(57)【要約】本発明の一部の態様によれば、核酸配列決定のための調製方法および関連組成物が提供される。一部の実施形態では、本明細書の方法は、例えば、ハイスループットフローセルベース配列決定システムを含めた標準的な次世代核酸配列決定システムとともに直接使用することができる試料を生成するための等温条件下での鋳型核酸の迅速な増幅をもたらす。一部の実施形態では、本発明の態様は、配列決定のために等温条件下で核酸を指数関数的に増幅することを伴う、核酸を調製するための方法に関する。
2017504346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析のための核酸を調製する方法であって、
（ａ）核酸鋳型から合成ＲＮＡを生成するステップと、
（ｂ）等温反応で前記合成ＲＮＡを指数関数的に増幅するステップと、
（ｃ）前記指数関数的に増幅された合成ＲＮＡからｃＤＮＡを作製するステップであって、前記ｃＤＮＡは、少なくとも１つの非標的配列を含む、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
核酸鋳型の配列を決定する方法であって、
（ａ）核酸鋳型から合成ＲＮＡを生成するステップと、
（ｂ）等温反応で前記合成ＲＮＡを指数関数的に増幅するステップと、
（ｃ）前記指数関数的に増幅された合成ＲＮＡからｃＤＮＡを作製するステップと、
（ｄ）前記ｃＤＮＡを配列決定するステップと
を含む、方法。
【請求項３】
前記等温反応が、鋳型依存性伸長およびＲＮＡポリメラーゼ転写の２つまたはそれ超のサイクルを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
各サイクル中の少なくとも１つの鋳型依存性伸長が、逆転写である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記等温反応が、３５℃〜４５℃の範囲内の温度で実行される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記等温反応が、４５〜９０分の持続時間にわたって実行される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記等温反応が、前記合成ＲＮＡに相補的である第１のＤＮＡ鎖を合成する鋳型依存性伸長を含み、前記第１のＤＮＡ鎖と前記合成ＲＮＡとの間のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成をもたらす、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記等温反応が、前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの前記合成ＲＮＡ部分の分解をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分解が、酵素的に媒介される分解である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分解が、ＲＮＡｓｅＨによって媒介される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記等温反応が、前記第１のＤＮＡに相補的である第２のＤＮＡ鎖を合成する鋳型依存性伸長をさらに含み、前記第１のＤＮＡ鎖および前記第２のＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡの形成をもたらす、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記等温反応が、前記二本鎖ＤＮＡから合成ＲＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼ媒介転写反応をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が繰り返される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅された合成ＲＮＡが、ステップ（ｂ）のそれぞれ連続したラウンドの後に精製され、前記精製された合成ＲＮＡが、ステップ（ｂ）の後続のラウンド（複数可）の出発材料として使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
繰り返されるステップ（ｂ）の前記等温反応の少なくとも２つが、前記鋳型合成ＲＮＡまたは第１のＤＮＡ鎖の入れ子配列と相補的であるハイブリダイゼーション配列を有するオリゴヌクレオチドによってプライミングされる鋳型依存性伸長を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
繰り返されるステップ（ｂ）の前記等温反応の少なくとも２つが、前記鋳型合成ＲＮＡまたは第１のＤＮＡ鎖と相補的であるハイブリダイゼーション配列、および追加の非相補的配列を有するオリゴヌクレオチドによってプライミングされる鋳型依存性伸長を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記追加の非相補的配列が、バーコード配列、インデックス配列、またはアダプター配列のうちの１つまたは複数を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的特異的ハイブリダイゼーション配列を含むオリゴヌクレオチドを使用して少なくとも１つの伸長反応を実行することによって前記核酸鋳型を生成するステップと、異なるハイブリダイゼーション配列の５’にある共通配列を共有する複数の異なるオリゴヌクレオチドを使用して少なくとも１つの伸長反応を実行するステップとをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸鋳型が、標的領域および隣接領域を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的特異的ハイブリダイゼーション配列が、前記標的領域と相補的であり、前記異なるハイブリダイゼーション配列の少なくとも１つが、前記隣接領域と相補的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的領域が、第１の遺伝子の配列を含み、前記隣接領域が、第２の遺伝子の配列を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の遺伝子が、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、またはＡＬＫである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸鋳型が、プロモーターを含む二本鎖ＤＮＡであり、前記合成ＲＮＡが、前記プロモーターに特異的に結合し、前記プロモーターの下流のＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼによって酵素的に生成される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＳＰ６ポリメラーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記合成ＲＮＡが、前記核酸鋳型から生成される中間体二本鎖ＤＮＡから転写され、前記核酸鋳型が、単離ＲＮＡである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記単離ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、または非コードＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｍＲＮＡが、遺伝子再構成を含む染色体セグメントからコードされる融合ｍＲＮＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸鋳型が、遺伝子再構成の一部を含む染色体セグメントである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子再構成が、逆位、欠失、または転座である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｃＤＮＡが、配列決定反応をプライミングする配列決定プライマーのハイブリダイゼーション部位として働く非鋳型配列を含有する、請求項２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｃＤＮＡが、異なる供給源を起源とする異なる核酸を含む多重反応において配列決定される、請求項２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記異なる供給源が、前記核酸鋳型が得られた異なる被験体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記異なる供給源が、前記核酸鋳型が得られた異なる組織である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
核酸を配列決定するための方法であって、
標的領域および隣接領域を含む核酸鋳型から合成ＲＮＡを生成するステップと、
鋳型として前記合成ＲＮＡを使用して鋳型依存性伸長によって合成される第１の鎖、および鋳型として前記第１の鎖を使用して鋳型依存性伸長によって合成される第２の鎖を含む二本鎖核酸を生成するステップであって、前記二本鎖核酸は、前記核酸鋳型の前記標的領域および前記隣接領域を示す、ステップと、
前記二本鎖核酸を使用して配列決定反応を実行して、前記標的領域および前記隣接領域のヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
前記合成ＲＮＡを増幅するステップと、鋳型として前記増幅された合成ＲＮＡを使用して前記二本鎖核酸を生成するステップとをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記合成ＲＮＡが、等温増幅によって増幅される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記合成ＲＮＡが、前記等温増幅によって指数関数的に増幅される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記合成ＲＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記二本鎖核酸を増幅するステップと、前記増幅された二本鎖核酸を配列決定するステップとをさらに含む、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記二本鎖核酸の各鎖が、それが前記配列決定反応をプライミングする配列決定プライマーのハイブリダイゼーション部位として働く非鋳型配列を含有するように生成される、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記二本鎖核酸が、異なる供給源を起源とする異なる核酸を含む多重反応において配列決定される、請求項３４から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記異なる核酸が、供給源を特定するバーコード配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ハイブリダイゼーション配列およびＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＲＮＡポリメラーゼを含む凍結乾燥組成物を収容する容器
を含む、キット。
【請求項４４】
前記組成物が、ＲＮＡｓｅＨをさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、およびその他からなる群より選択される、請求項４３または４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｅｏｎｉｘ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＶｅｒａＳｅｑ  ＵＬｔｒａポリメラーゼ、およびＥｎｚＳｃｒｉｐｔからなる群より選択される、請求項４３から４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、およびＳＰ６ポリメラーゼからなる群より選択される、請求項４３から４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、バーコード配列、インデックス配列、およびアダプター配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４９】
前記容器が、マルチチャンバーカートリッジのチャンバーである、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
次世代配列決定技術の最近の進歩により、研究現場および臨床現場の両方における配列決定法および調製方法が急速に向上した。ハイスループット能力および高いカバレッジの深さは、次世代配列決定を分子診断にとって魅力的で有望な方向にする。全ゲノム配列決定の代わりに、遺伝子の特定のサブセットを調べることができ、複数の試料をプールして（例えば、多重化して）単一の配列決定ランにし（例えば、フローセルレーン）、したがって分析の全体的なコストを低減することができる。現在の方法は、依然として速度が限られており、改良法が望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明の態様は、配列決定のために核酸を調製するための既存の方法は、労働集約的であり、かつ大量の出発材料を必要とすることが多いという認識に関係する。既存の方法は、非常に長く、かつ非効率であるステップ（例えば、ライゲーションステップ、末端修復、およびポリアデニル化−テーリング）を伴い、方法を、分子診断上の場面において望ましい迅速で正確な配列決定結果を得ることについて非効率的にすることがさらに認識されている。一部の実施形態では、本明細書の方法は、例えば、ハイスループットフローセルベース配列決定システムを含めた標準的な次世代核酸配列決定システムとともに直接使用することができる試料を生成するための、等温条件下での鋳型核酸の迅速な増幅をもたらす。一部の実施形態では、本発明の態様は、配列決定のために等温条件下で核酸を指数関数的に増幅することを伴う、核酸を調製するための方法に関する。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、等温反応条件を活用し、特殊な温度サイクリング機構の必要性を回避するので有利である。一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、出発材料としてＲＮＡおよび／またはＤＮＡを使用して活用することができるので有利である。したがって、一部の実施形態では、方法は、病理学的分析のために得られる試料を含めた様々な異なるタイプの試料（例えば、血液試料および他の組織試料）から抽出される核酸を使用して活用することができ、それによって、並列の診断検査を共通の組織試料に対して実行することを可能にする。
【０００３】
一部の実施形態では、従来の調製方法は、標的領域に隣接する増幅プライマーを設計するために、温度サイクリング（例えば、ＰＣＲのように）だけでなく、不変の既知の配列も利用することが多いことが認識されている。一部の実施形態では、これは、既存の方法を使用して捕捉される遺伝的事象のタイプを制限し、超変異、遺伝子の再構成、または未知の遺伝子パートナーとの融合から生じる核酸バリアントを検出することを課題にしている。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、広範囲の遺伝的バリアント、再構成、または多型を検出する目的で配列決定するための核酸を調製するのに有用である。例えば、一部の実施形態では、未知の配列を同定する目的で未知の配列に融合した既知の標的配列を含有する核酸鋳型を増幅するのに有利である方法が提供される。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、遺伝子再構成から生じる核酸融合物を調製するのに有用である。一部の実施形態では、融合物は、染色体再構成を受けた遺伝子中でコードされるｍＲＮＡ融合物である。一部の実施形態では、融合物は、染色体再構成の結果として一緒に融合された２つの遺伝子座を含む染色体セグメントである。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供する調製方法は、ゲノム再構成または融合を検出するために核酸を配列決定する目的で核酸のプールを増幅するのに有用である。一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、標準的な病理学的アッセイ、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの相補的な診断検査として配列決定を使用してゲノム再構成または融合を検出するのに使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に提供する調製方法は、新規の遺伝子アセンブリー、例えば、ショットガン配列決定にとって有用である。このような実施形態では、ハイブリダイゼーション配列を含むオリゴヌクレオチドを、ゲノムアセンブリー断片間（例えば、コンティグ間）に接合部を含む核酸を増幅するのに使用してもよい。したがって、一部の実施形態では、調製方法は、ゲノムアセンブリー断片間に接合部を含む核酸を増幅し、断片のいずれかの側の実際の配列を決定し、実際の配列がゲノムアセンブリー予測とフィットするか否かを確認することによって、ゲノムアセンブリー予測の正確さを確認するのに使用することができる。
【０００４】
