(57)【要約】本発明は抗酸化物質活性保護のためのプロラミンベース経口用フィルム製造方法に関するものであって、より詳細には（ａ）プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する段階；及び（ｂ）０℃乃至80℃の減圧条件で溶媒を蒸発させる段階を含む経口用フィルム製造方法に関する。本発明の製造方法によれば抗酸化物質の活性が高い水準で維持される経口用フィルムを製造することができて、特に、胃腸及び小腸の過酷な環境の中でもフィルムに含まれた抗酸化物質の活性が高い水準で維持されるので産業上の利用可能性が高い。
2017510649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する段階；及び
（ｂ）０℃乃至80℃の減圧条件で溶媒を蒸発させる段階を含む経口用フィルムの製造方法。
【請求項２】
前記プロラミンは小麦、ライ麦、麦、燕麦、米、モロコシ、粟、鳩麦及びトウモロコシからなる群より選ばれた少なくとも一つの植物由来のプロラミンであることを特徴とする請求項１記載の経口用フィルムの製造方法。
【請求項３】
前記プロラミンはゼイン、グリアジン、ホルデイン、セカリン、カフィリン、コイクシン、グルテニン、グルビグルテリン及びアベインからなる群より選ばれるいずれか一つであることを特徴とする請求項２記載の経口用フィルムの製造方法。
【請求項４】
前記抗酸化物質は抗酸化酵素、非酵素的抗酸化物質及びこれらの混合物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１記載の経口用フィルムの製造方法。
【請求項５】
抗酸化酵素はスーパオキシドジスムターゼ(superoxide  dismutase)、カタラーゼ(catalase)、グルタチオンペルオキシダーゼ(glutathione  peroxidase)、グルタチオン還元酵素(glutathione  reductase)、グルタチオン−Ｓ−伝達酵素ヘムオキシゲナーゼ(glutathione-S-transferase  hemeoxygenase)及びこれらの合成酵素又はペプチド類似体からなる群より選ばれたいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項４記載の経口用フィルムの製造方法。
【請求項６】
前記非酵素的抗酸化物質はビタミンＥ、クルクミン(curcumin)、カロチン(carotene)、リポ酸(lipoic  acid)、コエンザイムQ10、トコフェロール、ポリフェノール、レチニル、パルミテート、チオクト酸、カロチノイド、ビタミンＣ、ビタミンＣ誘導体、カフェイン、カフェ酸、BHA(butylated  hydroxyanisole)、BHT(butylated  hydroxytoluene)、TBHQ(tertiary  butylhydroquinone)、エピガルロカテキン-3-ガレート(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)、プロアントシアニジン(proanthocyanidin)、没食子酸(Gallic  acid)、セレニウム、亜鉛、タウリン、プラボノイド及びスコポレチン(Scopoletin)からなる群より選ばれる一つ以上であることを特徴とする請求項４記載の経口用フィルムの製造方法。
【請求項７】
前記温度は０℃乃至45℃であることを特徴とする請求項１記載の経口用フィルムの製造方法。
【請求項８】
前記温度は10℃乃至38℃であることを特徴とする請求項１記載の経口用フィルムの製造方法。
【請求項９】
前記圧力は１×10-5mbar乃至999mbarであることを特徴とする請求項１記載の経口用フィルムの製造方法。
【請求項１０】
請求項１の方法で製造された抗酸化剤を含むプロラミンベース経口用フィルム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2014年03月31日に出願された大韓民国特許出願第10-2014-0038163号を優先権主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は抗酸化物質活性保護のためのプロラミンベース経口用フィルム製造方法に関するもので、さらに、詳しくは（ａ）プロラミン、グリセロールホルマール(glycerol  formal)及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する段階；及び（ｂ）０℃乃至80℃の減圧条件で溶媒を蒸発させる段階を含む経口用フィルム製造方法及び前記方法で製造された抗酸化剤を含むプロラミンベース経口用フィルムに関する。
【背景技術】
【０００３】
生体内でエネルギー生産のための酸化過程中に相当量の活性酸素等が生産される。これらの活性酸素は生体内除去機作により大部分消滅されるが、瞬間的に活性酸素が多量発生したり、慢性的に活性酸素が発生して抗酸化防御系との均衡が崩れると各種の疾患の原因になる。酸素は代謝過程のうち一部分がスーパオキシードラジカル(02・-)、過酸化水素(H202)、ヒドロキシラジカル(HO・)、酸素単分子（一重項酸素、1O2)のような活性有害酸素に変化されるが、これらは抗酸化酵素と非酵素的抗酸化剤で構成された酸化剤と抗酸化剤均衡を崩して生体構成成分等の損傷を引起こす。
【０００４】
老化、ガン、脳血管疾患、心血管系疾患等のような疾患の主要原因のうちの一つにフリーラジカル(free  radical)又は活性酸素種(reactive  oxygen  species,ROS)を挙げられる。前記活性酸素種は生物体に侵入した病菌等による生物学的ストレスや地球環境悪化に伴う各種環境ストレス等のストレスにより、生物維持に必須的に要求される酸素の反応性が高くなった酸素を意味することができ、前記反応性が高い酸素は深刻な生理的障害等を誘発するようになる。具体的にフリーラジカル又は活性酸素種は細胞を破壊したり、皮膚真皮層の結合組織を切断したり交差結合を引起こすのでシワ形成、アトピ性皮膚炎、ニキビ、又は皮膚ガンのような皮膚関連疾病だけでなく、ガン、心筋梗塞症(myocardial  infarction)、脳卒中(stroke)、動脈硬化症(atherosclerosis)等を含む心血管系疾患、筋萎縮測索硬化症(amyotrophic  laternal  sclerosis)やアルツハイマー性痴呆(Alzheimer's  disease,AD）、パーキンソン病(Parkinsion's  disease,PD)のような慢性退行性神経疾患(chronic  neurodegenerative  disease)の原因になるものと報告されている。さらに、フリーラジカル又は活性酸素種は人体内で脂質を過酸化させて過酸化脂質という有害な物質を生成することができ、前記過酸化脂質は血管に作用して動脈硬化や血栓のような各種の成人病及び慢性疾患の原因になるものと報告されている。
