(57)【要約】本発明はＴ細胞エフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比を増加するための方法を対象とする。本発明は、被験者にＬＬＯ断片および腫瘍関連抗原を含む融合ペプチドを含む組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、腫瘍を治療する、腫瘍に対して保護する、および腫瘍に対する免疫応答を誘発する方法をさらに対象とする。本発明は、有益な免疫応答を引き起こすために、調節性Ｔ細胞の免疫抑制効果をどのようにして克服することができるかを詳細に示す、効果的かつ安全な免疫療法を提供する。この免疫療法は、内在性ｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡの突然変異を含み、かつエピソームとして発現するＮ末端切断ＬＬＯを含む弱毒化組み換え型リステリアの使用を採用している。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍またはガンを有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出す方法であって、前記被験者に組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、前記核酸分子が組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームと代謝をコードする第２のオープンリーディングフレームとを含み、前記組み換え型ポリペプチドは異種抗原またはその断片に融合した切断ＬＬＯタンパク質を含み、前記リステリアは内在性アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）、およびａｃｔＡ遺伝子内の突然変異を含み、かつ前記Ｔ細胞応答はＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比の増加を含み、これによって前記被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出す、方法。
【請求項２】
前記腫瘍関連抗原がヒトパピローマウイルスＥ７抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記切断ＬＬＯタンパク質がＮ末端ＬＬＯである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＬＬＯが配列番号：２で示される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記異種抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍関連抗原が血管形成抗原である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リステリアが抗生剤耐性遺伝子を欠いている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換え型核酸が前記リステリア内のプラスミド内にある、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記プラスミドがエピソーム性プラスミドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プラスミドがマルチコピープラスミドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プラスミドが組み込みプラスミドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記代謝酵素がアミノ酸代謝酵素である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記代謝酵素がＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素またはアラニンラセマーゼ酵素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験者にアジュバントを投与することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡａ、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、または細菌毒素を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み換え型リステリアの前記投与の前またはその後に免疫チェックポイントタンパク質阻害剤を同時投与することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫チェックポイントタンパク質が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、または細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗腫瘍免疫応答を強化するサイトカインを同時投与することをさらに含む、請求項１〜１５または請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サイトカインが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／ＩＦＮ−β）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が末梢リンパ器官内での前記Ｔエフェクター細胞の増殖を誘発し、前記腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在の強化をもたらす、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔエフェクター細胞の増殖が前記Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに前記末梢内および腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加をもたらす、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔエフェクター細胞がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−およびＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｔエフェクター細胞がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記調節性Ｔ細胞がＣＤ４＋ＦｏｘＰ＋Ｔ細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
被験者の脾臓内のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加するための方法であって、前記方法は切断ＬＬＯタンパク質をコードする組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含み、前記リステリアは前記内在性アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）、およびａｃｔＡ遺伝子内での突然変異を含み、前記Ｔ細胞応答がＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比の増加を含む、方法。
【請求項２６】
前記腫瘍関連抗原がヒトパピローマウイルスＥ７抗原である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記切断ＬＬＯタンパク質がＮ末端ＬＬＯである、請求項２５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＬＬＯが配列番号：２で示される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記リステリアが抗生剤耐性遺伝子を欠いている、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸が前記リステリア内のプラスミド内にある、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記プラスミドがエピソーム性プラスミドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プラスミドがマルチコピープラスミドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プラスミドが組み込みプラスミドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験者にアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、または細菌毒素を含む、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組み換え型リステリアの前記投与の前またはその後に免疫チェックポイントタンパク質阻害剤を同時投与することをさらに含む、請求項２５〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫チェックポイントタンパク質が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、または細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗腫瘍免疫応答を強化するサイトカインを同時投与することをさらに含む、請求項２５〜３５または請求項２５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サイトカインが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／ＩＦＮ−β）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が末梢リンパ器官内で前記Ｔエフェクター細胞の増殖を誘発する、請求項２５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｔエフェクター細胞の増殖が前記Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、前記末梢でのＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加をもたらす、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｔエフェクター細胞がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−およびＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｔエフェクター細胞がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記調節性Ｔ細胞がＣＤ４＋ＦｏｘＰ＋Ｔ細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍またはガンを有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すことが前記被験者内の前記腫瘍またはガンを治療することを可能にする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍またはガンを有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すことが前記被験者内の前記腫瘍またはガンを治療することを可能にする、請求項２５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の関与
本発明は部分的に共同研究開発契約（ＣＲＡＤＡ）＃０２６４８によって支援されている。米国政府は本発明に関してある特定の利益を有する場合がある。
【０００２】
本発明はＴ細胞エフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比を増加するための方法を対象とする。本発明は、被験者にＬＬＯ断片および腫瘍関連抗原を含む融合ペプチドを含む組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、腫瘍を治療する、腫瘍に対して保護する、および腫瘍に対する免疫応答を誘発する方法をさらに対象とする。
【背景技術】
【０００３】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、リステリア症を発生させるグラム陽性の通性細胞内病原体である。宿主細胞に侵入すると、Ｌｍは、血管膜を溶解し、細胞質の中に入ることを可能にして、そこで複製してアクチン重合化タンパク質（ＡｃｔＡ）の移動度に基づいて隣接する細胞に拡散する孔形成タンパク質、ステリオシンＯ（ＬＬＯ）の生成を通してファゴリソソームから脱出しうる。細胞質内では、Ｌｍ−分泌タンパク質はプロテアソームによって分解され、そして小胞体内のＭＨＣクラスＩ分子と関連するペプチドへと処理される。この特有の特徴により、これは大変魅力的なガンワクチンベクターとされ、この中で腫瘍抗原は腫瘍に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化するためにＭＨＣクラスＩ分子を提示されうる。
【０００４】
予防的なＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ感染からおよび子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）の発生からの保護に効果的であることが示されているが、進行子宮頸ガン患者のための治療ワクチンは、未だ開発中である。切断ＬＬＯおよびＥ７抗原の全長から成る融合タンパク質を生成および分泌する、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン、弱毒生Ｌｍベースのワクチンの構築が進歩してきている。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７が、マウス内で定着ＨＰＶ不死化ＴＣ−１腫瘍の完全な退行を誘発できたことが示された。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって誘発された抗腫瘍活性は、これらの枯渇が腫瘍成長の阻害を完全に無効にするので、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって決定的に媒介され、そしてＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンが調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を減少させることも観察された。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋（または最初に発見されたときは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）Ｔ細胞として識別されるＴｒｅｇは、免疫性を抑制する小集団である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７誘発性のＴｒｅｇの減少が、その抗腫瘍効果に寄与しうることが考えられるが、どのようにしてＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンがＴｒｅｇの減少を誘発するのかは未だ不明確なままである。Ｔｒｅｇを操作する新規治療戦略を開発することによってその抗腫瘍有効性をさらに改善するために、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７がＴｒｅｇを減少させる機構を特定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、有益な免疫応答を引き起こすために、調節性Ｔ細胞の免疫抑制効果をどのようにして克服することができるかを詳細に示す、効果的かつ安全な免疫療法を提供する。この免疫療法は、内在性ｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡの突然変異を含み、かつエピソームとして発現するＮ末端切断ＬＬＯを含む弱毒化組み換え型リステリアの使用を採用している。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、前記腫瘍を有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出す方法であって、前記被験者に組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、前記核酸分子は組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームと代謝をコードする第２のオープンリーディングフレームとを含み、前記組み換え型ポリペプチドは異種抗原またはその断片に融合した切断ＬＬＯタンパク質を含み、前記リステリアは前記内在性アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）、およびａｃｔＡ遺伝子内に突然変異を含み、前記Ｔ細胞応答には、前記被験者の脾臓内でのＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比の増加を含む、方法に関する。別の実施形態では、腫瘍またはガンを有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すことが前記被験者内の前記腫瘍またはガンを治療することを可能にする。別の実施形態では、腫瘍またはガンを有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すことが前記被験者内の転移の定着を防止する。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、被験者の脾臓内のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加するための方法であって、この方法は切断ＬＬＯタンパク質をコードする組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含み、前記リステリアは内在性アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）、およびａｃｔＡ遺伝子内での突然変異を含み、前記Ｔ細胞応答がＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比の増加を含む、方法に関する。
【０００９】
以下の詳細な記述例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が明らかとなるので、この詳細な説明および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示としてのみ与えられることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
