(57)【要約】  本発明は、最適化されたＨＩＶ遺伝子を含有する遺伝的に安定な複製可能センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスベクター、それを製造する方法、及び最適化されたＨＩＶ遺伝子を含有する遺伝的に安定な複製可能センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスベクターを含み得る、ワクチン生産について適格性が評価された細胞基質に関する。
2017534284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最適化ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原をコードする核酸を含有及び発現する遺伝的に安定なセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルス（ＳｅＶ）ベクターであって、前記ＨＩＶ免疫原が、ＢＧ５０５に基づくクレードＡ  Ｅｎｖ−Ｇハイブリッド又はクレードＡ  Ｅｎｖ−Ｆハイブリッド、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターでの使用のために修飾されたＨＩＶＣＯＮコード配列、ｐＤＮＡベクターのために最適化されたＣ５ｅｎｖ−タグ付きＨＩＶＣＯＮである、遺伝的に安定なセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルス（ＳｅＶ）ベクター。
【請求項２】
前記核酸が図２、４、６Ａ又は２５の核酸配列を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記ＨＩＶ免疫原のアミノ酸配列が図１、５又は６Ｃのアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
図８の核酸配列のいずれか１つの配列を含むベクター。
【請求項５】
図２３、図２４、図２５又は図２６の核酸配列のいずれか１つの核酸配列を含有及び発現するベクター。
【請求項６】
ＳｅＶベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターでトランスフェクトされた細胞。
【請求項８】
ベロ細胞である、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
ＨＩＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター又は請求項７若しくは８に記載の細胞の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
アジュバントを投与するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アジュバントがアクリルポリマーからなる、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び参照による組み込み
本願は、２０１４年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／０６９，０２２号明細書に対する利益及び優先権を主張する。また、いずれも２０１３年３月１０日に出願された米国特許出願第１３，７９２，１０３号明細書及び同第１３／７９２，１０６号明細書も参照する。
【０００２】
前述の出願、並びにそこで又はそれらの手続き追行中に引用された全ての文献（「出願引用文献」）及び出願引用文献で引用又は参照された全ての文献、並びに本明細書で引用又は参照される全ての文献（「本明細書で引用される文献」）、及び本明細書で引用された文献において引用又は参照される全ての文献は、本明細書で述べる任意の製品に関する、又は参照により本明細書に組み込まれる任意の文献における製造者の指示、説明書、製品仕様書、及び製品図面と共に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に際して使用され得る。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれ個別の文献が参照により組み込まれることが明示的且つ個別に記載されているのと同じ範囲まで参照により組み込まれるものとする。
【０００３】
本発明は、ワクチン生産について適格性が評価された細胞基質を用いて最適化されたＨＩＶ遺伝子を含有する、遺伝的に安定な複製可能センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスベクターを包含する。
【０００４】
連邦基金についての説明
本発明は、ＵＳＡＩＤにより付与された助成金番号ＡＩＤ−ＯＡＡ−Ａ−１１−０００２０による政府の支援を受けて実施された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
ＡＩＤＳ、すなわち後天性免疫不全症候群は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を原因とし、消耗症候群、中枢神経系変性、並びに日和見感染及び悪性疾患を引き起こす重篤な免疫抑制状態などのいくつかの臨床兆候を特徴とする。ＨＩＶは、動物レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）のレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ファミリーのメンバーであり、これには、ヒツジのビスナ（ｖｉｓｎａ）ウイルス並びにウシ、ネコ及びサルの免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。２つの極めて近縁のタイプのＨＩＶ（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２と呼ばれる）が、はるかによく同定されており、そのうちのＨＩＶ−１は、群を抜いてＡＩＤＳの最も一般的な原因である。しかしながら、ゲノム構造及び抗原性が異なるＨＩＶ−２も同様の臨床症候群を引き起こす。
【０００６】
感染性ＨＩＶ粒子は、ＲＮＡの２つの同一の鎖から構成され、これらは各々約９．２ｋｂ長で、ウイルスタンパク質のコア内に充填されている。このコア構造は、ウイルスにコードされる膜タンパク質も含む宿主細胞膜に由来するリン脂質二重層エンベロープで取り囲まれている（Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２０００，ｐ．４５４）。ＨＩＶゲノムは、レトロウイルスファミリーに特有の５’−ＬＴＲ−Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｅｎｖ−ＬＴＲ−３’構成を有する。ウイルスゲノムの各末端の長い末端反復配列（ＬＴＲ）は、宿主からの転写調節タンパク質に対する結合部位として役立ち、宿主ゲノム、ウイルス遺伝子発現、及びウイルス複製へのウイルス組み込みを調節する。
【０００７】
ＨＩＶゲノムは、複数の構造タンパク質をコードする。ギャップ遺伝子は、ヌクレオキャプシドコア及びマトリックスの構造タンパク質をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスの複製に必要な逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（ＩＮ）、及びウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）酵素をコードする。ｔａｔ遺伝子は、ウイルス転写物の伸長に必要なタンパク質をコードする。ｒｅｖ遺伝子は、不完全にスプライシングされた、又はスプライシングされていないウイルスＲＮＡの核輸出を促進するタンパク質をコードする。ｖｉｆ遺伝子産物は、ウイルス粒子の感染力を増強する。ｖｐｒ遺伝子産物は、ウイルスＤＮＡの核移入を促進し、Ｇ２細胞周期停止を調節する。ｖｐｕ及びｎｅｆ遺伝子は、宿主細胞ＣＤ４発現を下方制御し、感染細胞からのウイルスの放出を増大するタンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、１６０キロダルトン（ｋＤａ）前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳され、細胞プロテアーゼにより切断されて、細胞の感染に必要な外部１２０−ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）及び貫膜４１−ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）をもたらすウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする（Ａｂｂａｓ，ｐｐ．４５４−４５６）。ｇｐ１４０は、Ｅｎｖ糖タンパク質の修飾された形態であり、これは、外部１２０−ｋＤａエンベロープ糖タンパク質部分と、Ｅｎｖのｇｐ４１部分の細胞外部分とを含有し、ｇｐ１２０及びｇｐ４１の両方の特徴を有する。ｎｅｆ遺伝子は、霊長類レンチウイルスの間で保存されており、感染後に転写される最初のウイルス遺伝子の１つである。ＣＤ４及びＭＨＣクラスＩ表面発現の下方制御、Ｔ細胞シグナル伝達及び活性化の改変、並びにウイルス感染力の増強を含め、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでいくつかの機能が記載されている。
【０００８】
ＨＩＶ感染は、ウイルス粒子上のｇｐ１２０と、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ及び樹状細胞などの標的細胞の細胞膜上のＣＤ４及びケモカイン受容体分子（例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）との結合によって開始する。結合したウイルスは、標的細胞と融合して、ＲＮＡゲノムを逆転写する。その結果生じたウイルスＤＮＡは、細胞ゲノムに組み込まれ、そこで、新たなウイルスＲＮＡと、それによりウイルスタンパク質及び新たなビリオンとの産生を指令する。これらのビリオンは、感染した細胞膜から出芽して、他の細胞に増殖感染を定着させる。このプロセスは、初めに感染した細胞も殺傷する。非感染Ｔ細胞上のＣＤ４受容体は、感染細胞の表面に発現したｇｐ１２０に対し強い親和性を有するため、ＨＩＶは細胞を間接的に殺傷することもできる。この場合、非感染細胞は、ＣＤ４受容体−ｇｐ１２０相互作用を介して、感染細胞に結合し、融合することにより、生存することができない合胞体を形成する。免疫防御には不可欠であるＣＤ４＋Ｔリンパ球の破壊は、進行性免疫不全の主要原因であり、これは、ＡＩＤＳ疾患進行の特徴である。ＣＤ４＋Ｔ細胞の喪失は、ほとんどの侵入物に対処する身体の能力を大きく損なうが、これは、ウイルス、真菌、寄生体及びマイコバクテリウムなどの特定の細菌に対する防御に特に深刻な影響を与える。
【０００９】
Ｅｎｖ糖タンパク質の研究から、ウイルスは、脆弱性がほとんどない多くの有効な防御機構を有することが明らかにされている（Ｗｙａｔｔ＆Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８  Ｊｕｎ．１９；２８０（５３７１）：１８８４−８）。その標的細胞との融合のために、ＨＩＶ−１は、ｇｐ１２０及びｇｐ４１サブユニットを含有する三量体Ｅｎｖ複合体を使用する（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  Ｍａｒｃｈ；５（３）：２３３−６）。Ｅｎｖ複合体の融合能力は、ＣＤ４受容体及び補助受容体、一般にＣＣＲＳ又はＣＸＣＲ４の結合によってトリガーされる。中和抗体は、ビリオン表面上の成熟三量体に結合して、最初の受容体結合事象を阻止するか、又はビリオン付着後に結合して、融合プロセスを阻害するいずれかによって機能すると思われる（Ｐａｒｒｅｎ＆Ｂｕｒｔｏｎ，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；７７：１９５−２６２）。後者の場合、中和抗体は、受容体結合によって露出が増強又はトリガーされたエピトープに結合し得る。しかしながら、中和抗体の潜在的抗ウイルス作用を考慮すると、ＨＩＶ−１が、抗体の結合から自己を防御するために複数の機構を進化させたのは意外なことではない（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．２００２；５３：４９９−５１８）。
【００１０】
ワクチン送達ベクター作製中に頻繁に直面する問題として、外来タンパク質の低発現、免疫原の非効率的又は不完全な翻訳後のプロセシング、ベクター増殖の低減、及び遺伝子挿入断片の不安定性が挙げられる。これらの問題は、ベクター増殖に必須ではない外来遺伝子、及び往々にしてヌクレオチド配列又はコードされたタンパク質の生物学的若しくは物理的特徴により付与される複製適合性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｆｉｔｎｅｓｓ）に対する負の作用に関係することが多い。
【００１１】
ワクチンベクター用の遺伝子挿入断片を作製するために用いられた初期の「遺伝子最適化」方法は、高度に発現される細胞ｍＲＮＡの特徴を備えた合成コード配列の設計に主眼を置いた（Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：１４９７−１５０３，Ｂａｒｏｕｃｈ  ２００６．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０８：２８３−２８９、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８及びＨａａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ＣＢ  ６：３１５−３２４）。この一般的な最適化手法は、多くの場合、コードされたポリペプチドの発現を増大するが、発現したタンパク質は細胞傷害性であり、及び／又は操作されたヌクレオチド配列は、複製が困難であり且つ不安定であるため、この方法もベクターとの適合性が低い遺伝子挿入断片をもたらし得る。従って、外来タンパク質を豊富に発現すると同時に、ベクターの遺伝的背景に外来遺伝子配列を導入することによって生じる負の作用を低減することも可能にする遺伝子設計手法を開発することが求められる。
【００１２】
本願におけるいずれの文献の引用又は明示も、そうした文献が本発明の先行技術として利用可能であることを承認するものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、最適化ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原をコードする核酸を含有及び発現することができる遺伝的に安定なセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルス（ＳｅＶ）ベクターであって、ＨＩＶ免疫原は、ＢＧ５０５に基づくクレード（Ｃｌａｄｅ）Ａ  Ｅｎｖ−Ｇ若しくはＥｎｖ−Ｆハイブリッド、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターでの使用のために修飾されたＨＩＶＣＯＮコード配列、又はマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター及びプラスミドＤＮＡベクターでの使用のために最適化されたＣ５ｅｎｖ−タグ付きＨＩＶＣＯＮである、遺伝的に安定なセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルス（ＳｅＶ）ベクターに関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の組換えウイルスベクターを産生するようにＤＮＡでトランスフェクトされた細胞にも関する。有利には、細胞はベロ（Ｖｅｒｏ）細胞である。
【００１５】
本発明はまた、最適化ＨＩＶ免疫原にも関し、これらは、本発明のベクターに含有され、そこで発現され得る。有利には、ＨＩＶ免疫原は、ＢＧ５０５に基づくクレードＡ  Ｅｎｖ−Ｇ及びＥｎｖ−Ｆハイブリッド、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターでの使用のために修飾されたＨＩＶＣＯＮコード配列又はマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、例えばＣＤＶベクターのために最適化されたＣ５ｅｎｖ−タグ付きＨＩＶＣＯＮであり、これらは、ｐＤＮＡベクターにおける効率的な発現のために使用することもできる。
【００１６】
本発明はまた、最適化ＨＩＶ免疫原として発現されるタンパク質にも関し、これらは、本発明のベクターに含有されて発現され得る。
【００１７】
本発明は、本発明のベクターを含み得るワクチン、及び免疫応答を誘発する方法にもさらに関する。
【００１８】
従って、本発明の目的は、既知の製品、製品の製造方法、又は製品を使用する方法を本発明に一切包含せず、その結果、本出願人らが権利を留保し、これにより、あらゆる既知の製品、製法又は方法の特許権の一部放棄を開示することである。さらに、本発明は、本発明の範囲に、ＵＳＰＴＯ（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、最初のパラグラフ）又はＥＰＯ（ＥＰＣの第８３条）の記載用件及び実施可能要件を満たさない、あらゆる製品、製法、製品の製造、又は上記製品を使用する方法を包含することを意図せず、その結果、本出願人らが権利を留保し、これにより、既に記載された製品、任意の製品を製造する方法、又は製品を使用する方法の特許権の一部の放棄を開示することも留意される。
【００１９】
本開示において、特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む」、「含んだ」、「含んでいる」などの用語は、米国特許法に依る意味を有し得、例えば、これらは、「含む」、「含んだ」、「含んでいる」などを意味し得るものであり、「〜から本質的になっている」及び「〜から本質的になる」などの用語は、米国特許法に依る意味を有し、例えば、それらは、明示的に列記されない要素を考慮するが、従来技術に見出される要素、又は本発明の基本的又は新規の特徴に影響を与える要素を除外する。
【００２０】
以上の及び他の実施形態は開示されるか、又は以下の詳細な説明から明らかであり、またその説明に包含される。
【００２１】
以下の詳細な説明は例として付与され、記載される具体的な実施形態のみに本発明を限定する意図はなく、添付の図面と一緒に最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＨＩＶ単離物ＢＧ５０５に基づくクレードＡ  Ｅｎｖ−Ｇハイブリッドのアミノ酸配列である。
【図２】ＨＩＶ単離物ＢＧ５０５  Ｅｎｖに基づくクレードＡ  Ｅｎｖ−Ｇハイブリッドのヌクレオチド配列である。色分けは、図１の特徴を示す。ヌクレオチド配列は、ＶＳＶ遺伝子に類似するよう設計されているが、本出願人らは、これがトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡからも効率的に発現されることを見出した。５−ヌクレオチドＫｏｚａｋ配列は、発現ベクターへの挿入に先立ち、ＡＴＧ（５’−ｇｃｃａｃｃ）（Ｋｏｚａｋ（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６，１９８６７−１９８７０）の前に付加する。
【図３】ＥｎｖＧ（ＢＧ５０５）をコードするプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析である。検出用に使用される抗体は各パネルで識別される。プラスミドＤＮＡベクターは、図２に含まれるＥｎｖＧヌクレオチド配列を含有していることに留意されたい。
【図４】マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで使用するために修飾されたＨＩＶＣＯＮコード配列である。コード配列は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノム配列に類似するように設計した。具体的には、ＣＤＶ由来の遺伝子に類似するように配列を設計した。３’末端は、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕら（（２００７）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２，ｅ９８４）により記載されているエピトープタグのコード配列を含む。このバージョンの合成遺伝子では、５’末端は、ＶＳＶシグナルペプチドのコード配列を含む。いくつかの免疫原に対するＢ及びＴ細胞応答の両方を刺激することがわかっている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０，１２６８−１２７３；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１４，８４−９１及びＦｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，１４６９−１４８１）、小胞体に対するＨＩＶＣＯＮタンパク質の合成を指令する遺伝子を作製する選択肢を賦与するために、シグナルペプチドコード配列を付加した。シグナルペプチド及び／又はエピトープタグをコードする配列は、ＰＣＲにより遺伝子の部分領域を増幅することによって除去し得る。エピトープタグは、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕら（（２００７）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２，ｅ９８４）により記載されている通り、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）、マウスＴ細胞エピトープ、及び抗体タグ（Ｖ５エピトープ）により認識される強力なＴ細胞エピトープを含む。また、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＤＭ０５９２７６．１及びＦＷ５５６９０３．１も参照されたい。
【図５】ＨＩＶＣＯＮポリペプチド配列である。ＨＩＶＣＯＮアミノ酸配列は、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕら（（２００７）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２，ｅ９８４）により記載されている。また、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＤＭ０５９２７６．１及びＦＷ５５６９０３．１も参照されたい。Ｃ末端マルチエピトープタグをグレイのハイライトで示す。
【図６Ａ】Ｃ５ｅｎｖ−タグを含むＨＩＶＣＯＮのヌクレオチド配列（ｐＤＮＡについて最適化されている）である。
【図６Ｂ】図６Ａのヌクレオチド配列の翻訳である。
【図６Ｃ】ＨＩＶＣＯＮＣ５のアミノ酸配列である。
【図７Ａ】ＣＤＶについて最適化されたＨＩＶＣＯＮＣ５ヌクレオチド配列である。
【図７Ｂ】図７Ａのヌクレオチド配列の翻訳である。
【図７Ｃ】図７Ａのヌクレオチド配列のタンパク質配列である。
