(57)【要約】  本発明は、体外循環式光化学療法（ＥＣＰ）による治療における、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体の使用であって、前記ポルフィリン誘導体を含有する患者の血液またはその一部は、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光にさらされる使用に関する。
2017513952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノレブリン酸またはそのエステル、またはその酸またはエステルの塩と接触させた患者の血液またはその一部を、３１５ｎｍ〜４５０ｎｍの両端を含む波長の光にさらすことによって体外循環式光化学療法による治療に使用するための５−アミノレブリン酸またはそのエステル、またはその酸またはエステルの塩であり、
前記体外循環式光化学療法による治療が、癌、リンパ球が介在する悪性および非悪性の障害、Ｔ細胞が介在する疾患、自己免疫疾患の治療のためであるか、または悪性腫瘍および免疫疾患に対する免疫応答を調整するためのものである、ＡＬＡ化合物。
【請求項２】
式Ｉの化合物
Ｒ２’Ｒ２Ｎ−ＣＨ２ＣＯＣＨ２−ＣＨ２ＣＯ−ＯＲ１
（Ｉ）
であり、
Ｒ１は、場合により、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アミノ基、スルホ基、アリール基、オキソ基またはハロゲン基によって置換され、場合により、酸素原子、窒素原子、硫黄原子またはリン原子によって中断された、アルキル基をあらわしてもよく；
Ｒ２およびＲ２’は、互いに独立して、水素原子をあらわすか、または場合により、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アミノ基、スルホ基、アリール基、オキソ基またはハロゲン基によって置換され、場合により、酸素原子、窒素原子、硫黄原子またはリン原子によって中断された、アルキル基をあらわす、請求項１に従って使用されるＡＬＡ化合物。
【請求項３】
前記化合物は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはＡＬＡ−メチルエステル、ＡＬＡ−エチルエステル、ＡＬＡ−プロピルエステル、ＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）、ＡＬＡ−ヘプチルエステル、ＡＬＡ−オクチルエステルまたはこれらの塩であり、好ましくは、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ＡＬＡ−メチルエステル（メチル−アミノレブリネート）またはＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキサアミノレブリネート；ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）であり、さらに好ましくは、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキサアミノレブリネート；ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）である、請求項１または２のいずれか一項に従って使用されるＡＬＡ化合物。
【請求項４】
前記患者の血液またはその一部と、前記５−アミノレブリン酸、エステルまたは塩とを接触させてから、前記波長の光にさらすまでの時間は、５分〜４８０分の両端を含む時間であり、好ましくは、１５分〜２４０分の両端を含む時間であり、さらに好ましくは、３０分〜１２０分の両端を含む時間であり、最も好ましくは、４５分〜７５分の両端を含む時間である、請求項１〜３のいずれか一項に従って使用されるＡＬＡ化合物。
【請求項５】
体外循環式光化学療法による治療に使用するための、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体であって、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を含有する患者の血液またはその一部が、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光にさらされることによるものであり、
前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長は、３１５ｎｍ〜４５０ｎｍであり、かつ、その両端を含み、
前記ポルフィリン誘導体は、
請求項３〜５のいずれか一項に記載のＡＬＡ化合物から誘導されるポルフィリン誘導体から選択され、好ましくは、プロトポルフィリンＩＸ、ＡＬＡ誘発性プロトポルフィリンＩＸまたはヘキサアミノレブリネート誘発性プロトポルフィリンＩＸであり、
前記体外循環式光化学療法による治療は、癌、リンパ球が介在する悪性および非悪性の障害、Ｔ細胞が介在する疾患、自己免疫疾患の治療のためであるか、または悪性腫瘍および免疫疾患に対する免疫応答を調整するためのものである、活性化可能なポルフィリン誘導体。
【請求項６】
前記ポルフィリン誘導体または前記ＡＬＡ化合物を、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）のようなソラレンと組み合わせて使用する、請求項１〜５のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項７】
前記化合物を活性化させる光の波長は、３８０ｎｍ〜４５０ｎｍの両端を含む波長から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項８】
前記体外循環式光化学療法による治療が、癌を治療するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項９】
前記体外循環式光化学療法による治療が、さらに、
−リンパ腫、好ましくは、Ｔ細胞リンパ腫、最も好ましくは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫または紅皮症の皮膚のＴ細胞リンパ腫；および／または
−血液の癌またはリンパ球の白血病のためのものである、請求項１〜８のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項１０】
前記体外循環式光化学療法による治療が、さらに、
−移植片対宿主病、
○例えば骨髄移植後のｃＧＶＨＤ、皮膚／粘膜が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、肝臓が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、胃腸管／肺が関与する急性または慢性の移植片対宿主病；および／または
−移植拒絶、
○例えば固体臓器移植、例えば、肺、腎臓または肝臓の移植、心臓移植、心臓移植拒絶の予防、
−臓器同種移植拒絶、例えば、心臓、肺または腎臓の同種移植拒絶、気管支閉塞性症候群（ＢＯＳ）および／または
−多発性硬化症、全身性硬化症、全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、全身性肺エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、若年発症糖尿病、Ｉ型糖尿病のためのものである、請求項１〜８のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項１１】
さらされる前記患者の血液の一部は、単離された白血球細胞、または白血球を豊富に含む血液、または白血球を豊富に含むバフィーコートから選択され、好ましくは、末梢血単核細胞要素全体の０％〜１０％および／または５％〜２５％のヘマトクリット値を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項１２】
前記治療は、１週間に１日または連続した２日から、４週間あたり１日または連続した２日まで、または２週間ごとに連続した２日の間隔で行われ；および／または
前記治療は、１〜１２ヶ月間、２〜６ヶ月間、または３ヶ月間の期間にわたって行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項１３】
体外循環式光化学療法による治療は、
（ａ）前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物が投与された患者を選択する（前記患者に前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物を、場合により、全身的に、例えば経口または静脈から、投与する）工程；および／または
（ｂ）前記患者の血液を体外で集め、場合により、抗凝血剤と混合する工程；および／または
（ｃ）前記患者の血液中の単核細胞要素のいずれかを濃縮し、例えば、白血球細胞を濃縮し、前記単核細胞要素のいずれかおよび残りの部分を場合により遠心分離によって濃縮した患者の血液の一部を作成する工程；および／または
（ｄ）場合により、患者の血液の前記残りの部分を再び注入する工程；および／または
（ｅ）前記患者の血液またはその一部と、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物とを接触させる工程；および／または
（ｆ）前記患者の血液またはその一部を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物と共にインキュベートする工程；および／または
（ｇ）前記患者の血液またはその一部を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光または１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらす工程；および／または
（ｈ）前記処理された患者の血液または前記処理されたその一部を再び注入する工程を含むか、これらからなり、
好ましくは、体外循環式光化学療法による治療は、工程（ｂ）〜（ｈ）、（ａ）〜（ｄ）および（ｇ）〜（ｈ）、または工程（ｂ）〜（ｅ）および（ｇ）〜（ｈ）を含むか、これらの工程からなり、
さらに好ましくは、これに加え、工程（ｂ）〜（ｈ）、工程（ａ）〜（ｄ）および（ｇ）〜（ｈ）、または工程（ｂ）〜（ｅ）および（ｇ）〜（ｈ）が、この体外循環式光化学療法による治療において、順序通りに行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項１４】
−使用される化合物は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキサアミノレブリネート；ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）であり、
○好ましくは、前記患者の血液またはその一部中、０．１〜１０ｍＭ、または０．５〜５ｍＭ、または１ｍＭの濃度、または体重１ｋｇあたり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、または０．７５〜２ｍｇ／ｋｇの濃度であり、
−血清が存在しない状態、または５〜２０％、または１０％の血清が存在する状態で；および／または
−前記患者の血液またはその一部と、前記ＡＬＡまたはＨＡＬまたはこれらの塩とを接触させてから、前記波長の光にさらすまでの時間は、３０分〜１２０分、４５分〜７５分、または１時間の両端を含む時間であり；および／または
−前記光の波長は、３１５ｎｍ〜１０００ｎｍ、または３１５〜８５０ｎｍ、好ましくは、３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ、３８０〜４５０ｎｍ、または３１５〜４５０ｎｍであり、両端を含み；
−前記光は、線量が０．０１〜２０Ｊ／ｃｍ２であり、両端を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物。
【請求項１５】
体外循環式光化学療法による治療に使用するための５−アミノレブリン酸またはそのエステル、またはこの酸またはエステルの塩であるＡＬＡ化合物であって、前記５−アミノレブリン酸、前記エステルまたは前記塩と接触させた患者の血液またはその一部を、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらすことによるものであり、前記ＡＬＡ化合物を、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）のようなソラレンと組み合わせて使用する、ＡＬＡ化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外循環式光化学療法（ＥＣＰ）による治療における、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体の使用であって、前記ポルフィリン誘導体を含有する患者の血液またはその一部は、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光にさらされる使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外循環式光化学療法（ＥＣＰ）は、アフェレシスおよび光線力学的療法（ＰＤＴ）の一形態であり、全血から白血球（白血球細胞）が分離され、光増感剤としての光活性８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）および紫外線Ａ（ＵＶ−Ａ）光にさらされた後、患者の循環血に再び入れられる。ＥＣＰは、２０数年より前から、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の治療のために承認されている［１］。ＣＴＣＬは、非ホジキンリンパ腫の異質の群をあらわし、一方、ＧＶＨＤは、幹細胞または骨髄の移植後に起こり得る合併症であり、免疫細胞が、移植レシピエントの身体を攻撃する。
【０００３】
これに加え、ｃＧｖＨＤ、移植された臓器の拒絶、特定の自己免疫障害を含め、多くのＴ細胞が介在する疾患が、ＥＣＰの適切な適応症として探求されている。今日、Ｔｈｅｒａｋｏｓ，Ｉｎｃ．によってこの治療法のために設計されたデバイスであるＴｈｅｒａｋｏｓ  Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍが、米国および欧州の１５０を超える大学の医療センターで使用されており、今までに２５０，０００より多い症例が治療されている。
【０００４】