以下の図面は本明細書の一部分を形成し、かつ本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示した具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つ以上を参照することによって本発明をより良好に理解することができる。本特許ファイルまたは本特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。本特許または本特許出願のカラー図面（複数可）付きの出版物の複製物は、要求に応じ、かつ必要な料金の支払いに応じて米国特許商標局から提供される。
【００１１】
【図１】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｔｒｅｇ頻度の減少を伴うＴＣ−１腫瘍の退行を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して、週に２回腫瘍を測定した。次の式によって腫瘍体積を測定した：長さ×幅×幅／２。腫瘍直径がおよそ２．０ｃｍに達したとき、または２４日目にフローサイトメトリー解析のためにマウスを屠殺した。（Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（Ｃ）生存パーセンテージ。（Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（Ｅ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｆ）脾臓内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（Ｇ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｈ）腫瘍内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは３つの独立した実験（ＡおよびＢ）からのものであり、そしてこれは３つの独立した実験の代表である（Ｃ〜Ｈ）。
【図２】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は定着ＴＣ−１腫瘍の退行を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して、週に２回腫瘍を測定した。次の式によって腫瘍体積を測定した：長さ×幅×幅／２。（Ａ）ＰＢＳ。（Ｂ）ＬｍｄｄＡ。（Ｃ）Ｌｍ−Ｅ７。（Ｄ）ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７。データは、３つの独立した実験からのものである。
【図３】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７は、類似のＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、または０．５ＬＤ５０野生型Ｌｍ１０４０３Ｓ（１×１０４ＣＦＵ）で、腹腔内免疫した。マウスを２４日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。Ａ．脾臓および腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（ＢおよびＣ）脾臓（Ｂ）および腫瘍（Ｃ）内のＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（ＤおよびＥ）マウスの脾臓当たり（Ｄ）および腫瘍細胞１００万個当たり（Ｅ）のＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数。ｎ＝３〜１０。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図４】Ｌ．モノサイトゲネスは、Ｔｒｅｇ頻度の減少を誘発するのに十分である。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ（１×１０８ＣＦＵ）または０．５ＬＤ５０の野生型Ｌｍ１０４０３Ｓ（１×１０４ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。マウスを２４日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（Ｂ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｃ）脾臓内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（Ｄ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｅ）腫瘍内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図５】Ｌ．モノサイトゲネスは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を優先的に誘発することによってＴｒｅｇ頻度を減少させる。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、または０．５ＬＤ５０野生型Ｌｍ１０４０３Ｓ（１×１０４ＣＦＵ）で、腹腔内免疫した。マウスを２４日目に屠殺し、腫瘍から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。データは平均±標準誤差として提示されている。ｎ＝３〜１０。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図６】ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＬ．モノサイトゲネス誘発性増殖はＬＬＯに依存し、かつＬＬＯによって媒介される。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ＰＢＳ（１００μｌ）中、１×１０４ＣＦＵの１０４０３Ｓ、Δｈｌｙ、Δｈｌｙ：：ｐｆｏ、またはｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）を、腹腔内注射した。マウスを注射後７日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（Ａ）脾臓内のＴ細胞数。（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｄ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。＊Ｐ＜０．０５（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図７】ＬｍｄｄＡ内の切断ＬＬＯのエピソームの発現はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のより高いレベルまでの増殖を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ＰＢＳ（１００μｌ）中、１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡまたはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯを、腹腔内注射した。マウスを注射後７日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（Ａ）脾臓内のＴ細胞数。（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｄ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（Ｅ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（Ｆ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｇ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞の蛍光強度。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図８】Ｌｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合せは、定着ＴＣ−１腫瘍の退行を誘発する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７（５×１０５ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（５×１０７ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７プラス０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯで腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、そして腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。２４日目にマウスの生存を観察するかまたは屠殺し、脾臓から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。（Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（Ｃ）生存パーセンテージ。（Ｄ）脾臓内のＴ細胞の数。（Ｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（Ｆ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｇ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図９】Ｔｒｅｇの養子移植は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の定着ＴＣ−１腫瘍に対する抗腫瘍有効性を損なう。Ｃ５７ＢＬ６マウス（生後１１週）に、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍チャレンジ後９日目にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（１×１０６細胞／各）を静注した。マウスを、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中の０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、そして腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。マウスを注射後２４日目に屠殺し、脾臓から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。（Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（Ｄ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｅ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（Ｆ）脾臓内のＴ細胞の数。（Ｇ）腫瘍細胞１００万個当たりのＴ細胞の数。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図１０】ＬｍｄｄＡはＬｍ−Ｅ７抗腫瘍活性を増強しない。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７（５×１０５ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ（５×１０７ＣＦＵ）、または０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７プラス０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡで腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を測定し、腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。２４日目の腫瘍体積を示す。データは平均±標準誤差として提示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一態様では、本発明は、組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型核酸を含む組み換え型リステリアワクチンベクターを提供し、組み換え型ポリペプチドは異種抗原に融合した非溶血性Ｎ末端リステリオリシン（ＬＬＯ）を含み、前記リステリアは内在性ｄａｌ／ｄａｔおよびａｃｔＡ遺伝子内の突然変異を含み、前記Ｔ細胞応答は前記被験者の脾臓内のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比の増加を含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、前記腫瘍を有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出す方法であって、前記被験者に組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、前記核酸分子は組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームと代謝をコードする第２のオープンリーディングフレームとを含み、前記組み換え型ポリペプチドは異種抗原またはその断片に融合した切断ＬＬＯタンパク質を含み、前記リステリアは前記内在性アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）、およびａｃｔＡ遺伝子内に突然変異を含み、前記Ｔ細胞応答には、前記被験者の脾臓内でのＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比の増加を含む、方法を提供する。別の実施形態では、腫瘍またはガンを有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すことが前記被験者内の前記腫瘍またはガンを治療することを可能にする。別の実施形態では、腫瘍またはガンを有する被験者内で抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すことが前記被験者内の転移の定着を防止する。
【００１４】
別の実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原である。
【００１５】
一実施形態では、前記被験者の脾臓内のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加することは、前記被験者内のより著名な抗腫瘍応答を可能にする。
【００１６】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、抗生剤耐性遺伝子を欠いている。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、被験者の脾臓内のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加するための方法であって、この方法は切断ＬＬＯタンパク質をコードする組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含み、前記リステリアは内在性アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）、およびａｃｔＡ遺伝子内での突然変異を含み、前記Ｔ細胞応答がＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比の増加を含む、方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリアは、ファゴリソソームを避ける能力を有する。
【００１９】
別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、調節性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、腫瘍またはガンを治療する、腫瘍またはガンから保護する、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む。
【００２１】
一実施形態では、本発明はヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する方法を提供し、これには被験者に本明細書に提供される組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、この組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質のＮ末端断片および腫瘍関連抗原を含む組み換え型ポリペプチドを含み、それによってこの組み換え型リステリア株が腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は腫瘍またはガンから被験者を保護する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は、被験者内で腫瘍の退行を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は腫瘍またはガンの発生または再発を減少させる方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は被験者内での腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は被験者内でガンの寛解を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む。
【００２３】
一実施形態では、リステリアゲノムは、一実施形態では病原性因子である内在性ＡｃｔＡ遺伝子の欠失を含む。一実施形態では、かかる欠失は、より弱毒化し、ひいてはヒトの使用のためにより安全なリステリア株を提供する。この実施形態によると、抗原性ポリペプチドは、リステリア染色体では、フレーム内でＬＬＯと統合される。別の実施形態では、統合核酸分子は、ＡｃｔＡ遺伝子座へと統合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする染色体の核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。
【００２４】
一実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は、異種抗原またはその断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは異種抗原と融合したＮ末端ＬＬＯをさらに含む。別の実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内在性遺伝子を相補する。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株はゲノムのｄａｌ／ｄａｔ遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、リステリアはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いている。