【図８】ＳｅＶ（ＮＰ）、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）、ＳｅＶ−ｓｇＥｎｖＧ（ＮＰ）及びＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎＣ５（ＮＰ）のヌクレオチド配列である。
【図９】ＳｅＶベクターゲノムの構造である。
【図１０】ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）の作製である。
【図１１】クローン単離物の選択である。ｐＭＶＳの作製のための選択単離物の増幅に先立つ、３ラウンドの限界希釈後のＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）のＰＣＲ及びウェスタンブロット分析である。
【図１２】遺伝的安定性試験の概要である。
【図１３】増殖したｐＭＶＳの分析である。
【図１４】ＨＩＶ  Ｅｎｖ修飾である。
【図１５】ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ及びＳｅＶ−ｓｇＥｎｖＧのレスキューである。
【図１６】フローサイトメトリーである。
【図１７】抗体結合曲線である。
【図１８】クローン単離工程中のタンパク質発現及び遺伝子挿入断片完全性のモニタリングである。
【図１９】ＳｅＶ−ＥｎｖＦｐｒｅ−ＭＶＳを用いて実施した遺伝的安定性分析である。
【図２０】ＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎＣ５の作製である。
【図２１】Ｇａｇ特異的ＩＦＮ−ｇＥＬＩＳＰＯＴである。応答は、各群について初回及び追加免疫（矢印↑で示す）後のクレードＡ  Ｇａｇペプチドプールに対するものである。赤い線は、中央値を示し、ボックス及びひげは、第１及び第３四分位値並びに最小／最大値である。○は応答者、○は非応答者を示す。グレイ／赤の円は、それぞれ、カットオフ未満／超の応答を示す。各点は、Ｇａｇからの単一の観測値を表す。黒い矢印は、ワクチン接種外来を示し、Ｘ軸は、外来数及びワクチン接種後の週数を示す。赤い線は、応答中央値を示す。各群について、重なり合ったボックスプロットが全応答の概要を示す（すなわち、中央値、第１及び第３四分位値並びに最小／最大値）。
【図２２】Ｇａｇ−ＥＬＩＳＡである。陽性Ｇａｇ−ｐ１４力価応答は、力価≧１００として定義した。カットオフ未満の値は全て５０（カットオフの半分）として表示する。Ｘ軸は、群ＩＤ及び応答率（％）を示す。
【図２３】Ｇａｇ（ＮＰ）配列である。
【図２４】ＳｅＶに使用するＥｎｖＧ配列である。
【図２５】ＳｅＶに使用するＥｎｖＦ配列である。
【図２６】ＳｅＶに使用するＨＩＶｃｏｎ配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
膜アンカーＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体及びＨＩＶｃｏｎｓｖ  Ｔ細胞免疫原を発現する遺伝的に安定なセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルス（ＳｅＶ）ベクターは、ワクチン生産について適格性が評価されたベロ細胞、及び将来のｃＧＭＰワクチン製造と適合する方法を用いて作製された。ＨＩＶ  Ｇａｇ又は修飾ＨＩＶ三量体（ＥｎｖＧ若しくはＥｎｖＦ）又は修飾ＨＩＶｃｏｎｓｖ免疫原（ＨＩＶｃｏｎｓｖＣ５）を発現する新規のベクターは、遺伝的不安定性が稀に観察されるか、又は全く観察されることなく作製された。観察された遺伝的安定性は、１）外来遺伝子設計、及び２）クローン化ＤＮＡからウイルスを作製するために用いる修正された手順、及びクローン単離物を選択及び確認するために、次に用いる方法に起因し得る。
【００２４】
ＳｅＶベクターから発現されるＥｎｖ三量体免疫原は、シグナルペプチド、貫膜、及び細胞質領域がＶＳＶ  Ｇ又はＳｅＶ  Ｆ由来の類似配列で置換したハイブリッド免疫原である。ＥｎｖＧ免疫原は、米国特許出願第１３，７９２，１０３号明細書及び同第１３／７９２，１０６号明細書（いずれも、２０１３年３月１０日に出願）に記載されている。ＥｎｖＦは、ＥｎｖＧコード領域におけるＳＳ、ＴＭＲ、及びＣＴコード配列を、ＳｅＶ  Ｆ遺伝子から直接得たヌクレオチド配列で置換することにより作製される新規の免疫原である。続いて、最も高度に転写された転写単位においてＮＰの上流に位置する最適化ＥｎｖＧ又はＥｎｖＦ遺伝子を用いて、ＳｅＶベクターゲノムＤＮＡクローンを作製した（図９Ｇ及びＨ）。修飾ＨＩＶｃｏｎｓｖＣ５遺伝子は、元のＨＩＶｃｏｎｓｖ配列に関連する（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００７  Ｏｃｔ  ３；２（１０）：ｅ９８４．ＰＭＩＤ：１７９１２３６１）。元のＨＩＶｃｏｎｓｖで使用されたｃ末端エピトープタグを、ＨＩＶ  Ｅｎｖ由来のｓペプチド配列である「Ｃ５タグ」で置換した。ＥｎｖＧ、ＥｎｖＦ、及びＨＩＶｃｏｎｓｖＣ５をコードする遺伝子は、米国特許出願第１３，７９２，１０３号明細書及び同第１３／７９２，１０６号明細書（いずれも、２０１３年３月１０日に出願）に記載されている通り、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターでの使用のために最適化した。
【００２５】
ＳｅＶベクターレスキュー及び増殖方法は、適格性評価ベロ細胞と一緒に使用するために開発された。最初に、ＳｅＶ−ＥｎｖＦ、ＳｅＶ−ＥｎｖＧ、及びＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎｓｖのレスキューは、市販のＤＮＡトランスフェクション試薬及びヒト２９３Ｔ細胞又はＬＬＣＭＫ２（サル腎細胞株）を用いて問題なく実施されたが、適格性評価ベロ細胞を用いたウイルスレスキューへの上記プロトコルの適用は失敗した。本出願人らは、ＤＮＡのエレクトロポレーションに基づくプロトコルを使用し、熱ショック処理によって適格性評価ベロ細胞由来の組換えＳｅＶ−ＥｎｖＦ、ＳｅＶ−ＥｎｖＧ、及びＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎｓｖＣ５のレスキューを達成した。遺伝的に安定なクローン単離物を調製した後、無血清条件下でベロ細胞を用いて増殖させ、マスターウイルスシードも生成した。
【００２６】
本発明はまた、エレクトロポレーション法によるベロ細胞でのＳｅＶ−ＧＯＩ（目的の遺伝子：ＥｎｖＦ、ＥｎｖＧ、ＨＩＶｃｏｎなど）のベクターレスキューも包含する。例えば、エレクトロポレータを用いて、ｐＳｅＶ−ＧＯＩプラスミド及び支持プラスミド（ＮＰ、Ｐ、Ｌ、Ｆ及びＴ７）でベロ細胞をトランスフェクトした後に培養する。トランスフェクションから数日後にＨＡテストを実施して、ベクターレスキューを評価する。レスキューされたベクターを含有する培地（ウイルスシード：ＶＳ）を採取し、クライオチューブに等分し、ドライアイス／エタノールで急速凍結した後、−８０℃で保存する。
【００２７】
ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）ウイルスレスキュー及びウイルスシード（ＶＳ）の生成：組換えＳｅＶコードＨＩＶ  Ｇａｇ、（ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ））をレスキューするために、ＳｅＶ  ＮＰ、Ｐ、及びＬを発現する支持プラスミド、並びにバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと一緒にｐＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）ゲノムクローンを、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００ＣＤを用いて、適格性評価ベロ細胞に共トランスフェクトした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００ＣＤは、動物由来の材料を含まない。次に、トランスフェクトした細胞単層から産生された組換えＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）をベロ細胞において増幅することにより、ウイルスシード（ＶＳ）を生成する。ＶＳを分析して、ＣＩＵアッセイによりウイルス力価を決定し、ＲＴ／ＰＣＲによりｇａｇ遺伝子挿入断片の完全性を確認し、ｇａｇ挿入断片のヌクレオチド配列を確認すると共に、ウェスタンブロット分析により、Ｇａｇタンパク質発現を評価した。
【００２８】
ｐＭＶＳ生成：ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）ＶＳを、限界希釈クローン単離法による連続３ラウンドのクローン精製に付すことにより、クローン化ウイルスシード（ＣＶＳ）を生成した。４つのクローン化ウイルスシード（ＣＶＳ）を選択し、これらを使用して、４つの個別のプリマスターウイルスシード（ｐＭＶＳ）を生成した。ｐＭＶＳの各々が、ウイルス生産性、ウェスタンブロットによるＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質発現、及びＲＴ／ＰＣＲによるｇａｇ遺伝子挿入断片の完全性によって決定される規格を満たすことが判明した。
【００２９】
ｐＭＶＳ遺伝的安定性試験：ベロ細胞で各ｐＭＶＳの５回の連続継代（Ｐ５）を実施し、ウイルス生産性についてのｐＭＶＳ＋ｐ５（プラス５回の継代）、ウェスタンブロットによるＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質発現、及びＲＴ／ＰＣＲによる遺伝子挿入断片の完全性を試験することにより、４つのｐＭＶＳを遺伝的安定性評価に付した。この試験の目的は、臨床試験材料（ＣＴＭ）の生産に必要なレベルを超えて、３継代のウイルス増幅を刺激することであった。力価、遺伝子挿入断片の完全性、Ｇａｇタンパク質発現、及び完全なゲノムヌクレオチド配列決定の結果に基づいて、ＭＶＳ生成のために、１つのＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）ｐＭＶＳ（クローンＦＡＡ）を選択した。さらに、５０の個別のサブクローンをｐＭＶＳ＋ｐ５レベルで単離し、これらを分析して、ＲＴ／ＰＣＲにより挿入断片の遺伝子完全性を、及びウェスタンブロットによりＧａｇタンパク質発現を確認した。全てのｐＭＶＳを、ＤＮＡＶＥＣにおいて無菌状態及びマイコプラズマ（ＰＣＲ）についてさらに試験した。選択したＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）ｐＭＶＳ（クローンＦＡＡ）のバイアルをさらなる試験のためにＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（ＢＲＥＬ）に輸送した（Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  −  Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ−ＦＤＡ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ）。試験結果は全て規格を満たした。データは、ｐＭＶＳロットについての分析証明（Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐＭＶＳ  Ｌｏｔ）として編集した。
【００３０】
ｓｆＥｎｖＦ、ｓｇＥｎｖＧ、又はＨＩＶｃｏｎＣ５を発現するＳｅＶのレスキュー：ｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｌ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｔ７、及び目的の遺伝子を含有するＳｅＶベクターゲノムクローン（ｐＳｅＶ−ＧＯＩ）を混合することにより、プラスミド溶液を調製した。培地２（１０％ＦＢＳ、２２０ｕＭ２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補充したイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）改変ＭＥＭ［ＩＭＥＭ］、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）中の約０．７ｍＬの細胞懸濁液を３つのクライオバイアル中に分散させ、事前に調製したプラスミド溶液１００μＬを細胞懸濁液に添加した。ＤＮＡ及び細胞懸濁液を穏やかに混合した後、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレータ（ＢＴＸ  Ｔ８２０，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を低電圧モード（ＬＶ）に設定して、パルス間隔２００ｍｓで、７０ｍｓｅｃの１４０ボルトパルスを３回送達した。エレクトロポレーション後、続いて、ピペットで細胞を滅菌５０ｍＬ遠心分離用コニカルチューブに移した。室温の約１０ｍＬの培地１（１０％ＦＢＳ、２２０ｕＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を細胞に添加し、混合した。細胞を５分間の遠心分離（１０００ｒｐｍ、室温）により回収した後、上清を廃棄し、細胞を４８ｍＬの培地１に再懸濁させた。均質な細胞懸濁液を調製し、４×６−ウェルプレート（２４ウェル）に１ウェル当たり２ｍＬの細胞懸濁液を添加した。細胞を３７℃で４時間インキュベートした後、熱ショックを４２℃で２時間実施した。その後、６ウェルプレートを３７℃で１５〜２４時間インキュベートし、顕微鏡で検査することにより、結合が良好であり、且つ混入がないことを確実にした。１５〜２４時間毎にウェルから培地を採取して、ＨＡ活性を試験し、単層に新鮮な２ｍＬの培地４（５０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシンとＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔとを含有して補充された培地１）を供給した後、３７℃で大気雰囲気において５％ＣＯ２でインキュベーションを継続した。上清を分配してから、０．２ｍＬアリコート中に保存（−８０℃）し、ＨＡ活性を呈示するウェルからの上清も感染力について試験し、細胞感染単位（ＣＩＵ）／ｍＬとして表した。
【００３１】
ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＧ（ＮＰ）及びＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎＣ５（ＮＰ）ｐＭＶＳ生成：ｓＳｅＶ−ｆＥｎｖＦ（ＮＰ）及びＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎＣ５（ＮＰ）ウイルスシード（ＶＳ）を、限界希釈クローニング法による連続３ラウンドのクローン精製に付すことにより、クローン化ウイルスシード（ＣＶＳ）を生成した。３〜５のＣＶＳを選択し、それを用いて、個別のプリマスターウイルスシード（ｐＭＶＳ）を生成した。ｐＭＶＳの各々が、ウイルス生産性、ウェスタンブロットによるＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質発現、及びＲＴ／ＰＣＲによるｇａｇ遺伝子挿入断片の完全性によって決定される規格を満たすことが判明した。全てのｐＭＶＳを、無菌状態及びマイコプラズマについてさらに試験した（ＰＣＲ）。
【００３２】
ベロ細胞で各ｐＭＶＳの５回の連続継代を実施し、ウイルス生産性についてのｐＭＶＳ＋ｐ５（プラス５回の継代）、ウェスタンブロットによるＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質発現、及びＲＴ／ＰＣＲによる遺伝子挿入断片の完全性を試験することにより、これらのｐＭＶＳを遺伝的安定性評価に付した。この試験の目的は、ＣＴＭ生産レベルを超えて、３継代のウイルス増幅を刺激することであった。力価、遺伝子挿入断片の完全性、Ｇａｇタンパク質発現、及び完全なゲノムヌクレオチド配列決定の結果に基づいて、ＭＶＳ生成のために１つのｐＭＶＳを選択した。選択したｐｒｅＭＶＳからのウイルスを連続的に５回継代して（ｐｒｅＭＶＳ＋ｐ５）、製造に必要なものを超える増幅を刺激した後、５０の個別のサブクローンをｐＭＶＳ＋ｐ５から単離した。これらのウイルスサブクローンを分析して、ＲＴ／ＰＣＲにより挿入断片の遺伝子完全性を、及びウェスタンブロット分析によりＧａｇタンパク質発現を確認した。ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）及びＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＧ（ＮＰ）ベクターについてのＲＴ／ＰＣＲにより、予想サイズ（ｓｆＥｎｖＦは約２．５ｋｂ、ｓｇＥｎｖＧは約２．４ｋｂ）で単一のＰＣＲバンドが生成され、検出された。ＥｎｖＦ及びＥｎｖＧタンパク質を予想分子量（約１６０ｋＤａの前駆体タンパク質及び約１２０ｋＤａのタンパク質分解プロセシングの産物）で検出した。個々のクローンの９０％超が完全長ＥｎｖＦ又はＥｎｖＧタンパク質を発現した。ＨＩＶｃｏｎＣ５ベクターのクローンで実施したＲＴ／ＰＣＲでも、予想サイズ（約２．６ｋｂ）で単一バンドが生成された。ＨＩＶｃｏｎＣ５タンパク質は、予想分子量（約９０ｋＤａ）で検出した。個々のクローンの９０％超が完全長ＨＩＶｃｏｎＣ５タンパク質を発現した。
【００３３】
組換えＳｅＶベクターの作製は、ワクチン及び遺伝子療法用途に適用可能である。これらの方法は、他のパラミクソウイルス、例えば、動物又はヒトパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、並びにウシ及びヒト呼吸系発疹ウイルスなどに基づくベクターに適用することができる。
【００３４】
本発明では、米国特許第８，７４１，６５０号明細書；同第８，２１７，０１９号明細書；同第７，４４２，５４４号明細書；同第７，３１４，６１４号明細書；同第７，２４１，６１７号明細書；同第７，２２６，７８６号明細書；同第７，１４４，５７９号明細書；同第７，１０１，６８５号明細書；同第６，８２８，１３８号明細書；同第６，７４６，８６０号明細書；同第６，７２３，５３２号明細書及び同第６，６４５，７６０号明細書に開示されるセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスベクターも考慮される。
【００３５】
クレードＡ  Ｅｎｖ三量体免疫原。本出願人らは、ＩＡＶＩ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｇ臨床試験から回収された試料に関連したＨＩＶデータベースにおいて祖先ウイルス配列候補を同定するためにコンピュータ解析を実施した。その結果は、ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５（サブタイプＡ；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：ＡＢＡ６１５１６．１）が、ＰＧ９及びＰＧ１６を単離した患者に感染した子孫ウイルスと非常に近縁である高い可能性が存在することを示した。従って、ワクチンベクター作製のために、ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ＢＧ５０５を用いて、新たな膜結合三量体Ｅｎｖ免疫原をコードする遺伝子を作製した。
【００３６】
水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ）から膜結合Ｅｎｖ三量体を効率的に発現するため、シグナルペプチド、貫膜ドメイン、及び細胞質尾部がＶＳＶ  Ｇからの配列で置換されたハイブリッドＥｎｖタンパク質を作製する必要があった。ＶＳＶ又はプラスミドＤＮＡベクターから発現されるこのハイブリッドタンパク質（ＥｎｖＧと呼ぶ；図１及び２を参照）は、Ｅｎｖ機能を保持し、細胞表面上で複数の決定基に特異的な抗体により認識され（図３）、このような決定基には、ＣＤ４結合部位（ｂ１２、ＰＧＶ０４）、Ｖ３及び炭水化物（ＰＧＴ１２６）、ＭＰＥＲ（２Ｆ５及び４Ｅ１０）、グリカンシールド（２Ｇ１２）、並びにＶ１／Ｖ２により形成されるもの、及び炭水化物により形成される構造（ＰＧ９、ＰＧ１６、ＰＧＴ１４５）などがある。
【００３７】
タンパク質ドメインスワップに加えて、ＶＳＶベクター複製及び遺伝的安定性は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムに類似したヌクレオチド配列を含むＥｎｖＧ（ＢＧ５０５）遺伝子インサートを作製することにより、有意に改善された（図２）。修飾遺伝子配列の特徴としては、ＶＳＶ及びモノネガウイルスファミリーの他のウイルスとより調和するコドンバイアス及びグアニン＋シトシン含有率、並びにＶＳＶ及びイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）での不安定性を促進することがわかっている配列、例えば、４（ＡＡＡＡ若しくはＴＴＴＴ）又は５（ＧＧＧＧＧ若しくはＣＣＣＣＣ）より大きいホモポリマー領域の排除などがある。
【００３８】
本出願人らは、主として、機能を保持するＥｎｖ三量体免疫原の作製に取り組んだ。この戦略に従って、ＨＩＶ粒子上の真正三量体Ｅｎｖスパイクに酷似する免疫原を生成した。Ｅｎｖ機能を低減する必要がある場合、本出願人らは、融合ペプチドドメイン内のアミノ酸置換を評価することを提案する（Ｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６，４１３３１−４１３４３）。これは、膜融合物を障害するが、免疫原の全体的三量体構造に対する作用を限定するはずである。
【００３９】
ＳｅＶ−Ｅｎｖベクター感染後に細胞表面上に発現された免疫原をモノクローナル抗体の群で包括的に分析することにより、予想した抗原決定基が存在することを確認する。これは、アミノ酸置換によってＥｎｖ機能を不活性化しなければならない場合に特に重要である。本出願人らは、モノクローナル抗体の群を用いてＦＡＣＳ分析を標準化した（図３を参照）。
【００４０】
ＨＩＶＣＯＮ免疫原。ＨＩＶＣＯＮ免疫原は、ＨＩＶ−１サブタイプＡ〜Ｄの多数の単離物由来のタンパク質配列を比較することにより同定される、高度に保存されたアミノ酸配列モチーフから構成される融合タンパク質である（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２，ｅ９８４）。本出願人らは、ＨＩＶＣＯＮを、ｐＤＮＡ及びＣＤＶを含むいくつかのベクターに導入する。Ｈａｎｋｅらにより作製されたオリジナルのヌクレオチド配列は、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ＭＶＡ、及びプラスミドなどのＤＮＡベクターからの発現のために最適化した（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：ＤＭ０５９２７６．１及びＦＷ５５６９０３．１）。本出願人らは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターにこのタイプの最適化遺伝子挿入断片を用いるのが困難であったため、本出願人らは、ＲＮＡウイルスの配列に類似する修飾ヌクレオチド配列を作製した。修飾ＨＩＶＣＯＮヌクレオチド配列を図４に示す。オリジナルＨＩＶＣＯＮポリペプチド配列（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２，ｅ９８４）を図５に示す。