【０００５】
上記のようにフリーラジカル又は活性酸素種が多くの病症と関係があるので、このような活性酸素種の生成を抑制したり、既に体内に生成された活性酸素種を速やかに除去する効果がある多様な抗酸化剤物質等を人体に投与して疾病を予防又は治療しようとする努力が継続している。
【０００６】
疾病の治療において、特に慢性的疾患の治療において最も一般的で、便利な投薬(drug  administration)方式は口腔(oral  route)を通じた薬剤伝達方法である。しかし、前記抗酸化物質等はそのまま経口投与された際、胃腸、小腸等の消化管を移動する途中で消化器官の過酷な環境（pH変化及び各種の消化酵素等）により、その生物学的活性が減少したり除去されて実際のin  vivo上における治療効果が極めて制限的に表れる。特に、治療活性を有するタンパク質の場合には、そのもの自体で経口投与された際胃腸管(gastrointestinal  tract,GI)内の環境によって容易に分解されものと知られている(Woodley,J,F.,1994.Enzymatic  barriers  for  GI  peptide  and  protein  delivery.Crit.Rev.Ther.Drug  Carrier  Syst.11,61-5.)。
【０００７】
ここに、胃腸及び小腸等における消化過程において抗酸化物質の活性を高い水準で保護する効果的な口腔薬剤伝達システムを開発して投薬効果を増進させる新たな戦略が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ここで、本発明者らは、消化器官から抗酸化物質の活性を保護する効果的な口腔薬剤の伝達システムを研究中、プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むエタノール水溶液を有して特定温度及び圧力条件で溶媒を蒸発させて経口用フィルム製剤を製造した際、前記製造されたフィルムにおいて抗酸化物質等の活性が極めて高い水準で維持されることを確認して本発明を完成した。
【０００９】
従って、本発明の目的は（ａ）プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する段階；及び（ｂ）０℃乃至80℃の減圧条件で溶媒を蒸発させる段階を含む経口用フィルム製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は前記方法で製造された抗酸化剤を含むプロラミンベース経口用フィルムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目的を達成するために、本発明は（ａ）プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する段階；及び（ｂ）０℃乃至80℃の減圧条件で溶媒を蒸発させる段階を含む経口用フィルム製造方法を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記方法で製造された抗酸化剤を含むプロラミンベース経口用フィルムを提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、
（ａ）プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する段階；及び
（ｂ）０℃乃至80℃の減圧条件で溶媒を蒸発させる段階を含む経口用フィルム製造方法を提供する。
【００１４】
（ａ）段階ではプロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する。
【００１５】
プロラミンは穀物(cereal)のような植物から発見される一群の球形タンパク質を示す。プロラミンタンパク質は一般的に、70乃至80%のアルコールには溶解されるが、水と純粋アルコールには溶解されない。これらのタンパク質はグルタミン酸とプロリンを高い水準で含む。
【００１６】
本発明のプロラミンは植物から由来した公知のプロラミンタンパク質であれば、その種類が制限はされないが、例えば、小麦(wheat)、ライ麦(rye)、麦(barley)、オート麦(oat)、お米(rice)、モロコシ(sorghum)、キビ(millet)、鳩麦(coix)及びトウモロコシからなる群より選ばれた少なくとも一つの植物由来のプロラミンである。好ましくは本願発明のプロラミンはゼイン(zein)、グリアジン(gliadin)、ホルデイン(hordein)、セカリン(secalin)、カフィリン(kafirin)、コイクシン(coixin)、グルテニン(glutenin)、グルビーグルテリン(GluB-Glutelin)及びアベイン(avenin)からなる群より選ばれるいずれか一つ又は二つ以上の混合物である。
【００１７】
グリセロールホルマール(glycerol  formal,C4H8O3)はMethylidinoglycerol;Sericosol  N;1,3-Dioxolane-4-methanol;1,2-(Methylidene)glycerol;5-hydroxy-1,3-dioxane及び4-hydroxymethyl-1,3-dioxolaneの混合物；Glycerin  formal;Formal  Glycerol等の多様な異名を有し、非水溶性(water-insoluble)化合物の溶解のための可溶化剤の役割を果たすものと知られている。
【００１８】
本発明のグリセロールホルマールは、下記化学式１及び化学式２の構造を有するものであって、47-67%  5-hydroxy-1,3-dioxane  basis及び  33-53%  4-hydroxymethyl-1,3-dioxolane  basisの混合物である。本発明のグリセロールホルマールは商業的に購入して使用したり又は当業界で公知の化学的合成法で製造したものも使用できる。
【化１】
2017510649.tif 000003