【００２５】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第２のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々はプロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００２６】
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００２７】
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。
【００２８】
一実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病原性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または切断ＬＬＯ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。
【００２９】
別の実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄａである。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株はゲノムのｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、リステリアはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｒｆＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＡである。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的な特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はＥＧＤリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では、本発明で使用される株は非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。
【００３０】
別の実施形態では、リステリア株は、栄養要求性突然変異体である。別の実施形態では、リステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
【００３１】
一実施形態では、Ｄ−アラニンを欠損したリステリアのＡＡ株の生成は、例えば、欠失突然変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の発生の結果として生じる突然変異生成、タンパク質の中途終始を生じる突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節性配列の突然変異を含む、当業者には周知の数多くの方法で達成されうる。別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ技法を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射、およびそれに続く突然変異体の選択を使用する従来の突然変異生成技術を使用して突然変異生成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰をともなう可能性が低いため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異体は、単純な実験室の培養アッセイでＤ−アラニンの非存在下で成長する能力を試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で成長することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
【００３２】
別の実施形態では、本明細書に提供されるように、リステリアの突然変異生成のための標的として上述のＤ−アラニンに関連する遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子が使用されてもよい。
【００３３】
別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型細菌株の染色体の残りのものに欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。一実施形態では、内在性代謝遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、内在性代謝遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、前記代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、前記代謝酵素は前記組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、前記代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、前記代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。各々の可能性は本明細書に提供される方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００３４】
一実施形態では、前記栄養要求性リステリア株は、前記栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソームの発現ベクターを含む。別の実施形態では、構成物はエピソームの様式でリステリア株内に含有される。別の実施形態では、外来抗原は組み換え型リステリア株が抱えるベクターから発現される。別の実施形態では、前記エピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物の抗原はＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドに融合される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む前記ポリペプチドは切断ＬＬＯである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む前記ポリペプチドはＡｃｔＡである。
【００３５】
別の実施形態では、リステリア株はＡＡ代謝酵素が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が欠損している。ＣｙｓＫ。別の実施形態では、遺伝子はビタミンＢ１２に依存しないメチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
【００３６】
別の実施形態では、リステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ｆｏｌＰである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型サブユニットシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態では、遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。
【００３７】
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
【００３８】
別の実施形態では、リステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩／亜硝酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレッシンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ共輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はメジャーファシリテイターファミリーの輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はテイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。
【００３９】
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に提供される。別の実施形態では、リステリアを形質転換するために使用される本明細書に提供される核酸は病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、そして非機能的病原性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病原性遺伝子は組み換え型リステリアのゲノム内で突然変異する。別の実施形態では、病原性遺伝子は組み換え型リステリアのゲノム内で欠失する。別の実施形態では、病原性遺伝子は組み換え型リステリアのゲノム内で切断される。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内在性遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態では、病原性遺伝子は、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、およびｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、ｐｒｆＡ遺伝子、またはこれらの組み合せである。病原性遺伝子は、組み換え型リステリア内で病原性と関連することが当該技術分野で知られている任意の遺伝子としうることを当業者は理解するであろう。
【００４０】
さらに別の実施形態では、リステリア株は、ｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ａｃｔＡ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、ｐｌｃＡおよびｐｌｃＢ遺伝子の両方の二重変異体、またはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の二重変異体である。別の実施形態では、リステリアはこれらの遺伝子の個別または組み合せでの欠失または突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、遺伝子のうちの各々１つを欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む、本明細書に提供される任意の遺伝子のうちの少なくとも１つでかつ最高１０個を欠いている。一実施形態では、弱毒生リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、リステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これはプロセスに関与するので、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００４１】
一実施形態では、代謝遺伝子、病原性遺伝子などはリステリア株の染色体を欠いている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病原性遺伝子などはリステリア株の染色体および何らかのエピソーム性の遺伝子的な要素を欠いている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病原性遺伝子などは、病原性株のゲノムを欠いている。一実施形態では、病原性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病原性遺伝子は染色体から欠失される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００４２】
一実施形態では、本明細書に提供される代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で成長させる。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、そして栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで成長し、一方でプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、成長しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする分離された核酸を含む場合、本発明のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで成長することになる。必要な増殖因子、補助剤、アミノ酸、ビタミン、抗生剤、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、そして市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）。各々の方法は本発明の別個の実施形態を代表する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が適切な培地上で一旦選択されると、この細菌は選択的な圧力の存在下で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の成長を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドが複製することを確保し、したがってプラスミドを持つ細菌を継続的に選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が成長する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【００４４】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に適合されることを当業者は理解するであろう。
【００４５】
一実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は、別の実施形態では、相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。本明細書に提供されるように、ＬＬＯを発現する組み換え型リステリア株は脾臓内で、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、切断ＬＬＯを発現しない組み換え型リステリア株より高いレベルまで予想外に増加させ（実施例５）、これによってＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖がＬＬＯによって直接媒介されることを実証している（実施例４）。本明細書にさらに提供されるように、切断ＬＬＯをエピソーム的に発現する組み換え型リステリアは、Ｔｒｅｇの数を減少せずにＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔの増殖を誘発することによって、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞（調節性Ｔ細胞、すなわちＴｒｅｇ）に対する比を予想外に増加させ、これによってＴｒｅｇの頻度をそれに比例して減少させる。本明細書にさらに提供されるように、ＬＬＯを有する融合タンパク質の状況でＨＰＶ−Ｅ７を発現する組み換え型リステリアは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を選択的に誘発し、これはワクチンの抗腫瘍活性を強化し、ケモカイン受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３の発現をＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で上方制御するが、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞上では上方制御せず、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３がＴｈ１およびＣＤ８＋Ｔ細胞輸送のために極めて重要であることを示している（実施例７参照）。
【００４６】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型核酸を含む。別の実施形態では、本明細書に提供されるプラスミドは、前記組み換え型リステリア株の染色体の中へと統合されないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態では、プラスミドは前記リステリア株の染色体の中へと組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはマルチコピープラスミドである。
【００４７】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に提供される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物を用いて被験者をブーストすることをさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法は本明細書に提供される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物のブースター用量を投与する工程を含む。別の実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の代替形態である。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースター免疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の単一のプライミング用量の後に続く。別の実施形態では、プライミング用量の後に単一のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に２回のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に３回のブースター投与量を投与する。一実施形態では、本明細書に提供される弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、この用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム用量とブースト用量との間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト用量を免疫原性組成物のプライム用量の８〜１０週間後に投与する。
【００４８】
