(57)【要約】  ５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を含む非従来型酵母が、本明細書中で開示される。このキャップ離脱ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソーム中の標的部位配列と相補的な配列を含む。ＲＧＥＮは、標的部位配列の一方のＤＮＡ鎖または双方のＤＮＡ鎖に結合することができ、かつ場合によってはこれを切断することができる。本明細書中のＲＧＥＮの例が、ガイドＲＮＡとのＣａｓ９タンパク質の複合体である。リボザイムが、ある実施形態において、５’キャップを欠くＲＮＡ構成要素を提供するために用いられる。さらに開示されるのは、非従来型酵母における遺伝的ターゲティング法である。
2017522897.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を含む非従来型酵母であって、前記ＲＮＡ構成要素は、前記酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な配列を含み、前記ＲＧＥＮは、前記標的部位配列に結合することができる、非従来型酵母。
【請求項２】
前記ＲＧＥＮは、前記標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる、請求項１に記載の非従来型酵母。
【請求項３】
前記酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、およびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からなる群から選択される属のメンバーである、請求項１に記載の非従来型酵母。
【請求項４】
前記ＲＧＥＮは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）結合（Ｃａｓ）タンパク質９（Ｃａｓ９）アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の非従来型酵母。
【請求項５】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、および少なくとも１つのヌクレオチド配列に機能可能なように結合するプロモータを含むポリヌクレオチド配列を含む非従来型酵母であって、前記ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ構成要素をコードするＤＮＡ配列の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ構成要素は、前記酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な可変ターゲティングドメインを含み、前記ＲＮＡ構成要素および前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を形成することができ、前記ＲＧＥＮは、前記標的部位配列に結合することができる、非従来型酵母。
【請求項６】
前記ＲＧＥＮは、前記標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる、請求項５に記載の非従来型酵母。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、前記リボザイムを自己触媒的に除去して、前記ＲＮＡ構成要素を生成することができ、前記ＲＮＡ構成要素は、５’キャップを有していない、請求項５に記載の非従来型酵母。
【請求項８】
前記リボザイムは、ハンマーヘッドリボザイム、デルタ型肝炎ウィルスリボザイム、グループＩイントロンリボザイム、ＲｎａｓｅＰリボザイム、またはヘアピンリボザイムである、請求項７に記載の非従来型酵母。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、自己触媒的に前記リボザイムを除去しないで、５’キャップなしのリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子を生成する、請求項５に記載の非従来型酵母。
【請求項１０】
非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を修飾する方法であって、前記方法は、非従来型酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記第２の組換えＤＮＡ構築体から転写されるＲＮＡは、自己触媒的に前記リボザイムを除去して、前記ＲＮＡ構成要素が生じ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入する、方法。
【請求項１１】
非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を修飾する方法であって、前記方法は、非従来型酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するＲＧＥＮを形成することができる、方法。
【請求項１２】
前記標的に修飾を有する少なくとも１つの非従来型酵母細胞を同定する工程をさらに含み、前記修飾は、前記標的部位中の１つまたは複数のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失、付加、または置換を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ドナーＤＮＡを前記酵母に提供する工程をさらに含み、前記ドナーＤＮＡは、対象のポリヌクレオチドを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的部位に組み込まれた対象の前記ポリヌクレオチドを染色体またはエピソーム中に含む少なくとも１つの酵母細胞を同定する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法であって、前記方法は、非従来型酵母に、ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記第２の組換えＤＮＡ構築体から転写されるＲＮＡは、自己触媒的に前記リボザイムを除去して、前記ＲＮＡ構成要素が生じ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の前記染色体または前記エピソーム中の標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
【請求項１６】
非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列をサイレンシングする方法であって、前記方法は、非従来型酵母に、不活化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡ構築体、および少なくとも１つのポリヌクレオチドに機能可能なように結合するプロモータを含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードし、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子および前記不活化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の前記染色体または前記エピソーム中の前記ヌクレオチド配列に結合するＲＧＥＮを形成することによって、前記ヌクレオチド配列の転写を阻止することができる、方法。
【請求項１７】
非従来型酵母における遺伝子修飾のための複数のガイドＲＮＡの生産のための高スループット法であって、前記方法は：
ａ）５’から３’の順に、リボザイムをコードする第１のＤＮＡ配列、カウンターセレクション剤をコードする第２のＤＮＡ配列、ガイドＲＮＡのＣＥＲドメインをコードする第３のＤＮＡ配列、およびターミネータ配列に機能可能なように結合するプロモータを含む組換えＤＮＡ構築体を提供する工程と；
ｂ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチド二重鎖を、（ａ）の前記組換えＤＮＡ構築体に提供する工程であって、前記オリゴヌクレオチド二重鎖は、ガイドＲＮＡ標的配列の可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）をコードすることができるＤＮＡ配列を含む第１の単鎖オリゴヌクレオチドの、前記可変ターゲティングドメインをコードする前記ＤＮＡ配列と相補的な配列を含む第２の単鎖オリゴヌクレオチドとの組合せに由来する、工程と；
ｃ）（ａ）の前記カウンターセレクション剤を、（ｂ）の前記少なくとも１つのオリゴ二重鎖と交換することによって、ガイドＲＮＡの可変ターゲティングドメインをコードすることができるＤＮＡ配列をそれぞれが含む組換えＤＮＡ構築体のライブラリを作製する工程と；
ｄ）（ｃ）の組換えＤＮＡ構築体の前記ライブラリを転写することによって、リボザイム−ガイドＲＮＡ分子のライブラリを作製する工程と
を含む、方法。
【請求項１８】
前記分子が、前記リボザイムの上流で前記リボザイムおよびあらゆるＲＮＡ配列を自己触媒的に除去して、５’キャップを含有しないガイドＲＮＡ分子のライブラリを作製するように、リボザイム−ガイドＲＮＡ分子の前記ライブラリを誘導する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分子が、前記リボザイムの上流で、あらゆるＲＮＡ配列を切断して、５’キャップを含有しないリボザイム−ｇＲＮＡ融合分子が生じるように、リボザイム−ガイドＲＮＡ分子の前記ライブラリを誘導する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）ポリメラーゼＩＩプロモータ、（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、リボザイムおよびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ配列であって、前記リボザイムは、前記ガイドＲＮＡの上流にあり、（ｉｉ）の前記ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、自己触媒的に前記リボザイムを除去して、前記ガイドＲＮＡが生じ、前記ガイドＲＮＡは、非従来型酵母のゲノム中の標的部位を認識することができ、これに結合することができ、かつ場合によってはこれを切断することができるＲＧＥＮを形成することができる、組換えＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年８月１３日出願の米国仮特許出願第６２／０３６６５２号明細書の利益を主張し、この出願は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、分子生物学の分野に属する。詳細には、本発明は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を用いた、非従来型酵母における遺伝的ターゲティングに関する。
【０００３】
電子的手段によって提出された配列表の参照
配列表の認証謄本が、２０１５年７月２１日作成の２０１５０７２１＿ＣＬ６２７２ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔのファイル名の、４１１キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含有される配列表は、本明細書の一部であり、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
生物における遺伝子の機能を理解する有効な方法が、その発現を阻害することである。遺伝子発現の阻害は、例えば、遺伝子のＤＮＡ配列を分断して、または欠失させて、遺伝子の「ノックアウト」をもたらすことによって達成され得る（非特許文献１）。遺伝子ノックアウトは殆どの場合、相同組換え（ＨＲ）を介して実行され、この技術は、細菌から哺乳類まで広範囲の生物にわたって適用可能である。遺伝子機能を研究するための別のツールが、遺伝的「ノックイン」を介してなされ得、これもまた通常、ＨＲによって実行される。遺伝子ターゲティング（ノックアウトまたはノックイン）を目的とするＨＲは、標的部位との相同性を有する、外因的に供給されるＤＮＡの存在を利用することができる。
【０００５】
ＨＲによる遺伝子ターゲティングは強力なツールであるが、複雑となり得、労働力を要する手順であるといえる。ＨＲを用いた殆どの研究は通常、経路における複数遺伝子ではなく単一遺伝子のノックアウトに制限された。これは、ＨＲにとって、対費用効果の高いスケールアップが通常困難なためである。この困難は、ＨＲが効率的でない生物において悪化する。そのような低い効率性により、実践者は典型的に、所望のＨＲ事象が起こった細胞の同定の一助となるような、選択可能な表現型または外因性マーカーへの依拠を強いられる。
【０００６】
遺伝子ターゲティング用のＨＲは、標的とされるＤＮＡ部位が二本鎖切断を含有する場合に高められることが示された（非特許文献２；非特許文献３）。したがって、ＨＲ媒介ＤＮＡターゲティングを促進するように二本鎖切断を導入する戦略が開発されてきた。例えば、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼが、特定のＤＮＡ部位を切断するように操作されて、ドナーＤＮＡが存在する場合に、当該部位にてＨＲのレベルが高められた（非特許文献４；非特許文献５）。同様に、人工メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）および転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼもまた、ＨＲ媒介ＤＮＡターゲティングで用いるために開発された（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）ＤＮＡ切断系をコードする遺伝子座が、細菌ゲノムの約４０％、そして殆どの古細菌ゲノムにおいて排他的に見出された（非特許文献８；非特許文献９）。特に、ＩＩ型ＣＲＩＰＳＲ系のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、Ｃａｓ９が、部位特異的ＤＮＡ鎖切断を導入する手段として開発された（特許文献１、２０１５年３月１９日公開、および特許文献２、２０１５年２月２６日公開。双方とも参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９のＲＮＡ構成要素の配列は、Ｃａｓ９が、（ｉ）ＲＮＡ構成要素の一部と相補的な配列、および（ｉｉ）プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有するＤＮＡを認識して切断するように設計され得る。
【０００８】
天然のＣａｓ９／ＲＮＡ複合体は、２つのＲＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、標的ＤＮＡ部位と相補的なユニーク配列、および、ｃｒＲＮＡが由来したＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピート領域によってコードされる配列の一部を含有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、ｃｒＲＮＡのリピート領域とアニールする配列、およびステムループ含有部分を含有する。最近の研究では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が開発され、これは、５’から３’の方向に、ｃｒＲＮＡ、およびこれに結合するｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラ配列である（米国仮特許出願第６１／８６８７０６号明細書、２０１３年８月２２日出願）。
【０００９】
Ｃａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングを実行するための、真核細胞においてｇＲＮＡ等のＲＮＡ構成要素を発現する方法が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモータを用いるものであり、これは、正確に定義された、非修飾５’末端および３’末端を有するＲＮＡの転写を可能とする（非特許文献１０；非特許文献１１）。この戦略は、トウモロコシおよびダイズ（米国仮特許出願第６１／８６８７０６号明細書、２０１３年８月２２日出願）、ならびにヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属および出芽酵母（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるいくつかの異なる種の細胞において、首尾よく利用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６：９２１−９２４
【非特許文献２】Ｒｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：５１９−５３４
【非特許文献３】Ｓｍｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：５０１２−５０１９
【非特許文献４】Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：７６４
【非特許文献５】Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７
【非特許文献６】Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２
【非特許文献７】Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３−１４８
【非特許文献８】Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０
【非特許文献９】Ｋａｒｇｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３７：７−１９
【非特許文献１０】ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：４３３６−４３４３
【非特許文献１１】Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３：ｅ１６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それでもやはり、本願において開示されるように、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータで転写されるｇＲＮＡを用いて、酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）等の非従来型酵母においてＣａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングを実行するのは困難であると判明した。したがって、非従来型酵母におけるＣａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングを提供する、Ｃａｓ９に関するＲＮＡ構成要素を生じさせる他の手段が注目される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態において、本開示は、５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を含む非従来型酵母に関し、ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な配列を含み、ＲＧＥＮは、標的部位配列に結合することができる。ＲＧＥＮはまた、標的部位に結合することもでき、かつこれを切断することもできる。
【００１４】
一実施形態において、非従来型酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、およびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からなる群から選択される属のメンバーである。
【００１５】
一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）結合（Ｃａｓ）タンパク質９（Ｃａｓ９）アミノ酸配列を含む。Ｃａｓ９タンパク質は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属Ｃａｓ９タンパク質であってよいが、ＲＮＡ構成要素は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に機能可能なように結合するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含んでよい。ＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列は、標的部位配列に隣接してよい。ＲＧＥＮはまた、標的部位に結合することもでき、かつこれを切断することもできる。ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、リボザイムを自己触媒的に除去して、前記ＲＮＡ構成要素を生成することができ、前記ＲＮＡ構成要素は、５’キャップを有していない。そのようなリボザイムとして、ハンマーヘッドリボザイム、デルタ型肝炎ウィルスリボザイム、グループＩイントロンリボザイム、ＲｎａｓｅＰリボザイム、またはヘアピンリボザイムが挙げられ得る。ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去しないで、５’キャップなしのリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子を生成するＲＮＡ分子であってよい。
【００１６】
一実施形態において、本開示は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、および少なくとも１つのヌクレオチド配列に機能可能なように結合するプロモータを含むポリヌクレオチド配列を含む非従来型酵母に関し、前記ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ構成要素をコードするＤＮＡ配列の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な可変ターゲティングドメインを含み、ＲＮＡ構成要素は、ＣａｓエンドヌクレアーゼによるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を形成することができ、前記ＲＧＥＮは、標的部位配列に結合することができる。
【００１７】
一実施形態において、本明細書中に記載される方法は、非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を修飾する方法を含み、当該方法は、非従来型酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、第２の組換えＤＮＡ構築体から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去して、前記ＲＮＡ構成要素が生じ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入する。
【００１８】
一実施形態において、本明細書中に記載される方法は、非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を修飾する方法を含み、当該方法は、非従来型酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するＲＧＥＮを形成することができる。
【００１９】
当該方法はさらに、前記標的に修飾を有する少なくとも１つの非従来型酵母細胞を同定する工程を含んでよく、修飾は、前記標的部位中の１つまたは複数のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失または置換を含む。当該方法はさらに、ドナーＤＮＡを前記酵母に提供する工程を含んでよく、前記ドナーＤＮＡは、対象のポリヌクレオチドを含む。
【００２０】
一実施形態において、本明細書中に記載される方法は、非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法を含み、当該方法は、非従来型酵母に、ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、第２の組換えＤＮＡ構築体から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去して、前記ＲＮＡ構成要素が生じ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む。
【００２１】
一実施形態において、本明細書中に記載される方法は、非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列をサイレンシングする方法を含み、当該方法は、非従来型酵母に、不活化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡ構築体、および少なくとも１つのポリヌクレオチドに機能可能なように結合するプロモータを含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードし、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子および不活化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の前記ヌクレオチド配列に結合するＲＧＥＮを形成することによって、前記ヌクレオチド配列の転写を阻止することができる。
【００２２】
一実施形態において、本明細書中に記載される方法は、非従来型酵母における遺伝子修飾のための複数のガイドＲＮＡの生産のための高スループット法を含み、当該方法は：ａ）５’から３’の順に、リボザイムをコードする第１のＤＮＡ配列、カウンターセレクション剤をコードする第２のＤＮＡ配列、ガイドＲＮＡのＣＥＲドメインをコードする第３のＤＮＡ配列、およびターミネータ配列に機能可能なように結合するプロモータを含む組換えＤＮＡ構築体を提供する工程と；ｂ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチド二重鎖を、（ａ）の組換えＤＮＡ構築体に提供する工程であって、前記オリゴヌクレオチド二重鎖は、ガイドＲＮＡ標的配列の可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）をコードすることができるＤＮＡ配列を含む第１の単鎖オリゴヌクレオチドの、可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡ配列と相補的な配列を含む第２の単鎖オリゴヌクレオチドとの組合せに由来する、工程と；ｃ）（ａ）のカウンターセレクション剤を、（ｂ）の少なくとも１つのオリゴ二重鎖と交換することによって、ガイドＲＮＡの可変ターゲティングドメインをコードすることができるＤＮＡ配列をそれぞれが含む組換えＤＮＡ構築体のライブラリを作製する工程と；ｄ）（ｃ）の組換えＤＮＡ構築体のライブラリを転写することによって、リボザイム−ガイドＲＮＡのライブラリを作製する工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】単一ガイドポリヌクレオチド、例えば単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の構造モデルである。可変ターゲティング（ＶＴ）ドメインを灰色で示す。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインを黒色で示す。
【図２Ａ】ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセットである。ＦＢＡ１プロモータを黒色で示し、Ｃａｓ９をコードする、Ｃ末端ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有するオープンリーディングフレームを明るい灰色で示す。
【図２Ｂ】ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化プレｓｇＲＮＡ  ＲＧＲ発現カセット（ＲＧＲ、リボザイム−ｓｇＲＮＡ−リボザイム）である。ＦＢＡ１プロモータを黒色で示し、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムを暗い灰色で示し、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を明るい灰色で示し、ＨＤＶリボザイムを縦方向のストライプで示す。
【図２Ｃ】ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化プレｓｇＲＮＡ  ＲＧ発現カセット（ＲＧ、リボザイム−ｓｇＲＮＡ）である。ＦＢＡ１プロモータを黒色で示し、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムを暗い灰色で示し、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を明るい灰色で示し、Ｓｕｐ４ターミネータを縦方向のストライプで示す。
【図３Ａ】図２Ａに示すヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセットを含有する、ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）プラスミドである。複製起源（ＡＲＳ  １８、ｆ１  ｏｒｉ、ＣｏｌＥ１）をクロスハッチングで、選択可能なマーカー（Ｕｒａ３、Ａｍｐ）を灰色で示す。
【図３Ｂ】図２Ａに示すヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット、およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属中のＬｅｕ２−３を標的とするＹｌ  Ｓｎｒ５２（Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ。「Ｙｌ５２」と示す）−ｓｇＲＮＡ発現カセットを含有する、ｐＺＵＦＣａｓ９／Ｐｏｌ  ＩＩＩ−ｓｇＲＮＡプラスミドである。図示しないが、ｓｇＲＮＡカセットはまた、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ４遺伝子転写ターミネータ配列を含有した。複製起源（ＡＲＳ  １８、ｆ１  ｏｒｉ、ＣｏｌＥ１）をクロスハッチングで、選択可能なマーカー（Ｕｒａ３、Ａｍｐ）を灰色で示す。
【図３Ｃ】酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＣＡＮ１遺伝子を標的とする、配列番号１８のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化プレｓｇＲＮＡ発現カセット（ＦＢＡ１プロモータを白色で、ＲＧＲプレｓｇＲＮＡを斜めのストライプで示す）を含有する、ｐＲＦ３８プラスミド（配列番号１９）である。複製起源（ＡＲＳ  １８、ｆ１  ｏｒｉ、ＣｏｌＥ１）をクロスハッチングで、選択可能なマーカー（Ｕｒａ３、Ａｍｐ）を灰色で示す。
【図４】（ｉ）ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）のみで、または（ｉｉ）ｐＺＵＦＣａｓ９、および配列番号１８のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化プレｓｇＲＮＡ発現カセットを含む線状ＤＮＡで形質転換した酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞における、一時的なターゲティング効率である（実施例３参照）。ｙ軸は、カナバニン耐性（ＣａｎＲ）でもある、ｐＺＵＦＣａｓ９で形質転換した細胞（すなわち、Ｕｒａ＋細胞）の頻度を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図５】ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）、および配列番号１８のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化プレｓｇＲＮＡ発現カセットを含む線状ＤＮＡで形質転換した酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の、ＣＡＮ１コード領域におけるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ切断部位の配列地図である（実施例３参照）。野生型（ＷＴ）ＣＡＮ１配列に関して、Ｃａｎ１−１標的部位配列を太字で示し、ＰＡＭ配列に下線を引いている。予測される切断部位は、ＰＡＭの上流３番目のヌクレオチドの直ぐ５’側である。挿入されたヌクレオチドをイタリック体にしている。突然変異体（１〜１８）の各クラスの数および頻度を、右手側に表す。この図において示す配列を、図中の番号の配列番号７１〜８９として、配列表に含めている。
【図６】（ｉ）ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）のみで、（ｉｉ）ｐＺＵＦＣａｓ９、および配列番号１８のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化プレｓｇＲＮＡ発現カセット（ＲＧＲ）を含む線状ＤＮＡで、または（ｉｉｉ）ｐＺＵＦＣａｓ９、および配列番号２５のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化プレｓｇＲＮＡ発現カセット（ＲＧ）を含む線状ＤＮＡで形質転換した酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞における、一時的なターゲティング効率である（実施例４参照）。ｙ軸は、カナバニン耐性（ＣａｎＲ）でもある、ｐＺＵＦＣａｓ９で形質転換した細胞（すなわち、Ｕｒａ＋細胞）の頻度を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図７】ＨＲ  ＤＮＡ修復経路およびＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路による突然変異頻度の比較である。ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ配列を形質転換の際に与えた場合の、ＨＲ（暗い灰色）およびＮＨＥＪ（明るい灰色）によるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介ＤＮＡ二本鎖切断修復の総頻度を測定した（実施例５参照）。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図８】ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ配列のタイプによる、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介ＤＮＡ二本鎖切断部位でのＨＲの頻度である。点突然変異鋳型ＤＮＡ（暗い灰色）、フレームシフト鋳型ＤＮＡ（明るい灰色）、および大きな欠失鋳型ＤＮＡ（白色）を用いた場合のＨＲ頻度を示す（実施例５参照）。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図９】は、ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡの存在に影響を受けていない、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１遺伝子座での突然変異頻度（Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡによって切断されるＣａｎ１−１部位での修復）である。ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡを含まない（暗い灰色、鋳型ＤＮＡなし）、またはポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡを含む（明るい灰色、鋳型ＤＮＡあり）形質転換に由来する細胞のカナバニン耐性頻度（形質転換群は双方とも、ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）およびＲＧＲ発現カセット［配列番号１８］を含んだ）である（実施例５参照）。ｙ軸は、カナバニン耐性（ＣａｎＲ）でもある、ｐＺＵＦＣａｓ９で形質転換した細胞（すなわち、Ｕｒａ＋細胞）の頻度を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図１０Ａ】図２Ａに示すヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット、および配列番号１８のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧＲプレｓｇＲＮＡカセット（斜線で示すＲＧＲプレｓｇＲＮＡコード領域［「Ｃａｎ１  ＲＧＲ」］）を含有する、ｐＲＦ８４プラスミド（配列番号４１）である。複製起源（ＡＲＳ  １８、ｆ１  ｏｒｉ、ＣｏｌＥ１）をクロスハッチングで、選択可能なマーカー（Ｕｒａ３、Ａｍｐ）を灰色で示す。
【図１０Ｂ】図２Ａに示すヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット、および配列番号２５のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧプレｓｇＲＮＡカセット（斜線で示すＲＧプレｓｇＲＮＡコード領域［「Ｃａｎ１  ＲＧ」］）を含有する、ｐＲＦ８５プラスミド（配列番号４２）である。複製起源（ＡＲＳ  １８、ｆ１  ｏｒｉ、ＣｏｌＥ１）をクロスハッチングで、選択可能なマーカー（Ｕｒａ３、Ａｍｐ）を灰色で示す。
【図１１】Ｃａｓ９のみ（ｐＺＵＦＣａｓ９、配列番号１４）を発現する、または（ｉ）Ｃａｓ９および（ｉｉ）ＲＧＲプレｓｇＲＮＡ（ｐＲＦ８４）もしくはＲＧ  ｓｇＲＮＡ（ｐＲＦ８５）を発現することによる、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１遺伝子座での突然変異頻度である（実施例６参照）。ｙ軸は、カナバニン耐性（ＣａｎＲ）でもある、各ベクターで形質転換した細胞（すなわち、Ｕｒａ＋細胞）の頻度を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図１２Ａ】ＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ融合発現カセットを構築するための高スループットクローニングカセットの例である。図１２Ａは、黒色のボックス中にプロモータ配列を、灰色のボックス中に、ＨＤＶリボザイムをコードするＤＮＡ配列を、水平方向にハッチングしたボックス中に、ＩＩ型制限部位がフランキングする、クローニング株についてカウンターセレクション可能なマーカーを、黒色ドットのボックス中に、Ｃａｓ９との相互作用用のｓｇＲＮＡのＣＥＲドメインを、そして対角線的にハッチングしたボックス中に転写ターミネータを示す。可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡ配列、およびＩＩ型制限部位に適した突出部を含有するＤＮＡ二重鎖（縦方向にハッチングしたボックスＶＴ）を、プラスミド、ＤＮＡリガーゼ、およびＩＩ型酵素と混合すると、可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）をコードするＤＮＡ配列は、カウンターセレクション可能なマーカーを置換することによって、ＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ発現カセット（プロモータ−ＨＤＶ−ＶＴ−ＣＥＲ−ターミネータ）が生じることとなる。ＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ発現カセットが転写されると、ＲＮＡ転写産物（ＨＤＶ−ＶＴ−ＣＥＲ転写産物）が生じ、そのＨＤＶリボザイムはいかなる５’側配列も切断する。
