(57)【要約】  本開示の実施形態は、サバイビン腫瘍抗原に特異的であって、「オンターゲット  オフ腫瘍（on-target off tumor）」傷害性の無い、遺伝子操作されたＴ細胞受容体に関する。特定の実施形態では、特定のアルファ鎖及びベータ鎖が、有効な抗腫瘍活性を有するが同胞殺し（fratricidal）効果がない、細胞療法のための遺伝子操作されたＴ細胞受容体に利用された。方法、組成物、及びキット本明細書において提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞を含む組成物であって、前記細胞が遺伝子操作されたサバイビン特異的Ｔ細胞受容体を含み、前記受容体が下記：
配列番号１を含む前記受容体のアルファ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体及び
配列番号２を含む前記受容体のベータ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体
の一方又は両方を含む組成物。
【請求項２】
前記免疫細胞がＴ細胞である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞がＴ細胞受容体ではない抗原認識部分を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原認識部分が、キメラ抗原受容体、エンゲージャー分子（engager molecule）、又は他のＴ細胞受容体である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原認識部分がサバイビンを認識する請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原認識部分がサバイビン以外の腫瘍抗原を認識する請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が個人にとって自己由来である請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞が個人にとって同種異系である請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
配列番号１の前記機能的断片が配列番号１の配列のＮ末端トランケーションをもつ請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記Ｎ末端トランケーションが、配列番号１のＮ末端からトランケートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸である請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
配列番号１の前記機能的断片が配列番号１の配列のＣ末端トランケーションをもつ請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｃ末端トランケーションが、配列番号１のＣ末端からトランケートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
配列番号１の前記機能的誘導体が、配列番号１に７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一である請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
配列番号２の前記機能的断片が配列番号２の配列のＮ末端トランケーションをもつ請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｎ末端トランケーションが、配列番号２のＮ末端からトランケートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
配列番号２の前記機能的断片が配列番号２の配列のＣ末端トランケーションをもつ請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｃ末端トランケーションが、配列番号２のＣ末端からトランケートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
配列番号２の前記機能的誘導体が、配列番号２と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一である請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
配列番号１の前記機能的断片が配列番号１の配列のＮ末端及びＣ末端トランケーションをもつ請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
配列番号２の前記機能的断片が配列番号２の配列のＮ末端及びＣ末端トランケーションをもつ請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞が自殺遺伝子産物を発現する請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記受容体がＨＬＡ−Ａ２拘束性である請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記受容体が配列番号１５を含むエピトープ又はその機能的断片若しくは誘導体、配列番号１６を含むエピトープ又はその機能的断片若しくは誘導体からなる群より選択されるエピトープ、又は両者を認識する請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
配列番号１５を含む前記エピトープの前記機能的断片又は誘導体が、配列番号１５に７０、７５、７７、８０、８５、８８、９０、９１、９１、９５、９７、又は９９％同一である請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
配列番号１６を含む前記エピトープの前記機能的断片又は誘導体が、配列番号１６に７０、７５、７７、８０、８５、８８、９０、９１、９１、９５、９７、又は９９％同一である請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記エピトープが配列番号１５に関してＮ末端の伸長又はトランケーションを含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記Ｎ末端及び／又はＣ末端の伸長が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のアミノ酸である請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記Ｎ末端及び／又はＣ末端のトランケーションが、１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸である請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記エピトープが配列番号１６に関してＮ末端の伸長又はトランケーションを含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記Ｎ末端及び／又はＣ末端の伸長が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のアミノ酸である請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記Ｎ末端及び／又はＣ末端のトランケーションが、１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸である請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
それを必要としている個人に細胞療法を提供する方法であって、治療有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の前記組成物を前記個人に提供する工程を含む方法。
【請求項３３】
前記個人がサバイビン陽性がんをもつ請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記サバイビン陽性がんが、白血病、骨髄腫、乳がん、肺がん、結腸がん、黒色腫、リンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、中枢神経系がん、又は腎がんである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
さらなるがん療法を前記個人に提供する工程をさらに含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記さらなるがん療法が、化学療法、免疫療法、放射線、手術、又はホルモン療法である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
配列番号１、配列番号２、配列番号１及び配列番号２の組み合わせ、又は配列番号３のアミノ酸配列を発現するポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターである請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３７〜３８のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の前記組成物、請求項３７〜３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３９に記載の細胞、又はそれら組み合わせを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／０７３，０７６号に基づく優先権を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
合衆国政府の助成による研究または開発に関する陳述
【０００２】
本発明は、米国国立がん研究所から受けたＲ０１  ＣＡ１３１０２７及びＰ５０  ＣＡ１２６７５２のもと政府の支援によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本開示の実施形態は、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、がん医学を含む医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子組換えαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いたがん標的養子Ｔ細胞療法は一部の患者で有望な反応をもたらした（Morgan, et al., 2006; Johnson, et al., 2009; Robbins, et al., 2011）。この方法をより多くの悪性腫瘍に広めるには、より幅広く発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的にすることが必要となる。しかし、大部分のＴＡＡは排他的に腫瘍特異的ではな、正常成人組織にも低いレベルで発現しており、それらの重要な抗原をＴＣＲによって標的にすることには課題がある。ＴＣＲが腫瘍細胞に対して正常細胞に提示されたＴＡＡのレベルを識別できない場合、例えば、抗原が同程度に発現している場合又はＴＣＲが低レベルの標的ＴＡＡエピトープを認識するだけでなく、正常細胞に発現された交差反応性のエピトープも認識する場合などに、「オンターゲット  オフ腫瘍（On-target off-tumor）」傷害性が生じることがある。そのような混合標的認識はその後のＴ細胞活性化につながることがあり、所望のＴＡＡを安全に標的にすることが起きないようにすると思われる傷害性がもたらされる。この推定メカニズムを特徴付けるのに、ＴＡＡサバイビンがモデルとして使用された。サバイビンは、がんにおけるその遍在的な過剰表現並びに腫瘍細胞の表現型及び機能の維持におけるその重要な役割から、免疫療法の開発のための標的として米国国立がん研究所によって高い優先順位を付けられた（Chever, et al., 2009）。さらに、それまでの研究の説得力のある結果から、サバイビンが抗原閾値感度及び分子識別の問題を研究するのに優れたモデル抗原であることが示唆された。サバイビン由来ペプチドを用いた自家ワクチン接種は安全であり（Rapoport, et al., 2011）且つサバイビン特異的Ｔ細胞前駆体を誘導するのに効果的であること（Becker, et al., 2012）が証明されているが、客観的な臨床反応は依然として限られている（Becker, et al., 2012）。逆に、胸腺選択を回避するアロ拘束性ＴＣＲレパトアから単離された、トランスジェニックサバイビン特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞は、抗腫瘍活性を生じるだけではなく、活性化されたＴ細胞に対する強い「同胞殺し（fratricidal）」効果又は傷害性も生じるので、腫瘍と自己が識別不能であった（Leisegang, et al., 2010）。サバイビンｍＲＮＡが活性化されたＴリンパ球で増加していることが判明したので、この細胞傷害性効果は「オンターゲット  オフ腫瘍」と考えられた（Leisegang, et al., 2010）。
【０００５】
しかし、自己／交差反応性の高いＴ細胞クローンは既に胸腺選択を経ており、生存Ｔ細胞は健康な細胞及び組織に存在する抗原閾値に対して「寛容な」ＴＣＲを発現するはずであるので、自己ＴＣＲレパトアからの選択は、高いアフィニティー及び自己対腫瘍識別が可能な選択性をもつサバイビン特異的クローンを同定できるはずと考えられた。この方法は、ヒト胸腺選択が無い同種異系又は異種レパトアからＴ細胞応答をプライミングすること（Spranger, et al., 2012）又は高いアビディティー若しくは超生理的なアビディティーをもつＴＣＲの生体外（ex vivo）生成（Li, et al., 2005）を目的とするＴＣＲを組換え操作する他のアプローチとは際立って対照的である。しかしこれらの方法は、健康な組織によって発現されうる全く関連の無いタンパク質由来のエピトープを標的にする無認識交差反応性に起因して強い傷害性を生じてきた（Cameron, et al., 2013; Linette, et al., 2013）。本明細書で記載されるのは、抗腫瘍活性を有するが「同胞殺し」効果又は正常造血幹細胞／前駆細胞に対する傷害性が無いサバイビン特異的ＴＣＲを自己培養から成功裡にクローニングすることである。同種異系ＴＣＲレパトアと対比して、自己ＴＣＲレパトアから単離されたＴＣＲの分子認識におけるこの顕著な違いの基本メカニズムを理解するために、サバイビンＴＣＲのアラニン置換分析を行った。観察結果は他のＴＡＡを標的にする一連のさらなるＴＣＲについて検証された。これらの研究から、選択的ＴＣＲ分子認識を支配する決定因子に関する非常に重要な理解が得られる。
【０００６】
本開示は、サバイビンを発現する非がん細胞を含む他の細胞に対する傷害性が無いサバイビン特異的がん免疫療法を提供することによって当該技術分野におけるニーズを満たす。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の実施形態は、細胞療法のための方法及び組成物を包含する。特定の実施形態では、細胞療法は特定の受容体をもつ改変された細胞を含む。具体的な実施形態では、細胞は免疫細胞であり、例えば、そのなかに特定のアミノ酸配列を含む特定の受容体をもつＴ細胞である免疫細胞を含む。ある態様では、組成物は、選択的抗腫瘍活性をもたらす特定のアルファ鎖及びベータ鎖を含む改変されたＴ細胞受容体をもつ細胞を有している。具体的な実施形態では、細胞は、配列番号１を含む前記受容体のアルファ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体及び配列番号２を含む前記受容体のベータ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体の一方又は両方を含む。
【０００８】
第１の態様では、サバイビンを対象にし、「オンターゲット  オフ腫瘍」選択性に特異的な遺伝子組換え免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞、又はＮＫＴ細胞が本明細書において提供される。具体的な実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞はＴ細胞である。具体的な実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、がん細胞のサバイビン発現のレベルに対して感度が高いが、非がん細胞のサバイビンの発現のレベル（又は少なくともがん細胞と比較して低い、非がん細胞のサバイビンのレベル）に対してはそうではない受容体を含む。具体的な実施形態では、ＴＣＲが、がん細胞上のサバイビン−ＭＨＣ複合体に結合したとき、免疫細胞はがん細胞を殺傷する。ある実施形態では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、配列番号１及び配列番号２又はその機能的断片若しくは誘導体の一方又は両方を含むＴＣＲを含む。サバイビンを発現するがんを標的にするように改変されうる本開示の細胞には、少なくともＴ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれることがある）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、又はエフェクター免疫応答の誘導能をもつ他のいずれの細胞要素が含まれる。特定の場合では、細胞はサバイビン特異的ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを内部にもつ。
【０００９】
別の態様では、本明細書において記載されるサバイビン特異的ＴＣＲポリペプチドのいずれかが本明細書において提供される。また、そのようなＴＣＲをコードするポリヌクレオチドも提供される。本発明の実施形態では、ポリヌクレオチドは、サバイビン特異的ＴＣＲ、特に、特有のアルファ及び／又はベータ鎖をもつものをコードする配列を含んでいる。本発明の実施形態では、ポリヌクレオチドは、サバイビン特異的ＴＣＲをコードする配列を含んでいる。
【００１０】
本開示のいずれのポリヌクレオチドも、発現ベクターに含まれうる。例えば、レトロウィルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベクターであるものがある。具体的な実施形態では、ベクターは非ウィルスベクターであり、例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ又はピギーバック及びｍＲＮＡエレクトロポーレーションなどの非ウィルスベクター媒介遺伝子導入がある。本開示の実施形態では、細胞は本開示のいずれの発現ベクターの少なくとも１つを含んでいる。細胞は真核細胞又は原核細胞でありうる。細胞は免疫系細胞でありうる。細胞は例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞でありうる。
【００１１】
実施形態では、がんはいずれの種類でも、いずれのステージでもありうる。がんをもつ個人はいずれの年齢でも、いずれの性別でもありうる。具体的な実施形態では、個人はがんに罹患していることを知られているか、がんに罹患するリスクがあるか、又はがんに罹患している疑いがある。がんは原発がんであってもよく、転移がんであってもよい。がんは他のモダリティー、例えば、化学療法、放射線などを用いた治療に不応であってもよい。具体的な実施形態では、がんは、血液がん（急性および慢性白血病、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、並びに多発性骨髄腫を含む血液及び（骨髄などの）造血組織のがん）又は非血液がんである。特定の実施形態では、非血液がんは、脳、皮膚、肺、乳房、前立腺、結腸、膵臓、甲状腺、骨、腎臓、脾臓、肝臓、胆嚢、膀胱、直腸、子宮内膜、卵巣、精巣、子宮頸などのがんである。
【００１２】
本開示のある実施形態では、本開示は、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球などの治療免疫系細胞を含む治療細胞に関する方法及び組成物に関する。細胞はエフェクター免疫応答の誘導能をもつ細胞要素を含んでもよい。ある態様では、細胞は特定の腫瘍抗原を標的にする非内在性分子を少なくとも１つ発現し、少なくともいくつかの場合、分子はＴＣＲを含む。
【００１３】
本開示の実施形態では、個人をがん治療する方法は、複数の本発明のいずれかの細胞の治療有効量を提供する工程を含んでいる。がんは１つ以上の腫瘍を含みうる。
【００１４】
本開示の実施形態では、キットは、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチド、少なくとも１つの本発明の発現ベクター、及び／又は少なくとも１つの本発明の細胞または複数の本発明の細胞を含んでいる。
【００１５】
本開示の実施形態は、がんを標的にするがＴ細胞を標的にしないサバイビン特異的Ｔ細胞受容体を提供する。エピトープ特異性、サバイビン発現がんに対する抗腫瘍活性を備え、自己反応性がないＴ細胞受容体が本明細書において開示される。
【００１６】
ある実施形態では、組成物は免疫細胞を含んでおり、前記細胞は遺伝子操作されたサバイビン特異的Ｔ細胞受容体を含み、該受容体は以下の一方又は両方を含む：配列番号１を含む前記受容体のアルファ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体及び配列番号２を含む前記受容体のベータ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体。具体的な実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞受容体ではない抗原認識部分を含む。具体的な実施形態では、抗原認識部分はキメラ抗原受容体、エンゲージャー分子（engager molecule）、又は他のＴ細胞受容体である。特定の実施形態では、抗原認識部分はサバイビン又はサバイビン以外の腫瘍抗原を認識する。細胞は個人にとって同種異系であってよいが、場合によっては、細胞は個人にとって自己である。具体的な実施形態では、配列番号１の機能的断片は配列番号１の配列のＮ末端トランケーションをもつ。いくつかの場合では、Ｎ末端トランケーションは、配列番号１のＮ末端からトランケートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸である。ある特定の場合では、配列番号１の機能的断片は配列番号１の配列のＣ末端トランケーションをもつ。具体的な実施形態では、Ｃ末端トランケーションは、配列番号１のＣ末端からトランケートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸である。具体的な実施形態では、配列番号１の機能的誘導体が配列番号１に７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であることを規定する。ある実施形態では、配列番号２の機能的断片は配列番号２の配列のＮ末端トランケーションをもつ。具体的な実施形態では、Ｎ末端トランケーションは、配列番号２のＮ末端からトランケートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸のアミノ酸である。特定の実施形態では、配列番号２の機能的断片は配列番号２の配列のＣ末端トランケーションをもつ。具体的な実施形態では、Ｃ末端トランケーションは、配列番号２のＣ末端からトランケートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸である。特定の実施形態では、配列番号２の機能的誘導体は配列番号２に７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一である。特定の実施形態では、配列番号１の機能的断片は配列番号１の配列のＮ末端及びＣ末端トランケーションをもつ。いくつかの場合では、配列番号２の機能的断片は配列番号２の配列のＮ末端及びＣ末端トランケーションをもつ。
