(57)【要約】  本発明は、（ａ）１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの抗原と、（ｂ）２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの配列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’を含有するＣｐＧオリゴヌクレオチドと、（ｃ）２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌのアルミニウムアジュバントとを含む治療対象体内の免疫反応を誘導するための医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導又は向上することができる。【選択図】図１
2017524682.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療対象体内の免疫反応を誘導するための医薬組成物であって、
（ａ）１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの抗原と、
（ｂ）２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの配列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’を含有するＣｐＧオリゴヌクレオチドと、
（ｃ）２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌのアルミニウムアジュバントと、
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドの配列は、5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記アルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウムを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗原は、ウイルスと関連する抗原である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ウイルスは、組換えヒトＢ型肝炎ウイルスから選ばれる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記アルミニウムアジュバントの濃度は、２５μｇ／ｍｌ〜１２５μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、又は２５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は３００μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、又は４００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は３００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記配列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’を含有するＣｐＧオリゴヌクレオチドの濃度は、１２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は２５μｇ／ｍｌ〜１２５μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、又は２５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗原の濃度は、２０μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗原の濃度が２０μｇ／ｍＬで、前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドの濃度が５００μｇ／ｍｌで、前記アルミニウムアジュバントの濃度が２５μｇ／ｍｌであり、又は
前記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、前記アルミニウムアジュバントの濃度が２５μｇ／ｍｌで、前記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は
前記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、前記アルミニウムアジュバントの濃度が１２５μｇ／ｍｌで、前記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が２５μｇ／ｍｌであり、又は
前記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、前記アルミニウムアジュバントの濃度が３００μｇ／ｍｌで、前記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は
前記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、前記アルミニウムアジュバントの濃度が４００μｇ／ｍｌで、前記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は
前記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、前記アルミニウムアジュバントの濃度が１２５μｇ／ｍｌで、前記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が５００μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物の、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導するための薬剤の製造における使用。
【請求項１３】
前記薬剤は、Ｂ型肝炎ワクチン又はＣ型肝炎ワクチンである、請求項１２に記載の応用。
【請求項１４】
前記薬剤は、遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチンである、請求項１２に記載の応用。
【請求項１５】
前記遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチンは、組換え酵母Ｂ型肝炎ワクチン及び組換えＣＨＯ  Ｂ型肝炎ワクチンを含む、請求項１４に記載の応用。
【請求項１６】
前記薬剤は、非経口投与のための剤形、経口投与のための剤形、又は経皮投与のための剤形に調製される、請求項１２に記載の応用。
【請求項１７】
前記非経口投与のための剤形は、注射剤である、請求項１４に記載の応用。
【請求項１８】
前記経口投与のための剤形は、錠剤、丸薬、カプセル、ゲル、シロップ、スラリー、又は懸濁液である、請求項１４に記載の応用。
【請求項１９】
治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導する方法であって、
有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記治療対象に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記治療対象に再投与することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記再投与の時間間隔は、２週間〜１２週間である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記再投与の時間間隔は、４週間である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年６月２６日に出願された中国特許出願第２０１４１０２９４１４２．３号の優先権を主張しており、上記中国特許出願のすべての内容は参考により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、全体としてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関し、具体的に、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとアルミニウムアジュバントとの相乗効果に基づく抗原に対する免疫反応を強化するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、公衆衛生に危害を与えるグローバルな重大問題である。ワクチンを使用すれば、ＨＢＶ感染を有効に予防し、慢性肝炎のキャリア率を低下させ、Ｂ型肝炎の流行を抑えることができる。ＷＴＯの報告によると、１９８２年以来、全世界で１０億用量のＢ型肝炎ウイルスワクチンが使用されており、Ｂ型肝炎ウイルスの伝播の予防及び抑制に非常に重要な役割を果たしている。ＨＢＶは、エラーが発生しやすいＲＮＡに基づく複製を利用しているので、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が変化したＨＢＶ耐性エスケープ変異株の生成を引き起こす。現在、市販の予防用Ｂ型肝炎ワクチンは、いずれも水酸化アルミニウム（Ａ１（ＯＨ）３）をアジュバントとして使用するものであり、Ｔｈ２型免疫応答及び体液性免疫を向上でき、生体からの防御抗体ＩｇＧ１の生成及び分泌を誘導することができる。水酸化アルミニウムは、抗原を貯蔵して抗原クリアランス時間を遅延させる機能、抗原の免疫システムに曝される時間を延長する機能を果たすとともに、補体を活性化してリンパ節捕捉能力及びリンパ球滞留時間を向上させる機能、抗原を吸着してリンパ節に輸送し、免疫応答を発生させる機能、及び抗原の倉庫として抗原を包んで徐々に放出する機能を果たす。しかしながら、近年、ワクチン学及び免疫学の発展に伴って、このようなワクチンに制限があることを発見した。すなわち、水酸化アルミニウムは、主としてＴｈ２関連抗体の発生（ＩｇＥを含む）を促進するが、Ｔｈ１細胞免疫反応の発生を誘導できず、Ｔｈ１活性を刺激できず、細胞免疫（ＣＴＬ）を向上させＣＤ８＋ＣＴＬの活性化を阻害することもできない。このような抗体は、細胞外のウイルスを中和できるが、感染細胞に潜伏しているＢ型肝炎ウイルスを徹底的に除去できないので、患者体内におけるＢ型肝炎ウイルスの潜伏を引き起こしやすい。また、１０％程度の人は、当該ワクチンに対して低反応又は非反応である。そのため、従来のＢ型肝炎ウイルスワクチンの免疫活性を向上すること、又は細胞に潜伏するＢ型肝炎ウイルスを活性化して除去し得るワクチンを開発することは特に重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の目的の１つは、（ａ）１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの抗原と、（ｂ）２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの配列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’を含有するＣｐＧオリゴヌクレオチドと、（ｃ）２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌのアルミニウムアジュバントとを含む治療対象体内の免疫反応を誘導するための医薬組成物を提供することにある。