簡単に言うと、ＥＣＰの基本的な手順は、患者の腕に静脈ラインを挿入することから始まる。次いで、約５００ｍＬの血液（全血の１０％〜１５％）を抜き取り、Ｔｈｅｒａｋｏｓ  Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍの中の抗凝血剤と共に集める。白血球細胞（主にリンパ球）を、何サイクルも遠心分離処理することによって分離する。次いで、白血球を豊富に含む分画を、光増感剤としての８−ＭＯＰ滅菌溶液で処理し、ＵＶＡを照射し、その後、処理した白血球を患者に戻す。赤血球細胞と血漿は、各サイクルの間に患者に戻される［２、３］。
【０００５】
ＣＴＣＬにおいて、８−ＭＯＰは、分離した白血球の中のＤＮＡに共有結合し、細胞周期を止め、アポトーシスを引き起こすと考えられる。しかし、ＰＵＶＡ条件下でソラレンを使用する（ソラレンとＵＶ−Ａの併用）治療の後に、皮膚悪性腫瘍が進行するリスクが示唆されている［４］。８−ＭＯＰは、新生物細胞のＤＮＡだけではなく、正常細胞のＤＮＡにも結合するため、発癌の潜在的なリスクを高める。さらに、８−ＭＯＰは、ＵＶ−Ａ光にさらされた後、腫瘍細胞と通常細胞に対し、選択性なく細胞死を誘発する。これに加え、光増感剤としての光活性８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）に対するＵＶ−Ａ光の排他的な使用は、特定の条件下で、ＵＶ光の使用によって引き起こされる健康上のリスクに起因して、潜在的に不都合な場合もある。
【０００６】
従って、本発明の基本的な意図は、この状況を改善し、ＥＣＰにおいて使用するための８−ＭＯＰの１つ以上の代替物質を見つけることであった。
【０００７】
本発明は、ＥＣＰに従来から使用されている化合物を、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体に置き換えることができるという知見に基づく。従って、ヘキサアミノレブリネート（ＨＡＬ）によって誘発されるプロトポルフィリンＩＸ（強力な光増感剤）が、細胞核の外側に局在化し、ＨＡＬが介在する光線力学的療法によって、活性化／変換されたリンパ球が選択的に破壊され、この療法が、全身的な抗腫瘍免疫を誘発することがわかった。これに加え、従来の８−ＭＯＰ療法は、ＵＶ−Ａのみを使用し、アポトーシスのみを誘発するのに対し、ＨＡＬが介在する光線力学的療法において、ＵＶ−Ａと「青色の」（可視）光を使用し、アポトーシスおよび壊死の両方を誘発することができる。最後に、ＵＶ−Ａ光を用い、ＨＡＬが介在する光線力学的プロセスは、明らかに、８−ＭＯＰよりも効率的にＧｖＨＤ患者およびＣＴＬＣ患者からのリンパ球を殺す。従って、ＥＣＰにおいて、８−ＭＯＰを、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体に置き換えることができ、そのため、ＨＡＬ（プロトポルフィリンＩＸの合成を誘発する）に置き換えることもできる。
【発明の概要】
【０００８】
要するに、本発明は、ＥＣＰに従来から使用されている化合物を、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体に置き換えることができるという知見に基づく。これらの光によって活性化可能なポルフィリン誘導体は、その合成が５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはヘキサアミノレブリネート（ＨＡＬのような）そのエステルによって誘発されるポルフィリンまたはプロトポルフィリンも含み、これらの化合物は、ヘキサアミノレブリネートによって誘発されるプロトポルフィリンＩＸを含むポルフィリン誘導体に組み込まれる。
【０００９】
従って、本発明は、体外循環式光化学療法（ＥＣＰ）による治療における光によって活性化可能なポルフィリン誘導体の使用であって、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を含有する患者の血液またはその一部が、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光にさらされる使用に関する。この化合物を活性化させる光の波長は、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長から選択され、３１５ｎｍ〜６３０ｎｍ、３１５〜４９５ｎｍ、または３１５ｎｍ〜４５０ｎｍ、または３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ（ＵＶ−Ａ）または３８０〜４５０ｎｍ（「青色の光」）の範囲および両端を含む波長から選択される。
【００１０】
前記ポルフィリン誘導体は、ベンゾポルフィリン誘導体モノ酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ；Ｖｙｓｕｄｙｎｅ(登録商標)、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ(登録商標)）、テトラ（メタヒドロキシフェニル）クロリン（ｍＴＨＰＣ；Ｆｏｓｃａｎ(登録商標)）、ポルフィマーナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ(登録商標)）、クロリンｅ６、Ｐｄ−バクテリオフェオホルビド（Ｔｏｏｋａｄ(登録商標)）、または２−（１−ヘキシルオキシエチル）−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ；Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ(登録商標)）のような、天然に存在しない既知のポルフィリン誘導体から選択されてもよい。
【００１１】
これに加え、上述のように、前記ポルフィリン誘導体は、プロトポルフィリンＩＸのような、ＡＬＡ化合物（５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、またはヘキサアミノレブリネートのようなそのエステル）から誘導されるポルフィリン誘導体、またはヘキサアミノレブリネートによって誘発されるプロトポルフィリン−ＩＸのようなＡＬＡ化合物によって誘発されるプロトポルフィリン／ポルフィリンから選択されてもよい。
【００１２】
従って、本発明は、副次的な態様において、体外循環式光化学療法による治療におけるＡＬＡ化合物（５−アミノレブリン酸またはそのエステル、またはこの酸またはエステルの塩）の使用であって、前記５−アミノレブリン酸、前記エステルまたは前記塩（前記ＡＬＡ化合物）と接触させた患者の血液またはその一部を、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらすことによる使用に関するものであると考えることもできる。この化合物を活性化させる光の波長は、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長から選択され、３１５ｎｍ〜６３０ｎｍ、３１５〜４９５ｎｍ、または３１５ｎｍ〜４５０ｎｍ、または３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ（ＵＶ−Ａ）または３８０〜４５０ｎｍ（「青色の光」）の範囲および両端を含む波長から選択される。ＡＬＡ化合物は、最も多くは、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはその塩、およびＡＬＡ−メチルエステル（メチル−アミノレブリネート）であるか、または、特に、ＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキサアミノレブリネート；ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）またはこれらの塩である。
【００１３】
前記体外循環式光化学療法（ＥＣＰ）による治療は、大部分が、癌、リンパ球が介在する悪性および非悪性の障害、Ｔ細胞が介在する疾患、自己免疫疾患および／または感染の治療を目的とするか、または、悪性腫瘍および免疫疾患に対する免疫応答を刺激および／または調整することを目的とする。これは、特に、皮膚Ｔ細胞リンパ腫または紅皮症の皮膚のＴ細胞リンパ腫のようなリンパ腫を含む。
【００１４】
当該技術分野で知られている従来のＥＣＰ治療と同じく、本発明のＥＣＰ治療のほとんどの場合においても、患者から血液が抜き取られ、集められる。白血球細胞（主にリンパ球）は、何サイクルも遠心分離処理することによって分離される。前記ポルフィリン誘導体を含有し、白血球を豊富に含む分画（この場合には、患者の血液の一部）に光が照射され、その後、処理された白血球（処理された患者の血液の一部）が患者に戻される。赤血球細胞と血漿（患者の血液の残りの部分）は、各サイクルの間に患者に戻される。本発明の非常によくある使用において、その後、前記患者の血液の一部（例えば、白血球を豊富に含む分画）が、前記ポルフィリン誘導体または前記ＡＬＡ化合物で処理される（その後、誘発されるポルフィリン誘導体の合成が終了するように３０〜１２０分間インキュベートする）。前記ポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物を患者に全身的に（経口または静脈から）あらかじめ適用しておくことも可能である。全身投与の後、ＥＣＰ手法を使用する本明細書で請求される本発明の代替的な使用において、患者の身体が光にさらされてもよい（例えば、ＡＬＡ投与後に皮膚に照射）。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１（実施例１を参照）：（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＨＡＬ誘発性ＰｐＩＸのスペクトル。（Ｂ）ＵＶ−Ａランプによって発せられた光のスペクトル。
【図２】図２（実施例１を参照）：ＨＡＬを用いたＪｕｒｋａｔ細胞の光力学的不活性化を示す図。
【図３】図３（実施例１を参照）：８−ＭＯＰを用いたＪｕｒｋａｔ細胞の光不活性化を示す図。
【図４】図４（実施例１を参照）：ＵＶ−Ａ光源に対する、８−ＭＯＰによるＪｕｒｋａｔ細胞の光不活性化の依存性を示す図。
【図５】図５（実施例１を参照）：ＨＡＬと、８−ＭＯＰおよびＵＶ−Ａ光による照射との組み合わせを用いることによる、Ｊｕｒｋａｔ細胞の光不活性化を示す図。
【図６】図６（実施例１を参照）：暗状態での毒性（コントロールとの比較）を示す図。
【図７】図７（実施例１を参照）：細胞生存アッセイを示す図。
【図８】図８（実施例１を参照）：異なる処理の後のＪｕｒｋａｔ細胞の蛍光画像を示す図。
【図９】図９（実施例２を参照）：ＣＤ４＋  Ｔリンパ球に対する５−ＡＬＡの影響を示す図。
【図１０】図１０（実施例２を参照）：ＣＤ８＋  Ｔリンパ球に対する５−ＡＬＡの影響を示す図。
【図１１】図１１（実施例３を参照）：ＨＡＬを用いたヒトＴ細胞リンパ腫細胞株の光力学的不活性化を示す図。
【図１２】図１２（実施例３を参照）：８−ＭＯＰを用いたヒトＴ細胞リンパ腫細胞株の光力学的不活性化を示す図。
【図１３】図１３（実施例４を参照）：同じ治療された患者の血液サンプルから分析された異なる分画のヒト白血球に対する５−ＡＬＡの暗状態での毒性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
従って、本発明は、最も広い態様において、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を含有する患者の血液またはその一部が、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光にさらされることによる、体外循環式光化学療法による治療に使用するための光によって活性化可能なポルフィリン誘導体に関する。
【００１７】
本発明のこの広い態様の別の実施形態において、本発明は、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を含有する患者の血液またはその一部が、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光にさらされることによる、体外循環式光化学療法によって患者を治療するための医薬の製造における光によって活性化可能なポルフィリン誘導体の使用にも関する。
【００１８】
従って、本発明は、最も広い態様において、治療を必要とする患者の治療方法も包含し、この方法は、
（ａ）光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を、治療を必要とする患者の血液（またはその一部）に投与することと、
（ｂ）工程（ａ）の前記患者の血液（またはその一部）を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光で処理することと、
（ｃ）工程（ｂ）からの前記患者の血液（またはその一部）の少なくとも一部を前記患者に投与することとを含む。
【００１９】
本発明のこの最も広い態様の好ましいことが多い実施形態において、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長は、１００ｎｍ〜１０００ｎｍであり、両端を含む。
【００２０】
本発明は、体外循環式光化学療法による治療に使用するための５−アミノレブリン酸またはそのエステル、またはこの酸またはエステルの塩であるＡＬＡ化合物であって、前記５−アミノレブリン酸、前記エステルまたは前記塩（前記ＡＬＡ化合物）と接触させた患者の血液またはその一部を、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらすことによるＡＬＡ化合物にも関する。
【００２１】
一実施形態において、但し、体外循環式光化学療法による治療は、病原体の不活性化のためのものではなく、特に、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎、または「血液で不安定な産物（ｐｒｏｄｕｉｔｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｌａｂｉｌｅ）」（ＰＳＬ）によって作られる細菌のようなウイルスまたは細菌から選択される病原体の不活性化のためのものではない。
【００２２】
一実施形態において、但し、体外循環式光化学療法による治療は、輸血、特に、化学療法または外科的介入の後の輸血または血小板減少症のための血液の血小板濃縮物の処理のためのものではない。
【００２３】
従って、ＡＬＡ化合物のこの使用の別の実施形態において、本発明は、ＡＬＡ化合物と接触させた患者の血液またはその一部を、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらすことによる、体外循環式光化学療法によって患者を治療するための医薬の製造におけるＡＬＡ化合物の使用にも関する。