異種「プライムブースト」戦略は免疫応答および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１２２６−３１（２００２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−７（２００１）。プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対する免疫応答を最大化するように思われる。ＤＮＡ株プライミングの後にアジュバント中のタンパク質を用いたブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達が続くのが、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるように思われる。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  ２０：１０３９−４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ  １９：９５−１０２（２０００）；Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡをプライムでワクチン接種し、ＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）を用いたブーストを後に続けた場合、ＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％  ＰＯＥ）をＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えることがＴ細胞応答を強化することを示唆している。ＤＮＡ／ポロクサマーのプライムの後にＡｄ５−ｇａｇブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロクサマーを用いない）プライムの後に続くＡｄ５−ｇａｇブーストで、またはＡｄ５−ｇａｇのみで誘発される応答より大きい。Ｓｈｉｖｅｒ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、Ｂ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られる。さらに、米国特許第６，５００，４３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が０〜１０日間または３〜７日間であるのが好ましい。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（すべての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属からの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌など挙げられるがこれに限定されない）が挙げられる。すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
別の実施形態では、組み換え型リステリア株はブースター接種で使用される。別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型リステリア株は初期の「プライミング」接種で使用される株と同一である。別の実施形態では、ブースター株はプライミング株とは異なる。別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型免疫チェックポイント阻害剤は、初期の「プライミング」接種で使用される阻害剤と同一である。別の実施形態では、ブースター阻害剤は、プライミング阻害剤とは異なる。別の実施形態では、プライミング接種とブースティング接種とでは同一の用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより大きい用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより小さい用量が使用される。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースターワクチン接種を実施する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースターワクチン接種は単一のプライミングワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後に単一のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、２回のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、３回のブースターワクチン接種を実施する。一実施形態では、プライム株とブースト株との間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム株とブースト株との間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト株をプライム株の８〜１０週間後に投与する。
【００５０】
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するであろうように、本発明の組成物は、家族性遺伝のためまたはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状況のために、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、外科手術による腫瘍成長の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。かかる治療に続いて、本発明のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、本発明のワクチンは、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００５１】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、本発明の組み換え型リステリア株を用いてヒト被験者をブーストする工程を含む。別の実施形態では、方法はＥ７抗原を含む免疫原性組成物を用いてヒト被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法は被験者の細胞がＥ７抗原を発現するように導く免疫原性組成物を用いてヒト被験者をブーストする工程をさらに含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００５２】
別の実施形態では、「ブースティング」とは、追加的なワクチン用量または追加的な治療用量の被験者への投与を指す。本発明の方法の別の実施形態では、２回のブースト（すなわち、合計３回の接種）が投与される。別の実施形態では、３回のブーストが投与される。別の実施形態では、４回のブーストが投与される。別の実施形態では、５回のブーストが投与される。別の実施形態では、６回のブーストが投与される。別の実施形態では、７回以上のブーストが投与される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００５３】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は組み換え型リステリアを追加的な療法とともに同時投与する工程を含む。別の実施形態では、追加的な療法は外科手術、化学療法、免疫療法、またはこれらの組み合せである。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与より追加的療法を先に行う。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与に続いて追加的療法を行う。別の実施形態では、追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、抗体療法は、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加し、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するために、組み換え型リステリアは漸増用量で投与される。細胞の免疫応答を強化するために、腫瘍を有する被験者にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当該技術分野で既知の他のサイトカインを含むがこれに限定されないサイトカインを提供することによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることが当業者によって理解されるであろう。これらのうちのいくつかは米国特許第６，９９１，７８５号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、「抗体」という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど、本明細書に記述される所望の標的と特異的に相互作用する（例えば、食作用を有する細胞と結合することなどの）能力を有する無傷の分子ならびにその機能的断片を指す。いくつかの実施形態では、抗体断片は以下のものを含む。
【００５５】
（１）Ｆａｂ、抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片で、これは無傷の軽鎖および１つの重鎖の一部分を得るために酵素パパインを用いた抗体全体の消化によって生成できる。
【００５６】
（２）Ｆａｂ’、無傷の軽鎖および重鎖の一部分を得るためにペプシンを用いて抗体全体を処理し、引き続いて還元することによって得られる抗体分子の断片、抗体分子当たり２つのＦａｂ’断片が得られる。
【００５７】
（３）（Ｆａｂ’）２、酵素ペプシンを用いて、引き続いて還元を行わずに抗体全体を処理することによって得られる抗体の断片、Ｆ（ａｂ’）２は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片の二量体である。
【００５８】
（４）Ｆｖ、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片。
【００５９】
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子学的に融合した一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによってリンクされた、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子。
【００６０】
これらの断片を作製する方法は当該技術分野で既知である。（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、（参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。
【００６１】
いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解、または大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）内での断片をコードするＤＮＡの発現によって調製される場合がある。
【００６２】
いくつかの実施形態では、抗体断片は、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得られる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓ断片を提供するためにペプシンを用いた抗体の酵素的開裂によって、抗体断片を生成することができる。チオール還元剤、および任意選択的にジスルフィド結合の開裂の結果として得られるスルフヒドリル基の保護基を使用して、この断片をさらに開裂して３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的開裂は、２つの一価Ｆａｂ’断片および１つのＦｃ断片を直接的に生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、およびその中に含有される参考文献によって記述され、これらの特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９−１２６，１９５９も参照のこと。断片が無傷の抗体によって識別される抗原に結合する限り、一価の軽重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる開裂、または他の酵素的、化学的、または遺伝子学的な技法など、抗体を開裂する他の方法を使用してもよい。
【００６３】
Ｆｖ断片はＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２６５９−６２，１９７２に記述されるように非共有結合性である場合がある。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によってリンクする、またはグルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋することができる。Ｆｖ断片はペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含むことが好ましい。これらの単一鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されるＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造的遺伝子は発現ベクター内へと挿入され、これはその後大腸菌などの宿主細胞の中へと導入される。組み換え型宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを用いて単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成するための方法は、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａによる方法、２：９７−１０５，１９９１；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７，１９９３；およびＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、に記述されている。
【００６４】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって、ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。かかる遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０，１９９１を参照のこと。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述される抗体または断片は、抗体の「ヒト化形態」を含む場合がある。いくつかの実施形態では、「抗体のヒト化形態」という用語は、非ヒト（例えば、マウスの）抗体を指し、これは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリンのキメラ型分子、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体は、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、非ヒト種（ドナー抗体）（所望の特異性、親和性、および容量を有するマウス、ラット、またはウサギなど）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見られない残基も含む場合がある。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つの、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ここでＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン共通配列のものである。最適にはヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含むことになる［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【００６６】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と称され、これらは典型的には移入可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的にウィンターおよびその協力者の方法［Ｊｏｎｅｓｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列の代わりに用いることによって遂行できる。したがって、かかるヒト化抗体はキメラ型抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、無傷のヒト可変ドメインより大幅に少ないものが非ヒト種からの対応配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この中でいくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基は齧歯類の抗体の類似部位からの残基によって置換されている。
【００６７】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野で既知の様々な技法を使用しても生産することができる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］．Ｃｏｌｅらの技法およびＢｏｅｒｎｅｒらの技法もヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスの中へと導入することによってヒトを作製することができ、この中で内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的にまたは完全に無効化されている。チャレンジに際して、ヒト抗体の生成が観察され、これは遺伝子の再配列、組立、および抗体レパートリーを含むすべてに関してヒトの中で見られるものと酷似している。この取り組みは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６、および以下の科学出版物：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）に記述されている。
【００６８】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体、またはその断片がこれに特異的に結合する抗原上の部位を指す。タンパク質の３次折り畳みによって並置された連続アミノ酸または不連続アミノ酸の両方から、エピトープを形成することができる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶剤への曝露に対して保持されるが、３次折り畳みによって形成されたエピトープは典型的には変性溶剤を用いた処理で失われる。エピトープは固有の空間的配座にある典型的に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的配座を決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析、および２次元核磁気共鳴が挙げられる。
