(57)【要約】  本発明は、抗ＣＤＨ６抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲートおよびがんの処置のためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、
ＡｂはヒトＣＤＨ６のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｄは薬物部分であり、
ｍは１から８の整数であり、
ｎは１から１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記ｎが３または４である、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＨ６の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号５３４のアミノ酸配列を含むヒトＣＤＨ６のエピトープに特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）（ａ）配列番号２２４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２２５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２２６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２２７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号２１０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２１１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２１３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２１４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２６６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２６７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２６８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２６９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２７０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２７１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｖ）（ａ）配列番号３０８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３０９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３１２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３１３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖ）（ａ）配列番号１４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉ）（ａ）配列番号２８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号４２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号４３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号５６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号５７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｘ）（ａ）配列番号７０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘ）（ａ）配列番号８４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号８５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号８７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号８９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉ）（ａ）配列番号９８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号９９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１００のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１０１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１０３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１１３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１１５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号１２６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１２７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１２９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号１４０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１４１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１４５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖ）（ａ）配列番号１５４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１５７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１５８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１５９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号１６８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１６９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１７２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１８３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１８４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１８５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号１９６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１９７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１９８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１９９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２００のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号２３８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２３９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２４０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２４１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２４２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２４３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘ）（ａ）配列番号２５２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２５３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２５５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２５６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２５７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号２８０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２８１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２８３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２８４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２８５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号２９４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２９７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２９９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、または
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号３２２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３２３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３２４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３２５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、請求項１から４のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項６】
ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、表５または６中の別の抗ＣＤＨ６抗体の対応するＣＤＲの対応する残基によって置換されている、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項７】
ＣＤＲ内の１個または２個のアミノ酸が修飾されている、欠失しているまたは置換されている、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号２３０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２３１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉ）配列番号２１６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号２７２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２７３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｖ）配列番号３１４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３１５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖ）配列番号２０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉ）配列番号３４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉ）配列番号４８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号４９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉｉ）配列番号６２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号６３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｘ）配列番号７６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号７７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘ）配列番号９０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号９１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉ）配列番号１０４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１０５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉ）配列番号１１８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１１９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉｉ）配列番号１３２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１３３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｖ）配列番号１４６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１４７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖ）配列番号１６０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１６１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉ）配列番号１７４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１７５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉ）配列番号１８８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１８９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２０２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２０３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｘ）配列番号２４４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２４５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘ）配列番号２５８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２５９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉ）配列番号２８６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２８７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉｉ）配列番号３００を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３０１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、または
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３２８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３２９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）
を含む、請求項１から４のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号２３４を含む重鎖および配列番号２３５を含む軽鎖、
（ｉｉ）配列番号２２０を含む重鎖および配列番号２２１を含む軽鎖、
（ｉｉｉ）配列番号２７６を含む重鎖および配列番号２７７を含む軽鎖、
（ｉｖ）配列番号３１８を含む重鎖および配列番号３１９を含む軽鎖、
（ｖ）配列番号２４を含む重鎖および配列番号２５を含む軽鎖、
（ｖｉ）配列番号３８を含む重鎖および配列番号３９を含む軽鎖、
（ｖｉｉ）配列番号５２を含む重鎖および配列番号５３を含む軽鎖、
（ｖｉｉｉ）配列番号６６を含む重鎖および配列番号６７を含む軽鎖、
（ｉｘ）配列番号８０を含む重鎖および配列番号８１を含む軽鎖、
（ｘ）配列番号９４を含む重鎖および配列番号９５を含む軽鎖、
（ｘｉ）配列番号１０８を含む重鎖および配列番号１０９を含む軽鎖、
（ｘｉｉ）配列番号１２２を含む重鎖および配列番号１２３を含む軽鎖、
（ｘｉｉｉ）配列番号１３６を含む重鎖および配列番号１３７を含む軽鎖、
（ｘｉｖ）配列番号１５０を含む重鎖および配列番号１５１を含む軽鎖、
（ｘｖ）配列番号１６４を含む重鎖および配列番号１６５を含む軽鎖、
（ｘｖｉ）配列番号１７８を含む重鎖および配列番号１７９を含む軽鎖、
（ｘｖｉｉ）配列番号１９２を含む重鎖および配列番号１９３を含む軽鎖、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２０６を含む重鎖および配列番号２０７を含む軽鎖、
（ｘｉｘ）配列番号２４８を含む重鎖および配列番号２４９を含む軽鎖、
（ｘｘ）配列番号２６２を含む重鎖および配列番号２６３を含む軽鎖、
（ｘｘｉ）配列番号２９０を含む重鎖および配列番号２９１を含む軽鎖、
（ｘｘｉｉ）配列番号３０４を含む重鎖および配列番号３０５を含む軽鎖、または
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３３２を含む重鎖および配列番号３３３を含む軽鎖
を含む、請求項１から４のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
前記可変軽鎖または可変重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持している、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または抗体断片である、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
前記リンカー（Ｌ）が切断可能リンカー、非切断可能リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ  ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する、請求項１２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）に由来する、請求項１３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
前記薬物部分（Ｄ）が、マイタンシノイド、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリア中のホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合物質およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
前記薬物部分がマイタンシノイドである、請求項１５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
前記マイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）である、請求項１６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
別の治療剤と組み合わせた、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
表１８に列挙する治療剤と組み合わせた、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
免疫調節分子と組み合わせた、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
式：
【化１】
2017524364.tif 000117
（式中、
ＡｂはヒトＣＤＨ６に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、ｎは１から１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２３】
前記抗体または抗原結合断片が、（配列番号４）でヒトＣＤＨ６のエピトープに特異的に結合する、請求項２２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
前記抗体またはその抗原結合断片が、（配列番号５３４）でヒトＣＤＨ６に特異的に結合する、請求項２２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２５】
前記Ａｂが、
（ｉ）（ａ）配列番号２２４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２２５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２２６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２２７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号２１０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２１１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２１３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２１４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２６６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２６７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２６８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２６９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２７０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２７１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｖ）（ａ）配列番号３０８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３０９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３１２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３１３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖ）（ａ）配列番号１４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉ）（ａ）配列番号２８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号４２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号４３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号５６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号５７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｘ）（ａ）配列番号７０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘ）（ａ）配列番号８４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号８５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号８７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号８９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉ）（ａ）配列番号９８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号９９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１００のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１０１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１０３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１１３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１１５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号１２６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１２７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１２９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号１４０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１４１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１４５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖ）（ａ）配列番号１５４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１５７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１５８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１５９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号１６８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１６９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１７２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１８３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１８４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１８５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号１９６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１９７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１９８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１９９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２００のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号２３８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２３９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２４０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２４１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２４２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２４３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘ）（ａ）配列番号２５２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２５３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２５５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２５６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２５７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号２８０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２８１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２８３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２８４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２８５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号２９４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２９７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２９９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、または
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号３２２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３２３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３２４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３２５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む抗体またはその抗原結合断片である、請求項２２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２６】
ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、表５または６中の別の抗ＣＤＨ６抗体の対応するＣＤＲの対応する残基によって置換されている、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
ＣＤＲ内の１個または２個のアミノ酸が修飾されている、欠失しているまたは置換されている、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号２３０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２３１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉ）配列番号２１６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号２７２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２７３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｖ）配列番号３１４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３１５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖ）配列番号２０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉ）配列番号３４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉ）配列番号４８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号４９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉｉ）配列番号６２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号６３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｘ）配列番号７６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号７７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘ）配列番号９０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号９１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉ）配列番号１０４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１０５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉ）配列番号１１８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１１９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉｉ）配列番号１３２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１３３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｖ）配列番号１４６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１４７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖ）配列番号１６０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１６１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉ）配列番号１７４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１７５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉ）配列番号１８８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１８９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２０２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２０３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｘ）配列番号２４４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２４５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘ）配列番号２５８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２５９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉ）配列番号２８６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２８７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉｉ）配列番号３００を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３０１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、または
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３２８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３２９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）
を含む、請求項２２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
前記可変軽鎖または可変重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持している、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３０】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または抗体断片である、請求項２２から２９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３１】
前記ｎが２から８の整数である、請求項２２から２９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３２】
前記ｎが３から４の整数である、請求項２２から２９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３３】
別の治療剤と組み合わせた、請求項２２から３２のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３４】
表１８に列挙する治療剤と組み合わせた、請求項２２から３２のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３５】
ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３６】
免疫調節分子と組み合わせた、前記請求項のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３７】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３８】
凍結乾燥物として調製される、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１から３２のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲートまたは請求項３７から３８に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする前記患者においてＣＤＨ６陽性がんを処置する方法。
【請求項４０】
前記がんが、卵巣がん、腎臓がん、肝臓がん、軟部組織がん、ＣＮＳがん、甲状腺がんおよび胆管細胞癌からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体薬物コンジュゲートまたは前記医薬組成物が、別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体薬物コンジュゲートまたは前記医薬組成物が、表１８に列挙する治療薬と組み合わせて投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体薬物コンジュゲートまたは前記医薬組成物が、ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と組み合わせて投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体薬物コンジュゲートまたは前記医薬組成物が、免疫調節分子と組み合わせて投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
医薬品としての使用のための、請求項１から３２のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項４６】
ＣＤＨ６陽性がんの処置における使用のための、請求項１から３２のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲートまたは請求項３７から３８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４７】
別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項４５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項４８】
表１８に列挙する治療剤と組み合わせて投与される、請求項４５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項４９】
ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、請求項４５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５０】
免疫調節分子と組み合わせた、請求項４５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５１】
請求項１から３０のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項５２】
請求項５１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５３】
請求項５２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
請求項５３に記載の宿主細胞を培養することおよび培養物から抗体を回収することを含む、抗体または抗原結合断片を産生するためのプロセス。
【請求項５５】
（ａ）Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）を薬物部分ＤＭ−４に化学的に連結すること、
（ｂ）前記リンカー−薬物を請求項５５に記載の細胞培養物から回収した抗体にコンジュゲートすること、および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製すること
を含む、抗ＣＤＨ６抗体薬物コンジュゲートを産生するためのプロセス。
【請求項５６】
ＵＶ分光光度計で測定された約３．５の平均マイタンシノイド対抗体比（ＭＡＲ）を有する、請求項５５に従って作製された抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５７】
（ｉ）（ａ）配列番号２２４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２２５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２２６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２２７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号２１０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２１１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２１３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２１４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２６６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２６７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２６８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２６９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２７０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２７１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｖ）（ａ）配列番号３０８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３０９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３１２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３１３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖ）（ａ）配列番号１４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉ）（ａ）配列番号２８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号４２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号４３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号５６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号５７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｘ）（ａ）配列番号７０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘ）（ａ）配列番号８４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号８５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号８７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号８９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉ）（ａ）配列番号９８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号９９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１００のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１０１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１０３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１１３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１１５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号１２６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１２７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１２９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号１４０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１４１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１４５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖ）（ａ）配列番号１５４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１５７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１５８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１５９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号１６８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１６９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１７２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１８３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１８４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１８５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号１９６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１９７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１９８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１９９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２００のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号２３８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２３９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２４０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２４１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２４２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２４３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘ）（ａ）配列番号２５２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２５３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２５５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２５６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２５７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号２８０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２８１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２８３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２８４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２８５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号２９４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２９７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２９９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、または
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号３２２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３２３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３２４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３２５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５８】
ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、表５または６中の別の抗ＣＤＨ６抗体の対応するＣＤＲの対応する残基によって置換されている、請求項５７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号２３０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２３１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉ）配列番号２１６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号２７２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２７３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｖ）配列番号３１４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３１５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖ）配列番号２０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉ）配列番号３４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉ）配列番号４８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号４９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉｉ）配列番号６２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号６３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｘ）配列番号７６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号７７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘ）配列番号９０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号９１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉ）配列番号１０４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１０５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉ）配列番号１１８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１１９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉｉ）配列番号１３２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１３３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｖ）配列番号１４６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１４７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖ）配列番号１６０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１６１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉ）配列番号１７４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１７５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉ）配列番号１８８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１８９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２０２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２０３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｘ）配列番号２４４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２４５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘ）配列番号２５８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２５９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉ）配列番号２８６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２８７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉｉ）配列番号３００を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３０１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、または
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３２８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３２９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）
を含む、請求項５７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６０】
標識されている請求項５７または５９に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む診断試薬。
【請求項６１】
前記標識が放射標識、フルオロフォア、クロモフォア、造影剤および金属イオンからなる群から選択される、請求項６０に記載の診断試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗ＣＤＨ６抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲートおよびがんの処置のためのそれらの使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
カドヘリンは、細胞間接着に関与する細胞接着分子のファミリーである。独自の結合特異性を有するサブクラスからなるファミリーには３０を超えるカドヘリン分子がある。上皮などの組織の発生および維持において重要な役割を演じる上皮（Ｅ）カドヘリン、神経（Ｎ）カドヘリンおよび胎盤（Ｐ）カドヘリンなどの十分に研究された古典的カドヘリンがある。カドヘリンファミリーは、カドヘリンを２個の群、Ｉ型およびＩＩ型に分けるそれらのアミノ酸類似性によっても分類されている。次いでカドヘリン−６（ＣＤＨ６）などの組織特異的カドヘリンがある。
【０００３】
ＣＤＨ６は、１９９５年に最初にクローニングされ、特徴付けられた（Shimoyama et al., Cancer Res. 1995: 55 (10)2206-2211）。Ｓｈｉｍｏｙａｍａによって単離されたＣＤＨ６  ｃＤＮＡは、４３１５ヌクレオチドであり、７９０アミノ酸のカドヘリンタンパク質をコードしており、ラットＫカドヘリンに９７％の相同性を示した（Shimoyama、上記）。ＣＤＨ６は、５個の細胞外カドヘリン反復、膜貫通ドメインおよび細胞質性ドメインを有するＩＩ型カドヘリンである。正常組織発現についての探索ではＣＤＨ６は、肺、膵臓および胃粘膜でのより弱い発現を伴って脳、小脳および腎臓で検出された。神経系ではＣＤＨ６は、聴覚系と体性感覚系との境界を示すことが見出された（Inoue et al., Mol. Cell Neuro. 2008: (39) 95-104）。ＣＤＨ６は、明るさ、移動方向または境界などの視覚の質に関与する眼の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のサブセットによって発現されることが実証された（Osterhout et al., Neuron 2011: 71(4)632-639）。ＣＤＨ６ノックアウトマウスではＣＤＨ６の欠如は軸索標的化の喪失を生じる。ＣＤＨ６変異体軸索は、適正に伸長し、それらの標的に適切に導かれたが、次いでそれらの連結を通り、超えて成長した（Osterhout、上記）。別の研究では、ＣＤＨ６ノックアウトマウスは啼鳴における欠陥を実証した（Nakagawa eta la., PLOS 2012: 7(11) e49233）。
【０００４】
がんにおけるその発現を検討し、ＣＤＨ６  ｃＤＮＡは肝細胞癌細胞系統からクローニングされ、それがこの種類のがんに関与する可能性があることの初期の徴候であった（Shimoyama、上記）。初期の研究は、いくつかの肝細胞腫系統においてＣＤＨ６発現を見出したが、正常な肝臓では発現を見出さなかった。後の研究では、グループは腎細胞癌を有する患者２１６名を分析し、ＣＤＨ６発現がこの種類のがんと相関することを見出した（Paul et al., J Urology 2004 (171): 97-101）。ＳｈｉｍａｚｕｉはＣＤＨ６を発現し、Ｅカドヘリン発現を欠いている腎細胞癌患者が予後不良であることを見出した（Shimazui et al., Clin. Cancer Res. 1998 (4): 2419-2424）。ＣＤＨ６がＴＧＦ−Ｂ標的であり、甲状腺がんにおいて役割を演じていることも発見された（Sancisi et al., PLoS One 2013; 8(9): e75489）。最後にＣＤＨ６は卵巣がんについてのバイオマーカーであることが示された（Kobel et al., PLoS One 2008 5(12): e232）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗体薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）は、がんの処置における細胞傷害剤の局所送達のために使用されている（例えばLambert, Curr. Opinion In Pharmacology 5:543-549, 2005を参照されたい）。ＡＤＣは、最少の毒性を伴って最大の有効性が達成され得る薬物部分の標的化送達を可能にする。さらにＡＤＣが有望な臨床結果を示すことから、がん治療のための新たな治療薬を開発するさらなる必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
