(57)【要約】本発明は、生体分子を包接する構造体を有する金属有機構造体（ＭＯＦ）を生成するための方法に関し、該方法は、溶液中で生体分子とＭＯＦ前駆体とを合わせる工程を含み、ここで該生体分子は、包接している構造体の形成を促進する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を包接する構造体を有する金属有機構造体（ＭＯＦ）を生成するための方法であって、溶液中で生体分子とＭＯＦ前駆体とを組み合わせる工程を含み、ここで該生体分子は包接している構造体の形成を促進する、方法。
【請求項２】
本来備わっている空洞を規定しかつ生体分子を包接する構造体を有する結晶性金属有機構造体（ＭＯＦ）を生成する方法であって、
溶液中でＭＯＦ前駆体と生体分子とを組み合わせる工程を含み、該生体分子は包接している構造体の形成を促進し、
ここで該生体分子は、構造体のあらゆる本来備わっている空洞の最大空洞直径（ＬＣＤ）より大きい最小の寸法を有する、方法。
【請求項３】
生体分子の最小の寸法が、構造体のあらゆる本来備わっている空洞のＬＣＤより少なくとも１．５倍大きい、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＬＣＤが５Å〜５００Åである、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記生体分子がタンパク質、核酸、アミノ酸、又はその組合せである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記生体分子が酵素であるタンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記生体分子がタンパク質であり、溶液中で０．１〜２０mg/mLの濃度を有する、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記生体分子がアミノ酸であり、溶液中で０．１〜１００mg/mLの濃度を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記生体分子が核酸であり、溶液中で０．００１〜１００μMの濃度を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
ＭＯＦ前駆体が溶液中で約０．００１Ｍ〜１Ｍの濃度を有する、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
包接している構造体の形成が、７５℃より低い溶液の温度で行なわれる、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ＭＯＦが、ＭＯＦの重量に対して１重量％〜３２重量％の生体分子を包接する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
本来備わっている空洞を規定しかつ生体分子を包接する構造体を有する結晶性金属有機構造体（ＭＯＦ）であって、ここで該生体分子は、構造体のあらゆる本来備わっている空洞の最大空洞直径（ＬＣＤ）よりも大きな最小の寸法を有する、該結晶性金属有機構造体（ＭＯＦ）。
【請求項１４】
前記生体分子がタンパク質、核酸、アミノ酸、又はその組合せである、請求項１３記載のＭＯＦ。
【請求項１５】
前記生体分子が、酵素であるタンパク質である、請求項１４記載のＭＯＦ。
【請求項１６】
ＭＯＦの重量に対して１重量％〜３２重量％の生体分子を包接している、請求項１３〜１５のいずれか一項記載のＭＯＦ。
【請求項１７】
ＬＣＤが５Å〜５００Åである、請求項１３〜１６のいずれか一項記載のＭＯＦ。
【請求項１８】
前記生体分子の最小寸法が、構造体のあらゆる本来備わっている空洞のＬＣＤより少なくとも１．５倍大きい、請求項１３〜１７のいずれか一項記載のＭＯＦ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、ホスト−ゲスト金属有機構造体（ＭＯＦ）システムに関する。特に、本発明は、生体分子を含有しているＭＯＦ、及びそれを生成するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ＭＯＦは、多機能有機配位子の配位した、金属イオン、例えば金属イオン又は金属酸化物を含む金属クラスターによって形成された、ハイブリッド配位構造である。これにより、非常に多孔性であり得る１次元、２次元、又は３次元構造が形成される。
【０００３】
ＭＯＦの多孔度は、チャンネルによって接続されたケージの形態の空洞の空間的配置として可視化され得る。金属イオン及び有機配位子の特定の選択に依存して、空のマイクロ細孔及びメソ細孔の形態の空洞を有するＭＯＦを利用できる。
【０００４】
空洞の独特なサイズ特徴及び空間的分布は、ＭＯＦに、１ｇあたり数千平方メートルの次数の表面積を与える。有利には、空洞の表面の化学的特性はまた、ＭＯＦ構造の有機的対応物に適用された伝統的な有機化学を使用してテーラーメードされ得る。
【０００５】
その独特な多孔度特徴のお蔭で、ＭＯＦは理想的な多孔性マトリックスを示し、その中に所望の成分を包んで、ホスト−ゲストＭＯＦシステムを形成する。ゲスト種の性質に依存して、このようなシステムは、ガス貯蔵／分離装置、触媒、薬物送達、光電子工学、及びセンシングへの適用にとって極めて魅力的である。例えば、ＭＯＦマトリックスは、ＭＯＦ構造体を通って特定の化学種が拡散して、そこに包まれた化学的に活性な種に出会い、そして特定の化学反応を促進することを可能とする、サイズ選択的フィルターとして作用することができる。
【０００６】
生体分子は、ホスト−ゲストＭＯＦシステムの生成のための特に魅力的なクラスのゲストである。なぜなら、このようなシステムは、例えば、工業的規模の酵素触媒、薬物送達システム、高感度のバイオアッセイ、及びバイオセンサーに非常に適用可能であろうからである。典型的には、そうした適用は、その生理活性を損なうことなく、支持体上の生物学的に活性な種の安定化を必要とする。
【０００７】
しかしながら、このようなシステムの開発は依然として初期の段階にある。生体分子を包接しているＭＯＦを得るための利用可能な経路は大半が、関心対象の生体分子を予め形成されたＭＯＦに浸潤させること（合成後の浸潤）に基づく。
【０００８】
合成後の浸潤の例は、Vasiliki Lykourinou, Yao Chen, Xi-Sen Wang, Le Meng, Tran Hoang, Li-June Ming, Ronald L. Musselman, and Shengqian Ma, 'Immobilization of MP-11 into a Mesoporous Metal-Organic Framework, MP-11@mesoMOF: A New Platform for Enzymatic Catalysis', Journal of the American Chemical Society, 133 (2011), 10382; Yao Chen, Vasiliki Lykourinou, Carissa Vetromile, Tran Hoang, Li-June Ming, Randy W. Larsen, and Shengqian Ma,' How Can Proteins Enter the Interior of a MOF? Investigation of Cytochrome c Translocation into a MOF Consisting of Mesoporous Cages with Microporous Windows', Journal of the American Chemical Society, 134 (2012), 13188; Yao Chen, Vasiliki Lykourinou, Tran Hoang, Li-June Ming, Shengqian Ma, 'Size-selective biocatalysis of myoglobin immobilized into a mesoporous metal-organic framework with hierarchical pore sizes', Inorganic Chemistry, 51 (2012), 9156に見出すことができる。
【０００９】
しかしながら、そうしたアプローチは、例えば、ＭＯＦ構造体に浸潤することのできる生体分子の量、サイズ、及び種類に関していくつかの制限を呈する。また、浸潤させたＭＯＦ内の生体分子の分布は、ホスト構造体の至る所で不均一である。さらに、合成後の浸潤により、ゲスト生体分子の特異的な生理活性の減少が起こる可能性がある。
【００１０】
したがって、このような１つ以上の制限に対処する、ＭＯＦの構造体内に生体分子を包接する、代替的なプロトコールを開発する機会が依然としてある。
【００１１】
発明の要約
それ故、本発明は、生体分子を包接する構造体を有するＭＯＦを生成するための方法を提供し、該方法は、溶液中で生体分子とＭＯＦ前駆体とを組み合わせる工程を含み、ここで該生体分子は、包接している構造体の形成を促進する。
【００１２】
本発明は、生体分子が、ＭＯＦ前駆体と溶液中で一緒に組み合わせられた場合に、ＭＯＦの形成を促進又はトリガーすることができるという驚くべき効果に由来する。すなわち、生体分子は、種晶として効果的に作用することができ、その種晶の周囲で構造体が形成され、結果として生じた構造体は生体分子を包接していることが今回発見された。理論によって制限されたくはないが、該生体分子は、構造体の形成のための異質な核形成中心として作用すると考えられる。
【００１３】
前記生体分子は有利には、生体分子の非存在下ではさもなくばＭＯＦは形成されないであろう条件下で、溶液内でＭＯＦの形成を促進する。例えば、ＭＯＦの形成は、有利には、室温で促進され得る。
【００１４】
さらに、生体分子によって促進されるＭＯＦの形成は迅速である可能性があり、典型的には数分以内にＭＯＦの形成と生体分子の包接が起こる。これは、商業的な規模での本発明の適用にとって特に有利である。
【００１５】
本発明は、有利には、構造体内での生体分子の均一な分布を与えることができ、これは次いで、このようにして形成されたＭＯＦが、伝統的な合成後の含浸法を使用して調製されたＭＯＦ／生体分子システムと比較して、単位質量又は単位容積あたりにより多くの量の包接された生体分子を含有することを可能とし得る。
【００１６】
多種多様な生体分子を本発明に従って使用することができる。
【００１７】
１つの実施態様では、前記生体分子はアミノ酸、ペプチド、タンパク質、又は核酸である。
【００１８】
当業者は、タンパク質及び核酸などの生体分子の生理活性が、その空間的コンフォメーションに強く関連していることを理解しているだろう。
【００１９】
有利には、本発明に記載の生体分子の包接は、該生体分子の天然コンフォメーションを保持することができる。したがって、包接された生体分子は、その生理活性を維持することができる。すなわち、包接している構造体は有利には、生体分子に保護的支援を与える。構造体の保護能は、構造体とゲスト生体分子との間の荷電に基づいた相互作用に由来すると考えられ、その結果として、生体分子の安定性は有意に増強される。
【００２０】
本発明は、様々な異なるＭＯＦに適用できる。例えば、ＭＯＦは、無定形であっても、結晶性であってもよい。ＭＯＦはメソＭＯＦであっても、マイクロＭＯＦであってもよい。
【００２１】
１つの実施態様では、ＭＯＦは結晶性ＭＯＦである。ＭＯＦの結晶性は、構造体内の本来備わっている空洞の規則的かつ空間的に秩序立った分布から派生する。本来備わっている空洞のサイズは、各々の具体的な結晶性ＭＯＦに特徴的であり、一桁から数十オングストローム（Å）までの範囲であり得る。本来備わっている空洞のサイズ分布は極めて狭い可能性があり、これによりこのような材料は、例えばろ過された又は吸収された物質の正確なサイズ選択性を必要とする適用に役立つ。
【００２２】
本発明はまた有利には、本来備わっている空洞と生体分子との間の相対的寸法に関係なく、結晶性ＭＯＦ内への生体分子の包接を可能とする。例えば、本発明の方法は、構造体の本来備わっている空洞よりもかなり大きなタンパク質又は核酸などの生体分子を、結晶性ＭＯＦ内に包接することを可能とする。このアプローチは独特なＭＯＦを与えることができ、そのようなものは、伝統的な合成後浸潤法によって妨げられる。
【００２３】
それ故、本発明はまた、（ｉ）本来備わっている空洞を規定しかつ（ｉｉ）生体分子を包接する、構造体を有する結晶性ＭＯＦを生成する方法を提供し、該方法は溶液中でＭＯＦ前駆体と生体分子とを組み合わせる工程を含み、該生体分子は包接している構造体の形成を促進し、該生体分子は、構造体のあらゆる本来備わっている空洞の最大空洞直径よりも大きい最小の寸法を有する。
【００２４】
本発明はまた、（ｉ）本来備わっている空洞を規定しかつ（ｉｉ）生体分子を包接する、構造体を有する結晶性ＭＯＦを提供し、ここで該生体分子は、構造体のあらゆる本来備わっている空洞の最大空洞直径よりも大きい最小の寸法を有する。
【００２５】
本発明に従って形成されたＭＯＦは独特なバイオコンポジットとして可視化され得、ここでＭＯＦは連続的なホストマトリックス相を形成し、その中にゲスト生体分子が均一に分散している。
【００２６】
１つの実施態様では、前記生体分子はタンパク質又は核酸である。
【００２７】
また、前記生体分子は、このようにして形成されたＭＯＦの動態、形状、及び結晶化度に影響を及ぼし得ることが驚くべきことに発見された。
【００２８】
包接された生体分子の生化学的特徴は有利には保存されることができるので、本発明のＭＯＦ／生体分子システムは有利には、高い生理活性、例外的な保護能、及びトリガー・放出特性を有し得、工業的規模の酵素触媒、工業的酵素治療、薬物送達システム、高感度のバイオアッセイ、及びバイオセンサーに有望な適用可能性を与える。本発明のＭＯＦ／生体分子システムはまた、医学分野及び研究に一般的に適用を見出し得る。本発明のさらなる態様及び／又は実施態様は、以下においてより詳細に考察されている。
【００２９】
本発明の実施態様は、これから以下の非制限的な図面を参照して記載されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、（ａ）ＺＩＦ−８及び（ｂ）ＺＩＦ−６５における本来備わっている空洞の模式図を示す。
【図２】図２は、その構造体内に包接された生体分子を有するＭＯＦの合成の実施態様の模式図を示す。
【図３】図３は、様々なアミノ酸を使用して播種されたＺＩＦ−８の形成効率を示す。効率は、実施例１に記載のように光散乱測定によって決定される。
【図４】図４は、（ａ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、（ｂ）オボアルブミン（ＯＶＡ）、（ｃ）リボヌクレアーゼＡ、（ｄ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、（ｅ）ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（（ＰＱＱ）ＧＤＨ）、（ｆ）リパーゼ、（ｇ）ヘモグロビン、（ｈ）リゾチーム、（ｉ）インスリン、（ｊ）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、（ｋ）本発明の実施態様の方法に従って合成されたトリプシン、（ｍ）ウレアーゼ、及び（ｎ）オリゴヌクレオチドを包接している、（ａ〜ｋ）ＺＩＦ−８の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。図（４）（ｌ）は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）生体分子を包接しているＺＩＦ−８の結晶からの発光を示す。画像は、共焦点走査型レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ、主な画像）を使用して記録された。図４のスケールバーは１μmである。
【図５】図５は、生体分子を包接しているＺＩＦ−８のＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを示す。試料は、実施例に記載されているような本発明の実施態様に従って得られ、ＸＲＤパターンを、シミュレーションした純粋なＺＩＦ−８の回折と比較する。
【図６】図６は、（ａ）ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８、（ｂ）ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８、及び（ｃ）ウレアーゼ＠ＺＩＦ−８の試料に関して測定されたＸ線小角散乱（ＳＡＸＳ）データを示す。
【図７】図７は、発光しているＦＩＴＣで標識されたＢＳＡ＠ＺＩＦ−８結晶の共焦点走査型レーザー顕微鏡画像の集合を示す。一連の画像は、焦点面をｚ軸に沿って１２６nmずつ移動しながら得られた連続画像に関する。
