(57)【要約】  本発明は、新規単鎖インターロイキン−１２ポリペプチドに関する。本発明は、特に、ワクチンアジュバントなどとして免疫系の機能を増強するために本発明の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を使用する方法における、ならびに感染および癌の処置における、この単鎖インターロイキン−１２ポリペプチドをコードする単離された核酸、それらを含むベクターおよび細胞、ならびにそれらの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ．第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）、
ｉｉ．任意選択の第１のペプチドリンカー、
ｉｉｉ．ＩＬ−１２  ｐ３５ドメイン、
ｉｖ．任意選択の第２のペプチドリンカー、および
ｖ．第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）
を含む、単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドであって；
前記第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）は、ｐ４０サブユニットのＮ末端断片であり；前記ＩＬ−１２  ｐ３５ドメインは、成熟ｐ３５サブユニットまたはその断片であり；前記第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）は、ｐ４０サブユニットのＣ末端断片である、単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端側のシグナルペプチドドメインを含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項３】
第１のペプチドリンカーを含まない、第２のペプチドリンカーを含まない、または第１のペプチドリンカーを含まずかつ第２のペプチドリンカーを含まない、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項４】
第１のペプチドリンカーを含まない、第２のペプチドリンカーを含まない、または第１のペプチドリンカーを含まずかつ第２のペプチドリンカーを含まない、請求項２に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１０のアミノ酸２３〜５３３のポリペプチド配列と、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１０のアミノ酸２３〜５３３を含む、請求項５に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１０のポリペプチド配列と、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項９】
前記第１および第２のペプチドリンカーが、各々、
ａ）０アミノ酸；
ｂ）１アミノ酸；
ｃ）２アミノ酸；
ｄ）３アミノ酸；
ｅ）４アミノ酸；
ｆ）５アミノ酸；
ｇ）６アミノ酸；
ｈ）７アミノ酸；
ｉ）８アミノ酸；
ｊ）９アミノ酸；および
ｋ）１０アミノ酸
からなる群より選択されるアミノ酸残基数を含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１０】
前記第１もしくは第２のペプチドリンカーのいずれかまたは両方のペプチドリンカー中のアミノ酸残基が、
ａ）グリシン（Ｇｌｙ）；
ｂ）セリン（Ｓｅｒ）；
ｃ）アラニン（Ａｌａ）；
ｄ）スレオニン（Ｔｈｒ）；および
ｅ）プロリン（Ｐｒｏ）
からなる群より選択される１または複数のアミノ酸の任意の組合せを含む、請求項９に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１１】
前記第１および第２のペプチドリンカーが、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）から選択される、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１２】
ｐ４０Ｎが、配列番号２のアミノ酸１８〜２８８、アミノ酸１８〜２９８、アミノ酸２８〜２８８またはアミノ酸２８〜２９８と、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１３】
ｐ４０Ｎが、配列番号２のポリペプチド配列の断片を含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１４】
ｐ４０Ｎが、配列番号２のポリペプチド配列の断片を含み、前記断片の最初の残基が、
ａ）配列番号２のアミノ酸残基１８；
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１９；
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２０；
ｄ）配列番号２のアミノ酸残基２１；
ｅ）配列番号２のアミノ酸残基２２；
ｆ）配列番号２のアミノ酸残基２３；
ｇ）配列番号２のアミノ酸残基２４；
ｈ）配列番号２のアミノ酸残基２５；
ｉ）配列番号２のアミノ酸残基２６；
ｊ）配列番号２のアミノ酸残基２７；および
ｋ）配列番号２のアミノ酸残基２８
からなる群より選択される位置で始まり、
前記断片の最後の残基が、
ｌ）配列番号２のアミノ酸残基２８８；
ｍ）配列番号２のアミノ酸残基２８９；
ｎ）配列番号２のアミノ酸残基２９０；
ｏ）配列番号２のアミノ酸残基２９１；
ｐ）配列番号２のアミノ酸残基２９２；
ｑ）配列番号２のアミノ酸残基２９３；
ｒ）配列番号２のアミノ酸残基２９４；
ｓ）配列番号２のアミノ酸残基２９５；
ｔ）配列番号２のアミノ酸残基２９６；
ｕ）配列番号２のアミノ酸残基２９７；および
ｖ）配列番号２のアミノ酸残基２９８
からなる群より選択される位置で終わる、請求項１３に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１５】
ｐ３５が、配列番号４のアミノ酸５２〜２４７、アミノ酸５２〜２５３、アミノ酸６２〜２４７またはアミノ酸６２〜２５３と、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１６】
ｐ３５が、配列番号４のポリペプチド配列の断片を含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１７】
ｐ３５が、配列番号４のポリペプチド配列の断片を含み、前記断片の最初の残基が、
ａ）配列番号４のアミノ酸残基５２；
ｂ）配列番号４のアミノ酸残基５３；
ｃ）配列番号４のアミノ酸残基５４；
ｄ）配列番号４のアミノ酸残基５５；
ｅ）配列番号４のアミノ酸残基５６；
ｆ）配列番号４のアミノ酸残基５７；
ｇ）配列番号４のアミノ酸残基５８；
ｈ）配列番号４のアミノ酸残基５９；
ｉ）配列番号４のアミノ酸残基６０；
ｊ）配列番号４のアミノ酸残基６１；および
ｋ）配列番号４のアミノ酸残基６２
からなる群より選択される位置で始まり、
前記断片の最後の残基が、
ｌ）配列番号４のアミノ酸残基２４７；
ｍ）配列番号４のアミノ酸残基２４８；
ｎ）配列番号４のアミノ酸残基２４９；
ｏ）配列番号４のアミノ酸残基２５０；
ｐ）配列番号４のアミノ酸残基２５１；
ｑ）配列番号４のアミノ酸残基２５２；および
ｒ）配列番号４のアミノ酸残基２５３
からなる群より選択される位置で終わる、請求項１６に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１８】
ｐ４０Ｃが、配列番号２のアミノ酸２８９〜３２２、アミノ酸２８９〜３２８、アミノ酸２９９〜３２２またはアミノ酸２９９〜３２８と、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項１９】
ｐ４０Ｃが、配列番号２のポリペプチド配列の断片を含む、請求項１に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項２０】
ｐ４０Ｃが、配列番号２のポリペプチド配列の断片を含み、前記ｐ４０Ｃ断片の最初の残基が、
ａ）配列番号２のアミノ酸残基２８９；
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２９０；
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２９１；
ｄ）配列番号２のアミノ酸残基２９２；
ｅ）配列番号２のアミノ酸残基２９３；
ｆ）配列番号２のアミノ酸残基２９４；
ｇ）配列番号２のアミノ酸残基２９５；
ｈ）配列番号２のアミノ酸残基２９６；
ｉ）配列番号２のアミノ酸残基２９７；
ｊ）配列番号２のアミノ酸残基２９８；および
ｋ）配列番号２のアミノ酸残基２９９
からなる群より選択される位置で始まり、
前記断片の最後の残基が、
ｌ）配列番号２のアミノ酸残基３２２；
ｍ）配列番号２のアミノ酸残基３２３；
ｎ）配列番号２のアミノ酸残基３２４；
ｏ）配列番号２のアミノ酸残基３２５；
ｐ）配列番号２のアミノ酸残基３２６；
ｑ）配列番号２のアミノ酸残基３２７；および
ｒ）配列番号２のアミノ酸残基３２８
からなる群より選択される位置でおいて終わる、請求項１９に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号９のヌクレオチド６７〜１５９９と、少なくとも８０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一な核酸配列を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号９の核酸６７〜１５９９を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２５】
前記単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドの発現を調節することが可能な遺伝子スイッチをさらに含む、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
前記遺伝子スイッチが、ＥｃＲベースの遺伝子スイッチである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた、単離された宿主細胞または非ヒト生物。
【請求項２９】
免疫細胞または幹細胞である、請求項２８に記載の単離された宿主細胞。
【請求項３０】
前記免疫細胞が、樹状細胞、マクロファージ細胞、好中球細胞、肥満細胞、好酸球細胞、好塩基球細胞、ナチュラルキラー細胞またはリンパ球細胞である、請求項２９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項３１】
前記リンパ球細胞がＴ細胞である、請求項３０に記載の単離された宿主細胞。
【請求項３２】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞、子宮内膜幹細胞または胚性幹細胞である、請求項２９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項３３】
前記子宮内膜幹細胞が子宮内膜再生細胞（ＥＲＣ）である、請求項３２に記載の単離された宿主細胞。
【請求項３４】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドの有効量を投与するステップを含む、患者を処置する方法。
【請求項３５】
請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与するステップを含む、患者を処置する方法。
【請求項３６】
請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のベクターの有効量を投与するステップを含む、患者を処置する方法。
【請求項３７】
請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の宿主細胞の有効量を投与するステップを含む、患者を処置する方法。
【請求項３８】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のベクター、または請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の単離された宿主細胞を含む医薬。
【請求項３９】
それを必要とする患者において免疫応答を増強するのに有効な量で投与される、請求項３８に記載の医薬。
【請求項４０】
癌、感染性疾患および免疫系障害からなる群より選択される状態の処置に有用である、請求項３８に記載の医薬。
【請求項４１】
前記癌が、乳房癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳癌、原発性脳癌腫、頭頸部癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌腫、乳房癌腫、卵巣癌腫、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、精巣癌腫、膀胱癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、尿生殖器癌腫、甲状腺癌腫、食道癌腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌腫、腎細胞癌腫、子宮内膜癌腫、副腎皮質癌腫、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌、菌状息肉症、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、ヘアリー細胞白血病、神経芽腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟組織肉腫、中皮腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症および網膜芽細胞腫からなる群より選択される、請求項４０に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表への参照
本出願と共に提出された電子的に提出された配列表（名称：ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：１２７，３２５バイト；作成日：２０１３年１２月１６日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、単鎖インターロイキン−１２融合タンパク質をコードする新規核酸、それらを含むベクター、それらによってコードされるポリペプチド、および治療用途におけるそれらの使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、食作用細胞、Ｂ細胞および活性化された樹状細胞などの免疫系の種々の細胞によって、感染に応答して産生される炎症性サイトカインである（Colombo and Trinchieri (2002), Cytokine & Growth Factor Reviews, 13: 155-168）。ＩＬ−１２は、免疫系の自然アームと適応アームとの相互作用を媒介し、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対して作用し、細胞傷害性リンパ球の増殖および活性、ならびに他の炎症性サイトカイン、特にインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）の産生を増強することにおいて、重要な役割を果たす。
【０００４】
ＩＬ−１２は、腎、結腸および卵巣癌、黒色腫ならびにＴ細胞リンパ腫を含む、広範な種々の癌の処置のための免疫療法剤として（Atkins et al. (1997), Clin. Cancer Res., 3: 409-17；Gollob et al. (2000), Clin. Cancer Res., 6: 1678-92；Hurteau et al. (2001), Gynecol. Oncol., 82: 7-10；およびYoussoufian, et al. (2013) Surgical Oncology Clinics of North America, 22(4): 885-901）、ならびに癌ワクチンのためのアジュバントとして（Lee et al. (2001), J. Clin. Oncol. 19: 3836-47）、ヒト臨床試験において試験されてきた。しかし、ＩＬ−１２は、組換えタンパク質として全身投与される場合、毒性である。Trinchieri, Adv. Immunol. 1998; 70:83-243。その全身毒性を最小化しつつ、ＩＬ−１２の抗腫瘍効果を最大化するために、ＩＬ−１２遺伝子療法アプローチが、腫瘍部位におけるサイトカインの産生を可能にし、それによって、低い血清濃度と共に高い局所レベルのＩＬ−１２を達成するために提唱されている。Qian et al., Cell Research (2006) 16: 182-188；米国特許出願公開第２０１３０１９５８００号。
【０００５】
ＩＬ−１２は、生物学的に活性な７０ｋＤａダイマーを形成するためにジスルフィド架橋によって共有結合されたアルファ鎖（ｐ３５サブユニット）およびベータ鎖（ｐ４０サブユニット）から構成されたヘテロダイマー分子である。２つのサブユニットの同時発現が、生物学的に活性なヘテロダイマーの産生に必要である。組換えＩＬ−１２発現は、単一のベクターからの両方のサブユニットの独立した発現を可能にするために、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列によって分離されたｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットを含むバイシストロン性ベクターを使用して達成されてきた。しかし、ＩＲＥＳ配列の使用は、タンパク質発現を損ない得る。Mizuguchi et al. Mol Ther (2000); 1: 376-382。さらに、ｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットの不均等な発現は、ＩＬ−１２シグナル伝達に対して阻害効果を有し得るホモダイマータンパク質（例えば、ｐ４０−ｐ４０）の形成をもたらし得る。Gillessen et al. Eur. J. Immunol. 1995 Jan;25(1):200-6。
【０００６】
ＩＬ−１２サブユニットのバイシストロン性の発現に対する代替法として、機能的単鎖ＩＬ−１２融合タンパク質は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーまたはＧｌｙ６Ｓｅｒリンカーを用いてｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットを接続することによって、産生されている。Lieschke et al., (1997), Nature Biotechnology 15, 35-40；Lode et al., (1998), PNAS 95, 2475-2480。しかし、より長いリンカー配列は、遺伝子療法のためのウイルスベクターを構築する能力を妨害し得、免疫原性応答を誘導する可能性を増加させ得る（例えば、抗単鎖ＩＬ−１２抗体を生成することによって）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ワクチンアジュバントなどとして免疫系の機能を増強することにおける、ならびに感染および癌の処置における使用のための、改善された単鎖ＩＬ−１２融合タンパク質およびかかる融合タンパク質をコードする核酸が、当該分野で依然必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、新規単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）ポリペプチドであって、存在する場合、リンカー配列の長さは、ＩＬ−１２の少なくとも１つの生物学的活性を保持しつつ、ＩＬ−１２  ｐ４０ポリペプチド配列内にＩＬ−１２  ｐ３５ポリペプチド配列を挿入することによって最小化される、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）ポリペプチドに関する。
【０００９】
本発明は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
（ｉ）第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）、
（ｉｉ）任意選択の第１のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）ＩＬ−１２  ｐ３５ドメイン、
（ｉｖ）任意選択の第２のペプチドリンカー、および
（ｖ）第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）
を含む、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドに関する。
【００１０】
好ましい実施形態では、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、ＩＬ−１２の少なくとも１つの生物学的活性に関する。
【００１１】
本発明はさらに、本明細書に記載されるｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチド、および前記ｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００１２】
本発明は、本明細書に開示されるｓｃＩＬ−１２ポリペプチドと、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する、バリアントｓｃＩＬ−１２ポリペプチドにも関する。
【００１３】
本発明は、本明細書に記載されるｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドまたはベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた、細胞または非ヒト生物にも関する。
【００１４】
本発明は、活性薬剤として、本明細書に記載されるｓｃＩＬ−１２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含む、医薬組成物または診断組成物にも関する。
【００１５】
本発明は、ワクチンアジュバントなどとして免疫系の機能を増強するために、ならびに感染および癌の処置において、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を使用する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｐ４０−ｐ３５単鎖の構成（図１Ａ）、ｐ３５−ｐ４０単鎖の構成（図１Ｂ）およびｐ４０Ｎ−ｐ３５−ｐ４０Ｃ挿入物の構成（図１Ｃ）を示す模式図を示す図である。これらの設計の構築および特徴付けは、実施例において詳細に議論される。
【図２】ｐ７０  ＥＬＩＳＡによって決定された、ヒトｓｃＩＬ−１２設計の発現レベルを示す図である（実施例２を参照のこと）。
【図３】ＥＬＩＳＡによって測定された、ｓｃＩＬ−１２刺激されたＩＦＮ−ガンマ産生を示す図である（実施例３を参照のこと）。
【図４】組換えヒトまたはマウスＩＬ−１２  ｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマーポリペプチドに曝露させたＮＫ９２細胞による、インターフェロン−ガンマ（即ち、「ＩＦＮ−ガンマ」、「ＩＦＮ−ｇ」または「ＩＦＮ−γ」）のｉｎ  ｖｉｔｒｏの用量依存的発現を示す図である（実施例４を参照のこと）。
【図５】ヘテロダイマーＩＬ−１２  ｐ４０／ｐ３５ポリペプチドおよび単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド（ｐ４０Ｎ−ｐ３５−ｐ４０Ｃ単鎖ＩＬ−１２（配列番号１０）を含む）に曝露させたＮＫ９２細胞による、インターフェロン−ガンマのｉｎ  ｖｉｔｒｏの用量依存的発現を示す図である；（実施例５を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを有利に提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ワクチンアジュバントなどとして宿主の免疫応答を増強する方法において、ならびに癌などの増殖性障害、感染性疾患および免疫系障害の処置において、有用である。
【００１８】
本発明の種々の態様は、本発明の核酸、ポリペプチド、ベクター、組成物、抗体および使用の方法に関して、以下のセクションにおいてさらに詳細に示される。種々のセクションへのこの組織化は、本発明の理解を容易にすることを意図しており、その限定を決して意図しない。
【００１９】
定義
以下に定義される用語は、本明細書を通じて使用され、本発明の範囲および実施を理解することにおいて有用であるはずである。
【００２０】
具体的な一実施形態では、用語「約」または「およそ」とは、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内、なおより好ましくは１％以内を意味する。
【００２１】
用語「実質的に含まない」とは、組成物中のタンパク質、ＤＮＡ、ベクターの少なくとも約７５重量％が、（ＡおよびＢが属する種のカテゴリーに依存して）「Ａ」である場合に、「Ａ」を含む組成物（ここで、「Ａ」は、単一のタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター、組換え宿主細胞などである）が、「Ｂ」（ここで、「Ｂ」は、１または複数の混入するタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクターなどを含む）を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、「Ａ」は、組成物中のＡ＋Ｂ種の少なくとも約９０重量％、最も好ましくは少なくとも約９９重量％を構成する。混入を実質的に含まない組成物は、目的の種の活性または特徴を有する単一分子量種のみを含むこともまた、好ましい。
【００２２】
本発明の目的のために、用語「単離された」は、その元の環境（それが天然に存在する環境）から取り出されている、生物学的材料（核酸またはタンパク質）を指定する。例えば、植物または動物中に天然状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されていないが、それが天然に存在する隣接核酸から分離された同じポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされる。用語「精製された」は、その材料が、他の化合物の存在を除外した絶対純度を示す形態で存在することを必要としない。これはむしろ、相対的な定義である。
【００２３】
ポリヌクレオチドは、出発材料または天然の材料の精製後、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、好ましくは４または５桁「精製された」状態である。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「実質的に純粋な」は、そのネイティブの混入物から分離されたポリペプチドまたは他の材料を記述する。典型的には、モノマーポリペプチドは、サンプルの少なくとも約６０〜７５％が単一のポリペプチド骨格を示す場合、実質的に純粋である。微量バリアントまたは化学的改変は、典型的には、同じポリペプチド配列を共有する。通常、実質的に純粋なポリペプチドは、ポリペプチドサンプルの約８５〜９０％よりも多くを構成し、好ましくは、約９９％を超えて純粋である。通常、純度は、ポリアクリルアミドゲル上で測定され、均一性は、染色によって決定される。あるいは、特定の目的のために、高い分解能が必要であり、ＨＰＬＣまたは精製のための類似の手段が使用される。ほとんどの目的のために、単純なクロマトグラフィーカラムまたはポリアクリルアミドゲルが、純度を決定するために使用される。
【００２５】
用語「天然に関連する宿主細胞成分を実質的に含まない」は、その天然の宿主細胞状態においてそれに付随するネイティブの混入物から分離された、ポリペプチドまたは他の材料を記述する。従って、化学合成された、またはそれが天然に起源する宿主細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然に関連する宿主細胞成分を含まない。
【００２６】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書で互換的に使用されており、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合されたサブユニットから構成されるポリマー性化合物を指す。核酸には、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれ、これらは共に、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡが含まれるがこれらに限定されない。ＤＮＡは、直鎖状、環状またはスーパーコイルであり得る。
【００２７】
「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンもしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー性形態、あるいは一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかの、ホスホロチオエートおよびチオエステルなどのその任意のホスホエステルアナログを指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。用語、核酸分子、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次構造および二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態に分子を限定しない。従って、この用語には、とりわけ、直鎖状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミドおよび染色体において見出される二本鎖ＤＮＡが含まれるがこれに限定されない。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（即ち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向で、その配列のみを与える通常の慣習に従って、本明細書に記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００２８】