【００１９】
抗酸化とは、体内で起きる多様な酸化作用を防止することを意味し、抗酸化物質（又は抗酸化剤）は基質の量と比較して少量で存在しながら基質の酸化を遅延させたり抑制する物質を意味する。
【００２０】
本願発明の抗酸化物質はフリーラジカル又は活性酸素種(ROS)の消去又は生成抑制機能（抗酸化力）を有する物質及び前記機能を促進（抗酸化上昇作用）する効果がある物質であればその種類は制限されないが、具体的に抗酸化酵素及び非酵素的抗酸化物質を含む。
【００２１】
前記抗酸化酵素は抗酸化力又は抗酸化上昇作用効果があるタンパク質を意味するものであって、生体内抗酸化システムに関与する公知のタンパク質であればその種類が制限されないが、好ましくはスーパーオキシドジスムターゼ(superoxide  dismutase)、カタラーゼ(catalase)、グルタチオンペルオキシダーゼ(glutathione  peroxidase)、グルタチオン還元酵素(glutathione  reductase)、グルタチオン-S-伝達酵素ヘムオキシゲナーゼ(glutathione-S-transferase  hemeoxygenase)及びこれらの合成酵素又はぺプチド類似体(mimetic)からなる群より選ばれたいずれか一つ以上のものでもあり得る。
【００２２】
前記非酵素的抗酸化物質は、抗酸化力又は抗酸化上昇作用効果がある化合物を意味するものであって、生体内抗酸化システムに関与する公知の化合物であればその種類が制限されないが、好ましくはビタミンＥ、クルクミン(curcumin)、カロチン(carotene)、リポ酸(lipoic  acid)、コエンザイムQ10、トコフェロール、ポリフェノール、レチニルパルミテート、チオクト酸、カロチノイド、ビタミンＣ、ビタミンＣ誘導体、カフェイン(Caffeine)、カフェ酸(Caffeic  acid)、BHA(butylated  hydroxyanisole)、BHT(butylated  hydroxytoluene)、TBHQ(tertiary  butylhydroquinone)、エピガルロカテキン-3-ガレット(epigallocatechin-3-gallete,EGCG)、プロアントシアニジン(proanthocyanidin)、没食子酸(Gallic  acid)、セレニウム、亜鉛、タウリン、プラボノイド及びスコポレチン(Scopoletin)からなる群より選ばれる一つ以上のものである。
【００２３】
本願発明の前記（ａ）段階で使用される溶媒は、プロラミン及びグリセロールホルマールを全て溶解できる物質であればその種類が制限されないが好ましくはアルコールを使用することもできる。
【００２４】
本願発明の前記“アルコール”は好ましくは炭素数１乃至６の低価アルコールであって、より好ましくは、エタノールである。前記エタノールは揮発性と可燃性を有する無色の液体で、鎖状の炭化水素のうち炭素数が２個のエタン(ethane)から水素原子一つがヒドロキシ基に置換されたアルコールである。
【００２５】
本願発明の前記アルコールは100%アルコールと水（蒸留水）を特定体積比(v/v)で混合及び希釈してアルコール水溶液状態で使用できる。従って、本発明のアルコール濃度は全体溶液の体積に対するアルコールの体積比で示す。前記“水”は蒸留水又は脱イオン水であってもよい。アルコール添加量はこれに制限はされないが、40%(v/v)乃至95%(v/v)の範囲で好ましくは55%乃至75%であってより好ましくは70%である。
【００２６】
前記（ａ）段階で“プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液”はその製造方法に制限はしないが具体的に
（i)プロラミンをアルコール水溶液に溶解する段階；
（ii)前記(i)段階のアルコール水溶液にグリセロールホルマールを添加する段階；
（iii)前記(ii)段階の溶液に抗酸化物質を添加する段階；
を含み順次的に行える。
【００２７】
前記プロラミン及び抗酸化物質の比率はこれに制限はされないが、好ましくは１乃至1,000,000:1の重量比であって、さらに、好ましくは１乃至1000:1の重量比であって、最も好ましくは100乃至600:1の重量比である。
【００２８】
さらに、前記プロラミン及びグリセロールホルマールの比率はこれに制限はされないが、好ましくは１乃至10,000:1の重量比であって、さらに、好ましくは１乃至100:1の重量比であって、より好ましくは1乃至10:1の重量比である。
【００２９】
（ｂ）段階は前記（ａ）段階で製造されたプロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質が含まれたアルコール水溶液を０℃乃至80℃の減圧条件下でアルコール水溶液に含まれた物質等の相対的な反応を継続する段階で、前記条件により溶媒が蒸発してフィルムが形成される。
【００３０】
前記溶媒蒸発の際、温度はこれに制限はされないが、具体的に０℃乃至80℃の温度範囲であって、より好ましくは０℃乃至45℃の温度範囲であって、さらに好ましくは10℃乃至38℃温度範囲であって、より好ましくは15℃乃至35℃である。
【００３１】
本願発明の一実施例によれば、本願発明のフィルム製造方法を利用して同一な減圧条件で多様に温度条件を変化させて製造した多様な経口用フィルムから内部に含まれた抗酸化酵素の活性を測定したところ、［図12］に示した通り、15℃、25℃、35℃等により製造された経口用フィルムでは内部に含まれたカタラーゼの活性が相対的に極めて高く維持され、45℃の温度条件で製造された経口用フィルムでも相対的に20%最大30%まで活性が好く維持されることを確認することができる。さらに、［図13］に示した通り、０℃の温度条件で製造された経口用フィルムから内部に含まれたカタラーゼの活性が高く示されたことを確認することができた。
【００３２】
前記溶媒蒸発は減圧条件でなされて、この際圧力は好ましくは1×10-5mbar乃至999mbarであり、より好ましくは1×10-4mbar乃至1×10-2mbarの圧力範囲である。
【００３３】
前記温度及び減圧は溶媒が十分に蒸発できる時間だけ維持することができ、前記時間は使用される溶媒の量と種類によって異なる。前記温度及び減圧条件を維持する時間はこれに制限はされないが、好ましくは10秒乃至12時間であって、より好ましくは１分乃至１時間である。
【００３４】
