(57)【要約】  本発明の主題は、ガラス棒（Ｅ）に埋め込まれた少なくとも２つの金属電極（Ａ）を含む選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブであって、第１ガラス製のガラス棒（Ｅ）が５０μｍ〜２ｍｍ径、好ましくは５０μｍ〜５００μｍ径であり、金属アロイ製の金属電極（Ａ）が１μｍ〜１００μｍ径、好ましくは２０μｍ〜３０μｍ径を有する棒として形成され、金属電極の棒の末端が露出しており、第１ガラス及び金属アロイは、第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが金属アロイの融点に近くなるように組み合わされていることを特徴とする、選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブである。本発明はまた、当該マイクロプローブの製造方法を含む。
2017534384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス棒（Ｅ）に埋め込まれた少なくとも２つの金属電極（Ａ）を含む選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブであって、
第１ガラス製の該ガラス棒（Ｅ）が、５０μｍ〜２ｍｍ径、好ましくは５０μｍ〜５００μｍ径であり、
金属アロイ製の該金属電極（Ａ）が、１μｍ〜１００μｍ径、好ましくは２０μｍ〜３０μｍ径を有する棒として形成され、前記金属電極の棒の末端が露出しており、
前記第１ガラスと前記金属アロイが、前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが前記金属アロイの融点に近くなるように組み合わされていることを特徴とする、選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブ。
【請求項２】
前記金属アロイが前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより低い融点を示し、好ましくは前記金属アロイが前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより５０℃以上低い融点を示し、好ましくは前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが少なくとも６１０℃である、請求項１に記載のマイクロプローブ。
【請求項３】
前記金属アロイが銀アロイ、好ましくは銀及び錫アロイ、例えばＢＡｇ７（Ａｇ５６Ｓｎ）アロイである、請求項１又は２に記載のマイクロプローブ。
【請求項４】
前記マイクロプローブが、前記ガラス棒（Ｅ）内に設置される、薬剤送達用空気チャンネル（Ｂ）を少なくとも１つ含み、該空気チャンネルが好ましくは２μｍ〜１５００μｍ径である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロプローブ。
【請求項５】
前記マイクロプローブが、前記ガラス棒（Ｅ）内に設置される、第２ガラス製の光学信号移送用光学チャンネル（Ｃ）を少なくとも１つ含み、該光学チャンネルが好ましくは１μｍ〜３００μｍ径である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロプローブ。
【請求項６】
前記マイクロプローブが、前記ガラス棒（Ｅ）内に設置される、第２ガラス製の光学信号移送用画像チャンネル（Ｄ）を少なくとも１つ含み、該画像チャンネルが好ましくは５０μｍ〜１５００μｍ径である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロプローブ。
【請求項７】
前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより低く、好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．００１低く、より好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．０１低く、最も好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．５低く、例えば前記第１ガラスの屈折率ｎDが１．５１であり、前記第２ガラスの屈折率ｎDが少なくとも２．４９である、請求項５又は６に記載のマイクロプローブ。
【請求項８】
前記第１ガラスと前記第２ガラスの線熱膨張係数が類似しており、
好ましくは前記第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８４．０×１０-7Ｋ-1であり、前記第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で８９．０×１０-7Ｋ-1であるか、又は、
好ましくは前記第２ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８９．７×１０-7Ｋ-1であり、前記第２ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で９４．５×１０-7Ｋ-1である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロプローブ。
【請求項９】
前記第１ガラスがＳＫ２２２、ＮＣ−２１Ａ、ＰＢＧ−８９、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、及びＫＢ−０３ガラスからなる群より選択されるか、又は、
前記第２ガラスがＺｒ３／ＸＶ、ＮＣ−３２、ＮＣ−４１、ＬＬＦ１  Ｓｃｈｏｔｔ、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、ＰＢＧ−０８（ＰＢＧ８１）、Ｆ２／ｌ、６７／２、及びＰＢＳ−５７Ａガラスからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のマイクロプローブ。
【請求項１０】
選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブの製造方法、特に請求項１〜９のいずれか１項に記載の選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブの製造方法であって、
ａ）第１ガラス製のキャピラリー中で第１ガラス製の棒と金属アロイを含むコアとの位置合わせを行い、該キャピラリーは好ましくは延伸により予め調製されている、工程、
ｂ）該キャピラリー内の嫌気性雰囲気下で工程ａ）の調製物を細線化に供する工程、
