(57)【要約】  本発明は、ヘンドラ及びニパ免疫原性組成物及び使用方法に関する。本発明はまた、本発明の免疫原性組成物で予防接種された対象を、ヘンドラ及び／またはニパウイルスに感染した対象から区別する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘンドラ及び／またはニパウイルスＧ糖タンパク質と、免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と、１種以上の賦形剤とを含む免疫原性組成物を投与する方法であって、前記免疫原性組成物は、複数投薬で投与され、さらに、第１の投薬に続いて、前記第１の投薬から少なくとも約２１日後から約４２日後に第２の投薬が行われる、前記方法。
【請求項２】
前記第１の投薬に続いて、前記第１の投薬から２８日後に第２の投薬が行われ、さらにそれに続いて、前記第２の投薬から２８日後に第３の投薬が行われる、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
最終投薬から６ヵ月後にブースター投薬が施される、請求項１または２に記載の前記方法。
【請求項４】
前記ブースター投薬から１年後に、追加の投薬が施される、請求項３に記載の前記方法。
【請求項５】
各投薬は、約５０μｇまたは約１００μｇの可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項６】
対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌまたはネコである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項７】
前記Ｇ糖タンパク質は、ヘンドラウイルス由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項８】
前記Ｇ糖タンパク質は、ニパウイルス由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］
本発明は、ヘンドラウイルス（ＨｅＶ）由来Ｇ糖タンパク質を含む免疫原性及びワクチン組成物、ならびにウマにおける使用方法に関する。本発明はまた、予防接種後の長期間にわたる向上した抗体力価の維持を促進する、改善された投薬計画に関する。
【背景技術】
【０００２】
［０００２］
多数の人間の死亡数をもたらすＮｉＶの反復的な大流行が、近年問題となっている（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４２９，７を参照されたい）。また、ＨｅＶは、人間及び動物を致死させることが知られており、遺伝学的及び免疫学的にＮｉＶに密接に関連している。現在、ニパウイルスまたはヘンドラウイルスによりもたらされる感染または疾患の予防のためのワクチンは、１つしか存在が知られていない（国際公開第２００９／１１７０３５号）。ニパウイルス及びヘンドラウイルスは共に、米国立アレルギー感染病研究所、生物兵器防衛に関するカテゴリーＣの最重要物質である。さらに、これらのウイルスは、動物原性感染症生物学的安全性レベル４物質（ＢＳＬ−４）であるため、安全性を有するワクチン及び／または診断薬の製造は、非常に費用を要し困難である。したがって、ワクチン及び／または診断薬の高スループット製造を可能とする、さらなる改善されたニパウイルスまたはヘンドラウイルスワクチン及び診断薬が必要とされている。
【０００３】
［０００３］
ＨｅＶ及びＮｉＶ等のパラミクソウイルスは、ウイルス粒子のエンベロープ内の２つの主要な膜固定糖タンパク質を有する。一方の糖タンパク質は、宿主細胞上の受容体へのビリオン付着に必要であり、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質（ＨＮ）または赤血球凝集素タンパク質（Ｈ）と呼ばれ、他方は、赤血球凝集もノイラミニダーゼ活性も有さない糖タンパク質（Ｇ）である。付着糖タンパク質は、分子のアミノ（Ｎ）末端が細胞質に向かって配向し、タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端が細胞外であるＩＩ型膜タンパク質である。他の主要な糖タンパク質は、２つの７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）領域及び疎水性融合ペプチドを含有する三量体クラスＩ融合性エンベロープ糖タンパク質である、融合（Ｆ）糖タンパク質である。ＨｅＶ及びＮｉＶは、受容体結合後のそれらの付着Ｇ糖タンパク質及びＦ糖タンパク質の協調作用により、受容性の宿主細胞へのｐＨ依存性膜融合プロセスを介して細胞に感染する。ＨｅＶ及びＮｉＶ付着Ｇ糖タンパク質の主要な機能は、十分特性決定された大多数のパラミクソウイルスにおいてシアル酸部分である、宿主細胞の表面上の適切な受容体に係合することである。ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、宿主細胞タンパク質受容体エフリンＢ２及び／またはエフリンＢ３を利用し、Ｇ糖タンパク質によるウイルス付着をブロックする抗体が開発されている（国際公開第２００６１３７９３１号、Ｂｉｓｈｏｐ（２００８）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８２：１１３９８−１１４０９）。さらに、Ｇ糖タンパク質をＨｅＶ及びＮｉＶ感染に対する免疫防御反応を生成するための手段としても使用するワクチンが開発されている（国際公開第２００９１１７０３５号）。
【０００４】
［０００４］
投薬部位反応性は、ワクチン調製におけるＱｕｉｌ  Ａの動物及びヒトに対する使用の両方において、大きな懸案事項である。このＱｕｉｌ  Ａの毒性を回避するための１つの手法は、免疫刺激性複合体（Ｒａｊｐｕｔ（２００７）Ｊ．  Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｕｎｉｖ．  Ｓｃｉ．Ｂ，８：１５３−１６１）の使用である。これは主に、Ｑｕｉｌ  Ａが、免疫刺激性複合体内に組み込まれた場合に反応性がより低いためであり、これは、複合体内のコレステロールとのその関連が、細胞膜からコレステロールを抽出するその能力、ひいてはその細胞溶解作用を低減するためである。さらに、同様のレベルのアジュバント効果を生成するのに必要なＱｕｉｌ  Ａの量がより少ない。Ｑｕｉｌ  Ａサポニンの免疫調節性、及びこれらのサポニンが免疫刺激性複合体内に組み込まれた場合にそれらから得られる付加的利益は、国際公開第２００００４１７２０号に記載されている。
【０００５】
［０００５］
単一ワクチンにおけるＨｅＶ及び／またはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質と免疫刺激性複合体との組み合わせは、これらの成分が組み合わせて投与された場合の減少したアジュバント副作用を伴う向上した免疫反応性の可能性を考慮すると、効果的なＨｅＶ及びＮｉＶワクチンの開発における進展を意味する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／１１７０３５号
【特許文献２】国際公開第２００６１３７９３１号
【特許文献３】国際公開第２００００４１７２０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｕｔｌｅｒ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４２９，７
【非特許文献２】Ｂｉｓｈｏｐ（２００８）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８２：１１３９８−１１４０９
【非特許文献３】Ｒａｊｐｕｔ（２００７）Ｊ．  Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｕｎｉｖ．  Ｓｃｉ．Ｂ，８：１５３−１６１
【発明の概要】
【０００８】
［０００６］
本発明は、対象への投与後にヘンドラ及び／またはニパウイルスに対する中和抗体の産生を惹起するのに効果的な量で、ヘンドラ及び／またはニパウイルスＧタンパク質と、免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と、１種以上の賦形剤とを含む免疫原性組成物を包含する。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、サポニン、リン脂質、及びステロイドを含む。
【０００９】
［０００７］
いくつかの実施形態において、可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、天然ヘンドラ  Ｇ糖タンパク質（配列番号２）のアミノ酸７３から６０４からなる。いくつかの実施形態において、可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、配列番号１６のヌクレオチド６４から１６６２を含むヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態において、可溶性ヘンドラウイルスＧタンパク質は、二量体形態で存在し、各可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質二量体サブユニットは、１つ以上のジスルフィド結合により接続されている。いくつかの実施形態において、可溶性ヘンドラウイルスＧタンパク質は、四量体形態で存在する。いくつかの実施形態において、四量体形態は、１つ以上のジスルフィド結合により非共有結合的に連結及び／または接続された二量体の二量体として存在する。可溶性ヘンドラウイルスＧタンパク質の濃度は、免疫原性組成物中約５μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌである。
【００１０】
［０００８］
いくつかの実施形態において、サポニンは、シャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）から単離され、またＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、ＱＨ−ＣまたはＱＳ２１から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジン酸（ホスファチジン酸塩）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、ホスホリルコリン（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（Ｃｅｒ−ＰＥ）及びセラミドホスホリルグリセロールからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、サポニンはＱｕｉｌ  Ａであり、リン脂質はＤＰＰＣであり、ステロイドはコレステロールであり、組成物中のＱｕｉｌ  Ａ：ＤＰＰＣ：コレステロールの比は、重量で５：１：１である。
【００１１】
［０００９］
本発明はまた、対象におけるヘンドラ及び／またはニパウイルスに対する中和抗体反応を生成する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物を、中和抗体反応を生成するのに効果的な量及び期間で対象に投与することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、中和抗体反応は、対象におけるヘンドラ及び／またはニパウイルス複製を低減し、また、対象におけるヘンドラ及び／またはニパウイルス排出を低減し得る。いくつかの実施形態において、対象は、まだヘンドラ及び／またはニパウイルスに曝露されておらず、他の実施形態において、対象は、ヘンドラ及び／またはニパウイルス感染に罹患している。いくつかの実施形態において、本発明は、対象におけるヘンドラウイルスに対する中和抗体反応を生成する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物を、中和抗体反応を生成するのに効果的な量及び期間で対象に投与することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象におけるニパウイルスに対する中和抗体反応を生成する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物を、中和抗体反応を生成するのに効果的な量及び期間で対象に投与することを含む方法を包含する。
【００１２】
［００１０］
いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、筋肉内投与される。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は複数回投薬で投与され、第１の投薬に続いて、第１の投薬から少なくとも約２１日から約４２日後に第２の投薬が行われる。いくつかの実施形態において、第１の投薬に続いて、第１の投薬から２８日後に第２の投薬が行われ、さらにそれに続いて、第２の投薬から２８日後に第３の投薬が行われる。いくつかの実施形態において、最終投薬から６ヶ月後にブースター投薬が施される。第３の投薬が施されない実施形態において、第２の投薬が最終投薬である。第３の投薬が施される実施形態において、第３の投薬が最終投薬である。さらなる実施形態において、ブースター投薬から１年後に追加の投薬が施される。いくつかの実施形態において、各投薬は、約５０μｇまたは約１００μｇの可溶性ヘンドラウイルスＧタンパク質を含有する。
【００１３】
［００１１］
本発明は、さらに、本明細書に記載の免疫原性組成物で予防接種された対象を、ヘンドラ及び／またはニパウイルスに曝露された対象から区別する方法であって、対象から単離された生体試料において、融合タンパク質（Ｆ）、基質タンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）からなる群から選択されるＨｅＶ及び／またはＮｉＶウイルスタンパク質のいずれかの少なくとも１つに対する抗体の存在を検出することを含む方法を包含する。
【００１４】
［００１２］
本発明の免疫原性組成物及び方法は、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌまたはネコ等の対象に施すことができる。
【００１５】
［００１３］
本発明はまた、ヒト対象におけるヘンドラ及び／またはニパウイルスに対する中和抗体反応を生成する方法であって、ヘンドラウイルス可溶性Ｇ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、中和抗体反応を生成するのに効果的な量及び期間で対象に投与することを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】［００１４］  図１は、２５０μｇの免疫刺激性複合体で補助された５０または１００μｇ／投薬の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）を投与され、続いて０日目に生きたヘンドラウイルスに曝露されたウマにおける、経時的な直腸温度を示すグラフである。
【図２】［００１５］  図２は、２５０μｇの免疫刺激性複合体で補助された５０または１００μｇ／投薬の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）を投与され、続いて０日目に生きたヘンドラウイルスに曝露されたウマにおける、経時的な心拍数を示すグラフである。
【図３】［００１６］  図３は、免疫刺激複合体の調製のための概略を示す図である。
【図４】［００１７］  図４は、ｓＧＨｅＶ予防接種及びＮｉＶ負荷スケジュールの概略図である。ｓＧＨｅＶ予防接種、ＮｉＶ負荷及び安楽死の日付が、矢印により示されている。示されるように（＊）、負荷後−４２日目、−７日目、０日目、３日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目及び２８日目に血液及びスワブ検体を採取した。灰色文字は、負荷タイムライン（上の行）を示し、黒字は、予防接種タイムライン（下の行）を示す。各ワクチン投薬群内の対象、及び１匹の対照対象のアフリカミドリザル（ＡＧＭ）の番号が示されている。
【図５】［００１８］  図５は、ＮｉＶ感染対象の生存曲線を示す図である。対照対象（ｎ＝２）及びｓＧＨｅＶ予防接種対象（ｎ＝９）からのデータを使用して、カプラン−マイヤー生存曲線を生成した。対照は、１つの追加的な歴史的対照対象からのデータを含んでいた。予防接種された対象は、１０μｇ、５０μｇまたは１００μｇの２回のｓＧＨｅＶ皮下投与を受けた。終末期疾患までの平均時間は、対照対象においては１１日であり、一方全ての予防接種対象は、試験の最後に安楽死させられるまで生存した。
