(57)【要約】本発明において、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤に対する耐性を付与するのに有用なポリペプチド及び組換えＤＮＡ分子、ならびに前記組換えＤＮＡ分子を含む除草剤耐性トランスジェニック植物、種子、細胞、及び植物部分、ならびにその使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記核酸配列が、配列番号２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５及び５３〜５９からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記組換えＤＮＡ分子が、植物細胞内で機能する異種プロモーターに作動可能に連結する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記組換えＤＮＡ分子が、さらに葉緑体輸送ペプチドをコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結する、請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子に作動可能に連結する、植物細胞内で機能する異種プロモーターを含むＤＮＡ構築物。
【請求項６】
前記組換えＤＮＡ分子に作動可能に連結する、葉緑体輸送ペプチドをコードするＤＮＡ分子をさらに含む、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
前記核酸配列が、配列番号１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
前記ＤＮＡ構築物が、トランスジェニック植物のゲノムに存在する、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞。
【請求項１０】
前記植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞が、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、ピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の除草剤に対して耐性を有する、請求項９に記載の植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞。
【請求項１１】
請求項５に記載のＤＮＡ構築物を含む、植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドを含む、植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞。
【請求項１３】
配列番号１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対してオキシゲナーゼ活性を有する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記植物、種子、細胞、または植物部分において請求項１３に記載のポリペプチドを発現させることを含む、植物、種子、細胞、または植物部分への除草剤耐性の付与方法。
【請求項１６】
前記植物、種子、細胞、または植物部分が、配列番号１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に作動可能に連結する、植物細胞内で機能する異種プロモーターを含むＤＮＡ構築物を保有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物、種子、細胞、または植物部分が、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対する耐性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
除草剤耐性トランスジェニック植物の産生方法であって、植物細胞または組織を：
ａ）配列番号１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列；
ｂ）配列番号２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５及び５３〜５９からなる群から選択される核酸配列；及び、
ｃ）配列番号１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有し、トランスジェニック植物に除草剤耐性を付与することができるポリペプチドをコードする核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換し、ならびに、前記形質転換した植物細胞または組織から除草剤耐性トランスジェニック植物を再生することを含む、前記産生方法。
【請求項１９】
前記除草剤耐性トランスジェニック植物が、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対する耐性を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
植物栽培区域における雑草の防除方法であって、配列番号１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を保有する植物または種子を含む植物栽培区域を、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも１種の除草剤と接触させることを含み、そこにおいて、前記植物または種子は前記少なくとも１種の除草剤に耐性である、前記防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１０月１５日に出願された米国仮出願第６２／０６４，３４３号の利益を主張し、その全体を参照として本明細書に援用する。
【０００２】
配列表の登録
２０１５年９月２５日に作成した１１８，３６４バイト（ＭＳ‐ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）で測定）の「ＭＯＮＳ３７８ＷＯ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含めた配列表を、電子提出によって本明細書とともに提出し、及びこれを参照として本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
技術分野
本発明は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明は、除草剤を分解する酵素をコードする組換えＤＮＡ分子に関する。本発明はまた、組換えＤＮＡ分子を保有するトランスジェニック植物、部分、種子、細胞、及び植物部分、ならびにそれらを使用する方法にも関する。
【０００４】
関連技術の説明
農作物の生産は、しばしば、バイオテクノロジーの方法を用いて作製したトランスジェニック形質を利用する。トランスジーンとしても知られる異種遺伝子を植物に導入して遺伝子組換え形質を作成する。植物内のトランスジーンの発現は、除草剤耐性のような望ましい形質を植物に付与する。トランスジェニック除草剤耐性形質の例としては、グリホサート耐性、グルホシネート耐性、及びジカンバ耐性が挙げられる。最も汎用される除草剤に耐性を示す雑草種の増加に伴い、この分野において新規除草剤耐性形質が必要とされている。特に重要な除草剤は、アリールオキシフェノキシプロピオン酸（ＡＯＰＰ）除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤である。ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤は、グリホサート耐性雑草に対する殺草スペクトルを提供し、したがって、他の除草剤耐性形質（複数可）と組み合わせた栽培体系において特に有用な耐性を付与する形質を作り出す。
【０００５】
ジクロロプロップ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｒｏｐ）分解土壌試料から単離したＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ菌株は、様々なフィエノキシアルカン酸（ｐｈｙｅｎｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）除草剤のエーテル結合を切断することができ、これを生長のための唯一の炭素及びエネルギー源として利用していることが同定された（ＨＰＥ  Ｋｏｈｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）２３：３３６‐３４０）。除草剤の異化は、２種の異なるエナンチオ選択的αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼＲｄｐＡ（Ｒ‐ジクロロプロップ・ジオキシゲナーゼ）及びＳｄｐＡ（Ｓ‐ジクロロプロップ・ジオキシゲナーゼ）によって行われる。（Ａ  Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）１５７：３１７‐３２２；Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａ（２００３）２３（１）：３‐１７）。ＲｄｐＡは、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５１６７５２（ＤＮＡ）及びＡＡＭ９０９６５（タンパク質））及びＤｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿０３６９２４（ＤＮＡ）及びＹＰ＿００９０８３２８３（タンパク質））から単離されている（ＴＡ  Ｍｕｅｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００４）７０（１０）：６０６６‐６０７５）。ＲｄｐＡ及びＳｄｐＡ遺伝子は、作物への除草剤耐性を付与するための植物形質転換に用いられている（ＴＲ  Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，（２０１０）１０７（４７）：２０２４０‐５）。タンパク質工学技術を用いてＲｄｐＡ酵素の活性を改善し、トランスジェニック植物で使用するためのタンパク質を産生することにより、除草剤の大量散布が可能になり、したがってトランスジェニック作物の安全性及び雑草防除方法を改善することができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９２％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一つの除草剤に対してオキシゲナーゼ活性を有する。
【０００７】
本発明は、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９２％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を提供する。一実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、及び５３〜５９からなる群から選択される核酸配列を含む。別の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対するオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態において、組換えＤＮＡ分子は、植物細胞内で機能する異種プロモーターに作動可能に連結する。別の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、作動可能に連結したポリペプチドを細胞内に局在化させる働きを有する葉緑体輸送ペプチドをコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結する。
【０００８】
本発明は、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも約９２％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子と、それに作動可能に連結した植物細胞内で機能する異種プロモーターとを含むＤＮＡ構築物を提供する。一実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、作動可能に連結したポリペプチドを細胞内に局在化させるように機能する葉緑体輸送ペプチドをコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結する。別の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、トランスジェニック植物内におけるこのポリペプチドの発現は、除草剤耐性を植物に付与する。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、トランスジェニック植物のゲノムに存在する。
【０００９】
本発明は、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９２％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を保有するトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分を提供する。一実施形態では、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤に対する耐性のためのトランスジェニック形質を含む。別の実施形態では、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、本発明のＤＮＡ構築物を保有する。別の実施形態において、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、本発明のポリペプチドを保有する。
【００１０】
本発明は、植物、種子、細胞、または植物部分に本発明のポリペプチドを発現させることを含む、植物、種子、細胞、または植物部分への除草剤耐性の付与方法を提供する。一実施形態において、除草剤耐性付与方法は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック形質を含むトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分と共に使用する。一実施形態において、除草剤耐性付与方法は、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される除草剤と共に使用する。
【００１１】
本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を植物細胞に導入し、そのＤＮＡ構築物の保有によってＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、ピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤への耐性を備えた植物を再生することを含む植物形質転換の方法を提供する。一実施形態では、植物形質転換の方法は、再生植物をそれ自体または第二の植物と交配させ、交配から種子を回収することを含む。
【００１２】
本発明は、本発明のトランスジェニック植物または種子を有する植物栽培区域に、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも一種の除草剤を接触させることによって、植物栽培区域の雑草を防除する方法を提供し、そこにおいては、トランスジェニック植物または種子は、除草剤に対して耐性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】キザロホップ‐Ｐ処理後の対照及びＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１１）トランスジェニック・トウモロコシ植物。未処理または１倍量のキザロホップ‐Ｐ（０．０８ｌｂ  ａｉ／ａｃ）で処理した対照及びトランスジェニック・トウモロコシ植物を示す。
【図１Ｂ】Ｆ１ハイブリッド対照トウモロコシ植物を示す。２倍量のキザロホップ‐Ｐを噴霧する前に、植物を（１）２０℃／２０℃、（２）２８℃／２０℃、または（３）３８℃／３０℃の昼／夜温度で栽培した。
【図１Ｃ】Ｆ１ハイブリッドＭＯＮ‐ＨＴ５５トランスジェニック・トウモロコシ植物を示す。２倍量のキザロホップ‐Ｐを噴霧する前に、植物を（１）２０℃／２０℃、（２）２８℃／２０℃、または（３）３８℃／３０℃の昼／夜温度で栽培した。
【００１４】
【図２Ａ】改変タンパク質の温度依存的活性を示すグラフ。基質としてキザロホップ‐Ｐを用いて試験した場合のＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１１）及び野生型ＲｄｐＡ酵素の活性を示す。データは、２５℃での各タンパク質の活性に対して正規化したものである。
【図２Ｂ】改変タンパク質の温度依存的活性を示すグラフ。基質としてキザロホップ‐Ｐを用いて試験した場合の、ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）、ＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：１８）、ＭＯＮ‐ＨＴ７（配列番号：３４）、ＭＯＮ‐ＨＴ８（配列番号：３７）及び野生型ＲｄｐＡの活性を示す。データは、２５℃での各タンパク質の活性に対して正規化したものである。
【図２Ｃ】改変タンパク質の温度依存的活性を示すグラフ。２，４‐Ｄを基質として試験した場合のＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ７、ＭＯＮ‐ＨＴ８及び野生型ＲｄｐＡの活性を示す。データは、２５℃での各タンパク質の活性に対して正規化したものである。
【００１５】
【図３】タンパク質改変に有用な例示的アミノ酸位置（四角で囲った箇所）を有する野生型ＲｄｐＡ（配列番号：６０）のタンパク質配列である。
【００１６】
【図４Ａ】ＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１１）、ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）、ＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：１８）、ＭＯＮ‐ＨＴ３（配列番号：２２）、ＭＯＮ‐ＨＴ４（配列番号：２５）、ＭＯＮ‐ＨＴ７（配列番号：３４）、またはＦ１ハイブリッド対照（ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４）を発現するＦ１ハイブリッド・トウモロコシ植物（ＭＯＮ‐ＨＴ×ＭＯＮ８９０３４近交系を発現するホモ接合型Ｒ１）への２倍量のキザロホップ‐Ｐ（０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃ）散布後の薬害度である。２倍量のキザロホップ‐Ｐを散布する前に、２０℃に設定した日中及び夜間温度（２０℃／２０℃）で順化した植物からのデータである。