ｃ）少なくとも２つの工程ｂ）の調製物、第１ガラス製のチューブに設置される第１ガラス製の棒を含み、好ましくは更に第２ガラス製の光ファイバーの棒を少なくとも１つ含む、プリフォームを調製する工程、
ｄ）圧力制御を有する光ファイバー延伸塔上で、かつ該プリフォーム内の保護的雰囲気下で、細線化を行い、工程ｃ）の該プリフォームを処理する工程
を含み、
５０μｍ〜２ｍｍ径、好ましくは５０μｍ〜５００μｍ径の第１ガラス製のガラス棒（Ｅ）、１μｍ〜１００μｍ径、好ましくは２０μｍ〜３０μｍ径を有する棒として形成される金属アロイ製の金属電極（Ａ）を作製し、
前記第１ガラス及び前記金属アロイが、前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが前記金属アロイの融点に近くなるように組み合わされている、選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブの製造方法。
【請求項１１】
工程ｄ）の後に、特にエッチング方法を用い、前記マイクロプローブの末端で金属電極を剥ぎ出す工程を行う、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
金属電極を剥ぎ出す工程の後に、続いて下層板に前記マイクロプローブを載せることにより前記マイクロプローブの金属電極を外部電力供給源に接続する、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
好ましくはフッ化水素酸溶液における水に対する酸の比が１：１である場合、より好ましくはエッチング時間が３０分である場合、フッ化水素酸溶液を用いたエッチング方法を行う、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより低い融点を有する前記金属アロイが使用され、好ましくは前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより５０℃以上低い融点を有する金属アロイが使用され、好ましくは前記金属アロイが銀アロイ、より好ましくは銀及び錫アロイ、例えばＢＡｇ７（Ａｇ５６Ｓｎ）アロイであり、前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが少なくとも６１０℃である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記第１ガラスと前記第２ガラスの線熱膨張係数が類似しており、
好ましくは前記第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８４．０×１０-7Ｋ-1であり、前記第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で８９．０×１０-7Ｋ-1であるか、又は、
好ましくは前記第２ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８９．７×１０-7Ｋ-1であり、前記第２ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で９４．５×１０-7Ｋ-1である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより低く、好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．００１低く、より好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．０１低く、最も好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．５低く、例えば前記第１ガラスの屈折率ｎDが１．５１であり、前記第２ガラスの屈折率ｎDが少なくとも２．４９である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記第１ガラスが、ＳＫ２２２、ＮＣ−２１Ａ、ＰＢＧ−８９、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、及びＫＢ−０３ガラスからなる群より選択されるか、又は、
前記第２ガラスが、Ｚｒ３／ＸＶ、ＮＣ−３２、ＮＣ−４１、ＬＬＦ１  Ｓｃｈｏｔｔ、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、ＰＢＧ−０８（ＰＢＧ８１）、Ｆ２／ｌ、６７／２、及びＰＢＳ−５７Ａガラスからなる群より選択される、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、インビボでの内部器官の選択細胞領域及びインビトロでの単一細胞の選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブであり、一つの装置において、局所薬物送達用チャンネル、エレクトロポレーションが適用される領域の観察用画像チャンネル、発光または治療信号の送達又は受容のための光学ファイバーをさらに組み込んだ選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブである。本発明の主題は、前記マイクロプローブの製造方法である。
【背景技術】
【０００２】
エレクトロポレーションは、実験で使用される送達方法の一つであり、生体の細胞膜に孔を開け、生物学的に活性な化合物を内部に送達し、内部から細胞の断片、例えばＤＮＡを単離する。この方法は、局所電磁場の生成に基づき、細胞膜の電気構造を破壊し、分子が細胞内で移動できるチャンネルを生成する（非特許文献１）。エレクトロポレーションは、遺伝子治療と新生疾患の治療のための実験方法として使用され、電場により細胞膜の局所的破壊及び悪性細胞への新規薬物の正確な送達を可能とする。エレクトロポレーションの利点は、生物全体に影響を及ぼす一般的化学治療を適用する必要性がなく、非常に毒性が高い抗がん剤の局所送達を可能にするところにある（非特許文献２）。
【０００３】
当該技術分野において、表面処理、特に皮膚癌（例えばメラノーマ）に使用される又はインビトロ選択性なしで細胞培養のエレクトロポレーションに使用される針又はプレート形状の肉眼で見えるプローブが知られている。既知の手段は、インビトロ培養の単一細胞のエレクトロポレーションを支持せず、非常に限定された領域での内部器官のエレクトロポレーションも支持しない。現在までに使用されるプローブの製造方法は、ファイバーエッチングの繰り返し及び金属と誘電層の適用に基づいたリソグラフ方法を使用するものである。当該方法において、異なる構造を有する材料は、スプレーにより混合され、延伸、いわゆるプローブシャフト細線化が使用される。前記方法で製造されたプローブは、選択的に作動し、限定された長さを有するため十分に薄くなっていない（最小約１ｍｍ）。更に、当該プローブのギャップ及び光導コアの品質は低い。リソグラフ法で得られるプローブは、低耐熱性と低曲げ耐性、低応力耐性を示し、例えば（当該プローブのシャフト中のチャンネルにより）薬剤送達に反映される機能は極端に制限されている。
