(57)【要約】  本発明は一種の化合物又はその薬学的に許容される塩を開示する。それは一般式R-Link-Rを有している。本発明が提供する化合物又はその薬学的に許容される塩は、Bcr-Abl二倍体の阻害剤としてチロシンキナーゼの活性を有効に阻害し、当該キナーゼの異常な活性化に関連する疾病の効果的治療に使用でき、悪性腫瘍に対し良好な治療効果を有している。当該阻害剤の調製方法は簡便であり、低コストであるため、その応用の見通しは良好である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
2017511348.tif 000022
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
〔式中、Rは下記のいずれかから選択される。〕
2017511348.tif 000023
【請求項２】
前記一般式中、Linkerが-(CH2CH2O)x3-(CH2)x2-(NHCO)-(CH2)x1-(CONH)-(CH2)x2-(OCH2CH2)x3-であって、x1、x2及びx3がそれぞれ独立して1、2、3、4、5又は6から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
構造式が式I、式II又は式IIIで表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
2017511348.tif 000024
2017511348.tif 000025
2017511348.tif 000026
【請求項４】
Linkerが、(Z1)a−(Z2)b−(Z3)cであって、Z1、Z2及びZ3がそれぞれ独立してC(O)(CH2)dNH、CO(CH2)eC(O)、(CH2CH2)fNHC(O)、(CH2CH2)g-C(O)NH、(CH2)hC(O)(OCH2CH2)iNHC(O)(CH2)jC(O)、NH(CH2)k(OCH2CH2)l-O(CH2)mNH、
(CH2)nC(O) (OCH2CH2)oNH(C(O) (CH2)pNH)qC(O)-alkyl又はC(O)NH(CH2)rNHC(O)-(CH2)sC(O) (NHCH2CH2)tNH(C(O) (CH2)uNH)v-C(O)-alkylから選択され、a〜vがそれぞれ独立して1〜20から選択される任意の数値であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
前記化合物が、
2017511348.tif 000027
2017511348.tif 000028
であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
以下の操作手順を含むことを特徴とする、式Iの化合物の調製方法。
2017511348.tif 000029
【請求項７】
以下の操作手順を含むことを特徴とする、請求項６に記載の調製方法。
（１）  化合物2aの調製
2017511348.tif 000030
（２）  化合物BGCの調製
2017511348.tif 000031
【請求項８】
以下の操作手順を含むことを特徴とする、請求項７に記載の調製方法。
a. 化合物2aの調製：
室温で、化合物1a、トリエチルアミン及び4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライドをジクロロメタン中で撹拌し、18時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物2aを得る。
b. 化合物6aの調製：
(1)化合物4aの調製
室温で、化合物3a、トリエチルアミン及びグルタリルクロライドをジクロロメタン中で撹拌し、6時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物4aを得る。
(2)化合物6aの調製
氷浴中で、化合物4a、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩及びN-メチルモルホリンをジクロロメタン中で0.5時間反応させた後、化合物5aを加え、室温で完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物6aを得る。
c. 化合物BGCの調製
100℃で、化合物2a、化合物6a及び炭酸カリウムをN、N-ジメチルホルムアミド中で撹拌し、18時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物BGCを得る。
【請求項９】
以下を特徴とする、請求項８に記載の調製方法。
ステップaに記載の化合物1a、トリエチルアミン及び4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライドのモル比が18：35.6：21.3であって、前記化合物1aとジクロロメタンのモル体積比が18：400 mmol/mlであり、
ステップbの(1)に記載の化合物3a、トリエチルアミン及びグルタリルクロライドのモル比が45.4：68.1：22.7であって、前記化合物3aとジクロロメタンのモル体積比が45.4：300 mmol/mlであり、
ステップbの(2)に記載の化合物4a、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩、N-メチルモルホリン及び化合物5aのモル比が1：1.2：1.2：3：2.1であって、前記化合物4aとジクロロメタンのモル体積比が1：20 mmol/mlであり、
ステップcに記載の化合物2a、化合物6a及び炭酸カリウムのモル比が0.28：0.09：2.69であって、前記化合物2aとN、N-ジメチルホルムアミドのモル体積比が0.28：20 mmol/mlである。
【請求項１０】
以下の操作手順を含むことを特徴とする、化合物BPの調製方法。
a.    化合物12の調製：
2017511348.tif 000032
b.    化合物BPの調製：
2017511348.tif 000033
【請求項１１】
以下の操作手順を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の調製方法。
i. 化合物4の調製：
（1）窒素ガス雰囲気下で、四塩化炭素中の2-メチル-5-ニトロベンゾトリフルオリド（化合物1）にN-ブロモスクシンイミド及びアゾビスイソブチロニトリルを加え、還流して24時間反応させ、反応液を得る。反応液を分離し、化合物2を得る。
（2）ジクロロメタン中で、化合物2、N-Boc-ピペラジン及びトリエチルアミンを室温で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物3を得る。
（3）水及びエタノールの混合溶媒の中に還元鉄粉、塩化アンモニウム及び化合物3を加え、還流して1時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物4を得る。
ii. 化合物8の調製：
（4）60℃で、3-ヨード-4-メチル安息香酸及び塩化チオニルをテトラヒドロフラン及びN、N-ジメチルホルムアミドの混合溶媒中で1時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物6を得る。
（5）室温で、化合物4、トリエチルアミン及び化合物6をジクロロメタン中で完全に反応させた後、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物7を得る。
（6）メタノール中の化合物7にHClガスを導入し、完全に反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物8を得る。
iii. 化合物11の調製：
（7）窒素ガス雰囲気下で、アセトニトリル中の3-ブロモ-イミダゾ[1,2-b]ピリダジンに、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド、ヨウ化第一銅、ジシクロヘキシルアミン及びトリメチルシリルアセチレンを加え、80℃で完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物10を得る。
（8）室温で、化合物10をメタノール、フッ化カリウムの飽和溶液と完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物11を得る。
iv. 化合物12の調製：
（9）窒素ガス雰囲気下で、N、N-ジメチルホルムアミド中の化合物8及び化合物11に、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド、ヨウ化第一銅及びジイソプロピルエチルアミンを加え、室温で撹拌し、完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物12を得る。
v. 化合物17の調製：
（10）化合物13とBOC無水物とをジクロロメタン中で完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物14を得る。
（11）化合物14、トリエチルアミン及び塩化グルタリルをジクロロメタン中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物15を得る。
（12）室温で、化合物15をHCl/酢酸エチル中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物16を得る。
（13）室温で、化合物16、ジイソプロピルエチルアミン及び3-クロロプロピオニルクロリドをジクロロメタン中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物17を得る。
vi. 化合物BPの調製：
（14）化合物12、化合物17及びトリエチルアミンをテトラヒドロフラン中で還流し、24時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物BPを得る。
【請求項１２】
以下を特徴とする請求項１１に記載の調製方法。
ステップiの（1）に記載の2-メチル-5-ニトロベンゾトリフルオリド、N-ブロモスクシンイミド及びアゾビスイソブチロニトリルのモル比が0.15：0.16：0.01であって、前記2-メチル-5-ニトロベンゾトリフルオリドと四塩化炭素のモル体積比が0.15：200 mmol/mlであり、
ステップiの（2）に記載の化合物2、N-Boc-ピペラジン及びトリエチルアミンのモル比が0.146：0.16：0.22であって、前記化合物2とジクロロメタンのモル体積比が14.6：200 mmol/mlであり、
ステップiの（3）に記載の還元鉄粉、塩化アンモニウム及び化合物3のモル比が0.5：0.3：0.1であって、前記化合物3と混合溶媒のモル体積比が0.1：200 mmol/ml であって、前記混合溶媒の中、水とエタノールの体積比が1：1であり、
ステップiiの（4）に記載の3-ヨード-4-メチル安息香酸と混合溶媒のモル体積比が0.09：101 mmol/mlであって、前記混合溶媒の中、テトラヒドロフランとN、N-ジメチルホルムアミドの体積比が100：1であり、
ステップiiの（5）に記載の化合物4、トリエチルアミン及び化合物6のモル比が0.08：0.12：0.088であって、前記化合物4及びジクロロメタンのモル体積比が0.08：250 mmol/mlであり、
ステップiiの（6）に記載の化合物7とメタノールのモル体積比が0.03：100 mmol/mlであり、
ステップiiiの（7）に記載の3-ブロモ-イミダゾ[1,2-b]ピリダジンとアセトニトリルのモル体積比が0.05：100 mmol/mlであって、前記3-ブロモ-イミダゾ[1,2-b]ピリダジン、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド、ヨウ化第一銅、ジシクロヘキシルアミン及びトリメチルシリルアセチレンのモル比が0.05：0.0014：0.0014：0.06：0.6であり、
ステップiiiの（8）に記載の化合物10とメタノールのモル体積比が0.04：50 mol/mlであって、前記メタノールとフッ化カリウムの飽和溶液の体積比が50：20であり、
ステップivの（9）に記載の化合物8、化合物11、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド、ヨウ化第一銅及びジイソプロピルエチルアミンのモル比が17.3：19：1：1：38であって、前記化合物8とN、N-ジメチルホルムアミドのモル体積比が17.3：150 mmol/mlであり、
ステップvの（10）に記載の化合物13とBOC無水物のモル比が45.5：43.18であって、前記化合物13とジクロロメタンのモル体積比が45.5：600 mmol/mlであり、
ステップvの（11）に記載の化合物14、トリエチルアミン及び塩化グルタリルのモル比が8.42：14.85：4.17であって、前記化合物14とジクロロメタンのモル体積比が8.42：120 mmol/mlであり、
ステップvの（12）に記載の化合物15とHCl/酢酸エチルのモル体積比が3.8：100 mmol/mlであって、前記HCl/酢酸エチルの濃度が2Mであり、
