(57)【要約】  本発明は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイシステムを使用して、微生物の抗生物質耐性を無効にするために、微生物中の抗生物質耐性遺伝子及び／又はそのような遺伝子を有するレプリコンを妨害するための、組換えポリヌクレオチド、組成物、及び方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを抗生物質耐性微生物に導入するための送達ビヒクルであって、
ここで、前記送達ビヒクルは、前記抗生物質耐性微生物に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性酵素をコードする遺伝子を有するＤＮＡの不活性化のための組換えポリヌクレオチドを含み、
ここで前記組換えポリヌクレオチドは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物又はその修飾物の存在下で前記抗生物質耐性遺伝子を標的化かつ不活性化し、それにより前記微生物を抗生物質に対して敏感化するために、抗生物質耐性遺伝子の標的ＤＮＡ配列と充分に相補的なスペーサー配列を有するＲＮＡガイド分子を有するか又は転写する、ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列を含み、
ここで前記送達ビヒクルは非毒性又は溶原性バクテリオファージである、前記送達ビヒクル。
【請求項２】
前記ＲＮＡガイド分子が、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物の前記抗生物質耐性遺伝子への結合を媒介する、請求項１に記載の送達ビヒクル。
【請求項３】
前記ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物をコードする核酸配列を更に含む、請求項１又は請求項２に記載の送達ビヒクル。
【請求項４】
前記ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドがＣａｓ９又はその機能性同等物若しくは修飾物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の送達ビヒクル。
【請求項５】
病原性に関与する遺伝子、又は微生物代謝の他の側面に関与する遺伝子、例えばバイオフィルム産生のための細菌の代謝に関与する遺伝子、を標的とするＲＮＡガイド分子を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の送達ビヒクル。
【請求項６】
前記ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドは修飾されてリコンビナーゼ触媒ドメインを含み、その結果、前記修飾されたＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドは、欠失を作成し標的配列を封止することにより標的ＤＮＡ配列を不活性化するが、標的ＤＮＡ配列中に２本鎖切断を生成しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の送達ビヒクル。
【請求項７】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列が追加のＲＮＡガイド分子を有するか又は転写し、ここで各ＲＮＡガイド分子は、抗生物質耐性遺伝子又は１又は複数の追加の抗生物質耐性遺伝子の標的配列と充分に相補的なスペーサー配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の送達ビヒクル。
【請求項８】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列が１又は複数のＲＮＡガイド分子を有するか又は転写し、ここで各ＲＮＡガイド分子は、１又は複数のベータラクタマーゼ遺伝子の標的配列と充分に相補的なスペーサー配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の送達ビヒクル。
【請求項９】
前記１又は複数のＲＮＡガイド分子が、ＮＤＭ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＫＰＣ、ＯＸＡ、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ、ＯＫＰ、ＬＥＮ、ＧＥＳ、ＭＩＲ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＣＭＹ、ＬＡＴ、及びＦＯＸからなる群から選択される遺伝子の１又は複数、又は全てを標的とする、請求項８に記載の送達ビヒクル。
【請求項１０】
前記又は各ＲＮＡガイド分子が自身のプロモーター配列から転写される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１１】
前記抗生物質耐性遺伝子が、染色体上又は、プラスミド及びバクテリオファージを含む染色体外複製性ＤＮＡ分子（レプリコン）上に位置する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１２】
前記微生物に選択的利点を付与する遺伝子をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の送達ビヒクルを含む組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、医薬組成物；非病原性微生物、例えば共生細菌、例えばプロバイオティクス製剤中の共生細菌；又は栄養補助食品である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
局所、経腸、又は非経口投与のために製剤化される、請求項１３又は１５に記載の組成物。
【請求項１６】
医薬として使用される、請求項１３又は１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組換えポリヌクレオチドのＲＮＡガイド分子により標的とされる抗生物質耐性遺伝子を含む抗生物質耐性微生物により引き起こされる感染症の治療又は予防における使用のための、請求項１３又は１５に記載の組成物。
【請求項１８】
抗生物質耐性遺伝子を含む抗生物質耐性微生物により引き起こされる、対象における感染症を治療又は予防する方法であって、前記方法が、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を微生物に導入する工程を含み、ここで前記ＲＮＡガイド分子が抗生物質耐性遺伝子を標的とし、それにより抗生物質耐性遺伝子を不活性化して、前記微生物を前記抗生物質に対して敏感化する、方法。
【請求項１９】
前記組成物が局所又は経口投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、魚、鳥、爬虫類、又は哺乳動物（例えばヒト）である。請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記送達ビヒクルが、プラスミド接合又はバクテリオファージ感染により、抗生物質耐性微生物から直接別の微生物（例えば抗生物質耐性微生物）に伝達される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
微生物が敏感化された抗生物質を、同時に又は続いて前記対象に投与する工程を更に含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の送達ビヒクルを微生物に導入することを含む、抗生物質耐性微生物中の抗生物質耐性を不活性化する方法。
【請求項２４】
請求項１〜１２のいずれか１項で定義される組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項２５】
宿主細胞が共生細菌である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
添付図面に関連して本明細書に記載された、送達ビヒクル、組成物、組成物の使用、方法、又は宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の抗生物質耐性を無効にするために、微生物中の抗生物質耐性遺伝子及び／又はそのような遺伝子を有するレプリコンを妨害するための、組換えポリヌクレオチド、組成物、及び方法に関する。
【０００２】
元々ストレプトマイセス（Streptomyces）などの微生物から単離された抗生物質は、感染性疾患を治療するための強力な方法である。しかし細菌は選択圧に対応して、抗生物質に対する抗菌剤耐性（ＡＭＲ）を極めて迅速に獲得した。抗菌剤耐性への１つの共通の経路は、プラスミドベクター上の水平伝播を介する、元々の抗生物質産生微生物中で進化した耐性遺伝子の獲得である。いくつかの例では、このようなプラスミドは、転位性要素及びインテグロン（integron）が有する複数の抗生物質耐性遺伝子を獲得してきた。細菌のタンパク質標的を修飾するか抗生物質の侵入を妨害するような宿主にコードされる変異体も、出現してきた。
【０００３】
病原性細菌などの微生物による抗生物質耐性は、我々の最も深刻な健康上の脅威の１つである。例えば耐性細菌の感染は現在珍しいことではなく、いくつかの病原菌は、複数の種類又はクラスの抗生物質に対してさえ耐性になっている。有効な抗生物質の消失は、２次感染症を治療できる能力が非常に重要な患者、例えば癌に対する化学療法、腎不全に対する透析、及び手術、特に臓器移植、を受けている易感染性患者に共通する、感染性疾患と闘い、感染性合併症を管理する我々の能力を弱体化させる。
【０００４】
第１及び第２の治療選択肢が抗生物質耐性により制限されるか又は使用できなくなると、医療提供者は、患者に対してより毒性が強くより高価であまり効果的でない代替抗生物質を使用することを余儀なくされる。代替治療が存在する場合でも、抵抗性の感染症を有する患者は多くの場合死亡する可能性が高く、生存者も長期の入院、回復の遅延、及び長期の障害を持っていることがある。
【０００５】
抗菌剤耐性により、現代医学の多くの成果が危険にさらされている。感染症の治療と予防に有効な抗生物質が無い場合、臓器移植、癌化学療法、及び大きな手術などの治療の成功が損なわれるであろう。地球規模の貿易と旅行の拡大は、抗生物質耐性微生物が、ヒト、他の動物、及び食品を介して急速に拡散することを可能にしている。
【０００６】
耐性機構は４つのクラスに分類される：
（１）抗生物質を分解する酵素、例えばペニシリンファミリーの抗生物質のベータラクタム環を分解するベータラクタマーゼ；
（２）抗生物質を修飾する酵素、例えばカナマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質をリン酸化するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；クロラムフェニコールをアセチル化するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）；
（３）抗生物質を細胞質から細胞外に活発に排出する排出ポンプ、例えばテトラサイクリンの存在下で発現されるテトラサイクリン排出ポンプ、及びある範囲の抗生物質を排出することができる多剤耐性を付与する他のポンプ；及び
（４）タンパク質標的がそれ以上不活性化されないように、抗生物質のタンパク質標的を変化させる突然変異；例えばベータラクタムは、ペプチドグリカン生合成及び細菌の細胞壁完全性に必要なペニシリン結合タンパク質 (penicillin-binding proteins)（ＰＢＰs）を阻害するため、ベータラクタムは殺菌性であり、ベータラクタムへの結合が低下しているＰＢＰ変異体は阻害されないであろう。
【０００７】
以下を含む抗生物質耐性の問題に対処するために、現在いくつかの方法が使用され開発されている。
【０００８】
第１に、既存の薬剤の誘導体などの新しい抗生物質が開発されている。開発されている新しい薬剤は少なくなっており、多くはより毒性が強く、従って最後の手段として使用されている。微生物は、両方のタイプの新しい抗生物質に対して耐性を獲得している。
【０００９】
第２に、耐性酵素の直接の阻害が試みられている。例としては、ベータラクタム系抗生物質アモキシシリン（オーグメンチンも呼ばれる）と組み合わせて使用されるベータラクタマーゼ阻害剤であるクラブラン酸がある。他のベータラクタマーゼ抗生物質阻害剤にはカルバペネムが挙げられる。しかし、ここでも耐性が現れている。Blueberry Therapeutics and Avacta社は、耐性機構を標的にするペプチドアフィマー（affimer）を開発している。抗生物質耐性酵素の新たな阻害剤の開発は、長期間の薬剤開発を必要とする。McMaster University, CanadaのDr Eric Brownにより別のアプローチが採用されており、彼は抗体耐性機構を不活性化する隠れた活性について、既知の薬剤（すでに使用が承認されている）を無関係な標的を用いてスクリーニングしている。
【００１０】
第３に、非抗生物質殺菌剤が使用されてきた。例えば、１９２０年代にバクテリオファージによる感染が開発され、抗生物質の発見によりほとんど中止されているが、いくつかの国では継続されている。現在の手法は、抗生物質耐性菌を含む細菌を殺す毒性の溶菌性バクテリオファージを使用しているが、これはバクテリオファージ感染に耐性のある細菌の変異体の選択のための道を切り開いている。これを回避するために、バクテリオファージの異なる株 (strains)の混合物を含有する調製物が使用されている。敗血症患者におけるこのような溶菌性バクテリオファージの使用の別の欠点は、溶菌性バクテリオファージによる細胞の溶解と死滅が、細胞から血液中にエンドトキシンを放出し、エンドトキシンショックを引き起こす可能性があることである。
【００１１】
抗生物質耐性微生物を防除するためのさらなる組成物と方法が必要である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第１の態様において、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(ＣＲＩＳＰＲ)関連（Ｃａｓ）ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物又はその修飾物の存在下で抗生物質耐性遺伝子を不活性化し、それにより微生物を抗生物質に対して敏感化する（sensitising）ために、微生物中の抗生物質耐性遺伝子の標的配列と充分に相補的なスペーサー配列を有するＲＮＡガイド分子を有するか又は転写する、ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列を含む組換えポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドを抗生物質耐性微生物などの微生物に導入するための送達ビヒクルが提供され、ここで、前記送達ビヒクルは、微生物に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性酵素をコードする遺伝子を有するＤＮＡの不活性化のための組換えポリヌクレオチドを含み、かつここで、前記組換えポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能的同等物又はその修飾物の存在下で、抗生物質耐性遺伝子を標的化かつ不活性化し、それにより微生物を抗生物質に対して敏感化するために、抗生物質耐性遺伝子の標的ＤＮＡ配列と充分に相補的なスペーサー配列を有するＲＮＡガイド分子を有するか又は転写する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイ核酸配列を含み、ここで送達ビヒクルは非毒性又は溶原性バクテリオファージである。
【００１４】
本発明の１つの全般的な目的は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する、抗生物質耐性酵素をコードする遺伝子を有するＤＮＡの不活性化である。本発明の利点は、微生物が抗生物質に対して再敏感化され、抗生物質耐性の獲得が妨害されるように、感染性疾患を治療するために１又は複数の既存の抗生物質を使用することができることである。
【００１５】
抗生物質耐性遺伝子の標的配列は、破壊された場合、抗生物質耐性遺伝子を不活性化する前記遺伝子自体に隣接する配列でもよい。例えば、抗生物質耐性遺伝子がプラスミド上に位置する時、本発明はプラスミド中の標的配列を包含することができる。
【００１６】
抗生物質耐性酵素を不活性化する先行技術の手法とは対照的に、本発明は、新薬開発や各新薬に対する規制当局の同時の承認を必要としないであろう。むしろ本発明は、遺伝子産物ではなく、関連する抗生物質耐性遺伝子を直接標的とし不活性化するために適用できる手段を提供する。例えば、抗生物質耐性酵素をコードする遺伝子、又は膜透過性及び排出ポンプ発現を改変することにより抗生物質の摂取と排出を制御するタンパク質をコードする遺伝子を、それぞれ標的とすることができる。
【００１７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核生物ＲＮＡｉ経路（例えば、Grissa et al., 2007, BMC Informatics 8: 172; Horvath & Barrangou, 2010, Science, 327: 167-170; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl Acad. Sci. USA 109: E2579; Marraffini & Sontheimer, 2008, Science, 322: 1843-1845; Garneau et.al.,2010, Nature 468: 67を参照）と類似の、核酸侵入物に対する天然の細菌性及び古細菌性免疫系の一部であるＲＮＡ媒介性ゲノム防御経路である。天然のＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ遺伝子と、ＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コーディングＲＮＡ要素との組合せを含む。広範囲の細菌及び古細菌宿主にわたって、これまで３種類（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。各ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、非反復性スペーサー配列により分離された一連の短いＤＮＡ直接反復配列からなる。スペーサー配列は自然界では、典型的にはバクテリオファージやプラスミドなどの外来遺伝要素に由来する。本明細書においてこの一連の反復配列＋非反復性スペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲアレイとして知られている。ＣＲＩＳＰＲアレイは転写され、反復相補性ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズされ、次に直接反復配列内で切断され処理されて、個々のスペーサー配列を含む短い成熟２重ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡとなり、これはＣａｓヌクレアーゼを標的部位（「プロトスペーサー」としても知られている）に導く。例えば、詳細に検討された例であるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、標的化ＤＮＡ２本鎖切断 (double strand break)（「ＤＳＢ」）を４工程で行う。最初に、プレｃｒＲＮＡアレイとｔｒａｃｒＲＮＡとの２つのＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡはプレｃｒＲＮＡの反復配列領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡから成熟ｃｒＲＮＡ（本明細書において、個々の又はモノマースペーサー配列を含有する「ＲＮＡガイド分子ｇＲＮＡ」とも呼ぶ）への処理を媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の標的部位との塩基対合により、リボヌクレオタンパク質の形のＣａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに導く。最後に、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介し、ＤＳＢを作成する。
【００１８】
本発明において詳述されるように、抗生物質耐性遺伝子を標的とするために、修飾ＣＲＩＳＰＲ構築物が使用される。このような構築物を使用する本発明の組換えポリヌクレオチドは、「アサシン構築物（assassin construct）」とも呼ばれ、このような遺伝子の不活性化を行うために使用される。
【００１９】
現在までのＣＲＩＳＰＲ技術を使用する主要な注目点は、主に真核生物における逆遺伝学のためのＤＮＡ編集ツールとしての使用であった。しかし国際公開第２００７／０２５０９７号は、侵入する標的核酸又はその転写産物に対する、特に侵入するバクテリオファージに対する、細胞中の耐性を調節するためのＣＲＩＳＰＲ技術の使用を記載する。ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して原核生物遺伝子発現をダウンレギュレートして、遺伝子により転写されたｍＲＮＡを標的とする方法が、例えば国際公開第２０１０／０７５４２４号に記載されている。国際公開第２０１２／１６４５６５号は、ラクトコッカス（Lactococcus）からのＣＲＩＳＰＲシステムと、侵入する標的核酸又はその転写産物に対する細胞の耐性を調節するためのこのシステムの使用とを記載する。これに対して本発明は、特に抗生物質耐性微生物中の抗生物質耐性の付与に関する遺伝子の不活性化に関する。
【００２０】
本発明においてＲＮＡガイド分子は、抗生物質耐性遺伝子へのＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物 (functional equivalent)又はその修飾物 (modified version)の結合を媒介することができる。これは、上記した自然のシステムを反映する。
【００２１】
本発明のＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物はまた、ＲＮＡ又は他の核酸分子に結合することもできる。すなわちＤＮＡに結合できるためのＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物における必要条件は、本発明のある態様において、ＲＮＡ又は他の核酸分子に結合することができる前記ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物を排除しない。これらの態様において、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物は、Ｃａｓ核酸結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物と呼ぶことができる。
【００２２】
いくつかの応用のために、微生物は、天然の内因性、又は導入され改変されたＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物を有することができる。これは、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物をコードするのに、本発明の組換えポリヌクレオチドが必要とされないことを意味する。あるいは本発明の組換えポリヌクレオチドは、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物をコードする核酸配列を更に含むことができる。別の態様において本発明の組換えポリヌクレオチドは、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物をコードしないが、これをコードする別のポリヌクレオチドとともに使用することができる。ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド又はその機能性同等物又はその修飾物を微生物に導入するための他の手段を使用してもよい。
【００２３】
典型的な本発明のＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｃａｓ９又はその機能性同等物又はその修飾物である。
【００２４】
本発明の種々の態様に従う組換えポリヌクレオチドにおいて、ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列は、その各々が抗生物質耐性遺伝子又は１又は複数の追加の抗生物質耐性遺伝子の標的配列と充分に相補的なスペーサー配列を含む、追加のＲＮＡガイド分子を有するか又は転写することができる。前記又は各ＲＮＡガイド分子は、それ自体のプロモーター配列から転写することができる。あるいは、ある数のＲＮＡガイド分子のセットを、１つのプロモーター配列から、任意選択的に１又は複数の他の同様のセットと組合せて転写することができる。例えば、４つのＲＮＡガイド分子のセットを、１つのプロモーター配列から、例えばガイド分子の１又は複数の他の同様のセットと組合せて転写することができる。
【００２５】
複数のＲＮＡガイド分子を有することは、微生物中の異なる抗生物質耐性（又は他の種類の）遺伝子が標的とされ、同時に不活性化されることを可能にする。
【００２６】
本発明の種々の態様に従う組換えポリヌクレオチドは、更に又は代替的に、病原性又は微生物代謝の他の側面に関与する遺伝子を標的とするＲＮＡガイド分子（例えばさらなるＲＮＡガイド分子）を含むように設計することができる。例えば、いくつかの病原体は、抗生物質がこれらにアクセスすることを困難にするバイオフィルムを形成する。バイオフィルム産生のための細菌の代謝に関与する１又は複数の遺伝子を標的とすることもできる。