【図８】図８は、（ａ）図７のＦＩＴＣで標識されたＢＳＡ＠ＺＩＦ−８結晶の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像；（ｂ）同じ試料の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）の３次元平面図の画像；（ｃ、ｄ）ｚ軸に沿って図７の画像を積み重ねることによって得られ、ｘ方向及びｙ方向にそれぞれ沿って見た、図７の連続画像の３次元再構成を示す。
【図９】図９は、タンパク質溶解剤の存在下、及び沸騰水中での処理後の、（ＰＱＱ）ＧＤＨ＠ＺＩＦ−８、対、遊離（ＰＱＱ）ＧＤＨの標準化された生成物変換率を示す。
【図１０】図１０は、８０℃の水中で１時間かけての熱処理の前後における、ウレアーゼ＠ＺＩＦ−８対遊離ウレアーゼの標準化された生成物変換率を示す。
【図１１】図１１は、（ａ〜ｄ）本発明の実施態様に従ってＭＯＦ結晶に初期に包接されたタンパク質のｐＨによりトリガーされる放出の模式図を示す。図１１（ｅ）は、異なるｐＨにおける時間の関数としてのＢＳＡの放出を示した対応する実験データを示す。図１１（ｆ〜ｉ）は、酵素を含有しているＭＯＦと別のタンパク質を含有しているＭＯＦとの混合物に対して実施された同じようなｐＨ下降試験の表示を示す。図１１（ｊ）は、トリプシンを包接しているＺＩＦ−８とＤＱ−オボアルブミン（ＤＱ−ＯＶＡ）を包接しているＺＩＦ−８との混合物に関して測定された対応する実験データを示す。
【図１２】図１２は、ｐＨ６．０におけるＢＳＡ＠ＺＩＦ−８結晶の経時的な進行的な分解を示した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
【図１３】図１３は、ＭＯＦ前駆体（８０mMのＨｍＩｍ及び酢酸亜鉛２０mM）に対して漸増量のＢＳＡを使用して、本発明の実施態様に従って形成された生体分子を含有しているＺＩＦ−８の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。画像は、室温で（ａ）１mg、（ｂ）５mg、（ｃ）１０mg、及び（ｄ）２０mgのＢＳＡを使用して得られた試料に言及する。
【図１４】図１４は、室温で漸増量のＢＳＡを使用して得られた、ＢＳＡを包接しているＺＩＦ−８試料から測定されたＸ線回折（ＸＲＤ）の回折パターンを示す。
【図１５】図１５は、漸増量のＢＳＡを使用して得られたＢＳＡ＠ＺＩＦ−８の細孔サイズ分布を示す。
【図１６】図１６は、比較実施例１に従って、ＦＩＴＣで標識されたＢＳＡを用いて合成後に浸潤させた後に、伝統的な方法を使用して合成された純粋なＺＩＦ−８結晶の（ａ）微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像及び（ｂ）共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示す。
【図１７】図１７は、ＢＳＡ（赤色）、ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８（橙色）、７０℃で１時間ＳＤＳ（１０％）溶液で洗浄した後のＢＳＡ＠ＺＩＦ−８ＭＯＦ（黄色）、ＺＩＦ−８（緑色）、ＢＳＡ（１mg／mL）水溶液への曝露後のＺＩＦ−８（青色）、及びＢＳＡ溶液と共にインキュベートした後に７０℃で１時間ＳＤＳ（１０％）溶液で洗浄したＺＩＦ−８（紫色）のフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）スペクトルを示す。
【図１８】図１８は、同じ熱処理の前後の遊離ＨＲＰ酵素の酵素活性と比較した、熱処理の前後に測定した、ＺＩＦ−８に包接されたセイヨウワサビ酵素（ＨＲＰ）の酵素効率のプロットを示す。
【００３１】
いくつかの図面は、色の表示又は実体を含有する。着色版の図面は、要請されれば入手可能である。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、生体分子を包接する構造体を有するＭＯＦを生成するための方法を提供する。
【００３３】
ＭＯＦ構造体の形成が生体分子によって促進されることができれば、本発明に有用なＭＯＦの組成に関する特定の制約はない。
【００３４】
本発明は、様々な異なるＭＯＦに適用可能である。例えば、ＭＯＦは、無定形であっても結晶性であってもよい。ＭＯＦはまた、メソＭＯＦであっても、マイクロＭＯＦであってもよい。
【００３５】
本発明に記載のＭＯＦとしては、少なくとも１つの有機配位子によって配位された少なくとも２つの金属クラスターを有するものが挙げられる。
【００３６】
本明細書において使用する「金属クラスター」という表現は、少なくとも１つの金属又は半金属の少なくとも１つの原子又はイオンを含有している化学的部分を意味することを意図する。この定義は、有機配位子又は共有結合した基を場合により含む、単一の原子又はイオン、及び一群の原子又はイオンを包含する。したがって、「金属イオン」という表現は、例えば、金属イオン、半金属イオン、及び金属酸化物を含む。
【００３７】
ＭＯＦ構造の一部を形成する適切な金属イオンは、アクチニド及びランタニドを含む、ＩＵＰＡＣの元素周期表の第１族から第１６族の金属、及びその組合せから選択され得る。金属イオンは、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｓc３＋、Ｙ３＋、Ｔｉ４＋、Ｚｒ４＋、Ｈｆ４＋、Ｖ５＋、Ｖ４＋、Ｖ３＋、Ｖ２＋、Ｎｂ３＋、Ｎｂ５＋、Ｔａ５＋、Ｃｒ６＋、Ｃｒ３＋、Ｍｏ６＋、Ｍｏ３＋、Ｗ６＋、Ｗ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ２＋、Ｒｅ７＋、Ｒｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋、Ｒｕ４＋、Ｒｕ３＋、Ｒｕ２＋、Ｏｓ３＋、Ｏｓ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｏ２＋、Ｒｈ３＋、Ｒｈ２＋、Ｒｈ＋、Ｉｒ４＋、Ｉｒ２＋、Ｉｒ＋、Ｎｉ２＋、Ｐｄ４＋、Ｐｄ２＋、Ｐｔ４＋、Ｐｔ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ＋、Ａｇ＋、Ａｕ＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｂ３＋、Ａｌ３＋、Ｇａ３＋、Ｉｎ３＋、ＴＩ３＋、Ｓｉ４＋、Ｓｉ２＋、Ｇｅ４＋、Ｇｅ２＋、Ｓｎ４＋、Ｓｎ２＋、Ｐｂ４＋、Ｐｂ２＋、Ａｓ５＋、Ａｓ３＋、Ｓｂ５＋、Ｓｂ３＋、Ｂｉ５＋、Ｂｉ３+、Ｌａ３＋、Ｃｅ３＋、Ｃｅ４＋、Ｐｒ３＋、Ｐｒ４＋、Ｎｄ３＋、Ｓｍ３＋、Ｓｍ２＋、Ｅｕ３＋、Ｅｕ２＋、Ｇｄ３＋、Ｔｂ３＋、Ｔｂ４＋、Ｄｙ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｔｍ３＋、Ｔｍ２＋、Ｙｂ３＋、Ｙｂ２＋、Ｌｕ３＋、Ｔｈ４＋、Ｕ６＋、Ｕ５＋、Ｕ４＋、Ｕ３＋、及びその組合せから選択され得る。
【００３８】
有機配位子に配位している適切な金属イオンは、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、クエン酸、トリメシン酸、１，２，３−トリアゾール、ピロジアゾール、又はスクアリン酸から導かれ得る。
【００３９】
本発明の目的のために適した有機配位子は、国際公開公報第２０１０／０７５６１０号及びFilipe A. Almeida Paz, Jacek Klinowski, Sergio M. F. Vilela, Joao P. C. Tome, Jose A. S. Cavaleiro, Joao Rocha, ‘Ligand design for functional metal-organic frameworks’, Chemical Society Reviews, 2012, Volume 41, pages1088-1110に列挙された有機配位子を含み、この内容はその全体が本明細書に含まれる。
【００４０】
いくつかの実施態様では、ＭＯＦは、ランタニド（Ｌｎ）ＭＯＦ、例えばＥｒ（ｂｄｃ）、Ｄｙ（ｂｄｃ）、Ｔｂ（ｂｐｄｃ）、Ｇｄ（ｂｐｄｃ）及びＴｂ（ｂｐｙｄｃ）、Ｔｂ（ｂｄｃ）、Ｅｕ（ｂｄｃ）、Ｇｄ（ｂｄｃ）又はＬｎ（ｂｐｅｄｃ）であり、ここでｂｄｃ＝１，４−ベンゼンジカルボキシラート、ｂｐｄｃ＝４，４’−ビフェニルジカルボキシラート、及びｂｐｙｄｃ＝２，２’−ビピリジン−５，５’−ジカルボキシラート、及びｂｐｅｄｃ＝ビフェニルエテン−４，４’−ジカルボキシラート。
【００４１】
いくつかの実施態様では、ＭＯＦは、ＭＣ−ＭＯＦとして知られる混合成分ＭＯＦから選択される。ＭＣ−ＭＯＦは、１種類を超える有機配位子及び／又は金属によって特徴付けられる構造を有する。ＭＣ−ＭＯＦは、様々な有機配位子及び／又は金属をＭＯＦ前駆体と生体分子を組み合わせた溶液中に使用することによって、あるいは、形成されたＭＯＦの有機配位子及び／又は金属種の合成後置換によって得ることができる。ＭＣ−ＭＯＦの具体例は、A.D. Burrows, CrystEngComm 2011, Volume 13, pages 3623-3642に見られ得、その内容はその全体が本明細書に含まれる。
【００４２】
いくつかの実施態様では、ＭＯＦは、亜鉛イミダゾラート構造体（ＺＩＦ）である。ＺＩＦは、（ｉ）生理学的条件におけるそのより長期な安定性、（ｉｉ）その金属−有機配位子結合のｐＨ応答性（これは、ｐＨにより誘発される薬物送達への適用のためのトリガーとして使用され得る）、及び（ｉｉｉ）無視できる細胞毒性のお蔭で、生物学的適用に特に適したＭＯＦのサブクラスである。さらに、ＺＩＦは水中で合成することができ、高温でさえ（例えば沸点）長期間（例えば数週間）水中で化学的に安定である。水中でのＺＩＦの安定性により、それらは、生物学的環境において使用するための生体分子をホスティングするための好ましいマトリックスとなる。
【００４３】
ＺＩＦ構造体は、有機イミダゾラート有機配位子によって接続された四配位遷移金属イオン（例えばＦｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｚｎ）を特色とし、その結果、３次元の多孔性固体が生じる。ゼオライトと同様に、ＺＩＦは、非常に高い熱的及び化学的安定性を有する。前駆体の選択に依存して、今回、本発明に従って、生体分子の選択に依存して、多くのＺＩＦトポロジーを合成することができる。
【００４４】
したがって、本発明に従って製造され得るＭＯＦは、カルボキシラートをベースとしたＭＯＦ、ヘテロ環式アゾラートをベースとしたＭＯＦ、金属シアニドＭＯＦであり得る。本発明に従って製造され得るＭＯＦの具体例としては、ＣＤ−ＭＯＦ−１、ＣＤ−ＭＯＦ−２、ＣＤ−ＭＯＦ−３、ＣＰＭ−１３、ＦＪＩ−１、ＦＭＯＦ−１、ＨＫＵＳＴ−１、ＩＲＭＯＦ−１、ＩＲＭＯＦ−２、ＩＲＭＯＦ−３、ＩＲＭＯＦ−６、ＩＲＭＯＦ−８、ＩＲＭＯＦ−９、ＩＲＭＯＦ−１３、ＩＲＭＯＦ−２０、ＪＵＣ−４８、ＪＵＣ−６２、ＭＩＬ−１０１、ＭＩＬ−１００、ＭＩＬ−１２５、ＭＩＬ−５３、ＭＩＬ−８８（ＭＩＬ−８８Ａ、ＭＩＬ−８８Ｂ、ＭＩＬ−８８Ｃ、ＭＩＬ−８８Ｄシリーズを含む）、ＭＯＦ−５、ＭＯＦ−７４、ＭＯＦ−１７７、ＭＯＦ−２１０、ＭＯＦ−２００、ＭＯＦ−２０５、ＭＯＦ−５０５、ＭＯＲＯＦ−２、ＭＯＲＯＦ−１、ＮＯＴＴ−１００、ＮＯＴＴ−１０１、ＮＯＴＴ−１０２、ＮＯＴＴ−１０３、ＮＯＴＴ−１０５、ＮＯＴＴ−１０６、ＮＯＴＴ−１０７、ＮＯＴＴ−１０９、ＮＯＴＴ−１１０、ＮＯＴＴ−１１１、ＮＯＴＴ−１１２、ＮＯＴＴ−１１３、ＮＯＴＴ−１１４、ＮＯＴＴ−１４０、ＮＵ−１００、ｒｈｏ−ＺＭＯＦ、ＰＣＮ−６、ＰＣＮ−６’、ＰＣＮ９、ＰＣＮ１０、ＰＣＮ１２、ＰＣＮ１２’、ＰＣＮ１４、ＰＣＮ１６、ＰＣＮ−１７、ＰＣＮ−２１、ＰＣＮ４６、ＰＣＮ６６、ＰＣＮ６８、ＰＭＯＦ−２（Ｃｕ）、ＰＭＯＦ−３、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１５’、ＳＮＵ−２１Ｓ、ＳＮＵ−２１Ｈ、ＳＮＵ−５０、ＳＮＵ−７７Ｈ、ＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７、ｓｏｃ−ＭＯＦ、ｓｏｄ−ＺＭＯＦ、ＴＵＤＭＯＦ−１、ＵＭＣＭ−２、ＵＭＣＭ−１５０、ＵＴＳＡ−２０、ＺＩＦ−２、ＺＩＦ−３、ＺＩＦ−４、ＺＩＦ−８、ＺＩＦ−９、ＺＩＦ−１０、ＺＩＦ−１１、ＺＩＦ−１２、ＺＩＦ−１４、ＺＩＦ−２０、ＺＩＦ−２１、ＺＩＦ−２３、ＺＩＦ−６０、ＺＩＦ−６１、ＺＩＦ−６２、ＺＩＦ−６４、ＺＩＦ−６５、ＺＩＦ−６７、ＺＩＦ−６８、ＺＩＦ−６９、ＺＩＦ−７０、ＺＩＦ−７１、ＺＩＦ−７２、ＺＩＦ−７３、ＺＩＦ−７４、ＺＩＦ−７５、ＺＩＦ−７６、ＺＩＦ−７７又はＺＩＦ−９０のような当技術分野において一般的に公知であるものが挙げられる。
【００４５】
１つの実施態様では、ＭＯＦは無定形である。
【００４６】
無定形ＭＯＦ（ａＭＯＦ）では、金属クラスター及び有機配位子は、検出可能な空間秩序を有さない構造体を形成する。ａＭＯＦの空洞は、原子の非周期的な空間的分布から生じ、ＭＯＦ構造体内でランダムに空間内に分布している。原子の非周期的配置により、散漫散乱によって引き起こされる幅広い「丘」によって占められるＸ線回折パターンを生じるａＭＯＦが得られ、したがって、それらの大部分は、Ｘ線回折（ＸＲＤ）の回折測定を用いて互いに識別できない。
【００４７】
本明細書に列挙されたＭＯＦのいずれかはａＭＯＦであってもよい。ａＭＯＦの特徴及び特性は、例えば、Thomas D. Bennett, Anthony K. Cheetham, ‘Amorphous Metal-Organic Frameworks’, Accounts of Chemical Research 2014, 47, 1555に記載され、その内容はその全体が本明細書に組み入れられる。
【００４８】
ａＭＯＦの空洞のサイズ分布は、当業者には公知であろう技術によって決定され得る。例えば、ブルナウアー・エメット・テラー法（ＢＥＴ）の使用に基づいた測定は、Brunauer, S., Emmett, P., and Teller, E. 'Adsorption of gases in multimolecular layers' Journal of the American Chemical Society (1938), 60, 309-319に提唱されている。様々なガスをプローブとして使用することができるが（例えば窒素、水素、アルゴン、ヘリウム、二酸化炭素、Ｈ２０、及びメタン）、ガスプローブとしての窒素が最も一般的である。
【００４９】
ａＭＯＦの種類に依存して、生体分子を包接している生じた構造体の空洞は、例えば、ＢＥＴで測定された５００Å以下のサイズを有し得る。
【００５０】
１つの実施態様では、ＭＯＦは結晶性である。
【００５１】
結晶性ＭＯＦでは、金属クラスターは有機配位子によって配位されて、クラスター／有機配位子の単位が反復している配置から作られた幾何学的に規則的なネットワークを形成する。
【００５２】
結晶性ＭＯＦは、一般的に公知である結晶学的特徴付け技術によって特徴付けられる場合に回折パターンを生じる。これらとしては、例えば、粉末Ｘ線回折（ＸＰＤ）、斜入射Ｘ線回折、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）、単結晶Ｘ線回折、電子線回折法、中性子回折法、及び材料の結晶学の分野の熟練者には公知であろうその他の技術が挙げられる。
【００５３】
ＭＯＦの結晶性は、構造体を形成している本来備わっている空洞の規則的かつ空間的に秩序立った分布から生じる。
【００５４】
本明細書において使用する「本来備わっている空洞」という表現は、ＭＯＦのまさにその性質によって結晶性ＭＯＦに特異的である、相互接続された空隙の秩序立ったネットワークを意味することを意図する。当技術分野において公知であるように、ＭＯＦの本来備わっている空洞ネットワークは、ＭＯＦの金属クラスター及び有機配位子の特定の空間的配置から生じ、任意の元の状態の結晶性ＭＯＦに対して独特である。
【００５５】
結晶性ＭＯＦの本来備わっている空洞は、ウィンドウ又はチャンネルによって相互接続された規則的に分布したケージによって形成されるので可視化され得る。結晶性ＭＯＦにおけるケージ及びウィンドウ／チャンネルの具体的な形状は、ＭＯＦ構造体を形成している化学種の空間的配置によって決定される。したがって、「本来備わっている空洞」という表現は、天然のＭＯＦ構造体のケージ及びウィンドウ／チャンネルの全体的に秩序立ったネットワークを具体的に特定する。
【００５６】