ステップvの（13）に記載の化合物16、ジイソプロピルエチルアミン及び3-クロロプロピオニルクロリドのモル比が0.90：6.15：1.81であって、前記化合物16とジクロロメタンのモル体積比が0.90：50 mmol/mlであり、
ステップviの（14）に記載の化合物12、化合物17及びトリエチルアミンのモル比が0.2：0.1：0.3であって、前記化合物12とテトラヒドロフランのモル体積比が0.2：10 mmol/mlである。
【請求項１３】
以下の操作手順を含むことを特徴とする、化合物BDBの調製方法。
2017511348.tif 000034
【請求項１４】
以下の操作手順を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の調製方法。
A.    化合物9bの調製：
室温で、クロロギ酸エチル、化合物8b及びジイソプロピルエチルアミンをテトラヒドロフラン中で撹拌し、16時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物9bを得る。
B.    化合物11bの調製：
室温で、化合物9b、ジイソプロピルエチルアミン及び4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライドをジクロロメタン中で撹拌し、16時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物11bを得る。
C.    化合物12bの調製：
室温で、化合物11bをHCl/酢酸エチル中で撹拌し、2時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物12bを得る。
D.   化合物14bの調製：
室温で、化合物12b、化合物13b、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール及びジイソプロピルエチルアミンをジクロロメタン中で撹拌し、16時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物14bを得る。
E.    化合物BDBの調製：
60℃で、化合物7b、化合物14b及び炭酸カリウムをN、N-ジメチルホルムアミドの中で撹拌し、5時間反応させ、反応液を得る。反応液を分離し、化合物BDBを得る。
【請求項１５】
以下を特徴とする、請求項１４に記載の調製方法。
ステップAに記載のクロロギ酸エチル、化合物8b及びジイソプロピルエチルアミンのモル比が46.5：44.5：264であって、前記クロロギ酸エチルとテトラヒドロフランのモル体積比が46.5：350 mmol/mlであり、
ステップBに記載の化合物9b、ジイソプロピルエチルアミン及び4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライドのモル比が0.67：0.8：0.8であって、前記化合物9bとジクロロメタンのモル体積比が0.67：50 mmol/mlであり、
ステップCに記載の化合物11bとHCl/酢酸エチルのモル体積比が0.445：20 mmol/mlであって、前記HCl/酢酸エチルの濃度が2Mであり、
ステップDに記載の化合物12b、化合物13b、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール及びジイソプロピルエチルアミンのモル比が0.445：0.445：0.534：0.534：0.534であって、前記化合物12bとジクロロメタンのモル体積比が0.445：25 mmol/mlであり、
ステップEに記載の化合物7b、化合物14b及び炭酸カリウムのモル比が0.4：1：4.8であって、前記化合物7bとN、N-ジメチルホルムアミドのモル体積比が0.4：50 mmol/mlである。
【請求項１６】
ステップEに記載の化合物7bが以下の操作手順で調製されることを特徴とする、請求項５に記載の調製方法。
2017511348.tif 000035
【請求項１７】
前記化合物7bが以下の操作手順で調製されることを特徴とする、請求項１６に記載の調製方法。
I. 化合物2bの調製：
化合物1bとBOC無水物をジクロロメタン中で完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物2bを得る。
II. 化合物3bの調製：
室温で化合物2b、トリエチルアミン及びグルタリルクロライドをジクロロメタン中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物3bを得る。
III. 化合物4bの調製：
室温で化合物3bをHCl/酢酸エチル中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物4bを得る。
IV. 化合物の5b調製：
室温で化合物4b、ジイソプロピルエチルアミン及び3-クロロプロピオニルクロリドをジクロロメタン中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物5bを得る。
V. 化合物の6b調製：
化合物5b、ピペラジン-1-カルボキシレート及びジイソプロピルエチルアミンをジオキサン中で還流し、18時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物6bを得る。
VI. 化合物の7b調製：
室温で化合物6bをHCl/酢酸エチル中で撹拌し、2時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物7bを得る。
【請求項１８】
以下を特徴とする、請求項１７に記載の調製方法。
ステップIに記載の化合物1bとBOC無水物のモル比が45.5：43.18であって、前記化合物1bとジクロロメタンのモル体積比が45.5：600 mmol/mlであり、
ステップIIに記載の化合物2b、トリエチルアミン及びグルタリルクロライドのモル比が8.42：14.85：4.17であって、前記化合物2bとジクロロメタンのモル体積比が8.42：120 mmol/mlであり、
ステップIIIに記載の化合物3bとHCl/酢酸エチルのモル体積比が3.8：100 mmol/mlであって、前記HCl/酢酸エチルの濃度が2Mであり、
ステップIVに記載の化合物4b、ジイソプロピルエチルアミン及び3-クロロプロピオニルクロリドのモル比が0.9：6.15：1.81であって、前記化合物4bとジクロロメタンのモル体積比が0.9：50 mmol/mlであり、
ステップVに記載の化合物5b、ピペラジン-1-カルボキシレート及びジイソプロピルエチルアミンのモル比が0.14：2.68：0.77であって、前記化合物5bとジオキサンのモル体積比が0.14：20 mmol/mlであり、
ステップVIに記載の化合物6bとHCl/酢酸エチルのモル体積比が0.1：20 mmol/mlであって、前記HCl/酢酸エチルの濃度が2Mである。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物及びその薬学的に許容される塩の、細胞増殖に関連する疾病の治療薬の製造における使用。
【請求項２０】
前記薬物がチロシンキナーゼの阻害剤であることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記薬物がABLの阻害剤類の薬物であることを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記薬物がBCR-ABL又はその突然変異株の阻害剤類の薬物であることを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記BCR-ABLの突然変異株がT315I突然変異株であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記細胞増殖に関連する疾病が癌であることを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記癌が慢性骨髄性白血病、腸間質腫瘍、婦人科腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫又はPh+ALLであることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Bcr-Abl二倍体の阻害剤、その調製方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病では、染色体は遺伝子の突然変異を起こし、[t(9:22)(q34;q11)]が相互に転座する。染色体の9位にあるABL遺伝子とその22位にあるBCR遺伝子が融合し、BCR-ABLが生成される。この融合された遺伝子が、210kDaチロシンキナーゼであるBcr-Ablをコーディングする。このタンパク質が慢性骨髄性白血病の主な原因である。c-Ablは正常な細胞の細胞質に存在している一倍体チロシンキナーゼである。これがBcrと融合すると、形態が変化し、一倍体から四量体に変わる。そのため、このキナーゼは常に活性状態になり、腫瘍を誘発する。Bcrのタンパク質配列の中には多量体化を誘導するアミノ酸配列が存在しているため、Bcr-Abl四量体が生成される。c-Ablは心筋等の正常な細胞の中で重要な役割を果たしている。そのため、Ablを阻害せず、発がん性のBcr-Ablを特異的に阻害する阻害剤が開発されれば、この種の阻害剤が持つ心臓毒性等の様々な副作用が大きく軽減されることが期待される。
2001年、FDAは最初のチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）としてイマチニブ（Imatinib）１の販売を承認した。イマチニブは慢性骨髄性白血病（CML）の治療に使用され、初代のBcr-Abl阻害剤として、現在では既にCMLを治療するための第一線の薬物となった。しかし、ほとんどの患者には、最終的にイマチニブ（IM）に対する耐性が現れる。IM耐性の出現は、G250E、Q252H、Y253F、Y253H、E255K、E355G、E255V、T315A、T315I、F317L、F317V、M351T、F359V、H396P及びM244V等のAblキナーゼの活性領域での遺伝子突然変異と関連しうることがその後の研究から明らかになった。遺伝子の突然変異により、イマチニブのAblキナーゼに対する親和性は低下する。ほとんどの場合では、イマチニブの親和性は5〜30倍低下する。これは薬物耐性をもたらす主な原因である。特に、T315Iは低下作用が最も著しく、IC50は6400 nM程までに低下する。最近に開発されたポナチニブは、T315Iには有効だけではなく、野生型及びほとんどの突然変異株にも有効である。
イマチニブとAblタンパク質のキナーゼ部分のX線共晶の構造をみると、そのメチルピペラジン部分のN-メチルが溶媒の中に暴露され、二つの阻害剤とこの窒素原子との間の直線距離は約24Åである。Bcr-Ablは四量体であるため、四つの阻害剤と同時に結合できる。仮に二つの阻害剤を鎖で連結すれば、四量体のBcr-Ablとの親和性が大きく強化され、特異的にBcr-Ablを阻害することになる。一方、Ablは一倍体であるため、一つの阻害剤としか結合できない。二倍体の阻害剤はキナーゼとの親和性には大きく影響しないと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、Bcr-Abl二倍体の阻害剤、その調製方法及びその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、下記一般式で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を提供する。
2017511348.tif 000002
〔式中、Rは下記のいずれかから選択される。〕
2017511348.tif 000003
【０００５】
さらに、前記一般式中、Linkerが-(CH2CH2O)x3-(CH2)x2-(NHCO)-(CH2)x1-(CONH)-(CH2)x2-(OCH2CH2)x3-であって、x1、x2、x3がそれぞれ独立して1、2、3、4、5又は6から選択される。
【０００６】
本発明が提供する化合物又はその薬学的に許容される塩の構造式は、式I、式II又は式IIIで表される。
2017511348.tif 000004
2017511348.tif 000005
2017511348.tif 000006
【０００７】
さらに、Linkerが、(Z1)a−(Z2)b−(Z3)cであって、Z1、Z2及びZ3が、それぞれ独立してC(O)(CH2)dNH、CO(CH2)eC(O)、(CH2CH2)fNHC(O)、(CH2CH2)g-C(O)NH、(C2)hC(O)(OCH2CH2)iNHC(O)(CH2)jC(O)、NH(CH2)k(OCH2CH2)l-O(CH2)mNH、
(CH2)nC(O) (OCH2CH2)oNH(C(O) (CH2)pNH)qC(O)-alkyl
又はC(O)NH(CH2)rNHC(O)-(CH2)sC(O) (NHCH2CH2)tNH(C(O) (CH2)uNH)v-C(O)-alkylから選択され、a〜vがそれぞれ独立して1〜20から選択される。
【０００８】
さらに、前記化合物が、
2017511348.tif 000007
、
2017511348.tif 000008