【００４１】
２０１２年２月２１日に付与されたＨＩＶ−１  ＣＬＡＤＥ  Ａ  ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＡＮＴＩＧＥＮＳ，ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＧＥＮＥＳという名称の米国特許第８，１１９，１１４Ｂ２号明細書；２０１０年８月２６日に出願されたＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳという名称の米国特許出願公開第２０１００２１５６９１号明細書；２０１２年３月２９日に出願されたＭＥＴＨＯＤＳ  ＴＯ  ＩＭＰＲＯＶＥ  ＶＥＣＴＯＲ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＴＡＢＩＬＩＴＹという名称の米国仮特許出願第６１／６１７，３６８号明細書及び２０１２年３月２３日に出願されたＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳという名称の米国仮特許出願第６１／６１４，５８４号明細書を参照されたい。なお、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
本発明はまた、ＨＩＶ  Ｅｎｖ由来のＣ末端エピトープタグ（Ｃ５エピトープタグ：ＡＰＴＫＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲ）を含み得る修飾ＨＩＶＣＯＮタンパク質配列のための配列も提供する。このタグアミノ酸配列は、ｇｐ１２０ＥｎｖサブユニットのＣ末端に位置するアミノ酸番号４９７〜５１１（ＨＩＶ−１  ＢＨ−１０株）に対応する。Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（参照番号Ｄ７３２４）から入手可能な抗体は、エピトープを認識する。この抗体が使用された刊行物の一例は、Ｅｇｇｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０  Ｊｕｎ  ５；４０１（２）：２３６−４７．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｍａｒ  ２１．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０  Ｏｃｔ  １０；４０６（１）：１６２−３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０３０４４５７である。
【００４３】
提供される２つの配列は、以下の通りである：プラスミドＤＮＡベクター用に最適化された遺伝子であり、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００７  Ｏｃｔ  ３；２（１０）：ｅ９８４．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（３）．ｄｏｉ：１０．１３７１／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｆｃａ２６ａ４ｆ−４２ｃ１−４７７２−ａ１９ｅ−ａａ９ｄ９６ｃ４ｅｅｂ２．ＰｕｂＭｅｄＰＭＩＤ：１７９１２３６１；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１９９１５８４により公開されたヌクレオチド配列から修飾された遺伝子（図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃを参照）、及びＣＤＶベクターなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターへの組み込みのために最適化された遺伝子（図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃを参照）。
【００４４】
本発明はまた、適格性評価ベロ細胞からの組換えＳｅＶ−ＥｎｖＦ、ＳｅＶ−ＥｎｖＧ、及びＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎｓｖＣ５のレスキューを達成する、ＤＮＡのエレクトロポレーション及び熱ショック処理に基づくプロトコルにも関する。
【００４５】
ウイルスレスキューのための一プロトコルは、ＢＴＸ  ＥＣＭ８３０エレクトロポレーション装置に基づく。ＢＴＸ及びＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩは、根本的に異なる装置である。ＢＴＸは、矩形波電気パルスでＤＮＡを送達する。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒは、指数関数的減衰電気パルスでＤＮＡを送達する。矩形波装置は、複数の高速電気パルスを送達することを可能にし、本出願人らは、これがベロ細胞に有用であると考える。本出願人のプロトコルは、３種の電気パルスを使用する。残念ながら、装置の違いは、このプロトコルがＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒに直接適用できないことを意味する。本出願人らのプロトコルを直接試験するには、矩形波エレクトロポレータが必要である。
【００４６】
ＶＳＶの場合、本出願人らは、Ｔ７、ゲノムＤＮＡ、及び他の全てのＶＳＶ遺伝子をコードするプラスミド（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ）を共トランスフェクトする。ＣＤＶの場合も、本出願人らは、Ｔ７、ゲノム、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ及びＬを共トランスフェクトする。
【００４７】
包膜マイナス鎖ＲＮＡウイルスを用いて、実験ワクチンベクターを作製する。なぜなら、このクラスのウイルスは、ワクチン作製に有利な複数の生物学的特性を有するからである（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：１０２９３−１０３０６、Ｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ＨＩＶ  ＡＩＤＳ  ８：４０２−４１１）。その共通の特徴の中でも、注目すべきは、比較的小さい一本鎖非セグメント化ＲＮＡゲノムであり、これは、いくつかの実用的利点を賦与する（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ  ２００４．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８３：１−４１、Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２８：２３９−２５３）。重要なことには、遺伝子修飾されたウイルスベクターと循環野生型ウイルスとの間の遺伝子交換は、マイナス鎖ＲＮＡゲノムが相同組換えを被らないため、有意なリスクではないことである。さらに、遺伝子セグメント再集合による遺伝子輸送は、上記ゲノムの非セグメント化構造のために不可能である。ＲＮＡゲノムはまた、ＤＮＡ中に組み込まれ得ないことから、これらのウイルスに基づくベクターは、宿主細胞染色体を改変しない。また、ベクターの複製能力及び外来遺伝子発現を調節するために、それらのユニークなゲノム構造を修飾することもできる（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ  ２００４．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８３：１−４１、Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２８：２３９−２５３）。
【００４８】
非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡゲノムは、重要な利点をもたらすが、ＲＮＡウイルスが突然変異及び進化する能力はベクターの作製を困難にし得る。最も一般的な障害は、ＤＮＡポリメラーゼと同様の校正及び修復機能が欠如したウイルスコード化ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの忠実度が比較的低いために起こるヌクレオチド置換である（Ｎｏｖｅｌｌａ  ２００３．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：３９９−４０５）。ヌクレオチドの誤取込みは、１複製ゲノムにつき約１塩基置換を引き起こす頻度で起こる。これは、個別のゲノムＲＮＡのレベルでわずかなヌクレオチド異質性をもたらすが、ウイルスを一定条件下で増殖させれば、複製ゲノムの集団全体にわたって非常に安定した共通配列が確立される。共通配列の安定性は、適用した増殖条件下で複製するのに最も適したウイルスが選択的優位性を有し、その集団中で優勢を維持するが、増殖条件が塩基置換を変化させれば、ウイルスプール中に存在する変異体は、集団のより優勢なエレメントとしてそれらが出現することを可能にする複製利点を有し得るという事実を表している。
【００４９】
配列欠失はまた、マイナス鎖ＲＮＡゲノムにも存在し得る。これらのゲノムは、最初に欠陥干渉粒子を研究することにより観察され、１細胞につき大量のウイルスによって感染が開始する条件下でウイルスを連続的に増幅するとき、最も容易に形成される（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６４（Ｐｔ９）：１８３９−１８４７）。これらの条件下では、ほとんどの細胞が野生型ウイルスに同時感染しており、それが欠陥粒子を増殖させるのに必要な複製機構を賦与することから、欠陥干渉粒子は急速に増幅することになる。欠陥干渉粒子ゲノムＲＮＡ構造の分析により、一部の粒子は、かなりのゲノムに及ぶ大きい内部欠失を含むことが判明し、これらは、恐らく複製中に結合したポリメラーゼが複製鋳型の下流位置にジャンプするときに形成される（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８０．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ３３：８１８−８２９）。一部の欠陥干渉粒子ゲノムの構造も、ポリメラーゼが鋳型から合成中の成長ゲノムにジャンプすることができ、その結果、新生ゲノムＲＮＡに沿って逆コピーし得ることを示している（Ｃａｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１：６２−７１）。マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムには可欠配列が非常に少ないため、ポリメラーゼのジャンプによる欠失が生存可能な突然変異ウイルスを産生することは稀である。これに対し、外来遺伝子を含有するベクターは、欠失事象の標的となり得る非必須配列を有する。
【００５０】
前述した突然変異機構は、小さいマイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムへの外来タンパク質コード遺伝子の付加に伴う複製適応性コストを最小限に抑える措置を講じない場合、ベクター作製に問題を呈し得る。外来遺伝子は、通常、ウイルス複製に必須ではないため、増殖に必要なウイルス機能を喪失することなく、突然変異を蓄積することができる。有意な増殖優位性をもたらす突然変異は稀であり得るが、組換えベクターを生成し、前臨床及び臨床試験で使用するためのワクチンを生産するのに必要な広範囲の増幅により、突然変異ウイルスが発生する十分な機会が提供される。水泡性口炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクターを用いて実施した研究では、ウイルスが遺伝子挿入断片のいかなる負の適応性コストも相殺しようと試みるにつれて、外来遺伝子又は関連する転写制御領域中のヌクレオチド置換が蓄積することが示されている（Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｋｏｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８７：４２７−４３５、Ｗｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７６４２−７６５０）。ベクター作製に対する欠失の作用は、文献に記載されていないが、生弱毒化ＲＳウイルスワクチンの開発中に観察され（Ｋａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４：１３９６１−１３９６６）、これも問題を呈し得ることを示している。以下に記載するように、ヌクレオチド置換及び欠失突然変異のいずれも、ＨＩＶ免疫原をコードする一部のプロトタイプセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルス（ＳｅＶ）ワクチンベクターの作製及び大量生産中に起こった（図９）。一部には、ＳｅＶベクターでのこの経験に基づき、ベクター生産及び遺伝的安定性分析のための遺伝子挿入断片の最適化手法及び手順が開発され、これらは、いくつかのｃＧＭＰ適合ＳｅＶ−ＨＩＶワクチン候補の開発を支持した。
【００５１】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの開発中、本出願人らは、いくつかの遺伝子挿入断片が、ベクターレスキューを阻止し、ウイルス増殖を阻害するか、又は問題を呈し得る頻度で突然変異を被ることを見出した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４６：２５−３６、Ｗｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７６４２−７６５０、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１：２８２２−２８２７、Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１：３７５６−３７６２、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８：４２３７−４２５０、Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｋｏｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８７：４２７−４３５）。顕著には、パラミクソウイルス、例えば、イヌジステンパーウイルスに基づくベクターを作製したとき、欠失突然変異が観察された（図示していない）が、それでも、この欠失は、生存可能なウイルスを産生するために６つのヌクレオチドの単位により均等に分割が可能なゲノム長さを維持しているはずである（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：８９１−８９９）。これは、大規模な前臨床実験又は臨床試験を支持するためのベクターを作製し、且つワクチンを製造するのに必要な広範囲のウイルス増殖が、非常に稀な突然変異がワクチン生産に影響を及ぼす機会を賦与することを示している。従って、突然変異の頻度を最小限にし、及び／又は別の遺伝子を付加する負の適応性コストを低減するベクター及び挿入断片設計の作製及び試験が、小規模実験室調査を超えてワクチン候補を前進させるうえで不可欠である。
【００５２】
４つの異なるＨＩＶワクチン免疫原をコードする安定なＳｅＶベクターを作製し（図９Ｅ〜Ｈ）、それらの遺伝的安定性を厳密に評価した。ベクターのうちの３つは、ｃＧＭＰ適合ウイルスシードバンクが製造される段階へと進み、ＨＩＶ  Ｇａｇをコードする１つを用いて、第１相臨床試験用のワクチンを調製した。これらのベクターの作製過程で、下記を含む異なる段階のベクター設計、開発、及び試験において、いくつかの進歩が達成された：１）マイナス鎖ＲＮＡウイルスに合わせた遺伝子挿入断片設計手法の明確化；２）ｃＧＭＰに適合する条件下での組換えウイルスのレスキュー及び増殖のためのプロセス；及び３）新たなワクチン候補が製造を支持する規模で増殖することができるかどうかを決定するために設計された厳密な遺伝的安定性試験手法。これは、ＨＩＶ  Ｇａｇ、ＨＩＶｃｏｎＣ５免疫原、及び２つの異なるＨＩＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質変異体をコードする、以下に記載する安定なベクターの開発によって例示する（図９）。
【００５３】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおけるいくつかの遺伝子挿入断片の遺伝的安定性に寄与する可能性のある因子が提示されており、それは、以下に挙げるものを含む：１）大きい遺伝子挿入断片サイズ、２）ウイルスゲノムにおける挿入断片の位置；３）グアニン及びシトシンを高い割合（６１％Ｇ＋Ｃ）で含有し得る、挿入断片のヌクレオチド配列、及び／又は４）複製に対し阻害性のタンパク質活性。著者らは、遺伝子挿入断片の安定性を最大にするいくつかの遺伝子設計手法を開発及び適用し、且つ従って遺伝的に安定なベクターが生産され、ワクチン製造を支持し得ることを厳密に確認する手法を開発した。ＧＲＩＮ遺伝子（米国特許第８，１１９，１４４号明細書及び同第８，７３５，５４２号明細書、並びにＫｅｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４１９３６）由来のＧａｇコード配列（１．５ｋｂ、図９Ｅ）のみがＮＰの上流に挿入されたＳｅＶゲノムクローンを作製した。ｃＧＭＰとの適合性を確実にするように改変された手順（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ：ｄｅｖｏｔｅｄ  ｔｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  １：５６９−５７９、Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８（Ｐｔ  １１）：２８１３−２８２０）を用いて、ＤＮＡから組換えウイルス（ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）と称する）を作製した。手短には、このウイルスレスキュー手順の重要な要素は、以下に挙げるものを含んだ：レスキューを開始するためのプラスミドＤＮＡのみを使用し、補足のヘルパーウイルスは使用しないこと、ワクチン生産のための適格性が評価されたトランスフェクトベロ細胞からの組換えＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）の回収、動物由来の材料を含まないトランスフェクション試薬の使用、及び文献に記載のウシ胎仔血清を含有する培地。これにより、ウイルスレスキュー、限界希釈によるクローン単離、及びプリマスターウイルスシードバンク（Ｐｒｅ−ＭＶＳ）を生成するためのウイルス増殖を含む、ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）作製の全工程を通して、適格性評価ベロ細胞を使用することが可能になった（図１０）。限界希釈による第３ラウンドのクローン単離後のウイルス単離物の分析を示す図１１に表示すように、挿入されたヌクレオチド配列の完全性、及び発現されたポリペプチドのサイズを確認するために、ＲＴ／ＰＣＲ及びウェスタンブロッティングの組み合わせによるプロセスの間、Ｇａｇ遺伝子挿入断片の安定性を連続的にモニターした。
【００５４】
ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）の遺伝的安定性が臨床試験用のワクチンの生産を支持するのに適しているかを厳密に評価するために、ｐｒｅ−ＭＶＳ由来のウイルスをベロ細胞で、製造ランに必要な増殖の規模を超えると推定される、さらに５回の連続増幅（ｐｒｅ−ＭＶＳｐ５）に付した（図１２）。増殖したウイルスの組成を詳細に分析するために、限界希釈によりｐｒｅ−ＭＶＳｐ５から５０のクローン単離物を得て、遺伝子挿入断片の完全性を確認するために各々を分析した（図１２）。Ｇａｇ挿入断片とフランキングするＳｅＶ配列に特異的なプライマーを用いてＲＴ／ＰＣＲを実施したところ（図１１Ａ）、結果から、全てのクローン単離物が完全長Ｇａｇ遺伝子を有することがわかった（図１５Ａ）。ウェスタンブロッティングは、５０のうちの４７（９４％）のクローン単離物が、完全長Ｇａｇタンパク質を発現したことを明らかにした（図１１Ａ）。完全長Ｇａｇを発現しなかった３つのクローン単離物の分析から、点突然変異が存在し、これが、Ｇａｇポリペプチドを切断した未成熟終止コドンを導入したことがわかった（図１１Ｂ）。これらの結果全体から、ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）中の１．５ｋｂのＧａｇ遺伝子は、欠失突然変異を被らないこと、及び集団中のウイルスの大部分が完全長Ｇａｇ免疫原をコードすることが立証された。この結果はまた、ｐｒｅＭＶＳが、より大きいマスターウイルスシード（ＭＶＳ）バンクの生産、及びそれに続くｃＧＭＰ製造を支持するであろうという確信ももたらした。
【００５５】
ｐｒｅＭＶＳの１部分を契約製造者に送り、ＭＶＳバンクを調製し、臨床試験材料を製造した。大部分のワクチン材料の分析から、遺伝子挿入断片がインタクトであり、Ｇａｇタンパク質が感染細胞から発現され、Ｇａｇ遺伝子の共通ヌクレオチド配列が正しいことが明らかにされた。これらの結果から、ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）が、ｃＧＭＰ製造を通して遺伝的に安定しており、また、遺伝的安定性試験手法（図１２）が製造工程中の結果の信頼できる予測因子を提供したという結論を引き出すことができる。
【００５６】
ＳｅＶ−ＨＩＶワクチンのさらなる開発の計画には、ｇａｇコード配列より大きい外来遺伝子（図１Ｆ〜Ｈ）、及び場合によりベクターの遺伝的不安定性を促進することがわかっているコードされた免疫原、例えば、三量体ＨＩＶ  Ｅｎｖなどの使用が必要であった（Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７２：２６０−２７２、Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：７１７６−７１８４）。従って、外来ヌクレオチド配列中の突然変異の蓄積を最小限にすると共に、トランスジーンによりコードされたポリペプチドの発現に関連するあらゆる阻害作用を低減する遺伝子設計戦略を開発することが不可欠であった。これを達成するために、Ｅｎｖ及びＨＩＶｃｏｎＣ５免疫原をコードするＳｅＶベクターの開発中に２つの遺伝子設計戦略を適用した（図９Ｆ〜Ｈ）。
【００５７】
