００個／ｃｍ２または培地＋０．５ｍＭのｃＡＭＰ中に細胞２００００個／ｃｍ２で播種した。培地を週に３回変えた。増殖マーカーＫｉ６７の発現を１５日目に免疫細胞化学によって測定し、ｃＡＭＰの存在下で播種した細胞におけるＫｉ６７の発現の増加が観察された。３５日目に、細胞を固定し、ヘキスト染色を使用して核を染色した。染色された核の数は細胞数に等しい。細胞２００００個／ｃｍ２の密度で播種した細胞においてｃＡＭＰを補充した際に細胞数の増加が観察され、この増加は、培地単独中に細胞４００００個／ｃｍ２の播種密度で得られた細胞数に等しかった（図１１Ｂ）。このことは、ｃＡＭＰを培養中に取り込ませることによって収率が倍化することを示している。また、細胞を、ＲＰＥマーカーであるＰＭＥＬ１７についても免疫染色した。細胞にｃＡＭＰを補充し、細胞２００００個／ｃｍ２で播種した場合にＰＭＥＬ１７の発現が増加し、この増加は、細胞を細胞４００００個／ｃｍ２というより高い密度で播種した場合に見られるレベルに類似していた（図１１Ｃ）。このことは、拡大ステップ中のｃＡＭＰの存在はＲＰＥマーカーの発現を増加させ、したがって増加した成熟度を示すことを示している。
【０１７９】
さらに、ｃＡＭＰの細胞内濃度を増加させる他の化学薬品、たとえばアデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンも、細胞の収率およびＰＭＥＬ１７の発現の増加に関してｃＡＭＰに対して同様の効果を有する。自発的分化によって生成したＲＰＥ細胞を、培地単独中に細胞４００００個／ｃｍ２または１０μＭのフォルスコリンを含む培地中に細胞２００００個／ｃｍ２で播種した。培地を週に３回変え、細胞を１４日目に免疫染色した。ｃＡＭＰで見られた効果と同様、フォルスコリンの存在下でＰＭＥＬ１７の発現が増加した（図１１Ｄ）
【０１８０】
ｂ）全ゲノム転写物プロファイリング
ＲＰＥ細胞の拡大に対するｃＡＭＰの効果のさらなる理解を得るために、細胞を細胞１００００個／ｃｍ２および細胞２００００個／ｃｍ２の密度で、培地単独または０．５ｍＭのｃＡＭＰを補充した培地中に播種する時間経過を設定した。これらを、細胞４００００個／ｃｍ２で培地単独中に播種したＲＰＥ細胞と比較した。培地を週に３回変えた。試料を播種後のＤ３、Ｄ１５、およびＤ３５に収集し、全ゲノム転写物の分析を３連で行った。より低い密度で播種したがｃＡＭＰを補充した細胞とより高い密度で播種したが培地単独であった細胞とを比較して、ＲＰＥマーカーであるＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ６５、ＢＥＳＴ１、およびＭＥＲＴＫの発現は、試験したすべての時点で類似していた。
【０１８１】
ｃ）ｃＡＭＰで処理したＲＰＥにおけるＥｄＵの取り込み
Ｋｉ６７の免疫細胞化学を行うことに加えて、細胞におけるＥｄＵの取り込みを、ｃＡＭＰの存在下でＲＰＥ細胞の増殖を測定するための追加のアッセイとして使用した。Ｋｉ６７は、細胞周期のすべての活動期（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、および有糸分裂）中で発現されるが、休止細胞（Ｇ０）では存在しなかった。しかし、Ｋｉ６７の生物学的機能は大部分が未だ不明であり、Ｋｉ６７を発現するすべての細胞が有糸分裂を完了するかどうかは不明確である。増殖を測定するための補完的な技法は、ＥｄＵなどのチミジン類似体のＤＮＡ内への取り込みを測定することであり、これは、ＥｄＵ標識期間中に細胞周期のＳ期を通過する細胞の同定を容易にする。
【０１８２】
ｈＥＳＣ細胞の自発的分化によって得られたＲＰＥを細胞３８０００個／ｃｍ２の密度で播種し、０．５ｍＭのｃＡＭＰの存在下または非存在下で８週間の期間維持した。ＥｄＵの取り込みを、播種後の２日目、３日目、５日目、７日目、１４日目、２１日目、５６日目の時点で測定した。結果は、ＥｄＵについて陽性に染色される細胞のパーセンテージとして表す。ｃＡＭＰで処理した細胞において７日目、１４日目、および２１日目の時点で％のＥｄＵの増加が見られ、このことは、ｃＡＭＰが、ＲＰＥの拡大のこれらの段階で増殖を増加させたことを示している（図１１Ｅ）。細胞数の定量は、１フレームあたり画像処理したヘキスト陽性核の数から外挿した。キャプチャーしたそれぞれの画像フレームの大きさは０．０６４５×０．０６４５ｍｍであり、ウェルの総表面積は６ｍｍ２であった。したがって、ウェル内の全細胞数は、１画像あたりのヘキスト陽性核の数に、６／（０．０６４５×０．０６４５）の商（１４４２．２に等しい）を乗じた数にほぼ等しかった。ｃＡＭＰを加えた際に全細胞数の増加が観察され、このことは、ｃＡＭＰの添加による増加した増殖がＲＰＥ数の増加をもたらしたことを示している（図１１Ｆ）。
