(57)【要約】  本発明は、ALWGPDPAAA(ヒトプレプロインスリン(PPI)タンパク質に由来)−HLA-A*02複合体に対して結合性を有し、TCR α鎖可変ドメイン及びTCR β鎖可変ドメインを含んでなるＴ細胞レセプター(TCR)を提供する。α鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％の同一性を有し、少なくとも１つの特定の置換及び/又は挿入を有するアミノ酸配列を含んでなる。β鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜116の配列に対して少なくとも90％の同一性を有し、少なくとも１つの特定の置換を有するアミノ酸配列を含んでなる。また、該TCRをコードする核酸及びT該CRを提示するように工学的に操作された細胞も提供される。本発明のTCRに基づく治療剤は、ベータ細胞へ免疫抑制剤を送達して、CD8+ Ｔ細胞によるベータ細胞の破壊を予防するという目的に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ALWGPDPAAA(配列番号１)−HLA-A*02複合体に対して結合性を有し、TCR α鎖可変ドメイン及びTCR β鎖可変ドメインを含んでなり、
α鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、
β鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜116の配列に対して少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、
α鎖可変ドメインは、配列番号２の番号付けを参照して、下記の置換：
【表１】
2017504319.tif 000014
の少なくとも１つ及び/又は少なくとも１つのアミノ酸挿入を有し、及び/又は
β鎖可変ドメインは、配列番号３の番号付けを参照して、下記の置換：
【表２】
2017504319.tif 000015
の少なくとも１つを有するＴ細胞レセプター(TCR)。
【請求項２】
α鎖可変ドメインが、配列番号２の番号付けを参照して、S28、F30、Y32、Y51、S52、S53、G54及び/又はD58に相当する残基の直後に挿入された少なくとも１つのアミノ酸を有する請求項１に記載のTCR。
【請求項３】
挿入が、配列番号２の番号付けを参照して、下記：
【表３】
2017504319.tif 000016
の１つ又はそれより多くである請求項２に記載のTCR。
【請求項４】
α鎖可変ドメインが、配列番号２の番号付けを参照して、S28、Y32、Y51及び/又はS53に相当する残基の直後に挿入された少なくとも１つのアミノ酸を有する請求項２又は３に記載のTCR。
【請求項５】
挿入が、配列番号２の番号付けを参照して、下記：
【表４】
2017504319.tif 000017
の１つ又はそれより多くである請求項４に記載のTCR。
【請求項６】
α鎖可変ドメインが(ａ)S28での挿入を、単独で又はY51若しくはS53での挿入との組合せで、又は(ｂ)Y32での挿入を、単独で又はY51若しくはS53での挿入との組合せで有する請求項４又は５に記載のTCR。
【請求項７】
α鎖可変ドメインが、配列番号２の番号付けを参照して、下記の置換：
【表５】
2017504319.tif 000018
の少なくとも１つを有し、及び/又は
β鎖可変ドメインが、配列番号３の番号付けを参照して、下記の置換：
【表６】
2017504319.tif 000019
の少なくとも１つを有する請求項１〜６のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項８】
α鎖可変ドメインが、配列番号２の番号付けを参照して、下記の置換：
【表７】
2017504319.tif 000020
の少なくとも１つを有する請求項７に記載のTCR。
【請求項９】
α鎖可変ドメインが、配列番号８〜59のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなる請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１０】
β鎖可変ドメインが、配列番号60〜91のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなる請求項１〜９のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１１】
α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１２】
α鎖及びβ鎖の定常ドメイン配列が、短縮又は置換により、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失させるように改変されている請求項１１に記載のTCR。
【請求項１３】
α鎖及びβ鎖の定常ドメイン配列が、TRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57からのシステイン残基への置換により改変されており、該システイン同士がTCRのα及びβ定常ドメイン間でジスルフィド結合を形成している請求項１１又は１３に記載のTCR。
【請求項１４】
Vα-L-Vβ、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ又はVα-Cα-L-Vβ-Cβ型(式中、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域を表し、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβ定常領域を表し、Ｌはリンカー配列を表す)又はその逆方向での単鎖形式である請求項１〜１３のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１５】
α-βヘテロ二量体である請求項１〜１３のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１６】
検出標識、治療剤又はPK改変成分と結合した請求項１〜１５のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のTCRのα鎖可変ドメインをコードする配列及び/又は請求項１〜１６のいずれか１項に記載のTCRのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含んでなる核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のTCRを提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は工学的に操作された細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくはTreg細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のTCR、請求項１７に記載の核酸及び/又は請求項１８に記載の細胞を、１又はそれより多い医薬的に許容され得るキャリア又は賦形剤と共に含んでなる医薬組成物。
【請求項２０】
医薬に使用するための、ALWGPDPAAA(配列番号１)−HLA-A*02複合体に対して結合性を有するＴ細胞レセプター(TCR)、又は該TCRを発現及び/又は提示する細胞。
【請求項２１】
Ｉ型糖尿病の治療方法で使用するための、請求項２０に記載のTCR又は細胞。
【請求項２２】
前記方法が養子療法を含んでなる請求項２１に記載のTCR又は細胞。
【請求項２３】
TCRが請求項１〜１６のいずれか１項に記載のものであり、及び/又は細胞が請求項１７に記載のものである請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のTCR又は細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド−HLA-A*02複合体として提示された(ヒトプレプロインスリン(PPI)タンパク質に由来する)ALWGPDPAAAペプチドに結合するＴ細胞レセプター(TCR)に関する。TCRは、下記で説明する参照PPI TCRと比較して改善された、ペプチド−HLA複合体に関する結合親和性及び/又は結合半減期を有する。本発明はまた、本発明のPPI TCRでトランスフェクトされたＴ細胞、及び、免疫抑制剤に融合した可溶性PPI TCRを提供する。当該試薬は自己免疫疾患(例えば、糖尿病)の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｉ型糖尿病 (T1DM)は、特徴的な長期血管性及び神経学的合併症を伴う、代謝不全、とりわけグルコース代謝の調節不全により特徴付けられる自己免疫疾患である。T1DMは、最も一般的な自己免疫疾患の１つであり、米国では250人に一人が罹患し、毎年約10,000〜15,000の新たな症例が報告されており、発生率は上昇している。T1DMの罹患率が最も高いのは北欧であり、150人に一人を超えるフィンランド人が15歳までにT1DMを発症する。対照的に、T1DMは、黒人及びアジア人では然程一般的ではなく、頻度は白人の半分未満である。
