(57)【要約】  本発明は、パラミクソウイルス亜科(例えばヘニパウイルス、ルブラウイルス又はモルビリウイルス)のウイルスの複製を阻害する特性を有する、ウイルスRNAフリー核タンパク質(N0)に対するウイルスリンタンパク質(P)サブユニットの結合ドメインを含む単離ペプチドに関する。この単離ペプチドを、パラミクソウイルス亜科の感染の予防又は処置に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I):
バリン-Xaa1-Xaa2-グリシン-ロイシン-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8
(式(I)中、
Xaa1はグルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン(N)、リジン(K)又は等価の極性アミノ酸であり、
Xaa2はグルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、リジン(K)又は等価の負に帯電した(若しくは酸の)アミノ酸であり、
Xaa3はグルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、リジン(K)又はグルタミン(Q)、セリン(S)又はアスパラギン(N)であり、
Xaa4はシステイン(C)、イソロイシン(I)であり、
Xaa5はイソロイシン(I)、ロイシン(L)若しくはバリン(V)又は等価の無極性脂肪族アミノ酸であり、
Xaa6はグルタミン(Q)、リジン(K)、アルギニン(R)又はアスパラギン酸(D)であり、
Xaa7はアラニン(A)若しくはフェニルアラニン(F)又は等価の無極性アミノ酸であり、
Xaa8はイソロイシン(I)、ロイシン(L)若しくはバリン(V)又は等価の無極性脂肪族アミノ酸である)
のアミノ酸配列を含む、最大で100個のアミノ酸からなる単離ペプチド。
【請求項２】
Xaa1がアスパラギン(N)又はグルタミン(Q)である、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
Xaa2がアスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E)である、請求項1又は2に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
Xaa3がアスパラギン(N)又はグルタミン酸(E)である、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
Xaa4がイソロイシン(I)又はシステイン(C)である、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項６】
Xaa5がイソロイシン(I)である、請求項1から5のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
Xaa6がアスパラギン酸(D)又はグルタミン(Q)である、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項８】
Xaa7がフェニルアラニン(F)又はアラニン(A)である、請求項1から7のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項９】
Xaa8がイソロイシン(I)である、請求項1から8のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項１０】
iv)配列番号1における第7位のバリン残基から第17位のイソロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列、
v)配列番号2における第9位のバリン残基から第19位のロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列、
vi)(i)又は(ii)の配列に実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは(i)又は(ii)の配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項１１】
式(II):
Yaa1-Yaa2-Yaa3-Yaa4-Yaa5-バリン-Xaa1-Xaa2-グリシン-ロイシン-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Yaa6-Yaa7-Yaa8
(式(II)中、
Xaa1-Xaa2 Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8は請求項1で規定されており、
Yaa1はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)又は等価の酸性アミノ酸であり、
Yaa2はグルタミン(Q)又はリジン(K)であり、
Yaa3はアラニン(A)、ロイシン(L)又はチロシン(Y)であり、
Yaa4はグルタミン酸(E)、チロシン(Y)又はアルギニン(R)であり、
Yaa5はアスパラギン(N)、ヒスチジン(H)又はロイシン(L)であり、
Yaa6はグルタミン(Q)、リジン(K)又はアルギニン(R)であり、
Yaa7はリジン(K)、アラニン(A)又はグルタミン酸(E)であり、
Yaa8はアスパラギン(N)、グルタミン酸(E)又はセリン(S)である)
のアミノ酸配列を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項１２】
Yaa1がアスパラギン酸(D)である、請求項11に記載の単離ペプチド。
【請求項１３】
Yaa2がリジン(K)又はグルタミン(Q)である、請求項11又は12に記載の単離ペプチド。
【請求項１４】
Yaa3がロイシン(L)又はアラニン(A)である、請求項11から13のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項１５】
Yaa4がグルタミン酸(E)である、請求項11から14のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項１６】
Yaa5がロイシン(L)又はアスパラギン(N)である、請求項11から15のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項１７】
Yaa6がグルタミン(Q)である、請求項11から16のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項１８】
Yaa7がリジン(K)である、請求項11から17のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項１９】
Yaa8がアスパラギン(N)である、請求項11から18のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項２０】
i)MDKLELVNDGLNIIDFIQKNQKEIQKTYGRSSIQQPSIKD(配列番号1)からなるアミノ酸配列、
ii)配列番号1における第6位のロイシン残基から第40位のアスパラギン酸残基までの範囲のアミノ酸配列、
iii)配列番号1における第11位のロイシン残基から第40位のアスパラギン酸残基までの範囲のアミノ酸配列、
iv)配列番号1における第1位のメチオニン残基から第20位のアスパラギン残基までの範囲のアミノ酸配列、
v)配列番号1における第20位のアスパラギン残基から第35位のグルタミン残基までの範囲のアミノ酸配列、
vi)MAEEQAYHVSKGLECLKALRENPPDIEEIQEVSSLRDQTC(配列番号2)からなるアミノ酸配列、
vii)配列番号2における第1位のメチオニン残基から第22位のアスパラギン残基までの範囲のアミノ酸配列、
viii)DQAENVQEGLECIQAIQKN(配列番号3)からなるアミノ酸配列、
ix)MAEEQARHVKNGLECIRALKAEPIGSLAIEEAMAAWSEIS(配列番号4)からなるアミノ酸配列、
x)配列番号4における第9位のバリン残基から第19位のロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列、
xi)(i)から(x)の配列に実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは(i)から(x)の配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項11に記載の単離ペプチド。
【請求項２１】
少なくとも1種の細胞透過性ペプチドに連結されている、請求項1から20のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項２２】
前記少なくとも1種の細胞透過性ペプチドが、Tatペプチド、ポリアルギニンペプチド、HA2-R9ペプチド、Penetratinペプチド、Transportanペプチド、Vectocellペプチド、マウロカルシンペプチド、デカリジンペプチド、HIV-Tat由来PTD4ペプチド、B型肝炎ウイルス転位モチーフ(PTM)ペプチド、mPrP1-28ペプチド、POD、pVEC、EB1、Rath、CADY、Histatin 5、Antpペプチド、Cyt86-101ペプチド、DPTペプチドから選択される、請求項21に記載の単離ペプチド。
【請求項２３】
請求項1から20のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸を含む又はこの核酸からなるポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項1から22のいずれか一項に記載のペプチドを製造する方法であって、
a)請求項1から22のいずれか一項に記載のペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項23に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを含む組み換え細胞を培養する工程、
b)任意選択で、工程a)で得られるペプチドを精製する工程
を含む、方法。
【請求項２５】
ルブラウイルス感染、アブラウイルス(Avulavivirus)感染、ヘニパウイルス感染、ヘニパウイルス様感染、モルビリウイルス感染、モルビリウイルス様(TPMV様ウイルス)感染又はフェルラウイルス感染から選択されるパラミクソウイルス亜科感染を予防及び/又は処置するために使用するための請求項1から22のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項２６】
前記ヘニパウイルス感染が、ニパウイルス(NiV)又はヘンドラウイルス(HeV)の感染である、請求項25に記載の使用するための単離ペプチド。
【請求項２７】
前記モルビリウイルス感染が、麻疹ウイルス(MeV)又はリンデルペストウイルスの感染である、請求項25に記載の使用するための単離ペプチド。
【請求項２８】
前記ルブラウイルス感染が、ムンプスウイルス及びパラインフルエンザ2型、4型ウイルスの感染である、請求項25に記載の使用するための単離ペプチド。
【請求項２９】
請求項1から22のいずれか一項に記載のペプチドと、1種又は複数種の薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)のウイルス(ヘニパウイルス(Henipavirus)、ルブラウイルス(Rubulavirus)又はモルビリウイルス(Morbillivirus)のような)の複製を阻害する特性を有する、ウイルスRNAフリー核タンパク質(viral RNA free nucleoprotein)(N0)に対するウイルスリンタンパク質(P)サブユニットの結合ドメインを含む単離ペプチドに関する。この単離ペプチドを、パラミクソウイルス亜科の感染の予防又は処置に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)は、ヒト呼吸器疾患(例えば呼吸器合抱体ウイルス(RSV)、ヒトパラインフルエンザウイルス(human parainfluenza virus))と麻疹及び流行性耳下腺炎等の一般的な小児疾患とに関連する非セグメント化マイナス鎖(non-segmented negative-strand)RNAウイルス(NNV)の大きな科である。系統的関係から、パラミクソウイルス科は2種の亜科、即ちパラミクソウイルス亜科及びニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)に分類され、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、ボルナウイルス科(Bornaviridae)及びフィロウイルス科(Filoviridae)と共にモノネガウイルス目(Mononegavirales)に順に分類される10。ニパウイルス(Nipah virus)(NiV)は新興ウイルスの象徴であり、このウイルスは東南アジアにおいて天然コウモリ宿主から広がり、ヒト等の様々な哺乳動物において呼吸器疾患及び脳疾患の大流行を引き起こす1。NiVによる死亡率はヒトで70%を超える可能性があり、NiVのヒトからヒトへの伝播する可能性があり、ワクチン又は特異的な抗ウイルス処置が存在しないことにより、NiVはバイオセーフティーレベル4(BSL-4)病原体に分類される。
【０００３】
NiVのゲノムRNAは全てのNNVのゲノムRNAと同様に、核タンパク質(N)のホモポリマーにより凝縮され、長いらせん状のヌクレオカプシド(NC)を形成する。このリボ核タンパク質複合体は、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼによるRNA合成に使用される生物学的に活性な鋳型であり2,3、そのため、このウイルスの複製には、プラスセンス及びマイナスセンスの子孫RNA分子をカプシド封入するために未集合N分子の継続的供給が必要である4。
【０００４】
ヌクレアーゼに対してゲノムRNAを保護するNNV NCの能力と一致して、Nタンパク質は、RNA分子を完全に包む2種の球状ドメイン、即ちN末端(NNTD)及びC末端(NCTD)を含む5〜8(図1a)。Nホモポリマーは、側方接触により並びに隣接するプロトマー間でのN末端(NTアーム)及びC末端サブドメイン(CTアーム)の交換により安定化される5〜8。パラミクソウイルス亜科のNは、NCの外側に延びてPのC末端ドメイン(PXD)に結合する追加の長くて不規則なC末端テイル(Nテイル)を有する11〜13。RNAが強固にパッケージングされていることから、NC集合プロセス時に結合溝内でRNAを収容し、RNAポリメラーゼの通過時にRNA鋳型を一時的に放出するためにNは開閉しなければならないという仮説が浮上するが、これまで、開N型と閉N型との間の変換の証拠はない。
【０００５】
その他のウイルスタンパク質が存在しない場合、Nは細胞RNA上で重合及び集合する傾向が強い。パラミクソウイルス科において、しかしながらラブドウイルス科においても、そしておそらく全てのNNVにおいても、ウイルスタンパク質は新生Nの特異的シャペロンとして作用し、新生Nの重合及び細胞RNAとの相互作用の両方を防止することにより、新生Nを集合能のある形態(N0)に保つ9,14。パラミクソウイルス科及びラブドウイルス科のPタンパク質はモジュール状の多機能タンパク質であり、長くて本質的に不規則なN末端領域(PNTR)と、柔軟なリンカーによりNC結合ドメイン(PXD)に接続された多量体化ドメイン(PMD)を有するC末端領域(PCTR)とを含み11,15,16(図1a)、その結果として、溶液中において高度に柔軟である17。両方の科において、Pの短いN末端領域は、両方のシャペロンの役割を果たすのに十分である9,18。ここで、本発明者らは、NC集合のメカニズムを理解するために可溶性NiV N0-Pコア複合体を研究する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第2007/0184015号
【特許文献２】国際公開第2004/011595号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2003/011898号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Walensky他、Science. 2004、305、1466〜70頁
【非特許文献２】Fonseca S.B.他、Advanced Drug Delivery Reviews、2009、61 : 953〜964頁
【非特許文献３】Johansson他、Methods in Molecular Biology、2011、第683巻、第17章
【非特許文献４】Bechara and Sagan、(2013) FEBS letters 587、1693〜1702頁
【非特許文献５】Jones and Sayers (2012)、Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 161、582〜591頁