である。
【０００９】
本発明は、上記化合物又はその薬学的に許容される塩の調製方法も提供する。
本発明が提供する式Iの化合物の調製方法は、以下の操作手順を含む。
2017511348.tif 000009
【００１０】
さらに、以下の操作手順を含む。
（１）  化合物2aの調製
2017511348.tif 000010
（２）  化合物BGCの調製
2017511348.tif 000011
【００１１】
さらに、以下の操作手順を含む。
a. 化合物2aの調製：
室温で、化合物1a、トリエチルアミン及び4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライドをジクロロメタン中で撹拌し、18時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物2aを得る。
b. 化合物6aの調製：
(1)化合物4aの調製
室温で、化合物3a、トリエチルアミン及びグルタリルクロライドをジクロロメタン中で撹拌し、6時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物4aを得る。
(2)化合物6aの調製
氷浴中で、化合物4a、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩及びN-メチルモルホリンをジクロロメタン中で0.5時間反応させた後、化合物5aを加え、室温で完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物6aを得る。
c. 化合物BGCの調製
100℃で、化合物2a、化合物6a及び炭酸カリウムをN、N-ジメチルホルムアミド中で撹拌し、18時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物BGCを得る。
【００１２】
さらに、
ステップaに記載の化合物1a、トリエチルアミン及び4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライドのモル比が18：35.6：21.3であって、前記化合物1aとジクロロメタンのモル体積比が18：400 mmol/ mlであり、
ステップbの(1)に記載の化合物3a、トリエチルアミン及びグルタリルクロライドのモル比が45.4：68.1：22.7であって、前記化合物3aとジクロロメタンのモル体積比が45.4：300 mmol/ mlであり、
ステップbの(2)に記載の化合物4a、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩、N-メチルモルホリン及び化合物5aのモル比が1：1.2：1.2：3：2.1であって、前記化合物4aとジクロロメタンのモル体積比が1：20 mmol/ mlであり、
ステップcに記載の化合物2a、化合物6a及び炭酸カリウムのモル比が0.28：0.09：2.69であって、前記化合物2aとN、N-ジメチルホルムアミドのモル体積比が0.28：20 mmol/ mlである。
【００１３】
本発明が提供する化合物BPの調製方法は、以下の操作手順を含む。
a.    化合物12の調製：
2017511348.tif 000012
b. 化合物BPの調製：
2017511348.tif 000013
【００１４】
さらに、以下の操作手順を含む。
i. 化合物4の調製：
（1）窒素ガス雰囲気下、で四塩化炭素中の2-メチル-5-ニトロベンゾトリフルオリド（化合物1）にN-ブロモスクシンイミド及びアゾビスイソブチロニトリルを加え、還流して24時間反応させ、反応液を得る。反応液を分離し、化合物2を得る。
（2）ジクロロメタン中で、化合物2、N-Boc-ピペラジン及びトリエチルアミンを室温で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物3を得る。
（3）水及びエタノールの混合溶媒の中に還元鉄粉、塩化アンモニウム及び化合物3を加え、還流して1時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物4を得る。
ii. 化合物8の調製：
（4）60℃で、3-ヨード-4-メチル安息香酸及び塩化チオニルを、テトラヒドロフラン及びN、N-ジメチルホルムアミドの混合溶媒中で1時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物6を得る。
（5）室温で、化合物4、トリエチルアミン及び化合物6を、ジクロロメタン中で完全に反応させた後、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物7を得る。
（6）メタノール中の化合物7にHClガスを導入し、完全に反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物8を得る。
iii. 化合物11の調製：
（7）窒素ガス雰囲気下で、アセトニトリル中の3-ブロモ-イミダゾ[1,2-b]ピリダジンに、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド、ヨウ化第一銅、ジシクロヘキシルアミン及びトリメチルシリルアセチレンを加え、80℃で完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物10を得る。
（8）室温で、化合物10をメタノール及びフッ化カリウムの飽和溶液と完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物11を得る。
iv. 化合物12の調製：
（9）窒素ガス雰囲気下で、N、N-ジメチルホルムアミド中の化合物8及び化合物11に、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド、ヨウ化第一銅及びジイソプロピルエチルアミンを加え、室温で撹拌し、完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物12を得る。
v. 化合物17の調製：
（10）化合物13とBOC無水物とをジクロロメタン中で完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物14を得る。
（11）化合物14、トリエチルアミン及び塩化グルタリルをジクロロメタン中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物15を得る。
（12）室温で、化合物15をHCl/酢酸エチル中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物16を得る。
（13）室温で、化合物16、ジイソプロピルエチルアミン及び3-クロロプロピオニルクロリドをジクロロメタン中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物17を得る。
vi. 化合物BPの調製：
（14）化合物12、化合物17及びトリエチルアミンをテトラヒドロフラン中で還流し、24時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物BPを得る。
【００１５】
さらに、
ステップiの（1）に記載の2-メチル-5-ニトロベンゾトリフルオリド、N-ブロモスクシンイミド及びアゾビスイソブチロニトリルのモル比が0.15：0.16：0.01であって、前記2-メチル-5-ニトロベンゾトリフルオリドと四塩化炭素のモル体積比が0.15：200 mmol/mlであり、
ステップiの（2）に記載の化合物2、N-Boc-ピペラジン及びトリエチルアミンのモル比が0.146：0.16：0.22であって、前記化合物2とジクロロメタンのモル体積比が14.6：200 mmol/mlであり、
ステップiの（3）に記載の還元鉄粉、塩化アンモニウム及び化合物3のモル比が0.5：0.3：0.1であって、前記化合物3と混合溶媒のモル体積比が0.1：200 mmol/mlであって、前記混合溶媒の中、水とエタノールの体積比が1：1であり、
ステップiiの（4）に記載の3-ヨード-4-メチル安息香酸と混合溶媒のモル体積比が0.09：101 mmol/mlであって、前記混合溶媒の中、テトラヒドロフランとN、N-ジメチルホルムアミドの体積比が100：1であり、
ステップiiの（5）に記載の化合物4、トリエチルアミン及び化合物6のモル比が0.08：0.12：0.088であって、前記化合物4及びジクロロメタンのモル体積比が0.08：250 mmol/mlであり、
ステップiiの（6）に記載の化合物7とメタノールのモル体積比が0.03：100 mmol/mlであり、
ステップiiiの（7）に記載の3-ブロモ-イミダゾ[1,2-b]ピリダジンとアセトニトリルのモル体積比が0.05：100 mmol/mlであって、前記3-ブロモ-イミダゾ[1,2-b]ピリダジン、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド、ヨウ化第一銅、ジシクロヘキシルアミン及びトリメチルシリルアセチレンのモル比が0.05：0.0014：0.0014：0.06：0.6であり、
ステップiiiの（8）に記載の化合物10とメタノールのモル体積比が0.04：50 mol/mlであって、前記メタノールとフッ化カリウムの飽和溶液の体積比が50：20であり、
ステップivの（9）に記載の化合物8、化合物11、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド、ヨウ化第一銅及びジイソプロピルエチルアミンのモル比が17.3：19：1：1：38であって、前記化合物8とN、N-ジメチルホルムアミドのモル体積比が17.3：150 mmol/mlであり、
ステップvの（10）に記載の化合物13とBOC無水物のモル比が45.5：43.18であって、前記化合物13とジクロロメタンのモル体積比が45.5：600 mmol/mlであり、
ステップvの（11）に記載の化合物14、トリエチルアミン及び塩化グルタリルのモル比が8.42：14.85：4.17であって、前記化合物14とジクロロメタンのモル体積比が8.42：120 mmol/mlであり、
ステップvの（12）に記載の化合物15とHCl/酢酸エチルのモル体積比が3.8：100 mmol/mlであって、前記HCl/酢酸エチルの濃度が2Mであり、
ステップvの（13）に記載の化合物16、ジイソプロピルエチルアミン及び3-クロロプロピオニルクロリドのモル比が0.90：6.15：1.81であって、前記化合物16とジクロロメタンのモル体積比が0.90：50 mmol/mlであり、
ステップviの（14）に記載の化合物12、化合物17及びトリエチルアミンのモル比が0.2：0.1：0.3であって、前記化合物12とテトラヒドロフランのモル体積比が0.2：10 mmol/mlである。
【００１６】
本発明が提供する化合物BDBの調製方法は、以下の操作手順を含む。
2017511348.tif 000014
【００１７】
さらに、以下の操作手順を含む。
A.    化合物9bの調製：
室温で、クロロギ酸エチル、化合物8b及びジイソプロピルエチルアミンをテトラヒドロフラン中で撹拌し、16時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物9bを得る。
B.    化合物11bの調製：
室温で、化合物9b、ジイソプロピルエチルアミン及び4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライドをジクロロメタン中で撹拌し、16時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物11bを得る。
C.    化合物12bの調製：
室温で、化合物11bをHCl/酢酸エチル中で撹拌し、2時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物12bを得る。
D.   化合物14bの調製：
室温で、化合物12b、化合物13b、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール及びジイソプロピルエチルアミンをジクロロメタン中で撹拌し、16時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物14bを得る。
E.    化合物BDBの調製：
60℃で、化合物7b、化合物14b及び炭酸カリウムをN、N-ジメチルホルムアミド中で撹拌し、5時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離を行い、化合物BDBを得る。
【００１８】
さらに、
ステップAに記載のクロロギ酸エチル、化合物8b及びジイソプロピルエチルアミンのモル比が46.5：44.5：264であって、前記クロロギ酸エチルとテトラヒドロフランのモル体積比が46.5：350 mmol/ mlであり、
ステップBに記載の化合物9b、ジイソプロピルエチルアミン及び4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライドのモル比が0.67：0.8：0.8であって、前記化合物9bとジクロロメタンのモル体積比が0.67：50 mmol/mlであり、
