(57)【要約】細菌病原性因子、例えば、抗生物質耐性もしくはバイオフィルム形成の一因となる遺伝子、または脂肪酸生合成と関連する遺伝子に対して標的化されるアンチセンスモルホリノオリゴマー、ならびに関連する組成物、ならびに、例えば、感染した哺乳動物被験体の処置におけるこれらのオリゴマーおよび組成物を使用する方法を提供する。一局面において、モルホリノサブユニット、および１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に接合するリン含有サブユニット間連結から構成され、かつ（ａ）約１０〜４０個のヌクレオチド塩基、および（ｂ）病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性の標的化配列を有し、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしている、アンチセンスモルホリノオリゴマーが提供される。
2017522044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルホリノサブユニット、および１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に接合するリン含有サブユニット間連結から構成され、かつ（ａ）約１０〜４０個のヌクレオチド塩基、および（ｂ）病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性の標的化配列を有し、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしている、アンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２】
前記アンチセンスモルホリノオリゴマーが、式（Ｉ）：
【化４３】
2017522044.tif 000054
のものまたは薬学的に許容されるその塩であり、
式中、各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｘは、９〜３８の整数であり、
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化４４】
2017522044.tif 000055
の部分から選択され、式中、各Ｒ４は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ５は、電子対およびＨから選択され、Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化４５】
2017522044.tif 000056
の部分から選択され、式中、
Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ８は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ９ＯＨ、アシル、トリチル、および４−メトキシトリチルから選択され、
Ｒ９は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−のものであり、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、ｙ個のアルキル基のそれぞれは、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ１の各実例は、−Ｎ（Ｒ１０）２Ｒ１１であり、式中、各Ｒ１０は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、ステアロイル、および式：
【化４６】
2017522044.tif 000057
の部分から選択され、式中、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、各Ｒ１２は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１４）２のものであり、式中、各Ｒ１４は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２のものであり、
Ｒ３は、電子対、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化４７】
2017522044.tif 000058
のものであり、式中、前記ＣＰＰは、前記ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によって前記リンカー部分に付着しており、ただし、Ｇの１つのみの実例が存在し、
前記標的化配列が、病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項３】
前記標的配列が、前記細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンおよび／または前記細菌ｍＲＮＡの前記翻訳開始コドンの上流または下流の約３０塩基内の配列を含む、請求項２に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項４】
前記病原性因子が、ニューデリーメタロ−ベータ−ラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）および耐性−小結節形成−細胞分裂（ＲＮＤ）型多剤排出ポンプサブユニットＡｄｅＡ（ａｄｅＡ）の少なくとも１つから選択される抗生物質耐性タンパク質であるか、または前記病原性因子が、バイオフィルム形成タンパク質である、請求項２または３に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項５】
前記標的配列が、配列番号１〜４から選択され、ここでチミン塩基（Ｔ）が任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である、請求項４に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項６】
前記標的化配列が、配列番号１１〜１５に記載されているか、配列番号１１〜１５の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含むか、または配列番号１１〜１５と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含み、ここでチミン塩基（Ｔ）が、任意選択でウラシル塩基（Ｕ）である、請求項４に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項７】
前記バイオフィルム形成タンパク質が、ＣｅｐＩまたはＳｕｈＢの少なくとも１つによってコードされる、請求項４に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項８】
前記標的配列が、配列番号５〜９から選択され、ここでチミン塩基（Ｔ）が任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である、請求項７に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項９】
前記標的化配列が、配列番号１６〜２４に記載されているか、配列番号１６〜２４の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含むか、または配列番号１６〜２４と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含み、ここでチミン塩基（Ｔ）が任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である、請求項７に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１０】
前記病原性因子が、脂肪酸生合成と関連するタンパク質である、請求項２または３に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１１】
脂肪酸生合成と関連する前記タンパク質が、アシルキャリアータンパク質である、請求項１０に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１２】
前記アシルキャリアータンパク質が、ＡｃｐＰである、請求項１１に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１３】
前記標的配列が、配列番号１０であり、ここでチミン塩基（Ｔ）が任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である、請求項１２に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１４】
前記標的化配列が配列番号２５〜３７に記載されているか、配列番号２５〜３７の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含むか、または配列番号２５〜３７と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含み、ここでチミン塩基（Ｔ）が任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である、請求項１２に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１５】
Ｔが、
【化４８】
2017522044.tif 000059
から選択される、請求項１に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１６】
Ｒ２が、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される、請求項１または１５に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１７】
Ｔが、
【化４９】
2017522044.tif 000060
から選択され、そして
Ｒ２が、Ｇである、請求項１に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１８】
Ｔが、式：
【化５０】
2017522044.tif 000061
のものであり、Ｒ６が、式：
【化５１】
2017522044.tif 000062
のものであり、そしてＲ２が、Ｇである、請求項１に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項１９】
Ｔが、式：
【化５２】
2017522044.tif 000063
のものであり、そしてＲ２が、Ｇである、請求項１に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２０】
Ｔが、式：
【化５３】
2017522044.tif 000064
のものである、請求項１に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２１】
Ｒ２が、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される、請求項１または２０に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２２】
Ｒ１の少なくとも１つの実例が、−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項１または１５から２１のいずれか一項に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２３】
各Ｒ１が、−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項２２に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２４】
前記ＣＰＰが、
【化５４】
2017522044.tif 000065
から選択され、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される、請求項１および１５から２３のいずれか一項に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２５】
Ｇが、
【化５５】
2017522044.tif 000066
から選択され、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される、請求項１または１５から２３のいずれか一項に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２６】
前記アンチセンスオリゴマーが、
【化５６】
2017522044.tif 000067
【化５７】
2017522044.tif 000068
【化５８】
2017522044.tif 000069
から選択される式（ＶＩＩ）のもの、または上記のいずれかの薬学的に許容される塩であり、
式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒｂは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、および４−メトキシトリチルから選択され、そしてＸおよびＮｕは、請求項１で定義された通りである、請求項１に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２７】
Ｒａが、アセチルであり、そしてＲｂが、Ｈである、請求項２６に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２８】
前記標的化配列が、
ａ）配列番号１１（ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣ）；
ｂ）配列番号１２（ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＴＣ）；
ｃ）配列番号１３（ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＴＴ）；
ｄ）配列番号１４（ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＡＴ）；
ｅ）配列番号１５（ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＡＡ）；
から選択され、ここでＸが、９であり、チミン塩基（Ｔ）が、ウラシル塩基（Ｕ）であり得る、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項２９】
前記標的化配列が、
ａ）配列番号１６（ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴ）；
ｂ）配列番号１７（ＴＣＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＴＧ）；
ｃ）配列番号１８（ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＣＣ）；
ｄ）配列番号１９（ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＡＧ）；
ｅ）配列番号２０（ＣＧＴ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＡＣ）；
ｆ）配列番号２１（ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＣＣ）；
ｇ）配列番号２２（ＣＴＴ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＣ）；
ｈ）配列番号２３（ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＣ）；および
ｉ）配列番号２４（ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＡＧ）、
から選択され、ここでＸが、９であり、チミン塩基（Ｔ）が、ウラシル塩基（Ｕ）であり得る、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項３０】
前記標的化配列が、
ａ）配列番号２５（ＧＴＣＣＡＴＴＡＣＣＣ）；
ｂ）配列番号２６（ＣＡＴＴＡＣＣＣＣＴＣ）；
ｃ）配列番号２７（ＣＣＡＴＴＡＣＣＣＣＴ）；
ｄ）配列番号２８（ＴＣＣＡＴＴＡＣＣＣＣ）；
ｅ）配列番号２９（ＴＧＴＣＣＡＴＴＡＣＣ）；
ｆ）配列番号３０（ＴＴＧＴＣＣＡＴＴＡＣ）；
ｇ）配列番号３１（ＧＴＴＧＴＣＣＡＴＴＡ）；
ｈ）配列番号３２（ＴＧＴＴＧＴＣＣＡＴＴ）；
ｉ）配列番号３３（ＡＴＧＴＴＧＴＣＣＡＴ）；
ｊ）配列番号３４（ＴＴＴＡＣＡＡＧＴＧＣ）；
ｋ）配列番号３５（ＣＣＴＣＣＧＡＧＧＧＡ）；
ｌ）配列番号３６（ＡＣＡＣＧＴＴＧＴＴＣ）；および
ｍ）配列番号３７（ＡＧＴＴＣＡＧＣＧＡＣ）、
から選択され、ここでｘが、９であり、チミン塩基（Ｔ）が、ウラシル塩基（Ｕ）であり得る、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のアンチセンスモルホリノオリゴマー。
【請求項３１】
薬学的に許容される担体およびアンチセンスモルホリノオリゴマーを含む医薬組成物であって、前記アンチセンスモルホリノオリゴマーが、モルホリノサブユニット、および１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に接合するリン含有サブユニット間連結から構成され、かつ（ａ）約１０〜４０個のヌクレオチド塩基、および（ｂ）病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性の標的化配列を有し、前記オリゴマーが、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしている、医薬組成物。
【請求項３２】
前記アンチセンスモルホリノオリゴマーが、式（Ｉ）：
【化５９】
2017522044.tif 000070
のものまたは薬学的に許容されるその塩であり、
式中、各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｘは、９〜３８の整数であり、
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化６０】
2017522044.tif 000071
の部分から選択され、式中、各Ｒ４は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ５は、電子対およびＨから選択され、Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化６１】
2017522044.tif 000072
の部分から選択され、式中、
Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ８は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ９ＯＨ、アシル、トリチル、および４−メトキシトリチルから選択され、
Ｒ９は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−のものであり、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、ｙ個のアルキル基のそれぞれは、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ１の各実例は、−Ｎ（Ｒ１０）２Ｒ１１であり、式中、各Ｒ１０は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、ステアロイル、および式：
【化６２】
2017522044.tif 000073
の部分から選択され、式中、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、各Ｒ１２は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１４）２のものであり、式中、各Ｒ１４は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２のものであり、
Ｒ３は、電子対、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化６３】
2017522044.tif 000074
のものであり、式中、前記ＣＰＰは、前記ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によって前記リンカー部分に付着しており、ただし、Ｇの１つのみの実例が存在し、
前記標的化配列が、病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズする、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記標的配列が、前記細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンおよび／または前記細菌ｍＲＮＡの前記翻訳開始コドンの上流もしくは下流の約３０塩基内の配列を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記標的化配列が、配列番号１１〜１５に記載されているか、配列番号１１〜１５の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含むか、または配列番号１１〜１５と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含み、ここでチミン塩基（Ｔ）が任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記標的化配列が、配列番号１６〜２４に記載されているか、配列番号１６〜２４の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含むか、または配列番号１６〜２４と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含み、ここでチミン塩基（Ｔ）が任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記標的化配列が、配列番号２５〜３７に記載されているか、配列番号２５〜３７の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含むか、または配列番号２５〜３７と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含み、ここでチミン塩基（Ｔ）が任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
細菌中の病原性因子の発現および活性を低減させる方法であって、前記方法は、前記細菌とアンチセンスモルホリノオリゴマーとを接触させるステップを含み、前記アンチセンスモルホリノオリゴマーは、モルホリノサブユニット、および１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に接合するリン含有サブユニット間連結から構成され、かつ（ａ）約１０〜４０個のヌクレオチド塩基、および（ｂ）病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性の標的化配列を有し、前記オリゴマーは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしている、方法。
【請求項３８】
前記アンチセンスモルホリノオリゴマーが、式（Ｉ）：
【化６４】
2017522044.tif 000075
のものまたは薬学的に許容されるその塩であり、
式中、各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｘは、９〜３８の整数であり、
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化６５】
2017522044.tif 000076
の部分から選択され、式中、各Ｒ４は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ５は、電子対およびＨから選択され、Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化６６】
2017522044.tif 000077
の部分から選択され、式中、
Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ８は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ９ＯＨ、アシル、トリチル、および４−メトキシトリチルから選択され、
Ｒ９は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−のものであり、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、ｙ個のアルキル基のそれぞれは、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ１の各実例は、−Ｎ（Ｒ１０）２Ｒ１１であり、式中、各Ｒ１０は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、ステアロイル、および式：
【化６７】
2017522044.tif 000078
の部分から選択され、式中、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、各Ｒ１２は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１４）２のものであり、式中、各Ｒ１４は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２のものであり、