【非特許文献６】Khafagy el and Morishita、(2012) Advanced drug delivery reviews 64、531〜539頁
【非特許文献７】Malhi and Murthy、(2012) Expert opinion on drug delivery 9、909〜935頁
【非特許文献８】Sambrook他、Molecular Cloning, Second Edition (1989)、9.47〜9.62頁
【非特許文献９】Rodrigues-Ferreira他(2009、PLoS One. 4(10):e7239 2009)
【非特許文献１０】Barbeau B他(J Virol. 1998 Sep;72(9):7125〜36頁
【非特許文献１１】http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX/About_our_beamlines/BM29
【非特許文献１２】Tanaka M、Herr W. Cell. 1990 Feb 9;60(3):375〜86頁. 10.1016/0092-8674(90)90589-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒト細胞中で発現された場合、このP N0結合ドメイン(NiV Pの最初の40個のアミノ酸を含む)はニパウイルスの複製を阻害することができる。構造に基づく変異形成により、Pペプチドの阻害活性の標的として及びNiV等のパラミクソウイルス亜科のより高い病原性のメンバーに対する薬剤開発の標的としてN0-P複合体を検証する。パラミクソウイルス亜科の様々なメンバー間でのNとPとの間の結合界面中における配列保存により、いくつかのウイルスに対する広域薬剤の開発の可能性が浮上する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
式(I):
バリン-Xaa1-Xaa2-グリシン-ロイシン-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8
(式(I)中、
Xaa1はグルタミン(Q)、セリン(S)若しくはアスパラギン(N)、リジン(K)又は等価の極性アミノ酸であり、
Xaa2はグルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、リジン(K)又は等価の負に帯電した(若しくは酸の)アミノ酸であり、
Xaa3はグルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、リジン(K)、グルタミン(Q)、セリン(S)又はアスパラギン(N)であり、
Xaa4はシステイン(C)、イソロイシン(I)であり、
Xaa5はイソロイシン(I)、ロイシン(L)若しくはバリン(V)又は等価の無極性脂肪族アミノ酸であり、
Xaa6はグルタミン(Q)、リジン(K)、アルギニン(R)又はアスパラギン酸(D)であり、
Xaa7はアラニン(A)若しくはフェニルアラニン(F)又は等価の無極性アミノ酸であり、
Xaa8はイソロイシン(I)、ロイシン(L)若しくはバリン(V)又は等価の無極性脂肪族アミノ酸である)のアミノ酸配列を含む単離ペプチドを提供する。
【００１０】
好ましい実施形態では、Xaa5はイソロイシン(I)であり、Xaa8はイソロイシン(I)である。好ましい実施形態では、Xaa1はアスパラギン(N)又はグルタミン(Q)であり、Xaa2はアスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E)であり、Xaa3はアスパラギン(N)又はグルタミン酸(E)であり、Xaa4はイソロイシン(I)又はシステイン(C)であり、Xaa5はイソロイシン(I)であり、Xaa6はアスパラギン酸(D)又はグルタミン(Q)であり、Xaa7はフェニルアラニン(F)又はアラニン(A)であり、Xaa8はイソロイシン(I)である。
【００１１】
本発明はまた、
式(II):
Yaa1-Yaa2-Yaa3-Yaa4-Yaa5-バリン-Xaa1-Xaa2-グリシン-ロイシン-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Yaa6-Yaa7-Yaa8
(式(II)中、
Xaa1-Xaa2 Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8は上記で規定されており、
Yaa1はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)又は等価の酸性アミノ酸であり、
Yaa2はグルタミン(Q)又はリジン(K)であり、
Yaa3はアラニン(A)、ロイシン(L)又はチロシン(Y)であり、
Yaa4はグルタミン酸(E)、チロシン(Y)又はアルギニン(R)であり、
Yaa5はアスパラギン(N)、ヒスチジン(H)又はロイシン(L)であり、
Yaa6はグルタミン(Q)、リジン(K)又はアルギニン(R)であり、
Yaa7はリジン(K)、アラニン(A)又はグルタミン酸(E)であり、
Yaa8はアスパラギン(N)、グルタミン酸(E)又はセリン(S)である)のアミノ酸配列を含む単離ペプチドも提供する。
【００１２】
好ましい実施形態では、Yaa1はアスパラギン酸(D)である。好ましい実施形態では、Yaa1はアスパラギン酸(D)であり、Yaa2はリジン(K)又はグルタミン(Q)であり、Yaa3はロイシン(L)又はアラニン(A)であり、Yaa4はグルタミン酸(E)であり、Yaa5はロイシン(L)又はアスパラギン(N)であり、Yaa6はグルタミン(Q)であり、Yaa7はリジン(K)であり、Yaa8はアスパラギン(N)である。
【００１３】
好ましい実施形態では、単離ペプチドは、配列番号3の配列又は配列番号1の第7位のバリン残基から第17位のイソロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号1のP7〜P17)を含む、又はこの配列からなる。
【００１４】
一部の実施形態では、単離ペプチドは少なくとも1種の細胞透過性ペプチドに連結されている。
【００１５】
また、包含されているのは、本発明に係るペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む又はこのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドでもある。
【００１６】
本発明は更に、本発明のペプチドを調製する又は生成する方法に関する。
【００１７】
本発明は更に、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組成物、及びパラミクソウイルス亜科の感染を処置するための又は予防するための本発明に係るペプチド又は医薬組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】再構成したNiV N0-P複合体の溶液中での及び結晶での構造を示す図である。NiV Nタンパク質及びPタンパク質の構造の概要。NNTD、NコアのN末端ドメイン;NCTD、NコアのC末端ドメイン;NTアーム、NのN末端アーム;CTアーム、NのC末端アーム;PNTR、PのN末端領域;PCTR、PのC末端領域;PMD、Pの多量体化ドメイン;PXD、PのC末端Xドメイン。四角形及び直線は、構造化ドメイン及び天然変性(intrinsically disordered)領域をそれぞれ示す。矢印は、この研究で使用した組み換え構築物を示す。
【図１Ｂ】再構成したNiV N0-P複合体の溶液中での及び結晶での構造を示す図である。多角度レーザー光散乱(MALLS)及び屈折率測定(RI)によるオンライン検出と組み合わされたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)。挿入図は、クマシーブルー染色したSDS-PAGEを示す。ヘテロ二量体複合体に関して算出した理論的分子量は45,613Daである。
【図１Ｃ】再構成したNiV N0-P複合体の溶液中での及び結晶での構造を示す図である。単離での及びN0との複合体での15N標識付きP100の1H-15N HSQCスペクトルの差異強度プロファイル。
【図１Ｄ】再構成したNiV N0-P複合体の溶液中での及び結晶での構造を示す図である。NiV N、GFPと融合したP40-野生型ペプチド又は両方のタンパク質(下側のパネル)を発現する293T遺伝子導入細胞の蛍光画像。画像は、3つの独立した実験の内の1つを表す。スケールバー(左側のパネル)は10μmを表す。
【図１Ｅ】再構成したNiV N0-P複合体の溶液中での及び結晶での構造を示す図である。カートゥーン表示によるNiV N32〜3830-P50複合体の結晶構造の図。N32〜383をP50と一緒に示す。一部の二次構造要素及びN末端アーム及びC末端アーム及びテイルの位置を示す。P断片のC末端残基及びN末端残基を示す。
【図２Ａ】NiVタンパク質とRSV Nタンパク質との比較により、開いたコンフォメーションから閉じたコンフォメーションへの変化が明らかになることを示す図である。同様の方向で整列させたNiV N及びRSV N(PDBコード2WJ8;参考文献5)の構造の図。
【図２Ｂ】NiVタンパク質とRSV Nタンパク質との比較により、開いたコンフォメーションから閉じたコンフォメーションへの変化が明らかになることを示す図である。NC様複合体(PDBコード2WJ8;参考文献5)から取り出したRSV NによるNiV N32〜383の結晶構造(左側のパネル)と仮定上の閉じたコンフォメーション(右側のパネル)とでのNiV N32〜383の構造比較。NiV N32〜383、RSV N、及びRSV Nに結合したRNAを示す。左側のパネルにおける直線は、各タンパク質でのαN9軸の方向を示す。RSV Nの対応するドメイン上でNiV NNTDとNCTDとを別々に整列させることにより、NiV Nの仮定上の閉じた形態を得た。
【図２Ｃ】NiVタンパク質とRSV Nタンパク質との比較により、開いたコンフォメーションから閉じたコンフォメーションへの変化が明らかになることを示す図である。カートゥーン表示によるRSV NにおけるRNA結合部位の正面図。RNAと相互作用する及びパラミクソウイルス亜科のいくつかのメンバーで保存されている残基(K170、R184、R185、R338及びY337)をスティック表現で示す。
【図２Ｄ】NiVタンパク質とRSV Nタンパク質との比較により、開いたコンフォメーションから閉じたコンフォメーションへの変化が明らかになることを示す図である。NiV Nの推定されるRNA結合溝の、その開いたコンフォメーション及び仮定上の閉じたコンフォメーションでの正面図。図2cで示したこれらに対応する残基をスティック表現で示す(K178、R192、R193、R352及びY354)。
【図２Ｅ】NiVタンパク質とRSV Nタンパク質との比較により、開いたコンフォメーションから閉じたコンフォメーションへの変化が明らかになることを示す図である。カートゥーン表示によるRSV NにおけるRNA結合部位の側面図。ヘリックスαN9上で平坦な表面を形成する及び各Nプロトマーに結合した6個のヌクレオチドからなる塩基1と相互作用する2個のグリシン残基(G241及びG245)を黄色で示す。
【図２Ｆ】NiVタンパク質とRSV Nタンパク質との比較により、開いたコンフォメーションから閉じたコンフォメーションへの変化が明らかになることを示す図である。パラミクソウイルス亜科の下記のいくつかのメンバーの間の多重配列アラインメント:MeV、麻疹ウイルス(measlesvirus)(モルビリウイルス);MuV、ムンプスウイルス(mumpsvirus)(ルブラウイルス);NDV、ニューキャッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)(アブラウイルス(Avulavirus))。
【図２Ｇ】NiVタンパク質とRSV Nタンパク質との比較により、開いたコンフォメーションから閉じたコンフォメーションへの変化が明らかになることを示す図である。NiV Nの推定されるRNA結合溝の、その開いたコンフォメーション及び仮定上の閉じたコンフォメーションでの側面図。RNA分子(図示)は、RSV NCでのようにNiV NCTDにドッキングされる。
【図３Ａ】PのN0結合ペプチドによるN0-P界面の保存及びNiV複製の阻害を示す図である。N32〜383に関する表面表現及び保存表現による及びP50に関するカートゥーン表示及びスティック表現によるNiV N32〜3830P50複合体の図。多重配列アラインメントに由来するNでの保存をNiV Nの表面上に示す。PN末端領域における保存残基の側鎖をスティック表現で示す。
【図３Ｂ】PのN0結合ペプチドによるN0-P界面の保存及びNiV複製の阻害を示す図である。ウイルス複製に対するペプチド発現の効果の定量化。GFPのみ(コントロール)、P40-野生型、P40-G10R又はP40-I17Rをコードするプラスミドの様々な量(2μgから0.125μg;バー1から5)で遺伝子導入した293T細胞の培養上清におけるNiV(MOI 0.01)の感染から48時間後に測定したウイルス力価。示したのは、3つの独立した実験からの平均である。エラーバーは、標準偏差(n=6;ANOVA検定:*はP<0.05の値を示す)を表す。
【数１】
2017522051.tif 000002
は、プラスミドがないことを示す。
【図３Ｃ】PのN0結合ペプチドによるN0-P界面の保存及びNiV複製の阻害を示す図である。GFP(コントロール)又はGFP-P40-野生型又はGFP-P40-G10Rを発現するNiV感染細胞でのシンシチウム形成の目視分析。矢印は典型的なシンシチウム形成の例を示す。画像は、3つの独立した実験の内の1つで得たものを表す。スケールバー(左側のパネル)は50μmを表す。
【図４Ａ】NiV Pのシャペロン活性を示す図である。NiV N32〜3830-P50複合体(PDBコード2WJ8及び4BKK;参考文献5)のNCTDと整列させたNコアに関する表面表現により示した、N-RNA複合体内の1つのRSV Nプロトマーの平面図。Ni-1 RSV NプロトマーのNTアーム及びNi+1 RSV NプロトマーのCTアームをカートゥーン表示で示す。NiV複合体のP50のみをカートゥーン表示で示す。挿入図は、NC内でのRSV Nプロトマーの局在化を示す。
【図４Ｂ】NiV Pのシャペロン活性を示す図である。同じ構造的オーバーレイ(structural overlay)の正面図。挿入図は、NC内でのRSV Nプロトマーの局在化を示す。
【図４Ｃ】NiV Pのシャペロン活性を示す図である。カートゥーン表示によるN32〜3830P50複合体中のNCTDに結合したNiV P50の図。NCTD中のラッチを示す。P50とNCTDとを接触させる残基のCαをP50又はN32〜3830に関して球で示す。矢印は、P50とNCTDのヘリックスαC1、ηC1、αC2及びαC4との間の結合を示す。
【図４Ｄ】NiV Pのシャペロン活性を示す図である。パラミクソウイルス亜科のいくつかのメンバーの間の多重配列アラインメント。
【図４Ｅ】NiV Pのシャペロン活性を示す図である。カートゥーン表示によるRSV N-RNA複合体及びNiV N32〜383の構造的オーバーレイ。NiV Nの残基Y258及びG305並びにRSV Nの残基Y251及びG295をスティック表現で示す。矢印は、P放出時のY258の仮定上の回転を示す。
【図５Ａ】PのN0結合ペプチドによるNiV又はCDVの複製の阻害を示す図である。NiVからのPのN0結合領域由来のペプチド(P40)がNiV及びCDVの両方のウイルス増殖を阻害する。293T細胞に、1μgのGFPと融合した野生型P40-CDVをコードするプラスミド(P40-CDV)、GFPと融合した野生型P40-NiVをコードするプラスミド(P40-NIV)、別々にコードするプラスミド(pCG P40-NIV)、GFPのみをコードするプラスミド(MOCK)、又はプラスミドなし(NT)で遺伝子導入した。24時間後、細胞にNiV(黒色のバー)又はCDV(白色のバー)のいずれかを感染させた(MOI 0.01)。感染から48時間後に、培養上清中でのウイルス力価を測定した。
【図５Ｂ】PのN0結合ペプチドによるNiV又はCDVの複製の阻害を示す図である。NiV由来ペプチド及びCDV由来ペプチドの両方によるCDV複製の阻害は用量依存的である。細胞に、示したように1μgから0.5μgの範囲で量が減少する「P」プラスミド又は1μgのGFPコーディングプラスミド(MOCK)若しくは空プラスミド(NT)で上記のように遺伝子導入した。遺伝子導入から24時間後、細胞にCDVを感染させた(MOI 0.01)。感染から72時間後に、培養上清中でのウイルス力価を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、パートナーである未集合RNAフリーウイルス核タンパク質(N0)と相互作用するN末端領域中のウイルスリンタンパク質Pサブユニット由来の配列(配列番号1:MDKLELVNDGLNIIDFIQKNQKEIQKTYGRSSIQQPSIKD、受託番号Q9IK91でSwiss-Protデータベースに寄託されたウイルスニパリンタンパク質P配列の第1〜40位)を同定した。このN0結合ドメインはアミノ酸位1〜40に対応する。このP N0結合ドメインは、細胞中で発現された場合、ニパウイルスの複製を阻害することができる。本発明者らは、このペプチドの分子タンパク質パートナー(ウイルス未集合核タンパク質N0)を同定しており、この複合体の結晶構造を解明する。本発明者らは、このペプチドが、このタンパク質パートナーへの結合に関して天然リンタンパク質Pと競合するという証拠を得た。リンタンパク質Pと核タンパク質N0との間の界面は、パラミクソウイルス亜科のいくつかのメンバー(麻疹ウイルス及びムンプスウイルス等)の間で保存されている。
