(57)【要約】  本開示は、鞘翅目害虫における標的コードおよび転写非コード配列のＲＮＡ干渉媒介阻害による鞘翅目害虫の防除のための核酸分子およびその使用の方法に関する。本開示はまた、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子を発現するトランスジェニック植物を作る方法、ならびにそれにより得られた植物細胞および植物に関する。
2017510246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒｎａｐＩＩ−１４０の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列との少なくとも８０％の同一性をその全長にわたって有する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むＲＮＡ。
【請求項２】
ステムおよびループを含む、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項３】
前記核酸が前記少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと相補的な配列をさらに含む、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項４】
発現ＲＮＡの前記ステム−ループのステムの少なくとも一部が前記少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと相補的な前記配列への前記少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの結合により形成されている、請求項２に記載のＲＮＡ。
【請求項５】
ｉＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｉＲＮＡがｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｈｐＲＮＡである、請求項５に記載のＲＮＡ。
【請求項７】
核酸アナログを含む、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項８】
鞘翅目におけるＲＮＡＰＩＩ−１４０の発現を阻害することができる、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項９】
ＲＮＡＰＩＩ−１４０の発現の阻害が転写後遺伝子サイレンシングによるものである、請求項８に記載のＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ｒｎａｐＩＩ−１４０がジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ｒｎａｐＩＩ−１４０である、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ｒｎａｐＩＩ−１４０が配列番号１によりコードされる、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項１２】
前記ｒｎａｐＩＩ−１４０がメリゲテス属（Meligethes）ｒｎａｐＩＩ−１４０である、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項１３】
前記ｒｎａｐＩＩ−１４０が配列番号７３、７５および８１からなる群から選択される核酸によりコードされる、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項１４】
ｒｎａｐＩＩ−１４０の少なくとも一部をコードする前記配列が配列番号３、４、５、および７７からなる群から選択される、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項１５】
前記少なくとも１５個の連続したヌクレオチドが１９、２１、２５、２９、３０、４０、５０、７０および１００個の連続したヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項１６】
前記少なくとも８０％の同一性が８５％、９０％、９５％および１００％の同一性からなる群から選択される、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項１７】
請求項１に記載のＲＮＡを含む植物細胞。
【請求項１８】
前記植物がゼア・マイス（Zea mays）、グリシン・マクス（Glycine max）、ブラシカ（Brassica）種およびイネ科（Poaceae）からなる群から選択される、請求項１５に記載の植物細胞。
【請求項１９】
請求項１に記載のＲＮＡをコードする核酸。
【請求項２０】
配列番号１６、１７、７８および７９からなる群から選択される配列を含む、請求項１７に記載の核酸。
【請求項２１】
プロモーターに作動可能に連結した、請求項１７に記載の核酸。
【請求項２２】
請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２３】
請求項１７に記載の核酸を含む植物細胞。
【請求項２４】
前記植物がゼア・マイス（Zea mays）、グリシン・マクス（Glycine max）、ブラシカ（Brassica）種およびイネ科（Poaceae）からなる群から選択される、請求項２１に記載の植物細胞。
【請求項２５】
請求項１７に記載の核酸が前記植物細胞のゲノムに組み込まれている、請求項２１に記載の植物細胞。
【請求項２６】
植物において請求項１７に記載の核酸を発現させることを含む、鞘翅目を防除する方法。
【請求項２７】
前記鞘翅目がジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）、ジアブロティカ・バルベリ（Diabrotica barberi）、ジアブロティカ・ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（Diabrotica undecimpunctata howardi）、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Diabrotica virgifera zeae）、ジアブロティカ・バルテアタ（Diabrotica balteata）、ジアブロティカ・ウンデシムプンクタータ・テネラ（Diabrotica undecimpunctata tenella）、ジアブロティカ・ウンデシムプンクタータ・ウンデシムプンクタータ（Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata）およびメリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のＲＮＡを含む鞘翅目食物源。
【請求項２９】
請求項２６に記載の食物源を鞘翅目に与えることを含む、鞘翅目を防除する方法。
【請求項３０】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質をコードする核酸を発現させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）毒素タンパク質がＣｒｙ３５Ａｂ１、Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１０、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ６Ａおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
鞘翅目遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉをコードする核酸を発現させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸がＣａｆｌ−１８０、ＶａｔｐａｓｅＣ、Ｒｈｏ１、ＶａｔｐａｓｅＨ，ＰＰＩ−８７Ｂ、ＲＰＡ７およびＲＰＳ６からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、「鞘翅目害虫に対する抵抗性を付与するｒｎａｐＩＩ−１４０核酸分子」について２０１３年１２月２０日に出願した米国特許出願番号第６１／９１９，２３９号の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本開示は、一般的に、鞘翅目害虫により引き起こされる植物被害の防除に関する。特定の実施形態において、本開示は、植物保護効果を得るための、標的コードおよび非コード配列の同定ならびに鞘翅目害虫の細胞内の標的コードおよび非コード配列の発現を転写後に抑制または阻害するための核酸技術の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント（LeConte）は、北アメリカにおける最も破壊的なトウモロコシ根切り虫の種の１つであり、米国中西部のコーン栽培地域において特に問題となっている。ノーザンコーンルートワーム（ＮＣＲ）、ジアブロティカ・バルベリ（Diabrotica barberi）スミスおよびローレンス（Smith and Lawrence）は、ＷＣＲと同じ範囲の多くにおいてともに生息する密接に関連する種である。北アメリカにおける重要な害虫であるジアブロティカ属（Diabrotica）種の次のいくつかの他の関連亜種：メキシカンコーンルートワーム（ＭＣＲ）、Ｄ．ヴィルギフェラ・ゼアエ（D. virgifera zeae）クリサンおよびスミス（Krysan and Smith）；サザンコーンルートワーム（ＳＣＲ）、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（D. undecimpunctata howardi）バーバー（Barbar）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ウンデシムプンクタータ・テネラ（D. undecimpunctata tenella）；ならびにＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム（Mannerheim）が存在する。米国農務省は、現在、トウモロコシ根切り虫が８億ドルの収量低下および２億ドルの処理費用を含む１０億ドルの収入減をもたらしていると推定している。
【０００４】
ＷＣＲおよびＮＣＲの両方の卵は、夏に土壌中に産み付けられる。該昆虫は、冬期に卵期に留まる。卵は、楕円形で、白く、長さが０．０１０ｃｍ未満である。幼虫は、５月後期または６月後期に孵化し、卵孵化の正確な時期は、温度差および場所により年ごとに異なる。新たに孵化した幼虫は、長さが０．３１７５ｃｍ未満の白色の虫である。孵化した時点に、幼虫は、コーンの根を常食とし始める。トウモロコシ根切り虫は、３つの幼虫齢を経る。数週間の摂食の後、幼虫は、脱皮して蛹期に入る。それらは、土壌中で蛹化し、その後、７月および８月に成虫として土壌から出てくる。根切り虫の成虫は、長さが約０．６３５ｃｍである。
【０００５】
トウモロコシ根切り虫の幼虫は、コーンおよび他のいくつかの草種を食して発育を完了する。スズメノテッポウを食して生育した幼虫は、後に出現し、コーンを食して生育した幼虫よりも成虫として小さい頭蓋サイズを有する。Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-634. ＷＣＲ成虫は、コーンのひげ、花粉および露出した穂先の穀粒を常食とする。ＷＣＲ成虫がコーンの生殖組織が存在する前に出現する場合、それらは、葉組織を常食とし、それにより植物の成長を遅くし、さらに宿主植物を殺すこともあり得る。しかし、成虫は、得られるようになるとき、好ましいひげおよび花粉に速やかに移る。ＮＣＲ成虫もコーン植物体の生殖組織を常食とするが、対照的にめったにコーンの葉を常食としない。
【０００６】
コーンにおける根切り虫被害の大部分は、幼虫による摂食によって引き起こされる。新たに孵化した根切り虫は、最初に微細なコーン根毛を常食とし、根端に潜り込む。幼虫がさらに成長すると、一次根を常食とし、それに潜り込む。トウモロコシ根切り虫が多数である場合、幼虫による摂食により、コーンの茎の基部に至るまでの根の切り取りがしばしばもたらされる。重度の根の傷害は、水および栄養素を植物体に輸送する根の能力を妨げ、植物体の成長を低下させ、穀物の生産の減少をもたらし、それにより、全収率をしばしば大幅に減少させる。重度の根の傷害は、収穫をより困難にし、収量をさらに減少させる、コーン植物体の倒伏もしばしばもたらす。さらに、成虫によるコーンの生殖組織の常食により、穂先のひげの切り取りがもたらされ得る。この「ひげのクリッピング」が花粉飛散時に十分に高度である場合、授粉が妨げられる可能性がある。
【０００７】
トウモロコシ根切り虫の防除は、輪作、化学殺虫剤、生物農薬（例えば、胞子形成グラム陽性細菌、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis））またはそれらの組合せにより試みることができる。輪作は、農地の使用に望まれない制限を設けるという著しい不利な状況に見舞われる。さらに、一部の根切り虫の種の産卵は、ダイズ畑で起こり、それにより、コーンおよびダイズを用いて実施される輪作の有効性が減ずることがあり得る。
【０００８】
ヨーロッパ花粉甲虫（ＥＰＢ）は、アブラナにおける重要害虫であり、幼虫および成虫の両方が花および花粉を常食とする。花粉甲虫による作物被害は、２０〜４０％の収量低下をもたらし得る。主要な害虫種は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）である。現在のところ、アブラナにおける花粉甲虫の防除は、それらの環境および規制プロファイルのため、間もなく段階的に廃止されると予想されるピレスロイド類に主として依拠している。さらに、既存の化学殺虫剤に対する花粉甲虫の抵抗性が報告された。したがって、新規作用機序を有する環境にやさしい花粉甲虫防除液が緊急に必要である。
【０００９】
自然において、花粉甲虫は、土壌中または落葉の下で成虫として越冬する。春には、成虫は、冬眠から覚め、雑草の花を常食とし始め、開花アブラナ植物上に移動する。卵は、アブラナの花芽に産みつけられる。幼虫は、つぼみの中で摂食し、発育し、花を常食とする。後期幼虫は、土壌中に蛹化場所を見つける。第２世代の成虫は、７月および８月に出現し、越冬の場所を見つける前に様々な顕花植物を常食とする。
【００１０】
化学殺虫剤は、トウモロコシ根切り虫の防除を達成するための戦略に最も高度に依拠する。化学殺虫剤の使用は、不完全なトウモロコシ根切り虫防除戦略であるが、化学殺虫剤の費用が殺虫剤の使用にもかかわらず起こり得る根切り虫被害の費用に加えられる場合にトウモロコシ根切り虫により毎年米国で１０億ドル以上が失われ得る。幼虫の高個体数、多雨および殺虫剤（複数可）の不適切な散布はすべて、不十分なトウモロコシ根切り虫防除をもたらし得る。さらに、殺虫剤の連用は、非標的種に対するそれらの多くの毒性による重大な環境への懸念を生じさせるだけでなく、殺虫剤抵抗性の根切り虫の系統を選び出すこととなり得る。
【００１１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子配列のすべて、またはその十分なサイズの任意の一部に対して特異的である干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）がそれによりコードされるｍＲＮＡの分解をもたらす、内因性細胞経路を利用する方法である。近年、ＲＮＡｉは、多くの種および実験系、例えば、エレガンス線虫（Caenorhabitis elegans）、植物、昆虫胚および組織培養中細胞における遺伝子「ノックダウン」を実施するために用いられている。例えば、Fire et al. (1998) Nature 391:806-811; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747参照。
【００１２】
ＲＮＡｉは、ＤＩＣＥＲタンパク質複合体を含む内因性経路を経るｍＲＮＡの分解を伴う。ＤＩＣＥＲは、長いｄｓＲＮＡ分子を低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、約２０ヌクレオチドの短い断片に切断する。ｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の２つの一本鎖ＲＮＡに巻き戻される。パッセンジャー鎖は、分解され、ガイド鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。マイクロ阻害リボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子は、同様にＲＩＳＣに取り込まれ得る。転写後遺伝子サイレンシングは、ガイド鎖がｍＲＮＡ分子の相補的配列に特異的に結合し、ＲＩＳＣ複合体の触媒構成成分である、アルゴノートによる切断を誘導するときに起こる。このプロセスは、植物、線虫および一部の昆虫等の一部の真核生物においてｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの濃度が最初に制限されているにもかかわらず生物体全体にわたり全身的に広がることが公知である。
【００１３】
ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡに相補的な転写物のみが切断され、分解され、したがって、ｍＲＮＡ発現のノックダウンは、配列特異的である。植物では、ＤＩＣＥＲ遺伝子のいくつかの官能基が存在する。ＲＮＡｉの遺伝子サイレンシング効果は、何日間も持続し、実験条件下では、９０％以上の標的転写物の存在量の減少と、対応するタンパク質のレベルの結果としての低下につながり得る。
【００１４】
米国特許第７，６１２，１９４号ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号、第２０１０／０１９２２６５号および第２０１１／０１５４５４５号は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコントの蛹から単離された９１１２発現配列タグ（ＥＳＴ）配列のライブラリーを開示している。米国特許第７，６１２，１９４号および米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号において植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のためにそこに開示されたＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）液胞型プロトンＨ＋−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）のいくつかの特定の部分配列の１つと相補的である核酸分子をプロモーターに作動可能に連結することが示唆されている。米国特許出願公開第２０１０／０１９２２６５号は、植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のために未知および非開示機能のＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）遺伝子の特定の部分配列（部分配列は、エレガンス線虫（C. elegans）におけるＣ５６Ｃ１０．３遺伝子産物と５８％同一であると述べられている）と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。米国特許出願公開第２０１１／０１５４５４５号は、植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のためにＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）コートマーベータサブユニット遺伝子の２つの特定の部分配列と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。さらに、米国特許第７，９４３，８１９号は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコントの幼虫、蛹および切開中腸から単離された９０６の発現配列タグ（ＥＳＴ）のライブラリーを開示し、植物細胞における二本鎖ＲＮＡの発現のためにＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）負荷（charged）多胞体タンパク質４ｂ遺伝子の特定の部分配列と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。
【００１５】
Ｖ−ＡＴＰアーゼのいくつかの特定の部分配列および未知の機能の遺伝子の特定の部分配列以外には、ＲＮＡ干渉のためにそれらに示されている９千を超える配列のいずれかの特定の配列を使用するさらなる示唆は、米国特許第７，６１２，１９４号ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号、第２０１０／０１９２２６５号および第２０１１／０１５４５４５号に示されていない。さらに、米国特許第７，６１２，１９４号ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号、第２０１０／０１９２２６５号および第２０１１／０１５４５４５号のいずれも、示された９千を超える配列のどのその他のものがｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、トウモロコシ根切り虫の種において致死性、または別の面では有用でさえあるかについての指針を記載していない。米国特許第７，９４３，８１９号は、負荷多胞体タンパク質４ｂ遺伝子の特定の部分配列以外には、ＲＮＡ干渉のためにそれに示されている９千を超える配列のいずれかの特定の配列を使用する示唆を記載していない。さらに、米国特許第７，９４３，８１９号は、示された９千を超える配列のどのその他のものがｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、トウモロコシ根切り虫の種において致死性、または別の面では有用でさえあるかについての指針を記載していない。米国特許出願公開第２０１３／０４０１７３号およびＰＣＴ出願公開国際公開第２０１３／１６９９２３号は、トウモロコシにおけるＲＮＡ干渉のためのジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）Ｓｎｆ７遺伝子由来の配列の使用を記載している。（Bolognesi et al. (2012) PLos ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534にも開示されている。）
【００１６】
トウモロコシ根切り虫ＤＮＡと相補的な配列（前述のような）の圧倒的大多数は、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合にトウモロコシ根切り虫の種において致死性でない。例えば、Baum et al.(2007, Natute Biotechnology 25:1322-1326)は、ＲＮＡｉによりいくつかのＷＣＲ遺伝子標的を阻害する効果を記載している。これらの著者らは、彼らが試験した２６標的遺伝子のうちの８標的遺伝子が５２０ｎｇ／ｃｍ２を超える非常に高いｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）濃度で実験的に有意な鞘翅目害虫の死亡率をもたらすことができなかったことを報告した。
【発明の概要】
【００１７】
開示
本明細書に開示するのは、核酸分子（例えば、標的分子、ＤＮＡ、ｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）、ならびに例えば、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコント（ウェスタンコーンルートワーム、「ＷＣＲ」）；Ｄ．バルベリ（D. barberi）スミスおよびローレンス（ノーザンコーンルートワーム、「ＮＣＲ」）；Ｄ．ｕ．ホワルディ（D. u. howardi）バーバー（サザンコーンルートワーム、「ＳＣＲ」）；Ｄ．ｖ．ゼアエ（D. v. zeae）クリサンおよびスミス（メキシカンコーンルートワーム、「ＭＣＲ」）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；Ｄ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム；メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）ファブリツィウス（Fabricius）（花粉甲虫、「ＰＢ」）を含む鞘翅目害虫の防除のためのそれらの使用の方法である。特定の例において、鞘翅目害虫における１つまたは複数の天然核酸配列の少なくとも一部と相同的であり得る例示的な核酸分子を開示する。
【００１８】
これらおよびさらなる例において、天然核酸配列は、標的遺伝子である可能性があり、その産物は、例えばかつ制限なしに、代謝プロセスに関与する；生殖プロセスに関与する；または幼虫の発育に関与することがあり得る。いくつかの例において、それと相同的な配列を含む核酸分子による標的遺伝子の発現の翻訳後阻害は、鞘翅目害虫において致死性である、あるいは成長および／または生殖の低減をもたらすことがあり得る。特定の例において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ−１４０（本明細書でＲＮＡＰＩＩ−１４０と呼ぶコード化タンパク質、および本明細書でｒｎａｐＩＩ−１４０と呼ぶＲＮＡＰＩＩ−１４０をコードする核酸）をコードする遺伝子は、転写後サイレンシングのための標的遺伝子として選択することができる。特定の例において、転写後阻害に有用な標的遺伝子は、本明細書でｒｎａｐＩＩ−１４０と呼ぶ新規遺伝子である。したがって、ｒｎａｐＩＩ−１４０（例えば、配列番号１、配列番号７３、配列番号７５および配列番号８１）；ｒｎａｐＩＩ−１４０（例えば、配列番号１、配列番号７３、配列番号７５および配列番号８１）の相補体ならびに前述のもののいずれかの断片のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を本明細書で開示する。
【００１９】
標的遺伝子産物（例えば、ｒｎａｐＩＩ−１４０の産物であるＲＮＡＰＩＩ−１４０
）内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子も開示する。例えば、核酸分子は、配列番号２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８０または配列番号８２（ＲＮＡＰＩＩ−１４０）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。特定の例において、核酸分子は、ＲＮＡＰＩＩ−１４０内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。標的遺伝子産物内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに開示する。
【００２０】
鞘翅目害虫標的遺伝子、例えば、ｒｎａｐＩＩ−１４０のすべてまたは一部と相補的であるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子の生成に用いることができる核酸ｃＤＮＡ配列も開示する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡは、植物または細菌等の遺伝子操作生物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生され得る。特定の例において、ｒｎａｐＩＩ−１４０（例えば、配列番号１、配列番号７３、配列番号７５および配列番号８１）のすべてまたは一部と相補的であるｉＲＮＡ分子を産生させるために用いることができるｃＤＮＡ分子を開示する。
【００２１】
鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段、ならびに植物に鞘翅目害虫抵抗性を与える手段をさらに開示する。鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段の例は、配列番号３（ｒｎａｐＩＩ−１４０領域１；本明細書で時としてｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ１と呼ぶ）、配列番号４（ｒｎａｐＩＩ−１４０領域２；本明細書で時としてｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ２と呼ぶ）、配列番号５（ｒｎａｐＩＩ−１４０領域３；本明細書で時としてｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ３と呼ぶ）、配列番号７７（ｒｎａｐＩＩ−１４０領域１；本明細書で時としてＰＢｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ１と呼ぶ）またはそれらの相補体の少なくとも１つからなる一本または二本鎖ＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段の機能的等価物は、配列番号１を含むＷＣＲ遺伝子のすべてまたは一部と実質的に相同である一本または二本鎖ＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段の機能的等価物は、配列番号７３、配列番号７５または配列番号８１を含むＰＢ遺伝子のすべてまたは一部と実質的に相同である一本または二本鎖ＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。植物に鞘翅目害虫抵抗性を与える手段は、プロモーターに作動可能に連結した鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子であり得、該ＤＮＡ分子は、トウモロコシ植物体のゲノムに組み込まれることができる。
【００２２】
開示するのは、鞘翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するために鞘翅目害虫により取り込まれる時に機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を鞘翅目害虫に与えることを含む、鞘翅目害虫の集団を防除する方法であって、ｉＲＮＡ分子は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１；配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１の相補体；配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれかのすべてまたは一部を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれかのすべてまたは一部を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれかのすべてまたは一部を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５のいずれかのすべてまたは一部を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１のいずれかのすべてまたは一部を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列；配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１のいずれかのすべてまたは一部を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の相補体；配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１のいずれかのすべてまたは一部を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列；ならびに配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１のいずれかのすべてまたは一部を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の相補体。
【００２３】
特定の例において、鞘翅目害虫内部の生物学的機能を阻害するために鞘翅目害虫により取り込まれる時に機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を鞘翅目害虫に与えることを含む、鞘翅目害虫の集団を防除する方法であって、ｉＲＮＡ分子は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法を開示する：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１のすべてまたは一部；配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１のすべてまたは一部の相補体；配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列のすべてまたは一部；配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体のすべてまたは一部；配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列のすべてまたは一部；ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体のすべてまたは一部；配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列のすべてまたは一部；配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の相補体のすべてまたは一部；配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列のすべてまたは一部；ならびに配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の相補体のすべてまたは一部。
【００２４】
ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを注射アッセイ、飼料、植物上に噴霧することにより、あるいはｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを発現する遺伝子組換え植物細胞で、鞘翅目害虫に与えることができる方法も本明細書に開示する。これらおよびさらなる例において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡは、鞘翅目害虫の幼虫および／または成虫により摂取させることができる。本明細書に開示のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡの摂取は、幼虫および／または成虫におけるＲＮＡｉをもたらす可能性があり、これがひいては鞘翅目害虫の生存能力に必須な遺伝子のサイレンシングをもたらし、最終的に幼虫および／または成虫の死につながる可能性がある。したがって、鞘翅目害虫の防除に有用な例示的な核酸配列（複数可）を含む核酸分子を鞘翅目害虫に与える方法を開示する。特定の例において、本明細書で述べる核酸分子の使用により防除される鞘翅目害虫は、ＷＣＲ、ＮＣＲ、ＳＣＲまたはＰＢであり得る。前述および他の特徴は、添付図面に関連して行われる、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｄｓＲＮＡの生成のための特異的鋳型を得るために用いた戦略を示す図である。
【図２】ｄｓＲＮＡの生成のための特異的鋳型を得るために用いた戦略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
配列一覧表
添付の配列一覧表に列挙した核酸配列を３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定の通りにヌクレオチド塩基の標準的文字略記を用いて示す。各核酸配列の１つの鎖のみを示すが、相補鎖および逆相補鎖は、表示鎖の記載により含められるものと理解される。添付の配列一覧表において、