【０１８３】
ｄ）ｃＡＭＰの用量
ＲＰＥを細胞２００００個／ｃｍ２の密度で播種し、以下の範囲のｃＡＭＰ濃度、５００μＭ、５０μＭ、５μＭ、０．５μＭ、および０．０５μＭで、１４日間の期間処理した。対照の設定には、培地単独中に細胞４００００個／ｃｍ２および細胞２００００個／ｃｍ２で播種した細胞が含まれていた。１４日間の終わりに、細胞を固定し、増殖のマーカーであるＫｉ６７ならびにＲＰＥの同定および純度のマーカーであるＰＭＥＬ１７の発現を測定するために免疫細胞化学を行った。核は核色素ヘキストで対比染色した。
【０１８４】
５００μＭのｃＡＭＰの用量は、細胞２００００個／ｃｍ２で播種した細胞におけるＫｉ６７の発現を、培地単独中に２倍の細胞４００００個／ｃｍ２の密度で播種したＲＰＥの発現に類似のレベルまで誘導した（図１１Ｇ）。さらに、５００μＭのｃＡＭＰの用量で処理した際に、ＰＭＥＬ１７の発現が増加した。ｃＡＭＰ処理なしでは、細胞２００００個／ｃｍ２で播種した細胞は、ＰＭＥＬ１７の発現が低かった（図１１Ｈ）。
【０１８５】
このデータは、５０μＭより高い用量が、増殖およびＲＰＥの表現型の発生に対するｃＡＭＰの効果を誘導するために十分であることを示している。好ましくは、５００μＭ以上の用量を使用してＲＰＥ細胞の増殖を誘導することができる。
【０１８６】
ｅ）ＲＰＥをｃＡＭＰの存在下で細胞２００００個／ｃｍ２または培地単独中に細胞４００００個／ｃｍ２のいずれかの密度で拡大した後に得られるＲＰＥパッチの同等性。
自発的分化によって得られたＲＰＥの懸濁液を、細胞２００００個／ｃｍ２または細胞４００００個／ｃｍ２のいずれかの密度で、４８ウェルの様式で播種した。細胞２００００個／ｃｍ２で播種した細胞は５００μＭのｃＡＭＰで処理した一方で、細胞４００００個／ｃｍ２で播種した細胞は培地単独中で１０週間の期間維持した。拡大の期間の終わりに、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して両条件からの細胞を浮かせ、これを使用して細胞１１６０００個／Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）に播種した。５週間の期間、培地単独中でＴｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）の培養を維持した。両条件におけるＶＥＧＦおよびＰＥＤＦのレベルを定量するために、使用済み培地を週に１回収集した。培養期間の終わりに、パッチを切断し、ＲＰＥマーカーＺＯ１について免疫染色した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の外側領域を、ＲＰＥマーカーのパネルの遺伝子発現の、ｑＰＣＲに基づく分析のために使用した。
【０１８７】
拡大の終わりに、どちらの拡大条件からの細胞も同様の形態を示しており、特徴的な色素性の敷石状細胞の存在を示したことが観察された。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）培養中にＶＥＧＦおよびＰＥＤＦの分泌のレベルを定量し、ｃＡＭＰの存在下で細胞２００００個／ｃｍ２の密度または培地中で細胞４００００個／ｃｍ２で拡大した培養物から得られたかどうかにかかわらず、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）の両方の組から比較可能なＶＥＧＦ：ＰＥＤＦ比が得られた。遺伝子発現に関しては、２つの拡大条件から設定したＴｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）からＲＰＥ遺伝子（Ｍｉｔｆ、Ｓｉｌｖ、Ｔｙｒ）の比較可能な発現が観察された（図１１Ｉ、１１Ｊ、および１１Ｋ）。さらに、ＲＰＥマーカーＺＯ−１のタンパク質発現は２つの条件間で比較可能であった。
【０１８８】