【００２０】
本発明者らはまた、この1〜40ニパリンタンパク質Pサブユニットから、異なる長さのより短い単離ペプチドも生成したが(11〜37個のアミノ酸(P6〜40、P11〜40、P1〜20、P20〜35及びP7〜17))、このより短い単離ペプチドは、リンタンパク質P/核タンパク質N0相互作用を阻害する能力及びウイルス複製を連続的に阻害する能力を有する。
【００２１】
本発明者らは、残基1〜40からなる、CDVリンタンパク質Pサブユニット由来の単離ペプチド(配列番号2:MAEEQAYHVSKGLECLKALRENPPDIEEIQEVSSLRDQTC、ウイルスCDVリンタンパク質P配列(NCBI参照株NC_001921.1)の第1〜40位)及びより短いペプチドP1〜22、P9〜19を更に生成したが、このペプチドは、1〜40ニパウイルスリンタンパク質Pサブユニットと同様の活性を示す。
【００２２】
本発明者らは、パラミクソウイルス亜科のメンバー間のリンタンパク質Pサブユニットのこの保存配列に基づいて、保存残基(太字)及びその他の位置では最良の残基を含むコンセンサスペプチド(配列番号3: DQAENVQEGLECIQAIQKN)を更に生成した。
【００２３】
本発明者らは、残基1〜40からなる、麻疹ウイルスリンタンパク質Pサブユニット由来の単離ペプチド(配列番号4:MAEEQARHVKNGLECIRALKAEPIGSLAIEEAMAAWSEIS、受託番号(Q76VZ7_MEASE)でSwiss-Protデータベースに寄託されたウイルスMeVリンタンパク質P配列の第1〜40位)及びより短いペプチドP9〜19を更に生成したが、このペプチドは、1〜40ニパウイルスリンタンパク質Pサブユニットと同様の活性を示す。
【００２４】
従って、本発明者らは、標的療法が使えなかったパラミクソウイルス亜科のメンバーによるウイルス感染を処置するための新規の標的療法を発見した。本発明は、ルブラウイルス、ヘニパウイルス、モルビリウイルスによる感染の処置に特に有利である。
【００２５】
定義:
本明細書全体を通して、いくつかの用語を用い、下記の段落で定義する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「パラミクソウイルス亜科」は、パラミクソウイルス科の亜科を示す。この亜科のメンバーは、非セグメント化マイナス単鎖RNAゲノムが、ウイルスによりコードされた核タンパク質(N)によりらせん状のヌクレオカプシド内にカプシド封入されているエンベロープウイルスである。この(N:RNA)鋳型の転写及び複製は、リンタンパク質(P)及びラージタンパク質(L)で作られたウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ複合体により行なわれる(Lamb & Kolakofsky, 2001により概説されている)。Pと可溶性単量体型のN(N0)との会合により、Pの細胞RNA上への非正統な自己集合が防止される。「パラミクソウイルス亜科」には、パラインフルエンザウイルス及び麻疹ウイルス(MV)等の主要なヒト病原体が含まれる。
【００２７】
下記の様々な「パラミクソウイルス亜科」属が存在する:
アクアパラミクソウイルス(Aquaparamyxovirus)属(タイセイヨウサケパラミクソウイルス(Atlantic salmon paramyxovirus)模式種、その他として、タイヘイヨウサケパラミクソウイルス(Pacific salmon paramyxovirus)が挙げられる)
アブラウイルス属(ニューキャッスル病ウイルス模式種)
フェルラウイルス(Ferlavirus)属(フェルドランスウイルス(Fer-de-Lance virus))
ヘニパウイルス属(ヘンドラウイルス(Hendravirus)模式種、その他としてニパウイルスが挙げられる)
モルビリウイルス属(麻疹ウイルス模式種、その他としてリンデルペストウイルス(Rinderpest virus)、イヌジステンパーウイルス(Canine distemper virus)、アザラシジステンパーウイルス(phocine distemper virus)、ヒツジリンデルペスト(Ovine rinderpest)が挙げられる)
レスピロウイルス(Respirovirus)属(センダイウイルス(Sendai virus)模式種、その他として、ヒトパラインフルエンザウイルス1型及び3型並びに感冒のウイルスの一部が挙げられる)
ルブラウイルス属(ムンプスウイルス模式種、その他として、アチモタウイルス(Achimota virus)1型及び2型、ヒトパラインフルエンザウイルス2型及び4型、サルパラインフルエンザウイルス(Simian parainfluenza virus)5型、メナングルウイルス(Menangle virus)、チオマンウイルス(Tioman virus)、ツホコウイルス(Tuhoko virus)1型、2型及び3型が挙げられる)
TPMV様ウイルス属(ツパイア・パラミクソウイルス(Tupaia paramyxovirus)模式種、その他の種として、モスマンウイルス(Mossman virus)、ナリバウイルス(Nariva virus)及びサレムウイルス(Salem virus)が挙げられる)。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、キラルなアミノ酸の場合にはD立体異性体及びL立体異性体の天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を意味する。アミノ酸及び対応するアミノ酸残基(例えばペプチジル構造中に存在する)の両方を意味すると理解される。天然アミノ酸及び非天然アミノ酸は当分野で公知である。一般的な天然アミノ酸として、アラニン(Ala)、アルギニン(Arg)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)、システイン(Cys)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リジン(Lys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン(Pro)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)及びバリン(Val)が挙げられるがこれらに限定されない。珍しい非天然アミノ酸として、アリルグリシン(AllylGly)、ノルロイシン、ノルバリン、ビフェニルアラニン(Bip)、シトルリン(Cit)、4-グアニジノフェニルアラニン(Phe(Gu))、ホモアルギニン(hArg)、ホモリジン(hLys)、2-ナフチルアラニン(2-Nal)、オルニチン(Orn)及びペンタフルオロフェニルアラニンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
アミノ酸は典型的には、その側鎖に応じて1種又は複数種のカテゴリー(例えば極性、疎水性、酸性、塩基性及び芳香族)に分類される。極性アミノ酸の例として、ヒドロキシル、スルフヒドリル及びアミド等の側鎖官能基を有するもの並びに酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸が挙げられる。極性アミノ酸として、アスパラギン、システイン、グルタミン、ヒスチジン、セレノシステイン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられるがこれらに限定されない。疎水性アミノ酸又は無極性アミノ酸の例として、残基が無極性脂肪族側鎖を有するもの、例えばロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、プロリン、メチオニン及びフェニルアラニンが挙げられるがこれらに限定されない。塩基性アミノ酸残基の例として、塩基性側鎖を有するもの、例えばアミノ基又はグアニジノ基が挙げられる。塩基性アミノ酸残基として、アルギニン、ホモリジン及びリジンが挙げられるがこれらに限定されない。酸性アミノ酸残基の例として、カルボキシ基等の酸性側鎖官能基を有するものが挙げられる。酸性アミノ酸残基として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられるがこれらに限定されない。芳香族アミノ酸として、芳香族側鎖基を有するものが挙げられる。芳香族アミノ酸の例として、ビフェニルアラニン、ヒスチジン、2-ナフチルアラニン(2-napthylalananine)、ペンタフルオロフェニルアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられるがこれらに限定されない。一部のアミノ酸は複数種の群に分類される(例えば、ヒスチジン、トリプトファン及びチロシンは極性アミノ酸及び芳香族アミノ酸の両方に分類される)ことが留意される。アミノ酸は、帯電していないアミノ酸又は(正若しくは負に)帯電したアミノ酸に更に分類され得る。正に帯電したアミノ酸の例として、リジン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられるがこれらに限定されない。負に帯電したアミノ酸の例として、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられるがこれらに限定されない。上記の群それぞれに分類される更なるアミノ酸が当業者に既知である。
【００３０】
「等価のアミノ酸」は、本発明に係るペプチド化合物中において、機能のいかなる認識可能な喪失なしに別のアミノ酸に置換され得るアミノ酸を意味する。等価のアミノ酸は当業者に認識され得る。同様のアミノ酸の置換は、例えば本明細書で説明するようにサイズ、電荷、親水性及び疎水性に関して相対的に類似の側鎖置換に基づいて行なわれる。語句「又はこの等価のアミノ酸」は、個々のアミノ酸のリストの後に続いて使用する場合、リストに含まれる個々のアミノ酸の内の1種又は複数種の等価物を意味する。
【００３１】
本明細書で説明するペプチドのN末端及びC末端をタンパク質分解に対して保護することができる。例えば、N末端をアセチル基の形にすることができる、及び/又はC末端をアミド基の形にすることができる。タンパク質分解に対して耐性を示すペプチドの内部修飾も想定され、例えば、少なくとも-CONHペプチド結合は、(CH2NH)還元性結合、(NHCO)レトロ-インベルソ(retro-inverso)結合、(CH2-O)メチレン-オキシ結合、(CH2-S)チオメチレン結合、(CH2CH2)カルバ結合(carba bond)、(CO-CH2)セトメチレン結合、(CHOH-CH2)ヒドロキシエチレン結合、(N-N)結合、E-アルセン結合(E-alcene bond)又は-CH=CH-結合により修飾される、及び置き換えられる。本明細書で説明するペプチドを、Walensky他、Science. 2004、305、1466〜70頁で説明されているようなステープルドペプチド(stapled peptide)の技術により、タンパク質分解に対して保護することもできる。
【００３２】
本発明の別の態様では、尿クリアランス及び使用する治療用量の低下並びに血漿中半減期の増加のために、ペプチドは、そのC末端又はリジン残基によりポリエチレングリコール(PEG)分子(特に1500MW又は4000MWのPEG)に共有結合している。更に別の実施形態では、ペプチドを薬剤送達システム形成ミクロスフィア用の生分解性及び生体適合性のポリマー材料中に含めることにより、ペプチド半減期が増加している。ポリマー及びコポリマーは、例えば(米国特許出願公開第2007/0184015号、SoonKap Hahn他で説明されているような)ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド(PLGA)である。
【００３３】
用語「細胞透過性ペプチド」又は「CPP」は互換的に使用され、輸送ペプチド、キャリアペプチド又はペプチド導入ドメインとも呼ばれるカチオン性の細胞透過性ペプチドを意味する。CPP(本明細書で示す場合)は、所与の細胞培養集団の30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%の細胞(間の全ての整数を含む)内で、CPPに融合したペプチドの細胞透過を誘発する能力を有し、全身投与時にin vivoでの複数の組織内での高分子移行を可能にする。細胞透過性ペプチドはまた、適切な条件下で細胞と接触する場合、受動拡散と比べて著しく大きい状況で外部環境から細胞内環境(例えば細胞質、ミトコンドリア等の細胞小器官又は細胞の核)へと移るペプチドも意味することができる。そのような透過性ペプチドは、Fonseca S.B.他、Advanced Drug Delivery Reviews、2009、61 : 953〜964頁、Johansson他、Methods in Molecular Biology、2011、第683巻、第17章、Bechara and Sagan、(2013) FEBS letters 587、1693〜1702頁、Jones and Sayers (2012)、Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 161、582〜591頁、Khafagy el and Morishita、(2012) Advanced drug delivery reviews 64、531〜539頁、Malhi and Murthy、(2012) Expert opinion on drug delivery 9、909〜935頁、国際公開第2004/011595号パンフレット及び国際公開第2003/011898号パンフレットで説明されているものであってよい。全てのCPPが参照により援用される。
【００３４】
「ストリンジェントな条件」は、2種の相補核酸断片の間での特異的なハイブリダイゼーションを可能にする及び非特異的な結合を制限する温度及びイオン強度の条件を意味する(Sambrook他、Molecular Cloning, Second Edition (1989)、9.47〜9.62頁)。温度条件は一般に、(Tm-5℃)と(Tm-10℃)との間であり、Tmは理論的融合温度であり、対となった鎖の50%が分離する温度として定義される。30個超の塩基を含む配列の場合、Tmは、式:Tm=81.5+0.41(%G+C)+16.6Log(カチオン濃度)-0.63(%ホルムアミド)-(600/塩基数)により定義される。30個未満の塩基を含む配列の場合、Tmは、式:Tm=4(G+C)+2(A+T)により定義される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」及びこの文法的な変化形は、これらが組成物、担体、希釈液及び試薬に言及する場合、互換的に使用され、物質が、例えば吐き気、めまい、異常亢進等の望ましくない生理学的効果を生じることなく哺乳動物に投与可能であることを表す。
【００３６】
用語「患者」又は「対象」は、雄、雌、大人及び子供を含むヒト又は非ヒト哺乳動物(好ましくはマウス、ネコ、イヌ、サル、ウマ、ウシ類(即ち、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ)を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「処置」又は「治療」には、治癒的な及び/又は予防的な処置が含まれる。より具体的には、治癒的処置は、症状の緩和、改善及び/又は除去、軽減及び/又は安定化(例えば、より進行したステージへと進行しないこと)並びに具体的な障害の症状の進行の遅延のいずれかを意味する。予防的処置は、発症を停止させること、発生のリスクを軽減すること、発生率を低下させること、発症を遅延させること、発生を軽減すること並びに具体的な障害の症状の発症までの時間を延ばすことのいずれかを意味する。
【００３８】
単離ペプチド
本発明は、パラミクソウイルス亜科ウイルスのN末端リンタンパク質Pに由来する新規の単離ペプチドに関し、この単離ペプチドは、パラミクソウイルス亜科ウイルスのリンタンパク質P/核タンパク質N0相互作用を阻害する能力及び/又はパラミクソウイルス亜科のウイルス複製を阻害する能力を有する。
【００３９】
一態様では、本発明は、
式(I):
バリン-Xaa1-Xaa2-グリシン-ロイシン-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8
(式(I)中、
Xaa1はグルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン(N)、リジン(K)又は等価の極性アミノ酸であり、
Xaa2はグルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、リジン(K)又は等価の負に帯電した(若しくは酸の)アミノ酸であり、