【００１７】
組成物の特定の実施形態では、細胞は自殺遺伝子産物を発現する。具体的な実施形態では、受容体はＨＬＡ−Ａ２拘束性であり、受容体は、配列番号１５を含むエピトープ又はその機能的断片若しくは誘導体、配列番号１６を含むエピトープ又はその機能的断片若しくは誘導体、又は両方からなる群より選択されるエピトープを認識する。具体的な実施形態では、配列番号１５を含むエピトープの機能的断片又は誘導体は、配列番号１５に７０、７５、７７、８０、８５、８８、９０、９１、９１、９５、９７、又は９９％同一である。
【００１８】
ある実施形態では、配列番号１６を含むエピトープの機能的断片又は誘導体は、配列番号１６に７０、７５、７７、８０、８５、８８、９０、９１、９１、９５、９７、又は９９％同一である。具体的な実施形態では、エピトープは配列番号１５に関してＮ末端の伸長又はトランケーションを含む。具体的な実施形態では、Ｎ末端及び／又はＣ末端の伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のアミノ酸である。ある実施形態では、Ｎ末端及び／又はＣ末端のトランケーションは、１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸である。特定の実施形態では、エピトープは配列番号１６に関してＮ末端の伸長又はトランケーションを含む。ある実施形態では、Ｎ末端及び／又はＣ末端の伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のアミノ酸である。具体的な場合では、Ｎ末端及び／又はＣ末端のトランケーションは、１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸である。
【００１９】
１つの実施形態では、それを必要としている個人に細胞療法を提供する方法は、治療有効量の本明細書において企図される組成物のいずれかを個人に提供する工程を含んでいる。具体的な実施形態では、個人はサバイビン陽性がんをもつ。特定の実施形態では、サバイビン陽性がんは、白血病、骨髄腫、乳がん、肺がん、結腸がん、黒色腫、リンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、中枢神経系がん、又は腎がんである。具体的な実施形態では、方法はさらなるがん療法を個人に提供する工程をさらに含みうる。具体的な実施形態では、さらなるがん療法は、化学療法、免疫療法、放射線、手術、又はホルモン療法である。
【００２０】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号１及び配列番号２の組み合わせ、又は配列番号３のアミノ酸配列を発現する。具体的な実施形態では、ポリヌクレオチドは発現ベクターである。
【００２１】
ある実施形態では、細胞は本明細書において企図されるいずれかのポリヌクレオチドを含んでいる。
【００２２】
特定の実施形態では、キットは本明細書において企図されるいずれかの組成物、本明細書において企図されるいずれかのポリヌクレオチド、本明細書において企図される細胞、又はそれら組み合わせを含んでいる。
【００２３】
以下の本発明の詳細な記載がより良く理解されうるために、上記は本発明の特徴及び技術的利点をやや大まかに概説してきた。本発明のさらなる特徴及び利点は、本発明の請求項の主題を形成する本明細書において記載されることになる。開示された概念及び具体的な実施形態は、本発明の同一の目的を実施する他の構成を変更又は設計する基礎として容易に利用されうることが当業者によって理解されるべきである。そのような均等構成は、添付の請求項に記載の本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことが当業者によって理解されるべきである。本発明を特徴付ける新規の特徴は、さらなる目的及び利点とともに、その組織及び動作方法に両方に関して、添付図面と合わせて検討すれば以下の説明からより良く理解されるであろう。しかし、各図面は例示及び説明の目的でのみ提供され、本発明の制限を規定するのを意図しないことが明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】傷害性の非存在下で抗腫瘍効果をもつサバイビン特異的Ｔ細胞クローン。（Ａ）ＣＤ８及びＬＭＬ特異的四量体又は無関係の四量体を染色したサバイビン特異的Ｔ細胞クローンのＦＡＣＳ分析。（Ｂ）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価した、無関係クローンのＬＭＬペプチド（黒色のバー）に対するＴ細胞アビディティー、サバイビン特異的クローンのＬＭＬ（灰色のバー）又はＥＬＴペプチド（白色のバー）に対するＴ細胞アビディティー。スポット形成細胞（spot forming cell）（ＳＦＣ）／１０５個の細胞。３連の平均±ＳＤ。（Ｃ）５１Ｃｒ放出アッセイで評価した、ＬＭＬ（四角、実線）又はＥＬＴでパルスしたＴ２細胞（三角形、破線）に対するＴ細胞アビディティー。Ｅ：Ｔ比が１０：１での特異的溶解の、３連の平均±ＳＤを示す。（Ｄ）５１Ｃｒ放出アッセイによる、同一提供者由来の無関係（左パネル）及びサバイビン特異的（右パネル）クローンの、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋標的細胞株ＢＶ１７３及びＵ２６６並びにＨＬＡ−Ａ＊０２−サバイビン＋標的細胞株ＨＬ−６０に対する抗腫瘍活性。２回の実験のうち代表的な１つの３連の平均±ＳＤを示す。（Ｅ）２名のＣＭＬ急性転化患者及びＨＬＡ−Ａ＊０２＋正常提供者骨髄（ＢＭ）提供者由来のＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋初代白血病性芽球に対するサバイビン特異的クローン（白四角）及び無関係クローン（黒丸）のＣＦＵアッセイによる、抗白血病活性及び正常造血前駆体に対する傷害性の非存在。３回の独立した２連の実験の概要（平均±ＳＤ）を示す、＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＝０．００１。（Ｆ）サバイビン特異的（白四角、破線）及び無関係（黒丸、実線）クローンの超増殖（superexpansion）後の３週間の培養に対する増殖倍数として評価されたＴ細胞同胞殺しの非存在。
【００２５】
【図２】ポリクローナルＣＤ８＋Ｔ細胞によるトランスジェニックサバイビンＴＣＲの効率的な発現。（Ａ）レトロウィルスベクターのスキーム。（Ｂ）マウス定常β鎖（ｍＣβ）及びＬＭＬ四量体の染色により検出された形質導入効率。ＬＭＬでパルスしたａＡＰＣ（２回の週１回刺激）の存在下におけるＴ細胞増殖間のＬＭＬ四量体＋細胞の富化。形質導入直後（ＴＤ後）、及び１回の刺激後（Ｅｎｄ  Ｓ１）又は２回の刺激後（Ｅｎｄ  Ｓ２）の代表的なＦＡＣＳプロット（左）。右側のグラフは、４名の提供者の平均±ＳＤを示す。（Ｃ）週１回の抗原特異的刺激後のＬＭＬ四量体平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加。無関係の四量体（灰色）、ＴＤ（黒）、Ｅｎｄ  Ｓ１（青）、及びＥｎｄ  Ｓ２（赤）後のＬＭＬ四量体を染色する代表的なヒストグラム（左）。グラフ（右）は、４名の提供者の平均±ＳＤを示す。
【００２６】
【図３】異所的に発現したサバイビンＴＣＲは、インビトロで機能的且つ特異的であるが、同胞殺しではない。（Ａ〜Ｃ、Ｅ、Ｆ）記号は提供者１名当たり３連の平均を、水平バー（horizontal bars）は平均±ＳＤを表わす。（Ａ）非形質導入（ＮＴ、黒丸）及び形質導入（ＴＤ、白四角）Ｔ細胞によるＬＭＬ及びＥＬＴペプチドに応答したＩＦＮ−γの産生（ＥＬＩＳｐｏｔ）、ｎ＝５。（Ｂ）ＮＴ及びＴＤ  Ｔ細胞による、ＬＭＬでパルスしたＴ２細胞（５１Ｃｒ放出）の殺傷、Ｅ：Ｔが２０：１での％特異的溶解、ｎ＝３。（Ｃ）ＴＤ  Ｔ細胞（白四角）及びＮＴ  Ｔ細胞（黒四角、実線）による、ＨＬＡクラスＩ（点線）、ＨＬＡクラスＩＩブロッキング抗体（破線）で予めインキュベーション又は抗体（実線）の非存在下での、ＬＭＬでパルスしたＴ２細胞の殺傷のＨＬＡ拘束性の評価。２回の実験の代表的な１つ。（Ｄ）ＨＬＡ−Ａ＊０２＋（黒丸、実線）又はＨＬＡ−Ａ＊０２−（白四角、破線）提供者から生成された週１回の抗原特異的刺激でのトランスジェニックＴ細胞の増殖。平均±ＳＤ、ｎ＝７、ｐ＝ＮＳ。（Ｅ及びＦ）ＬＭＬ又はＥＬＴペプチドで積載された又は積載のない活性化ＨＬＡ−Ａ＊０２＋標的Ｔ細胞に対するＮＴ（黒丸）及びＴＤ  Ｔ細胞（白四角）の５１Ｃｒ放出アッセイ。（Ｅ）ＨＬＡ−Ａ＊０２−（ｎ＝７）又は（Ｆ）ＨＬＡ−Ａ＊０２＋提供者（ｎ＝７）に発現するサバイビンＴＣＲのＥ：Ｔが２０：１での％特異的溶解。
【００２７】
【図４】サバイビンＴＣＲリダイレクト（redirected）Ｔ細胞は、インビトロで抗腫瘍活性を有するが正常造血幹細胞／前駆細胞に対する傷害性が無い。（Ａ）サバイビンＴＣＲ＋ＴＤ（白四角）及びＮＴ対照Ｔ細胞（黒丸）による、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋がん細胞株ＢＶ１７３及びＵ２６６、並びにＨＬＡ−Ａ＊０２−サバイビン＋標的ＨＬ−６０及びＫ５６２に対する５１Ｃｒ放出アッセイ。記号：３連／提供者の平均、バー：特異的溶解（Ｅ：Ｔ  ２０：１）の平均±ＳＤ、ｎ＝１２名の提供者。＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＝０．００３。（Ｂ）ＢＶ１７３（左パネル、三角）又はＵ２６６（右パネル、丸）をＨＬＡクラスＩブロッキング抗体（点線）、ＨＬＡクラスＩＩブロッキング抗体（破線）とともに、又は抗体無し（ｎｏ  Ａｂ、実線）で予めインキュベーションすることによって評価した、ＴＣＲ＋ＴＤ（白色記号）及びＮＴ  Ｔ細胞（黒色記号）のＨＬＡ拘束性。２名の提供者のうち代表的な１名の３連の平均±ＳＤ。（Ｃ）ＢＶ１７３、Ｕ２６６、Ｋ５６２、及びＨＬ−６０細胞（Ｅ：Ｔ  ５：１）とともに培養したＴＣＲ＋ＴＤ（白四角）及びＮＴ（黒丸）Ｔ細胞の５日目の共培養における残存腫瘍細胞の定量。残存腫瘍細胞の平均±ＳＤ、ｎ＝６。＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＝０．０２。（Ｄ）ＥＬＩＳｐｏｔによる、ＢＶ１７３、Ｕ２６６、Ｋ５６２、及びＨＬ−６０細胞に対する、ＴＣＲ＋ＴＤ（白四角）及びＮＴ（黒丸）Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生。記号：提供者１名当たり３連の平均、バー：平均±ＳＤ  ｎ＝５。＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＝０．０１。（Ｅ、Ｆ、Ｇ）ＨＬＡ−Ａ＊０２＋ＣＭＬ急性転化（ｎ＝２）及びＡＭＬ（ｎ＝３）（Ｅ）、ＨＬＡ−Ａ＊０２−白血病性芽球（Ｆ）、及びＨＬＡ−Ａ＊０２＋健康な提供者由来骨髄（ＢＭ、ｎ＝１）又は臍帯血（ＣＢ、ｎ＝４）前駆体（Ｇ）に対するＴＣＲ＋ＴＤ（白四角）及びＮＴ（黒丸）Ｔ細胞による白血病性コロニー形成の評価。２連で播いた５名の提供者のＣＦＵの平均±ＳＤ。＊ｐ＜０．００１。
【００２８】
【図５】サバイビンＴＣＲリダイレクトＴ細胞は生体内抗白血病活性をもつ。（Ａ）実験計画。亜致死照射（１２０ｃＧｙ）後に、ＮＳＧマウスに３×１０６個のＢＶ１７３−ＦＦｌｕｃ細胞を静脈内投与した後、Ｔ細胞輸注、ＩＬ２、及び週１回の生物発光イメージング（ＢＬＩ）を１８日目から開始。（Ｂ）両処置群の代表的な個体マウスのＢＬＩの経時変化、目盛りは５ｘ１０４〜５ｘ１０５光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ。（Ｃ）マウス１頭当たりの平均光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ。ＢＬＩにより決定。対照Ｔ細胞（ＮＴ、ｎ＝９、黒丸）又はサバイビンＴＣＲ＋Ｔ細胞（ＴＤ、ｎ＝１０、白四角）で処置したマウスを比較。平均±ＳＤ、多重比較調製後、３２日目、＊ｐ＝０．０１及び３９日目、＊ｐ＝０．００９。また、強度信号は対数変換し、経時的応答プロファイルはロバスト一般化推定方程式法によって解析した（ｐ＜０．０００１）。２回の独立した実験のまとめ。（Ｄ）サバイビンＴＣＲ＋Ｔ細胞（ＴＤ）又は対照Ｔ細胞（ＮＴ）で処置したマウスのカプランマイヤー生存曲線（ｐ＜０．００１）。
【００２９】
【図６】サバイビンＴＣＲ＋Ｔ細胞は、白血病負荷（leukemia burden）の高いマウスの生存期間を延ばす。（Ａ）実験計画  亜致死照射（１２０ｃＧｙ）後に、３×１０６個のＢＶ１７３−ＦＦｌｕｃ細胞をＮＳＧマウスに静脈内投与。ＢＬＩで検知して、白血病が播種性で多臓器において確立された場合、Ｔ細胞が１４〜１７日後に輸注された。Ｔ細胞輸注、ＩＬ−２、及び週１回のＢＬＩ。（Ｂ）両処理群の代表的な個体マウスのＢＬＩの経時変化。目盛りは、１ｘ１０３〜１ｘ１０４光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ（０日目）、１ｘ１０５〜１ｘ１０６光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ（７〜２８日目）。（Ｃ）マウス１頭当たりの平均光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ。対照Ｔ細胞（ＮＴ、ｎ＝１６）又はサバイビンＴＣＲ＋Ｔ細胞（ＴＤ、ｎ＝１５）で治療したマウスを比較。平均±ＳＤ。また、強度信号は対数変換し、経時的応答プロファイルはロバスト一般化推定方程式法によって解析した（ｐ＝０．００６）。３回の独立した実験のまとめ。（Ｄ）サバイビンＴＣＲ＋Ｔ細胞（ＴＤ）又は対照Ｔ細胞（ＮＴ）（ｐ＝０．０１）で処置したマウスのカプランマイヤー生存曲線。
【００３０】
【図７】同種異系レパトア由来のサバイビンＴＣＲの同胞殺し活性。（Ａ〜Ｅ）ｓ２４−サバイビンＴＣＲ（ｓ２４−ＴＤ、白色のバー）、Ａ７２−サバイビンＴＣＲ（Ａ７２−ＴＤ、灰色のバー）、又はＮＴ対照Ｔ細胞（黒色のバー）で形質導入したＴＣＲ＋Ｔ細胞の比較。２〜４名の提供者の代表的な１名、３連の平均±ＳＤ。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２＋サバイビン＋（ＢＶ１７３、Ｕ２６６）及びＨＬＡ−Ａ２−サバイビン＋（ＨＬ−６０、Ｋ５６２）がん細胞株に対する５１Ｃｒ放出アッセイ。特異的溶解（Ｅ：Ｔ  ２０：１）について３連の平均±ＳＤ。（Ｂ）外来ペプチドの非存在下（−）又はＬＭＬ若しくはＥＬＴペプチドでパルスした、活性化されたＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋標的Ｔ細胞に対する５１Ｃｒ放出アッセイ。３連の％特異的溶解の平均±ＳＤ、Ｅ：Ｔ  ２０：１。（Ｃ）正常ＨＬＡ−Ａ２＋臍帯血提供者でのＣＦＵアッセイ。２連の平均、Ｅ：Ｔ  １０：１。ＩＦＮ−γ前処理又はＩＦＮ−γ前処理及びＬＭＬペプチドでパルスした、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋線維芽細胞（Ｄ）及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋心筋細胞株ＡＣ１０（Ｅ）に対する５１Ｃｒ放出アッセイ。％特異的溶解の平均±ＳＤ、４名の提供者のまとめ、Ｅ：Ｔ  ２０：１。
【００３１】
【図８】同種異系レパトア由来サバイビンＴＣＲに対した、自己レパトア由来サバイビンＴＣＲの異なる分子認識パターン。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによる、ペプチドでパルスしたＴ２細胞の認識についてｓ２４ＴＤ（白色のバー）又はＡ７２  ＴＤ（灰色のバー）Ｔ細胞を調べるアラニン置換分析。平均±ＳＤ、ｎ＝４の提供者。
【００３２】
【図９】トランスジェニックＴＣＲ発現はＨＬＡ−Ａ２＋及びＨＬＡ−Ａ２−提供者において同等である。２回の抗原特異的刺激後のＨＬＡ−Ａ＊０２＋（黒丸）及びＨＬＡ−Ａ＊０２−（白四角）健常成人提供者由来のサバイビンＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞を、形質導入効率及び四量体平均蛍光強度（ＭＦＩ）について比較した。（Ａ）ｍＣβ＋及びＬＭＬ四量体＋細胞のパーセント割合及び（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２＋及びＨＬＡ−Ａ２−形質導入Ｔ細胞におけるＬＭＬ四量体のＭＦＩ。平均±ＳＤ、ｎ＝５。
【００３３】
【図１０】共培養の代表的なＦＡＣＳ分析。対照Ｔ細胞（ＮＴ、上列top row）又はサバイビンＴＣＲ＋Ｔ細胞（ＴＤ、下列lower row）とＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋（ＢＶ１７３、Ｕ２６６）又はＨＬＡ−Ａ＊０２−サバイビン＋（ＨＬ−６０、Ｋ５６２）がん細胞株とのＥ：Ｔ比が５：１でのサイトカイン非存在下における共培養。第５日目のＦＡＣＳ分析は、ＣＤ３（Ｔ細胞）並びに腫瘍マーカーＣＤ１９（ＢＶ１７３）、ＣＤ１３８（Ｕ２６６）、ＣＤ３３（ＨＬ−６０及びＫ５６２）の染色を示す。８名の提供者の代表的な１つの実験を示す。
【００３４】
【図１１】共培養におけるＴＣＲ＋Ｔ細胞のサイトカイン産生。ＴＣＲ＋Ｔ細胞（ＴＤ、白色のバー）及び対照（ＮＴ、黒色のバー）によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＩＬ１０、ＩＬ４、及びＩＬ２の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を測定するために共培養から２４時間後に集めた上清のサイトメトリービーズアレイ（cytometric bead array）（ＣＢＡ）による分析。２名の提供者の代表的な１つの実験を示す。
【００３５】
【図１２】自己レパトア由来のＴＣＲは交差反応の可能性が低い。さまざまなＴＡＡを標的にする場合の、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによる、ペプチドでパルスしたＴ２細胞の認識に関する、トランスジェニックの自己ＴＣＲ（Ａ）及び同種異系ＴＣＲ（Ｂ）を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞のアラニン置換分析。３連の平均±ＳＤ、各ＴＣＲについて試験した２名の提供者のうち代表的な１名。
【００３６】
【図１３】線維芽細胞及び心筋細胞のＨＬＡ−Ａ２及びサバイビン発現。ＩＦＮ−γ処置の非存在（灰色線）又は存在（黒）下におけるＨＬＡ−Ａ２（表面）及びサバイビン（細胞内）についての線維芽細胞（Ａ）及び心筋細胞株ＡＣ１０（Ｂ）のＦＡＣＳ分析。アイソタイプ対照（黒線、影付き領域）。
【００３７】
【図１４】ＢＶ１７３マウスモデルにおける、Ａ７２−ＴＣＲ＋Ｔ細胞に対比したｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の生体内抗腫瘍活性。マウスにおけるｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞（ｎ＝１５）とＡ７２−ＴＣＲ＋Ｔ細胞（ｎ＝１０）との抗腫瘍活性をＢＬＩによって比較する図５（Ａ）と同じ実験計画。強度信号は対数変換し、経時的応答プロファイルはロバスト一般化推定方程式法によって解析した（ｐ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
長年の特許法の慣習にしたがって、「１（a）」及び「１（an）」という語は、請求項を含めて本明細書で含むこと（comprising）という語に合わせて用いられる場合、「１または複数」を意味する。本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上の本発明の構成要素、方法工程、及び／又は方法からなってもよく、又は本質的にそれらからなってもよい。本明細書に記載のいずれの方法又は組成物は、開示された本明細書実施形態に記載の他の方法又は組成物のいずれに対しても実行でき、それでもやはり本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を獲得できることが企図される。
【００３９】
サバイビンは、幅広く発現される腫瘍関連抗原であり、がん細胞において非常に重要な機能を発揮する。しかし、トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこの抗原を標的にする免疫療法は、同種異系ＨＬＡミスマッチＴＣＲレパトアから単離された高アビディティーサバイビン特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞において見られる「同胞殺し」活性が障害となってきた。本明細書において、自己ＴＣＲレパトアからもとにした場合、インビトロ及び生体内で抗腫瘍活性をもつ一方で同胞殺し傷害性がないＨＬＡ−Ａ２−拘束性サバイビン特異的ＴＣＲが単離できることが示されている。この選択的活性の基本機序を理解するために、アラニンスキャニングが行なわれ、自己ＴＣＲは、「同胞殺し」ＴＣＲに比べて、サバイビンペプチドとの相互作用がより特異的であることが明らかとなった。よって、最大限のペプチド認識がＴＣＲ選択性に肝要であり、不必要なオフターゲット（off-target）傷害性を軽減するのに非常に重要である可能性がある。この方法は、選択的抗腫瘍活性をもつと思われる他の共通腫瘍／自己抗原特異的ＴＣＲを同定及び選択するのにように適応されうる。
Ｉ．例示的なサバイビン特異的Ｔ細胞受容体
【００４０】
本開示は特定のアルファ鎖及びベータ鎖をもつＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関し、そのＴ細胞はサバイビン抗原に特異的である。特定の態様では、受容体は人の手によって遺伝子操作された受容体である。特定の実施形態では、受容体は遺伝子を組み換えて作られ、Ｔ細胞などの免疫細胞に発現する。受容体はがん細胞上のサバイビン抗原を認識することができ、具体的な実施形態では、受容体は非がん細胞上のサバイビン抗原を認識しないか、又はがん細胞と比較して低いレベルで該抗原を認識する。