１つの方法は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムＲＮＡと類似するヌクレオチド含有率を有する外来遺伝子を設計する配列最適化方法を含んだ。この遺伝子最適化方法をＥｎｖ及びＨＩＶｃｏｎＣ５遺伝子に適用した。第２の手法は、いくつかのＥｎｖ機能性ドメインが、異種貫膜糖タンパク質の類似領域で置換されたハイブリッドポリペプチドをコードするように、Ｅｎｖ遺伝子を修飾することを含んだ。
【００５８】
新規の遺伝子最適化手法を開発するための理論的根拠の一部は、高いＧ＋Ｃ含有率（＞６０％）のＳＩＶ  Ｇａｇが、ＣＤＶベクターにクローン化されると不安定であるという観察に基づくものであった。遺伝子欠失は、最初にインタクトなＧａｇ遺伝子を有するベクターのレスキューを阻止した。特に、高いＧ＋Ｃ含有率は、一般に比較的低いパーセンテージのＧ＋Ｃを有する（すなわち、ＳｅＶ  Ｇ＋Ｃは４６％で、ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ血清型は４２％である）マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムと実質的に異なっていた。ＳＩＶ  Ｇａｇ配列の高いＧ＋Ｃ含有率は、遺伝子を設計するのに用いられる遺伝子最適化方法に起因した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：４８９２−４９０３）。哺乳動物細胞での最大発現を達成するように最適化された遺伝子は、典型的に、高いＧ＋Ｃ含有率をもたらすコドンバイアスを有する（Ｋｕｄｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００６．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ４：ｅ１８０）。マイナス鎖ＲＮＡウイルスに典型的ではないヌクレオチド含有率及びコドンバイアスを生成する以外に、標準的な遺伝子最適化方法では、ＲＮＡゲノム複製又はウイルスｍＲＮＡ合成にマイナスの作用を有し得る配列モチーフについてデザイナー遺伝子を調べない。不安定を引き起こし得る配列モチーフの例として、以下のものが挙げられる：１）ウイルスＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを阻害する二次構造から形成し得るＧ＋Ｃが豊富な領域、２）ｍＲＮＡ編集又はポリアデニル化中のウイルスＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの鋳型非依存性付加を指令する天然のシス作用シグナルに類似する配列エレメント（Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．．２００７．Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｉｅｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．，ｐ．１４４９−１４９６、Ｋｎｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２．Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｙｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ，ｐ．１３６３−１４０８、Ｋｎｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｆｉｅｌｄｓ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１．Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）；３）ウイルスポリメラーゼに特異的な保存的転写開始又は終結シグナルに類似する配列（Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５６：２２１−２２６、Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．．２００７．Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｉｅｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．，ｐ．１４４９−１４９６、Ｋｎｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２．Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｙｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ，ｐ．１３６３−１４０８、Ｋｎｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｆｉｅｌｄｓ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１．Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ５１６３３）；及びＲＮＡポリメラーゼスタッター（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）を引き起こ���得るホモポリマー配列モチーフ（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：２７０−２７９、Ｈａｕｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：５５６８−５５７６、Ｂｉｌｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４：４８７３−４８８３）。上記のようなヌクレオチド配列エレメントは、外来遺伝子に存在する場合、ＲＮＡゲノム複製に干渉するか、又は高頻度のヌクレオチドの誤取込みを促すことにより、遺伝的不安定性を促進し得る。
【００５９】
特に、ＲＮＡ複製に干渉するか、又はヌクレオチドの誤取込みの割合を増大し得る配列モチーフを除外しながら、マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムに類似する遺伝子を作製するために、新規の遺伝子最適化方法が開発された。最終結果は、マイナス鎖ウイルスに類似するコドンバイアス、低い総Ｇ＋Ｃ含有率を有し、シス作用ウイルスＲＮＡポリメラーゼ制御エレメントに類似する配列がなく、且つ４〜５ヌクレオチド長を超えるホモポリマーヌクレオチド区間が極めて少ないか、又は全くない外来タンパク質コード配列である。この遺伝子最適化方法は、ＨＩＶ  Ｅｎｖ（２．１〜２．３ｋｂ、図９Ｇ及びＨ）を発現するか、又は２．２Ｋｂ  ＨＩＶｃｏｎＣ５遺伝子（図９Ｆ）を含有する遺伝的に安定なＳｅＶベクターの作製中に使用されている。
【００６０】
前述した遺伝子最適化方法を適用する以外に、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質をマイナス鎖ＲＮＡウイルスとより適合性にすると共に、ウイルス複製適応性に対するその既知の負の作用を低減するために、追加の措置を講じた。ワクチン設計の目標は、真正ＨＩＶ糖タンパク質と酷似するＥｎｖ免疫原を発現することであった。これは、Ｅｎｖを三量体貫膜糖タンパク質として発現することを意味するが、Ｅｎｖは細胞表面でわずかにのみ発現され、細胞傷害性であり、且つＥｎｖ遺伝子はベクター不安定性を促進する傾向があることから、貫膜糖タンパク質としてのＥｎｖのベクター送達には問題があった（Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７２：２６０−２７２、Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：７１７６−７１８４、Ｐｏｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２−１５）。Ｅｎｖ発現を改善しながら、トランスジーンの負の作用を低減するために、タンパク質ドメイン置換を、細胞表面組み込みを制御する領域に導入した。Ｅｎｖシグナル配列（ＳＳ）、貫膜領域（ＴＭＲ）、及び細胞質尾部（ＣＴ）がＶＳＶ  Ｇ又はＳｅＶ  Ｆからの類似配列で置換されたハイブリッドＥｎｖを開発した（図１４）。これらのドメインは、三量体Ｅｎｖ細胞外ドメインのネイティブ構造にほとんど作用がないと予想されるために交換されたが、初期の研究では、ＳＳ又はＣＴの置換がＥｎｖ発現を調節し得ることが立証され（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ＣＢ  ６：３１５−３２４、Ｏｗｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：３６０−３６５）、ＴＭＲ置換は、ＨＩＶ  Ｅｎｖを含む様々な異なる貫膜糖タンパク質の表面発現に影響を与えることが明らかにされた（Ｇａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：９４ｒａ７１、Ｋｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１７４−１８０、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：１０８６９−１０８７８、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８：１０１６５−１０１７６、Ｇｒａｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：３４８６−３４９７、Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１０４６７−１０４７７）。
【００６１】
ＳｅＶ−Ｅｎｖベクターにおいて試験するために、２つのキメラＥｎｖを作製した。１つ目では、ＳＳ、ＣＴ、及びＴＭＲ領域をＶＳＶ  Ｇ由来の類似配列で置換することにより、株ＢＧ５０５由来のクレードＡ  ＨＩＶ  Ｅｎｖ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢＡ６１５１６．１）（Ｈｏｆｆｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：５３７２−５３８３、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：８３５−８４４）を修飾して、ＥｎｖＧと称するハイブリッドを作製した。第２の遺伝子は、同じ領域をＳｅＶ融合タンパク質（Ｆ）由来の配列で置換したハイブリッドをコードするように設計され、このハイブリッドは、ＥｎｖＦと称した。ＥｎｖＦ遺伝子を作製するために、ＥｎｖＧコード領域中のＳＳ、ＴＭＲ、及びＣＴコード配列を、ＳｅＶ  Ｆ遺伝子から直接得たヌクレオチド配列で置換した。続いて、最も高度に転写された転写単位中のＮＰの上流に位置する最適化ＥｎｖＧ又はＥｎｖＦ遺伝子（図９Ｇ及びＨ）を用いて、ＳｅＶベクターゲノムＤＮＡクローンを作製した。
【００６２】
ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）について成功したベロ細胞プロトコルを用いたところ、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）又はＳｅＶ−ｓｇＥｎｖＧ（ＮＰ）をレスキューする複数回の試みで、感染ＳｅＶベクターを生成することができなかった。様々なＤＮＡ量又は代替トランスフェクション試薬の使用などのトランスフェクション変数を調べても、特にプロモータ近位の転写単位に挿入された遺伝子に由来する、Ｅｎｖを発現するベクターの回収が、より頑健なウイルスレスキュー手順を必要とするであろうことを示すことができなかった。従って、ＤＮＡをエレクトロポレーションにより送達し、細胞の熱ショック応答の誘導によって組換えウイルスの回収を促進する、別のマイナス鎖ウイルスで機能することが証明された初期の手法に基づいて、新たなベロ細胞によるＳｅＶレスキュー方法を開発した（Ｗｉｔｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６４：４３−５０、Ｗｉｔｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３５：９１−１０１）。この新規のＳｅＶレスキュー方法を研究室条件下で使用して、感染組換え体をベロ細胞から回収した後、３ラウンドの限界希釈を実施することにより、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）及びＳｅＶ−ｓｇＥｎｖＧ（ＮＰ）の複数のクローン単離物を作製した。ＲＴ／ＰＣＲ及びウェスタンブロッティングによる分析から、全てのクローン単離物がインタクトな遺伝子挿入断片を含有し、予想されたＥｎｖ免疫原を発現することが明らかにされた（図１５）。この結果は、この方法によって生成されたＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）及びＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＧ（ＮＰ）がｃＧＭＰ適合条件下でのベクターシードの作製を可能にすることを示した。
【００６３】
ワクチン設計の目的は、細胞膜に組み込まれたネイティブＨＩＶ  Ｅｎｖスパイクを模倣する免疫原を発現するベクターを開発することであったことから、Ｅｎｖ免疫原の表面発現を評価するため、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）又はＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＧ（ＮＰ）に感染した細胞を用いてフローサイトメトリーを実施した。ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）又はＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＧ（ＮＰ）クローン単離物でベロ細胞を感染させ、４８時間後にいくつかの異なるＥｎｖエピトープに特異的なモノクローナル抗体で染色した（Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３７：４１２−４２５、Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １７：１０８−１１６、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：１８３−１８６）。これらの結果（図１６）から、ＥｎｖＦ又はＥｎｖＧがＥｎｖに特異的な複数の広域中和モノクローナル抗体（ｂｎＡｂ）により細胞表面に検出され、重要なことには、これには、成熟三量体Ｅｎｖスパイクに優先的に結合するｂｎＡｂｓ  ＰＧＴ１５１及びＶＲＣ０６ｂが含まれることが判明した（Ｆａｌｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｂｌａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：１１２３１−１１２４１）。
【００６４】
細胞表面に発現されるＥｎｖＦ及びＥｎｖＧの相対存在量を評価するために、抗体の量を増やしながら抗体と感染細胞を反応させ、一定の濃度範囲にわたって結合を評価すると共に、抗体結合が水平状態になる地点を推定した。抗体滴定から、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）に感染した細胞は、多量の抗体と結合することが明らかにされ、これは、ＥｎｖＦがより多量に細胞表面に発現されたことを示しており、そのため、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）をさらなる開発のために選択した。
【００６５】
エレクトロポレーションに基づくＳｅＶレスキュー方法を用い、ｃＧＭＰに適合する条件下で感染ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）を生成した。その後、３ラウンドのクローン単離を限界希釈により実施し、その間、ＥｎｖＦ（ＮＰ）挿入断片完全性及びタンパク質発現をモニターした（図１８）。次に、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦクローン単離物を選択し、ベロ細胞において増幅することにより、ｐｒｅＭＶＳを生成した。ｐｒｅＭＶＳ由来のウイルスは、ＥｎｖＦを発現することが判明し、ベクターゲノムの完全なヌクレオチド配列を確認した（データは示していない）。
【００６６】
ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）ｐｒｅＭＶＳがｃＧＭＰ製造を支持することを確認するために、ｐｒｅＭＶＳ由来のウイルスを連続して５回増幅し（ｐｒｅＭＶＳｐ５）、ワクチン製造中の増殖を模倣した。ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）（図１１）について前述したように、５０のクローン単離物をｐＭＶＳｐ５から取得し、分析した。ウェスタンブロット分析（図１９Ａ）から、クローン単離物に感染した細胞は全て、フリンプロテアーゼによるタンパク質分解プロセシングにより生成されるＥｎｖ  ｇｐ１６０前駆体及びｇｐ１２０サブユニットと均等な予想したＥｎｖＦ種を含有することが判明した。このデータと一致して、クローン単離物の全てが、ＲＴ／ＰＣＲにより示される通り、インタクトなＥｎｖＦ遺伝子挿入断片も有した（図１９Ｂ）。これらの結果は、ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）の遺伝的安定性が臨床試験材料の製造を支持することを示している。
【００６７】
ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦについて前述したｃＧＭＰ適合ウイルスレスキュー及びクローン単離方法を用いて、ＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎＣ５と称する遺伝的に安定なベクターもレスキューし、ｐＭＶＳの生成に進めた。ＨＩＶｃｏｎＣ５免疫原（図１２Ａ）は、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕら（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２：ｅ９８４）により作製されたＨＩＶＣＯＮＳＶに関連する。ＨＩＶＣＯＮＳＶ免疫原は、１４の高度に保存されたＨＩＶポリペプチド配列エレメントと、Ｃ末端エピトープタグとから構成される融合タンパク質である。オリジナルのＨＩＶＣＯＮＳＶヌクレオチド配列は供給業者（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｉｎｃ；Ｇｅｎｂａｎｋ  ＤＭ０５９２７６．１）により最適化されて、６４％Ｇ＋Ｃとなった。２．４ｋｂｐのＨＩＶｃｏｎＣ５は、前文及び付録（Ａｐｐｅｎｄｉｘ）６に記載のヌクレオチド最適化方法を用いていた。さらに、ＨＩＶＣＯＮＳＶ中のＣ末端エピトープタグをクレードＢ  ＨＩＶ  Ｅｎｖ由来の既知抗体エピトープ（抗血清Ｄ７３２４により認識されるＣ５エピトープ、参考文献を参照（Ｅｇｇｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０１：２３６−２４７）で置換した。新規のＨＩＶｃｏｎＣ５遺伝子最適化方法は、Ｇ＋Ｃ含有率を４０％まで有意に低減した。
【００６８】
ＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）について前述したｃＧＭＰ基準に適合する条件下で、ＮＰ転写単位の上流に挿入された外来遺伝子（図９Ｆ）を含むＳｅＶ−ＨＩＶｃｏｎＣ５（ＮＰ）をベロ細胞からレスキューした。レスキューしたウイルスを、限界希釈による３ラウンドのクローン単離に付したところ、ウェスタンブロッティングにより示される（図２０Ｂ）ように、クローン単離物は全て、予想した約９０ｋｄのＨＩＶｃｏｎＣ５融合タンパク質を一貫して発現した。クローン単離物を増殖させることにより、ｐｒｅＭＶＳバンクを生成し、その後、バンクからのウイルスをさらに増殖させて遺伝的安定性を確認した。ＲＴ／ＰＣＲ（図１２Ｃ）及びウェスタンブロッティング（データは示していない）によるｐｒｅ−ＭＶＳｐ５の分析により、増殖したｐｒｅ−ＭＶＳｐ５から得られた５０のクローン単離物の全てがインタクトなＨＩＶｃｏｎＣ５遺伝子を含有することが判明した。
【００６９】
ｃＧＭＰ製造に好適である遺伝的に安定なＳｅＶワクチンベクターを作製するための、改良され且つ精密な方法が開発されている。この方法の多くの要素は、ＳｅＶ−Ｇａｇ（ＮＰ）ワクチンの作製によって例証され、後に製造されて、第１相臨床試験で評価された。遺伝子設計及び組換えウイルスレスキューの改善は、Ｅｎｖ三量体免疫原をコードするＳｅＶベクター、及びＴリンパ球応答を誘発するための複数の保存エピトープから構成される融合タンパク質（ＨＩＶｃｏｎＣ５）の作製を可能にした。特に、ＥｎｖＦ、ＥｎｖＧ、及びＨＩＶｃｏｎＣ５をコードするＳｅＶベクターは、ＮＰ転写単位の上流に外来遺伝子が挿入されていても極めて安定していた。様々なマイナス鎖ＲＮＡウイルスについて研究した他者により明らかにされているように、プロモータに近い位置に挿入された外来遺伝子ほど、レスキュー及び増殖するのが困難となる傾向がある（Ｗｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７６４２−７６５０、Ｃａｒｎｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：５８４−５９７、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４６：２５−３６）。
【００７０】
最終的なベクター作製方法は、以下を含んだ：ワクチンを製造することができるかどうかを確実に予測する遺伝的安定性試験の厳密な手順の作製、後のｃＧＭＰ製造を支持する組換えウイルスのレスキュー、クローン単離、及びｐｒｅ−ＭＶＳ生成のための工程、特にマイナス鎖ＲＮＡウイルスに使用するための遺伝子挿入断片のヌクレオチド配列を最適化する方法、並びにＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＧ（ＮＰ）及びＳｅＶ−ｓｆＥｎｖＦ（ＮＰ）の作製中に明らかにされる、貫膜糖タンパク質免疫原発現及びベクターの遺伝的安定性を促進する、タンパク質ドメイン置換に基づく戦略。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、組換えＳｅＶベクターにおいて、有利には、ＨＩＶ−１ワクチン成分として発現される免疫原の使用を包含する。
【００７２】