要約すると、データは、培地中に細胞４００００個／ｃｍ２またはｃＡＭＰの存在下で半分の播種密度、すなわち細胞２００００個／ｃｍ２でＴｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）上で培養し拡大したＲＰＥ間に相違はなかったことを示している。
【０１８９】
ｆ）ＳＭＡＤ阻害剤の存在下での拡大はＲＰＥ細胞の増殖を増加させる
１．ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲ）の低分子阻害剤はＲＰＥの増殖およびＲＰＥマーカーの発現を増加させる
表２に列挙するＴＧＦＢＲ阻害剤を、ＲＰＥの増殖およびＲＰＥマーカーの発現に対するその効果について調査した。
【０１９０】
【表４】
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【０１９１】
実施例１０ａ中に開示したようにＳｈｅｆ−１  ｈＥＳＣ細胞から得られ、細胞２５００個／ｃｍ２の密度で播種したＲＰＥに、化合物を１０μＭ、１μＭ、および０．１μＭの濃度で加えた。化合物を１０日間の期間培地中に維持した。細胞を１０μＭのＥｄＵに４時間の期間曝露させ、その後、細胞を固定し、製造業者の推奨に従ってＣｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｃ１０３３７）キットを使用して取り込まれたＥｄＵを検出することによって、増殖を評価した。ビヒクル処理と比較した増殖の増加が、３つすべての化合物で処理した際に観察された（図１２Ａを参照）。ＴＧＦＢＲ阻害剤によって引き起こされた増加した増殖がＲＰＥの表現型の獲得に影響を与えたかどうかを試験するために、ｑＰＣＲを実施してＲＰＥマーカーＢｅｓｔ１およびＲｌｂｐ１の転写レベルを測定した。化合物で処理した際にＲＰＥマーカーの発現の増加が観察された（図１２Ｂおよび１２Ｃを参照）。また、脱分化ＲＰＥのマーカーであるＧｒｅｍ１のレベルも確認し、これは化合物で処理した試料中でより低かったことが判明した（図１２Ｄを参照）。
【０１９２】
このデータは、ＴＧＦＢＲ阻害剤によるＳＭＡＤシグナル伝達の阻害が増殖およびＲＰＥの表現型の達成を増加させることを示している。
【０１９３】
２．抗体に基づくＳＭＡＤシグナル伝達の阻害はＲＰＥの増殖およびＲＰＥマーカーの発現を増加させる
ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する代替手段として、１Ｄ１１として知られる、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２リガンドに対する中和抗体を使用した（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４２巻、１５３６〜１５４１、５号、１９８９年３月）。実施例１０ａに開示したようにＳｈｅｆ−１  ｈＥＳＣ細胞から得られたＲＰＥを細胞５０００個／ｃｍ２の密度で播種し、抗体１Ｄ１１を１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの濃度で培地に加えた。抗体を１４日間の期間培地中に維持した。細胞を１０μＭのＥｄＵに４時間の期間曝露させ、その後、細胞を固定し、製造業者の推奨に従ってクリックケミストリーを使用して取り込まれたＥｄＵを検出することによって、増殖を評価した。中和抗体を用いて処理した際に、ビヒクル処理と比較した増殖の増加が用量依存的な様式で観察された（図１３Ａ）。このことにより、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を阻害する抗体による、ＲＰＥにおけるＳＭＡＤシグナル伝達の阻害が、ＲＰＥの増殖を増加させることが示された。
【０１９４】
ＴＧＦβの阻害によって引き起こされた増加した増殖がＲＰＥの表現型の獲得に影響を与えたかどうかを試験するために、免疫染色およびｑＰＣＲによってＲＰＥマーカーのレベルを確認した。ＰＭＥＬ１７の発現の増加は、タンパク質（図１３Ｂを参照）および転写のどちらのレベルでも見られ、他のＲＰＥマーカーのパネルの転写レベルの増加および脱分化ＲＰＥマーカーＧＲＥＭ１のレベルの減少も見られた（図１３Ｃ〜１３Ｈを参照）。
【０１９５】