【０００５】
本発明の一実施形態では、上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドの配列は5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’であり、上記アルミニウムアジュバントは水酸化アルミニウムであり、上記抗原はウイルスと関連する抗原である。好ましくは、上記ウイルスは、例えば、組換えヒトＢ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルスから選ばれ、上記抗原はＢ型肝炎表面抗原である。
【０００６】
本発明の医薬組成物において、上記アルミニウムアジュバントの濃度は、２５μｇ／ｍｌ〜１２５μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、又は２５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は３００μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、又は４００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は３００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである。上記配列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’を含有するＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の濃度は、１２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は２５μｇ／ｍｌ〜１２５μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、又は２５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである。上記抗原の濃度は、２０μｇ／ｍＬである。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の医薬組成物において、上記抗原の濃度は２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度は２５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ又は３００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は１２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである。
【０００８】
本発明のより好ましい実施形態において、上記抗原の濃度２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度は１２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、又は５００μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は１２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、又は５００μｇ／ｍｌである。
【０００９】
本発明の特に好ましい実施形態において、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、上記アルミニウムアジュバントの濃度が２５μｇ／ｍｌで、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が５００μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、上記アルミニウムアジュバントの濃度が２５μｇ／ｍｌで、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、上記アルミニウムアジュバントの濃度が１２５μｇ／ｍｌで、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が２５μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、上記アルミニウムアジュバントの濃度が３００μｇ／ｍｌで、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、上記アルミニウムアジュバントの濃度が４００μｇ／ｍｌで、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌで、上記アルミニウムアジュバントの濃度が１２５μｇ／ｍｌで、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が５００μｇ／ｍｌである。
【００１０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。上記賦形剤は、溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、薬物安定剤、粘着剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、調味剤、顔料、及びそれらの組み合わせ又は類似物から選ばれる。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明の医薬組成物の、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導するための薬剤の製造における応用を提供することにある。医薬分野で常用の賦形剤を使用することにより、本発明の医薬組成物を例えば注射剤のような非経口投与のための剤形、例えば錠剤、丸薬、カプセル、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液のような経口投与のための剤形、経皮投与のための剤形、又は当該技術分野で常用のその他の剤形に調製することができる。本発明の一実施形態では、本発明の医薬組成物により調製された治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導するための薬剤は、Ｂ型肝炎ワクチン又はＣ型肝炎ワクチンであってもよい。選択的に、本発明の医薬組成物により調製された治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導するための薬剤は、組換え酵母Ｂ型肝炎ワクチン及び組換えＣＨＯ  Ｂ型肝炎ワクチンを含む遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチン（genetically engineered hepatitis B vaccine）である。
【００１２】
本発明の更に別の目的は、有効量の本発明の医薬組成物を上記治療対象に投与すること含む、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導する方法を提供することにある。上記方法は、有効量の本発明の医薬組成物を上記治療対象に再投与することをさらに含んでもよい。ここで、上記再投与の時間間隔は２週間〜１２週間である。本発明の一実施形態では、上記再投与の時間間隔は４週間である。治療対象に本発明の医薬組成物を２回投与することにより、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導して防御抗体応答レベルを生じさせることができ、従来の３回投与で免疫反応を誘導する方法と比べて、投与回数を減少させ、治療対象体内の免疫反応を誘導するための全過程の免疫時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、異なる濃度のＣｐＧと異なる濃度のアルミニウムアジュバントを併用することによりＨＢｓＡｇを誘導して生成されたＩｇＧの総量の変化を示す。
【図２】図２は、異なる濃度のＣｐＧと異なる濃度のアルミニウムアジュバントを併用することによりＨＢｓＡｇを誘導して生成されたＩｇＧ２ａサブタイプの量の変化を示す。
【図３】図３は、異なる濃度のＣｐＧと異なる濃度のアルミニウムアジュバントを併用することによりＨＢｓＡｇを誘導して生成されたＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の変化を示す。
【図４】図４は、異なる濃度のＣｐＧと異なる濃度のアルミニウムアジュバントを併用することによりマウス体内でＨＢｓＡｇを誘導して生成された抗ＨＢｓ抗体力価の変化を示す。
【図５】図５は、異なる濃度のＣｐＧと異なる濃度のアルミニウムアジュバントを併用することによりマウス体内でＩＦＮ−γを誘導して生成された量の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、実施例を参照しながら本発明に係る複数の態様について詳細に説明するが、これらの実施例は例示的なものにすぎない。本発明が実施例に記載される具体的な操作ステップに限定されるものではないことは、当業者に理解されるところである。
【００１５】
別途の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、通常、当業者が一般的に理解している意味と同様の意味を有する。
【００１６】
［用語の説明］
＜免疫アジュバント＞