本発明の態様は、分析のための核酸を調製する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）核酸鋳型から合成ＲＮＡを生成するステップと、（ｂ）等温反応で合成ＲＮＡを指数関数的に増幅するステップと、（ｃ）指数関数的に増幅された合成ＲＮＡからｃＤＮＡを作製するステップであって、ｃＤＮＡは、少なくとも１つの非標的配列を含む、ステップとを伴う。本発明のさらなる態様は、核酸鋳型の配列を決定する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）核酸鋳型から合成ＲＮＡを生成するステップと、（ｂ）等温反応で合成ＲＮＡを指数関数的に増幅するステップと、（ｃ）指数関数的に増幅された合成ＲＮＡからｃＤＮＡを作製するステップと、（ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップとを伴う。ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の指数関数的な増幅が繰り返される。一部の実施形態では、増幅された合成ＲＮＡは、ステップ（ｂ）のそれぞれ連続したラウンドの後に精製され、精製された合成ＲＮＡは、ステップ（ｂ）の後続のラウンド（複数可）の出発材料として使用される。ある特定の実施形態では、繰り返されるステップ（ｂ）の等温反応の少なくとも２つは、鋳型合成ＲＮＡまたは第１のＤＮＡ鎖の入れ子配列と相補的であるハイブリダイゼーション配列を有するオリゴヌクレオチドによってプライミングされる鋳型依存性伸長を含む。
【０００５】
一部の実施形態では、等温反応は、鋳型依存性伸長およびＲＮＡポリメラーゼ転写の２つまたはそれ超のサイクルを含む。ある特定の実施形態では、各サイクル中の少なくとも１つの鋳型依存性伸長は、逆転写である。一部の実施形態では、等温反応は、３５℃〜４５℃の範囲内の温度で実行される。ある特定の実施形態では、等温反応は、４５〜９０分の持続時間にわたって実行される。一部の実施形態では、等温反応は、合成ＲＮＡに相補的である第１のＤＮＡ鎖を合成する鋳型依存性伸長を含み、第１のＤＮＡ鎖と合成ＲＮＡとの間のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成をもたらす。ある特定の実施形態では、等温反応は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの合成ＲＮＡ部分の分解をさらに含む。一部の実施形態では、分解は、酵素的に媒介される分解である。ある特定の実施形態では、分解は、ＲＮＡｓｅＨによって媒介される。一部の実施形態では、等温反応は、第１のＤＮＡに相補的である第２のＤＮＡ鎖を合成する鋳型依存性伸長をさらに含み、第１および第２のＤＮＡ鎖を含む二本鎖ＤＮＡの形成をもたらす。一部の実施形態では、等温反応は、二本鎖ＤＮＡから合成ＲＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼ媒介転写反応をさらに含む。
【０００６】
一部の実施形態では、繰り返されるステップ（ｂ）の等温反応の少なくとも２つは、鋳型合成ＲＮＡまたは第１のＤＮＡ鎖と相補的であるハイブリダイゼーション配列、および追加の非相補的配列を有するオリゴヌクレオチドによってプライミングされる鋳型依存性伸長を含む。ある特定の実施形態では、追加の非相補的配列は、バーコード配列、インデックス配列、またはアダプター配列のうちの１種または複数を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、方法は、標的特異的ハイブリダイゼーション配列を含むオリゴヌクレオチドを使用して少なくとも１つの伸長反応を実行することによって核酸鋳型を生成するステップと、異なるハイブリダイゼーション配列の５’にある共通配列を共有する複数の異なるオリゴヌクレオチドを使用して少なくとも１つの伸長反応を実行するステップとをさらに含む。
【０００８】
ある特定の実施形態では、核酸鋳型は、標的領域および隣接領域を含む。一部の実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーション配列は、標的領域と相補的であり、異なるハイブリダイゼーション配列のうちの少なくとも１つは、隣接領域と相補的である。ある特定の実施形態では、標的領域は、第１の遺伝子の配列を含み、隣接領域は、第２の遺伝子の配列を含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子は、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、またはＡＬＫである。
【０００９】
ある特定の実施形態では、核酸鋳型は、プロモーターを含む二本鎖ＤＮＡであり、合成ＲＮＡは、プロモーターに特異的に結合し、プロモーターの下流のＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼによって酵素的に生成される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＳＰ６ポリメラーゼである。ある特定の実施形態では、合成ＲＮＡは、核酸鋳型から生成される中間体二本鎖ＤＮＡから転写され、核酸鋳型は、単離ＲＮＡである。一部の実施形態では、単離ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、または非コードＲＮＡである。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、遺伝子再構成を含む染色体セグメントからコードされる融合ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸鋳型は、遺伝子再構成の部分を含む染色体セグメントである。ある特定の実施形態では、遺伝子再構成は、逆位、欠失、または転座である。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは、配列決定反応をプライミングする配列決定プライマーのハイブリダイゼーション部位として働く非鋳型配列を含有する。ある特定の実施形態では、ｃＤＮＡは、異なる供給源を起源とする異なる核酸を含む多重反応において配列決定される。一部の実施形態では、異なる供給源は、核酸鋳型が得られた異なる被験体である。ある特定の実施形態では、異なる供給源は、核酸鋳型が得られた異なる組織である。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、核酸を配列決定する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、標的領域および隣接領域を含む核酸鋳型から合成ＲＮＡを生成するステップと、鋳型として合成ＲＮＡを使用して鋳型依存性伸長によって合成される第１の鎖、および鋳型として第１の鎖を使用して鋳型依存性伸長によって合成される第２の鎖を含む二本鎖核酸を生成するステップであって、二本鎖核酸は、核酸鋳型の標的領域および隣接領域を示す、ステップと、二本鎖核酸を使用して配列決定反応を実行して、標的領域および隣接領域のヌクレオチド配列を決定するステップとを伴う。一部の実施形態では、方法は、合成ＲＮＡを増幅するステップと、鋳型として増幅された合成ＲＮＡを使用して二本鎖核酸を生成するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、合成ＲＮＡは、等温増幅によって増幅される。ある特定の実施形態では、合成ＲＮＡは、等温増幅によって指数関数的に増幅される。一部の実施形態では、合成ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。
【００１１】
ある特定の実施形態では、方法は、二本鎖核酸を増幅するステップと、増幅された二本鎖核酸を配列決定するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、二本鎖核酸の各鎖は、それが、配列決定反応をプライミングする配列決定プライマーのハイブリダイゼーション部位として働く非鋳型配列を含有するように生成される。ある特定の実施形態では、二本鎖核酸は、異なる供給源を起源とする異なる核酸を含む多重反応において配列決定される。一部の実施形態では、異なる核酸は、供給源を特定するバーコード配列を含む。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示されている方法において有用である構成要素を含むキットに関する。一部の実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーション配列およびＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＲＮＡポリメラーゼを含む凍結乾燥組成物を収容する容器を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＲＮＡｓｅＨをさらに含む。ある特定の実施形態では、逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、およびＨＩＶ−２逆転写酵素からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｅｏｎｉｘ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＶｅｒａＳｅｑ  ＵＬｔｒａポリメラーゼ、およびＥｎｚＳｃｒｉｐｔからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、およびＳＰ６ポリメラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、バーコード配列、インデックス配列、およびアダプター配列のうちの少なくとも１つをさらに含む。ある特定の実施形態では、容器は、マルチチャンバーカートリッジのチャンバーである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｇは、鋳型としてＲＮＡから始まる、３’未知融合パートナーによって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｇは、鋳型としてＲＮＡから始まる、３’未知融合パートナーによって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｇは、鋳型としてＲＮＡから始まる、３’未知融合パートナーによって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｇは、鋳型としてＲＮＡから始まる、３’未知融合パートナーによって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｇは、鋳型としてＲＮＡから始まる、３’未知融合パートナーによって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図１Ｆ】図１Ａ〜Ｇは、鋳型としてＲＮＡから始まる、３’未知融合パートナーによって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図１Ｇ】図１Ａ〜Ｇは、鋳型としてＲＮＡから始まる、３’未知融合パートナーによって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図２Ｅ】図２Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｄは、鋳型としてＤＮＡを使用する標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｄは、鋳型としてＤＮＡを使用する標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｄは、鋳型としてＤＮＡを使用する標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｄは、鋳型としてＤＮＡを使用する標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’または３’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’または３’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’または３’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’または３’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜Ｅは、鋳型としてＲＮＡから始まる、５’または３’未知配列によって隣接された標的核酸配列の等温増幅のワークフローの非限定的な例を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書の方法は、例えば、ハイスループットフローセルベース配列決定システムを含めた標準的な核酸配列決定システムとともに直接使用することができる試料を生成するための、鋳型核酸の迅速な調製を可能にする。一部の実施形態では、配列決定のために等温条件下で核酸を指数関数的に増幅することを伴う調製方法が提供される。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、等温反応条件を活用し、特殊な温度サイクリング機構の必要性を回避するので有利である。一部の実施形態では、等温条件下で実行される鋳型依存性伸長およびＲＮＡ転写反応を交互に行い、鋳型核酸を指数関数的に増幅することを伴う、配列決定のための核酸を調製するための方法が提供される。さらに、一部の実施形態では、本明細書に開示されている調製方法は、およそ２〜５時間以内で配列決定のための増幅核酸を生成することができ、したがって、配列決定による比較的迅速な分子診断検査を可能にする。さらに、本明細書に提供する方法は、並列の試験（例えば、配列決定および画像ベース分析による）を共通の組織試料に対して実行することを可能にする。例えば、一部の実施形態では、本明細書に開示されている核酸を調製するための方法は、病理学的分析のために得られる生物学的試料（例えば、ホルマリン固定組織切片、血液、および他の組織）から抽出される核酸を用いて使用するのに適している。
【００１５】
本明細書に提供する方法は、限定することなく、部分的または完全なヌクレオチド配列決定のための核酸を調製することを含めたいくつかの適用を有することが理解されるであろう。一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含めた、出発材料として一連の異なる核酸を使用して活用することができるので有利である。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、哺乳動物ゲノム、より具体的には、ヒトゲノムを含めたゲノム中に存在する染色体セグメントを示す核酸を調製することを伴う。本明細書に開示されている方法を使用して調製される核酸は、ゲノムのサブセット（エクソンもしくはエクソームなど）、トランスクリプトームもしくはそのサブセット、または細胞から得られる他のＤＮＡもしくはＲＮＡを含み得る。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、配列決定によって試料中の核酸の存在または非存在を決定する目的で核酸を調製することを伴う。このような方法は、例えば、診断上の適用および法医学的適用において有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、核酸が、一塩基多型、遺伝子再構成、コピー数の変動などを含めた、配列中の変異またはバリエーション、例えば、対立遺伝子バリエーションなどを含むか否かを決定する目的で核酸を調製することを伴う。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、試料中の遺伝的に修飾された生物または遺伝子操作された核酸の存在を決定する目的で核酸を調製することを伴う。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、試料中に存在する核酸を検出および／または配列決定する目的で、任意の適切な試料（例えば、食品試料、環境試料、生物学的試料、例えば、血液試料など）から核酸を調製するのに有用である。一部の実施形態では、核酸は、試料中の病原体、感染性因子、または生物の配列ベース検出を促進するのに調製される場合がある。用語「食品試料」は、例えば、肉および肉製品、ミルクおよびミルクベースの製品、卵および卵ベースの製品、ベーカリー製品（ｂａｋｅｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、菓子類、野菜、果実、ならびに飲料水を含めた飲み物などを含めた食用である任意の液体、半固体、固体、および乾燥材料を指す。環境試料としては、地表水、地下水、海洋水、土壌試料、および空気試料などの試料が挙げられる。用語「生物学的試料」は、任意の細胞、組織、生物学的流体、臓器、またはこれらの部分を含む。生物学的試料は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞または組織培養物から得ることができ、またはそれに由来し得る。代わりに、生物学的試料は、生物から得ることができ、またはそれに由来し得る。例としては、血液、痰、尿、生検材料（例えば、腫瘍生検材料）、および臨床検査室で通常検査される他の試料が挙げられる。用語の生物学的試料は、分析のために処理された試料、例えば、固定組織切片も含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、既知の核酸が疾患（例えば、がん）をもたらす変異を経たか否かを配列決定または他の検出法によって決定する目的で核酸を調製することを伴う。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、核酸を配列決定することによって被験体における特定の状態の存在または非存在を決定する目的で核酸を調製することを伴う。状態は、例えば、がん、神経変性状態などの非がん性状態、または感染症であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、２つの試料、例えば、正常組織と患部組織などの間に存在する遺伝的差異を評価する目的で核酸を調製することを伴う。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、個体のキャリア状態を配列決定または他の方法によって決定する目的で核酸を調製することを伴う。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、出生前の遺伝子検査の目的で出生前の試料から核酸を調製することを伴う。本明細書に開示されている方法は、微生物における抗生物質耐性、またはウイルスとの関連における免疫耐性もしくは抗ウイルス耐性の根本的な原因を配列決定により決定するための試料を調製するのに有用であり得る。