【０００３】
T1DMは、患者を生存に関し外因性インスリン依存性とする絶対的なインスリン欠損により特徴付けられる。高血糖の症状を伴うT1DMの現実の臨床発症の前に、長い無症状の前臨床期間が存在し、その間に、インスリン産生ベータ細胞が進行性に破壊される。ベータ細胞(β細胞)の自己免疫破壊はリンパ球浸潤に関連する。加えて、細胞表面でのMHCクラスＩ抗原の提示の異常が、動物モデル及びヒトT1DMの両方で同定されている。この免疫異常は、ヒトが自己抗原に不寛容になる理由を説明し得るが、ベータ細胞のみが優先的に破壊される理由は明らかでない。
【０００４】
CD8+ Ｔ細胞が、T1DMに至る疾患プロセスに関与するという十分な証拠が存在する(Liblau Immunity. 2002 Jul;17(1):1-6)。罹患個体における膵島の組織学的分析によりCD8+ Ｔ細胞による浸潤が示される(Bottazzoら，1985 N. Engl. J. Med. 313:353-360)。T1DMの動物モデルにおいて、CD8+ Ｔ細胞を用いて、疾患プロセスを罹患動物から健常動物に移し得る。T1DMの発症とCD8+標的認識に重要な或る種のHLAクラスＩ分子との間に遺伝的関連性が存在する(Toddら，2007 Nat. Genet. 39:857-864a及びMarronら，2002 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:13753-13758)。最後に、活性化CD8+ Ｔ細胞は、T1DMを発症するリスクが高い対象者の循環中に存在する(Skoweraら，2008 J Clin Invest. 118:3390-402)。
【０００５】
発症後初期におけるＩ型糖尿病の抗原特異的免疫療法は、疾患進行を停止させ、残る膵島細胞機能を保存する可能性がある。膵島同種移植物の保護のため、及びＩ型糖尿病への強い遺伝的素因が存在する場合の予防のためにも、安全な免疫療法が考慮される。膵島ベータ細胞は、天然には、Foxp3を発現する調節性CD4+Ｔ細胞(Treg)により病原性Ｔ細胞から保護され(Wildinら，(2001) Nat Genet. 27 (1): 18-20を参照)、養子性にトランスフェクトされたＴ細胞が媒介する保護には、膵島細胞抗原の認識が必要であることが確立されている(Tonkinら，(2008) J Immunol. 181 (7): 4516-22を参照)。
【０００６】
幾つかの糖尿病特異的ヒト自己反応性CD8+Ｔ細胞が罹患個体から単離されている(Skoweraら，2008 J Clin Invest. 118:3390-402及びLiebermanら，Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2003 Jul 8;100(14):8384-8)。これらＴ細胞は、β細胞抗原(例えば、プレプロインスリン(PPI))のペプチドエピトープを主に認識するＴ細胞レセプター(TCR)を有する。ALWGPDPAAA15-24(配列番号１)ペプチドは、ヒトPPIのシグナル配列に由来するそのようなペプチドの１つである(Skoweraら，2008 J Clin Invest. 118:3390-402及びWO2009004315)。このペプチドはHLA-A*02分子にロード(load)され、インスリン産生β細胞の表面に提示される。したがって、ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体は、TCRにより認識され得るヒトベータ細胞特異的マーカーを提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
T1DMの診断及び治療のための新たな組成物を提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の観点によれば、
ALWGPDPAAA(配列番号１)−HLA-A*02複合体に対して結合性を有し、TCR α鎖可変ドメイン及びTCR β鎖可変ドメインを含んでなるＴ細胞レセプター(TCR)が提供される。ここで、
α鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、
β鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜116の配列に対して少なくとも90％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、
α鎖可変ドメインは、配列番号２の番号付けを参照して、下記の置換：
【表１】
2017504319.tif 000002
の少なくとも１つ及び/又は少なくとも１つのアミノ酸挿入を有し、及び/又は
β鎖可変ドメインは、配列番号３の番号付けを参照して、下記の置換：
【表２】
2017504319.tif 000003
の少なくとも１つを有する。
【０００９】
本発明のTCR分子をベースとする治療剤は、CD8+ Ｔ細胞によるベータ細胞の破壊を防止するために、該ベータ細胞に免疫抑制剤を送達するという目的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１(配列番号２)は、TRAV12-3/TRAJ12/TRAC遺伝子を用いる野生型PPI特異的TCRのα鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２(配列番号３)は、TRBV12-4/TRBJ2-4/TRBD2*02/TRBC2遺伝子を用いる野生型PPI特異的TCRのβ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３(配列番号４)は、(本明細書で「参照TCR」と呼ぶ)可溶性TCRのα鎖のアミノ酸配列を示す。この配列は、システイン(太字及び下線)が配列番号１のT159(すなわち、TRAC定常領域のT48)から置換されていることを除き、図１のものと同じである。相補性決定領域に下線を付す。
【図４】図４(配列番号５)は、(本明細書で「参照TCR」と呼ぶ)可溶性TCRのβ鎖のアミノ酸配列を示す。この配列は、システイン(太字及び下線)が配列番号１のS173(すなわち、TRBC2定常領域のS57)から、A202がC191から、そしてD205がN216から置換されていることを除き、図２のものと同じである。相補性決定領域に下線を付す。
【図５】図５(配列番号６及び配列番号７)は、図３及び４にそれぞれ示すTCRα鎖及びβ鎖をコードするDNA配列を示す(導入されたシステインを太字で示す)。
【図６−１】図６(配列番号８〜18)は、本発明のTCRに存在し得る置換を含有するα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図６−２】図６−１の続き。
【図７−１】図７(配列番号19〜59)は、本発明のTCRに存在し得る挿入又は挿入及び置換を含有する更なるα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図７−２】図７−１の続き。
【図７−３】図７−２の続き。
【図７−４】図７−３の続き。
【図７−５】図７−４の続き。
【図７−６】図７−５の続き。
【図７−７】図７−６の続き。
【図８−１】図８(配列番号60〜91)は、本発明のTCRに存在し得る置換を含有するβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−２の続き。
【図８−４】図８−３の続き。
【図８−５】図８−４の続き。
【図８−６】図８−５の続き。
【図９】図９は、非肥満糖尿病(NOD)マウスにTCR形質導入Treg細胞を注射した実験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体を標的するTCRは、養子免疫療法として知られる治療プロセスにも使用することができる。MHCクラスＩ制限TCRをトランスフェクトされた調節性Ｔ細胞(Treg)は、非トランスフェクトTregと比較して増強したエフェクターＴ細胞抑制を生じることができること(Plesaら，2012 Blood. 119(15):3420-3430)及び当該細胞は自己免疫疾患の治療に有望であること(Wrightら，2011 Expert Rev Clin Immunol. 7(2):213-25)が知られている。
調節性Ｔ細胞(Treg)は、CD4+ Ｔリンパ球の総集団の小さな割合(５〜10％)を構成している(Powrieら，(2003) Science 299 (5609): 1030-1)。調節性Ｔ細胞は、CD25及びFoxp3転写因子の構成性発現により特徴付けられる。Treg細胞が減少しているか又は機能的に変化しているげっ歯類での実験により、種々の自己免疫疾患(自己免疫甲状腺炎、胃炎及びＩ型糖尿病を含む)の自然発症が示されている(Horiら，(2003) Science 299 (5609): 1057-61)。
【００１２】