本発明の免疫アジュバントとは、当業者が熟知している免疫アジュバントであり、一般的に、（１）マイコバクテリウム、コリネバクテリウムパルヴム、百日咳菌、グラム陰性桿菌の抽出物のリポ多糖、及びマイコバクテリウムの抽出物のムラミールジペプチドなどの通常の微生物及びその生成物と、（２）例えば、ポリイノシン酸：シチジル酸（ｐｏｌｙ１：Ｃ）、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙ１：Ａ：μ）などのポリヌクレオチドと、（３）フロイントアジュバントと、（４）例えば、ミョウバンなどの無機物との４種類に分けられる。免疫アジュバントは、主として（１）単核食細胞系を刺激し、それにより抗原に対する処理能力及び提示能力を向上させるというメカニズムと、（２）体内における抗原の生存期間を延長し、免疫細胞との接触確率を高めるというメカニズムと、（３）抗原注射部位及びその所属リンパ節の炎症反応を誘発し、免疫細胞増殖作用への刺激に有利であるというメカニズムによって発効する。
【００１７】
＜ＣｐＧオリゴヌクレオチド＞
本発明に係るＣｐＧオリゴヌクレオチドは、新型の免疫アジュバントに属し、ホスホジエステル結合によって接続してなる非メチル化ジヌクレオチドであり、免疫刺激作用を有する。ＣｐＧ−ＯＤＮは、Ｂ細胞の増殖分化を促進してＩＬ−６を分泌することにより抗体の分泌を誘導し、また、単球、マクロファージ、樹状細胞などの抗原提示細胞を活性化して多種のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、及びＩＦＮ−βなど）を分泌することができる。サイトカインにより、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性を間接的に促進し、細胞内の病原体を誘導して細胞免疫を生じさせ、また、ＮＫ細胞及びＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌を誘導することができる。ＣｐＧ−ＯＤＮは、先天性免疫応答を誘導する以外、（１）Ｂ細胞抗原受容体により発生する信号伝達経路とＣｐＧにより発生するＢ細胞信号伝達経路との間に強い相乗効果が存在するという理由と、（２）抗原特異的ＴヘルパーＴｈ１様サイトカイン（T helper Th1 like cytokine）を強めることによりＢ細胞及びＴ細胞の抗原特異的反応を増強し得るという理由と、（３）細胞反応に共刺激分子（costimulatory molecule）の正の制御が必要であるという理由で、抗原特異的反応を増強することができる。
【００１８】
１９世紀９０年代に、人々は、癌患者に細菌抽出物を注射することにより病状を明らかに軽減できることを見出した。後続研究により、細菌ＤＮＡは、直接的な免疫刺激作用及び抗腫瘍作用を有することが明らかになった。合成のオリゴデオキシヌクレオチドで行った実験研究では、細菌ＤＮＡの免疫刺激作用はその中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドと関係があることを発見した。
【００１９】
免疫刺激活性を有するＣｐＧ−ＯＤＮの基本的構造特性は、下記のａ〜ｄの通りである。
ａ．ＣｐＧモチーフは、ＣｐＧ−ＯＤＮが免疫刺激作用を生じるための基本構造であり、ＣｐＧジヌクレオチドとその５'末端の２つの塩基及び３'末端の２つの塩基とからなる。
ｂ．ＣｐＧ両側のプリン及びピリミジンとＣｐＧの間隔とは、いずれもＣｐＧ−ＯＤＮの免疫刺激活性及びその作用特性に影響を与える。
ｃ．ＯＤＮに含まれるＣｐＧモチーフの数について、一般的に、２〜４個のＣｐＧモチーフが最適であり、ＣｐＧモチーフの間の間隔について、一般的に、少なくとも２つの塩基、望ましくはチミンを隔てる。
ｄ．ｐｏｌｙ−Ｇ配列（３つ以上のグアニンからなる）を含有するＣｐＧ−ＯＤＮは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を刺激してインターフェロン−αを生成する作用が比較的強い一方、完全チオ化修飾されたＣｐＧ−ＯＤＮは、最も安定でかつＢ細胞に対する刺激作用が最も良いが、ｐＤＣを刺激してＩＦＮ−αを生成する作用が部分的チオ化修飾されたＣｐＧ−ＯＤＮに及ばない。
【００２０】
ＣｐＧ−ＯＤＮは、その機能特性に基づいて下記（１）Ａ型ＣｐＧ−ＯＤＮ、（２）Ｂ型ＣｐＧ−ＯＤＮ、及び（３）Ｃ型ＣｐＧ−ＯＤＮの３種類に分けられる（Tomoki Ito, et al., Blood, 2006, Vol 107, Num 6: 2423-2431）。
【００２１】
（１）Ａ型ＣｐＧ−ＯＤＮは、キメラ骨格により合成され、そのうち骨格の５’末端及び３’末端がチオリン酸エステルであり、中間のＣｐＧ領域がリン酸ジエステルであり、これらのＯＤＮはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ細胞）を良好に活性化してＩＦＮ−αを大量に生成することができるが、Ｂ細胞については有限的にしか活性化できない。
【００２２】
（２）Ｂ型ＣｐＧ−ＯＤＮは、ヌクレアーゼ耐性のチオリン酸エステル骨格により合成され、Ｂ細胞及びｐＤＣ細胞を良好に活性化してＩＬ−１２を生成しかつ抗体の分泌を誘導するが、ＮＫ細胞については有限的にしか活性化できず、一般的に、Ｂ型ＣｐＧ−ＯＤＮをワクチンアジュバントとして効率よく使用することができる。
【００２３】
（３）Ｃ型ＣｐＧ−ＯＤＮは、チオリン酸エステル骨格により合成され、Ａ型とＢ型ＣｐＧ−ＯＤＮの間の刺激活性を有し、例えば、Ｂ細胞を良好に活性化できるとともにＮＫ細胞及びｐＤＣ細胞をも良好に活性化することができる。
【００２４】
本発明で使用されるＣｐＧ−ＯＤＮは、配列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’（配列番号１）を有する。本発明の好適な実施形態において、本発明で使用されるＣｐＧ−ＯＤＮのヌクレオチド配列は、5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’（配列番号１）である。上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は、１２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は２５μｇ／ｍｌ〜１２５μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、又は２５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである。
【００２５】
本発明のＣｐＧ−ＯＤＮにおける塩基は、非修飾塩基（unmodified base）、部分的修飾塩基（partly modifiedbase）、又は完全修飾塩基（completely modified base）であってもよい。上記修飾は、様々な化学修飾を含んでもよく、例えば、チオリン酸エステルで本発明のＣｐＧ−ＯＤＮにおける塩基を全部又は部分的に修飾することができる。上記修飾は、オリゴヌクレオチドの合成過程で行ってもよいし、合成の後で行ってもよく、ヌクレオシドの間におけるリン酸ジエステル架橋結合の上、リボースユニットの上、及び／又は天然ヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、及びチミン）の上で発生することができる。オリゴヌクレオチドを合成する過程で修飾を行う場合、修飾される塩基は、オリゴヌクレオチドの内部又はオリゴヌクレオチド末端に導入され得る。オリゴヌクレオチドを合成した後で修飾を行う場合、上記修飾は、例えば、アミノ基修飾成分、３’もしくは５’ヒドロキシ基、又はホスフェート基などの活性基を使用することにより行うことができる。
【００２６】
本発明に係る化学修飾は、本発明のＣｐＧ−ＯＤＮの骨格に対して行う修飾を含んでもよく、チオリン酸エステルで骨格に対して行う修飾を含むがこれに限定されない。このようなチオリン酸エステルで骨格に対して行う修飾により得られるチオリン酸エステル骨格は、安定的な核酸分子の糖リン酸エステル骨格である。当該骨格では、ヌクレオチドの間の少なくとも１つの結合において、架橋結合されないホスフェートの酸素が硫黄に置換され、又は、ヌクレオチドの間の各結合もしくは１つおきの結合において、架橋結合されないホスフェートの酸素が硫黄に置換される。また、オリゴヌクレオチド骨格に対して他の修飾を行ってもよい。例えば、アルキルホスフェート及びアリールホスフェートなどのノニオン性ＤＮＡ類似物を用いて骨格に対して修飾を行い、アルキル基又はアリール基で荷電ホスフェートにおける酸素を置換してもよいし、リン酸ジエステル及びアルキルリン酸トリエステルを用いて骨格に対して修飾を行い、荷電酸素をアルキル化してもよい。
【００２７】
＜アルミニウムアジュバント＞
本発明に係るアルミニウムアジュバントは、当技術分野で公知かつ常用の免疫アジュバントであり、溶液からタンパク質抗原を強く吸着して沈殿を形成することができる。そのアルミニウムアジュバントを生体に接種した後、「抗原プール」を形成して抗原を徐々に放出し、抗原作用時間を十分に延長することができる。同時に、局部（注射部位）のマクロファージの応答を促進することもできる。本発明のアルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウムから選ぶことができる。
【００２８】
本発明の好適な実施形態において、上記アルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）である。上記アルミニウムアジュバントの濃度は、２５μｇ／ｍｌ〜１２５μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、又は１２５μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、又は２５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は３００μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、又は４００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、又は３００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである。
【００２９】
＜抗原＞
本発明に係る抗原は、生体の免疫システムを誘導して免疫応答を生成可能であり、かつインビボ又はインビトロで免疫応答の生成物（抗体及び／又はエフェクター細胞）と結合して特異的反応を発生可能な物質であり、タンパク質、脂質、糖類、核酸、化合物などが含まれる。ここで、抗原としてのタンパク質は、修飾又は非修飾のタンパク質を含む。上記修飾は、例えば、糖基化又は甲基化であり、例えば、上記タンパク質が環化される修飾、又は上記タンパク質が脂質に結合される修飾である。感染源又は疾患と関連する抗原は、例えば、エンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、表面タンパク質、毒素、細胞壁、抗原脂質などの感染源の一部である抗原を含む。その他の適切な抗原は、宿主抗原を含んでもよい。このような宿主抗原は、感染又は疾患のマーカーに誘導、修飾、過剰発現される抗原を含む。感染源、感染、病状、もしくは疾患から誘導されたすべての抗原、又は感染源、感染、病状もしくは疾患と関連するすべての抗原は、本発明に適用される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態において、上記抗原は、ウイルスと関連する抗原である。上記ウイルスは、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルスを含むがこれらに限定されない。