【図４Ｂ】ＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１１）、ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）、ＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：１８）、ＭＯＮ‐ＨＴ３（配列番号：２２）、ＭＯＮ‐ＨＴ４（配列番号：２５）、ＭＯＮ‐ＨＴ７（配列番号：３４）、またはＦ１ハイブリッド対照（ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４）を発現するＦ１ハイブリッド・トウモロコシ植物（ＭＯＮ‐ＨＴ×ＭＯＮ８９０３４近交系を発現するホモ接合型Ｒ１）への２倍量のキザロホップ‐Ｐ（０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃ）散布後の薬害度である。２倍量キザロホップ‐Ｐを散布する前に、２８℃の日中温度及び２０℃の夜間温度（２８℃／２０℃）で順化した植物からのデータを示す。
【図４Ｃ】ＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１１）、ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）、ＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：１８）、ＭＯＮ‐ＨＴ３（配列番号：２２）、ＭＯＮ‐ＨＴ４（配列番号：２５）、ＭＯＮ‐ＨＴ７（配列番号：３４）、またはＦ１ハイブリッド対照（ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４）を発現するＦ１ハイブリッド・トウモロコシ植物（ＭＯＮ‐ＨＴ×ＭＯＮ８９０３４近交系を発現するホモ接合型Ｒ１）への２倍量のキザロホップ‐Ｐ（０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃ）散布後の薬害度である。２倍量のキザロホップ‐Ｐの散布前に、日中温度３８℃及び夜間温度３０℃（３８℃／３０℃）で順化した植物からのデータを示す。
【図４Ｄ】ＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１１）、ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）、ＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：１８）、ＭＯＮ‐ＨＴ３（配列番号：２２）、ＭＯＮ‐ＨＴ４（配列番号：２５）、ＭＯＮ‐ＨＴ７（配列番号：３４）、またはＦ１ハイブリッド対照（ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４）を発現するＦ１ハイブリッド・トウモロコシ植物（ＭＯＮ‐ＨＴ×ＭＯＮ８９０３４近交系を発現するホモ接合型Ｒ１）への４倍量の２，４‐Ｄ（４ｌｂ  ａｅ／ａｃ）散布後の薬害度である。４倍量の２，４‐Ｄを散布する前に、２０℃に設定した日中及び夜間温度（２０℃／２０℃）で順化した植物からのデータである。
【図４Ｅ】ＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１１）、ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）、ＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：１８）、ＭＯＮ‐ＨＴ３（配列番号：２２）、ＭＯＮ‐ＨＴ４（配列番号：２５）、ＭＯＮ‐ＨＴ７（配列番号：３４）、またはＦ１ハイブリッド対照（ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４）を発現するＦ１ハイブリッド・トウモロコシ植物（ＭＯＮ‐ＨＴ×ＭＯＮ８９０３４近交系を発現するホモ接合型Ｒ１）への４倍量の２，４‐Ｄ（４ｌｂ  ａｅ／ａｃ）散布後の薬害度である。４倍量の２，４‐Ｄの散布前に、日中温度３８℃及び夜間温度３０℃（３８℃／３０℃）で順化した植物からのデータを示す。
【００１７】
【図５Ａ】対照、及びＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：２０であり、配列番号１８：をコードする）を保有するトランスジェニック・トウモロコシ植物に、１６倍量（１．２８ｌｂ  ａｉ／ａｃ）のキザロホップ‐Ｐを、Ｖ２に、その後Ｖ４において散布し、キザロホップ‐Ｐ散布の１０〜１４日後に撮影した写真である。
【図５Ｂ】対照、及びＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：２０であり、配列番号１８：をコードする）を保有するトランスジェニック・トウモロコシ植物に、１６倍量（１．２８ｌｂ  ａｉ／ａｃ）のキザロホップ‐Ｐを、Ｖ２に、その後Ｖ４において散布し、キザロホップ‐Ｐ散布の１０〜１４日後に撮影した写真である。
【００１８】
【図６Ａ】Ｓ．ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来の野生型ＲｄｐＡ（配列番号：６０）ならびに配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２のタンパク質配列と、下部に記載するコンセンサス配列（配列番号：６１として提供する）とのマルチ配列アラインメントである。
【図６Ｂ】Ｓ．ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来の野生型ＲｄｐＡ（配列番号：６０）ならびに配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２のタンパク質配列と、下部に記載するコンセンサス配列（配列番号：６１として提供する）とのマルチ配列アラインメントである。
【図６Ｃ】Ｓ．ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来の野生型ＲｄｐＡ（配列番号：６０）ならびに配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２のタンパク質配列と、下部に記載するコンセンサス配列（配列番号：６１として提供する）とのマルチ配列アラインメントである。
【図６Ｄ】Ｓ．ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来の野生型ＲｄｐＡ（配列番号：６０）ならびに配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２のタンパク質配列と、下部に記載するコンセンサス配列（配列番号：６１として提供する）とのマルチ配列アラインメントである。
【図６Ｅ】Ｓ．ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来の野生型ＲｄｐＡ（配列番号：６０）ならびに配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２のタンパク質配列と、下部に記載するコンセンサス配列（配列番号：６１として提供する）とのマルチ配列アラインメントである。
【００１９】
配列の簡単な説明
配列番号：１〜３は、ＭＯＮ‐ＨＴ５１のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号：４〜６は、ＭＯＮ‐ＨＴ５２のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号：７〜８は、ＭＯＮ‐ＨＴ５３のアミノ酸配列及び細菌コドンポリヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号：９〜１０は、ＭＯＮ‐ＨＴ５４のアミノ酸配列及び細菌コドンポリヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号：１１〜１３は、ＭＯＮ‐ＨＴ５５のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号：１４〜１７は、ＭＯＮ‐ＨＴ１のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列、及び双子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号：１８〜２１は、ＭＯＮ‐ＨＴ２のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列、及び双子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号：２２〜２４は、ＭＯＮ‐ＨＴ３のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号：２５〜２７は、ＭＯＮ‐ＨＴ４のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号：２８〜３０は、ＭＯＮ‐ＨＴ５のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号：３１〜３３は、ＭＯＮ‐ＨＴ６のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号：３４〜３６は、ＭＯＮ‐ＨＴ７のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号：３７〜３９は、ＭＯＮ‐ＨＴ８のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号：４０〜４２は、ＭＯＮ‐ＨＴ９のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号：４３〜４５は、ＭＯＮ‐ＨＴ１０のアミノ酸配列、細菌コドンポリヌクレオチド配列、及び単子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号：４６〜５２は、ＭＯＮ‐ＨＴ１１、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１４、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、ＭＯＮ‐ＨＴ１６、ＭＯＮ‐ＨＴ１７、及びＭＯＮ‐ＨＴ１８のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号：５３〜５９は、ＭＯＮ‐ＨＴ１１、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１４、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、ＭＯＮ‐ＨＴ１６、ＭＯＮ‐ＨＴ１７、及びＭＯＮ‐ＨＴ１８の双子葉植物コドン最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号：６０は、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来の野生型ＲｄｐＡのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号：６１は、図６Ａ〜図６Ｅのコンセンサス配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明をより良く定義し、当業者に本発明の実施における指針を与えるために、以下の定義及び方法を提供する。特記しない限り、用語は、当業者による従来の使用に従って理解すべきである。
【００３９】
本発明は、本明細書においてＭＯＮ‐ＨＴタンパク質と呼称する新規遺伝子改変タンパク質、及びそれらをコードする組換えＤＮＡ分子、ならびにこれらを使用する組成物及び方法を提供することによって、先行技術の限界を克服する。ＭＯＮ‐ＨＴタンパク質は、アリールオキシフェノキシプロピオン酸（ＡＯＰＰ）除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤を不活性化することができるオキシゲナーゼである。本明細書中で使用する場合、除草剤を不活性化するとは、除草剤が、植物に対してもはや除草活性を有さないようにすることを意味する。ＭＯＮ‐ＨＴタンパク質は、新規基質選択性、有用な酵素反応速度、及び高温における酵素安定性の増加を示す。ＭＯＮ‐ＨＴタンパク質を発現するトランスジェニック植物は、ＡＯＰＰ、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤の散布に対し、向上した耐性を示す。
【００４０】
改変タンパク質及び組換えＤＮＡ分子
本発明は、新規遺伝子改変タンパク質及びそれらをコードする組換えＤＮＡ分子を提供する。本明細書中で使用する場合、用語「改変」とは、天然には通常見出されず、人間が介入して創造した非天然のＤＮＡ、タンパク質、または生物を指す。「改変タンパク質」とは、そのポリペプチド配列を、部位特異的突然変異誘発を用いたタンパク質デザイン及びランダム突然変異誘発及びＤＮＡシャッフリングを用いた定向進化のような１つ以上のタンパク質工学技術を用いて、実験室において考案及び作成したタンパク質のことである。例えば、改変タンパク質は、野生型タンパク質のコード配列に対して１つ以上の欠失、挿入、または置換を有する場合があり、各欠失、挿入または置換は、１つ以上のアミノ酸からなっていてもよい。改変タンパク質の例を、本明細書において、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２として提供する。
【００４１】
本発明によって提供する改変タンパク質は、オキシゲナーゼ活性を有する酵素である。本明細書中で使用する場合、用語「オキシゲナーゼ活性」とは、酸素分子から酸素を、基質、副生物または中間体に移動させることによって基質を酸化する能力を意味する。本発明によって提供する改変タンパク質のオキシゲナーゼ活性は、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤の１つ以上を不活性化することができる。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「野生型」とは、天然に存在することを意味する。本明細書中で使用する場合、「野生型ＤＮＡ分子」、「野生型ポリペプチド」、または「野生型タンパク質」とは、天然に存在するＤＮＡ分子、ポリペプチド、またはタンパク質、すなわち、すでに天然に存在するＤＮＡ分子、ポリペプチド、またはタンパク質のことである。ポリペプチド、タンパク質、またはＤＮＡ分子の野生型バージョンは、改変タンパク質または遺伝子との比較において有用である場合がある。本発明によって提供する改変タンパク質との比較において有用な野生型タンパク質の例として、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＭＨ株由来のＲｄｐＡ酵素が挙げられる。本発明によって提供する組換えＤＮＡ分子との比較において有用な野生型ＤＮＡ分子の例として、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＭＨ株由来のＲｄｐＡ遺伝子が挙げられる。野生型タンパク質またはＤＮＡ分子は、実験の対照として有用である場合がある。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「対照」とは、比較目的のために設計する実験対照を意味する。例えば、トランスジェニック植物分析における対照植物は、実験植物（すなわち、試験対象の植物）と同じ型の植物であるが、実験植物の遺伝子組換え用挿入断片、組換えＤＮＡ分子、またはＤＮＡ構築物を保有していない。トランスジェニック・トウモロコシ植物との比較に有用な対照植物の例として、非トランスジェニックＬＨ２４４トウモロコシ（米国特許第６，２５２，１４８号）が挙げられ、トランスジェニック・ダイズ植物との比較では、非トランスジェニックＡ３５５５ダイズ（米国特許第７，７００，８４６号）が挙げられる。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「組換え」とは、遺伝子工学の産物であって、通常自然界には見出されず、人間が介入して創造する非天然ＤＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。「組換えＤＮＡ分子」は、天然には生じないＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であり、人間の介入による産物であるＤＮＡ分子、例えば改変タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。別の例は、タンパク質コードＤＮＡ分子及び作動可能に連結した異種プロモーターのような、互いに異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子の組み合わせからなるＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子の一例は、配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５及び５３〜５９から選択される少なくとも一つの配列を含むＤＮＡ分子である。「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」は、天然に存在しないアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質であり、人間の介入による産物、例えば改変タンパク質などである。
【００４５】