式
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、
ＡｂはヒトＣＤＨ６のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｄは薬物部分であり、
ｍは１から８の整数であり、
ｎは１から１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
【０００７】
前記ｎが３または４である、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【０００８】
前記抗体またはその抗原結合断片がＣＤＨ６（配列番号４）の細胞外ドメインに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【０００９】
前記抗体または抗原結合断片が配列番号５３４でヒトＣＤＨ６のエピトープに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００１０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）（ａ）配列番号２２４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２２５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２２６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２２７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号２１０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２１１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２１３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２１４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２６６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２６７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２６８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２６９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２７０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２７１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｖ）（ａ）配列番号３０８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３０９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３１２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３１３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖ）（ａ）配列番号１４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉ）（ａ）配列番号２８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号４２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号４３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号５６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号５７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｘ）（ａ）配列番号７０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘ）（ａ）配列番号８４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号８５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号８７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号８９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉ）（ａ）配列番号９８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号９９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１００のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１０１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１０３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１１３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１１５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号１２６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１２７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１２９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号１４０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１４１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１４５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖ）（ａ）配列番号１５４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１５７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１５８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１５９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号１６８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１６９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１７２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１８３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１８４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１８５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号１９６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１９７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１９８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１９９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２００のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号２３８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２３９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２４０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２４１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２４２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２４３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘ）（ａ）配列番号２５２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２５３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２５５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２５６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２５７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号２８０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２８１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２８３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２８４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２８５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号２９４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２９７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２９９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、または
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号３２２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３２３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３２４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３２５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００１１】
ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、表５または６中の別の抗ＣＤＨ６抗体の対応するＣＤＲの対応する残基によって置換されている、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００１２】
ＣＤＲ内の１個または２個のアミノ酸が修飾されている、欠失しているまたは置換されている、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００１３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号２３０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２３１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉ）配列番号２１６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号２７２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２７３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｖ）配列番号３１４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３１５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖ）配列番号２０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉ）配列番号３４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉ）配列番号４８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号４９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉｉ）配列番号６２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号６３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｘ）配列番号７６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号７７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘ）配列番号９０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号９１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉ）配列番号１０４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１０５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉ）配列番号１１８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１１９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉｉ）配列番号１３２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１３３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｖ）配列番号１４６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１４７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖ）配列番号１６０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１６１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉ）配列番号１７４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１７５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉ）配列番号１８８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１８９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２０２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２０３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｘ）配列番号２４４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２４５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘ）配列番号２５８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２５９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉ）配列番号２８６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２８７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉｉ）配列番号３００を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３０１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、または
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３２８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３２９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）
を含む、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００１４】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号２３４を含む重鎖および配列番号２３５を含む軽鎖、
（ｉｉ）配列番号２２０を含む重鎖および配列番号２２１を含む軽鎖、
（ｉｉｉ）配列番号２７６を含む重鎖および配列番号２７７を含む軽鎖、
（ｉｖ）配列番号３１８を含む重鎖および配列番号３１９を含む軽鎖、
（ｖ）配列番号２４を含む重鎖および配列番号２５を含む軽鎖、
（ｖｉ）配列番号３８を含む重鎖および配列番号３９を含む軽鎖、
（ｖｉｉ）配列番号５２を含む重鎖および配列番号５３を含む軽鎖、
（ｖｉｉｉ）配列番号６６を含む重鎖および配列番号６７を含む軽鎖、
（ｉｘ）配列番号８０を含む重鎖および配列番号８１を含む軽鎖、
（ｘ）配列番号９４を含む重鎖および配列番号９５を含む軽鎖、
（ｘｉ）配列番号１０８を含む重鎖および配列番号１０９を含む軽鎖、
（ｘｉｉ）配列番号１２２を含む重鎖および配列番号１２３を含む軽鎖、
（ｘｉｉｉ）配列番号１３６を含む重鎖および配列番号１３７を含む軽鎖、
（ｘｉｖ）配列番号１５０を含む重鎖および配列番号１５１を含む軽鎖、
（ｘｖ）配列番号１６４を含む重鎖および配列番号１６５を含む軽鎖、
（ｘｖｉ）配列番号１７８を含む重鎖および配列番号１７９を含む軽鎖、
（ｘｖｉｉ）配列番号１９２を含む重鎖および配列番号１９３を含む軽鎖、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２０６を含む重鎖および配列番号２０７を含む軽鎖、
（ｘｉｘ）配列番号２４８を含む重鎖および配列番号２４９を含む軽鎖、
（ｘｘ）配列番号２６２を含む重鎖および配列番号２６３を含む軽鎖、
（ｘｘｉ）配列番号２９０を含む重鎖および配列番号２９１を含む軽鎖、
（ｘｘｉｉ）配列番号３０４を含む重鎖および配列番号３０５を含む軽鎖、または
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３３２を含む重鎖および配列番号３３３を含む軽鎖
を含む、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００１５】
可変軽鎖または可変重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持している、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００１６】
抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体（human engineered andtibody）、ヒト抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または抗体断片である、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００１７】
前記リンカー（Ｌ）が切断可能リンカー、非切断可能リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【００１８】
リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ  ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【００１９】
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【００２０】
前記薬物部分（Ｄ）が、マイタンシノイド、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリア中のホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合物質およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００２１】
薬物部分がマイタンシノイドである、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００２２】
マイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）である、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００２３】
別の治療剤と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００２４】
表１８に列挙する治療剤と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００２５】
ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００２６】
免疫調節分子と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００２７】
式：
【００２８】
【化１】
2017524364.tif 000002
（式中、
ＡｂはヒトＣＤＨ６に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、ｎは１から１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
【００２９】
前記抗体または抗原結合断片が、（配列番号４）でヒトＣＤＨ６のエピトープに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、（配列番号５３４）でヒトＣＤＨ６に特異的に結合する、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３１】
前記Ａｂが、
（ｉ）（ａ）配列番号２２４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２２５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２２６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２２７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号２１０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２１１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２１３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２１４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２６６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２６７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２６８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２６９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２７０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２７１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｖ）（ａ）配列番号３０８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３０９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３１２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３１３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖ）（ａ）配列番号１４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉ）（ａ）配列番号２８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号４２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号４３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号５６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号５７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｘ）（ａ）配列番号７０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘ）（ａ）配列番号８４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号８５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号８７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号８９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉ）（ａ）配列番号９８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号９９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１００のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１０１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１０３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１１３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１１５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号１２６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１２７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１２９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号１４０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１４１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１４５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖ）（ａ）配列番号１５４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１５７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１５８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１５９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号１６８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１６９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１７２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１８３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１８４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１８５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号１９６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１９７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１９８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１９９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２００のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号２３８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２３９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２４０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２４１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２４２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２４３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘ）（ａ）配列番号２５２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２５３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２５５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２５６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２５７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号２８０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２８１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２８３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２８４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２８５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号２９４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２９７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２９９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、または
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号３２２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３２３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３２４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３２５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む抗体またはその抗原結合断片である、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３２】
ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、表５または６中の別の抗ＣＤＨ６抗体の対応するＣＤＲの対応する残基によって置換されている、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３３】
ＣＤＲ内の１個または２個のアミノ酸が修飾されている、欠失しているまたは置換されている、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３４】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号２３０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２３１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉ）配列番号２１６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号２７２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２７３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｖ）配列番号３１４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３１５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖ）配列番号２０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉ）配列番号３４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉ）配列番号４８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号４９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉｉ）配列番号６２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号６３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｘ）配列番号７６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号７７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘ）配列番号９０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号９１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉ）配列番号１０４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１０５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉ）配列番号１１８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１１９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉｉ）配列番号１３２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１３３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｖ）配列番号１４６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１４７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖ）配列番号１６０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１６１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉ）配列番号１７４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１７５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉ）配列番号１８８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１８９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２０２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２０３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｘ）配列番号２４４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２４５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘ）配列番号２５８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２５９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉ）配列番号２８６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２８７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉｉ）配列番号３００を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３０１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、または
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３２８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３２９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）
を含む、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３５】
可変軽鎖または可変重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持している、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３６】
抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または抗体断片である、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３７】
前記ｎが２から８の整数である、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３８】
前記ｎが３から４の整数である、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００３９】
別の治療剤と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００４０】
表１８に列挙する治療剤と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００４１】
ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００４２】
免疫調節分子と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００４３】
先行する実施形態のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【００４４】
凍結乾燥物として調製される、先行する実施形態のいずれかに記載の医薬組成物。
【００４５】
前記凍結乾燥物が、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート、コハク酸ナトリウムおよびポリソルベート２０を含む、先行する実施形態のいずれかの医薬組成物。
【００４６】
抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする前記患者においてＣＤＨ６陽性がんを処置する方法。
【００４７】
前記がんが、卵巣がん、腎臓がん、肝臓がん、軟部組織がん、ＣＮＳがん、甲状腺がんおよび胆管細胞癌からなる群から選択される、方法。
【００４８】
抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物が、別の治療剤と組み合わせて投与される、方法。
【００４９】
抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物が、表１８に列挙する治療薬と組み合わせて投与される、方法。
【００５０】
ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００５１】
免疫調節分子と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００５２】
医薬品としての使用のための、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００５３】
ＣＤＨ６陽性がんの処置における使用のための抗体薬物コンジュゲートまたはその医薬組成物。
【００５４】
別の治療剤と組み合わせて投与される、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００５５】
表１８に列挙する治療剤と組み合わせて投与される、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００５６】
ＢＣＬ２阻害剤、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＢＣＬ２／ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００５７】
免疫調節分子と組み合わせた、先行する実施形態のいずれかの抗体薬物コンジュゲート。
【００５８】
先行する実施形態のいずれかの抗体または抗原結合断片をコードする核酸。
【００５９】
先行する実施形態のいずれかの核酸を含むベクター。
【００６０】
先行する実施形態のいずれかのベクターを含む宿主細胞。
【００６１】
宿主細胞を培養することおよび培養物から抗体を回収することを含む、抗体または抗原結合断片を産生するためのプロセス。
【００６２】
（ａ）Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）を薬物部分ＤＭ−４に化学的に連結すること、
（ｂ）前記リンカー−薬物を細胞培養物から回収した抗体にコンジュゲートすること、および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製すること
を含む、抗ＣＤＨ６抗体薬物コンジュゲートを産生するためのプロセス。
【００６３】
ＵＶ分光光度計で測定された約３．５の平均マイタンシノイド対抗体比（ＭＡＲ）を有する、先行する実施形態のいずれかに従って作製された抗体薬物コンジュゲート。
【００６４】
（ｉ）（ａ）配列番号２２４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２２５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２２６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２２７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号２１０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２１１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２１３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２１４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２６６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２６７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２６８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２６９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２７０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２７１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｖ）（ａ）配列番号３０８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３０９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３１２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３１３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖ）（ａ）配列番号１４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉ）（ａ）配列番号２８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号４２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号４３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号５６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号５７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｘ）（ａ）配列番号７０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘ）（ａ）配列番号８４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号８５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号８７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号８９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉ）（ａ）配列番号９８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号９９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１００のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１０１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１０３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１１３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１１５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号１２６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１２７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１２９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号１４０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１４１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１４５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖ）（ａ）配列番号１５４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１５７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１５８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１５９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号１６８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１６９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１７２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１８３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１８４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１８５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号１９６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１９７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１９８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１９９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２００のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号２３８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２３９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２４０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２４１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２４２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２４３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘ）（ａ）配列番号２５２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２５３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２５５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２５６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２５７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号２８０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２８１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２８３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２８４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２８５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号２９４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２９７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２９９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、または
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号３２２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３２３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３２４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３２５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含む抗体またはその抗原結合断片。
【００６５】
ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、表５または６中の別の抗ＣＤＨ６抗体の対応するＣＤＲの対応する残基によって置換されている、先行する実施形態のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
【００６６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号２３０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２３１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉ）配列番号２１６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号２７２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２７３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｖ）配列番号３１４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３１５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖ）配列番号２０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉ）配列番号３４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉ）配列番号４８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号４９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｖｉｉｉ）配列番号６２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号６３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｉｘ）配列番号７６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号７７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘ）配列番号９０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号９１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉ）配列番号１０４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１０５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉ）配列番号１１８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１１９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｉｉ）配列番号１３２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１３３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｖ）配列番号１４６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１４７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖ）配列番号１６０を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１６１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉ）配列番号１７４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１７５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉ）配列番号１８８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号１８９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２０２を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２０３を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｉｘ）配列番号２４４を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２４５を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘ）配列番号２５８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２５９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉ）配列番号２８６を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号２８７を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、
（ｘｘｉｉ）配列番号３００を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３０１を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）、または
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３２８を含む重鎖可変領域（ｖＨ）および配列番号３２９を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）
を含む、先行する実施形態のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
【００６７】
標識されている先行する実施形態のいずれかの抗体またはその抗原結合断片を含む診断試薬。
【００６８】
標識が放射標識、フルオロフォア、クロモフォア、造影剤および金属イオンからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかの診断試薬。
【００６９】
定義
他に述べる場合を除いて、本明細書において使用される以下の用語および句は以下の意味を有すると意図される：
【００７０】
用語「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有する一価飽和炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１−６アルキルは、１個から６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基は、直鎖状または分枝状であってよい。代表的な分枝状アルキル基は、１個、２個または３個の分枝を有する。アルキル基の例は、これだけに限らないが、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチル）、ペンチル（ｎ−ペンチル、イソペンチルおよびネオペンチル）ならびにヘキシルを含む。
【００７１】
本明細書において使用される用語「抗体」は、対応する抗原に非共有結合的、可逆的および特異的様式で結合できる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例えば天然に存在するＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって相互結合された少なくとも２個の重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖を含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が組み入れられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高頻度可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４で配置された３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介できる。
【００７２】
用語「抗体」は、これだけに限らないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含む。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であってよい。
【００７３】
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、ＶＬおよびＶＨの高頻度可変性領域を互換的に指す。ＣＤＲは、そのような標的タンパク質に対する特異性を有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶＬまたはＶＨ中に、可変ドメインの約１５〜２０％を構成する３個のＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から逐次的に番号付けられる）がある。ＣＤＲは、それらの領域および順番によって呼ばれる場合がある。例えば「ＶＨＣＤＲ１」または「ＨＣＤＲ１」は、両方とも重鎖可変領域の第１のＣＤＲを指す。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに構造的に相補性であり、それにより結合特異性に直接関与している。ＶＬまたはＶＨの残りのストレッチ、いわゆるフレームワーク領域は、アミノ酸配列においてあまりバリエーションを示さない（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