【００６９】
一実施形態では、本発明の組成物は治療的モノクローナル抗体または免疫調節性モノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物はＬｍ株および治療的モノクローナル抗体または免疫調節性モノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は治療的モノクローナル抗体または免疫調節性モノクローナル抗体を含み、組成物は本明細書に提供されるリステリア株を含まない。
【００７０】
一実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原はＨｅｒ−２である。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼである。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態では、抗原はＥ７、Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、ＳＣＣＥ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）から選択される。別の実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、抗原は感染性疾病抗原である。
【００７１】
別の実施形態では、腫瘍関連抗原は血管形成抗原である。別の実施形態では、血管形成抗原は活性化した周皮細胞と腫瘍血管形成血管系内の周皮細胞との両方の上で発現され、これは別の実施形態では、インビボでの新血管形成と関連付けられる。別の実施形態では、血管形成抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、血管形成抗原は当該技術分野で既知のものであり、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１０２１４０号で提供され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
一実施形態では、本発明の組成物はインターフェロンγの強い刺激を誘発し、これは、一実施形態では抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本発明のリステリアはインターフェロンγの強い刺激を誘発し、これは、一実施形態では、抗血管形成特性を有する（Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  ２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−γ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。
【００７３】
別の実施形態では、本発明の組成物は１つ以上の抗血管形成タンパク質または因子の生産を誘発する。一実施形態では、抗血管形成タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態では、抗血管形成タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本発明のリステリアは、抗血管形成因子の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を被験者に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。各々のリステリア株およびそのタイプは、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７４】
他の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法で使用するための抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５からのヒトパピロマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、またはｐＳＡから選択される。
【００７５】
他の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法で使用するための抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形及び血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、及び肝臓などの移植拒否反応、グラベス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リューマチ、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜（sclera）、上強膜（episclera）、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、類でんぷん症、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、及びリステリア症。
【００７６】
他の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法で使用するための抗原は以下の腫瘍抗原、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチド、もしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、結腸直腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原、のうちの１つである。
【００７７】
本発明の方法の標的であるＨＰＶは、別の実施形態ではＨＰＶ１６である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態では、ＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態では、ＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００７８】
一実施形態では、本明細書に提供される疾患は感染性疾患、ガン、または腫瘍である。
【００７９】
一実施形態では、感染性疾患は以下の病原体（しかしこれに限定されない）のうちの１つによって生じたものである。ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当該技術分野で既知の任意の他の感染性疾患。別の実施形態では、被験者の免疫系が損なわれている場合があるとき、移植術の後に感染が生じる。
【００８０】
別の実施形態では、感染性疾患は、家畜の感染性疾患である。別の実施形態では、家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態では、これらの疾患としては、口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、ブタコレラ（ＣＳＦ）、牛の１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）感染によって生じるＩＢＲ、および豚の仮性狂犬病（オーエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト（エルシニア・ペスチス）、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
一実施形態では、本発明の方法で治療されるガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮頸ガンである。別の実施形態では、このガンはＨＥＲ２を発現するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、これは多形性膠芽腫である。別の実施形態では、このガンは大腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。一実施形態では、これは、低酸素固形腫瘍である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞肺ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。別の実施形態では、このガンは中咽頭ガンである。別の実施形態では、このガンは肺ガンである。別の実施形態では、このガンは肛門ガンである。別の実施形態では、このガンは大腸ガンである。別の実施形態では、このガンは食道ガンである。別の実施形態では、このガンは中皮腫である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００８２】
一実施形態では、本明細書に提供される切断ＬＬＯは推定ＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号：１）である。別の実施形態では、リステリアから他のＬＭ  ＰＥＳＴ  ＡＡ配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も強化することになる。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は配列番号：１を含む。別の実施形態では、断片はＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、断片は配列番号：２を含む。別の実施形態では、断片は配列番号：２をほぼ含む。別の実施形態では、断片は配列番号：２を本質的に含む。別の実施形態では、断片は配列番号：２に対応する。別の実施形態では、断片は配列番号：２と相同である。別の実施形態では、断片は配列番号：２の断片と相同である。いくつかの実施例で使用されるΔＬＬＯは、システイン４８４を含有する活性化領域を含むアミノ末端からの８８個の残基が切断されるので、４１６  ＡＡ長さ（単一配列を含まない）である。活性化領域を有しない、そして特にシステイン４８４を有しない任意のΔＬＬＯは本発明の方法および組成物のために好適であることが当業者には明らかであろう。別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列、配列番号：１を含む、異種抗原の任意のΔＬＬＯへの融合は、媒介される細胞、および抗原の抗腫瘍免疫性を強化する。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００８４】
別の実施形態では、本発明のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１３１２８、配列番号：３、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１２７に示される）。この配列に対応する前駆タンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯから切断される。こうして、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００８５】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号：２）。
【００８６】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書で利用されるＡＡ２０〜４４２のＬＬＯタンパク質にほぼ対応する。
【００８７】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号：４）。
【００８８】
一実施形態では、本発明はリステリオシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはこれを発現する組み換え型リステリアを含む組み換え型タンパク質またはポリペプチドを提供し、前記ＬＬＯタンパク質は前記ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、またはこれらの組み合わせの突然変異を含む（米国特許第８，７７１，７０２号を参照、本特許は参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、前記Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２残基は、配列番号：３の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２であるが、別の実施形態では、当業者には既知のように、これらは配列アラインメント使用して推測することができるような対応残基である。一実施形態では、残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２は突然変異している。一実施形態では、突然変異は置換であり、別の実施形態では、欠失である。一実施形態では、ＣＢＤ全体が突然変異しており、一方で別の実施形態では、ＣＢＤの部分が突然変異しており、一方で別の実施形態では、ＣＢＤ内の特異的な残基のみが突然変異している。
【００８９】
別の実施形態では、「切断ＬＬＯ」または「ΔＬＬＯ」はＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯの非溶血性断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ領域を含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＮ末端ＬＬＯ断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は少なくとも４９２アミノ酸（ＡＡ）長である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は４９２〜５２８ＡＡ長である。別の実施形態では、非ＬＬＯペプチドは１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態では、突然変異領域は１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態では、非ＬＬＯペプチドは突然変異領域と同一の長さである。別の実施形態では、非ＬＬＯペプチドは突然変異領域より短く、または別の実施形態では、突然変異した領域より長い。別の実施形態では、置換は溶血活性に関する不活化突然変異である。別の実施形態では、組み換え型ペプチドは野生型ＬＬＯに関する溶血活性の減少を呈する。別の実施形態では、組み換え型ペプチドは非溶血性である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９０】
一実施形態では、本発明は突然変異ＬＬＯタンパク質またはその断片を含む組み換え型タンパク質またはポリペプチドを提供し、突然変異ＬＬＯタンパク質またはその断片は突然変異ＬＬＯタンパク質またはその断片の突然変異領域に対する非ＬＬＯペプチドの置換を含み、突然変異領域はＣ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２から選択された残基を含む。
【００９１】
本明細書に提供されるように、突然変異体ＬＬＯタンパク質は残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２の野生型ＬＬＯの置換を含む。
【００９２】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性形態である。
【００９３】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９４】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用されるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＬＬＯ断片である。
【００９５】
別の実施形態では、相同ＬＬＯは、ＬＬＯ配列（例えば、配列番号：２〜４）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＬＬＯは、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９６】
別の実施形態では、「相同性」という用語は、本明細書に提供されるいずれかの核酸配列を参照するとき、対応するネイティブ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを同様に示す。
【００９７】
一実施形態では、当該技術分野で十分に記述される方法によって、相同性は配列アラインメントに対するコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合があり、これらは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどである。
【００９８】
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列番号：１〜５から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は配列番号：１〜５から選択された配列との同一性が７２％より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態では、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい。別の実施形態では、同一性は１００％である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９９】
別の実施形態では、相同性は候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介して決定され、その方法は当該技術分野で十分に記述されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙを参照のこと）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、ネイティブカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【０１００】
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、イムノブロット解析を含む当該技術分野において十分に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、そして、例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。各々の相同性を決定する方法は、本発明の別個の実施形態を代表する。
【０１０１】