【００３１】
＜Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）＞
本発明に係るＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、２２６個のアミノ酸残基からなり、低分子Ｓタンパク質と、中分子Ｍタンパク質と、高分子Ｌタンパク質との３種類の共通Ｃ末端を有するタンパク質成分を含む。Ｓ領域は、Ｓタンパク質をコードするＳ遺伝子と、ｐｒｅＳ１タンパク質をコードするｐｒｅＳ１遺伝子と、ｐｒｅＳ２タンパク質をコードするｐｒｅＳ２遺伝子との３つの領域に分けられ、これらの領域は、リーディングフレームの位相が同一であり、連続的に直列に配列される。Ｓ遺伝子領域がコードする生成物は、ウイルス及びサブウイルス粒子の組み立てにおける主成分である以外、生体を刺激して中和抗体（防御抗体とも呼ばれる）を生成する。以前は、Ｓタンパク質のみが生体を刺激して中和抗体を生成できると考えられたが、現在の研究によると、ｐｒｅＳ１ポリペプチド及びｐｒｅＳ２ポリペプチドは、いずれも免疫原性が強く、複数の優位性抗原決定基を含有し、ｐｒｅＳ抗原によるＴ細胞免疫反応は、ある個体のＳタンパク質に対する免疫不応答状態、又は同時にＳタンパク質及びｐｒｅＳ２タンパク質に対する二重不応答状態の克服に寄与することを示した。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、合計１４個のシステイン残基（Ｃｙｓ）を有し、Ｃｙｓのジスルフィド結合で複雑な立体構造を形成する。ＨＢｓＡｇは、血清学でａｄｒと、ａｄｗと、ａｙｒと、ａｙｗとの４つの主要なサブタイプに分けられる。共通抗原ａ決定基（common antigen a determinant）は、Ｓタンパク質の１２４〜１４７位のアミノ酸残基に位置し、親水性二環状構造を形成し、この構造がａ決定基の抗原性と緊密な関係を持つだけでなく、免疫原性とも重要な関係を持つ。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、完整なウイルスではなく、Ｂ型肝炎ウイルスの外部カプシドタンパク質（external capsid protein）である。このような表面抗原は、ウイルス遺伝物質を含有せず、感染性及び病原性を有しないが、免疫原性、すなわち生体を刺激して防御抗体を生成する能力を保有する。以前、Ｂ型肝炎ウイルスキャリアの血液からＢ型肝炎表面抗原を抽出し、精製、不活化などの厳しい工程により血漿由来Ｂ型肝炎ワクチンを製造したが、このようなワクチンは、安全、由来、及びコストなどの理由（例えば、血液由来疾患を引き起こす可能性、及び大量の血漿を無駄にする可能性がある）で排除された。
【００３２】
本発明の好適な実施形態において、上記抗原はＢ型肝炎表面抗原である。上記抗原の濃度は、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、又は５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、又は１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、又は１５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、又は２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜９０μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜７０μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌである。
【００３３】
＜濃度＞
本発明の医薬組成物における各成分の濃度は、生体の免疫システムを誘導して免疫応答を発生するのに十分な量である。本発明の医薬組成物における各成分の濃度は、使用する特定の免疫アジュバント、抗原の活性、投与経路、併用するその他の成分、治療又は予防する特定疾患の重症度、及び投与方法などに依存する。本発明の医薬組成物における各成分の濃度は、安全性及び治療効果を最適にさせた濃度である。典型的に、インビトロ及び／又はインビボでのオリジナル試験からの用量−効果関係は、組成物における各成分の濃度の決定に指導作用を提供できる。
【００３４】
本発明の好適な実施形態によれば、本発明が提供する医薬組成物において、上記抗原の濃度は２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度は２５０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ又は３００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は１２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである。より好ましくは、上記抗原の濃度は２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度は１２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、又は５００μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は１２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、又は５００μｇ／ｍｌである。
【００３５】
本発明の特に好適な実施形態によれば、本発明が提供する医薬組成物において、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度が２５μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が５００μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度が２５μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が２５μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度が３００μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度が４００μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、又は、上記抗原の濃度が２０μｇ／ｍｌであり、上記アルミニウムアジュバントの濃度が１２５μｇ／ｍｌであり、上記ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が５００μｇ／ｍｌである。
【００３６】
＜薬学的に許容される賦形剤＞
本発明の医薬組成物は、抗原と、配列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’を含有するＣｐＧオリゴヌクレオチドと、アルミニウムアジュバントとを含む以外、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。本発明の「薬学的に許容される賦形剤」には、溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、薬物安定剤、粘着剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、調味剤、顔料、及びそれらの組み合わせ又は類似物が含まれる。上記薬学的に許容される賦形剤は、当業者が熟知しているものである（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. Mack Printing Company,1990: 1289-1329を参照、この参考文献が本明細書に参照として組み込まれる）。
【００３７】
例えば、充填剤の実例として、ラクトース一水和物、無水ラクトース、及び各種のデンプンが挙げられる。粘着剤の実例として、各種のセルロース、架橋ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、及びケイ化微結晶セルロースが挙げられる。適切な潤滑剤の実例として、例えば、コロイダルシリカ、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、及びシリカゲルのような圧縮粉末の流動性に作用する薬剤を含む。甘味料の実例として、例えばショ糖、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラミン酸ナトリウム、及びアスパルテームのような天然又は人工の甘味料が挙げられる。防腐剤の実例として、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、ヒドロキシ安息香酸プロピル、安息香酸及びその塩、パラオキシ安息香酸ブチルのようなパラオキシ安息香酸エステル、エタノール又はベンジルアルコールのようなアルコール、フェノールのようなフェノール化合物、又は塩化ベンザルコニウムなどの四級化合物が挙げられる。適切な希釈剤の実例として、例えば、微結晶セルロース、ラクトース、リン酸水素カルシウム、及び糖類のような薬学的に許容される不活性充填剤を含む。希釈剤の実例として、微結晶セルロース、ラクトース一水和物及び無水ラクトースのようなラクトース、リン酸水素カルシウム、マンニトール、デンプン、ソルビトール、ショ糖、並びにグルコースを含む。適切な崩壊剤として、軽度架橋ポリビニルピロリドン、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン及び加工デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、並びにそれらの混合物を含む。
【００３８】
＜剤形＞