ステップCに記載の化合物11bとHCl/酢酸エチルのモル体積比が0.445：20 mmol/mlであって、前記HCl/酢酸エチルの濃度が2Mであり、
ステップDに記載の化合物12b、化合物13b、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール及びジイソプロピルエチルアミンのモル比が0.445：0.445：0.534：0.534：0.534であって、前記化合物12bとジクロロメタンのモル体積比が0.445：25 mmol/mlであり、
ステップEに記載の化合物7b、化合物14b及び炭酸カリウムのモル比が0.4：1：4.8であって、前記化合物7bとN、N-ジメチルホルムアミドのモル体積比が0.4：50 mmol/mlである。
【００１９】
さらに、ステップEに記載の化合物7bが以下の操作手順で調製される。
2017511348.tif 000015
【００２０】
さらに、前記化合物7bが以下の操作手順で調製される。
I. 化合物2bの調製：
化合物1bとBOC無水物をジクロロメタン中で完全に反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物2bを得る。
II. 化合物3bの調製：
室温で、化合物2b、トリエチルアミン及びグルタリルクロライドをジクロロメタン中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物3bを得る。
III. 化合物4bの調製：
室温で、化合物3bをHCl/酢酸エチル中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物4bを得る。
IV. 化合物の5b調製：
室温で、化合物4b、ジイソプロピルエチルアミン及び3-クロロプロピオニルクロリドをジクロロメタン中で撹拌し、3時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物5bを得る。
V. 化合物の6b調製：
化合物5b、ピペラジン-1-カルボキシレート及びジイソプロピルエチルアミンをジオキサン中で還流し、18時間反応させ、反応液を得る。反応液の分離及び精製を行い、化合物6bを得る。
VI. 化合物の7b調製：
室温で、化合物6bをHCl/酢酸エチル中で撹拌し、2時間反応させ、反応液を得る。反応液中の溶媒を除去し、化合物7bを得る。
【００２１】
さらに、
ステップIに記載の化合物1bとBOC無水物のモル比が45.5：43.18であって、前記化合物1bとジクロロメタンのモル体積比が45.5：600 mmol/mlであり、
ステップIIに記載の化合物2b、トリエチルアミン及びグルタリルクロライドのモル比が8.42：14.85：4.17であって、前記化合物2bとジクロロメタンのモル体積比が8.42：120 mmol/mlであり、
ステップIIIに記載の化合物3bとHCl/酢酸エチルのモル体積比が3.8：100 mmol/mlであって、前記HCl/酢酸エチルの濃度が2Mであり、
ステップIVに記載の化合物4b、ジイソプロピルエチルアミン及び3-クロロプロピオニルクロリドのモル比が0.9：6.15：1.81であって、前記化合物4bとジクロロメタンのモル体積比が0.9：50 mmol/mlであり、
ステップVに記載の化合物5b、ピペラジン-1-カルボキシレート及びジイソプロピルエチルアミンのモル比が0.14：2.68：0.77であって、前記化合物5bとジオキサンのモル体積比が0.14：20 mmol/mlであり、
ステップVIに記載の化合物6bとHCl/酢酸エチルのモル体積比が0.1：20 mmol/mlであって、前記HCl/酢酸エチルの濃度が2Mである。
【００２２】
本発明は、上記化合物及びその薬学的に許容される塩の、細胞増殖に関連する疾病の治療薬の製造における用途を提供する。
さらに、前記薬物がチロシンキナーゼの阻害剤である。
さらに、前記薬物がABLの阻害剤類の薬物である。
さらに、前記薬物がBCR-ABL又はその突然変異株の阻害剤類の薬物である。
さらに、前記BCR-ABLの突然変異株がT315I突然変異株である。
さらに、前記細胞増殖に関連する疾病が癌である。
さらに、前記癌が慢性骨髄性白血病、腸間質腫瘍、婦人科腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫又はPh+ALLである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明が提供する化合物又はその薬学的に許容される塩は、Bcr-Abl二倍体の阻害剤としてチロシンキナーゼの活性を有効に阻害し、当該キナーゼの異常な活性化に関連する疾病の治療に有効に使用でき、悪性腫瘍に対し良好な治療効果を有している。当該阻害剤の調製方法は簡便であり、低コストであるため、その応用の見通しは良好である。
【００２４】
当然ながら、上記本発明の基本的な技術発想を逸脱しないことを前提に、本技術分野の常識や通常の手段を用いて、本発明の上記内容に基づく様々な修正、代替又は変更が可能である。
【００２５】
以下は実施例による具体的な実施形態を通じ、本発明の上記内容をさらに詳しく説明する。なお、本発明の上記課題の範囲が以下の実施例に限るものと解釈すべきではない。本発明の上記内容に基づいて得られた如何なる技術は本発明の範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の化合物BGCのKBM5担癌マウスの腫瘍体積に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の具体的な実施形態において使用する原料や設備はいずれも既知の製品であり、市販品を購入して得たものである。
略語の名称：
HOBT：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール；EDC：1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩；NMM：N-メチルモルホリン；DMSO：ジメチルスルホキシド；AIBN：アゾビスイソブチロニトリル；DMF：N、N-ジメチルホルムアミド；TLC：薄層クロマトグラフィー；DCM：ジクロロメタン；(Boc)2O：BOC無水物。
【実施例１】
【００２８】
本発明の化合物BGCの調製
（１）合成経路は以下の通りである。
2017511348.tif 000016
（２）化合物BGCの調製：
2017511348.tif 000017
【００２９】
具体的な合成手順は以下の通りである。
【００３０】
a)    化合物2aの調製
化合物1a（5.0 g, 18.0 mmol, メーカー：上海旭剛生物科技有限公司）及びトリエチルアミン(3.6 g, 35.6 mmol)をジクロロメタン(400 ml)に溶解した。4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライド(4.0 g, 21.3 mmol)をジクロロメタン(100 ml)に溶解し、これを0℃で反応液に滴下した。滴下が終了した後に室温まで自然に昇温し、その後攪拌して18時間反応させた。反応瓶の中で固体が析出した。この反応混合物を濾過し、収集した固体をジクロロメタン及び水で洗浄し、黄色固体の化合物2aを得た(5.3 g, 収率68%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.23 (s, 1 H), 9.28 (s, 1 H), 8.97 (s, 1 H), 8.69 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 8.52 (m, 2 H), 8.09 (s, 1 H), 7.97 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.59-7.42 (m, 5 H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 4.84 (s, 2 H), 2.23 (s, 3 H). MS (ESI+) m/z: 430 [M +1]+
【００３１】
b) 化合物4aの調製
室温で化合物3a（10.0 g, 45.4 mmol, メーカー：Sigma-Aldrich）をジクロロメタン(250 ml)に溶解し、そこへトリエチルアミン（6.9 g，68.1 mmol）を加えた。さらに、グルタリルクロライド（3.8 g, 22.7 mmol）をジクロロメタン（50 ml）に溶解し、反応液にゆっくり滴下した。滴下が終了した後に室温で攪拌し、6時間反応させた。その反応液を水(200 ml × 2)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮を行い、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール = 20/1）で精製し、化合物4aを得た（4.3 g, 収率35.4%）。
【００３２】
c) 化合物6aの調製
氷浴中で化合物4a（2.7 g, 5.0 mmol）をジクロロメタン(100 ml)に溶解し、そこへHOBT(0.81 g, 6.0 mmol)、EDC(0.59 g, 6.0 mmol)及びNMM(1.52 g, 15 mmol)を加え、30分間反応させた。反応液に化合物5a(1.67 g，10.5 mmol, メーカー：百霊威科技有限公司）を数回に分けて添加した。添加終了後、室温まで徐々に昇温し、終夜反応させた。反応液を塩化ナトリウムの飽和水溶液(100 ml × 2)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物6aを得た(1.3 g, 収率31.8%)。
1H NMR (400 MHz, D2O) 3.62 (30H, m), 3.53 (14H, m), 3.21 (8H, q, J=7,2Hz). 2.77(4H, t, J=6.8Hz). 2.21(4H, t, J=7.6Hz). 1.82 (2H, m)
【００３３】
d) 化合物BGCの調製
化合物6a（72 mg, 0.09 mmol）、化合物2a（120 mg, 0.28 mmol）、K2CO3（350 mg, 2.69 mmol）及びN、N-ジメチルホルムアミド（20 ml）を丸底フラスコの中に入れ、100℃で攪拌し、18時間反応させた。反応液が室温まで冷却した後、氷水を激しく攪拌しながら、そこへ反応液を注ぎ入れた。固体が析出した。これを濾過し、固体を収集した。残渣を分取HPLCで精製し、オレンジ色固体の化合物BGCを得た(18 mg, 収率12%)。
1H NMR (400 MHz, D2O): δ 9.40 (s, 2 H), 9.12 (d, J=8Hz，2 H,), 8.87 (d, J=5.2Hz, 2 H), 8.50 (bs,2H), 8.13 (t,J=6.8Hz, 2 H), 7.95 (d, J=7.6Hz, 4 H), 7.90 (s, 2 H),7.65 (d, J=8Hz,4 H), 7.45 (d, J=5.2Hz,2 H), 7.36 (d, J=8Hz,2 H), 7.24 (d, J=7.6Hz,2 H), 4.43 (s, 4 H),3.66-3.44 (m, 44 H), 3.28 (t, J=6.8Hz, 4H), 3.22 (t, J=6.8Hz, 4H),2.78 (t, J=6.8Hz, 4 H), 2.26 (s, 6 H), 2.22 (t, J = 7.2 Hz, 4 H), 1.87-1.70 (m,10 H). MS (ESI+) m/z: 1604 [M +1]+
【実施例２】
【００３４】
本発明の化合物BPの調製
合成経路は以下の通りである。
a.    化合物12の調製：
2017511348.tif 000018
b. 化合物BPの調製：
2017511348.tif 000019
【００３５】
化合物2の調製
2-メチル-5-ニトロベンゾトリフルオリド（化合物1）（30 g, 0.15 mol）を四塩化炭素（200 ml）中に入れ、窒素ガス雰囲気下でN-ブロモスクシンイミド（28.8 g, 0.16 mol）及びAIBN （2.5 g，0.01 mol）を加えた。これをマグネットで攪拌し、還流するまで昇温し、24時間反応させた。その後反応を停止させ、室温まで冷却し、反応液を濾過した。固体を酢酸エチルで洗浄し、酢酸エチル層を合わせた。これを炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で洗浄し、塩化ナトリウムの飽和水溶液（10 ml × 2）でさらに洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ、黄色油状物の化合物2を得た。これを精製する必要はなく、直接に次のステップに用いた。
【００３６】
化合物3の調製