前記（ａ）乃至（ｂ）段階を含む本発明の製造方法によれば、抗酸化物質の活性が高い水準で維持される経口用フィルムを製造することができる。特に胃腸及び小腸の過酷な環境の中でもフィルムに含まれた抗酸化物質の活性が高い水準で維持される（実施例２）。
【００３５】
さらに、前記本願発明の製造方法で製造された経口用フィルムは、同量のゼインと抗酸化剤で製造したとき、従来のナノパーティクル剤形より遥かに多量の抗酸化剤を含有して効果的に抗酸化物質の活性を保存する（実験例１）。
【００３６】
従って、本発明は前記方法で製造された抗酸化剤を含むプロラミンベース経口用フィルムを提供する。
【００３７】
本発明の経口用フィルムは前記（ａ）及び（ｂ）段階を含む方法で製造されたことを特徴とし、前記段階に対しては前述した通りである。
【００３８】
本願発明の経口用フィルムの中の抗酸化物質の量はフィルムの類型、フィルムの厚さ及び表面積によって当業者が選択的に設定することができる。本願に提供された経口投与可能なフィルムは広範囲な量の抗酸化物質を収容することができる。好ましくは0.01乃至80%(w/w)であって、より好ましくは0.1乃至10%(w/w)である。
【００３９】
本発明の経口用フィルムは有効薬剤成分として抗酸化物質を含み、口腔を通じて簡便迅速に薬剤を人体内に投与することができる。さらに、プロラミンを基にして特定条件でフィルム製剤を製造することにより、内部に含まれた抗酸化物質が体内でその活性を高い水準で維持することが可能で、特に、消化管内の過酷な環境でも抗酸化酵素の生理活性が高い水準で維持される。
【００４０】
さらに、本発明の経口用フィルムを薬剤放出の時期によって即時(immediate)放出型及び／又は変形(modified)放出型に製剤化することができて、好ましくは速崩解のための速溶錠剤又は口腔内崩解用フィルムに製剤化することができる。
【００４１】
一方、本発明の経口用フィルムはプロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化剤以外の添加物をその配合目的による適量で添加することができる。例えば、充填剤、可塑剤、酸味剤、凝集防止剤、可溶化剤、安定化剤、甘味料、嬌媚剤、乳化剤、その他の溶解補助剤、着色料、香料等が挙げられる。特に、フィルム製造の際にはフィルム形成基剤、漸増剤、乳化剤、その他澱粉等を追加して含め得る。
【００４２】
前記フィルム形成基剤はフィルムに柔軟性を与えることができて、崩解がよくなされて、粒子形成のための粘度を維持することができるものであれば、特に制限はされずに使用することができ、好ましくはハイプロメロス、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド又はポリビニルピロリドンのような高分子を使用することができる。さらに、漸増剤にはフルラン、澱粉、乳糖、セルロース、カラギーナン、アラビアゴム、グアガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、ゲルランガム、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム等を使用することができる。
【００４３】
充填剤は口腔でフィルムがすべすべする特性を減少させて、フィルムに形状形成を付与する役割をする。さらに、フィルム同士が粘着する性質も減少させて、粘り気と口腔におけるフィルムの分解速度と薬剤の溶出速度を調節することができる。充填剤には例えば、微細結晶セルロース、セルロース重合体、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、石灰石粉、シリケート、粘土、滑石、二酸化チタニウム及びリン酸カルシウム等を使用することができる。
【００４４】
フィルムの柔軟性を与えるための可塑剤としては、例えば、クエン酸トリエチル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール、キシリトール、グリセリン、ポリエチレングリコール等を使用することができる。
【００４５】
さらに、酸味剤は例えば、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、タルタル酸、アスコルビン酸、琥珀酸、アジピン酸及びラクト酸等を使用することができて、凝集防止剤は例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム等を使用できる。
【００４６】
可溶化剤は、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、モノステアリン酸ソルビタン、ラウリル硫酸ナトリウム等を使用することができ、安定化剤は例えば、硬質無水ケイ酸、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム及びケイ酸カルシウム等を使用することができる。
【００４７】
さらに、甘味料は例えば、アスファルタム、サッカリン、グリシルリジン酸二カリウム、ステビア等を挙げられ、嬌媚剤は例えば、１−メントール、塩化ナトリウム、アセスルファムカリウム、スクラロース等を使用することができ、乳化剤はグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、レシチン、酵素分解レシチン、ポリソルベート、ソルビタン脂肪酸エステル及びプロピレングリコール等を使用することができる。
【００４８】
溶解補助剤は例えば、シクロデキストリン、アルギニン、リシン、トリスアミノメタン等を使用することができる。
【００４９】
さらに、本発明の経口用フィルムは目的とする色調を得るに適合した量の着色剤を追加して含むことができる。着色剤は例えば、天然食品の色調及び食用に適合した染料を含む。このような着色剤は通常的にＦＤ＆Ｄ染料に公知されている。
【００５０】
本発明の経口用フィルムは生体内の多様な酸化反応、つまり、フリーラジカル又は活性酸素種により引き起こされる多様な組織損傷及び疾病の予防及び治療用の目的で使用することができる。前記フリーラジカル又は活性酸素種によって引き起こされる多様な損傷及び疾病に対しては当業界で公知であり、これに制限はされないが、具体的に炎症、感染、動脈硬化、高血圧、ガン、放射線損傷、神経学的疾患、神経退行性疾患、虚血／再灌流損傷、老化、傷治療、グルタチオン欠乏症、後天性免疫欠乏症候群、鎌状細胞貧血、糖尿病及びリウマチ関節炎等である。
【発明の効果】
【００５１】