用語「トランスジーン」とは、例えば植物形質転換法などによる人間の介入の結果として生物のゲノムに人工的に組み込まれたＤＮＡ分子を指す。本明細書中で使用する場合、用語「トランスジェニック」は、トランスジーンを含むことを意味し、例えば「トランスジェニック植物」とは、ゲノムにトランスジーンを保有する植物を指し、「トランスジェニック形質」とは、植物ゲノムに組み込まれたトランスジーンの存在により、導入または供与された特徴または形質を指す。このようなゲノム改変の結果として、トランスジェニック植物は、関連する野生型植物とは明らかに異なっており、また、トランスジェニック形質は、野生型植物に天然には見出されない形質である。本発明のトランスジェニック植物は、本発明によって提供する組換えＤＮＡ分子及び改変タンパク質を保有する。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、用語「異種」とは、異なる供給源に由来し、したがって本質的に通常は関連しない２つ以上のものの間の関係を指す。例えば、タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子は、作動可能に連結するプロモーターに対して、そのような組み合わせが通常天然には見出されない場合、異種である。さらに、特定の組換えＤＮＡ分子は、それがその特定の細胞または生物において天然に生じない場合には、それが挿入される細胞または生物に対して異種であり得る。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、用語「タンパク質コードＤＮＡ分子」または「ポリペプチドコードＤＮＡ分子」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を指す。「タンパク質コード配列」または「ポリペプチドコード配列」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。「配列」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の連続配列を意味する。タンパク質コード配列またはポリペプチドコード配列の境界は、通常、５′末端の翻訳開始コドン及び３′末端の翻訳終止コドンによって決定される。タンパク質コード分子またはポリペプチドコード分子は、タンパク質またはポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。本明細書中で使用する場合、「トランスジーン発現（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「トランスジーンの発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」、「タンパク質発現（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「ポリペプチド発現（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「タンパク質の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」及び「ポリペプチドの発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、ＤＮＡ分子をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写し、そのｍＲＮＡをポリペプチド鎖に翻訳し、それを最終的にタンパク質へと折り畳むプロセスを介したタンパク質またはポリペプチドの産生を意味する。タンパク質コードＤＮＡ分子またはポリペプチドコードＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ分子で形質転換した細胞中でのタンパク質またはポリペプチドの発現に使用するために、ＤＮＡ構築物中の異種プロモーターに作動可能に連結させてもよい。本明細書中で使用する場合、「作動可能に連結」とは、一方が他方の機能に影響を及ぼすように、２つのＤＮＡ分子が連結していることを意味する。作動可能に連結したＤＮＡ分子は、単一の隣接分子の一部であってもよく、隣接していてもいなくてもよい。例えば、ＤＮＡ構築物中のタンパク質コードＤＮＡ分子またはポリペプチドコードＤＮＡ分子にプロモーターを作動可能に連結し、そこにおいて、プロモーターがトランスジーンの発現に影響を与え得るように２つのＤＮＡ分子を位置決めする。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「ＤＮＡ構築物」とは、２つ以上の異種ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、トランスジーンの発現に有用であり、ベクター及びプラスミドに組み込んでもよい。ＤＮＡ構築物は、トランスジェニック植物及び細胞を産生するために、形質転換の目的で、すなわち、異種ＤＮＡを宿主細胞に導入するためにベクターにおいて使用してもよく、同様に、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分のプラスチドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに組み込んでもよい。本明細書中で使用する場合、「ベクター」とは、植物形質転換の目的で使用してもよい任意の組換えＤＮＡ分子を意味する。配列表に示すような組換えＤＮＡ分子は、例えば、植物中で機能するプロモーターに作動可能に連結した組換えＤＮＡ分子を有する構築物の一部としてベクターに挿入され、組換えＤＮＡ分子がコードする改変タンパク質の発現を駆動する。ＤＮＡ構築物及びベクターを構築するための方法は、当技術分野において周知である。ＤＮＡ構築物、またはＤＮＡ構築物を含むベクターの構成要素は、一般に、以下の１つ以上のものを含むが、必ずしもこれらに限定するものではない：作動可能に連結したＤＮＡの発現用の適切なプロモーター、作動可能に連結したタンパク質コードＤＮＡ分子、及び３′非翻訳領域（３′‐ＵＴＲ）。本発明の実施に有用なプロモーターとしては、作動可能に連結したポリヌクレオチドを発現するために植物において機能するプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターには様々なものがあり、当技術分野において周知であり、誘導性、ウイルス性、合成性、構成的、時間的調節性、空間的調節性、及び／または時間空間的調節性のものを含む。追加の任意の成分としては、以下の１つ以上の要素が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない：５′‐ＵＴＲ、エンハンサー、リーダー、シス作用エレメント、イントロン、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）、及び１つ以上の選択マーカーのトランスジーン。
【００４９】
本発明のＤＮＡ構築物には、本発明が提供するタンパク質コードＤＮＡ分子に作動可能に連結したＣＴＰ分子を組み込んでもよい。本発明を実施するのに有用なＣＴＰとしては、改変タンパク質分子の細胞内局在化を促進するように機能するものが挙げられる。前記ＣＴＰは、細胞内でのタンパク質局在化の促進により、改変タンパク質の蓄積を増加させ、タンパク質分解からタンパク質を保護し、除草剤耐性のレベルを高め、それにより除草剤散布後の薬害度を低減し得る。本発明で使用するためのＣＴＰ分子は当該分野で公知であり、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ  ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（ｄｅｌｌａ‐Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、トウモロコシｃａｂ‐ｍ７シグナル配列（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；ＰＣＴ  ＷＯ  ９７／４１２２８）及びエンドウ・グルタチオン還元酵素のシグナル配列（Ｃｒｅｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；ＰＣＴ  ＷＯ  ９７／４１２２８）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【００５０】
本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＤＮＡ操作に有用な配列（制限酵素認識部位または組換えベースのクローニング部位など）、植物に好適な配列（植物コドン利用またはコザックコンセンサス配列など）、またはＤＮＡ構築物の設計に有用な配列（スペーサーまたはリンカー配列など）を提供することが望ましい場合に、当技術分野で公知の方法によって、完全または部分的に合成及び修飾してもよい。本発明は、本明細書において提供する任意の組換えＤＮＡ分子または改変タンパク質、例えば、配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４４、４５、及び５３〜５９からなる群から選択される配列を含む組換えＤＮＡ分子に対し、少なくとも約８０％（％）の配列同一性、約８５％の配列同一性、約９０％の配列同一性、約９１％の配列同一性、約９２％の配列同一性、約９３％の配列同一性、約９４％の配列同一性、約９５％の配列同一性、約９６％の配列同一性、約９７％の配列同一性、約９８％の配列同一性、及び約９９％の配列同一性を有する組換えＤＮＡ分子及び改変タンパク質を含む。本明細書中で使用する場合、用語「パーセント配列同一性」または「％配列同一性」とは、２つの配列を最適に整列させた（参照配列が適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、欠失またはギャップを、比較のウインドウにわたって合計２０％未満で有する）場合に、試験（「対象」）配列（またはその相補鎖）と比較した参照（「クエリー」）配列（またはその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率のことを指す。比較ウインドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、当業者に周知であり、例えばＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメント・アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性探索法などのツールによって、ならびに、これらのアルゴリズムをコンピュータ上で実装した、ＧＣＧ（登録商標）ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア）、ＭＥＧＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳｔａｒ社、１２２８  サウスパークストリート、マディソン、ウィスコンシン．５３７１５）及びＭＵＳＣＬＥ（バージョン３．６）（ＲＣ  Ｅｄｇａｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）３２（５）：１７９２‐１７９７）配列解析ソフトウェアパッケージの一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどにより、既定のパラメータを用いて実行してもよい。試験配列及び参照配列のアラインメントしたセグメントの「同一フラクション」は、位置合わせした２つの配列が共有する同一の構成要素の数を、参照配列セグメント中の構成要素の総数、すなわち参照配列全体、または参照配列内のより小さな規定部分で除したものである。パーセント配列同一性は、同一フラクションを１００倍化したものとして表される。１つ以上の配列の比較は、完全長配列もしくはその一部、またはより長���配列に対して行ってもよい。
【００５１】
改変タンパク質は、変化したＶｍａｘ、Ｋｍ、基質特異性、基質選択性、及びタンパク質安定性などの有用なタンパク質特性の新規組み合わせを用いて野生型タンパク質を変化させる（すなわち改変する）ことによって産生してもよい。修飾は、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で行ってもよく、天然（すなわち、野生型タンパク質）のその位置で見出されるアミノ酸とは異なるアミノ酸への置換であってもよい。タンパク質改変に有用な野生型タンパク質ＲｄｐＡ（配列番号：６０）のタンパク質配列と比較したアミノ酸位置の例を図３に示す。図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅは、野生型ＲｄｐＡタンパク質配列と、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２の改変タンパク質配列とのマルチ配列アラインメント結果を提供する。改変タンパク質は、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９２％の配列同一性を有するように、及びこれらのアミノ酸変異の少なくとも１つを含むように設計することができる。したがって、本発明が提供する改変タンパク質は、自然界に見出される野生型タンパク質と比較して、１つ以上の変化したタンパク質特性を有する新規タンパク質を提供する。本発明の一実施形態では、改変タンパク質は、類似の野生型タンパク質と比較して、１つ以上の除草剤に対する活性の改善または低下などのタンパク質特性の変化、もしくはタンパク質安定性の向上、またはそのような特性の任意の組み合わせを有する。一実施形態では、本発明は、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１８、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、及び４６〜５２からなる群から選択される改変タンパク質配列に対し、少なくとも約８０％の配列同一性、約８５％の配列同一性、約９０％の配列同一性、約９１％の配列同一性、約９２％の配列同一性、約９３％の配列同一性、約９４％の配列同一性、約９５％の配列同一性、約９６％の配列同一性、約９７％の配列同一性、約９８％の配列同一性、及び約９９％の配列同一性を有する改変タンパク質、及びそれをコードする組換えＤＮＡ分子を提供する。アミノ酸突然変異は、タンパク質における単一のアミノ酸置換として、または１つ以上の他のアミノ酸置換（複数可）、欠失、または追加などの１つ以上の他の突然変異（複数可）との組み合わせとして作成してもよい。突然変異は、本明細書中に記載するように、または当業者に公知の他の任意の方法によって作成してもよい。
【００５２】
トランスジェニック植物
本発明の態様は、本発明で提供する組換えＤＮＡ分子及び改変タンパク質を含むトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織、トランスジェニック植物、及びトランスジェニック種子を含む。組換えＤＮＡ分子及び改変タンパク質を含むこれらの細胞、組織、植物及び種子は、アリールオキシフェノキシプロピオン酸（ＡＯＰＰ）除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシ酸除草剤の１種以上に対する除草剤耐性を示す。
【００５３】
本発明で使用するための宿主植物細胞の適切な形質転換方法は、ＤＮＡを細胞に導入できる任意の方法（例えば、組換えＤＮＡ構築物を植物染色体に安定に組み込む）を含み、これらの方法は当該分野で公知である。組換えＤＮＡ構築物を植物に導入するための例示的かつ広範に利用されている方法は、当業者に周知のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系である。形質転換した植物細胞から、植物細胞培養の方法によってトランスジェニック植物を再生できる。それ自身と単一のトランスジーン対立遺伝子とを含むトランスジェニック植物、例えばＲ０植物を自家受粉（自殖）させ、Ｒ１種子を産生することにより、トランスジーン（すなわち、トランスジーンの２つの対立遺伝子コピー）に関してホモ接合性であるトランスジェニック植物を得ることができる。産生するＲ１種子の４分の１は、トランスジーンに関してホモ接合性である。発芽するＲ１種子から生長する植物は、通常、ＳＮＰアッセイ、ＤＮＡ配列決定、または接合アッセイと呼ばれるヘテロ接合体とホモ接合体とを区別可能にする熱増幅アッセイを用いて、接合性について試験することができる。
【００５４】
本発明で提供する植物、種子、植物部分、植物組織、及び細胞は、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、及びピリジニルオキシル酸除草剤の１種以上に対して除草剤耐性を示す。ＡＯＰＰ除草剤は、脂肪酸生合成経路の一部である植物のアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）を標的とする。草木植物は、それらの色素体及びサイトゾルに除草剤感受性ＡＣＣａｓｅを有するため、これらの除草剤に感受性である。ＡＯＰＰ除草剤は当該技術分野において周知であり、市販されている。ＡＯＰＰ除草剤の例として、クロジナホップ、シハロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ‐Ｐ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フルアジポップ‐Ｐ、ハロキシホップ、イソキサピリホップ、メタミホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ‐Ｐ、及びトリホップが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。フェノキシ酸及びピリジニルオキシ酸除草剤は、植物成長ホルモンインドール酢酸（ＩＡＡ）に類似した合成オーキシン類である。広葉植物は、これらの除草剤に感受性であり、これらの除草剤は、急速で抑制のない生長を誘導し、最終的に植物を枯死させる。フェノキシ酸除草剤の例として、２，４‐Ｄ；２，４‐ＤＢ；クロメプロップ；ジクロルプロップ；フェノプロップ；ＭＣＰＡ；ＭＣＰＢ、及びメコプロップが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。ピリジニルオキシ酸除草剤の例として、トリクロピル；フルロキシピル；アミノピラリド、クロピラリド、及びピクロラムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【００５５】
雑草を防除するための方法として、除草剤を、本発明で提供する植物及び種子を含む植物栽培区域に散布してもよい。本発明で提供する植物及び種子は、除草剤耐性形質を有し、１種以上のＡＯＰＰ除草剤、またはフェノキシ酸除草剤、またはピリジニルオキシル酸除草剤の散布に耐性を示す。除草剤の散布は、推奨商業量（１倍量）もしくはその一部、またはその複数倍、例えば推奨商業量の２倍（２倍量）などであってもよい。除草剤の割合は、１エーカー当たりの１ポンド当たり酸当量（ｌｂ  ａｅ／ａｃ）または１エーカーあたりの有効成分のポンド（ｌｂ  ａｉ／ａｃ）として表す場合がある。除草剤の散布は、ＡＯＰＰ除草剤及びフェノキシ酸除草剤及びピリジニルオキシ酸除草剤からなる群から選択される少なくとも１種の除草剤を含む。植物栽培区域は、除草剤の散布時に、雑草植物を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。雑草を防除するために前記区域で使用するＡＯＰＰ除草剤の除草有効量は、生育期にわたって約０．０１ｌｂ  ａｉ／ａｃ〜約１６ｌｂ  ａｉ／ａｃの範囲からなるべきである。例えば、キザロホップ‐Ｐの１倍量は、０．０８ｌｂ  ａｉ／ａｃの割合である。雑草を防除するために前記区域で使用するフェノキシ酸除草剤の除草有効量は、生育期にわたって約０．０１ｌｂ  ａｅ／ａｃ〜約１６ｌｂ  ａｅ／ａｃの範囲からなるべきである。例えば、２，４‐Ｄの１倍量は、約０．７５ｌｂ  ａｅ／ａｃ〜１．０ｌｂ  ａｅ／ａｃの割合である。雑草を防除するために前記区域で使用するピリジニルオキシ酸除草剤の除草有効量は、生育期にわたって約０．０１ｌｂ  ａｅ／ａｃ〜約１６ｌｂ  ａｅ／ａｃの範囲からなるべきである。例えば、フルロキシピルの１倍量は、約０．１３〜０．４８ｌｂ  ａｅ／ａｃの割合である。