【図６】［００１９］  図６は、予防接種対象におけるＮｉＶ及びＨｅＶ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）を示す図である。予防接種対象から血清及び鼻腔スワブを採取し、ｓＧＨｅＶ及びｓＧＮｉＶ多重ミクロスフェアアッセイを使用して、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ反応を評価した。同じワクチン投薬群（ｎ＝３）における対象からの血清またはスワブを個々に分析し、ミクロスフェア中央蛍光強度（Ｍ．Ｆ．Ｉ．）の平均を計算したが、これはＹ軸上に示されている。エラーバーは、標準誤差を表す。血清ｓＧ特異的Ｉｇは、黒で示され（ｓＧＨｅＶ（白抜きの三角）、ｓＧＮｉＶ（塗りつぶされた三角））、粘膜ｓＧ特異的ＩｇＡは、灰色の記号で示されている（ｓＧＨｅＶ（白抜きの三角）、ｓＧＮｉＶ（塗りつぶされた三角））。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ワクチン及び免疫原性組成物
［００２０］
本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、投与が、予防接種の目的、ならびに／またはＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶの１つ以上の株によるＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶ感染の予防に好適であるように、組成物を投与された、または、ＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶの少なくとも１つの株に対する少なくとも１つの免疫反応の向上に効果的な対象におけるいくつかの液性及び細胞性免疫反応の少なくとも１つを誘発する。本発明の組成物は、それを必要とする対象に、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶからの可溶性Ｇ糖タンパク質を含むＧ糖タンパク質、ならびにアジュバントとして作用する免疫刺激複合体（ＩＳＣ）を送達する。いくつかの実施形態において、Ｇ糖タンパク質の量は、これらに限定されないが、１ｍｌ当たり５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００または２５０μｇを含み、これはまた、１ｍｌ当たり１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００μｇのＩＳＣを含有し得る。いくつかの実施形態において、Ｇ糖タンパク質の量は、１ｍｌ当たり５、５０または１００μｇであり、ＩＳＣの量は、１ｍｌ当たり２５０μｇである。
【００１８】
Ａ．ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｇタンパク質
［００２１］
いくつかの実施形態において、ワクチン及び免疫原性組成物は、本明細書に記載のように、１つ以上のＨｅＶ及び／またはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を含む。タンパク質という用語は、本明細書において、ポリペプチドまたはその断片を含むように広義で使用される。例えば、限定されないが、Ｗａｎｇ（２０００）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７４，９９７２−９９７９において、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質は、可溶性形態であってもよく、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸７３〜６０４を含んでもよい（Ｙｕ（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１，２２７−２３３もまた参照されたい）。また、例として、限定されないが、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  （２０００）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１：３３４−３４９，２０００において、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、可溶性形態であってもよく、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸７１〜６０２を含んでもよい（Ｃｈｕａ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，１４３２−１もまた参照されたい）。
【００１９】
［００２２］
一般に、ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の可溶性形態は、ＨｅＶまたはＮｉＶのＧ糖タンパク質の外部ドメイン（例えば細胞外）の全てまたは一部を含み、また一般に、Ｇ糖タンパク質の膜貫通ドメインの全てまたは一部、ならびにＧ糖タンパク質の細胞質尾部の全てまたは一部を削除することにより生成される。例えば、可溶性Ｇ糖タンパク質は、ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の完全な外部ドメインを含んでもよい。また、例えば、限定されないが、可溶性Ｇ糖タンパク質は、ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の外部ドメインの全てまたは一部、及び膜貫通ドメインの一部を含んでもよい。
【００２０】
［００２３］
本発明の可溶性ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、一般に、対応する天然ウイルス糖タンパク質の１つ以上の特徴、例えば、ウイルス宿主細胞受容体と相互作用もしくは結合して、オリゴマー形態（複数を含む）で生成され得る能力、または、天然Ｇ糖タンパク質を認識することができる抗体（これに限定されないが、ウイルス中和抗体を含む）を惹起する能力を保持する。追加の特徴の例は、これに限定されないが、宿主細胞の感染をブロックまたは予防する能力を含む。特徴の１つ以上に関して可溶性ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を評価するために、従来の方法を利用することができる。
【００２１】
［００２４］
例えば、限定されないが、Ｗａｎｇ（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，９９７２−９９７９において、可溶性ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列の約アミノ酸７３〜６０４をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。また、例えば、限定されないが、Ｗａｎｇ（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，９９７２−９９７９において、可溶性ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド９１２９から１０７２７を含んでもよい。さらに、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質（配列番号２）の約アミノ酸７３〜６０４をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列が利用されてもよい。いくつかの実施形態において、これらのコドン最適化配列は、配列番号１６のヌクレオチド６４から１６６２を含む、またはそれらからなる。さらなる実施形態において、コドン最適化配列は、Ｉｇκリーダー配列をコードするヌクレオチドを含む、配列番号１６を含む、またはそれからなる。
【００２２】
［００２５］
例として、限定されないが、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１，３３４−３４９において、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、可溶性形態であってもよく、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸７１〜６０２を含んでもよい。可溶性ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を構築するために使用され得る配列の限定されない例は、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１，３３４−３４９において見出すことができる。一般に、任意のニパウイルス分離株またはウイルス株からのＧ糖タンパク質配列が、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを誘導するために利用され得る。
【００２３】
［００２６］
例えば、限定されないが、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１，３３４−３４９において、可溶性ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質のアミノ酸配列の約アミノ酸７１〜６０２をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。また、例えば、限定されないが、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１，３３４−３４９において、可溶性ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質のポリヌクレオチド配列の２３４〜２０４２を含んでもよい。さらに、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質のアミノ酸配列の約アミノ酸７１〜６０４をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列が利用されてもよい。
【００２４】
［００２７］
これらのＧ糖タンパク質の機能的均等物が、本発明の免疫原性及びワクチン組成物において使用されてもよい。例えば、限定されないが、機能的に均等なポリペプチドは、以下の特性の１つ以上を有する：ウイルス宿主細胞受容体と相互作用もしくは結合して、二量体もしくは四量体形態（複数を含む）で生成され得る能力、天然Ｇ糖タンパク質を認識することができる抗体（これに限定されないが、ＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶウイルス中和抗体を含む）、ならびに／または、宿主細胞の感染をブロックもしくは予防する能力。
【００２５】
［００２８］
いくつかの実施形態において、Ｇ糖タンパク質は、二量体及び／または四量体形態であってもよい。そのような二量体は、Ｇ糖タンパク質内のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合の形成に依存する。そのようなジスルフィド結合は、ＨｅＶまたはＮｉＶの表面において発現される場合、天然Ｇ糖タンパク質内に形成されるものに対応してもよく（例えば、システインの場所が不変のままである）、または、抗原性を高めるＧ糖タンパク質の異なる二量体及び／もしくは四量体形態を形成するように、Ｇ糖タンパク質の存在もしくは場所において（例えば、アミノ酸配列内のシステイン（複数可）の場所を改変することにより）改変されてもよい。さらに、Ｇ糖タンパク質が数々の立体構造依存性エピトープ（すなわち、三級の３次元構造から生じるもの）を提示すること、及び、多くのそのような自然エピトープの保存が、中和抗体反応を付与するために極めて好ましいことを再び考慮して、非二量体及び四量体形態もまた本発明の範囲内である。
【００２６】
［００２９］
本発明のＨｅＶ免疫原性及びワクチン組成物は、可変長のタンパク質を含有してもよいが、配列番号２のアミノ酸残基７３から６０４を含む。本発明の一実施形態において、本発明のエンベロープタンパク質は、配列番号２（アミノ酸７３から６０４を含む）のＨｅＶ  糖タンパク質と少なくとも約８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。したがって、本発明のＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質は、立体構造エピトープを生成するのに十分な数のアミノ酸を有する天然ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質の免疫原性断片を含む。免疫原性断片の限定されない例は、少なくとも５３０、５３１、５３２、５３３、５３４もしくは５３５またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよいアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質は、配列番号２、またはＩｇκリーダー配列（配列番号１５）をさらに含む合成コンストラクトを含む、またはそれらからなる。
【００２７】
［００３０］
本発明のＮｉＶ免疫原性及びワクチン組成物は、可変長のタンパク質を含有してもよいが、配列番号４のアミノ酸残基７１から６０２を含む。本発明の一実施形態において、本発明のエンベロープタンパク質は、配列番号４（アミノ酸７１から６０２を含む）のＮｉＶ糖タンパク質と少なくとも約８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。したがって、本発明のＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、立体構造エピトープを生成するのに十分な数のアミノ酸を有する天然ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の免疫原性断片を含む。免疫原性断片の限定されない例は、少なくとも５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、もしくは５３３またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよいアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、配列番号４、またはリーダー配列をさらに含む合成コンストラクトを含む、またはそれらからなる。
【００２８】
［００３１］
本明細書に記載のような免疫原性断片は、抗原の少なくとも１つのエピトープを含有し、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶ抗原性を示し、好適なコンストラクトにおいて提示された場合、例えば他のＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶ抗原に融合された場合、または担体上に提示された場合、免疫反応を引き起こすことができ、免疫反応は、天然抗原に対するものである。本発明の一実施形態において、免疫原性断片は、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶ抗原からの少なくとも２０の連続したアミノ酸、例えば、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶ抗原からの少なくとも５０、７５、または１００の連続したアミノ酸を含有する。
【００２９】
［００３２］
ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質実施形態は、天然ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質に対する少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドをさらに含み、前記ポリペプチド配列は、天然ＨｅＶもしくはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質アミノ酸配列と同一であってもよく、または、天然ＨｅＶもしくはＮｉＶ  Ｇタンパク質アミノ酸配列と比較して、ある特定の整数値までのアミノ酸改変を含んでもよく、前記改変は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的及び非保存的置換を含む置換、または挿入からなる群から選択され、前記改変は、参照ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置の間のいずれかの箇所で生じ、参照配列内の、または天然ＨｅＶもしくはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質アミノ酸配列内の１つ以上の連続した群内のアミノ酸間で個々に散在してもよい。
【００３０】
［００３３］