【０００４】
特許文献１によれば、内部器官の電気刺激のために設計された直径約１ｍｍの円筒状断面を有する、前記方法を用いて製造された柔軟性プローブが知られている。当該プローブは、シャフトの長さ全体でのプローブの異なる部分に電気信号を移送する電線を含んでいる。
【０００５】
同様に、特許文献２には、脳細胞刺激用リソグラフ方法を伴う円筒状断面を有する柔軟性プローブの製造方法が開示されている。当該文献のプローブは、厚さ０．５ｍｍの絶縁材料の薄層で覆われた表面電極を含んでいる。
【０００６】
特許文献３によれば、表面に伸びる多くの電極を含む円筒状の固いコアを有するプローブ、リソグラフ法及び絶縁材料の薄層を有するカバーステージを含むプローブの製造方法が開示されている。
【０００７】
一方、特許文献４のニューロプローブは、１つ以上のシャフトからなり、プローブシャフトまたは複数のシャフトの長さ全体に伸びた、少なくとも１つの光学ファイバーに連結された光源を含んでいる。また、当該発明において、プローブを製造するためのリソグラフ方法が使用され、リソグラフ法で調製された導波管と金属線を含む半導体材料の表面に電極が接続されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，３０４，７８４号明細書
【特許文献２】欧州特許出願第２４９７４１９号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００２／０１９８４４６号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２０１３／００３０２７４号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｖｒｙ，  Ｊｏｃｈｅｎ  （２０１０）  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ：  Ａ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９２（３）
【非特許文献２】Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．Ｗ．  Ｓｍｙｅ，  Ｍ．Ｐ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｉ  Ｊ．Ａ．  Ｅｖａｎｓ，  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｏｒｉｅｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，  ｔｏｒｎ  ４４，  １−２  （２００６），  ５−１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記手段は、単一細胞または内部器官等の限定領域に、選択的に細胞膜に孔を開けるエレクトロポレーションを利用できない。この様に、従来より小さい寸法により、患者の単一細胞または限定領域に到達し、選択的エレクトロポレーションの道具として使用される当該プローブを開発する必要がある。
【００１１】
本発明の課題は、従来より小さく、単一細胞又は限定領域に到達できる選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブ及び当該マイクロプローブの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
当該課題を解決した本発明の要旨は以下の通りである。
［１］  ガラス棒（Ｅ）に埋め込まれた少なくとも２つの金属電極（Ａ）を含む選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブであって、
第１ガラス製の該ガラス棒（Ｅ）が、５０μｍ〜２ｍｍ径、好ましくは５０μｍ〜５００μｍ径であり、
金属アロイ製の該金属電極（Ａ）が、１μｍ〜１００μｍ径、好ましくは２０μｍ〜３０μｍ径を有する棒として形成され、前記金属電極の棒の末端が露出しており、
前記第１ガラスと前記金属アロイが、前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが前記金属アロイの融点に近くなるように組み合わされていることを特徴とする、選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブ。
［２］  前記金属アロイが前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより低い融点を示し、好ましくは前記金属アロイが前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより５０℃以上低い融点を示し、好ましくは前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが少なくとも６１０℃である、［１］に記載のマイクロプローブ。
［３］  前記金属アロイが銀アロイ、好ましくは銀及び錫アロイ、例えばＢＡｇ７（Ａｇ５６Ｓｎ）アロイである、［１］又は［２］に記載のマイクロプローブ。
［４］  前記マイクロプローブが、前記ガラス棒（Ｅ）内に設置される、薬剤送達用空気チャンネル（Ｂ）を少なくとも１つ含み、該空気チャンネルが好ましくは２μｍ〜１５００μｍ径である、［１］〜［３］のいずれかに記載のマイクロプローブ。
［５］  前記マイクロプローブが、前記ガラス棒（Ｅ）内に設置される、第２ガラス製の光学信号移送用光学チャンネル（Ｃ）を少なくとも１つ含み、該光学チャンネルが好ましくは１μｍ〜３００μｍ径である、［１］〜［４］のいずれかに記載のマイクロプローブ。
［６］  前記マイクロプローブが、前記ガラス棒（Ｅ）内に設置される、第２ガラス製の光学信号移送用画像チャンネル（Ｄ）を少なくとも１つ含み、該画像チャンネルが好ましくは５０μｍ〜１５００μｍ径である、［１］〜［５］のいずれかに記載のマイクロプローブ。