先のステップで調製した化合物2をジクロロメタン（200 ml）に溶解し、N-Boc-ピペラジン（29.7 g, 0.16 mol）及びトリエチルアミン（30 ml，0.22 mol）を加え、室温で攪拌し、3時間反応させた。反応が完了した後に、反応液に水100 mlを加え、1N塩酸でpHを2〜3に調整し、層を分離させた。ジクロロメタン（100 ml）で水層中の未反応の原料及び不純物を抽出した後、1 N水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを9〜10に調整し、ジクロロメタン（50ml×3）で生成物を抽出し、塩化ナトリウムの飽和水溶液（10 ml × 2）で有機層を洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ、淡黄色の油状液体、即ち化合物3を得た（48.1 g, 化合物1に対して計算した収率84.4%）。
ESI-MS m/z：390.2 [M+H]+；
1H NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 8.52(d, J=1.5Hz, 1H), 8.39(d, J=8.5 Hz, 1H), 8.12(d, J=8.5Hz, 1H), 3.75 (s, 2H)，3.47(s, 4H), 2.45(s, 4H), 1.47 ( s, 9H)
【００３７】
化合物4の調製
水（100 ml）及びエタノール（50 ml）の混合溶媒中に還元鉄粉（28 g, 0.50 mol）及び塩化アンモニウム（15.9 g, 0.30 mol）を加え、還流するまで加熱した。30分間反応させた後、化合物3（38.9 g ，0.10 mol）をエタノール（50 ml）に溶解し、これを反応フラスコに滴下した。滴下が終了した後、1時間反応させ、TLC（薄層クロマトグラフィー）で反応を観測した。反応が完了した後に、反応系を室温まで冷却し、濾過した。固体をエタノールで洗浄し、エタノールを蒸発させた後、酢酸エチル（50 ml × 3）で生成物を抽出し、有機層を塩化ナトリウムの飽和水溶液（10 ml × 2）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ、淡黄色の油状物、即ち化合物4を得た（34.9 g, 収率97.3%）。
ESI-MS m/z : 360.2 [M+H]+；
1H NMR(d6-DMSO, 500MHz) δ: 7.29(d, J=8.5Hz, 1H), 6.86(d, J=2Hz, 1H), 6.75(dd, J=2, 8.5Hz, 1H), 5.45 (s, 2H)，3.29(br s, 4H), 2.26-2.28(m, 4H), 1.38 ( s, 9H)
【００３８】
化合物6の調製
3-ヨード-4-メチル安息香酸（化合物5）（23.6 g, 0.09 mol）をTHF（100 ml）中に入れ、DMF（1 ml）を加えた後、塩化チオニル（11.78 g，0.099 mol）を加えた。これを60℃まで昇温し、1時間反応させた。反応完了後、溶媒を蒸発させ、3-ヨード-4-メチルベンゾイルクロリド（化合物6）を得た。これを次のステップに直接に用いた。
【００３９】
化合物7の調製
化合物4（28.7 g, 0.08 mol）をジクロロメタン（200 ml）に溶解し、これにトリエチルアミン（17 ml, 0.12 mol）を加えた。先のステップで得た3-ヨード-4-メチルベンゾイルクロリド（化合物6）をジクロロメタン（50 ml）で希釈した後、これを氷浴中で前記の反応液にゆっくり滴下した。滴下が終了した後、室温まで昇温して反応した。1時間後にTLCで反応を観測した。反応が完了した後、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（20 ml × 3）で反応液を洗浄した。有機層をさらに塩化ナトリウムの飽和水溶液（20 ml × 2）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発し、淡黄色の固体、即ち化合物7を得た（39.7 g, 収率82.5%）。
ESI-MS m/z : 604.2 [M+H]+；
1N MR(CDCl3, 500MHz) δ: 8.32(s, 1H), 7.91(s, 2H), 7.88~7.92(m, 2H), 7.75~7.79(m, 2H), 7.30(d, J=8Hz, 1H), 3.62 (s, 2H)，3.42-3.44(m, 4H), 2.48 ( s, 2H), 2.39-2.41(m, 4H), 1.46 ( s, 9H)
【００４０】
化合物8の調製
化合物7（18 g, 0.03 mol）をメタノール（100 ml）に溶解し、HClガスを導入した。反応が完了した後、溶媒を蒸発させ、化合物8を得た。これを次のステップに直接に用いた。
【００４１】
化合物10の調製
3-ブロモ-イミダゾ[1,2-b]ピリダジン（化合物9）（10 g, 0.05 mol）をアセトニトリル（100 ml）に溶解し、窒素ガス雰囲気下でビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド（1.0 g, 1.4 mmol）、ヨウ化第一銅（0.3 g, 1.4 mmol）及びジシクロヘキシルアミン（11 ml, 0.06 mol）を加えた。80℃まで昇温し、反応液にトリメチルシリルアセチレン（8 ml，0.6 mol）をゆっくり滴下した。滴下が終了した後、1時間反応させ、TLCで反応を観測した。反応が完了した後、反応液を室温まで冷却し、濾過した。ジクロロメタン（200 ml）で固体を洗浄し、有機層を合わせ、溶媒を蒸発した。残渣にジクロロメタン（100 ml）を加え、有機層を塩化ナトリウムの飽和水溶液（20 ml × 2）でさらに洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ、粗生成物を得た。これを酢酸エチル/石油エーテルの混合液で結晶させ、黒褐色の粉末状固体、即ち化合物10を得た（8.9 g, 収率81.8%）。
1H NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.47(dd, J=1.6, 4.4Hz, 1H), 7.99(s, 1H), 7.96 (dd, J=1.6, 9.2Hz, 1H), 7.10(dd, J=4.4, 9.2Hz , 1H), 0.33 (s, 9H)
【００４２】
化合物11の調製
化合物10（8 g, 0.04 mol）をメタノール（50 ml）に溶解し、フッ化カリウムの飽和溶液（20 ml）を加え、室温で20分間反応させた。TLCで反応を観測し、反応が完了した後、メタノールを蒸発させ、残渣をジクロロメタン（100 ml）に溶解した。有機層を塩化ナトリウムの飽和水溶液（30 ml × 3）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させ、黒褐色の粉末状固体、即ち化合物11を得た（5.2 g, 収率98.4%）。
ESI-MS m/z : 144.1 [M+H]+；
1H NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.48(dd, J=1.6, 4.4Hz, 1H), 8.02(s, 1H), 8.00 (dd, J=1.6, 9.2Hz, 1H), 7.12(dd, J=4.4, 9.2Hz , 1H), 3.82 (s, 1H)
【００４３】
化合物12の調製
化合物8（10 g, 17.3 mmol）をDMF（100 ml）中に入れ、窒素ガス雰囲気下でビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリド（0.7 g, 1 mmol）、ヨウ化第一銅（0.2 g, 1 mmol）及びジシクロヘキシルアミン（6.6 ml, 38 mmol）を加えた。室温で攪拌し、化合物11（2.7 g, 19 mmol）をDMF（50 ml）で希釈した後、この反応液にゆっくり滴下した。1時間後にTLCで反応を観測した。反応が完了した後、反応液を水（300 ml）に注ぎ入れ、ジクロロメタン（50 ml × 3）で生成物を抽出した。有機層を塩化ナトリウムの飽和水溶液（20 ml × 2）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ、粗製品を得た。これをエタノール/石油エーテルの混合液で再結晶させ、淡黄色の粉末状固体、即ち化合物12を得た（7.7 g, 収率85.7%）。
ESI-MS m/z : 519.2 [M+H]+；
1H NMR(d6-DMSO, 500MHz) δ: 10.57(s, 1H), 8.73(dd, J=1.5, 4.5Hz, 1H), 8.28(dd, J=1.5, 9.5Hz,1H), 8.24 (s, 1H), 8.22 (d, J=1.5, 2H), 8.07(d, J=8Hz, 1H), 7.95(dd, J=1.5, 8Hz,1H),  7.73(d, J=8.5Hz, 1H), 7.55(d, J=8.5Hz, 1H), 7.40(dd, J=4.5, 9.5Hz , 1H), 3.54 (s, 2H)，2.75 (br s, 4H),  2.61 (s, 3H), 2.34(br s,4H), 1.23(br s,1H)
【００４４】
化合物14の調製
化合物13（10 g, 45.5 mmol）を500 mlのDCMに溶解した。室温で(Boc)2O（9.4 g，43.18 mmol）を100 ml のDCMに溶解し、これを反応フラスコにゆっくり滴下し、終夜反応させた。この反応液に水200 mlを加え、pHを3〜4に調整し、有機層中の不純物を抽出した。水層のpHを10に調整し、塩化ナトリウムを加え、飽和させた。生成物を抽出し、有機層を塩化ナトリウムの飽和水溶液（10 ml × 6）で洗浄し、未反応の原料を除去した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発し、無色の油状物、即ち化合物14を得た（4.7 g, 収率34.1%）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.11 (br s, 1 H), 3.63-3.45 (m, 12 H), 3.21 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 2.81 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 1.77-1.42 (m, 6 H), 1.42 (s, 9 H)
【００４５】
化合物15の調製
室温で化合物14（2.7 g, 8.42 mmol）及びトリエチルアミン（1.5 g, 14.85 mmol）をジクロロメタン（100 ml）に溶解した。グルタリルクロライド（0.7 g, 4.17 mmol）をジクロロメタン（20 ml）に溶解し、反応液に1時間以上をかけて滴下した。滴下が終了した後、室温で攪拌し、3時間反応させた。次に、塩化ナトリウムの飽和水溶液（100 ml × 2）で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、真空下で濃縮を行い、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール = 20/1）で精製し、無色の油状物、即ち化合物15を得た（3.1 g, 収率100%）。
ESI-MS m/z : 737.4 [M+H]+；
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.55 (br s, 2 H), 5.06 (br s, 2 H), 3.63-3.49 (m, 24 H), 3.34 (m, 4 H), 3.20 (m, 4 H), 2.22 (t, J = 7.2 Hz, 4 H), 1.93 (m, 2 H), 1.78-1.70 (m, 8 H), 1.41 (s, 18 H)
【００４６】
化合物16の調製
化合物15（2.8 g, 3.80 mmol）をHCl/酢酸エチル(2 M, 100 ml)の中に入れ、室温で攪拌し、3時間反応させた。真空下で濃縮を行い、溶媒を蒸発させ、無色の油状の液体、即ち化合物16を得た（2.6 g, 収率は約100%)。これを精製する必要はなく、次のステップの反応に直接に用いた。
【００４７】
化合物17の調製
室温で化合物16（484 mg, 0.90 mmol）及びジイソプロピルエチルアミン（DIPEA)(800 mg, 6.15 mmol)をジクロロメタン（40 ml）に溶解した。3-クロロプロピオニルクロリド（230 mg, 1.81 mmol）をジクロロメタン（10 ml）で希釈した後、反応液に1時間以上をかけて滴下した。滴下が終了した後、室温で攪拌し、3時間反応させた。次に、塩化ナトリウムの飽和水溶液（50 ml × 2）で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、減圧下で濃縮を行い、溶媒を蒸発させた。残渣にヘキサンを加え、均一に攪拌した。これを濾過し、白色固体の化合物17を得た（330 mg, 収率50.9%）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.85 (bs, 2 H), 6.58 (bs, 2 H), 3.81 (t, J = 6.4 Hz, 4 H), 3.66-3.53 (m, 24 H), 3.39-3.31 (m, 8 H), 2.64 (m, 4 H), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, 4 H), 1.81 (m, 2 H), 1.55-1.47 (m, 8 H)