【図１２Ｂ】ＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ融合発現カセットを構築するための高スループットクローニングカセットの例である。図１２Ｂは、Ｃａｎ１−１標的部位をコードするＤＮＡ配列、およびプラスミドｐＲＦ２９１中へのクローニングに適した突出部を含有する二重鎖ＤＮＡ分子（配列番号９９および配列番号１００のオリゴ二重鎖）の例を示す。
【図１３Ａ】構築体ＨＨ−ｓｇＲＮＡ発現カセットを構築するための高スループットクローニングカセットの例である。図１３−は、黒色のボックス中にプロモータ配列を；水平方向にハッチングしたボックス中に、ＩＩ型制限部位がフランキングする、クローニング株についてカウンターセレクション可能なマーカーを；黒色ドットのボックス中に、Ｃａｓ９との相互作用用のｓｇＲＮＡのＣＥＲドメインを；対角線的にハッチングしたボックス中に転写ターミネータを示す。標的部位特異的ハンマーヘッドリボザイムコードＤＮＡ（縦方向にハッチングしたボックスＨＨ）、ターゲティング配列、およびＩＩ型部位に適した突出部を含有するＤＮＡ二重鎖（ドットボックスＴＳ）を、プラスミド、ＤＮＡリガーゼ、およびＩＩ型酵素と混合すると、ＨＨ標的部位二重鎖が、カウンターセレクション可能なマーカーを置換して、ＨＨ−ｓｇＲＮＡ発現カセットが生じる。発現カセットが転写されると、転写産物が生じ、ＨＨリボザイムは、それ自体を、そしていかなる５’側配列も切断する。
【図１３Ｂ】構築体ＨＨ−ｓｇＲＮＡ発現カセットを構築するための高スループットクローニングカセットの例である。図１３Ｂは、ｄｓ−ｔｅｍｐ−１標的部位を標的とする可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）および配列特異的ＨＨリボザイムコードＤＮＡ（ＨＨ）、ならびにプラスミドｐＲＦ２９１中へのクローニングに適した突出部を含有する（配列番号１６２および配列番号１６３の）二重鎖ＤＮＡ分子の例を示す。
【図１４】ｐＲＦ３０３（配列番号１０３）およびＣａｎ１短編集鋳型（配列番号１５７）で形質転換した細胞由来のＣａｎ１遺伝子座のゲル電気泳動の例である。レーンにマークされるＭＷは、分子量マーカーである。レーン１〜１６は、ストリーク精製形質転換体由来の個々のコロニーを表す。より高いＭＷのバンドは、ＷＴ  Ｃａｎ１遺伝子座（配列番号１６０）、または、小ｉｎｄｅｌ突然変異を有するＣａｎ１遺伝子座について適当なサイズである。より小さな分子量のバンドは、短Ｃａｎ１編集鋳型（配列番号１５７）で編集されたＣａｎ１遺伝子座（配列番号１６１）の正確なサイズである。
【図１５】コロニーＰＣＲおよびそのアラインメントに由来する、プラスミドＵＲＡ３遺伝子およびゲノムＵＲＡ３遺伝子の代表的な配列決定結果を示す。破線および太字はそれぞれ、欠失および挿入を示す。ＰＡＭ配列に下線を引いている。
【図１６Ａ】ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ＵＲＡ３遺伝子内のＲＧＲ−ＵＲＡ３．１、ＲＧＲ−ＵＲＡ３．２、およびＲＧＲ−ＵＲＡ３．３についてのターゲティング配列の相対位置を示す。
【図１６Ｂ】５−ＦＯＡを含有するＳＣ培地上で増殖したｐＹＲＨ２２２形質転換体のコロニーＰＣＲの配列決定結果および配列アラインメントを示す。太字は挿入を示す。ＰＡＭ配列に下線を引いている。「Ｎ」は、混合配列を表す。
【図１６Ｃ】５−ＦＯＡを含有するＳＣ培地上で増殖したｐＹＲＨ２８２形質転換体のコロニーＰＣＲの配列決定結果および配列アラインメントを示す。破線は欠失を示す。ＰＡＭ配列に下線を引いている。「Ｎ」は、混合配列を表す。
【図１６Ｄ】５−ＦＯＡを含有するＳＣ培地上で増殖したｐＹＲＨ２８３形質転換体のコロニーＰＣＲの配列決定結果および配列アラインメントを示す。破線は欠失を示す。ＰＡＭ配列に下線を引いている。「Ｎ」は、混合配列を表す。
【図１７】ｐＹＲＨ２８２（コロニーＩＤ．２３および２４）形質転換体およびｐＹＲＨ２８３（コロニーＩＤ．２７および３６）形質転換体由来のＰＣＲ産物の異なる移動を示す。ラダー由来のＤＮＡサイズを右に示す。
【図１８】図１８は、Ｃａｎ１標的配列の代表的な配列決定結果を示す。破線は欠失を示す。ＰＡＭ配列を太字で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
【表１】
2017522897.tif 000003
【００２５】
【表２】
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【００２６】
【表３】
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【００２７】
【表４】
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【００２８】
【表５】
2017522897.tif 000007
【００２９】
【表６】
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【００３０】
【表７】
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【００３１】
【表８】
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【００３２】
【表９】
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【００３３】
引用される全ての特許文献および非特許文献の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本明細書中で用いられる用語「本発明」または「開示される本発明」は、限定することが意味されるのではなく、全般的に、特許請求の範囲において定義される、または本明細書中に記載されるあらゆる発明に当てはまる。これらの用語は、本明細書中で互換的に用いられる。
【００３５】
本明細書中の用語「非従来型酵母」は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種（例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））でもシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種でもないあらゆる酵母を指す。非従来型酵母は、Ｎｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。ある実施形態における非従来型酵母は追加的に（または代わりに）、相同組換え（ＨＲ）によって媒介される修復プロセスに対して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復プロセスを優先する酵母であってよい。当該ライン（ＨＲに勝るＮＨＥＪの優先度）に沿う非従来型酵母の定義が、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ５７９５２）によってさらに開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中で好ましい非従来型酵母が、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属のもの（例えば酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））である。本明細書中の用語「酵母」は、主に単細胞の形態で存在する菌類の種を指す。酵母は代わりに、本明細書中で「酵母細胞」と呼ぶことができる。
【００３６】
本明細書中の用語「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」（ＲＧＥＮ）は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）結合（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む複合体を指す。簡潔に、ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素は、標的部位配列においてＤＮＡ配列と相補的である配列を含有する。この相補性に基づいて、ＲＧＥＮは、特定のＤＮＡ標的部位配列を特異的に認識し、かつ切断することができる。本明細書中でＲＧＥＮは、４つの既知のＣＲＩＳＰＲ系（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）、例えばＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のいずれかのＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を含んでよい。好ましい実施形態におけるＲＧＥＮは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ系）および少なくとも１つのＲＮＡ構成要素（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）を含む。
【００３７】
用語「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）は、例えば、外来ＤＮＡを破壊するために細菌細胞および古細菌細胞によって用いられる、クラスＩ、ＩＩまたはＩＩＩ  ＤＮＡ切断系の因子をコードする特定の遺伝子座を指す（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）。ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、本明細書中で、非従来型酵母細胞におけるＤＮＡターゲティングに利用される。
【００３８】
用語「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系」および「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系」は、本明細書中で互換的に用いられ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と複合させて利用するＤＮＡ切断系を指す。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合させることができる。別の例において、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡと複合させることができる。ゆえに、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡは、本明細書中で、ＲＮＡ構成要素の非限定的な例である。
【００３９】
用語ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）エンドヌクレアーゼは、本明細書中で、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣａｓタンパク質を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、適切なＲＮＡ構成要素と複合すると、ある実施形態において、特定のＤＮＡ標的配列の全て、または一部を切断することができる。例えば、特定のＤＮＡ標的配列中に一本鎖切断または二本鎖切断を導入することができる；これ以外にも、特定のＤＮＡ標的配列の一方の鎖または双方の鎖を切断することができると特徴付けられ得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓと複合したｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡによる標的配列の認識によって媒介されて、標的配列にてＤＮＡ二重鎖を解いて、少なくとも一本のＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列のそのような認識およびカットは典型的には、正確なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置決めされれば、またはＤＮＡ標的配列の３’末端に隣接すれば、生じる。これ以外にも、Ｃａｓタンパク質は、本明細書中で、適切なＲＮＡ構成要素と複合化する場合、ＤＮＡ切断活性またはニッキング活性を欠くかもしれないが、ＤＮＡ標的配列に依然として特異的に結合することができる。好ましいＣａｓタンパク質は、本明細書において、Ｃａｓ９である。
【００４０】
「Ｃａｓ９」（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、またはＣｓｘ１２と呼ばれた）は、本明細書中で、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとの、またはガイドＲＮＡとの複合体を形成して、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を特異的に認識して切断する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、およびＨＮＨ（Ｈ−Ｎ−Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含み、これらはそれぞれ、標的配列にて一本鎖ＤＮＡを切断する（双方のドメインが協調して作用すると、ＤＮＡ二本鎖が切断されるが、一方のドメインの活性ではニックに至る）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近くに位置決めされ、そしてサブドメインＩＩおよびＩＩＩは、タンパク質の中央に位置決めされて、ＨＮＨドメインにフランキングする（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １５７：１２６２−１２７８）。「Ａｐｏ−Ｃａｓ９」は、ＲＮＡ構成要素と複合化しないＣａｓ９を指す。Ａｐｏ−Ｃａｓ９は、ＤＮＡに結合することができるが、非特異的であり、そしてＤＮＡを切断することができない（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０７：６２−６７）。
【００４１】
一部の実施形態において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドの修飾型を含んでよい。Ｃａｓ９ポリペプチドの修飾型は、Ｃａｓ９タンパク質の自然に生じるヌクレアーゼ活性を引き下げるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含んでよい。例えば、一部の例において、Ｃａｓ９タンパク質の修飾型は、対応する野生型のＣａｓ９ポリペプチドのヌクレアーゼ活性が、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満である（米国特許出願公開第２０１４００６８７９７  Ａ１号明細書、２０１４年３月６日公開）。場合によっては、Ｃａｓ９ポリペプチドの修飾型は、実質的なヌクレアーゼ活性を有しておらず、触媒的に「不活化されたＣａｓ９」または、「非活性化されたｃａｓ９（ｄＣａｓ９）」と呼ばれる。触媒的に不活化されたＣａｓ９変異体として、ＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中に突然変異を含有するＣａｓ９変異体が挙げられる。これらの触媒的に不活化されたＣａｓ９変異体は、インビボで、ｓｇＲＮＡと相互作用して標的部位に結合することができるが、標的ＤＮＡのいずれの鎖も切断することができない。ＤＮＡに結合するが切断しないこの作用様式は、永続的な遺伝的変異を生じさせることなく、染色体中の特定の遺伝子座の発現を一時的に減少させるのに用いられ得る。
【００４２】
触媒的に不活性のＣａｓ９は、非相同配列に融合し得る（米特許出願公開第２０１４００６８７９７Ａ１号明細書、２０１４年３月６日公開）。適切な融合パートナーとして、標的ＤＮＡ、または標的ＤＮＡと関連するポリペプチド（例えば、ヒストンまたは他のＤＮＡ結合タンパク質）に直接作用することによって、転写を間接的に増進する活性を提供するポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。付加的な適切な融合パートナーとして、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を付与するポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。さらに適切な融合パートナーとして、標的核酸の転写の増進を直接実現するポリペプチド（例えば、転写活性化因子またはそのフラグメント、転写活性化因子、小分子／薬物反応性転写レギュレータその他を動員するタンパク質またはそのフラグメント）が挙げられるが、これに限定されない。触媒的に不活性のＣａｓ９はまた、ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合して、二本鎖切断を生じさせることもできる（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ３２，ｎｕｍｂｅｒ  ６，Ｊｕｎｅ  ２０１４）。
【００４３】
本明細書中で用語「ＲＮＡ構成要素」は、ＤＮＡ標的配列の鎖と相補的なリボ核酸配列を含有するＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素を指す。この相補的な配列は、本明細書中で「ガイド配列」または「可変ターゲティングドメイン」配列と呼ぶ。本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素の例として、ｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡが挙げられる。また、本明細書中でＲＮＡ構成要素は、５’キャップを有していない。
【００４４】
用語「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」（ｃｒＲＮＡ）は、本明細書中で、１つまたは複数のＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）との複合体を形成することができるＲＮＡ配列を指し、複合体にＤＮＡ結合特異性を付与する。ｃｒＲＮＡは、ＤＮＡ標的配列の鎖と相補的である「ガイド配列」（「可変ターゲティングドメイン」［ＶＴ］）を含有するので、ＤＮＡ結合特異性を付与する。ｃｒＲＮＡはさらに、ｃｒＲＮＡが由来するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピート領域によってコードされる「リピート配列」（「ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列」）を含む。ｃｒＲＮＡのリピート配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の配列にアニールすることができる。本来のＣＲＩＳＰＲ系におけるｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される「プレｃｒＲＮＡ」に由来する。プレｃｒＲＮＡは、スペーサ領域およびリピート領域を含む；スペーサ領域は、ＤＮＡ標的部位配列と相補的なユニーク配列を含有する。本来の系におけるプレｃｒＲＮＡは、複数の異なるｃｒＲＮＡにプロセシングされ、それぞれがガイド配列、およびリピート配列の一部を有する。ＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、ＤＮＡターゲティング特異性のために、ｃｒＲＮＡを利用する。
【００４５】
本明細書中で用語「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）」は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に用いられる非コードＲＮＡを指し、５’から３’の方向に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型ｃｒＲＮＡのリピート領域とアニールする配列、および（ｉｉ）ステムループ含有部分を含有する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７）。
【００４６】
用語「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）および「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）は、本明細書中で互換的に用いられる。ｇＲＮＡは、本明細書中で、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合するｃｒＲＮＡを含有するキメラ配列を指し得る。これ以外にも、ｇＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合体を指し得る。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１）は、いくつかのｇＲＮＡの特徴を開示している。ｇＲＮＡはまた、ガイド配列（可変ターゲティングドメイン）に続いてＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインを有する観点からも特徴付けられ得る［国際公開第２０１５０２６８８３号パンフレット、２０１５年２月２６日公開、米国特許出願公開第２０１５−００８２４７８Ａ１号明細書、２０１５年３月１９日公開、および米国特許出願公開第２０１５−００５９０１０Ａ１号明細書、２０１５年２月２６日公開。全てが参照によってその全体が本明細書に組み込まれる］。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列に続いてｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。
【００４７】
用語「標的部位配列」、「標的部位」、「標的配列」、「標的ＤＮＡ」、「ＤＮＡ標的配列」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、「ゲノム標的遺伝子座」、および「プロトスペーサ」は、本明細書中で互換的に用いられる。標的部位配列は、本明細書中のＲＧＥＮが認識し、結合し、場合によってはニックを入れ、または切断することができる、非従来酵母の染色体、エピソーム、またはゲノム中の他のあらゆるＤＮＡ分子上のポリヌクレオチド配列を指す。標的部位は、（ｉ）酵母中の内在部位／在来部位であってもよいし、（ｉｉ）ゲノム中に自然に生じ得ない、酵母とは異種起源であってもよいし、（ｉｉｉ）本来生じる場所に対して非相同ゲノム位置に見出されてもよい。
【００４８】
本明細書中で標的部位配列は、長さが少なくとも１３ヌクレオチドであり、そして、（ある実施形態において、適切なＰＡＭが、標的配列に隣接するならば）（ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの）ガイド配列とハイブリダイズすることができ、かつ標的配列にＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体を配列特異的に直接結合することができるほど十分な、ガイド配列との相補性がある鎖を有する。切断／ニック部位（エンドヌクレオチド結合分解性ＣａｓまたはニッキングＣａｓが該当する）は、標的配列内であってもよいし（例えば、Ｃａｓ９が用いられる）、切断／ニック部位は、標的配列外であってもよい（例えば、非相同エンドヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩ酵素に由来するものに融合するＣａｓ９が用いられる）。
【００４９】
本明細書中で「人工標的部位」または「人工標的配列」は、非従来型酵母のゲノム中に導入された標的配列を指す。一部の実施形態における人工標的配列は、酵母のゲノム中の本来の標的配列と配列が同じでありながら、ゲノム中の異なる位置（非相同位置）に位置決めされてもよいし、酵母のゲノム中の同じ位置に位置決めされるならば本来の標的配列と異なってもよい。
【００５０】
本明細書中で「エピソーム」は、酵母細胞の染色体は別として、酵母細胞中に自律的に存在することができる（複製して娘細胞に進むことができる）ＤＮＡ分子を指す。エピソームＤＮＡは、在来であってもよいし、酵母細胞とは異種起源であってもよい。明細書中の在来エピソームの例として、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が挙げられる。本明細書中の異種起源エピソームの例として、プラスミドおよび酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。
【００５１】
本明細書中で「プロトスペーサ隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は、本明細書中のＲＧＥＮによって認識される短い配列を指す。本明細書中でＰＡＭの配列および長さは、用いられるＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体に応じて異なってよいが、典型的には、例えば、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド長である。
【００５２】
用語「５’キャップ」および「７−メチルグアニル酸（ｍ７Ｇ）キャップ」は、本明細書中で互換的に用いられる。７−メチルグアニル酸残基は、真核生物においてメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’末端上に位置決めされる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）は、真核生物においてｍＲＮＡを転写する。メッセンジャＲＮＡキャッピングは一般に、以下のように起こる：ｍＲＮＡ転写産物の最も末端の５’リン酸基が、ＲＮＡ末端ホスファターゼによって除去されて、２つの末端リン酸が残る。グアニリルトランスフェラーゼによって、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）が転写産物の末端のリン酸に加えられて、転写産物末端に５’−５’三リン酸結合グアニンが残る。最後に、この末端グアニンの７−窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。
【００５３】
本明細書中で専門用語「５’キャップを有していない」は、例えば、５’キャップの代わりに５’−水酸基を有するＲＮＡを指すのに用いられる。そのようなＲＮＡは、例えば、「キャップ離脱ＲＮＡ」と呼ぶことができる。キャップ離脱ＲＮＡは、転写後、核内により十分に蓄積することができる。というのも、５’キャッピングされたＲＮＡは、核外搬出に曝されるからである。本明細書中で、１つまたは複数のＲＮＡ構成要素が、キャップ離脱している。
【００５４】
用語「リボザイム」および「リボ核酸酵素」は、本明細書中で互換的に用いられる。リボザイムは、特定の部位にてＲＮＡを切断することができる、二次、三次、および／または四次構造を形成する１つまたは複数のＲＮＡ配列を指す。リボザイムとして、リボザイム配列に対してシス部位にてＲＮＡを切断することができる（すなわち、自己触媒的である、または自己切断する）「自己切断リボザイム」が挙げられる。リボザイム核酸分解活性の一般的な性質が解説されてきた（例えば、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１−６４６）。「ハンマーヘッドリボザイム」（ＨＨＲ）は、本明細書中で、触媒反応に関与する３つの塩基対形成されたステム、および高度に保存された、非相補的ヌクレオチドのコアで構成される小さな触媒的ＲＮＡモチーフを含んでよい。Ｐｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：６８−７４）、そしてＨａｍｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  １８：８７１−８８５）（これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる）が、ハンマーヘッドリボザイムの構造および活性を開示している。本明細書中でハンマーヘッドリボザイムは、例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  ８１：９９１−１００２（参照によって本明細書に組み込まれる））によって開示される「最小のハンマーヘッド」配列を含んでよい。
【００５５】
本開示の一実施形態において、方法は、非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を標的として向ける方法を含み、前記方法は、前記酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、第２の組換えＤＮＡ構築体から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去して前記ＲＮＡ構成要素が生成し、ＲＮＡ構成要素およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができるＲＧＥＮを形成することができる。
【００５６】
本開示の一実施形態において、非従来型酵母は、少なくとも１つのヌクレオチド配列に機能可能なように結合するプロモータを含むポリヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ構成要素をコードするＤＮＡ配列の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な可変ターゲティングドメインを含み、ＲＮＡ構成要素は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を形成することができ、前記ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは自己触媒的にリボザイムを除去して前記ＲＮＡ構成要素が生成し、前記ＲＮＡ構成要素は５’キャップを有していない。
【００５７】
リボザイムはまた、自己の配列の５’を切断して、先行するあらゆる転写産物を除去するが、リボザイム配列を無傷のままにするリボザイムを含む。
【００５８】
本開示の一実施形態において、非従来型酵母は、少なくとも１つのヌクレオチド配列に機能可能なように結合するプロモータを含むポリヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ構成要素をコードするＤＮＡ配列の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な可変ターゲティングドメインを含み、ＲＮＡ構成要素は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を形成することができ、前記ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは自己触媒的にリボザイムを除去して前記ＲＮＡ構成要素が生成し、ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは自己触媒的にリボザイムを除去しないで、５’キャップなしのリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子を生成する。
【００５９】
用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」、「ＤＮＡターゲティング」、「編集」、「遺伝子編集」、および「ＤＮＡ編集」は、本明細書中で互換的に用いられる。本明細書中でＤＮＡターゲティングは、例えば非従来型酵母の染色体またはエピソーム中の、特定のＤＮＡ配列でのｉｎｄｅｌ、ノックアウト、またはノックインの特異的な導入であってよい。一般に、ＤＮＡターゲティングは、本明細書中で、Ｃａｓタンパク質が適切なＲＮＡ構成要素と関連して、非従来型酵母中の特定のＤＮＡ配列にて一方の鎖または双方の鎖を切断することによって、実行され得る。そのようなＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の場合、標的部位にてｉｎｄｅｌを形成することができるＮＨＥＪプロセスを促進することができる。また、切断が一本鎖切断（ＳＳＢ）であるかＤＳＢであるかを問わず、適切なドナーＤＮＡポリヌクレオチドがＤＮＡニック部位またはＤＮＡ切断部位に提供される場合、ＨＲプロセスが促進され得る。そのようなＨＲプロセスは、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの配列に応じて、標的部位にてノックアウトまたはノックインを導入するのに用いられ得る。
【００６０】
これ以外にも、本明細書中でＤＮＡターゲティングは、標的ＤＮＡ配列に対する本明細書中のＣａｓ／ＲＮＡ構成要素複合体の特異的な関連を指し得、Ｃａｓタンパク質は、（Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレオチド結合分解性ドメインの状態に応じて）ＤＮＡ鎖をカットしたりカットしなかったりする。
【００６１】
本明細書中で用語「ｉｎｄｅｌ」は、染色体またはエピソーム中の標的ＤＮＡ配列中のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。そのような挿入または欠失は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基のものであってよい。ある実施形態におけるｉｎｄｅｌは、さらにより大きくてよく、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０ｐ、８０、９０、または１００塩基である。ｉｎｄｅｌが遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に導入されれば、ｉｎｄｅｌは多くの場合、フレームシフト突然変異を生じさせることによって、ＯＲＦによってコードされるタンパク質の野生型発現を分裂させる。
【００６２】
用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」および「遺伝的ノックアウト」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックアウトは、本明細書中で、Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによって部分的に、または完全に無効とされた、非従来型酵母のＤＮＡ配列を表す；ノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードしていてもよいし、例えば調節機能（例えばプロモータ）を有していてもよい。ノックアウトは、ターゲティング部位の配列、もしくはその近くの配列の機能を弱める、もしくは完全に破壊する、（ＮＨＥＪによる）ｉｎｄｅｌによって、または配列の特異的な除去によってもたらされ得る。ノックアウトされたＤＮＡポリヌクレオチド配列は、本明細書中で代わりに、例えば、部分的に、または全体として分裂する、または下方制御されると特徴付けられ得る。
【００６３】
一実施形態において、本開示は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、および少なくとも１つのヌクレオチド配列に機能可能なように結合するプロモータを含むポリヌクレオチド配列を含む非従来型酵母に関し、前記ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ構成要素をコードするＤＮＡ配列の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な可変ターゲティングドメインを含み、ＲＮＡ構成要素は、ＣａｓエンドヌクレアーゼによるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を形成することができ、前記ＲＧＥＮは、標的部位配列に結合することができる。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、酵母中にタンパク質として導入されてもよいし、組換えＤＮＡ構築体を介して導入されてもよい。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、当該技術分野において知られているあらゆる方法によって安定的に、または一時的に発現され得る。
【００６４】
用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」および「遺伝的ノックイン」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックインは、Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによる、非従来型酵母中の特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換または挿入を表す。ノックインの例として、遺伝子のコード領域中の異種起源アミノ酸コード配列の特異的な挿入、または遺伝子座中への転写調節要素の特異的な挿入がある。
【００６５】
用語「ドナーポリヌクレオチド」、「ドナーＤＮＡ」、「ターゲティングポリヌクレオチド」、および「ターゲティングＤＮＡ」は、本明細書中で互換的に用いられる。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ標的部位（例えば、本明細書中で、Ｃａｓタンパク質によって特異的に標的とされる配列）の配列、またはその近くの配列に相同である少なくとも１つの配列を含むＤＮＡ配列を指す。少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含むポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、編集されることとなるヌクレオチド配列と比較した場合、「ポリヌクレオチド修飾鋳型」、「ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ」、または「鋳型ＤＮＡ」とも呼ばれる。ヌクレオチド修飾は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、付加、または欠失であり得る。場合によっては、ポリヌクレオチド修飾鋳型は、少なくとも１つのヌクレオチド修飾にフランキングする相同ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、フランキング相同ヌクレオチド配列は、編集されることが所望されるヌクレオチド配列との十分な相同性を提供する。
【００６６】
本明細書中でドナーポリヌクレオチド内の「相同配列」は、標的部位の配列、もしくはその近くの配列との同一性が１００％、または標的部位の配列、もしくはその近くの配列との同一性が少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である少なくとも約２５ヌクレオチドの配列を含んでもよいし、この配列からなってもよい。
【００６７】
ある実施形態において、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、標的部位の配列と非相同である配列によって分離される２つの相同配列を有してよい。そのようなドナーポリヌクレオチドのこれら２つの相同配列は、「相同アーム」と呼ぶことができ、これらは非相同配列にフランキングする。標的部位と、２本の相同アームを有するドナーポリヌクレオチドとのＨＲは典型的に、標的部位の配列の、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列との置換を生じさせる（ドナーポリヌクレオチドの相同アームに相同なＤＮＡ配列間に位置決めされる標的部位配列は、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列によって置換される）。２本の相同アームを有するドナーポリヌクレオチドにおいて、アームは１つまたは複数のヌクレオチドによって分離されてよい（すなわち、ドナーポリヌクレオチド中の非相同配列は、少なくとも１ヌクレオチド長であってよい）。本明細書中で非従来型酵母において実行され得る種々のＨＲ手順が、例えば、ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｈ．Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１１）に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６８】