【００２７】
プロモーターから遠いスペーサー配列は通常、あまり効率的に転写されない。理想的には、異なる標的に対する複数のＲＮＡガイド分子は、多少同等に扱われるべきである。したがって、（長いポリシストロン性ＲＮＡガイド分子［又は前駆体ｃｒＲＮＡ］転写の代わりに）各ＲＮＡガイド分子を転写する１つのプロモーターを使用することができる。
【００２８】
例えば広範囲の異なるベータラクタム抗生物質に対する耐性を与えるベータラクタマーゼをコードする多くの耐性遺伝子（ｂｌａ遺伝子）がある。それぞれが自身のそのようなプロモーターから個々に転写され得る複数のＲＮＡガイド分子を発現するＤＮＡ構築物は、多くの異なるｂｌａ遺伝子を標的とするために使用することができる。
【００２９】
したがって本発明の態様において、ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列は、それぞれが１又は複数のベータラクタマーゼ遺伝子の標的配列と充分に相補的なスペーサー配列を含む１又は複数のＲＮＡガイド分子を有するか又は転写するすることができる。
【００３０】
例えば１又は複数のＲＮＡガイド分子は、ＮＤＭ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＫＰＣ、ＯＸＡ、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ、ＯＫＰ、ＬＥＮ、ＧＥＳ、ＭＩＲ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＣＭＹ、ＬＡＴ、及びＦＯＸからなる群から選択される遺伝子の１又は複数又は全てを標的とすることができる。
【００３１】
具体的には、１又は複数のＲＮＡガイド分子は、以下の１若しくは複数又は全てを含む、ベータラクタムファミリーの抗生物質耐性遺伝子の標的配列と充分に相補的なスペーサー配列を含むことができる：ＮＤＭ−１、−２、−１０の標的配列と充分に相補的な第１のスペーサー配列；ＶＩＭ−１、−２、−４、−１２、−２６、−２７、−３３、−３４の標的配列と充分に相補的な第２のスペーサー配列；ＩＭＰ−３２、−３８、−４８の標的配列と充分に相補的な第３のスペーサー配列；ＫＰＣ−１、−２、−３、−４、−６、−７、−８、−１１、−１２、−１４、−１５、−１６、−１７の標的配列と充分に相補的な第４のスペーサー配列；ＯＸＡ−４８の標的配列と充分に相補的な第５のスペーサー配列；ＴＥＭ−１、−１Ｂ、−３、−１３９、−１６２、−１８３、−１９２、−１９７、−１９８、−２０９の標的配列と充分に相補的な第６のスペーサー配列；ＳＨＶ及びその変種の標的配列と充分に相補的な第７のスペーサー配列；及びＣＴＸ及びその変種の標的配列と充分に相補的な第８のスペーサー配列。
【００３２】
不活性化すべき抗生物質耐性遺伝子は、染色体上又はレプリコンとして知られプラスミド及びバクテリオファージを含む染色体外複製性ＤＮＡ分子上に位置してもよい。
【００３３】
本発明の態様に従って使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的配列中でＤＳＢを発生する。標的配列が染色体又は細菌染色体若しくはプラスミドなどのレプリコン上に位置する時、ＤＳＢは、ＤＳＢを受ける染色体又はレプリコンの分解に従ってその喪失に至る。標的配列が細菌染色体上に位置する場合、細胞はＤＳＢの結果として直接死滅し得る。更に一部のプラスミド（天然のプラスミドを含む）は、細胞がプラスミドを喪失する時にのみ毒性となる死滅機能を有し、これは、分裂細胞中のプラスミドの忠実な遺伝を確実にする自然の機構である。抗生物質耐性遺伝子の標的配列を有するプラスミドもそのような死滅機能を有する場合、そして発生するＤＳＢの結果として失われる場合、細胞は死滅することがある（Sengupta & Austin, 2011, Infect. Immun. 79: 2502-2509を参照）。
【００３４】
そのようなＤＳＢにより引き起こされる細胞死滅が、本発明の種々の態様に従う組換えポリヌクレオチドに対する耐性の選択圧を上昇させる場合、これは、例えばＤＳＢを発生するよりも、抗生物質耐性遺伝子の標的配列を不活性化する欠失を発生した後、標的配列を封止する (seal)修飾ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドを使用することにより、緩和される。
【００３５】
すなわち、本発明の種々の態様に従うＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドは、いくつかの態様において、リコンビナーゼ触媒ドメインを含む修飾ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドにより置換することができ、ここで修飾ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドはＤＳＢを発生しないが、標的配列のある部位を再封止する (reseal)。
【００３６】
修飾ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えばリコンビナーゼ触媒ドメインを含む修飾Ｃａｓ９タンパク質でもよい。
【００３７】
本発明の種々の態様に従う組換えポリヌクレオチドは更に、微生物に選択利点 (selective advantage)を付与する遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むことができ、例えばそれにより、標的微生物へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達効率を上昇させる。例えば遺伝子は、非感染同胞種を超えて又はバクテリオシン（これらは、細菌により産生される、他の細菌を死滅させるか又はその増殖を阻害する毒素である）をコードする遺伝子を超えて増殖利点 (growth advantage)を付与することができ、対応する免疫ポリペプチドを使用することができる。
【００３８】
微生物への選択利点には、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドにより引き起こされるＤＳＢによるレプリコンの喪失の影響を防止するか又は低減させることであるか又はこれを含むことができる。例えば、微生物に選択利点を付与する遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、その上に標的配列が位置するレプリコンが有する毒素又はキラー機能の影響を中和する抗毒素をコードすることができる。また、微生物に選択利点を付与する遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドにより引き起こされるＤＳＢによる分解を受けるレプリコンにコードされる１又は複数のタンパク質をコードしてもよい。
【００３９】
本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドを微生物中に導入するための送達ビヒクルが提供され、ここで送達ビヒクルは、本明細書で定義される組換えポリヌクレオチドを含む。
【００４０】
本発明の種々のいくつかの態様に従う送達ビヒクルはバクテリオファージでもよい。あるいは送達ビヒクルは、接合プラスミド又は他のプラスミドレプリコン、ヌクレオチドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、ＲＮＡファージ、又はＲＮＡ分子などのプラスミドであってもよい。
【００４１】
送達ビヒクルは、非毒性バクテリオファージ、例えば、大腸菌（Escherichia coli）細胞に感染し複製し、成長し、よりゆっくり分裂し続ける前記細菌宿主を殺すことなく細菌宿主細胞から分泌される繊維状ファージであるバクテリオファージＭ１３であってもよい。他の適切な繊維状ファージは、宿主を死滅させることなく種々のグラム陰性細菌に感染することができる淋菌（Neisseria gonorrhoeae）から単離されたＮｇｏＰｈｉ６である。
【００４２】
あるいは、感染後に必ずしも宿主細胞を死滅させず、感染して休眠プロファージになる溶原性ファージを使用することができる。
【００４３】
従って本発明は、主に、細菌を死滅させないバクテリオファージ、及び／又は接合プラスミド、及び／又は直接ＤＮＡ形質転換を使用して、細菌中の抗生物質耐性遺伝子を不活性化する新規システムを、本発明の組換えポリヌクレオチドの送達機構として使用してもよい。
【００４４】
本発明のさらなる態様において、本明細書で定義される組換えポリヌクレオチド、又は本明細書で定義されるような送達ビヒクルを含む組成物が提供される。
【００４５】
前記組成物は、医薬組成物；非病原性微生物、例えば共生細菌、例えばプロバイオティクス製剤中の共生細菌；又は栄養補助食品 (dietary supplement)であってもよい。
【００４６】
本明細書において「医薬組成物」は、１又は複数の活性物質（例えば、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチド又は送達ビヒクル）と、生理学的に適切な担体及び賦形剤などの他の化学成分との調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への活性物質の投与を促進することである。
【００４７】
組成物は、局所、経腸、又は非経口投与のために製剤化され得る。
【００４８】
本発明の組成物は、所望の場合、パック、ディスペンサー器具、又はキットで提供されてもよく、これらの各々は、活性物質を含む１又は複数の単位剤形を含んでいてもよい。パック、ディスペンサー器具、又はキットには、投与のための説明書を添付することができる。
【００４９】
また本発明により、医薬として本明細書で定義される組成物が提供される。
【００５０】
別の態様において本発明に従って、組換えポリヌクレオチドのＲＮＡガイド分子により標的とされる抗生物質耐性遺伝子を含む抗生物質耐性微生物により引き起こされる感染症の治療又は予防における使用のための、本明細書で定義される組成物が提供される。
【００５１】
本発明は更に、抗生物質耐性遺伝子を含む抗生物質耐性微生物により引き起こされる、対象における感染症を治療又は予防する方法を提供し、ここで前記方法は、本明細書で定義される組成物の治療有効量を微生物に導入する工程を含み、前記ＲＮＡガイド分子が抗生物質耐性遺伝子を標的とし、それにより抗生物質耐性遺伝子を不活性化して、前記微生物を前記抗生物質に対して敏感化する。
【００５２】
組成物は局所的又は経口的に投与することができる。あるいは組成物は、静脈内、非経口、眼内、又は経肺投与により投与することができる。
【００５３】
局所的投与のための本発明の組成物は、例えばエアロゾル、クリーム、軟膏、ローション、又は散布粉末などの局所使用に適した形態であることができる。
【００５４】
本明細書で提供される組成物は、吸入による投与のために製剤化することができる。例えば組成物は、エアロゾル、ミスト、又は粉末の形態であってもよい。従って本明細書に記載の組成物は、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスなどの適切な噴射剤を使用して送達することができる。加圧エアロゾルを使用する場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。
【００５５】
前記方法において、対象は植物、魚、鳥、爬虫類、又は哺乳動物（例えばヒト）であってもよい。
【００５６】
前記方法によれば、送達ビヒクルは、プラスミド接合(plasmid conjugation)又はバクテリオファージ感染により、微生物から別の微生物（例えば抗生物質耐性微生物）に直接伝達され得る。
【００５７】
前記方法は更に、微生物が敏感化された抗生物質を同時に又は続いて、対象に投与する工程を含んでもよい。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、微生物中の抗生物質耐性を不活性化する方法を提供し、ここで前記方法は、本明細書で定義される組換えポリヌクレオチド又は本明細書で定義される送達ビヒクルを微生物に導入することを含む。この方法は、対象に適用されるインビボ法、又はインビトロ方法であってもよい。
【００５９】
また本発明において、ここで定義された組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。この宿主細胞は例えば共生細菌であってもよい。
【００６０】
本発明の種々の態様により標的とされる微生物は、体表面上で局所的に（例えば、臓器内に、外科的創傷又は他の創傷の部位に、膿瘍内に、含まれる）、又は全身的に存在してもよい。本発明には、例えば本発明のバクテリオファージを用いる局所適用による治療に適した細菌感染症の治療が含まれる。
【００６１】
本発明はまた、例えば創傷包帯又は医療装置表面などの体表面以外の表面を、本発明の組換えポリヌクレオチド、送達ビヒクル、又は組成物で被覆することを包含する。
【００６２】
本発明のさらなる態様、特徴、及び非限定例が、以下の図面を参照して以下で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】プラスミド上の抗生物質耐性遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性細菌性免疫化：  Ｉ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座、ここで四角は異なる抗生物質耐性遺伝子を標的とする異なるスペーサー配列を表す；ＩＩ、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９、ここで四角は各抗生物質耐性遺伝子を標的とする異なるｇＲＮＡを表す；ＩＩＩ、抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミド；ＩＶ、Ｃａｓ９の標的認識と位置付け；Ｖ、切断されたプラスミド；ＶＩ：バクテリオファージ、ＡｐR＝アンピシリン耐性、ＣｍR＝クロラムフェニコール耐性、ＫｍR＝カナマイシン耐性、ＡｐS＝アンピシリン感受性、ＣｍS＝クロラムフェニコール感受性、ＫｍS＝カナマイシン感受性、Ｂｌａ＝ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ＝クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＡＰＨ＝アミノグリコシドホストランスフェラーゼ。１．注射−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、細菌特異的ファージ感染によりファージＤＮＡと一緒に細菌細胞内に注入される。２．溶原化−ファージＤＮＡは溶原化され、細菌宿主染色体に組み込まれる（Ｂ．ｃｈｒ．）。３．ｃｒＲＮＡ生合成とＣａｓ９の組み立て−プレｃｒＲＮＡが転写され、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズされ処理されて、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＲＮＡガイド分子、すなわち「ｇＲＮＡ」）が作成され、これがＣａｓ９とともに組み立てられる。４．認識−これらのｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体はプラスミド上の標的ＤＮＡを認識する。５．切断−ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体は、ｃｒＲＮＡにより認識される部位でＤＮＡを切断する。６．不活性化−これは、抗生物質耐性酵素の産生の不活性化に至る。７．感受性−すなわち、細菌細胞は種々の抗生物質に対して感受性になる。
【図２】非病原性細菌及び無症候性病原体が将来抗生物質耐性遺伝子と遭遇することを防ぐ：  Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座、細菌染色体（Ｂ．Ｃｈｒ．）内に存在するとして例示され、ここで四角は異なる抗生物質耐性遺伝子を標的とする異なるスペーサー配列を示す：ＩＩ、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９、ここで四角は各抗生物質耐性遺伝子を標的とする異なるｇＲＮＡを表す；ＩＩＩ、リラクサーゼ（relaxase）−プラスミドＤＮＡの接合伝達を開始するために、２本鎖ＤＮＡ中に鎖特異的、配列特異的ニックを作る酵素；ＩＶ、バクテリオファージ；Ｖ、プラスミド；ＶＩ、２本鎖ＤＮＡ；ＶＩＩ、１本鎖ＤＮＡ。将来抗生物質耐性遺伝子に遭遇する３つの侵入経路が示される。１．形質転換−抗生物質耐性遺伝子を有する裸のＤＮＡの細菌細胞への侵入、２．バクテリオファージ媒介性形質導入−抗生物質耐性遺伝子を有するファージが細菌細胞に感染する。３．接合−抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドが、ドナー細菌細胞から受容体細菌細胞に接合的に伝達される。これらの抗生物質耐性遺伝子が「免疫化された」細胞に導入されると、これはｇＲＮＡ−Ｃａｓ９をコードするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座で予備武装され、これが抗生物質耐性遺伝子上の特異的標的配列を見つけ、これを切断して遺伝子を破壊する。
【図３】症候性病原体を抗生物質に対して再敏感化：  Ｉ．細菌染色体（Ｂ．ｃｈｒ）内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座、ここで、四角は各抗生物質耐性遺伝子を標的とする異なるスペーサー配列を示す；ＩＩ、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９、ここで四角は各抗生物質耐性遺伝子を標的とする異なるｇＲＮＡを表す；ＩＩＩ、抗生物質；ＩＶ、対応する遺伝子を切断することにより、タンパク質合成が破壊される；Ｖ、プラスミド。この図は、日和見感染症により症候性になる無症候性病原体を示す。病原体は、１．排出ポンプ−細菌細胞から抗生物質を排出することができる、２．抗生物質分解酵素、３．抗生物質修飾酵素、などの種々の抗生物質耐性物質を提供するプラスミドＤＮＡを含有する。各抗生物質耐性物質は、対応する遺伝子のｇＲＮＡ−Ｃａｓ９媒介性部位特異的切断により破壊される（Ｘ）。
【図４】３つの可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ送達経路：  Ｉ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座、ここで四角は、各抗生物質耐性遺伝子を標的とする異なるスペーサー配列を示す：ＩＩ、リラクサーゼ−プラスミドＤＮＡの接合伝達を開始するために、２本鎖ＤＮＡ中に鎖特異的、配列特異的ニックを作る酵素；ＩＩＩ、バクテリオファージ；ＩＶ、プラスミド；Ｖ、２本鎖ＤＮＡ；ＶＩ、１本鎖ＤＮＡ。この図は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現構築物の３つの可能な送達経路を示す。１．細胞表面のＤＮＡ受容体を介する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を有する裸のＤＮＡの細菌細胞への侵入、続いて細菌染色体（Ｂ．Ｃｈｒ．）への組み込み（４）。２．バクテリオファージ媒介性形質導入−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を有するファージが細菌細胞に感染し、続いて環状化され（５）、次に細菌染色体（Ｂ．Ｃｈｒ．）へのファージ媒介性組み込み。３．接合−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を有するプラスミドが、ドナー細菌細胞から受容体細菌細胞に接合的に伝達され、続いて環状化（５）され、プラスミドが複製される。全ての場合に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子座中の四角は、各抗生物質耐性遺伝子を標的とする異なるスペーサー配列を示す。
【図５】双方向性抗生物質耐性伝染モデルの構造（Am J Epidemiol. 2013;178(4):508-520を参照）及び抗生物質耐性遺伝子不活性化療法の効果：  Ａ、抗生物質耐性が優勢である；Ｂ、抗生物質感受性が優勢である；Ｓ、感受性；ＡＳ、抗生物質感受性；ＡＲ、抗生物質耐性；Ｔ、伝染；Ｒ、回復、Ｃ、転換；ＣＣＤ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９送達。抗生物質耐性状態の抗生物質耐性遺伝子と、感受性状態の抗生物質耐性遺伝子の遭遇とは、例えばｇＲＮＡ媒介性Ｃａｓ９切断により破壊される。抗生物質耐性遺伝子の不活性化療法は、抗生物質耐性から感受性への転換速度を上昇させ、抗生物質感受性から耐性への転換速度を低下させることにより、双方向性モデル（Ａ）をほとんど一方向性転換モデル（Ｂ）に転換する。各四角の面積は、各状態の集団密度を示す。この図では、矢印の幅は各パラメータ（伝染、回収、及び転換）の大きさに比例し、すなわち抗生物質耐性菌の伝染は、抗生物質感受性細菌よりも高いと推定される。抗生物質に感受性の病原体の感染からの回復は、抗生物質耐性病原体の場合よりも高くなる。抗生物質の存在下では、選択圧のために、抗生物質感受性の病原体は、耐性病原体から感受性病原体への反転よりはるかに多く、抗生物質耐性病原体に転換される。この治療の目的は、細菌にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を導入することにより、これらの転換パラメータを反転させて、抗生物質耐性病原体集団を感受性状態にすることである。
【図６Ａ】重複感染抗生物質耐性伝染モデルの構造と抗生物質耐性遺伝子不活性化療法の効果：  図５に記載された双方向性抗生物質耐性伝染モデルは、以下の重複感染抗生物質耐性伝染モデル（Am J Epidemiol. 2013;178(4):508-520, 図５に記載）により追加的に又は代替的に記載することができる。抗生物質耐性遺伝子が例えばｇＲＮＡ媒介性Ｃａｓ９切断により破壊されると、これは、重複感染状態を介して抗生物質耐性状態から抗生物質感受性状態への集団のシフトを可能にする。抗生物質耐性状態の破壊は、抗生物質耐性状態から感受性状態への転換速度を上昇させる。この図は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを適用する前（図６Ａ）と後（図６Ｂ）の相対的集団密度の比較を与える。集団は、Ｓ、易感染性；ｌｗ、感受性；ｌｚ、耐性；ｌｗｚ、重複感染状態からなる。各円の面積は、各状態の相対的集団密度に比例する。このシミュレーションでは、各状態での初期密度は、同一（各０．２５、細い線の円で表される）であると仮定される。太い線の円は、平衡状態での集団密度を示す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、易感染性状態の集団の増加に、従って平衡状態での回復速度（すなわち、ＢでＳが拡大している）と、耐性状態での集団の減少（すなわち、Ｂでｌｚが縮小している）に明らかに寄与している。矢印の幅は、各パラメータ（感染、回復、及び転換）の大きさに比例し、すなわち、この図では抗生物質耐性菌の感染は、抗生物質感受性細菌の感染よりも低いと推定される。抗生物質は感受性株で有効であるため、抗生物質に感受性の病原体の感染からの回復は、抗生物質耐性病原体の感染からの回復よりも高くなる。抗生物質の存在下では、抗生物質選択圧のために、抗生物質感受性の病原体は、反転よりはるかに多く、抗生物質耐性病原体に転換される。この治療の目的は、これらの転換パラメータを反転させ、抗生物質耐性病原体集団を感受性状態にすることである。
【図６Ｂ】重複感染抗生物質耐性伝染モデルの構造と抗生物質耐性遺伝子不活性化療法の効果：  図５に記載された双方向性抗生物質耐性伝染モデルは、以下の重複感染抗生物質耐性伝染モデル（Am J Epidemiol. 2013;178(4):508-520, 図５に記載）により追加的に又は代替的に記載することができる。抗生物質耐性遺伝子が例えばｇＲＮＡ媒介性Ｃａｓ９切断により破壊されると、これは、重複感染状態を介して抗生物質耐性状態から抗生物質感受性状態への集団のシフトを可能にする。抗生物質耐性状態の破壊は、抗生物質耐性状態から感受性状態への転換速度を上昇させる。この図は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを適用する前（図６Ａ）と後（図６Ｂ）の相対的集団密度の比較を与える。集団は、Ｓ、易感染性；ｌｗ、感受性；ｌｚ、耐性；ｌｗｚ、重複感染状態からなる。各円の面積は、各状態の相対的集団密度に比例する。このシミュレーションでは、各状態での初期密度は、同一（各０．２５、細い線の円で表される）であると仮定される。太い線の円は、平衡状態での集団密度を示す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、易感染性状態の集団の増加に、従って平衡状態での回復速度（すなわち、ＢでＳが拡大している）と、耐性状態での集団の減少（すなわち、Ｂでｌｚが縮小している）に明らかに寄与している。矢印の幅は、各パラメータ（感染、回復、及び転換）の大きさに比例し、すなわち、この図では抗生物質耐性菌の感染は、抗生物質感受性細菌の感染よりも低いと推定される。抗生物質は感受性株で有効であるため、抗生物質に感受性の病原体の感染からの回復は、抗生物質耐性病原体の感染からの回復よりも高くなる。抗生物質の存在下では、抗生物質選択圧のために、抗生物質感受性の病原体は、反転よりはるかに多く、抗生物質耐性病原体に転換される。この治療の目的は、これらの転換パラメータを反転させ、抗生物質耐性病原体集団を感受性状態にすることである。