Xaa3はグルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、リジン(K)又はグルタミン(Q)、セリン(S)又はアスパラギン(N)であり、
Xaa4はシステイン(C)、イソロイシン(I)であり、
Xaa5はイソロイシン(I)、ロイシン(L)若しくはバリン(V)又は等価の無極性脂肪族アミノ酸であり、
Xaa6はグルタミン(Q)、リジン(K)、アルギニン(R)又はアスパラギン酸(D)であり、
Xaa7はアラニン(A)若しくはフェニルアラニン(F)又は等価の無極性アミノ酸であり、
Xaa8はイソロイシン(I)、ロイシン(L)若しくはバリン(V)又は等価の無極性脂肪族アミノ酸である)のアミノ酸配列を含む単離ペプチドを提供する。
【００４０】
好ましい実施形態では、Xaa5はイソロイシン(I)であり、Xaa8はイソロイシン(I)である。好ましい実施形態では、Xaa1はアスパラギン(N)又はグルタミン(Q)であり、Xaa2はアスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E)であり、Xaa3はアスパラギン(N)又はグルタミン酸(E)であり、Xaa4はイソロイシン(I)又はシステイン(C)であり、Xaa5はイソロイシン(I)であり、Xaa6はアスパラギン酸(D)又はグルタミン(Q)であり、Xaa7はフェニルアラニン(F)又はアラニン(A)であり、Xaa8はイソロイシン(I)である。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明は、
i)配列番号1における第7位のバリン残基から第17位のイソロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号1のP7〜17)、
ii)配列番号2における第9位のバリン残基から第19位のロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号2のP9〜19)、
iii)(i)又は(ii)の配列に実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは(i)又は(ii)の配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列
からなる群から選択される単離ペプチドを提供する。
【００４２】
本発明はまた、
式(II):
Yaa1-Yaa2-Yaa3-Yaa4-Yaa5-バリン-Xaa1-Xaa2-グリシン-ロイシン-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Yaa6-Yaa7-Yaa8
(式(II)中、
Xaa1-Xaa2 Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8は上記で規定されており、
Yaa1はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)又は等価の酸性アミノ酸であり、
Yaa2はグルタミン(Q)又はリジン(K)であり、
Yaa3はアラニン(A)、ロイシン(L)又はチロシン(Y)であり、
Yaa4はグルタミン酸(E)又はチロシン(Y)又はアルギニン(R)であり、
Yaa5はアスパラギン(N)、ヒスチジン(H)又はロイシン(L)であり、
Yaa6はグルタミン(Q)、リジン(K)又はアルギニン(R)であり、
Yaa7はリジン(K)、アラニン(A)又はグルタミン酸(E)であり、
Yaa8はアスパラギン(N)、グルタミン酸(E)又はセリン(S)である)のアミノ酸配列を含む単離ペプチドも提供する。
【００４３】
好ましい実施形態では、Yaa1はアスパラギン酸(D)である。好ましい実施形態では、Yaa1はアスパラギン酸(D)であり、Yaa2はリジン(K)又はグルタミン(Q)であり、Yaa3はロイシン(L)又はアラニン(A)であり、Yaa4はグルタミン酸(E)であり、Yaa5はロイシン(L)又はアスパラギン(N)であり、Yaa6はグルタミン(Q)であり、Yaa7はリジン(K)であり、Yaa8はアスパラギン(N)である。
【００４４】
好ましい実施形態では、このペプチドは、配列番号3の配列DQAENVQEGLECIQAIQKN又は配列番号1の第7位のバリン残基から第17位のイソロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号1のP7〜P17)を含む、又はこの配列からなる。
【００４５】
好ましくは、本発明に係る単離ペプチドは、(i)パラミクソウイルス亜科ウイルスのリンタンパク質P/核タンパク質N0相互作用を阻害する能力及び/又は(ii)パラミクソウイルス亜科のウイルス複製を阻害する能力を有する。
【００４６】
当業者は、単離ペプチドが生物学的に活性であるかどうかを容易に決定することができる。例えば、(例えば、実施例2及び図1dで説明したように)免疫蛍光研究により明らかなようにNの細胞局在性の変化及び点状の出現の欠如により示されるオリゴマー化の阻害によってNの可溶化につながるN0-P断片複合体形成を評価することにより、リンタンパク質P/核タンパク質N0相互作用を阻害する能力を測定することができる。免疫蛍光研究において核タンパク質N0との共局在化を分析することにより、及び/又は例えばRodrigues-Ferreira他(2009、PLoS One. 4(10):e7239 2009)で説明されている共沈殿プロトコルを使用して細胞抽出物中での核タンパク質N0結合を評価することにより、核タンパク質N0と会合する能力を測定することができる。
【００４７】
例えば、阻害剤の存在下で培養したウイルスのウイルス増殖力価を測定することにより、及び/又は(例えば実施例+図3b、図3cで説明したように)実験によってシンシチウム形成の消滅を評価することにより、ウイルス複製を阻害する能力を測定することができる。Barbeau B他(J Virol. 1998 Sep;72(9):7125〜36頁)で説明されているルシフェラーゼをベースとするシンシチウム定量アッセイを使用して、パラミクソウイルス感染の特徴であるシンシチウム形成を測定することができる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「生物学的に活性な」断片は、配列番号1のペプチドの少なくとも1つの(好ましくは全ての)生物学的活性を示す断片を意味しており、但し、この生物学的に活性な断片はウイルス複製を阻害する能力を保持する。この生物学的に活性な断片は例えば、共局在化実験(実施例2及び図1dを参照されたい)により評価した場合にリンタンパク質P/核タンパク質N0の相互作用を阻害することができることを特徴とすることができる、並びに/又はウイルス複製力価の測定及び/若しくはシンシチウム形成実験及び/若しくはウイルスゲノムRNA若しくはmRNAのqPCR定量化(実施例及び図3b、図3cを参照されたい)により評価した場合にウイルス複製を阻害することができることを特徴とすることができる。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明は、
i)MDKLELVNDGLNIIDFIQKNQKEIQKTYGRSSIQQPSIKD(配列番号1)からなるアミノ酸配列、
ii)配列番号1における第6位のロイシン残基から第40位のアスパラギン酸残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号1のP6〜40)、
iii)配列番号1における第11位のロイシン残基から第40位のアスパラギン酸残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号1のP11〜40)、
iv)配列番号1における第1位のメチオニン残基から第20位のアスパラギン残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号1のP1〜20)、
v)配列番号1における第20位のアスパラギン残基から第35位のグルタミン残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号1のP20〜35)、
vi)MAEEQAYHVSKGLECLKALRENPPDIEEIQEVSSLRDQTC(配列番号2)からなるアミノ酸配列、
vii)配列番号2における第1位のメチオニン残基から第22位のアスパラギン残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号2のP1〜22)、
viii)DQAENVQEGLECIQAIQKN(配列番号3)からなるアミノ酸配列、
ix)MAEEQARHVKNGLECIRALKAEPIGSLAIEEAMAAWSEIS(配列番号4)P40 MeVからなるアミノ酸配列、
x)配列番号4における第9位のバリン残基から第19位のロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列(配列番号4のP9〜19)、
xi)(i)から(x)の配列に実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは(i)から(x)の配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列
からなる群から選択される単離ペプチドを提供する。
【００５０】
参照ペプチドに「実質的に相同な」ペプチドは、1個又は複数個の保存的置換により参照配列に由来していてもよい。好ましくは、この相同ペプチドは2個のシステイン残基を含まず、その結果、環化が防止される。1個又は複数個のアミノ酸残基が生物学的に類似の残基で置き換えられている場合、又はアミノ酸の80%超が同一である場合、若しくは約90%超が類似(機能的に同一)であり、好ましくは約95%超が類似(機能的に同一)である場合、2種のアミノ酸配列は「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、例えばGCG(Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、Version 7、ウィスコンシン州、マディソン(Madison))パイルアッププログラム(pileup program)又は当分野で既知のプログラム(BLAST、FASTA等)のいずれかを使用するアラインメントにより、類似の、同一の又は相同の配列が同定される。例えば、Needleを使用して、及び10のギャップ開始ペナルティ及び0.5のギャップ伸長ペナルティを有するBLOSUM62マトリックスを使用して、Needleman-Wunschアラインメントアルゴリズムに基づくペアワイズグローバルアラインメント(pairwise global alignment)を実施して2種の配列の全長に沿ってこれらの配列の最適なアラインメント(ギャップを含む)を見出すことにより、同一性の割合を算出することができる。
【００５１】
用語「保存的置換」は、本明細書で使用する場合、ペプチドの全体のコンフォメーション及び機能を変更することなく、あるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを示し、この保存的置換として、類似の特性(例えば極性、水素結合能、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族等)を有するものによる、あるアミノ酸の置き換えが挙げられるがこれらに限定されない。類似の特性を有するアミノ酸は当分野で公知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性の塩基性アミノ酸であり、交換可能である。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンを、ロイシン、メチオニン又はバリンで置き換えることができる。中性の親水性アミノ酸(互いに置換され得る)として、アスパラギン、グルタミン、セリン及びトレオニンが挙げられる。
【００５２】
「置換」又は「修飾」により、本発明は、天然に存在するアミノ酸から変更されている又は修飾されているアミノ酸を含む。
【００５３】
従って、本発明の文脈において、保存的置換は、類似の特性を有する別のアミノ酸による、あるアミノ酸の置換として当分野で認識されていることを理解すべきである。
【００５４】
本発明によれば、第2のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する第1のアミノ酸配列は、第1の配列が第2のアミノ酸配列と80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の同一性を有することを意味する。好ましくは、BLAST P(Karlin及びAltschul、1990)等の適切な配列アラインメントアルゴリズム及びデフォルトパラメータを使用してアミノ酸配列の同一性を測定する。
【００５５】
一部の実施形態では、本発明の単離ペプチドは、最大で100個(及び少なくとも9個)のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10又は9個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは50個未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは30個未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは25個未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは20個未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは15個未満のアミノ酸を含む。
【００５６】
キメラペプチド
一部の実施形態では、単離リンタンパク質Pペプチドは、少なくとも1種の細胞透過性ペプチド(CPP)に連結されており、キメラペプチドを形成している。
【００５７】
好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドは、Tatペプチド、ポリアルギニンペプチド、HA2-R9ペプチド、Penetratinペプチド、Transportanペプチド、Vectocell(登録商標)ペプチド、マウロカルシン(maurocalcine)ペプチド、デカリジンペプチド、HIV-Tat由来PTD4ペプチド、B型肝炎ウイルス転位モチーフ(Hepatitis B virus Translocation Motif)(PTM)ペプチド、mPrP1-28ペプチド、POD、pVEC、EB1、Rath、CADY、Histatin 5、Antpペプチド、Cyt86-101ペプチド、DPTペプチドを含む、又はこれらのペプチドからなる。
【００５８】
「Tatペプチド」は、配列RKKRRQRRR(配列番号5、Tatペプチド2)又はYGRKKRRQRRR(配列番号6)を有するペプチドを意味する。
【００５９】
「ポリアルギニンペプチド」は、少なくとも9個のアルギニンからなるペプチドを意味する。好ましくは、ポリアルギニンペプチドは、配列R9(配列番号7)又はR11(配列番号8)を有するペプチドである。
【００６０】
「HA2-R9ペプチド」は、配列GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG-R9(配列番号9)を有するペプチドを意味する。
【００６１】
「Penetratinペプチド」は、配列RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号10)を有するペプチドを意味する。
【００６２】
「Transportanペプチド」は、配列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(配列番号11)を有するペプチドを意味する。
【００６３】
「Vectocell(登録商標)ペプチド」は、ヒトヘパリン結合タンパク質及び/又は抗DNA抗体に由来するペプチド意味する。
【００６４】
「マウロカルシンペプチド」は、配列GDCLPHLKLCKENKDCCSKKCKRRGTNIEKRCR(配列番号12)を有するペプチドを意味する。
【００６５】
「デカリジンペプチド」は、配列KKKKKKKKKK(K10)(配列番号13)を有するペプチドを意味する。
【００６６】
「HIV-Tat由来PTD4ペプチド」は、配列YARAAARQARA(配列番号14)を有するペプチドを意味する。
【００６７】
「B型肝炎ウイルス転位モチーフ(PTM)ペプチド」は、配列PLSSIFSRIGDP(配列番号15)を有するペプチドを意味する。
【００６８】
「mPrP1-28ペプチド」は、配列MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP(配列番号16)を有するペプチドを意味する。
【００６９】
「PODペプチド」は、配列GGG(ARKKAAKA)4(配列番号17)を有するペプチドを意味する。
【００７０】
「pVECペプチド」は、配列LLIILRRRRIRKQAHAHSK(配列番号18)を有するペプチドを意味する。
