(57)【要約】tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッド分子ならびに作製方法および使用方法が提供される。従って、一局面では、プレマイクロRNA(プレmiRNA)またはショートヘアピンRNA(shRNA)に機能的に連結されたtRNAを含むポリヌクレオチドが提供される。様々な態様において、tRNAはメチオニルtRNAである。様々な態様において、プレmiRNA(またはshRNA)は、プレmiRNA-1291、プレmiRNA-34a、プレmiRNA-125b、プレmiRNA-124、プレmiRNA-27b、およびプレmiRNA-22より選択される。2017524341.tif 000090
2017524341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレマイクロRNA(プレmiRNA)またはショートヘアピンRNA(shRNA)に機能的に連結されたtRNAを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
tRNAがメチオニルtRNAである、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
tRNAが、SEQ ID NO:1と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項2記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
プレmiRNAが天然に得られたか、または人工的に得られた、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
プレmiRNAが、プレmiRNA-1291、プレmiRNA-34a、プレmiRNA-125b、プレmiRNA-124、プレmiRNA-27b、およびプレmiRNA-22より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
(a)プレmiRNA-1291が、miRBaseアクセッション番号MI0006353と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(b)プレmiRNA-34aが、miRBaseアクセッション番号MI0000268と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(c)プレmiRNA-125b-1が、miRBaseアクセッション番号MI0000446と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(d)プレmiRNA-124が、miRBaseアクセッション番号MI0000443と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(e)プレmiRNA-27bが、miRBaseアクセッション番号MI0000440と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、かつ/または
(f)プレmiRNA-22が、miRBaseアクセッション番号MI0000078と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含む、
請求項5記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
(a)プレmiRNA-34aが、SEQ ID NO:2と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(b)プレmiRNA-1291が、SEQ ID NO:9と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(c)プレmiRNA-125-1が、SEQ ID NO:17と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(d)プレmiRNA-124が、SEQ ID NO:26と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(e)プレmiRNA-27bが、SEQ ID NO:29と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含み、かつ/または
(f)プレmiRNA-22が、SEQ ID NO:32と少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含む、
請求項5〜6のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
プレmiRNA-1291、プレmiRNA-34a、プレmiRNA-125b、プレmiRNA-124、プレmiRNA-27b、およびプレmiRNA-22からなる群より選択されるプレmiRNAまたはその変異体もしくは変種に機能的に連結されたメチオニルtRNAを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
(a)プレmiRNA-34aに機能的に連結されたメチオニルtRNAが、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、およびSEQ ID NO:40からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を有し、
(b)プレmiRNA-1291に機能的に連結されたメチオニルtRNAが、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、および SEQ ID NO:16からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも 90％の配列同一性を有する核酸配列を有し、
(c)プレmiRNA-125に機能的に連結されたメチオニルtRNAが、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、および SEQ ID NO:25からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも 90％の配列同一性を有する核酸配列を有し、
(d)プレmiRNA-124に機能的に連結されたメチオニルtRNAが、SEQ ID NO:27 および SEQ ID NO:28からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも 90％の配列同一性を有する核酸配列を有し、
(e)プレmiRNA-27bに機能的に連結されたメチオニルtRNAが、SEQ ID NO:30 および SEQ ID NO:31からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも 90％の配列同一性を有する核酸配列を有し、かつ/または
(f)プレmiRNA-155に機能的に連結されたメチオニルtRNAが、SEQ ID NO:33およびSEQ ID NO:34からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも 90％の配列同一性を有する核酸配列を有する、
請求項8記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
tRNAのステム-ループアンチコドンの全てまたは一部がプレmiRNAと交換されている、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ショートヘアピンRNA(shRNA)に機能的に連結されたtRNAが、SEQ ID NO:41-45からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
tRNAおよび/またはプレmiRNAもしくはshRNAがさらに、1つまたは複数の挿入RNA分子に機能的に連結されている、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
挿入RNA分子が
(a)プレmiRNAの5'末端;
(b)プレmiRNAの3'末端;
(c)プレmiRNAのダイサー切断部位の5'側;または
(d)プレmiRNAのダイサー切断部位の3'側
に挿入されているか、接しているか、または機能的に連結されている、請求項12記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
挿入RNAが、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で200ヌクレオチドを有する、請求項12〜13のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
挿入RNAが、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で50ヌクレオチドを有する、請求項14記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
挿入RNAが、ノンコーディングRNA(ncRNA)、成熟マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、低分子核小体RNA(snoRNA)、ガイドRNA(gRNA)、触媒RNA、リボスイッチ、およびRNAアプタマーからなる群より選択される、請求項12〜15のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
挿入RNAがノンコーディングRNAである、請求項12〜16のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ノンコーディングRNAがHOX antisense intergenic RNA(HOTAIR)である、請求項17記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
挿入RNAが、miR-21、miR-22、miR-27b、miR-33、miR-34a、miR-122、miR-124-1、miR-125-1、miR-1291、およびlet-7aからなる群より選択される成熟miRNAである、請求項12〜17のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
挿入RNAが標的ポリペプチドの発現を阻止するか、低減するか、または阻害する、請求項12〜19のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
挿入RNAが、標的分子または標的ポリペプチドに結合するアプタマーである、請求項12〜15のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
標的ポリペプチドが、蛍光タンパク質、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、酵素、イオンチャンネル、キナーゼ、核受容体、Gタンパク質共役受容体、エピジェネティックレギュレーター、転写因子からなる群より選択される、請求項20〜21のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
蛍光タンパク質が、青紫色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質(BFP)、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、オレンジ色蛍光タンパク質(OFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、およびサファイア型タンパク質からなる群より選択される、請求項22記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
サイトカインが、IL-1α、IL-1β、TNFα、IFNα、IFNβ、IFNγ、TGFβ1、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23、およびMIFからなる群より選択される、請求項22記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
核受容体がペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ(PPAR-γまたはPPARG)である、請求項22記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
増殖因子が血管内皮増殖因子(VEGF)である、請求項22記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
キナーゼが上皮増殖因子受容体(EGFR)である、請求項22記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、およびSEQ ID NO:40からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項1〜27のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項1〜28のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
【請求項３０】
請求項1〜27のいずれか一項記載のポリヌクレオチドまたは請求項29記載の発現カセットを含む、リポソーム、ポリマー、またはナノ粒子。
【請求項３１】
請求項1〜28のいずれか一項記載のポリヌクレオチドまたは請求項29記載の発現カセットを含む、ウイルスベクター。
【請求項３２】
請求項1〜28のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、または請求項29記載の発現カセット、または請求項30記載のリポソーム、ポリマー、もしくはナノ粒子、または請求項31記載のウイルスベクターでトランスフェクトまたは形質転換された、宿主細胞。
【請求項３３】
原核細胞または真核細胞である、請求項32記載の宿主細胞。
【請求項３４】
細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞より選択される、請求項32〜33のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞の集団において、請求項1〜28のいずれか一項記載のtRNA/プレマイクロRNAもしくはtRNA/shRNAポリヌクレオチド、請求項29記載の発現カセット、または請求項31記載のウイルスベクターを発現させる工程を含む、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子を生成する方法。
【請求項３６】
少なくとも1mgのtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子が、宿主細胞の集団を含む1リットル培養物から生成される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
宿主細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞より選択される、請求項35〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも1mgのtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子が約24時間の期間にわたって大腸菌(E.coli)宿主細胞の1リットル培養物から生成される、請求項35〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも1mgのtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子が酵母宿主細胞の1リットル培養物から生成される、請求項35〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
生成されたtRNA/プレマイクロRNA分子が全RNAの少なくとも約5％を構成する、請求項35〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
宿主細胞の集団において、請求項1〜28のいずれか一項記載のtRNA/プレマイクロRNAもしくはtRNA/shRNAポリヌクレオチド、請求項29記載の発現カセット、または請求項31記載のウイルスベクターからRNA分子を発現させる工程を含む、RNA分子を生成する方法。
【請求項４２】
少なくとも1mgのRNA分子が、宿主細胞の集団を含む1リットル培養物から生成される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
宿主細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞より選択される、請求項41〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも1mgのRNA分子が大腸菌宿主細胞の1リットル培養物から約24時間の期間にわたって生成される、請求項41〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも1mgのRNA分子が酵母宿主細胞の1リットル培養物から生成される、請求項41〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
請求項12〜28のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、請求項29記載の発現カセット、請求項30記載のリポソームもしくはナノ粒子、または請求項31記載のウイルスベクターをその必要がある対象に投与する工程を含む、該対象において標的ポリヌクレオチドの発現を阻止するか、低減するか、または阻害する方法。
【請求項４７】
請求項12〜28のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、請求項29記載の発現カセット、請求項30記載のリポソームもしくはナノ粒子、または請求項31記載のウイルスベクターをその必要がある対象に投与する工程を含む、該対象において癌の成長、増殖、および/または進行を阻止する、軽減する、低減する、および/または阻害する方法。
【請求項４８】
癌が、乳癌、リンパ腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、および肺癌からなる群より選択される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
請求項12〜28のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、請求項29記載の発現カセット、請求項30記載のリポソームもしくはナノ粒子、または請求項31記載のウイルスベクターから発現した挿入RNAを結合させることができる条件下で、標的分子を含有すると疑われる試料を接触させる工程であって、該挿入RNAと該試料中の標的分子との結合が該標的分子の存在を特定する工程を含む、試料中の標的分子の存在を特定する方法。
【請求項５０】
請求項1〜28のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、請求項29記載の発現カセット、請求項30記載のリポソームもしくはナノ粒子、または請求項31記載のウイルスベクターを備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.119条(e)の下で2014年5月28日に出願された米国特許仮出願第62/003,806号の恩典を主張する。米国特許仮出願第62/003,806号は全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNA分子ならびに作製方法および使用方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
マイクロRNA(miRNAまたはmiR)および長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)などのゲノムにコードされる機能的なノンコーディングRNA(ncRNA)のいくつかのスーパーファミリーが様々な細胞プロセスの制御において発見されたことで、細胞内の「遺伝子」についての知識が広がった。これはまた新規の治療方針の開発への洞察も与える。例えば、腫瘍進行を管理するために、癌組織では枯渇している腫瘍抑制性ncRNA(例えば、miR-34a)が癌細胞に再導入される可能性がある(He, et al. (2007)Nature, 447, 1130-1134（非特許文献1）; Welch, et al., (2007)Oncogene, 26, 5017-5022（非特許文献2）;およびLiu, et al. (2011)Nature Medicine, 17, 211-215（非特許文献3）)。実際に、リポソームで処方されたmiR-34a、すなわち「MRX34」は、切除不能な原発性肝癌または他の癌から肝臓に転移した癌を処置するために第I相臨床試験に進んでいる(Kelnar, et al., (2014)Anal Chem. 86(3):1534-42（非特許文献4）;およびLing, et al. (2013)Nature Reviews. Drug Discovery, 12, 847-865（非特許文献5）)。しかしながら、多量の安価な、天然の、かつ生物学的に機能するncRNA作用物質を生成する効率的な方法が無いために、ncRNAの構造および機能に関する基礎研究ならびにncRNAベースの療法に関するトランスレーショナルリサーチが妨げられている。現在、模倣物、前駆体、およびアンタゴmirなどのmiRNA作用物質は主に化学合成を介して生成される(Kelnar, et al., (2014)Anal Chem. 86(3):1534-42（非特許文献4）; Ling, et al., (2013)Nature Reviews. Drug Discovery, 12, 847-865（非特許文献5）; Takahashi, et al., (2013)Nucleic Acids Research, 41, 10659-10667（非特許文献6）;およびGebert, et al.(2014)Nucleic Acids Research, 42, 609-621（非特許文献7）)。オリゴヌクレオチドの有機合成が自動化される可能性があるが、計画された試験量または治療量の22nt低分子RNA作用物質は驚くほど高価である。模倣物が、半減期が長いなど、いくつかの好ましい薬物動態学的特性を示していても、化学修飾によってRNA構造、生物学的活性、および安全性プロファイルがどの程度まで変わるのかということもはっきりと分からない。さらに、天然RNAの生分解、機能、および安全性にとって重大な可能性がある、いくつかの天然修飾を化学合成を介して成し遂げることは極めて難しい(Cantara, et al.(2011)Nucleic Acids Research, 39, D195-201（非特許文献8）; Limbach, et al., (1994)Nucleic Acids Research, 22, 2183-2196（非特許文献9）; Liu, et al., (2013)PloS One, 8, e81922（非特許文献10）;およびDominissini, et al.(2012)Nature, 485, 201-206（非特許文献11）)。インビトロ転写(Beckert, et al., (2011)Methods in Molecular Biology, 703, 29-41（非特許文献12）)は長さが異なるRNA作用物質を生成する別の手法である。しかしながら、インビトロ転写では一般的に試験管内でマイクログラムスケールでRNA分子が生じ、多量のRNAを生成するには、安価であるが多くのRNAポリメラーゼが必要となる。tRNAおよびrRNAが細胞内で安定したRNA分子として存在するという事実を考えて、最近、tRNA(Ponchon, et al., (2007)Nature Methods, 4, 571-576（非特許文献13）; Ponchon, et al., (2009)Nature Protocols, 4, 947-959（非特許文献14）; Nelissen, et al., (2012)Nucleic Acids Research, 40, e102（非特許文献15）)およびrRNA(Liu, et al., (2010)BMC Biotechnology, 10, 85（非特許文献16）)がRNA生成のためのスキャフォールドとして首尾よく用いられた。従って、組換えRNAキメラが単離され、構造分析および生物物理学的分析のために、需要のある標的RNAが放出される可能性がある。この組換えRNA技術は、多量の組換えRNA(例えば、1L細菌培養物から何ミリグラムものRNA種)を費用対効果が高く、かつ急速に生成するための新規の手法となる。そうではあるが、組換えRNAが天然修飾(例えば、塩基のメチル化およびプソイドウリジル化(pseudouridylation))を含むかどうか、また、ヒト細胞内で生物学的に機能するかどうかは示されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】He, et al. (2007)Nature, 447, 1130-1134
【非特許文献２】Welch, et al., (2007)Oncogene, 26, 5017-5022
【非特許文献３】Liu, et al. (2011)Nature Medicine, 17, 211-215
【非特許文献４】Kelnar, et al., (2014)Anal Chem. 86(3):1534-42
【非特許文献５】Ling, et al. (2013)Nature Reviews. Drug Discovery, 12, 847-865
【非特許文献６】Takahashi, et al., (2013)Nucleic Acids Research, 41, 10659-10667
【非特許文献７】Gebert, et al.(2014)Nucleic Acids Research, 42, 609-621
【非特許文献８】Cantara, et al.(2011)Nucleic Acids Research, 39, D195-201
【非特許文献９】Limbach, et al., (1994)Nucleic Acids Research, 22, 2183-2196
【非特許文献１０】Liu, et al., (2013)PloS One, 8, e81922
【非特許文献１１】Dominissini, et al.(2012)Nature, 485, 201-206
【非特許文献１２】Beckert, et al., (2011)Methods in Molecular Biology, 703, 29-41
【非特許文献１３】Ponchon, et al., (2007)Nature Methods, 4, 571-576
【非特許文献１４】Ponchon, et al., (2009)Nature Protocols, 4, 947-959
【非特許文献１５】Nelissen, et al., (2012)Nucleic Acids Research, 40, e102
【非特許文献１６】Liu, et al., (2010)BMC Biotechnology, 10, 85
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明者らは、tRNAスキャフォールドを用いて、一般的な大腸菌(E.coli)株においてプレmiRNAキメラを生成した。tRNA/プレmiRNAキメラの大部分は細菌内に蓄積しなかったか、またはごくわずかなレベルでしか蓄積しなかったが、tRNA/プレmiRNA-34a、tRNA/プレmiRNA-1291、およびtRNA/プレmiRNA-125-1などのいくつかのキメラは高レベルで発現した。従って、本発明者らは、関心対象の様々なタイプの機能的低分子RNA、例えば、miRNA、siRNA、RNAアプタマー、ガイドRNA、触媒RNA、およびリボスイッチを運ぶ多用途性を提供するキメラRNAを大腸菌内で一貫して高収率で生成するために、高発現ノンコーディングncRNAスキャフォールド(以下「OnRS」)に基づく戦略を開発した。ここでOnRSは、高発現のtRNAが融合したプレmiRNAでもよく、修飾された/人工的なショートヘアピンRNA(shRNA)でもよい。本明細書において証明されるように、このアプローチは頑健なことが判明し、例えば、研究ツールとして利用され、治療剤および診断ツールとしてさらに開発され得る標的キメラRNAi作用物質およびRNAセンサーを作製する幅広い用途がある。
【０００６】
従って、一局面において、プレマイクロRNA(プレmiRNA)またはショートヘアピンRNA(shRNA)に機能的に連結されたtRNAを含むポリヌクレオチドが提供される。様々な態様において、tRNAはメチオニルtRNAである。様々な態様において、tRNAは、SEQ ID NO:1と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する核酸配列を有する。様々な態様において、プレmiRNAまたはshRNAは天然に得られたか、人工的/合成的に得られた。様々な態様において、プレmiRNA(またはshRNA)は、プレmiRNA-1291、プレmiRNA-34a、プレmiRNA-125b、プレmiRNA-124、プレmiRNA-27b、およびプレmiRNA-22より選択される。
【０００７】
様々な態様において、
(a)プレmiRNA(もしくはshRNA)-1291は、miRBaseアクセッション番号MI0006353と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(b)プレmiRNA(もしくはshRNA)-34aは、miRBaseアクセッション番号MI0000268と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(c)プレmiRNA(もしくはshRNA)-125b-1は、miRBaseアクセッション番号MI0000446と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(d)プレmiRNA(もしくはshRNA)-124は、miRBaseアクセッション番号MI0000443と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(e)プレmiRNA(もしくはshRNA)-27bは、miRBaseアクセッション番号MI0000440と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、かつ/または
(f)プレmiRNA(もしくはshRNA)-22は、miRBaseアクセッション番号MI0000078と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０００８】
様々な態様において、
(a)プレmiRNA(もしくはshRNA)-34aは、SEQ ID NO:2と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(b)プレmiRNA(もしくはshRNA)-1291は、SEQ ID NO:9と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(c)プレmiRNA(もしくはshRNA)-125-1は、SEQ ID NO:17と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(d)プレmiRNA(もしくはshRNA)-124は、SEQ ID NO:26と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
(e)プレmiRNA(もしくはshRNA)-27bは、SEQ ID NO:29と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含み、かつ/または
(f)プレmiRNA(もしくはshRNA)-22は、SEQ ID NO:32と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０００９】
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、プレmiRNA-1291、プレmiRNA-34a、プレmiRNA-125b、プレmiRNA-124、プレmiRNA-27b、およびプレmiRNA-22からなる群より選択されるプレmiRNA(もしくはshRNA)またはその変異体もしくは変種に機能的に連結されたメチオニルtRNAを含む。
【００１０】
様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは以下を含む：
(a)プレmiRNA(もしくはshRNA)-34aに機能的に連結されたメチオニルtRNAは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、およびSEQ ID NO:40からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を有する、
(b)プレmiRNA(もしくはshRNA)-1291に機能的に連結されたメチオニルtRNAは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:16からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を有する、
(c)プレmiRNA(もしくはshRNA)-125に機能的に連結されたメチオニルtRNAは、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、およびSEQ ID NO:25からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を有する、
(d)プレmiRNA(もしくはshRNA)-124に機能的に連結されたメチオニルtRNAは、SEQ ID NO:27およびSEQ ID NO:28からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を有する、
(e)プレmiRNA(もしくはshRNA)-27bに機能的に連結されたメチオニルtRNAは、SEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を有する、ならびに/または
(f)プレmiRNA(もしくはshRNA)-155に機能的に連結されたメチオニルtRNAは、SEQ ID NO:33およびSEQ ID NO:34からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の配列同一性を有する核酸配列を有する。
【００１１】
様々な態様において、tRNAはステム-ループアンチコドンを含むか、またはステム-ループアンチコドンを含んだ。tRNAのステム-ループアンチコドンの全てまたは一部はプレmiRNA(またはshRNA)と交換される。様々な態様において、ショートヘアピンRNA(shRNA)に機能的に連結されたtRNAは、SEQ ID NO:41-45からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する核酸配列を含む。様々な態様において、tRNAおよび/またはプレmiRNA(またはshRNA)はさらに、1つまたは複数の挿入RNA分子に機能的に連結されている。様々な態様において、挿入RNA分子は、(a)プレmiRNA(もしくはshRNA)の5'末端;(b)プレmiRNA(もしくはshRNA)の3'末端;(c)プレmiRNA(もしくはshRNA)のダイサー切断部位の5'側;または(d)プレmiRNA(もしくはshRNA)のダイサー切断部位の3'側に挿入されているか、接しているか、または機能的に連結されている。様々な態様において、挿入RNAは、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約200ヌクレオチドを、例えば、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約50ヌクレオチドを有する。様々な態様において、挿入RNAは、ノンコーディングRNA(ncRNA)、成熟マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA)(piRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、低分子核小体RNA(snoRNA)、ガイドRNA(gRNA)、触媒RNA、リボスイッチ、およびRNAアプタマーからなる群より選択される。様々な態様において、挿入RNAはノンコーディングRNAである。一部の態様において、ノンコーディングRNAは、HOX antisense intergenic RNA(HOTAIR)である。一部の態様において、挿入RNAは、miR-21、miR-22、miR-27b、miR-33、miR-34a、miR122、miR124-1、miR-125-1、miR-1291、およびlet-7aからなる群より選択される成熟miRNAである。一部の態様において、挿入RNAは標的ポリペプチドの発現を阻止するか、低減するか、または阻害する。一部の態様において、挿入RNAは、標的分子または標的ポリペプチドに結合するアプタマーである。一部の態様において、標的ポリペプチドは、蛍光タンパク質、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、酵素、イオンチャンネル、キナーゼ、核受容体、Gタンパク質共役受容体、エピジェネティックレギュレーター、転写因子からなる群より選択される。一部の態様において、蛍光タンパク質は、青紫色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質(BFP)、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、オレンジ色蛍光タンパク質(OFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、およびサファイア型タンパク質からなる群より選択される。一部の態様において、サイトカインは、インターロイキン(IL)-1α、IL-1β、腫瘍壊死因子(TNF)α、インターフェロン(IFN)α、IFNβ、IFNγ、TGFβ1、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23、および遊走阻止因子(MIF)からなる群より選択される。一部の態様において、核受容体はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ(PPAR-γまたはPPARG)である。一部の態様において、増殖因子は血管内皮増殖因子(VEGF)である。一部の態様において、キナーゼは上皮増殖因子受容体(EGFR)である。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、およびSEQ ID NO:40からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する核酸配列を有する。
【００１２】
さらなる局面において、前記および本明細書において説明されたプレマイクロRNA(プレmiRNA)またはショートヘアピンRNA(shRNA)に機能的に連結されたtRNAを含むポリヌクレオチドを含む、発現カセットが提供される。
【００１３】
別の局面において、前記および本明細書において説明されたプレマイクロRNA(プレmiRNA)またはショートヘアピンRNA(shRNA)に機能的に連結されたtRNAを含むポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む、リポソーム、ポリマー、またはナノ粒子が提供される。
【００１４】
別の局面において、前記および本明細書において説明されたプレマイクロRNA(プレmiRNA)またはショートヘアピンRNA(shRNA)に機能的に連結されたtRNAを含むポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む、ウイルスベクターが提供される。
【００１５】
別の局面において、前記および本明細書において説明されたtRNA/プレマイクロRNAもしくはtRNA/shRNAハイブリッド分子をコードするポリヌクレオチド、またはtRNA/プレマイクロRNAもしくはtRNA/shRNAハイブリッド分子を含む発現カセット、リポソーム、ポリマー、ナノ粒子、ウイルスベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞が提供される。様々な態様において、宿主細胞は原核細胞または真核細胞である。様々な態様において、宿主細胞は、細菌細胞(例えば、大腸菌)、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)、昆虫細胞、または植物細胞より選択される。
【００１６】
さらなる局面において、宿主細胞の集団において、前記および本明細書において説明されたポリヌクレオチド、発現カセット、リポソーム、ポリマー、ナノ粒子、またはウイルスベクターからtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子を発現させる工程を含む、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子を生成する方法が提供される。様々な態様において、少なくとも1mg、例えば、少なくとも約2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、またはそれより多いtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子が、宿主細胞の集団を含む1リットル培養物から生成される。一部の態様において、宿主細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞より選択される。様々な態様において、少なくとも約1mg、例えば、少なくとも約2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、またはそれより多いtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子が大腸菌宿主細胞の1リットル培養物から約24時間の期間にわたって生成される。様々な態様において、少なくとも約1mg、例えば、少なくとも約2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、またはそれより多いtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子が、酵母宿主細胞の1リットル培養物から、例えば、約24時間の期間にわたって生成される。様々な態様において、生成されたtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子は、全RNAの少なくとも約5％、例えば、少なくとも約6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、15％、20％、またはそれより多くを構成する。