本発明は（ａ）プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する段階；及び（ｂ）０℃乃至80℃温度の減圧条件で溶媒を蒸発させる段階を含む、経口用フィルム製造方法及び前記方法で製造された抗酸化剤を含むプロラミンベース経口用フィルムを提供する。本発明の製造方法によれば、抗酸化物質の活性が高い水準で維持される経口用フィルムを製造することができる。特に、胃腸及び小腸の過酷な環境の中でもフィルムに含まれた抗酸化物質の活性が高い水準で維持される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、pH7.0条件で各実験群のSOD活性を示す(zein:ゼインフィルム、SOD:free  superoxide  dismutase,Zein-SOD:SODを含むゼインベース経口用フィルム)。
【図２】図２は、pH7.0条件で各実験群のカタラーゼ活性を示す(zein:ゼインフィルム、CAT:free  catalase,Zein-CAT:カタラーゼを含むゼインベース経口用フィルム)。
【図３】図３は、pH7.0条件で各実験群のカタラーゼ活性を示す(Gliadin:グリアジンフィルム、CAT:free  catalase,Gliadin-CAT:カタラーゼを含むグリアジンベース経口用フィルム)。
【図４】図４は、pH1.3条件（胃腸内環境模倣条件）で各実験群のSOD活性を示す（白色グラフ：ペプシン処理群、黒色グラフ：ペプシン非処理群、zein:ゼインフィルム、SOD:free  superoxide  dismutase,Zein-SOD:SODを含むゼインベース経口用フィルム)。
【図５】図５は、pH1.3条件（胃腸内環境模倣条件）で各実験群のカタラーゼ活性を示す（白色グラフ：ペプシン処理群、黒色グラフ：ペプシン非処理群、zein:ゼインフィルム、CAT;free  catalase,Zein-CAT;カタラーゼを含むゼインベース経口用フィルム)。
【図６】図６は、pH1.3条件（胃腸内環境模倣条件）で各実験群のカタラーゼ活性を示す（白色グラフ：ペプシン処理群、黒色グラフ：ペプシン非処理群、Gliadin:グリアジンフィルム、CAT:free  catalase,Gliadin-CAT:カタラーゼを含むグリアジンベース経口用フィルム)。
【図７】図７は、pH7.4条件（小腸内環境模倣条件）で各実験群のSOD活性を示す（白色グラフ：トリプシン処理群、黒色グラフ：トリプシン非処理群、zein:ゼインフィルム、SOD:free  superoxide  dismutase,Zein-SOD:SODを含むゼインベース経口用フィルム)。
【図８】図８は、pH7.4条件（小腸内環境模倣条件）で各実験群のカタラーゼ活性を示す（白色グラフ：トリプシン処理群、黒色グラフ：トリプシン非処理群、zein:ゼインフィルム、CAT:free  catalase,Zein-CAT;カタラーゼを含むゼインベース経口用フィルム)。
【図９】図９は、pH7.4条件（小腸内環境模倣条件）で各実験群のカタラーゼ活性を示す（白色グラフ：トリプシン処理群、黒色グラフ：トリプシン非処理群、Gliadin:グリアジンフィルム、CAT:free  catalase,Gliadin-CAT;カタラーゼを含むグリアジンベース経口用フィルム)。
【図１０】図１０は、従来のナノ粒子（ナノパーチクル）剤形と本願発明のプロラミンベース経口用フィルム剤形の中に含まれたカタラーゼ活性を示す。
【図１１】図１１は、従来の経口用フィルム製造方法と、本願発明のプロラミンベース経口用フィルム製造方法で製造されたそれぞれの経口用フィルムに含まれたカタラーゼ活性を示す。
【図１２】図１２は、本願発明のプロラミンベース経口用フィルム製造時の2℃,15℃,25℃,35℃,45℃,55℃,65℃及び75℃温度条件に伴うカタラーゼ活性を示す。
【図１３】図１３は、本願発明のプロラミンベース経口用フィルム製造時０℃,又は15℃の温度条件に伴うカタラーゼ活性を示す。
【図１４】図１４は、本願発明のプロラミンベース経口用フィルム製造時の多様な圧力条件に伴うカタラーゼ活性を示す。
【図１５】図１５は、非酵素的抗酸化物質であるカフェインを含むプロラミン（ゼイン又はグリアジン）ベース経口用フィルム製造時、各pH条件に伴う抗酸化力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５４】
ただし、下記、実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００５５】
＜比較例１＞
抗酸化酵素を含むナノ粒子（ナノパーチクル）製造
＜比較例１−１＞
ゼイン(zein,Sigma-Aldrich)100mgを1.825mLのエタノール水溶液に溶解した。ソルビトール(Sorbitol,Sigma-Aldrich)52.5mg及びグリセロールホルマール(glycerol  formal,Sigma-Aldrich)67.5mgを入れて溶液が透明になるまで混ぜた。抗酸化物質をゼインでカプセル化するために、前記溶液にカタラーゼ（EC  1.11.16.1,Sigma-Aldrich)3mg/mLを一滴ずつ落しながら掻き混ぜて混合溶液を製造した（カタラーゼ総200μL添加）。ナノパーチクルは相分離方法(phase  separation  method)を利用して製造した。簡略に前記製造された混合溶液に8.0mLの水を添加して１分間21,500rpmで均質化方法で分散させた。47,500rpmで５分間遠心分離して結果的に生じたナノパーチクルを分離し、この際、黄色の固体パウダーが生成した。パーチクルサイズ及び形態はMasdar  Institute  of  Science  and  Technology(Abu  Dhabi,UAE)のQUANTA  FEG  250(FEI  company,Hillsboro,Oregon)を使用してscanning  electron  microscopy  (SEM)で確認した。
【００５６】
＜比較例１−２＞