本発明の上記医薬組成物は、水溶液の形、塩水溶液の形、粒子、エアゾール、粉末、錠剤、糖衣錠剤、微カプセル、坐剤、シロップ、エマルション、懸濁剤、クリーム剤、点滴剤、又はその他の多種の薬物送達システムに適している形であってもよい。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、経口投与、非経口投与、舌下投与、径粘膜投与、経皮投与、直腸投与、腹腔内注射投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、髄腔内投与、局所投与（粉末、軟膏、ゲル、点滴剤、又は経皮パッチ剤の形での局所投与）、口腔内投与、カテーテルによる投与、インプラントによる投与などの投与方法によって投与され得る。いずれの投与方法であっても、本発明の医薬組成物は、無菌かつ製造及び貯蔵条件下で安定であって、さらに細菌又は微生物によって汚染されないものでなければならない。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、さらに、注射（例えば、急速注射又は連続注入）の方法によって非経口投与を行う剤形に調製され得る。注射投与のための剤形は、例えば、アンプル又はマルチドーズ容器のような単位用量の形で提供され得る。本発明の医薬組成物は、油性担体又は水性担体における懸濁液、溶液又はエマルションのような形を使用してもよく、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤のような調節剤を含んでもよく、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）を添加してもよい。
【００４１】
本発明の医薬組成物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液又は水性注射懸濁液に調製され得る。ここで、適切な親油性溶媒又は担体は、脂肪油（例えば、ゴマ油）、合成の脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセライド）、又はリポソームを含んでもよく、水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加可能な物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランを含んでもよい。必要に応じて、懸濁液は、高濃縮溶液を製造するために、化合物の溶解度を増加可能な適切な安定剤又は試薬を含んでもよい。注射の場合、本発明の医薬組成物は、水性溶液に調製可能であり、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液（physiologically compatible buffer）（例えば、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液）に調製される。
【００４２】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、使用前に適切な担体に溶解させる粉末の形であってもよく、上記適切な担体として、例えば、無菌無発熱原性水が挙げられる。
【００４３】
径粘膜投与の場合、その剤形には、透過しようとするバリアに適している浸透剤を使用する。これらの浸透剤は、一般的に当該技術分野で知られているものである。
【００４４】
口腔内投与の場合、本発明の医薬組成物は、常法によって調製された錠剤又はバッカル錠の形で投与され得る。
【００４５】
吸入投与の場合、本発明の医薬組成物は、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切な気体）の使用により加圧パック又は噴霧器から提供される噴霧の形で送達するのに便利なものに調製され得る。加圧噴霧を使用する場合、用量単位は、所定の送達量を提供する計量バルブにより確定され得る。吸入器（inspirator）又は吹送器（insufflator）に使用されるカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンカプセル及びカートリッジ）は、本発明の医薬組成物及び適切な粉末基体（例えば、ラクトース又はデンプン）を含む粉末混合物の剤形に調製され得る。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、適切な固体担体もしくはゲル相担体又は賦形剤をさらに含んでもよい。これらの担体又は賦形剤の実例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリグリコールのようなポリマーを含む。
【００４７】
＜ワクチン＞
本発明における「ワクチン」とは、抗原に対する免疫反応を誘導するように設計された製剤を指す。ワクチンは、免疫反応を増強したり特定方向への反応を促進したりするように治療過程に投与される治療用ワクチンであってもよく、疾患を患う前又は疾患を患った直後に投与される予防用ワクチンであってもよい。発生した疾患の治療及び将来再発可能な疾患の予防の面において、ワクチンは、治療用と予防用を両立するものであってもよい。ワクチンは、当該技術分野の常用の投与方法によって治療対象に投与され得る。本明細書で使用される用語「投与」は、患者に物質を提供するすべての適切な方法を含む。一般的な経路には、経口投与、舌下投与、径粘膜投与、経皮投与、直腸投与、膣内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、髄腔内投与、カテーテルによる投与、インプラントによる投与などが含まれる。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導するための薬剤の製造に使用され得る。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、Ｂ型肝炎ワクチン又はＣ型肝炎ワクチンの製造に使用され得る。本発明の好適な実施形態において、本発明の医薬組成物は、例えば、組換え酵母Ｂ型肝炎ワクチン、組換えＣＨＯＢ型肝炎ワクチンなどの遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチンの製造に使用され得る。上記遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチンは、ＤＮＡ組換え技術を用いてＢ型肝炎ウイルスの表面抗原遺伝子を発現ベクターに構築し、宿主酵母細胞又は哺乳動物細胞に導入して発現させ、インビトロでの培養増殖過程にＨＢｓＡｇの組み立て・分泌を行った後、本発明のアルミニウムアジュバント及びＣｐＧと結合し、分離、精製技術により製造して得られる。トランスフェクトされた宿主細胞によって、異なる遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチンが得られる。例えば、宿主細胞が酵母細胞（例えば、ビール酵母又はハンゼヌラ酵母（Hansenula polymorpha））である場合、組換え酵母Ｂ型肝炎ワクチンが得られるが、宿主細胞がＣＨＯ細胞（Chinese Hamster Ovary cells）である場合、組換えＣＨＯＢ型肝炎ワクチンが得られる。
【００４９】
＜医薬用途＞
本発明の医薬組成物は、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導するために使用され得る。その使用方法は、有効量の本発明の医薬組成物を治療対象に投与することを含んでもよいし、有効量の本発明の医薬組成物を治療対象に再投与することをさらに含んでもよい。ここで、再投与の時間間隔は２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、又は１２週間であり、同一又は異なる投与経路により同一又は異なる量で投与され得る。治療対象に本発明の医薬組成物を２回投与することにより、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導して防御抗体応答レベルを生じさせることができ、従来の３回投与で免疫反応を誘導する方法と比べて、投与回数を減少させ、治療対象体内の免疫反応を誘導するための全過程の免疫時間を短縮することができる。
【００５０】
本発明の好適な実施形態において、０時点で有効量の本発明の医薬組成物を治療対象に投与した後、４週間目の時点で０時点と同様の投与方法によって有効量の本発明の医薬組成物を治療対象に投与することにより、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導する。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体とともに治療対象に投与され得る。例えば、無菌無発熱原の食塩水に溶解された溶液の形又は無菌無発熱原の食塩水に懸濁された懸濁液の形で、に治療対象に投与され得る。上記薬学的に許容される担体とは、本発明の医薬組成物の治療対象への投与に適用される１種以上の固体又は液体充填物、希釈剤、又は封入材料（encapsulating material）を指す。上記担体は、有機物、無機物、天然生成物、又は合成物質であってもよい。上記担体は、任意及びすべての溶液、希釈液、溶媒、分散媒、リポソーム、エマルション、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤、並びに本発明の医薬組成物の治療対象への投与に適用されるその他の如何なる担体を含む。上記薬学的に許容される担体は、特定の投与方法に基づいて選ばれる。非経口剤形は、一般的に、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、グルコース水溶液、グリセロールなどの薬学的及び生理学的に許容される液体を含む注射可能な液体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤、又はカプセル）の場合、上記組成物は、例えば、潤湿剤、乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤などの微量かつ無毒のアジュバントを含んでもよい。
【００５１】
本発明に係る有効量とは、本発明の医薬組成物の、治療対象体内の抗原に対する免疫反応を誘導するのに十分な有効用量を指す。この有効用量は、当業者が当該技術分野の公知常識に基づいて確定され得る。例えば、この有効用量は、当業者が治療対象の年齢、性別、体重、投与方法、誘導しようとする免疫反応の種類などの様々な要素に基づいて確定され得る。また、上記有効用量は、動物モデルにより確定され得る。例えば、マウスなどの動物モデルで抗原に対する免疫反応を効果的に実現できる用量を確定することにより、ヒト治療対象のための有効用量を調節する。上記有効用量は、さらに、類似活性を示す既知の医薬組成物の人体データにより確定され得る。例えば、注射方法により本発明の医薬組成物を投与する場合、上記有効用量は、一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇ／人〜１５０ｍｇ／ｋｇ／人であってもよい。