結晶性ＭＯＦの「本来備わっている空洞」によって何を意味するかをさらに定義することを支援するために、図１を参照されたい。図１は、例であるイミダゾラート構造体ＺＩＦ−８及びＺＩＦ−６５のスーパーセルの本来備わっている空洞の模式図を示す。各スーパーセルは、ウィンドウ（ＺＩＦ−８の場合）又はチャンネル（ＺＩＦ−６５の場合）によって接続された９つのケージから作られることが示されている。図１のスーパーセルの実際の化学構造は、スーパーセルの隅に亜鉛イオンを有し、有機配位子は接続しているエッジであると想像され得る。
【００５７】
本発明によると、結晶性ＭＯＦの本来備わっている空洞の寸法は、数学的モデルによって定量されることになる。当技術分野において公知であるように、結晶性ＭＯＦの３次元化学構造は、ＭＯＦ構造体を構成する原子の特定の空間的分布に基づいて数学的モデルによって復元され得る。該モデルは、本来備わっている空洞の寸法を示すパラメーター、すなわち、あらゆる構造体の原子と重なることなくＭＯＦの本来備わっている空洞内の空間のある点に挿入され得る最大球状プローブの直径を示す「最大空洞直径」（ＬＣＤ）を推定することを可能とする。
【００５８】
結晶性ＭＯＦの本来備わっている空洞のＬＣＤの数値は本明細書において、E. Haldoupis, S. Nair and D. S. Sholl, Journal of the American Chemical Society, 132 (2010), 7528（これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載の手順に従って計算されるものとする。
【００５９】
結晶性ＭＯＦの種類に依存して、本来備わっている空洞は、約５Å〜約５００Å、約５Å〜約１００Å、約５Å〜約５０Å、約５Å〜約４０Å、約５Å〜約３０Å、約５Å〜約２０Å、約５Å〜約１５Å、約５Å〜約１２Å、約５Å〜約１０Å、約５Å〜約９Å、約５Å〜約８Å、約５Å〜約７Å、又は約５Å〜約６Åの範囲内のＬＣＤの数値によって特徴付けられ得る。
【００６０】
本発明は、マイクロＭＯＦ及びメソＭＯＦの両方に適用可能である。これは、典型的にはメソＭＯＦの本来備わっている空洞に浸潤している生体分子に限定されている、既存の後で浸潤の方法とは対照的である。
【００６１】
本明細書において使用する「マイクロＭＯＦ」という用語は、ＢＥＴによって測定された空洞のサイズ（ａＭＯＦの場合）又は本来備わっている空洞のＬＣＤ（結晶性ＭＯＦの場合）が２nmより小さいＭＯＦを指す。「メソＭＯＦ」という用語は、測定された空洞のサイズ（ａＭＯＦの場合）又は本来備わっている空洞のＬＣＤ（結晶性ＭＯＦの場合）が２nm〜５０nmであるＭＯＦを含む。
【００６２】
ＭＯＦが生体分子を包接するならば、ＭＯＦのサイズに関する特定の制約はない。いくつかの実施態様では、ＭＯＦは粒子の形態で提供され、その最大寸法は、約１０nm〜約５００μm、約２５nm〜約２５０μm、約５０nm〜約１００μm、約５０nm〜約５０μm、約５０nm〜約２５μm、約５０nm〜約１０μm、約５０nm〜約５μm、約５０nm〜約２．５μm、約５０nm〜約１μm、又は約５０nm〜約０．５μmの範囲である。
【００６３】
本明細書において使用する「生体分子」という用語及びその変化形は、生存生物から単離された任意の化合物、並びに、合成又は組換え類似体若しくは模倣体、誘導体、突然変異体若しくは変異体、及び／又はその生物学的断片を含む。
【００６４】
例えば、前記生体分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチド、又はアミノ酸であり得る。
【００６５】
本明細書において使用する「生理活性（の）」という用語及びその変化形、例えば生体分子への言及に使用される「生理活性」は、生体分子と１つ以上の標的との相互作用をはじめとする、生体分子それ自体の特徴である任意のインビボ又はインビトロ活性を指す。
【００６６】
例えば、生理活性は、抗原への抗体の選択的な結合、酵素の酵素活性などを含み得る。このような活性はまた、場合により別の生体分子との又は標的分子との、結合、融合、結合形成、会合、接近、触媒、又は化学反応を含み得るがこれらに限定されない。
【００６７】
本発明の方法は、例えば図２の模式図で例示されているように、溶液中で生体分子とＭＯＦ前駆体とを合わせる工程を含む。
【００６８】
ＭＯＦ前駆体は、適切な溶媒内の溶液中に本明細書に列挙された金属イオンを与える当技術分野において公知である化合物を含む。このような化合物は、妥当な金属イオンの塩、例えば、金属塩化物、金属硝酸塩、金属酢酸塩、金属硫酸塩、金属硫酸水素塩、金属臭化物、金属炭酸塩、金属リン酸塩、及びその誘導体、例えば一水和物誘導体及び多水和物誘導体であり得る。
【００６９】
適切な金属塩前駆体の例としては、硝酸コバルト（Ｃｏ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸亜鉛（Ｚｎ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸アルミニウム（Ａｌ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸マグネシウム（Ｍｇ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸ベリリウム（Ｂｅ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸ユウロピウム（Ｅｕ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸テルビウム（Ｔｂ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸イッテルビウム（Ｙｂ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸ジスプロシウム（Ｄｙ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸エルビウム（Ｅｒ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸ガリウム（Ｇａ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸ガドリニウム（Ｇｄ（ＮＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、硝酸ニッケル（Ｎｉ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸鉛（Ｐｂ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸カドミウム（Ｃｄ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸マンガン（ＩＩ）（Ｍｎ（ＮＯ３）２・ｘＨ２Ｏ）、硝酸コバルト（ＣｏＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化ベリリウム（ＢｅＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化ユウロピウム（ＥｕＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化テルビウム（ＴｂＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化イッテルビウム（ＹｂＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化ジスプロシウム（ＤｙＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化エルビウム（ＥｒＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化ガリウム（ＧａＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３・ｘＨ２Ｏ）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化鉛（ＩＩ）（ＰｂＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、塩化マンガン（ＩＩ）（ＭｎＣｌ２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸コバルト（Ｃｏ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸亜鉛（Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸鉄（ＩＩ）（Ｆｅ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸アルミニウム（Ａｌ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸ベリリウム（Ｂｅ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸ユウロピウム（Ｅｕ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸テルビウム（Ｔｂ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸イッテルビウム（Ｙｂ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸ジスプロシウム（Ｄｙ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸エルビウム（Ｅｒ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸ガリウム（Ｇａ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸ガドリニウム（Ｇｄ（ＣＨ３ＣＯＯ）３・ｘＨ２Ｏ）、酢酸ニッケル（Ｎｉ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸鉛（ＩＩ）（Ｐｂ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸カドミウム（Ｃｄ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、酢酸マンガン（ＩＩ）（Ｍｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・ｘＨ２Ｏ）、硫酸コバルト（ＣｏＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸アルミニウム（Ａｌ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸ベリリウム（ＢｅＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸ユウロピウム（Ｅｕ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸テルビウム（Ｔｂ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸イッテルビウム（Ｙｂ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸ジスプロシウム（Ｄｙ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸エルビウム（Ｅｒ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸ガリウム（Ｇａ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸ガドリニウム（Ｇｄ２（ＳＯ４）３・ｘＨ２Ｏ）、硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸鉛（ＰｂＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸カドミウム（ＣｄＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、硫酸マンガン（ＩＩ）（ＭｎＳＯ４・ｘＨ２Ｏ）、水酸化コバルト（Ｃｏ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化亜鉛（Ｚｎ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化酸化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＯ（ＯＨ）・ｘＨ２Ｏ）、水酸化鉄（ＩＩ）（Ｆｅ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化ベリリウム（Ｂｅ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化ユウロピウム（Ｅｕ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化テルビウム（Ｔｂ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化イッテルビウム（Ｙｂ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化ジスプロシウム（Ｄｙ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化エルビウム（Ｅｒ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化ガリウム（Ｇａ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化ガドリニウム（Ｇｄ（ＯＨ）３・ｘＨ２Ｏ）、水酸化ニッケル（Ｎｉ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化鉛（Ｐｂ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化カドミウム（Ｃｄ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、水酸化マンガン（ＩＩ）（Ｍｎ（ＯＨ）２・ｘＨ２Ｏ）、臭化コバルト（ＣｏＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化亜鉛（ＺｎＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化鉄（ＩＩ）（ＦｅＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化アルミニウム（ＡｌＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化マグネシウム（ＭｇＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化カルシウム（ＣａＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化ベリリウム（ＢｅＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化ユウロピウム（ＥｕＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化テルビウム（ＴｂＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化イッテルビウム（ＹｂＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化ジスプロシウム（ＤｙＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化エルビウム（ＥｒＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化ガリウム（ＧａＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化ガドリニウム（ＧｄＢｒ３・ｘＨ２Ｏ）、臭化ニッケル（ＮｉＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化鉛（ＰｂＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化カドミウム（ＣｄＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、臭化マンガン（ＩＩ）（ＭｎＢｒ２・ｘＨ２Ｏ）、炭酸コバルト（ＣｏＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸亜鉛（ＺｎＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸アルミニウム（Ａｌ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸ベリリウム（ＢｅＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸ユウロピウム（Ｅｕ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸テルビウム（Ｔｂ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸イッテルビウム（Ｙｂ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸ジスプロシウム（Ｄｙ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸エルビウム（Ｅｒ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸ガリウム（Ｇａ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸ガドリニウム（Ｇｄ２（ＣＯ３）３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸ニッケル（ＮｉＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸鉛（ＰｂＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸カドミウム（ＣｄＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、炭酸マンガン（ＩＩ）（ＭｎＣＯ３・ｘＨ２Ｏ）、及びその混合物が挙げられるがこれらに限定されず、ここでｘは０〜１２の範囲である。