用語「断片」は、参照核酸と比較して低減された長さの、共通部分にわたって参照核酸と同一なヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明に係るかかる核酸断片は、必要に応じて、それが構成要素であるより大きいポリヌクレオチド中に含まれ得る。かかる断片は、長さが、本発明に係る核酸の少なくとも６〜１５００連続するヌクレオチドの範囲であるオリゴヌクレオチドを含むまたはこれからなる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「単離された核酸断片」は、合成の、非天然のまたは変更されたヌクレオチド塩基を任意選択で含む、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１または複数のセグメントから構成され得る。
【００３０】
「遺伝子」とは、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリを指し、これには、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸が含まれる。「遺伝子」とは、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）およびコード配列の後ろの調節配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質またはポリペプチドを発現する核酸断片もまた指す。「ネイティブ遺伝子」とは、それ自体の調節配列を有する、天然において見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見出されない調節配列および／またはコード配列を含む、ネイティブ遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源由来の調節配列およびコード配列、または同じ供給源由来であるが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された、調節配列およびコード配列を含み得る。キメラ遺伝子は、異なる供給源由来のコード配列および／または異なる供給源由来の調節配列を含み得る。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその天然の位置に存在するネイティブ遺伝子を指す。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物において通常は見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非ネイティブの生物中に挿入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
【００３１】
「異種」ＤＮＡとは、細胞中に、または細胞の染色体部位中には天然には位置しない、ＤＮＡを指す。好ましくは、この異種ＤＮＡは、細胞にとって外来の遺伝子を含む。
【００３２】
用語「ゲノム」は、染色体、ならびにミトコンドリア、葉緑およびウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００３３】
核酸分子は、一本鎖形態の核酸分子が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（以下のSambrook et al., 1989を参照のこと）。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)、特に、その中のChapter 11およびTable 11.1（参照により全体が本明細書に組み込まれる）中に示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００３４】
ストリンジェンシー条件は、遠く関連する生物由来の相同配列などの中程度に類似の断片から、密接に関連する生物由来の機能的酵素を重複させる遺伝子などの高度に類似の断片までについて、スクリーニングするために調整され得る。相同核酸についての予備的スクリーニングのために、５５℃のＴｍに対応する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、ホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）が、使用され得る。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。
【００３５】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である。用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンは、チミンに対して相補的であり、シトシンは、グアニンに対して相補的である。従って、本発明は、本明細書で開示または使用される完全配列に対して相補的な、単離された核酸断片、ならびに実質的に類似の核酸配列もまた含む。
【００３６】
本発明の具体的な一実施形態では、ポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍにおけるハイブリダイゼーションステップを含むハイブリダイゼーション条件を使用し、上に示したような条件を利用することによって、検出される。特定の実施形態では、このＴｍは、６０℃、６３℃または６５℃である。
【００３７】
ハイブリダイゼーション後の洗浄もまた、ストリンジェンシー条件を決定する。特定の実施形態では、このハイブリダイゼーション条件は、室温で１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで開始し、次いで、４５℃で３０分間の２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの反復、および次いで、５０℃で３０分間の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回の反復による、一連の洗浄を使用する。よりストリンジェントなセットの条件は、より高い温度を使用し、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分間の洗浄の温度が６０℃に増加されることを除いて、洗浄は上記と同一である。高度にストリンジェントなセットの条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃における２回の最終洗浄を使用する。
【００３８】
核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当該分野で周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きくなるほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長よりも長いハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための方程式が導出されている（Sambrook et al.,上記, 9.50-0.51を参照のこと）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置が、より重要になり、オリゴヌクレオチドの長さが、その特異性を決定する（Sambrook et al.,上記, 11.7-11.8を参照のこと）。
【００３９】
ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の全面的な欠如よりも選択的なハイブリダイゼーションが起こる場合に、存在する。典型的には、少なくとも約１４／２５ヌクレオチドのストレッチにわたる少なくとも約５５％の相同性、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性が存在する場合に、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。参照によって本明細書に組み込まれる、Kanehisa,M. (1984), Nucleic Acids Res. 12:203-213を参照のこと。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満の塩濃度、より通常は約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。温度条件は、典型的には、２０セルシウス度よりも高く、より通常は約３０セルシウス度よりも高く、好ましくは約３７セルシウス度を超える。とりわけ、塩基組成および相補鎖のサイズ、有機溶媒の存在、ならびに塩基ミスマッチの程度を含む他の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに顕著に影響を与え得るので、パラメーターの組合せは、いずれか１つの絶対的尺度よりも重要である。
【００４０】
本発明の具体的な一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７セルシウス度におけるハイブリダイゼーションステップ、ならびに少なくとも６３セルシウス度での２×ＳＳＰＥ中での洗浄ステップを含むハイブリダイゼーション条件を使用することによって、検出される。特定の一実施形態では、これらのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションステップのために、２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７セルシウス度を含む。別の一実施形態では、これらのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションステップおよび洗浄ステップの両方のために、２×ＳＳＰＥおよび６３セルシウス度を含む。
【００４１】
一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸についての好ましい最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド；より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり；なおより好ましくは、この長さは、少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度が、プローブの長さなどの因子に従って、必要に応じて調整され得ることを認識する。
【００４２】
用語「プローブ」とは、相補的一本鎖標的核酸と塩基対合して二本鎖分子を形成し得る、一本鎖核酸分子を指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な、一般には少なくとも１８ヌクレオチドの、核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、またはビオチンなどの標識が共有結合によりコンジュゲート化されたヌクレオチドによって、標識され得る。標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。オリゴヌクレオチド（その一方または両方が標識され得る）は、核酸の全長もしくは断片をクローニングするため、または核酸の存在を検出するためのいずれかのために、ＰＣＲプライマーとして使用され得る。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子と共に三重らせんを形成するためにも使用され得る。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸合成機で、合成により調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、天然に存在しないホスホエステルのアナログ結合、例えば、チオエステル結合などを用いて調製され得る。
【００４４】
「プライマー」は、標的核酸配列にハイブリダイズして、適切な条件下でのＤＮＡ合成のための開始点として機能し得る二本鎖核酸領域を創出する、オリゴヌクレオチドである。かかるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において使用され得る。
【００４５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと略称され、特定の核酸配列を酵素的に増幅するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を意味する。ＰＣＲには、各サイクルが３つの段階を有する、一連の反復する温度サイクルが関与する：標的分子の鎖を分離するための、鋳型核酸の変性、鋳型核酸への一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニールしたプライマー（複数可）の伸長。ＰＣＲは、標的分子の存在を検出するための手段、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内の標的分子の相対的量を決定するための手段を提供する。
【００４６】
「逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＲＴ−ＰＣＲと略称され、ＲＮＡ分子（単数または複数）から標的ｃＤＮＡ分子（単数または複数）を酵素的に産生し、その後、上記のように標的ｃＤＮＡ分子（単数または複数）内の特定の核酸配列（単数または複数）を酵素的に増幅するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を意味する。ＲＴ−ＰＣＲもまた、標的分子の存在を検出するための手段、および定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内の標的分子の相対的量を決定するための手段を提供する。
【００４７】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置いた場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞においてポリペプチドへと転写および翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列（５’非コード配列）、コード配列内に位置するヌクレオチド配列、またはコード配列の下流に位置するヌクレオチド配列（３’非コード配列）を指し、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響する。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が含まれ得るがこれらに限定されない。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物配列、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列およびさらには合成ＤＮＡ配列が含まれ得るがこれらに限定されない。コード配列が真核生物細胞における発現のために意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が、通常、コード配列に対して３’側に位置する。
【００４８】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略称され、翻訳開始シグナルまたは開始コドン、例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧ、および終結コドンを含み、ポリペプチド配列へと潜在的に翻訳され得る、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸配列の長さを意味する。
【００４９】
用語「頭−頭」は、互いに対する２つのポリヌクレオチド配列の配向を記述するために本明細書で使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が、他方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端に隣接する場合、頭−頭の配向で位置付けられ、それによって、各ポリヌクレオチドの転写の方向は、他方のポリヌクレオチドの５’末端から離れて進行する。用語「頭−頭」は、（５’）−（５’）と略称される場合もあり、記号（←→）または（３’←５’５’→３’）と示される場合もある。
【００５０】
用語「尾−尾」は、互いに対する２つのポリヌクレオチド配列の配向を記述するために本明細書で使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端が、他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接する場合、尾−尾の配向で位置付けられ、それによって、各ポリヌクレオチドの転写の方向は、他方のポリヌクレオチドに向かって進行する。用語「尾−尾」は、（３’）−（３’）と略称される場合もあり、記号（→←）または（５’→３’３’←５’）と示される場合もある。
【００５１】
用語「頭−尾」は、互いに対する２つのポリヌクレオチド配列の配向を記述するために本明細書で使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が、他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接する場合、頭−尾配向で位置付けられ、それによって、各ポリヌクレオチドの転写の方向は、他方のポリヌクレオチドの転写の方向と同じ方向で進行する。用語「頭−尾」は、（５’）−（３’）と略称される場合もあり、記号（→→）または（５’→３’５’→３’）と示される場合もある。
【００５２】
用語「下流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、下流のヌクレオチド配列は、一般に、転写の出発点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。
【００５３】
用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、上流のヌクレオチド配列は、一般に、コード配列または転写の出発点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写の開始部位の上流に位置する。
【００５４】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列内で結合および切断する酵素を指す。
【００５５】
「相同組換え」とは、別のＤＮＡ分子中への外来ＤＮＡ配列の挿入、例えば、染色体中のベクターの挿入を指す。好ましくは、このベクターは、相同組換えのために特定の染色体部位を標的化する。特異的相同組換えのために、このベクターは、ベクターの相補的結合および染色体中への取り込みを可能にするために、染色体の配列に対する相同性の十分に長い領域を含む。相同性のより長い領域、およびより高い程度の配列類似性は、相同組換えの効率を増加させ得る。
【００５６】
当該分野で公知の多くの方法が、本発明に係るポリヌクレオチドを増やすために使用され得る。適切な宿主系および増殖条件が一旦確立されると、組換え発現ベクターは、多量に増やされ調製され得る。本明細書に記載するように、使用され得る発現ベクターには、以下のベクターまたはそれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない：数例挙げると、ヒトまたは動物ウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；昆虫ウイルス、例えば、バキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）；ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
【００５７】
「ベクター」は、核酸のクローニングおよび／または宿主細胞中への移入のための任意の手段である。ベクターは、取り付けられたセグメントの複製が起こるように別のＤＮＡセグメントを取り付けることができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、即ち、それ自体の制御下で複製が可能な、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞中に核酸を導入するための、ウイルス手段および非ウイルス手段の両方が含まれる。当該分野で公知の多数のベクターは、核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子中に取り込むなどのために使用され得る。可能なベクターには、プラスミド、または例えば、ラムダ誘導体などのバクテリオファージを含む改変されたウイルス、あるいはプラスミド、例えばｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。例えば、応答エレメントおよびプロモーターに対応するＤＮＡ断片の、適切なベクター中への挿入は、相補的付着末端を有する選択されたベクター中に適切なＤＮＡ断片をライゲーションすることによって、達成され得る。あるいは、ＤＮＡ分子の末端が、酵素的に改変され得、または任意の部位が、ＤＮＡ末端中にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることによって、産生され得る。かかるベクターは、細胞ゲノム中にマーカーを取り込んだ細胞の選択を提供する、選択可能なマーカー遺伝子を含むように操作され得る。かかるマーカーは、マーカーによってコードされるタンパク質を取り込みおよび発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。
【００５８】
ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、細胞、ならびに生きた動物対象において、広範な種々の遺伝子送達用途において使用されている。使用され得るウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン・バー、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカリモウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン（cytofectin））、ＤＮＡ−タンパク質複合体およびバイオポリマーが含まれるがこれらに限定されない。核酸に加えて、ベクターは、１または複数の、調節領域、ならびに／または核酸移入結果（いずれかの組織への移入、発現の持続時間など）を選択、測定およびモニタリングするのに有用な選択可能なマーカーもまた、含み得る。
【００５９】
用語「プラスミド」とは、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有する場合が多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外エレメントを指す。かかるエレメントは、直鎖状、環状またはスーパーコイルの、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、任意の供給源由来の、自律的に複製する配列、ゲノムに統合される配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得、プラスミドにおいて、いくつかのヌクレオチド配列は、適切な３’非翻訳配列と共に、プロモーター断片および選択された遺伝子産物についてのＤＮＡ配列を細胞中に導入することが可能な独自の構築へと、接続または組み換えられる。
【００６０】
「クローニングベクター」は、取り付けられたセグメントの複製が起こるように別の核酸セグメントを取り付けることができる「レプリコン」であり、連続的に複製し、複製起点を含む、単位長さの核酸、好ましくはＤＮＡ、例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドである。クローニングベクターは、１つの細胞型において複製が可能であり得、別の細胞型において発現が可能であり得る（「シャトルベクター」）。
【００６１】
ベクターは、当該分野で公知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、微粒子銃、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターによって、所望の宿主細胞中に導入され得る（例えば、Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967；Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624；およびＨａｒｔｍｕｔら、カナダ特許出願第２，０１２，３１１号、１９９０年３月１５日出願を参照のこと）。
【００６２】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、リポフェクションによってｉｎ  ｖｉｖｏで導入され得る。過去十年間にわたり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの核酸のカプセル封入およびトランスフェクションのためのリポソームの使用は、漸増してきた。リポソーム媒介性のトランスフェクションで遭遇する困難および危険を制限するために設計された合成カチオン性脂質が、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Felgner et al., 1987.  PNAS 84:7413；Mackey, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031；およびUlmer et al., 1993. Science 259:1745-1748）。カチオン性脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル封入を促進し得、負に荷電した細胞膜との融合もまた促進し得る（Felgner and Ringold, 1989. Science 337:387-388）。核酸の移入のために特に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許出願公開ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の器官中に外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実務的利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的化は、利益になる１つの領域を示す。トランスフェクションを特定の細胞型に指示することは、細胞不均一性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓および脳において特に好ましいことが明らかである。脂質は、標的化の目的のために、他の分子と化学的にカップリングされ得る（Mackey, et al., 1988, 上記）。標的化されたペプチド、例えばホルモンもしくは神経伝達物質、およびタンパク質、例えば抗体、または非ペプチド分子が、リポソームに化学的にカップリングされ得る。
【００６３】
カチオン性オリゴペプチド（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８）またはカチオン性ポリマー（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）などの他の分子もまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸のトランスフェクションを促進するために有用である。
【００６４】
ネイキッドＤＮＡプラスミドとして、ベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで導入することもまた可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号を参照のこと）。受容体媒介性のＤＮＡ送達アプローチもまた使用され得る（Curiel et al., 1992. Hum. Gene Ther. 3:147-154；およびWu and Wu, 1987. J. Biol. Chem. 262:4429-4432）。
【００６５】
用語「トランスフェクション」とは、細胞による外因性または異種のＲＮＡまたはＤＮＡの組込みを意味する。細胞は、外因性または異種のＲＮＡまたはＤＮＡが細胞の内側に導入されている場合、かかるＲＮＡまたはＤＮＡによって「トランスフェクト」されている。細胞は、トランスフェクトされた外因性または異種のＲＮＡまたはＤＮＡが表現型変化をもたらす場合、かかるＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換するＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に統合（共有結合）されてもよい。
【００６６】
「形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝を生じる、宿主生物のゲノム中への核酸分子の移入を指す。形質転換された核酸分子を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。
【００６７】
用語「遺伝子領域」は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、核酸分子またはヌクレオチド配列の領域を指す。
【００６８】
さらに、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、１または複数の、それらの増幅もしくはそれらの発現が求められる細胞性宿主における複製起点、マーカーまたは選択可能なマーカーを含み得る。