［７］  前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより低く、好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．００１低く、より好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．０１低く、最も好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．５低く、例えば前記第１ガラスの屈折率ｎDが１．５１であり、前記第２ガラスの屈折率ｎDが少なくとも２．４９である、［５］又は［６］に記載のマイクロプローブ。
［８］  前記第１ガラスと前記第２ガラスの線熱膨張係数が類似しており、
好ましくは前記第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８４．０×１０-7Ｋ-1であり、前記第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で８９．０×１０-7Ｋ-1であるか、又は、
好ましくは前記第２ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８９．７×１０-7Ｋ-1であり、前記第２ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で９４．５×１０-7Ｋ-1である、［１］〜［７］のいずれかに記載のマイクロプローブ。
［９］  前記第１ガラスがＳＫ２２２、ＮＣ−２１Ａ、ＰＢＧ−８９、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、及びＫＢ−０３ガラスからなる群より選択されるか、又は、
前記第２ガラスがＺｒ３／ＸＶ、ＮＣ−３２、ＮＣ−４１、ＬＬＦ１  Ｓｃｈｏｔｔ、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、ＰＢＧ−０８（ＰＢＧ８１）、Ｆ２／ｌ、６７／２、及びＰＢＳ−５７Ａガラスからなる群より選択される、［１］〜［８］のいずれかに記載のマイクロプローブ。
［１０］  選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブの製造方法、特に［１］〜［９］のいずれかに記載の選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブの製造方法であって、
ａ）第１ガラス製のキャピラリー中で第１ガラス製の棒と金属アロイを含むコアとの位置合わせを行い、該キャピラリーは好ましくは延伸により予め調製されている、工程、
ｂ）該キャピラリー内の嫌気性雰囲気下で工程ａ）の調製物を細線化に供する工程、
ｃ）少なくとも２つの工程ｂ）の調製物、第１ガラス製のチューブに設置される第１ガラス製の棒を含み、好ましくは更に第２ガラス製の光ファイバーの棒を少なくとも１つ含む、プリフォームを調製する工程、
ｄ）圧力制御を有する光ファイバー延伸塔上で、かつ該プリフォーム内の保護的雰囲気下で、細線化を行い、工程ｃ）の該プリフォームを処理する工程
を含み、
５０μｍ〜２ｍｍ径、好ましくは５０μｍ〜５００μｍ径の第１ガラス製のガラス棒（Ｅ）、１μｍ〜１００μｍ径、好ましくは２０μｍ〜３０μｍ径を有する棒として形成される金属アロイ製の金属電極（Ａ）を作製し、
前記第１ガラス及び前記金属アロイが、前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが前記金属アロイの融点に近くなるように組み合わされている、選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブの製造方法。
［１１］  工程ｄ）の後に、特にエッチング方法を用い、前記マイクロプローブの末端で電極を剥ぎ出す工程を行う、［１０］に記載の製造方法。
［１２］  電極を剥ぎ出す工程の後に、続いて下層板に前記マイクロプローブを載せることにより前記マイクロプローブの電極を外部電力供給源に接続する、［１１］に記載の製造方法。
［１３］  好ましくはフッ化水素酸溶液における水に対する酸の比が１：１である場合、より好ましくはエッチング時間が３０分である場合、フッ化水素酸溶液を用いたエッチング方法を行う、［１１］に記載の製造方法。
［１４］  前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより低い融点を有する前記金属アロイが使用され、好ましくは前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより５０℃以上低い融点を有する金属アロイが使用され、好ましくは前記金属アロイが銀アロイ、より好ましくは銀及び錫アロイ、例えばＢＡｇ７（Ａｇ５６Ｓｎ）アロイであり、前記第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが少なくとも６１０℃である、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］  前記第１ガラスと前記第２ガラスの線熱膨張係数が類似しており、
好ましくは前記第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８４．０×１０-7Ｋ-1であり、前記第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で８９．０×１０-7Ｋ-1であるか、又は、
好ましくは前記第２ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８９．７×１０-7Ｋ-1であり、前記第２ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で９４．５×１０-7Ｋ-1である、［１０］〜［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］  前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより低く、好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．００１低く、より好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．０１低く、最も好ましくは前記第１ガラスの屈折率ｎDが前記第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．５低く、例えば前記第１ガラスの屈折率ｎDが１．５１であり、前記第２ガラスの屈折率ｎDが少なくとも２．４９である、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］  前記第１ガラスが、ＳＫ２２２、ＮＣ−２１Ａ、ＰＢＧ−８９、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、及びＫＢ−０３ガラスからなる群より選択されるか、又は、