【００１９】
さらに、方法のある特定の実施形態では、複数の反応が、複数の供給源（例えば、複数の患者試料）に由来する複数の核酸および／または試料を処理または評価する目的で並行して実施される場合がある。例えば、１０〜２５、１５〜５０、２５〜７５、５０〜１００、７５〜２００、１００〜５００、２００〜５００、２００〜１０００、５００〜１５００、１０００〜２５００、２５００〜５０００、またはそれ超の核酸（例えば、異なる遺伝子座、例えば、異なる融合ブレイクポイントまたは多型）が、各試料について評価され得る。複数の反応を、単一反応チャンバーまたは別個の反応チャンバー内で実行することができることが理解されるはずである。さらに、複数の異なる供給源に由来する試料を、並行して処理することができる。例えば、１〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２５００、２５００〜５０００、もしくはそれ超、または中間の数の供給源を、並行して処理することができる。
【００２０】
本明細書に開示されている方法は、自動化することができ、かつ／または反応を実施し、もしくは反応同士間で材料を移動させるためのロボティクスの使用を伴い得ることが理解されるはずである。例えば、自動化されたインプリメンテーションでは、本明細書に開示されている調製方法を使用して調製された核酸は、ロボティクスまたは他の自動化された構成要素を使用して配列決定のための配列決定プラットフォームに移動させることができる。さらに、配列決定システムの検出器またはセンサーから得られる配列決定データは、コンピューター、モバイルデバイスに入力され、かつ／またはスクリーン上に表示されてもよく、その結果、ユーザーは、遠隔で配列決定反応の進行を監視するか、または配列決定反応から得られる情報にアクセスし、それを分析することができる。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法によって調製される核酸は、核酸配列決定によって分析される。一部の実施形態では、核酸配列決定は、次世代配列決定法である。一部の実施形態では、次世代配列決定法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代配列決定装置に適用可能な合成による配列決定法であり、この方法では、配列決定される増幅されたＤＮＡに隣接するアダプター配列は、この方法にとって適切な配列を含有する。一部の実施形態では、配列決定法は、イオントレント（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）配列決定プラットフォームに適用可能なイオン半導体を使用し、ここで、配列決定される増幅されたＤＮＡに隣接するアダプター配列は、この方法にとって適切な配列を含有する。核酸分析のための追加の配列決定法としては、それだけに限らないが、連鎖停止配列決定（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（サンガー配列決定とも呼ばれる）、ライゲーションによる配列決定（ＳＯＬｉＤ配列決定とも呼ばれる）、４５４ピロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、および単一分子リアルタイム配列決定（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ配列決定とも呼ばれる）が挙げられる。
【００２２】
一部の実施形態では、合成による配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムを使用する）は、分析される核酸のいずれかの末端に接合され、フローセル内で固定化されるＰ５およびＰ７オリゴヌクレオチドに相補的であるアダプター配列（Ｐ５、Ｐ７）を使用する。一部の実施形態では、プロセスは、固定化されたＤＮＡ分子のクローン増幅、その後の蛍光標識ヌクレオチドの添加を伴い、このヌクレオチドは、相補的ＤＮＡ鎖中に、それが１サイクルで合成される際に一度に組み込まれる。Ｐ５およびＰ７アダプター配列に加えて、増幅されたＤＮＡは、１つまたは複数の配列決定オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのための配列（例えば、Ｒｄ１またはＲｄ２と呼ばれる配列）も含有し得る。
【００２３】
一部の実施形態では、イオン半導体配列決定法（例えば、イオントレントシステムを使用する）は、分析される核酸のいずれかの末端に接合され、核酸分子の球状粒子への付着を可能にする別個のアダプター配列（Ａ、Ｐ１）を伴う。一部の実施形態では、球状粒子に結合体化した核酸が、エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）によって増幅され、配列決定のためにチップウェルにロードされる。イオン半導体配列決定装置は、粒子に結合体化した鋳型ＤＮＡに相補的であるＤＮＡ鎖の重合中に放出されるプロトンの検出に基づく。それぞれの放出された水素イオンは、超高感度イオンセンサーによって検出される。
【００２４】
一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、標的配列の増幅によって標的核酸に追加の配列を接合することを伴う。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸とハイブリダイズするためのハイブリダイゼーション配列および追加の配列を含有する。一部の実施形態では、追加の配列は、識別子配列（例えば、バーコード）、配列決定プライマーハイブリダイゼーション配列（例えば、Ｒｄ１）、アダプター配列、およびその他を含めた以下の非限定的な例の１種または複数を含む。一部の実施形態では、アダプター配列は、次世代配列決定技術を用いた分析に関与する配列である。一部の実施形態では、アダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａベース配列決定技術のためのＰ５（配列番号６２）および／またはＰ７（配列番号６３）配列である。一部の実施形態では、アダプター配列は、イオントレント配列決定技術に適合するＰ１（配列番号６４）およびＡ（配列番号６５）である。
【００２５】
一部の実施形態では、目的の遺伝子領域と未知の融合パートナーとの間で起こった遺伝子再構成事象を包含する核酸を調製するための方法が提供される。したがって、より一般には、隣接領域（例えば、その隣接領域の配列が決定されることになる）の次に標的領域を有する核酸を調製および評価するための方法が本明細書に提供される。一部の場合では、標的領域は、疾患を引き起こす融合タンパク質を生じさせる遺伝子再構成のホットスポットである既知の遺伝子（例えば、癌遺伝子）の領域である。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、融合事象の位置、および未知の融合パートナーの配列の両方を同定するのに使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、既知の標的配列の３’で起こった遺伝子再構成を増幅するのに使用することができる。一部の実施形態では、方法は、既知の標的遺伝子座の５’で起こった遺伝子再構成を増幅するのに使用することができる。他の実施形態では、方法は、逆位、欠失、または転座事象を同定するのに使用することができる。一部の実施形態では、標的核酸は、メッセンジャーＲＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は、染色体ＤＮＡセグメントである。本明細書に提供する方法は、ゲノムＤＮＡを単離し、これらの融合物と関連したブレイクポイントを含有する遺伝子座を増幅することによってＤＮＡレベルでこれらの再構成を包含する核酸を調製するのに使用することができる。他の実施形態では、本明細書に提供する方法は、細胞ＲＮＡを単離し、これらの再構成を含有する遺伝子座内でコードされる融合ｍＲＮＡを増幅することによってＲＮＡレベルでこれらの再構成を包含する核酸を調製するのに使用することができる。一部の実施形態では、方法は、がんと関連したＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＦＧＦＲ３、およびＡＬＫ融合物を評価するのに使用され得る。
【００２６】
以下の表は、本明細書に提供する方法を使用して調べられ得る遺伝子再構成の例のさらなる限定されないリストを提供する。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
一部の実施形態では、隣接領域（例えば、未知の配列内容の隣接領域）の５’に標的領域を有する核酸を調製するための方法が提供される。例えば、図１は、隣接領域の５’に標的領域を有する核酸を調製するための例示的なプロセスを例示する。ステップ１０１で、最初のＲＮＡが鋳型分子として得られるか、または提供される。ＲＮＡ鋳型は、異なるハイブリダイゼーション配列の５’にある共通配列を共有する複数のオリゴヌクレオチドに曝露される。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドによって共有される共通配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列も含有する。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション配列の少なくとも１つは、ＲＮＡ鋳型の領域にハイブリダイズし、第１の逆転写酵素反応をプライミングして最初のＲＮＡに相補的であるＤＮＡ分子を生成するように機能する。ステップ１０２で、最初のＲＮＡ鋳型が、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨによって）。ＲＮａｓｅＨが、提供した例で使用されていることが理解されるが、ＲＮａｓｅ活性を有する多くの酵素が、本明細書に記載するように使用され得る。
【００２９】
ステップ１０３では、残りのＤＮＡ分子が、１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチドによって接触され、その結果、標的特異的オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡの領域にハイブリダイズし、伸長されて相補的ＤＮＡ鎖を合成する。一部の実施形態では、この反応は、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＤＮＡポリメラーゼによって実行される。一部の実施形態では、この反応は、やはりＤＮＡポリメラーゼ活性を有する二重機能逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ逆転写酵素）によって実行される。しかし、他の適切なポリメラーゼ酵素も、本明細書に記載するように使用され得ることが理解されるはずである。ステップ１０４では、ＲＮＡポリメラーゼが、共通配列内に含有されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用して、ＤＮＡ鋳型に相補的なＲＮＡ分子を転写する。一部の実施形態では、ステップ１０１〜１０４は、それぞれが、ステップ１０１において鋳型として働くステップ１０４から生じる相補的ＲＮＡ分子から始まる複数のサイクルによって繰り返すことができる。転写されたＲＮＡは、ステップ１０５で引き続いて精製されてもよい。
【００３０】
ステップ１０６では、次いで５’共通配列を含有する精製されたＲＮＡが、１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチドによって接触される。標的特異的オリゴヌクレオチド＃１は、標的配列において相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、鋳型依存性逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ１０７では、ＲＮＡ鋳型が、ＲＮａｓｅＨの相補的ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅ活性によって）。ステップ１０８では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列の５’にＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。オリゴヌクレオチドは、反応におけるＤＮＡポリメラーゼの活性によって伸長されて、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ１０９では、ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用して、相補的ＲＮＡ分子を転写する。ステップ１０６〜１０９は、それぞれが、ステップ１０６で鋳型として働くステップ１０９から生じる相補的ＲＮＡ分子から始まる複数のサイクルによって繰り返され、こうして、ステップ１０９でＲＮＡを増幅する。
【００３１】
一部の実施形態では、１０６〜１０９を通じたサイクルの数は、等温反応の持続時間によって少なくとも部分的に影響を受けることが理解されるはずである。さらに、一部の実施形態では、プロセスがステップ１０９を通じてサイクルされるにつれて、生成されるＤＮＡ鋳型が蓄積し、その結果、最後のサイクルは、出発材料と比べてＲＮＡ分子の指数関数的に増幅されたプールをもたらす。反応１０９からのＲＮＡ分子はまた、後続のステップのための調製においてステップ１１０のように精製され得る。一部の実施形態では、ステップ１０１〜１０９は、単一の反応管中で連続して実行される。一部の実施形態では、ステップ１０１〜１０９に関与する構成要素のすべては、始めに、かつ反応の全体にわたって存在する。一部の実施形態では、ステップ１０１〜１０９は、等温反応として実行される。
【００３２】
任意選択で、増幅の第２のサイクルが実行されてもよく、このサイクルでは、ステップ１１０で精製されたＲＮＡ分子が１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチドと接触される。ステップ１１１では、標的特異的オリゴヌクレオチドが、標的配列において相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、鋳型依存性逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ１１２では、ＲＮＡ鋳型が、相補的ＤＮＡ鎖から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨによって）。ステップ１１３では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列の５’にＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されて、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ１１４では、ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用して、相補的ＲＮＡ分子を転写する。ステップ１１１〜１１４は、それぞれが、ステップ１１１で鋳型として働くステップ１１４から生じる相補的ＲＮＡ分子から始まる複数のサイクルによって繰り返される。ステップ１１４からのＲＮＡ分子はまた、後続のステップのための調製においてステップ１１５のように精製され得る。一部の実施形態では、増幅のさらなるサイクルを必要に応じて実行してもよい。
【００３３】
ステップ１１６では、精製されたＲＮＡが、標的特異的配列、および共通配列、バーコード、インデックス、またはアダプター配列を含み得る標的特異的配列の５’の追加の配列を含む１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチド＃２によって接触される。標的特異的オリゴヌクレオチドは、標的配列において相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、逆転写酵素反応をプライミングし、標的特異的オリゴヌクレオチド＃２によって提供される５’の追加の配列も含有する相補的ＤＮＡ鎖を生成する。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチド＃１および標的特異的オリゴヌクレオチド＃２は、別個の配列を含有する。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチド＃２の配列は、標的特異的オリゴヌクレオチド＃１の配列の３’／下流の鋳型ＤＮＡ分子内に存在し、その結果、反応が入れ子となる。
【００３４】