CD4+CD25+Treg細胞のレベルは、NODマウス(T1DMを自然発症する非肥満糖尿病マウス)及びT1DM患者において、正常コントロールと比較して低いことが示されている(Wuら，(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(19): 12287-92)。NODマウスへのCD4+CD25+Treg細胞の注射によりT1DMを防止することができる(Wuら，(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(19): 12287-92)。NODマウスは、ヒトにおけるT1Dの多くの特徴(例えば、高血糖及び膵島細胞を指向する自己抗体の存在)が類似する糖尿病を自然発症する(Sgouroudisら，(2009) Diabetes Metab Res Rev 25(3): 208-18)ので、NODマウスモデルはヒト自己免疫の原型モデルとして役立つ。
天然Tregが低頻度であることが、その治療的使用に対する重要な制限となっている。フォークヘッド/翼状ヘリックス転写因子Foxp3は、調節性Ｔ細胞分化のマスタープロモーターであると考えられている(Horiら，(2003) Science 299 (5609): 1057-61)。Foxp3の異所性発現により、ナイーブCD4+CD25-Ｔ細胞が、調節性Ｔ細胞の表現型及び機能的特徴を有する細胞に転換し(Horiら，(2003) Science 299 (5609): 1057-61)、多数のTregが治療的使用に利用可能となる。
【００１３】
Tregの抗原特異性はTreg養子移入による炎症抑制の成功に必要であることが明らかとなっている(Tonkinら，(2008) J Immunol. 181 (7): 4516-22)。加えて、Jaeckelら(2005 DIABETES 54: 306-310)は、ポリクローナルCD4+Ｔ細胞へのFoxp3のレトロウイルスによる形質導入がインビボで、確立したＩ型糖尿病への干渉に有効でないことを見出した。しかし、膵島抗原に関して特異性を有するFoxp3形質導入Ｔ細胞の投与は、最近発症した糖尿病を有するマウスにおいて、疾患を安定化し、反転させた。
CD4+細胞としてのTregは、抗原提示細胞(APC)上にのみ発現されるMHCクラスIIにより提示される抗原を認識する。膵島細胞の破壊は、糖尿病患者において、おそらくはMHCクラスII-エピトープに制限された利用可能なTregのレパートリーが小さいために起こる。MHCクラスＩは実質的に全ての体性細胞に発現し、膵島ベータ細胞は、糖尿病特異的抗原−クラスＩ MHC複合体を最も高い密度で有する蓋然性が高い。この抗原−クラスＩ MHC複合体に関する特異性とTregのサプレッサー表現型とを組み合わせて新たなタイプのTregを工学的に操作することで、当該改変Tregは、そうでなければ膵島細胞の破壊を支持する炎症促進性環境を最適に制御するようになり得る。
【００１４】
本発明のTCRは、ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体を提示する細胞を検出する診断試薬として使用してもよい。この場合、TCRは検出標識と融合されてもよい。
ALWGPDPAAA−HLA-A*02を提示するβ細胞の効果的な標的化を確実にするため、本発明のTCRは、該ペプチド-HLA複合体に関して、下記で説明する参照PPI TCRと比較して改善された結合親和性及び/又は結合半減期を有する。本発明の或る特定のTCR(例えば、治療剤の送達のため又は診断に使用するもの)は、該ペプチド−HLA複合体に関して、高い親和性及び/又は遅い解離速度を有することが望ましい。
【００１５】
TCRは、国際免疫遺伝学(International Immunogenetics；IMGT)のTCR命名法を用いて説明され、IMGTのTCR配列についての公開データーベースに関連する。天然型α-βへテロ二量体TCRはα鎖及びβ鎖を有する。広義には、各鎖は、可変領域、連結領域及び定常領域を含んでなり、β鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域をも含有するが、この多様性領域は連結領域の一部と見なされることが多い。各可変領域は、フレームワーク配列中に埋め込まれた３つのCDR(相補性決定領域)を含んでなり、その１つはCDR3と名付けられた超可変領域である。フレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列並びに部分的に規定されるCDR3配列により区別される幾つかのタイプのα鎖可変(Vα)領域及び幾つかのタイプのβ鎖可変(Vβ)領域が存在する。VαタイプはIMGT命名法では独特なTRAV番号で指称される。よって、「TRAV12-3」は、独特なフレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列並びに(TCR間で保存されるアミノ酸配列により部分的に規定されるが、TCR間で変化するアミノ酸配列も含む)CDR3配列を有するTCR Vα領域を規定する。同様に、「TRBV12-4」は、独特なフレームワーク配列、CDR1及びCDR2配列を、部分的にのみ規定されるCDR3配列と共に有するTCR Vβ領域を規定する。
【００１６】
同様に、TCRの連結領域は独特なIMGT TRAJ及びTRBJ命名法により規定され、定常領域はIMGT TRAC及びTRBC命名法により規定される。β鎖多様性領域は、IMGT命名法では略号TRBDで指称され、上記のとおり、TRBD/TRBJ領域の連鎖は合わせて連結領域と見なされることが多い。
αβTCRのα鎖及びβ鎖は、一般に、各々が２つの「ドメイン」、すなわち可変ドメイン及び定常ドメインを有すると考えられている。可変ドメインは可変領域及び連結領域の連鎖からなる。したがって、本明細書及び特許請求の範囲において、用語「TCRα可変ドメイン」とはTRAV領域及びTRAJ領域の連鎖をいい、用語 TCRα定常ドメインとは細胞外TRAC領域又はＣ末端短縮型TRAC配列をいう。同様に、用語「TCRβ可変ドメイン」とは、TRBV領域及びTRBD/TRBJ領域の連鎖をいい、用語 TCRβ定常ドメインとは、細胞外TRBC領域又はＣ末端短縮型TRBC配列をいう。
【００１７】
IMGT命名法により規定される独特な配列は、広く知られており、TCR分野の当業者に利用可能である。例えば、それらはIMGTの公開データベースに見出すことができる。「T cell Receptor Factsbook」(2001) LeFranc and LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8もまた、IMGT命名法により規定される配列を開示しているが、公開日及びその後のタイムラグのため、その情報は、時に、IMGTデータベースを参照して確認する必要がある。
【００１８】
天然型PPI TCRは、下記のα鎖及びβ鎖のＶ、Ｊ及びＣ遺伝子を利用する：
α鎖−TRAV12-3/TRAJ12/TRAC(天然型PPI TCRα鎖の細胞外配列を図１に示す；配列番号２)。CDRは、アミノ酸27〜32(CDR1)、50〜55(CDR2)及び90〜100(CDR3)により規定される。
β鎖−TRBV12-4/TRBJ2-4/TRBD2*02/TRBC2(天然型PPI TCRβ鎖の細胞外配列を図２に示す；配列番号３)。TRBD2配列は、IMGT命名法においてTRBD2*01及び*02として指定される２つの対立遺伝子変異型(バリアント)を有し、上記天然型PPI TCRクローンは*02バリエーションを有することに留意すべきである。また、限定詞「*」なしは、該当配列に関しては唯１つの対立遺伝子のみが既知であることを意味する。CDRは、アミノ酸27〜31(CDR1)、49〜54(CDR2)及び93〜106(CDR3)により規定される。
【００１９】
用語「野生型TCR」、「天然型TCR」、「野生型PPI TCR」及び「天然型PPI TCR」は、本明細書中で同義に使用され、それぞれ配列番号２及び３の細胞外α鎖及びβ鎖を有する天然に存在するTCRをいう。それぞれ配列番号２及び３のα鎖及びβ鎖可変ドメインを含んでなる、単離された及び/又は組換えの及び/又は天然に存在しない及び/又は工学的に操作されたTCRは、本発明の別の観点を構成する。既知のPPI TCRは、Bulekら，2012 Nat Immunol. 13:283-9及びSkoweraら，2008 J Clin Invest. 118:3390-402に記載されているが、それぞれ配列番号２及び３のα鎖及びβ鎖可変ドメインを含んでなるTCRと比較して、この既知のTCRは、β鎖において18位にＥの代わりにＱを有する。
本発明のTCRの結合プロフィールと比較し得る参照TCRを提供する目的には、図３に示す天然型PPI TCRα鎖の細胞外配列(配列番号４)及び図４に示す天然型PPI TCRβ鎖の細胞外配列(配列番号５)を有する可溶性TCRを用いることが好都合である。このTCRを本明細書では「参照TCR」又は「参照PPI TCR」と呼ぶ。配列番号４は、C159がT159(すなわちTRACのT48)から置換されていることを除き、天然型α鎖細胞外配列(配列番号２)であることに留意すべきである。同様に、配列番号５は、C173がS173(すなわちTRBC2定常領域のS57)から、A191がC191から、そしてD205がN205から置換されていることを除き、天然型β鎖細胞外配列(配列番号３)である。天然型α鎖及びβ鎖細胞外配列に対するこれらシステイン置換により、リフォールドした可溶性TCR(すなわち、細胞外α鎖及びβ鎖のリフォールディングにより形成されたTCR)を安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成が可能となる。安定なジスルフィド連結可溶性TCRを参照TCRとして使用することにより、結合親和性及び結合半減期のより簡便な評価が可能となる。