アミノ酸配列レベルでの配列同一性または相同性は、配列類似性検索用に設計された、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘプログラムにより使用されるアルゴリズムを使用したＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアライメント検索ツール）分析により決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２及びＫａｒｌｉｎ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，２２６４−２２６８）。ＢＬＡＳＴプログラムにより使用される手法は、まず、クエリ配列とデータベース配列との間のギャップあり（非連続的）及びギャップなし（連続的）の類似したセグメントを考慮し、次いで、識別される全てのマッチの統計的有意性を評価し、最後に、事前に選択された有意性の閾値を満足するマッチのみを集約することである。配列データベースの類似性検索における基本的問題の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６，１１９−１２９を参照されたい。ヒストグラム、説明、アライメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する報告するマッチの統計的有意性閾値）、カットオフ、行列及びフィルタ（低複雑度）の検索パラメータは、初期設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘにより使用される初期スコア行列は、８５アミノ酸を超える長さにわたるクエリ配列に推奨される、ＢＬＯＳＵＭ６２行列である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０９１５−１０９１９）。
【００３１】
［００３４］
本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、本発明の免疫化方法をさらに強化し得る、異なる株からの追加的なＨｅＶ及び／またはＮｉＶ  Ｇタンパク質をさらに含んでもよい。
【００３２】
Ｂ．免疫刺激複合体
［００３５］
一般に、本発明は、免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と組み合わせたＨｅＶ及び／またはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質エンベロープタンパク質の可溶形態を含む、ワクチン組成物を含む免疫原性組成物、ならびに、対象におけるＨｅＶ及び／またはＮｉＶ感染の予防及び治療にこれらの組成物を使用するための方法を提供する。本発明において、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、アジュバントとして作用する免疫刺激複合体を含む。本明細書において使用される場合、「アジュバント」は、それ自体はいかなる特定の抗原作用も有さないが、免疫系を刺激して抗原に対する反応を増加させることができる薬剤を指す。
【００３３】
［００３６］
ＩＳＣは、それを以下のある特定の用途において理想的なアジュバントとするいくつかの特徴を有する。
【００３４】
［００３７］
抗原の節約：例えばＷｅｅ（２００８）Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，４８９−４９６において言及されているように、抗原の利用可能性が限られている、または抗原の費用が高い場合、ＩＳＣは、１０倍から１００倍という高い抗原の節約を可能とすることが示されている。これは、他のアジュバントと比較して増加した効率またはより適切な作用機序の組み合わせに起因する可能性が最も高い。
【００３５】
［００３８］
交差提示：例えばＳｃｈｎｕｒｒ（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，１２５３−１２５９において言及されているように、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の提示は、通常、２つの経路のうちの１つに従う。外来抗原は、通常、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に関連して、ＡＰＣにより取り囲まれ、次いで処理されてＡＰＣの表面上に再発現される。次いでそれらはリンパ球により認識され得、正しい共刺激因子／信号が存在する場合、適宜反応され得る。自己またはがん抗原及びウイルス抗原は、通常、クラスＩ分子に関連して処理及び発現され得るが、これは、それらがＡＰＣの細胞質内に存在するためである。がん及びウイルス抗原に対する効果的な免疫には、クラスＩ経路へのアクセスが必要である。これは、ウイルス感染または細胞恒常性（内部抗原の細胞交替）の間、自然に発生する。ワクチンとして導入された抗原（ウイルス抗原または自己抗原）は、細胞の外側から細胞の抗原処理機構に、及びクラスＩＩ経路からクラスＩ経路に入る方法を発見することが必要となる。これは、樹状細胞（ＤＣ−スペシャリストＡＰＣ）において自然に生じ得るか、または、アジュバントとしてのＩＳＣと混合された抗原で予防摂取することにより達成され得る。外部由来抗原が抗原提示のクラスＩ経路に入る方法を見出すこのプロセスは、交差提示と呼ばれる。ＩＳＣが抗原の交差提示を達成する正確な機序は完全には明らかになっていないが、ＩＳＣ成分の膜摂動に依存している可能性がある。
【００３６】
［００３９］
液性及び細胞媒介反応：例えば、Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８７，３７１−３７６）において言及されているように、ＩＳＣの作用機序により、適応免疫系の液性及び細胞性アームの両方が関与する。いくつかの種において、これは、このアジュバントを用いた予防接種により刺激されるサイトカインのプロファイルと並行する。インターロイキン−２及びＩＦＮ−ガンマ発現及び細胞内病原体（細菌、原生動物及びウイルス）に対する防御により特徴付けられる１型免疫応答と、インターロイキン−４の発現ならびに抗毒素及び抗病原体関連免疫に対する中和抗体の生成により特徴付けられる２型反応。ＩＳＣは、これらの２つの両極端の間でバランスのとれたサイトカインプロファイルをもたらし、より広範な免疫反応を可能にする。さらに、いくつかの研究では、ワクチンが鼻腔内に送達された場合、ＩＳＣが効果的となり得ることが示されている。これにより、粘膜表面の感作が可能になり、したがって、病原菌進入部位での関連した免疫（この場合では特に関連する免疫）（粘膜免疫）がもたらされる。Ｓｊoｌａｎｄｅｒ（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９，４０７２−４０８０もまた参照されたい。
【００３７】
［００４０］
滅菌濾過性及び一貫性のある製造基準：ＩＳＣ粒子のサイズは通常、直径４０ｎｍであり、後に製剤化される調製物の滅菌に使用されるフィルタを通過することが可能となる。さらに、Ｑｕｉｌ  Ａにおいて見出されるようなトリテルペノイドサポニンがコレステロール及びリン脂質と関連する自然な傾向が、ＩＳＣの製造方法の開発において利用されている。ＩＳＣ粒子を形成しないＱｕｉｌ  Ａ種は、最終生成物から透析により除去される。成分比を制御することにより、Ｑｕｉｌ  Ａサポニンの不均一連続体から一貫した生成物が生成される。偏差により特徴的な４０ｎｍ粒子ではない構造（へリックス、シート等）がもたらされるため、この比は重要である。ＩＳＣコロイドの自由流動性、ならびに透過型電子顕微鏡、ＨＰＬＣ及び他の技術を使用して測定されるその能力により、このアジュバントは放出アッセイ及び他の品質測定法で展開させ易い。
【００３８】
［００４１］
したがって、上記に基づき、いくつかの実施形態において、免疫刺激性複合体の最適な量のＧ糖タンパク質との製剤は、サポニン、リン脂質及びステロイド分子を含む。いくつかの実施形態において、５：１：１の比のサポニン、リン脂質、ステロイド分子のモル比。免疫刺激性複合体は、例えば、５重量％から１０重量％のサポニン、１％から５％のステロイド分子及びリン脂質、ならびにＧ糖タンパク質を含む残部を含有してもよい。Ｇ糖タンパク質は、直接的に、または、タンパク質が免疫刺激性複合体内に組み込まれた後の担体タンパク質（例えば、キメラもしくは融合タンパク質）への化学結合により、免疫刺激性複合体内に組み込まれてもよい。免疫刺激性複合体への言及は、その誘導体、化学的均等物及び類似体に対する言及を含むものとして理解されるべきである。いくつかの実施形態において、ＩＳＣは、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質とは別個に混合され、次いでＧ糖タンパク質がＩＳＣと混合される。いくつかの実施形態において、Ｇ糖タンパク質は、サポニン、リン脂質及びステロイド分子と直接混合される。
【００３９】
［０００１］
好適なサポニンは、トリテルペノイドサポニンを含む。これらのトリテルペノイドは、植物起源の表面活性グリコシドの群を含み、ステロイドまたはトリテルペノイド構造の疎水性領域に関連した親水性領域（通常はいくつかの糖鎖）で構成される共通した化学コアを有する。これらの類似性のため、この化学コアを共通して有するサポニンは、同様の補助特性を有する可能性がある。アジュバント組成物における使用に好適なトリテルペノイドは、これらに限定されないが、キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）、トマチン、朝鮮人参エキス、キノコ、及びステロイドサポニンと構造的に類似したアルカロイドグリコシドを含む、植物由来または合成均等物である多くの源を起源とし得る。
【００４０】
［００４２］
いくつかの実施形態において、本発明における使用のためのサポニンは、Ｑｕｉｌ  Ａ及び／またはその誘導体である。Ｑｕｉｌ  Ａは、南アメリカの樹木であるシャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）から単離されたサポニン調製物であり、最初にＤａｌｓｇａａｒｄ（１９７４）Ｓａｐｏｎｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ，Ａｒｃｈｉｖ．ｆuｒ  ｄｉｅ  ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，Ｖｏｌ．４４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．２４３−２５４によりアジュバント活性を有することが説明された。Ｑｕｉｌ  Ａに関連した毒性を有さないアジュバント活性を保持するＱｕｉｌ  Ａの精製断片（ＥＰ０３６２２７８）、例えばＱＳ７及びＱＳ２１（ＱＡ７及びＱＡ２１としても知られる）が、ＨＰＬＣにより単離されている。ＱＳ２１は、シャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来する天然サポニンであり、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞及び支配的ＩｇＧ２ａ抗体反応を誘発し、本発明に関連した使用のためのサポニンである。ＩＳＣにおける使用に好適な他のサポニンは、これらに限定されないが、Ｑｕｉｌ  ＡのＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃ亜分画、キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）以外の種からのもの、例えばオタネニンジン（Ｐａｎａｘ）属（朝鮮人参）、レンゲ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ）属、イノコズチ（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ）属、ダイズ、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属及びツルニンジン（Ｃｏｄｏｎｏｐｓｉｓ）属からのものを含む。いくつかの実施形態において、サポニンは、キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）以外の種から単離される。
【００４１】
［００４３］
本発明の免疫原性及びワクチン組成物における使用のためのリン脂質の限定されない例は、ジアシルグリセリド構造を有する分子及びリンスフィンゴ脂質を含む。ジアシルグリセリド構造を有するリン脂質の限定されない例は、ホスファチジン酸（ホスファチジン酸塩）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）またはホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む。ジアシルグリセリド構造を有するリン脂質の別の限定されない例は、ホスホイノシチジドを含む。例示的なホスホイノシチジドは、これらに限定されないが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）またはホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）を含む。リンスフィンゴ脂質の限定されない例は、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ−ＰＥ）またはセラミドホスホリルグリセロールを含む。
【００４２】
［００４４］
本発明の免疫原性及びワクチン組成物における使用のためのステロイド分子は、その構造の一部としてステロイドを組み込んだ分子を含む。ステロイド分子の限定されない例は、コレステロール、プレグネノロン、１７−アルファ−ヒドロキシブレグネノロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオール、プロゲステロン、１７−アルファ−ヒドロキシプロゲステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロキシテストロン（ｄｉｈｙｒｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｒｏｎｅ）、デオキシコルチコステロン、１１−デオキシコルチコステロン、コルチゾル、コルチコステロン、アルドステロン、エストロン、エストラジオール、またはエストリオールを含む。
【００４３】
［００４５］
いくつかの実施形態において、免疫刺激性複合体は、これらに限定されないが、典型的には、直径３０〜４０ｎＭの小かご様構造である。いくつかの実施形態において、免疫刺激性複合体の製剤は、５：１：１の比のＱｕｉｌ  Ａ、コレステロール及びホスファチジルコリンのモル比を有する。免疫刺激性複合体は、例えば、５重量％から１０重量％のＱｕｉｌ  Ａ、１％から５％のコレステロール及びリン脂質、ならびにＧ糖タンパク質を含む残部を含有してもよい。Ｇ糖タンパク質は、直接的に、または、タンパク質が免疫刺激性複合体内に組み込まれた後の担体タンパク質（例えば、キメラもしくは融合タンパク質）への結合により、免疫刺激性複合体内に組み込まれてもよい。免疫刺激性複合体への言及は、その誘導体、化学的均等物及び類似体に対する言及を含むものとして理解されるべきである。例えば、免疫刺激性複合体の誘導体への言及は、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレステロール、ホスファチジルコリンまたはタンパク質の１つ以上が、例えば、欠失している、置換されている、またはＱｕｉｌ  Ａ、コレステロール、ホスファチジルコリンもしくはタンパク質に加えてある成分が複合体に付加されている免疫刺激性複合体への言及を含む。免疫刺激性複合体の機能的均等物は、その４つの成分の１つ以上が機能的均等物により置き換えられた免疫刺激性複合体であってもよい。本発明のいくつかの実施形態において、免疫刺激性複合体のＧ糖タンパク質成分が欠失している。この種の免疫刺激性複合体は、本明細書において、タンパク質不含免疫刺激性複合体と呼ばれる。
【００４４】
［００４６］
いくつかの実施形態において、本発明は、これに限定されないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨｅＶ及び／またはＮｉＶの複数の株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘発し得る単離されたＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇタンパク質と、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ及びコレステロールを含むアジュバントとを含む免疫原性組成物を含み、例えば、組成物は、５、５０または１００μｇの可溶性ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇタンパク質と、適切な量のＱｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ、及びコレステロールとを含有する。免疫刺激複合体及びその調製のさらなる例示的実施形態は、欧州特許第０２４２３８０Ｂ１号及び同第０１８０５６４Ｂ１号、ならびに国際公開第２００００４１７２０号（例えば、Ｃｏｘ＆Ｃｏｕｌｔｅｒ（１９９２）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，Ｙｏｎｇ（ｅｄ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄａｌｓｇａｒｄ（１９７４）Ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ，４４，２４３−２５４を参照しているその３ページ目及び９ページ目を参照されたい）；オーストラリア特許明細書第５５８２５８号、同第５８９９１５号、同第５９０９０４号及び同第６３２０６７号にも記載されている。また、米国特許第６，５０６，３８６号に記載の代表的プロトコル、ならびに同文献における、形成される際にタンパク質抗原が免疫刺激複合体に包含される免疫刺激複合体が使用され得る（欧州特許第０１０９９４２Ｂ１号を参照されたい）、または代替として、予め形成された免疫刺激複合体が提供され、これが次いで抗原の別個に添加された一定分量と混合されてワクチンが形成される（欧州特許第０４３６６２０Ｂ１号を参照されたい）という周知の事実への言及も参照されたい。一般的に認識されるように、タンパク質抗原はまた、免疫刺激複合体に共有結合し得る（再びＥＰ０１８０５６４Ｂ１を参照されたい）。また、当該技術分野において十分認識されているように、免疫刺激複合体は、粘膜予防接種により投与されてもよく（Ｍｏｗａｔ（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７２，３１７−３２２を参照されたい）、本発明の免疫刺激複合体は、膜標的化タンパク質の含有により粘膜予防接種用にさらに改善され得る（国際公開第９７３０７２８号）。