【００４１】
具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１を含むアルファ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体を含む。具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号２を含むベータ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体を含む。具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１を含むアルファ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体及び配列番号２を含むベータ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体の両方を含む。
【００４２】
本開示の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、サバイビンの１つ以上のエピトープと結合する。エピトープはいずれの種類であってもよいが、具体的な実施形態では、エピトープは、配列番号１５若しくは配列番号１６又はその機能的断片を含むその断片を含み、それから成り、又は本質的にそれから成る。特定の実施形態では、本開示のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープは配列番号１５若しくは配列番号１６又はその断片、例えば、その機能的断片であるか、それに少なくとも７０、７５、７７、８０、８５、８８、９０、９１、９１、９５、９７、又は９９％同一である。エピトープは、配列番号１５又は配列番号１６に関してＮ末端及び／又はＣ末端の伸長又はトランケーションを有しうる。そのようなＮ末端及び／又はＣ末端の伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のアミノ酸でありうる。そのようなＮ末端及び／又はＣ末端のトランケーションは、１、２、３、４、又は５個以上のアミノ酸でありうる。本開示のＴＣＲは、配列番号１５又は配列番号１６と比較して特定の残基に１、２、３、４、又は５つ以上の変更があるサバイビンエピトープと結合できうる。具体的な実施形態では、配列番号１５のＬｅｕ４、Ｇｌｙ５、及び／又はＰｈｅ７は変更されないが、代替的な実施形態では、それらの１つ以上が変更される。
Ａ．タンパク質性組成物、一般
【００４３】
ある実施形態では、本発明は少なくとも１つのタンパク質性分子を含む新規のＴＣＲ組成物に関する。本明細書で使用される場合、「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」、又は「タンパク質性材料」は一般に、限定はされないが、約２００個を超えるアミノ酸若しくは遺伝子から翻訳された全長内在配列のタンパク質、約１００個を超えるアミノ酸のポリペプチド、及び／又は約３〜約１００個のアミノ酸のペプチドを指す。上記の「タンパク質性」用語はすべて、本明細書において互換可能に用いられうる。
【００４４】
ある実施形態では、少なくとも１つのタンパク質性分子の大きさは、限定されないが、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、又は約２５００個以上のアミノ分子残基及びそこから導き出せるいずれの範囲を含みうる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「アミノ分子」は、当業者に公知と思われるいずれのアミノ酸、アミノ酸誘導体又はアミノ酸模倣体を指す。ある実施形態では、非アミノ分子がアミノ分子残基の配列を少しも割り込むことなく、タンパク質性分子の残基は連続的である。その他の実施形態では、配列は１つ以上の非アミノ分子部分を含んでいてもよい。特定の実施形態では、タンパク質性分子の残基の配列は１つ以上の非アミノ分子部分によって割り込まれてもよい。
【００４６】
したがって、「タンパク質性組成物」という用語は、うち少なくとも１つの、天然に合成されたタンパク質の２０個の一般的なアミノ酸又は少なくとも１つの修飾アミノ酸若しくは異常（unusual）アミノ酸を含むアミノ分子配列を包含する。
【００４７】
ある実施形態では、タンパク質性組成物は、少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む。さらなる実施形態では、タンパク質性組成物は、生体適合性のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「生体適合性の」という用語は、本明細書に記載の方法及び量に従って所与の生物に適用又は投与されたとき、著しい悪い影響を及ぼさない物質を指す。
生物としては、限定されないが、以下が挙げられ、そのような悪影響又は望ましくない影響が著しい傷害性又は有害な免疫反応などのものである。好ましい実施形態では、組成物を含有する生体適合性のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは一般に各々、毒素、病原体、及び有害な免疫原が本質的に存在しない哺乳類タンパク質若しくはペプチド又は合成タンパク質若しくはペプチドあることになる。
【００４８】
タンパク質性組成物は、標準的な分子生物学的手法を通したタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現、天然源からのタンパク質性化合物の単離、又はタンパク質性材料の化学合成を含む、当業者に公知のいずれかの手法によって作られうる。様々な遺伝子に関するヌクレオチド配列並びにタンパク質、ポリペプチド、及びペプチド配列がこれまで開示されてきており、当業者に公知のコンピューター化されたデータベースで見られうる。１つのそのようなデータベースは、国立生物工学情報センターのジェンバンク（登録商標）及びＧｅｎＰｅｐｔ（登録商標）データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）である。これらの既知遺伝子のコード領域は、本明細書において開示される手法又は当業者に公知であろう手法を用いて増幅及び／又は発現しうる。代替的に、多様なタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの市販調製品が当業者に公知である。
【００４９】
ある実施形態では、タンパク質性化合物は精製されうる。一般に、「精製された」とは、分画に供されて、さまざまな他のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを除去した特定の組成物又はタンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチ組成物を指すことになり、その組成物は、その特定又は所望のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドについて当業者に公知であると思われる、例えば、タンパク質アッセイによって評価されたとき、その活性を実質的に保持する。
【００５０】
構成要素を含有する事実上いずれのタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドでも、本明細書に開示の組成物及び方法に使用されうることが企図される。しかし、タンパク質性材料は生体適合性であることが好ましい。ある実施形態では、組成物がより正確且つ容易に組織に適用でき、手順全体を通して組織と接触して維持できるという点で、より粘性のある組成物の形成が有利であろうことが想定される。そのようなケースでは、ペプチド組成物、又はより好ましくは、ポリペプチド若しくはタンパク質組成物に使用が企図される。粘度の範囲としては約４０〜約１００ポアズが挙げられるが、これに限定されない。ある態様では、約８０〜約１００ポアズの粘度が好ましい。
【００５１】
本発明での使用に適したタンパク質及びペプチドは自己由来タンパク質又はペプチドでありうる。しかし、本発明がそのような自己由来タンパク質の使用に限定されないことは明らかである。本明細書で使用される場合、「自己由来タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド」という用語は、生物に由来する又は生物から得られるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを指し、該生物は好ましくは、選ばれた動物又はヒト対象である。次に、「自己由来タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド」は、選ばれた動物又はヒト対象への適用を意図された組成物の構成要素として使用されうる。ある態様では、自己由来のタンパク質又はペプチドが、例えば、選ばれた提供者の全血漿から調製される。その血漿はチューブに入れられ、約−８０℃の冷凍庫に少なくとも約１２時間に置かれた後、約１２，０００倍ｇで約１５分間遠心分離して沈殿物を得る。フィブリノゲンなどの沈殿物は最長で約１年間で保存されうる（Oz、1990）。
Ｂ．生物学的機能等価物
【００５２】
類似の特徴又は向上した特徴をもつ分子を得る間に、修正及び／又は変更が本発明によるＴＣＲポリヌクレオチド及び／又はタンパク質の構造になされうるので、そのような生物学的に機能が等価な物ものもまた、本発明内に包含される。
【００５３】
本開示は、それぞれ配列番号１及び配列番号２の断片及び／又は誘導体であるＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖を提供する。そのような断片及び／又は誘導体は、それぞれ配列番号１及び配列番号２の活性を維持することになる。特定の実施形態では、全体として、ＴＣＲの一部としての断片及び／又は誘導体は選択的抗腫瘍活性を提供する。
１．修飾ポリヌクレオチド及びポリペプチド
【００５４】
生物学的機能等価物は、「野生型」又は標準タンパク質をコードする能力を同時に保持しつつ異なる配列を含有するよう遺伝子操作されたポリヌクレオチドを含みうる。これは、同じアミノ酸をコードする遺伝コードの縮重、すなわち、複数のコドンの存在に関して達成できる。１つの例では、当業者は、タンパク質をコードするそのポリヌクレオチドの能力を妨げずに、制限酵素認識配列をポリヌクレオチドに導入したいと望むかもしれない。
【００５５】
別の例では、ポリヌクレオチドは、より重要な変更をもつ生物学的機能等価物でありうる（及びコードしうる）。あるアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域、基質分子の結合部位、受容体などの構造体との相互作用的な結合能を明らかに感知できるほど失うことなく、タンパク質構造において他のアミノ酸に置換されうる。いわゆる「保存的」変更は、その構造変化がタンパク質の設計された機能を実行する能力に影響を与えるものではないのでタンパク質の生物学的活性を乱さない。よって、さまざまな変更が、本発明の目的を依然として実現させつつ、本明細書に開示の遺伝子及びタンパク質の配列においてなされうることが発明者によって企図される。
【００５６】
機能等価物という点で、許容可能なレベルの等価な生物学的活性をもつ分子を保持しつつ、分子の画定された部分内になされうる変更の数に制限があるという概念が「生物学的機能等価な」タンパク質及び／又はポリヌクレオチドの定義に本来備わっていることが当業者によって理解される。よって生物学的機能等価物は、選ばれたアミノ酸（又はコドン）のタンパク質（及びポリヌクレオチド）が置換されうるように本明細書において定義される。具体的な実施形態では、機能活性としては、同胞殺し効果又は正常造血幹細胞／前駆細胞に対する傷害性を生じない活性を含む選択的抗腫瘍活性が挙げられる。特定の実施形態では、機能活性は自己傷害性がない。ある態様では、機能活性は自己組織上のサバイビンと腫瘍関連サバイビン発現との識別を可能にし、「オンターゲット  オフ腫瘍」活性なしに抗腫瘍反応性を選択的に仲介する。
【００５７】
一般に、分子長が短いほど、機能を維持しつつ分子内に可能である変更は少ない。より長い領域には、中間の数（intermediate number）の変更がなされうる。全長タンパク質はより多くの数の変更に最も寛容であろう。しかし、その構造に大きく依存するあるいくつかの分子又は領域は、ほとんど又は全く修飾に寛容がない場合があることが理解されなければならない。
【００５８】
アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ及び／又は同種のものに基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状、及び／又は種類の分析は、アルギニン、リジン、及び／若しくはヒスチジンはすべて正の電荷をもつ残基であり、アラニン、グリシン、及び／若しくはセリンはすべて同様のサイズであり、並びに／又はフェニルアラニン、トリプトファン、及び／若しくはチロシンはすべて、概して同様の形状をもつことを明らかにする。したがって、これらの考慮に基づいて、アルギニン、リジン、及び／若しくはヒスチジン、アラニン、グリシン、及び／若しくはセリン、並びに／又はフェニルアラニン、トリプトファン、及び／若しくはチロシンが、本明細書において生物学的機能等価物として定義される。
【００５９】
より定量的変更をもたらすために、アミノ酸のハイドロパシーインデックス（hydropathic index）が考慮されうる。各アミノ酸にはその疎水性及び／又は電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスが付与されており、それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（０．４）；トレオニン（０．７）；セリン（０．８）；トリプトファン（０．９）；チロシン（１．３）；プロリン（１．６）；ヒスチジン（３．２）；グルタミン酸（３．５）；グルタミン（３．５）；アスパラギン酸（３．５）；アスパラギン（３．５）；リジン（３．９）；及び／又はアルギニン（４．５）である。
【００６０】
相互作用的な生物学的機能タンパク質に付与する際のハイドロパシーアミノ酸インデックス（hydropathic amino acid index）の重要性は一般に当該技術分野において理解されている（Kyte & Doolittle, 1982、参照により本願明細書に組み込まれる）。あるアミノ酸が、同様のハイドロパシーインデックス及び／若しくはスコアをもつ他のアミノ酸に置換され、且つ／又はそれでもなお生物学的活性を保持しうることが知られている。ハイドロパシーインデックスに基づいて変更するとき、そのハイドロパシーインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、且つ／又は±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【００６１】
特に、その置換によって作られる生物学的機能等価タンパク質及び／又はペプチドが、本発明のある実施形態のように免疫に関する実施形態での使用を意図される場合、類似アミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされうることが当該技術分野においてまた理解される。米国特許第4,554,101号は、参照により本願明細書に組み込まれ、その隣接するアミノ酸の親水性によって左右されるタンパク質の最大局所平均親水性が、その免疫原性及び／又は抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的性質と相関することを述べている。
【００６２】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（０．５）；ヒスチジン（０．５）；システイン（１．０）；メチオニン（１．３）；バリン（１．５）；ロイシン（１．８）；イソロイシン（１．８）；チロシン（２．３）；フェニルアラニン（２．５）；トリプトファン（３．４）。類似の親水性値に基づいて変更するとき、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、且つ／又は±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
２．改変アミノ酸
【００６３】
態様では、本発明は適切なポリヌクレオチドの転写及び翻訳を介した細胞質（cyto）でのペプチド及びポリペプチドの合成に依存する。これらのペプチド及びポリペプチドは、２０個の「天然」アミノ酸及びその翻訳後修飾を含むことになる。しかし、インビトロペプチド合成は、修飾アミノ酸及び／又は異常アミノ酸の使用を許容する。限定しないが、例示的な修飾アミノ酸及び／又は異常アミノ酸は次の通りである：２−アミノアジピン酸、Ｎ−エチルアスパラギン、３−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、β−アラニン、ベータ−アミノ−プロピオン酸、アロ−ヒドロキシリシン、２−アミノ酪酸、３−ヒドロキシプロリン、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、４−ヒドロキシプロリン、６−アミノカプロン酸、イソデスモシン、２−アミノヘプタン酸、アロ−イソロイシン、２−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、３−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルイソロイシン、２−アミノピメリン酸、６−Ｎ−メチルリジン、２，４−ジアミノ酪酸、Ｎ−メチルバリン、デスモシン、ノルバリン、２，２’−ジアミノピメリン酸、ノルロイシン、２，３−ジアミノプロピオン酸、オルニチン、及びＮ−エチルグリシン。
３．模倣体
【００６４】
上記で論じられた生物学的機能等価物に加えて、本発明の発明者はまた、構造的に類似した化合物が本発明のペプチド又はポリペプチドの重要な部分を模倣するのに調合されうることを企図する。そのような化合物はペプチド模倣体と呼ばれることがあり、本発明のペプチドと同じように使用されうる。故に機能等価物でもある。
【００６５】
タンパク質二次及び三次構造の構成要素を模倣するあるいくかの模倣体が、Johnson et al. (1993)に記載されている。ペプチド模倣体の使用の背後にある基本的な理論的根拠は、タンパク質のペプチド主鎖が、主として、抗体及び／又は抗原の分子相互作用などの分子相互作用を容易にするようにアミノ酸側鎖を配向するために存在することである。よって、ペプチド模倣体は天然の分子に類似した分子相互作用を許容するように設計されている。
【００６６】
ペプチド模倣体概念のいくつかの成功した用途では、抗原性が高いことが知られている、タンパク質内のβターンの模倣体が注目されている。おそらく、ポリペプチド内のβターン構造は、本明細書で論じられるコンピューターに基づいたアルゴリズムによって予想できる。いったんそのターンの構成アミノ酸が決定されると、模倣体が構築されてアミノ酸側鎖の必須要素の類似空間配向を達成できる。
【００６７】
他の方法では、大きいタンパク質の結合部位を模倣する生物学的活性コンフォメーションを作るための魅力的な構造鋳型として、小さい、複数のジスルフィドを含有するタンパク質の使用が注目されている。Vita et al. (1998)。あるいくつかの毒素の進化的に保存されていると思われる構造モチーフは、小さく（３０〜４０個のアミノ酸）、安定で、容易に変異を入れることができる。このモチーフは、３つのジスルフィドによって内部コア内で架橋されたベータシート及びアルファヘリックスから構成される。
【００６８】
ベータＩＩターンは、環式Ｌ−ペンタペプチド及びＤ−アミノ酸をもつものを用いて成功裡に模倣されている。Weisshoff et al. (1999)。また、Johannesson et al. (1999)は、特性を含めて逆向ターンをもつ二環式トリペプチドについて報告している。
【００６９】
特有の構造を作る方法が当該技術分野で開示されている。例えば、アルファヘリックス模倣体は、米国特許第５，４４６，１２８号；同第５，７１０，２４５号；同第５，８４０，８３３号；及び同第５，８５９，１８４号に開示されている。これらの構造は、ペプチド又はタンパク質をより熱的に安定にし、タンパク質分解に対する耐性も増加させる。６員環、７員環、１１員環、１２員環、１３員環、及び１４員環構造が開示されている。
【００７０】
立体配座的に拘束された（conformationally restricted）ベータターン及びベータバルジを作る方法が、例えば、米国特許第５，４４０，０１３号；同第５，６１８，９１４号；及び同第５，６７０，１５５号に記載されている。ベータターンは、対応するする主鎖コンフォメーションにおける変化を有することなく、側鎖置換基を許容し、標準的な合成手順によってペプチドに組み込むための適切な末端をもつ。他のタイプの模倣ターンとして、逆向ターン及びガンマターンが挙げられる。逆向ターン模倣体は米国特許第５，４７５，０８５号及び同第５，９２９，２３７号に開示され、ガンマターン模倣体は米国特許第５，６７２，６８１号及び同第５，６７４，９７６号に記載されている。
４．具体的な実施形態
【００７１】
マウス由来のＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータのベータ鎖、アルファ鎖、複数のフレームワーク領域、複数の多様性領域、連結領域、及び定常領域を含むサバイビン特異的Ｔ細胞受容体の例が配列番号３に提供される。マウス由来のＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータのベータ鎖、アルファ鎖、複数のフレームワーク領域、複数の多様性領域、連結領域、及び定常領域を含むサバイビン特異的Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドの例が配列番号５に提供される。マウス由来のＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータのベータ鎖、アルファ鎖、複数のフレームワーク領域、複数の多様性領域、複数の連結領域、及び定常領域をコードするベクターの例が配列番号４に提供される。前記ポリヌクレオチドは５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲも含む。
ＩＩ．サバイビン特異的ＴＣＲを発現する宿主細胞