【００７０】
ＭＯＦ前駆体はまた、ＭＯＦ構造体内の金属イオンクラスターに配位する、本明細書に記載された種類の有機配位子を含む。有機配位子は、金属イオンに配位することのできる少なくとも２つの化学部分を有する分子を含む。いくつかの実施態様では、これらの基は、カルボン酸基、リン酸基、硫酸基、Ｎ−ヘテロ環基、及びその組合せを含む。
【００７１】
適切な有機配位子としては、国際公開公報第２０１０／０７５６１０号及びFilipe A. Almeida Paz, Jacek Klinowski, Sergio M. F. Vilela, Joao P. C. Tome, Jose A. S. Cavaleiro, Joao Rocha, Ligand design for functional metal-organic frameworks, Chemical Society Reviews, 2012, Volume 41, pages1088-1110（これらの文献の内容はその全体が本明細書に含まれる）に列挙された配位子が挙げられる。
【００７２】
有機配位子前駆体の例としては、４，４’，４’’−［ベンゼン−１，３，５−トリイル−トリス（エチン−２，１−ジイル）］トリベンゾアート、ビフェニル−４，４’−ジカルボキシラート、４，４’，４’’− ［ベンゼン−１，３，５−トリイル−トリス（ベンゼン−４，１−ジイル）］トリベンゾアート、１，３，５−ベンゼントリベンゾアート、１，４−ベンゼンジカルボキシラート、ベンゼン−１，３，５−トリス（１Ｈ−テトラゾール）、１，３，５−ベンゼントリカルボン酸、テレフタル酸、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、２−ニトロイミダゾール、２−メチルイミダゾール（ＨｍＩｍ）、２−エチルイミダゾール、５−クロロベンゾイミダゾール、プリン、フマル酸、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、１，４−ビス（１−イミダゾリル）ベンゼン）、４，４’−ビスピリジル、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、２−アミノ−１，４−ベンゼンジカルボキシラート、２−アミノ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、４，４’−アゾベンゼンジカルボキシラート、４，４’−アゾベンゼンジカルボン酸、アニリン−２，４，６−トリベンゾアート、アニリン−２，４，６−トリ安息香酸、ビフェニル−４，４’−ジカルボン酸、１，１’−ビフェニル−２，２’，６，６’−テトラカルボキシラート、１，１’−ビフェニル−２，２’，６，６’−テトラカルボン酸、２，２’−ビピリジル−５，５’−ジカルボキシラート、２，２’−ビピリジル−５，５'−ジカルボン酸、１，３，５−トリス（４−カルボキシフェニル）ベンゼン、１，３，５−トリス（４−カルボキシラートフェニル）ベンゼン、１，３，５−ベンゼントリカルボキシラート、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジカルボキシラート、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、２，５−ジメトキシ−１，４−ベンゼンジカルボキシラート、２，５−ジメトキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、１，４−ナフタレンジカルボキシラート、１，４−ナフタレンジカルボン酸、１，３−ナフタレンジカルボキシラート、１，３−ナフタレンジカルボン酸、１，７−ナフタレンジカルボキシラート、１，７−ナフタレンジカルボン酸、２，６−ナフタレンジカルボキシラート、２，６−ナフタレンジカルボン酸、１，５−ナフタレンジカルボキシラート、１，５−ナフタレンジカルボン酸、２，７−ナフタレンジカルボキシラート、２，７−ナフタレンジカルボン酸、４，４’，４’’−ニトリロトリスベンゾアート、４，４’，４’’−ニトリロトリス安息香酸、２，４，６−トリス（２，５−ジカルボキシフェニルアミノ）−１，３，５−トリアジン、２，４，６−トリス（２，５−ジカルボキシラートフェニルアミノ）−１，３，５−トリアジン、１，３，６，８−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ピレン、１，３，６，８−テトラキス（４−カルボキシラートフェニル）ピレン、１，２，４，５−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ベンゼン、１，２，４，５−テトラキス（４−カルボキシラートフェニル）ベンゼン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラキス（４−カ���ボキシラートフェニル）ポルフィリン、アデニン、アデニナート、フマラート、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボキシラート、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸、１，３，５−ベンゼントリ安息香酸、３−アミノ−１，５−ベンゼンジカルボン酸、３−アミノ−１，５−ベンゼンジカルボキシラート、１，３−ベンゼンジカルボン酸、１，３−ベンゼンジカルボキシラート、４，４’，４’’−［ベンゼン−１，３，５−トリイル−トリス（エチン−２，１−ジイル）］トリ安息香酸、４，４’，４’’−［ベンゼン−１，３，５−トリイル−トリス（ベンゼン−４，１−ジイル）］トリ安息香酸、シュウ酸、オキサラート、フマル酸、フマラート、マレイン酸、マレアート、trans,trans−ムコン酸、trans,trans−ムコナート、cis,trans−ムコン酸、cis,trans−ムコナート、cis,cis−ムコン酸、cis,cis−ムコナート、ピラゾール、２，５−ジメチルピラゾール、１，２，４−トリアゾール、３，５−ジメチル−１，２，４−トリアゾール、ピラジン、２，５−ジメチルピラジン、ヘキサメチレンテトラアミン、ニコチン酸、ニコチナート、イソニコチン酸、イソニコチナート、４−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール）−安息香酸、２，５−フランジカルボン酸、２，５−フランジカルボキシラート、３，５−ジメチル−４−カルボキシピラゾール、３，５−ジメチル−４−カルボキシラートピラゾール、４−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−安息香酸、４−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ベンゾアート、及びその混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
有機配位子はまた、官能基化された有機配位子であってもよいことが理解されるだろう。例えば、本明細書に列挙されている有機配位子のいずれか１つを、アミノ−、例えば２−アミノテレフタル酸、ウレタン−、アセトアミド−、又はアミド−によってさらに官能基化してもよい。有機配位子は、ＭＯＦ形成のための前駆体として使用する前に官能基化しても、または代替的には、構築されたＭＯＦそれ自体を化学的に処理して、その架橋有機配位子を官能基化してもよい。
【００７４】
当業者は、ＭＯＦを合成するために使用される有機配位子を事前に官能基化することによって、又は予め形成されたＭＯＦを後で官能基化することのいずれかによって、官能基を用いてＭＯＦを官能基化することを可能とする適切な化学的プロトコールを知っているだろう。
【００７５】
ＭＯＦ上に与えられ得る適切な官能基としては、−ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ（アリール）、ハロゲン化物、アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、ピリジル、ビピリジル、テルピリジル、アニリノ、−Ｏ（アルキル）、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、スルホンアミド、ヒドロキシル、シアノ、−（ＣＯ）Ｒ、−（ＳＯ２）Ｒ、−（ＣＯ２）Ｒ、−ＳＨ、−Ｓ（アルキル）、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−Ｍ＋、−ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−Ｍ＋、−ＰＯ３Ｈ２、−ＰＯ３Ｈ−Ｍ＋、−ＰＯ３２−Ｍ２＋、−ＣＯ２Ｈ、シリル誘導体、ボラン誘導体、フェロセン、及びその他のメタロセンが挙げられ、ここでＭは金属原子であり、ＲはＣ１―１０アルキルである。
【００７６】
ＭＯＦ前駆体と生体分子を組み合わせる溶液を調製するために使用され得る溶媒に関する特定の制約はない。ただし、（ｉ）ＭＯＦ前駆体は溶媒中で可溶性であり、（ｉｉ）生体分子は溶媒と適合性である。すなわち、溶媒は典型的には、生体分子の生理活性に有害な影響を及ぼさないものであろう。
【００７７】
使用され得る溶媒の例としては、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、水、及びその混合物が挙げられる。
【００７８】
いくつかの実施態様では、溶液（この中で生体分子とＭＯＦ前駆体とを合わせる）は、水溶液、例えば脱イオン水、又は生理緩衝溶液（１つ以上の塩、例えばＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２などを含む水）である。
【００７９】
ＭＯＦが形成されるならば、溶液中に存在するＭＯＦ前駆体の濃度に関する特定の制約はない。
【００８０】
溶液中のＭＯＦ前駆体の濃度は、約０．００１Ｍ〜１Ｍ、約０．０１Ｍ〜０．５Ｍ、約０．０１Ｍ〜０．２Ｍ、約０．０２Ｍ〜０．２Ｍ、約０．０２Ｍ〜０．１５Ｍ、約０．０５Ｍ〜０．１５Ｍ、約０．０８Ｍ〜０．１６Ｍの範囲を含み得る。数値は、ＭＯＦ前駆体と生体分子を含有している溶液の全容量に対する、有機配位子の濃度並びに金属塩の濃度を指す。
【００８１】
有機配位子の濃度と金属塩の濃度との間の比は限定されない。ただし、比は、本発明に記載の生体分子との組合せによって促進されるＭＯＦの形成に適したものである。いくつかの実施態様では、有機配位子と金属塩の比は、６０：１から１：６０（モル：モル）、３０：１から１：３０、１０：１から１：１０、５：１から１：５、２．５：１から１：２．５、２：１から１：２、又は１．５：１から１：１．５の範囲であり得る。
【００８２】
本発明の方法によると、前記生体分子は、包接している構造体の形成を促進する。
【００８３】
前記生体分子が、包接している構造体の形成を「促進」するとは、該生体分子それ自体が、溶液中でＭＯＦ前駆体と組み合わせられた場合に、ＭＯＦ構造体の形成を引き起こすか、誘発するか、又はトリガーすることを意味する。該生体分子が構造体の形成を促進する結果として、ＭＯＦ構造体は、該生体分子の周辺で成長して、最終的にそれを包接する。
【００８４】
理論に制限されたくはないが、前記生体分子により誘発されるＭＯＦの形成は、特定の生体分子の荷電、親水性／疎水性、又はキレート能に関連し得ると考えられる。包接しているＭＯＦの形成は、例えば分子間水素結合及び疎水性相互作用から生じた、ＭＯＦ前駆体に対する生体分子の親和性によって促進されると考えられる。ＮＭＲ分光分析法及び元素分析により、各生体分子が、溶液中でそのような前駆体と組み合わせられるとＭＯＦ前駆体と配位することができることが確認された。
【００８５】
金属陽イオン（金属塩前駆体の崩壊から生じる）及び有機配位子の両方の局所濃度（すなわち生体分子の直近における）の結果として生じる増加は、ＭＯＦ構造体の核形成前のクラスターを促進するだろう。
【００８６】
親水性分子及び負に荷電したドメイン又は部分（例えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基など）を有する分子は、より疎水性の特徴及び正に荷電した部分を有する分子よりも、ＭＯＦの改善された核形成能を示すことが判明した。それ故、生体分子内で負に荷電したドメインは、溶液中のＭＯＦ金属前駆体によって提供される正の金属イオンを誘引し、ＭＯＦ形成の初期段階で金属−有機配位子クラスターを安定化させることに寄与すると仮説し得る。
【００８７】
溶液中でＭＯＦ前駆体を生体分子と組み合わせることは驚くべきことに、ＭＯＦ構造体の形成を引き起こすのに十分である。ＭＯＦの形成をトリガーするために他の因子又は試薬を適用する必要は全くない。例えば、伝統的なソルボサーマルＭＯＦ合成法（これは典型的には、オーブン、例えばマイクロ波オーブン、ホットプレート、又は加熱マントルなどの熱源の使用を必要とする）で慣用的に実施されるような、溶液に熱を適用する必要はない。
【００８８】
したがって、いくつかの実施態様では、包接している構造体の形成は、１００℃、９０℃、７５℃、５０℃、又は３５℃より低い溶液の温度で行なわれる。したがって、溶液の温度は、−５０℃から７５℃、−５０℃から５０℃、又は−５０℃から３０℃であり得る。
【００８９】
いくつかの実施態様では、前記方法は室温で行なわれる。本明細書において使用する「室温」という表現は、約２０℃〜２５℃の温度範囲を包含すると理解され、約２３℃が平均である。これらのより低い温度で方法を実施することは、抗体、フィブロネクチン糖タンパク質、タンパク質分解酵素、及びコラーゲンなどの熱に感受性のタンパク質にとって有利である。
【００９０】
ＭＯＦ前駆体と生体分子とを溶液中で組み合わせ得る順序に関する特定の制約はない。
【００９１】
例えば、金属前駆体を含有している溶液をまず、有機配位子を含有している溶液と混合し得、生体分子を含有している別の溶液をその後、金属塩と有機配位子とを含有している溶液中に導入する。
【００９２】
あるいは、生体分子と有機配位子とを含有している溶液をまず調製し得、続いて、金属前駆体を含有している別の溶液中に導入する。
【００９３】
また、生体分子と金属前駆体とを含有している溶液をまず調製し得、続いて、有機配位子を含有している別の溶液に導入する。
【００９４】
またさらに、各々個々に金属前駆体、有機配位子、及び生体分子をそれぞれ含有している別々の溶液を、同時に一緒に混合してもよい。
【００９５】
１つの実施態様では、前記生体分子を、ＭＯＦ前駆体を含む溶液中に導入する。
【００９６】
本発明の方法によるＭＯＦの形成は有利には迅速である。使用される生体分子の種類、及び使用されるＭＯＦ前駆体の種類に依存して、該生体分子とＭＯＦ前駆体が互いに溶液中で架橋されると、ＭＯＦは、約１秒間、１０秒間、１分間、１０分間、３０分間、６０分間、又は２時間以内に形成され得ることが判明した。同じ時間、温度、及びＭＯＦ前駆体濃度の条件下で、ＭＯＦ前駆体のみを含有している溶液中において（すなわち生体分子は全く含まれない）、ＭＯＦは形成されないだろうことが判明した。換言すれば、該生体分子それ自体が、ＭＯＦの形成を促進することが判明した。