【００５２】
＜治療対象＞
本発明で使用される用語「治療対象」とは、霊長類動物（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、サカナ、トリなどを含むがこれらに限定されない動物を指す。好ましくは、上記動物は哺乳動物である。好適な実施形態において、上記治療対象はヒトである。
【００５３】
＜免疫細胞＞
本発明における免疫細胞とは、免疫応答に関与するすべての細胞及び免疫応答と関連するすべての細胞、並びにそれらの前駆細胞を指し、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び様々なその他のＴ細胞サブクラス）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、単球、樹状細胞、及び好中性顆粒球を含む。
【００５４】
特異的抗原受容体を発現する特異的Ｔリンパ球及び特異的Ｂリンパ球は、獲得免疫応答の媒介に関与する。そのうち、Ｂリンパ球は、抗原特異的刺激を受けた後、活性化、増殖して形質細胞に分化し、特異的抗体を生成し、体液性免疫応答を媒介する一方、Ｔリンパ球は、抗原特異的刺激を受けた後、活性化、増殖してエフェクターＴ細胞に分化し、細胞免疫応答を媒介しかつ体液性免疫応答を補助する。また、獲得免疫応答の始動期間では、樹状細胞、単核マクロファージなどのプロフェッショナルＡＰＣが関与し、抗原を提示してＴ細胞を活性化する一方、獲得免疫応答の発効期間では、単核マクロファージ、ＮＫ細胞などが関与し、Ｔ細胞、抗体などと共同して抗原を取り除く作用を発揮する。
【００５５】
先天性免疫応答に関与する細胞には、主として、単核マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、肥満細胞、赤血球、血小板など、及び極少数のＴ、Ｂリンパ球サブセットがある。そのうち、ＮＫ細胞は、第３のリンパ球集団であり、非特異的細胞毒性活性を有し、先天性免疫応答抗ウイルス感染及び抗腫瘍の面で重要な作用を発揮する。単核マクロファージ、顆粒球などは、強い貪食能や殺傷能力を有し、大量の活性生成物を放出することにより炎症反応に関与する。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、アルミニウムアジュバントとＣｐＧ−オリゴヌクレオチドとの相乗効果により、体液性免疫応答及び細胞免疫応答を同時に誘導し、Ｔｈ１型Ｔ細胞免疫機能を増強し、Ｔ細胞免疫反応を大幅に増強することができる。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１：Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、水酸化アルミニウム、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物＞
本実施例は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、水酸化アルミニウム、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物におけるＨＢｓＡｇ、Ａｌ（ＯＨ）３、及びＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は、それぞれ下記の表１に示される。
【００５８】
【表１】
2017524682.tif 000003
【００５９】
下記の実験方法により、本実施例における表１に示す異なる濃度のＨＢｓＡｇ、Ａｌ（ＯＨ）３、及びＣｐＧ−ＯＤＮを含む医薬組成物の、ＩｇＧ、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ１の生成を誘導するときの作用を測定した。
【００６０】
１．１試薬：
（１）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ、アルミニウムアジュバントを含有せず、北京NationalVaccine and Serum Institute）。
【００６１】
（２）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１（Serotec社）。
【００６２】
（３）ＰＢＳ溶液：８００ｍｌの超純水に８ｇのＮａＣｌ（BeijingChemical Industry）、０．２ｇのＫＣｌ（Beijing Chemical Industry）、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（Beijing Chemical Industry）、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４（Beijing Chemical Industry）を十分に溶解した後、ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ７．２〜７．４に調節して調製される。
【００６３】
（４）被覆液：８０ｍｌのＰＢＳで調製される。
【００６４】
（５）洗浄液：４００ｍｌのＰＢＳ及び０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０（BeijingChemical Industry）で調製される。
【００６５】
（６）ブロッキング液（blocking solution）：８０ｍｌのＰＢＳ及び１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Beijing Dingguo Biotech CO.LTD）で調製される。
【００６６】
（７）サンプル希釈液：８００ｍｌの超純水に２．４２ｇのＴｒｉｓ（BeijingChemical Industry）及び８．７７ｇのＮａＣｌ（Beijing ChemicalIndustry）を溶解した後、ＨＣｌでｐＨ７．１に調節し、その後、１ｇのＢＳＡ、０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を加えて調製される。
【００６７】
（８）基体液：クエン酸（Beijing Chemical Industry）１９．２ｇの水溶液とＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（Beijing Chemical Industry）７１．７ｇの水溶液とを混合した後、０．２２μｍのろ過膜でろ過滅菌して調製される。
【００６８】
（９）停止液：希硫酸溶液で調製される。
【００６９】
（１０）ＣｐＧ−ＯＤＮ（5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’、配列番号１、Beijing DNAchem Biotechnology Co., Ltdによって合成される）溶液：無菌生理食塩水を溶媒として異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮを溶解し、異なる濃度のＣｐＧ−ＯＤＮ溶液を調製する。
【００７０】
（１１）Ａｌ（ＯＨ）３（Beijing ChemicalIndustry）溶液：無菌生理食塩水を溶媒として異なる量のＡｌ（ＯＨ）３を溶解し、異なる濃度のＡｌ（ＯＨ）３溶液を調製する。
【００７１】
１．２方法：
ＨＢｓＡｇ（５μｇ／ｍｌ）１００μｌを被覆液１０ｍｌに加えて希釈した後、希釈されたＨＢｓＡｇをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃下で一夜静置した。翌日、ＥＬＩＳＡプレートを取り出して、各ウェルにおける液体を吸い尽くした後洗浄液３００μｌを加えて室温で３分間放置する操作を３回繰り返した。その後、各ウェルにブロッキング液３００μｌを加え、室温で１時間放置した後、洗浄を行った。続いて、各ウェルに異なる濃度のＡｌ（ＯＨ）３溶液及びＣｐＧ−ＯＤＮ溶液（Ａｌ（ＯＨ）３及びＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は表１を参照）を加えた。その後、サンプル希釈液で希釈された（希釈比１：１０００００）ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１を加え、室温、暗条件下で１時間放置した。続いて、各ウェルに基体液１００μｌを加え、室温、暗条件下で１０〜２０分間培養した後、停止液５０μｌを添加した。停止液を添加してから５分間以内でマイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７２】
１．３結果：
図１に示すように（ここで、ブランクサンプルを対照とする）、水酸化アルミニウムの濃度がそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、及び５００μｇ／ｍｌである条件下で、ＣｐＧ−ＯＤＮは２５〜５００μｇ／ｍｌの濃度範囲において、ＩｇＧの生成を顕著に誘導することができる。水酸化アルミニウムの濃度が２５μｇ／ｍｌで、ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌである場合、及び水酸化アルミニウムの濃度が１２５μｇ／ｍｌで、ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が２５μｇ／ｍｌである場合、水酸化アルミニウムとＣｐＧ−ＯＤＮを併用して誘導生成したＩｇＧの量が最も多い。また、ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムを併用して生成したＩｇＧの量は、水酸化アルミニウムを単独使用する場合に生成したＩｇＧの量より多く、低濃度〜中濃度の（２５〜１２５μｇ／ｍｌ）ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムを併用して生成したＩｇＧの量は、高濃度（高于１２５μｇ／ｍｌ）のＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムを併用して生成したＩｇＧの量よりやや多い。
【００７３】