【００７４】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当技術分野において周知の種々の定義、例えば、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＡｂＭを使用して決定され得る（例えばJohnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)、Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)、Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)、Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)を参照されたい）。抗原結合部位の定義も以下に記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)、MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)、Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991)およびRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
【００７５】
軽鎖および重鎖の両方は、構造的および機能的に相同な領域に分割される。用語「定常」および「可変」は機能的に使用される。これに関して、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することは理解される。反対に軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤性移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を与える。慣習により、定常領域ドメインの番号付けは抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬドメインは実際に重鎖および軽鎖それぞれのカルボキシ末端ドメインを含む。
【００７６】
本明細書において使用される用語「抗原結合断片」は、抗原のエピトープと特異的に（例えば結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）相互作用する能力を保持している抗体の１つまたは複数の部分を含むポリペプチドを指す。結合断片の例は、これだけに限らないが、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエピトープ結合断片を含む。
【００７７】
さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別の遺伝子によってコードされているが、それらは組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が一価分子を形成するように対合する単一のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーによって繋がれてよい（一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）としても公知、例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988を参照されたい）。そのような一本鎖抗体も用語「抗原結合断片」に包含されることが意図される。これらの抗原結合断片は、従来の当業者に公知の技術を使用して得られ、断片はインタクトな抗体と同様の様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００７８】
抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディー、ミニボディー、ナノボディー、イントラボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込まれてもよい（例えばHollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照されたい）。抗原結合断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づくスキャホールドに移植されてよい（フィブロネクチンポリペプチドモノボディーを記載している米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。
【００７９】
抗原結合断片は、相補性軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成する縦列Ｆｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む一本鎖分子に組み込まれてよい（Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００８０】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するまたは同じ遺伝的供給源に由来する抗体および抗原結合断片を含むポリペプチドを指す。この用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、具体的なエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
【００８１】
本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに抗体が定常領域を含有する場合、定常領域も例えばヒト生殖系列配列もしくはヒト生殖系列配列の変異バージョンなどのヒト配列または例えばKnappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000に記載のとおりヒトフレームワーク配列分析由来のコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来する。
【００８２】
本開示のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基を含み得る（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの無作為もしくは部位特異的変異誘発によってまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換）。
【００８３】
本明細書において使用される用語「認識する」は、エピトープが直鎖状または立体構造的であるかに関わらず、エピトープを見出し、相互作用する（例えば結合する）抗体またはその抗原結合断片を指す。用語「エピトープ」は、開示の抗体または抗原結合断片が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは近接アミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非近接アミノ酸の両方から形成され得る。近接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への曝露で保持されるが、一方三次フォールディングによって形成されるエピトープは典型的には変性溶媒での処置で失われる。エピトープは、独自の空間的立体構造中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を典型的には含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法は、当技術分野における技術、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴を含む（例えばEpitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい）。「パラトープ」は、抗原のエピトープを認識する抗体の部分である。
【００８４】
句「特異的に結合」または「選択的に結合」は、抗原（例えばタンパク質）と抗体、抗体断片または抗体由来結合剤との間の相互作用を記載する場面において使用される場合、タンパク質および他の生物製剤、例えば生物学的試料、例えば血液、血清、血漿または組織試料中の不均一な集団における抗原の存在の決定要因である結合反応を指す。したがって、ある特定のイムノアッセイ条件下で、具体的な結合特異性を有する抗体または結合剤は、具体的な抗原にバックグラウンドの少なくとも２倍で結合し、試料中に存在する他の抗原に顕著な量では実質的に結合しない。一態様では、特定のイムノアッセイ条件下で、具体的な結合特異性を有する抗体または結合剤は、具体的な抗原にバックグラウンドの少なくとも１０（１０）倍で結合し、試料中に存在する他の抗原に顕著な量では実質的に結合しない。そのような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、抗体または薬剤が具体的なタンパク質に対するその特異性について選択されていることを必要とする。所望によりまたは好適にはこの選択は、他の種（例えばマウスもしくはラット）または他のサブタイプ由来の分子と交差反応する抗体を除外することによって達成され得る。代替的にいくつかの態様では、抗体または抗体断片は、特定の望ましい分子との交差反応で選択される。
【００８５】
本明細書において使用される用語「親和性」は、単一の抗原性部位での抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位では、抗体「腕」の可変領域は、弱い非共有結合力を通じて抗原と多数の部位で相互作用し、相互作用が多ければ多いほど、親和性が強い。
【００８６】
用語「単離された抗体」は、異なる抗原特異的を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。１個の抗原に特異的に結合する単離された抗体は、しかし、他の抗原に交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００８７】
用語「対応するヒト生殖系列配列」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされるすべての他の公知の可変領域アミノ酸配列と比較して参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列に最も高く決定されたアミノ酸配列同一性を共有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列は、他のすべての評価された可変領域アミノ酸配列と比較して参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列に最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列も指す場合がある。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域だけ、相補性決定領域だけ、フレームワークおよび相補性決定領域、可変性セグメント（上に定義のとおり）または可変領域を含む配列もしくはサブ配列の他の組合せであってよい。配列同一性は、本明細書に記載の方法を使用して、例えば、２個の配列をＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたは当技術分野において公知の別のアラインメントアルゴリズムを使用してアラインさせて決定され得る。対応するヒト生殖系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域核酸またはアミノ酸配列に少なくとも約９０％、９１、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する場合がある。
【００８８】
多種多様なイムノアッセイフォーマットが具体的なタンパク質に特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用できる。例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質に特異的に免疫反応性である抗体を選択するために日常的に使用されている（特異的免疫反応性を決定するために使用できるイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載について例えばHarlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい）。典型的には特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルを少なくとも２倍超えるシグナルを産生し、さらに典型的にはバックグラウンドを少なくとも１０から１００倍超える。
【００８９】
用語「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」は、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を会合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で割ったものを指す。平衡解離定数は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定され得る。一般に本開示の抗体は、約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、いくつかの態様では、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有する。
【００９０】
用語「生物学的利用能」は、患者に投与された薬物の所与の量の全身性利用能（すなわち、血液／血漿レベル）を指す。生物学的利用能は、時間（速度）および投与された投薬形態から全身循環に達した薬物の合計量（程度）の両方の測定を示す絶対項である。
【００９１】
本明細書において使用される句「から本質的になる」は、方法または組成物に含まれる活性医薬品の属または種、および方法または組成物の意図する目的のために不活性である任意の賦形剤を指す。いくつかの態様では、句「から本質的になる」は、本開示の抗体薬物コンジュゲート以外の１つまたは複数の追加的活性剤の包含を明確に排除する。いくつかの態様では、句「から本質的になる」は、本開示の抗体薬物コンジュゲート以外の１つまたは複数の追加的活性剤および第２の同時投与剤の包含を明確に排除する。
【００９２】
用語「アミノ酸」は、天然に存在する、合成および非天然アミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびにその後修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学的構造、すなわち水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学的構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似する様式で機能する化学的化合物を指す。
【００９３】
用語「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。具体的な核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えばコドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。それによりアラニンがコドンによって特定されるすべての位置で、コドンはコードされるポリペプチドを変更することなく記載された対応するコドンのいずれかに変更されてよい。そのような核酸バリエーションは、保存的に修飾されたバリエーションの１つの種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレントバリエーションも記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が機能的に同一の分子を得るために修飾されてよいことを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載の各配列に潜在している。
【００９４】
ポリペプチド配列について「保存的に修飾されたバリアント」は、化学的に類似するアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じるポリペプチド配列への個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、多形性バリアント、種間ホモログおよび対立遺伝子に付加的であり、それを排除しない。以下の８個の群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えばCreighton, Proteins (1984)を参照されたい）。いくつかの態様では、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に顕著に影響を与えない、または変更しないアミノ酸修飾を指して使用される。
【００９５】
本明細書において使用される用語「最適化」は生細胞または生物、一般に真核細胞、例えば酵母細胞、ピキア細胞、真菌細胞、トリコデルマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変更されたヌクレオチド配列を指す。最適なヌクレオチド配列は、「親」配列としても公知である、開始ヌクレオチド配列によって本来はコードされたアミノ酸配列を完全にまたは可能な限り保持するように操作される。
【００９６】
２個以上の核酸またはポリペプチド配列の場面では、用語「同一百分率」または「同一性百分率」は、２個以上の配列またはサブ配列が同一である程度を指す。２個の配列は、それらが比較される領域にわたってアミノ酸またはヌクレオチドの同じ配列を有する場合に「同一」である。２個の配列は以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手作業でのアラインメントおよび目視によって測定した比較ウインドウまたは指定領域にわたる最大一致について比較しアラインさせた場合に、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの具体的な百分率を２個の配列が有する（すなわち、特定の領域にわたってまたは特定されない場合は配列全体にわたって６０％同一、任意選択で６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一）場合に「実質的に同一」である。任意選択で同一性は、長さ少なくとも約３０ヌクレオチド（もしくは１０アミノ酸）またはより好ましくは長さ１００から５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（またはアミノ酸２０、５０、２００以上）である領域にわたって存在する。
【００９７】
配列比較について、典型的には１個の配列が検査配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、検査および参照配列はコンピューターに入力され、サブ配列座標は必要に応じて指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。初期設定プログラムパラメーターは使用されてよく、または代替パラメーターが指定されてよい。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて参照配列と比較した検査配列についての同一性配列百分率を算出する。
【００９８】
本明細書において使用される「比較ウインドウ」は、２個の配列が最適にアラインした後に配列が同じ数の近接位置の参照配列と比較され得る２０個から６００個、通常約５０個から約２００個、さらに通常では約１００個から約１５０個からなる群から選択される数の近接位置のいずれか１個のセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばSmith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)の局所相同アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似方法に関する探索によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手作業のアラインメントおよび目視（例えばBrent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003を参照されたい）によって実施され得る。
【００９９】
配列同一性百分率および配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムの２個の例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインさせた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴに合致するまたは満たすのいずれかであるクエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによってスコアが高い配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、上記）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出す探索を開始するための種として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（合致する残基対についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（適合しない残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列についてスコアマトリクスは、累積スコアを算出するために使用される。各方向でのワードヒットの伸長は：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下がっている；１つまたは複数の負のスコア残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に達する場合に停止されてよい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を初期値として使用する。アミノ酸配列についてＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長および１０の予測（Ｅ）ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を初期値として使用する。
【０１００】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２個の配列間の類似性の統計解析も実施する（例えばKarlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の合致が偶然生じる可能性の指標を提供する。例えば核酸は、検査核酸と参照核酸との比較において最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満および最も好ましくは約０．００１未満である場合に参照配列に類似していると考えられる。
【０１０１】
２個のアミノ酸配列間の同一性百分率は、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、１２のｇａｐ長ペナルティーおよび４のｇａｐペナルティーを使用してＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられたE. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。追加的に２個のアミノ酸配列間の同一性百分率は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のｇａｐウエイトおよび１、２、３、４、５または６のウエイト長を使用してＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970）アルゴリズムを使用して決定されてもよい。
【０１０２】
上に記載の配列同一性百分率以外で、２個の核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、第１の核酸によってコードされたポリペプチドが、上に記載のとおり第２の核酸によってコードされたポリペプチドに対して生じさせた抗体に免疫学的に交差反応性であることである。したがってポリペプチドは、例えば２個のペプチドが保存的置換によってだけ異なっている場合、典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２個の核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下に記載のとおり、２個の分子またはそれらの相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２個の核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーが配列を増幅するために使用できることである。
【０１０３】
用語「核酸」は用語「ポリヌクレオチド」と本明細書において互換的に用いられ、一本鎖または二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボ核酸またはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。用語は、合成である、天然に存在するおよび天然に存在せず、参照核酸と類似の結合特性を有する、および参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは連結を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例は、非限定的にホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、メチルホスホン酸、キラル−メチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【０１０４】
他に示す場合を除いて、具体的な核酸配列もその保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補性配列、ならびに明確に示された配列を暗黙の内に包含する。具体的には、下に詳述するとおり、縮重したコドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第三位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608およびRossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
【０１０５】
核酸の場面では用語「作動可能に連結した」は２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。典型的にはそれは、転写制御配列の転写される配列との機能的関係を指す。例えばプロモーターまたはエンハンサー配列は、適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合にコード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されるプロモーター転写制御配列は、転写される配列に物理的に近接している、すなわちそれらはｃｉｓ作用性である。しかしエンハンサーなどのいくつかの転写制御配列は、物理的に近接である、またはその転写をそれらが増強するコード配列に近接近で位置付けられる必要はない。
【０１０６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においてアミノ酸残基のポリマーを指して互換的に用いられる。用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。他に示す場合を除いて、具体的なポリペプチド配列もその保存的に修飾されたバリアントを暗黙の内に包含する。
【０１０７】
本明細書において使用される用語「イムノコンジュゲート」または「抗体薬物コンジュゲート」は、抗体またはその抗原結合断片とペイロード、薬物部分、化学療法剤、毒素、免疫療法剤、造影プローブなどの別の薬剤との連結を指す。連結は、共有結合、または静電力を通じたものなどの非共有結合的相互作用であってよい。当技術分野において公知の種々のリンカーは、イムノコンジュゲートを形成するために用いられてよい。追加的にイムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドから発現され得る融合タンパク質の形態で提供されてよい。本明細書において使用される「融合タンパク質」は、本来は別のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）をコードする２つ以上の遺伝子または遺伝子断片を繋ぐことを通じて作製されたタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、それぞれの元のタンパク質に由来する機能的特性を有する単一のタンパク質を生じる。
【０１０８】
用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類およびは虫類などの哺乳動物および非哺乳動物を含む。記載される場合を除いて、用語「患者」または「対象」は、本明細書で互換的に用いられる。
【０１０９】
本明細書において使用される用語「毒素」、「細胞毒」または「細胞傷害剤」は、細胞の成長および増殖に有害であり、細胞または悪性腫瘍を低減、阻害または破壊するように作用できる任意の薬剤を指す。
【０１１０】
本明細書において使用される用語「抗がん剤」は、これだけに限らないが、細胞傷害剤、化学療法剤、放射線治療および放射線治療剤、標的化抗がん剤および免疫治療剤を含むがんなどの細胞増殖性障害を処置するために使用できる任意の薬剤を指す。
【０１１１】
本明細書において使用される用語「薬物部分」または「ペイロード」は、抗体または抗原結合断片にコンジュゲートされる化学的部分を指し、任意の治療剤または診断剤、例えば抗がん剤、抗炎症剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤）または麻酔剤を含む場合がある。特定の態様では、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコンドリア中のホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、プロテアソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合物質およびＤＨＦＲ阻害剤から選択される。これらそれぞれを抗体に適合性のリンカーに接着するための方法および本開示の方法は当技術分野において公知である。例えばSingh et al., (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457を参照されたい。付加的にペイロードは、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外線プローブ、親和性プローブ、キレーター、分光学的プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、糖類または多糖類であってよい。
【０１１２】
用語「マイタンシノイド薬物部分」は、マイタンシノイド化合物の構造を有する抗体薬物コンジュゲートの部分構造を意味する。マイタンシンは、東アフリカの低木メイテナス・セラタ（Maytenus serrata）から最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。次いで、ある種の微生物もマイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイド類を産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体が報告されている。米国特許第４，１３７，２３０号明細書、米国特許第４，２４８，８７０号明細書、米国特許第４，２５６，７４６号明細書、米国特許第４，２６０，６０８号明細書、米国特許第４，２６５，８１４号明細書、米国特許第４，２９４，７５７号明細書、米国特許第４，３０７，０１６号明細書、米国特許第４，３０８，２６８号明細書、米国特許第４，３０８，２６９号明細書、米国特許第４，３０９，４２８号明細書、米国特許第４，３１３，９４６号明細書、米国特許第４，３１５，９２９号明細書、米国特許第４，３１７，８２１号明細書、米国特許第４，３２２，３４８号明細書、米国特許第４，３３１，５９８号明細書、米国特許第４，３６１，６５０号明細書、米国特許第４，３６４，８６６号明細書、米国特許第４，４２４，２１９号明細書、米国特許第４，４５０，２５４号明細書、米国特許第４，３６２，６６３号明細書および米国特許第４，３７１，５３３号明細書ならびにKawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451を参照されたい、それぞれは明確に参照により組み込まれる。コンジュゲーションのために有用なマイタンシノイド類の具体的な例は、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４を含む。
【０１１３】
「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず新生細胞成長および増殖、すべての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。
【０１１４】
用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞増殖速度、生存率または転移活性における低減を意味する。抗腫瘍活性を示す可能性がある方法は、腫瘍細胞の成長速度の低下、腫瘍サイズ停滞または腫瘍サイズ低減を示すことである。そのような活性は、これだけに限らないが異種移植モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデルおよび抗腫瘍活性を調査するために当技術分野において公知である他の周知のモデルを含む承認されたｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルを使用して評価され得る。
【０１１５】
用語「悪性腫瘍」は、非良性腫瘍またはがんを指す。本明細書において使用される用語「がん」は、制御されていないまたは調節されていない細胞成長によって特徴付けられる悪性腫瘍を含む。例示的がんは：癌、肉腫、白血病およびリンパ腫を含む。
【０１１６】
用語「がん」は、原発性悪性腫瘍（例えば、その細胞が元の腫瘍の部位以外の対象の身体の部位に転移していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、転移、元の腫瘍の部位とは異なる二次部位への腫瘍細胞の転移から生じたもの）を含む。
【０１１７】
用語「カドヘリン６」または「ＣＤＨ６」は、細胞間接着分子のカドヘリンファミリーのメンバーである細胞間接着分子を指す。ＣＤＨ６の核酸およびアミノ酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ２９１２９０（タンパク質受託番号ＢＡＦ８３９７９．１）で公開されている。ヒトＣＤＨ６  ｃＤＮＡ配列について配列番号１およびヒトＣＤＨ６タンパク質配列について配列番号２も参照されたい。構造的にＣＤＨ６受容体は、５個の細胞外カドヘリン反復を有するＩＩ型カドヘリンであり、その全長にわたって少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を配列番号２のアミノ酸配列に有する。構造的にＣＤＨ６核酸配列は、その全長にわたって少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を配列番号１の核酸配列に有する。
【０１１８】
用語「ＣＤＨ６発現がん」または「ＣＤＨ６陽性がん」は、がん細胞の表面上にＣＤＨ６および／またはＣＤＨ６の変異形態を発現しているがんを指す。
【０１１９】
本明細書において使用される用語、任意の疾患または障害の「処置（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、一態様では、疾患または障害を回復させること（すなわち疾患またはその少なくとも１つの臨床症状の発生を遅くするまたは抑止するまたは低減すること）を指す。別の態様では、「処置（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、患者によって識別可能ではない場合があるものを含む少なくとも１つの身体的パラメーターを緩和するまたは回復させることを指す。さらに別の態様では、「処置（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、身体的に（例えば識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば身体的パラメーターの安定化）のいずれかまたは両方で疾患または障害を調節することを指す。さらに別の態様では、「処置（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患または障害の発症または発生または進行を予防するまたは遅延させることを指す。
【０１２０】
用語「治療的に許容される量」または「治療有効用量」は、所望の結果をもたらす（すなわち腫瘍サイズにおける低減、腫瘍成長の阻害、転移の防止、ウイルス性、細菌性、真菌性または寄生虫感染の阻害または防止）ために十分な量を互換的に指す。いくつかの態様では、治療的に許容される量は、望ましくない副作用を誘導せず、生じない。治療的に許容される量は、最初に低用量を投与し、次いで所望の結果が達成されるまで用量を徐々に増加させることによって決定され得る。本開示の分子の「予防有効投与量」および「治療有効投与量」は、それぞれがんに伴う症状を含む疾患症状の発症を予防できる、または重症度の減少を生じることができる。
【０１２１】
用語「同時投与」は、個体の血液中に２個の活性剤が同時に存在することを指す。同時投与される活性剤は、同時にまたは逐次的に送達されてよい。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】ＯＶＣＡＲ３細胞上の抗ＣＤＨ６抗体細胞性結合ＥＣ５０を示すグラフである。
【図２】抗ＣＤＨ６抗体のエピトープビニングを示す表である。
【図３】ＣＤＨ６の５個のＥＣドメインの重水素マッピングを示す図である。
【図４】ＣＤＨ２  ＥＣＤの公知の構造に重ねたＣＤＨ６  ＥＣ５ドメインに結合しているＮＯＶ０７１０結合の結晶構造を示す図である。
【図５】ＣＤＨ６に結合しているＮＯＶ０７１２の結晶構造を示す図である。
【図６】ＣＤＨ６に結合しているＮＯＶ０７１０の結晶構造を示す図である。
【図７】３個の抗ＣＤＨ６抗体がＣＤＨ６の変異形態に結合する能力を示すＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。
【図８】ヒト、カニクイザル、ラットまたはマウスＣＤＨ６を発現しているＣＨＯ細胞株に結合している、未コンジュゲートまたはスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー／ペイロードにコンジュゲートされたのいずれかでの抗ＣＤＨ６抗体のＦＡＣＳデータを示す図である。
【図９】ＣＤＨ６がトランスフェクトされた株およびＣＤＨ６  ｓｉＲＮＡノックダウン株を含む、卵巣がん細胞株でのＣＤＨ６発現レベルを示すＦＡＣＳグラフである。
【図１０】卵巣がん細胞株のパネルでの未コンジュゲートまたはスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー／ペイロードにコンジュゲートされたのいずれかの抗ＣＤＨ６抗体を示す図である。
【図１１】卵巣がん細胞株上でＤＭ１またはＤＭ４にコンジュゲートされた場合の抗ＣＤＨ６抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す図である。
【図１２】未コンジュゲート抗ＣＤＨ６抗体またはスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４にコンジュゲートされた抗ＣＤＨ６  抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す図である。
【図１３】ＤＭ１にコンジュゲートされ、卵巣がん異種移植マウスモデルにおいて検査した抗ＣＤＨ６抗体の有効性を実証するグラフである。
【図１４】ＤＭ１にコンジュゲートされ、卵巣がん異種移植マウスモデルにおいて検査した抗ＣＤＨ６抗体の有効性を実証するグラフである。
【図１５】ＳＰＤＢ−ＤＭ４にコンジュゲートされ、卵巣がん異種移植マウスモデルにおいて検査した抗ＣＤＨ６抗体の有効性を示すグラフである。
【図１６】卵巣がん異種移植マウスモデルにおいてＮＯＶ０７１２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４とＮＯＶ０７１２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１との有効性を比較するグラフである。
【図１７】卵巣がんの患者由来原発性腫瘍異種移植（ＰＴＸ）マウスモデルにおけるＳＰＤＢ−ＤＭ４、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびＳＭＣＣ−ＤＭ１リンカー／ペイロード組合せを伴うＮＯＶ０７１２の有効性を比較するグラフである。
【図１８】卵巣がん異種移植マウスモデルにおいてＳＰＤＢ−ＤＭ４またはスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４にコンジュゲートした場合のＮＯＶ０７１２のさまざまな用量の有効性を示すグラフである。
【図１９】患者由来原発性卵巣腫瘍異種移植マウスモデルにおいてスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を伴うＮＯＶ０７１２とＳＭＣＣ−ＤＭ１のリンカーペイロード組合せとを比較するグラフである。
【図２０】卵巣がんの患者由来原発性異種移植マウスモデルにおけるスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４にコンジュゲートされた抗ＣＤＨ６抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を実証するグラフである。
【図２１】腎臓がんの患者由来原発性異種移植マウスモデルにおけるスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４にコンジュゲートされた抗ＣＤＨ６抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を実証するグラフである。
【図２２】腎臓がんの患者由来原発性異種移植マウスモデルにおけるスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４にコンジュゲートされた抗ＣＤＨ６抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を実証するグラフである。
【図２３】腎臓がんの患者由来原発性異種移植マウスモデルにおけるスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４にコンジュゲートされた抗ＣＤＨ６抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示すグラフである。
【図２４】ＢＣＬ２／ＢＣＬ−Ｘｌ、ＢＣＬ−Ｘｌ、ＩＡＰおよびＭＥＫ阻害剤を伴うＣＤＨ６標的化ＡＤＣの組合せ活性についてのＬｏｅｗｅ相乗スコアを示す表である。
【図２５】がん性組織におけるＣＤＨ６  ｍＲＮＡ発現を表すグラフである。
【図２６】卵巣がん、子宮内膜がん、腎臓がんおよび胆管細胞癌組織において免疫組織化学によるＣＤＨ６タンパク質発現を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
詳細な説明
本開示は、ＣＤＨ６に結合する抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）および抗体薬物コンジュゲートを提供する。具体的には本開示は、ＣＤＨ６に結合し、そのような結合で内部移行する抗体および抗体断片（例えば抗原結合断片）を対象とする。本開示の抗体および抗体断片（例えば抗原結合断片）は、抗体薬物コンジュゲートを産生するために使用され得る。さらに本開示は、望ましい薬物動態学的特徴および他の望ましい性状を有し、それによりＣＤＨ６を発現しているがん、非限定的に例えば：卵巣がん、腎臓がん、肝臓がん、軟部組織がん、ＣＮＳがん、甲状腺がんおよび胆管細胞癌を処置するために使用され得る抗体薬物コンジュゲートを提供する。本開示は抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、およびそのような医薬組成物をがんの処置のために作製し、使用する方法をさらに提供する。
【０１２４】
抗体薬物コンジュゲート
本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体、抗原結合断片またはその機能性等価物が薬物部分に連結されている抗体薬物コンジュゲートを提供する。一態様では、抗体、抗原結合断片またはそれらの機能性等価物は、リンカーによって共有結合を介して抗がん剤である薬物部分に連結される。抗体薬物コンジュゲートは、抗がん剤（例えば細胞傷害剤）の有効用量をＣＤＨ６を発現している腫瘍組織に選択的に送達でき、それによりさらに高い選択性（および低い有効用量）が達成され得る。
【０１２５】
一態様では、本開示は式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中Ａｂは本明細書に記載のＣＤＨ６結合抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）を表し、
Ｌはリンカーであり、
Ｄは薬物部分であり、
ｍは１〜８の整数であり；および
ｎは１〜２０の整数である）
のイムノコンジュゲートを提供する。一態様では、ｎは１から１０、２から８または２から５の整数である。具体的な態様では、ｎは３から４である。いくつかの態様では、ｍは１である。いくつかの態様では、ｍは２、３または４である。
【０１２６】
特異的コンジュゲート分子について薬物部分対抗体比は正確に整数値を有する（例えば式（Ｉ）においてｎにｍを掛ける）が、典型的にはコンジュゲーションステップに伴うある程度の不均一性のために多数の分子を含有する試料を記載するために使用される場合に値はしばしば平均値であることが理解される。イムノコンジュゲートの試料についての平均負荷は、本明細書において薬物部分対抗体比または「ＤＡＲ」として参照される。マイタンシノイドの態様において、これは、マイタンシノイドに対する抗体の比または「ＭＡＲ」と称される場合がある。いくつかの態様では、ＤＡＲは、約１から約５の間、典型的には約３、３．５、４、４．５または５である。いくつかの態様では、重量で試料の少なくとも５０％が平均ＤＡＲプラスマイナス２を有する化合物であり、好ましくは試料の少なくとも５０％が平均ＤＡＲプラスマイナス１を含有するコンジュゲートである。他の態様は、ＤＡＲは約３．５であるイムノコンジュゲートを含む。いくつかの態様では、「約ｎ」のＤＡＲはＤＡＲについての測定値がｎの２０％以内であることを意味する。
【０１２７】
本開示は、薬物部分に連結またはコンジュゲートされた抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）および本明細書で開示のそれらの機能性等価物を含むイムノコンジュゲートを提供する。一態様では、薬物部分Ｄは、構造：
【０１２８】
【化２】
2017524364.tif 000003
を有するものを含むマイタンシノイド薬物部分であり、式中、波線はマイタンシノイドの硫黄原子の抗体薬物コンジュゲートのリンカーへの共有結合を示す。Ｒは、出現毎に独立にＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。アミド基を硫黄原子に接着しているアルキレン鎖は、メタニル、エタニルまたはプロパニルであってよい、すなわちｍは１、２または３である（米国特許第６３３，４１０号明細書、米国特許第５，２０８，０２０号明細書、Chari et al. (1992) Cancer Res. 52;127-131, Lui et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623）。
【０１２９】
マイタンシノイド薬物部分のすべての立体異性体、すなわちマイタンシノイドの不斉炭素でのＲおよびＳ立体配置の任意の組合せは、開示のイムノコンジュゲートについて検討される。一態様では、マイタンシノイド薬物部分は以下の立体化学を有する。
【０１３０】
【化３】
2017524364.tif 000004
【０１３１】
一態様では、マイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１としても公知）である。ＤＭ１は以下の構造式によって表される。
【０１３２】
【化４】
2017524364.tif 000005
【０１３３】
別の態様では、マイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３としても公知）である。ＤＭ３は以下の構造式によって表される。
【０１３４】
【化５】
2017524364.tif 000006
【０１３５】
別の態様では、マイタンシノイド薬物部分はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４としても公知）である。ＤＭ４は以下の構造式によって表される。
【０１３６】
【化６】
2017524364.tif 000007
【０１３７】
ＤＭ４
薬物部分Ｄは、リンカーＬを通じて抗体Ａｂに連結されてよい。Ｌは抗体Ａｂを薬物部分Ｄに連結できる任意の化学的部分である。リンカーＬは、共有結合（複数可）を通じて抗体Ａｂを薬物部分Ｄに付着させる。リンカー試薬は、抗体薬物コンジュゲートを形成するように薬物部分Ｄと抗体Ａｂとを連結するために使用され得る二機能性または多機能性部分である。抗体薬物コンジュゲートは、薬物部分Ｄおよび抗体Ａｂへの結合のために反応性の機能を有するリンカーを使用して調製され得る。システイン、チオールまたはアミン、例えば抗体のＮ末端またはリジンなどのアミノ酸側鎖は、リンカー試薬の官能基と結合を形成できる。
【０１３８】
一態様では、Ｌは切断可能リンカーである。別の態様では、Ｌは非切断可能リンカーである。いくつかの態様では、Ｌは、酸不安定性リンカー、光不安定性リンカー、ペプチダーゼ切断可能リンカー、エステラーゼ切断可能リンカー、ジスルフィド結合還元可能リンカー、親水性リンカー、プロチャージ（procharged）リンカーまたはジカルボン酸に基づくリンカーである。
【０１３９】
薬物部分Ｄ、例えばマイタンシノイドと抗体Ａｂの間に非切断可能リンカーを形成する好適な架橋試薬は、当技術分野において周知であり、硫黄原子（ＳＭＣＣなど）を含む非切断可能リンカーまたは硫黄原子を含まないものを形成できる。薬物部分Ｄ、例えばマイタンシノイドと抗体Ａｂとの間に非切断可能リンカーを形成する好ましい架橋試薬は、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分を含む。本開示によりそのような非切断可能リンカーは、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分に由来するものと称される。
【０１４０】
マレイミドに基づく部分を含む架橋試薬は、これだけに限らないが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミドブタン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＳＡ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（−ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＩＰ）およびポリエチレングリコールスペーサーを含有するマレイミドに基づく架橋試薬、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳなどを含む。これらの架橋試薬は、マレイミドに基づく部分に由来する非切断可能リンカーを形成する。マレイミドに基づく架橋試薬の代表的な構造は下に示される。
【０１４１】
【化７】
2017524364.tif 000008
【０１４２】
別の態様では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）またはＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳに由来する。
【０１４３】
ハロアセチルに基づく部分を含む架橋試薬は、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）を含む。これらの架橋試薬は、ハロアセチルに基づく部分に由来する非切断可能リンカーを形成する。ハロアセチルに基づく架橋試薬の代表的な構造は下に示される。
【０１４４】
【化８】
2017524364.tif 000009
【０１４５】
一態様では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）またはＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）に由来する。
【０１４６】
薬物部分Ｄ、例えばマイタンシノイド、と抗体Ａｂとの間に切断可能リンカーを形成する好適な架橋試薬は、当技術分野において周知である。ジスルフィド含有リンカーは、生理的条件下で生じる場合があるジスルフィド交換を通じて切断可能なリンカーである。本開示によりそのような切断可能リンカーは、ジスルフィドに基づく部分に由来すると称される。好適なジスルフィド架橋試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）を含み、その構造は下に示される。これらのジスルフィド架橋試薬は、ジスルフィドに基づく部分に由来する切断可能リンカーを形成する。
【０１４７】
【化９】
2017524364.tif 000010
【０１４８】
一態様では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）に由来する。
【０１４９】
薬物部分Ｄ、例えばマイタンシノイドと抗体Ａｂとの間に荷電リンカーを形成する好適な架橋試薬は、プロチャージ架橋試薬として公知である。一態様では、プロチャージ架橋試薬に由来するリンカーＬはＣＸ１−１である。ＣＸ１−１の構造は下のとおりである。
【０１５０】
【化１０】
2017524364.tif 000011
【０１５１】
開示により提供される一態様では、コンジュゲートは、以下の構造式のいずれか１つによって表される：
【０１５２】
【化１１−１】
2017524364.tif 000012
【０１５３】
【化１１−２】
2017524364.tif 000013
式中：
ＡｂはヒトＣＤＨ６に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、
Ａｂの第一級アミンとのアミド結合の形成を通じてＡｂに付着するＤ−Ｌ基の数を示すｎは、１から２０の整数である。一態様では、ｎは１から１０、２から８または２から５の整数である。具体的な態様では、ｎは３または４である。
【０１５４】
一態様では、コンジュゲート中の薬物部分（例えばＤＭ１またはＤＭ４）対抗体の平均モル比（すなわち、平均ｗ値、マイタンシノイド抗体比（ＭＡＲ）としても公知）は、約１から約１０、約２から約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０または８．１）、約２．５から約７、約３から約５、約２．５から約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０から約４．０、約３．２から約４．２または約４．５から５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４もしくは約５．５）である。
【０１５５】
本開示で提供される一態様では、コンジュゲートは実質的に高い純度を有し、以下の特性の１つまたは複数を有する：（ａ）コンジュゲート種の約９０％より多く（例えば約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％以上）、好ましくは約９５％より多くが単量体である、（ｂ）コンジュゲート調製物中の未コンジュゲートリンカーレベルは、約１０％未満（例えば約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％以下）（全リンカーと比較）である、（ｃ）コンジュゲート種の１０％未満が架橋されている（例えば約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％以下）、（ｄ）コンジュゲート調製物中の遊離薬物部分（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）レベルが約２％未満（例えば約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％または０％以下）（全細胞傷害剤と比較するｍｏｌ／ｍｏｌ）である。
【０１５６】
本明細書において使用される用語「未コンジュゲートリンカー」は、架橋試薬（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）由来のリンカーに共有結合的に連結される抗体を指し、ここで抗体は、リンカーを通じて薬物部分（例えばＤＭ１またはＤＭ４）に共有結合的にカップリングされない（すなわち「未コンジュゲートリンカー」はＡｂ−ＳＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢ、Ａｂ−スルホ−ＳＰＤＢまたはＡｂ−ＣＸ１−１によって表され得る）。
【０１５７】
１．薬物部分
本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合するイムノコンジュゲートを提供する。本開示のイムノコンジュゲートは、抗ＣＤＨ６抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または薬物部分例えば抗がん剤、抗血液障害剤、自己免疫処置剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤または麻酔剤にコンジュゲートする機能性等価物を含む。抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物は、当技術分野において公知の任意の方法を使用していくつかの同一のまたは異なる薬物部分にコンジュゲートされ得る。
【０１５８】
特定の態様では、本開示のイムノコンジュゲートの薬物部分は：マイタンシノイド、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリア中のホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合物質およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。
【０１５９】
一態様では、本開示のイムノコンジュゲートの薬物部分は、これだけに限らないがＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４などのマイタンシノイド薬物部分である。
【０１６０】
さらに本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物は、所与の生物学的応答を修飾する薬物部分にコンジュゲートされてよい。薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定されて構築されない。例えば薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質は、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、コレラ毒またはジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生薬剤などのタンパク質、または例えばリンホカインなどの生物学的応答修飾剤を含んでよい。
【０１６１】
一態様では、本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素などの薬物部分にコンジュゲートされる。細胞毒の例は、これだけに限らないが、タキサン（例えば国際（ＰＣＴ）特許出願第０１／３８３１８号パンフレットおよび第ＰＣＴ／米国特許出願公開第０３／０２６７５号明細書を参照されたい）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイクリン、チューブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、マイタンシノイドおよび、反応性ポリエチレングリコール部分を含む細胞傷害剤（例えばSasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000)、Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000)、Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44, 1045-53 (1991)、Francisco et al., Blood 2003 15;102(4):1458-65を参照されたい）、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、米国特許第６，３４０，７０１号明細書、米国特許第６，３７２，７３８号明細書および米国特許第６，４３６，９３１号明細書、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３号明細書、出願中米国特許出願第１０／０２４，２９０号明細書および第１０／１１６，０５３号明細書、ならびに国際（ＰＣＴ）特許出願第０１／４９６９８号パンフレット）、タクソン（taxon）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにその類似体またはホモログを含む。治療剤は、例えば、抗代謝物（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、切断剤（例えばメクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メイファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含む（例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ米国特許出願公開第２００９０３０４７２１号明細書を参照されたい）。
【０１６２】
本開示の抗体、抗体断片（抗原結合断片）または機能性等価物にコンジュゲートできる細胞毒の他の例は、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、マイタンシンおよびオーリスタチンならびにその誘導体を含む。
【０１６３】
種々の種類の細胞毒、リンカーおよび抗体に治療剤をコンジュゲートするための方法は、当技術分野において公知である、例えばSaito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215、Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337、Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212、Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763、Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091、Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を参照されたい。
【０１６４】
本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物は、放射性イムノコンジュゲートと称される細胞傷害性放射線医薬品を生成するために放射性同位元素にコンジュゲートされてもよい。診断用または治療用使用のために抗体にコンジュゲートされ得る放射性同位元素の例は、これだけに限らないが、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７を含む。放射性イムノコンジュゲートを調製するための方法は当技術分野において確立されている。放射性イムノコンジュゲートの例はＺｅｖａｌｉｎ（商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含んで商業的に入手でき、類似の方法は本明細書に開示の抗体を使用して放射性イムノコンジュゲートを調製するために使用され得る。特定の態様では、大環状キレーターは、リンカー分子を介して抗体に付着できる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当技術分野において一般に公知であり、Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7およびZimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている、それぞれその全体が参照により組み込まれる。
【０１６５】