【００１７】
さらなる局面において、前記および本明細書において説明されたtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAのハイブリッドポリヌクレオチド、発現カセット、リポソーム、ポリマー、ナノ粒子、またはウイルスベクターからRNA分子を発現させる工程を含む、RNA分子を生成する方法が提供される。様々な態様において、少なくとも1mg、例えば、少なくとも約2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、またはそれより多くのRNA分子が、宿主細胞の集団を含む1リットル培養物から生成される。一部の態様において、宿主細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞より選択される。様々な態様において、少なくとも約1mg、例えば、少なくとも約2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、またはそれより多くのRNA分子が、大腸菌宿主細胞の1リットル培養物から、例えば、約24時間の期間にわたって生成される。様々な態様において、少なくとも約1mg、例えば、少なくとも約2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、またはそれより多くのRNA分子が、酵母宿主細胞の1リットル培養物から、例えば、約24時間の期間にわたって生成される。様々な態様において、生成されたRNA分子は、全RNAの少なくとも約5％、例えば、少なくとも約6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、15％、20％、またはそれより多くを構成する。
【００１８】
別の局面において、前記および本明細書において説明されたポリヌクレオチド、発現カセット、リポソーム、ポリマー、ナノ粒子、またはウイルスベクターをその必要がある対象に投与する工程を含む、該対象において標的ポリヌクレオチドの発現を阻止するか、低減するか、または阻害する方法が提供される。様々な態様において、少なくとも約1mg、例えば、少なくとも約2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、またはそれより多いtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子が大腸菌宿主細胞の1リットル培養物から約24時間の期間にわたって生成される。様々な態様において、少なくとも約1mg、例えば、少なくとも約2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、またはそれより多いtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子が、酵母宿主細胞の1リットル培養物から、例えば、約24時間の期間にわたって生成される。様々な態様において、生成されたtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子は、全RNAの少なくとも約5％、例えば、少なくとも約6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、15％、20％、またはそれより多くを構成する。
【００１９】
別の局面において、前記および本明細書において説明されたポリヌクレオチド、発現カセット、リポソーム、ポリマー、ナノ粒子、またはウイルスベクターをその必要がある対象に投与する工程を含む、該対象において癌の成長、増殖、および/または進行を阻止する、軽減する、低減する、および/または阻害する方法が提供される。様々な態様において、癌は、乳癌、リンパ腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、および肺癌からなる群より選択される。
【００２０】
別の局面において、前記および本明細書において説明されたポリヌクレオチド、発現カセット、リポソーム、ポリマー、ナノ粒子、またはウイルスベクターから発現した挿入RNAを結合させることができる条件下で、標的分子を含有すると疑われる試料を接触させる工程であって、該挿入RNAと該試料中の標的分子との結合が該標的分子の存在を特定する工程を含む、試料中の標的分子の存在を特定する方法が提供される。
【００２１】
別の局面において、前記および本明細書において説明されたポリヌクレオチド、発現カセット、リポソーム、ポリマー、ナノ粒子、またはウイルスベクターを備えるキットが提供される。
【００２２】
定義
特に定義のない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、一般的に、本発明が属する当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。一般的には、本明細書において用いられる命名法、ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションにおける実験手順は周知であり、当技術分野において一般に用いられる。核酸合成およびペプチド合成のために標準的な技法が用いられる。一般的に、酵素反応および精製工程は製造業者の仕様に従って行われる。技法および手順は、一般的に、当技術分野における従来の方法、および本文書の全体にわたって示される様々な一般的な参考文献(一般的には、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)およびAusubel, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Interscience,(1990-2014)を参照されたい)に従って行われる。本明細書において用いられる命名法ならびに下記の分析化学および有機合成における実験手順は周知であり、当技術分野において一般に用いられる。標準的な技法またはその改良が化学合成および化学分析に用いられる
【００２３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組み合わせで構成されるポリマーを指す。
【００２４】
本明細書で使用する「ヌクレオチド」という用語は、糖(修飾された糖、修飾されていない糖、またはその類似体)と、ヌクレオチド塩基(修飾されたヌクレオチド塩基、修飾されていないヌクレオチド塩基、またはその類似体)と、リン酸基(修飾されたリン酸基、修飾されていないリン酸基、またはその類似体)を有する化学部分を指す。ヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチドと、リボヌクレオチドと、例えば、ロックド核酸(「LNA」)、ペプチド核酸(「PNA」)、L-ヌクレオチド、エチレン架橋核酸(「ENA」)、アラビノシド、およびヌクレオチド類似体(脱塩基ヌクレオチドを含む)を含む修飾ヌクレオチド類似体が含まれる。同様に、「核酸」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはその任意の断片を指し、天然分子または合成分子を指す。これらの句はまた、一本鎖もしくは二本鎖でもよく、センス鎖もしくはアンチセンス鎖でもよい、ゲノムもしくは合成由来のDNAもしくはRNA、または任意のDNA様材料もしくはRNA様材料も指す。RNAが本明細書に記載の方法において用いられてもよく、ならびに/または逆転写によってcDNAに変換されてもよく、および/もしくは本明細書に記載の方法において使用するためのRNAに変換されてもよい。
【００２５】
本明細書において同義に用いられる「マイクロRNA」、「miR」、または「miRNA」は、miRNA遺伝子に由来するプロセシングされていないRNA転写物またはプロセシングされたRNA転写物を指す。プロセシングされていないmiRNA遺伝子転写物は「miRNA前駆体」とも呼ばれ、典型的には、長さが約70〜100ヌクレオチドのRNA転写物を含む。RNアーゼ(例えば、ダイサー、アルゴノート、またはRNアーゼIII)を用いた消化によって、miRNA前駆体を、活性のある19〜25ヌクレオチドRNA分子にプロセシングすることができる。この活性のある19〜25ヌクレオチドRNA分子は、「プロセシングされた」miRNA遺伝子転写物または「成熟」miRNAとも呼ばれる。
【００２６】
「プレマイクロRNA」または「プレmiR」またはプレmiRNA」という用語は、同義に、ポリヌクレオチド配列内に、少なくとも1つの成熟したマイクロRNA配列と、ダイサーで切断可能な少なくとも1つの部位を含むRNAヘアピンを指す。
【００２７】
「プレmiRNA-1291」または「hsa-mir-1291」または「HGNC:MIR1291」という用語は、同義に、miRBaseアクセッション番号MI0006353(www.mirbase.org)またはSEQ ID NO:9と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有するRNAポリヌクレオチドを指す。
【００２８】
「プレmiRNA-34a」または「hsa-mir-34a」または「HGNC:MIR34A」という用語は、同義に、miRBaseアクセッション番号MI0000268(www.mirbase.org)またはSEQ ID NO:2と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有するRNAポリヌクレオチドを指す。
【００２９】
「プレmiRNA-125-1」または「hsa-mir-125b-1」または「HGNC:MIR125B1」という用語は、同義に、miRBaseアクセッション番号MI0000446(www.mirbase.org)またはSEQ ID NO:17と少なくとも90％の配列同一性、例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有するRNAポリヌクレオチドを指す。
【００３０】
「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況において、配列比較アルゴリズム(例えば、BLAST、ALIGN、FASTA、もしくは他の任意の公知のアラインメントアルゴリズム)を用いて、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって測定された時に、同じであるか、または特定のパーセントの同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する(すなわち、比較ウィンドウもしくは指定された領域にわたって最大限一致するように比較およびアラインメントされた時に、参照配列、例えば、本明細書に記載のtRNA、プレマイクロRNAおよびtRNA/マイクロRNAハイブリッドポリヌクレオチド分子、例えば、SEQ ID NO:1-45と、指定された領域にわたって少なくとも約80％の同一性、例えば、少なくとも約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の同一性を有する)、2つ以上の配列または部分配列を指す。次いで、このような配列は「実質的に同一」と言われる。この定義はまた試験配列を編集したもの(compliment)も指す。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約10、15、20、25、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120ヌクレオチドの領域にわって、または参照配列の完全長にわって存在する。
【００３１】
本明細書で使用する「低分子干渉核酸」または「siRNA」という用語は、哺乳動物細胞(好ましくは、ヒト細胞)内での遺伝子発現をダウンレギュレート(すなわち阻害)することができる任意の核酸分子を指す。siRNAには、配列特異的なRNAiを媒介することができる核酸分子、例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、およびショートヘアピンRNA(shRNA)が含まれるが、それに限定されるわけではない。同様に、「センス領域」という用語は、siRNA分子のアンチセンス領域に(部分的または完全に)相補的な、siRNA分子のヌクレオチド配列を指す。任意で、siRNA分子のセンス鎖は、siRNA分子のアンチセンス領域に相補的でない、さらなるヌクレオチドも含んでもよい。逆に、本明細書で使用する「アンチセンス領域」という用語は、標的核酸配列に(部分的または完全に)相補的な、siRNA分子のヌクレオチド配列を指す。任意で、siRNA分子のアンチセンス鎖は、siRNA分子のセンス領域に相補的でない、さらなるヌクレオチドを含んでもよい。
【００３２】
「piRNA」および「Piwi相互作用RNA」という用語は同義であり、遺伝子サイレンシングに関与する低分子RNAの一種を指す。piRNA分子は典型的には長さが26〜31ヌクレオチドである。
【００３３】
「snRNA」および「低分子核内RNA」という用語は同義であり、RNAスプライシングおよび転写因子の調節を含む様々なプロセスに関与する低分子RNAの一種を指す。低分子核小体RNA(snoRNA)のサブクラスも含まれる。この用語は、ncRNAに対して作られたアンチセンス配列を含むsnRNAのアンチセンス誘導体などの人工snRNAも含むことが意図される。
【００３４】
「機能的に連結された」とは、このように述べられた成分が通常の機能を果たすように構成されている要素の配置を指す。従って、コード配列に機能的に連結された、ある特定のプロモーターは、適切な酵素が存在する時にコード配列を発現させることができる。発現とは、DNAまたはRNAテンプレートからのマイクロRNA、siRNA、piRNA、snRNA、lncRNA、アンチセンス核酸、またはmRNAの転写のいずれか1つまたは複数の転写を含むことが意図され、mRNAテンプレートからのタンパク質の翻訳をさらに含む場合がある。プロモーターは、コード配列の発現を誘導するように機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。従って、例えば、転写されるが翻訳されない介在性の配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在する場合があり、それでもなおプロモーター配列はコード配列に「機能的に連結されている」とみなすことができる。
【００３５】
「相同領域」という用語は、別の核酸領域と相同性を有する核酸領域を指す。従って、「相同領域」が核酸分子に存在するかどうかは、同じ分子または異なる分子内の別の核酸領域を参照して判定される。さらに、核酸は二本鎖であることが多いので、本明細書で使用する「相同領域」という用語は、核酸分子が互いにハイブリダイズする能力を指す。例えば、一本鎖核酸分子に、互いにハイブリダイズすることができる2つの相同領域がある場合がある。従って、「相同領域」という用語は、相補配列をもつ核酸セグメントを含む。相同領域は長さが異なってもよいが、典型的には、4〜40ヌクレオチド(例えば、約4〜約40、約5〜約40、約5〜約35、約5〜約30、約5〜約20、約6〜約30、約6〜約25、約6〜約15、約7〜約18、約8〜約20、約8〜約15など)である。
【００３６】
「相補的な」および「相補性」という用語は同義であり、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成することができる能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行のポリヌクレオチド鎖または領域内のヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的なポリヌクレオチド鎖または領域は、ワトソン-クリック様式(例えば、AとT、AとU、CとG)で塩基対を形成することができる。100％相補性とは、あるポリヌクレオチド鎖または領域の各ヌクレオチド単位が、もう1つのポリヌクレオチド鎖または領域の各ヌクレオチド単位と水素結合を形成することができる状況を指す。完全とは言えない相補性とは、2つの鎖または2つの領域の全てのヌクレオチド単位が互いに水素結合することができないが、一部のヌクレオチド単位が互いに水素結合することができる状況を指し、パーセントで表すことができる。
【００３７】
「標的部位」または「標的配列」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは阻害性RNA分子によって認識される(すなわち、ハイブリダイゼーションのために十分な相補性をもつ)核酸配列である。
【００３８】
本明細書で使用する「対象」という用語はヒトなどの哺乳動物を指すが、家畜(domestic animal)(例えば、イヌ、ネコなど)、家畜(farm animal)(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど)、または実験動物(例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど)などの別の動物でもよい。「患者」という用語は、疾患に罹患している対象か、または疾患に罹患していると疑われる対象を指す。
【００３９】
本明細書で使用する、組成物の「有効量」または「薬学的有効量」または「治療的有効量」という用語は、望ましい治療効果および/または予防効果を実現するのに十分な量、例えば、治療を行っている疾患に関連した症状の阻止または軽減をもたらす量である。対象に投与される本発明の組成物の量は、疾患のタイプおよび重篤度ならびに個体の特徴、例えば、身体全体の健康、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐性に左右される。これは疾患の程度、重篤度、およびタイプにも左右される。当業者は、これらの要因および他の要因に応じて適切な投与量を決定することができるだろう。本発明の組成物はまた、1種類または複数種のさらなる治療用化合物と組み合わせて投与することもできる。
【００４０】
「癌関連抗原」または「腫瘍関連抗原」または「腫瘍特異的マーカー」または「腫瘍マーカー」という用語は同義で、正常細胞と比較して癌細胞の表面に優先的に発現しており、薬理学的薬剤を癌細胞に優先的に標的化するのに有用な分子(典型的にはタンパク質、炭水化物、または脂質)を指す。多くの場合、癌関連抗原は、正常細胞と比較して癌細胞において過剰発現している、例えば、正常細胞と比較して1倍過剰発現している、2倍過剰発現している、3倍過剰発現している、またはそれより多く過剰発現している細胞表面分子である。多くの場合、癌関連抗原は、癌細胞において不適切に合成された細胞表面分子、例えば、正常細胞において発現した分子と比較して欠失、付加、または変異を含有する分子である。多くの場合、癌関連抗原は癌細胞の細胞表面でしか発現せず、正常細胞の表面には合成も発現していない。例示された細胞表面腫瘍マーカーには、乳癌の場合はタンパク質c-erbB-2およびヒト上皮増殖因子受容体(HER)、前立腺癌の場合はPSMA、乳癌、卵巣癌、および結腸直腸癌を含む非常に多くの癌では炭水化物ムチンが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図1A〜Dは、大腸菌内で組換えRNAを高レベルで発現させるためのOnRSの確立を図示する。(A)および(B)tRNAスキャフォールドだけを使用した場合、プレmiRNAの大部分は発現しなかったか、限られたレベルで発現したが、mir-34a、mir-1291、およびmir-125などは非常に高いレベルで発現した。(C)および(D)従って、miRNAもしくはsiRNA(または他の低分子RNA;以下の図を参照されたい)を一貫して高レベルで生成するのを可能にする新たなスキャフォールドとして、tRNA/mir-34a、tRNA/mir-1291、およびtRNA/mir-125などを開発した。
【図２】図2A〜Dは、tRNA/プレmiRNAまたはtRNA/shRNAノンコーディングRNA(ncRNA)スキャフォールド(OnRS)を用いた組換えRNAの設計を図示する。OnRS、例えば、miRNAもしくはsiRNAを運んでいるtRNA/プレmiRNAハイブリッド(A)、またはsiRNAもしくはmiRNAを積んでいるtRNA/shRNA OnRS(B)、プレmiRNAもしくはshRNAの5'側に低分子RNA(例えば、アプタマー)もしくは他のRNA種を運んでいるOnRS(C)、およびプレmiRNAもしくはshRNAの3'側に低分子RNA(例えば、アプタマー)もしくは他の標的RNA種を運んでいるOnRS(D)の二次構造を示した。陰を付けた部分は、OnRS担体に挿入した低分子RNAを強調している。
【図３】図3A〜Dは、OnRSを用いて組換えmiRNAが一貫して高レベルで発現されることを図示する。これは精製中のFPLCトレースでも示された。ほぼ同じ量の全RNAをカラムにロードした。(A)tRNA/プレmir-34aスキャフォールド(A)のレベルはtRNAスキャフォールドの約5〜10倍である。(B)tRNA/プレmir-34aスキャフォールドを用いたmiR-27bの発現レベル対tRNAのみを用いたmiR-27bの発現レベル。(C)tRNA/プレmir-34aスキャフォールドを用いたmiR-124の発現対tRNAのみを用いたmiR-124の発現。(D)OnRS(OnRS/Neg)を用いたスクランブルRNAの発現。
【図４】図4A〜Cは、癌細胞増殖および標的遺伝子発現の抑制ならびに異種移植腫瘍進行の制御における組換えmir-34aの有効性を図示する。(A)tRNA/mir-34aはヒト癌腫A549細胞の増殖を用量依存的に、かつ対照tRNA/MSAよりかなり大きな程度(P<0.001、二元配置ANOVA)で阻害した。トランスフェクトして72時間後にMTTアッセイを用いて細胞生存率を確かめた。値は、3回再現した培養の平均±SDである。(B)対照tRNA/MSAと比較して、組換えtRNA/mir-34aは、A549細胞において、CDK6、MET、およびSIRT1を含む多くのmiR-34a標的遺伝子のタンパク質レベルを急減させた。タンパク質選択的抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。GAPDHをローディング対照として使用した。(C)同じ用量のtRNA/MSAまたはビヒクル対照と比較して、tRNA/mir-34a(100μg)はマウスモデルにおいてA549異種移植腫瘍の成長を有意に(P<0.001、独立t検定)抑制した。FPLC精製ncRNAを1日おきに3回、腫瘍内投与した。値は平均±SDである(ビヒクル処置のN=4を除いてN=6/群)。
【図５】図5A〜Dは、ヒト細胞における組換えncRNAの運命を図示する。(aおよびb)アンバイアスド(unbiased)ディープシークエンシング研究から、OnRSによって運ばれるmiR-124およびGFP-siRNAは標的低分子RNAに正確にプロセシングされて、A549細胞ではmiR-124、ES-2/GFP細胞ではGFP siRNAが3桁増加したことが明らかになった。miRNAおよびsiRNAアイソフォーム、ならびに非常に少ないレベルの対応するパッセンジャー鎖および他の低分子RNAが存在することに留意されたい。対照的に、他の細胞miRNAのレベルは変化を示さなかったか、わずかな変化しか示さなかった。値は、別々に配列決定した、3回再現した処理の平均±SDである。(cおよびd)A549細胞におけるOnRS/miR-124に由来する主要な細胞tRF対OnRS(tRNA/mir-34a)に由来する主要な細胞tRFのマッピングと、ES-2/GFP細胞におけるOnRS/GFP-siRNAに由来する主要な細胞tRF対OnRS/Negに由来する主要な細胞tRFのマッピング。3回再現した処理のリード（read）数の平均を示した。3,000リードをカットオフとして使用した。
【図６】図6A〜Eは、OnRSによって運ばれるmiRNAが、ヒト細胞における標的遺伝子の発現調節および細胞プロセス制御において生物学的/薬理学的な活性を有することを図示する。(a)RT-qPCR分析から、A549細胞における成熟miR-124レベルは、OnRS/miR-124でトランスフェクトしてから4日間、OnRS/Negと比較して3桁高く保たれたことが明らかになった。(b)ウエスタンブロットから、トランスフェクションの72時間後のA549細胞において、OnRS/miR-124がmiR-124標的遺伝子STAT3のタンパク質発現レベルを低減させるのに有効であることが分かった。(c)フローサイトメトリー分析によって、トランスフェクションの48時間後のA549細胞において、OnRS/miR-124がアポトーシスを誘導するのに有効であることが証明された。OnRS/Negで処理した細胞を対照として使用した。(d)MTTアッセイから、処理して72時間後に、OnRS/Negと比較してOnRS/miR-124はA549細胞の増殖を有意に抑制したことが分かった。(e)OnRS/miR-124によるA549細胞増殖の阻害は、Icelligence Real-Time Cellアナライザーを用いて細胞増殖をモニタリングした時でも証明された。矢印はncRNAで処理した時点を示す。値は、3回再現した処理の平均±SDである。*P<0.01。
【図７】図7A〜Fは、OnRSによって運ばれるsiRNAがインビトロおよびインビボでRNAiに効果があることを図示する。ES-2/GFP細胞においてインビトロでは、OnRS/GFP-siRNAでトランスフェクトした72時間後にGFP蛍光強度は急減した(a)。これは、(b)70〜80％少ないGFP mRNAレベルと、(c)1000倍多いGFP siRNAレベルと関連した。OnRS/GFP-siRNAをi.v.投与した後、GFP-トランスジェニックマウスモデルにおいてインビボでは、(d)固定していない肝臓スライスおよび(e)固定した肝臓スライスの鏡検ならびに(f)肝臓GFP mRNAレベルのRT-qPCR分析によって証明された時に、肝臓GFP蛍光は有意に抑制された。固定した肝臓スライスをDAPI染色し、GFP蛍光と、DAPI染色した核(青色)の画像を一緒に合成した(e)。対照RS-2/GFP細胞(N=3匹/群)またはGFP-トランスジェニックマウス(N=3〜4匹/群)を同じ用量のOnRS/Negで処置した。値は平均±SDである。*OnRS/Neg処置と比較してP<0.01。
【図８】マラカイトグリーンアプタマー(MGA)センサーを用いた、本明細書において説明されたRNアーゼアッセイ法の基本原理を図示する。
【図９】図9A〜Eは、MGに結合すると強力かつ選択的な蛍光を発するキメラMGAセンサーの高収率でラージスケールの生成を図示する。(a)MGAは、OnRS/MGA5を供給するためにOnRSスキャフォールドの5'末端に挿入されてもよく、OnRS/MGA3を供給するためにOnRSスキャフォールドの3'末端に挿入されてもよい。ヒートカラー(heat color)グラデーションは0〜1で塩基対合の確率を示している。(b)大腸菌内でのキメラMGA、例えば、全RNAの中で50％超のOnRS/MGA5およびOnRS/MGA3の一貫した高レベルの発現。(c)FPLC精製中のOnRS/MGA5の代表的なFPLCトレース。挿入図は、10.6分に溶出した、収集したRNA画分(1、2、および3)の尿素-PAGE分析である。(d)OnRS/MGA5およびOnRS/MGA3に結合するとMG最大吸光度の波長が618nmから630nmにシフトした。FPLCで精製したOnRS/MGAと、OnRS/MGA発現細菌から単離した全RNAを使用した時に、同じシフトが観察された。SEPHADEX(商標)で精製したアプタマー(OnRS/Seph)および対応する全RNAを、さらなる対照として使用した。(e)MGがOnRS/MGA5またはOnRS/MGA3に結合した時に、強力かつ選択的な蛍光が示された。FPLCで精製したOnRS/MGAと、OnRS/MGAを含有する全RNAを用いた時に同じ結果が得られた。
【図１０】図10A〜Eは、キメラMGAセンサーを用いてRNアーゼ活性を確かめる方法を図示する。(a)MG濃度およびMGA濃度の増加に伴う、MGAに結合したMGの蛍光強度の変化。対応するMGA濃度およびMG濃度をそれぞれ1.6μg/mLおよび10μMに固定した。(b)ヒト血清とインキュベートした時に蛍光強度はだんだんと減少し、in vivo-jetPEIで処方したOnRS/MGAは血清RNアーゼによる分解から守られた。(c)ヒト血清RNアーゼへの曝露およびOnRS/MGAに結合したMGの蛍光の強度について用量反応は明らかであった。RNアーゼ阻害剤を添加すると、血清RNアーゼによるOnRS/MGAの切断は完全にブロックされた。(d)OnRS/MGAのヒトRNアーゼA(10分間のインキュベーション)に対する感受性は、アンジオゲニン(RNアーゼ5; 30分間のインキュベーション)に対する感受性よりかなり高かった。(e)MGAに結合したMGの蛍光強度(ΔA.U./min/μL)の減少により確かめられた時に、ヒト膵臓癌患者は良性/正常患者より有意に高い血清RNアーゼ活性を示した。各群でN=10。本研究ではOnRS/MGA5を使用した。
【図１１】図11A〜Dは、組換えキメラmiR-1291の設計、発現、および精製を図示する。(A)tRNA/MSA、プレmiR-1291、およびキメラtRNA/mir-1291-123ntの二次構造をCentroidFoldで予測した。(B)標的プレmiR-1291インサートを、エンドヌクレアーゼSalIおよびAatIIで直線化したpBSMrnaベクターにクローニングした。(C)尿素-PAGE分離後に、新たなRNAバンド(矢印で示した)が予想されたサイズ/移動度で出現したことで、大腸菌内での組換えtRNA/mir-1291の発現が成功したことが証明された。(D)sephadexアプタマーを積んでいる組換えncRNAをアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。細胞溶解産物フロースルーおよび個々の画分を尿素-PAGEで分析した。フロースルーおよび洗浄液1〜3は、主に、結合しなかったRNAを含んだ。溶出液1および溶出液2は純度が>85％の組換えncRNAを含有した。
【図１２】図12A〜Cは、組換えncRNAの構造特徴付けを図示する。(A)インタクトなncRNAのMWをESI-MS分析によって確かめた。MWの測定値と予測値との差から転写後修飾ヌクレオシドが存在することが示唆される。(B)組換えncRNAの加水分解産物をLC-UV-MS分析することによって転写後修飾ヌクレオシドを特定した。tRNA/MSAおよびtRNA/mir-1291の加水分解産物のLC-UVトレースを示し、個々のピークを保持時間および質量スペクトルに従ってアノテートした。D、ジヒドロウリジン; Ψ、プソイドウリジン; C、シチジン; acp3U、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン; U、ウリジン; m5U、5 メチルウリジン; G、グアノシン; m7G、7-メチルグアノシン; S4U、4-チオウリジン; Gm、2'-O-メチルグアノシン; m1G、1-メチルグアノシン; A、アデノシン。(C)RNアーゼT1消化のLC-MS/MS分析によって、tRNA/MSAおよびtRNA/mir-1291のマッピングおよび配列決定を成し遂げた。MS/MS断片化に基づいて修飾ヌクレオシドの場所も突き止めた。
【図１３】図13A〜Dは、tRNAによって運ばれるプレmiR-1291はヒトMCF-7乳癌細胞において成熟miR-1291にプロセシングされたことを図示する。(A〜B)MCF-7細胞において精製tRNA/mir-1291でトランスフェクトした後に、プレmiR-1291および成熟miR-1291のレベルは用量依存的に増加した。(C〜D)MCF-7細胞において、20nMの組換えtRNA/mir-1291でトランスフェクトして6時間後、24時間後、48時間後、および72時間後に、プレmiR-1291および成熟miR-1291の時間経過をモニタリングした。無処理の細胞または同じ用量のtRNA/MSAもしくはビヒクルで処理した細胞を対照として使用した。RNAレベルを選択的qPCRアッセイによって確かめた。値は、3回再現した処理の平均±SDである。*同じ時点で回収した、同じ用量のtRNA/MSAもしくはビヒクルで処理した細胞または無処理の細胞と比較してP<0.05。
【図１４】図14A〜Cは、組換えtRNA/mir-1291はヒト癌細胞においてmiR-1291標的遺伝子の発現を調節する効果があることを図示する。ヒト癌細胞において、20nMのtRNA/mir-1291でトランスフェクトして48時間後に、MRP1(A)、FOXA2(B)、およびMeCP2(C)のタンパク質レベルは有意に低減した。選択的抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。GAPDHをローディング対照として使用した。値は、3回再現した処理の平均±SDである。対照tRNA/MSA処理と比較して*P<0.05、**P<0.01。
【図１５】図15A〜Cは、キメラmiR-1291はヒト癌細胞の増殖を抑制する効果があることを図示する。PANC-1(A)およびMCF-7(B)細胞は、tRNA/MSAより有意に(P<0.01、二元配置ANOVA)大きな程度で組換えtRNA/mir-1291に対して用量依存的な感受性があった。これは推定EC50値およびHillスロープ値でも示された(C)。MTTアッセイを用いて細胞生存率を確かめた。値は、3回再現した処理の平均±SD(N=3)である。*同じ細胞株における対照tRNA/MSAと有意な(P<0.05)差がある。
【図１６】図16A〜Bは、tRNAによって運ばれるプレmiR-1291がPANC-1細胞の化学療法感受性を増強することを図示する。(A)tRNA/mir-1291は、tRNA/MSAまたはビヒクル処理と比較してドキソルビシンに対するPANC-1細胞の感受性を有意に(P<0.01、二元配置ANOVA)増加させた。(B)ビヒクルでトランスフェクトしたPANC-1細胞、tRNA/MSAでトランスフェクトしたPANC-1細胞、およびtRNA/mir-1291でトランスフェクトしたPANC-1細胞におけるドキソルビシン細胞傷害性についての推定EC50値およびHillスロープ値。MTTアッセイを用いて細胞生存率を確かめた。値は、3回再現した処理の平均±SD(N=3)である。*tRNA/MSAおよびビヒクル処置と有意な(P<0.05)差がある。
【図１７】図17A〜Eは、組換えtRNA/mir-34a作用物質の生成および構造特徴付けを図示する。(A)CentroidFoldで予測されたキメラtRNA/mir-34a(233nt)の二次構造から、mir-34aのステム-ループ構造がキメラncRNAの中で保持されたことが分かった。ヒートカラーグラデーションは0〜1で塩基対合の確率を示している。(B)様々な大腸菌株内でのtRNA/mir-34aの発現。試験した組換えncRNAのうち最高レベルの組換えncRNAがHST08において見出された。(C)精製中のtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAのFPLCトレース。全RNAを陰イオン交換FPLCを用いて分離し、260nmでモニタリングした。(D)HPLC分析によって、精製したtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAが高度(>98％)に均一なことが確認された。(E)RNアーゼT1で消化した後の、精製したtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAのLC-MS/MSマッピング/配列決定。ヌクレオシド分析で特定した、デオキシアデノシンを除く全ての転写後修飾(図18)をRNアーゼT1消化産物にマッピングし、特定の部位に割り当てることができた。
【図１８】図18A〜Eは、組換えtRNA/mir-34aの発現およびアフィニティ精製を図示する。(A)tRNA/mir-34a-129nt(全体で233nt)およびtRNA/mir-34a-112nt(全体で216nt)キメラはHST08大腸菌内で同じ程度に高いレベルで発現した。さらに調べるためにtRNA/mir-34a-129ntを選択した。tRNA/mir-34a-129ntを簡単にtRNA/mir-34aと名付けた。(B)形質転換後にHST08細胞内に蓄積したtRNA/mir-34aレベルの時間経過から、形質転換して9〜14時間後に高いncRNAレベルに達したことが分かった。キメラtRNA/mir-34aレベルをqPCRアッセイによって確かめ、細菌16Sに対して基準化し、次いで、対応する培養物から単離した全RNAの量を掛けた。値は、3回再現した培養の平均±SDである。(C)手製および市販のHST08コンピテント細胞を用いたtRNA/mir-34aの発現/蓄積レベルは同等であった。(D)0.5L細菌培養の異なるバッチにおける一貫した高レベルの組換えncRNAの発現。(E)Sephadex G-100ビーズを用いたアフィニティ精製中のRNA画分の尿素-PAGE分析。純粋な組換えncRNAが容易に得られたが、Sephadexアプタマーへの明らかな、十分でない結合のために、全精製収率は非常に低かった(例えば、約2％の組換えncRNA/全RNA)。
【図１９】図19A〜Cは、陰イオン交換FPLCで精製した組換えtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAの構造特徴付けを図示する。(A)エレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)分析を行った後に、多重プロトン化(multiply protonated)イオンのデコンボリューションを行ってインタクトなncRNAの分子量(MW)を確かめた。tRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAのMWの測定値と予測値との差からから転写後修飾ヌクレオシドが存在することが示唆される。(B)組換えncRNAの加水分解産物のLC-UV-MS分析による転写後修飾ヌクレオシドの特定。tRNA/MSAおよびtRNA/mir-34aの加水分解産物のLC-UVトレースを示した。個々のピークを保持時間および質量スペクトルに基づいて天然ヌクレオシドに割り当てた。D、ジヒドロウリジン; Ψ、プソイドウリジン; C、シチジン; acp3U、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン; U、ウリジン; m5U、5-メチルウリジン; G、グアノシン; m7G、7 メチルグアノシン; S4U、4-チオウリジン; Gm、2'-O-メチルグアノシン; m1G、1-メチルグアノシン; A、アデノシン; dA、デオキシアデノシン。(C)tRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAのRNアーゼT1マッピング。RNアーゼT1で消化したtRNA/MSAおよびtRNA/mir-34aの全イオンLC-MSクロマトグラムと、MS/MS断片イオンに基づく、33.0分に溶出した断片例[m7G][acp3U]CACAG(m/z1157.76, [M-2H+]2-)の特定を示した。
【図２０】図20A〜Cは、アンバイアスドディープシークエンシング研究によって明らかにされた時に、tRNAによって運ばれるプレmiR-34aはヒト癌細胞内で成熟miR-34aに選択的にプロセシングされたのに対して、tRNAスキャフォールドはtRFに分解されたことを図示する。5nMのtRNA/mir-34aで処理したA549細胞内の成熟miR-34aレベルは対照tRNA/MSA(A)またはビヒクル(B)で処理した細胞と比較して70倍超多かった。これは、15nt miR-34a-p3断片(5'-CACGUUGUGGGGCCC-3')のリード数が60〜65倍増加したことと関連した。対照的に、いくつかの明らかにされていない低分子RNA(例えば、hsa-mir-7641-1-p5_1ss6TC)を除いて、他のmiRNAの変化は小さいか、またはわずかであった。値は、別々に配列決定した3回再現した処理の平均±SDである。(C)A549細胞におけるtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAに由来する主要なtRFのマッピング。
【図２１】図21A〜Dは、キメラtRNA/mir-34aの細胞安定性およびRNアーゼ感受性を図示する。(A)選択的なステム-ループRT-qPCR分析によって確かめられた時に、キメラtRNA/mir-34aは様々なタイプのヒト癌細胞において成熟miR-34aにプロセシングされた。値は、3回再現した処理の平均±SDである。(B)A549細胞において、1nM、5nM、または25nMのFPLC精製tRNA/mir-34aまたはtRNA/MSAでトランスフェクトして24時間後に、キメラncRNA(tRNA/mir-34aまたはtRNA/MSA)、プレmiRNA mir-34a、および成熟miRNA miR-34aのレベルは用量依存的に増加した(P<0.001、一元配置ANOVA)。mir-34aおよびmiR-34aのレベルは、tRNA/mir-34aで処理した細胞でしか上昇しなかったことに留意されたい。(C)キメラncRNA(tRNA/mir-34aまたはtRNA/MSA; 5nM)はA549細胞において優れた安定性を示した。成熟miR-34aレベルの変化はtRNA/mir-34a処理に依存したことに留意されたい。(D)キメラtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAは、RNアーゼA、アンジオゲニン、およびダイサーを含む多くのヒトRNアーゼに対する感受性があった。RNアーゼ消化を8％尿素PAGEで分析した。
【図２２】図22A〜Bは、組換えmir-34aが、癌細胞増殖および標的遺伝子発現の抑制において生物学的/薬理学的に活性であることを図示する。(A)tRNA/mir-34aは、ヒトA549癌細胞およびHepG2癌細胞の増殖を用量依存的に、かつ対照tRNA/MSAよりかなり大きな程度(P<0.001、二元配置ANOVA)で阻害した。H460細胞およびHuh-7細胞に対する抗増殖活性を図23に示した。推定ED50値およびHillスロープ値を表2に示した。トランスフェクトして72時間後にMTTアッセイを用いて細胞生存率を確かめた。値は、3回再現した培養の平均±SDである。(B)対照tRNA/MSAと比較して、組換えtRNA/mir-34aは、A549細胞およびHepG2細胞において、CDK6、MET、およびSIRT1を含む多くのmiR-34a標的遺伝子のタンパク質レベルを急減させた。タンパク質選択的抗体を用いてウエスタンブロットを行った。GAPDHをローディング対照として使用した。
【図２３】図23A〜Bは、組換えtRNA/mir-34aは肺H460(A)および肝臓Huh-7(B)ヒト癌細胞の増殖を用量依存的に、かつ対照tRNA/MSAより大きな程度(P<0.001、二元配置ANOVA)で阻害したことを図示する。同じ用量のtRNA/MSAでトランスフェクトした細胞を対照として使用した。トランスフェクトして72時間後にMTTアッセイを用いて細胞生存率を確かめた。値は、3回再現した処理の平均±SDである。