【００２０】
本発明のTCRは、天然に存在しなくてもよく、及び/又は精製されていてもよく、及び/又は工学的に操作されていてもよい。本発明者らは、驚くべきことに、α鎖可変ドメインにおける挿入及び置換が、改善された結合親和性/延長した半減期をもたらすことを見出した。本発明のTCRは、α鎖可変ドメインに存在する１又はそれより多い挿入を有していてもよい。加えて、又は或いは、本発明のTCRは、β鎖可変ドメインに存在する１又はそれより多い挿入を有していてもよい。挿入アミノ酸の数は、１〜８、２〜５の範囲であってもよく、及び/又は１、２、３、４又は５であってもよい。２又は３のアミノ酸が挿入されていることが現段階では好ましい。理論に拘束されることは望まないが、挿入はCDRを拡張し、CDRとペプチド−MHC複合体とをより近づけることにより両者の接触を増大させると考えられる。挿入を有するTCRは、検出標識又は治療剤に結合した場合、治療薬及び/又は診断薬としての使用に適切であり得る。
α鎖可変ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸がS28、F30、Y32、Y51、S52、S53、G54及び/又はD58に相当する残基の直後に挿入されていてもよい。好ましくは、α鎖可変ドメインは、配列番号２の番号付けを参照して、少なくとも１つのアミノ酸がS28、Y32、Y51及び/又はS53に相当する残基の直後に挿入されていてもよい。
【００２１】
α鎖可変ドメインにおいて、挿入は、(配列番号２の番号付けを参照して)示された残基の後の、下記のうちの１又はそれより多くであってもよい：
【表３】
2017504319.tif 000004
【００２２】
α鎖可変ドメインは、S28での挿入を、単独で又はY51若しくはS53での挿入との組合せで有していてもよいし、Y32での挿入を、単独で又はY51若しくはS53での挿入との組合せで有していてもよい。α鎖可変ドメインにおいて、挿入は、(配列番号２の番号付けを参照して)下記のうちの１又はそれより多くであってもよい：
【表４】
2017504319.tif 000005
【００２３】
挿入は、配列番号２の番号付けを参照してS28の直後のQYDであってもよく、必要に応じて、配列番号２の番号付けを参照してS53の直後にSFYが追加的に挿入されていてもよい。或いは、挿入は、配列番号２の番号付けを参照して、Y32の直後のPAQ及びS53の直後のSFYであってもよい。
当業者に公知であるように、配列は、典型的には当該分野において周知である配列アラインメントプログラム及び/又はアルゴリズム(例えば、BLAST、FASTA及びMEGALIGNなど)を用いて、互いに比較することができる。当業者は、変異が残基の挿入又は欠失を含むアラインメントでは、配列アラインメントは、当該挿入された残基又は欠失した残基を含まない配列に「ギャップ」(典型的には、ダッシュ又は「Ａ」で表される)を導入することを容易に理解することができる。
【００２４】
特定の実施形態において、一方又は両方の可変ドメインに２〜11の置換が存在する。一方又は両方の可変ドメインには２、３、４、５、６、７、８、９、10又は11の置換が存在してもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRのα鎖可変ドメインは、上記挿入及び/又は置換の少なくとも１つを有するという条件で、配列番号２のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRのβ鎖可変ドメインは、上記置換の少なくとも１つを有するという条件で、配列番号３のアミノ酸残基１〜116の配列に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【００２５】
本発明の更なる実施形態は、図６及び７に示される変異α鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号８〜59)の１つ及び/又は図８に示される変異β鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号60〜91)の１つを含んでなるTCRにより提供される。本発明の具体的実施形態は、配列番号32、55、56、57、58及び59に示される変異α鎖可変領域アミノ酸配列の１つ及び/又は配列番号90に示される変異β鎖可変領域アミノ酸配列を含んでなるTCRにより提供される。
挿入及び置換は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにするもの、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いて実施することができる。これら方法は、分子生物学の標準的教科書の多くに詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び制限酵素ベースのクローニングに関しての更なる詳細については、Sambrook & Russell(2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第３版) CSHL Pressを参照。ライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についての更なる情報は、Rashtchian(1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6に見出すことができる。
【００２６】
本明細書に開示する任意のTCRの表現型上サイレントな変異型もまた、本発明の範囲に含まれる。用語「表現型上サイレントな変異型」とは、本明細書で使用する場合、ALWGPDPAAA(配列番号１)−HLA-A*02複合体に関して、下記の範囲内のKD及び/又は結合半減期を有するTCRをいうと理解される。例えば、当業者に公知であるように、ALWGPDPAAA(配列番号１)−HLA-A*02複合体との相互作用に関する親和性を変更することなく、定常ドメイン及び/又は可変ドメインに、上記のものからの変化が組み込まれているTCRを製造することは可能であり得る。このような軽微な変異型も本発明の範囲に含まれる。１又はそれより多い保存的置換がなされているTCRもまた本発明の一部を構成する。
当業者に自明なように、配列は、TCRの結合特性に実質的に影響を及ぼすことなく、そのＣ末端及び/又はＮ末端で１、２、３、４、５又はそれより多くの残基を切り取ることも可能であり得る。このような軽微な変異型の全てが本発明に包含される。
【００２７】
本発明のTCRは、ALWGPDPAAA(配列番号１)−HLA-A*02複合体に結合する特性を有する。本発明の或る特定のTCRは、このエピトープを提示する細胞に特異的に結合することが見出されており、よって、これらエピトープをディスプレイする細胞及び組織への治療剤又は検出標識の送達用ターゲティングベクターとして特に適切である。本発明のTCRに関して、特異性は、PPI抗原陽性HLA-A*02陽性標的細胞を認識できる一方で、抗原陰性標的細胞(特に、非ガン性ヒト細胞)を認識する能力が極めて小さいことに関する。
本発明の或る特定のTCRは、養子療法における使用に高度に適切であることが見出されている。このようなTCRは、当該複合体に関して、200μM未満のKD(例えば、約0.1μM〜約100μM)及び/又は約３秒から約12分までの範囲の結合半減期(T1/2)を有していてもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRは、当該複合体に関して、約0.5μM〜約50μM、約１μM〜約20μM又は約２μM〜約10μMのKDを有していてもよい。
【００２８】
本発明の或る特定のTCRは、検出標識又は治療剤に結合した場合、治療薬及び/又は診断薬としての使用に高度に適切であることが見出されている。このようなTCRは、当該複合体に関して、約10pM〜約200nMの範囲のKD及び約10分〜約60時間のT1/2を有していてもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRは、当該複合体に関して、約20pM〜約100nM、約50pM〜約１nM、約100pM〜約0.8nM、約200pM〜約0.7nMのKDを有していてもよい。
【００２９】
治療薬及び/又は診断薬としての使用に適切であるTCRのα鎖可変ドメインは、配列番号２の番号付けを参照して、下記の置換：
【表５】
2017504319.tif 000006
の少なくとも１つを有していてもよく、及び/又は、β鎖可変ドメインは、配列番号３の番号付けを参照して、下記の置換：
【表６】
2017504319.tif 000007
の少なくとも１つを有していてもよい。
【００３０】
このようなTCRのα鎖可変ドメインは、配列番号２の番号付けを参照して、下記の置換：
【表７】
2017504319.tif 000008
の少なくとも１つを有していてもよく、及び/又は、β鎖可変ドメインは、配列番号３の番号付けを参照して、下記の置換：
【表８】
2017504319.tif 000009