前記第２ガラスが、Ｚｒ３／ＸＶ、ＮＣ−３２、ＮＣ−４１、ＬＬＦ１  Ｓｃｈｏｔｔ、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、ＰＢＧ−０８（ＰＢＧ８１）、Ｆ２／ｌ、６７／２、及びＰＢＳ−５７Ａガラスからなる群より選択される、［１０］〜［１６］のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来より小さく、単一細胞又は限定領域に到達できる選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブ及び当該マイクロプローブの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、２つの金属電極Ａが、柔軟なガラスファイバー、いわゆるガラス棒Ｅに埋め込まれた本発明のマイクロプローブの図を示す。
【図２】図２は、更なる機能が図１に示すマイクロプローブに組み込まれた本発明のマイクロプローブの図を示す。
【図３】図３は、２つの金属電極Ａを有する、本発明のマイクロプローブのＳＥＭ断面画像である。
【図４】図４は、２つの金属電極Ａを有する、本発明のマイクロプローブ細線化のプリフォーム断面図を示す。
【図５】図５は、延伸で得られる金属コアを有するガラス棒Ｅの写真を示す。
【図６】図６は、本発明のマイクロプローブの充電の図を示す。
【図７】図７は、グリップにより試料に対する電気的及び機械的調節への接続が可能となる本発明のマイクロプローブを示す。
【図８】図８は、肉眼で見える電線を有する、本発明のマイクロプローブのガラス棒Ｅの導電性接着による接続を示す。
【図９ａ】図９ａは、実施例３のＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１TM）細胞のエレクトロポレーション結果を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、実施例３のＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１TM）細胞のエレクトロポレーション結果を示す。
【図９ｃ】図９ｃは、実施例３のＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１TM）細胞のエレクトロポレーション結果を示す。
【図１０ａ】図１０ａは、実施例３のＨ９Ｃ２細胞、ラット心筋細胞のエレクトロポレーション結果を示す。
【図１０ｂ】図１０ｂは、実施例３のＨ９Ｃ２細胞、ラット心筋細胞のエレクトロポレーション結果を示す。
【図１０ｃ】図１０ｃは、実施例３のＨ９Ｃ２細胞、ラット心筋細胞のエレクトロポレーション結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の主題は、第１ガラス製のガラス棒が、５０μｍ〜２ｍｍ径、好ましくは５０μｍ〜５００μｍ径を有し、金属アロイ製の金属電極が１μｍ〜１００μｍ径、好ましくは２０μｍ〜３０μｍ径の棒の形態で作製され、金属電極の棒の末端が露出しており、第１ガラスと金属アロイが、第１ガラスの膨張軟化点が金属アロイの融点に近くなるように組み合わされていることを特徴とする、ガラス棒に埋め込まれた少なくとも２つの金属電極を含む選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブである。金属電極を含むマイクロプローブの構築により、一定した電気が導入され、電位が生成され、金属電極は互いに隔離され、ガラスによって周囲から隔離されている。全ての装置は、小さく、一体化され、長く、ファイバーの形態である。
【００１６】
好ましくは、金属アロイは、第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより低い融点を示し、好ましくは金属アロイは、第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより５０℃以上低い融点を示し、好ましくは第１ガラスの膨張軟化点は少なくとも６１０℃である。この温度範囲に合わせると、内部に金属を有するキャピラリー構造の延伸が可能となるが、金属温度はガラスの温度より低くする必要があり、これが延伸塔で細線化を行う条件となる。金属アロイの融点と第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭの差が低い方がよい。これにより、金属が延伸しにくくなり、そのため、適切な構造が得られる。その為、金属アロイとガラスの組成は、温度差が最も低く、５０℃以下であるように組み合わされる。同時に、第１ガラスの低い膨張軟化点ＤＴＭはマイクロプローブ構造の良好な形成を可能とする。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、金属アロイは銀アロイであり、好ましくは銀及び錫アロイであり、例えば金属アロイはＢＡｇ７（Ａｇ５６Ｓｎ）アロイである。銀アロイの選択において、第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭは低いことが好ましい。ＢＡｇ７（Ａｇ５６Ｓｎ）は、第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭに適合した良好な変換パラメーターを有するアロイである。
【００１８】
好ましくは、本発明のマイクロプローブは、ガラス棒の内部に設置される、薬剤送達用空気チャンネルを少なくとも１つ含み、好ましくは該空気チャンネルは２μｍ〜１５００μｍ径を有する。
【００１９】
好ましくは、本発明のマイクロプローブは、ガラス棒に内部に設置される、光学信号移送用光学チャンネルを少なくとも１つ含み、好ましくは該光学チャンネルは、第２ガラス製であり、１μｍ〜３００μｍ径を有する。
【００２０】
他の好ましい態様において、本発明のマイクロプローブは、ガラス棒の内部に設置される、光学画像移送用の第２ガラス製の画像チャンネルを少なくとも１つ含み、好ましくは該画像チャンネルは、５０μｍ〜１５００μｍ径を有する。
【００２１】