このデータは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２経路を阻害する抗体によるＳＭＡＤシグナル伝達の阻害が増殖およびＲＰＥの表現型の達成を増加させることを示している。
【０１９６】
（実施例１３）
ＲＰＥ細胞の精製
ａ）細胞表面マーカーの発現を同定するためのスクリーニング
早期再播種を用いた定方向分化プロトコルに従うことによって、細胞をＳｈｅｆ１．３  ｈＥＳＣから得た。細胞を９日目までＭａｔｒｉｇｅｌ上で培養し、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ（再播種１）上に再播種し、ここでこれを１９日間培養し、続いてＣｅｌｌｓｔａｒｔ（再播種２）上に再播種し、ここでこれを１５日間培養した後、この実験に使用した。細胞を、細胞１０００００個／ｃｍ２の密度で、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした３８４ウェルプレート上に播種した。細胞を７日間培養した後、ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅヒト細胞表面マーカースクリーニングパネル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃５６０７４７）を使用して、細胞表面タンパク質の発現のスクリーニングを行った。バイオイメージングによる細胞のスクリーニングには製造業者の推奨に従った。細胞染色の画像をマーカーの陽性発現について分析した。また、ＲＰＥの同定を確認するために、細胞をＲＰＥマーカーであるＰＭＥＬ１７、ＣＲＡＬＢＰ、およびＺＯ１についても染色した。ＣＤ５９は、アイソタイプのバックグラウンドを超えてＲＰＥ細胞中で発現されることが同定された。
【０１９７】
ｂ）早期再播種を用いた定方向分化プロセスからの試料におけるＣＤ５９のフローサイトメトリー
フローサイトメトリーを使用してＣＤ５９の発現を定量した。定方向分化プロトコルからの以下の細胞の試料を分析用に調製した。
１／Ｓｈｅｆ１  ｈＥＳＣ（０日目）、
２／６日目（２日目から６日目までの１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２）、
３／９日目（ＬＤＮ／ＳＢ−ＢＭＰ４／７）：２日目から６日目までの１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２ならびに６日目から９日目までのＢＭＰ４／７を含まない培地）
４／９日目（ＬＤＮＳＢ＋ＢＭＰ４／７）：２日目から６日目までの１μＭのＬＤＮ１９３１８９および１０μＭのＳＢ−４３１５４２ならびに６日目から９日目までの１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４／７）
５／再播種２後に得られたＲＰＥ試料の２つの複製：２日目から６日目までのＬＤＮ／ＳＢ、６日目から９日目までのＢＭＰ４／７、Ｄ９にアクチビンＡの存在下で再播種して２週間の期間、その後、培地単独中で３カ月の期間。
【０１９８】
すべての試料はＡｃｃｕｔａｓｅを使用して収集した。細胞を、緑色（ＦＬ２）チャネルが蛍光であるＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能死細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｌ２３１０１）を使用して、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ色素を用いて染色した。細胞を１％のＰＦＡで固定し、ＰＢＳ（−／−）で３回洗浄した。遠心分離を３００×ｇで５分間行った。細胞を、ＰＢＳ（−／−）＋２％のＢＳＡ中に細胞約１×１０６個／１００μＬで再懸濁させた。ＰＥマウス抗ヒトＣＤ５９抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ＃５６０９５３）を使用して細胞をＣＤ５９について染色した。１回の試験あたり２０μＬの抗体を１００μＬの実験試料中で使用した。試料を３０分間、光から保護して室温でインキュベートした。試料を２回洗浄した後、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターで分析するために１５０μＬのＰＢＳ（−／−）＋２％のＢＳＡに再懸濁させた。未染色の細胞およびアイソタイプ対照（ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ＃１２−４７２４−４１）を用いて染色した細胞からなる陰性対照も行った。ゲートをかけて細片およびダブレットを除去し、生細胞染色について陽性に染色される集団のみを選択することによって、フローサイトメトリー分析を行った。この分析からの結果を表３に示す。