ステップ１１７では、ＲＮＡ鋳型鎖が酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨによって）。ステップ１１８では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列、ならびにバーコード、インデックス、およびアダプター配列を含めた任意の１種または複数の配列を含有し得る追加の配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズし、伸長されて相補的ＤＮＡ鎖を生成する。得られるＤＮＡ分子は、二本鎖であり、標的配列および適切な配列決定プラットフォームのためのアダプター配列を含有する追加の配列によって隣接されたその隣接領域を含有する。生成物は、反応１１９で精製され、分析の準備が整っている。任意選択で、ステップ１１８でオリゴヌクレオチドに提供される追加の配列は、相補的共通配列の５’にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有し得る。この場合、ステップ１１８の伸長反応の後に、ステップ１２０において、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用して相補的ＲＮＡ分子を転写する。ステップ１１６〜１１８は、それぞれが、ステップ１１６で鋳型として働くステップ１１８から生じる相補的ＲＮＡ分子から始まる複数のサイクルによって繰り返される。ステップ１２０からのＲＮＡ分子はまた、後続のステップのための調製においてステップ１２１のように精製され得る。
【００３５】
核酸の一端または両端に追加の配列を付加するために、さらなる増幅サイクルを実行してもよい。ステップ１２２では、ＲＮＡ分子の３’末端に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡとハイブリダイズし、鋳型依存性逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。一部の実施形態では、ステップ１２２のオリゴヌクレオチドは、追加の配列を含有する。一部の実施形態では、追加の配列は、バーコード、インデックス、および／またはアダプター配列を含む。ステップ１２３では、ＲＮＡ鋳型が、相補的ＤＮＡ鎖から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨによって）。ステップ１２４では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列、ならびにバーコード、インデックス、およびアダプター配列を含めた任意の１種または複数の配列を含有し得る追加の配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、伸長されて相補的ＤＮＡ鎖を生成し、それは、ステップ１２５で精製される。一部の実施形態では、得られるＤＮＡ分子は、二本鎖であり、標的配列および適切な配列決定プラットフォームのためのアダプター配列を含有する追加の配列によって隣接されたその隣接領域を含有する。
【００３６】
一部の実施形態では、隣接領域（例えば、未知の配列内容の隣接領域）の３’に標的領域を有する核酸を調製するための方法が提供される。例えば、図２は、隣接領域の３’にある標的領域を有する核酸を調製するための例示的なプロセスを例示する。最初のＲＮＡは、鋳型分子として得られるか、または提供される。ステップ２０１では、ＲＮＡ鋳型が、最初のＲＮＡの標的領域に相補的である、標的特異的オリゴヌクレオチド＃１と呼ばれる１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチドに曝露される。標的特異的オリゴヌクレオチド＃１は、ハイブリダイズし、第１の逆転写酵素反応をプライミングし、最初のＲＮＡに相補的であるＤＮＡ分子を生成する。ステップ２０２では、最初のＲＮＡ鋳型が、相補的なハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨによって）。ステップ２０３では、残りのＤＮＡ分子が、異なるハイブリダイゼーション配列（例えば、ランダムまたは疑似ランダム配列、異なる既定の配列のセットなど）の５’にある共通配列を共有する複数のオリゴヌクレオチドによって接触される。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドによって共有される共通配列も、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有する。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション配列の少なくとも１つがＤＮＡの領域にハイブリダイズし、伸長されて第２の相補的ＤＮＡ鎖を合成する。ステップ２０４では、ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を使用して、ＤＮＡ鋳型に相補的なＲＮＡ分子を転写する。転写されたＲＮＡは、ステップ２０５で引き続いて精製される。
【００３７】
ステップ２０６では、次いで５’共通配列を含有する精製されたＲＮＡが、１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチド＃１によって接触される。標的特異的オリゴヌクレオチドは、標的配列において相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、鋳型依存性逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。反応２０７では、ＲＮＡ鋳型が、相補的なハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨ活性）。ステップ２０８では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列の５’に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。オリゴヌクレオチドは、伸長されて相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ２０９では、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用して、相補的ＲＮＡ分子を転写する。ステップ２０６〜２０９は、それぞれが、ステップ２０６で鋳型として働くステップ２０９から生じる相補的ＲＮＡ分子から始まる複数のサイクルによって繰り返される。反応２０９からのＲＮＡ分子はまた、後続のステップのための調製においてステップ２１０のように精製され得る。一部の実施形態では、ステップ２０１〜２０９は、単一の反応管内で連続して実行される。一部の実施形態では、ステップ２０１〜２０９は、等温反応として実行される。
【００３８】
任意選択で、増幅の第２のサイクルが実行されてもよく、このサイクルでは、ステップ２１０で精製されたＲＮＡ分子が１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチド＃２によって接触される。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチドの使用は、特異性を加え、標的配列を含む核酸をさらに濃縮する。ステップ２１１では、標的特異的オリゴヌクレオチド＃２が、標的配列において相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、鋳型依存性逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ２１２では、ＲＮＡ鋳型が酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨ）。ステップ２１３では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列の５’に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長されて相補的ＤＮＡ鎖を生成する。一部の実施形態では、ＤＮＡ活性は、二重機能酵素、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素によってもたらされる。ステップ２１４では、ＲＮＡポリメラーゼが相補的ＲＮＡ分子を転写する。ステップ２１１〜２１４は、それぞれが、ステップ２１１で鋳型として働くステップ２１４から生じる相補的ＲＮＡ分子から始まる複数のサイクルによって繰り返される。ステップ２１４で生成されるＲＮＡ分子はまた、ステップ２１５で精製され得る。一部の実施形態では、増幅のさらなるサイクルが、必要に応じて実行され得る。
【００３９】
ステップ２１６では、精製されたＲＮＡが、標的特異的配列、ならびに共通領域、バーコード、インデックス、および／またはアダプター配列を含み得る５’の追加の配列を含む１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチド＃２によって接触される。しかし、追加の配列を、プロセス中の他のポイントで同様の手法を使用して組み込むことができることが理解されるはずである。標的特異的オリゴヌクレオチドは、標的配列において相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、逆転写酵素反応をプライミングし、標的特異的オリゴヌクレオチド＃２によってもたらされる５’の追加の配列も含有する相補的ＤＮＡ鎖を生成する。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチド＃１および標的特異的オリゴヌクレオチド＃２は、別個の配列を含有する。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチド＃２の配列は、標的特異的オリゴヌクレオチド＃１の配列の３’／下流の鋳型ＤＮＡ分子内に存在し、その結果、反応が入れ子となる。
【００４０】
ステップ２１７では、ＲＮＡ鋳型鎖が酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨ）。反応２１８では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列、ならびにバーコード、インデックス、およびアダプター配列を含有し得る追加の配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズし、伸長されて相補的ＤＮＡ鎖を生成する。得られるＤＮＡ分子は、二本鎖であり、標的配列および適切な配列決定プラットフォームのためのアダプター配列を含有する追加の配列によって隣接されたその隣接配列を含有する。この生成物は、ステップ２１９で精製され、分析の準備が整っている。
【００４１】
一部の実施形態では、図１および図２に表した方法は、例えば、図４と同様の様式で、同じ反応容器（例えば、管、カートリッジウェル）内で並行して行われ得る。
【００４２】
一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型を使用して、標的遺伝子座および隣接領域を含む核酸を調製するための方法が提供される。例えば、図３は、ＤＮＡ鋳型を使用して、標的遺伝子座および隣接領域を含む核酸を増幅するための例示的なプロセスを表す。最初のＤＮＡは、鋳型分子として得られるか、または提供される。ステップ３０１では、ＤＮＡが破壊されて断片にされる（例えば、配列決定にとって適切な長さの断片、例えば、長さが１００〜６００、１００〜１０００、１００〜１５００、またはそれ超の塩基対の間の範囲の断片）。ステップ３０２では、断片化されたＤＮＡの末端が修復され、終端のリン酸基が各５’末端に付加される。ステップ３０２ではまた、単一のアデノシンオーバーハングが、ターミナルトランスフェラーゼの活性によって各３’末端で作製される。終端のリン酸基およびアデノシンオーバーハングを使用して、二本鎖のアダプターが、ステップ３０３のように、ＤＮＡ断片のいずれかの末端上にライゲーションされる。一部の実施形態では、アダプター分子は、共通配列を含有し得る。一部の実施形態では、アダプター分子は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列も含有し、その結果、ライゲーション反応は、共通配列およびＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列によって両末端上に隣接した二本鎖ＤＮＡ分子をもたらす。
【００４３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、アダプター分子として働くオリゴヌクレオチド）は、これらの安定性および／またはオリゴヌクレオチドを組み込んでいる反応生成物の安定性を高めるための１つまたは複数の修飾を含有し得る。このような修飾の非限定的な例としては、塩基修飾（ｂａｓｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および主鎖修飾が挙げられる。一部の実施形態では、３’チミンオーバーハングにおけるホスホロチオエート結合または他の主鎖修飾の存在は、３’エキソヌクレアーゼ活性がオリゴヌクレオチドを平滑末端化することを防止する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドアダプター分子のボトム鎖（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔａｎｄ）は、後続のステップにおけるＰＣＲ／ＡＭＰが、遺伝子特異的でない生成物を作ることを防止する反転したデオキシチミンを有することができる。
【００４４】
ステップ３０４では、ＲＮＡポリメラーゼが、隣接しているＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の一方または両方を使用して転写して、一方向または両方向で相補的ＲＮＡ分子を生成する。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ＤＮＡ分子のプラス鎖およびマイナス鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｎｄｓ）の両方から合成される。一部の実施形態では、両方の鎖からの合成が有利である。なぜなら、合成されるＲＮＡが標的特異的オリゴヌクレオチドを使用して伸長されて、ＲＮＡ分子が合成される鎖に応じて単一のＤＮＡ鎖に沿って５’または３’方向に伸長され得るためである。したがって、一部の実施形態では、鋳型分子のプラス鎖およびマイナス鎖の両方からＲＮＡを作製すると、標的配列へのいずれかの方向で隣接する未知の配列の増幅および同定が促進される。
【００４５】
ステップ３０５では、ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ分子上の共通配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドによって接触される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列も含有する。ステップ３０５では、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ分子を生成する。ステップ３０６では、ＲＮＡ鋳型が、相補的なハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨ）。ステップ３０７では、残りのＤＮＡ分子が、１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチドによって接触される。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチドは、バーコード、インデックス、および／またはアダプター配列を含み得る追加の配列を含有する。標的特異的オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの標的領域にハイブリダイズし、伸長され、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ３０８では、ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ鋳型に相補的であるＲＮＡ分子を転写する。ステップ３０５〜３０８は、それぞれが、ステップ３０５で鋳型として働くステップ３０８から生じる相補的ＲＮＡ分子から始まる複数のサイクルによって繰り返される。ステップ３０８からのＲＮＡ分子はまた、後続のステップのための調製においてステップ３０９で精製され得る。一部の実施形態では、ステップ３０１〜３０９は、単一の反応管内で連続して実行される。一部の実施形態では、ステップ３０１〜３０９は、等温反応として実行される。
【００４６】
ステップ３１０では、精製されたＲＮＡが、１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチド＃２によって接触される。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチドは、バーコード、インデックス、およびアダプター配列を含めた追加の配列を含む。標的特異的オリゴヌクレオチド＃２は、ハイブリダイズし、逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ分子を生成する。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチド＃１および標的特異的オリゴヌクレオチド＃２は、同じ配列を含有する。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチド＃１および標的特異的オリゴヌクレオチド＃２は、別個の配列を含有する。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチド＃２の配列は、標的特異的オリゴヌクレオチド＃１の配列の３’／下流の鋳型ＤＮＡ分子内に存在し、その結果、反応が入れ子となる。