配列番号１は、ジアブロティカ属（Diabrotica）のｒｎａｐＩＩ−１４０のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は、ジアブロティカ属（Diabrotica）のＲＮＡＰＩＩ−１４０タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成に用いたｒｎａｐＩＩ−１４０領域１のジアブロティカ属（Diabrotica）のＤＮＡ配列（５’および３’末端におけるＴ７プロモーター配列は示さず）を示す。
配列番号４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成に用いたｒｎａｐＩＩ−１４０領域２のジアブロティカ属（Diabrotica）のＤＮＡ配列（５’および３’末端におけるＴ７プロモーター配列は示さず）を示す。
配列番号５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成に用いたｒｎａｐＩＩ−１４０領域３のジアブロティカ属（Diabrotica）由来のＤＮＡ配列を示す（５’および３’末端におけるＴ７プロモーター配列は示さず）。
配列番号６は、Ｔ７ファージプロモーターのＤＮＡ配列を示す。
配列番号７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成に用いたＹＦＰコード領域セグメントのＤＮＡ配列（５’および３’末端におけるＴ７プロモーター配列は示さず）を示す。
配列番号８〜１５は、ｒｎａｐＩＩ−１４０領域１、ｒｎａｐＩＩ−１４０領域２およびｒｎａｐＩＩ−１４０領域３を含むｒｎａｐＩＩ−１４０配列の一部を増幅するために用いたプライマー、ならびにＹＦＰコード領域セグメントを増幅するために用いたプライマーを示す。
配列番号１６は、ｐＤＡＢ１１４５２４に見いだされるｒｎａｐＩＩ−１４０ヘアピンＲＮＡ形成配列ｖ１を表す。大文字の塩基は、ｒｎａｐＩＩ−１４０センス鎖であり、下線付きの小文字の塩基は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含み、下線付きでない小文字の塩基は、ｒｎａｐＩＩ−１４０アンチセンス鎖である。
【００２７】
【化１】
2017510246.tif 000003
配列番号１７は、ｐＤＡＢ１１４５２５に見いだされるｒｎａｐＩＩ−１４０ヘアピンＲＮＡ形成配列ｖ２を表す。大文字の塩基は、ｒｎａｐＩＩ−１４０センス鎖であり、下線付きの小文字の塩基は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含み、下線付きでない小文字の塩基は、ｒｎａｐＩＩ−１４０アンチセンス鎖である。
【００２８】
【化２】
2017510246.tif 000004
配列番号１８は、ｐＤＡＢ１１０８５３に見いだされるＹＦＰヘアピンＲＮＡ形成配列ｖ２を表す。大文字の塩基は、ＹＦＰセンス鎖であり、下線付きの塩基は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含み、小文字の下線付きでない塩基は、ＹＦＰアンチセンス鎖である。
【００２９】
【化３】
2017510246.tif 000005
配列番号１９は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンの配列を示す。
配列番号２０は、プラスミドｐＤＡＢ１１０５５６に見いだされる黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１は、アネキシン領域１のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２２は、アネキシン領域２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２３は、ベータスペクトリン２領域１のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４は、ベータスペクトリン２領域２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２５は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２６は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２７〜５０は、ｄｓＲＮＡ合成のためのアネキシン、ベータスペクトリン２、ｍｔＲＰ−Ｌ４およびＹＦＰの遺伝子領域を増幅するために用いたプライマーを示す。
配列番号５１は、ＴＩＰ４ｌ様タンパク質をコードするトウモロコシＤＮＡ配列を示す。
配列番号５２は、オリゴヌクレオチドＴ２０ＮＶのＤＮＡ配列を示す。
配列番号５３〜５７は、トウモロコシ組織における転写レベルを測定するために用いたプライマーおよびプローブを示す。
配列番号５８は、バイナリーベクター主鎖検出に用いたＳｐｅｃＲコード領域の一部のＤＮＡ配列を示す。
配列番号５９は、ゲノムコピー数解析に用いたＡＡＤＩコード領域の一部のＤＮＡ配列を示す。
配列番号６０は、トウモロコシインベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号６１〜７２は、遺伝子コピー数解析およびバイナリーベクタープラスミド主鎖検出に用いたプライマーおよびプローブの配列を示す。
配列番号７３は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）のＲｐＩＩ１４０を含むＤＮＡ配列を示す。
配列番号７４は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）のＲｐＩＩ１４０タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号７５は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）のＲｐＩＩ１４０を含むＤＮＡ配列を示す。
配列番号７６は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）のＲｐＩＩ１４０タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号７７は、ｄｓＲＮＡの生成のために用いたＲｐＩＩ１４０  ｒｅｇ１を示す。
配列番号７８および７９は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）ＲｐＩＩ１４０  ｒｅｇ１を含むＲｐＩＩ１４０配列の一部を増幅するために用いたプライマーを示す。
配列番号８０は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）のＲｐＩＩ１４０タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号８１は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）のＲｐＩＩ１４０を含むＤＮＡ配列を示す。
配列番号８２は、メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）のＲｐＩＩ１４０タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
発明を実施するための形態
１．いくつかの実施形態の概要
鞘翅目害虫の外寄生の遺伝子防除のための方法および組成物を本明細書に開示する。鞘翅目害虫集団のＲＮＡｉ媒介防除のための標的遺伝子として用いる鞘翅目害虫の生活環に必須の１つまたは複数の遺伝子を同定する方法も提供する。１つまたは複数のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子をコードＤＮＡプラスミドベクターは、成長、生存、発育および／または生殖に必須の１つまたは複数の標的遺伝子を抑制するように設計することができる。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子による標的遺伝子の発現の転写後抑制または阻害の方法を提供する。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫は、標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子のすべてまたは一部から転写される１つまたは複数のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子を摂取し、それにより植物保護効果をもたらし得る。
【００３１】
したがって、いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫の少なくとも部分的な防除を達成するために標的遺伝子（複数可）のコードおよび／または非コード配列と相補的であるｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを用いる、標的遺伝子産物の発現の配列特異的阻害を含む。例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７および配列番号８１ならびにそれらの断片のいずれかに示す、ヌクレオチド配列を含む一組の単離および精製核酸分子を開示する。いくつかの実施形態では、安定化ｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子の転写後サイレンシングまたは阻害のために、この配列、その断片、またはこれらの配列の１つを含む遺伝子から発現させることができる。特定の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号１のすべてまたは一部を含む。他の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号３のすべてまたは一部を含む。他の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号４のすべてまたは一部を含む。さらに他の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号５のすべてまたは一部を含む。またさらなる実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号７３のすべてまたは一部を含む。他の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号７５のすべてまたは一部を含む。さらに他の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号７７のすべてまたは一部を含む。またさらなる実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号８１のすべてまたは一部を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子（複数可）をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列をそのゲノムに有する組換え宿主細胞（例えば、植物細胞）を含む。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子（複数可）は、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を転写後に検出されなくするまたは阻害するために、組換え宿主細胞によって生成され、次いで鞘翅目害虫により摂取され得る。組換えＤＮＡ配列は、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７もしくは配列番号８１のいずれかの１つもしくは複数；配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７もしくは配列番号８１のいずれかの断片または配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７もしくは配列番号８１の１つもしくは複数を含む遺伝子の部分配列；あるいはそれらの相補体を含み得る。
【００３３】
特定の実施形態は、配列番号１、配列番号７３、配列番号７５および／または配列番号８１のすべてまたは一部を含む少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子（複数可）をコードする組換えＤＮＡ配列をそのゲノムに有する組換え宿主細胞を含む。鞘翅目害虫により摂取されるときに、ｉＲＮＡ分子（複数可）は、鞘翅目害虫における配列番号１、配列番号７３、配列番号７５または配列番号８１を含む標的遺伝子の発現を検出されなくし、または阻害し、それにより、鞘翅目害虫における成長、発育、生殖および／または摂食の停止をもたらし得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｉＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列をそのゲノムに有する組換え宿主細胞は、形質転換植物細胞であり得る。いくつかの実施形態は、そのような形質転換植物細胞を含むトランスジェニック植物を含む。そのようなトランスジェニック植物に加えて、トランスジェニック植物世代の子孫植物、トランスジェニック種子およびトランスジェニック植物産物をすべて提供し、それらのそれぞれが組換えＤＮＡ配列（複数可）を含む。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞中で発現させることができる。したがって、これらおよび他の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞から単離することができる。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、コーン（ゼア・マイス（Zea mays））、ダイズ（グリシン・マクス（Glycine max））、カノーラ（ブラシカ（Brassica）種）およびイネ科（Poaceae）の植物からなる群から選択される植物である。
【００３５】
いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を含む。これらおよび他の実施形態では、核酸分子を提供することができ、該核酸分子は、ｉＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結することができ、転写終結配列にも作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、鞘翅目害虫細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法は、（ａ）ｉＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターにより植物細胞に形質転換を起こさせることと、（ｂ）複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で形質転換植物細胞を培養することと、（ｃ）ベクターをそのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、（ｄ）選択された形質転換植物細胞がベクターのヌクレオチド配列によりコードされたｉＲＮＡ分子を含むことを判定することとを含み得る。植物は、そのゲノムに組み込まれたベクターを有し、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされたｉＲＮＡ分子を含む植物細胞から再生させることができる。
【００３６】
したがって、そのゲノムに組み込まれたｉＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされたｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物も開示する。特定の実施形態では、植物におけるｉＲＮＡ分子の発現は、例えば、形質転換植物、植物の一部（例えば、根）または植物細胞を常食にすることにより、形質転換植物または植物細胞に接触する鞘翅目害虫の細胞中の標的遺伝子の発現を調節するのに十分である。本明細書に開示するトランスジェニック植物は、鞘翅目害虫の外寄生に対する抵抗性および／または耐性の増大を示し得る。特定のトランスジェニック植物は、ＷＣＲ；ＮＣＲ；ＳＣＲ；ＭＣＲ；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；Ｄ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム；ならびにメリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）ファブリツィウスからなる群から選択される１つまたは複数の鞘翅目害虫に対する抵抗性および／または耐性の増大を示し得る。
【００３７】
また鞘翅目害虫へのｉＲＮＡ分子等の防除剤の送達の方法も本明細書に開示する。そのような防除剤は、宿主において摂食する、成長する、または別の方法で被害を引き起こす鞘翅目害虫の能力の低下を直接的または間接的にもたらし得る。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における少なくとも１つの標的遺伝子を抑制するために鞘翅目害虫に安定化ｉＲＮＡ分子を送達し、それにより鞘翅目害虫による植物被害を低減または排除することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を阻害する方法は、鞘翅目害虫における成長、発育、生殖および／または摂食の停止をもたらし得る。いくつかの実施形態では、該方法は、最終的には鞘翅目害虫の死をもたらし得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の外寄生の排除または低減を達成するために植物、動物および／または植物もしくは動物の環境に対してまたはそれにおいて用いるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子を含む組成物（例えば、局所組成物）を提供する。特定の実施形態では、組成物は、鞘翅目害虫に食させる栄養組成物または食物源であり得る。いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫が利用できる栄養組成物または食物源を作ることを含む。ｉＲＮＡ分子を含む組成物の摂取は、鞘翅目害虫の１つまたは複数の細胞による該分子の取込みをもたらし得、これがひいては鞘翅目害虫の細胞（複数可）における少なくとも１つの標的遺伝子の発現の阻害をもたらし得る。鞘翅目害虫による植物または植物細胞の摂取または被害は、鞘翅目害虫の宿主にｉＲＮＡ分子を含む１つまたは複数の組成物を供給することにより、鞘翅目害虫が存在する宿主組織または環境中またはその上において制限または排除することができる。
【００３９】
本明細書に開示する組成物および方法は、鞘翅目害虫による被害を防除するための他の方法および組成物と組み合わせて一緒に用いることができる。例えば、鞘翅目害虫から植物を保護するための本明細書で述べるｉＲＮＡ分子は、鞘翅目害虫に対して有効な１つもしくは複数の化学物質、鞘翅目害虫に対して有効な生物農薬、輪作、またはＲＮＡｉ媒介法およびＲＮＡｉ組成物（例えば、鞘翅目害虫に有害である植物におけるタンパク質（例えば、Ｂｔ毒素）の組換え産生）の特徴と異なる特徴を示す遺伝子組換え技術のさらなる使用を含む方法に用いることができる。
【００４０】
ＩＩ．略語
ｄｓＲＮＡ  二本鎖リボ核酸
ＧＩ        成長阻害
ＮＣＢＩ    米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）
ｇＤＮＡ    ゲノムＤＮＡ
ｉＲＮＡ    阻害リボ核酸
ＯＲＦ      オープンリーディングフレーム
ＲＮＡｉ    リボ核酸干渉
ｍｉＲＮＡ  マイクロ阻害リボ核酸
ｓｉＲＮＡ  低分子阻害干渉リボ核酸
ｈｐＲＮＡ  ヘアピンリボ核酸
ＵＴＲ      非翻訳領域
ＷＣＲ      ウェスタンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）
ＮＣＲ      ノーザンコーンルートワーム（ジアブロティカ・バルベリ（Diabrotica barberi）スミスおよびローレンス）
ＭＣＲ      メキシカンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Diabrotica virgifera zeae）クリサンおよびスミス）
ＰＣＲ      ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＳＣ    ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体
ＳＣＲ      サザンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（Diabrotica undecimpunctata howardi）バーバー）
ＰＢ        花粉甲虫（メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）ファブリツィウス）
【００４１】
ＩＩＩ．用語
続く説明および表において、多くの用語が用いられている。そのような用語に与えるべき範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確で、一貫した理解を可能にするために、以下の定義を記載する。
【００４２】
鞘翅目害虫：  特定の例において、鞘翅目害虫は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコント（ＷＣＲ）；Ｄ．バルベリ（D. barberi）スミスおよびローレンス（ＮＣＲ）；Ｄ．ｕ．ホワルディ（D. u. howardi）（ＳＣＲ）；Ｄ．ｖ．ゼアエ（D. v. zeae）（ＭＣＲ）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D.u. tenella）；Ｄ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム；ならびにメリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus）ファブリツィウスを含むリストから選択される。
【００４３】
（生物との）接触：  本明細書で用いているように、核酸分子に関する、生物（例えば、鞘翅目害虫）「との接触」または「による取込み」という用語は、生物体内への核酸分子のインターナリゼーション、例えば、かつ制限なく、生物による分子の摂取（摂食による）；生物を核酸分子を含む組成物と接触させること；核酸分子を含む溶液による生物を漬けることを含む。
【００４４】
コンティグ：  本明細書で用いているように、「コンティグ」という用語は、単一遺伝源に由来する一組の重複ＤＮＡセグメントから再構成されているＤＮＡ配列を意味する。
【００４５】
コーン植物体：  本明細書で用いているように、「コーン植物体」という用語は、ゼア・マイス種（Zae mays）（トウモロコシ）の植物を意味する。
【００４６】
ｉＲＮＡをコードする：  本明細書で用いているように、「ｉＲＮＡをコードする」という用語は、そのＲＮＡ転写産物が分子内ｄｓＲＮＡ構造（例えば、ヘアピン）または分子間ｄｓＲＮＡ構造（例えば、標的ＲＮＡ分子とハイブリダイズすることにより）を形成することができる遺伝子を含む。
【００４７】
発現：  本明細書で用いているように、コード配列（例えば、遺伝子または導入遺伝子）の「発現」は、しばしばタンパク質の合成を含む、核酸転写単位のコード化情報（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）が細胞の作動、非作動または構造部分に変換されるプロセスを意味する。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加または減少させる作用因子への細胞、組織または生物体の曝露による影響を受け得る。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡを経てタンパク質までの経路のどこかで調節することもできる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解に作用するコントロールにより、またはそれらが行われた後に特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、画分化、もしくは分解により、またはそれらの組合せにより起こる。遺伝子発現は、制限なく、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタン（免疫）ブロット、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕもしくはｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法によりＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【００４８】
遺伝物質：  本明細書で用いているように、「遺伝物質」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の、すべての遺伝子および核酸分子を含む。
【００４９】
阻害：  本明細書で用いているように、「阻害」という用語は、コード配列（例えば、遺伝子）に対する効果を記述するために用いる場合、コード配列から転写されたｍＲＮＡおよび／またはコード配列のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質産物の細胞レベルの測定可能な低下を意味する。いくつかの例において、コード配列の発現は、発現がほぼ無くなるように阻害することができる。「特異的阻害」は、特異的阻害が達成される細胞中の他のコード配列（例えば、遺伝子）の発現に後に影響を及ぼすことのない標的コード配列の阻害を意味する。
【００５０】
単離された：  「単離された」生物学的構成成分（核酸またはタンパク質等）は、構成成分が天然に存在する生物体の細胞中の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離された、とは別に産生された、またはから精製された。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。該用語は、宿主細胞中で組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドも含む。
【００５１】
核酸分子：  本明細書で用いているように、「核酸分子」という用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含み得る、ヌクレオチドの重合体、ならびに合成体および上記のものの混合重合体を意味し得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、いずれかの型のヌクレオチドの修飾体を意味し得る。「核酸分子」は、本明細書で用いているように、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義語である。核酸分子は、特に示さない限り、通常、長さが少なくとも１０塩基である。慣例により、核酸分子のヌクレオチド配列は、分子の５’末端から３’末端の方向に読み取られる。ヌクレオチド配列の「相補体」は、ヌクレオチド配列の核酸塩基と塩基対（すなわち、Ａ−Ｔ／ＵおよびＧ−Ｃ）を形成する核酸塩基の５’から３’までの配列を意味する。核酸配列の「逆相補体」は、ヌクレオチド配列の核酸塩基と塩基対を形成する核酸塩基の３’から５’までの配列を意味する。
【００５２】
「核酸分子」は、一本および二本鎖型のＤＮＡ；一本鎖型のＲＮＡ；ならびに二本鎖型のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖としての、または二重らせんにおける核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の両方を意味する。「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語は、ｉＲＮＡ（阻害ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｈｐＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ、対応するアシル化アミノ鎖を負荷されているか、または負荷されていないかを問わず）およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含む。ｉＲＮＡは、本明細書で用いているように、標的遺伝子または複数の標的遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡ分子を意味し、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含むが、これらに限定されない。「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）という用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。「核酸セグメント」および「ヌクレオチド配列セグメント」またはより一般的には「セグメント」という用語は、ゲノム配列、リボソームＲＮＡ配列、転移ＲＮＡ配列、メッセンジャーＲＮＡ配列、オペロン配列、およびペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするまたはコードするように適合させることができる工学的に操作したより小さいヌクレオチド配列の両方を含む機能用語と当業者により理解されよう。
【００５３】
オリゴヌクレオチド：  オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントの切断により、または個々のヌクレオチド前駆体を重合させることにより、形成させることができる。自動合成器により、長さが数百塩基までのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、相補的ヌクレオチド配列に結合し得るので、それらは、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして用いることができる。ＤＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡを生成するように逆転写された）配列の増幅のための技術である、ＰＣＲに用いることができる。ＰＣＲにおいて、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を複製することを可能にする、「プライマー」と一般的に呼ばれる。
【００５４】
核酸分子は、天然および／または非天然ヌクレオチド結合により結合した天然および修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。核酸分子は、当業者により容易に理解されるように、化学的もしくは生化学的に修飾することができ、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。そのような修飾は、例えば、標識、メチル化、類似体による１つまたは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等；荷電結合：例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等；ペンダント部分：例えば、ペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソレラン等；キレート剤；アルキル化剤；修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸等）を含む。「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分二重らせん、三重らせん、ヘアピン、環状およびパドロック型立体配座を含む、任意の位相幾何学的立体配座も含む。
【００５５】
本明細書で用いているように、ＤＮＡに関して、「コード配列」、「構造ヌクレオチド配列」または「構造核酸分子」という用語は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、転写されて、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｉＲＮＡ）を産生し、ｍＲＮＡの場合、最終的にポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列を意味する。ＲＮＡに関しては、「コード配列」という用語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、５’末端における翻訳開始コドンおよび３’末端における翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ＥＳＴ；および組換えヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
ゲノム：  本明細書で用いているように、「ゲノム」という用語は、細胞の核内に見いだされる染色体ＤＮＡを意味し、細胞の細胞分画物内に見いだされるオルガネラＤＮＡも意味する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が植物細胞のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子を植物細胞に導入することができる。これらおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、植物細胞の核ＤＮＡに組み込むか、または植物細胞の葉緑体もしくはミトコンドリアのＤＮＡに組み込むことができる。「ゲノム」という用語は、細菌に適用するとき、細菌細胞内の染色体およびプラスミドの両方を意味する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が細菌のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子を細菌に導入することができる。これらおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、染色体に組み込むか、または安定プラスミドとしてもしくはそれに位置することができる。
【００５７】
配列同一性：  「配列同一性」または「同一性」という用語は、本明細書で用いているように、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において、規定の比較ウインドウにわたり最大の一致を得るようにアライメントした場合に同じである２つの配列における残基を意味する。
【００５８】
本明細書で用いているように、「配列同一性の百分率」という用語は、２つの最適にアライメントされた配列（例えば、核酸配列またはポリペプチド配列）を比較ウインドウにわたり比較することにより決定される値を意味し、比較ウインドウにおける配列の一部は、２つの配列の最適のアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を測定して、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって計算する。参照配列と比較してすべての位置で同一である配列は、参照配列と１００％同一であると言われ、またその逆も同じである。
【００５９】
比較のために配列をアライメントする方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250に記載されている。配列のアラインメントの方法および相同性の計算の詳細な考察は、例えばAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410において見いだすことができる。
【００６０】