【００５６】
除草剤の散布は、ＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、ピリジニルオキシ酸除草剤、もしくは任意の他の適合する除草剤のうちの１つ、２つ、またはいくつかの組み合わせを連続的に、またはタンク内混合して行ってもよい。広範囲の双子葉雑草、単子葉雑草、またはその両方を防除するために、生育期にわたって、本発明のトランスジェニック植物を含む区域に、１つの除草剤または２つ以上の除草剤を、組み合わせまたは単独で、複数回の散布、例えば、２回の散布（植え付け前の散布と出芽後の散布、もしくは出芽前の散布と出芽後の散布など）または３回の散布（植え付け前の散布、出芽前の散布、及び出芽後の散布、もしくは出芽前の散布と２回の出芽後の散布など）を利用してもよい。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、「耐性」または「除草剤耐性」とは、１つ以上の除草剤（複数可）の毒性効果に抵抗する植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞の能力を意味する。植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞の除草剤耐性は、植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞を適切な対照と比較することによって測定し得る。例えば、除草剤耐性を与え得るタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を保有する植物（試験植物）、及び除草剤耐性を与え得るタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を有さない植物（対照植物）に除草剤を散布し、２種の植物の植物薬害度を比較することによって、除草剤耐性を測定または評価してもよく、試験植物の除草剤耐性は、対照植物の薬害度に比べて低下した薬害度によって示される。除草剤耐性植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞は、対照植物、種子、植物組織、植物部分、または細胞に比べ、除草剤の毒性作用に対する応答性が低い。本明細書中で使用する場合、「除草剤耐性形質」とは、野生型植物または対照植物に比べて高い除草剤耐性を植物に付与するトランスジェニック形質である。
【００５８】
本発明のトランスジェニック植物、子孫、種子、植物細胞、及び植物部分はまた、１つ以上の追加のトランスジェニック形質を含み得る。追加のトランスジェニック形質は、本発明で提供する組換えＤＮＡ分子を含むトランスジーンを保有する植物を、追加のトランスジェニック形質（複数可）を有する別の植物と交配することによって導入してもよい。本明細書中で使用する場合、「交配する」とは、２つの別個の植物を育種し、子孫植物を産生することを意味する。したがって、２つのトランスジェニック植物を交配して、トランスジェニック形質を有する子孫を産生してもよい。本明細書中で使用する場合、「子孫」とは、親植物の任意の世代の子孫を意味し、トランスジェニック子孫は、少なくとも１つの親植物から継承された本発明で提供するＤＮＡ構築物を有する。あるいは、追加のトランスジェニック形質（複数可）のＤＮＡ構築物を、本発明で提供する組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物（例えば、植物形質転換用に使用する同一ベクターの一部として表されるすべてのＤＮＡ構築物）と共形質転換することによって、または本発明で提供するＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物に追加の形質（複数可）を挿入することによって、もしくはその逆によって（例えば、トランスジェニック植物または植物細胞に、いずれかのトランスジェニック植物形質転換法を使用することによって）追加のトランスジェニック形質（複数可）を導入してもよい。そのような追加のトランスジェニック形質として、耐虫性の向上、水分利用効率の向上、収量の増加、耐乾性の向上、種子品質の向上、栄養品質の改善、ハイブリッド種子産生、及び除草剤耐性が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。なお、前記形質は野生型植物または対照植物に関して測定してのものである。そのような追加のトランスジェニック形質は、当業者に公知であり、例えば、そのような形質のリストが、米国農務省（ＵＳＤＡ）の動植物検疫局（ＡＰＨＩＳ）に提供され、そのウェブサイト（ｗｗｗ．ａｐｈｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ）で閲覧可能である。
【００５９】
本発明で提供するトランスジェニック形質を含むトランスジェニック植物及び子孫は、当技術分野で一般的に公知の任意の育種方法と共に使用してもよい。２種以上のトランスジェニック形質を含む植物系統において、トランスジェニック形質は、個々に分離しているか、関連しているか、または３種以上のトランスジェニック形質を含む植物系統においては両方の組み合わせであってもよい。親植物との戻し交配及び非トランスジェニック植物との外交配も、栄養繁殖と同様に考慮される。異なる形質及び作物に一般的に用いる育種方法の記載は、当業者に周知である。特定の植物または種子中のトランスジーン（複数可）の存在を確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。このようなアッセイとしては、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＰＣＲ、ならびにＤＮＡ配列決定などの分子生物学的アッセイ；例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティング）または酵素的機能によってタンパク質産物の存在を検出するなどの生化学的アッセイ；葉または根アッセイなどの植物部分アッセイ；及び、植物全体の表現型の分析が挙げられる。
【００６０】
戻し交配変換のプロセスの結果として、トランスジェニック形質の植物遺伝子型への遺伝子移入が達成される。トランスジェニック形質を遺伝子移入した植物遺伝子型は、戻し交配変換遺伝子型、系統、近交系、またはハイブリッドと呼ぶ場合がある。同様に、所望のトランスジェニック形質を欠く植物遺伝子型は、未変換遺伝子型、系統、近交系、またはハイブリッドと呼ぶ場合がある。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含むがそれに限定するものではない」を意味する。
【実施例】
【００６２】
下記の実施例を含むことにより、本発明の好ましい実施形態を示す。当業者は、本発明者らが見出した代表的技術に基づく本実施例に開示する技術が、本発明の実施において良好に機能し、したがって、その実施における好ましい形態を構成すると考え得ることを理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示を参照して、本発明の概念、趣旨、及び範囲を逸脱することなく、開示する特定の実施形態における多くの変更を加えることが可能であり、その場合でも類似または同様の結果が得られることを理解すべきである。より具体的には、化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤に置き換えて、同一または類似の結果を達成し得ることは明らかである。当業者に明らかなこのような類似の置換及び修飾はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定する本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。
【００６３】
実施例１：初期タンパク質改変及び酵素分析
これらのタンパク質をコードする新規改変タンパク質及び組換えＤＮＡ分子を、研究室において考案し、及びタンパク質工学技術を用いて作製した。改変タンパク質は、オキシゲナーゼ活性を有する酵素であり、野生型タンパク質との比較においてＡＯＰＰ除草剤、フェノキシ酸除草剤、またはその両方を不活性化する能力が変化するようにこれらを改変した。
【００６４】
オキシゲナーゼ活性を有する１６種の公知のタンパク質を選択し、これを用いてコンセンサスホモロジー配列アラインメントを作成した。これを構造情報に基づいた解析と組み合わせ、合理的設計戦略における情報として用いた。これらの解析をもとに、本明細書で「アイランド」と呼ぶ１３〜２１アミノ酸長の５つの領域を突然変異誘発のために選択した。これらの領域の各々における突然変異は、当業者に公知の技術、例えばアラニンスキャニング突然変異；相同性スキャニング突然変異；Ｐｒｏ／Ｇｌｙスキャニング突然変異；領域置換または突然変異；及びこれらの様々な技術の組み合わせなどを用いて作成する。（Ｍ  Ｌｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍ  Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１）１２（４）：３７１‐３７５；Ｂ  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｕｒｇ  ａｎｄ  ＶＧＨ  Ｅｉｊｓｉｎｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）１３（４）：３３３‐３３７；及びＷｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０００）９７（１６）：８９５０‐８９５４参照）。これらの方法を用いて、１，２００種を超えるユニークな改変タンパク質及びそれをコードする組換えＤＮＡ分子を、さらなる分析及び特徴付けのために生成した。試験用に生成した改変タンパク質の数の多さ、及び各タンパク質の酵素活性を試験及び比較する必要があることから、粗精製細菌抽出物を用いた高速分析のためのハイスループット細菌タンパク質発現及び酵素アッセイ系を開発した。
【００６５】
各改変タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を合成し、これを、組換えＤＮＡ分子に作動可能に連結したＣ末端ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を有する細菌発現ベクターにクローニングすることにより、ハイスループットな細菌タンパク質発現を達成した。ベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、改変タンパク質の細菌発現を誘導した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を９６ウェルプレートで一晩増殖させ、培養物を遠心分離して細菌をペレット化した。１００ｕｌの溶解マスターミックス（１０ｍｌの細菌タンパク質抽出試薬（Ｂ‐ＰＥＲ（登録商標））ＩＩ（ピアス・バイオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ；カタログ番号７８２６０）；１０ｕｌのリゾチーム（終濃度１０ｕｇ／ｍｌ；リゾチーム  アメリカン・バイオアナリティカル、ネイティック、マサチューセッツ；カタログ番号ＡＢ０１１７８０‐００００５）；及び４０ｕｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（終濃度１００ユニット／ｍｌ、ノバジェン、ダルムシュタット、ドイツ；カタログ番号７１２０６‐３））を各ウェルに添加し、細菌ペレットを溶解した。プレートをボルテックスし、次いで４℃で３０分間インキュベートした。４００ｕｌのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５７）を各ウェルに添加し、細胞片を遠心分離によってペレット化した。溶解物上清を慎重に除去し、その後の酵素分析のための粗精製細菌抽出物として使用した。
【００６６】
ハイスループット除草剤分解酵素アッセイを設計し、粗精製細菌抽出物を使用して様々な除草剤に対する改変タンパク質の酵素活性を分析した。改変タンパク質のオキシゲナーゼ活性（すなわち、その酵素の酵素活性）は、４‐アミノアンチピリン及びフェリシアン化カリウムによる５１０ｎｍでの吸光度測定によるフェノール生成物の検出を利用したエンドポイント比色分析法によって測定した。このアッセイは、Ｆｕｋｏｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｈａｕｓｉｎｇｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）２６８（３２）：２４３１１‐２４３１７に記載のアッセイに基づく。酵素反応は、９６ウェルプレート内において、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ６．７５）、５０〜２００ｕＭのＮＨ４ＦｅＳＯ４、５０〜２００ｕＭのアスコルビン酸ナトリウム、１ｍＭのαケトグルタル酸（ａＫＧ）、発現した改変タンパク質を含有する１０ｕｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解物、及び基質（ＡＯＰＰ除草剤またはフェノキシ酸除草剤のいずれか）を含む合計量１５０ｕｌ中で分析した。基質との反応の開始時に、プレートを様々な温度で様々な時間インキュベートし、ＥＤＴＡを終濃度６．２５ｍＭになるように添加するか、または１５ｕｌのｐＨ１０緩衝液（５０ｍＭのホウ酸、５０ｍＭのＫＣｌ）、続いて１５ｕｌの０．２％の４‐アミノアンチピリン及び１５ｕｌの０．８％フェリシアン化カリウムを添加することによりクエンチ（終結）した。吸光度測定は、標準的な実験室分光計で行った。必要に応じてアッセイをスケーリングし、スループットを高めた。精製タンパク質または製品標準を用いて標準曲線を作成した。
【００６７】
このハイスループット細菌タンパク質発現及び酵素アッセイ系を用いて、約１２００種の改変タンパク質の活性を、選択した野生型タンパク質ＲｄｐＡの活性と比較して測定した。９６ウェルプレートアッセイにおいて、３つの対照（改変タンパク質を有さない粗精製細菌抽出物）及び３つの陽性対照（野生型タンパク質を有する粗精製細菌抽出物）を設けた。ウェルの吸光度を測定し、タンパク質活性を以下の式を用いて計算した：
【数１】
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ここで、Ａｃｔｉｖｉｔｙｉは試料の活性、Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅｉは試料の吸光度、ＡｂｓｏｒｂａｎｃｅＷＴは野生型酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ由来抽出物を含むウェルの吸光度、ＡｂｓｏｒｂａｎｃｅｐＥＴは改変タンパク質を有さないＥ．ｃｏｌｉ由来抽出物を含むウェルの吸光度である。ユニークな各改変タンパク質の活性を２回測定し、２回の測定の平均として報告した。
【００６８】
ハイスループット酵素アッセイ系からの結果に基づいて、約５４５種のユニークな改変タンパク質を、精製改変タンパク質を用いるさらなる分析のために選択した。精製改変タンパク質調製アッセイにおいて、製造元のプロトコールに従ってＱＵＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｎｉ‐ＮＴＡアガロース（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア、カタログ番号３０２３０）を用いて粗精製細菌発現溶解物を調製した。
【００６９】
ＡＯＰＰ除草剤キザロホップを基質とし、本実施例１に記載の除草剤分解酵素アッセイを用いて、精製改変タンパク質を分析した。精製改変タンパク質アッセイの結果は、ハイスループット酵素アッセイの結果を大部分裏付けるものであった。約５４５種の改変タンパク質のうちの７種について、本アッセイ結果を表１に示す。ここで、酵素活性は、野生型ＲｄｐＡ酵素の活性（本実施例１に記載のように計算した）に対する試料の活性として表す。これらのアッセイからのこれらのデータは、特定の突然変異の組合せが他のものよりも有意に良好に作用し、改変タンパク質の酵素活性を有意に変化させ得ることを実証した驚くべき結果をもたらした。
【表１】
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【００７０】
第一のアッセイから学んだ情報を用いて、前記のようにタンパク質改変を実施して追加の改変タンパク質を産生し、これらを本実施例１に記載のように試験した。これらの追加のタンパク質のうちの５種について、キザロホップ‐Ｐを基質として用いたハイスループット酵素アッセイの結果を表２に示す。
【表２】
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【００７１】