【００４７】
ステップ３１０から生じるＤＮＡ分子は、標的特異的オリゴヌクレオチド＃２にもたらされる追加の配列を含有し得る。ステップ３１１では、ＲＮＡ鋳型が酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨ）。残りのＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、バーコード、インデックス、およびアダプター配列を含めた追加の配列の任意の１種または複数を含有する。ステップ３１２では、オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ分子の共通配列にハイブリダイズし、伸長され、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ３１２のＤＮＡ産物は、二本鎖であり、標的領域および適切な配列決定プラットフォームのためのアダプター配列を含有する追加の配列によって隣接された隣接領域を含有する。この生成物は、ステップ３１３で精製され、分析の準備が整っている。
【００４８】
一部の実施形態では、隣接領域（例えば、未知の配列内容の隣接領域）によってその５’および／または３’末端に隣接されている標的領域を有する核酸を調製するための方法が提供される。例えば、図４は、５’および／または３’隣接領域を伴った標的領域を有する核酸を調製するための例示的なプロセスを例示する。ステップ４０１で、最初のＲＮＡは、鋳型分子として得られるか、または提供される。ＲＮＡ鋳型は、異なるハイブリダイゼーション配列の５’にある共通配列（共通配列＃１）を共有する複数のオリゴヌクレオチドに曝露される。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドによって共有される共通配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列も含有する。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション配列の少なくとも１つは、ＲＮＡ鋳型の領域にハイブリダイズし、第１の逆転写酵素反応をプライミングして最初のＲＮＡに相補的であるＤＮＡ分子を生成するように機能する。ステップ４０２で、最初のＲＮＡ鋳型が、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨによって）。ＲＮａｓｅＨが、提供した例で使用されていることが理解されるが、ＲＮａｓｅ活性を有する多くの酵素が、本明細書に記載するように使用され得る。
【００４９】
ステップ４０３では、残りのＤＮＡ分子が、異なるハイブリダイゼーション配列（例えば、ランダムまたは疑似ランダム配列、異なる既定の配列のセットなど）の５’にある共通配列を共有する複数のオリゴヌクレオチドによって接触される。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドによって共有される共通配列も、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有する。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション配列の少なくとも１つがＤＮＡの領域にハイブリダイズし、伸長されて第２の相補的ＤＮＡ鎖を合成する。ステップ４０４では、ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を使用して、ＤＮＡ鋳型に相補的なＲＮＡ分子を転写する。一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＤＮＡ鋳型の両末端に存在する。一部の実施形態では、両方のＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＲＮＡポリメラーゼによって利用されて、相補的ＲＮＡの両方の鎖を作製する。転写されたＲＮＡは、ステップ４０５で引き続いて精製される。
【００５０】
ステップ４０６では、一方または両方の鋳型鎖から合成された精製ＲＮＡが、１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチド＃１によって接触される。標的特異的オリゴヌクレオチドは、標的配列において（例えば、共通配列において）相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、鋳型依存性逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。反応４０７では、ＲＮＡ鋳型が、相補的なハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨ活性）。ステップ４０８では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列の５’に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。オリゴヌクレオチドは、伸長されて相補的ＤＮＡ鎖を生成する。ステップ４０９では、ＲＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用して相補的ＲＮＡ分子を転写する。ステップ４０６〜４０９は、それぞれが、ステップ４０６で鋳型として働くステップ４０９から生じる相補的ＲＮＡ分子から始まる複数のサイクルによって繰り返される。反応４０９からのＲＮＡ分子はまた、後続のステップのための調製においてステップ４１０で精製され得る。一部の実施形態では、ステップ４０１〜４０９は、単一の反応管内で連続して実行される。一部の実施形態では、ステップ４０１〜４０９は、等温反応として実行される。
【００５１】
ステップ４１１では、標的特異的配列の５’に追加の配列を含有する１つまたは複数の標的特異的オリゴヌクレオチドによる精製ＲＮＡ。一部の実施形態では、追加の配列としては、それだけに限らないが、バーコード、インデックス、および／またはアダプター配列が挙げられる。標的特異的オリゴヌクレオチドは、標的配列において相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、鋳型依存性逆転写酵素反応をプライミングし、相補的ＤＮＡ鎖を生成する。反応４１２では、ＲＮＡ鋳型が、相補的なハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子から酵素的に分解される（例えば、ＲＮａｓｅＨ活性）。ステップ４１３では、残りのＤＮＡ分子が、ＤＮＡ分子の３’末端に存在する共通配列に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドによって接触される。一部の実施形態では、ステップ４１３のオリゴヌクレオチドは、それだけに限らないが、バーコード、インデックス、およびアダプター配列を含めた追加の配列を含有する。オリゴヌクレオチドは、伸長されて相補的ＤＮＡ鎖を生成し、それは、ステップ４１４で精製される。一部の実施形態では、得られるＤＮＡ分子は、二本鎖であり、標的配列、および適切な配列決定プラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム、イオントレントプラットフォームなど）のためのアダプター配列を含有する追加の配列によって隣接されたその隣接領域を含有する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、ヌクレオチド間連結によって一緒に共有結合的に連結された複数のヌクレオチドを含むポリマー分子を指す。一部の実施形態では、核酸は、ヌクレオチド間連結によって一緒に共有結合的に連結された複数のリボヌクレオチドによって形成されるリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の実施形態では、核酸は、ヌクレオチド間連結によって一緒に共有結合的に連結された複数のデオキシリボヌクレオチドによって形成されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。一部の実施形態では、核酸は、１種または複数のヌクレオチド類似体（架橋型ヌクレオチドなど）、またはタグ付きもしくは標識ヌクレオチドを含めた修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然に存在するヌクレオチドのみを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然に存在しないヌクレオチドのみを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの組み合わせを含む。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖領域および二本鎖領域の組み合わせを有する。用語の核酸は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体（架橋型ヌクレオチドなど）、および／またはタグ付きもしくは標識ヌクレオチドを含めた修飾ヌクレオチドの混合物を有するハイブリッド分子も包含する。一部の態様では、核酸の破壊が、より小さい核酸断片を作製するのに有利であり得る。一部の実施形態では、破壊は、以下のうちのいずれかによって実行される：超音波処理（すなわち、流体力学的せん断）、音響せん断（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｓｈｅａｒｉｎｇ）、針せん断（ｎｅｅｄｌｅ  ｓｈｅａｒｉｎｇ）、フレンチ圧力セル（Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）、または酵素（例えば、制限）消化。本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによって核酸鋳型の転写を開始する核酸の領域を指す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、短い核酸を指す。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが２〜２５０ヌクレオチド、長さが２〜１００ヌクレオチド、長さが１０〜１００ヌクレオチド、長さが１０〜５０ヌクレオチド、または長さが１０〜３０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、または２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の少なくとも一部と相補的な塩基対を形成することによって標的核酸とハイブリダイズするハイブリダイゼーション配列を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、伸長反応をプライミングすることができる３’末端を有する。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、長さが６〜５０ヌクレオチド、長さが６〜３５ヌクレオチド、長さが６〜２０ヌクレオチド、長さが１０〜２５ヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、一本鎖形態の核酸分子またはそのハイブリダイゼーション配列が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合、別の核酸、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡと「ハイブリダイズする」ことができる。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が十分に相補的な配列を含有し、かつハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能であるとき、起こる。一部の実施形態では、核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、および相補性の程度、ＧＣ含有量、および他のパラメータに依存する。一部の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値が大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。用語「相補的な」は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記述する。例えば、ＤＭＡに関して、アデノシンは、チミンに対して相補的であり、シトシンは、グアニンに対して相補的である。
【００５５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのＧＣ含有量は、およそ２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、またはそれ超である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのＧＣ含有量は、２０％〜８０％、２０％〜７０％、３５％〜６５％、４０％〜６０％、または４５％〜５５％の範囲内である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３’末端に複数（例えば、２〜３、２〜４、２〜５、またはそれ超）のグアニンまたはシトシンヌクレオチドを含有する（例えば、ＧＣクランプ（ＧＣ  ｃｌａｍｐ））。
【００５６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端が修飾される。一部の実施形態では、１つまたは複数の内部ヌクレオチドが修飾される。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ヌクレアーゼ媒介分解に対する耐性、そのハイブリダイゼーションパラメータなどを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル（ｃａｒｂｏｘｙｈｙｄｒｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌ））ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、および２，６−ジアミノプリンから選択される修飾塩基部分を含み得る。修飾のさらなる例としては、メチル化、「ｃａｐ」の組込み、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似体との置換、ならびにヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結を有するもの（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、および荷電連結を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）など、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。さらに、本明細書のオリゴヌクレオチドは、一部の実施形態では、直接または間接的に検出可能な信号を提供することができる標識で修飾される場合もある。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光性分子、ビオチン、およびその他が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドは、５’ビオチンリンカーまたは他の適当なリンカーを含有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、適切な制限消化酵素を用いた切断がリンカーを除去するように制限消化配列を含有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端は、ビーズまたは他の支持体、例えば、フローセル担体に結合した核酸に相補的である核酸配列を含有する。
【００５７】
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドが共通の反応において組み合わされる場合、オリゴヌクレオチドは、ホモまたはヘテロ多量体（例えば、ホモまたはヘテロ二量体）の形成を最小限にするか、または防止するように設計される。
【００５８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸の標的配列と相補的であるハイブリダイゼーション配列を含み、ここで標的核酸は、核酸の既知の配列と隣接配列との間の接合部から所定の距離内にある。一部の実施形態では、接合部は、ゲノムアセンブリー中の断片間の接合部である。一部の実施形態では、接合部は、２つの核酸間の融合をもたらすブレイクポイント（例えば、ゲノム再構成から生じるブレイクポイント）である。一部の実施形態では、標的配列の末端は、核酸の既知の配列と隣接配列（例えば、未知の配列）との間の接合部の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、またはそれ超のヌクレオチド内にある。
【００５９】