の少なくとも１つを有していてもよい。
【００３１】
これらα鎖可変ドメインにおいて、配列番号２の番号付けを参照して、S28、Y32、Y51及び/又はS53に相当する残基の直後に挿入された少なくとも１つのアミノ酸が存在していてもよい。これらα鎖可変ドメインは、S28での挿入を、単独で又はY51若しくはS53での挿入との組合せで有していてもよいし、Y32での挿入を、単独ｄ又はY51若しくはS53での挿入との組合せで有していてもよい。挿入は、(配列番号２の番号付けを参照して)下記：
【表９】
2017504319.tif 000010
のうちの１又はそれより多くであってもよい。
【００３２】
挿入は、配列番号２の番号付けを参照して、S28の直後のQYD及びS53の直後のSFYであってもよい。或いは、挿入は、配列番号２の番号付けを参照して、Y32の直後のPAQ及びS53の直後のSFYであってもよい。TCRは、配列番号32、55、56、57、58及び59に示される変異α鎖可変領域アミノ酸配列の１つ及び/又は配列番号90に示される変異β鎖可変領域アミノ酸配列を含んでなってもよい。
【００３３】
結合親和性(平衡定数KDに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表される)は、任意の適切な方法により測定することができる。TCRの親和性が２倍になればKDは1/2になることが理解されている。T1/2はln2/解離速度(koff)として算出される。よって、T1/2が２倍になればkoffは1/2になる。TCRのKD値及びkoff値は、通常、可溶形態のTCR、すなわち細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの残基を除去するように短縮された形態のTCRについて測定する。したがって、所与のTCRは、その可溶形態がALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体に関して結合親和性及び/又は結合半減期を有する場合には、該特性を有すると理解されるべきである。好ましくは、所与のTCRの結合親和性又は結合半減期は、同じアッセイプロトコルを用いて数回(例えば３回又はそれより多い回数)測定して、結果の平均をとる。１つの好適な実施形態において、この測定は、本明細書の実施例３の表面プラズモン共鳴(BIAcore)法を用いてなされる。参照ALWGPDPAAA−HLA-A*02 TCRは、この方法で測定したときに約287μMのKDをする。
【００３４】
本発明のTCRはαβヘテロ二量体であってもよいし、単鎖形式であってもよい。単鎖形式は、Vα-L-Vβ型、Vβ-L-Vα型、Vα-Cα-L-Vβ型、Vα-L-Vβ-Cβ型又はVα-Cα-L-Vβ-Cβ型(ここで、Vα及びVβはそれぞれTCRα及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCRα及びβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である)のαβTCRポリペプチドを含む。抗原提示細胞への治療剤の送達用ターゲティング剤としての使用のためには、TCRは可溶形態(すなわち、膜貫通ドメインも細胞質ドメインも有しない形態)であってもよい。安定性のために、本発明のTCR(好ましくは、可溶性αβヘテロ二量体TCR)は、例えばWO 03/020763に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。本発明のTCRは、単離されていてもよいし、工学的に操作されていてもよいし、又は天然に存在していなくてもよい。養子療法における使用のためには、αβヘテロ二量体TCRは、例えば、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされていてもよい。
【００３５】
幾つかの実施形態において、α鎖可変ドメインは、配列番号２の番号付けを参照して、配列番号８〜59(必要に応じて、配列番号32、55、56、57、58及び59のサブセットのもの)のQ1〜D112のアミノ酸配列に対して少なくとも96、97、98若しくは99％の配列同一性又は100％の配列同一性を有していてもよい。図６及び７において下線を付したアミノ酸は不変であり得る。
幾つかの実施形態において、β鎖可変ドメインは、配列番号60〜91(必要に応じて、配列番号90)のD1〜L116のアミノ酸配列に対して少なくとも96、97、98若しくは99％の配列同一性又は100％の配列同一性を有していてもよい。図８において下線を付したアミノ酸は不変であり得る。
本発明に従うαβヘテロ二量体TCRは、実施例４に示されるような具体的なα鎖及びβ鎖組合せから作製され得る。
【００３６】
本発明のαβヘテロ二量体TCRは、通常、α鎖TRAC定常ドメイン配列及びβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を含んでなる。α鎖及びβ鎖定常ドメイン配列は、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1若しくはTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失するように短縮化又は置換により改変されていてもよい。α鎖及びβ鎖定常ドメイン配列はまた、TRACのThr48及びTRBC1若しくはTRBC2のSer57からシステイン残基への置換により改変され、当該システインがTCRのα定常ドメインとβ定常ドメインとの間でジスルフィド結合を形成していてもよい。
【００３７】
当該分野において周知であるように、TCRは翻訳後修飾に付されていてもよい。グリコシル化はそのような修飾の１つであり、TCR鎖中の規定されたアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基又はセリン/スレオニン残基は、周知のオリゴ糖付加位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状況は、タンパク質配列、タンパク質コンホメーション及び特定の酵素の利用可能性を含む幾つかの因子に依存する。更に、グリコシル化状況(すなわち、オリゴ糖タイプ、共有結合及び付加の総数)は、タンパク質の機能に影響することがある。したがって、組換えタンパク質を製造するときには、グリコシル化の制御が望ましい場合が多い。制御されたグリコシル化は、抗体ベースの治療薬を改善するために使用されている(Jefferis R.，Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar；8(3):226-34)。本発明の可溶性TCRのためには、グリコシル化は、例えば特定の細胞株を用いることにより、インビボで制御されてもよいし、化学的修飾により、インビトロで制御されてもよい。このような修飾は望ましい。なぜならば、グリコシル化は、薬物動態を改善し、免疫原性を低減し、天然型ヒトタンパク質をより厳密に模擬することができるからである(Sinclair AM and Elliott S.，Pharm Sci. 2005 Aug；94(8):1626-35)。
【００３８】
本発明の１つの観点は、少なくとも２つの本発明のTCRを含んでなる多価TCR複合体を提供する。１つの実施形態において、少なくとも２つのTCR分子は、リンカー成分を介して連結して多価複合体を形成する。好ましくは、複合体は水溶性であり、リンカー成分はそのように適宜選択されるべきである。更に、リンカー成分は、形成される複合体の構造的多様性が最小となるように、TCR分子の規定位置に付着可能であることが好ましい。例えば、TCRは、非ペプチド性ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列により連結されてもよい。本発明のTCR複合体は、各TCRの可変領域配列に位置しないアミノ酸残基間に伸びる非ペプチド性ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列を有していてもよい。本発明の複合体は内科治療に使用され得るので、リンカー成分は、当然に薬学的適合性、例えば免疫原性に関して選択されるべきである。上記所望の基準を充足するリンカー成分の例は当該分野(例えば、抗体フラグメントを連結する分野)において公知である。
【００３９】
本発明の幾つかの可溶性TCR(又はその多価複合体)は、検出標識又は治療剤の抗原提示細胞及び抗原提示細胞を含有する組織への送達に有用である。したがって、本発明の可溶性TCR(又はその多価複合体)は、検出標識；治療剤；又は(例えば、PEG化による)PK調節成分と(共有結合的又はその他の様式で)結合されていてもよい。
診断用の検出標識としては、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ及び造影剤が挙げられる。このような標識されたTCR又は多価TCR複合体は、ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体又は該複合体を提示する細胞を検出する方法において有用であり、該方法は、試験すべきサンプルを本発明のTCR又はTCR複合体と接触させること；及び、TCR又はTCR複合体の結合を検出することを含んでなる。(例えば、ビオチン化ヘテロ二量体を用いて)形成された四量体TCR複合体において、蛍光ストレプトアビジンを用いて検出標識を提供することができる。このような蛍光標識TCR四量体は、FACS分析(例えば、ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体(当該高親和性TCRはこの複合体に特異的である)を保持する抗原提示細胞を検出するFACS分析)における使用に適切である。