【図２４】図24A〜Bは、組換えmir-34aが、ヒト癌細胞の増殖および標的遺伝子の発現を低減するのに合成miR-34a模倣物と同等またはそれ以上に有効であったことを図示する。(A)A549癌細胞およびHepG2癌細胞の増殖に対する5nM生物学的tRNA/mir-34aならびに合成miR-34a前駆体および模倣物の効果。トランスフェクトして72時間後にMTTアッセイを用いて細胞生存率を確かめた。値は、3回再現した処理の平均±SDである。*対応する対照と比較してP<0.05。(B)トランスフェクトして72時間後にウエスタンブロットによって確かめられた時の、A549癌細胞およびHepG2癌細胞におけるmiR-34a標的遺伝子CDK6、MET、およびSIRT1のタンパク質レベルに対する25nM組換えmir-34aおよび合成miR-34a模倣物の効果。
【図２５】図25A〜Bは、組換えmir-34aはマウスモデルにおいて異種移植腫瘍の進行を制御する効果があったことを図示する。(A)同じ用量のtRNA/MSAまたはビヒクル対照と比較して、tRNA/mir-34a(100μg)はA549異種移植腫瘍の成長を有意に(P<0.001、独立t検定)抑制した。100μgのtRNA/mir-34aで処置した後に、3匹のマウスにおいて腫瘍は完全に消失したことに留意されたい。(B)100μg用量のtRNA/mir-34a処置によってHepG2異種移植腫瘍の成長も、同じ用量のtRNA/MSAまたはビヒクルと比較して有意に(P<0.01、独立t検定)抑制された。FPLCで精製したncRNAを1日おきに3回、腫瘍内投与した。値は、平均±SD(A549異種移植片についてはN=6/群; HepG2異種移植片についてはN=4/群)である。さらなる対照として、別のマウス群(N=4)をビヒクルで処置した。
【図２６】図26A〜Cは、マウスモデルにおいて生物学的ncRNAの忍容性が高かったことを図示する。(A)in vivo-jetPEIが装填されたncRNAは血清RNアーゼによる分解から守られた。(B)ビヒクル対照処置と比較して、in vivo-jetPEIで処方した組換えncRNA(100μg, i.v.)はマウス血清IL-6レベルを有意に変えなかったが、LPSは有意に変えた(二元配置ANOVAとボンフェローニ事後検定(Bonferroni post-test))。(C)組換えncRNA(100μg、i.v.)は、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、血中尿素窒素(BUN)、アルカリホスファターゼ(ALP)、クレアチニン、総ビリルビン、アルブミン、および総タンパク質を含む血液化学プロファイルに有意な影響を及ぼさなかった。灰色の陰を付けた部分は、UC Davisの比較病理学研究室(Comparative Pathology Laboratory)が報告したガイドライン範囲を示している。値は平均±SDである(1つの時点で1回の処置につきN=3〜4匹のマウス)。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
1.序論
一つには、tRNAスキャフォールドを用いた時だけプレmiRNAおよびtRNA/shRNAの大部分が発現しなかった、または限られたレベルで発現したという予想外の観察に基づいて、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAスキャフォールドが提供される。本発明のtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAスキャフォールドは、標的低分子RNA(例えば、miRNA、siRNA、RNAアプタマー、触媒RNA、リボスイッチ、ガイドRNA、および他のRNA種)を積んでいる組換えRNAを高レベルで生成するのに用いられる。
【００４３】
標的RNAからなる組換えncRNAをラージスケールで一貫して高レベルで発現させるための、ノンコーディングRNA(ncRNA)スキャフォールド(OnRS)に基づくtRNA/プレmiRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッド分子が本明細書において提供される。精製および構造特徴付けの後に、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAスキャフォールドキメラはダイサーに直接結合し、標的RNA(例えば、siRNAおよびmiRNA)にプロセシングされることが確かめられた。最も重要なことに、OnRSによって運ばれるRNA(すなわち、挿入RNA)は、同じ濃度の化学修飾されたRNA(例えば、miRNA模倣物またはプレマイクロRNA)よりもさらに大きな程度で、標的遺伝子発現の調節および細胞プロセス制御における生物学的な活性を有する。tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAスキャフォールドを用いると、生物学的に活性な標的miRNA、siRNA、およびRNAアプタマー(ならびにスクランブル低分子RNA)を一貫して高レベルで発現させることが可能になる。その結果として、OnRSによって運ばれる組換えRNAは、治療用、診断用、または予後用の作用物質として用いられ、研究材料として用いられる。
【００４４】
挿入RNA分子または標的RNA分子、例えば、siRNA、アプタマー、または診断用RNA作用物質は、OnRSの適切な部位、例えば、ダイサーで切断可能な部位、5'隣接領域および3'隣接領域に取り付けられてもよい。
【００４５】
さらに、標的RNA作用物質を高レベルかつラージスケールで生成するための一連のtRNA/プレマイクロRNAスキャフォールドの設計、確立、および適用が提供される。これはまた、これらの組換えncRNAの精製および送達にも関連する。
【００４６】
さらに、RNA治療剤を送達するための前駆体または担体である本発明のtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAスキャフォールドから発現されたncRNAの設計、生成、および精製が提供される。従って、組換えOnRS/RNAそのものが「プレRNAドラッグ」および/または研究用作用物質として使用することができる。
【００４７】
さらに、siRNA、miRNA、および/またはmiRNAアンタゴmirを生成および送達するための、本発明のtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAスキャフォールドの設計、調製、および適用が提供される。
【００４８】
さらに、薬物標的に対するRNA分子、例えば、RNAアプタマーを生成および送達するための、本発明のtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAスキャフォールドの設計、調製、および適用が提供される。
【００４９】
さらに、新たな治療剤を特定するために新薬の開発につながるようなRNA標的を生成するための、ならびに新たな診断用/予後用の作用物質またはキットを開発するために診断用/予後用RNA分子を生成するための、本発明のtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAスキャフォールドの設計、生成、および適用が提供される。
【００５０】
さらに、この組換えRNAと低分子および/またはタンパク質薬剤の同時投与などの組み合わせ治療剤のための、OnRSベースのncRNAおよび/またはOnRSによって生じるRNAの設計、生成、および送達が提供される。
【００５１】
さらに、画像化のための、または新たな画像化薬剤および/もしくは画像化方法を開発するためのRNA作用物質を生成するためのOnRSの設計、調製、および適用が提供される。
【００５２】
さらに、特定の低分子化合物(例えば、薬物、ホルモンなど)または生物学的分子(例えば、タンパク質)を定量するためのRNAセンサーを生成するためのOnRSの設計、調製、および適用が提供される。
【００５３】
さらに、特定の遺伝子を選択的または非選択的にノックアウトもしくはノックダウンするための、または特定のタンパク質もしくは他の生物学的分子をブロックするためのRNA種を生成するためのOnRSの設計、調製、および適用が提供される。
【００５４】
さらに、診断バイオマーカーまたは予後バイオマーカーならびにアッセイキットとしてのRNA材料の設計および生成が提供される。
【００５５】
さらに、有機化合物および/または他の生物学的分子を生成するための触媒としてRNA種を生成するためのOnRSの設計、調製、および適用が提供される。
【００５６】
さらに、遺伝子発現および細胞プロセスを制御するための、および治療剤または研究用作用物質として使用するためのリボスイッチとしてRNA種を生成するためのOnRSの設計、調製、および適用が提供される。
【００５７】
さらに、ゲノム編集および疾患処置のためのガイドRNAとしてRNA種を生成するためのOnRSの設計、調製、および適用が提供される。
【００５８】
さらに、研究材料、試薬、触媒、診断処置、予後処置、および/または治療処置としての、結果として生じた化学修飾を含む新たなRNA分子および/または製剤の作製が提供される。
【００５９】
さらに、癌または他の疾患を処置または制御するための、治療用マイクロRNA、例えば、mir-34a、mir-1291、mir-125-1およびmir-124-1の設計、調製、精製、および送達が提供される。
【００６０】
さらに、新たな処置、診断、および/または予後を開発するためのマイクロRNA、例えば、mir-125-1およびmir-33の設計、調製、精製、および送達が提供される。
【００６１】
2.tRNA/プレマイクロRNAスキャフォールド
一般的に、前記ポリヌクレオチドは、プレマイクロRNAに機能的に連結されたtRNAを含む。様々な態様において、tRNAのアンチコドンはプレマイクロRNA分子と交換される。例えば、一部の態様において、プレマイクロRNAの3'末端および5'末端は、アンチコドンが取り除かれた時に作り出されたtRNAの3'末端および5'末端と連結または融合される。tRNA分子およびプレマイクロRNA分子は、機能的に連結されるように互いに直接連結または融合されてもよいが、そうする必要はない。様々な態様において、プレマイクロRNAは、ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAポリヌクレオチドから発現させることが望ましい挿入RNA分子を高レベルで発現させ、効率的に切断するためにダイサーで切断可能な1つまたは複数の部位を含有してもよい。
【００６２】
ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNA分子は標準的な組換え方法によって生成されてもよく、合成により調製されてもよい。様々な態様において、前記ポリヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド間結合、ヌクレオシド内結合、ジデオキシリボヌクレオチド、2'-糖修飾、2'-アミノ基、2'-フルオロ基、2'-メトキシ基、2'-アルコキシ基、2'-アルキル基、2'-デオキシリボヌクレオチド、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、ビオチン基、末端グリセリルの組み込み、逆デオキシ脱塩基残基(inverted deoxy abasic residue)の組み込み、立体障害のある分子、3'-デオキシアデノシン(コルジセピン)、3'-アジド-3'-デオキシチミジン(AZT)、2',3'-ジデオキシイノシン(ddI)、2',3'-ジデオキシ-3'-チアシチジン(3TC)、2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン(d4T)、3'-アジド-3'-デオキシチミジン(AZT)の一リン酸ヌクレオチド修飾(MNM)、MNM-2',3'-ジデオキシ-3'-チアシチジン(3TC)、MNM-2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン(d4T)、キャッピング部分、L-ヌクレオチドロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、2'-メトキシエトキシ(MOE)ヌクレオチド、2'-メチル-チオ-エチル、2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-クロロヌクレオチド、2'-アジドヌクレオチド、2'-O-メチル、コレステロール基、2'-O-メチル基、ホスホロチオエート基、2'-フルオロ基、2'-O-メトキシエチル基、ボラノリン酸基、4'-チオリボース基、胆汁酸、脂質、および2'-酸素と4'-炭素をつなぐ架橋を含むが、それに限定されるわけではない1つまたは複数の化学修飾を有してもよい。
【００６３】
様々な態様において、ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNA分子はリボヌクレオチド塩基の類似体を含む。本明細書で使用する「類似体」という用語は、これが生成された細胞のtRNA転写後修飾酵素の活性から生じた、可能性のあるリボヌクレオチド誘導体を定義する。tRNA内で見出され得るリボヌクレオチドA、C、G、およびUの類似体は、tRNAが生成される細胞と、tRNA内の問題のヌクレオチドの位置とに基づいている。多数の類似体が、Sprinzl et al. (1998)「Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes」. Nucleic Acids Res., 26, 148-153において、かつ「RNA modification database」データ(http://medstat.med.utah.edu/RNAmods/)に基づいて示されている。Aの類似体は、さらに詳細には、1-メチル-A、イノシン、および2'-O-メチル-Aによって構成されるグループから選択されてもよい。Cの類似体は、さらに詳細には、5-メチル-Cおよび2'-O-メチル-Cによって構成されるグループから選択されてもよい。Gの類似体は、さらに詳細には、7-メチル-Gおよび2'-O-メチル-Gによって構成されるグループから選択されてもよい。Uの類似体は、さらに詳細には、プソイドウリジン、リボチミジン、2'-O-メチル-リボチミジン、ジヒドロウリジン、4-チオウリジン、および3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-ウリジンによって構成されるグループから選択されてもよい。
【００６４】
a. tRNA
tRNAの一般的な特徴は当業者に周知である。一部の態様において、tRNAは、折り畳まれて、特徴的な、いわゆるクローバー型の二次構造をとることができる1本のリボヌクレオチド鎖から形成される。この特徴的な二次構造は、
(i)リボヌクレオチド鎖の5'末端の最初の7リボヌクレオチドと、リボヌクレオチド鎖の3'末端の最後の4リボヌクレオチドの前にある7リボヌクレオチドで構成され、従って、6対または7対のリボヌクレオチドを含む二本鎖構造を形成するアクセプターステム（リボヌクレオチド鎖の5'末端の最初のリボヌクレオチドと、リボヌクレオチド鎖の3'末端の最後の4リボヌクレオチドの前にあるリボヌクレオチドによって構成されるリボヌクレオチドは対形成しない可能性がある）、
(ii)リボヌクレオチド鎖の5'末端の最初の7リボヌクレオチドの後にあるリボヌクレオチド鎖の一部が折り畳まれることで形成される、4対のリボヌクレオチドによって構成されるDアームと、8〜10リボヌクレオチドによって構成されるDループ、
(iii)DアームとDループの後にあるリボヌクレオチド鎖の一部が折り畳まれることで形成される、5対のリボヌクレオチドによって構成されるアンチコドンのステムと、7リボヌクレオチドによって構成されるアンチコドンのループ(アンチコドンのステム-ループ)、
(iv)4〜21リボヌクレオチドによって構成され、アンチコドンのステムとアンチコドンのループの後にあるリボヌクレオチド鎖の一部によって形成される可変ループ、
(v)可変ループの後にあり、アクセプターステムの構成に関与するリボヌクレオチド鎖の3'末端のリボヌクレオチドの前にあるリボヌクレオチド鎖の一部が折り畳まれることで形成される、5対のリボヌクレオチドによって構成されるTアームと、8リボヌクレオチドによって構成されるTループ
を含む。
【００６５】
ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAポリヌクレオチドは、例えば、任意のアミノ酸をコードするために、当技術分野において公知の任意のtRNAを含有することができる。適切なtRNA分子の選択は、一つには、挿入RNAを発現させるのに用いられる宿主細胞によって決められてもよい。例えば、望ましい挿入RNA分子の高発現レベルを生じさせようとする時、選択されるtRNAは、宿主細胞種内の稀なコドンではなく、宿主細胞種が好むコドンをコードするtRNAに由来してもよい。様々な態様において、tRNAはメチオニル-tRNAである。様々な態様において、tRNAは、発現に用いられる宿主細胞に由来する。様々な態様において、tRNAは哺乳動物tRNAである。様々な態様において、tRNAはヒトtRNAである。
【００６６】
一部の態様において、上記で定義したキメラtRNAは、これが得られたtRNAのアンチコドンの実質的にインタクトなステムを含まない。例えば、キメラtRNAでは、修飾前のtRNA内のアンチコドンのステム-ループの前にあるリボヌクレオチドと、修飾前のtRNA内のアンチコドンのステム-ループの後にあるリボヌクレオチドとの間に、修飾前のtRNAのアンチコドンのステムはもはや存在しない。
【００６７】
b. プレマイクロRNA
tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドポリヌクレオチドは当技術分野において公知の任意のプレマイクロRNA分子を含有することができ、天然供給源から入手されてもよく(例えば、プレmiRNAもしくはmiRNA)、人工的に得られてもよい(例えば、shRNA)。様々な態様において、プレマイクロRNAは、ヒトプレmiRNA-1291、ヒトプレmiRNA-34a、ヒトプレmiRNA-125-1、ヒトプレmiRNA-124、ヒトプレmiRNA-27b、ヒトプレmiRNA-22、およびその変異体または変種より選択される。ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAポリヌクレオチドにおいて使用することができる他のプレマイクロRNA分子には、同じ宿主細胞(例えば、大腸菌宿主細胞)におけるヒトプレmiRNA-1291、ヒトプレmiRNA-34a、ヒトプレmiRNA-125-1、ヒトプレmiRNA-124、ヒトプレmiRNA-27b、ヒトプレmiRNA-22の発現レベルで、またはその発現レベルより多く、宿主細胞(例えば、大腸菌宿主細胞)において発現するプレマイクロRNA分子が含まれる。様々な態様において、プレマイクロRNA分子は哺乳動物プレマイクロRNA分子に由来する。様々な態様において、プレマイクロRNA分子はヒトプレマイクロRNA分子に由来する。様々な態様において、ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAポリヌクレオチドのプレマイクロRNA成分は、長さが約80ヌクレオチド〜約120ヌクレオチド、例えば、長さが約80ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド、例えば、長さが約80、85、90、95、100、105、110、115、または120ヌクレオチドである。
【００６８】
様々な態様において、プレマイクロRNAは、
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からなる群より選択されるヒトプレマイクロRNAである。例えば、miRBase.orgに列挙されているプレマイクロRNAを参照されたい。
【００６９】
様々な態様において、プレマイクロRNAは、プレmiRNA-22でもなく、プレmiRNA-122でもなく、プレmiRNA-124-2でもなく、プレmiRNA-125-2でもなく、プレmiRNA-155でもなく、プレmiRNA-221でもない。
【００７０】
様々な態様において、ハイブリッド分子は完全長ネイティブプレマイクロRNAを含む。一部の態様において、ハイブリッド分子はネイティブプレマイクロRNA分子の断片または部分配列を含む。挿入RNA分子(例えば、ノンコーディングRNA(ncRNA)、成熟マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、低分子核小体RNA(snoRNA)、アプタマー)をハイブリッドtRNA/プレマイクロRNA分子から切断または放出することができるように、用いられるネイティブプレマイクロRNA分子の断片または部分配列には、エンドリボヌクレアーゼ(例えば、ダイサー)が認識し、利用できる1つまたは複数の切断部位がある。
【００７１】
3. 挿入RNA分子
様々な態様において、ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNA分子は、挿入RNA配列を含有し、挿入RNA配列を高レベルで生成するためのスキャフォールドとして役立つ。挿入RNA配列は、例えば、エンドリボヌクレアーゼによって、例えば、ダイサーによってハイブリッドtRNA/プレマイクロRNA分子から切断することができる。様々な態様において、挿入RNA分子は、約18ヌクレオチドから最長で約200ヌクレオチド、例えば、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約150ヌクレオチド、例えば、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約125ヌクレオチド、例えば、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約100ヌクレオチド、例えば、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約75ヌクレオチド、例えば、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約50ヌクレオチド、例えば、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約40ヌクレオチド、例えば、少なくとも約18ヌクレオチドかつ最長で約30ヌクレオチドでもよい。様々な態様において、挿入RNA分子は長さが約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドでもよい。
【００７２】
適宜、または所望であれば、挿入RNAは、標的核酸または標的タンパク質の転写または翻訳を阻止するか、低減するか、または阻害する阻害性核酸でもよい。様々な態様において、阻害性核酸は、ノンコーディングRNA(ncRNA)、成熟マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、または低分子核小体RNA(snoRNA)である。一部の態様において、挿入RNAは、成熟miRNA、例えば、ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAスキャフォールド内にあるプレマイクロRNA分子に由来する(例えば、相同な)成熟miRNA、またはハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAスキャフォールド内にあるプレマイクロRNA分子と非相同な成熟miRNAである。様々な態様において、挿入RNAは、miR-21、miR-22、miR-27b、miR-33、miR-34a、miR122、miR124-1、miR-125-1、miR-1291、およびlet7aからなる群より選択される成熟miRNAである。様々な態様において、挿入RNAはノンコーディングRNAである。一部の態様において、ノンコーディングRNAは、Homeobox (HOX) antisense intergenic RNA(HOTAIR)である。
【００７３】
一部の態様において、挿入RNAは、標的分子または標的ポリペプチドに結合するアプタマーである
【００７４】
一部の態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、蛍光タンパク質、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、キナーゼ、核受容体、Gタンパク質共役受容体、エピジェネティックレギュレーター、転写因子からなる群より選択される。一部の態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、青紫色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質(BFP)、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、オレンジ色蛍光タンパク質(OFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、およびサファイア型タンパク質より選択される蛍光タンパク質である。一部の態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、インターロイキン(IL)-1α、IL-1β、腫瘍壊死因子(TNF)α、インターフェロン(IFN)α、IFNβ、IFNγ、TGFβ1、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23、および遊走阻止因子(MIF)より選択されるサイトカインである。一部の態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ(PPAR-γまたはPPARG)、レチノイン酸受容体(RAR)、ビタミンD受容体、エストロゲン受容体(ER)、アンドロゲン受容体(AR)、グルココルチコイド受容体(GR)、甲状腺ホルモン受容体(THR)、ファルネソイドX受容体(FXR)またはNR1H4(核受容体サブファミリー1、グループH、メンバー4)、肝臓X受容体(LXR)、構成的アンドロスタン受容体(CAR)、およびプレグナンX受容体(PXR)より選択される核受容体である。一部の態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、血管内皮増殖因子(VEGF)、アドレノメデュリン(AM)、アンジオポエチン(Ang)、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質(BMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、エリスロポエチン(EPO)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、増殖分化因子-9(GDF9)、治癒因子(Healing factor)、肝細胞増殖因子(HGF)、ヘパトーマ由来増殖因子(Hepatoma-derived growth factor)(HDGF)、インシュリン様増殖因子(IGF)、遊走刺激因子、ミオスタチン(GDF-8)、神経成長因子(NGF)および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子(PDGF)、トロンボポエチン(TPO)、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-β)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、wingless型MMTV組み込み部位(wingless-type MMTV integration site)(WNT)ファミリーメンバー、胎盤増殖因子(PGF)、ソマトトロピン(成長ホルモンまたはGH)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、ならびにIL-7より選択される増殖因子である。
【００７５】
a. 疾患マーカーおよび標的
一部の態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、癌の進行に関連するか、または癌の原因となるバイオマーカーである。
【００７６】
乳癌の場合、標的miRNAは、miR-10b、miR-21、miR-29b、miR-17-5p、miR-125b、miR-145、miR-146、およびmiR-155を含むが、これに限定されないヒトmiRNAより選択されてもよい。悪性リンパ腫を検出する場合、標的miRNAは、miR-155、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、およびmiR-92を含むが、これに限定されないヒトmiRNAより選択されてもよい。さらに、乳腺腫瘍は、例えば、let-7ファミリー、mir-10b、mir-18a、mir-106a、mir125-a、mir125-b、mir-126、mir-130a、mir-145、mir-155、mir-141、mir-214、mir-205、mir-206、mir-210、mir-126、mir-335、mir-213、mir-203、17-5p、miR-30、mir-34、およびmir-342の不均一なmiRNAプロファイルおよびmiRNAシグネチャーを含み、乳癌アウトカムに影響を及ぼすと提唱されている。例えば、Wiemer, Eur. J Cancer 43: 1529-1544 (2007)を参照されたい。
【００７７】
結腸直腸癌では、標的miRNAは、let-7ファミリー、miR-10a、miR-20a、miR-24、miR-29b、miR-31、miR-96、miR-133b、miR-135b、miR-143、miR-145、miR-183、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、およびmiR-92を含むが、これに限定されないヒトmiRNAより選択されてもよい。
【００７８】
肝細胞癌の場合、標的miRNAは、miR-18、miR-125a、miR-195、miR-199a、miR-200a、およびmiR-224を含むが、これに限定されないヒトmiRNAより選択されてもよい。様々な態様において、miR-16、miR-199a、および/またはmiR-195は様々な肝臓癌用の標的miRNAとして役立つことができる。
【００７９】
膵臓癌の場合、標的miRNAは、miR-21、miR-24、miR-34a、miR-100、miR-101、miR-103、miR-107、miR-125b、miR-143、miR-145、miR-148b、miR-200、およびmiR-155を含むが、これに限定されないヒト miRNAより選択されてもよい。Wiemer, Eur. J Cancer 43: 1529-1544 (2007); Zhao et al., Mol Cancer Ther. 2013 Jan;12(1):83-93; Bao et al., 「Anti-Tumor Activity of a Novel Compound-CDF Is Mediated by Regulating miR-21, miR-200, and PTEN in Pancreatic Cancer.」 PloS One, Vol. 6(3)| el7850 (2011); Qazi et al., 「Restoration of E-cadherin expression in pancreatic ductal adenocarcinoma treated with microRNA-101.」 Surgery 152: 704-13 (2012); Pramanik et al., 「Restitution of Tumor Suppressor MicroRNAs Using a Systemic Nanovector Inhibits Pancreatic Cancer Growth in Mice.」 Mol Cancer Ther; 10(8)(2011); Kaestner, 「The FoxA factors in organogenesis and differentiation.」 Current Opinion in Genetics & Development, 20:527-532 (2010);およびBrychtova, 「Anterior gradient 2: A novel player in tumor cell biology.」 Cancer Letters 304, 1-7 (2011)を参照されたい。
【００８０】
前立腺癌の場合、標的miRNAは、let-7d、miR-128a、miR-195、およびmiR-203を含むが、これに限定されないヒトmiRNAより選択されてもよい。
【００８１】
肺癌の場合、標的miRNAは、let-7ファミリー、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR34、miR-92、miR-21、miR-126*、miR-155、miR-200b、miR-205、およびmiR-210を含むが、これに限定されないヒトmiRNAより選択されてもよい。
【００８２】
さらに、メラノーマ細胞では多くのさらなるmiRNAが異なって発現しており、過剰発現しているmiRNAのいくつかはメラノーマ細胞の侵襲性を調節するように思われる(Ma et al., 2009; Mueller and Bosserhoff, 2009; Mueller et al., 2009; Philippidou et al., 2010; Segura et al., 2010; Stark et al., 2010)。miRNA miR-221/222はp27Kipl/CDKNlBとc-KIT受容体のmRNAレベルをダウンレギュレートし、それによって、新形成の進行を制御して、このような癌細胞の増殖を強化し、分化を低減させる(Felicetti et al., 2008)。さらに、miR-137は、メラノーマにおける細胞増殖、成熟、および色素沈着のマスターレギュレーターであるMITFの発現をダウンレギュレートする(Bemis et al., 2008)。最近、メラノーマ細胞において、いくつかのmiRNA遺伝子が異なって調節されており、従って、癌を引き起こすことが示された。このようなmiRNAの1つであるmiR-211はメラノーマでは一貫して少なく(Mazar et al, 2010を参照されたい)、このことは、感受性のある細胞における高い侵襲性と、速い増殖速度に関係がある。さらに、エピジェネティックに調節されるmiRNA遺伝子の一群、例えば、miR-34b、-489、-375、-132、-142-3p、-200a、-145、-452、-21、-34c、-496、-let7e、-654、および-519bがメラノーマと関連付けられている。
【００８３】
一部の態様において、標的核酸または標的ポリペプチドは、miR-1291; AKT2; サイクリンBl; MeCP2; FOXA2; AMPKal; Anterior gradient homolog 2(AGR2); アルギニノコハク酸合成酵素(ArSS); 鎖C、H3-H4シャペロンASF1の構造(Chain C, structure of the H3-H4 chaperone ASF1); オルニチンアミノトランスフェラーゼ(OAT); ケラチン、II型細胞骨格8(KRT8); ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ2(PEPCK2); エノイル-コエンザイムA(CoA)ヒドラターゼ(ECHS1); ホスホセリンアミノトランスフェラーゼアイソフォーム1(PSAT1); ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ(DLAT); ペルオキシレドキシン3、アイソフォームCRA a(PRDX3); システインリッチタンパク質2(CRIP2); 鎖C、ヒトPCNA; ファスシンホモログ1、アクチン結束タンパク質(actin-bundling protein)、アイソフォームCRA a(FSCN1); セルピンHI前駆体; タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体; 鎖A、ジスルフィドイソメラーゼ関連シャペロンERP29; トリオースリン酸イソメラーゼアイソフォーム2(TPII); ペルオキシレドキシン-4(PRDX4); およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼ[NAD]サブユニットβ(IDH3B); a-フェトプロテイン(AFP); AFP-L3％、デス-γ-カルボキシプロトロンビン(DCP); CDH1(E-カドヘリン); H3ヒストンのトリメチル化リジン27(H3K27me3); ヒストンデアセチラーゼ-1; ヒストンデアセチラーゼ-2; SIRT1; CD44; アルデヒドデヒドロゲナーゼ; KRAS2; もしくはRREB1、ABC輸送体(例えば、ABCC1、ABCG2、ABCB1、ABCC2、ABCC3、およびABCC4)、またはその任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００８４】
4. インビトロでのtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッド分子の高レベル生成
tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッド分子は宿主細胞内で組換え発現によって生成されてもよく、合成により調製されてもよい。このような組換え方法および合成方法は当技術分野において周知である。宿主細胞内で組換え発現によって生成される場合、宿主細胞は真核細胞でもよく原核細胞でもよい。様々な態様において、宿主細胞は、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子において用いられるtRNA分子またはプレマイクロRNA分子もしくはshRNA分子の種と同じ種の細胞である。挿入RNA配列を含むtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッド分子を生成する場合、挿入RNAを切断する可能性があるエンドリボヌクレアーゼ(例えば、ダイサー)を含まない宿主細胞が用いられてもよい。様々な態様において、ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNA分子を組換え発現させるための宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞である。様々な態様において、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッド分子を組換え発現させるための宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、昆虫細胞、植物細胞、または酵母細胞である。例えば、Commins, et al. Proc Natl Acad Sci USA, (2006)103(10):3687-3692; Murchison, et al., Proc Natl Acad Sci USA, (2005)102(34):12135-12140;およびKanellopoulou, et al., Genes Dev., (2005)19:489-501に記載のように、ダイサーが欠損している真核(例えば、哺乳動物またはヒト)宿主細胞は当技術分野において公知であり、真核宿主細胞内でtRNA/プレマイクロRNAおよび/またはtRNA/shRNAハイブリッド分子を生成するために高レベルで発現させるのに用いられる。
【００８５】
tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドを用いると、本明細書に記載のように、インビボおよびインビトロで、望ましい挿入RNA分子を安定して、一貫して、かつ確実に高レベルで発現させることが容易になる。様々な態様において、高レベルのtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドが、挿入RNAを切断する可能性があるエンドリボヌクレアーゼ(例えば、ダイサー)を含まない宿主細胞によってインビトロで生成される。様々な態様において、少なくとも約5〜100mg、例えば、少なくとも約10〜50mgのtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド分子を、1リットルの大腸菌培養物から16〜48時間にわたってインビトロで生成することができる。様々な態様において、少なくとも約5〜100mg、例えば、少なくとも約10〜50mgのtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド分子を1リットルの酵母細胞培養物からインビトロで生成することができる。一部の態様において、生成されたtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNA分子は、全RNAの少なくとも約5％、例えば、少なくとも約6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、15％、20％、またはそれより多くを含む。
【００８６】
様々な態様において、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドは生成宿主細胞から全RNAの一部として精製される。宿主細胞から全RNAを単離または精製する、このような方法は当技術分野において確立されている。一部の態様では、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドは、生成宿主細胞の他のRNA分子および成分から、さらに大幅に単離または精製される。これは、例えば、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、クロマトグラフィー、FPLC、および/またはHPLCによる分離による分離を含む当技術分野における任意の方法を用いて行うことができる。次いで、大幅に単離および/または精製されたtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドはトランスフェクションまたは送達によって真核細胞に導入することができ、次いで、真核細胞はtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドをプロセシングして、挿入RNAが切断または放出される。
【００８７】
様々な態様において、ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAスキャフォールドは、インビトロで、挿入RNAを切断または放出するのに十分な条件下でエンドリボヌクレアーゼ(例えば、ダイサー)と接触されるか、またはこれに曝露される。様々な態様において、挿入RNAをハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAスキャフォールドからインビトロで切断または放出する効率は、RNアーゼ部位、リボザイム部位、またはDNAザイム部位をtRNA-プレmiRNA分子に付加することによって促進することができる。