【００９７】
ＭＯＦ構造体内に包接されている生体分子は、その構造体の全容積の至る所で有利には均一に分布し得る。構造体内の生体分子の分布プロファイルは、共焦点顕微鏡の発光測定によって決定され得る。蛍光色素で標識された包接された生体分子を有するＭＯＦのあらゆる面を横切って共焦点走査型レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）走査を使用して記録された発光シグナルの強度が、０．１２μmの直線的な増加を使用して色素の最適な発光波長で測定された場合、色素の最適な励起波長で走査された場合、１０％以上変化していない場合に、生体分子の分布は構造体の容積の至る所で「均一」であると考えられるだろう。
【００９８】
本発明とは対照的に、合成後の浸潤の方法によるＭＯＦ内の生体分子の浸潤は、構造体の容積の至る所での生体分子の均一な分布を本質的に妨げる。
【００９９】
さらに、本発明の方法によって得られたＭＯＦ内に包接された生体分子の均一な分布は本質的に、合成後の浸潤の方法に従って予め形成されたＭＯＦに浸潤することのできる単位容積あたりの生体分子の量と比較して、単位容積あたりにＭＯＦ構造体内に包接されるより多くの量の生体分子を与え得る。
【０１００】
例えば、本発明の方法は、包接されるタンパク質の量（mg）と得られたＭＯＦの重量（mg）との間の比として表現される、約１重量％〜約３２重量％の生体分子、約５重量％〜約３０重量％の生体分子、又は約１０重量％〜約２０重量％の生体分子を包接しているＭＯＦを提供し得る。包接されたタンパク質の量は、包接の前後で液体溶液の試料に対して実施された、溶液中のタンパク質の紫外可視分光分析法の吸光度測定から導かれる。
【０１０１】
生体分子を「包接している」ＭＯＦ構造体とは、構造体が生体分子の周辺で形成されることを意味する。
【０１０２】
有利には、本発明の方法は、ＭＯＦが、その天然のコンフォメーションで生体分子を包接する構造体を有することを可能とする。「天然コンフォメーション」という表現は本明細書において、生体分子の生理活性を生じる３次元コンフォメーションを示すために使用される。
【０１０３】
例えば、ペプチド、タンパク質、又は核酸などの生体分子の天然コンフォメーションは、最もエンタルピーの低い分子コンフォメーションを想定するための、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの自発的な又は支援された折り畳みから生じる。このようなコンフォメーションは、ポリペプチド及びポリヌクレオチドをそれぞれ形成するアミノ酸及びヌクレオチドの具体的な化学的特徴及び配列から生じる。
【０１０４】
その天然コンフォメーションで生体分子を包接することによって、ＭＯＦは有利には、生体分子の生理活性を保持することができる。このことは、（ｉ）包接された生体分子が、遊離している生体分子と同一な生理活性特徴を示すか、又は（ｉｉ）包接された生体分子が、遮蔽された生理活性を示す（なぜなら、それは外部環境から物理的に隔離されているからである）ことのいずれかを意味する。（ｉｉ）では、しかしながら、生体分子の生理活性を有利には、構造体の崩壊／破壊時に利用することができる。
【０１０５】
構造体内に包接された生体分子は、溶媒内に懸濁されたＭＯＦを溶解することによって、例えば溶媒のｐＨの変動を誘導することによって溶媒中へと放出させることができる。このアプローチによると、ＭＯＦは、例えば生存生物への薬物送達の適用に有用である、ｐＨにより誘発される包接された生体分子の標的化放出のための良好な候補であり得る。あるいは、光の適用は、配位子−金属立体化学のコンフォメーション変化をトリガーし得、これにより本来備わっている空洞サイズの変化が起こり得、よって生体分子の積荷は放出され得る。
【０１０６】
ｐＨによりトリガーされる生体分子の放出に基づいた適用に使用され得るＭＯＦの例としては、特定のｐＨ値で安定であるが特定の他のｐＨ値では溶解するＭＯＦが挙げられる。例えば、ＭＯＦは、閾値のｐＨ値を超えると安定であり得る。その場合、ＭＯＦが懸濁されている溶液中への該生体分子の検出可能な放出はない。しかしながら、ｐＨが閾値未満に下降するとＭＯＦは溶解し得、その結果、該生体分子が溶液中に放出され得る。
【０１０７】
例えば、特定のＺＩＦは、細胞外ｐＨ（約７．４）では安定であるが、ｐＨが６．５未満に下降する場合、例えば細胞内ｐＨ（約６）では溶解する。これにより、構造体内で遮蔽されることによってその生理活性を維持している包接されている生体分子は放出され得る。
【０１０８】
これに関連して、特定のｐＨの溶媒中でのＭＯＦの安定性は、溶解された場合にＭＯＦによって溶媒中に放出される金属イオンの量に関連して決定される。溶媒中の金属イオンの濃度は、ＭＯＦをそのｐＨ条件に２時間曝した前後に行なわれた誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によって決定される。２時間後の溶液中の金属イオンの測定された濃度が初期値から１５％未満異なる場合には、ＭＯＦは「安定」であるとみなされるだろう。
【０１０９】
ＭＯＦ構造体は有利には、その遊離形の生体分子、すなわちＭＯＦ内に包接されていない生体分子をさもなくば破壊するであろう環境条件から、包接された生体分子を保護することができる。すなわち、包接している構造体は、多様な環境条件において生体分子の安定性を向上させる。例えば、包接された生体分子は、ＭＯＦが１時間を超える時間、９０℃までの温度に曝されていた後でさえも、その生理活性を保存することが判明した。
【０１１０】
本発明はまた有利には、本来備わっている空洞と生体分子との間の相対的な寸法に関係なく、結晶性ＭＯＦ内への生体分子の包接を可能とする。
【０１１１】
例えば、本発明の方法は、結晶性ＭＯＦ内への、構造体の本来備わっている空洞よりもかなり大きい生体分子の包接を可能とする。このアプローチは独特なＭＯＦを提供し得、そのようなものは、伝統的な合成後の浸潤の方法によって妨げられる。
【０１１２】
それ故、本発明はまた、（ｉ）本来備わっている空洞を規定しかつ（ｉｉ）生体分子を包接する、構造体を有する結晶性ＭＯＦを生成する方法を提供し、該方法は、溶液中でＭＯＦ前駆体と生体分子を組み合わせる工程を含み、該生体分子は、包接している構造体の形成を促進し、ここで該生体分子は、構造体のあらゆる本来備わっている空洞の最大空洞直径（ＬＣＤ）よりも大きな最小の寸法を有する。
【０１１３】
本発明はまた、（ｉ）本来備わっている空洞を規定しかつ（ｉｉ）生体分子を包接する、構造体を有する結晶性ＭＯＦを提供し、該生体分子は、構造体のあらゆる本来備わっている空洞の最大空洞直径（ＬＣＤ）よりも大きな最小の寸法を有する。
【０１１４】
前記生体分子の最小寸法は、当業者には周知である技術を使用することによって決定され得る。
【０１１５】
前記生体分子が、Ｘ線回折（ＸＲＤ）による特徴付けの目的のために結晶化することのできるタンパク質又は核酸である場合、「最小寸法」という表現は、対応するタンパク質データバンク（ＰＤＢ）ファイルのタンパク質又は核酸から得られたタンパク質又は核酸のあらゆる寸法（分子量とは違う）の最小値を意味する。
【０１１６】
当技術分野において公知であるように、ＰＤＢファイルのタンパク質又は核酸は、その結晶化形のタンパク質又は核酸に対して行なわれたＸ線回折（ＸＲＤ）及びＮＭＲ特徴付けによって決定されるような、タンパク質又は核酸を形成している各原子の空間的分布をコードする。タンパク質又は核酸の結晶化は、当業者には公知であろう手順に従って達成される。
【０１１７】
当技術分野において公知であるように、ＰＤＢファイルは３次元編集ソフトウェアによって解読することができ、これにより、得られたタンパク質又は核酸構造の３次元での可視化が得られる。３次元可視化ソフトウェアは、「ａ×ｂ×ｃ」形式の一連の３つの長さの数値を用いて、モデル化されたタンパク質又は核酸の幾何サイズの正確な決定を可能とする。したがって、この文脈において、タンパク質又は核酸の「最小寸法」は、最も小さいａ、ｂ及びｃである。
【０１１８】
Ｘ線回折（ＸＲＤ）及びＮＭＲ特徴付けの目的のために結晶化できないタンパク質又は核酸などの生体分子の場合、「最小寸法」という表現は、Harold P. Erickson, 'Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy', Biological Procedures Online, Volume 11, Number 1に詳細に記載された手順に従って決定されたタンパク質又は核酸のストークス半径を指す。
【０１１９】
前記生体分子の最小寸法が、結晶性構造体のあらゆる本来備わっている空洞のＬＣＤよりも大きいならば、結晶性ＭＯＦの本来備わっている空洞のＬＣＤに対する生体分子のサイズに関する制約は全くない。
【０１２０】
前記生体分子が、結晶性ＭＯＦ構造体内に包接されるならば、該生体分子の最小寸法は有利には、結晶性ＭＯＦの本来備わっている空洞のＬＣＤよりもどのような程度大きくてもよい。例えば、該生体分子の最小寸法は、構造体のあらゆる本来備わっている空洞のＬＣＤの少なくとも１．５、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、又は１０００倍大きくてもよい。
【０１２１】
前記生体分子は、ＭＯＦ構造体内に比較的緻密に包接されている場合があるので、例えば該生体分子と、包接している構造体との間の相対的な動きは妨害される。該生体分子は、自己規定した空洞内に不均一かつ不連続的なゲスト相として、ＭＯＦ構造体内に座していると考えられている。すなわち、該生体分子は、ＭＯＦ構造体の本来備わっている空洞内には座していない。実際に、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定は、包接された生体分子のサイズよりも１７％から３０％大きいことが判明している、ＭＯＦ構造体内のこのような自己規定した空洞の存在を確認する。
【０１２２】
ＭＯＦ構造体内に緻密に包接されることによって、前記生体分子は、構造体と相互作用することができる。該生体分子と構造体との間の起こり得る相互作用は、該生体分子内の負に荷電したドメインと構造体の金属イオンとの間のイオン配位、又はイオン性相互作用／共有結合性相互作用の混合したものであり得る。例えば、タンパク質を包接しているＺＩＦ−８に対して行なわれたフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）による特徴付けは、タンパク質骨格のカルボニル基とＺＩＦ−８構造体のＺｎ２＋陽イオンとの間の起こり得る相互作用を示す。これらの相互作用は、ＭＯＦ構造体内に包接された場合に、多様な環境条件において、該生体分子の改善された物理的及び化学的安定性に貢献すると考えられる。
【０１２３】
結晶性構造体のあらゆる本来備わっている空洞の最大空洞直径よりも大きい最小の寸法を有する生体分子の包接を可能とすることによって、合成後の浸潤の方法の固有の限界が克服される可能性がある。
【０１２４】
合成後の浸潤の方法に関して、利用可能な結晶性ＭＯＦ／生体分子システムの数は、結晶性ＭＯＦ構造体の本来備わっている空洞の寸法と比較した該生体分子のサイズに関する考慮によって制限される。すなわち、報告されている合成後の浸潤の方法は、該生体分子が構造体を通って拡散するのに十分なほどに小さく、かつ構造体の本来備わっている空洞が生体分子を空間的に収容するのに十分なほどに大きい、このような結晶性ＭＯＦ／生体分子システムのみの合成を可能とする。
【０１２５】
結果として、合成後の浸潤の経路によって得ることのできる結晶性ＭＯＦと生体分子との利用可能な組合せは制限される。例えば、最も一般的なＭＯＦのファミリーを示す細孔の寸法が典型的には２nm（２０Å）より小さいマイクロ細孔ＭＯＦは、本質的に、その最小の寸法が通常２nmを超える酵素をはじめとするタンパク質又は核酸などの大多数の生体分子によって浸潤されるには不適切である。
【０１２６】
１つの実施態様では、前記生体分子はアミノ酸である。
【０１２７】
本明細書において使用する「アミノ酸」という表現は、塩基性アミノ基（ＮＨ２）と酸性カルボキシル基（ＣＯＯＨ）の両方を含有している有機酸を指す。この表現はその最も広義の意味で使用され、そして、その多くの異なる化学形のアミノ酸、例えば単独投与のアミノ酸、その生理学的に活性な塩若しくはエステル、その様々な塩とのその組合せ、その互変異性体形、ポリマー形及び／若しくは異性体形、その類似体形、その誘導体形のアミノ酸、並びに／又は、その脱カルボン酸生成物を指し得る。
【０１２８】
本発明において有用であるアミノ酸の例としては、非制限的な例によると、アグマチン、βアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニル−β−アラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが挙げられる。
【０１２９】
ＭＯＦが形成されるならば、ＭＯＦ前駆体と共に溶液中に存在するアミノ酸の濃度に関する特定の制約はない。
【０１３０】
溶液中のアミノ酸の適切な濃度は、約０．１〜１００mg/mL、約０．１〜７５mg/mL、約０．１〜５０mg/mL、約０．１〜２５mg/mL、約０．２〜２５mg/mL、約０．２５〜２５mg/mL、約０．２５〜２０mg/mL、約０．２５〜１５mg/mL、約０．２５〜１０mg/mL、及び約０．０２５〜１．５mg/mLの範囲を含み得る。
【０１３１】
１つの実施態様では、前記生体分子はタンパク質である。
【０１３２】
本明細書において使用する「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマー、並びにその変異体及び合成類似体を指す。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成で非天然のアミノ酸、例えば対応する天然のアミノ酸の化学的類似体であるようなアミノ酸ポリマー、並びに、天然のアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書において使用する「タンパク質」という用語はまた酵素も包含する。
【０１３３】
タンパク質は一般的に、独特な３次元構造へと折り畳まれる。タンパク質は多くの３次元形状を想定し得る。単一タンパク質分子の全体の形状は、「３次構造」として同定される。タンパク質の基礎的な生理活性機能は、その３次構造によって決定／制御される。
【０１３４】
本発明によると、前記タンパク質は、治療用又は予防用タンパク質から選択され得る。これらには、血漿タンパク質、ホルモン、及び成長因子、細胞外タンパク質、及びワクチン用のタンパク質抗原が挙げられ得る。それらはまた、化粧品及び食品に使用するための構造的に有用なタンパク質から選択されてもよい。
【０１３５】
血漿タンパク質の例としては、アルブミン（ＨＳＡ）、ヘモグロビン、トロンビン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、凝固因子（ＦＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）が挙げられるがこれらに限定されない。細胞外タンパク質（及びいくつかの場合においてはこれらはまた構造タンパク質としても記載されている）の例としては、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、アクチン、チューブリン、ミオシン、キネシン、及びダイニンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３６】
ホルモン及び成長因子の例としては、インスリン、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、インスリン様成長因子、アンドロゲン、エストロゲンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３７】
抗原タンパク質の例としては、オボアルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び免疫グロブリンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３８】
本発明に使用され得るタンパク質としては酵素が挙げられる。本明細書において使用する「酵素」という用語は、触媒作用によって有機物質の化学的変化を起こすことができる、生存細胞を起源とするか又は人工的に合成されたタンパク質を指す。
【０１３９】
酵素は、食品、織物、畜産食品、パーソナルケア製品、及び洗剤、バイオレメディエーション、及び触媒などの多くの領域において工業的に有用である。これらの適用領域においては、コンフォメーション及び活性の保存、バイオアベイラビリティ―及び放出プロファイル、並びに包接キャリアの採用は全て、その工業的有用性において何等かの役割を果たす。酵素はまた、その高い選択性から、生体医療機器及びセンサーにおいても有用である。