【００２４】
従って、本発明は、このようなＡＬＡ化合物の使用に関し、治療を必要とする患者の治療方法も包含し、この方法は、
（ａ）ＡＬＡ化合物を、治療を必要とする患者の血液（またはその一部）に投与することと、
（ｂ）工程（ａ）の前記患者の血液（またはその一部）を、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光で処理することと、
（ｃ）工程（ｂ）からの前記患者の血液（またはその一部）の少なくとも一部を前記患者に投与することとを含む。
【００２５】
本発明は、体外循環式光化学療法による治療に使用するための５−アミノレブリン酸またはそのエステル、またはこの酸またはエステルの塩であるＡＬＡ化合物であって、５−アミノレブリン酸またはそのエステル、またはこの酸またはエステルの塩と接触させた患者の血液またはその一部を、３１５ｎｍ〜４５０ｎｍの両端を含む波長の光にさらすことによるものであり、
前記体外循環式光化学療法による治療は、癌、リンパ球が介在する悪性および非悪性の障害、Ｔ細胞が介在する疾患、自己免疫疾患の治療のためであるか、または悪性腫瘍および免疫疾患に対する免疫応答を調整するためのものである、ＡＬＡ化合物にも関する。
【００２６】
本発明のＡＬＡ化合物のこの使用の好ましいことが多い実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＡ化合物は、式Ｉの化合物
Ｒ２’Ｒ２Ｎ−ＣＨ２ＣＯＣＨ２−ＣＨ２ＣＯ−ＯＲ１
（Ｉ）
であり、
Ｒ１は、場合により、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、スルホ基、アミノ基、アリール基、オキソ基またはハロゲン基によって置換され、場合により、酸素原子、窒素原子、硫黄原子またはリン原子によって中断された、アルキル基をあらわしてもよく；
Ｒ２およびＲ２’は、互いに独立して、水素原子をあらわすか、または場合により、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アミノ基、アリール基、オキソ基またはハロゲン基によって置換され、場合により、酸素原子、窒素原子、硫黄原子またはリン原子によって中断された、アルキル基をあらわす。
【００２７】
好ましい実施形態において、上に定義されるように場合により置換されるアルキルは、Ｃ１−１２−アルキル、Ｃ１−１０−アルキル、Ｃ１−８−アルキルまたはＣ１−６−アルキルから選択され、従って、場合により置換されたメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシルであってもよい。
【００２８】
別の潜在的に関連する好ましい実施形態において、置換基は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、＝Ｏ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ４、−ＯＣ３Ｈ７、−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ５、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ベンジルまたはフェニルから選択されてもよく、最も好ましくは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、＝Ｏ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ４、−ＯＣ３Ｈ７、−ＯＣ４Ｈ９または−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３から選択されてもよい。
【００２９】
本発明のＡＬＡ化合物のこの使用の好ましいことが多い実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＡ化合物は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはＡＬＡ−メチルエステル、ＡＬＡ−エチルエステル、ＡＬＡ−プロピルエステル、ＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）、ＡＬＡ−ヘプチルエステル、ＡＬＡ−オクチルエステルまたはこれらの塩から選択され、好ましくは、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ＡＬＡ−メチルエステル（メチル−アミノレブリネート）またはＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキサアミノレブリネート；ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）であり、さらに好ましくは、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキサアミノレブリネート；ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）である。
【００３０】
本発明のＡＬＡ化合物のこの使用の好ましいことが多い実施形態において、前記患者の血液またはその一部と、前記５−アミノレブリン酸、エステルまたは塩とを接触させてから、前記波長の光にさらすまでの時間は、５分〜４８０分の両端を含む時間であり、好ましくは、１５分〜２４０分の両端を含む時間であり、さらに好ましくは、３０分〜１２０分の両端を含む時間であり、最も好ましくは、４５分〜７５分の両端を含む時間である。
【００３１】
本発明は、体外循環式光化学療法による治療に使用するための光によって活性化可能なポルフィリン誘導体であって、光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を含有する患者の血液またはその一部が、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光にさらされることによるものであり、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長は、３１５ｎｍ〜４５０ｎｍであり、両端を含み、前記ポルフィリン誘導体は、ＡＬＡ化合物（上述のもの）から誘導されるポルフィリン誘導体から選択され、好ましくは、プロトポルフィリンＩＸ、ＡＬＡ誘発性プロトポルフィリンＩＸまたはヘキサアミノレブリネート誘発性プロトポルフィリンＩＸであり、前記体外循環式光化学療法による治療は、癌、リンパ球が介在する悪性および非悪性の障害、Ｔ細胞が介在する疾患、自己免疫疾患の治療のためであるか、または悪性腫瘍および免疫疾患に対する免疫応答を調整するためのものである、活性化可能なポルフィリン誘導体にも関する。
【００３２】
本発明の最も広い態様の好ましいことが多い実施形態において、本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体（前記ポルフィリン誘導体）は、上に記載され、本発明に従って使用されるＡＬＡ化合物から誘導されるポルフィリン誘導体から選択され、好ましくは、プロトポルフィリンＩＸ、上述のＡＬＡ化合物によって誘発されるプロトポルフィリン／ポルフィリン、またはヘキサアミノレブリネート誘発性プロトポルフィリンＩＸである。
【００３３】
例えば５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはそのヘキシルエステル（ＨＡＬ）であるポルフィリン前駆体であるこれらのＡＬＡ化合物の生物学的基本は、［５〜８］中に見出すことができる。細胞内で、ＡＬＡは、ヘム生合成経路の開始時にグリシンとスクシニルＣｏＡから作られる。この経路の最後の段階で、中間体生成物であるプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に鉄が組み込まれ、ヘムが生成する。ＰｐＩＸは、強力な光増感剤であり、外因性ＡＬＡを投与した後に、細胞中に蓄積するだろう［５、６］。局所的に適用されたＡＬＡは、一般に、表在性の皮膚悪性腫瘍のＰＤＴで使用され、望ましい治療結果が得られる［５、６］。ＡＬＡは、親水性の特徴を有するため、細胞膜を通って浸透しやすくするために、ＨＡＬを含む親油性を高くしたＡＬＡエステルが開発されている［９、１０］。
【００３４】
本発明の最も広い態様の好ましいことが多い実施形態において、本発明に従って使用される前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体は、光増感剤である。
【００３５】
本発明の最も広い態様の好ましいことが多い実施形態において、本発明に従って使用される前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体は、天然に存在しないポルフィリン誘導体から選択され、好ましくは、以下から選択される。
【００３６】
−ベンゾポルフィリン誘導体モノ酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ；Ｖｙｓｕｄｙｎｅ(登録商標)、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ(登録商標)）、
−テトラ（メタヒドロキシフェニル）クロリン（ｍＴＨＰＣ；Ｆｏｓｃａｎ(登録商標)）、
−ポルフィマーナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ(登録商標)）、
−スズエチルエチオプルプリン（ＳｎＥＴ２；Ｐｕｒｌｙｔｉｎ(登録商標)）、
−Ｐｃ４、
−ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）、
−２−（１−ヘキシルオキシエチル）−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ；Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ）、
−モノ−Ｎ−アスパルチルクロリンｅ６（ＮＰｅ６、Ｔａｌｐｏｒｆｉｎ(登録商標)）、
−ポリビニルピロリドンと接合したクロリンｅ６（Ｆｏｔｏｌｏｎ(登録商標)）、
−Ｐｄ−バクテリオフェオホルビド（Ｔｏｏｋａｄ(登録商標)）、
−ルテチウム−テキサフィリン（Ｌｕ−ｔｅｘ；Ｌｕｔｒｉｎ(登録商標)）、
−ホウ酸化ポルフィリン（ＢＯＰＰ）、
−ヒペリシン（ＶＩＭＲｘｙｎ）、
−スルホン酸化アルミニウムフタロシアニン（ＡＩＰｃＳ；Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｅ(登録商標)）、
−ポルフィセン（ＡＴＭＰｎ）、または
−ジブロモローダミン誘導体（ＴＨ９４０２）。
【００３７】
本発明の最も広い態様の別の好ましい実施形態において、天然に存在しないポルフィリン誘導体から選択される本発明に従って使用される前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体は、好ましくは、以下から選択される。
【００３８】
−ベンゾポルフィリン誘導体モノ酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ；Ｖｙｓｕｄｙｎｅ(登録商標)、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ(登録商標)）、
−テトラ（メタヒドロキシフェニル）クロリン（ｍＴＨＰＣ；Ｆｏｓｃａｎ(登録商標)）、
−ポルフィマーナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ(登録商標)）、
−クロリンｅ６、
−Ｐｄ−バクテリオフェオホルビド（Ｔｏｏｋａｄ(登録商標)）、または
−２−（１−ヘキシルオキシエチル）−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ；Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ）。
【００３９】
「光によって活性化可能な」は、本発明によれば、ある化合物が、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光によって活性化される能力であると定義される。このことは、光によって活性化可能な化合物が、この波長で強い吸収帯を有する高度に共役した系であると理解すべきである。
【００４０】
「光によって活性化可能なポルフィリン誘導体」は、本発明によれば、光によって活性化可能な化合物が、ポルフィリンに構造的に関連することであると定義される。従って、この誘導体は、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光によって活性化される能力を有し、この波長で強い吸収帯を有する高度に共役した系である。ほとんどの場合に、この誘導体は、以下に定義するような光増感剤である。定義によれば、最も多くは、構造内にポルフィリン環系を有する化合物であるか、またはプロトポルフィリンであってもよい。例えば、プロトポルフィリンＩＸであってもよい。以下に定義する光増感剤以外に、上述のＡＬＡ化合物によって誘発されるプロトポルフィリン／ポルフィリン誘導体であってもよい。可能な例の１つは、ＡＬＡ誘発性プロトポルフィリンＩＸであり、合成中にその少なくとも一部であるＡＬＡ（５−アミノレブリン酸またはその塩）が、プロトポルフィリンの構造に組み込まれる（プロトポルフィリンの構造の一部になる）。別の可能な例は、ヘキサアミノレブリネート誘発性プロトポルフィリンＩＸであり、合成中にその少なくとも一部であるヘキサアミノレブリネートが、プロトポルフィリンの構造に組み込まれる（プロトポルフィリンの構造の一部になる）。
【００４１】