一実施形態において、ドナーＤＮＡ構築体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位中に挿入されることになる、対象のポリヌクレオチドを含み、ドナーＤＮＡ構築体はさらに、対象のポリヌクレオチドにフランキングする第１および第２の相同領域を含む。ドナーＤＮＡの第１および第２の相同領域は、植物ゲノムの標的部位中に存在する、またはこれにフランキングするそれぞれ第１および第２のゲノム領域との相同性を共有する。
【００６９】
用語「容量パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｙ  ｖｏｌｕｍｅ）」、「容量パーセント（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒｃｅｎｔ）」、「ｖｏｌ％」、および「ｖ／ｖ％」は、本明細書中で互換的に用いられる。溶液中の溶質の容量パーセントは、式：［（溶質の容量）／（溶液の容量）］×１００％を用いて確定され得る。
【００７０】
用語「重量パーセント」、「重量パーセンテージ（ｗｔ％）」、および「重量−重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ）」は、本明細書中で互換的に用いられる。重量パーセントは、組成物、混合物、または溶液中に含まれるままの、質量ベースでの材料のパーセンテージを指す。
【００７１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「核酸配列」は、本明細書中で互換的に用いられる。これらの用語は、ヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、場合によっては合成の、非天然の、または変更されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーであってよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つまたは複数のセグメントで構成されてよい。ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）は、以下の一文字呼称によって呼ぶことができる：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに関する）について「Ａ」、シチジル酸またはデオキシチジル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに関する）について「Ｃ」、グアニル酸またはデオキグアニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに関する）について「Ｇ」、ウリジル酸（ＲＮＡに関する）について「Ｕ」、デオキシチミジル酸（ＤＮＡに関する）について「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）について「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）について「Ｙ」、ＧまたはＴについて「Ｋ」、Ａ、Ｃ、またはＴについて「Ｈ」、イノシンについて「Ｉ」、ＡまたはＴについて「Ｗ」、そしてあらゆるヌクレオチドについて「Ｎ」（例えば、ＤＮＡ配列に言及するならば、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであり得；ＲＮＡ配列に言及するならば、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｕ、またはＧであり得る）。本明細書中に開示されるあらゆるＲＮＡ配列（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、適切なＤＮＡ配列によってコードされ得る。
【００７２】
本明細書中で用いられる用語「単離された」は、その本来の源から完全に、または部分的に精製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を指す。場合によっては、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、より大きな組成物、バッファ系、または試薬混合物の一部である。例えば、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、細胞内または生物内に異種起源のものとして含まれてよい。
【００７３】
本明細書中で用いられる用語「遺伝子」は、コード領域からＲＮＡを発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列を指し（ＲＮＡは、ＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）、当該ＲＮＡは、メッセンジャＲＮＡ（タンパク質をコードする）またはタンパク質非コードＲＮＡ（例えば、本明細書中でｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）であってよい。遺伝子は、コード領域のみを指してもよいし、コード領域の上流かつ／または下流に調節配列（例えば、プロモータ、５’非翻訳領域、３’転写ターミネータ領域）を含んでもよい。タンパク質をコードするコード領域は代わりに、本明細書中で「オープンリーディングフレーム」［ＯＲＦ］と呼ぶことができる。「在来の」または「内在性の」遺伝子は、自然界で見出されるような、自己調節配列を有する遺伝子を指す；そのような遺伝子は、宿主細胞のゲノム中の、その本来の位置に位置決めされている。「キメラ」遺伝子は、在来遺伝子でなく、自然界では一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む（すなわち、調節領域およびコード領域が互いに異種起源である）あらゆる遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、様々な源に由来する調節配列およびコード配列を含んでもよいし、同じ源に由来するが、自然界で見出されるものとは異なるようにして配置される調節配列およびコード配列を含んでもよい。「外来の」または「異種起源」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非在来生物中に挿入される在来遺伝子、在来宿主内の新しい位置に導入される在来遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでよい。本明細書中に開示されるある実施形態におけるポリヌクレオチド配列は、異種起源である。「トランスジーン」は、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されている。
【００７４】
在来アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、自然界に存在するものであるが、非在来アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、自然界に存在するものでない。
【００７５】
本明細書中で用いられる「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位（例えばプロモータ）、５’非翻訳領域、および３’非コード領域の上流に位置決めされるヌクレオチド配列を指し、転写、プロセシングもしくは安定性、または遺伝子から転写されるＲＮＡの翻訳に影響し得る。本明細書中の調節配列として、プロモータ、エンハンサ、サイレンサ、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクタ結合部位、ステム−ループ構造、および遺伝子発現の調節に関与する他の要素が挙げられ得る。本明細書中で１つまたは複数の調節要素は、本明細書中のコード領域とは異種起源であってよい。
【００７６】
本明細書中で用いられる「プロモータ」は、遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、プロモータ配列は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。プロモータは、その全体が在来遺伝子に由来してもよいし、自然界に見出される様々なプロモータに由来する様々な要素から構成されてもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。遺伝子を殆どの細胞型において殆どの時点で発現させるプロモータは一般に、「構成プロモータ」と呼ばれる。本明細書中で１つまたは複数のプロモータは、本明細書中のコード領域とは異種起源であってよい。
【００７７】
本明細書中で用いられる「強プロモータ」は、単位時間あたりに比較的多数の生産開始を導くことができるプロモータを指し得、かつ／または、酵母における遺伝子の平均転写レベルよりも高い遺伝子転写レベルを駆動するプロモータである。
【００７８】
本明細書中で用いられる用語「３’非コード配列」、「転写ターミネータ」、および「ターミネータ」は、コード配列の下流に位置決めされるＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列、および、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が挙げられる。
【００７９】
本明細書中で用いられる用語「カセット」は、タンパク質コードＲＮＡまたはタンパク質非コードＲＮＡをコードする配列に機能可能なように結合したプロモータを指す。カセットは場合によっては、３’非コード配列に機能可能なように結合してよい。
【００８０】
ポリヌクレオチドに関して本明細書中で用いられる用語「上流」および「下流」はそれぞれ、「５’」および「３’」を指す。
【００８１】
本明細書中で用いられる用語「発現」は、（ｉ）コード領域からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質非コードＲＮＡ、例えばｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）の転写、または（ｉｉ）ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を指す。
【００８２】
遺伝子またはポリヌクレオチド配列の発現を記載するのに用いられる場合、用語「下方制御」、「分裂」、「阻害」、「不活化」、および「サイレンシング」は、ポリヌクレオチド配列の転写が引き下げられる、または除外される例に言及するために、本明細書中で互換的に用いられる。これにより、ポリヌクレオチド配列からのＲＮＡ転写産物の引下げまたは除外がもたらされ、結果として（遺伝子がＯＲＦを含むならば）ポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質発現の引下げまたは除外がもたらされる。これ以外にも、下方制御は、ポリヌクレオチド配列によって生じる転写産物からのタンパク質の翻訳が引き下げられる、または除外される例に言及し得る。さらにこれ以外にも、下方制御は、ポリヌクレオチド配列によって発現されるタンパク質の活性が低下する例に言及し得る。細胞における上記プロセス（転写、翻訳、タンパク質活性）のいずれかの引下げは、適切なコントロール細胞の転写、翻訳、またはタンパク質活性に対して約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％であり得る。下方制御は、例えば、本明細書中に開示されるターゲティング事象（例えば、ｉｎｄｅｌ、ノックアウト）の結果であり得る。
【００８３】
用語「コントロール細胞」および「適切なコントロール細胞」は、本明細書中で互換的に用いられ、特定の修飾（例えば、ポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドの下方制御）がなされた細胞（すなわち、「実験細胞」）に対して参照され得る。コントロール細胞は、実験細胞の特定の修飾を有しもしなければ、これを発現もしないあらゆる細胞であり得る。ゆえに、コントロール細胞は、非形質転換野生型細胞であってもよいし、遺伝的に形質転換されているが、遺伝的形質転換を発現しないものであってもよい。例えば、コントロール細胞は、実験細胞の直接の親であってよく、この直接の親細胞は、実験細胞中に存在する特定の修飾を有していない。これ以外にも、コントロール細胞は、一世代または複数世代によって除かれる、実験細胞の親であってよい。さらにこれ以外にも、コントロール細胞は、実験細胞のきょうだいであってよく、このきょうだいは、実験細胞中に存在する特定の修飾を含まない。
【００８４】
本明細書中で用いられる用語「増大」は、量または活性の増大が比較されることになる量または活性を、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％超える量または活性に言及し得る。用語「増大」、「超」、および「向上」は、本明細書中で互換的に用いられる。用語「増大」は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を特徴付けるために用いられ得、「発現の増大」は、「過剰発現」を意味することもある。
【００８５】
本明細書中で用いられる用語「機能可能なように結合」は、２つ以上の核酸配列について、一方の機能が他方によって影響されるような関連を指す。例えば、プロモータが、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、そのコード配列と機能可能なように結合している。すなわち、コード配列は、プロモータの転写制御下にある。コード配列は、例えば、調節配列に機能可能なように結合し得る。また、例えば、ｃｒＲＮＡは、本明細書中で、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列が、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’配列とアニールするように、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合（融合）し得る。そのような機能可能な結合は、適切なループ形成配列、例えばＧＡＡＡ（配列番号４３）、ＣＡＡＡ（配列番号４４）、またはＡＡＡＧ（配列番号４５）を含んでよい。
【００８６】
本明細書中で用いられる用語「組換え」は、例えば化学合成による、または、遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作による、配列の２つの、通常であれば分離しているセグメントの人工的な組合せを指す。用語「組換え」、「トランスジェニック」、「形質転換」、「操作」、または「外来遺伝子発現のために修飾」は、本明細書中で互換的に用いられる。
【００８７】
本明細書中の組換え構築体／ベクター（例えば、本明細書中のリボザイム−ＲＮＡ構成要素カセットをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、または本明細書中のＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡポリヌクレオチド）を調製する方法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００２）によって記載されるような標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術に従ってよい。
【００８８】
本明細書中で用いられる用語「形質転換」は、宿主生物中または宿主細胞中への核酸分子の運搬を指す。例えば、核酸分子は、細胞中で自律的に複製し、宿主生物／細胞のゲノム中に組み込まれ、または複製することも組み込まれることもなく細胞中に一時的に存在する。形質転換に適した核酸分子の非限定的な例、例えばプラスミドおよび線状ＤＮＡ分子が、本明細書中に開示される。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物／細胞（例えば、本明細書中の非従来型酵母）は、「トランスジェニック」、「組換え体」、「形質転換された」、または「形質転換体」と呼ぶことができる。
【００８９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して本明細書中で用いられる用語「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較ウィンドウ上で最大に一致するようにアラインされた場合に、２つの配列中の同じである核酸残基またはアミノ酸残基を指す。ゆえに、「配列同一性のパーセンテージ」または「パーセント同一性」は、比較ウィンドウ上の２つの最適にアラインされた配列を比較することによって確定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適アラインメントについて、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでよい。パーセンテージは、双方の配列において、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が起こる位置の数を判定して、マッチする位置の数を得て、マッチする位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数によって除して、結果に１００を乗じることで配列同一性のパーセンテージを得ることによって、算出される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間で配列同一性を算出する場合、ＤＮＡ配列のＴ残基が、ＲＮＡ配列のＵ残基とアラインすると「同一である」と考えられ得ることが理解されるであろう。第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとのパーセント相補性を確定する目的で、例えば、（ｉ）第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの相補体配列（またはその反対）との間のパーセント同一性、および／または（ｉｉ）規範的なワトソンおよびクリックの塩基対を生じさせることになる第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の塩基のパーセンテージを確定することによって、当該パーセント相補性を得ることができる。
【００９０】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトにてオンラインで利用可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムが、例えば、本明細書中に開示される２つ以上のポリヌクレオチド配列間の（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）、またはポリペプチド配列間の（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）パーセント同一性を測定するのに用いられてよい。これ以外にも、配列間のパーセント同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＶ）を用いて実行されてもよい。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法を用いるマルチプルアラインメントについて、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、そしてＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応してよい。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いた、ペアワイズアラインメント、およびタンパク質配列のパーセント同一性の計算についてのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、そしてＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であってよい。核酸について、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、そしてＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であってよい。さらにこれ以外にも、配列間のパーセント同一性は、ＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えばｎｅｅｄｌｅ）を用いて実行されてよく、パラメータは例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ｍａｔｒｉｘ（例えばＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて、ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝ｆａｌｓｅ、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５である。
【００９１】
本明細書中で、第２の配列と「相補的な」第１の配列を、代わりに、第２の配列と「アンチセンス」の向きにあると呼ぶことができる。
【００９２】
種々のポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が、開示される本発明のある実施形態の特徴として、本明細書中に開示される。本明細書中に開示される配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％、または９０％〜９５％同一である配列の変異体が用いられてよい。これ以外にも、種々のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、本明細書中に開示される配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し得る。種々のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、開示される配列と同じ機能／活性、または開示される配列の、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の機能／活性を有する。
【００９３】
本明細書中のＣａｓ９タンパク質の各アミノ酸位置の、本明細書中に開示される全てのアミノ酸残基は、例である。あるアミノ酸が互いに類似した構造的特徴および／または電荷の特徴を共有する（すなわち、保存されている）ならば、Ｃａｓ９中の各位置のアミノ酸は、開示される配列に与えられるそのものであってもよいし、以下のように、保存アミノ酸残基で置換されてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．以下の小さな、無極性の、または僅かに極性のある脂肪族残基は、互いに置換し得る：Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．以下の極性のある、負に帯電する残基、およびそれらのアミドは、互いに置換し得る：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．以下の極性のある、正に帯電する残基は、互いに置換し得る：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．以下の無極性の脂肪族残基は、互いに置換し得る：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；そして
５．以下の大きな芳香族残基は、互いに置換し得る：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
【００９４】
以下で実施例１において示されるように、非従来型酵母、例えば酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータで転写されるｇＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングを実行するのは、困難であることが証明された。したがって、Ｃａｓ９用の、ＲＮＡ構成要素を生じさせる他の手段が、非従来型酵母におけるＣａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングの実現のために注目されている。
【００９５】
開示される本発明の実施形態は、５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を含む非従来型酵母に関する。このキャップ離脱ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソームにおける標的部位配列と相補的な配列を含む。ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができる。
【００９６】
重要なことに、ＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングは、ｉｎｄｅｌ形成、またはＲＧＥＮ標的部位配列と、外因的に供給されるドナーＤＮＡ配列との相同組換え（ＨＲ）のレベルの増大によって明らかにされるように、非従来型酵母中で起こる。本開示に先立って、非従来型酵母は概して、ＨＲによる遺伝子ターゲティングに抵抗性であり、典型的には、標的部位でのランダムな、稀なＤＮＡ切断をあてにして、ドナーＤＮＡとのＨＲを促進していた。これは、非従来型酵母が、低いＨＲ活性を有し、代わりとして非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性を優先するためである。ゆえに、非従来型酵母中のＨＲによる遺伝的ターゲティングは今回、ＮＨＥＪプロセスよりもＨＲを優先する従来の酵母、例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるのとほぼ同じくらい実行可能であり得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、５’キャップのない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を非従来型酵母細胞中に提供することで、ＲＮＡ構成要素が核中でより十分に蓄積して、ＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングに関与することができると考えられる。
【００９７】
ＲＮＡプロセシングツール、例えばＣｓｙ４（Ｃａｓ６）ベースのＲＮＡプロセシングツールが記載されている（Ｎｉｓｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５４：６９８−７１０）。Ｃｓｙ４は、プレｃｒＲＮＡステム−ループリピートに結合し、かつその同起源の担体を特異的に切断して、リピートのフラグメントがフランキングするスペーサ配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡを生じさせる（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．ＲＮＡ，１８（４）：６６１−７２）。本明細書（実施例１２）中に開示されるのは、ガイドＲＮＡをプロセシングするためのＣｓｙ４の使用であり、これは、５’キャップを有していないＲＮＡ構成要素（ガイドＲＮＡ）をもたらし、ＲＮＡ構成要素は、非従来型酵母のゲノム中の標的部位に結合してこれを切断することができるＲＧＥＮを形成することができる。
【００９８】
本明細書中で非従来型酵母は、「従来型」（「モデル」）酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、出芽酵母、パン酵母、および／または醸造酵母としても知られる出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））でも、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、分裂酵母としても知られるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））種でもない。ある実施形態における従来型酵母は、ＮＨＥＪによって媒介される修復プロセスよりもＨＲ  ＤＮＡ修復プロセスを優先する酵母である。
【００９９】
ある実施形態における非従来型酵母は、ＨＲによって媒介される修復プロセスよりもＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復プロセスを優先する酵母であってよい。従来の酵母、例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）は典型的に、短フランキング相同アーム（３０〜５０ｂｐ）を有するドナーＤＮＡの特異的な組込みを示し、効率はルーチン的に７０％を超える一方、非従来型酵母、例えばピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、およびクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）は通常、類似した構造のドナーＤＮＡによる特異的組込みを示すが、効率は１％未満である（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ５７９５２）。ゆえに、ＨＲプロセスの優先度は、例えば、酵母を適切なドナーＤＮＡで形質転換して、ドナーＤＮＡによって標的とされると予測されるゲノム部位と特異的に組み換えられる程度を判定することによって、測定され得る。例えば、そのようなアッセイにより、酵母ゲノムにおけるドナーＤＮＡのランダムな組込みの高い程度が得られるならば、ＮＨＥＪの優先度（すなわちＨＲの低い優先度）が顕在化するであろう。酵母におけるＤＮＡの特異的な（ＨＲ媒介）、かつ／またはランダムな（ＮＨＥＪ媒介）組込み率を判定するためのアッセイが、当該技術分野において知られている（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１８：２２４９−２２５４；Ｃｏｒｒｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ６９６２８；Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６３５４−６３５８；Ｋｅｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｏｅｋｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３６：８４９−８５６）。
【０１００】
低いレベルのＨＲ活性を考えると、本明細書中の非従来型酵母は、（ｉ）３０〜５０ｂｐのフランキング相同アームを有する適切なドナーＤＮＡによる、例えば約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、もしくは８％未満の特異的なターゲティング率を示し得、かつ／または（ｉｉ）前述のドナーＤＮＡの、例えば約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、もしくは７５％超のランダムな組込み率を示し得る。適切なドナーＤＮＡのこれらの（ｉ）特異的なターゲティング率、および／または（ｉｉ）ランダムな組込み率は、本明細書中に開示されるＲＧＥＮが提供されるよりも前から存在するため、非従来型酵母を特徴付けることができる。ある実施形態においてＲＧＥＮを非従来型酵母に提供する目的は、酵母を特定の部位でのＨＲに偏らせるための部位特異的ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることである。ゆえに、本明細書中で適切なＲＧＥＮを含む非従来型酵母は典型的に、特定のドナーＤＮＡとのＨＲ率の増大を示すはずである。そのような率の増大は、適切なコントロール（例えば、適切なＲＧＥＮを欠く以外は同じドナーＤＮＡで形質転換した同じ非従来型酵母）のＨＲ率よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高くなり得る。
【０１０１】
本明細書中のある態様における非従来型酵母は、無性生殖で繁殖する（アナモルフィック）ものであっても、有性生殖で繁殖する（テレオモルフィック）ものであってもよい。本明細書中の非従来型酵母は典型的に、単細胞の形態で存在する一方、当該酵母のある型は場合によっては、偽菌糸（出芽細胞が連結したストリング）を形成することができてもよい。更なる態様において、非従来型酵母は、半数体であっても二倍体であってもよいし、かつ／またはこれらの倍数性のどちらの形態でも存在する能力を有してもよい。
【０１０２】
本明細書中で非従来型酵母は、例えばＮｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）、Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｈａｂｉｔａｔｓ（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９７）、および／またはＹｅａｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｔ．Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａ，Ｇ．Ｋｕｎｚｅ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００９）（これらの文献は全て、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される、当該技術分野において知られているあらゆる手段に従って培養され得る。
【０１０３】
本明細書中の非従来型酵母の非限定的な例として、以下の属の酵母が挙げられる：ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、およびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種の適切な例は、酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種の適切な例として、ピキア酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、メチロトローフ酵母（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）、およびピキア・アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）が挙げられる。シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、シュワニオミセス・カステリィ（Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シュワニオミセス・ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、シュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、シュワニオミセス・カプリオッティ（Ｓ．ｃａｐｒｉｏｔｔｉｉ）、シュワニオミセス・エチェルシィ（Ｓ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、シュワニオミセス・ポリモルファス（Ｓ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、シュワニオミセス・シュードポリモルファス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、シュワニオミセス・バンリジエ（Ｓ．ｖａｎｒｉｊｉａｅ）、およびシュワニオミセス・ヤマダエ（Ｓ．ｙａｍａｄａｅ）が挙げられる。クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クルイベロミセス・ファゼオロスポラス（Ｋ．ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）、クルイベロミセス・バヌデニィ（Ｋ．ｖａｎｕｄｅｎｉｉ）、クルイベロミセス・ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、クルイベロミセス・アフリカヌス（Ｋ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、およびクルイベロミセス・ポリスポラス（Ｋ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属種の適切な例として、アルクスラ・アデニニボランス（Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）およびアルクスラ・テレストレ（Ａ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｅ）が挙げられる。トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属種の適切な例として、トリコスポロン・クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・キャピタトゥム（Ｔ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、トリコスポロン・インキン（Ｔ．ｉｎｋｉｎ）、およびトリコスポロン・ビーメリ（Ｔ．ｂｅｅｍｅｒｉ）が挙げられる。カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属種の適切な例として、カンディダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンディダ・アスカラフィダルム（Ｃ．ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ）、カンディダ・アムフィキシエ（Ｃ．ａｍｐｈｉｘｉａｅ）、カンディダ・アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンディダ・アルゲンティア（Ｃ．ａｒｇｅｎｔｅａ）、カンディダ・アトランティカ（Ｃ．ａｔｌａｎｔｉｃａ）、カンディダ・アトモスファェリカ（Ｃ．ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ）、カンディダ・ブラッテ（Ｃ．ｂｌａｔｔａｅ）、カンディダ・ブロメリアセアルム（Ｃ．ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｒｕｍ）、カンディダ・カルポフィラ（Ｃ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・カルバジャリス（Ｃ．ｃａｒｖａｊａｌｉｓ）、カンディダ・セラムビシダルム（Ｃ．ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ）、カンディダ・チャウリオデス（Ｃ．ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ）、カンディダ・コリダリ（Ｃ．ｃｏｒｙｄａｌｉ）、カンディダ・ドッセイ（Ｃ．ｄｏｓｓｅｙｉ）、カンディダ・デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンディダ・エルガテンシス（Ｃ．ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ）、カンディダ・フルクトゥス（Ｃ．ｆｒｕｃｔｕｓ）、カンディダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンディダ・フェルメンタティ（Ｃ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、カンディダ・ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンディダ・ハエムロニィ（Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ）、カンディダ・インセクタメンス（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ）、カンディダ・インセクトルム（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ）、カンディダ・インテルメディア（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、カンディダ・イェフレシィ（Ｃ．ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ）、カンディダ・ケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、カンディダ・ケロセニエ（Ｃ．ｋｅｒｏｓｅｎｅａｅ）、カンディダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、カンディダ・ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンディダ・リキソソフィラ（Ｃ．ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、カンディダ・マリーナ（Ｃ．ｍａｒｉｎａ）、カンディダ・メンブラニファシエンス（Ｃ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、カンディダ・ミレリ（Ｃ．ｍｉｌｌｅｒｉ）、カンディダ・モギィ（Ｃ．ｍｏｇｉｉ）、カンディダ・オレオフィラ（Ｃ．ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・オレゴネンシス（Ｃ．ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ）、カンディダ・パラシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンディダ・クエルシトルーサ（Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ）、カンディダ・ルゴサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）、カンディダ・サケ（Ｃ．ｓａｋｅ）、カンディダ・シャハテア（Ｃ．ｓｈｅｈａｔｅａ）、カンディダ・テムノキラエ（Ｃ．ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ）、カンディダ・テヌイス（Ｃ．ｔｅｎｕｉｓ）、カンディダ・テアエ（Ｃ．ｔｈｅａｅ）、カンディダ・トレランス（Ｃ．ｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンディダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンディダ・ツチヤエ（Ｃ．ｔｓｕｃｈｉｙａｅ）、カンディダ・シノラボランティウム（Ｃ．ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔｉｕｍ）、カンディダ・ソーヤ（Ｃ．ｓｏｊａｅ）、カンディダ・サブハシィ（Ｃ．ｓｕｂｈａｓｈｉｉ）、カンディダ・ビスワナシィ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンディダ・ユティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、カンディダ・ウバトゥベンシス（Ｃ．ｕｂａｔｕｂｅｎｓｉｓ）、およびカンディダ・ゼプリニナ（Ｃ．ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａ）が挙げられる。ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属種の適切な例として、エンバク裸黒穂病菌（Ｕ．ａｖｅｎａｅ）、黒穂病菌（Ｕ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、堅黒穂病菌（Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ）、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）、オオムギ裸黒穂病菌（Ｕ．ｎｕｄａ）、および裸黒穂病菌（Ｕ．ｔｒｉｔｉｃ）が挙げられる。トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属種の適切な例として、トルロプシス・ゲオチャレス（Ｔ．ｇｅｏｃｈａｒｅｓ）、トルロプシス・アジマ（Ｔ．ａｚｙｍａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）、およびトルロプシス・カンディダ（Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ）が挙げられる。チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、チゴサッカロミセス・バイリィ（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミセス・ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、チゴサッカロミセス・シドリ（Ｚ．ｃｉｄｒｉ）、チゴサッカロミセス・フェルメンタティ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、チゴサッカロミセス・フロレンティヌス（Ｚ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、チゴサッカロミセス・コンブチャエンシス（Ｚ．ｋｏｍｂｕｃｈａｅｎｓｉｓ）、チゴサッカロミセス・レントゥス（Ｚ．ｌｅｎｔｕｓ）、チゴサッカロミセス・メリス（Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ）、チゴサッカロミセス・ミクロエリプソイデス（Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）、チゴサッカロミセス・ムラキィ（Ｚ．ｍｒａｋｉｉ）、チゴサッカロミセス・シュードルーキシィ（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ）、およびチゴサッカロミセス・ルーキシィ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属種の適切な例として、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）が挙げられる。クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種の適切な例として、クリプトコッカス・ローレンティ（Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・アルビダス（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃ．ｇａｔｔｉｉ）、クリプトコッカス・ユニグトゥラトゥス（Ｃ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）、クリプトコッカス・アデリエンシス（Ｃ．ａｄｅｌｉｅｎｓｉｓ）、クリプトコッカス・エリウス（Ｃ．ａｅｒｉｕｓ）、クリプトコッカス・アルビドシミリス（Ｃ．ａｌｂｉｄｏｓｉｍｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・アンタルクティカス（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・アクアティカス（Ｃ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・アーテル（Ｃ．ａｔｅｒ）、クリプトコッカス・ブータネンシス（Ｃ．ｂｈｕｔａｎｅｎｓｉｓ）、クリプトコッカス・コンソルティオニス（Ｃ．ｃｏｎｓｏｒｔｉｏｎｉｓ）、クリプトコッカス・カルバトゥス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・フェノリカス（Ｃ．ｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・スキンネリ（Ｃ．ｓｋｉｎｎｅｒｉ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、およびクリプトコッカス・ビシュニアッシ（Ｃ．ｖｉｓｈｎｉａｃｃｉ）が挙げられる。ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種の適切な例として、ロドトルラ・アケニオルム（Ｒ．ａｃｈｅｎｉｏｒｕｍ）、ロドトルラ・トゥラ（Ｒ．ｔｕｌａ）、ロドトルラ・アクタ（Ｒ．ａｃｕｔａ）、ロドトルラ・アメリカーナ（Ｒ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ロドトルラ・アラウカリエ（Ｒ．ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、ロドトルラ・アークティカ（Ｒ．ａｒｃｔｉｃａ）、ロドトルラ・アルメニアカ（Ｒ．ａｒｍｅｎｉａｃａ）、ロドトルラ・アウランティアカ（Ｒ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・アウリクラリエ（Ｒ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）、ロドトルラ・バカルム（Ｒ．ｂａｃａｒｕｍ）、ロドトルラ・ベンチカ（Ｒ．ｂｅｎｔｈｉｃａ）、ロドトルラ・ビオウルゲイ（Ｒ．ｂｉｏｕｒｇｅｉ）、ロドトルラ・ボゴリエンシス（Ｒ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ブロンキアリス（Ｒ．ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ロドトルラ・ブフォニィ（Ｒ．ｂｕｆｆｏｎｉｉ）、ロドトルラ・カリプトゲナエ（Ｒ．ｃａｌｙｐｔｏｇｅｎａｅ）、ロドトルラ・チュングナメンシス（Ｒ．ｃｈｕｎｇｎａｍｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・クラディエンシス（Ｒ．ｃｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・コラリナ（Ｒ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ロドトルラ・クレゾリカ（Ｒ．ｃｒｅｓｏｌｉｃａ）、ロドトルラ・クロセア（Ｒ．ｃｒｏｃｅａ）、ロドトルラ・シクロクラスティカ（Ｒ．ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃａ）、ロドトルラ・ダイレネンシス（Ｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ディフルエンス（Ｒ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、ロドトルラ・エベルグラディエンシス（Ｒ．ｅｖｅｒｇｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・フェルリカ（Ｒ．ｆｅｒｕｌｉｃａ）、ロドトルラ・フォリオルム（Ｒ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ）、ロドトルラ・フラガリア（Ｒ．ｆｒａｇａｒｉａ）、ロドトルラ・フジサネンシス（Ｒ．ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、
ロドトルラ・フトロネンシス（Ｒ．ｆｕｔｒｏｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ゲラティノーサ（Ｒ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・グラシアリス（Ｒ．ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グリンベルグシィ（Ｒ．ｇｒｉｎｂｅｒｇｓｉｉ）、ロドトルラ・ヒマライエンシス（Ｒ．ｈｉｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ヒヌレア（Ｒ．ｈｉｎｎｕｌｅａ）、ロドトルラ・ヒストリティカ（Ｒ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ロドトルラ・ヒロフィラ（Ｒ．ｈｙｌｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・インカルナタ（Ｒ．ｉｎｃａｒｎａｔａ）、ロドトルラ・インゲニオサ（Ｒ．ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）、ロドトルラ・ジャバニカ（Ｒ．ｊａｖａｎｉｃａ）、ロドトルラ・コイシカウェンシス（Ｒ．ｋｏｉｓｈｉｋａｗｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ラクトーサ（Ｒ．ｌａｃｔｏｓａ）、ロドトルラ・ラメリブラキエ（Ｒ．ｌａｍｅｌｌｉｂｒａｃｈｉａｅ）、ロドトルラ・ラリンギス（Ｒ．ｌａｒｙｎｇｉｓ）、ロドトルラ・リグノフィラ（Ｒ．ｌｉｇｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・リニ（Ｒ．ｌｉｎｉ）、ロドトルラ・ロンギッシマ（Ｒ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）、ロドトルラ・ルドウィギィ（Ｒ．ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、ロドトルラ・リシノフィラ（Ｒ．ｌｙｓｉｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・マリーナ（Ｒ．ｍａｒｉｎａ）、ロドトルラ・マルチニエ−フラガンティス（Ｒ．ｍａｒｔｙｎｉａｅ−ｆｒａｇａｎｔｉｓ）、ロドトルラ・マトリテンシス（Ｒ．ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・メリ（Ｒ．ｍｅｌｉ）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・ニテンス（Ｒ．ｎｉｔｅｎｓ）、ロドトルラ・ノトファギ（Ｒ．ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、ロドトルラ・オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、ロドトルラ・パシフィカ（Ｒ．ｐａｃｉｆｉｃａ）、ロドトルラ・パリダ（Ｒ．ｐａｌｌｉｄａ）、ロドトルラ・ペネウス（Ｒ．ｐｅｎｅａｕｓ）、ロドトルラ・フィリラ（Ｒ．ｐｈｉｌｙｌａ）、ロドトルラ・フィロプラナ（Ｒ．ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎａ）、ロドトルラ・ピラティ（Ｒ．ｐｉｌａｔｉｉ）、ロドトルラ・ピリマネ（Ｒ．ｐｉｌｉｍａｎａｅ）、ロドトルラ・ピニコラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・ピリカタ（Ｒ．ｐｌｉｃａｔａ、）、ロドトルラ・ポリモルファ（Ｒ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ロドトルラ・サイクロフェノリカ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａ）、ロドトルラ・サイクロフィラ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・パストゥラ（Ｒ．ｐｕｓｔｕｌａ）、ロドトルラ・レティノフィラ（Ｒ．ｒｅｔｉｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・ロザケア（Ｒ．ｒｏｓａｃｅａ）、ロドトルラ・ロスラータ（Ｒ．ｒｏｓｕｌａｔａ）、ロドトルラ・ルベファシエンス（Ｒ．ｒｕｂｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロドトルラ・ルベラ（Ｒ．ｒｕｂｅｌｌａ）、ロドトルラ・ルベスセンス（Ｒ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒ．ｒｕｂｒａ）、ロドトルラ・ルブロルゴサ（Ｒ．ｒｕｂｒｏｒｕｇｏｓａ）、ロドトルラ・ルフラ（Ｒ．ｒｕｆｕｌａ）、ロドトルラ・ルティラ（Ｒ．ｒｕｔｉｌａ）、ロドトルラ・サングイネア（Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、ロドトルラ・サニエイ（Ｒ．ｓａｎｎｉｅｉ）、ロドトルラ・サルトリィ（Ｒ．ｓａｒｔｏｒｙｉ）、ロドトルラ・シルベストリス（Ｒ．ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ロドトルラ・シンプレックス（Ｒ．ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロドトルラ・シネンシス（Ｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・スルーフィエ（Ｒ．ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）、ロドトルラ・ソンクキィ（Ｒ．ｓｏｎｃｋｉｉ）、ロドトルラ・ストラミネア（Ｒ．ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、ロドトルラ・スベリコラ（Ｒ．ｓｕｂｅｒｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・スガニィ（Ｒ．ｓｕｇａｎｉｉ）、ロドトルラ・タイワネンシス（Ｒ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・タイワニアナ（Ｒ．ｔａｉｗａｎｉａｎａ）、ロドトルラ・テルペノイダリス（Ｒ．ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ）、ロドトルラ・テッレア（Ｒ．ｔｅｒｒｅａ）、ロドトルラ・テキセンシス（Ｒ．ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・トキョエンシス（Ｒ．ｔｏｋｙｏｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ウルザメ（Ｒ．ｕｌｚａｍａｅ）、ロドトルラ・バニリカ（Ｒ．ｖａｎｉｌｌｉｃａ）、ロドトルラ・ブイレミニィ（Ｒ．ｖｕｉｌｌｅｍｉｎｉｉ）、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒ．ｙａｒｒｏｗｉｉ）、ロドトルラ・ユナネンシス（Ｒ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、およびロドトルラ・ゾルティ（Ｒ．ｚｓｏｌｔｉｉ）が挙げられる。ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属種の適切な例として、赤色酵母（Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、スポロボロミセス・アルボルベスセンス（Ｓ．ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、スポロボロミセス・バナエンシス（Ｓ．ｂａｎｎａｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ベイジンゲンシス（Ｓ．ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ビスフォフィエ（Ｓ．ｂｉｓｃｈｏｆｉａｅ）、スポロボロミセス・クラバトゥス（Ｓ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、スポロボロミセス・コプロスメ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍａｅ）、スポロボロミセス・コプロスミコーラ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍｉｃｏｌａ）、スポロボロミセス・コラリヌス（Ｓ．ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、スポロボロミセス・ディメネ（Ｓ．ｄｉｍｍｅｎａｅ）、スポロボロミセス・ドラコフィリィ（Ｓ．ｄｒａｃｏｐｈｙｌｌｉ）、スポロボロミセス・エロンガトゥス（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、スポロボロミセス・グラシリス（Ｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、スポロボロミセス・イノシトフィルス（Ｓ．ｉｎｏｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）、スポロボロミセス・ジョンソニィ（Ｓ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポロボロミセス・コアラエ（Ｓ．ｋｏａｌａｅ）、スポロボロミセス・マグニスポラス（Ｓ．ｍａｇｎｉｓｐｏｒｕｓ）、スポロボロミセス・ノボゼアランディカス（Ｓ．ｎｏｖｏｚｅａｌａｎｄｉｃｕｓ）、スポロボロミセス・オドラス（Ｓ．ｏｄｏｒｕｓ）、スポロボロミセス・パタゴニカス（Ｓ．ｐａｔａｇｏｎｉｃｕｓ）、スポロボロミセス・プロダクトゥス（Ｓ．ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、スポロボロミセス・ロセウス（Ｓ．ｒｏｓｅｕｓ）、スポロボロミセス・サシコーラ（Ｓ．ｓａｓｉｃｏｌａ）、スポロボロミセス・シバタヌス（Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、スポロボロミセス・シンギュラリス（Ｓ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、スポロボロミセス・スブルンネウス（Ｓ．ｓｕｂｂｒｕｎｎｅｕｓ）、スポロボロミセス・シンメトリカス（Ｓ．ｓｙｍｍｅｔｒｉｃｕｓ）、スポロボロミセス・シジギィ（Ｓ．ｓｙｚｙｇｉｉ）、スポロボロミセス・タウポエンシス（Ｓ．ｔａｕｐｏｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ツガエ（Ｓ．ｔｓｕｇａｅ）、スポロボロミセス・ザンザス（Ｓ．ｘａｎｔｈｕｓ）、およびスポロボロミセス・ユナネンシス（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属種の適切な例として、パキソレン・タノフィルス（Ｐ．ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。
【０１０４】
酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、本明細書中に開示されるある実施形態において、好ましい。適切な酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の例として、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な、以下の単離物が挙げられる：株名称ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃８８６２、＃８６６１、＃８６６２、＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７３、＃２０３８３、＃２０３９０、＃２０４００、＃２０４６０、＃２０４６１、＃２０４６２、＃２０４９６、＃２０５１０、＃２０６２８、＃２０６８８、＃２０７７４、＃２０７７５、＃２０７７６、＃２０７７７、＃２０７７８、＃２０７７９、＃２０７８０、＃２０７８１、＃２０７９４、＃２０７９５、＃２０８７５、＃２０２４１、＃２０４２２、＃２０４２３、＃３２３３８、＃３２３３９、＃３２３４０、＃３２３４１、＃３４３４２、＃３２３４３、＃３２９３５、＃３４０１７、＃３４０１８、＃３４０８８、＃３４９２２、＃３４９２２、＃３８２９５、＃４２２８１、＃４４６０１、＃４６０２５、＃４６０２６、＃４６０２７、＃４６０２８、＃４６０６７、＃４６０６８、＃４６０６９、＃４６０７０、＃４６３３０、＃４６４８２、＃４６４８３、＃４６４８４、＃４６４３６、＃６０５９４、＃６２３８５、＃６４０４２、＃７４２３４、＃７６５９８、＃７６８６１、＃７６８６２、＃７６９８２、＃９０７１６、＃９０８１１、＃９０８１２、＃９０８１３、＃９０８１４、＃９０９０３、＃９０９０４、＃９０９０５、＃９６０２８、＃２０１２４１、＃２０１２４２、＃２０１２４３、＃２０１２４４、＃２０１２４５、＃２０１２４６、＃２０１２４７、＃２０１２４９、および／または＃２０１８４７。
【０１０５】
本明細書中で酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）および他のあらゆる非従来型酵母は、油産生性であってよく（例えば、その乾燥細胞重の少なくとも２５％を油として産生する）、かつ／または１種もしくは複数種の多価不飽和脂肪酸（例えば、オメガ６またはオメガ３）を産生してよい。そのような油産生性は、酵母が、その野生型の形態と比較して、脂質を大量に産生するように遺伝子操作された結果であってよい。油産生性酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の例が、米国特許出願公開第２００９／００９３５４３号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０３１７０７２号明細書、米国特許出願公開第２０１２／００５２５３７号明細書、および米国特許出願公開第２０１４／０１８６９０６号明細書に開示されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
非従来型酵母について本明細書中に開示される実施形態はまた、他の微生物、例えば菌類に応用され得る。ある実施形態における菌類は、ＨＲによって媒介される修復プロセスよりもＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復プロセスを優先する菌類であってよい。本明細書中で菌は、担子菌類、接合菌類、ツボカビ類、または子嚢菌類の菌であってよい。本明細書中の糸状菌類の例として、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属（例えば、アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・ストフィラ（Ｎ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ））、クリフォネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）属（例えばクリフォネクトリア・パラシティカ（Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ））、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）（例えばオーレオバシディウム・プルランス（Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））、フィロバシディウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、スキタリディウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）属、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（例えば、ペニシリウム・ビライエ（Ｐ．ｂｉｌａｉａｅ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カンディドゥム（Ｐ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・エキスパンスム（Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グラウクム（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐ．ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・ベルコースム（Ｐ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、ペニシリウム・ビリディカトゥム（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ））、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属（例えば、ジベレラ・アクミナタ（Ｇ．ａｃｕｍｉｎａｔａ）、リンゴ水腐病菌（Ｇ．ａｖｅｎａｃｅａ）、ジベレラ・バッカタ（Ｇ．ｂａｃｃａｔａ）、ジベレラ・シルシナタ（Ｇ．ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、ジベレラ・シアノゲナ（Ｇ．ｃｙａｎｏｇｅｎａ）、イネ馬鹿苗病菌（Ｇ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ジベレラ・イントリカンス（Ｇ．ｉｎｔｒｉｃａｎｓ）、ジベレラ・プリカリス（Ｇ．ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、ジベレラ・スティルボイデス（Ｇ．ｓｔｉｌｂｏｉｄｅｓ）、ジベレラ・トリシンクタ（Ｇ．ｔｒｉｃｉｎｃｔａ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇ．ｚｅａｅ））、マイセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、ムコール・ルーキシィ（Ｍ．ｒｏｕｘｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏ���ｙｚａｅ）、アスペルギラス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギラス・フラブス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギラス・レントゥルス（Ａ．ｌｅｎｔｕｌｕｓ）、アスペルギラス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギラス・クラバトゥス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギラス・フミガトゥス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（例えば、ムギ類赤カビ病菌（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ヌビゲヌム（Ｆ．ｂｕｂｉｇｅｎｕｍ）、フサリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・バーティシリオイデス（Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・プロリフェラトゥム（Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）、フザリウム・ベネナトゥム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、およびフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ならびにそれらのアナモルフおよびテレオモルフの糸状菌類が挙げられる。本明細書中で菌類の属および種は、Ｂａｒｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ（Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ  Ｆｕｎｇｉ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７２）に開示されるように、必要に応じて、形態によって定義され得る。菌は場合によっては、ペスト／病原体、例えば動物（例えばヒト）のペスト／病原体として特徴付けられ得る。
【０１０７】
本明細書中のある態様におけるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種として、トリコデルマ・アグレッシバム（Ｔ．ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、トリコデルマ・アマゾニクム（Ｔ．ａｍａｚｏｎｉｃｕｍ）、トリコデルマ・アスペレルム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アウレオビリデ（Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アウストロコニンギィ（Ｔ．ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ブレビコンパクトゥム（Ｔ．ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、トリコデルマ・カンディドゥム（Ｔ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、トリコデルマ・カリッベウム（Ｔ．ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ）、トリコデルマ・カトプトロン（Ｔ．ｃａｔｏｐｔｒｏｎ）、トリコデルマ・クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、トリコデルマ・セラミクム（Ｔ．ｃｅｒａｍｉｃｕｍ）、トリコデルマ・セリヌム（Ｔ．ｃｅｒｉｎｕｍ）、トリコデルマ・クロロスポルム（Ｔ．ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・クロロスペルマム（Ｔ．ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ）、トリコデルマ・シナモメウム（Ｔ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ）、トリコデルマ・シトリノビリデ（Ｔ．ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・クラッスム（Ｔ．ｃｒａｓｓｕｍ）、トリコデルマ・クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、トリコデルマ・ジングレエアエ（Ｔ．ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ）、トリコデルマ・ドロテアエ（Ｔ．ｄｏｒｏｔｈｅａｅ）、トリコデルマ・エフスム（Ｔ．ｅｆｆｕｓｕｍ）、トリコデルマ・エリナセウム（Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｕｍ）、トリコデルマ・エストニクム（Ｔ．ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ）、トリコデルマ・フェルティル（Ｔ．ｆｅｒｔｉｌｅ）、トリコデルマ・ゲラティノサス（Ｔ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ）、トリコデルマ・グハネンセ（Ｔ．ｇｈａｎｅｎｓｅ）、トリコデルマ・ハマトゥム（Ｔ．ｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・ヘリクム（Ｔ．ｈｅｌｉｃｕｍ）、トリコデルマ・イントリカトゥム（Ｔ．ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）、トリコデルマ・コニラングブラ（Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、トリコデルマ・コニンギィ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・コニンギオプシス（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｏｐｓｉｓ）、トリコデルマ・ロンギブラチアトゥム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ロンギピレ（Ｔ．ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ）、トリコデルマ・ミヌティスポルム（Ｔ．ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・オブロギスポルム（Ｔ．ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・オバリスポルム（Ｔ．ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・ペテルセニィ（Ｔ．ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）、トリコデルマ・フィロスタヒディス（Ｔ．ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ）、トリコデルマ・ピルリフェルム（Ｔ．ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ）、トリコデルマ・プレウロティコラ（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ）、トリコデルマ・プレウロトゥム（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ）、トリコデルマ・ポリスポルム（Ｔ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・シュードコニンギィ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・プベスセンス（Ｔ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロゲルソニィ（Ｔ．ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ）、トリコデルマ・ロシクム（Ｔ．ｒｏｓｓｉｃｕｍ）、トリコデルマ・サトゥルニスポルム（Ｔ．ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・シネンシス（Ｔ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、トリコデルマ・シヌオスム（Ｔ．ｓｉｎｕｏｓｕｍ）、トリコデルマ・スピラレ（Ｔ．ｓｐｉｒａｌｅ）、トリコデルマ・ストラミネウム（Ｔ．ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ）、トリコデルマ・ストリゴスム（Ｔ．ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ）、トリコデルマ・ストロマティクム（Ｔ．ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、トリコデルマ・スロトゥンドゥム（Ｔ．ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ）、トリコデルマ・タイワネンセ（Ｔ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、トリコデルマ・タイランディクム（Ｔ．ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｍ）、トリコデルマ・テレフォリコルム（Ｔ．ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｉｃｏｌｕｍ）、トリコデルマ・セオブロミコラ（Ｔ．ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ・トメントスム（Ｔ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）、トリコデルマ・ベルティヌム（Ｔ．ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ）、トリコデルマ・ビレンス（Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、およびトリコデルマ・ビリデスセンス（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。本明細書中でトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種は、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．Ｋ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＣＡＢＩ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ，２０１３）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように培養され、かつ／または操作され得る。