本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物は、融合タンパク質を生成するために異種性タンパク質またはポリペプチド（またはその断片、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０もしくは少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド）にコンジュゲートされてもよい。具体的には本開示は、本明細書に記載の抗体断片（例えば抗原結合断片）（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ  ＣＤＲ）および異種性タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【０１６６】
追加的融合タンパク質は、遺伝子−シャッフリング、モチーフ−シャッフリング、エクソン−シャッフリングおよび／またはコドン−シャッフリング（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」と称される）の技術を通じて生成されてよい。ＤＮＡシャッフリングは、本開示の抗体またはその断片の活性を変更するために用いられてよい（例えば、高い親和性および低い解離速度を有する抗体またはその断片）。一般に米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８１１，２３８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書、米国特許第５，８３４，２５２号明細書および米国特許第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76およびLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308- 313（これらの特許および刊行物それぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはその断片またはコードされた抗体もしくはその断片は、組換えに先行するエラープローンＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法による無作為変異誘発に供されることによって変更されてよい。抗原に特異的に結合する抗体またはその断片をコードしているポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種性分子の１つまたは複数の構成成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えられてよい。
【０１６７】
さらに本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物は、精製を促進するためにペプチドなどのマーカー配列にコンジュゲートされてよい。好ましい態様では、マーカーアミノ酸配列は、とりわけｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）において提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは商業的に入手できる。Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のとおり、例えばヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグは、これだけに限らないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Wilson et al., (1984) Cell 37:767）、および「ＦＬＡＧ」タグ（A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 2001）を含む。本開示に記載のとおり抗体または抗原結合断片は、それらの有効性を増強するために腫瘍貫通性ペプチドにコンジュゲートされてよい。
【０１６８】
他の態様では、本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物は、診断用または検出可能な薬剤にコンジュゲートされる。そのようなイムノコンジュゲートは、具体的な療法の有効性を決定するなどの臨床検査手順の一部として、疾患または障害の発症、発生、進行および／または重症度をモニタリングまたは診断するために有用であり得る。そのような診断および検出は、これだけに限らないが西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼなどの種々の酵素；これだけに限らないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの接合団；これだけに限らないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンなどの蛍光材料；これだけに限らないが、ルミノールなどの発光材料；これだけに限らないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンなどの生物発光材料；これだけに限らないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉおよび１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎおよび１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、６４Ｃｕ、１１３Ｓｎおよび１１７Ｓｎなどの放射性材料；ならびに種々のポジトロン発光断層撮影を使用するポジトロン発光金属および非放射性常磁性金属イオンを含む検出可能な物質に抗体をカップリングすることによって達成され得る。
【０１６９】
本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物も固体支持体に接着されてよく、それは標的抗原のイムノアッセイまたは精製のために特に有用である。そのような固体支持体は、これだけに限らないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンを含む。
【０１７０】
２．リンカー
本明細書において使用される「リンカー」は、抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または機能性等価物を薬物部分などの別の部分に連結できる任意の化学的部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性のままである条件下で、酸誘発切断、光誘発切断、ペプチダーゼ誘発切断、エステラーゼ誘発切断およびジスルフィド結合切断などの切断に感受性であってよい（切断可能リンカー）。代替的にリンカーは、切断に実質的に抵抗性であってよい（例えば安定リンカーまたは非切断可能リンカー）。いくつかの態様では、リンカーは、プロチャージリンカー、親水性リンカーまたはジカルボン酸に基づくリンカーである。
【０１７１】
一態様では、使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋試薬に由来する。別の態様では、使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋剤に由来する。
【０１７２】
非切断可能リンカーは、マイタンシノイドなどの薬物部分を抗体に安定で、共有結合様式で連結でき、切断可能リンカーについて上に列挙したカテゴリーから外れていない任意の化学的部分である。したがって非切断可能リンカーは、酸誘発切断、光誘発切断、ペプチダーゼ誘発切断、エステラーゼ誘発切断およびジスルフィド結合切断に実質的に抵抗性である。さらに非切断可能は、マイタンシノイドなどの薬物部分または抗体がその活性を失わない条件下で酸、感光性切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼまたはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理学的化合物によって誘導される切断に耐えるリンカー中またはリンカーに隣接する化学結合の能力を指す。
【０１７３】
酸不安定性リンカーは酸性ｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどのある種の細胞内コンパートメントは、酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸不安定性リンカーを切断するために好適な条件を提供する。
【０１７４】
光不安定性リンカーは、身体表面でおよび光が到達できる多数の体腔で有用であるリンカーである。さらに赤外線光は組織を透過できる。
【０１７５】
いくつかのリンカーは、ペプチダーゼによって切断され得る、すなわちペプチダーゼ切断可能リンカーである。ある種のペプチドだけが細胞の内側または外側で容易に切断される、例えばTrout et al., 79 Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 626-629 (1982)およびUmemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)を参照されたい。さらにペプチドは、α−アミノ酸および、化学的には１個のアミノ酸のカルボキシレートと第２のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合から構成されている。カルボキシレートとリジンのεアミノ基との間の結合などの他のアミド結合は、ペプチド結合であるとは理解されず、非切断可能であると考えられる。
【０１７６】
いくつかのリンカーは、エステラーゼによって切断され得る、すなわちエステラーゼ切断可能リンカーである。再度ある種のエステルだけが細胞の内部または外部に存在するエステラーゼによって切断され得る。エステルは、カルボン酸とアルコールとの縮合によって形成される。単純エステルは、脂肪族アルコールならびに小さな環状および小さな芳香族アルコールなどの単純アルコールで産生されるエステルである。
【０１７７】
プロチャージリンカーは、抗体薬物コンジュゲートへの組み込み後にそれらの電荷を保持している荷電架橋試薬に由来する。プロチャージリンカーの例は、米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号明細書に見出すことができる。
【０１７８】
３．ＡＤＣのコンジュゲーションおよび調製
本開示のコンジュゲートは、米国特許第７，８１１，５７２号明細書、米国特許第６，４１１，１６３号明細書、米国特許第７，３６８，５６５号明細書および米国特許第８，１６３，８８８号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１６６３１９号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２５３０２１号明細書および米国特許出願公開第２０１２／０２５９１００号明細書に記載されているものなどの当技術分野において公知の任意の方法によって調製され得る。これらの特許および特許出願公開の教示全体は本明細書に参照により組み込まれる。
【０１７９】
１ステッププロセス
一態様では本開示のコンジュゲートは、１ステッププロセスによって調製されてよい。プロセスは、任意選択で１つまたは複数の共溶媒を含有する実質的に水性の媒体中、好適なｐＨで抗体、薬物および架橋剤を合わせることを含む。一態様では、プロセスは、抗体および薬物を含む第１の混合物を形成するように本開示の抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）と接触させるステップ、ならびに次いで（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するように、ｐＨ約４から約９である溶液中で抗体および薬物を含む第１の混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。
【０１８０】
一態様では、１ステッププロセスは、約６以上（例えば、約６から約９、約６から約７、約７から約９、約７から約８．５、約７．５から約８．５、約７．５から約８．０、約８．０から約９．０または約８．５から約９．０）のｐＨを有する溶液中で抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および次いで架橋剤（例えばＳＭＣＣ、スルホＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。例えばプロセスは、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９または約９．０のｐＨを有する溶液中で、細胞結合剤を薬物（ＤＭ１またはＤＭ４）および次いで架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。別の態様では、プロセスは、約７．８（例えば７．６から８．０のｐＨまたは７．７から７．９のｐＨ）のｐＨを有する溶液中で細胞結合剤を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および次いで架橋剤（例えばＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。
【０１８１】
１ステッププロセス（すなわち抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および次いで架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に接触させることは、当技術分野において公知の任意の好適な温度で実行され得る。例えば１ステッププロセスは、約２０℃以下（例えば、約−１０℃（例えば細胞傷害剤および二機能性架橋試薬を溶解するために使用される有機溶媒の存在により溶液が凍ることがない条件で）から約２０℃、約０℃から約１８℃、約４℃から約１６℃）、室温（例えば、約２０℃から約３０℃または約２０℃から約２５℃）でまたは上昇された温度（例えば、約３０℃から約３７℃）で生じ得る。一態様では、１ステッププロセスは、約１６℃から約２４℃（例えば、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃または約２５℃）の温度で行われる。別の態様では、１ステッププロセスは約１５℃以下（例えば、約−１０℃から約１５℃または約０℃から約１５℃）の温度で実行される。例えばプロセスは、抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および次いで架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に、例えば架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＰＤＢ  ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を溶解するために使用される有機溶媒（複数可）の存在により溶液が凍ることがない条件で、約１５℃、約１４℃、約１３℃、約１２℃、約１１℃、約１０℃、約９℃、約８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、約１℃、約０℃、約−１℃、約−２℃、約−３℃、約−４℃、約−５℃、約−６℃、約−７℃、約−８℃、約−９℃または約−１０℃の温度で接触させることを含む。一態様では、プロセスは、抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および次いで架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に約−１０℃から約１５℃、約０℃から約１５℃、約０℃から約１０℃、約０℃から約５℃、約５℃から約１５℃、約１０℃から約１５℃または約５℃から約１０℃の温度で接触させることを含む。別の態様では、プロセスは、抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および次いで架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に約１０℃（例えば８℃から１２℃の温度または９℃から１１℃の温度）の温度で接触させることを含む。
【０１８２】
一態様では、上に記載の接触は、抗体を提供すること、次いで抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む第１の混合物を形成するように抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）に接触させること、ならびに次いで抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む第１の混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることによって達成される。例えば一態様では、抗体は反応容器中で提供され、薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）は反応容器に加えられ（それにより抗体を接触させる）次いで架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）は抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物に加えられる（それにより抗体および薬物を含む混合物に接触させる）。一態様では、抗体は、反応容器中で提供され、薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）は抗体を容器に入れた直後に反応容器に加えられる。別の態様では、抗体は、反応容器中で提供され、薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）は反応容器に抗体を容器に入れた後に時間（例えば細胞結合剤をその場所に提供した後、約５分間、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約１時間、約１日以上）をおいてから加えられる。薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）は急速に（すなわち約５分間、約１０分間などの短時間内）またはゆっくり（ポンプを使用することによってなど）加えられてよい。
【０１８３】
抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物は、次いで架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に、抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）に接触させた直後または抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）に接触させたいくらかの後の時点（例えば、約５分間から約８時間以上）で接触されてよい。例えば一態様では、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）は、抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物に、抗体を含む反応容器への薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）の添加直後に加えられる。代替的に抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物は、架橋剤（例えばＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に、抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）に接触させた約５分間、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間以上後に接触されてよい。
【０１８４】
抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物を架橋剤（例えばＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後に、反応は約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間以上（例えば、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間または約４８時間）進行されてよい
【０１８５】
一態様では、１ステッププロセスは、任意の未反応薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および／または未反応架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢもしくはＣＸ１−１）をクエンチするためのクエンチステップをさらに含む。クエンチステップは、コンジュゲートの精製より先に典型的には実施される。一態様では、混合物は、混合物をクエンチ試薬に接触させることによってクエンチされる。本明細書において使用される「クエンチ試薬」は、遊離薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および／または架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応する試薬を指す。一態様では、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオネート、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミドまたはヨードアセトアミドプロピオン酸などのマレイミドまたはハロアセトアミドクエンチ試薬は、薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）中の任意の未反応基（チオールなど）がクエンチされることを確実にするために使用されてよい。クエンチステップは、薬物（例えばＤＭ１）の二量体化を妨げることに役立つ。二量体化ＤＭ１は、除去することが困難である場合がある。極性、荷電チオールクエンチ試薬（４−マレイミド酪酸または３−マレイミドプロピオン酸など）でのクエンチでは、過剰量、未反応ＤＭ１は、精製ステップの際に共有結合で連結されたコンジュゲートから容易に分離され得る極性、荷電、水溶性付加物に転換される。非極性および中性チオールクエンチ試薬でのクエンチも使用されてよい。一態様では、混合物は、混合物を未反応架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤもしくはＣＸ１−１）と反応するクエンチ試薬に接触させることによってクエンチされる。例えば、求核試薬は、いかなる未反応ＳＭＣＣもクエンチするために混合物に加えられてよい。求核試薬は、好ましくはリジン、タウリンおよびヒドロキシルアミンなどの求核試薬を含有するアミノ基である。
【０１８６】
別の態様では、反応（すなわち抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）とおよび次いで架橋剤（例えばＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること）は、混合物をクエンチ試薬と接触させる前に完了まで進行されてよい。これに関して、クエンチ試薬は抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物が架橋剤（例えばＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に接触された約１時間から約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間または約２５時間から約４８時間）後に混合物に加えられる。
【０１８７】
代替的に混合物は、混合物のｐＨを約５．０（例えば４．８、４．９、５．０、５．１または５．２）に低下させることによってクエンチされる。別の態様では、混合物は、ｐＨを６．０未満、５．５未満、５．０未満、４．８未満、４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満に低下させることによってクエンチされる。代替的にｐＨは、約４．０（例えば、３．８、３．９、４．０、４．１または４．２）から約６．０（例えば、５．８、５．９、６．０、６．１または６．２）、約４．０から約５．０、約４．５（例えば、４．３、４．４、４．５、４．６または４．７）から約５．０に低下される。一態様では、混合物は、混合物のｐＨを４．８に低下することによってクエンチされる。別の態様では、混合物は、混合物のｐＨを５．５に低下することによってクエンチされる。
【０１８８】
一態様では、１ステッププロセスは、抗体から不安定に結合したリンカーを遊離させるためのホールディングステップをさらに含む。ホールディングステップは、コンジュゲートの精製の前（例えば反応ステップ後、反応ステップとクエンチステップの間またはクエンチステップ後）に混合物をホールドすることを含む。例えばプロセスはａ）抗体および薬物（例えばＤＭ１もしくはＤＭ４）を含む混合物を形成するように抗体を薬物（例えばＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させること、ならびに次いで（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４もしくはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えばＤＭ１もしくはＤＭ４）および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するように、ｐＨ約４から約９を有する溶液中で抗体および薬物（例えばＤＭ１もしくはＤＭ４）を含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること、（ｂ）細胞結合剤から不安定に結合したリンカーを遊離させるためにステップ（ａ）において調製された混合物をホールドすること、ならびに（ｃ）精製されたコンジュゲートを提供するように混合物を精製することを含む。
【０１８９】
別の態様では、プロセスは（ａ）抗体および薬物（例えばＤＭ１もしくはＤＭ４）を含む混合物を形成するように抗体を薬物（例えばＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させること、ならびに次いで（ｉ）コンジュゲート、（ｉｉ）遊離薬物（例えばＤＭ１もしくはＤＭ４）および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するように、ｐＨ約４から約９を有する溶液中で抗体および薬物（例えばＤＭ１もしくはＤＭ４）を含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること、（ｂ）いかなる未反応薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および／または未反応架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢもしくはＣＸ１−１）もクエンチするようにステップ（ａ）において調製された混合物をクエンチすること、（ｃ）細胞結合剤から不安定に結合したリンカーを遊離させるためにステップ（ｂ）において調製された混合物をホールドすること、ならびに（ｄ）精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、Ａｂ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供するように混合物を精製することを含む。
【０１９０】
代替的にホールディングステップは、コンジュゲートの精製後に実施されてよく、追加的精製ステップが続く。
【０１９１】
別の態様では、反応は、ホールディングステップの前に完了まで進行されてよい。これに関してホールディングステップは、抗体および薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物が架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触された約１時間から約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間または約２４時間から約４８時間）後に実施されてよい。
【０１９２】
ホールディングステップは、安定に結合したリンカーを抗体から実質的に放出せずに不安定に結合したリンカーを抗体から放出するために、溶液を好適な温度（例えば、約０℃から約３７℃）で好適な期間（例えば、約１時間から約１週間、約１時間から約２４時間、約１時間から約８時間または約１時間から約４時間）維持することを含む。一態様では、ホールディングステップは、溶液を約２０℃以下（例えば、約０℃から約１８℃、約４℃から約１６℃）、室温（例えば約２０℃から約３０℃または約２０℃から約２５℃）、または上昇させた温度（例えば、約３０℃から約３７℃）で維持することを含む。一態様では、ホールディングステップは、溶液を約１６℃から約２４℃（例えば、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃または約２５℃）の温度で維持することを含む。別の態様では、ホールディングステップは、溶液を約２℃から約８℃（例えば、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃または約１０℃）の温度で維持することを含む。別の態様では、ホールディングステップは、溶液を約３７℃（例えば、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃または約４０℃）の温度で維持することを含む。
【０１９３】
ホールディングステップの持続時間は、ホールディングステップが実施される温度およびｐＨに依存する。例えばホールディングステップの持続時間は、最大温度が細胞結合剤細胞傷害剤コンジュゲートの安定性によって制限されて、上昇させた温度でホールディングステップを実施することによって実質的に低減され得る。ホールディングステップは、溶液を約１時間から約１日（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間もしくは約２４時間）、約１０時間から約２４時間、約１２時間から約２４時間、約１４時間から約２４時間、約１６時間から約２４時間、約１８時間から約２４時間、約２０時間から約２４時間、約５時間から約１週間、約２０時間から約１週間、約１２時間から約１週間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間もしくは約７日間）または約１日から約１週間維持することを含み得る。
【０１９４】
一態様では、ホールディングステップは、溶液を約２℃から約８℃の温度で少なくとも約１２時間から１週間までの期間維持することを含む。別の態様では、ホールディングステップは、溶液を約２℃から約８℃の温度で終夜（例えば、約１２から約２４時間、好ましくは約２０時間）維持することを含む。
【０１９５】
ホールディングステップのためのｐＨ値は好ましくは約４から約１０である。一態様では、ホールディングステップのためのｐＨ値は約４以上約６未満（例えば４から５．９）または約５以上約６未満（例えば５から５．９）である。別の態様では、ホールディングステップのためのｐＨ値は約６から約１０の範囲（例えば、約６．５から約９、約６から約８）である。例えばホールディングステップのためのｐＨ値は約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５または約１０であってよい。
【０１９６】
他の態様では、ホールディングステップは、混合物を２５℃、約６〜７．５のｐＨで約１２時間から約１週間インキュベートすること、混合物を４℃、約４．５〜５．９のｐＨで約５時間から約５日間インキュベートすることまたは、混合物を２５℃、ｐＨ約４．５〜５．９で約５時間から約１日インキュベートすることを含んでよい。
【０１９７】
１ステッププロセスは、コンジュゲートの溶解度および回収率を増加させるために反応ステップへのショ糖の添加を任意選択で含んでよい。望ましくはショ糖は、約０．１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）（例えば約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）または２０％（ｗ／ｖ））の濃度で添加される。好ましくはショ糖は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）（例えば約０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）または約１１％（ｗ／ｖ））の濃度で添加される。付加的に反応ステップは、緩衝剤の添加も含んでよい。当技術分野において公知の任意の好適な緩衝剤が使用され得る。好適な緩衝剤は、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液およびリン酸緩衝液を含む。一態様では、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ｂｉｓ−（２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸）脱水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１９８】
１ステッププロセスは、精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、Ａｂ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供するために混合物を精製するステップをさらに含んでよい。当技術分野において公知の任意の精製方法は、本開示のコンジュゲートを精製するために使用され得る。一態様では、本開示のコンジュゲートは、接線流ろ過（ＴＦＦ）、非吸着性クロマトグラフィー、吸着性クロマトグラフィー、吸着性ろ過、選択的沈殿または任意の他の好適な精製プロセスならびにこれらの組合せを使用する。別の態様では、コンジュゲートを上に記載の精製プロセスに供する前に、最初にコンジュゲートは１つまたは複数のＰＶＤＦ膜を通してろ過される。代替的にコンジュゲートは、コンジュゲートを上に記載の精製プロセスに供した後に１つまたは複数のＰＶＤＦ膜を通してろ過される。例えば一態様では、コンジュゲートは、１つまたは複数のＰＶＤＦ膜を通してろ過され、次いで接線流ろ過を使用して精製される。代替的にコンジュゲートは、接線流ろ過を使用して精製され、次いで１つまたは複数のＰＶＤＦ膜を通してろ過される。
【０１９９】
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ｔｙｐｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ）およびＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ（登録商標）ｔｙｐｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）を含む任意の好適なＴＦＦ系は、精製のために利用され得る。
【０２００】
任意の好適な吸着性クロマトグラフィーレジンは、精製のために利用され得る。好ましい吸着性クロマトグラフィーレジンは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびこれらの組合せを含む。好適なヒドロキシアパタイトレジンの例は、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標）ヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）およびセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む。好適なＨＣＩＣレジンの例は、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（登録商標）レジン（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）である。好適なＨＩＣレジンの例は、ブチルセファロース、ヘキシルセファロース、フェニルセファロースおよびオクチルセファロースレジン（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）ならびにＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ（登録商標）メチルおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ｔ−ブチルレジン（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む。好適なイオン交換レジンの例は、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）レジン（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）ならびにＵｎｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）Ｓレジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む。好適な混合モードイオン交換の例は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ（登録商標）ＡＢｘレジン（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ  ＮＪ）を含む。好適なＩＭＡＣレジンの例は、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）レジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ（登録商標）ＩＭＡＣレジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む。好適な色素リガンドレジンの例は、ブルーセファロースレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびアフィゲルブルーレジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む。好適な親和性レジンの例は、プロテインＡセファロースレジン（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびレクチン親和性レジン、例えばＬｅｎｔｉｌ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）レジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含み、ここで抗体は適切なレクチン結合部位を有する。好適な逆相レジンの例は、Ｃ４、Ｃ８��よびＣ１８レジン（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を含む。
【０２０１】
任意の好適な非吸着性クロマトグラフィーレジンは、精製のために利用され得る。好適な非吸着性クロマトグラフィーレジンの例は、これだけに限らないがＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）レジン（例えばＳ−２００およびＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）レジン（例えばＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）レジン（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０およびＰ−１００）ならびに当業者に公知の他のものを含む。
【０２０２】
２ステッププロセスおよびワンポットプロセス
一態様では、本開示のコンジュゲートは、米国特許第７，８１１，５７２号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号明細書に記載のとおり調製され得る。プロセスは（ａ）リンカーを抗体に共有結合的に付着させる（すなわち、Ａｂ−ＳＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢまたはＡｂ−ＣＸ１−１）ために本開示の抗体を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に接触させること、およびそれにより結合したリンカーを有する抗体を含む第１の混合物を調製すること、（ｂ）任意選択で結合したリンカーを有する抗体の精製された第１の混合物を調製するために第１の混合物を精製プロセスに供すること；（ｃ）（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、Ａｂ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２の混合物を調製するために、結合したリンカーを有する抗体を薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）と約４から約９のｐＨを有する溶液中で反応させることによって、薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を第１の混合物中の結合したリンカーを有する抗体にコンジュゲートすること、ならびに（ｄ）第２の混合物の他の構成成分からコンジュゲートを精製するために第２の混合物を精製プロセスに供すること、のステップを含む。代替的に精製ステップ（ｂ）は、省かれてよい。本明細書に記載の任意の精製方法は、ステップ（ｂ）および（ｄ）について使用されてよい。一実施形態では、ＴＦＦは、ステップ（ｂ）および（ｄ）両ステップについて使用される。別の実施形態では、ＴＦＦは、ステップ（ｂ）について使用され、吸収クロマトグラフィー（例えば、ＣＨＴ）はステップ（ｄ）について使用される。
【０２０３】
１ステップ試薬および原位置プロセス
一態様では、本開示のコンジュゲートは、米国特許第６，４４１，１６３号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号明細書および米国特許出願公開第２００８／０１４５３７４号明細書に記載のとおり、予め形成された薬物リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を本開示の抗体にコンジュゲートすることに、精製ステップが続くことによって調製され得る。本明細書に記載の任意の精製方法が使用され得る。薬物リンカー化合物は、薬物（例えばＤＭ１またはＤＭ４）を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応させることによって調製される。薬物リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）は、抗体にコンジュゲートされる前に任意選択で精製に供される。
【０２０４】
４．望ましい抗体および抗体薬物コンジュゲートの特徴付けおよび選択
本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートは、それらの物理的／化学的特性および／または生物学的活性について当技術分野において公知の種々のアッセイによって特徴付けられ、選択されてよい。
【０２０５】
例えば本開示の抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅまたはウエスタンブロットなどの公知の方法によってその抗原結合活性について検査され得る。
【０２０６】
トランスジェニック動物および細胞株は、腫瘍関連抗原および細胞表面受容体を過剰発現するがんの予防または治療処置としての可能性を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）をスクリーニングすることにおいて特に有用である。有用なＡＤＣについてのスクリーニングは、候補ＡＤＣを用量範囲にわたってトランスジェニック動物に投与すること、および評価される疾患または障害へのＡＤＣの効果（複数可）について種々の時点でアッセイすることを含む。代替的にまたは追加的に薬物は、該当する場合、疾患の誘導因子への曝露の前にまたは同時に投与されてよい。候補ＡＤＣは、中程度またはハイスループットなスクリーニング形式下で連続的および個々に、または並行してスクリーニングされてよい。
【０２０７】
一態様は、（ａ）ＣＤＨ６を発現している安定がん細胞株またはヒト患者腫瘍（例えば卵巣細胞株もしくは腫瘍断片、腎臓細胞株もしくは腫瘍断片、肝臓細胞株もしくは腫瘍断片、甲状腺細胞株もしくは腫瘍断片、ＣＮＳがん細胞株もしくは腫瘍断片、胆管細胞癌がん細胞株もしくは腫瘍断片、卵巣、腎臓、肝臓、軟部組織、ＣＮＳ、甲状腺または胆管細胞癌原発細胞）由来の細胞を非ヒト動物に移植すること、（ｂ）ＡＤＣ薬物候補を非ヒト動物に投与すること、および（ｃ）移植された細胞株由来の腫瘍の成長を阻害する候補の能力を決定することを含むスクリーニング方法である。本開示は（ａ）ＣＤＨ６を発現している安定がん細胞株由来の細胞を薬物候補に接触させること、および（ｂ）安定細胞株の成長を阻害するＡＤＣ候補の能力を評価することを含むＣＤＨ６の過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害の処置のためのＡＤＣ候補をスクリーニングする方法も包含する。
【０２０８】
さらなる態様は、（ａ）ＣＤＨ６を発現している安定がん細胞株由来の細胞をＡＤＣ薬物候補に接触させること、および（ｂ）細胞死を誘導するＡＤＣ候補の能力を評価することを含むスクリーニング方法である。一態様では、アポトーシスを誘導するＡＤＣ候補の能力が評価される。
【０２０９】
候補ＡＤＣは、用量の範囲にわたってトランスジェニック動物に投与することおよび経時的な化合物への動物の生理学的応答を評価することによってスクリーニングされてよい。いくつかの場合では、化合物の有効性を増強する補助因子と合わせて化合物を投与することが好ましい場合がある。対象トランスジェニック動物由来の細胞株が、ＣＤＨ６の過剰発現に関連する種々の障害を処置することにおいて有用なＡＤＣについてスクリーニングするために使用される場合、検査ＡＤＣは適切な時期に細胞培養培地に加えられ、ＡＤＣへの細胞性応答が適切な生化学および／または組織学的アッセイを使用して経時的に評価される。
【０２１０】
したがって本開示は、ＣＤＨ６および腫瘍細胞上に発現されたＣＤＨ６を特異的に標的化および結合するＡＤＣを同定するためのアッセイを提供する。
【０２１１】
ＣＤＨ６抗体
本開示は、ヒトＣＤＨ６に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）を提供する。本開示の抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）は、これだけに限らないが、下の実施例に記載のとおり単離されたヒトモノクローナル抗体またはその断片を含む。
【０２１２】
特定の態様において、本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）を提供し、前記抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）は配列番号２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８、２７２、２８６、３００、３１４または３２８（表５および６）のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）も提供し、前記抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）は表５および６に列挙するＶＨ  ＣＤＲのいずれか１個のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む。具体的な態様では、本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）を提供し、前記抗体は表５および６に列挙するＶＨ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１個、２個、３個、４個、５個以上のＶＨ  ＣＤＲを含む（または代替的に、それからなる）。
【０２１３】
本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）も提供し、前記抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）は配列番号２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９、２７３、２８７、３０１、３１５または３２９（表５および６）のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）も提供し、前記抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）は表５および６以下に列挙するＶＬ  ＣＤＲのいずれか１個のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む。具体的には本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）も提供し、前記抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）は表５および６に列挙するＶＬ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１個、２個、３個以上のＶＬ  ＣＤＲを含む（または代替的にからなる）。
【０２１４】
本開示の他の抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）は、変異しているアミノ酸を含むにも関わらず、表５および６に記載の配列に示されているＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５の同一性百分率をＣＤＲ領域において有する。いくつかの態様では、それは、表５および６に記載の配列に示されているＣＤＲ領域と比較した場合に１個、２個、３個、４個または５個以下のアミノ酸がＣＤＲ領域において変異している変異アミノ酸配列を含む。
【０２１５】
本開示は、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。そのような核酸配列は哺乳動物細胞における発現のために最適化されてよい。
【０２１６】
本開示の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異しているにも関わらず、表５および６に記載の配列に少なくとも６０、７０、８０、９０または９５の同一性百分率を有するものを含む。いくつかの態様では、それは、表５および６に記載の配列に示されている可変領域と比較した場合に１個、２個、３個、４個または５個以下のアミノ酸が可変領域において変異している、一方で同じ治療活性を実質的に保持している変異アミノ酸配列を含む。
【０２１７】
これらそれぞれの抗体がＣＤＨ６に結合できることから、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列）は他のＣＤＨ６結合抗体を作るために「混合および適合（mixed and matched）」されてよい。そのような「混合および適合」ＣＤＨ６結合抗体は、当技術分野において公知の結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡおよび実施例セクションに記載の他のアッセイ）を使用して検査されてよい。これらの鎖が混合および適合される場合、具体的なＶＨ／ＶＬ対合由来のＶＨ配列は構造的に類似するＶＨ配列で置き換えられるべきである。同様に具体的な全長重鎖／全長軽鎖対合由来の全長重鎖配列は、構造的に類似する全長重鎖配列で置き換えられるべきである。同様に具体的なＶＨ／ＶＬ対合由来のＶＬ配列は構造的に類似するＶＬ配列で置き換えられるべきである。同様に具体的な全長重鎖／全長軽鎖対合由来の全長軽鎖配列は、構造的に類似する全長軽鎖配列で置き換えられるべきである。したがって一態様では、開示は：配列番号２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８、２７２、２８６、３００、３１４または３２８（表５および６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９、２７３、２８７、３０１、３１５または３２９（表５および６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供し；ここで抗体はＣＤＨ６に特異的に結合する。
【０２１８】
別の態様では、開示は（ｉ）哺乳動物の細胞における発現のために最適化されており、配列番号２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２、２７６、２９０、３０４、３１８もしくは３３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖；および哺乳動物の細胞における発現のために最適化されており、配列番号２５、３９、５３、６７、８１、９５、１０９、１２３、１３７、１５１、１６５、１７９、１９３、２０７、２２１、２３５、２４９、２６３、２７７、２９１、３０５、３１９もしくは３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離されたモノクローナル抗体または（ｉｉ）その抗原結合部分を含む機能性タンパク質を提供する。
【０２１９】
別の態様では、本開示は、表５および６に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組合せを含むＣＤＨ６結合抗体を提供する。抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５、２６９、２８３、２９７、３１１および３２５に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２，１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６、２７０、２８４、２９８、３１２および３２６に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７、２７１、２８５、２９９、３１３および３２７に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４、１６８、１８２、１９６、２１０、２２４、２３８、２５２、２６６、２８０、２９４、３０８および３２２に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３、２６７、２８１、２９５、３０９および３２３に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４、２６８、２８２、２９６、３１０および３２４に示されている。
【０２２０】
これらそれぞれの抗体がＣＤＨ６に結合でき、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域によって提供されることを考えるとＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は「混合および適合」されてよい（すなわち他のＣＤＨ６結合結合分子を作るために各抗体はＶＨ  ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含有しなければならないが、さまざまな抗体由来のＣＤＲは混合および適合されてよい。そのような「混合および適合」されたＣＤＨ６結合抗体は、当技術分野において公知の結合アッセイおよび実施例に記載のもの（例えばＥＬＩＳＡ）を使用して検査されてよい。ＶＨ  ＣＤＲ配列が混合および適合される場合、具体的なＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）で置き換えられるべきである。同様にＶＬ  ＣＤＲ配列が混合および適合される場合、具体的なＶＬ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）で置き換えられるべきである。新規ＶＨおよびＶＬ配列が１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を本開示のモノクローナル抗体について本明細書で示すＣＤＲ配列由来の構造的に類似する配列で置換することによって作ることができることは、当業者に容易に明らかである。
【０２２１】
したがって本開示は、配列番号１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５、２６９、２８３、２９７、３１１および３２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２，１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６、２７０、２８４、２９８、３１２および３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７、２７１、２８５、２９９、３１３および３２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；配列番号１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４、１６８、１８２、１９６、２１０、２２４、２３８、２５２、２６６、２８０、２９４、３０８および３２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３、２６７、２８１、２９５、３０９および３２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４、２６８、２８２、２９６、３１０および３２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、抗体がＣＤＨ６に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
【０２２２】
具体的な態様では：
（ｉ）（ａ）配列番号２２４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２２５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２２６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２２７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２２８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２２９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号２１０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２１１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２１３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２１４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２６６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２６７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２６８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２６９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２７０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２７１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｖ）（ａ）配列番号３０８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３０９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３１２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３１３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖ）（ａ）配列番号１４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉ）（ａ）配列番号２８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号４２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号４３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号５６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号５７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｉｘ）（ａ）配列番号７０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号７３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘ）（ａ）配列番号８４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号８５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号８６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号８７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号８９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉ）（ａ）配列番号９８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号９９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１００のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１０１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１０２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１０３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１１３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１１５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１１６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号１２６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１２７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１２８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１２９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３０のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号１４０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１４１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１４２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１４３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１４５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖ）（ａ）配列番号１５４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１５５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１５７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１５８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１５９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号１６８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１６９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１７１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１７２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１７３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１８３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１８４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１８５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１８６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号１８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号１９６のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号１９７のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１９８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号１９９のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２００のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２０１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号２３８のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２３９のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２４０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２４１のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２４２のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２４３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘ）（ａ）配列番号２５２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２５３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２５４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２５５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２５６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２５７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号２８０のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２８１のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２８３のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２８４のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２８５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号２９４のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号２９５のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２９６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号２９７のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号２９８のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号２９９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、または