【００４５】
［００４７］
いくつかの実施形態において、本発明は、これに限定されないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨｅＶ及び／またはＮｉＶの複数の株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘発し得る単離されたＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇタンパク質と、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ及びコレステロールを含むアジュバントとを含む免疫原性組成物を含み、例えば、組成物は、５、５０または１００μｇの可溶性ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇタンパク質と、適切な量のＱｕｉｌ  Ａ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、及びコレステロールとを含有する。免疫刺激複合体のさらなる例示的実施形態は、国際公開第２００００４１７２０号に記載されている。
【００４６】
［００４８］
本発明の別の実施形態において、ワクチン及び免疫原性組成物は、医薬組成物の一部であってもよい。本発明の医薬組成物は、作用部位への送達のために薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の加工を容易化する賦形剤及び助剤を含む、好適な薬学的に許容される担体を含有してもよい。
【００４７】
Ｃ．賦形剤
［００４９］
本発明の免疫原性及びワクチン組成物は、さらに、薬学的に許容される担体、賦形剤及び／または安定剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００５）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓを参照されたい）を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で含んでもよい。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、特定の用量及び濃度においてレシピエントに対し非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば（（ｏ−カルボキシフェニル）チオ）エチル水銀ナトリウム塩（ＴＨＩＯＭＥＲＳＡＬ）、オクタデシルメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＴＷＥＥＮもしくはＰＬＵＲＯＮＩＣＳ等の非イオン性界面活性剤を含み得る。
【００４８】
［００５０］
本発明の組成物は、用量を保持するのに十分な体積の任意の適切な薬学的ビヒクルまたは担体中に懸濁される用量であってもよい。一般に、担体、アジュバント等を含む最終体積は、典型的には、少なくとも１．０ｍｌである。上限は、投与される量の実用性によって定められ、一般に、約０．５ｍｌから約２．０ｍｌ以下である。
使用方法
［００５１］
本発明は、ヘンドラ及び／またはニパウイルス感染を予防及び／または治療する方法であって、本発明の免疫原性及びワクチン組成物を、任意の哺乳動物対象に投与することを含む方法を包含する。本明細書に記載のアジュバントと共にＨｅＶ及び／またはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質で予防接種することにより惹起される能動免疫は、細胞性または液性免疫反応をプライムまたはブーストすることができる。有効量のＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質またはその抗原断片は、ワクチンを調製するために、アジュバントと混合して調製され得る。
【００４９】
［００５２］
本発明は、ヒト対象におけるヘンドラ及び／またはニパウイルス感染を予防及び／または治療する方法であって、可溶性ＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を含む免疫原性及び／もしくはワクチン組成物、またはそれらの組み合わせを、単独で、またはヒトにおける使用に好適な少なくとも１種のアジュバントと組み合わせて投与することを含む方法を包含する。ヒトにおける使用に好適なアジュバントは、単独で、または組み合わせて使用され得る。ヒトにおける使用に好適なアジュバントの例は、これに限定されないが、アルミニウム塩を含む。アルミニウム塩の例は、これらに限定されないが、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標））、リン酸アルミニウム、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）、または混合アルミニウム塩を含む。ヒトにおける使用に好適なアジュバントのさらなる例は、これらに限定されないが、油中水エマルション、水中油エマルション、及びＡＳ０４（水酸化アルミニウム及びモノホスホリル脂質Ａの組み合わせ）、ならびにＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを含む。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを特定の配列構成（ＣｐＧモチーフ）に含有する合成オリゴヌクレオチドである。これらのＣｐＧモチーフは、哺乳動物ＤＮＡと比較して、細菌ＤＮＡにおいて２０倍高い頻度で存在する。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）により認識され、強力な免疫刺激作用がもたらされる。
【００５０】
［００５３］
本明細書に記載の１種以上のアジュバントと共にＨｅＶ及び／またはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物の投与は、予防目的または治療目的のいずれであってもよい。本発明の一態様において、組成物は、予防目的に有用である。予防用として提供される場合、ワクチン組成物は、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶ感染の任意の検出または症状に先立って提供される。有効量の化合物（複数種可）の予防的投与は、任意のその後のＨｅＶ及び／またはＮｉＶ感染を予防または減弱するのに役立つ。
【００５１】
［００５４］
治療用として提供される場合、ワクチンは、実際の感染の症状の検出後に、有効量で提供される。組成物は、その投与がレシピエントに忍容され得る場合、「薬学的に許容される」と言われる。そのような組成物は、投与される量が生理学的に有意義である場合、「治療または予防有効量」で投与されると言われる。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、その存在が、例えばＨｅＶ及び／またはＮｉＶの１種以上の株に対する広範な反応性を有する液性または細胞性免疫反応を強化することにより、レシピエント患者の検出可能な生理学的変化をもたらす場合、生理学的に有意義である。対照集団に比べて統計的に有意な改善が存在する限り、提供される防御は完全である必要はない（すなわち、ＨｅＶまたはＮｉＶ感染が完全に予防または根絶される必要はない）。防御は、疾患の症状の重症度または発症の急速性を緩和することに限定されてもよい。
【００５２】
［００５５］
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶの複数の株に対する耐性を付与し得る。本明細書において使用される場合、ワクチンは、患者へのその投与により、感染の症状もしくは状態の完全もしくは部分的な減弱（すなわち抑制）、または感染に対する個人の完全もしくは部分的免疫がもたらされる場合、感染を予防または減弱すると言われる。
【００５３】
［００５６］
少なくとも１種の本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載のような医薬組成物を使用して、意図される目的を達成する任意の手段により投与され得る。例えば、そのような組成物の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、または頬粘膜経路等の様々な非経口経路によるものであってもよい。本発明の一実施形態において、組成物は、皮下投与される。非経口投与は、ボーラス注射によるものであってもよく、または、長時間の段階的かん流によるものであってもよい。
【００５４】
［００５７］
能動的な特異的細胞免疫療法による細胞性免疫反応によって軽減され得る疾患または状態の予防、抑制または治療のための典型的な計画は、単回治療として施される、または最長１週間から約２４ヶ月（これらを含む）の期間にわたり増強もしくはブースター用量として反復される、上述のような有効量のワクチン組成物の投与を含む。限定されない例は、第１の投薬に続く、第１の投薬（０日目）から少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４日後の第２の投薬を含む。別の例において、第２の投薬は、第１の投薬から４２日後に施される。さらに別の例において、第２の投薬は、第１の投薬から２８日後に施され、続いて第２の投薬から２８日後に第３の投薬が施される。さらに別の例において、ブースター投薬は、最後の予防接種から６ヶ月後に施され、続いてブースター投薬から１年後に年１回の再予防接種が施される。免疫原性またはワクチン組成物の投薬量は、０日目に施される第１の投薬より少なくてもよく、それと同じでもよく、またはそれより多くてもよい。
【００５５】
［００５８］
本発明によれば、ワクチンまたは免疫原性組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果を、この場合はＨｅＶ及び／またはＮｉＶの１種以上の株に対する細胞性または液性免疫反応の少なくとも１つを達成するのに十分な量である。有効量は、対象の年齢、性別、健康、及び体重、該当する場合には併用治療の種類、治療頻度、ならびに所望の効果の性質に依存することが理解される。以下に記載の有効用量の範囲は、本発明を限定することを意図せず、本発明の組成物の投与に好適となり得る用量範囲の例を表す。しかしながら、用量は、必要以上の実験を行うことなく当業者により理解及び決定され得るように、個々の対象に合わせて設計され得る。
【００５６】
［００５９］
本発明のワクチン及び免疫原性組成物のレシピエントは、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶに対する細胞性または液性免疫反応を介して特定の免疫を獲得し得る任意の対象であってもよく、細胞性反応は、ＭＨＣクラスｉまたはクラスｉｉタンパク質により媒介される。哺乳動物のうち、レシピエントは、霊長目の哺乳動物（ヒト、チンパンジー、類人猿及びサルを含む）であってもよい。本発明の一実施形態において、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物でヒトを治療する方法が提供される。対象は、ＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶに感染していてもよく、または、試験研究の場合のようにＨｅＶもしくはＮｉＶ感染のモデルとなってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、これらに限定されないが、ウマ、雌ウシ、雄ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ブタ（Ｍｉｎｇｙｉ（２０１０）Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４１，３３）、ヤギ、イヌ（Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ａｌｅｒｔ−Ｈｅｎｄｒａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｕｐｄａｔｅ，２７  Ｊｕｌｙ  ２０１１，Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）またはネコを含む、飼い慣らされた哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ニワトリを含む家禽類である。
【００５７】
［００６０］
本発明のワクチンはまた、ヘンドラウイルスに対する防御に使用される用量でのニパウイルス感染に対する交差防御も提供し、したがって、ニパウイルスに対する効果的な予防接種も提供する。
【００５８】
［００６１］
効果的な免疫反応への言及は、有益な予防または治療効果を直接的または間接的にもたらす免疫反応への言及として理解されるべきである。免疫原が本明細書に記載のようなＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を含む場合、そのような反応は、ウイルス複製及び／もしくはウイルス排出の低減またはブロック、ならびに／または動物における疾患症状の低減を含む。有効性は機能に関する尺度であり、循環抗体の存在だけでは、前記循環抗体がウイルス複製及び排出をブロックする能力が必ずしも示されるわけではないことから、抗ＨｅＶ及び／または抗ＮｉＶ抗体力価に言及するだけでは規定されないことが理解されるべきである。
【００５９】
［００６２］
また、例えば、限定されることなく、本発明の可溶性Ｇタンパク質ポリペプチドが、ヘンドラもしくはニパに感染した、またはその感染が疑われる対象における免疫反応を増大させるために投与されている場合、及び／あるいは、本発明の抗体が、受動免疫療法の形態として投与されている場合、組成物は、例えば、他の治療薬剤（例えば抗ウイルス薬剤）をさらに含んでもよい。
【００６０】
［００６３］
後述の実施例４は、予防接種を受けるウマにおいて使用するためのある特定の好ましい組成物に関する情報を提供する。ヘンドラウイルスに感染している可能性があり、したがってヘンドラ及びニパウイルス感染の両方から動物を、ひいてはヒトを防御するために予防接種を認容する他の動物に関しては、一般に以下の情報が適用され、当業者によって容易に適合され得る。一般的に言えば、コンパニオンアニマル（イヌ及びネコ）は、約２５マイクログラムのヘンドラ抗原を認容し、２５〜１５０マイクログラムの範囲内のＩＳＣアジュバントから利益を得ることができ、５：１：１の比のサポニン、リン脂質及びステロールが好ましいＩＳＣ組成物の１つであるが、本明細書において開示されるような成分種のいずれかが使用される。コンパニオンアニマルにおいて、最終用量が約１ｍｌであることが好ましい。コポリマー系アジュバントであるＰｏｌｙｇｅｎ（商標）（ＭＶＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）もまた、好ましくは約５〜１５％（ｖ／ｖ）で使用され得る。
【００６１】
［００６４］
一般的に言えば、より大型の家畜（ヒツジ、ウシ、ブタ等）では、本明細書において別様にウマに対して指定される抗原及びアジュバント投薬（及び最終投薬体積）量が適用可能であり、すなわち、５０〜１００マイクログラムの抗原、典型的には約２５０マイクログラムのＩＳＣが使用され得、最終体積は例えば１〜３ｍｌである。ブタに関しては、代替及び効果的なアジュバント製剤は、（ほぼ同量の抗原に対して）１〜３ｍｌの最終投薬体積中にＩＳＣ及びイオン性多糖類、具体的には１００ｍｇのＤＥＡＥデキストラン及び８００マイクログラムのＩＳＣのブレンドを含む（同じく５：１：１のＱｕｉｌ  Ａ：ホスファチジルコリン：コレステロール（国際公開第２０００／４１７２０号を参照されたい））。
【００６２】
予防接種された動物の区別
［００６５］