【０１９９】
【表５】
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【０２００】
このことは、ＣＤ５９は再播種前の定方向分化プロトコルの早期の時点で発現されておらず、２回目の再播種後に得られる成熟ＲＰＥ中でのみ発現されることを示している。したがって、ＣＤ５９を発現する細胞の選別は、成熟ＲＰＥを濃縮し、最終ＲＰＥ培養物中に残留汚染細胞として存在する可能性があり得る任意のＲＰＥ前駆体または他のＣＤ−５９陰性細胞を除去するための手段であり得る。
【０２０１】
ｃ）定方向分化プロトコルの再播種２の後に得られたＳｈｅｆ１  ｈＥＳＣおよびＲＰＥを用いた添加実験
ＲＰＥに対するＣＤ５９の発現の特異性を示すために、添加実験を行った。早期再播種を用いた定方向分化プロトコルの再播種２の後に得られたＳｈｅｆ１  ｈＥＳＣおよびＲＰＥを、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して収集した。細胞を、遠赤（ＦＬ４）チャネルが蛍光であるＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能死細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｌ１０１２０）を使用して、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ色素を用いて染色した後、１％のＰＦＡで固定し、ＰＢＳ（−／−）＋２％のＢＳＡで同じ濃度に再懸濁させた。以下の比のｈＥＳＣおよびＲＰＥを一緒に混合して１００μＬの最終体積を得た：１００％のＲＰＥ＋０％のｈＥＳＣ、７５％のＲＰＥ＋２５％のｈＥＳＣ、５０％のＲＰＥ＋５０％のｈＥＳＣ、２５％のＲＰＥ＋７５％のｈＥＳＣ、０％のＲＰＥ＋１００％のｈＥＳＣ。すべての試料に対して、ＣＤ５９および多能性ＥＳ細胞のマーカーＴＲＡ−１−６０についてフローサイトメトリーを行った。未染色の細胞および適切なアイソタイプ対照を用いて染色した細胞からなる陰性対照も行った。試料をＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターで分析した。ゲートをかけて細片およびダブレットを除去し、生細胞染色について陽性に染色される集団のみを選択することによって、フローサイトメトリー分析を行った。この分析からの結果を表４および５に示す。
【０２０２】
【表６】
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【０２０３】
【表７】
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【０２０４】
これらの結果は、検出されたＣＤ５９のレベルが試料中に存在するＲＰＥの割合に相関しており、抗体が試料中に存在する他の非ＲＰＥ細胞を区別できることを示している。さらに、試料中に添加した非ＲＰＥ  ｈＥＳＣ細胞の割合は検出された％ＴＲＡ−１−６０に相関する。したがって、ＣＤ５９を発現する細胞の選別は、成熟ＲＰＥを濃縮し、最終ＲＰＥ培養物中に残留汚染細胞として存在する可能性があり得る任意のｈＥＳＣまたはＲＰＥ前駆体を除去するための手段であり得る。
【０２０５】
ｄ）ＣＤ５９陽性ＲＰＥをＥＳＣおよびＲＰＥ細胞の混合集団から選別するためのフローサイトメトリーの使用