【図７】ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構造：  この図は、６つの異なる領域を標的とする６つのスペーサーを含有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を示す。各ｃｒＲＮＡは、Ｐと記載される同じプロモーターから単シストロン性に転写されて、各標的について同一の転写レベルに制御される。各ｃｒＲＮＡ転写体は、リーダー配列Ｌで始まりターミネーター配列Ｔで終わる。各プレｃｒＲＮＡの転写体は矢印で示され、異なるスペーサー配列を含む四角はユニークな陰影で示される。
【図８】ｂｌａ遺伝子配列上の短い細菌オフターゲット配列のマッピング。  この図は、ベータラクタマーゼ遺伝子にマッピングされた細菌の短い配列（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）３〜５、８〜１４、１７〜２３、２６〜３３）の局所的アラインメントを示す。ベータラクタマーゼ配列（配列番号１〜２、６〜７、１５〜１６、２４〜２５）は、各パネルの上部に灰色で表示され、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列は黒で表示される。ｃｒＲＮＡとの塩基対形成領域は下線が引かれ、細菌のゲノム上のオフターゲットシード配列はイタリック体で示される。ＰＡＭ配列を含むオフターゲットシード配列は、２つの縦の線で示される。ベータラクタマーゼ遺伝子の配列上の２つの数字は、ホスホジエステル結合がＣａｓ９により切断されることが予測される２つの塩基位置である（以下の実施例１を参照）。
【図９】予測されるｃｒＲＮＡ二次構造。  図８と実施例１を参照して、ｍＦｏｌｄを使用してｃｒＲＮＡ配列の予測される二次構造が示される。図９に示されるＣＲ０５、ＣＲ３０、ＣＲ７０、及びＣＲ９０の配列は、それぞれ配列番号３４〜３７に対応する。
【図１０】ｐＢＲ３２２（配列番号３８）からのベータラクタマーゼ遺伝子上の期待される切断位置。  ｃｒＲＮＡスペーサー配列と塩基対形成している２つのプロトスペーサー配列は下線が引かれている（プロトスペーサー鎖）。プロトスペーサー配列がｃｒＲＮＡスペーサー配列と塩基対形成している時、置換される２つの抗プロトスペーサー配列は、太字イタリック体である（抗プロトスペーサー鎖）。関連するＰＡＭ配列は、四角で囲った小文字（プロトスペーサー鎖上）又は四角で囲った大文字（抗プロトスペーサー鎖上）のいずれかで示される。予測される切断位置は、アステリスクで示される。リーダー配列は、１〜６９塩基まで下線が引かれ、灰色で強調表示される。
【図１１】３つの領域とＥｃｏＲＶ消化したベクターｐＡＣＹＣ１８４の各々から、実施例２で生成されたＰＣＲアンプリコンを示す０．８％アガロースゲル上で電気泳動的に分離されたＤＮＡ産物の写真。  マークしたレーンは以下のとおりである：１*−ＮＥＢ（Ｎ３２３２Ｓ）１Ｋｂ分子マーカー、２μｇ／レーン；２−断片１、ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９領域：４７５８ｂｐ；３*−ＮＥＢ（Ｎ３２３２Ｓ）１Ｋｂ分子マーカー、０．７５μｇ／レーン；４−切断されていないｐＡＣＹＣ１８４；５−ＥｃｏＲＶ切断されたｐＡＣＹＣ１８４：４２４５ｂｐ；６−ＥｃｏＲＶ切断されたｐＡＣＹＣ１８４：４２４５ｂｐ；７*−ＮＥＢ（Ｎ３２３２Ｓ）１Ｋｂ分子マーカー、０．１２μｇ／レーン；８−断片２、リーダー配列と最初の直接反復配列領域：２７６ｂｐ；９*−ＮＥＢ（Ｎ３２３２Ｓ）１Ｋｂ分子マーカー、０．２μｇ／レーン；１０−断片３、第２の直接反復ｓｑ領域：４５２ｂｐ。注：*各ＰＣＲアンプリコンの質量は、NIH ImageJ 1.48vソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/）を使用して、適切なマーカバンドの強度を比較することにより推定される。
【図１２】実施例２で構築されたｐＮＢ１００のプラスミド地図。  このプラスミド地図は、SnapGene viewer ver 2.4.3 無料版（http://www.snapgene.com）により描かれた。２つの直接反復配列（ＤＲ）は、リーダー配列の３’末端に接する狭い白色の長方形として示される。
【図１３】写真は、細菌細胞接合による本発明の実施態様に係る「ネメシス共生活性」（ＮＳＡ）の結果を示す（実施例２を参照）。  左のプレートはＡｐ１００Ｃｍ３５中のＪＡ２００  ｐＮＴ３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１００を示し、右のプレートはＡｐ１００Ｃｍ３５中のＪＡ２００  ｐＮＴ３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１０２を示し、いずれも５×１０7細胞／ｍｌで播種した。
【図１４】写真は、プラスミド形質転換による本発明の実施態様に係るＮＳＡの結果を示す（実施例２を参照）。  左：ＬＢ  Ｃｍ３５プレート。コロニー１〜４０は、ｐＮＢ１０２で形質転換されたＤＨ５α  ｐＢＲ３２２である。コロニー４５〜６０は、ｐＮＢ１００で形質転換されＤＨ５α  ｐＢＲ３２２である。全てのコロニーは、プラスミドｐＮＢ１００とｐＮＢ１０２上のＣｍに対する抵抗性を示す。右：ＬＢ  Ａｐ１００プレート。コロニー１〜４０は、ＮＢＥｃ００１株中のプラスミドｐＢＲ３２２上のベータラクタマーゼ遺伝子を標的とするスペーサー領域を有するｐＮＢ１０２で形質転換後にＡｐＲを失い、それによりネメシス共生活性を示すことに注意されたい。このスペーサー領域を欠失しているがＣａｓ９遺伝子を保有するｐＮＢ１００は、ベータラクタマーゼ遺伝子を不活性化することができない。
【図１５】Ｎｇｏｐｈｉ６のファージミドを示す。  Ｎｇｏｐｈｉ６のＯＲＦ１１及びＯＲＦ７はＮｇｏｐｈｉ６ゲノムから削除されている。コード配列は、各ＯＲＦの翻訳極性を示す矢印で表される。Ｍ１３に対する各Ｎｇｏｐｈｉ６ファージＯＲＦの対応する遺伝子名は、ＯＲＦ１（ｇＩＩ）、ＯＲＦ２（ｇＶ）、ＯＲＦ４（ｇＶＩＩＩ）、ＯＲＦＶ（ｇＶＩＩＩ）、ＯＲＦ８（ｇＶＩ）、ＯＲＦ９（ｇＩ）である。Ｍ１３遺伝子名は括弧内にある。推定上の左組み込み部位Ｌ＝ＣＴＴＡＴＡＴの第２のＴは、組み込みを回避するために、Ａに変更されてＬ’＝ＣＡＴＡＴＡＴを与える。ＭＣＳ＝多重クローニング部位。Ｎｇｏｐｈｉ６とＭ１３ｍｐ１８の位置は、大きな２つの白い矢印で示される。
【図１６】肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）についてのＮＣＢＩ  ＡＲＤＢデータベース内で同定された１１７の異なるｂｌａ遺伝子を標的とする２０のガイドＲＮＡ分子をコードするスペーサー配列のセット（配列番号３９〜６０）を示す（実施例５を参照）。  候補スペーサー配列は、ＡＲＤＢデータベースで見つかった全ての肺炎桿菌のベータラクタマーゼ遺伝子を破壊することが同定された。ベータラクタマーゼ遺伝子配列は、キーワード「肺炎桿菌」を用いてＡＲＤＢデータベースから収集される。重複配列は除去され、ユニークな配列が、ＷｅｂプログラムであるClustal Omegaを使用して複数の配列アラインメントに使用される。１つの標準的な配列が各クラスタから選択され、ウェブプログラムであるJack LinのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇＲＮＡファインダーにより予測さる２０ｎｔのスペーサー配列が収集された。スペーサー配列は、同じ分類に属する配列中で見出さるプロトスペーサー配列の比率を最大にするように選択される。すなわち、第４列に示されたスペーサー配列の各例は、第３列中の遺伝子を破壊する能力を有する。この分析で使用されるベータラクタマーゼ遺伝子は以下の通りである：ＳＨＶ−ａ＝１、２、２ａ、５、５ａ、１１、１２、１４、２６、２７、２８、３１、３３、３８、４３、４４、４８、５５、５６、６０、６１、６２、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８５、８９、９２、９８、９９、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１０９、ＣＴＸＭ−ｂ＝１、３、１０、１２、１５、２２、３２、５４、６０、６２、６８、ＣＴＸＭ−ｃ＝１３、１４、１６、１８、１９、２４、２６、ＣＴＸＭ−ｄ＝２、３５、５９、ＣＴＸＭ−ｅ＝２６、６３、ＴＥＭ−ｆ＝１、１ｂ、３、ＥＳＢＬ、１３９、ＫＰＣ−ｇ＝１、２、３、４、ＯＫＰ−ｈ＝Ａ１１、Ａ１２、Ａ１６、Ａ１７、Ｂ１３、Ｂ−ＳＢ６１３、６、ＬＥＮ−ｉ＝２、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、ＧＥＳ−ｊ＝１、３、４、５、ＶＩＭ−ａ＝１、２、４、１２、１９、ＩＭＰ−ｂ＝４、８、ＣＭＹ−ａ＝２、４、２５、３１、３６、ＬＡＴ−ｂ＝１、２、ＣＭＹ−ｃ＝１、８ｂ、１０、１９、ＦＯＸ−ｄ＝１、５、７、ＯＸＡ−ａ＝１、３０、４７、ＯＸＡ−２、ＯＸＡ−９、ＯＸＡ−ｂ＝１０、１７。ベータラクタム抗生物質は、ペネム系、セフェム系、カルバペネム系、及びモノバクタム系の４つのクラスに分類される。各クラスの下に、例として１つの抗生物質名が表示される。ベータラクタム環を開くことができるベータラクタマーゼはＲで示される、例えばカルバペネムはＫＰＣにより不活性化される。細菌をカルバペネムに再敏感化することが望まれる場合、ＫＰＣ遺伝子を不活性化するためにスペーサー配列５’−ＴＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＧをスペーサーアレイ中に使用すべきである。ＣＭＹ−ａのスペーサー配列もＬＡＴ−ｂ切断のために使用することができることに注意されたい。スペーサー配列の例は、５’から３’方向で示される。
【図１７】肺炎桿菌についてのＣＡＲＤデータベース内で同定された１５４の異なるのｂｌａ遺伝子を標的とする１７のガイドＲＮＡ分子をコードするスペーサー配列のセット（配列番号６１〜７７）を示す（実施例５を参照）。  候補スペーサー配列は、ＣＡＲＤデータベースで見つかった全ての肺炎桿菌ベータラクタマーゼ遺伝子を破壊することが同定された。この表は、図１６の凡例で説明したものと同じ方法を用いて作成した。スペーサー配列の例は、５’から３’の方向で示される。
【図１８】修飾ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドであるＣａｓ９Ｒの地図。  Ｃａｓ９とのＴｎ３リゾルベース間の遺伝的融合。リゾルベースとＣａｓ９は矢印で示される。矢印の方向は転写極性を表す。Ｃａｓ９の機能ドメイン名は、Ｃａｓ９の白い矢印の下の四角に示される。このＣａｓ９はエンドヌクレアーゼ活性欠損変異体ｄＣａｓ９であり、ＲｕｖＣｌドメイン中にアミノ酸置換Ｄ１０Ａ、ＨＮＨドメイン中にアミノ酸置換Ｈ８４０Ａを有する（sai et al. [2014, Nature Biotechnology 32: 569?576]により記載されているように）。変異体Ｔｎ３リゾルベース（Proudfoot et al. [2011 PLoS ONE?6(4): e19537]により記載されているように）は、１２量体ポリペプチドリンカーを介して、このｄＣａｓ９のＮ末端に融合される。組換え部位の特異性を低下させるこれらの置換されたアミノ酸残基のいくつかの位置は、リゾルベースのＮ末端ドメインの残基１〜１４８における短い縦棒により示される。これらの置換の完全なリストは、次のとおりである。Ｒ２Ａ、Ｅ５６Ｋ、Ｇ１０１Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、Ｍ１０３Ｉ、Ｑ１０５Ｌ、Ｖ１０７Ｆ、Ｅ１３２Ａ、Ｌ１３５Ｒ。融合体のＣａｓ９領域では：ＲｕｖＣＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＨＮＨ、及びＰＩ（ＰＡＭ相互作用）ドメインはヌクレアーゼドメインであり、ＲＥＣ１ａとＲＥＣ１ｂは、それぞれ反復及び抗反復ＲＮＡの認識ドメインである。ＲＥＣ２ドメインはプロトスペーサー−ｇＲＮＡヘテロ２本鎖に全く接触しない。４つのＣＲＩＳＰＲスペーサー配列Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、及びＳ４は、１つのＣＲＩＳＰＲリーダー配列の発現下に整列され、標的配列の欠失及び再連結を引き起こす変異体Ｔｎ３リゾルベースによるＣａｓ９Ｒ媒介性組換えイベントをもたらすために必要とされる。Ｔｎ３Ｒ＝Ｔｎ３リゾルベース、Ｒ＝直接反復配列、Ｌ＝リーダー配列。
【図１９】ｇＲＮＡ指令Ｃａｓ９によるリゾルベースの部位特異的配置を示す概略図。  工程１の白い矢印は、不活性化のためのプラスミド上の標的抗生物質耐性遺伝子である。各組み換え部位Ａ（Ａ１，Ａ２）とＢ（Ｂ１，Ｂ２）はｇＲＮＡにより独立して認識され、正しく配置されたリゾルベースは、近接して２量体化される（工程ＩＩ）。各組換え部位中のダイマーＡ１＋Ａ２とＢ１＋Ｂ２は４量体化されてシナプスを形成する（工程ＩＩＩ）。シナプス複合体（ＩＩＩ）は拡大され、ｇＲＮＡはＳ１、Ｓ２、Ｓ３、及びＳ４と指定された点線の矢印として表示される。大きな楕円はｄＣａｓ９を表し、縦方向の楕円はリンカーペプチドを介して接続されたリゾルベースである。白と灰色の縦の楕円は、それぞれ組換え部位ＢとＡ上の二量体化しているリゾルベース触媒ドメインである。縦の矢印は、組換え部位上のリゾルベースによる切断位置を示す。細い横に平行の矢印は、組換え部位Ａ１＋Ａ２を含むＤＮＡを表し、太い横に平行の矢印は組換え部位Ｂ１＋Ｂ２を含むＤＮＡを表す。矢じりはＤＮＡ配列の３’末端を示す。短い黒ブロック矢印は各ＰＡＭ配列の位置である。
【図２０】組換え部位Ａ１＋Ａ２とＢ１＋Ｂ２の半分の部位の交換と、引き続く鎖の分解と破談点の封止を示す概略図。  組み換えＡ１とＢ１の半分の部位を交換し、連結し、分解する。標的抗生物質遺伝子の領域は環状ＤＮＡとして分解され、一方、染色体又はプラスミドのレプリコンの残りの部分は再環化される（工程ＩＶ）。短い黒のブロック矢印は、分解後の各ＰＡＭ配列の位置である。
【図２１】クラスＡ遺伝子ＳＨＶ−ａ、ＣＴＸ−Ｍ−ｂ、ＴＥＭ−ｃ、ＫＰＣ−ｄ；クラスＢ遺伝子ＶＩＭ−ｅ、ＩＭＰ−ｆ、ＮＤＭ−ｇ、及びクラスＤ遺伝子ＯＸＡ−４８を標的とする８つのガイドＲＮＡ分子をコードするスペーサー配列のセット（配列番号７８〜８５）を示し、ここで、ＳＨＶ−ａ＝１、１ａ、２、２ａ、５、５ａ、１１、１２、１４、１８、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３８、４３、４４、４８、５２、５５、５６、６０、６１、６２、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８５、８９、９２、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１２１、１３６、１３４、１３７、１４０、１４３、１４４、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７２、１７３、１７８、１７９；ＣＴＸＭ−ｂ＝１、３、１０、１２、１５、１９、２２、３２、５２、５４、５９、６０、６２、６８、７１、８０、８１、９９、１４１、１４７；ＴＥＭ−ｃ＝１、１Ｂ、３、１３９、１６２、１８３、１９２、１９７、１９８、２０９；ＫＰＣ−ｄ＝１、２、３、４、６、７、８、１１、１２、１４、１５、１６、１７；ＶＩＭ−ｅ＝１、２、４、１９、２６、２７、３３、３４；ＩＭＰ−ｆ＝４、８、３２、３８；及びＮＤＭ−ｇ＝１、９、１０（実施例７を参照）である。
【図２２】プラスミドｐＮＢ２００、２０２、２０３、１０４Ａ、１０４Ｂ、及び１０８（実施例７を参照）の構築に使用されるオリゴヌクレオチドの配列（配列番号８６〜９８）を与える表を示す。
【図２３】実施例７で構築されたｐＮＢ１０４Ａのプラスミド地図。  このプラスミド地図は、SnapGene viewer ver 2.4.3 無料版（http://www.snapgene.com）により描かれた。４量体スペーサーコンカテマー (concatemer)（図２９Ａ）を、その制限部位がＡ１とＡ２に位置するＢｓａＩで消化し、ｐＮＢ２０２上のＢｓａＩスペーサークローニング部位に連結してｐＮＢ２０３を得た。ｐＮＢ１０４Ａ上の単一プロモーターとスペーサー領域（６２２１〜７００１）が示される。Ｐ＝プロモーター、Ｌ＝リーダー、Ｒ＝直接反復配列、Ｓ＝スペーサー、Ｔ＝テイル。連結されたスペーサー (concatenated spacers)（ＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、及びＫＰＣを標的とする）は、単一プロモーターの下流に位置している。
【図２４】実施例７で構築されたｐＮＢ１０４Ｂのプラスミド地図。  このプラスミド地図は、SnapGene viewer ver 2.4.3 無料版（http://www.snapgene.com）により描かれた。ｐＮＢ１０４Ｂ上の単一プロモーターの領域（６２２１〜６９８７）が示される。Ｐ＝プロモーター、Ｌ＝リーダー、Ｒ＝直接反復配列、Ｓ＝スペーサー、Ｔ＝テイル。連結されたスペーサー（ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、及びＣＴＸ−Ｍを標的とする）は、単一プロモーターからの発現下に配置される。
【図２５】実施例７で構築されたｐＮＢ１０８のプラスミド地図。  このプラスミド地図は、SnapGene viewer ver 2.4.3 無料版（http://www.snapgene.com）により描かれた。８量体スペーサーコンカテマー（図２９Ｂ）を、その制限部位がＡ１とＡ２に位置するＢｓａＩで消化し、ｐＮＢ１００上のＢｓａＩスペーサークローニング部位に連結してｐＮＢ１０８を得た。ｐＮＢ１０８上の単一プロモーターとスペーサー領域（６２２１〜７２２５）が示される。Ｐ＝プロモーター、Ｌ＝リーダー、Ｒ＝直接反復配列、Ｓ＝スペーサー、Ｔ＝テイル。連結されたスペーサー（ＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、ＫＰＣ、ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、及びＣＴＸ−Ｍを標的とする）は、単一プロモーター下に位置している。
【図２６】実施例７で構築されたｐＮＢ２００のプラスミド地図。  このプラスミド地図は、SnapGene viewer ver 2.4.3 無料版（http://www.snapgene.com）により描かれた。２重プロモーターカセットを、ＰＣＲによりテンプレートｐＮＢ１００から、プライマー対ＮＢ０１８とＮＢ０１９を用いて合成し、アンプリコンをＢｂｖＩで消化し、ｐＮＢ１００のＢｓａＩ部位に連結してｐＮＢ２００を得て、この過程で、位置５７７６〜５７４１からのｐＮＢ１００の小さなＢｓａＩ断片を置換した。ｐＮＢ２００上の２重プロモーターと２つのスペーサークローニング領域（６２２１〜７３８２）が示される。Ｐ＝プロモーター、Ｌ＝リーダー、Ｒ＝直接反復配列、Ｓ＝スペーサー、Ｔ＝テイル。制限酵素ＢｓａＩとＳａｐＩは、それぞれ上流と下流のスペーサー配列をクローニングするのに使用される。
【図２７】実施例７で構築されたｐＮＢ２０２のプラスミド地図。  このプラスミド地図は、SnapGene viewer ver 2.4.3 無料版（http://www.snapgene.com）により描かれた。４量体スペーサーコンカテマー（図２９Ａ）を、その制限部位がＢ１とＢ２に位置するＳａｐＩで消化し、ｐＮＢ２００上のＳａｐＩスペーサークローニング部位に連結してｐＮＢ２０２を得た。ｐＮＢ２０２上の２重プロモーターとスペーサー領域（６２２１〜７３２９）が示される。Ｐ＝プロモーター、Ｌ＝リーダー、Ｒ＝直接反復配列、Ｓ＝スペーサー、Ｔ＝テイル。連結されたスペーサー（ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、及びＣＴＸ−Ｍを標的とする）は、第２のプロモーターの下流に位置している。
【図２８】実施例７で構築されたｐＮＢ２０３のプラスミド地図。  このプラスミド地図は、SnapGene viewer ver 2.4.3 無料版（http://www.snapgene.com）により描かれた。図２９Ａに示した４量体スペーサーコンカテマーａ＋ｂ＋ｃ＋ｄを、その制限部位がＡ１とＡ２に位置するＢｓａＩで消化し、ｐＮＢ２０２上のＢｓａＩスペーサークローニング部位に連結してｐＮＢ２０３を得た。ｐＮＢ２０３上の２重プロモーターとスペーサー領域（６２２１〜７５０１）が示される。Ｐ＝プロモーター、Ｌ＝リーダー、Ｒ＝直接反復配列、Ｓ＝スペーサー、Ｔ＝テイル。連結されたスペーサー（ＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、及びＫＰＣを標的とする）は、第１のプロモーターの下流に位置している。連結されたスペーサー（ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、及びＣＴＸ−Ｍを標的とする）は、第２のプロモーターの下流に位置している。
【図２９Ａ】実施例７の４量体スペーサー連結。  オリゴを関連付ける番号は、図２２に列記したプライマーの番号に対応する。オリゴは、２６と２７、２８と３４、３５と３１、３２と３６の間で対になって、それぞれａ、ｃ、ｅ、及びｇのユニークなスペーサー領域（Ｉ）を介してアニーリングされ、個々のチューブ（ＩＩ）で延長される。２６と２７からのダイマーコンカテマーは、スペーサーａとｂに連結する。２８と３４からのダイマーコンカテマーは、スペーサーｂ、ｃ、及びｄに連結する。３５と３１からのダイマーコンカテマーは、スペーサーｅとｆに連結する。３２と３６からのダイマーコンカテマーは、スペーサーｆ、ｇ、及びｈ（ＩＩ）に連結する。連結されたダイマーａ＋ｂとｂ＋ｃ＋ｄ、ｅ＋ｆとｆ＋ｇ＋ｈは更に、それぞれｂ及びｆスペーサー領域を介してハイブリダイズされ、伸長されて４つのスペーサーａ、ｂ、ｃ、及びｄ、又はｅ、ｆ、ｇ、及びｈ（ＩＩＩ）を連結する。４量体スペーサーコンカテマーｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈは、その制限部位がＢ１とＢ２に位置するＳａｐＩで消化し、ｐＮＢ２００上のＳａｐＩスペーサークローニング部位に連結してｐＮＢ２０２を得た。４量体スペーサーコンカテマーａ＋ｂ＋ｃ＋ｄを、その制限部位がＡ１とＡ２に位置するＢｓａＩで消化し、ｐＮＢ２０２上のＢｓａＩスペーサークローニング部位に連結してｐＮＢ２０３を得た。  ａ＝ＮＤＭ用２０量体スペーサー、ｂ＝ＩＭＰ用２０量体スペーサー、ｃ＝ＶＩＭ用２０量体スペーサー、ｄ＝ＫＰＣ用２０量体スペーサー、ｅ＝ＯＸＡ−４８用２０量体スペーサー、ｆ＝ＳＨＶ用２０量体スペーサー、ｇ＝ＴＥＭ用２０量体スペーサー、ｈ＝ＣＴＸ−Ｍ用２０量体スペーサー。
【図２９Ｂ】実施例７の８量体スペーサー連結。  ４量体スペーサーコンカテマーａ＋ｂ＋ｃ＋ｄとｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈを、それぞれプライマー対ＮＢ０２６とＮＢ０２９、ＮＢ０３０とＮＢ０３３を用いて増幅し（Ｖ）、４量体コンカテマーをスペーサーｄ領域を介してハイブリダイズし、次に伸長して８量体コンカテマーａ＋ｂ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈを得た。この８量体を、その制限部位がＡ１とＡ２に位置するＢｓａＩで消化し、ＢｓａＩに連結し、ｐＮＢ１００上のＢｓａＩスペーサークローニング部位に連結してｐＮＢ１０８を得た。ａ＝ＮＤＭ用２０量体スペーサー、ｂ＝ＩＭＰ用２０量体スペーサー、ｃ＝ＶＩＭ用２０量体スペーサー、ｄ＝ＫＰＣ用２０量体スペーサー、ｅ＝ＯＸＡ−４８用２０量体スペーサー、ｆ＝ＳＨＶ用２０量体スペーサー、ｇ＝ＴＥＭ用２０量体スペーサー、ｈ＝ＣＴＸ−Ｍ用２０量体スペーサー。
【図３０Ａ】細菌細胞接合による本発明の実施態様に係る「ネメシス共生活性」（ＮＳＡ）の結果を示す写真（実施例７を参照）。  図３０Ａの左上のプレートは、Ａｐ１００Ｃｍ３５中のＪＡ２００  ｐＮＴ３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１００を示し、右上のプレートは、Ａｐ１００Ｃｍ３５中のＪＡ２００  ｐＮＴ３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１０２を示す。
【図３０Ｂ】細菌細胞接合による本発明の実施態様に係る「ネメシス共生活性」（ＮＳＡ）の結果を示す写真（実施例７を参照）。図３０Ｂは、ＮＣＴＣ１３４４×ＤＨ５α  ｐＮＢ１００（左上のプレート）、及びＮＣＴＣ１３３５３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１００（右上のプレート）、及びＮＣＴＣ１３４４０×ＤＨ５α  ｐＮＢ１０４Ａ（左下のプレート）、及びＮＣＴＣ１３３５３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１０４Ｂ（右下のプレート）を示す（全てＡｐ１００Ｃｍ３５中）。
【図３０Ｃ】細菌細胞接合による本発明の実施態様に係る「ネメシス共生活性」（ＮＳＡ）の結果を示す写真（実施例７を参照）。図３０Ｃは、ＪＡ２００ｐＮＴ３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１００（５−）、ＮＣＴＣ１３４４０×ＤＨ５α  ｐＮＢ１００（２−）、及びＮＣＴＣ１３３５３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１００（４−）（左上のプレート）、及びＪＡ２００  ｐＮＴ３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１０８（５／８）、ＮＣＴＣ１３４４０×ＤＨ５α  ｐＮＢ１０８（２／８）、及びＮＣＴＣ１３３５３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１０８（４／８）（右上のプレート）、及びＪＡ２００  ｐＮＴ３×ＤＨ５α  ｐＮＢ１００（５＋）（下のプレート）を示す（全てＡｐ１００Ｃｍ３５中）。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本明細書において用語「抗生物質 (antibiotic)」は、他の微生物の増殖に拮抗的な微生物により産生される古典的な抗生物質を指し、より一般的には、微生物を死滅させるか又はその増殖を阻害することができる抗菌剤を包含し、例えば化学的に合成されたもの及び天然の抗生物質の変種を含む。