本発明はまた、健常な予防接種された動物を、ＨｅＶ及び／もしくはＮｉＶに曝露された、または感染した動物から区別する方法を包含する。ウイルス感染の間、ＨｅＶ及びＮｉＶは、融合タンパク質（Ｆ）、基質タンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）を含む、Ｇ糖タンパク質（Ｇ）以外の追加的なタンパク質を発現する。これらの追加的なタンパク質は、これらのタンパク質またはＴ細胞免疫に結合する抗体の形態で、動物における免疫反応を誘発する可能性を有する。これらの他のタンパク質に対する抗体反応のレベルは、通常、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）等のアッセイにより測定され得る。本発明の免疫原性及びワクチン製剤は、いくつかの実施形態において、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶ抗原としてＧ糖タンパク質のみを含有し、したがって、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶのＧ糖タンパク質のみに対する抗体による免疫反応を誘発する。その後ＨｅＶまたはＮｉＶにより感染される本明細書に記載の免疫原性組成物で予防接種された動物は、Ｇ糖タンパク質に対してブースター免疫反応を開始するが、Ｇ糖タンパク質以外のいくつかの他のＨｅＶ及びＮｉＶタンパク質に対する抗体提示の変化も示す。したがって、融合タンパク質（Ｆ）、基質タンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）のいずれかに対する抗体の存在は、血清試料中のこれらのタンパク質に特異的な抗体の存在または非存在を決定するためのＥＩＡにおいて測定され得る。これらの他のタンパク質（すなわち、Ｇ糖タンパク質以外のタンパク質）のいずれかに対する抗体が検出される場合は、動物は、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶに曝露されている。代替として、これらの他のタンパク質に対する抗体が発見されず、Ｇタンパク質に結合する抗体のみが見出される場合は、動物は予防接種を受けただけである。
【００６３】
［００６６］
本発明のＥＩＡは、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶに感染した動物と、本明細書に記載の免疫原性組成物で予防接種された健常動物との間の検出及び区別において極めて特異的であると共に、極めて選択的でもある。本発明は、均一及び不均一環境の両方において、ＥＬＩＳＡを含む様々なアッセイ手順を利用し得る。アッセイ手順は、血液、血清、乳、または抗体を含有する任意の他の体液等の試料に対して行うことができる。
【００６４】
［００６７］
いくつかの実施形態において、ＥＩＡにおいて使用される抗体は、Ｇ糖タンパク質での予防接種により誘発された抗体のみと競合し得るが、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶの感染により動物において誘発された抗体とは競合しない。これにより、ＨｅＶ及びＮｉＶ感染の血清学的診断だけでなく、１回のアッセイでの予防接種と感染との区別が可能になる。ＥＩＡ手順は、標準的な血液血清試料、または抗体を含有する任意の体液もしくは分泌物に対して行うことができる。ＥＩＡ手順は、Ｇ糖タンパク質ならびに任意の他のＨｅＶ及び／またはＮｉＶウイルスタンパク質（例えば、融合タンパク質（Ｆ）、基質タンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）であり、そのようなタンパク質はＨｅＶ及び／またはＮｉＶに曝露されていない予防接種された健常動物においては存在しないため）に対するモノクローナル及び／またはポリクローナル抗体を使用し得る。ＥＩＡは、任意の数の市販の固定または携帯式の手動型、半自動型またはロボット工学的自動型のＥＬＩＳＡ機器において、コンピュータ支援データ分析軽減ソフトウェア及びハードウェアを用いて、または用いずに行うことができる。いくつかの実施形態において、健常な予防接種された動物を、ＨｅＶ及び／またはＮｉＶに曝露された、または感染した動物から区別する方法は、これらに限定されないが、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌまたはネコを含む飼い慣らされた哺乳動物から単離された生体試料に対して行うことができる。いくつかの実施形態において、対象は、ニワトリを含む家禽類である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
【実施例】
【００６５】
［００６８］
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態のみを例示し、実施形態の全てを例示しているわけではなく、したがって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６６】
実施例１：ベクターコンストラクト
［００６９］
ベクターは、膜貫通／細胞質尾部欠失ＨｅＶ  ＧまたはＮｉＶ  Ｇを発現するように構築した。全長ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇタンパク質のクローンｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、膜貫通ドメイン／細胞質尾部欠失ＨｅＶまたはＮｉＶ  Ｇタンパク質をコードする約２６００のヌクレオチドの断片を生成した。
【００６７】
［００７０］
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＨｅＶ  Ｇの増幅のために合成した。ｓＨＧＳ：５’−ＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＡＧＡＡＣＧＡＣＴＧＡＴＡＡＴ−３’（配列番号５）。ｓＨＧＡＳ：５’−ＧＴＴＴＡＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号６）。
【００６８】
［００７１］
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＮｉＶ  Ｇの増幅のために合成した。ｓＮＧＳ：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡ−３’（配列番号７）。ｓＮＧＡＳ：５’−ＣＴＣＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号８）。
全てのＰＣＲ反応は、以下の設定でＡｃｃｕｐｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＧＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ  Ｃｏｒｐ）を使用して行った：最初に９４℃で５分間、次いで９４℃で１分間、５６℃で２分間、７２℃で４分間を２５サイクル。これらのプライマーは、Ｓａｌ  １部位が隣接するｓＨｅＶ  Ｇ  ＯＲＦ及びＸｈｏ  １部位が隣接するｓＮｉＶ  Ｇ  ＯＲＦのためのＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物をゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。ゲル精製後、ｓＨｅＶ  Ｇ及びｓＮｉＶ  Ｇを、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。
【００６９】
［００７２］
ＰＳｅｃｔａｇ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を購入し、Ｓ−ペプチドタグまたはｍｙｃ−エピトープタグを含有するように改質した。Ｓ−ペプチドならびに消化Ｋｐｎ  １及びＥｃｏＲ１オーバーハングの配列をコードする、重複オリゴヌクレオチドを合成した。
ＳＰＥＰＳ：５’−ＣＡＡＧＧＡＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴ−３’（配列番号９）。ＳＰＥＰＡＳ：５’ＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＡＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＡＣ−３’（配列番号１０）。
【００７０】
［００７３］
ｍｙｃ−エピトープタグならびに消化Ｋｐｎ  １及びＥｃｏＲ１オーバーハングの配列をコードする、重複オリゴヌクレオチドを合成した。
ＭＴＳ：５’−ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１１）。ＭＴＡＳ５’−ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＧＴＡＣ−３’（配列番号１２）。
【００７１】
［００７４］
６４ρｍｏｌのＳＰＥＰＳ及び６４ρｍｏｌのＳＰＥＰＡＳを混合し、６５℃まで５分間加熱し、５０℃に徐々に冷却した。６４ρｍｏｌのＭＴＳ及び６４ρｍｏｌのＭＴＡＳを混合し、６５℃まで５分間加熱し、５０℃に徐々に冷却した。２つの混合物を希釈し、Ｋｐｎ１−ＥｃｏＲ１消化ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂにクローニングして、Ｓ−ペプチド改質ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂまたはｍｙｃ−エピトープ改質ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂを生成した。全てのコンストラクトを、ます制限酵素消化によりスクリーニングし、さらに配列決定により検証した。
【００７２】
［００７５］
ＴＯＰＯ  ｓＧコンストラクトを、Ｓａｌ  １ゲル精製（Ｑｉａｇｅｎ）で消化し、Ｓ−ペプチド改質ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂまたはｍｙｃ−エピトープ改質ｐＳｅｃＴａｇ２ＢのＸｈｏ  １部位にインフレームでサブクローニングした。全てのコンストラクトを、まず制限酵素消化によりスクリーニングし、さらに配列決定により検証した。
【００７３】
［００７６］
次いで、Ｉｇκリーダー−Ｓ−ペプチド−ｓＨｅＶＧ（ｓＧＳ−ｔａｇ）及びＩｇkリーダー−ｍｙｃタグ−ｓＨｅＶＧ（ｓＧｍｙｃ−ｔａｇ）コンストラクトを、ワクシニアシャトルベクターｐＭＣＯ２にサブクローニングした。オリゴヌクレオチドＳＥＱＳ：５’−ＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡ−３’（配列番号１３）を合成し、オリゴヌクレオチドｓＨＧＡＳと組み合わせて使用して、ＰＣＲによりｓＧＳ−ｔａｇ及びｓＧｍｙｃ−ｔａｇを増幅した。全てのＰＣＲ反応は、以下の設定でＡｃｃｕｐｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＧＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ  Ｃｏｒｐ）を使用して行った：最初に９４℃で５分間、次いで９４℃で１分間、５６℃で２分間、７２℃で４分間を２５サイクル。これらのプライマーは、Ｓａｌ  １部位が隣接するＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物をゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。ゲル精製後、ｓＧＳ−ｔａｇ及びｓＧｍｙｃ−ｔａｇを、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ｓＧ  Ｓ−タグ及びｓＧ  ｍｙｃ−タグを、Ｓａｌ  １で消化し、ｐＭＣＯ２のＳａｌ  １部位にサブクローニングした。全てのコンストラクトを、まず制限酵素消化によりスクリーニングし、さらに配列決定により検証した。その後、配列番号１６で示される真核細胞株における産生を促進するために、コドン最適化ヌクレオチド配列を生成した。
【００７４】
［００７７］
Ｃｈｒｏｍｏｓ人工染色体発現（ＡＣＥ）系を使用したＣＨＯ細胞におけるヘンドラｓＧタンパク質の発現のために、ヘンドラｓＧタンパク質のＤＮＡコード化を、製造者の指示に従い、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＰＣＲにより増幅した。鋳型は、ｐＣＤＮＡ  ヘンドラｓＧ（Ｓ−ペプチドタグなし）であった。ＤＮＡを増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧ−３’（配列番号１８）及び５’−ＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧ−３’（配列番号１９）であった。断片のゲル精製は、製造者の指示に従い、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。次いで、ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、ライゲーション混合物を、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｍａｘ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。陽性形質転換体からのＤＮＡを精製し、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶを使用してｓＧ挿入体を切断し、ＡＣＥ系標的化ベクター（ＡＴＶ）であるｐＣＴＶ９２７にライゲーションした。次いで、ライゲーション反応物を、大腸菌ＯｍｎｉＭａｘ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。陽性クローンの識別後、ｐＣＴＶ９２７／ヘンドラｓＧ  Ｔ１プラスミドを単離し、次いで配列決定により挿入体を確認した。
【００７５】
実施例２：ＣＨＯ細胞を使用した可溶性Ｇタンパク質のタンパク質産生
［００７８］
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓからのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＣｈＫ２細胞を解凍し、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び６ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含む滅菌１２５ｍｌフラスコに移し、継代に供した。トランスフェクションの１時間前に、培養培地を除去し、新鮮なＣｈＫ２接着培養培地で置換した。ｐＣＴＶ９２７／ヘンドラｓＧ  Ｔ１プラスミドを単離し、エタノール沈殿させ、０．８５μｇ／μＬの濃度まで再懸濁させた。ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、製造者の指示に従い、接着細胞をＡＣＥ  Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ（ｐＳＩ０３４３）ならびにｐＣＴＶ９２７／ヘンドラｓＧ  Ｔ１及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で共トランスフェクトした。ＡＣＥ  Ｉｎｔｅｇｒａｓｅは、バクテリオファージラムダＤＮＡから増幅されたが哺乳動物発現用に最適化されたインテグラーゼ遺伝子からなる。新鮮なＣｈＫ２接着培地を用い、３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養物をインキュベートした。翌日、培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで慎重に洗浄し、続いて２ｍＬのトリプシン溶液を添加して細胞を分離させ、さらに４ｍＬの新鮮なＣｈＫ２接着培地を添加した。次いで、細胞を９６ウェルプレート内での制限的な連続希釈に供し、続いて、２ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンによる選択を行い、２４時間後に９６ウェルプレート内に堆積させた。
【００７６】
［００７９］
１７日間の慎重なモニタリングの後、８０の個々のトランスフェクトされたクローンを選択し、６ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する１ｍｌのＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（維持選択培地）を含む２４ウェルプレート内に分注した。４日後、クローンを、以下に示すように維持選択培地を含む新たな２４プレートに分割した。５００マイクロリットル（μＬ）の懸濁培養物を各発現フラスコから取り出し、５００×ｇで５分間遠心分離した。上澄みを取り出し、清浄な新しい管に移し、−２０℃で凍結した。全ての上清を後に解凍し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供した。各試料に対して２組を、一方はゲル染色に、他方はウェスタンブロット分析に供した。ｉＢｌｏｔ（登録商標）ゲル移送デバイス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、第２の組のゲルをニトロセルロース上に移した。抗Ｇタンパク質ポリクローナル抗体を一次抗体として使用し、続いてペルオキシダーゼコンジュゲート親和性精製抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用した。次いで、ブロットを、ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）の添加により展開した。Ｇタンパク質の発現が確認された。