【０１０８】
ある実施形態における微生物細胞は、藻類細胞である。例えば、藻類細胞は、以下のいずれに由来してもよい：緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）門（緑藻類）、紅藻植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）門（紅藻類）、褐藻植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）綱（褐藻類）、珪藻植物（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃａｅａｅ）綱（珪藻類）、および渦鞭毛虫（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）門（渦鞭毛虫類）。藻類細胞は、他の態様において、微細藻類（例えば、植物プランクトン、微細植物、またはプランクトン藻類）の細胞であっても大型藻類（ケルプ、海草）の細胞であってもよい。更なる例として、本明細書中で藻類細胞は、アマノリ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）属（アサクサノリ）、ダルス（Ｐａｌｍａｒｉａ）属種、例えばダルス（Ｐ．ｐａｌｍａｔａ）、アルトロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属種、例えばスピルリナ（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属（例えばクロレラ（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ））、ツノマタ（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ）属種、例えばトチャカ（Ｃ．ｃｒｉｓｐｕｓ）、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、ホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）属、コチャユヨ（Ｃｏｃｈａｙｕｙｏ）属、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばボツリオコッカス・ブラウニィ（Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉ））、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属（例えばドナリエラ・テルティオレクタ（Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ））、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属（例えばプレウロクリシス・カルテレ（Ｐ．ｃａｒｔｅｒａｅ））、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属（例えばフェオダクチルム・トリコルヌトゥム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、スティココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属（例えばテトラセルミス・スエシカ（Ｔ．ｓｕｅｃｉｃａ））、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属（例えばタラシオシラ・シュードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属（例えばクリプテコディニウム・コーニィ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属（例えばネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎ．ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ））、またはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のものであってよい。本明細書中で藻類種は、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ａｌｇａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＯＬＳＳ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  １、ｅｏｌｓｓ．ｎｅｔ／ｓａｍｐｌｅ−ｃｈａｐｔｅｒｓインターネットサイトにて入手可能）（この文献は参照によ��て本明細書に組み込まれる）に記載されるように培養され、かつ／または操作され得る。
【０１０９】
本明細書中の、５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む少なくとも１つのＲＧＥＮを含む非従来型酵母は、自然界に存在しない。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、そのような酵母は本来、存在しないと考えられる。というのも、本明細書中のＲＧＥＮは、例えば、原核生物中に存在することしか見出されなかったためである。また、酵母のある実施形態は、ｇＲＮＡを含むＲＮＡ構成要素を有するＲＧＥＮを含む（これは、ｃｒＲＮＡの、ｔｒａｃｒＲＮＡとの異種結合を表す）ことによって、本来存在しないと考えられる。
【０１１０】
本明細書中でＲＧＥＮは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質および少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む複合体を指す。適切なＣａｓタンパク質の例として、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のＣａｓエンドヌクレアーゼが挙げられる（Ｂｈａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：２７３−２９７（参照によって本明細書に組み込まれる））。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ３タンパク質またはＣａｓ４タンパク質であってよい。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ９タンパク質であってよい。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ１０タンパク質であってよい。好ましい実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質が用いられる。ある実施形態におけるＣａｓタンパク質は、細菌タンパク質または古細菌タンパク質であってよい。本明細書中でＩ〜ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は典型的に、起源が原核生物である；例えば、Ｉ型およびＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、細菌種または古細菌種に由来し得るが、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質（すなわちＣａｓ９）は、細菌種に由来し得る。他の実施形態において、適切なＣａｓタンパク質として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、またはそれらの修飾型の１つまたは複数が挙げられる。
【０１１１】
開示される本発明の他の態様において、本明細書中でＣａｓタンパク質は、以下の属のいずれに由来してもよい：アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）属、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノサルシーナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノピラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピクロフィルス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｒｘ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）属、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）属、サームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アザーカス（Ａｚａｒｃｕｓ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）属、デサルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、ジオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）属、マイクロコッカス（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、またはテルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属。これ以外にも、本明細書中のＣａｓタンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示される配列番号４６２〜４６５、４６７〜４７２、４７４〜４７７、４７９〜４８７、４８９〜４９２、４９４〜４９７、４９９〜５０３、５０５〜５０８、５１０〜５１６、または５１７〜５２１のいずれによってコードされてもよい。
【０１１２】
ある実施形態におけるＲＧＥＮは、Ｃａｓ９アミノ酸配列を含む。本明細書中でＣａｓ９タンパク質、および本明細書中で他のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属種（例えばリステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属種（例えばスピロプラズマ・アピス（Ｓ．ａｐｉｓ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓ．ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ））、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科種、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属種、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属種（例えばポルフィロモナス・カトニアエ（Ｐ．ｃａｔｏｎｉａｅ））、プレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属種（例えばプレボテラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属種、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属種（例えば、トレポネーマ・ソクランスキィ（Ｔ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属種、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属種（例えばフィネゴルディア・マグナ（Ｆ．ｍａｇｎａ））、コリオバクテリア（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科種（例えばＣ．バクテリウム（Ｃ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属種（例えばオルセネラ・プロフューザ（Ｏ．ｐｒｏｆｕｓａ））、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属種（例えば、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘモフィルス・ピットマニエ（Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ））、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属種（例えばパスツレラ・ベッティアエ（Ｐ．ｂｅｔｔｙａｅ））、オリビバクター（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えばオリビバクター・シティエンシス（Ｏ．ｓｉｔｉｅｎｓｉｓ））、エピリソニモナス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ）属種（例えばエピリソニモナス・テナックス（Ｅ．ｔｅｎａｘ））、メソニア（Ｍｅｓｏｎｉａ）属種（例えばメソニア・モビリス（Ｍ．ｍｏｂｉｌｉｓ））、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種（例えば乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ））、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種（例えばセレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））、アクイマリーナ（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ）属種（例えばアクイマリーナ・ムエレリ（Ａ．ｍｕｅｌｌｅｒｉ））、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えばクリセオバクテリウム・パルストレ（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｅ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属種（例えばバクテロイデス・グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属種（例えば髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属種（例えばフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、フラボバクテリウム・フリギダリウム（Ｆ．ｆｒｉｇｉｄａｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム・ソリ（Ｆ．ｓｏｌｉ））に由来してよい。本明細書中のある態様において、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９が好ましい。別の例として、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：７２６−７３７）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるＣａｓ９タンパク質のいずれであってもよい。
【０１１３】
したがって、本明細書中でＣａｓ９タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｇ３ＥＣＲ１（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＷＰ＿０２６７０９４２２、ＷＰ＿０２７２０２６５５、ＷＰ＿０２７３１８１７９、ＷＰ＿０２７３４７５０４、ＷＰ＿０２７３７６８１５、ＷＰ＿０２７４１４３０２、ＷＰ＿０２７８２１５８８、ＷＰ＿０２７８８６３１４、ＷＰ＿０２７９６３５８３、ＷＰ＿０２８１２３８４８、ＷＰ＿０２８２９８９３５、Ｑ０３ＪＩ６（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＥＧＰ６６７２３、ＥＧＳ３８９６９、ＥＧＶ０５０９２、ＥＨＩ６５５７８（ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ））、ＥＩＣ７５６１４（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ２２０２７（ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ））、ＥＩＪ６９７１１、ＥＪＰ２２３３１（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＪＰ２６００４（ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ＥＪＰ３０３２１、ＥＰＺ４４００１（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＰＺ４６０２８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８０４３（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８５４８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＲＬ１０５１１、ＥＲＬ１２３４５、ＥＲＬ１９０８８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５７８０７（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５９２５４（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＵ８５３０３（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＴＳ９６８０４、ＵＣ７５５２２、ＥＧＲ８７３１６（ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＥＧＳ３３７３２、ＥＧＶ０１４６８（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＨＪ５２０６３（ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ））、ＥＩＤ２６２０７（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ３３３６４、ＥＩＧ２７０１３（ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、ＥＪＦ３７４７６、ＥＪＯ１９１６６（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ３５ｂ）、ＥＪＵ１６０４９、ＥＪＵ３２４８１、ＹＰ＿００６２９８２４９、ＥＲＦ６１３０４、ＥＲＫ０４５４６、ＥＴＪ９５５６８（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＴＳ８９８７５、ＥＴＳ９０９６７（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＳＲ４）、ＥＴＳ９２４３９、ＥＵＢ２７８４４（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ２１）、ＡＦＪ０８６１６、ＥＵＣ８２７３５（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＣＭ６）、ＥＷＣ９２０８８、ＥＷＣ９４３９０、ＥＪＰ２５６９１、ＹＰ＿００８０２７０３８、ＹＰ＿００８８６８５７３、ＡＧＭ２６５２７、ＡＨＫ２２３９１、ＡＨＢ３６２７３、Ｑ９２７Ｐ４、Ｇ３ＥＣＲ１、またはＱ９９ＺＷ２（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））（これらは参照によって組み込まれる）に開示されるＣａｓ９アミノ酸配列のいずれを含んでもよい。これらのＣａｓ９タンパク質配列のいずれの変異体が用いられてもよいが、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた、特異的な結合活性を、そして場合によってはエンドヌクレオチド結合分解活性を有するべきである。そのような変異体は、基準Ｃａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。
【０１１４】
これ以外にも、本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示される、配列番号４６２（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４７４（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４８９（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９４（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９９（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、５０５（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、または５１８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））のいずれによってコードされてもよい。さらにこれ以外にも、本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１の残基１〜１３６８を含んでよい。さらにこれ以外にも、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。そのような変異体Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、そして場合によっては、切断またはニッキング活性を有するべきである。
【０１１５】
本明細書中で用いられるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の起源は、ＲＮＡ構成要素が由来する同じ種であってもよいし、異なる種であってもよい。例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に由来するＣａｓ９タンパク質を含むＲＧＥＮは、同じ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種に由来する配列（例えば、ｃｒＲＮＡ反復配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を有する少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と複合化されてよい。これ以外にも、本明細書中で用いられるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の起源は、ＲＮＡ構成要素が由来するのとは異なる種であってよい（Ｃａｓタンパク質およびＲＮＡ構成要素は、互いに異種起源であってよい）；そのような異種起源のＣａｓ／ＲＮＡ構成要素ＲＧＥＮは、ＤＮＡターゲティング活性を有するはずである。
【０１１６】
特定の標的ＤＮＡ配列に向けた、本明細書中のＣａｓタンパク質の結合活性および／またはエンドヌクレオチド結合分解活性の判定は、例えば米国特許第８６９７３５９号明細書（この文献は参照によって本明細書に開示される）に開示されるような、当該技術分野において知られているあらゆる適切なアッセイによって評価されてよい。判定は、例えば、非従来型酵母中でＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を発現させてから、ｉｎｄｅｌの存在が予測されるＤＮＡ標的部位を調査することによってなされてよい（Ｃａｓタンパク質は、この特定のアッセイにおいて、完全なエンドヌクレオチド結合分解活性［二本鎖切断活性］を有することになる）。予測される標的部位でのｉｎｄｅｌの存在についての調査は、例えば、ＤＮＡ配列決定法を介して、または標的配列の機能の欠如についてアッセイすることによりｉｎｄｅｌ形成を推測することによって、なされ得る。別の例において、Ｃａｓタンパク質活性は、標的部位中の配列、またはその近くの配列に相同である配列を含むドナーＤＮＡが提供された非従来型酵母において、Ｃａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を発現させることによって判定され得る。標的部位でのドナーＤＮＡ配列の存在（例えば、ドナーと標的配列との首尾良いＨＲによって予測されるであろう）により、ターゲティングが起こったことが示されることになる。
【０１１７】
本明細書中のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９は、典型的にはさらに、異種起源の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。本明細書中で異種起源のＮＬＳアミノ酸配列は、例えば、本明細書中の酵母細胞の核内でのＣａｓタンパク質の蓄積を検出可能な量で駆動するのに十分な強度のものであり得る。ＮＬＳは、塩基性の、正に帯電する残基（例えば、リジンおよび／またはアルギニン）の１つ（一分節）または複数（例えば、二分節）の短い配列（例えば、２〜２０残基）を含んでよく、そして、タンパク質表面上に曝されるのであれば、Ｃａｓアミノ酸配列中のどこに位置決めされてもよい。ＮＬＳは、例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端に機能可能なように結合してよい。例えば、２つ以上のＮＬＳ配列が、Ｃａｓタンパク質に、例えばＣａｓタンパク質のＮ末端およびＣ末端に結合してよい。本明細書中の適切なＮＬＳ配列の非限定的な例として、米国特許第６６６０８３０号明細書および米国特許第７３０９５７６号明細書（例えば、その中でも表１）に開示されるものが挙げられる（これらの文献は双方とも参照によって本明細書に組み込まれる）。本明細書中の有用なＮＬＳの別の例として、配列番号１１のアミノ酸残基１３７３〜１３７９が挙げられる。
【０１１８】
ある実施形態において、Ｃａｓタンパク質、およびその、Ｃａｓタンパク質によるＤＮＡ特異的ターゲティングを導く各ＲＮＡ構成要素（例えばｃｒＲＮＡ）は、開示される非従来型酵母と異種起源である。当該ＲＧＥＮ構成要素の異種起源の本質は、Ｃａｓタンパク質およびその各ＲＮＡ構成要素が、原核生物（細菌および古細菌）中に存在することしか知られていないという事実によるものである。
【０１１９】
本明細書中のＣａｓタンパク質は、場合によっては、酵母細胞での発現のためにコドン最適化されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を用いて、非従来酵母細胞中で発現されてよい。「コドン最適化された」配列は、本明細書中で、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されたコドン使用頻度を有するＯＲＦである。酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が非従来型酵母細胞である態様において、ＯＲＦのコドン最適化は、米国特許第７１２５６７２号明細書（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に提供されるような酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン使用頻度プロフィールに従って実行されてよい。
【０１２０】
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数の異種起源のタンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に加えて１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。そのような融合タンパク質は、あらゆる付加的なタンパク質配列を、そして場合によっては任意の２つのドメイン間に、例えばＣａｓと第１の異種起源のドメインとの間にリンカー配列を含んでよい。本明細書中でＣａｓタンパク質に融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定されないが、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザヘマグルチニン［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、チオレドキシン［Ｔｒｘ］）、リポータ（例えば、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］）、および以下の活性の１つまたは複数を有するドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６またはＶＰ６４）、転写抑制活性、転写終止因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性。他の実施形態におけるＣａｓタンパク質は、ＤＮＡ分子または他の分子、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン、および単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６と結合するタンパク質と融合し得る。本明細書中でＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質の一部であってよい付加的なドメインが、米国特許出願公開第２０１１／００５９５０２号明細書に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。Ｃａｓタンパク質が異種起源のタンパク質（例えば転写因子）に融合する実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、（本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素と複合した場合に）ＤＮＡ認識および結合活性を有するが、ＤＮＡニッキング活性も切断活性も有していない。
【０１２１】
本明細書中のＲＧＥＮは、ＤＮＡ標的配列のＤＮＡ鎖に結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができる。ある実施形態において、ＲＧＥＮは、ＤＮＡ標的配列の一方の鎖または双方の鎖を切断することができる。ＲＧＥＮは、例えば、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができる。
【０１２２】
ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができる本明細書中のＲＧＥＮは典型的に、エンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型エンドヌクレアーゼドメインまたはその変異体）を含む。ゆえに、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書中に開示されるＣａｓ９タンパク質）またはその変異体が、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＲＧＥＮの適切な例である。機能的なＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインを含むＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＣａｓタンパク質の例である。本明細書中でＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＲＧＥＮは典型的に、カット部位にて平滑末端（すなわち、ヌクレオチド突出部がない）が形成されるように、双方の鎖を同じ位置にてカットする。
【０１２３】
ＤＮＡ標的配列の一本鎖を切断することができる本明細書中のＲＧＥＮは、本明細書中で、ニッカーゼ活性（例えば、部分的切断能力）を有すると特徴付けられ得る。本明細書中でＣａｓニッカーゼ（例えばＣａｓ９ニッカーゼ）は典型的に、ＣａｓがＤＮＡ標的配列の一本鎖のみを切断する（すなわち、ニックを入れる）ことを可能にする一機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）突然変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および（ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば野生型ＨＮＨドメイン）を含んでよい。別の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば野生型ＲｕｖＣドメイン）、および（ｉｉ）突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインを含んでよい。
【０１２４】
本明細書中での使用に適したＣａｓ９ニッカーゼの非限定的な例が、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６）、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１），Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：９２７５−９２８２）、および米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号明細書に開示されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、Ａｓｐ−３１置換（例えば、Ａｓｐ−３１−Ａｌａ）（突然変異したＲｕｖＣドメインの例）、またはＨｉｓ−８６５置換（例えばＨｉｓ−８６５−Ａｌａ）、Ａｓｎ−８８２置換（例えばＡｓｎ−８８２−Ａｌａ）、もしくはＡｓｎ−８９１置換（例えばＡｓｎ−８９１−Ａｌａ）（突然変異したＨＮＨドメインの例）を有するサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９を含んでよい。また例えば、本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、Ａｓｐ−１０置換（例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ）、Ｇｌｕ−７６２置換（例えばＧｌｕ−７６２−Ａｌａ）、もしくはＡｓｐ−９８６置換（例えばＡｓｐ−９８６−Ａｌａ）（突然変異したＲｕｖＣドメインの例）、またはＨｉｓ−８４０置換（例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａ）、Ａｓｎ−８５４置換（例えば、Ａｓｎ−８５４−Ａｌａ）、もしくはＡｓｎ−８６３置換（例えばＡｓｎ−８６３−Ａｌａ）（突然変異したＨＮＨドメインの例）を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含んでよい。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に関して、３つのＲｕｖＣサブドメインは概して、アミノ酸残基１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８にそれぞれ位置決めされ、ＨＮＨドメインは、アミノ酸残基７７５〜９０８に位置決めされる（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５６：９３５−９４９）。
【０１２５】
本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、開示される本発明の非従来型酵母において、種々の目的で用いられ得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、適切なドナーポリヌクレオチドとの、ＤＮＡ標的部位配列での、またはその近くでのＨＲを誘発するのに用いられてよい。ニックが入ったＤＮＡは、ＮＨＥＪプロセス用の担体ではなく、ＨＲプロセスによって認識されるので、特定の標的部位のニッキングＤＮＡにより、部位は、適切なドナーポリヌクレオチドとのＨＲをより受け入れ易くなるはずである。
【０１２６】
別の例として、一対のＣａｓ９ニッカーゼが、ＤＮＡターゲティングの特異度を高めるのに用いられてよい。一般にこれは、２つのＣａｓ９ニッカーゼを与えることによってなされ得、これらが、ガイド配列が様々なＲＮＡ構成要素との関連により、所望のターゲティング領域における反対側の鎖のＤＮＡ配列近くを標的とし、かつそこにニックを入れる。各ＤＮＡ鎖のそのような近くでの切断により、ＤＳＢ（すなわち、一本鎖突出部を有するＤＳＢ）が生じ、これはその後、ＮＨＥＪ（ｉｎｄｅｌ形成の原因となる）またはＨＲ（提供されるならば、適切なドナーポリヌクレオチドとの組換えの原因となる）用の担体として認識される。これらの実施形態における各ニックは、例えば、互いと少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００（または５から１００までのあらゆる整数）塩基離れてよい。先に記載されるように、本明細書中で１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼタンパク質が、Ｃａｓ９ニッカーゼ対に用いられてよい。例えば、突然変異したＲｕｖＣドメインを有するが、機能するＨＮＨドメインのないＣａｓ９ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）が用いられてよい（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）。各Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）は、各ニッカーゼをそれぞれの特定のＤＮＡ部位に標的として向けるガイドＲＮＡ配列を有する本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素を用いることによって、互いに近い（最大で１００塩基対離れている）特定のＤＮＡ部位に導かれることになる。
【０１２７】