【００６５】
「充分に相補的 (sufficiently complementary)」という用語は、スペーサー配列と標的配列の配列同一性が、スペーサー配列を含むＲＮＡガイド分子が、好ましくは特異的かつ選択的に標的配列とハイブリダイズすることができ、従って、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを介する標的配列を含む抗生物質耐性遺伝子の不活性化を可能にするようなものであることを意味する。例えばスペーサー配列は、その全長にわたって標的配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有していてもよい。
【００６６】
本明細書において用語「機能性同等物」は、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド（又は本明細書においてＣａｓ核酸結合ポリペプチド）と同じ活性を示すことができるポリペプチドを指す。「機能性同等物」は、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドと同じ定性的生物学的性質を有することができる。「機能性同等物」は、特に限定されないが、未変性のＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドの断片又は誘導体及びその断片を含むが、前記同等物は、対応する未変性の配列ポリペプチドと同様の生物活性を有する。共通の生物活性に構造的同一性は必要ではないが、ある態様において機能性同等物はその全長にわたって、ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド、例えばＣａｓ９（(Ferretti et al, 2001, PNAS, 98 No. 8: 4658-4663, Gene ID: 901176, Cas9 GI: 15675041; 標準誤差平衡99）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【００６７】
用語「ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチド」は、完全長Ｃａｓポリペプチド、Ｃａｓポリペプチドの酵素活性断片、及びＣａｓポリペプチド又はその断片の酵素活性誘導体を包含する。Ｃａｓポリペプチド又はその断片の適切な誘導体は、特に限定されないが、Ｃａｓタンパク質又はその断片の変異体 (mutants)、融合体 (fusions)、共有結合性修飾物 (covalent modifications)を含む。
【００６８】
用語「修飾された」ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドは、上記で定義されたＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドを包含するが、このポリペプチドのＤＳＢ触媒機能は、例えばリコンビナーゼ触媒ドメインの存在のために、ＤＮＡ封止機能により置換される。このような修飾ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドのさらなる特徴は本明細書に記載されている。
【００６９】
ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の配列同一性は、これらの配列のアラインメントを比較することにより決定することができる。比較された配列中の同等の位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められるなら、その分子はその位置で同一である。アラインメントを同一性パーセントとしてのスコア化することは、比較された配列により共有される同一のアミノ酸又は塩基の数の関数である。配列を比較する時、最適なアラインメントは、配列中の可能な挿入と欠失を考慮するために、１又は複数の配列にギャップを導入する必要がある。配列比較法はギャップペナルティを使用することができ、従って、例えば比較される配列中の同じ数の同じ分子について、２つの比較される配列間の高い関連性を反映して、できるだけ少ないギャップを有する配列アラインメントが、多くのギャップを有するものより高いスコアを達成するであろう。最大の同一性パーセントの計算は、ギャップペナルティを考慮して、最適のアラインメントの生成を含む。
【００７０】
配列比較を行うための適切なコンピュータープログラムは、商業部門及び公共部門で広く入手可能である。例としては、ＭａｔＧａｔ (Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4: 29; プログラムは http://bitincka.com/ledion/matgat から入手可能である), Ｇａｐ (Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), ＦＡＳＴＡ (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; プログラムは http://www.ebi.ac.uk/fasta から利用可能である), Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２．０及びＸ２．０ (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948; プログラムは http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2 から利用可能である) 及び EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms (Needleman & Wunsch, 1970, supra; Kruskal, 1983, In: Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, Sankoff & Kruskal (eds), pp 1-44, Addison Wesley; programs available from http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align) が挙げられる。全てのプログラムはデフォールトパラメータを使用して実施できる。
【００７１】
例えば配列比較は、EMBOSS Pairwise Alignment Algorithmsの「ニードル」法を使用して行うことができ、これは、２つの配列の全長にわたって考慮され、同一パーセントのスコアを提供する時、２つの配列の最適アラインメント（ギャップを含む）を決定する。アミノ酸配列比較のためのデフォールトパラメータ（「タンパク質分子」オプション）は、ギャップ伸長ペナルティ：０．５、ギャップオーンペナルティ：１０．０、マトリックス：バイソサム６２、でもよい。ヌクレオチド配列比較のためのデフォールトパラメータ（「ＤＮＡ分子」オプション）は、ギャップ伸長ペナルティ：０．５、ギャップオーンペナルティ：１０．０、マトリックス：ＤＮＡfullでもよい。
【００７２】
本発明のある態様において、配列比較は、参照配列の完全長にわたって行うことができる。
【００７３】
本明細書において用語「遺伝子」は、そこからポリペプチドがコードされるか又は非コード性の機能性ＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列を指す。
【００７４】
用語「抗生物質耐性遺伝子 (antibiotic resistance gene)」は、抗生物質耐性を付与する生成物をコードするか機能性ＲＮＡを転写する遺伝子又はそのコード部分を包含する。例えば抗生物質耐性遺伝子は、上記した４つの耐性機構のいずれかに寄与する遺伝子又はそのコード部分でもよい。抗生物質耐性遺伝子は、例えば（１）抗生物質を分解する酵素、（２）抗生物質を修飾する酵素、（３）排出ポンプなどのポンプ、又は（４）抗生物質の作用を抑制する変異された標的をコードすることができる。
【００７５】
用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、例えばＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）又はＤＮＡを指す。この用語はまた、特にオリゴヌクレオチドマーカーについて、既知のタイプの修飾物、例えば当該分野で公知標識物、メチル化、「キャップ (caps)」、類似体による１又は複数の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば未変化結合を有するもの、例えばメチルリン酸塩、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど、及び荷電性結合を有するものを含むことができる。
【００７６】
本明細書において用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指す。この用語は、ポリヌクレオチドの特定の長さを指すものではなく、従ってペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。用語「ポリペプチド」は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などの発現後修飾を含むことができる。「ポリペプチド」の定義には、例えばアミノ酸の１又は複数の類似体（例えば、天然ではないアミノ酸）を含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、並びに天然の及び非天然の当該分野で公知の他の修飾が含まれる。
【００７７】
用語「微生物」は、細菌及び古細菌（例えば、ユリアーキオータ門（Euryarchaeota）及びクレンアーキオータ門（Crenarchaeota）に属するもの）などの原核生物を包含する。細菌はグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両方を含む。臨床的に重要な病原性真菌、例えばカンジダ（Candida）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、ヒストプラズマ（Histoplasma）属、ニューモシステス（Pneumocystis）属、及びスタキボトリス（Stachybotrys）属などのいくつかの種が微生物の定義に含まれる。
【００７８】
本発明の種々の態様は、図面で示され、後述される。
【００７９】
本発明において、本発明の組換えポリヌクレオチドを含むバクテリオファージ又は接合プラスミドを使用することの利点は、それぞれが「トロイの木馬 (Trojan horse)」として機能していることであり、従って、バクテリオファージの感染後又は以下のプラスミド接合後に、標的細菌又は他の微生物に「アサシン構築物」が挿入される。
【００８０】
アサシン構築物はまた、いったん標的微生物に挿入されると、抗生物質耐性遺伝子（図２を参照）を保有するプラスミドの将来の到着に対する、更にもちろんすで存在するこのような遺伝子の破壊に対する、細胞の免疫化を提供する（図１及び図３を参照）。
【００８１】
次に、アサシン構築物は抗生物質耐性遺伝子の分解のプロセスを開始する。もし本発明のＣａｓＤＮＡ結合タンパク質により作成されたＤＳＢが、そのような抗生物質耐性遺伝子を有するレプリコンを破壊すると、抗生物質耐性遺伝子を保有する微生物は、アサシン構築物により直接殺害され得る。微生物がＤＳＢを生き延びると、耐性遺伝子は不活性化され、患者は、微生物が敏感化された抗生物質により処理されることができる。
【００８２】
重要なことは、患者が次に抗生物質で治療される場合及び治療されるまで、このイベントに対して、選択圧は全く無いか又は低下していなければならない。すなわち、病原性細菌又は他の微生物中のバクテリオファージ（又はプラスミド）耐性について直接的選択はほとんど又は全く存在すべきではなく、従って、「進化的軍備競争 (evolutionary arms race)」（時に、直接的な殺菌剤としてのバクテリオファージの公知の使用の重要な制限的特徴）はまったく又はほとんど樹立されてはならない。
【００８３】
微生物のＤＳＢ誘導性死滅が、バクテリオファージ又は接合プラスミド送達物質に対する耐性の選択圧を上昇させる場合、例えば本明細書で定義された修飾ＣａｓＤＮＡポリペプチドを使用することにより、問題が小さくなるであろう。
【００８４】
本発明は、経口、局所、及びプロバイオティックな、栄養補助食品の送達の候補薬剤、並びに病原性細菌又は他の微生物における抗生物質耐性遺伝子を静かに不活性化するための疫学的なツールを提供する（図３を参照）。病院での手術又は他の治療が予定されている患者は、入院の前に予防的に抗生物質耐性遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（又は他の）アサシン構築物を有する組換えバクテリオファージで治療することができるであろう。こうして、これらの微生物中に存在する病原体を直接死滅させるか、又は抗生物質による治療の必要性が発生する可能性のある術後感染を予測して、抗生物質耐性遺伝子を追い出すことができる。
【００８５】
すなわち本発明は、病原性細菌中の抗生物質耐性遺伝子を静かに不活性化するための疫学的ツールを提供する。
【００８６】
本発明の例を実施するために、選択された抗生物質を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アサシン物のセットを構成することができる。変動物は、バクテリオファージ（同義で単に「ファージ」とも呼ばれる）、又は接合プラスミド、又はＤＮＡ、送達物質である：ある範囲の重要な細菌性病原体に特異的な、ある範囲のバクテリオファージやプラスミド薬剤を開発することができる。
【００８７】
単一の一般化されたバクテリオファージ又はプラスミド送達物質を、異なる細菌病原体を標的とするために変更する必要性の程度は、ファージのライフサイクルに関与するファージタンパク質、又はプラスミドの生物学、及び病原性細菌標的の相互作用の特異性の詳細に依存する。
【００８８】
宿主に感染しプロファージとして休止状態になる溶原性ファージ、並びに複製するが宿主を殺さない非毒性ファージの両方を、開発することができる。溶原性ファージの特異性に関しては、ファージの溶原性ライフサイクル、従って（ｉ）細菌細胞へのファージの侵入と（ｉｉ）標的染色体中の付着部位への以後の組み込みと、に関与する特異性のみが必要である。組み込みは必要とされないことがあり、次に例えばｃｒｅ−ｌｏｘ組換えを行い、細胞中で独立して複製することができるプラスミドを送達するファージを使用して置換することができる。非毒性Ｍ１３ファージ及びその誘導体を使用してもよい。
【００８９】
溶原化された細菌中の溶菌サイクルへの低レベルの侵入が、他の細菌（免疫を提供する病原性細菌又は非病原性細菌）に実質的に感染し続けることができる新しいファージを生成するように、溶原性ファージ中の機能的な溶菌サイクルを保持することができる。病原性集団中のファージの疫学的拡散の観点から、これは必要ではなく、１回の初期感染で充分であろう。これは実験で調べることができる。効率的な感染の最適条件と感染の適切な回数が特定される。
【００９０】
実験はモデル系で行うことができる（図１を参照）。例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、及びカナマイシンに、又はその耐性が広がっている一般的に使用される抗生物質を標的とする、多剤耐性を有する大腸菌。
【００９１】
実験はまた、標的病原体、例えば肺炎桿菌カルバペネマーゼ（「ＫＰＣ」）を用いて行うこともできる。ＫＰＣは、英国の病院での感染と死亡の原因である。
【００９２】
バクテリオファージによる送達：ファージ送達系（例えば図２の経路２を参照）は、抗生物質耐性細菌に感染された創傷と火傷の治療に適しているかも知れない。
【００９３】
２つの異なる大腸菌溶原性バクテリオファージによるこれらの抗生物質を標的とするアサシン構築物の送達：バクテリオファージラムダ及びバクテリオファージＭｕ（ミュー）を使用することができる。バクテリオファージラムダは、ラムダ付着部位として知られている宿主染色体中の特定の組み込み部位を有する。バクテリオファージＭｕは、宿主ゲノムにランダムに組み込むことができ、細菌中の特定の結合部位を必要としないという利点を有する。
【００９４】
上記したように感染後のｃｒｅ−ｌｏｘ組換えにより又はエピソームとして複製するファージＰ１の使用により切除する、本発明の組換えポリヌクレオチドを含有するプラスミドレプリコンを送達するために、ファージを使用することもできる。感染の成功に関与する特異性は、細菌細胞表面上の膜タンパク質の認識である。ラムダの場合、これは、糖マルトースを細菌細胞に輸送するマルトースパーミアーゼタンパク質である。バクテリオファージＭｕの場合、受容体であるＬＰＳである。
【００９５】
Ｆ因子プラスミドを有する大腸菌細胞に感染する雄性特異的ファージＭ１３もまた、１又は複数の抗生物質耐性遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物（又は本発明の他のアサシン構築物）を送達するために使用することもできる。Ｍ１３はよく研究されたファージであり、複製するが細菌宿主を殺すことは無い。
【００９６】
組換えバクテリオファージによる溶原化後の、又はこれらの抗生物質耐性遺伝子に対するアサシン構築物を有するＭ１３組み換え体による感染後の、抗生物質を標的とする耐性の排除の成功が評価される。
【００９７】
同じ抗生物質に対する耐性を有する他の密接に関連した腸内細菌が研究されている。これらには、上記の肺炎桿菌以外に、ネズミチフス菌（S. typhimurium）、及びシゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）を含むことができる。
【００９８】
これを行うために、バクテリオファージのテイル繊維タンパク質をコードする異なる遺伝子を用いて修飾ファージが構築され、これが細菌表面上に存在する異なる受容体と相互作用することを可能にする。これらの細菌の天然の宿主である溶原性ファージ、すなわちＭ１３などの雄性特異的ファージを使用することができる。
【００９９】
遺伝子発現を制御し代替テイル繊維タンパク質を発現するようにＤＮＡセグメントを低頻度で反転することにより、バクテリオファージがその宿主特異性をスイッチすることができる、相変化の現象を使用することもできる。こうして、多目的なファージ送達系が開発される。例えばファージＭｕは反転可能なＧセグメント（Ｍｕにコードされる部位特異的リコンビナーゼにより制御される、Ｇｉｎ）を有し、２つのタイプのファージ［大腸菌Ｋ１２に感染できるＧ（＋）とエンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、シトロバクター・フロインデイ（Citrobacter freundii）、霊菌（Serratia marcescens）、及び軟腐病菌（Erwinia carotovora）に感染できるＧ（−）］を与える。
【０１００】
別の例は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）繊維状ファージＮｇｏＰｈｉ６又はその修飾された形態である。この天然の（野生型）ファージは、グラム陰性菌（アルファ、ベータ、及びガンマプロテオバクテリア）に対して広い宿主範囲を有する −Piekarowicz et al. (2014 J. Virol. 88: 1002 - 1010) を参照。天然のファージは溶菌性ではなく溶原性であり、宿主ゲノム上に組み込み部位を有する。本発明のある態様において、ファージが宿主染色体に組み込まれる能力が除去され、ファージは独立して複製するように操作される。左の組込み部位Ｌ、ＣＴＴＡＴＡＴをＬ’、ＣＡＴＡＴＡＴで置換することは、組み込みイベントを排除するであろう。ファージゲノムを染色体外で複製するために、Ｍ１３ｏｒｉ及びＭ１３遺伝子ＩＩを使用してＭ１３ファージ複製を模倣することができる。感染した細菌からの子孫の生産能力を維持するために、修飾は最小限に抑えることができる。最大パッケージングサイズは不明であるが、約１２ＫｂのファージＤＮＡがパッケージング可能であることが実験的に証明されており、このファージに感染した細菌から産生さるファージ子孫は感染可能である。ファージの長さは約４ミクロンであり、これはＭ１３ファージ粒子よりも４．４倍長く、そして、Ｍ１３より長いＤＮＡの高いパッケージング能力を示しており、すなわちＤＮＡのパッケージングサイズはファージ粒子長の大きさに比例すると推定され、ＮｇｏＰｈｉ６ファージのＤＮＡパッケージング能力は、４ミクロン／０．９ミクロン×６４０７ｎｔ＝２８４７５ｎｔであり、これは、例えば所望であればＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物を含む本発明の組換えポリヌクレオチドとともにファージゲノムをパッケージングするには充分に大きい。ファージベクター（ファージミド (phagemid)）の例示構造はこの要件を満足する（図１５を参照）。
【０１０１】
接合プラスミドによる送達：これらの抗生物質を標的とするアサシン構築物の、選択された広宿主範囲の接合プラスミドによる送達を評価することができる（図４の経路３を参照）。ここでプラスミドは、良性の非病原性宿主により送達することができる。ここでの用途は、消化管についてプロバイオティックとしてであり、予防的に使用することができる。この態様において、プラスミドは受容者には伝達されないであろうから、ＣａｓＤＮＡ結合タンパク質により引き起こされるＤＳＢの致死作用は関心事ではない。
【０１０２】
同様にアサシン貨物を有するプラスミドの接合伝達後の、３種の標的抗生物質に対する耐性の排除の成功の証明を、評価することができる。
【０１０３】
線状ＤＮＡの形質転換による送達：これらの抗生物質を標的とするアサシン構築物の、線状２本鎖ＤＮＡの形質転換（図４の経路１を参照）による送達も行うことができる。ここで、ＤＮＡは、細菌の表面上のＤＮＡ受容体を介して、細菌の周囲の環境から送達される。
【０１０４】
本発明は、以下の非限定の実施例によって説明される。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
実施例１の目的は、大腸菌の非病原性細菌株へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物の導入による、抗生物質効力の復活の実証実験を示すことである。
【０１０６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物は、化膿性ブドウ球菌（Staphylococcus pyogenes）ＳＦ３７０株（これは、http://www.straininfo.net/strains/117800/browser;jsessionid=A07A638D6D2472EA2FEDBD3A1928F347.straininfo2から入手できる）から分離されたゲノムＤＮＡから直接作成される。ここで、Ｃａｓ９コード領域＋隣接制御領域そしてｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＰＣＲにより配列特異的ＤＮＡプライマーを使用して抽出され、適切なプラスミドクロニーングベクター中にクローニングされる。スペーサー配列に隣接する直接反復配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイの単位反復配列は同様にＰＣＲにより抽出され、スペーサー配列をクローニング部位により置換するように修飾されて、抗生物質耐性遺伝子などの選択されたＤＮＡ領域を標的とするように設計されたスペーサー配列の以後の導入を可能にする。そのようなスペーサー配列がクローニング部位中にうまくクローニングされている所望の組み換え体を有する細菌形質転換体についての陽性選択を、有することが有用である。付録３は、そのような陽性選択の例を与える。
【０１０７】
あるいは、組み換え体に対する陽性選択は欠如しているが、同等のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子標的構築は、例えばAddgene: http://www.addgene.org/42876/ から入手できるｐＣａｓ９プラスミドから得られる。このプラスミドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる切断のためのあるＤＮＡ配列を標的とすることが所望であるスペーサー配列を導入するために、Ｃａｓ９遺伝子とｔｒａｃｒＲＮＡとユニークなクローニング部位を有するＣＲＩＳＰＲアレイとをコードするＤＮＡ配列を有する。例示目的のために、この既存のｐＣａｓ９プラスミドの使用が以下に記載される。
【０１０８】
実施例１は、ベータラクタム抗生物質であるアンピシリンに対する耐性を付与するベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子を有する細菌が、ｂｌａ遺伝子を標的とする修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ構築物）の導入後に、アンピシリンに対して感受性となることを示す。
【０１０９】
材料と方法