【００７１】
「EB1ペプチド」は、配列LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK(配列番号19)を有するペプチドを意味する。
【００７２】
「Rathペプチド」は、配列TPWWRLWTKWHHKRRDLPRKPE(配列番号20)を有するペプチドを意味する。
【００７３】
「CADYペプチド」は、配列GLWRALWRLLRSLWRLLWRA(配列番号21)を有するペプチドを意味する。
【００７４】
「Histatin 5ペプチド」は、配列DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY(配列番号22)を有するペプチドを意味する。
【００７５】
「Antpペプチド」は、配列RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号23)を有するペプチドを意味する。
【００７６】
「Cyt86-101ペプチド」は、配列KKKEERADLIAYLKKA(配列番号24)を有するペプチドを意味する。
【００７７】
「DPTペプチド」は、配列VKKKKIKREIKI(配列番号25)を有するペプチドを意味する。
【００７８】
別の好ましい実施形態では、リンタンパク質Pペプチドは、2種、3種又は複数種の透過性ペプチドに連結されている。
【００７９】
単離ペプチドとして、本発明に係るキメラタンパク質は、パラミクソウイルス亜科ウイルスのリンタンパク質P/核タンパク質N0相互作用を阻害する能力及び/又はパラミクソウイルス亜科のウイルス複製を阻害する能力を有する。
【００８０】
核酸
本発明はまた、本発明に係る単離ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む又はこのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにも関する。
【００８１】
ある実施形態では、このポリヌクレオチドは、
-  配列番号26(5'-ATGGATAAATTGGAACTAGTCAATGATGGCCTCAATATTATTGACTTTATTCAGAAGAACCAAAAAGAAATACAGAAGACATACGGACGATCAAGTATTCAACAACCCAGCATCAAAGAT-3');P40 Nipah
-  配列番号27(5'-ATGGCAGAGGAACAGGCCTACCATGTCAGCAAAGGGCTGGAATGCCTCAAAGCCCTCAGAGAGAATCCTCCTGACATTGAGGAGATTCAAGAGGTCAGCAGCCTCAGAGACCAAACCTGC-3');P40 CDV
-  配列番号28(5'-ATGGCAGAAGAGCAGGCACGCCATGTCAAAAACGGACTGGAATGCATCCGGGCTCTCAAGGCCGAGCCCATCGGCTCACTGGCCATCGAGGAAGCTATGGCAGCATGGTCAGAAATATCA-3');P40 MeV
(それぞれ配列番号1、2、4の配列のペプチドをコードする)から選択されるヌクレオチド配列を含む、又はこのヌクレオチド配列からなる。
【００８２】
本発明はまた、上記に記載した配列の内の1つに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及びストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を有するポリヌクレオチドにも関する。
【００８３】
本発明は更に、本明細書で定義したポリヌクレオチドと、宿主細胞中において本発明に係るペプチドの発現(例えば転写及び翻訳)を可能にする調節配列(例えば、適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等)とからなる又はこれらを含む遺伝子構築物に関する。
【００８４】
本発明の遺伝子構築物はDNA又はRNAであってよく、好ましくは二本鎖DNAである。本発明の遺伝子構築物はまた、目的の宿主細胞若しくは宿主生物の形質転換に適した形態、目的の宿主細胞のゲノムDNA中への組込みに適した形態、又は目的の宿主生物中での独立した複製、維持及び/若しくは遺伝に適した形態であることもできる。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えばプラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクター又はトランスポゾン等のベクターの形態であってよい。特に、ベクターは発現ベクターであってよく、即ち、(例えば、適切な宿主細胞中で、宿主生物中で及び/又は発現系で)in vitro及び/又はin vivoで発現を行なうことができるベクターであってよい。
【００８５】
好ましいが非限定的な態様では、本発明の遺伝子構築物は、i)本発明の少なくとも1種の核酸であって、ii)1種又は複数種の調節エレメント、例えばプロモーター及び任意選択で適切なターミネーターに作動可能に接続され、任意選択でiii)それ自体既知である遺伝子構築物の1種又は複数種の更なるエレメントにも接続されている核酸を含み、用語「調節エレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」及び「作動可能に接続されている」は、当分野における(更に本明細書で説明する)これらの通常の意味を有し、遺伝子構築物中に存在する前記「更なるエレメント」は、例えば3'-UTR配列若しくは5'-UTR配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー/レポーター遺伝子、及び/又は形質転換若しくは組込み(の効率)を促進することができる若しくは増加させることができるエレメントであってよい。そのような遺伝子構築物に適したこれらの及びその他のエレメントは当業者に明らかであり、例えば、使用する構築物、目的の宿主細胞若しくは宿主生物の種類、(例えば構成的発現、一過性発現若しくは誘導性発現により)目的の本発明のヌクレオチド配列を発現させることができる方法、並びに/又は使用する形質転換技術によって決定され得る。例えば、抗体及び抗体断片((単一)ドメイン抗体及びScFv断片が挙げられるがこれらに限定されない)の発現及び産生用のそれ自体は既知である調節配列、プロモーター及びターミネーターを、本質的に類似した方法で使用することができる。
【００８６】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物では、前記本発明の少なくとも1種の核酸及び前記調節エレメント並びに任意選択で前記1種又は複数種の更なるエレメントは、互いに「作動可能に連結」されており、このことは、これらの配列及びエレメントが互いに機能的関係であることを一般に意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターがコード配列の転写及び/又は発現を開始させることができる又は制御する/調節することができる(前記コード配列は前記プロモーターの「制御下」にあるように理解すべきである)場合に、コード配列と「作動可能に連結されている」と見なされる。一般に、2種のヌクレオチド配列が作動可能に連結されている場合、これらのヌクレオチド配列は同じ配向であってよく、通常は同じリーディングフレーム中であってもよい。これらのヌクレオチド配列は通常、本質的に連続していることもできるが、このことが必要とされない場合もある。
【００８７】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の調節エレメント及び更なるエレメントは、目的の宿主細胞中で又は宿主生物中で本発明の遺伝子構築物の目的の生物学的機能を提供することができるようなものである。
【００８８】
例えば、プロモーター、エンハンサー又はターミネーターは目的の宿主細胞中で又は宿主生物中で「作動可能」であるべきであり、このことは、(例えば)前記プロモーターが、作動可能に連結されている本明細書で定義のヌクレオチド配列(例えばコード配列)の転写及び/又は発現を開始可能であるべきである又は制御/調節可能であるべきであることを意味する。
【００８９】
いくつかの特に好ましいプロモーターとして、本明細書で述べる宿主細胞中での発現用のそれ自体既知であるプロモーター、特に細菌細胞中での発現用のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
選択マーカーは、即ち適切な選択条件下で、本発明のヌクレオチド配列により(成功裏に)形質転換されている宿主細胞及び/又は宿主生物の(成功裏に)形質転換されていない宿主細胞/生物からの識別を可能にするようなものであるべきである。そのようなマーカーのいくつかの好ましいが非限定的な例は、抗生物質(例えばカナマイシン若しくはアンピシリン)に対する耐性を示す遺伝子、温度耐性を示す遺伝子、又は非形質転換細胞若しくは非形質転換生物の生存に必須である培地中のある特定の因子、化合物及び/若しくは(食物)成分の非存在下での宿主細胞若しくは宿主生物の維持を可能にする遺伝子である。
【００９１】
リーダー配列は、目的の宿主細胞中で又は宿主生物中で、所望の翻訳後修飾を可能にするようなもの及び/又は転写mRNAを細胞の所望の部位若しくは小器官へ誘導するようなものであるべきである。リーダー配列はまた、前記細胞からの発現産物の分泌も可能にし得る。従って、リーダー配列は、宿主細胞中で又は宿主生物中で作動可能な任意のプロ配列、プレ配列又はプレプロ配列であってよい。
【００９２】
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、宿主細胞中で又は宿主生物中で、遺伝子構築物上に存在する遺伝子又はヌクレオチド配列の発現の検出を可能にするようなものであるべきである。発現マーカーは、例えば細胞の特定の部位中での若しくは小器官中での、及び/又は多細胞生物の特定の細胞中での、組織中での、器官中での若しくは部位中での、発現産物の局在化も任意選択的に可能にし得る。そのようなレポーター遺伝子はまた、本発明のアミノ酸配列とのタンパク質融合として発現され得る。いくつかの好ましいが非限定的な例として、GFP等の蛍光タンパク質が挙げられる。
【００９３】
適切なプロモーター、ターミネーター及び更なるエレメントのいつかの好ましいが非限定的な例として、本発明で述べた宿主細胞中での発現に使用され得るもの、特に、本明細書で述べたもの等の細菌細胞中での発現に適したものが挙げられる。本発明の遺伝子構築物中に存在し得る/本発明の遺伝子構築物中で使用され得るプロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー及び更なるエレメント(例えばターミネーター、転写及び/若しくは翻訳エンハンサー、並びに/又は組込み因子)のいくつかの(更なる)非限定的な例に関して、Sambrook他等の一般的なハンドブックを参照されたい。その他の例は当業者に明らかであるだろう。
【００９４】
本発明の遺伝子構築物は一般に、例えばSambrook他等の一般的なハンドブックで説明されている技術を使用して、本発明のヌクレオチド配列を上記で説明した1種又は複数種の更なるエレメントに適切に連結させることにより生成され得る。
【００９５】
多くの場合、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体既知である適切な(発現)ベクターに挿入することにより、本発明の遺伝子構築物を得ることができる。
【００９６】
本発明の核酸及び/又は本発明の遺伝子構築物を、宿主細胞又は宿主生物を形質転換させるために使用することができ、即ち、本発明のペプチドを発現させるために及び/又は産生するために使用することができる。
【００９７】
そのため、別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを発現する(若しくは適切な状況下で発現可能である)及び/又は本発明のポリヌクレオチド若しくは本発明の遺伝子構築物を含む宿主又は宿主細胞に関する。適切な宿主又は宿主細胞は当業者に明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核若しくは真核の細胞若しくは細胞株又は任意の適切な真菌、原核生物若しくは真核生物、例えば:細菌株(グラム陰性株、例えば大腸菌(Escherichia coli)の株;プロテウス(Proteus)の株、例えばプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)の株;シュードモナス(Pseudomonas)の株、例えばシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)の株;及びグラム陽性株、例えばバチルス(Bacillus)の株、例えばバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)の株若しくはバチルス・ブレビス(Bacillus brevis)の株;ストレプトマイセス(Streptomyces)の株、例えばストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)の株;スタフィロコッカスの株、例えばスタフィロコッカス・カルノーサス(Staphylococcus carnosus)の株;及びラクトコッカス(Lactococcus)の株、例えばラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)の株が挙げられるがこれらに限定されない)、真菌細胞(トリコデルマ(Trichoderma)の種由来の細胞、例えばトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)由来の細胞;ニューロスポラ(Neurospora)の種由来の細胞、例えばニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)由来の細胞;ソルダリア(Sordaria)の種由来の細胞、例えばソルダリア・マクロスポレ(Sordaria macrospore)由来の細胞;アスペルギルス(Aspergillus)の種由来の細胞、例えばアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来の細胞若しくはアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)由来の細胞;若しくはその他の糸状菌由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない)、酵母細胞(サッカロマイセス(Saccharomyces)の種由来の細胞、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の細胞;シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)の種由来の細胞、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)の細胞;ピチア(Pichia)の種由来の細胞、例えばピチア・パストリス(Pichia pastoris)の細胞若しくはピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)の細胞;ハンゼヌラ(Hansenula)の種由来の細胞、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)の細胞;クリベロマイセス(Kluyveromyces)の種由来の細胞、例えばクリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)の細胞;アルクスラ(Arxula)の種由来の細胞、例えばアルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)の細胞;ヤロウイア(Yarrowia)の種由来の細胞、例えばヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の細胞が挙げられるがこれらに限定されない)、両生類の細胞若しくは細胞株、例えばアフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞、昆虫に由来する細胞若しくは細胞株、例えば鱗翅類に由来する細胞/細胞株(スポドプテラ属(Spodoptera)SF9及びSf21細胞が挙げられるがこれらに限定されない)、若しくはショウジョウバエ(Drosophila)に由来する細胞/細胞株、例えばシュナイダー(Schneider)細胞及びKc細胞、植物若しくは植物細胞、例えばタバコ植物、並びに/又は哺乳動物の細胞若しくは細胞株、例えば、ヒトに由来する細胞若しくは細胞株、CHO細胞、BHK細胞(例えばBHK-21細胞)が挙げられるがこれらに限定されない哺乳動物由来の細胞若しくは細胞株、ヒトの細胞若しくは細胞���、例えばHeLa、COS(例えばCOS-7)及びPER.C6細胞であってよい。
【００９８】
ペプチドを調製する方法
本発明は更に、本発明のペプチドを調製する又は生成する方法に関する。