ある実施形態におけるＲＧＥＮは、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列にていかなる鎖も切断しない。そのようなＲＧＥＮは、全ヌクレアーゼドメインが、突然変異した、機能不全であるＣａｓタンパク質を含んでよい。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列にていかなる鎖も切断しない本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、突然変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインの双方を含んでよい。そのようなＣａｓ９タンパク質の非限定的な例は、先に開示されるＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン突然変異およびＨＮＨヌクレアーゼドメイン突然変異（例えば、Ａｓｐ−１０置換、例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ、およびＨｉｓ−８４０置換、例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａを有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）のいずれかを含む。標的ＤＮＡ配列に結合するがこれを切断しない本明細書中のＣａｓタンパク質は、遺伝子発現を調整するために用いられてよく、例えば、その場合には、Ｃａｓタンパク質は、転写因子（またはその一部）（例えば、リプレッサまたは活性化因子、例えば本明細書中で開示されるもののいずれか）と融合し得る。例えば、Ａｓｐ−１０置換（例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ）およびＨｉｓ−８４０置換（例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａ）を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むＣａｓ９は、ＶＰ１６転写活性化因子ドメインまたはＶＰ６４転写活性化因子ドメインに融合し得る。そのようなＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素に用いられるガイド配列は、例えば、遺伝子プロモータまたは他の調節要素（例えばイントロン）中のＤＮＡ配列と相補的であることになる。
【０１２８】
ある態様における酵母は、（ｉ）ＤＮＡ標的配列の一方のＤＮＡ鎖または双方のＤＮＡ鎖を切断することができるＲＧＥＮ、および（ｉｉ）ＤＮＡ標的部位配列（本明細書中のＣａｓタンパク質によって特異的に標的とされる配列）の配列、またはその近くの配列に相同である少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドを含んでよい。適切なドナーポリヌクレオチドは、標的部位がＳＳＢまたはＤＳＢを含有するならば（例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質を用いて導入され得る）、ＤＮＡ標的部位の配列、またはその近くの配列とのＨＲに曝され得る。本明細書中のドナーポリヌクレオチド内の「相同配列」は、例えば、標的部位配列の配列、もしくはその近くの配列と１００％の同一性を、または標的部位配列の配列、もしくはその近くの配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、少なくとも約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００ヌクレオチド、または約５０〜５００、５０〜５５０、５０〜６００、５０〜６５０、もしくは５０〜７００ヌクレオチドの配列を含んでよく、またはこれからなってよい。
【０１２９】
本明細書中のドナーポリヌクレオチドは、例えば、標的部位配列の配列、またはその近くの配列に非相同である配列によって分離される、２つの相同配列（相同アーム）を有してよい。そのようなドナーポリヌクレオチドと標的部位配列とのＨＲにより、典型的には、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列との、標的部位の配列の置換が生じる（ドナーポリヌクレオチドの相同アームに相同である標的部位配列間に位置決めされる標的部位配列は、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列によって置換される）。２本の相同アームを有するドナーポリヌクレオチドにおいて、アームは、例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、または３００００ヌクレオチドによって分離されてよい（すなわち、ドナーポリヌクレオチド中の非相同配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、または３００００ヌクレオチド長である）。各相同アームの長さ（例えば、相同配列について先に開示される長さのいずれか）は、同じであっても異なってもよい。標的部位の各相同配列、またはその近くの各相同配列との各アームのパーセント同一性（例えば、相同配列について先に開示される％同一性のいずれか）は、同じであっても異なってもよい。
【０１３０】
ドナーポリヌクレオチド中の対応する相同配列に相同である標的部位配列のＤＮＡ配列、またはその近くの（代わりに、その場所にある、またはそれに近接する）ＤＮＡ配列は、例えば、標的配列中の予測されるＣａｓタンパク質カット部位（ＤＳＢまたはニック）から、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、または６００００（または１から６００００までのあらゆる整数）ヌクレオチド（例えば、約１〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００、１〜５００、または１００〜５００ヌクレオチド）以内にあってよい。これらのヌクレオチド距離は、カット部位から上流方向に、または下流方向に進む、カット部位から相同配列の第１のヌクレオチドまでで評価されてよい。例えば、ドナーポリヌクレオチド中の対応する配列に相同である標的配列近くの配列は、標的配列中の予測されるＣａｓタンパク質カット部位の下流５００ヌクレオチド塩基対から開始してよい。本明細書中で２本の相同アーム（例えば、非相同配列によって分離される第１および第２の相同アーム）を有するドナーポリヌクレオチドを利用する実施形態において、相同配列（相同性においてドナーの第１の相同アームと対応する）は、例えば、予測されるＣａｓカット部位の上流にあってよく、相同配列（相同性においてドナーの第２の相同アームと対応する）は、予測されるＣａｓカット部位の下流にあってよい。これらの上流の相同配列および下流の相同配列のそれぞれの、予測されるカット部位からのヌクレオチド距離は、同じであっても異なってもよく、例えば、先に開示されるヌクレオチド距離のいずれであってもよい。例えば、相同配列（相同性においてドナーの第１の相同アームと対応する）の３’末端は、予測されるＣａｓカット部位の上流６００ヌクレオチド塩基対に位置決めされてよく、相同配列（相同性においてドナーの第２の相同アームと対応する）の５’末端は、予測されるＣａｓカット部位の下流４００ヌクレオチド塩基対に位置決めされてよい。
【０１３１】
本明細書中のＲＧＥＮは、非従来型酵母の染色体、エピソーム、またはゲノム中の他のあらゆるＤＮＡ分子における標的部位配列のＤＮＡ鎖に結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができる。標的配列のこの認識および結合は、ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素が、標的配列の鎖と相補的である配列（ガイド配列）を含むならば、特異的である。ある実施形態における標的部位は、固有であってよい（すなわち、対象ゲノム中に標的部位配列が１つ存在する）。
【０１３２】
本明細書中で標的配列の長さは、例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド；１３から３０ヌクレオチド；１７から２５ヌクレオチド；または１７から２０ヌクレオチドであってよい。この長さは、ＰＡＭ配列を含んでも除いてもよい。また、本明細書中で標的配列の鎖は、ガイド配列とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体の、標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な、（ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの）ガイド配列との相補性を有する（適切なＰＡＭが標的配列に隣接する場合、以下参照）。ガイド配列と、その対応するＤＮＡ標的配列の鎖との相補性の程度は、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。本明細書中で標的部位は、例えば、遺伝子産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）をコードする配列中に位置決めされてもよいし、非コード配列（例えば、調節配列または「ジャンク」配列）中に位置決めされてもよい。
【０１３３】
ＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列が、標的部位配列に隣接してよい。ＰＡＭ配列は、本明細書中のＲＧＥＮによって認識される短いＤＮＡ配列である。関連するＰＡＭ、およびＤＮＡ標的配列の最初の１１のヌクレオチドは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡターゲティングおよび切断にとっておそらく重要である（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：２３３−２３９）。本明細書中でＰＡＭ配列の長さは、用いられるＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体に応じて変動し得るが、典型的には、例えば、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド長である。ＰＡＭ配列は、例えば、標的部位中で、ＲＮＡ構成要素のガイド配列と相補的である鎖と相補的である標的部位配列から直ぐ下流にあり、またはその下流２または３ヌクレオチド以内にある。ＲＧＥＮが、ＲＮＡ構成要素と複合化した、エンドヌクレオチド結合分解活性のあるＣａｓ９タンパク質である本明細書中の実施形態において、Ｃａｓ９は、ＲＮＡ構成要素によって導かれて標的配列に結合し、ＰＡＭ配列の上流にある第３のヌクレオチド位置の直ぐ５’側の双方の鎖を切断する。標的部位の以下の例を考える：ＰＡＭ配列：
【化１】
2017522897.tif 000012
Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよく、Ｘは、この例の配列において、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよい（Ｘは、ＮＰＡＭと呼ぶこともできる）。ＰＡＭ配列は、この例において、ＸＧＧである（下線が引かれている）。適切なＣａｓ９／ＲＮＡ構成要素複合体は、この標的を、二重下線が引かれたＮの直ぐ５’側で切断することになる。配列番号４６におけるＮのストリングは、例えば、本明細書中のＲＮＡ構成要素中のガイド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の標的配列を表す（ＤＮＡ標的配列のどのＴも、ＲＮＡガイド配列の全てのＵとアラインすることになる）。Ｃａｓ９複合体のＲＮＡ構成要素のガイド配列は、この標的配列（本明細書中の標的部位を代表する）での認識および結合の際に、Ｎのストリングの相補体配列とアニールすることになる；ガイド配列と標的部位相補体とのパーセント相補性は、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。Ｃａｓ９ニッカーゼがゲノム中の配列番号４６を標的とするのに用いられる場合、ニッカーゼは、ニッカーゼ中のどのエンドヌクレアーゼドメインが機能不全であるかに応じて、相補鎖の、二重下線が引かれたＮの直ぐ５’側、または同じ位置にニックを入れることになる。核酸分解活性を有していないＣａｓ９（ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの双方が機能不全）がゲノム中の配列番号４６を標的とするのに用いられる場合、標的配列を認識してこれに結合することになるが、配列にいかなるカットも入れることはない。
【０１３４】
本明細書中でＰＡＭは典型的に、利用されることになるＲＧＥＮのタイプを考慮して選択される。本明細書中でＰＡＭ配列は、Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓが由来し得る、本明細書中に開示されるあらゆる種に由来する、例えばＣａｓ９を含むＲＧＥＮによって認識されるものであってよい。ある実施形態において、ＰＡＭ配列は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、またはフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）に由来するＣａｓ９を含むＲＧＥＮによって認識されるものであってよい。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する適切なＣａｓ９は、ＮＧＧのＰＡＭ配列（配列番号４７；Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよい）を有するゲノム配列を標的とするのに用いられ得る。他の例として、以下のＰＡＭ配列を有するＤＮＡ配列を標的とする場合、適切なＣａｓ９が、以下の種のいずれかに由来してよい：サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＮＡＧＡＡ［配列番号４８］）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（ＮＧＧ［配列番号４７］）、ＮＮＡＧＡＡＷ［配列番号４９、Ｗは、ＡまたはＴである］、ＮＧＧＮＧ［配列番号５０］）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＮＮＮＧＡＴＴ［配列番号５１］）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（ＮＡＡＡＡＣ［配列番号５２］）、またはフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）（ＮＧ［配列番号５３］）（これらの特定の全ＰＡＭ配列中のＮは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧである）。本明細書中の有用なＣａｓ９／ＰＡＭの他の例として、Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：８９１−８９９）およびＥｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：１１１６−１１２１）に開示されるものが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中の標的配列の例は、配列番号４６に従うが、「ＸＧＧ」ＰＡＭは、前述のＰＡＭのいずれか１つによって置換されている。
【０１３５】
５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素が、本明細書中の実施形態におけるＲＧＥＮに含まれる。このキャップ離脱ＲＮＡ構成要素は、非従来型酵母中の染色体またはエピソームにおける標的部位配列と相補的な配列を含む。ＲＧＥＮは特異的に、この配列相補体に基づいて標的部位のＤＮＡ鎖に結合し、そして場合によってはこれを切断する。ゆえに、開示される本発明の実施形態におけるＲＮＡ構成要素の相補配列はまた、ガイド配列または可変ターゲティングドメインと呼ぶこともできる。
【０１３６】
本明細書中のＲＮＡ構成要素のガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ）は、例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０リボヌクレオチド長；１３〜３０リボヌクレオチド長；１７〜２５リボヌクレオチド長；または１７〜２０リボヌクレオチド長であってよい。一般に、本明細書中のガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体の、標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な、標的ＤＮＡ配列の鎖との相補性を有する（適切なＰＡＭが標的配列に隣接する場合）。例えば、ガイド配列と、その対応するＤＮＡ標的配列との相補性の程度は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。ガイド配列は、酵母細胞中のＤＮＡ標的配列にＲＧＥＮを標的として向けるように、然るべく操作されてよい。
【０１３７】
本明細書中のＲＮＡ構成要素は、例えば、ガイド配列およびリピート（ｔｒａｃｒＲＮＡメイト）配列を含むｃｒＲＮＡを含んでよい。ガイド配列は典型的に、ｃｒＲＮＡの５’末端に、またはその近く（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基以内）に位置決めされる。ｃｒＲＮＡのガイド配列の下流には、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の配列と相補的であり、かつこれとハイブリダイズすることができる「リピート」配列または「ｔｒａｃｒＲＮＡメイト」配列がある。ガイド配列およびｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列は、直接隣接してもよいし、例えば、１、２、３、４、またはそれ以上の塩基によって分離されてもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列は、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に対する配列相補性が、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。一般に、相補性の程度は、２つの配列のうちのより短い方の全長に沿う、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の最適アラインメントに関するものであってよい。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列の長さは、例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８リボヌクレオチド長であってよく、そしてｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の同じ、または類似した長さ（例えば、プラスマイナス１、２、３、４、または５塩基）の配列とハイブリダイズする。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列の適切な例が、配列番号５４（ｇｕｕｕｕｕｇｕａｃｕｃｕｃａａｇａｕｕｕａ）、配列番号５５（ｇｕｕｕｕｕｇｕａｃｕｃｕｃａ）、配列番号５６（ｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａ、実施例参照）、もしくは配列番号５７（ｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇ）、またはその変異体を含み、これらは、（ｉ）少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、かつ（ｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端配列とアニールすることができる。本明細書中のｃｒＲＮＡの長さは、例えば、少なくとも約１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、もしくは４８リボヌクレオチド；約１８〜４８リボヌクレオチド；または約２５〜５０リボヌクレオチドであってよい。
【０１３８】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓ９タンパク質がＲＧＥＮ中に含まれる実施形態において、ｃｒＲＮＡと共に含まれるべきである。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、（ｉ）ｃｒＲＮＡのリピート領域（ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列）とアニールする配列、および（ｉｉ）ステムループ含有部分を含む。（ｉ）の配列の長さは、例えば、先に開示されるｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列長のいずれかと同じであってもよいし、類似（例えば、プラスマイナス１、２、３、４、または５塩基）であってもよい。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡ（すなわち、配列構成要素［ｉ］および［ｉｉ］）の全長は、例えば、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０（または３０から９０までのあらゆる整数）リボヌクレオチドであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡはさらに、３’末端に１、２、３、４、５、またはそれ以上のウラシル残基を含んでよく、これは、転写ターミネータ配列によるｔｒａｃｒＲＮＡの発現によって存在し得る。
【０１３９】
本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、Ｃａｓ９配列が由来してよい、先に記載されるいずれの細菌種に由来してもよい。適切なｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例として、米国特許第８６９７３５９号明細書、およびＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：７２６−７３７）に開示されるものが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中の好ましいｔｒａｃｒＲＮＡは、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種のｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に由来してよい。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡの他の適切な例は、以下を含んでよく：
配列番号５８：
ｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃ（実施例参照）、
配列番号５９：
ｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇ、または
配列番号６０：
ｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａ、
これらは化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｔｒａｃｒＲＮＡに由来する。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡの他の適切な例は、以下：
配列番号６１：
ｕａａａｕｃｕｕｇｃａｇａａｇｃｕａｃａａａｇａｕａａｇｇｃｕｕｃａｕｇｃｃｇａａａｕｃａａｃａｃｃｃｕｇｕｃａｕｕｕｕａｕｇｇｃａｇｇｇｕｇｕｕｕｕｃｇｕｕａｕｕｕａａ、
配列番号６２：
ｕｇｃａｇａａｇｃｕａｃａａａｇａｕａａｇｇｃｕｕｃａｕｇｃｃｇａａａｕｃａａｃａｃｃｃｕｇｕｃａｕｕｕｕａｕｇｇｃａｇｇｇｕｇｕｕｕｕｃｇｕｕａｕｕｕａ、または
配列番号６３：
ｕｇｃａｇａａｇｃｕａｃａａａｇａｕａａｇｇｃｕｕｃａｕｇｃｃｇａａａｕｃａａｃａｃｃｃｕｇｕｃａｕｕｕｕａｕｇｇｃａｇｇｇｕｇｕ、
を含んでよく、これらは、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｔｒａｃｒＲＮＡに由来する。
【０１４０】
本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡのさらに他の例は、これらのｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号の変異体であって、（ｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号と少なくとも約８０％、８５％、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有し、かつ（ｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡとして機能することができる変異体である（例えば、５’末端配列は、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列にアニールすることができ、５’末端配列から下流の配列は、１つまたは複数のヘアピンを形成することができ、変異体ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成することができる）。
【０１４１】
本明細書中に開示されるＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素は、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合する、またはこれに融合するｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含んでよい。ある好ましい実施形態におけるｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ構成要素は、ｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の上流にある（すなわち、例えばｇＲＮＡは、５’から３’の方向に、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合するｃｒＲＮＡを含む）。本明細書（例えば、先の実施形態）中に開示されるあらゆるｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ（および／またはその一部、例えば、ｃｒＲＮＡリピート配列、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列、またはｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端配列）は、例えば、ｇＲＮＡ中に含まれてよい。
【０１４２】
本明細書中のｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ構成要素のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の５’末端とアニールすることによって、ヘアピン構造を形成することができるべきである。（ｃｒＲＮＡ構成要素の）ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列と、（ｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の）５’末端配列との長さ、およびパーセント相補性に関する先の開示はいずれも、例えば、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ構成要素およびｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素を特徴付けることができる。このアニーリングを促進するために、ｃｒＲＮＡ構成要素およびｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の機能可能な結合または融合は好ましくは、適切なループ形成リボヌクレオチド配列を含む（すなわち、ループ形成配列が、ｃｒＲＮＡ構成要素およびｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素をまとめて結合して、ｇＲＮＡを形成し得る）。ＲＮＡループ形成配列の適切な例として、ＧＡＡＡ（配列番号４３、実施例参照）、ＣＡＡＡ（配列番号４４）、およびＡＡＡＧ（配列番号４５）が挙げられる。しかしながら、代わりのループ配列として、より長い、またはより短いループ配列が用いられてもよい。ループ配列は好ましくは、リボヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）を、そしてトリプレットのどちらかの末端に付加的なリボヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。
【０１４３】
本明細書中のｇＲＮＡは、その（ｃｒＲＮＡ構成要素の）ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列部分およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端配列部分のアニーリングにより、ヘアピン（「第１のヘアピン」）を形成する。１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４つ）の付加的なヘアピン構造が、ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の配列に応じて、この第１のヘアピンから下流に形成されてよい。したがって、ｇＲＮＡは、例えば、最大５つのヘアピン構造を有し得る。ｇＲＮＡはさらに、例えば、ｇＲＮＡ配列の末端に続く、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の残基を含んでよく、これは、転写ターミネータ配列によるｇＲＮＡの発現によって存在し得る。これらの付加的な残基は、例えば、ターミネータ配列の選択に応じて、全てがＵ残基であってもよいし、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がＵ残基であってもよい。
【０１４４】
開示される本発明に有用な、適切なｇＲＮＡの非限定的な例は、以下を含んでよい：
【化２】
2017522897.tif 000013
【０１４５】
配列番号６４〜７０のそれぞれにおいて、一重下線が引かれた配列は、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を表す。各「Ｎ」は、適切なガイド配列のリボヌクレオチド塩基（Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣ）を表す。小文字の第１のブロックは、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列を表す。小文字の第２のブロックは、ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を表す。二重下線が引かれた配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列とアニールして、第１のヘアピンを形成するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の部分に接近する。ループ配列（ＧＡＡＡ、配列番号４３）は大文字で示され、これは、各ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分およびｔｒａｃｒＲＮＡ部分と機能可能なように結合する。本明細書中のｇＲＮＡの他の例として、前述のｇＲＮＡの変異体であって、（ｉ）前述のｇＲＮＡの配列と少なくとも約８０％、８５％、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有し（この計算において、ガイド配列は除外する）、かつ（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質を特異的に標的として、標的ＤＮＡ配列と結合し、場合によってはこれにニックを入れ、またはこれを切断するｇＲＮＡとして機能し得る変異体が挙げられる。
【０１４６】
本明細書中のｇＲＮＡはまた、ガイド配列（ＶＴドメイン）に続いてＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインを有する観点から特徴付けられ得る。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列に続いてｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。本明細書中の有用なＣＥＲドメインの例として、先の配列番号６４〜７０に含まれるものが挙げられる（それぞれにおけるＣＥＲドメインは、ＶＴドメインのＮに続く配列である）。ＣＥＲドメインの別の適切な例が、配列番号１であり（実施例参照）、これは、５’から３’の方向に、配列番号５６のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列、配列番号４３のループ形成配列（ＧＡＡＡ）、および配列番号５８のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。
【０１４７】
開示される本発明のＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素は、５’キャップ（７−メチルグアニル酸［ｍ７Ｇ］キャップ）を有していない。ゆえに、本明細書中のＲＮＡ構成要素は、その５’末端に７メチルグアニル酸（ｍ７Ｇ）キャップを有していない。本明細書中のＲＮＡ構成要素の、５’キャップの代わりに、例えば、５’水酸基を有してよい。これ以外にも、本明細書中のＲＮＡ構成要素は、例えば、５’キャップの代わりに、５’リン酸を有してよい。ＲＮＡ構成要素は、転写後、核中により十分に蓄積し得ると考えられる。というのも、５’キャッピングされたＲＮＡ（すなわち、５’ｍ７Ｇキャップを有するＲＮＡ）は、核搬出を受けるからである。本明細書中のキャップ離脱ＲＮＡ構成要素の好ましい例として、適切なｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／またはｔｒａｃｒＲＮＡが挙げられる。ある実施形態において、本明細書中のＲＮＡ構成要素は、ＲＮＡ構成要素の前駆体の５’末端でのリボザイム配列によるＲＮＡ自動プロセシングによって、５’キャップを欠き、場合によっては、その代わりとして５’水酸基を有する（すなわち、ｇＲＮＡ等のＲＮＡ構成要素の上流にリボザイム配列を含む前駆体ＲＮＡは、リボザイム配列を除去するリボザイム媒介自動プロセシングを受けることによって、ＲＮＡ構成要素の下流は、５’キャップを欠いたままとなる）。ある他の実施形態において、本明細書中のＲＮＡ構成要素は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモータからの転写によって生じない。
【０１４８】
ある実施形態における酵母はさらに、（ｉ）プロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、ＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド配列を含む。このポリヌクレオチド配列は、酵母によって、Ｃａｓタンパク質と複合化してＲＧＥＮを形成するＲＮＡ構成要素を発現するために用いられる。そのようなポリヌクレオチド配列は、例えば、プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウィルス、または線状ＤＮＡ（例えば、線状ＰＣＲ産物）の形態であってもよいし、非従来型酵母細胞中にポリヌクレオチド配列を移すのに有用な他のタイプのあらゆるベクターまたは構築体であってもよい。本明細書中でこのポリヌクレオチド配列は、一時的に存在してもよいし（すなわち、ゲノム中に組み込まれない）、酵母細胞内に安定して存在してもよい（すなわち、ゲノム中に組み込まれる）。また、このポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の適切なマーカー配列（例えば、選択マーカーまたは表現型マーカー）を含んでもよいし、欠いていてもよい。
【０１４９】
ＲＮＡ構成要素発現用のポリヌクレオチド配列に含まれる適切なプロモータは、本明細書中で、非従来型酵母細胞において機能可能であり、そして例えば、構成的であっても誘導可能であってもよい。ある態様におけるプロモータは、強プロモータを含んでよく、これは、単位時間あたり比較的多数の生産開始を導くことができるプロモータであり、かつ／または、酵母を含む酵母における遺伝子の平均転写レベルよりも高い転写レベルを駆動するプロモータである。
【０１５０】
本明細書中で有用な強プロモータの例として、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０７９号明細書（ＤＧＡＴ２）、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０９３号明細書（ＥＬ１）、米国特許出願公開第２０１３／００８９９１０号明細書（ＡＬＫ２）、米国特許出願公開第２０１３／００８９９１１号明細書（ＳＰＳ１９）、米国特許出願公開第２００６／００１９２９７号明細書（ＧＰＤおよびＧＰＭ）、米国特許出願公開第２０１１／００５９４９６号明細書（ＧＰＤおよびＧＰＭ）、米国特許出願公開第２００５／０１３０２８０号明細書（ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ）、米国特許出願公開第２００６／００５７６９０号明細書（ＧＰＡＴ）、および米国特許出願公開第２０１０／００６８７８９号明細書（ＹＡＴ１）に開示されるものが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。適切な強プロモータの他の例として、表２に記載されるものが挙げられる。
【０１５１】
【表１０】
2017522897.tif 000014
【０１５２】
上に列挙される強プロモータは、酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来であるが、本明細書中に開示されるあらゆる非従来型酵母に由来する、その対応するプロモータ（例えば、相同体）は、例えば、強プロモータとして機能し得ると考えられる。ゆえに、強プロモータは、例えば、ＸＰＲ２、ＴＥＦ、ＧＰＤ、ＧＰＭ、ＧＰＤＩＮ、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ、ＧＰＡＴ、ＹＡＴ１、ＥＸＰ１、ＤＧＡＴ２、ＥＬ１、ＡＬＫ２、またはＳＰＳ１９プロモータを含んでよい。これ以外にも、前述のいずれかに対応するような強プロモータが、他のタイプの酵母（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））に由来し得る（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１５０８７１号明細書（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるあらゆる強プロモータ）。本明細書中で有用な強プロモータの他の例として、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＨＯ５、ＬＥＵ２、およびＧＡＬ１プロモータ、ならびにＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−２５１）に開示される強酵母プロモータが挙げられ、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中で有用な強プロモータのさらに別の例は、配列番号１２（ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ＦＢＡ１プロモータ配列）を含んでよい。
【０１５３】
本明細書中でプロモータは、ある実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモータを含んでよい。先に列挙した全ての強プロモータは、適切なＰｏｌ  ＩＩプロモータの例であると考えられる。Ｐｏｌ  ＩＩプロモータからの転写は、例えば、少なくとも約１２のタンパク質（例えば、ＲＰＢ１−ＲＰＮ１２タンパク質）のＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の形成を含んでよい。本明細書中でＰｏｌ  ＩＩプロモータから転写されるＲＮＡは典型的に、５’キャッピングされる（例えば、５’末端にｍ７Ｇ基を含有する）。本明細書中のＲＮＡ構成要素は５’キャップを有していないので、本明細書中でＰｏｌ  ＩＩプロモータから発現される場合、ＲＮＡ構成要素から５’キャップを除去する手段が利用されるべきである。本明細書中でＰｏｌ  ＩＩ転写ＲＮＡ構成要素から５’キャップを効果的に除去する適切な手段として、例えば、１つまたは複数のリボザイム（下記参照）、グループ１自己スプライシングイントロン、およびグループ２自己スプライシングイントロンの適切な使用が挙げられる。