【００７７】
実施例３：ワクシニアを使用した可溶性Ｇタンパク質のタンパク質産生
［００８０］
タンパク質産生のために、コドン最適化配列を含有する遺伝子コンストラクトを使用して、組換えポックスウイルスベクター（ワクシニアウイルス、ＷＲ株）を生成した。次いで、ｔｋ選択及びＧＵＳ染色を使用した標準的技術を使用して、組換えポックスウイルスを得た。簡潔に説明すると、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＣＶ−１細胞をｐＭＣＯ２  ｓＨｅＶ  Ｇ融合体またはｐＭＣＯ２  ｓＮｉＶ  Ｇ融合体でトランスフェクトした。次いで、これらの単層を、ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）野生株に、０．０５ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。２日後、細胞ペレットを粗組換えウイルスストックとして回収した。ＴＫ−細胞を、２５μｇ／ｍｌの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で組換え粗ストックに感染させた。２時間後、ウイルスを、１％の低融点（ＬＭＰ）アガロース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びμｇ／ｍｌのＢｒｄＵを含有するＥＭＥＭ−１０オーバーレイで置換した。２日間のインキュベーション後、１％のＬＭＰアガロース、２５μｇ／ｍｌのＢｒｄＵ、及び０．２ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧＬＵＣ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有する追加のＥＭＥＭ−１０を添加した。２４〜４８時間以内に、青色のプラークが明らかとなり、これを採取して、二重選択プラーク精製にさらに２回供した。次いで、組換えワクシニアウイルスｖＫＢ１６（ｓＨｅＶ  Ｇ融合体）及びｖＫＢ２２（ｓＮｉＶ  Ｇ融合体）を増幅し、標準的方法により精製した。簡潔に説明すると、組換えワクシニアウイルスを、プラーク精製、細胞培養増幅、超遠心分離でのショ糖クッションペレット化、及びプラークアッセイによる滴定によって精製する。ｓＨｅＶ  Ｇの発現は、細胞溶解物及び培養上澄みにおいて検証した。
【００７８】
実施例４：２９３Ｆ細胞を使用した可溶性Ｇタンパク質のタンパク質産生
［００８１］
コドン最適化配列を含有する遺伝子コンストラクトを使用して、２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、ＨｅＶ可溶性Ｇ糖タンパク質を発現する安定な細胞株を生成した。ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もまた、ＨｅＶ可溶性Ｇ糖タンパク質の形質転換及び発現に使用され得る。形質転換された細胞を、３５ｍｌのＤＭＥＭ−１０を含む１６２ｃｍ２組織培養フラスコに播種する。細胞を接着させ、３７℃、５〜８％ＣＯ２下で数日間増殖させた。細胞がコンフルエントになったら、１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭ−１０を有する複数のフラスコ（フラスコ当たり３０ｍｌ）に分割した。細胞が７０〜８０％コンフルエントになったら、３０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、次いで、２０ｍｌの２９３  ＳＦＭ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、細胞を、３７℃、５〜８％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、２００ｍｌのＳＦＭ  ＩＩ培地を有する三角フラスコに移した。細胞を、３７℃、５〜８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍで５〜６日間、細胞が死滅し始めるまで増殖させた。その時点で、上澄みを回収する。
【００７９】
［００８２］
各三角フラスコからの培地を、３，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。次いで、上澄みを２５０ｍｌの遠心ボトルに移し、１０，０００ｒｐｍで１時間回転させた。得られた上澄みを回収し、製造者の推奨に従ってプロテアーゼ阻害剤をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に添加し、最終濃度を０．１％とする。次いで、上澄みを、０．２μｍの低タンパク質結合フィルタ膜を通して濾過する。
【００８０】
［００８３］
Ｓ−タンパク質アガロース親和性カラムを使用して、ＨｅＶｓＧを精製する。総体積２０ｍｌのＳ−タンパク質アガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、ＸＫ  ２６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填する。カラムを、総体積の１０倍の結合／洗浄緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で洗浄する。調製されたＨｅＶ  ｓＧの上澄みをカラムに投入し、３ｍｌ／分の流速を維持する。カラムを、総体積の１０倍（２００ｍｌ）の結合／洗浄緩衝液Ｉで洗浄し、続いて、総体積の６倍（１２０ｍｌ）の洗浄緩衝液１×洗浄緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、及び２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄する。
【００８１】
［００８４］
次いで、ポンプを止め、ビーズ表面に達するまで洗浄緩衝液を排出させたら、３０ｍｌの溶出緩衝液（０．２Ｍのクエン酸、ｐＨ２）を添加する。最初の１０ｍｌの流出分（これはまだ洗浄緩衝液であるはずである）を回収し、次いで、溶出緩衝液を、ビーズと共に１０分間インキュベートする。次に、１５ｍｌの溶出液を、２５ｍｌの中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８）を含む５０ｍＬの滅菌円錐遠心管に回収する。ｐＨを中性に調節し、溶出及びインキュベーションを３回繰り返す。中和された溶出液を全て組み合わせ、約４ｍｌに濃縮する。回収したＨｅＶ  ｓＧ（４ｍｌ）を、０．２μｍの低タンパク質結合フィルタ膜（０．２μｍ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅを備えるＡｃｒｏｄｉｓｃ  １３ｍｍ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ）を通して精製する。
【００８２】
［００８５］
ゲル濾過を利用して、ＨｅＶ  ｓＧをさらに精製することができる。品質管理分析、ならびに純度及びオリゴマー状態の確認後、四量体＋二量体、二量体、及び単量体の一定分量のＨｅＶ  ｓＧプール分画を、−８０℃で保存する。
【００８３】
実施例５：ＣＨＯ  ＨｅＶ  ｓＧタンパク質のガンマ線照射
［００８６］
ＣＨＯ  ＨｅＶマスター細胞シードストックを解凍し、４回連続継代により、振盪フラスコ内で拡大した。採取した材料を、８×１０６細胞／ｍｌの最終細胞密度まで、バイオリアクタ内で３回連続継代によりさらに拡大した。遠心分離により細胞を除去した（代替として、これは深層ろ過により行われてもよい）。次いで、得られた清浄化ＨｅＶ  ｓＧ培養材料を、０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度までアスコルビン酸と混合し、５０ｋＧｒａｙの蓄積線量でＣｏ−６０ガンマ照射源に供した。
【００８４】
実施例６：ワクチン製剤の調製
［００８７］
ＩＳＣの調製を要約した概略を図３に示し、さらに以下で説明する。
【００８５】
［００８８］
ステップ１：９０ｇ／Ｌのデカノイル−ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ−１０洗剤）の溶液を、注射用水（ＷＦＩ）で調製する。溶液を加熱して、Ｍｅｇａ  １０を確実に完全溶解させ、次いで、すぐにステップ２で使用するか、または滅菌濾過する。
【００８６】
［００８９］
ステップ２：２５ｇ／Ｌのコレステロール及び２５ｇ／Ｌのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含有する溶液を、これらの成分をＭｅｇａ  １０洗剤のストック溶液中に溶解することにより調製する。溶液を加熱して全ての成分を溶解させ、次いですぐにステップ３で使用するか、または滅菌濾過する。
【００８７】
［００９０］
ステップ３：等張緩衝生理食塩水、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．２±１（ＢＩＳ）を、ＷＦＩで調製し、すぐに使用しない場合は滅菌濾過する。
【００８８】
［００９１］
ステップ４：Ｑｕｉｌ  Ａを、ＢＩＳ中で１００ｇ／Ｌの最終濃度に調製し、すぐに使用しない場合は滅菌濾過する。
【００８９】
［００９２］
ステップ５：予熱されたＢＩＳ、Ｍｅｇａ−１０溶液中のコレステロール／ＤＰＰＣ（１６０ｍｌ／Ｌ）、及びＱｕｉｌ  Ａ溶液（２００ｍｌ／Ｌ）を順次添加することにより、ＩＳＣを撹拌された温度制御槽（２２〜３７℃）内で製剤化する。ＢＩＳを添加することにより、反応物を標的体積とする。
【００９０】
［００９３］
ステップ６：製剤全体を、必要とされる温度（標的温度２７℃、許容される動作温度範囲２２〜３７℃）に平衡化し、次いで、撹拌しながら１５分間インキュベートして、ＩＳＣの製剤化を促進する。ＩＳＣ溶液をステップ７においてさらに処理するか、または中間的保存のために滅菌濾過する。
【００９１】
［００９４］
ステップ７：複合化していない成分を除去するために、ＩＳＣ反応混合物を、温度制御（標的温度２７℃、許容される動作温度範囲２１〜３７℃）下で、ＢＩＳに対し最小で２０回の体積交換での透析（膜：Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ））により洗浄する。
【００９２】
［００９５］
ステップ８：透析されたＩＳＣを、透析に使用した膜と同じ膜を使用した限外濾過により約２倍に濃縮する。濾過系をＢＩＳで濯ぎ、ＩＳＣを元の体積に戻す。
【００９３】
［００９６］
ステップ９：０．２２μｍの酢酸セルロースフィルタを通した滅菌濾過を介して、ＩＳＣを滅菌保存容器に移す。
【００９４】
［００９７］
ステップ１０：ＩＳＣアジュバントを、ワクチン製剤における使用のために放出されるまで、２〜８℃で保存する。
【００９５】
［００９８］
次いで、免疫刺激組成物（２５０μｇ／ｍｌ）を、適切な量の可溶性ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質（例えば、５、５０、１００μｇ／ｍｌ）と組み合わせ、ＢＩＳで体積を調節する。
【００９６】
実施例７：ウマにおける第１の臨床実験
［００９９］
試験ワクチン１：２５０μｇの免疫刺激性複合体で補助された１００μｇ／用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）；体積は生理食塩水で１ｍｌ／用量に調節される。
【００９７】
［００１００］
試験ワクチン２：２５０μｇの免疫刺激性複合体で補助された５０μｇ／用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）；体積は生理食塩水で１ｍｌ／用量に調節される。
【００９８】
［００１０１］
試験ワクチン３：２５０μｇの免疫刺激性複合体で補助された５μｇ／用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）；体積は生理食塩水で１ｍｌ／用量に調節される。
【００９９】
［００１０２］
ウマからの血清学的及び負荷防御データを、より高いレベルの抗原を含有するワクチン（５０μｇ／用量及び１００μｇ／用量）が与えられた２ロットのウマから収集した。
【０１００】
［００１０３］
血清学的検査：２頭のウマをそれぞれ、２１日の間隔をあけた２回のワクチン投薬（１００μｇ  ｓＧ及びＩＳＣ）で免疫化した。プライミング後及び負荷前の血清学的検査では、ＨｅＶに対するワクチン誘発血清転換が確認された（表１）。負荷前のウイルス中和抗体レベルは、さもなくば致死量である近縁のニパウイルスに曝露されたネコにおいて防御効果があることが見出された抗体レベルに匹敵するものであった。アジュバントのみが与えられたウマ（陰性対照）は、ウイルス負荷前にＨｅＶに対する抗体を生じなかった。
【０１０１】
【表１】
2017501162.tif 000002
【０１０２】
［００１０４］
したがって、それぞれのウマを、ブースター免疫化を受けさせてから２７日後、ＢＳＬ４封じ込め施設で生きたＨｅＶに曝露させた。ウイルスを鼻腔内投与（１×１０６  ＴＣＩＤ５０）及び経口投与（１×１０６  ＴＣＩＤ５０）した。負荷の時点、及びその後の観察期間の間、対照ウマの素性は、作業のこの部分に関与するスタッフには知らされなかった。
【０１０３】
［００１０５］
Ｖ１の臨床観察結果：このウマは、ＨｅＶへの曝露後の観察期間の間、負荷後８日目に認められた留置頸静脈カテーテルの入口部位での局所的な感染以外、臨床的に良好な状態を維持した。これは、いかなる疾患の構成的な兆候にも関連していなかった。ウマは、ウイルス負荷後９日目に選択的に安楽死させた。全体的な死後の検査での異常は、１０ｃｍの腸間膜脂肪腫（偶発的所見）、ならびにバルビツール酸塩に起因する左肺心葉の腹面先端におけるリンパ管の軽度の拡張に限定されていた。組織の初回スクリーニングでは、このウマにおいて、病変またはＨｅＶ抗原の痕跡は発見されなかった。
【０１０４】
［００１０６］
Ｖ２の臨床観察結果：このウマは、３日目に一時的な軽度の鼻漏を示したが、その後その他は良好な状態を維持したものの、６日目に留置頸静脈カテーテル部位における局所的な炎症反応に関連した体温上昇を示した。カテーテルを除去したが、病変は拡大を続け、ウマはかなりの興奮状態となったため、翌日（ｄ７）、その雌ウマを長期作用型ペニシリンで処置した。８日目には、体温及び気性の両方が通常に戻り、そのウマを選択的に安楽死させた。全体的な死後の検査での異常は、バルビツール酸塩に起因する右肺心葉の腹面先端におけるリンパ管の軽度の拡張に限定されていた。組織の初回スクリーニングでは、このウマにおいて、病変またはＨｅＶ抗原の痕跡は発見されなかったが、詳細な検査が現在完了しつつある。
【０１０５】
［００１０７］
Ｖ３の臨床観察結果：このウマは、４日目に一時的な軽度の鼻漏を示したが、その後その他は良好な状態を維持したものの、６日目に局所的な兆候を有さない体温上昇を示した。このウマの心拍数もまた上昇し、皮膚にわずかなテンティングがあり、これは軽度の脱水症状及びめくれ上がったような（ｔｕｃｋｅｄ−ｕｐ）外観に一致した。この一連の兆候は、我々の実験室条件下での急性ＨｅＶ感染に典型的なものであった。ウマの体温及び心拍数はその後１２時間にわたり上昇し続け（図１及び２）、ウマは軽い抑鬱となったため、７日目に人道的理由によりウマを安楽死させた。死後の検査では、肺の心葉におけるリンパ管の中等度の拡大が見られ、また胸膜肥厚及び浮腫が付随する８〜１０ｃｍ腹部の関与があった。
【０１０６】
［００１０８］
組織学的検査において、血管壁のフィブリノイド壊死を伴う肺血管炎、小葉間隔壁の浮腫、及び巣状壊死性肺胞隔炎が見られた。肺の血管の内皮及び中膜；髄膜；脳柔組織；三叉神経節；顎下、気管支、鼠径部及び腎リンパ節；脾臓；肝臓；心臓；軟口蓋；副腎；腎糸球体；小腸及び大腸；卵巣；咽頭及び鼻甲介、ならびに脾臓の胚中心、及び時に心筋細胞にＨｅＶ抗原の過剰な沈着が見られた。脊髄、喉嚢、膀胱、及び脳の嗅葉は陰性であった。組織学的及び免疫組織学的に最急性ＨｅＶ感染と一致するものであった。
【０１０７】
［００１０９］
臨床試料の分子解析。臨床観察期間を通して、免疫化したウマＶ１及びＶ２から採取された生物学的試料のいずれからもＨｅＶの排出の痕跡は見られなかった。具体的には、曝露後のいずれの日においても、鼻奥の鼻腔スワブまたは血液のいずれからもゲノムは回収されなかった。
【０１０８】
［００１１０］
対照的に、免疫化していないウマＶ３では、負荷後３日目に鼻腔スワブにおいてウイルスゲノムが検出された。連続的な試料採取日におけるＣｔ値の減少は上部気道におけるウイルス複製を示唆しており、我々の実験室による、無処置のウマをＨｅＶに曝露した後の初期の観察結果と一致していた（Ｒｅｄｌａｎｄｓ２００８）。発熱直前の血液及びその後のすべての分泌物においてウイルスゲノムが見られたことは、抑鬱等の他の臨床徴候についての最初の認識と合致し、先の観察結果とも一致している。