米国国立生物技術情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990)）が、いくつかの配列解析プログラムに関連して使用するために、米国国立生物技術情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの情報源およびインターネット上で利用できる。このプログラムを用いて配列同一性をどのようにして決定するかの説明は、ＢＬＡＳＴの「ヘルプ」セクションのもとにインターネット上で入手できる。核酸配列の比較のために、デフォルトパラメーターに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いてＢＬＡＳＴ（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ  ２配列」関数（function）を用いることができる。参照配列とのより大きい類似性を有する核酸配列は、この方法により評価する場合、同一性の百分率の増加を示す。
【００６１】
特異的にハイブリダイズ可能な／特異的に相補的な：  本明細書で用いているように、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」という用語は、安定かつ特異的な結合が核酸分子と標的核酸分子との間で起こるように十分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子の核酸配列間の逆平行アライメントの形成を伴う。２つの分子は、そのとき逆鎖上の対応する塩基との水素結合を形成して、それが十分に安定である場合、当技術分野で周知の方法を用いて検出できる二重らせん分子を形成することができる。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるにはその標的配列と１００％相補的である必要はない。しかし、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない配列相補性の量は、用いるハイブリダイゼーション条件の関数である。
【００６２】
特定の厳密度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、最適なハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さによって異なる。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションのイオン強度（とりわけＮａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションの厳密性を決定する。洗浄緩衝液のイオン強度および洗浄温度も厳密性に影響を及ぼす。特定の厳密度を達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapter 9 and 11, and updatesおよびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に述べられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および指針は、例えば、Tijssen, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995, and updatesに見いだすことができる。
【００６３】
本明細書で用いているように、「厳密条件」は、ハイブリダイゼーション分子間に８０％を超える配列の一致および標的核酸分子内に相同配列が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。「厳密条件」は、厳密性のさらなる特定のレベルを含む。したがって、本明細書で用いているように、「中厳密性」条件は、８０％を超える配列の一致を有する（２０％未満のミスマッチ）分子がハイブリダイズする条件であり、「高厳密性」の条件は、９０％を超える一致を有する（１０％未満のミスマッチ）配列がハイブリダイズする条件であり、「超高厳密性」の条件は、９５％を超える一致を有する（５％未満のミスマッチ）配列がハイブリダイズする条件である。
【００６４】
以下は、代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
高厳密条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：  ５Ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２Ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温でそれぞれ１５分間２回洗浄する；および０．５Ｘ  ＳＳＣ緩衝液で６５℃でそれぞれ２０分間２回洗浄する。
中厳密条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：  ５Ｘ〜６Ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２Ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温でそれぞれ５〜２０分間２回洗浄する；および１Ｘ  ＳＳＣ緩衝液で５５〜７０℃でそれぞれ３０分間２回洗浄する。
非厳密対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有する配列がハイブリダイズする）：  ６Ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での室温〜５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２Ｘ〜３Ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間少なくとも２回洗浄する。
【００６５】
本明細書で用いているように、連続した核酸配列に関する「実質的に相同」または「実質的相同性」という用語は、参照核酸配列を有する核酸分子と厳密条件下でハイブリダイズする核酸分子が有する連続したヌクレオチド配列を意味する。例えば、配列番号１の参照核酸配列と実質的に相同である配列を有する核酸分子は、配列番号１の参照核酸配列を有する核酸分子と厳密条件（例えば、上に示した中厳密条件）のもとでハイブリダイズする核酸分子である。実質的に相同の配列は、少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。例えば、実質的に相同の配列は、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約１００％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９または１００％等の、約８０％〜１００％の配列同一性を有し得る。実質的相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーションに密接に関連している。例えば、特異的結合が望まれる条件下、例えば、厳密ハイブリダイゼーション条件下で非標的配列に対する核酸の特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合に、核酸分子は、特異的にハイブリダイズする。
【００６６】
本明細書で用いているように、「オルソログ」という用語は、共通の祖先のヌクレオチド配列から発生し、２つ以上の種において共通の機能を保持し得る２つ以上の種における遺伝子を意味する。
【００６７】
本明細書で用いているように、５’→３’方向に読み取られた配列のすべてのヌクレオチドが３’→５’方向に読み取られた場合の他の配列のすべてのヌクレオチドと相補的である場合、２つの核酸配列分子は、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補体配列と配列同一性を示す。これらの用語および記述は、当技術分野で十分に定義されており、当業者に容易に理解される。
【００６８】
作動可能に連結した：  第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。組換えによって産生させる場合、作動可能に連結した核酸配列は、一般的に連続しており、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を同じ読取枠で（例えば、翻訳段階で融合されるＯＲＦで）連結させることができる。しかし、核酸は、作動可能に連結するように連続している必要はない。
【００６９】
「作動可能に連結した」という用語は、調節配列およびコード配列に関連して用いる場合、調節配列が連結コード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」または「制御エレメント」は、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター；翻訳リーダー配列；イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；レプレッサー結合配列；終結配列；ポリアデニル化認識配列等を含み得る。特定の調節配列は、それと作動可能に連結するコード配列の上流および／または下流に位置することができる。また、コード配列と作動可能に連結する特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連相補鎖に位置することができる。
【００７０】
プロモーター：  本明細書で用いているように、「プロモーター」という用語は、転写の開始の上流にあり、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与し得るＤＮＡの領域を意味する。プロモーターは、細胞中の発現のためにコード配列に作動可能に連結することができる。あるいはプロモーターは、細胞中の発現のためにコード配列に作動可能に連結することができるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。「植物プロモーター」は、植物細胞中の転写を開始することができるプロモーターであり得る。発育制御下のプロモーターの例としては、葉、根、種子、繊維、木質導管、仮導管または厚膜組織等の特定の組織における転写を優先的に開始するプロモーター等がある。そのようなプロモーターは、「組織優先的」と呼ばれる。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型特異的」プロモーターは、１つまたは複数の器官における特定の細胞型、例えば、根または葉における維管束細胞における発現を主として推進する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあり得るプロモーターであり得る。誘導性プロモーターにより転写を開始させ得る環境条件の例としては、嫌気性条件および光の存在等がある。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的および誘導性プロモーターは、「非構成性」プロモーターのクラスを構成する。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境条件下またはほとんどの組織もしくは細胞型で活性であり得るプロモーターである。
【００７１】
任意の誘導性プロモーターをいくつかの実施形態で用いることができる。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366を参照のこと。誘導性プロモーターにより、転写の速度は、誘導剤に応答して増大する。例示的な誘導性プロモーターは、銅に応答するＡＣＥＩシステムに由来するプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシに由来するIn2遺伝子；Ｔｎ１０のＴｅｔレプレッサー；およびその転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導され得る（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425）、ステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導性プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００７２】
例示的な構成性プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター等の、植物ウイルスに由来するプロモーター；イネアクチン遺伝子に由来するプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；およびＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５‘側のＸｂａｌ／ＮｃｏＩ断片（または前記Ｘｂａｌ／ＮｃｏＩ断片と類似のヌクレオチド配列）（米国特許第５，６５９，０２６号）を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
さらに、あらゆる組織特異的または組織優先的プロモーターは、いくつかの実施形態で用いることができる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結したコード配列を含む核酸分子を用いて形質転換した植物は、特定の組織において、もっぱら、または優先的にコード配列の産物を産生し得る。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、インゲンマメ属に由来するもの等の、種子優先的プロモーター；キャブまたはルビスコに由来するもの等の葉特異的および光誘導性プロモーター；ＬＡＴ５２に由来するもの等の葯特異的プロモーター；Ｚｍ１３に由来するもの等の花粉特異的プロモーター；およびａｐｇに由来するもの等の小胞子優先的プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００７４】
形質転換：  本明細書で用いているように、「形質転換」または「形質導入」という用語は、細胞への１つまたは複数の核酸分子（複数可）の移入を意味する。核酸分子の細胞ゲノムへの取込みにより、またはエピソーム複製により、核酸分子が細胞により安定に複製されるようになる場合、細胞は、細胞に形質導入された核酸分子によって「形質転換」される。本明細書で用いているように、「形質転換」という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入することができるすべての技術を含む。例は、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-793）；リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417）；マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-585）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807）；直接DNA取込み；および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
導入遺伝子：  外因性核酸配列。いくつかの例において、導入遺伝子は、鞘翅目害虫に見いだされる核酸分子と相補的であるヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子の１つまたは２つの鎖をコードする配列であり得る。さらなる例において、導入遺伝子は、アンチセンス核酸配列であってもよく、アンチセンス核酸配列の発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。またさらなる例において、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤抵抗性遺伝子）、産業的または薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業的形質をコードする遺伝子であり得る。これらおよび他の例において、導入遺伝子は、導入遺伝子のコード配列と作動可能に連結する調節配列を含み得る（例えば、プロモーター）。
【００７６】
ベクター：  例えば、形質転換細胞を生産するために細胞に導入する核酸分子。ベクターは、複製起点等の、宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含む。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、または外因性ＤＮＡを細胞内に運ぶウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターは、ＲＮＡ分子でもあり得る。ベクターは、１つもしくは複数の遺伝子、アンチセンス配列、および／または選択可能マーカー遺伝子ならびに当技術分野で公知の他の遺伝エレメントも含み得る。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換または感染させ、それにより、ベクターによりコードされる核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させる。ベクターは、細胞への核酸分子の侵入を達成することを促進する物質を場合によって含む（例えば、リポソーム、タンパク質コーティング等）。
【００７７】
収量：  同時に同じ条件下で成長する同じ成長場所における基準品種の収量と比べて約１００％またはそれ以上の安定化収量。特定の実施形態では、「収量向上」または「収量の向上」は、栽培品種が、同時に同じ条件下で成長する当作物に害である著しい密度の鞘翅目害虫を含む同じ成長場所における基準品種の収量と比べて１０５％〜１１５％またはそれ以上の安定化収量を有することを意味する。
【００７８】
特に示さないまたは黙示しない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、本明細書で用いているように、「少なくとも１つ」を意味する。
【００７９】
特に説明しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、例えば、Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。特に示さない限り、すべての百分率は、重量によるものであり、すべての溶媒の混合割合は、容積によるものである。すべての温度は、摂氏温度である。
【００８０】
ＩＶ．鞘翅目害虫配列を含む核酸分子
Ａ．概要
本明細書で述べるのは、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子である。述べる核酸分子は、標的配列（例えば、天然遺伝子および非コード配列）、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む。例えば、鞘翅目害虫における１つまたは複数の天然核酸配列のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であり得るｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子をいくつかの実施形態で述べる。これらおよびさらなる実施形態では、天然核酸配列（複数可）は、１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）であり得、その産物は、例えばかつ制限なく、代謝プロセスに関与、生殖プロセスに関与、または幼虫の発育に関与し得る。本明細書で述べる核酸分子は、核酸分子が特異的に相補的である少なくとも１つの天然核酸配列（複数可）を含む細胞に導入した場合、細胞中でＲＮＡｉを開始し、結果として天然核酸配列（複数可）の発現を低減または排除し得る。いくつかの例において、標的遺伝子に特異的に相補的である配列を含む核酸分子による標的遺伝子の発現の低減または排除は、鞘翅目害虫において致死性である、あるいは成長および／または生殖の低減をもたらすことがあり得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における少なくとも１つの標的遺伝子を選択することができ、該標的遺伝子は、ｒｎａｐＩＩ−１４０（例えば配列番号１、配列番号７３、配列番号７５または配列番号８１）を含むヌクレオチド配列を含む。特定の例において、鞘翅目害虫における標的遺伝子が選択され、該標的遺伝子は、ｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号１、配列番号７３、配列番号７５または配列番号８１）を含む新規ヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ＲＮＡＰＩＩ−１４０（例えば配列番号２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８０または配列番号８２）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一（例えば、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９または１００％同一）である連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であり得る。標的遺伝子は、鞘翅目害虫における任意の核酸配列であり得、その転写後阻害は、鞘翅目害虫に対する有害効果を有し、あるいは鞘翅目害虫に対する保護効果を植物にもたらす。特定の例において、標的遺伝子は、新規ヌクレオチド配列である配列番号２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８０または配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、約１００％同一、８５％同一、８６％同一、８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一または１００％同一である連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子である。
【００８３】
その発現が鞘翅目害虫におけるコード配列によりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をもたらす、ヌクレオチド配列を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫による発現ＲＮＡ分子の摂取後に、鞘翅目害虫の細胞中のコード配列の下方制御を得ることができる。特定の実施形態では、鞘翅目害虫の細胞中のコード配列の下方制御は、鞘翅目害虫の成長、生存能力、増殖および／または生殖に対する有害効果をもたらし得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、標的配列は、標的鞘翅目害虫遺伝子の５’ＵＴＲ；３’ＵＴＲ；スプライスリーダー配列；イントロン配列；アウトロン配列（例えば、トランススプライシングでその後修飾される５’ＵＴＲ  ＲＮＡ）；ドナトロン配列（トランススプライシングのためのドナー配列を提供するのに必要な非コードＲＮＡ）等の転写非コードＲＮＡ配列および他の非コード転写ＲＮＡを含む。そのような配列は、モノシストロン性およびポリシストロン性遺伝子の両方に由来し得る。
【００８５】
したがって、いくつかの実施形態に関連して鞘翅目害虫における標的配列のすべてまたは一部に対して特異的に相補的である少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）についても本明細書で述べる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、複数の標的配列、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の標的配列のすべてまたは一部に相補的であるヌクレオチド配列（複数可）を含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、植物または細菌等の遺伝子組換え生物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生され得る。鞘翅目害虫における標的配列のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であるｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子および／またはｈｐＲＮＡ分子の産生に用いることができるｃＤＮＡ配列も開示する。特定の宿主標的の安定な形質転換を達成するのに用いる組換えＤＮＡ構築物をさらに述べる。形質転換宿主標的は、組換えＤＮＡ構築物から有効レベルのｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子を発現し得る。したがって、植物細胞中で機能し得る異種プロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベクターについても述べるものであり、該ヌクレオチド配列（複数可）の発現により、鞘翅目害虫における標的配列のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子が結果として生じる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、ｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号１）を含むジアブロティカ属（Diabrotica）から単離された天然核酸配列のすべてまたは一部；ｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号７３、配列番号７５または配列番号８１）を含むメリゲテス属（Meligethes）から単離された天然核酸配列のすべてまたは一部；発現した場合、ｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号１、配列番号７３、配列番号７５または配列番号８１）によりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部に特異的に相補的であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をもたらすヌクレオチド配列；ｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号１、配列番号７３、配列番号７５または配列番号８１）のすべてまたは一部に特異的に相補的である少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）；ｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号１、配列番号７３、配列番号７５または配列番号８１）のすべてまたは一部に特異的に相補的であるｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子および／またはｈｐＲＮＡ分子の生成に用いることができるｃＤＮＡ分子；ならびに特定の宿主標的の安定な形質転換を達成するのに用いる組換えＤＮＡ構築物を含み得、形質転換宿主標的は、１つまたは複数の前述の核酸分子を含む。
【００８７】
Ｂ．核酸分子
本発明は、とりわけ、鞘翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子；ならびに鞘翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するために細胞もしくは微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができるＤＮＡ分子を提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態は、以下からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）の核酸配列（複数可）を含む単離核酸分子を提供する：配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の相補体；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体。特定の実施形態では、単離核酸配列の鞘翅目害虫との接触またはそれらによる取込みは、鞘翅目害虫の成長、発育、生殖および／また��摂食を阻害する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、鞘翅目害虫の細胞、組織または器官における標的遺伝子発現を阻害するように細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができる少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のＤＮＡ配列（複数可）を含み得る。そのようなＤＮＡ配列（複数可）は、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）を形成することができるコード化ＲＮＡの転写を開始または増大させるようにＤＮＡ分子を含む細胞中で機能するプロモーター配列に作動可能に連結させることができる。一実施形態では、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のＤＮＡ配列（複数可）は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１を含むヌクレオチド配列に由来し得る。配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の誘導体は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の断片を含む。いくつかの実施形態では、そのような断片は、例えば、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１あるいはその相補体の少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドを含み得る。したがって、そのような断片は、例えば、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１あるいはその相補体の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の連続したヌクレオチドを含み得る。これらおよびさらなる実施形態では、そのような断片は、例えば、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１あるいはその相補体の約１５個を超える連続したヌクレオチドを含み得る。したがって、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の断片は、例えば、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１あるいはその相補体の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、約２５（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９）、３０、約３０、４０、約４０（例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４および４５）、５０、約５０、６０、約６０、７０、約７０、８０、約８０、９０、約９０、１００、約１００、１１０、約１１０、１２０、約１２０、１３０、約１３０、１４０、約１４０、１５０、約１５０、１６０、約１６０、１７０、約１７０、１８０、約１８０、１９０、約１９０、２００、約２００個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含み得る。
【００９０】
いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫の細胞、組織または器官における標的遺伝子の発現を阻害するために部分的または完全に安定化されたｉＲＮＡ分子を鞘翅目害虫に導入することを含む。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）として発現させ、鞘翅目害虫により取り込ませた場合、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の１つまたは複数の断片を含む核酸配列は、死、成長阻害、性比の変化、一腹子数の減少、鞘翅目害虫による感染の停止および／または摂食の停止の１つまたは複数をもたらし得る。例えば、いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の標的遺伝子配列と実質的に相同であり、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１を含むヌクレオチド配列の１つまたは複数の断片を含む約１５〜約３００個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子を提供する。そのようなｄｓＲＮＡ分子の発現は、例えばｉＲＮＡ分子を取り込む鞘翅目害虫における死および／または成長阻害をもたらす。
【００９１】
特定の実施形態では、本明細書で提供するｉＲＮＡ分子は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７もしくは８１を含む標的遺伝子に相補的なヌクレオチド配列および／または配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７もしくは８１の断片に相補的なヌクレオチド配列を含み、鞘翅目害虫におけるその標的遺伝子の阻害は、鞘翅目害虫の成長、発育または他の生物学的機能に必須であるタンパク質またはヌクレオチド配列剤の低減または除去をもたらす。選択されるヌクレオチド配列は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１に示すヌクレオチド配列の連続した断片、あるいは前述のもののいずれかの相補体と約８０％〜約１００％の配列同一性を示し得る。例えば、選択されるヌクレオチド配列は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１に示すヌクレオチド配列の連続した断片、あるいは前述のもののいずれかの相補体と約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約１００％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９または１００％の配列同一性を示し得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現を阻害するために細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子を生成するように発現することができるＤＮＡ分子は、１つまたは複数の標的鞘翅目害虫種に見いだされる天然核酸配列のすべてまたは一部に特異的に相補的である単一ヌクレオチド配列を含み得る。あるいは該ＤＮＡ分子は、複数のそのような特異的に相補的配列からキメラとして構築することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、「スペーサー配列」により分離された第１および第２のヌクレオチド配列を含み得る。スペーサー配列は、これが要求される場合、第１および第２のヌクレオチド配列の間の二次構造の形成を促進するヌクレオチドの任意の配列を含む領域であり得る。一実施形態では、スペーサー配列は、ｍＲＮＡのセンスまたはアンチセンスコード配列の一部である。スペーサー配列は、代わりになるべきものとして、核酸分子と共有結合することができるヌクレオチドの任意の組合せまたはそのホモログを含み得る。
【００９４】
例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、異なるＲＮＡ分子のそれぞれが第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含み、第１および第２のヌクレオチド配列が互いに相補的である、１つまたは複数の異なるＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。第１および第２のヌクレオチド配列は、スペーサー配列によりＲＮＡ分子内でつなぐことができる。スペーサー配列は、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列の一部を構成し得る。第１および第２のヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子の発現は、第１および第２のヌクレオチド配列の特異的塩基対合による、ｄｓＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子の形成につながり得る。第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、鞘翅目害虫の生得の核酸配列（例えば、標的遺伝子または転写非コード配列）、その誘導体、またはそれと相同的な配列と実質的に同一または相補的であり得る。