【００４８】
化合物BPの調製
化合物12（0.1 g, 0.2 mmol）、化合物17（0.07 g, 0.1 mmol）及びトリエチルアミン（42 μl，0.3 mmol）を10 ml のテトラヒドロフランに加え、還流するまで昇温し、24時間反応させた。、溶媒を蒸発させ、分取HPLCで黄色粉末状の固体、即ち化合物BPを得た（63 mg, 収率37.5%）。
ESI-MS m/z : 1681.8 [M+H]+；
1H NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.48(dd, J=1.6, 4.4Hz, 2H), 8.03(dd, J=1.6, 9.6Hz,2H), 7.99 (s, 2H), 8.97 (d, J=1.6, 4H), 7.82(d, J=8Hz, 2H), 7.71(dd, J=1.6, 8Hz,2H),  7.48(d, J=8.8Hz, 2H), 7.31(d, J=8.8Hz, 2H), 7.15(dd, J=4.4, 9.6Hz , 2H), 3.66-3.44 (m, 44 H), 3.34 (s, 4H), 3.28 (t, J=6.8Hz, 4H), 3.22 (t, J=6.8Hz, 4H),2.78 (t, J=6.8Hz, 4 H), 2.26 (s, 6 H), 2.22 (t, J = 7.2 Hz, 4 H), 1.87-1.70 (m,10 H)
【実施例３】
【００４９】
本発明の化合物BDBの調製
合成経路は以下の通りである。
2017511348.tif 000020
2017511348.tif 000021
【００５０】
具体的な合成手順は以下の通りである。
【００５１】
化合物2bの調製
化合物1b（10 g, 45.5 mmol、メーカー：Sigma-Aldrich）を500 mlのDCMに溶解した。室温で(Boc)2O（9.4 g, 43.18 mmol）を100 mlのDCMに溶解し、反応フラスコの中にゆっくり滴下し、終夜反応させた。この反応液に水200 mlを加え、pHを3〜4に調整した後、有機層中の不純物を抽出した。水層のpHを10に調整し、塩化ナトリウムを加え、飽和させ、生成物を抽出した。塩化ナトリウムの飽和水溶液（10 ml × 6）で有機層を洗浄し、未反応の原料を除去した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ、無色の油状物、即ち化合物2bを得た（4.7 g，収率34.1%）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.11 (bs, 1 H), 3.63-3.45 (m, 12 H), 3.21 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 2.81 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 1.77-1.42 (m, 6 H), 1.42 (s, 9 H)
【００５２】
化合物3bの調製
室温で化合物2b（2.7 g, 8.42 mmol）及びトリエチルアミン（1.5 g, 14.85 mmol）をジクロロメタン（100 ml）に溶解した。グルタリルクロライド（0.7 g, 4.17 mmol）をジクロロメタン（20 ml）に溶解し、これを反応液に1時間以上をかけて滴下した。滴下が終了した後、室温で攪拌し、3時間反応させた。次に、塩化ナトリウムの飽和水溶液（100 ml × 2）で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、真空下で濃縮を行い、溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール = 20/1）で精製し、無色の油状物、即ち化合物3bを得た（3.1 g, 収率100%）。
ESI-MS m/z : 737.4 [M+H]+；
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.55 (bs, 2 H), 5.06 (bs, 2 H), 3.63-3.49 (m, 24 H), 3.34 (m, 4 H), 3.20 (m, 4 H), 2.22 (t, J = 7.2 Hz, 4 H), 1.93 (m, 2 H), 1.78-1.70 (m, 8 H), 1.41 (s, 18 H)
【００５３】
化合物4bの調製
化合物3b（2.8 g, 3.80 mmol）をHCl/酢酸エチル（2 M, 100 ml）に入れ、室温で攪拌し、3時間反応した。真空下で濃縮を行い、溶媒を蒸発し、無色油状の液体、即ち化合物4bを得た（2.6 g, 収率は約100％）。これをさらに精製せず、次のステップの反応に直接に用いた。
【００５４】
化合物5bの調製
室温で、化合物4b（484 mg, 0.90 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA)(800 mg, 6.15 mmol)をジクロロメタン（40 ml）に溶解した。3-クロロプロピオニルクロリド（230 mg, 1.81 mmol）をジクロロメタン（10 ml）に溶解し、1時間以上をかけて反応液に滴下した。滴下が終了した後、室温で攪拌し、3時間反応させた。次に、塩化ナトリウムの飽和水溶液（50 ml × 2）で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、減圧下で濃縮を行い、溶媒を蒸発させた。残渣にヘキサンを加え、均一に攪拌した。これを濾過し、白色固体の化合物5bを得た（330 mg, 収率50.9%）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.85 (bs, 2 H), 6.58 (bs, 2 H), 3.81 (t, J = 6.4 Hz, 4 H), 3.66-3.53 (m, 24 H), 3.39-3.31 (m, 8 H), 2.64 (m, 4 H), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, 4 H), 1.81 (m, 2 H), 1.55-1.47 (m, 8 H)
【００５５】
化合物6bの調製
化合物5b（100 mg, 0.14 mmol）、ピペラジン-1-カルボキシレート(500 mg, 2.68 mmol)、
ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA)（100 mg, 0.77 mmol）及びジオキサン（20 ml）を丸底フラスコに入れた。これを加熱し、還流下で18時間反応させた。次に、反応液を室温まで冷却し、減圧下で溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解した。塩化ナトリウムの飽和水溶液で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、減圧下で濃縮を行い、溶媒を蒸発させ。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール = 10/1）で精製し、無色の油状液体、即ち化合物6bを得た（50 mg, 収率35.2%）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.98 (bs, 2 H), 7.07 (bs, 2 H), 3.66-3.53 (m, 24 H), 3.46 (m, 8 H), 3.36-3.31 (m, 8 H), 2.71 (m, 4 H), 2.47 (m, 12 H), 2.27 (t, J = 6.8 Hz, 4 H), 1.95 (m, 2 H), 1.79-1.75 (m, 8 H), 1.45 (s, 18 H)
【００５６】
化合物7bの調製
化合物6b（100 mg, 0.10 mmol）をHCl/酢酸エチル（2 M, 20 ml）に入れ、室温で撹拌し、2時間反応させた。次に、真空下で濃縮を行い、溶媒を蒸発させ、無色の油状液体、即ち化合物7bを得た（100 mg, 収率は約100％）。
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 3.62 (m, 30H), 3.53 (m, 14H), 3.21 (q, J=7,2Hz, 8H), 2.77(t, J=6.8Hz, 4H), 2.21(t, J=7.6Hz, 4H), 1.82 (m, 2H), 1.74 (m, 8H)
【００５７】
化合物9bの調製
クロロギ酸エチル（4.5 ml, 46.5 mmol）をテトラヒドロフラン（100 ml）に溶解し、氷浴の中で冷却した。化合物8b（10 g, 44.5 mmol）及びジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（46 ml, 264 mmol）をテトラヒドロフラン（250 ml）に溶解し、0~5℃で反応液にゆっくり滴下した。滴下が終了した後、室温まで自然に昇温し、攪拌して、16時間反応させた。次に、真空下で反応液を濃縮し、溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、水で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、真空下で溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル = 1:3）で精製し、白色固体の化合物9bを得た（8.0 g, 収率60.7%）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.72(s, 2H), 4.40 (q, J=7.2Hz, 2H), 4.12 (d, J=7.2Hz, 2H), 1.53(s, 9H), 1.40(t, J=6.8Hz, 3H)
【００５８】
化合物11bの調製
化合物9b（200 mg, 0.67 mmol）及びジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（103 mg, 0.8 mmol）をジクロロメタン（25 ml）に溶解し、氷水で冷却した。4-（クロロメチル）ベンゾイルクロライド（化合物10）（151 mg, 0.8 mmol）をジクロロメタン（25 ml）に溶解し、0~5℃で反応液に滴下した。滴下が終了した後、室温まで自然に昇温し、攪拌して16時間反応させた。真空下で反応液の溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、水で有機層を洗浄した。硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、減圧下で溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル = 1:2）で精製し、黄色固体の化合物11bを得た（220 mg, 収率73%）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.98(d, J=8.4Hz, 2H). 7.60(d, J=7.6Hz, 2H). 4.74(s, 2H), 4.69(s, 4H), 4.50 (q, J=7.2Hz, 2H), 1.55(s, 9H), 1.45(t, J=7.2Hz, 3H)
【００５９】
化合物12bの調製
化合物11b（200 mg, 0.445 mmol）をHCl/酢酸エチル（2 M, 20 ml）に入れ、室温で攪拌し、2時間反応した。真空下で濃縮し、溶媒を蒸発させ、白色固体の化合物12bを得た（172 mg, 収率は約100％）。これをさらに精製せず、次のステップの反応に直接に用いた。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.98(d, J=8.0Hz, 2H), 7.60(d, J=8.0Hz, 2H), 4.74 (s, 2H), 4.71(s, 4H), 4.52 (q, J=7.2Hz, 2H), 1.46(t, J=7.2Hz, 3H)
【００６０】
化合物14bの調製
室温で化合物12b（153 mg, 0.445 mmol）、化合物13b（74 mg, 0.445 mmol）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDCI）（91 mg, 0.534 mmol）及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（72 mg, 0.534 mmol）をジクロロメタン（25 ml）に溶解し、反応液にジイソプロピルエチルアミン（DIPEA)（115 mg, 0.89 mmol）をゆっくり滴下した。滴下が終了した後、攪拌し、16時間反応させた。次に、反応液に水を加えて希釈した。ジクロロメタン（100 ml × 2）で水層を抽出し、有機層を合わせた。塩化ナトリウムの飽和水溶液で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、減圧下で溶媒を蒸発した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル = 1:1)で精製し、黄色固体の化合物14bを得た（100 mg, 収率45%）。