【００７２】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という用語は互換可能に用いられうる。これらの用語はすべて、いずれのすべての次の世代である、その子孫世代も含む。意図的変異又は不測の変異のため、すべての子孫世代は全く同じではないことが理解される。異種の核酸配列を発現するという文脈で、「宿主細胞」は、ベクターを複製でき、且つ／又はベクターでコードされる異種遺伝子を発現できる真核細胞を指す。宿主細胞はベクターのレシピエントとして使用でき、そのようにされてきた。宿主細胞は「トランスフェクションする」又は「形質転換した」されうる。それは外来の核酸が宿主細胞に移入又は導入される過程を指す。形質導入された細胞は、初代対象細胞及びその子孫世代を含む。本明細書で使用される場合、"engineered" and "recombinant" 細胞又は宿主細胞という用語は、例えば、ベクターなどの外来の核酸配列が導入されている細胞を指すことが意図される。したがって、組換え細胞は、遺伝子を組み換えて導入された核酸を含有しない天然の細胞と識別される。本発明の実施形態では、宿主細胞は細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、細胞傷害性（cytolytic）Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はキラーＴ細胞としても知られる）を含むＴ細胞であり、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞も本発明に包含される。
【００７３】
１つの態様では、１つ以上のＴＣＲを発現するように遺伝子組換えされている細胞が本明細書で提供される。ある実施形態では、遺伝子組換え細胞は、例えば、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、又はＮＫ細胞である。他のある実施形態では、遺伝子組換え細胞は、非免疫細胞、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、又は胚性幹細胞である。具体的な実施形態では、細胞はまた、遺伝子操作されたＴＣＲ又はその機能を高めうるいずれの他の遺伝子改変も含む。
【００７４】
ある実施形態では、ＲＮＡ又はタンパク質性配列が、同一ＣＴＬなどの同一細胞の他の選ばれたＲＮＡ又はタンパク質性配列と共発現されうることが企図される。共表現は、ＣＴＬを２つ以上の異なる組換えベクターで共トランスフェクションすることによって達成されうる。代替的に、単一の組換えベクターがＲＮＡの複数の異なるコーディング領域を含むように構築されてもよく、それは該単一ベクターでトランスフェクションされたＣＴＬにおいて発現されうる。
【００７５】
いくつかのベクターは、原核細胞と真核細胞の両方でのその複製及び／又は発現を可能にする調節配列を用いうる。さらに、上記すべての宿主細胞をインキュベーションしてそれらを維持し、且つベクターの複製を許容する条件を当業者なら理解するであろう。また、大量のベクターの産生並びにベクターによってコーディングされた核酸及びその同族ポリペプチド、タンパク質、又はペプチドの産生を可能にすると思われる手法及び条件も理解され、且つ公知である。
【００７６】
細胞は、自己由来細胞、同系細胞、同種異系細胞であることができ、場合によっては異種細胞でもあることができる。
【００７７】
遺伝子組換えＴ細胞を殺傷できることを望むかもしれない多くの状況において、その細胞の存在後のそれらの不在が対象又は他の目的である研究では、治療を終えたい場合、その細胞は新生物となる。この目的のために、誘導可能な自殺遺伝子などの、制御された条件下で遺伝子操作された細胞を殺傷できるある特定の遺伝子産物の発現を提供できる。そのような自殺遺伝子は当技術分野で公知であり、例えば、カスパーゼ９の改変された形態が低分子、例えば、ＡＰ１９０３と二量体化可能であるｉＣａｓｐａｓｅ９システムがある。例えば、Straathof et al., Blood 105:4247-4254 (2005)を参照されたい。
【００７８】
さらに、本開示の医薬組成物が、本明細書で定義されるベクターで形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を含むことが想定される。宿主細胞は、少なくとも１つの上記ベクター又は少なくとも１つの上記核酸分子を宿主細胞に導入することによって作製されうる。宿主内の少なくとも１つのベクター又は少なくとも１つの核酸分子の存在は、上記の特有の一本鎖抗体コンストラクトをコードする遺伝子の発現を仲介しうる。
【００７９】
宿主細胞に導入されている記載の核酸分子又はベクターは、宿主のゲノムに組み込まれるか、又は染色体外に維持されうるかのいずれかである。
【００８０】
宿主細胞はいずれの原核細胞又は真核細胞であることができ、具体的な実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。具体的な実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、又は動物細胞である。記載の宿主は、哺乳類細胞、より好ましくは、ヒト細胞又はヒト細胞株でありうることが特に想定される。特に好ましい宿主細胞は、免疫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０又はＮＳ／０といった骨髄腫細胞株を含む。
【００８１】
また、本開示の医薬組成物は、活性化シグナルを細胞増殖又は細胞刺激に有用な免疫エフェクター細胞に提供できるタンパク質性化合物を含みうる。本開示を踏まえると、活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に提供する「タンパク質性化合物」は、例えば、Ｔ細胞に対するさらなる活性化シグナル（例えば、さらなる共刺激分子：Ｂ７ファミリーの分子、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ）、又はさらなるサイトカイン：インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、若しくはＩＬ−１５）、又はＮＫＧ−２Ｄ結合（engaging）化合物でありうる。また、タンパク質性化合物は活性化シグナルを非Ｔ細胞である免疫エフェクター細胞に提供しうる。非Ｔ細胞である免疫エフェクター細胞の例は、とりわけ、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞を含む。
【００８２】
１つの実施形態は本開示の組成物を作製するための方法に関し、該方法は、コンストラクトの発現を可能する条件下で本明細書において上記に定義される宿主細胞を培養することを含み、該細胞又は複数の細胞は個人に提供される。
【００８３】
ＴＣＲ分子の発現を可能にする、発現コンストラクトを内部にもつ細胞を培養する条件は当技術分野で公知であり、所望の場合にコンストラクトを精製／回収する手順も同様に公知である。
【００８４】
１つの実施形態では、宿主細胞は、選択され、クローンされ、且つ／又は続いて養子免疫療法に使用されるＴ細胞の集団に導入される、選ばれた標的抗原に対するアビディティー及び反応性が高いＴＣＲを含む遺伝子組換えＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）である。
ＩＩＩ．医薬組成物
【００８５】
遺伝子組換え免疫細胞、例えば、遺伝子組換えサバイビン特異的ＴＣＲ発現Ｔ細胞を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【００８６】
本開示においては、「医薬組成物」という用語は個人に投与するための組成物に関する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口投与、経皮投与、管腔内投与、動脈内投与、髄腔内投与、若しくは静脈内投与、又はがんへの直接注入のための組成物を含む。前記医薬組成物は注入又は注射によって個人に投与されることが特に想定される。好適な組成物の投与はさまざまな方法、例えば、静脈内投与、皮下の投与、腹膜内投与、筋肉内投与、局所投与、又は皮内投与によってもたらされうる。
【００８７】
本開示の医薬組成物は、薬理学的に許容される担体をさらに含みうる。好適な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、例えば、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、さまざまな種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。そのような担体を含む組成物は周知の従来の方法によって調合できる。これらの医薬組成物は被験者に好適な投与量で投与できる。
【００８８】
投与計画は、担当医及び臨床的な因子によって決定されることになる。医療分野において周知のように、いずれの１名の患者に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全身の健康状態、並びに同時に投与される他の薬を含む多くの因子に依存する。投与量の例は、体表面積１ｍ２当たり２ｘ１０７個の細胞又は体重１Ｋｇ当たり１×１０６個の細胞から最高で１ｍ２当たり２×１０８個の細胞又は体重１Ｋｇ当たり５×１０６個の細胞の範囲であると推定される。これらの注入は反復されてよい。経過は定期評価によってモニターできる。
【００８９】
本開示のＴＣＲ細胞組成物は局所的にまたは全身的に投与されうる。投与は一般に非経口、例えば、静脈内であることになり、またＤＮＡは、体内若しくは体外の標的部位への微粒子銃送達又は動脈内の部位へのカテーテルによって標的部位に直接投与もされうる。好ましい実施形態では、医薬組成物は皮下に投与され、さらにより好ましい実施形態では静脈内に投与される。非経口投与用の製剤としては、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルション、又は懸濁液が挙げられ、生理食塩水及び緩衝媒質を含む。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は不揮発性油が挙げられる。静脈内媒体としては、流体及び栄養素補充液、（リンゲルデキストロースを基にしたものなどの）電解物補充液などが挙げられる。また、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加物が存在してもよい。くわえて、本開示の医薬組成物が、例えば、血清アルブミン又は免疫グロブリンといったタンパク質性担体を含みうることが推定され、ヒト由来のものが好ましい。本開示の医薬組成物は、タンパク質性二重特異性一本鎖抗体コンストラクト若しくは核酸分子又は（本開示で記載されるように）それらをコードするベクターの他に、医薬組成物の使用目的に応じてさらなる生物活性薬品を含みうることが想定される。
Ｖ．ＴＣＲ及びＴＣＲを含む宿主Ｔ細胞の治療用途
【００９０】
さまざまな実施形態では、本明細書で企図されるＴＣＲコンストラクト、核酸配列、ベクター、宿主細胞及び／又はそれらを含む医薬組成物は、腫瘍性疾患などのがん性疾患の予防、治療、又は改善に使用される。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、腫瘍のあるがんを含むがんを予防、改善及び／又は治療するのに特に有用である。
【００９１】
特定の実施形態では、治療有効量の複数の本開示のいずれかの細胞を個人に提供する工程を含む個人をがん治療する方法が本明細書において提供される。ある態様では、がんは固形腫瘍であり、腫瘍はいずれの大きさでもありうる。ある態様では、該方法は治療有効量のさらなるがん療法を個人に提供する工程をさらに含む。
【００９２】
本明細書において使用する場合、「治療」又は「治療すること」は、病気又は病態の症状又は病理へのいずれの有益な効果又は望ましい効果を含み、治療されている病気又は疾患、例えば、がんの１つ以上の測定可能なマーカーの減少が最小であってもそれを含みうる。治療は、随意に、病気若しくは疾患の症状の低減若しくは改善すること、又は病気若しくは疾患の進行を遅らせることを含むことができる。「治療」は必ずしも、病気若しくは疾患又はその関連症状を完全になくすことや治癒させることを示さない。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「予防する」及び「予防された」、「予防すること」などの類似の語は、病気又は疾患、例えば、がんの発生又は再発の可能性を予防、阻止、又は軽減する方法を指す。また、病気又は疾患の発症若しくは再発を遅らせること又は病気又は疾患の症状の発生若しくは再発を遅らせることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」及び類似の語はまた、病気又は疾患の発症又は再発の前の病気又は疾患の強度、影響、症状、及び／又は負荷を軽減することも含む。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明は、部分的には、標準的なベクター及び／又は遺伝子送達系を用いて単独又はいずれの組み合わせで、少なくともいくつかの態様では、薬理学的に許容される担体又は賦形剤とともに投与できる細胞、ＴＣＲコンストラクト、核酸分子、及びベクターを企図する。ある実施形態では、投与に続いて、前記核酸分子又はベクターは対象のゲノムに安定に組み込まれる。
【００９５】
具体的な実施形態では、ある細胞又は組織の特異的であり、前記細胞に存続するウィルスベクターが使用されうる。好適な医薬担体及び賦形剤が当該技術分野において周知である。本開示に従って調製された組成物は、上記の特定された疾患を予防又は治療又は遅らせるのに使用できる。
【００９６】
さらに本開示は、本明細書において記載される及び／又は本明細書において記載される方法によって作られる、サバイビン特異的ＴＣＲ発現細胞；ＴＣＲをコードする核酸配列；ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを内部にもつ免疫細胞、例えば、Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球の有効量を、それを必要とする対象又は個人に投与する工程を含む、腫瘍性疾患を予防、治療、又は改善する方法に関する。
【００９７】
例示的なＴＣＲ細胞の組成物の投与の可能性のある適応症は、腫瘍性疾患を含むがん性疾患、例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、及び結腸がん、又は乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、尿生殖路のがん、例えば、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、及び腎臓がん、肺がん、胃がん、小腸のがん、肝がん、膵がん、胆嚢がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、及び甲状腺のがんなどの上皮性がん／上皮性悪性腫瘍である。本開示の組成物の投与は、微小残存病変、初期がん、進行がん、及び／又は転移がん及び／又は難治性がんを含むすべてのステージ及び種類のがんに有用であり、例えば、がんは病原性血管新生と関連する。
【００９８】
さらに本開示は、他の化合物、例えば、二重特異性抗体コンストラクト、標的毒素、又は免疫細胞を介して作用する他の化合物との共投与プロトコールを包含する。本発明の化合物の共投与に関する臨床投与計画は、他の構成要素の投与と同時、投与前、又は投与後の共投与を包含しうる。特定の併用療法としては、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、又は他のタイプの免疫療法が挙げられる。
【００９９】
療法のための特定の投与量は当該技術分野で慣用の方法を用いて決定されうる。しかし具体的な実施形態では、Ｔ細胞はそれを必要としている個人に１回送達される。一方で場合によっては複数回、例えば、２、３、４、５、６回以上である。複数回投与で投与される場合、投与間の期間の長さはいずれの好適な期間であってよく、具体的な実施形態では、投与間は数週間又は数か月（weeks or months）である。投与間の期間は単一投与計画で異なりうる。特定の実施形態では、投与間の期間は２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０週間以上である。具体的な場合では、投与間の期間は、例えば、４〜８又は６〜８  週間である。
【０１００】
特定の実施形態では、医薬組成物はサバイビン特異的ＴＣＲを発現する細胞を含む。有効量の細胞がそれを必要としている個人に与えられる。
【０１０１】
実例として、がん患者又はがんを罹患しやすい患者又はがんの疑いのある患者は、次にように治療されうる。本明細書に記載されるように改変された細胞が患者に投与され、長期間保持されうる。個人は細胞の投与を１回以上受けうる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞はカプセル封入されて免疫認識を阻み、腫瘍部位に配置される。
【０１０２】
特定の場合では、個人は、サバイビンに特異的なＴＣＲを含むように遺伝子操作された治療用Ｔ細胞が提供される。送達が複数回繰り返され、細胞は同一の製剤又は別個の製剤で送達されうる。細胞は個人に別々の送達経路で提供されうる。細胞は例えば、腫瘍部位での注射又は経静脈若しくは経口で送達されうる。そのような組成物のための慣用の送達経路は当技術分野において公知である。
【０１０３】
ＴＣＲをコードする発現ベクターは１つ以上のＤＮＡ分子又はコンストラクトとして導入でき、そこにはコンストラクトを含有する宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つのマーカーが存在する。コンストラクトは従来のやり法で調製でき、遺伝子及び調節領域は必要に応じて単離され、ライゲーションされ、適切なクローニング宿主にクローニングされ、制限酵素又はシークエンシング又は他の簡便な手段で分析される。具体的には、ＰＣＲを用いて、機能単位の全部または一部を含む個々の断片が単離されうる。そこでは１つ以上の変異が、「プライマー修復」、ライゲーション、インビトロ突然変異誘発などを用いて適宜導入されうる。いったん完成されて、適切な配列をもつことが示されたコンストラクトは次に、いずれかの簡便な手段によってＣＴＬに導入されうる。コンストラクトは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などといった非複製、欠陥ウイルスゲノムに組み込まれ且つパッケージされうる。例えば、細胞への感染又は形質導入のためのレトロウィルスベクターが挙げられる。所望の場合、コンストラクトはトランスフェクション用のウィルス配列を含んでもよい。代替的に、コンストラクトは、融合、エレクトロポーレーション、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入されてもよい。宿主細胞はコンストラクトの導入前に培養で成長及び増殖し、続いてコンストラクトの導入及びコンストラクトの組み込みのために適切に処理されうる。次に、細胞を増殖させ、コンストラクトに存在するマーカーに基づいてスクリーニングされる。成功裡に使用されうるさまざまなマーカーとしては、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが挙げられる。
【０１０４】
場合によって、コンストラクトが特定の座に組み込まれることが望ましい場合、相同性組換えのための標的部位を有してもよい。例えば、内在遺伝子をノックアウトし、その遺伝子を（同じ座又は別の座において）、相同性組換えに関して当該技術分野で公知の材料及び方法を用いて、コンストラクトによってコードされる遺伝子で置換できる。相同性組換えのために、．ＯＭＥＧＡ．又はＯ−ベクターのいずれかを使用しうる。例えば、Thomas and Capecchi, Cell (1987) 51, 503-512、Mansour, et al., Nature (1988) 336, 348-352、及びJoyner, et al., Nature (1989) 338, 153-156を参照されたい。
【０１０５】
コンストラクトは、少なくともＴＣＲ及び随意に別の遺伝子をコーディングする単一のＤＮＡ分子又は１つ以上の遺伝子をもつ別個のＤＮＡ分子として導入されうる。コンストラクトはそれぞれ同一マーカー又は異なるマーカーとともに、同時又は連続して導入されうる。
【０１０６】
コンストラクトＤＮＡのストックを調製し、トランスフェクションを実行するのに使用されうる、細菌又は酵母の複製起点、選択可能及び／又は増幅可能なマーカー、原核生物又は真核生物での発現のプロモーター／エンハンサーエレメントなどの有用な要素を含有するベクターは、当該技術分野において周知であり、多くは市販されている。
【０１０７】
次に、ＴＣＲコンストラクトを含むように遺伝子操作された例示的なＴ細胞を選択条件下培養で成長させ、次いで、コンストラクトを有するものとして選択される細胞を増殖させ、宿主細胞でのコンストラクトの有無を決定するために、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてさらに分析する。遺伝子操作された宿主細胞が特定されたら、次にそれらの細胞は次に計画通りに使用され、例えば、培養され増殖するか又は宿主生物に導入される。
【０１０８】
細胞の性質に応じて、細胞は宿主生物、例えば哺乳類に、多様な方法で導入されうる。特定の実施形態では、細胞は腫瘍部位に導入されうる。一方で代替的な実施形態では、細胞はがんに的を絞っているか、がんに的を絞るよう改変されている。使用されうる細胞の数は、いろいろな周囲の状況、導入の目的、細胞の生存期間、使用されるプロトコール、例えば、投与の数、細胞の増殖能、組換えコンストラクトの安定性などに依存することになる。細胞は分散体として適用され、一般に目的の部位又はその近くに注射されうる。細胞は生理学的に許容される培地中に存在してよい。
【０１０９】
ＤＮＡ導入は、必ずしもすべての場合において結果として組み込まれる必要はない。いくつかの状況では、導入されたＤＮＡの一過的な維持が充分であることがある。このように、細胞が宿主に導入され、所定の時間の後、例えば、細胞が特定の部位に存在できた後に作動されうる場合、効果は短期である可能性がある。
【０１１０】
所望の場合、細胞は投与されうる。所望の応答、投与の方法、細胞の寿命、存在する細胞の数に応じて、さまざまなプロトコールが採用されうる。投与の回数は少なくとも上記因子に依存することになる。
【０１１１】
系が、リガンドに対する細胞応答、発現の効率、及び、適宜、発現産物の活性、患者の特有のニーズなどの、多くの変数に供され、該変数は、時間及び周囲の状況、細胞又は個々の細胞の発現活性の喪失の結果としての細胞活性の喪失の速度などに伴って変化しうることが理解されるべきである。したがって一人一人の患者に関して、普遍的特質をもつ細胞が集団全般に投与されうるとしても、各患者はその個人にとって適切な投与量についてモニターされることが期待され、そのような患者モニターの実行は当該技術分野において慣用である。
【０１１２】