【００９５】
ｄｓＲＮＡ核酸分子は、重合リボヌクレオチド配列の二本鎖を含み、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドの修飾を含み得る。ＲＮＡ構造の修飾は、特異的阻害を可能にするように調整することができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を生成することができるように、ｄｓＲＮＡ分子をユビキタス酵素法により修飾することができる。この酵素法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、真核生物におけるＤＩＣＥＲ等のＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素を利用し得る。Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498;およびHamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-952を参照のこと。ＤＩＣＥＲまたは機能的に同等のＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素は、より大きいｄｓＲＮＡ鎖および／またはｈｐＲＮＡ分子を、それぞれが長さが約１５〜２５ヌクレオチドである、より小さいオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）に切断する。これらの酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、２〜３ヌクレオチドの３’突出ならびに５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を有する。ＲＮＡｓｅＩＩＩ酵素から生成されたｓｉＲＮＡ分子は、細胞中の一本鎖ＲＮＡに巻き戻され、分離される。ｓｉＲＮＡ分子は、次に標的遺伝子から転写されたＲＮＡ配列と特異的にハイブリダイズし、両ＲＮＡ分子は、その後、固有の細胞ＲＮＡ分解メカニズムにより分解される。このプロセスは、標的生物における標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の効果的な分解または除去をもたらし得る。その結果は、標的遺伝子の転写後サイレンシングである。いくつかの実施形態では、異種核酸分子から内因性ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、鞘翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を効果的に媒介し得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、分子間ハイブリダイゼーションによりｉｎ  ｖｉｖｏでｄｓＲＮＡ分子を形成することができる一本鎖ＲＮＡ分子を生成するように転写され得る少なくとも１種の非天然ヌクレオチド配列を含み得る。そのようなｄｓＲＮＡ配列は、一般的に自己集合性であり、標的遺伝子の転写後阻害を達成するために鞘翅目害虫の栄養源に供給することができる。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子は、それぞれが鞘翅目害虫における異なる標的遺伝子と特異的に相補的である、２種の非天然ヌクレオチド配列を含み得る。そのような核酸分子を鞘翅目害虫に供給する場合、分子は、鞘翅目害虫における少なくとも２種の異なる標的遺伝子の発現を阻害する。
【００９７】
Ｃ．核酸分子を得ること
鞘翅目害虫における様々な天然配列は、ｉＲＮＡおよびｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子等の、核酸分子の設計のための標的配列として用いることができる。しかし、天然配列の選択は、簡単なプロセスではない。鞘翅目害虫における少数の天然配列のみが有効な標的となる。例えば、特定の天然配列を核酸分子により効果的に下方制御することができるかどうか、あるいは特定の天然配列の下方制御が鞘翅目害虫の成長、生存能力、増殖および／または生殖に対して有害効果を有するかどうかを確実に予測することはできない。それらから単離されたＥＳＴ等の、天然鞘翅目害虫配列の圧倒的大多数（例えば、米国特許第７，６１２，１９４号および米国特許第７，９４３，８１９号に示されている）は、ＷＣＲまたはＮＣＲ等の鞘翅目害虫の成長、生存能力、増殖および／または生殖に対する有害効果を有さない。鞘翅目害虫に対する有害作用を有し得る天然配列のどれを、宿主植物におけるそのような天然配列に対して相補的な核酸分子を発現させ、宿主植物に害をもたらすことなく、摂食により鞘翅目害虫に対して有害効果をもたらすための組換え技術に用いることができるかも予測できない。
【００９８】
いくつかの実施形態では、核酸分子（例えば、鞘翅目害虫の宿主植物に供給すべきｉＲＮＡ分子）は、代謝または異化生化学的経路、細胞分裂、生殖、エネルギー代謝、消化、宿主植物認識等に関与するアミノ酸配列等の、鞘翅目害虫の生存に必須のタンパク質またはタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡを標的とするように選択される。本明細書で述べたように、その少なくとも１つのセグメントが標的害虫生物の細胞中で産生されるＲＮＡの少なくとも実質的に同一のセグメントに特異的に相補的である１つまたは複数のｉＲＮＡを含む、標的生物による組成物の摂取は、標的の死または他の阻害をもたらし得る。鞘翅目害虫に由来する、ヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡは、鞘翅目害虫による外寄生に抵抗性の植物細胞を構築するために用いることができる。鞘翅目害虫の宿主植物（例えば、Ｚ．マイス（Z. mays）またはＧ．マクス（G. max））は、例えば、本明細書に提供する鞘翅目害虫に由来する１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むように形質転換を起こさせることができる。宿主に形質転換を起こさせたヌクレオチド配列は、形質転換宿主内の細胞または生体液中でｄｓＲＮＡ配列を含むまたは形成する１つまたは複数のｉＲＮＡをコードし、ひいては鞘翅目害虫がトランスジェニック植物との栄養関係を結ぶ場合／時にｄｓＲＮＡを利用できるようにし得る。これは、鞘翅目害虫の細胞中の１つまたは複数の遺伝子の発現の抑制、ならびに最終的に死またはその成長もしくは発育の阻害をもたらし得る。
【００９９】
したがって、いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の成長、発育および生殖に本質的に関与する遺伝子を標的とする。他の標的遺伝子は、例えば、鞘翅目害虫の生存能力、運動、移動、成長、発育、感染能、餌場の確定および生殖に重要な役割を果たすものを含み得る。したがって、標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子または転写因子であり得る。さらに、本明細書で述べる天然鞘翅目害虫ヌクレオチド配列は、その機能が当業者に公知であり、そのヌクレオチド配列が標的鞘翅目害虫のゲノムにおける標的遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能である、植物、ウイルス、細菌または昆虫遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）から得ることもできる。ハイブリダイゼーションにより既知のヌクレオチド配列を有する遺伝子のホモログを同定する方法は、当業者に公知である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を生成するためのヌクレオチド配列を含む核酸分子を得る方法が本明細書に開示される。１つのそのような実施形態は、（ａ）鞘翅目害虫におけるｉＲＮＡ媒介遺伝子抑制時に１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）をそれらの発現、機能および表現型について解析するステップと、（ｂ）ｄｓＲＮＡ媒介抑制解析で成長または発育表現型の変化（例えば、低下）を示す標的鞘翅目害虫のヌクレオチド配列またはそのホモログのすべてもしくは一部を含むプローブによりｃＤＮＡまたはｇＤＮＡライブラリーを探査するステップと、（ｃ）プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）で同定されたＤＮＡクローンを単離するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）で単離されたクローンを含むｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片の配列を決定するステップであって、配列決定された核酸分子がＲＮＡ配列またはそのホモログのすべてもしくは実質的な部分を含んでいるステップと、（ｆ）遺伝子配列、またはｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡまたはｈｐＲＮＡまたはｍＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのすべてもしくは実質的な部分を化学的に合成するステップとを含む。
【０１０１】
さらなる実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子の実質的な部分を生成するためのヌクレオチド配列を含む核酸断片を得る方法は、（ａ）標的鞘翅目害虫の天然ヌクレオチド配列の一部と特異的に相補的である第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを合成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクターに存在するｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ挿入断片を増幅するステップとを含み、増幅核酸分子は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたはｈｐＲＮＡまたはｍＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ分子の実質的な部分を含む。
【０１０２】
核酸は、多くのアプローチにより単離し、増幅し、または生成することができる。例えば、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子は、ｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはその一部から得られた標的核酸配列（例えば、標的遺伝子または標的転写非コード配列）のＰＣＲ増幅により得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、標的生物から抽出することができ、核酸ライブラリーは、当業者に公知の方法を用いてそれから作製することができる。標的生物から得られたｇＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、標的遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定に用いることができる。確認済みのＰＣＲ産物は、最小プロモーターによりセンスおよびアンチセンスＲＮＡを生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として用いることができる。あるいは、核酸分子は、ホスホルアミダイト化学等の標準的な化学を用いる自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置）の使用を含む、多くの技術（例えば、Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214;およびAgrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423）のいずれかにより合成することができる。例えば、Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311；米国特許第４，４１５，７３２号、第４，４５８，０６６号、第４，７２５，６７７号、第４，９７３，６７９号および第４，９８０，４６０号を参照のこと。ホスホロチオエート、ホスホルアミデート等の非天然主鎖基をもたらす代替の化学も用いることができる。
【０１０３】
ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子は、手動または自動化反応により当業者により化学的もしくは酵素的に、あるいはＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子をコードする配列を含む核酸分子を含む細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏで生成することができる。ＲＮＡは、部分または完全有機合成によっても生成することができ、任意の修飾リボヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素または有機合成により導入することができる。ＲＮＡ分子は、細胞ＲＮＡポリメラーゼまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）により合成することができる。ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現に有用な構築物の発現は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，５９３，８７４号、第５，６９３，５１２号、第５，６９８，４２５号、第５，７１２，１３５号、第５，７８９，２１４号および第５，８０４，６９３号を参照のこと。化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成により合成されるＲＮＡ分子は、細胞に導入する前に精製することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組合せにより混合物から精製することができる。あるいは、化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成により合成されるＲＮＡ分子は、例えば、試料の処理による損失を避けるために、精製せずにまたは最小限の精製で用いることができる。ＲＮＡ分子は、保存のために乾燥するか、または水溶液に溶解することができる。溶液は、ｄｓＲＮＡ分子の二重らせん鎖のアニーリングおよび／または安定化を促進するための緩衝剤または塩を含んでいてもよい。
【０１０４】
実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、単一自己相補的ＲＮＡ鎖により、または２つの相補的ＲＮＡ鎖から形成させることができる。ｄｓＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏで１つまたは２つのＲＮＡ鎖の転写を媒介し得る。あるいはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を媒介するのにクローン化ＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。鞘翅目害虫における標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官、組織もしくは細胞型における特異的転写（例えば、組織特異的プロモーターを用いることによる）；宿主における環境条件の刺激（例えば、感染、ストレス、温度および／または化学誘導物質に応答性である誘導性プロモーターを用いることによる）；および／または宿主の発育段階もしくは年齢における工学的転写（例えば、発育段階特異的プロモーターを用いることによる）により宿主標的化することができる。ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ鎖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで転写されるかどうかを問わず、ポリアデニル化され得るか、またはされ得ず、細胞の翻訳装置によりポリペプチドに翻訳されることができ得るか、またはでき得ない。
【０１０５】
Ｄ．組換えベクターおよび宿主細胞形質転換
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞または植物細胞）への導入のためのＤＮＡ分子であって、ＲＮＡへの発現ならびに鞘翅目害虫による摂取により、鞘翅目害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子の抑制を達成するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。したがって、いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫における標的遺伝子発現を阻害するために植物細胞中でｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を生成するように発現することができる核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。発現を開始または増大させるために、そのような組換え核酸分子は、１つまたは複数の調節配列を含んでいてもよく、調節配列は、ｉＲＮＡを生成するように発現することができる核酸配列に作動可能に連結することができる。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は、公知であり、ヌクレオチド配列を発現させるために用いることができる。例えば、国際ＰＣＴ公開国際公開第０６／０７３７２７号および米国特許出願公開第２００６／０２００８７８Ａ１号を参照のこと。
【０１０６】
特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含み得る。そのような組換えＤＮＡ分子は、摂取により鞘翅目害虫細胞における内因性標的遺伝子（複数可）の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子をコードし得る。多くの実施形態では、転写ＲＮＡは、安定化構造で、例えば、ヘアピンならびにステムおよびループ構造として提供することができるｄｓＲＮＡ分子を形成し得る。
【０１０７】
これらおよびさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子の１つの鎖は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１からなるヌクレオチド配列と実質的に相同であるヌクレオチド配列；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の相補体；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からの転写により形成させることができる。
【０１０８】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ分子は、転写配列内に少なくとも２つのヌクレオチド配列セグメントを含む可能性があり、そのような配列は、転写配列が、少なくとも１つのプロモーターに対して、センス配向をなす第１のヌクレオチド配列セグメントを含み、第２のヌクレオチド配列セグメント（第１のヌクレオチド配列セグメントの相補体を含む）がアンチセンス配向にあるように配列し、センスヌクレオチド配列セグメントとアンチセンスヌクレオチド配列は、約５から約１０００ヌクレオチドのスペーサー配列セグメントにより連結またはつながれている。スペーサー配列セグメントは、センスおよびアンチセンス配列セグメントの間のループを形成する可能性がある。センスヌクレオチド配列セグメントまたはアンチセンスヌクレオチド配列セグメントは、標的遺伝子（例えば、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１を含む遺伝子）またはその断片のヌクレオチド配列と実質的に相同であり得る。しかし、いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、スペーサー配列を有さずにｄｓＲＮＡ分子をコードし得る。複数の実施形態では、センスコード配列およびアンチセンスコード配列が異なる長さであり得る。
【０１０９】
鞘翅目害虫に対する有害効果または鞘翅目害虫に対する植物保護効果を有すると同定された配列は、組換え核酸分子における適切な発現カセットの創製により発現ｉＲＮＡ分子に容易に取り込むことができる。例えば、そのような配列は、標的遺伝子配列（例えば、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１およびその断片）に対応する第１のセグメントを選択し、この配列を第１のセグメントに相同または相補的でない第２のセグメントのスペーサー領域に連結し、これを、少なくとも一部が第１のセグメントと実質的に相補的である第３のセグメントに連結することにより、ステムおよびループ構造を有するヘアピンとして発現させることができる。そのような構築物は、第１のセグメントと第３のセグメントとの分子内塩基対合によりステムおよびループ構造を形成し、ループ構造が生じ、第２のセグメントを含む。例えば、米国特許出願公開第２００２／００４８８１４号および第２００３／００１８９９３号ならびに国際ＰＣＴ公開国際公開第９４／０１５５０号および国際公開第９８／０５７７０号を参照のこと。ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、ステム−ループ構造（例えば、ヘアピン）等の二本鎖構造の形態で生成することができ、それにより、天然鞘翅目害虫配列を標的とするｓｉＲＮＡの生成は、ｓｉＲＮＡの生成の増大をもたらす、またはｄｓＲＮＡヘアピンプロモーターの転写遺伝子サイレンシングを防ぐためにメチル化を低下させる、例えば、追加の植物発現性カセット上の標的遺伝子の断片の共発現により増大する。
【０１１０】
実施形態は、１つまたは複数のｉＲＮＡ分子の発現の鞘翅目害虫阻害レベルを達成するための植物への組換え核酸分子の導入（すなわち、形質転換）を含む。組換えＤＮＡ分子は、例えば、線状または閉環プラスミド等のベクターであり得る。ベクターシステムは、単一ベクターもしくはプラスミド、または宿主のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む２つ以上のベクターもしくはプラスミドであり得る。さらに、ベクターは、発現ベクターであり得る。核酸配列は、例えば、連結コード配列または他のＤＮＡ配列の発現を駆動するために１つまたは複数の宿主において機能する適切なプロモーターの制御下でベクターに適切に挿入することができる。多くのベクターがこの目的のために利用でき、適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に主として依存する。各ベクターは、その機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する個々の宿主細胞に依存する様々な構成成分を含む。
【０１１１】
トランスジェニック植物に鞘翅目害虫抵抗性を与えるために、例えば、組換え植物の組織または液内で組換えＤＮＡをｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ分子）を生成するように転写させることができる。ｉＲＮＡ分子は、宿主植物種に被害を与え得る鞘翅目害虫体内の対応する転写ヌクレオチド配列と実質的に相同であり、特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み得る。鞘翅目害虫は、例えば、ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック宿主植物の細胞または液を摂取することにより、トランスジェニック宿主植物の細胞中で転写されるｉＲＮＡ分子と接触し得る。したがって、標的遺伝子の発現は、トランスジェニック宿主植物に外寄生する鞘翅目害虫体内のｉＲＮＡ分子により抑制される。いくつかの実施形態では、標的鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現の抑制により、植物が害虫による攻撃に対して抵抗性を示すことがもたらされ得る。
【０１１２】
組換え核酸分子により形質転換された植物細胞との栄養関係にある鞘翅目害虫へのｉＲＮＡ分子の送達を可能にするために、植物細胞中のｉＲＮＡ分子の発現（すなわち、転写）が必要である。したがって、組換え核酸分子は、核酸分子を増幅させる細菌細胞および核酸分子を発現させる植物細胞等の、宿主細胞中で機能する異種プロモーター配列等の１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１３】
核酸分子に用いるのに適するプロモーター配列は、すべてが当技術分野で周知である、誘導性、ウイルス、合成または構成性であるものを含む。そのようなプロモーターを記載している非限定的な例としては、米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；第５，６４１，８７６号（イネアクチンプロモーター）；第６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；第６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；第６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）；第６，１７７，６１１号（構成性トウモロコシプロモーター）；第５，３２２，９３８号、第５，３５２，６０５号、第５，３５９，１４２号および第５，５３０，１９６号（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）；第６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；第６，４２９，３５７号（イネアクチン２プロモーターおよびイネアクチン２イントロン）；第６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）；第６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）；第６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）；第６，１７５，０６０号（リン欠乏誘導性プロモーター）；第６，３８８，１７０号（二方向プロモーター）；第６，６３５，８０６号（ガンマコイキシンプロモーター）；ならびに米国特許出願公開第２００９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）等がある。追加のプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-5749）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導プラスミド上で運ばれる）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター等のカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324）；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-812）；ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-6628）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号、第５，３５２，６０５号、第５，３５９，１４２号および第５，５３０，１９６号）；ＦＭＶ  ３５Ｓ（米国特許第５，３７８，６１９号および第６，０５１，７５３号）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号）；およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｖ０００８７；Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187）等がある。
【０１１４】
特定の実施形態では、核酸分子は、根特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターを含む。根特異的プロモーターは、作動可能に連結したコード配列の発現を根組織においてもっぱらまたは優先的に駆動する。根特異的プロモーターの例は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，１１０，７３２号、第５，４５９，２５２号および第５，８３７，８４８号ならびにOpperman et al. (1994) Science 263:221-3；およびHirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18を参照のこと。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の防除のためのヌクレオチド配列または断片は、該ヌクレオチド配列または断片に対して反対の転写方向に配向した２つの根特異的プロモーター間でクローニングされ得る。そして、それらは、トランスジェニック植物細胞中で作動可能であり、その中で発現して、上述のように、その後にｄｓＲＮＡ分子を形成し得るトランスジェニック植物細胞中のＲＮＡ分子を生成する。植物組織において発現したｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子発現の抑制が達成されるように鞘翅目害虫により摂取せることができる。
【０１１５】
対象の核酸分子に任意選択的に作動可能に連結することができるさらなる調節配列としては、プロモーター配列とコード配列との間に位置する翻訳リーダー配列として機能する５’ＵＴＲ等がある。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在し、それは、一次転写物のプロセシングおよび／またはＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例としては、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号）、植物ウイルス外被タンパク質、植物ルビスコリーダーおよびその他等がある。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。５’ＵＴＲの非限定的な例としては、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号）；ＡｔＡｎｔｌ；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）等がある。
【０１１６】
対象の核酸分子に任意選択的に作動可能に連結することができるさらなる調節配列としては、３’非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域等もある。これらは、ヌクレオチド配列の下流に位置する遺伝エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、および／または転写またはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができる他の調節シグナルをもたらすポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物においてｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすように機能する。ポリアデニル化配列は、様々な植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し得る。３’転写終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ３’領域（ｎｏｓ３’；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）である。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80に示されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ｐｓ．ＲＢｃＳ２−Ｅ９；Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｅ０１３１２）からのもの等がある。
【０１１７】
いくつかの実施形態は、本明細書で述べる１つまたは複数のヌクレオチド配列に作動可能に連結した上述の調節配列の少なくとも１つを含む単離かつ精製ＤＮＡ分子を含む植物形質転換ベクターを含み得る。発現した場合、該１つまたは複数のヌクレオチド配列は、鞘翅目害虫における天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部と特異的に相補的であるヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のＲＮＡ分子（複数可）を生じさせる。したがって、該ヌクレオチド配列（複数可）は、標的鞘翅目害虫ＲＮＡ転写物内に存在するリボヌクレオチド配列のすべてまたは一部をコードするセグメントを含み得、標的鞘翅目害虫転写物のすべてまたは一部の逆向き反復配列を含み得る。植物形質転換ベクターは、複数の標的配列に特異的に相補的な配列を含み、それにより、標的鞘翅目害虫の１つまたは複数の集団または種の細胞中の２つ以上の遺伝子の発現を阻害するための複数のｉＲＮＡの生成を可能にし得る。異なる遺伝子に存在するヌクレオチド配列に特異的に相補的なヌクレオチド配列のセグメントは、トランスジェニック植物における発現のための単一複合核酸分子中に組み合わせることができる。そのようなセグメントは、連続していても、またはスペーサー配列により分離されていてもよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド配列（複数可）を既に含むプラスミドは、同じプラスミドにおける追加のヌクレオチド配列（複数可）の逐次的挿入により修飾することができ、追加のヌクレオチド配列（複数可）は、最初の少なくとも１つのヌクレオチド配列（複数可）と同じ調節エレメントに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、複数の標的遺伝子の阻害のために設計することができる。いくつかの実施形態では、阻害される複数の遺伝子は、同じ鞘翅目害虫種から得ることができ、これにより、核酸分子の有効性が増大し得る。他の実施形態では、遺伝子は、異なる鞘翅目害虫から得ることができ、これにより、作用物質（複数可）が有効である鞘翅目害虫の範囲が拡大し得る。複数の遺伝子を抑制または発現と抑制の組合せの標的とする場合、ポリシストロン性ＤＮＡエレメントを作製することができる。
【０１１９】