1H NMR (400 MHz，CD3OD) δ 7.96(d, J=8.0Hz, 2H), 7.59(d, J=8.0Hz, 2H), 7.37~7.48(m, 4H), 5.13(s, 1H), 4.69~4.79(m, 6H), 4.50 (q, J=7.2Hz, 2H),  3.44(s, 3H), 1.46(t, J=7.2Hz, 3H)
【００６１】
化合物BDBの調製
化合物7b（327 mg, 0.4 mmol）、化合物14b（500 mg, 1 mmol）、K2CO3 （664 mg, 4.8 mmol）及びN、N-ジメチルホルムアミド（50 ml）を丸底フラスコに入れ、60℃で攪拌し、5時間反応させた。反応液を室温まで冷却した後、反応液を200 mlの水に注ぎ入れ、水層を酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせた。塩化ナトリウムの飽和水溶液で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、減圧下で溶媒を蒸発し、淡い黄色の油状液体、即ち、化合物BDBを得た（522 mg, 収率81%）。
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.77(d, J=7.2Hz, 2H), 7.68(d, J=8Hz, 2H), 7.47(d, J=7.2Hz, 2H), 7.43(d, J=7.6Hz, 2H), 7.35(bs, J=7.2Hz, 10H), 5.01 (s, 1H), 4.98 (s ,1H, s)， 4.38 (s, 4H)，3.54~3.42 (m, 44H), 3.27~3.26 (bs, 6H), 3.11(t, J=6.8Hz, 4H), 3.04 (t, J=6.8Hz, 4H), 2.66 (bs, 4H), 2.05 (m, 4H), 1.75~1.54 (m, 10 H)
【００６２】
以下、試験例を通じて本発明の効果を具体的に説明する。
【試験例１】
【００６３】
本発明の化合物BGCの薬効
１．チロシンキナーゼに対する阻害作用
参考資料：Amy Card et al., Journal of Biomolecular Screening 14 (1) 2009; Jude Dunne et al., Assay & Drug Development Technologies  Vol. 2, No. 2, 2004
移動度シフトアッセイ法を用いて、本発明の化合物BGCによるin-vitroキナーゼAblのスクリーニングを行った。三倍希釈法に従って化合物BGCを100%DMSOで100 μMから0.005 μMまでの濃度に希釈し、合計10ポイントの濃度レベルを調製し、測定を行った（n＝2ウェル）。スタウロスポリンを標準対照とし、溶媒対照（10%DMSO）及び陰性対照（EDTA）を設けた。
384ウェルの反応プレートを用いた酵素免疫測定法で、化合物BGCの各濃度でのキナーゼAblに対する阻害作用を測定した。ノギスから変換率のデータを読み取り、変換率を阻害率に換算した。
Percent inhibition = (max-conversion)/(max-min)*100。ここで、maxはDMSO対照の変換率を表し、minは酵素活性のない対照の変換率を表す。各濃度における阻害率から化合物BGCのチロシンキナーゼAblに対する半数阻害濃度IC50を計算した。
阻害作用の結果は以下の通りであった。
化合物BGCのIC50：0.02 μM
試験結果により、本発明の化合物BGCがc-Ablチロシンキナーゼに強い阻害作用を有することが示された。
【００６４】
２．本発明の化合物BGCのKBM5（Bcr-Abl陽性）腫瘍細胞のin-vitro増殖に対する阻害に関する試験
ATP法を用いて本発明のBGC系列化合物の細胞毒性を測定した。KBM5細胞を適切な細胞密度に調整し、96ウェルプレートの各ウェルに140 μlの細胞懸濁液を接種した。各ウェルあたりの細胞の接種密度は2000〜6000個であった。前記細胞培養プレートをインキュベーター中に24時間放置し、細胞をウェル壁に完全に付着させた。三倍希釈法で本発明の化合物BGCを適切な様々な濃度にそれぞれ調製し、予め細胞接種された96ウェルプレートの適切なウェルに入れた。各ウェルには10 μLを添加し、BGCの最終濃度はそれぞれ100 μM、33.3 μM、11.1 μM、3.70 μM、1.23 μM、0.41 μM、0.14 μM、0.046 μM、0.015 μMとなった。各濃度においてそれぞれn=3ウェルで実施し、37℃のインキュベーター中で72時間インキュベーションを行った後、ATP法を用いて各ウェルにおける細胞増殖の程度を測定し、各濃度における薬物のKBM5細胞増殖に対する半数致死濃度IC50を計算した。
試験の結果：
化合物BGCのKBM5（ヒト野生型Bcr-Abl）腫瘍細胞に対する細胞毒性は以下の通りであった。
化合物BGCのIC50：9 μM
試験結果により、本発明の化合物BGCはin-vitro細胞レベルにおいて強い阻害作用を有することが示された。
【００６５】
３．本発明の化合物BGCの、in vivoにおける白血病の皮下異種移植での増殖に対する阻害に関する試験
In-vitroにおける増殖に対する阻害に関する試験の結果に基づき、BGCのC57BL/6(Es-1c)マウスにヒト白血病KBM5細胞を皮下移植した場合の細胞増殖に対する阻害作用について検討した。
本発明の化合物BGCの投与量はそれぞれ80 mg/Kg、160 mg/Kg及び350 mg/Kgで、同時に陽性対照群（160 mg/Kgイマチニブ）及びコントロール対照群（生理食塩水）を設けた。担癌マウスについて群分けした後、一日一回投薬した。２週間連続投与した後、腫瘍の体積を計測した。
腫瘍の増速が阻害若しくは遅延されたか、又は腫瘍が治癒したかについて考察した。週に２回又は２日に１回、カリパスを用いて腫瘍の直径を測量した。腫瘍体積の計算式はV = 0.5a×b2、a及びbはそれぞれ腫瘍の長辺幅及び短辺幅を表す。
データ解析：T検定は２群間の比較に用い、一元配置分散分析は３群又は多群間の比較に用いた。F値に有意差がある場合には、分散分析を実施した後に多重比較を行うべきである。二元分散分析は併用投与群における潜在的な相互作用の解析に用いた。すべてのデータ解析にはSPSS 17.0を用いた。p < 0.05の場合に有意差ありと判断した。
試験の結果：本発明の化合物BGCの、KBM5細胞の皮下移植腫瘍モデルに対するin vivoでの薬効に関する研究結果を図１に示す。
皮下腫瘍のモデルでは、本発明の化合物BGCが抗腫瘍作用を有し、その投与量が350 mg/kgの場合の阻害作用が、イマチニブを160 mg/kg投与した場合の阻害作用と同等である。
【００６６】
４．本発明の化合物BGCの薬物動態に関する初期検討
C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）に本発明の化合物BGCを静脈内単回投与し、LC-MS/MSにより主要な組織及び血中における薬物濃度を測定し、被験薬のC57BL/6(Es-1c)マウス(雌)血中及び主要な組織中での分布の相違について検討した。イマチニブを対照薬とした。
実験方法及び操作過程は以下の通りである。C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）、体重18〜25 g，6〜8週齢を用い、その他、３匹のC57BL/6(Es-1c)マウス（雌）をコントロール試料の採取に用いた。分析用の標準検量線を作成した。静脈注射の投与量は1 mg/kgで、投与体積はいずれも5 mL/kgであった。静脈投与に用いる溶媒としてDMSO: Solutol HS15: Saline = 5:5:90, v/v/vを使用した。LC-MS/MS測定法を設定し、内部標準法で血中及び組織中の被験薬の濃度を測定した。定量範囲は1〜1000 ng/mLで、定量下限は約1 ng/mLであった。C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）に静脈投与した後、それぞれ0.25、2、8及び24時間後にマウスの尾静脈より全血を約20 μL採取し、抗凝固剤にはK2EDTAを用いた。体積比で３倍量の蒸留水を加えて希釈し、その血液試料を分析するまで-70℃で保存した。同時に、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、胃、小腸及び膵臓等の組織試料を採取し、生理食塩水で洗浄した。濾紙で水を拭き取り、秤量し、重量を記録した。その後、試料を分析するまで-70℃で保存した。秤量した臓器組織を解凍し、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、胃、小腸及び膵臓に３倍量のPBS緩衝液を加え、ビーズビーターでホモジナイズした。骨髄試料については、採取時に0.3 mLのPBS緩衝液でリンスした後、12000 rpmで５分間遠心分離し、その上澄み0.25 mLを除去し、残った細胞試料を150 mLのPBS緩衝液に入れ、ホモジナイズした。
データ解析：WinNonlin (Ver.6.2)のソフトウェアを用い、非コンパートメントモデルに従って薬物動態パラメーターを算出した。
実験結果より、本発明の化合物BGCの半減期（t1/2）は3.5時間であり、イマチニブの半減期（t1/2は1.5時間である。）より遥かに長いことが分かった。イマチニブと比べて、本発明の化合物BGCは静脈注射による薬物動態の特徴において顕著に優れている。
【試験例２】
【００６７】
本発明の化合物BPの薬効
【００６８】
１．チロシンキナーゼに対する阻害作用
参考資料：Amy Card et al., Journal of Biomolecular Screening 14 (1) 2009; Jude Dunne et al., Assay & Drug Development Technologies  Vol. 2, No. 2, 2004
移動度シフトアッセイ法を用いて、本発明の化合物BPによるin-vitroキナーゼAblのスクリーニングを行った。三倍希釈法に従って化合物BPを100%DMSOで100 μMから0.005 μMまでの濃度に希釈し、合計10ポイントの濃度レベルを調製し、測定を行った（n＝2ウェル）。スタウロスポリンを標準対照とし、溶媒対照（10%DMSO）及び陰性対照（EDTA）を設けた。
384ウェルの反応プレートを用いた酵素免疫測定法で化合物BPの各濃度でのキナーゼAblに対する阻害作用を測定した。ノギスから変換率のデータを読み取り、変換率を阻害率に換算した。
Percent inhibition = (max-conversion)/(max-min)*100。ここで、maxはDMSO対照の変換率を表し、minは酵素活性のない対照の変換率を表す。各濃度における阻害率から化合物BPのc-Ablチロシンキナーゼの酵素活性に対する半数阻害濃度IC50を計算した。
阻害作用の結果は以下の通りであった。
化合物BPのIC50：0.01 μM
試験結果により、本発明の化合物BPがc-Ablチロシンキナーゼには強い阻害作用を有することが示された。
【００６９】
２．本発明の化合物BPのKBM5（Bcr-Abl陽性）及びKBM5R（T315I突然変異株）腫瘍細胞のin-vitro増殖に対する阻害に関する試験
ATP法を用いて本発明のBP系列化合物の細胞毒性を測定した。KBM5及びKBM5R細胞を適切な細胞密度に調整し、96ウェルプレートの各ウェルに140 μlの細胞懸濁液を接種した。各ウェルあたりの細胞接種密度は2000〜6000個であった。前記細胞培養プレートをインキュベーター中に24時間放置し、細胞をウェル壁に完全に付着させた。三倍希釈法で本発明のBP系列化合物の各化合物を適切な様々な濃度にそれぞれ調製し、予め細胞接種された96ウェルプレートの適切なウェルに入れ、各ウェルには10 μLを添加した。BP系列化合物の最終濃度はそれぞれ100 μM、33.3 μM、11.1 μM、3.70 μM、1.23 μM、0.41 μM、0.14 μM、0.046 μM、0.015 μMとなった。各濃度においてそれぞれn=3ウェルで実施し、37℃のインキュベーターの中で72時間インキュベーションを行った後、ATP法を用いて各ウェルにおける細胞増殖の程度を測定し、各濃度における薬物のKBM5及びKBM5R細胞増殖に対する阻害率及び半数致死濃度(IC50)を計算した。
試験の結果：
化合物BPのKBM5（ヒト野生型Bcr-Abl）腫瘍細胞に対する細胞毒性は以下の通りであった。
化合物BPのIC50：2 μM
化合物BPのKBM5R（Bcr-AblT315I突然変異株）腫瘍細胞に対する細胞毒性は以下の通りであった。
化合物BPのIC50：5 μM
試験結果により、本発明の化合物BPはin-vitro細胞レベルにおいて強い阻害作用を有することが示された。
【００７０】
３．本発明の化合物BPの、in vivoにおける白血病の皮下異種移植での増殖に対する阻害に関する試験