【００９９】
本発明のペプチドを、化学合成技術及び組み換え技術等の当分野で公知のあらゆる手段により生成することができる。
【０１００】
化学合成技術の例は、固相合成及び液相合成である。固相合成の場合、例えば、合成するペプチドのC末端に対応するアミノ酸が、有機溶媒に不溶である支持体に結合しており、適切な保護基で保護されているアミノ基及び側鎖官能基を有するアミノ酸がC末端からN末端へと一つずつ縮合される反応と、樹脂に結合したアミノ酸又はペプチドのアミノ基の保護基が遊離される反応との交互の反復により、ペプチド鎖はこのようにして伸長される。固相合成法は、使用する保護基の種類に応じてtBoc法及びFmoc法に大きく分類される。一般的に使用される保護基として、アミノ基に関してはtBoe(t-ブトキシカルボニル)、Cl-Z(2-クロロベンジルオキシカルボニル)、Br-Z(2-ブロモベンジルオキシカルボニル)(2-bromobenzyloyycarbonyl)、Bzl(ベンジル)、Fmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)、Mbh(4, 4'-ジメトキシジベンズヒドリル)、Mtr(4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル)、Trt(トリチル)、Tos(トシル)、Z(ベンジルオキシカルボニル)及びClz-Bzl(2,6-ジクロロベンジル)が挙げられ、グアニジノ基に関してはNO2(ニトロ)及びPmc(2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル)が挙げられ、ヒドロキシル基に関してはtBu(t-ブチル)が挙げられる。所望のペプチドの合成後、このペプチドを、脱保護反応及び固体支持体からの切断にかける。そのようなペプチド切断反応を、Boc法の場合にはフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸により実行することができ、Fmoc法の場合にはTFAにより実行することができる。
【０１０１】
あるいは、ペプチドを、組み換え技術を使用して合成することができる。この場合、上記で説明した本発明に係る核酸及び/又は遺伝子構築物を使用する。
【０１０２】
ペプチドを生成する方法は、前記ペプチドを精製する工程、前記ペプチドを化学的に修飾する工程、及び/又は前記ペプチドを医薬組成物へと配合する工程を任意選択で含むことができる。
【０１０３】
医薬組成物
本発明は更に、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組成物に関する。
【０１０４】
より具体的には、本発明は、本発明の単離ペプチド又は本発明のキメラペプチドを薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組成物に関する。
【０１０５】
ペプチドを、薬学的に許容される担体と共に配合する。
【０１０６】
医薬組成物中に溶解している又は分散している活性成分を含む薬理学的組成物の調製は当分野でよく理解されており、製剤に基づいて限定される必要はない。典型的には、そのような組成物は溶液又は懸濁液のいずれかとして注射可能なように調製されるが、使用前には液体の、溶液又は懸濁液に適した固形を調製することもできる。調製物を乳化させることもできる。特に、医薬組成物を固形剤形に製剤化することができ、例えばカプセル、錠剤、丸剤、粉末、糖衣錠又は顆粒剤に製剤化することができる。
【０１０７】
ビヒクルの選択及びビヒクル中の活性物質の含有量は一般に、活性化合物の溶解性及び化学的性質、具体的な投与様式、並びに薬務で見られる条件に従って決定される。例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク等の潤滑剤と組み合わせた、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム等の賦形剤並びにデンプン、アルギン酸及びある特定の複合ケイ酸塩等の崩壊剤を使用して、錠剤を調製することができる。カプセル剤を調製するためには、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールを使用することが有利である。水性懸濁液を使用する場合には、この水性懸濁液は、乳化剤又は懸濁を促進する薬剤を含むことができる。希釈剤、例えばスクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン及びクロロホルム又はこれらの混合物を使用することもできる。
【０１０８】
投薬は当業者により抗感染効果が達成されるように選択され、使用する投与経路及び剤形よって決まる。単回投与又は分割投与で対象に投与されるペプチドの1日当たりの総用量は、例えば1日当たり約0.001〜約100mg/体重1kgの量であってよく、好ましくは0.01〜10mg/kg/日であってよい。投薬単位組成物は、1日の用量を構成するために使用され得るように、この投薬単位組成物の約数の量を含むことができる。しかしながら、任意の特定の患者に特異的な用量レベルを、様々な因子、例えば体重、全身の健康、性別、食事、投与の時間及び経路、吸収及び排泄の速度、その他の薬剤との組合せ、並びに処置中の特定の疾患の重症度によって決めることができることが理解されるだろう。
【０１０９】
治療用途
上記で定義した単離ペプチド及びキメラペプチド、本発明の医薬組成物を、パラミクソウイルス亜科感染の処置に使用することができる。
【０１１０】
そのため、本発明は、パラミクソウイルス亜科感染の処置に使用するための本発明のペプチド又はキメラペプチドにも関する。
【０１１１】
特に、本発明の単離ペプチド又はキメラペプチドは、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%又は100%の対象でウイルス負荷を低下させる能力を有することができる。
【０１１２】
本発明は、それを必要とする患者でのパラミクソウイルス亜科感染の処置方法であって、本発明の単離ペプチド又はキメラペプチドを前記患者に投与する工程を含む処置方法も提供する。
【０１１３】
パラミクソウイルス亜科感染は、ルブラウイルス感染、アブラウイルス感染、へニパウイルス感染、ヘニパウイルス様感染、モルビリウイルス感染、モルビリウイルス様(TPMV様ウイルス)感染又はフェルラウイルス感染の間で選択される属に属するウイルスに起因する。
【０１１４】
ヘニパウイルス感染は、特にニパウイルス(NIV)又はヘンドラ(Hendra)ウイルス(HeV)の感染であるがこれらに限定されない。
【０１１５】
モルビリウイルス感染は、特に麻疹ウイルス(MeV)又はリンデルペストウイルスの感染であるがこれらに限定されない。
【０１１６】
ルブラウイルス感染は、特にムンプスウイルス及びパラインフルエンザ2型、4型ウイルスの感染であるがこれらに限定されない。
【０１１７】
本発明を、下記の図面及び実施例により更に説明することができる。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定すると決して解釈すべきではない。
【実施例】
【０１１８】
(実施例1)
材料及び方法
N0-Pコア複合体の再構成。ニパウイルスのマレーシア単離株UMMC1(Uniprot番号Q9IK91及びQ9IK92)由来のPの残基1〜50(P50)とNの残基32〜383(N32〜383)又は32〜402(N32〜402)とを含む構築物を、N末端マルトース結合タンパク質(MBP)タグと融合したpETM40ベクターにクローニングした。全てのタンパク質を、大腸菌(E.coli)BL21(DE3)Rosetta細胞中で発現させた。O.D.が0.6に達するまで細胞をLB培地中で37℃にて増殖させ、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで添加することにより、タンパク質発現を20℃にて一晩誘導した。細胞を回収し、ペレットを、P構築物用のバッファーA(150mMのNaCl、50mMのアルギニン、50mMのグルタミン酸塩及び0.5mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を含む20mMのTris-HClバッファー(pH7.5))とN構築物用のバッファーB(150mMのNaClを含むTris-HClバッファー(pH7.5))とに懸濁させた。全てのバッファーにCompleteプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche社)を補充した。細胞を超音波処理で破壊し、粗抽出物を20分にわたる4℃での45,000gの遠心分離により清浄化した。上清を、バッファーA又はバッファーBで平衡化したアミロース樹脂カラム(New England Biolabs社)にロードした。このカラムを、500mMのNaClを含む10体積のバッファーA又はバッファーBで洗浄し、タンパク質を、バッファーA中の又はバッファーB中の50mMのマルトース(Sigma社)で溶出させた。
【０１１９】
P-MBP融合タンパク質をTEVプロテアーゼで切断してMBPタグを除去した。このプロテアーゼを100:1(融合タンパク質:TEV)の近似質量比で添加し、4℃にて一晩、バッファーA中で消化を実施した。3kDaのカットオフでVivaspin濃縮器(GE Healthcare社)を使用した濃縮後、タンパク質溶液を、4℃にてバッファーAで平衡化したS75 Superdex(GE Healthcare社)カラムにロードした。精製したPペプチドを精製したN-MBPと混合し、混合物を4℃で一晩インキュベートした。濃縮後、溶液を、バッファーAで平衡化したS75 Superdexカラムにロードした。N0-MBP-P複合体を含む画分をプールし、100:1の質量比でのTEVプロテアーゼの存在下における4℃での一晩のインキュベーションにより、MBPタグを切断した。溶液を濃縮し、バッファーBで平衡化した短アミロース樹脂(NEB社)カラムに連結されたS75 Superdex(GE Healthcare社)カラムにロードして、切断したMBPを完全に除去した。N0-P複合体を含む画分をプールし、10kDaカットオフでAmicon濃縮器(Millipore社)を使用して濃縮した。この精製工程中、タンパク質純度をSDS-PAGEでチェックした。
【０１２０】
Pの残基1〜100(P100)を含む構築物を、C末端Hisタグを有するpET28ベクターにクローニングし、大腸菌BL21(DE3)Rosetta細胞中で発現させた。未標識のP100を生成するために、O.D.が0.6に達するまで細胞をLB培地中で37℃にて増殖させ、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで添加することにより、タンパク質発現を20℃にて一晩誘導した。13C-15N標識付きP100の場合、既に説明されているように24、細胞を、1.0g.L-1の15NH4Cl及び4.0g.L-1の13Cグルコースと共にMEMビタミン(Gibco社)を補充したM9最小培地中で増殖させた。細胞を回収し、ペレットを、Completeプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche社)を補充したバッファーAに懸濁させた。細胞を超音波処理で破壊し、粗抽出物を20分にわたる4℃での45,000gの遠心分離により清浄化した。上清を、バッファーAで予め平衡化したHis Select樹脂(Sigma社)カラムにロードした。このカラムを、500mMのNaCl及び10mMのイミダゾール(Sigma社)を含む10体積のバッファーAで洗浄し、タンパク質を、300mMのイミダゾールを含むバッファーA中に溶出させた。ペプチドを含む画分をプールし、5kDaカットオフでVivaspin濃縮器(GE Healthcare社)を使用して濃縮した。溶液を、4℃にてバッファーAで平衡化したS200 Superdexカラムにロードした。ペプチドを含む画分をプールして濃縮した。NMR実験用に、N32〜4020-P100複合体を上記で説明したように再構成し、バッファーAを、150mMのNaCl、50mMのアルギニン、50mMのグルタミン酸塩及び0.5mMのTCEPを含む20mMのBis-Trisバッファー(pH6.0)と交換した。
【０１２１】
N32〜383の代わりにセレノメチオニンを生成するために、O.D.が0.6に達するまで、細胞を、1.0g.L-1のNH4Cl及び2.0g.L-1のグルコースと共にMEMビタミン(Gibco社)を補充したM9最小培地中で37℃にて増殖させた。次いで、温度を20℃まで低下させ、培養物に、培地1リットル当たり100mgのLys、100mgのPhe、100mgのThr、50mgのIle、50mgのLeu、50mgのVal及び50mgのSelenoMetを含むアミノ酸の混合物を補充し、45分にわたりインキュベートした。イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで添加することにより、タンパク質発現を20℃にて一晩誘導した。セレノメチオニン誘導体を上記で説明したように精製した。
【０１２２】
SEC-MALLS実験。多角度レーザー光散乱(MALLS)及び屈折率測定(RI)によるオンライン検出と組み合わされたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、溶液中の粒子の大きさ及び形状とは無関係にこの粒子の絶対的な分子量を測定する方法である25。SECを、150mMのNaClを含む20mMのTris-HClバッファーで平衡化したS200 Superdexカラム(GE Healthcare社)で実施した。このカラムを球状の標準タンパク質で較正した。0.5mL.分-1の流速で20℃にて分離を実施した。オンライン多角度レーザー光散乱(MALLS)検出を、690nmでのレーザー発光を使用してDAWN-HELEOS II検出器(Wyatt Technology社)で実施し、タンパク質濃度を、Optilab T-rEX検出器(Wyatt Technology社)を使用する示差屈折率測定及び0.185mL.g-1の屈折率増加dn/dcを使用してオンライン測定した。ASTRAソフトウェア(Wyatt Technology社)を使用して質量平均モル質量(Mw)を算出した。サイズを決定するために、カラムを既知のStokes半径(Rs)のタンパク質で較正した26。
【０１２３】
小角度X線散乱実験。小角度X線散乱(SAXS)データを、ESRFのBioSAXSビームライン(BM29)(http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX/About_our_beamlines/BM29)で収集した。各試料の測定前に及び測定後にバッファーのみからの散乱を測定し、ATSASパッケージからのプログラムPRIMUSを使用するバックグラウンド減算に使用した27。P100の場合には0.3mg.mL-1から0.6mg/mL-1の範囲での様々な濃度で、及びN0-P複合体の場合には0.55mg.mL-1から2.4mg.mL-1の範囲での様々な濃度で、散乱データを収集した。濃度依存的な粒子間効果は観測されなかった。Guinier近似を使用して、低Q値でRgを推定した。プログラムDAMMINを使用して、距離分布関数P(r)(Dmax=10nm)からN0-P複合体の非経験的な低分解能ビーズモデルをコンピュータで算出した28。独立した再構築物から得られた20例の低分解能モデルを、プログラムDAMAVERで整列させ、平均化し、次いでフィルタ処理した29。プログラムSUPCOMBを使用して、結晶構造をエンベロープ内にドッキングさせた29。
【０１２４】
NMR分光法。BEST型三重共鳴実験のセットを使用して、150mMのNaCl、50mMのアルギニン、50mMのグルタミン酸塩及び0.5mMのTCEPを含む20mMのBis-Trisバッファー(pH6.0)中で25℃にて、NiV Pタンパク質のP100のスペクトル帰属を得た30。800MHzの1H周波数でNMR実験結果を得た。下記の合計で6例の実験結果を得た:HNCO、残基内HN(CA)CO、HN(CO)CA及び残基内HNCA、HN(COCA)CB及び残基内HN(CA)CB。全てのスペクトルをNMRPipeで処理し31、Sparkyで分析し32、MARSを使用してスピン系の自動帰属を行ない33、続いて手動で検証した。P100の1H-15N HSQCスペクトルを、精製したN32〜3830P100複合体のスペクトルと比較した。これら2つのスペクトルでの共鳴の強度比を使用して、P100上のN0の結合部位をマッピングした。化学シフトは、骨格角φ及びψ二面角によって決まり、無秩序系では、この化学シフトは一過性の二次構造の存在に対して高度に敏感であり、二次構造性向(SSP)で一般に表される34,35。単離P100に関するSSPスコアから、いくつかの振動性α-ヘリックスの存在が明らかとなった。
【０１２５】