組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞等の形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択可能マーカーを含み得る。選択可能マーカーは、組換え核酸分子を含む植物または植物細胞を選択するためにも用いることができる。マーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、ジェネチシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、ハイグロマイシン等）または除草剤抵抗性（例えば、グリホセート等）をコードし得る。選択可能マーカーの例は、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８等を用いて選択することができるｎｅｏ遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホセート抵抗性をコードする突然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を付与する突然変異アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子：およびメトトレキセート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子であり得るが、これらに限定されない。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリン等に対する抵抗性を付与する複数の選択可能マーカーが利用できる。そのような選択可能マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号、第５，６３３，４３５号、第５，７８０，７０８号および第６，１１８，０４７号に示されている。
【０１２０】
組換え核酸分子またはベクターは、スクリーニング可能マーカーも含み得る。スクリーニング可能マーカーは、発現をモニターするために用いることができる。例示的なスクリーニング可能マーカーとしては、様々な色原性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするＲ遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al. (1988) “Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.” In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp.263-82）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41）；様々な色原性基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、色原性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al. (1986) Science 234:856-9）；色原性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2）；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化し、これが次にメラニンに縮合することを可能にする酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14）；およびα−ガラクトシダーゼ等がある。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、上述の組換え核酸分子は、トランスジェニック植物の創製ならびに鞘翅目害虫に対する感受性の低下を示すトランスジェニック植物を調製するための植物における異種核酸の発現の方法に用いることができる。植物形質転換ベクターは、例えば、ｉＲＮＡ分子をコードする核酸分子を植物形質転換ベクターに挿入し、これらを植物に導入することによって調製することができる。
【０１２２】
宿主細胞の形質転換の適切な方法としては、例えば、プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号参照）、乾燥／抑制媒介ＤＮＡ取込みによる（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8参照）、エレクトロポレーションによる（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号参照）、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌による（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号、第５，５９１，６１６号、第５，６９３，５１２号、第５，８２４，８７７号、第５，９８１，８４０号および第６，３８４，３０１号参照）およびＤＮＡコーティング粒子の促進による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８８０号、第６，１６０，２０８号、第６，３９９，８６１号および第６，４０３，８６５号参照）等の、ＤＮＡを細胞に導入することができる方法等がある。コーンを形質転換するのに特に有用である技術は、例えば、米国特許第５，５９１，６１６号、第７，０６０，８７６号および第７，９３９，３２８号に記載されている。これらのような技術の適用により、事実上あらゆる種の細胞を安定に形質転換させることができる。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込む。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞をトランスジェニック生物に再生することができる。これらの技術のいずれも、例えば、トランスジェニック植物のゲノムに１つまたは複数のｉＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数の核酸配列を含むトランスジェニック植物を産生するのに用いることができる。
【０１２３】
発現ベクターを植物に導入するために最も広く用いられている方法は、様々なアグロバクテリウム属（Agrobacterium）種の天然の形質転換システムに基づいている。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞に遺伝的に形質転換を起こさせる植物病原性土壌細菌である。それぞれＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を運ぶ。Ｔｉ（腫瘍誘導）プラスミドは、形質転換植物に転移する、Ｔ−ＤＮＡとして公知である大きいセグメントを含む。Ｔｉプラスミドの他のセグメントである、Ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ転移に関与する。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端反復配列に隣接する。修飾バイナリーベクターにおいて、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、Ｖｉｒ領域の機能は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列が隣接する外来ＤＮＡを導入するために用いられる。Ｔ領域は、トランスジェニック細胞および植物の効率的な回収のための選択可能マーカー、ならびに核酸をコードするｄｓＲＮＡ等の導入のための配列を挿入するための多重クローニング部位も含み得る。
【０１２４】
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号、第４，６９３，９７７号、第４，８８６，９３７号および第５，５０１，９６７号ならびに欧州特許ＥＰ０１２２７９１参照）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドに由来する。追加の植物形質転換ベクターとしては、例えば、および制限なく、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7；Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42により；および欧州特許ＥＰ０１２０５１６に記載されているもの、ならびに前述のもののいずれかに由来するもの等がある。天然で植物と相互作用するシノリゾビウム属（Sinorhizobium）、リゾビウム属（Rhizobium）およびメソリゾビウム属（Mesorhizobium）等の他の細菌を、多くの多様な植物への遺伝子導入を媒介するように修飾することができる。これらの植物関連共生細菌は、非病害性Ｔｉプラスミドおよび適切なバイナリーベクターの両方の獲得により遺伝子導入に適格にすることができる。
【０１２５】
外因性ＤＮＡをレシピエント細胞に供給した後、形質転換細胞は、一般的にさらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改善するために、前述の選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を形質転換体を生成するために用いる形質転換ベクターとともに用いることを望むことができる。選択可能マーカーを用いる場合、細胞を選択剤または複数の選択剤に曝露することにより、形質転換細胞は、形質転換された可能性のある細胞集団内で同定される。スクリーニング可能マーカーを用いる場合、所望のマーカー遺伝子形質について細胞をスクリーニングすることができる。
【０１２６】
選択剤への曝露で生残している細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性と評価された細胞は、植物の再生を補助する培地中で培養することができる。いくつかの実施形態では、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、成長調節剤等のさらなる物質を含めることにより改良することができる。植物再生努力を開始するのに十分な組織が利用できるまで、または手作業による選択を反復した後、組織の形態が再生に適するまで（例えば、一般的に約２週間）、組織を成長調節剤を含む基礎培地上に維持し、その後、芽条形成を促す培地に移す。十分な芽条形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。芽条が形成されたならば、それらを根形成を促す培地に移す。十分な根が形成されたならば、さらなる成長および成熟のために植物を土壌に移すことができる。
【０１２７】
再生植物における対象の核酸分子（例えば、鞘翅目害虫における標的遺伝子発現を抑制する１つまたは複数のｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列）の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲならびに核酸配列決定等の分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはイムノブロット）によるまたは酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出等の生化学的アッセイ；葉部または根部アッセイ等の植物部位アッセイ；ならびに全再生植物の表現型の解析等がある。
【０１２８】
組込みイベントは、例えば、例えば対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により解析することができる。ＰＣＲ遺伝子型決定は、ゲノムに組み込まれた対象の核酸分子を含むと予測された単離宿主植物カルス組織から得られたゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、それに続くＰＣＲ増幅産物の標準クローニングおよび配列解析を含むが、これらに限定されないと理解される。ＰＣＲ遺伝子型決定の方法は、十分に記載され（例えば、Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53）、任意の植物種（例えば、Ｚ．マイス（Z. mays）またはＧ．マクス（G. max））または細胞培養物を含む組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用することができる。
【０１２９】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、一般的に１つの染色体に挿入された単一組換えＤＮＡ配列を含む。該単一組換えＤＮＡ配列は、「トランスジェニックイベント」または「組込みイベント」と呼ばれる。そのようなトランスジェニック植物は、挿入外来配列に対して半接合である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に対して同型接合であるトランスジェニック植物は、単一外来遺伝子配列を含む独立分離トランスジェニック植物をそれ自体、例えば、Ｔ０植物と性的に交配（自殖）して、Ｔ１種子を産生することにより得ることができる。産生されたＴ１種子の４分の１は、導入遺伝子に対して同型接合となる。Ｔ１種子を発芽させることにより、一般的に異型接合体と同型接合体との区別を可能にするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち、接合性アッセイ）を用いて異型接合性について試験することができる植物が得られる。
【０１３０】
特定の実施形態では、鞘翅目害虫抑制効果を有する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０種またはそれ以上の異なるｉＲＮＡ分子が植物細胞中で産生される。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、異なる形質転換イベントで導入された複数の核酸配列から、または単一形質転換イベントで導入された単一核酸配列から発現させることができる。いくつかの実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子が単一プロモーターの制御下で発現する。他の実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子が複数のプロモーターの制御下で発現する。鞘翅目害虫の同じ種の異なる集団、あるいは鞘翅目害虫の異なる種の両方において、１つもしくは複数の鞘翅目害虫体内の異なる遺伝子座（例えば、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７および８１により定義される遺伝子座）に対してそれぞれ相同である複数の核酸配列を含む単一ｉＲＮＡ分子を発現させることができる。
【０１３１】
組換え核酸分子による植物の直接形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第１の植物をそのようなイベントを欠いている第２の植物と交配することにより、トランスジェニック植物を作製することができる。例えば、ｉＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を形質転換に適用できる第１の植物系統に導入して、トランスジェニック植物を産生することができ、そのトランスジェニック植物を第２の植物系統と交配して、ｉＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を第２の植物系統に移入することができる。
【０１３２】
本明細書で述べる１つまたは複数の配列を含む商品生産物も含まれる。特定の実施形態は、本明細書で述べる１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む組換え植物または種子から生産された商品生産物を含む。本明細書で述べる１つまたは複数の配列を含む商品生産物は、本明細書に開示する１つまたは複数の配列を含む、植物の粗びき粉、油、粉砕もしくは全粒または種子、あるいは組換え植物または種子の粗びき粉、油、または粉砕もしくは全粒を含む食品または動物飼料生産物を含むと思われるが、これらに限定されないものとする。ここで企図した１つまたは複数の一次産品または商品生産物中の本明細書に開示する１つまたは複数の配列の検出は、一次産品または商品生産物が、ｉＲＮＡ媒介遺伝子抑制法を用いて鞘翅目植物害虫を防除する目的のために本明細書に開示する１つまたは複数のヌクレオチド配列を発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されるという事実上の証拠である。
【０１３３】
いくつかの態様では、形質転換植物細胞から得られたトランスジェニック植物により生産された種子および商品生産物が含まれ、種子または商品生産物は、検出可能な量の本明細書に開示する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を得て、それらから食品または飼料を調製することによって生産することができる。本明細書に開示する１つまたは複数の核酸配列を含む商品生産物としては、例えば、および制限なく、本明細書に開示する１つまたは複数の核酸配列を含む、植物の粗びき粉、油、粉砕もしくは全粒または種子、ならびに組換え植物または種子の粗びき粉、油、または粉砕もしくは全粒を含むあらゆる食品等がある。１つまたは複数の一次産品または商品生産物中の本明細書に開示する１つまたは複数の配列の検出は、一次産品または商品生産物が、鞘翅目害虫を防除する目的のために本明細書に開示する１つまたは複数のｉＲＮＡ分子を発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されるという事実上の証拠である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する核酸分子を含むトランスジェニック植物または種子は、制限なく、以下を含む、そのゲノムに少なくとも１つの他のトランスジェニックイベントも含み得る：  例えば、Ｃａｆｌ−１８０（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５８号）、ＶａｔｐａｓｅＣ（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５９号）、Ｒｈｏｌ（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２６０号）、ＶａｔｐａｓｅＨ（米国特許出願公開第２０１２／０１９８５８６号）、ＰＰＩ−８７Ｂ（米国特許出願公開第２０１３／００９１６００号）、ＲＰＡ７０（米国特許出願公開第２０１３／００９１６０１号）およびＲＰＳ６（米国特許出願公開第２０１３／００９７７３０号）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子座等の、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７および８１により定義されるもの以外の鞘翅目害虫における遺伝子座を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；鞘翅目害虫以外の生物（例えば、植物寄生線虫）における遺伝子を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；例えば、Ｃｒｙ３４Ａｂ１（米国特許第６，１２７，１８０号、第６，３４０，５９３号および第６，６２４，１４５号）、Ｃｒｙ３５Ａｂ１（米国特許第６，０８３，４９９号、第６，３４０，５９３号および第６，５４８，２９１号）、単一イベントにおける「Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１」組合せ（例えば、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７；米国特許第７，３２３，５５６号）、Ｃｒｙ３Ａ（例えば、米国特許第７，２３０，１６７号）、Ｃｒｙ３Ｂ（例えば、米国特許第８，１０１，８２６号）、Ｃｒｙ６Ａ（例えば、米国特許第６，８３１，０６２号）およびそれらの組合せ（例えば、米国特許出願第２０１３／０１６７２６８号、第２０１３／０１６７２６９号および第２０１３／０１８００１６号）等の殺虫タンパク質（例えば、バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホセート、グルホシネート、ジカンバまたは２，４−Ｄに対する耐性を与える遺伝子（例えば、米国特許第７，８３８，７３３号））；ならびに収量の増加、脂肪酸代謝の変化または細胞質雄性不稔性の回復等のトランスジェニック植物における望ましい表現型に寄与する遺伝子。特定の実施形態では、昆虫被害および植物病害の防除の増大のための所望の形質を達成するために本明細書に開示するｉＲＮＡ分子をコードする配列を他の昆虫防除または病害抵抗性形質と組み合わせることができる。異なる作用機序を用いる昆虫防除形質を組み合わせることは、単一の防除形質を有する植物と比べて優れた耐久性を有する保護トランスジェニック植物をもたらし得る。その理由は、例えば、形質（複数可）に対する抵抗性が圃場で起こる可能性が低いためである。
【０１３５】
Ｖ．鞘翅目害虫における標的遺伝子の抑制
Ａ．概要
いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な少なくとも１つの核酸分子を鞘翅目害虫に与えることができ、核酸分子は、鞘翅目害虫におけるＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングをもたらす。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）を鞘翅目害虫に与えることができる。いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、核酸分子を鞘翅目害虫と接触させることによって鞘翅目害虫に与えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、鞘翅目害虫の給餌基体、例えば、栄養組成物に加えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、鞘翅目害虫により摂取される核酸分子を含む植物物質の摂取により与えることができる。特定の実施形態では、核酸分子は、植物物質に導入された組換え核酸配列の発現により、例えば、組換え核酸配列を含むベクターによる植物細胞の形質転換および形質転換植物細胞からの植物物質または全植物の再生により、植物物質中に存在する。
【０１３６】
Ｂ．ＲＮＡｉ媒介遺伝子抑制
複数の実施形態では、例えば、標的配列と特異的に相補的であるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの鎖を含むｉＲＮＡ分子を設計することにより、鞘翅目害虫（例えば、ＷＣＲまたはＮＣＲまたはＰＢ）のトランスクリプトームにおける必須天然ヌクレオチド配列（例えば、必須遺伝子）を標的とするように設計することができるｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）を提供する。そのように設計されたｉＲＮＡ分子の配列は、標的配列と同一または完全に相補的であり得るか、あるいはｉＲＮＡ分子とその標的配列との特異的ハイブリダイゼーションを妨げないミスマッチを取り込み得る。
【０１３７】
本明細書に開示のｉＲＮＡ分子を鞘翅目害虫における遺伝子抑制の方法に用い、それにより、植物（例えば、ｉＲＮＡ分子を含む保護形質転換植物）おける害虫によってもたらされる被害のレベルまたは発生率を低下させることができる。本明細書で用いているように、「遺伝子抑制」という用語は、発現の転写後抑制および転写抑制を含む遺伝子またはコード配列からのタンパク質発現の低下を含む、ｍＲＮＡへの遺伝子転写およびｍＲＮＡのその後の翻訳の結果として産生されるタンパク質のレベルを低下させる周知の方法のいずれかを意味する。転写後抑制は、抑制の標的とする遺伝子から転写されたｍＲＮＡのすべてまたは一部と抑制のために用いる対応するｉＲＮＡ分子との間の特異的相同性によって媒介される。さらに、転写後抑制は、リポソームによる結合のために細胞中で利用できるｍＲＮＡの量の実質的かつ測定可能な低下を意味する。
【０１３８】
ｉＲＮＡ分子がｄｓＲＮＡ分子である実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、酵素であるＤＩＣＥＲによって短いｓｉＲＮＡ分子（長さが約２０ヌクレオチド）に切断され得る。ｄｓＲＮＡ分子に対するＤＩＣＥＲ活性により生じた二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、２つの一本鎖ｓｉＲＮＡ、すなわち「パッセンジャー鎖」と「ガイド鎖」に分離され得る。パッセンジャー鎖は、分解することができ、ガイド鎖は、ＲＩＳＣに取り込むことができる。転写後抑制は、ガイド鎖とｍＲＮＡ分子の特異的に相補的な配列との特異的ハイブリダイゼーションおよびその後のアルゴノート（ＲＩＳＣ複合体の触媒構成成分）酵素による切断によって起こる。
【０１３９】
実施形態では、あらゆる形態のｉＲＮＡ分子を用いることができる。当業者は、ｄｓＲＮＡ分子が、調製中および細胞にｉＲＮＡ分子を供給するステップ中に一般的に一本鎖ＲＮＡ分子よりも安定であり、細胞中でも一般的により安定であることを理解するであろう。したがって、例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子は、いくつかの実施形態では同等に有効であり得るが、ｄｓＲＮＡ分子をその安定性のため選択することができる。
【０１４０】
特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させて、鞘翅目害虫のゲノム内のヌクレオチド配列によりコードされる核酸分子と実質的に相同であるｉＲＮＡ分子を生成することができる、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｉＲＮＡ分子は、ステム−ループ構造を含む安定化ｄｓＲＮＡ分子であり得る。鞘翅目害虫がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｉＲＮＡ分子と接触した後、鞘翅目害虫における標的遺伝子（例えば、必須遺伝子）の転写後抑制が起こり得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子の発現を鞘翅目害虫における標的遺伝子の転写後阻害の方法に用い、該ヌクレオチド配列は、以下からなる群から選択される：配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の相補体；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の少���くとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体。特定の実施形態では、前述のもののいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％）である核酸分子の発現を用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の少なくとも１つの細胞中に存在するＲＮＡ分子と特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む少なくとも１つの核酸分子の発現を鞘翅目害虫における標的遺伝子の転写後抑制の方法に用いることができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の相補体；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１、３、４または５を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１、３、４または５を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物（例えば、ＰＢ）の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７３、７５、７７または８１を含むメリゲテス属（Meligethes）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号７３、７５、７７または８１を含む天然ＲＮＡ分子を生成するように転写されるメリゲテス属（Meligethes）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からな��群から選択される。特定の実施形態では、前述のもののいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％）である核酸分子の発現を用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の少なくとも１つの細胞中に存在するＲＮＡ分子と特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。特定の例において、そのような核酸分子は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１を含むヌクレオチド配列を含み得る。
【０１４３】
ＲＮＡｉ転写後抑制システムが、遺伝子突然変異、系統多型または進化的分岐のため予想され得る標的遺伝子における配列変動に耐えることができることは、いくつかの実施形態の重要な特徴である。導入される核酸分子が標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズされる限り、導入される核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと絶対的に相同である必要はあり得ない。さらに、導入される核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡに対して、全長である必要はあり得ない。
【０１４４】
本明細書に開示のｉＲＮＡ技術を用いる標的遺伝子の抑制は、配列特異的である。すなわち、ｉＲＮＡ分子（複数可）と実質的に相同のヌクレオチド配列は、遺伝的抑制の標的となる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子配列の一部と同一または相補的であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を抑制のために用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、標的遺伝子配列と比べて１つまたは複数の挿入、欠失および／または点突然変異を有するヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を用いることができる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子と標的遺伝子の一部は、例えば、少なくとも約８０％以上、少なくとも約８１％以上、少なくとも約８２％以上、少なくとも約８３％以上、少なくとも約８４％以上、少なくとも約８５％以上、少なくとも約８６％以上、少なくとも約８７％以上、少なくとも約８８％以上、少なくとも約８９％以上、少なくとも約９０％以上、少なくとも約９１％以上、少なくとも約９２％以上、少なくとも約９３％以上、少なくとも約９４％以上、少なくとも約９５％以上、少なくとも約９６％以上、少なくとも約９７％以上、少なくとも約９８％以上、少なくとも約９９％以上、少なくとも約１００％以上、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を共有し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の二重らせん領域は、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズ可能であり得る。特異的にハイブリダイズ可能な分子において、より大きい相同性を示す全長に満たない配列は、より長く、より低い相同性の配列を補う。標的遺伝子転写物の一部と同一または相補的であるｄｓＲＮＡ分子の二重らせん領域のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１５、２０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００または少なくとも約１０００または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００塩基であり得る。いくつかの実施形態では、２０〜１００ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。特定の実施形態では、約１００〜２００ヌクレオチドを超える配列、約２００〜３００ヌクレオチドヌクレオチドを超える配列または約３００〜５００ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。特定の実施形態では、標的遺伝子のサイズによって、約５００〜１０００ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。
【０１４５】
特定の実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現は、著しい抑制が起こるように、鞘翅目害虫の細胞内で少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％抑制され得る。著しい抑制は、検出可能な表現型をもたらす閾値を超える抑制（例えば、成長の停止、摂食の停止、発育の停止、死の誘発等）、あるいはＲＮＡの検出可能な減少および／または標的遺伝子に対応する遺伝子産物が抑制されることを意味する。特定の実施形態では、抑制は、鞘翅目害虫の実質的にすべての細胞で起こるが、他の実施形態では、抑制は、標的遺伝子を発現する細胞のサブセットでのみ起こる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、細胞中の転写抑制は、「プロモータートランス抑制」と呼ばれることを達成するように、プロモーターＤＮＡ配列またはその相補体との実質的な配列同一性を示すｉＲＮＡ分子の存在によって媒介される。遺伝子抑制は、例えば、ｄｓＲＮＡ分子を含む植物物質を摂取またはそれと接触することにより、そのようなｉＲＮＡ分子を摂取またはそれと接触し得る鞘翅目害虫における標的遺伝子に対して有効であり得る。プロモータートランス抑制に用いるｉＲＮＡ分子は、鞘翅目害虫の細胞中の１つまたは複数の相同または相補的配列の発現を阻害または抑制するように特別に設計することができる。植物細胞における遺伝子発現を調節するためのアンチセンスまたはセンス配向ＲＮＡによる転写後遺伝子抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号、第５，２３１，０２０号、第５，２８３，１８４号および第５，７５９，８２９号に開示されている。
【０１４７】
Ｃ．鞘翅目害虫に与えるｉＲＮＡ分子の発現
鞘翅目害虫におけるＲＮＡｉ媒介遺伝子抑制のためのｉＲＮＡ分子の発現は、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ方式のいずれか１つにより行うことができる。ｉＲＮＡ分子は、次に、例えば、ｉＲＮＡ分子を害虫と接触させることにより、または害虫にｉＲＮＡ分子を摂取もしくは別の方法でインターナリゼーションさせることにより、鞘翅目害虫に与えることができる。いくつかの実施形態は、鞘翅目害虫の形質転換宿主植物、形質転換植物細胞ならびに形質転換植物の子孫を含む。形質転換植物細胞および形質転換植物は、害虫保護効果をもたらすために、例えば、異種プロモーターの制御下で１つまたは複数のｉＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作することができる。したがって、形質転換植物および植物細胞が摂食時に鞘翅目害虫により消費される場合、害虫は、トランスジェニック植物または細胞において発現したｉＲＮＡ分子を摂取し得る。本明細書に開示のヌクレオチド配列は、様々な原核および真核微生物宿主に導入して、ｉＲＮＡ分子を生成することもできる。「微生物」という用語は、細菌および菌類等の原核および真核種を含む。
【０１４８】