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「アミノ酸配列」という用語は、本明細書において置き換え可能に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖又は分岐状のいずれでもよく、修飾されたアミノ酸又はアミノ酸類似体を含んでもよく、アミノ酸以外の化学的部分が介在していてもよい。これらの用語は、自然に、又は介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、アセチル化、リン酸化、又はその他の任意の操作若しくは修飾、例えば、標識若しくは生物活性成分との結合により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「抗原」又は「免疫原」という用語は、置き換え可能に使用されて、対象に免疫応答を誘導することができる物質、典型的にはタンパク質を指す。この用語はまた、対象に投与されると（直接、又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列若しくはベクターを対象に投与することにより）、そのタンパク質に対して向けられる体液性及び／又は細胞性の免疫応答を誘発することができるという意味で免疫学的に活性であるタンパク質も指す。
【００７４】
「抗体」という用語は、エピトープ決定基と結合することができる、インタクトな分子並びにその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖを含む。これらの抗体断片は、その抗原又は受容体と選択的に結合するある程度の能力を保持しており、例えば、以下のものが挙げられる。
【００７５】
Ｆａｂ、すなわち、抗体分子の１価抗原結合断片を含有する断片は、酵素パパインによる全抗体の消化により、インタクトな軽鎖と１重鎖の１部分とを得ることによって生成することができる。
【００７６】
Ｆａｂ’、すなわち、抗体分子の断片は、ペプシンで全抗体を処理した後、還元により、インタクトな軽鎖と重鎖の１部分とを得ることによって取得することができ、１抗体分子につき２つのＦａｂ’断片が得られる。
【００７７】
Ｆ（ａｂ’）２、すなわち、酵素ペプシンで全抗体を処理することにより、後の還元なしに得ることができる抗体の断片；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合により一緒に保持される２つのＦａｂ’断片の二量体である。
【００７８】
ｓｃＦｖ、融合した一本鎖分子として、重鎖及び軽鎖の可変領域を含有する遺伝子操作断片を含む。
【００７９】
これらの断片を作製する一般的方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照されたい；この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８０】
「中和抗体」という用語は、中和指数＞１．５又は＞２．０で、ＨＩＶ−１ウイルスＦの侵入を阻害し得る。広域且つ強力な中和抗体は、中和アッセイにおいて、約５０％超のＨＩＶ−１ウイルス（多様なクレード及び１クレード内の異なる株由来の）を中和し得る。中和アッセイで投入ウイルスの約５０％を中和するモノクローナル抗体の阻害濃度は、約２５ｍｇ／ｍｌ未満であってよい。
【００８１】
本発明の抗体及び／又は抗原などのタンパク質が本明細書に例示及び記載する正確な配列と相違し得ることは理解すべきである。従って、本発明は、配列が本発明の方法に従って機能する限り、示される配列に対する欠失、付加及び置換を考慮する。これに関して、特に好ましい置換は、一般に天然で保存的であり、すなわち、１ファミリーのアミノ酸内で起こる置換である。例えば、アミノ酸は、一般に次の４つのファミリーに分けられる：（１）酸性  −  アスパラギン酸及びグルタミン酸；（２）塩基性  −  リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性  −  アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非荷電極性  −  グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。イソロイシン若しくはバリンによるロイシンの単独置換、又はその逆；グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、又はその逆；セリンによるトレオニンの置換、又はその逆；或いは、構造的に関連するアミノ酸による１アミノ酸の同様の保存的置換が生物学的活性に大きい影響をもたらさないであろうことは合理的に予測可能である。従って、例示及び記載される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない小さいアミノ酸置換をプロセシングするタンパク質は、本発明の範囲に含まれる。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）配列を指し、このようなものとして、限定はしないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、又は合成核酸が挙げられる。核酸は、一本鎖、又は部分的若しくは完全に二本鎖（二重螺旋）であってよい。二重螺旋核酸は、ホモ二重螺旋又はヘテロ二重螺旋のいずれであってもよい。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「トランスジーン」という用語は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれかから得ることができる「組換え」ヌクレオチド配列を指すために用いられる場合がある。「組換え」という用語は、「人により」操作され、天然では存在しないか、又は別のヌクレオチド配列と結合している、若しくは天然で異なる構成で見出されるヌクレオチド配列を意味する。「人により」操作されたとは、何らかの人工的手段、例えば、機械の使用、コドン最適化、制限酵素などによって操作されることを意味すると理解される。
【００８４】
例えば、一実施形態では、コードされたタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を無効にするように、ヌクレオチド配列を突然変異させることもできる。別の実施形態では、ヌクレオチド配列をコドン最適化してもよく、例えば、コドンをヒトでの使用のために最適化してもよい。好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、コードされたタンパク質の正常なｉｎ  ｖｉｖｏ機能を無効化するように突然変異させると共に、ヒトでの使用のためにコドン最適化する。例えば、本発明のＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、ＲＴ、及びＩｎｔ配列の各々をこれらの方法で改変してもよい。
【００８５】
コドン最適化に関して、本発明の核酸分子は、本発明の抗原をコードするヌクレオチド配列を有しており、この核酸分子は、抗原を生成しようとする対象の遺伝子で用いられるコドンを使用するように設計することができる。ＨＩＶ及び他のレンチウイルスを含め、多くのウイルスは、多数の稀有コドンを使用し、これらのコドンが所望の対象において一般に使用されるコドンと一致するように、これらのコドンを改変することにより、抗原の増強された発現を達成することができる。好ましい実施形態では、使用するコドンは、「ヒト化」コドンであり、すなわち、上記コドンは、ＨＩＶにより頻繁に使用されるコドンではなく、高度に発現されたヒト遺伝子に頻繁に出現するものである（Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４９７−１５０３，１９９８）。こうしたコドン使用頻度は、ヒト細胞においてトランスジェニックＨＩＶタンパク質の効率的な発現をもたらす。任意の好適なコドン最適化方法を使用してよい。このような方法及びこうした方法の選択は当業者に周知である。さらに、Ｇｅｎｅａｒｔ（ｇｅｎｅａｒｔ．ｃｏｍ）などのように、配列のコドンを最適化するいくつかの企業もある。従って、本発明のヌクレオチド配列は、容易にコドン最適化することができる。
【００８６】
本発明は、本発明の抗原の機能的及び／又は抗原的に均等な変異体及び誘導体並びにその機能的に均等な断片をコードするヌクレオチド配列をさらに包含する。これらの機能的に均等な変異体、誘導体、及び断片は、抗原活性を保持する能力を呈示する。例えば、コードされたアミノ酸配列を変えないＤＮＡ配列の変化、及びアミノ酸残基の保存的置換をもたらす変化、１つ若しくは２、３のアミノ酸欠失又は付加、及びアミノ酸類似体によるアミノ酸残基の置換は、コードされたポリペプチドの特性に有意に影響しないものである。保存的アミノ酸置換は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン／メチオニン；リシン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。一実施形態では、変異体は、目的の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチドに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の相同性又は同一性を有する。
【００８７】
本発明の目的のために、配列同一性又は相同性は、配列ギャップを最小限にしながら、重複及び同一性を最大限にするようにアラインメントしたとき、配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、いくつかの数学アルゴリズムのいずれを用いて決定してもよい。２つの配列の比較に使用される数学アルゴリズムの非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３；９０：５８７３−５８７７に記載のように改変された、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０；８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。
【００８８】
配列の比較に使用される数学アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ  １９８８；４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用することができる。局所配列類似性の領域の検出及びアラインメントのための別の有用なアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：２４４４−２４４８に記載されているＦＡＳＴＡアルゴリズムである。
【００８９】
本発明に従う使用に有利なものは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（ワシントン大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）ＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェアである。いくつかのＵＮＩＸプラットフォームのためのＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０実行可能プログラムは、ｆｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓからダウンロードすることができる。このプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４であり、これは、パブリックドメインＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４（Ａｌｔｓｃｈｕｌ＆Ｇｉｓｈ，１９９６，Ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９０；２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ＆Ｓｔａｔｅｓ，１９９３；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２；Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に基づいている。
【００９０】
本発明の様々な組換えヌクレオチド配列並びに抗体及び／又は抗原は、標準的組換えＤＮＡ及びクローン化技術を用いて作製される。こうした技術は当業者に周知である。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）を参照されたい。
【００９１】
本発明のヌクレオチド配列を「ベクター」に挿入してもよい。「ベクター」という用語は、当業者により広範に使用され、理解されており、本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、当業者に周知の意味と一致して用いられる。例えば、「ベクター」という用語は、当業者に一般に使用され、ある環境から別の環境への核酸分子の輸送を可能にするか、又は容易にするか、或いは核酸分子の操作を可能にするか、又は容易にするビヒクルを指す。
【００９２】
本発明の抗体及び／又は抗原の発現を可能にする任意のベクターを本発明に従い使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗原及び／又は抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、無細胞発現系を用いて）及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた培養細胞中で使用することにより、コードされたＨＩＶ−抗原及び／又は抗体を生成することができ、次に、これらをタンパク質性ワクチンの生産などの様々な用途に使用することができる。こうした用途のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ並びに／又は培養細胞における抗原及び／若しくは抗体の発現を可能にする任意のベクターを使用してよい。
【００９３】
抗体及び／又は抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることが要望される用途、例えば、本発明のトランスジーンをＤＮＡ又はＤＮＡ含有ワクチンに使用する場合、本発明の抗体及び／又は抗原の発現を可能にし、且つｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に安全である任意のベクターを使用してよい。好ましい実施形態では、使用するベクターは、ヒト、哺乳動物及び／又は実験動物で使用するのに安全である。
【００９４】
本発明の抗体及び／又は抗原を発現させるために、タンパク質コード配列は、そのタンパク質の転写及び翻訳を指令する調節又は核酸制御配列に「作動可能に連結される」べきである。本明細書で使用されるとき、コード配列及び核酸制御配列又はプロモータは、それらが、コード配列の発現又は転写及び／若しくは翻訳を核酸制御配列の影響又は制御下に置くように共有結合されているとき、「作動可能に連結されている」と言う。「核酸制御配列」は、いずれの核酸エレメントであってもよく、例えば、限定はしないが、プロモータ、エンハンサー、ＩＲＥＳ、イントロン、及びそれに作動可能に連結された核酸配列又はコード配列の発現を指令する、本明細書に記載される他のエレメントなどがある。「プロモータ」という用語は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位周辺にクラスター形成し、本発明のタンパク質コード配列に作動可能に連結されると、コードされたタンパク質の発現をもたらす転写制御モジュールの群を指すために用いられる。本発明のトランスジーンの発現は、構成的プロモータ又は誘導性プロモータの制御下にあってよく、このプロモータは、ある特定の外部刺激、例えば、限定はしないが、テトラサイクリンなどの抗生物質、エクジソンなどのホルモン、又は重金属などに曝露されて初めて転写を開始する。プロモータは、特定の細胞型、組織又は臓器に特異的であってもよい。多くの好適なプロモータ及びエンハンサーが当技術分野で公知であり、こうした好適なプロモータ又はエンハンサーのいずれを本発明のトランスジーンの発現に使用してもよい。例えば、好適なプロモータ及び／又はエンハンサーは、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＥＰＤＢ）から選択することができる。
【００９５】
本発明は、外来エピトープを発現する組換えベクターに関する。有利には、エピトープはＨＩＶエピトープである。有利な実施形態では、ＨＩＶエピトープは、可溶性エンベロープ糖タンパク質であるが、本発明は、別のＨＩＶ抗原、エピトープ又は免疫原も含み得る。有利には、ＨＩＶエピトープは、ＨＩＶ抗原、ＨＩＶエピトープ又はＨＩＶ免疫原、例えば、限定はしないが、米国特許第７，３４１，７３１号明細書；同第７，３３５，３６４号明細書；同第７，３２９，８０７号明細書；同第７，３２３，５５３号明細書；同第７，３２０，８５９号明細書；同第７，３１１，９２０号明細書；同第７，３０６，７９８号明細書；同第７，２８５，６４６号明細書；同第７，２８５，２８９号明細書；同第７，２８５，２７１号明細書；同第７，２８２，３６４号明細書；同第７，２７３，６９５号明細書；同第７，２７０，９９７号明細書；同第７，２６２，２７０号明細書；同第７，２４４，８１９号明細書；同第７，２４４，５７５号明細書；同第７，２３２，５６７号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，２２３，８４４号明細書；同第７，２２３，７３９号明細書；同第７，２２３，５３４号明細書；同第７，２２３，３６８号明細書；同第７，２２０，５５４号明細書；同第７，２１４，５３０号明細書；同第７，２１１，６５９号明細書；同第７，２１１，４３２号明細書；同第７，２０５，１５９号明細書；同第７，１９８，９３４号明細書；同第７，１９５，７６８号明細書；同第７，１９２，５５５号明細書；同第７，１８９，８２６号明細書；同第７，１８９，５２２号明細書；同第７，１８６，５０７号明細書；同第７，１７９，６４５号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第７，１７２，７６１号明細書；同第７，１６９，５５０号明細書；同第７，１５７，０８３号明細書；同第７，１５３，５０９号明細書；同第７，１４７，８６２号明細書；同第７，１４１，５５０号明細書；同第７，１２９，２１９号明細書；同第７，１２２，１８８号明細書；同第７，１１８，８５９号明細書；同第７，１１８，８５５号明細書；同第７，１１８，７５１号明細書；同第７，１１８，７４２号明細書；同第７，１０５，６５５号明細書；同第７，１０１，５５２号明細書；同第７，０９７，９７１号明細書；同第７，０９７，８４２号明細書；同第７，０９４，４０５号明細書；同第７，０９１，０４９号明細書；同第７，０９０，６４８号明細書；同第７，０８７，３７７号明細書；同第７，０８３，７８７号明細書；同第７，０７０，７８７号明細書；同第７，０７０，７８１号明細書；同第７，０６０，２７３号明細書；同第７，０５６，５２１号明細書；同第７，０５６，５１９号明細書；同第７，０４９，１３６号明細書；同第７，０４８，９２９号明細書；同第７，０３３，５９３号明細書；同第７，０３０，０９４号明細書；同第７，０２２，３２６号明細書；同第７，００９，０３７号明細書；同第７，００８，６２２号明細書；同第７，００１，７５９号明細書；同第６，９９７，８６３号明細書；同第６，９９５，００８号明細書；同第６，９７９，５３５号明細書；同第６，９７４，５７４号明細書；同第６，９７２，１２６号明細書；同第６，９６９，６０９号明細書；同第６，９６４，７６９号明細書；同第６，９６４，７６２号明細書；同第６，９５８，１５８号明細書；同第６，９５６，０５９号明細書；同第６，９５３，６８９号明細書；同第６，９５１，６４８号明細書；同第６，９４６，０７５号明細書；同第６，９２７，０３１号明細書；同第６，９１９，３１９号明細書；同第６，９１９，３１８号明細書；同第６，９１９，０７７号明細書；同第６，９１３，７５２号明細書；同第６，９１１，３１５号明細書；同第６，９０８，６１７号明細書；同第６，９０８，６１２号明細書；同第６，９０２，７４３号明細書；同第６，９００，０１０号明細書；同第６，８９３，８６９号明細書；同第６，８８４，７８５号明細書；同第６，８８４，４３５号明細書；同第６，８７５，４３５号明細書；同第６，８６７，００５号明細書；同第６，８６１，２３４号明細書；同第６，８５５，５３９号明細書；同第６，８４１，３８１号明細書；同第６，８４１，３４５号明細書；同第６，８３８，４７７号明細書；同第６，８２１，９５５号明細書；同第６，８１８，３９２号明細書；同第６，８１８，２２２号明細書；同第６，８１５，２１７号明細書；同第６，８１５，２０１号明細書；同第６，８１２，０２６号明細書；同第６，８１２，０２５号明細書；同第６，８１２，０２４号明細書；同第６，８０８，９２３号明細書；同第６，８０６，０５５号明細書；同第６，８０３，２３１号明細書；同第６，８００，６１３号明細書；同第６，８００，２８８号明細書；同第６，７９７，８１１号明細書；同第６，７８０，９６７号明細書；同第６，７８０，５９８号明細書；同第６，７７３，９２０号明細書；同第６，７６４，６８２号明細書；同第６，７６１，８９３号明細書；同第６，７５３，０１５号明細書；同第６，７５０，００５号明細書；同第６，７３７，２３９号明細書；同第６，７３７，０６７号明細書；同第６，７３０，３０４号明細書；同第６，７２０，３１０号明細書；同第６，７１６，８２３号明細書；同第６，７１３，３０１号明細書；同第６，７１３，０７０号明細書；同第６，７０６，８５９号明細書；同第６，６９９，７２２号明細書；同第６，６９９，６５６号明細書；同第６，６９６，２９１号明細書；同第６，６９２，７４５号明細書；同第６，６７０，１８１号明細書；同第６，６７０，１１５号明細書；同第６，６６４，４０６号明細書；同第６，６５７，０５号明細書；同第６，６５７，０５０号明細書；同第６，６５６，４７１号明細書；同第６，６５３，０６６号明細書；同第６，６４９，４０９号明細書；同第６，６４９，３７２号明細書；同第６，６４５，７３２号明細書；同第６，６４１，８１６号明細書；同第６，６３５，４６９号明細書；同第６，６１３，５３０号明細書；同第６，６０５，４２７号明細書；同第６，６０２，７０９号明細書；同第６，６０２，７０５号明細書；同第６，６００，０２３号明細書；同第６，５９６，４７７号明細書；同第６，５９６，１７２号明細書；同第６，５９３，１０３号明細書；同第６，５９３，０７９号明細書；同第６，５７９，６７３号明細書；同第６，５７６，７５８号明細書；同第６，５７３，２４５号明細書；同第６，５７３，０４０号明細書；同第６，５６９，４１８号明細書；同第６，５６９，３４０号明細書；同第６，５６２，８００号明細書；同第６，５５８，９６１号明細書；同第６，５５１，８２８号明細書；同第６，５５１，８２４号明細書；同第６，５４８，２７５号明細書；同第６，５４４，７８０号明細書；同第６，５４４，７５２号明細書；同第６，５４４，７２８号明細書；同第６，５３４，４８２号明細書；同第６，５３４，３１２号明細書；同第６，５３４，０６４号明細書；同第６，５３１，５７２号明細書；同第６，５３１，３１３号明細書；同第６，５２５，１７９号明細書；同第６，５２５，０２８号明細書；同第６，５２４，５８２号明細書；同第６，５２１，４４９号明細書；同第６，５１８，０３０号明細書；同第６，５１８，０１５号明細書；同第６，５１４，６９１号明細書；同第６，５１４，５０３号明細書；同第６，５１１，８４