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号３２２のＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号３２３のＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３２４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｄ）配列番号３２５のＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２６のＨＣＤＲ２および（ｆ）配列番号３２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
を含むＣＤＨ６に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）。
【０２２３】
特定の態様では、ＣＤＨ６に特異的に結合する抗体は、表５および／または６に記載される抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）である。
【０２２４】
１．同じエピトープに結合するエピトープおよび抗体の同定
本開示は、ＣＤＨ６の細胞外ドメイン内のエピトープに結合する抗体および抗体断片（例えば抗原結合断片）を提供する。特定の態様では、抗体および抗体断片は、ＣＤＨ６細胞外ドメインのドメイン内のエピトープに結合できる。
【０２２５】
本開示は、表５および６に記載の抗ＣＤＨ６抗体がするように同じエピトープに結合する抗体および抗体断片（例えば抗原結合断片）も提供する。追加的抗体および抗体断片（例えば抗原結合断片）は、したがってＣＤＨ６結合アッセイにおいて他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意な様式で、競合的にその結合を阻害する）それらの能力に基づいて同定され得る。本開示の抗体および抗体断片（例えば抗原結合断片）のＣＤＨ６タンパク質（例えばヒトＣＤＨ６）への結合を阻害する検査抗体の能力は、検査抗体がＣＤＨ６への結合について抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）と競合でき、そのような抗体が非限定的理論に従ってそれが競合する抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）と同じまたは関連する（例えば構造的に類似または空間的に近位）ＣＤＨ６タンパク質上のエピトープに結合できることを実証する。特定の態様では、本開示の抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）と同じＣＤＨ６上のエピトープに結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。そのようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載のとおり調製および単離され得る。
【０２２６】
２．Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる変更
本開示は、部位特異的標識されたイムノコンジュゲートを提供する。これらのイムノコンジュゲートは、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基への修飾をさらに含む修飾される抗体またはその抗原結合断片を含み得る。典型的にはそのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるように作られる。例えば１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。さらに具体的には体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有してよい。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列立体配置に戻すために、体細胞変異は、例えば部位特異的変異誘発による生殖系列配列への「復帰変異」であってよい。そのような「復帰変異」抗体が包含されることも意図される。
【０２２７】
別の種類のフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、またはさらに１つまたは複数のＣＤＲ領域内の１つまたは複数の残基を、Ｔ細胞エピトープを除去しそれにより抗体の潜在的免疫原性を低減するために変異させることを含む。この手法は、「脱免疫化」とも称され、Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０２２８】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内に作られた修飾に付加的にまたは代替的に抗体は、典型的には血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害性などの抗体１つまたは複数の機能的特性を変更するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作されてよい。さらに抗体は、化学的に修飾されてよい（例えば１つまたは複数の化学的部分は抗体に付着されてよい）または再度抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更するためにそのグリコシル化を変更するように修飾されてよい。これらの態様それぞれは、下にさらに詳細に記載されている。
【０２２９】
一態様では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更される、例えば増加または減少するように修飾される。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば軽鎖および重鎖の会合を促進するまたは抗体の安定性を増加もしくは減少させるように変更される。
【０２３０】
別の態様では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように変異している。さらに具体的に１つまたは複数のアミノ酸変異は、抗体が天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して傷害されたブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。この手法は、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０２３１】
さらに他の態様では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって変更される。例えば１つまたは複数のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持しているように異なるアミノ酸残基で置き換えられてよい。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１構成成分であってよい。この手法は、例えば両方ともＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書に記載されている。
【０２３２】
別の態様では、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸は、抗体が変更されたＣ１ｑ結合および／または低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置き換えられてよい。この手法は、例えばＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，１９４，５５１号明細書に記載されている。
【０２３３】
別の態様では、１つまたは複数のアミノ酸残基は、それにより補体を固定する抗体の能力を変更するように変更される。この手法は例えばＢｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開第９４／２９３５１号パンフレットに記載されている。具体的な態様では、本開示の抗体またはその抗原結合断片の１つまたは複数のアミノ酸は、ＩｇＧ１サブクラスおよびカッパアイソタイプについての１つまたは複数のアロタイプアミノ酸残基によって置き換えられる。アロタイプアミノ酸残基は、Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)に記載のとおり、これだけに限らないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域ならびにカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域も含む。
【０２３４】
さらに別の態様では、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるおよび／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるように修飾される。この手法は、例えばＰｒｅｓｔａによる国際公開第００／４２０７２号パンフレットに記載されている。さらにＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧ１上の結合部位は、マッピングされ、結合の改善されたバリアントは記載されている（Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001を参照されたい）。
【０２３５】
さらに別の態様では、抗体のグリコシル化は修飾される。例えばアグリコシル化抗体（すなわちグリコシル化を欠いた抗体）は作られてよい。グリコシル化は、例えば「抗原」に対する抗体の親和性を増加させるために変更されてよい。そのような炭水化物修飾は、例えば抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変更することによって達成され得る。例えば１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去を生じ、それによりその部位でのグリコシル化を除外する１つまたは複数のアミノ酸置換は作られてよい。そのようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させる場合がある。そのような手法はＣｏ  ｅｔ  ａｌ．による、例えば米国特許第５，７１４，３５０号明細書および米国特許第６，３５０，８６１号明細書に記載されている。
【０２３６】
追加的にまたは代替的に抗体は、フコシル残基の量が低減している低フコシル化抗体または二分しているＧｌｃＮａｃ構造が増加している抗体などのグリコシル化の種類が変更された抗体は作られてよい。そのようなグリコシル化様式の変更は、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構の変更を有する宿主細胞において抗体を発現することによって達成され得る。グリコシル化機構が変更された細胞は、当技術分野において記載されており、組換え抗体を発現し、それによりグリコシル化が変更された抗体を産生するための宿主細胞として使用され得る。例えばＨａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．による欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載しており、そのような細胞株で発現される抗体は低フコシル化を示す。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、Ａｓｎ（２９７）連結炭水化物にフコースを付着させる能力が低減しており、宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化も生じているバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞を記載している（Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開第９９／５４３４２号パンフレットは、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株を記載しており、操作された細胞株で発現された抗体は抗体のＡＤＣＣ活性の増加を生じる二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示す（Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999も参照されたい）。
【０２３７】
別の態様では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるために修飾される。種々の手法が可能である。例えばＷａｒｄへの米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のとおり１つまたは複数の以下の変異は導入されてよい：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。代替的に生物学的半減期を増加させるためにＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，８６９，０４６号明細書および米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載のとおり、抗体はＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更されてよい。
【０２３８】
抗体のＡＤＣＣ活性を最少化するために、Ｆｃ領域中の特異的変異はエフェクター細胞との相互作用が最少化した「Ｆｃ発現抑制」抗体を生じる。一般に「ＩｇＧ  Ｆｃ領域」は天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、ＩｇＧ抗体の位置Ｃ２２６からまたはＰ２３０からカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むと定義される。Ｆｃ領域における残基の番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（残基Ｋ４４７）は、例えば抗体の産生または精製の際に除去されてよい。
【０２３９】
発現抑制されたエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域における変異によって得られてよく、当技術分野において記載されている：ＬＡＬＡおよびＮ２９７Ａ（Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691）ならびにＤ２６５Ａ（Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181 : 6664-69）、Ｈｅｕｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第２０１２０６５９５０号パンフレットも参照されたい。発現抑制Ｆｃ  ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列中にＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を含むＬＡＬＡ変異体である。発現抑制ＩｇＧ１抗体の別の例は、ＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ）変異（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）である。別の発現抑制ＩｇＧ１抗体は、アグリコシル化／非グリコシル化抗体を生じるＮ２９７Ａ変異を含む。
【０２４０】
Ｆｃ発現抑制抗体は、ＡＤＣＣ活性を生じないまたは、５０％より低い特異的細胞溶解であるＡＤＣＣ活性をＦｃ発現抑制抗体が示すことを意味する低いＡＤＣＣ活性を生じる。ＡＤＣＣ活性が無いことは、Ｆｃ発現抑制抗体が１％より低いＡＤＣＣ活性（特異的細胞溶解）を示すことを意味している。
【０２４１】
３．ＣＤＨ６抗体の産生
抗ＣＤＨ６抗体およびその抗体断片（例えば抗原結合断片）は、これだけに限らないが、組換え発現、化学合成および抗体四量体の酵素消化を含む当技術分野において公知の任意の手段によって産生されてよく、一方全長モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマまたは組換え産生物によって得ることができる。組換え発現は、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などの当技術分野において公知の任意の適切な宿主細胞由来であってよい。
【０２４２】
本開示は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、重鎖もしくは軽鎖可変領域または本明細書に記載の相補性決定領域を含むセグメントをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかの態様では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を配列番号２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０、２７４、２８８、３０２、３１６および３３０からなる群から選択されるポリヌクレオチドに有する。いくつかの態様では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を配列番号２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１、２７５、２８９、３０３、３１７および３３１からなる群から選択されるポリヌクレオチドに有する。
【０２４３】
いくつかの態様では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を配列番号２６、４０、５４、６８、８２、９６、１１０、１２４、１３８、１５２、１６６、１８０、１９４、２０８、２２２、２３６、２５０、２６４、２７８、２９２、３０６、３２０および３３４のポリヌクレオチドに有する。いくつかの態様では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を配列番号２７、４１、５５、６９、８３、９７、１１１、１２５、１３９、１５３、１６７、１８１、１９５、２０９、２２３、２３７、２５１、２６５、２７９、２９３、３０７、３２１および３３５のポリヌクレオチドに有する。
【０２４４】
本開示のポリヌクレオチドは、抗ＣＤＨ６抗体の可変領域配列だけをコードする場合がある。それらは、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードする場合もある。ポリヌクレオチド配列のいくつかは例示された抗ＣＤＨ６抗体の内の１個の重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。いくつかの他のポリヌクレオチドは、マウス抗体の内の１個の重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２個のポリペプチドセグメントをコードする。
【０２４５】
ポリヌクレオチド配列は、新規の固相ＤＮＡ合成によってまたは抗ＣＤＨ６抗体もしくはその結合断片をコードする既存の配列（例えば下の実施例に記載の配列）のＰＣＲ変異誘発によって、産生されてよい。核酸の直接化学合成は、Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979のホスホトリエステル方法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のリン酸ジエステル方法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホラミダイト方法；ならびに米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持体方法などの当技術分野において公知の方法によって達成され得る。ＰＣＲによってポリヌクレオチド配列に変異を導入することは、例えばPCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990、Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のとおり実施されてよい。
【０２４６】
本開示において同様に提供されるのは、上に記載の抗ＣＤＨ６抗体を産生するための発現ベクターおよび宿主細胞である。種々の発現ベクターは、抗ＣＤＨ６抗体鎖または結合断片をコードしているポリヌクレオチドを発現するために用いられてよい。ウイルスに基づくおよび非ウイルス性の両方の発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞において抗体を産生するために使用され得る。非ウイルス性ベクターおよび系は、プラスミド、エピソームベクターを典型的にはタンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットと共に、およびヒト人工染色体を含む（例えばHarrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えばヒト）細胞における抗ＣＤＨ６ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のために有用な非ウイルス性ベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、Ｂ  ＆  Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、Ｂ  ＆  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクターおよび他のタンパク質を発現するための当技術分野において公知の多数の他のベクターを含む。有用なウイルス性ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクチニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターを含む。Brent et al., 上記、Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
【０２４７】
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される目的の宿主細胞に依存する。典型的には発現ベクターは、抗ＣＤＨ６抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の制御配列（例えばエンハンサー）を含有する。いくつかの態様では、誘導可能プロモーターは、誘導条件下以外での挿入配列の発現を妨げるために用いられる。誘導可能プロモーターは、例えばアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、その発現産生物が宿主細胞によってより良く許容されるコード配列に集団を偏らせることなく非誘導条件下で増殖されてよい。プロモーターに加えて他の制御エレメントも抗ＣＤＨ６抗体鎖または断片の効率的な発現のために必要であるまたは望ましい場合もある。これらのエレメントは、典型的にはＡＴＧ開始コドンを含み、リボソーム結合部位または他の配列に近接している。付加的に発現の効率は、使用される細胞系に好適なエンハンサーの組み入れによって増強され得る（例えばScharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えばＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるために使用され得る。
【０２４８】
発現ベクターは、挿入された抗ＣＤＨ６抗体配列によってコードされたポリペプチドと融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供できる。さらに頻繁には挿入された抗ＣＤＨ６抗体配列は、ベクターへの組み入れの前にシグナル配列に連結される。抗ＣＤＨ６抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受けるために使用されるベクターは、時に定常領域またはその一部もコードする。そのようなベクターは、定常領域を含む融合タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それによりインタクトな抗体またはその断片の産生をもたらす。典型的にはそのような定常領域はヒトである。
【０２４９】
抗ＣＤＨ６抗体鎖を保有し発現する宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれであってもよい。大腸菌（E. coli）は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングおよび発現するために有用な１つの原核生物宿主である。使用のために好適な他の微生物性宿主は、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌およびサルモネラなどの他の腸内細菌、セラチアおよび種々のシュードモナス菌種を含む。これらの原核宿主では、典型的には宿主細胞に適合性である発現調節配列（例えば複製開始点）を含有する発現ベクターも作ることができる。付加的に、乳糖プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系またはファージラムダ由来プロモーター系などの多数の種々の周知のプロモーターが存在する。プロモーターは、任意選択でオペレーター配列と共に典型的には発現を調節し、転写および翻訳を開始し、完了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も抗ＣＤＨ６ポリペプチドを発現するために用いられてよい。昆虫細胞はバキュロウイルスベクターと組み合わせて使用されてもよい。
【０２５０】
他の態様では、哺乳動物宿主細胞は、本開示の抗ＣＤＨ６ポリペプチドを発現および産生するために使用される。例えばそれらは、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株（例えば骨髄腫ハイブリドーマクローン）または外来性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞株（例えばＳＰ２／０骨髄腫細胞）のいずれかであってよい。これらは、任意の正常致死細胞または正常もしくは異常不死性動物もしくはヒト細胞を含む。例えば、インタクトな免疫グロブリンを分泌できるいくつかの好適な宿主細胞株がＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含んで開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養の使用は一般に例えばWinnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において考察されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーターおよびエンハンサー（例えばQueen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）などの発現調節配列ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列などの必要なプロセシング情報部位を含んでよい。これらの発現ベクターは、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターを通常含有する。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、ステージ特異的および／または調節可能もしくは制御可能であってよい。有用なプロモーターは、これだけに限らないがメタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト前初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーターおよび当技術分野において公知のプロモーターエンハンサー組合せを含む。
【０２５１】
目的のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞性宿主の種類に依存して変化する。例えば塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞のために一般に利用される、一方リン酸カルシウム処置または電気穿孔法は他の細胞性宿主のために使用され得る（一般に上記Sambrook et al.を参照されたい）。他の方法は、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム処置、リポソーム媒介形質転換、注入および微量注入、弾道方法、ビロソーム、イムノリポソース、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Elliot and O’Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強取り込みおよびｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入を含む。組換えタンパク質の長期、高収量産生、安定発現はしばしば望ましい。例えば、抗ＣＤＨ６抗体鎖または結合断片を安定に発現する細胞株は、ウイルス由来複製開始点または内在性発現エレメントおよび選択可能マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用して調製され得る。ベクターの導入後、細胞は、選択培地に切り替えられる前に富化された培地中で１〜２日間成長させてよい。選択可能マーカーの目的は、選択のための耐性を与えることであり、その存在は選択的培地中で導入された配列をうまく発現する細胞の成長を可能にする。耐性で安定にトランスフェクトされた細胞は細胞型に好適な組織培養技術を使用して増殖され得る。
【０２５２】
治療的および診断的使用
本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）および抗体薬物コンジュゲートは、これだけに限らないが、固形がんなどのがんの処置を含む種々の適用において有用である。特定の態様では、抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）および抗体薬物コンジュゲートは、腫瘍成長を阻害すること、分化を誘導すること、腫瘍容積を低減することおよび／または腫瘍の腫瘍形成能を低減することにおいて有用である。使用の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ方法であってよい。
【０２５３】
一態様では、抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）および抗体薬物コンジュゲートは、生物学的試料中のＣＤＨ６の存在を検出するために有用である。本明細書において使用される用語「検出する」は、定量的または定性的検出を包含する。特定の態様では、生物学的試料は細胞または組織を含む。特定の態様では、そのような組織は、他の組織と比較してより高いレベルのＣＤＨ６を発現する正常および／またはがん性組織を含む。
【０２５４】
一態様では、本開示は、生物学的試料中のＣＤＨ６の存在を検出する方法を提供する。特定の態様では、方法は、抗体の抗原への結合を許容する条件下で生物学的試料を抗ＣＤＨ６抗体に接触させることおよび、複合体が抗体と抗原との間で形成されるかどうかを検出することを含む。
【０２５５】
同様に含まれるのは、ＣＤＨ６の発現の増加と関連する障害を診断する方法である。特定の態様では、方法は、検査細胞を抗ＣＤＨ６抗体と接触させること、抗ＣＤＨ６抗体のＣＤＨ６抗原への結合を検出することによって検査細胞でのＣＤＨ６の発現のレベルを（定量的または定性的のいずれかで）決定すること、および検査細胞でのＣＤＨ６の発現のレベルを対照細胞（例えば検査細胞と同じ組織由来の正常細胞またはそのような正常細胞に匹敵するレベルでＣＤＨ６を発現している細胞）でのＣＤＨ６の発現のレベルを比較することを含み、対照細胞と比較して検査細胞におけるＣＤＨ６の発現のより高いレベルはＣＤＨ６の発現の増加に関連する障害の存在を示している。特定の態様では、検査細胞は、ＣＤＨ６の発現の増加に関連する障害を有すると疑われる個体から得られる。特定の態様では、障害は、がんまたは腫瘍などの細胞増殖性障害である。
【０２５６】
特定の態様では、上に記載のものなどの診断または検出方法は、細胞の表面上に発現されるまたはその表面上にＣＤＨ６を発現している細胞から得られた膜調製物中のＣＤＨ６への抗ＣＤＨ６抗体の結合を検出することを含む。細胞の表面上に発現されるＣＤＨ６への抗ＣＤＨ６抗体の結合を検出するための例示的アッセイは「ＦＡＣＳ」アッセイである。
【０２５７】
ある種の他の方法は、ＣＤＨ６への抗ＣＤＨ６抗体の結合を検出するために使用され得る。そのような方法は、これだけに限らないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）などの当技術分野において周知である抗原結合アッセイを含む。
【０２５８】
特定の態様では、抗ＣＤＨ６抗体は標識される。標識は、これだけに限らないが、直接検出される標識または部分（蛍光、発色団、電子密度、化学発光および放射標識など）、ならびに間接的に、例えば酵素反応または分子相互作用を通じて検出される酵素またはリガンドなどの部分を含む。
【０２５９】
特定の態様では、抗ＣＤＨ６抗体は、不溶性マトリクスに固定される。固定化は、溶液において遊離のままであるいかなるＣＤＨ６タンパク質からも抗ＣＤＨ６抗体を分離することを伴う。従来は、これは、アッセイ手順の前に抗ＣＤＨ６抗体を不溶化することによって、不溶性マトリクスもしくは表面に吸着させることによって（Ｂｅｎｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第３，７２０，７６０号明細書）または共有結合することによって（例えばグルタルアルデヒド架橋を使用して）または抗ＣＤＨ６抗体とＣＤＨ６タンパク質との間の複合体の形成後に例えば免疫沈降によって抗ＣＤＨ６抗体を不溶化することによってのいずれかによって達成される。
【０２６０】
診断または検出の上記態様のいずれも抗ＣＤＨ６抗体の代わりにまたは付加的に本開示のイムノコンジュゲートを使用して実行され得る。
【０２６１】
一態様では、本開示は、患者に抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）および抗体薬物コンジュゲートを投与すること、それにより疾患を処置することを含む疾患を処置する、予防するまたは回復させる方法を提供する。特定の態様では、抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）および抗体薬物コンジュゲートで処置される疾患は、がんである。処置および／または予防され得る疾患の例は、これだけに限らないが、卵巣がん、腎臓がん、肝臓がん、軟部組織がん、ＣＮＳがん、甲状腺がんおよび胆管細胞癌を含む。特定の態様では、がんは、抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）および抗体薬物コンジュゲートが特異的に結合できるＣＤＨ６発現細胞によって特徴付けられる。
【０２６２】
本開示は、治療有効量の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含むがんを処置する方法を提供する。特定の態様では、がんは、固形がんである。特定の態様では、対象はヒトである。
【０２６３】
特定の態様では、腫瘍成長を阻害する方法は、治療有効量の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートを対象に投与することを含む。特定の態様では、対象はヒトである。特定の態様では、対象は、腫瘍を有するまたは腫瘍が除去されたことがある。
【０２６４】
特定の態様では、腫瘍は、抗ＣＤＨ６抗体が結合するＣＤＨ６を発現する。特定の態様では、腫瘍はヒトＣＤＨ６を過剰発現する。
【０２６５】
疾患の処置のための抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートの好適な投与量は、処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、疾患の応答性、過去の治療、患者の病歴などの種々の因子に依存する。抗体または薬剤は、一度または数日から数カ月間継続する一連の処置にわたってまたは、治癒が達成されるもしくは疾患状況の減退（例えば腫瘍サイズにおける低減）が達成されるまで投与されてよい。最適な投薬スケジュールは、患者の身体中の薬物蓄積の測定から算出でき、個々の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートの相対強度に応じて変化する。特定の態様では、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１０ｍｇ（例えば、０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇまたは１０ｍｇ）であり、１日に、週に、月にまたは１年に１回以上与えられてよい。特定の態様では、本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートは、２週間ごとに１回または３週間ごとに１回与えられる。処置医師は、体液または組織中での薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて投薬の反復数を見積もることができる。
【０２６６】
組合せ療法
場合により、本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートは、他の抗がん剤、抗アレルギー剤、制吐剤（または催吐剤）、鎮痛剤、細胞保護剤およびこれらの組合せなどの他の治療剤と組み合わされる。
【０２６７】
組合せ療法における使用について検討される一般化学療法剤は、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、ブレオマイシン硫酸塩（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射剤（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントオキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ（登録商標））、ダウノルビシン塩酸塩（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン（tezacitibine）、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、タモキシフェンクエン酸塩（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用トポテカン塩酸塩（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含む。
【０２６８】
一態様では、本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートは、抗がん特性を有する第２の化合物と医薬組合せ製剤中にまたは組合せ療法として投薬レジメン中で組み合わされる。医薬組合せ製剤または投薬レジメン中の第２の化合物は、組合せの抗体またはイムノコンジュゲートに、それらが互いに悪影響を与えないような相補的活性を有する場合がある。例えば本開示の抗体、抗体断片（例えば抗原結合断片）または抗体薬物コンジュゲートは、これだけに限らないが化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブと組み合わせて投与されてよい。
【０２６９】
本明細書において使用される用語「医薬組合せ」は、一投与単位形態中の一定の組合せ、または一定でない組合せ、または２つ以上の治療剤が個々に同時にもしくは期間内で別々に投与され得る場合、特にこれらの期間が組合せのパートナーが協同、例えば相乗効果を示す場合の組合せ投与のためのキットの一部を指す。
【０２７０】
用語「組合せ療法」は、本開示に記載の治療的状態または障害を処置するための２個以上の治療剤の投与を指す。そのような投与は、一定の割合で活性成分を含む単一のカプセル中などの実質的に同時の様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。代替的にそのような投与は、各活性成分について複数でのまたは別々の容器中（例えば、カプセル、粉末および液体）での同時投与を包含する。粉末および／または液体は、投与前に所望の用量に再構成または希釈されてよい。付加的にそのような投与は、およそ同時または異なる時点でのいずれかの逐次的様式での各種類の治療剤の使用も包含する。それぞれの場合において、処置レジメンは、本明細書に記載の状態または障害を処置することに薬物組合せの有益な効果を提供する。
【０２７１】
組合せ療法は、「相乗効果」を提供でき、「相乗的」を証明できる、すなわち、活性成分が一緒に使用される場合に達成される効果が、化合物が別々に使用されて生じる効果の合計より大きい。相乗効果は、活性成分が：（１）同時製剤化され、組み合わせて単位投与製剤で同時に投与もしくは送達される、（２）別々の製剤として交互にもしくは並行して送達される、または（３）何らかの他のレジメンによる場合に達成され得る。代替療法において送達される場合、相乗効果は例えば別々のシリンジ中での異なる注射によって、化合物が逐次的に投与または送達される場合に達成され得る。一般に代替療法の際に各活性成分の有効投与量は逐次的、すなわち逐次的に投与される一方で、組合せ療法では２つ以上活性成分の有効投与量は一緒に投与される。
【０２７２】
一態様では、本開示は、抗体薬物コンジュゲートをこれだけに限らないが、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含む１つまたは複数のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせてそれを必要とする対象に投与することによってがんを処置する方法を提供する。
【０２７３】
例えばチロシンキナーゼ阻害剤は、これだけに限らないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｎ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）尿素、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能なＡＢＴ８６９としても公知）；スニチニブリンゴ酸（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、ＳＫＩ−６０６としても公知、米国特許第６，７８０，９９６号明細書に記載）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パソパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；ザクチマ（Ｚａｃｔｉｍａ）（ＺＤ６４７４）；ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））；レゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標））およびイマチニブまたはイマチニブメシレート（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））を含む。
【０２７４】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤は、これだけに限らないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３’’Ｓ’’）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ４９７８３９−６２−０）；ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（quinazolinamine）（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）；および４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール（ＰＫＩ１６６、ＣＡＳ１８７７２４−６１−４）を含む。
【０２７５】
ＥＧＦＲ抗体は、これだけに限らないが、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ３３９１５１−９６−１）；およびｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ９４６４１４−０９−１）を含む。
【０２７６】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２受容体）（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０またはｐ１８５としても公知）阻害剤は、これだけに限らないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ペルスツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［（ピリジン−２−イル）メトキシ］フェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミドおよび国際公開第０５／０２８４４３号パンフレットに記載のもの）；ラパチニブまたはラパチニブジトシル化物（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；（２Ｅ）−Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（ＢＩＢＷ−２９９２、ＣＡＳ８５０１４０−７２−６）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６、ＣＡＳ７１４９７１−０９−２）；カネルチニブ二塩酸塩（ＰＤ１８３８０５またはＣＩ−１０３３）；およびＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）を含む。
【０２７７】
ＨＥＲ３阻害剤は、これだけに限らないが、ＬＪＭ７１６、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、ＲＧ７１１６、ＲＥＧＮ−１４００、ＡＶ−２０３、ＭＰ−ＲＭ−１、ＭＭ−１１１およびＭＥＨＤ−７９４５Ａを含む。
【０２７８】
ＭＥＴ阻害剤は、これだけに限らないが、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ８４９２１７−６８−１）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、公式にはＸＬ８８０、ＣＡＳ８４９２１７−６４−７）；チバンチニブ（ＡＲＱ１９７、ＣＡＳ１０００８７３−９８−２）；１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（５−（７−メトキシキノリン−４−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−５−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＡＭＧ４５８）；クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６）；（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＳＵ１１２７１）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１２７４）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１６０６）；６−［ジフルオロ［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］メチル］−キノリン（ＪＮＪ３８８７７６０５、ＣＡＳ９４３５４０−７５−８）；２−［４−［１−（キノリン−６−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロロ［４，５−ｂ］ピラジン−６−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノール（ＰＦ０４２１７９０３、ＣＡＳ９５６９０５−２７−４）；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド（ＭＫ２４６１、ＣＡＳ９１７８７９−３９−１）；６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］チオ］−キノリン（ＳＧＸ５２３、ＣＡＳ１０２２１５０−５７−７）；および（３Ｚ）−５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］スルホニル］−３−［［３，５−ジメチル−４−［［（２Ｒ）−２−（１−ピロリジニルメチル）−１−ピロリジニル］カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＰＨＡ６６５７５２、ＣＡＳ４７７５７５−５６−７）を含む。
【０２７９】
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤は、これだけに限らないが、ＢＭＳ−７５４８０７、ＸＬ−２２８、ＯＳＩ−９０６、ＧＳＫ０９０４５２９Ａ、Ａ−９２８６０５、ＡＸＬ１７１７、ＫＷ−２４５０、ＭＫ０６４６、ＡＭＧ４７９、ＩＭＣＡ１２、ＭＥＤＩ−５７３およびＢＩ８３６８４５を含む。概説について例えばYee, JNCI, 104; 975 (2012)を参照されたい。
【０２８０】
別の態様では、本開示は、抗体薬物コンジュゲートを、これだけに限らないが、ＭＥＫ阻害剤、Ｂｒａｆ阻害剤、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤、ＳＨＰ２阻害剤および同様にｍＴｏｒ阻害剤を含む１つまたは複数のＦＧＦ下流シグナル伝達経路阻害剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによってがんを処置する方法を提供する。
【０２８１】
例えばマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤は、これだけに限らないが、ＸＬ−５１８（ＧＤＣ−０９７３としても公知、Ｃａｓ  Ｎｏ．１０２９８７２−２９−４、ＡＣＣ  Ｃｏｒｐ．から入手可能）；２−［（２−クロロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド（ＣＩ−１０４０またはＰＤ１８４３５２としても公知、国際公開第２００００３５４３６号パンフレットに記載）；Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１としても公知、国際公開第２００２００６２１３号パンフレットに記載）；２，３−ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ］メチレン］−ブタンジニトリル（Ｕ０１２６としても公知、米国特許第２，７７９，７８０号明細書に記載）；Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６−メトキシフェニル］−１−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロピル］−シクロプロパンスルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９またはＢＡＹ８６９７６６としても公知、国際公開第２００７０１４０１１号パンフレットに記載）；（３Ｓ，４Ｒ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）−１４−（エチルアミノ）−８，９，１６−トリヒドロキシ−３，４−ジメチル−３，４，９，１９−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾキサシクロテトラデシン−１，７（８Ｈ）−ジオン］（Ｅ６２０１としても公知、国際公開第２００３０７６４２４号パンフレットに記載）；２’−アミノ−３’−メトキシフラボン（Ｂｉａｆｆｉｎ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．、ＫＧ、ドイツから入手可能なＰＤ９８０５９としても公知）；ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２、ＣＡＳ９１８５０４−６５−１）；（Ｒ）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４，７（３Ｈ，８Ｈ）−ジオン（ＴＡＫ−７３３、ＣＡＳ１０３５５５５−６３−５）；ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６、ＣＡＳ１２０４５３１−２６−９）；およびトラメチニブジメチルスルホキシド（ＧＳＫ−１１２０２１２、ＣＡＳ１２０４５３１−２５−８０）を含む。
【０２８２】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤は、これだけに限らないが、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（ＧＤＣ  ０９４１としても公知、国際公開第０９／０３６０８２号パンフレットおよび国際公開第０９／０５５７３０号パンフレットに記載）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ  ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ  ２３５としても公知、国際公開第０６／１２２８０６号パンフレットに記載）；４−（トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−アミン（ＢＫＭ１２０またはＮＶＰ−ＢＫＭ１２０としても公知、国際公開第２００７／０８４７８６号パンフレットに記載）；トザセルチブ（ＶＸ６８０またはＭＫ−０４５７、ＣＡＳ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６、ＣＡＳ５０２６３２−６６−８）；および８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ１５４４４７−３６−６）を含む。
【０２８３】
ｍＴｏｒ阻害剤は、これだけに限らないが、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））；リダフォロリムス（公式にはデフェロリムス（deferolimus）として公知、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ、２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３、２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても公知、国際公開第０３／０６４３８３号パンフレットに記載）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；シマピモド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−Ｂｉｓ［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；およびＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）を含む。
【０２８４】
さらに別の態様では、本開示は、抗体薬物コンジュゲートを、これだけに限らないが、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣｌ１阻害剤、Ｔｒａｉｌ剤、Ｃｈｋ阻害剤を含む１つまたは複数のアポトーシス促進剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによってがんを処置する方法を提供する。
【０２８５】
例えばＩＡＰ阻害剤は、これだけに限らないが、ＮＶＰ−ＬＣＬ１６１、ＧＤＣ−０９１７、ＡＥＧ−３５１５６、ＡＴ４０６およびＴＬ３２７１１を含む。ＩＡＰ阻害剤の他の例は、これだけに限らないが、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０４／００５２８４号パンフレット、国際公開第０４／００７５２９号パンフレット、国際公開第０５／０９７７９１号パンフレット、国際公開第０５／０６９８９４号パンフレット、国際公開第０５／０６９８８８号パンフレット、国際公開第０５／０９４８１８号パンフレット、米国特許出願公開２００６／００１４７００号明細書、米国特許出願公開２００６／００２５３４７号明細書、国際公開第０６／０６９０６３号パンフレット、国際公開０６／０１０１１８号パンフレット、国際公開第０６／０１７２９５号パンフレットおよび国際公開第０８／１３４６７９号パンフレットに記載のものを含む。
【０２８６】
ＢＣＬ−２阻害剤は、これだけに限らないが、４−［４−［［２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル］メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］フェニル］スルホニル］ベンズアミド（ＡＢＴ−２６３としても公知、国際公開第０９／１５５３８６号パンフレットに記載）；テトロカルシンＡ；アンチマイシン；ゴシポール（（−）ＢＬ−１９３）；オバトクラックス；エチル−２−アミノ−６−シクロペンチル−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈクロモン−３−カルボキシレート（ＨＡ１４−１）；オブリメルセン（Ｇ３１３９、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））；Ｂａｋ  ＢＨ３ペプチド；（−）−ゴシポール酢酸（ＡＴ−１０１）；４−［４−［（４’−クロロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−ニトロフェニル］スルホニル］−ベンズアミド（ＡＢＴ−７３７、ＣＡＳ８５２８０８−０４−９）；およびナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３、ＣＡＳ９２３５６４−５１−６）を含む。
【０２８７】
アポトーシス促進性受容体アゴニスト（ＰＡＲＡ）は、これだけに限らないが、デュラネルミン（ＡＭＧ−９５１、ＲｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）；マパツムマブ（ＨＲＳ−ＥＴＲ１、ＣＡＳ６５８０５２−０９−６）；レクサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＡＳ８４５８１６−０２−６）；アポマブ（Ａｐｏｍａｂ（登録商標））；コナツムマブ（ＡＭＧ６５５、ＣＡＳ８９６７３１−８２−１）；およびティガツムマブ（ＣＳ１００８、ＣＡＳ９４６４１５−３４−５、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏから入手可能）を含むＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）を含む。
【０２８８】
チャックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）阻害剤は、これだけに限らないが、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）；６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピペリジニル−ピラゾール［１，５−α］ピリミジン−７−アミン（ＳＣＨ９００７７６、ＣＡＳ８９１４９４−６３−６）；５−（３−フルオロフェニル）−３−ウレイドチオフェン−２−カルボン酸Ｎ−［（Ｓ）−ピペリジン−３−イル］アミド（ＡＺＤ７７６２、ＣＡＳ８６０３５２−０１−８）；４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２，２，２］ｏｃｔ−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＨＩＲ  １２４、ＣＡＳ４０５１６８−５８−３）；７−アミノダクチノマイシン（７−ＡＡＤ）、イソグラヌラチミド、デブロモハイメニアルディシン；Ｎ−［５−ブロモ−４−メチル−２−［（２Ｓ）−２−モルホリニルメトキシ］−フェニル］−Ｎ’−（５−メチル−２−ピラジニル）尿素（ＬＹ２６０３６１８、ＣＡＳ９１１２２２−４５−２）；スルホラファン（ＣＡＳ４４７８−９３−７、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート）；９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＳＢ−２１８０７８、ＣＡＳ１３５８９７−０６−２）；およびＴＡＴ−Ｓ２１６Ａ（Sha et al.、Mol. Cancer. Ther 2007; 6(1):147-153）およびＣＢＰ５０１を含む。
【０２８９】