Ｒ３は、電子対、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化６８】
2017522044.tif 000079
のものであり、式中、前記ＣＰＰは、前記ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によって前記リンカー部分に付着しており、ただし、Ｇの１つのみの実例が存在し、
前記標的化配列が、前記病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌が、被験体中にあり、前記方法が、前記アンチセンスモルホリノオリゴマーを前記被験体に投与するステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａの属から選択される、請求項３７または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり、前記病原性因子が、ＮＤＭ−１およびａｄｅＡの１つまたは複数から選択される抗生物質耐性タンパク質である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記細菌が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）であり、前記病原性因子が、ｃｅｐＩおよびｓｕｈＢの１つまたは複数によってコードされるバイオフィルム形成タンパク質である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記細菌が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）であり、前記病原性因子が、ａｃｐＰによってコードされるアシルキャリアータンパク質である、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７５０号、２０１４年１２月３１日に出願された米国出願第６２／０９９，０４６号および２０１５年３月６日に出願された米国出願第６２／１２９，７４６号（これらの各々は、それらの全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供し、参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＳＡＴＨ−００３＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約１０ＫＢであり、２０１５年５月１５日に作製され、ＥＦＳ−ウェブによって電子的に提出されている。
【０００３】
本開示は、細菌病原性因子、例えば、抗生物質耐性、バイオフィルム形成または脂肪酸生合成の一因となる遺伝子に対して標的化されるアンチセンスモルホリノオリゴマー、ならびに関連する組成物、ならびに、例えば、感染した哺乳動物被験体の処置におけるオリゴマーおよび組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
現在、細菌病原体に対する使用におけるいくつかのタイプの抗生物質化合物が存在し、これらの化合物は種々の抗細菌機序によって作用する。例えば、ベータ−ラクタム系抗生物質、例えば、ペニシリンおよびセファロスポリンは、ペプチドグリカン合成における最終ステップを阻害するように作用する。バンコマイシンおよびテイコプラニン（ｔｅｉｃｈｏｐｌａｎｉｎ）を含めたグリコペプチド系抗生物質は、ムラミル−ペンタペプチドのグリコシル基転移およびペプチド転移の両方を阻害し、ペプチドグリカン合成を再び妨げる。他の周知の抗生物質は、細菌ＤＮＡ複製を阻害するキノロン、細菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤、例えば、リファンピン、およびスルホンアミドを含めた、テトラヒドロフォレートの産生のための経路における酵素の阻害剤を含む。
【０００５】
一部のクラスの抗生物質は、タンパク質合成のレベルにおいて作用する。これらの中で注目すべきであるのは、アミノグリコシド、例えば、カナマイシンおよびゲンタマイシンである。このクラスの化合物は、細菌３０Ｓリボソームサブユニットを標的化し、５０Ｓサブユニットとの会合を防止し、機能的リボソームを形成する。別の重要なクラスの抗生物質であるテトラサイクリンはまた、３０Ｓリボソームサブユニットを標的化し、対応するｍＲＮＡコドンとのアミノアシル化したｔＲＮＡのアラインメントを防止することによって作用する。別のクラスの抗生物質であるマクロライドおよびリンコサミドは、５０Ｓリボソームサブユニットに結合し、ペプチド伸長を阻害するか、またはリボソームトランスロケーションを防止することによって、細菌合成を阻害する。
【０００６】
抗生物質による細菌感染を制御または排除することにおける目覚ましい成功に関わらず、ヒトへの薬、ならびに家禽および家畜の生産における飼料の栄養補助剤としての両方における抗生物質の広範な使用は、多くの病原性細菌における薬物耐性をもたらしてきた。抗生物質耐性機序は、種々の形態をとることができる。特に、グラム陰性菌における、ベータラクタムに対する耐性の主要な機序の１つは、ラクタム環を切断することによって抗生物質を不活性とする酵素ベータ−ラクタマーゼである。同様に、アミノグリコシドに対する耐性は、この場合は、ホスホリル、アデニル、またはアセチル基を加えることによって、抗生物質を不活性化することができる酵素が関与することが多い。抗生物質の能動排出は、多くの細菌が耐性を発生させる別の方法である。テトラサイクリン排出について排出タンパク質をコードする遺伝子、例えば、ｔｅｔＡ、ｔｅｔＧ、ｔｅｔＬ、およびｔｅｔＫ遺伝子は同定されている。細菌標的は、薬物の標的を変化させることによって耐性を発生し得る。例えば、多くのベータ−ラクタム耐性菌におけるいわゆるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は、標的タンパク質への重大な抗生物質結合を阻害するように変化する。テトラサイクリンに対する耐性は、排出が増進されることに加えて、抗生物質への結合についてリボソームと競合することができる細胞質タンパク質の出現が関与し得る。細菌酵素を阻害することによって作用するこれらの抗生物質、例えばスルホンアミドについて、標的酵素における点変異は耐性を与え得る。
【０００７】
バイオフィルム形成はまた、他の臨床上の困難の中でも抗生物質耐性をもたらし得る。典型的には、細菌が感染した宿主内でバイオフィルムを形成する状況において、感染症は処置不能となり、慢性状態へと発達し得る。慢性バイオフィルムをベースとする感染症の顕著な特徴は、抗生物質処置および多くの他の通常の抗微生物剤に対する耐性だけでなく、宿主防御を逃れる能力も含む。したがって、バイオフィルムを防止または崩壊させる戦略は、治療上の目的であり、治療的に有効であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
多剤耐性（ＭＤＲ）が関与する場合を含めた多くの病原性細菌における抗生物質耐性の出現は、多くの細菌病原体が医学的介入によって単純に処置不能であった抗生物質後の時代の恐怖を増加させる。このように、（ｉ）細菌感染の抗生物質処置を現在妨害している主要なタイプの抗生物質耐性に供されない、（ｉｉ）急速におよび標的細菌特異性に関して妥当な程度の予測性を伴って開発することができ、（ｉｉｉ）低用量において有効であり、かつ（ｉｖ）副作用をほとんど示さない抗微生物剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示の実施形態は部分的に、細菌病原性因子のアンチセンス標的化が、とりわけ、そうでなければ抗生物質耐性である病原性細菌の抗生物質感受性を増加させ、ある特定の病原性細菌が、処置困難なバイオフィルムを形成および維持する能力を低減させることができるという発見に関する。例えば、抗生物質耐性遺伝子のアンチセンス標的化、例えば、カルバペネマーゼおよび排出ポンプは、多くの一般に使用される抗生物質に対する抗生物質耐性（例えば、多剤耐性）細菌の感受性を増加させ、例えば、抗生物質と組み合わせて、このような細菌の処置において有用性を見出すことができたことが示された。また、バイオフィルム形成と関連する遺伝子のアンチセンス標的化は、現存するバイオフィルムを崩壊させ、新たなバイオフィルムの産生を低減させることが示された。このようなアンチセンス標的化は、例えば、抗生物質に対するバイオフィルム形成細菌の感受性を増加させる、バイオフィルム形成細菌に対する単独型療法において、および併用療法として有用性を見出すことができた。
【００１０】
したがって、本開示の実施形態は、モルホリノサブユニット、および１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に接合するリン含有サブユニット間連結から構成され、かつ（ａ）約１０〜４０個のヌクレオチド塩基、および（ｂ）病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性の標的化配列を有する実質的に非荷電のアンチセンスモルホリノオリゴマーを含み、オリゴマーは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしている。
【００１１】
ある特定の実施形態では、標的配列は、細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンおよび／または細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの上流もしくは下流の約３０塩基内の配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、病原性因子は、抗生物質耐性タンパク質、バイオフィルム形成タンパク質または脂肪酸生合成と関連するタンパク質である。
【００１３】
ある特定の実施形態では、抗生物質耐性タンパク質は、ニューデリーメタロ−ベータ−ラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）および耐性−小結節形成−細胞分裂（ＲＮＤ）型多剤排出ポンプサブユニットＡｄｅＡ（ａｄｅＡ）の１つまたは複数から選択される。具体的な実施形態では、標的配列は、表１Ａから選択される。一部のアンチセンスオリゴマーは、表２Ａに記載されている標的化配列、表２Ａにおける標的化配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメント、または表２Ａにおける標的化配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【００１４】
一部の実施形態では、バイオフィルム形成タンパク質は、ｃｅｐＩまたはｓｕｈＢの１つまたは複数によってコードされる。特定の実施形態では、標的配列は、表１Ｂから選択される。一部のアンチセンスオリゴマーは、表２Ｂに記載されている標的化配列、表２Ｂにおける標的化配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメント、または表２Ｂにおける標的化配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【００１５】
一部の実施形態では、脂肪酸生合成と関連するタンパク質は、ａｃｐＰの１つまたは複数によってコードされるアシルキャリアータンパク質である。特定の実施形態では、標的配列は、表１Ｃから選択される。一部のアンチセンスオリゴマーは、表２Ｃに記載されている標的化配列、表２Ｃにおける標的化配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメント、または表２Ｃにおける標的化配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【００１６】
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスモルホリノオリゴマーは、式（Ｉ）：
【化１】
2017522044.tif 000003
のもの、または薬学的に許容されるその塩であり得、
式中、各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｘは、９〜３８の整数であり、
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化２】
2017522044.tif 000004
の部分から選択され、式中、各Ｒ４は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ５は、電子対およびＨから選択され、Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化３】
2017522044.tif 000005
の部分から選択され、式中、
Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ８は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ９ＯＨ、アシル、トリチル、および４−メトキシトリチルから選択され、
Ｒ９は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−のものであり、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基のそれぞれは、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ１の各実例は、−Ｎ（Ｒ１０）２Ｒ１１であり、式中、各Ｒ１０は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、ステアロイル、および式：
【化４】
2017522044.tif 000006
の部分から選択され、式中、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、各Ｒ１２は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１４）２のものであり、式中、各Ｒ１４は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２のものであり、
Ｒ３は、電子対、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化５】
2017522044.tif 000007
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によってリンカー部分に付着しており、ただし、Ｇの１つのみの実例が存在し、
標的化配列は、病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズする。
【００１７】
ある特定の実施形態では、ＣＰＰは、アルギニンに富んだペプチドである。ある特定の実施形態では、ＣＰＰは、表１Ｃから選択される。
【００１８】
また含まれるのは、細菌（複数可）と本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーとを接触させることを含む、細菌（複数可）において病原性因子の発現および活性を低減させる方法である。
【００１９】
一部の実施形態では、細菌は、被験体中にあり、方法は、アンチセンスオリゴマーを被験体に投与することを含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａの属から選択される。ある特定の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群（ｃｏｍｐｌｅｘ））である。ある特定の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり、病原性因子は、ＮＤＭ−１およびＡｄｅＡの１つまたは複数から選択される抗生物質耐性タンパク質である。
【００２１】
一部の実施形態では、細菌は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）であり、病原性因子は、ｃｅｐＩおよびｓｕｈＢの１つまたは複数によってコードされるバイオフィルム形成タンパク質である。ある特定の実施形態では、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｄｏｌｏｓａ、および／またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーの投与は、バイオフィルムの形成または現存するバイオフィルムを少なくとも約１０％低減させる。ある特定の実施形態では、被験体は、免疫無防備状態であり、根底にある肺疾患を有する。具体的な実施形態では、被験体は、嚢胞性線維症（ＣＦ）または慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）を有する。
【００２２】
一部の実施形態では、細菌は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）であり、病原性因子は、ａｃｐＰの１つまたは複数によってコードされる、脂肪酸生合成と関連するアシルキャリアータンパク質である。ある特定の実施形態では、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｄｏｌｏｓａ、および／またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーの投与は、バイオフィルムの形成または現存するバイオフィルムを少なくとも約１０％低減させる。ある特定の実施形態では、被験体は、免疫無防備状態であり、根底にある肺疾患を有する。具体的な実施形態では、被験体は、嚢胞性線維症（ＣＦ）または慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）を有する。
【００２３】
一部の方法は、オリゴマーを抗微生物剤と別々または同時に投与することを含み、例えば、オリゴマーの投与は、抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる。一部の方法は、エアゾール化によってオリゴマーを投与することを含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり、病原性因子は、ＮＤＭ−１であり、抗微生物剤は、カルバペネムである。ある特定の実施形態では、カルバペネムは、メロペネム、イミペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム、ビアペネム、ラズペネム、テビペネム、レナペネム、およびトモペネム（ｔｏｍｏｐｅｎｅｍ）の１つまたは複数から選択される。
【００２５】
一部の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり、病原性因子は、ＡｄｅＡであり、抗微生物剤は、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、およびβ−ラクタム系抗生物質の１つまたは複数から選択される。ある特定の実施形態では、アミノグリコシドは、トブラマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシンａ、アミカシン、ジベカシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、ネオマイシンＣ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）、およびストレプトマイシンの１つまたは複数から選択される。ある特定の実施形態では、テトラサイクリン系抗生物質は、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、およびドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｌｉｎｅ）の１つまたは複数から選択される。ある特定の実施形態では、β−ラクタム系抗生物質は、カルバペネム、ペニシリン誘導体（ペナム）、セファロスポリン（セフェム）、およびモノバクタムの１つまたは複数から選択される。
【００２６】
ある特定の実施形態では、細菌は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）であり、病原性因子は、ｃｅｐＩまたはｓｕｈＢの１つまたは複数によってコードされるバイオフィルム形成タンパク質であり、抗微生物剤は、セフタジジム、ドキシサイクリン、ピペラシリン、メロペネム、クロラムフェニコール、およびコトリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）の１つまたは複数から選択される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、細菌は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）であり、病原性因子は、ａｃｐＰの１つまたは複数によってコードされる、脂肪酸生合成と関連するアシルキャリアータンパク質であり、抗微生物剤は、セフタジジム、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、ピペラシリン、メロペネム、クロラムフェニコール、およびコトリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）の１つまたは複数から選択される。
【００２８】
一部の実施形態では、オリゴマーは、抗微生物剤単独に対して少なくとも約１０％、細菌に対する抗微生物剤の最小発育阻止濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＭＩＣ）を低減させる。ある特定の実施形態では、オリゴマーは、抗微生物剤単独に対して少なくとも約１０％、抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる。
【００２９】
また含まれるのは、本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。ある特定の医薬組成物は、１種または複数の抗微生物剤をさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】図１Ａは、ホスホロジアミデート連結を有する例示的なモルホリノオリゴマー構造を示す。図１Ｂ〜Ｅは、Ｂ〜Ｅと示される例示的なモルホリノオリゴマーの繰返しサブユニットセグメントを示す。図１Ｆ〜Ｈは、例示的なＰＰＭＯにおいて使用される例示的なペプチドＰＭＯコンジュゲート構造を示す。
【図１−２】図１Ａは、ホスホロジアミデート連結を有する例示的なモルホリノオリゴマー構造を示す。図１Ｂ〜Ｅは、Ｂ〜Ｅと示される例示的なモルホリノオリゴマーの繰返しサブユニットセグメントを示す。図１Ｆ〜Ｈは、例示的なＰＰＭＯにおいて使用される例示的なペプチドＰＭＯコンジュゲート構造を示す。
【００３１】
【図２】図２は、ａｄｅＡに対して標的化されるＰＰＭＯによるＡｄｅＡ（排出ポンプ）を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉの処置が、アミノグリコシド系抗生物質であるゲンタマイシンのＭＩＣを有意に低減させたことを示す。
【００３２】
【図３】図３は、ａｄｅＡに対して標的化されるＰＰＭＯによるＡｄｅＡを発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉの処置が、アミノグリコシド系抗生物質であるトブラマイシンのＭＩＣを有意に低減させたことを示す。
【００３３】
【図４】図４は、ａｄｅＡに対して標的化されるＰＰＭＯによるＡｄｅＡを発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉの処置が、テトラサイクリンのＭＩＣを有意に低減させたことを示す。
【００３４】
【図５Ａ】図５Ａは、ＮＤＭ−１に対して標的化されるＰＰＭＯによるＮＤＭ−１を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉの処置が、カルバペネム系抗生物質であるメロペネムのＭＩＣを有意に低減させたことを示す。図５Ｂは、ＮＤＭ−１に対して標的化されるＰＰＭＯおよびメロペネムが、ＮＤＭ−１を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を相乗的に低減させたことを示す。
【図５Ｂ】図５Ａは、ＮＤＭ−１に対して標的化されるＰＰＭＯによるＮＤＭ−１を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉの処置が、カルバペネム系抗生物質であるメロペネムのＭＩＣを有意に低減させたことを示す。図５Ｂは、ＮＤＭ−１に対して標的化されるＰＰＭＯおよびメロペネムが、ＮＤＭ−１を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を相乗的に低減させたことを示す。
【００３５】
【図６】図６は、ＮＤＭ−１に対して標的化されるＰＰＭＯによるＮＤＭ−１を発現しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの処置が、カルバペネム系抗生物質であるメロペネムのＭＩＣを有意に低減させたことを示す。
【００３６】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、ａｃｐＰ、ｓｕｈＢまたはｃｅｐＩに対して標的化されるＰＰＭＯによるバイオフィルム形成Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａの処置が、バイオフィルムの形成を撹乱するだけでなく（７Ａ；ＰＰＭＯをバイオフィルム形成の前に加え、４８時間インキュベートした）、確立したバイオフィルムを崩壊させたことを示す（７Ｂ；ＰＰＭＯとの４８時間のインキュベーションの前に、バイオフィルムを４８時間成長させた）。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、ａｃｐＰ、ｓｕｈＢまたはｃｅｐＩに対して標的化されるＰＰＭＯによるバイオフィルム形成Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａの処置が、バイオフィルムの形成を撹乱するだけでなく（７Ａ；ＰＰＭＯをバイオフィルム形成の前に加え、４８時間インキュベートした）、確立したバイオフィルムを崩壊させたことを示す（７Ｂ；ＰＰＭＯとの４８時間のインキュベーションの前に、バイオフィルムを４８時間成長させた）。