ＣＤ５９選別を使用して混合集団からＲＰＥを濃縮することが可能であることを示すために、同数のｈＥＳＣおよびＲＰＥ細胞（早期再播種２の後に得られたもの）を一緒に混合した。この混合物からの試料を、選別前の集団として別に保管した。残りの混合物をＰＥマウス抗ヒトＣＤ５９抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ＃５６０９５３）で染色した。１回の試験あたり２０μＬの抗体を、１×１０６個の細胞を含有する１００μＬの実験試料中で使用した。試料を３０分間、光から保護して室温でインキュベートした。試料を２回洗浄した後、１ｍｌのＰＢＳ（−／−）＋２％のＢＳＡあたり１×１０６個の細胞の密度で再懸濁させた。ＣＤ５９陽性細胞をｉｎＦｌｕｘ  ｖ７サイトメーター上で選別し、ＣＤ５９陰性集団とは別々に収集した。ＲＮＡを選別前のＣＤ５９陽性およびＣＤ５９陰性画分から抽出した。ｑＰＣＲを使用して、ＥＳおよびＲＰＥマーカーのパネルの発現を確認した。このことにより、ＣＤ５９陽性画分がＲＰＥマーカーＢｅｓｔ１、Ｓｉｌｖ、Ｒｌｂｐ１で濃縮され（図１４Ｂを参照）、ＣＤ５９陰性画分がＥＳマーカーＮａｎｏｇ、Ｐｏｕ５ｆ１、およびＬｉｎ２８で濃縮された（図１４Ａを参照）ことが示された。このことは、ＣＤ５９のフロー選別がＲＰＥ細胞を混合集団から濃縮し、非ＲＰＥ細胞種を除去できることを示している。
【０２０６】
（実施例１４）
定方向分化プロトコルを誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）で行った。ＩＰＳＣを健康なボランティアから得られた赤芽球から生成し、ＣｙｔｏＴｕｎｅ−ｉＰＳ再プログラミングキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１３７８０−０１／０２）を使用して再プログラミングした。ＩＰＳＣをＥ８培地中に細胞２４００００個／ｃｍ２の密度で播種し、早期再播種を用いた定方向分化プロトコルの９−１９日目まで分化させた。誘導細胞とは、２日目から６日目までＬＤＮ１９３１８９／ＳＢ−４３１５４２で処理し、続いて６日目から９日目までＢＭＰ４／７で処理した細胞をいう。未誘導の細胞は、ＬＤＮ１９３１８９／ＳＢ−４３１５４２およびＢＭＰ４／７のどちらにも曝露せずに維持する。免疫染色を目的のマーカーについて行った。図１５Ａ〜１５Ｄに見られるように、誘導されたｉＰＳＣは、誘導されたｈＥＳＣと同様に、９日目にＯＣＴ４を下方制御し、ＰＡＸ６およびＬＨＸ２を上方制御した。９日目にアクチビンＡの存在下で再播種した後、ｉＰＳＣはＲＰＥマーカーＣＲＡＬＢＰを上方制御した。９−１９日目での２回目の再播種ステップおよび４５日間の期間の培養の後、ｉＰＳＣに由来するＲＰＥは、ＲＰＥマーカーのパネルを、実施例８のプロトコルによって得られた、定方向分化によってＥＳ細胞に由来するＲＰＥで見られるものと同様のレベルまで発現した（図１５Ｅ、１５Ｆ、および１５Ｇを参照）。したがって、これらの結果は、定方向分化プロトコルは、ＲＰＥを生成するためにＩＰＳＣに伝達可能であることを実証している。
【０２０７】
上記実施例では以下の方法を使用した。
【０２０８】
免疫細胞化学：
免疫細胞化学を９６ウェルまたは３８４ウェルの様式で実施した。培地を吸引し、５０μＬの４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）をそれぞれのウェルに加え、３５分間、室温でインキュベートした。ＰＦＡを吸引し、細胞を３×１００ｕＬのＰＢＳ（＋／＋）で洗浄した。細胞を１時間、室温の暗所で、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ（＋／＋）／５％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）／０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ１００）中でインキュベートした。１°抗体をＰＢＳ（＋／＋）／１％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）／０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ１００中で構成した。６０μＬの１°抗体溶液をそれぞれのウェルに加え、１時間、室温の暗所でインキュベートした。溶液を吸引し、細胞を３×１００ｕＬのＰＢＳ（＋／＋）で洗浄した。２°抗体をＰＢＳ（＋／＋）／１％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）／０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ１００中で構成した。