図２に示すように（ここで、ブランクサンプルを対照とする）、水酸化アルミニウムの濃度がそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、及び５００μｇ／ｍｌである条件下で、ＣｐＧ−ＯＤＮは２５〜５００μｇ／ｍｌの濃度範囲において、ＩｇＧ２ａ抗体の含有量を顕著に増加することができる。ＩｇＧ２ａ抗体の含有量は、水酸化アルミニウム濃度が２５μｇ／ｍｌでＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌである条件下で最も高く、水酸化アルミニウム濃度が２５μｇ／ｍｌでＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が５００μｇ／ｍｌである条件、水酸化アルミニウム濃度が１２５μｇ／ｍｌでＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が２５μｇ／ｍｌである条件、及び水酸化アルミニウム濃度が５００μｇ／ｍｌでＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が１２５μｇ／ｍｌである条件下で二番目に高い。図２の結果から、ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムとの併用は、ＩｇＧ２ａ抗体の含有量を顕著に増加できることが分かった。また、分散分析によると、ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムを併用して生成したＩｇＧ２ａの量は、水酸化アルミニウムを単独使用して生成したＩｇＧ２ａ抗体の量に対して、有意差（Ｐ<０．０５）を示すことが分かった。これは、ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムとの併用は、ＩｇＧ２ａ抗体の生成を大幅に促進できるとともに、Ｔ細胞反応を促進できることを示した。
【００７４】
図３に示すように（ここで、ブランクサンプルを対照とする）、水酸化アルミニウムの濃度がそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、及び５００μｇ／ｍｌである条件下で、ＣｐＧ−ＯＤＮは２５〜５００μｇ／ｍｌの濃度範囲において、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を顕著に向上することができる。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、水酸化アルミニウムの濃度が２５μｇ／ｍｌでＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が５００μｇ／ｍｌである条件下で最も高く、水酸化アルミニウム濃度が１２５μｇ／ｍｌ、ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が５００μｇ／ｍｌである条件下で二番目に高い。これは、ＣｐＧ−ＯＤＮはＩｇＧ２ａ抗体の生成を促進しＩｇＧ１抗体の生成を抑制でき、ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムとの併用はＴ細胞免疫反応を増強できることをさらに示した。
【００７５】
図１〜図３から、ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度が２５〜５００μｇ／ｍｌである条件下で、水酸化アルミニウムの用量の低減は、ＩｇＧ総レベルの低下を引き起こさないことが見られた。水酸化アルミニウムの濃度が２５μｇ／ｍｌである条件下で、Ｔｈ１型Ｔ細胞免疫機能（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を指標とする）が低下しないことから、主としてＣｐＧ−ＯＤＮがＴｈ１に影響を与え、Ｔｈ１型Ｔ細胞免疫機能とＣｐＧ−ＯＤＮとは濃度依存性を有することが分かった。
【００７６】
＜実施例２：Ｂ型肝炎表面抗原、水酸化アルミニウムアジュバント、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が抗体を誘導して発生した免疫応答＞
本実施例は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、水酸化アルミニウム、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物におけるＨＢｓＡｇ、Ａｌ（ＯＨ）３、及びＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は、それぞれ下記の表２に示される。
【００７７】
【表２】
2017524682.tif 000004
【００７８】
下記の実験方法により、本実施例における表２に示す異なる濃度のＨＢｓＡｇ、Ａｌ（ＯＨ）３、及びＣｐＧ−ＯＤＮを含む医薬組成物の、抗体を誘導して免疫応答を発生するときの作用を測定した。
【００７９】
２．１材料及び試薬：
実験動物：クリーンＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス、４〜６週齢（Beijing VitalRiver Laboratory Animal Technology Co., Ltd）、体重１５〜２５ｇ。
【００８０】
ＨＢｓＡｇ原液（アルミニウムアジュバントを含有せず、北京NationalVaccine and Serum Institute）：１ｍｌのＰＢＳに１ｍｇのＨＢｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解して調製される。
【００８１】
ＣｐＧ−ＯＤＮ（5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’、配列番号１、BeijingDNAchem Biotechnology Co., Ltdによって合成される）溶液：無菌生理食塩水を溶媒として異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮを溶解し、異なる濃度のＣｐＧ−ＯＤＮ溶液（ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は表２を参照）を調製する。使用前日に調製して４℃で一夜放置する。
【００８２】
Ａｌ（ＯＨ）３（Beijing Chemical Industry）溶液：無菌生理食塩水を溶媒として異なる量のＡｌ（ＯＨ）３を溶解し、異なる濃度のＡｌ（ＯＨ）３溶液（Ａｌ（ＯＨ）３の濃度は表２を参照）を調製する。
【００８３】
２．２方法：
異なる濃度のＣｐＧ−ＯＤＮ溶液と、水酸化アルミニウム溶液と、ＨＢｓＡｇ溶液とを含む混合溶液５０μｌを、氷において１０分間放置した後、希釈した。希釈されたサンプル（１μｇＢ型肝炎表面抗原を含有する）１００μｌをそれぞれ４〜５週齢雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウス（８匹／群）の左前脛筋肉に注射した。０週目及び４週目と免疫を２回行った。２週目、４週目、６週目、８週目、及び１０週目にそれぞれ尾静脈から採血を行い、１２週目にマウスを殺処分して全血を採取した。基礎血清は免疫の５日前に得た。Ｂ型肝炎表面抗体キットを用いて、免疫前並びに免疫後２週目、４週目、６週目、８週目及び１０週目のマウス血清における抗ＨＢｓ抗体レベルを測定した。
【００８４】
２．３結果：
図４に示すように、抗体測定結果から、アジュバントとしてのＣｐＧ−ＯＤＮ及び水酸化アルミニウムを含むＢ型肝炎ワクチンは、免疫後６〜８週目にいずれも高力価抗ＨＢｓの生成を誘導することができ、抗体力価が時間の経過に伴って増加し、上昇速度が１０週目まで穏やかな傾向があることが分かった。これは、アジュバントとしてのＣｐＧ−ＯＤＮ及び水酸化アルミニウムを含むワクチン群は、対照群（１０＃、Ａｌ（ＯＨ）３単一アジュバントしか含まない）のワクチンと比較して、より良い免疫原性を有し、防御抗体の生成を迅速に刺激でき、かつ抗体が時間の経過に伴って高レベルを維持できることを示した。
【００８５】
ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムとの相乗効果により、ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウムを併用することで、ワクチンにより誘導された抗ＨＢｓＡｇ抗体の応答レベルを向上でき、単一アジュバントである水酸化アルミニウムを含むＢ型肝炎ワクチンと比べて、二アジュバント（double adjuvant）ワクチンシステムの優位性が見られた。
【００８６】
生体免疫応答の誘導において、ＣｐＧ−ＯＤＮ及びＡｌ（ＯＨ）３アジュバントの濃度が血清抗体力価と関連性を有し、ＣｐＧ−ＯＤＮとＡｌ（ＯＨ）３アジュバントとは、体液性免疫を刺激する面で相乗効果を有する。
【００８７】
＜実施例３：異なる濃度の水酸化アルミニウム及びＣｐＧオリゴヌクレオチドの相乗効果＞
本実施例は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、水酸化アルミニウム、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物におけるＨＢｓＡｇ、Ａｌ（ＯＨ）３、及びＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は、それぞれ下記の表３に示される。
【００８８】
【表３】
2017524682.tif 000005
【００８９】
下記の実験方法により、本実施例における表３に示す異なる濃度のＨＢｓＡｇ、Ａｌ（ＯＨ）３、及びＣｐＧ−ＯＤＮを含む医薬組成物中の二アジュバントの相乗効果を測定する。
【００９０】
３．１材料及び試薬：
実験動物：クリーンＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス、４〜６週齢（Beijing Vital River LaboratoryAnimal Technology Co., Ltd）、体重１５〜２５ｇ。
【００９１】
ＨＢｓＡｇ原液（アルミニウムアジュバントを含有せず、北京NationalVaccine and Serum Institute）：１ｍｌのＰＢＳに１ｍｇのＨＢｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解して調製される。
【００９２】
ＣｐＧ−ＯＤＮ（5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’、配列番号１、Beijing DNAchem Biotechnology Co., Ltdによって合成される）溶液：無菌生理食塩水を溶媒として異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮを溶解し、異なる濃度のＣｐＧ−ＯＤＮ溶液（ＣｐＧ−ＯＤＮの濃度は表３を参照）を調製する。使用前日に調製して４℃で一夜放置する。
【００９３】
Ａｌ（ＯＨ）３溶液：無菌生理食塩水を溶媒として異なる量のＡｌ（ＯＨ）３を溶解し、異なる濃度のＡｌ（ＯＨ）３溶液（Ａｌ（ＯＨ）３の濃度は表３を参照）を調製する。
【００９４】
３．２方法：