遺伝子発現の調節は、そのような発現の部分的または完全な抑制を含み得る。他の実施形態では、鞘翅目害虫における遺伝子発現の抑制の方法は、その少なくとも１つのセグメントが鞘翅目害虫の細胞内のｍＲＮＡ配列と相補的である、本明細書で述べたヌクレオチド配列の転写後に形成された遺伝子抑制量の少なくとも１つのｉＲＮＡ分子を害虫の宿主の組織に供給することを含む。鞘翅目害虫により摂取された、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子等のその変形態様を含む、ｉＲＮＡ分子は、配列番号１、３、４、５、７３、７５、７７または８１を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子から転写されたＲＮＡ分子と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一または相補的であり得る。したがって、それらに導入された場合、鞘翅目害虫における内因性コード配列または標的コード配列の発現を抑制または阻害する、ｉＲＮＡ分子を得るための非天然ヌクレオチド配列および組換えＤＮＡ構築物を含むが、これらに限定されない単離され、実質的に精製された核酸分子を提供する。
【０１４９】
特定の実施形態は、鞘翅目植物害虫における１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）の転写後阻害ならびに鞘翅目植物害虫の集団の防除のためのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムを提供する。いくつかの実施形態では、送達システムは、宿主細胞中で転写されたＲＮＡ分子を含む宿主トランスジェニック植物細胞または宿主細胞の内容物の摂取を含む。これらおよびさらなる実施形態では、安定化ｄｓＲＮＡ分子を供給する（providing）組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を創製する。特定のｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物は、組換えＤＮＡ技術（当技術分野で周知である基本技術）を用いて、ｉＲＮＡ分子（例えば、安定化ｄｓＲＮＡ分子）をコードするヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベーターを構築し、植物細胞または植物を形質転換し、転写ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を生成することにより、産生することができる。
【０１５０】
トランスジェニック植物に鞘翅目害虫抵抗性を与えるために、例えば、組換えＤＮＡ分子をｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子またはｈｐＲＮＡ分子等のｉＲＮＡ分子を生成するように転写することができる。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子は、組換え植物の組織もしくは体液内でまたは該ＲＮＡ分子と接触したもしくはそれを摂取した生物の組織もしくは体液内でｄｓＲＮＡ分子を形成し得る。そのようなｉＲＮＡ分子は、宿主植物に外寄生し得る種類の鞘翅目害虫体内のＤＮＡ配列から転写される対応するヌクレオチド配列と同一または相補的であるヌクレオチド配列から一部構成され得る。鞘翅目害虫体内の標的遺伝子の発現は、摂取されたｉＲＮＡ分子により抑制され、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、鞘翅目害虫による摂食の停止をもたらし、最終的な結果は、例えば、トランスジェニック植物が鞘翅目害虫によるさらなる被害から保護されることである。ｉＲＮＡ分子の調節作用は、例えば、ハウスキーピング遺伝子を含む、細胞代謝または細胞形質転換に関与する内因性遺伝子；転写因子；脱皮関連遺伝子；ならびに細胞の代謝または正常な成長および発育に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子を含む、害虫において発現する様々な遺伝子に適用できることが示された。
【０１５１】
導入遺伝子からのｉｎ  ｖｉｖｏでの、または発現構築物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよびポリアデニル化シグナル）をいくつかの実施形態で用いて、ＲＮＡ鎖（または（複数の）鎖）の生成を調節することができる。したがって、いくつかの実施形態では、上述のように、ｉＲＮＡ分子を生成するのに用いるヌクレオチド配列は、植物宿主細胞中の機能し得る１つまたは複数のプロモーター配列に作動可能に連結することができる。プロモーターは、通常、宿主ゲノムに常在する内因性プロモーターであり得る。ヌクレオチド配列は、作動可能に連結したプロモーター配列の制御下で、その転写および／または得られる転写物の安定性に有利に作用するさらなる配列により両側に隣接され得る。そのような配列は、作動可能に連結したプロモーターの上流、発現構築物の３’末端の下流に位置し、プロモーターの上流と発現構築物の３’末端の下流の両方に存在し得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態は、植物を常食とする鞘翅目害虫により引き起こされる宿主植物（例えば、コーン植物体）の被害を低減する方法であって、本明細書に開示の少なくとも１つの核酸分子を発現する形質転換植物細胞を宿主植物に供給することを含み、核酸分子（複数可）が、鞘翅目害虫により取り込まれることにより機能して、鞘翅目害虫体内の標的配列の発現を抑制し、発現の抑制が、鞘翅目害虫の死亡、成長の低下、および／または生殖の低減をもたらし、それにより、鞘翅目害虫より引き起こされる宿主植物の被害を低減する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、ｉＲＮＡ分子を含む。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれが鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な１つのヌクレオチド配列からなる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、コーン作物の収量を増加させる方法であって、本明細書に開示の少なくとも１つの核酸分子をコーン植物に導入することと、核酸配列を含むｉＲＮＡ分子の発現を可能にするためにコーン植物を培養することとを含み、核酸配列を含むｉＲＮＡ分子の発現が、鞘翅目害虫の成長ならびに／あるいは鞘翅目害虫被害を抑制し、それにより、鞘翅目害虫の外寄生による収量低下を低減または解消する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれが鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な１つのヌクレオチド配列からなる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、少なくとも１つの核酸分子をコードする、ヌクレオチド配列がプロモーターおよび転写終結配列に作動可能に連結されている、核酸配列を含むベクターにより植物細胞を形質転換することと、複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で形質転換植物細胞を培養することと、核酸分子をそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、組み込まれた核酸分子によりコードされるｉＲＮＡ分子の発現について形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、ｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック植物細胞を選択することと、鞘翅目害虫に選択されたトランスジェニック植物細胞を食餌として与えることとを含む、方法を提供する。植物も、組み込まれた核酸分子によりコードされるｉＲＮＡ分子を発現する形質転換植物細胞から再生させることができる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれが、鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子に特異的にハイブリダイズ可能である複数のヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、鞘翅目害虫細胞中で発現する核酸分子に特異的にハイブリダイズ可能である１つのヌクレオチド配列からなる。
【０１５５】
ｉＲＮＡ分子は、植物細胞のゲノムに取り込まれた、または植え付けの前の種子に適用されるコーティングもしくは種子処理に取り込まれた組換え遺伝子からの発現の産物として、植物種（例えば、コーン）の種子に取り込むことができる。組換え遺伝子を含む植物細胞は、トランスジェニックイベントであると考えられる。実施形態に鞘翅目害虫へのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムも含まれる。例えば、ｉＲＮＡ分子は、鞘翅目害虫の細胞に直接導入することができる。導入の方法は、ｉＲＮＡと鞘翅目害虫の宿主の植物組織との直接混合、ならびに宿主植物組織へのｉＲＮＡ分子を含む組成物の施用を含み得る。例えば、ｉＲＮＡ分子は、植物表面上に噴霧することができる。あるいは、ｉＲＮＡ分子は、微生物により発現させることができ、微生物は、植物表面上に塗布することができ、または注入等の物理的手段により根もしくは幹に導入することができる。上で述べたように、トランスジェニック植物は、植物に外寄生することが公知の鞘翅目害虫を殺すのに十分な量で少なくとも１つのｉＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作することもできる。化学または酵素合成により生成したｉＲＮＡ分子は、一般的農業慣行と調和した方法で製剤化することもでき、鞘翅目害虫による植物被害を防除するためのスプレー式製品として用いることができる。製剤は、効果的な葉の被覆に必要な適切な展着剤および湿潤剤、ならびにＵＶ損傷からｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）を保護するためのＵＶ保護剤を含み得る。そのような添加物は、生物殺虫剤産業で一般的に用いられており、当業者に周知である。そのような施用は、鞘翅目害虫からの植物の保護を向上させるために他のスプレー式殺虫剤施用（生物学的に基づくまたは別の方法）と組み合わせることができる。
【０１５６】
本明細書で引用した刊行物、特許および特許出願を含む、本明細書で述べたすべての参考文献は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ示す。本明細書における何物も、発明者らが先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことの容認と解釈すべきでない。
【０１５７】
以下の実施例は、特定の個別の特徴および／または態様を例示するために示す。これらの実施例は、本開示を、記載した個別の特徴または態様に限定するものと解釈すべきでない。
［実施例］
【実施例１】
【０１５８】
候補標的遺伝子の同定
ＲＮＡｉトランスジェニック植物昆虫抵抗性技術による防除のための候補標的遺伝子配列を得るためのプールされたトランスクリプトームの解析のためにＷＣＲ（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）の発育の複数の段階を選択した。
【０１５９】
一適例において、以下のフェノール／ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）に基づく方法（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＥＮＴＥＲ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて、全ＲＮＡを約０．９ｇｍの全初齢ＷＣＲ幼虫（孵化後４〜５日；１６℃に保持）から単離し、精製した。
【０１６０】
幼虫を、均一な懸濁液が得られるまで、１０ｍＬのＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）を含む１５ｍＬホモジナイザーで室温でホモジナイズした。室温での５分のインキュベーションの後に、ホモジネートを１．５ｍＬ小遠心管に分配し（１本の管につき１ｍＬ）、２００μＬのクロロホルムを加え、混合物を１５秒間激しく振とうした。抽出物を室温で１０分間静置した後、４℃で１２０００ｘｇで遠心分離することにより相を分離した。上相（約０．６ｍＬを構成する）を他の滅菌済み１．５ｍＬ管に注意深く移し、等容積の室温のイソプロパノールを加えた。室温で５〜１０分間インキュベートした後、混合物を１２０００ｘｇ（４℃または２５℃）で８分間遠心分離した。
【０１６１】
上清を注意深く除去し、捨て、毎回の洗浄後に７５００ｘｇ（４℃または２５℃）で５分間の遠心分離により回収して、ＲＮＡペレットを７５％エタノールを用いてボルテックスすることにより２回洗浄した。エタノールを注意深く除去し、ペレットを３〜５分間風乾し、次いで、ヌクレアーゼ不含有滅菌水に溶解した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度（Ａ）を測定することにより決定した。約０．９ｇｍの幼虫からの一般的な抽出により、１．９のＡ２６０／Ａ２８０比を有する１ｍｇを超える全ＲＮＡが得られた。そのように抽出されたＲＮＡは、さらなる処理まで−８０℃で保存した。
【０１６２】
ＲＮＡの質は、アリコートを１％アガロースゲルに通すことにより判断した。アガロースゲル溶液は、高圧滅菌済み容器中でＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水で希釈した高圧滅菌済み１０Ｘ  ＴＡＥ緩衝液（トリス・酢酸・ＥＤＴＡ；１Ｘ濃度は０．０４Ｍトリス・酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）、ｐＨ８．０）を用いて調製した。１Ｘ  ＴＡＥをランニング緩衝液として用いた。使用前に、電気泳動槽およびウエル形成コームをＲＮＡＳＥ  ＡＷＡＹ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＩＮＣ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で清浄にした。２μＬのＲＮＡ試料を８μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）および１０μＬのＲＮＡ試料緩衝液（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）カタログ番号７０６０６；ＥＭＤ４  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）と混合した。試料を７０℃で３分間加熱し、室温に冷却し、１ウエル当たり５μＬ（１μＬ〜２μＬのＲＮＡを含む）をロードした。分子の大きさの比較のために市販のＲＮＡ分子量マーカーを同時に別個のウエルで実験にかけた。ゲルは、６０ボルトで２時間実験にかけた。
【０１６３】
標準化ｃＤＮＡライブラリーは、商業サービス提供会社（ＥＵＲＯＦＩＮＳ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によってランダムプライミングを用いて幼虫の全ＲＮＡから作製された。標準化幼虫ｃＤＮＡライブラリーは、ＥＵＲＯＦＩＮＳ  ＭＷＧ  ＯｐｅｒｏｎにおいてＧＳ  ＦＬＸ  ４５４  Ｔｉｔａｎｉｕｍ（商標）シリーズ化学により１／２プレートスケールで配列決定がなされ、これにより、３４８ｂｐの平均リード長を有する６００，０００を超えるリードが得られた。３５０，０００リードが５０，０００を超えるコンティグにアセンブルされた。非アセンブルリードおよびコンティグの両方が公開プログラムであるＦＯＲＭＡＴＤＢ（ＮＣＢＩから入手できる）を用いてＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースに変換された。
【０１６４】
他のＷＣＲ発育段階で集められた物質から全ＲＮＡおよび標準化ｃＤＮＡライブラリーが同様に作製された。様々な発育段階を代表するｃＤＮＡライブラリーメンバーを合わせることによって標的遺伝子スクリーニング用のプールされたトランスクリプトームライブラリーが構築された。
【０１６５】
ショウジョウバエ属（Drosophila）およびトリボリウム（Tribolium)等の他の昆虫における特定の遺伝子の致死性ＲＮＡｉ効果に関する情報を用いてＲＮＡｉターゲティングのための候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、鞘翅目昆虫における生存および成長に必須であるという仮説が立てられた。選択された標的遺伝子ホモログが下記のようにトランスクリプトーム配列データーベースにおいて同定された。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成のための鋳型を作製するために標的遺伝子の全長または部分配列をＰＣＲにより増幅した。
【０１６６】
候補タンパク質コード配列を用いたＴＢＬＡＳＴＮ検索を非アセンブルジアブロティカ属（Diabrotica）配列リードまたはアセンブルコンティグを含むＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースに対して行った。ＢＬＡＳＴＸを用いてジアブロティカ属（Diabrotica）配列への有意なヒット（コンティグ相同性についてはｅ−２０より良好、非アセンブル配列リード相同性についてはｅ−１０より良好と定義）がＮＣＢＩ非冗長データベースに対して確認された。このＢＬＡＳＴＸ検索の結果は、ＴＢＬＡＳＴＮ検索で同定されたジアブロティカ属（Diabrotica）ホモログ候補遺伝子配列が実際にジアブロティカ属（Diabrotica）遺伝子を含んでいたか、またはジアブロティカ属（Diabrotica）配列に存在する非ジアブロティカ属（Diabrotica）候補遺伝子配列へのベストヒットであったことを確認するものであった。ほとんどの場合に、タンパク質をコードすると注釈をつけられたトリボリウム（Tribolium)候補遺伝子は、ジアブロティカ属（Diabrotica）トランスクリプトーム配列における配列または複数の配列との明確な配列相同性を示した。少数の場合に、ジアブロティカ属（Diabrotica）コンティグの一部または非ジアブロティカ属（Diabrotica）候補遺伝子との相同性により選択された非アセンブル配列が重複していたこと、およびコンティグのアセンブリがこれらの重複に加わらなかったことが明らかであった。これらの場合、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ｖ４．９（ＧＥＮＥ  ＣＯＤＥＳ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、配列をより長いコンティグにアセンブルした。
【０１６７】
ジアブロティカ属（Diabrotica）ｒｎａｐＩＩ−１４０をコードする候補標的遺伝子（配列番号１）は、鞘翅目害虫の死、成長の抑制、発育の抑制またはＷＣＲにおける生殖の抑制をもたらし得る遺伝子として同定された。
【０１６８】
ＷＣＲｒｎａｐＩＩ−１４０との相同性を有する遺伝子
真核生物では、次の３つのクラスのＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）：リボソームＲＮＡを転写する、ＲＮＡＰＩ、すべてのタンパク質コード遺伝子を転写する、ＲＮＡＰＩＩ、ならびに５ＳｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ遺伝子を転写するＲＮＡＰＩＩＩが存在する。これらの複合構造は、９〜１４サブユニットからなり、それらの一部は、すべての種における３つの形態のポリメラーゼのすべてにおいて共通であるが、他のものは、クラスおよび種特異的である。キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のＲＮＡＰＩＩは、少なくとも１２の電気泳動により分離可能なサブユニットからなる（Kramer and Bautz (1981) European Journal Biochemistry 117:449-455）。２つの最も大きいサブユニットの遺伝子は、ＲｐＩＩ１４０（１４０ｋＤａのベータサブユニットをコードする）およびＲｐＩＩ２１５（２１５ｋＤａのサブユニットをコードする）である。両遺伝子は、ショウジョウバエ属（Drosophila）の生存能力に必須であることが示され、これは、ＲｐＩＩ１５によりコードされるより小さい（１５ｋＤａ）サブユニットをコードする遺伝子にも当てはまる（Falkenburg et al. (1987) Journal Molecular Biology 195:929-937; Jokerst et al. (1989) Molecular General Genetics 215:266-275; Harrison et al. (1992) Molecular and Cell Biology 12:928-935）。公知の突然変異が存在しない、他のサブユニット遺伝子（ＲｐＩＩ１８；Hamilton et al. (1993) Genetics 134:517-529）は、１８ｋＤａタンパク質をコードする。
【０１６９】
ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）のｒｎａｐＩＩ−１４０（ベータサブユニット）に対するＲＮＡｉの標的配列および致死効果を本明細書に開示する。
【０１７０】
ｒｎａｐＩＩ−１４０との相同性を有する遺伝子は、ＲＮＡｉ標的をグループ分けする機能を備えている。ＲＮＡＰＩＩの他のサブユニットもＲＮＡｉ標的である。重複ＲＮＡｉ標的および相乗的なＲＮＡｉ効果を得るためにＲＮＡＰＩＩ  ｄｓＲＮＡ導入遺伝子を他のｄｓＲＮＡ分子と組み合わせることができる。ＲＮＡＰＩＩ−１４０の産生を標的とするｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニックコーンイベントは、トウモロコシ根切り虫による根の食害を防止するのに有用である。ｒｎａｐＩＩ−１４０  ｄｓＲＮＡ導入遺伝子は、これらの根切り虫防除技術のいずれかに対して抵抗性の根切り虫集団の発生を軽減するための昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドにおけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質技術との併用のための新たな作用機序を提示している。
【０１７１】
本明細書でｒｎａｐＩＩ−１４０と呼ぶ、ジアブロティカ属（Diabrotica）候補遺伝子の配列の全長または部分クローンを用いて、ｄｓＲＮＡ合成のためのＰＣＲアンプリコンを得た。
配列番号１は、ジアブロティカ属（Diabrotica）ｒｎａｐＩＩ−１４０の３７４５ｂｐ  ＤＮＡ配列を示す。
配列番号３は、ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ１の４６８ｂｐ  ＤＮＡ配列を示す。
配列番号４は、ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ２の１８０ｂｐ  ＤＮＡ配列を示す。
配列番号５は、ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ３の１６１ｂｐ  ＤＮＡ配列を示す。
【実施例２】
【０１７２】
ｄｓＲＮＡを産生するための標的遺伝子の増幅
各標的遺伝子のコード領域の一部をＰＣＲにより増幅するためにプライマーを設計した。表１参照。適切な場合、Ｔ７ファージプロモーター配列（ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ；配列番号６）を増幅センスまたはアンチセンス鎖の５’末端に取り込んだ。表１を参照のこと。全ＲＮＡをＷＣＲから抽出し、第一鎖ｃＤＮＡを、天然標的遺伝子配列のすべてまたは一部を増幅するために配置された対向プライマーを用いたＰＣＲ反応用の鋳型として用いた。ｄｓＲＮＡは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のコード領域（配列番号７；Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50）を含むＤＮＡクローンからも増幅した。
【０１７３】
【表１】
2017510246.tif 000006
【実施例３】
【０１７４】
ＲＮＡｉ構築物
ＰＣＲによる鋳型の調製およびｄｓＲＮＡ合成
ｒｎａｐＩＩ−１４０およびＹＦＰ  ｄｓＲＮＡの産生のための特定の鋳型を得るために用いた戦略を図１に示す。ｒｎａｐＩＩ−１４０  ｄｓＲＮＡ合成に用いることを目的とした鋳型ＤＮＡは、表１におけるプライマー対およびＷＣＲ初齢幼虫から単離した全ＲＮＡから作製した（ＰＣＲ鋳型としての）第一鎖ｃＤＮＡを用いたＰＣＲにより作製した（ＹＦＰは、ＹＦＰコード領域のＤＮＡクローンから増幅した。）。各選択されたｒｎａｐＩＩ−１４０およびＹＦＰ標的遺伝領域について、ＰＣＲ増幅により、増幅センスおよびアンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された。次いで、標的遺伝子の各領域の２つのＰＣＲ増幅断片をほぼ等量で混合し、混合物をｄｓＲＮＡの産生のための転写鋳型として用いた。図１を参照のこと。特定のプライマー対により増幅されたｄｓＲＮＡ鋳型の配列は、配列番号３（ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ１）、配列番号４（ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ２）、配列番号５（ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ３）およびＹＦＰ（配列番号７）であった。昆虫バイオアッセイ用の二本鎖ＲＮＡは、ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて製造業者の指示（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に従って合成し、精製した。ｄｓＲＮＡの濃度は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定した。
【０１７５】
植物形質転換ベクターの構築
ｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号１）のセグメントを含むヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むエントリーベクター（ｐＤＡＢ１１５７６２およびｐＤＡＢ１１５７６３）は、化学合成断片の組合せ（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）および標準分子クローニング法を用いてアセンブルした。ＲＮＡ一次転写物による分子内ヘアピン形成は、互いに反対の方向の標的遺伝子セグメントの２つのコピーを配列すること（単一転写単位内に）によって促進したが、２つのセグメントは、ＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（配列番号１９）により分離されている（Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50）。したがって、一次ｍＲＮＡ転写物は、イントロン配列によって分離された、互いの大きな逆方向反復配列としての２つのｒｎａｐＩＩ−１４０遺伝子セグメント配列を含む。トウモロコシユビキチン１プロモーターのコピー（米国特許第５，５１０，４７４号）を一次ｍＲＮＡヘアピン転写物の生成を駆動するために用い、トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む断片（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ  ｖ２；米国特許第６，６９９，９８４号）をヘアピンＲＮＡ発現遺伝子の転写を終結させるために用いた。
【０１７６】
エントリーベクターｐＤＡＢ１１５７６２は、ｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号１）のセグメントを含むヘアピンＲＮＡ構築物（配列番号１６）を含む。
【０１７７】
エントリーベクターｐＤＡＢ１１５７６３は、ｐＤＡＢ１１５７６２に見いだされるものと異なるｒｎａｐＩＩ−１４０（配列番号１）のセグメントを含むヘアピンＲＮＡ構築物（配列番号１７）を含む。
【０１７８】
上述のエントリーベクターｐＤＡＢ１１５７６２およびｐＤＡＢ１１５７６３は、一般的なバイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５との標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応に用いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介トウモロコシ胚形質転換用のヘアピンＲＮＡ発現形質転換ベクター（それぞれｐＤＡＢ１１４５２４およびｐＤＡＢ１１４５２５）を生成した。
【０１７９】
ＹＦＰヘアピンｄｓＲＮＡを発現する遺伝子を含む、陰性対照バイナリーベクターｐＤＡＢ１１０８５３は、一般的なバイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５およびエントリーベクターｐＤＡＢ１０１６７０を用いた標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築した。エントリーベクターｐＤＡＢ１０１６７０は、（上記のような）トウモロコシユビキチン１プロモーターの発現制御下のＹＦＰヘアピン配列（配列番号１８）およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む（上記のような）断片を含む。
【０１８０】
バイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５は、強いサトウキビ桿状バドナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-30）の調節下の除草剤抵抗性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＡＡＤ−１  ｖ３）（米国特許第７８３８７３３号（Ｂ２）およびWright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5）を含む。トウモロコシ縞葉ウイルス（ＭＳＶ）外被タンパク質遺伝子５’ＵＴＲおよびトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）遺伝子のイントロン６の配列から構成されている、合成５’ＵＴＲ配列は、ＳＣＢＶプロモーターセグメントの３’末端とＡＡＤ−１コード領域の開始コドンとの間に配置する。トウモロコシリパーゼ遺伝子の３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；米国特許第７，１７９，９０２号）を含む断片をＡＡＤ−１  ｍＲＮＡの転写を終結させるために用いた。
【０１８１】
ＹＦＰタンパク質を発現する遺伝子を含む、さらなる陰性対照バイナリーベクターｐＤＡＢ１１０５５６を、一般的なバイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ９９８９およびエントリーベクターｐＤＡＢ１００２８７を用いた標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築した。バイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ９９８９は、（上記のような）トウモロコシユビキチン１プロモーターの調節発現下の（上記のような）除草剤抵抗性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＡＡＤ−１  ｖ３）およびトウモロコシリパーゼ遺伝子の３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；上記のような）を含む断片を含む。エントリーベクターｐＤＡＢ１００２８７は、（上記のような）トウモロコシユビキチン１プロモーターの発現制御下のＹＦＰコード領域（配列番号２０）およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む（上記のような）断片を含む。
配列番号１６は、ｐＤＡＢ１１４５２４に見いだされるｒｎａｐＩＩ−１４０ヘアピンＲＮＡ形成配列バージョン１を表す。
配列番号１７は、ｐＤＡＢ１１４５２５に見いだされるｒｎａｐＩＩ−１４０ヘアピンＲＮＡ形成配列バージョン２を表す。
【実施例４】
【０１８２】
昆虫食餌バイオアッセイ
試料の調製およびバイオアッセイ  多くのｄｓＲＮＡ分子（ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ１（配列番号３）、ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ２（配列番号４）およびｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ３（配列番号５）に対応するものを含む）をＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて合成し、精製した。精製ｄｓＲＮＡ分子は、ＴＥ緩衝液に入れて用意し、すべてのバイオアッセイは、ＷＣＲ（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）の死および成長阻害についてのバックグラウンド基準としての役割を果たした、この緩衝液からなる対照処理を含んでいた。バイオアッセイ緩衝液中のｄｓＲＮＡ分子の濃度は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定した。
【０１８３】
人工昆虫飼料を給餌した新生幼虫を用いて実施したバイオアッセイにおける昆虫活性について試料を試験した。ＷＣＲ卵は、ＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ，ＩＮＣ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から入手した。
【０１８４】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された（Ｃ−Ｄ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）１２８ウエルプラスチックトレーで実施した。各ウエルは、鞘翅目昆虫の成長用に設計された約１．０ｍＬの人工飼料を含んでいた。ｄｓＲＮＡ試料の６０μＬアリコートを各ウエルの飼料の表面上にピペットにより送達した（４０μＬ／ｃｍ２）。ｄｓＲＮＡ試料の濃度は、ウエルにおける表面積（１．５ｃｍ２）の１平方センチメートル当たりのｄｓＲＮＡの量（ｎｇ／ｃｍ２）として計算した。処理トレーは、飼料表面上の液体が蒸発するかまたは飼料中に吸収されるまで、フュームフード内に保持した。
【０１８５】
羽化の数時間以内に、個々の幼虫を湿らせたラクダ毛ブラシで捕捉し、処理飼料上にのせた（１ウエル当たり１または２匹の幼虫）。次いで、１２８ウエルプラスチックトレーの外寄生ウエルを透明プラスチックの粘着性シートで密封し、ガス交換を可能にするために通気孔をつけた。バイオアッセイトレーを制御された環境条件下（２８℃、相対湿度約４０％、１６：８（明／暗））で９日間保持し、その後、各試料に曝露した昆虫の総数、死亡昆虫の数および生存昆虫の体重を記録した。平均死亡百分率および平均成長阻害を各処理について計算した。成長阻害（ＧＩ）は、以下のように計算した。
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
ここで、ＴＷＩＴは、処理における生存昆虫の総体重であり、ＴＮＩＴは、処理における昆虫の総数であり、ＴＷＩＢＣは、バックグラウンド基準（緩衝液対照）における生存昆虫の総体重であり、ＴＮＩＢＣは、バックグラウンド基準（緩衝液対照）における昆虫の総数である。
【０１８６】
統計解析は、ＪＭＰ（登録商標）ソフトウエア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて行った。
【０１８７】
ＬＣ５０（致死濃度）は、試験昆虫の５０％が殺される用量と定義される。ＧＩ５０（成長阻害）は、試験昆虫の平均成長（例えば、生存体重）がバックグラウンド基準試料で認められる平均値の５０％である用量と定義される。
【０１８８】
反復したバイオアッセイで、個々の試料の摂取が、トウモロコシ根切り虫幼虫の驚くべきかつ予期しない死亡および成長阻害をもたらしたことが示された。