本発明のTCRは、TCR特異的抗体(特に、モノクローナル抗体)の使用により検出されてもよい。
【００４０】
１つの更なる観点において、本発明のTCR(又はその多価複合体)は、択一的に又は追加的に、例えば(インターロイキン又はサイトカインのような)免疫エフェクター分子であり得る治療剤と(例えば、共有結合的に又は他の様式により)結合していてもよい。IL-4、IL-10及びIL-13が本発明のTCRとの結合に適切なサイトカインの例である。
１つの更なる観点において、本発明は、本発明のTCRのα鎖可変ドメインをコードする配列及び/又は本発明のTCRのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含んでなる核酸を提供する。核酸は本発明のTCRをコードし得る。幾つかの実施形態において、核酸はcDNAである。核酸は、天然に存在しないものであってもよいし、及び/又は精製されていてもよいし、及び/又は遺伝子操作されていてもよい。
【００４１】
別の１つの観点において、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。好ましくは、ベクターはTCR発現ベクターである。
ベクターは、Ｔ細胞において、Foxp3及び本発明のTCRの両方を発現することが可能であってもよい。代表的には、TCR α鎖及びβ鎖は、ウイルス性リボソームスキップ(2A)及び内部リボソーム進入部位(IRES)を用いるトリシストロンレトロウイルスベクターから、GFP/Foxp3融合タンパク質と共に発現される。このタイプのベクターは、従来のCD4+ Ｔ細胞を抗原特異的調節性表現型Ｔ細胞に効率的に変換する。膵島抗原特異的な本発明の高親和性TCR及びFoxp3の同時送達により、膵島特異性は確実に調節活性から分離せず、したがって、トランスフェクトＴ細胞は、そうでなければ膵島細胞の破壊を支持する炎症促進性環境を最適に制御することが可能となる。
【００４２】
本発明はまた、本発明の核酸又はベクターを有する細胞を提供する。ベクターは、単一のオープンリーディングフレーム内にα鎖及びβ鎖をコードする本発明の核酸を含んでなってもよいし、２つの別個のオープンリーディングフレーム内にα鎖及びβ鎖をそれぞれコードする本発明の核酸を含んでなってもよい。別の１つの観点は、本発明のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクター及び本発明のTCRのβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターを有する細胞を提供する。このような細胞は養子療法に特に有用である。本発明の細胞は、単離されていてもよいし、及び/又は組換えであってもよいし、及び/又は天然に存在しないものであってもよいし、及び/又は遺伝子操作されていてもよい。
【００４３】
本発明のTCRは養子療法に有用であるので、本発明は、本発明のTCRを提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子操作された細胞を包含する。遺伝子操作された細胞は、Ｔ細胞、特に調節性Ｔ細胞(Treg)であり得る。本発明のTCRをコードする核酸(例えばDNA又はRNA)でのＴ細胞のトランスフェクションに適切な方法が存在する(例えば、Robbinsら(2008) J. Immunol. 180:6116-6131及びPlesaら(2012) Blood. 119(15):3420-3430を参照)。本発明のTCRを発現するＴ細胞は、T1DMの養子療法ベースの治療における使用に適切である。当業者に公知であるように、養子療法を行なうことができる適切な方法が存在する(例えば、Rosenbergら(2008) Nat Rev Cancer 8(4):299-308を参照)。
【００４４】
１つの観点において、本発明は、膵島細胞で提示されるALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体を認識する複数の調節性表現型Ｔ細胞及び１又はそれより多い医薬的に許容され得るキャリア又は賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。ここで、前記調節性表現型Ｔ細胞は、本発明のTCR(αβヘテロ二量体TCRであり得る)を発現可能なベクターが導入されている。この組成物はＩ型糖尿病の治療に使用され得る。
TCR形質導入Ｔ細胞が関わる本発明の観点は、膵島細胞で提示されるALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体を認識する、αβヘテロ二量体TCRがトランスフェクトされている調節性表現型Ｔ細胞を必要とし得る。所与の個体に由来するCD4+ Ｔ細胞の典型的集団は、通常、約５〜10％の天然型調節性Ｔ細胞を含んでなる。調節性Ｔ細胞を総集団から分離し、TCRでトランスフェクトすることも可能であるが、非調節性CD4+ Ｔ細胞から出発し、Foxp3を発現可能なベクターを導入して、それらを調節性Ｔ細胞表現型にスイッチさせることが好ましい。簡便には、導入される、Foxp3を発現可能なベクターは当該TCRも発現可能である。通常(必須ではない)、TCR又はTCR及びFoxp3の両方でトランスフェクトするＴ細胞は、本発明の組成物で治療すべき患者から採取する。
【００４５】
患者への投与のために、本発明のTCR、多価複合体、核酸、ベクター又は細胞は、医薬的に許容され得る１又はそれより多いキャリア又は賦形剤と共に医薬組成物で提供されてもよい。本発明に従うTCR、多価複合体、核酸、ベクター又は細胞は、通常、医薬的に許容され得るキャリアを通常含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。この医薬組成物は、(患者への望ましい投与方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。医薬組成物は、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封された容器中で提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、通常(必須ではない)、使用指示書を含む。キットは複数の単位剤形を含んでいてもよい。
医薬組成物は、任意の適切な経路(好ましくは、非経口経路[皮下、筋内、より好ましい静脈内経路を含む])による投与に適合されていてもよい。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分をキャリア又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造されてもよい。
【００４６】
本発明はまた、以下のものを提供する：
・医薬における使用のため、好ましくは自己免疫疾患の治療法における使用のための、ペプチド−HLA-A2複合体として提示されたALWGPDPAAAペプチドに結合するTCR、複数の当該TCRを含んでなる多価TCR複合体、当該TCR若しくは多価TCR複合体をコードする核酸、当該核酸を含んでなるベクター並びに/又は当該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞；
・自己免疫疾患治療用医薬の製造における、ペプチド−HLA-A2複合体として提示されたALWGPDPAAAペプチドに結合するTCR、複数の当該TCRを含んでなる多価TCR複合体、当該TCR若しくは多価TCR複合体をコードする核酸、当該核酸を含んでなるベクター並びに/又は当該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞の使用；
・ペプチド−HLA-A2複合体として提示されたALWGPDPAAAペプチドに結合するTCR、複数の当該TCRを含んでなる多価TCR複合体、当該TCR若しくは多価TCR複合体をコードする核酸、当該核酸を含んでなるベクター並びに/又は当該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞を患者に投与することを含んでなる、自己免疫疾患患者の治療法。
【００４７】
好ましくは、本発明のTCRは、ペプチド−HLA-A2複合体として提示されたALWGPDPAAAペプチドに結合するTCRである。多価TCR複合体、核酸、ベクター及び細胞も同様に本発明に従い得る。自己免疫疾患はＩ型糖尿病であり得る。方法は養子免疫療法を含み得る。
本発明の各々の観点の好適な特徴は、他の観点の各々についてのとおりである(ただし、必要な変更は加える)。本明細書において言及した刊行物は、法が許容する最大範囲まで組み込まれる。本明細書における文献の引用又は特定は、その文献が本発明の先行技術として利用可能であることを自認するものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例