好ましくは、第１ガラスの屈折率ｎDは、第２ガラスの屈折率ｎDより低く、好ましくは第１ガラスの屈折率ｎDは、第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．００１低く、より好ましくは第１ガラスの屈折率ｎDは、第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．０１低く、最も好ましくは第１ガラスの屈折率ｎDは、第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．５低く、例えば第１ガラスの屈折率ｎDは１．５１であり、第２ガラスの屈折率ｎDは、少なくとも２．４９である。屈折率の差が大きくなるほど、画像チャンネルが小さくなり、多くのチャンネルが所定の構造に挿入でき、高画像解像度を得ることができる。これは、いわゆる”熱的に適合した”これらの種類のガラスが光学ファイバー塔上で細線化することができる為（すなわち高い温度条件で好ましい構造を作製できる為）、非常に重要であり、冷却後に当該構造は安定になり、一時的な構造破壊となり得る内部応力を示さず、曲げに耐性となる。
【００２２】
好ましくは第１ガラスと第２ガラスの線熱膨張係数は、類似しており、好ましくは第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜３００℃の温度範囲で８４．０×１０-7Ｋ-1であり、第１ガラスの線熱膨張係数が２０〜４５０℃の温度範囲で８９．０×１０-7Ｋ-1であるか、又は好ましくは第２ガラスの線熱膨張係数は、２０〜３００℃の温度範囲で８９．７×１０-7Ｋ-1であり、第２ガラスの線熱膨張係数は、２０〜４５０℃の温度範囲で９４．５×１０-7Ｋ-1である。第１ガラスと第２ガラスの線熱膨張係数の差は、できるだけ小さいことが好ましい。ガラスを一緒に熱処理し（高い温度で構造を細線化し）、冷却し、構造の１次的崩壊となり得る又は曲げ、接触等の影響下で、高い内部構造応力の発生を回避することが重要である。
【００２３】
好ましくは、第１ガラスは、ＳＫ２２２、ＮＣ−２１Ａ、ＰＢＧ−８９、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、及びＫＢ−０３ガラスからなる群より選択できるか、又は第２ガラスは、Ｚｒ３／ＸＶ、ＮＣ−３２、ＮＣ−４１、ＬＬＦ１  Ｓｃｈｏｔｔ、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、ＰＢＧ−０８（ＰＢＧ８１）、Ｆ２／ｌ、６７／２、及びＰＢＳ−５７Ａガラスからなる群より選択される。これらはマイクロプローブ製造の過程で熱変形を可能とし、当該変形中に結晶化されないガラスである。当該群の各ガラスは適切な第１ガラスと熱的に対を形成することが重要である。
【００２４】
本発明はまた、選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブの製造方法、特に［１］〜［９］のいずれかに記載の選択的エレクトロポレーション用マイクロプローブの製造方法を含み、当該方法は、細線化法を使用し、
ａ）第１ガラス製のキャピラリー中で第１ガラス製の棒と金属アロイ製のコアとを挿入し、該キャピラリーは好ましくは延伸により予め調製されている、工程、
ｂ）該キャピラリー内の嫌気性雰囲気下で工程ａ）の調製物を細線化に供する工程、
ｃ）少なくとも２つの工程ｂ）の調製物、第１ガラス製のチューブに設置される第１ガラス製の棒を含み、好ましくは第２ガラス製の光学ファイバーの棒を少なくとも１つ含む、プリフォームを調製する工程、
ｄ）圧力制御と該プリフォーム内での保護的雰囲気（例えば嫌気性雰囲気）を用い、光学ファイバー塔上で、細線化を行い、工程ｃ）のプリフォームを処理する工程を含み、
５０μｍ〜２ｍｍ径、好ましくは５０μｍ〜５００μｍ径を有する第１ガラス製のガラス棒（Ｅ）、１μｍ〜１００μｍ径、より好ましくは２０μｍ〜３０μｍ径を有する棒として形成される金属アロイ製の金属電極（Ａ）を作製し、第１ガラス及び金属アロイが、第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭが金属アロイの融点に近くなるように組み合わされていることを特徴とする。
【００２５】
第１ガラス製のキャピラリーにより、薬物送達のためのマイクロプローブに沿ったチャンネルが作製でき、電場が生じる領域や電流が流れる領域、すなわち電極が剥ぎ出されたマイクロプローブの末端で試料を取得したり、試料を導入したりすることができる。マイクロプローブの末端の露出は重要であり、そのおかげで、電場が生成する領域、任意に電流が流れる領域を制御することができる（剥ぎ出されたマイクロプローブ末端が位置する領域、すなわち電極末端でのみ電流が流れる）。更に、マイクロプローブの製造方法において、第１ガラス製のキャピラリーにより、金属棒を構築物に挿入でき、金属棒は、細線化を行い一体化した後、キャピラリーに含まれることになる。細線化後の他のプレフォーム要素を一体化した後の、第２ガラス製の光学ファイバーの棒は、いわゆる光学ファイバーコアとなり、エレクトロポレーションした領域に薬物を送達したり、エレクトロポレーションした領域から分析のための光学信号を取り出したりすることができる。
【００２６】
他のプリフォーム要素と一体化した後、第２ガラス製の多くの光学ファイバーの棒は、細線化後に画像チャネルを構成することができ、各光学ファイバーの棒は１つの画像要素（ピクセル）を伝送する。
【００２７】
好ましくは、工程ｄ）の後に、特にエッチング法を用い、マイクロプローブの末端で電極を剥ぎ出す工程を行い、続いてマイクロプローブの電極は、マイクロプローブを下層板に載せることにより、外部電力供給源に接続される。
【００２８】
好ましくは、好ましくはフッ化水素酸溶液中の水に対する酸の比が１：１である場合、より好ましくはエッチング時間が３０分である場合、フッ化水素酸溶液を用いたエッチング法を使用する。
【００２９】
好ましくは、第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより低い融点を有する金属アロイを使用し、好ましくは第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭより５０℃以上低い融点を有する金属アロイを使用し、好ましくは金属アロイは銀アロイであり、好ましくは銀及び錫アロイであり、例えばＢＡｇ７（Ａｇ５６Ｓｎ）アロイであり、第１ガラスの膨張軟化点ＤＴＭは少なくとも６１０℃である。
【００３０】
好ましくは、第１ガラスと第２ガラスの線熱膨張係数は、類似しており、好ましくは第１ガラスの線熱膨張係数は２０〜３００℃の温度範囲で８４．０×１０-7Ｋ-1であり、第１ガラスの線熱膨張係数は２０〜４５０℃の温度範囲で８９．０×１０-7Ｋ-1であるか、又は好ましくは第２ガラスの線熱膨張係数は２０〜３００℃の温度範囲で８９．７×１０-7Ｋ-1であり、第２ガラスの線熱膨張係数は２０〜４５０℃の温度範囲で９４．５×１０-7Ｋ-1である。第１ガラスと第２ガラスの線熱膨張係数の差はできるだけ小さいことが好ましい。ガラスは同時に熱処理され（高温で構造を細線化し）続いて冷却し、構造の一時的な破壊となる又は曲げ、接触等の影響下で、高い内部構造応力の生成を回避できる。