表２の５種の改変タンパク質を用いて、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、及び結晶構造解析などのさらなるタンパク質特性決定を実施した。この詳細な分析のために、精製タンパク質を以下のように調製した：所与のＭＯＮ‐ＨＴタンパク質をコードするトランスジーンを発現するＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物２ｍｌを用いて、５００ｍｌのブロスに播種し、３７℃で４時間増殖させた後、１５℃で約３６時間培養した。次いで、５００ｍｌの細菌培養物のうち、２５０ｍｌを遠心分離によってペレット化し、２５ｍｌの抽出用緩衝液（２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．８）、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２０ｍＭのイミダゾール（フルカ／シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ）、１２５ユニット／ｍｌのベンゾナーゼ及び１０Ｋユニット／ｍｌのリゾチーム（ノバジェン、ダルムシュタット、ドイツ）に再懸濁した。細胞懸濁液を細胞破砕器に２００００ｐｓｉで１回通過させ、次いでこの細胞溶解物を、４℃で２０分間３５，０００×ｇで遠心分離して清澄化した。可溶性Ｈｉｓタグ付きタンパク質の上清を、タンパク質精製に用いた。この精製のために、ＡＫＴａｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（ＧＥヘルスケア、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用い、製造元の標準的なプロトコールに従って、上清を１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦカラム（ニッケル・セファロース）（ＧＥヘルスケア、ピスカタウェイ、ニュージャージー）にアプライした。洗浄緩衝液は：２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．８）、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール及び５ｍＭのＢＭＥからなっていた。溶出緩衝液は、５００ｍＭのイミダゾールを用いた以外は、洗浄緩衝液と同じであった。ニッケルカラムからの溶出液を、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐２５ファインカラム（ロシュ・アプライド・サイエンス、インディアナポリス、インディアナ）上で製造元のプロトコールに従って脱塩した。溶出したタンパク質は：２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．８）、５０ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＢＭＥからなる緩衝液中に存在した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析によってタンパク質抽出物の純度を評価した。バイオラッドＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ色素試薬（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア、カタログ番号５００‐０００６）を用いたブラッドフォード・アッセイによってタンパク質濃度を測定した。
【００７２】
本実施例１に記載の酵素アッセイを用いて、ただし、基質として４種の異なるＡＯＰＰ除草剤：キザロホップ‐Ｐ、ハロキシホップ、フェノキサプロップ、及びフルアジホップを用いて、前記５種の改変タンパク質の精製タンパク質を分析した。一般的なフェノール標準曲線を作成するために用いる２，４‐ジクロロフェノール（２，４‐ＤＣＰ）を用いて標準曲線を作成した。改変タンパク質によるアッセイでの生成フェノール量を、この標準曲線に基づいて計算した。対照は、精製した野生型酵素、酵素なし、及び基質なしであった。０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、または１２８０μＭのキザロホップ‐Ｐ、ハロキシホップ、フェノキサプロップ、またはフルアジホップ除草剤を用いて、５種の改変タンパク質の酵素反応速度の測定を行った。表３は、５種のタンパク質について、４種のＡＯＰＰ除草剤基質を用いて測定したＫｍ及びＶｍａｘ（相対値として表す）を示す。基質として４種のＡＯＰＰ除草剤のそれぞれを用いたこれらの５種の改変タンパク質のタンパク質特性は、改変タンパク質の酵素活性、すなわちＫｍ及びＶｍａｘがタンパク質改変によって有意に変化し得ることを示した。
【表３】
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【００７３】
実施例２：改変タンパク質のトウモロコシでの発現
単子葉植物での発現に最適化したタンパク質コード配列を有する３つの改変タンパク質、ＭＯＮ‐ＨＴ５１（配列番号：３）、ＭＯＮ‐ＨＴ５２（配列番号：６）、及びＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１３）のうち、各々１つをコードする組換えＤＮＡ分子を含む植物形質転換ベクターを構築した。ベクターは、プロモーター、リーダー、イントロン、及び３′ＵＴＲの異なる組み合わせを用いるとともに、タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰの存在下及び非存在下で作製した。また、グリホサート耐性用にトランスジェニック植物において使用するためのｃｐ４‐ＥＰＳＰＳコード配列を含む第二のＤＮＡカセットをベクターに組み込んだ。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該分野で公知の標準的な方法を用いて、未成熟トウモロコシ（ＬＨ２４４）胚をこれらのベクターで形質転換した。再生Ｒ０トランスジェニック幼植物体を温室内で栽培し、およそＶ２〜Ｖ４の生育段階において、それぞれ約０．５倍及び１倍量を表わす０．０４または０．０８ｌｂ  ａｉ／ａｃのキザロホップ‐Ｐ（Ａｓｓｕｒｅ（商標）ＩＩ、Ｅ．Ｉ．デュポン）をこれらに噴霧した。葉の試料を使用して、単一コピーのトランスジェニックＤＮＡインサート（すなわち、単一事象の植物）を保有するトランスジェニック植物を同定した。単一コピーのみを含み、０．５倍または１倍量のキザロホップ‐Ｐ噴霧試験に合格したＲ０植物を自家受粉させ、Ｒ１種子を産生した。ＭＯＮ‐ＨＴ５２を含む構築物では事象は得られなかった。ＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ５１を含む構築物及びＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ５１を含む構築物から、１つの事象のみが再生した。ＭＯＮ‐ＨＴ５５を含む２組のベクターを形質転換した。各組は、ＣＴＰを含むか否かのみが異なる。
【００７４】
作動可能に連結したＣＴＰを含む及び含まないＭＯＮ‐ＨＴ５５を発現するＲ１植物を温室内で栽培し、Ｖ２生育段階において、キザロホップ‐Ｐ除草剤を０．０８ｌｂ  ａｅ／ａｃ（１倍）の割合で散布した。処置後１１日目に植物の薬害度を評価した。Ｒ１植物は一般的なメンデル比で形質を分離させており、予想数（約２５％）の除草剤処理で生存しなかったヌル分離個体（トランスジェニック形質を含まない子孫植物）が認められた。作動可能に連結したＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ５５を発現するすべてのＲ１トランスジェニック植物は、１つの事象を表すものを除いて、キザロホップ‐Ｐの散布後に最も若い露出した葉に軽微な萎黄病の小斑点を示したのみであった。これらの植物では、除草剤散布後に５％を超える薬害スコアを記録することはなかった。同様に、未噴霧のトランスジェニック植物は、未噴霧の対照植物と表現型の上で異なってはいなかった。図１Ａは、キザロホップ‐Ｐ散布１８日後の対照ＬＨ２４４植物及びＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１３）保有トランスジェニック植物を示す。
【００７５】
改変タンパク質を植物細胞葉緑体に標的化することに対するＣＴＰの使用効果を評価するために、タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰを含む及び含まないトランスジーンインサートを保有するトランスジェニック植物を比較した。タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰを保有する植物は、ＣＴＰを含まないものと比較して、キザロホップ‐Ｐに対してより良好な耐性を示した。本実施例２に記載のＲ１温室試験において、タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰを保有するトランスジェニック植物の大部分は、キザロホップ‐Ｐに対して完全な耐性を示した。タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰを保有しない植物は、キザロホップ‐Ｐ耐性を示したものの、中程度の薬害表現型を示した。これらの結果は、ＣＴＰを使用して改変タンパク質を植物細胞葉緑体に標的化することが、トランスジェニック植物のキザロホップ‐Ｐ耐性を高めることを示した。この予期しない発見を、タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰを含むもしくは含まないＭＯＮ‐ＨＴ５１またはタンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰを含むもしくは含まないＭＯＮ‐ＨＴ５５を保有するＲ１植物を用いた形質有効性圃場試験において再び試験した。これらのＲ１植物は単一コピーであったが、依然として遺伝的に分離していた。この圃場試験では、種子を圃場に植え、以下のように処理した：植え付け前に２倍量（０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃ）のキザロホップ‐Ｐ処理、Ｖ４生育段階において２倍量（０．１４ｌｂ  ａｉ／ａｃ）のハロキシホップ処理、及びＶ８生育段階において２倍量のキザロホップ‐Ｐ処理。タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰを保有しない植物に比べ、タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰを保有する植物は、より高い割合で、キザロホップ‐Ｐ及びハロキシホップの散布に耐え、薬害スコアが低かった。データを表４に提供する。これは、タンパク質コード配列に作動可能に連結したＣＴＰが、改変タンパク質に、除草剤の散布に対する高い植物耐性を付与するという予想外の発見を裏付けるものであった。
【表４】
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【００７６】
近交系形質有効性圃場試験を実施し、近交系バックグラウンドにおいて、ＡＯＰＰ除草剤に対する耐性及びシクロヘキサンジオン（ＣＨＤ）除草剤に対する感受性を評価した。ホモ接合性トランスジェニックＲ１植物を自家受粉させ、種子を採取してＲ２近交系植物を生成した。Ｒ２近交系植物は、ＣＴＰを含むもしくは含まないＭＯＮ‐ＨＴ５５またはＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ５１を保有する近交系植物であり、これらを２つの圃場地点で評価した。除草剤処理は、ＰＲＥ（植え付け後だが出芽前）に０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃの２倍量キザロホップ‐Ｐを散布し、続いてＶ４生育段階に０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃのキザロホップ‐Ｐを散布し、続いてＶ８生育段階に０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃのキザロホップ‐Ｐを散布した。除草剤散布の７〜１０日後に、０〜１００のスケール上で作物薬害度についてプロットを評価した。ここで０は薬害なしであり、１００は作物の完全死である。すべてのデータを、ＬＳＤ（０．０５）で分離される分散及び平均の分析に供した。近交系Ｒ１植物のほとんどは薬害を示さず、このことからＣＴＰを含むまたは含まないＭＯＮ‐ＨＴ５５及びＭＯＮ‐ＨＴ５１の両方が、トウモロコシに対してキザロホップ‐Ｐ耐性を付与することを確認した。自生植物防除での使用に望ましいＣＨＤ除草剤に対する感受性を試験するために、植物をＶ８生育段階において１倍量のクレトジム（０．２５ｌｂ  ａｉ／ａｃ）で処理した。１倍量のクレトジムを用いた自生植物防除は、試験した全てのトランスジェニック植物に対して１００％有効であった。ハイブリッド形質有効性圃場試験を実施し、ハイブリッド・バックグラウンドでのＡＯＰＰ除草剤に対する耐性及びシクロヘキサンジオン（ＣＨＤ）除草剤に対する感受性を評価した。Ｒ１近交系植物を非トランスジェニック植物と交配させ、種子を採取することにより、Ｆ１ハイブリッド植物を産生した。結果として得られた、ＣＴＰを含むもしくは含まないＭＯＮ‐ＨＴ５５（配列番号：１３）またはＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ５１（配列番号：３）を保有するＦ１植物を、６か所の圃場で評価した。圃場の季節の間の高熱及び干ばつ条件を含む環境条件の範囲の下で、ハイブリッド形質有効性圃場試験を６カ所で実施した。こうすることにより、トウモロコシにおいて、高熱及び水ストレス条件下で改変タンパク質を評価することを可能とした。データを表５に示す。２倍量のキザロホップ‐Ｐ散布に由来する最初の薬害は、散布後７〜１０日目において所望よりも高かった（＞１０％の薬害度）。植物は、最終的に大部分の薬害から脱して生長した。一般的にはＶ４生育段階での散布に比べてＶ８生育段階での散布のほうが、より薬害の程度は少なかった。過度の薬害は、キザロホップ‐Ｐを非常に早期に散布した場合（例えば、ＶＥ〜Ｖ２生育段階）にも認められた。
【表５】
2017534273.tif 000007
【００７７】
高温の圃場条件下で生育した場合、改変タンパク質ＭＯＮ‐ＨＴ５５またはＭＯＮ‐ＨＴ５１を発現するハイブリッド植物が、キザロホップ‐Ｐ散布に感受性であるという知見を、植物ベースのアッセイを用いて確認した。植物ベースのアッセイは、圃場試験の前に、生育室におけるＦ１ハイブリッドのキザロホップ‐Ｐに対する耐性を試験するように設計した。このアッセイは、トウモロコシ事象ＮＫ６０３（米国特許第８，２７３，９５９号）×ＭＯＮ８９０３４（米国特許第８，５８１，０４７号）を保有する植物のＦ１ハイブリッド、及びＭＯＮ‐ＨＴ５５×ＭＯＮ８９０３４を保有する植物のＦ１ハイブリッドを用いて開発した。Ｆ１ハイブリッド種子を生育室内で１週間発芽させた後、３つの異なる生育室のうちの１つに移動し、２倍量（０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃ）のキザロホップ‐Ｐを散布する前に、２０℃／２０℃、２８℃／２０℃、及び３８℃／３０℃の昼／夜温度で２日間、順化させた。予想どおり、すべての温度レジメンでＭＯＮ‐ＨＴ５５を保有しない植物は、２倍量のキザロホップ‐Ｐ散布によって重篤な薬害を受けた（図１Ｂ）。ＭＯＮ‐ＨＴ５５を保有するトランスジェニック植物は、２０℃／２０℃または２８℃／２０℃の昼／夜温度に順化させた場合、２倍量のキザロホップ‐Ｐ散布に対して良好な耐性を示したが、３８℃／３０℃の昼／夜温度で順化させた場合は、有意な感受性を示した（図１Ｃ）。このことは、植物ベースのアッセイを用いて、温度感受性活性に関して、生育室内の植物のタンパク質をスクリーニングできることを裏付けた。
【００７８】
前記データは、改変タンパク質がトランスジェニック植物内で発現し、除草剤耐性を与えることができること、及び未噴霧の対照植物に比べて未噴霧のトランスジェニック植物が表現型の上で異なっていないことを示した。前記データはまた、植物内で改変タンパク質を発現させることにより、自生植物防除のためにＣＨＤ除草剤を使用することが可能になることを裏付けた。予期しないことに、前記データは、改変タンパク質の葉緑体標的化のためにＣＴＰを使用することが除草剤耐性形質を高めること、及び改変タンパク質が提供する除草剤耐性が温度感受性であり、高温条件下では低下することを示した。
【００７９】
実施例３：改変タンパク質の最適化
高温の圃場条件下で栽培した場合、改変タンパク質ＭＯＮ‐ＨＴ５５またはＭＯＮ‐ＨＴ５１を発現するハイブリッド事象がキザロホップ‐Ｐ散布に感受性であるという知見は、驚くべきことであり、タンパク質改変によって変更可能な追加のタンパク質特性を提供した。高温に対する感受性についてタンパク質を試験するための一連の新規生体外酵素アッセイ及び植物ベースの酵素活性アッセイを開発した。
【００８０】
より高温での活性に最適化した改変タンパク質を作製するために、タンパク質改変の最初の２ラウンドで使用したタンパク質モチーフ分析を、いくつかの改変タンパク質の結晶構造データと組み合わせた。これらを情報として用いて、前記のように実施する追加のラウンドの突然変異誘発を行い、そのようにして約１４００種の追加の改変タンパク質を生成した。これらを、実施例１に記載の約１２００種の改変タンパク質と組み合わせ、新規温度感受性アッセイを用いてより高温での活性に最適化したタンパク質を同定するためのスクリーニングを行うための合計約２６００種の改変タンパク質を得た。
【００８１】
高温での活性についてこれらの改変タンパク質を分析するために、実施例１の生体外酵素アッセイを改変して、成分の混合前にすべてのアッセイ成分を所望の温度に５分間予熱し、反応の間は、所望の温度に維持するように仕様を定めた。アッセイ測定値を正規化するために、キザロホップ‐Ｐを反応の基質として使用し、２５℃の測定値に基づいて酵素活性を正規化した。これらのパラメータを用いて、酵素活性が最大値の半分（Ｔ１／２）になる温度を計算した。ＭＯＮ‐ＨＴ５５のＴ１／２を２９℃と算出し、野生型ＲｄｐＡのＴ１／２を３８℃と算出した（図２Ａ）。
【００８２】
試験する変異体が多数存在するため、５段階のスクリーニングプロセスを用いた。表６は、異なるスクリーニングで試験した変異体のおおよその数を示す。
【表６】
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【００８３】
約２６００種の改変タンパク質に対して１次スクリーニングを行った。実施例１に記載したように、粗精製細菌溶解物を用いたハイスループット細菌タンパク質発現及び酵素アッセイ系を使用し、ただし、２５℃及び４０℃の所望の温度で実施し、クエンチ後の発色を２５℃で行うように変更した。本スクリーニングにより約１２５０種の改変タンパク質を選択し、次工程に移行させた。２次スクリーニングを同様に行ったが、ただし、試料間のタンパク質の正規化を組み入れた。本スクリーンにより、９４種の改変タンパク質を選択し、次工程に移行させた。３次スクリーニングは、実施例１に記載したように、精製タンパク質ならびに除草剤分解酵素アッセイを使用し、ただし、２５℃及び４０℃の所望の温度で実施し、クエンチ後の発色を２５℃で行うように変更した。本スクリーニングにより、４７種の改変タンパク質を選択し、次工程に移行させた。４次スクリーニングは、精製タンパク質を用いて行い、タンパク質濃度を正規化した。また、前記スクリーニングは、２３℃及び４０℃で行うエンドポイント・アッセイに、基質としてキザロホップ‐Ｐ及び（タンパク質変異体のサブセットについては）２，４‐Ｄを含んでいた。本スクリーニングにより、１３種の改変タンパク質を選択し、次工程に移行させた。
【００８４】