実施例１−それぞれpEX956ベースの及びpEX821ベースの発現プラスミドへの参照PPI TCRα鎖及びβ鎖可変領域配列のクローニング
参照PPI TCRのα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを、PPI Ｔ細胞クローン(Mark Peakman[King's College London，United Kingdom]から提供されたクローン1E6)から単離したトータルcDNAからPCR増幅した。α鎖の場合、制限部位NdeIをコードするα鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドA1(プライマー配列：gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaagatcctggaccactc；配列番号92)と、制限部位SalIをコードするα鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドA2(プライマー配列：ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg；配列番号93)とを用いてα鎖可変ドメインを増幅する。β鎖の場合、制限部位NdeIをコードするβ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドB1(プライマー配列：gaattccatatggatgctggagttattcaatcaccccggcacgag；配列番号94)と、制限部位AgeIをコードするβ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドB2(プライマー配列：tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc；配列番号95)とを用いてβ鎖可変ドメインを増幅する。
【００４９】
Sambrook及びRussellによるMolecular Cloning a Laboratory Manual(第３版)に記載の標準的方法によって、α可変ドメイン及びβ可変ドメインを、Cα又はCβをそれぞれ含有するpEX956ベース及びpEX821ベースの発現プラスミドにクローニングした。Applied Biosystems 3730xl DNA分析機を使用してプラスミドを配列決定した。
NdeI及びSalIで切断したTCRα鎖をコードするDNA配列を、NdeI及びXhoIで切断したpEX956＋Cαベクターにライゲートした。NdeI及びAgeIで切断したTCRβ鎖をコードするDNA配列を、NdeI及びAgeIで切断した別のpEX821＋Cβベクターにライゲートした。
【００５０】
ライゲートしたプラスミドを、コンピテントなE. coli株XL1-blue細胞に形質転換し、100μg/mlアンピシリン含有LB/アガープレートに播種した。37℃にて10晩のインキュベーション後、単一コロニーを採取し、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのLB中で一晩37℃にて振盪しながら増殖させる。Miniprepキット(Qiagen)を使用してクローン化プラスミドを精製し、Applied Biosystems 3730xl DNA分析機を使用してプラスミドを配列決定した。
図３及び４はそれぞれ、図５(配列番号６及び７)のDNA配列からそれぞれ生じる参照PPI TCRのα鎖及びβ鎖細胞外アミノ酸配列(配列番号４及び５)を示す。リフォールディングしてへテロ二量体TCRを形成する際に、人工の鎖間ジスルフィド結合が提供されるように、天然型TCRに関して、α鎖及びβ鎖の定常領域においてシステインが置換導入されたことに留意すべきである。導入システインを太字及び下線で示す。
【００５１】
実施例２−可溶性参照PPI TCRの発現、リフォールディング及び精製
実施例１で作製したように、TCRα鎖及びβ鎖をそれぞれ含有する発現プラスミドを、E.coli株BL21pLysSに別々に形質転換し、単一アンピシリン耐性コロニーを、0.6〜0.8程度のOD600までTYP(アンピシリン100μg/ml)培地で37℃にて増殖後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導後３時間で、Beckman J-6Bでの4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を採取した。MgCl2及びDNaseIの存在下に25mlのBug Buster(登録商標)(NovaGen)を用いて細胞ペレットを溶解させた。Beckman J2-21遠心分離機での13000rpmにて30分間の遠心分離により封入体ペレットを回収した。その後、３回の界面活性剤洗浄を行って細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、0.5％ Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21で13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液：50mM Tris-HCl pH8.0、１mM NaEDTA中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去した。最後に、封入体を30mgのアリコートに分け、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質の収量を６Ｍグアニジン-HClで溶解することによって定量し、OD測定はHitachi U-2001分光光度計で行った。次いで、消光率を用いてタンパク質濃度を算出した。
【００５２】
約15mgのTCRβ鎖及び15mgのTCRα鎖の可溶化封入体を凍結ストックから解凍し、10mlのグアニジン溶液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中に希釈して、完全な鎖変性を確実にした。その後、十分に還元及び変性したTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、0.5リットルの以下のリフォールディング緩衝液中に注入した：100mM Tris pH8.1、400mM L-アルギニン、２mM EDTA、５Ｍ尿素。酸化還元カップル(システアミン塩酸及びシスタミン二塩酸)をそれぞれ6.6mM及び3.7mMの最終濃度まで添加し、約５分後に変性TCR鎖を添加した。溶液を30分間程度放置した。リフォールドしたTCRを、Spectra/Por(登録商標)1メンブレン(Spectrum；Product No. 132670)において10ＬのH2Oに対して18〜20時間透析した。その後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris pH8.1(10Ｌ)に２回交換し、透析を５℃±３℃にて更に８時間程度継続した。
透析後のリフォールド産物をPOROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムにロードし、50カラム容量にわたる10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させることにより、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を用いて、変性産物及び不純物から可溶性TCRを分離した。ピーク画分をプールし、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、プールした画分を４℃で保存し、クーマシー染色SDS-PAGEにより分析後、プールして濃縮した。最後に、PBS緩衝液(Sigma)中で予め平衡化したGE Healthcare Superdex(登録商標) 75HRゲル濾過カラムを使用して、可溶性TCRを精製し、特徴付けた。約50kDaの相対分子量で溶出するピークをプールし、濃縮後、BIAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴分析により特徴決定した。
【００５３】
実施例３−結合特性決定
BIAcore分析
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(BIAcore(登録商標) 3000)を使用して、可溶性TCRのペプチド−MHCリガンドへの結合を分析することができる。これは、ストレプトアビジン被覆結合表面(センサチップ)に固定可能な可溶性ビオチン化ペプチド−HLA(「pHLA」)複合体の製造によって容易になる。センサチップは、４つの異なるpHLA複合体へのＴ細胞レセプター結合の同時測定を可能にする４つの個別フローセルを備える。pHLA複合体の手動注入により、固定化クラスＩ分子の正確なレベルを容易に操作することができる。