「光増感剤」は、本発明によれば、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光に感受性であり、この光によって活性化されてもよい化合物であると定義される。ほとんどの場合に、この光増感剤は、構造内にポルフィリン環を有するか、またはプロトポルフィリンである。好ましくは、光増感剤は、ベンゾポルフィリン誘導体モノ酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ；Ｖｙｓｕｄｙｎｅ(登録商標)、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ(登録商標)）、テトラ（メタヒドロキシフェニル）クロリン（ｍＴＨＰＣ；Ｆｏｓｃａｎ(登録商標)）、ポルフィマーナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ(登録商標)）、スズエチルエチオプルプリン（ＳｎＥＴ２；Ｐｕｒｌｙｔｉｎ(登録商標)）、Ｐｃ４、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）、２−（１−ヘキシルオキシエチル）−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ；Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ）、モノ−Ｎ−アスパルチルクロリンｅ６（ＮＰｅ６、Ｔａｌｐｏｒｆｉｎ(登録商標)）、ポリビニルピロリドンと接合したクロリンｅ６（Ｆｏｔｏｌｏｎ(登録商標)）、Ｐｄ−バクテリオフェオホルビド（Ｔｏｏｋａｄ(登録商標)）、ルテチウム−テキサフィリン（Ｌｕ−ｔｅｘ；Ｌｕｔｒｉｎ(登録商標)）、ホウ酸化ポルフィリン（ＢＯＰＰ）、ヒペリシン（ＶＩＭＲｘｙｎ）、スルホン酸化アルミニウムフタロシアニン（ＡＩＰｃＳ；Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｅ(登録商標)）、ポルフィセン（ＡＴＭＰｎ）、またはジブロモローダミン誘導体（ＴＨ９４０２）から選択される。最も好ましくは、光増感剤は、ベンゾポルフィリン誘導体モノ酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ；Ｖｙｓｕｄｙｎｅ(登録商標)、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ(登録商標)）、テトラ（メタヒドロキシフェニル）クロリン（ｍＴＨＰＣ；Ｆｏｓｃａｎ(登録商標)）、ポルフィマーナトリウム（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ(登録商標)）、クロリンｅ６、Ｐｄ−バクテリオフェオホルビド（Ｔｏｏｋａｄ(登録商標)）、または２−（１−ヘキシルオキシエチル）−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ；Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ(登録商標)）から選択される。
【００４２】
これらの構造を有するこのような光増感剤の例は、以下に見出すことができる。
【００４３】
【化１】
2017513952.tif 000003
誘発される（ｂｅｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄまたはｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ）ポルフィリン誘導体のような化合物は、本発明によれば、合成中に、誘発する化合物（例えば、ＡＬＡ化合物）の構造またはその少なくとも一部が組み込まれるプロトポルフィリンまたはポルフィリンのような化合物であると定義される。最も多くは、特に、律速段階における平衡が移動する局所的な増加／蓄積によって「誘発される化合物」の合成も誘発される／増加する。好ましい例の１つは、ＡＬＡ（５−アミノレブリン酸）またはその塩によって誘発されるプロトポルフィリンＩＸのようなプロトポルフィリンであり、ＡＬＡの一部も、プロトポルフィリンの構造に組み込まれ、局所的に過剰なＡＬＡによってプロトポルフィリンの蓄積が起こる。別の好ましい例は、ＨＡＬ（ヘキサアミノレブリネート）によって誘発されるプロトポルフィリンＩＸであり、ＨＡＬの一部も、プロトポルフィリンの構造に組み込まれ、局所的に過剰なＨＡＬによってプロトポルフィリンの蓄積が起こる。
【００４４】
「ＡＬＡ化合物」は、本発明によれば、５−アミノレブリン酸またはそのエステル、またはこの酸またはエステルの塩であると定義され、構造Ｒ２’Ｒ２Ｎ−ＣＨ２ＣＯＣＨ２−ＣＨ２ＣＯ−ＯＲ１の化合物を含む。好ましい例は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ＡＬＡ−メチルエステル（メチル−アミノレブリネート）またはＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキサアミノレブリネート；ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）である。ＡＬＡは、ヘム合成の第１工程で、スクシニルＣｏＡとグリシンから作られる。鉄付加酵素（金属を付加する酵素）の作用がヘム合成の律速段階であるため、ＡＬＡが増加（従って、全ＡＬＡ化合物が増加）すると、プロトポルフィリンＩＸの局所的な蓄積が起こる。従って、過剰なＡＬＡ（および全ＡＬＡ化合物）によって、非常に強力な光増感剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ／「Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ」）の蓄積が起こる。これは、例えば、ＡＬＡによって「誘発される」プロトポルフィリンＩＸ（ＡＬＡ誘発性プロトポルフィリンまたはＡＬＡ誘発性プロトポルフィリンＩＸ）と理解されるべきである。原則として、ＡＬＡ化合物は、ポルフィリン前駆体である。本明細書でＡＬＡ化合物の一部として定義される５−アミノレブリン酸のエステルは、本明細書と共に参照されるＷＯ９６／０２８４１２  Ａ１号に詳細に記載される。
【００４５】
「体外循環式光化学療法」（「ＥＣＰ」と省略される）は、本発明によれば、アフェレシスおよび光線力学的療法（ＰＤＴ）の一形態であると定義される。患者の血液、または、ほとんどの場合には、全血から（例えば、遠心分離によって）分離された白血球（白血球細胞）は、光活性化合物または光活性化合物を誘発する化合物（光活性化合物の一部を生成し、その合成を誘発する化合物。上を参照）にさらされる。次いで、血液またはその一部（例えば、白血球を豊富に含む分画）は、光活性化合物を活性化させる波長の光にさらされる。次いで、処理された血液（またはその一部）が、患者に戻され、投与される。
【００４６】
「体外循環式光化学療法による治療」は、本発明によれば、「体外循環式光化学療法」による疾患の治療であると定義される。例としては、癌の治療、リンパ球が介在する悪性および非悪性の障害の治療、Ｔ細胞が介在する疾患の治療、自己免疫疾患の治療または感染の治療が挙げられる。「体外循環式光化学療法による治療」は、悪性腫瘍および免疫疾患に対する免疫応答を刺激または調整することも目的とする場合がある。最も顕著な例としては、皮膚Ｔ細胞リンパ腫または紅皮症の皮膚のＴ細胞リンパ腫のようなリンパ腫、または皮膚癌が挙げられる。
【００４７】
「〜をさらす」は、本発明によれば、ある物質（例えば、患者の血液またはその一部）を特定の物理的な影響（例えば、特定の波長の光による照射）にさらすことであると定義される。
【００４８】
「患者の血液の一部」は、本発明によれば、患者の血液の単核／血球要素、またはこれらの単核／血球要素を豊富に含む患者の血液であると定義される。従って、この用語は、単離された白血球細胞、または白血球を豊富に含む血液、または白血球を豊富に含むバフィーコートを包含する。これらは、末梢血単核細胞要素全体の０％〜１０％、または２．５％〜７％のヘマトクリット値を有していてもよく、または５％〜２５％、または１０％〜３０％のヘマトクリット値を有していてもよい。患者の血液の一部は、例えば、遠心分離または濾過によって、血液中の上述の単核／血球要素を濃縮することによって作られてもよい。患者の血液中の上述の単核／血球要素を濃縮した後に残る部分は、「患者の血液の残りの部分」と呼ばれ、例えば、赤血球細胞（赤血球）および血漿を含むか、またはこれらからなる。
【００４９】
「前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる光の波長」は、本発明によれば、１００ｎｍ〜１０００ｎｍ（両端を含む）の波長の光であると定義される。光によって活性化可能なポルフィリン誘導体は、強い吸収帯を有する高度に共役した系であるため、この吸収帯は、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長を規定する。
【００５０】
「前記ＡＬＡ化合物と接触させる」は、本発明によれば、このＡＬＡ化合物を患者の血液またはその一部に適用することによって、患者の血液またはその一部をＡＬＡ化合物で処理することであると定義される。このことは、血液が患者の身体の外にあるときに最も多く行われる（例えば、混合または溶解によって）が、原則として、身体の内部で血液とＡＬＡ化合物が接触するように、ＡＬＡ化合物が患者に全身的に（例えば、静脈から、または経口で）与えられる場合にも適用される。
【００５１】
以下に、本発明に従って使用される、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を用いる本発明の最も広い態様またはＡＬＡ化合物の関連する態様の好ましいことが多い実施形態を記載する。これらの（好ましいことが多い）実施形態を、本発明のこれら両者の関連する態様に適用することができるという事実は、「本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において」によって示される。これらの実施形態が、処理態様のそれぞれの方法および医薬の製造における使用にも適用されることも理解すべきである。
【００５２】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、前記ポルフィリン誘導体または前記ＡＬＡ化合物を、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）のようなソラレンと組み合わせて使用する。
【００５３】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、化合物を活性化させる光の波長は、１００ｎｍ〜９００ｎｍ、１００ｎｍ〜６３０ｎｍ、１００ｎｍ〜４９５ｎｍ、３１５ｎｍ〜６３０ｎｍ、３１５〜４９５ｎｍ、３１５ｎｍ〜４５０ｎｍの両端を含む波長から選択され、好ましくは、３１５ｎｍ〜４９５ｎｍ、３１５〜４５０ｎｍ、３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ、３８０〜４９５ｎｍ、または３８０〜４５０ｎｍの両端を含む波長から選択され、さらに好ましくは、３１５ｎｍ〜４５０ｎｍ、または３８０ｎｍ〜４５０ｎｍの両端を含む波長から選択される。
【００５４】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、化合物を活性化させる光の波長は、３８０〜４５０ｎｍの両端を含む波長から選択される。
【００５５】
以下の範囲の波長の光（両端を含む）。
【００５６】
−３１５ｎｍ〜３８０ｎｍは、ＵＶ−Ａ光であり、
−３８０〜４９５ｎｍは、紫色から青色を含む可視光であり、
−３１５ｎｍ〜４５０ｎｍは、ＵＶ−Ａと可視光の「青色の光」であり、
−３８０ｎｍ〜４５０ｎｍは、可視光の「青色の光」である。
【００５７】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の他の実施形態は、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を含有する患者の血液またはその一部、またはＡＬＡ化合物と接触させた患者の血液またはその一部が、前記特定の波長の光にさらされる時間に関する。この時間は、わずか数秒から、１時間より長く、または２時間以上までの非常に広い範囲でさまざまであってもよい。ある場合（例えば、血液またはその一部がＵＶ−Ａ光にさらされる場合に適用し得る）には、さらされる時間は、１５分〜１２０分であろう。別の場合（例えば、血液またはその一部が「青色の光」にさらされる場合に適用し得る）には、さらされる時間は、５秒〜３０分であろう。
【００５８】
以下に、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体または前記ＡＬＡ化合物を本発明に従って使用する体外循環式治療を首尾良く適用し得る可能性を有する適応症のさまざまなリストが存在する。従って、これらのリストは、処理態様のそれぞれの方法の適応症および本発明に従って製造される医薬を使用するための適応症も包含する。
【００５９】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、前記体外循環式光化学療法による治療は、癌、リンパ球が介在する悪性および非悪性の障害、Ｔ細胞が介在する疾患、自己免疫疾患および／または感染の治療のためであるか、または悪性腫瘍および免疫疾患に対する免疫応答を刺激および／または調整するためのものであり、好ましくは、癌、リンパ球が介在する悪性および非悪性の障害、Ｔ細胞が介在する疾患、自己免疫疾患の治療のためであるか、または悪性腫瘍および免疫疾患に対する免疫応答を調整する（例えば、刺激するか、または阻害する）ためのものである。
【００６０】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、前記体外循環式光化学療法による治療は、癌の治療のためのものである。
【００６１】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、前記体外循環式光化学療法による治療は、以下の治療のためのものである。
【００６２】
−リンパ腫、好ましくは、Ｔ細胞リンパ腫、最も好ましくは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫または紅皮症の皮膚のＴ細胞リンパ腫；および／または
−血液の癌またはリンパ球の白血病；および／または
−移植片対宿主病、
○例えば骨髄移植後のｃＧＶＨＤ、皮膚／粘膜が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、肝臓が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、胃腸管／肺が関与する急性または慢性の移植片対宿主病；および／または
−移植拒絶、
○例えば固体臓器移植、例えば、肺、腎臓または肝臓の移植、心臓移植、心臓移植拒絶の予防、
−臓器同種移植拒絶、例えば、心臓、肺または腎臓の同種移植拒絶、気管支閉塞性症候群（ＢＯＳ）および／または
−多発性硬化症、全身性硬化症、全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、全身性肺エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、若年発症糖尿病、Ｉ型糖尿病；および／または
−炎症性大腸炎、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎；および／または