別の実施形態では、本明細書に提供される構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。相同的組み換えのための技法は当該技術分野で周知であり、例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ、ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ｛ut2}ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５、１０９（１−２）：１１−７）、およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００５、３７（１）：１９−２４）。別の実施形態では、相同的組み換えは米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施される。この場合、Ｅ７を発現する組み換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、また遺伝子生成物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含めることによって、Ｅ７遺伝子の染色体組み込みによって作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドが、組み換え型を選択するために使用される。各々の技法は本発明の別個の実施形態を代表する。
【０１０２】
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、とりわけ以下のＳｕｎらの文献（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：３７７０−３７７８）にＤＰ−Ｌ９６７の構築について記述されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されたゲノム内の位置が未知であるという欠点を有する。
【０１０３】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，  Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位でありうる対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’端）へと挿入するために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内在性プロファージは構築体または異種遺伝子組み込みの前に利用された付着部位から治癒する。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。別の実施形態では、本発明は、臨床用途のためのファージベースの染色体組み込みシステムをさらに含み、ここでｄ−アラニン・ラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用することができ、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）である。別の実施形態では、「ファージ治癒工程」を避けるためにＰＳＡに基づくファージ組み込みシステムを使用する。別の実施形態では、これは組み込まれた遺伝子を維持するための抗生物質による継続的な選択を要求する。こうして、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組み込みシステムの確立を可能にする。代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１０４】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ＬＬＯ、ＰＥＳＴ、もしくはＡｃｔＡ配列またはその断片をコードする核酸配列を用いてエピソーム性ベクターまたはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、プラスミドは組み換え型リステリアワクチン株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリアに抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性断片である。
【０１０５】
別の実施形態では、「免疫原性断片」は、単独でまたは本明細書に提供されるようなワクチンもしくは組成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す免疫原性断片である。別の実施形態では、かかる断片は適応免疫応答を引き出すために必要なエピトープを含有する。
【０１０６】
別の実施形態では、「安定して維持される」とは、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失を伴わずに、核酸分子またはプラスミドを１０世代の間、維持することを指す。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１０７】
別の実施形態では、「機能的断片」は免疫原性断片であり、単独でまたは本明細書に提供されるワクチンもしくは組成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す。別の実施形態では、当業者は理解するであろうように、また本明細書にさらに提供されるように、機能的断片は生物活性を有する。
【０１０８】
別の実施形態では、組み換え型リステリア株をヒト被験者に１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量で投与する。別の実施形態では、用量は５〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１００〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜７０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜２０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜７×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜５×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜５×１０９ＣＦＵである。
【０１０９】
別の実施形態では、用量は１×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は６×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は７×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は８×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１０×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３．３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０１０生命体である。
【０１１０】
各々の用量および用量の範囲は本発明の別個の実施形態を代表する。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明の方法の組み換え型ポリペプチドは組み換え型リステリア株によって発現される。別の実施形態では、発現は組み換え型リステリア株によって担持されるヌクレオチド分子によって媒介される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組み換え型リステリア株は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、当該技術分野で既知の任意の他のリステリア種の組み換え型株である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリア株は動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜株の普及を減少する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、継代は本明細書に記述されるように実施される。別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって継代を遂行する。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明のワクチンはアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法および組成物で使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントであるか、またはこれを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１１５】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記組み換え型リステリア株の投与の前または後に免疫チェックポイントタンパク質阻害剤を含む免疫原性組成物を同時投与する工程をさらに含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は免疫チェックポイントタンパク質阻害剤である。当該技術分野で既知の任意の免疫チェックポイントタンパク質が、免疫チェックポイント阻害剤による標的となりうることを当業者は理解するであろう。免疫チェックポイントタンパク質は、以下のものから選択されてもよいがこれに限定されない。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、または細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤タンパク質は、Ｂ７／ＣＤ２８受容体スーパーファミリーに属するものである。
【０１１６】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化するサイトカインを含む免疫原性組成物を同時投与する工程をさらに含む。免疫応答を強化するように機能するサイトカインは周知であり、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／ＩＦＮ−β）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、および免疫応答を強化することが既知の任意の他のサイトカインを含むことを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、サイトカインは炎症性サイトカインである。
【０１１７】
「免疫原性組成物」が本明細書に提供される組み換え型リステリア、およびアジュバント、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤、および本明細書に提供されるサイトカインを含んでもよいことが理解されるであろう。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるアジュバントを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるサイトカインを含む。本明細書にさらに提供されるように、かかる組成物が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
【０１１８】
本明細書に提供される組み換え型リステリア投与に続いて、単独、または本明細書に提供される免疫原性組成物と同時投与するとき、本明細書に提供される方法は末梢リンパ器官内でのＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在の強化をもたらす。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は末梢リンパ器官におけるＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、Ｔエフェクター細胞の末梢における存在の強化をもたらす。Ｔエフェクター細胞のかかる増殖は、本明細書で実証するように、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、末梢内および腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加をもたらす（実施例参照）。末梢リンパ器官としては、脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイドなどが挙げられるが、これに限らないことを当業者は理解するであろう。一実施形態では、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加が末梢で生じる。別の実施形態では、末梢、リンパ器官、および腫瘍部位で、これらの部位でのＴｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加が生じる。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞の比の増加はＴｒｅｇの頻度を減少するが、この部位におけるＴｒｅｇの総数は減少しない。
【０１１９】
一実施形態では、本明細書で実証するように、切断ＬＬＯおよび異種抗原の融合タンパク質を発現する弱毒化組み換え型リステリア株を、同一の抗原を発現する組み換え型リステリアと組み合わせることは、完全な腫瘍退行をもたらす（実施例６参照）。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明の組み換え型核酸は、リステリア株内のコードしたペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節性配列に動作可能にリンクしている。遺伝子の構成的発現を駆動するために有用なプロモーター／調節性配列が当該技術分野で周知であり、これらとしては、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明のペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘発性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘発性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド、およびこれに類するものなどの誘発剤に応答して誘発されたプロモーターが利用される。こうして、本発明は、既知または未知のいずれかで、かつこれらに動作可能にリンクする所望のタンパク質の発現を駆動する能力を有する、任意のプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解されるであろう。
医薬組成物
【０１２１】
別の実施形態では、本発明のワクチンおよび組成物を含有する医薬組成物は、非経口的、癌近傍に、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、腟内、または腫瘍内など、当業者に既知の任意の方法によって被験者に投与される。
【０１２２】
一実施形態では、本発明の組成物は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）株を含む。
【０１２３】
全体を通して使用されるように、「組成物」、「ワクチン」、および「免疫原性組成物」という用語はすべて同一の意味と質を有して交換可能である。いくつかの実施形態では、「医薬組成物」という用語は、例えば、必要な被験者に投与するなど、医薬用途に好適な組成物を指す。別の実施形態では、「医薬組成物」という用語は、リステリア株を医薬的に許容される担体または希釈剤とともに含む治療的に有効な量の活性成分（複数可）を包含する。「治療的に有効な量」という用語が、所与の病状および投与レジメンに対して治療的効果を提供する量を指すことが理解されるであろう。
【０１２４】
被験者内に強化した抗腫瘍Ｔ細胞応答を引き出すため、被験者内で腫瘍を薬物治療した免疫抑制を阻害するため、もしくは被験者の脾臓および腫瘍のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加するため、またはこれらの任意の組み合せの目的で、本発明の組成物を本発明の方法で使用してもよい。
【０１２５】
本明細書に提供される方法および組成物の別の実施形態では、組成物は経口投与され、したがって経口投与に好適な形態、すなわち固形製剤または液体製剤として処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散体、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセルを含む。
【０１２６】
別の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、液体製剤の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散体、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０１２７】
「投与する」という用語は被験者に本発明の組成物との接触をもたらすことを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、投与はインビトロで、すなわち、試験管内で、またはインビボで、すなわち、生命体、例えば、ヒトの細胞または組織の中で遂行することができる。一実施形態では、本発明は、本発明のリステリア株およびその組成物を被験者に投与することを包含する。
【０１２８】
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態が範囲の形式で提示される場合がある。範囲の形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、本発明の範囲の一定不動の制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記述はすべての可能性のある部分的範囲ならびにその範囲内の個別の数値を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などのような範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、等々などの具体的に開示された部分的範囲、ならびにこの範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅広さに関わらず適用される。
【０１２９】
本明細書に数値的範囲が示されるときはいつも、示される範囲内のあらゆる引用された数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１に示す数と第２に示す数と「の間の範囲」という句、および第１に示す数「から」第２に示す数「までの範囲」という句は、本明細書で互換的に使用され、第１に示す数および第２に示す数ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
【０１３０】
本明細書で使用される時「方法」という用語は、化学技術、薬学技術、生物学技術、生化学技術、および医術の実践者に既知であるか、または既知の様式、手段、技法、および手順からこれらの施術者によって容易に開発される様式、手段、技法、および手順を含むがこれに限定されない、所与の課題を遂行するための様式、手段、技法、および手順を指す。
【０１３１】