別の態様では、少なくともＴＣＲを発現する細胞の治療有効量を個人に投与すること含む、腫瘍細胞をもつ個人を治療する方法が、本明細書において提供される。関連する態様では、少なくともサバイビン特異的ＴＣＲを発現する細胞の治療有効量を個人に投与すること含む、腫瘍細胞をもつ個人を治療する方法が、本明細書において提供される。具体的な実施形態では、前記投与することは該個人の腫瘍の増殖の測定可能な減少をもたらす。別の具体的な実施形態では、前記投与することは該個人の腫瘍の大きさの測定可能な減少をもたらす。さまざまな実施形態において、腫瘍の大きさ又は増殖速度は、例えば、直接イメージング（例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャンなど）、蛍光イメージング、組織生検、及び／又は関連する生理学的マーカー（例えば、前立腺がんに関するＰＳＡレベル、絨毛がんに関するＨＣＧレベルなど）の評価によって決定されうる。本発明の具体的な実施形態では、個人は悪い予後と相関がある高レベルの抗原をもつ。いくつかの実施形態では、個人は、手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、又はそれら組み合わせなどのさらなるがん療法を提供される。
ＩＶ．本開示のキット
【０１１３】
実施形態は、本明細書において定義される細胞、本明細書において定義されるTCRコンストラクト、本明細書において定義される核酸配列、及び／又は本明細書において定義されるベクターを含むキットに関する。また、本開示のキットが本明細書の上記に記載医薬組成物を単独で含むか、又は薬物治療若しくは治療介入を必要とする個人に投与されるさらなる薬剤と組み合わせて含むことが企図される。
【０１１４】
本明細書において記載される組成物はいずれもキットに含まれうる。非限定的な例では、細胞療法のための細胞又は該細胞を作るための１つ以上の試薬がキットに含まれうる。よってキットは、好適な容器手段内に、細胞、ベクター、プライマー、酵素、バッファー、塩、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどを含むことになる。特定の実施形態では、細胞はサバイビンに特異的なＴＣＲ、例えば、配列番号１を含む前記受容体のアルファ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体及び配列番号２を含む前記受容体のベータ鎖又はその機能的断片若しくは機能的誘導体の一方又は両方を含むＴＣＲをコードする特定のベクターで形質導入されている。キットはまた、受容体又はそれをコードするポリヌクレオチドをさらに操作するための細菌も含んでもよい。キットは、本開示のＴＣＲの一部又は全部をコードするベクターで形質導入できる免疫細胞などの非形質導入哺乳類免疫細胞を含んでよい。キットは、発現コンストラクトを含むものなど、本開示のＴＣＲの一部又は全部をコードするポリヌクレオチド、例えば、ベクターポリヌクレオチドを含んでよい。
【０１１５】
キットは、好適に分注された本開示の細胞組成物又は好適に分注された細胞を生成するための試薬を含みうる。キットの構成要素は水性媒質中に又は凍結乾燥形態でパッケージされうる。キットの容器手段は一般に、構成要素が入り、好ましくは、好適に分注されうる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、又は他の容器手段を含みうる。キットはまた、滅菌された、薬理学的に許容される緩衝液及び／又は他の希釈剤を含むための第２の容器手段を含んでもよい。キット中に２つ以上の構成要素がある場合、キットはまた一般に、追加の構成要素が別々に入る第２、第３、又は他の追加の容器を含んでもよい。しかし、構成要素のさまざまな組合せがバイアルに含まれうる。キットは単一の容器手段を有してもよく、及び／又は各化合物用に別々容器手段を有してもよい。また、本発明のキットは典型的には、商業販売のために密に閉じたいずれの容器を含有する手段を含むことになる。そのような容器としては、所望のバイアルがそのなかに保持される射出成形又は中空成形プラスチック容器が挙げられる。
【０１１６】
本開示のキットは、Ｔ細胞受容体の一部又は全部をコードするポリヌクレオチド及び／又はそのようなポリヌクレオチドを、例えば、増幅によって作るためのプライマーを含みうる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、Ｔ細胞受容体ベータ鎖、Ｔ細胞受容体アルファ鎖、又は受容体の別の領域をコードする。
【０１１７】
キットの構成要素が１種及び／又は複数種の液体溶液中に提供される場合、液体溶液は水溶液でありうる。滅菌水溶液が特に好ましい。また、組成物は送達可能組成物に製剤されてもよい。その場合では、容器手段自体が、注射器、ピペット、及び／又は他のそのような種類の装置であってよく、そこから製剤が身体の感染領域に適用されてもよく、動物に注射されてもよく、且つ／又はキットの他の構成要素に適用及び／若しくは混合されさえしてもよい。
【０１１８】
しかし、ある実施形態では、キットの構成要素は乾燥粉末として提供されうる。試薬及び／又は構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は好適な溶媒を添加することによって再溶解できる。別の容器手段で提供されうることが想定される。
【０１１９】
容器の数及び／又は種類に関係なく、本発明のキットはまた、注射／投与及び／又は最終的な配置を補助する器具を含んでもよく、且つ／又は該器具とパッケージされてもよい。そのような器具は、注射器、ピペット、鉗子、及び／又はいずれのそのような医学的に承認された送達媒体でありうる。
【０１２０】
本開示のある実施形態では、キットは特定の種類のがんを診断するための１つ以上の装置又は試薬を含む。本開示の特定の実施形態では、キットは、例えば化学療法などの１つ以上のさらなる療法を含む。
Ｖ．ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド
【０１２１】
本開示はまた、本明細書において定義されるＴＣＲをコードする核酸配列を含む組成物及び該核酸配列を内部にもつ細胞を包含する。特定の態様では核酸分子は組換え核酸分子であり、合成されたものであってもよい。該核酸分子としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡ（ペプチド核酸）が挙げられうる。それらのハイブリッドであってもよい。
【０１２２】
１つ以上の調節配列が本開示の組成物に含まれる核酸分子に付け加えられうることが当業者に明らかである。例えば、プロモーター、転写エンハンサー、及び／又は本開示のポリヌクレオチドの誘導発現を可能にする配列が採用されうる。例えば、好適な誘導可能な系は、例えば、Gossen and Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551)及びGossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62)で記載されるテトラサイクリン調節遺伝子発現、又は例えば、Crook (1989) EMBO J. 8, 513-519で記載されるデキサメタゾン誘導遺伝子発現系である。
【０１２３】
さらに、核酸分子が、例えば、チオエステル結合及び／又はヌクレオチド類似体を含有しうることが、さらなる目的のために想定される。改変が、細胞内のエンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化に有用でありうる。核酸分子は、細胞内での前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適切なベクターによって転写されうる。これに関して、そのようなポリヌクレオチドは「遺伝子ターゲティング」又は「遺伝子治療」アプローチに使用できることも理解されるべきである。別の実施形態では、核酸分子は標識される。核酸の検出方法は当該技術分野において周知であり、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＰＣＲ、又はプライマー伸長である。この実施形態は、遺伝子治療アプローチの間に上記核酸分子導入の成功を検証するスクリーニング方法に有用でありうる。
【０１２４】
核酸分子は、前述の核酸分子のいずれかを単独又は組み合わせて含む、遺伝子を組み換えて作られたキメラ核酸分子でありうる。具体的な態様では、核酸分子はベクターの一部である。
【０１２５】
したがって、本開示はまた、本開示に記載の核酸分子を含むベクターを含む組成物にも関する。
【０１２６】
多くの好適なベクターが分子生物学分野の当業者に公知であり、その選択は所望の機能に依存することになり、例としては、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子工学で従来用いられる他のベクターが挙げられる。当業者に周知の方法がさまざまなプラスミド及びベクターを構築するのに使用でき、例えば、Sambrook et al. (1989)及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)に記載の手法を参照されたい。代替的に、本開示のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達用リポソームに再構成できる。クローニングベクターがＤＮＡの個々の配列を特定するのに使用されうる。特定のポリペプチドの発現が必要とされる場合は、関連配列が発現ベクターに移されることができる。典型的なクローニングベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、及びｐＧＢＴ９が挙げられる。典型的な発現ベクターとしては、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが挙げられる。
【０１２７】
具体的な実施形態では、ベクターは本明細書において定義されるＴＣＲコンストラクトをコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列である核酸配列を含む。そのような調節配列（調節エレメント）は当業者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット（splice cassette）、翻訳開始コドン、翻訳及びベクターにインサートを導入するための挿入部位を含みうる。具体的な実施形態では、核酸分子は前記発現調節配列に作動可能に連結され、真核細胞又は原核細胞での発現を可能にする。
【０１２８】
ベクターは本明細書において定義されるＴＣＲコンストラクトをコードする核酸分子発現ベクターであることが想定される。具体的な態様では、ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウィルスベクターである。例えば、レンチウイルスベクターは、例えば、クロンテック（カリフォルニア州マウンテンビュー）又はジーンコピア（メリーランド州ロックビル）から市販されている。
【０１２９】
「調節配列」という用語は、ライゲーションされるコード配列の発現をもたらすのに必要であるＤＮＡ配列を指す。そのような調節配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物では、調節配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含む。真核生物では一般に、調節配列はプロモーター、ターミネーター、及び場合によっては、エンハンサー、トランス転写活性化因子、又は転写因子を含む。「調節配列」という用語は、最低でもその存在が発現に必要であるすべての構成要素を含み、さらなる有益な構成要素も含みうることが意図される。
【０１３０】
「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載される構成要素が、意図されたやり方で機能すること許容する関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」調節配列は、コード配列の発現が調節配列に適合する条件下で達成されるようにライゲーションされる。調節配列がプロモーターの場合、二本鎖の核酸が好ましく使用されることは当業者にとって明らかである。
【０１３１】
よってある実施形態では、記載のベクターは発現ベクターである。「発現ベクター」は選ばれた宿主を形質転換するのに使用できるコンストラクトであり、その選ばれた宿主内でコード配列の発現を提供する。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター、又は組込み型ベクターであることができる。発現は、核酸分子の転写、好ましくは、翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。原核細胞及び／又は真核細胞での発現を確実にする調節エレメントは当業者に周知である。真核細胞の場合、調節エレメントは、通常は、転写の開始を確実にするプロモーター、並びに随意に、転写の終結及び転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核生物の宿主細胞内での発現を許容する可能性のある調節エレメントとしては、例えば、大腸菌のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ、又はｔａｃプロモーターが挙げられ、真核生物の宿主細胞内での発現を許容する調節エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１若しくはＧＡＬ１プロモーター又は哺乳類細胞及び他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサー、若しくはグロビンイントロンである。
【０１３２】
転写の開始の原因となるエレメントの他に、そのような調節エレメントはまた、ＳＶ４０−ｐｏｌｙ−Ａサイト又はｔｋ−ｐｏｌｙ−Ａサイトなどの、ポリヌクレオチドの下流に転写終了シグナルを含みうる。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞コンパートメントに向けることができるリーダー配列又はポリペプチドを培地に分泌することができるリーダー配列が、記載の核酸配列のコード配列に付け加えられてもよく、当該技術分野において周知である。リーダー配列は、翻訳配列、開始配列及び終結配列、並びに好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部に分泌をペリプラズム又は細胞外の培地に向けることができるリーダー配列を用いて適切な段階で組み立てられる。随意に異種配列が、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化又は簡便な生成を与えるＮ末端同定ペプチド（N-terminal identification peptide）を含む融合タンパク質をコードできる。上記を参照されたい。これに関連して、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア）、ｐＥＦ−Ｎｅｏ、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ及びｐＥＦ−ＡＤＡ（Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150）、又はｐＳＰＯＲＴ１（ギブコＢＲＬ）などの好適な発現ベクターが当該技術分野において公知である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、発現調節配列は、真核生物宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションできるベクター中の真核生物プロモーター系であり、原核生物宿主用の調節配列も使用されうる。いったんベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高いレベルの発現に適した条件下で維持され、所望な場合、それに続いて本開示のポリペプチドは集められて精製されうる。
【０１３４】
さらなる調節エレメントは、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサーを含みうる。有利には、本開示の上記ベクターは選択可能マーカー及び／又は定量可能（scorable）マーカーを含む。形質導入された細胞の選択に有用な選択可能マーカー遺伝子は当業者に周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Reiss, Plant Physiol. (Life-Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン、及びパロマイシンに対する耐性を与えるｎｐｔ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995）、並びにハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Marsh, Gene 32 (1984), 481-485）を選択の根拠とする代謝拮抗物質耐性が挙げられる。さらなる選択可能遺伝子が記載されている。具体的には、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号）、及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）、又はブラストサイジンＳに対する耐性を付与するアスペルギルス・テレウス由来のアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338）である。
【０１３５】
有用な定量可能なマーカーもまた当業者に公知であり、市販されている。有利には、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121）、緑蛍光タンパク質（Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47）、又はベータ−グルクロニダーゼ（Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907）をコードする遺伝子である。本実施形態は、記載のベクターを含有する細胞、組織、及び生物を簡単且つ迅速にスクリーニングするのに特に有用である。
【０１３６】
上記のように、核酸分子は、単独で又は細胞内でコードされたポリペプチドを発現するためのベクターの一部として細胞に使用できる。本明細書において記載されているＴＣＲコンストラクトのいずれか１つをコードするＤＮＡ配列を含有する核酸分子又はベクターは、目的のポリペプチドを次に産生する細胞に導入される。記載の核酸分子及びベクターは、細胞への直接導入又はリポソーム若しくはウィルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のために設計されうる。ある実施形態では、細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＴＣＲ  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＭＳＣ、神経幹細胞、又は造血幹細胞である。
【０１３７】
上記に一致して、本開示は、本明細書において定義されるＴＣＲのポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む、遺伝子工学で従来使用されるベクター、具体的に、プラスミド、コスミド、ウイルス、及びバクテリオファージを得る方法に関する。ある特定の場合では、前記ベクターは発現ベクター及び／又は遺伝子導入若しくは標的ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターが、標的細胞集団への記載のポリヌクレオチド又はベクターの送達に使用されうる。当業者に周知である方法が組換えベクターを構築するのに使用でき、例えば、Sambrook et al.（上記引用文中（loc cit.））、Ausubel（１９８９、上記引用文中）、又は他の標準的な教科書に記載の手法を参照されたい。代替的に記載の核酸分子及びベクターは、標的細胞に送達するためのリポソーム中に再構成できる。本開示の核酸分子を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて異なる周知の方法によって宿主細胞内に移入できる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に利用される一方で、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理又はエレクトロポーレーションが使用されうる。上記Sambrookを参照されたい。
ＶＩ．併用療法
【０１３８】
本発明のある実施形態では、臨床の態様に関する本発明の方法は、抗がん剤などの、過剰増殖性疾患の治療に有効な他の薬剤と併用される。「抗がん」剤は、例えば、がん細胞を殺傷すること、がん細胞のアポトーシスを誘導すること、がん細胞の増殖速度を下げること、腫瘍転移の発生若しくは数を減らすこと、腫瘍サイズを減らすこと、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍若しくはがん細胞への血液の供給を減らすこと、がん細胞若しくは腫瘍に対する免疫反応を促進すること、がんの進行を予防又は阻害すること、又はがんをもつ対象の寿命を長くすることによって対象のがんに負の影響を及ぼすことができる。より一般的に、これらの他の組成物は細胞の増殖を止める又は阻害するのに有効な総量で供されることになる。この方法は、がん細胞を発現コンストラクト及び薬剤又は複数の因子と同時に接触させることを含みうる。これは、両薬剤を含む単一の組成物若しくは薬理学的製剤と細胞を接触させること、又は１つの組成物が発現コンストラクトを含み、もう１つが第２の薬剤を含む２つの異なる組成物又は製剤と細胞を同時に接触させることによって達成されうる。
【０１３９】
化学療法及び放射線療法の薬剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学において大きな問題である。現在のがん研究の目標の１つは、遺伝子治療と組み合わせることによって化学療法及び放射線療法の有効性を向上する方法を見出すことである。本発明と関連して、他のアポトーシス促進剤の又は細胞周期調節剤に加えて、化学療法介入、放射線療法介入、又は免疫療法介入と併せて、細胞療法が同様に使用されうることが企図される。
【０１４０】
代替的に、本発明の治療は、数分〜数週の範囲の間隔をあけて他の薬剤治療の前又は後に行われる。他の薬剤及び本発明が別々に個人に適用される実施形態では、該薬剤治療及び本発明の治療が細胞に対して有利に併用効果を依然発揮できることになるように、一般には必ず各送達の時間の間に相当長い期間が過ぎないようにするであろう。そのような例では、細胞を両モダリティー（modalities）と約１２〜２４時間内で互いに、より好ましくは、約６〜１２時間内で互いに接触させうることが企図される。しかし状況によっては、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６、若しくは７）〜数週（１、２、３、４、５、６、７、若しくは８）が経過する場合、治療の時間を大幅に延ばすことが望ましいことがある。
【０１４１】
さまざまな組み合わせが採用されうる。本開示を「Ａ」、放射線療法又は化学療法などの第２の薬剤を「Ｂ」とする。
【０１４２】