【００３７】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、蛍光を発現しているＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａを使用し、共焦点顕微鏡を利用した、ＭＢＥＣペグ上のバイオフィルム形成の低減を視覚的に示す。図８Ａは、４８時間における未処置のバイオフィルムを示し、図８Ｂは、１０μＭのスクランブルＰＰＭＯ対照で処置された４８時間のバイオフィルムを示し、図８Ｃは、１０μＭのｃｅｐＩ標的化ＰＰＭＯで処置された４８時間のバイオフィルムを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、蛍光を発現しているＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａを使用し、共焦点顕微鏡を利用した、ＭＢＥＣペグ上のバイオフィルム形成の低減を視覚的に示す。図８Ａは、４８時間における未処置のバイオフィルムを示し、図８Ｂは、１０μＭのスクランブルＰＰＭＯ対照で処置された４８時間のバイオフィルムを示し、図８Ｃは、１０μＭのｃｅｐＩ標的化ＰＰＭＯで処置された４８時間のバイオフィルムを示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、蛍光を発現しているＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａを使用し、共焦点顕微鏡を利用した、ＭＢＥＣペグ上のバイオフィルム形成の低減を視覚的に示す。図８Ａは、４８時間における未処置のバイオフィルムを示し、図８Ｂは、１０μＭのスクランブルＰＰＭＯ対照で処置された４８時間のバイオフィルムを示し、図８Ｃは、１０μＭのｃｅｐＩ標的化ＰＰＭＯで処置された４８時間のバイオフィルムを示す。
【００３８】
【図９】図９は、ｃｅｐＩ  ＰＰＭＯおよびアミノグリコシド系抗生物質であるトブラマイシンが、バイオフィルム生物負荷量を低減させることにおいて相乗的であることを示す。
【００３９】
【図１０】図１０は、表２Ｃにおいて列挙したものを含めた、様々なＰＰＭＯについての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値のヒートマップを示す。ＰＰＭＯを、様々なレベルの抗生物質耐性を有する３９のＢｃｃ臨床分離株のパネルに対して試験した。
【００４０】
【図１１】図１１は、ＰＰＭＯがＢｃｃにおいて殺菌性であることを示す。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａの２つの異なる分離株を、異なるａｃｐＰ  ＰＰＭＯの存在下または非存在下で２４時間インキュベートした。３つのａｃｐＰ  ＰＰＭＯすべては、臨床ＣＦ分離株Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｋ５６−２（パネルＡ）において成長の有意な低減をもたらし、この効果はまた、汎耐性株Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  ＨＩ４２７７について見られた（パネルＢ）。
【００４１】
【図１２】図１２は、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯが、人工のＣＦ痰においてＢｃｃ成長を阻害することを示す。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｋ５６−２を、単独で、または１０μＭもしくは２０μＭの濃度でのスクランブル配列（Ｓｃｒ）プラセボＰＰＭＯもしくはａｃｐＰ  ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ＃１５、表２Ｃ）のいずれかの存在下でインキュベートした。培地またはＰＰＭＯを、２、８および１２時間において投与した。試料を２４時間においてプレーティングし、ＣＦＵ／ｍｌを決定した。
【００４２】
【図１３】図１３は、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯがＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５においてバイオフィルム形成を防止することを示す。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５を、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯ（１０μＭ）、スクランブルＰＰＭＯ（１０μＭ）、ペプチドまたは培地単独のいずれかの存在下で、ＭＢＥＣバイオフィルムアッセイプレートを利用して４８時間成長させた。バイオフィルム産生は、クリスタルバイオレット法を利用して測定した。
【００４３】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃは、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯが現存するＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを崩壊させることができることを示す。ｄｓＲｅｄを発現しているＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５を、ＭＢＥＣペグ上で４８時間成長させた。ペグを、ＰＰＭＯなし、１０μＭの濃度のスクランブル（Ｓｃｒ）対照ＰＰＭＯ、または１０μＭの濃度のａｃｐＰ  ＰＰＭＯのいずれかを含有する新鮮な培地に移動した。ＭＢＥＣペグをさらに４８時間インキュベートし、次いで、バイオフィルムについて蛍光緑色のピーナッツ−アグルチニン染料で染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。ＰＰＭＯなし（図１４Ａ）またはＳｃｒ  ＰＰＭＯ（図１４Ｂ）は、厚いバイオフィルムを示す一方で、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯ処置したペグ（図１４Ｃ）は、目に見えない生物のポケットを有するバイオフィルムを示した。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｃは、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯが現存するＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを崩壊させることができることを示す。ｄｓＲｅｄを発現しているＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５を、ＭＢＥＣペグ上で４８時間成長させた。ペグを、ＰＰＭＯなし、１０μＭの濃度のスクランブル（Ｓｃｒ）対照ＰＰＭＯ、または１０μＭの濃度のａｃｐＰ  ＰＰＭＯのいずれかを含有する新鮮な培地に移動した。ＭＢＥＣペグをさらに４８時間インキュベートし、次いで、バイオフィルムについて蛍光緑色のピーナッツ−アグルチニン染料で染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。ＰＰＭＯなし（図１４Ａ）またはＳｃｒ  ＰＰＭＯ（図１４Ｂ）は、厚いバイオフィルムを示す一方で、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯ処置したペグ（図１４Ｃ）は、目に見えない生物のポケットを有するバイオフィルムを示した。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｃは、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯが現存するＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを崩壊させることができることを示す。ｄｓＲｅｄを発現しているＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５を、ＭＢＥＣペグ上で４８時間成長させた。ペグを、ＰＰＭＯなし、１０μＭの濃度のスクランブル（Ｓｃｒ）対照ＰＰＭＯ、または１０μＭの濃度のａｃｐＰ  ＰＰＭＯのいずれかを含有する新鮮な培地に移動した。ＭＢＥＣペグをさらに４８時間インキュベートし、次いで、バイオフィルムについて蛍光緑色のピーナッツ−アグルチニン染料で染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。ＰＰＭＯなし（図１４Ａ）またはＳｃｒ  ＰＰＭＯ（図１４Ｂ）は、厚いバイオフィルムを示す一方で、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯ処置したペグ（図１４Ｃ）は、目に見えない生物のポケットを有するバイオフィルムを示した。
【００４４】
【図１５】図１５は、ＰＰＭＯのエアゾール送達が、肺感染モデルにおけるＢ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓの負荷量を低減させることを示す。慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）マウスを、Ｂｃｃ感染モデルとして使用した。Ａｅｒｏｇｅｎネブライザーを使用して、感染６時間後の１回の用量としてスクランブル（Ｓｃｒ）ＰＰＭＯ（３００μｇ）またはａｃｐＰ  ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ＃１５、表２Ｃ、３００μｇもしくは３０μｇ）のいずれかを送達した。感染の２４時間後にマウスを安楽死させ、肺負荷量をＣＦＵ／ｇとして決定した。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
他に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等な任意の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本開示の目的のために、下記の用語を下で定義する。
【００４６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）の、冠詞の文法上の目的を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つ超の要素を意味する。
【００４７】
「約」は、参照の含量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さと、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％ほど変化する、含量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
【００４８】
「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のためのコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。対照的に、用語「非コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のためのコードに直接寄与しない任意の核酸配列を指す。
【００４９】
本明細書を通じて、文脈上他に要求されない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、表示されたステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群を含むことを暗示するが、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の除外することを暗示しないと理解される。
【００５０】
「からなる」は、語句「からなる」に続くいかなるものを含み、これらに限定されることを意味する。このように、語句「からなる」は、列挙された要素が必要とされるか、または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」は、語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙された要素について本開示において特定される活性もしくは作用を妨げないか、またはこれの一因とならない他の要素に限定されることを意味する。このように、語句「から本質的になる」は、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、他の要素が列挙された要素の活性または作用に物質的に影響を与えるかどうかによって、存在してもしなくてもよいことを示す。
【００５１】
本明細書において使用する場合、用語「細胞を接触させること」、「導入すること」または「送達すること」は、当技術分野で通例の方法、例えば、トランスフェクション（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン）、電気穿孔法（例えば、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ））、マイクロインジェクション、形質転換、および投与による細胞中への本開示のオリゴマーの送達を含む。
【００５２】
用語「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）または「細胞の取込みを増進するペプチド部分」は互換的に使用され、「輸送ペプチド」、「担体ペプチド」、または「ペプチド形質導入ドメイン」とも称されるカチオン性細胞透過性ペプチドを指す。一部の態様では、ペプチドは、所与の集団の細胞の約または少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の細胞透過を誘発する能力を有し、かつ／または全身的投与の際にｉｎ  ｖｉｖｏでの複数の組織への、または複数の組織内の巨大分子トランスロケーションを可能とする。ＣＰＰの特定の例は、「アルギニンに富んだペプチド」を含む。ＣＰＰは当技術分野において周知であり、例えば、参照によりその全体が組み込まれている米国特許出願第２０１０／００１６２１５号に開示されている。
【００５３】
「電子対」は、他の原子と結合または共有していない電子の原子価対を指す。
【００５４】
「相同性」は、同一であるか、または保存的置換を構成するアミノ酸の百分率数を指す。相同性は、配列比較プログラム、例えば、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻、３８７〜３９５頁）またはＢＬＡＳＴを使用して決定し得る。このように、本明細書において引用したものと同様または実質的に異なる長さの配列は、アラインメント中へのギャップの挿入によって比較することができたが、このようなギャップは、例えば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【００５５】
「単離した」は、その天然状態で材料に通常付随する構成成分を実質的または本質的に非含有である材料を意味する。例えば、「単離したポリヌクレオチド」または「単離したオリゴマー」は、本明細書において使用する場合、天然に存在する状態でポリヌクレオチドを挟む配列から精製または除去されているポリヌクレオチド、例えば、ゲノム中のフラグメントに隣接する配列から除去されたＤＮＡフラグメントを指し得る。用語「単離すること」は、細胞に関するときに、供給源の被験体（例えば、ポリヌクレオチド反復疾患を有する被験体）からの細胞（例えば、線維芽細胞、リンパ芽球）の精製を指す。ｍＲＮＡまたはタンパク質との関連で、「単離すること」は、供給源、例えば、細胞からのｍＲＮＡまたはタンパク質の回収を指す。
【００５６】
用語「モジュレートする」は、任意選択で明確な量および／または統計的に有意な量だけ、１つまたは複数の定量化できるパラメーターを「増加させる」か、または「減少させる」ことを含む。「増加する」もしくは「増加すること」、「増進する」もしくは「増進すること」または「刺激する」もしくは「刺激すること」は一般に、アンチセンス化合物なしまたは対照化合物のいずれかによってもたらされる応答に対して、１種または複数のアンチセンス化合物または組成物が、細胞または被験体においてより大きな生理学的応答（すなわち、下流効果）を生じさせるか、または引き起こす能力を指す。関連性のある生理学的応答または細胞応答（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの）は、当業者には明らかである。「増加した」または「増進した」量は典型的には、「統計的に有意な」量であり、アンチセンス化合物なし（薬剤が存在しない）または対照化合物によって生成される量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍もしくは５０倍を超える（例えば、５００倍、１０００倍）（すべての整数、およびその間の範囲および１超を含めた、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８）増加を含み得る。用語「低減させる」または「阻害する」は一般に、１種または複数のアンチセンス化合物または組成物が、診断の技術分野における通例の技術によって測定すると、関連性のある生理学的応答または細胞応答、例えば、本明細書に記載されている疾患または状態の症状を「減少させる」能力に関し得る。関連性のある生理学的応答または細胞応答（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの）は当業者には明らかであり、細菌細胞成長の低減、抗微生物剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の低減などを含み得る。応答における「減少」は、アンチセンス化合物なしまたは対照組成物によって生じた応答と比較して「統計的に有意」であってよく、すべての整数およびその間の範囲を含めた、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少を含み得る。
【００５７】
本明細書において使用する場合、「アンチセンスオリゴマー」、「オリゴマー」または「オリゴマー」は、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体の直鎖状配列を指し、これは核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン塩基対合部分）がワトソン−クリック塩基対合によってＲＮＡにおける標的配列とハイブリダイズし、標的配列内でオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成することを可能にする。用語「アンチセンスオリゴマー」、「アンチセンスオリゴマー」、「オリゴマー」および「化合物」は、互換的に使用され、オリゴマーを指し得る。環状サブユニットは、リボースもしくは別のペントース糖、またはある特定の実施形態では、モルホリノ基（下記のモルホリノオリゴマーの記載を参照されたい）をベースとし得る。
【００５８】
用語「オリゴマー」、「オリゴマー」または「アンチセンスオリゴマー」はまた、例えば、その３’末端または５’末端においてオリゴマーにコンジュゲートしている１つまたは複数のさらなる部分を有するオリゴマー、例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー、例えば、溶解度を増進することにおいて有用であり得る１０〜１００個のモノマーサブユニットを有するもの、または標的細菌細胞中への化合物の取込みを増進し、かつ／もしくは細胞内の化合物の活性を増進し、例えば、標的ポリヌクレオチドへのその結合を増進するのに有効な部分、例えば、脂質もしくはペプチド部分を包含する。
【００５９】
「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマーは、体内または細菌細胞内の一般の細胞外および細胞内ヌクレアーゼ（例えば、エクソヌクレアーゼ、例えば、３’−エクソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈによる）によって、非ハイブリダイズ形態またはハイブリダイズ形態で、その骨格がヌクレアーゼ切断に対して実質的に耐性であるものを指し、すなわち、オリゴマーは、オリゴマーが曝露される通常のヌクレアーゼ条件下でヌクレアーゼ切断をほとんど示さないか、ヌクレアーゼ切断を示さない。「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖」は、ヘテロ二重鎖が二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断することができる細胞内および細胞外ヌクレアーゼによるｉｎ  ｖｉｖｏでの分解に対して実質的に耐性であるような、その相補的標的へのアンチセンスオリゴマーの結合によって形成されたヘテロ二重鎖を指す。「ヘテロ二重鎖」は、アンチセンスオリゴマー、および標的ＲＮＡの相補的部分の間の二重鎖を指す。
【００６０】
本明細書において使用する場合、「核酸塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」または「塩基」は、互換的に使用され、天然ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて見出されるプリンまたはピリミジン塩基（ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）、ならびに改善された特性、例えば、オリゴマーへの結合親和性を付与する天然に存在するプリンおよびピリミジンの類似体を指す。例示的な類似体は、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基構成成分）；２，６−ジアミノプリン；５−メチルシトシン；Ｃ５−プロピニル−修飾ピリミジン；９−（アミノエトキシ）フェノキサジン（Ｇ−クランプ）などを含む。
【００６１】
リボース、糖類似体またはモルホリノに共有結合的に連結している核酸塩基は、ヌクレオシドを含む。「ヌクレオチド」は、１個のリン酸基と一緒にヌクレオシドから構成される。リン酸基は、隣接するヌクレオチドを互いに共有結合的に連結し、オリゴマーを形成させる。
【００６２】
オリゴマーが、生理学的条件下で、実質的に４０℃超または４５℃超、好ましくは、少なくとも５０℃、および典型的には、６０℃〜８０℃もしくはそれ超のＴｍで標的とハイブリダイズする場合、オリゴマーは、標的配列と「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所与のイオン強度およびｐＨで、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする温度である。このようなハイブリダイゼーションは、標的配列に対するアンチセンスオリゴマーの「ほとんど」または「実質的な」相補性、および正確な相補性を伴って起こり得る。
【００６３】
本明細書において使用する場合、「十分な長さ」は、細菌ｍＲＮＡ標的配列の領域における、少なくとも約８、より典型的には、約８〜１０、８〜１１、８〜１２、８〜１３、８〜１４、８〜１５、８〜１６、８〜１７、８〜１８、８〜１９、８〜２０、８〜３０、８〜４０、または１０〜１１、１０〜１２、１０〜１３、１０〜１４、１０〜１５、１０〜１６、１０〜１７、１０〜１８、１０〜１９、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０（すべての整数およびその間の範囲を含めた）の連続しているかもしくは連続していない核酸塩基に対して相補的であるアンチセンスオリゴマーを含む。十分な長さのアンチセンスオリゴマーは、細菌ｍＲＮＡ標的の領域と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも最小数のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、十分な長さのオリゴマーは、長さが１０〜４０もしくは１０〜３０ヌクレオチド、例えば、長さが約１０〜１１、１０〜１２、１０〜１３、１０〜１４、１０〜１５、１０〜１６、１０〜１７、１０〜１８、１０〜１９、１０〜２０、１０〜２５、１０〜２８、１０〜３０、１０〜４０、１１〜１２、１１〜１３、１１〜１４、１１〜１５、１１〜１６、１１〜１７、１１〜１８、１１〜１９、１１〜２０、１１〜２５、１１〜２８、１１〜３０、もしくは１１〜４０ヌクレオチド、または長さが約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０ヌクレオチドである。
【００６４】
用語「配列同一性」または、例えば、「と５０％同一の配列」を含むことは、本明細書において使用する場合、配列が、比較のウィンドウにわたり、ヌクレオチドごとにまたはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。このように、「配列同一性の百分率」は、比較のウィンドウにわたり２つの最適に整列した配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列において存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）における位置の総数で除算し、結果を１００で乗じて、配列同一性の百分率を得ることによって計算し得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムのコンピュータ化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または選択した様々な方法のいずれかによって生じさせた検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたる最も高い百分率の相同性をもたらす）によって行い得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９頁、１９９７年によって開示されているようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照し得る。