【０１５４】
本明細書中の、ＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列はさらに、例えば、リボザイムをコードしてよく、これは、ＲＮＡ構成要素をコードする配列の上流にある。ゆえに、ある実施形態における酵母はさらに、（ｉ）プロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、５’から３’の方向にリボザイムおよびＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド配列を含む。そのようなポリヌクレオチド配列から発現される転写産物は自己触媒的に、リボザイム配列を除去して、５’キャップを有していないがＲＮＡ構成要素配列を含むＲＮＡを生成する。この「自動プロセシングされた」ＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを含んでよく、そしてＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９と複合化することよって、ＲＧＥＮを形成することができる。
【０１５５】
本明細書中のリボザイムは、例えば、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイム、デルタ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム、グループＩイントロンリボザイム、ＲｎａｓｅＰリボザイム、またはヘアピンリボザイムであってよい。本明細書中のリボザイムの他の非限定的な例として、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）リボザイム、グルコサミン−６−リン酸活性化リボザイム（ｇｌｍＳ）、およびＣＰＥＢ３リボザイムが挙げられる。Ｌｉｌｌｅｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１−６４６）は、リボザイムの構造および活性に関する情報を開示している。本明細書中で用いるのに適しているはずであるリボザイムの例として、ＥＰ０７０７６３８号明細書、ならびに米国特許第６０６３５６６号明細書、米国特許第５５８０９６７号明細書、米国特許第５６１６４５９号明細書および米国特許第５６８８６７０号明細書に開示されるリボザイムが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
ハンマーヘッドリボザイムは、ある好ましい実施形態において用いられる。このタイプのリボザイムは、例えば、Ｈａｍｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  １８：８７１−８８５）（この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるように、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムであってよい。ハンマーヘッドリボザイムをコードするＤＮＡを同定する複数の手段が、Ｈａｍｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．に開示されており、これらが本明細書中で然るべく利用され得る。本明細書中のハンマーヘッドリボザイムは、例えば、ウィルス、ウィロイド、植物ウィルスサテライトＲＮＡ、原核生物（例えば、古細菌、シアノバクテリア、アシドバクテリア）、または真核生物、例えば植物（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、カーネーション）、原生生物（例えば、アメーバ、ユーグレナ）、菌類（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、両生類（例えば、イモリ、カエル）、住血吸虫、昆虫（例えばコオロギ）、軟体動物、哺乳類（例えば、マウス、ヒト）、もしくは線虫に由来してよい。
【０１５７】
本明細書中のハンマーヘッドリボザイムは典型的に、３つの塩基対形成ヘリックスを含み、それぞれ、ヘリックスＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと呼ばれ、保存配列の短リンカーによって分離されている。ハンマーヘッドリボザイムの３つの型（Ｉ〜ＩＩＩ）は一般に、リボザイムの５’末端および３’末端がどのヘリックスに含まれるかに基づく。例えば、ハンマーヘッドリボザイム配列の５’末端および３’末端がステムＩに寄与するならば、Ｉ型ハンマーヘッドリボザイムと呼ぶことができる。３つの起こり得る位相型のうち、Ｉ型は、原核生物、真核生物、およびＲＮＡ植物病原体のゲノム中に見出され得るが、ＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムは、原核生物において記載されたのみであり、ＩＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムは殆どの場合、植物、植物病原体、および原核生物中に見出される。ある実施形態におけるハンマーヘッドリボザイムは、Ｉ型ハンマーヘッドリボザイムである。
【０１５８】
ある実施形態において、ハンマーヘッドリボザイムをコードする配列は、少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０（または、４０から１５０までのあらゆる整数）ヌクレオチド、４０〜１００ヌクレオチド、または４０〜６０ヌクレオチドを含んでよい。
【０１５９】
ハンマーヘッドリボザイムをコードする配列は、ＲＮＡ構成要素をコードする配列の上流にある。本明細書中のハンマーヘッドリボザイムをコードする配列は、例えば、ＲＮＡ構成要素のガイド配列（例えば、ガイド配列は、ｃｒＲＮＡのものであってもｇＲＮＡのものであってもよい）をコードする配列の直ぐ５’側であってもよいし、５’側の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドにあってもよい。ハンマーヘッドリボザイムの最初の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５リボヌクレオチドは典型的に、ハンマーヘッドリボザイム配列の直ぐ下流の配列の最初の同数のリボヌクレオチドにそれぞれ相補的であるべきである。例えば、本明細書中のポリヌクレオチド配列が、ＲＮＡ構成要素のガイド配列の直ぐ上流にハンマーヘッドリボザイムを含むＲＮＡをコードするならば、リボザイムの最初の６リボヌクレオチドは、例えば、ガイド配列の最初の６リボヌクレオチドと相補的であってよい。この例では、ハンマーヘッドリボザイムは、ガイド配列の第１の位置の直ぐ上流にあるＲＮＡ転写産物を切断することになる（または、別の言い方をすれば、ハンマーヘッドリボザイムは、リボザイム配列の直ぐ下流にあるＲＮＡ転写産物を切断することになる）。この論理は、他の前述の例となる実施形態に同様に当てはまる。例えば、本明細書中のポリヌクレオチド配列が、ＲＮＡ構成要素のガイド配列の８残基上流に（例えば、８残基スペーサ配列がある）ハンマーヘッドリボザイム配列を含むＲＮＡをコードするならば、リボザイムの最初の６リボヌクレオチドは、例えば、リボザイム配列の直ぐ３’側の６リボヌクレオチドと相補的であってよい。この例において、ハンマーヘッドリボザイムは、リボザイム配列の直ぐ下流にあるＲＮＡ転写産物を切断することになる。さらに別の例として、本明細書中のポリヌクレオチド配列が、ＲＮＡ構成要素のガイド配列の直ぐ上流にハンマーヘッドリボザイム配列を含むＲＮＡをコードするならば、リボザイムの最初の１０リボヌクレオチドは、例えば、ガイド配列の最初の１０リボヌクレオチドと相補的であってよい。この例において、ハンマーヘッドリボザイムは、ガイド配列の最初の位置の直ぐ上流にあるＲＮＡ転写産物を切断することになる（または、別の言い方をすれば、ハンマーヘッドリボザイムは、リボザイム配列の直ぐ下流にあるＲＮＡ転写産物を切断することになる）。
【０１６０】
ハンマーヘッドリボザイム配列の例が、以下のように示され得る：
【化３】
2017522897.tif 000015
配列番号１５の最初の６残基は、本明細書中のＤＮＡポリヌクレオチドから発現されるＲＮＡ転写産物中の配列番号１５の直ぐ後ろに、（例えば、本明細書中に開示されるｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡのガイド配列の）最初の６残基と相補的である（とアニールする）ように設計されてよい。リボザイムは、配列番号１５の直ぐ後ろにある転写産物を切断することになる。配列番号１５は、配列番号１５の直ぐ後ろの配列残基とアニールする６残基（「Ｎ」）と共に示されているが、この目的のために、このリボザイムの始まりに５〜１５「Ｎ」残基が存在してよい。なお、配列番号１５を含むＲＮＡ転写産物により、（ｉ）ハンマーヘッドリボザイムのヘリックスＩが、転写産物におけるＮ残基の、配列番号１５の直ぐ後ろの最初の６残基とのアニーリングによって形成されることになり、（ｉｉ）ヘリックスＩＩが、一重下線により示される相補配列のアニーリングによって形成されることになり、そして（ｉｉｉ）ヘリックスＩＩＩが、二重下線により示される相補配列のアニーリングによって形成されることになる。ゆえに、ある実施形態におけるハンマーヘッドリボザイムは、（ｉ）配列番号１５と少なくとも約８０％、８５％、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有し（この計算において、「Ｎ」配列は除外する）、かつ（ｉｉ）互いにアニールしてヘリックスＩＩおよびヘリックスＩＩＩを形成する（ヘリックスＩは、「Ｎ」残基の適切な選択によって形成される）、配列番号１５の一重下線領域および二重下線領域とアラインする領域を有する、配列番号１５の変異体であってよい。
【０１６１】
配列番号１５、およびその（上記の）種々の実施形態に結合し得る配列の例として、配列番号６４〜７０の１つを含むｇＲＮＡが挙げられる。
【０１６２】
本明細書中の、ＲＮＡ構成要素に結合する５’ハンマーヘッドリボザイムを含むＲＮＡ配列（本明細書の「リボザイム−ＲＮＡ構成要素カセット」）をコードするＤＮＡポリヌクレオチドは、ハンマーヘッドリボザイム配列の５’末端の直ぐから始まる転写産物の転写を駆動するように設計されてよい（すなわち、リボザイム配列は、転写開始点から始まる）。これ以外にも、ＤＮＡポリヌクレオチドは、リボザイム−ＲＮＡ構成要素カセットから上流に非リボザイム配列を有する転写産物の転写を駆動するように設計されてもよい。そのような５’非リボザイム転写産物の配列は、例えば、数ヌクレオチド（１〜１０）長しかなくてもよいし、最大５０００〜２００００ヌクレオチド長もあってもよい（リボザイムのこの５’側配列は、リボザイムがそれ自体をＲＮＡ構成要素から切断するときに、ＲＮＡ構成要素から除去される）。
【０１６３】
ある実施形態において、リボザイム−ＲＮＡ構成要素カセットを含むＤＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡ構成要素配列の下流に、適切な転写終止配列を含んでよい。本明細書中で有用な転写終止配列の例が、米国特許出願公開第２０１４／０１８６９０６号明細書に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ４遺伝子転写ターミネータ配列（例えば、配列番号８）が用いられてよい。そのような実施形態は典型的に、リボザイム−ＲＮＡ構成要素カセットから下流に位置決めされるリボザイム配列を含まない。また、そのような実施形態は典型的に、ターミネータ配列の選択に応じて、ＲＮＡ構成要素配列の末端の後ろに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の残基を含む。これらの付加的な残基は、例えば、ターミネータ配列の選択に応じて、全てＵ残基であってもよいし、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がＵ残基であってもよい。これ以外にも、リボザイム配列（例えば、ハンマーヘッドまたはＨＤＶリボザイム）は、ＲＮＡ構成要素配列の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド）３’側にあってよい；そのような実施形態におけるＲＮＡ構成要素配列は、上流リボザイムおよび下流リボザイムがフランキングする。３’リボザイム配列は、それ自体をＲＮＡ構成要素配列から切断するように然るべく位置が定められ得る；そのような切断により、転写産物は、例えば、ＲＮＡ構成要素配列の末端にて正確に終止し、または、ＲＮＡ構成要素配列の末端の後ろに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくはそれ以上の残基が続くことになる。
【０１６４】
ある実施形態において、ＤＮＡポリヌクレオチドは、（ｉ）プロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、複数のリボザイム−ＲＮＡ構成要素カセット（すなわち、タンデム型カセット）を含む配列を含んでよい。そのようなＤＮＡポリヌクレオチドから発現される転写産物は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のリボザイム−ＲＮＡ構成要素カセットを有してよい。３’リボザイム配列は、場合によっては、各ＲＮＡ構成要素配列の後ろに（例えば、上記のように）含まれて、下流転写産物配列からのＲＮＡ構成要素の切断および分離が可能となる。そのような実施形態における各ＲＮＡ構成要素は典型的に、固有のＤＮＡ標的部位に本明細書中のＲＧＥＮを誘導するように設計される。ゆえに、そのようなＤＮＡポリヌクレオチドは、例えば、複数の異なる標的部位を同時に標的とするように、非従来型酵母において然るべく用いられ得る；そのような使用は場合によっては、多重法と特徴付けられ得る。３’リボザイムに結合するＲＮＡ構成要素に結合する５’ハンマーヘッドリボザイムは、本明細書中で「リボザイム−ＲＮＡ構成要素−リボザイムカセット」と呼ぶことができる。タンデム型リボザイム−ＲＮＡ構成要素−リボザイムカセットを含む転写産物を発現するための本明細書中のＤＮＡポリヌクレオチドは、各カセット間に約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のヌクレオチド（例えば、非コードスペーサ配列）が存在するように設計されてよい。各カセットの間の距離は、同じであっても異なってもよい。
【０１６５】
たとえ上記の一部の実施形態が、ハンマーヘッドリボザイム配列に関して記載されなかったとしても、そのような実施形態はまた、本明細書中で、ハンマーヘッドリボザイム配列の代わりに、他のあらゆるリボザイム配列（例えば、ＨＤＶリボザイム）に関して、然るべく特徴付けられ得る。当業者であれば、特定の部位にて切断するように、そのような他のリボザイム配列を配置する方法を理解するであろう。
【０１６６】
ある実施形態における酵母はさらに、（ｉ）プロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド配列を含む。このポリヌクレオチド配列は、酵母によって用いられて、ＲＧＥＮを形成するようにＲＮＡ構成要素と複合化するＣａｓタンパク質を発現する。そのようなポリヌクレオチド配列は、例えば、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、ファージミド、ＢＡＣ、ウィルス、または線状ＤＮＡ（例えば、線状ＰＣＲ産物）の形態であってもよいし、ポリヌクレオチド配列を非従来型酵母細胞中に移すのに有用な他のあらゆるタイプのベクターまたは構築体であってもよい。例えば、本明細書中に開示されるあらゆるＰｏｌ  ＩＩプロモータが用いられてよい。ＲＮＡ構成要素を発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列に関して先に開示されるいずれの特徴も、Ｃａｓタンパク質を発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列に然るべく当てはまり得る。このポリヌクレオチド配列は、本明細書中で、酵母細胞中に一時的に存在してもよいし（すなわち、ゲノム中に組み込まれない）、安定して存在してもよい（すなわち、ゲノム中に組み込まれる）。他の態様における酵母は、Ｃａｓタンパク質を発現するＤＮＡポリヌクレオチドに加えて、ＲＮＡ構成要素（例えば、先に記載される）を発現するＤＮＡポリヌクレオチドを有してよい。これらのＤＮＡポリヌクレオチドは双方とも、酵母に対して安定していてもよいし、一時的であってもよい；これ以外にも、Ｃａｓタンパク質を発現するＤＮＡポリヌクレオチドは安定してよく、かつＲＮＡ構成要素を発現するＤＮＡポリヌクレオチドは一時的であってよい（またはその反対）。
【０１６７】
ＤＮＡポリヌクレオチド配列は代わりに、酵母細胞中にＲＧＥＮを提供するためにＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素の双方を発現させるものであってよい。そのようなＤＮＡポリヌクレオチドは、例えば、（ｉ）（ＲＧＥＮの）ＲＮＡ構成要素（ＲＮＡ構成要素カセット）をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように結合するプロモータ、および（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）（Ｃａｓカセット）をコードするヌクレオチド配列に機能可能なように結合するプロモータを含んでよい。Ｃａｓタンパク質またはＲＮＡ構成要素を発現するＤＮＡポリヌクレオチドに関する、先に記載されるあらゆる特徴は、例えば、非従来型酵母細胞においてＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素の双方を発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列に当てはまり得る。また、本明細書中に開示されるＣａｓタンパク質およびＲＮＡ構成要素（例えば、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ）はいずれも、このＤＮＡポリヌクレオチド配列から発現され得る。１つまたは複数のＲＮＡ構成要素および／またはＣａｓカセットは、ある実施形態において、ＤＮＡポリヌクレオチド配列内に含まれてよい。他の態様において、１つまたは複数のＲＮＡ構成要素は、先に記載されるように、タンデムに発現されてよい。ＣａｓカセットおよびＲＮＡカセットに用いられるプロモータは、同じであっても異なってもよい。そのようなＤＮＡポリヌクレオチド配列は、非従来型酵母および従来型酵母の双方においてＲＧＥＮを発現するのに有用であろうと考えられる。
【０１６８】
開示される本発明はまた、非従来型酵母中の染色体またはエピソーム中の標的部位配列にＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を標的として向ける方法に関する。この方法は、酵母の核に、５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含むＲＧＥＮを提供する工程を含み、ＲＮＡ構成要素は、標的部位配列と相補的な配列を含み、ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合し、そして場合によってはこれを切断する。
【０１６９】
このターゲティング法は、例えば、方法の各特徴（例えば、酵母型、ＲＧＥＮ、ＲＮＡ構成要素、その他）に関する、先に開示される実施形態または以下の実施例のいずれかを用いて実行され得る。ゆえに、先に、または実施例に開示される特徴のいずれか、または当該特徴のあらゆる組合せが、本明細書中のターゲティング法の実施形態を特徴付けるために適切に用いられてよい。以下のターゲティング法の特徴は、例である。
【０１７０】
本明細書中のターゲティング法のある実施形態における非従来型酵母は、以下の属のいずれのメンバーであってもよい：ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、およびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属。酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、本明細書において適したヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属酵母である。ターゲティング法に有用な非従来型酵母の他の非限定的な例が、本明細書中に開示される。
【０１７１】
本明細書中のターゲティング法に用いるのに適したＲＧＥＮは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓタンパク質を含んでよい。Ｃａｓ９タンパク質、例えば連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属Ｃａｓ９が、ある実施形態において用いられ得る。ターゲティング法に用いるのに適した連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属Ｃａｓ９タンパク質の例として、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、またはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のＣａｓ９タンパク質に由来するアミノ酸配列を含むＣａｓ９タンパク質が挙げられる。本明細書中のターゲティング法に有用なＲＧＥＮおよびＣａｓ９タンパク質の他の非限定的な例が、本明細書中に開示されている。例えば、ＤＮＡ標的配列の一方の鎖または双方の鎖を切断することができるＲＧＥＮが用いられてよい。
【０１７２】
本明細書中のターゲティング法に用いられるＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素は、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合し、または融合するｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡを含んでよい。本明細書中に開示されるあらゆるｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ（および／またはその部分、例えばｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列またはｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端配列）は、例えば、ｇＲＮＡに含まれてよい。また、本明細書中に開示されるあらゆるｇＲＮＡは、例えば、ターゲティング法に用いられ得る。
【０１７３】
ＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列は、例えば、標的部位配列に隣接してよい。本明細書中のターゲティング法のある実施形態において、ＰＡＭ配列は、標的部位中で、ＲＮＡ構成要素のガイド配列と相補的である鎖と相補的である標的部位配列から直ぐ下流にあり、またはその下流２または３ヌクレオチド以内にある。ＲＧＥＮが、ＲＮＡ構成要素と複合化した、エンドヌクレオチド結合分解活性のあるＣａｓ９タンパク質である本明細書中の実施形態において、Ｃａｓ９は、ＲＮＡ構成要素によって導かれて標的配列に結合し、ＰＡＭ配列の上流にある第３のヌクレオチド位置の直ぐ５’側の双方の鎖を切断する。適切なＰＡＭ配列の例として、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＮＧＧ［配列番号４７］）およびサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＮＡＧＡＡ［配列番号４８］）ＰＡＭ配列が挙げられ、これらはそれぞれ、各種由来のＣａｓ９タンパク質によるターゲティングに用いられ得る。また、本明細書中に開示されるあらゆるＰＡＭ配列が、例えば、ターゲティング法に用いられ得る。
【０１７４】
本明細書中のターゲティング法のある実施形態における酵母はさらに、（ｉ）プロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、ＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド配列を含む。そのようなＤＮＡポリヌクレオチドにより、ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素が酵母の核に提供され得る。というのも、ＲＮＡ構成要素は、ＤＮＡポリヌクレオチドから転写されるからである。酵母核において（ＲＧＥＮの）ＲＮＡ構成要素を発現するのに適したＤＮＡポリヌクレオチド配列の例が、本明細書中に開示されている。本明細書中に開示される、例えば、強プロモータおよび／またはＰｏｌ  ＩＩプロモータ配列を含むプロモータ等のあらゆるプロモータが、ＤＮＡポリヌクレオチド配列に用いられ得る。ある実施形態において、ＲＮＡ構成要素をコードするＤＮＡポリヌクレオチドは、Ｃａｓタンパク質を発現（例えば、Ｃａｓを安定して発現）するように既に操作された酵母中にＲＮＡ構成要素を提供するのに用いられ得る。
【０１７５】
本明細書中の、ＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列はさらに、例えば、リボザイムをコードしてよく、これは、ＲＮＡ構成要素をコードする配列の上流にある。ゆえに、本明細書中のターゲティング法のある実施形態における酵母は、（ｉ）プロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、５’から３’の方向にリボザイムおよびＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド配列を含んでよい。そのようなＤＮＡポリヌクレオチドにより、ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素が酵母の核に提供され得る。というのも、ＲＮＡ構成要素は、ＤＮＡポリヌクレオチドから転写されるからである。本明細書中のリボザイムは、例えば、ハンマーヘッドリボザイム、デルタ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム、グループＩイントロンリボザイム、ＲｎａｓｅＰリボザイム、またはヘアピンリボザイムであってよい。本明細書中に開示されるあらゆるリボザイム、および本明細書中に開示される、ＲＮＡ構成要素に結合するリボザイムをコードするあらゆるポリヌクレオチド配列は、例えば、ターゲティング法に用いられ得る。
【０１７６】
本明細書中のターゲティング法のある実施形態における酵母はさらに、（ｉ）プロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド配列を含んでよい。そのようなＤＮＡポリヌクレオチドにより、ＲＧＥＮのＣａｓタンパク質構成要素が酵母中に提供され得る。酵母中で（ＲＧＥＮの）Ｃａｓタンパク質構成要素を発現するのに適したＤＮＡポリヌクレオチド配列の例が、本明細書中に開示されている。例えば、強プロモータ等の、本明細書中に開示されるあらゆるプロモータが、そのようなＤＮＡポリヌクレオチド配列に用いられ得る。
【０１７７】
ＤＮＡ標的部位配列の配列、またはその近くの配列に相同である少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドもまた、ターゲティング法のある実施形態において、酵母に提供され得る（標的部位配列にてニックを入れ、またはカットするＲＧＥＮを提供することを伴う）。適切な例として、相同アームを有するドナーポリヌクレオチドが挙げられる。本明細書中に開示されるあらゆるドナーポリヌクレオチドは、例えば、ターゲティング法に用いられ得る。当該方法のそのような実施形態は典型的に、（標的配列のＲＧＥＮ媒介ニッキングまたは切断の後に）ドナーポリヌクレオチドと標的配列とのＨＲを伴う；ゆえに、当該方法は、場合によっては、非従来型酵母においてＨＲを実行する方法と呼ぶこともできる。当該方法によって実行され得るＨＲ戦略の例が、本明細書中に開示されている。酵母細胞におけるターゲティングのためのドナーＤＮＡポリヌクレオチドの適切な量は、酵母細胞あたり、少なくとも約３００、４００、５００、６００、７００、または８００分子のドナーＤＮＡであってよい。
【０１７８】
ＲＧＥＮ構成要素を発現するのに本明細書中に記載されるＤＮＡポリヌクレオチドを含むあらゆる構築体またはベクターは、あらゆる標準的な技術によって非従来型酵母細胞中に導入されてよい。これらの技術として、例えば、形質転換（例えば、酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７）、バイオリスティックインパクト、エレクトロポーレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられる。例として、米国特許第４８８０７４１号明細書および米国特許第５０７１７６４号明細書、ならびにＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：２３２−２３５）（これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる）が、酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）用のＤＮＡ運搬技術を記載している。
【０１７９】
本明細書中のターゲティング法は、非従来型酵母においてｉｎｄｅｌを生じさせる目的で実行され得る。そのような方法は、先に開示されるように、標的ＤＮＡ部位にて、またはその近くでＨＲを受け得るドナーＤＮＡポリヌクレオチドをさらに提供することなく実行され得る（すなわち、ＮＨＥＪが当該方法において誘導される）。生じ得るｉｎｄｅｌの例が、本明細書中に開示されている。ｉｎｄｅｌのサイズは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基であってよい。ある実施形態におけるｉｎｄｅｌは、さらに大きくてよく、例えば少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基であってよい。さらに他の実施形態において、挿入または欠失は、少なくとも約５００、７５０、１０００、または１５００塩基であってよい。ある実施形態においてｉｎｄｅｌを生じさせようとする場合、その代わりとして単一の塩基置換が、標的部位配列中に形成されてよい。ゆえに、本明細書中のターゲティング法は、例えば、単一の塩基置換を生じさせる目的で実行されてよい。
【０１８０】
ｉｎｄｅｌ形成を意図する本明細書中のターゲティング法のある実施形態において、非従来型酵母（例えば、酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））におけるｉｎｄｅｌ形成の頻度は、従来型酵母、例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において同じ、または類似のターゲティング戦略を用いて観察されるであろう頻度よりも、有意に高い。例えば、従来型酵母におけるｉｎｄｅｌ形成の頻度は、約０．０００１から０．００１であり得（ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：４３３６−４３４３）、非従来型酵母における頻度は本明細書中で、少なくとも約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、または０．８０であり得る。ゆえに、非従来型酵母のｉｎｄｅｌ形成の頻度は本明細書中で、例えば、従来型酵母において同じ、または類似のＣａｓ媒介ターゲティング戦略を用いて観察されるであろう頻度よりも、少なくとも約５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、４０００、または８０００倍高くなり得る。これらの実施形態のある態様は、ドナーＤＮＡを含まない、かつ／またはＲＧＥＮ構成要素（Ｃａｓ、および適切なＲＮＡ構成要素）が同じベクター／構築体から発現されるターゲティング法に関してよい。
【０１８１】
本明細書中のターゲティング法は、例えば、当該方法において２つ以上のＤＮＡ標的部位が標的とされるように実行されてよい。そのような方法は、酵母に、本明細書中に開示されるタンデム型リボザイム−ＲＮＡ構成要素カセット（例えば、タンデム型リボザイム−ＲＮＡ構成要素−リボザイムカセット）を含む転写産物を発現するＤＮＡポリヌクレオチドを提供する工程を含んでよい。当該方法は、同じ配列（例えば、プロモータ、またはオープンリーディングフレーム）に非常に近いＤＮＡ部位を、かつ／または互いに離れている部位（例えば、異なる遺伝子および／または染色体にある）を標的とすることができる。そのような方法は、ターゲティングの所望される結果に応じて、適切なドナーＤＮＡポリヌクレオチドがあっても（ＨＲについて）、なくても（ｉｎｄｅｌおよび／または塩基置換の原因となるＮＨＥＪについて）実行され得る。
【０１８２】
ある実施形態におけるターゲティング法は、タンパク質または非コードＲＮＡをコードする１つまたは複数のＤＮＡポリヌクレオチド配列を分裂させるために実行されてよい。分裂のために標的とされてよいそのような配列の例が、マーカーをコードする配列（すなわち、マーカー遺伝子）である。本明細書中のマーカーの非限定的な例として、スクリーニング可能なマーカーおよび選択可能なマーカーが挙げられる。本明細書中のスクリーニング可能なマーカーとして、適切な条件下で酵母を視覚的に異ならせるものであってよい。スクリーニング可能なマーカーの例として、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、および蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本明細書中の選択可能なマーカーは、酵母を、選択剤または選択環境に対して耐性にするものであってよい。選択可能なマーカーの例として、栄養要求性マーカー、例えばＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＭＥＴ１５、またはＵＲＡ３があり、これらにより酵母は、外因的に提供されるヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、メチオニン、またはウラシルの不在下でそれぞれ生存することができる。選択可能なマーカーの他の例として、抗生物質（抗真菌）耐性マーカー、例えば、酵母を、ハイグロマイシンＢ、ノウルセオスリシン、フレオマイシン、ピューロマイシン、またはネオマイシン（例えばＧ４１８）に対して耐性にするものがある。
【０１８３】
ある実施形態においてマーカーを分裂させる少なくとも１つの目的は、マーカーリサイクルのためであってよい。マーカーリサイクルは、例えば、（ｉ）酵母をマーカーおよび非相同ＤＮＡ配列で形質転換する工程と、（ｉｉ）マーカーおよび非相同ＤＮＡ配列を含む形質転換された酵母を選択する工程（マーカー選択可能な酵母は典型的に、非相同ＤＮＡ配列を含有する見込みがより高い）と、（ｉｉｉ）マーカーを分裂させる工程と、その後、酵母を、複数の非相同ＤＮＡ配列で形質転換するために、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を必要なだけ繰り返す（同じマーカーを用いるが、各サイクルで、異なる非相同ＤＮＡ配列を用いる）工程を含むプロセスである。当該プロセスの１つまたは複数の非相同配列は、ドナーポリヌクレオチドの形態のマーカーそれ自体（例えば、特定の遺伝子座を標的とする相同アームがフランキングするマーカー）を含んでよい。本明細書中のマーカーリサイクルプロセスの例として、ＵＲＡ３を、非従来型酵母（例えば酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））においてマーカーとして用いるものが挙げられる。
【０１８４】
本明細書中に開示される組成物および方法の非限定的な例は、以下の通りである：
１．５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を含む非従来型酵母であって、ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な配列を含み、ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができる、非従来型酵母。
２．ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、かつこれを切断することができる、実施形態１の非従来型酵母。
３．前記酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、およびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からなる群から選択される属のメンバーである、実施形態１の酵母。
４．ＲＧＥＮは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）結合（Ｃａｓ）タンパク質９（Ｃａｓ９）アミノ酸配列を含む、実施形態１の酵母。
５．Ｃａｓ９タンパク質は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属Ｃａｓ９タンパク質である、実施形態４の酵母。
６．ＲＮＡ構成要素は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に機能可能なように結合するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態４の酵母。
７．ＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列が、標的部位配列に隣接する、実施形態４の酵母。
８．少なくとも１つのヌクレオチド配列に機能可能なように結合するプロモータを含むポリヌクレオチド配列を含む非従来型酵母であって、前記ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ構成要素をコードするＤＮＡ配列の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含み、前記ＲＮＡ構成要素は、酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列と相補的な可変ターゲティングドメインを含み、ＲＮＡ構成要素は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を形成することができ、前記ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができる、非従来型酵母。
９．ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、かつこれを切断することができる、実施形態８の非従来型酵母。
１０．ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去して前記ＲＮＡ構成要素が生じ、前記ＲＮＡ構成要素は、５’キャップを有していない、実施形態８の非従来型酵母。
１１．リボザイムは、ハンマーヘッドリボザイム、デルタ型肝炎ウィルスリボザイム、グループＩイントロンリボザイム、ＲｎａｓｅＰリボザイム、またはヘアピンリボザイムである、実施形態１０の非従来型酵母。
１２．ヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去しないで、５’キャップなしのリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子を生成する、実施形態８の非従来型酵母。
１３．リボザイムはＨＤＶリボザイムである、実施形態１２の非従来型酵母。
１４．プロモータは強プロモータである、実施形態８の非従来型酵母。
１５．プロモータはＰｏｌ  ＩＩプロモータ配列を含む、実施形態８の非従来型酵母。
１６．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列にＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を標的として向ける方法であって、前記方法は、前記酵母に、５’キャップを有していない少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含むＲＧＥＮを提供する工程を含み、ＲＮＡ構成要素は、標的部位配列と相補的な配列を含み、ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合する、方法。