本明細書で使用される時、単数形（「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」）は複数形の参照を含むが、その文脈によってそうでないことが明らかに示される場合はその限りではない。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含む場合がある。
【０１３２】
本明細書で使用される時、「約」という用語は数量的にプラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。
【０１３３】
「被験者」という用語は、一実施形態では、症状もしくはその後遺症の療法を必要とする、または症状もしくはその後遺症を受けやすい、ヒトを含む哺乳類を指す。被験者は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウス、ならびにヒトを含んでもよい。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０１３４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【実施例】
【０１３５】
実施例
材料および方法：
マウス
メスの生後６〜８週（記載のない限り）のＣ５７ＢＬ／６マウスをＦｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＦＮＬＣＲ）から購入した。マウスを米国国立ガン研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）の動物施設で飼育した。実験用マウスの使用のためのプロトコルは、米国国立衛生研究所の実験動物委員会で承認された。
細胞株
【０１３６】
低いレベルのＥ６およびＥ７を発現するＴＣ−１細胞は、原発性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺上皮細胞から、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７ならびにｒａｓガン遺伝子活性化を用いた形質転換によって派生させた。細胞をＲＰＭＩ  １６４０内で、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μＭの非必須アミノ酸、および０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を補充して、３７℃にて５％ＣＯ２を用いて成長させた。
Ｌ．モノサイトゲネス株
【０１３７】
Ａｄｖａｘｉｓ  Ｉｎｃ（米国ニュジャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）で、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７、ならびにその対照ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯおよびＬｍｄｄＡが生成された。ｄａｌ  ｄａｔ  ΔａｃｔＡ株（ＬｍｄｄＡ）は、ｄａｌ  ｄａｔ株から構築されたが、これはＬｍ野生型株１０４０３Ｓに基づいてストレプトマイシン耐性遺伝子を染色体に組み込んだものである。ｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡを突然変異させることによって、ＬｍｄｄＡは高度に弱毒化される。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７株は、ｐｒｆＡ、並びにプラスミド中のクロラムフェニコール耐性遺伝子の欠失後、ｐＴＶ３プラスミドを用いたＬｍｄｄＡの形質転換によって構築された。上述のように、ＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質の発現および分泌がＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７株の培養上清でウエスタンブロットによって確認された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ対照株の構築は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７株のものと類似であるが、ｐＴＶ３プラスミドでｐｒｆＡとＥ７との両方が欠失された。Ｌｍ野生型株である１０４０３Ｓと、Δｈｌｙ、Δｈｌｙ：：ｐｆｏ、およびｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）を含むいくつかの突然変異株は、好意によりＤ．Ｐｏｒｔｎｏｙ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（米国カリフォルニア州Ｂｅｒｋｅｌｅｙ））によって提供された。株ｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃは、野生型Ｌｍの非溶血性突然変異体であり、この中でＴｎ９１７−ｌａｃ融合遺伝子はｈｌｙ遺伝子（ＬＬＯをコードする遺伝子）の中へと挿入され、ＬＬＯ溶血活性を妨害する。ＬＬＯ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）を発現するプラスミドを用いてこの突然変異体がトランスフェクトされたとき、それはＬＬＯを有するので溶血活性を再度獲得する。全長のＥ７遺伝子がＬｍ染色体に組み込まれているＬｍ−Ｅ７株は、好意によりＹ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）によって提供された。細菌をブレインハートインフュージョン培地にストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を加えたものの中で、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で培養した。
試薬
【０１３８】
蛍光共役抗マウス抗体ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＧＫ１．５）およびＣＤ８−Ｂｒｉｌｌｉｅｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（５３−６．７）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から得た。ＦｏｘＰ３−ＦＩＴＣ（ＦＪＫ−１６ｓ）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から得た。Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）、配列番号：５をロードしたＨ−２Ｄｂ四量体は、好意により米国国立アレルギー感染病研究所四量体コア施設（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）および米国国立衛生研究所ＡＩＤＳ試薬の研究および寄託プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）によって提供された。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数ビーズはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）から得た。
腫瘍接種およびマウスのワクチン接種ワクチン接種
【０１３９】
０日目にＴＣ−１細胞（１０５細胞／マウス）をマウスの右の脇腹に皮下移植した。１０日目に、腫瘍が直径５〜６ｍｍになったとき、マウスにＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンまたは適正な対照を０．１  ＬＤ５０の用量で腹腔内注射した。１７日目にワクチン接種をブーストした。腫瘍を週に２回電子キャリパーを使用して測定し、腫瘍サイズを次の式によって計算した：長さ×幅×幅／２。腫瘍の直径が２．０ｃｍに達したとき、マウスを安楽死させた。
フローサイトメトリー
【０１４０】
マウスの脾臓細胞または腫瘍から採取した細胞をＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ８−Ｂｒｉｌｌｉｅｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１、およびＨ−２ＤｂＥ７四量体−ＡＰＣで３０分間染色した。細胞を固定し、透過処理して、ＦｏｘＰ３−ＦＩＴＣで一晩染色した。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。リンパ球ゲートを、ＴｒｅｇがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋と識別されたところにセットした。絶対細胞数を計数するためにＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数ビーズを添加した。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの養子移植
【０１４１】
Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ））によってマウスの脾臓からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が分離された。腫瘍細胞接種後９日目に、ＴＣ−１腫瘍を持つマウスの中へと細胞を静脈内注射した。Ｔｒｅｇ導入の１日後、マウスにＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（０．１  ＬＤ５０）を用いて、１週間の間隔で２回腹腔内免疫付与した。腫瘍の成長を監視した。
統計
【０１４２】
非パラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用してデータを解析した。Ｐ＜０．０５で有意性を判定した。
実施例１：ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｔｒｅｇ頻度の減少に付随して起こる定着したＴＣ−１腫瘍の退行を誘発する。
【０１４３】
Ｌｍべースのワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、融合タンパク質ＬＬＯ−Ｅ７ならびにＰｒｆＡがリステリアＸＦＬ−７のｐｒｆＡ陰性株中でエピソーム発現されとき、定着したＴＣ−１腫瘍の完全な退行を誘発したことが以前報告された。ここで、融合タンパク質ＬＬＯ−Ｅ７をｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡ変異型Ｌｍ株中でプラスミドによって生成する、別の高度に弱毒化されたＬｍベースのワクチン、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の抗腫瘍活性を調査した。クロラムフェニコール耐性遺伝子およびＰｒｆＡがプラスミドから除去されているので、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と比較してより弱毒化されている。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同様に、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７も定着したＴＣ−１腫瘍の成長を著しく阻害することが観察された（図１、ＡおよびＢ、図２）。ＴＣ−１腫瘍を持つマウスのおよそ４０％では、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７を２回用いたワクチン接種後に腫瘍は完全に退行した（図１Ｂおよび図２）。再発し、３か月で死んだ１匹のマウスを除いて、腫瘍退行を示した他のマウス（全動物の３３％）は再発なしで少なくとも６か月生存した（図１Ｃ）。Ｌｍ−Ｅ７はＴＣ−１腫瘍の成長を遅らせたが、完全な腫瘍退行を誘発することはできなかった（図１、ＡおよびＢ、ならびに図２）。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（Ｅ７無し）は、ＴＣ−１腫瘍成長を著しく阻害することができず（図１、ＡおよびＢ、ならびに図２）、先天的な免疫応答はＴＣ−１腫瘍細胞を撲滅するのに十分ではないことを示唆した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７は脾臓内に類似のＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し（図３、Ａの上のパネル、Ｂ、およびＤ）、これは以前の所見と一致する。次いで、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを解析した。予想外に、ＰＢＳ対照と比較して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯがすべて脾臓内でＴｒｅｇ頻度を著しく減少させ、この減少は腫瘍内でより劇的であったが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯがＬｍ−Ｅ７よりも頻度を減少することが観察された（図１、Ｄ〜Ｈ）。
実施例２：Ｌｍは、Ｔｒｅｇ頻度の減少を誘発するのに十分である
【０１４４】
最初、Ｔｒｅｇ頻度の減少が切断ＬＬＯによって媒介されることが疑われた。しかし切断ＬＬＯの発現無しでも、Ｌｍ−Ｅ７はＴｒｅｇ頻度を減少することができた（図１、Ｄ〜Ｈ）。この観察は、ＬｍがＴｒｅｇ頻度を減少することができる場合があることを示唆する。実際、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７に対するベクター対照であるＬｍｄｄＡと、野生型Ｌｍ株でかつＬｍ−Ｅ７に対するベクター対照である１０４０３Ｓの両方は、Ｔｒｅｇ頻度を脾臓内で著しく減少し、腫瘍内ではより著しく減少する（図４）。
実施例３：ＬｍはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を選択的に誘発することによってＴｒｅｇ頻度を減少する
【０１４５】
相対的Ｔｒｅｇ頻度（総Ｔ細胞の比率）はＴｒｅｇの数だけではなく、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数によっても決定される。どのようにしてＬｍがＴｒｅｇ頻度を減少するのかを調査するために、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ、ＬｍｄｄＡ、Ｌｍ−Ｅ７、またはＬｍ（１０４０３Ｓ）で処置されたＴＣ−１腫瘍を持つマウス内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量した。驚くべきことに、図５に示すように、ＬｍｄｄＡは腫瘍内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の数を目立って変化させないことが見出された。これは実際にはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増加し、ひいてはＴｒｅｇ頻度を相対的に減少させている。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７内での切断ＬＬＯのエピソーム性発現は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増加し、ひいてはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度をさらに減少させる。野生型Ｌｍ  １０４０３ＳおよびＬｍ−Ｅ７は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の数を著しく変化しない一方で、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加も誘発する。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、腫瘍内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を著しく増加させる。これらの結果は、ＬｍがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を選択的に誘発して、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を減少させることを実証する。
実施例４：Ｌｍに誘発されたＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖はＬＬＯに依存し、それによって媒介される
【０１４６】
ｈｌｙ遺伝子によってコードされたＬＬＯは、孔形成細胞溶解素であり、Ｌｍはこれによって宿主細胞ファゴソームの液胞から細胞質の中へと脱出することができる。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、およびすべてのこれらの対照はＬＬＯを生成するので、その中でｈｌｙ遺伝子がシャトルベクターの使用に続く相同的組み換えで欠失される、１０４０３Ｓに由来するＬＬＯ欠損Ｌｍ突然変異体が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発する上でＬＬＯが役割を果たすかどうかを研究するために使用された。ΔｈｌｙＬｍは、単回投与後７日目にマウスの脾臓内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増加することができなかったことが見出され（図６Ａ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘発がＬＬＯに依存することを示した。これはＬＬＯの直接的な効果、またはファゴリソソームから逃れるための要件である可能性がある。この質問に対処するために、ＬＬＯをＰＦＯで置き換えたＬＭを研究した。クロストリジウム・パーフリンジェンスによって生成されたパーフリンゴリジンＯ（ＰＦＯ）は、アミノ酸についてはＬＬＯと４３％同一であり、液胞膜を溶解することもできる。ｈｌｙプロモーターの制御下でＰＦＯをコードするｐｆｏ遺伝子は、Δｈｌｙ株の染色体の中へと遺伝子組み換えされて、Δｈｌｙ：：ｐｆｏ株を形成した。Δｈｌｙ：：ｐｆｏは食作用から逃れて細胞質内に入ることができたが、マウスの脾臓内でＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増加することはできなかった（図６Ａ）。対照的に、ｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）、野生型Ｌｍの非溶血性Ｔｎ９１７−ｌａｃ突然変異体（その中でＴｎ９１７−ｌａｃ融合遺伝子がｈｌｙ遺伝子の中へと挿入され、ＬＬＯ溶血活性を妨害する）は、ＬＬＯ発現プラスミドｐＡＭ４０１−ｈｌｙで形質転換され、マウスの脾臓のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発した（図６Ａ）。これらの結果はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖がＬＬＯによって直接的に媒介されることを示唆する。ＬｍはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の増殖を有意に誘発しなかったので、Ｌｍで誘発されたＴｒｅｇはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加の結果得られた頻度を減少する（図６、Ａ〜Ｄ）。