【００６５】
「被験体」または「それを必要とする被験体」は、哺乳動物被験体、例えば、ヒト被験体を含む。
【００６６】
用語「ＴＥＧ」、「ＥＧ３」または「トリエチレングリコールテール」は、例えば、その３’末端または５’末端においてオリゴマーにコンジュゲートしているトリエチレングリコール部分を指す。例えば、一部の実施形態では、「ＴＥＧ」は、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化合物のＴが、式：
【化６】
2017522044.tif 000008
のものであることを含む。
【００６７】
用語「ｐｉｐ−ＰＤＡ」は、Ｇ基リンカーおよびピペラジニル窒素の間のアミド結合によって、Ｇ基（Ｇ基は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）および下記でさらに考察するリンカー部分を含む）をオリゴマーの５’末端に接続する、５’末端ピペラジン−ホスホロジアミデート部分を指す。例えば、一部の実施形態では、「ｐｉｐ−ＰＤＡ」は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物のＴが、式：
【化７】
2017522044.tif 000009
のものであることを含む。
【００６８】
用語「標的配列」は、それに対してアンチセンスオリゴマーが対象としている標的ＲＮＡ、例えば、細菌ｍＲＮＡの一部、すなわち、オリゴマーが相補的配列のワトソン−クリック塩基対合によってハイブリダイズする配列を指す。ある特定の実施形態では、標的配列は、細菌遺伝子の翻訳開始領域の連続する領域であり得る。
【００６９】
「翻訳開始コドン領域」は、遺伝子の翻訳開始コドンの上流または下流の３０塩基である領域を指す。
【００７０】
用語「標的化配列」または「アンチセンス標的化配列」は、ＲＮＡ、例えば、細菌ｍＲＮＡ中の標的配列に対して相補的または実質的に相補的であるオリゴマー中の配列を指す。アンチセンス化合物の全配列、または一部のみは、標的配列に対して相補的であり得る。例えば、約１０〜３０塩基のオリゴマーにおいて、その塩基のうち約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個は、標的領域に対して相補的である標的化配列であり得る。典型的には、標的化配列は、連続する塩基で形成されるが、代わりに、例えば、オリゴマーの反対の末端から一緒に置かれたとき、標的配列にまたがる配列を構成する、連続していない配列から形成され得る。
【００７１】
「標的化配列」は、標的配列に対する「ほとんど」または「実質的な」相補性を有し、本開示の目的のために依然として機能し、すなわち、依然として「相補的」であり得る。好ましくは、本開示において用いられるオリゴマー類似体化合物は、１０ヌクレオチドのうち標的配列と最大で１つのミスマッチ、好ましくは、２０ヌクレオチドのうち最大で１つのミスマッチを有する。代わりに、用いられるアンチセンスオリゴマーは、本明細書において示すような例示的な標的化配列と、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性を有する。
【００７２】
本明細書において使用する場合、用語「定量化すること」、「定量化」または他の関連する単語は、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴマー、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の、単位体積における含量、質量、または濃度を決定することを指す。
【００７３】
本明細書において使用する場合、被験体（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然経過を変化させる試みにおいて使用される任意のタイプの介入である。処置には、これらに限定されないが、医薬組成物の投与が含まれ、予防的に、または病的事象の開始もしくは病原因子との接触の後に行われ得る。また含まれるのは、処置される疾患もしくは状態の進行の速度を低減させるか、その疾患もしくは状態の発生を遅延させるか、またはその発生の重症度を低減させることを対象とすることができる「予防的」処置である。「処置」または「予防法」は、疾患もしくは状態、またはその関連する症状の完全な根絶、治癒、または予防を必ずしも示さない。
【００７４】
細菌病原性因子を標的化するための配列
ある特定の実施形態は、病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性のものである、アンチセンスオリゴマー、ならびに関連する組成物および方法に関する。病原性因子の一般例は、抗生物質耐性遺伝子、バイオフィルム形成遺伝子、脂肪酸生合成と関連する遺伝子、およびこれらのコードされたタンパク質を含む。さらに、病原性因子は、感染のプロセスの間に細菌に利益を提供する他の遺伝子の発現（転写および／または翻訳）を制御する調節タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００７５】
ある特定の実施形態では、標的配列は、細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンのすべてまたは一部分（例えば、１または２ヌクレオチド）を含有する。一部の実施形態では、標的配列は、細菌ｍＲＮＡ標的配列の翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ；ＡＵＧ）の上流もしくは下流の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の塩基、または約１、２、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以内の塩基である配列を含有する。例えば、特定の実施形態では、標的配列の５’末端は、細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンにおけるアデニン、ウラシル、またはグアニンヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的配列の５’末端または３’末端は、細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの最後のヌクレオチド（例えば、グアニン）の下流の残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０において始まる。一部の実施形態では、標的配列の５’末端または３’末端は、細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの最初のヌクレオチド（例えば、アデニン）の上流の残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０において始まる。
【００７６】
一部の実施形態では、病原性因子は、抗生物質耐性遺伝子またはそのコードされたタンパク質、すなわち、少なくとも１種の抗微生物剤に対する細菌の耐性と関連する遺伝子またはタンパク質である。抗生物質耐性遺伝子の一般例は、ある特定の抗微生物剤を酵素的に非活性化することができるベータ−ラクタマーゼ、および抗微生物剤の透過性または能動排出（ポンプアウト）を増加させるタンパク質を含む。抗生物質耐性遺伝子の特定の例は、ニューデリーメタロ−ベータ−ラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）および耐性−小結節形成−細胞分裂（ＲＮＤ）型多剤排出ポンプサブユニットＡｄｅＡ（ａｄｅＡ）を含む。ＮＤＭ−１およびＡｄｅＡ耐性遺伝子の例示的な翻訳開始コドン領域配列を、下記の表１Ａにおいて提供する。
【００７７】
一部の実施形態では、病原性因子は、バイオフィルム形成遺伝子またはそのコードされたタンパク質、すなわち、バイオフィルムの形成と関連するか、またはその一因となる遺伝子またはタンパク質である。バイオフィルムは、表面、例えば、組織表面または移植した医療デバイスの表面上で互いに接着する細菌細胞の任意の群を含むことができる。このような接着細胞は、例えば、細胞外ＤＮＡ、タンパク質、および多糖類から構成されるポリマー混合物である細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）の自己産生されたマトリックス内に包埋されていることが多い。細菌は、表面上の特異的または非特異的付着部位の細胞認識、栄養的手掛かりを含み得る多くの因子に応答して、または場合により阻害濃度未満の抗生物質への細胞の曝露によって、バイオフィルムを形成する。バイオフィルム中で成長する微生物細胞は、同じ生物の個々の細胞とは生理学的に別個である。例えば、細菌細胞が成長のバイオフィルムモードに切り替わったとき、細菌細胞は挙動における表現型シフトを起こし、ここである特定の遺伝子（例えば、バイオフィルム形成に関連する）が差次的にレギュレートされる。バイオフィルム形成遺伝子の特定の例は、ｃｅｐＩ、ｃｅｐＲ、およびｓｕｈＢを含む。特定の実施形態では、ｃｅｐＩ遺伝子は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種または亜種（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ種群、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来であり、アシルホモセリンラクトンシンターゼをコードする。一部の実施形態では、ｓｕｈＢ遺伝子は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種または亜種（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ種群、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来であり、推定上のイノシトール−１−モノホスファターゼをコードする。ある特定の実施形態では、ｃｅｐＲ遺伝子は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種または亜種（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ種群、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来であり、アシルホモセリンラクトン依存的調節タンパク質をコードする。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ由来のバイオフィルム形成遺伝子の例示的な翻訳開始コドン領域配列を、下記の表１Ｂにおいて提供する。
【００７８】
一部の実施形態では、病原性因子は、脂肪酸の生合成と関連する遺伝子またはタンパク質である。脂肪酸生合成と関連するタンパク質の一般例は、中間の脂肪酸鎖の安定化、および脂肪酸シンターゼ複合体中の酵素のそれぞれへの中間の脂肪酸鎖のシャトリングにおいて重要な役割を果たすアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、例えば、ＡｃｐＰ；４’−ホスホパンテテイン補欠分子族をａｐｏ−ＡＣＰに移動して、機能的ホロ−ＡＣＰを形成させる酵素であるアシルキャリアータンパク質シンターゼ（ＡｃｐＳ）；脂肪酸生合成の最初の方向決定ステップ（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｐ）におけるマロニル−ＣｏＡへのアセチル−ＣｏＡの変換を触媒する４種のタンパク質から構成される酵素であるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；成長している脂肪酸鎖上の伸長または適合ステップのいずれかをそれぞれ触媒する脂肪酸生合成（Ｆａｂ）酵素、例えば、ＦａｂＡ、ＦａｂＩ、ＦａｂＦ、ＦａｂＢ、ＦａｂＤ、ＦａｂＨ、ＦａｂＧおよびＦａｂＺを含む。脂肪酸生合成と関連する遺伝子の特定の例は、アシルキャリアータンパク質ａｃｐＰ遺伝子を含む。アシルキャリアータンパク質ａｃｐＰ遺伝子の例示的な翻訳開始コドン領域配列を、下記の表１Ｃにおいて提供する。
【表１−１】
2017522044.tif 000010
【表１−２】
2017522044.tif 000011
【００７９】
このように、ある特定の実施形態では、アンチセンス標的化配列は、表１において列挙した標的配列または本明細書に記載されている標的遺伝子の１つまたは複数の領域にハイブリダイズするように設計されている。選択されたアンチセンス標的化配列は、より短く、例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５塩基、またはより長く、例えば、約２０、３０、もしくは４０塩基に作製することができ、配列が、標的配列へのハイブリダイゼーションの際に転写または翻訳を低減させるのに十分に相補的であり、かつ任意選択でＲＮＡと共に４５℃もしくはそれ超のＴｍを有するヘテロ二重鎖を形成する限りは、少数のミスマッチを含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、標的配列およびアンチセンス標的化配列の間の相補性の程度は、安定的な二重鎖を形成するのに十分である。標的ＲＮＡ配列とのアンチセンスオリゴマーの相補性の領域は、これらの範囲の間のすべての整数を含めた、８〜９塩基、８〜１０塩基、８〜１１塩基、８〜１２塩基、１０〜１１塩基、１０〜１２塩基ほどの短さであり得るが、１２〜１５塩基もしくはそれ超、例えば、１０〜４０塩基、１２〜３０塩基、１２〜２５塩基、１５〜２５塩基、１２〜２０塩基、または１５〜２０塩基であってよい。約１０〜１５塩基のアンチセンスオリゴマーは一般に、特有の相補的配列を有するのに十分に長い。ある特定の実施形態では、本明細書において考察されているように、相補的塩基の最小の長さを、必要な結合Ｔｍを達成するのに必要とし得る。
【００８１】
ある特定の実施形態では、４０塩基ほども長いオリゴマーが適切であり得、ここで、少なくとも最小数の塩基、例えば、１０〜１２塩基が、標的配列に対して相補的である。しかし、一般に、細胞における促進されたまたは能動取込みは、約３０塩基未満または約２０塩基未満のオリゴマー長さで最適化される。含まれるのは、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０塩基からなるアンチセンスオリゴマーであり、ここでは少なくとも約６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０の連続しているかもしくは連続していない塩基は、本明細書に記載されている標的遺伝子、例えば、表１の標的配列（例えば、配列番号１〜１０）に対して相補的である。
【００８２】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、標的配列に対して１００％相補的であり得るか、または、オリゴマーおよび標的配列の間に形成されるヘテロ二重鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用、およびｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る分解の他のモードを耐え、かつ標的化されたｍＲＮＡの発現を低減させるのに十分に安定的である限り、例えば、変異体を収容するようにミスマッチを含み得る。したがって、ある特定のオリゴマーは、オリゴマーおよび標的配列の間に約または少なくとも約７０％の配列相補性、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相補性を有し得る。ヌクレアーゼによる切断に対して影響されにくいオリゴマー骨格が、本明細書において考察されている。ミスマッチは、存在する場合、典型的には、中間におけるよりもハイブリッド二重鎖の末端領域に向かってより不安定化していない。許容されるミスマッチの数は、二重鎖安定性のよく理解された原理によって、オリゴマーの長さ、二重鎖中のＧ：Ｃ塩基対の百分率、および二重鎖中のミスマッチ（複数可）の位置によって決まる。このようなアンチセンスオリゴマーは標的配列に対して必ずしも１００％相補的でないが、例えば、標的ＲＮＡの翻訳が低減するように、標的配列に安定におよび特異的に結合することが有効である。
【００８３】
オリゴマーおよび標的配列の間に形成される二重鎖の安定性は、結合Ｔｍ、および細胞の酵素的切断に対する二重鎖の感受性の関数である。相補的配列ＲＮＡに関するオリゴマーのＴｍは、例えば、Ｈａｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年、１０７〜１０８頁によって記載されているもの、またはＭｉｙａｄａ  Ｃ．  Ｇ．およびＷａｌｌａｃｅ  Ｒ．  Ｂ．、１９８７年、Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１５４巻、９４〜１０７頁に記載されているように、従来の方法によって測定され得る。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、相補的配列ＲＮＡに関して、体温より高い、好ましくは、約４５℃超または５０℃超の結合Ｔｍを有し得る。６０〜８０℃の範囲またはそれ超のＴｍも含まれる。周知の原理によると、相補性をベースとするＲＮＡハイブリッドに関してオリゴマーのＴｍは、二重鎖におけるＣ：Ｇ対合塩基の比を増加させることによって、および／またはヘテロ二重鎖の長さ（塩基対で）を増加させることによって、増加させることができる。同時に、細胞の取込みを最適化する目的のために、オリゴマーのサイズを限定することが有利であり得る。
【００８４】
下記の表２Ａ〜Ｃは、本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーの例示的な標的化配列（５’から３’の方向で）を示す。
【表２−１】
2017522044.tif 000012
【表２−２】
2017522044.tif 000013
【表２−３】
2017522044.tif 000014
【００８５】
このように、ある特定のアンチセンスオリゴマーは、表２における標的化配列（例えば、配列番号１１〜３７）またはその変異体、またはその連続しているかもしくは連続していない部分（複数可）を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。例えば、ある特定のアンチセンスオリゴマーは、表２における標的化配列（例えば、配列番号１１〜３７）のいずれかの約または少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、もしくは２７の連続しているかもしくは連続していないヌクレオチドを含む。連続していない部分について、介在するヌクレオチドを、欠失させるかもしくは異なるヌクレオチドで置換することができるか、または介在するヌクレオチドを加えることができる。変異体のさらなる例は、表２における標的化配列（例えば、配列番号１１〜３７）のいずれかの全長にわたり、約または少なくとも約７０％の配列同一性または相同性、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性または相同性を有するオリゴマーを含む。
【００８６】
アンチセンスオリゴマーおよびその変異体の活性は、当技術分野で通例の技術によってアッセイすることができる（例えば、実施例を参照されたい）。
【００８７】
Ｉ．アンチセンスオリゴマー化合物
アンチセンスオリゴマーは典型的には、病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズし、それによって病原性因子タンパク質の発現（例えば、翻訳）を低減させるのに十分な長さおよび相補性の塩基配列を含む。オリゴマー化合物が細菌細胞によって能動的に取り込まれる能力を有し、一度取り込まれると、任意選択で約４０℃超または４５℃超のＴｍを有する、標的ｍＲＮＡと安定的な二重鎖（またはヘテロ二重鎖）を形成するとき、この必要条件を任意選択で満たす。
【００８８】
Ａ．アンチセンスオリゴマーの化学的特色
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーの骨格は実質的に非荷電であり、任意選択で細胞壁および／または細胞膜を横断する能動または促進輸送のための基質として認識される。標的ＲＮＡと安定的な二重鎖を形成するオリゴマーの能力はまた、標的に関するアンチセンスオリゴマーの長さおよび相補性の程度、Ｇ：ＣとＡ：Ｔ塩基マッチとの比、および任意のミスマッチした塩基の位置を含めた、骨格の他の特色に関し得る。アンチセンスオリゴマーが細胞ヌクレアーゼに耐える能力は、生存、および細胞への薬剤の最終送達を促進し得る。例示的なアンチセンスオリゴマー標的化配列を、表２（上述）において列挙する。
【００８９】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、モルホリノをベースとするオリゴマー、例えば、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。モルホリノをベースとするオリゴマーは、核酸塩基を支持するモルホリノサブユニットを含み、リボースの代わりに、モルホリン環を含有するオリゴマーを指す。例示的なヌクレオシド間連結は、例えば、１つのモルホリノサブユニットのモルホリン環窒素を隣接するモルホリノサブユニットの４’環外炭素に接合するホスホルアミデートまたはホスホロジアミデートヌクレオシド間連結を含む。各モルホリノサブユニットは、塩基特異的水素結合によって、オリゴヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン核酸塩基を含む。
【００９０】
モルホリノをベースとするオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含めた）は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，２１７，８６６号；同第５，１４２，０４７号；同第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，５２１，０６３号；同第５，５０６，３３７号ならびに係属中の米国特許出願第１２／２７１，０３６号；同第１２／２７１，０４０号；ならびにＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ／２００９／０６４４７１号および同第ＷＯ／２０１２／０４３７３０号ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、７巻、１８７〜１９５頁において詳述されている。
【００９１】
オリゴマー構造内で、リン酸基は一般に、オリゴマーの「ヌクレオシド間連結」を形成すると言及される。ＲＮＡおよびＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間連結は、３’から５’のホスホジエステル連結である。「ホスホルアミデート」基は、３個の付着した酸素原子および１個の付着した窒素原子を有するリンを含み、一方、「ホスホロジアミデート」基は、２個の付着した酸素原子および２個の付着した窒素原子を有するリンを含む。本明細書に記載されているモルホリノをベースとするオリゴマーの非荷電またはカチオン性のヌクレオシド間連結において、１個の窒素は必ず連結鎖に対してペンダントである。ホスホロジアミデート連結における第２の窒素は典型的には、モルホリン環構造における環窒素である。
【００９２】
したがって、本開示の様々な実施形態は、モルホリノサブユニット、および１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に接合するリン含有サブユニット間連結から構成され、かつ（ａ）約１０〜４０個のヌクレオチド塩基、および（ｂ）病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さおよび相補性の標的化配列を有する実質的に非荷電のアンチセンスモルホリノオリゴマーを含み、オリゴマーは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしている。特定の実施形態では、モルホリノサブユニットは、構造：
【化８】
2017522044.tif 000015
によるリン含有サブユニット間連結によって接合しており、式中、Ｙ１＝酸素（Ｏ）または硫黄、窒素、または炭素であり、Ｚ＝酸素または硫黄、好ましくは、酸素であり、Ｐｊは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効であるプリンまたはピリミジン塩基対合部分であり、Ｘは、−ＮＲＲ’であり、式中、ＲおよびＲ’は、同じまたは異なり、かつＨまたはアルキルのいずれかである。特定の実施形態では、Ｘは、−ＮＲＲ’であり、式中、ＲおよびＲ’は、同じまたは異なり、かつＨまたはメチルのいずれかである。
【００９３】
また含まれるのは、図１Ａ〜１Ｅにおける式のヌクレオチドの配列を含むアンチセンスオリゴマーである。図１Ａにおいて、Ｂは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチドにおける塩基に結合するのに有効であるプリンまたはピリミジン塩基対合部分である。Ｙ１またはＹ２は、酸素、硫黄、窒素、または炭素、好ましくは、酸素であり得る。リンからペンダントであるＸ部分は、フッ素、アルキルもしくは置換アルキル、アルコキシもしくは置換アルコキシ、チオアルコキシもしくは置換チオアルコキシ、または環状構造、例えば、モルホリンもしくはピペリジンを含めた、非置換、一置換、もしくは二置換窒素であり得る。アルキル、アルコキシおよびチオアルコキシは、１〜６個の炭素原子を含む。Ｚ部分は、硫黄または酸素であってよく、好ましくは、酸素である。