５号明細書；同第６，５１１，８１２号明細書；同第６，５１１，８０１号明細書；同第６，５０９，３１３号明細書；同第６，５０６，３８４号明細書；同第６，５０３，８８２号明細書；同第６，４９５，６７６号明細書；同第６，４９５，５２６号明細書；同第６，４９５，３４７号明細書；同第６，４９２，１２３号明細書；同第６，４８９，１３１号明細書；同第６，４８９，１２９号明細書；同第６，４８２，６１４号明細書；同第６，４７９，２８６号明細書；同第６，４７９，２８４号明細書；同第６，４６５，６３４号明細書；同第６，４６１，６１５号明細書；同第６，４５８，５６０号明細書；同第６，４５８，５２７号明細書；同第６，４５８，３７０号明細書；同第６，４５１，６０１号明細書；同第６，４５１，５９２号明細書；同第６，４５１，３２３号明細書；同第６，４３６，４０７号明細書；同第６，４３２，６３３号明細書；同第６，４２８，９７０号明細書；同第６，４２８，９５２号明細書；同第６，４２８，７９０号明細書；同第６，４２０，１３９号明細書；同第６，４１６，９９７号明細書；同第６，４１０，３１８号明細書；同第６，４１０，０２８号明細書；同第６，４１０，０１４号明細書；同第６，４０７，２２１号明細書；同第６，４０６，７１０号明細書；同第６，４０３，０９２号明細書；同第６，３９９，２９５号明細書；同第６，３９２，０１３号明細書；同第６，３９１，６５７号明細書；同第６，３８４，１９８号明細書；同第６，３８０，１７０号明細書；同第６，３７６，１７０号明細書；同第６，３７２，４２６号明細書；同第６，３６５，１８７号明細書；同第６，３５８，７３９号明細書；同第６，３５５，２４８号明細書；同第６，３５５，２４７号明細書；同第６，３４８，４５０号明細書；同第６，３４２，３７２号明細書；同第６，３４２，２２８号明細書；同第６，３３８，９５２号明細書；同第６，３３７，１７９号明細書；同第６，３３５，１８３号明細書；同第６，３３５，０１７号明細書；同第６，３３１，４０４号明細書；同第６，３２９，２０２号明細書；同第６，３２９，１７３号明細書；同第６，３２８，９７６号明細書；同第６，３２２，９６４号明細書；同第６，３１９，６６６号明細書；同第６，３１９，６６５号明細書；同第６，３１９，５００号明細書；同第６，３１９，４９４号明細書；同第６，３１６，２０５号明細書；同第６，３１６，００３号明細書；同第６，３０９，６３３号明細書；同第６，３０６，６２５号明細書；同第６，２９６，８０７号明細書；同第６，２９４，３２２号明細書；同第６，２９１，２３９号明細書；同第６，２９１，１５７号明細書；同第６，２８７，５６８号明細書；同第６，２８４，４５６号明細書；同第６，２８４，１９４号明細書；同第６，２７４，３３７号明細書；同第６，２７０，９５６号明細書；同第６，２７０，７６９号明細書；同第６，２６８，４８４号明細書；同第６，２６５，５６２号明細書；同第６，２６５，１４９号明細書；同第６，２６２，０２９号明細書；同第６，２６１，７６２号明細書；同第６，２６１，５７１号明細書；同第６，２６１，５６９号明細書；同第６，２５８，５９９号明細書；同第６，２５８，３５８号明細書；同第６，２４８，３３２号明細書；同第６，２４５，３３１号明細書；同第６，２４２，４６１号明細書；同第６，２４１，９８６号明細書；同第６，２３５，５２６号明細書；同第６，２３５，４６６号明細書；同第６，２３２，１２０号明細書；同第６，２２８，３６１号明細書；同第６，２２１，５７９号明細書；同第６，２１４，８６２号明細書；同第６，２１４，８０４号明細書；同第６，２１０，９６３号明細書；同第６，２１０，８７３号明細書；同第６，２０７，１８５号明細書；同第６，２０３，９７４号明細書；同第６，１９７，７５５号明細書；同第６，１９７，５３１号明細書；同第６，１９７，４９６号明細書；同第６，１９４，１４２号明細書；同第６，１９０，８７１号明細書；同第６，１９０，６６６号明細書；同第６，１６８，９２３号明細書；同第６，１５６，３０２号明細書；同第６，１５３，４０８号明細書；同第６，１５３，３９３号明細書；同第６，１５３，３９２号明細書；同第６，１５３，３７８号明細書；同第６，１５３，３７７号明細書；同第６，１４６，６３５号明細書；同第６，１４６，６１４号明細書；同第６，１４３，８７６号明細書；同第６，１４０，０５９号明細書；同第６，１４０，０４３号明細書；同第６，１３９，７４６号明細書；同第６，１３２，９９２号明細書；同第６，１２４，３０６号明細書；同第６，１２４，１３２号明細書；同第６，１２１，００６号明細書；同第６，１２０，９９０号明細書；同第６，１１４，５０７号明細書；同第６
，１１４，１４３号明細書；同第６，１１０，４６６号明細書；同第６，１０７，０２０号明細書；同第６，１０３，５２１号明細書；同第６，１００，２３４号明細書；同第６，０９９，８４８号明細書；同第６，０９９，８４７号明細書；同第６，０９６，２９１号明細書；同第６，０９３，４０５号明細書；同第６，０９０，３９２号明細書；同第６，０８７，４７６号明細書；同第６，０８３，９０３号明細書；同第６，０８０，８４６号明細書；同第６，０８０，７２５号明細書；同第６，０７４，６５０号明細書；同第６，０７４，６４６号明細書；同第６，０７０，１２６号明細書；同第６，０６３，９０５号明細書；同第６，０６３，５６４号明細書；同第６，０６０，２５６号明細書；同第６，０６０，０６４号明細書；同第６，０４８，５３０号明細書；同第６，０４５，７８８号明細書；同第６，０４３，３４７号明細書；同第６，０４３，２４８号明細書；同第６，０４２，８３１号明細書；同第６，０３７，１６５号明細書；同第６，０３３，６７２号明細書；同第６，０３０，７７２号明細書；同第６，０３０，７７０号明細書；同第６，０３０，６１８号明細書；同第６，０２５，１４１号明細書；同第６，０２５，１２５号明細書；同第６，０２０，４６８号明細書；同第６，０１９，９７９号明細書；同第６，０１７，５４３号明細書；同第６，０１７，５３７号明細書；同第６，０１５，６９４号明細書；同第６，０１５，６６１号明細書；同第６，０１３，４８４号明細書；同第６，０１３，４３２号明細書；同第６，００７，８３８号明細書；同第６，００４，８１１号明細書；同第６，００４，８０７号明細書；同第６，００４，７６３号明細書；同第５，９９８，１３２号明細書；同第５，９９３，８１９号明細書；同第５，９８９，８０６号明細書；同第５，９８５，９２６号明細書；同第５，９８５，６４１号明細書；同第５，９８５，５４５号明細書；同第５，９８１，５３７号明細書；同第５，９８１，５０５号明細書；同第５，９８１，１７０号明細書；同第５，９７６，５５１号明細書；同第５，９７２，３３９号明細書；同第５，９６５，３７１号明細書；同第５，９６２，４２８号明細書；同第５，９６２，３１８号明細書；同第５，９６１，９７９号明細書；同第５，９６１，９７０号明細書；同第５，９５８，７６５号明細書；同第５，９５８，４２２号明細書；同第５，９５５，６４７号明細書；同第５，９５５，３４２号明細書；同第５，９５１，９８６号明細書；同第５，９５１，９７５号明細書；同第５，９４２，２３７号明細書；同第５，９３９，２７７号明細書；同第５，９３９，０７４号明細書；同第５，９３５，５８０号明細書；同第５，９２８，９３０号明細書；同第５，９２８，９１３号明細書；同第５，９２８，６４４号明細書；同第５，９２８，６４２号明細書；同第５，９２５，５１３号明細書；同第５，９２２，５５０号明細書；同第５，９２２，３２５号明細書；同第５，９１９，４５８号明細書；同第５，９１６，８０６号明細書；同第５，９１６，５６３号明細書；同第５，９１４，３９５号明細書；同第５，９１４，１０９号明細書；同第５，９１２，３３８号明細書；同第５，９１２，１７６号明細書；同第５，９１２，１７０号明細書；同第５，９０６，９３６号明細書；同第５，８９５，６５０号明細書；同第５，８９１，６２３号明細書；同第５，８８８，７２６号明細書；同第５，８８５，５８０号明細書；同第５，８８５，５７８号明細書；同第５，８７９，６８５号明細書；同第５，８７６，７３１号明細書；同第５，８７６，７１６号明細書；同第５，８７４，２２６号明細書；同第５，８７２，０１２号明細書；同第５，８７１，７４７号明細書；同第５，８６９，０５８号明細書；同第５，８６６，６９４号明細書；同第５，８６６，３４１号明細書；同第５，８６６，３２０号明細書；同第５，８６６，３１９号明細書；同第５，８６６，１３７号明細書；同第５，８６１，２９０号明細書；同第５，８５８，７４０号明細書；同第５，８５８，６４７号明細書；同第５，８５８，６４６号明細書；同第５，８５８，３６９号明細書；同第５，８５８，３６８号明細書；同第５，８５８，３６６号明細書；同第５，８５６，１８５号明細書；同第５，８５４，４００号明細書；同第５，８５３，７３６号明細書；同第５，８５３，７２５号明細書；同第５，８５３，７２４号明細書；同第５，８５２，１８６号明細書；同第５，８５１，８２９号明細書；同第５，８５１，５２９号明細書；同第５，８４９，４７５号明細書；同第５，８４９，２８８号明細書；同第５，８４３，７２８号明細書；同第５，８４３，７２３号明細書；同第５，８４３，６４０号明細書；同第５，８４３，６３５号明細書；同第５，８４０，４８０号明細書；同第５，８３７，５１０号明細書；同第５，８３７，２５０号明細書；同第５，８３７，２４２号明細書；同第５，８３４，５９９号明細書；同第５，８３４，４４１号明細書；同第５，８３４，４２９号明細書；同第５，８３４，２５６号明細書；同第５，８３０，８７６号明細書；同第５，８３０，６４１号明細書；同第５，８３０，４７５号明細書；同第５，８３０，４５８号明細書；同第５，８３０，４５７号明細書；同第５，８２７，７４９号明細書；同第５，８２７，７２３号明細書；同第５，８２４，４９７号明細書；同第５，８２４，３０４号明細書；同第５，８２１，０４７号明細書；同第５，８１７，７６７号明細書；同第５，８１７，７５４号明細書；同第５，８１７，６３７号明細書；同第５，８１７，４７０号明細書；同第５，８１７，３１８号明細書；同第５，８１４，４８２号明細書；同第５，８０７，７０７号明細書；同第５，８０４，６０４号明細書；同第５，８０４，３７１号明細書；同第５，８００，８２２号明細書；同第５，７９５，９５５号明細書；同第５，７９５，７４３号明細書；同第５，７９５，５７２号明細書；同第５，７８９，３８８号明細書；同第５，７８０，２７９号明細書；同第５，７８０，０３８号明細書；同第５，７７６，７０３号明細書；同第５，７７３，２６０号明細書；同第５，７７０，５７２号明細書；同第５，７６６，８４４号明細書；同第５，７６６，８４２号明細書；同第５，７６６，６２５号明細書；同第５，７６３，５７４号明細書；同第５，７６３，１９０号明細書；同第５，７６２，９６５号明細書；同第５，７５９，７６９号明細書；同第５，７５６，６６６号明細書；同第５，７５３，２５８号明細書；同第５，７５０，３７３号明細書；同第５，７４７，６４１号明細書；同第５，７４７，５２６号明細書；同第５，７４７，０２８号明細書；同第５，７３６，３２０号明細書；同第５，７３６，１４６号明細書；同第５，７３３，７６０号明細書；同第５，７３１，１８９号明細書；同第５，７２８，３８５号明細書；同第５，７２１，０９５号明細書；同第５，７１６，８２６号明細書；同第５，７１６，６３７号明細書；同第５，７１６，６１３号明細書；同第５，７１４，３７４号明細書；同第５，７０９，８７９号明細書；同第５，７０９，８６０号明細書；同第５，７０９，８４３号明細書；同第５，７０５，３３１号明細書；同第５，７０３，０５７号明細書；同第５，７０２，７０７号明細書；同第５，６９８，１７８号明細書；同第５，６８８，９１４号明細書；同第５，６８６，０７８号明細書；同第５，６８１，８３１号明細書；同第５，６７９，７８４号明細書；同第５，６７４，９８４号明細書；同第５，６７２，４７２号明細書；同第５，６６７，９６４号明細書；同第５，６６７，７８３号明細書；同第５，６６５，５３６号明細書；同第５，６６５，３５５号明細書；同第５，６６０，９９０号明細書；同第５，６５８，７４５号明細書；同第５，６５８，５６９号明細書；同第５，６４３，７５６号明細書；同第５，６４１，６２４号明細書；同第５，６３９，８５４号明細書；同第５，６３９，５９８号明細書；同第５，６３７，６７７号明細書；同第５，６３７，４５５号明細書；同第５，６３３，２３４号明細書；同第５，６２９，１５３号明細書；同第５，６２７，０２５号明細書；同第５，６２２，７０５号明細書；同第５，６１４，４１３号明細書；同第５，６１０，０３５号明細書；同第５，６０７，８３１号明細書；同第５，６０６，０２６号明細書；同第５，６０１，８１９号明細書；同第５，５９７，６８８号明細書；同第５，５９３，９７２号明細書；同第５，５９１，８２９号明細書；同第５，５９１，８２３号明細書；同第５，５８９，４６６号明細書；同第５，５８７，２８５号明細書；同第５，５８５，２５４号明細書；同第５，５８５，２５０号明細書；同第５，５８０，７７３号明細書；同第５，５８０，７３９号明細書；同第５，５８０，５６３号明細書；同第５，５７３，９１６号明細書；同第５，５７１，６６７号明細書；同第５，５６９，４６８号明細書；同第５，５５８，８６５号明細書；同第５，５５６，７４５号明細書；同第５，５５０，０５２号明細書；同第５，５４３，３２８号明細書；同第５，５４１，１００号明細書；同第５，５４１，０５７号明細書；同第５，５３４，４０６号明細書；同第５，５２９，７６５号明細書；同第５，５２３，２３２号明細書；同第５，５１６，８９５号明細書；同第５，５１４，５４１号明細書；同第５，５１０，２６４号明細書；同第５，５００，１６１号明細書；同第５，４８０，９６７号明細書；同第５，４８０，９６６号明細書；同第５，４７０，７０１号明細書；同第５，４６８，６０６号明細書；同第５，４６２，８５２号明細書；同第５，４５９，１２７号明細書；同第５，４４９，６０１号明細書；同第５，４４７，８３８号明細書；同第５，４４７，８３７号明細書；同第５，４３９，８０９号明細書；同第５，４３９，７９２号明細書；同第５，４１８，１３６号明細書；同第５，３９９，５０１号明細書；同第５，３９７，６９５号明細書；同第５，３９１，４７９号明細書；同第５，３８４，２４０号明細書；同第５，３７４，５１９号明細書；同第５，３７４，５１８号明細書；同第５，３７４，５１６号明細書；同第５，３６４，９３３号明細書；同第５，３５９，０４６号明細書；同第５，３５６，７７２号明細書；同第５，３５４，６５４号明細書；同第５，３４４，７５５号明細書；同第５，３３５，６７３号明細書；同第５，３３２，５６７号明細書；同第５，３２０，９４０号明細書；同第５，３１７，００９号明細書；同第５，３１２，９０２号明細書；同第５，３０４，４６６号明細書；同第５，２９６，３４７号明細書；同第５，２８６，８５２号明細書；同第５，２６８，２６５号明細書；同第５，２６４，３５６号明細書；同第５，２６４，３４２号明細書；同第５，２６０，３０８号明細書；同第５，２５６，７６７号明細書；同第５，２５６，５６１号明細書；同第５，２５２，５５６号明細書；同第５，２３０，９９８号明細書；同第５，２３０，８８７号明細書；同第５，２２７，１５９号明細書；同第５，２２５，３４７号明細書；同第５，２２１，６１０号明細書；同第５，２１７，８６１号明細書；同第５，２０８，３２１号明細書；同第５，２０６，１３６号明細書；同第５，１９８，３４６号明細書；同第５，１８５，１４７号明細書；同第５，１７８，８６５号明細書；同第５，１７３，４００号明細書；同第５，１７３，３９９号明細書；同第５，１６６，０５０号明細書；同第５，１５６，９５１号明細書；同第５，１３５，８６４号明細書；同第５，１２２，４４６号明細書；同第５，１２０，６６２号明細書；同第５，１０３，８３６号明細書；同第５，１００，７７７号明細書；同第５，１００，６６２号明細書；同第５，０９３，２３０号明細書；同第５，０７７，２８４号明細書；同第５，０７０，０１０号明細書；同第５，０６８，１７４号明細書；同第５，０６６，７８２号明細書；同第５，０５５，３９１号明細書；同第５，０４３，２６２号明細書；同第５，０３９，６０４号明細書；同第５，０３９，５２２号明細書；同第５，０３０，７１８号明細書；同第５，０３０，５５５号明細書；同第５，０３０，４４９号明細書；同第５，０１９，３８７号明細書；同第５，
０１３，５５６号明細書；同第５，００８，１８３号明細書；同第５，００４，６９７号明細書；同第４，９９７，７７２号明細書；同第４，９８３，５２９号明細書；同第４，９８３，３８７号明細書；同第４，９６５，０６９号明細書；同第４，９４５，０８２号明細書；同第４，９２１，７８７号明細書；同第４，９１８，１６６号明細書；同第４，９００，５４８号明細書；同第４，８８８，２９０号明細書；同第４，８８６，７４２号明細書；同第４，８８５，２３５号明細書；同第４，８７０，００３号明細書；同第４，８６９，９０３号明細書；同第４，８６１，７０７号明細書；同第４，８５３，３２６号明細書；同第４，８３９，２８８号明細書；同第４，８３３，０７２号明細書及び同第４，７９５，７３９号明細書に記載のＨＩＶ抗原、ＨＩＶエピトープ又はＨＩＶ免疫原である。
【００９６】
別の実施形態では、ＨＩＶ、又はその免疫原性断片をＨＩＶエピトープとして使用してもよい。例えば、米国特許第７，３９３，９４９号明細書、同第７，３７４，８７７号明細書、同第７，３０６，９０１号明細書、同第７，３０３，７５４，号明細書、同第７，１７３，０１４号明細書、同第７，１２２，１８０号明細書、同第７，０７８，５１６号明細書、同第７，０２２，８１４号明細書、同第６，９７４，８６６号明細書、同第６，９５８，２１１号明細書、同第６，９４９，３３７号明細書、同第６，９４６，２５４号明細書、同第６，８９６，９００号明細書、同第６，８８７，９７７号明細書、同第６，８７０，０４５号明細書、同第６，８０３，１８７号明細書、同第６，７９４，１２９号明細書、同第６，７７３，９１５号明細書、同第６，７６８，００４号明細書、同第６，７０６，２６８号明細書、同第６，６９６，２９１号明細書、同第６，６９２，９５５号明細書、同第６，６５６，７０６号明細書、同第６，６４９，４０９号明細書、同第６，６２７，４４２号明細書、同第６，６１０，４７６号明細書、同第６，６０２，７０５号明細書、同第６，５８２，９２０号明細書、同第６，５５７，２９６号明細書、同第６，５３１，５８７号明細書、同第６，５３１，１３７号明細書、同第６，５００，６２３号明細書、同第６，４４８，０７８号明細書、同第６，４２９，３０６号明細書、同第６，４２０，５４５号明細書、同第６，４１０，０１３号明細書、同第６，４０７，０７７号明細書、同第６，３９５，８９１号明細書、同第６，３５５，７８９号明細書、同第６，３３５，１５８号明細書、同第６，３２３，１８５号明細書、同第６，３１６，１８３号明細書、同第６，３０３，２９３号明細書、同第６，３００，０５６号明細書、同第６，２７７，５６１号明細書、同第６，２７０，９７５号明細書、同第６，２６１，５６４号明細書、同第６，２２５，０４５号明細書、同第６，２２２，０２４号明細書、同第６，１９４，３９１号明細書、同第６，１９４，１４２号明細書、同第６，１６２，６３１号明細書、同第６，１１４，１６７号明細書、同第６，１１４，１０９号明細書、同第６，０９０，３９２号明細書、同第６，０６０，５８７号明細書、同第６，０５７，１０２号明細書、同第６，０５４，５６５号明細書、同第６，０４３，０８１号明細書、同第６，０３７，１６５号明細書、同第６，０３４，２３３号明細書、同第６，０３３，９０２号明細書、同第６，０３０，７６９号明細書、同第６，０２０，１２３号明細書、同第６，０１５，６６１号明細書、同第６，０１０，８９５号明細書、同第６，００１，５５５号明細書、同第５，９８５，６６１号明細書、同第５，９８０，９００号明細書、同第５，９７２，５９６号明細書、同第５，９３９，５３８号明細書、同第５，９１２，３３８号明細書、同第５，８６９，３３９号明細書、同第５，８６６，７０１号明細書、同第５，８６６，６９４号明細書、同第５，８６６，３２０号明細書、同第５，８６６，１３７号明細書、同第５，８６４，０２７号明細書、同第５，８６１，２４２号明細書、同第５，８５８，７８５号明細書、同第５，８５８，６５１号明細書、同第５，８４９，４７５号明細書、同第５，８４３，６３８号明細書、同第５，８４０，４８０号明細書、同第５，８２１，０４６号明細書、同第５，８０１，０５６号明細書、同第５，７８６，１７７号明細書、同第５，７８６，１４５号明細書、同第５，７７３，２４７号明細書、同第５，７７０，７０３号明細書、同第５，７５６，６７４号明細書、同第５，７４１，７０６号明細書、同第５，７０５，６１２号明細書、同第５，６９３，７５２号明細書、同第５，６８８，６３７号明細書、同第５，６８８，５１１号明細書、同第５，６８４，１４７号明細書、同第５，６６５，５７７号明細書、同第５，５８５，２６３号明細書、同第５，５７８，７１５号明細書、同第５，５７１，７１２号明細書、同第５，５６７，６０３号明細書、同第５，５５４，５２８号明細書、同第５，５４５，７２６号明細書、同第５，５２７，８９５号明細書、同第５，５２７，８９４号明細書、同第５，２２３，４２３号明細書、同第５，２０４，２５９号明細書、同第５，１４４，０１９号明細書、同第５，０５１，４９６号明細書及び同第４，９４２，１２２号明細書に記載のＨＩＶヌクレオチドが本発明に有用である。
【００９７】