【００８８】
5. インビボでのRNA分子の治療用送達
関心対象の挿入RNA(例えば、阻害性核酸、アプタマー)を標的細胞の内部に送達するために、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドを、その必要がある対象に投与することができる。一般的に、対象は哺乳動物であり、従って、エンドリボヌクレアーゼ(例えば、ダイサー)を発現する真核細胞を含む。対象の標的真核細胞がtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドでトランスフェクトまたは形質転換されたら、標的細胞内のエンドリボヌクレアーゼ(例えば、ダイサー)が、関心対象の挿入RNAを切断または放出する。
【００８９】
様々な態様において、挿入RNAは、阻害性核酸(例えば、ノンコーディングRNA(ncRNA)、成熟マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、低分子核小体RNA(snoRNA)、アプタマー)である。様々な態様において、阻害性RNAは真核細胞内でハイブリッドスキャフォールドから放出されたら、標的核酸または標的ポリペプチドの量および/または活性を、少なくとも約10％〜約100％、20％〜約100％、30％〜約100％、40％〜約100％、50％〜約100％、60％〜約100％、70％〜約100％、10％〜約90％、20％〜約85％、40％〜約84％、60％〜約90％分だけ、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、および99％などがあるが、これに限定されない、これらの範囲内の任意のパーセントを含めて低減する。
【００９０】
ある特定の態様において、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドはベクターからインビボで発現される。「ベクター」とは、関心対象の核酸を細胞の内部に送達するのに使用することができる組成物である。直鎖ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むが、これに限定されない非常に多くのベクターが当技術分野において公知である。従って、「ベクター」という用語は自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが含まれるが、これに限定されない。発現構築物は生細胞内で複製されてもよく、合成により作られてもよい。本願の目的で、「発現構築物」、「発現ベクター」、および「ベクター」という用語は、一般的で例示的な意味で用途を証明するために同義に用いられ、本発明を限定することが意図されない。
【００９１】
一態様において、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドを発現させるための発現ベクターは、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)をコードするポリヌクレオチドに「機能的に連結された」プロモーターを含む。本明細書で使用する「機能的に連結された」または「転写制御下にある」という句は、ポリヌクレオチドに対してプロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始と前記ポリヌクレオチドの発現を制御する正しい場所と方向にあることを意味する。
【００９２】
ある特定の態様において、関心対象のポリヌクレオチドをコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構によって認識されるDNA配列、または導入された合成機構を指す。プロモーターという用語は、本明細書では、RNAポリメラーゼI、II、またはIIIの開始部位の周囲でクラスター化している転写制御モジュールの一群を指すために用いられる。哺乳動物細胞発現のための例示的なプロモーターには、特に、SV40初期プロモーター、CMVプロモーター、例えば、CMV最初期プロモーター(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,168,062号および同第5,385,839号を参照されたい)、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP)、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモーターなどの他の非ウイルス性プロモーターも哺乳動物発現に用いられる。これらのプロモーターおよび他のプロモーターは、当技術分野において周知の技法を用いて市販のプラスミドから入手することができる。例えば、Sambrook et al., 前記を参照されたい。構築物の発現レベルを増大させるために、エンハンサーエレメントがプロモーターと共同で用いられてもよい。例には、Dijkema et al., EMBO J.(1985)4:761に記載のSV40初期遺伝子エンハンサー、Gorman et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982b)79:6777に記載のラウス肉腫ウイルスの末端反復配列(LTR)に由来するエンハンサー/プロモーター、およびBoshart et al., Cell (1985)41:521に記載のヒトCMVに由来するエレメント、例えば、CMVイントロンA配列に含まれるエレメントが含まれる。
【００９３】
典型的に、転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナルも発現構築物に存在する。このような配列の例には、Sambrook et al., 前記に記載のSV40に由来する配列、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列(例えば、米国特許第5,122,458号を参照されたい)が含まれるが、これに限定されない。さらに、コード配列の発現を強化するために、5'-UTR配列をコード配列に隣接して配置することができる。このような配列には、ピコルナウイルスのリーダー配列に存在する配列内リボソーム進入部位(IRES)を含むUTR、例えば、脳心筋炎ウイルス(EMCV)UTR(Jang et al. J.Virol.(1989)63:1651-1660)が含まれる。本発明でも用いられる他のピコルナウイルスUTR配列には、ポリオリーダー配列およびA型肝炎ウイルスリーダーおよびC型肝炎IRESが含まれる。
【００９４】
発現ベクターを細胞に導入することができる多数の手法がある。ある特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。ある特定のウイルスは、受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞に侵入して宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定して、かつ効率的に発現する能力があるために、外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入するための魅力的な候補となっていた(Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986)。
【００９５】
インビボ送達のための利用可能な方法の1つはアデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。「アデノウイルス発現ベクター」とは、(a)構築物のパッケージングを支援するのに十分なアデノウイルス配列と、(b)この中にクローニングされているポリヌクレオチドを発現させるのに十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを意味する。発現ベクターは、遺伝子操作された形態のアデノウイルスを含む。36kBの直鎖二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成が分かっているので、アデノウイルスDNAの大きな断片を7kBまでの外来配列で置換することができる(Grunhaus and Horwitz, 1992)。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスは宿主細胞に感染しても染色体に組み込まれない。なぜなら、アデノウイルスDNAは潜在的な遺伝毒性が無く、エピソームとなって複製することができるからである。さらに、アデノウイルスは構造が安定しており、大規模に増幅された後にゲノム再編成は検出されたことがない。アデノウイルスは、細胞周期段階に関係なく、ほとんど全ての上皮細胞に感染することができる。
【００９６】
アデノウイルスは、ゲノムのサイズが中程度であり、操作が簡単であり、力価が高く、標的細胞の範囲が広く、感染性が高いので遺伝子導入ベクターとして使用するのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスDNA複製とパッケージングに必要なcisエレメントである100〜200塩基対の末端逆位配列(ITR)を含有する。
【００９７】
アデノウイルスベクターに複製欠損がある、または少なくとも条件付きで欠損があるという要件以外に、アデノウイルスベクターがどういったものであるかということは実施の成功にとって重大であると考えられていない。アデノウイルスは42の異なる既知の血清型またはサブグループA〜Fのいずれでもよい。本発明において使用するための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るためには、サブグループCのアデノウイルス5型が好ましい出発物質である。これは、アデノウイルス5型が多くの生化学情報および遺伝子情報が知られているヒトアデノウイルスであり、ベクターとしてアデノウイルスを用いた大部分の構築に歴史を通して用いられてきたからである。
【００９８】
本発明による代表的なベクターは複製欠損であり、アデノウイルスE1領域を有さない。従って、関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、E1コード配列が取り除かれた位置に導入することが最も便利であろう。しかしながら、アデノウイルス配列内に構築物を挿入する位置は本発明にとって重大な意味を持たない。関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Karlsson et al.(1986)に記載のようにE3交換ベクター内の欠失E3領域の代わりに挿入されてもよく、ヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがE4欠陥を補うE4領域の代わりに挿入されてもよい。
【００９９】
アデノウイルスベクターは真核生物遺伝子発現(Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992)およびワクチン開発(Grunhaus and Horwitz、1992; Graham and Prevec, 1991)において用いられてきた。最近、動物試験から、組換えアデノウイルスを遺伝子療法に使用できることが示唆された(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993)。組換えアデノウイルスを様々な組織に投与する試験には、気管点滴注入(Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992)、筋肉注射(Ragot et al., 1993)、末梢静脈内注射(Herz and Gerard, 1993)および脳への定位接種(Le Gal La Salle et al., 1993)が含まれる。
【０１００】
レトロウイルスベクターも、細胞内でtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を発現させるのに適している。レトロウイルスは、感染した細胞の中で、逆転写プロセスによってRNAを二本鎖DNAに変換する能力を特徴とする一本鎖RNAウイルスの一群である(Coffin, 1990)。次いで、結果として生じたDNAはプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を誘導する。組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫にウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、3種類の遺伝子、キャプシドタンパク質をコードするgag、ポリメラーゼ酵素をコードするpol、およびエンベロープ成分をコードするenvを含有する。gag遺伝子の上流で見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含有する。ウイルスゲノムの5'末端および3'末端には2つの末端反復配列(LTR)配列が存在する。これらは強力なプロモーターとエンハンサー配列を含有し、これらも宿主細胞ゲノム内での組み込みに必要とされる(Coffin, 1990)。
【０１０１】
レトロウイルスベクターを構築するために、ある特定のウイルス配列の代わりに、関心対象の遺伝子をコードする核酸がウイルスゲノムに挿入され、複製欠損のあるウイルスが産生される。ビリオンを産生するために、gag遺伝子と、pol遺伝子と、env遺伝子を含有するが、LTRとパッケージング成分は無いパッケージング細胞株が構築される(Mann et al., 1983)。この細胞株に、cDNAと、レトロウイルスLTRとパッケージング配列を含有する組換えプラスミドが(例えば、リン酸カルシウム沈殿によって)導入されると、パッケージング配列によって組換えプラスミドのRNA転写物はウイルス粒子にパッケージングされ、次いで、培養培地に分泌される(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983)。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地は収集され、任意で濃縮され、遺伝子導入に用いられる。レトロウイルスベクターは多種多様な細胞タイプに感染することができる。しかしながら、組み込みと安定発現には宿主細胞が分裂することが必要である(Paskind et al., 1975)。
【０１０２】
本発明における発現構築物として他のウイルスベクターが用いられてもよい。ワクシニアウイルス(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988)、アデノ随伴ウイルス(AAV)(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984)、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが用いられてもよい。これらは、様々な哺乳動物細胞に対して、いくつかの魅力的な特徴を提供する(Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990)。
【０１０３】
挿入RNAの切断および発現を行うためには、発現構築物を細胞に送達しなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験室手順の場合のようにインビトロで成し遂げられもよく、ある特定の疾患状態を処置する場合のようにインビボまたはエクスビボで成し遂げられもよい。送達のための機構の1つは、発現構築物がキャプシドで包まれて感染性ウイルス粒子になるウイルス感染を介した機構である。
【０１０４】
発現構築物を培養哺乳動物細胞に導入するための、いくつかの非ウイルス方法も本発明によって意図される。これらには、リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)、DEAE-デキストラン(Gopal, 1985)、エレクトロポレーション(Tur-Kaspa et al., 1986; Porter et al., 1984)、直接的なマイクロインジェクション(Harland and Weintraub, 1985)、DNA装填リポソーム(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979)およびLipofectamine-DNA複合体、細胞超音波処理(Fechheimer et al., 1987)、高速マイクロプロジェクタイル(high velocity microprojectile)を用いた遺伝子ボンバードメント(gene bombardment)(Yang et al., 1990)、ならびに受容体を介したトランスフェクション(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)が含まれる。これらの技法の一部はインビボまたはエクスビボでの使用に首尾よく合わせられる場合がある。
【０１０５】
発現構築物が細胞に送達されたら、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド、例えば、関心対象の挿入RNAを含有するtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドをコードする核酸は様々な部位に配置され、様々な部位で発現することができる。ある特定の態様において、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドをコードする核酸は細胞ゲノムに安定して組み込まれてもよい。この組み込みは、相同組換え(遺伝子交換)を介して同じ場所および方向で行われてもよく、ランダムで非特異的な場所に組み込まれてもよい(遺伝子増強(gene augmentation))。なおさらなる態様において、核酸は、DNAの別々のエピソームセグメントとして細胞内で安定に維持されてもよい。このような核酸セグメント、すなわち「エピソーム」は、宿主細胞周期とは無関係に、または宿主細胞周期と同期して維持および複製するのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達されるか、また、核酸が細胞内のどこにとどまるのかは、使用する発現構築物のタイプによって決まる。
【０１０６】
さらに別の態様において、発現構築物は、単純に、裸の組換えDNAまたはプラスミドからなってもよい。構築物は、細胞膜を物理的または化学的に透過処理する上記で述べた任意の方法によって導入することができる。これは、特に、インビトロで導入するのに適用することができるが、インビボ使用にも適用される場合がある。Dubenskyら(1984)は、ポリオーマウイルスDNAをリン酸カルシウム沈殿物の形で成獣マウスおよび新生仔マウスの肝臓および脾臓に首尾よく注射し、活発にウイルスが複製し、急性感染が生じることを証明した。BenvenistyおよびNeshif(1986)も、リン酸カルシウムで沈殿させたプラスミドを直接腹腔内注射することによって、トランスフェクトされた遺伝子が発現することを証明した。関心対象の遺伝子をコードするDNAが同様にインビボでも導入され、遺伝子産物を発現する可能性があることが想定される。
【０１０７】
さらに別の態様において、裸のDNA発現構築物の細胞への導入はパーティクルボンバードメントを伴う場合がある。この方法は、DNAでコーティングされたマイクロプロジェクタイルを高速に加速して、マイクロプロジェクタイルが細胞を死滅させることなく細胞膜に穴を開け、細胞に入るのを可能にする能力に依存する(Klein et al., 1987)。小さな粒子を加速するための装置がいくつか開発されている。このような装置の1つは電流を発生させて原動力を供給するために高圧放電に頼る(Yang et al., 1990)。使用するマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズなどの生物学的に不活性な物質で構成されてきた。
【０１０８】
さらなる態様において、発現構築物はリポソームの中に閉じ込められてもよい。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームには、水性媒体によって分けられた複数の脂質層がある。リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると多重膜リポソームは自発的に形成する。脂質成分は自己再編成した後に、閉じた構造が形成され、脂質二重層の間に水と、溶解した溶質が閉じ込められる(Ohosh and Bachhawat, 1991)。リポフェクタミン-DNA複合体も意図される。
【０１０９】
ある特定の態様において、リポソームはセンダイウイルス(hemagglutinating virus)(HVJ)と複合体化されてもよい。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームでカプセル化されたDNAが細胞に入るのを促進することが示されている(Kaneda et al., 1989)。他の態様において、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質(HMG-I)と複合体化されてもよく、これと一緒に用いられてもよい(Kato et al., 1991)。なおさらなる態様において、リポソームはHVJおよびHMG-Iと複合体化されてもよく、これと一緒に用いられてもよい。このような発現構築物はインビトロおよびインビボでの核酸の導入および発現において首尾よく用いられてきたので、本発明に適用することができる。細菌プロモーターがDNA構築物に用いられた場合、リポソームの中に適切な細菌ポリメラーゼを含めることも望ましいだろう。
【０１１０】
特定のlncRNAまたは阻害剤をコードする核酸を細胞に送達するのに使用することができる他の発現構築物は、受容体を介した送達ビヒクルである。これらは、ほとんど全ての真核細胞において、受容体を介したエンドサイトーシスによる選択的な高分子取り込みを利用する。様々な受容体が細胞タイプ特異的に分布しているので、送達を高度に特異的することができる(Wu and Wu, 1993)。
【０１１１】
受容体を介した遺伝子標的化ビヒクルは、一般的に、2つの成分:細胞受容体特異的リガンドとDNA結合剤からなる。いくつかのリガンドが、受容体を介した遺伝子導入に用いられてきた。最も大規模に特徴付けられたリガンドはアシアロオロソムコイド(ASOR)(Wu and Wu, 1987)およびトランスフェリン(Wagner et al., 1990)である。最近、ASORと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達ビヒクルとして用いられ(Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994)、上皮細胞増殖因子(EGF)も、遺伝子を扁平上皮癌細胞に送達するために用いられた(Myers, EPO0273085)。
【０１１２】
他の態様において、送達ビヒクルは、カプセル化粒子と、外部標的化リガンド、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する外部標的化リガンドを含んでもよい。例えば、Nicolau et al.(1987)は、リポソームの中に組み込まれたガラクトース末端アシアルガングリオシド(asialganglioside)であるラクトシル-セラミドを使用し、肝細胞によるインシュリン遺伝子の取り込みが増加することを観察した。従って、特定の遺伝子をコードする核酸を、リポソームを用いて、またはリポソームを用いずに、任意の数の受容体-リガンド系によって細胞タイプに特異的に送達することができる可能性がある。例えば、EGF受容体のアップレギュレーションを示す細胞に核酸を媒介送達するための受容体として上皮細胞増殖因子(EGF)が用いられてもよい。肝臓細胞上にあるマンノース受容体を標的化するためにマンノースを使用することができる。CD5(CLL)、CD22(リンパ腫)、CD25(T細胞白血病)、およびMAA(メラノーマ)に対する抗体も標的化部分として同様に使用することができる。標的化のために用いられる他の腫瘍関連抗原には、例えば、メラノーマ関連抗原(メラノーマに関連するMAGE-1、MAGE-3、TRP-2、メラノソーム膜糖タンパク質gp100、gp75、およびMUC-1(ムチン-1));例えば、卵巣癌、メラノーマ、または結腸癌と関連している可能性があるCEA(癌胎児抗原);卵巣癌において発現している葉酸受容体α;ミエローマを含むが、これに限定されない多くの異なる腫瘍において発現している遊離ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ(hCGβ)サブユニット;乳癌に関連するHER-2/neu;小細胞肺癌に関連する脳脊髄炎抗原HuD;神経芽細胞腫に関連するチロシンヒドロキシラーゼ;前立腺癌に関連する前立腺特異的抗原(PSA);卵巣癌に関連するCA125が含まれるが、それに限定されるわけではない。B細胞リンパ腫のイディオタイプ決定基は(イディオタイプ特異的な体液性免疫応答に起因する)腫瘍特異的免疫を生じることができる。さらに、ヒトT細胞白血病ウイルス1型の抗原は、ウイルスによって誘導されるヒト成人T細胞白血病(ATL)に対する特異的なCTL応答および抗腫瘍免疫を誘導することが示されている。例えば、Haupt, et al., Experimental Biology and Medicine (2002)227:227-237; Ohashi, et al., Journal of Virology (2000)74(20):9610-9616を参照されたい。他のTAAは公知であり、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドの処方および標的送達に用いられる。
【０１１３】
特定の例では、前記オリゴヌクレオチドはカチオン性脂質と組み合わせて投与されてもよい。カチオン性脂質の例には、リポフェクチン、DOTMA、DOPE、およびDOTAPが含まれるが、これに限定されない。明確に参照により組み入れられるWO00/71096の公報は、遺伝子療法に効果的に使用することができる様々な製剤、例えば、DOTAP:コレステロールまたはコレステロール誘導体製剤について説明している。他の開示も、ナノ粒子を含む様々な脂質製剤またはリポソーム製剤および投与方法について議論している。これらには、製剤ならびに核酸の投与および送達の他の関連する局面を開示する程度まで明確に参照により組み入れられる、米国特許出願公開第20030203865号、同第20020150626号、同第20030032615号、および同第20040048787号が含まれるが、これに限定されない。粒子を形成するのに用いられる方法も、これらの局面のために参照により組み入れられる、米国特許第5,844,107号、同第5,877,302号、同第6,008,336号、同第6,077,835号、同第5,972,901号、同第6,200,801号、および同第5,972,900号に開示される。
【０１１４】
ある特定の態様では、遺伝子導入はエクスビボ条件下ではもっと簡単に行われる場合がある。エクスビボ遺伝子療法とは、動物から細胞が単離され、インビトロで核酸が細胞に送達され、次いで、改変された細胞が動物に戻されることを指す。これは、動物から組織/器官が外科的に取り出されるか、または細胞および組織が初代培養されることを伴う場合がある。
【０１１５】
tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールドと薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も包含される。臨床用途が意図される場合、薬学的組成物は意図された用途に適した形で調製される。一般的に、これは、発熱物質、ならびにヒトまたは動物に有害な可能性のある他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを必要とする。
【０１１６】
本明細書に記載のtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド用の送達ビヒクルとして、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が用いられてもよい。核酸を、心筋組織および平滑筋組織などの組織に送達するのに適した市販の脂肪エマルジョンには、Intralipid、Liposyn、LiposynII、LiposynIII、Nutrilipid、および他の類似の脂質エマルジョンが含まれるが、これに限定されない。送達ビヒクルとしてインビボで使用するのに好ましいコロイド系はリポソーム(すなわち人工膜小胞)である。このような系の調製および使用は当技術分野において周知である。例示的な製剤は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,981,505号;米国特許第6,217,900号;米国特許第6,383,512号;米国特許第5,783,565号;米国特許第7,202,227号;米国特許第6,379,965号;米国特許第6,127,170号;米国特許第5,837,533号;米国特許第6,747,014号;およびWO03/093449にも開示される。
【０１１７】
一般的に、送達ビヒクルを安定にし、標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を使用することが望ましい。緩衝剤はまた、組換え細胞が患者に導入される時にも用いられる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された有効量の送達ビヒクルを含む。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与された時に有害な反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子的実体および組成物を指す。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」には、薬、例えば、ヒトへの投与に適した薬の処方における使用に許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のために、このような培地および薬剤を使用することは当技術分野において周知である。従来の培地または薬剤が本発明の活性成分と適合しない場合を除いて、従来の培地または薬剤を治療用組成物において使用することが意図される。組成物の核酸を不活化しないのであれば、補助的な活性成分も組成物に組み入れることができる。
【０１１８】
注射使用またはカテーテル送達に適した薬学的剤形には、例えば、滅菌した水溶液または分散液、および滅菌した注射液または分散液を即時に調製するための滅菌散剤が含まれる。一般的に、これらの調製物は滅菌されており、容易な注射可能性が存在する程度まで流動性がある。調製物は製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用を防ぐように保存されなければならない。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、適切なその混合物、ならびに植物油を含有してもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は、必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって適当な流動性を維持することができる。微生物の活動は、様々な他の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを用いることによって可能になる。
【０１１９】
滅菌注射液は、適量の活性化合物を、要望に応じて他の任意の成分(例えば、上記で列挙した成分)と共に溶媒に組み入れ、その後に濾過滅菌することによって調製されてもよい。一般的に、分散液は、様々な滅菌した活性成分を、基本分散媒および望ましい他の成分、例えば、上記で列挙した成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法には、予め濾過滅菌した溶液から、活性成分+任意のさらなる望ましい成分の散剤を生じさせる真空乾燥法およびフリーズドライ法が含まれる。
【０１２０】
本発明の組成物は、一般的に、中性または塩の形で処方されてもよい。薬学的に許容される塩には、例えば、無機酸(例えば、塩酸もしくはリン酸)、または有機酸(例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など)から得られた(タンパク質の遊離アミノ基と形成された)酸添加塩が含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基と形成された塩も、無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄)または有機塩基(例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど)から得ることができる。
【０１２１】
溶液が処方されたら、好ましくは、投与製剤に適合するやり方で、および治療に有効な量で投与される。製剤は、注射液、薬物放出カプセルなどなどの様々な剤形で簡単に投与することができる。水溶液に溶解して非経口投与するために、例えば、一般的に、溶液は適切に緩衝化され、最初に、液体希釈剤は、例えば、十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。このような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に用いられてもよい。好ましくは、滅菌水性媒体が、当業者に公知のように、特に、本開示を考慮して用いられる。例示として、単回用量が1mlの等張性NaCl溶液に溶解され、1000mlの皮下点滴療法(hypodermoclysis)液に添加されてもよく、提案された注入部位に注射されてもよい(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」15th Edition, 1035-1038頁および1570-1580頁を参照されたい)。処置されている対象の状態に応じて、投与量のいくらかのばらつきが必ず発生する。いずれにしても、投与を担当している人は、対象一人一人に適した用量を決定する。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、FDAの生物製剤部(Office of Biologics)の基準により求められるような無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【０１２２】
当業者は、過度の実験なく、インビトロまたはインビボで阻害性核酸または発現ベクターを標的細胞に送達するための適切な系を選択し、使用することができるだろう。
【０１２３】
tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、白金配位錯体を含む化学療法に対する反応性を強化するか、または増大させるために癌をもつ対象に投与されてもよい。代わりの態様において、癌は化学療法レジメン(regime)を用いた処置に対して耐性がある。「化学療法に対して耐性がある」とは、癌が、化学療法を用いた処置に実質的に応答しないことを意味する。このような耐性のある癌および癌の特定。
【０１２４】
一部の態様において、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、標準的な化学療法もしくは骨髄移植または他の新たに出現した標的療法もしくは新規の標的療法の後に失敗(再発)した対象を処置するのに用いられてもよい。「処置する(treat)」、「処置(treatment)」、または「処置する(treating)」とは、疾患症状の開始を阻止もしくは遅延する、および/または疾患症状の重篤度もしくは頻度を小さくする、および/または軽快を延長する、および/または再発の頻度もしくは重篤度を小さくすることを含む、癌に関連する症状を寛解させることを意味する。様々な態様において、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、白金配位錯体を含む化学療法と共に(例えば、白金配位錯体を含む化学療法の前、または白金配位錯体を含む化学療法と同時に)対象に投与することができる。
【０１２５】
tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は単独で、または他の化合物(例えば、化学療法剤)と組み合わせて、リポソーム、アジュバント、または任意の薬学的に許容される担体の存在下で、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジなどへの投与に適した形で提供されてもよい。所望であれば、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を用いた処置は、従来の療法および既存の癌療法または新たに出現した癌療法、例えば、癌特異的ペプチドを用いた標的化学療法、例えば、国際公開公報番号2011/038142に記載の癌特異的ペプチドを用いた標的化学療法と組み合わされてもよい。
【０１２６】
tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は長期にわたって、または断続的に投与されてもよい。「長期」投与とは、長期間にわたって初期治療効果(活性)を維持するように、短期的な形式ではなく連続的な形式で薬剤を投与することを指す。「断続的な」投与とは、とぎれることなく続けて行われることがない処置、もっと正確に言うと、実際には周期的に行われる処置である。代わりの態様において、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、このような阻害剤を必要とする対象、例えば、癌と診断された対象または癌があると疑われる対象に投与される。
【０１２７】
代わりの態様において、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、当業者に公知の様々な方法によって癌細胞に効果的に送達することができる。このような方法には、リポソームのカプセル化/送達、ベクターベースの遺伝子導入、細胞標的化を向上させるためのペプチドまたは免疫グロブリン配列(例えば、国際公開公報番号2011/038142に記載のペプチド)との融合、および他の技法が含まれるが、これに限定されない。適切なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが含まれる。代わりの態様において、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)はまた、当業者に周知の薬学的組成物に処方されてもよい。これらには、リポソーム製剤、および阻害性核酸の送達を強化し得る他の薬剤またはビヒクル/賦形剤、例えば、シクロデキストリンとの組み合わせが含まれる。代わりの態様において、適切な担体には、脂質ベースの担体、例えば、安定化された核酸-脂質粒子(例えば、SNALPもしくはSPLP)、カチオン性脂質もしくはリポソーム核酸複合体(すなわちリポプレックス)、リポソーム、ミセル、ビロソーム、またはその混合物が含まれる。他の態様において、担体系は、ポリマーベースの担体系、例えば、カチオン性ポリマー-核酸複合体(すなわちポリプレックス)である。代わりの態様において、担体系は、シクロデキストリンベースの担体系、例えば、シクロデキストリンポリマー-核酸複合体である。さらなる態様において、担体系は、カチオン性ペプチド-核酸複合体などのタンパク質ベースの担体系である。
【０１２８】
適切な担体は当技術分野において公知であり、2007年7月26日に公開された米国特許出願第20070173476号;2005年1月13日に公開された同第20050008617号;2005年1月20日に公開された同第20050014962号;2005年3月24日に公開された同第20050064595号;2006年1月12日に公開された同第20060008910号;2006年3月9日に公開された同第20060051405号;2006年4月20日に公開された同第20060083780号;2005年1月13日に公開された同第20050008689号;2007年7月26日に公開された同第20070172950号;2006年9月5日にLewisらに発行された米国特許第7,101,995号;2007年5月22にMonahanらに発行された同第7,220,400号;1998年1月6日にBallyらに発行された同第5,705,385号;1999年10月12日にWasanらに発行された同第5,965,542号;2001年9月11日にSempleらに発行された同第6,287,591号に記載されているが、それに限定されるわけではない。これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２９】
一態様において、本発明は、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を含む核酸-脂質粒子を意図する。前記の参考文献に加えて、適切な核酸-脂質粒子およびその使用が米国特許第6,815,432号、同第6,586,410号、および同第6,534,484号に記載されている。
【０１３０】
従来の薬学的実施を用いて、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を、癌に罹患している対象、癌のリスクがある対象、または癌の前駆症状がある対象に投与するための適切な製剤または組成物を提供することができる。適切な薬学的組成物は、当技術分野において公知の手段によって処方することができ、投与方法および用量は当業者によって決定することができる。任意の適切な投与経路、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、室内投与、尿道内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾル投与、経口投与、または選択された処置に適した任意の形式を使用することができる。治療用製剤は液体溶液または懸濁液の形をとってもよい。経腸投与の場合、化合物は錠剤、カプセルの形で投与されてもよく、液体の形で溶解されてもよい。錠剤(table)またはカプセルは腸溶性でもよく、または持続放出用の製剤の形をとってもよい。鼻腔内製剤の場合、散剤、点鼻薬、またはエアロゾルの形をとってもよい。非経口投与の場合、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、滅菌水もしくは食塩水、または非水溶性のtRNA/プレマイクロRNAもしくはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)の投与に用いられる薬学的に許容されるビヒクル、例えば、ビタミンKに用いられる薬学的に許容されるビヒクルに溶解されてもよい。適切な製剤には、望ましい薬学的特性をもつ、例えば、癌細胞に標的送達される、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)の血清中半減期/安定性が改善している、細胞内浸透および細胞質送達が改善している、インビボ活性の持続性が改善している、効力に必要な用量が少ない、必要とされる投与頻度が少ないなどの製剤が含まれる。代わりの態様において、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)のリポソームナノ粒子ベースの投与製剤は、当業者に周知であり、かつアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび/またはRNAi(siRNA)ベースの作用物質を含む他のオリゴヌクレオチドベースの試薬/治療剤の薬学的製剤を調製するのに現在行われている方法を用いて調製されてもよい。代わりの態様において、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を標的細胞(例えば、癌細胞)に形質導入するための遺伝子療法アプローチ、例えば、レンチウイルスベースベクターを用いた遺伝子療法アプローチが用いられてもよい。