【０１０９】
【表２−１】
2017501162.tif 000003
【０１１０】
【表２−２】
2017501162.tif 000004
【０１１１】
［００１１１］
死後の試料。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ（ＨｅＶ  Ｎ−遺伝子）では、Ｖ３（対照）において、負荷ウイルスの複製物が複数の組織に伝播し感染していることが確認された（表３）。最高レベルの複製は、先に報告されているように、肺、脾臓、腎臓、心筋、ならびに上部及び下部気道に関連するリンパ組織に存在するようであった。免疫化したウマ（Ｖ１及びＶ２）の組織では、ウイルス複製の痕跡は見られなかった。
【０１１２】
【表３】
2017501162.tif 000005
【０１１３】
［００１１２］
負荷後の血清学的検査。免疫化したウマＶ１及びＶ２では、ＨｅＶ負荷後、力価の上昇が見られなかった（表４）。これは、これらの動物において負荷ウイルスの顕著な複製がなかったことと一致する。負荷後７日目の安楽死の時点で、対照ウマＶ３において抗体は検出されなかった。検出可能な抗体の生成に十分な時間がウイルス曝露と動物の死との間に存在しなかったと考えられ、これはＲｅｄｌａｎｄｓのウマのＨｅＶに関する我々の実験室における先の観察結果と一致する。
【０１１４】
【表４】
2017501162.tif 000006
【０１１５】
［００１１３］
プライムブースト計画において１００μｇのｓＧ＋ＩＳＣアジュバントで予防接種された２頭のウマ（Ｖ１及びＶ２）は、ＨｅＶ曝露の前にＨｅＶに血清転換した。ＩＳＣのみを与えられた１頭のウマ（Ｖ３）は、負荷ウイルスに対して血清陰性のままであった。
【０１１６】
［００１１４］
さもなくば致死量のＨｅＶによる負荷後、免疫化したウマは観察期間を通して臨床的に良好な状態を維持し、ウマにおけるＨｅＶのすべての実験的に誘発された場合の発症時間を上回っていた。免疫の血清学的痕跡を有さないウマ（Ｖ３）は、急性ＨｅＶと一致する臨床徴候を示した後、安楽死させた。免疫化したウマでは、負荷後に抗体力価の上昇が検出されず、これらの動物において負荷ウイルスの複製が見られなかったことと一致していた。
【０１１７】
［００１１５］
毎日の臨床試料の全てにおけるＰＣＲの陰性試験結果により反映されるように、免疫化したウマによるウイルス排出の痕跡は見られなかった。免疫化していない対照では、ウイルス曝露後３日目に鼻腔スワブにおいて、発熱直前に血液において、及び発熱が確立された時からはすべての臨床試料においてウイルスゲノムが検出された。この排出パターンは、この施設での先の試験でＨｅＶに曝露された無処置のウマにおいて見られたものと一致する。
【０１１８】
［００１１６］
急性感染期間と推定される期間中の安楽死後、死後の検査において採取された免疫化したウマのいずれの組織においても、ＨｅＶウイルス複製の痕跡は見られなかった。対照的に、対照ウマの組織全体に、ＨｅＶゲノム及び抗原が急性ＨｅＶ感染と一致するパターンで分布しており、ＨｅＶ感染に典型的な脈管障害も特定された。
【０１１９】
実施例８：ウマにおける第２の臨床試験
［００１１７］
３頭のウマをそれぞれ、２１日の間隔をあけた２回のワクチン投薬（５０μｇのｓＧ及びＩＳＣ）で免疫化した。プライミング後及び負荷前の血清学的検査では、ＨｅＶに対するワクチン誘発血清転換が確認された（表５）。負荷前のウイルス中和抗体レベルは、さもなくば致死量である近縁のニパウイルスに曝露されたネコにおいて防御効果があることが見出された抗体レベルに匹敵するものであり、また、本明細書に記載の第１の臨床試験においてＨｅＶに曝露されたウマに匹敵するものであった。アジュバントのみが与えられたウマは、免疫化したウマのウイルス負荷前に、ＨｅＶに対する抗体を生じなかった（データは示さず）。
【０１２０】
【表５】
2017501162.tif 000007
【０１２１】
［００１１８］
したがって、それぞれの免疫化したウマを、ブースター免疫化を受けさせてから２７日後、ＢＳＬ４封じ込め施設で生きたＨｅＶに曝露させた。ウイルスを鼻腔内投与（１×１０６  ＴＣＩＤ５０）及び経口投与（１×１０６  ＴＣＩＤ５０）した。４匹のモルモットを、この試験において病原性対照として用い、これらのうち少なくとも１匹はＨｅＶ疾患で死亡すると推定した。モルモットを腹腔内経路により５０，０００ＴＣＩＤ５０  ＨｅＶに曝露した。
【０１２２】
［００１１９］
Ｖ４の臨床観察結果：このウマは、ＨｅＶへの曝露後の観察期間の間、臨床的に良好な状態を維持し、体温及び心拍数は正常な範囲内に留まっていた。ウマは、ウイルス負荷後８日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングでは、このウマにおいて、病変またはＨｅＶ抗原の痕跡は発見されなかったが、詳細な検査が現在完了しつつある。
【０１２３】
［００１２０］
Ｖ５の臨床観察結果：このウマは、ＨｅＶへの曝露後の観察期間の間、臨床的に良好な状態を維持し、体温及び心拍数は正常な範囲内に留まっていた（図２）。ウマは、ウイルス負荷後７日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングでは、このウマにおいて、病変またはＨｅＶ抗原の痕跡は発見されなかったが、詳細な検査が現在完了しつつある。
【０１２４】
［００１２１］
Ｖ６の臨床観察結果：このウマは、ＨｅＶへの曝露後の観察期間の間、臨床的に良好な状態を維持し、体温及び心拍数は正常な範囲内に留まっていた（図２）。ウマは、ウイルス負荷後９日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングでは、このウマにおいて、病変またはＨｅＶ抗原の痕跡は発見されなかったが、詳細な検査が現在完了しつつある。
【０１２５】
［００１２２］
モルモット：４匹のモルモットのうち１匹（番号３）は、ＨｅＶ負荷後３日目に体重が減少し始めた。体重の減少は、動物が神経学的徴候（頭部後屈、振戦）を示し、安楽死させられた５日目まで進行した。死後の検査での異常は後腹膜結合組織の浮腫に限定された。
【０１２６】
［００１２３］
組織学的検査では、ＨｅＶ抗原の蓄積に関連して、肺血管炎、腎周囲血管の脈管炎、卵巣炎、及び非化膿性脳炎が見られた。組織学的及び免疫組織学的に急性ＨｅＶ感染と一致するものであり、負荷ウイルスの病原性が確認された。
【０１２７】
［００１２４］
臨床観察期間を通して、Ｖ４、Ｖ５またはＶ６から採取されたいずれの生体試料においてもＨｅＶ排出の痕跡は見られなかったが、但し、３日目にＶ６からの直腸スワブにおいて３６．２のＣｔ値（ＨｅＶ  Ｎ遺伝子）がＴａｑＭａｎＰＣＲにより２つの複製物のウェルの１つで観察され、第２のウェルは増幅を示さなかった（表６）。具体的には、曝露後のいずれの日においても、鼻奥の鼻腔スワブまたは血液のいずれからもゲノムは回収されなかった。
【０１２８】
【表６−１】
2017501162.tif 000008
【０１２９】
【表６−２】
2017501162.tif 000009
【０１３０】
［００１２５］
死後の試料。免疫化したウマＶ４、Ｖ５またはＶ６の組織では、ウイルス複製の痕跡は見られなかった。１匹のモルモット（番号３）において、負荷後５日目にウイルスゲノムが血液（Ｃｔ３４．２）、脳、肺及び脾臓において検出され、この動物の急性ＨｅＶ感染の臨床的、組織学的及び免疫組織学的所見が裏付けられた（表７）。
【０１３１】
【表７】
2017501162.tif 000010
【０１３２】
［００１２６］
負荷後の血清学的検査。免疫化したウマＶ４、Ｖ５及びＶ６では、ＨｅＶ負荷後、力価の上昇が見られなかった（表８）。これは、これらの動物において負荷ウイルスの顕著な複製がなかったことと一致する。
【０１３３】
【表８】
2017501162.tif 000011
【０１３４】
［００１２７］
プライムブースト計画において５０μｇのｓＧ＋ＩＳＣアジュバントで予防接種された３頭のウマ（Ｖ４、Ｖ５及びＶ６）は、ＨｅＶ曝露の前にＨｅＶに血清転換した。ＩＳＣのみを与えられた１頭のウマは、負荷ウイルスに対して血清陰性のままであった。
【０１３５】
［００１２８］
さもなくば致死量のＨｅＶによる負荷後、免疫化したウマは観察期間を通して臨床的に良好な状態を維持し、ウマにおけるＨｅＶのすべての実験的に誘発された場合の発症時間を上回っていた。病原性対照として使用された１匹のモルモットは、急性ＨｅＶと一致する臨床兆候を示した後、安楽死させた。免疫化したウマでは、負荷後に抗体力価の上昇が検出されず、これらの動物において負荷ウイルスの複製が見られなかったことと一致していた。
【０１３６】
［００１２９］
３日目のＶ６の直腸スワブからの１つの複製物以外、毎日の臨床試料の全てにおけるＰＣＲの陰性試験結果により反映されるように、免疫化したウマによるウイルス排出の痕跡は見られなかった。この試験は繰り返されているが、同様の結果が観察される場合、これは低レベルの残留接種源を示すというのが１つの説明である。１匹の免疫化していないモルモットにおいては、ウイルスへの曝露後５日目に、主要器官及び血液においてウイルスゲノムが検出された。
【０１３７】
［００１３０］
急性感染期間と推定される期間中の安楽死後、死後の検査において採取された免疫化したウマのいずれの組織においても、ＨｅＶウイルス複製の痕跡は見られなかった。対照的に、感染しやすいモルモットの組織全体に、ＨｅＶゲノム及び抗原が急性ＨｅＶ感染と一致するパターンで分布しており、この動物においてＨｅＶ感染に典型的な脈管障害も特定された。
【０１３８】
実施例９：ウマに対するヘンドラウイルスワクチンを使用した代替的予防接種計画の評価
［００１３１］
３ヶ月齢以上の健常なウマを、この試験に採用した。試験群は、表９に概説される通りである。
【０１３９】
【表９】
2017501162.tif 000012
【０１４０】
［００１３２］
ウマヘンドラウイルスへの以前の曝露の影響がないことを確認するために、０日目の予防接種前の全てのウマから血液を採取した。さらに、８０及び９１日目に血液試料を採取した。ヘンドラウイルスに対する抗体の検出を、検証された実験室手順を使用した血清中和アッセイにより評価した。
【０１４１】
［００１３３］
ウマを、指定された試験日にＩＶＰで予防接種した。ＩＶＰは、２５０ｇ／用量の免疫刺激複合体（ＩＳＣ）で補助された１１６ｇの照射ヘンドラウイルス可溶性Ｇタンパク質（ｓＧ）からなっていた。ワクチンの用量は、各場合においてウマ当たり１ｍｌであった。
【０１４２】
［００１３４］
予防接種部位をまず８０％アルコールで拭き、そこを確実に清浄化した。ワクチン投与は、経験豊富な獣医により、個別の３ｍｌゴム不使用注射器及び１８Ｇ  １．５インチ針を使用して行われた。ワクチンは、全ての場合において、標準的な獣医学的手順に従い、頸部の左側中央の筋肉内に投与した。
【０１４３】
［００１３５］
有効な試験の基準は、以下のように定義された：１）全てのウマは、０日目の予防接種前は臨床的に正常である；２）全てのウマは、０日目においてウマヘンドラウイルスに対する抗体を有さない；３）対照群Ｔ０１内のウマは、試験期間を通してウマヘンドラウイルスに対する抗体を有さない。
【０１４４】
［００１３６］
結果。試験期間を通して、ワクチンに対する有害な副作用を経験したと報告された動物はいなかった。処置群Ｔ０２において、動物は全てワクチンに反応し、８０日目に２５６以上の血清中和力価（ＳＮＴ）に達し、９１日目に６４以上のＳＮＴに達した。処置群Ｔ０３においても、動物は全てワクチンに反応し、８０日目に２５６以上のＳＮＴに達し、９１日目に３２以上のＳＮＴに達した。最後に、処置群Ｔ０４においても、動物は全てワクチンに反応し、８０日目に５１２以上のＳＮＴに達し、９１日目に１２８以上のＳＮＴに達した。
【０１４５】
［００１３７］
結論として、処置群Ｔ０２、Ｔ０３及びＴ０４内の全ての動物がワクチンに反応し、８０日目に２５６から１０２４超の間のＳＮＴに達し、９１日目に３２から２０４８の間のＳＮＴに達した。これらの結果は、ウマヘンドラウイルスワクチンの予防接種間隔を、３週間間隔の２回投薬（Ｔ０２）から６週間間隔の２回投薬（Ｔ０３）、または４週間間隔の３回投薬（Ｔ０４）に変更すると、最終投薬が行われてから約３週間（２４日）後までに、ウマヘンドラウイルスに対する血清中和抗体反応がもたらされることを示している。ウマが３週間間隔の２回の予防接種後に負荷及び防御された先の有効性試験に基づき、本試験において８０及び９１日目に３つ全ての予防接種群（Ｔ０２、Ｔ０３及びＴ０４）で測定されたＳＮＴは、ウマヘンドラウイルスに対して同等の防御効果を有すると推定される。
【０１４６】
実施例１０：ヘンドラウイルスワクチンのウマにおける免疫継続期間
［００１３８］
５〜１４歳齢の臨床的に健常なウマのみを、試験に採用した。さらに、以下の基準を使用して、この負荷試験用のウマを選択した：身体的適合性（全体的な健康、心肺機能、足及び四肢の完全性）；気性；ならびに低い負荷前抗体力価。試験デザインを、表１０に示す。
【０１４７】
【表１０】
2017501162.tif 000013
【０１４８】
［００１３９］
封じ込め施設の制限に関連した制約、人間による生きたウイルス及び感染した（予防接種されていない）ウマの取り扱いに関連したリスク、ならびに動物福祉に関する配慮に起因して、この試験は、ごく小規模の動物群を利用し、試験の負荷段階中に標的動物（ウマ）対照はなかった。予防接種していないウマにヘンドラウイルスを負荷することを含む先の実験研究は、負荷モデルの有効性を一貫して示しており、その後フェレットが病原性対照として成功裏に利用された。この試験において同じ実験デザインを使用し、負荷段階中２匹のフェレットを対照として使用して、負荷ウイルスの病原性を確認した。各フェレットを口鼻経路により５０，０００ＴＣＩＤ５０  ＨｅＶに曝露した。フェレット対象に投与された負荷ウイルスは、ウマに投与されたものと同じであった。
【０１４９】
［００１４０］
負荷のために、組織培養上澄み中のウマヘンドラウイルスの毒性溶液を調製した。ウイルス培養物を、Ｖｅｒｏ細胞において増殖させた。負荷の日の朝、負荷材料を以下の手順に従って調製した：組織培養上澄み中のストックヘンドラウイルスの一定分量を−８０℃から取り出し、解凍し、適切に希釈して、負荷接種源を生成した。投与された接種源の力価を確認するために、一定分量の接種源を逆滴定を行うために保留した。接種源を、実験用のウマ及び病原性対照（フェレット）に投与するまで湿潤した氷上で保持した。負荷ウイルスをウマに鼻腔内投与（標的１×１０６ＴＣＩＤ５０）及び経口投与（標的１×１０６ＴＣＩＤ５０）した。
【０１５０】
［００１４１］
ウマヘンドラウイルスへの曝露前に、ウマから血液を採取した。さらに、２１、４２、５６、８４、１２０、１３６及び１７８日目に血液試料を採取し、予防接種後のＨｅＶに対する抗体のレベルを決定した。負荷の日（２１８日目）に開始して、２２６日目まで、血液試料を毎日または１日おきに採取した。留置カテーテルに関する問題により、２１８日目以降の１頭のウマからは血液試料を採取しなかった。ヘンドラウイルスに対する抗体の検出を、検証された実験室手順を使用した血清中和アッセイにより評価した。
【０１５１】
［００１４２］
負荷前の２日間（２１６日目及び２１７日目）、体温を１日２回記録し、負荷の日にも記録し（負荷前に１回、及び４〜５時間後に再度）、次いでそれぞれのウマの安楽死の日まで１日２回記録した。
【０１５２】
［００１４３］
ウマを最大４〜５時間毎日観察し、１日２回心拍数及び臨床兆候を記録した（負荷前に１回、負荷から４〜５時間後に１回、次いでそれ以降は１日２回）。
【０１５３】
［００１４４］
ウイルス同定及び単離のために、２１８日目（負荷前）、次いでそれぞれのウマが安楽死させられるまで毎日、全てのウマから鼻腔、口腔及び直腸スワブ試料を採取した。各試料採取日に、尿及び糞便もまたそれぞれのウマの囲いから採取した。
【０１５４】
［００１４５］
負荷後７、８及び９日目（２２５、２２６及び２２７日）にウマを選択的に安楽死させ、その囲いの中で死後の検査を行った。上述のようにスワブ試料を採取し、ウイルス学及び組織病理学検査用に組織試料を採取した。全ての主要器官系を採取したが、脳、気道及びリンパ系に対しては特に注意した。
【０１５５】
［００１４６］
結果。負荷接種源の逆滴定により、ウマにはそれぞれ３．０６×１０６  ＴＣＩＤ５０、及びフェレットにはそれぞれ５．８７ｘ１０５  ＴＣＩＤ５０のヘンドラウイルスが与えられたことが確認された。
【０１５６】
［００１４７］
有効な試験の基準は、試験の各負荷段階後のフェレット病原性対照の１つ以上における、臨床兆候の発症、及び急性ＨｅＶ感染に一致する組織学的／免疫組織学的所見として定義される。試験のこの段階において両方のフェレットが急性ＨｅＶ感染で死亡したため、この基準は満たされた。主要転帰の基準は、負荷されたウマにおける、急性ヘンドラウイルス感染に一致する臨床疾患の発症またはその他であった。
【０１５７】
［００１４８］
表１１及び表１２は、この試験に採用された３頭のウマのＨｅＶ血清中和抗体力価を列挙している。表内の日数は、ワクチンの第１の投薬（０日目）から数えられている。
【０１５８】
【表１１】
2017501162.tif 000014
【０１５９】
【表１２】
2017501162.tif 000015