Ａ／Ｂ／Ａ        Ｂ／Ａ／Ｂ        Ｂ／Ｂ／Ａ        Ａ／Ａ／Ｂ        Ａ／Ｂ／Ｂ        Ｂ／Ａ／Ａ        Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ        Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
【０１４３】
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ              Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ              Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ              Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ            Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ            Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
【０１４４】
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ              Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ              Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ            Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ            Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ            Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１４５】
必要に応じて治療サイクルが繰り返されるであろうことが予想される。また、さまざまな標準的な療法及び外科的介入が本発明の細胞療法と併用して適用されうることも企図される。
Ａ．化学療法
【０１４６】
またがん療法は、化学薬品に基づいた治療及び放射線に基づいた治療の両方との多様な併用療法を含む。併用抗がん剤としては、例えば、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；メシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキセート；エフロルニチン（eflornithine）塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン（fluorocitabine）；ホスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン（ilmofosine）；イプロプラチン；イリノテカン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；リュープロレリン酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン（metoprine）；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパラガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；ミトラマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニマスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌール（sulofenur）；タリソマイシン；テコガランナトリウム；タキソテール；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシナート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩；２０−エピ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫ拮抗剤；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；拮抗剤Ｄ；拮抗剤Ｇ；アンタレリックス；抗背側化形態形成タンパク質（dorsalizing morphogenetic protein）−１；抗アンドロゲン、前立腺がん；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子調節剤；アポトーシス制御因子；アプリン酸；アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗剤；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータアレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔＭ３；ＣＡＲＮ７００；軟骨由来阻害物質；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クラムベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタンスレキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデンミンＢ（dehydrodidenmin B）；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド（dexifosfamide）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン：ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲン作動薬；エストロゲン拮抗薬；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン（fluorodaunorunicin）塩酸塩；ホルフェニメクス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；ガリウム硝酸塩；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イマチニブ（例えば、グリベック（登録商標））、イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様成長因子−１受容体阻害剤；インターフェロン作動薬；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４−；イロプラクト（iroplact）；イルソグラジン；イソベンガゾール（isobengazole）；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリンＮトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトールスタチン；レトロゾール；白血病阻止因子；白血球アルプァインターフェロン；リュープロレリン＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメテレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロキソリビン；ラルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン（lysofylline）；細胞溶解性ペプチド（lytic peptides）；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン（meterelin）；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；アービタックス、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリア（myobacterium）細胞壁ｓｋ；モピダモール；マスタード抗がん剤；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（napavin）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン：ネリドロン酸；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節剤；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン（nitrullyn）；オブリメルセン（ゲナセンス（登録商標））；Ｏ．ｓｕｐ．６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシオン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペグアスパラガーゼ；ペルデシン；ペントサン多硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセンチンＡ；プラセンチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａベース免疫調節剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、ミクロアルガル（microalgal）；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合体；ｒａｆ拮抗剤；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓタンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロン酸塩（rhenium Re 186 etidronate）；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス
；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣剤；セムスチン；老化細胞由来阻害物質１（senescence derived inhibitor 1）；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シゾフラン（sizofuran）；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテイト；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸管ペプチド拮抗剤；スラジスタ（suradista）；スラミン；スワインソニン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣剤；チマルファシン；チモポエチン受容体作動薬；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイントリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；泌尿生殖洞増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体拮抗剤；バプレオチド；バリオリンＢ；ベラレゾール（velaresol）；ベラミン（veramine）；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマー、又は前述のものいずれかのアナログ若しくは誘導体バリアント並びにまたその組み合わせが挙げられる。
【０１４７】
具体的な実施形態では、例えば、本発明の投与前、投与中、及び／又は投与後に、本発明と併せて個人に対する化学療法が採用される。
Ｂ．放射線療法
【０１４８】
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されてきた他の因子としては、一般的にガンマ線として知られているもの、Ｘ線、及び／又は腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達が挙げられる。マイクロ波及びＵＶ照射などのＤＮＡ損傷因子の他の形態も企図される。これらの因子のすべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＡＮの複製及び修復、並びに染色体の構築及び維持に対して広範囲の損傷をもたらす可能性が非常に高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）の一日線量５０〜２００レントゲンから単回投与の２０００〜６０００レントゲンに及ぶ。放射性同位元素の投与量は非常にさまざまであり、放射性同位元素の半減期、放出放射線の強さ及び種類、及び新生腫瘍細胞による取り込みに依存する。
【０１４９】
細胞に適用される場合、「接触させた（contacted）」及び「曝された（exposed）」という用語は、本明細書において、治療コンストラクト及び化学療法剤又は放射線療法剤が標的細胞に送達されたり、標的細胞に直接並置されたり過程を表現するのに使用される。細胞殺傷又は細胞静止を達成するには、両剤は細胞の殺傷又は細胞分割の防止に有効な総量で細胞に送達される。
Ｃ．免疫療法
【０１５０】
免疫療法剤は一般に、がん細胞を標的にし、破壊する免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体でありうる。抗体は単独で治療とエフェクターとして役目を果たすこともあり、又は抗体は細胞殺傷を実際にもたらす他の細胞を動員することもある。また、抗体は薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合され、単に標的剤として働きうる。代替的に、エフェクターは、直接的又は間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子をもつリンパ球であってもよい。多様なエフェクター細胞としては細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
【０１５１】
よって、本明細書において記載される本発明の療法以外の免疫療法は、併用療法の一部として本細胞療法と共に使用されうる。併用療法の一般的な方法を以下に論じる。一般に腫瘍細胞は、標的にしやすい、つまり、大部分の他の細胞にはないいくつかのマーカーをもたなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、それらのいずれも本発明に関連して標的にするのに好適でありうる。一般的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原（Sialyl Lewis Antigen）、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、及びｐ１５５が挙げられる。
【０１５２】
ある実施形態では、免疫療法は、Ｎｏｔｃｈ経路リガンド又は受容体に対する抗体、例えば、ＤＬＬ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、Ｆｚｄ７、又はＷｎｔに対する抗体である。ある実施形態では、免疫療法は、ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、又はＲＳＰＯ４に対する抗体である。
Ｄ．遺伝子
【０１５３】
さらに別の実施形態では、第２の治療は治療用ポリヌクレオチドが本発明の臨床実施形態の前、後、または同時に投与される遺伝子治療である。多様な発現産物が本発明に包含され、例えば、細胞増殖の誘導物質、細胞増殖の阻害物質、又はプログラム細胞死の調節物質が含まれる。
Ｅ．手術
【０１５４】
がんをもつ人の約６０％が、予防手術、診断及びステージング手術、根治手術、並びに姑息的手術を含む何らかの手術を受けると推定される。根治手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／又は代替療法などの他の療法と併せて用いられるうるがん治療である。
【０１５５】
根治手術は、全部又は一部のがん性組織が物理的に除去、切除、及び／又は破壊される切除術を含む。腫瘍切除術は少なくとも一部の腫瘍の物理的除去を指す。腫瘍切除術にくわえて、手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡下手術（モース術）を含む。本発明が、表在がん、前がんの除去、又は偶発量の正常組織の除去と併せて用いられうることがさらに企図される。
【０１５６】
がん性細胞、組織、又は腫瘍の一部又は全部を切除するときに、体内に空洞が形成される場合がある。治療は、さらなる抗がん療法と共に、領域の灌流、直接注射、または局所適用により達成されうる。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７日毎、又は１、２、３、４、及び５週間毎、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２か月毎に繰り返してもよい。また、これらの治療はさまざまな投薬量のものであってもよい。
Ｆ．他の薬剤
【０１５７】
治療の治療有効性を向上するのに本発明と併用して他の薬剤が使用されることが企図される。これらのさらなる薬剤としては、免疫調節剤、細胞表面受容体及びギャップ結合の増加に影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、又はアポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる薬剤が挙げられる。免疫調節剤としは、腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマ；ＩＬ−２及び他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋ及び他のサイトカインアナログ；又はＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、及び他のケモカインが挙げられる。Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４又はＤＲ５／ＴＲＡＩＬなどの細胞表面受容体又はそのリガンドの増加が、過剰増殖細胞への自己分泌又は傍分泌効果を確立することによって本発明のアポトーシス誘導能を増強するであろうことがさらに企図される。ギャップ結合の数が増えることによる細胞間のシグナリングの増加は、隣接する過剰増殖細胞集団への抗過剰増殖効果を増加させるであろう。その他の実施形態では、細胞増殖抑制剤又は分化剤が本発明と併用されて治療の抗過剰増殖効能を向上できる。細胞接着の阻害剤は本発明の有効性を向上するのに企図される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。さらに、抗体ｃ２２５などの過剰増殖細胞のアポトーシスに対する感度を上げる他の薬剤が、治療有効性を向上するのに本発明と併用して使用されうることが企図される。
【実施例】
【０１５８】
下記の例が、本発明の好ましい実施形態を説明するために含まれる。下記の例に開示される手法が、本発明の実行に良好に機能するように発明者によって発見された手法を表わし、よってその実行に好ましいやり方を構成するものとみなされうることが当業者によって理解されるべきである。しかし、本開示に照らして、多くの変更が開示されている具体的な実施形態においてなされる可能性があり、それでもやはり本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることを当業者は理解すべきである。
実施例１
選択的抗腫瘍効果をもつ自己サバイビン特異的Ｔ細胞クローンの生成
【０１５９】
ＨＬＡ−Ａ＊０２＋健康な提供者から採取した末梢血試料を使用して、そのヘテロクリット性バリアントサバイビン９６−１０４９７Ｍ（ＬＭＬと呼ぶ；ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ；配列番号１６）を用いて、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−拘束性サバイビン９５−１０４（ＥＬＴと呼ぶ；ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ；配列番号１５）エピトープに対して特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生成した（Andersen, et al., 2001）。
【０１６０】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔで評価すると、３回の抗原特異的刺激後、５つのＣＴＬ株のうち３つ（提供者＃２、４、及び５に由来）が、ＬＭＬ（６４３±５、４９±１、及び９６±７ＳＦＣｓ／１０５個のＴ細胞）並びにＥＬＴペプチド（６６２±６５、４５±６、及び８６±９ＳＦＣｓ／１０５個のＴ細胞）の両方に特異的に反応した。最も反応性のある提供者（＃２）から限界希釈によって単一Ｔ細胞クローンを生成し、サバイビン特異的と非特異的な（無関係）クローンを比較する複数のアッセイを用いて、最適な機能的アビディティーをもつクローンを同定した。具体的には、クローン＃２４が、ＬＭＬ四量体に対して最も高い特異性（＞９９％）（図１Ａ）及びＬＭＬとＥＬＴペプチドともに最も高いＴＣＲアビディティーを示した（ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価した場合、１０−７Ｍ（図１Ｂ）、並びに標準的な５１Ｃｒ放出で測定した場合、ＬＭＬに対して５ｘ１０−８Ｍ及びＥＬＴに対して１０−６Ｍ（図１Ｃ））。クローン＃２４の機能的アビディティーは、「同胞殺し」ＴＣＲに関してそれまで記載されていた広い範囲のアビディティーと重なった（表１）。重要なことには、クローン＃２４はＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋腫瘍細胞株ＢＶ１７３（白血病）及びＵ２６６（骨髄腫）に対して細胞傷害活性（図１Ｄ）、並びにＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋白血病前駆体のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の阻害（図１Ｅ）を示した。対照的に、同じクローンは、ＨＬＡ−Ａ＊０２−サバイビン＋細胞株ＨＬ−６０に対しても、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋正常造血前駆細胞（図１Ｄ、Ｅ）に対しても細胞傷害性ではなかった。このクローンはインビトロで効果的に増殖し（３週間後＞６３倍増殖）（図１Ｆ）、検出可能なＴ細胞同胞殺し効果がないことを示した。