ゼイン100mgを1.825mLの70%エタノール水溶液に溶解した。ソルビトール52.5mg及びグリセロールホルマール67.5mgを入れて溶液が透明になるまで混ぜた。抗酸化物質をゼインでカプセル化するために、前記溶液にスーパオキシドジスムターゼ((EC1.15.1.1,Sigma-Aldrich)100U/mL(スーパオキシドジスムターゼ1Uはスーパオキシド１マイクロモル(micro  mole)を１分で処理できる活性を意味する）を一滴ずつ落しながら掻き混ぜて混合溶液を製造した（SOD総200μL添加）。ナノパーチクルは相分離方法を利用して製造した。簡略に前記製造された混合溶液に8.0mLの水を添加して１分間21,500rpmで均質化方法で分散させた。47,500rpmで５分間遠心分離して結果的に生じたナノパーチクルを分離し、この際、黄色の固体パウダーが生成した。パーチクルサイズ及び形態はMasdar  Institute  of  Science  and  Technology(Abu  Dhabi,UAE)のQUANTA  FEG  250(FEI  company,Hillsboro,Oregon)を使用してscanning  electron  microscopy(SEM)で確認した。
【００５７】
＜比較例２＞
抗酸化酵素を含む経口用フィルム製造
＜比較例２−１＞
ゼイン450mgを1.825mLの50%エタノール水溶液に溶解した。ソルビトール52.5mg及びグリセロールホルマール67.5mgを入れて溶液が透明になるまで混ぜた。これにカタラーゼ3mg/mLを一滴ずつ落しながら掻き混ぜて混合溶液を製造した（カタラーゼ総200μL添加）。常温(25℃)で24時間蒸発させてフィルムを製造した。
【００５８】
＜比較例２−２＞
ゼイン450mgを1.825mLの50%エタノール水溶液に溶解した。ソルビトール52.5mg及びグリセロールホルマール67.5mgを入れて溶液が透明になるまで混ぜた。これにスーパオキシドジスムターゼ100U/mLを一滴ずつ落しながら掻き混ぜて混合溶液を製造した（SOD総200μL添加）。常温(25℃)で24時間蒸発させてフィルムを製造した。
【００５９】
＜比較例２−３＞
ゼイン100mgを1.825mLの70%エタノール水溶液に溶解した。グリセロールホルマール67.5mgを入れて溶液が透明になるまで混ぜた。前記溶液にカタラーゼ3mg/mLを一滴ずつ落しながら掻き混ぜて混合溶液を製造した（カタラーゼ総200μL添加）。この混合溶液をガラス容器に広く延ばして常温(25℃)で24時間乾燥させてゼインフィルムを完成した。
【００６０】
＜実施例１＞
本発明に伴う抗酸化酵素を含むプロラミンベース経口用フィルム製造
＜実施例１−１＞カタラーゼを含むゼインベース経口用フィルム製造
ゼイン500mgを70%エタノール水溶液10mLに溶解させた。グリセロールホルマール335mgを入れて溶液が透明になるまで混ぜた。前記混合溶液2mL(100mgゼイン含む)を減圧フラスコに移して、これにカタラーゼ3mg/mLを一滴ずつ落しながら掻き混ぜて混合溶液を製造した（カタラーゼ総200μL添加）。減圧フラスコにある混合溶液はrotary  evaporatorを使用して薄いフィルムが形成されるまで35℃の減圧条件(0.002mbar)で溶媒（エタノール）を蒸発させた。
【００６１】
＜実施例１−２＞スーパオキシドジスムターゼ(superoxide  dismutase,SOD)を含むゼインベース経口用フィルム製造
ゼイン500mgを70%エタノール水溶液10mLに溶解させた。グリセロールホルマール335mgを入れて溶液が透明になるまで混ぜた。前記混合溶液2mL(100mgゼイン含む)を減圧フラスコに移してこれにスーパオキシドジスムターゼ((EC1.15.1.1,Sigma-Aldrich)100U/mL（スーパオキシドジスムターゼ1Uはスーパオキシド１マイクロモル(micro  mole)を１分で処理できる活性を意味する）100U/mLを一滴ずつ落しながら掻き混ぜて混合溶液を製造した（SOD総200μL添加）。減圧フラスコにある混合溶液はrotary  evaporatorを使用して薄いフィルムが形成されるまで35℃温度の減圧条件で溶媒を蒸発させた。
【００６２】
＜実施例１−３＞カタラーゼを含むグリアジンベース経口用フィルム製造
グリアジン(Sigma-Aldrich)500mgを70%エタノール水溶液10mLに溶解させた。グリセロールホルマール335mgを入れて溶液が透明になるまで混ぜた。前記混合溶液2mL(100mgゼインを含む)を減圧フラスコに移して、これにカタラーゼ3mg/mLを一滴ずつ落しながら掻き混ぜて混合溶液を製造した（カタラーゼ総200μL添加）。減圧フラスコにある混合溶液はrotary  evaporatorを使用して薄いフィルムが形成されるまで35℃温度の減圧条件で溶媒を蒸発させた。
【００６３】
＜実施例２＞
本発明に伴うプロラミンベース経口用フィルムの抗酸化酵素活性保護効果
前記実施例１で製造された経口用フィルムに含まれた抗酸化物質の活性は下記のような方法で測定された。
【００６４】
＜実施例２−１＞プロラミンベース経口用フィルムシステム
カタラーゼを含むプロラミンベース経口用フィルムにおいて、カタラーゼの活性は過酸化水素分解率を測定することにより確認した。pH7.0緩衝溶液でカタラーゼ又はカタラーゼを含むプロラミンベース経口用フィルムを10μMH202と混合した後、240nmでH202の吸光度をモニタリングしてカタラーゼ活性を測定した。SODを含むプロラミンベース経口用フィルムで、SOD活性はSOD  assay  kit(SOD  assay  kit(SOD  determination  kit  19,160,Fluka,St  Louis,MO)を利用して製造社の方法で測定した。結果の有意値は、SOD又はカタラーゼを含むゼインフィルムとその外のフィルム間のt検定でp<0.05(*)で決定された。
【００６５】
その結果、［図１］及び［図２］に示した通り、pH7.0でSOD又はカタラーゼの単独活性とゼインベースフィルムに含まれたSOD又はカタラーゼの活性が殆ど類似した。これはSOD又はカタラーゼがゼインと共にフィルム状薬剤伝達システムを形成した後にも、各物質の活性を同一な水準で維持することを示す。
【００６６】
同様に［図３］に示した通り、グリアジンを利用してフィルムを製造した後にも内部に含まれたカタラーゼが抗酸化機能を維持することを確認した。
【００６７】
＜実施例２−２＞胃腸内の環境における抗酸化酵素活性評価