Ａ．細菌株、プラスミド、及びファージ
１．細菌株：
ＤＨ５αは、（Ｆ−ｅｎｄＡ１  ｇｌｎＶ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｄｅｏＲ  ｎｕｐＧ  Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、  ｈｓｄＲ１７（ｒＫ-  ｍＫ+）、λ−）である。
ＪＭ１０９は、（ｅｎｄＡ１  ｇｌｎＶ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｌＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｃＡ１  ｍｃｒＢ+  Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）  ｅ１４−［Ｆ’ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡＢ+  ｌａｃＩq  ｌａｃＺΔＭ１５］ｈｓｄＲ１７（ｒK-ｍK+））である。
【０１１０】
２．プラスミド：
ｐＵＣ１８（Ｏｒｉ  ｐＭＢ１）；ｐＣａｓ９（Ｏｒｉ  ｐ１５Ａ、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座＋Ｃａｓ９遺伝子を有するｐＡＣＹＣ１８４ベースのベクター、ＣＭR）；ｐＣＲＩＳＰＲ（Ｏｒｉ  ｐＭＢ１、ＣＲＩＳＰＲ、ＫｎR）。
【０１１１】
３．ファージ：Ｍ１３ｍｐ１８
実施例１Ａにおいて、中コピープラスミドであるｐＢＲ３２２又は代替的に低コピープラスミドを有する１つの株である大腸菌ＤＨ５αにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ構築物は、プラスミドｐＣａｓ９中の裸のＤＮＡ形質転換により送達され、これはｐＣａｓ９：：抗ｂｌａと指定される。すでに存在するプラスミドｐＢＲ３２２すなわち低コピープラスミドは、細菌トランスポゾンＴｎ３から誘導されるベータラクタマーゼを発現する；ｐＢＲ３２２はまた、テトラサイクリンに対する耐性を有する。ｐＣａｓ９：：抗ｂｌａはクロラムフェニコールに対する耐性を有するため、ｐＣａｓ９：：抗ｂｌａを保持する細胞の選択は、増殖培地にクロラムフェニコールを添加することにより行われる。別の陰性対照実験において、ｐＢＲ３２２又は低コピープラスミドを有するＤＨ５ａ細胞は、ｐＣａｓ９（これは全ての点でｐＣａｓ９：：抗ｂｌａのようなプラスミドであるが、ｂｌａ遺伝子を標的とするスペーサー配列である抗ｂｌａが欠如している）を用いて形質転換される。抗ｂｌａが欠如したｐＣａｓ９は、ｂｌａ遺伝子を攻撃し不活性化することはできないであろうと予測される。再度、ｐＣａｓ９はクロラムフェニコールの存在により維持される。
【０１１２】
ベータラクタマーゼ活性は、セファロスポリンの発色誘導体であるニトロセフィンにより検出することができ、ベータラクタム環が加水分解されると、未変性ニトロセフィンの紫外線吸収は約５００ｎｍにシフトし、これが、ベータラクタマーゼの存在の視覚的検出を可能にする。
【０１１３】
クロラムフェニコールに対する耐性菌の総数はＮ0とし、ベータラクタマーゼ耐性菌の数をＮrとする。Ｎrの増加は、ニトロセフィンの存在下で赤いコロニーとして現れる。ベータラクタマーゼ感受性細菌の数をＮWとする。ＮWの増加は、ニトロセフィンの存在下で白色のコロニーとして現れる。すなわち、ｂｌａ遺伝子効率のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ媒介性不活性化は、白色コロニーの割合を測定することにより算出され、すなわちＮｗ／Ｎ０＝（Ｎ０−Ｎｒ）／Ｎ０。
【０１１４】
あるいは、アンピシリンを含むＬＢプレート上の細菌を直接刺激するベータラクタマーゼ活性が見られる。クロラムフェニコールに耐性の総細菌がＮoであり、アンピシリン耐性菌がＮaであると、ｂｌａ遺伝子効率のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ媒介性不活性化は、アンピシリン感受性のコロニーの割合、１−Ｎａ／ＮＯ、を測定することにより規定することができる。
【０１１５】
実施例１Ｂにおいて、常在プラスミドから、ベータラクタマーゼ遺伝子を発現する大腸菌株ＪＭ１０９にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ構築物を導入するために、Ｍ１３ファージの送達システムが使用される。
【０１１６】
Ｍ１３：：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａファージ組み換え体は以下のように調製される：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ構築物は、この構築物をＳａｌＩとＸｂａＩで消化することにより、ｐＣａｓ９：：抗ｂｌａから単離される。消化された断片のサイズは５７９６ｂｐである。この断片は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＩのＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）部位及びＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位でクローニングされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ構築物を含有するＭ１３ｍｐ１８の全サイズは１３０３５ｂｐである。このＭ１３組み換え体ファージＤＮＡは、Ｆ’プラスミドを有する細菌株である大腸菌ＪＭ１０９に形質転換され、この細菌から押出された組換えＭ１３ファージは精製され、ｐＢＲ３２２を有する大腸菌ＪＭ１０９にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物を導入するために使用される。陰性対照として、抗ｂｌａ領域を欠く同等のＭ１３：：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ファージ組み換え体が、ｐＣａｓ９から制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩにより調製され、そのアンプリコンは、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＩのＳａｌＩ及びＸｂａＩ部位にクローニングされる。
【０１１７】
Ｍ１３は細菌細胞に感染すると、これは細菌細胞を死滅させないが、ファージＤＮＡが細胞内で複製し、ファージ遺伝子を発現する。すなわちＭ１３：：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａファージ組換え体によるＭ１３ファージ感染は、陰性対照における抗ｂｌａ領域を欠くＭ１３：：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ファージ組換え体による感染とは異なり、ｂｌａ遺伝子の不活性化をもたらすはずである。Ｍ１３ファージ感染は細胞増殖の速度を遅らせるため、感染されると、細胞のローン（lawn）上で増殖させた細胞は、ゆっくり増殖する感染細胞の濁ったプラークを生じる。ニトロセフィンが増殖培地に添加されると、ｂｌａ遺伝子効率のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ媒介性不活性化の効力は、プラークを拾い上げコロニーとして増殖させてバックグランドローンを除去して、白色コロニー対赤色コロニーの割合を測定することにより計算される。またプラークは拾い上げ、アンピシリン有り／無しのＬＢプレート上に播いて、生じるアンピシリン感受性コロニーとアンピシリン耐性コロニーの比率をスコア化する。
【０１１８】
Ｂ．標的配列からのスペーサー配列の選択
標的からスペーサー配列を選択するために、BlueHeronのガイドＲＮＡ標的設計ツール（Guide RNA Target Design Tool）（https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp）を使用することができる。このプログラムは単純に、３’末端の適切なＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）とＧＣ含量を有する２０ｎｔのスペーサー配列を返す。これは、２次構造安定性や配列特異性を考慮しない。２次構造予測と特異性検索は手動で行われる。
【０１１９】
我々は、上記プログラムで得られた候補配列から実際のスペーサー配列を選択したが、これは以下の２つの基準を満たすはずである：１）ｃｒＲＮＡの安定な２次構造を形成する傾向が低い、２）宿主ゲノムＤＮＡ上に標的ＤＮＡが存在しない。基準２を満足するユニークな配列を見つけることは困難かも知れない。Jinek et al Science 337, 816 (2012) 中の図３Ｅからのミスマッチの標的データを考慮すると、基準２は、一致した配列は標的配列中の最大１２番目までのヌクレオチド位置（最初のヌクレオチド位置はＰＡＭ配列のすぐ隣から数えられる）まで、に緩和される。すなわち、標的配列の最初の１２量体プロトスペーサー配列が、３’末端のｃｒＲＮＡスペーサー配列の１２量体配列に完全に一致するが、残りの配列が一致しない場合、標的ｄｓＤＮＡは切断されないと見なされる。大腸菌Ｋ１２ゲノム配列に沿ったプロトスペーサー配列の特異性チェックは、ＢＬＡＳＴにより行われる。ｂｌａ配列は、対象配列の大腸菌株ＭＧ１６５５亜株（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/556503834?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=JUYB76FX014）に対して検索され、一致した各染色体配列は、標準的なＰＡＭ（ＮＧＧ）配列からのシード配列を数えるために、ｂｌａ配列に対してマッピングされる。２次構造はｍＦｏｌｄ（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）により予測することができ、そのＧができるだけ大きい配列、好ましくはｃｒＲＮＡスペーサー２次構造について陽性である配列を選択される。以下は、ｂｌａ配列から適切なスペーサー配列を選択するための方法である。
【表１】
2017513489.tif 000002
【０１２０】
表１．候補抗プロトスペーサー配列
ｂｌａ遺伝子からの全ての標的配列は、BlueHeronからのガイドＲＮＡ標的設計ツール（https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp）を使用して得られた。９８の標的候補配列が戻された。細菌のオフターゲット染色体性の短い同様の配列がｂｌａ遺伝子に対してマッピングし、次に標準的なＰＡＭ配列からのシード配列を数えた。そのシード配列数が８未満であり、そのギブシ（Gibbs）フリーエネルギーが比較的大きい配列を選択する。選択された標的配列の特性の要約は表１に示される。この表はまた、ｐＣａｓ９とｐＢＲ３２２上のオフターゲット配列のシード配列のヌクレオチド長さも示す。
【０１２１】
スペーサー配列のオリゴカセット配列
以下の４つのスペーサー配列は、宿主株としての大腸菌中のｐＢＲ３２２上のベータラクタマーゼを標的とするカセットを生成するｃｒＲＮＡであり、これは上記２つの基準を満足する。ベータラクタマーゼ遺伝子上で、ｃｒＲＮＡ  ＣＲ０５は、７６２番目の塩基Ｃと７６３番目の塩基Ｃとの間のホスホジエステル結合を切断し、ＣＦ３０は、１９８番目の塩基Ｇと１９９番目の塩基Ａとの間のホスホジエステル結合を切断し、ＣＲ７０は、ベータラクタマーゼ遺伝子上の、５７５番目の塩基Ｔと５７６番目の塩基Ａとの間のホスホジエステル結合を切断し、そしてＣＲ９０は、２２１番目の塩基Ｔと２２２番目の塩基Ａとの間のホスホジエステル結合を切断する。
【０１２２】
ベータラクタマーゼ遺伝子上の単一の標的のアダプター
【化１】
2017513489.tif 000003
【０１２３】
ベータラクタマーゼ遺伝子上の２重標的のアダプター
内部直接反復配列はイタリック体であり下線が引かれている。
【化２】
2017513489.tif 000004
【０１２４】
各オリゴの５’末端はリン酸化され、Ｂｓａｌ部位でのクローニングの準備ができる。
６塩基カッター制限エンドヌクレアーゼの部位に下線が引かれ、これらは組み換え体をスクリーニングするのに有用である。またプラスミドベクターの別のユニークなプライマーとともに組み換え体を、ＰＣＲによりスクリーニングするために、カセットオリゴの１つをプライマーとして使用することができる。
【０１２５】
付録１
ｐＣａｓ９プラスミド配列（配列番号１２５）
Ｃａｓ９遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ発現遺伝子座、及びｔｒａｃｒＲＮＡ（全て化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）から）
【化３】
2017513489.tif 000005
【化４】
2017513489.tif 000006
【化５】
2017513489.tif 000007
【０１２６】
ｔｒａｃｒＲＮＡの逆相補体は小文字であり、Ｃａｓ９コード配列（配列番号１２６）は四角で囲ってあり、ＣＲＩＳＰＲ中の直接反復配列は太字である。プロモーター配列は神経ネットワークアルゴリズム（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）により予測された。太字のイタリック体で強調表示されている２つのユニークな部位、ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）とＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）は、Ｍ１３ｍｐ１８へのクローニングのための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物を単離するために使用される。ｐＡＣＹＣ１８４骨格配列はイタリック体である。
【０１２７】
上記付録１の情報は、以下のように代替的に示される。
【０１２８】
ｐＣａｓ９プラスミド配列（配列番号１２５）
ｐＣａｓ９遺伝子、ＣＲＩＳＰＲ発現遺伝子座、及びｔｒａｃｒＲＮＡ（全て、化膿性連鎖球菌から）
【化６】
2017513489.tif 000008
【化７】
2017513489.tif 000009
【化８】
2017513489.tif 000010
【０１２９】
骨格ベクターｐＡＣＹＣ１８４配列はイタリック体で示され、配列位置は下線を引いたＥｃｏＲＩ部位のＧから番号が付いている。ｔｒａｃｒＲＮＡの逆相補体はイタリック体の太字であり１８４４〜１９２９に位置する。Ｃａｓ９開始コドンと終止コドンはイタリック体の太字の３文字であり、ヌクレオチド２２２５から始まり６３３１で終わり、続いてリーダー配列６３８９〜６４８３がイタリック体の太字で示され、第１、第２、及び第３の直接反復配列は、スペーサークローニング領域がその間に位置する第１と第２の直接反復配列の間で、下線を引いてある。
【０１３０】
スペーサークローニング領域は、それぞれ５’の４塩基突出スペーサークローニング部位５’−ＧＴＴＴ−３’と５’−ＴＴＴＴ−３’を作成するための、それぞれ太いイタリック体文字で示される２つの反転Ｂｓａｌ部位５’−ＧＴＴＴ−３’と５’−ＧＧＴＣＴＣ−３’を含有する。プロモーター配列は上記のように予測され、Ｃａｓ９のフォワードプライマー及びリーダー配列については小文字で示され、ｔｒａｃｒＲＮＡのリバースプライマーについてはイタリック体の小文字で示され、推定転写開始部位は太い大文字で示される。太いイタリック体の黒字で強調された２つのユニークな部位ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）とＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）は、Ｍ１３ｍｐ１８へのクローニングのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物を単離するために使用される。
【０１３１】
付録２
ｐＣａｓ９上のスペーサークローニング部位の修飾
ミニ遺伝子は、発現のために誘導された時、宿主細胞中のｔＲＮＡを枯渇させる特定のオリゴペプチドを与え、これがタンパク質合成の破壊につながるという事実を、このシステムは利用する（Tenson T, Vega-Herrera J, Kloss P, Guarneros G, Mankin AS. J. Bacteriol. 1999; 181:1617-1622）。この概念をスペーサー配列のクローニングに適用すると：スペーサー配列が挿入されると、これはミニ遺伝子を妨害し、オリゴペプチド発現が起きなくなり、従ってｔＲＮＡは枯渇せず、挿入体を有するプラスミドを保持する細菌のみが、誘導発現条件下で生存し、一方、挿入体の無いプラスミドを保持する細菌は増殖することができない。以下（配列番号１２９）は配列の構造である。この構造を構築するためには、細菌はｌａｃＩリプレッサーを構成的に発現して、ミニ遺伝子の転写のスイッチを切るべきである。転写を誘導するためにＩＰＴＧの存在下で組換え選択が行われるべきである。
【化９】
2017513489.tif 000011
【０１３２】
ＢｓａＩ認識部位は下線が引かれており、ｌａｃオペレーター３と１は太いイタリック体で示される。Ｔａｃプロモーターは太文字で示され、プロモーター配列中の−３５と−１０領域は下線を引いてある。シャイン‐ダルガルノ (Shine-Dalgarno)配列は四角で囲ってあり、最初のジペプチドは太字のＭとＲであり、続いて３つの連続終止コドンがイタリック体のＴＡＡで示される。イタリック体文字で示されるトリプトファン終止シグナル配列が利用される。
【０１３３】
付録３
ＣＲ９０スペーサー配列を使用する標的配列上の予測される切断部位
第１のプロセシングイベント
ｔｒａｃｒＲＮＡは下線付きの配列を使用して、大文字で示されるプレｃｒＲＮＡの直接反復配列領域にハイブリダイズする。細菌性ＲＮａｓｅＩＩＩは、記載された位置「|」で２本鎖ＲＮＡ領域を切断し、これは第１のプロセシングイベントである。
【化１０】
2017513489.tif 000012
【０１３４】
第１プロセシングイベント後の構造
【化１１】
2017513489.tif 000013
【０１３５】
第１のプロセシングイベントはまた以下のように説明することもできる：小文字で示されるｔｒａｃｒＲＮＡは、黒い太文字の大文字で示されるプレｃｒＲＮＡの直接反復配列領域にハイブリダイズする。細菌性ＲＮａｓｅＩＩＩは、矢印で示された位置で２本鎖ＲＮＡ領域を切断し、これは第１のプロセシングイベントである。第１及び第２の反復配列中の２２番目の塩基と２３番目の塩基の間のホスホジエステル結合が切断される。イタリック体のスペーサー配列ＣＲ９０は四角で囲まれている。
【化１２】
2017513489.tif 000014
【０１３６】
第２のプロセシングイベント
第２の切断点（＊）は、スペーサー配列の３’末端から約２０ｎｔ離れている。「第２のプロセシングイベントは、反復配列内で第１の切断から特定の距離で起きる点に留意すること。スペーサー配列が互いに同一ではないことを考察すると、スペーサー内の第２プロセシングイベントが配列依存性ではなく距離依存性である可能性が高い」（Nature. Mar 31, 2011;471 (7340):602-607中の補足図２の凡例を参照）。
【０１３７】
上記参考文献は第２のプロセシングイベントに関与する酵素及び／又は機構を具体的に特定していないが、Ｃａｓ９が第２の切断に関与している可能性が高い。スペーサー配列内の切断位置を考慮すると、全スペーサー配列は標的認識に寄与せず、その代わりに２０ｎｔのスペーサー配列のみがハイブリダイゼーションに使用される。
【化１３】
2017513489.tif 000015
【０１３８】
第２プロセシングイベントはまた以下のように説明することもできる。矢印で示される第２の切断点は、上記図中のスペーサー配列の３’末端から約２０ｎｔ離れている。
【０１３９】
Natureから引用した上記注釈、及び我々のコメントが適用される。
【０１４０】
イタリック体のスペーサー配列ＣＲ９０は四角で囲われている。
【化１４】
2017513489.tif 000016
【０１４１】
標的ＤＮＡ切断
ＣＲ９０を含有する標的ベータラクタマーゼＤＮＡ配列の部分が示される。ｃｒＲＮＡは標的領域の相補配列にハイブリダイズし、Ｃａｓ９切断点は点「・」で示され、ＰＡＭ配列タグは四角で囲われて示される。
【化１５】
2017513489.tif 000017
【０１４２】
標的ＤＮＡ切断の代替説明は以下に示される。ここで、ＣＲ９０プロトスペーサー配列を含有する標的ベータラクタマーゼＤＮＡ配列の部分は、黒い太字の小文字で示される。ｃｒＲＮＡはプロトスペーサー鎖の相補配列にハイブリダイズし、Ｃａｓ９切断点は点の矢印で示され、ＰＡＭ配列タグは下線を引いてある。
【化１６】
2017513489.tif 000018
【０１４３】
実施例２
以下の実験は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムが細菌中の抗生物質耐性を不活性化するのに使用できることを示す、いくつかの実証実験を記載する。これらは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムと、裸のＤＮＡ形質転換及びバクテリオファージ感染による送達のための抗生物質耐性遺伝子を標的とするスペーサー配列を有する誘導体とを送達するための、及びプラスミド接合による抗生物質耐性の拡散の阻害を証明するための、実施例に記載された遺伝的に適用可能なＤＮＡカセットの構築を記載する。
【０１４４】
ｐＮＢ１００の構築
ｐＮＢ１００は、適切な認識部位ＢｓａＩを用いて大腸菌中でＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを発現して、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中の２つの直接反復配列間の所望のスペーサー配列をクローニングするベクターである。このベクターの骨格はｐＡＣＹＣ１８４から誘導され、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座はベクターのＥｃｏＲＶに挿入される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座の３つの領域は、ＡＴＣＣから購入した化膿性ブドウ球菌ＳＦ３７０株のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅され、反応中にｐＡＣＹＣ１８４ベクターとともにギブソン（Gibson）アセンブリー（Gibson DG, et.al. Nature Methods 2009; 6: 343-345）により組み立てられる。最終構築物の配列はサンガー（Sanger）配列決定法により証明される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９活性は、細菌トランスポゾンＴｎ３とＴｎ１のベータラクタマーゼ遺伝子を標的とするスペーサー配列を有するｐＮＢ１００の誘導体であるｐＮＢ１０２を使用して確認された。
【０１４５】
３つの領域の増幅配列とゲル上のアンプリコンイメージ
以下の配列は、ＰＣＲにより増幅された３つの領域である。下線付きの配列はテンプレート特異的プライマー配列であり、太字はギブソンアセンブリーに使用される重複配列である。
【０１４６】
１．断片１（配列番号１４０）、ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９：アンプリコン長さ＝４７５８ｂｐ
化膿性連鎖球菌ＳＦ３７０のゲノムＤＮＡ上で、フォワードプライマーは８５４１７０〜８５４１９３であり、リバースプライマーは８５８８６７〜８５８８４８である。
【化１７】
2017513489.tif 000019
【化１８】
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【０１４７】
２．断片２（配列番号１４１）、リーダー及び第１直接反復配列：アンプリコン長さ＝２７６ｂｐ
化膿性連鎖球菌のゲノムＤＮＡ上で、フォワードプライマーは８６０６４８〜８６０６７１であり、リバースプライマーは８６０８６２〜８６０８０６である。
【化１９】
2017513489.tif 000021
【０１４８】
３．断片３（配列番号１４４）、第２直接反復配列：アンプリコン長さ＝４５２ｂｐ
化膿性連鎖球菌のゲノムＤＮＡ上で、フォワードプライマーは８６１２２１〜８６１２７６であり、リバースプライマーは８６１６１３〜８６１５９４である。ゲノムＤＮＡ上でＢｓａＩ認識配列を含有する８６１２４６〜８６１２５５の１０量体配列ＧＧＴＣＴＣＣＡＴＴ（配列番号１４２）を、ＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡ（配列番号１４３）で置換して、ＢｓａＩ認識配列を破壊し、このゲノム上のＣＲＩＳＰＲアレイ中の７番目を末端切断した直接反復配列を、このベクター中の標準的な２番目の直接反復配列配列に変換した。
【化２０】
2017513489.tif 000022
【０１４９】
これらの３つの断片を作成するためのＰＣＲ条件は以下の通りである：
【表２】
2017513489.tif 000023
【０１５０】
ＰＣＲアンプリコンを示す結果は図１１に提供される。
【０１５１】
３つのＰＣＲアンプリコンであるｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９、リーダー及び第１直接反復配列、第２直接反復配列からのｐＮＢ１００と、ＥｃｏＲＶで消化したｐＡＣＹＣ１８４との組み立て