【０１４０】
したがって、本発明において有用である酵素は、その最終用途の適用に応じて分類することができる。
【０１４１】
食品工業において使用される酵素の例としては、ペクチナーゼ、レニン、リグニン修飾酵素、パパイン、リパーゼ、アミラーゼ、ペプシン、及びトリプシンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４２】
織物工業に使用される酵素の例としては、エンドグルカナーゼ、オキシダーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、及びキシラナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４３】
生体医学／センサー工業に使用される酵素の例としては、デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウレアーゼ、及びＲＮＡ酵素又はＤＮＡ酵素、例えばリボヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４４】
ＭＯＦが前駆体から形成されるならば、ＭＯＦ前駆体と共に溶液中に存在するタンパク質の濃度に関する特定の制約は全くない。
【０１４５】
溶液中のタンパク質の適切な濃度は、約０．１〜２０mg/mL、約０．１５〜１０mg/mL、約０．１５〜７．５mg/mL、約０．２〜５mg/mL、約０．２５〜５mg/mL、約０．０３〜５mg/mL、約０．０２５〜２．５mg/mL、約０．０２５〜２mg/mL、約０．０２５〜１．５mg/mL、又は約０．０２５〜１．２５mg/mLの範囲を含み得る。
【０１４６】
１つの実施態様では、前記生体分子は核酸である。
【０１４７】
本明細書において使用する「核酸」という表現は、「ポリヌクレオチド」という用語の同義語であるが、これは全ての公知の生命形にとって必須であるポリマー性巨大分子又は大型の生物学的分子を指し、これにはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ｃｐＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｍｓＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ）、オリゴヌクレオチド（二本鎖又は一本鎖）、ＲＮＡ（センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ／ｈｎＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ａＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＹＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｔａ−ｓｉＲＮＡ、ＳｇＲＮＡ、Sutherland ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、piwi-interacting ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内低分子（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ型複合体、及び本明細書に記載されているようなその他のこのような分子が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０１４８】
疑義を避けるために、「核酸」という表現は、天然の形態だけでなく、非天然の改変された形態も含む。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、核酸分子は、約８から約８０個の核酸塩基（すなわち、約８から約８０個の連続的に連結された核酸）を含む。当業者は、本発明が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９又は８０核酸塩基長の核酸分子を例示することを理解しているだろう。
【０１５０】
ＭＯＦが形成されるならば、ＭＯＦ前駆体と共に溶液中に存在する核酸の濃度に関する特定の制約は全くない。
【０１５１】
溶液中の核酸の適切な濃度は、ＭＯＦ前駆体と核酸とを含有している溶液の全容積に対して、約０．００１〜１００μM、約２〜５０μM、約２〜１０μM、約３〜５μM、約３．４５〜５μM、又は約３．４５〜４μMの範囲を含む。
【０１５２】
本発明の具体的な実施態様は、これから以下の非制限的な実施例を参照して記載されるだろう。
【０１５３】
実施例
生体分子
実施例に使用されるアミノ酸は、アラニン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、グリシン、セリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸である。
【０１５４】
実施例に使用されるタンパク質は、ＤＱ−オボアルブミン（ＤＱ−ＯＶＡ、ニワトリ卵白由来、分子量約４４kDa）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ウシ血清由来、５番目の画分、分子量約６６kDa）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、ヒト血清由来、分子量約６６KDa）、オボアルブミン（ＯＶＡ、ニワトリ卵白由来、分子量約４４kDa）、ヘモグロビン（ウシ血液由来、分子量約６４．５kDa）、及びインスリン（ウシ膵臓由来、分子量約５．８kDa）である。これらの好ましい実施態様の酵素は、トリプシン（ウシ膵臓由来、分子量約２３．８kDa）、グルコースデヒドロゲナーゼピロロキノリンキノン（（ＰＱＱ）ＧＤＨ、グルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）由来、分子量約１００kDa）、リゾチーム（ニワトリ卵白由来、分子量約１４．３kDa）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、アモラシア・ルスティカーナ（Amoracia rusticana）由来、ＩＩ型、分子量約４４kDa）、リボヌクレアーゼＡ（ウシ膵臓由来、Ｉ−ＡＳ型、分子量約１３．７kDa）、リパーゼ（シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）由来、分子量約３４kDa）、及びウレアーゼ（タチナタマメ（Canavalia ensiformis）由来、ＩＩＩ型、単一サブユニットの分子量は約９０．８kDa、６つのサブユニットの分子量は約５４４．６kDa）である。
【０１５５】
これらの好ましい実施態様のために使用される核酸は、Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドである。
【０１５６】
タンパク質データバンクから得られた典型的なサイズ（ユニットセル、ａ×ｂ×ｃ、Å）：ＤＱ−ＯＶＡ及びＯＶＡ：６２．９×８４．７×７１．５；ＢＳＡ：２１７．８×４４．９×１４３．０６；ＨＳＡ：５４．８４×５５．６２×１２０．２７；ヘモグロビン：６３．１×８２．９１×５３．６５；インスリン：８１．５６×８１．５６×３３．５４；トリプシン：７６．９×５３．４×４６．６；（ＰＱＱ）ＧＤＨ：６０．５９×１５８．７２×２２１．３９；リゾチーム：７７．９３×７７．９３×３６．９６；ＨＲＰ：４０．０４×６６．８１×１１６．３６；リボヌクレアーゼＡ：１００．７４×３２．８２×７２．６９；リパーゼ：２４４．３３×２４４．３３×２４４．３３；ウレアーゼ：１３８．５７×１３８．５７×１９８．３５。
【０１５７】
Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチド（５０塩基、分子量：１６kDa）は、Trilink Biotechnologies Inc.（San Diego, California, USA）から購入した。ＤＱ−オボアルブミン（ＤＱ−ＯＶＡ）は、Life Technologies（VIC, Australia）から入手した。使用される全ての他の反応物はSigma-Aldrichから購入し、さらに改変することなく使用した。
【０１５８】
ＭＯＦ
実施例で作製されたＭＯＦは、ＺＩＦ−８（ＬＣＤ １１．３Å）、ＨＫＵＳＴ−１（ＬＣＤ １３．２Å）、Ｅｕ（ｂｄｃ）（ｂｄｃ＝１，４−ベンゼントリカルボキシラートＭＯＦ、ＬＣＤ＜１Å）、Ｔｂ（ｂｄｃ）（ＬＣＤ［ここにＴｂ（ＢＤＣ）の最大空洞直径の数値を挿入してください］Å、ＭＩＬ−８８Ａ（ＬＣＤ［ここにＭＩＬ−８８Ａの最大空洞直径の数値を挿入してください］Å）であった。
【０１５９】
ＦＩＴＣで標識されたタンパク質の合成
いくつかの実施例では、タンパク質をＦＩＴＣを用いて標識した。ＦＩＴＣ １mg及びＢＳＡ ３５mgを、ＭＯＰＳ緩衝液 ２．５mL（ＣＡＳ１１３２−６１２−２、１０mM、ｐＨ７．０）に溶解し、弱く穏やかな撹拌を介して室温で２時間放置した。混合物をGE Healthcare illustra NAP-25カラム（GE Healthcare Life sciences, NSW, Australia）に通過させることによって、ＦＩＴＣで標識されたＢＳＡを回収した。
【０１６０】
実施例１
アミノ酸＠ＺＩＦ−８
ＺＩＦ−８を作製するために、溶液中の妥当な前駆体試薬に、２０個のアミノ酸を使用して播種し、各々のアミノ酸は計２０回の実験における個々の実験のためのものである。等量（０．０２ｇ）の各アミノ酸をまず、ＨｍＩｍ（１６０mM、２mL）の水溶液に導入した。これらの各々の最初の溶液を続いてそして個々に、ＭＯＦ金属前駆体（すなわち酢酸亜鉛、４０mM、２mL）を含有している水溶液と混合した。
【０１６１】
異なるアミノ酸を含有しているＭＯＦ前駆体溶液の間にｐＨの有意な変化は全く観察されなかった。溶液を室温で保持した。経時的な溶液の乳白度の増加により、ＺＩＦ−８の結晶の形成が判明した。結晶の性質を、ＮＭＲ、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、及び粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）の測定を用いて確認した。ＺＩＦ−８の形成速度は、使用されるアミノ酸に依存する。
【０１６２】
紫外可視分光分析計を使用して測定された光散乱を、アミノ酸をＺＩＦ−８前駆体と組み合わせてから１０分後に行なわれた、結晶形成の効率／速度を同定するための定性的なパラメーターとして使用した。結果を図３に集める。
【０１６３】
粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）分析により、形成された結晶が、シミュレーションされたＺＩＦ−８並びに標準的なプロトコールを使用して合成されたＺＩＦ−８の両方と同一であるピークを有していたことが確認された。図３では、ＭＯＦ結晶形成を播種する個々のアミノ酸の効率を、アミノ酸側鎖基の性質に応じて分類する。
【０１６４】
結晶の形成は、アミノ酸の荷電及び親水性に強く関連することが判明した：最も親水性が高く負に荷電したアミノ酸が、より疎水性で正に荷電したアミノ酸よりも、ＺＩＦ−８の結晶形成を誘導する優れた能力を示した。これらの観察により、負に荷電した分子は正のＺｎ２＋イオンを誘引し、ＺＩＦ−８の結晶形成を促進する核形成段階中にＺｎ−ＨｍＩｍクラスターを安定化させることを助けるであろうという仮説に至った。
【０１６５】
実施例２
タンパク質＠ＺＩＦ−８
１０mgの適切なタンパク質及び酵素を、２−メチルイミダゾール（１６０mM、２０mL、ｐＨ１０．３）の脱イオン水溶液中に加えた。インスリンの場合、インスリン １０mgを水中に加え、ｐＨをＨＣｌ（２０mM）を用いて３〜４に調整して、インスリンを完全に溶解し、調整してｐＨ１０．３まで戻し、その後、２−メチルイミダゾール（１６０mM）を加えた。脱イオン水中に溶解した酢酸亜鉛の別の溶液（４０mM、２０mL）も調製した。これらの２つの溶液を合わせ、その後、１０秒間撹拌した。得られた溶液を室温（２３℃）で１２時間置いた。得られた沈降物を、６０００rpmで１０分間の遠心分離によって回収し、その後、脱イオン水又はエタノール中で洗浄し、遠心分離にかけた。
【０１６６】
ＺＩＦ−８におけるタンパク質の包接効率（重量％）は、ＦＩＴＣで標識されたタンパク質の予め決定された検量曲線を使用して蛍光分光分析法によって決定された。
【０１６７】
タンパク質包接効率：ＢＳＡ約１００％、ＨＳＡ約１００％、リゾチーム約９６％、ＨＲＰ約１００％、リボヌクレアーゼＡ約８６％、ヘモグロビン約９０％、トリプシン約９６％、リパーゼ約８８％、インスリン約８６％、（ＰＱＱ）ＧＤＨ約８２％、ウレアーゼ約９５％。
【０１６８】
ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８ＭＯＦの形成動態
ＢＳＡの場合、ＺＩＦ−８は、ＺＩＦ−８前駆体溶液にタンパク質を導入した後、１秒以内に形成される。
【０１６９】
ＢＳＡを導入すると、ＭＯＦ前駆体とＢＳＡの溶液は、ほぼ即座に（１秒間）より透明でなくなり、その後、乳白度は３０秒間までの反応で増加する。
【０１７０】
ＢＳＡがなければ、透明度の変化は全く検出されない。なぜなら、ＭＯＦ構造体は、全ての研究された反応時間（３０日間以内）中に成長しないからである。Ｘ線散乱分析により、ＢＳＡの非存在下では小さな粒子（回転半径、Ｒｇ＝３５nm）が水溶液中でＺＩＦ−８前駆体の注入直後に形成されるが、それらは非常に少量で形成され、構造体の成長を促進するに十分なほどには大きくないことが判明する。対照的に、ＢＳＡを使用すると、より大きなＭＯＦ粒子（Ｒｇ＝１００nm）が約３０秒後に形成され、同時に小さな粒子が枯渇する（Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）データからＲｇを決定するための手順が以下に詳述されている）。
【０１７１】
ＢＳＡの存在下では前記溶液はほぼ即座により透明ではなくなり、次第に乳白度が増加する。ＢＳＡの非存在下では、全ての研究された反応時間においてＺＩＦ−８の形成を除いて、透明度の変化は全く検出されない。該混合物は１か月間以上の間、依然として透明かつ無色であり、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による研究により、結晶はこれらの条件下では形成できないことが確認された。
【０１７２】
ＢＳＡを含有している溶液の乳白度は、散乱している粒子の形成に関連し、これを沈降させて分析することができる。
【０１７３】
Ｘ線回折（ＸＲＤ）分析により、分離された粒子状物は結晶性ＺＩＦ−８であることが確認される。なぜなら、測定された回折パターンは、全ての合成された種について図５に示されているように、シミュレーションされた純粋なＺＩＦ−８の回折パターンと一致するからである。
【０１７４】
前記生体分子を含有している試料から分離された結晶に対して行なわれた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析は、図４（ａ〜ｋ）で示されているように、使用される生体分子の種類に対する、ＺＩＦ−８結晶形態の依存性を同定することを可能とする。形態は、使用される生体分子に依存して、立法形から星形のようなＺＩＦ−８粒子に及ぶ。したがって、結晶の形状を制御できることは、該生体分子が、ＭＯＦ結晶の形態の鋳型を作る上で役割を果たしていることを示唆する。
【０１７５】
ＺＩＦ−８構造体内に包接されたＦＩＴＣで標識された生体分子からの発光を、共焦点顕微鏡を使用して検出することができる（図４（ｌ））。図４（ｌ）の挿入図は、ＦＩＴＣで標識された生体分子を包接しているＺＩＦ−８結晶の懸濁液を含有しているバイアルのカメラ画像を示す。
【０１７６】
ＺＩＦ−８構造体内の生体分子の空間的分布は、図４（ｌ）、７及び８に示される、ＦＩＴＣで標識されたＢＳＡを包接しているＺＩＦ−８に対して共焦点レーザー顕微鏡法を実施することによって調べることができる。画像は、各々の走査されたＺＩＦ−８結晶薄片を横切る均一な発光シグナルを認識することを可能とし、これにより、蛍光標識されたＢＳＡが、各結晶の至る所に均等にかつ均一に分布していることが確認される。
【０１７７】
ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８、ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８、及びウレアーゼ＠ＺＩＦ−８のＸ線小角散乱（ＳＡＸＳ）による特徴付け
ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８の階層学的細孔構造を、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）によって評価した。シンクロトロンＳＡＸＳデータを、オーストラリアシンクロトロン施設のＳＡＸＳビームラインで収集した。キャピラリーに、洗浄し乾燥させた試料を積載した。試料を、ＳＡＸＳ／ＷＡＸＳビームライン（９．３keV、検出器としてPilatus 1Mを使用して２６７５nmのカメラ長、トランスミッションモード）を使用して調べた。各々のＳＡＸＳ分析について、各々のキャピラリーについての４回の測定（異なる位置）を平均化し、空キャピラリーのバックグラウンドを差し引いた。Scatterbrainソフトウェアを、平均化及びバックグラウンド差し引き過程の両方に使用した。
【０１７８】
自己規定した空洞（すなわち、ＭＯＦ構造体の本来備わっている空洞ではなく、生体分子が中に包接されている構造体の空洞）のサイズの数値（回転半径、Ｒｇ）を、Unifiedモデルにギニエkneeフィッティングを使用して決定した。Beaucage et al（Beaucage, G. Small-Angle Scattering from Polymeric Mass Fractals of Arbitrary Mass-Fractal Dimension. J. Appl. Crystallogr. 29, 134-146 (1996)）は、ギニエ則及び構造的に制限される冪乗則をどのように、相互に排他的な散乱事象から導くことができるかを記載する。最も簡単なケースでは、観察された散乱は、２つの成分の総和であり、
【数１】
2017522904.tif 000002
ここで、Ｇは古典的なギニエ前因子であり、Ｂは、指数部Ｐが該当するレジームによって特定化される冪乗則散乱の種類に対して特異的な前因子である。運動量輸送ｑは単位（長さ）−１を有し、よって大きなｑの散乱は、短い長さ尺度を調べる。表面フラクタクルについては、
B=4π2ρ2Rg(6-P)τ((P-1)sin(π(P-3)/2)(P-3))
であり、ここで、Ｒｇは大きな粒子状物の回転半径である。誤差関数（ｅｆｔ）は多くのフィッティングプログラム（ｅ、ｇ、Ｉｇｏｒ）で入手することができるか、又は、漸近展開を使用して計算することができる。
【０１７９】
図６（ａ）は、ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８バイオコンポジットで得られたデータを示す。観察されたギニエkneeを、ＢＳＡの最大寸法よりも僅かに大きい、回転半径（Ｒｇ）３５（±５）Åを用いてUnifiedモデルを使用してフィッティングすることができる（E. Mylonasa et al Accuracy of molecular mass determination of proteins in solution by small-angle X-ray scattering, Journal of Applied Crystallography 2007, volume 40, s245による１Ｎ５Ｕ ＰＢＤデータから導く場合には約３０ÅのＲｇ）。
【０１８０】
前記生体分子を収容するのに十分なサイズであるこのような半径の細孔は、純粋なＺＩＦ−８には検出されない。データは、該生体分子が、自己規定した空洞内に不均一かつ不連続的なゲスト相として、ＭＯＦ構造体内に座している、すなわち、該生体分子はＭＯＦ構造体の本来備わっている空洞内に座していないという本明細書で行なったコメントを支持する。
【０１８１】
ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８及びウレアーゼ＠ＺＩＦ−８試料に対して行なわれたＸ線小角散乱から得られたデータを図６（ｂ）及び６（ｃ）に示す。これらの図面は、ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８及びウレアーゼ＠ＺＩＦ−８の強度（計数）対Ｑ（Å−１）のプロットを示す。実験データのUnifiedフィット及びUnifiedフィットのギニエ成分は、ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８についてはＲｇ＝４５Å及びウレアーゼ＠ＺＩＦ−８についてはＲｇ＝６８Åを有する、それぞれの生体分子よりも大きい、ＺＩＦ−８内の新しく生成された自己規定した空洞の存在を示す。
【０１８２】
実施例３
ＤＮＡ＠ＺＩＦ−８
オリゴヌクレオチド ２００μL（２０．８μM）を２−メチルイミダゾール（１６０mM、０．５mL）の脱イオン水溶液中に加えた。脱イオン水に溶解した酢酸亜鉛の別の溶液（４０mM、０．５mL）を調製した。次いで、これらの２つの溶液を混合し、１０秒間ボルテックスにかけた。混合物を室温で１２時間置いた。得られた沈降物を６０００rpmで２０分間の遠心分離によって回収し、次いでエタノール中で洗浄し遠心分離にかけた。ＺＩＦ−８へのＤＮＡの積載効率（７５重量％）を、前駆体溶液中及び得られた結晶の上清中のＤＮＡの濃度を測定することによって、予め決定された検量曲線から５６１nm（Ｃｙ３の発光極大）での発光を収集する蛍光分光分析計を使用して決定した。
【０１８３】
アミノ酸により誘発されるＺＩＦ−８は、２−メチルイミダゾール（１６０mM、20mL）の脱イオン水溶液への個々のアミノ酸（６．６７mM）の添加から合成された。脱イオン水に溶解した酢酸亜鉛の別の溶液（４０mM、２０mL）も調製した。次いで、これらの２つの溶液を混合し、１０秒間ボルテックスにかけた。混合物を室温で１０分間置いた。得られた沈降物を２００００ｇで１０分間の遠心分離によって回収し、次いでエタノール中で洗浄し遠心分離にかけた。
【０１８４】
実施例４
ＨＫＵＳＴ−１のバイオ播種
ベンゼン−１，３，５−トリカルボン酸（ｂｔｃ）をエタノール（５３．４５mM、２０mL）に溶解した。脱イオン水に溶解した硝酸銅（ＩＩ）の別の溶液（４０．０９mM、２０mM）も調製した。次いで、これらの２つの溶液を混合し、１０秒間ボルテックスにかけた。次いで、ＢＳＡ溶液 １２０μL（ＭＱ中１０mg/mL）を混合物に加えた。該混合物の溶液を室温で１２時間置いた。懸濁液を６０００rpmで２０分間遠心分離にかけ、洗浄緩衝液としてエタノールを使用して遠心分離−洗浄サイクルに３回かけた。収率：１１％。
【０１８５】
実施例５
Ｅｕ−ＢＤＣ及びＴｂ−ＢＤＣのバイオ播種
テレフタル酸二ナトリウム塩を、Daiguebonne, C. et al.“Structural and Luminescent Properties of Micro- and Nanosized Particles of Lanthanide Terephthalate Coordination Polymers” Inorganic Chemistry 47,3700-3708（2008）の手順に従って調製した。テレフタル酸 ５ｇを脱イオン水に溶解し、これに水酸化ナトリウム ２．３２ｇを加えた。得られた溶液を蒸発乾固し、次いで固体をエタノールに再懸濁し、１時間還流し、その後、ろ過し、水で洗浄し、そして乾燥させた。次いで、テレフタル酸の二ナトリウム塩を脱イオン水に溶解し（１０mM、２０mL）、これにＢＳＡ ２００mgを溶解した。ＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ又はＴｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏも脱イオン水に溶解した（１０mM、２０mL）。次いで、ランタノイド塩溶液とＢＳＡ配位子溶液とを混合し、１０秒間ボルテックスにかけた。該溶液を穏やかに１２時間撹拌し、その後、６０００rpmで２０分間の遠心分離によって沈降物を回収し、次いで、エタノール中で洗浄及び遠心分離を３回行なった。
【０１８６】
ＭＩＬ−８８Ａのバイオ播種
様々な量のＢＳＡ（２、４、８、１６mg/mL）をフマル酸の脱イオン水溶液（２５mM）に溶解した。ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏの別の溶液（２５mM）を調製し、等容量のＢＳＡを含有しているフマル酸溶液と直ちに混合し、１０秒間ボルテックスにかけた。混合物溶液を室温で７日間置いた。懸濁液を６０００rpmで２０分間遠心分離にかけ、洗浄緩衝液としてエタノールを使用して遠心分離−洗浄のサイクルに３回かけた。
【０１８７】
実施例６
ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８の生理活性
実施例２で得られたＨＲＰ＠ＺＩＦ−８の結晶をまず、７０℃で１０分間、ドデシル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ、脱イオン水中１０％ｗ／ｗ、２mL）の溶液に再分散させて、結晶表面上の遊離酵素を洗い流した。ＨＲＰの活性を、Chance, B. & Maehly, A. C. in Methods in enzymology Volume 2, 764-775（Academic Press, 1955）に記載の手順に従って、水素供与体としてのピロガロール（これは黄色がかった生成物であるプルプロガリンへと変換され得る）による過酸化水素の分解速度を測定することによって決定した。典型的なアッセイでは、ＫＨ２ＰＯ３７６μL（１００mM、ｐＨ６．０）、Ｈ２Ｏ２３８μL（脱イオン水中５％ｗ／ｗ）、ピロガロール ７６μL（脱イオン水中５％ｗ／ｗ）及びＰＢＳ緩衝液 １．８mL（ｐＨ７．４）を含有する溶液Ａを調製した。
【０１８８】
溶液ＡにＨＲＰ＠ＺＩＦ−８結晶 ０．１mgを加え、溶液の吸光度を、４２０nmで紫外可視分光法によって３０秒間隔で直ちにモニタリングした。対照実験では、ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８結晶 １mgを最初に脱イオン水（１mL）に再分散させ、９０℃で１時間インキュベートした。次いで、得られた溶液 １００μLを溶液Ａに加え、溶液の吸光度を４２０nmで紫外可視分光法によって３０秒間隔で直ちにモニタリングした。遊離ＨＲＰを使用した酵素活性アッセイでは、溶液Ａに導入された遊離酵素の量を、積載効率から決定されるような、ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８に積載された酵素の量と等しくなるように調整した。
【０１８９】
実施例７
（ＰＱＱ）ＧＤＨ＠ＺＩＦ−８の生理活性
実施例２で得られた（ＰＱＱ）ＧＤＨ＠ＺＩＦ−８の結晶を、７０℃で１０分間ＳＤＳ（脱イオン水中１０％ｗ／ｗ、２mL）溶液中に再分散させて、結晶表面上の遊離酵素を洗い流した。典型的なアッセイでは、グルコース １mL（１０mM ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中２０mM）、２，６−ジクロロインドフェノール １０μL（脱イオン水中０．１mM）、フェナジンメトスルファート １０μL（脱イオン水中０．０６mM）を含有している溶液Ｂを調製した。溶液Ｂに、（ＰＱＱ）ＧＤＨ＠ＺＩＦ−８結晶 ０．１mgを加え、溶液の吸光度を６００nmで紫外可視分光法によって３０秒間隔で直ちにモニタリングした。対照実験では、（ＰＱＱ）ＧＤＨ＠ＺＩＦ−８結晶 １mgを脱イオン水（１mL）に再分散させ、９０℃で１時間インキュベートした。次いで、得られた溶液 １００μLを溶液Ｂに加え、溶液の吸光度を６００nmで紫外可視分光法によって３０秒間隔で直ちにモニタリングした。遊離（ＰＱＱ）ＧＤＨを使用した酵素活性アッセイでは、溶液Ｂに導入された遊離酵素の量を、積載効率から決定されたような、（ＰＱＱ）ＧＤＨ＠ＺＩＦ−８に積載された酵素の量に等しくなるように調整した。
【０１９０】
図９は、タンパク質溶解剤の存在下及び沸騰水中での処理後における、（ＰＱＱ）ＧＤＨ＠ＺＩＦ−８対遊離（ＰＱＱ）ＧＤＨの標準化された生成物の変換率を示す。（ＰＱＱ）ＧＤＨの活性は、電子受容体としてフェナジンメトスルファートを使用して決定された。
【０１９１】
ウレアーゼ＠ＺＩＦ−８の生理活性
４５℃を超えると変性するウレアーゼは、ＭＯＦ構造体内に包接されると８０℃まで保護され得る。ウレアーゼのサイズ（約６００kDa、流体力学上は１７７．９Å）及びアルコール（例えばメタノール）存在下におけるその迅速な分解のために、提案された方法は、生体巨大分子のためのホストとしてＭＯＦを使用することを目指した以前に報告された方法の制約及び／又は有機溶媒の必要性を克服することができる。
【０１９２】
ウレアーゼ＠ＺＩＦ−８の活性は、ｐＨ指示薬としてフェノールレッドを使用して、尿素からアンモニアへの変換の結果としてのｐＨの上昇を測定することによって決定された。フェノールレッド溶液は、フェノールレッド １０mgをＮａＯＨ溶液 ２８４μL（０．１Ｍ）に溶解することによって調製され、脱イオン水を用いて最終容量 １０mLとした。典型的なアッセイでは、フェノールレッド溶液 １０μL、尿素溶液 ９９０μL（０．５Ｍ）及びＺＩＦ−８＠ウレアーゼを、紫外可視分光法用のキュベットに加え、溶液の吸光度を５６０nmで紫外可視分光法によって３０秒間隔でモニタリングした。
【０１９３】
図１０は、８０℃の水中で１時間の熱処理の前後における、ウレアーゼ＠ＺＩＦ−８対遊離ウレアーゼの標準化された生成物の変換率を示す。実験は３回行なわれた。ウレアーゼの活性は、尿素からアンモニアへの変換の結果としてｐＨ指示薬としてフェノールレッドを使用して決定された。半減時間は、最大基質変換率の半分に達する時間であり；Ｖ０は、初期の酵素の基質変換率である。
【０１９４】
実施例８
ｐＨによりトリガーされるタンパク質の放出
試験の手順を図１１（ａ〜ｄ）に示す。実施例２の合成に使用されたＢＳＡを標識することによって調製されたＦＩＴＣ−ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８ １mgを、穏やかな撹拌下で、ｐＨ７．４又はｐＨ６．０にｐＨの調整された３７℃のＰＢＳ ２mL中に分散させた。２４時間の間、定期的な間隔で、結晶分散液を、２００００ｇで１０分間遠心分離にかけ、放出されたＦＩＴＣ−ＢＳＡの蛍光強度を、蛍光分光分析計を使用して上清からの蛍光強度をモニタリングすることによって評価した。測定されたデータを図１１（ｅ）に示す。
【０１９５】
ｐＨによりトリガーされる酵素の放出、及び放出された酵素の生理活性
ホスト種としてＺＩＦを使用することによってもたらされるさらなる利点は、ＺｎイオンとＨｍＩｍ有機配位子との間の配位が、生理学的に妥当な条件においてｐＨ依存性であることである。すなわち、構造体は特定のｐＨ値で溶解し得、したがって、包接された生体分子は外部環境に放出される。これは、例えば特定のｐＨ値によって特徴付けられる特定の場所に酵素を放出しなければならないような薬物送達への適用にとって特に有用である。
【０１９６】
これは、ＦＩＴＣで標識されたＢＳＡ＠ＺＩＦ−８試料の結晶について実験的に判明しており、これについて特定のｐＨにより誘導される放出プロファイルが測定された。図１１（ａ〜ｄ）はこの試験を説明する。ｐＨ７．４では（すなわち細胞外ｐＨ）、１０％未満のＢＳＡが２４時間かけて結晶から放出され、このことは、結晶が依然として安定であることを実証する。しかしながら、ｐＨ６．０のＰＢＳでは（すなわち細胞内条件）、ＭＯＦ構造体が次第に崩壊するために、定量的なＢＳＡの放出を、約２４時間後に測定することができる（図１１（ｅ））。
【０１９７】
ｐＨによりトリガーされる反応性生体分子の同溶液への放出
包接された分子がその生理活性を保持することを実証するために、同じようなｐＨ放出試験を、図１１（ｆ〜ｉ）に示された試験に従って、ＤＱ−オボアルブミン（ＤＱ−ＯＶＡ）を包接しているＺＩＦ−８と混合された酵素トリプシンを包接しているＺＩＦ−８に対して行なった。ＤＱ−ＯＶＡは蛍光発生タンパク質基質であり、トリプシンによるＤＱ−ＯＶＡの酵素的タンパク質分解が一旦起こると、高度な蛍光を有する色素で標識されたペプチドが形成される。したがって、トリプシン及びオボアルブミンの両方がＭＯＦから放出されると、該酵素は、放出されたタンパク質のオボアルブミンを切断するその触媒活性を遂行することができる。生体分子を含有している２つのＭＯＦバッチを別々に洗浄し、次いで一緒に混合すると、ｐＨ７．４の懸濁液が形成される。このバイオ官能基化されたＺＩＦ−８溶液から放出された蛍光強度を、無視できるばらつきを示す分光蛍光光度計を使用して経時的に測定した（図１１（ｊ））。
【０１９８】
試験の手順を図１１（ｆ〜ｉ）に示す。トリプシン＠ＺＩＦ−８ １mg及びＤＱ−ＯＶＡ＠ＺＩＦ−８ １mgを、ｐＨ７．４又はｐＨ６．０にｐＨの調整された３７℃のＰＢＳ ２mLに穏やかな撹拌下で分散させた。トリプシンによるＤＱ−ＯＶＡのタンパク質分解から生じた溶液中のＢＯＤＩＰＹ色素に由来する蛍光を、蛍光分光光度計を使用して定期的にモニタリングした。測定されたデータを図１１（ｊ）に示す。