【０１３１】
製剤を作製するための当技術分野において周知の方法は、例えば、Remington: the Science & Practice of Pharmacy, Loyd, et al., eds., 22nd ed., Pharmaceutical Press, (2012)において見られる。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、または食塩水、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレン(hydrogenated napthalene)を含有してもよい。化合物の放出を制御するために、生体適合性生分解性のラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーが用いられてもよい。他の潜在的に有用な非経口送達系には、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ(osmotic pump)、埋め込み型注入システム、およびリポソームが含まれる。吸入用製剤は賦形剤、例えば、ラクトースを含有してもよく、例えば、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココラート、およびデオキシコラートを含有する水溶液でもよく、点鼻薬の形で、またはゲルとして投与するための油性溶液でもよい。治療用組成物または予防用組成物の場合、tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、癌を止めるか、もしくは遅くするのに十分な量で、分化を促進するのに十分な量で、または自己複製を阻害もしくは減少するのに十分な量で、または癌細胞の生着もしくは転移を阻害もしくは減少するのに十分な量で個体に投与される。
【０１３２】
本発明によるtRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)の「有効量」は治療的有効量または予防的有効量を含む。「治療的有効量」とは、必要な投与量および期間で、望ましい治療結果、例えば、癌の処置、または分化の促進、または自己複製の阻害もしくは減少、または癌細胞の生着もしくは転移の阻害もしくは減少を実現するのに有効な量を指す。増加または減少は、対照または参照の対象、試料、または化合物と比較した時に10％〜90％の間、例えば、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％でもよく、200％、300％、500％以上など100％を超えてもよい。
【０１３３】
tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)の治療的有効量は、個々の対象の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびにtRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)が個体において望ましい応答を誘発する能力などの要因に応じて異なってもよい。最適な治療応答を提供するように投与計画が調整されてもよい。治療的有効量はまた、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)の治療に有益な効果が、あらゆる毒性作用または有害作用を上回る量でもある。「予防的有効量」とは、必要な投与量および期間で、望ましい予防結果、例えば、癌の予防もしくは癌からの保護、または分化の促進、自己複製の阻害もしくは減少、または癌細胞の生着もしくは転移の阻害もしくは減少を実現するのに有効な量を指す。典型的には、疾患の前または疾患の初期段階の対象において予防用量が用いられるので、予防的有効量は治療的有効量より少ないことがある。代わりの態様において、対象の癌が軽快したかどうかに応じて投与量が調整されることがある。tRNA/プレマイクロRNAおよびtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)の治療的有効量または予防的有効量に好ましい範囲は0.1nM〜0.1M、0.1nM〜0.05M、0.05nM〜15μMまたは0.01nM〜10μMの任意の整数でよい。代わりの態様において、対象に投与される治療的有効量または予防的有効量は、対象の体重1kgあたり約5〜約3000マイクログラムまたはその間の任意の数でもよい。
【０１３４】
代わりの態様において、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、癌細胞に存在する標的核酸もしくは標的ポリペプチドの量より10％〜99％多い量で、またはさらに一般的には、癌細胞に存在する量より少なくとも10％、20％、30％、40％、50、55％、もしくは60％多い量で、または少なくとも65％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％多い量で、または大きく96％、97％、98％、もしくは99％多い量で提供される。代わりの態様において、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、癌細胞に存在する量の0.5〜50倍の量で、またはさらに一般的には、癌細胞に存在する量の少なくとも0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍の量で提供される。代わりの態様において、tRNA/プレマイクロRNAまたはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)は、非癌性膀胱細胞に存在する量に等しい量または正常膀胱細胞に存在する量に存在する量で提供される。
【０１３５】
投薬量の値は、軽減しようとする状態の重篤度によって異なってもよいことに留意すべきである。任意の特定の対象について、特定の投与計画が、個々のニーズに従って、および組成物を投与する人または組成物の投与を監督する人の専門的な判断に従って、ある期間にわたって調整されてもよい。本明細書中に示した投薬量の範囲は単なる例示であり、医師によって選択される可能性がある投薬量の範囲を限定しない。組成物中の活性化合物の量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因に応じて異なってもよい。最適な治療応答を提供するように投与計画が調整されてもよい。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割量が、ある期間にわたって投与されてもよく、用量が、治療状況の要件により示されるように比例して増減されてもよい。投与を簡単にし、投与量を均一にするために非経口組成物を単位剤形で処方することが有利な場合がある。
【０１３６】
6. キット
様々な態様において、本明細書に記載のtRNA/プレマイクロRNAおよび/またはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を備えるキットが提供される。
【０１３７】
様々な態様において、適切な製剤は、1つまたは複数のtRNA/プレマイクロRNAおよび/またはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)と、ハイブリッドtRNA/プレマイクロRNAスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を用いて癌を処置するための説明書を備えるキットの形で提供されてもよい。キットは、さらなる薬剤、例えば、薬学的担体、例えば、リポソーム担体、またはさらなる活性成分、例えば、化学療法剤を備えてもよい。さらなる薬剤は、tRNA/プレマイクロRNAおよび/またはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を含有する容器と同じ容器の中に入れられて提供されてもよく、tRNA/プレマイクロRNAおよび/またはtRNA/shRNAハイブリッドスキャフォールド(例えば、挿入RNAを含有する)を含有する容器とは別の容器の中に入れられて提供されてもよい。
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例は、クレームされた発明を例示するために提供されるが、クレームされた発明を限定するために提供されない。
【０１３９】
実施例1
幅広い用途のために、様々なタイプの機能的低分子RNAを積んでいるキメラRNAを高収率で生合成するための一般的アプローチ
RNA研究およびRNA療法は主として合成RNAに頼る。本発明者らは、細菌内でのプレmiRNA作用物質のラージスケール生成に向けて組換えRNA技術を使用したが、標的RNAの大部分は発現しなかったか、またはごくわずかしか発現しなかったことを発見した。従って、本発明者らは、tRNA融合プレmiR-34a(tRNA/mir-34a)に由来する最適なノンコーディングRNAスキャフォールド(OnRS)をベースとする、様々な低分子RNA(例えば、miRNA、siRNA、およびRNAアプタマー)を運んでいるキメラRNAを一貫して高収率で生合成するための新規の戦略を開発した。何ミリグラムものキメラRNA(例えば、OnRS/miR-124、OnRS/GFP-siRNA、OnRS/Neg(スクランブルRNA)、およびOnRS/MGA(マラカイトグリーンアプタマー))が1L細菌培養物から容易に得られた。ディープシークエンシング分析から成熟miR-124が明らかになり、ヒト細胞内でキメラRNAから標的GFP-siRNAが選択的に放出された。結果として、OnRS/miR-124は、miR-124標的遺伝子の発現の抑制、および細胞プロセスの制御における活性を有した。OnRS/GFP-siRNAは、ES-2/GFP細胞およびGFP-トランスジェニックマウスにおいてGFP mRNAレベルおよび蛍光強度のノックダウンにおける効果を有した。さらに、OnRS/MGAセンサーはMGに結合すると特異的で強力な蛍光を示した。これを、膵臓癌患者における血清RNアーゼ活性を正確に確かめるための標識のない基質として利用した。これらの結果から、OnRSベースの生物工学は、幅広い用途のために様々なタイプの低分子RNAを組み立てるための一般的で、頑健な、かつ用途が広い戦略であることが証明された。
【０１４０】
序論
RNA干渉(RNAi)技術はゲノム機能研究に広く用いられてきた。加齢黄斑変性処置のために米食品医薬品局により承認されているRNAアプタマー(Pegaptanib) (4)の他に、臨床試験が行われている多数のRNAiベースの療法(1〜3)もある。現在、基礎研究、トランスレーショナルリサーチ、および臨床研究に用いられているRNAi作用物質およびノンコーディングRNA(ncRNA)材料、例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA)、RNAアプタマー、およびマイクロRNA(miRまたはmiRNA)は主に化学合成によって生成されるが(5-9)、他のウイルスおよび非ウイルスベクターをベースとする戦略では文字どおりDNA作用物質が用いられる。オリゴヌクレオチドの有機合成が自動化される可能性があるが、インビボ試験または計画された療法用の何ミリグラムもの用量の22nt二本鎖siRNAまたはmiRNA作用物質は非常に高価である。合成ncRNAが、半減期が長いなど、いくつかの好ましい薬物動態学的特性を示していても、化学修飾によって、これらのncRNAの構造、生物学的活性、および安全性プロファイルがどの程度まで変わるのかということもはっきりと分からない。インビトロ転写(10,11)は、長さが異なるRNA作用物質を生成する別の手法である。しかしながら、インビトロ転写では、一般的に、RNA分子は試験管内でマイクログラムスケールで生成される。従って、さらに多量のRNAを生成するには、もっと多くの高価なRNAポリメラーゼが必要となる。
【０１４１】
すぐに使用できるRNAi作用物質をラージスケールで生物工学によって作製するための新たな戦略を開発することに関心が集まり、つい最近、p19発現細菌から完全にプロセシングされたsiRNAの作製について成功例が報告された(12)。他方で、tRNAおよびrRNAが細胞内で安定したRNA分子として存在するという事実を考えて、一般的な細菌株内で多くのキメラRNAを生成するためのスキャフォールドとしてtRNA(13〜15)およびrRNA(16)が用いられてきた。従って、組換えRNAキメラを単離され、構造分析および生物物理学的分析のために、対応するRNアーゼ(13,14)、リボザイム(15)、またはDNAザイム(16)によって、需要のある標的RNAが放出される可能性がある。これらの組換えRNA技術から、多量の組換えRNA(例えば、1L細菌培養物から数ミリグラムのRNAキメラ)を費用対効果が高く、かつ迅速に生成するための新規の手法が得られる。
【０１４２】
本発明者らは、tRNAスキャフォールドを用いて一般的な大腸菌株内でプレmiRNAキメラ(図1a)を生成することを先駆けて行った(17)。本発明者らは、細菌から単離した融合tRNA/プレmiRNAが、プレmiRNAがヒト細胞内で成熟miRNAに選択的にプロセシングされ、tRNAスキャフォールドがtRNA断片(tRF)に分解される「プロドラッグ」として働く可能性があると仮説を立てた。本研究において、本発明者らは、tRNA/プレmiRNAキメラの大部分は細菌内で蓄積しなかったか、またはごくわずかなレベルでしか蓄積しなかったことを証明した。従って、本発明者らは、関心対象の様々なタイプの機能的低分子RNA、例えば、miRNA、siRNA、およびRNAアプタマーを運ぶための多用途性を提供する、大腸菌内でキメラRNAを一貫して高収率で生成するための新規の最適なncRNAスキャフォールド(OnRS)ベースの戦略を開発した(図1b)。このアプローチは頑健なことが判明し、研究ツールとして利用され、さらに、治療剤および診断ツールとして開発される可能性のある、標的キメラRNAi作用物質およびRNAセンサーを作製することに幅広く利用されるものとする。
【０１４３】
材料および方法
細菌培養
大腸菌株を全て、100μg/mLアンピシリンを加えたLBブロス中で37℃で培養した。クローニングするためにDH5α(Life Technologies, Grand Island, NY)を使用し、何ミリグラムものキメラRNAを生成するためにHST08(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)を使用した。ncRNA発現/蓄積を評価するために、DH5α、Top10(Life Technologies, Grand Island, NY)、およびBL21(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)などの他の株も使用した。
【０１４４】
ヒト細胞培養
ヒト癌細胞株A549をAmerican Type Culture Collection(Manassas, VA)から購入し、ES-2/GFPをCell Biolabs(San Diego, CA)から購入した。両細胞株とも、37℃、5％CO2および95％空気を含む加湿雰囲気の中で、10％胎仔ウシ血清を含むRPMI 1640中で維持した。
【０１４５】
RNA二次構造の予測
キメラncRNAの二次構造を、CentroidFold(http://www.ncrna.org/centroidfold)(18)およびCentroidHomfold(http://www.ncrna.org/centroidhomfold)(19)を用いて予測した。
【０１４６】
プラスミドの構築
遺伝子特異的プライマー(IDT, San Diego, CA)を用いてヒトゲノムDNAから標的配列をPCR増幅した後に、本発明者らが報告したように(17)、個々のtRNA/プレmiRNA発現プラスミドをクローニングした。表1を参照されたい。OnRS/miR-124、OnRS/Neg、OnRS/GFP-siRNA、およびTrna-miR-155/GFP-siRNA発現プラスミドを作り出すために、オリゴヌクレオチド(表1)をアニールし、増幅し、次いで、アンプリコンを、エンドヌクレアーゼSalI-HF(登録商標)およびAatII(New England Biolabs, Ipswich, MA)で直線化したベクターpBSMrnaSeph(14)(Dr.Luc Ponchon, Franceの厚意により提供された)にクローニングした。OnRS/MGA5発現プラスミドおよびOnRS/MGA3発現プラスミドを構築するために、オリゴヌクレオチド(表1)を用いて標的配列を増幅するためのテンプレートとしてTrna/mir-34aを使用し、次いで、アンプリコンを、SacIIおよびEagI(New England Biolabs)で直線化したpBSMrnaSephベクターに挿入すると同時に、TrnaスキャフォールドからSEPHADEX(商標)アプタマーを取り除いた。インサートは全て、UC Davis Genome Centerにおいてサンガー配列決定分析によって確認した。
【０１４７】
（表１ａ）OnRSベースのキメラRNAの配列
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tRNAスキャフォールドの配列に下線を引いた。
残りの部分は、それぞれのプライム(prime)に約9nt隣接配列のあるhas-miR-34a前駆体である。
赤色の配列は標的配列を示し、緑色の部分は相補配列である。太字の配列はMGAを示す。
【０１４８】
（表１ｂ）プラスミド構築およびqPCR分析に使用したオリゴヌクレオチド
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【０１４９】
大腸菌内でのキメラRNAの発現
記載のように(13,14,17)、キメラRNAをHST08においてラージスケールで発現させた。全RNAをTris-HCl飽和フェノール抽出法を用いて大腸菌から単離し、NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いて定量し、変性尿素(8M)ポリアクリルアミド(8％)ゲル電気泳動(PAGE)で分析した。ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて全画像を取得した。バンドの強度を用いて、全RNAに存在する組換えncRNAの相対レベルを大まかに見積もった。
【０１５０】
組換えncRNAの精製
NGC QUEST 10PLUS CHROM高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)装置(Bio-Rad)を用いて組換えncRNAを精製した。UNO Q6陰イオン交換カラム(Bio-Rad)で全RNAから組換えncRNAを分離した。最初に、UNO Q6陰イオン交換カラム(Bio-Rad)を、緩衝液A(10mMリン酸ナトリウム、pH=7.0)を用いて流速5.0mL/minで0.5分間、平衡化した後に、同じ流速で0〜56％緩衝液B(緩衝液A+1M塩化ナトリウム)を0.5分、56％緩衝液Bを2分、56〜65％緩衝液Bを10分、次いで、100％緩衝液Bを2分、100〜0％緩衝液Bを0.5分、100％緩衝液Aを5分の勾配溶出を行った。FPLCトレースをUV/Vis検出器を用いて260nmでモニタリングした。ピーク面積を用いて、全RNA内での組換えncRNAの相対レベルを評価した。これは、尿素-PAGE分析によって確かめられた相対レベルと一致する。変性PAGEゲルで分析した後に、純粋なncRNAを含有する画分をプールした。組換えncRNAをエタノールで沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水で再構成し、次いで、脱塩し、Amicon ultra-2mL遠心分離フィルター(30KD; EMD Millipore, Billerica, MA)で濃縮した。唯一の例外は、10mM HEPES(pH=7.4)緩衝液で再構成したOnRS/MGAであった。NanoDropを用いて精製ncRNAの量を確かめ、他の実験の前にPAGE分析によって品質を検証した。
【０１５１】
低分子RNAのディープシークエンシングおよびデータ分析
Lipofectamine 2000(Life Technologies)を用いて、A549細胞を、FPLCで精製した50nMのOnRS/miR-124およびtRNA/mir-34a(OnRS)でトランスフェクトし、ES-2/GFP細胞をOnRS/NegおよびOnRS/GFP-siRNAでトランスフェクトした。トランスフェクトして48時間後に、Direct-zol RNA抽出キット(Zymo Research, Irvine, CA)を用いて全RNAを単離した。低分子RNAライブラリーを、Illumina Truseq(商標)Small RNA Preparation kit(Illumina, San Diego, CA)を用いて説明書に従って作製した。精製したcDNAライブラリーをIllumina Cluster Stationでのクラスター作製に使用し、次いで、Illumina GAIIxでベンダーの説明書に従って配列決定した。リアルタイム配列決定画像分析後のIllumina Sequencing Control Studioソフトウェアバージョン2.8(SCS v2.8)と、Illumina Real-Time Analysisバージョン1.8.70(RTA v1.8.70)によるベースコーリング(base-calling)を用いて、生の配列リード(40nt)を得た。抜き出した配列リードを、知的財産権によって保護されているパイプラインスクリプト(pipeline script)、ACGT101-miR v4.2(LC Sciences, Houston, TX)(20,21)に従うことで標準的な配列決定データ分析に使用した。細胞を3回再現して処理し、別々に配列決定した。
【０１５２】
逆転写定量リアルタイムPCR(RT-qPCR)
細胞を様々な用量の組換えncRNAでトランスフェクトし、特定の時点で回収した。Direct-zol RNA単離キット(Zymo Research)を用いて全RNAを単離し、NanoDrop 2000分光光度計を用いてRNA濃度を確かめた。NxGen M-MuLV逆転写酵素(Lucigen, Middleton, WI)を用いてRTを行い、qPCR分析を、記載のように(17,22)、定量RT-PCR Master mix(New England Biolabs)を用いてCFX96 TouchリアルタイムPCR装置(Bio-Rad)において行った。miRNAレベルをU74に対して基準化し、mRNAレベルをPPIAに対して基準化した。遺伝子特異的プライマーを表1に示した。各実験を3回再現して行い、各試料を2〜3回測定した。研究を繰り返した時に同様の結果が得られた。
【０１５３】
ウエスタンブロット
A549細胞を100nMのOnRS/miR-124またはOnRS/Negでトランスフェクトし、48時間後に回収した。完全プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche, Nutley, NJ)からなるRIPA溶解緩衝液(Rockland Immunochemical Inc., Limerick, PA)を用いて細胞溶解産物を調製した。タンパク質濃度を、BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いて求めた。全細胞タンパク質(40μg/レーン)を10％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜(Bio-Rad)に電気泳動により転写した。次いで、膜を、P-STAT-3、STAT-3に対する選択的抗体(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)またはGAPDHに対する選択的抗体(Santa Cruz Biotech Inc., Texas, TX)とインキュベートし、その後に、ペルオキシダーゼ抗ウサギ(Jackson ImmunoResearch Inc., West Grove, PA)または抗マウスIgG(Cell Signaling)とインキュベートした。次いで、膜をECL基質(Bio-Rad)とインキュベートし、ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)を用いて画像を取得した。細胞を3回再現して処理した。研究全体を繰り返した時に同じ結果が得られた。
【０１５４】
アポトーシスアッセイ
FACS Annexin Vアッセイキット(Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD, USA)を用いて製造業者のプロトコールに従ってアポトーシスアッセイを行った。簡単に述べると、A549細胞を100nMの組換えncRNAでトランスフェクトし、トランスフェクトして72時間後に回収し、アネキシンV-FITC結合体およびヨウ化プロピジウム溶液とインキュベートし、次いで、試料をFACScanフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA)で分析した。Flowjo(Ashland, OR)を用いてデータ分析を行った。細胞を3回再現して処理した。実験全体を繰り返した時に同様の結果が得られた。
【０１５５】
MTTアッセイ
A549細胞を20nMまたは100nMのキメラRNAでトランスフェクトした。トランスフェクトして72時間後に、本発明者らが以前に説明したように(23)、MTTを用いて細胞生存率を確かめた。細胞を3回再現して処理した。研究全体を繰り返した時に同様の結果が得られた。
【０１５６】
リアルタイム細胞増殖分析
A549細胞を8ウェルE-Plateに40,000/ウェルで播種し、24時間後に20nMまたは100nMの組換えncRNAで処理した。細胞増殖を、iCELLigenceシステム(ACEA Biosciences, San Diego, CA)を用いてモニタリングした。実験全体を3回繰り返した時に同様の結果が得られた。
【０１５７】
GFPのインビトロノックダウン
ES-2/GFP細胞を24ウェルプレートに8,000細胞/ウェルで播種し、24時間後に、FPLCで精製した5nMまたは15nMのキメラRNAでトランスフェクトした。トランスフェクトして24時間後、48時間後、および72時間後に、蛍光をOlympus IX81顕微鏡(Olympus, Center Valley, PA)を用いてモニタリングした。全画像を、同じ時間で同じ設定を用いて取得した。研究が終わったら、全RNAを細胞から単離し、GFP mRNAレベルおよびsiRNAレベルのRT-qPCR評価に供した。細胞を3回再現して処理した。実験全体を繰り返した時に同様の結果が得られた。
【０１５８】
GFPのインビボノックダウン
動物の処置は全てUC Davisの動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)による承認を受けた。6〜7週齢の雄GFP-トランスジェニック(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J)マウス(24)(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)に、in vivo-jetPEI(Polyplus-transfection Inc., New York, NY)で処方し、FPLCで精製したOnRS/Neg(N=3)またはOnRS/GFP-siRNA(N=4) 75μgを3日間連続して毎日i.v.注射した。最後に注射して3日後に、マウスを屠殺し、肝臓組織を収集した。Tissue-Tek O.C.T.(Sakura Finetek, Torrance, CA)に包埋した後に凍結切片(8μm)を調製し、Zeiss LSM 710 Scanning Device(Zeiss, Oberkochen, Germany)に連結しているZeiss Axio Observer.z1 Microscopeを用いて直接調べた。異なる一組の切片(8μm)を4％パラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)で固定し、1μg/mLの4',6-ジアミド-2-フェニルインドール(DAPI; Sigma-Aldrich)で染色した。GFP蛍光およびDAPIで染色した画像を共焦点顕微鏡で連続して記録し、次いで、一緒に合成した。
【０１５９】
さらに、肝臓組織のRNAを単離し、GFP mRNAレベルならびに18SおよびU74に対するsiRNAレベルのRT-qPCR分析をそれぞれ対照として使用した。遺伝子特異的プライマーを表1に示した。
【０１６０】
マラカイトグリーン(MG)アプタマー結合アッセイ
総体積100μLで、32μgの精製ncRNAまたは80μgの全RNAを、100mM KCl、5mM MgCl2、および10mM HEPES(pH=7.4)緩衝液に溶解した10μM MGとインキュベートした後に、SpectraMax Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて550nm〜700nmで吸光度スキャニングを行った。MG(10μM)の非存在下および存在下での精製ncRNA(32μg)または全RNA(80μg)について、蛍光強度を、同じSpectraMax Microplate Readerを用いて630/650nm(励起/発光)で確かめた。MG濃度およびMGA濃度に対するMGAに結合したMGの蛍光強度の直線性を確立するために、総体積100μLで、10mM HEPES(pH=7.4)緩衝液中で、2.08μMのOnRS/MGA5を0〜10μMのMGに曝露した時と、10μMを0〜5.2μMのOnRS/MGA5とインキュベートした時の蛍光強度を調べた。それぞれのアッセイを3回再現して行い、全実験を少なくとも1回繰り返し、同様の結果が示された。
【０１６１】
血清RNアーゼ活性アッセイ
IRBにより承認された、前向き研究で集められたUC Davis膵臓登録バンク(Pancreas Registry bank)からの血清標本を利用した。4時間の血液採取の間に血清は均一に処理され、アリコートされ、最小限の凍結融解サイクルを用いて使用するまで-80℃の冷凍庫の中に保管されている。10件の膵管腺癌(PDAC)(5件の初期PDAC(American Joint Committee of Cancer, ステージ1&2))および10件の良性/正常膵臓症例(5件の慢性膵炎および5件の正常膵臓)から合計20個の患者血清を選択した。PDAC症例は4人の男性とおよび6人の女性からなり、良性/正常は5人の男性と5人の女性からなった。年齢の範囲はPDACでは51〜80歳(平均=67y/o)であり、良性/正常群では37〜85歳(平均=60y/o)であった。正常プールヒト血清試料(Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)、ヒト組換えRNアーゼA(Novoprotein, Summit, NJ)、およびヒト組換えアンジオゲニン(R&D Systems, Minneapolis, MN)を方法の開発に使用した。
【０１６２】
ヒト血清に曝露した後のインキュベーション時間(0〜30分)に関連した、MGAに結合したMGの蛍光強度の変化を評価するために、総体積90μLで、2.08μMのOnRS/MGA5を、10mM HEPES(pH=7.4)緩衝液に溶解した正常プールヒト血清0.4μLまたは2.0μLとインキュベートし、次いで、最終濃度10μMになるように10μLのMGを添加した後に蛍光を確かめた。in vivo-jetPEIによるMGAの保護を評価するために、2.08μM OnRS/MGA5と1.0μLプールヒト血清を0〜60分間インキュベートした。用量反応を確かめるために、様々な体積のプールヒト血清(0.01〜10μL)または様々な濃度の組換えヒトRNアーゼA(0〜10-4μg/μL)およびアンジオゲニン(0〜10-2μg/μL)を2.08μM OnRS/MGA5と10分間インキュベートした。RNアーゼ阻害剤の影響を明らかにするために、プールヒト血清(0μL、1μL、2μL、および5μL)を、0.4U/μL RNアーゼ阻害剤(Lucigen, Middleton, WI)と共に、または伴わずに2.08μM OnRS/MGA5と10分間インキュベートした。それぞれのインキュベーション反応を3回再現して行い、全実験を少なくとも1回繰り返し、首尾一貫した発見が得られた。
【０１６３】
MG濃度およびMGA濃度、インキュベーション時間、ならびにヒト血清量にわたる蛍光強度の直線性に基づいて、0.4μLの患者血清試料を、総体積90μLで、10mM HEPES(pH=7.4)緩衝液に溶解した2.08μM OnRS/MGA5と37℃で5分間インキュベートし、次いで、630/650nm(励起/発光)での蛍光を確かめるために、最終濃度10μMになるように10μLのMGを添加した。血清RNアーゼ活性を、時間および血清試料量に対する蛍光強度の変化、すなわち、ΔA.U./min/μLとして計算した。それぞれの患者試料を<10％のばらつきで2回アッセイした。
【０１６４】
統計解析
値は平均±SDで表した。群の数および分散に応じて、データを独立スチューデントt検定または一元配置ANOVAもしくは二元配置ANOVA(GraphPad Prism, San Diego, CA)で分析した。P値が0.05未満である場合に(P<0.05)、差が有意であるとみなした。
【０１６５】
結果
組換えRNAi作用物質を高収率で生成するためにOnRSを開発する
本発明者らは、tRNA融合プレmiRNA(tRNA/mir)作用物質を一般的な細菌株内でラージスケールで、すなわち、1L細菌培養物から何ミリグラムもの組換えncRNAを生物工学によって作製しようと考えた(図1a)。一連のプラスミドを作り出し、大腸菌の形質転換に使用した。驚いたことに、本発明者らは、同じtRNAスキャフォールドを使用した時に、HST08大腸菌内で発現/蓄積した組換えプレmiRNAキメラのレベルは大きく異なることを見出した。残念なことに、tRNA/プレmiRNAキメラの大部分は蓄積しなかったか、またはごくわずかなレベルで蓄積した(図1a)。他の大腸菌株を用いても、標的ncRNAキメラは得られなかったか、またはさらに低いレベルの標的ncRNAキメラが得られた。そうではあるが、tRNA/mir-34aが細菌内で高レベル(例えば、全RNAの約15〜20％)まで蓄積し、キメラtRNA/mir-34aが様々なタイプのヒト癌細胞内で安定しており、成熟has-miR-34aに選択的にプロセシングされたという発見を考えて、本発明者らは、tRNA/mir-34aが、標的miRNAの一貫した高レベルでの生成に向けた、tRNAスキャフォールドより優れたOnRSとして開発される可能性があると仮説を立てた(図1b)。
【０１６６】
従って、本発明者らは、OnRS(tRNA/mir-34a)プラットフォームを用いてmiR-124を組み立てる挑戦に応じた。miR-124はmiR-34aとはサイズの点で(20nt対22nt)、および起点アーム(arm of origin)の点で(3'対5')大きく異なることに留意されたい。本発明者らは22nt miR-34a-5pを20nt miR-124-3pと交換し、それに応じて、これらの相補配列を置換した(表1)。これにより、実際に、HST08大腸菌内でOnRS/miR-124キメラの高レベル発現が得られた(図1b)。次いで、組換えOnRS/miR-124を、陰イオン交換FPLC法を用いて高度(>99％)に均一になるまで容易に精製した(図1c)。同様に、OnRSは他のmiRNA(例えば、21nt miR-27bおよび22nt miR-22など)ならびに22ntスクランブルRNA配列(キメラRNAをOnRS/Negと名付け、以下の研究において対照として使用した;表1)を組み立てることができた。これらは全て、HST08大腸菌内で高収率かつラージスケールで一貫して生成された。すなわち、全RNAの中で>15％のOnRS/miRNAと、0.5L細菌培養物から>1.5mgのFPLC精製OnRS/miRNAが常に生成された。
【０１６７】
さらに、本発明者らは、このOnRSベースのアプローチを利用して、1L大腸菌培養物で何ミリグラムもの機能的siRNA作用物質を生成できるかどうかを評価した。キメラOnRS/GFP-siRNAを組み立てるためのモデルsiRNAとして22nt GFP siRNA(25)を選択した(表1)。tRNA/mir-155を担体として利用した時に細菌内で最小レベルの蓄積があったこととは対照的に、OnRS(tRNA/mir-34a)を用いることによって、OnRS/GFP-siRNAは一貫して高レベルで発現し(図1b)、組換えncRNAのFPLC精製が容易になった(図1d)。結果として、本発明者らは、0.5L細菌培養物から1.5〜2.0mg、純度が>98％のOnRS/GFP-siRNAをいつも生成することができた。これらの結果から、OnRSベースのプラットフォームを用いて、細菌内でキメラncRNAを一貫して高レベルで生成することによって標的miRNA/siRNA作用物質を組み立てることができることが分かる。
【０１６８】
ヒト細胞内でキメラncRNAから標的miRNA/siRNAが選択的に放出されるのに対して、tRNAスキャフォールドはtRNA断片(tRF)にプロセシングされる
次に、本発明者らは、ヒト細胞内でOnRS/miR-124から成熟miR-124を選択的に生成できるかどうかを評価した。OnRS/miR-124およびOnRS(tRNA/mir-34a)でトランスフェクトした48時間後にヒト肺癌A549細胞から低分子RNAライブラリーを調製した後に、アンバイアスドディープシークエンシング研究を行った。データから、OnRS/miR-124はA549細胞内で多数(リード数5,613±975)の20nt miR-124に選択的にプロセシングされたことが分かった(図2a)。対照的に、実際に22nt miR-34aを提供するtRNA/mir-34a(OnRS)で処理したA549細胞内で特定した成熟miR-124のリード数は0±1であった。長さが21ntのアイソフォームを含む他のmiR-124アイソフォームならびにいくつかのパッセンジャー鎖も非常に低いレベルだか認められた。さらに、OnRS/miR-124は、has-mir-34a-p3断片を含む他の細胞miRNAに影響を及ぼさなかったか、または比較的かなり小さな影響を及ぼした(図2a)。その一方で、tRNAスキャフォールドはtRFに分解された。このtRFは、OnRS/miR-124で処理した細胞とtRNA/mir-34aで処理した細胞との間で類似したパターンを実際に示した(図2c)。
【０１６９】
同様に、本発明者らは、FPLCで精製したOnRS/GFP-siRNAおよびOnRS/Negでトランスフェクトして48時間後に、ヒトES-2/GFP細胞において細胞低分子RNAのアンバイアスドディープシークエンシング分析を行った。データから、キメラOnRS/GFP-siRNAで処理したES-2/GFP細胞のGFP-siRNAレベルは対照OnRS/Negの約1,000倍であることが分かった(図2b)。これは主に22ntアイソフォーム、23ntアイソフォーム、および21ntアイソフォームの増加に起因し、低レベルのパッセンジャー鎖が伴った。OnRS/Negは、実際には、非常に低レベルであるが、長さが22〜23ntの多くのスクランブルRNAにプロセシングされたことも認められた。これは、スクランブルRNAの低い安定性または不十分なプロセシングと関連しているのかもしれない。そうではあるが、OnRS/GFP-siRNAで処理した細胞とOnRS/Negで処理した細胞との間で他の細胞miRNAレベルには差が無かったか、またはほとんど差が無かった。さらに、ES-2/GFP細胞の全tRFレベルがA549細胞よりかなり少なかったのにもかかわらず、tRFパターンもOnRS/GFP-siRNAで処理した細胞とOnRS/Negで処理した細胞との間で似ていた(図2d)。まとめると、これらの結果から、キメラncRNAが細菌内で高収率で生成された後に、標的miRNAおよびsiRNAをヒト細胞に「ステルス送達(stealth delivery)」するためのOnRSの有用性と、OnRS/siRNA活性を評価するための対照としてのOnRS/Negの使用が裏付けられた。
【０１７０】
OnRSによって運ばれるmiR-124は標的遺伝子発現および癌細胞プロセスの制御において生物学的/薬理学的な活性を有する
次いで、本発明者らは、miR-124が発癌性のシグナル伝達性転写因子(signal transducer and activator of transcription)3(STAT3)などの多くの標的遺伝子を調節し、アポトーシスを増強し、細胞増殖を阻害することが知られているので(26-28)、OnRSによって運ばれるmiR-124の生理活性を評価した。ディープシークエンシングデータと一致して、選択的なステム-ループRT-qPCR分析から、A549細胞においてOnRS/miR-124でトランスフェクトした後1日目〜4日目に、成熟miR-124レベルはOnRS/Negと比較して約1000倍多いことが分かった(図3a)。OnRS/miR-124で処理したA549細胞においてmiR-124が増加したことでSTAT3タンパク質レベルは60％低減し(図3b)、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスならびに壊死の程度は1〜2倍になった(図3c)。結果として、OnRS/miR-124は、MTTアッセイにより証明された時に、およびReal-Time Cell Analyzerを用いた時にOnRS/Negより有意に大きな抗増殖活性を示した(図3d〜3e)。これらの結果から、キメラOnRS/miR-124は細胞内で成熟miR-124にプロセシングされた後に、miR-124標的遺伝子の発現調節および癌細胞の増殖制御において生物学的/薬理学的な活性を有することが証明された。
【０１７１】
OnRSによって運ばれるGFP siRNAはインビトロおよびインビボでGFP発現をノックダウンするのに有効である