一態様では、本開示は、抗体薬物コンジュゲートを１つまたは複数のＦＧＦＲ阻害剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによってがんを処置する方法を提供する。例えばＦＧＦＲ阻害剤は、これだけに限らないが、ブリバニブアラニネート（ＢＭＳ−５８２６６４、（Ｓ）−（（Ｒ）−１−（４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ）プロパン−２−イル）２−アミノプロパノエート）；ヴァルガテフ（Vargatef）（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ９２８３２６−８３−４）ドビチニブ二乳酸（ＴＫＩ２５８、ＣＡＳ８５２４３３−８４−２）；３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル尿素（ＢＧＪ３９８、ＣＡＳ８７２５１１−３４−７）；ダヌセルチブ（ＰＨＡ−７３９３５８）；および（ＰＤ１７３０７４、ＣＡＳ２１９５８０−１１−７）を含む。具体的な態様では、本開示は、抗体薬物コンジュゲートを３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−１−（６（（４−（４−エチルピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−１−メチル尿素（ＢＧＪ−３９８としても公知）；または４−アミノ−５−フルオロ−３−（５−（４−メチルピペラジン１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（ドビチニブまたはＴＫＩ−２５８としても公知）、ＡＺＤ４５４７（Gavine et al., 2012, Cancer Research 72, 2045-56、Ｎ−［５−［２−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル］−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−４−（３Ｒ，５Ｓ）−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４；Gozgit et al., 2012, Mol Cancer Ther., 11; 690-99；３−［２−（イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）エチニル］−４−メチル−Ｎ−｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル｝ベンズアミド、ＣＡＳ９４３３１９−７０−８）などのＦＧＦＲ２阻害剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによってがんを処置する方法を提供する。
【０２９０】
医薬組成物
イムノコンジュゲートを含む医薬または滅菌組成物を調製するために、本開示のイムノコンジュゲートは薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。組成物は、がん、例えば、卵巣がん、腎臓がん、肝臓がん、軟部組織がん、ＣＮＳがん、甲状腺がんおよび胆管細胞癌を処置または予防するために好適である１つまたは複数の他の治療剤を追加的に含有してよい。
【０２９１】
治療剤および診断剤の製剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローションまたは懸濁物の形態で調製され得る（例えばHardman et al., Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001、Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000、Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993、Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990、Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990、Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000を参照されたい）。
【０２９２】
具体的な態様では、本開示の抗体薬物コンジュゲートの臨床サービス形態（ＣＳＦ）は、ＡＤＣ、コハク酸ナトリウムおよびポリソルベート２０を含有するバイアル中の凍結乾燥物である。凍結乾燥物は注射用の水で再構成されてよく、溶液はＡＤＣ、コハク酸ナトリウム、ショ糖およびポリソルベート２０を約５．０のｐＨで含む。続く静脈内投与のために、得られた溶液は通常担体溶液にさらに希釈される。
【０２９３】
治療用の投与レジメンを選択することは、実体の血清または組織代謝回転率、症状のレベル、実体の免疫原性および生物学的マトリクス中での標的細胞の到達性を含むいくつかの因子に依存する。特定の態様では、投与レジメンは、副作用の許容可能なレベルに合致して、患者に送達される治療剤の量を最大化する。したがって、送達される生物剤の量は、具体的な実体および処置される状態の重症度に一部依存する。抗体、サイトカインおよび小分子の好適な用量を選択する指針は利用可能である（例えばWawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996、Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991、Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993、Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003、Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999、Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001、Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000、Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003、Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000を参照されたい）。
【０２９４】
好適な用量の決定は、例えば、当技術分野において処置に影響を与えることが公知であるもしくは疑われるまたは処置に影響を与えると予測されるパラメーターまたは因子を使用して医師によってなされる。一般に用量は、最適用量よりいくぶん少ない量で始め、その後すべての負の副作用と比較して所望のまたは最適な効果が達成されるまでわずかずつ増加される。重要な診断測定は、症候性のもの、例えば炎症または産生される炎症性サイトカインのレベルを含む。
【０２９５】
医薬組成物抗体薬物コンジュゲート中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性であることなく、具体的な患者のために所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量、組成物および投与の様式を得るために変更されてよい。選択される投与量レベルは、用いられる本開示の具体的な組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時期、用いられる具体的な化合物の排出速度、処置の持続時間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および病歴、ならびに医学において公知の同様の因子を含む種々の薬物動態学的因子に依存する。
【０２９６】
抗体またはその断片を含む組成物は、持続点滴によってまたは例えば１日１回、１週間に１回もしくは１週間に１〜７回の間隔での投薬によって提供されてよい。投薬は、静脈内、皮下、局所的、経口、経鼻、直腸内、筋肉内、脳内または吸入によって提供されてよい。具体的な投薬プロトコールは、顕著な望ましくない副作用を回避する最大用量または投薬頻度を含むものである。
【０２９７】
本開示のイムノコンジュゲートについて患者に投与される投与量は、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇであってよい。投与量は、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１から２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１から１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１から０．１５またはｍｇ／ｋｇ、０．０００１から０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１から０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１から０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１から０．１０ｍｇ／ｋｇの間であってよい。抗体またはその断片の投与量は、キログラム（ｋｇ）での患者の体重にｍｇ／ｋｇで投与される用量を乗じたものを使用して算出され得る。
【０２９８】
イムノコンジュゲートの投薬は反復されてよく、投与は少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月または少なくとも６カ月離されていてよい。具体的な態様では、本開示のイムノコンジュゲートの用量は、３週間ごとに反復される。
【０２９９】
具体的な患者のための有効量は、処置される状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度などの因子に依存して変化する場合がある（例えばMaynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996、Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001を参照されたい）。
【０３００】
投与の経路は、例えば局所もしくは皮膚適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼球内、動脈内、脳脊髄内、病巣内への注射もしくは点滴または徐放性系もしくはインプラントによってであってよい（例えばSidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981、Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985、Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980、米国特許第６，３５０，４６６号明細書および米国特許第６，３１６，０２４号明細書を参照されたい）。必要に応じて組成物は、可溶化剤もしくは注射部位の疼痛をやわらげるためのリドカインなどの局所麻酔を、または両方を含む場合もある。付加的に経肺投与も、例えば吸入器または噴霧器およびエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって用いられてよい。例えばそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０１９，９６８号明細書、米国特許第５，９８５，３２０号明細書、米国特許第５，９８５，３０９号明細書、米国特許第５，９３４，２７２号明細書、米国特許第５，８７４，０６４号明細書、米国特許第５，８５５，９１３号明細書、米国特許第５，２９０，５４０号明細書および米国特許第４，８８０，０７８号明細書；ならびにＰＣＴ出願国際公開第９２／１９２４４号パンフレット、国際公開第９７／３２５７２号パンフレット、国際公開第９７／４４０１３号パンフレット、国際公開第９８／３１３４６号パンフレットおよび国際公開第９９／６６９０３号パンフレットを参照されたい。
【０３０１】
本開示の組成物は、当技術分野において公知の１つまたは複数の種々の方法を使用して１つまたは複数の投与の経路を介して投与されてもよい。当業者によって理解されるとおり、投与の経路および／またはモードは、所望の結果に応じて変化する。イムノコンジュゲートのために選択される投与経路は、例えば注射または点滴による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路を含む。非経口投与は、経腸的および局所投与以外の、通常注射による投与のモードを表す場合があり、非限定的に静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含む。代替的に本開示の組成物は、投与の局所、表皮または粘膜経路の投与、例えば鼻腔内、経口、経膣、直腸内、舌下または局所的などの非経口ではない経路を介して投与されてよい。一態様では、本開示のイムノコンジュゲートは、点滴によって投与される。別の態様では、イムノコンジュゲートは皮下で投与される。
【０３０２】
本開示のイムノコンジュゲートが放出制御されたまたは徐放系で投与される場合、ポンプが制御または徐放を達成するために使用されてよい（Langer, 上記、Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987、Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980、Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989を参照されたい）。ポリマー性材料は、イムノコンジュゲートの治療薬の制御された放出または徐放を達成するために使用されてよい（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974、Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984、Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983を参照されたい、Levy et al., Science 228:190, 1985、During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989、Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989、米国特許第５，６７９，３７７号明細書、米国特許第５，９１６，５９７号明細書、米国特許第５，９１２，０１５号明細書、米国特許第５，９８９，４６３号明細書、米国特許第５，１２８，３２６号明細書、国際公開第９９／１５１５４号パンフレットおよび国際公開第９９／２０２５３号パンフレットも参照されたい。徐放性製剤において使用されるポリマーの例は、これだけに限らないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルを含む。一態様では、徐放性製剤において使用されるポリマーは、不活性、溶出不純物不含有、保存において安定、滅菌および生分解性である。制御された放出または徐放の系は、予防的または治療的な標的の近接に置かれてよく、それにより全身用量の一部だけを必要とする（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, 上記, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照されたい）。
【０３０３】
放出制御系は、Langer, Science 249:1527-1533, 1990）による概説において考察されている。当業者に公知の任意の技術は、本開示の１つまたは複数のイムノコンジュゲートを含む徐放性製剤を産生するために使用され得る。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５２６，９３８号明細書、ＰＣＴ公開国際公開第９１／０５５４８号パンフレット、ＰＣＴ公開国際公開第９６／２０６９８号パンフレット、Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996、Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995、Cleek et al., Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997およびLam et al., Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997を参照されたい。
【０３０４】
本開示のイムノコンジュゲートが局所的に投与される場合、それらは軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、乳液の形態または当業者に周知の他の形態に製剤化されてよい。例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。スプレー可能ではない局所投薬形態のために、局所適用に適合性であり、いくつかの場合では水より大きい動的粘度を有する担体または１つもしくは複数の賦形剤を含む粘稠から半流動性または固形形態は、典型的には用いられる。好適な製剤は、所望により滅菌されている、または例えば浸透圧などの種々の特性に影響を与えるために補助剤（例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液または塩）と混合されている、溶液、懸濁物、乳液、クリーム、軟膏、粉剤、リニメント、軟膏剤などを非限定的に含む。他の好適な局所投薬形態は、活性成分が、いくつかの場合では固体または液体不活性担体と組み合わせて、加圧された揮発性物質（例えばフレオンなどのガス状噴霧剤）との混合で、またはスクイーズボトルに包装されているスプレー可能なエアロゾル調製物を含む。保湿剤または保水剤も所望により医薬組成物および投薬形態に加えられてよい。そのような追加的成分の例は当技術分野において周知である。
【０３０５】
イムノコンジュゲートを含む組成物が鼻腔内に投与される場合、それはエアロゾル形態、スプレー、ミストまたは滴下剤の形態に製剤化されてよい。具体的には、本開示による使用のための予防または治療剤は、加圧された包装またはネブライザーからのエアロゾルスプレーを示す形態で、好適な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガス）の使用を伴って簡便に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投与単位は計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器における使用のためのカプセルおよび薬包（例えばゼラチンからなる）は、化合物と、乳糖またはデンプンなどの好適な粉末基剤との混合粉末を含有して製剤化されてよい。
【０３０６】
第２の治療剤、例えばサイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗菌薬または放射線との同時投与または処置のための方法は当技術分野において公知である（例えばHardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.、Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.、Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい）。治療薬の有効量は、症状を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも約３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％減少できる。
【０３０７】
イムノコンジュゲートと組み合わせて投与できる追加的治療薬（例えば、予防または治療剤）は、本開示のイムノコンジュゲートから５分間未満離して、３０分間未満離して、１時間離して、約１時間離して、約１から約２時間離して、約２時間から約３時間離して、約３時間から約４時間離して、約４時間から約５時間離して、約５時間から約６時間離して、約６時間から約７時間離して、約７時間から約８時間離して、約８時間から約９時間離して、約９時間から約１０時間離して、約１０時間から約１１時間離して、約１１時間から約１２時間離して、約１２時間から１８時間離して、１８時間から２４時間離して、２４時間から３６時間離して、３６時間から４８時間離して、４８時間から５２時間離して、５２時間から６０時間離して、６０時間から７２時間離して、７２時間から８４時間離して、８４時間から９６時間離してまたは９６時間から１２０時間離して投与されてよい。２つ以上の治療薬は、患者の同じ１回の来院で投与されてよい。
【０３０８】
特定の態様では、イムノコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な分布を確実にするために製剤化されてよい。例えば血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高度に親水性の化合物を排除する。本開示の治療用化合物がＢＢＢを通過すること（所望により）を確実にするために、それらは例えばリポソーム中に製剤化されてよい。リポソームを製造するための方法について、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書、米国特許第５，３７４，５４８号明細書および米国特許第５，３９９，３３１号明細書を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送され、それにより標的化薬物送達を増強する１つまたは複数の部分を含んでよい（例えばRanade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。例示的標的化部分は、葉酸またはビオチン（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照されたい）、マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）、ｐ１２０（Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）を含み、K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123、J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
【０３０９】
本開示は、イムノコンジュゲートを単独または他の治療剤と組み合わせて含む医薬組成物のそれを必要とする対象への投与のためのプロトコールを提供する。組合せ療法（例えば予防または治療剤）は、対象に同時にまたは逐次的に投与されてよい。組合せ療法の治療（例えば、予防または治療剤）は、周期的にも投与されてもよい。周期的治療は、一定期間の第１の治療（例えば第１の予防または治療剤）の投与に続く、一定期間の第２の治療（例えば第２の予防または治療剤）の投与およびこの逐次投与の反復すなわち周期を治療（例えば薬剤）のうちの１つへの耐性の発生を低減するため、治療（例えば薬剤）のうちの１つの副作用を回避もしくは低減するため、および／または治療の有効性を改善するために含む。
【０３１０】
本開示の組合せ療法の治療（例えば予防または治療剤）は、対象に同時に投与されてよい。
【０３１１】
用語「同時に」は、正確に同時での治療（例えば予防または治療剤）の投与に限定されず、むしろイムノコンジュゲートが他の治療（複数可）と一緒に作用でき、別に投与された場合よりも増加した利益を提供するように抗体またはその断片を含む医薬組成物が逐次的に一定時間間隔内で対象に投与されることを意味する。例えば各治療は、同時にまたは異なる時点で任意の順序で逐次的に対象に投与されてよい；しかし同時に投与されない場合、それらは望ましい治療的または予防効果を提供するために十分に近い時間で投与されるべきである。各治療は、任意の適切な形態でおよび任意の好適な経路によって別々に対象に投与されてよい。種々の態様では、治療（例えば、予防または治療剤）は、１５分間未満、３０分間未満、１時間未満離して、約１時間未満離して、約１時間から約２時間離して、約２時間から約３時間離して、約３時間から約４時間離して、約４時間から約５時間離して、約５時間から約６時間離して、約６時間から約７時間離して、約７時間から約８時間離して、約８時間から約９時間離して、約９時間から約１０時間離して、約１０時間から約１１時間離して、約１１時間から約１２時間離して、２４時間離して、４８時間離して、７２時間離してまたは１週間離して対象に投与される。他の態様では、２つ以上の治療（例えば予防または治療剤）は、患者の同じ来院で投与されてよい。
【０３１２】
組合せ療法の予防または治療剤は、同じ医薬組成物中で対象に投与されてよい。代替的に組合せ療法の予防または治療剤は、別の医薬組成物中で同時に投与されてよい。予防または治療剤は、投与の同じまたは別の経路によって対象に投与されてよい。
[実施例]
【実施例１】
【０３１３】
ファージディスプレイ技術によるＣＤＨ６抗体の同定
ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）パニング
抗体をＣＤＨ６−ＥＣＤに結合するクローンの選択によって同定した。抗体バリアントの供給源として、商業的に入手できるファージディスプレイライブラリー、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用した。ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Knappik et al., . J Mol Biol. 2000: 296(1):57-86、Prassler et al., J Mol Biol. 2011: 413(1):261-78 2011）に基づき、ファージ表面にＦａｂを提示するためのＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術（Rothe et al., J Mol Biol. 2008: 376(4):1182-200）を用いた。抗ＣＤＨ６抗体の単離のために固相および溶液パニング手法を使用する標準的パニング戦略を実施した。
【０３１４】
パニングおよびスクリーニングのために使用される抗原（組換えタンパク質および細胞株）ならびに抗体試薬の概要
パニングをＣＤＨ６抗原の種々の形態に行った。パニングおよび続くスクリーニングおよび特徴付けのための抗原として使用した組換えＣＤＨ６タンパク質およびＣＤＨ６発現細胞株の概要を表１に示す。
【０３１５】
ヒト、マウスおよびラットＣＤＨ６細胞外ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔデータベース由来のアミノ酸配列に基づいて合成された遺伝子であった（表１を参照されたい）。カニクイザルＣＤＨ６ｃＤＮＡ鋳型は、アミノ酸配列および種々のｃｙｎｏ組織由来のｍＲＮＡを使用して作成された相同情報に基づいて合成された遺伝子であった（例えばＺｙａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。すべての合成ＤＮＡ断片は、精製を可能にするための親和性タグと列挙された好適な発現ベクターに、または哺乳動物細胞表面発現のために発現ベクターＺｙａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにクローニングした。
【０３１６】
ヒトＣＤＨ６を外来性に発現している安定ＣＨＯ細胞株の生成のために、ＴＲＥＸ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用した。簡潔にはＣＨＯ−ＴＲＥｘ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ７１８−０７、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１００８２−１４７、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１０μｇ／ｍｌブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１１１３９−０２、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１９９５−０８５）中で成長させた。細胞が９０％コンフルエンスに達したらトランスフェクションを６ウエルプレートで実施した。直鎖化ＣＤＨ６プラスミドＤＮＡ  ４μｇをＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ不含有）１００μｌと滅菌エッペンドルフチューブ中で混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１６６８−０１９、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）１２μｌをＤＭＥＭ培地１００μｌと別の滅菌エッペンドルフチューブ中で混合した。ＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）を合わせて混合し、室温で、１５分間インキュベートした。ＣＨＯ−ＴＲＥｘ細胞の培養培地を各ウエルについてＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地１ｍｌに交換した；上記ＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）混合物の半分を各ウエルに加え、２時間、インキュベートした。次いで成長培地（ＦＢＳを含む）２ｍｌを各ウエルに加え、細胞を終夜、インキュベートした。トランスフェクトした細胞を翌日６ウエルプレートからＴ１７５フラスコに分け、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌブラストサイジン、８００〜１０００μｇ／ｍｌジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０１３１−０２７）を含む選択ＤＭＥＭ培地中で成長させた。ＣＤＨ６発現は選択培地中、最終１μｇ／ｍｌテトラサイクリンで２０〜２４時間誘導した。陽性細胞を最終５μｇ／ｍｌ抗ＣＤＨ６一次モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮからのＭＡＢ２７１５）で標識し、次いでＰＥコンジュゲート抗マウス二次抗体（ｃａｔ  ＃１２−４０１０−８７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で標識し、ＦＡＣＳによって選別した。
【０３１７】
マウス、ラットおよびカニクイザル由来のＣＤＨ６の外来性発現を特性とする安定ＣＨＯ細胞株を哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ６．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングしたそれぞれのｃＤＮＡでのＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションは、細胞が９０％コンフルエンスに達した時に６ウエルプレートで実施した。直鎖化ＣＤＨ６プラスミドＤＮＡ  ４μｇをＦＢＳを含まない１００μｌ  ＤＭＥＭ培地と滅菌エッペンドルフチューブ中で混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１６６８−０１９、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）１２μｌをＤＭＥＭ培地１００μｌと別の滅菌エッペンドルフチューブ中で混合した。ＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）溶液を合わせて混合し、室温で、１５分間インキュベートした。ＣＨＯ細胞の培養培地を各ウエルについてＦＢＳを含まない１ｍｌ  ＤＭＥＭ培地に交換した；上記ＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）混合物の半分を各ウエルに加え、２時間、インキュベートした。次いで成長培地（ＦＢＳを含む）２ｍｌを各ウエルに加え、細胞を終夜、インキュベートした。トランスフェクトした細胞を翌日６ウエルプレートからＴ１７５フラスコに分け、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌブラストサイジン、８００〜１０００μｇ／ｍｌジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０１３１−０２７）を含む選択ＤＭＥＭ培地中で成長させた。ＣＤＨ６発現は選択培地中、最終１μｇ／ｍｌテトラサイクリンで２０〜２４時間誘導した。陽性細胞は、最終５μｇ／ｍｌ抗ＣＤＨ６一次モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮからのＭＡＢ２７１５）で標識し、次いでＰＥコンジュゲート抗マウス二次抗体（ｃａｔ  ＃１２−４０１０−８７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で標識し、ＦＡＣＳによって選別した。代替的に商業的に入手できる抗ＣＤＨ６抗体は、２Ｂ６抗体（＃ＧＷＢ−Ｅ８ＦＤＦ３−Ｇｅｎｗａｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）である。この抗体は、細胞においてＣＤＨ６発現を確認するためにも使用された。
【０３１８】
【表１−１】
2017524364.tif 000014
【０３１９】
【表１−２】
2017524364.tif 000015
【０３２０】
【表１−３】
2017524364.tif 000016
【０３２１】
【表１−４】
2017524364.tif 000017
【０３２２】
組換えタンパク質発現および精製：
Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＣＤＨ６  ａａ５４−２６０−ＡＰＰ−Ａｖｉ
タンパク質を２ｘＹＴ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを使用してｐＥＴベクターでＲｏｓｅｔｔａ（登録商標）２  Ｄｅ３  ｐＬｙｓＳ細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中で発現させた。細胞を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、３０℃で誘導した。ペレットを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭイミダゾール、＋ＰＩ錠（５０ｍｌあたり１個）＋新鮮添加１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、４００ｍｌ中に再懸濁し、凝集塊を壊すためにホモジナイズし、マイクロフルダイザーを３回通した。２０Ｋｘｇ、３０分間での遠心分離に続いて上清の可溶性画分をＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）２ｍｌでの精製のために使用した。可溶化物をカラムに２．０ｍｌ／分で通し、１０ＣＶ（カラム容積）の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭイミダゾールで洗浄し、タンパク質を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５０ｍＭイミダゾールを使用して４ｘ３．０ｍｌ溶出画分で溶出させた。画分をプールした。ＳＵＭＯプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００単位を約１５ｍｌタンパク質（約２０ｍｇ）で加え、５Ｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２に終夜、４℃で１０Ｋカットオフ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のＳｎａｋｅｓｋｉｎ（登録商標）ひだ状チューブを使用して透析した。透析した材料を回収し、未切断タンパク質およびＳＵＭＯプロテアーゼを除去するために２．０ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡレジンで再精製した。切断されたタンパク質を素通りおよび洗浄画分から回収した。逆Ｎｉ−ＮＴＡからの素通りおよび洗浄を容量５ｍｌに濃縮し、ＮａＣｌを最終濃度５００ｍＭに加え、Ｓ２００カラム、緩衝液＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭＣａＣｌ２に注入した。
【０３２３】
ｈＣＤＨ６ａａ５４−６１５  ＡＰＰａｖｉ、ｈＣＤＨ６ａａ５４−６１５  Ｆｃ、ｃｙｎｏＣＤＨ６  ＦＬ、ｍｏＣＤＨ６  ＦＬ、ｒａｔＣＤＨ６  ＦＬ
タンパク質を予め懸濁培養に適合させたＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）由来細胞株で発現させ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ専売無血清培地で成長させた。小規模発現確認をリポフェクションに基づく一過的６ウエルプレートトランスフェクションアッセイで行った。一過的トランスフェクションを介する大規模タンパク質産生を１０〜２０Ｌ規模でＷａｖｅ（商標）バイオリアクターシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で実施した。ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を１：３（ｗ：ｗ）の割合でプラスミド担体として使用した。細胞培養上清をトランスフェクション７〜１０日間後に回収し、クロスフローろ過によって濃縮し、精製の前にダイアフィルトレーションした。
【０３２４】
精製のために、清澄化し、ろ過し馴化した一過的トランスフェクションからの上清を２０ｍｌアフィニティカラムに５ｍｌ／分で通した。２０ＣＶ  ＰＢＳ、１％ＴＸ１００、０．３％ｔ−ｎ−ブチルリン酸緩衝液、２０ＣＶ  ＰＢＳで洗浄。１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ３．０を使用して溶出、タンパク質を２ｍｌ画分で回収。プールした画分を中和し、次いで４℃、５Ｌ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、３ｍＭ  ＣａＣｌ２で終夜透析した。次いで試料を透析緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）Ｓ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でのサイズ排除クロマトグラフィーに供した。
【０３２５】
種々のパニング戦略の概要を表２に示す。
【０３２６】
【表２】
2017524364.tif 000018
【０３２７】
タンパク質のビオチン化
Ａｖｉ−タグ化タンパク質をＡｖｉ−タグ化タンパク質でのタンパク質ビオチン化のための製造業者（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ａｕｒｏｒａ、ＣＯ）の標準的プロトコールに従ってＢｉｒＡ酵素を使用してビオチン化した。ビオチン化後タンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、３ｍＭ  ＣａＣｌ２でＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）Ｓ２００  １６／６０カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーに供した。
【０３２８】
非Ａｖｉ−タグ化タンパク質をビオチン化の前にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｕｎｉｔｓ、１００００ＭＷＣＯ（＃６９５７６  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して２時間、５Ｌの１ｘ  ＰＢＳに対して撹拌しながら室温で２回透析した。ＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ（＃２１３２７  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造業者のプロトコールに従って再構成した。タンパク質を２０倍モル過剰のビオチン試薬と共に３０分間、室温でインキュベートした。未反応ビオチン試薬を除去するために試料を再度、２時間、５Ｌの１ｘＰＢＳに対して撹拌しながら室温で２回透析した。タンパク質濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の手段によって決定した。試料を使用まで４℃で保存した。
【０３２９】
固相パニング
固相パニングでは、Ｆａｂ断片提示ファージを直接固定化によって表面サポートに結合された抗原とインキュベートした。
【０３３０】
抗原選択プロセスの前に、コーティング検査ＥＬＩＳＡを最適な抗原コーティング濃度を決定するために実施した。この目的のために、２４から０．１９μｇ／ｍＬの範囲のｈＣＤＨ６ａａ５４−６１５  ＡＰＰａｖｉ（表１を参照されたい）の２倍希釈系列を生成した。個々の希釈物を直接固定を介して９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（＃４４２４０４  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）上のウエルをコーティングするために使用した。コーティング後、プレートを３００μＬ  ＰＢＳで３回洗浄し、続いて１ｘブロッキング緩衝液（２．５％ミルク、２．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２時間、室温でブロックした。
【０３３１】
結合した抗原を検出するために、抗ＡＰＰ抗体（所内生成）を１μＭ、０．１８μＭまたは０．０４μＭで加えた。二次検出を１：５０００希釈でＡＰ−標識抗マウスＩｇＧ−Ｆ（ａｂ）二特異性抗体を使用して行ったＲｅｆ．１１５−０５６−００６  Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）。シグナル飽和が観察された抗原濃度をＳＰパニングのためのコーティング濃度として選んだ。
【０３３２】
パンコード１０３８．１−８
ＳＰパニング１０３８．１−８（表２を参照されたい）のためにｈＣＤＨ６ａａ５４−６１５  ＡＰＰａｖｉ（表１、配列番号４を参照されたい）を９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）に直接固定化を介してコーティングした。ファージサブプール組合せあたり２ウエルを３００μＬ抗原溶液（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ）でコーティングした。コーティングは４℃、終夜、１ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下（パニング１０３８．１−４）または非存在下（パニング１０３８．４−８）で行った。次いでウエルを４００μＬ  ＰＢＳで２回洗浄し、４００μＬブロッキング緩衝液で２時間、室温、４００ｒｐｍでブロックした。ブロッキング後、細胞を４００μＬ  ＰＢＳで２回洗浄した。
【０３３３】
非特異的およびタグ結合剤を排除するために結合の前にファージサブプールを無関係のＦＬＴ２−ＡＰＰａｖｉ、１０μｇ／ｍＬで１時間、室温でブロックし、枯渇させた。ブロックし、枯渇させたファージプールをコーティングしたウエルあたり３００μＬ移し、２時間、室温、４００ｒｐｍでインキュベートした。非特異的結合ファージを下の表３に列挙した洗浄ステップによって除去した。
【０３３４】
【表３】
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【０３３５】
特異的に結合したファージを３００μＬ溶出緩衝液で１０分間、室温で溶出させた。溶出したファージを大腸菌（E.coli）ＴＧ１Ｆ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）１４ｍＬを再感染させるためにＯＤ６００＝０．６〜０．８の光学密度で使用した。大腸菌（E.coli）ＴＧ１Ｆ＋とファージ溶出物との混合物をファージ感染のために４５分間、水浴中３７℃でインキュベートした。細菌ペレットを２ｘＹＴ培地に再懸濁し、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢアガープレートに置き、終夜、３７℃でインキュベートした。コロニーをプレートからこすり取り、濃縮されたクローンおよびファージ産生物のポリクローナル増幅のために使用した。精製したファージで次のパニングラウンドを開始した。パニングの第２ラウンドをさらにストリンジェントな洗浄条件を除いて第１ラウンドのプロトコールに従って実施した。第３パニングラウンドは、約１０４ｃｆｕ／ｍＬの低い第２ラウンド産出物の力価のために省いた。
【０３３６】
パンコード１０３８．９−１６
ＳＰパニング１０３８．９−１６（表２）のためにＨｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＣＤＨ６  ａａ５４−２６０−ＡＰＰ−Ａｖｉ（表１を参照されたい）を９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）に直接固定化を介してパンコード１０３８．１−８について記載のとおりコーティングした。パニング１０３８．１３−１６のために１ウエルあたりツール抗体ＭＡＢ２７１５の１００ｎＭ溶液３００μＬを加え、ＭＡＢ２７１５と同じエピトープを認識する結合剤の選択を回避するために１時間、室温でインキュベートした。コーティングされた抗原および第３パニングラウンド以外は、パンコード１０３８．１−８について記載のとおりパニングを行った。
【０３３７】
パンコード１０３８．２６−２８
ＳＰパニング１０３８．２６−２８（表２を参照されたい）のためにｈＣＤＨ６ａａ５４−６１５−Ｆｃ（表１、配列番号６を参照されたい）を９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）に直接固定化を介してパンコード１０３８．１−８について記載のとおりコーティングした。コーティングされた抗原および洗浄のストリンジェンシー以外は、パンコード１０３８．１−８について記載のとおりパニングを行った。
【０３３８】
液体相パニング
溶液パニングの間、Ｆａｂ断片提示ファージおよびビオチン化抗原をファージによる抗原への到達性を増加すると予測される溶液中でインキュベートする。抗原ビオチン化は、上に記載のとおり行った。
【０３３９】
パンコード１０３８．１７−２２
各ファージライブラリーサブプールを回転ホイールの上で等容量の２ｘＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒで２時間、室温でブロックした。ＡＰＰａｖｉおよびビオチンタグに対する抗体の選択を回避するために、無関係のＦＬＴ３−ＡＰＰＡｖｉおよびビオチン化抗Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  ｍｓＩｇＧをブロッキングステップにおいてそれぞれ７．５および１８μｇ／ｍＬで加えた。ストレプトアビジンビーズに結合するファージ粒子の除去のために、ブロックされたファージ粒子の予備吸着をブロックされたストレプトアビジンビーズ（＃１１２．０６Ｄ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して実施した。ブロックされ、予備吸着されたファージをビオチン化ｈＣＤＨ６ａａ５４−６１５  ＡＰＰａｖｉ（表１、配列番号４を参照されたい）と１時間、室温、回転ホイール上でインキュベートした。ファージ抗原複合体を、非２Ｂ６エピトープに対する結合剤を濃縮するために、洗浄したビーズ（パンコード１０３８．１７−１９）またはビオチン化抗ＣＤＨ６抗体２Ｂ６（Ｇｅｎｗａｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で予備コードしたビーズで捕捉した（パンコード１０３８．２０−２２）。非特異的ファージ粒子をいくつかの洗浄ステップによって除去した（下を参照されたい）。特異的に結合したファージ粒子の溶出のために、感染および増幅をパンコード１０３８．１−８について記載のとおり行った。
【０３４０】
【表４】
2017524364.tif 000020
【０３４１】
パンコード１０３８．２３−２５
パニングを抗原としてビオチン化ｈＣＤＨ６ａａ５４−６１５−Ｆｃを使用したこと以外はパンコード１０３８．１−８について記載のとおり行った（表１、配列番号６を参照されたい）。
【０３４２】
サブクローニング
ＦＡＢ−ＦＨ発現のための転換
可溶性Ｆａｂ断片の急速な発現を促進するために、選択されたＨｕＣＡＬ（登録商標）ＰＬＡＴＩＮＵＭファージ粒子のＦａｂコード挿入物をｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０ディスプレイベクターからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）１１＿ＦＨ発現ベクターにサブクローニングした。最終パニングラウンドアウトプットファージを感染させた大腸菌（E.coli）を含有するグリセロールストックをＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌｕｓ  キットを製造業者のマニュアル（＃７４０．４１２．５０  Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）に従って使用してｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０  ＤＮＡ精製のための培養物に接種するために使用した。各ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０  ＤＮＡアウトプットプール５μｇをＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ／ＢｍｔＩで三重消化した（すべての制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡから購入した）。１４８５ｂｐ断片をコードしている得られたＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ  ＦａｂをＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキットを製造業者のマニュアル（Ａ９２８２、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に従って使用してゲル精製し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）１１＿ＦＨベクター骨格にライゲーションした。
【０３４３】
ＩｇＧ発現のための転換
全長ＩｇＧを発現するために、ＶＨおよびＶＬの可変ドメイン断片をＦａｂ発現ベクターからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４＿ｈＩｇＧ１ｆベクターにＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）プロトコール（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ、ドイツ）に従ってサブクローニングした。ＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）は、多量のＦａｂ発現ベクターのＩｇＧ発現ベクターへのバッチ転換のための２ステップクローニング方法である。第１のクローニングステップでは、真核生物発現カセットをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）１１発現ベクターにＢｓｉＷＩ／ＭｆｅＩ（κプールのため）またはＨｐａＩ／ＭｆｅＩ（λプールのため）消化および続くライゲーションを介して導入した。これに、発現カセットを含有するＦａｂプールをＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ（κおよびλプールの両方）を使用して消化し、続いて哺乳動物細胞での発現のためにｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４＿ＩｇＧ１ｆアクセプターベクターにクローニングする第２クローニングステップが続いた。
【０３４４】
Ｆａｂ断片の発現および精製
大腸菌（E.coli）ＴＧ１Ｆの形質転換
電気穿孔法コンピテント大腸菌（E.coli）  ＴＧ１Ｆ  ５０μＬのアリコートを氷上で解凍し、５０ｐｇ／μｌ  ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）１１＿ＦＨプラスミドＤＮＡと混合し、予め冷却した電気穿孔法キュベットに移した。細胞を電気穿孔し（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｉｌｓｅｒ；設定：１．７５ｋＶ、２００Ω、および２５μＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、予め温めたＳＯＢ培地９５０μｌに移し、１時間、３７℃、２２０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。適切な容量の形質転換試料を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢアガープレートに置き、単一のコロニーを得るために３７℃で終夜インキュベートした。
【０３４５】
マスタープレートの生成
クロラムフェニコール耐性単一クローンを３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％グルコースを補充した２ｘＹＴ培地６０μｌで予め満たした滅菌３８４ウエルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウエルに採取し、３７℃で終夜成長させた。翌朝、６０％グリセロールおよび１％グルコースを含有する滅菌２ｘＹＴ培地２０μｌをマスタープレートの各ウエルに加えた。プレートをアルミホイルでシールし、−８℃で保存した。
【０３４６】
ＥＬＩＳＡスクリーニングのためのＦａｂ含有細菌可溶化物の生成
マスタープレートの各ウエルの５μｌを、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび０．１％グルコースを補充した２ｘＹＴ培地１ウエルあたり４０μｌで予め満たした滅菌３８４−ウエルマイクロタイタープレートに移した。プレートを３７℃、４８０ｒｐｍ、湿度８０％で培養物がわずかに濁るまでインキュベートした。３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび５ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した２ｘＹＴ培地の１ウエルあたり１０μｌをＦａｂ断片発現の誘導のために加えた。プレートをガス透過性テープでシールし、２２℃、５００ｒｐｍ、湿度８０％で終夜インキュベートした。翌日ＢＥＬ溶解緩衝液（２．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム（＃１０８３７０５９００１、Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０Ｕ／μｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（＃１．０１６５４．０００１  Ｍｅｒｃｋ、Ｗｈｉｔｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）１５μｌを各ウエルに加え、プレートを１時間、５００ｒｐｍ、湿度８０％でインキュベートした。得られたＦａｂ可溶化物を１ウエルあたり１５μＬの２ｘＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒを加えることによってブロックし、３０分間、２２℃、５００ｒｐｍ、湿度８０％でのインキュベーションが続いた。
【０３４７】
ＦＡＣＳスクリーニングのためのＦａｂ含有細菌可溶化物の生成
加圧プレートの各ウエルの５μｌを、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した２ｘＹＴ培地１ウエルあたり１００μｌで予め満たした滅菌９６−ウエル丸底マイクロタイタープレートに移した。プレートを３７℃、５００ｒｐｍ、湿度８０％で培養物がわずかに濁るまでインキュベートした。３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび５ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した２ｘＹＴ培地の１ウエルあたり１０μｌをＦａｂ断片発現の誘導のために加えた。プレートをガス透過性テープでシールし、２２℃、５００ｒｐｍ、湿度８０％で終夜インキュベートした。翌日プレートを１０分間、１２００ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。細菌ペレットを可溶化ステップを促進するために−２０℃で終夜凍結した。融解したペレットをＢＥＬ溶解緩衝液（上記を参照されたい）２００μＬに再懸濁し、１時間、２２℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。得られたＦａｂ可溶化物を細胞片を除去するために１０分間、１２００ｇで遠心分離した。Ｆａｂ含有上清をスクリーニング目的のために使用した。
【０３４８】
Ｈｉｓ６−タグ化Ｆａｂ断片の大腸菌（E.coli）での発現および精製
ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）１１  Ｆａｂ  ＦＨ  ＤＮＡを含有する大腸菌（E.coli）ＴＧ１Ｆ形質転換体を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１％グルコースを補充した２ｘＹＴで選んだ。個々のクローンを採取し、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１％グルコースを補充した２ｘＹＴ種培養物３ｍＬに移し、３７℃、２２０ｒｐｍ、４時間インキュベートした。種培養物を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１％グルコースを補充した２ｘＹＴ、５０ｍＬでの主培養物に接種するために使用し、２５０ｍＬ振盪フラスコ中、３０℃でＯＤ６００が０．６の値に達するまでインキュベートした。Ｆａｂ発現をＩＰＴＧの最終濃度０．７５ｍＭまでの添加によって誘導し、培養物を２５℃、２２０ｒｐｍで終夜さらにインキュベートした。翌日細胞を回収し、細胞ペレットを−２０℃で終夜凍結した。細胞ペレットを溶解緩衝液（（２５ｍＭ  ＴＲＩＳ／ｐＨ＝８、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０Ｕ／μｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（＃１．０１６５４．０００１  Ｍｅｒｃｋ）、０．１％リゾチーム（＃１０８３７０５９００１、Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｗ／ｏ  ＥＤＴＡ  １錠／緩衝液５０ｍＬ（＃１１８７３５８０００１  Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁し、１時間、室温、ロッキングテーブル上でインキュベートすることによって破壊した。可溶化物を３０分間、１５０００ｇでの遠心分離および２００ｎｍポアサイズフィルターを通じた上清のろ過によって清澄化した。Ｈｉｓ６−タグ化Ｆａｂ断片を固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）ビーズ、＃３０４３０  Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）を介して単離し、イミダゾールを使用して溶出した。ＰＤ−１０カラム（＃１７−０８５１−０１  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して１ｘＰＢＳへの緩衝液交換を実施した。試料を滅菌ろ過し、タンパク質濃度をＵＶ分光光度法によって決定した。試料の純度を変性還元１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。試料の同一性をＭＳによって確認した。
【０３４９】
ＩｇＧの発現および精製
スクリーニング規模でのＩｇＧの発現
真核ＨＥＫ２９３ｃ１８細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０８５２）を続く特異性および／または機能性アッセイにおける使用のために全長ＩｇＧを含有する馴化細胞培養上清の生成のために９６ウエル発現系において使用した。真核ＨＥＫ２９３  ｃ１８細胞をトランスフェクション培地（２％Ｌ−グルタミン（＃２５０３０−０２４  Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）１０％ＦＣＳ（＃３３０２  ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、ドイツ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（＃１５１４０−１２２  Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補充したＤ−ＭＥＭ）中に再懸濁し、前日に１ウエルあたり５０μｌ中に細胞およそ４ｘ１０４個の密度で９６ウエルＦ底プレートに播種した。トランスフェクションマスター混合物をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（＃１１６６８  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）１ウエルあたり０．６μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（＃３１９８５−０４７  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）２５μＬと混合することによって調製した。マスター混合物を１５分間、室温でインキュベートした。新たなプレートでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地２０μＬをＤＮＡ３００ｎｇを含有するウエルに加え、穏やかに混合した。その後ＤＮＡを予備インキュベートしたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００と合わせ、穏やかに混合し、２０分間、室温でインキュベートした。予備インキュベートしたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００／ＤＮＡ複合体１００μｌを次いで細胞を含むプレートの各ウエルに移し、穏やかに混合した。プレートを４０時間、３７℃、６％ＣＯ２で一過的発現のためにインキュベートした。培養上清を９６ウエルＶ底プレートに移し、遠心分離によって澄ませた。得られたＩｇＧ含有上清を公知の標準物を参照したＩｇＧタンパク質濃度の評価のために抗Ｆｄ捕捉ＥＬＩＳＡによって検査し、後の使用のために−８０℃で保存した。
【０３５０】
抗Ｆｄ  ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ発現確認
スクリーニング規模由来の上清中のＩｇＧレベルを評価するためにＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）９６ウエルプレート（＃４３７１１１  Ｎｕｎｃ）を５０μｌ／ウエルでＰＢＳ中１：１０００に希釈したＦｄ断片特異的ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（＃ＰＣ０７５  Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でコーティングした。コーティング後、プレートをＴＢＳＴで２回洗浄し、１時間、ＴＢＳＴ中５％スキムミルク粉末でブロックした。一方ＩｇＧ含有上清をＴＢＳＴ中２．５％スキムミルク粉末に１：５０希釈した。ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで３回洗浄後、１ウエルあたり希釈上清１００μＬを移し、プレートを１時間、室温でインキュベートした。続いてプレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、捕捉されたＩｇＧをＴＢＳＴ中０．５％スキムミルク粉末中のＦ（ａｂ’）２−特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（＃１０９−０５５−０９７  Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）（希釈１：５０００）５０μｌとの１時間のインキュベーションによって検出した。プレートをＴＢＳＴで５回洗浄後、ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（＃１４８４２８１  Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）を製造業者の説明書に従って加え、５３５ｎｍでの蛍光発光を４３０ｎｍでの励起でＥＬＩＳＡリーダーで記録した。
【０３５１】
マイクロスケールでのＩｇＧの発現および精製
ＣＡＰ−Ｔ（登録商標）細胞（ＣＥＶＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｌｏｎｇｅ、ドイツ）を４０ｋＤａ直鎖状ＰＥＩ（（ＰＥＩ  Ｍａｘ（＃２４７６５−２  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ））を遺伝子送達ビヒクルとして使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３（登録商標）発現培地（＃１２３３８  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）においてｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４  ＩｇＧ発現プラスミドで一過的にトランスフェクトした。
【０３５２】