【０１９９】
一旦トリプシン又はＤＱ−ＯＶＡを包埋しているＭＯＦ結晶がｐＨ６．０に曝されると、ＭＯＦは分解し始め、したがって、それぞれの生体分子を溶液中に放出する。一旦溶液中で生体分子が反応すると、ＤＱ−ＯＶＡに対するトリプシンのタンパク質分解活性から派生する色素標識ペプチドの形成の結果として、蛍光強度の増加が誘発される（図１１（ｊ））。
【０２００】
図１２は、経時的なｐＨ６．０におけるＢＳＡ＠ＺＩＦ−８結晶の漸進的な分解を示した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像示す。
【０２０１】
実施例９
ＢＳＡ濃度の上昇につれてＺＩＦ−８が形成される
包接され得る生体分子の量を変化させる実験を行なった。結果はまた、タンパク質の量を変化させることによって、ＭＯＦの結晶化度を調整することができることを示した。いくつかのバッチは漸増量のＢＳＡを用いて作製されたこと以外は、実施例２に従ってＢＳＡ＠ＭＯＦ試料を調製した。特に、試料は、ＨｍＩｍ水溶液（１６０mM、２mL）に溶解させた１mg、５mg、１０mg、及び２０mgの量のＢＳＡを使用して調製され、その後、室温で酢酸亜鉛水溶液（４０mM、２mL）と混合した。調製されたＢＳＡ＠ＭＯＦを、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、及びブルナウアー・エメット・テラー法（ＢＥＴ）を用いて調べた。
【０２０２】
結果を図１３、１４及び１５にまとめる。
【０２０３】
図１３は、ＢＳＡを包接しかつ漸増量のＢＳＡを使用して合成された、ＺＩＦ−８の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。１mg（ａ）、５mg（ｂ）、１０mg（ｃ）、及び２０mg（ｄ）のＢＳＡを、ＨｍＩｍ水溶液（１６０mM、２mL）に溶解し、その後、室温で酢酸亜鉛水溶液（４０mM、２mL）と混合した。
【０２０４】
図１４は、バイオ播種過程に使用されるＢＳＡの濃度が上昇するにつれて結晶化度が減少することを示したＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを示す。１mg（青色）、５mg（緑色）、１０mg（橙色）、及び２０mg（赤色）のＢＳＡを、ＨｍＩｍ水溶液（１６０mM、２mL）に溶解し、その後、室温で酢酸亜鉛水溶液（４０mM、２mL）と混合した。Ｘ線回折（ＸＲＤ）スペクトルは、前駆体溶液中のＢＳＡの量を変化させることによって、生成物を結晶性（ＺＩＦ−８）からほぼ無定形へとどのように調整することができるかを示す。結果は、あらゆる種類の結晶性ＭＯＦを形成する能力に影響を及ぼすことなく、かなりの量のタンパク質をＭＯＦに包接することができることを示す。
【０２０５】
実施例１０
ＢＥＴによるタンパク質＠ＺＩＦ−８の特徴付け
ＢＳＡを包接しかつ様々な量のＢＳＡを使用して得られた、ＺＩＦ−８の細孔サイズ分布を、図１５で示されているような、ＢＥＴ測定からのデータを使用して測定した。ＢＳＡの量が増加するにつれて、細孔容積は次第に減少する。細孔サイズの明白なシフトは全く見られず、このことは、ＺＩＦ−８は生体分子の周辺に形成されることを示唆する。約１３．８Åの細孔幅に中心を置く第二のピークは、ＺＩＦ−８構造体内の本来備わっている空洞を示すのではなく、むしろ試料中のＺＩＦ−８凝集体の存在を反映することに留意する。凝集体は、一緒に充填された個々のＺＩＦ−８結晶から作られる。凝集体は、凝集体を形成している隣接している結晶間の平均サイズ１３．８Åの空隙によって特徴付けられる。第一のピークは約１１の細孔直径を示し、これはＬＣＤの予測と良く相関することに留意する。
【０２０６】
また、ＢＥＴを使用して、ＢＳＡ、ＨＳＡ、ＯＶＡ、トリプシン、（ＰＱＱ）ＧＤＨ、ヘモグロビン、リゾチーム、ＨＲＰ、リボヌクレアーゼＡをはじめとする様々なタンパク質の播種された、ＺＩＦ−８の接触面積を評価した。何も含まれていないＺＩＦ−８のＢＥＴを比較のために提供する。合成は、ここに列挙されたタンパク質を使用して、実施例２に記載されたものに準拠する。
【０２０７】
ＢＥＴ表面積を、Micromeritics社の６ポートのＡＳＡＰ２４２０分析装置を使用して、−１９６℃における窒素吸着を使用して決定した。試料を、分析前に真空下で１２０℃で８時間かけて脱気した。細孔分布を、密度汎関数理論を使用して決定した。これは、細孔サイズ分布を実験的に測定する典型的な方法である。結果は、Haldoupis, S. Nair and D. S. Sholl, Journal of the American Chemical Society, 132 (2010), 7528に概略が示されているように、ＬＣＤ値などの数学的に導かれた数値と相関する。
【０２０８】
（ａ）ＢＳＡ、（ｂ）ＨＳＡ、（ｃ）ＯＶＡ、（ｄ）トリプシン、（ｅ）（ＰＱＱ）ＧＤＨ、（ｆ）ヘモグロビン、（ｇ）リゾチーム、（ｈ）ＨＲＰ、（ｉ）リボヌクレアーゼＡ １mgを使用したＺＩＦ−８のバイオ播種についての７７ＫでのＢＥＴ Ｎ２吸着／脱離曲線は、それぞれ（ａ）１３８１、（ｂ）１０２５、（ｃ）１０３１、（ｄ）１３０７、（ｅ）１２７８、（ｆ）１３２９、（ｇ）１３７０、（ｈ）１３７６、及び（ｉ）１４０４m２g−１の表面積を与えた。
【０２０９】
実施例１１
ＺＩＦ−８にオリゴヌクレオチドを播種（活性、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ））
Ｃｙ３−オリゴヌクレオチド ２００μL（２０．８μM）を、２−メチルイミダゾールの脱イオン水溶液（１６０mM、０．５mL）に加えた。脱イオン水に溶解した酢酸亜鉛の別の溶液（４０mM、０．５mL）を調製した。次いで、これらの２つの溶液を混合し、１０秒間ボルテックスにかけた。混合物を室温で２４時間置いた。得られた沈降物を、１６０００rpmで１０分間の遠心分離によって回収し、次いで、エタノール中で洗浄し遠心分離にかけた。ＺＩＦ−８へのＤＮＡの積載効率（７５％）を、前駆体溶液中及び得られた結晶の上清中のＤＮＡ濃度を測定することによって、予め決定された検量曲線から５６１nm（Ｃｙ３の発光極大）での発光を収集する蛍光分光光度計を使用して決定した。
【０２１０】
比較実施例１
ＺＩＦ−８へのＢＳＡの合成後の浸潤
純粋なＺＩＦ−８のバッチを、本明細書に記載された標準的な手順に従って調製し、続いてＦＩＴＣで標識されたＢＳＡ溶液に曝した。ＦＩＴＣで標識されたＢＳＡに後で曝された純粋なＺＩＦ−８の共焦点顕微鏡による調査を行ない、ＭＯＦ内でのタンパク質の拡散能力を検証した。
【０２１１】
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を、ライカＴＣＳ ＳＰ５を使用して行なった。合成後に浸潤させた試料は、図１６に示されるような発光特徴を示した。浸潤した試料の発光を、図７及び８に示される、本発明に従って調製されたＢＳＡ＠ＺＩＦ−８試料からの発光と比較することができる。ＢＳＡは単に、ＺＩＦ−８試料内で拡散しなかった。なぜなら、発光シグナルの大半が、結晶の表面上に検出されるからである。
【０２１２】
また、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を使用して、後で浸潤させたＭＯＦ内（先行技術）と本発明に従って調製されたＢＳＡを含有しているＭＯＦ内のタンパク質の分布をさらに比較した。測定されたデータを図１７に示す。したがって、以下の試料を調べた。
１）純粋なＢＳＡ；
２）ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８：
３）実施例２の手順による、界面活性剤で洗浄された、ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８；
４）純粋なＺＩＦ−８；
５）合成後にＢＳＡを浸潤させた予め形成された純粋なＺＩＦ−８；
６）合成後にＢＳＡを浸潤させ界面活性剤で洗浄した、予め形成された純粋なＺＩＦ−８。
【０２１３】
図１７のスペクトルに関して、タンパク質（ＢＳＡ）に特徴的なアミドＩ（１６５５cm−１）及びアミドＩＩ（１５４８cm−１）ピークが、ＢＳＡ＠ＺＩＦ−８（橙色）及びＢＳＡ溶液中でインキュベートされたＺＩＦ−８（青色）において検出された。しかしながら、ＳＤＳによる洗浄後、アミドのピークは、本発明によって作製されたＢＳＡ＠ＺＩＦ−８結晶においてのみ検出され、このことは、ＢＳＡ溶液に後で曝されたＺＩＦ−８からタンパク質が洗い流されたことを示唆する。播種されたＺＩＦ−８中のＢＳＡの別の指標は、タンパク質に属している化学基によって大半が派生する３６００〜２８００cm−１の範囲内の幅広いバンドに関連する。
【０２１４】
界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）による洗浄は、アミドに関連したスペクトルモードが、ＢＳＡ溶液に後で曝されたＺＩＦ−８から消失することを示す。振動モードは依然として、播種されたＢＳＡ＠ＺＩＦ−８に存在し、このことは、タンパク質がＺＩＦ−８の内側にあり、したがって包接され、かつ空間的な制約によって緻密に結合している可能性が高いことを確認する。
【０２１５】
比較実施例２
高温への曝露前後における、ＨＲＰ＠ＣａＣＯ３及びＨＲＰ＠ＳｉＯ２粒子、対、ＨＲＰ＠ＺＩＦ−８及び（ＰＱＱ）ＧＤＨの生理活性
ＨＲＰの積載されたＣａＣｏ３粒子を、以前に報告された方法（Volodkin, D. V. Larionova, N. I. & Sukhorukov G. B. ‘Protein Encapsulation via Porous CaCO3 Microparticles Templating’ Biomacromolecules 5, 1962-1972 (2004)、及びPetrov A. I., Volodkin D. V. & Sukhorukov G. B. ‘Protein-Calcium Carbonate Coprecipitation: A Tool for Protein Encapsulation’, Biotechnology Progress, 21, 918-925 (2005)）に従って合成した。
【０２１６】
伝統的なタンパク質の積載されたＣａＣｏ３粒子の生理活性と、本発明に従って調製されたタンパク質を包接しているＭＯＦの生理活性とを比較するために合成が行なわれた。
【０２１７】
Ｎａ２ＣＯ３（脱イオン水中３３０mM）溶液を、ＨＲＰ（脱イオン水中２mg/mL）を含有している等容量のＣａＣｌ２（３３０mM）溶液と迅速に混合し、その後、室温で３０秒間激しく撹拌した。次いで、得られた溶液を撹拌せずに１５分間置いた。得られた沈降物を、水中で１０００ｇでの２分間の遠心分離によって回収した。ＣａＣｏ３粒子へのＨＲＰの積載効率を、前駆体溶液中及び得られた粒子の上清中のＨＲＰ濃度を測定することによって、予め決定された検量曲線から２８０nmにおける紫外可視分光法を使用して決定した。積載効率：２８重量％。
【０２１８】
ＨＲＰの積載されたＳｉＯ２粒子の調製のために、粒子の表面を、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を用いて修飾した。シリカ粒子 １０mg（平均細孔サイズ７nm ＳＢＡ−１５、ACS Material、LLC；２０、５０及び１００nmの細孔サイズ、TESSEK Ltd.）を、ＡＰＴＥＳ ０．５mLを含むトルエン（５mL）に懸濁した。室温で１２時間撹拌した後、ＡＰＴＥＳで修飾されたシリカ粒子を、３回の連続的な洗浄／遠心分離サイクルにおいてエタノール及び水を用いて洗浄し、最後にＭＥＳ緩衝液（１mL、０．１Ｍ、ｐＨ５）に分散させた。
【０２１９】
次いで、ＨＲＰ（１mg）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１mg）をシリカ粒子懸濁液に導入し、一定の穏やかな撹拌下で２時間インキュベートした。酵素積載効率：８２．０％（７nmの細孔のＳｉＯ２）、６８．８％（２０nmの細孔のＳｉＯ２）、６９．１％（５０nmの細孔のＳｉＯ２）、６６．２％（１００nmの細孔のＳｉＯ２）。
【０２２０】
ＨＲＰの積載されたＺＩＦ−８、ＣａＣＯ３及びＳｉＯ２粒子を、７０℃のＳＤＳ（脱イオン水中１０％ｗ／ｗ、２mL）溶液中に１０分間再分散させ、粒子表面上の遊離酵素を洗い流した。典型的な生理活性アッセイでは、溶液Ａに導入されたＺＩＦ−８、ＣａＣＯ３及びＳｉＯ２粒子の量を、積載効率から決定されたような、粒子に積載された酵素と同じ量となるように調整した。一旦粒子が溶液Ａに添加されると、溶液の吸光度を、４２０nmで紫外可視分光法によって３０秒間隔で直ちにモニタリングした。対照実験では、ＺＩＦ−８、ＣａＣＯ３及びＳｉＯ２粒子を、脱イオン水（１mL）に再分散し、９０℃で１時間インキュベートし、その後、生理活性アッセイを開始した。
【０２２１】
重要なことには、ＭＯＦ結晶は、高温における生体分子を保護するための頑強なバリアのように作用する。ＺＩＦ−８結晶に包埋されたＨＲＰは、ピロガロールの存在下で酵素反応を誘発するが（遊離酵素の活性の８８．５％、図１８（ａ））、（ＰＱＱ）ＧＤＨはグルコースを処理する（遊離酵素の活性の７４．２％、図１８（ｂ））。
【０２２２】
ＭＯＦバイオコンポジットを９０℃で１時間水熱処理することにより、生理活性はほんの僅かしか減少しない（すなわち、全体の効率は依然として高く、ＨＲＰでは８２．３％、（ＰＱＱ）ＧＤＨでは６８．２％である）。重要なことには、溶液中の遊離酵素に対する同じ熱処理により、その効率はＨＲＰでは僅か６％に、（ＰＱＱ）ＧＤＨでは６％に下降し、このことは、ＭＯＦの相当に保護的な役割を強調する。
【０２２３】
しかしながら、ＣａＣＯ３及びＳｉＯ２粒子を９０℃で１時間処理した後、そこに含有される酵素の酵素活性のかなりの低下が記録されたが、ＭＯＦ粒子は、酵素活性の有意な減少は全く示さなかった（図１８（ｃ））。
【０２２４】
追加の実験において、遊離ＨＲＰ、ＨＲＰ＠ＣａＣＯ３、ＨＲＰ＠ＳｉＯ２及びＨＲＰ＠ＺＩＦ−８バイオコンポジットも、沸騰水に１時間浸漬させた。遊離酵素は完全に活性を失ったが、ＨＲＰ＠ＣａＣＯ３は基質の３９％、ＨＲＰ＠ＳｉＯ２コンポジットは基質の６５％（７nmの細孔）、４４％（２０nmの細孔）、１７％（５０nmの細孔）及び１３％（１００nmの細孔）をそれぞれ変換した。これらの数値は、同じ条件下でＺＩＦ−８により保護されたＨＲＰによって達成された８８％の変換率よりかなり低い。
【０２２５】
さらなる一連の実験では、同じシステムを、沸騰しているＤＭＦ（１５３℃）中に１時間浸漬させた。ここでも、遊離酵素は活性を完全に失ったが、炭酸塩及びシリカ粒子に包埋された酵素は、それぞれ３２％及び２２％の基質変換率を示した。これらの条件下で、ＭＯＦバイオコンポジットは９０％の変換率を示し、このことは、ＭＯＦ層の顕著に保護的な特性をここでも実証する。
【０２２６】
実験は、熱による分解から酵素を保護することに関して、ＭＯＦ構造が有する優れた特性を証明する（１１０％の相対的な保護の改善）。このことは、ＭＯＦが、生体分子の周辺により緻密に順応し得（典型的にはＣａＣＯ３は２０〜７０nmの範囲の細孔サイズを有する［参考文献A.I. Petrov, D. V. Volodkin, G.B. Sukhorukov Biotechnol. Prog. 2005, 21, 918-925, Yu-Ho Won, Ho Seong Jang, Ding-Wen Chunga, Lia A. Stanciu J. Mater. Chem., 2010, 20, 7728-7733］）、生体巨大分子が熱によってアンフォールディングされるのを防ぐことを示唆する。
【０２２７】
それ故、ＣａＣＯ３及びＳｉＯ２と比較して、包接しているＭＯＦによってもたらされる優れた安定性は、ＭＯＦ構造体による生体分子の緻密な包接に直接関連し得る。
【０２２８】
本明細書及び以下の特許請求の範囲の全体を通して、本文で特記されない限り、「含む（comprise）」という単語、並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」などの変化形は、記載の整数若しくは工程、又は一群の整数若しくは工程の包含を意味するが、任意の他の整数若しくは工程、又は一群の整数若しくは工程の除外を意味するものではないことが理解されるだろう。
【０２２９】
あらゆる先行の刊行物（又はそれから得られた情報）又はあらゆる公知の事項への本明細書における言及は、その先行の刊行物（又はそれから得られた情報）又は公知の事項が、本明細書が関連する努力の分野における共通一般知識の一部を形成するという、了承若しくは承認又は任意の形式の示唆ではなく、またそう捉えられるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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