【００６９】
用語「選択可能なマーカー」とは、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択され得る識別因子、通常は抗生物質または化学物質耐性遺伝子を意味し、この効果は、目的の核酸の遺伝を追跡するため、および／または目的の核酸を受け継いだ細胞もしくは生物を同定するために使用される。当該分野で公知であり使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、以下：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；ならびに表現型マーカーとして使用される遺伝子、即ち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが含まれるがこれらに限定されない。選択可能なマーカー遺伝子もまた、レポーター遺伝子とみなされ得る。
【００７０】
用語「レポーター遺伝子」とは、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定され得る識別因子をコードする核酸を意味し、この効果は、目的の核酸の遺伝を追跡するため、目的の核酸を受け継いだ細胞もしくは生物を同定するため、および／または遺伝子の発現誘導もしくは転写を測定するために使用される。当業者で公知であり使用されるレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが含まれるがこれらに限定されない。
【００７１】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターは、ネイティブ遺伝子にその全体が由来し得、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成され得る、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含み得る。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階において、または異なる環境条件もしくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示できることが、当業者に理解される。ほとんどの時点においてほとんどの細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。特定の発生段階または細胞分化の段階において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。そのプロモーターを誘導する薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理後に誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「誘導性プロモーター」または「調節可能なプロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に規定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
【００７２】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合することが可能であり、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることが可能である、ＤＮＡ調節領域である。本発明を定義することを目的として、このプロモーター配列は、その３’末端において転写開始部位と境界を接し、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように、上流（５’方向）に伸びる。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることによって簡便に定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００７３】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、このｍＲＮＡが、トランス−ＲＮＡスプライスされ（コード配列がイントロンを含む場合）、コード配列によってコードされるタンパク質へと翻訳される場合、細胞において転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００７４】
「転写制御配列および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。真核生物細胞では、ポリアデニル化シグナルは、制御配列である。
【００７５】
用語「応答エレメント」とは、第１のキメラ遺伝子のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を介して媒介される、プロモーターに応答性を付与する、１または複数のシス作用性ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントは、その配列中の回文構造（完全もしくは不完全）である、または変動する数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフもしくはハーフサイトから構成される、のいずれかであり得る。これらのハーフサイトは、類似もしくは同一であり得、直列反復もしくは逆方向反復として、または単一のハーフサイトもしくは隣接ハーフサイトのタンデムのマルチマーとして、配置され得る。この応答エレメントは、応答エレメントが取り込まれる細胞または生物の性質に依存して、異なる生物から単離されたミニマルプロモーターを含み得る。第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの非存在下または存在下で、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合して、この応答エレメントの調節下にある下流の遺伝子（複数可）の転写を開始または抑制する。
【００７６】
用語「作動可能に連結された」とは、他方によって一方の機能が影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の配列に影響を与えることが可能である（即ち、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００７７】
用語「発現」とは、本明細書で使用する場合、核酸またはポリヌクレオチド由来のセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現は、タンパク質またはポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳もまた指し得る。
【００７８】
用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」とは、特定の制限部位において、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチド中に挿入され得る、ＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のために適切なリーディングフレームでのカセットの挿入を確実にするために設計される。「形質転換カセット」とは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する、特定のベクターを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットは、宿主細胞における目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能にするエレメントもまた含み得る。これらのエレメントには、以下が含まれ得るがこれらに限定されない：プロモーター、ミニマルプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列など。
【００７９】
用語「モジュレートする（modulate）」および「モジュレートする（modulates）」とは、核酸または遺伝子の発現を誘導、低減または阻害して、タンパク質またはポリペプチドの産生のそれぞれの誘導、低減または阻害を生じることを意味する。
【００８０】
本発明に係るプラスミドまたはベクターは、宿主細胞において遺伝子の発現を駆動するために適切な少なくとも１つのプロモーターをさらに含み得る。用語「発現ベクター」とは、宿主中への形質転換後に挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計された、ベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味する。クローニングされた遺伝子、即ち、挿入された核酸配列は、通常、制御エレメント、例えば、プロモーター、ミニマルプロモーター、エンハンサーなどの制御下に配置される。所望の宿主細胞において核酸の発現を駆動するために有用な開始制御領域またはプロモーターは、多数であり、当業者に知られている。以下が含まれるがこれらに限定されない、これらの遺伝子を駆動することが可能な事実上任意のプロモーターが、本発明にとって適切である：ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節されるプロモーター；ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、アルカリホスファターゼプロモーター（サッカロマイセス属（Saccharomyces）における発現に有用）；ＡＯＸ１プロモーター（ピキア属（Pichia）における発現に有用）；ｂ−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーター（大腸菌（Escherichia coli）における発現に有用）；光調節される、種子特異的、花粉特異的、卵巣特異的、病理発生もしくは疾患関連、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ  ３５Ｓミニマル、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ悍状ウイルス（rice tungro bacilliform virus）、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸レダクターゼ、マンノパインシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現に有用）；当該分野で公知の動物および哺乳動物プロモーターには、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末端反復配列（ＬＴＲ）中に含まれるプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａもしくは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターの調節配列および転写制御領域、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、���ラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ因子などの）治療遺伝子のプロモーター、病理発生または疾患関連プロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されてきたプロモーター、例えば、膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域；アルブミン遺伝子、肝臓において活性なＡｐｏ  ＡＩおよびＡｐｏ  ＡＩＩ制御領域、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳中のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質（fatty acid binding intestinal protein）のプロモーター、平滑筋細胞α−アクチンのプロモーター、など。さらに、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列の付加などによって改変され得る。
【００８１】
本発明の実施形態において使用され得るエンハンサーには、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなど。
【００８２】
終結制御領域、即ち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列もまた、好ましい宿主にとってネイティブの種々の遺伝子から誘導され得る。任意選択で、終結部位が不必要であり得るが、含まれる場合が最も好ましい。本発明の特定の実施形態では、この終結制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列などを含み得るか、またはこれらから誘導され得る。
【００８３】
用語「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、コード配列の下流（３’側）に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含み得る。このポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を与えることを特徴とする。
【００８４】
「調節領域」とは、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、特定の核酸を発現することを天然に担う配列（相同領域）を含み得るか、または異なるタンパク質もしくはさらには合成タンパク質を発現することを担う異なる起源の配列（異種領域）を含み得る。特に、これらの配列は、原核生物遺伝子、真核生物遺伝子もしくはウイルス遺伝子の配列、または特異的様式もしくは非特異的様式で、および誘導性もしくは非誘導性の様式で遺伝子の転写を刺激もしくは抑制する、誘導された配列であり得る。調節領域には、複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、および標的細胞の分泌経路中にポリペプチドを指示するシグナル配列が含まれるがこれらに限定されない。
【００８５】
「異種供給源」由来の調節領域は、発現された核酸と天然には関連しない調節領域である。異種調節領域には、異なる種由来の調節領域、異なる遺伝子由来の調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然には存在しないが当業者によって設計される調節配列が含まれるがこれらに限定されない。
【００８６】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒された転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、これは、一次転写物と呼ばれるか、または一次転写物の転写後プロセシングから誘導されたＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを有さない、細胞によってタンパク質へと翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、このｍＲＮＡから誘導される、二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、従って、細胞によってタンパク質へと翻訳され得る、ＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全てまたは一部と相補的であり、標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物を指す。特定の遺伝子転写物の任意の一部との、即ち、５’非コード配列、３’非コード配列またはコード配列におけるアンチセンスＲＮＡの相補性が、存在し得る。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳はされないが細胞性プロセスに対して影響を有する他のＲＮＡを指す。
【００８７】
「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基から構成されるポリマー性化合物である。アミノ酸は、以下の一般構造を有する：
【００８８】
【化１】
2017501712.tif 000002
【００８９】
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて、以下の７つの群に分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性基もしくはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香環を含む側鎖、および（７）側鎖がアミノ基に融合されたイミノ酸、プロリン。本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４アミノ酸を含む。
【００９０】
「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」は、その天然状態でそれらと通常関連する化合物（例えば、他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まない、ポリペプチドまたはタンパク質である。「単離された」とは、他の化合物との人工混合物もしくは合成混合物、または生物学的活性を妨害しない、例えば不完全な精製、安定剤の添加もしくは薬学的に許容される調製物中への配合に起因して存在し得る不純物の存在を排除する意味ではない。
【００９１】
本発明に係るポリペプチドの「断片」は、そのアミノ酸配列が参照ポリペプチドのアミノ酸配列よりも短く、全部分にわたって、これらの参照ポリペプチドと同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを意味すると理解される。かかる断片は、必要に応じて、それらがその一部であるより大きいポリペプチド中に含まれ得る。本発明に係るポリペプチドのかかる断片は、少なくとも２〜３００アミノ酸の長さを有し得る。
【００９２】
「異種タンパク質」とは、細胞中で天然には産生されないタンパク質を指す。
【００９３】
「成熟タンパク質」とは、翻訳後プロセシングされたポリペプチド；即ち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されたもの、を指す。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物；即ち、プレペプチドおよびプロペプチドがなお存在するもの、を指す。プレペプチドおよびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであり得るが、これらに限定されない。
【００９４】
用語「シグナルペプチド」とは、分泌された成熟タンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドを指す。このシグナルペプチドは、成熟タンパク質から切断され、従って成熟タンパク質中には存在しない。シグナルペプチドは、分泌されたタンパク質を、細胞膜を横切って指示および転位させる機能を有する。シグナルペプチドは、シグナルタンパク質とも呼ばれる。
【００９５】
「シグナル配列」は、細胞の表面上で発現されるタンパク質のコード配列の最初の部分において含まれる。この配列は、宿主細胞にポリペプチドを転位させるように指示する、成熟ポリペプチドに対してＮ末端側のシグナルペプチドをコードする。用語「転位シグナル配列」は、この種類のシグナル配列を指すために本明細書で使用される。真核生物および原核生物にとってネイティブの種々のタンパク質に関連する転位シグナル配列を見出してもよく、両方の型の生物において機能的な場合が多い。
【００９６】
用語「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分間の同一性のパーセントを指す。１つの部分から別の部分への配列間の対応関係は、当該分野に公知の技術によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報をアラインさせ、容易に入手可能なコンピュータープログラムを使用することによる、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定され得る。あるいは、相同性は、相同な領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、その後の、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化および消化された断片のサイズ決定とによって、決定され得る。
【００９７】
本明細書で使用する場合、その全ての文法的形態および綴りのバリエーションにおける、用語「相同な」とは、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）由来のタンパク質を含む、「共通の進化上の起源」を有するタンパク質と、異なる種由来の相同なタンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）との間の関連性を指す（Reeck et al., 1987, Cell 50:667.）。かかるタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、それらの高い程度の配列類似性に反映されるような、配列相同性を有する。しかし、一般的用法および本出願では、用語「相同な」とは、「高度に」などの副詞で修飾される場合、共通の進化上の起源ではなく、配列の類似性を指し得る。
【００９８】
従って、その全ての文法的形態における用語「配列類似性」とは、共通の進化上の起源を共有してもしなくてもよい、核酸またはタンパク質のアミノ酸配列間の同一性または対応関係の程度を指す（Reeck et al., 1987, Cell 50:667を参照のこと）。
【００９９】
具体的な一実施形態では、２つのＤＮＡ配列は、それらのＤＮＡ配列の規定された長さにわたり、ヌクレオチドの少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）がマッチする場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。
【０１００】
実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを使用して配列を比較することによって、または特定の系について規定されるようなストリンジェントな条件下などでのサザンハイブリダイゼーション実験において、同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の技術範囲内である。例えば、Sambrook et al., 1989、上記を参照のこと。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「実質的に類似」とは、１または複数のヌクレオチド塩基における変化が、１または複数のアミノ酸の置換を生じるが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の機能的特性には影響を与えない、核酸断片を指す。「実質的に類似」とはまた、１または複数のヌクレオチド塩基における変化が、アンチセンスまたは共抑制（co-suppression）テクノロジーによる遺伝子発現の変更を媒介する核酸断片の能力に影響を与えない、核酸断片を指す。「実質的に類似」とはまた、本発明の核酸断片の改変、例えば、得られた転写物の機能的特性に実質的に影響を与えない１または複数のヌクレオチド塩基の欠失または挿入を指す。従って、本発明は、具体的な例示的配列以上のものを包含すると理解される。提唱された改変の各々は、コードされた産物の生物学的活性の保持の決定と同様、十分に当業者の技術範囲内である。
【０１０２】
さらに、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似の配列が、本明細書に例示される配列と、ストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、その後の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄）下でハイブリダイズするそれらの能力によっても規定されることを認識している。本発明の実質的に類似の核酸断片は、そのＤＮＡ配列が本明細書で報告された核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一な核酸断片である。本発明の実質的に類似の核酸断片には、そのＤＮＡ配列が本明細書で報告された核酸断片のＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一な核酸断片が含まれる。特定の実施形態では、核酸断片は、本明細書で報告された核酸断片のＤＮＡ配列と、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。特定の実施形態では、本発明の実質的に類似のヌクレオチド配列は、本明細書に記載される特定のポリヌクレオチド配列と比較して存在するヌクレオチド配列中のいずれの差異にもかかわらず、本出願に記載される任意のポリペプチド配列（例えば、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチド）をコードし得る。
【０１０３】
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の約４０％超が同一であるか、または６０％超が類似（機能的に同一）である場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同な配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを使用するアラインメントによって同定される。
【０１０４】
用語「〜に対応する」は、正確な位置が、類似性または相同性が測定される分子と同一であるか異なるかに関わらず、類似または相同な配列を指すために、本明細書で使用される。核酸またはアミノ酸の配列アラインメントは、スペースを含み得る。従って、用語「〜に対応する」とは、配列類似性を指し、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを指すわけではない。
【０１０５】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価によって、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照のこと）などのアルゴリズムを使用したコンピューターで自動化した配列の比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定により同定するために十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、１０以上連続するアミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が、既知のタンパク質または遺伝子と相同なポリペプチドまたは核酸配列を推定により同定するために必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、２０〜３０連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが、遺伝子の同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の配列依存的方法において使用され得る。さらに、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドが、これらのプライマーを含む特定の核酸断片を取得するために、ＰＣＲにおいて増幅プライマーとして使用され得る。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。
【０１０６】
用語「パーセント同一性」は、当該分野で公知のように、これらの配列を比較することによって決定される、２以上のポリペプチド配列間または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係性である。当該分野では、「同一性」とは、場合によってかかる配列のストリング間のマッチによって決定され得る、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度もまた意味する。「同一性」および「類似性」は、以下に記載されるものが含まれるがそれらに限定されない公知の方法によって容易に計算され得る：Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing:  Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)；およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)。同一性を決定するための好ましい方法は、試験した配列間で最良のマッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムにおいて成文化される。配列のアラインメントおよびパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して実施され得る。配列のマルチプルアラインメントは、デフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）と共にＣｌｕｓｔａｌ法のアラインメント（Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153）を使用して実施され得る。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーターが選択され得る：ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５。