本発明者らはまた、GFP発現ES-2細胞およびGFP-トランスジェニックマウスモデルを用いて、OnRSによって運ばれるGFP siRNAの有効性も評価した。ES-2/GFP細胞において、トランスフェクションの72時間後に、OnRS/GFP-siRNAはGFPの蛍光強度およびmRNAレベルを有意に抑制した(図4a〜4b)。これはGFP siRNAレベルの3桁の増加と関連付けられた(図4c)。次いで、本発明者らは、GFP-トランスジェニックマウス(24)を、in vivo-jetPEIで処方したOnRS/GFP-siRNAで処置した。in vivo-jetPEIで処方した同じ用量のOnRS/Negで処置したGFP-トランスジェニックマウスと比較して、OnRS/GFP-siRNAで処置したGFP-トランスジェニックマウスの肝臓GFP蛍光強度(図4d〜4e)およびmRNAレベル(図4f)は著しく低下した。これはGFP siRNAレベルの3,000倍を超える増加と結び付けられた。これらのデータから、OnRS担持物(cargo)を用いてラージスケールで生成されたキメラGFP-siRNAはインビトロおよびインビボでのRNAi用途のための効果的な作用物質であることが分かる。
【０１７２】
活性のあるRNAアプタマーキメラを細菌内で高レベルで生成するためのOnRSの有用性
これらの発見により勇気付けられて、さらに、本発明者らは、機能的RNAアプタマーを生成するOnRSの潜在的な用途に挑んだ。マラカイトグリーンアプタマー(MGA)(9)をモデルアプタマーとして選択し、miR-34aの5'および3'に挿入して、それぞれ、OnRS/MGA5およびOnRS/MGA3を得た(図6a)。両キメラとも、細菌内で驚くほど高いレベル、すなわち、全RNAの中で50％超のOnRS/MGAで発現することが明らかになった(図6b)。従って、本発明者らは、FPLC(図6c)を用いて、0.5Lの細菌培養物から単離した15〜20mgの全RNAから5〜6mgのOnRS/MGAをいつも簡単に精製することができた。
【０１７３】
MGA(9)の報告された特性と一致して、本発明者らは、標識のないキメラOnRS/MGAセンサーが結合するとMGの最大吸光度の波長が618nmから630nmにシフトすることを見出した(図6d)。興味深いことに、FPLCで精製したOnRS/MGAまたはOnRS/MGA発現細菌から単離した全RNAを用いると同じ波長シフトが生じたのに対して、SEPHADEX(商標)アプタマー(OnRS/Seph)および対応する全RNAでは波長シフトが生じなかった。このことはMGA-MG相互作用の選択性を示している。OnRSによって運ばれるMGAの機能は、MGが結合した時の630/650nm(励起/発光)での強力な蛍光強度によってさらに証明された(図6e)。対照的に、標識のないOnRS/MGAそれ自体は蛍光を全く示さず、MGAを含有しない全RNAおよびHPLCで精製したOnRS/Sephの非存在下または存在下では最小基礎レベルのMG蛍光強度しか示されなかった(図6e)。このことから、MGAに結合したMGの蛍光の特異性が裏付けられた。これらの結果から、OnRSは関心対象の機能的RNAアプタマーを高収率で生成するのにもよく効くことが証明された。
【０１７４】
ヒト膵臓癌患者間で血清RNアーゼ活性を確かめるための、標識のないOnRSによって運ばれるマラカイトグリーンアプタマーセンサーの適用
蛍光を発する際のMGAに結合したMGの独特の特徴を考えて、本発明者らは、さらに、OnRS/MGAベースのRNアーゼ活性アッセイを開発し、膵臓癌患者が非常に高い血清RNアーゼ活性をもつことが示されたので(29)、標識のないキメラOnRS/MGAを用いて血清RNアーゼ活性を調べ、ヒトPDAC患者と良性(慢性膵炎を含む)患者/正常患者との間で比較した。蛍光強度はMG濃度と共に増加し、OnRS/MGA濃度が2.08μM(すなわち0.16μg/μL)に固定された時に10μM MGでほぼプラトーに達したのに対して、MG濃度が10μMに固定された時に0.04〜5.2μM OnRS/MGAについて良好な直線範囲が示された(図7a)。予想通り、OnRSによって運ばれるMGAが正常プールヒト血清試料中のRNアーゼによって切断された時に、OnRS/MGAに結合したMGの蛍光強度は時間が経つにつれて減少し(図7b)、応答はヒト血清の用量に依存したのに対して(図7c)、血清そのものには蛍光は全くなかった。実際に、in vivo-jetPEIを用いると、時間が経つにつれて蛍光強度が減少がすることがうまく妨げられ、RNアーゼ阻害剤を添加すると血清RNアーゼによるOnRS/MGAの切断が完全にブロックされた。これらのデータから、OnRS/MGAはRNアーゼ活性を直接確かめるのに利用される可能性があることが分かる。
【０１７５】
キメラncRNAを切断する際のRNアーゼA(ヒト血清中で主要な形態のRNアーゼ)の役割を明らかにするために、本発明者らは、cDNAから発現したRNアーゼAおよびアンジオゲニン(RNアーゼ5)に対する、OnRSによって運ばれるMGAの感受性を直接比較した。MGAに結合したMGの蛍光強度の変化の程度によって明らかにされたように、2.08μM OnRS/MGAは5.0x10-5μg/μL RNアーゼAによって10分で完全に切断されたが、500倍の濃度(0.01μg/μL)のアンジオゲニンでは30分で40％のOnRS/MGAしか分解されなかった。RNアーゼAはヒト血清中のRNアーゼの主要な形態であるので(30)、このアッセイは、主に、ヒト血清中の膵臓由来RNアーゼA活性を示しているのだろう。従って、本発明者らは、OnRS/MGAを利用して、PDAC患者および良性/正常患者から前向き研究で集められた一組の血清試料におけるRNアーゼ活性を評価した。データから、PDAC患者の血清RNアーゼ活性(ΔA.U./min/μL)(196±22)は良性/正常患者(118±8)より有意に(P<0.01)高いことが分かった。これらの結果は、OnRSプラットフォームを用いて生成されたキメラMGAセンサーがRNアーゼ活性を確かめるのに有用である可能性があることを示している。
【０１７６】
考察
一般的な大腸菌株の1L培養物において関心対象の様々なタイプの低分子RNAを積んでいる数ミリグラムから数十ミリグラムのキメラncRNAを一貫して、費用対効果が高く生成するための一般的なアプローチが確立した。このプラットフォームで用いられるOnRSは、細菌内での核酸分解消化に対して耐性があるtRNA融合プレmiRNA-34aをベースとしており、従って、陰イオン交換FPLC法を用いて簡単に精製するために有意に高レベル(例えば、全RNAの>15％)まで蓄積した。OnRS担持物におけるmiR-34a-5p/miR-34a-3p二重鎖は、この報告において0.5L細菌培養物から>1.5mgのOnRS/miR-124、OnRS/GFP-siRNA、および対照OnRS/Negキメラを首尾よく生成することによって例示されるように、対応するキメラsiRNAまたはmiRNA作用物質を高収率で生成するためにsiRNAまたはmiRNA/miRNA*二重鎖などの任意の標的二本鎖低分子RNA(図1b)によって交換することができる。さらに、アプタマーキメラを提供するためにRNAアプタマーなどの一本鎖低分子RNAがOnRS上の特定の部位に生じてもよい(図5a)。これは、OnRS/MGA5センサーおよびOnRS/MGA3センサーを組み立てることによってうまく証明されている。OnRSベースのプラットフォームの頑健性および多用途性は他の標的RNA作用物質(例えば、miR-27b、miR-22、および血管内皮増殖因子(VEGF)アプタマーなど)を首尾よく生成することでも裏付けられたが、生体内変換の場合は触媒RNA(リボザイム)、ゲノム編集の場合はガイドRNA(gRNA)などの他のタイプの生物学的RNAを生物工学によって作製する用途のために、さらなる調査が正当化される。
【０１７７】
キメラOnRS/miRNAおよびOnRS/siRNAは標的RNAi作用物質を細胞に「送達」するための「プロドラッグ」として働くことができる。実際に、アンバイアスドディープシークエンシング研究によって確かめられた時に、これらはヒト細胞内で多数の標的miRNAおよびsiRNAに選択的にプロセシングされた(図2a〜2b)。OnRS/NegからはスクランブルRNAがプロセシングされた。キメラncRNAで処理したヒト細胞およびビヒクルで処理したヒト細胞の中に、5'または3'にある1ntまたは2ntの点で異なる低分子RNAアイソフォームが存在することは、プレmiRNAまたはshRNAから低分子RNAを生成する際のエンドリボヌクレアーゼの融通性を示しているのかもしれない(31-33)。結果として、選択的なステム-ループRT-qPCRアッセイから、A549細胞においてmiR-124が3桁増加し、ES-2/GFP細胞においてGFP siRNAが3桁増加したことが明らかになった。これらの結果はまた、ヒト細胞内でのtRNA/mir-34aキメラ安定性についての本発明者らの発見ともよく一致している。すなわち、標的低分子RNAレベルの増加は、処理後4日と長く続く高レベルのOnRSキメラと関連付けられた。このことは、ヒト細胞内でのOnRSキメラの好ましい安定性を強調している。他方で、他の細胞miRNAのレベルは変化しなかったか、またはわずかに変化し、tRNA由来tRFは同じヒト細胞株において同様のパターンを示した(図2c〜2d)。そうではあるが、ES-2/GFP細胞において特定した個々のtRFまたは全tRFのレベルはA549細胞よりかなり少なかった。このことは、おそらく、様々なタイプの細胞におけるtRFの作製、分解、排出、および/または保持の差によるものである。さらに、ヒト細胞内のキメラncRNA作用物質に由来する標的miRNA/siRNA、tRF、および他の低分子RNAは完全に解明されたが、このプロセスにおけるダイサーなどの特異的リボヌクレアーゼの役割はまだ明らかにされていない。
【０１７８】
OnRS担持物から放出されたmiRNA(図3)およびsiRNA(図4)の生理活性は、対照としてOnRS/Negを用いて、インビトロおよびインビボで対応する標的遺伝子発現を選択的に抑制することによって、はっきりと証明された。公知のmiR-124標的遺伝子である転写因子STAT3(27,28)は細胞増殖およびアポトーシスなどの多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。miR-124によってSTAT3タンパク質の発現レベルが低減したことは、少なくとも部分的に、A549細胞のアポトーシスが増強され、増殖が抑制されたことの説明となるかもしれない(図3)。他方で、OnRSで送達されたGFP siRNAによって、GFP発現ES-2/GFP細胞およびGFP-トランスジェニックマウス肝臓組織においてGFP mRNA発現レベルが抑制されたことはGFP蛍光強度が低いことの説明となる(図4)。RNAiを実現するために組換えDNA作用物質、合成RNA、および組換えRNAを用いる利点と欠点は間違いなく議論の主題であるが、OnRSベースの技術を用いると、研究室の場において何ミリグラムものキメラmiRNAおよびsiRNA作用物質を容易に、かつ費用対効果が高く生成する新たな機会が得られ、インビトロおよびインビボでRNAの働きをする生物学的RNAを利用することが可能になる。そうではあるが、既存の薬剤または方法と比較した、OnRSによって運ばれるRNAi作用物質の相対的な選択性、効率、および安全性の、さらに大規模な評価が待ち構えている。
【０１７９】
OnRSの有用性を、RNAアプタマーを一貫して高収率で生成することまでさらに広げた。アプタマー活性がtRNA(13-15)および5S rRNA(16)スキャフォールドに依然として存在するかどうかはアプリオリ(a priori)に分からないが、生成しようとする標的RNAと一緒にハンマーヘッド型リボザイム配列を挿入した時に、tRNAスキャフォールドの状況ではリボザイム活性が観察された(15)。実際に、最初に発見されたように(9)、OnRSに似ているRNAアプタマーMGAセンサーはMGと相互作用して、630/650nm(励起/発光;図5e)で特異的で強力な蛍光を発した。さらに、これを、臨床試料中の血清RNアーゼ活性を確かめるために使用した(図7e)。本研究において開発した、標識のないMGAセンサーを用いたRNアーゼ活性アッセイは現行の方法とは異なる。クニッツRNアーゼ活性アッセイ(29,34-36)は、比較的、選択性および感受性が低い、260nmでの標識のない核酸の紫外線吸光度または280nmでのヌクレオシドの紫外線吸光度に基づいている。市販キットを含む最近のRNアーゼ活性アッセイおよび現行のRNアーゼ活性アッセイは同位体またはフルオロフォアで標識したRNAまたは抗体に頼り(37-40)、従って、非常に低いレベルのRNアーゼ活性を確かめるか、またはRNアーゼタンパク質レベルを示すために高い感受性を提供する。しかしながら、ヒト血清は、かなり高いRNアーゼ活性で構成される。直線範囲を含むRNアーゼ活性アッセイに影響を及ぼす可能性がある血清試料を大規模に(例えば、1:1,000)希釈しなければ、もっと多い量(例えば、>10μg)の標識合成RNA作用物質が必要となり、従って、このアッセイは高価になる。MGおよびOnRS/MGAの濃度とヒト血清量およびインキュベーション時間に関連した直線性を注意深く調べた後に、本発明者らは、標識のないOnRS/MGAセンサーを用いて、蛍光ベースのRNアーゼアッセイを確立することができた。以前の発見(29,36,38)と一致して、本発明者らのアッセイから、PDAC患者において、膵臓癌から放出された、主要な形態であるRNアーゼAに起因する可能性がある、有意に高い血清RNアーゼ活性が明らかにされた。
【０１８０】
要約すると、本発明者らは、一般的な大腸菌株内で、miRNA、siRNA、およびRNAアプタマーなどの関心対象の機能的低分子RNAを運ぶキメラRNAを一貫して高収率で生成するための新規のOnRSベースの一般的アプローチを提示した。このアプローチは頑健であり、かつ用途が広いことが判明し、インビトロおよびインビボでの研究ツールとして利用され、さらに、診断剤および治療剤として開発される可能性のあるキメラncRNAを作製する幅広い用途があるものとする。
【０１８１】
実施例1の参考文献
2017524341.tif 000025
2017524341.tif 000026
2017524341.tif 000027
2017524341.tif 000028
【０１８２】
実施例2
大腸菌内で効率的に生合成されたキメラMir-1291はヒト癌細胞における標的遺伝子の発現を低減させ、化学療法感受性を改善する効果がある
本実施例は、同じtRNAスキャフォールドを用いた、一般的な大腸菌株内でのキメラプレmiR-1291の高収率発現を証明する。次いで、tRNA融合プレmiR-1291(tRNA/mir-1291)を、アフィニティクロマトグラフィーを用いて高度に均一になるまで精製し、その一次配列および転写後修飾を質量分析によって直接、特徴付けた。キメラtRNA/mir-1291は、ヒト癌MCF-7細胞およびPANC-1細胞において成熟miR-1291に容易にプロセシングされた。結果として、組換えtRNA/mir-1291は、同じ用量の対照tRNAスキャフォールド(tRNA/MSA)でトランスフェクトした細胞と比較して、ATP結合カセット輸送体ABCC1、およびフォークヘッドボックス(forkheadbox)タンパク質FOXA2、およびメチルCpG結合タンパク質MeCP2を含むmiR-1291標的遺伝子のタンパク質レベルを低減させた。さらに、tRNAによって運ばれるプレmiR-1291はMCF-7細胞およびPANC-1細胞の増殖を用量依存的に抑制し、ドキソルビシンに対するABCC1過剰発現PANC-1細胞の感受性を有意に増強した。これらの結果から、組換えmiR-1291作用物質は標的遺伝子発現および化学療法感受性の調整に有効であることが分かる。このことから、ファーマコエピジェネティクス(pharmacoepigenetics)研究のための新たなncRNA作用物質を高収率で生物工学によって作製することへの洞察が得られる可能性がある。
【０１８３】
序論
薬物処分および細胞増殖を含む様々な細胞プロセスの制御において、ゲノムにコードされる機能的なノンコーディングRNA(ncRNA)、例えば、マイクロRNA(miRNAまたはmiR)および長鎖ノンコーディングRNAが発見されたことで、細胞内の「遺伝子」についての知識が広がった。ATP結合カセット(ABC)排出輸送体(efflux transporter)(例えば、ABCC1、ABCC2、ABCC4、およびABCG2)の発現を負に調節する、いくつかのmiRNA(例えば、miR-519c、-328、-326、-379、-1291、および-124)(To et al., 2008; Pan et al., 2009; Liang et al., 2010; Haenisch et al., 2011; Pan et al., 2013; Markova and Kroetz, 2014)は抗癌剤に対するヒト癌細胞の感受性を改善するのに用いられる可能性がある。さらに、腫瘍組織において調節不全になっている多数の発癌性miRNAが、腫瘍進行を管理するために直接、標的化される可能性がある(Trang et al., 2008; Bader et al., 2010)。これらのアプローチは、実際に、miRNAファーマコエピジェネティクスの理解の改善および新規のmiRNAベースの療法の開発に向けて盛んに研究されている。
【０１８４】
しかしながら、多量の安価な、かつ天然のmiRNA作用物質を生成する効率的な方法が無いことで、miRNAファーマコエピジェネティクスおよびmiRNA療法についての研究は妨げられている。広く用いられているウイルスまたは非ウイルスベクターベースのmiRNA発現系ではRNAではなくDNA作用物質が用いられる。このアプローチは、細胞質miRNA機構に入る前にDNAをmiRNA前駆体に転写させるために宿主細胞または宿主生物に頼る。miRNA作用物質の他の主要なグループはmiRNA模倣物、前駆体、およびアンタゴmirからなり、これらは全て化学合成を介して生成される。オリゴヌクレオチドの有機合成が自動化される可能性があるが、インビボ研究のための計画された用量のmiRNA模倣物または前駆体は非常に高価である。人工miRNA模倣物が、半減期が長いなど、いくつかの好ましい薬物動態学的特性を示していても、化学修飾によって、miRNAの構造、フォールディング、生物学的活性、および安全性プロファイルがどの程度まで変わるのかということもはっきりと分からない。インビトロ転写が標的RNA作用物質を生成するのに用いられる場合があるが、通常、インビトロ転写ではRNA分子は試験管内でマイクログラムスケールで生成され、さらに多量のRNAを生成するには、もっと多くの高価なRNAポリメラーゼが必要となる。最近、tRNAおよびrRNAが細胞内で安定したRNA分子として存在するという事実を考えて、tRNA (Ponchon and Dardel, 2007; Ponchon et al., 2009; Nelissen et al., 2012)およびrRNA(Liu et al., 2010)が、構造分析および生物物理学的分析のために組換えRNAを生合成するためのスキャフォールドとして首尾よく用いられている。この組換えRNA技術から、多量の組換えRNA(例えば、1L細菌培養物から数ミリグラムの標的RNA)を費用対効果が高く、かつ迅速に生成するための新規の手法が得られる。
【０１８５】
miRNAの働きをする天然miRNA作用物質を生成する試みの中で、本発明者らは、ヒト細胞内での薬物代謝調整におけるmiR-27b機能を研究するために、tRNAスキャフォールドを用いてキメラプレmiR-27b(tRNA/mir-27b)作用物質を大腸菌内で生成できることを証明した(Li et al., 2014)。しかしながら、組換えtRNA/mir-27bの収率は極めて低い(例えば、全RNAの中で<2％のキメラtRNA/mir-27b)。本明細書において、本発明者らは、同じtRNAスキャフォールドを用いて様々な長さのヒトプレmiR-1291キメラを組み立てることができ、一般的な大腸菌株HST08において、長さが約120ntのプレmiR-1291について、かなり期待された高レベル発現(例えば、全RNAの中で>10％の融合tRNA/mir-1291)が特定され、比較的あまり理解されていないmiR-1291の機能を調べるのにプレmiR-1291が用いられる可能性があることを示す(Pan et al., 2013; Bi et al., 2014)。Sephadexアプタマーでタグ化した組換えtRNA/mir-1291をアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、転写後修飾の特徴付けを含む質量分析法(MS)ベースの研究によってマッピング/配列決定した。さらに、キメラtRNA/mir-1291は、ヒト癌MCF-7細胞およびPANC-1細胞において成熟miR-1291にプロセシングされた。対照tRNAスキャフォールド(tRNA/MSA)と比較して、tRNA/mir-1291はmiR-1291標的遺伝子(例えば、ABCC1)のタンパク質発現レベルを低減させ、抗癌剤ドキソルビシン(輸送体ABCC1の既知の基質)に対するABCC1過剰発現ヒト癌細胞の感受性を増加させた。これらの発見から、ファーマコエピジェネティクス研究および治療研究のための組換えmiRNA作用物質の開発への洞察が得られた。
【０１８６】
材料および方法
化学物質および材料
ドキソルビシンをLC Laboratories(Woburn, MA)から購入した。Lipofectamine 2000、トリゾル試薬、およびBCA Protein Assay KitをThermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA)から購入した。RIPA溶解緩衝液をRockland Immunochemical(Limerick, PA)から購入し、完全プロテアーゼインヒビターカクテルをRoche Diagnostics(Mannheim, Germany)から購入した。メチルCpG結合タンパク質2(MeCP2)に対する抗体をCell Signaling(Danvers, MA)から購入し、ABCC1およびフォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)に対する抗体をAbcam(Cambridge, MA)から購入し、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対する抗体をSanta Cruz Biotechnologies(Santa Cruz, CA)から購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗ウサギまたは抗マウス二次抗体をJackson Immuno-Research Laboratories(West Grove, PA)から購入した。ECL基質およびPVDF膜をBio-Rad(Hercules, CA)から入手した。他の全ての化学物質および分析グレードの有機溶媒をSigma-Aldrich(St.Louis, MO)またはThermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA)から購入した。
【０１８７】
RNA二次構造の予測
Sephadexアプタマーでタグ化したメチオニル-tRNAスキャフォールド(tRNA/MSA)、プレmiRNA、およびキメラRNA(図11A)の二次構造を、CentroidFold(http://www.ncrna.org/centroidfold)およびCentroidHomfold(http://www.ncrna.org/centroidhomfold)を用いて予測した。  
【０１８８】
プラスミドの構築
tRNAスキャフォールドを用いてプレmiR-1291(図11A)を発現させるために、123ntプレmiR-1291をコードするDNA断片、164ntプレmiR-1291をコードするDNA断片、および197ntプレmiR-1291をコードするDNA断片を、それぞれ、プライマー
2017524341.tif 000029
を用いてPCR増幅し、次いで、制限エンドヌクレアーゼSalIおよびAatII(New England Biolabs, Ipswich, MA)で直線化したベクターpBSMrnaSeph(Universite Paris Descartes, FranceのDr.Luc Ponchonの厚意により提供された)(Ponchon and Dardel, 2007; Ponchon et al., 2009)(図11B)にクローニングした。インサートは全てサンガー配列決定分析によって確認した。
【０１８９】
大腸菌内でのキメラRNAの発現
記載のように(Ponchon and Dardel, 2007; Ponchon et al., 2009; Li et al., 2014)、tRNA/mir-1291キメラおよび対照tRNA/MSAを発現させた。簡単に述べると、新鮮に形質転換したHST08大腸菌細胞(Clontech, Mountain View, CA)を100μg/mLのアンピシリンを含有するLB寒天プレートにプレートした。37℃で一晩増殖させた後、シングルコロニーをつついて、100μg/mLのアンピシリンを含有するLB培地5mLを含む一晩培養物に37℃で接種した。ラージスケールRNA発現のために、新鮮な形質転換体を100μg/mLのアンピシリンを含有するLB培地1Lに入れて37℃で一晩、直接インキュベートした。全RNAを、Tris-HCl飽和フェノール抽出法を用いて細菌から単離し、NanoDrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を用いて定量し、変性尿素(8M)ポリアクリルアミド(8％)ゲル電気泳動(PAGE)で分析して、組換えncRNAの発現を調べた。
【０１９０】
組換えncRNAの精製
報告されたように(Ponchon and Dardel, 2007; Ponchon et al., 2009)、わずかな変更を加えて、Sephadexアプタマータグからなる組換えncRNAを精製した。簡単に述べると、1グラムのSephadex G-100ビーズ(Sigma-Aldrich)を、50mMリン酸カリウム、5mM MgCl2、および100mM NaCl、pH7.5からなる緩衝液A 10mLの中で90℃で5時間インキュベートし、次いで、緩衝液Aで2回洗浄した後に使用した。大腸菌細胞ペレットを超音波処理し、10,000gで10分間、遠心分離することによって細胞破片を除去した。上清をSephadexカラムにロードし、緩衝液Aで3回洗浄し、50mg/mL可溶性デキストランB512(平均分子量9,000〜11,000Da, Sigma-Aldrich)からなる緩衝液Aで溶出させた。Ultra-0.5mL遠心分離フィルター(tRNA/MSAの場合30KD 、tRNA/mir-1291の場合50KD; Millipore, Billerica, MA)を用いて緩衝液を交換することでデキストランを除去した。変性PAGEゲルで分離した後のバンド強度に基づいて、単離したRNAの純度を推定し、NanoDropによって量を求めた。精製した組換えRNAをDEPC処理水に溶解して-80℃で保管した後に、さらに分析した。
【０１９１】
エレクトロスプレーイオン化-質量分析法(ESI-MS)によるインタクトな組換えncRNAの分析
インタクトなncRNAをESI-MS分析するために、以前に述べられた手順(Taucher and Breuker, 2010)に従った。特に、エレクトロスプレー溶液は、1μM ncRNA、25mMイミダゾール、および25mMピペリジンを含む1:1水/メタノールからなった。直接注入するための流速は3.0μL/minであった。質量スペクトルを、Thermo LTQ XL-イオントラップ質量分析計を用いてネガティブイオンモードで600〜2000のm/z範囲にわたって取得した。スプレー電圧は4.2kVであり、キャピラリー温度は275℃であり、キャピラリー電圧は-38Vであり、チューブレンズ(tube lens)電圧は-95Vであった。シースガス、補助ガス、およびスィープガス(sweep gas)を、それぞれ、20任意単位、5任意単位、および2任意単位に設定した。機器の設定を、ポリd(T)80を用いた自動調整によって最適化した。機器を製造業者の説明書に従って較正した(誤差は約100 ppm)。インタクトなncRNAのESI質量スペクトルを、Xcalibur用のProMassソフトウェア(Novatia LLC, www.enovatia.com)を用いてデコンボリューションして、組換えRNAの平均分子量(MW)を求めた。
【０１９２】
紫外線検出および質量分析検出と連結した液体クロマトグラフィー(LC-UV-MS)による組換えncRNAのヌクレオシド分析
RNAを95℃で5分間、加熱し、その後に氷上で3分間、冷やすことによって、組換えRNAの加水分解産物を調製した。最初に、記載のように(Russell and Limbach, 2013)、RNAを、1/10体積の0.1M酢酸アンモニウム(pH5.3)の存在下でヌクレアーゼP1(2U/0.5 A260単位)(Sigma-Aldrich)で45℃で2時間、消化した。さらに、オリゴヌクレオチドからヌクレオシドを放出するために、混合物を、1/10体積の1M炭酸水素アンモニウムに溶解した0.002単位のヘビ毒ホスホジエステラーゼ(Worthington Biochemicals Lakewood, Lakewood, NJ)および0.5単位の95lbany95ylホスファターゼ(New England Biolabs)で37℃で2時間、処理した。これらのヌクレオシドを、ダイオードアレイ検出器が搭載されているHitachi D-7000 HPLCを用いることによって、2.1mmx20mm Supelguard LC-18-Sガードカラムを備えた2.1mmx250mm Supelcosil LC-18-S(5μm粒子)逆相カラムで流速250μL/minで分離した。ポストカラムフローをUV検出器(2/3体積)と質量分析計(1/3体積)とで、それぞれ、分析イオンのUVトレースとm/z値を記録するために分けた。移動相は、記載のように(Pomerantz and McCloskey, 1990)、多重線形勾配(multilinear gradient)のある5mM酢酸アンモニウム(pH5.3)(移動相A)および40％アセトニトリル水溶液(移動相B)であった。質量スペクトルを、イオンマックスエレクトロスプレー源を備えたThermoLTQ-XLイオントラップ質量分析計を用いてポジティブイオンモードで100〜1000のm/z範囲にわたって記録した。エレクトロスプレー条件は、275℃のキャピラリー温度、4.2kVのスプレー電圧、35Vのキャピラリー電圧および85Vのチューブレンズ電圧、25任意単位のシースガス、15任意単位の補助ガス、および10任意単位のスィープガスを含んだ。全クロマトグラフィー操作の間に、ある特定の時間で観察された2種類の最も豊富なイオンについてデータ依存的な衝突誘起解離(CID)タンデム質量分析(MS/MS)を行った。
【０１９３】
LCタンデムMS(LC-MS/MS)分析によるncRNAのマッピングおよび配列決定
RNアーゼT1で消化したRNA断片をLC-MS/MS分析することによって、組換えncRNAのマッピングおよびヌクレオシド修飾の特定を行った(Krivos et al., 2011)。簡単に述べると、酢酸アンモニウムで沈殿させた組換えncRNA(3μg)を、RNアーゼT1(25U/μgのRNA, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)および細菌アルカリホスファターゼ(0.0001U/μgのRNA, Worthington Biochemical Corporation)で37℃で2時間処理した。その後に、消化物をSpeedvacに入れて乾燥させ、4℃で保管した。LC-MS/MSの直前に、試料を移動相C(水に溶解した400mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)および16.3mM 96lbany96ylアミン(TEA)、pH7.0)で再懸濁した。Thermo Surveyor HPLC装置およびThermo Micro ASオートサンプラーを用いて、Xbridge C18カラム(Waters, Milford, MA)(1.0mmx150mm)による流速30μL/minで移動相Cおよび移動相D(50％移動相C、50％メタノール)を用いた70分間の勾配溶出によってRNA消化産物を分離した。調整およびMS方法は、記載のもの(Wong et al., 2013)と本質的に同じであった。質量値はm/z 600〜2000のスキャン範囲に制限され、上位4種類の最も豊富なイオンについてデータ依存的なCID MS/MSを行った後に、これらを排除リスト(exclusion list)に30秒間、保管した。
【０１９４】
各組換えncRNAの無修飾バージョンのRNアーゼT1消化を、Mongo Oligo Mass Calculator(http://mods.rna.albany.edu/masspec/Mongo-Oligo)を用いてインシリコ分析した。これは、tRNA/MSAおよびtRNA/mir-1291に共通する適切なm/z値ならびにtRNA/mir-1291に特有のm/z値を特定する助けとなった。手作業によるデータ分析の後に、予測値からのm/z値の観察された逸脱を記録した。
【０１９５】
ヒト細胞培養およびトランスフェクション
ヒト膵癌PANC-1細胞および乳癌MCF-7細胞をAmerican Type Culture Collection(Manassas, VA)から購入した。37℃、5％二酸化炭素の加湿雰囲気の中で、PANC1細胞を、10％胎仔ウシ血清、100U/mLペニシリンナトリウム、および100mg/mL硫酸ストレプトマイシンを含有するDMEM培地中で培養し、MCF-7細胞を、10％胎仔ウシ血清、100U/mLペニシリンナトリウム、および100mg/mL硫酸ストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地中で培養した。細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、精製した組換えncRNAでトランスフェクトした。
【０１９６】
逆転写(RT)定量リアルタイムPCR(qPCR)
MCF-7細胞およびPANC-1細胞を、Lipofectamine 2000を用いて様々な用量の組換えncRNAでトランスフェクトした後に様々な時点で回収した。Direct-zol RNA単離キット(Zymo Research, Irvine, CA)を用いて全RNAを単離した。RT-qPCR分析をCFX96 TouchリアルタイムPCR装置(Bio-Rad, Hercules, CA)で行った。プレmiR-1291の定量を、GoTaq 2-Step RT-qPCR装置(Promega, Madison, WI)と遺伝子選択的プライマーを用いて行い、成熟miR-1291のステム-ループRT-qPCR分析を、報告されたように(Li et al., 2011; Pan et al., 2013)、TaqMan低分子RNAアッセイキット(Thermo Fisher Scientific)を用いて行った。それぞれの分析物について、アンプリコン濃度が規定の閾値と交わるサイクル数(CT)を求めた。式2-ΔCtを用いて相対発現を計算し、次いで、対照処理に対して基準化した。ΔCtは、分析物(プレmiR-1291またはmiR-1291)と内部標準(18SおよびU6)との間のCT値の差であった。
【０１９７】
イムノブロット分析
MCF-7細胞およびPANC-1細胞を、Lipofectamine 2000を用いて20nMのtRNA/mir-1291またはtRNA/MSAでトランスフェクトし、次いで、48時間後に回収した。完全プロテアーゼインヒビターカクテルを加えたRIPA溶解緩衝液を用いて細胞溶解産物を調製し、BCA Protein Assay Kitを用いてタンパク質濃度を求めた。全細胞タンパク質(40μg/レーン)を10％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜に電気泳動により転写し、次いで、PVDF膜を、MeCP2、FOXA2、MRP1、またはGAPDHに対する選択的抗体とインキュベートした。ペルオキシダーゼヤギ抗ウサギまたは抗マウスIgGをブロットした後に、膜をECL基質とインキュベートし、ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)を用いて画像を取得した。実験を全て、異なるトランスフェクション(N=3)を用いて3回再現して行い、少なくとも2回繰り返した。
【０１９８】
細胞傷害性アッセイ
MCF-7細胞およびPANC-1細胞を24ウェル培養プレートには10,000細胞/ウェルで播種し、96ウェル培養プレートには3,000細胞/ウェルで播種した。Lipofectamine 2000を用いて、特定の濃度の組換えtRNA/mir-1291またはtRNA/MSAでトランスフェクトした後に様々な時点で、記載のように(Pan et al., 2009; Pan et al., 2013)、Infinite M200 Pro Microplateリーダー(Tecan, Durham, NC)を用いてMTT(Sigma-Aldrich)アッセイを用いて細胞生存率を確かめた。ドキソルビシン細胞傷害性に及ぼすncRNAの影響を調べるために、最初に、PANC-1細胞を20nMのncRNAで、またはLipofectamine 2000(ビヒクル対照)だけで48時間トランスフェクトした。様々な濃度のドキソルビシンまたは薬物ビヒクル(0.1％DMSO)とさらに48時間インキュベートした後に、MTTアッセイによって細胞生存率を確かめた。ドキソルビシン細胞傷害性データを、傾きが変化する基準化された阻害用量反応モデル、Y=100/(1+10^((LogIC50-X)xHillスロープ))(GraphPad Prism, San Diego, CA)にフィッティングした。基準化された阻害性用量反応モデルY=ボトム(Bottom)+(トップ(Top)-ボトム)/(1+10^((LogEC50-X)xHillスロープ))にフィッティングすることによって、細胞増殖に対する組換えncRNAの効果をさらにうまく推定した。ボトムを40％と定義し、トップを100％と定義した。
【０１９９】
統計解析
値は全て平均±標準偏差(SD)であった。群の数および分散に応じて、データを、GraphPadPrismを用いて独立スチューデントt検定、一元配置ANOVA、または二元配置ANOVAで比較した。確率が0.05未満である場合に(P<0.05)、差が有意であるとみなした。
【０２００】
結果
tRNA/mir-1291発現プラスミドの設計および構築
プレmiR-1291(87nt)のヘアピン構造をさらに良好に維持するために、本発明者らは5'隣接配列および3'隣接配列を両方とも123nt、164nt、および197ntまで伸長し、その対応するDNAセグメントをクローニングした(図11B)。様々な長さのプレmiR-1291配列からなるncRNA発現プラスミドを構築することによって、組換えncRNA発現に及ぼすオリゴヌクレオチドの長さの影響を評価することもできるようになるだろう。tRNA/MSA、プレmiR-1291、およびtRNA/mir-1291(図11A)の予測された二次構造から、164ntおよび197ntのプレmiR-1291を含有するtRNA/mir-1291キメラはtRNA D-ループ構造およびT-ループ構造を維持することができる可能性があり、123ntのプレmiR-1291は、T-ループアームにおいて、さらに安定した分子内ステム-ループ構造を形成することが示唆された(図11A)。そうではあるが、3つ全てのtRNA/mir-1291キメラの中でプレmiR-1291の基本ステム-ループ構造は保持された。このことから、ヒト細胞内で成熟miR-1291を生成するために、これらにエンドリボヌクレアーゼが到達できることが示唆された。
【０２０１】
組換えtRNA/mir-1291の発現および精製
tRNA/mir-1291キメラの発現を調べるために、全RNAを大腸菌から単離し、RNA電気泳動移動度アッセイに供した。tRNA/MSA発現プラスミドで形質転換した細胞と比較して、tRNA/mir-1291発現プラスミドで形質転換した大腸菌細胞内で、予想したサイズの新たなRNAバンド(200〜300nt; 図11C)が出現したことから、組換えtRNA/mir-1291作用物質が首尾よく発現したことが分かった。キメラtRNA/プレmiRNAの電気泳動移動度は一本鎖RNAマーカーにより示されるものより大きく見えたことに注目した。これは、これらのncRNAに「二本鎖」ステム構造が存在したことによる可能性が高い(図11A)。tRNA/mir-1291-123nt(全体で長さが227nt)は、同じ条件下の他の長いtRNA/mir-1291-164ntおよびtRNA/mir-1291-197nt種(それぞれ全体で268ntおよび301nt;全RNAの中で<2％)よりも非常に高いレベル(例えば、全RNAの中で>10％)で蓄積したように見えた(図11C)。
【０２０２】
Sephadexアプタマータグを積んでいる組換えtRNA/mir-1291-123ntおよびtRNA/MSAをアフィニティクロマトグラフィーで単離した(図11D)。ローディングプロセスおよび洗浄プロセスの間に、rRNA、tRNA、DNA、およびタンパク質などの他の細胞成分は容易に除去された。Sephadex G-100に結合している組換えncRNAはデキストランを用いた溶出後に単離された。tRNA/mir-1291-123ntおよびtRNA/MSAについては、良好な純度(>85％;ゲル電気泳動に基づく)と妥当な収率(約2％の組換えncRNA/全RNAまたは1L細菌培養物から2〜3mg のncRNA ;NanoDropを用いた定量に基づく)が成し遂げられた。対照的に、tRNA/mir-1291-164ntおよび-197ntキメラの純度は60％未満であった。これは低い発現レベルと関連している可能性が高かった。従って、以下の研究にはtRNA/mir-1291-123ntだけ利用した。tRNA/mir-1291-123ntを簡単にtRNA/mir-1291と呼んだ。
【０２０３】
組換えncRNAの構造の特徴付け
最初に、cDNAを調製した後に、精製tRNA/mir-1291の配列をサンガー配列決定によって確認した。組換えtRNA/mir-1291の一次配列および可能性のある転写後修飾を直接確かめるために、MS技法を用いて、いくつかの研究を行った。最初に、構成要素であるRNA種のMWを測定するために、インタクトなtRNA/mir-1291をESI-MSで分析した。多重荷電(multiply charged)ESIデータのデコンボリューションから複数のRNA種が存在することが分かった。最も豊富な(約70％; ピーク面積に基づく)実験により確かめられたMWはtRNA/mir-1291については73,422.4Daだと見出された(図12A)。MWの測定値と予測値(162.4Da)との差から修飾ヌクレオシドが存在することが示唆される。さらなる成分も認められた。これらのMWは、tRNA/mir-1291より小さなMWの無修飾RNA種または切断型RNA種に対応する。
【０２０４】