５次スクリーニングでは、詳細な生化学分析を行うために、１１種の改変タンパク質の各々について、組換えタンパク質を合成及び精製した。本生化学分析は：（１）反応速度論分析（Ｖｍａｘ及びＫｍ）、（２）温度範囲にわたる活性アッセイ、（３）タンパク質融解分析、（４）追加のＡＯＰＰ除草剤基質に対する活性、及び（５）同一性を確認するためのペプチドの質量分析を含んでいた。比較のために、精製組換え野生型タンパク質及びＭＯＮ‐ＨＴ５５タンパク質に対しても生化学分析を行った。反応速度論分析については、基質としてキザロホップ‐Ｐまたは２，４‐Ｄのいずれかを用いて２３℃で非エンドポイント・アッセイを行った。これらのアッセイ用の組換えタンパク質を細菌中で産生し、タンパク質のＣ末端に融合した６‐Ｈｉｓタグを用いて精製した。１０種の改変タンパク質、野生型タンパク質、及びＭＯＮ‐ＨＴ５５タンパク質について、キザロホップ‐Ｐまたは２，４‐Ｄのいずれかを基質として用いた反応速度論分析の結果を表７に示す（標準誤差を括弧内に示す）。Ｖｍａｘは比活性、ｕｍｏｌ除草剤製品ｍｇ酵素-１分-１として表し；ＫｍはｍＭ除草剤基質として表す。ＮＤＢは、より高濃度の除草剤では酵素活性が明らかである可能性があるが、試験した濃度における活性は、適切な速度論的特徴付けを提供するのに十分なロバスト性を有していないことを示している。ＭＯＮ‐ＨＴ５５については、２，４‐Ｄを基質として用いた場合の活性レベル（Ｖｍａｘ）が低かったため、報告値の信頼性は低いものとなった。ＭＯＮ‐ＨＴ７は、キザロホップ‐Ｐを用いた場合のＶｍａｘが野生型酵素よりも約４０％高く、２，４‐Ｄに対するＶｍａｘは野生型酵素の約半分に過ぎなかった。ＭＯＮ‐ＨＴ１は、キザロホップ‐Ｐに対しては、野生型酵素の約半分のＶｍａｘ、及び２，４‐Ｄに対しては野生型酵素より９．５倍高いＶｍａｘを有していた。ＭＯＮ‐ＨＴ１とＭＯＮ‐ＨＴ７とは、わずかに４つのアミノ酸が異なるのみであることから、このＭＯＮ‐ＨＴ１とＭＯＮ‐ＨＴ７のタンパク質反応速度の差異は驚くべきものであった。具体的には、ＭＯＮ‐ＨＴ１は示す位置に以下のアミノ酸を有し：Ｉ８２；Ｆ１０５；Ｔ１１２；及びＶ２７３、ならびにＭＯＮ‐ＨＴ７は示す位置に以下のアミノ酸を有する：Ｌ８２；Ｖ１０５；Ｓ１１２；及びＡ２７３。
【表７】
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【００８５】
ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ７、及びＭＯＮ‐ＨＴ８について、ある範囲の温度にわたっての酵素活性を詳細に分析した。これらのアッセイは上記のように行った。これらの反応の基質としてキザロホップ‐Ｐまたは２，４‐Ｄを使用し、２５℃での野生型酵素の活性に基づいて活性を正規化した。得られた活性曲線を図２Ｂ（基質としてキザロホップ‐Ｐを使用）及び図２Ｃ（基質として２，４‐Ｄを使用）に示す。基質としてキザロホップ‐Ｐを使用した場合、ＭＯＮ‐ＨＴ５５は最も温度感受性が高く、Ｔ１／２は２９℃であった。野生型酵素のＴ１／２は３８℃であった。ＭＯＮ‐ＨＴ１及びＭＯＮ‐ＨＴ８は、野生型酵素よりも温度感受性が低く、それぞれＴ１／２は４２℃及び４１℃であり、これらの温度下では野生型酵素は９０％不活性である。ＭＯＮ‐ＨＴ２及びＭＯＮ‐ＨＴ７は、温度感受性がはるかに低く、それぞれＴ１／２は４６℃及び４７℃であり、これらの温度下では野生型酵素は完全に不活性である。基質として２，４‐Ｄを用いた場合、野生型酵素のＴ１／２は３６℃であった。ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ７、及びＭＯＮ‐ＨＴ８はいずれも、わずかに温度感受性が高く、野生型酵素よりＴ１／２が低かった。ＭＯＮ‐ＨＴ１は、わずかに温度感受性が低く、野生型酵素よりＴ１／２が約１℃高かった。
【００８６】
タンパク質融解分析も実施した。タンパク質融解測定を行うために、精製酵素を、５０ｕＭのＦｅ２＋及び１．０ｍＭのａＫＧを含むかまたは含まない標準保存緩衝液（３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中の９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。次いでタンパク質のアンフォールディングを、ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジタンパク質ゲル染色試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ＃Ｓ６６５１、ライフテクノロジーズ、グランド・アイランド、ニューヨーク）を用いて、バイオラッドＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ装置（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア）中で１０℃〜９５℃まで０．５℃ステップで測定しながら検出した。Ｔ１／２（ここでは、タンパク質の５０％が折り畳まれていない温度）を表８に示す。野生型酵素は、５０ｕＭのＦｅ２＋及び１．０ｍＭのａＫＧで安定化を示した。対照的に、５０ｕＭのＦｅ２＋及び１．０ｍＭのａＫＧでは、いずれの改変タンパク質の安定性にもほとんど影響を与えなかった。ＭＯＮ‐ＨＴ５５、ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、ＭＯＮ‐ＨＴ６、及びＭＯＮ‐ＨＴ１０の融解温度は、野生型酵素の融解温度より低い４１℃〜４８℃の範囲にあった。ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ５、ＭＯＮ‐ＨＴ７、ＭＯＮ‐ＨＴ８、及びＭＯＮ‐ＨＴ９の融解温度は５８℃〜６７℃であり、野生型酵素より８〜１７℃高かった。ＭＯＮ‐ＨＴ７及びＭＯＮ‐ＨＴ１について、融解点の差異は、Ｆｅ２＋及びａＫＧを含まない緩衝液中では１１℃、Ｆｅ２＋及びａＫＧを含む緩衝液中では８℃であった。２つの酵素の間には、わずかに４つのアミノ酸の相違があるのみであることから、これは驚くべきことであった。酵素の融解点に関するこのデータは、改変タンパク質が、より高温でのタンパク質安定性に最適化されていることを裏付けた。このデータはまた、異なる温度で実施したタンパク質の酵素活性アッセイの結果と一致する。
【表８】
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【００８７】
ハロキシホップ、フェノキサプロップ、フルアジホップ、及びジクロルプロップを基質とするＭＯＮ‐ＨＴタンパク質変異体の酵素活性を、精製酵素を用いて２３℃で酵素活性アッセイを実施して測定した。測定した活性を最大活性とし、野生型酵素の活性を１００％と設定した場合の百分率として、前記活性を記録した。データを表９に示す。ＭＯＮ‐ＨＴ５５、ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、ＭＯＮ‐ＨＴ５、及びＭＯＮ‐ＨＴ９は、同じ基質に対する野生型酵素の最大活性を下回るかまたは同等の最大活性を、４種の基質すべてについて有していた。ハロキシホップを基質とした場合、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ７、及びＭＯＮ‐ＨＴ１０は、野生型酵素よりも高い最大活性を有していた。フェノキサプロップを基質とした場合、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ６、ＭＯＮ‐ＨＴ７、ＭＯＮ‐ＨＴ８、及びＭＯＮ‐ＨＴ１０は、野生型酵素よりも高い最大活性を有していた。フルアジホップを基質とした場合、ＭＯＮ‐ＨＴ２及びＭＯＮ‐ＨＴ７は、野生型酵素よりも高い最大活性を有していた。ジクロルプロップを基質とした場合、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ７、及びＭＯＮ‐ＨＴ８は、野生型酵素よりも高い最大活性を有していた。
【表９】
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【００８８】
質量分析を用いて酵素の同一性を確認した。本分析のために、精製タンパク質をＰＡＧＥゲル上で分離し、染色した。次いで、染色したバンドを切り取り、脱染色し、及びトリプシン消化を標準的なプロトコールを用いて行った。トリプシン消化したタンパク質調製物を、Ｄｉｏｎｏｘ  ＵｌｔｉＭａｔ（登録商標）３０００  ＲＳＬＣｎａｎｏ  ＬＣシステム（サーモサイエンティフィック、サニーベール、カリフォルニア）において、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＡＱＵＡＳＩＬ（商標）Ｃ‐１８  Ｊａｖｅｌｉｎ（商標）Ｇｕａｒｄカラムを標準条件で使用して分離し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ハイブリッド四重極型オービトラップ質量分析計（サーモサイエンティフィック、サニーベール、カリフォルニア）を用いたＭＳ‐ＭＳ分析を行うために注入した。
【００８９】
フェノキシ酸除草剤の存在下での活性を高めるようにタンパク質を最適化するために、いくつかの改変タンパク質の結晶構造に対し、コンピュータ上でタンパク質改変を行った。これらの情報をもとに、前記のように実施する追加のラウンドの突然変異誘発を行い、ただし、初期配列として、タンパク質配列ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）をコードするバクテリア配列、配列番号：１５を使用した。およそ４７２種の追加の改変タンパク質を生成した。これらを実施例１及び表６に記載の約２６００種の改変タンパク質と組み合わせて、合計約３０７２種の改変タンパク質とし、２，４‐Ｄ存在下での活性に関して最適化されたタンパク質を同定した。新規変異体の１次スクリーニングは、実施例１に記載したような粗精製細菌溶解物を用いたハイスループット（ＨＴＰ）細菌タンパク質発現及び酵素アッセイ系であり、ただし、２５℃及び４０℃の所望の温度で実施し、クエンチ後の発色を２５℃で行うように変更した。このＨＴＰスクリーニングの後、およそ３４種の改変タンパク質を選択し、これらをスクリーニングに供するとともに、すべての試料間でタンパク質を正規化した。このスクリーニングから１２種の改変タンパク質を選択し、それらを、実施例１に記載したように精製タンパク質を用いて除草剤分解酵素アッセイで分析するスクリーニングに移行させた。酵素熱安定性を、タンパク質限定融解アッセイで分析した。このスクリーニングから７種の改変タンパク質を選択し、それらを植物内試験に移行させた。３種の酵素変異体を、精製タンパク質を用いた詳細な特徴付けのために選択し、そこにおいてタンパク質濃度は正規化し、スクリーニングは、基質としてキザロホップ‐Ｐ及び２，４‐Ｄを、ならびに表１０及び表１２に示す追加の除草剤及びタンパク質融解特徴を含んでいた。
【００９０】
上記で詳述したように、野生型酵素、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、及びＭＯＮ‐ＨＴ１７の精製タンパク質に対して、２３℃での非エンドポイント・アッセイを用いた反応速度論分析を実施し、基質としてキザロホップ‐Ｐまたは２，４‐Ｄのいずれかを用いた。データは、２，４‐Ｄを基質として試験した場合に、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、及びＭＯＮ‐ＨＴ１７の酵素活性が、野生型ＲｄｐＡ酵素及びＭＯＮ‐ＨＴ１酵素の両方に比べて、有意かつ予想外に増強したことを示した。具体的には、３種すべての変異体で、ＭＯＮ‐ＨＴ１と比較して活性（Ｖｍａｘ）が約２．５〜３倍増加したことを示した。キザロホップを基質とした場合のＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、及びＭＯＮ‐ＨＴ１７変異体の酵素活性は、ＭＯＮ‐ＨＴ１の活性とおおよそ同等であった。表１０参照。
【表１０】
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【００９１】
タンパク質融解分析を上記のように実施した。ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、及びＭＯＮ‐ＨＴ１７の融解温度はＭＯＮ‐ＨＴ１の融解温度と同等であり、緩衝液中でＴ１／２は５５〜５８℃の範囲にあり、及びＦｅ２＋及びａＫＧを含む緩衝液中ではＴ１／２は６０〜６２℃の範囲にあった。これらのデータは、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、及びＭＯＮ‐ＨＴ１７変異体が、ＭＯＮ‐ＨＴ１と比較して同等の酵素熱安定性を有することを示している。酵素変異体の融解点に関するこのデータは、改変タンパク質が高温でのタンパク質安定性のために最適化されていることを裏付けるものである。表１１参照。
【表１１】
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【００９２】
トリクロピル、フルロキシピル、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢ、メコプロップを基質としたＭＯＮ‐ＨＴタンパク質変異体の酵素活性を、精製酵素を用いて２３℃で酵素活性アッセイを実施して測定した。測定した活性を最大活性とし、野生型酵素の活性を１００％と設定した場合の百分率として、前記活性を記録した。データを表１２に示す。除草剤トリクロピル及びフルロキシピルを基質として分析した各タンパク質（ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、及びＭＯＮ‐ＨＴ１７）は、特に改変タンパク質において検出可能な活性を有していたものの、活性には定量化できるほどのロバスト性がなかった。除草剤ＭＣＰＢを基質として分析した各タンパク質（ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、及びＭＯＮ‐ＨＴ１７）には、検出可能な活性はなかった。メコプロップを基質とした場合の酵素活性は、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５及びＭＯＮ‐ＨＴ１７変異体の各々について、野生型ＲｄｐＡ酵素に比べて低かった。予想外の結果として、ＭＣＰＡを基質とした場合の酵素活性は、ＭＯＮ‐ＨＴ１については野生型ＲｄｐＡ酵素に比べて約６倍高く、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、及びＭＯＮ‐ＨＴ１７については約１０倍高かった。表１２参照。
【表１２】
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【００９３】
実施例４：最適化した改変タンパク質のトウモロコシでの発現
より高温での活性に関して最適化した１０種のユニークな改変タンパク質を、植物におけるトウモロコシの形質転換及び分析のために選択した。単子葉植物での発現用に最適化したコドン使用頻度を用いてこれらの改変タンパク質を発現させるために、当業者に公知の方法を用いてＤＮＡ構築物を作成した。これらのＤＮＡ構築物中において、改変タンパク質とともに、エンハンサー、プロモーター、リーダー、イントロン、ＣＴＰ、及び３′ＵＴＲを様々な組み合わせで試した。ＤＮＡ構築物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該分野で公知の標準的方法を使用して未成熟トウモロコシ（ＬＨ２４４）胚をそれらのベクターで形質転換するために用いた。再生したＲ０トランスジェニック幼植物体を温室内で栽培した。
【００９４】
プラグへの移植の７〜１０日後（通常、Ｖ３〜Ｖ４生育段階に相当する）に、キザロホップ‐Ｐ（２倍）＋２，４‐Ｄ（２倍）を散布することにより、トランスジェニックＲ０トウモロコシ植物をスクリーニングした。試験した全ての構築物は、Ｒ０スクリーニングを通過したユニークな事象を保有する植物を産生した。Ｒ０植物を自家受粉させてＲ１ホモ接合性種子を生成し、Ｒ０を雄性植物としても使用して、トウモロコシ事象ＭＯＮ８９０３４を有する近交系植物と交配させ、有効性圃場試験のための分離Ｆ１ハイブリッド種子を生成した。
【００９５】
５０％の半接合性及び５０％のヌルのトランスジーンを有する分離Ｆ１ハイブリッド植物を用いて、有効性圃場試験を実施した。２つの除草剤散布レジメンを使用してキザロホップ‐Ｐ（２倍）＋２，４‐Ｄ（２倍）に対する耐性を評価した：（１）０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃ（２倍）キザロホップ‐Ｐ（Ａｓｓｕｒｅ  ＩＩ）＋０．２５体積％非イオン性界面活性剤（ＮＩＳ）をＶＥ〜Ｖ２生育段階に散布し、続いて同じものをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階に散布する。（２）２ｌｂ  ａｅ／ａｃ（２倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．０４ｌｂ  ａｉ／ａｃ（０．５倍）のキザロホップ‐Ｐ＋０．２５体積％のＮＩＳをＶＥ〜Ｖ２生育段階に散布し、続いて２ｌｂ  ａｅ／ａｃ（２倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％のＮＩＳをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階に散布した。トランスジーンがヌルであった５０％の植物は、ＶＥ〜Ｖ２生育段階での最初のキザロホップ‐Ｐ散布によって除去された。散布後１０〜１４日目に、作物薬害について０〜１００のスケールでプロットを視覚的に評価した。「０」は無し、「１００」は作物の完全破壊であった。表１３は、両方の噴霧レジメンのＶ４及びＶ８生育段階における平均薬害度を示す。１０％未満の薬害度は非常に良好な耐性と考えられ、２０％未満の薬害度は良〜可の耐性と考えられた。Ｖ８生育段階での２，４‐Ｄの２倍量散布による薬害度は、上が４０％〜下が０の範囲にあった。同様に、Ｖ８生育段階での２倍量のキザロホップ‐Ｐの散布による薬害度は、上が９０％〜下が０であった。同一タンパク質を発現する植物の間での薬害度のバラツキは、構築物の設計またはトランスジーンの挿入位置のバラツキによるものである可能性が高い。このデータは、改変タンパク質を発現する植物が、２，４‐Ｄ及びキザロホップ除草剤の２倍量での散布に対し、耐性を示したことを裏付けた。
【表１３】
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【００９６】
熱感受性に関する植物ベースの酵素活性アッセイを使用して、最適化した改変タンパク質を有するトランスジェニック植物の除草剤耐性に対する生育温度上昇の影響を測定した。上昇した生育温度でのキザロホップ‐Ｐ耐性を試験するために、Ｆ１ハイブリッド（ＭＯＮ‐ＨＴタンパク質の１つを発現するＲ１ホモ接合性植物と近交系トウモロコシ事象ＭＯＮ８９０３４とを交配して産生した）トウモロコシ種子を、生育室内で１０日間、日中温度２８℃及び夜間温度２０℃、湿度５０％の下で栽培した。１０日後に植物を移動させ、下記の３つの異なる昼夜温度レジメンのうちの１つで３日間順化させた：（１）昼夜温度をいずれも２０℃に設定；（２）日中温度が２８℃及び夜間温度が２０℃；または（３）日中温度が３８℃及び夜間温度が３０℃。順化期間の終了時、植物は一般的にＶ４生育段階にあり、２倍量のキザロホップ‐Ｐをこれらに噴霧した。処置の１０日後に、植物に対し１〜５の評定尺度で薬害度を採点した。ここで、『０』は目視レベルでの薬害なし、『１』は萎黄病の小斑点、『２』は退緑条斑、『３』は葉隙または破れ有り、『４』は発育不良及び／またはねじれた葉を有する植物、及び『５』は枯死した植物または生長が認められない、である。結果を図４に示す。ＭＯＮ‐ＨＴ５５を発現するＦ１ハイブリッド・トウモロコシ植物は、昼／夜温度が２０℃／２０℃（図４Ａ）または２８℃／２０℃（図４Ｂ）であった場合に、Ｆ１ハイブリッド対照植物（トウモロコシ事象ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４）（薬害度５）に比べて、噴霧処理に対する良好な耐性（薬害度２前後）を示した。昼／夜温度が３８℃／３０℃の場合、Ｆ１ハイブリッド対照植物の薬害度は５、ＭＯＮ‐ＨＴ５５を発現するＦ１ハイブリッド植物の平均薬害度は３、及びＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、またはＭＯＮ‐ＨＴ７を発現するＦ１ハイブリッド植物は、薬害度≦１であった（図４Ｃ）。より高温での活性に最適化された前記改変タンパク質は、これらの改変タンパク質を発現する植物を高温に曝した場合にＡＯＰＰ除草剤耐性を示した。