【００３１】
好ましい態様において、第１ガラスの屈折率ｎDは第２ガラスの屈折率ｎDより低く、好ましくは第１ガラスの屈折率ｎDは第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．００１低く、より好ましくは第１ガラスの屈折率ｎDは第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．０１低く、最も好ましくは第１ガラスの屈折率ｎDは第２ガラスの屈折率ｎDより少なくとも０．５低く、例えば第１ガラスの屈折率ｎDは１．５１であり、第２ガラスの屈折率ｎDは少なくとも２．４９である。屈折率の差が大きい程、画像チャンネルが小さくなり、多くのチャンネルが所定の構造に挿入でき、高解像度を得ることができる。これは、いわゆる”熱的に適合した”これらの種類のガラスは、光学ファイバー塔上で細線化でき（すなわち、高い温度で好ましい構造を作製でき）、冷却後、当該構造は安定であり、一時的な構造破壊となり得る内部応力を示さず、曲げに耐性となる為、非常に重要である。
【００３２】
好ましくは、第１ガラスは、ＳＫ２２２、ＮＣ−２１Ａ、ＰＢＧ−８９、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、及びＫＢ−０３ガラスからなる群より選択することができるか、又は第２ガラスは、Ｚｒ３／ＸＶ、ＮＣ−３２、ＮＣ−４１、ＬＬＦ１  Ｓｃｈｏｔｔ、Ｆ２  Ｓｃｈｏｔｔ、ＰＢＧ−０８（ＰＢＧ８１）、Ｆ２／ｌ、６７／２、及びＰＢＳ−５７Ａガラスからなる群より選択することができる。これらは、マイクロプローブの製造過程で熱変形を可能とし、当該変形中に結晶化しないガラスである。当該群の各ガラスは、適切な第１ガラスと熱的に対を形成することが重要である。
【００３３】
本発明のマイクロプローブは、ファイバーの形態で一体化構造を示し、生検針を用いたインビボ用途又はインビトロ用途で利用することができる。内部応力のない安定で一体化されたマイクロプローブ構造を得る為、本発明のマイクロプローブのパラメーター、すなわち柔軟性、温度及び応力耐性は、光学ファイバー塔上での細線化において、熱的に適合し、一体化され、良好なレオロジー特性を有する材料を選択することにより得られる。
【００３４】
電極間の距離が狭く、細胞のエレクトロポレーションに必要な電場を作製する為、わずかな電圧Ｖが、肉眼で見える標準エレクトロポレーション装置に必要なキロボルト電圧の代わりに印加される。これにより、本発明のマイクロプローブは、電池を用いて充電することができる。
【００３５】
本発明のマイクロプローブの製造方法は、同じ幾何学パラメーターを有するマイクロプローブの大量生産が可能となる。引張工程、いわゆる光学ファイバー延伸塔での延伸は、同じパラメーターとして数メートルの長さを有するマイクロプローブの製造を可能とし、所定の長さのマイクロプローブに切断することができる。
【実施例】
【００３６】
以下の材料をマイクロプローブの製造に使用した：
マイクロプローブ設計：第１ガラス、すなわちＳＫ２２２（Ｋｒｏｓｎｏ  Ｇｌａｓｓｗｏｒｋｓ製の温度測定型ガラス）製のチューブ及び棒
光学チャンネルＣ：第２ガラス、すなわちＺｒ３／ＸＶガラス（ＩＴＭＥで設計され溶融されたもの）製の棒
金属電極Ａ：ＢＡｇ７（Ａｇ５６Ｓｎ）アロイ（製造元Ｌｕｃａｓ−Ｍｉｌｈａｕｐｔ  Ｇｌｉｗｉｃｅ）製の２ｍｍ径の棒
材料特性を表１及び２に示す。
【００３７】
【表１】
2017534384.tif 000003
【００３８】
【表２】
2017534384.tif 000004
【００３９】
第１ガラスと第２ガラスの線熱膨張係数は類似している。金属アロイがガラスの細線化の温度より５０℃低い融点である為、ＳＫ２２２ガラスとＢＡｇ７アロイが選択される。それにより、ガラスキャピラリー延伸中に金属流動性が提供され、延伸したガラス金属棒の間隔の生成が制限される。第１ガラスのＳＫ２２２ガラスの比較的高い線熱膨張係数（２０〜４５０℃で８９×１０-7Ｋ-1）により、ガラス金属界面の張力が減少する。第２ガラスのＺｒ３／ＸＶは、屈折率と線熱膨張係数の点で、第１ガラスのＳＫ２２２ガラスと組み合わされ、良好な機械特性を有する光学画像移送用画像チャンネルＤが作製される。
【００４０】
本発明の理想として、レオロジーの点で熱的に適合した異なる種類のガラスを選択することができる。以下に、質と量の組成と屈折率ｎDに関する、熱的に適合するガラスの組を示す。
【００４１】
【数１】
2017534384.tif 000005
【００４２】
【数２】
2017534384.tif 000006
【００４３】
実施例１
エレクトロポレーション用マイクロプローブ
本態様において、図１のスキーム及び図３のＳＥＭ画像に示されるエレクトロポレーション用マイクロプローブは、２つの組み合わされた金属電極Ａを有するガラス棒Ｅである。或いは、マイクロプローブは、図２に示される様に、微小の電線の形態であり、ガラス棒Ｅに組み込まれている金属電極Ａを多く含む。連続して長い金属電極Ａは、それぞれ２９μｍ及び２８μｍ径の小さい直径、３７μｍの間隔を示す。ガラス棒の外径は４５８μｍである。
【００４４】
更なる応用に応じて、マイクロプローブは、光学画像移送用画像チャンネルＤ、光学信号移送用光学チャンネルＣ、又は薬物送達用空気チャンネルＢ等の他の要素を用い、１ユニットに一体化される。
【００４５】
実施例２
光学画像移送用光学チャンネルＣを含むＧＭ１Ａ型マイクロプローブの製造
マイクロプローブの製造方法は数工程で行われた。
２ｍｍ内径及び約０．５の内径／外径比を有するＳＫ２２２ガラスのキャピラリーの製造
この目的のため、Φｅｘｔ／Φｉｎｔ１５／１１チューブから、Φｅｘｔ１０を延伸し、Φｅｘｔ１５キャピラリーと組み合わせて、Φｅｘｔ／Φｉｎｔ寸法４．２／２で延伸した。
【００４６】
金属コアを有するガラス棒Ｅの延伸
研磨及び脱脂後のＢＡｇ７アロイ製の棒を、組み込まれたＳＫ２２２ガラス製のキャピラリーに入れた。キャピラリーは、酸素を除き金属酸化を避ける為、細線化前にポンプで空気を吸引し数分アルゴンを流した。細線化において、キャピラリー（アルゴン）内で嫌気的条件を保持した。０．３〜１．１の外径を有するように棒を（金属コアと共に）延伸した。これを図２に示す。
【００４７】
光学画像移送用ガラス棒Ｃの延伸
光学ファイバー構造の棒は、ＳＫ２２２ガラス製のチューブにＺｒ３／ＸＶガラス製の棒を入れ、続いて０．７ｍｍ径にプリフォームを細線化する「棒−チューブ」法を用いて製造された。
【００４８】
ＳＫ２２２棒の延伸
プリフォームの調製