【０１０７】
用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販され得るか、または独立して開発され得る。典型的な配列分析ソフトウェアは、ＧＣＧスイートのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本出願の文脈内で、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、その分析の結果は、特記しない限り、参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化したときにソフトウェアに元々ロードされた値またはパラメーターの任意のセットを意味する。
【０１０８】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルされ得る。これらの構成単位は、遺伝子全体を構築するために次いで酵素的にアセンブルされる遺伝子セグメントを形成するために、ライゲーションおよびアニールされる。「化学合成された」とは、ＤＮＡの配列に関する場合、成分ヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルされたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は、十分確立された手順を使用して達成され得、または自動化された化学合成は、いくつかの市販の機械のうち１つを使用して実施され得る。従って、これらの遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するためのヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整され得る。当業者は、宿主によって好まれるコドンに向けたバイアスがコドン用法にかかっている場合の、首尾よい遺伝子発現の可能性を理解している。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づき得る。コドンバイアスを反映するための最適化の代わりに、またはそれに加えて、最適化は、特定の宿主細胞に基づくヌクレオチド配列の最適化もまた含み得、ここで、最適化は、転写の速度または量、転写物半減期、および翻訳の速度または量を最大化するために実施される。かかる最適化は、特定の宿主細胞に基づく経験的決定を介して実施され得る。
【０１０９】
用語「遺伝子スイッチ」とは、プロモーターと関連する応答エレメントと、１または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが作動可能に関連した遺伝子の発現をモジュレートするリガンド依存的転写因子ベースの系との組合せを指す。用語「遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド」とは、プロモーターと関連する応答エレメントと、１または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが作動可能に関連した遺伝子の発現をモジュレートするリガンド依存的転写因子ベースの系をコードするポリヌクレオチドとの組合せを指す。
【０１１０】
用語「ＩＬ−１２活性」および「ＩＬ−１２生物学的活性」とは、ＩＬ−１２の周知の生物活性のいずれかを指し、これには、Ｔｈ１細胞へのナイーブＴ細胞の分化を刺激すること、Ｔ細胞の増殖および機能を刺激すること、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）の産生を刺激すること、ＩＦＮ−ガンマのＩＬ−４媒介性の抑制の低減を刺激すること、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害活性の増強を刺激すること、ＩＬ−１２Ｒ−ベータ１およびＩＬ−１２Ｒ−ベータ２の発現を刺激すること、ＭＨＣ  Ｉ分子およびＩＩ分子の上方調節を介して腫瘍抗原の提示を促進すること、ならびに抗血管新生活性を刺激することが含まれるが、これらに限定されない。ＩＬ−１２活性についての例示的なアッセイには、ガンマインターフェロン誘導アッセイ（実施例３、および米国特許第５，４５７，０３８号を参照のこと）が含まれる。ＮＫ細胞自発的細胞傷害性アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、同時分裂促進効果アッセイ（Co-Mitogenic Effect Assay）およびＧＭ−ＣＳＦ誘導アッセイ（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４５７，０３８号の実施例８に開示される）などであるがこれらに限定されないさらなるアッセイが、当該分野で公知である。
【０１１１】
好ましい一実施形態では、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＬ−１２生物学的活性を保持する。特定の実施形態では、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、１よりも多いＩＬ−１２生物学的活性を保持する。特定の実施形態では、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つの、上述のＩＬ−１２生物学的活性を保持する。特定の実施形態では、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドのＩＬ−１２生物学的活性は、ＩＬ−１２のヘテロダイマーｐ３５／ｐ４０（野生型）形態と比較される（かかる形態に対してアッセイされる）。特定の実施形態では、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、ＩＬ−１２のヘテロダイマーｐ３５／ｐ４０（野生型）形態と比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれ超の、ＩＬ−１２の生物学的活性を保持する。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、疾患の、用語「処置すること」または「処置」とは、疾患の徴候または症状を軽減する試みにおいて、１または複数の薬物またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された細胞を、哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）に投与することを含み得るプロトコールを実行することを指す。従って、「処置すること」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とすると必ずしも解釈すべきではなく、治癒を必要とせず、対象に対する最低限の効果のみを有するプロトコールを具体的に含む。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「免疫細胞」には、樹状細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞ならびにリンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）が含まれる。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」には、胚性幹細胞、成体幹細胞および誘導多能性幹細胞が含まれる。幹細胞は、骨髄、脂肪組織および血液（臍帯血および月経血が含まれるがこれらに限定されない）を含む、任意の適切な供給源から取得され得る。幹細胞の例には、間葉系幹細胞および造血幹細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、用語「樹状細胞」および「ＤＣ」は、互換的に使用される。同様に、用語「ナチュラルキラー細胞」および「ＮＫ細胞」は、互換的に使用される。
【０１１６】
単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、全長および成熟ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを含む本発明の単鎖インターロイキン−１２（ｓｃＩＬ−１２）ポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドを提供する。
【０１１７】
本発明の具体的実施形態によれば、新規ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードする核酸配列が提供される。具体的には、本発明は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
（ｉ）第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）、
（ｉｉ）任意選択の第１のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）ＩＬ−１２  ｐ３５ドメイン、
（ｉｖ）任意選択の第２のペプチドリンカー、および
（ｖ）第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）
を含むｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１１８】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（本明細書でｐ４０Ｎとも呼ばれる）は、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットのＮ末端断片である。本発明における使用のためのＩＬ−１２  ｐ４０ポリヌクレオチドには、配列番号１のヒトＩＬ−１２  ｐ４０核酸配列および配列番号５のマウスＩＬ−１２  ｐ４０核酸配列が含まれる。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１８０５６３．１（ヒト）、ＮＭ＿００２１８７．２（ヒト）、ＮＧ＿００９６１８．１（ヒト）、ＮＭ＿００１０７７４１３．１（ネコ）、ＡＦ０９１１３４．１（イヌ）、ＮＭ＿００８３５２．２（マウス）、ＮＭ＿００１１５９４２４．１（マウス）およびＮＭ＿００８３５１．２（マウス）が含まれるがこれらに限定されない、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットをコードするポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例が、公的配列データベースにおいて利用可能である。
【０１１９】
本発明のポリヌクレオチドによってコードされる、第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）として適切なＩＬ−１２  ｐ４０のＮ末端断片には、配列番号２のアミノ酸１〜２８８、１〜２８９、１〜２９０、１〜２９１、１〜２９２、１〜２９３、１〜２９４、１〜２９５、１〜２９６、１〜２９７および１〜２９８を含むまたはこれらからなるポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる、第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）として適切なＩＬ−１２  ｐ４０の好ましいＮ末端断片は、配列番号２のアミノ酸１〜２９３を含むまたはこれからなる。
【０１２０】
本発明のポリヌクレオチドによってコードされる、第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）として適切なＩＬ−１２  ｐ４０のＮ末端断片は、シグナル配列を欠き得る。シグナルペプチドの特異的な切断部位は、１、２、３またはそれ超の残基分、変動し得ることが理解される。従って、さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）は、配列番号２の残基１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８で始まり、配列番号２の残基２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７または２９８で終わる、配列番号２の断片を含むまたはこれらからなる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）は、配列番号２のアミノ酸残基２３〜２９３を含むまたはこれからなる。
【０１２１】
任意選択の第１のペプチドリンカー（ｉｉ）は、機能的タンパク質へのｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの折り畳みを可能にする、任意の適切なペプチドリンカーであり得る。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる任意選択の第１のペプチドリンカーは、１０以下のアミノ酸からなる。具体的実施形態では、この第１のペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸からなる。具体的実施形態では、この第１のペプチドリンカーは、グリシン（Ｇｌｙ）；セリン（Ｓｅｒ）；アラニン（Ａｌａ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；およびプロリン（Ｐｒｏ）から選択される１または複数のアミノ酸の任意の配列および組合せを含む。好ましい一実施形態では、この第１のペプチドリンカーは、ペプチドＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）、ならびにＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）中に１つのアミノ酸置換を有するペプチドから選択される。特定の実施形態では、この第１のペプチドリンカーは、存在しない。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ−１２  ｐ３５ドメイン（ｉｉｉ）は、シグナルペプチドを欠く成熟ＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットである。本発明における使用のためのＩＬ−１２  ｐ３５ポリヌクレオチドには、配列番号３のヒトＩＬ−１２  ｐ３５核酸配列および配列番号７のマウスＩＬ−１２  ｐ３５核酸配列が含まれる。ＡＦ１０１０６２．１（ヒト）、ＮＭ＿０００８８２．３（ヒト）、ＮＧ＿０３３０２２．１（ヒト）、ＮＭ＿００１１５９４２４．１（マウス）、ＮＭ＿００８３５１．２（マウス）、ＮＭ＿００１００９８３３（ネコ）、ＮＭ＿００１０８２５１１．１（ウマ）、ＮＭ＿００１００３２９３．１（イヌ）が含まれるがこれらに限定されない、ＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットをコードするポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例が、公的配列データベースにおいて利用可能である。
【０１２３】
シグナルペプチドの特異的な切断部位は、１、２、３またはそれ超の残基分、変動し得ることが理解される。従って、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ−１２  ｐ３５ドメインには、配列番号４の残基５７〜２５３を含むまたはこれからなる予測された成熟配列、ならびに配列番号４のアミノ酸５２〜２５３、５３〜２５３、５４〜２５３、５５〜２５３、５６〜２５３、５８〜２５３、５９〜２５３、６０〜２５３、６１〜２６３および６２〜２５３を含むまたはこれらからなる成熟配列が含まれる。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドによってコードされる適切なＩＬ−１２  ｐ３５ドメインは、Ｃ末端において、１または複数のアミノ酸残基分、短縮され得る。従って、さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ−１２  ｐ３５ドメインは、配列番号４の残基５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２で始まり、配列番号４の残基２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２または２５３で終わる、配列番号４の断片を含むまたはこれらからなる。
【０１２５】
任意選択の第２のペプチドリンカー（ｉｖ）は、機能的タンパク質へのｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの折り畳みを可能にする、任意の適切なペプチドリンカーであり得る。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる任意選択の第２のペプチドリンカーは、１０以下のアミノ酸からなる。具体的実施形態では、この第２のペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸からなる。具体的実施形態では、この第２のペプチドリンカーは、グリシン（Ｇｌｙ）；セリン（Ｓｅｒ）；アラニン（Ａｌａ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；およびプロリン（Ｐｒｏ）から選択される１または複数のアミノ酸の任意の配列および組合せを含む。好ましい一実施形態では、この第２のペプチドリンカーは、ペプチドＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）、ならびにＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）中に１つのアミノ酸置換を有するペプチドから選択される。特定の実施形態では、この第２のペプチドリンカーは、存在しない。好ましい一実施形態では、この第１および第２のペプチドリンカーは、組み合わせて１０、９、８、７またはそれ未満のアミノ酸残基からなる。
【０１２６】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（本明細書でｐ４０Ｃとも呼ばれる）は、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットのＣ末端断片である。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる、第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）として適切なＩＬ−１２  ｐ４０のＣ末端断片は、配列番号２のアミノ酸２８９〜３２８、２９０〜３２８、２９１〜３２８、２９２〜３２８、２９３〜３２８、２９４〜３２８、２９５〜３２８、２９６〜３２８、２９７〜３２８、２９８〜３２８および２９９〜３２８を含むまたはこれらからなる。
【０１２７】
本発明のポリヌクレオチドによってコードされる適切な第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）は、Ｃ末端において、１または複数のアミノ酸残基分、短縮され得る。従って、さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）は、配列番号２の残基２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８または２９９で始まり、配列番号２の残基３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７または３２８で終わる、配列番号２の断片を含むまたはこれらからなる。
【０１２８】
本発明の好ましいｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全長配列は、配列番号９として本明細書に示される。この全長配列は、配列番号９の核酸１〜６６において予測されたシグナルペプチドをコードし、配列番号９の核酸６７〜１５９９において成熟ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードする。
【０１２９】
従って、本発明の第１の主題は、新規ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。具体的な一実施形態では、この単離されたポリヌクレオチドは、配列番号９および配列番号９の核酸６７〜１５９９からなる群より選択される核酸配列を含む。具体的な一実施形態では、この単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を可能にする領域をさらに含む。
【０１３０】
本発明は、配列番号１０および配列番号１０のアミノ酸２３〜５３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【０１３１】
本発明は、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドのバリアントをコードするポリヌクレオチドもまた提供する。好ましい一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１０の全長または成熟アミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なｓｃＩＬ−１２バリアントポリペプチドをコードし、このバリアントポリペプチドは、少なくとも１つのＩＬ−１２活性、例えば、ＮＫ細胞からのＩＦＮ−ガンマ分泌の誘導を示す。かかるＩＬ−１２活性は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，４５７，０３８号の実施例８に記載されるアッセイなどの、当該分野で公知のアッセイを使用して容易に決定される。
【０１３２】
ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、単一のアミノ酸バリアントを含むアミノ酸配列を含む、本明細書に開示されるｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のポリヌクレオチドが、本発明の実施において使用され得る。これらには、対立遺伝子、他の種由来の相同な遺伝子、およびその配列内の同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、従って、サイレント変化を生じる、ｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドの全てまたは部分を含むヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない。同様に、本発明のｓｃＩＬ−１２誘導体には、一次アミノ酸配列として、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内の残基を置換して保存的アミノ酸置換を生じている変更された配列を含むｓｃＩＬ−１２ポリペプチドのアミノ酸配列の全てまたは一部を含む誘導体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、配列内の１または複数のアミノ酸残基が、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換されて、サイレント変更を生じ得る。配列内のアミノ酸の代替物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。かかる変更は、当該分野で公知の種々の方法によって産生され得（以下のSambrook et al., 1989を参照のこと）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定される見かけの分子量、または等電点に影響を与えないと予測される。
【０１３３】
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドによってコードされる単離されたｓｃＩＬ−１２ポリペプチドにも関する。
【０１３４】
単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド
本発明は、全長および成熟ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを含む、新規ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを提供する。
【０１３５】
従って、本発明は、単離されたｓｃＩＬ−１２ポリペプチドに関する。具体的な一実施形態では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
（ｉ）第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）、
（ｉｉ）任意選択の第１のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）ＩＬ−１２  ｐ３５ドメイン、
（ｉｖ）任意選択の第２のペプチドリンカー、および
（ｖ）第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）
を含む、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを提供する。
【０１３６】
特定の実施形態では、この第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）は、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットのＮ末端断片である。本発明における使用のためのＩＬ−１２  ｐ４０ポリペプチドには、配列番号２のヒトＩＬ−１２  ｐ４０アミノ酸配列および配列番号６のマウスＩＬ−１２  ｐ４０アミノ酸配列が含まれる。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ２９４６０．１（ヒト）、ＡＡＤ５６３８６．１（ヒト）、ＮＰ＿００５５２６．１（ヒト）、ＮＰ＿７１４９１２．１（ヒト）、Ｑ２８２６８．１（イヌ）、ＮＰ＿００１００３２９２．１（イヌ）、ＮＰ＿０３２３７８．１（マウス）、ＮＰ＿００１１５２８９６．１（マウス）、ＮＰ＿０３２３７７．１（マウス）が含まれるがこれらに限定されない、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットのさらなる非限定的な例が、公的配列データベースにおいて利用可能である。
【０１３７】
第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）として適切なＩＬ−１２  ｐ４０のＮ末端断片には、配列番号２のアミノ酸１〜２８８、１〜２８９、１〜２９０、１〜２９１、１〜２９２、１〜２９３、１〜２９４、１〜２９５、１〜２９６、１〜２９７および１〜２９８を含むまたはこれらからなるポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。好ましい第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）は、配列番号２のアミノ酸１〜２９３を含むまたはこれからなる。
【０１３８】
第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）として適切なＩＬ−１２  ｐ４０のＮ末端断片は、シグナル配列を欠き得る。従って、さらなる実施形態では、この第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）は、配列番号２の残基１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８で始まり、残基２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７または２９８で終わる、配列番号２の断片を含むまたはこれらからなる。一実施形態では、この第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）は、配列番号２のアミノ酸残基２３〜２９３を含むまたはこれからなる。
【０１３９】
任意選択の第１のペプチドリンカー（ｉｉ）は、機能的タンパク質へのｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの折り畳みを可能にする、任意の適切なペプチドリンカーであり得る。特定の実施形態では、この任意選択の第１のペプチドリンカーは、１０以下のアミノ酸からなる。具体的実施形態では、この第１のペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸からなる。具体的実施形態では、この第１のペプチドリンカーは、グリシン（Ｇｌｙ）；セリン（Ｓｅｒ）；アラニン（Ａｌａ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；およびプロリン（Ｐｒｏ）から選択される１または複数のアミノ酸の任意の配列および組合せを含む。好ましい一実施形態では、この第１のペプチドリンカーは、ペプチドＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）、ならびにＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）中に１つのアミノ酸置換を有するペプチドから選択される。特定の実施形態では、この第１のペプチドリンカーは、存在しない。
【０１４０】
特定の実施形態では、ＩＬ−１２  ｐ３５ドメイン（ｉｉｉ）は、シグナルペプチドを欠く成熟ＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットである。本発明における使用のためのＩＬ−１２  ｐ３５ポリペプチドには、配列番号４のヒトＩＬ−１２  ｐ３５アミノ酸配列および配列番号８のマウスＩＬ−１２  ｐ３５アミノ酸配列が含まれる。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ３２７５８．１（ネコ）、ＮＰ＿００１００３２９３（イヌ）、ＮＰ＿００１０７５９８０．１（ウマ）、ＮＰ＿０００８７３．２（ヒト）、ＡＡＤ５６３８５．１（ヒト）、ＮＰ＿００１１５２８９６．１（マウス）およびＮＰ＿０３２３７７．１（マウス）を含むがこれらに限定されない、ＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットのさらなる非限定的な例が、公的配列データベースにおいて利用可能である。