ビオチン化クラスＩ HLA-A*02分子を、構成成分たるサブユニットタンパク質及び合成ペプチドを含有する細菌発現封入体からインビトロでリフォールドさせ、続いて精製及びインビトロでの酵素的ビオチン化を行った(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15)。HLA-A*02-重鎖を、該タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに代えてＣ末端ビオチン化タグと共に適切な構築物で発現させた。約75mg/リットル細菌培養物の封入体発現レベルが得られた。MHC軽鎖又はβ2-ミクログロブリンもまたE.coliで適切な構築物から封入体として約500mg/リットル細菌培養物のレベルで発現させた。
【００５４】
E. coli細胞を溶解し、封入体を約80％の純度まで精製した。封入体からのタンパク質を６Ｍグアニジン-HCl、50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA中で変性させ、0.4Ｍ L-アルギニン、100mM Tris pH8.1、3.7mMシスタミン二塩酸、6.6mMシステアミン塩酸、４mg/Ｌの(HLA-A*02分子によるローディングに必要な)AFPペプチド中、＜５℃のリフォールディング緩衝液中への変性タンパク質の単発添加により、30mg/リットルの重鎖、30mg/リットルのβ2mの濃度でリフォールドさせた。少なくとも１時間４℃にて完全にリフォールドさせた。
10容量の10mM Tris pH8.1への透析により緩衝液を交換した。次いで、タンパク質溶液を1.5μm酢酸セルロースフィルターに通して濾過し、POROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラム(８mlのベッド容積)にロードした。Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を使用して、10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaCl線形グラジエントでタンパク質を溶出させた。HLA-A*02−ペプチド複合体は約250mM NaClで溶出した。ピーク画分を収集し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加え、該画分を氷上で冷却した。
ビオチンタグ化pHLA分子を、10mM Tris pH8.1、５mM NaCl中に、同じ緩衝液中で平衡化させたGE Healthcare迅速脱塩カラムを用いて緩衝液交換した。溶出直後に、タンパク質含有画分を氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、ビオチン化試薬を添加した：１mMビオチン、５mM ATP(pH８に緩衝化)、7.5mM MgCl2及び５μg/ml BirA酵素(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15に従って精製)。その後、混合物を室温にて一晩インキュベートした。
【００５５】
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いてビオチン化pHLA-A*01分子を精製した。GE Healthcare Superdex(登録商標) 75 HR 10/30カラムを、濾過PBSで予め平衡化した。１mlのビオチン化反応混合物をロードし、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を使用してカラムをPBSで0.5ml/分にて展開した。ビオチン化pHLA-A*02分子は、約15mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。タンパク質濃度はクーマシー結合アッセイ(PerBio)を用いて決定し、ビオチン化pHLA-A*02分子のアリコートを−20℃にて凍結保存した。
BIAcore(登録商標) 3000表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサは、小さなフローセル内のセンサ表面近くでの、応答単位(RU)で表された屈折指数の変化(レセプターリガンド相互作用を検出し、親和性及び動力学的パラメータを分析するために使用することができる原理である)を測定する。BIAcore(登録商標)実験は、PBS緩衝液(Sigma，pH7.1〜7.5)をランニング緩衝液として及びタンパク質サンプルの希釈物の調製に使用して、温度25℃にて実施した。ストレプトアビジンは、標準アミンカップリング法によりフローセルに固定化した。pHLA複合体は、ビオチンタグを介して固定化した。次いで、可溶性TCRを、異なるフローセルの表面上を一定の流速で通過させ、その際のSPR応答を測定することによりアッセイを実施した。
【００５６】
平衡結合定数
上記BIAcore(登録商標)分析法を使用して、平衡結合定数を決定した。ジスルフィド連結可溶性へテロ二量体形態の参照PPI TCRの系列希釈物を調製し、５μl/分の一定流速にて２つの異なるフローセル上に注入した；一方は1000RU程度の特異的ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体が被覆され、他方は1000RU程度の非特異的HLA-A*02−ペプチド複合体が被覆されていた。応答は、コントロールセルからの測定値を用いて、各濃度に関して規格化した。規格化した応答データをTCRサンプルの濃度に対してプロットし、、非線形曲線フィッティングモデルにフィットさせて、平衡結合定数KDを算出した(Price & Dwek，Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (第２版) 1979，Clarendon Press，Oxford)。ジスルフィド結合した可溶性形態の参照PPI TCR(実施例２)は、約287μMのKDを示した。同じBIAcoreデータから、T1/2値は測定するには速過ぎた。
【００５７】
動力学的パラメータ
高親和性TCRに関して、KDは、解離速度定数kd及び会合速度定数kaを実験的に測定することにより決定した。平衡定数KDはkd/kaとして算出した。一方は約1000RUの特異的ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体が被覆され、他方は約1000RUの非特異的HLA-A1−ペプチド複合体が被覆された２つの異なるセルに、TCRを注入した。流速は50μl/分に設定した。代表的には、約１μM濃度のTCRを250μl注入した。その後、応答がベースラインに復帰するか又は２時間以上が経過するまで、緩衝液を流した。動力学的パラメータはBIAevaluationソフトウエアを用いて算出した。解離相を一次指数関数減衰式にフィットさせた。これにより半減期の算出が可能になった。
【００５８】
実施例４−親和性が向上したPPI TCRの作製
実施例１に記載の参照PPI TCRを、ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体に関する親和性が増大した本発明のTCRを作製するためのテンプレートとして用いた。
当業者に公知のとおり、これら変異鎖の作製に必要なコドン置換又はコドン挿入は、対応する野生型インスリン特異的マウスTCR鎖をコードするDNAに、部位特異的変異誘発(StratageneのQuickChangeTM部位特異的変異誘発キット)により導入することができる。
組み合わせたときに、ALWGPDPAAA−HLA-A*02複合体に関して、参照TCRと比較して向上した親和性を示すTCR α鎖及びβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、図６、７(α鎖)及び図８(β鎖)(配列番号８〜59(α鎖)及び60〜91(β鎖))に列挙する。
【００５９】
参照WT PPI TCRに比して向上した親和性をもたらすTCR α鎖及びβ鎖の組合せの例は以下のとおりである：
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【００６０】
実施例５−高親和性TCRを形質導入されたTregはマウスモデルで糖尿病の発症を予防する
CD25涸渇CD4+ Ｔ細胞を、非肥満糖尿病(NOD)マウスの脾臓から単離し、Foxp3を発現するように誘導して、Treg表現型を作製した。この細胞に、マウスインスリン由来ペプチドに特異的な高親和性TCR(Kd=0.74μM)を形質導入した。次いで、活性化細胞をレシピエントのNODマウス(ｎ=４)に注射した。CD4細胞を注射しないコントロール群を同時に準備した(ｎ=３)。
糖尿病の迅速な発症を誘導するため、２日後に、NODマウスに、G9トランスジェニックマウスから単離した活性化CD8+ Ｔ細胞クローンを注射した(Wongら，2009 Diabetes 58(5): 1156-1164)。
G9細胞の注射後30日間、マウスを尿グルコースについてモニターした。一旦陽性となったら、マウスを血中グルコース検査に供して糖尿病の発症を確証した。
結果(図９)は、TCR形質導入Tregの注射が、モニター期間内の糖尿病発症を予防したことを示す。対照的に、細胞を注射されなかったマウスは全て、30日後の時点で糖尿病に関して陽性であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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