【０１６１】
表１．ＬＭＬペプチドでパルスしたＴ２細胞に対するサバイビン特異的Ｔ細胞クローンの機能的アビディティー
【表１】
2017534280.tif 000002
【０１６２】
ＴＣＲ  Ａ６６、ＴＣＲ  Ａ７１、及びＴＣＲ  Ａ７２は、既報のアロ拘束性サバイビン特異的ＴＣＲである（Leisegang, et al, 2010）。
実施例２
サバイビン特異的ＴＣＲを発現するように組換え操作されたポリクローナルＴ細胞は同胞殺しではない
【０１６３】
クローン＃２４のＴＣＲα鎖及びβ鎖（以下、ｓ２４−ＴＣＲという）を、クローニングし、コドンを最適化し、定常領域をマウスの対応する領域で置換した後、レトロウィルスベクターにコードした（図２Ａ）。ＴＣＲ鎖利用及び相補性決定領域は、これまで既報の同胞殺しＴＣＲ（表２及び表３）と全く異なった。
【０１６４】
表２．サバイビン特異的ＴＣＲα鎖利用
【表２】
2017534280.tif 000003
【０１６５】
国際免疫遺伝情報システム（international Immunogenetics information system）のウェブサイトwww.imgt.orgに従った術語体系。ＴＣＲ  Ａ６６、ＴＣＲ  Ａ７１、及びＴＣＲ  Ａ７２の配列は、同胞殺しを伴う既報のアロ拘束性サバイビン特異的ＴＣＲである（Leisegang, et al., 2010）。
【０１６６】
表３．サバイビン特異的ＴＣＲβ鎖利用
【表３】
2017534280.tif 000004
【０１６７】
国際免疫遺伝情報システムのウェブサイトwww.imgt.orgに従った術語体系。ＴＣＲ  Ａ６６、ＴＣＲ  Ａ７１、及びＴＣＲ  Ａ７２の配列は、同胞殺しを伴う既報のアロ拘束性サバイビン特異的ＴＣＲである（Leisegang, et al., 2010）。
【０１６８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入し、ＬＭＬペプチドでパルスした人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）及びＩＬ−２の存在下で増殖させた。形質導入直後、８９％±４％のＴ細胞がマウス定常β鎖（ｍＣβ＋）に関して染色され、４７％±３２％がＬＭＬ四量体で染色された（図２Ｂ）。平均蛍光強度（ＭＦＩ）が２６±１２で、ＬＭＬ四量体に関する陽性度はあまり大きくないが、ＬＭＬでパルスしたａＡＰＣの存在下で増殖後、ＬＭＬ四量体＋細胞は著しく富化した（９７％±１％）（図２Ｂ、Ｃ）。異所的に発現したｓ２４−ＴＣＲは機能し、ＬＭＬ（７２５±２７４ＳＦＣｓ／１０５個のＴ細胞）及びＥＬＴ（９７８±３４１ＳＦＣｓ／１０５個のＴ細胞）ペプチド双方に応答してｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γを産生した（図３Ａ）。また、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞は、ＬＭＬペプチドでパルスしたＴ２細胞を溶解し（７７％±８％特異的溶解、Ｅ：Ｔ  ２０：１）（図３Ｂ）、細胞傷害活性がＭＨＣクラスＩブロッキング抗体で予めインキュベーションすることによって著しく減少したので（図３Ｃ）（５３％±１０％特異的溶解、Ｅ：Ｔ  ２０：１；ｐ＝０．０３）、その溶解はＨＬＡ拘束的である。ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞が同胞殺しを生じなかったことを確認するために、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋提供者とＨＬＡ−Ａ＊０２−提供者の両方から生成されたｓ２４−ＴＣＲ＋細胞の表現型、増殖、及び細胞傷害活性を比較した。ＴＣＲは両者ともに効率的に発現されており（図９）、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞はＬＭＬでパルスしたａＡＰＣ及びＩＬ−２に応えて同様に増殖した（３回の刺激後、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋提供者及びＨＬＡ−Ａ＊０２−提供者はそれぞれ、６６±３８対７６±３８倍増殖）（図３Ｄ）。さらに、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｔ細胞に対してｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞による検出可能な細胞傷害活性はなかった。図３Ｅ及びＦに示されるように、活性化されたＴ細胞の溶解はごくわずかであった（２％±４％対６％±３％特異的溶解、Ｅ：Ｔ  ２０：１、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋提供者対ＨＬＡ−Ａ＊０２−提供者）。これらの細胞はＬＭＬ又はＥＬＴペプチドを積載した後のみ、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞による標的可能となった（ＬＭＬ積載Ｔ細胞について４６％±１２％対５５％±７％特異的溶解；ＥＬＴ積載Ｔ細胞について６８％±１４％対６２％±１６％、Ｅ：Ｔ  ２０：１、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋提供者対ＨＬＡ−Ａ＊０２−提供者）。予想された通り、対照Ｔ細胞は活性化されたＴ細胞に対して細胞傷害活性がなかった（図３Ｅ、Ｆ）。
実施例３
サバイビンＴＣＲリダイレクトＴ細胞は正常造血前駆細胞に対する傷害性なしに抗腫瘍活性を発揮する
【０１６９】
同胞殺しが無いことが抗腫瘍活性の減少を犠牲にして起こらなかったことを確かめるために、サバイビン＋血液悪性腫瘍に対するｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を評価した。ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞では、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋白血病細胞株ＢＶ１７３（２０：１のＥ：Ｔ比で４６％±１４％特異的溶解）及びＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋多発性骨髄腫由来細胞株Ｕ２６６（２７％±１２％）の溶解が、対照Ｔ細胞（それぞれ、８％±６％及び１４％±６％）と比較してより多く生じた（ＢＶ１７３に対してｐ＜０．００１、Ｕ２６６に対してｐ＝０．００３）（図４Ａ）。対照的に、形質導入Ｔ細胞及び対照Ｔ細胞の両方で、対照標的であるＨＬＡ−Ａ＊０２−サバイビン＋白血病細胞株Ｋ５６２及びＨＬ−６０に対してごくわずかの殺作用が見られた（図４Ａ）。ＨＬＡクラスＩブロッキング抗体での標的細胞を予めインキュベーションすることでＢＶ１７３及びＵ２６６細胞に対する細胞傷害活性が妨げられたので、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の細胞傷害活性はＭＨＣクラスＩ拘束性であった（図４Ｂ）。対照Ｔ細胞又はｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞をこれらのＨＬＡ−Ａ＊０２＋サバイビン＋腫瘍細胞と５日間共培養した長期間のアッセイでは、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の存在下においてのみＢＶ１７３及びＵ２６６腫瘍細胞ともに著しい減少があった（図４Ｃ、図１０）。これらの細胞傷害性効果は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価されたＢＶ１７３及びＵ２６６細胞株に対するｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生（図４Ｄ）並びにサイトメトリービーズアレイで評価されたＴｈ１サイトカインの放出（図１１）と同時に起きた。また、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞抗腫瘍効果は、原発白血病試料に対するＣＦＵアッセイでも確認された。図４Ｅに示されるように、白血病ＣＦＵ形成は、対照Ｔ細胞と比較して、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞とインキュベーションした５つのＨＬＡ−Ａ＊０２＋白血病試料すべてで著しく減少し、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の存在下でのＣＦＵ形成の減少は中央値が４８％であった（範囲３２〜７８％；ｐ＝０．０３）。くわえて、２つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１−白血病試料に対して細胞傷害性効果は見られなかった（図４Ｆ）。際立って対照的に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋健康な提供者由来の造血幹細胞／前駆細胞のＣＦＵ形成は、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞でのインキュベーションに影響されず、対照Ｔ細胞との培養と比較して、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の存在下でＣＦＵはわずか中央値３％の減少であった（図４Ｇ）。
実施例４
サバイビンＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は生体内で抗腫瘍活性をもち、生存を向上する
【０１７０】
ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の生体内抗腫瘍機能を確認するために、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬｕｃ）で遺伝子改変されたＢＶ１７３細胞を全身的に移植した異種間ＮＳＧマウスモデルを使用し、生物発光イメージング（ＢＬＩ）で腫瘍増殖をモニターした。残留白血病に似た症状を呈する条件で、白血病輸注に次の日、マウスは対照Ｔ細胞又はｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞のいずれかで養子Ｔ細胞移入を受けた（図５Ａ）。輸注４０日目後、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞で処理したマウスは、対照Ｔ細胞を受けたマウスと比べて著しくより良く白血病進行を制御した（８．１×１０６±９×１０６対１９５×１０６±８５×１０６光子／秒）（ｐ＝０．００３）（図５Ｂ、Ｃ）。これはｓ２４−ＴＣＲ＋で処理したマウスの全生存期間が８０日まで改善することにつながり（ｐ＜０．００１）（図５Ｄ）、１０頭のうち３頭のｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞処理マウスは腫瘍が無くなった。白血病量（leukemic burden）が高いマウスでの抗腫瘍活性を測定するために、疾患播種及び量がＢＬＩによって確認された白血病接種（leukemia inoculation）の２週間後にＴ細胞を輸注した（図６Ａ）。ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞を受けたマウスは、対照マウスと比べて白血病の進行が著しく遅く、結果として２８日まで生物発光信号が弱かった（図６Ｂ、Ｃ）（４０×１０６±７１×１０６対１２８×１０６±１７６×１０６光子／秒）（ｐ＝０．０４）。このＴＣＲ媒介抗白血病活性はマウスの生存の著しい向上（ｐ＝０．０１）につながった（図６Ｄ）。
実施例５
アラニンスキャニングはサバイビンエピトープの認識に最適化されたＴＣＲ結合様式を明らかにする。
【０１７１】
ｓ２４−ＴＣＲが同胞殺し又は正常造血細胞に対する傷害性なしに抗腫瘍活性を生じた機序を理解するために、ｓ２４−ＴＣＲ又は既報の「同胞殺し」ＴＣＲ（Ａ７２−ＴＣＲ）（Leisegang, et al., 2010）のいずれかを発現しているＴ細胞を同時並行実験で比較した。いずれかのＴＣＲを発現するＴ細胞の間でインビトロでの抗腫瘍活性の点で有意差は見られなかったが（図７Ａ）、Ａ７２−ＴＣＲを発現するＴ細胞のみが、自己反応性（図７Ｂ）及び正常造血幹細胞／前駆細胞に対する傷害性を示した（図７Ｃ）。さらに、Ａ７２−ＴＣＲ＋Ｔ細胞は、線維芽細胞（図７Ｄ）及び心筋細胞（図７Ｅ）などの非造血細胞に対する細胞傷害活性も示したが、ｓ２４−ＴＣＲ＋細胞は示さなかった。重要なことには、標的をＨＬＡ−Ａ＊０２０１発現を調節するＩＦＮ−γで予めインキュベーションした場合などの、炎症性傷害に似た症状を呈する条件においてさえも、ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるより安全なプロファイルが保たれた（図１３）。ｓ２４−ＴＣＲ＋Ｔ細胞は、Ａ７２−ＴＣＲ＋Ｔ細胞と比較して、優れた腫瘍制御を仲介した（ｐ＜０．０００１）（図１４）ので、この好ましい傷害性プロファイルはＢＶ１７３腫瘍モデルの生体内抗腫瘍活性の減少に起因するものではなかった。
【０１７２】
コンピューターモデリング研究から、大部分がＨＬＡ−Ａ＊０２溝（groove）と相互作用するＡ７２−ＴＣＲと対照的に、ｓ２４−ＴＣＲの選択的腫瘍特異性がＴＣＲとサバイビン−ＭＨＣ複合体との狭く延びたインターフェースに依存することが示された。具体的には、ｓ２４−ＴＣＲは、Ｌｅｕ４、Ｇｌｙ５、及びＰｈｅ７を含むサバイビンペプチドの局所領域とともに数多くの芳香族残基が関与する高度に最適化された物理的相互作用のネットワークを創った。次いで、この構造解析は、サバイビンペプチドのアラニン置換実験によって行われたＴＣＲ−ペプチド−ＭＨＣ相互作用の機能解析によって裏付けられた。図８に示されるように、１０箇所の単置換のうち７つがＩＦＮ−γ放出を完全に抑止し、且つ１０箇所のうち３つがＩＦＮ−γ放出を著しく減少させたので、サバイビンペプチドの一つ一つの残基（１０／１０）が、ｓ２４−ＴＣＲ機能的活性化に極めて重要なようであった。対照的に、１０箇所の置換うち３つのみがＡ７２−ＴＣＲ活性化の完全な機能喪失に極めて重要であり（図８）、より小さく少ない最適ＴＣＲ−ペプチド結合様式を示唆した。予測モデルとアラニン置換分析の両方に基づいて、ＸＬＴＸＧＥＦＬＫＸ（配列番号１３）及びＸＸＸＬＸＸＦＬＫＬ（配列番号１４）のモチーフを含有するタンパク質配列についてＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータ塩基配列に照会をかけて、潜在的な交差反応性エピトープを同定した。造血系又はＴリンパ球を含む免疫系の細胞に関連した７つのペプチドが選ばれた。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイから、Ａ７２−ＴＣＲはこれらのペプチドの数個でパルスしたＴ２細胞に対して反応したが、ｓ２４−ＴＣＲは反応しなかったことが示された（表４）。
【０１７３】
表４．同種異系レパトア由来に対比した自己レパトア由来のサバイビンＴＣＲの異なる分子認識パターン
【表４】
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【０１７４】
アラニン置換分析によって予想されたＡエピトープは、Ｔ２細胞に載っており、ｓ２４−ＴＣＲ＋又はＡ７２−ＴＣＲ＋Ｔ細胞による反応性はＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価した。３名の提供者の代表的な結果。略称：ＣＤ３ｄ：ＣＤ３デルタ；ＣＤ８１：ＣＤ８１抗原；ＣＳＦ３Ｒ：顆粒球コロニー刺激因子受容体；ＣＲＬＳ１：カルジオリピンシンターゼ；ＥＰＢ４２：赤血球膜タンパク質バンド４．２．；ＩＮＧＲ２：インターフェロンγ受容体２。
実施例６
あるいくつかの実施形態のまとめ
【０１７５】
本開示は、ポリクローナルＴ細胞に移植されたとき、自己傷害性を生じることなくインビトロでも生体内でも多様な腫瘍細胞を除去するのに十分な機能的アビディティーを示す新規のサバイビン特異的ｓ２４−ＴＣＲの自己ＴＣＲレパトアからの単離を示す。この新規のＴＣＲは、自己組織上サバイビンを腫瘍関連サバイビン発現と識別することができ、「オンターゲット  オフ腫瘍」傷害性なしに抗腫瘍反応性を選択的に仲介する。機能性データは、ｓ２４−ＴＣＲの選択的腫瘍特異性がＴＣＲとサバイビン−ＭＨＣ複合体との高度に特異的な相互作用に依存することを明らかにする。よって、ＴＣＲによる自己ペプチドの最適認識はその選択性を与え、交差反応性、したがって自己反応性を最小限にする。その知見は、機能的なサバイビン特異的ＴＣＲは傷害性があり、よって臨床での使用には適さないというこれまでの結論や、そのようなＴＣＲによって仲介される同胞殺し効果は活性化されたＴ細胞の「オンターゲット」認識のみに起因という主張（Leisegang, et al., 2010）に異議を唱える。観察結果から、数種の異なるＴＡＡを標的にする自己又は同種異系レパトアに由来する７つのさらなるＴＣＲのセットに関する比較分析において一般化され、胸腺選択段階がＴＣＲ交差反応性を最小限するのに極めて重要であることが示唆された。
【０１７６】
多くの研究から、サバイビンが大部分のがんで増加しているが、ＣＤ３４＋造血幹細胞、Ｔリンパ球（Altieri, 2003）及び心筋細胞（Wohlschlaeger, et al., 2010; Levkau, 2011）などの正常細胞でも機能的であることが示されている。例えば、コンディショナルノックアウトマウスでは、サバイビン欠失は初期にはダブルネガティブ細胞からダブルポジティブ細胞へのＴ細胞転換を阻止し、一方で後期には循環血液中のその数が減少することが示されている（Xing, et al., 2004）。また、サバイビンはヒトＴ細胞においてＴＣＲ架橋すると増加することがわかった（Leisegang, et al., 2010; Kornacker, et al., 2001）。サバイビンはうっ血性心不全の間（Wohlschlaeger, et al., 2010）及び虚血再灌流心（Levkau, 2011）における心筋細胞リモデリングの拡散に関与する。こられのサバイビンの機能活性にもかかわらず、の幹細胞移植後にサバイビンベースのワクチンを受けた患者において、自己由来サバイビン特異的ＣＴＬの惹起があっても、心毒性及び幹細胞生着又はＴ細胞再構成の遅れは報告されていない（Rapoport, et al., 2011）。この臨床での経験に一致して、正常造血前駆体の増殖傷害が存在せず、ｓ２４−ＴＣＲリダイレクトＴ細胞の存在下におけるＴ細胞増殖への悪影響は少しもなかった。白血病前駆体及び腫瘍細胞はインビトロでも生体内でもｓ２４−ＴＣＲを発現するポリクローナルＴ細胞によって著しく殺傷されたので、この安全性プロファイルは抗腫瘍効果を弱めることなく現れた。よって、これらのデータから、ｓ２４−ＴＣＲは腫瘍標的を認識するが、認識の閾値を下回って抗原を発現する健康な細胞に対して「寛容」であることが示唆される。対照的に傷害性効果は、同種異系ＨＬＡミスマッチＴＣＲレパトアから単離されたＡ７２−ＴＣＲを発現するポリクローナルＴ細胞によって常時誘導された。
【０１７７】
ｓ２４−ＴＣＲが腫瘍細胞を選択的に認識するという結論は、少なくともサバイビンエピトープの機能的アラニン置換分析によって支持される。これらの研究は、ｓ２４−ＴＣＲがサバイビンペプチドとその最も強い相互作用の大部分を確立し、一方で既知の「同胞殺し」Ａ７２−ＴＣＲはペプチドと交差反応しやすいので、ｓ２４−ＴＣＲは「同胞殺し」でも自己反応的でもないことを示す。その知見は、生来の交差反応性は、任意のペプチド−ＭＨＣ複合体における限られた数のホットスポット残基に集中しているようであることを示す以前の研究と一致する（Tynan, et al., 2005; Birnbaum, et al., 2014）。これまでのマウスでの研究から、生理的条件で起こる負の選択はＴＣＲによって認識される異なるリガンドの数を大幅に制限するのでペプチド交差反応性は同種異系の設定でのみ起こることが示された（Huseby, et al., 2003）。交差反応性ＴＣＲは負の選択が実験的に制限されているマウスでのみ観察でき、よって標的ペプチド内のアミノ酸置換が「許容されている（accepting）」（Huseby, et al., 2006）。アロ拘束性サバイビンＴＣＲに対比して自己由来のサバイビンＴＣＲの分子認識パターン比較することによって、ｓ２４−ＴＣＲが天然のサバイビン発現レベルを腫瘍サバイビン発現レベルと識別する能力に関する機構を説明する分子決定因子が特定された。したがって、同種異系ＴＣＲレパトアから生成されたサバイビン特異的Ａ７２−ＴＣＲとともに報告されている「同胞殺し」効果は、活性化されたＴ細胞の「オンターゲット」認識の閾値が下がることに起因しうるだけでなく、最適ではないペプチド−ＴＣＲ相互作用による交差反応性ペプチドの「オフターゲット」認識にも起因しうると考えられた。結果として、ｓ２４  ＴＣＲと比較すると、Ａ７２−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の生体内抗腫瘍機能は、実際にＢＶ１７３マウスモデルで観察されたように限定されうる。さまざまなＴＡＡを標的にする自己及び同種異系ＴＣＲのさらなるセットでの知見を検証することによって、研究が示唆するのは、「オフターゲット」傷害性の可能性のある交差反応性が同種異系レパトアから単離されたＴＣＲのより一般的な課題でありうることである。その知見はトランスジェニックＴＣＲを手段として用いる治療腫瘍標的に幅広い影響をもつ。同種異系若しくは異種レパトア由来のＴＣＲ又は実験的に増強されたアフィニティーをもつＴＣＲは、高アフィニティーＴＣＲを得る手段として広く使われてきたが、自己レパトアは依然として有効な方法に変わりない。
【０１７８】
結論として、本開示は、エピトープ特異性、抗腫瘍活性があり、自己反応性が無いという要件を満たすＴＣＲの異所性発現の手段を用いて、がん免疫療法における標的としてのサバイビンの妥当性を再確立する。このＴＣＲは、ＭＨＣ−エピトープ複合体の最適で且つ選択的な認識に依存し、腫瘍標的と対比して自己組織上のサバイビン抗原レベルを感知することができる。この方法は、他の共通腫瘍／自己抗原を標的にするさらなるＴＣＲの同定に適応でき、ＴＣＲ媒介自己反応性を生じるリスクを軽減する。
実施例７
例示的方法
細胞株
【０１７９】