In-vitroでの増殖に対する阻害に関する試験の結果に基づき、本発明のBP 系列化合物の中から、IC50値の最も小さい阻害剤を選び、C57BL/6(Es-1c)マウスにヒト白血病KBM5及びKBM5R細胞を皮下移植した場合の細胞増殖に対する阻害作用について検討した。
本発明の化合物BPの投与量はそれぞれ80 mg/Kg、160 mg/Kg及び350 mg/Kgで、同時に陽性対照群（160 mg/Kgイマチニブ）及びコントロール対照群（生理食塩水）を設けた。担癌マウスについて群分けした後、１日１回投薬した。連続２週間で腹腔注射による投薬を行った後、腫瘍の体積を計測した。
腫瘍の増殖が阻害若しくは遅延されたかどうか、又は腫瘍が治癒したかどうかについて考察した。週に２回又は２日に２回、カリパスを用いて腫瘍の直径を測量した。腫瘍体積の計算式はV = 0.5a×b2、a及びbはそれぞれ腫瘍の長辺幅及び短辺幅を表す。
データ解析：T検定は２群間の比較に用い、一元配置分散分析は３群又は多群間の比較に用いた。F値に有意差がある場合には、分散分析を実施した後に多重比較を行うべきである。二元分散分析は併用投与群における潜在的な相互作用の解析に用いた。すべてのデータ解析にはSPSS 17.0を用いた。p < 0.05の場合に有意差ありと判断した。
試験の結果：ヒト白血病KBM5(Bcr-Abl陽性)の皮下移植の腫瘍モデルでは、本発明の化合物BPが抗腫瘍作用を有し、その投与量が80 mg/kgの場合の阻害作用が、イマチニブを160 mg/kg投与した場合と同等であった。また、ヒト白血病KBM5R(Bcr-AblT315I突然変異株)の皮下移植の腫瘍モデルでは、本発明の化合物BPがKBM5の皮下移植腫瘍に対する阻害作用と同等な阻害作用を示した。一方、イマチニブの場合では明らかな阻害作用は認められなかった。
【００７１】
４．本発明の化合物BPの薬物動態に関する初期検討
C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）に本発明の化合物BPを静脈内単回投与し、LC-MS/MSによりその主要な組織及び血中における薬物濃度を測定し、被験薬のC57BL/6(Es-1c)マウス(雌)血中及び主要な組織中での分布の相違について検討した。イマチニブを対照薬とした。
実験方法及び操作過程は以下の通りである。C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）、体重18〜25 g，6〜8週齢を用い、その他、３匹のC57BL/6(Es-1c)マウス（雌）をコントロール試料の採取に用いた。分析用の標準検量線を作成した。静脈注射の投与量は1 mg/kgで、投与体積はいずれも5 mL/kgであった。静脈投与に用いる溶媒としてDMSO: Solutol HS15: Saline = 5:5:90, v/v/vを使用した。LC-MS/MS測定法を設定し、内部標準法で血中及び組織中の被験薬の濃度を測定した。定量範囲は1〜1000 ng/mLで、定量下限は約1 ng/mLであった。C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）に静脈注射により投薬した後、それぞれ0.25、2、8及び24時間後にマウスの尾静脈により全血を約20 μL採取し、抗凝固剤としてK2EDTAを用いた。体積比で３倍量の蒸留水を加えて希釈し、その血液試料を分析するまで-70℃で保存した。同時に、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、胃、小腸及び膵臓等の組織試料を採取し、生理食塩水で洗浄した。濾紙で水を拭き取り、秤量し、重量を記録した。その後、試料を分析するまで-70℃で保存した。秤量した臓器の組織を解凍し、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、胃、小腸及び膵臓に３倍量のPBS緩衝液を加え、ビーズビーターでホモジナイズした。骨髄試料については、採取時に0.3 mLのPBS緩衝液でリンスした後、12000 rpmで５分間遠心分離し、その上澄み0.25 mLを除去し、残った細胞試料を150 LのPBS緩衝液に入れ、ホモジナイズした。
データ解析：WinNonlin (Ver.6.2)のソフトウェアを用い、非コンパートメントモデルに従って薬物動態パラメーターを算出した。
実験結果により、本発明の化合物BPの半減期（t1/2）は3.5時間であり、イマチニブの半減期（t1/2は1.5時間である。）より遥かに長いことが分かった。イマチニブと比べて、本発明の化合物BPは、静脈注射による薬物動態の特徴において顕著に優れている。
【試験例３】
【００７２】
本発明の化合物BDBの薬効
【００７３】
１．チロシンキナーゼに対する阻害作用
参考資料：Amy Card et al., Journal of Biomolecular Screening 14 (1) 2009; Jude Dunne et al., Assay & Drug Development Technologies  Vol. 2, No. 2, 2004
移動度シフトアッセイ法を用いて、本発明の化合物BDBによるin-vitroキナーゼAblのスクリーニングを行った。三倍希釈法に従って化合物BDBを100% DMSOで100 μMから0.005 μMまでの濃度に希釈し、合計10ポイントの濃度レベルを調製し、測定を行った（n＝2ウェル）。スタウロスポリンを標準対照とし、溶媒対照（10%DMSO）及び陰性対照（EDTA）を設けた。
384ウェルの反応プレートを用いた酵素免疫測定法で、化合物BDBの各濃度でのキナーゼAblに対する阻害作用を測定した。ノギスから変換率のデータを読み取り、変換率を阻害率に換算した。
Percent inhibition = (max-conversion)/(max-min)*100。ここで、maxはDMSO対照の変換率を表し、minは酵素活性のない対照の変換率を表す。各濃度における阻害率から化合物BDBのc-Ablチロシンキナーゼの酵素活性に対する半数阻害濃度IC50を計算した。
阻害作用の結果は以下の通りであった。
化合物BDBのIC50：0.05 μM
試験結果により、本発明の化合物BDBがc-Ablチロシンキナーゼに強い阻害作用を有することが示された。
【００７４】
２．本発明の化合物BDBのKBM5（Bcr-Abl陽性）及びKBM5R（T315I突然変異株）腫瘍細胞のin-vitro増殖に対する阻害に関する試験
ATP法を用いて本発明のBDB系列化合物の細胞毒性を測定した。KBM5及びKBM5R細胞を適切な細胞密度に調整し、96ウェルプレートの各ウェルに140 μlの細胞懸濁液を接種し、各ウェルあたりの細胞の接種密度は2000〜6000個であった。前記細胞培養プレートをインキュベーターの中に24時間放置し、細胞をウェル壁に完全に付着させた。三倍希釈法で本発明のBDB系列化合物の各化合物を適切な様々な濃度にそれぞれ調製し、予め細胞接種された96ウェルプレートの適切なウェルに入れ、各ウェルには10 μLを添加し、BDB系列化合物の最終濃度はそれぞれ100 μM、33.3 μM、11.1 μM、3.70 μM、1.23 μM、0.41 μM、0.14 μM、0.046 μM、0.015 μMとなった。各濃度においてそれぞれn=3ウェルで実施し、37℃のインキュベーターの中で72時間インキュベーションを行った後、ATP法を用いて各ウェルにおける細胞増殖の度合いを測定し、各濃度における薬物のKBM5及びKBM5R細胞増殖に対する阻害率及び半数致死濃度(IC50)を計算した。
試験の結果：
化合物BDBのKBM5（ヒト野生型Bcr-Abl）腫瘍細胞に対する細胞毒性は以下の通りであった。
化合物BDBのIC50：7 μM
化合物BDBのKBM5R腫瘍細胞に対する細胞毒性は以下の通りであった。
化合物BDBのIC50：8.9 μM
試験結果により、本発明の化合物BDBはin-vitro細胞レベルにおいて強い阻害作用を有することが示された。
【００７５】
３．本発明の化合物BDBの、in vivoにおける白血病の皮下異種移植での増殖に対する阻害に関する試験
In-vitroでの増殖に対する阻害に関する試験の結果に基づき、本発明のBDB 系列化合物の中で、IC50値の最も小さい阻害剤を選び、C57BL/6(Es-1c)マウスにヒト白血病KBM5及びKBM5R細胞を皮下移植した場合の細胞増殖に対する阻害作用について検討した。
本発明の化合物BDBの投与量はそれぞれ80 mg/Kg、160 mg/Kg及び350 mg/Kgで、同時に陽性対照群（160 mg/Kgイマチニブ）及びコントロール対照群（生理食塩水）を設けた。担癌マウスについて群分けした後、１日１回投薬した。連続２週間で腹腔注射による投薬を行った後、腫瘍の体積を計測した。
腫瘍の増殖が阻害若しくは遅延されたかどうか、又は腫瘍が治癒したかどうかについて考察した。週に２回又は２日に２回、カリパスを用いて腫瘍の直径を測量した。腫瘍体積の計算式はV = 0.5a×b2、a及びbはそれぞれ腫瘍の長辺幅及び短辺幅を表す。
データ解析：T検定は２群間の比較に用い、一元配置分散分析は３群又は多群間の比較に用いた。F値に有意差がある場合には、分散分析を実施した後に多重比較を行うべきである。二元分散分析は併用投与群における潜在的な相互作用の解析に用いた。すべてのデータ解析にはSPSS 17.0を用いた。p < 0.05の場合に有意差ありと判断した。
試験の結果：ヒト白血病KBM5(Bcr-Abl陽性)の皮下移植の腫瘍モデルでは、本発明の化合物BDBが抗腫瘍作用を有し、その投与量が80 mg/kgの場合の阻害作用が、イマチニブを160 mg/kg投与した場合と同等であった。また、ヒト白血病KBM5R(Bcr-AblT315I突然変異株)の皮下移植の腫瘍モデルでは、本発明の化合物BDBがKBM5の皮下移植腫瘍に対する阻害作用と同等な阻害作用を示した。一方、イマチニブの場合では明らかな阻害作用は認められなかった。
【００７６】
４．本発明の化合物BDBの薬物動態に関する初期検討
C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）に本発明の化合物BDBを静脈内単回投与し、LC-MS/MSによりその主要な組織及び血中における薬物濃度を測定し、被験薬のC57BL/6(Es-1c)マウス(雌)血中及び主要な組織中での分布の相違について検討した。イマチニブを対照薬とした。
実験方法及び操作過程は以下の通りである。C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）、体重18〜25 g，6〜8週齢を用い、その他、３匹のC57BL/6(Es-1c)マウス（雌）をコントロール試料の採取に用いた。分析用の標準検量線を作成した。静脈注射の投与量は1 mg/kgで、投与体積はいずれも5 mL/kgであった。静脈投与に用いる溶媒としてDMSO: Solutol HS15: Saline = 5:5:90, v/v/vを使用した。LC-MS/MS測定法を設定し、内部標準法で血中及び組織中の被験薬の濃度を測定した。定量範囲は1〜1000 ng/mLで、定量下限は約1 ng/mLであった。C57BL/6(Es-1c)マウス（雌）に静脈投与した後、それぞれ0.25、2、8及び24時間後にマウスの尾静脈により全血を約20 μL採取し、抗凝固剤としてK2EDTAを用いた。体積比で３倍量の蒸留水を加えて希釈し、その血液試料を分析するまで-70℃で保存した。同時に、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、胃、小腸及び膵臓等の組織試料を採取し、生理食塩水で洗浄した。濾紙で水を拭き取り、秤量し、重さを記録した。その後、試料を分析するまで-70℃で保存した。秤量した臓器の組織を解凍し、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、胃、小腸及び膵臓に３倍量のPBS緩衝液を加え、ビーズビーターでホモジナイズした。骨髄試料については、採取時に0.3 mLのPBS緩衝液でリンスした後、12000 rpmで５分間遠心分離し、その上澄み0.25 mLを除去し、残った細胞試料を150 mLのPBS緩衝液に入れ、ホモジナイズした。
データ解析：WinNonlin (Ver.6.2)のソフトウェアを用い、非コンパートメントモデルに従って薬物動態パラメーターを算出した。
実験結果により、本発明の化合物BDBの半減期（t1/2）は3.8時間であり、イマチニブの半減期（t1/2は1.5時間である。）より遥かに長いことが分かった。イマチニブと比べて、本発明の化合物BDBが静脈注射による薬物動態の特徴において顕著に優れている。
【００７７】
以上をまとめて、本発明が提供する化合物又はその薬学的に許容される塩は、Bcr-Abl二倍体の阻害剤としてチロシンキナーゼの活性を有効に阻害し、当該キナーゼの異常な活性化に関連する疾病の効果的治療に使用でき、悪性腫瘍に対し良好な治療効果を有している。当該阻害剤の調製方法は簡便であり、低コストであるため、その応用の見通しは良好である。
【図１】
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【国際調査報告】
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