−膀胱の炎症性障害、例えば膀胱炎または間質性膀胱炎；および／または
−レトロウイルス感染、急性または慢性のウイルス感染、ＨＣＶ感染またはＣＭＶ感染、慢性Ｃ型肝炎感染以外の感染；および／または
−ＡＩＤＳに関連する合併症、ＨｌＶ感染疾患、ＡＩＤＳに関連するカポジ肉腫、頸部ＨＰＶ感染；および／または
−腎性全身性線維症および潰瘍性大腸炎、後天性表皮水疱症；および／または
−天疱瘡による尋常性乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、扁平苔癬。
【００６３】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、前記体外循環式光化学療法による治療は、以下の治療のためのものである。
【００６４】
−リンパ腫、好ましくは、Ｔ細胞リンパ腫、最も好ましくは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫または紅皮症の皮膚のＴ細胞リンパ腫；および／または
−血液の癌またはリンパ球の白血病；および／または
−移植片対宿主病、
○例えば骨髄移植後のｃＧＶＨＤ、皮膚／粘膜が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、肝臓が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、胃腸管／肺が関与する急性の移植片対宿主病；および／または
−移植拒絶、
○例えば固体臓器移植、例えば、肺、腎臓または肝臓の移植、心臓移植、心臓移植拒絶の予防、
−臓器同種移植拒絶、例えば、心臓、肺または腎臓の同種移植拒絶、気管支閉塞性症候群（ＢＯＳ）および／または
−全身性肺エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、若年発症糖尿病、Ｉ型糖尿病；および／または
−炎症性大腸炎、例えばクローン病または潰瘍性大腸炎；および／または
−膀胱の炎症性障害、例えば膀胱炎または間質性膀胱炎；および／または
−レトロウイルス感染、急性または慢性のウイルス感染、ＨＣＶ感染またはＣＭＶ感染以外の感染；および／または
−ＡＩＤＳに関連する合併症、ＨｌＶ感染疾患、ＡＩＤＳに関連するカポジ肉腫、頸部ＨＰＶ感染；および／または
−尋常性天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、扁平苔癬。
【００６５】
または、さらに好ましくは、以下の治療のためのものである。
【００６６】
−リンパ腫、好ましくは、Ｔ細胞リンパ腫、最も好ましくは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫または紅皮症の皮膚のＴ細胞リンパ腫；および／または
−血液の癌またはリンパ球の白血病、例えば、Ｂ細胞または慢性のリンパ球の白血病；および／または
−移植片対宿主病、
○例えば骨髄移植後のｃＧＶＨＤ、皮膚／粘膜が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、肝臓が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、胃腸管／肺が関与する急性の移植片対宿主病；および／または
−移植拒絶、
○例えば固体臓器移植、例えば、肺、腎臓または肝臓の移植、心臓移植、心臓移植拒絶の予防、
−臓器同種移植拒絶、例えば、心臓、肺または腎臓の同種移植拒絶、気管支閉塞性症候群（ＢＯＳ）および／または
−全身性肺エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、若年発症糖尿病、Ｉ型糖尿病；および／または
−ＡＩＤＳに関連する合併症、ＨｌＶ感染疾患、ＡＩＤＳに関連するカポジ肉腫、頸部ＨＰＶ感染；および／または
−天疱瘡による尋常性乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、扁平苔癬。
【００６７】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、前記体外循環式光化学療法による治療は、以下の治療のためのものである。
【００６８】
−リンパ腫、好ましくは、Ｔ細胞リンパ腫、最も好ましくは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫または紅皮症の皮膚のＴ細胞リンパ腫；および／または
−血液の癌またはリンパ球の白血病。
【００６９】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、前記体外循環式光化学療法による治療は、以下の治療のためのものである。
【００７０】
−移植片対宿主病、
○例えば骨髄移植後のｃＧＶＨＤ、皮膚／粘膜が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、肝臓が関与する慢性移植片対宿主病（ｃＧｖＨＤ）、胃腸管／肺が関与する急性または慢性の移植片対宿主病；および／または
−移植拒絶、
○例えば固体臓器移植、例えば、肺、腎臓または肝臓の移植、心臓移植、心臓移植拒絶の予防、
−臓器同種移植拒絶、例えば、心臓、肺または腎臓の同種移植拒絶、気管支閉塞性症候群（ＢＯＳ）。
【００７１】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、前記体外循環式光化学療法による治療は、以下の治療のためのものである。
【００７２】
−多発性硬化症、全身性硬化症、全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、全身性肺エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、若年発症糖尿病、Ｉ型糖尿病。
【００７３】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、さらされる上述の患者の血液の一部は、単離された白血球細胞、または白血球を豊富に含む血液、または白血球を豊富に含むバフィーコートから選択され、好ましくは、末梢血単核細胞要素全体の０％〜１０％（または場合により、２．５％〜７％）および／または５％〜２５％のヘマトクリット値を有する。原則として、これは、特に、血液（全血の５％〜２５％、５％〜２０％、または１０％〜１５％）が患者から抜き取られ（場合により、抗凝血剤と合わされる）場合に適用される。白血球細胞（主にリンパ球）を、何サイクルも遠心分離処理することによって分離する。この白血球を豊富に含む分画は、「上述の患者の血液の一部」に包含される最も好ましい実施形態である。
【００７４】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、上述の治療は、１週間に１日または連続した２日から、４週間あたり１日または連続した２日まで、または２週間ごとに連続した２日の間隔で行われ；および／または
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、上述の治療は、１〜１２ヶ月間、２〜６ヶ月間、または３ヶ月間の期間にわたって行われる。
【００７５】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、体外循環式光化学療法による治療は、以下の工程を含むか、または以下の工程からなる。
【００７６】
（ａ）前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物が投与された（場合により、全身的に、例えば経口または静脈から）患者を選択する工程；および／または
（ｂ）前記患者の血液を体外で集め、場合により、抗凝血剤と混合する工程；および／または
（ｃ）前記患者の血液中の単核細胞要素のいずれかを濃縮し、例えば、白血球細胞を濃縮し、前記単核細胞要素のいずれかおよび残りの部分を場合により遠心分離によって濃縮した患者の血液の一部を作成する工程；および／または
（ｄ）場合により、患者の血液の前記残りの部分を、好ましくはその後の任意の時間に再び注入する工程；および／または
（ｅ）前記患者の血液またはその一部と、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物とを接触させる工程；および／または
（ｆ）前記患者の血液またはその一部を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物と共にインキュベートする工程；および／または
（ｇ）前記患者の血液またはその一部を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光または１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらす工程；および／または
（ｈ）前記処理された患者の血液または前記処理されたその一部を再び注入する工程。
【００７７】
好ましくは、体外循環式光化学療法による治療は、工程（ｂ）〜（ｈ）、（ａ）〜（ｄ）および（ｇ）〜（ｈ）、または工程（ｂ）〜（ｅ）および（ｇ）〜（ｈ）を含むか、これらの工程からなり、
さらに好ましくは、これに加え、工程（ｂ）〜（ｈ）、工程（ａ）〜（ｄ）および（ｇ）〜（ｈ）、または工程（ｂ）〜（ｅ）および（ｇ）〜（ｈ）が、この体外循環式光化学療法による治療において、順序通りに行われる。
【００７８】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、体外循環式光化学療法による治療は、以下の工程を含むか、または以下の工程からなる。
【００７９】
（ｂ）前記患者の血液を体外で集め、場合により、抗凝血剤と混合する工程；および
（ｃ）前記患者の血液中の単核細胞要素のいずれかを濃縮し、例えば、白血球細胞を濃縮し、前記単核細胞要素のいずれかおよび残りの部分を場合により遠心分離によって濃縮した患者の血液の一部を作成する工程；および
（ｄ）患者の血液の前記残りの部分を、好ましくはその後の任意の時間に再び注入する工程；および
（ｅ）前記患者の血液またはその一部と、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物とを接触させる工程；および
（ｆ）前記患者の血液またはその一部を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物と共にインキュベートする工程；および
（ｇ）前記患者の血液またはその一部を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光または１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらす工程；および
（ｈ）前記処理された患者の血液または前記処理されたその一部を再び注入する工程。
【００８０】
この体外循環式光化学療法による治療において、これらの工程が順序通りに行われることが好ましい。
【００８１】
本発明に従って使用されるＡＬＡ化合物の一実施形態において、体外循環式光化学療法による治療は、以下の工程を含むか、または以下の工程からなる。
【００８２】
（ｂ）前記患者の血液を体外で集め、場合により、抗凝血剤と混合する工程；および
（ｃ）前記患者の血液中の単核細胞要素のいずれかを濃縮し、例えば、白血球細胞を濃縮し、前記単核細胞要素のいずれかおよび残りの部分を場合により遠心分離によって濃縮した患者の血液の一部を作成する工程；および
（ｄ）患者の血液の前記残りの部分を、好ましくはその後の任意の時間に再び注入する工程；および
（ｅ）前記患者の血液またはその一部と、ＡＬＡ化合物とを接触させる工程；および
（ｆ）前記患者の血液またはその一部を、ＡＬＡ化合物と共にインキュベートする工程；および
（ｇ）前記患者の血液またはその一部を、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらす工程；および
（ｈ）前記処理された患者の血液または前記処理されたその一部を再び注入する工程。
【００８３】
この体外循環式光化学療法による治療において、これらの工程が順序通りに行われることが好ましい。
【００８４】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体の一実施形態において、体外循環式光化学療法による治療は、以下の工程を含むか、または以下の工程からなる。
【００８５】
（ｂ）前記患者の血液を体外で集め、場合により、抗凝血剤と混合する工程；および
（ｃ）前記患者の血液中の単核細胞要素のいずれかを濃縮し、例えば、白血球細胞を濃縮し、前記単核細胞要素のいずれかおよび残りの部分を場合により遠心分離によって濃縮した患者の血液の一部を作成する工程；および
（ｄ）患者の血液の前記残りの部分を、好ましくはその後の任意の時間に再び注入する工程；および
（ｅ）前記患者の血液またはその一部と、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体とを接触させる工程；および
（ｇ）前記患者の血液またはその一部を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光にさらす工程；および
（ｈ）前記処理された患者の血液または前記処理されたその一部を再び注入する工程。
【００８６】
この体外循環式光化学療法による治療において、これらの工程が順序通りに行われることが好ましい。
【００８７】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、体外循環式光化学療法による治療は、以下の工程を含むか、または以下の工程からなる。
【００８８】
（ａ）前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物が投与された（場合により、全身的に、例えば経口または静脈から）患者を選択する工程；および
（ｂ）前記患者の血液を体外で集め、場合により、抗凝血剤と混合する工程；および
（ｃ）前記患者の血液中の単核細胞要素のいずれかを濃縮し、例えば、白血球細胞を濃縮し、前記単核細胞要素のいずれかおよび残りの部分を場合により遠心分離によって濃縮した患者の血液の一部を作成する工程；および
（ｄ）患者の血液の前記残りの部分を、好ましくはその後の任意の時間に再び注入する工程；および
（ｇ）前記患者の血液またはその一部を、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体を活性化させる波長の光または１００ｎｍ〜１０００ｎｍの両端を含む波長の光にさらす工程；および／または
（ｈ）前記処理された患者の血液または前記処理されたその一部を再び注入する工程。