【００９４】
様々な態様では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（Ｉ）：
【化９】
2017522044.tif 000016
の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、
式中、各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｘは、９〜３８の整数であり、
Ｔは、ＯＨおよび式：
【化１０】
2017522044.tif 000017
の部分から選択され、式中、各Ｒ４は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ５は、電子対およびＨから選択され、Ｒ６は、ＯＨ、−Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、および式：
【化１１】
2017522044.tif 000018
の部分から選択され、式中、
Ｒ７は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ８は、Ｇ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ９ＯＨ、アシル、トリチル、および４−メトキシトリチルから選択され、
Ｒ９は、式−（Ｏ−アルキル）ｙ−のものであり、式中、ｙは、３〜１０の整数であり、
ｙ個のアルキル基のそれぞれは、Ｃ２〜Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ１の各実例は、−Ｎ（Ｒ１０）２Ｒ１１であり、式中、各Ｒ１０は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１１は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、ステアロイル、および式：
【化１２】
2017522044.tif 000019
の部分から選択され、式中、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−から選択され、各Ｒ１２は、式−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１４）２のものであり、式中、各Ｒ１４は、式−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２のものであり、
Ｒ３は、電子対、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化１３】
2017522044.tif 000020
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によってリンカー部分に付着しており、ただし、Ｇの１つのみの実例が存在し、
標的化配列は、病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズする。
【００９５】
一部の実施形態では、Ｘは、９〜１８である。ある特定の実施形態では、Ｘは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である。
【００９６】
ある特定の実施形態では、Ｔは、
【化１４】
2017522044.tif 000021
から選択される。
【００９７】
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【００９８】
様々な実施形態では、Ｔは、
【化１５】
2017522044.tif 000022
から選択され、Ｒ２は、Ｇである。
【００９９】
一部の実施形態では、Ｔは、式：
【化１６】
2017522044.tif 000023
のものであり、Ｒ６は、式：
【化１７】
2017522044.tif 000024
のものであり、Ｒ２は、Ｇである。
【０１００】
ある特定の実施形態では、Ｔは、式：
【化１８】
2017522044.tif 000025
のものであり、Ｒ２は、Ｇである。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、Ｔは、式：
【化１９】
2017522044.tif 000026
のものである。
【０１０２】
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｇであるか、またはＴは、式：
【化２０】
2017522044.tif 000027
のものである。
【０１０３】
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０１０４】
様々な実施形態では、Ｒ２は、ＨまたはＧから選択され、Ｒ３は、電子対またはＨから選択される。特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｇである。一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｈまたはアシルである。一部の実施形態では、各Ｒ１は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つの実例は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。ある特定の実施形態では、Ｒ１の各実例は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１０５】
本開示の様々な実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＩ）：
【化２１】
2017522044.tif 000028
の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、
式中、各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｘは、９〜２８の整数であり、
Ｔは、
【化２２】
2017522044.tif 000029
から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、Ｇ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、
Ｒ３は、電子対、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化２３】
2017522044.tif 000030
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によってリンカー部分に付着しており、ただし、Ｇの１つのみの実例が存在する。様々な実施形態では、Ｒ２は、Ｇであるか、またはＴは、式：
【化２４】
2017522044.tif 000031
のものである。
【０１０６】
一部の実施形態では、Ｔは、上記に定義されているようなＴＥＧであり、Ｒ２は、Ｇであり、Ｒ３は、電子対またはＨである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈ、アシル、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｔは、式：
【化２５】
2017522044.tif 000032
のものである。
【０１０７】
様々な態様では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＩＩ）：
【化２６】
2017522044.tif 000033
の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、
式中、各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｘは、９〜２８の整数であり、
Ｔは、
【化２７】
2017522044.tif 000034
から選択され、
Ｒ１の各実例は、−Ｎ（Ｒ１０）２Ｒ１１であり、式中、各Ｒ１０は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ１１は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ２は、電子対、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化２８】
2017522044.tif 000035
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によってリンカー部分に付着している。
【０１０８】
一部の実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つの実例は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。ある特定の実施形態では、Ｒ１の各実例は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１０９】
様々な態様では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶ）：
【化２９】
2017522044.tif 000036
の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中、
Ｘは、９〜２８の整数であり、
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｒ１の各実例は、−Ｎ（Ｒ１０）２Ｒ１１であり、式中、各Ｒ１０は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ１１は、電子対およびＨから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化３０】
2017522044.tif 000037
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によってリンカー部分に付着している。一部の実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つの実例は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。ある特定の実施形態では、Ｒ１の各実例は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１１０】
様々な態様では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（Ｖ）：
【化３１】
2017522044.tif 000038
の化合物であってよく、式中、
Ｘは、９〜１８の整数であり、
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｒ１の各実例は、−Ｎ（Ｒ１０）２Ｒ１１であり、式中、各Ｒ１０は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ１１は、電子対およびＨから選択され、
Ｒ２は、Ｈ、トリチル、４−メトキシトリチル、アシル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、
Ｒ３は、電子対、Ｈ、およびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化３２】
2017522044.tif 000039
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によってリンカー部分に付着している。一部の実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つの実例は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。ある特定の実施形態では、Ｒ１の各実例は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１１１】
様々な態様では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＶＩ）：
【化３３】
2017522044.tif 000040
の化合物または薬学的に許容されるその塩を含み、式中、
Ｘは、９〜２８の整数であり、
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｒ２は、Ｈまたはアシルから選択され、
Ｇは、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）、ならびに−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰから選択されるリンカー部分であるか、またはＧは、式：
【化３４】
2017522044.tif 000041
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によってリンカー部分に付着している。
【０１１２】
アンチセンスオリゴマーは、当技術分野において公知であり、本明細書において引用した参照文献において記載されている方法を用いて、段階的固相合成によって調製することができる。
【０１１３】
Ｂ．細胞透過性ペプチド
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＣＰＰは、アルギニンに富んだペプチドである。「アルギニンに富んだ担体ペプチド」は、ＣＰＰが少なくとも２個、好ましくは、２、３、４、５、６、７、または８個のアルギニン残基を有し、それぞれは１個または複数の非荷電の疎水性残基によって任意選択で分離しており、約６〜１４個のアミノ酸残基を任意選択で含有することを意味する。図１Ｆ〜１Ｈは、５’および３’ＰＭＯコンジュゲートを含めた実施例において使用されるＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートの例示的な化学構造を示す。
【０１１４】
例示的なＣＰＰを、表Ｃ１において提供する（配列番号３８〜４２）。
【表２−４】
2017522044.tif 000042
【０１１５】
ＣＰＰ、これらの合成、およびＣＰＰをオリゴマーにコンジュゲートする方法は、例えば、すべてが参照によりその全体が組み込まれている国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０９７０１７号、同第ＷＯ２００９／００５７９３号、および同第ＷＯ２０１２／１５０９６０号において詳述されている。
【０１１６】
一部の実施形態では、ＣＰＰは、１アミノ酸リンカー、２アミノ酸リンカー、３アミノ酸リンカー、４アミノ酸リンカー、または５アミノ酸リンカーを介して、そのＣ末端においてオリゴマーの３’末端または５’末端に連結している。式（Ｉ）〜（ＶＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた特定の実施形態では、リンカーは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ（Ｘリンカー）、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ−ＣＰＰ（Ｂリンカー）、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ−ＣＰＰ（ＸＢペプチドリンカー）、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ−ＣＰＰ（Ｇｌｙリンカー）を含むことができるか、またはＧは、式：
【化３５】
2017522044.tif 000043
のものであり、式中、ＣＰＰは、ＣＰＰのカルボキシ末端においてアミド結合によってリンカー部分に付着している。式（Ｉ）〜（ＶＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた本開示の一部の実施形態において、Ｇは、配列番号４０〜４２から選択される。式（Ｉ）〜（ＶＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた様々な実施形態では、ＣＰＰは、配列番号３８および３９から選択され、リンカーは、上記の群から選択される。
【０１１７】
式（Ｉ）〜（ＶＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた一部の実施形態では、ＣＰＰは、
【化３６】
2017522044.tif 000044
から選択され、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
【０１１８】
式（Ｉ）〜（ＶＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた一部の実施形態では、Ｇは、
【化３７】
2017522044.tif 000045
から選択され、式中、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
様々な態様では、本開示のアンチセンスオリゴマー、または薬学的に許容されるその塩は、
【化３８】
2017522044.tif 000046
【化３９】
2017522044.tif 000047
から選択される式（ＶＩＩ）のアンチセンスオリゴマーを含み、式中、Ｘは、９〜３８の整数であり、Ｒａは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒｂは、Ｈ、アセチル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、および４−メトキシトリチルから選択され、各Ｎｕは、一緒になって上記の標的化配列を形成するプリンまたはピリミジン塩基対合部分である。
【０１１９】
Ｃ．アンチセンスオリゴマー標的化配列
式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた本開示のアンチセンスオリゴマーの様々な実施形態では、標的化配列は、病原性因子をコードする細菌ｍＲＮＡ標的配列と特異的にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、標的配列は、細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンおよび／または細菌ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの上流もしくは下流の約３０塩基内の配列を含む。ある特定の実施形態では、病原性因子は、抗生物質耐性タンパク質またはバイオフィルム形成タンパク質であってよい。一部の実施形態では、抗生物質耐性タンパク質は、ニューデリーメタロ−ベータ−ラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）および耐性−小結節形成−細胞分裂（ＲＮＤ）型多剤排出ポンプサブユニットＡｄｅＡ（ａｄｅＡ）の少なくとも１つから選択され得る。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１〜４から選択することができ、チミン塩基（Ｔ）は任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である。ある特定の実施形態では、標的化配列は、配列番号１１〜１５に記載されている標的化配列の１つであってよいか、配列番号１１〜１５の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含んでもよいか、または配列番号１１〜１５と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含んでもよく、チミン塩基（Ｔ）は任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である。一部の実施形態では、バイオフィルム形成タンパク質は、ＣｅｐＩまたはＳｕｈＢの少なくとも１つによってコードされ得る。ある特定の実施形態では、標的配列は、配列番号５〜９から選択することができ、チミン塩基（Ｔ）は任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である。一部の実施形態では、標的化配列は、配列番号１６〜２４に記載されている標的化配列の１つであってよいか、配列番号１６〜２４の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含んでもよいか、または配列番号１６〜２４と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含んでもよく、チミン塩基（Ｔ）は任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である。様々な実施形態では、病原性因子は、ａｃｐＰの１つまたは複数によってコードされる、脂肪酸生合成と関連するアシルキャリアータンパク質である。ある特定の実施形態では、アシルキャリアータンパク質は、ＡｃｐＰであり得る。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１０であってよく、チミン塩基（Ｔ）は任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である。ある特定の実施形態では、標的化配列は、配列番号２５〜３７に記載されている標的化配列の１つであってよいか、配列番号２５〜３７の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのフラグメントを含んでもよいか、または配列番号２５〜３７と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含んでもよく、チミン塩基（Ｔ）は任意選択で、ウラシル塩基（Ｕ）である。式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた本開示の一部の実施形態において、標的化配列は、
【化４０】
2017522044.tif 000048
から選択され、Ｘは、９であり、チミン塩基（Ｔ）は、ウラシル塩基（Ｕ）であり得る。
【０１２０】
式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた本開示の様々な実施形態では、標的化配列は、
【化４１】
2017522044.tif 000049
から選択され、Ｘは、９であり、チミン塩基（Ｔ）は、ウラシル塩基（Ｕ）であり得る。
【０１２１】
式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のアンチセンスオリゴマー化合物を含めた本開示のある特定の実施形態では、標的化配列は、
【化４２】
2017522044.tif 000050
から選択され、Ｘは、９であり、チミン塩基（Ｔ）は、ウラシル塩基（Ｕ）であり得る。
【０１２２】
Ｄ．例示的なアンチセンスオリゴマー
本開示の例示的なアンチセンスオリゴマー（ＡＯＮ）は、下記の表３Ａ〜３Ｃに記載されているものを含む。
【表３−１】
2017522044.tif 000051
【表３−２】
2017522044.tif 000052
【表３−３】
2017522044.tif 000053
【０１２３】
ＩＩ．使用の方法および製剤
本開示の実施形態は、１種または複数の細菌病原性因子の発現および活性を低減させる本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーを使用する方法を含む。ある特定の実施形態は、アンチセンスオリゴマーを使用して、細菌の複製、増殖、病原性因子、または成長を低減させ、例えば、単独で、または１種もしくは複数のさらなる抗微生物剤と組み合わせて、被験体において細菌感染を処置する方法を含む。一部の場合において、アンチセンスオリゴマーは、抗生物質に対する細菌の感受性を増加させる。ある特定の実施形態は、本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーを使用して、細菌バイオフィルムの形成または存在を低減させ、例えば、単独で、または１種もしくは複数のさらなる抗微生物剤と組み合わせて、被験体において細菌感染を処置する方法を含む。
【０１２４】
また含まれるのは、典型的には、薬学的に許容される担体と組み合わせた、アンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物である。本明細書において提供する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。
【０１２５】
例えば、ある特定の実施形態は、それを必要とする被験体（例えば、細菌感染を有する被験体または細菌感染を有する危険性がある被験体）に、本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーまたは医薬組成物を投与することを含む、被験体において細菌感染を処置する方法を含む。また含まれるのは、細菌（単数または複数）と本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーとを接触させることを含む、病原性因子をコードする遺伝子を含む細菌（単数または複数）の病原性および／またはバイオフィルム形成を低減させる方法である。
【０１２６】
一部の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの属から選択される。
【０１２７】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科由来のグラム陰性の非胞子形成の条件的嫌気性桿状細菌の属であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａが関連する病因の大多数に関与している種Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを含む。
【０１２８】