異なる濃度のＣｐＧ−ＯＤＮ溶液と、異なる濃度の水酸化アルミニウム溶液と、異なる濃度のＨＢｓＡｇ溶液とを含む混合溶液５０μｌを、氷において１０分間放置した後、下記の表４における比例に応じて連続希釈した。下記の表４に示す各希釈度のＣｐＧ−ＯＤＮと、水酸化アルミニウムと、ＨＢｓＡｇとの混合溶液を４〜６週齢、体重１４ｇ〜１６ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（１０匹）に接種し、１匹あたり１．０ｍｌの混合溶液を腹腔内注射した。４〜６週間飼養した後、マウス眼球から約１ｍｌ採血し、採取されたマウス血液を室温で１時間以上放置した後、８，０００ｒｐｍ／分の速度で２分間遠心分離し、免疫血清を得た。Ｂ型肝炎表面抗体キットを用いて、製造業者の操作規程に基づいて下記のように抗ＨＢｓを測定した。
【００９５】
ブランク対照１部、陰性対照５部、陽性対照２部を設定し、各ウェルに測定すべき免疫血清５０μｌ及び陰陽対照血清５０μｌをそれぞれ加えた。ブランク対照ウェルを除いて、各ウェルに酵素複合体５０μｌを加え、均一に混合してプレートをクブロッキングした後、３７℃で３０分間培養した。プレートを洗浄した後、ウェル内の液体を取り除き、洗浄液３５０μｌを加え、プレートを５回洗浄した。最後の洗浄が終わった後、プレートを乾燥させ、各ウェルに顕色剤５０μｌを順次添加し、均一に混合してプレートをクブロッキングした後、３７℃で顕色液を１５分間培養した。その後、各ウェルに停止液５０μｌを加え、均一に混合した。マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍ（基準波長６３０ｎｍ）の吸光度値（反応終止後１０分間以内に吸光度値を読み取る）を測定し、ブランク対照ウェルでゼロ較正した。陰性対照平均吸光度値ＮＣＸを計算し、臨界値＝陰性対照平均吸光度値ＮＣＸ×２．１（陰性対照吸光度値が０．０５を下回る場合に０．０５として計算し、０．０５以上の場合に実際の吸光度で計算する）で臨界値を計算した。各ウェルの吸光度値を臨界値と比較して、吸光度値が臨界値以上のサンプルを陽性と判定した。各希釈度の陽性数及び陰性数に基づいて、抗体陽転率（seroconversion rate）を計算し、さらにＥＤ５０（５０％有効量）を計算した。
【数１】
2017524682.tif 000006
ここで、５０％陽転率終点対数＝５０％陽転率超えの希釈度（含有量）対数＋距離比×希釈系列対数であり、
【数２】
2017524682.tif 000007
【００９６】
３．３結果：
下記の表４は、本実施例に係る異なる濃度のＨＢｓＡｇ、Ａｌ（ＯＨ）３及びＣｐＧ−ＯＤＮを含む医薬組成物により体液性免疫応答を活性化した効果、及び抗ＨＢｓ陽転率を誘導した結果を示す。
【００９７】
【表４】
2017524682.tif 000008
【００９８】
上記の結果から、１０＃サンプルで免疫したマウスのＥＤ５０は０．２３５であるが、１＃サンプル〜９＃サンプルで免疫したマウスのＥＤ５０はいずれも０．２未満であり、１０＃サンプルで免疫したマウスと比べて、有意差（Ｐ＜０．０５）を示すことが見られた。これは、水酸化アルミニウムとＣｐＧ−ＯＤＮとの二アジュバントにより調製されたワクチンで免疫したマウスの抗体陽転率が明らかに上昇することを示し、ＣｐＧ−ＯＤＮアジュバントと水酸化アルミニウムとは、相乗効果を有し、両者を併用することでワクチンの保護効果を向上できることを証明した。
【００９９】
＜実施例４：異なる濃度のＡｌ（ＯＨ）３と異なる濃度のＣｐＧ−ＯＤＮとの併用により誘導した特異的細胞免疫応答＞
実施例３で提供される異なる濃度のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、水酸化アルミニウム、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を用いて、下記の実験方法で当該医薬組成物の、特異的細胞免疫応答を誘導するときの作用を測定する。
【０１００】
４．１材料及び試薬：
実験動物：クリーンＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス、４〜６週齢（Beijing VitalRiver Laboratory Animal Technology Co., Ltd）、体重１５〜２５ｇ、８匹／群。
【０１０１】
ＨＢｓＡｇ原液（アルミニウムアジュバントを含有せず、北京NationalVaccine and Serum Institute）：１ｍｌのＰＢＳに１ｍｇのＨＢｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解して調製される。
【０１０２】
ＣｐＧ−ＯＤＮ（5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’、配列番号１、Beijing DNAchem Biotechnology Co., Ltdによって合成される）溶液：無菌生理食塩水を溶媒として異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮを溶解し、異なる濃度のＣｐＧ−ＯＤＮ溶液を調製する。使用前日に調製して４℃で一夜放置する。
【０１０３】
Ａｌ（ＯＨ）３溶液：無菌生理食塩水を溶媒として異なる量のＡｌ（ＯＨ）３を溶解し、異なる濃度のＡｌ（ＯＨ）３溶液を調製する。
【０１０４】
４．２方法：
異なる濃度のＣｐＧ−ＯＤＮ溶液と、水酸化アルミニウム溶液と、ＨＢｓＡｇ溶液とを含む混合溶液５０μｌを、氷において１０分間放置した後、希釈した。希釈されたサンプル（１μｇＢ型肝炎表面抗原を含有する）１００μｌをそれぞれ４〜５週齢雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウス（８匹／群）の左前脛筋肉に注射した。０週目及び４週目と免疫を２回行った。５週目にマウスを殺処分した。脾臓を取り出して脾臓細胞を調製した。抗ＩＦＮ−γ抗体でＰＶＤＦ膜９６ウェルプレートを被覆し、マウス脾臓リンパ球を調製し計数した。ブロッキングした後、細胞を培養し、プレートを洗浄して顕色を行い、ＥＬＩＳＰＯＴプレートをＣＴＬ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Enzyme-Linked Immune Spot Assay）のプレート自動読取装置に置き、パラメーターを調節して画像を採取し、計数を行った。
【０１０５】
４．３結果：
図５に示すように、採取された画像におけるスポットの密度は、水酸化アルミニウム濃度が３００μｇ／ｍｌでＣｐＧ−ＯＤＮ濃度が１２５μｇ／ｍｌである条件下で最も高く、すなわち、抗原と抗体の結合が最も多く、その次が、水酸化アルミニウム濃度が４００μｇ／ｍｌでＣｐＧ−ＯＤＮ濃度が１２５μｇ／ｍｌである条件、次に、水酸化アルミニウム濃度が３００μｇ／ｍｌでＣｐＧ−ＯＤＮ濃度が２５０μｇ／ｍｌである条件下である。ＣｐＧ−ＯＤＮを含まない条件下では、採取された画像にスポットがほとんど存在せず、すなわち、抗原と抗体の結合がほとんどない。これは、ＩＦＮ−γの分泌を誘導する面で、水酸化アルミニウムのみを含む１０＃サンプルワクチンにより誘導して発生したＩＦＮ−γ発現レベルは、水酸化アルミニウムとＣｐＧ−ＯＤＮとの二アジュバントを含む１＃〜９＃サンプルワクチンよりも低く、水酸化アルミニウム単一アジュバントワクチンは、Ｔｈ２型免疫応答を刺激できるが、誘導して発生したＴｈ１細胞免疫反応が望ましくないことを示した。水酸化アルミニウムとＣｐＧ−ＯＤＮとの二アジュバントを含む１＃〜９＃サンプルワクチンにより誘導して生成したＩＦＮ−γのレベルは、１０＃サンプルワクチンよりも明らかに高い一方、体液性免疫応答の研究結果からも、水酸化アルミニウムとＣｐＧ−ＯＤＮとの二アジュバントを含むワクチンにより刺激して生成した抗体レベルが、水酸化アルミニウム単一アジュバント群より明らかに高いことを示した。これは、Ｂ型肝炎ワクチンとして水酸化アルミニウム及びＣｐＧ−ＯＤＮを二アジュバントを併用した相乗効果により、体液性免疫を増強できるだけでなく、ＩＦＮ−γの発現を誘導してＴｈ１細胞免疫応答を活性化することもできることを示した。このような二アジュバント製剤は、従来の水酸化アルミニウムのみを含む単一アジュバントのＢ型肝炎ワクチンよりも優位性がある。そのため、二アジュバントワクチンは、ウイルス性疾患の治療及び予防作用を同時に有し、実用化の将来性がある。
【０１０６】
［結論］
本発明で提供される（ａ）１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの抗原と、（ｂ）２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの配列5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’を含有するＣｐＧオリゴヌクレオチドと、（ｃ）２５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌのアルミニウムアジュバントとを含む医薬組成物は、Ｂ型肝炎表面抗原に対する免疫反応を誘導しかつＢ型肝炎ワクチン免疫効果を増強することができる。本発明に係る二アジュバントを含む医薬組成物は、ワクチンとして使用されてもよく、従来の水酸化アルミニウムのみを含む単一アジュバントワクチンよりも優位性がある。２つのアジュバントの相乗効果により、体液性免疫を増強できるだけでなく、Ｔｈ１細胞免疫応答を活性化することもできる。本発明の医薬組成物により製造されたワクチンは、細胞外のウイルスを中和できるだけでなく、感染細胞に潜伏しているウイルスを徹底的に除去することもできる。
【０１０７】
以上、本発明の好適な実施例について説明したが、当然、これらの実施例は例示的なものにすぎない。本発明の本質を逸脱しない範囲において、当業者が、複数の改良、修正、及び置換を行うことができる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定され、本発明の特許請求の範囲における組成物及びその使用並びにそれらの等価物も添付の特許請求の範囲に包含される。
【図１】
2017524682.tif 000009
【図２】
2017524682.tif 000010
【図３】
2017524682.tif 000011
【図４】
2017524682.tif 000012
【図５】
2017524682.tif 000013
【配列表】
2017524682000001.app
【国際調査報告】
2017524682.tif 000014
2017524682.tif 000015
2017524682.tif 000016
2017524682.tif 000017
2017524682.tif 000018
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