トランスフェクションの前日に指数関数的成長を確実にするために細胞を細胞約０．８Ｅ＋０６個／ｍｌに希釈した。トランスフェクション当日に細胞を予め温めたＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）培地９ｍＬに細胞約０．５ｘ１０７個／ｍｌに希釈し、１２５ｍｌ振盪フラスコに移した。３０μｇ  ＤＮＡを５００μｌ  ＯｐｔｉＭＥＭに希釈した。１２００μｇ  ＰＥＩ  Ｍａｘ（＃２４７６５−２  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を８．８０ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ培地に希釈した。ＤＮＡ溶液を細胞に滴下添加し、穏やかに混合した。その後、ＰＥＩ  Ｍａｘ溶液５００μＬを細胞に加え、穏やかに混合した。
【０３５３】
細胞を３７℃、６％ＣＯ２、８５％湿度、１００ｒｐｍで撹拌してインキュベートした。４時間後、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５μｇ／ｍｌブラストサイジン（＃Ｒ２１００１  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充し、予め温めたＰＥＭ  １０ｍＬを加えた。同時に、４００μＬバルプロ酸（＃Ｐ４５４３−２５Ｇ  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を最終濃度４ｍＭに加えた。細胞を６日間、３７℃、６％ＣＯ２、８５％湿度、１００ｒｐｍで撹拌してインキュベートした。
【０３５４】
５分間、１２００ｇ、４℃での遠心分離後、上清を滅菌ろ過（０．２μｍポアサイズ）し、液体操作ステーションを使用してプロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳＵＲＥ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に供した。緩衝液交換を１ｘＰＢＳに実施し、試料を滅菌ろ過（０．２μｍポアサイズ）した。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法によって決定し、ＩｇＧの純度を変性還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０３５５】
Ｆａｂ含有未加工細菌可溶化物のスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して単一Ｆａｂクローンを標的抗原への結合についてのパニングアウトプットから同定した。Ｆａｂ断片をＦａｂ含有粗大腸菌（E.coli）粗可溶化物を使用して検査した。
【０３５６】
直接コーティングした抗原でのＥＬＩＳＡスクリーニング
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）（＃４４２４０４  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）３８４ウエルプレートをｈｕＣＤＨ６タンパク質、ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌの濃度で４℃、終夜コーティングした。洗浄後プレートを２時間、１ｘＰＢＳＴ中５％スキムミルクでブロックした。Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli）可溶化物を加え、１時間、室温で結合させた。
【０３５７】
結合Ｆａｂ断片を検出するためにプレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、ＡＰ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（＃１０９−０５５−０９７  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を１／２５００希釈で加えた。室温、１時間後プレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質を製造業者の仕様書に従って加えた。プレートを基質添加後５分後にＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。
【０３５８】
ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）プレートを使用するビオチン化抗原でのＥＬＩＳＡスクリーニング
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）（＃４４２４０４  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）３８４ウエルプレートを終夜４℃、ＰＢＳ中濃度１０μｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）（＃３１０００  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でコーティングした。洗浄後、プレートを２時間、１ｘＣｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒでブロックした。Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli）可溶化物を新たな３８４−ウエルマイクロタイタープレートに分注し、ビオチン化ＣＤＨ６抗原を濃度２．５μｇ／ｍＬで加えた。次いでＦａｂ抗原複合体をＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）でコーティングしたプレートに移し、１時間、室温で捕捉させ、上に記載のとおり検出した。
【０３５９】
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳスクリーニングでは、細胞表面発現ＣＤＨ６抗原に結合しているＦａｂ断片をパニングアウトプットから同定した。細胞１ｘ１０５個／ウエルをＵ底９６ウエルプレートに移し、４０μｌ／ウエルのＦａｂ含有細菌可溶化物と混合した。プレートを４℃、１時間振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、１００μｌ／ウエル氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中３％ＦＣＳ、０．０２％ＮａＮ３、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、細胞を４℃、５分間、２５０ｇで遠沈し、１８０μｌ／ウエル氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。各洗浄ステップ後、細胞を遠心分離し、注意深く再懸濁した。最終洗浄ステップ後、細胞を１／２００希釈二次検出抗体（ＰＥ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（＃１０９−１１６−０８８、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）５０μＬ中に再懸濁した。１時間、４℃でインキュベーション後、細胞を再度１８０μＬ／ウエル氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。最終的に細胞ペレットを０．４％パラホルムアルデヒドを含む１２０μｌ／ウエルＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＨＴＳプレートリーダーを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。
【０３６０】
クローン配列決定
Ｆａｂクローン配列決定
確認された細胞結合ＦａｂヒットをＶＬおよびＶＨ配列決定に供した。３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１％グルコースを補充した２ｘＹＴ  １．２ｍＬを加圧プレート由来の細菌グリセロールストック５μＬで接種し、９６ウエルディープウエルマイクロタイタープレートで終夜、３７℃、５００ｒｐｍで成長させた。翌日細菌を回収し、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）１１  ＦＨプラスミドを９６ウエルＤＮＡ精製キット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）９６プラスミド精製キット＃７４０６２５．２４、Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用して精製した。配列決定のためにＶＬおよびＶＨプライマーＭ１３ｒｅｖ（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ３’（配列番号１０）およびＨｕＣＡＬ＿ＶＨ＿について（（５‘ＧＡＴＡＡＧＣＡＴＧＣＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡ３（配列番号１１））をそれぞれ使用した。
【０３６１】
ＩｇＧクローン配列決定
独自の細胞結合Ｆａｂクローンをポリクローナル様式でＩｇＧ１形態に転換し、その後ＶＬおよびＶＨ配列決定によって回収した。１００μｇ／ｍＬ  Ａｍｐおよび１％グルコースを補充した２ｘＹＴ培地１．５ｍＬを単一クローンで接種し、９６ウエルディープウエルマイクロタイタープレートで終夜、３７℃、４５０ｒｐｍおよび湿度８０％で成長させた。翌日、細菌を回収し、ＩｇＧコードｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４プラスミドを９６ウエルＤＮＡ精製キット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）９６プラスミド精製キット＃７４０６２５．２４、Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用して精製した。配列決定するためにＶＬおよびＶＨプライマー（（Ｔ７  ５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’（配列番号１２）およびＣＭＶ  ＨＣについて（５’ＣＴＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＡ３’（配列番号１３））をそれぞれ使用した。
【０３６２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫを使用する親和性評価
動力学的パラメーターを決定することによる親和性評価をバイオレイヤー干渉技術を介して実施した。すべてのＦａｂ試料をＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（＃１８−０００９  ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使用して測定した。プレートをＯｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）に置き、チャンバーで２７℃に平衡化させた。センサーを１５０ｎＭビオチン化ＣＤＨ６タンパク質を含有するウエルに３００秒間置くことによって実行を開始させた。その後、センサーを２５０ｎＭ  Ｆａｂ試料を含有するウエルに置いた。Ｆａｂ会合および解離をそれぞれ層の厚さの変化（ナノメートルで、ｎｍ）を測定するステップによってすべてコンピューター管理下で６００秒間記録した。データをＯｃｔｅｔ（登録商標）Ｕｓｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０を使用して自動で処理した。
【０３６３】
抗体細胞内部移行傾向の評価
標的媒介エンドサイトーシスによるＩｇＧの細胞内部移行をＶＴＩ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＨＣ  ｒｅａｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して下に記載のとおり顕微鏡によって評価した。基礎となる分析プロトコールは、Ｓｐｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｖ４  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）であった。簡潔にはこの分析プロトコールは、免疫蛍光染色後のＩｇＧ含有ライソソームビヒクルなどの細胞内の断続的な目的物を同定する高速で一般的なスポット分析を提供する。合計の断続的蛍光強度は、分析された細胞の数について平均されてよい。
【０３６４】
ＯＶＣＡＲ３細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１６１）をＴ１５０組織培養フラスコでおよそ９０％コンフルエンスまで成長させた。培地を廃棄し、細胞を１０ｍＬ  ＰＢＳで流した。細胞を４ｍＬ細胞解離緩衝液で５分間、３７℃でのインキュベーションによって剥離させた。剥離した細胞を成長培地に完全に再懸濁し、５０ｍＬ管に移した。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（登録商標）ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）で細胞を計数後、懸濁物を成長培地中で細胞１０５個／ｍＬに調整した。細胞懸濁物１００μＬを透明底の９６ウエルマイクロタイタープレートの１ウエルあたりに接種した。細胞が接着し、増殖するようにプレートを２４時間、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。
【０３６５】
ＩｇＧ含有細胞培養上清を記載のとおり生成し、ＰＢＳ中に４倍希釈系列に１：４から１：１２８の希釈範囲で希釈した。各試料希釈物１００μｌを細胞含有マイクロタイタープレートの１ウエルあたりに分注し、ＩｇＧ内部移行を可能にするように２時間、３７℃でインキュベートした。続いて１ウエルあたり１ｘ  ＣｅｌｌＦｉｘ（登録商標）試薬（＃３４０１８１  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）１００μｌを加えることによって細胞を固定した。１０分間後プレートをＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１ウエルあたり１００μｌ加えることによって透過性にした。１０分後、プレートを再度ＰＢＳで２回洗浄し、１ｘ  Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（＃９２７−４００００  ＬｉＣｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）１００μｌで２時間、室温でブロックした。内部移行したＩｇＧを検出するためにＨｏｅｃｈｓｔ核染色試薬（＃Ｂ２２６１  Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）の１：１００００希釈物を補充した二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（＃１１００１  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の１：０００希釈物１００μｌを１ウエルあたりに加え、１時間、室温、暗所でインキュベートした。次いで細胞を最後の吸引を行わずにＰＢＳで２回洗浄した。次いでプレートをＣｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標）ＶＴＩ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＨＣ  ｒｅａｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にロードし、分析した。ＩｇＧ内部移行の程度を細胞あたりの平均スポット強度（mean average spot intensity）（ＭＳＡＩ）によって評価した。
【０３６６】
抗ヒトＦＡＢ−ＤＭ１コンジュゲートを使用するサロゲートＡＤＣアッセイ
受容体結合後に内部移行し、細胞傷害性ペイロードを送達するＣＤＨ６抗体能力を検査するために、サロゲートＡＤＣアッセイを抗ヒトＦａｂ−ＤＭ１試薬（ＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（登録商標）Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ）と精製ＩｇＧとを一定の１：２比で混合することによって実施した。細胞傷害性潜在力をがん細胞株ＯＶＣＡＲ３（卵巣漿液性癌、ＭｃＣｏｙｓ＋２０％ＦＣＳで培養）においてこれらの細胞がＣＤＨ６の高い発現を示すことから検査した。
【０３６７】
培養物中の細胞を計数し、培地中に細胞１ｘ１０５個／ｍｌの濃度に希釈した。細胞１０００個／ウエルを３８４ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ＃３７０７、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）に移した。一次抗体／Ｆａｂ−ＤＭ１溶液を６６６ｎＭ  Ｆａｂ−ＤＭ１を細胞培養培地に希釈した３３３ｎＭ一次ヒトＩｇＧと合わせ、３７℃、３０分間インキュベートすることによって１．４ｍｌ  Ｍａｔｒｉｘ  ｔｕｂｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃３７９０、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中に調製した。１０点、１：３系列希釈を３８４ウエルディープウエルプレート（Ｂｒａｎｄｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ  ＃７０１３５５、Ｅｓｓｅｘ、ＣＴ）に調製し、それぞれ６６ｎＭおよび３３ｎＭのＦＡＢ−ＤＭ１／ヒトＩｇＧの最高開始濃度を生じるように、アッセイプレートあたり２５μｌを移した（３回重複）。対照として、細胞だけ（＝１００％対照生存率）およびＦａｂ−ＤＭ１とインキュベートしただけの細胞（二次試薬の非特異的死滅を調べるため）を含むウエルを調製した。プレートを１２０時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。一次抗体／Ｆａｂ−ＤＭ１複合体の細胞活性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（＃Ｇ７５７１  Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者の説明書に従って使用して決定した。生存率を対照だけの細胞に対して標準化した。
【０３６８】
抗体スクリーニング概要
ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＰＬＡＴＩＮＵＭファージミドライブラリーをヒトＣＤＨ６−ＥＣＤ抗原に対する特異的Ｆａｂ断片を選択するために使用した。組換えヒトＡＰＰＡｖｉならびにＦｃ融合および切断ドメインＡＰＰＡｖｉ融合タンパク質をパニングのために使用した。ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＰＬＡＴＩＮＵＭ抗体ファージ粒子を２８個のパニングアウトプットプールを生じる合計８個の異なるパニング戦略のためのさまざまなサブプール組合せに供した。要約すると８個の戦略の内６個が増殖性であり、７７１個のＥＬＩＳＡ陽性スクリーニングヒットを生じた。
【０３６９】
ヒトＣＤＨ６を発現しているＣＨＯ細胞およびＯＶＣＡＲ３細胞でのＦＡＣＳスクリーニングは、２７１個の確認された細胞結合ヒットをもたらした。これらの細胞結合ヒットを強化にするためにＶＬおよびＶＨ配列決定を実施し、５３個の独自のＦａｂ抗体クローンの同定を導いた。
【０３７０】
機能性の特徴付けを可能にするために、Ｆａｂ抗体クローンをＩｇＧ形態に転換し、４７個の独自のＩｇＧクローンを得て、その４４個はスクリーニング規模で良好に発現されていた。精製された独自のＩｇＧをＦＡＣＳによるヒト／ｃｙｎｏ／ラット／マウス交差反応性、Ｏｃｔｅｔによる親和性順位付け、細胞内部移行アッセイおよび抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１二次試薬を使用するサロゲートＡＤＣアッセイを含む一連の特徴付けアッセイに供した。これらのアッセイに基づいてヒトＩｇＧを大規模産生、続くＡＤＣリンカー／ペイロードへの直接コンジュゲーションならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験でのＡＤＣとしての検査のために選択した。
【０３７１】
さらに詳細な特徴付けのために選択された抗ＣＤＨ６  ＩｇＧについての配列情報を表５に示す。
【０３７２】
【表５−１】
2017524364.tif 000021
【０３７３】
【表５−２】
2017524364.tif 000022
【０３７４】
【表５−３】
2017524364.tif 000023
【０３７５】
【表５−４】
2017524364.tif 000024
【０３７６】
【表５−５】
2017524364.tif 000025
【０３７７】
【表５−６】
2017524364.tif 000026
【０３７８】
【表５−７】
2017524364.tif 000027
【０３７９】
【表５−８】
2017524364.tif 000028
【０３８０】
【表５−９】
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【０３８１】
【表５−１０】
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【０３８２】
【表５−１１】
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【０３８３】
【表５−１２】
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【０３８４】
【表５−１３】
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【０３８５】
【表５−１４】
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【０３８６】
【表５−１５】
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【０３８７】
【表５−１６】
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【０３８８】
【表５−１７】
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【０３８９】
【表５−１８】
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【０３９０】
【表５−１９】
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【０３９１】
【表５−２０】
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【０３９２】
【表５−２１】
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【０３９３】
【表５−２２】
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【０３９４】
【表５−２３】
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【０３９５】
【表５−２４】
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【０３９６】
【表５−２５】
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【０３９７】
【表５−２６】
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【０３９８】
【表５−２７】
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【０３９９】
【表５−２８】
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【０４００】
【表５−２９】
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【０４０１】
【表５−３０】
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【０４０２】
【表５−３１】
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【０４０３】
【表５−３２】
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【０４０４】
【表５−３３】
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【０４０５】
【表５−３４】
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【０４０６】
【表５−３５】
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【０４０７】
【表５−３６】
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【０４０８】
【表５−３７】
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【０４０９】
【表５−３８】
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【０４１０】
【表５−３９】
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【０４１１】
【表５−４０】
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【０４１２】
【表５−４１】
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【０４１３】
【表５−４２】
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【０４１４】
【表５−４３】
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【０４１５】
【表５−４４】
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【０４１６】
【表５−４５】
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【０４１７】
【表５−４６】
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【０４１８】
【表５−４７】
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【０４１９】
【表５−４８】
2017524364.tif 000068
【０４２０】
【表５−４９】
2017524364.tif 000069
【０４２１】
【表５−５０】
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【０４２２】
【表５−５１】
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【０４２３】
【表５−５２】
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【０４２４】
【表５−５３】
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【０４２５】
【表５−５４】
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【０４２６】
【表５−５５】
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【実施例２】
【０４２７】
部位特異的変異誘発によって操作された抗体
翻訳後修飾および生殖系列化のための潜在的部位の除去のために部位特異的変異誘発をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して抗ＣＤＨ６抗体のサブセットについて実施した。ＮＯＶ６９０配列をＤ５３ＳおよびＶＬ（３−Ｊ−生殖系列）で変更し、抗体ＮＯＶ１１２６を生じた。ＮＯＶ６９５配列をＮ３１ＱおよびＳ４９Ｙで変更し、抗体ＮＯＶ１１２７を生じた。ＮＯＶ０７２０配列をＮ３１Ｑ、Ｎ９５ＱおよびＶＬ（３−Ｊ−生殖系列）で変更し、抗体ＮＯＶ１１３２を生じた。操作された抗体についての配列情報を表６に記載する。
【０４２８】
【表６−１】
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【０４２９】
【表６−２】
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【０４３０】
【表６−３】
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【０４３１】
【表６−４】
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【０４３２】
【表６−５】
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【０４３３】
【表６−６】
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【０４３４】
【表６−７】
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【０４３５】
【表６−８】
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【０４３６】
【表６−９】
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【実施例３】
【０４３７】
ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス由来のＣＤＨ６の発現を特徴とする細胞への抗ＣＤＨ６  ＩｇＧ結合の決定
さまざまな種由来のＣＤＨ６の発現を特徴とする細胞への抗ＣＤＨ６結合を決定するために、ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞選別）分析をＣＤＨ６を内因的に発現しているＯＶＣＡＲ３細胞ならびにヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス由来のＣＤＨ６を発現するように操作されたＣＨＯ細胞に実施した。
【０４３８】
ＯＶＣＡＲ３（卵巣漿液性癌）をＡＴＣＣ（＃ＨＴＢ−１６１）から得た。ＣＤＨ６発現を特徴とするＣＨＯ細胞株の生成は上の実施例１に記載されている。
【０４３９】
細胞懸濁物を培養物中の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（＃Ａ１１１０５０１  Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で製造業者の説明書に従って処置し、次に細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ、Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄することによって調製した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に細胞１ｘ１０６個／ｍｌで再懸濁し、９６ウエル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃ＣＬＳ３３６０に１００μｌ／ウエルでアリコートにした。一次抗体の８点、１：５系列希釈物を最も高い最終開始濃度１０μｇ／ｍｌを生じるように調製し、１００μｌ／ウエルを細胞懸濁物に加えた。陰性対照抗体としてヒトアイソタイプ対照ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃１−００１−Ａ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用した。細胞を一次抗体溶液と３０分間氷上でインキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌ中での３回洗浄が続いた。細胞を１／５００希釈で使用するＰＥ−コンジュゲート抗ヒトヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−１１６−０９８  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）１００μｌ中に再懸濁し、細胞を３０分間氷上でインキュベートした。冷ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌ中での３回洗浄に続いて、細胞をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。試料あたりのシグナルの幾何平均をＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して決定し、ＥＣ５０をシグナルの幾何平均対濃度をプロットし、Ｔｉｂｃｏ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（登録商標）（Ｔｉｂｃｏ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用する、非線形回帰曲線フィッティングによって決定した。分析した２０個すべての抗ＣＤＨ６抗体は、ＣＤＨ６を発現しているＯＶＣＡＲ３細胞およびＣＨＯ細胞での用量依存性、標的特異的結合を示した（図１）。ＣＤＨ６を発現しない野生型ＣＨＯ細胞への反応性は観察されなかった。ＥＣ５０値を表７にまとめる。
【０４４０】
【表７】
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【実施例４】
【０４４１】
Ｂｉａｃｏｒｅ測定によるヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス由来の組換えＣＤＨ６への結合親和性および交差反応性の決定
ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス由来の組換えＣＤＨ６タンパク質への抗体の親和性をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）およびＣＭ５センサーチップでのＳＰＲ技術を使用して決定した。
【０４４２】
簡潔には、０．５％ウシアルブミン画分Ｖ（７．５％溶液）（Ｇｉｂｃｏ  １５２６０−０３７）を補充したＨＢＳ−Ｐ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）をすべての実験について実行緩衝液として使用した。固定化レベルおよび分析物相互作用を応答単位（ＲＵ）によって測定した。試験的実験を抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  １０９−００６−０９８  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の固定化および検査抗体の捕捉可能性を検査および確認するために実施した。
【０４４３】
動力学的測定のために、抗体が固定化抗ヒトＦｃ抗体を介してセンサーチップ表面に捕捉される実験を実施し、遊離溶液中で結合するＣＤＨ６タンパク質の能力を決定した。簡潔には抗ヒトＦｃ抗体３０μｇ／ｍｌをｐＨ５でアミンカップリングを通じてＣＭ５センサーチップ上に流速１２μｌ／分で４個すべてのフローセルが７５００ＲＵに達するように固定した。検査抗体５〜１０μｇ／ｍｌを次いで１０μｌ／分で１２秒間、フローセル２、３および４に注入した。続いて０．７８〜５０ｎＭのＣＤＨ６受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を２倍系列に希釈し、流速８０μｌ／分で１００秒間、参照（フローセル１）および検査フローセル２、３および４を注入した。検査ＥＣＤの表は下に列挙されている。結合の解離を１０分間追跡した。注射サイクル後、チップ表面を１０ｍＭグリシンｐＨ２．０、６０μｌ／分で３０秒間再生した。すべての実験を２５℃で実施し、応答データをオン速度（ｋａ）、オフ速度（ｋｄ）および親和性（ＫＤ）の概算を得るためにＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．３を使用して単純な１：１相互作用モデルで包括的にフィットさせた。結果は、このパネルでアッセイされた大部分のＣＤＨ６抗体がヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスに交差反応性であることを示唆している（表８）。
【０４４４】
【表８】
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【実施例５】
【０４４５】
Ｂｉａｃｏｒｅによるエピトープビニング
ＣＤＨ６抗体のエピトープマッピングをＣＭ５（複数可）センサーチップを備えるＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ａ−１００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定した。簡潔には、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．２５％  ＢＳＡおよび１０ｍＭカルシウムを補充した１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ；ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）をすべての実験について実行緩衝液として使用した。固定化レベルおよび分析物相互作用を応答単位（ＲＵ）によって測定した。試験的な実験を抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１０９−００６−０９８  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の固定化および検査抗体の捕捉可能性を検査および確認するために実施した。
【０４４６】
エピトープマッピングのために抗ヒトＦｃ抗体を４個すべてのフローセルのスポット１、２および４、５に１０，０００ＲＵで固定化した。スポット５を基準として使用した。一次検査ＣＤＨ６抗体それぞれを次いで固定化抗ヒトＦｃを介してバイオセンサーチップ上に３００ＲＵより大きい応答レベルで捕捉し、２０ＲＵを超える結合レベルでのスポット１および５へのＣＤＨ６タンパク質の注射が続いた。スポット２および４は、追加的参照表面として使用した。各フローセルの５個すべてのスポットを抗ヒトＦｃのいかなる遊離結合部位もブロックするために１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧの２回の注入でブロックした。次いで二次検査抗体それぞれを一次検査抗体およびＣＤＨ６タンパク質の複合体への結合の程度を評価するために、スポット１、２または４、５について注入した。ヒトＩｇＧアイソタイプ対照を一次および二次検査陰性対照抗体として使用した。すべての可能な抗体対の組合せが評価されるまで抗体を４個すべてのフローセルにおいて並行して検査した。各一次および二次抗体結合サイクル後のすべてのフローセル表面の再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０の注射で行った。
【０４４７】
結果をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）４０００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ中のエピトープマッピングモジュールを使用して評価し、一次抗体を行、二次を列でマトリクスとして表した（図２）。二次検査抗体の一次検査抗体とＣＤＨ６タンパク質との複合体への追加的結合を正の応答値として示す。負の対に印を付け、ヒトＩｇＧアイソタイプ対照と比較する。次いでどの抗体がどのエピトープを認識するかを、それらがどのように他の抗体と対を形成できるかに基づいてマッピングするためにマトリクスを使用する。抗体ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２は互いに競合し、それらが抗原上の重複するエピトープを認識していることを示している。抗体ＮＯＶ１１２７は一次および二次結合抗体として使用された場合に正の結合を示し、それがＣＤＨ６上の複数の部位に結合できるまたはその最初の結合が立体構造を変更し追加的結合部位を開けることを示唆している。ＮＯＶ０７１９、ＮＯＶ０６９２、ＮＯＶ１１２６およびＮＯＶ１１３２は、この分析に基づいてすべて異なるエピトープに結合していると考えられる。
【実施例６】
【０４４８】
水素重水素交換／質量分析によるエピトープマッピング
質量分析（ＭＳ）と組み合わせて水素重水素交換（ＨＤｘ）（Woods et al., J. Cell Biochem. 2001 S37: 89-98）をカドヘリンドメイン（ＥＣ）１から５まで（表９）を含むｈＣＤＨ６全長（ａａ５４−６１５）の全長細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上への抗体ＮＯＶ１１２７、ＮＯＶ０７１９、ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２の結合部位をマッピングするために使用した。付加的にＨＤｘはＥＣ１から３までからなる切断型ＥＣＤにも抗体ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２を使用して実施した（表１０）。ＨＤｘではタンパク質の交換可能なアミド水素が重水素によって置き換えられる。このプロセスは、タンパク質構造／動態および溶媒接触性に感受性であり、したがってリガンド結合で重水素取り込みが減少する位置について報告できる。これらの実験の目的は潜在的エピトープを同定し、本発明者らの治療的抗体に結合した場合のｈＣＤＨ６の動態を理解することである。重水素取り込みにおける変化が、直接結合およびアロステリック事象の両方に感受性であることに注目することは重要であり、エピトープを正確に決定するためにはＨＤｘは直行性の技術（例えばＸ線結晶解析）と組み合わされるべきである。
【０４４９】
自動化ＨＤｘ／ＭＳ実験を文献（Chalmers et al., Anal Chem. 2006: 78(4):1005-14）に記載のものと同様の方法を使用して実施した。実験は、ＬＥＡＰオートサンプラー、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＳｙｓｔｅｍおよびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＨＤｘ−ＭＳ（登録商標）プラットホームで実施した。全長ｈＣＤＨ６（５４−６１５）のタンパク質骨格を重水素で標識するために使用した重水素緩衝液は５０ｍＭ  Ｄ−Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４＋３ｍＭ  ＣａＣｌ２であり；溶液中の重水素の全百分率は８９．５％であった。ｈＣＤＨ６（５４−６１５）についてｈＣＤＨ６抗体非存在下での重水素標識実験では、６００ｐｍｏｌのｈＣＤＨ６（５４−６１５）、容量５μｌを４５μｌの重水素緩衝液を使用して冷却した管で希釈し、２５分間、ローテーター上４℃でインキュベートした。次いで標識反応を７５μｌの冷却クエンチ緩衝液で氷上、３分間クエンチし、自動化ペプシン消化およびペプチド分析のためのＬＣ−ＭＳ系への注入が続いた。結合ｈＣＤＨ６抗体の存在下でのｈＣＤＨ６（５４−６１５）重水素標識実験のために、６００ｐｍｏｌのｈＣＤＨ６抗体を最初にサーモプロテインＧプラスビーズに固定化し、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）を使用して架橋した。標識実験を実施するために抗体ビーズ（抗体６００ｐｍｏｌ含有）を６００ｐｍｏｌ  ｈＣＤＨ６（５４−６１５）と３０分間、４℃でインキュベートした。３０分間後ビーズをＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４＋３ｍＭ  ＣａＣｌ２）２００μｌで洗浄した。次いで冷却重水素緩衝液（８０．６％重水素）２００μｌを加え、複合体を２５分間、４℃でインキュベートした。２５分間後、標識反応を１２５μｌの冷クエンチ緩衝液で氷上、２．５分間クエンチした。試料を３０秒間遠心機で回した後、クエンチ溶液を自動化ペプシン消化およびペプチド分析のためにＬＣ−ＭＳ系に注入した。同様の実験をＥＣ３から５までだけを含有するｈＣＤＨ６（２６７−６１５）構築物についても実施した。これらの実験では緩衝液は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２であり、緩衝液の重水素バージョンは９４．２％重水素を含有していた。
【０４５０】
すべての測定は、最低限の３回の分析重複を使用して実行した。すべての重水素交換実験は、０．５Ｍ  ＴＣＥＰおよび３Ｍ尿素（ｐＨ＝２．５）を使用してクエンチした。クエンチ後、交換された抗原をＰｏｒｏｓｚｙｍｅ（登録商標）固定化ペプシンカラム（２．１ｘ３０ｍｍ）を１２℃で使用してオンラインペプシン消化に供し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｖａｎｇｕａｒｄ（登録商標）ＨＳＳ  Ｔ３（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）トラッピングカラムでのトラッピングが続いた。ペプチドをトラッピングカラムから溶出し、２から３５％Ｂ（移動相Ａは９９．９％水および０．１％ギ酸であった；移動相Ｂは９９．９％アセトニトリルおよび０．１％ギ酸であった）へのバイナリー８分間のグラジエントを使用してＷａｔｅｒｓ  ＣＳＨ  Ｃ１８  １ｘ１００ｍｍカラム（１℃に維持）、流速４０μｌ／分で分離した。
【０４５１】
ｈＣＤＨ６（５４−６１５）タンパク質について配列の７３％を重水素交換実験によってモニタリングした；これらのペプチドの完全な一覧を表９に示す。図３は、ｈＣＤＨ６（５４−６１５）タンパク質のオン交換特徴の要約を提供する。ＥＣ３などの重水素のより多い取り込みを有する領域は、領域ＥＣ４およびＥＣ５などの少ない重水素取り込みを示す領域より溶媒に曝露されているまたは弱い水素結合ネットワークを有する。全体としてＥＣ１からＥＣ３までのドメインはＥＣ４からＥＣ５ドメインより多い重水素のオン交換を有することが観察される。例えばＥＣ２ペプチド１８１〜１９９  ＶＴＡＴＤＡＤＤＰＴＹＧＮＳＡＫＶＶＹ（配列番号３３６）平均重水素取り込みは３．６１Ｄａである；対照的にＥＣ５ペプチド５０６〜５２５  ＩＱＴＬＨＡＶＤＫＤＤＰＹＳＧＨＱＦＳＦ（配列番号３３７）平均重水素取り込みは、１．１８Ｄａだけである。限定された重水素取り込みは、ダイナミックレンジにおける制限によりさらに困難になる抗体結合による−０．５Ｄａ以下のシフトを受ける保護領域の決定を可能にする。
【０４５２】
ＥＣ１（５４−１５９）について４個すべての抗体の結合について重水素取り込みにおける減少を示した唯一のペプチドは６１〜７０  ＦＬＬＥＥＹＴＧＳＤ（配列番号３３８）である。ＥＣ１では抗体ＮＯＶ１１２７およびＮＯＶ０７１９が０．５Ｄａ以上の重水素取り込みにおける変化を伴って構造における顕著な不安定化を実証する。ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２の結合は、ＥＣ１ドメインにおける抗原の重水素交換挙動を顕著に変更しない。
【０４５３】
ＥＣ２（１６０−２６８）について領域１９５〜２０２  ＡＫＶＶＹＳＩＬ（配列番号３３９）は、すべての抗体による重水素取り込みにおける境界域の減少を有する。さらに興味深いことに領域２０３〜２２１  ＱＧＱＰＹＦＳＶＥＳＥＴＧＩＩＫＴＡＬ（配列番号３４０）は、ＮＯＶ０７１９によって実質的におよびＮＯＶ０７１２によってわずかに少なく不安定化される（すなわち重水素取り込みにおける増加を受ける）。ＮＯＶ１１２７およびＮＯＶ０７１０はどちらも＋０．５Ｄａ以上の重水素組み込みにおける変化を伴ってこの領域を不安定化しない。最終的に領域２２５〜２３７  ＤＲＥＮＲＥＱＹＱＶＶＩＱ（配列番号３４１）はｈＣＤＨ６抗原へのＮＯＶ０７１９結合でだけ不安定化された。
【０４５４】
ＥＣ３（２６９−３８３）について領域２７５〜３０２  ＦＫＴＰＥＳＳＰＰＧＴＰＩＧＲＩＫＡＳＤＡＤＶＧＥＮＡＥ（配列番号３４２）は、ＮＯＶ０７１９によって不安定化される。領域３０３〜３１５  ＩＥＹＳＩＴＤＧＥＧＬＤＭ（配列番号３４３）は、すべての抗体による重水素取り込みにおける減少を示すが、減少はＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２によるものが他の２個と比較してより明らかである。領域３１６〜３３０  ＦＤＶＩＴＤＱＥＴＱＥＧＩＩＴ（配列番号３４４）は、すべての抗体について重水素取り込みにおける減少を示すが、減少はＮＯＶ０７１９によるものが最も少ない、対照的に領域３３１〜３３６  ＶＫＫＬＬＤ（配列番号３４５）は、ＮＯＶ０７１９によって不安定化され、ＮＯＶ０７１２によってはあまりされない。領域３３７〜３５８  ＦＥＫＫＫＶＹＴＬＫＶＥＡＳＮＰＹＶＥＰＲＦ（配列番号３４６）は、ＮＯＶ０７１９を除くすべての抗体で重水素取り込みにおける減少を示す；対照的にＮＯＶ０７１９は、領域３３７〜３４５  ＦＥＫＫＫＶＹＴＬ（配列番号３４７）を不安定化する唯一の抗体である。最後にＮＯＶ０７１９も領域３７０〜３７６  ＶＲＩＶＶＥＤ（配列番号３４８）を不安定化することが観察された。
【０４５５】
ＥＣ４（３８４−４８６）およびＥＣ５（４８７−６０８）について抗原の重水素オン交換（図３）は、全体的に比較的低く、重水素取り込みにおける減少の検出を困難にしている。ＥＣ４領域４０７〜４２７  ＡＱＤＰＤＡＡＲＮＰＶＫＹＳＶＤＲＨＴＤＭ（配列番号３４９）は、ＮＯＶ０７１０での重水素取り込みにおいて境界域の減少を示す。ＥＣ４では、４個の抗体のいずれかとの結合について重水素取り込みが減少する他の領域はない。全体としてこれらの観察はＥＣ４がエピトープに含まれていないことを強く示唆する。対照的に、４５９〜４８８  ＩＡＴＥＩＮＮＰＫＱＳＳＲＶＰＬＹＩＫＶＬＤＶＮＤＮＡＰＥＦ（配列番号３５０）は、ＮＯＶ０７１９、ＮＯＶ１１２７、ＮＯＶ０７１２およびＮＯＶ０７１０（不安定化が減少する順に列挙する）で種々の程度の不安定化を示す。
【０４５６】
ＥＣ５については領域５６４〜５８６  ＹＬＬＰＶＶＩＳＤＮＤＹＰＶＱＳＳＴＧＴＶＴＶ（配列番号３５１）だけが重水素取り込みにおいて境界域の減少を、ｈＣＤＨ６がＮＯＶ０７１０またはＮＯＶ０７１２のいずれかと複合体化する場合に示す。ｈＣＤＨ６が研究された４個の抗体のいずれかと相互作用する場合に、５個の細胞外ドメインの内、ＥＣ５だけがいかなる領域の不安定化も示さないことは注目されるべきである。
【０４５７】
ＨＤｘ実験をＥＣ３〜ＥＣ５だけからなるｈＣＤＨ６構築物、ｈＣＤＨ６（２６７−６１５）についても実施した。これらの実験では抗体ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２を研究した。この構築物は、結晶解析実験において使用されたものと同じ構築物である。これらの実験での配列カバー範囲は８６％であった。表１０は、すべてのペプチドの包括的リストを提供する。
【０４５８】
この構築物で、ＥＣ３では重水素取り込みにおける減少がＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２の両方について領域２９５〜３１５  ＡＤＶＧＥＮＡＥＩＥＹＳＩＴＤＧＥＧＬＤＭ（配列番号３５２）において観察される；これは領域３０３〜３１５  ＩＥＹＳＩＴＤＧＥＧＬＤＭ（配列番号３４３）がすべての抗体による重水素取り込みにおける減少を示すが、ＮＯＶ０７１２およびＮＯＶ０７１０によってはさらにそうである全長抗原に非常に良く似た挙動である。興味深いことに、２つの構築物間で差次的挙動を示すＥＣ３中の領域がある。例えばｈＣＤＨ６（５４−６１５）ではＮＯＶ０７１９は多数の領域で顕著な不安定化を生じる一方で、他の抗体は生じない。対照的にｈＣＤＨ６（２６７−６１５）タンパク質ではＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２の両方も、全長ｈＣＤＨ６（５４−６１５）タンパク質におけるＮＯＶ０７１９による不安定化が観察された領域に非常に良く似ている領域において顕著な不安定化を示す。
【０４５９】
ＥＣ４では、不安定化について類似の傾向が観察される。ｈＣＤＨ６（５４−６１５）においてＮＯＶ０７１９はこのドメインのＣ末端側に最も顕著な不安定化を生じ、ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２はわずかな効果だけであった。対照的にｈＣＤＨ６（２６７−６１５）構築物を使用する場合、ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ７１２の両方がＥＣ４のＣ末端側を顕著に不安定化する。不安定化挙動における差異の原因は、十分に理解されていない。ＥＣ４ドメインにおいていずれの構築物もＮＯＶ０７１０またはＮＯＶ０７１２で重水素取り込みにおいて実質的な減少を有さないことに注目するのは重要であり、この領域がＮＯＶ０７１０またはＮＯＶ０７１２結合に関与していないことを示唆している。
【０４６０】
ＥＣ５において本発明者らは、最も一貫した重水素交換挙動をｈＣＤＨ６（５４−６１５）とｈＣＤＨ６（２６７−６１５）構築物との間に観察する。いずれの構築物もＮＯＶ０７１２またはＮＯＶ０７１０で顕著な不安定化を示さなかった。さらにｈＣＤ６（５４−６１５）での重水素取り込みにおける軽微でしばしば顕著でない減少（−０．５Ｄａ以上）は、ｈＣＤＨ６（２６７−６１５）ではさらに明らかになる。ＮＯＶ０７１０またはＮＯＶ０７１２いずれかとの結合で重水素取り込みにおいて最も顕著な減少を示すｈＣＤＨ６（２６７−６１５）領域のＥＣ５は、領域４９２〜５０５  ＹＥＴＦＶＣＥＫＡＫＡＤＱＬ（配列番号３５３）、５５１〜５６３  ＴＲＫＮＧＹＮＲＨＥＭＳＴ（配列番号３５４）および５７２〜５８６  ＤＮＤＹＰＶＱＳＳＴＧＴＶＴＶ（配列番号３５５）を含む。５７２〜５８６  ＤＮＤＹＰＶＱＳＳＴＧＴＶＴＶ（配列番号３５５）の実質的な保護は、ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２の両方についてＸ線結晶解析からのエピトープデータと非常に良く一致している。アミノ酸Ｎ５７３、Ｄ５７４およびＹ５７５は広い接触面積を示し、いずれかの抗体との複合体の形成において３個すべてが実質的に埋没される。Ｖ５７７も両構造において埋没されており、さらなる一致を示している。結晶解析データは、４９２〜５０５  ＹＥＴＦＶＣＥＫＡＫＡＤＱＬ（配列番号３５３）が埋没していることを示しておらず、それによりこの保護は天然ではアロステリックであると考えられるが、５５１〜５６３  ＴＲＫＮＧＹＮＲＨＥＭＳＴ（配列番号３５４）の保護は、Ｒ５５２が実質的に埋没されているＮＯＶ０７１２複合体では特に顕著であると考えられる。
【０４６１】
最終的に、２個の抗体のいずれかとの複合体形成で重水素取り込みにおける顕著な減少（−０．５Ｄａ以下）を示すＥＣ５ドメイン中の他の領域があることに注目することは重要である。ＮＯＶ０７１０についてこれらの領域は、５１０〜５２５  ＨＡＶＤＫＤＤＰＹＳＧＨＱＦＳＦ（配列番号３５６）、５４２〜５５０  ＮＫＤＮＴＡＧＩＬ（配列番号３５７）および５９１〜６０４  ＣＤＨＨＧＮＭＱＳＣＨＡＥＡ（配列番号３５８）を含む。ＮＯＶ０７１２についてこれらの領域は５１２〜５２２  ＶＤＫＤＤＰＹＳＧＨＱ（配列番号３５９）、５４２〜５５０  ＮＫＤＮＴＡＧＩＬ（配列番号３５７）および５９１〜６０４  ＣＤＨＨＧＮＭＱＳＣＨＡＥＡ（配列番号３５８）を含む。
【０４６２】
全体的にＨＤｘデータは、同定されたＣＤＨ６結合抗体によるＣＤＨ６の結合がＣＤＨ６タンパク質のいくつかの領域をさらに重水素交換しやすくしており、ＣＤＨ６抗体の結合によって誘導される立体構造的変化を反映していることを示唆している。ＣＤＨ６抗体の存在下での重水素交換から保護されるとして同定された領域は、ＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ０７１２についてのＸ線結晶解析データと一致しており、これらの抗体のエピトープの一部を形成している。
【０４６３】
【表９−１】
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【０４６４】
【表９−２】
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【０４６５】
【表９−３】
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【０４６６】
【表９−４】
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【０４６７】
【表９−５】
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【０４６８】
【表９−６】
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【０４６９】
【表９−７】
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【０４７０】
【表１０−１】
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【０４７１】
【表１０−２】
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【０４７２】
【表１０−３】
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【０４７３】
【表１０−４】
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【０４７４】
【表１０−５】
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【０４７５】
【表１０−６】
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【０４７６】
【表１０−７】
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【実施例７】
【０４７７】
Ｘ線結晶解析によるエピトープマッピング
ＮＯＶ０７１２またはＮＯＶ０７１０のＦａｂ断片（配列番号４４４〜４４７、表１２および１３）に結合しているヒトＣＤＨ６断片（細胞外ドメイン５、またはＥＣ５、配列番号４４３、表１１）の結晶構造を決定した。下に詳述するとおり、ＣＤＨ６  ＥＣ５を精製複合体を産生するために哺乳動物細胞においてＮＯＶ０７１２またはＮＯＶ０７１０  Ｆａｂと共発現した。次いでタンパク質結晶解析をＮＯＶ７１２またはＮＯＶ７１０  Ｆａｂに結合しているＣＤＨ６  ＥＣ５についての原子分解データを生成し、エピトープを定義するために用いた。
【０４７８】
エピトープマッピングのためのタンパク質産生
結晶解析のために産生されたＣＤＨ６  ＥＣ５、ＮＯＶ０７１２  ＦａｂおよびＮＯＶ０７１０  Ｆａｂの配列を上の表９に示す。ＣＤＨ６  ＥＣ５構築物は、ヒトＣＤＨ６（ＵｎｉＰｒｏｔ識別名Ｐ５５２８５、配列番号５３３、表１１）において下線で示す残基４９０から６０８を含み、下の表１１で配列番号５３４として示す。マウスＩｇＧカッパ軽鎖由来Ｎ末端シグナル配列は、ＣＤＨ６  ＥＣ５の分泌発現のために使用され、発現の際に切断され、ＣＤＨ６  ＥＣ５のインタクトなＮ末端が残る。ＣＤＨ６  ＥＣ５のＣ末端は、精製後のタグの切断および除去を促進するためにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）認識部位（アミノ酸：ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号５３２））が先行する、βアミロイド（ＡＰＰタグ、アミノ酸：ＥＦＲＨＤＳ（配列番号５３１））由来精製タグに融合される。ＮＯＶ０７１２およびＮＯＶ０７１０  Ｆａｂについて、重鎖および軽鎖の配列を示す（配列番号５３５〜５３８）。
【０４７９】
【表１１−１】
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【０４８０】
【表１１−２】
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【０４８１】
【表１１−３】
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【０４８２】
【表１１−４】
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【０４８３】
【表１１−５】
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【０４８４】
ＣＤＨ６  ＥＣ５を結晶解析のための複合体を産生するためにＥｘｐｉ２９３（登録商標）細胞においてＮＯＶ０７１２またはＮＯＶ０７１０  Ｆａｂと共発現した。詳細にはＣＤＨ６  ＥＣ５をコードするプラスミド０．５ｍｇをＮＯＶ０７１２またはＮＯＶ０７１０  Ｆａｂプラスミド０．５ｍｇと混合し、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）５０ｍｌ中に希釈し、同じ培地５０ｍｌ中のＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）２．５ｍｇと３０分間インキュベートした。次いで混合物をトランスフェクションのために細胞１００万個／ｍｌ、３７℃、８％ＣＯ２でＥｘｐｉ２９３（登録商標）発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の懸濁液で成長中のＥｘｐｉ２９３（登録商標）細胞１Ｌに加えた。７２時間後、ＣＤＨ６  ＥＣ５−Ｆａｂ複合体を含有している培地を遠心分離によって回収し、ＣａＣｌ２を３ｍＭに補充した。抗ＡＰＰタグＩｇＧ（所内生成）をコンジュゲートしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）１０ｍｌを次いで培地に加え、４℃で終夜撹拌し続けた。翌日ビーズを重力カラムに充填し、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＨＢＳ）および３ｍＭ  ＣａＣｌ２で洗浄した。標的複合体を３カラム容積（ＣＶ）の１００ｍＭグリシンｐＨ２．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２で１／１０（ｖ／ｖ）の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５に溶出した。ＡＰＰタグを切断するために複合体を１／１００（ｗ／ｗ）ＧＳＴ−タグ化ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）と４℃、終夜インキュベートした。翌日、混合物を１ｍｌ  ＧＳＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に通すことによってＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼを除去した。次いでＮ結合型グリコシルを除去するために素通りを１／１０（ｗ／ｗ）のＰＮＧａｓｅＦ（所内精製）と３７℃でインキュベートした。脱グリコシル化後、混合物を濃縮し、３ｍＭ  ＣａＣｌ２を加えたＨＢＳに平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）にロードした。精製ＣＤＨ６−Ｆａｂ複合体を含有するピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳによって分析し、プールし、結晶化のために濃縮した。
【０４８５】
結晶化および構造決定
ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１２およびＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１０複合体を９．３ｍｇ／ｍｌおよび１４．７ｍｇ／ｍｌにそれぞれ濃縮し、２０，０００ｇ、５分間遠心分離し、結晶化についてスクリーニングした。データ回収のための結晶をハンギングドロップ蒸気拡散法によって２０℃で成長させた。ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１２複合体の結晶を、複合体１．２μｌを２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ３３５０および０．２Ｍクエン酸水素二アンモニウムを含有するリザーバー溶液１μｌと混合し、液滴を同じリザーバー溶液４５０μｌに水５０μｌを加えたものに平衡化させることによって成長させた。ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１０複合体の結晶を、複合体０．８μｌを０．７Ｍクエン酸三ナトリウムおよび０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ８．５を含有するリザーバー溶液１μｌと混合し、液滴を同じリザーバー溶液４２５μｌに水７５μｌを加えたものに平衡化させることによって成長させた。データ回収の前に結晶を７５％リザーバー溶液に２５％グリセロールを加えたものに移し、液体窒素中で急冷する。
【０４８６】