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒは、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの綱に属するグラム陰性菌の属である。臨床的に関連性のあるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種群の例は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ−ｂａｕｍａｎｉｉ種群（グルコース酸化非溶血性）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ（グルコース陰性非溶血性）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（溶血性）を含む。具体例は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉを含む。
【０１２９】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａは、突出した多糖類をベースとする莢膜を有する非運動性グラム陰性オキシダーゼ陰性の桿状細菌の属である。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ生物は、広範囲の病態、例えば、肺炎、尿路感染、敗血症、髄膜炎、下痢、および軟部組織感染をもたらすことができる。ヒト感染症の大部分は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａによってもたらされる。
【０１３０】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（従前は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの一部）は、ほぼ遍在性のグラム陰性の運動性偏性好気性桿状細菌の群を指す。これらのプロテオバクテリアは、病原性細菌、例えば、鼻疽に関与しているＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ；類鼻疽の原因因子であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ；および例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する被験体における肺感染症の重要な病原体であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａを含む。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ種群）は、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｄｏｌｏｓａ、および／またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａを含めた多くの異なる亜種から構成されるグラム陰性菌である。
【０１３１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科に属するグラム陰性好気性ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの属である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、臨床的に関連性のある新興の日和見病原体としてますます認識されている。これは低い抗生物質感受性を有し、バイオフィルムを形成することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．はペニシリン、および関連するベータ−ラクタム系抗生物質の大部分に対して天然に耐性であるが、一部は、ピペラシリン、イミペネム、チカルシリン、および／またはシプロフロキサシンに対して感受性である。アミノグリコシド、例えば、トブラマイシン、ゲンタマイシン、およびアミカシンは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染の処置のための他の有望な微生物剤である。
【０１３２】
このように、一部の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの属の上記のメンバーのいずれかである。具体的な実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの１つまたは複数である。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、細菌は、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌（単数または複数）である。複数薬剤耐性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（ＭＤＲ）、多剤耐性（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）または多耐性（ｍｕｌｔｉｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）は、疾患を引き起こす微生物（細菌、ウイルス、真菌または寄生生物）が別個の抗微生物薬、例えば、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗寄生生物薬などに耐えることができる状態である。特定の実施形態では、細菌は、広範囲薬剤耐性（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（ＸＤＲ）または汎薬剤耐性（ｐａｎ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（ＰＤＲ）である。一部の実施形態では、細菌は、広域スペクトルのβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生グラム陰性菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネマーゼ（ＫＰＣ）産生グラム陰性菌、または多剤耐性グラム陰性桿状（ＭＤＲ  ＧＮＲ）ＭＤＲＧＮ細菌である。具体的な実施形態では、細菌は、ＭＤＲ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＭＤＲ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、ＭＤＲ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＭＤＲ  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）、またはＭＤＲ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。
【０１３４】
上で述べたように、本明細書に記載されている細菌（単数または複数）は典型的には、１種または複数の病原性因子、例えば、抗生物質耐性遺伝子、バイオフィルム形成遺伝子および／または脂肪酸生合成と関連する遺伝子を含む（例えば、コードする）。抗生物質耐性遺伝子（およびこれらの関連するタンパク質）の一般例は、ある特定の抗微生物剤を酵素的に非活性化することができるベータ−ラクタマーゼ、および抗微生物剤の透過性または能動排出（ポンプアウト）を増加させる遺伝子／タンパク質を含む。抗生物質耐性遺伝子の特定の例は、ニューデリーメタロ−ベータ−ラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）および耐性−小結節形成−細胞分裂（ＲＮＤ）型多剤排出ポンプサブユニットＡｄｅＡ（ａｄｅＡ）を含む。具体的な実施形態では、細菌は、ＮＤＭ−１およびａｄｅＡから選択される少なくとも１種の抗生物質耐性遺伝子を含むか、または発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。
【０１３５】
バイオフィルム形成遺伝子（およびこれらの関連するタンパク質）の例は、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ由来のｃｅｐＩ、ｃｅｐＲ、および／またはｓｕｈＢ遺伝子を含む。特定の実施形態では、細菌は、アシルホモセリンラクトンシンターゼをコードするｃｅｐＩ遺伝子を含むか、または発現する。一部の実施形態では、細菌は、イノシトール−１−一リン酸をコードするｓｕｈＢ遺伝子を含むか、または発現する。具体的な実施形態では、１つまたは複数のバイオフィルム形成遺伝子を含むか、または発現する細菌は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａまたはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）である。これらおよび関連する実施形態の一部では、それを必要とする被験体は、免疫無防備状態であり、根底にある肺疾患、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）または慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）を有する。
【０１３６】
脂肪酸生合成と関連する遺伝子（およびこれらの関連するタンパク質）の例は、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ由来のａｃｐＰ、ａｃｐＳ、および／またはｆａｂ遺伝子を含む。特定の実施形態では、細菌は、アシルキャリアータンパク質をコードするａｃｐＰ遺伝子を含むか、または発現する。具体的な実施形態では、脂肪酸生合成と関連する１種または複数の遺伝子を含むか、または発現する細菌は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａまたはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）である。これらおよび関連する実施形態の一部では、それを必要とする被験体は、免疫無防備状態であり、根底にある肺疾患、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）または慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）を有する。
【０１３７】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、細菌の成長を低減または阻害する。例えば、一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、対照（例えば、アンチセンスオリゴマー、スクランブルオリゴマーが存在しない、オリゴマーとの接触の前）と比べて、約または少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００％もしくはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）、または対照と比べて、約または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００倍もしくはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）細菌の成長を低減させる。細菌成長は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、実施例を参照されたい）またはｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のように、アンチセンスオリゴマーを、１種または複数の抗微生物剤と組み合わせて用いる。
【０１３８】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、対照と比べて、約または少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは約１０００％もしくはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）、または対照と比べて、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００倍もしくはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）細菌のペリプラズムにおけるベータ−ラクタマーゼ（例えば、カルバペネマーゼ）活性を低減させる。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、細菌のペリプラズムにおいてメロペネマーゼ（ｍｅｒｏｐｅｎｅｍａｓｅ）酵素活性を低減させる。特定の実施形態では、ベータ−ラクタマーゼ（例えば、カルバペネマーゼ）活性を低減させるアンチセンスオリゴマーは、ＮＤＭ−１に対して標的化され、細菌は、ＮＤＭ−１を含むか、または発現する、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。これらは、例示的な細菌種であり、ＮＤＭ−１遺伝子を発現している任意の細菌は、本明細書に記載されている化合物および方法に対して影響されやすいと予想される。ベータ−ラクタマーゼ（例えば、カルバペネマーゼ）活性は、当技術分野で通例の技術によって測定することができる。
【０１３９】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、対照（例えば、オリゴマーが存在しない）と比べて、バイオフィルム形成および／または現存するバイオフィルムのレベルを低減させる。例えば、一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、対照と比べて、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００％もしくはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）、または対照と比べて、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００倍もしくはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）バイオフィルム形成および／または現存するバイオフィルムのレベルを低減させる。特定の実施形態では、バイオフィルム形成および／または現存するバイオフィルムのレベルを低減させるアンチセンスオリゴマーは、ｃｅｐＩ、ｃｅｐＲ、ｓｕｈＢ、および／またはａｃｐＰに対して標的化され、細菌は、ｃｅｐＩ、ｃｅｐＲ、ｓｕｈＢおよび／またはａｃｐＰを含むか、または発現する、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）またはその亜種（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｄｏｌｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）である。バイオフィルム形成および／または現存するバイオフィルムのレベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、実施例を参照されたい）またはｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。
【０１４０】
一部の実施形態では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで実施され、それを必要とする被験体、例えば、本明細書に記載されている細菌（単数または複数）の１つまたは複数に感染しているか、または感染している危険性があるそれを必要とする被験体にアンチセンスオリゴマーを投与することを含む。このように、本開示のアンチセンスオリゴマーを、被験体に投与して、本明細書に記載されている細菌（単数または複数）のいずれかによる感染症を（予防的または治療的に）処置することができる。このような処置と併せて、薬理ゲノミクス（例えば、個体の遺伝子型／表現型と、外来性化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係の研究）を考慮し得る。治療薬の代謝における差異は、薬理学的活性薬物の用量および血中濃度の間の関係を変化させることによって重度の毒性または治療上の失敗をもたらし得る。
【０１４１】
このように、医師または臨床医は、治療剤を投与するかどうかの決定において、関連性のある薬理ゲノミクス研究において得た知識を適用し、治療剤による処置の投与量および／または治療レジメンを適合させることを考慮し得る。
【０１４２】
標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの有効な送達は、処置の一態様である。アンチセンスオリゴマー送達の経路には、これらに限定されないが、経口および非経口経路を含めた様々な全身的経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および筋内、ならびに吸入、経皮的、および局部送達が含まれる。アンチセンスオリゴマーは、送達のためにエアゾール化され得る。適当な経路は、処置を受けている被験体の状態に応じて当業者が決定し得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、アンチセンスオリゴマーを導入し得る一部の非限定的な部位である。直接的なＣＮＳ送達を用いてもよく、例えば、脳内、脳室内、または髄腔内投与を、投与経路として使用し得る。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、経皮的な方法で（例えば、リポソーム中に任意選択でパッケージ化されているアンチセンスオリゴマーの、例えばエマルジョン中への組込みにより）送達することができる。このような経皮的およびエマルジョン／リポソーム媒介性送達の方法は、例えば、その内容が参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第６，９６５，０２５号において、当技術分野におけるアンチセンスオリゴマーの送達について記載されている。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、エアゾール化によって送達することができる。エアゾールとして肺へ医薬を投与する利点は、経口療法と比較したより急速な作用の発現；気道への直接の送達による高い局所濃度；乏しい経口バイオアベイラビリティーを有する薬物の針によらない全身的送達；ならびに皮下または静脈内注射を必要とする薬物のための疼痛を伴わず針によらない送達を含む。肺を標的とする伝統的なエアゾール療法は、短時間作用性β２−アドレナリン作用性アゴニストおよび長時間作用性β２−アドレナリン作用性アゴニスト（ＬＡＢＡ）、抗コリン作用薬、吸入コルチコステロイド剤（ＩＣＳ）、非ステロイド性抗炎症剤、抗生物質および粘液溶解剤からなる。これらの薬物を送達するデバイスは、単独で、もしくはスペーサーに付着させて使用される加圧式定量吸入器（ｐＭＤＩ）、またはバルブ式保持チャンバー（ＶＨＣ）、息によって作動する（ＢＡ）−ｐＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ジェットネブライザー、振動メッシュネブライザーおよびソフトミスト吸入器を含む。喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の管理のための十分に確立した処置ガイドラインはそれぞれ、これらの医薬を投与する主要な経路として吸入療法を推奨している。嚢胞性線維症（ＣＦ）についての処置ガイドラインはまた、エアゾール化した医薬の吸入についての推奨を含む。
【０１４５】
本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーはまた、埋め込み可能なデバイスを介して送達され得る。このようなデバイスの設計は当技術分野において承認されているプロセスであり、例えば、合成埋め込み物の設計は、例えば、その内容が参照により組み込まれている米国特許第６，９６９，４００号に記載されている。
【０１４６】
アンチセンスオリゴマーは、当技術分野において承認されている技術（例えば、トランスフェクション、電気穿孔法、融合、リポソーム、コロイド状ポリマー粒子、ならびにウイルスおよび非ウイルスベクター、ならびに当技術分野において公知の他の手段）を使用して、細胞中に導入することができる。選択される送達の方法は、オリゴマー化学、処置される細胞、および細胞の場所によって少なくとも決まり、これは当業者には明らかである。例えば、局在化は、リポソームを方向付ける表面上の特異的マーカーを有するリポソーム、標的細胞を含有する組織中への直接の注入、特異的受容体媒介性取込みなどによって達成することができる。
【０１４７】
当技術分野において公知のように、アンチセンスオリゴマーは、例えば、リポソーム媒介性取込み、脂質コンジュゲート、ポリリシン媒介性取込み、ナノ粒子媒介性取込み、および受容体媒介性エンドサイトーシス、ならびにさらなる送達の非エンドサイトーシスモード、例えば、マイクロインジェクション、透過処理（例えば、ストレプトリシンＯ透過処理、アニオン性ペプチド透過処理）、電気穿孔法を伴う方法、および当技術分野において公知の送達の様々な非侵襲的非エンドサイトーシス方法を使用して送達し得る（例えば、参照によりその全体が組み込まれているＤｏｋｋａおよびＲｏｊａｎａｓａｋｕｌ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、４４巻：３５〜４９頁を参照されたい）。
【０１４８】
アンチセンスオリゴマーは、生理学的におよび／または薬学的に許容される任意の好都合なビヒクルまたは担体中で投与され得る。このような組成物は、当業者によって用いられる種々の標準的な薬学的に許容される担体のいずれかを含み得る。例には、これらに限定されないが、食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョン、錠剤およびカプセル剤が含まれる。適切な生理学的に許容される担体の選択は、投与の選択したモードによって変化する。「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合性のありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の通常の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物におけるその使用が意図される。補助的活性化合物をまた、組成物中に組み込むことができる。
【０１４９】
本明細書に記載されている化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー、抗微生物剤）は一般に、遊離酸または遊離塩基として利用され得る。代わりに、本開示の化合物は、酸付加塩または塩基付加塩の形態で使用され得る。本開示の遊離アミノ化合物の酸付加塩は、当技術分野で周知の方法によって調製してもよく、有機酸および無機酸から形成され得る。適切な有機酸は、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、ケイ皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸、およびベンゼンスルホン酸を含む。
【０１５０】
適切な無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸を含む。塩基付加塩はカルボン酸アニオンと共に形成されるそれらの塩を含み、有機および無機カチオン、例えば、アルカリ金属およびアルカリ土類金属から選択されるもの（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウムおよびカルシウム）、ならびにアンモニウムイオンおよびその置換誘導体（例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウムなど）と形成される塩を含む。このように、用語「薬学的に許容される塩」は、ありとあらゆる許容される塩の形態を包含することを意図する。
【０１５１】
さらに、プロドラッグがまた、本開示の文脈内に含まれる。プロドラッグは、このようなプロドラッグが患者に投与されるとき、化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで放出する任意の共有結合的に結合した担体である。プロドラッグは一般に、通例の操作によってまたはｉｎ  ｖｉｖｏで修飾が切断され、親化合物が生じるように官能基を修飾することによって調製される。プロドラッグは、例えば、ヒドロキシ、アミンまたはスルフヒドリル基が、患者に投与されたとき切断されてヒドロキシ、アミンまたはスルフヒドリル基を形成する任意の基に結合している本開示の化合物を含む。このように、プロドラッグの代表例は、本開示のアンチセンスオリゴマーのアルコールおよびアミン官能基のアセテート、ホルメートおよびベンゾエート誘導体を含む（しかしこれらに限定されない）。さらに、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）の場合、エステル、例えば、メチルエステル、エチルエステルなどを用いてもよい。
【０１５２】