【０１６０】
［００１４９］
全ての動物は、死後の検査において全体的に正常であり、脾臓、肝臓、心臓、腎臓（皮質、髄質、骨盤）、膀胱、リンパ節（頭部のリンパ節を含む）、肺、副腎、（皮質及び髄質）、脊髄（２レベル）、大腸、小腸、卵巣、下垂体、三叉神経節、脳（嗅球を含む全ての主要領域）、喉嚢、咽頭ならびに鼻甲介の検査後に、いかなるウマにおいても組織学的病変は検出されなかった。
【０１６１】
［００１５０］
試験期間を通して、ワクチンに対する有害な副作用を経験したと報告された動物はいなかった。
【０１６２】
［００１５１］
結論として、３頭のウマに、ブースター（第２の）予防接種から１９７日後に負荷し、負荷後の７、８及び９日目にそれぞれ選択的に安楽死させた。全てのウマが観察期間の間臨床的に良好な状態を維持し、正常範囲を超える心拍数及び体温の上昇は観察されなかった。
【０１６３】
［００１５２］
負荷後の３頭のウマのうち２頭から採取された血液試料に対する血清学的検査は、力価の上昇を示さず、これは、これらの予防接種された動物において、顕著なウイルス複製がなかったことと一致した（表１２）。留置カテーテルに関して生じる問題により、第３のウマ（Ｖ１２）からは血液を採取しなかった。
【０１６４】
［００１５３］
ヘンドラウイルスゲノム（Ｎ遺伝子）は、ＨｅＶへの曝露後の任意の時点でＶ１２及びＶ１４から採取されたいかなる臨床試料からも回収されず、負荷後２、３、４及び７日目のＶ１３からの鼻腔スワブ試料において、低レベルのゲノムが発見されたが、安楽死の日のものからは発見されなかった。ウイルスは、ＨｅＶ  Ｎ遺伝子の低いコピー数を示す鼻腔スワブを含むいかなる臨床試料からも、再び単離されることはなかった。無処置の対照動物と比較して、予防接種されたウマの上部気道においてウイルス複製がはるかに低いことが明らかである。
【０１６５】
［００１５４］
全ての動物は、死後の検査において全体的に正常であり、採取された組織の検査後に、いかなるウマにおいても組織学的病変は検出されなかった。ＨｅＶ抗原は、いずれのウマからも採取されたいずれの組織においても検出されなかった。これらの免疫組織病理学的所見はまた、Ｔａｇｍａｎ  ｑＰＣＲの結果によって裏付けられており、死後の検査において３頭のウマのいずれからも採取されたいかなる組織からも、ＨｅＶゲノムは回収されなかった（データは示さず）。
【０１６６】
［００１５５］
要約すると、予防接種から約６ヶ月後にウマヘンドラウイルスの生きた毒性株を負荷されたウマは、ヘンドラウイルス感染の臨床兆候から防御された。これにより、２１日間隔でのＨｅＶ  ｓＧワクチンの２回の投薬によりもたらされる免疫継続期間は、少なくとも１９７日（約６ヶ月）であることが確認される。
【０１６７】
実施例１１：ニパウイルスに対する霊長類における臨床試験
［００１５６］
統計。バイオセーフティレベル４（ＢＳＬ−４）の動物試験、特に非ヒト霊長類の試験の実施においては、動物対象の数、得ることができる生体試料の体積、及び分析の独立した再試可能性が厳しく制限され、したがって統計学的分析が限定される。結果として、データは、複製アッセイではなく複製試料から計算した平均値または中央値で表され、エラーバーは複製物にわたる標準偏差を表す。
【０１６８】
［００１５７］
ウイルス。ＮｉＶ−マレーシア（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２１２３０２）を、米国疾病管理予防センターの特殊病原菌部門（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  Ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（ジョージア州アトランタ）から入手した。Ｒｏｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４，９８３１においてＨｅＶに対して説明されているように、ＮｉＶをベロ細胞で増殖させ、力価を測定した。
【０１６９】
［００１５８］
ワクチン製剤。３種のｓＧＨｅＶワクチン製剤を用いた（１０μｇ、５０μｇまたは１００μｇ）。ｓＧＨｅＶの生成及び精製は、以前にＰａｌｌｉｓｔｅｒ（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９，５６２３において説明されているように行った。各ワクチン製剤はまた、Ａｌｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及び完全なホスホロチオエート骨格を含むＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）２００６（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含有していた。一定量のＯＤＮ２００６、様々な量のｓＧＨｅＶ及びアルミニウムイオン（重量比１：２５）を含有するワクチン用量を、以下のように製剤化した。１００μｇ用量：１００μｇのｓＧＨｅＶ、２．５ｍｇのアルミニウムイオン及び１５０μｇのＯＤＮ  ２００６；５０μｇ用量：５０μｇのｓＧＨｅＶ、１．２５ｍｇのアルミニウムイオン及び１５０μｇのＯＤＮ２００６；ならびに１０μｇ用量：５μｇのｓＧＨｅＶ、２５０μｇのアルミニウムイオン及び１５０μｇのＯＤＮ２００６。全ての用量において、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）及びｓＧＨｅＶを、まずＯＤＮ２００６を添加する前に混合した。各ワクチン用量をＰＢＳで１ｍｌに調節し、混合物を室温で少なくとも２時間から３時間、回転ホイール上でインキュベートした後で注射した。各対象には、プライム及びブーストにおいて同じ１ｍｌ用量を与え、全てのワクチン用量は、筋肉内注射により与えた。
【０１７０】
［００１５９］
動物。体重４〜６ｋｇの若齢成体アフリカミドリザル（ＡＧＭ）（クロロセブス・アエチオプス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ））（Ｔｈｒｅｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）１０匹を別個に檻に入れた。対象をケタミン（１０〜１５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔し、−４２日目（プライム）及び−２１日目（ブースト）にｓＧＨｅＶで予防接種した。３匹の対象に１０μｇ用量を２回（ＡＧＭ１６、ＡＧＭ１７、ＡＧＭ１８）、３匹の対象に５０μｇ用量を２回（ＡＧＭ１３、ＡＧＭ１４、ＡＧＭ１５）、３匹の動物に１００μｇ用量を２回（ＡＧＭ１０、ＡＧＭ１１、ＡＧＭ１２）、１匹の対象（ＡＧＭ９）にアジュバントのみを与えた。０日目に、対象を麻酔し、４ｍｌのダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の１×１０５ＴＣＩＤ５０（組織培養感染用量中央値）のＮｉＶで気管内接種した。感染後（ｐ．ｉ．）０、３、５、７、１０、１４、２１及び２８日目に、体温、呼吸数、胸部Ｘ線写真、採血、ならびに鼻腔、口腔及び直腸粘膜のスワブを含む臨床検査のために対象を麻酔した。対照対象（ＡＧＭ  ９）は、感染後１０日目に、承認された人道的エンドポイントに従って安楽死させる必要があった。他の全ての対象は、試験終了まで生存し、感染後２８日目に安楽死させた。剖検に際し、ウイルス学及び組織病理学検査用に様々な組織を採取した。試料採取された組織は、結膜、扁桃、中／鼻咽頭、鼻腔粘膜、気管、右気管支、左気管支、右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉、左肺上葉、左肺中葉、左肺下葉、気管支リンパ節（ＬＮ）、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、副腎、膵臓、空腸、横行結腸、脳（前頭葉）、脳（小脳）、脳幹、頸部脊髄、脳下垂体、下顎骨ＬＮ、唾液ＬＮ、鼠径部ＬＮ、腋下ＬＮ、腸間膜ＬＮ、膀胱、精巣または卵巣、大腿骨骨髄を含む。予防接種は、ＢＳＬ−２封じ込め条件で行った。予防接種スケジュール、負荷及び生物標本採取日のタイムラインを図４に示す。
【０１７１】
［００１６０］
予防接種及びＮｉＶ負荷。以前に、我々は、１０５  ＴＣＩＤ５０（組織培養感染用量中央値）のＮｉＶによるＡＧＭの気管内接種が、一様に致死的転帰をもたらすことを実証した（Ｒｏｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４，９８３１）。急速に進行する臨床的疾患がこれらの研究において示されたが、臨床的徴候は、重度抑鬱、急性呼吸窮迫をもたらす呼吸器疾患、重度の神経疾患、及び重度の可動性低下を含み、安楽死に対して承認された人道的エンドポイントの基準に至るまでの時間は、７日から１２日の範囲であった。ここで、我々は、ｓＧＨｅＶによる予防接種がＡＧＭにおけるＮｉＶ感染及び疾患を予防できるかの判定を試みた。上記方法で説明したように、１０、５０または１００μｇの用量のｓＧＨｅＶを、ミョウバン及びＣｐＧ部分と混合した。各ワクチン製剤を３匹の対象に０日目（プライム）及び再度２１日目（ブースト）に皮下投与し、１匹の対照対象（ＡＧＭ９）には同じ日程でアジュバントのみのプライミング及びブースティングを行った。４２日目に、全ての対象に１０５ＴＣＩＤ５０のＮｉＶを気管内接種した。対照対象（ＡＧＭ９）は、食欲の喪失、重度の持続性行動の変化（抑鬱、活動性の低下、猫背の姿勢）、血小板数の減少、及び末期疾患での呼吸数の段階的増加を示した。その後、ＡＧＭ  ９は、急性呼吸窮迫を示し、感染後１０日目に、承認された人道的エンドポイントに従って安楽死させる必要があった。対照的に、予防接種された対象のいずれも臨床的な疾患を有さず、全て試験終了まで生存した。カプラン−マイヤー生存曲線のグラフを図５に示す。
【０１７２】
［００１６１］
対照対象におけるＮｉＶ媒介性疾患。対照対象における全体的な病理学的変化は、以前にＮｉＶ感染ＡＧＭにおいて見られたものと一致していた（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，ｅ１０６９０）。脳の表面に巨脾及び血管の鬱血が現れ、肺の全葉が湿り、重かった。ＮｉＶ  ＲＮＡ及び感染ウイルスはＡＧＭ９血液試料からは回収されず、ウイルス血症の痕跡もなかった。ＡＧＭ９では、ＮｉＶ特異的ＩｇＭならびに検出可能なＮｉＶ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのレベルが顕著であった。組織試料のさらなる分析により、以前にＡＧＭにおいて見られた広範なＮｉＶ感染と類似する広域のＮｉＶ組織屈性が明らかとなった（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，ｅ１０６９０）。ＡＧＭ９は、示されたように組織の大半にＮｉＶ  ＲＮＡを有しており、多数の組織から感染性ウイルスが回収された。顕著な病変は、間質性肺炎、亜急性脳炎及び壊死、ならびに白脾髄の出血を含んでいた。肺胞空間には、浮腫液、フィブリン、核崩壊及び細胞残屑、ならびに肺胞マクロファージが充満していた。多病巣性脳炎は、適度な数のリンパ球、及びより少ない好中球による、ウイルヒョウ−ロバン腔の拡大により特徴付けられた。より少数のこれらの炎症細胞が、隣接する柔組織内に拡大していた。複数のニューロンが膨張し、空胞化し（変性）、または核崩壊（壊死）により細片化していた。白脾髄における小胞の多病巣性胚中心は、出血及びフィブリンだけでなく、少数の好中球ならびに細胞性及び核崩壊性残屑により失われていた。これらの所見は、脾臓での壊死及び胚中心の喪失と一致していた。過剰量のウイルス抗原が脳幹に存在しており、ＮｉＶが中枢神経系に著しい損傷を引き起こしていることを強調していた。
【０１７３】
［００１６２］
ｓＧＨｅＶ予防接種対象の防御。負荷後に採取した全血液試料及び剖検の際に採取した全ての組織を含む全ての生物学的試料がＮｉＶ  ＲＮＡ陰性であり、いずれの試料からも感染性ウイルスは単離されなかった。予防接種された対象からの組織切片をより詳細に検査した結果、組織構築は正常のようであり、ＮｉＶ抗原は、免疫組織化学的技術を使用して、いずれの組織においても検出されなかった。ワクチンにより惹起される防御機序をさらに分析するために、血清及び粘膜ｓＧＮｉＶ及びｓＧＨｅＶ特異的ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ、ならびにＮｉＶ及びＨｅＶ血清中和力価を、予防接種された動物において測定した。図６に示されるように、負荷の７日前、最低用量のｓＧＨｅＶが与えられた対象は、検出可能な抗原特異的血清ＩｇＭと最高レベルのｓＧＨｅＶ特異的血清ＩｇＧを有していた。５０μｇのｓＧＨｅＶが与えられた対象も、負荷の７日前に、検出可能レベルの血清ＩｇＭ及び最高レベルの血清ＩｇＧを有していた。高用量の対象は検出可能な血清ＩｇＭを有さず、血清ＩｇＧレベルは、−７日目において他の２つの群と比較して著しく低かった。ＮｉＶ負荷の日までに、高用量対象の血清ＩｇＧレベルが増加し、すべての予防接種対象が同様のＩｇＧレベルを有していた。血清ＩｇＭレベルは、ＮｉＶ負荷後、いずれの対象においても変化しなかった。血清ＩｇＧレベルはＮｉＶ負荷の日に中用量対象において減少し、ＩｇＧレベルはＮｉＶ負荷後すぐに低用量対象において減少した。興味深いことに、ＩｇＧレベルは、これらの群の両方において感染後３日目及び５日目までに増加したが、負荷の７日前に示されたＩｇＧレベルを超えることはなく、両方の群において力価は感染後２８日目までに顕著に減少した。
【０１７４】
［００１６３］
反対に、血清ＩｇＧレベルは高用量群において高いままであり、感染後２８日目において最も高くなった。抗原特異的血清ＩｇＡは、予防接種後のすべての対象において検出可能であったが、レベルは非常に低く、負荷前と負荷後のレベルに顕著な差は見られなかった（図６）。粘膜の抗原特異的ＩｇＡのわずかな増加が、感染後１４日目に低用量対象からの鼻腔スワブにおいて検出されたが、レベルは非常に低く、これらの粘膜抗体は負荷後のＮｉＶの広がりを予防する役割を果たしそうではなかった。血清中和試験（ＳＮＴ）の結果を表９に示す。全ての予防接種対象に対して、ＨｅＶ特異的中和力価は同様に維持されたか、または感染後２８日目までに減少し、ＮｉＶ特異的中和力価は、負荷前の力価が最も低い対象であっても、感染後７日目までに顕著な変化を示さなかった。１匹の低用量対象及び１匹の高用量対象は、感染後１４日目までにＮｉＶ  ＳＮＴ力価の対数増加を示し、１匹の中用量対象は、感染後２１日目までにＮｉＶ  ＳＮＴ力価の対数増加を示した。他の全ての予防接種動物において、ＳＮＴ力価の変化は一貫性がない（力価が増加し、次いで減少する）か、または顕著でなかった（力価は３〜４倍増加するが、１対数分を超えない）。最後に、ＮｉＶ融合（Ｆ）エンベロープ糖タンパク質に対する血清転換がＮｉＶ負荷後の予防接種対象において測定された。血清抗ＮｉＶ  Ｆ  ＩｇＭの最小レベルが、低用量対象及び中用量対象においてそれぞれ感染後１０日目及び２１日目に検出され、これらの低いＭ．Ｆ．Ｉ．値は、ＮｉＶ負荷後の一次抗体反応が弱いことを示唆する。血清抗ＮｉＶ−Ｆ  ＩｇＭは高用量対象においては検出されず、これらの動物では、負荷後のウイルスの循環がほとんど、または全くないことが示唆された。
【０１７５】
【表１３】
2017501162.tif 000016
【０１７６】
実施例１２：ヘンドラウイルスに対する霊長類における臨床試験
［００１６４］
ヘンドラウイルスによる予防接種及び負荷を評価するために、第２の臨床試験をＡＧＭにおいて行った。実施例９に記載のものと同じ製剤をワクチンとして利用したが、ｓＧＨｅＶ及びアジュバントとしてＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）のみ（ＯＤＮ２００６は含めなかった）が与えられた別の群との比較も行った。動物に、−２１日目に予防接種し、０日目にブースティングを行い、２１日目に負荷を行った。別段に指定されない限り、全ての条件は実施例７の条件と同じであった。実験概要を以下に示す。
【０１７７】
【表１４】
2017501162.tif 000017
【０１７８】
［００１６５］
結果：両方の群（Ａ及びＢ）内の全ての動物（ｎ＝４）が、１０５  ＴＣＩＤ５０のヘンドラウイルスを気管内接種した後、ヘンドラウイルス負荷に対して生存した。対照対象は８日目に死亡した。予防接種された対象のいずれにおいても臨床的疾患は観察されず、健康で良好な状態が試験の終了時点まで維持された。
【０１７９】
［００１６６］
本発明の他の実施形態及び使用は、本明細書において開示される本発明の説明及び実践を考慮すれば、当業者には明らかである。全ての出版物、米国及び外国の特許及び特許出願を含む、本明細書において引用される全ての参考文献は、参照により具体的及び全体的に組み込まれる。明細書及び実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲及び精神は、以下の特許請求の範囲により示されることが意図される。
【図１】
2017501162.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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