結晶学。本発明者らは、N及びPの様々な構築物を使用してN0-P類似体を再構成したが、N32〜3830P50複合体のみが結晶化した。N32〜3830P50複合体に関する最初の結晶化条件を、High Throughput Crystallization Laboratory of the EMBL Grenoble Outstation(https://htxlab.embl.fr)で特定した。22%のPEG 3350、0.2MのKBrで得たプレートクラスターを使用して、マイクロ播種法によりN32〜3830P50複合体のセレノメチオニン誘導体の結晶を成長させた。Seed Beadキット(Hampton Research社)を使用して、天然タンパク質のプレートクラスターを50μlの安定化溶液(22%のPEG 3350、0.2MのKBr及び0.2MのNaClを含む20mMのTris HCl(pH8.0))中で粉砕した。この種ストックを連続的に希釈し(5回、25回、100回、1000回)、0.5μlの得られた種ストック、1μlのタンパク質溶液及び1μlの沈殿剤溶液を混合することにより液滴をセットした。データ収集に使用する結晶を、16〜18%のPEG 3350及び0.2MのKBrの存在下での10から20mg.mL-1のタンパク質濃度で得て、凍結保護物質としての15%のグリセリンと共に凍結した。X線回折データを、0.9793Åの波長及び100Kの温度でのESRFのID29ビームラインで収集し、XDSパッケージで処理した36。プログラムHKL2MAPを用いたSAD法によるセレン原子からの変則的な散乱を使用して、初期位相を得た37。モデルを、phenix suite39からのAutobuildプログラム38により最初に構築し、その後、phenix.refineプログラム40及びCoot41で改良した。最終モデルの幾何学的形状をMolProbityでチェックした42。このモデルでは、Ramachandranプロットの好適な領域において残り97.0%が骨格二面角を有し、2.77%が許容される領域に入り、0.23%が異常値である。αN5-αN6ループの一部は、結晶電子密度では不明確である。PyMol43及びChimera44により作図した。N0の低周波数正常モードをElastic Network Modelによりコンピュータで算出した45。多重配列アラインメントをMAFFTで実施した46。
【０１２６】
プラスミド構築。構築物pEGFP-P40並びに誘導体(NiV PのP6〜40、P11〜40;P1〜20;P12〜35及びP7〜17、並びにCDV PのP1〜22、P9〜19、並びにMeV PのP9〜19)を生成するために、NiV P、CDV P又はMeV Pの残基に対応する配列を、GFPを有するフレーム内でpEGFP-C2ベクター(CLONTECH Laboratories社)にクローニングした。QuickChange XLキット(Stratagene社)を使用する部位特異的変異誘発により、NiV P多様体P40-G10R及びP40-I17Rを得た。同じpEGFP-C2ベクターへのPCRクローニングにより、コンセンサスペプチドを生成した。
【０１２７】
N及びP40の細胞内局在。HEK 293T細胞をATCCから得た(HEK 293T/17-ATCC CRL-11268)。細胞株をマイコプラズマ汚染に関して定期的にアッセイした。293T細胞を、10%のウシ胎仔血清(FCS)(PerbioHyclone社)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、PAA laboratories社)中で培養した。遺伝子導入のために、細胞を約50%のコンフルエンスまで24時間にわたり増殖させ、推奨されるように4:1の試薬:DNAの比でTurbofect遺伝子導入試薬(Thermoscientific社)を使用して、N、GFP-P40-野生型又は両方をコードする0.5μgのプラスミド(又はコントロールとして空のプラスミド)で遺伝子導入した。48時間後、細胞を45分にわたりリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3.7%のパラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、次いで50mmol.L-1のNH4Clで30分にわたり処理し、最後に0.1%のTriton X100-PBS中で更に40分にわたり処理した。1/1000の希釈度の自家製のへニパウイルス特異的ウサギ抗N抗体によりNの免疫蛍光を実施し、抗体特異性を、示した免疫蛍光により、並びにウエスタンブロット及び1/1000の希釈度のAlexa Fluor 555二次抗体(Life Technologies社)により測定した。1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで希釈した4,6-ジアミジノ(diamindino)-2-フェニルインドール(DAPI)を核染色に使用した。数回の洗浄工程後、Zeiss 200M蛍光顕微鏡を使用して撮像した。Axiovision Software(Zeiss社)及びImageJソフトウェアにより画像を分析した47。
【０１２８】
ウイルス複製の阻害。ニパウイルスによる全ての実験を、バイオセーフティーレベル4(BSL-4)の封じ込め実験室であるINSERM「Laboratoire Jean Merieux」(フランス、リヨン(Lyon))で実施した。HEK 293T細胞を、約40%のコンフルエンスまで24時間にわたり上記で説明したように増殖させた。最初に、この細胞に、上記で説明したようにTurbofect試薬を使用して、GFPと融合した野生型P40、GFPと融合したP40の多様体(P40-G10R若しくはP40-I17R)又はコントロールとしてのpEGFPのみをコードするプラスミドで遺伝子導入した。いずれの場合でも、プラスミドの量は2μgから0.125μgまで様々であった。遺伝子導入から24時間後、細胞に0.01の感染多重度(MOI)でNiV(マレーシア単離株UMMC1)を感染させた。感染後(p.i.)1時間でウイルス接種源を取り除き、3%のFCSを含むDMEM培地と置き換えた。TCID50力価測定用にp.i.48時間で培養上清及び細胞溶解物を採取し、シンシチウム形成を調べることによりウイルス増殖を視覚的に評価した。Zeiss 200M蛍光顕微鏡を使用してGFP蛍光を撮像した。Axiovision Software(Zeiss社)により画像を分析した。Karber TCID50測定のために、ウイルス培養上清の連続10倍希釈を使用して、上記で説明したのと同じ方法でVero E6細胞を感染させ、p.i.48時間で読み取った。ANOVA検定(適切にはn=6)を使用して有意差を算出した。
【０１２９】
(実施例2)
結果
機能的NiV N0-Pコア複合体の再構成
本発明者らは、PのN0結合領域、及びNTアーム及びCTアーム及びNテイルで切断された組み換えN分子を包含するペプチドを使用してNiV N0-P複合体の数種の構造多様体を再構成した。多角度レーザー光散乱(MALLS)と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により(図1b)、及び小角度X線散乱(SAXS)により、本発明者らは、これらの再構成したN0-Pコア複合体が、その他のNNV Nタンパク質に特有の全体で豆の形状であるコンパクトなヘテロ二量体であることを発見した18。
【０１３０】
本発明者らは、核磁気共鳴(NMR)分光法により、N0と直接相互作用するPの領域をマッピングした。この目的のために、本発明者らは、PのN末端領域に対応する100個のアミノ酸からなるペプチド(P100)を発現させて精製し、このペプチドの構造的特徴をキャラクタライズした。SEC-MALLSにより、本発明者らは、このペプチドが溶液中で単量体であり、このペプチドのSECで測定した流体力学半径及びSAXSで測定した回転半径は両方とも、この分子量の球状タンパク質で予想されるよりも大きいことを示した。加えて、異核単一量子コヒーレンス(HSQC)NMRスペクトルでのアミド共鳴の化学シフトの不十分な分散は変性タンパク質に特有であったが、NMRスペクトルの帰属後、Cα二次化学シフト及びCβ二次化学シフトから算出した二次構造性向(SSP)パラメータは、5つの振動性α-ヘリックスの存在を示した。次いで、本発明者らは、N32〜383に結合したP100のHSQCスペクトルを分析した。このサイズ(約50kDa)の複合体では、プロトン化試料でNMRシグナルが強く広がるためにこれらの検出は不可能であるが、HSQCスペクトルでは、本発明者らは、残基50から100に対応する共鳴を観察しており、このことは、この領域が複合体中で柔軟性を残していること及びN0結合領域がPの最初の50個のN末端アミノ酸に含まれること(図1c)を示す。
【０１３１】
従って、本発明者らは、Pの最初の40個の残基に対応するペプチド(P40)はNをin vitroで可溶型に維持するのに十分であることを実証した(図1d)。NiV Nのみを発現するヒト細胞では、本発明者らは、タンパク質に固有の自己集合特性に起因し得る点状(punctuate)分布を観測した。1:1の比でN及びGFP融合P40(P40-GFP)の両方を共発現する細胞では、本発明者らは、細胞中におけるNの著しく均一な分布及びNのP40との共局在化を観測しており、このことは、細胞内環境下でN0-P40複合体が生じ、Nが可溶化されることを示唆する(図1d)。
【０１３２】
NiV N0-Pコア複合体の結晶構造
NiV N32〜3830-P50複合体を、非対称単位で3個のヘテロ二量体を有する空間群P212121で結晶化した。本発明者らは、SAD法により2.5Åの分解能で構造を決定した(図1e)。NiV NはNNV Nに特徴的な2ドメイン構造を示しており5〜8、RNAに結合することができる塩基性の溝を画定した。全体で低い配列保存にもかかわらず、Nコアを4つの異なる部分、即ちNNTD1、NNTD2、NNTD3及びNCTDに分けることができ、これらの内の3つは、様々なNNVファミリの中で保存された折り畳みを有すると思われる(図2a)5〜7,19。この構造におけるこれらの位置の特定に基づいて、本発明者らは、パラミクソウイルス亜科のほとんどのメンバー中で保存されている10個のモチーフを定義し、これらのモチーフを構造的役割又は機能的役割に割り当てた。
【０１３３】
PのN末端シャペロン領域はそのN0パートナーへの結合時に安定化されるが、溶液中で観測した最初の振動性ヘリックス(ヘリックスαp1)に対応するPの最初の35個の残基だけは、N32〜3830-P50複合体の結晶構造中で明確であった。この複合体では、この領域は、短ヘリックス(ヘリックスαp1b:アミノ酸21〜28)をもたらす残基N20で90°のねじれを有する2.9nm長のヘリックス(ヘリックスαp1a:aa1〜19)を形成した(図1e)。長ヘリックスαp1aは、保存モチーフ6(アミノ酸265〜305)のヘリックスαC1、ηC1及びαC2により形成されるNCTDの浅い疎水性の溝にドッキングし、短ヘリックスはNCTDの上部(モチーフ10)にドッキングする(図1e)。この複合体は、1.440Åの相互作用で埋もれた全表面領域にわたり、多重の疎水性接触と8個の水素結合とを含む2。
【０１３４】
NiV Nは、N0-P複合体では開いたコンフォメーションである
NiV N32〜3830-P50の構造をRNAとの複合体中のRSV Nの構造5と比較することにより、本発明者らは、Nの折り畳みが保存されている(図2a)が、NiV N0の推定されるRNA結合溝が開いていて、NNTDがNCTDから約30°で垂れ下がっている(図2b)ことを発見した。本発明者らは、RSV NにおいてRNAと相互作用するTyr残基(Y337)並びに5個の塩基性残基(K170、R184、R185、R338及びR342)の内の4個(図2c)は、NiV NのヘリックスαN5、αN5〜αN6ループ、ヘリックスαN6及びαC3〜αC4ループにおいて等価の位置(それぞれY354及びK178、R192、R193、R352)で存在し(図2d)、パラミクソウイルス亜科の間で保存されていることを観測した。しかしながら、これらはNiV N0では極端に離れており、RNA分子と同時に相互作用することができない。RSV NによるNiV NNTD及びNCTDの独立した3Dアラインメントでは、これらの残基は両方のタンパク質において類似の位置であり(図2b及び図2d)、このことは、ノーマルモードのシミュレーションと一致して、NCTDとNNTDとの間のヒンジ運動を伴う開いたコンフォメーションと閉じたコンフォメーションとの間のコンフォメーション切り替えの共通のメカニズムを示唆する。
【０１３５】
RNA結合及び6の法則
RSV NCでは、各Nは7個のヌクレオチド(nt)と相互作用し、塩基1は、2個のグリシン残基(G241及びG245)で形成されたヘリックスαN9の平坦な表面上でパッケージングされる(図2e)5。しかしながら、パラミクソウイルス亜科では、Nは6個のntのみに結合し、ゲノムは6の法則(即ち、これらのゲノムが6個のntの倍数からなるという厳密な条件)に従う20,21。NiV Nの推定される閉じた形態では、本発明者らは、ヘリックスαN6中の数個の残基(保存モチーフ3)(図2f)及びヘリックスαN9中のD254(保存モチーフ5)が塩基1の類似のパッケージングを妨げることを発見した(図2g)。そのため、モチーフ3の存在(パラミクソウイルス亜科では厳密に保存されるが、ニューモウイルス亜科では存在しない)が、パラミクソウイルス亜科のNタンパク質が6個のntのみに結合する理由及びこれらのウイルスが6の法則に従う理由を説明するかもしれない。
【０１３６】
N0-P結合界面の保存
NNVリンタンパク質は長さ及びアミノ酸配列が大きく異なり22、配列保存は一般に、ファミリレベルを超えて検出できなくなる。しかしながら、最近の研究により、全体では離れた進化的関係にもかかわらずパラミクソウイルス科のほとんどのメンバーの間で保存されているPのN末端領域中の残基が同定された23。これらの保存された残基のほとんどは、N0との相互作用に重要な残基であると思われた(図3a)が、パラミクソウイルス亜科の間での残基保存のNiV Nの表面上へのマッピングにより、Pへの結合部位の強固な保存が明らかになる(図3a)。そのため、これらの結果は、亜科の様々な属の間でのN0-P複合体の保存された構造構築を示唆し、したがって、本発明者らのNiV N0-Pコア構造はより広い範囲で有効である。
【０１３７】
NiV複製の阻害
本発明者らは、感染前のヒト細胞(HEK293T)中でのGFP融合P40ペプチドの発現が用量依存的にウイルス増殖を有意に阻害し、シンシチウム形成を破壊することを発見しており、後者はNiV感染の特徴である(図3b及び図3c)。本発明者らはN32〜3830-P50結晶構造を使用して、N0とP50との間の界面を不安定化させるペプチド多様体を設計し、保存残基G10又はI17がアルギニン(G10R、I17R)に変異した多様体はウイルス複製の阻害での効率が下がることを発見した。そのため、これらの結果は、結晶で観測された相互作用の特異性を支持した(図3b及び図3c)。再構成したN0-Pコア複合体はP分子の大部分を欠いており、特に、四量体化ドメインとポリメラーゼ及びNC結合領域の両方とを欠いていることから、本発明者らは、P40がN0を非増殖性複合体中に閉じ込めることによりウイルス増殖を阻害することができると仮定した。
【０１３８】
Pのシャペロン機能
PNTRのシャペロン機能を理解するために、本発明者らは、NiV N-RNA複合体のモデルとしてRSV N-RNA複合体を使用した(図4a、図4b)。本発明者らは、NiV N32〜3830-P50のNCTDとRSV N-RNA複合体の1個のNプロトマーのNCTDと整列させると、N表面上の同じ結合部位に対してヘリックスαP1bはNi+1プロトマーのCTアームと競合し(図4a)、一方、ヘリックスαP1aはNi-1プロトマーのNTアームと競合する(図4b)ことを発見した。そのため、Pの第1の役割は、交換されたサブドメインの結合を妨げることによりNの重合を防止することである。NiV N32〜3830-P50複合体の構造はまた、結合したPが、RNAを直接妨げることなくN0を開いたコンフォメーションに閉じ込めることにより、NC集合及びRNA結合を防止することも示唆した(図2g)。分子の閉鎖には、ヘリックスαN5及びαN9がNNTD-NCTD接合部付近の回転軸の周りを回転し(図2b)、その結果、ヘリックスαC2、ηC2、ηC3、ηC4により形成されたラッチがNCTDコアから離れることが必要である。本発明者らは、ヘリックスαC1、ηC1、αC2及びαC4を架橋することにより(図4c)、PがNCTDドメイン全体を硬直化させ、Nでの全体的なコンフォメーション変化を防止することを提案する。加えて、パラミクソウイルス科の間で高度に保存された残基(図4d)であるY258の嵩高い側鎖はRNA結合溝内に向いており、RNAがタンパク質の表面に密着するようになるのを防止する(図4e)。RSV N-RNA複合体では、ヘリックスαN9の末端に同様に位置するY251は反対方向に向いており、ヘリックスαC2中のグリシン残基の骨格にドッキングする。グリシンはまた、NiV Nにおいてもこの位置で保存されており、このことは、チロシン側鎖がRNA結合時に反対側に反転する(図4e)が、N0-P複合体では、Y258の動きがPのN末端の存在により妨げられることを示唆する。あるいは、Y258がRNA塩基の内の1つと相互作用するかもしれない。
【０１３９】
考察:
本発明者らは、ニパウイルスのN0-Pコア複合体の構造を示し、未集合N0が開いたコンフォメーションで維持されることを明らかにし、NC集合中にNNV Nが開いたコンフォメーションと閉じたコンフォメーションとの間で切り替わる実験的証拠を提供する。N0-P複合体では、PのN末端N0結合領域は、隣接するNの交換されるサブドメインとの結合部位を占めることによりNの重合を防止し、NCTDを架橋することにより及び分子の閉鎖を妨げることによりRNAのカプシド封入を防止する。本発明者らは、N0のN0-P複合体から新生RNA分子への移行の協奏的メカニズムにより新たに合成されたウイルスRNAに沿ったN0分子の集合に関して考えうる、Pの放出及びRNA結合溝の閉鎖を伴うシナリオを提案する。第1の段階では、本発明者らは、遭遇複合体が、開いた空洞に緩く挿入されたRNA分子と共に生じることを想定する。第2の協奏的段階では、Pが放出され、NがRNA分子を捉える。RNAが結合したNからのPの放出により、次に入ってくるN分子のNTアームとの結合部位が解放される。次のN0-P複合体との遭遇複合体の形成時に、入ってくるNのNTアームは、以前に結合していたNに結合することができる。結合したNのCTアームは、入ってくるNに結合することができ、Pペプチドの置き換えに有用であってよい。第2の又は同時に起こるプロセスでは、Pが放出されてNがRNAを閉じ込める。最初に結合したN分子のNTアームは、NNTDとNCTDとを架橋することにより、2番目のNをその閉じたコンフォメーション中に閉じ込める。
【０１４０】
本発明者らは、Pの短N0結合領域はN0にシャペロンとして作用するのに及びN0を可溶型に保つのに十分であるが、P40はウイルス複製を阻害することを確認しており、このことは、PのN末端領域はNC集合を可能にするには不十分であることを示し、このプロセスでのPのその他の領域の関与を示唆する。Pは多機能で高度に柔軟な分子であり、L又はNCとの結合部位も持ち、そのため、これらのその他のウイルスタンパク質との相互作用が、N0-P複合体をウイルスRNA合成の部位に正確に配置するのに必要であると考えてよい。図5cで示唆されるように、N0-PのNCへの付着により、RNA合成の部位の周囲の局所濃度が上昇し、その結果、ウイルスRNAのカプシド封入が支持される。
【０１４１】
PのN0結合ペプチドによるNiV感染の阻害の成功は、NiV複製の阻害剤を設計するためにN中のP結合空洞を特異的に標的とすることができることを示唆する。N0-Pコア複合体の構造は、複合体の形成を防止することができるであろう小分子の設計の構造的基盤を提供する。結合界面の強固な保存は、NiV N32〜3830-P50構造が、その他の医学関連のパラミクソウイルスのN0-P複合体に良好な構造モデルであること、及びもしかしたらいくつかのウイルスに対して広域薬剤が開発されるかもしれないということを示唆する。
【０１４２】
(実施例3)
材料及び方法:
プラスミド構築。構築物pEGFP-P40-NIV及びpEGFP-P40-CDVを生成するために、NiV P又はCDV P(参照株、Genbank NC_001921.1)の残基に対応する配列を、GFPを有するフレーム内でpEGFP-C2ベクター(CLONTECH Laboratories社)中に、又はGFP-IRESマルチクローニング部位を含むベクターpCG(参照、Oct-1及びOct-2による差次的な転写活性化:相互依存活性化ドメインがOct-2リン酸化反応を誘発する。Tanaka M、Herr W. Cell. 1990 Feb 9;60(3):375〜86頁. 10.1016/0092-8674(90)90589-7)中にクローニングした。このベクターは、哺乳動物細胞中への遺伝子導入後、GFP及びp40ペプチド両方を別々に、しかしながら同じバイシストロニックRNA転写産物からの同時発現を可能にする。
【０１４３】
NIV及びCDVによるウイルス複製の阻害。293T細胞を、10%のウシ胎仔血清(FCS)(PerbioHyclone社)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、PAA laboratories社)中で培養した。ニパウイルスによる全ての実験を、バイオセーフティーレベル4(BSL-4)の封じ込め実験室であるINSERM「Laboratoire Jean Merieux」(フランス、リヨン(Lyon))で実施した。イヌジステンパーウイルスによる全ての実験を、感染性物質による研究用に確保した細胞培養バイオセーフティーキャビネット中においてバイオセーフティーレベル2の閉じ込め下にて実施した。細胞を、約40%のコンフルエンスまで24時間にわたり上記で説明したように増殖させた。最初に、製造業者の推奨に従ってTurbofectを使用して、細胞に、GFPと融合した野生型P40-NIVをコードするプラスミド(pEGFPベクター)、(pCGバイシストロニックIRESベクター(上記で説明した)から)別々に発現される野生型P40-NIVをコードするプラスミド、又はGFPと融合した野生型P40-CDVをコードするプラスミド(pEGFPベクター)又はコントロールとしてpEGFP/pCGのいずれかのみをコードするプラスミドで遺伝子導入した。遺伝子導入の24時間後、細胞に0.01の感染多重度(MOI)でNiV(マレーシア単離株UMMC1)又はCDVのいずれかを感染させた。感染後(p.i.)1時間でウイルス接種源を取り除き、3%のFCSを含むDMEM培地と置き換えた。TCID50力価測定用にp.i.48時間で培養上清及び細胞溶解物を採取し、シンシチウム形成を調べることによりウイルス増殖を視覚的に評価した。Zeiss 200M蛍光顕微鏡を使用してGFP蛍光を撮像した。Axiovision Software(Zeiss社)により画像を分析した。Karber TCID50測定のために、ウイルス培養上清の連続10倍希釈を使用して、上記で説明したのと同じ方法でVero E6細胞を感染させ、p.i.48〜72時間で読み取った。
【０１４４】
結果:
PのN0結合ペプチドによるNiV又はCDVの複製の阻害。
本発明者らは、NiVからのPのN0結合領域に由来するペプチド(P40)がNiV及びCDVの両方のウイルス増殖を阻害することを実証した(図5A)。本発明者らはまた、NiV由来ペプチド及びCDV由来ペプチドの両方によるCDV複製の阻害が用量依存的であることも実証した(図5B)。
【０１４５】
参考文献：
本出願を通じて、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の現状を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれている。
（参考文献）
2017522051.tif 000003
2017522051.tif 000004
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２ＡａｎｄＢ】
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【図２Ｃ】
2017522051.tif 000013
【図２Ｄ】
2017522051.tif 000014
【図２Ｅ】
2017522051.tif 000015
【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2017522051.tif 000019
【図３Ｃ】
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【図４ＡａｎｄＢ】
2017522051.tif 000021
【図４ＣａｎｄＤ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
2017522051.tif 000024
【図５Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月21日(2017.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I):
バリン-Xaa1-Xaa2-グリシン-ロイシン-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8
(式(I)中、
Xaa1はグルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン(N)、リジン(K)又は等価の極性アミノ酸であり、
Xaa2はグルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、リジン(K)又は等価の負に帯電した(若しくは酸の)アミノ酸であり、
Xaa3はグルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、リジン(K)又はグルタミン(Q)、セリン(S)又はアスパラギン(N)であり、
Xaa4はシステイン(C)、イソロイシン(I)であり、
Xaa5はイソロイシン(I)、ロイシン(L)若しくはバリン(V)又は等価の無極性脂肪族アミノ酸であり、
Xaa6はグルタミン(Q)、リジン(K)、アルギニン(R)又はアスパラギン酸(D)であり、
Xaa7はアラニン(A)若しくはフェニルアラニン(F)又は等価の無極性アミノ酸であり、
Xaa8はイソロイシン(I)、ロイシン(L)若しくはバリン(V)又は等価の無極性脂肪族アミノ酸である)
のアミノ酸配列を含む、最大で100個のアミノ酸からなる単離ペプチド。
【請求項２】
Xaa1がアスパラギン(N)又はグルタミン(Q)であり、
Xaa2がアスパラギン酸(D)又はグルタミン酸(E)であり、
Xaa3がアスパラギン(N)又はグルタミン酸(E)であり、
Xaa4がイソロイシン(I)又はシステイン(C)であり、
Xaa5がイソロイシン(I)であり、
Xaa6がアスパラギン酸(D)又はグルタミン(Q)であり、
Xaa7がフェニルアラニン(F)又はアラニン(A)であり、
Xaa8がイソロイシン(I)である、
請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
i)配列番号1における第7位のバリン残基から第17位のイソロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列、
ii)配列番号2における第9位のバリン残基から第19位のロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列、
iii)(i)又は(ii)の配列に実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは(i)又は(ii)の配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項1に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
式(II):
Yaa1-Yaa2-Yaa3-Yaa4-Yaa5-バリン-Xaa1-Xaa2-グリシン-ロイシン-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Yaa6-Yaa7-Yaa8
(式(II)中、
Xaa1-Xaa2 Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8は請求項1で規定されており、
Yaa1はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)又は等価の酸性アミノ酸であり、
Yaa2はグルタミン(Q)又はリジン(K)であり、
Yaa3はアラニン(A)、ロイシン(L)又はチロシン(Y)であり、
Yaa4はグルタミン酸(E)、チロシン(Y)又はアルギニン(R)であり、
Yaa5はアスパラギン(N)、ヒスチジン(H)又はロイシン(L)であり、
Yaa6はグルタミン(Q)、リジン(K)又はアルギニン(R)であり、
Yaa7はリジン(K)、アラニン(A)又はグルタミン酸(E)であり、
Yaa8はアスパラギン(N)、グルタミン酸(E)又はセリン(S)である)
のアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
i)MDKLELVNDGLNIIDFIQKNQKEIQKTYGRSSIQQPSIKD(配列番号1)からなるアミノ酸配列、
ii)配列番号1における第6位のロイシン残基から第40位のアスパラギン酸残基までの範囲のアミノ酸配列、
iii)配列番号1における第11位のロイシン残基から第40位のアスパラギン酸残基までの範囲のアミノ酸配列、
iv)配列番号1における第1位のメチオニン残基から第20位のアスパラギン残基までの範囲のアミノ酸配列、
v)配列番号1における第20位のアスパラギン残基から第35位のグルタミン残基までの範囲のアミノ酸配列、
vi)MAEEQAYHVSKGLECLKALRENPPDIEEIQEVSSLRDQTC(配列番号2)からなるアミノ酸配列、
vii)配列番号2における第1位のメチオニン残基から第22位のアスパラギン残基までの範囲のアミノ酸配列、
viii)DQAENVQEGLECIQAIQKN(配列番号3)からなるアミノ酸配列、
ix)MAEEQARHVKNGLECIRALKAEPIGSLAIEEAMAAWSEIS(配列番号4)からなるアミノ酸配列、
x)配列番号4における第9位のバリン残基から第19位のロイシン残基までの範囲のアミノ酸配列、
xi)(i)から(x)の配列に実質的に相同なアミノ酸配列、好ましくは(i)から(x)の配列に対して少なくとも80%同一のアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項4に記載の単離ペプチド。
【請求項６】
少なくとも1種の細胞透過性ペプチドに連結されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸を含む又はこの核酸からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを製造する方法であって、
a)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項7に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを含む組み換え細胞を培養する工程、
b)任意選択で、工程a)で得られるペプチドを精製する工程
を含む、方法。
【請求項９】
パラミクソウイルス亜科感染;特にルブラウイルス感染、アブラウイルス感染、ヘニパウイルス感染、ヘニパウイルス様感染、モルビリウイルス感染、モルビリウイルス様(TPMV様ウイルス)感染、レスピロウイルス感染又はフェルラウイルス感染からなる群から選択されるパラミクソウイルス亜科感染を予防及び/又は処置するために使用するための請求項1から6のいずれか一項に記載の単離ペプチド。
【請求項１０】
前記アブラウイルス感染がニューカッスル病ウイルスの感染であり、
前記ヘニパウイルス感染が、ニパウイルス(NiV)又はヘンドラウイルス(HeV)の感染であり、
前記モルビリウイルス感染が、麻疹ウイルス(MeV)、リンデルペストウイルス、イヌジステンパーウイルス、アザラシジステンパーウイルス又はヒツジリンデルペストウイルスの感染であり、
前記TPMV様ウイルス感染が、ツパイアパラミクソウイルス、モスマンウイルス、ナリバウイルス又はサレムウイルスの感染であり、
前記フェルラウイルス感染がフェルドランスウイルスの感染であり、
前記ルブラウイルス感染が、ムンプスウイルス、パラインフルエンザ2型、4型ウイルス、アチモタウイルス1型及び2型、サルパラインフルエンザウイルス5型、メナングルウイルス、チオマンウイルス又はツホコウイルス1型、2型及び3型の感染であり、
前記レスピロウイルス感染が、センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス1型及び3型の感染である、
請求項9に記載の使用するための単離ペプチド。
【請求項１１】
請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドと、1種又は複数種の薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項１２】
パラミクソウイルス亜科感染を処置又は予防するための、前記パラミクソウイルス亜科ウイルスのリンタンパク質(P)と核タンパク質(N0)との間の相互作用を阻害する能力を有する、パラミクソウイルス亜科ウイルスのN末端リンタンパク質(P)由来の単離ペプチド。
【請求項１３】
少なくとも9個及び最大で100個のアミノ酸を含む、請求項12に記載の使用するための単離ペプチド。
【請求項１４】
少なくとも1種の細胞透過性ペプチドに連結されている、請求項12又は13に記載の使用するための単離ペプチド。
【請求項１５】
修飾ペプチドである、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離ペプチド又は請求項12から14のいずれか一項に記載の使用するための単離ペプチド。
【国際調査報告】
2017522051.tif 000026
2017522051.tif 000027
2017522051.tif 000028
2017522051.tif 000029