回折データをｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）においてビームライン１７−ＩＤで集めた。データを処理し、Ａｕｔｏｐｒｏｃ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ、ＬＴＤ）を使用して調整する。ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１２のデータを２．３Åに空間群Ｐ２１２１２１で格子寸法ａ＝７８．８３Å、ｂ＝８８．８６Å、ｃ＝１８６．７３Å、アルファ＝９０°、ベータ＝９０°、ガンマ＝９０°で処理した。ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１０複合体のデータを３．５Åに空間群Ｐ４３２１２で格子寸法ａ＝１０１．４８Å、ｂ＝１０１．４８Å、ｃ＝２４０．９６Å、アルファ＝９０°、ベータ＝９０°、ガンマ＝９０°で処理した。複合体の構造を探索モデルとして自家Ｆａｂ構造でＰｈａｓｅｒ（McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674）を使用する分子置換によって解析した。ＣＤＨ６  ＥＣ５の構造をＣＣＰ４プログラム一式(Winn et al., (2011) Acta. Cryst. D67:235-242）でＢｕｃｃａｎｅｅｒ（K. Cowtan (2006) Acta Cryst. D62:1002-1011）を使用してスクラッチから構築した。最終モデルをＣＯＯＴ（Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. D60:2126-2132）で構築し、Ｂｕｓｔｅｒ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ、ＬＴＤ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）で改良した。ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１２複合体についてＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅ値はそれぞれ２１．２％および２５．２％であり、結合長および結合角の平均二乗（ｒ．ｍ．ｓ）偏差値はそれぞれ０．０１０Åおよび１．２４°である。ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１０複合体について、ＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅ値はそれぞれ１８．２％および２４．６％であり；結合長および結合角のｒ．ｍ．ｓ偏差値はそれぞれ０．０１０Åおよび１．２８°である。
【０４８７】
ＮＯＶ０７１２またはＮＯＶ０７１０  Ｆａｂと接触しているＣＤＨ６  ＥＣ５の残基、相互作用の種類および埋没面積はすべてＰＩＳＡ（Krissinel et al., (2007) J Mol Biol. 372:774-97）によって同定し、表１２および１３に列挙する。複合体の１個より多い複製物を非対称単位（結晶中の最も小さな固有の単位）に含有している構造について、すべての複製物において共通である抗体接触残基だけをエピトープ残基として列挙する。
【０４８８】
ＣＤＨ６上のＮＯＶ０７１２およびＮＯＶ０７１０のエピトープ
全体構造
現時点でＣＤＨ６  ＥＣ５の結晶構造は報告されていない。ＣＤＨ６  ＥＣ５の全体的フォールディングはＣＤＨ２（Ｎ−カドヘリン）ＥＣ５のものに類似しており、両方とも別の４鎖βシートに対して重なっている１個の３鎖βシートからなっている。２個の構造の重層は、２．４Åの小さな二乗平均平方根距離（ＲＭＳＤ）を生じ、ＮおよびＣ末端を同じ方向にする。したがって、ＣＤＨ６  ＥＣ５／Ｆａｂ複合体構造を、方向ならびにＮＯＶ０７１２およびＮＯＶ０７１０  Ｆａｂを推定するためにＥＣ５ドメインの重層に基づいてＣＤＨ２の全長ＥＣＤ構造に重ねることができる。図４に示すとおりＮＯＶ０７１２およびＮＯＶ０７１０はＣＤＨ６  ＥＣ５の同じ側に結合し、顕著に重複するエピトープを共有する。ＮＯＶ０７１２は、ＮＯＶ０７１０と比較してＥＣ４−ＥＣ５リンカーからわずかに離れて結合する。
【０４８９】
ＮＯＶ０７１２のエピトープ
ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１２複合体の結晶構造をＣＤＨ６上のＮＯＶ０７１２エピトープを同定するために使用する。ＮＯＶ０７１２  ＦａｂによるＣＤＨ６  ＥＣ５上の相互作用表面はいくつかの連続および非連続（すなわち非隣接）配列：すなわち表１２に詳述のとおり残基５０３、５２０−５２７、５２９、５３２−５３４、５３８−５４３、５５０、５５２、５６９および５７１−５７７によって形成されている。これらの残基は、ＮＯＶ０７１２  Ｆａｂによって認識される三次元立体構造エピトープを形成する（図５上パネル）。結晶解析によって定義されたこのエピトープは、残基５７２−５８６がＮＯＶ０７１２によって実質的に保護されている水素重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）によって定義されたものと良く一致している。興味深いことにＣＤＨ６  ＥＣ５（残基５７１−５７９）の潜在的Ｃａ２＋結合ループは、その大部分（１０残基のうち８残基）がＮＯＶ０７１２と接触しており、特にＴｙｒ５７５およびＡｓｎ５７３は抗体によってほとんど完全に埋没されている（表１２および図５下パネル）。ＣＤＨ２構造と比較してＣＤＨ６  ＥＣ５のこのＣａ２＋結合ループはＮＯＶ０７１２結合によって誘導される「アウト」立体構造にある（例えばＣＤＨ６のＡｓｐ５７２はＣＤＨ２におけるその対応する残基Ａｓｐ５２５と比較して反転している）。
【０４９０】
【表１２】
2017524364.tif 000106
【０４９１】
ＮＯＶ０７１０のエピトープ
ＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１０複合体の結晶構造をＣＤＨ６上のＮＯＶ０７１０エピトープを同定するために使用する。ＮＯＶ０７１２  ＦａｂによるＣＤＨ６  ＥＣ５上の相互作用表面はいくつかの連続および非連続（すなわち非隣接）配列：すなわち表１３に詳述のとおり残基５２０−５２７、５２９、５４１、５４３、５６９、および５７１−５７９によって形成されている。これらの残基は、ＮＯＶ０７１０  Ｆａｂによって認識される三次元立体構造エピトープを形成する（図６上パネル）。結晶解析によって定義されたこのエピトープは、残基５７２−５８６がＮＯＶ０７１０によって実質的に保護されている水素重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）によって定義されたものと良く一致している。興味深いことにＣＤＨ６  ＥＣ５／ＮＯＶ０７１２複合体構造においてと同様にＣＤＨ６  ＥＣ５（残基５７１−５７９）の潜在的Ｃａ２＋結合ループ中のすべての残基がＮＯＶ０７１２０と接触しており、とりわけＴｙｒ５７５、Ａｓｎ５７３およびＡｓｐ５７４は抗体によってほとんど完全に埋没されている（表１３および図６下パネル）。ＣＤＨ２構造と比較してＣＤＨ６  ＥＣ５のこのＣａ２＋結合ループはＮＯＶ０７１０結合によって誘導される「アウト」立体構造にある（例えばＣＤＨ６のＡｓｐ５７２はＣＤＨ２におけるその対応する残基Ａｓｐ５２５と比較して反転している）。
【０４９２】
【表１３】
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【実施例８】
【０４９３】
共結晶構造を検証し、抗ＣＤＨ６抗体の野生型および変異体ＣＤＨ６タンパク質への結合を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
ＣＤＨ６タンパク質／ＮＯＶ０７１０または／ＮＯＶ０７１２結晶構造の分析は、高い埋没表面値を有するいくつかのアミノ酸残基（Ａｓｎ５７３、Ａｓｐ５７４およびＴｙｒ５７５）を明らかにし、それらが抗体のＣＤＨ６タンパク質との相互作用を媒介するために重要である可能性があることを示唆している。本発明者らは、これらの残基をアラニンによって置き換えた組換え変異体ＣＤＨ６タンパク質を産生し（表１１、配列番号５３９、５４０および５４１）、ＥＬＩＳＡを実施した。９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を適切な組換えヒトタンパク質（ＣＤＨ６ｗｔ、ＣＤＨ６−Ｎ５７３Ａ、ＣＤＨ６−Ｄ５７４ＡまたはＣＤＨ６−Ｙ５７５Ａ）の１ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｌ／ウエルで４℃、終夜コーティングした。次いですべてのウエルをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１時間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックし、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。抗ＣＤＨ６抗体の系列希釈物を関連するウエルに加え（１００ｎＭ開始濃度；５倍系列希釈）、プレートを室温で、２時間インキュベートした。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中に１／１００００希釈したヤギ抗ヒトペルオキシダーゼ結合検出抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３１４１２、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の添加の前にプレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄する前にプレートを室温で、１時間インキュベートした。２．５％Ｈ２ＳＯ４  ５０μｌで反応を停止する前にＴＭＢ（３，３’、５，５’テトラメチルベンジジン）基質溶液（ＢｉｏＦｘ）１００μｌをすべてのウエルに６分間加えた。各組換えタンパク質に結合するＣＤＨ６抗体の程度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ４５０を測定することによって決定した。用量依存的曲線をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。
【０４９４】
図７に示すとおりＤ５７４Ａ変異はＮＯＶ０７１０およびＮＯＶ７１２の両方の結合を抑制し、この残基が２個の抗体の共有エピトープの不可欠な構成成分であることを確認している。興味深いことにＮ５７３Ａ変異体はＮＯＶ７１２への結合を保持しているがＮＯＶ０７１０へはしておらず、一方Ｙ５７５Ａ変異体はＮＯＶ０７１０への結合を保持しているがＮＯＶ０７１２へはしていない。注目すべきことにこれらの変異のいずれも別のエピトープに結合する抗ＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７２０の結合に影響を与えず（ＮＯＶ０７２０は、図２のＮＯＶ１１３２の非生殖系列バージョンである）、変異体がタンパク質の全体構造を変化させないことを示している。これらのデータは、共結晶構造をさらに検証し、２個の抗体が重複しているが別のエピトープに注目していることを確認している。
【実施例９】
【０４９５】
抗体薬物コンジュゲートの調製
１ステッププロセスによるＤＭ４コンジュゲートの調製
抗ＣＤＨ６抗体、例えばＮＯＶ７０１２を約１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭ４（抗体の量と比較して６．８倍モル過剰）および、次いでスルホ−ＳＰＤＢ（抗体の量と比較して約５．２倍モル過剰）と混合した。反応を２０℃、１０％ＤＭＡを含有する２０ｍＭ  ＥＰＰＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸］緩衝液（ｐＨ８．１）中でおよそ１６時間実施した。ｐＨを５．０に調整するように１Ｍ酢酸を加えることによって反応をクエンチした。ｐＨ調整後、反応混合物を多層（０．４５／０．２２μｍ）ＰＶＤＦフィルターを通してろ過し、精製し、接線流ろ過を使用して１０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ４．５）にダイアフィルトレーションした。接線流ろ過のための装置パラメーターの例を下の表１４に列挙する。
【０４９６】
【表１４】
2017524364.tif 000108
【０４９７】
上に記載のプロセスから得られたコンジュゲートを：細胞傷害剤ローディングについてＵＶ分光法（マイタンシノイド対抗体比、ＭＡＲ）；コンジュゲートされた単量体の決定についてＳＥＣ−ＨＰＬＣ；および遊離マイタンシノイド百分率について逆相ＨＰＬＣまたは疎水性遮蔽相（hydrophobic shielded phase）（Ｈｉｓｅｐ）−ＨＰＬＣによって分析した。
【０４９８】
ＳＰＤＢまたはスルホ−ＳＰＤＢリンカーおよびＤＭ４細胞傷害剤を含むＡＤＣの調製
抗ＣＤＨ６抗体、例えば抗体ＮＯＶ０７１２を約１０％ＤＭＡを含有する５０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．１）中でＤＭ４（６．８および１０．２倍モル過剰）と２５℃で合わせた。この混合物にＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ、それぞれ４．０および６．０倍モル過剰）を最終抗体濃度が４ｍｇ／ｍＬであり、最終ＤＭＡ含有量が１０％であるように加えた。反応を約１６時間、２５℃、５０ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．１）中で進行させた。コンジュゲーション反応混合物を１０ｍＭコハク酸、２５０ｍＭグリシン、０．５％ショ糖、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ５．５で平衡化し、溶出したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。同様の手順を抗ＣＤＨ６−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートを生成するために使用した。
【０４９９】
上のいずれの方法も抗体のＳＰＤＢ−ＤＭ４またはスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４とのコンジュゲーションにおいて有用である。下の表１５はＣＤＨ６  ＡＤＣの例を提供する。
【０５００】
【表１５】
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【０５０１】
原位置でのプロセスによるＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの調製
抗ＣＤＨ６抗体は、以下の手順による原位置でのプロセスを使用してＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされてもよい。ＣＤＨ６抗体をスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）リンカーを使用してＤＭ１にコンジュゲートした。ＤＭ１およびスルホ−ＳＭＣＣヘテロ二機能性リンカーの保存溶液をＤＭＡに調製した。スルホ−ＳＭＣＣおよびＤＭ１チオールを１０分間、２５℃、４０％ｖ／ｖの水性５０ｍＭコハク酸緩衝液、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡ中で反応させるために、ＤＭ１対リンカー１．３：１モル等量比、ＤＭ１の最終濃度１．９５ｍＭで混合した。次いで抗体を上記原位置で生成されたＳＭＣＣ−ＤＭ１のアリコートと反応させ、最終コンジュゲーション条件は、５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０、１０％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）中の２．５ｍｇ／ｍＬのＡｂを含み、ＳＭＣＣ：Ａｂのモル比はおよそ６．５であった。２５ｏＣでおよそ１８時間後、コンジュゲーション反応混合物を１０ｍＭコハク酸、２５０ｍＭグリシン、０．５％ショ糖、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。
【実施例１０】
【０５０２】
ヒト、カニクイザル、ラットまたはマウス由来のＣＤＨ６を発現しているＣＨＯ細胞株のパネルにおける抗ＣＤＨ６抗体およびＡＤＣ結合の検証
さまざまな種由来のＣＤＨ６の発現を特徴とする細胞への非コンジュゲート抗ＣＤＨ６抗体および抗ＣＤＨ６−ＡＤＣ結合を検証するために、ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）分析をヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス由来のＣＤＨ６を発現するように操作されたＣＨＯ細胞で実施した。ＣＤＨ６発現を特徴とするＣＨＯ細胞株の生成は実施例１に記載されている；ＦＡＣＳ方法は実施例３に記載されている。
【０５０３】
図８に示すとおり、非コンジュゲートＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２は、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウス由来のＣＤＨ６への同等の細胞結合を特徴とする。ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４抗体薬物コンジュゲートは、非コンジュゲートＮＯＶ０７１２への同等の結合プロファイルを特徴としている。この結果は、リンカーおよびペイロードの添加が抗ＣＤＨ６抗体の親和性または特異性を干渉しないことを示している。
【実施例１１】
【０５０４】
卵巣がん細胞株のパネルでのＣＤＨ６標的化抗体およびＡＤＣのＣＤＨ６発現および細胞結合の評価
ＣＤＨ６標的化ＡＤＣの細胞活性の評価のための調製において、ＣＤＨ６細胞表面発現レベルをＦＡＣＳによって卵巣がん細胞株のパネルで評価した。具体的には細胞懸濁物を、培養物中の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ、＃Ａ１１１０５０１  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で製造業者の説明書に従って細胞を処置することに続いて、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ、Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で洗浄することによって調製した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に細胞１ｘ１０６個／ｍｌで再懸濁し、９６ウエル丸底プレートに１００μｌ／ウエルでアリコートにした（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃ＣＬＳ３３６０  Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）。一次抗体（抗ＣＤＨ６−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＦＡＢ２７１５Ｐ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および対照マウスＩｇＧ１  ＰＥコンジュゲート（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＩＣ００２Ｐ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）をＦＡＣＳ緩衝液中に５μｇ／ｍｌで希釈した。２００μｌ冷ＦＡＣＳ緩衝液での３回洗浄に続いて、細胞をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。試料あたりのシグナルの幾何平均をＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して決定した。
【０５０５】
ＯＶＣＡＲ３は、高レベルのＣＤＨ６を内因的に発現する。ＣＤＨ６発現が抑制された同質遺伝子的細胞株を生成するために、ＯＶＣＡＲ３を製造業者の説明書に従ってＣＤＨ６標的化ｓｈＲＮＡを送達するレンチウイルスベクターで形質導入した（Ｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｈＲＮＡ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｓｔｏｃｋ、＃ＴＲＣＮ０００００５４１１７、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。ＯＶＣＡＲ８細胞は、ＣＤＨ６を内因的に発現しない。ＣＤＨ６発現を特徴とする同質遺伝子的細胞株を生成するために、ＯＶＣＡＲ８細胞にヒトＣＤＨ６  ｃＤＮＡの発現を駆動するレンチウイルス構築物を形質導入した。具体的にはＣＤＨ６に対するｃＤＮＡをＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ（＃Ｚ２０２８、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＡ）から購入し、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングを製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従って使用してｐＬｅｎｔｉ６．３にクローニングした。
【０５０６】
ＦＡＣＳ分析は、野生型ＯＶＣＡＲ３での高レベルの内在性ＣＤＨ６発現およびＯＶＣＡＲ３  ｓｈＲＮＡＣＤＨ６細胞株でのＣＤＨ６の抑制を確認した。ＯＶＣＡＲ８細胞がＣＤＨ６陰性であることが確認された一方で、ＣＤＨ６の高レベルの外来性発現がＯＶＣＡＲ８操作されたＣＤＨ６＋細胞において観察された（図９）。
【０５０７】
ＦＡＣＳ分析は、生成されたＣＤＨ６標的化抗体とＡＤＣとの特異的細胞結合をさらに確認した。図１０に示すとおり非コンジュゲートＣＤＨ６抗体（ＮＯＶ０７１２）は、同じ抗体およびスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー／ペイロードを使用するスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのものに匹敵するＣＤＨ６特異的結合パターンを特徴とする。非結合非コンジュゲートＩｇＧまたはＡＤＣを対照として含め、予想される細胞結合が生じないことを見出した。再度、リンカーおよびペイロードの添加が抗ＣＤＨ６抗体の親和性または特異性を干渉しないことを示している。
【実施例１２】
【０５０８】
ＣＤＨ６標的化ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞活性
選択された抗ＣＤＨ６抗体のＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞活性をＯＶＣＡＲ３（卵巣漿液性癌、ＲＰＭＩ＋２０％ＦＣＳで培養）、ＪＨＯＳ４（１：１  Ｆ１２：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、ＫＮＳ４２（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、ＮＣＩＨ６６１（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）、ＳＮＵ８（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）およびＯＶＣＡＲ８（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を含む細胞株のパネルで決定した。ＯＶＣＡＲ３およびＮＣＩＨ６６１細胞株はＡＴＣＣから得た（＃ＨＴＢ−１６１および＃ＨＴＢ−１８３、ＡＴＣＣ  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）。ＪＨＯＳ４はＲＩＫＥＮ（＃ＲＣＢ１６７８、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ、ＲＩＫＥＮ、Ｔｓｕｋｕｂａ、Ｊａｐａｎ）から得た。ＫＮＳ４２はＨｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ  ＨＳＲＲＢ（＃ＩＦＯ５０３５６、ＨＳＲＲＢ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）から得た。ＳＮＵ８はＫｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ  ＫＣＬＢ（＃００００８、ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から得た。ＯＶＣＡＲ８はＮＣＩ／ＤＣＴＤ  Ｔｕｍｏｒ／Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＣＩ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＡ）から得た。
【０５０９】
培養物中の細胞を計数し、培地中に細胞１ｘ１０５個／ｍｌの濃度に希釈した。細胞１０００個／ウエルを３８４ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ＃３７０７、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）に移した。ＡＤＣ保存溶液を１．４ｍｌマトリクス管（Ｔｈｅｒｍｏ、＃３７９０、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中に調製した。１０点、１：３系列希釈を３８４ウエルディープウエルプレート（Ｂｒａｎｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ  ＃７０１３５５、Ｅｓｓｅｘ、ＣＴ）に調製し、３３ｎＭのＡＤＣの最高開始濃度を生じるように、アッセイプレート（３回重複）あたり２５μｌを移した。対照として、細胞だけ（＝１００％対照生存率）およびＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート非標的化抗体とインキュベートした細胞（非標的由来活性を調べるため）を含むウエルを調製した。プレートを１２０時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。一次抗体／Ｆａｂ−ＤＭ１複合体の細胞活性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（＃Ｇ７５７１  Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者の説明書に従って使用して決定した。生存率を対照だけの細胞に対して標準化し、データをＴｉｂｃｏ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（Ｔｉｂｃｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用してプロットした。
【０５１０】
ＣＤＨ６標的化ＡＤＣのサブセットは、ＣＤＨ６発現（ＯＶＣＡＲ８）を欠いている細胞において不活性である濃度（１．２２ｎＭ）でＣＤＨ６陽性細胞の増殖を阻害でき、ＣＤＨ６−ＡＤＣの標的依存性ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞活性を示している（表１６）。
【０５１１】
【表１６】
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【実施例１３】
【０５１２】
卵巣がん細胞株へのＳＭＣＣ−ＤＭ１およびＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートとしての抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞活性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートとしての抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞活性を卵巣がん細胞株のパネルで評価した（図１１および表１７）。抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの標的依存性および特異的活性を評価するために、同質遺伝子的細胞株対をＯＶＣＡＲ３およびＯＶＣＡＲ８細胞株から実施例１１に記載のとおり生成した。
【０５１３】
ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびＳＰＤＢ−ＤＭ４フォーマットの両方におけるＣＤＨ６標的化ＡＤＣは、非発現同質遺伝子的細胞株対およびアイソタイプ対照ＡＤＣと比較してＣＤＨ６発現細胞株での増殖阻害によって示されるとおり、標的および用量依存性細胞活性を示した（図１１および表１７）。細胞活性アッセイを実施例１２に記載のとおり実施し、分析した。
【０５１４】
【表１７】
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【実施例１４】
【０５１５】
非コンジュゲート形態またはスルホＳＰＤＢ−ＤＭ４抗体薬物コンジュゲートとしてのいずれかでのＣＤＨ６標的化抗体または対照ＩｇＧのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞活性
非コンジュゲートＩｇＧまたはスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートいずれかとしてのＣＤＨ６抗体ＮＯＶ０７１２の細胞活性を卵巣がん細胞株のパネルにおいて評価した（実施例１１を参照されたい）。非コンジュゲート形態または、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートとしてのいずれかでの非標的化アイソタイプ対照抗体をさらに含めた。図１２に示すとおりＣＤＨ６標的化抗体薬物コンジュゲートＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、非発現細胞株（ＯＶＣＡＲ８）と比較したＣＤＨ６発現細胞株（ＯＶＣＡＲ３およびＯＶＣＡＲ８−ＣＤＨ６＋）における増殖の阻害によって示されるとおり標的および用量依存的細胞活性を示した。非コンジュゲートＮＯＶ０７１２抗体または非標的化ＩｇＧ対照では細胞活性は観察されなかった。非特異的細胞傷害性を生じることが認められている濃度での境界活性が対照ＩｇＧ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートで見られた。細胞活性アッセイを実施例９に記載のとおり実施し、分析した。
【実施例１５】
【０５１６】
卵巣がんの異種移植マウスモデルにおけるＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートとしての抗ＣＤＨ６  抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
選択された抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの抗腫瘍活性をＯＶＣＡＲ−３卵巣異種移植モデルにおいて評価した。メスＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ガンママウスにリン酸緩衝液溶液（ＰＢＳ）中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＯＶＣＡＲ−３細胞１０ｘ１０６個を右側腹皮下にインプラントした。懸濁物中に細胞を含有する合計注射容量は２００μｌであった。マウスをインプラント２９日後に、１６５ｍｍ３の平均腫瘍容積で研究に登録した。７群の内の１個に無作為に割り当てた後（ｎ＝４／群）、マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）または５個の抗ＣＤＨ６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の内の１個の単一ｉ．ｖ．用量を投与した。腫瘍容積および体重を１週間に２回測定した。各抗ＣＤＨ６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣは、対照アームと比較した場合、１０ｍｇ／ｋｇの単一用量後に腫瘍成長に阻害的効果を誘発した（図１３）。
【０５１７】
第２の選択された抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの抗腫瘍活性をＯＶＣＡＲ−３卵巣異種移植モデルにおいて評価した。メスＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ガンママウスにＰＢＳ中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＯＶＣＡＲ−３細胞１０ｘ１０６個を右側腹皮下にインプラントした。懸濁物中に細胞を含有する合計注射容量は２００μｌであった。マウスをインプラント３５日後に、１６６ｍｍ３の平均腫瘍容積で研究に登録した。７群の内の１個に無作為に割り当てた後（ｎ＝４／群）、マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）または５個の抗ＣＤＨ６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の内の１個に加えて以前のＯＶＣＡＲ３トリアージで投薬されたＮＯＶ０７１２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の単一ｉ．ｖ．用量を投与した。腫瘍容積および体重を１週間に２回測定した。体重の減少を示したマウスはおらず、ＡＤＣが十分許容されたことを示している（データ未記載）。５個の抗ＣＤＨ６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の内、ＮＯＶ０６９０だけがＮＯＶ０７１２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のものに相当する応答を誘発した（図１４）。
【実施例１６】
【０５１８】
卵巣がんの異種移植マウスモデルにおけるＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートとしての抗ＣＤＨ６抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
選択された抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの抗腫瘍活性をＯＶＣＡＲ−３卵巣異種移植モデルにおいて評価した。メスＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ガンママウスにＰＢＳ中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＯＶＣＡＲ−３細胞１０ｘ１０６個を右側腹皮下にインプラントした。懸濁物中に細胞を含有する合計注射容量は２００μｌであった。マウスをインプラント２１日後に、１７４ｍｍ３の平均腫瘍容積で研究に登録した。９群の内の１個に無作為に割り当てた後（ｎ＝５／群）、マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）、ＮＯＶ０７１２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）または７個の抗ＣＤＨ６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）の内の１個の単一ｉ．ｖ．用量を投与した。腫瘍容積および体重を１週間に１〜２回測定した。体重の減少を示したマウスはおらず、ＡＤＣがこの投与量で十分許容されたことを示している（データ未記載）。すべての抗ＣＤＨ６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４剤の内、ＮＯＶ０７１２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４が投薬後７０日間の退縮を伴って最も大きな抗腫瘍効果を誘発した。ＮＯＶ０７１０−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はこの研究での２番目に活性な抗ＣＤＨ６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４であった（図１５）。
【実施例１７】
【０５１９】
卵巣がんの異種移植マウスモデルにおけるＳＭＣＣ−ＤＭ１またはＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートとしての抗ＣＤＨ６抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
さまざまなリンカー−ペイロード形式での選択された抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ  ＮＯＶ０７１２の抗腫瘍活性をＯＶＣＡＲ−３卵巣異種移植モデルにおいて評価した。メスＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ガンママウスにＰＢＳ中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＯＶＣＡＲ−３細胞１０ｘ１０６個を右側腹皮下にインプラントした。懸濁物中に細胞を含有する合計注射容量は２００μｌであった。マウスをインプラント２１日後に、１７４ｍｍ３の平均腫瘍容積で研究に登録した。５群の内の１個に無作為に割り当てた後（ｎ＝５／群）、マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）、ＮＯＶ０７１２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）またはＮＯＶ０７１２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）の単一ｉ．ｖ．用量を投与した。腫瘍容積および体重を１週間に１〜２回測定した。体重の減少を示したマウスはいなかった（データ未記載）。ＮＯＶ０７１２のＬ／Ｐ形式の両方は抗腫瘍性効果を誘発したが、ＳＰＤＢ−ＤＭ４フォーマットがさらに強力に投薬後７０日間にわたる永続的な退縮を導いた（図１６）。薬物動態学的試料採取は、２個の薬剤が同様のＰＫプロファイルを有することを示している（データ未記載）。
【実施例１８】
【０５２０】
卵巣がんの患者由来原発腫瘍異種移植マウスモデルにおけるさまざまなリンカー／ペイロードフォーマットを有する抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ  ＮＯＶ０７１２のさまざまなリンカーペイロードフォーマットの抗腫瘍活性をマウスに異種移植されたＣＤＨ６発現原発（患者由来）卵巣腫瘍において評価した。ヒト原発異種移植モデルは原発ヒト腫瘍組織のｎｕ／ｎｕヌードマウスの皮下への直接インプラントによって確立した。得られた異種移植片をこの研究での使用の前に４から１０回の間で連続的に継代した。胸腺欠損ヌードマウスにサイズおよそ２７ｍｍ３の腫瘍の断片を右側腹皮下にインプラントした。マウスをインプラント研究４８日後に、１７８ｍｍ３の平均腫瘍容積で研究に登録した。８群の内の１個に無作為に割り当てた後（ｎ＝５／群）、マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１リンカーペイロードフォーマット（−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）、ＮＯＶ０７１２リンカーペイロードフォーマット（−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）またはネイキッド抗体としてＮＯＶ０７１２の単一ｉ．ｖ．用量を１４日（Ｑ１４Ｄ）ごとに投与した。すべての群は５ｍｇ／ｋｇで投薬された。腫瘍容積および体重を１週間に１〜２回測定した。体重の減少を示したマウスはいなかった（データ未記載）。ネイキッド抗体としてのＮＯＶ０７１２は、腫瘍成長に阻害効果を有さなかった。ＮＯＶ０７１２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１処置は、このモデルでは退縮を生じなかった。ＮＯＶ０７１２の各切断可能フォーマットは退縮を生じた。５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ１４Ｄ（１４日ごとに単一用量）でのＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、最初の投薬後１５０日間を超えて持続する永続的な腫瘍退縮を伴う最も強力な処置アームであった（図１７）。
【実施例１９】
【０５２１】
卵巣がんの異種移植マウスモデルにおけるさまざまなリンカー／ペイロードフォーマットを有する抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
選択された抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの抗腫瘍活性をＯＶＣＡＲ−３卵巣異種移植モデルにおいて評価した。メスＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ガンママウスにＰＢＳ中に５０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＯＶＣＡＲ−３細胞１０ｘ１０６個を右側腹皮下にインプラントした。懸濁物中に細胞を含有する合計注射容量は２００μｌであった。マウスをインプラント２０日後に、１７２ｍｍ３の平均腫瘍容積で研究に登録した。８群の内の１個に無作為に割り当てた後（ｎ＝５／群）、マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）、ＮＯＶ０７１２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（１．２５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ）またはＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（１．２５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ）の単一ｉ．ｖ．用量を投与した。腫瘍容積および体重を研究の継続期間の間ずっと１週間に１〜２回測定した。体重の減少を示したマウスはおらず、ＡＤＣが十分に許容されたことを示している（データ未記載）。ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、ＮＯＶ０７１２−ＳＰＤＢよりも２．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの両方の用量レベルでより有効であった。ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の単一２．５ｍｇ／ｋｇ用量は退縮を導く。各フォーマットの単一５ｍｇ／ｋｇ用量は、退縮を導いたが、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４用量の効果はＳＰＤＢ−ＤＭ４用量のものより長く継続した。全体としてこれらのデータは、評価したパネル内でＡＤＣを使用してＣＤＨ６を標的化するためにスルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４フォーマットが最も活性な形態であることを示している（図１８）。
【実施例２０】
【０５２２】
卵巣がんの患者由来原発腫瘍異種移植マウスモデルにおけるさまざまなリンカー／ペイロードフォーマットを有する抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ  ＮＯＶ０７１２のさまざまなリンカーペイロードフォーマットの抗腫瘍活性をマウスに異種移植されたＣＤＨ６発現原発（患者由来）卵巣腫瘍において評価した。ヒト原発異種移植モデルは原発ヒト腫瘍組織のｎｕ／ｎｕヌードマウスの皮下への直接インプラントによって確立した。得られた異種移植片をこの研究での使用の前に４から１０回の間で連続的に継代した。胸腺欠損ヌードマウスにサイズおよそ２７ｍｍ３の腫瘍の断片を右側腹皮下にインプラントした。原発腫瘍の成長動態における可変性の潜在期間のために、マウスはローリング様式（rolling fashion）で研究に参加させた。適切な容積１４７ｍｍ３から２４４ｍｍ３に達したら腫瘍を群に割り当てた（登録時の平均サイズは１８０ｍｍ３であった）。最初のマウス５匹を群１から５に割り当て、次のマウス５匹を群５から１に割り当て、５群が（ｎ＝５／群）が満たされるまでそのようにした。登録により各マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１  ＳＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）、ＮＯＶ０７１２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）、非標的アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（２．５ｍｇ／ｋｇ）またはＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（２．５ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｖ．用量を２週間ごと（Ｑ１４Ｄ）に投与した。腫瘍容積および体重を１週間に２回測定した。体重の減少を示したマウスはおらずＡＤＣが十分に許容されたことを示している（データ未記載）。ＮＯＶ０７１２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１  ５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ１４Ｄは、このモデルにおいて腫瘍成長を低減できる。ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４  ２．５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ１４Ｄは、このモデルにおいて４２日間腫瘍成長を停止させることに有効である（図１９）。
【実施例２１】
【０５２３】
卵巣がんの患者由来原発腫瘍異種移植マウスモデルのパネルにおける抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ（ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）の抗腫瘍活性を２８個の卵巣原発腫瘍異種移植（ＰＴＸ）モデルのパネルにおいて１ｘ１ｘ１設計（１ＰＴＸｘ１動物ｘ１処置）で評価した。ヒト原発異種移植モデルは原発ヒト腫瘍組織のｎｕ／ｎｕヌードマウスの皮下への直接インプラントによって確立した。得られた異種移植片をこの研究での使用の前に４から１０回の間で連続的に継代した。メスヌードマウスに３ｘ３ｘ３ｍｍ腫瘍断片を１２ゲージトロカールを使用して腋窩領域皮下にインプラントした。腫瘍が２００〜２５０ｍｍ３と測定されたら、マウスを研究に登録し、処置を開始した。登録で各マウスにＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｖ．用量を２週間（Ｑ１４Ｄ）ごとに投与した。体重の減少を示したマウスはおらずＡＤＣが十分に許容されたことを示している（データ未記載）。腫瘍容積および体重を１週間に２回測定した。抗腫瘍活性の可視化のために、腫瘍容積の経時的な百分率変化をＴｉｂｃｏ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（Ｔｉｂｃｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用してプロットした。
【０５２４】
ＰＴＸ試料におけるＣＤＨ６発現を免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して未処置ＰＴＸ腫瘍からの試料で評価した。具体的には屠殺時に腫瘍を直ちに切除し、組織学カセットに回収し、１０％緩衝ホルマリン中で２４時間固定した。次いでカセットを７０％ＥｔＯＨに移し、処理し、日常的組織学的手順を使用してパラフィンに包埋した。実験用ＦＦＰＥブロックをスライド上の全切片として３．５μｍで切断した。ウサギポリクローナル抗ヒトＣＤＨ６抗体をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｔ＃ＨＰＡ００７０４７、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得て、一次免疫組織化学（ＩＨＣ）抗体として使用した。抗体をＶｅｎｔａｎａ  Ｂｉｏｔｉｎ−ｆｒｅｅ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍｓをＶｅｎｔａｎａ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＸＴ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）で使用して検出した。
【０５２５】
最適化されたプロトコールはＶｅｎｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｔｉｏｎｉｎｇ  ＃１  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ＃９５０−１２４）への標準的曝露を含んだ。一次抗体をＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｃａｔ＃Ｓ０８０９）中１：２００の濃度に希釈し、１００μｌ容量で添加し、６０分間、３７℃でインキュベートした。続いてＶｅｎｔａｎａ  ＯｍｎｉＭａｐ  ｐｒｅｄｉｌｕｔｅｄ  ＨＲＰ−コンジュゲート抗ウサギ二次抗体（Ｃａｔ＃７６０−４３１１）でのインキュベーションを４分間実施した。次いで二次抗体をＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ  ｋｉｔ（Ｃａｔ＃７６０−１５９）を使用して検出し、スライドをＶｅｎｔａｎａ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｃａｔ＃７６０−２０２１）での４分間に続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｂｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ＃７６０−２０３７）４分間対比染色した。スライドをエタノールの濃度を増加させ（９５〜１００％）、次いでキシレン中で脱水し、続いてカバーガラスを載せた。カバーガラスを載せたスライドを光学顕微鏡によって評価し、Ｌｅｉｃａ／Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ｓｌｉｄｅ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）によって走査した。染色したスライドの走査画像をｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｌｅｉｃａ  ｅＳｌｉｄｅ  Ｍａｎａｇｅｒ／Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）から開いてＩｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ  ＨＡＬＯ（Ｃｏｒｒａｌｅｓ、ＮＭ）に入れた。Ａｒｅａ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ａｒｅａ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖ１．０）を腫瘍検出のための分類モジュール（ＣＤＨ６遊離（Loose）腫瘍２、ＣＤＨ６陰性腫瘍２およびＣＤＨ６腫瘍およびＣＤＨ６腫瘍２）を伴ってまたは分類モジュールを伴わずにのいずれかで使用してデジタル画像を観察、アノテートおよび分析した。画像分析アルゴリズムを任意の強度を検出するように使用した。
【０５２６】
図２０に例示するとおり、抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの有効性をＰＴＸモデル、特にＩＨＣにより２０％を超えるＣＤＨ６陽性腫瘍領域を特徴とする腫瘍モデル、で観察した。特記として、ＰＴＸモデルの１１／２８（３９％）が１５０日を超えて持続する完全腫瘍退縮を伴って応答した。
【実施例２２】
【０５２７】
腎臓がんの患者由来原発腫瘍異種移植マウスモデルにおける２．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．、Ｑ１４Ｄまたは５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．Ｑ１４Ｄのいずれかで投薬された抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ（ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ１４Ｄまたは２．５ｍｇ／ｋｇ  Ｑ１４Ｄのいずれかで投薬）の抗腫瘍活性を腎臓原発腫瘍異種移植（ＰＴＸ）モデルで評価した。ヒト原発異種移植モデルは原発ヒト腫瘍組織のｎｕ／ｎｕヌードマウスの皮下への直接インプラントによって確立した。得られた異種移植片をこの研究での使用の前に４から１０回の間で連続的に継代した。メスヌードマウスに３ｘ３ｘ３ｍｍ腫瘍断片を１２ゲージトロカールを使用して腋窩領域皮下にインプラントした。動物を腫瘍断片インプラントの２０日後に処置群に無作為化し、平均腫瘍容積は１９５ｍｍ３（範囲１１５〜２８２ｍｍ３）であった。処置を２０日目に開始した。抗腫瘍活性を腫瘍細胞インプラント５３日後、処置開始３３日後、すべての動物が研究に残っている最終日に決定した。非標的化ＡＤＣをＣＤＨ６特異的抗腫瘍活性を決定するための対照として含めた。体重の減少を示したマウスはおらず、ＡＤＣが十分に許容されたことを示している（データ未記載）。卵巣がんモデルと同様に抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの有効性をＩＨＣにより２０％を超えるＣＤＨ６陽性腫瘍領域を特徴とする腎臓ＰＴＸモデルにおいて観察した。図２１に示すとおり、抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ処置は腎臓ＰＴＸモデルにおいて原発ヒト腫瘍に対して有効であった。
【実施例２３】
【０５２８】
腎臓がんの患者由来原発腫瘍異種移植マウスモデルにおける２．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．、Ｑ１４Ｄまたは５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．Ｑ１４Ｄのいずれかで投薬された抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ（ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）の抗腫瘍活性を腎臓原発腫瘍異種移植（ＰＴＸ）モデルで評価した。ヒト原発異種移植モデルは原発ヒト腫瘍組織のｎｕ／ｎｕヌードマウスの皮下への直接インプラントによって確立した。得られた異種移植片をこの研究での使用の前に４から１０回の間で連続的に継代した。メスヌードマウスに３ｘ３ｘ３ｍｍ腫瘍断片を１２ゲージトロカールを使用して腋窩領域皮下にインプラントした。動物を腫瘍断片インプラントの１４日後に処置群に無作為化し、平均腫瘍容積は１６０ｍｍ３（範囲１１３〜２４５ｍｍ３）であった。処置を１４日目に開始した。抗腫瘍活性を腫瘍細胞インプラント５０日後に決定した。体重の減少を示したマウスはおらず、ＡＤＣが十分に許容されたことを示している（データ未記載）。卵巣がんモデルと同様に抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの有効性をＩＨＣにより２０％を超えるＣＤＨ６陽性腫瘍領域を特徴とする腎臓ＰＴＸモデルにおいて観察した。図２２に示すとおり、抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ処置は腎臓ＰＴＸモデルにおいて原発ヒト腫瘍に対して有効であった。
【実施例２４】
【０５２９】
腎臓がんの患者由来原発腫瘍異種移植マウスモデルにおける２．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．、Ｑ１４Ｄまたは５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．Ｑ１４Ｄのいずれかで投薬された抗ＣＤＨ６  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ（ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）の抗腫瘍活性を腎臓原発腫瘍異種移植（ＰＴＸ）モデルで評価した。ヒト原発異種移植モデルは原発ヒト腫瘍組織のｎｕ／ｎｕヌードマウスの皮下への直接インプラントによって確立した。得られた異種移植片をこの研究での使用の前に４から１０回の間で連続的に継代した。メスヌードマウスに３ｘ３ｘ３ｍｍ腫瘍断片を１２ゲージトロカールを使用して腋窩領域皮下にインプラントした。動物を腫瘍断片インプラントの１９日後に処置群に無作為化し、平均腫瘍容積は１７６ｍｍ３（範囲１２３〜２６７ｍｍ３）であった。処置を１９日目に開始した。抗腫瘍活性を腫瘍細胞インプラント４９日後に決定した。体重の減少を示したマウスはおらず、ＡＤＣが十分に許容されたことを示している（データ未記載）。卵巣がんモデルと同様に抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの有効性をＩＨＣにより２０％を超えるＣＤＨ６陽性腫瘍領域を特徴とする腎臓ＰＴＸモデルにおいて観察した。図２３に示すとおり、抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ処置は腎臓ＰＴＸモデルにおいて原発ヒト腫瘍に対して５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの両方の投与量において有効であった。
【実施例２５】
【０５３０】
組合せ療法における抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ
抗ＣＤＨ６  ＡＤＣは、小分子阻害剤または他の抗体と組み合わされてよい。Ｃｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｚａｌｉｃｕｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）またはＣｏｍｂｏＥｘｐｌｏｒｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ  ＣＨ）のいずれかを使用して、組合せの応答をその単剤、それ自体が用量相加性を有する薬物のために広く使用されるＬｏｅｗｅモデルに対して比較する（Lehar et al. Nat. Biotechnol. (2009) 27: 659-666、Zimmermann et al., Drug Discov. Today (2007) 12: 34-42）。相加性と比較して超過している阻害は、相乗効果が生じる薬物濃度を可視化するための全用量マトリクスチャートとしてプロットできる。表１８は、いくつかの抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ／化合物組合せを示している。
【０５３１】
細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を使用して細胞性ＡＴＰ含有量を測定することによって決定できる。薬物添加の１日前に、細胞２５０〜５００個を３８４ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）中２０μｌ成長培地に置く。次いで細胞を１２０時間、種々の濃度の抗ＣＤＨ６  ＡＤＣと（表１８）、単一薬剤、単一薬剤化合物または抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ／化合物組合せとして、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウエルに加える前にインキュベートし、発光をＥｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）で記録した。発光値をＤＭＳＯ処置細胞と比較した細胞生存率の阻害を算出するために使用する（０％阻害）。
【０５３２】
【表１８−１】
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【０５３３】
【表１８−２】
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【０５３４】
【表１８−３】
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【０５３５】
【表１８−４】
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【０５３６】
【表１８−５】
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【０５３７】
図２４は、小分子阻害剤と組み合わせた抗ＣＤＨ６  ＡＤＣの例である。ＳＮＵ−８卵巣がん細胞を実施例１２に記載のとおり成長させ、抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ（ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）および、Ｂｃｌ２／Ｂｃｌ−Ｘｌ阻害剤（ＡＢＴ−２６３）、Ｂｃｌ−Ｘｌ阻害剤（ＷＥＨＩ−５３９）、ＩＡＰ阻害剤（ＮＶＰ−ＬＣＬ１６１）またはＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ）のいずれかとの滴定で処置した。強力な相乗作用がＢｃｌ２／Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−Ｘｌ、ＭＥＫおよびＩＡＰ阻害剤と組み合わせた抗ＣＤＨ６  ＡＤＣ（ＮＯＶ０７１２−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）で見られる。ＡＤＣの自己自己組合せ、例えば（ＣＤＨ６−ＡＤＣ＋ＣＤＨ６−ＡＤＣ）または小分子の自己自己組合せ、例えば（ＮＶＰ−ＬＣＬ１６１＋ＮＶＰ−ＬＣＬ１６１）は、真の相乗効果から用量の相加性を区別するために含め、これらのスコアを図２４に報告する。図２４に示すとおり、ＣＤＨ６−ＡＤＣに加えた小分子組合せは、自己自己組合せと比較して顕著に高いＬｏｅｗｅ相乗効果スコアを特徴としている。
【０５３８】
このデータは、抗有糸分裂ペイロード（例えば、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ＳＭＣＣ−ＤＭ１）を有するＡＤＣまたは、アポトーシス促進性小分子阻害剤（例えば、ＡＢＴ−２６１、ＡＢＴ−１９９、ＷＥＨＩ−５３９もしくはＮＶＰ−ＬＣＬ１６１などのＩＡＰ阻害剤）もしくはＭＡＰＫ経路阻害剤（すなわちトラメチニブ）を有する他のペイロードの組合せが、抗有糸分裂／細胞傷害性ＡＤＣペイロード単独によって誘導される初期Ｇ２／Ｍ停止もしくは損傷の後にさらに有効なアポトーシスの実行を生じることを示している。
【０５３９】
付加的にＣＤＨ６−ＡＤＣ組合せは、ｉｎ  ｖｉｖｏ組合せ処置によってさらに評価されてよい。ＣＤＨ６−ＡＤＣは、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペンブロリズマブ）またはＯｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ）などのＰＤ／ＰＤ−Ｌ１経路を標的化する免疫調節剤と共同できる。要約すると本明細書に開示の抗ＣＤＨ６  ＡＤＣは、他の分子と組み合わせて使用された場合に、処置のためにさらなる選択肢をもたらす相乗効果を発揮できる。
【実施例２６】
【０５４０】
腫瘍徴候におけるＣＤＨ６発現
ＣＤＨ６は、卵巣がん、腎臓がん、軟部組織がん、ＣＮＳがん、甲状腺がんおよび胆管細胞癌を含むいくつかの腫瘍徴候において過剰発現されている。ＣＤＨ６  ｍＲＮＡ発現をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して評価した。具体的にはヒト腫瘍および正常組織試料でのデータを含むＮｏｖａｒｔｉｓ−ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍＲＮＡ発現データベースをＣＤＨ６プローブセット２１４８０３＿ａｔを使用して検索し、データをＴｉｂｃｏ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用してプロットした。グラフ上の各ポイントは、個々の腫瘍または正常組織試料を表している。図２５に例示のとおり、ＣＤＨ６は、限定された正常組織発現を特徴とし、卵巣がん、腎臓がん、ＣＮＳがん、軟部組織がんおよび甲状腺がんならびに胆管細胞癌において顕著に過剰発現されている。
【０５４１】
ＣＤＨ６発現を実施例２１に記載のプロトコールを使用して免疫組織化学によってヒト原発腫瘍試料の一群においてさらに評価した。図２６に示すとおり、ＣＤＨ６タンパク質発現が大部分の卵巣がんおよび腎臓がん試料において観察された。ＣＤＨ６発現は、子宮内膜がんおよび胆管細胞癌においてもしばしば検出された。興味深いことに胆管細胞癌内のＣＤＨ６発現は、肝臓内のサブタイプにおいて豊富であった。
【０５４２】
本明細書に記載の実施例および態様が例示的目的のみのためであり、その観点から種々の修飾および変化は、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることは理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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