生細胞内で生成された天然RNAによくある、可能性のある転写後修飾を特定するために、LC-UV-MS分析を行って、tRNA/mir-1291から調製した加水分解産物中のヌクレオシドを明らかにし、スキャフォールドtRNA/MSAと比較した。tRNA/mir-1291およびtRNA/MSA試料の両方に多くの修飾ヌクレオシド、例えば、ジヒドロウリジン(D)、プソイドウリジン(Ψ)、7-メチルグアノシン(m7G)、4-チオウリジン(s4U)、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、5-メチルウリジン(m5U)、2'-O-メチルグアノシン(Gm)、および1-メチルグアノシン(m1G)が見出された(図12B)。一部の修飾ヌクレオシド(例えば、DおよびΨ)はUVデータおよびMSデータの両方で明確に特定されたのに対して、その他の修飾ヌクレオシド(例えば、tRNA/mir-1291のGmおよびm1G)はUV検出でははっきりと確かめられなかったが、対応するMSデータでは容易に識別された。
【０２０５】
ヌクレオシド修飾の場所をさらに突き止めるために、ncRNAをグアノシン特異的リボヌクレアーゼT1および細菌アルカリホスファターゼで処理した。結果として生じた消化産物をイオン対逆相C18カラムで分離し、タンデムMSによって特定および配列決定した(図12C)。LC-UV分析によってはっきりと特定された修飾ヌクレオシドの大部分(例えば、D、Ψ、m7G、s4U、acp3U、およびm5U)(図12B)をRNアーゼT1消化産物にマッピングすることができ、tRNAスキャフォールドに割り当てることができた。これに対して、割り当てられなかった修飾(例えば、m1G)は、同時精製した核酸または以前のキャリーオーバーに起因する可能性がある。これらの結果から、精製tRNA/mir-1291の一次配列が検証されただけでなく、ncRNA安定性に影響を及ぼすtRNAスキャフォールドの天然修飾の存在も証明された。
【０２０６】
キメラtRNA/mir-1291はヒト癌細胞において成熟miR-1291にプロセシングされる
ヒト細胞内で成熟miR-1291を組換えtRNA/mir-1291キメラから生成できるかどうか明らかにするために、本発明者らは、成熟miR-1291を定量するために、選択的なTaqManステム-ループRT-qPCR低分子RNAアッセイキットを使用し、プレmiR-1291レベルを確かめるために通常のRT-qPCRを使用した。本発明者らのデータから、tRNA/mir-1291で処理したヒト癌MCF-7細胞においてプレmiR-1291レベルは急増したことが分かった(図13A)。このことはtRNA/mir-1291のトランスフェクションが成功したことを示している。一方では、成熟miR-1291のレベルは用量依存的に著しく上昇した(図13B)。興味深いことに、MCF-7細胞においてトランスフェクション後72時間にわたり、プレmiR-1291の3桁の増加および成熟miR-1291の2桁の増加がそれぞれ持続した(図13C〜D)。同様に、PANC-1細胞では20nMの組換えtRNA/mir-1291をトランスフェクトして24時間後および72時間後に、プレmiR-1291の約3桁の増加および成熟miR-1291の2桁の増加があった。これらの結果から、組換えtRNA/mir-1291はヒト癌細胞内で成熟miR-1291に容易にプロセシングされることが示唆される。
【０２０７】
組換えtRNA/mir-1291はヒト癌細胞内でのmiR-1291標的遺伝子の発現を制御するのに有効である
キメラtRNA/mir-1291がヒト癌細胞におけるmiR-1291標的遺伝子発現の調整に薬理学的活性を有するかどうかを評価するために、最初に、本発明者らは、検証されたmiR-1291標的である輸送体ABCC1(Pan et al., 2013)のタンパク質レベルに及ぼす組換えtRNA/mir-1291の影響を調べた。タンパク質選択的抗体を用いたイムノブロット分析から、対照tRNA/MSA処理と比較して、20nMのtRNA/mir-1291によってPANC-1細胞のABCC1タンパク質の発現が90％低減したことが明らかになった(図14A)。従って、本発明者らは、TargetScanアルゴリズム(http://www.targetscan.org/)によって特定し、本発明者らの研究室において検証した他の2つの標的MeCP2およびFOXA2に及ぼすtRNA/mir-1291およびtRNA/MSAの影響を評価した。MeCP2およびFOXA2は、それぞれ、MCF-7細胞(Lin and Nelson, 2003)およびPANC-1細胞(Song et al., 2010)において過剰発現している。両細胞株ともmiR-1291レベルはMCF-7/MX100およびHepG2などの他の細胞株と比較して比較的低レベルであった。本発明者らのデータから、対照tRNA/MSA処理と比較して、tRNA/mir-1291によってPANC-1細胞ではFOXA2タンパク質レベルは30％低減し(図14B)、MCF-7細胞ではMeCP2は50％減少した(図14C)ことが分かった。これらの結果から、組換えtRNA/mir-1291はヒト癌細胞においてmiR-1291標的遺伝子の発現を調節する効果があることが証明された。これは、細胞内でのキメラtRNA/mir-1291から生成された成熟miR-1291の働きに起因する可能性がある(図13)。
【０２０８】
tRNAによって運ばれるプレmiR-1291はヒト癌細胞の増殖を抑制する
従って、本発明者らの研究(Yu et al., 2013; Bi et al., 2014)および他の研究(Hidaka et al., 2012; Yamasaki et al., 2013)によってmiR-1291が腫瘍抑制因子として働くことが明らかにされているので、本発明者らは癌細胞増殖に及ぼすキメラmiR-1291の影響を評価した。本発明者らの予備研究から、MCF-7細胞ではトランスフェクトして48時間後に、PANC-1細胞では処理して72時間後に、対照tRNA/MSAと比較してtRNA/mir-1291によって大きな程度の阻害が示されることが分かった。従って、本発明者らは、MCF-7細胞およびPANC-1細胞の増殖の抑制におけるtRNA/mir-1291の用量反応関係を、それぞれ、48時間および72時間で調べた。本発明者らのデータから、組換えtRNA/mir-1291はPANC-1細胞およびMCF-7細胞の増殖を用量依存的に、かつ対照tRNA/MSAより有意に(P<0.01、二元配置ANOVA)大きな程度で著しく阻害することが分かった(図15A〜B)。これは、tRNA/MSAのEC50値(MCF-7細胞では1160±1026nM、PANC-1細胞では7.09±1.22nM)より低い、tRNA/mir-1291のEC50値(MCF-7細胞では2.59±1.30nM、PANC-1細胞では1.61±1.29nM)でも明らかにされた(図15C)。これらの結果から、tRNAによって運ばれるプレmiR-1291はヒト癌細胞の増殖を阻害する機能があることが分かる。
【０２０９】
キメラtRNA/mir-1291はドキソルビシンに対するヒト癌PANC-1細胞の感受性を増加させる
miR-1291はABCC1輸送体のダウンレギュレーションによって化学療法感受性を増強することができ(Pan et al., 2013)、tRNAによって運ばれるプレmiR-1291はヒト癌PANC-1細胞内でABCC1タンパク質レベルを低減する効果があるので(図14A)、本発明者らは、組換えtRNA/mir-1291が、抗癌剤であるABCC1基質ドキソルビシンに対するABCC1過剰発現PANC-1細胞の感受性を変えることができるかどうかを調べた。tRNA/mir-1291、対照tRNA/MSA、およびビヒクルでトランスフェクトした後に、PANC-1細胞に対するドキソルビシン細胞傷害性をMTTアッセイによって確かめた。本発明者らのデータから、対照tRNA/MSAで処理した細胞およびビヒクルで処理した細胞よりtRNA/mir-1291でトランスフェクトした細胞の方がドキソルビシンに対する感受性が高いことが分かった(図16A)。感受性の改善は、tRNA/mir-1291でトランスフェクトした細胞のEC50値(133±21nM)がtRNA/MSA(297±42nM)およびビヒクル対照(325±50nM)より有意に低いことでも示された(図16B)。これらの結果から、組換えtRNA/mir-1291を同時投与することでドキソルビシンの抗増殖作用が増強することが示唆される。
【０２１０】
考察
1L細菌培養物から何ミリグラムものキメラプレmiR-1291作用物質を効率的に生成する新たな手法が本研究において証明された。本研究ではtRNAベースの組換えRNA技術を利用する。tRNAと融合したプレmiR-1291は細菌内での核酸分解消化から保護され、従って、さらに精製するために高レベルまで蓄積した。この安定したtRNAスキャフォールドは多くの転写後修飾ヌクレオシドを含むことが明らかになった。これらの転写後修飾ヌクレオシドは精製ncRNAのMS分析によって直接、特定され、特定の部位にマッピングされた。本発明者らのデータからまた、tRNAによって運ばれるプレmiR-1291は様々タイプのヒト癌細胞において成熟miR-1291に容易にプロセシングされ、結果として、miR-1291標的遺伝子の発現(例えば、ABCC1)を抑制し、ヒトMCF-7細胞およびPANC-1細胞の増殖を阻害し、PANC-1細胞の化学療法感受性を増強することも分かった。
【０２１１】
ヒトmiR-1291は輸送体ABCC1の発現を調節し、細胞内の薬物蓄積を調整し、化学療法感受性に影響を及ぼすことが示されている(Pan et al., 2013)。さらに、miR-1291は、本発明者らの研究(Yu et al., 2013; Bi et al., 2014)ならびに他の研究(Hidaka et al., 2012; Yamasaki et al., 2013)によって、様々なヒト癌細胞株において腫瘍抑制因子として働くことが明らかにされている。miRNAの働きをする天然miRNA作用物質を生成するという考えにより動機付けられ、本発明者らは、tRNAスキャフォールドを用いてプレmiR-1291作用物質を生合成して、インビトロおよびインビボでのmiR-1291の生物学的機能と治療上の影響を調べるために多大な取り組みを行った(Li et al., 2014; Chen et al., 2015)。組換えRNAを生成する際の成功および効率は生物における標的RNAの構造および代謝安定性に頼る。細菌RNアーゼ消化に対して不安定な標的RNAは全て、間違いなく核酸分解切断に供されることは明らかであり、従って、組換えRNA(例えば、プレmiR-27b)の蓄積は限定されるか、または組換えRNA(例えば、プレmiR-27b)は蓄積しない(Li et al., 2014; Chen et al., 2015)。組換えプレmiR-1291キメラは多くの一般的な大腸菌株において首尾よく発現することが明らかにされ、プレmiR-34aと同様に(Chen et al., 2015)、高レベルの蓄積がHST08細胞およびDH5α細胞において観察された。以前の発見(Ponchon and Dardel, 2007; Ponchon et al., 2009)と一致して、長いプレmiR-1291種については低レベルの組換えRNAが見出された。これは、おそらく、誤って折り畳まれた、および/または細菌RNアーゼによって切断された構造不定の領域が増加したためである。高レベル発現によって組換えtRNA/mir-1291-123ntを精製することも容易になった。組換えtRNA/mir-1291-123ntは1L発酵物から何ミリグラムもの量で一貫して生成された。これにより、本発明者らが、他の効率的に発現させたncRNAを用いて行ってきたように(Chen et al., 2015)、miR-1291活性をインビボで評価することが可能になるだろう。Sephadex G-100を用いた精製収率は比較的低いが(例えば、2〜3％)、この方法は簡単であり、最初の回でSephadexに結合しなかった、Sephadexでタグ化した組換えncRNA(例えば、フロースルーおよび洗浄液1〜3)を再精製のために組み合わせて、陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィー法(Li et al., 2014; Chen et al., 2015)に近い非常に改善した全収率(例えば、5〜10％)が示される可能性がある。
【０２１２】
RNA分子の転写後修飾は生物において広範に存在し、化学多様性を大きく増やす。結果として、修飾RNAは代替フォールディング(alternative folding)を介して様々な構造と、物理化学的特性および生物学的機能を示す可能性がある。様々なクラスの天然RNAについて100を超える様々な塩基修飾、例えば、メチル化、プソイドウリジル化、チオール化、およびジヒドロウラシルへのウラシルの還元が特定されており、約85％がtRNAに存在する(Limbach et al., 1994; Cantara et al., 2011)。単離したtRNA/mir-1291およびtRNA/MSAの質量分析を用いて、本発明者らは修飾ヌクレオシドを確かめ、tRNAスキャフォールドの特定の部位にマッピングすることができた。多くの修飾ヌクレオシドは、天然メチオニルtRNAの安定性(Alexandrov et al., 2006)および機能に重要な可能性がある、D20、D21、[m7G]77、[acp3U]78、[m5U]85、およびΨ86を含むD-ループおよびT-ループ上に発生した。そうではあるが、LC-UV-MSベースのヌクレオシド分析によって検出した全ての修飾を組換えncRNAに割り当てることができたわけではない。このことは、同時精製した細菌tRNAの小さな画分に起因するのかもしれない(Hossain and Limbach, 2007; 2009)。
【０２１３】
全細胞系では、トランスフェクトして72時間後にプレmiR-1291レベルの3桁の増加が示された。このことは、ヒト細胞へのtRNA/mir-1291キメラの導入が成功したことと、最も重要なことには、ヒト細胞内での組換えncRNAの好ましい安定性を強調している。結果として、成熟miR-1291レベルは2桁増加した。このことから、tRNA/mir-1291が成熟miR-1291に首尾よくプロセシングされたことが分かる。tRNA/mir-27(Li et al., 2014)、tRNA/mir-1291(本研究)、およびtRNA/mir-34a(Chen et al., 2015)などの組換えncRNAが全て、標的成熟miRNAの好ましい細胞安定性および選択的生成を示したことは注目に値する。このことから、キメラncRNAが細菌内で生成された後に、tRNA担体はヒト細胞に標的miRNAを「ステルス送達」したことが示唆される。そうではあるが、ヒト細胞内での組換えncRNAのプロセシングに関与する特異的RNアーゼを明らかにするために、さらなる研究が正当化される。
【０２１４】
キメラRNAから成熟miR-1291が生成されると、miR-1291標的遺伝子、例えば、PANC-1細胞内ではABCC1およびFOXA2、MCF-7細胞内ではMeCP2のタンパク質レベルが有意に抑制された。排出輸送体ABCC1の過剰発現は多剤耐性に関連し(Filipits et al., 2005; Haber et al., 2006; Faggad et al., 2009)、このような輸送体のダウンレギュレーションまたは阻害は多剤耐性を克服する有効な手段となる可能性がある(Choi and Yu, 2014)。本発明者らの最近の研究(Pan et al., 2013)と一致して、tRNAによって運ばれるプレmiR-1291はABCC1タンパク質の発現を抑制することができ、結果として、ドキソルビシンに対するPANC-1細胞の感受性を改善した。他方で、MeCP2は、転写のクロマチンレギュレーターとして働く、そのファミリー内で発見された最初のメチル-CpG-結合ドメインタンパク質であり、神経発達障害であるレット症候群において変異している遺伝子によってコードされる(LaSalle and Yasui, 2009)。MeCP2は、通常、ヒト癌腫において過剰発現しており、乳癌細胞を含む多くのタイプの癌細胞の増殖および侵襲性を促進し(Billard et al., 2002; Ray et al., 2013)、ABCB1/MDR1発現を調整する可能性がある(El-Osta and Wolffe, 2001)。DNA結合タンパク質のフォークヘッドクラスに属する転写因子であるFOXA2は膵臓/肝臓/結腸直腸細胞の分化および臓器の発生の促進(Gao et al., 2008; Song et al., 2010)ならびにいくつかの癌遺伝子(癌原遺伝子)(Zhang et al., 2010)および多くのABC輸送体(Bochkis et al., 2008; Bochkis et al., 2012)の発現の調節における重要なレギュレーターとして明らかにされている。従って、MeCP2およびFOXA2のタンパク質レベルが低減したことは、少なくとも部分的に、癌細胞増殖の抑制(Yu et al., 2013; Bi et al., 2014)および化学療法感受性の増強におけるmiR-1291の説明となるかもしれない。まとめると、これらの発見から、miR-1291機能を調べるために、および抗癌剤に対するヒト癌細胞の感受性を増加させるために組換えmiR-1291作用物質が潜在的に有用なことが分かる。
【０２１５】
要約すると、この研究から、研究室の場で1L細菌培養物から何ミリグラムものキメラmiR-1291作用物質を生成するための迅速かつ効率的な方法が証明された。この方法はメチオニルtRNAスキャフォールドを用いることによって成し遂げられた。本発明者らのデータから、tRNAスキャフォールドは多くの天然転写後修飾からなり、tRNAによって運ばれるプレmiR-1291は、ヒト癌細胞においてmiR-1291標的遺伝子(例えば、ABCC1)発現を調整し、化学療法感受性を改善する効果があることが分かった。これらの結果は、ファーマコエピジェネティクスを研究し、ncRNA治療剤を開発するために新たなmiRNA作用物質を生成する手がかりを与える。
【０２１６】
実施例2の参考文献
2017524341.tif 000030
2017524341.tif 000031
2017524341.tif 000032
2017524341.tif 000033
【０２１７】
実施例3
プロドラッグ癌療法用の新規のキメラマイクロrna-34aを生物工学によって作製する:高収率発現および精製ならびに構造および機能の特徴付け
miR-34a補充療法などのマイクロRNA(miRNAまたはmiR)をベースとする処置の開発は、人工修飾をもつ合成RNAの使用に限定される。本実施例は、癌療法のためのプロドラッグとして働くことができる、tRNAスキャフォールドを用いた大腸菌内でのキメラmiR-34a作用物質の高収率かつラージスケールの生合成を証明する。組換えtRNA融合プレmiR-34a(tRNA/mir-34a)を、陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を用いて高度(>98％)に均一になるまで素早く精製した。この一次配列および転写後修飾を質量分析によって直接、特徴付けた。キメラtRNA/mir-34aは好ましい細胞安定性を示したが、いくつかのリボヌクレアーゼによって分解することができた。ディープシークエンシングおよびqPCR研究から、tRNAによって運ばれるプレmiR-34aはヒト癌細胞内で成熟miR-34aに正確にプロセシングされたのに対して、tRNA/mir-34aおよび対照tRNAスキャフォールド(tRNA/MSA)から同じtRNA断片が生成されたことが明らかになった。結果として、tRNA/mir-34aは様々なタイプのヒト癌細胞の増殖を用量依存的に、かつ対照tRNA/MSAより非常に大きな程度で阻害した。これは、機構的には、miR-34a標的遺伝子が低減したことに起因する。さらに、tRNA/mir-34aは同じ用量のtRNA/MSAと比較して、マウスにおけるヒト非小細胞肺癌A549異種移植腫瘍および肝癌HepG2異種移植腫瘍の成長を有意に抑制した。さらに、組換えtRNA/mir-34aはマウスモデルにおいて血液化学的性質およびIL-6レベルに影響を及ぼさなかったか、またはほとんど影響を及ぼさなかった。このことから組換えRNAの忍容性は高いことが示唆された。これらの発見から、miRNAの働きをする生物学的miRNAが実行可能に生成されることと、miRNAベースの療法が証明された。
【０２１８】
序論
マイクロRNAは、癌細胞の増殖、アポトーシスおよび浸潤、ならびに腫瘍の開始および進行の制御(Kasinski and Slack, 2011; Bader, 2012)ならびに薬物処分(Yu, 2009; Ingelman-Sundberg et al., 2013)および他の疾患の発生(Yao and Li, 2015)における重要な因子である、ゲノムにコードされるノンコーディングRNA(ncRNA)の大きなファミリーとして明らかにされてきた。miRNAの生物学的機能についての研究は新規の癌処置を開発する手がかりを与えてきた。実際に、多くのmiRNAベースの療法の臨床試験が行われているか、またはこれらは臨床試験に向けて進められている。特に、癌細胞の増殖および腫瘍の成長を制御するために、癌細胞においてアップレギュレートされる発癌性のmiRNA、例えば、miR-10bが標的化される可能性がある(Ma et al., 2007)。他方で、腫瘍の進行を抑制するために、癌組織において機能喪失している腫瘍抑制性のmiRNA、例えば、miR-34aが癌細胞に再導入される可能性がある(He et al., 2007; Welch et al., 2007)。後者のアプローチ、すなわち「miRNA補充療法」は前者のmiRNAアンタゴニズム戦略と区別される。miRNA補充療法において用いられるmiRNAまたはプレmiRNAは、ゲノムにコードされるmiRNAまたはプレmiRNAと同じ配列を有し、従って、「オフターゲット」効果を生じる可能性は低い。一方では、miRNAは健常細胞の正常な構成要素であるので、治療用miRNAの再導入によって大きな毒性が引き起こされる可能性は低い(Bader, 2012)。
【０２１９】
ヒトmiR-34aは、癌を処置するための最も有望な腫瘍抑制性miRNAの1つである。肺、前立腺、乳房、膵臓、肝臓、結腸、腎臓、膀胱、皮膚、食道、脳、子宮頸部、卵巣、尿路上皮、およびリンパ系を含む広範囲の固形腫瘍および血液腫瘍においてmiR-34a発現が消失することが記述されている(総説(Bader, 2012)を参照されたい)。miR-34aのバイオジェネシスは腫瘍タンパク質p53によって転写レベルで直接制御されるが(Chang et al., 2007; He et al., 2007)、miR-34aが異所発現すると、サイクリン依存性キナーゼ6(CDK6)、肝細胞増殖因子受容体MET、血小板由来増殖因子受容体-α(PDGFRA)、およびGTPアーゼKRASなどの一組の標的遺伝子の劇的なリプログラミングが引き起こされ、結果として、癌細胞の増殖が阻害され、細胞周期の停止が誘導され、アポトーシスが増強される(Chang et al., 2007; He et al., 2007; Sun et al., 2008; Yamakuchi et al., 2008; Li et al., 2009; Kasinski and Slack, 2012)。一方では、miR-34aは、p53を不活性化するNAD依存性デアセチラーゼサーチュイン-1(SIRT1)と、p53に結合し、p53ユビキチン結合および分解を促進する転写リプレッサーYin Yang 1(YY1)を標的化することによって正のフィードバックループで内因性p53活性を刺激することができる(Yamakuchi et al., 2008)。さらに、miR-34aは、CD44および癌幹細胞または腫瘍開始細胞を標的化することによってクローン形成増殖、腫瘍再生、および転移を抑制する(Liu et al., 2011)。miR-34aの抗癌活性は、インビトロで、肺、肝臓、膵臓、結腸、脳、皮膚、前立腺、骨、卵巣、ならびにリンパ腫および白血病を含む様々なタイプのヒト癌細胞において見事に証明されている。さらに、動物モデルにおけるmiR-34a補充療法の成績は、使用する送達系に大きく依存するが、多くの成功例が、非小細胞肺癌(Wiggins et al., 2010; Kasinski and Slack, 2012)、前立腺癌(Liu et al., 2011)、膵臓癌(Pramanik et al., 2011)、およびリンパ腫(Craig et al., 2012)を含む多くのタイプの異種移植腫瘍の進行の阻害においてmiR-34aの有効性を示している。結果として、リポソームで処方されたmiR-34aである「MRX34」は、切除不能な原発性肝癌を処置するために第I相臨床試験に進んでいる(Kelnar et al., 2014)。
【０２２０】
そうではあるが、miRNA薬理学および治療学についての研究は主として合成RNA(例えば、miRNA模倣物およびアンタゴmirならびにプレmiRNA(mir))ならびに組換えDNA作用物質(例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクターベースのmiRNAまたは「デコイ(decoy)」アンチセンスRNA発現プラスミド)に頼る。DNA材料を用いるとRNAベースのプロセスは複雑になる場合がある。このアプローチも、遺伝子をmiRNA前駆体に転写させた後に成熟miRNAを生じるために宿主細胞または宿主生物に頼る。オリゴヌクレオチドの有機合成が自動化される可能性があるのにもかかわらず、インビボでの試験または療法のために計画された何ミリグラムもの用量の22nt二本鎖miRNA模倣物は非常に高価である。さらに、合成miRNAが、長い半減期などの、いくつかの好ましい薬物動態学的特性を示すが、人工修飾によってフォールディング、生物学的活性、および安全性プロファイルがどのように変化する可能性があるのかは分かっていない。
【０２２１】
薬物療法のためにRNAの働きをする生物学的RNAを展開するという考えにより動機付けられ、本発明者らは、tRNAスキャフォールドを用いて、プレmiRNA(mir)作用物質を一般的な細菌株内でラージスケールで生物工学によって作製することを目標にした(Ponchon and Dardel, 2007; Ponchon et al., 2009; Nelissen et al., 2012)。本発明者らは、プレmiRNAがヒト細胞内で成熟miRNAに選択的にプロセシングされる可能性があり、tRNAスキャフォールドがtRNA断片(tRF)に代謝または分解されるプロドラッグとして、tRNA融合プレmiRNA(tRNA/mir)が働くことができると仮説を立てた。プレmiR-27bが低収率で生成されたこととは対照的に(Li et al., 2014)、本発明者らは、本明細書において、研究室の場で1L細菌培養物から何ミリグラムものtRNA融合プレmiR-34a(tRNA/mir-34a)が最適に発現され、迅速に精製されたことを示す。組換えtRNA/mir-34aの分子量、一次配列、および転写後修飾が質量分析法(MS)研究によって直接、特徴付けられた。さらに、アンバイアスドディープシークエンシング研究および標的qPCR分析から、tRNAによって運ばれるプレmiR-34aは実際にヒト癌細胞内で成熟miR-34aに正確にプロセシングされ、それによって、細胞miR-34aレベルが70〜100倍増加することが分かった。結果として、tRNA/mir-34aは、対照tRNAスキャフォールド(tRNA/MSA)と比較して、インビトロで用量依存的にmiR-34a標的遺伝子(例えば、CDK6、SIRT1、およびMET)のタンパク質レベルと、ヒト肺癌細胞(A549およびH460)ならびに肝臓癌細胞(HepG2およびHuh-7)の増殖を有意に抑制した。さらに、本発明者らは、組換えtRNA/mir-34aが動物モデルにおいて忍容性が高く、インビボでA549異種移植腫瘍およびHepG2異種移植腫瘍の成長を著しく抑制したことが証明された。これらの発見から、細菌内で作製された生物学的RNA作用物質は創薬ならびに基礎研究およびトランスレーショナルリサーチのためのRNA作用物質の新たなカテゴリーとして役立つことが分かる。
【０２２２】
材料および方法
化学物質および材料
Lipofectamine 2000、トリゾル試薬、およびBCA Protein Assay KitをThermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA)から購入した。RIPA溶解緩衝液をRockland Immunochemical(Limerick, PA)から購入し、完全プロテアーゼインヒビターカクテルをRoche Diagnostics(Mannheim, Germany)から購入した。CDK6(C-21)、SIRT1(H-300)、Met(C-28)、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対する抗体をSanta Cruz Biotech Inc.(Texas, TX)から購入した。ペルオキシダーゼヤギ抗ウサギIgGをJackson ImmunoResearch Inc.(West Grove, PA)から購入した。ECL基質およびPVDF膜をBio-Rad(Hercules, CA)から購入した。他の全ての化学物質および分析グレードの有機溶媒をSigma-Aldrich(St.Louis, MO)またはThermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA)から購入した。
【０２２３】
細菌培養
大腸菌株を全て、100μg/mLアンピシリンを加えたLBブロス中で37℃で培養した。組換えncRNAの発現のためにクローニングならびにスクリーニングするためにDH5およびTOP10(Life Technologies, Grand Island, NY)を使用した。ncRNA蓄積をスクリーニングするために、BL21(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)およびHST08(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)も使用した。組換えncRNAをラージスケールで生成するためにHST08を特定および利用した。
【０２２４】
ヒト細胞培養
ヒト癌細胞株HepG2、Huh-7、A549、およびH460をAmerican Type Culture Collection(Manassas, VA)から購入した。37℃、5％CO2を含有する加湿雰囲気の中でHepG2細胞をEMEM培地中で培養し、A549細胞およびH460細胞をRPMI1640培地中で培養し、Huh-7細胞を、10％胎仔ウシ血清(GBICO BRL, Rockville, MD)を加えたDMEM培地中で培養した。対数増殖期の細胞を実験に使用した。
【０２２５】
RNA二次構造の予測
様々なサイズのヒトプレmiR-34a、tRNAスキャフォールド、およびキメラncRNAの二次構造を、CentroidFold(http://www.ncrna.org/centroidfold)、CentroidHomfold(http://www.ncrna.org/centroidhomfold)、およびRNAstructure(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)を用いて予測した。
【０２２６】
tRNA/mir-34a発現プラスミドの構築
112ntおよび129ntヒトプレmiR-34a(miRBase ID: MI0000268)をコードするDNA断片を、それぞれ、プライマー
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(IDT, San Diego, CA)を用いてヒトゲノムDNAからPCR増幅した。アンプリコンを、SalI-HF(登録商標)およびAatII(New England Biolabs, Ipswich, MA)で直線化したpBSMrnaSephベクター(Universite Paris DescartesのDr.Luc Ponchonの厚意により提供された)(Ponchon et al., 2009)に挿入した。標的tRNA/mir-34a発現プラスミドをUC Davis Genome Centerにおいてサンガー配列決定分析によって確認した。
【０２２７】
大腸菌内での組換えncRNAの発現
記載のように(Ponchon and Dardel, 2007; Ponchon et al., 2009; Li et al., 2014)、組換えncRNAをHST08において発現させた。全RNAを、Tris-HCl飽和フェノール抽出法を用いて単離し、NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いて定量し、変性尿素(8M)ポリアクリルアミド(8％)ゲル電気泳動(PAGE)で分析して、組換えncRNAの発現を評価した。本発明者らは、通常、尿素-PAGE分析の場合、1レーンにつき0.2〜1.0μgのRNAをロードした。ssRNAラダーおよびsiRNAマーカーをNew England Biolabsから購入した。ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて画像を取得した。バンドの強度を用いて、全RNAに存在する組換えncRNAの相対レベルを大まかに見積もった。
【０２２８】
組換えncRNAのアフィニティ精製
報告されたように(Ponchon et al., 2009; Li et al., 2015)、sephadexアプタマーでタグ化したncRNAをSephadex G-100ビーズ(Sigma-Aldrich)を用いて精製し、RNA画分を尿素-PAGEで分析した。
【０２２９】
組換えncRNAのFPLC精製
NGC QUEST 10PLUS CHROM FPLC System(Bio-Rad)を用いてUN OQ6陰イオン交換カラム(Bio-Rad)で全RNAから組換えtRNA/mir-34aを精製した。試料をロードした後に、最初に、カラムを、緩衝液A(10mMリン酸ナトリウム、pH=7.0)を用いて流速6.0mL/minで0.5分間、平衡化した後に、同じ流速で、0〜56％緩衝液B(緩衝液A+1M塩化ナトリウム)を0.5分、56％緩衝液Bを2分、56〜65％緩衝液Bを10分、次いで、100％緩衝液Bを2分、100〜0％緩衝液Bを0.5分、100％緩衝液Aを5分の勾配溶出を行った。対照tRNA/MSAの塩勾配溶出条件は、報告されたもの(Lietal.,2014)と本質的に同じであった。FPLCトレースを、UV/Vis検出器を用いて260nmでモニタリングした。全RNA内での組換えncRNAの相対レベルを評価するためにピーク面積も使用した。これは、尿素-PAGE分析によって確かめられた相対レベルと一致した。尿素-PAGEで分析した後に、純粋なncRNAを含有する画分をプールした。組換えncRNAをエタノールで沈殿させ、ヌクレアーゼフリー水で再構成し、次いで、脱塩し、Amicon ultra-2mL遠心分離フィルター(30KD; EMD Millipore, Billerica, MA)で濃縮した。NanoDrop 2000分光光度計を用いてncRNAの量を確かめ、他の実験の前にPAGEおよびHPLC分析によって品質を検証した。
【０２３０】
精製ncRNAのHPLC分析
HPLC分析を、Shimadzu LC-20AD HPLC装置においてXBridge OST C18カラム(2.1x50mm, 2.5μm粒径; Waters, Milford, MA)を用いて行った。流速は0.2mL/minであり、カラムを60℃に維持した。移動相Aは、水に溶解した8.6mMトリエチルアミン(TEA)および100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP, pH8.3)からなり、移動相Bは、メタノールに溶解した8.6mM TEAおよび100mM HFIPからなった。LC勾配は、以下:0〜1分、16％移動相B;21分、22％移動相Bであった。RNAを、光ダイオードアレイ検出器を用いて260nmでモニタリングした。
【０２３１】
エンドトキシンの除去および検出
さらに、CleanAll DNA/RNA Clean-up Kit(Norgen Biotek, Thorold, ON, Canada)とエンドトキシンフリー水(Lonza, Walkersville, MD)を用いて、製造業者により指示されたように、FPLCで精製したncRNAからエンドトキシンを除去した。全RNA中のエンドトキシン活性ならびにFPLCで精製し、CleanAllキットで処理したncRNA試料中のエンドトキシン活性を、Pyrogent-5000 kinetic LAL assay(Lonza)を用いて説明書に従って確かめた。特に、SpectraMax3プレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて340nm波長で濁度を測定した。提供されたエンドトキシン標準を用いて検量線を作成し、RNA試料中のエンドトキシンレベルをEU/μg RNA(エンドトキシン単位/μg RNA)で表した。
【０２３２】
インタクトな組換えncRNAのエレクトロスプレーイオン化-質量分析法(ESI-MS)分析
TaucherおよびBreuker(Taucher and Breuker, 2010)が述べた手順に従った。機器の設定を、ポリd(T)80を用いた自動調整によって最適化した。質量スペクトルを、Thermo LTQ XL-イオントラップ質量分析計を用いてネガティブイオンモードで600〜2000のm/z範囲にわたって取得した。インタクトなncRNAのESI質量スペクトルをXcalibur用のProMassソフトウェア(バージョン2.8rev.2)(Novatia LLC, Newtown, PA)を用いてデコンボリューションして、組換えRNAの平均分子量(MW)を求めた。
【０２３３】
LC-UV-MSによるヌクレオシド分析
RussellおよびLimbach(Russell and Limbach, 2013)記載のように、加水分解産物を、ヌクレアーゼP1(Sigma-Aldrich)、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ(Worthington Biochemicals Lakewood, Lakewood, NJ)、および南極(antarctic)ホスファターゼ(New England Biolabs)を用いて調製し、Hitachi D-7000 HPLC装置を用いて5μm, 2.1mmx250mm Supelcosil LC-18-Sカラムで分離し、ダイオードアレイ検出器およびThermo LTQ-XLイオントラップ質量分析計によって分析した。
【０２３４】
LC-MS/MSによるRNAマッピング
記載のように(Krivos et al., 2011)、RNアーゼT1(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)および細菌アルカリホスファターゼ(Worthington Biochemical Corporation)で消化した後に、Thermo LTQ XLイオントラップ質量分析計およびThermo Micro ASオートサンプラーと連結したThermo Surveyor HPLC装置を用いてRNAマッピングおよび修飾の割り当てを行った。衝突誘起解離タンデム質量分析(CID MS/MS)を用いてRNアーゼ消化産物から配列情報を得た。
【０２３５】
RNアーゼに対する感受性
組換えncRNAを、提供された緩衝液またはHEPES(100mM KCl, 5mM MgCl2, 10mM HEPES, pH7.4)の中で個々のRNアーゼで37℃で1時間消化した。特に、12μgのncRNAを1μg/mLヒト組換えRNアーゼI(Novoprotein, Summit, NJ)とインキュベートし、12μgのncRNAを10μg/mLヒト組換えアンジオゲニン(R&D Systems, Minneapolis, MN)とインキュベートし、1μgのncRNAを1Uの組換えダイサー(Genlantis Inc., San Diego, CA)とインキュベートし、6μgのncRNAを5Uの細菌RNアーゼIII(Life Technologies)とインキュベートし、5μgのncRNAを5UのRNアーゼR(Epicentre, Madison, WI)とインキュベートした。同様に、4μgのRNAを、5％の最終グルコース濃度になるように、0.64μLのin vivo-jetPEI(Polyplus-transfection Inc., New York, NY)送達薬剤を用いて処方し、次いで、100μLの体積になるように1μLのヒト血清(Thermo Scientific)と共に、または伴わずにOptiMEMに添加して、37℃で20分間インキュベートした。消化産物を8％尿素PAGEで分析した。
【０２３６】
逆転写定量リアルタイムPCR(RT-qPCR)
Direct-zol RNA MiniPrepキット(Zymo Research, Irvine, CA)を用いて全RNAを細胞から単離し、NxGen M-MuLV逆転写酵素(Lucigen, Middleton, WI)と、miR-34aの場合はステム-ループプライマー
2017524341.tif 000035
、またはキメラncRNA、プレmiR-34a、およびU6の場合はiScript reverse-transcription Supermix(Bio-Rad)を用いて逆転写した。定量リアルタイムPCR(qPCR)を、記載のように(Bi et al., 2014; Li et al., 2014)、定量RT-PCR Master mix(New England Biolabs)を用いてCFX96 TouchリアルタイムPCR装置(Bio-Rad)において行った。プライマーは以下の通りであった。
キメラncRNAについては
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プレmiRNA mir-34aについては
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成熟miR-34aについては
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U6については
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。比較閾値サイクル(comparative threshold cycle)(Ct)法と式2-ΔΔCtを用いることによって相対発現を計算した。
【０２３７】
低分子RNAライブラリー構築
高度に精製したncRNAまたはLipofectamine 2000(Life Technologies)そのもので処理して48時間後に回収したA549細胞から、トリゾル試薬(Invitrogen)を用いて全RNAを単離し、低分子RNAライブラリーを、Illumina Truseq(商標)Small RNA Preparation kit(Illumina, San Diego, CA)を用いて説明書に従って作製した。
【０２３８】
ディープシークエンシングおよびデータ分析
精製したcDNAライブラリーをIllumina Cluster Stationでのクラスター作製に使用し、次いで、Illumina GAIIxにおいてベンダーの説明書に従って配列決定した。リアルタイム配列決定画像分析後のIllumina Sequencing Control Studioソフトウェアバージョン2.8(SCS v2.8)と、Illumina Real-Time Analysisバージョン1.8.70(RTA v1.8.70)によるベースコーリングを用いて、生の配列リード(40nt)を得た。抜き出した配列リードを、知的財産権によって保護されているパイプラインスクリプト、ACGT101-miR v4.2(LC Sciences, Houston, TX)に従うことで標準的な配列決定データ分析に使用した。