【００８９】
この体外循環式光化学療法による治療において、これらの工程が順序通りに行われることが好ましい。
【００９０】
特に、本発明の前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体または前記ＡＬＡ化合物を使用する上述の治療方法に適した、これらのさらなる１つの実施形態において、体外循環式光化学療法による治療は、以下の工程を含む。
【００９１】
（ａ）前記患者に、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物を、場合により、全身的に、例えば経口または静脈から投与する工程。
【００９２】
本発明に従って使用される光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物の一実施形態において、
−使用される化合物は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはＡＬＡ−ヘキシルエステル（ヘキサアミノレブリネート；ヘキシル  ５−アミノ−４−オキソペンタノエート；ＨＡＬ）であり、
○好ましくは、前記患者の血液またはその一部中、０．１〜１０ｍＭ、または０．５〜５ｍＭ、または１ｍＭの濃度、または体重１ｋｇあたり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、または０．７５〜２ｍｇ／ｋｇの濃度であり、
−血清が存在しない状態、または５〜２０％、または１０％の血清が存在する状態で；および／または
−前記患者の血液またはその一部と、前記ＡＬＡまたはＨＡＬまたはこれらの塩とを接触させてから、前記波長の光にさらすまでの時間は、３０分〜１２０分、４５分〜７５分、または１時間の両端を含む時間であり；および／または
−前記光の波長は、３１５ｎｍ〜１０００ｎｍ、または３１５〜８５０ｎｍ、好ましくは、３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ、３８０〜４５０ｎｍ、または３１５〜４５０ｎｍであり、両端を含み；
−前記光は、線量が０．０１〜２０Ｊ／ｃｍ２であり、両端を含む。
【００９３】
本発明の別の態様は、前記光によって活性化可能なポルフィリン誘導体またはＡＬＡ化合物を含む容器と、指示リーフレットとを含む、体外循環式光化学療法または体外循環式光化学療法による治療に使用するためのキットを指す。好ましくは、この容器は、ＡＬＡまたはＨＡＬのような前記ＡＬＡ化合物を含む。容器は、抗凝血剤および／または８−ＭＯＰも含んでいてもよい。
【００９４】
本発明を、実施例を用いて以下に説明する。これらの説明は、単なる例として与えられており、本発明の一般的な精神を限定するものではない。
（実施例）
（概要（実施例１に関する））
背景：皮膚Ｔ細胞リンパ腫および移植片対宿主病を管理するために、単離された白血球細胞を８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）および紫外線Ａ（ＵＶ−Ａ）光にさらす体外循環式光化学療法を使用する。８−ＭＯＰは、腫瘍細胞および正常細胞の両方のＤＮＡに結合するため、正常細胞の発癌リスクを高め、その後に、ＵＶ−Ａは、腫瘍細胞および正常細胞の両方を選択性なく殺す。ヘキサアミノレブリネート（ＨＡＬ）誘発性プロトポルフィリンＩＸは、強力な光増感剤であり、細胞の核の外側の膜構造に局在化する。ＨＡＬが介在する光線力学的療法は、活性化／変換されたリンパ球を選択的に破壊し、全身的な抗腫瘍免疫を誘発する。この試験の目的は、８−ＭＯＰの代わりにＨＡＬを用い、ＵＶ−Ａ照射後に細胞を殺す可能性を調べることであった。
【００９５】
方法：ヒトＴ細胞リンパ腫のＪｕｒｋａｔ細胞株を使用し、細胞増殖および長期間生存アッセイを用い、８−ＭＯＰおよび／またはＨＡＬとＵＶ−Ａまたは青色の光の後の細胞の光不活性化を評価した。細胞死の態様も蛍光顕微鏡によって分析した。
【００９６】
結果：ＨＡＬ／ＵＶ−Ａ、ＨＡＬ／青色の光、８−ＭＯＰ／ＵＶ−ＡまたはＨＡＬ／８−ＭＯＰ／ＵＶ−Ａによって、細胞増殖が減少した。十分な線量では、全ての計画によって細胞が殺されたが、細胞死の態様は、処理条件に依存して変わった。８−ＭＯＰ／ＵＶ−Ａは、排他的にアポトーシスによる死を発生させ、一方、ＨＡＬ／ＵＶ−ＡまたはＨＡＬ／青色の光によって、アポトーシスと壊死の両方が誘発された。
【００９７】
結論：８−ＭＯＰをＨＡＬによって置き換え、ＵＶ−Ａ照射後のＪｕｒｋａｔ細胞をアポトーシスおよび壊死を介して不活性化させることができる。この知見は、循環式光化学療法の効能の改良に対して影響を与えるだろう。
【００９８】
省略語：ＡＬＡ  −  ５−アミノレブリン酸、ＣＴＣＬ  −  皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＥＣＰ  −  体外循環式光化学療法、ＦＢＳ  −  胎児ウシ血清、ＨＡＬ  −  ヘキサアミノレブリネート、ＧＶＨＤ  −  移植片対宿主病、ＭＯＰ  −  メトキシソラレン、ＭＴＳ  −  ４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、ＰＤＴ  −  光線力学的療法、ＰＩ  −  ヨウ化プロピジウム、ＰｐｌＸ  −  プロトポルフィリンＩＸ、ＰＵＶＡ  −  ソラレンと紫外線Ａ、ＵＶ  −  紫外線。
【００９９】
（序論）
ＥＣＰにＡＬＡまたはＨＡＬを使用する主な利点は、強力な光増感剤としてのＡＬＡ／ＨＡＬ誘発性ＰｐＩＸが、細胞の核の外側の膜構造に局在化する［５］ため、８−ＭＯＰと比較して、潜在的な発癌リスクが減ることであろう。さらに、光にさらされた後のＡＬＡ／ＨＡＬ誘発性ＰｐＩＸは、活性化／変換されたリンパ球を選択的に破壊する［１１〜１３］。これに加え、ＰＤＴは、全身的な抗腫瘍免疫を誘発することができる（例えば、［１４、１５］）。
【０１００】
臨床的に、局所的に適用されるＡＬＡ−ＰＤＴは、すでに、皮膚の光線性角化症および表在性基底細胞上皮腫について承認された治療法である［１６〜１８］）。ＡＬＡの全身投与も、悪性神経膠腫のＰｐＩＸ蛍光によってガイドされる切除術に広く使用されており［１９〜２２］）、バレット食道の異形成のＰＤＴ治療に広く使用されている［２３〜２５］）。
【０１０１】
ＡＬＡは、天然に存在するアミノ酸であり、臨床的な使用では、暗状態での毒性はほとんど示さない。一般的に、用量２０％のＡＬＡを３時間より短い時間、局所的に適用しても、全身性の光増感は起こらない。全身投与の場合には、ＬＤ５０は、ＡＬＡを１回経口投与または腹腔内投与した後に、マウスおよびラットにおいて２，５００ｍｇ／ｋｇ体重（ｂ．ｗ）であることがわかっている［２６］。マウスおよびラットにおいて、それぞれ５００ｍｇ／ｋｇおよび２５０ｍｇ／ｋｇのＡＬＡを１回静脈注射した後に、観察可能な毒性の影響はみられなかった［２６］。ヒトにおいて、神経膠腫の蛍光によってガイドされる切除術のために、通常、飲料水中、１回経口投薬量が２０ｍｇ／ｋｇのＡＬＡが投与される［１９〜２２］）。一方、バレット食道のＰＤＴ治療のために、６０ｍｇ／ｋｇの投薬量が経口で与えられる［２３〜２５］。経口ＡＬＡの最も一般的な副作用は、吐き気、嘔吐および肝臓酵素の一時的な上昇であり、通常は４８時間後には解消する［２７］。
【０１０２】
［２８、２９］以降、動物腫瘍モデルのＰＤＴのためにＡＬＡを用いる可能性が観察されており、その後１９９０年から、ヒトの皮膚および胃腸管の腫瘍のＰＤＴ治療における臨床治験によって、ＡＬＡの局所投与または全身投与の後に、動物腫瘍モデルのＰＤＴのためにＡＬＡを用いる可能性が観察された［１６〜１８、３０、３１］。１９９６年に、ＡＬＡ−ＰＤＴが、上皮性悪性腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し得ることを発見した［３２、３３］）。この知見は、ＡＬＡのヘキシルエステル（ＨＡＬ）を用い、いくつかのヒト白血病およびリンパ腫の細胞株においてさらに確認された［７、８、３４］。
【０１０３】
本発明に先立つある実験において、本願発明者らは、ＰＤＴにＨＡＬを使用し、白血病または転移した乳癌と臨床的に関連する動物モデルにおいて、骨髄から腫瘍細胞を一掃し、有望な結果を得た［３５、３６］。
【０１０４】
本発明の基本的な知見は、変換されたリンパ球または活性化されたリンパ球において、通常の休止状態のリンパ球で作られるＰｐＩＸの選択性がかなり低いのに比べ、ＡＬＡまたはそのエステルからＰｐＩＸが選択的に産生することであった。
【０１０５】
近年、本願発明者らは、ＨＡＬをＵＶ−Ａランプ（既存の市販されているＴｈｅｒａｋｏｓ  ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍで使用されるＵＶ−Ａランプとほぼ同一の発光スペクトルを有する）と組み合わせると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞リンパ腫細胞を効果的に殺すことができることを発見し（本出願）、このことは、ＥＣＰにＡＬＡまたはそのエステルを用いる可能性を示唆している。
【０１０６】
ＥＣＰにＡＬＡを用いる利点は、以下のようにまとめることができる。
【０１０７】
ａ．増殖性の（変換または活性化された）Ｔ細胞は、通常の休止状態のＴ細胞よりもＡＬＡ誘発性ＰｐＩＸを約１５倍以上産生する。結果として、これらの増殖性Ｔ細胞は、８−ＭＯＰの非選択的な効果とは異なり、光の後にもっと選択的に破壊される。
【０１０８】
ｂ．ＡＬＡ誘発性ＰｐＩＸは、細胞の核の外側の膜構造にのみ局在化するため、発癌性を生じない。
【０１０９】
ｃ．膜の標的化によって、ＤＮＡに結合する８−ＭＯＰよりも強力な抗原性分子を生成する。４Ｔ１マウス乳癌のｅｘ  ｖｉｖｏでのＨＡＬ−ＰＤＴは、マウスにおいて全身性の抗腫瘍免疫を誘発することが示唆されている［３７］。
【０１１０】
ｄ．ＡＬＡは、良好な安全性プロフィールを有する承認薬である。１０％の胎児ウシ血清存在下、１ｍＭのＡＬＡと共に１時間インキュベートした後にＵＶＡ光を照射した後、９５％を超えるＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞リンパ腫細胞を殺すことができる。典型的な臨床背景において、これは約１ｍｇ／ｋｇの投薬量に対応し、この投薬量は、臨床的なＡＬＡ適用に使用される安全な投薬量よりかなり低い［１９〜２５］。
【０１１１】
ｅ．ＡＬＡとＴｈｅｒａｋｏｓ  Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる現在の手技との適合性は、８−ＭＯＰとの適合性と同様のものであるはずである。唯一の差は、患者が、ＵＶＡ光照射の前にＡＬＡの１時間のインキュベートの間、待たなければならないことであろう。
【０１１２】
本願発明者らは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしてヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ細胞株を使用し、ＵＶ−Ａと組み合わせてＨＡＬを用い、この細胞を不活性化する可能性を試験した。本願発明者らは、細胞を殺すことに対する８−ＭＯＰ／ＵＶ−ＡおよびＨＡＬ／青色の光の効果も比較し、現在のＨＡＬを用いるＥＣＰ技術において、８−ＭＯＰを置き換える実現可能性を評価した。
【０１１３】
本願発明者らは、さらに、ＨＡＬ／ＵＶ−Ａ、ＨＡＬ／青色の光、８−ＭＯＰ／ＵＶ−ＡまたはＨＡＬ／８−ＭＯＰ／ＵＶ−Ａによって細胞増殖が減少することを発見した。十分な線量では、全ての計画によって細胞が殺されたが、細胞死の態様は、処理条件に依存して変わった。８−ＭＯＰ／ＵＶ−Ａは、排他的にアポトーシスによる死を発生させ、一方、ＨＡＬ／ＵＶ−ＡまたはＨＡＬ／青色の光によって、アポトーシスと壊死の両方が誘発された。従って、本願発明者らは、８−ＭＯＰをＨＡＬによって置き換え、ＵＶ−Ａ照射後のＪｕｒｋａｔ細胞をアポトーシスおよび壊死を介して不活性化させることができると結論付けた。
【０１１４】
ＧＶＨＤ患者の血液サンプルにおけるｅｘ  ｖｉｖｏでのフォローアップ試験は、ＥＣＰによってＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を殺すことにおいて、８−ＭＯＰよりも５−ＡＬＡの方が優れていることを示した。これらの知見は、５−ＡＬＡを用いた循環式光化学療法の効能の向上を示している。
【実施例】
【０１１５】
（実施例１）
（材料および方法）
化学物質。
【０１１６】
ヘキサアミノレブリネート（ＨＡＬ）は、Ｐｈｏｔｏｃｕｒｅ  ＡＳＡ（オスロ、ノルウェー）によって提供された。それぞれの実験前に、ＨＡＬの新しいストック溶液を、エタノールと、血清を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ノルウェー）の混合物（１：９）で、濃度が８ｍＭになるように調製した。８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）のストック溶液を無水エタノールで調製し、使用するまで凍結させておいた。使用した全ての化学物質は、市販されている中で最も高い純度のものであった。
【０１１７】
細胞株。
【０１１８】
懸濁液中で成長させた４〜２４継代のヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−１５２ＴＭ）をこの試験で使用した。この細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ノルウェー）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ノルウェー）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ノルウェー）を追加したＲＰＭＩ  １６４０培地中でインキュベートした。継代培養のために、２日ごとに３×１０５細胞／ｍｌの密度になるまで細胞を希釈した。実験のために、実験開始の前日に１×１０６細胞／ｍｌの密度になるまで細胞を希釈した。
【０１１９】
蛍光分光法。
【０１２０】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用い、発光波長６３５ｎｍで蛍光励起スペクトルを記録した。この測定のために、スリット幅１５ｎｍの１．０×０．４ｃｍ２の石英キュベットを使用した。
【０１２１】
ファイバーを接続した分光計（それぞれ、ＵＳＢ４０００、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ、Ｄｕｉｖｅｎ、オランダと、Ａｖａｎｔｅｓ  ＡｖａＳｐｅｃ−２０４８ｘ１４−ＵＳＢ２、オランダ）を用いることによって、ＵＶランプおよび青色ランプの発光スペクトルを記録した。