【０１４１】
シグナルペプチドの特異的な切断部位は、１、２、３またはそれ超の残基分、変動し得ることが理解される。従って、特定の実施形態では、本発明の成熟ｐ３５ポリペプチドには、配列番号４の残基５７〜２５３からなる予測された成熟配列、ならびに配列番号４のアミノ酸５２〜２５３、５３〜２５３、５４〜２５３、５５〜２５３、５６〜２５３、５８〜２５３、５９〜２５３、６０〜２５３、６１〜２６３および６２〜２５３からなる成熟配列が含まれる。
【０１４２】
適切なＩＬ−１２  ｐ３５ドメインは、Ｃ末端において、１または複数のアミノ酸残基分、短縮され得る。従って、さらなる実施形態では、このＩＬ−１２  ｐ３５ドメインは、配列番号４の残基５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２で始まり、配列番号４の残基２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２または２５３で終わる、配列番号４の断片を含むまたはこれらからなる。
【０１４３】
任意選択の第２のペプチドリンカー（ｉｖ）は、機能的タンパク質へのｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの折り畳みを可能にする、任意の適切なペプチドリンカーであり得る。特定の実施形態では、この任意選択の第２のペプチドリンカーは、１０以下のアミノ酸からなる。具体的実施形態では、この第２のペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸からなる。具体的実施形態では、この第２のペプチドリンカーは、グリシン（Ｇｌｙ）；セリン（Ｓｅｒ）；アラニン（Ａｌａ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；およびプロリン（Ｐｒｏ）から選択される１または複数のアミノ酸の任意の配列および組合せを含む。好ましい一実施形態では、この第２のペプチドリンカーは、ペプチドＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）、ならびにＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４１）およびＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）中に１つのアミノ酸置換を有するペプチドから選択される。特定の実施形態では、この第２のペプチドリンカーは、存在しない。好ましい一実施形態では、この第１および第２のペプチドリンカーは、組み合わせて１０以下のアミノ酸残基からなる。
【０１４４】
特定の実施形態では、第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）は、ＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットのＣ末端断片である。第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）として適切なｐ４０のＣ末端断片は、配列番号２のアミノ酸２８９〜３２８、２９０〜３２９、２９１〜３２８、２９２〜３２８、２９３〜３２８、２９４〜３２８、２９５〜３２８、２９６〜３２８、２９７〜３２８、２９８〜３２８および２９９〜３２８を含むまたはこれらからなる。
【０１４５】
適切な第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）は、Ｃ末端において、１または複数のアミノ酸残基分、短縮され得る。従って、さらなる実施形態では、この第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）は、配列番号２の残基２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８または２９９で始まり、配列番号２の残基３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７または３２８で終わる、配列番号２の断片を含むまたはこれらからなる。
【０１４６】
本発明の代表的ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの全長配列は、本明細書で配列番号１０として示される。この全長配列は、配列番号１０のアミノ酸１〜２２において予測されたシグナルペプチドを含み、配列番号１０のアミノ酸２３〜５３３において成熟ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを含む。
【０１４７】
別の具体的一実施形態では、このｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、配列番号９および配列番号９のヌクレオチド６７〜１５９９からなる群より選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１４８】
従って、本発明の第１の主題は、単離されたｓｃＩＬ−１２ポリペプチドに関する。具体的な一実施形態では、この単離されたポリペプチドは、配列番号１０および配列番号１０のアミノ酸２３〜５３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
当業者は、本発明、および本明細書に記載される遺伝コードの縮重または非普遍性を使用することによって、本発明のポリペプチドをコードするように、他のポリヌクレオチドを産生することができる。
【０１５０】
本発明のさらなる実施形態には、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの機能的断片、または異種の、もしくは通常は非連続のタンパク質ドメインを含む第２のポリペプチドに融合された本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを含む融合タンパク質が含まれる。好ましくは、この第２のポリペプチドは、単鎖抗体または抗体断片を含む抗体などの標的化ポリペプチドである。従って、本発明は、そのＮ末端またはＣ末端において、第２のポリペプチド、好ましくは抗体、抗体断片または単鎖抗体に融合された、ＳｃＩＬ−１２ポリペプチドを提供する。
【０１５１】
本発明は、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドのバリアントもまた提供する。特定の実施形態では、ｓｃＩＬ−１２バリアントポリペプチドは、配列番号１０の全長または成熟アミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、このバリアントポリペプチドは、少なくとも１つのＩＬ−１２活性、例えば、ＮＫ細胞からのＩＦＮ−ガンマ分泌の誘導を示す。かかるＩＬ−１２活性は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４５７，０３８号の実施例８に記載されるアッセイなどの、当該分野で公知のアッセイを使用して容易に決定される。
【０１５２】
本発明は、本発明に係る単離されたポリペプチドを含む組成物にも関する。
【０１５３】
組成物
本発明は、本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物にも関する。かかる組成物は、上で規定したような、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドまたはｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、許容される担体またはビヒクルとを含み得る。本発明の組成物は、治療的投与における使用のための生物学的材料の製剤に特に適切である。従って、一実施形態では、この組成物は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の一実施形態では、この組成物は、本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを含む。
【０１５４】
語句「許容される」とは、投与した場合に細胞または生物にとって生理学的に耐容可能な分子実体および組成物を指す。用語「担体」とは、この組成物が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。かかる担体は、無菌液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成起源の油を含む油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。許容される担体の例は、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、等張生理食塩水（例えば、リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウム、またはかかる塩の混合物）、リンゲル溶液、デキストロース、水、無菌水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せである。１，３−ブタンジオールおよび無菌不揮発油が、溶媒または懸濁媒として簡便に使用される。合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無味無臭の不揮発油が使用される。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注射剤の調製において使用を見出す。水または水溶液生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは、特に注射可能な溶液のために、担体として使用される。適切な医薬担体は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。本発明の医薬組成物は、外用、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋内、腫瘍内、皮下、眼内などの投与の目的のために、製剤化され得る。
【０１５５】
好ましくは、これらの組成物は、注射可能な製剤のための許容されるビヒクルを含む。このビヒクルは、特に、無菌の等張生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはかかる塩の混合物）、または必要に応じた滅菌水の添加または生理学的生理食塩水の添加の際に、注射可能な溶液を形成させることができる、乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であり得る。好ましい無菌の注射可能な調製物は、非毒性の非経口的に許容される溶媒または希釈剤中の、溶液または懸濁物であり得る。
【０１５６】
なお別の一実施形態では、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチド、またはこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、徐放系で送達され得る。例えば、このポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたは他の様式の投与を使用して、投与され得る。他の徐放系は、Langerによる総説［Science 249:1527-1533 (1990)］において議論されている。
【０１５７】
単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドの発現
ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドの配列を用いて、大量のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドが調製され得る。細胞におけるベクターの適切な発現によって、高い効率の産生が達成され得る。その後、例えば硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などの標準的な精製方法が、使用され得る。タンパク質精製のために典型的に使用される技術については、Methods in Enzymologyの種々の巻を参照のこと。あるいは、一部の実施形態では、高い効率の産生は不要であるが、注意深く操作された発現系内の既知の誘導性タンパク質の存在には、非常に価値がある。典型的には、この発現系は細胞であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系もまた構築され得る。
【０１５８】
ｓｃＩＬ−１２、またはその断片、誘導体もしくはアナログ、またはキメラタンパク質を含むそれらの機能的に活性な誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター中に、挿入され得る。本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターにおいて転写制御配列と作動可能に連結される。発現ベクターは、好ましくは、複製起点もまた含む。
【０１５９】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、任意の適切なクローニングベクター中に挿入され得る。当該分野で公知の多数のベクター−宿主系が、使用され得る。可能なベクターには、プラスミドまたは改変ウイルスが含まれるがこれらに限定されず、このベクター系は、使用される宿主細胞と適合性でなければならない。ベクターの例には、大腸菌（Escherichia coli）、バクテリオファージ、例えば、ラムダ誘導体、またはプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２誘導体もしくはｐＵＣプラスミド誘導体、例えば、ｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧなどが含まれるがこれらに限定されない。クローニングベクター中への挿入は、例えば、相補的付着末端を含むクローニングベクター中にポリヌクレオチドをライゲーションすることによって達成され得る。しかし、ポリヌクレオチドを断片化するために使用される相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ポリヌクレオチド分子の末端は、酵素的に改変され得る。あるいは、所望の任意の部位は、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることによって産生され得る；これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特定の化学合成されたオリゴヌクレオチドを含み得る。好ましくは、クローニングされた遺伝子は、クローニング細胞、例えば、大腸菌（E. coli）における拡大、およびそれが所望される場合には、適切な発現細胞株中への引き続く挿入のための精製、を提供する、シャトルベクタープラスミド上に含まれる。例えば、１つよりも多い型の生物において複製し得るベクターであるシャトルベクターは、大腸菌（E. coli）プラスミド由来の配列を、酵母２μプラスミド由来の配列と連結させることによって、大腸菌（E. coli）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の両方における複製のために調製され得る。
【０１６０】
さらに、本発明は、転写調節エレメントに作動可能に連結された本発明に係るポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。一実施形態では、このポリヌクレオチドは、発現コンピテントな宿主細胞におけるｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの発現を可能にする発現制御配列と作動可能に連結される。この発現制御配列は、発現が所望される宿主細胞において機能的であるプロモーターを含み得る。このベクターは、プラスミドＤＮＡ分子またはウイルスベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスが含まれるがこれらに限定されない。本発明は、そのゲノム中に本発明に係るポリヌクレオチドを含む複製欠損組換えウイルスにさらに関する。従って、本発明は、かかる発現ベクターを含む単離された宿主細胞であって、転写調節エレメントは、宿主細胞において作動可能である、宿主細胞に関する。
【０１６１】
所望の遺伝子は、幅広い選択肢の発現ベクターのいずれかの中に挿入される。適切なベクターおよび細胞株の選択は、所望の産物の制約に依存する。典型的な発現ベクターは、Sambrook et al. (1989)に記載されている。適切な細胞株は、ＡＴＣＣなどの寄託機関から選択され得る。それらの各々が参照によって本明細書に組み込まれる、ATCC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (6th ed.) (1988)；ATCC Cell Lines, Viruses, and Antiseraを参照のこと。これらのベクターは、例えばSambrook et al. (1989)に記載されるような、標準的な形質転換手順またはトランスフェクション手順によって、所望の細胞に導入される。融合タンパク質は、典型的には、組換え核酸法または合成ポリペプチド法のいずれかによって作製される。核酸操作のための技術は、一般に、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory中に記載されている。ポリペプチドの合成のための技術は、例えば、Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963)中に記載されている。
【０１６２】
特定の組換えＤＮＡ分子が一旦同定され単離されると、当該分野で公知の複数の方法のいずれかが、それを増やすために使用され得る。適切な宿主系および増殖条件が一旦確立されると、組換え発現ベクターは、多量に増やされ調製され得る。以前に説明したように、使用され得る発現ベクターには、以下のベクターまたはそれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない：数例挙げると、ヒトまたは動物ウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；昆虫ウイルス、例えば、バキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
【０１６３】
さらに、挿入された配列の発現をモジュレートする、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株が、選択され得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。酵母における発現は、生物学的に活性な産物を産生し得る。真核生物細胞における発現は、「ネイティブの」折り畳みの可能性を増加させ得る。さらに、哺乳動物細胞における発現は、ｓｃＩＬ−１２活性を再構成または構成するためのツールを提供し得る。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度まで、タンパク質分解性切断などのプロセシング反応に影響を与え得る。
【０１６４】
ベクターは、当該分野で公知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、微粒子銃、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターによって、所望の宿主細胞中に導入される（例えば、Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967；Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624；Ｈａｒｔｍｕｔら、カナダ特許出願第２，０１２，３１１号、１９９０年３月１５日出願を参照のこと）。
【０１６５】
可溶性形態のタンパク質は、上記のように、培養液を集めること、または例えば、界面活性剤による処理によって、および所望の場合には超音波処理もしくは他の機械的プロセスによって封入体を可溶化させることによって、取得され得る。可溶化されたまたは可溶性のタンパク質は、種々の技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、免疫アフィニティおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度、免疫沈降を使用して、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、単離され得る。
【０１６６】
ｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドを含むベクターおよび遺伝子発現カセット
本発明は、本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。本発明は、本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットもまた提供する。必要に応じてベクターまたは遺伝子発現カセット中に取り込まれた本発明のポリヌクレオチド、およびそれらを含む組成物は、ワクチンアジュバントなどとして免疫系の機能を増強するために、ならびに感染および癌の処置において他の免疫調節因子および／または小分子医薬品と組み合わせて、有用である。これらは、任意の型の細胞または組織におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子の移入および発現のために使用され得る。形質転換は、さらに、標的化され得る（特定の組織への移入は、特に、ベクターの選択によって決定され得、発現は、特定のプロモーターの選択によって決定され得る）。本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの産生のために有利に使用される。
【０１６７】
本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プラスミドベクターにおいて使用され得る。好ましくは、発現制御配列は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの発現のために、ｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドコード配列に作動可能に連結される。この発現制御配列は、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能なベクター中の、任意のエンハンサー、応答エレメントまたはプロモーター系であり得る。一旦ベクターが適切な宿主中に取り込まれると、この宿主は、使用に依存して、ポリヌクレオチドの高レベル発現に適切な条件下で維持される。
【０１６８】
ポリヌクレオチドは、通常、配列が発現制御配列に作動可能に連結された（即ち、発現制御配列の機能を確実にするように位置付けられた）後、宿主において発現される。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な一部として、宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシンを含む（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと）。
【０１６９】
大腸菌（Escherichia coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングために有用な原核生物宿主である。使用に適切な他の微生物宿主には、桿菌、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、ならびに他の腸内細菌科、例えばサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）および種々のシュードモナス属（Pseudomonas）の種が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７０】
酵母細胞、昆虫組織培養細胞、トリ細胞などが含まれるがこれらに限定されない、他の真核生物細胞が使用され得る。好ましくは、哺乳動物組織細胞培養物が、本発明のポリペプチドを産生するために使用される（参照によって本明細書に組み込まれる、Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y. (1987)を参照のこと）。
【０１７１】
発現ベクターは、限定ではなく、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、および必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列もまた含み得る。好ましくは、これらのエンハンサーまたはプロモーターは、ＩＬ−１２のサブユニットｐ４０およびｐ３５をコードする遺伝子と天然に関連するエンハンサーまたはプロモーターであるが、多くの場合には、他のエンハンサーまたはプロモーターが、等しく適切またはより適切であると理解される。さらなる実施形態では、発現制御配列は、例えばＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどのウイルス由来のエンハンサーまたはプロモーターである。
【０１７２】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、細胞性宿主の型に依存して変動する周知の方法によって、宿主細胞中に移入され得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核生物細胞に一般に利用されるが、リン酸カルシウム処理が、他の細胞性宿主のために使用され得る（一般に、参照によって本明細書に組み込まれる、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), Cold Spring Harbor Pressを参照のこと）。用語「形質転換された細胞」は、形質転換された細胞の後代もまた含む意味である。
【０１７３】
潜在的な宿主−ベクター系には、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；微生物、例えば、酵母ベクターを含む酵母；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が含まれるが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性において変動する。利用される宿主−ベクター系に依存して、いくつかの適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれか１つが使用され得る。
【０１７４】
本発明の組換えｓｃＩＬ−１２タンパク質、またはその機能的断片、誘導体、キメラ構築物もしくはアナログは、組換えによるコード配列の統合後に、染色体性に発現され得る。これに関して、いくつかの増幅系のいずれかが、高レベルの安定な遺伝子発現を達成するために使用され得る（Sambrook et al., 1989、上記を参照のこと）。
【０１７５】
ｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含む細胞は、細胞によるｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの発現を提供する条件下で、適切な細胞培養培地中で培養される。クローニングベクター中へのＤＮＡ断片の挿入のための以前に記載された方法のいずれかが、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡおよび合成技術ならびにｉｎ  ｖｉｖｏの組換え（遺伝子組換え）が含まれ得る。
【０１７６】
ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の調節領域、即ち、プロモーター／エンハンサーエレメントに作動可能に連結され得、それらによって制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主細胞において機能的でなければならない。これらの調節領域は、宿主細胞における機能的転写のためのプロモーター領域、ならびに目的の遺伝子の３’側に位置し、転写の終結のためのシグナルおよびポリアデニル化部位を特定する領域、を含み得る。これら全てのエレメントが、発現カセットを構成する。
【０１７７】
本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、５つの一般的アプローチによって同定され得る：（ａ）所望のプラスミドＤＮＡまたは特定のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能の存在または非存在、（ｄ）適切な制限エンドヌクレアーゼを用いた分析、および（ｅ）挿入された配列の発現。第１のアプローチでは、核酸は、増幅された産物の検出を提供するために、ＰＣＲによって増幅され得る。第２のアプローチでは、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたマーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第３のアプローチでは、組換えベクター／宿主系は、ベクター中の外来遺伝子の挿入によって引き起こされる特定の「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける包埋体形成など）の存在または非存在に基づいて、同定および選択され得る。別の例では、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードする核酸がベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入される場合、ｓｃＩＬ−１２核酸挿入物を含む組換え体は、遺伝子機能の非存在によって同定され得る。第４のアプローチでは、組換え発現ベクターは、適切な制限酵素による消化によって同定される。第５のアプローチでは、組換え発現ベクターは、発現されたタンパク質が機能的に活性なコンフォメーションを取ることを条件として、組換え体によって発現された遺伝子産物の活性、生化学的特徴または免疫学的特徴についてアッセイすることによって同定され得る。