腫瘍細胞株ＢＶ１７３（Ｂ細胞急性リンパ性白血病）はドイツ培養細胞系統保存機関（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手し、並びに腫瘍細胞株Ｕ２６６Ｂ１（多発性骨髄腫）、Ｋ５６２（赤白血病）、ＨＬ−６０（急性骨髄単球性白血病）、ＣＥＭ−Ｔ２（ＴＡＰトランスポーター欠損）、２９３Ｔ、及び心筋細胞株ＡＣ１０は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から入手した。細胞は、業者の推奨による１０％又は２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ハイクローン）、１％Ｌ−グルタミン、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン）を含有する、２９３Ｔ細胞ついてはＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン、サーモサイエンティフィック社、マサチューセッツ州ウォルサム）若しくはＩＭＤＭ培地（ギブコ、インビトロジェンライフテクノロジーズ、ニューヨーク州グランドアイランド）、又はＡＣ１０細胞についてはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコ）を用いて、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気で３７℃にて培養して維持した。以前の記載（Hoyos, et al., 2010）の通りに、ＢＶ１７３細胞株にホタルルシフェラーゼ（ＦＦｌｕｃ）及びネオマイシン耐性遺伝子をコードするレトロウィルスベクターを形質導入した。Ｋ５６２細胞株を遺伝子操作してＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子並びに共刺激分子としてＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、及びＯＸ４０Ｌを発現させ、Ｔ細胞増殖のための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）として使用した（Quintarelli, et al., 2008）。細胞株は、テキサス大学州ＭＤアンダーソンがんセンター特性化済み細胞株コア施設（Characterized Cell Line Core Facility）により認証された。高分解能シーケンスベースタイピング（ヒューストンメソジスト病院、テキサス州ヒューストン）で、ＡＣ１０細胞はＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋であることを確認した。
健康な提供者及び白血病患者由来の試料
【０１８０】
健常ボランティア血液提供者のバフィーコートは、湾岸地域血液センター（Gulf Coast Regional Blood Center）、テキサス州ヒューストンを通して入手した。非特定化された臍帯血（ＣＢ）ユニットは、ＩＲＢ承認プロトコールに基づいてＭＤアンダーソン臍帯血バンク（テキサス大学、テキサス州ヒューストン）を通して入手した。非特定化されたＡＭＬ又はＣＭＬ患者の末梢血（ＰＢ）及び骨髄（ＢＭ）試料は、地域施設内審査委員会（ＩＲＢ）承認プロトコール（ベイラー医科大学、テキサス州ヒューストン）に従って採取するか、テキサス小児がんセンター組織バンク（Texas Children' s Cancer Center Tissue Bank）によって提供された。皮膚線維芽細胞は、地域ＢＣＭ−ＩＲＢ承認プロトコールに従ってＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋健康な提供者（高分解能シーケンスベースタイピングにより確認、ヒューストンメソジスト病院、テキサス州ヒューストン）から採取し、以前に報告されている通りに（Leen, et al., 2004）生成した。
ペプチド及びアラニン置換実験
【０１８１】
天然の１０ｍｅｒのペプチドであるサバイビン９５−１０４  ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（ＥＬＴ；配列番号１５）、そのヘテロクリット性の９ｍｅｒのバリアントサバイビン９６−１０４９７Ｍ  ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（ＬＭＬ；配列番号１６）、メラノーマ優先発現抗原メラノーマ優先発現抗原（Preferentially Antigen Expressed in Melanoma）（ＰＲＡＭＥ）Ｐ４３５（Ｐ４３５、ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ［配列番号２９］）、ＰＲＡＭＥ  Ｐ３００（Ｐ３００、ＡＬＹＶＤＳＬＦＦＬ［配列番号３０］）、ＭＡＲＴ−１  ＥＬＡ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ［配列番号３１］）、チロシナーゼＹＭＤ（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ［配列番号３２］）、及びこれら全てのペプチドの各アミノ酸位置のアラニン置換バリアントは、Ｇｅｎｅｍｅｄｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社（テキサス州サンアントニオ）によって合成された。ペプチドはすべてＤＭＳＯに再溶解し、他に指示がない限り５μＭの濃度で使用した。メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）Ｐ４３５ペプチド（Ｐ４３５、ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ；配列番号１７）又はインフルエンザマトリックスタンパク質５８−６６（ｆｌｕ、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番１８）を無関係対照（Quintarelli, et al., 2008）として用いた。トランスジェニックＴ細胞によるＨＬＡ−ペプチド複合体の認識を、ペプチドでパルスしたＴ２細胞を標的にして用いるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって分析した。
サバイビン特異的Ｔ細胞株及びクローンの生成と増殖
【０１８２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．社、ニューヨーク州ウエストベリー）密度勾配遠心によって単離した。以前に記載されているように（Quintarelli, et al., 2008）、ＨＬＡ−Ａ２ステータスをフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価し、サバイビン特異的Ｔ細胞株をＨＬＡ−Ａ２陽性提供者から生成した。簡単に記載すると、樹状細胞（ＤＣ）を（ＣＤ１４＋ビーズ及び手動ＭＡＣＳカラム、ミルテニーバイオテク、カリフォルニア州オーバーンを用いて）ＣＤ１４で選択した単球から精製し、成熟させた後に５μＭの特異的ペプチドで３７℃にて２時間パルスした。次にＤＣを使用して、自己由来のＣＤ８＋Ｔ細胞（免疫磁気選択によって得た、ミルテニーバイオテク）を、２０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比にて、完全ＣＴＬ培地（４５％クリック培地（アーバイン・サイエンティフィック、カリフォルニア州サンタアナ）、４５％ＲＰＭＩ１６４０、５％加熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、バージニア州ウィンチェスター）、１％Ｌ−グルタミン、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）中で、以前に検証されたサイトカインの組み合わせ（ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−１５（２ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ、ニュージャージー州ロッキー・ヒル又はＲ＆Ｄシステム、ミネソタ州ミネアポリス）の存在下で刺激した。培養の９日目及び１６日目に、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１５を含有する培地中で、Ｔ細胞をペプチドでパルスした人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を用いて１０：１のＥ：Ｔ比で再び刺激した。以前に記載されている通り（Quintarelli, et al., 2008）、インターロイキン−２（５０Ｕ／ｍｌ）（Ｔｅｃｅｌｅｕｋｉｎ、ホフマン・ラ・ロシュ社、ニュージャージー州ナットリー）を１６日目から培養に加えた。
【０１８３】
以前に記載されている通りに（Perna、et al., 2013）、単一細胞サバイビン特異的Ｔ細胞クローンをＬＭＬ及びＥＬＴ反応性Ｔ細胞株から限界希釈によって生成した。成長細胞をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでサバイビン特異的反応性についてスクリーニングし、同種異系フィーダー細胞、ＩＬ−２、及びＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）の存在下でさらに増殖させた。並行して、非特異的な（無関係）クローンを同一提供者から増殖させ、対照とした。増殖させたクローンは、高分解能シーケンスベースタイピング（メソジスト病院、テキサス州ヒューストン）でＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋であることを確認した。ＰＲＡＭＥ−特異的クローンを同じ方法に従って生成した。
免疫表現型検査
【０１８４】
細胞を、ＢＤバイオサイエンス（カリフォルニア州サンノゼ）又はベックマン・コールター（カリフォルニア州ブレア）のＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ４５に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗体、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗体、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）結合抗体、又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−結合抗体、サバイビンに対するＰＥ結合抗体（Ｒ＆Ｄシステム）、マウスＴＣＲ定常β鎖に対するＡＰＣ結合抗体（イーバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）、又はベイラー医科大学ＭＨＣ四量体作製施設（MHC Tetramer Production Facility）により作製されたＰＥ結合ＬＭＬ若しくはＥＬＴサバイビン特異的四量体を用いて染色した。データ取得は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を用いてＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで行った。データ分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、オレゴン州アシュランド）を用いて行った。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
【０１８５】
以前に記載されている通りに（Quintarelli, et al., 2008）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。簡単に記載すると、１×１０５個のＴ細胞／ウェルを３連で播き、次に５μＭ若しくは示された濃度の特異的ペプチド、又は対応する標的細胞株の１×１０５個の細胞、又は培地のみで刺激した。陽性対照として、Ｔ細胞を２５ｎｇ／ｍｌのホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）（シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）及び１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（シグマアルドリッチ）で刺激した。ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）を数えた（ＺｅｌｌＮｅｔ、ニュージャージー州フォートリー）。
クロム放出アッセイ
【０１８６】
以前に記載されている通りに（Quintarelli, et al., 2008）、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標準的な４時間（ペプチドでパルスしたＴ２細胞を用いるＴＣＲアビディティー測定のため）〜６時間（腫瘍細胞株、活性化されたＴ細胞、線維芽細胞、及び心筋細胞の殺作用評価のため）の５１Ｃｒ放出アッセイを用いて評価した。標的細胞を培地のみ又は１％トリトンＸ−１００（シグマアルドリッチ）中でインキュベーションして、それぞれ自発的及び最大５１Ｃｒ放出を測定した。３連のウェルの特異的溶解の平均％割合を次のように計算した：［（テストカウン−自然カウント）／（最大カウント−自然カウント）］×１００％。ブロッキング実験に関して、以前に記載されている通りに（Quintarelli, et al., 2008）、標的細胞を抗ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩブロッキング抗体（ＤＡＫＯ、カリフォルニア州カーピンテリア）で予めインキュベーションした。選ばれた実験では、線維芽細胞及び心筋細胞をＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で予め４８時間インキュベーションした後、ＬＭＬペプチド（２８）の非存在又は存在下で標的にして使用した。
共培養及びサイトメトリービーズアレイ
【０１８７】
２４ウェルプレート中でサイトカインの非存在下において、形質導入又は非形質導入Ｔ細胞（１×１０６個／ウェル）を腫瘍細胞株（２×１０５個／ウェル）と５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養した。培養の５日目、細胞を採取し、ＣＤ３及び特異的腫瘍マーカー（ＢＶ１７３についてはＣＤ１９、Ｕ２６６についてはＣＤ１３８、ＨＬ−６０及びＫ５６２についてはＣＤ３３）を染色した。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（インビトロジェン）を用いて培養中の残存腫瘍細胞をＦＡＣＳで数えた。共培養上清を培養の２４時間後に採取し、特異的サイトメトリービーズアレイ（ＢＤ）を製造業者の取扱説明書に従って使用してサイトカインを測定した。
白血病及び正常造血前駆体のコロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵ）
【０１８８】
以前に記載されている通りに（Quintarelli, et al., 2008）、健康な提供者又は白血病患者のＢＭ、ＣＢ、又はＰＢからの単核細胞（ＭＮＣ）をサバイビン特異的若しくは非特異的Ｔ細胞クローン、又はサバイビンＴＣＲ形質導入若しくは非形質導入Ｔ細胞と１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で６時間共インキュベーションし、次に組換えサイトカイン（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｈ４４３４  ｃｌａｓｓｉｃ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ワシントン州タックウィラ）を補充したメチルセルロースベースの培地に２連で播いた。培養の２週間後に、高性能倒立顕微鏡を用いて顆粒球マクロファージコロニー形成ユニット及び赤血球ＣＦＵを記録した。
サバイビン特異的ＴＣＲ遺伝子の単離及びレトロウィルスベクターの生成
【０１８９】
キアゲン（メリーランド州ジャーマンタウン）のＲＮｅａｓｙキットを用いて、トータルＲＮＡを、サバイビン特異的クローン＃２４（ｓ２４）、＃１６（ｓ１６）から又はＰＲＡＭＥ特異的クローンｐ１１、ｐ２８、及びｐ３００から単離し、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｒａｃｅｒキット、インビトロジェン）を用いて製造業者の取扱説明書に従ってＴＣＲ  ｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０コンピテント細胞（インビトロジェン）を形質転換した。プラスミドＤＮＡを４０個の個別コロニーから調製し、２０個がＴＣＲα−鎖ｃＤＮＡを含み、２０個がＴＣＲβ鎖ｃＤＮＡを含んだ。１つのＴＣＲ鎖につき１０個のプラスミドから全長インサートを配列決定して（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ、テキサス州ヒューストン）、ＣＴＬクローンｓ２４のＴＣＲ利用を決定した。同定後、ヒトＴＣＲ定常領域をマウスＴＣＲ定常領域で置換することによってＴＣＲ配列を改変し、２Ａ配列を連結し、Ｇｅｎｅａｒｔ（インビトロジェン）でコドン最適化し、最後にＳＦＧレトロウィルスベクターに導入した（図２Ａ）。Ａ７２−ＴＣＲ（Leisegang、et al., 2010）の天然α鎖及びβ鎖ＴＣＲ配列を、Ｇｅｎｅａｒｔ（インビトロジェン）でコドン最適化及び合成し、さらに改変することなくＳＦＧレトロウィルスベクターに別々に導入した。ＭＡＲＴ−１（Ｍ１−２９及びＭ１−６７）並びにチロシナーゼ（Ｔ５８）ＴＣＲ配列（Wilde, et  al., 2009）をコドン最適化し、２Ａ配列を連結して、Ｇｅｎｅａｒｔで合成し、ＳＦＧレトロウィルスベクターに導入した。
レトロウイルス上清の生成、Ｔ細胞形質導入及び増殖
【０１９０】
以前に記載されている通りに（Quintarelli, et al., 2007）、一過性レトロウイルス上清を、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることによって調製し、磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク）を用いて健康な提供者のＰＢＭＣから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するのに使用した。形質導入細胞を１０％ＦＢＳを含有するＣＴＬ培地で増殖させ、４：１のＥ：Ｔ比にてサバイビンＬＭＬペプチド積載γ照射（８０Ｇｙ）ａＡＰＣ及びＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）で週１回刺激した。非形質導入Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ及びＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）を含有するＣＴＬ培地で維持し、固定化したＯＫＴ３及び抗ＣＤ２８（ＢＤ）抗体で再刺激した。
ＢＶ１７３白血病異種移植片モデル及び生体内生物発光イメージング
【０１９１】
ＮＳＧマウス（８〜１０週齢）は、ジャクソン研究所（メイン州バー・ハーバー）から購入し、ＩＡＣＵＣ承認プロトコールに基づいてベイラー医科大学動物施設で維持した。亜致死照射（１２０ｃＧｙ）を受けたＮＳＧマウスに３×１０６個のＦＦｌｕｃ標識ＢＶ１７３細胞を尾静脈から静脈内輸注した。ＩＶＩＳシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州アラメダ）を用いる生物発光イメージング（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）によって白血病負荷をモニターした。形質導入Ｔ細胞又は非形質導入Ｔ細胞（１０×１０６／マウス）の計３回のＴ細胞輸注（２日間隔）を、ＢＶ１７３接種の２４時間後（低全身腫瘍組織量モデル；図５Ａ）又は１４〜１７日後（高全身腫瘍組織量モデル；図６Ａ）に後眼窩注射で行った。組換えヒトＩＬ−２（１０００Ｕ／マウス）を、Ｔ細胞輸注の間及びその次の週に、計６回腹腔内投与した。白血病の進行を週１回イメージング及び記録生存期間によってモニターした。有病マウスを犠牲にし、臓器（脾臓、血液、骨髄、リンパ節、肝臓）を白血病細胞及びＴ細胞の有無についてＦＡＣＳで分析した。
交差反応性ペプチドに関するＥｘＰＡＳｙ−ＰＲＯＳＩＴＥ検索
【０１９２】
ＥｘＰＡＳｙ−ＰＲＯＳＩＴＥウェブサーバー（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）を使用して、ｓ２４及びＡ７２  ＴＣＲの比較のために、すべてのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録データ（２０１３年１０月１６日のリリース２０１３＿１０：登録数５４１５６１）内のペプチドモチーフを検索した（登録数５４６０００を含む２０１４年７月９日のリリース２０１４＿０７、全ＴＣＲについて）。フィルターはホモサピエンス及び造血系に設定した。
統計的解析
【０１９３】
データを平均及び標準偏差（ＳＤ）でまとめた。スチューデントのｔ検定を使用して、治療群間の統計的に有意な差を決定した。適切な場合はボンフェローニ法で調整した多重比較を伴った。マウスの白血病進行傾向を経時的に比較するために、各時点の生物発光シグナル強度を対数変換し、反復測定値についてロバスト一般化推定方程式法で解析した。生存分析はカプランマイヤー法を用いてＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（カリフォルニア州ラホヤ）で行った。ログランク検定を使用して、ｐ値＜０．０５が有意な差であること示すものとして、マウスの群間の統計的有意差を評価した。
参考文献
【０１９４】
本明細書で言及された特許及び刊行物はすべて、本発明の属する分野の当業者の水準を示す。特許及び刊行物のすべては、それぞれ個別の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されるように、同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
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【０１９５】
本発明及びその利点が詳細に記載されてきたが、さまざまな変更、置換、及び改変が本明細書において添付の請求項に規定される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくなされうることが理解されるべきである。そのうえ、本願の範囲は、本明細書に記載のプロセス、機械、製造物、組成物、手段、方法、及び工程の特定の実施形態に限定されることは意図されない。当業者なら本発明の本開示から容易に理解するであろうように、現在存在している又は後に開発される、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たす又は実質的に同じ結果を成し遂げるプロセス、機械、製造物、組成物、手段、方法、又は工程が本発明に従って利用されうる。したがって、添付の請求項は、その範囲内にそのようなプロセス、機械、製造物、組成物、手段、方法、又は工程を含むことを意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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