我々は、NEBからのギブソンアセンブリーキット（E5510）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、上記３つのＰＣＲアンプリコンをｐＡＣＹＣ１８４とともに組み立てた。組み立て反応中の各断片の構成要素は以下の表に示される：
【表３】
2017513489.tif 000024
【０１５２】
２μｌのアセンブリー反応物をＤＨ５αコンピタント細胞（New England Biolabs社から購入）に形質転換し、次にクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）ＬＢプレート上で選択した。組み換え体をＰＣＲにより、初期の３つの断片を得るために使用した３つのプライマーセットを使用してスクリーニングした。３つの所望のアンプリコンを与えるプラスミドテンプレートを候補コロニーから単離し、配列解析を行った。
【０１５３】
ｐＮＢ１００の最終構築物の配列（配列番号１４５）
【化２１】
2017513489.tif 000025
【化２２】
2017513489.tif 000026
【化２３】
2017513489.tif 000027
【０１５４】
ヌクレオチドの総数は９５７８ｂｐである。骨格ベクターｐＡＣＹＣ１８４配列はイタリック体で示され、配列位置は、下線付きのＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）のＧから番号付けされる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、太文字で示された１８８９〜１９７４までのヌクレオチドに位置し、Ｃａｓ９開始コドン及び終止コドンは太い３字で示され、ヌクレオチド２２７０で開始し６３７６で終止し、そしてイタリック体の太字で示されているリーダー配列６４６２〜６５５６が続き、第１及び第２の直接反復配列は下線を引いてあり、その間にスペーサークローニング領域（３０量体）が配置されている。このスペーサークローニング領域は、５’の４塩基突出スペーサークローニング部位５’−ＧＴＴＴ−３’と５’−ＴＴＴＴ−３’を作成するための、それぞれイタリック体の太字で示される２つの反転ＢｓａＩ部位５’−ＧＡＧＡＣＣ−３’と５’−ＧＧＴＣＴＣ−３’とを含有し、またイタリック体太字で示される１つのユニークなＡａｔＩＩ（５’−ＧＡＣＧＴＣ−３’）部位を含有して、不完全なＢｓａＩの消化の際の自己連結を低下させる。サンガー配列決定法により検出され太字で示されている、それぞれ転移及び塩基変換Ｇ６５７３Ａ、Ａ６７７９Ｔに注意されたい。しかし、これらの点突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９活性に影響を与えず、これは後の節で示される。太いイタリック体文字で強調表示された２つのユニークな部位ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）及びＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）は、Ｍ１３ｍｐ１８へをクローニング用のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物を単離するために使用される。
【０１５５】
ｐＮＢ１００のプラスミド地図は図１２に示される。
【０１５６】
所望のスペーサー配列は、Ｂｓａｌ部位の間で時計回り方向でクローニングすることができる。このベクターは、１３９３〜８４８にｐ１５Ａに複製開始点を、２１９〜９１３７にｃａｔ（クロラムフェニコール耐性）遺伝子を含有する。括弧で示される各制限酵素の切断位置は、認識配列内の上の鎖上の５’切断部位の位置を指す。
【０１５７】
ｐＮＢ１０２の構築
ｐＮＢ１００はＢｓａｌとＡａｆＩＩで消化され、次にAgencourt ampureビーズを使用して精製された。上記した「材料と方法」欄中の「Ｂ．標的配列からのスペーサー配列の選択」欄での議論から、スペーサー配列ＣＲ３０が使用された。ＣＲ３０配列は以下の通りである：
【化２４】
2017513489.tif 000028
【０１５８】
この２本鎖ＤＮＡカセットを、１×Ｔ４リガーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（２５℃でｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＱＴＴ）及び５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で、９５℃で１分間変性させ、−１℃で毎分３０℃で再アニーリングして作成し、次にキナーゼ反応で各オリゴの５’末端にリン酸塩成分を付加した。アニーリングされたカセットは、Ｂｓａｌ消化によりｐＮＢ１０２上に作成された部位の両端に、５’突出４塩基適合性塩基を含有する。このＣＲ３０カセットをＴ４ ＤＮＡリガーゼによりｐＮＢ１００に連結し、ＤＨ５αコンピタント細胞（New England Biolabs社から購入した）に形質転換した。形質転換体をクロラムフェニコールＬＢプレート上で選択し、ＰＣＲによりＣＲ３０カセットの底部配列をリバースプライマーとして、ＣＦ１：５’−ａｃｇｔｔｇａｃｇａａｔｃｔｔｇｇａｇｃ（これは、組換えプラスミド上の６２０９〜６２２８領域をアニーリングして４０９ｂｐのＰＣＲアンプリコンを生成する）をフォワードプライマーとして用いてスクリーニングした。ＰＣＲ陽性クローンを配列決定してＣＲ３０スペーサー配列を確認し、この組換えクローンをｐＮＢ１０２と命名し、インビトロのベータラクタマーゼ遺伝子破壊実験に使用した。ＣＲ３０スペーサーはベータラクタマーゼ遺伝子のセンス鎖にアニーリングし、センス鎖とアンチセンス鎖上の１８８番目と１８９番目のヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を切断する。
【０１５９】
Ｍ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２の構築
ｐＮＢ１０２をユニークな制限部位ＳａｌＩとＸｂａＩを用いて消化して、６０４４ｂｐと３５２４ｂｐの２つの断片を作成した。断片長さは、制限認識部位内の上の鎖中の制限部位の５’末端から計算した。ＣＲＩＳＰＲ中のＣＲ３０スペーサー配列を有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含有する６０４４ｂｐ断片を３５２４ｂｐ断片から分離し、分取用１％アガロースゲルで精製した。Ｍ１３ｍｐ１８をＳａｌＩ−ＸｂａＩで消化し、次にAgencourt ampure精製により、反応物から６塩基のＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片を取り出した。これらの２つの精製断片を一緒にし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結し、ＤＨ５αＦ’ｌｑコンピタント細胞（New England Biolabs社から購入した）に形質転換した。形質転換細胞を、ファージ指標としての新たに増殖させたＤＨ５αＦ’ｌｑと、青−白色指標としてのＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌとともに、溶融した上部寒天を用いてＬＢプレートに播いた。ローンから収集した白色プラークを、ＰＣＲによりＣＲ３０スペーサー配列の存在についてスクリーニングした。得られた正しいファージ構築物を２回の単一プラーク単離により精製した。最終構築物の全配列長は１３２８８ｂｐである。このスペーサーＣＲ３０陽性組み換え体はＭ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２と命名され、Ｍ１３ファージ送達により媒介されるｂｌａ遺伝子不活性化実験に使用された。
【０１６０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物の細菌への送達
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドｐ１００と、細菌性伝達因子Ｔｎ１とＴｎ３によりコードされるベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子を標的とするスペーサー挿入体を有するその誘導体プラスミドｐＮＢ１０２とを構築した後、３つの送達法、（ｉ）プラスミド接合、（ｉｉ）プラスミドＤＮＡ形質転換、（ｉｉｉ）バクテリオファージ感染、を使用して、ｂｌａ−スペーサー挿入体を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物のコピーを有する細菌細胞が、ベータラクタム抗生物質アンピシリンの存在下で増殖できないであろうことの証明を試みた。
【０１６１】
抗生物質耐性遺伝子を含む標的遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを介して不活性化することができない本発明の態様である構築物もまた、ここで「ネメシス共生物（Nemesis symbiotics）」とも呼ばれる。
【０１６２】
プラスミド接合による「ネメシス共生活性 (Nemesis symbiotic activity)」（ＮＳＡ）アッセイ：予防実験
ここで、ネメシス共生物が、ドナー細胞からネメシス共生物を有する受容細胞への、抗生物質耐性遺伝子を有する接合プラスミドの接合伝達を阻害することにより、抗生物質耐性の拡散を防ぐことができることを示す。これを行うために我々は、ネメシス共生物を有する受容細胞を、接合プラスミドを有するドナー細胞及び抗生物質耐性をコードするｂｌａ遺伝子を有する複数コピー可動性プラスミドに接合した。接合が成功した場合、接合プラスミドは、自分自身を抗生物質耐性を有する可動性プラスミドとともに受容体へ移動するであろう。接合完了体は、受容体中の非可動性プラスミド上に存在するクロラムフェニコールと、ドナーから受け取ったアンピシリンとの両方に対する耐性について選択することができる。ネメシス共生活性の成功は、アンピシリン耐性の転移効率を低下させるであろう。
【０１６３】
受容細胞ＤＨ５α（Ｆ−  ｅｎｄＡ１  ｇｌｎＶ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｄｅｏＲ  ｎｕｐＧ  Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）、λ−）をNew England Biolabs社から購入し、プラスミドｐＮＢ１００又はｐＮＢ１０２又はｐＡＣＹＣ１８４を用いて形質転換し、ここで、プラスミドはクロラムフェニコール耐性をコードし、ｐＮＢ１００とｐＮＢ１０２の両方はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を有するが、ｐＮＢ１０２のみがベータラクタマーゼ遺伝子を標的とするスペーサー配列を有する。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４は、上記したようにｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０２の構築に使用される非可動性親プラスミドである。
【０１６４】
プラスミドｐＮＴ３を有するドナー株ＪＡ２００（Ｆ＋ｔｈｒ−１、ｌｅｕ−６、ＤＥ（ｔｒｐＥ）５、ｒｅｃＡ、ｌａｃＹ、ｔｈｉ、ｇａｌ、ｘｙｌ、ａｒａ、ｍｔｌ）も、Saka et al. DNA Research 12, 63-68 (2005) に記載されている。このプラスミドｐＮＴ３は、Ｔｎ１のｂｌａ遺伝子を有する可動性プラスミドである。
【０１６５】
ドナーＪＡ２００  ｐＮＴ３の単一コピーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するルリアブロス（ＬＢ）プレートから拾い上げ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有する１ｍｌのＬＢ培地で、３７℃で一晩振盪培養した。各受容体ＤＨ５α  ｐＮＢ１００及びＤＨ５α  ｐＮＢ１０２の単一コロニーを、３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢプレートから拾い上げ、３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを有する１ｍｌのＬＢ培地で、３７℃で一晩振盪培養した。細胞を洗浄して抗生物質を除去するために、５０μｌの細胞をエッペンドルフチューブ中の１ｍｌ  ＬＢに加え、１２５００ｒｐｍで６０秒間遠心分離した。細胞を５０μｌのＬＢ中に再懸濁した。接合を構成するために、ＪＡ２００  ｐＮＴ３をＬＢプレート上にスポットし、次にｐＮＢ１００及びｐＮＢ１０２を有する各ＤＨ５αの２μｌをこのスポットに加えた。別にドナーと受容体の２μｌのスポットを行った（接合していない）。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＬＢに再懸濁し、１００μｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールの両方を含むＬＢプレート（ＬＢＡｐＣｍ）に播いた。１０，０００倍（１０-4）希釈物１００μｌもＬＢプレート上に播き、３７℃で一晩インキュベートした。得られたコロニーを、以下の表に示されるように計数した。
【表４】
2017513489.tif 000029
【０１６６】
図１３の写真は、（Ａ）ＪＡ２００  ｐＮＴ３ｘＤＨ５α  ｐＮＢ１００（予測されるように、ネメシス共生活性が欠如する）；及び（Ｂ）ＪＡ２００  ｐＮＴ３ｘＤＨ５α  ｐＮＢ１０２（ネメシス共生活性を示す）間の接合物のプレーティングを示す。
【０１６７】
ＬＢプレートに播いた１０-4希釈物は、接合細胞懸濁液中で約５００コロニー、５×１０7細胞／ｍｌを示し、ＪＡ２００  ｐＮＴ３ｘＤＨ５α  ｐＮＢ１０２について、３．７×１０2細胞／ｍｌのみが、ＬＢ  Ａｐ１００Ｃｍ３５プレート上で増殖することができた。すなわち、細胞の半分が受容体／接合完了体であると仮定すると、３．７×１０2細胞／ｍｌ÷２．５×１０7は、ｐＮＢ１０２を有する受容体の接合効率１．２×５×１０-5を与える。
【０１６８】
この実験は、ｐＮＢ１００×ＪＡ２００  ｐＮＴ３に対してｐＮＢ１０２対を有するＤＨ５αとの接合において、ＣｍＲＡｐＲの顕著な低下を示した。
【０１６９】
相対的接合効率をより正確に測定するために、液体接合後、細胞を、全ての細胞を力価測定するためにＬＢプレートに播き、ドナー＋接合完了体を力価測定するためにＬＢ  Ａｐ１００プレートに播き、受容体＋接合完了体を力価測定するためにＬＢ  Ｃｍプレートに播き、そして接合完了体のみを力価測定するためにＬＢ  Ａｐ１００Ｃｍ３５プレートに播いた。
【０１７０】
液体接合のために、１０μｌのＪＡ２００  ｐＮＴ３の一晩培養物を１０μｌの受容体ＤＨ５α  ｐＮＢ１００又はＤＨ５α  ｐＮＢ１０２と混合し、２００μｌのＬＢを加え、チューブを３７℃で一晩インキュベートした。接合混合物をＬＢで１０-1、１０-3、１０-5希釈し、５０μｌの希釈物をＬＢ、ＬＢ  Ａｐ１００Ｃｍ３５、ＬＢ  Ａｐ１００、及びＬＢ  Ｃｍ３５プレート上に播き、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。以下の表は、得られた細胞力価を要約する。
【表５】
2017513489.tif 000030
【０１７１】
ＬＢ  ＣｍプラスＬＢ  Ａｐプレート上の細胞数は、ＬＢプレート上の細胞数と等しいはずである。ｐＮＢ１００について、１．４０×１０8（Ｃｍプレート）プラス２．６４×１０8（Ａｐプレート）＝４．０４×１０8であり、これは、ＬＢプレート上の４．１４×１０8に非常によく一致する。ｐＮＢ１０２について、１．７８×１０8（Ｃｍプレート）＋３．８２×１０8（Ａｐプレート）＝５．６×１０8であり、これは、ＬＢプレート上の５．１６×１０8に非常によく一致する。
【０１７２】
結論として、データは、液体培養で一晩接合後に、スペーサーを有するｐＮＢ１０２をスペーサーの無いｐＮＢ１００と比較すると、受容体当たりの接合効率が５，０００倍低下している。
【０１７３】
プラスミド形質転換によるＮＳＡアッセイ
この実験で我々は、ＤＮＡ形質転換による受容細胞へのネメシス共生物の導入が形質転換体中の抗生物質耐性を不活性化することを示す。
【０１７４】
テスター株を得るために、New England Biolabs社から購入したＤＨ５αコンピタント細胞をｐＢＲ３２２（Ｔｎ３から誘導されるｂｌａ遺伝子を有する）で形質転換し、ＬＢ  Ａｐ１００プレート上で選択した。次に、Sambrook and Russell in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001) に記載されたように、ＣａＣｌ２プロトコール２５（１．１１６）を使用して、得られたＤＨ５α  ｐＢＲ３２２株のコンピタント細胞を調製し、次にＣｍＲの選択のために、プラスミドｐＮＢ１００、ｐＮＢ１０２、及びｐＡＣＹＣ１８４を用いて形質転換した。次に形質転換体コロニーを、ＬＢ  Ｃｍ３５及びＬＢ  Ａｐ１００プレート上で拾い上げた。１次形質転換体のレプリカをようじでＬＢ  Ｃｍ３５及びＬＢ  Ａｐ１００プレート上に移し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１７５】
図１４に示される結果は、ｐＮＢ１００（ｂｌａ遺伝子標的スペーサー配列が欠如する）により形質転換されたＤＨ５α  ｐＢＲ３２２からようじで拾い上げた全てのコロニーが、アンピシリンに対して耐性のままであることを示す。これに対して、ｐＮＢ１０２により形質転換されたＤＨ５α  ｐＢＲ３２２からようじで拾い上げた全てのコロニーは、アンピシリン耐性を喪失し、ネメシス共生活性を示している。
【０１７６】
上記実験は、ＮＳＡがｂｌａ遺伝子を不活性化した１次形質転換体の割合の値を与えない。この問題に対処するために、１次形質転換体からの単一のコロニーを１ｍｌのＬＢに拾い上げ、ＬＢで１０-3希釈した。次に、１００μｌを以下のようにプレートに播き、結果をスコア化した。結果は、ｐＮＢ１０２でＤＨ５α  ｐＢＲ３２２を形質転換すると、１０-6未満の細胞がＡｐＲを保持することを示した。ネメシス共生活性は非常に効率的であった。
【０１７７】
バクテリオファージＭ１３感染によるＮＳＡアッセイ
この実験で我々は、バクテリオファージ感染による受容細胞へのネメシス共生物の導入が、形質転換体の抗生物質耐性を不活性化することを示す。我々は、雄性特異的繊維性ファージＭ１３を、ネメシス共生構築物の送達物質として選択した。Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲとｐＮＢ１０２のｂｌａ遺伝子標的スペーサー領域とを有するＭ１３誘導体Ｍ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２を使用して、プラスミドｐＮＴ３上でアンピシリン耐性を有するＦ＋株ＪＡ２００の感染によりネメシス共生物を送達した。この株の新鮮な培養物０．２ｍｌを３ｍｌのＬＢ上部寒天（０．７％寒天を有するルリアブロス）に加え、ＬＢプレート上に注いだ。次にＭ１３ｍｐ１８：：ＮＢ１０２（１０8ｐｆｕ／ｍｌ）の２μｌのファージストック及び対照としてＭ１３ｍｐ１８をローン上にスポットし、プレートを３７℃で８時間インキュベートした。プラークを１．５ｍｌのＬＢに拾い上げ、３７℃で一晩振盪培養した。アンピシリン耐性が欠如した対照株ＤＨ５αも、１．５ｍｌのＬＢに拾い上げた単一コロニーから一晩培養した。
【０１７８】
ベータラクタマーゼ活性のニトロセフィンアッセイを行った：
１ｍｌの細胞培養物をミクロフュージ中で１２，５００ｒｐｍで６０秒間遠心分離し、２μｌのストックニトロセフィン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌの上清に加え、ニトロセフィンの分解産物の吸光度を、ニトロセフィンの添加後数個の時点で分光光度計で４８２ｎｍで測定した。以下の表は結果を要約する。
【表６】
2017513489.tif 000031
【０１７９】
上記で報告された実験は、モデル生物である大腸菌において、Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ領域とベータラクタマーゼ遺伝子の標的領域に対する配列を有するスペーサー領域とを有するＤＮＡ構築物が、裸のＤＮＡ形質転換及びバクテリオファージ感染により送達された時、アンピシリン耐性を不活性化し、並びにプラスミド接合によるアンピシリン耐性の転移を防止するという実証実験を提供する。本発明のネメシス共生物が、病原性細菌に及び他の抗生物質耐性遺伝子に適用できることが明らかである。
【０１８０】
実施例３
実施例３の目的は、肺炎桿菌中の病原性細菌株中へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物の導入による抗生物質効力の復活という実証実験を拡張することである。カルバペネム系でさえ分解することができるベータラクタマーゼをコードする新しいｂｌａ遺伝子の獲得により、より新しいクラスのベータラクタム抗生物質であるカルバペネム系に対する耐性が腸内細菌科微生物に出現した。カルバペネム系に対する耐性を有する肺炎桿菌株であるＫＰＣは、院内感染症及び長期治療関連感染症における罹患率及び死亡率の重要な原因である。バクテリア血症又は肺感染症を有する患者の非常に高い死亡率（約３０〜７０％）が顕著である。
【０１８１】
実施例３は、ベータラクタム抗生物質であるアンピシリンに対する耐性を付与するベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子を有する肺炎桿菌が、ｂｌａ遺伝子を標的とする修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物の導入後に、アンピシリンに対して感受性になることを示す。実施例１又は実施例２で使用されたものと同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ構築物が使用され、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａを有する接合プラスミドを有するドナー株との接合により肺炎桿菌に送達される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ構築物を有するプラスミドを有する接合完了受容体である肺炎桿菌は、ドナー細胞及びプラスミドを受け取れなかった肺炎桿菌細胞に対して対向選択により、適切な培地で選択される。
【０１８２】
実施例１と実施例２について、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａ構築物の効力は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を有するプラスミド（すなわち、抗ｂｌａ領域が欠如する）を受け取った肺炎桿菌接合完了体株の陰性対照と比較して評価される。実施例１と実施例２に示されるようにベータラクタマーゼ活性は、ニトロセフィンにより白色コロニーと赤コロニーを計測することにより検出することができる。また実施例１と実施例２において、代替的にベータラクタマーゼ活性は、アンピシリン有り／無しのＬＢプレート上の細菌を刺激し、アンピシリン耐性コロニーに対するアンピシリン感受性コロニーの割合を測定することにより直接見られる。
【０１８３】
上記したものと同一の実験は、代わりにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａＣｂを使用して評価され、ここでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／抗ｂｌａＣｂ構築物は、カルバペネムを破壊することができるベータラクタマーゼをコードするｂｌａ遺伝子を標的とし、特定の肺炎桿菌株中に存在する領域である抗ｂｌａＣｂを有する。
【０１８４】
実施例４
実施例４は、治療構築物の送達経路を与える。これらの経路は全て、経口的に、局所的に、プロバイオティックとして送達するために、及び外科的灌漑流体及び創傷被覆材に使用するために、家畜やヒトへに適用される。
【０１８５】
経口的：活性成分としてアサシン構築体を含有するファージは、経口的に、安定化された治療調製物として投与することができ、抗生物質治療の前に投与されるか、又は抗生物質と補助剤との複合体の形態で投与することができる。活性成分としてアサシン構築体を含有する接合プラスミドは、これらのプラスミドを有する商業用細菌培養物として投与して、これらのプラスミドを腸内細菌叢に送り、こうして抗生物質耐性細菌病原体による将来の感染に対する予防的防御を生成することができる。
【０１８６】
局所的：活性成分としてアサシン構築体を含有するファージは、局所的に、安定化された医薬（軟膏剤、スプレー、粉末など）として投与することができ、抗生物質局所的医薬の前に投与されるか、又は抗生物質医薬との複合体の形態で投与することができる。活性成分としてアサシン構築体を含有する接合プラスミドの局所的投与は、これらのプラスミドを有する商業用細菌の安定化培養物を介して行って、これらのプラスミドを腸内細菌叢に送り、それにより抗生物質耐性細菌病原体による将来の感染に対する予防的防御を生成することができる。
【０１８７】
プロバイオティクスとして：活性成分としてアサシン構築体を含有するファージは、これらのプラスミドを有する商業的細菌（例えばラクトバシルス（Lactobacillus）属菌種）の安定化培養物としてプロバイオティクスとして投与することができ、これらのプラスミドを腸内細菌叢に送り、これにより抗生物質耐性細菌病原体による将来の感染に対する予防的防御を生成することができる。この１つの例は、病院、介護施設、学校、移植センターなどの抗生物質耐性細菌性病原体による感染のリスクが高い状況における、そのような調製物の患者へのプロバイオティクス的予防的投与である。別の例は、動物飼料を介した家畜へのそのような調製物の投与であって、こうして、抗生物質耐性菌の水平伝播が制限される。こうして家畜における本発明の使用は、ヒトにおける抗生物質耐性菌の（間接的）予防的治療のための１つの手段である。