胃腸内環境においてゼインの抗酸化タンパク質保護能力を評価した。カタラーゼ又はカタラーゼを含むプロラミンベース経口用フィルムを塩酸(50.1mMHCl,pH1.3)溶液に入れて20分間放置後胃腸内環境を模倣した。この時、実験群を分けて349.1mMペプシン処理群及びペプシン非処理群に分けて実験した(Metheny,N.A.,Stewart,B.J.,et  al.,1997.pH  and  concentrations  of  pepsin  and  trypsin  in  feeding  tube  aspirates  as  predictors  of  placement.J.Parenter.Enteral  Nutr.21,279-85.)。カタラーゼ及びSOD活性は前記実施例２−１に記載されたのと同一な方法で測定した。結果の有意値は、SOD又はカタラーゼを含むゼインフィルムとその外のフィルム間のt検定でp<0.05(*)で決定された。
【００６８】
その結果、［図４］及び［図５］に示した通り、SOD又はカタラーゼ単独では胃腸内酸性環境(pH1.3)で活性が殆ど消失された。しかし、ゼインベースフィルムに含まれたSOD又はカタラーゼは胃腸内環境でもその活性が高い水準で維持されることを確認した。さらに、胃腸で分泌される酵素のペプシンを処理した群と処理しない群において、SOD又はカタラーゼの活性に有意的な差はなかった。これで本願発明の製造方法で製造されたゼインベースフィルムは抗酸化物質の活性を保護する効果が優れたことを確認した。
【００６９】
さらに、［図６］に示した通り、グリアジンフィルムに存在するカタラーゼが胃腸条件において抗酸化機能が保護されていることが確認できた。
【００７０】
＜実施例２−３＞小腸内環境における抗酸化酵素活性評価
小腸内環境を模倣するために、実験群を分けて143.0mMトリプシン処理群及びトリプシン非処理群に区分してpH7.4の環境で30分間放置した。カタラーゼ及びSOD活性は前記実施例２−１に記載されたのと同一な方法で測定した。結果の有意値は、SOD又はカタラーゼを含むゼインフィルムとその外のフィルム間のt検定でp<0.05(*)で決定された。
【００７１】
その結果、［図７］及び［図８］に示した通り、SOD又はカタラーゼの単独ではpH7.4条件ではその活性が維持されたが、小腸環境と同じくトリプシンを共に処理した群ではその活性が極めて低い水準に減少する傾向を示した。これに反してゼインベースフィルム内に含まれたSOD又はカタラーゼはトリプシン処理に関係なく高い水準で活性を維持することを確認した。
【００７２】
さらに、［図９］に示した通り、グリアジンフィルム内に存在するカタラーゼが小腸条件(pH7.4)で抗酸化機能が保護されていることが確認できた。
【００７３】
＜実験例１＞
剤形別活性評価
前記比較例１−１及び実施例１−１で製造された経口用フィルムにおいて、カタラーゼ活性を比較した。先ず、各剤形別にカタラーゼの含有量を決定するために蛍光物質(fluorescein  isothiocyanate,  FITC,  Sigma-Aldrich)をカタラーゼに化学的に結合させた後、これを利用してゼインナノパーチクル及びフィルムを形成して各剤形別に1mgずつ採り、蛍光の量を計ってこれを最初使用した蛍光の量と比較して剤形別にカタラーゼの含有量を決定した。カタラーゼ活性測定は蛍光物質が結合されていないカタラーゼを使用し、ゼインナノパーチクル及びフィルムを形成して各剤形別に1mgずつを採り、pH7.0で実施例２−１に記載された方法と同一に行われた。
【００７４】
【表１】
2017510649.tif 000004
【００７５】
前記［表１］及び［図10］に示した通り、経口用フィルム剤形がナノ粒子に比べて内部に含まれたカタラーゼがはるかに高い水準の活性を維持していることを確認した。これは製造過程でフィルムがはるかに多量のカタラーゼを保有しているためと解釈できる。
【００７６】
＜実験例２＞
製造方法に伴う活性評価
＜実験例２−１＞従来の経口用フィルム製造方法と本願発明の経口用フィルム製造方法比較
前記比較例２−３及び実施例１−１で製造された経口用フィルムから各1mgのフィルムを採りカタラーゼ活性を比較した。カタラーゼ活性測定はpH7.0において実施例２−１に記載された方法と同一に行われた。
【００７７】
その結果、［図11］に示した通り、従来の方法で製造されたフィルムでは、カタラーゼの活性が殆ど消滅されたが、本願発明の製造方法で生産されたフィルムではカタラーゼが極めて高い水準で活性を維持していることを確認した。
【００７８】
＜実験例２−２＞多様な温度条件に伴う経口用フィルム比較
本願発明のフィルム製造方法で、また同一な減圧条件(0.002mbar)で温度を変化させながら製造した多様な経口用フィルムにおいて、内部に含まれた抗酸化酵素等の活性を測定した。
【００７９】
圧力条件及び温度条件を除いては実施例１−１に記載された方法と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００８０】
その結果、［図12］及び［図13］に示した通り、0-45℃、特に15-35℃条件で製造された経口用フィルムにおいて、カタラーゼの活性が相対的に高い活性を維持していることを確認した。
【００８１】
＜実験例２−３＞多様な圧力条件に伴う経口用フィルム比較
本願発明のフィルム製造方法で、また同一な温度条件(35℃)で圧力を変化させながら製造した多様な経口用フィルムにおいて、内部に含まれた抗酸化酵素等の活性を測定した。
【００８２】
圧力条件及び温度条件を除いては実施例１−１に記載された方法と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００８３】
その結果、［図14］に示した通り、圧力が低くなるほどフィルムに含まれたカタラーゼの活性が高い水準で維持されることを確認した。特に、圧力0.002mbarで相対的に高い活性を維持した。
【００８４】
＜実施例３＞
本願発明に伴う非酵素的抗酸化物質を含むプロラミンベース経口用フィルム
カフェイン5mgと、プロラミンとしてグリアジン100mg又はゼイン100mgを利用して前記実施例１−１に記載された方法と同一な方法で経口用フィルムを製造した。胃腸内環境でプロラミンの抗酸化タンパク質保護能力を評価するために、カフェイン又はカフェインを含むプロラミンベース経口用フィルムを塩酸溶液に入れて20分間放置し、胃腸内環境を模倣してこの溶液を再びpH7.0に中和して次の細胞実験に使用した。
【００８５】
経口用フィルムのカフェインの抗酸化性効果を測定するために、12  well  plateに細胞(RAW264.7,  4x105  cells/well)を培養後、各wellに前記で製造された経口用フィルム1mgずつを細胞と２時間培養した後、上記の培養液を取除いて細胞を過酸化水素(100μM)で４時間処理して細胞がどれほど過酸化水素により死んだか又はカフェインがどれほど細胞を過酸化水素から保護できるかを測定した。