一部の場合において、リポソームを用いて、細胞中へのアンチセンスオリゴマーの取込みを促進し得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１０巻（１２号）：１９８０〜１９８９頁、１９９６年；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．、２３巻：１１９頁、１９９４年；Ｕｈｌｍａｎｎら、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０巻、第４号、２５、５４４〜５８４頁、１９９０年；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｇ．、第１４章、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２８７〜３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７９年を参照されたい）。ヒドロゲルはまた、例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載されているように、アンチセンスオリゴマー投与のためのビヒクルとして使用され得る。代わりに、オリゴマーは、ミクロスフィアまたは微粒子中で投与され得る。（例えば、Ｗｕ，  Ｇ．Ｙ．およびＷｕ，  Ｃ．Ｈ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６２巻：４４２９〜４４３２頁、３０号、１９８７年を参照されたい）。代わりに、アンチセンスオリゴマーと複合体化したガスを充填した微小気泡の使用は、米国特許第６，２４５，７４７号に記載されているように標的組織への送達を増進することができる。持続放出組成物をまた使用し得る。これらは、成形した物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、適切な医薬担体中で、細菌感染（例えば、抗生物質耐性またはＭＤＲ細菌感染）の症状を示す哺乳動物被験体、例えば、ヒトまたは家畜に投与される。一部の態様では、被験体は、ヒト被験体、例えば、細菌感染を有すると診断されている患者である。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、薬学的に許容される担体中に含有され、経口的に送達される。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、薬学的に許容される担体中に含有され、静脈内に（ｉ．ｖ．）送達される。
【０１５４】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも２００〜４００ｎＭのピーク血中濃度のアンチセンスオリゴマーをもたらすのに有効な量および様式で投与される。典型的には、１つまたは複数の用量のアンチセンスオリゴマーは、一般に規則的な間隔で約１〜２週間の期間投与される。経口投与のためのある特定の用量は、７０ｋｇ当たり約１〜１０００ｍｇのオリゴマーである。場合によって、患者あたり１０００ｍｇ超の用量のオリゴマーが必要であり得る。ｉ．ｖ．投与のために、一部の用量は、７０ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜１０００ｍｇのオリゴマーである。アンチセンスオリゴマーは、規則的な間隔で短期間、例えば、２週間またはそれ未満毎日投与され得る。しかし、場合によって、アンチセンスオリゴマーは、より長期間にわたって間欠的に投与される。投与は、抗微生物剤（例えば、抗生物質）または本明細書に記載のような他の治療的処置の投与の前か、または同時でよい。処置レジメンは、処置を受けている被験体の免疫アッセイ、他の生化学的試験および生理学的検査の結果に基づいて、示されるように調節され得る（用量、頻度、経路など）。
【０１５５】
本開示のアンチセンスオリゴマーを使用した有効なｉｎ  ｖｉｖｏの処置レジメンは、投与の持続期間、用量、頻度および経路、ならびに処置を受けている被験体の状態によって変化し得る（すなわち、予防的投与  対  限局性感染または全身性感染に応じた投与）。したがって、このようなｉｎ  ｖｉｖｏの療法は、処置を受けている特定のタイプの障害または細菌感染に適している試験によるモニタリング、および最適な治療成績を達成するための用量または処置レジメンにおける対応する調節を含むことが多い。
【０１５６】
処置は、例えば、当技術分野において公知の疾患の一般指標によってモニターし得る。ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された本開示のアンチセンスオリゴマーの有効性は、アンチセンスオリゴマーの投与の前、間および後に、被験体から採取した生物学的体試料（組織、血液、尿など）から決定され得る。このような試料のアッセイは、（１）当業者には公知の手順、例えば、電気泳動ゲル移動度アッセイを使用して、標的配列および非標的配列を伴うヘテロ二重鎖形成が存在するか、または存在しないかについてモニターすること；（２）標準的な技術、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングによって決定するような、参照正常ｍＲＮＡまたはタンパク質に対して変異体ｍＲＮＡの量をモニターすることを含む。
【０１５７】
ＩＩＩ．併用療法
ある特定の実施形態は、併用療法、例えば、抗微生物剤、例えば、抗生物質と組み合わせたアンチセンスオリゴマーの投与を含む。併用療法を用いて、例えば、１種または複数の抗微生物剤に対する所与の細菌の感度または感受性を増加させ、それによって治療成績（例えば、感染症の消散）を改善させることができる。同様に、ある特定の併用療法を用いて、例えば、１種または複数の抗微生物剤に対する所与の細菌の抗生物質耐性を低減または逆転させることができる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、細菌に対する抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を低減させる。また含まれるのは、アンチセンスオリゴマーおよび抗微生物剤、例えば、抗生物質を含む本明細書に記載のような医薬組成物である。
【０１５８】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーおよび抗微生物剤は、別々に投与される。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーおよび抗微生物剤は、逐次的に投与される。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーおよび抗微生物剤は、例えば、同じまたは異なる医薬組成物の一部として同時に投与される。
【０１５９】
アンチセンスオリゴマーと組み合わせて投与することができる抗微生物剤（例えば、抗生物質）の例には、ベータ−ラクタム系抗生物質、例えば、カルバペネム、ペニシリンおよびペニシリン誘導体（またはペナム）、セファロスポリン（例えば、セファセトリル（Ｃｅｆａｃｅｔｒｉｌｅ）（セファセトリル（ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ））、セファドロキシル（Ｃｅｆａｄｒｏｘｉｌ）（セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｙｌ）；Ｄｕｒｉｃｅｆ）、セファレキシン（Ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）（セファレキシン（ｃｅｆａｌｅｘｉｎ）；Ｋｅｆｌｅｘ）、セファログリシン（Ｃｅｆａｌｏｇｌｙｃｉｎ）（セファログリシン（ｃｅｐｈａｌｏｇｌｙｃｉｎ））、セファロニウム（Ｃｅｆａｌｏｎｉｕｍ）（セファロニウム（ｃｅｐｈａｌｏｎｉｕｍ））、セファロリジン（ｃｅｆａｌｏｒｉｄｉｎｅ）（セファロリジン（ｃｅｐｈａｌｏｒａｄｉｎｅ））、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）（セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ）；Ｋｅｆｌｉｎ）、セファピリン（Ｃｅｆａｐｉｒｉｎ）（セファピリン（ｃｅｐｈａｐｉｒｉｎ）；Ｃｅｆａｄｒｙｌ）、セファトリジン、セファザフルール、セファゼドン、セファゾリン（Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）（セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）；Ａｎｃｅｆ、Ｋｅｆｚｏｌ）、セフラジン（Ｃｅｆｒａｄｉｎｅ）（セフラジン（ｃｅｐｈｒａｄｉｎｅ）；Ｖｅｌｏｓｅｆ）、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル（Ｃｅｃｌｏｒ、Ｄｉｓｔａｃｌｏｒ、Ｋｅｆｌｏｒ、Ｒａｎｉｃｌｏｒ）、セフォニシド（Ｍｏｎｏｃｉｄ）、セフプロジル（セフプロキシル；Ｃｅｆｚｉｌ）、セフロキシム（Ｚｅｆｕ、Ｚｉｎｎａｔ、Ｚｉｎａｃｅｆ、Ｃｅｆｔｉｎ、Ｂｉｏｆｕｒｏｋｓｙｍ、Ｘｏｒｉｍａｘ）、セフゾナム、セフメタゾール、セフォテタン、セフォキシチン、ロラカルベフ（Ｌｏｒａｂｉｄ）；セファマイシン：セフブペラゾン、セフメタゾール（Ｚｅｆａｚｏｎｅ）、セフミノクス、セフォテタン（Ｃｅｆｏｔａｎ）、セフォキシチン（Ｍｅｆｏｘｉｎ）、セフォチアム（Ｐａｎｓｐｏｒｉｎ）、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル（Ｓｅｆｄｉｎ、Ｚｉｎｉｒ、Ｏｍｎｉｃｅｆ、Ｋｅｆｎｉｒ）、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム（Ｆｉｘｘ、Ｚｉｆｉ、Ｓｕｐｒａｘ）、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム（Ｃｌａｆｏｒａｎ）、セフォベシン（Ｃｏｎｖｅｎｉａ）、セフピミゾール、セフポドキシム（Ｖａｎｔｉｎ、ＰＥＣＥＦ）、セフテラム、セフチブテン（Ｃｅｄａｘ）、セフチオフル、セフチオレン、セフチゾキシム（Ｃｅｆｉｚｏｘ）、セフトリアキソン（Ｒｏｃｅｐｈｉｎ）、セフォペラゾン（Ｃｅｆｏｂｉｄ）、セフタジジム（Ｍｅｅｚａｔ、Ｆｏｒｔｕｍ、Ｆｏｒｔａｚ）、ラタモキセフ（モキサラクタム）、セフクリジン、セフェピム（Ｍａｘｉｐｉｍｅ）、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム（Ｃｅｆｒｏｍ）、セフキノム、フロモキセフ、セフトビプロール、セフタロリン、セファロラム、セファパロール、セフカネル、セフェドロロール、セフェンピドン、セフェトリゾール、セフィビトリル、セフマチレン、セフメピジウム（Ｃｅｆｍｅｐｉｄｉｕｍ）、セフォキサゾール、セフロチル（Ｃｅｆｒｏｔｉｌ）、セフスミド（Ｃｅｆｓｕｍｉｄｅ）、セフチオキシド（Ｃｅｆｔｉｏｘｉｄｅ）、セフラセチム（Ｃｅｆｕｒａｃｅｔｉｍｅ））、およびモノバクタム（例えば、アズトレオナム、チゲモナム（ｔｉｇｅｍｏｎａｍ）、ノカルジン（ｎｏｃａｒｄｉｎ）Ａ、タブトキシン（ｔａｂｔｏｘｉｎ））；アミノグリコシド、例えば、トブラマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシンａ、アミカシン、ジベカシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、ネオマイシンＣ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）、およびストレプトマイシン；テトラサイクリン、例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、およびドキシサイクリン；スルホンアミド、例えば、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファフラゾール、スルフイソミジン、スルファドキシン、スルファメトキサゾール、スルファモキソール、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリダジン、スルファメトキシジアジン、スルファドキシン、およびスルファメトピラジン；キノロン、例えば、シノキサシン、ナリジキシン酸、オキソリン酸（Ｕｒｏｘｉｎ）、ピロミド酸（Ｐａｎａｃｉｄ）、ピペミド酸（Ｄｏｌｃｏｌ）ロソキサシン（Ｅｒａｄａｃｉｌ）、シプロフロキサシン（Ａｌｃｉｐｒｏ、Ｃｉｐｒｏｂａｙ、Ｃｉｐｒｏ、Ｃｉｐｒｏｘｉｎ、ウルトラシプロ（ｕｌｔｒａｃｉｐｒｏ））、エノキサシン（Ｅｎｒｏｘｉｌ、Ｐｅｎｅｔｒｅｘ）、フレロキサシン（Ｍｅｇａｌｏｎｅ、Ｒｏｑｕｉｎｏｌ）、ロメフロキサシン（Ｍａｘａｑｕｉｎ）、ナジフロキサシン（Ａｃｕａｔｉｍ、Ｎａｄｏｘｉｎ、Ｎａｄｉｘａ）、ノルフロキサシン（Ｌｅｘｉｎｏｒ、Ｎｏｒｏｘｉｎ、Ｑｕｉｎａｂｉｃ、Ｊａｎａｃｉｎ）、オフロキサシン（Ｆｌｏｘｉｎ、Ｏｘａｌｄｉｎ、Ｔａｒｉｖｉｄ）、ペフロキサシン（Ｐｅｆｌａｃｉｎｅ）、ルフロキサシン（Ｕｒｏｆｌｏｘ）、バロフロキサシン（Ｂａｌｏｘｉｎ）、グレパフロキサシン（Ｒａｘａｒ）、レボフロキサシン（Ｃｒａｖｉｔ、Ｌｅｖａｑｕｉｎ、Ｔａｖａｎｉｃ）、パズフロキサシン（Ｐａｓｉｌ、Ｐａｚｕｃｒｏｓｓ）、スパルフロキサシン（Ｚａｇａｍ）、テマフロキサシン（Ｏｍｎｉｆｌｏｘ）、トスフロキサシン（Ｏｚｅｘ、Ｔｏｓａｃｉｎ）、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン（Ｚｉｇａｔ、Ｔｅｑｕｉｎ）（Ｚｙｍａｒ−ｏｐｔｈ．）、ゲミフロキサシン（Ｆａｃｔｉｖｅ）、モキシフロキサシン（Ａｃｆｌｏｘ  Ｗｏｏｄｗａｒｄ、Ａｖｅｌｏｘ、Ｖｉｇａｍｏｘ、シタフロキサシン（Ｇｒａｃｅｖｉｔ）、トロバフロキサシン（Ｔｒｏｖａｎ）、プルリフロキサシン（Ｑｕｉｓｎｏｎ）；オキサゾリジノン、例えば、エペレゾリド（ｅｐｅｒｅｚｏｌｉｄ）、リネゾリド、ポシゾリド（ｐｏｓｉｚｏｌｉｄ）、ラデゾリド（ｒａｄｅｚｏｌｉｄ）、ランベゾリド（ｒａｎｂｅｚｏｌｉｄ）、ステゾリド（ｓｕｔｅｚｏｌｉｄ）、およびテジゾリド；ポリミキシン、例えば、ポリスポリン（ｐｏｌｙｓｐｏｒｉｎ）、ネオスポリン（ｎｅｏｓｐｏｒｉｎ���、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＥ（コリスチン）；リファマイシン、例えば、リファンピシンまたはリファンピン、リファブチン、リファペンチン、およびリファキシミン；リピアルマイシン（ｌｉｐｉａｒｍｙｃｉｎ）、例えば、フィダキソマイシン；マクロライド、例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシン（ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ）Ａ、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン／酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン（ｓｏｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、スピラマイシン、およびトロレアンドマイシン；リンコサミド、例えば、リンコマイシン、クリンダマイシン、およびピルリマイシン；環状リポペプチド、例えば、ダプトマイシン；グリコペプチド、例えば、バンコマイシンおよびテイコプラニン（ｔｅｉｃｈｏｐｌａｎｉｎ）；グリシルサイクリン、例えば、チゲサイクリンが含まれる。このように、上記の抗生物質の任意の１つまたは複数は、本明細書に記載されている細菌のいずれかの処置のために本明細書に記載されているアンチセンスオリゴマーのいずれかと合わせることができる。
【０１６０】
一部の実施形態では、抗微生物剤は、本明細書に記載のようなベータ−ラクタム系抗生物質である。これらおよび関連する実施形態のある特定のものでは、細菌は、ベータ−ラクタマーゼ、例えば、ＮＤＭ−１を含むか、または発現し、アンチセンスオリゴマーは、ベータ−ラクタマーゼに対して標的化される。特定の実施形態では、抗微生物剤は、カルバペネムである。カルバペネムの例は、メロペネム、イミペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム、ビアペネム、ラズペネム、テビペネム、レナペネム、およびトモペネムを含む。これらおよび関連する実施形態のある特定のものでは、細菌は、カルバペネマーゼ、例えば、ＮＤＭ−１を含むか、または発現し、アンチセンスオリゴマーは、カルバペネマーゼに対して標的化される。具体的な実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。
【０１６１】
一部の実施形態では、抗微生物剤は、アミノグリコシド、例えば、本明細書に記載のようなトブラマイシンまたはゲンタマイシンまたはテトラサイクリンである。これらおよび関連する実施形態の一部では、細菌は、抗生物質耐性遺伝子ａｄｅＡを含むか、または発現し、アンチセンスオリゴマーは、抗生物質耐性遺伝子に対して標的化される。具体的な実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、抗微生物剤は、セフタジジム、ドキシサイクリン、ピペラシリン、メロペネム、クロラムフェニコール、および／またはコトリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）の１つまたは複数を含む。これらおよび関連する実施形態の一部では、細菌は、１つまたは複数のバイオフィルム形成遺伝子、例えば、ｃｅｐＩ、ｃｅｐＲ、および／もしくはｓｕｈＢを含むか、または発現するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種であり、アンチセンスオリゴマーは、バイオフィルム形成遺伝子（複数可）に対して標的化される。具体的な実施形態では、細菌は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａまたはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ種群である。具体的な実施形態では、被験体は、免疫無防備状態であり、根底にある肺疾患、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）または慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）を有する。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、抗微生物剤は、セフタジジム、ドキシサイクリン、ピペラシリン、ミノサイクリン、メロペネム、クロラムフェニコール、および／またはコトリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）の１つまたは複数を含む。これらおよび関連する実施形態の一部では、細菌は、脂肪酸生合成と関連する１種もしくは複数の遺伝子、例えば、ａｃｐＰを含むか、または発現するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種であり、アンチセンスオリゴマーは、アシルキャリアータンパク質をコードする遺伝子（複数可）に対して標的化される。具体的な実施形態では、細菌は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａまたはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ種群である。具体的な実施形態では、被験体は、免疫無防備状態であり、根底にある肺疾患、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）または慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）を有する。
【０１６４】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、抗微生物剤単独と比べて、抗微生物剤に対する所与の細菌の感度を増加させる。例えば、ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、抗微生物剤単独と比べて、標的化されている細菌に対する抗微生物剤の殺菌性（細胞死滅）および／または静菌性（成長緩徐化）活性を増加させることによって、抗微生物剤に対する細菌の感度を増加させる。特定の実施形態では、アンチセンスは、抗微生物剤単独と比べて、約または少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００％もしくはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）、または抗微生物剤単独と比べて、約または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００倍もしくはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）感度を増加させる。
【０１６５】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、抗微生物剤単独と比べて、標的化されている細菌に対する抗微生物剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を低減させる。「最小発育阻止濃度」または「ＭＩＣ」は、一晩（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のインキュベーション後の微生物の目に見える成長を阻害する抗微生物剤の最も低い濃度を指す。最小発育阻止濃度は、抗微生物剤に対する微生物の耐性を確認し、また新たな抗微生物剤の活性をモニターするために診断検査室において重要である。ＭＩＣは一般に、細菌性生物に対する抗微生物剤の活性の最も基本的な実験室測定値と見なされる。このように、ある特定の実施形態では、オリゴマーは、細菌に対する抗微生物剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、抗微生物剤単独と比べて少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００％またはそれ超（すべての整数およびその間の範囲を含めた）低減させる。ある特定の実施形態では、オリゴマーは、細菌に対する抗微生物剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、抗微生物剤単独に対して約または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００倍（すべての整数およびその間の範囲を含めた）低減させる。
【０１６６】
一部の実施形態では、感度を増加させるか、またはＭＩＣを低減させるアンチセンスオリゴマーは、ＮＤＭ−１に対して標的化され、細菌は、ＮＤＭ−１を含むか、または発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり、抗微生物剤は、カルバペネム、例えば、メロペネム、イミペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム、ビアペネム、ラズペネム、テビペネム、レナペネム、またはトモペネムである。
【０１６７】
特定の実施形態では、感度を増加させるか、またはＭＩＣを低減させるアンチセンスオリゴマーは、ａｄｅＡに対して標的化され、細菌は、ａｄｅＡを含むか、または発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり、抗微生物剤は、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、トブラマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシンａ、アミカシン、ジベカシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、ネオマイシンＣ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）、ストレプトマイシン）、テトラサイクリン系抗生物質（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、ドキシサイクリン）、またはβ−ラクタム系抗生物質（例えば、カルバペネム、ペニシリン誘導体（ペナム）、セファロスポリン（セフェム）、モノバクタム）である。
【０１６８】
特定の実施形態では、感度を増加させるか、またはＭＩＣを低減させるアンチセンスオリゴマーは、ｃｅｐＩに対して標的化され、細菌は、ｃｅｐＩを含むか、または発現するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）またはその亜種（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｄｏｌｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）であり、抗微生物剤は、セフタジジム、ドキシサイクリン、ピペラシリン、メロペネム、クロラムフェニコール、およびコトリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）の１つまたは複数から選択される。
【０１６９】
特定の実施形態では、感度を増加させるか、またはＭＩＣを低減させるアンチセンスオリゴマーは、ｓｕｈＢに対して標的化され、細菌は、ｓｕｈＢを含むか、または発現するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）またはその亜種（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｄｏｌｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）であり、抗微生物剤は、セフタジジム、ドキシサイクリン、ピペラシリン、メロペネム、クロラムフェニコール、およびコトリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）の１つまたは複数から選択される。
【０１７０】
特定の実施形態では、感度を増加させるか、またはＭＩＣを低減させるアンチセンスオリゴマーは、ａｃｐＰに対して標的化され、細菌は、ａｃｐＰを含むか、または発現するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（種群）またはその亜種（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｄｏｌｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）であり、抗微生物剤は、セフタジジム、ドキシサイクリン、ピペラシリン、ミノサイクリン、メロペネム、クロラムフェニコール、およびコトリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）の１つまたは複数から選択される。