６０ｕＬの２°抗体溶液をそれぞれのウェルに加え、１時間、室温の暗所でインキュベートした。溶液を吸引し、細胞を３×１００ｕＬのＰＢＳ（＋／＋）で洗浄した。ヘキスト３３３４２溶液をＰＢＳ（＋／＋）で１：５０００（２μｇ／ｍＬの最終濃度）に希釈し、５０μＬをそれぞれのウェルに加え、少なくとも６分間、室温の暗所でインキュベートした。溶液を吸引し、細胞を１×ＰＢＳ（＋／＋）で洗浄し、その後、１００μＬのＰＢＳ（＋／＋）をそれぞれのウェルに加え、プレートを密閉し、画像処理まで冷蔵庫内で保管。画像は、ＩＸＭ  ＭｅｔａＥｘｐｒｅｓｓプラットフォーム上にて１０×、２０×倍率でキャプチャーした。
【０２０９】
【表８】
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【０２１０】
分子生物学的技法：
ＲＮＡ抽出
培地を吸引し、細胞を１００μＬのＰＢＳ（−／−）で洗浄した。１００μＬのＲＬＴ緩衝液（１％の２−メルカプトエタノール）をそれぞれのウェルに加え、ピペットで吸ったり吐いたりした後、溶解物を、さらに２５０μＬのＲＬＴ緩衝液（１％の２−メルカプトエタノール）を含有する２ｍＬのチューブに移した。試料は処置まで−８０℃で保管した。製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｃｕｂｅ上でのカラムＤＮａｓｅ消化を含めたＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは１４μＬのＲＮａｓｅを含まない水で溶出させた。
【０２１１】
ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキットを使用して合成した。
【０２１２】
【表９】
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【０２１３】
マスターミックス（１６μＬ）を９６ウェルプレートのウェル内に分取し、４ｕＬのＲＮＡをそれぞれのウェルに加えた。ヌクレアーゼを含まない水を１つのウェルに加えて鋳型なしの対照とした。その後、プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して収集し、プレートをサーマルサイクラーに移し、以下のプロトコルを使用してｃＤＮＡを合成した。
【０２１４】
【表１０】
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【０２１５】
ｃＤＮＡ試料を８０ｕＬのヌクレアーゼを含まない水で希釈し、さらに使用するまで−２０℃で保管した。
【０２１６】
定量的ＰＣＲ
Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを使用して、ｑＰＣＲマスターミックスを以下のようにそれぞれのアッセイについて構成した。
【０２１７】
【表１１】
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【０２１８】
マスターミックス（１８ｕＬ）を９６ウェルプレートのウェル内に分取し、２ｕＬのｃＤＮＡ（または対照）をそれぞれのウェルに加えた。対照は、ｃＤＮＡ合成からの鋳型なしの対照、水、および自発的に分化したＲＰＥ  ｃＤＮＡであった。それぞれの試料を２連で実行した。その後、プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して収集し、プレートをサーマルサイクラーに移し、以下のプロトコルを使用してｑＰＣＲアッセイを実行した。
【０２１９】
【表１２】
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【０２２０】
データはマイクロソフト社のエクセルにエクスポートし、２＾−ＤＣＴ方法を使用して分析した。
【０２２１】
【表１３−１】
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【０２２２】
【表１３−２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【国際調査報告】
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