【実施例５】
【０１８９】
候補標的遺伝子のスクリーニング
実施例１で同定された標的遺伝子配列を阻害するように設計された合成ｄｓＲＮＡは、飼料ベースのアッセイにおいてＷＣＲに投与した場合、死亡および成長阻害を引き起こした。ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ１、ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ２およびｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ３は、スクリーニングした他のｄｓＲＮＡと比べてこのアッセイにおいて著しく高い有効性を示すことが認められた。
【０１９０】
反復したバイオアッセイで、ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ１、ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ２およびｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ３に由来するｄｓＲＮＡ調製物の摂取が、それぞれウェスタンコーンルートワーム幼虫の死亡および／または成長阻害をもたらしたことが示された。表２および表３にこれらのｄｓＲＮＡへの９日間の曝露後のＷＣＲ幼虫の飼料ベースの摂食バイオアッセイの結果、ならびに黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）コード領域（配列番号７）から調製したｄｓＲＮＡの陰性対照試料を用いて得られた結果を示す。
【０１９１】
【表２】
2017510246.tif 000007
【０１９２】
【表３】
2017510246.tif 000008
【０１９３】
ジアブロティカ属（Diabrotica）種の特定の遺伝子をＲＮＡｉ媒介昆虫防除に活用することができることは、以前に示唆された。９０６配列を開示している、米国特許出願公開第２００７／０１２４８３６号および９１１２配列開示している、米国特許第７，６１２，１９４号を参照のこと。しかし、ＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有用性を有すると示唆された多くの遺伝子がジアブロティカ属（Diabrotica）の防除に有効でないということが判断された。ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ１、ｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ２およびｒｎａｐＩＩ  ｒｅｇ３配列が、ＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有用性を有すると示唆された他の遺伝子と比較して、それぞれジアブロティカ属（Diabrotica）の驚くべきかつ予期しない優れた防除をもたらすということも判断された。
【０１９４】
例えば、アネキシン、ベータスペクトリン２およびｍｔＲＰ−Ｌ４は、それぞれ米国特許第７，６１４，９２４号においてＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有効であることが示唆された。配列番号２１は、アネキシン領域１（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号２２は、アネキシン領域２（Ｒｅｇ２）のＤＮＡ配列である。配列番号２３は、ベータスペクトリン２領域１（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号２４は、ベータスペクトリン２領域２（Ｒｅｇ２）のＤＮＡ配列である。配列番号２５は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号２６は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２（Ｒｅｇ２）のＤＮＡ配列である。ＹＦＰ配列（配列番号７）も陰性対照としてｄｓＲＮＡを生成するためにも用いた。
【０１９５】
前述の配列のそれぞれを実施例３の方法によりｄｓＲＮＡを生成するために用いた。ｄｓＲＮＡの生成のための特定の鋳型を得るために用いた戦略を図２に示す。ｄｓＲＮＡ合成に用いることを目的としたＤＮＡ鋳型は、表４におけるプライマー対およびＷＣＲ初齢幼虫から単離された全ＲＮＡから調製した第一鎖ｃＤＮＡ（ＰＣＲ鋳型としての）を用いてＰＣＲにより作製した。（ＹＦＰは、ＤＮＡクローンから増幅した。）それぞれの選択した標的遺伝子領域について、２回の別個のＰＣＲ増幅を実施した。第１のＰＣＲ増幅で、増幅センス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された。第２の反応で、アンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が取り込まれた。標的遺伝子の各領域の２つのＰＣＲ増幅断片をほぼ等量で混合し、混合物をｄｓＲＮＡの生成のための転写鋳型として用いた。図２を参照のこと。ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて製造業者の指示（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に従って二本鎖ＲＮＡを合成し、精製した。ｄｓＲＮＡの濃度をＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定し、ｄｓＲＮＡをそれぞれ上述の同じ飼料ベースのバイオアッセイにより試験した。表４にアネキシンＲｅｇ１、アネキシンＲｅｇ２、ベータスペクトリン２  Ｒｅｇ１、ベータスペクトリン２  Ｒｅｇ２、ｍｔＲＰ−Ｌ４  Ｒｅｇ１およびｍｔＲＰ−Ｌ４  Ｒｅｇ２  ｄｓＲＮＡ分子を生成するために用いたプライマーの配列を示す。図２に示した方法に用いるＹＦＰプライマー配列も表４に挙げる。表５にこれらのｄｓＲＮＡ分子への９日間の曝露後のＷＣＲ幼虫の飼料ベースのバイオアッセイの結果を示す。反復したバイオアッセイで、これらのｄｓＲＮＡの摂取がＴＥ緩衝液、水またはＹＦＰタンパク質の対照試料について認められたものを上回るウェスタンコーンルートワーム幼虫の死亡または成長阻害をもたらさなかったことが示された。
【０１９６】
【表４−１】
2017510246.tif 000009
【０１９７】
【表４−２】
2017510246.tif 000010
【０１９８】
【表５】
2017510246.tif 000011
【実施例６】
【０１９９】
殺虫ヘアピンｄｓＲＮＡを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換：植物ゲノムに安定に組み込まれたキメラ遺伝子の発現により１つまたは複数の殺虫ｄｓＲＮＡ分子（例えば、ｒｎａｐＩＩ−１４０；配列番号１を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を産生するトランスジェニックトウモロコシ細胞、組織および植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換の後に生成した。スーパーバイナリーまたはバイナリー形質転換ベクターを用いるトウモロコシ形質転換法は、例えば、米国特許第８，３０４，６０４号に記載されているように、当技術分野で公知である。形質転換組織は、ハロキシホップ含有培地上で成長するそれらの能力により選択し、適宜、ｄｓＲＮＡの産生についてスクリーニングした。そのような形質転換組織培養の一部は、実施例１で述べたように本質的に、バイオアッセイのために新生トウモロコシ根切り虫幼虫に与えることができる。
【０２００】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始：上（実施例４）で述べたバイナリー形質転換ベクターｐＤＡＢ１１４５２４、ｐＤＡＢ１１４５２５、ｐＤＡＢ１１０８５３またはｐＤＡＢ１１０５５６を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株ＤＡｔ１３１９２細胞（国際公開第２０１２／０１６２２２号Ａ２）のグリセロールストックを適切な抗生物質を含むＡＢ最少培地プレート（Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-264）に画線接種し、２０℃で３日間成長させた。次いで、培養物を同じ抗生物質を含むＹＥＰプレート（ｇｍ／Ｌ；酵母エキス、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）に画線接種し、２０℃で１日間インキュベートした。
【０２０１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養：実験当日に、接種培地およびアセトシリンゴンを含む保存溶液を実験における構築物の数に対して適切な容積で調製し、滅菌済みの使い捨て２５０ｍＬフラスコにピペットで移した。接種培地（Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341）は、２．２ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン（Frame et al., ibid.）；６８．４ｇｍ／Ｌスクロース；３６ｇｍ／Ｌグルコース；１１５ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；および１００ｍｇ／Ｌミオイノシトールを含んでいた（ｐＨ５．４）。アセトシリンゴンを接種培地を含むフラスコに１００％ジメチルスルホキシド中１Ｍ保存溶液から２００μＭの最終濃度になるまで加え、溶液を十分に混合した。
【０２０２】
各構築物について、ＹＥＰプレートからのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を満たした１または２接種ループを滅菌済みの使い捨て５０ｍＬ遠心管中の１５ｍＬの接種培地／アセトシリンゴン保存溶液に懸濁し、５５０ｎｍでの溶液の光学濃度（ＯＤ５５０）を測定した。次いで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合物を用いて懸濁液を０．３〜０．４のＯＤ５５０に希釈した。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を、室温で約７５ｒｐｍに設定したプラットフォーム振とう機上に水平にのせ、胚切開を実施しながら１〜４時間振とうした。
【０２０３】
穂の滅菌および胚の単離：トウモロコシ未熟胚を温室内で成長させたゼア・マイス（Zea mays）近交系Ｂ１０４の植物（Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406）から入手し、自家または近縁授粉して、穂を産生させた。穂は、授粉後約１０〜１２日目に収穫した。実験日に、脱殻した穂を層流フード内で市販の漂白剤（ＵＬＴＲＡ  ＣＬＯＲＯＸ（登録商標）殺菌漂白剤、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム；２滴のＴＷＥＥＮ  ２０を含む）の２０％溶液中に浸漬し、２０〜３０分間振とうした後、滅菌脱イオン水で３回すすぐことによって表面滅菌した。未熟接合胚（１．８〜２．２ｍｍ長）を各穂から無菌的に切り離し、２００μＭアセトシリンゴンを含む液体接種培地中適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の２．０ｍＬ懸濁液を含む小遠心管に無作為に分配し、２μＬの１０％ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤（ＥＶＯＮＩＫ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ；Ｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。所与のセットの実験について、プールした穂由来の胚を各形質転換に使用した。
【０２０４】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養：単離後、胚をロッカープラットフォーム上に５分間置いた。次いで、管の内容物を、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌジカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸または３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；ＤＭＳＯ中２００μＭアセトシリンゴン；および３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）を含むｐＨ５．８の共培養培地のプレート上に注いだ。液体アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を滅菌済みの使い捨てホールピペットにより除去した。次いで、胚を、顕微鏡を活用して滅菌済み鉗子を用いて胚盤を上向きにして配向させた。プレートを閉じ、３Ｍ（登録商標）ＭＩＣＲＯＰＯＲＥ（登録商標）医療用テープで密封し、約６０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光合成有効放射（ＰＡＲ）の連続光を用いた２５℃のインキュベーターに入れた。
【０２０５】
カルスの選択およびトランスジェニックイベントの再生：共培養期間の後、胚を、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌジカンバ；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＲ；Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）；２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン；および２．３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）から構成されていたｐＨ５．８の静止培地に移した。３６以下の胚を各プレートに除去した。プレートを透明プラスチックボックスに入れ、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７〜１０日間インキュベートした。次いで、カルス化胚を、１００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．０３６２ｍｇ／Ｌ；ＡＡＤ−１遺伝子を含むカルスの選択用）を含む（上記）静止培地から構成されていた、選択培地１上に移した（＜１８／プレート）。プレートを透明ボックスに戻し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７日間インキュベートした。次いで、カルス化胚を、５００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．１８１ｍｇ／Ｌ）を含む（上記）静止培地から構成されていた、選択培地ＩＩ上に移した（＜１２／プレート）。プレートを透明ボックスに戻し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で１４日間インキュベートした。この選択ステップは、トランスジェニックカルスがさらに増殖し、分化することを可能とした。
【０２０６】
増殖性の胚発生カルスを再生前培地に移した（＜９／プレート）。再生前培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；４５ｇｍ／Ｌスクロース；３５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；５０ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１．０ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．２５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ；ＮａＯＨ中０．５ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸；エタノール中２．５ｍｇ／Ｌアブシジン酸；１ｍｇ／Ｌ  ６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン；２．５ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）；および０．１８１ｍｇ／Ｌ  Ｒ−ハロキシホップ酸を含んでいた。プレートを透明ボックス中に保存し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７日間インキュベートした。次いで、再生カルスをＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）中の再生培地に移し（＜６／プレート）、１日当たり１６時間点灯／８時間消灯（約１６０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲで）で２８℃で１４日間または芽条および根が発生するまでインキュベートした。再生培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；６０ｇｍ／Ｌスクロース；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１２５ｍｇ／Ｌカルベニシリン；３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＬＡＮ（商標）ゴム；および０．１８１ｍｇ／Ｌ  Ｒ−ハロキシホップ酸を含んでいた。次いで、一次根付きの小芽条を単離し、選択せずに伸長培地に移した。伸長培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；および３．５ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＲＩＴＥ（登録商標）を含んでいた。
【０２０７】
ハロキシホップを含む培地上で成長するそれらの能力により選択した形質転換植物の芽条をＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）から成長培地（ＰＲＯＭＩＸ  ＢＸ；ＰＲＥＭＩＥＲ  ＴＥＣＨ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ）を満たした小ポットに移植し、カップまたはＨＵＭＩ−ＤＯＭＥＳ（ＡＲＣＯ  ＰＬＡＳＴＩＣＳ）で覆い、次いで、ＣＯＮＶＩＲＯＮ成長チャンバー（２７℃昼間／２４℃夜間、１６時間明期、５０〜７０％ＲＨ、２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲ）内で環境に順化させた。場合によっては、推定トランスジェニック小植物を、トウモロコシゲノムに組み込まれたＡＡＤ１除草剤耐性遺伝子を検出するように設計されたプライマーを用いた定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより導入遺伝子相対コピー数について解析した。さらに、ＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイを用いて、推定形質転換体の発現ｄｓＲＮＡにおけるＳＴ−ＬＳ１イントロン配列の存在を検出した。次いで、選択された形質転換小植物をさらなる成長および試験のために温室に移した。
【０２０８】
バイオアッセイおよび種子生産のための温室におけるＴ０植物の移動および樹立：植物がＶ３−Ｖ４段階に達した場合、それらをＩＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ（ＰＲＯＦＩＬＥ／ＭＥＴＲＯ  ＭＩＸ  １６０）土壌ミックスに移植し、温室内（光曝露の種類：光または同化；高照度限界：１２００ＰＡＲ；日照時間１６時間；２７℃昼間／２４℃夜間）で開花まで成長させた。
【０２０９】
昆虫バイオアッセイに用いるための植物を小ポットからＴＩＮＵＳ（商標）３５０−４  ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）（ＳＰＥＮＣＥＲ−ＬＥＭＡＩＲＥ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ、Ａｃｈｅｓｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）に移植した。ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）に移植してから約４日後に、バイオアッセイのために植物に外寄生させた。
【０２１０】
非トランスジェニックエリート近交系Ｂ１０４の植物または他の適切な花粉ドナーから採取した花粉をＴ０トランスジェニック植物のひげに授粉することにより、Ｔ１世代の植物を得た。可能な場合、逆交配も実施した。
【実施例７】
【０２１１】
トランスジェニックトウモロコシ組織の分子解析
トウモロコシ組織の分子解析（例えば、ＲＮＡ  ｑＰＣＲ）は、根の食害を評価したのと同じ日に温室成長植物から採取した葉および根の試料について実施した。
【０２１２】
Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲのＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの結果は、ヘアピン導入遺伝子の発現をバリデートするために用いた。（内因性Ｐｅｒ５遺伝子の発現がトウモロコシ組織に通常存在するので、非形質転換トウモロコシ植物で低レベルのＰｅｒ５  ３’ＵＴＲの検出が予想される。）発現ＲＮＡにおけるＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（ｄｓＲＮＡヘアピン分子の形成に不可欠である）のＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの結果は、ヘアピン転写物の存在をバリデートするために用いた。導入遺伝子ＲＮＡレベルは、内因性トウモロコシ遺伝子のＲＮＡ発現レベルと比較して測定した。
【０２１３】
ゲノムＤＮＡにおけるＡＡＤ１コード領域の一部を検出するためのＤＮＡ  ｑＰＣＲ解析は、導入遺伝子挿入配列のコピー数を推定するために用いた。これらの解析用の試料は、環境チャンバー内で成長した植物から採取した。結果を単一コピー天然遺伝子の一部を検出するように設計されたアッセイのＤＮＡ  ｑＰＣＲ結果と比較し、単純イベント（導入遺伝子の１つまたは２つのコピーを有する）を温室内のさらなる試験に進めた。
【０２１４】
さらに、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ＳｐｅｃＲ；Ｔ−ＤＮＡの外側のバイナリーベクタープラスミド上に存在）の一部を検出するように設計されたｑＰＣＲアッセイを用いて、トランスジェニック植物が外来組込みプラスミド主鎖配列を含んでいたかどうかを判断した。
【０２１５】
ヘアピンＲＮＡ転写物発現レベル：Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲのｑＰＣＲ：カルス細胞イベントまたはトランスジェニック植物をＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ配列のリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析して、ＴＩＰ４ｌ様タンパク質（すなわち、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＴ４Ｇ３４２７０のマイスホモログ；７４％同一性のｔＢＬＡＳＴＸスコアを有する）をコードする、内部トウモロコシ遺伝子（配列番号５１；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＢＴ０６９７３４）の転写物レベルと比較した、全長ヘアピン転写物の相対発現レベルを決定した。ＲＮＡは、ＲＮＡＥＡＳＹ（商標）９６キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離した。溶出後、全ＲＮＡをキットの提案プロトコールによるＤＮＡｓｅｌ処理にかけた。次いで、ＲＮＡをＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で定量し、濃度を２５ｎｇ／μＬに対して標準化した。第一鎖ｃＤＮＡは、製造業者の推奨プロトコールに実質的に従って、５μＬ変性ＲＮＡを含む１０μＬ反応容積でＨＩＧＨ  ＣＡＰＡＣＩＴＹ  ｃＤＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＫＩＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて作製した。複合ランダムプライマーおよびオリゴｄＴの作業ストックを調製するために、ランダムプライマーストックミックスの１ｍＬ管への１０μＬの１００μＭ  Ｔ２０ＶＮオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）（配列番号５２；ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ、ここで、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕである）の添加を含めるように、プロトコールをわずかに修正した。
【０２１６】
ｃＤＮＡ合成の後に、試料をヌクレアーゼ不含有水で１：３に希釈し、アッセイに供するまで−２０℃で保存した。
【０２１７】
Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲおよびＴＩＰ４ｌ様転写物の別個のリアルタイムＰＣＲアッセイは、１０μＬ反応容積でＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０（ＲＯＣＨＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて実施した。Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲアッセイについては、反応は、Ｐ５Ｕ７６Ｓ（Ｆ）（配列番号５３）およびＰ５Ｕ７６Ａ（Ｒ）（配列番号５４）プライマーならびにＲＯＣＨＥ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＲＯＢＥ（商標）（ＵＰＬ７６；カタログ番号４８８９９６０００１；ＦＡＭで標識した）を用いて行った。ＴＩＰ４ｌ様参照遺伝子アッセイについては、ＴＩＰｍｘＦ（配列番号５５）およびＴＩＰｍｘＲ（配列番号５６）プライマーおよびＨＥＸ（ヘキサクロロフルオロセイン）で標識したＨＸＴＩＰプローブ（配列番号５７）を用いた。
【０２１８】
すべてのアッセイに無鋳型（ミックスのみ）の陰性対照を含めた。標準曲線のために、試料の交差汚染の有無を確認するためにブランク（ソースウエル中水）もソースプレートに含めた。プライマーおよびプローブ配列を表６に示す。様々な転写物の検出のための反応成分処方を表７に開示し、ＰＣＲ反応条件を表８に要約する。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセインアミダイト）蛍光部分を４６５ｎｍで励起し、５１０ｎｍで蛍光を測定した。ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオロセイン）蛍光部分の対応する値は、５３３ｎｍおよび５８０ｎｍであった。
【０２１９】
【表６】
2017510246.tif 000012
【０２２０】
【表７】
2017510246.tif 000013
【０２２１】
【表８】
2017510246.tif 000014
【０２２２】
データは、供給業者の推奨に従ってＣｑ値の計算のための二次微分最大値アルゴリズムを用いた相対的定量によりＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウエアｖ１．５を用いて解析した。発現解析については、発現値は、最適化ＰＣＲ反応について産物がサイクルごとに倍加するという仮定のもとに２の基準値が選択される、２つの標的間のＣｑ値の差の比較に依拠する、ΔΔＣｔ法（すなわち、２−（Ｃｑ  ＴＡＲＧＥＴ−Ｃｑ  ＲＥＦ））を用いて計算した。
【０２２３】
ヘアピン転写物のサイズおよび完全性−ノーザンブロットアッセイ：場合によって、ｒｎａｐＩＩ−１４０ヘアピンｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック植物におけるｒｎａｐＩＩ−１４０ヘアピンＲＮＡの分子サイズを測定するためのノーザンブロット（ＲＮＡブロット）解析を用いることにより、トランスジェニック植物のさらなる分子的特徴付けが得られる。
【０２２４】
すべての材料および装置は、使用前にＲＮＡＺＡＰ（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）により処理する。組織試料（１００ｍｇ〜５００ｍｇ）は、２ｍＬ  ＳＡＦＥＬＯＣＫ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管に採取し、１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中３個のタングステンビーズを含むＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機（ＧＡＲＣＩＡ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて５分間破壊し、次いで、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。場合によって、試料を４℃で１１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を新しい２ｍＬ  ＳＡＦＥＬＯＣＫ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管に移す。２００μＬのクロロホルムをホモジネートに加えた後、管を反転により２〜５分間混合し、室温で１０分間インキュベートし、４℃で１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離する。上相を滅菌済みの１．５ｍＬ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管に移し、６００μＬの１００％イソプロパノールを加えた後、室温で１０分〜２時間インキュベートし、次いで、４〜２５℃で１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、ＲＮＡペレットを１ｍＬの７０％エタノールで２回洗浄し、洗浄の間に４〜２５℃で７，５００ｘｇで１０分間遠心分離する。エタノールを捨て、ペレットを、５０μＬのヌクレアーゼ不含有水に再懸濁する前に３〜５分間短く風乾する。
【０２２５】
全ＲＮＡをＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）８０００（ＴＨＥＲＭＯ−ＦＩＳＨＥＲ）を用いて定量し、試料を５μｇ／１０μＬに標準化した。次いで、１０μＬのグリオキサール（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を各試料に加える。５〜１４ｎｇのＤＩＧ  ＲＮＡ標準マーカーミックス（ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を分配し、等容積のグリオキサールに加える。試料およびマーカーＲＮＡを５０℃で４５分間変性し、ＮＯＲＴＨＥＲＮＭＡＸ  １０Ｘグリオキサールランニング緩衝液（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中１．２５％  ＳＥＡＫＥＭ  ＧＯＬＤアガロース（ＬＯＮＺＡ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）ゲル上にロードするまで、氷上で保存する。ＲＮＡは、６５ボルト／３０ｍＡで２時間１５分間の電気泳動により分離する。
【０２２６】
電気泳動の後、ゲルを２Ｘ  ＳＳＣで５分間すすぎ、ＧＥＬ  ＤＯＣステーション（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で撮像し、次いで、１０Ｘ  ＳＳＣを転移緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウムおよび３００ｍＭクエン酸三ナトリウムからなる２０Ｘ  ＳＳＣ、ｐＨ７．０）として用いてＲＮＡをナイロン膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に室温で一夜受動的に転移させる。転移後、膜を２Ｘ  ＳＳＣで５分間すすぎ、ＲＮＡを膜（ＡＧＩＬＥＮＴ／ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）にＵＶ架橋し、膜を室温で最長２日間乾燥する。
【０２２７】
膜をＵＬＴＲＡＨＹＢ緩衝液（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で１〜２時間プレハイブリダイズする。プローブは、ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＤＩＧ法によりジゴキシゲニンで標識された対象の配列（適宜、例えば、配列番号１６または配列番号１７のアンチセンス配列部分）を含むＰＣＲ増幅産物からなっている。推奨緩衝液中のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション管中６０℃の温度で一夜である。ハイブリダイゼーションの後、ブロットをＤＩＧ洗浄にかけ、包み、フィルムに１〜３０分間曝露し、次いで、フィルムを現像するが、すべてがＤＩＧキットの供給業者により推奨された方法による。
【０２２８】
導入遺伝子コピー数の決定
２回の葉のパンチにほぼ相当するトウモロコシ葉片を９６ウエルコレクションプレート（ＱＩＡＧＥＮ）に収集した。組織の破壊は、１個のステンレススチールビーズを含むＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６  ＡＰ１溶解緩衝液（ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６  ＰＬＡＮＴ  ＫＩＴ；ＱＩＡＧＥＮから供給）中でＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機（ＧＡＲＣＩＡ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて実施した。組織の温侵の後、ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６  ＰＬＡＮＴ  ＫＩＴおよびＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６抽出ロボットを用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を高処理式で単離した。ゲノムＤＮＡは、ｑＰＣＲ反応を始める前に２：３  ＤＮＡ：水に希釈した。
【０２２９】