【０１２２】
光線力学的治療およびソラレン／ＵＶ−Ａ治療。
【０１２３】
培養フラスコから細胞を集め、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、血清を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地を用い、３７．５×１０５細胞／ｍｌの密度になるまで希釈した。８０マイクロリットルの細胞懸濁物を９６ウェルプレートに分け入れた。１０μｌのＨＡＬ溶液または血清を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（コントロール）を添加した後、暗状態、３７℃で４時間、細胞をインキュベートした。ＨＡＬと共にインキュベートする終了約５分前に、１０μｌの８−ＭＯＰ溶液または血清を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（コントロール）をウェルに加えた。ＨＡＬと共に４時間インキュベートし、８−ＭＯＰと共に５分間インキュベートした後、サンプルにＵＶ−Ａ、青色の光、または両者を結果の章に示された露光時間、照射した。
【０１２４】
サンプルのＵＶ−Ａ照射のために、主に３４０〜４１０ｎｍの範囲の光を発する自家製のＵＶ−Ａランプ（Ｓφｒｅｎｓｅｎ  ＵＶ−Ａ  ｌａｍｐ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｔｈ  ２０Ｗ／０９）を使用した（図１）。サンプルの青色の光照射のために、主に４１０〜５００ｎｍの範囲の光を発し、ほぼ４４０ｎｍに最大を有する４個の蛍光管の束（３０２６型、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロンドン、英国）からの光を使用した（図１）。
【０１２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖アッセイ。
【０１２６】
市販のキットを用い、４９２ｎｍの吸光度によって検出することができるテトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム内部塩、ＭＴＳ）からホルマザン生成物への細胞内変換に基づく比色法を用い、細胞増殖を評価した。照射してから２４時間後、２０μｌのＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マディソン、ＷＩ）をそれぞれのウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後の４９２ｎｍでの吸光度を、ウェルプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｅｘ、Ｌａｂ−ｓｙｓｔｅｍｓ、フィンランド）を用いて測定した。
【０１２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの長期間細胞生存アッセイ。
【０１２８】
組み換えサイトカインを含むメチルセルロース系の培地であるヒトＭｅｔｈｏＣｕｌｔ(登録商標)（Ｈ４０３４、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を生存アッセイに使用した。処理直後に、２００個のＪｕｒｋａｔ細胞を含み、１２０μｌの血清を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地を、１．２ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ(登録商標)に添加した。このサンプルを製造業者の指示に従って処理し、懸濁物を３５ｍｍペトリ皿に移した。これを加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２中で３７℃でインキュベートした。
【０１２９】
アポトーシスを起こした細胞の評価。
【０１３０】
アポトーシスを起こした細胞を、４．０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を用いて３７℃で１０分間染色した後、核の形状に基づき、蛍光顕微鏡によって特定した。このアッセイは、本願発明者の以前の実験を実証した［７］。フィルタの組み合わせは、３３０〜３８０ｎｍの励起フィルタ、４００ｎｍのビームスプリッタ、４２０ｎｍの長路発光フィルタからなっていた。細胞死を確認するために、２．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）もサンプルに加えた。ＰＩ蛍光検出のために、フィルタの組み合わせは、５４０／２５ｎｍの励起フィルタ、５６５ｎｍのビームスプリッタ、６０５／５５ｎｍのバンドパス発光フィルタからなっていた。高感度の熱と電気によって冷却する電荷結合素子カメラＯＲＣＡＩＩ−ＥＲ（浜松、日本）によって蛍光画像を捕捉した。
【０１３１】
統計分析。
【０１３２】
データおよび曲線フィッティングの統計学的評価のために、シグマプロットソフトウェアを使用した。スチューデントのｔ検定を統計分析に適用した。
【０１３３】
（結果）
スペクトル測定。
【０１３４】
血清を含まない培地中、ＨＡＬと共に４時間インキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞の懸濁物の状態で、細胞内のＨＡＬ誘発性ＰｐＩＸの蛍光励起スペクトルを測定した。本願発明者らの実験室で使用したランプから発せられた光のスペクトルと、臨床的に使用されるＴｈｅｒａｋｏｓ  ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍの光源にから発せられた光のスペクトルを種々の設定で測定した（小型ランプ、蛍光管のみ、プラスチックを通過した光など）。
【０１３５】
測定したスペクトルの比較（図１Ａ）から、２つの結論を導き出すことができる。第１に、全てのランプの発光スペクトルは、細胞内のＨＡＬ誘発性ＰｐＩＸの励起スペクトルと部分的に重なり合っている。第２に、ＵＶランプによって発せられる光は、その設定に依存して変わる（図１Ｂ）。
【０１３６】
ＨＡＬおよび光を用いた処理。
【０１３７】
細胞内で産生したＨＡＬ誘発性ＰｐＩＸの蛍光励起スペクトルは、この試験で使用した青色ランプおよびＵＶ−Ａランプの発光スペクトルとかなり重なりあっていることが示されている（図１Ａ）。従って、ＨＡに基づくＰＤＴに対するＪｕｒｋａｔ細胞の感受性を、青色の光またはＵＶ−Ａ光によって細胞を照射した後に調べた。白血病およびリンパ腫の細胞株の光力学的不活性化に典型的に使用される線量より十分に高い１０秒または２０秒の青色の光照射と、臨床的なＥＣＰ中にＵＶ−Ａ光を細胞に照射する時間にほぼ対応する５分または１０分のＵＶ−Ａ照射を試験した。ＭＴＳアッセイによって評価される細胞増殖は、全ての場合において、濃度に依存する様式で減少することがわかった（図２Ａ）。ＨＡＬに基づくＰＤＴの間にサンプル中に１．００μＭの８−ＭＯＰが存在するとき、青色の光を用いても、細胞増殖に影響を与えなかった。ＵＶ−Ａ照射の後に血清（ＦＢＳ、最終濃度１０％）を細胞に添加したとき、実験誤差内で同じ結果が得られた（図２Ｂ、Ｃ）。
【０１３８】
これらの結果は、明らかに、ＨＡＬをＴｈｅｒａｋｏｓのＵＶ−Ａ光と組み合わせて使用し、細胞を光不活性化することができることを示す。
【０１３９】
８−ＭＯＰおよび光を用いた処理。
【０１４０】
まず、ＨＡＬが存在しない状態で、８−ＭＯＰおよびＵＶ−Ａ光を組み合わせた処理に対するＪｕｒｋａｔ細胞の光感受性を試験した。試験した両方のＵＶ−Ａ照射時間（５分および１０分）で、サンプル中の８−ＭＯＰの濃度を上げると、ＭＴＳアッセイによって測定される細胞増殖が減少する（図３）。青色ランプの発光スペクトルが８−ＭＯＰの作用スペクトルとはかなり離れているため（例えば［３８］）、青色の光による８−ＭＯＰの活性化は試験しなかった。これとは対照的に、８−ＭＯＰの効果は、ＵＶ−Ａランプの発光スペクトルのスペクトル範囲に依存して変わると予想される。実際に、１．００μＭの８−ＭＯＰがこの細胞を光増感によって光不活性化する能力は、ＵＶ−Ａランプのスペクトルがわずか数ｎｍシフトしたときに顕著に増加した（図４）。
【０１４１】
この実験は、明らかに、８−ＭＯＰの効果が、ＵＶ−Ａ光によってカバーされるスペクトル領域に大きく依存することを示す。
【０１４２】
ＨＡＬ、８−ＭＯＰおよび光の組み合わせを用いた処理。
【０１４３】
ＨＡＬおよび８−ＭＯＰは、両方とも、ＵＶ−Ａ光照射の後に細胞の光不活性化効果を発生させることができるため、この２つの薬物を低濃度で組み合わせて使用する可能性を試験した。この目的のために、８−ＭＯＰとＨＡＬの数種類の組み合わせを調べた（表１）。０．１０μΜの８−ＭＯＰ＋１．５５μΜのＨＡＬは、その後に１０分のＵＶ−Ａ照射をした場合に、対応する濃度の８−ＭＯＰのみ、またはＨＡＬのみのときと比較して、細胞をインキュベートした後に、顕著に低い細胞増殖を達成することができた（図５）。０．５０μΜの８−ＭＯＰ＋１．５５μΜのＨＡＬの組み合わせを用いると、その後に５分間のＵＶ−Ａ照射をした後に、同様の結果を達成することができた（図５）。ＵＶ−Ａ照射の後に血清（１０％ＦＢＳ）をサンプルに加えたとき、定性的に同じ結果が得られた（図示せず）。５．００μＭのＨＡＬ濃度は、光照射の後に細胞増殖を最低限になるまで減少させるのに十分であったため、８−ＭＯＰとの組み合わせの効果は試験しなかった。
【０１４４】
従って、このデータは、それぞれ単独で細胞を光不活性化するのに必要な濃度より低い濃度で、ＨＡＬと８−ＭＯＰの組み合わせによる細胞の光不活性化の可能性を示す。
【０１４５】
暗状態での毒性。
【０１４６】
８−ＭＯＰは、ＤＮＡに結合し、その毒性の問題が懸念される。ＨＡＬも、全身に摂取される場合には毒性の場合がある。従って、それぞれの実験において、これらの薬物で処理されたが、光を用いなかったサンプルを、薬物の暗状態での毒性を調べるために加えた。概して、ＭＴＳアッセイのデータに基づき、ＨＡＬ（１１．００μΜまで、図２、６）または８−ＭＯＰ（１．００μΜまで、図３、４、６）の暗状態での毒性に関する徴候はなかった。これらの薬物の組み合わせを用いて細胞を処理したときに、わずかに低い細胞増殖速度がみられた（図６）。
【０１４７】
長期間の細胞生存。
【０１４８】
試験した全ての処理計画から、Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖が減少した。細胞増殖の減少が、長期間の細胞死と相関関係にあるかどうかを調べるために、以下の処理の後に半固体培地中のコロニー形成アッセイを行った。１．０μΜのＭＯＰ／１０分間のＵＶ−Ａ、５．０μΜのＨＡＬ／１０分間のＵＶ−Ａ、０．１μΜのＭＯＰ＋１．５５μΜのＨＡＬ／１０分間のＵＶ−Ａ、７．４μΜのＨＡＬ／１０秒間の青色の光。驚くべきことに、このような特殊な培地ではコロニーが生成することが予想されたが、細胞を接種してから１週間後、どのサンプルにも（コントロール、未処理のものを含む）、密なコロニーはみられなかった［３９〜４１］。しかし、コントロールサンプルにおいて、多くの生きた１個の細胞がみられた。２週間後、高密度の細胞の重なりあって広がった領域がコントロールサンプルであらわれ、皿のほぼ全領域を覆っていた。ＵＶ−Ａで処理したサンプルでは、生きた細胞はみられなかった。ある場合には、コントロールでみられたのと同様の偶発的な密な細胞の領域が、ＨＡＬと青色の光の組み合わせで処理されたサンプルでみられた（表２）。このことは、この条件（７．４μＭのＨＡＬ／１０秒間の青色の光）で示される図２に示される結果と一致しており、細胞増殖は完全には減少しなかった。生きている代謝する細胞の存在と一致して、培地の色の黄色がかった変化がコントロールサンプルでみられた（図７）。
【０１４９】
細胞死の評価。
【０１５０】
この試験で調べて全ての処理（８−ＭＯＰ／ＵＶ−Ａ、ＨＡＬ／青色の光、ＨＡＬ／ＵＶ−Ａ、ＭＯＰ＋ＨＡＬ／ＵＶ−Ａ）は、薬物の投薬量または光の線量に依存した様式でＪｕｒｋａｔ細胞の死を誘発することができた。処理から２４時間後、細胞死の態様が処理方法に依存して変わるかどうかを調べるために、蛍光顕微鏡によって細胞を分析した。サンプルに存在するアポトーシスを起こした細胞の内容にかなりの差があった。１．００μＭの８−ＭＯＰの後ＵＶ−Ａで処理した後は、ほとんどの細胞がアポトーシスによって死に至っているようであったが、５．００μＭのＨＡＬと１０分間のＵＶ−Ａ照射で処理されたサンプルでは、アポトーシスを起こした細胞はみられなかった（図８）。ＨＡＬで処理したサンプル中の死んだ細胞の中のアポトーシスを起こした細胞の量は、処理方法に依存して変化した（表３）。
【０１５１】
（考察）
この試験において、本願発明者らは、ＵＶ−Ａと組み合わせたＨＡＬを試験し、皮膚Ｔ細胞リンパ腫のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしてＴ細胞リンパ腫のＪｕｒｋａｔ細胞株を不活性化し、ＵＶ−Ａ照射と、８−ＭＯＰを照射する細胞の光増感を合わせるか、または青色の光の照射とＨＡＬを用いた細胞の処理を合わせる典型的に使用される治療計画で達成される効果と比較した。
【０１５２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖および生存の減少を、ＨＡＬとＵＶ−Ａ照射を用いた処理によって誘発することができた。このことは、ＰｐＩＸの励起スペクトルとこの試験で使用するＵＶ−Ａランプの発光スペクトルが部分的に重なり合っているため、驚くべきことではなかった。この重なり合いは、ＰｐＩＸの励起スペクトルと、使用した青色光ランプの発光スペクトルに匹敵するものである（図１Ａ）。青色光ランプは、ＨＡＬ−ＰＤＴ後の白血病およびリンパ腫の細胞株を含め、種々の由来の細胞の不活性化に有効であることが示されていた［７、８、３４〜３７］。ＨＡＬおよびＵＶ−Ａ光を用いた処理の後のＪｕｒｋａｔ細胞の増殖の減少は、別の試験の結果と一致し、ＰＵＶＡ治療の目的のために、ＡＬＡとＵＶ−Ａの組み合わせを、Ｔ細胞リンパ腫ＨＵＴ−７８細胞株を用いて試験した［４２］。
【０１５３】
使用した処理計画に依存して、細胞死の態様に差がみられた。８−ＭＯＰおよびＵＶ−Ａ光を用いて細胞を処理した場合、アポトーシスのみが誘発され、ＨＡＬ濃度、光源（ＵＶ−Ａまたは青色の光）および照射時間のようなパラメータは、ＨＡＬによって誘発される細胞の光不活性化の場合に、Ｊｕｒｋａｔ細胞の死の態様に影響を与えた。
【０１５４】