ＨＩＶ抗体により認識されるいずれのエピトープを本発明で使用してもよい。例えば、米国特許第６，９４９，３３７号明細書、同第６，９００，０１０号明細書、同第６，８２１，７４４号明細書、同第６，７６８，００４号明細書、同第６，６１３，７４３号明細書、同第６，５３４，３１２号明細書、同第６，５１１，８３０号明細書、同第６，４８９，１３１号明細書、同第６，２４２，１９７号明細書、同第６，１１４，１４３号明細書、同第６，０７４，６４６号明細書、同第６，０６３，５６４号明細書、同第６，０６０，２５４号明細書、同第５，９１９，４５７号明細書、同第５，９１６，８０６号明細書、同第５，８７１，７３２号明細書、同第５，８２４，３０４号明細書、同第５，７７３，２４７号明細書、同第５，７３６，３２０号明細書、同第５，６３７，４５５号明細書、同第５，５８７，２８５号明細書、同第５，５１４，５４１号明細書、同第５，３１７，００９号明細書、同第４，９８３，５２９号明細書、同第４，８８６，７４２号明細書、同第４，８７０，００３号明細書及び同第４，７９５，７３９号明細書に記載の抗ＨＩＶ抗体が本発明に有用である。さらに、米国特許第７，０７４，５５６号明細書、同第７，０７４，５５４号明細書、同第７，０７０，７８７号明細書、同第７，０６０，２７３号明細書、同第７，０４５，１３０号明細書、同第７，０３３，５９３号明細書、米国再発行特許第３９，０５７号明細書、米国特許第７，００８，６２２号明細書、同第６，９８４，７２１号明細書、同第６，９７２，１２６号明細書、同第６，９４９，３３７号明細書、同第６，９４６，４６５号明細書、同第６，９１９，０７７号明細書、同第６，９１６，４７５号明細書、同第６，９１１，３１５号明細書、同第６，９０５，６８０号明細書、同第６，９００，０１０号明細書、同第６，８２５，２１７号明細書、同第６，８２４，９７５号明細書、同第６，８１８，３９２号明細書、同第６，８１５，２０１号明細書、同第６，８１２，０２６号明細書、同第６，８１２，０２４号明細書、同第６，７９７，８１１号明細書、同第６，７６８，００４号明細書、同第６，７０３，０１９号明細書、同第６，６８９，１１８号明細書、同第６，６５７，０５０号明細書、同第６，６０８，１７９号明細書、同第６，６００，０２３号明細書、同第６，５９６，４９７号明細書、同第６，５８９，７４８号明細書、同第６，５６９，１４３号明細書、同第６，５４８，２７５号明細書、同第６，５２５，１７９号明細書、同第６，５２４，５８２号明細書、同第６，５０６，３８４号明細書、同第６，４９８，００６号明細書、同第６，４８９，１３１号明細書、同第６，４６５，１７３号明細書、同第６，４６１，６１２号明細書、同第６，４５８，９３３号明細書、同第６，４３２，６３３号明細書、同第６，４１０，３１８号明細書、同第６，４０６，７０１号明細書、同第６，３９５，２７５号明細書、同第６，３９１，６５７号明細書、同第６，３９１，６３５号明細書、同第６，３８４，１９８号明細書、同第６，３７６，１７０号明細書、同第６，３７２，２１７号明細書、同第６，３４４，５４５号明細書、同第６，３３７，１８１号明細書、同第６，３２９，２０２号明細書、同第６，３１９，６６５号明細書、同第６，３１９，５００号明細書、同第６，３１６，００３号明細書、同第６，３１２，９３１号明細書、同第６，３０９，８８０号明細書、同第６，２９６，８０７号明細書、同第６，２９１，２３９号明細書、同第６，２６１，５５８号明細書、同第６，２４８，５１４号明細書、同第６，２４５，３３１号明細書、同第６，２４２，１９７号明細書、同第６，２４１，９８６号明細書、同第６，２２８，３６１号明細書、同第６，２２１，５８０号明細書、同第６，１９０，８７１号明細書、同第６，１７７，２５３号明細書、同第６，１４６，６３５号明細書、同第６，１４６，６２７号明細書、同第６，１４６，６１４号明細書、同第６，１４３，８７６号明細書、同第６，１３２，９９２号明細書、同第６，１２４，１３２号明細書、米国再発行特許第３６，８６６号明細書、米国特許第６，１１４，１４３号明細書、同第６，１０３，２３８号明細書、同第６，０６０，２５４号明細書、同第６，０３９，６８４号明細書、同第６，０３０，７７２号明細書、同第６，０２０，４６８号明細書、同第６，０１３，４８４号明細書、同第６，００８，０４４号明細書、同第５，９９８，１３２号明細書、同第５，９９４，５１５号明細書、同第５，９９３，８１２号明細書、同第５，９８５，５４５号明細書、同第５，９８１，２７８号明細書、同第５，９５８，７６５号明細書、同第５，９３９，２７７号明細書、同第５，９２８，９３０号明細書、同第５，９２２，３２５号明細書、同第５，９１９，４５７号明細書、同第５，９１６，８０６号明細書、同第５，９１４，１０９号明細書、同第５，９１１，９８９号明細書、同第５，９０６，９３６号明細書、同第５，８８９，１５８号明細書、同第５，８７６，７１６号明細書、同第５，８７４，２２６号明細書、同第５，８７２，０１２号明細書、同第５，８７１，７３２号明細書、同第５，８６６，６９４号明細書、同第５，８５４，４００号明細書、同第５，８４９，５８３号明細書、同第５，８４９，２８８号明細書、同第５，８４０，４８０号明細書、同第５，８４０，３０５号明細書、同第５，８３４，５９９号明細書、同第５，８３１，０３４号明細書、同第５，８２７，７２３号明細書、同第５，８２１，０４７号明細書、同第５，８１７，７６７号明細書、同第５，８１７，４５８号明細書、同第５，８０４，４４０号明細書、同第５，７９５，５７２号明細書、同第５，７８３，６７０号明細書、同第５，７７６，７０３号明細書、同第５，７７３，２２５号明細書、同第５，７６６，９４４号明細書、同第５，７５３，５０３号明細書、同第５，７５０，３７３号明細書、同第５，７４７，６４１号明細書、同第５，７３６，３４１号明細書、同第５，７３１，１８９号明細書、同第５，７０７，８１４号明細書、同第５，７０２，７０７号明細書、同第５，６９８，１７８号明細書、同第５，６９５，９２７号明細書、同第５，６６５，５３６号明細書、同第５，６５８，７４５号明細書、同第５，６５２，１３８号明細書、同第５，６４５，８３６号明細書、同第５，６３５，３４５号明細書、同第５，６１８，９２２号明細書、同第５，６１０，０３５号明細書、同第５，６０７，８４７号明細書、同第５，６０４，０９２号明細書、同第５，６０１，８１９号明細書、同第５，５９７，８９６号明細書、同第５，５９７，６８８号明細書、同第５，５９１，８２９号明細書、同第５，５５８，８６５号明細書、同第５，５１４，５４１号明細書、同第５，５１０，２６４号明細書、同第５，４７８，７５３号明細書、同第５，３７４，５１８号明細書、同第５，３７４，５１６号明細書、同第５，３４４，７５５号明細書、同第５，３３２，５６７号明細書、同第５，３００，４３３号明細書、同第５，２９６，３４７号明細書、同第５，２８６，８５２号明細書、同第５，２６４，２２１号明細書、同第５，２６０，３０８号明細書、同第５，２５６，５６１号明細書、同第５，２５４，４５７号明細書、同第５，２３０，９９８号明細書、同第５，２２７，１５９号明細書、同第５，２２３，４０８号明細書、同第５，２１７，８９５号明細書、同第５，１８０，６６０号明細書、同第５，１７３，３９９号明細書、同第５，１６９，７５２号明細書、同第５，１６６，０５０号明細書、同第５，１５６，９５１号明細書、同第５，１４０，１０５号明細書、同第５，１３５，８６４号明細書、同第５，１２０，６４０号明細書、同第５，１０８，９０４号明細書、同第５，１０４，７９０号明細書、同第５，０４９，３８９号明細書、同第５，０３０，７１８号明細書、同第５，０３０，５５５号明細書、同第５，００４，６９７号明細書、同第４，９８３，５２９号明細書、同第４，８８８，２９０号明細書、同第４，８８６，７４２号明細書及び同第４，８５３，３２６号明細書に記載のモノクローナル抗ＨＩＶ抗体も本発明に有用である。
【００９８】
本発明に従って使用するベクターは、典型的に、それらが好適な遺伝子調節領域、例えば、プロモータ又はエンハンサーを含有し、本発明の抗原及び／又は抗体を発現することができるようなものを選択すべきである。
【００９９】
例えば、目標が、本発明の抗体及び／又は抗原によりコードされるタンパク質を生成する目的で、これらの抗体及び／又は抗原をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又は培養細胞で、或いは任意の原核若しくは真核生物において発現させることであるとき、用途に応じて任意の好適なベクターを使用することができる。例えば、プラスミド、ウイルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター、昆虫ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、酵母ベクター、哺乳動物細胞ベクターなどを使用することができる。好適なベクターは、ベクターの特徴、並びに見出された状況下で抗体及び／又は抗原を発現するうえでの要件を考慮に入れて、当業者が選択することができる。
【０１００】
目標が、例えば、ＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答及び／又はＨＩＶ−１に対する防御免疫をもたらすために、本発明の抗体及び／又は抗原を対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることであるとき、その対象での発現に好適であり、且つｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に安全である発現ベクターを選択すべきである。例えば、いくつかの実施形態では、例えば、本発明のＨＩＶ−１免疫原性組成物及びワクチンの前臨床試験用などの実験動物において、本発明の抗体及び／又は抗原を発現させるのが望ましい場合もある。他の実施形態では、例えば、本発明の免疫原性組成物及びワクチンの臨床試験において、及びそれらの実際の臨床使用のために、ヒト対象において本発明の抗体及び／又は抗原を発現させるのが望ましいであろう。こうした使用に好適な任意のベクターを用いることができ、好適なベクターを選択することは、十分に当業者の能力の範囲内である。一部の実施形態では、これらのｉｎ  ｖｉｖｏ用途のために用いられるベクターは、対象において増幅からのベクターに弱毒化することが好ましい場合もある。例えば、プラスミドベクターを使用する場合、これらは、対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に際して安全性を高めるために、対象において機能する複製起点を欠失しているのが好ましい。ウイルスベクターを使用する場合、これらは、やはり対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏ使用のための安全性を高めるために、対象において弱毒化されているか、又は複製欠損型であるのが好ましい。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態では、ウイルスベクターを使用する。センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスベクターが好ましい。ウイルス発現ベクターは当業者に周知であり、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、及びアビポックスウイルス、弱毒化ポックスウイルス、ワクシニアウイルスを含むポックスウイルス、特に、改変ワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）ウイルス（ＭＶＡ；ＡＴＣＣアクセッション番号ＶＲ−１５６６）などのウイルスが挙げられる。こうしたウイルスは、発現ベクターとして使用されるとき、ヒトなどの選択される対象において本質的に非病原性であるか、又は選択される対象において非病原性となるように修飾されている。例えば、複製欠損型アデノウイルス及びアルファウイルスは、よく知られており、遺伝子送達ベクターとして使用することができる。こうしたウイルスはまた、本明細書に開示するタンパク質、例えば、ＥｎｖＦ及びＥｎｖＧなどの発現のためにも考慮される。
【０１０２】
例えば、目標が、培地で増殖した細胞などから、発現されたタンパク質を生産及び単離するために、細胞にＨＩＶ−１抗原を発現させることである場合、本発明のヌクレオチド配列及びベクターを細胞に送達することができる。細胞において抗体及び／又は抗原を発現させるために、任意の好適なトランスフェクション、形質転換、又は遺伝子送達方法を使用することができる。こうした方法は当業者に周知であり、当業者は、使用するヌクレオチド配列、ベクター、及び細胞型に応じて、好適な方法を選択することが容易にできるであろう。例えば、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、又はリポソーム媒介性送達を使用することができる。抗体及び／又は抗原の発現は、任意の好適なタイプの宿主細胞、例えば、細菌細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞などにおいて実施することができる。本発明の抗体及び／又は抗原は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系などを用いて発現させることもできる。こうした方法は全て当業者に周知であり、当業者は、使用するヌクレオチド配列、ベクター、及び細胞型の性質に応じて、好適な方法を選択することが容易にできるであろう。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド配列、抗体及び／又は抗原は、例えば、目標が対象において免疫原性応答をもたらすことである場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与される。本発明に関連して「対象」は、任意の動物であってよい。例えば、一部の実施形態では、例えば、本発明のＨＩＶ−１免疫原性組成物及びワクチンの前臨床試験用などの実験動物において、本発明のトランスジーンを発現させるのが望ましい場合もある。他の実施形態では、例えば、本発明の免疫原性組成物及びワクチンの臨床試験において、及びそれらの実際の臨床使用のために、ヒト対象において本発明の抗体及び／又は抗原を発現させるのが望ましいであろう。好ましい実施形態では、対象は、ヒト、例えば、ＨＩＶ−１に感染した、又はその感染のリスクがあるヒトである。
【０１０４】
こうしたｉｎ  ｖｉｖｏ用途のために、本発明のヌクレオチド配列、抗体及び／又は抗原は、薬学的に許容される担体と混合して、本発明のヌクレオチド配列及び／又は抗原を含む免疫原性組成物の成分として投与するのが好ましい。本発明の免疫原性組成物は、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を刺激するうえで有用であり、ＡＩＤＳの予防、改善若しくは治療のために、ＨＩＶ−１に対する予防若しくは治療用ワクチンの１つ又は複数の成分として使用することができる。本発明の核酸及びベクターは、遺伝子ワクチン、すなわち、ヒトなどの対象に、本発明の抗体及び／又は抗原をコードする核酸を送達するためのワクチンを提供するうえで特に有用であり、これにより抗体及び／又は抗原が対象において発現され、免疫応答を誘発する。
【０１０５】
本発明の組成物は、注射懸濁液、溶液、スプレー、凍結乾燥粉末、シロップ、エリキシールなどであってよい。いずれの好適な形態の組成物を使用してもよい。こうした組成物を調製するために、所望の純度を有する本発明の核酸又はベクターを１つ又は複数の薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と混合する。担体及び賦形剤は、組成物の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」ものでなければならない。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用する用量及び濃度で受容者に非毒性であり、限定はしないが、以下に挙げるものを含む：水、塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、又はそれらの組み合わせ、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンなどの他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はノニオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
【０１０６】
免疫原性又は免疫学的組成物はまた、水中油形エマルションの形態で製剤化することもできる。水中油形エマルションは、例えば、下記のものを基材とし得る：軽質流動パラフィンオイル（欧州薬局方タイプ）；スクアラン、スクアレン、ＥＩＣＯＳＡＮＥ（商標）又はテトラテトラコンタンなどのイソプレノイド油；アルケンのオリゴマー化により得られる油、例えば、イソブテン又はデセン；直鎖アルキル基を含む酸又はアルコールのエステル、例えば、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ（カプリル酸／カプリン酸）又はプロピレングリコールジオレエート；分岐状脂肪酸又はアルコールのエステル、例えば、イソステアリン酸エステル。油を乳化剤と組み合わせて用いることにより、エマルションを形成するのが有利である。乳化剤は、ソルビタン、マンニドのエステル（例えば、無水オレイン酸マンニトール）、グリセロール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、又はヒドロキシステアリン酸などのノニオン性界面活性剤（任意選択でエトキシ化される）、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）製品、例えばＬ１２１などのポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロックであってもよい。アジュバントは、乳化剤、ミセル形成剤、及び油の混合物、例えば、Ｐｒｏｖａｘ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の名称で市販されているものであってもよい。
【０１０７】
本発明の免疫原性組成物は、ワクチンの有効性を高めるために、追加物質、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、緩衝剤、又はアジュバントを含有してもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，（ｅｄ．）１９８０）。
【０１０８】
また、アジュバントを含有してもよい。アジュバントとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：無機塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ（ＳＯ４）２、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、若しくは炭素）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、例えば、Ｃｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．７１（３）：５３８−４４；Ａｈｍａｄ−Ｎｅｊａｄ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（７）：１９５８−６８に記載のものなどを含む、又は含まないポリヌクレオチド；ＣｐＧを含む、又は含まないポリＩＣ若しくはポリＡＵ酸、ポリアルギニン（当技術分野では、ＩＣ３１としても知られる；Ｓｃｈｅｌｌａｃｋ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３４ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｌｉｎｇｎａｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（２９−３０）：３４９８−５０８を参照）、ＪｕｖａＶａｘ（商標）（米国特許第６，６９３，０８６号明細書）、特定の天然物質（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のワックスＤ、コルニエバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又はブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属のメンバーに見出される物質）、フラジェリン（トール様受容体５リガンド；ＭｃＳｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（７）：３９１４−９を参照）、ＱＳ２１、ＱＳ１７、及びＱＳ７（米国特許第５，０５７，５４０号明細書；同第５，６５０，３９８号明細書；同第６，５２４，５８４号明細書；同第６，６４５，４９５号明細書）、モノホスホリルリピドＡ、特に、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）、イミキモド（当技術分野では、ＩＱＭとしても知られ、Ａｌｄａｒａ（登録商標）として市販されている；米国特許第４，６８９，３３８号明細書；同第５，２３８，９４４号明細書；Ｚｕｂｅｒ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ（２００４）２２（１３−１４）：１７９１−８）、及びＣＣＲ５阻害剤ＣＭＰＤ１６７（Ｖｅａｚｅｙ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８：１５５１−１５６２を参照）。
【０１０９】
水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム（ミョウバン）は、リン酸緩衝食塩水の０．０５〜０．１％溶液で一般に使用される。特にＤＮＡワクチンと一緒に使用することができる他のアジュバントは、コレラ毒素、特にＣＴＡ１−ＤＤ／ＩＳＣＯＭ（Ｍｏｗａｔ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（６）：３３９８−４０５を参照）、ポリホスファゼン（Ａｌｌｃｏｃｋ，Ｈ．Ｒ．（１９９８）Ａｐｐ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．１２（１０−１１）：６５９−６６６；Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４７３−９３）、サイトカイン、例えば、限定はしないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５  ＩＧＦ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、及びＩＦＮ−γ（Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２１：１３７−１４２；国際公開第０１／０９５９１９号パンフレット）、免疫調節タンパク質、例えば、ＣＤ４０Ｌ（ＡＤＸ４０；例えば、国際公開第０３／０６３８９９号パンフレットを参照）、及びナチュラルキラー細胞のＣＤ１ａリガンド（ＣＲＯＮＹ若しくはα−ガラクトシルセラミドとしても知られる；Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（３）：２０４６−２０５５を参照）、免疫刺激融合タンパク質、例えば、免疫グロブリンのＦｃ断片に融合したＩＬ−２（Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：４８６−４９２，２０００）及び共刺激分子Ｂ７．１及びＢ７．２（Ｂｏｙｅｒ）であり、これらは全て、本発明の抗原をコードするものと同じ発現ベクター上で、又は個別の発現ベクター上で、タンパク質として又はＤＮＡの形態のいずれかで投与することができる。
【０１１０】
有利な実施形態では、アジュバントは、アクリルポリマーと結合したレシチン（Ａｄｊｕｐｌｅｘ−ＬＡＰ）、水中油形エマルション中のレシチンコート油滴（Ａｄｊｕｐｌｅｘ−ＬＥ）又は水中油形エマルション中のレシチン及びアクリルポリマー（Ａｄｊｕｐｌｅｘ−ＬＡＯ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏＡｄｊｕｖａｎｔｓ（ＡＢＡ））であってよい。
【０１１１】
免疫原性組成物は、所望の作用部位に核酸若しくは発現ベクターを導入し、それを適切且つ制御可能な速度で放出するように設計することができる。制御放出製剤を製造する方法は、当技術分野において公知である。例えば、制御放出製剤は、ポリマーを使用して、免疫原及び／又は免疫原性組成物を複合体化するか、又はそれを吸収することにより製造することができる。制御放出製剤は、所望の制御放出特性若しくは放出プロフィールをもたらすことがわかっている適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又は硫酸プロタミン）を用いて製造することができる。制御放出製剤による作用の持続を制御するために考えられる別の方法は、活性成分を、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、これらの酸のコポリマー、又はエチレン酢酸ビニルコポリマーなどのポリマー材料の粒子に組み込むことである。或いは、これらの活性成分をポリマー粒子に組み込むのではなく、コアセルベーション技術又は界面重合、例えば、それぞれ、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルション中のヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、これらの材料を調製されたマイクロカプセル中に封入することも可能である。こうした技術は、Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，１９７８及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