【００９７】
高温生育温度での２，４‐Ｄ耐性を試験するために、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、ＭＯＮ‐ＨＴ７、またはＭＯＮ‐ＨＴ５５を保有するＲ１植物と、トウモロコシ事象ＭＯＮ８９０３４を保有する近交系植物との交配により、Ｆ１ハイブリッド植物を産生した。Ｆ１ハイブリッド植物を温室内で最低温度２０℃、最高温度２８℃、湿度５０〜８０％で１週間栽培した。１週間後、植物を移動させ、２つの異なる昼夜温度レジメンのいずれかで３日間順化させた：（１）昼夜温度をいずれも２０℃に設定、または（２）日中温度３８℃及び夜間温度３０℃。順化期間の終了時、植物は一般的にＶ４生育段階にあり、４倍量の２，４‐Ｄアミンをこれらに噴霧した。処置の１０日後に、０〜１００の薬害尺度を用いて薬害度を採点した。「０」は薬害なし、「１００」は枯死した植物である。４倍量の２，４‐Ｄアミンを散布する前に２０℃／２０℃の昼／夜温度で植物を順化させた場合、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、ＭＯＮ‐ＨＴ７、またはＭＯＮ‐ＨＴ５５を保有するＦ１植物は、薬害度平均＜１０％であり、対照植物は、薬害度平均＜２０％であった（図４Ｄ）。４倍量の２，４‐Ｄアミンを散布する前に昼／夜温度３８℃／３０℃で順化させた場合、ＭＯＮ‐ＨＴ４またはＭＯＮ‐ＨＴ７を保有するＦ１植物は、薬害度平均＜２０％、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、またはＭＯＮ‐ＨＴ３を保有するＦ１植物は、薬害度平均＜１０％（図４Ｅ）、ならびに対照植物及びＭＯＮ‐ＨＴ５５を保有するＦ１植物は、５０％の薬害度平均を有していた（図４Ｅ）。これらの結果は、より高温での活性に最適化された改変タンパク質が、これらの改変タンパク質を発現する植物を高温に曝した場合に２，４‐Ｄ除草剤耐性を示すことを実証した。
【００９８】
キザロホップ‐Ｐ及び２，４‐Ｄについての別個の形質有効性圃場試験を、トウモロコシ事象ＭＯＮ８９０３４を保有する近交系植物と、ＭＯＮ‐ＨＴ５５（ＣＴＰ有り）、ＭＯＮ‐ＨＴ１（ＣＴＰ有りまたは無し）、ＭＯＮ‐ＨＴ２（ＣＴＰ有りまたは無し）、ＭＯＮ‐ＨＴ３（ＣＴＰ有り）、ＭＯＮ‐ＨＴ４（ＣＴＰ有り）、ＭＯＮ‐ＨＴ５（ＣＴＰ有り）、ＭＯＮ‐ＨＴ６（ＣＴＰ有り）、またはＭＯＮ‐ＨＴ７（ＣＴＰ有り）を保有するＲ１植物とを交配することによって産生したＦ１ハイブリッド・トランスジェニック植物を各々に用いて、２箇所で実施した。トウモロコシ事象ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４を保有するトランスジェニックＦ１ハイブリッド植物を比較用に対照として使用した。
【００９９】
キザロホップ‐Ｐ耐性及びクレトジム感受性の有効性圃場試験では、下記の４つの除草剤処理のうちの１つを使用した：（１）０．３２ｌｂ  ａｉ／ａｃ（４倍）のキザロホップ‐Ｐ（Ａｓｓｕｒｅ  ＩＩ）＋０．２５体積％の非イオン性界面活性剤（ＮＩＳ）をＶＥ〜Ｖ２生育段階において散布し、続いて同じものをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階において散布する；（２）０．６４ｌｂ  ａｉ／ａｃ（８倍）のキザロホップ‐Ｐ＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２生育段階において散布し、続いて同じものをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階において散布する；（３）１．２８ｌｂ  ａｉ／ａｃ（１６倍）のキザロホップ‐Ｐ＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２生育段階において散布し、続いて同じものをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階において散布する；または（４）０．２５ｌｂ  ａｉ／ａｃ（１倍）のクレトジム＋０．２５体積％のＮＩＳを、Ｖ８生育段階において散布する。作物薬害の適用後１０〜１４日目に、０〜１００のスケールでプロットを視覚的に評価した。「０」は無し、「１００」は作物の完全破壊である。表１４及び１５は、それぞれＶ４またはＶ８生育段階における除草剤散布後の平均薬害度を示す。
【０１００】
ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、ＭＯＮ‐ＨＴ５、ＭＯＮ‐ＨＴ６、またはＭＯＮ‐ＨＴ７（いずれもＣＴＰに作動可能に連結）を保有する植物は、キザロホップ‐Ｐに対する非常に良好な耐性を示し、Ｖ４及びＶ８の両方の生育段階において、すべての散布量にわたって１５％未満の薬害度を示す。ＣＴＰに作動可能に連結したＭＯＮ‐ＨＴ５５を保有する植物は、中程度〜弱い耐性を示し、０．８〜７８．８％の薬害度であった。キザロホップ‐Ｐ散布後の対照植物の薬害度は９９．５％であった。これらの結果は、ＣＴＰに作動可能に連結したＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、ＭＯＮ‐ＨＴ５、ＭＯＮ‐ＨＴ６またはＭＯＮ‐ＨＴ７を保有する植物が、キザロホップ‐Ｐの連続的な散布に対する極めて良好な耐性を有することを示している。
【０１０１】
作動可能に連結したＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物よりもキザロホップ‐Ｐに対する耐性がより良好であった。すべてのキザロホップ‐Ｐ散布にわたって、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物の薬害度が３．３％〜１８．８％であったのに対し、作動可能に連結したＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物の薬害度は０〜５．５％であった。すべてのキザロホップ‐Ｐ散布にわたって、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物の薬害度が１６．３％〜８２．５％であったのに対し、作動可能に連結したＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は１．５％〜１０％であった。図５は、キザロホップ‐Ｐ散布（処理３）の１０〜１４日後に１．２８ｌｂ  ａｉ／ａｃ（１６倍）のキザロホップ‐Ｐ＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２生育段階において散布し、続いて同じものをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階に散布した場合の、ＣＴＰを作動可能に連結したＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物（図５Ａ）及びＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物（図５Ｂ）を示す。対照植物は生存せず、ＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は中程度〜低い耐性を有し、ＣＴＰに作動可能に連結したＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、キザロホップ‐Ｐ散布に対して頑健な耐性を有していた。これらの結果は、作動可能に連結したＣＴＰの使用が、キザロホップ‐Ｐ耐性を大きく向上させることを裏付けた。
【０１０２】
すべてのトランスジェニック植物は、Ｖ８生育段階において散布した１倍量のクレトジム（０．２５ｌｂ  ａｉ／ａｃ）の散布に対し、９０％を超える薬害度を有していた。このことは、改変タンパク質を有するトランスジェニック植物において、この除草剤を、自生植物防除のために使用できることを示している。
【０１０３】
２，４‐Ｄ耐性に対する有効性圃場試験では、下記の４種の除草剤処理のうちの１つを使用した：（１）２ｌｂ  ａｅ／ａｃ（２倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％の非イオン性界面活性剤（ＮＩＳ）を、ＶＥ〜Ｖ２に、続いてＶ４に、続いてＶ８に散布する；（２）４ｌｂ  ａｅ／ａｃ（４倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２に、続いてＶ４に、続いてＶ８に散布する；（３）８ｌｂ  ａｅ／ａｃ（８倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２に、続いてＶ４に、続いてＶ８のトウモロコシに散布する；または（４）１６ｌｂ  ａｅ／ａｃ（１６倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２に、続いてＶ４に、続いてＶ８に散布する。上記のように、プロットを視覚的に評価した。表１４及び１５は、それぞれＶ４またはＶ８生育段階における除草剤散布後の平均薬害度を示す。
【０１０４】
ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、またはＭＯＮ‐ＨＴ６（いずれもＣＴＰに作動可能に連結）を保有する植物は２，４‐Ｄに対して非常に良好な耐性を示し、Ｖ４及びＶ８生育段階において、すべての散布量にわたって、それぞれ１０％未満及び１７％未満の薬害度であった。ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、ＭＯＮ‐ＨＴ５、またはＭＯＮ‐ＨＴ７（すべて作動可能にＣＴＰに連結）を保有する植物は２，４‐Ｄに対する良好な耐性を示し、Ｖ４及びＶ８生育段階において、すべての散布量にわたって、それぞれ２０％未満及び２２％未満の薬害度であった。ＣＴＰに作動可能に連結したＭＯＮ‐ＨＴ５５を保有する植物は、中程度〜低い耐性を示し、７．５％〜６６％の薬害度であった。２，４‐Ｄ散布後の対照植物の薬害度は、４０％〜８２．２％の範囲内にあった。これらの結果は、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ３、ＭＯＮ‐ＨＴ４、ＭＯＮ‐ＨＴ５、ＭＯＮ‐ＨＴ６、またはＭＯＮ‐ＨＴ７を保有する植物が２，４‐Ｄの連続散布に対して良好な耐性を有することを示している。
【０１０５】
作動可能に連結したＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、全般的に、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物と比較して、キザロホップ‐Ｐ散布で認められたような顕著な差異を２，４‐Ｄ耐性において示さなかった。すべての２，４‐Ｄ散布にわたって、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物の薬害度が０〜１３．８％であったのに対し、作動可能に連結したＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物の薬害度は、０〜１６．３％であった。すべての２，４‐Ｄ散布にわたって、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物の薬害度が１．３〜２１．３％であったのに対し、作動可能に連結したＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物の薬害度は、１．３〜１５％であった。しかしながら、Ｖ４生育段階における２，４‐Ｄ散布後の、作動可能に連結したＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物（８倍量において４．５％、１６倍量において７．５％の薬害度）と、ＣＴＰを含まない植物（８倍量において１３．７５％、１６倍量において２１．２５％の薬害度）との差異は注目に値する。
【表１４】
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【表１５】
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【０１０６】
実施例５：最適化した改変タンパク質のトウモロコシでの発現に対する葉緑体標的化ペプチドの評価
各種の葉緑体標的化ペプチド（ＣＴＰ）を評価するために、単子葉植物での発現用に最適化したＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１６）、ＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：２０）、及びＭＯＮ‐ＨＴ８（配列番号：３９）、ＭＯＮ‐ＨＴ９（配列番号：４２）、またはＭＯＮ‐ＨＴ１０（配列番号：４５）をコードする組換えＤＮＡ分子を含む植物形質転換ベクターを構築した。ベクターは、同一の組合せのプロモーター、リーダー、イントロン、及び３′‐ＵＴＲを用いて作製し、ただし、３種の別個のＣＴＰ（Ａ、Ｂ、またはＣ）のうちの１種をタンパク質コード配列に作動可能に連結するか、またはＣＴＰを連結せずに作製した。表１６参照。このＤＮＡ構築物を使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて未成熟トウモロコシ（ＬＨ２４４）胚を形質転換した。再生したＲ０トランスジェニック幼植物体を温室内で栽培した。Ｒ０植物を自家受粉させ、Ｒ１ホモ接合性種子を生成した。Ｒ０植物は、トウモロコシ事象ＭＯＮ８９０３４を有する近交系植物と交配させるための雄性植物としても使用し、形質有効性圃場試験のための分離Ｆ１ハイブリッド種子を生成した。
【０１０７】
キザロホップ‐Ｐ及び２，４‐Ｄに関する別個の形質有効性圃場試験を、ホモ接合性近交系トランスジェニック植物（Ｒ２またはＲ４世代）を用いて２箇所で実施した。これらの圃場試験では、下記の２種の除草剤処理のうちの一方を使用した：（１）０．１６ｌｂ  ａｉ／ａｃ（２倍）のキザロホップ‐Ｐ（Ａｓｓｕｒｅ  ＩＩ）＋０．２５体積％の非イオン性界面活性剤（ＮＩＳ）を、Ｖ４生育段階に散布し、続いて同じものをＶ８生育段階に散布する；または（２）２ｌｂ  ａｅ／ａｃ（２倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％の非イオン性界面活性剤（ＮＩＳ）をＶ４に、続いてＶ８に散布する。Ｖ４及びＶ８散布の１０〜１４日後に、薬害度（Ｖ４（ＣＩＰＶ４）またはＶ８（ＣＩＰＶ８）における作物薬害の割合）を測定した。誤差はＬＳＤ（０．０５）を用いて計算した。その結果、これらの植物が、Ｖ４及びＶ８散布に続く２倍量のキザロホップ‐Ｐまたは２，４‐Ｄの連続散布に対して耐性を有し、１０％未満の薬害度であったことが明らかになった。表１６参照。
【表１６】
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【０１０８】
ＣＴＰ配列を含む及び含まないＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ならびにＭＯＮ‐ＨＴ８をコードするトランスジーン・カセットを保有する植物から葉試料を採取し、改変タンパク質をコードするトランスジーン・カセットから転写されたｍＲＮＡの発現を測定した。葉試料抽出物に対してＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）分析を行い、トランスジーン・カセットのｍＲＮＡ発現を測定した。これらのアッセイでは、プローブは、トランスジェニック植物を作製するために使用する各発現カセットに存在する共通の３′‐ＵＴＲ配列に対してのものであった。相対的発現を、トウモロコシ・ハウスキーピング遺伝子に対して正規化することによって計算した。トランスジェニック植物の作製に使用する各構築体構成に関し、８つの植物のそれぞれから葉試料を採集した。報告する相対的ｍＲＮＡ発現データは、８つの試料の平均であり、標準誤差を有する。
【０１０９】
ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）またはＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：１８）のいずれかをコードするトランスジーン構築物を保有する植物では、『Ａ』または『Ｂ』のＣＴＰのいずれかを含む構築物が、ＣＴＰを含まない構築物や『Ｃ』のＣＴＰを含む構築物に比べて、より高い相対的トランスジーンｍＲＮＡ発現を有していた。ＭＯＮ‐ＨＴ８（配列番号：３７）をコードするトランスジーン構築物を保有する植物では、３つのＣＴＰ（Ａ、Ｂ、またはＣ）のいずれかを含む構築物が、同様の高い相対的トランスジーンｍＲＮＡ発現を有していた。表１７参照。
【表１７】
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【０１１０】
キザロホップ‐Ｐ及び２，４‐Ｄの加圧スクリーニングのための別個の形質有効性圃場試験を、トウモロコシ事象ＭＯＮ８９０３４を保有する近交系植物と、作動可能に連結したＣＴＰ配列を含むＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、ＭＯＮ‐ＨＴ８、ＭＯＮ‐ＨＴ９、及びＭＯＮ‐ＨＴ１０を保有するＲ１植物とを交配させることによって産生したＦ１ハイブリッド・トランスジェニック植物をそれぞれ用いて、１カ所で実施した。トウモロコシ事象ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４を保有するトランスジェニックＦ１ハイブリッド植物を比較用に対照として使用した。
【０１１１】