【０１７１】
ＩＶ．処置をモニターする方法
本明細書に記載の方法が関与する所与の治療レジメンの有効性は、例えば、細菌感染の一般指標、例えば、全血球計算（ＣＢＣ）、核酸検出方法、免疫診断試験、または細菌培養によってモニターされ得る。
【０１７２】
一部の態様では、細菌感染の同定およびモニタリングは、（１）核酸検出方法、（２）血清学的検出方法、すなわち、従来の免疫アッセイ、（３）培養方法、および（４）生化学的方法の１つまたは複数が関与する。このような方法は、定性的または定量的であり得る。
【０１７３】
核酸プローブは、公に利用可能である細菌核酸配列に基づいて設計してもよく、特定の細菌タイプ、例えば、特定の種もしくは株に特異的であるか、または細菌の１つ超の種もしくはタイプに共通していてもよい（すなわち、グラム陽性菌またはグラム陰性菌）、細菌感染を示す標的遺伝子または代謝物（すなわち、毒素）を検出するために使用され得る。核酸増幅検査（例えば、ＰＣＲ）をまた、このような検出方法において使用し得る。
【０１７４】
血清学的同定は、生物標本、例えば、糞便、尿、脳脊髄液、血液などから単離した細菌試料または培養物を使用して達成され得る。細菌の検出のための免疫アッセイは一般に、当業者が通例通り用いる方法、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって行われる。さらに、特定の細菌株または細菌種に対して特異的なモノクローナル抗体は、商業的に利用可能であることが多い。
【０１７５】
培養方法を使用して、これらに限定されないが、好気性培養対嫌気性培養、様々な培養条件下での成長および形態を含めた技術を用いることによって、特定のタイプの細菌を単離および同定し得る。例示的な生化学的試験は、グラム染色（Ｇｒａｍ、１８８４年；グラム陽性菌は濃青色に染まり、そしてグラム陰性細菌は赤色に染まる）、酵素的分析、ならびにファージタイピングを含む。
【０１７６】
このような診断試験および定量試験、ならびに細菌感染を示す他の生理学的因子の正確な性質は、細菌標的、処置される状態、および処置が予防的または治療的であるかどうかによって変化することが理解される。
【０１７７】
被験体が特定のタイプの細菌感染を有すると診断された場合において、細菌感染の状態はまた、典型的には、処置を受けている特定のタイプの細菌感染をモニターするために当業者が使用する診断技術を使用してモニターされる。
【０１７８】
ＰＭＯまたはＰＰＭＯ処置レジメンは、処置を受けている被験体の免疫アッセイ、他の生化学的試験および生理学的検査の結果に基づいて、示したように調節（用量、頻度、経路など）され得る。
【０１７９】
上記から、どのように本開示の様々な目的および特色が満たされるかが認識される。方法は、増進された細胞取込みおよび抗細菌作用を達成する抗病原性アンチセンスオリゴマーを使用して、細菌感染、例えば、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌および／またはバイオフィルム形成細菌に対する療法において改善を提供する。その結果、必要とされる化合物の価格および量の両方に関して、薬物療法はより有効であり、より安価である。
【０１８０】
本開示の１つの例示は、実質的に任意の病原性細菌に対して有効な化合物を、例えば、新たな薬物耐性株に対する迅速な応答のために容易に設計および試験することができることである。
【０１８１】
下記の実施例は、本開示を例示することを意図するが、本開示を限定することを意図しない。本明細書において言及する特許および非特許参照文献のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれている。
【実施例】
【０１８２】
（実施例１）
ａｄｅＡに対して標的化されるＰＰＭＯの活性
耐性−小結節形成−細胞分裂（ＲＮＤ）型多剤排出ポンプサブユニットａｄｅＡ（ａｄｅＡ）に対して標的化される、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートしたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）を調製し、ａｄｅＡを発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉに対する様々な抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を低減させる能力について試験した。
【０１８３】
ａｄｅＡを標的化するＰＰＭＯは、下記の配列：ＡＴＡＣＴＧＴＣＣＡＡ（配列番号１５；ＰＰＭＯ＃５）を有する。ＰＰＭＯは、その３’末端において（ＲＸＲ）４ＸＢ（配列番号４０）のＣ末端β−アラニン残基にコンジュゲートさせた。
【０１８４】
抗生物質ゲンタマイシン、トブラマイシン、およびテトラサイクリンのＭＩＣを、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの微量希釈法を使用して測定した。各抗生物質の複数の同一の希釈系列を、各マイクロタイタープレート上に含めた。抗生物質の各希釈系列において、固定量のＰＰＭＯを加えた。抗生物質の各希釈系列は、異なる濃度のＰＰＭＯを含んだ。
【０１８５】
結果を図２〜４において示す。これらの図は、ａｄｅＡを標的化するＰＰＭＯによるａｄｅＡ（排出ポンプ）を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉの処置が、ゲンタマイシン（図２）、トブラマイシン（図３）、およびテトラサイクリン（図４）のＭＩＣを、それぞれ濃度依存的な様式で有意に低減させたことを示す。
【０１８６】
（実施例２）
ＮＤＭ−１に対して標的化されるＰＰＭＯの活性
ニューデリーメタロ−ベータ−ラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）に対して標的化される、ペプチドにコンジュゲートしたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）を調製し、ＮＤＭ−１を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉおよびＥ．ｃｏｌｉに対するメロペネムの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を低減させる能力について試験した。
【０１８７】
ＮＤＭ−１に対して標的化されるＰＰＭＯは、下記の配列：ＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＣ（配列番号１１；ＰＰＭＯ＃１）；ＴＣＣＴＴＴＴＡＴＴＣ（配列番号１２；ＰＰＭＯ＃２）；ＣＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴ（配列番号１３；ＰＰＭＯ＃３）；およびＧＧＣＡＡＴＴＣＣＡＴ（配列番号１４；ＰＰＭＯ＃４）を有する。ＰＰＭＯのそれぞれを、その３’末端において（ＲＸＲ）４ＸＢ（配列番号４０）のＣ末端β−アラニン残基にコンジュゲートさせた。
【０１８８】
メロペネムのＭＩＣを、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおいてＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの微量希釈法を使用して測定した。メロペネムの複数の同一の希釈系列を、各マイクロタイタープレート上に含めた。メロペネムの各希釈系列において、固定量のＰＰＭＯを加えた。メロペネムの各希釈系列は、異なる濃度のＰＰＭＯを含んだ。
【０１８９】
図５Ａ〜５Ｂおよび６に示すように、ＮＤＭ−１を標的化するＰＰＭＯは、細菌に応じて、メロペネムのＭＩＣを約８〜３２倍低減させた。これらの図は、ＮＤＭ−１を標的化するＰＰＭＯによる、ＮＤＭ−１を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ（図５Ａ）およびＮＤＭ−１を発現しているＥ．ｃｏｌｉ（図６）の処置が、メロペネムのＭＩＣを濃度依存的な様式で有意に低減させたことを示す。図５Ｂは、ＮＤＭ−１を標的化するＰＰＭＯおよびメロペネムが、ＮＤＭ−１を発現しているＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を相乗的に低減させたことを示す。このように、ＰＰＭＯ処置した細胞のペリプラズムにおけるメロペネマーゼ酵素活性は、加えたＰＰＭＯの量と反比例であることが観察された。
【０１９０】
同様の効果が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて示された。８μＭの濃度で、最も有効なＮＤＭ−１を標的化するＰＰＭＯは、メロペネムのＭＩＣを約６４μＭから約４μＭに低減させた（データは示さず）。
【０１９１】
このように、ＮＤＭ−１を標的化するＰＰＭＯは、３つの多剤耐性病原体においてＮＤＭ−１の発現を抑制し、メロペネムのＭＩＣを感受性の濃度に低減させた。
【０１９２】
（実施例３）
バイオフィルムおよびアシルキャリアータンパク質遺伝子に対して標的化されるＰＰＭＯの活性
バイオフィルム形成遺伝子ｓｕｈＢおよびｃｅｐＩならびにアシルキャリアータンパク質ａｃｐＰ遺伝子に対して標的化される、ペプチドにコンジュゲートしたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）を調製し、バイオフィルム形成を低減させ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５において確立したバイオフィルムを崩壊させる能力について試験した。
【０１９３】
ｓｕｈＢを標的化するＰＰＭＯは、下記の配列：ＡＴＧＣＡＴＧＡＧＣＣ（配列番号２３；ＰＰＭＯ＃１３）；およびＧＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧ（配列番号２４；ＰＰＭＯ＃１４）を有する。
【０１９４】
ｃｅｐＩを標的化するＰＰＭＯは、下記の配列：ＡＡＧＧＴＣＴＧＣＡＴ（配列番号１６；ＰＰＭＯ＃６）；ＴＣＧＧＡＴＣＴＧＴＧ（配列番号１７；ＰＰＭＯ＃７）；ＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＣ（配列番号１８；ＰＰＭＯ＃８）；ＣＧＴＧＡＡＣＧＡＡＧ（配列番号１９；ＰＰＭＯ＃９）；ＣＧＴＧＴＧＧＣＡＡＣ（配列番号２０；ＰＰＭＯ＃１０）；ＧＣＣＣＧＡＧＡＴＣＣ（配列番号２１；ＰＰＭＯ＃１１）；およびＣＴＴＴＣＧＴＴＣＧＣ（配列番号２２；ＰＰＭＯ＃１２）を有する。
【０１９５】
ｓｕｈＢを標的化するＰＰＭＯおよびｃｅｐＩを標的化するＰＰＭＯのそれぞれを、その３’末端において（ＲＦＦ）３ＲＸＢ（配列番号４１）のＣ末端β−アラニン残基にコンジュゲートさせた。
【０１９６】
ａｃｐＰを標的化するＰＰＭＯは、表３Ｃ（ＰＰＭＯ＃１５〜２９）において示すような配列およびペプチドコンジュゲーションを有する。
【０１９７】
９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートを使用して、バイオフィルムを、１５０μｌのＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５の培養物中で形成させた。バイオフィルム形成を低減させるＰＰＭＯの能力を試験するために、ＰＰＭＯ（１〜１０μＭ）を、バイオフィルム形成の前に細菌培養物に加え、細菌と共に４８時間インキュベートした。確立したバイオフィルムを低減させるＰＰＭＯの能力を試験するために、細菌培養物を４８時間成長させ、ＰＰＭＯ（１〜１０μＭ）の添加の前にバイオフィルムを形成させ、次いで、ＰＰＭＯの存在下でさらに４８時間インキュベートした。分析のために、液体培養物を除去し、マイクロタイタープレートに接着しているバイオフィルムをクリスタルバイオレットで染色した。バイオフィルムにおけるクリスタルバイオレット染色の量を測定し、これがバイオフィルムの量と比例的であることを見出した。共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）、およびｄｓＲｅｄを発現しているＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５を使用して、バイオフィルムの構造的変化を可視化した（図８Ａ〜８Ｃを参照されたい）。
【０１９８】
図７Ａ〜７Ｂに示すように、ａｃｐＰ、ｓｕｈＢまたはｃｅｐＩに対して標的化されるＰＰＭＯによるバイオフィルム形成Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａの処置は、バイオフィルムの形成を撹乱するだけでなく（７Ａ；ＰＰＭＯをバイオフィルム形成の前に加え、４８時間インキュベートした）、確立したバイオフィルムも崩壊させた（７Ｂ；バイオフィルムを、ＰＰＭＯとの４８時間のインキュベーションの前に４８時間成長させた）。１０μＭの濃度の、ａｃｐＰを標的化するＰＰＭＯは、バイオフィルム形成を約４５％低減させ、現存するバイオフィルムを約５０％低減させた。１０μＭの濃度の、ｃｅｐＩを標的化するＰＰＭＯは、バイオフィルム形成を約５２％低減させ、現存するバイオフィルムを約６５％低減させた。１０μＭの濃度の、ｓｕｈＢを標的化するＰＰＭＯは、バイオフィルム形成を約４０％低減させ、現存するバイオフィルムを約４２％低減させた。このように、バイオフィルムをＣＬＳＭで可視化したとき、ｃｅｐＩを標的化するＰＰＭＯおよびｓｕｈＢを標的化するＰＰＭＯの存在下でバイオフィルム形成の劇的な低減があった。
【０１９９】
（実施例４）
ＰＰＭＯは抗生物質と相乗的に作用し、確立したバイオフィルムにおける細菌成長を低減させる
バイオフィルム形成遺伝子ｃｅｐＩに対して標的化されるＰＰＭＯを調製し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５においてアミノグリコシド系抗生物質であるトブラマイシンと組み合わせて、確立したバイオフィルムにおける細菌成長を低減させる能力について試験した。
【０２００】
ｃｅｐＩを標的化するＰＰＭＯは、下記の配列：表３ＢにおけるＰＰＭＯ＃６〜１２を有する。
【０２０１】
ＰＰＭＯのそれぞれを、３’末端において（ＲＦＦ）３ＲＸＢ（配列番号４１）とコンジュゲートさせた。
【０２０２】
確立したバイオフィルムにおける細菌成長を低減させるｃｅｐＩ  ＰＰＭＯおよびトブラマイシンの能力を試験するために、細菌培養物を４８時間成長させ、ＰＰＭＯ、またはＰＰＭＯおよびトブラマイシンの添加の前にバイオフィルムを形成させ、次いで、ＰＰＭＯなし、スクランブル対照ＰＰＭＯ、６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬのトブラマイシンを伴うスクランブル対照ＰＰＭＯ、ｃｅｐＩ  ＰＰＭＯ、および６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬのトブラマイシンを伴うｃｅｐＩ  ＰＰＭＯの存在下でさらに４８時間インキュベートした。細菌成長をＣＦＵ／ｍＬとして測定した。
【０２０３】
図９に示すように、ｃｅｐＩ  ＰＰＭＯ単独、またはトブラマイシンを伴うスクランブルＰＰＭＯは、未処置バイオフィルムと比較して、細菌成長を有意に約２ｌｏｇ阻害することができた。しかし、トブラマイシンと組み合わせたｃｅｐＩ  ＰＰＭＯは、確立したバイオフィルム上の細菌成長をさらに有意に阻害することができ、より高い濃度のトブラマイシン（１２８μｇ／ｍＬ）で、ｃｅｐＩ  ＰＰＭＯ単独と比較して、細菌ＣＦＵ／ｍＬをもう１ｌｏｇだけ低減させることができた。
【０２０４】
（実施例５）
ＰＰＭＯはＢｃｃのメンバーを阻害する
様々な体の部位から得た様々なレベルの抗生物質耐性を有する臨床分離株を含めた種々のＢｃｃ分離株を試験した。株バンクは、ヒト疾患をもたらすことが報告されている最も頻繁に遭遇する種を含む３９の分離株を含んだ。図１０に示すように、６つのＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ＃１９〜２３および２５）は、８μＭまたはそれ未満のＩＣ７５値を達成した。これらのＰＰＭＯの６つすべては、ＡｃｐＰ（脂肪酸生合成と関連するアシルキャリアータンパク質）を標的化した。６つのＰＰＭＯにおける差異は、標的ｍＲＮＡ上の代替的な位置付け部位と関連した。最も強力なＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ＃１９）は、４μＭのＩＣ７５を有した。ａｃｐＰ  ＰＰＭＯ標的化配列を、表３Ｃにおいて列挙する。
【０２０５】
（実施例６）
ＰＰＭＯはＢｃｃにおいて殺菌性である
Ｂｃｃの多くのメンバーは、内因的に抗生物質耐性であり、処置を困難なものとしている。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａは、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者が遭遇する最も一般の種の１つである。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａの２つの異なる分離株を、異なるａｃｐＰ  ＰＰＭＯの存在下または非存在下で２４時間インキュベートした（図１１）。
【０２０６】
ａｃｐＰを標的化するＰＰＭＯは、下記の配列：ＧＴＣＣＡＴＴＡＣＣＣ（ＰＰＭＯ＃１５；配列番号２５）；ＣＣＡＴＴＡＣＣＣＣＴ（ＰＰＭＯ＃１９；配列番号２７）；およびＴＴＧＴＣＣＡＴＴＡＣ（ＰＰＭＯ＃２２；配列番号３０）を有する。
【０２０７】
ＰＰＭＯのそれぞれを、その５’末端において（ＲＦＦ）３ＲＸＢ（配列番号４１）のＣ末端β−アラニン残基にコンジュゲートさせた。
【０２０８】
Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｋ５６−２（ゲノム配列決定した臨床ＣＦ分離株；パネルＡ）において、３つのＰＰＭＯはすべて、成長の有意な低減をもたらし、１つのＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ＃１９；配列番号２７；１６μＭ）は、開始接種材料と比較して成長の＞３ｌｏｇの低減、強力な殺菌効果をもたらした。重要なことに、この効果は、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａの汎耐性株（ＨＩ４２７７、ＣＦ患者由来の汎耐性大流行分離株；図１１、パネルＢ）においてさえ見られた。この株はすべての伝統的な抗生物質に対して耐性を示したにも関わらず、ＰＰＭＯ＃１９は殺菌性であった。ＰＰＭＯ＃１９のＭＩＣは、ＨＩ４２７７において８μＭであったが（図１０）、成長を阻害するＰＰＭＯの能力は、任意の特定の株における抗生物質耐性の根底にあるレベルによって決まらないことを例示し、これはこのアプローチについての肯定的な意味あいを伴う重要な知見である。
【０２０９】
（実施例７）
ＰＰＭＯは痰におけるＢｃｃ成長を阻害する
ＣＦ患者における慢性感染は、通常肺において顕在化する。さらに、ＢｃｃおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのメンバーは、バイオフィルムを形成することが公知である。これらのバイオフィルムおよびＣＦ患者によって形成された濃厚な痰は、抗生物質による処置を特に困難なものとし、これらの病原体は肺の環境から完全に根絶することは実質的に不可能なものとなる。
【０２１０】
ＰＰＭＯを試験して、ＰＰＭＯが痰においてこれらの活性を保持したかどうかを決定した。「人工のＣＦ痰」を作製するために十分に記載された方法を使用して、実験を行って、ＰＰＭＯがこの環境におけるＢｃｃの負荷量を低減させることができたかどうかを調べた（図１２）。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｋ５６−２を、単独で、またはスクランブル配列（Ｓｃｒ）プラセボＰＰＭＯもしくはａｃｐＰ  ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ＃１５）いずれかの存在下でインキュベートした。ａｃｐＰを標的化するＰＰＭＯは、下記の配列：ＧＴＣＣＡＴＴＡＣＣＣ（ＰＰＭＯ＃１５；配列番号２５）を有する。ＰＰＭＯを、その５’末端において（ＲＦＦ）３ＲＸＢ（配列番号４１）のＣ末端β−アラニン残基にコンジュゲートさせた。培地またはＰＰＭＯを、２、８および１２時間において投与した。試料を２４時間においてプレーティングし、ＣＦＵ／ｍｌを決定した。ａｃｐＰ  ＰＰＭＯは、生物負荷量を低減させることができた（１０μＭおよび２０μＭの投与の両方において）。１０μＭの投与で、処置なしの対照と比較して２４時間までにＣＦＵ／ｍｌにおいて概ね２ｌｏｇの低減があった。２０μＭの投与で、＞３ｌｏｇの低減が見られた。２０μＭの群において早くも８時間において、および１０μＭの群において早くも１２時間においてこの低減は明らかであった。これらの実験は、ＣＦ患者において見られる濃厚な粘性の痰中においてさえ、ＰＰＭＯが活性のままであることを示す。これは、ＰＰＭＯの活性を痰において試験した最初のものである。
【０２１１】
（実施例８）
ａｃｐＰ  ＰＰＭＯは、バイオフィルム形成を防止し、現存するバイオフィルムを解体することの両方が可能である
バイオフィルムの形成は重要な病原性形質であり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＢｃｃの両方によって利用される。Ｂｃｃバイオフィルムを成長させて、バイオフィルム形成を防止し、現存するバイオフィルムを解体することの両方を行うことの能力について、ＰＰＭＯを試験した。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５（ゲノム配列決定した流行性ＣＦ分離株）を、再現性のあるバイオフィルムを日毎に成長させるペグを含有するＭＢＥＣバイオフィルムアッセイプレートを利用して成長させた。Ｊ２３１５を、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯ（１０μＭ）、スクランブルＰＰＭＯ（１０μＭ）、ペプチドまたは培地単独のいずれかの存在下で４８時間成長させた（図１３）。ａｃｐＰを標的化するＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ＃１９）は、下記の配列：ＣＣＡＴＴＡＣＣＣＣＴ（配列番号２７）を有する。ＰＰＭＯを、その５’末端において（ＲＦＦ）３ＲＸＢ（配列番号４１）のベータ−アラニン残基にコンジュゲートさせた。バイオフィルム産生を、クリスタルバイオレット方法を利用して測定した。見られ得るように、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯは、バイオフィルム形成を、対照と比較して＞５０％低減させた。次いで、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯを試験して、これが現存するバイオフィルムを崩壊させることができたかどうかを調べた。バイオフィルムを４８時間成長させ、次いで、成熟したバイオフィルムペグを、培地単独（図１４Ａ）、１０μＭでのスクランブル対照ＰＰＭＯ（図１４Ｂ）または１０μＭでのａｃｐＰ  ＰＰＭＯ（図１４Ｃ）を有する新鮮なプレートに移した。プレートをさらに４８時間インキュベートし、バイオフィルム形成を、クリスタルバイオレットによって、および共焦点顕微鏡によっての両方で測定した。蛍光赤色を発現しているＪ２３１５株によって測定されるように、ａｃｐＰ  ＰＰＭＯは、共焦点顕微鏡およびクリスタルバイオレット測定の両方によって存在するバイオフィルムの量を有意に低減させた（図１４Ｃ）。現存するバイオフィルムを崩壊させるＰＰＭＯ（必須の遺伝子標的に対して設計）の能力は、新規および決定的に重要な知見である。
【０２１２】
（実施例９）
ＰＰＭＯのエアゾール送達は、肺感染モデルにおいてＢ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓの負荷量を低減させる
慢性肺感染症の状況における肺への直接のＰＰＭＯの送達は有用である。慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）マウスを、Ｂｃｃ感染モデルとして使用した。これらのマウスは、様々なＢｃｃ株に感染したとき、有意な罹患率と死亡率が生じる。マウスに、臨床Ｂ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ分離株を鼻腔内で感染させた（図１５）。Ａｅｒｏｇｅｎネブライザーを使用して、スクランブル（Ｓｃｒ）ＰＰＭＯ（３００μｇ）またはａｃｐＰ  ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ＃１５、３００μｇもしくは３０μｇ）のいずれかを感染の６時間後の１回の用量として送達した。ａｃｐＰを標的化するＰＰＭＯは、下記の配列：ＧＴＣＣＡＴＴＡＣＣＣ（配列番号２５）を有する。ＰＰＭＯを、その５’末端において（ＲＦＦ）３ＲＸＢ（配列番号４１）のＣ末端β−アラニン残基にコンジュゲートさせた。感染の２４時間後にマウスを安楽死させ、肺負荷量を決定した。単一の３００μｇ用量のａｃｐＰ  ＰＰＭＯは、肺負荷量を９３％低減させ、これは統計的に有意な減少であった。ＰＰＭＯのエアゾール送達は実行可能な治療戦略であり、重要なことに、これはＢｃｃ  ＰＰＭＯの噴霧送達が試みられた最初のものである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
2017522044.tif 000094
【図１１】
2017522044.tif 000095
【図１２】
2017522044.tif 000096
【図１３】
2017522044.tif 000097
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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