一部の実施形態では、鋳型上で同じ方向または配向で異なる標的配列（例えば、標的配列＃１および標的配列＃２）に相補的であるハイブリダイゼーション配列を有する標的特異的オリゴヌクレオチドの本明細書に開示されている調製方法における使用は、別の方法では反対側のプライマーで標的化することが困難であり得る鋳型の増幅を促進する。このような実施形態では、同じ方向または配向で異なる標的配列に相補的であるハイブリダイゼーション配列を有する標的特異的オリゴヌクレオチドを使用すると、標的化された領域にわたってカバレッジを獲得するために反対方向で標的配列に相補的であるハイブリダイゼーション配列を有する標的特異的オリゴヌクレオチドを利用することなく、鋳型の既知の領域と相補的な２つのハイブリダイゼーション配列の特異性の恩恵がもたらされる。したがって、一部の実施形態では、同じ方向または配向で標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用すると、共通の反応において長い鋳型領域にわたるタイリングが促進される。
【００６０】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、標的オリゴヌクレオチド、異なるハイブリダイゼーション配列を有するオリゴヌクレオチド）は、追加の機能的配列も含有し得る。一部の実施形態では、追加の配列は、その５’末端で追加の配列を含むオリゴヌクレオチドを使用して標的配列の増幅によって核酸中に組み込まれる。一部の実施形態では、共通配列を含有するオリゴヌクレオチドも、追加の配列を含有する。一部の実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチドも、追加の配列を含有する。一部の実施形態では、追加の配列は、以下の非限定的な例の１種または複数を含む：識別子配列（例えば、バーコード、インデックス）、配列決定プライマーハイブリダイゼーション配列（例えば、Ｒｄ１）、およびアダプター配列。一部の実施形態では、アダプター配列は、次世代配列決定システムで使用される配列である。一部の実施形態では、アダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａベース配列決定技術のためのＰ５（配列番号６２）およびＰ７（配列番号６３）配列である。一部の実施形態では、アダプター配列は、イオントレント配列決定技術に適合するＰ１（配列番号６４）およびＡ（配列番号６５）である。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「バーコード」または「インデックス」配列は、核酸の供給源または位置識別子として働くヌクレオチド配列である。例えば、バーコードまたはインデックス配列は、処理され、配列決定される核酸鋳型が得られる患者を同定するように働き得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ断片中に組み込まれているバーコードまたはインデックス配列は、単一のフローセルで複数の異なる試料を配列決定することを可能にする。一部の実施形態では、インデックス配列は、個々の配列決定反応を検出する目的で配列イメージャー（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｍａｇｅｒ）を方向付けるために使用することができる。一部の実施形態では、バーコードまたはインデックス配列は、長さが２〜２５ヌクレオチド、長さが２〜１５ヌクレオチド、長さが２〜１０ヌクレオチド、長さが２〜６ヌクレオチドであり得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「アダプター」配列は、次世代配列決定プラットフォーム、または核酸を固定化する目的のための他の担体に核酸（例えば、増幅ＤＮＡ産物）を付着させるのに使用される配列を指す。一部の実施形態では、アダプター配列は、配列決定プライマーハイブリダイゼーション配列を含有する。一部の実施形態では、アダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａベース配列決定のためのＰ５（配列番号６２）および／またはＰ７（配列番号６３）配列を含有する。一部の実施形態では、アダプター配列は、イオントレント配列決定技術に適合するＰ１（配列番号６４）および／またはＡ（配列番号６５）配列を含有する。一部の実施形態では、アダプター配列は、長さが４〜５０ヌクレオチド、長さが４〜３０ヌクレオチド、長さが４〜２０ヌクレオチド、長さが１５〜３０ヌクレオチドであり得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「増幅」または「増幅すること」は、核酸鋳型のコピーの数を増加させるプロセスを指す。一部の実施形態では、増幅は、鋳型から核酸を合成する１種または複数のポリメラーゼの使用を伴う。一部の実施形態では、増幅は、等温条件下で達成される。一部の実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応においてなど、複数の温度サイクルを伴う条件下で達成される。一部の実施形態では、増幅は、その３’末端で鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドによってプライミングされる１つまたは複数の鋳型依存性伸長を伴う。一部の実施形態では、鋳型依存性伸長は、逆転写酵素によって実施される。一部の実施形態では、鋳型依存性伸長は、ＤＮＡポリメラーゼによって実施される。一部の実施形態では、鋳型依存性伸長は、やはりＤＮＡポリメラーゼ活性を含有する逆転写酵素によって実行される。鋳型依存性伸長反応は、鋳型として任意の適切な核酸を使用して実施され得る。一部の実施形態では、鋳型依存性伸長は、ＤＮＡ鋳型上で実施される。一部の実施形態では、鋳型依存性伸長は、ＲＮＡ鋳型上で実施される。一部の実施形態では、増幅は、１つまたは複数の転写反応を伴う。一部の実施形態では、増幅は、１つまたは複数の転写反応と組み合わせた１つまたは複数の鋳型依存性伸長を伴う。一部の実施形態では、増幅は、核酸鋳型のコピーの数の線形増加をもたらす。一部の実施形態では、線形増幅では、核酸の１つまたは複数のコピーが１種または複数の核酸鋳型の単一のセットから生成される。一部の実施形態では、増幅は、核酸鋳型のコピーの数の指数関数的増加をもたらす。一部の実施形態では、指数関数的な増幅では、核酸の新しく形成されたコピーは、鋳型のさらなるコピーを生成するための鋳型として働き、核酸の指数関数的に増幅されたプールをもたらす。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「鋳型」は、核酸合成、例えば、鋳型依存性伸長または転写反応の基質として働く二本鎖または一本鎖核酸を指す。二本鎖ＤＮＡ分子の場合では、その２本の鎖の少なくとも一部の変性が、核酸合成の前に、またはそれと併せて実行され得る。一部の実施形態では、鋳型は、一本鎖であり、変性は、核酸合成の前にも、核酸合成と併せても必要とされない。一部の実施形態では、核酸鋳型の一部に相補的なオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション配列を介して鋳型にハイブリダイズされる場合、適切なポリメラーゼが鋳型に相補的な核酸を合成し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型のアンチセンス鎖に相補的な核酸をプロモーター領域から合成し得る。一部の実施形態では、鋳型は、最大で１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、またはそれ超のヌクレオチドの範囲内の長さを有する核酸である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「鋳型依存性伸長」は、その３’末端で、ハイブリダイゼーション配列によって一本鎖核酸鋳型の相補的配列にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドが、相補的なヌクレオチドの逐次の共有結合によってオリゴヌクレオチドの３’末端に酵素的に伸長され、鋳型に相補的な新しい核酸を形成するプロセスを指す。一部の実施形態では、鋳型依存性伸長は、鋳型にハイブリダイズされた伸長産物を伴った部分的または完全に二本鎖の核酸をもたらす。
【００６６】
一部の実施形態では、伸長反応は、鋳型核酸の相補的領域にハイブリダイズし、伸長反応をプライミングして相補的ＤＮＡ鎖を作製するように機能するオリゴヌクレオチドを伴う。一部の実施形態では、鋳型からの相補的ＤＮＡ鎖の合成は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって実行され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩが、酵素が鋳型依存性伸長を実行する条件下で使用される。この機能も実行することができるＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｅｏｎｉｘ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＶｅｒａＳｅｑ  ＵＬｔｒａポリメラーゼ、およびＥｎｚＳｃｒｉｐｔが挙げられる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素でない。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型に対して作用する。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型に対して作用する。
【００６７】
一部の実施形態では、伸長反応は、相補的ＤＮＡ分子を生成するためにＲＮＡに対して実行される逆転写を伴う（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）。一部の実施形態では、マウスモロニー（ｍｏｌｏｎｙ）マウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）に由来する逆転写酵素が使用される場合がある。それだけに限らないが、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、または本明細書に開示されているその他を含めた多くの他の逆転写酵素が使用され得ることが理解されるはずである。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「伸長産物」は、核酸鋳型に相補的であり、鋳型依存性伸長によって形成される核酸を指す。一部の実施形態では、核酸鋳型とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列の３’末端は、核酸鋳型に相補的な新しい核酸をもたらす鋳型依存性伸長のプライマーとして働く。伸長産物は、それが生成された核酸鋳型に完全または部分的に相補的であり得る。
【００６９】
一部の実施形態では、伸長産物は、標的核酸と相補的であるハイブリダイゼーション配列、および鋳型と非相補的であり、伸長産物の５’末端中に組み込まれるハイブリダイゼーション配列の５’の追加の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用して生成される。このような追加の配列は、伸長産物中に所望の特徴を組み込む目的で、タグ、バーコード、インデックス、アダプター、または他の配列を含み得る。一部の実施形態では、伸長反応が鋳型の全長にわたり伸長しない場合、部分的に相補的な伸長産物が生成される。
【００７０】
一部の実施形態では、部分的に相補的な伸長産物は、鋳型の内部配列でプライミングされる。一部の実施形態では、部分的に相補的な伸長産物は、鋳型配列と完全に相補的である３’領域、および非相補的である５’領域を有し、非相補的な５’領域は、伸長産物を生成した伸長反応をプライミングしたオリゴヌクレオチドの追加の配列である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「等温反応」は、比較的均一な温度条件下で鋳型または鋳型の一部のコピーを生成するように核酸鋳型に対して作用する１種または複数の酵素を伴う反応を指す。一部の実施形態では、等温反応は、配列決定のための調製において比較的均一な温度条件下でＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子を指数関数的に増幅することを伴う。一部の実施形態では、等温反応は、定常状態反応条件下で、比較的均一な温度条件下で実行される。一部の実施形態では、等温反応は、比較的均一な温度で実行される１つまたは複数のラウンドの増幅を伴う。一部の実施形態では、等温反応は、３５℃〜５０℃、３８℃〜４２℃、３９℃〜４２℃、または３５℃〜４５℃の範囲内（例えば、約４１℃）で実行される。一部の実施形態では、等温反応は、約３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、または５０℃で実行される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ」は、核酸を合成する酵素を指す。この用語は、とりわけ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素を包含する。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、その３’末端で鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドによってプライミングされる鋳型依存性伸長によって核酸を合成する。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、転写反応によって核酸を合成する。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、適当な緩衝液条件下で、３５℃〜８０℃、または３５℃〜７５℃、または３５℃〜７０℃、または３５℃〜７０℃、または３５℃〜６５℃、または３５℃〜６０℃、または３５℃〜５５℃、または３５℃〜５０℃、または３５℃〜４５℃、または４０℃〜７０℃、または５０℃〜６０℃、または５５℃〜６５℃の範囲内の温度で核酸を最適に合成する。
【００７３】
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。一部の実施形態では、熱安定性ポリメラーゼは、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔ．ｂｏｃｋｉａｎｕｓ、Ｔ．ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｃｏｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ、Ｐ．ｗｏｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、またはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐｅｃ．に由来する好熱性真正細菌または古細菌ポリメラーゼである。
【００７４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ＲＮＡの分解を伴う。このような酵素の１つの非限定的な例は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を分解するＲＮａｓｅＨである。リボヌクレアーゼの追加の例としては、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、およびＲＮａｓｅＬが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、非酵素的方法を使用して分解される。それだけに限らないがＮａＯＨの添加を含めた多くの方法によって達成され得る溶液のｐＨの増大、および反応の温度の増大を含むが、これらに限られない、反応でＲＮＡを分解するための多くの方法および試薬が存在することが理解される。一部の実施形態では、反応のｐＨは、１０．０のｐＨにＮａＯＨを添加することによって増大される。
【００７５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、反応における過剰のオリゴヌクレオチドおよび他の核酸の除去または分解を伴う。一部の実施形態では、核酸は、酵素的に分解される。一部の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩが、酵素が示された活性を実行するのを可能にする緩衝液および条件の存在下で一本鎖核酸を分解するのに使用される。
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ＤＮＡ断片のいずれかの末端との二本鎖アダプターのライゲーションを伴う。この場面では、ライゲーションは、２つの核酸間の共有結合性ホスホジエステル結合を指す。一部の実施形態では、ライゲーションは、２つの二本鎖ＤＮＡ分子間、例えば、二本鎖アダプターと二本鎖ＤＮＡ断片との間で行われることになり、その結果、共有結合性ホスホジエステル結合がＤＮＡの両方の鎖間で形成される。一部の実施形態では、ライゲーション活性は、リガーゼによって酵素的に実行される。リガーゼ活性を有する酵素の以下の限定されないリストのうちのいずれも、この反応を実行するのに使用され得る：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｗ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ。
【００７７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を核酸と接合することを伴う。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを付加すると、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を実行し、相補的なＲＮＡ鎖を生成するＲＮＡポリメラーゼによる認識が可能になる。このようなプロモーターの例としては、それだけに限らないが、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６プロモーターが挙げられる。