【０１８８】
外科的灌漑液 (Surgical irrigation fluids)：活性成分としてアサシン構築体を含有するファージは、媒介物を殺菌するための外科的灌注液及び噴霧液に添加することができる。アサシン構築体を組み込んだ接合プラスミドを含む安定化された商業細菌培養物は、コーティングとして外科的ワイプ及び創傷包帯に加えることができる。
【０１８９】
実施例５
この例では構築物は、各ＲＮＡガイド分子がそれ自身のプロモーターにより転写される複数のＲＮＡガイド分子を、含むように設計される。
【０１９０】
図１６は、ＮＣＢＩ  肺炎桿菌についてＮＣＢＩ  ＡＲＤＢデータベース内で識別される１１７の異なるｂｌａ遺伝子を標的とする２０のガイドＲＮＡ分子をコードすることを我々が同定したスペーサー配列のセットを例示す。ＮＣＢＩ  ＡＲＤＢデータベースから得られた肺炎桿菌におけるベータラクタマーゼ遺伝子型、スペーサー配列、及び抗生物質耐性プロファイルが示される。
【０１９１】
ベータラクタマーゼ遺伝子配列は、キーワード「肺炎桿菌」でＡＲＤＢデータベースから収集された。重複配列を除去し、ウェブプログラムClustal Omegaを使用する複数の配列アラインメントのために、ユニークな配列が使用した。各クラスターから１つの標準的な配列が選択され、Jack LinのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡファインダーにより２０ｎｔのスペーサー配列が収集された。このスペーサー配列は、同じ分類に属する配列で見出されるプロトスペーサー配列の割合を最大にするように選択された。４列目に示された各スペーサー配列例は、３列目の遺伝子を破壊する能力を有する。
【０１９２】
この分析で使用されるベータラクタマーゼ遺伝子は以下の通りである：ＳＨＶ−ａ＝１、２、２ａ、５、５Ａ、１１、１２、１４、２６、２７、２８、３１、３３、３８、４３、４４、４８、５５、５６、６０、６１、６２、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８５、８９、９２、９８、９９、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１０９、ＣＴＸＭ−ｂ＝１、３、１０、１２、１５、２２、３２、５４、６０、６２、６８、ＣＴＸＭ−ｃ＝１３、１４、１６、１８、１９、２４、２６、ＣＴＸＭ−ｄ＝２、３５、５９、ＣＴＸＭ−ｅ＝２６、６３、ＴＥＭ−ｆ＝１、１Ｂ、３、ＥＳＢＬ、１３９、ＫＰＣ−ｇ＝１、２、３、４、ＯＫＰ−ｈ＝Ａ１１、Ａ１２、Ａ１６、Ａ１７、Ｂ１３、Ｂ−ＳＢ６１３、６、ＬＥＮ−ｉ＝２、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、ＧＥＳ−ｊ＝１、３、４、５、ＶＩＭ−ａ＝１、２、４、１２、１９、ＩＭＰ−ｂ＝４、８、ＣＭＹ−ａ＝２、４、２５、３１、３６、ＬＡＴ−ｂ＝１、２、ＣＭＹ−ｃ＝１、８Ｂ、１０、１９、ＦＯＸ−ｄ＝１、５、７、ＯＸＡ−ａ＝１、３０、４７、ＯＸＡ−２、ＯＸＡ−９、ＯＸＡ−ｂ＝１０、１７。
【０１９３】
ベータラクタム抗生物質は４つのクラス（ペネム系、セフェム系、カルバペネム系、及びモノバクタム系）に分類された。各クラスの１例として、１つの抗生物質名が図１６に記載されている。ベータラクタム環を開くことができるベータラクタマーゼは、Ｒで示される、例えばカルバペネムはＫＰＣにより不活性化される。カルバペネムに対して細菌を再敏感化するために、スペーサー配列５’−ＴＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＧ（配列番号４５）がスペーサーアレイ中に使用され、ＫＰＣ遺伝子を不活性化するはずである。ＣＭＹ−ａのスペーサー配列がＬＡＴ−ｂ切断に使用できることに注意されたい。
【０１９４】
同様に図１７は、肺炎桿菌についてＣＡＲＤデータベースにおいて同定される１５４の異なるｂｌａ遺伝子を標的とする１７のガイドＲＮＡ分子をコードするスペーサー配列のセットを示す。ＩＩＤＲＣＡＲＤデータベースから得られる、肺炎桿菌におけるベータラクタマーゼ遺伝子型、スペーサー配列、及び抗生物質耐性プロフィールが示されている。
【０１９５】
キーワード「肺炎桿菌」で収集した全てのベータラクタマーゼ遺伝子をフィルターにかけてベータラクタマーゼ遺伝子配列を収集し、これをウェブプログラムClustal Omegaを使用して複数配列アラインメントに供した。各クラスターから１つの標準的配列が選択され、ウェブプログラムJack LinのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡファインダーにより予測される２０ｎｔのスペーサー配列を収集した。このスペーサー配列は、同じ分類に属する配列で見出されるプロトスペーサー配列の割合を最大にするように選択された。４列目に示された各スペーサー配列例は、３列目の遺伝子を破壊する能力を有する。
【０１９６】
この分析で使用されるベータラクタマーゼ遺伝子は以下の通りである：ＳＨＶ−ａ＝１ａ、５、２（ａ）、１１、１８、２０、２１、２２、２３、２８、３１、３２、５２、５５、９８、９９、１００、１０６、１０７、１１０、１１１、１２１、１３４、１３６、１３７、１４０、１４３、１４４、１４７、１４８、１４９１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７２、１７３、１７８１７９、ＣＴＸＭ−ｂ＝１０、１２、１５、５２、５４、６２、７１、８０、ＣＴＸＭ−ｃ＝１９、８１、９９、１４７、ＴＥＭ−ｆ＝１、１６２、１８３、１９２、１９７、１９８、２０９、ＫＰＣ−ｇ＝３、４、６、７、８、１１、１２、１４、１５、１６、１７、ＯＫＰ−ｈ＝５、６、Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１６、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ１９、Ｂ２０、ＬＥＮ−ｉ＝５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、ＧＥＳ−ｊ＝１、３、４、ＶＩＭ−ａ＝４、２６、２７、２８、３３、３４、ＩＭＰ−ｂ＝３２、３８、ＮＤＭ−ｃ＝１、９、１０、ＡＣＴ−３、ＣＭＹ−ａ＝２５、３１、５６、８７、ＦＯＸ−ｄ＝８、９、ＯＸＡ−ａ＝１、３０、４７、ＯＸＡ−１、ＯＸＡ−ａ＝１８１、２０４、２４７、ＯＸＡ−９。
【０１９７】
ベータラクタム抗生物質は４つのクラス（ペネム系、セフェム系、カルバペネム系、及びモノバクタム系）に分類された。図１７において、各クラスの１例として１つの抗生物質名が記載されている。ベータラクタム環を開くことができるベータラクタマーゼはＲで示される、例えばカルバペネムはＫＰＣにより不活性化される。カルバペネムに対して細菌を再敏感化するために、スペーサー配列５’−ＴＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＧ（配列番号４５）をスペーサーアレイ中に使用され、ＫＰＣ遺伝子を不活性化するはずである。
【０１９８】
実施例６
この例では、ＤＳＢを残すのではなく、これを削除し再密封する修飾ＣａｓＤＮＡ結合ポリペプチドが作成される。
【０１９９】
上記したように、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９などのＣａｓ  ＤＮＡ結合性ポリペプチドにより引き起こされるＤＳＢは、標的とされるレプリコンに致死的であり、例えば、レプリコン中の抗生物質耐性遺伝子が不活性化の標的とされる場合、抗生物質の再敏感化ではなく、細胞死を引き起こすことがある。抗生物質による以後の死滅のために抗生物質に対して再敏感化するのではなく、即時的な細胞死は、標的構築物の送達に対して選択圧を増大させることがある。ＤＳＢの代わりに、欠失又は反転を導入することにより、遺伝子不活性化後の標的とされる配列の再封止を可能にするように、Ｃａｓ９遺伝子を修飾することができる。
【０２００】
Tsai et al. (2014)は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質と制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ１の野生型ヌクレアーゼドメインとの融合体を構築して、真核細胞中での切断の特異性を増加させた。Proudfoot et al. (2011)も同様に、ジンクフィンガーＤＮＡ認識ドメインをコンビナーゼの触媒ドメインに融合させて、指定されたＤＮＡ配列で部位特異的組換えをプログラムした。
【０２０１】
ここで我々は、ｄＣａｓ９に適切なリコンビナーゼドメインを追加して、標的遺伝子上のＣＲＩＳＰＲ媒介性ＲＮＡにガイドされた所望の位置における、ＤＳＢではなく組換え反応を触媒させる。
【０２０２】
図１８でＣａｓ９Ｒと呼ばれるＣａｓ９リゾルベース融合体は、Ｃａｓ９ドメイン：ガイドＲＮＡのスペーサー配列により決定される所望の部位に向けられている；融合したリゾルベースは組換え部位に配置される。２つの組換え部位ＡとＢ間に欠失を生成するには、リゾルベースはそれぞれの組換え部位で二量体化する必要がある。すなわち２つのＣａｓ９Ｒは、スペーサーＳ１〜Ｓ４によりコードされる配列により指定されるように、各換え部位Ａ１Ａ２とＢ１Ｂ２に近接して配置される必要がある。Ａ１対Ａ及びＢ１対Ｂ２の正しい方向は、実験的に決定する必要がある。
【０２０３】
図１９に示されるｇＲＮＡの方向は、ｄＣａｓ９融合ＦｏｋＩ（Tsai el al., 2014）の場合に既に証明されており、すなわち、組換え部位中の各プロトスペーサー配列のＰＡＭ配列は、完全長組換え部位の外側の境界に直接配置されている。従って我々は、アニーリングされたｇＲＮＡ極性の同じ構成を使用する。
【０２０４】
図１９及び図２０は、このＣａｓ９Ｒ融合リゾルベースがシナプスを分解し、親レプリコンＤＮＡが再循環される方法についての概略工程を示す。
【０２０５】
実施例７
以下の実験は、微生物病原体中で並びに微生物の非病原性メンバー中で見つかる多数の異なるベータラクタマーゼ遺伝子を不活性化するために、単一の構築物中でＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを使用することができることを示すために行われたいくつかの実証実験を記載する。
【０２０６】
これらの実験において、直接反復配列に隣接しており、以下の最大８つのベータラクタマーゼファミリーの耐性遺伝子（ＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、ＴＥＭ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＮＤＭ、ＯＸＡ）を標的とする、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムとスペーサー配列を有する誘導体とを有するプラスミドが構築される。
【０２０７】
これらの８つのファミリーのベータラクタマーゼ遺伝子のそれぞれについて、そのファミリーのいくつかの遺伝子メンバーを標的とする単一のスペーサーが設計される。これらは以下の通りである：ＳＨＶ−ａ＝１、１ａ、２、２ａ、５、５ａ、１１、１２、１４、１８、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、３１、３２、３３、３８、４３、４４、４８、５２、５５、５６、６０、６１、６２、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８５、８９、９２、９８、９９、１００、１０１、１０３、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１２１、１３６、１３４、１３７、１４０、１４３、１４４、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６８、１７２、１７３、１７８、１７９；ＣＴＸＭ−ｂ＝１、３、１０、１２、１５、１９、２２、３２、５２、５４、５９、６０、６２、６８、７１、８０、８１、９９、１４１、１４７；ＴＥＭ−ｃ＝１、１Ｂ、３、１３９、１６２、１８３、１９２、１９７、１９８、２０９；ＫＰＣ−ｄ＝１、２、３、４、６、７、８、１１、１２、１４、１５、１６、１７；ＶＩＭ−ｅ＝１、２、４、１９、２６、２７、３３、３４；ＩＭＰ−ｆ＝４、８、３２、３８；及びＮＤＭ−ｇ＝１、９、１０。
【０２０８】
図２１は、８つのベータラクタマーゼファミリーの耐性遺伝子（ＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、ＴＥＭ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＮＤＭ、ＯＸＡ−４８）を標的とするように設計された８つのスペーサー配列を示す。プラスミドの構築に使用したプライマー配列は、図２２の表に記載されている。
【０２０９】
一例において、直接反復配列に隣接し、細菌の４つのベータラクタマーゼファミリーの抗生物質耐性遺伝子（ＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、ＫＰＣ）を標的とする、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム及びスペーサー配列を有する誘導体を有する、一般的に適用可能なＤＮＡカセットである、ｐＮＢ１００（図１２）のプラスミド誘導体であるｐＮＢ１０４Ａ（図２３）が実施例に記載されており、１つのプロモーターから発現される。
【０２１０】
別の例において、直接反復配列に隣接し、細菌の４つのベータラクタマーゼファミリーの抗生物質耐性遺伝子（ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、ＣＴＸ−Ｍ）を標的とする、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム及びスペーサー配列を有する誘導体を有する、一般的に適用可能なＤＮＡカセットである、ｐＮＢ１００（図１２）のプラスミド誘導体であるｐＮＢ１０４Ｂ（図２４）が実施例に記載されており、１つのプロモーターから発現される。
【０２１１】
別の例において、直接反復配列に隣接し、細菌の４つのベータラクタマーゼファミリーの抗生物質耐性遺伝子（ＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、ＴＥＭ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＮＤＭ、ＯＸＡ−４８）を標的とする、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム及びスペーサー配列を有する誘導体を有する、一般的に適用可能なＤＮＡカセットである、ｐＮＢ１００（図１２）のプラスミド誘導体であるｐＮＢ１０８（図２５）が実施例に記載されており、１つのプロモーターから発現される。
【０２１２】
別の例において、スペーサー配列が２つの異なるプロモーターの選択から発現させることができるｐＮＢ１００のプラスミド誘導体が構築される。このプラスミドｐＮＢ２００（図２６）は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中の２つの直接反復配列間で、自身の直接反復配列に隣接する任意の所望のスペーサー配列をクローンするために、各プロモーターの下流に異なるユニークな制限部位を有する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムと、８つのベータラクタマーゼファミリーの耐性遺伝子（ＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、ＴＥＭ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＮＤＭ、及びＯＸＡ−４８）を標的とする、直接反復配列に隣接するスペーサー配列を有する誘導体とを有する、ｐＮＢ２００の誘導体が記載される。ｐＮＢ２０２（図２７）において、第２のプロモーターは、４つのベータラクタマーゼファミリーの抗生物質耐性遺伝子（ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、ＣＴＸ−Ｍ）を標的とする、直接反復配列に隣接するスペーサーを発現するために使用される。ｐＮＢ２０２から誘導されるｐＮＢ２０３（図２８）において、両方のプロモーターが使用され、第１のプロモーターは、ベータラクタマーゼファミリーの４つの抗生物質耐性遺伝子（ＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、ＫＰＣ）を標的とする、直接反復配列に隣接するスペーサーを発現し、第２のプロモーターは、ベータラクタマーゼファミリーの４つの抗生物質耐性遺伝子（ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、ＣＴＸ−Ｍ）を標的とする、直接反復配列に隣接するスペーサーを発現する。
【０２１３】
ｐＮＢ１０４Ａの構築
図２９Ａに示される４量体スペーサーコンカテマーａ＋ｂ＋ｃ＋ｄを、その制限部位がＡ１とＡ２に位置するＢｓａｌで消化し、ｐＮＢ１００上のＢｓａｌスペーサークローニング部位に連結した。ｐＮＢ１０４Ａ上の単一プロモーターとスペーサー領域（６２２１〜７００１）の構造は図２３に示される。４スペースコンカテマーは、単一プロモーターの近位端から遠位端へＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、及びＫＰＣを標的とするスペーサー配列を含む。
【０２１４】
ｐＮＢ１０４Ｂの構築
図２９Ａに示される４量体スペーサー配列コンカテマーｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈを、その制限部位がＢ１とＢ２に位置するＳａｐＩで消化し、ｐＮＢ２００上のＳａｐＩスペーサークローニング部位に連結した。ｐＮＢ２０２のスクリーニング中に、この構築物が発見され、配列決定により確認された。リーダー配列に隣接する直接反復配列間の削除イベントが発生し、直接反復配列が回復されてｐＮＢ１０４Ｂが得られた。ｐＮＢ１０４Ｂ上の単一プロモーター領域（６２２１〜６９８７）は図２４に示される。連結されたスペーサー（ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、及びＣＴＸ−Ｍを標的とする）は単一プロモーター下に位置する。
【０２１５】
ｐＮＢ１０８の構築
連結されたスペーサーアレイ配列ＡとＢは、サブクローン化ベクターｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ＿ＳｐａｃｅｒＡ及びｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ＿ＳｐａｃｅｒＢから、それぞれプライマーセットＮＢ０２６とＮＢ０２９、ＮＢ０３０とＮＢ０３３を用いて増幅した。スペーサーＡのアンプリコンの３’末端及びスペーサーＢのアンプリコンの５’末端には、ＫＰＣのスペーサー配列からの２０塩基の重複配列がある。これらの２つのアンプリコンをゲル精製し、プライマーの非存在下で、ＰＣＲに基づく対のサイクル伸長反応のために使用した。伸長された物質は、プライマーセットＮＢ０３７（５’−ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ−３’；配列番号１５０）とＮＢ０３８（５’−ＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ−３’；配列番号１５１）を用いて再増幅して、完全な８スペーサーアレイコンカテマーを生成した。この８スペーサーコンカテマーをｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、配列を確認した。
【０２１６】
このｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯサブクローンは、ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターから、完全な８スペーサーアレイコンカテマーをサブクローンとして取り出し、これは、ＢｓａＩの消化によりｐＮＢ１００上に作成される部位の両端に、５’突出性の４つの適合性塩基を含む。次にｐＮＢ１００をＢｓａｌで消化した後、アガロースゲル精製を行った。ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯから放出された８スペーサーコンカテマーカセットをＴ４  ＤＮＡリガーゼによりｐＮＢ１００に連結し、ＤＨ５αコンピテント細胞（New England Biolabs社から購入）に形質転換した。形質転換体をクロラムフェニコールＬＢプレート上で選択し、ＰＣＲによりリバースプライマーＮＢ０２１：５’−ＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＴ（配列番号１４９）及びフォワードプライマーＮＢ０２０：５’−  ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＡＡＣ（配列番号１４８）を用いてスクリーニングした（これらはそれぞれ、組換えプラスミド上の６３６８〜６３８５領域及び７２０３〜７２２５領域でアニーリングして、８５８ｂｐのＰＣＲアンプリコンを生成する）。ＰＣＲ陽性クローンを配列決定して８スペーサーコンカテマーの配列を確認し、この組換えクローンをｐＮＢ１０８として指定し、これを使用して、標的とされたベータラクタマーゼ遺伝子を有する細菌株へのＤＮＡ送達後の、このような遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性不活性化を証明した。ｐＮＢ１０８のプラスミド地図は図２５に示される。
【０２１７】
ｐＮＢ２００の構築
プラスミドｐＮＢ２００は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中の２つの直接反復配列間で、自身の直接反復配列に隣接する所望のスペーサー配列をクローン化するために、ｇＲＮＡ発現のための２つの同一のプロモーターと、各プロモーターの下流に異なるユニークな制限部位ＢｓａＩとＳａｐＩとを有する。ｐＮＢ２００中のＣＲＩＳＰＲアレイ遺伝子座の所望の構造は、プロモーター−リーダー−直接反復配列−スペーサークローニング領域−直接反復配列−テイルをタンデムに保有する２セットのカセットで構成される。フォワードプライマーＮＢ０１８はリーダー配列の５’末端でｐＮＢ１００中のプロモーターにアニーリングし、第１スペーサークローニング領域、第２直接反復配列、及びテイル配列を導入する。リバースプライマーＮＢ０１９はｐＮＢ１００中のリーダー配列の３’末端でアニーリングし、第３直接反復配列、第２スペーサークローニング領域を導入する。このアンプリコンはｐＮＢ１００上のＢｓａｌ部位間でクローン化されてｐＮＢ２００を与える。
【０２１８】
テンプレートとしてのｐＮＢ１００からのプライマーＮＢ０１８とＮＢ０１９により増幅された配列（配列番号１４６）
【化２５】
2017513489.tif 000032
【０２１９】
フォワードプライマーＮＢ０１８及びリバースプライマーＮＢ０１９は下線が引かれており、第一のＰＣＲサイクルの初期アニーリング部位は、それぞれ太字と太字のイタリック体太字で示されている。このアンプリコンは、ＢｂｖＩ（５’−ＧＣＡＧＣＮ８／Ｎ１２）で消化されて、４塩基適合性突出５’末端をＢｓａＩ消化ｐＮＢ１００に作成する。ＢｂｖＩ認識部位は太い小文字で示される。
【０２２０】
２重プロモーター−リーダーカセットを生成するためのＰＣＲ条件は以下の通りである：
【表７】
2017513489.tif 000033
【表８】
2017513489.tif 000034
【０２２１】
ｐＮＢ２００中の修飾ＣＲＩＳＰＲアレイの配列（配列番号１４７）
ｐＮＢ２００のヌクレオチドの総数は９９１９ｂｐである。修正領域中の配列は以下に示され、これはｐＮＢ１００中の小さいＢｓａｌ断片を置換している。第１及び第２のプロモーター配列は下線が引かれている。リーダー配列は太字である。直接反復配列はイタリック体であり、直接反復配列間のスペーサークローニング領域は、イタリック体で示され下線が引かれている。
【０２２２】
第１のスペーサーアレイクローニング領域は、ベクター上で５’の４塩基突出スペーサークローニング部位５’−ＧＴＴＴ−３’及び５’−ＴＴＴＴ−３’を作成するための、それぞれ太字のイタリック体で下線が引かれている５’−ＧＡＧＡＣＣ−３’と５’−ＧＧＴＣＴＣ−３’で示される２つの反転Ｂｓａｌ部位と、不完全なＢｓａｌ消化の場合の自己連結を低減するための、これも太字のイタリック体で下線が引かれている文字で示された１つのユニークなＡａｔＩＩ（５’−ＧＡＣＧＴＣ−３’）部位とを含有する。
【０２２３】
第２のスペーサークローニング領域は、ベクター上で５’の３塩基突出スペーサークローニング部位５’−ＧＴＴ−３’及び５’−ＴＴＴ−３’を作成するための、それぞれ太字のイタリック体で下線が引かれている５’−ＧＡＡＧＡＧＣ−３’と５’−ＧＣＴＣＴＴＣ−３’で示される２つの反転Ｓａｐｌ部位を含有する。
【化２６】
2017513489.tif 000035
【０２２４】
ｐＮＢ２００のプラスミド地図は図２６に示される。所望のスペーサーアレイ配列は、各プロモーターについて、それぞれ独立に２つのＢｓａＩ部位と２つのＳａｐＩ部位間で時計回りの方向にクローニングすることができる。
【０２２５】
ｐＮＢ２０２の構築
プラスミドｐＮＢ２０１はｐＮＢ２００の２重プロモーターを含み、そこからｐＮＢ２０１が得られるが、ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ、ＴＥＭ、及びＣＴＸ−Ｍベータラクタマーゼ遺伝子ファミリーを標的するスペーサーアレイは、第２のプロモーターから発現される。