実施例５：ＬｍｄｄＡ内の切断ＬＬＯのエピソーム性発現は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のより高いレベルへの増殖を誘発する
【０１４７】
次に、ＬｍｄｄＡおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯを比較し、ここで後者は健康で腫瘍を持っていないマウス内のＴ細胞増殖の誘発で、プラスミドによってエピソーム的に切断ＬＬＯを生成する。単回投与の７日目にＬｍｄｄＡがマウスの脾臓内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数をわずかに増加することができることが見出されたが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯはより高いレベルへのかかる増加をさらに誘発した（図７Ａ）。対照的に、ＬｍｄｄＡまたはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ感染の後、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の数は著しくは変化しなかった（図７Ａ）。これらは、ＰＢＳ対照と比較して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ投与後にＴｒｅｇの比例した著しい減少をもたらした（図７、Ｂ〜Ｄ）。これらの細胞内での細胞増殖マーカーＫｉ−６７の存在を調べた。ＬｍｄｄＡは、Ｋｉ−６７＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＫｉ−６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度および絶対数を増加したが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯは数をより大幅に増加した（図７、Ｅ〜Ｇ）。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＫｉ−６７発現のレベルもこれに応じて増加した（図７Ｈ）。対照的に、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞内でのＫｉ−６７＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞およびＫｉ−６７発現の頻度および絶対数は、顕著には変化せず、ＬｍｄｄＡおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯがこれらの増殖を誘発しなかったことを示している。
実施例６：Ｌｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合わせは定着したＴＣ−１腫瘍の退行を誘発する。
【０１４８】
Ｌｍ−Ｅ７ワクチン単独ではＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をあまり誘発しなかった（図５）。これはＴＣ−１腫瘍退行を誘発できなかったことを説明する可能性がある。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発したので（図５および図７Ａ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯの存在下でＬｍ−Ｅ７の抗腫瘍効果が改善する場合があると考えられる。実際、Ｌｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合せは定着したＴＣ−１腫瘍のほぼ完全な退行を誘発した（図８、Ａ〜Ｃ）。対照的に、ＬｍｄｄＡの追加はＬｍ−Ｅ７に誘発された抗腫瘍活性を増強する事ができず（データ非表示）、Ｌｍ−Ｅ７ワクチンの抗腫瘍有効性を改善するうえでの切断非溶血性ＬＬＯの重要性を示す。予想されるように、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、Ｌｍ−Ｅ７またはＰＢＳで処置したものと比較して組み合せ群のマウスの脾臓内で著しく増加する（図８Ｄ）。この場合もＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋の数は比較的変化しないので、組み合わせたｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとによるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数のより高いレベルまでの増加は、結果としてＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の比率のより大きな減少をもたらす（図８、Ｅ〜Ｇ）。
【０１４９】
さらにＬｍｄｄＡは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとＬｍ−Ｅ７との同時投与の間に非溶血性切断ＬＬＯが果たす役割を決定するために、対照としてＬｍ−Ｅ７とも同時投与された。ＬｍｄｄＡ株の追加はＬｍ−Ｅ７誘発性抗腫瘍活性を増強できなかったことが観察され、ＬｍｄｄＡによって生成された内在性ＬＬＯはＬｍ−Ｅ７誘発性抗腫瘍活性を補助することができないことを示した（図１０）。
実施例７：Ｔｒｅｇの養子移植はＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の定着したＴＣ−１腫瘍に対する抗腫瘍有効性を損なう。
【０１５０】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７はＴｒｅｇの数を著しくは変化しなかったが、Ｔｒｅｇ頻度を減少した（図１、Ｄ〜Ｈ）。ＴｒｅｇのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比は、Ｔｒｅｇ抑制能力を決定するための広く受け入れられているパラメータである。Ｔｒｅｇの比率がＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の抗腫瘍有効性に何らかの影響を有するかどうかを判定するために、無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスからＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを分離し、これらをＴＣ−１腫瘍を持つマウスに静脈注射し、引き続いてＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン接種を行った。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７はＴｒｅｇの養子移植なしで、マウス内でのＴＣ−１腫瘍成長を著しく阻害した（図９、ＡおよびＢ）。しかしながら、Ｔｒｅｇを与えられたマウスでは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、ＴＣ−１腫瘍の成長を有意に阻害することができなかった（図９、ＡおよびＢ）。Ｔｒｅｇを受容したマウスは、脾臓内でＴｒｅｇの数のわずかな増加を示したが、腫瘍内ではより大きい減少を示した。一方で、Ｔｒｅｇを受容したマウスは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いてワクチン接種した後、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７対照と比較してより少ないＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有し、Ｔｒｅｇの用紙移植がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を阻害することを示した（図９、ＦおよびＧ）。これらを一緒にして、結果としてＴｒｅｇ受容マウス内のＴｒｅｇ頻度の増加した（図９、Ｃ〜Ｅ）。
【０１５１】
腫瘍抗原に特異的なＣＴＬは、腫瘍細胞を殺すうえで主要な役割を果たし、Ｌｍは、細胞内細菌としてＭＨＣクラスＩ分子と関連付けられた抗原を送達してＣＴＬを活性化することができる。しかしながら、２つのＬｍベースのワクチンである、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７は類似のレベルのＨＰＶ  Ｅ７に特異的なＣＴＬを脾臓内で誘発するにもかかわらず、なぜ異なる抗腫瘍活性を呈し、前者（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）はより強い抗腫瘍効果を誘発するのであろうか（図１、Ａ〜Ｃ、図２、図３）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７誘発性腫瘍退行を無効にするので、ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺すことに関与していることは疑いが無い。Ｅ７発現を欠いているＬｍｄｄＡ−ＬＬＯはＴＣ−１腫瘍の成長を有意に阻害することができなかったので、腫瘍細胞を殺すためにはある特定のレベルの腫瘍抗原特異的ＣＴＬが必要であることも明らかである（図１、Ａ〜Ｃ、および図２）。Ｌｍ−Ｅ７がＴｒｅｇの増加を誘発して宿主免疫応答を抑制し、ひいてはその抗腫瘍免疫性を損なうということが提案されている。しかしながら、発明者らの側では、ＰＢＳ対照と比較してＴＣ−１腫瘍モデル内で実際にＬｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の両方がＴｒｅｇ頻度を減少することを見出した（図１、Ｄ〜Ｈ）。さらにＬｍ−Ｅ７もＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７も、ワクチン接種後にＴＣ−１腫瘍内のＴｒｅｇの総数を有意に増加しないことが見出された（図５）。
【０１５２】
事実、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７とＬｍ−Ｅ７との間の主な違いは、前者はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の際立った増加を誘発することができ、一方で後者は増加をずっと少ない程度まで誘発したことであることが見出された（図５）。これは、なぜＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７がＴｒｅｇパーセンテージをＬｍ−Ｅ７より大きい程度まで減少するかを説明する（図１、Ｄ〜Ｈ）。Ｌｍベクターが、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加するのに十分であることが観察された。しかしながら、切断ＬＬＯのエピソーム性発現によって、ＬｍはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数をより高いレベルまで劇的に増加し、ひいてはＴｒｅｇの頻度をなおさらに減少する（図７）。したがって、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加を誘発するうえでＬＬＯは重要な役割を果たすと考えられる。実際、ＬＬＯはＬ．モノサイトゲネスがファゴソームから脱出するために必要なだけでなく、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を直接的に増殖させるが、その理由はＬｍが細胞質に入ることを可能にするＰＦＯを発現する、ＬＬＯ−マイナス（Δｈｌｙ）Ｌ．モノサイトゲネス株もΔｈｌｙ：：ｐｆｏ株のどちらもＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘発には成功しなかったが、ＬＬＯ発現プラスミドを使用した非溶血性ＬＬＯ突然変異Ｌｍ株の形質転換は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を復元したからである（図６）。ＬｍｄｄＡ内での非溶血性切断ＬＬＯのエピソーム性の発現がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を大いに増強するので、ＬＬＯ誘発性のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、その溶血活性には無関係である（図７）。ＬＬＯによるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方の応答の増殖は抗原非特異的アジュバント効果であるように思われるが、ＬＬＯはこれらの２つの細胞タイプの免疫優勢エピトープも含有する場合がある。実際、初期の研究は、ＬＬＯが２つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（それぞれ残基１８９〜２０１および残基２１５〜２２６）と、１つのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（残基９１〜９９）とを持つことを特定した。
【０１５３】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の優れた抗腫瘍効果は、これがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の著しい増加を誘発するという事実に起因する可能性がある。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の際立った増加を誘発することができないのは、腫瘍の撲滅におけるその非効率性が原因であり、これはＬｍ−Ｅ７単独と比較してＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を劇的に増加したＬｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合わせが、定着ＴＣ−１腫瘍のほぼ完全な退行を誘発したことで示される（図８）。発明者らのデータは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７が誘発したＴｒｅｇ頻度の減少が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加の結果であることを示している。ＴｒｅｇのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞に対する比、またはＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を抑制するために重要である。実際、Ｔｒｅｇの腫瘍を持つマウスへの養子移植に続くＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７のワクチン接種によってインビボのＴｒｅｇ比を増加することは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害し、その結果としてワクチンの抗腫瘍有効性を損なった（図９）。
【０１５４】
選択的にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘発することに加えて、切断非溶血性ＬＬＯは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの抗腫瘍有効性の改善にその他の貢献もする。Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の類似の増殖を誘発したが、これは腫瘍の場合にはあてはまらないことが観察された。切断ＬＬＯ（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７）のエピソーム性の発現により、腫瘍内でより多くのＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘発される傾向があった（図３Ｅ）。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７が、ケモカイン受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３の発現をＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で上方制御することを見出したが、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞上では上方制御せず、Ｔｈ１およびＣＤ８＋Ｔ細胞の輸送のためにはＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３が極めて重要であることを示す。これらの結果は、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３の上方制御を通した、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ抗原特異的細胞の腫瘍微小環境への遊走を、ＬＬＯが誘発することを示唆する。さらに、抗原のＬｍからの効率的な分泌のために切断ＬＬＯが必要であり、またＬｍベクターから分泌されていない抗原は結果としてあまり効果的でない抗腫瘍免疫性の誘発をもたらすことが知られている。したがって、Ｌｍ−Ｅ７ベクターの強力な抗腫瘍活性の欠如は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を効果的に増殖できないことに起因するだけでなく、感染している抗原提示細胞および非効果的な抗原特異的Ｔ細胞応答のプライミングの状況でのＬｍからの抗原の非効率性な分泌にも起因する可能性がある。
【０１５５】
総合的に、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンでの非溶血性切断ＬＬＯのエピソーム性の発現が、ワクチンの抗腫瘍活性を強化するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を選択的に誘発することが実証された。結論としてこの結果は、効果的な抗腫瘍免疫応答を引き起こすためには、ある特定のレベルの抗原特異的ＣＴＬ、ある特定のレベルの非腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＴｒｅｇ比率の減少などの数多くの因子がすべて必要であり、そして本明細書に提供されるリステリア構築体を用いてこれを遂行することができることを示す。さらに、ＬＬＯはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を選択的に誘発し、ひいては全体的にＴｒｅｇ頻度を減少し好ましい免疫応答を支援して腫瘍細胞を死滅させるという点で、この特許はＬＬＯが有望なワクチンアジュバントであることを示している。
【０１５６】
添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を記述してきたが、本発明は厳密に実施形態に限定されず、かつ添付の特許請求の範囲に定義されるように、当業者によって本発明の範囲または趣旨から逸脱することなくこれらに様々な変更および修正がなされてもよいことが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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