【００７８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、後続のステップまたは分析のための調製において反応混合物からの核酸の精製を伴う。一部の実施形態では、ＲＮＡ精製が実行される。一部の実施形態では、任意の適切な精製法が使用され得る。一部の実施形態では、ビーズベース固相抽出を使用するＡＭＰｕｒｅキットが使用され得る。一部の実施形態では、追加の方法には、それだけに限らないが、他の固相抽出法（例えば、カラムベース法）および液液抽出法（例えば、フェノール−クロロホルム）が含まれる。
【００７９】
一部の実施形態では、調製反応および／または配列決定反応を実行するのに必要な様々な試薬、ならびに本明細書に示した方法による使用の指示書を含むキットが提供される。本明細書に開示されている酵素、オリゴヌクレオチド、核酸、または試薬のいずれも、任意の組み合わせでキット中に処方され得る。キットの一部の実施形態では、少なくとも１つの容器は、再使用可能な容器である。キットの一部の実施形態では、少なくとも１つの容器は、使い捨ての容器である。キットの一部の実施形態では、少なくとも１つの容器は、管、ボトル、またはカートリッジ（例えば、マルチウェルカートリッジ）である。一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のプロセスがカートリッジ中の異なる位置で実行されるように構成されている。一部の実施形態では、カートリッジは、核酸を調製するためのステップまたはプロセスの各セットについて完全に乾燥させたかもしくは凍結乾燥させた構成要素を充填され得るか、またはそれを含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるキットは、管、例えば、スナップトップ（ｓｎａｐ−ｔｏｐ）管またはスクリュートップ（ｓｃｒｅｗ−ｔｏｐ）管を含む。キットの一部の実施形態では、ボトルは、スナップトップボトルまたはスクリュートップボトルである。一部の実施形態では、少なくとも１つの容器は、ガラスバイアルである。一部の実施形態では、容器は、ボックスまたはパッケージ内に一緒に収容される。一部の実施形態では、キットは、核酸を調製する（例えば、実施例１〜３に概説される１つまたは複数のステップに従って）ための指示書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、特定の温度（例えば、０℃未満、室温など）で少なくとも１つの容器を貯蔵するための指示書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、キット中に提供されている試薬を使用して本明細書に開示されている方法のいずれかを実施するための指示書をさらに含む。
【００８０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているキットは、研究目的にとって有用であるが、他の実施形態では、本明細書に開示されているキットは、診断目的にとって有用である。したがって、一部の実施形態では、キットは、障害、例えば、がんを有すると個体を診断するか、または診断することを助ける方法において有用な１種または複数の試薬または構成要素を含有する。
【００８１】
本発明の例示的な実施形態を、以下の実施例によってより詳細に記載する。これらの実施形態は、当業者が例示的な実施形態に限定されないことを認識することになる本発明の例示的なものである。
【実施例】
【００８２】
実施例１：３’融合事象を増幅するためのタグ付きランダマーおよび標的化された第２の鎖のオリゴヌクレオチドとともに逆転写酵素を使用する等温方法
増幅＃１
未知の融合パートナーとの３’融合事象を増幅することに向けた第１のステップとして、第１の増幅反応を、ホルマリン固定組織試料から得たＲＮＡを使用して実行した。
【００８３】
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・精製ＲＮＡ（５０ｎｇ）  １μＬ
・３μΜ  Ｖ３−ＦＧＦＲ  ＧＳＰ１  １μＬ
・５μΜ  Ｔ７−Ｎ９ランダマー  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ    ２μＬ  。
【００８４】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【００８５】
一部の実施形態では、酵素ミックスを使用する。一部の実施形態では、酵素ミックスを凍結乾燥し、使用前に再構成する。一部の実施形態では、酵素ミックスは、２、３、またはそれ超の酵素を含む。一部の実施形態では、酵素ミックスは、高分子量糖ミックス（例えば、デキストラン）をさらに含む。一部の実施形態では、酵素ミックスは、等温ＲＮＡ増幅のための酵素混合物である。一部の実施形態では、酵素ミックスは、逆転写酵素（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素）、ＲＮａｓｅＨ、およびＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）を含む。一部の実施形態では、酵素ミックスは、逆転写酵素４〜１０ユニット、ＲＮａｓｅＨ０．０１〜０．１ユニット、およびＲＮＡポリメラーゼ１０〜４０ユニットを含む。
【００８６】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【００８７】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
以下のものを上記反応物に添加した。
・ＡＭＰｕｒｅビーズ  ３６μＬ  。
【００８８】
懸濁液を十分混合し、室温で５分間インキュベートした。磁石を２〜４分使用してビーズを収集し、溶液は、透明になった。上清を廃棄し、ビーズを磁石上で７０％エタノール２００μＬで３回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを室温で１０分間乾燥させた。最後に、磁石から管を取り出し、ＡＭＰｕｒｅキットに含まれていた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液１５μＬ中にビーズを再懸濁させることによって、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡ−ビーズ溶液を磁石上に２分間配置し、次いで新鮮な管にビーズを移さないようにして、ＲＮＡ溶液を新鮮なＰＣＲ管に移した。
【００８９】
増幅＃２
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅反応＃１からの２μＬ
・３μΜ  Ｖ３−ＦＧＦＲ  ＧＳＰ１  １μＬ
・５μΜ  Ｔ７−ｃＲＮＡ  Ｒ２Ｐ  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  １μＬ  。
【００９０】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【００９１】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【００９２】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
ＲＮＡ精製を上記の通り実行し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０溶出緩衝液１５μＬ中にＲＮＡを溶出した。
【００９３】
増幅＃３
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅反応＃２からの１μＬ
・３μΜ  Ｖ３−ＦＧＦＲ  ＧＳＰ２  １μＬ
・５μΜ  Ｔ７−ｃＲＮＡ  Ｒ２Ｐ  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  ２μＬ  。
【００９４】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【００９５】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【００９６】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
ＲＮＡ精製を上記の通り実行し、今回は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液６μＬ中にＲＮＡを溶出した。
【００９７】
増幅＃４
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅＃３からの５μＬ
・１０μΜ  Ρ５  １μＬ
・１０μΜ  Ρ７  １μＬ  。
【００９８】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【００９９】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１００】
ＤＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＤＮＡ精製
以下のものを上記反応物に添加した。
・ＡＭＰｕｒｅビーズ  ３６μＬ  。
【０１０１】
懸濁液を十分混合し、室温で５分間インキュベートした。磁石を２〜４分使用してビーズを収集し、溶液は、透明になった。上清を廃棄し、ビーズを磁石上で７０％エタノール２００μＬで３回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを室温で５分間乾燥させた。最後に、磁石から管を取り出し、ＡＭＰｕｒｅキットに含まれていた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液１５μＬ中にビーズを再懸濁させることによって、ＤＮＡを溶出した。ＲＮＡ−ビーズ溶液を磁石上に２分間配置した。次いで、新鮮な管にビーズを移さないようにして、ＤＮＡ溶液を新鮮なＰＣＲ管に移した。そのとき、この最終的なＤＮＡ産物は、配列決定の準備が整っている。
【０１０２】
実施例２：５’融合事象を増幅するためのタグ付きランダマーおよび標的化された第２の鎖のオリゴヌクレオチドとともに逆転写酵素を使用する等温方法
増幅＃１
未知の融合パートナーとの５’融合事象を含有する遺伝子座を増幅することに向けた第１のステップは、標的／遺伝子特異的プライマー（複数可）を使用して得られた試料ＲＮＡに対して逆転写酵素事象を実行することである。
【０１０３】
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・精製ＲＮＡ（５０ｎｇ）  １μＬ
・３μΜ  Ｖ３−ＦＧＦＲ  ＧＳＰ１  １μＬ
・５μΜ  Τ７−Ν９ランダマー  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  ２μＬ  。
【０１０４】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１０５】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１０６】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
以下のものを上記反応物に添加した。
・ＡＭＰｕｒｅビーズ  ３６μＬ  。
【０１０７】
懸濁液を十分混合し、室温で５分間インキュベートした。磁石を２〜４分使用してビーズを収集し、溶液は、透明になった。上清を廃棄し、ビーズを磁石上で７０％エタノール２００μＬで３回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを室温で１０分間乾燥させた。最後に、磁石から管を取り出し、ＡＭＰｕｒｅキットに含まれていた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液１５μＬ中にビーズを再懸濁させることによって、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡ−ビーズ溶液を磁石上に２分間配置し、次いで新鮮な管にビーズを移さないようにして、ＲＮＡ溶液を新鮮なＰＣＲ管に移した。
【０１０８】
増幅＃２
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅＃１からの２μＬ
・３μΜ  Ｖ３−ＦＧＦＲ  ＧＳＰ１  １μＬ
・５μΜ  Ｔ７−ｃＲＮＡ  Ｒ２Ｐ  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  １μＬ  。
【０１０９】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１１０】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１１１】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
ＲＮＡ精製を上記の通り実行し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０溶出緩衝液１５μＬ中にＲＮＡを溶出した。
【０１１２】
増幅＃３
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅＃２からの１μＬ
・３μΜ  Ｖ３−ＦＧＦＲ  ＧＳＰ２  １μＬ
・５μＭ  Τ７−ｃＲΝΑ  Ｒ２Ｐ  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  ２μＬ  。
【０１１３】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１１４】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１１５】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
ＲＮＡ精製を上記の通り実行し、今回は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液６μＬ中にＲＮＡを溶出した。
【０１１６】
増幅＃４
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅＃３からの５μＬ
・１０μΜ  Ｐ５  １μＬ
・１０μΜ  Ρ７  １μＬ  。
【０１１７】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１１８】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１１９】
ＤＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＤＮＡ精製
以下のものを上記反応物に添加した。
・ＡＭＰｕｒｅビーズ  ３６μＬ  。
【０１２０】
懸濁液を十分混合し、室温で５分間インキュベートした。磁石を２〜４分使用してビーズを収集し、溶液は、透明になった。上清を廃棄し、ビーズを磁石上で７０％エタノール２００μＬで３回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを室温で５分間乾燥させた。最後に、磁石から管を取り出し、ＡＭＰｕｒｅキットに含まれていた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液１５μＬ中にビーズを再懸濁させることによって、ＤＮＡを溶出した。ＲＮＡ−ビーズ溶液を磁石上に２分間配置した。次いで、新鮮な管にビーズを移さないようにして、ＤＮＡ溶液を新鮮なＰＣＲ管に移した。そのとき、この最終的なＤＮＡ産物は、配列決定の準備が整っている。
【０１２１】
実施例３：ゲノムＤＮＡから始めて標的配列を指数関数的に増幅するための等温方法
分析用の二本鎖ゲノムＤＮＡの標的領域を調製するために、ＤＮＡをサイズで１００〜６００ｂｐの間に最初に断片化した。
【０１２２】
断片の末端を修復するために、次いで対向する末端をリン酸化およびアデニル化し、以下の反応物を調製した。
・断片化したＤＮＡ（５０〜２５０ｎｇ）  １０μＬ
・末端修復緩衝液  ４μＬ
・末端修復ミックス  １μＬ
・Ｔａｑポリメラーゼ（Ａテーリング）１μＬ
・２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μＬ  。
【０１２３】
反応物を穏やかに混合し、１２℃で１５分間、３７℃で１５分間、次に７２℃で１５分間、その後、次のステップに進むまで４℃で、サーマルサイクラー内でインキュベートした。
【０１２４】
上記反応中に、５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有するオリゴヌクレオチドアダプター配列を、等体積の各オリゴヌクレオチドを混合し、９５℃に加熱し、室温に冷却させることによってアニールした。
【０１２５】
以下のライゲーション反応物を室温で組み立てた。
・上記で調製したＤＮＡ  ４０μＬ
・ＭｉＳｅｑインデックス２アダプター  １μＬ
・ライゲーション緩衝液  ４．９μＬ
・ＤＮＡリガーゼ  ２μＬ  。
【０１２６】
次いで反応を、１６℃で３０分間、次いで２２℃で３０分間、その後４℃で進行させた。
【０１２７】
１．８×反応体積でＡｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて精製する。
【０１２８】
増幅＃１
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記ライゲーション反応からの精製ＤＮＡ  ２μＬ
・プライマーＴ７−Ｒ２Ｐ  ｃＲＮＡ  ５μΜ  １μＬ
・ＧＳＰ１  ３μΜ  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  １μＬ  。