【００８６】
具体的な実験群は次のように分けた；Ａ：陰性対象群、Ｂ：H202だけを処理、Ｃ：pH1.3で20分間放置したカフェイン溶液及びH202処理、Ｄ：pH1.3で20分間放置したカフェイン溶液を再びpH7.0に中和した溶液及びH202処理、Ｅ：カフェインを含むグリアジンベース経口用フィルムをpH1.3で20分間放置した溶液及びH202処理、Ｆ：カフェインを含むグリアジンベース経口用フィルムをpH1.3で20分間放置した溶液を再びpH7.0に中和した溶液及びH202処理、Ｇ：カフェインを含むゼインベース経口用フィルムをpH1.3で20分間放置した溶液及びH202処理、Ｈ：カフェインを含むゼインベース経口用フィルムをpH1.3で20分間放置した溶液を再びpH7.0に中和した溶液及びH202処理。
【００８７】
細胞毒性は死んだ細胞だけを染色する染料(propidium  iodide,PI)を使用して測定し、各well当り100μL(50microgram/mL  PI)を入れて10分後マイクロプレートリーダ(microplate  reader  manufactured  by  Tecan)を使用して蛍光(excitation:535nm,emission:617nm)を測定した。培養液だけがある場合と過酸化水素だけがある場合をそれぞれ０％と100%の毒性で表示して他の生物等はこれの相対毒性で表記した。
【００８８】
カフェインは活性酸素から細胞を保護する機能があって(Silverberg  JI.,et.al.,J  Drugs  Dermatol.Nov;11(11):1342-6)、［図15］に示した通り、前記実験を通じてカフェインとグリアジン内でカフェインの活性がよく維持されていることを確認した。前記データは本願発明のプロラミン（特に、ゼイン又はグリアジン）を利用した経口用フィルムの製造方法が抗酸化酵素だけでなく非酵素的抗酸化物質でもよく適用できることを示す。
【００８９】
＜製造例＞
下記本発明による抗酸化剤を含むプロラミンベース経口用フィルムの製造例を例示する。
製造例１：SODを含むグリアジンベース経口用フィルム
グリアジン100mg、グリセロールホルマール67.5mg、SOD200μLを利用して前記実施例１−２と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９０】
製造例２：カタラーゼを含むホルデイン(hordein)ベース経口用フィルム
ホルデイン100mg、グリセロールホルマール67.5mg、カタラーゼ200μLを利用して前記実施例１−１と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９１】
製造例３：カタラーゼを含むグルテニン(glutenin)ベース経口用フィルム
グルテニン100mg、グリセロールホルマール67.5mg、カタラーゼ200μLを利用して前記実施例１−１と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９２】
製造例４：カタラーゼを含むセカリン(secalin)ベース経口用フィルム
セカリン100mg、グリセロールホルマール67.5mg、カタラーゼ200μLを利用して前記実施例１−１と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９３】
製造例５：SODを含むコイクシン(coixin)ベース経口用フィルム
コイクシン100mg、グリセロールホルマール67.5mg、SOD200μLを利用して前記実施例１−２と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９４】
製造例６：グルタチオンペルオキシダーゼ(glutathione  peroxidase)を含むゼインベース経口用フィルム
ゼイン100mg、グリセロールホルマール67.5mg、グルタチオンペルオキシダーゼ200μLを利用して前記実施例１−１と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９５】
製造例７：グルタチオン還元酵素を含むゼインベース経口用フィルム
ゼイン100mg、グリセロールホルマール67.5mg、グルタチオン還元酵素200μLを利用して前記実施例１−１と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９６】
製造例８：グルタチオン−Ｓ−伝達酵素ヘモオキシゲナーゼ(glutathione-S-transferase  hemeoxygenase)を含むゼインベース経口用フィルム
ゼイン100mg、グリセロールホルマール67.5mg、グルタチオン-S-伝達酵素ヘムオキシゲナーゼ200μLを利用して前記実施例１−１と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９７】
製造例９：ビタミンＣを含むゼインベース経口用フィルム
ゼイン100mg、グリセロールホルマール24mg、ビタミンＣ5mgを利用して前記実施例３と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【００９８】
製造例10：トコフェロールを含むゼインベース経口用フィルム
ゼイン100mg、グリセロールホルマール24mg、トコフェロール5mgを利用して前記実施例３と同一な方法で経口用フィルムを製造した。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
以上察した通り、本発明は抗酸化物質活性保護のためのプロラミンベース経口用フィルム製造方法に関するものであって、より詳細には（ａ）プロラミン、グリセロールホルマール及び抗酸化物質を含むアルコール水溶液を製造する段階；及び（ｂ）０℃乃至80℃の減圧条件で溶媒を蒸発させる段階を含む経口用フィルム製造方法に関する。本発明の製造方法によれば抗酸化物質の活性が高い水準で維持される経口用フィルムを製造することができ、特に、胃腸及び小腸の過酷な環境の中でもフィルムに含まれた抗酸化物質の活性が高い水準で維持されるので産業上の利用可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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