【０１１２】
本発明の免疫原性組成物中の本発明の核酸及び発現ベクター（集合的に、免疫原）の好適な用量は、当業者が容易に決定することができる。例えば、免疫原の用量は、投与経路及び対象の大きさに応じて変動し得る。好適な用量は、例えば、実験動物などの対象の免疫応答を測定し、従来の免疫学的技術を用いて、用量を適切に調節することにより、当業者が決定することができる。対象の免疫応答を測定するこうした方法として、限定はしないが、例えば、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅによる文献“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”に詳述されているように、クロミウム放出アッセイ、四量体結合アッセイ、ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、ＩＬ−２ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカインアッセイ、及び他の免疫学的検出アッセイが挙げられる。
【０１１３】
予防のために提供される場合、本発明の免疫原性組成物は、ＨＩＶ感染、若しくはＨＩＶ感染のエビデンスに先立ち、又はＡＩＤＳによるあらゆる症状に先立ち、対象に、特に高リスクの対象の場合に投与するのが理想的である。免疫原性組成物の予防的投与は、ＨＩＶ−１感染に対する対象の防御免疫をもたらすか、又はＨＩＶ−１に既に感染した対象においてＡＩＤＳの進行を妨げるか、若しくは弱めるうえで役立ち得る。治療のために提供される場合、免疫原性組成物は、ＡＩＤＳ症状を改善及び治療するのに役立つことができ、有利には感染後可能な限り早期に、また何らかのＡＩＤＳの症状の出現前に使用するのが好ましいが、症状の発症時（若しくは発症後）に使用してもよい。
【０１１４】
免疫原性組成物は、任意の好適な送達方法を用いて投与することができ、そうした方法として、限定はしないが、筋肉内、静脈内、皮内、粘膜内、及び局所送達が挙げられる。こうした技術は当業者に公知である。送達方法のより具体的な例は、筋肉内注射、皮内注射、及び皮下注射である。しかし、送達を注射方法に限定する必要はない。さらに動物組織へのＤＮＡの送達は、カチオン性リポソーム（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８：２６８−２７４；及び国際公開第９６／２００１３号パンフレット）、動物筋肉組織への裸のＤＮＡの直接注射（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：９５７−９６０；Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１５２９−１５３３；Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９：１３２−１４０；Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１４９５−１４９８；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１５０３−１５０９；及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．２：１８４７−１８５１）、又は「遺伝子ガン」技術を用いたＤＮＡの皮内注射（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：３５３−３６５）によって達成されている。或いは、送達経路は、経口、鼻内、又はその他の任意の好適な経路であってもよい。さらに、送達は、肛門、膣又は口腔粘膜などの粘膜表面を介して達成することもできる。
【０１１５】
免疫スケジュール（又はレジメン）は、動物（ヒトを含む）について公知であり、特定の対象及び免疫原性組成物について容易に決定することができる。従って、免疫原は、対象に１又は複数回投与することができる。好ましくは、免疫原性組成物の個別投与の間に時間間隔が設定される。この間隔は、対象に応じ変動するが、典型的には、１０日〜数週間、往々にして２、４、６若しくは８週間の範囲にわたる。ヒトの場合、間隔は、典型的に、２〜６週間である。免疫レジームは、典型的に、免疫原性組成物の１〜６回の投与を含むが、１回又は２回又は４回という少数回であってもよい。免疫応答を誘導する方法は、免疫原と一緒にアジュバントの投与を含んでもよい。一部の事例では、毎年、２年毎又はそれ以外の長期間隔（５〜１０年）の追加免疫により、初回免疫プロトコルを補足することができる。
【０１１６】
本方法は、様々なプライム−ブーストレジメン、例えば、ＤＮＡプライム−アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ブーストレジメンをさらに含む。これらの方法では、１回又は複数回の初回免疫後、１回又は複数回の追加免疫を実施する。実際の免疫原性組成物は、各免疫について同じであっても異なってもよく、また、免疫原性組成物のタイプ（例えば、タンパク質又は発現ベクターを含有する）、経路、及び免疫原の製剤化も変わり得る。例えば、初回免疫及び追加免疫ステップに発現ベクターを使用する場合、同じ又は別のタイプ（例えば、ＤＮＡ又は細菌若しくはウイルス発現ベクター）のいずれであってもよい。１つの有用なプライム−ブーストレジメンは、２回の初回免疫を４週間の間隔で実施し、次に、最後の初回免疫から４及び８週間後に２回の追加免疫を実施するものである。当業者には、初回免疫及び追加免疫レジメンを提供するために、本発明のＤＮＡ、細菌及びウイルス発現ベクターを用いて包含されるいくつかの順列及び組み合わせがあることは容易に明らかであろう。
【０１１７】
本発明の具体的な実施形態は、好ましくは本発明の１つ又は複数のエピトープをコードするＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターを含む本発明の免疫原性組成物を対象に１又は複数回投与することにより、対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、エピトープは、対象において特定の免疫応答を誘導するのに十分なレベルで発現される。こうした免疫は、所望の免疫レジメンに従って、少なくとも２、４若しくは６週間（又はそれを超える）の時間間隔で複数回にわたり反復することができる。
【０１１８】
本発明の免疫原性組成物は、単独で投与してもよく、或いは他のＨＩＶ免疫原及び／若しくはＨＩＶ免疫原組成物、例えば、「他の」免疫学的、抗原性又はワクチン若しくは治療組成物と一緒に同時投与、又は連続的に投与することにより、本発明の多価若しくは「カクテル」又は併用組成物及びそれらを使用する方法を提供することもできる。ここでも、成分及び投与の様式（連続的又は同時投与）、並びに用量は、特定の対象の年齢、性別、体重、種及び状態、並びに投与経路などの要因を考慮に入れて決定することができる。
【０１１９】
組み合わせて用いる場合、他のＨＩＶ免疫原は、例えば、プライム−ブーストレジメン又はその他の免疫プロトコルの一環として、全体的免疫レジームの一環として同時又は様々な時点で投与することができる。有利な実施形態では、他のＨＩＶ免疫原は、ｅｎｖ、好ましくはＨＩＶ  ｅｎｖ三量体である。
【０１２０】
他の多くのＨＩＶ免疫原が当技術分野で公知であり、そうした好ましい免疫原の１つは、ＨＩＶＡ（国際公開第０１／４７９５５号パンフレットに記載）であり、これは、プラスミド（例えば、ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡ）又はウイルスベクター（例えば、ＭＶＡ．ＨＩＶＡ）により、タンパク質として投与することができる。別のＨＩＶ免疫原は、ＲＥＮＴＡ（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００４／０３７６９９号明細書に記載）であり、これもプラスミド（例えば、ｐＴＨｒ．ＲＥＮＴＡ）又はウイルスベクター（例えば、ＭＶＡ．ＲＥＮＴＡ）により、タンパク質として投与することができる。
【０１２１】
例えば、ヒト対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する１つの方法は、少なくとも１回の初回免疫用量のＨＩＶ免疫原と、少なくとも１回の追加免疫用量のＨＩＶ免疫原とを投与するステップを含み、ここで、免疫原の少なくとも１つが、本発明のエピトープ、本発明のエピトープをコードする核酸、又は本発明のエピトープをコードする発現ベクター、好ましくはＶＳＶベクターであれば、各用量中の免疫原は、同じでも異なるものであってもよく、また、免疫原は、対象においてＨＩＶ特異的免疫応答を誘導するのに十分な量で投与されるか、又はそれに十分なレベルで発現される。ＨＩＶ特異的免疫応答は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫応答又はＨＩＶ特異的Ｂ細胞免疫応答を含み得る。こうした免疫は、好ましくは、少なくとも２〜６週間又はそれを超える間隔で実施することができる。
【０１２２】
本発明及びその利点を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲に記載する本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更形態、代用形態及び改変形態がなされ得ることは理解すべきである。
【０１２３】
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、これらはあくまで例示の目的で記載されるにすぎず、本発明を限定することを何ら意図するものではない。
【実施例】
【０１２４】
実施例：ＨＩＶ非感染及び健常な成人ボランティアにおける２つのＨＩＶワクチンＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）及びＡｄ３５−ＧＲＩＮの臨床的安全性並びに免疫原性
粘膜ＨＩＶ侵入地点での持続的体液性及び／又は細胞性免疫を刺激するワクチンの開発は、ＨＩＶワクチンの探求において重要である。この目標を達成するために、本出願人らは、生弱毒化ウイルスワクチンの効力を模倣し得る粘膜送達用の複製可能ウイルスベクター（Ｅｘｃｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）を研究する。センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルス（ＳｅＶ）は、マウスパラミクソウイルスであり、ヒトには病原性ではないが、霊長類の上気道の細胞に感染する可能性があり、ヒト鼻上皮細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製する。本出願人らは、ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）の鼻内（ＩＮ）投与が、粘膜免疫応答を刺激すると仮定する。さらに、ＩＮ投与は、ワクチン担体に対する既存の免疫の作用を最小限に抑え得る。センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスは、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ｈＰＩＶ−１）に遺伝的及び抗原的に関連している。
【０１２５】
ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）は、筋肉内（ＩＭ）で投与したアデノウイルス−３５コードサブタイプＡ  Ｇａｇ、ＲＴ、インテグラーゼ及びＮｅｆ（Ａｄ３５−ＧＲＩＮ、１×１０＾１０ｖｐ（Ｋｅｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）との異種プライム−ブースト（Ｐ／Ｂ）組み合わせで、ＩＮ投与する（Ａ〜Ｃ群）か、又は同種レジメン（Ｄ群）で投与し、投与は全て表１に示す通り０及び４ヵ月で実施した。６５人のＨＩＶ非感染成人（女性２０人；男性４５人）が３つの場所；Ｋｅｎｙａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＫＡＶＩ）、Ｎａｉｒｏｂｉ，Ｋｅｎｙａ；Ｐｒｏｊｅｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＰＳＦ）、Ｋｉｇａｌｉ，Ｒｗａｎｄａ及びＳｔ  Ｓｔｅｐｈｅｎ’ｓ  ＡＩＤＳ  Ｔｒｕｓｔ（ＳＳＡＴ）、Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫに登録された（表２）。予め定めた時点で安全性、耐容性及び免疫原性を評価した。末梢血液（ＰＢＭＣ）を各臨床施設で処理し、冷凍保存したＰＢＭＣを、ＧＲＩＮに合致する４つのペプチドプール（Ｇａｇ、ＲＴ、Ｉｎｔ及びＮｅｆについて各々１つずつ）を用いてＩＮＦ−ｙ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで評価した。ＥＬＩＳＡを用いて、血清及び粘膜サンプル中のＧａｇ−ｐ２４結合を評価した。記載されている（Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１）通りに、ＳｅＶ−ＮＡｂを評価した。鼻腔用綿棒（中鼻甲介（ｍｉｄｔｕｒｂｉｎａｔｅ）植毛綿棒）、耳下腺及び溢泌唾液、直腸分泌物（Ｍｅｒｏｃｅｌスポンジ）及び女性の経腟部分泌物（Ｓｏｆｔｃｕｐ及びＭｅｒｏｃｅｌスポンジ）中の分泌抗体の検出のために粘液サンプルを採取した。センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ワクチン接種後の５つの時点：２±１、５±１、６±１、７±１及び９±１日目で、Ａ、Ｂ及びＤ群における鼻腔用綿棒、活性耳下腺唾液及び尿サンプル中の排出を評価した。感染細胞感染力アッセイ（ＣＩＵ）アッセイにおいて抗センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）Ａｂを用いてウイルスフォーカスを検出した。次に、ＣＩＵ陽性サンプルをＳｅＶ−特異的ｑＰＣＲにより試験して、ＳｅＶの存在を確認した後、Ｇａｇ−特異的ＲＴ−ＰＣＲ試験により、インタクトなＧａｇ挿入断片の存在を確認した。
【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
安全性データは現時点でボランティアに関してマスクされており、これは、最後の試験外来（最後の試験ワクチン接種から１２ヵ月後；１Ｑ．２０１５）まで、重篤な有害事象（ＳＡＥ）について遵守される。関連するＳＡＥは報告されていない。局所及び全身の反応源性事象は、軽度（グレード１）又は中度（グレード２）であった。異常な有害事象又は上／下気道疾病パターンは報告されていない。最後の試験ワクチン接種後のプロトコル規定４ヶ月の期間中、付随ＨＩＶ感染は報告されておらず、妊娠も報告されていない。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
図２１は、Ｂ群の一人のボランティアを除く、ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）及び続くＡｄ３５−ＧＲＩＮの異種Ｐ／Ｂレジメンの全ての受容者において、全身ＨＩＶ−Ｇａｇ特異的ＩＦＮ−ｙＥＬＩＳＰＯＴ応答が認められたことを示す。Ｇａｇ応答は、Ａ及びＢ群で類似しており、明確な用量応答を示していない。ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）での１又は２回の免疫後のＤ群［ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）同種］にはＧａｇ応答が認められなかった。Ｃ群では、Ａｄ３５−ＧＲＩＮプライム後にＧａｇ応答が認められたが、ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）により増強されなかったことが明らかである。Ｇａｇに対する応答の程度は、ＲＴ、Ｉｎｔ及びＮｅｆに対する応答と比較して、プライム−ブースト後のＡ及びＢ群において最大であり、ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）が、強力な初回免疫効果（「隠れたプライム（ｈｉｄｄｅｎ  ｐｒｉｍｅ」）を賦与したことを示している。ＧａｇＥＬＩＳＰＯＴ応答は、最後のワクチンから８ヵ月で低下し始める。
【０１３０】
図２２は、全身ＩｇＧ  Ｇａｇ−ｐ２４抗体応答が、Ａｄ３５−ＧＲＩＮ及び続くＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）の異種Ｐ／Ｂレジメン（Ｃ群）の受容者の９２％に検出されたが、Ａ、Ｂ及びＤ群では頻度が低かったことを示している。全身ＩｇＡ  Ｇａｇ−ｐ２４抗体応答は、散発性で、低力価であった（データは示していない）。Ｇａｇ−ｐ２４抗体ＩｇＧ及びＩｇＡ応答も粘膜分泌物中に散発的に検出され、低力価であった。ＧａｇＥＬＩＳＡ力価は、Ｃ群において２回目の免疫後に急速に低下する。
【０１３１】
ＳｅＶ中和抗体の程度及び応答率は、全群で類似していた。５人のボランティアが抗体転換し、１９／５３（３６％）のボランティアは、ＳｅＶワクチン（一部のプラセボを含む）後のＳｅＶ−ＮＡｂ力価が２倍以上増加した。既存のｈＰＩＶ１／ＳｅＶＮＡｂ力価とＣＭＩ又は体液性免疫応答との間に直接の相関は認められなかった。
【０１３２】
ＳｅＶ排出．１４１／７０３（２０％）サンプルが、ＣＩＵアッセイにより陽性であった。全ＳｅＶ陽性サンプル（１７／１４１、１２％）が、ＨＩＶｇａｇ挿入断片を担持しており、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝的安定性を示した。これらの１７のサンプルは、活性製剤を受けた３６人の適格ボランティアのうちの１５人（４２％）から得られ、これらは、鼻腔用綿棒サンプル採取からのみ得られた。ボランティアの２人は、２つの時点で陽性であった。
【０１３３】
ＩＮ  ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）及びＩＭ  Ａｄ３５−ＧＲＩＮの組み合わせは良好な耐容性を示した。現在までの免疫原性データから、単回のＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）がＧａｇ特異的Ｔ細胞応答の強力なプライムであり、これに対し、ＳｅＶ−Ｇ（ＮＰ）がＡｄ３５−ＧＲＩＮ全身ＩｇＧＧａｇ特異的抗体応答を増強することが明らかである。このように、ワクチン接種の順序は、免疫応答のいずれのアームが刺激されるかを決定すると思われる。粘膜免疫応答は、試験した条件下で観察されなかった。既存のｈＰＩＶ１／ＳｅＶＮＡｂは、Ｔ細胞又は抗体応答に影響を与えなかった。
【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
このように、本発明の詳細な好ましい実施形態を説明してきたが、上の段落に記載される本発明は、その多くの明らかな変形形態が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく可能であるため、上の説明に記載される特定の詳細に限定されないことを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｂ−３】
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【図６Ｂ−４】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図７Ｂ−３】
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【図７Ｂ−４】
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【図７Ｃ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１６】
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【図８−１７】
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【図８−１８】
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【図８−１９】
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【図８−２０】
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【図８−２１】
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【図８−２２】
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【図８−２３】
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【図８−２４】
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【図８−２５】
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【図８−２６】
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【図８−２７】
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【図８−２８】
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【図８−２９】
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【図８−３０】
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【図８−３１】
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【図８−３２】
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【図８−３３】
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【図８−３４】
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【図８−３５】
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【図８−３６】
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【図８−３７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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