【０１２９】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１３０】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１３１】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
以下のものを上記反応物に添加した。
・ＡＭＰｕｒｅビーズ  ３６μＬ  。
【０１３２】
懸濁液を十分混合し、室温で５分間インキュベートした。磁石を２〜４分使用してビーズを収集し、溶液は、透明になった。上清を廃棄し、ビーズを磁石上で７０％エタノール２００μＬで３回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを室温で１０分間乾燥させた。最後に、磁石から管を取り出し、ＡＭＰｕｒｅキットに含まれていた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液１５μＬ中にビーズを再懸濁させることによって、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡ−ビーズ溶液を磁石上に２分間配置し、次いで新鮮な管にビーズを移さないようにして、ＲＮＡ溶液を新鮮なＰＣＲ管に移した。
【０１３３】
増幅＃２
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅＃１からのＲＮＡ  ２μＬ
・Ｔ７−Ｒ２Ｐ−ｃＲＮＡ  ５ｕＭ  １μＬ
・ＧＳＰ２  ３ｕＭ  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  １μＬ  。
【０１３４】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１３５】
上記のオリゴヌクレオチド−ＤＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１３６】
増幅＃４
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅＃３からの５μＬ
・１０μΜ  Ρ５  １μＬ
・１０μΜ  Ρ７  １μＬ  。
【０１３７】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１３８】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１３９】
ＤＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＤＮＡ精製
以下のものを上記反応物に添加した。
・ＡＭＰｕｒｅビーズ  ３６μＬ  。
【０１４０】
懸濁液を十分混合し、室温で５分間インキュベートした。磁石を２〜４分使用してビーズを収集し、溶液は、透明になった。上清を廃棄し、ビーズを磁石上で７０％エタノール２００μＬで３回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを室温で１０分間乾燥させた。最後に、磁石から管を取り出し、ＡＭＰｕｒｅキットに含まれていた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液１５μＬ中にビーズを再懸濁させることによって、ＤＮＡを溶出した。ＤＮＡ−ビーズ溶液を磁石上に２分間配置し、次いで新鮮な管にビーズを移さないようにして、ＤＮＡ溶液を新鮮なＰＣＲ管に移した。そのとき、この最終的なＤＮＡ産物は、配列決定の準備が整っている。
【０１４１】
実施例４：未知の５’および／または３’融合事象を増幅するためのタグ付きランダマーおよびランダムな第２の鎖のオリゴヌクレオチドとともに逆転写酵素を使用する等温方法
増幅＃１
未知の融合パートナーとの３’融合事象を増幅することに向けた第１のステップとして、第１の増幅反応を、ホルマリン固定組織試料から得たＲＮＡを使用して実行した。
【０１４２】
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・精製ＲＮＡ（５０ｎｇ）  １μＬ
・５μΜ  Ｔ７−Ｎ９ランダマー  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  ３μＬ  。
【０１４３】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１４４】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１４５】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
以下のものを上記反応物に添加した。
・ＡＭＰｕｒｅビーズ  ３６μＬ  。
【０１４６】
懸濁液を十分混合し、室温で５分間インキュベートした。磁石を２〜４分使用してビーズを収集し、溶液は、透明になった。上清を廃棄し、ビーズを磁石上で７０％エタノール２００μＬで３回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを室温で１０分間乾燥させた。最後に、磁石から管を取り出し、ＡＭＰｕｒｅキットに含まれていた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液１５μＬ中にビーズを再懸濁させることによって、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡ−ビーズ溶液を磁石上に２分間配置し、次いで新鮮な管にビーズを移さないようにして、ＲＮＡ溶液を新鮮なＰＣＲ管に移した。
【０１４７】
増幅＃２
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅反応＃１からの２μＬ
・３μΜ  ＧＳＰ１（５’または３’方向性プライマー）１μＬ
・５μＭ  Ｒ２Ｐ  １μＬ
・ｄＨ２Ｏ  １μＬ  。
【０１４８】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１４９】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１５０】
ＲＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＲＮＡ精製
ＲＮＡ精製を上記の通り実行し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０溶出緩衝液１５μＬ中にＲＮＡを溶出した。
【０１５１】
増幅＃３
以下の反応物を室温で反応緩衝液とともに組み立てた。
・上記増幅＃２からの５μＬ
・１０μΜ  Ρ５  １μＬ
・１０μΜ  Ｐ７  １μＬ  。
【０１５２】
反応物を穏やかに混合し、数秒間遠心分離し、サーマルサイクラーに移し、そこでこれを６５℃で２分間、その後４１℃で１１．５分間インキュベートした。
【０１５３】
上記のオリゴヌクレオチド−ＲＮＡアニーリング反応中に、酵素ミックスを調製した。凍結乾燥酵素ミックス用の希釈剤を解凍し、次いで冷たい希釈剤３０μＬを凍結乾燥酵素ミックスに添加し、６分間インキュベートした。上記アニーリング反応の直後に、酵素ミックス５μＬをアニールしたＲＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに添加し、４１℃で４５〜９０分間インキュベートした。
【０１５４】
ＤＮＡ  ＸＰ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用するＤＮＡ精製
以下のものを上記反応物に添加した。
・ＡＭＰｕｒｅビーズ  ３６μＬ  。
【０１５５】
懸濁液を十分混合し、室温で５分間インキュベートした。磁石を２〜４分使用してビーズを収集し、溶液は、透明になった。上清を廃棄し、ビーズを磁石上で７０％エタノール２００μＬで３回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを室温で５分間乾燥させた。最後に、磁石から管を取り出し、ＡＭＰｕｒｅキットに含まれていた１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３溶出緩衝液１５μＬ中にビーズを再懸濁させることによって、ＤＮＡを溶出した。ＲＮＡ−ビーズ溶液を磁石上に２分間配置した。次いで、新鮮な管にビーズを移さないようにして、ＤＮＡ溶液を新鮮なＰＣＲ管に移した。そのとき、この最終的なＤＮＡ産物は、配列決定の準備が整っている。
【０１５６】
実施例５：オリゴヌクレオチド
以下の表は、例えば、実施例１〜３に記載した、配列決定解析のための調製において核酸を増幅するための例示的なオリゴヌクレオチド配列を提供する。
【０１５７】
【表２−１】
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【０１５８】
【表２−２】
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【０１５９】
【表２−３】
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【０１６０】
【表２−４】
2017504346.tif 000007
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態を、本明細書に記載および例示してきたが、当業者は、機能を実行し、かつ／あるいは本明細書に記載の結果、および／または利点の１つもしくは複数を得るための様々な他の手段ならびに／あるいは構造を容易に想定することになり、このようなバリエーションおよび／または改変のそれぞれは、本発明の範囲内であると見なされる。より一般には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成は、例示的であるように意味されており、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される具体的な１つまたは複数の適用に依存することになることを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、または慣例的な実験しか使用せずに確認することができるであろう。したがって、上記の実施形態が単なる例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびそれに対する均等物以内で、本発明が具体的に記載および特許請求した以外に別段に実践され得ることが理解されるはずである。本発明は、本明細書に記載のそれぞれ個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。さらに、２つまたはそれ超のこのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾していない場合、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６２】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書においてかつ特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、それとは反対に明らかに示されていない限り、「少なくとも１つの」を意味するように理解されるはずである。
【０１６３】
語句「および／または」は、本明細書においてかつ特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、そのように等位接続された要素の「いずれか、または両方」、すなわち、一部の場合では接続的に存在し、他の場合では選言的に存在する要素を意味すると理解されるはずである。他の要素も、それとは反対に明らかに示されていない限り、具体的に識別されたこれらの要素に関係していても、無関係であっても、「および／または」の節によって具体的に識別される要素以外に任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「〜を含む」などの制限のない言語と併せて使用される場合、一実施形態では、Ｂを含まないＡ（Ｂ以外の要素を任意選択で含む）を指すことができ；別の実施形態では、Ａを含まないＢ（Ａ以外の要素を任意選択で含む）を指すことができ；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（他の要素を任意選択で含む）を指すことができる；などである。
【０１６４】
本明細書においてかつ特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、「または」は、上記に定義した「および／または」と同じ意味を有するように理解されるはずである。例えば、リスト中の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、少なくとも１つの、しかしまた１つ超を含む要素の数またはリスト、および任意選択で追加の列挙されていない項目を含めることと解釈されるものとする。「〜のうちのただ１つ」もしくは「〜のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「〜からなる」などのそれとは反対に明らかに示された用語のみが、要素の数またはリストのうちの正確に１つの要素を含めることを指す。一般に、本明細書において使用される用語「または」は、「いずれか」、「〜のうちの１つ」、「〜のうちのただ１つ」、または「〜のうちの正確に１つ」などの排他性の用語によって先行されているときのみ、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方でない」）を示すとして解釈されるものとする。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１６５】
本明細書においてかつ特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、１つまたは複数の要素のリストに言及した語句「少なくとも１つの」は、要素のリスト中の要素の任意の１つまたは複数から選択されるが、要素のリスト内に具体的に列挙されたありとあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外しない少なくとも１つの要素を意味すると理解されるはずである。この定義はまた、具体的に識別されたこれらの要素に関係していても、無関係であっても、語句「少なくとも１つの」が言及する要素のリスト内に具体的に識別された要素以外の要素も任意選択で存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つの」（または同等に「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つの」、または同等に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つの」）は、一実施形態では、Ｂが存在しないで、任意選択で１つ超を含めた少なくとも１つのＡ（かつＢ以外の要素を任意選択で含む）を指すことができ；別の実施形態では、Ａが存在しないで、任意選択で１つ超を含めた少なくとも１つのＢ（かつＡ以外の要素を任意選択で含む）を指すことができ；さらに別の態様では、任意選択で１つ超を含めた少なくとも１つのＡ、および任意選択で１つ超を含めた少なくとも１つのＢ（かつ他の要素を任意選択で含む）を指すことができる；などである。
【０１６６】
特許請求の範囲および上記明細書では、すべての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」などは、制約がない、すなわち、含むがそれだけに限らないを意味すると理解されるはずである。移行句「〜からなる」および「〜から本質的になる」のみが、米国特許局特許審査便覧、セクション２１１１．０３に示されているように、それぞれクローズドまたは一部クローズド移行句であるものとする。
【０１６７】
請求項要素を修飾するために特許請求の範囲内での順序の用語、例えば、「第１の」、「第２の」、「第３の」などの使用は、１つの請求項要素の別の要素に対するいずれの優先、先行、もしくは順序も、または方法の行為が実行される時間的順序をそれ自体で暗示せず、ある特定の名称を有する１つの請求項要素を同じ名称を有する別の要素と区別して（しかし、順序の用語の使用と引き換えに）、請求項要素を区別するために標識として単に使用されている。
【図１Ａ】
2017504346.tif 000008
【図１Ｂ】
2017504346.tif 000009
【図１Ｃ】
2017504346.tif 000010
【図１Ｄ】
2017504346.tif 000011
【図１Ｅ】
2017504346.tif 000012
【図１Ｆ】
2017504346.tif 000013
【図１Ｇ】
2017504346.tif 000014
【図２Ａ】
2017504346.tif 000015
【図２Ｂ】
2017504346.tif 000016
【図２Ｃ】
2017504346.tif 000017
【図２Ｄ】
2017504346.tif 000018
【図２Ｅ】
2017504346.tif 000019
【図３Ａ】
2017504346.tif 000020
【図３Ｂ】
2017504346.tif 000021
【図３Ｃ】
2017504346.tif 000022
【図３Ｄ】
2017504346.tif 000023
【図４Ａ】
2017504346.tif 000024
【図４Ｂ】
2017504346.tif 000025
【図４Ｃ】
2017504346.tif 000026
【図４Ｄ】
2017504346.tif 000027
【図４Ｅ】
2017504346.tif 000028
【配列表】
2017504346000001.app
【国際調査報告】
2017504346.tif 000029
2017504346.tif 000030