プローブ延伸のためのプリフォーム構造は、０．７ｍｍ径の２つのガラス金属の棒、０．７ｍｍ径の金属電極間に置かれた光学ファイバー棒、ＳＫ２２２ガラス棒からなった。全セットはＳＫ２２２ガラス製のチューブ中に置かれた。
【００４９】
プローブ細線化（延伸）
調製したプリフォームから、プリフォーム内部を嫌気的雰囲気として０．３〜０．５ｍｍの内径となるよう棒を延伸した。上記方法の結果として、図３に示す通り、２０μｍ径の金属電極Ａを含み、３５０μｍ径のマイクロプローブを調製した。光学画像移送用光学チャンネルＣは電極間に正確に置かれず、プリフォーム細線化の工程で移動させた。これは当該方法で製造されるマイクロプローブの機能とは関係がない。数個の金属電極について金属電極のわずかな断線が延伸したプローブに見出された。多数のプローブから選択して、１０〜３０ｃｍ長の連続金属棒をさらなる応用研究のために選んだ。製造したマイクロプローブのパラメーターを表３に示す。
【００５０】
【表３】
2017534384.tif 000007
【００５１】
製造したマイクロプローブは、標準電線に金属電極Ａを載せる等、プレートにマイクロプローブを載せて外部供給源に接続した。顕微鏡とマイクロマニピュレーターを用いて下部プレートにマイクロプローブを載せた。エポキシ接着剤を使用した。次の工程で、Ｅｐｏ−Ｔｅｋ導電性接着剤を用いて微小電極を肉眼で見える電線と接続した。マイクロプローブをオーブンにて１５分間３００℃で加熱した。これら条件で、接着剤を硬化した。金属電極Ａと肉眼で見える電線の結合を、図８に示した。この様に硬質なマイクロプローブ末端を得ることにより、電気的な接続及び試験中のマイクロプローブ操作を可能にした。図７に示すマイクロプローブ電気接続の製造により、金属電極Ａの耐性、表４に示す降伏電圧を測定することができた。測定は金属電極Ａの長さ及び正確な電力接続が必要である為顕微鏡下で行った。
【００５２】
【表４】
2017534384.tif 000008
【００５３】
得られた結果は、金属電極Ａの低い抵抗を示し、マイクロプローブ中の好ましくない熱条件が存在せずに２つの金属電極Ａ間に電位差が生じる。いくつかのエレクトロポレーション技術で使用される短い電気パルスを利用することもできる。
【００５４】
得られた結果によれば、マイクロプローブはガラス棒Ｅ内で均一な直径の電極を有する。続いて、降伏電圧を特定する実験を行った。試験は、室温で０濃度から飽和溶液（２６．５％濃度）までの塩化ナトリウム水溶液中で行った。降伏電圧を測定するために０〜３０Ｖ範囲の制御電圧を有する実験電力アダプターを利用した。実施した試験は、降伏電圧が３０Ｖより高いことを示すという陰性の結果を示した。これにより、試料やマイクロプローブの破損や破壊を心配することなく、（実験室での細胞培養に典型的な）水環境においてマイクロプローブは制約されることなく使用することができる。
【００５５】
実施例３
本発明で製造されたマイクロプローブを用いたエレクトロポレーション
図１に示す通り、約２０μｍ径を有する２つの金属電極Ａを有し、１０〜３０ｃｍ長と３５０μｍ径を有するマイクロプローブを製造した。フッ化水素酸溶液を用いたエッチングで金属電極Ａを剥ぎ出し、フッ化水素酸中の水に対する酸の比は１：１であり、エッチングを３０分間続けた。２０〜２５ｃｍ長のマイクロプローブで測定した抵抗は３０〜８０Ωであった。
塩溶液で行った試験は降伏電圧が３０Ｖより高いことを示した。製造したマイクロプローブを用いたエレクトロポレーション試験により、細胞膜に孔を開け、細胞に物質を送達した。３〜５Ｖ電圧をマイクロプローブに印加した。
２つの細胞株を研究に使用した：研究の結果は図９ａ〜ｃに示す様に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞−（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１TM）、Ｈ９Ｃ２ラット心筋細胞を使用した。細胞エレクトロポレーションの発生を確認する為、トリパンブルーを用いた現象マーカー法を使用した。両方の細胞株において、エレクトロポレーションがマイクロプローブの活動範囲で単一細胞で生じていることを明確に確認した。溶液から細胞内部への物質の移動は、エレクトロポレーションの発生を示す。
細胞を青色に染めるマーカーの蓄積を観察することができる。図６ａ〜ｃに、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−６１TM）細胞のエレクトロポレーションの測定結果を示す。実験において、金属電極Ａ間の距離は、内部端間で２２６．９３μｍであり、外部壁間で２７７．８３μｍであり、電極厚みは２８．６２μｍであり、電圧と電流強度はそれぞれ１．７〜２Ｖ、１．９μＡであった。（より高い電極電位の）エレクトロポレーション後の細胞は、トリパンブルーで染色され、図９ｂに示す通り、平坦な形態を示した。実験において、電極から３００μｍの距離に置かれた細胞（図９ｃ）は、エレクトロポレーションされず、無傷（いわゆる対照細胞）のままであった。
ラット心筋細胞株Ｈ９Ｃ２のエレクトロポレーション実験の結果を図１０ａ〜ｃに示す。実験において、金属電極Ａ間の距離は、内部端間で１５６．４６μｍであり、外部壁間で２０７．８３μｍであり、金属電極Ａの厚みは２７．１１μｍであり、電圧と電流強度はそれぞれ１．７〜２Ｖ、１．９μＡであった。
図１０ｂは、上部の電極近くでエレクトロポレーションした後の細胞を示し、染色された核が見える。エレクトロポレーションを行わなかった細胞（いわゆる対照細胞）は、図１０ｃの通り、染色の兆候を示さなかった。
【符号の説明】
【００５６】
Ａ：電極
Ｂ：空気チャンネル
Ｃ：光学チャンネル
Ｄ：画像チャンネル
Ｅ：ガラス棒
【図１】
2017534384.tif 000009
【図２】
2017534384.tif 000010
【図３】
2017534384.tif 000011
【図４】
2017534384.tif 000012
【図５】
2017534384.tif 000013
【図６】
2017534384.tif 000014
【図７】
2017534384.tif 000015
【図８】
2017534384.tif 000016
【図９ａ】
2017534384.tif 000017
【図９ｂ】
2017534384.tif 000018
【図９ｃ】
2017534384.tif 000019
【図１０ａ】
2017534384.tif 000020
【図１０ｂ】
2017534384.tif 000021
【図１０ｃ】
2017534384.tif 000022
【国際調査報告】
2017534384.tif 000023
2017534384.tif 000024