いくつかの刊行物に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＣＰの治療効果は、細胞の不活性化のみによって引き起こされるのではなく、さらに、免疫応答の誘発に依存する（参考文献［４３］を参照）。この観点で、免疫効果の誘発のために、いくつかの刊行物が、細胞死の態様の重要さを検討していることを述べることが重要である［４４〜４８］。生存能力のある細胞を、別個の細胞表面受容体によって壊死標的からのアポトーシスと区別することができることが理解され、このような受容体は、壊死標的と比較して、アポトーシスについて異なるシグナル伝達事象を誘発する能力を有する［４９］。本願発明者らのデータは、アポトーシスが８−ＭＯＰ−ＵＶ−Ａによって誘発されることを示し、臨床経験は、この細胞死の態様が、体外循環式光化学療法の治療効果を達成するのに効果的であることを示す。アポトーシスおよび壊死は、この試験において、ＨＡＬ−ＰＤＴによって誘発することができ、問題は、壊死細胞の外観が、この治療の転帰に有益であるかどうかである。この観点で、ＰＤＴによって誘発される免役増強は、多くの刊行物に示されている（例えば、［１４、５０］にまとめられている）。重要なことに、外因性の光増感剤に基づくＰＤＴによって作られるワクチンおよび溶解物は、ＵＶおよび電離線の照射または凍結解凍技術によって作られるものよりも有効であることが示された［５１〜５３］。ＰＤＴによって作られるワクチンの優れた効果は、ＵＶまたは電離線を照射するプロトコルで純粋なアポトーシスを起こした細胞または純粋な壊死細胞の存在とそれぞれ比較して、ＰＤＴ治療プロトコルで壊死細胞とアポトーシスを起こした細胞が一緒にあらわれることに起因する［５１］。しかし、特定の条件下で、ＰＤＴが、同様に免疫抑制を引き起こすことが報告されていることを述べておくべきである（参考文献［５０］を参照）。
【０１５５】
ＥＣＰは、ＣＴＣＬの推奨される治療であり、ＧＶＨＤでの使用を裏付ける十分な証拠が存在する［１］。しかし、多くの患者は、難治性の疾患を経験し、そのため、現行のＥＣＰ法のさらなる開発が、期待を込めて患者の利益となるだろう。
【０１５６】
この試験のデータに基づき、本願発明者らは、ＨＡＬが、市販のＴｈｅｒａｋｏｓ  ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍで使用される光源と同様の発光スペクトルを有するＵＶ−Ａランプを用いた後、Ｔ細胞リンパ腫のＪｕｒｋａｔ細胞株の光不活性化に効果的であると結論付けた。ＨＡＬ−ＵＶ−Ａは、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスと壊死を誘発し、そのため、ＥＣＰの効能の向上のための潜在的な選択肢を与えるだろう。ＨＡＬをＥＣＰに使用する場合、望ましい免疫応答の誘発を達成するために、インタクトな免疫系を有する被検体において、処理条件を最適化する必要がある。
表１  ＨＡＬ、８−ＭＯＰおよびＵＶ−Ａ光の組み合わせを用いた細胞処理の条件
【０１５７】
【表１】
2017513952.tif 000004
表２  処理から２週間後の半固体培地中で作られた高密度の細胞領域の数
【０１５８】
【表２】
2017513952.tif 000005
表３  ＨＡＬによって誘発される光不活性化の後の細胞死の態様の評価
（アポトーシスを起こした細胞の崩壊に起因して、定量的な評価は不可能であった）
【０１５９】
【表３】
2017513952.tif 000006
（図面の説明）
図１（Ａ）  Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＨＡＬ誘発性ＰｐＩＸの正規化された蛍光励起スペクトルと、青色およびＵＶ−Ａのランプの正規化された発光スペクトル。（Ｂ）  異なる設定でのＵＶ−Ａランプによって発せられる光のスペクトル（プラスチック培養プレートで覆われた本願発明者らの実験室で使用される小型ランプ、本願発明者らの実験室で使用されるランプの蛍光管、臨床的に使用される体外循環式光化学療システムのランプ）。
【０１６０】
図２  ＨＡＬを用いたＪｕｒｋａｔ細胞の光力学的不活性化。（Ａ）１．００μＭの８−ＭＯＰが存在しない状態（白い丸）および存在する状態（黒い丸）での青色の光の照射。（ａ）コントロール（青色の光なし）、（ｂ）１０秒および（ｃ）２０秒の青色の光の照射。（Ｂ）図１に示されるスペクトルを有する光によるＵＶ−Ａ光の照射、蛍光管のみ。（○）コントロール（照射なし）、（●）５分間、（■）１０分間の照射。（Ｃ）（Ｂ）と同じであるが、ＵＶ−Ａ照射の後にサンプルにＦＢＳを添加（最終濃度１０％）。各データ点は、少なくとも４個の異なる細胞サンプルからの平均±Ｓ．Ｄをあらわす。
【０１６１】
図３  ８−ＭＯＰおよびＵＶ−Ａ光照射を用いたＪｕｒｋａｔ細胞の光不活性化。（○）コントロール（照射なし）、（●）５分間、（■）１０分間の照射。サンプルに、図１に示されるスペクトルを有する小型ランプによって照射した。各データ点は、少なくとも６個の異なる細胞サンプルからの平均±Ｓ．Ｄをあらわす。
【０１６２】
図４  ＵＶ−Ａ光源に対する、８−ＭＯＰによるＪｕｒｋａｔ細胞の光不活性化の依存性。この細胞を１．００μΜの８−ＭＯＰと共にインキュベートし、サンプルに、図１に示されるスペクトルを有する光を照射した。蛍光管のみ（●）、全ランプ（■）、（○、□）コントロール（照射なし）。各データ点は、それぞれ４サンプルおよび２サンプルのみを使用した１０分および３０分の時間点を除き、少なくとも６個の異なる細胞サンプルからの平均±Ｓ．Ｄをあらわす。
【０１６３】
図５  ＨＡＬと、８−ＭＯＰおよびＵＶ−Ａ光による照射との組み合わせを用いることによる、Ｊｕｒｋａｔ細胞の光不活性化。１．５５μＭのＨＡＬについてのデータが示される。サンプルに、図１に示されるスペクトルを有する蛍光管の光を照射した。データは、コントロールに対してあらわされる。棒グラフは、８個の異なる細胞サンプルからの平均±Ｓ．Ｄをあらわす。
【０１６４】
図６  暗状態での毒性（コントロールとの比較）。ここに示した薬物および投薬量で細胞を処理したが、サンプルに光は照射しなかった。棒グラフは、少なくとも６個の異なる細胞サンプルからの平均±Ｓ．Ｄをあらわす。
【０１６５】
図７  細胞生存アッセイ。細胞を接種してから３週間後のコントロールサンプル中の培地の色変化は、生きている代謝する細胞の存在と一致する。
【０１６６】
図８  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（左側の欄）およびＰＩ（中央の欄）で染色した後の核の形状を示す、異なる処理の後のＪｕｒｋａｔ細胞の蛍光画像。位相差の画像を右側の欄に示す。（Ａ）コントロール、（Ｂ）０．１０μΜの８−ＭＯＰ／ＵＶ−Ａ、（Ｃ）１．５５μΜのＨＡＬ／ＵＶ−Ａ、（Ｄ）０．１０μΜの８−ＭＯＰ＋１．５５μΜのＨＡＬ／ＵＶ−Ａ、（Ｅ）１．００μΜの８−ＭＯＰ／ＵＶ−Ａ、（Ｆ）５．００μΜのＨＡＬ／ＵＶ−Ａ、（Ｇ）５．００μΜのＨＡＬ／ＵＶ−Ａ、（Ｈ）５．００μΜのＨＡＬ／青色の光。サンプルに、図１に示されるスペクトルを有する光を１０分間（Ｂ〜Ｆ）または１０秒間（Ｇ、Ｈ）照射した。蛍光管のみ（図１Ｂ）または青色のランプ（図１Ａ）。
【０１６７】
（実施例２）
（ｃＧｖＨＤおよびＣＴＣＬの患者におけるＡＬＡ−ＥＣＰのｅｘ  ｖｉｖｏでの効能の評価）
１０％胎児ウシ血清存在下、ＡＬＡ濃度（１〜５ｍＭ）および治療時間（１〜４時間）を変え、ＡＬＡ−ＥＣＰのための実験条件の最適化をＪｕｒｋａｔ細胞で行った。次いで、細胞を、既存の市販されるＴｈｅｒａｋｏｓ  ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍで使用されるＵＶ−Ａとほぼ同一の発光スペクトルを有するＵＶ−Ａランプを用いてＵＶＡに１０分間さらした。ＡＬＡ／ＵＶＡ処理後の細胞の生存を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を用い、蛍光顕微鏡によって測定した。
【０１６８】
ＥＣＰ患者から集めた白血球サンプルに、ＡＬＡの適切な投薬量およびインキュベート時間を使用した。所定の濃度でのＡＬＡの暗状態での毒性を評価し、その後、その作用（アポトーシス／壊死）の機序についての試験の前に、ＡＬＡ／ＵＶＡが介在する死の効率について試験した。最適化された実験条件で、患者由来のリンパ球をＡＬＡと共にインキュベートした後、ＥＣＰ実験で使用したのと同じ線量の光で、Ｔｈｅｒａｋｏｓ  Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  ＳｙｓｔｅｍでＵＶＡランプにさらした。ＡＬＡの暗状態での毒性の細胞生存、ＡＬＡ／ＵＶＡが介在する死の効率、アポトーシス／壊死を、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ／ＰＩ染色でＣＤ４＋またはＣＤ８＋を合わせて標識し、フローサイトメトリーによって測定した。
【０１６９】
標準的な体外循環式光化学療法を受けた移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）患者から集めたＣＤ４＋／ＣＤ８＋  Ｔリンパ球に対する５−ＡＬＡ（ポルフィリン前駆体）とＵＶＡ光照射の死の効果を評価した。この細胞を、標準的な体外循環式光化学療法用の機械でＡＬＡ＋ＵＶＡにさらし、種々の濃度で１時間〜２０時間、生存率を評価した。標準的な体外循環式光化学療法に使用される８−ＭＯＰとＵＶＡも、比較のために加えた。ＣＤ４／ＣＤ８抗体であるＡｎｎｅｘｉｎ−ＶおよびｅＦｌｕｏｒ４５０を合わせて染色し、フローサイトメトリーによって細胞の生存を測定した。
【０１７０】
１人の患者からの増殖性／活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞についてのデータを図１に示し、ＣＤ８  Ｔ細胞についてのデータを図２に示す。この結果は、ＡＬＡとＵＶＡを用いた処理は、８−ＭＯＰとＵＶＡを用いた場合よりもかなり効果的に、特に、低い線量（すなわち、５分間の光照射）で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を殺したことを示す。
【０１７１】
本願発明者らは、今までに、皮膚Ｔ細胞リンパ腫患者またはＧｖＨＤ患者の４人の患者からのＴ細胞を処理し、同様の結果を得て、これを表４にまとめている。ＵＶＡ照射のみでＴ細胞を殺すことができることは明らかであり、このことは、非毒性の可視光源を用いる方法を改良する必要があることを示唆している。
【０１７２】
【表４】
2017513952.tif 000007
データは、ＵＶＡのみ（コントロール）、ＵＶＡと５−ＡＬＡまたはＵＶＡと８−ＭＯＰを用いて処理してから１時間後および２０時間後のＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存割合を用いてあらわした。ＵＶＡ光の線量は、０．１５８Ｊ／ｃｍ２であった。
【０１７３】
（図面の説明）
図９  ＧｖＨＤ患者から集めたＣＤ４＋Ｔリンパ球に対する５−ＡＬＡとＵＶＡ光照射の死の効果。
【０１７４】
図１０  ＧｖＨＤ患者から集めたＣＤ８＋Ｔリンパ球に対する５−ＡＬＡとＵＶＡ光照射の死の効果。
【０１７５】
（実施例３）
上の実施例１に記載したのと同じ条件下、実施例１で使用したＪｕｒｋａｔ細胞とは異なる別のヒトＴ細胞リンパ腫細胞株であるＫａｒｐａｓ  ２９９で実験を行い、同様の結果を図１１および図１２に示す。
【０１７６】
（図面の説明）
図１１  ＨＡＬとＵＶ−Ａ照射を用いたヒトＴ細胞リンパ腫細胞株（Ｋａｒｐａｓ  ２９９）の光力学的不活性化。（○）コントロール（照射なし）、（●）５分間、（■）１０分間の照射。
【０１７７】
図１２  ８−ＭＯＰとＵＶ−Ａ照射を用いたヒトＴ細胞リンパ腫細胞株（Ｋａｒｐａｓ  ２９９）の光力学的不活性化。（○）コントロール（照射なし）、（●）１０分間、（■）２０分間の照射。
【０１７８】
（実施例４）
（ヒト白血球に対する５−ＡＬＡの暗状態での毒性の評価）
光が介在する活性化が無い状態で５−ＡＬＡの一般的な安全性（暗状態での毒性）を次に評価した。１０人のＧｖＨＤ患者またはＣＴＬＣ患者からの血液サンプルを１０ｍＭの５−ＡＬＡを用い、３７℃、５％  ＣＯ２加湿インキュベーターで一晩（１７〜２４時間）処理した。標準的な体外循環式光化学療法による治療の間に、患者からのバフィーコートサンプルをＴｈｅｒａｋｏｓ  Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍから直接集めた。全ての個人において、５−ＡＬＡを含まない培地でインキュベートした細胞もコントロールとして含めた。次いで、種々の副集合のフローサイトメトリーのために、白血球を抗体で標識した。この抗体は、白血球についてＣＤ４５  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、Ｔヘルパー細胞についてＣＤ４  ＦＩＴＣ、Ｔ細胞傷害性細胞についてＣＤ８  ＦＩＴＣ、Ｂ細胞についてＣＤ１９  ＦＩＴＣであった。さらに、死んだ細胞のために、細胞をＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０で標識し、アポトーシスを起こした／死んだ細胞のためにＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖで標識した。異なる副集合の白血球を取り出し、細胞の生存能力について分析した。Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０およびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖの両方について陰性であった細胞は、生存能力を有する細胞であるとした。
【０１７９】
結果を図１３にまとめ、処理された同じ患者の血液サンプルから分析した異なる分画を示している。技術的な理由のために、Ｂ細胞の分画は５人の患者のサンプルしか得られず、一方、全血細胞（ＷＢＣ）の分画は、患者サンプルの１つを失敗したことを注記しておく。概して、試験した白血球で、臨床的な設定で使用されると予想されるよりも過剰の５−ＡＬＡの濃度（１０ｍＭ）およびさらした時間（１７〜２４時間）で、５−ＡＬＡの暗状態での有意な細胞毒性効果は示されなかった。臨床的な設定で最終的に使用される５−ＡＬＡの濃度およびさらす時間は、多くの因子およびある症例の具体的な状況によって変わるため、変化することを注記しておかねばならない。
【０１８０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2017513952.tif 000009
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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