【０２３９】
イムノブロット分析
細胞溶解産物を、完全プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche, Nutley, NJ)を加えたRIPA緩衝液(Rockland Immunochemical Inc., Limerick, PA)を用いて調製した。タンパク質濃度を、BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いて求めた。タンパク質を10％SDS-PAGEゲルで分離し、Trans-Blot Turbo Transfer System(Bio-Rad)を用いてPVDF膜に電気泳動転写した。膜を、CDK6(C-21)、SIRT1(H-300)、またはMet(C-28)ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotech Inc., Texas, TX)とインキュベートし、その後に、ペルオキシダーゼヤギ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Inc., West Grove, PA)とインキュベートした。次いで、膜をClarity Western ECL基質(Bio-Rad)とインキュベートし、ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)で視覚化した。
【０２４０】
細胞傷害性
記載のように(Pan et al., 2013; Li et al., 2015)、MTTアッセイを用いて癌細胞増殖に対するtRNA/mir-34aの効果を確かめた。細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり3,000個または5,000個の細胞で播種し、Lipofectamine 2000を用いて様々な濃度のtRNA/mir-34aで72時間トランスフェクトした。同じ用量のtRNA/MSAまたはLipofectamine 2000を用いてトランスフェクトした細胞を対照として使用した。基準化された阻害用量反応モデルにデータをフィッティングすることによって(GraphPad Prism, San Diego, CA)、EC50値およびHillスロープ値を推定した。
【０２４１】
異種移植腫瘍マウスモデル
動物の処置は全てUC Davisの動物実験委員会による承認を受けた。A549細胞およびHepG2細胞を収集し、計数し、体積で1:1比でMatrigel(BD Biosciences, San Jose, CA)と混合した。100μLの培地/Matrigel溶液に溶解した細胞(5×106個)を、5〜6週齢の雄ヌードマウス(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)の下背領域にs.c.注射した。腫瘍量をカリパスで測定し、以下の式、腫瘍量(mm3)=0.5μ(長さ(mm)×幅2(mm2))に従って計算した。腫瘍が150〜200mm3になったら、組換えtRNA/mir-34aおよび対照tRNA/MSAをin vivo-jetPEI(Polyplus-transfection Inc.)を用いて処方し、腫瘍内(i.t.)投与した。病理学者が組織学的に検証するために腫瘍を収集し、10％ホルマリンで固定し、切断した。
【０２４２】
マウスモデルにおける安全性プロファイル
5〜6週齢の雄BALB/cマウス(The Jackson Laboratory)に、in vivo-jetPEIで処方した100μgのncRNAを尾静脈を介してi.v.投与した。別の動物群を、負の対照としてin vivo-jetPEIビヒクルで処置したか、またはサイトカイン誘導のために正の対照として20μgのリポ多糖(LPS)で処置した(Wiggins et al., 2010; Bodeman et al., 2013; Wang et al., 2015)。血液を様々な時点で収集し、血清分離器(BD Biosciences)を用いて血清を単離した。マウスIL-6アッセイキット(Pierce Thermo Scientific)を用いて、SpectraMax M3 Multi-Mode  Spectrophotometer(Molecular Devices)において血清サイトカインIL-6レベルを定量し、マウス血液化学プロファイルをUC Davisの比較病理学研究室で確かめた。
【０２４３】
統計解析
全データを平均±SDで表した。群の数および分散に応じて、データを、独立スチューデントt検定、または一元配置ANOVAもしくは二元配置ANOVA(GraphPad Prism)で比較した。確率が0.05未満である場合に(P<0.05)、差が有意であるとみなした。
【０２４４】
結果
キメラtRNA/mir-34aを一般的な大腸菌株内でラージスケールで効率的に生合成し、高度に均一になるまで迅速に精製することができる。大腸菌内でプレmiR-34a作用物質を高収率で生成するために、本発明者らは、tRNAスキャフォールド(Ponchon and Dardel, 2007; Ponchon et al., 2009)を用いて、融合ncRNA、すなわちtRNA/mir-34aを組み立てることにした(図17A)。様々な計算アルゴリズムによって予測された二次構造は全て、ダイサー切断部位からなるプレmiR-34aのステム-ループ構造がtRNA/mir-34aキメラ内で保持されることを示した。従って、tRNA/mir-34a発現プラスミドを得るために、プレmiR-34aをコードする配列をクローニングした。本発明者らのデータから、プレmiR-34aの長さがわずかに変化しても、組換えtRNA/mir-34aの蓄積レベルは変わらないことが分かった(図18A)。標的tRNA/mir-34a作用物質を様々な一般的な大腸菌株において発現させた。最大の蓄積レベルはHST08細胞において(図17B)、形質転換して9〜14時間後に(図18B)見出された。さらに、本発明者らの研究室で調製されたHST08コンピテント細胞を用いても、同様のレベルの組換えtRNA/mir-34aが得られた(図18C)。細菌培養を0.5Lまでスケールアップし、異なるバッチの培養を行った時に、高レベルの発現(例えば、全RNAの中で約15％の組換えncRNA)が保持された(図18D)。このことから、生物学的tRNA/mir-34a作用物質が一貫して、かつ効率的に発現することが証明された。
【０２４５】
次に、本発明者らは、組換えtRNA/mir-34aを高度(例えば、>98％)に均一になるまで精製することを目標にした。最初に、Sephadexアプタマータグを積んでいるtRNA/mir-34aおよび対照tRNA/MSAに対してアフィニティ精製を行った。アフィニティクロマトグラフィーによって優れた純度(>90％)が得られたが、全収率はあまり満足の行くものではなかった(約2％の組換えncRNA/全RNA)。このことは、予想外であったが、明らかで非効率的な結合に起因するのかもしれない(図18E)。従って、本発明者らは、塩勾配溶出を用いて全RNAからtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAを単離するために陰イオン交換FPLC法を開発した。このFPLC法は、標的ncRNAを、高度(例えば、ゲル電気泳動およびHPLC分析によって証明された時に>98％の純度)に均一になるまで迅速に(1回の操作あたり<25分;図17C)単離できただけでなく(図17D)、かなり高い精製収率も示した(例えば、全RNAに存在する15％の標的ncRNAの条件で67％、すなわち、10％の組換えncRNA/カラムにロードした全RNA)。このFPLC方法によって精製プロセスが大いに楽になった。これにより、常に、何ミリグラムものncRNA、すなわち、0.5Lの細菌培養物から単離した15mgの全RNAから約1.5mgの純度>98％のtRNA/mir-34aを容易に得ることが可能になる。
【０２４６】
組換えncRNAは転写後修飾を有する
組換えtRNA/mir-34aが、生細胞において生成される天然RNAに一般的な転写後修飾で構成されるかどうか明らかにするために(Novoa et al., 2012)、本発明者らは、サンガー配列決定によって逆転写cDNAの一次配列を確かめた後に、いくつかの質量分析法ベースの技法を用いて精製ncRNAを分析した。最初に、本発明者らは、インタクトなncRNAをエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)で分析することで分子量(MW)を確かめた。分子量(MW)はtRNA/mir-34aについては73,422.4Da、tRNA/MSAについては34,765.2Da であった。MWの測定値と予測値(tRNA/mir-34aについては146.8Da、tRNA/MSAについては149.2Da; 図19A)との差から修飾ヌクレオシドが存在することが示唆される。次いで、本発明者らはncRNA加水分解産物のLC-UV-MS分析を行い、tRNAスキャフォールドの(tRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAの両方に存在する)多くの修飾ヌクレオシド、例えば、ジヒドロウリジン(D)、プソイドウリジン(Ψ)、7-メチルグアノシン(m7G)、4-チオウリジン(s4U)、2'-O-メチルグアノシン(Gm)、および3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)を特定した(図19B)。従って、本発明者らは、RNアーゼT1によって組換えncRNAから生成されたRNA断片のLC-MS/MS分析(図19C)を行った。これにより、ncRNA配列を首尾よくマッピングし、tRNAスキャフォールドの修飾ヌクレオシドの場所を全て突き止めることができた(図17E)。tRNA/mir-34a加水分解産物中に見出されたデオキシアデノシン(dA)(図19B)はRNアーゼT1消化物にマッピングされなかった。これは、以前のキャリーオーバーまたは同時精製した核酸に起因するのかもしれない。まとめると、これらのデータから、大腸菌から得られた組換えncRNAは、実際には、RNAフォールディングおよび代謝安定性にとって重大な意味を持つ可能性がある様々な転写後修飾からなることが分かる。
【０２４７】
tRNAによって運ばれるプレmiR-34aはヒト癌細胞では成熟miR-34aに選択的にプロセシングされるのに対して、tRNAスキャフォールドはtRNA断片に分解される
ヒト細胞内でキメラtRNA/mir-34aを成熟miR-34aに選択的にプロセシングできるかどうか評価するために、最初に、本発明者らは、アンバイアスドディープシークエンシング研究を行った。RNAseqデータから、tRNA/mir-34aキメラはA549細胞内で成熟miR-34aに正確にプロセシングされ、それによって、miR-34aレベルが、tRNA/MSAまたはビヒクルで処理した細胞より70倍増加したことが明らかになった(図20A〜B)。対照的に、いくつかの明らかにされていない低分子RNA(例えば、hsa-miR-30c-5p_R+1およびhsa-mir-7641-1-p5_1ss6TCなど; 図20A〜B)を除いて、他の細胞miRNAは変化しなかったか、またはほとんど変化しなかった。これは、miR-34a標的遺伝子発現の変化によって引き起こされた二次効果かもしれない。さらに、miR-34aレベルの増加は、tRNA/mir-34aで処理した細胞、tRNA/MSAで処理した細胞、およびビヒクルで処理した細胞において生じた22ntおよび23ntのアイソフォームに起因した。さらに、共通のtRNAスキャフォールドは細胞内で分解されて、成熟miR-34aよりかなり低いレベルではあるが、tRNA/mir-34aで処理した細胞とtRNA/MSAで処理した細胞との間で類似のパターンを示す同じtRFを示した(図20B、これはプレmiR-34aの活性を区別するための適切な対照としてのtRNA/MSAの使用を裏付けている)。
【０２４８】
組換えtRNA/mir-34aは好ましい細胞安定性を示し、ヒトRNアーゼによって分解される
ディープシークエンシングデータと一致して、選択的なステム-ループRT-qPCR分析から、ヒト肺癌細胞(A549およびH460)ならびに肝臓癌細胞(HepG2およびHuh-7)ではtRNA/mir-34aでトランスフェクトした後に、成熟miR-34aレベルは70〜100倍増加することが明らかになった(図21A)。さらに、tRNA/mir-34aで処理したA549細胞では用量依存的に成熟miR-34aレベルおよびプレmiR-34aレベルは上昇した。これに対して、tRNA/MSAで処理した細胞内ではmiR-34aレベルは変化せず、tRNA/MSAレベルは実際に増加した(図21B)。最も重要なことに、トランスフェクション後、高レベルの組換えtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAが細胞内に6日間にわたって持続し、レベルは3日目から徐々に減少した(図21C)。このことは好ましい細胞安定性を示している。さらに、プレmiR-34aレベルおよび成熟miR-34aレベルの経時変化はtRNA/mir-34a処理だけに依存した。さらなる生化学実験から、tRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAはRNアーゼA(またはヒト血清中の主要な形態のリボヌクレアーゼであるRNアーゼI)およびダイサー(RNアーゼIII)によって容易にプロセシングされたが、アンジオゲニン(RNアーゼ5)では比較的低い程度でプロセシングされたことが証明された(図21D)。このことから、これらが組換えncRNAのプロセシングおよび分解に関与することが示唆される。対照的に、細菌RNアーゼRはキメラncRNAを切断できなかった。このことは、なぜ、このようなncRNAが細菌内で高レベルまで蓄積したかということへの上手な説明となる。
【０２４９】
tRNAによって運ばれるプレmiR-34aは、合成miR-34a作用物質と同等のまたはそれより効果的な、miR-34a標的遺伝子の発現を低減しかつ癌細胞の増殖を阻害する活性を有する
従って、本発明者らは、miR-34a標的遺伝子の発現および癌細胞の増殖の制御におけるtRNAによって運ばれるプレmiR-34aの効力を、重要な対照としてtRNA/MSAを用いて評価した。組換えtRNA/mir-34aは、本発明者らの研究において試験した全てのタイプの癌細胞の増殖を対照tRNA/MSAよりかなり大きな程度で用量依存的に阻害した(図22Aおよび図23)。tRNA/mir-34aによる癌細胞増殖の抑制における高い効力は推定EC50値(表2)でも示された。tRNA/mir-34aによってA549癌細胞およびHepG2癌細胞の増殖が阻害されたことは、tRNA/MSAまたはビヒクル処理と比較して、CDK6、SIRT1、およびMETなどの詳細に明らかにされた多くのmiR-34a標的遺伝子が著しく抑制されたことと関連した(図22B)。さらに、本発明者らは、ヒト細胞株モデル内で生物学的miR-34a作用物質と合成miR-34a作用物質の有効性を突き合わせて比較した。興味深いことに、本発明者らのデータから、組換えtRNA/mir-34aは、対応する対照と比較して、人工修飾を積んでいる同じ用量の合成プレmiR-34aおよびmiR-34a模倣物より、A549細胞およびHepG2細胞の増殖ならびにmiR-34a標的遺伝子(例えば、CDK6、SIRT1、およびMET)のタンパク質レベルを抑制するのにかなり効果があることが分かった(図24A〜B)。これらの結果から、tRNAによって運ばれるプレmiR-34aはmiR-34a標的遺伝子発現および癌細胞増殖の調整における生物学的/薬理学的な活性を有することが分かる。
【０２５０】
（表２）組換えtRNA/mir-34aおよび対照tRNA/MSAによるヒト癌細胞増殖の抑制についての推定EC50値およびHillスロープ値
2017524341.tif 000040
(適合度(Goodness of Fit)R2>0.75)。「フィッティングなし」とは、適合度が0.50未満であることを意味する。*同じ細胞株における対照tRNA/MSAと有意な(P<0.05)差がある。
【０２５１】
組換えプレmiR-34aはマウスモデルにおいて異種移植腫瘍の進行を抑制する効果がある
従って、本発明者らは、ヒト肺癌A549および肝臓癌HepG2の異種移植腫瘍マウスモデルを用いてインビボでtRNA/mir-34aの治療効果を評価した。A549異種移植腫瘍が、典型的には接種後3週間以内で約150mm3になったら、本発明者らは、組織分布によって複雑にならない、in vivo-jetPEIで処方した20μgまたは100μgのtRNA/mir-34aを用いて雄ヌードマウスの腫瘍内に処置した。対照として、別の動物群にin vivo-jetPEIで処方した同じ用量のtRNA/MSAを投与したか、または対照としてin vivo-jetPEIビヒクルだけを投与した。本発明者らのデータから、ビヒクル処置または同じ用量のtRNA/MSAと比較して、高用量(100μg)のtRNA/mir-34aを用いるとA549異種移植腫瘍(6つのうち3つ)が完全に消失し、生存可能な腫瘍の成長が全体的に有意に抑制されたことが分かった(図25A)。同じ用量(100μg)のtRNA/mir-34aを用いて、HepG2由来異種移植片の成長も、A549異種移植片に及ぼす影響より弱いが有意に抑制された(図25B)。これらの発見から、組換えtRNAによって運ばれるプレmiR-34aはインビボで異種移植腫瘍の進行を制御する効果があることが分かる。
【０２５２】
マウスモデルにおいてキメラncRNAの忍容性は高い
本発明者らは、大腸菌内で生成された組換えtRNA/mir-34a作用物質の安全性プロファイルをさらに調べた。最初に、これらの生物学的ncRNAが、哺乳動物細胞において免疫応答または毒性の原因となり得る有意なレベルのエンドトキシンを含有するかどうか評価するために、Limulus Amebocyte Lysate(LAL)アッセイを行った。大腸菌から単離した全RNAが様々なレベルのエンドトキシン(100〜1,000 EU/μgRNA)を示したが、FPLCで精製したncRNAのエンドトキシン活性(<10EU/μg RNA)およびエンドトキシン除去キットでさらに処理したncRNAのエンドトキシン活性(<3.0EU/μg RNA)はわずかしかなかった。RNA作用物質のエンドトキシン安全規格が無く、RNAがLALアッセイ(LALアッセイの機構)に影響を及ぼすかどうかはっきりしないのにもかかわらず、本発明者らの精製ncRNAにおけるエンドトキシン活性は、トランスフェクションおよび細胞増殖を有意に阻害するのに必要な2,000EU/μg DNAよりかなり低かった(Butash et al., 2000)。
【０２５３】
in vivo-jetPEIが装填されたtRNA/mir-34aおよびtRNA/MSAが血清RNアーゼによる分解から守られることを検証した後に(図26A)、本発明者らは、免疫応答性BALB/c雄マウスモデルにおける免疫応答ならびに肝機能および腎機能に対する、in vivo-jetPEIで処方したncRNAの効果を直接評価した。免疫応答の活性化は様々なサイトカインの血中濃度の増加によって示されることが多い。サイトカインの中で炎症促進性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインであるIL-6が核酸に応答する感受性が最も高い(Wiggins et al., 2010)。正の対照として、LPS処置マウスは、ストレスの明らかな徴候(例えば、背中を丸めた姿勢およびのろのろとした動き(labored movement))に加えて、注射して1〜6時間後に血清中IL-6レベルがすぐに急上昇し(図26B)、次いで24時間以内に完全に回復した。対照的に、100μgのtRNA/mir-34aまたはtRNA/MSAを静脈内投与して6時間後に、マウスの血清中IL-6レベルはわずかにしか上昇しなかった。LPS処置と比較して変化は非常に穏やかであり、有害な薬物応答を示さない可能性がある合成miR-34a模倣物について報告された変化に似ていた(Wiggins et al., 2010)。さらに、組換えtRNA/mir-34aによって、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アルブミン、アルカリホスファターゼ(ALP)、総ビリルビン、血中尿素窒素(BUN)、クレアチニン、および総タンパク質のレベルを含むマウス血液化学プロファイルは有意に変化しなかった(図7C)。このことから、生物学的ncRNA作用物質は急性の肝臓毒性も腎臓毒性も誘導しなかったことが示唆された。
【０２５４】
考察
miRNAベースの療法を開発する多大な取り組みとは対照的に、トランスレーショナルリサーチおよび臨床研究は、多量の安価な天然miRNA作用物質の入手方法によって妨げられることが多い。RNAの働きをする生物学的RNA作用物質を展開するという考えと「プロドラッグ」の原理により動機付けられ、本発明者らは、研究室の場で、一般的な大腸菌株の1リットル培養物中で何ミリグラムものtRNA融合miR-34a生物学的作用物質を費用対効果が高く生成する新規の戦略を確立した。HST08株における組換えncRNAの良好な発現は、HST08細胞にメチル化DNAを消化するための遺伝子クラスターが無いこと、または分解のためにncRNAをポリアデニル化する能力が低いことと関連するのかもしれない。本発明者らの戦略が、p19発現細菌を用いて、完全にプロセシングされたsiRNAを作製する新たに報告されたアプローチと異なることは注目に値する(Huang et al., 2013)。組換えtRNA/mir-34aが細菌内に高収率(全RNAの約15％)で蓄積することも、陰イオン交換FPLC法によって高度(>98％)に均一になるまで精製することを容易にした。さらに、本発明者らは、加水分解産物のLC-UV-MS分析とRNアーゼT1で切断した断片のLC-MS/MS分析によって、組換えncRNAの一次構造と修飾ヌクレオシドを特徴付けることができた。本発明者らの発見は、tRNAスキャフォールドの安定性にとって重大な意味を持つ、tRNAスキャフォールドの重要な転写後修飾を物語っている(Alexandrov et al., 2006)。
【０２５５】
キメラtRNA/mir-34aはヒト癌細胞内で驚くほど好ましい安定性を示した。このことから、キメラtRNA/mir-34aが細菌内で高収率で生成された後に、tRNA担体はヒト細胞に標的プレmiR-34aを「ステルス送達」したことも示唆される。予想通り、キメラtRNA/mir-34aは、ヒト癌細胞内で、プレmiR-34aが内因性のmiRNAプロセシング機構によって成熟miR-34aに選択的にプロセシングされ、tRNA担体がtRFに分解される「プロドラッグ」として働いた(Lee et al., 2009; Li et al., 2012)。70倍のレベルの成熟miR-34aには、プレmiR-34aに由来するmiR-34a-p3低分子RNAの60倍の増加も伴った。従って、キメラtRNA/mir-34aは、tRNAスキャフォールドを用いて生成できない関心対象の低分子RNAを組み立てるための最適な担体として役立つ可能性がある(Chen et al., 2015)。さらに、これらの結果から、ヒト細胞における組換えncRNAの運命と、いくつかの市販ヒトRNアーゼに対する感受性をよく理解できるようになる。これにもかかわらず、生物学的tRNA/mir-34aの代謝および薬物動態に特定のRNアーゼが的確に寄与することで、さらなる調査が正当化される。これらのtRFの効果は分かっていないが、ヒト細胞内で、tRNA/MSAおよびtRNA/mir-34aから同じtRFが同等のレベルで生成された。このことから、tRNAによって運ばれるプレmiR-34aの生理活性を評価するために、対照と同じ大腸菌株内で発現させ、同じように精製したtRNA/MSAを使用する妥当性が裏付けられた。
【０２５６】
tRNAによって運ばれるプレmiR-34aの機能は、A549細胞およびHepG2細胞の両方で、tRNA/MSAと比較して、多くの以前に検証されたmiR-34a標的遺伝子、例えば、CDK6、MET、およびSIRT1のタンパク質発現レベルを選択的に低減することでうまく証明された。これらの遺伝子は細胞周期およびアポトーシスなどの多くの細胞プロセスにとって重大な意味を持つ。従って、組換えプレmiR-34aによってmiR-34a標的遺伝子が抑制されることは、組換えプレmiR-34aの抗増殖活性の機構的な説明となる。様々なタイプの癌細胞に対する組換えプレmiR-34aの広い抗癌活性は、複数の癌遺伝子を標的化する際のmiR-34aの機能と、様々なタイプの癌細胞の間での発癌経路についての以前の発見と一致する(Chang et al., 2007; He et al., 2007; Sun et al., 2008; Yamakuchi et al., 2008; Li et al., 2009; Liu et al., 2011; Kasinski and Slack, 2012)。一方では、異なるヒト癌細胞株がtRNA/mir-34aに対して異なる感受性を示した。このことは、異なる細胞株におけるゲノムおよび遺伝子発現プロファイルと、標的遺伝子発現に対するプレmiR-34aの目に見える効果のばらつきによるものかもしれない。本発明者らは、miR-34a標的遺伝子発現および癌細胞増殖の調整におけるtRNAによって運ばれるプレmiR-34aの活性が、キメラtRNA/mir-34aから生成された成熟miR-34aに起因すると指摘したが、認められた効果の一部をプレmiR-34aそのものが担っている可能性を排除できない。
【０２５７】
ヒト肺癌においてよく見られる、KRAS変異体、野生型p53、および野生型EGFRからなる非小細胞肺癌A549細胞はヒト肺の発癌と腫瘍進行に適したモデルである(Lehman et al., 1991; Nomoto et al., 2006)。対照的に、肝細胞癌(HCC)HepG2細胞株は、ウイルス感染の無い純粋なヒト肝癌細胞株であり、NRAS変異体で構成され、HCCモデルとして用いられることが多い(Hsu et al., 1993; Charette et al., 2010; Costantini et al., 2013)。従って、インビボでの腫瘍成長の制御における組換えプレmiR-34aの有効性を評価するために、A549細胞およびHepG2細胞を用いてマウスモデルに異種移植腫瘍を作製した。本発明者らの研究から、A549異種移植腫瘍およびHepG2異種移植腫瘍の成長はいずれも、ビヒクル処置または同じ用量のtRNA/MSAと比較して高用量(100μg)のtRNA/mir-34aによって有意に抑制されることが明らかになった。腫瘍成長を6週間モニタリングした後に、本発明者らのデータから再発が起こるのかどうか、また、いつ起こるのかは分からないが、tRNA/mir-34aはA549腫瘍を大きく消し去る(6匹のマウスのうち3匹)ことが証明された。本発明者らはインビボでのtRNA/mir-34aの半減期を測定しなかったが、単回投与トランスフェクションの後にA549細胞株およびHepG2細胞株において6日目まで発現レベルが持続したことを証明した。一方では、本発明者らのデータから、tRNA/mir-34aによるA549異種移植片の阻害の程度がHepG2よりかなり大きいことが分かった。これは、インビトロで癌細胞株モデルを用いて明らかにされたtRNA/mir-34aの効力と一致する。本研究は腫瘍内薬物投与に限定されたが、インビボでの生物学的miR-34a作用物質の有効性を裏付ける直接的な証拠を提供する。そうではあるが、臨床研究の前に、標的薬物送達系および/またはさらに臨床に関連する腫瘍動物モデルを用いて、癌を処置するための組換えmiR-34a作用物質の有用性を検証しなければならない。
【０２５８】
本発明者らの研究はまた、FPLC精製キメラmiR-34a生物学的作用物質の比較的高い用量の静脈内ボーラスでも、薬物を投与して48時間以内にマウスにストレス(例えば、背中を丸めた姿勢およびのろのろとした動き)が全く起こらず、肝機能および腎機能が変化しなかったことを示した。肝機能および腎機能が変化しなかったことは血液化学プロファイルが変化しなかったことで明らかになった。核酸に反応する最も感受性の高いサイトカインである血清中IL-6のレベルは、LPS処置と比較して、キメラncRNAによってわずかにしか乱されなかった。短期間(6時間)で、組換えtRNA/mir-34およびtRNA/MSAによって引き起こされるIL-6レベルのわずかな変化は、実際に、合成miR-34a模倣物について報告された変化と同等であった(Wiggins et al., 2010)。注射して48時間後に、tRNA/mir-34aで処置したマウスにおいてALT、AST、ビリルビン、アルブミン、BUN、クレアチニン、および総タンパク質レベルが変化しなかったために、これらの発見から、組換えncRNAはマウスモデルにおいて忍容性が高く、急性毒性を全く誘導しないことが分かる。そうではあるが、臨床研究の前に様々な動物モデル種において生物学的ncRNAを長期投与した後の安全性プロファイルを批評眼をもって明らかにするために、さらなる研究が必要である。
【０２５９】
本研究において最初に述べたように、組換えtRNA/mir-34aが、対応する対照と比較した、標的遺伝子発現の調節および癌細胞増殖の抑制において、合成プレmiR-34aおよびmiR-34a模倣物と同等またはそれ以上の効果を有すると判明したことも、注目に値する。これは細胞内での二次構造および代謝安定性の違いに関連している可能性があり、その結果として、標的遺伝子発現を調節し、細胞プロセスを制御するために、これらの作用物質を利用する際のmiRNAプロセシング機構とRISC複合体の効率の違いに関連するのかもしれない。
【０２６０】
結論として、本発明者らの結果から、キメラプレmiR-34a作用物質を一般的な大腸菌株内でラージスケールで効率的に生成できたことが証明された。天然修飾がある生物学的tRNA/mir-34aは好ましい細胞安定性を示し、RNアーゼによって分解された。さらに、tRNAによって運ばれるプレmiR-34aは、成熟miR-34aへと選択的にプロセシングされた後にmiR-34a標的遺伝子の発現を調節することによってヒト癌細胞増殖を抑制するための薬理学的活性を有していた。さらに、キメラmiR-34aはマウスモデルにおいて異種移植腫瘍の進行を制御する効果があると同時に忍容性が高かった。本発明者らの発見から、細菌内で作製されたキメラmiRNA作用物質は新規の薬物療法を発見および開発するための有用なツールであることが分かる。
【０２６１】
実施例3の参考文献
2017524341.tif 000041
2017524341.tif 000042
2017524341.tif 000043
2017524341.tif 000044
【０２６２】
本明細書に記載の実施例および態様は例示目的にすぎず、本明細書に記載の実施例および態様を考慮して様々な修正または変更が当業者に示唆され、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の中に含まれることが理解される。本明細書において引用された刊行物、特許、および特許出願は全て、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６３】
非公式の配列表
tRNA配列に下線を引いた。イタリック体はプレmiRNA配列である。イタリック体で太字の配列はプレmiRNAの伸長した5'配列および3'配列である。下線を引いたイタリック体の太字は変異ヌクレオチドを表す。アプタマー(例えば、MGA)配列を四角で囲んだ。
SEQ ID NO:1-tRNA/MSA(107nt)
2017524341.tif 000045
SEQ ID NO:2-ヒトプレ-miR-34a(hsa-mir-34a; MI0000268)
2017524341.tif 000046
SEQ ID NO:3-OnRS-1またはtRNA/mir-34a(233nt)
2017524341.tif 000047
SEQ ID NO:4-OnRS-2またはtRNA/mir-34a-2(195nt)
2017524341.tif 000048
SEQ ID NO:5-OnRS-3またはtRNA/mir-34a-3(198nt)
2017524341.tif 000049
SEQ ID NO:6-OnRS-4aまたはtRNA/mir-34a-4a(181nt)
2017524341.tif 000050
SEQ ID NO:7-OnRS-4bまたはtRNA/mir-34a-4b(180nt)
2017524341.tif 000051
SEQ ID NO:8-OnRS-5またはtRNA/mir-34a-5(181nt)
2017524341.tif 000052
SEQ ID NO:9-ヒトプレ-miR-1291(hsa-mir-1291; MI0006353)
2017524341.tif 000053
SEQ ID NO:10-tRNA/mir-1291またはOnRS-6(227nt)
2017524341.tif 000054
SEQ ID NO:11-tRNA/mir-1291-2またはOnRS-7(175nt)
2017524341.tif 000055
SEQ ID NO:12-tRNA/mir-1291-3aまたはOnRS-8a(159nt)
2017524341.tif 000056
SEQ ID NO:13-tRNA/mir-1291-3bまたはOnRS-8b(159nt)
2017524341.tif 000057
SEQ ID NO:14-tRNA/mir-1291-3cまたはOnRS-8c(159nt)
2017524341.tif 000058
SEQ ID NO:15-tRNA/mir-1291-3dまたはOnRS-8d(158nt)
2017524341.tif 000059
SEQ ID NO:16-tRNA/mir-1291-3eまたはOnRS-8e(158nt)
2017524341.tif 000060
SEQ ID NO:17-プレ-miR-125b-1(hsa-mir-125b-1; MI0000446)
2017524341.tif 000061
SEQ ID NO:18-tRNA/mir-125b-1またはOnRS-9(216nt)
2017524341.tif 000062
SEQ ID NO:19-tRNA/mir-125b-2またはOnRS-10(159nt)
2017524341.tif 000063
SEQ ID NO:20-tRNA/mir-125b-2aまたはOnRS-10a(159nt)
2017524341.tif 000064
SEQ ID NO:21-tRNA/mir-125b-2bまたはOnRS-10b(159nt)
2017524341.tif 000065
SEQ ID NO:22-tRNA/mir-125b-2cまたはOnRS-10c(159nt)
2017524341.tif 000066
SEQ ID NO:23-tRNA/mir-125b-2dまたはOnRS-10d(159nt)
2017524341.tif 000067
SEQ ID NO:24-tRNA/mir-125b-2eまたはOnRS-10e(159nt)
2017524341.tif 000068
SEQ ID NO:25-tRNA/mir-125b-2fまたはOnRS-10f(159nt)
2017524341.tif 000069
SEQ ID NO:26-プレ-miR-124-1(hsa-mir-124-1; MI0000443)
2017524341.tif 000070
SEQ ID NO:27-tRNA/mir-124-1(232nt): メチオニルtRNAと、伸長配列のあるプレ-miR-124-1のハイブリッド分子
2017524341.tif 000071
SEQ ID NO:28-OnRS/miR-124(228nt): miR-34a配列(成熟およびガイド)がmiR-124(-3pおよびガイド)配列と交換されている、メチオニルtRNAとプレ-miR-34aのハイブリッド分子
2017524341.tif 000072
二重下線は成熟miR-124配列であり、太字の下線はガイドmiR-124配列である。
SEQ ID NO:29-プレ-miR-27b(hsa-mir-27b; MI0000440)
2017524341.tif 000073
SEQ ID NO:30-tRNA/miR-27b(227nt): メチオニルtRNAと、伸長配列のあるプレ-miR-27bのハイブリッド分子
2017524341.tif 000074
SEQ ID NO:31-OnRS/miR-27b(230nt): miR-34a配列(成熟およびガイド)がmiR-27b(成熟およびガイド)配列と交換されている、メチオニルtRNAとプレ-miR-34aのハイブリッド分子
2017524341.tif 000075
二重下線は成熟miR-27b配列であり、太字の下線はガイド配列である。
SEQ ID NO:32-プレ-miR-22(hsa-mir-22; MI0000078)
2017524341.tif 000076
SEQ ID NO:33-tRNA/miR-22(210nt): メチオニルtRNAと、伸長配列のあるプレ-miR-22のハイブリッド分子
2017524341.tif 000077
SEQ ID NO:34-OnRS/miR-22(232nt): miR-34a(成熟およびガイド)配列がmiR-22(成熟およびガイド)配列で置換されている、メチオニルtRNAとプレ-miR-34aのハイブリッド分子
2017524341.tif 000078
二重下線は成熟miR-22配列であり、太字の下線はガイドmiR-22配列である。
SEQ ID NO:35-OnRS/Neg(232nt)miR-34a(成熟およびガイド)配列がgRNA(成熟およびガイド)配列で置換されている、メチオニルtRNAとプレ-miR-34aのハイブリッド分子
2017524341.tif 000079
二重下線はスクランブルsRNA配列であり、太字の下線はガイドsRNA配列である。
SEQ ID NO:36-OnRS/GFP-siRNA(232nt): miR-34a(成熟およびガイド)配列がGFP-siRNA(成熟およびガイド)配列で置換されている、メチオニルtRNAとプレ-miR-34aのハイブリッド分子
2017524341.tif 000080
二重下線はGFP siRNA配列であり、太字の下線はガイドsiRNA配列である。
SEQ ID NO:37-tRNA/mir-155/GFP-siRNA(216nt): miR-155(成熟およびガイド)配列がGFP-siRNA(成熟およびガイド)配列で置換されている、メチオニルtRNAとプレmiR-155のハイブリッド分子
2017524341.tif 000081
SEQ ID NO:38-マラカイトグリーンアプタマー(MGA)(38nt)
2017524341.tif 000082
SEQ ID NO:39-OnRS-2/MGA5(233nt): メチオニルtRNAとプレ-miR-34aとMGAのハイブリッド分子。MGAはプレ-miR-34aの上流に挿入されている。
2017524341.tif 000083
SEQ ID NO:40-OnRS-2/MGA3(233nt): メチオニルtRNAとプレ-miR-34aとMGAのハイブリッド分子。MGAはプレ-miR-34aの下流に挿入されている。
2017524341.tif 000084
SEQ ID NO:41-tRNA/shRNA-1aまたはOnRS-11a/siRNA(miRNA)
2017524341.tif 000085
二重下線はsiRNAまたはmiRNA配列である。
SEQ ID NO:42-tRNA/shRNA-1bまたはOnRS-11b/siRNA(miRNA)
2017524341.tif 000086
二重下線はsiRNAまたはmiRNA配列である。
SEQ ID NO:43-tRNA/shRNA-1cまたはOnRS-11c/siRNA(miRNA)
2017524341.tif 000087
二重下線はsiRNAまたはmiRNA配列である。
SEQ ID NO:44-tRNA/shRNA-1dまたはOnRS-11d/siRNA(miRNA)
2017524341.tif 000088
二重下線はsiRNAまたはmiRNA配列である。
SEQ ID NO:45-tRNA/shRNA-1eまたはOnRS-11e/siRNA(miRNA)
2017524341.tif 000089
二重下線はsiRNAまたはmiRNA配列である。
【図１】
2017524341.tif 000091
【図２】
2017524341.tif 000092
【図３】
2017524341.tif 000093
【図４】
2017524341.tif 000094
【図５Ａ】
2017524341.tif 000095
【図５Ｂ】
2017524341.tif 000096
【図５Ｃ】
2017524341.tif 000097
【図５Ｄ】
2017524341.tif 000098
【図６−１】
2017524341.tif 000099
【図６−２】
2017524341.tif 000100
【図７−１】
2017524341.tif 000101
【図７−２】
2017524341.tif 000102
【図８】
2017524341.tif 000103
【図９Ａ】
2017524341.tif 000104
【図９Ｂ】
2017524341.tif 000105
【図９Ｃ】
2017524341.tif 000106
【図９Ｄ】
2017524341.tif 000107
【図９Ｅ】
2017524341.tif 000108
【図１０Ａ】
2017524341.tif 000109
【図１０Ｂ】
2017524341.tif 000110
【図１０Ｃ】
2017524341.tif 000111
【図１０Ｄ】
2017524341.tif 000112
【図１０Ｅ】
2017524341.tif 000113
【図１１】
2017524341.tif 000114
【図１２】
2017524341.tif 000115
【図１３】
2017524341.tif 000116
【図１４】
2017524341.tif 000117
【図１５】
2017524341.tif 000118
【図１６】
2017524341.tif 000119
【図１７】
2017524341.tif 000120
【図１８】
2017524341.tif 000121
【図１９】
2017524341.tif 000122
【図２０】
2017524341.tif 000123
【図２１】
2017524341.tif 000124
【図２２】
2017524341.tif 000125
【図２３】
2017524341.tif 000126
【図２４】
2017524341.tif 000127
【図２５】
2017524341.tif 000128
【図２６】
2017524341.tif 000129
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月22日(2017.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017524341000001.app
【国際調査報告】
2017524341.tif 000130
2017524341.tif 000131