キザロホップ‐Ｐ耐性の形質有効性圃場試験では、下記の３種の除草剤処理の１つを使用した：（１）０．３２ｌｂ  ａｉ／ａｃ（４倍）のキザロホップ‐Ｐ（Ａｓｓｕｒｅ  ＩＩ）＋０．２５体積％の非イオン性界面活性剤（ＮＩＳ）を、ＶＥ〜Ｖ２生育段階で散布し、続いて同じものをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階に散布する；（２）０．６４ｌｂ  ａｉ／ａｃ（８倍）キザロホップ‐Ｐ＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２生育段階で散布し、続いて同じものをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階に散布する；または（３）１．２８ｌｂ  ａｉ／ａｃ（１６倍）のキザロホップ‐Ｐ＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２生育段階で散布し、続いて同じものをＶ４生育段階に、続いて同じものをＶ８生育段階で散布する。上記のように、プロットを視覚的に評価した。表１８は、Ｖ４（ＣＩＰＶ４）またはＶ８（ＣＩＰＶ８）生育段階における除草剤散布後の平均薬害度をそれぞれ示す。すべてのキザロホップ‐Ｐ散布後の対照植物の薬害度は１００％であった。誤差はＬＳＤ（０．０５）を用いて計算した。
【表１８】
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【０１１２】
３種の作動可能に連結したＣＴＰ（Ａ、Ｂ、またはＣ）のいずれかを含むＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物は、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物よりもキザロホップ‐Ｐに対する耐性がより良好であった。作動可能に連結した『Ａ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において０〜１５％の薬害度を有していた。作動可能に連結した『Ｂ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において２．５〜２０％の薬害度を有していた。すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において２．５％〜３７．５％の薬害度を有していた作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物に対し、作動可能に連結した『Ｃ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐの散布において０〜２０％の薬害度を有していた。
【０１１３】
３種の作動可能に連結したＣＴＰ（Ａ、Ｂ、またはＣ）のいずれかを含むＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物よりもキザロホップ‐Ｐに対する耐性がより良好であった。作動可能に連結した『Ａ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において０〜１５％の薬害度を有していた。作動可能に連結した『Ｂ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において０〜２０％の薬害度を有していた。作動可能に連結した『Ｃ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において０〜２０％の薬害度を有していた。それに対し、作動可能に連結したＣＴＰを含まないＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において３５〜７０％の薬害度を有していた。
【０１１４】
作動可能に連結した『Ａ』または『Ｂ』のＣＴＰのいずれかを含むＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物は、作動可能に連結した『Ｃ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物よりもキザロホップ‐Ｐに対する耐性がより良好であった。作動可能に連結した『Ａ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において１５〜６０％の薬害度を有していた。作動可能に連結した『Ｂ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において５〜３５％の薬害度を有していた。それに対し、作動可能に連結した『Ｃ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物は、すべてのキザロホップ‐Ｐ散布において４５％〜８５％の薬害度を有していた。
【０１１５】
３種の作動可能に連結したＣＴＰのいずれかを含むＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物、及び作動可能に連結した『Ａ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ９またはＭＯＮ０ＨＴ１０を保有する植物は、３種の作動可能に連結したＣＴＰのいずれかを含むＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物よりもキザロホップ‐Ｐに対する耐性がより良好であった。作動可能に連結した『Ａ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ９またはＭＯＮ‐ＨＴ１０を保有する植物は、すべての散布にわたってキザロホップ‐Ｐに対する耐性を有し、これは３種の作動可能に連結したＣＴＰのいずれかを含むＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物に匹敵するものであった。最大量（１６倍）のキザロホップ散布において、作動可能に連結した『Ａ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、作動可能に連結した『Ｂ』または『Ｃ』のＣＴＰを含む、ＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物よりもわずかに高い耐性を有していた。
【０１１６】
下記の３種の除草剤処理を２，４‐Ｄ耐性についての形質有効性圃場試験で使用した：（１）４ｌｂ  ａｅ／ａｃ（４倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２に散布し、続いてＶ４に、続いてＶ８に散布する；（２）８ｌｂ  ａｅ／ａｃ（８倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２に散布し、続いてＶ４に、続いてＶ８のトウモロコシに散布する；または（３）１６ｌｂ  ａｅ／ａｃ（１６倍）の２，４‐Ｄアミン＋０．２５体積％のＮＩＳを、ＶＥ〜Ｖ２に散布し、続いてＶ４に、続いてＶ８に散布する。上記のようにプロットを視覚的に評価した。
【０１１７】
表１９は、Ｖ４（ＣＩＰＶ４）またはＶ８（ＣＩＰＶ８）生育段階での２，４‐Ｄ除草剤散布後のトウモロコシにおける平均薬害度をそれぞれ示す。すべての２，４‐Ｄ散布後の対照植物の薬害度は、８０％〜９６．２５％の範囲内にあった。Ｖ８に散布した最大量の２，４‐Ｄ（１６倍）において、３種のＣＴＰ（Ａ、Ｂ、またはＣ）のいずれかに作動可能に連結したＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物は、ＣＴＰに作動可能に連結していないＭＯＮ‐ＨＴ１またはＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物よりも良好な耐性を有していた。試験したすべての散布にわたって、作動可能に連結したＣＴＰを含むまたは含まないＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２またはＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物は、作動可能に連結した『Ａ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ９またはＭＯＮ‐ＨＴ１０のいずれかの植物よりも、２，４‐Ｄに対する耐性がより良好であった。２，４‐Ｄ散布の範囲を超えて、耐性の相対的順位は：ＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する植物がＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物より良好であり、ＭＯＮ‐ＨＴ２を保有する植物がＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物より良好であった。キザロホップ‐Ｐ加圧試験のデータと合致する点として、作動可能に連結した『Ａ』のＣＴＰを含むＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ２、またはＭＯＮ‐ＨＴ８を保有する植物は、数値的にわずかであり統計学的に有意とは言えないが、『Ｂ』及び『Ｃ』の輸送ペプチドに比べ、わずかに良好であった。誤差はＬＳＤ（０．０５）を用いて計算した。
【表１９】
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【０１１８】
実施例６：最適化した改変タンパク質のダイズでの発現
トランスジェニック・ダイズにおける分析のために、２つの改変タンパク質を選択した。双子葉植物発現用に最適化したコドン使用頻度を用いてＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）及びＭＯＮ‐ＨＴ２（配列番号：１８）を発現させるために、当業者に公知の方法を用いてＤＮＡ構築物を作製した。これらのＤＮＡ構築物において、エンハンサー、プロモーター、リーダー、イントロン、ＣＴＰ、及び３′ＵＴＲを様々な組合せで、改変タンパク質に作動可能に連結した。これらのＤＮＡ構築物を使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該分野で公知の標準的な方法を用いてダイズを形質転換した。再生したＲ０トランスジェニック幼植物体を温室内で栽培した。三つ葉の生育段階１〜２における形質転換から約９週間後、単一コピーのＲ０事象を同定し、０．５倍（０．３７５ｌｂ  ａｅ／ａｃ）、２倍（１．５ｌｂ  ａｅ／ａｃ）、または４倍（３．０ｌｂ  ａｅ／ａｃ）の２，４‐Ｄ除草剤を噴霧した。除草剤散布の約２週間後、植物を１〜３のスケールで除草剤薬害度について評価した。ここで、１＝軽微な薬害〜薬害なし（＜２０％）、２＝中程度の薬害（２０〜５０％）及び３＝重度の薬害（＞５０％）である。
【０１１９】
各構築物を保有するＲ０ダイズ植物は２，４‐Ｄに対する耐性を示し、軽微な薬害〜薬害なし（＜２０％）または中程度の薬害（２０〜５０％）を有していた。データを表２０に示す。これは、改変タンパク質ＭＯＮ‐ＨＴ１及びＭＯＮ‐ＨＴ２が、ダイズ植物において２，４‐Ｄに対する耐性を付与し得ることを示した。
【表２０】
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【０１２０】
次いで、２，４‐Ｄに対する活性について最適化した追加の５種の改変タンパク質を、トランスジェニック・ダイズにおいて分析するために選択した。コドン使用頻度を双子葉植物発現用に最適化させたＭＯＮ‐ＨＴ１３（配列番号：４７）、ＭＯＮ‐ＨＴ１４（配列番号：４８）、ＭＯＮ‐ＨＴ１５（配列番号：４９）、ＭＯＮ‐ＨＴ１７（配列番号：５１）、及びＭＯＮ‐ＨＴ１８（配列番号：５２）を発現するためのＤＮＡ構築物を作製した。作動可能に連結した発現エレメント（プロモーター、リーダー、イントロン、ＣＴＰ、及び３′ＵＴＲ）は、すべての構築物において同一であった。Ｒ０幼植物体から葉試料を採取し、単一コピーの植物をＰＣＲベースのアッセイを用いて同定した。単一コピーのＲ０植物が約２〜３枚の三つ葉を有する時に、これらを１．５ｌｂ  ａｅ／ａｃ（２倍）または３．０ｌｂ  ａｅ／ａｃ（４倍）の２，４‐Ｄのいずれかで処理した。除草剤散布の７日後、上記のように、薬害を示した植物の面積％に基づいて除草剤薬害度を採点した。
【０１２１】
２倍量の散布では、６種のＭＯＮ‐ＨＴ変異体（ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ１３、ＭＯＮ‐ＨＴ１４、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、ＭＯＮ‐ＨＴ１７、及びＭＯＮ‐ＨＴ１８）のいずれかを保有するダイズ植物は、単一コピー植物のうちの２種を除くすべてにおいて薬害度が＜２０％であることから証明されるように、２，４‐Ｄ処理に対する優れた耐性を示した；これらの２つの事象（一つはＭＯＮ‐ＨＴ１３、及びもう一つはＭＯＮ‐ＨＴ１８に対してのもの）は、２０〜３０％の薬害度を有していた。ＭＯＮ‐ＨＴ１を保有する１１種の単一コピー植物の４倍量散布において、５種の植物が＜２０％の薬害スコアを有し、６種の植物が２０〜５０％の薬害スコアを有していた。ＭＯＮ‐ＨＴ１３を保有する１１種の単一コピー植物のうち、１０種の植物が＜２０％の薬害スコアを有し、１種の植物が２０〜５０％の薬害スコアを有していた。ＭＯＮ‐ＨＴ１４を保有する８種の単一コピー植物のうち、６種の植物が＜２０％の薬害スコアを有し、１つの植物が２０〜５０％の薬害スコアを有し、１つの植物が＞５０％の薬害スコアを有していた。ＭＯＮ‐ＨＴ１５を保有する７種の単一コピー植物のうち、５種の植物が＜２０％の薬害スコアを有し、１種の植物が２０〜５０％の薬害スコアを有し、１種の植物が＞５０％の薬害スコアを有していた。ＭＯＮ‐ＨＴ１７を保有する１１種の単一コピー植物のうち、１１種の植物すべてが＜２０％の薬害スコアを有していた。ＭＯＮ‐ＨＴ１８を保有する１２種の単一コピー植物のうち、９種の植物は＜２０％の薬害スコアを有し、３種の植物は２０〜５０％の薬害スコアを有していた。これらの結果は、ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）、ＭＯＮ‐ＨＴ１３（配列番号：４７）、ＭＯＮ‐ＨＴ１４（配列番号：４８）、ＭＯＮ‐ＨＴ１５（配列番号：４９）、ＭＯＮ‐ＨＴ１７（配列番号：５１）、またはＭＯＮ‐ＨＴ１８（配列番号：５２）を保有するダイズ植物は、４倍量の散布において２，４‐Ｄに対する耐性を有していたことを示している。さらに、これは、ＭＯＮ‐ＨＴ１（配列番号：１４）に比べて、ＭＯＮ‐ＨＴ１３（配列番号：４７）、ＭＯＮ‐ＨＴ１４（配列番号：４８）、ＭＯＮ‐ＨＴ１５（配列番号：４９）、ＭＯＮ‐ＨＴ１７（配列番号：５１）、またはＭＯＮ‐ＨＴ１８（配列番号：５２）を保有するダイズ植物が、４倍量で散布した２，４‐Ｄに対してより高い耐性を有していたことを示している。＜２０％の薬害度を有する単一コピー植物の割合に基づいて、ＭＯＮ‐ＨＴ１３またはＭＯＮ‐ＨＴ１７を保有するダイズ植物は、ＭＯＮ‐ＨＴ１、ＭＯＮ‐ＨＴ１４、ＭＯＮ‐ＨＴ１５、またはＭＯＮ‐ＨＴ１８を保有するダイズ植物に比べ、４倍量で散布した２，４‐Ｄに対する耐性がより良好であった。表２１参照。
【表２１】
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【０１２２】
実施例７：合成オーキシン類であるフルロキシピル、トリクロピル、及びＭＣＰＡに対する耐性
ＭＯＮ‐ＨＴ１を保有するトウモロコシ及びダイズ植物の、２，４‐Ｄ、フルロキシピル、トリクロピル、及びＭＣＰＡの散布に対する耐性を測定した。ＭＯＮ‐ＨＴ１及び『Ａ』のＣＴＰを含む３種のユニークな事象のＦ１ハイブリッド・トウモロコシ種子と、Ｒ２ダイズ種子とをポットに植えた。ＮＫ６０３×ＭＯＮ８９０３４を有するハイブリッド・トウモロコシ種子及び植物形質転換に使用したものと同じダイズ生殖質を対照として使用した。温室で植物を栽培し、４本の植物を各処理に使用した。植物が６〜８インチ（ダイズ）及び１０〜１２インチ（トウモロコシ）の高さにあるときに、生育室内で除草剤を植物に噴霧し、最適な生育条件を維持するようにプログラムされた温室に移した。
【０１２３】
ダイズについては、以下の各々の２倍量の除草剤散布量を用いた：（１）２，４‐Ｄアミン４（１６８０ｇ  ａｅ／ｈａ）（２）トリクロピル（８４０ｇ  ａｅ／ｈａ、ＧＡＲＬＯＮ（登録商標））；（３）フルロキシピル（８４０ｇ  ａｅ／ｈａ、Ｓｔａｒａｎｅ（登録商標））；または（４）ＭＣＰＡ（ｇ  ａｅ／ｈａ  １６８０）。以下のトリクロピル、フルロキシピル、またはＭＣＰＡの散布後、ダイズに認められた主要な症候は、重度の壊死及び上偏生長であった。０％〜１００％の評価尺度で、すべての処理について視覚的な植物薬害度評価を行った。ここで、０％は未処理対照と同等の植物を表し、１００％は完全に枯死した植物を表していた。すべての評価は、処理後７日目に行った。３種すべてのダイズＭＯＮ‐ＨＴ１事象の植物は、２，４‐Ｄアミン（２，４‐Ｄ）に対して良好な耐性を示し、対照が９０〜９７％の作物薬害度であったのに対し、平均７％未満の作物薬害度であった。いずれのダイズ事象も、トリクロピルまたはフルロキシピルに対して耐性を示さず、対照の作物薬害度９１％に対し、３種の事象すべてにわたって作物薬害度は平均８１〜９７％であった。３種のダイズ事象の１つはＭＣＰＡに対して弱い耐性を示し、対照の薬害度９０％に対し、平均薬害度は７２％であったが、一方で他の２つの事象の作物薬害度は９０％であった。表２２参照。
【表２２】
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【０１２４】
トウモロコシについては、以下の各々の４倍量の除草剤散布量を用いた：（１）２，４‐Ｄアミン４（３３６０ｇ  ａｅ／ｈａ）（２）トリクロピル（１６８０ｇ  ａｅ／ｈａ、ＧＡＲＬＯＮ（登録商標））；（３）フルロキシピル（１６８０ｇ  ａｅ／ｈａ、Ｓｔａｒａｎｅ（登録商標））；または（４）ＭＣＰＡ（ｇ  ａｅ／ｈａ  ３３６０）。トリクロピル、フルロキシピル、またはＭＣＰＡをトウモロコシに散布した後の主な症候は、倒伏であった。３種すべてのトウモロコシＭＯＮ‐ＨＴ１事象の植物は、２，４‐Ｄに耐性があり、対照の作物薬害度４３％に対し、平均１５％未満の薬害度であった。これら３種のＭＯＮ‐ＨＴ１トウモロコシ事象は、トリクロピルに対してある程度の弱い耐性を示し、対照の作物薬害度４７％に対し、平均２６％〜３７％の作物薬害度を有していた。３種のＭＯＮ‐ＨＴ１トウモロコシ事象は、フルロキシピルに対してある程度の弱い耐性を示し、対照の作物薬害度５５％に対し、平均２０％〜２１％の作物薬害度を有していた。２種のＭＯＮ‐ＨＴ１トウモロコシ事象はＭＣＰＡに対して良好な耐性を示し、対照の作物薬害度３１％に対し、平均６％未満の作物薬害度を有していた。第３のトウモロコシＭＯＮ‐ＨＴ１事象の平均薬害度は２０％であった。表２３参照。トリクロピル及びフルロキシピルに対する弱い耐性ならびにＭＣＰＡに対する良好な耐性というこれらの結果は、精製ＭＯＮ‐ＨＴ１酵素を用いた生体外での酵素データに合致するものであった。
【表２３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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