ｑＰＣＲ解析  加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子検出は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムを用いてリアルタイムＰＣＲにより実施した。ＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（配列番号１９）を検出するために、またはＳｐｅｃＲ遺伝子の一部（すなわち、バイナリーベクタープラスミド上で運ばれるスペクチオマイシン抵抗性遺伝子；配列番号５８；表９におけるＳＰＣ１オリゴヌクレオチド）を検出するために加水分解プローブアッセイに用いるオリゴヌクレオチドは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）  ＰＲＯＢＥ  ＤＥＳＩＧＮ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ２．０を用いて設計した。さらに、ＡＡＤ−１除草剤耐性遺伝子のセグメント（配列番号５９；表９におけるＧＡＡＤ１オリゴヌクレオチド）を検出するために加水分解プローブアッセイに用いるオリゴヌクレオチドは、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳソフトウエア（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて設計した。表９にプライマーおよびプローブの配列を示す。アッセイは、各アッセイにおいてｇＤＮＡが存在していたことを保証するための内部参照配列としての役割を果たした、内因性トウモロコシ染色体遺伝子（インベルターゼ（配列番号６０；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｕ１６１２３；ここでＩＶＲ１と呼ぶ）用試薬を用いて多重化した。増幅のために、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含む１０μＬ容積多重反応においてＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０  ＰＲＯＢＥＳ  ＭＡＳＴＥＲミックス（ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を１Ｘ最終濃度で調製した（表１０）。表１１に概要を示すように２段階増幅反応を実施した。ＦＡＭおよびＨＥＸ標識プローブの発蛍光団の活性化および発光は、上述の通りであり、ＣＹ５コンジュゲートは、６５０ｎｍで最大限に励起され、６７０ｎｍで最大限に蛍光を発する。
【０２３０】
Ｃｐスコア（蛍光シグナルがバックグラウンド閾値に交差する点）は、フィットポイントアルゴリズム（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＳＯＦＴＷＡＲＥリリース１．５）およびＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔモジュール（ΔΔＣｔ法に基づく）を用いてリアルタイムＰＣＲデータから決定した。データは、上述のように処理した（上；ＲＮＡ  ｑＰＣＲ）。
【０２３１】
【表９】
2017510246.tif 000015
【０２３２】
【表１０】
2017510246.tif 000016
【０２３３】
【表１１】
2017510246.tif 000017
【実施例８】
【０２３４】
トランスジェニックトウモロコシのバイオアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ昆虫バイオアッセイ：植物細胞中で生成するｄｓＲＮＡの生物活性は、バイオアッセイ法によって示される。例えば、Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326を参照のこと。例えば、殺虫ｄｓＲＮＡを生成する植物に由来する様々な植物組織または組織片を制御された摂食環境における標的昆虫に与えることによって、有効性を示すことができる。あるいは、殺虫ｄｓＲＮＡを生成する植物に由来する様々な植物組織から抽出物を調製し、抽出された核酸を本明細書で前述したようにバイオアッセイのための人工飼料の上に分配して加える。そのような摂食アッセイの結果は、殺虫ｄｓＲＮＡを生成しない宿主植物の適切な対照組織を用いる同様に実施されたバイオアッセイと、または他の対照試料と比較する。
【０２３５】
トランスジェニックトウモロコシイベントを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ昆虫バイオアッセイ
洗浄卵から孵化した２匹のウェスタンコーンルートワーム幼虫（１〜３日齢）を選択し、バイオアッセイトレーの各ウエルに入れる。次いで、ウエルを「ＰＵＬＬ  Ｎ’  ＰＥＥＬ」タブカバー（ＢＩＯ−ＣＶ−１６、ＢＩＯ−ＳＥＲＶ）で覆い、１８時間／６時間  明／暗サイクルとした２８℃インキュベーターに入れた。最初の外寄生の９日後に、各処理における昆虫の総数のうちの死亡昆虫の百分率と計算される、死亡率について幼虫を評価した。昆虫試料を−２０℃で２日間凍結し、次いで、各処理の昆虫の幼虫をプールし、体重を測定する。成長阻害の百分率は、２つの対照ウエル処理の平均体重の平均値によって割った実験処理の平均体重として計算する。データは、成長阻害百分率（陰性対照の）として表す。対照平均体重を超える平均体重は、ゼロに標準化する。
【０２３６】
温室内の昆虫バイオアッセイ：ウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）卵は、ＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から土壌入りで受領した。ＷＣＲ卵を２８℃で１０〜１１日間インキュベートした。土壌からの卵を洗浄し、０．１５％寒天溶液中に入れ、濃度を０．２５ｍＬアリコート当たり約７５〜１００個の卵に調整した。孵化速度をモニターするために卵懸濁液のアリコートを用いて孵化プレートをペトリ皿中にセットした。
【０２３７】
ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）中で成育中のトウモロコシ植物体の周囲の土壌に１５０〜２００個のＷＣＲ卵を外寄生させた。昆虫に２週間摂食させ、その後、「根評点付け」を各植物に対して行った。Oleson et al.（2005)J. Econ. Entomol. 98(1):1-8に本質的に準拠して等級付けに節損傷評価基準（Node-Injury Scale）を用いた。このバイオアッセイに合格した植物を種子生産のために１８．９リットルのポットに移植した。移植した植物を殺虫剤で処理して、さらなる根切り虫被害および温室内の昆虫の放出を防止した。種子生産のために植物に人工授粉した。これらの植物により産生された種子は、Ｔ１および植物のその後の世代における評価のために残した。
【０２３８】
温室バイオアッセイに２種の陰性対照植物を含めた。トランスジェニック陰性対照植物は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはＹＦＰヘアピンｄｓＲＮＡを産生するように設計された遺伝子を含むベクターによる形質転換により生成した（実施例４参照）。非形質転換陰性対照植物は、７ｓｈ３８２またはＢ１０４系の種子から成長させた。バイオアッセイを２つの別個の日に実施し、陰性対照を各組の植物物質に含めた。
【０２３９】
表１２にｒｎａｐＩＩ−１４０ヘアピン植物の分子解析およびバイオアッセイの組み合わせた結果を示す。表１２に要約したバイオアッセイの結果の検討により、例えば、配列番号１６および配列番号１７に例示されるような、配列番号１のセグメントを含むｒｎａｐＩＩ−１４０ヘアピンｄｓＲＮＡを発現する構築物を含むトランスジェニックトウモロコシ植物のほとんどがウェスタンコーンルートワームの幼虫の摂食によって招かれる根の損傷から保護されるという驚くべきかつ予期しない所見が明らかになる。３６の等級付けしたイベントのうちの６のみが０．７５以上の根評点を有していた。表１３に陰性対照植物の分子解析およびバイオアッセイの組み合わせた結果を示す。３４の等級付けした植物のうちの５つが０．７５以下の根評点を有していたが、ほとんどの植物がＷＣＲ幼虫摂食からの保護を有さなかった。陰性対照植物の組における低い根評点付けスコアを有するいくつかの植物の存在が時として認められ、温室環境でのこの種のバイオアッセイの変動および実施することの困難を反映している。
【０２４０】
【表１２−１】
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【０２４１】
【表１２−２】
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【０２４２】
【表１３−１】
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【０２４３】
【表１３−２】
2017510246.tif 000021
【実施例９】
【０２４４】
鞘翅目害虫配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
１０〜２０のトランスジェニックＴ０ゼア・マイス（Zea mays）植物を実施例６で述べたように生成する。ｉＲＮＡを発現するさらなる１０〜２０のＴ１ゼア・マイス（Zea mays）独立系をトウモロコシ根切り虫チャレンジのために得る。ｉＲＮＡは配列番号１６、配列番号１７を含み、または他の場合配列番号１、３、４、または５をさらに含む。さらなるヘアピンＲＮＡは、例えば、Ｃａｆｌ−１８０（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５８号）、ＶａｔｐａｓｅＣ（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５９号）、Ｒｈｏ１（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２６０号）、ＶａｔｐａｓｅＨ（米国特許出願公開第２０１２／０１９８５８６号）、ＰＰＩ−８７Ｂ（米国特許出願公開第２０１３／００９１６００号）、ＲＰＡ７０（米国特許出願公開第２０１３／００９１６０１号）またはＲＰＳ６（米国特許出願公開第２０１３／００９７７３０号）等の鞘翅目害虫配列から得ることができる。これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の分子解析法により確認される。ｉＲＮＡがＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む選択される独立Ｔ１系からの全ＲＮＡ調製物は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンに結合するように設計されたプライマーによるＲＴ−ＰＣＲに用いる。さらに、ＲＮＡｉ構築物における各標的遺伝子に対する特異的プライマーは、適切な場合、植物体におけるｓｉＲＮＡ生成に必要なプロセシング前（pre-processed）ｍＲＮＡを増幅し、その生成を確認するために用いられる。各標的遺伝子の所望のバンドの増幅により、各トランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物におけるｉＲＮＡの発現が確認される。ｉＲＮＡのｓｉＲＮＡへのプロセシングは、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを用いて独立トランスジェニック系においてその後確認される。
【０２４５】
標的遺伝子との８０％を超える配列同一性を有するミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子との１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子について認められるものと同様の仕方でトウモロコシ根切り虫に作用する。ｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列との対合により、摂食鞘翅目害虫の成長、発育および生存能力に影響を及ぼす植物処理ｓｉＲＮＡがもたらされる。
【０２４６】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの植物体への送達および摂食による鞘翅目害虫によるその後の取込みにより、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる鞘翅目害虫における標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が発育の１つまたは複数の段階で重要である場合、鞘翅目害虫の成長、発育および生殖が影響を受け、ＷＣＲ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、ＭＣＲ、Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント、Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）およびＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイムの少なくとも１つの場合、外寄生し、摂食し、発育し、かつ／または生殖することの不成功につながるか、あるいは鞘翅目害虫の死につながる。次いで、鞘翅目害虫を防除するために、標的遺伝子の選択およびＲＮＡｉの成功裏での適用を用いる。
【０２４７】
トランスジェニックＲＮＡｉ系および非形質転換ゼア・マイス（Zea mays）の表現型比較  ｉＲＮＡを創製するために選択した標的鞘翅目害虫遺伝子または配列は、他のあらゆる公知の植物遺伝子配列との類似性が実質的にない。したがって、これらの鞘翅目害虫遺伝子または配列を標的とする構築物による（全身性）ＲＮＡｉの生成または活性化は、トランスジェニック植物に対してあらゆる有害な影響を及ぼすことは、予想されない。トランスジェニック系の発育および形態特性を非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有さない「空」のベクターにより形質転換したトランスジェニック系の植物と比較する。植物の根、芽条、茎葉および生殖特性を比較する。トランスジェニック植物および非形質転換植物の根の長さおよび成長パターンに観察可能な差はない。高さ等の植物の芽条の特性、葉の数およびサイズ、開花時期、花のサイズおよび外観は、同様である。温室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび土壌中で栽培した場合、一般的に、トランスジェニック系と標的ｉＲＮＡ分子の発現のないものとの間に観察可能な形態の差はない。
【実施例１０】
【０２４８】
鞘翅目害虫配列およびさらなるＲＮＡｉ構築物を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
鞘翅目害虫以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子を生成するように転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物を、１つまたは複数の殺虫ｉＲＮＡ分子（例えば、配列番号１、３、４または５を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を生成するようにアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）方法論（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67参照）により二次的に形質転換する。実施例４に述べたように本質的に調製される植物形質転換プラスミドベクターを、鞘翅目害虫以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子を生成するように転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックＨｉ  ＩＩまたはＢ１０４ゼア・マイス（Zea mays）植物から得られたトウモロコシ懸濁細胞または未熟トウモロコシ胚にアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換法により送達する。得られる形質転換胚は、鞘翅目害虫および鞘翅目害虫以外の生物に対する抵抗性を有することが示される全植物体を再生するために用いる。
【実施例１１】
【０２４９】
ＲＮＡｉ構築物およびさらなる鞘翅目害虫防除配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
鞘翅目害虫生物を標的とするｉＲＮＡ分子（例えば、配列番号１、３、４または５を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を生成するように転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物を、１つまたは複数の殺虫タンパク質分子、例えば、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３４およびＣｒｙ３５殺虫タンパク質を生成するようにアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）方法論により二次的に形質転換する。実施例４に述べたように本質的に調製される植物形質転換プラスミドベクターを、鞘翅目害虫生物を標的とするｉＲＮＡ分子を生成するように転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックＢ１０４ゼア・マイス（Zea mays）植物から得られたトウモロコシ懸濁細胞または未熟トウモロコシ胚にアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換法により送達する。鞘翅目害虫の防除のためのｉＲＮＡ分子および殺虫タンパク質を生成する二重形質転換植物が得られる。
【実施例１２】
【０２５０】
花粉甲虫トランスクリプトーム
昆虫：  幼虫および成虫花粉甲虫を開花セイヨウアブラナを含む圃場（Ｇｉｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から収集した。若い成体昆虫（処置群当たりそれぞれ：ｎ＝２０；３反復）を２種の異なる細菌（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、１種の酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））ならびに細菌ＬＰＳの混合物を注射することによりチャレンジした。細菌培養物を３７℃で撹拌しながら増殖させ、光学濃度を６００ｎｍでモニターした（ＯＤ６００）。細胞をＯＤ６００〜１で遠心分類により集め、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。混合物は、１０ｍｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（精製大腸菌（E. coli）エンドトキシン；Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の水溶液ならびに細菌および酵母培養に浸した解剖針を用いて花粉甲虫の成虫の腹部を刺すことにより腹部外側に導入した。免疫チャレンジ甲虫に加えて、ナイーブ甲虫および幼虫を同じ時点に収集した（それぞれｎ＝２０および３反復）。
【０２５１】
ＲＮＡの単離：  全ＲＮＡは、免疫化の８時間後に、それぞれの場合に製造業者のガイドラインに従って、凍結甲虫および幼虫からＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いて抽出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。ＲＮＡの完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて確認した。ＲＮＡの量は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を用いて測定した。ＲＮＡは、成虫免疫誘導処置群、成虫対照群および幼虫群から個別に抽出し、その後、全ＲＮＡの等量は配列決定のために試料（免疫チャレンジ成虫、対照成虫および幼虫）につき１つのプールに組み合わせた。
【０２５２】
トランスクリプトーム情報：  ＲＮＡ−Ｓｅｑデータの発生および単一リード１００ｂｐ  ＲＮＡ配列のアセンブリを免疫チャレンジ成体甲虫、ナイーブ（対照）成体甲虫および未処理の幼虫から単離された５μｇの全ＲＮＡについて別個に実施した。配列決定は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  ＯｐｅｒｏｎによりＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ−２０００プラットフォームを用いて行われた。これにより、成体対照甲虫試料について２０．８百万リード、ＬＰＳチャレンジ成体甲虫試料について２１．５百万リードおよび幼虫試料について２５．１百万リードが得られた。プールしたリード（６７．５百万）をＶｅｌｖｅｔ／Ｏａｓｅｓアセンブラーソフトウエア（M.H. Schulz et al. (2012) Bioinformatics. 28:1086-92；Zerbino & E. Birney (2008) Genome Research. 18:821-9）をアセンブルした。トランスクリプトームは、５５６４８配列を含んでいた。
【０２５３】
花粉甲虫ＲＮＡＰＩＩの同定：  トランスクリプトームのｔＢＬＡＳＴｎ検索を用いて、マッチングコンティグを同定した。クエリーとして、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットＲＰＢ２のペプチド配列を用いた（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＸＰ＿９７４６５３．１）。９つのコンティグが同定された（ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ３５１０１、ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ１５２２０、ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ５４５８６、ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ３３６７１、ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ５４７４８、ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ５０４４９、ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ２６７２４、ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ４００１０、ＲＧＫ＿ｃｏｎｔｉｇ１４２３２）。コンティグ間のギャップは、自家製ツールを用いて非アセンブルリードで満たした。ＧＡＰ５（Bonfield JK & Whitwham (2010) Bioinformatics 26:1699-1703を配列の検証に用いた。
【実施例１３】
【０２５４】
ｒｎａｐＩＩ  ＲＮＡｉによる処理後の花粉甲虫（メリゲテス・アエネウス（Meligethes aeneus））の死亡率
５’末端にＴ７ポリメラーゼプロモーター配列を含む遺伝子特異的プライマーを用いて、ＰＣＲにより約５００ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号７８および７９）を生成した。製造業者のプロトコールに従ってＰＣＲ断片をｐＧＥＭ  Ｔｅａｓｙベクターにクローニングし、配列を確認するために配列決定受託会社に送った。次いで、製造業者のプロトコールに従って配列決定されたプラスミドから創製したＰＣＲ構築物からｄｓＲＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉ  Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により生成した。
【０２５５】
幼虫および成体甲虫（ｎ＝１０、３生物学的反復）への約１００ｎｌ  ｄｓＲＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ）（配列番号７７）の注射は、解剖顕微鏡下でマイクロマニュピュレーターにより実施した。動物を二重粘着テープに付着させる前に動物を氷上で麻酔した。対照には同じ容積の水を投与した。ＩＭＰＩ（鱗翅目ハチノスツズリガ（Galleria mellonella）の昆虫メタロプロテイナーゼ阻害遺伝子）の陰性対照ｄｓＲＮＡを実施した。動物の不足のためすべての段階におけるすべての対照を試験することができるとは限らなかった。
【０２５６】
花粉甲虫は、乾燥花粉およびウエットティッシュとともにペトリ皿中に保持した。幼虫は、寒天／水培地中カノーラの花序上のプラスチックボックス中で飼育した。
【０２５７】
【表１４】
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【０２５８】
【表１５】
2017510246.tif 000023
【０２５９】
対照は、昆虫の利用可能性が限られていたため異なる日に実施した。
【０２６０】
摂食アッセイ：  昆虫は、処置の前２４時間空のファルコンチューブ中で水を与えずに保持した。ｄｓＲＮＡの小滴（約５μＬ）を小ペトリ皿に入れ、５〜８匹の甲虫をペトリ皿に加えた。動物を立体顕微鏡下で観察し、ｄｓＲＮＡを含む飼料溶液を摂取した動物をバイオアッセイに選択した。甲虫を乾燥花粉およびウエットティッシュを含むペトリ皿に移した。対照には同じ容積の水を投与した。ＩＭＰＩ（鱗翅目ハチノスツズリガ（Galleria mellonella）の昆虫メタロプロテイナーゼ阻害遺伝子）の陰性対照ｄｓＲＮＡを実施した。動物の不足のためすべての段階におけるすべての対照を試験することができるとは限らなかった。
【０２６１】
【表１６】
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【０２６２】
対照は、昆虫の利用可能性が限られていたため異なる日に実施した。
【実施例１４】
【０２６３】
カノーラ（セイヨウアブラナ（Brassica napus））胚軸のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の調製
バイナリープラスミドを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）株をストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）およびスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を含むＹＥＰ培地（Ｂａｃｔｏ  ＰｅＰｔｏｎｅ（商標）２０．０ｇｍ／Ｌおよび酵母エキス１０．０ｇｍ／Ｌ）プレートに画線接種し、２８℃で２日間インキュベートした。滅菌済み接種ループを用いて２日画線プレートからバイナリープラスミドを含む増殖アグロバクテリウム（Agrobacterium）株をこすり落とした。次いでバイナリープラスミドを含むこすり落とされたアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を滅菌済み５００ｍＬバッフル付きフラスコ（複数可）中ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）およびスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を含む１５０ｍＬ修飾ＹＥＰ液中に接種し、２８℃で２００ｒｐｍで振とうした。培養物を遠心分離し、Ｍ培地（ＬＳ塩、３％グルコース、修飾Ｂ５ビタミン、１μＭキネチン、１μＭ  ２，４−Ｄ、ｐＨ５．８）に再懸濁し、カノーラ胚軸の形質転換の前に適切な密度（分光光度計を用いて測定した５０クレット単位）に希釈した。
【０２６４】
カノーラの形質転換
種子の発芽：  カノーラ種子（ｖａｒ．ＮＥＸＥＲＡ  ７１０（商標））を１０％Ｃｌｏｒｏｘ（商標）で１０分間表面滅菌し、滅菌済み蒸留水で３回すすぐ（この工程中、種子はスチール製ストレーナーに含まれている）。種子を発芽のためにＰｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）（Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）につき２５種子）に含まれている１／２ＭＳカノーラ培地（１／２ＭＳ、２％スクロース、０．８％寒天）に植え、５日間の発芽期間中２５℃、１６時間明および８時間暗の光周期の成長様式設定のＰｅｒｃｉｖａｌ（商標）成長チャンバーに入れた。
【０２６５】
前処理：  ５日目に、長さ約３ｍｍの胚軸切片を無菌的に切除し、残りの根および芽条部分を捨てる（切除工程中に胚軸切片を１０ｍＬの滅菌ｍｉｌｌｉＱ（商標）水中に浸漬することによって胚軸切片の乾燥を防ぐ）。胚軸切片は、２２〜２３℃および１６時間明、８時間暗の光周期の成長様式設定のＰｅｒｃｉｖａｌ（商標）成長チャンバー内のカルス誘導培地ＭＳＫ１Ｄ１（ＭＳ、１ｍｇ／Ｌキネチン、１ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３．０％スクロース、０．７％フィトアガー）上の滅菌済みろ紙上に３日間の前処理期間中に水平にのせる。
【０２６６】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）との共培養：  アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養の前日に、適切な抗生物質を含むＹＥＰ培地のフラスコにバイナリープラスミドを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株を接種する。胚軸切片をろ紙カルス誘導培地ＭＳＫ１Ｄ１から胚軸切片の乾燥を防ぐための１０ｍＬの液体Ｍ培地を含む空の１００×２５ｍｍ  Ｐｅｔｒｉ（商標）皿に移す。この段階ではスパチュラを用いて切片をすくい上げ、切片を新しい培地に移す。液体Ｍ培地をピペットで除去し、４０ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液をＰｅｔｒｉ（商標）皿に加える（５００切片と４０ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液）。胚軸切片がアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液中に浸ったままであるようにＰｅｔｒｉ（商標）皿を定期的に旋回しながら胚軸切片を３０分間処理する。処理期間の終了時に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を廃棄物ビーカー中にピペットで移し、高圧滅菌し、廃棄する（アグロバクテリウム（Agrobacterium）の異常増殖を防ぐためにアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を完全に除去する。処理済み胚軸を鉗子でろ紙で覆った（切片が乾燥しないように注意を払う）ＭＳＫ１Ｄ１培地を含む最初のプレートに移して戻す。形質転換胚軸切片および非形質転換対照胚軸切片を低光度下（プレートをアルミニウムフォイルで覆うことにより）のＰｅｒｃｉｖａｌ（商標）成長チャンバーに戻し、処理胚軸切片をアグロバクテリウム（Agrobacterium）と３日間共培養する。
【０２６７】
選択培地上のカルス誘導：  ３日間の共培養の後、胚軸切片を２２〜２６℃に設定した成長様式のカルス誘導培地ＭＳＫ１Ｄ１Ｈ１（ＭＳ、１ｍｇ／Ｌキネチン、１ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ（商標）、２００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、１ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、３％スクロース、０．７％フィトアガー）上に鉗子で個別に移す。胚軸切片を培地上に固定するが、培地に深く埋め込まない。
【０２６８】
選択および芽条再生：  カルス誘導培地上７日後に、カルス性胚軸切片を選択により芽条再生培地１  ＭＳＢ３Ｚ１Ｈ１（ＭＳ、３ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１ｍｇ／Ｌゼアチン、０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ（商標）、２００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、１ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、３％スクロース、０．７％フィトアガー）に移す。１４日後に、芽条を発生している胚軸切片を選択を強化して２２〜２６℃に設定した成長様式の再生培地２  ＭＳＢ３Ｚ１Ｈ３（ＭＳ、３ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１ｍｇ／Ｌゼアチン、０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、３００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ（商標）、２００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、３ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、３％スクロース、０．７％フィトアガー）に移す。
【０２６９】
芽条伸長：  １４日後に、芽条を発生している胚軸切片を再生培地２から２２〜２６℃に設定した成長様式の芽条伸長培地ＭＳＭＥＳＨ５（ＭＳ、３００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ（商標）、５ｍｇ／Ｌ  Ｈｅｒｂｉａｃｅ（商標）、２％スクロース、０．７％  ＴＣ寒天）に移す。既に伸長している芽条は、胚軸切片から単離し、ＭＳＭＥＳＨ５に移した。１４日後に芽条伸長培地上の第１ラウンドの培養で伸長しなかった残りの芽条は、新鮮な芽条伸長培地ＭＳＭＥＳＨ５に移す。この段階で芽条を生成しないすべての残りの胚軸切片を廃棄する。
【０２７０】
根誘導：  芽条伸長培地上での１４日間の培養後に、単離芽条を２２〜２６℃での根誘導のためにＭＳＭＥＳＴ培地（ＭＳ、０．５ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、３００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ（商標）、２％スクロース、０．７％  ＴＣ寒天）に移す。ＭＳＭＥＳＴ培地への最初の移しでのインキュベーションの後に根を生成しないあらゆる芽条は、芽条が根を発生するまで、ＭＳＭＥＳＴ培地上の第２または第３ラウンドのインキュベーションのために移す。
【０２７１】
ＰＣＲ解析：  根を含む芽条に再生した形質転換カノーラ胚軸切片をＰＣＲ分子確認アッセイによりさらに解析する。緑芽条から葉組織を採取し、ｐａｔ選択性マーカー遺伝子の存在についてＰＣＲにより試験する。あらゆる萎黄病芽条は、廃棄し、ＰＣＲ解析にかけない。ｐａｔ選択性マーカー遺伝子の存在について陽性と同定される試料は、保持し、ＭＳＭＥＳＴ培地上で培養して、芽条および根の発生および伸長を継続する。ＰＣＲ解析によりｐａｔ選択性マーカー遺伝子を含まず、陰性と同定される試料は、廃棄する。
【０２７２】
ｐａｔ選択性マーカー遺伝子の存在についてＰＣＲ陽性である芽条および根を含む形質転換カノーラ植物は、温室内の土壌に移植する。土壌内のカノーラ植物の樹立後、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）定量的ＰＣＲアッセイおよびサザンブロッティングによりｐａｔ遺伝子発現カセットのコピー数を定量するために、カノーラ植物をさらに解析する。ｐａｔ遺伝子発現カセットの少なくとも１つのコピーを含むことが確認されるトランスジェニックＴ０カノーラ植物は、種子のさらなる解析に進める。これらのトランスジェニックＴ０カノーラ植物から得られた種子、すなわち、Ｔ１カノーラ種子は、標的遺伝子の存在を検出するために解析する。
【０２７３】
本開示は、様々な修正および代替形態を受け入れる余地を有し得るが、特定の実施形態を例として本明細書で詳細に述べた。しかし、本開示は、開示した特定の形態に限定を意図するものではないことを理解すべきである。それどころか、本開示は、以下の添付の特許請求の範囲およびそれらの法定の同等物により規定される本開示の範囲内に入るすべての修正、同等物および代替物を対象として含めるものとする。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2017510246000001.app
【国際調査報告】
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2017510246.tif 000028
2017510246.tif 000029