【０１７８】
広範な種々の宿主／発現ベクターの組合せが、本発明のＤＮＡ配列を発現する際に使用され得る。有用な発現ベクターは、例えば、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体、ならびに公知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌（E. coli）プラスミドｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Smith et al., 1988, Gene 67:31-40）、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、プラスミド、例えばＲＰ４；ファージＤＮＡＳ、例えば、ファージｌの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば、２ｍプラスミドまたはその誘導体；真核生物細胞において有用なベクター、例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するように改変されたプラスミドなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
本発明は、宿主細胞において発現されることが可能な遺伝子発現カセットであって、本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現カセットもまた提供する。従って、本発明は、ｓｃＩＬ−１２発現系において有用な新規遺伝子発現カセットもまた提供する。
【０１８０】
本発明の遺伝子発現カセットは、特異的リガンドの添加または除去による遺伝子発現の調節を可能にするための遺伝子スイッチを含み得る。一実施形態では、この遺伝子スイッチは、遺伝子発現のレベルが、存在するリガンドのレベルに依存する、遺伝子スイッチである。本発明の遺伝子スイッチにおいて使用され得るリガンド依存的転写因子複合体の例には、とりわけ、そのそれぞれのリガンド（グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、ならびにそれらのアナログおよび模倣物）によって活性化される核受容体スーパーファミリーのメンバー；テトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡ；ビオチンベースのスイッチ系；ＦＫＢＰ／ラパマイシンスイッチ系；クメート（cumate）スイッチ系；リボスイッチ（riboswitch）系が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８１】
本発明の一態様では、この遺伝子スイッチは、ＥｃＲベースの遺伝子スイッチである。かかる系の例には、その各々がその全体が参照によって組み込まれる、以下において記載される系が含まれるがこれらに限定されない：ＰＣＴ／ＵＳ２００１／００９０５０（ＷＯ２００１／０７０８１６）；米国特許第７，０９１，０３８号；米国特許第７，７７６，５８７号；米国特許第７，８０７，４１７号；米国特許第８，２０２，７１８号；ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０３０６０８（ＷＯ２００２／０２９０７５）；米国特許第８，１０５，８２５号；米国特許第８，１６８，４２６号；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５２３５（ＷＯ２００２／０６６６１３）；米国特許出願第１０／４６８，２００号（米国特許出願公開第２０１２０１６７２３９号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０６（ＷＯ２００２／０６６６１４）；米国特許第７，５３１，３２６号；米国特許第８，２３６，５５６号；米国特許第８，５９８，４０９号；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０９０（ＷＯ２００２／０６６６１２）；米国特許出願第１０／４６８，１９３号（米国特許出願公開第２００６０１００４１６号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５２３４（ＷＯ２００３／０２７２６６）；米国特許第７，６０１，５０８号；米国特許第７，８２９，６７６号；米国特許第７，９１９，２６９号；米国特許第８，０３０，０６７号；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０８（ＷＯ２００２／０６６６１５）；米国特許出願第１０／４６８，１９２（米国特許出願公開第２０１１０２１２５２８号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０２６（ＷＯ２００３／０２７２８９）；米国特許第７，５６３，８７９号；米国特許第８，０２１，８７８号；米国特許第８，４９７，０９３号；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５０８９（ＷＯ２００５／１０８６１７）；米国特許第７，９３５，５１０号；米国特許第８，０７６，４５４号；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１２７０（ＷＯ２００９／０４５３７０）；米国特許出願第１２／２４１，０１８号（米国特許出願公開第２００９０１３６４６５号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１５６３（ＷＯ２００９／０４８５６０）；米国特許出願第１２／２４７，７３８号（米国特許出願公開第２００９０１２３４４１号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５５１０（ＷＯ２０１０／０４２１８９）；米国特許出願第１３／１２３，１２９号（米国特許出願公開第２０１１０２６８７６６号）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２９６８２（ＷＯ２０１１／１１９７７３）；米国特許出願第１３／６３６，４７３号（米国特許出願公開第２０１３０１９５８００号）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２７５１５（ＷＯ２０１２／１２２０２５）；および米国特許出願第１４／００１，９４３号（米国特許出願公開［係属中］）。
【０１８２】
本発明の別の一態様では、この遺伝子スイッチは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）とＦＫＢＰラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）とのヘテロダイマー化に基づき、ラパマイシンまたはその非免疫抑制性アナログを介して調節される。かかる系の例には、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）ならびに米国特許第６，０１５，７０９号、米国特許第６，１１７，６８０号、米国特許第６，４７９，６５３号、米国特許第６，１８７，７５７号および米国特許第６，６４９，５９５号に記載される系が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８３】
本発明の別の一態様では、本発明の遺伝子発現カセットは、高い親和性でクメートオペレーター配列を結合するＣｙｍＲリプレッサーを介して作動するクメートスイッチ系を取り込む（ＳｐａｒＱ（商標）Ｃｕｍａｔｅ  Ｓｗｉｔｃｈ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）。この抑制は、ＣｙｍＲに結合する非毒性小分子クメートの添加によって軽減される。この系は、ダイナミックな誘導性を有し、細かく調整され得、可逆的かつ誘導性である。
【０１８４】
本発明の別の一態様では、本発明の遺伝子発現カセットは、リボスイッチを取り込み、このリボスイッチは、エフェクターに結合して、そのｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生における変化を生じる、メッセンジャーＲＮＡ分子の調節セグメントである。リボスイッチを含むｍＲＮＡは、そのエフェクター分子の濃度に応答して、それ自体の活性を調節することに直接関与する。エフェクターは、プリン／ピリミジン、アミノ酸、ビタミンまたは他の小分子補因子由来の代謝物であり得る。これらのエフェクターは、リボスイッチセンサーについてのリガンド、またはアプタマーとして作用する。Breaker, RR. Mol Cell. (2011) 43(6):867-79。
【０１８５】
本発明の別の一態様では、本発明の遺伝子発現カセットは、細菌リプレッサータンパク質ＴｅｔＲが、遺伝子発現を活性化するために、ＶＰ１６に融合された合成ビオチン化シグナルＡＶＩＴＡＧと相互作用するストレプトアビジンと融合されている、ビオチンベースの遺伝子スイッチ系を取り込む。ＡＶＩＴＡＧペプチドのビオチン化は、細菌ビオチンリガーゼＢｉｒＡによって調節され、従って、リガンド応答性を可能にする。Weber et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2643-2648；Weber et al. (2009) Metabolic Engineering, 11(2):117-124。
【０１８６】
本発明における使用に適切なさらなる遺伝子スイッチ系は、当該分野で周知であり、参照によって本明細書に組み込まれるAuslander and Fussenegger, Trends in Biotechnology (2012), 31(3):155-168に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１８７】
遺伝子スイッチ系における使用のためのリガンドの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない；エクジステロイド、例えば、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ（muristerone A）など、９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成アナログ、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、例えば、米国特許第６，０１３，８３６号；米国特許第５，１１７，０５７号；米国特許第５，５３０，０２８号；および米国特許第５，３７８，７２６号ならびに米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３号および米国特許出願公開第２００６／００２０１４６号に開示されるもの；米国特許出願公開第２００４／０１７１６５１号に記載されるようなオキサジアゾリン；ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、例えば、欧州特許出願第４６１，８０９号に開示されるもの；Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン、例えば、米国特許第５，２２５，４４３号に開示されるもの；Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン、例えば、欧州特許出願第２３４，９９４号に開示されるもの；Ｎ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン、例えば、米国特許第４，９８５，４６１号に記載されるもの；アルニドケトン（arnidoketone）、例えば、米国特許出願公開第２００４／００４９０３７号に記載されるもの；その各々は、参照によって本明細書に組み込まれる、ならびに３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド（8-O-acetylharpagide）、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−硫酸（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−硫酸、フラメソル（framesol）、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル（1,1-biphosphonate ester）、幼若ホルモンＩＩＩを含む他の類似の材料、など。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例には、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド−）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）が含まれる。例えば、それら両方がその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／１５５，１１１号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７５７号を参照のこと。
【０１８８】
単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドに対する抗体
本発明によれば、融合タンパク質を含む、組換え産生されるまたは化学合成によって産生されるｓｃＩＬ−１２ポリペプチド、およびそれらの断片または他の誘導体もしくはアナログが、抗体を生成するための抗原または免疫源として使用され得る。好ましくは、これらの抗体は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドに特異的に結合するが、ネイティブＩＬ−１２ポリペプチドには結合しない。より好ましくは、これらの抗体は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドに特異的に結合するが、他のサイトカインポリペプチドには結合しない。
【０１８９】
別の一実施形態では、本発明は、上記のような本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの断片を含む抗原性ペプチドを特異的に結合する抗体に関する。この抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの技術によって産生され得る。
【０１９０】
本発明の抗体は、特定のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドに結合するための特異性を有する。従って、これらまたは相同なポリペプチドの定性的または定量的な存在を決定するための試薬が、産生され得る。あるいは、これらの抗体は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを分離または精製するために使用され得る。
【０１９１】
ポリクローナル抗体の産生のために、適切な標的免疫系、典型的には、マウスまたはウサギが選択される。実質的に精製された抗原は、その動物にとって適切な方法、および免疫学者にとって周知の他のパラメーターによって決定される様式で、免疫系に提示される。注射のための典型的な部位は、足蹠中、筋内、腹腔内または皮内である。もちろん、別の種が、マウスまたはウサギの代わりになり得る。
【０１９２】
免疫学的応答は、通常、イムノアッセイを用いてアッセイされる。通常、かかるイムノアッセイには、例えば、抗原が産生されたのと同じ細胞によって同じ様式で産生された抗原の供給源のいくらかの精製が関与する。このイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光アッセイ、またはそのほとんどは機能的に等価であるが特定の条件下で利益を示し得る、多くの他の選択肢のうちいずれかであり得る。
【０１９３】
高い親和性を有するモノクローナル抗体は、典型的には、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory；またはGoding (1986), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New Yorkに記載されるような標準的な手順によって作製される。簡潔に述べると、適切な動物が選択され、所望の免疫化プロトコールが後に続く。適切な期間の後、かかる動物の脾臓が切り出され、個々の脾臓細胞が、適切な選択条件下で、典型的には不死化骨髄腫細胞と融合される。その後、これらの細胞は、クローン的に分離され、各クローンの上清は、抗原の所望の領域に対して特異的な適切な抗体の産生について試験される。
【０１９４】
他の適切な技術には、抗原性ポリペプチドへのリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露、あるいは、ファージまたは類似のベクター中の抗体のライブラリーの選択が関与する。参照によって本明細書に組み込まれる、Huse et al., (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281を参照のこと。
【０１９５】
本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変ありまたはなしで使用され得る。頻繁に、これらのポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を、共有結合または非共有結合のいずれかによって接続することによって標識される。広範な種々の標識およびコンジュゲート化技術は、公知であり、科学文献および特許文献の両方において広範に報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光、化学発光、磁性粒子などが含まれるがこれらに限定されない。かかる標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９３９，３５０号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，２７７，４３７号；米国特許第４，２７５，１４９号；および米国特許第４，３６６，２４１号が含まれる。また、組換え免疫グロブリンが産生され得る、Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。
【０１９６】
分子は、免疫系の抗原認識分子、例えば、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体と特異的に相互作用することが可能である場合、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５アミノ酸、好ましくは少なくとも約１０アミノ酸を含む。分子の抗原性部分は、抗体もしくはＴ細胞受容体認識について免疫優性である部分であり得、または、免疫化のための担体分子にその抗原性部分をコンジュゲート化することによってこの分子に対する抗体を生成するために使用される部分であり得る。抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である必要はない、即ち、担体なしに免疫応答を惹起することが可能である必要はない。
【０１９７】
かかる抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーが含まれるがこれらに限定されない。本発明のｓｃＩＬ−１２抗体は、交差反応性であり得る、例えば、これらの抗体は、異なる種由来のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを認識し得る。ポリクローナル抗体は、交差反応性のより高い可能性を有する。あるいは、本発明の抗体は、ヒトｓｃＩＬ−１２ポリペプチドなどのｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの単一の形態に対して特異的であり得る。好ましくは、かかる抗体は、ヒトｓｃＩＬ−１２に対して特異的である。
【０１９８】
当該分野で公知の種々の手順が、ポリクローナル抗体の産生のために使用され得る。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれるがこれらに限定されない種々の宿主動物が、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチド、またはその誘導体（例えば、断片もしくは融合タンパク質）による注射によって免疫化され得る。一実施形態では、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドまたはその断片は、免疫原性担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲート化され得る。以下が含まれるがこれらに限定されない種々のアジュバントが、宿主の種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得る：フロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin））およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）。
【０１９９】
ｓｃＩＬ−１２ポリペプチド、またはそれらの断片、アナログもしくは誘導体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養物中の連続的細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用され得る。これらには、Kohler and Milstein [Nature 256:495-497 (1975)]によって元々開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Kozbor et al., Immunology Today 4:72 1983)；Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983)］、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)］が含まれるがこれらに限定されない。本発明のさらなる一実施形態では、モノクローナル抗体は、無菌動物において産生され得る［国際特許出願公開番号ＷＯ８９／１２６９０、１９８９年１２月２８日公開］。実際、本発明によれば、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドに対して特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術［Morrison et al., J. Bacteriol. 159:870 (1984)；Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)；Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)］が使用され得る；かかる抗体は、本発明の範囲内である。これらのヒトまたはヒト化抗体は、免疫応答、特にアレルギー性応答をそれ自体誘導する可能性が、ゼノジニック抗体よりもかなり低いので、かかるヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾患または障害（以下に記載される）の療法における使用に好ましい。
【０２００】
本発明によれば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の産生のために記載された技術［Ｈｕｓｔｏｎに対する米国特許第５，４７６，７８６号および米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第４，９４６，７７８］が、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチド特異的単鎖抗体を産生するために適応され得る。本発明のさらなる一実施形態は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチド、またはその誘導体もしくはアナログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために記載された技術［Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)］を利用する。
【０２０１】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は、公知の技術によって生成され得る。例えば、かかる断片には、以下が含まれるがこれらに限定されない：抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂ’断片、ならびにパパインおよび還元剤によって抗体分子を処理することによって生成され得るＦａｂ断片。
【０２０２】
抗体の産生において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該分野で公知の技術、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を使用する）、ウエスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどによって、達成され得る。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の一実施形態では、この一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる一実施形態では、この二次抗体は、標識される。多くの手段が、イムノアッセイにおいて結合を検出するために当該分野で公知であり、本発明の範囲内である。例えば、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの特異的エピトープを認識する抗体を選択するために、かかるエピトープを含むｓｃＩＬ−１２ポリペプチド断片に結合する産物について、生成されたハイブリドーマをアッセイし得る。
【０２０３】
上述の抗体は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの局在化および活性に関する当該分野で公知の方法において、例えば、ウエスタンブロッティングのため、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕで画像化するため、上述のおよび当該分野で公知の検出技術のいずれかを使用して、適切な生理学的サンプル中のそのレベルを測定するためなどに使用され得る。
【０２０４】
単鎖ＩＬ−１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用
本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、種々の有用性を有する。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、免疫機能の刺激が有益であり得る疾患の処置において有用である。具体的実施形態では、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ガンマインターフェロンの増強された存在に対して応答性の疾患状態の処置のため；ウイルス、細菌、原生動物および寄生生物感染の処置のため；ならびに癌などの増殖性障害の処置のために、有用である。本発明のｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ワクチンアジュバントとしても有用である。
【０２０５】
ＩＦＮ−ガンマ産生を誘導する方法
本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、それを必要とする患者において、ＩＦＮ−ガンマの産生を誘導するために有用である。ＩＦＮ−ガンマ誘導から利益を得る病理学的状態は、疾患、照射または薬物に対する曝露から生じ得、これには、例えば以下が含まれるがこれらに限定されない：白血球減少症、細菌およびウイルス感染、貧血、骨髄移植後の免疫細胞または造血細胞欠損を含む、Ｂ細胞またはＴ細胞欠損。
【０２０６】
感染を処置する方法
本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、とりわけ、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、髄膜炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹、百日咳、脳炎ウイルス、パピローマウイルス、黄熱ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パルボウイルス、チクングニアウイルス、出血熱ウイルス、クレブシエラ属（Klebsiella）、ならびにヘルペスウイルス、特に水痘、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルス感染が含まれるがこれらに限定されない、ウイルス感染の処置において使用され得る。
【０２０７】
本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、とりわけ、ハンセン病、結核、ペスト菌（Yersinia pestis）、腸チフス、肺炎球菌細菌感染、破傷風および炭疽が含まれるがこれらに限定されない、細菌感染の処置において使用され得る。
【０２０８】
本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、とりわけ、例えば、リーシュマニア症およびマラリアであるがこれらに限定されない寄生生物感染；ならびに原生動物感染、例えば、クルーズトリパノソーマ（T. cruzi）であるがこれに限定されない、または蠕虫、例えば住血吸虫属（Schistosoma）の処置においても使用され得る。
【０２０９】
ワクチンアジュバントとしての使用の方法
これらのｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、ワクチンアジュバントとして有用である。「アジュバント」とは、免疫原または抗原と一緒に投与した場合に免疫応答を増強する物質を意味する。
【０２１０】
本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、髄膜炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹、百日咳、脳炎ウイルス、パピローマウイルス、黄熱ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パルボウイルス、チクングニアウイルス、出血熱ウイルス、クレブシエラ属（Klebsiella）、ならびにヘルペスウイルス、特に、水痘、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルスが含まれるがこれらに限定されないウイルスワクチンに対する免疫応答を増強するために有用である。
【０２１１】
本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、例えば、とりわけ、ハンセン病、結核、ペスト菌（Yersinia pestis）、腸チフス、肺炎球菌細菌、破傷風および炭疽に対するワクチンであるがこれらに限定されない細菌ワクチンに対する免疫応答を増強するためにも有用である。
【０２１２】
同様に、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、寄生生物感染（例えば、とりわけ、リーシュマニア症およびマラリア）に対するワクチン、ならびに原生動物感染（例えば、クルーズトリパノソーマ（T. cruzi））または蠕虫、例えば、住血吸虫属（Schistosoma）に対するワクチンに対する免疫応答を増強するためにも有用である。
【０２１３】
本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、治療的癌ワクチンに対する免疫応答を増強するためにも有用である。癌ワクチンは、癌細胞の表面上で発現された抗原を含み得る。この抗原は、癌細胞上に天然に存在し得る。あるいは、癌細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作され得、患者中に導入された場合に次いで発現する選択された抗原でトランスフェクトされ得る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドによって増強され得る癌ワクチンの非限定的な例には、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））が含まれる。
【０２１４】
ワクチンアジュバントを製剤化および投与する方法は、本明細書で参照によって組み込まれる米国特許第５，５７１，５１５号に記載される方法など、当該分野で公知である。
【０２１５】
癌を処置する方法
本発明に係るｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物は、癌を処置するために使用され得る。本発明に従って処置され得る癌の非限定的な例には、乳房癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳癌、原発性脳癌腫、頭頸部癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌腫、乳房癌腫、卵巣癌腫、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、精巣癌腫、膀胱癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、尿生殖器癌腫、甲状腺癌腫、食道癌腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌腫、腎細胞癌腫、子宮内膜癌腫、副腎皮質癌腫、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌、菌状息肉症、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、ヘアリー細胞白血病、神経芽腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟組織肉腫、中皮腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症および網膜芽細胞腫などが含まれるがこれらに限定されない。
【０２１６】
本発明は、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを治療有効量で患者に投与するステップを含む、癌を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、このｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、腫瘍内投与される。
【０２１７】
本発明は、治療有効用量のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを産生するのに十分な量で、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドを患者に投与するステップを含む、癌を処置する方法もまた提供する。特定の実施形態では、このｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、腫瘍内投与される。さらなる実施形態では、このｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドは、発現ベクター中に含まれる。好ましい一実施形態では、この発現ベクターは、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【０２１８】
本発明のｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、癌の処置、予防、寛解および／または治癒において、１または複数の治療剤および／または手順と組み合わせて投与され得る。
【０２１９】
具体的な一実施形態では、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、以下が含まれるがこれらに限定されない、癌の処置において有用な１または複数の化学療法剤と組み合わせて投与される：アルキル化剤；ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）；ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、エチレンイミン／メチル−メラミン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレンチオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン））；スルホン酸アルキル（ブスルファン）；トリアジン（ダカルバジン（ＤＴＩＣ））；葉酸アナログ（メトトレキサート、トリメトレキサート、ペメトレキセド）；ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル  フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシ−シチジン）；プリンアナログ（６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニル−アデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ））；Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン）；生物学的応答改変剤（ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）；分化剤（レチノイン酸誘導体、ホルモンおよびアンタゴニスト）；副腎皮質ステロイド／アンタゴニスト（プレドニゾンおよび等価物、デキサメタゾン、アミノグルテチミド）；プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）；エストロゲン（ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール／等価物）；抗エストロゲン（タモキシフェン）；アンドロゲン（プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン／等価物）；抗アンドロゲン（フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ、リュープロリド）；非ステロイド性抗アンドロゲン（フルタミド）；天然産物；抗有糸分裂薬物；タキサン（パクリタキセル、ビンカアルカロイド、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソテール（ドセタキセル）、エストラムスチン、リン酸エストラムスチン）；エピポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）；抗生物質（アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン（rubido-mycin））、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミスラマイシン）、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、アフィディコリン）；酵素（Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アルギナーゼ）；放射線増感剤（メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール（desmethylmisonidazole）、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、ＲＳＵ  １０６９、ＥＯ９、ＲＢ  ６１４５、ＳＲ４２３３、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン、５−ヨードデオキシウリジン、ブロモデオキシシチジン）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、アントラセンジオン、ミトキサントロン）；置換尿素（ヒドロキシ尿素）；オキサザホスホリン（シクロホスファミド；イホスファミド；トロホスファミド；マホスファミド（ＮＳＣ  ３４５８４２）、グルホスファミド（Ｄ１９５７５、ベータ−Ｄ−グルコシルイソホスホルアミドマスタード（beta-D-glucosylisophosphoramide mustard））、Ｓ−（−）−ブロモホスファミド（S-(-)-bromofosfamide）（ＣＢＭ−１１）、ＮＳＣ  ６１２５６７（アルドホスファミドペルヒドロチアジン（aldophosphamide perhydrothiazine））；ＮＳＣ  ６１３０６０（アルドホスファミドチアゾリジン（aldophosphamide thiazolidine））；イソホスホルアミドマスタード（isophosphoramide mustard）；パリホスファミドリジン（palifosfamide lysine））；メチルヒドラジン誘導体（Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）、プロカルバジン）；副腎皮質抑制薬（ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）、アミノグルテチミド）；サイトカイン（インターフェロン（アルファ、ベータ、ガンマ）、インターロイキン−２）；光増感剤（ヘマトポルフィリン誘導体、フォトフリン、ベンゾポルフィリン誘導体、Ｎｐｅ６、スズエチオポルフィリン（tin etioporphyrin）（ＳｎＥＴ２）、フェオホルビド−ａ、バクテリオクロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン）；および照射（Ｘ線、紫外線、ガンマ線照射、可視光、赤外線照射、マイクロ波照射）。
【０２２０】
投与の様式
ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、全身的または局所的に（例えば、疾患または障害の部位において）、対象に投与され得る。全身投与は、皮下および静脈内を含む、任意の適切な方法により得る。局所投与は、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、または組織もしくは器官中への直接注射、例えば腫瘍内注射が含まれるがこれらに限定されない、任意の適切な方法により得る。
【０２２１】
特定の実施形態では、ｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドの発現は、例えば以下に記載されるような、リガンド誘導性遺伝子スイッチ系によって制御される：ＰＣＴ／ＵＳ２００１／００９０５０（ＷＯ２００１／０７０８１６）；米国特許第７，０９１，０３８号；米国特許第７，７７６，５８７号；米国特許第７，８０７，４１７号；米国特許第８，２０２，７１８号；ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０３０６０８（ＷＯ２００２／０２９０７５）；米国特許第８，１０５，８２５号；米国特許第８，１６８，４２６号；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５２３５（ＷＯ２００２／０６６６１３）；米国特許出願第１０／４６８，２００号（米国特許出願公開第２０１２０１６７２３９号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０６（ＷＯ２００２／０６６６１４）；米国特許第７，５３１，３２６号；米国特許第８，２３６，５５６号；米国特許第８，５９８，４０９号；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０９０（ＷＯ２００２／０６６６１２）；米国特許出願第１０／４６８，１９３号（米国特許出願公開第２００６０１００４１６号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５２３４（ＷＯ２００３／０２７２６６）；米国特許第７，６０１，５０８号；米国特許第７，８２９，６７６号；米国特許第７，９１９，２６９号；米国特許第８，０３０，０６７号；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０８（ＷＯ２００２／０６６６１５）；米国特許出願第１０／４６８，１９２号（米国特許出願公開第２０１１０２１２５２８号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０２６（ＷＯ２００３／０２７２８９）；米国特許第７，５６３，８７９号；米国特許第８，０２１，８７８号；米国特許第８，４９７，０９３号；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５０８９（ＷＯ２００５／１０８６１７）；米国特許第７，９３５，５１０号；米国特許第８，０７６，４５４号；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１２７０（ＷＯ２００９／０４５３７０）；および米国特許出願第１２／２４１，０１８号（米国特許出願公開第２００９０１３６４６５号）。これらの実施形態では、遺伝子スイッチの制御下にあるｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドが対象に一旦導入されると、活性化リガンドが、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドの発現を誘導するために投与され得る。このリガンドは、全身的（例えば、経口、静脈内）または局所的に（例えば、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、その疾患または障害が存在する組織または器官中への、腫瘍内を含む直接注射）のいずれかで、任意の適切な方法によって投与され得る。リガンド投与の最適なタイミングは、慣用的な技術のみを使用して、各型の細胞および疾患または障害について決定され得る。
【０２２２】
特定の実施形態では、ｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドは、活性化リガンドによって活性化され得る遺伝子スイッチの制御下で条件付きでｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された細胞、例えば、免疫細胞（例えば、樹状細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞）または幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、子宮内膜幹細胞、子宮内膜再生細胞（endometrial regenerative cell）（ＥＲＣ）、胚性幹細胞）中に導入される。かかる方法は、例えば以下に詳細に記載されている：ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１５６３（ＷＯ２００９／０４８５６０）；米国特許出願第１２／２４７，７３８号（米国特許出願公開第２００９０１２３４４１号）；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５５１０（ＷＯ２０１０／０４２１８９）；米国特許出願第１３／１２３，１２９号（米国特許出願公開第２０１１０２６８７６６号）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２９６８２（ＷＯ２０１１／１１９７７３）；米国特許出願第１３／６３６，４７３号（米国特許出願公開第２０１３０１９５８００号）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２７５１５（ＷＯ２０１２／１２２０２５）；および米国特許出願第１４／００１，９４３号（米国特許出願公開［係属中］）。
【０２２３】
一実施形態では、免疫細胞または幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された細胞を産生するために、ｓｃＩＬ−１２ポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターでトランスフェクトされる。
【０２２４】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された免疫細胞または幹細胞は、自家細胞である。別の一実施形態では、このｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された免疫細胞または幹細胞は、同種である。
【０２２５】
本発明の一実施形態は、以下の順のステップを含む、腫瘍を処置するための方法を提供する：１）遺伝子スイッチの制御下にあるｓｃＩＬ−１２ベクターを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された免疫細胞または幹細胞の集団を、哺乳動物において腫瘍内投与するステップ；および２）治療有効量の活性化リガンドを前記哺乳動物に投与するステップ。
【０２２６】
特定の実施形態では、この哺乳動物はヒトである。他の実施形態では、この哺乳動物は、イヌ、ネコまたはウマである。
【０２２７】
一実施形態では、この活性化リガンドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された細胞またはベクター、例えば、アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベクターを含む組成物と実質的に同じ時点で、例えば、これらの細胞またはベクター組成物の投与の前または後１時間以内に、投与される。別の一実施形態では、この活性化リガンドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された免疫細胞もしくは幹細胞、またはベクターの投与の約２４時間後またはそれ未満の時点で投与され得る。なお別の一実施形態では、この活性化リガンドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された免疫細胞もしくは幹細胞、またはベクターの約４８時間後またはそれ未満の時点で投与される。別の一実施形態では、このリガンドは、ＲＧ−１１５９３２である。別の一実施形態では、このリガンドは、約１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。別の一実施形態では、このリガンドは、約３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。別の一実施形態では、このリガンドは、７〜２８日間の期間にわたって毎日投与される。別の一実施形態では、このリガンドは、１４日間の期間にわたって毎日投与される。別の一実施形態では、約１×１０６〜１×１０８の細胞が投与される。別の一実施形態では、約１×１０７の細胞が投与される。
【０２２８】
実質的に純粋なポリペプチド、その生物学的に活性な断片およびそれらをコードする組換えポリヌクレオチドを提供したところで、本発明は、それらの各々を含む細胞もまた提供する。当該分野で周知の適切な導入技術によって、それらを含む細胞が産生され得る。例えば、Sambrook et al. (1989)を参照のこと。
【０２２９】
宿主細胞および非ヒト生物
本発明の別の態様には、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む細胞が関与する。具体的な一実施形態では、本発明は、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む単離された宿主細胞に関する。本発明は、本発明に係る発現ベクターを含む単離された宿主細胞にも関する。別の具体的な一実施形態では、本発明は、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含む単離された宿主細胞に関する。別の具体的一実施形態では、本発明は、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現モジュレーション系でトランスフェクトされた単離された宿主細胞に関する。なお別の一実施形態では、本発明は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを産生するための方法に関し、この方法は、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、培養培地中で、本発明のｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞を培養するステップ、およびこの培養物からｓｃＩＬ−１２ポリペプチドを単離するステップを含む。
【０２３０】
一実施形態では、この単離された宿主細胞は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である。別の具体的一実施形態では、この単離された宿主細胞は、無脊椎動物宿主細胞または脊椎動物宿主細胞である。好ましくは、この単離された宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、線形動物細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、トリ細胞、動物細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される。例えば、限定ではなく、この単離された宿主細胞は、酵母細胞、線形動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、乳牛細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞もしくは非ヒト霊長類細胞（例えば、シミアン細胞、サル細胞、チンパンジー細胞）、またはヒト細胞であり得る。
【０２３１】
宿主細胞の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：真菌もしくは酵母種、例えば、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、または細菌種、例えば、シネコシスティス属（Synechocystis）、シネココッカス属（Synechococcus）、サルモネラ属（Salmonella）、桿菌属（Bacillus）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、大腸菌属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、シネコシスティス属（Synechocystis）、アナベナ属（Anabaena）、硫黄菌属（Thiobacillus）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）およびクレブシエラ属（Klebsiella）のもの；動物；ならびに哺乳動物宿主細胞。
【０２３２】
一実施形態では、この単離された宿主細胞は、サッカロマイセス属（Saccharomyces）宿主細胞、ピキア属（Pichia）宿主細胞およびカンジダ属（Candida）宿主細胞からなる群より選択される酵母細胞である。
【０２３３】
別の一実施形態では、この単離された宿主細胞は、線虫（Caenorhabditis elegans）線形動物細胞である。
【０２３４】
別の一実施形態では、この単離された宿主細胞は、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、乳牛細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、非ヒト霊長類細胞（例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞）およびヒト細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である。
【０２３５】
宿主細胞の形質転換は、当該分野で周知であり、エレクトロポレーション、ウイルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非ウイルスベクター媒介性トランスフェクション、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）媒介性形質転換、微粒子銃などが含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって達成され得る。所望の遺伝子産物の発現には、適切な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養するステップ、および形質転換された遺伝子の発現を誘導するステップが関与する。原核生物細胞および真核生物細胞における培養条件および遺伝子発現プロトコールは、当該分野で周知である（実施例の一般的な方法のセクションを参照のこと）。細胞が回収され得、遺伝子産物が、この遺伝子産物に特異的なプロトコールに従って単離され得る。
【０２３６】
さらに、トランスフェクトされたポリヌクレオチドの発現をモジュレートする、または所望の特定の様式でポリペプチド産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞が、選択され得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾［例えば、グリコシル化、切断（例えば、シグナル配列の）］のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化コアタンパク質産物を産生するために使用され得る。しかし、細菌において発現されたポリペプチドは、正確に折り畳まれない可能性がある。酵母における発現は、グリコシル化産物を産生し得る。真核生物細胞における発現は、異種タンパク質の「ネイティブの」グリコシル化および折り畳みの可能性を増加させ得る。さらに、哺乳動物細胞における発現は、ポリペプチドの活性を再構成または構成するためのツールを提供し得る。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、タンパク質分解性切断などのプロセシング反応に、異なる程度まで影響を与え得る。
【０２３７】
本発明は、本発明に係る単離された宿主細胞を含む非ヒト生物にも関する。具体的な一実施形態では、この非ヒト生物は、原核生物または真核生物である。別の具体的一実施形態では、この非ヒト生物は、無脊椎動物生物または脊椎動物生物である。
【０２３８】
特定の実施形態では、この非ヒト生物は、細菌、真菌、酵母、線形動物、昆虫、魚類、植物、鳥類、動物および哺乳動物からなる群より選択される。より好ましくは、この非ヒト生物は、酵母、線形動物、昆虫、植物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジまたは非ヒト霊長類（例えば、シミアン、サルもしくはチンパンジー）である。
【０２３９】
本発明は、本発明の例示として提供された以下の非限定的な実施例を参照してより良く理解され得る。
【実施例】
【０２４０】
一般的な分子生物学技術