【０２２６】
ｐＮＢ２０２を構築するために、ｐＮＢ２００をＢｓａＩで消化し、次にアガロースゲル精製した。連結されたスペーサーアレイ配列Ｂを、ＰＣＲに媒介された対のオリゴヌクレオチド連結により作製した。この４スペーサーコンカテマーレイＢは、Life Technologies社から購入したｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、配列を確認した。ＳａｐＩは、ＴＯＰＯベクターからサブクローンとしてスペーサーアレイ配列Ｂを切り出し、これはＳａｐＩ消化により、ｐＮＢ２００上で作成された部位の両端に５’突出性３塩基の適合性塩基を与える。この４スペーサーコンカテマーＢカセットはＴ４  ＤＮＡリガーゼによりｐＮＢ２００に連結され、ＤＨ５αコンピテント細胞（New England Biolabs社から購入）に形質転換された。この形質転換体をクロラムフェニコールＬＢプレート上で選択し、ＰＣＲによりリバースプライマーＮＢ０２１：５’−ＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＴ（配列番号１４９）及びフォワードプライマーＮＢ０２０：５’−ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＡＡＣ（配列番号１４８）（これらは、組換えプラスミド上のそれぞれ６３６８〜６３８５領域及び７３０７〜７３２９領域でアニーリングする）を用いてスクリーニングして、９６２ｂｐのＰＣＲアンプリコンを生成した。ＰＣＲ陽性クローンを配列決定しては４スペーサーコンカテマーＢ配列を確認し、この組換えクローンをｐＮＢ２０２として指定し、これを使用して、標的とされたベータラクタマーゼ遺伝子を有する細菌株へのＤＮＡ送達後の、そのような遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性不活性化を証明した。ｐＮＢ２０２のプラスミド地図は図２７に示される。
【０２２７】
ｐＮＢ２０３の構築
プラスミドｐＮＢ２０３はｐＮＢ２００の二重プロモーターを含有するが、各プロモーターは４つのスペーサーを発現する。第１のプロモーターはＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、及びＫＰＣを標的とするスペーサー配列を発現し、第２のプロモーターはＯＸＡ、ＳＨＶ、ＴＥＭ、及びＣＴＸ−Ｍベータラクタマーゼ遺伝子を発現する。プラスミドｐＮＢ２０２をＢｓａＩで消化し、次にアガロースゲル精製した。連結スペーサーアレイ配列Ａは、スペーサーコンカテマーＡを保有するｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターからＢｓａＩを用いて切り出した。ＢｓａＩはスペーサー領域を切り出し、これはＢｓａＩ消化によりｐＮＢ２０２に作成された部位の両端に５’突出性４塩基の適合性塩基を与える。この４スペーサーコンカテマーＢカセットをＴ４  ＤＮＡリガーゼによりｐＮＢ２０２に連結し、ＤＨ５αコンピテント細胞（New England Biolabs社から購入）に形質転換した。形質転換体をクロラムフェニコールＬＢプレート上で選択し、ＰＣＲによりリバースプライマーＮＢ０２１：５’−ＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＴ、及びフォワードプライマーＮＢ０２０：５’−ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＡＡＣ（これらは、組換えプラスミド上のそれぞれ６３６８〜６３８５領域及び７４７９〜７５０１領域でアニーリングする）を用いてスクリーニングして、１１３４ｂｐのＰＣＲアンプリコンを生成した。ＰＣＲ陽性クローンを配列決定して４スペーサーコンカテマーＡ及びＢ配列を確認し、この組換えクローンをｐＮＢ２０３として指定し、これを使用して、標的とされたベータラクタマーゼ遺伝子を有する細菌株へのＤＮＡ送達後の、そのような遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性不活性化を証明した。ｐＮＢ２０３のプラスミド地図は図２８に示される。
【０２２８】
連結されたスペーサーアレイの構造の概略図
スペーサー配列は、標的であるベータラクタマーゼ遺伝子ファミリーのカバー率を最大にするように決定した。各単位のオリゴは、各端部で適切なスペーサー配列に隣接する直接反復配列を含有する。連結反応は、対になったオリゴ間で行われ、すなわち、まず最近接部の単位オリゴが連結されて２つの単位長さのオリゴが生成され、次に２つの単位長のオリゴが連結されて、単位長さのオリゴなどを生成する。
【０２２９】
４量体及び８量体スペーサー構造の概略的な構造が図２９に示される。Ｓ：スペーサー、Ｒ：直接反復配列、ＡとＢは、ｐＮＢ１００中にクローニングするための、かつｐＮＢ２００の第１のプロモーターの下流にクローニングするための、連結適合性部位を作成するためのＢｓａＩ部位を含む。Ｃ及びＤは、ｐＮＢ２００の第２プロモーターの下流にクローニングするための連結適合性部位を作成するためのＳａｐＩ部位を含む。この例で、我々は、ＮＤＭを標的とするスペーサー配列Ｓ１、ＩＭＰを標的とするＳ２、ＶＩＭを標的とするＳ３、ＫＰＣを標的とするＳ４、ＯＸＡを標的とするＳ５、ＳＨＶを標的とするＳ６、ＴＥＭを標的とするＳ７、及びＣＴＸ−Ｍを標的とするＳ８を使用した。
【０２３０】
スペーサー連結反応
各オリゴは、最初と最後のオリゴ以外の最近接オリゴにアニーリングするために、３’及び５’末端に重複配列を有する。最初と最後のオリゴは、５’末端の第２の及び最後から２番目に重複配列を有する。４つのスペーサーを連結するために、４つのオリゴが合成される。すなわち、オリゴＮｏ．１は５’及び３’末端でスペーサー１及び２からなる。オリゴＮｏ．２は、３’及び５’末端でスペーサー２及び３の逆相補体を含む。オリゴＮｏ．３は、５’及び３’末端でスペーサー３及び４含む。オリゴＮｏ．４は、３’末端でスペーサー４の逆相補が含む。従って、オリゴＮｏ．２は、オリゴＮｏ．１とオリゴＮｏ．３を連結することができ、オリゴＮｏ．４は、オリゴＮｏ．３の３’末端にアニーリングする。オリゴＮｏ．１とオリゴＮｏ．２、オリゴＮｏ．３とオリゴＮｏ．４は、以下のＰＣＲ反応条件を用いて別のチューブに連結される。
【表９】
2017513489.tif 000036
【表１０】
2017513489.tif 000037
【０２３１】
この例では、ＮＢ０２６とＮＢ０２７、ＮＢ０２８とＮＢ０３４、ＮＢ０３５とＮＢ０３１、ＮＢ０３２とＮＢ０３６が連結される。各連結生成物Ａ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２をゲル精製し、精製したＡ１とＡ２、Ｂ１とＢ２の２量体生成物を使用して以下のＰＣＲ条件で第２の連結反応を設定した。
【表１１】
2017513489.tif 000038
【表１２】
2017513489.tif 000039
【０２３２】
これらの伸長生成物は、Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＮＢ０３７とＮＢ０３８により増幅された。最終的なアンプリコンをｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、コンカテマー配列を確認した。
【０２３３】
８スペーサー連結の場合、ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター上のスペーサーコンカテマーＡとスペーサーコンカテマーＢを、それぞれプライマー対ＮＢ０２６とＮＢ０２９、ＮＢ０３０とＮＢ０３３を用いて増幅し、アンプリコンをゲル精製した。精製されたスペーサーＡ及びＢは、以下のサイクル伸長反応で長いプライマーとして使用した。
【表１３】
2017513489.tif 000040
【表１４】
2017513489.tif 000041
【０２３４】
これらの伸長生成物は、Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＮＢ０３７とＮＢ０３８により増幅された。最終的なアンプリコンをｐＣＲブラントＩＩ  ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、コンカテマーの配列を確認した。
【０２３５】
細菌へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物の送達
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを介して、抗生物質耐性遺伝子を含む標的遺伝子を不活性化することができ、かつ本発明の態様である構築物はまた、本発明において「ネメシス共生物」と呼ばれる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミド誘導体であるｐＮＢ１０４Ａ、ｐＮＢ１０４Ｂ、ｐＮＢ２０２、及びｐＮＢ２０３の全ては、記載の選択されたベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子ファミリーを標的とするスペーサー挿入体を有し、従って単一プラスミド構築物がネメシス共生活性（ＮＳＡ）を有し、ベータラクタム抗生物質の全ての８つの異なるファミリーのベータラクタム抗生物質からの代表的な遺伝子を不活性化することができることを証明する例を提供する。プラスミドｐＮＢ１０４Ａ（図２３を参照）は、ＮＤＭ、ＩＭＰ、ＶＩＭ、及びＫＰＣファミリーの代表的な遺伝子メンバーを不活性化する能力について試験され、ｐＮＢ１０４Ｂ（図２４を参照）及びｐＮＢ２０２（図２７を参照）は、ＯＸＡ、ＳＨＶ、ＴＥＭ、及びＣＴＸ−Ｍファミリーの代表的な遺伝子メンバーを不活性化する能力について試験され、そしてｐＮＢ１０８（図２５を参照）及びｐＮＢ２０３（図２８を参照）は、ＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、ＴＥＭ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＮＤＭ、及びＯＸＡファミリーの代表的な遺伝子メンバーを不活性化する能力について試験される。
【０２３６】
プラスミド形質転換によるネメシス共生活性（ＮＳＡ）アッセイ
実施例２に記載のＮＳＡアッセイは、プラスミドｐＢＲ３２２上にＴＥＭ−３ベータラクタマーゼ遺伝子も有する大腸菌ＤＨ５α株の、プラスミドｐＮＢ１０２によるＤＮＡ形質転換は、形質転換体をアンピシリン感受性（ＡｐＳ）に変換することを示した。ここで、プラスミドｐＮＢ１０２は、クロラムフェニコールに対する耐性をコードし、ｐＮＢ１０２を有することになったＤＨ５α（ｐＢＲ３２２）形質転換体は、ＬＢ  Ｃｍプレート上で選択され、次にＡｐＳについてスクリーニングされた（図１４を参照）。ここで、プラスミドｐＮＢ１０２は、ＴＥＭ−３遺伝子を標的とするｇＲＮＡをコードするスペーサー配列を使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを発現する際に、ＴＥＭ−３遺伝子を不活性化した。陰性対照実験と比較して、ＤＨ５α（ｐＢＲ３２２）をＴＥＭ−３遺伝子を標的とするｇＲＮＡが欠如したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを有する親プラスミドｐＮＢ１００で形質転換した時、ＡｐＳへの変換は発生しなかった。
【０２３７】
例示の目的のために、ｐＢＲ３２２のプラスミド誘導体が構築される同等の実験が記載され、ここでＴＥＭ−３は、他の７つの異なるファミリーベータラクタム抗生物質（ＳＨＶ、ＣＴＸ−Ｍ、ＫＰＣ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＮＤＭ、ＯＸＡ）からの代表的な遺伝子により置換されている。このような遺伝子は、このような遺伝子を有する適切な細菌株から得られる。これは、同質遺伝子の遺伝的背景で、実施例２に記載の実証実験との直接比較を可能にする。
【０２３８】
これらの７つの異なるファミリーのベータラクタム系抗生物質からの代表的な遺伝子を有する大腸菌と肺炎桿菌株のセットは、Culture Collections, Public Health England, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, UKから購入した。これらは次のとおりである：ＮＣＴＣ１３３６８、ＳＨＶ−１８遺伝子を有する肺炎桿菌株；ＮＣＴＣ１３３５３、ＣＴＸ−Ｍ−１５遺伝子を有する大腸菌株；ＮＣＴＣ１３４３８、ＫＰＣ−３遺伝子を有する肺炎桿菌株；ＮＣＴＣ１３４４０、ＶＩＭ−１遺伝子を有する肺炎桿菌株；ＮＣＴＣ１３４７６、性状解析されていないＩＭＰ遺伝子を有する大腸菌株；ＮＣＴＣ１３４４３、ＮＤＭ−１遺伝子を有する肺炎桿菌株、及びＮＣＴＣ１３４４２、ＯＸＡ−４８遺伝子を有する肺炎桿菌株。全ての７つの遺伝子はまた、ペナムクラスの抗生物質を分解し不活性化することもできるベータラクタマーゼをコードする（図１６、１７を参照）。全ての株が試験され、予測されたように、ペナムクラスの抗生物質であるアンピシリンに耐性であることが判明した。
【０２３９】
ベータラクタマーゼのコード配列は、以下に示す適切なフォワードプライマーとリバースプライマーセットを用いて細胞から増幅される。
【化２７】
2017513489.tif 000042
【０２４０】
各フォワードプライマーは、ｐＢＲ３２２上のベータラクタマーゼプロモーターを復元するための１７の塩基配列を含み、各リバースプライマーは、５’−ＡＣＣＧの４塩基突出５’末端を作成するためのＢｓａＩ部位（ＮＤＭ−１、ＯＸＡ−４８、ＳＨＶ−１８、ＫＰＣ−３、ＩＭＰ−４、ＣＴＸ−Ｍ１５用）又はＦｏｋＩ部位（ＶＩＭ−１用）を含有する。Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼなどの高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて各ベータラクタマーゼ遺伝子を増幅した後、アンプリコンは、上記したようにリバースプライマー中に位置する適切な制限酵素で消化される。消化されたアンプリコンは、ＴＥＭ−３断片の除去後、プラスミドｐＢＲ３２２（New England Biolabs社から購入）上のＳｓｐＩとＢｓａＩ部位間をＴ４リガーゼを用いて連結する準備が整う。ＳｓｐＩは平滑末端を作成し、ＢｓａＩは５’−ＣＧＧＴ突出末端を作成する。制限消化後の各アンプリコンのコード配列の逆相補体は以下に示される。５’突出末端には下線を引いてあり、プロモーター配列の３’末端は太い小文字である。これらの７つの遺伝子のメチオニン開始コドンＡＴＧの逆相補体ＣＡＴ（これも太字である）は、７つの他のベータラクタマーゼのコード領域の正確な融合体をｐＢＲ３２２のＴＥＭ−３ベータラクタマーゼの翻訳シグナル配列にを与える。
【０２４１】
【化２８】
2017513489.tif 000043
【化２９】
2017513489.tif 000044
【０２４２】
次に、New England Biolabs社から購入したＤＨ５αコンピテント細胞をこれらの連結物で形質転換し、次にＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プレート上の所望の組換え体を選択した。
【０２４３】
これらの形質転換体からプラスミドＤＮＡ試料を単離し、ＤＮＡ配列分析を行って、７つの異なるベータラクタマーゼ遺伝子のそれぞれについて正しい配列が、プラスミドを与える各構築物中に存在することを確認する。
【０２４４】
このように誘導されたこれらのｐＢＲ３２２誘導体プラスミドは以下のように命名される：
ｉ．      ＳＨＶ−１８遺伝子を有するｐＮＢ０１０；
ｉｉ．    ＣＴＸ−Ｍ−１５遺伝子を有するｐＮＢ０１１；
ｉｉｉ．  ＫＰＣ−３遺伝子を有するｐＮＢ０１２；
ｉｖ．    ＶＩＭ−１遺伝子を有するｐＮＢ０１３；
ｖ．      ＩＭＰ遺伝子を有するｐＮＢ０１４；
ｖｉ．    ＮＤＭ−１遺伝子を有するｐＮＢ０１５；
ｖｉｉ．  ＯＸＡ−４８遺伝子を有するｐＮＢ０１６；これに加えて、上記したように
ｖｉｉｉ．ＴＥＭ−３遺伝子を有するｐＢＲ３２２。
【０２４５】
次に、それぞれがプラスミドｐＮＢ０１０−０１６上にこれらの７つのベータラクタマーゼ遺伝子の１つを有する７つの受容体大腸菌ＤＨ５α株を、プラスミドｐＮＢ１０４Ａ、ｐＮＢ１０４Ｂ、ｐＮＢ１０８、及びｐＮＢ２０３で形質転換し、次にクロラムフェニコール耐性について選択して、陰性対照ｐＮＢ１００とともに並びに陽性対照としてｐＮＢ１０２によるＤＨ５α（ｐＢＲ３２２）の形質転換とともに、これらのネメシス共生プラスミドの獲得について選択し、次に実施例２で説明したようにアンピシリン感受性への変換について試験した（図１４を参照）。
【０２４６】
ベータラクタマーゼ遺伝子ファミリーを標的とする複数のスペーサーを有する構築物の活性を試験するための、プラスミド接合による「ネメシス共生活性」（ＮＳＡ）アッセイ
実施例２に記載のプラスミド接合アッセイはまた、複数のベータラクタマーゼ遺伝子ファミリーを標的とするスペーサー配列を有する新規ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミド構築物のネメシス共生活性を試験するために、使用することもできる。このアッセイは、接合プラスミド上にベータラクタマーゼ遺伝子を有する、従ってアンピシリン耐性であるドナー細胞を、クロラムフェニコール耐性をコードする非可動性プラスミド上にネメシス共生物を有する受容細胞と接合することを含む。接合完了体は、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールの両方を含有するＬＢプレート上で選択される。良好なネメシス共生活性は、アンピシリン耐性遺伝子の移動効率の低下に見られる。
【０２４７】
ドナーとして、実施例２で使用したものと同じ株を使用した。Saka et al. (DNA Research 12, 63-68, 2005) により記載されているように、この株ＪＡ２００（Ｆ＋ｔｈｒ−１、ｌｅｕ−６、ＤＥ（ｔｒｐＥ）５、ｒｅｃＡ、ｌａｃＹ、ｔｈｉ、ｇａｌ、ｘｙｌ、ａｒａ、ｍｔｌ）はまたプラスミドｐＮＴ３を有する。プラスミドｐＮＴ３は、Ｔｎ１のＴＥＭ−１ベータラクタマーゼ遺伝子を有する可動性プラスミドである。ｐＮＴ３の接合、従ってアンピシリン耐性の移動は、共存Ｆ＋プラスミドの移動機能により行われる。
【０２４８】
他の可能性のあるドナーは、上記したように、Culture Collections, Public Health England から購入したベータラクタム系抗生物質のこれら７つの異なるファミリーからの、代表的な遺伝子を有する大腸菌と肺炎桿菌株のセットである。これらの株は、接合完了体の選択を可能にするためにクロラムフェニコール感受性であることが必要であり、ＬＢクロラムフェニコール３５μｇ／ｍｌプレート上の増殖について試験された。ＮＣＴＣ１３３６８、ＳＨＶ−１８遺伝子を有する肺炎桿菌株；ＮＣＴＣ１３４３８、ＫＰＣ−３遺伝子を有する肺炎桿菌株；ＮＣＴＣ１３４７６、性状解析されていないＩＭＰ遺伝子を有する大腸菌株；ＮＣＴＣ１３４４３、ＮＤＭ−１遺伝子を有する肺炎桿菌株、及びＮＣＴＣ１３４４２、ＯＸＡ−４８遺伝子を有する肺炎桿菌株は全て、クロラムフェニコールに耐性であることが判明したが、ＮＣＴＣ１３３５３、ＣＴＸ−Ｍ−１５遺伝子を有する大腸菌株、及びＮＣＴＣ１３４４０、ＶＩＭ−１遺伝子を有する肺炎桿菌株は、クロラムフェニコール感受性であることが見出され、受容体との接合試験に進められた。
【０２４９】
受容体として実施例２で使用された株は、新たなプラスミド構築物を試験するための対照として役立つ。すなわち、陰性対照は、ＤＨ５αである（Ｆ−  ｅｎｄＡ１  ｇｌｎＶ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｄｅｏＲ  ｎｕｐＧ  Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−  ｍＫ＋）、λであり、ここでプラスミドｐＮＢ１００はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９カセットをコードするが、抗生物質耐性遺伝子を標的とするスペーサー配列は持たない；そして、陽性対照は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９カセット並びにＴＥＭベータラクタマーゼファミリーを標的とするスペーサー配列をコードするプラスミドｐＮＢ１０２を有するＤＨ５αである。プラスミドｐＮＢ１０４Ａ、ｐＮＢ１０４Ｂ、及びｐＮＢ１０８を有するＤＨ５α株が試験される。これらのプラスミドもまた、スペーサー配列に加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９カセットをコードし、全て１つのプロモーターから、その近くから遠くへの順序で駆動される（ｐＮＢ１０４Ｂ）：ＮＤＭ−ＮＤＭ−ＩＭＰ−ＶＩＭ−ＫＰＣ；（ｐＮＢ１０４Ｂ）：ＯＸＡ−４８−ＳＨＶ−ＴＥＭ−ＣＴＸ−Ｍ  （ｐＮＢ１０８）：ＮＤＭ−ＩＭＰ−ＶＩＭ−ＫＰＣ−ＯＸＡ−４８−ＳＨＶ−ＴＥＭ−ＣＴＸ−Ｍ。
【０２５０】
接合を設定するために、ドナーのコロニーをＬＢ  Ａｐ１００（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）から拾い上げ、受容体をＬＢ  Ｃｍ３５（クロラムフェニコール３５μｇ／ｍｌ）プレートから拾い上げ、次に１００μｌの受容体を３５μｌのドナーと混合し、次にこの混合物５μｌをＬＢプレート上にスポットし、３７℃で５時間インキュベートして接合させた。
【０２５１】
図３０Ａは、ＴＥＭ−１ベータラクタマーゼを有し、図に指定（５）されるドナー（ＪＡ２００Ｆ＋  ｔｈｒ−１，ｌｅｕ−６，ＤＥ（ｔｒｐＥ）５，ｒｅｃＡ，ｌａｃＹ，ｔｈｉ，ｇａｌ，ｘｙｌ，ａｒａ，ｍｔｌ））を、受容体ＤＨ５α  ｐ１００（（−）と指定）、ＤＨ５α  ｐＮＢ１０２（（＋）と指定）と接合した結果を示す。ここで、各接合混合物の１白金耳を２２０μｌのＬＢに再懸濁し、細胞２００μｌをＬＢ  Ａｐ１００Ｃｍ３５プレート上に播いて接合完了体を選択した。実施例２から予測されるように、ＴＥＭ−１のドナーとｐＮＢ１００を有する受容体との交配は、効率的な接合と細胞のローン（図３０Ａ、左上、５−）を与え、ＴＥＭ−１のドナーと単一のＴＥＭスペーサーをコードするｐＮＢ１０２との交配は、ＴＥＭ−１遺伝子の伝達の強い阻害を示す（図３０Ａ、５＋、右上を参照、ほんの数個の孤立したコロニーのみが見られる）。ＴＥＭ−１遺伝子を有するドナーとｐＮＢ１０４を有する受容体との接合（図の底部のプレート、５Ｂを参照）もまた、ＴＥＭ−１遺伝子の伝達の強い阻害を示し、４つのスペーサーを有するｐＮＢ１０４Ｂ構築物ＯＸＡ−４８−ＳＨＶ−ＴＥＭ−ＣＴＸ−Ｍ４において、ＴＥＭスペーサーが活性であることを示す。
【０２５２】
図３０Ｂは、ＶＩＭ−１を有する肺炎桿菌株であるＮＣＴＣ１３４４０株（（２）と指定）、及びＣＴＸ−Ｍ−１５遺伝子を有する大腸菌株であるＮＣＴＣ１３３５３株（（４）と指定）の接合の結果を示す。再度、このような各接合混合物の１白金耳を２２０μｌのＬＢに再懸濁し、細胞２００μｌをＬＢ  Ａｐ１００Ｃｍ３５プレートに播いて接合完了体を選択した。この結果は、これらの株がドナーとして作用し、ＶＩＭ−１遺伝子とＣＴＸ−Ｍ−１５遺伝子がそれぞれ、ネメシス共生活性を欠くＤＨ５αｐ  ＮＢ１００陰性対照受容体に伝達することを示す（それぞれ、図３０Ｂの左上と右上を参照）。しかしＶＩＭ−１遺伝子とＣＴＸ−Ｍ−１５遺伝子の伝達は、これらの遺伝子を標的とするスペーサーを有する受容体ｐＮＢ１０４ＡとｐＮＢ１０４Ｂとの接合で、強く阻害されることが判明した（それぞれ、プレート２Ａ及び４Ｂ、左下と右下を参照）。
【０２５３】
別の実験において、プラスミドｐＮＢ１０８中に全ての８つのスペーサー配列を有する受容体におけるネメシス共生活性を試験するために、同様の接合を行った。ここで、細胞を接合混合物から直接拾い上げ、ＬＢＡｐ１００Ｃｍ３５プレート上に画線した。図３０Ｃプレート（左上）は再度、ドナー２、４、及び５とｐＮＢ１００を有する受容体との良好な接合を示す（図３０Ｃの２−、４−、及び５−を参照）。しかし全ての場合に、ｐＮＢ１０８を有する受容体との接合（図３０Ｃの右上のプレート、２／８、４／８、及び５／８を参照）は、アンピシリン耐性遺伝子の伝達の強い阻害を与える。このアッセイにおいて陽性対照と比較すると、５＋を有する下のプレート（図３０Ｃを参照）は、ｐＮＢ１０２を有する受容体へのＴＥＭ−１アンピシリン耐性遺伝子の伝達の強い阻害を示す。
【０２５４】
上記報告した実験は、モデル微生物である大腸菌において、Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ領域と、ベータラクタマーゼ遺伝子の標的領域に対する配列を有するスペーサー領域とを有するＤＮＡ構築物が、裸のＤＮＡ形質転換及びバクテリオファージ感染により送達される時、アンピシリン耐性を不活性化し、並びにプラスミド接合によりアンピシリン耐性の伝達を妨害することができることを示す証明を提供する。本発明のネメシス共生物が病原性細菌及び他の抗生物質耐性遺伝子に適用できることは明らかである。
【０２５５】
本発明を、好適な実施態様又は例示的実施態様を参照して説明したが、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修飾及び変更が可能であると、及びそのような修飾が明確に考慮できることを認識するであろう。本明細書で開示された具体例及び添付の特許請求の範囲で開示されたた具体例に関しては、何の制限も意図されても暗示されてもいない。
【０２５６】
本明細書で引用した全ての文献は、参照のためその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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