本発明によれば、当業者の技術範囲内の慣習的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。かかる技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (本明細書で「Green & Sambrook, 2012」)；DNA Cloning:  A Practical Approach, Volumes I and II, Second Edition (D.M. Glover and B.D. Hames, eds. 1995)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]；Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]；Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications [R.I. Freshney (2010)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Second Edition (1988)；F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (2013)を参照のこと。
【０２４１】
慣習的なクローニングビヒクルには、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ型プラスミドならびにＭ１３シリーズのファージが含まれる。これらは、市販で取得され得る（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【０２４２】
ライゲーションのために、ＤＮＡ断片は、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によって、それらのサイズに従って分離され得、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物で抽出され得、エタノールで沈殿され得、次いで、供給業者の推奨に従ってファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の存在下でインキュベートされ得る。
【０２４３】
５’突出末端の充填は、供給業者の仕様に従って大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施され得る。３’突出末端の破壊は、製造業者の推奨に従って使用されるファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の存在下で実施される。５’突出末端の破壊は、Ｓ１ヌクレアーゼによる制御された処理によって実施される。
【０２４４】
合成オリゴデオキシヌクレオチドによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで指示される変異誘発は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって配布されるものなどの市販のキットを使用して、Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]によって開発された方法に従って実施され得る。
【０２４５】
ＰＣＲ［ポリメラーゼ触媒連鎖反応、Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354；Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350］技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、製造業者の仕様に従って「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して実施され得る。
【０２４６】
ヌクレオチド配列の検証は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅおよびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．によって配布されるものなどの市販のキットを使用して、Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]によって開発された方法に従って実施され得る。
【０２４７】
プラスミドＤＮＡは、製造業者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによって精製され得る。
【実施例１】
【０２４８】
ｓｃＩＬ−１２融合タンパク質の設計
単鎖ＩＬ−１２分子を、図１に示される２つの構成のうちの１つを有するように設計した：
１）ｐ４０−リンカー−ｐ３５構成（図１Ａ）は、ペプチドリンカーを介して成熟ｐ３５サブユニット（シグナルペプチドなし）に融合された全長ｐ４０サブユニット（野生型シグナルペプチドを含む）を含む；
２）ｐ３５−リンカー−ｐ４０構成（図１Ｂ）は、ペプチドリンカーを介して成熟ｐ４０サブユニット（シグナルペプチドなし）に融合された全長ｐ３５サブユニット（野生型シグナルペプチドを含む）を含む；ならびに
３）ｐ４０Ｎ−ｐ３５−ｐ４０Ｃ挿入物構成（図１Ｃ）は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
（ｉ）第１のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）、
（ｉｉ）任意選択の第１のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）ＩＬ−１２  ｐ３５ドメイン、
（ｉｖ）任意選択の第２のペプチドリンカー、および
（ｖ）第２のＩＬ−１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）
を含む。
【０２４９】
特定のヒトｓｃＩＬ−１２構築物を表１にまとめる。説明の欄において番号によって特定されたアミノ酸残基は、それぞれ配列番号２および配列番号４に示される全長ヒトｐ４０サブユニットまたはｐ３５サブユニットのアミノ酸番号付けを指す。例えば、それぞれ配列番号９および配列番号１０に対応する、ｓｃＩＬ−１２構築物ＩＤ１４８１２７３の核酸配列およびアミノ酸配列は、ｐ４０Ｎ−ｐ３５−ｐ４０Ｃ挿入物構成である；これは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、配列番号２のアミノ酸１〜２９３からなる第１のｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）、ＴＰＳ（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ；配列番号４１）の第１のリンカー配列、配列番号４のアミノ酸５７〜２５３からなる成熟ｐ３５配列、ＧＰＡＰＴＳ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ；配列番号４２）の第２のペプチドリンカー配列、および配列番号２のアミノ酸２９４〜３２８からなる第２のｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）を含むように設計した。
【０２５０】
構築物ＩＤ１４８１２７２（配列番号１１および１２）もまた、ｐ４０Ｎ−ｐ３５−４０Ｃ挿入物構成であるが、ｐ３５挿入物は、ｐ４０サブユニットのアミノ酸残基２５９と２６０との間に存在する。
【０２５１】
残りのｓｃＩＬ−１２設計（構築物ＩＤ１４８０５３３〜１４８０５４６）は、表１に示されるような種々のリンカーを有するｐ４０−ｐ３５またはｐ３５−ｐ４０単鎖ＩＬ−１２分子を示す。
【０２５２】
並行するマウス構築物もまた、ヒトＩＬ−１２配列の代わりにマウスｐ４０およびｐ３５配列（配列番号５〜８）を使用して設計した。
【０２５３】
【表１】
2017501712.tif 000003
【０２５４】
本発明の実施形態には、上の表１に示されるｓｃＩＬ−１２構築物が含まれるがこれらに限定されない。本発明のｓｃＩＬ−１２構築物は、シグナルペプチド配列（シグナルペプチド配列ありもしくはなしで合成されたか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの発現および翻訳後プロセシングに引き続く、分泌形態におけるポリペプチド切断の結果として生じ得るかどうかに関わらない）を含んでも含まなくてもよい。例えば、限定ではなく、ｓｃＩＬ−１２構築物番号１４８１２７３（ｐ４０Ｎ（１〜２９３）−ＴＰＳ−ｐ３５（５７〜２５３）−ＧＰＡＰＴＳ−ｐ４０Ｃ（２９４〜３２８））に関して、本発明の実施形態は、シグナルペプチドなしのこのポリペプチド配列（例えば、ｐ４０Ｎ（２３〜２９３）−ＴＰＳ−ｐ３５（５７〜２５３）−ＧＰＡＰＴＳ−ｐ４０Ｃ（２９４〜３２８））もまた含む。同様に、限定ではなく、本発明の実施形態は、シグナルペプチドなしの、表１に示された残りのｓｃＩＬ−１２構築物のいずれかを含む。
【実施例２】
【０２５５】
ＣＨＯ細胞におけるｓｃＩＬ−１２融合タンパク質の発現
ヒトＧＡＰＤＨ由来の５’ＵＴＲエレメント、合成３’ＵＴＲエレメントと共にヒトまたはマウスｓｃＩＬ−１２（全ての場合において、ＮｈｅＩ部位とＣｌａＩ部位との間にクローニングした）のいずれかを含むベクターを構築し、導入遺伝子発現を構成的ＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。ヒトまたはマウスｓｃＩＬ−１２構築物をコードするベクターを、標準的なハイスループットトランスフェクション方法を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣアクセッションＣＣＬ−６１）中に３連で一過的にトランスフェクトした。簡潔に述べると、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、トリプシン処理し、計数し、全増殖培地（whole growth media）（Ｆ１２−Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ）＋Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））中で１２０，０００細胞／ｍｌで再懸濁した。１５０マイクロリットルの細胞懸濁物を、９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加した。プラスミドＤＮＡを、無菌水中に１００ｎｇ／μｌで調製し、３：１の比率のＤＮＡ対Ｆｕｇｅｎｅ  ６でＦｕｇｅｎｅ  ６試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と複合体化させた。５マイクロリットルのＤＮＡ／Ｆｕｇｅｎｅ６複合体を、細胞を含む９６ウェルプレートに添加した。次いで、これらの細胞を、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、培養物上清を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイに使用するまで−８０℃で凍結させた。陽性対照は、二鎖ＩＬ−１２（それぞれ、バーＡおよびＤとして図２中で標識されるｐ３５−ＩＲＥＳ−ｐ４０およびｐ４０−ＩＲＥＳ−ｐ３５）を発現するベクターを含んだ。トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞由来の培養物上清を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ＋１０％馴化ＣＨＯ−Ｋ１培地中に、１：１０、１：１００および１：１０００希釈した。
【０２５６】
ｓｃＩＬ−１２の発現を、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡアッセイ実行によって検出した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ４１９（マウスＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡ）およびカタログ番号ＤＹ１２７０（ヒトＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡ）。ベクター１つ当たり９つのサンプルを分析した。
【０２５７】
ヒトｓｃＩＬ−１２発現が、評価した３６のベクターのうち２０において検出され、５００ｐｇ／ｍＬ〜９００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。図２を参照のこと。マウスｓｃＩＬ−１２発現は、試験した３６のベクターのうち１８において検出された。マウスｓｃＩＬ−１２発現は、３８５ｐｇ／ｍＬ〜１．８μｇ／ｍＬの範囲であった（データ示さず）。ヒト構築物およびマウス構築物の両方について、ｐ４０−リンカー−ｐ３５構成は、ｐ３５−リンカー−ｐ４０構成および二鎖（バイシストロン性）ＩＬ−１２よりも高い発現レベルを実証し、これは、ｐ４０−リンカー−ｐ３５トポロジーを有するｓｃＩＬ−１２が、ｐ３５−リンカー−ｐ４０単鎖構成および二鎖ＩＬ−１２と比較して、増強された発現、折り畳みおよび／またはヘテロダイマーアセンブリを有することを示唆している。
【０２５８】
驚くべきことに、構成：
ｐ４０Ｎ（１〜２９３）−ＴＰＳ−ｐ３５（５７〜２５３）−ＧＰＡＰＴＳ−ｐ４０Ｃ（２９４〜３２８）
を有するヒトｓｃＩＬ−１２構築物ＩＤ１４８１２７３は、二鎖（バイシストロン性）ベクター（ｐ４０−ＩＲＥＳ−ｐ３５およびｐ３５−ＩＲＥＳ−ｐ４０）および単鎖ｐ３５−リンカー−ｐ４０構成によって産生されたレベルと類似のｓｃＩＬ−１２タンパク質発現を生じたが、ｐ４０−リンカー−ｐ３５構成ほど高くはなかった。図２を参照のこと。類似の発現パターンが、マウスｓｃＩＬ−１２設計について観察された。構成ｐ４０Ｎ（１〜２５９）−ＧＳ−ｐ３５（５７〜２５３）−ＰＱＴＰＧＰ−ｐ４０Ｃ（２６０〜３２８）を有する構築物ＩＤ１４８１２７２は、検出可能なタンパク質を発現しないことが見出された。
【実施例３】
【０２５９】
ＮＫ細胞におけるＩＦＮ−ガンマ産生のｓｃＩＬ−１２刺激
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＩＬ−１２曝露に応答してインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）を分泌する。従って、本発明者らは、本発明のｓｃＩＬ−１２設計の機能的活性を検出するためのバイオアッセイにおいて、ＮＫ−９２細胞（ＡＴＣＣアクセッションＣＲＬ−２４０７）、ヒトナチュラルキラー細胞株におけるＩＦＮ−ガンマ産生を測定した。
【０２６０】
ＮＫ−９２細胞を、推奨された培養培地（リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドなしのＡｌｐｈａ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム；０．２ｍＭイノシトール；０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール；０．０２ｍＭ葉酸；１００〜２００Ｕ／ｍｌ組換えＩＬ−２を含む；１２．５％ウマ血清および１２．５％胎仔ウシ血清の最終濃度に調整した）を使用して、製造業者の指示に従って培養した。ＮＫ−９２細胞を、アッセイでの使用の前に２４〜４８時間継代培養した。アッセイの当日に、ＮＫ−９２細胞を、トリパンブルーで染色することによって計数し、１ウェル当たり５×１０４細胞で９６ウェルプレート中に播種した。実施例２で取得したＣＨＯ−Ｋ１／ｓｃＩＬ−１２培養物上清を、ＮＫ−９２全増殖培地中に１：５希釈し、ＮＫ−９２細胞に添加した。対照は、トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１細胞由来の培養物上清（図３中で「Ｍｏｃｋ」と標識される）および陰性対照としてＩＬ−１２を発現しないプラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞由来の培養物上清（即ち、ＣＭＶ−ＧＦＰ；図３中で「陰性」と標識される）；ならびに１２５０ｎｇ／ｍｌまたは１２５ｎｇ／ｍｌ（それぞれ、図３中の左および右の陽性対照バー）で試験した市販の組換えヒトＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）からなる陽性対照を含んだ。ＮＫ−９２細胞培養物上清を、４８時間後に回収し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ中に、１：１０、１：１００および１：１０００希釈した。培養培地中のＩＦＮ−ガンマの量を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＹ２８５）を使用して決定した。ベクター１つ当たり９つのサンプルを分析した。
【０２６１】
ヒトｓｃＩＬ−１２タンパク質は、ＮＫ−９２においてヒトＩＦＮ−ガンマ産生を刺激した。ヒトＩＦＮ−ガンマ発現は、６００ｐｇ／ｍＬ〜３３ｎｇ／ｍＬの範囲であった。図３を参照のこと。類似のＩＦＮ−ガンマレベルが、マウスｓｃＩＬ−１２構築物について観察された。
【０２６２】
驚くべきことに、比較的低いタンパク質発現レベルを示したｓｃＩＬ−１２構築物ＩＤ１４８１２７３（実施例２を参照のこと）は、ＮＫ−９２バイオアッセイにおいて組換え二鎖ＩＬ−１２およびｐ４０−ｐ３５単鎖構築物と等価な活性を実証し、これは、構築物ＩＤ１４８１２７３が、分子１つ当たりで、より活性であり得ることを示唆している。
【実施例４】
【０２６３】
ＮＫ細胞を使用する例示的なＩＬ−１２機能的アッセイ
本明細書に記載されるアッセイは、ＩＬ−１２ポリペプチド（例えば、組換え産生された異種ｐ３５／ｐ４０（ｐ７０）ポリペプチドおよび単鎖ＩＬ−１２（ｐ７０）ポリペプチド）が、免疫細胞（例えばＮＫ−９２細胞であるがこれに限定されない）において、用量依存的様式でインターフェロン−ガンマ（「ＩＦＮ−ガンマ」または「ＩＦＮ−ｇ」）産生を誘導する能力を測定するために使用され得る。本発明の分野における当業者は、ＩＬ−１２の生物学的活性を測定するために、アッセイおよび手順、ならびに使用される異なるアッセイを改変し得ることが理解される。
【０２６４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＩＬ−１２との接触（ＩＬ−１２への曝露）に応答してインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）を分泌する。従って、このアッセイでは、ＮＫ−９２細胞を、上昇する用量の組換えヒトおよび／またはマウスＩＬ−１２によって２４時間刺激する。引き続いて、ＮＫ−９２上清中のＩＦＮ−ガンマを、ＥＬＩＳＡによって測定する。結果として、ＩＦＮ−ガンマ発現は、ＩＬ−１２用量の減少と共に減少し（または逆に、用量飽和の特定のレベルまで、ＩＦＮ−ガンマ発現は、ＩＬ−１２用量の増加と共に増加する）。
【０２６５】
図４は、ヒトＩＬ−１２およびマウスＩＬ−１２を使用して用量反応グラフ（または「曲線」）で取得された典型的な結果を示し、ここで、上昇する用量のＩＬ−１２で２４時間処理したＮＫ−９２細胞によるＩＦＮ−ガンマの用量依存的発現が測定された。このアッセイでは、ＮＫ−９２細胞を、５０，０００細胞／ウェルで播種し、０．０６〜１０００ナノグラム（ｎｇ）／ｍＬの組換えヒトまたはマウスＩＬ−１２で処理した。２４時間後にＮＫ−９２上清を播種し、ヒトＩＦＮ−ガンマのＥＬＩＳＡ検出によって試験した。示されたデータは、１：５のサンプル希釈に基づいて計算した、３つの復元サンプルからの平均ＩＦＮ−ガンマ発現を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。ＥＬＩＳＡを、細胞からの内因性ＩＦＮ−ガンマ発現を説明するために、２０％  ＮＫ−９２馴化培地の存在下で実行した。これらの結果は、ＮＫ−９２細胞からのＩＦＮ−ガンマ発現が、ＩＬ−１２用量依存的であることを実証している。顕著なことに、ＮＫ−９２細胞は、ヒトおよびマウスの両方のＩＬ−１２に対して同様に応答した。
【０２６６】
このアッセイで使用したプロトコールは、回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離したＮＫ−９２細胞を利用した。使用済みの培地を除去し、１／５体積の新鮮な培地で置き換えた。細胞を、血球計を使用して計数し、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。１ウェル当たり５０マイクロリットルのＮＫ−９２細胞を、９６ウェルの組織培養物処理プレート中にプレートし、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で、投薬の準備ができるまでインキュベートした。ｒｈＩＬ−１２（組換えヒトＩＬ−１２）またはｒｍＩＬ−１２（組換えマウスＩＬ−１２）の希釈曲線を、１０００、２５０、６２．５、１５．６３、３．９１、０．９８、０．２４および０．０６ナノグラム／ｍＬの最終濃度のＩＬ−１２で、ＮＫ−９２培養培地中にＩＬ−１２を希釈することによって作成した。９６ウェルプレート（ＮＫ９２細胞を有する）の各ウェルに、１ウェル当たり５０マイクロリットルのＩＬ−１２を投薬した；次いで、プレートを、２４時間インキュベートした。
【０２６７】
ＮＫ９２細胞プレートを、引き続いて遠心分離し、細胞培養物上清を回収し、アッセイ（ＩＦＮ−ガンマについての）の準備ができるまで４℃で貯蔵した。インターフェロン−ガンマＥＬＩＳＡについて、組換えタンパク質の検量線を、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、１５．６および０ピコグラム（ｐｇ）／ｍＬの濃度のＩＦＮ−ガンマで作成した。ＥＬＩＳＡ分析を、標準的な手順；ＩＦＮ−ガンマ標準を、１：５、１：２５、１：１２５、１：６２５および１：３１２５希釈のＮＫ９２細胞上清と比較すること、を使用して実施した。得られた結果を図４に示す。
【実施例５】
【０２６８】
単鎖ＩＬ−１２構築物の産生および生物学的活性試験
実験を実施して、２９３Ｔ細胞において単鎖ＩＬ−１２構築物を発現させ、ＩＬ−１２の用量反応生物学的活性（即ち、ＩＬ−１２ポリペプチドが用量依存的様式でＮＫ−９２細胞からのＩＦＮ−ガンマ産生を刺激する能力）を測定した。これらの実験は、本発明の単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）ポリペプチド（ここで、リンカー配列の長さは、存在する場合、ＩＬ−１２  ｐ４０ポリペプチド内にＩＬ−１２  ｐ３５ポリペプチド配列を挿入することによって最小化される）が、ネイティブＩＬ−１２の生物学的活性と類似の、用量依存的なＩＬ−１２生物学的活性を保持することをさらに示している。
【０２６９】
３つのＩＬ−１２構築物を、７２時間にわたる２９３Ｔ細胞の一過的なトランスフェクションによって発現させた。トランスフェクトされた上清を回収し、ＩＬ−１２  ｐ７０（即ち、ｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーまたは単鎖ＩＬ−１２ポリペプチド）を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。次いで、ＩＬ−１２構築物を、上昇する用量のＩＬ−１２（０．００００１〜１００ナノグラム／ｍＬ）でＮＫ−９２細胞を処理することによって、機能的アッセイにおいて試験した。組換えヒトＩＬ−１２（ＮＫ−９２細胞からのＩＦＮ−ガンマの用量依存的発現を誘導することが以前に実証された）を、陽性対照として含めた。ＧＦＰ対照ベクターでトランスフェクトされた細胞からの２９３Ｔ細胞上清を、陰性対照として含めた。結果は、単鎖ＩＬ−１２タンパク質およびネイティブＩＬ−１２タンパク質の両方が、ＮＫ−９２細胞による用量依存的なＩＦＮ−ガンマ発現を誘導したことを示している。さらに、誘導のレベルは、これら３つのＩＬ−１２構築物ならびに陽性対照の各々にまたがって類似であった。２９３Ｔ  ＧＦＰトランスフェクト上清で処理したＮＫ−９２細胞からのＩＦＮ−ガンマ発現は、観察されなかった。図５を参照のこと。
【０２７０】
【表２】
2017501712.tif 000004
【０２７１】
ＩＦＮ−ガンマ定量化手順
細胞播種：トランスフェクションの１日前に、２９３Ｔ細胞を、７．５８ｅ５細胞／ウェル（１０％  ＦＢＳ、ＤＭＥＭ、１×ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の培地組成）で６ウェルディッシュ中に播種し、５％二酸化炭素を補充した空気中で３７℃で一晩インキュベートした。
【０２７２】
トランスフェクション：次の日、ＤＮＡベクターを、１００マイクログラム／ｍＬの最終濃度のＤＮＡ（出発ＤＮＡ濃度は、１０００〜１３００マイクログラム／ｍＬの範囲であった）に希釈した。トランスフェクション混合物を、１５ｍＬコニカルポリスチレンチューブ中に、２２マイクロリットルのＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）、３０８マイクロリットルのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）細胞培養培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）および３６．７マイクロリットルのＤＮＡ溶液を用いて調製した。チューブを、迅速ではあるが穏やかに撹拌して混合し、室温で１５分間インキュベートした。１６７マイクロリットルのトランスフェクション混合物を、２連のウェルで、ベクター２７５５６６および２７５５６７と共に、６ウェルディッシュ中の各ウェルに添加した。プレートを、５％二酸化炭素と共に３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの７２時間後、細胞培養物上清を回収し、０．２ミクロンのフィルターおよびシリンジを使用して無菌濾過した。１サンプル当たり１５０マイクロリットルを、ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡ定量化に使用した。残りを、ＩＦＮ−ガンマアッセイにおける使用まで、−８０℃で貯蔵した。
【０２７３】
ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡ：市販のＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡのＨｕｍａｎ  ＩＬ−１２  ｐ４０（およびｐ７０）ＤＵＯＳＥＴ（登録商標）ＥＬＩＳＡ）を、細胞培養物上清中のＩＬ−１２の定量化のために、製造業者の指示に従って使用した。４５０ｎｍにおけるＥＬＩＳＡプレートの光学的吸収を測定した。細胞培養物上清は、以下の濃度のＩＬ−１２を有することが決定された：８３６４ｎｇ／ｍＬでのｐ４０Ｎ−ｐ３５−ｐ４０Ｃ（ベクター２７５５６６）；２８９０３ｎｇ／ｍＬでのｐ４０／ｐ３５ヘテロダイマー（ベクター２７５５６７）；および５７１９７ｎｇ／ｍＬでのｐ４０−リンカー−ｐ３５（ベクター２７５５６２）。ＩＬ−１２細胞培養物上清を、２０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度のＩＬ−１２に希釈した（２９３Ｔ細胞のＧＦＰトランスフェクト上清を、ｐ４０Ｎ−ｐ３５−ｐ４０Ｃ上清と同じ希釈係数で希釈した）。
【０２７４】
ＮＫ−９２機能的アッセイ：１日目に、ＮＫ−９２細胞を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。使用済みの培地を除去し、１／５体積の新鮮な培地で置き換えた。細胞を、血球計を使用して計数した。２．０３ｅ６ｃ／ｍＬにおいて８８％の生存細胞計数が観察された。１ｅ６細胞／ｍＬにおける８ｍＬのＮＫ−９２細胞を調製した（１ｅ６ｃ／ｍＬでの８ｍＬを生成するために、４．５ｍＬ細胞＋３．５ｍＬ培地を使用する）。ＮＫ９２細胞を、１ウェル当たり５０マイクロリットルで、２つの９６ウェルの組織培養物処理プレート中に播種し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで、ＩＬ−１２による投薬の準備ができるまでインキュベートした。１０倍希釈のＩＬ−１２を、２００、２０、２、０．２、０．０２、０．００２、０．０００２および０．００００２ｎｇ／ｍＬの最終濃度に調製した。次いで、９６ウェルプレート中のＮＫ−９２細胞に、５０マイクロリットルのＩＬ−１２を（各濃度において３連または４連で）投薬し、２４時間にわたってインキュベーターに戻した。２日目に、９６ウェルプレート中の各ウェルの内容物を、９６ウェルのＶ底プレートに移し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を集めて（細胞を廃棄した）、ＩＦＮ−ガンマ量についてのアッセイに使用するまで、４℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡ分析を実施して、組換えＩＦＮ−ガンマの検量線と比較して、市販のキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＨｕｍａｎ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ＤＵＯＳＥＴ（登録商標）ＥＬＩＳＡ）を使用して、製造業者の指示に従ってＩＦＮ−ガンマ産生を定量化した。４５０ｎｍにおける光学的吸収を測定した。
【０２７５】
結果：図５は、漸増する用量のＩＬ−１２（ＩＬ−１２への２４時間の曝露）で処理したＮＫ−９２細胞からのＩＦＮ−ガンマの発現を示す。ＮＫ−９２細胞を、５０，０００細胞／ウェルで播種し、０．００００１〜１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１２、２９３Ｔ細胞において発現させたＩＬ−１２、またはＧＦＰトランスフェクトした細胞由来の２９３Ｔ上清（陰性対照）で処理した。ＩＬ−１２誘導したＮＫ−９２細胞上清を、２４時間後に回収し、ヒトＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＡによって試験した。データは、１：５および１：２５のサンプル希釈で２連で試験した、３〜４つの復元サンプルからの平均ＩＦＮ−ガンマ発現を示す（ｎ＝１２）。エラーバーは、標準偏差を示す。ＥＬＩＳＡを、細胞からの内因性ＩＦＮ−ガンマ発現を説明するために、２０％  ＮＫ−９２馴化培地の存在下で実行した。データは、ＮＫ−９２細胞からのＩＦＮ−ガンマ発現が、トランスフェクトされたサンプルならびに組換えＩＬ−１２の両方について、ＩＬ−１２用量依存的であることを実証している。ＩＦＮ−ガンマ発現は、ＧＦＰ上清で処理した細胞からのＩＦＮ−ガンマ発現の欠如によって示されるように、ＩＬ−１２特異的であるようである。
【図１】
2017501712.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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