１７．ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、かつこれを切断することができる、実施形態１６の方法。
１８．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列にＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を標的として向ける方法であって、前記方法は、前記酵母に、少なくとも１つのリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子を含むＲＧＥＮを提供する工程を含み、ＲＮＡ構成要素は、標的部位配列と相補的な配列を含み、ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合する、方法。
１９．ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、かつこれを切断することができる、実施形態１８の方法。
２０．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列にＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を標的として向ける方法あって、前記方法は、前記酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、第２の組換えＤＮＡ構築体から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去して、前記ＲＮＡ構成要素が生じ、ＲＮＡ構成要素およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができるＲＧＥＮを形成することができる、方法。
２１．ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、かつこれを切断することができる、実施形態２０の方法。
２２．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列にＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を標的として向ける方法であって、前記方法は、前記酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができるＲＧＥＮを形成することができる、方法。
２３．ＲＧＥＮは、標的部位配列の全てまたは一部に結合することができ、かつこれを切断することができる、実施形態２２の方法。
２４．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を修飾する方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、第２の組換えＤＮＡ構築体から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去して、５’キャップを有していない前記ＲＮＡ構成要素が生じ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入する、方法。
２５．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を修飾する方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、および５’キャップを有していないリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するＲＧＥＮを形成することができる、方法。
２６．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の複数の標的部位を修飾する方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡ構築体、および少なくとも１つのポリヌクレオチドに機能可能なように結合するプロモータを含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムを含むＲＮＡ分子をコードし、前記ＲＮＡ分子は、自己触媒的にリボザイムを除去して、前記ＲＮＡ構成要素が生じ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入する、方法。
２７．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の複数の標的部位を修飾する方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡ構築体、および少なくとも１つのポリヌクレオチドに機能可能なように結合するプロモータを含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードし、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するＲＧＥＮを形成することができる、方法。
２８．前記標的に修飾を有する少なくとも１つの非従来型酵母細胞を同定する工程をさらに含み、修飾は、前記標的部位中の１つまたは複数のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失、付加、または置換を含む、実施形態２２〜２５のいずれかの方法。
２９．ドナーＤＮＡを前記酵母に提供する工程をさらに含み、前記ドナーＤＮＡは、対象のポリヌクレオチドを含む、実施形態２４〜２８のいずれかの方法。
３０．前記標的部位に組み込まれた対象のポリヌクレオチドを染色体またはエピソーム中に含む少なくとも１つの酵母細胞を同定する工程をさらに含む、実施形態２９の方法。
３１．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、およびＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、第２の組換えＤＮＡ構築体から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去して、５’キャップを有していない前記ＲＮＡ構成要素が生じ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
３２．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組換えＤＮＡ構築体、および５’キャップを有していないリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するＲＧＥＮを形成することができ、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
３３．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡ構築体、および少なくとも１つのポリヌクレオチドに機能可能なように結合するプロモータを含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＲＮＡ構成要素の上流にリボザイムを含むＲＮＡ分子をコードし、前記ＲＮＡ分子は、自己触媒的にリボザイムを除去して、５’キャップを有していない前記ＲＮＡ構成要素が生じ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
３４．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、少なくとも１つのポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡ構築体、および少なくとも１つのポリヌクレオチドに機能可能なように結合するプロモータを含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、５’キャップを有していないリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードし、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入するＲＧＥＮを形成することができ、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
３５．第１の組換えＤＮＡおよび第２の組換えＤＮＡは、同じプラスミド上に位置決めされる、実施形態２４〜３４のいずれかの方法。
３６．第１の組換えＤＮＡおよび第２の組換えＤＮＡは、別個のプラスミド上に位置決めされる、実施形態２４〜３４のいずれかの方法。
３７．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列をサイレンシングする方法であって、当該方法は、非従来型酵母に、不活化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡ構築体、および少なくとも１つのポリヌクレオチドに機能可能なように結合するプロモータを含む少なくとも第２の組換えＤＮＡ構築体を提供する工程を含み、前記少なくとも１つポリヌクレオチドは、５’キャップを有していないリボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子をコードし、前記リボザイム−ＲＮＡ構成要素融合分子および不活化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の前記ヌクレオチド配列に結合するＲＧＥＮを形成することによって、前記ヌクレオチド配列の転写を阻止することができる、方法。
３８．非従来型酵母における遺伝子修飾のための複数のガイドＲＮＡの生産のための高スループット法であって、当該方法は：
ａ）５’から３’の順に、リボザイムをコードする第１のＤＮＡ配列、カウンターセレクション剤をコードする第２のＤＮＡ配列、ガイドＲＮＡのＣＥＲドメインをコードする第３のＤＮＡ配列、およびターミネータ配列に機能可能なように結合するプロモータを含む組換えＤＮＡ構築体を提供する工程と；
ｂ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチド二重鎖を、（ａ）の組換えＤＮＡ構築体に提供する工程であって、前記オリゴヌクレオチド二重鎖は、ガイドＲＮＡ標的配列の可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）をコードすることができるＤＮＡ配列を含む第１の単鎖オリゴヌクレオチドの、可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡ配列と相補的な配列を含む第２の単鎖オリゴヌクレオチドとの組合せに由来する、工程と；
ｃ）（ａ）のカウンターセレクション剤を、（ｂ）の少なくとも１つのオリゴ二重鎖と交換することによって、ガイドＲＮＡの可変ターゲティングドメインをコードすることができるＤＮＡ配列をそれぞれが含む組換えＤＮＡ構築体のライブラリを作製する工程と；
ｄ）（ｃ）の組換えＤＮＡ構築体のライブラリを転写することによって、リボザイム−ガイドＲＮＡ分子のライブラリを作製する工程と
を含む方法。
３９．前記分子が、リボザイムの上流でリボザイムおよびあらゆるＲＮＡ配列を自己触媒的に除去して、５’キャップを含有しないガイドＲＮＡ分子のライブラリを作製するように、リボザイム−ガイドＲＮＡ分子のライブラリを誘導する工程をさらに含む、実施形態３８の方法。
４０．前記分子が、リボザイムの上流で、あらゆるＲＮＡ配列を切断して、５’キャップを含有しないリボザイム−ｇＲＮＡ融合分子が生じるように、リボザイム−ガイドＲＮＡ分子のライブラリを誘導する工程をさらに含む、実施形態３８の方法。
４１．（ｉ）ポリメラーゼＩＩプロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、リボザイムおよびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ配列であって、前記リボザイムは、前記ガイドＲＮＡの上流にあり、（ｉｉ）のヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、自己触媒的にリボザイムを除去して、前記ガイドＲＮＡが生じ、前記ガイドＲＮＡは、非従来型酵母のゲノム中の標的部位を認識することができ、これに結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができるＲＧＥＮを形成することができる、組換えＤＮＡ配列。
４２．リボザイムおよびガイドＲＮＡを含む組換えＲＮＡ配列であって、前記リボザイムは、前記ガイドＲＮＡの上流にあり、前記リボザイムは、自己触媒的に除去されて、前記ガイドＲＮＡが生じ得、前記ガイドＲＮＡは、非従来型酵母のゲノム中の標的部位を認識することができ、これに結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができるＲＧＥＮを形成することができる、組換えＲＮＡ配列。
４３．（ｉ）ポリメラーゼＩＩプロモータ、そして（ｉｉ）これが機能可能なように結合する、リボザイムおよびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ配列であって、前記リボザイムは、前記ガイドＲＮＡの上流にあり、（ｉｉ）のヌクレオチド配列から転写されるＲＮＡは、リボザイム−ガイドＲＮＡ融合分子を生成し、前記リボザイム−ガイド融合分子は、非従来型酵母のゲノム中の標的部位を認識することができ、これに結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができるＲＧＥＮを形成することができる、組換えＤＮＡ配列。
４４．リボザイム−ガイドＲＮＡ融合分子を含む組換えＲＮＡ配列であって、前記リボザイム−ガイドＲＮＡ融合分子は、非従来型酵母のゲノム中の標的部位を認識することができ、これに結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができるＲＧＥＮを形成することができる、組換えＲＮＡ配列。
【実施例】
【０１８５】
開示される本発明は、以下の実施例においてさらに明らかにされる。これらの実施例は、本発明のある好ましい態様を示す一方で、実例としてのみ与えられることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、そして、その精神および範囲を逸脱しない範囲で、本発明の種々の変更および改変を行なって、種々の用途および条件に適応させることができる。
【０１８６】
実施例１：ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属においてＰｏｌ  ＩＩＩプロモータから発現されるｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的部位に導かず、ＤＮＡ切断を媒介しない
この実施例は、Ｌｅｕ２遺伝子座を標的とする、酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）においてｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を発現するように設計されたベクターおよびカセットを開示する。この酵母において産生されるｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９が相互作用して、標的部位を見付けて切断することができるならば、標的部位にて、エラープロン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して突然変異が生じるはずである。
【０１８７】
図１は、ｓｇＲＮＡ分子を示し、これは、２つの領域、可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）（ガイド配列）およびＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）を含有する単一ＲＮＡ分子である。ＶＴ領域は、標的とされる核酸分子と同一である２０マーのＲＮＡポリヌクレオチドであり得る。ＶＴドメインは、ＰＡＭモチーフ（例えば、ＮＧＧ、配列番号４７）の５’側に存在する標的部位中の切断標的部位を特定する。ＣＥＲドメインは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用して、ＶＴドメインを相互作用させて、Ｃａｓ９タンパク質切断を導くことができる（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１）。ＶＴおよびＣＥＲドメインは双方とも、ｓｇＲＮＡの機能に必要とされる。
【０１８８】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属のＬＥＵ２遺伝子座のコード領域中の３つの個々の標的部位（Ｌｅｕ２−１、Ｌｅｕ２−２、Ｌｅｕ２−３）にＣａｓ９を標的として向けるＶＴドメインをコードするＤＮＡ配列を、表３に記載する。表３はまた、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ＣＡＮ１遺伝子座のコード領域を標的とするＶＴドメインをコードするＤＮＡ配列を記載する。
【０１８９】
【表１１】
2017522897.tif 000016
【０１９０】
表３における各ＬＥＵ２ターゲティングＤＮＡ配列を、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と相互作用するＣＥＲドメイン（配列番号１）をコードするＤＮＡ配列に個々に融合することによって、ＣＥＲドメインおよびＶＴドメインの双方を有する完全ｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が生じる（配列番号１は、５’から３’の方向に、配列番号５６のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列、配列番号４３のループ形成配列（ＧＡＡＡ）、および配列番号５８のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む点に注目されたい）。細胞の核内でこれらのｓｇＲＮＡを発現し、かつ核外搬出系および５’修飾系を逃れるために、ｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ（Ｓｎｒ５２［配列番号５］またはＲｐｒ１［配列番号６］）または酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ（Ｓｎｒ５２［配列番号７］）の制御下に置いた。具体的には、Ｓｃ  Ｓｎｒ５２をＬｅｕ２−１に融合し、Ｓｃ  Ｒｐｒ１をＬｅｕ２−２に融合し、そしてＹｌ  Ｓｎｒ５２をＬｅｕ２−３に融合した。各ｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の３’末端を、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＳｕｐ４遺伝子由来の強ターミネータ（配列番号８）に融合した。かくして、３つの異なるＰｏｌ  ＩＩＩ駆動ｓｇＲＮＡカセットを調製した。
【０１９１】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１  ＧＡＳ（ＳＦ３７０）由来のＣａｓ９遺伝子のオープンリーディングフレームを、標準的な技術によって、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属における発現用にコドン最適化して、配列番号９を生成した。シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）一分節核局在化シグナル（ＮＬＳ）プラス短リンカー（４アミノ酸）をコードするＤＮＡ配列を、配列番号９の最後のセンスコドンの後ろに組み込んで、配列番号１０とした。配列番号１０は、配列番号１１に示すアミノ酸配列をコードする。配列番号１１の最後の７つのアミノ酸は、加えたＮＬＳをコードする一方、配列番号１１の位置１３６９〜１３７２の残基は、加えたリンカーをコードする。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９−ＮＬＳ配列（配列番号１０）を、標準的な分子生物学技術によって、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属構成プロモータ、ＦＢＡ１（配列番号１２）に融合した。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１３）の例を図２Ａに示す。ＦＢＡ１構成プロモータ、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９、およびＳＶ４０  ＮＬＳが含有される。このＣａｓ９発現カセット（配列番号１３）を、プラスミドｐＺＵＦ中にクローニングして、構築体ｐＺＵＦＣａｓ９とした（図３Ａ、配列番号１４）。
【０１９２】
各ｓｇＲＮＡ発現カセット（前述）を、ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）のＰａｃＩ／ＣｌａＩ部位中に個々にクローニングして、ｐＺＵＦＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ構築体とした。これを用いて、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセットおよびＰｏｌ  ＩＩＩ駆動ｓｇＲＮＡ発現カセットで酵母細胞を共形質転換することができた。そのような構築体の例が、ｐＺＵＦＣａｓ９／Ｐｏｌ  ＩＩＩ−ｓｇＲＮＡ（図３Ｂ）であり、これは、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属においてＬｅｕ２−３を標的とするためのＹｌ  Ｓｎｒ５２−ｓｇＲＮＡ発現カセットを含有する。
【０１９３】
ウラシル栄養要求性酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞を、２００ｎｇのプラスミドｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）または特定のｐＺＵＦＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ（例えば、ｐＺＵＦＣａｓ９／Ｐｏｌ  ＩＩＩ−ｓｇＲＮＡ、図３Ｂ）で形質転換して、ウラシルを欠く完全最小プレート（ＣＭ−ｕｒａ）上で、ウラシル原栄養性について選択した。ＣＭ−ｕｒａプレート上に生じたコロニーを、ロイシンを欠く完全最小プレート（ＣＭ−ｌｅｕ）上で、ロイシン栄養要求性についてスクリーニングした。いずれのウラシル原栄養性形質転換体も、ロイシン栄養要求性を示さなかった。これらの結果から、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９およびＰｏｌ  ＩＩＩプロモータ駆動ｓｇＲＮＡは、発現されず、生じず、相互作用せず、ＤＮＡを標的とせず、かつ／またはＤＮＡを切断しなかったことが示唆される。仮にこの実験がロイシン栄養要求体を生じたならば、そのような結果は、おそらく、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体が、Ｌｅｕ２コード領域を標的として切断して、エラープロンＮＨＥＪおよびそれに伴うｉｎｄｅｌ形成に至って、フレームシフト突然変異が生じたことを示したであろう。
【０１９４】
ゆえに、ｓｇＲＮＡのＰｏｌ  ＩＩＩ駆動発現は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属において機能的Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を提供するのに有用でないように思われる。
【０１９５】
実施例２：ＤＮＡポリメラーゼＩＩプロモータによって駆動される５’リボザイムおよび３’リボザイムを含むヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｓｇＲＮＡ発現カセット  この実施例は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属における発現およびＣａｓ９媒介ターゲティングについて最適化したｓｇＲＮＡを開示する。そのような発現に用いた各カセットは、５’リボザイムおよび３’リボザイムに融合したｓｇＲＮＡ（リボザイム−ｓｇＲＮＡ−リボザイム、またはＲＧＲ）の転写を駆動するＰｏｌ  ＩＩプロモータを含んだ。５’リボザイムおよび３’リボザイムを与えて、ｓｇＲＮＡから、Ｐｏｌ  ＩＩプロモータ関連転写産物の修飾、例えば５’キャップ構造を除去して、まさしくｓｇＲＮＡ配列だけにした。これらの発現カセットは、ｓｇＲＮＡ発現について、より広いプロモータ選択を可能にする。また、これらのカセットから転写されるｓｇＲＮＡは、５’キャップ構造を欠くので、核外搬出を受けない。これらの特徴により、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞におけるｓｇＲＮＡのロバストな発現が可能となるので、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、標的とされたゲノム領域にインビボで導かれ得る。
【０１９６】
ｓｇＲＮＡ配列への５’ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムおよび３’デルタ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイムの追加により、一部のＲＮＡポリメラーゼ（例えばＰｏｌ  ＩＩ）によって転写されるプロモータで起こる転写後修飾について考慮せずとも、あらゆるプロモータからのｓｇＲＮＡの発現が可能となり、ｓｇＲＮＡ発現について限られている現在のプロモータ選択が回避される。そのようなｓｇＲＮＡが発現される場合、プレｓｇＲＮＡ転写産物中に存在するリボザイムをオートクレーブ処理することによって、転写産物から分離して、未修飾ｓｇＲＮＡにする。
【０１９７】
試験した各ｓｇＲＮＡについて、ｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、（ｉ）その５’末端にて、５’ＨＨリボザイムをコードする配列（配列番号１５）に、そして（ｉｉ）その３末端にて、３’ＨＤＶリボザイム（配列番号１６）をコードする配列に融合した。ＨＨリボザイムの５’結合は、ＨＨリボザイムの最初の６ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡのＶＴ領域（ガイド配列）の最初の６ヌクレオチドの逆相補体であるようにした。各リボザイムがフランキングするプレｓｇＲＮＡ（ＲＧＲ）を、標準的な分子生物学技術を用いて、ＦＢＡ１プロモータ（配列番号１２）に融合して、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｓｇＲＮＡ発現カセット（図２Ｂに表される最終カセット）を得た。そのようなカセットの例となる配列を、配列番号１８に示す。これは、ｓｇＲＮＡが、配列番号１７（Ｃａｎ１−１）によってコードされるＶＴドメイン、およびＣＥＲドメインとしての配列番号１を含むＲＧＲ（ＨＨ−ｓｇＲＮＡ−ＨＤＶ）をコードする配列に機能可能なように結合するＦＢＡ１プロモータ（配列番号１２）を含む（配列番号１８、ｐＲＦ３８（配列番号１９）、およびｐＲＦ８４（配列番号４１）の各ＣＥＲドメインコード領域に、「ＴＧＧ」が加えられている点に注目されたい。そのような「ＴＧＧ」は、配列番号１（ＣＥＲドメイン）の位置７３〜７４に対応する残基位置間にある）。このＶＴドメインは、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ＣＡＮ１遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００６０６８、染色体ＢのＹＡＬＩ０Ｂ１９３３８ｇ、２５５７５１３〜２５５９２３１ｂｐ）のコード領域中の部位を標的とする。コードされたＨＨリボザイムの最初の６残基は、ｓｇＲＮＡの最初の６残基（すなわち、ＶＴドメインの最初の６残基）と相補的である。配列番号１８中の配列番号１２（ＦＢＡ１プロモータ）の直ぐ後ろに３つの残基（ＡＴＧ）があり、これらは、プレｓｇＲＮＡの発現およびリボザイム媒介自触媒作用に影響を及ぼすと考えられていない点に注目されたい。配列番号１８を、ｐＲＦ３８と呼ばれる構築体中にクローニングした（図３Ｃ、配列番号１９）。
【０１９８】
かくして、５’および３’Ｐｏｌ  ＩＩプロモータ関連転写産物の変更なくｓｇＲＮＡを発現するＤＮＡカセットを調製した。カセットのこれらの型を、実施例３において、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣａｓ９遺伝子ターゲティングに用いた。
【０１９９】
実施例３：ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｓｇＲＮＡを、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ系に用いて、染色体ＤＮＡを切断することができる
この実施例は、実施例２に記載したヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｓｇＲＮＡ発現カセットを用いて、Ｃａｓ９と機能することができるｓｇＲＮＡを発現して、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属中の染色体ＤＮＡを認識して切断することを開示する。そのような切断は、予測されるＤＮＡ切断部位の領域における、切断部位でのエラープロンＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復による突然変異の出現によって明らかにされた。
【０２００】
酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＣＡＮ１遺伝子を、切断の標的とした。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属形質転換体におけるＣＡＮ１のターゲティングの成否を、突然変異頻度および突然変異スペクトルについて、それぞれ表現型（カナバニン耐性）および配列決定によって調査した。
【０２０１】
Ｕｒａ−酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞（株ＡＴＣＣ  ２０３６２に直接由来するウラシル栄養要求体、株Ｙ２２２４が、米国特許出願公開第２０１０／００６２５０２号明細書に開示されている（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる））を、ｐＺＵＦＣａｓ９（図３Ａ、配列番号１４）および線状ＰＣＲ産物（ＣＡＮ１遺伝子座を標的とするためのヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧＲプレｓｇＲＮＡカセット（配列番号１８に含まれる）を含有するｐＲＦ３８（図３Ｃ、配列番号１９）から増幅した）で、リチウムイオン媒介形質転換（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：１６３−１６８）によって、共形質転換した。このＰＣＲ増幅に用いたプライマーは、配列番号２０（フォワード）および配列番号２１（リバース）であった。ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）のみで形質転換したＵｒａ−酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞（Ｙ２２２４）を、ネガティブコントロールとして供した。ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）およびＲＧＲプレｓｇＲＮＡ発現カセットで形質転換した細胞を、ＣＭ−ｕｒａ培地上でウラシル原栄養体として選択した。ウラシルを欠き、アルギニンを欠き、そして６０μｇ／ｍｌの毒性のアルギニン類似体、カナバニン（ＣＭ＋ｃａｎ）を補った完全最少培地上にＣＭ−ｕｒａプレートをレプリカプレーティングすることによって、ＣＡＮ１遺伝子中に機能欠失突然変異を含有する細胞をスクリーニングした。機能的ＣＡＮ１遺伝子を有する細胞は、カナバニンを細胞中に輸送して、細胞死を引き起こし得る。ＣＡＮ１遺伝子中に機能欠失対立遺伝子を有する細胞は、カナバニンを輸送せず、ＣＭ＋ｃａｎプレート上で増殖することができる。
【０２０２】
カナバニン耐性の表現型スクリーニングによって回収した機能欠失突然変異体の頻度は、Ｃａｓ９のみで形質転換した細胞について、ゼロであった（図４）。しかしながら、Ｃａｓ９を、ＲＧＲプレｓｇＲＮＡ発現カセットで共形質転換すると、カナバニン耐性形質転換体の頻度は、１０パーセントに増大した（図４）。
【０２０３】
カナバニン耐性コロニーのＣＡＮ１遺伝子座を、フォワード（配列番号２２）およびリバース（配列番号２３）ＰＣＲプライマーを用いて増幅した。Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）および濃縮カラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ＰＣＲ産物を精製した。配列決定プライマー配列番号２４を用いて、ＰＣＲ産物を配列決定した（サンガー法）。配列を、標的部位を含有する野生型（ＷＴ）ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ＣＡＮ１コード配列とアラインした（図５）。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡの双方を発現する細胞中のＣＡＮ１遺伝子座にある機能欠失一次突然変異（配列決定した単離体の７３％）は、Ｃａｓ９切断部位での−１フレームシフト突然変異であった（図５）。他の少数の欠失および挿入が、ＣＡＮ１遺伝子座にある残りの突然変異を構成した。全部で、突然変異の９０％は、小さな欠失または挿入であった（図５）。稀ではあるが、別の染色体からの少量の配列の挿入（４％）、切断部位での、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｓｇＲＮＡ発現カセットの挿入（１．５％）、またはより大きな欠失（１％）等の他の事象が生じた。スクリーニングしたカナバニン耐性コロニーの３．５％は、ＣＡＮ１遺伝子座での再配列が複雑であり、配列決定によって確定できなかった。全体として、ＣＡＮ１標的部位にて観察した突然変異から、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体によって生じた切断を修復するために、エラープロンＮＨＥＪが細胞中で用いられたことが示される。
【０２０４】
（ｉ）ＣＡＮ１特異的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現するように形質転換した細胞における、カナバニン耐性コロニーの頻度増大、および（ｉｉ）カナバニン耐性突然変異が、予測されるＣａｓ９切断部位でのエラープロンＮＨＥＪ事象によることを示した配列決定データの双方から、実施例２に記載するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化Ｃａｓ９およびＲＧＲプレｓｇＲＮＡ発現カセットが、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属染色体ＤＮＡを切断して、突然変異を発生させたことが確認される。
【０２０５】
かくして、ＲＮＡ構成要素の５’キャップがリボザイムによって自己触媒的に除去される場合、５’キャップを有していないＲＧＥＮ（例えばＣａｓ９）のＲＮＡ構成要素（例えばｓｇＲＮＡ）の発現により、非従来型酵母におけるＤＮＡ配列のＲＧＥＮ媒介ターゲティングが可能となる。
【０２０６】
実施例４：５’リボザイムと共に（３’リボザイムなし）発現したヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｓｇＲＮＡは、染色体ＤＮＡを切断するｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ系において有用である
この実施例において、５’ＨＨリボザイムのみを含有し、３’リボザイムを含有しないヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化カセットから生じたｓｇＲＮＡの機能性を評価して、ｓｇＲＮＡがＣａｓ９と相互作用し、ＤＮＡ標的配列を認識し、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断を誘導し、かつエラープロンＮＨＥＪによる突然変異をもたらすことができるかを判定した。
【０２０７】
Ｐｏｌ  ＩＩプロモータから転写されたＲＮＡを、５’末端および３’末端の双方にて重度にプロセシングして修飾することで、Ｐｏｌ  ＩＩプロモータから機能的ｓｇＲＮＡを生じさせるには、５’末端および３’末端が切断されなければならないことが示唆される。フランキング領域と共にインビトロで生じたｓｇＲＮＡは、（ｉ）５’フランキング領域が存在するならば、機能せず、（ｉｉ）３’フランキング領域が存在するならば、有意に機能的に損なわれることが以前に示されていた（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５６：３４３−３４９）。５’リボザイム、そしてまた３’フランキング領域を含有するプレｓｇＲＮＡが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、Ｃａｓ９を伴って発現されれば、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を標的部位に導いて切断するように機能しなかった（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．、同書）。
【０２０８】
５’リボザイムがフランキングするｓｇＲＮＡ（３’に位置決めされるリボザイムを欠く）が非従来型酵母において機能することができるかを試験するために、５’から３’の方向に、ＦＢＡ１プロモータ（配列番号１２）、これに融合したＨＨリボザイム（配列番号１５）、これに融合した、Ｃａｎ１−１標的部位（配列番号１７）を標的とするｓｇＲＮＡをコードする配列（配列番号７０の例）、これに融合した、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ４遺伝子由来の強転写ターミネータ（配列番号８）を含有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｓｇＲＮＡ発現カセット（配列番号２５）を構築した（このカセットは、ＲＧ［リボザイム−ｓｇＲＮＡ］ＲＮＡを発現するとして特徴付けることができる）。ＲＧ発現カセットにおいてコードされるｓｇＲＮＡは、配列番号１７に対応するＶＴドメインを含み、ＣＥＲドメイン（配列番号１）が結合する。コードされるＨＨリボザイムの最初の６残基は、ｓｇＲＮＡの最初の６残基（すなわち、ＶＴドメインの最初の６残基）と相補的である。配列番号２５中の配列番号１２（ＦＢＡ１プロモータ）の直ぐ後ろに３つの残基（ＡＴＧ）があり、これらは、プレｓｇＲＮＡの発現およびリボザイム媒介自触媒作用に影響を及ぼすと考えられていない点に注目されたい。このヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧ発現カセット（配列番号２５）を、図２Ｃに示す。
【０２０９】
Ｃａｓ９と相互作用して、Ｃａｓ９をＤＮＡ標的配列に導いて、Ｃａｓ９により切断することができるｓｇＲＮＡを発現するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧカセットの能力を試験するために、ＲＧ構築体（配列番号２５）またはＲＧＲ構築体（配列番号１８、実施例２）のいずれかを含有するＰＣＲ産物を、リチウムイオン媒介形質転換（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、同書）によって、ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）でＵｒａ−酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞（Ｙ２２２４）中に共形質転換した。Ｕｒａ＋形質転換体を、ＣＭ＋ｃａｎプレート上にレプリカプレーティングして、（実施例３のように）カナバニン耐性細胞についてスクリーニングした。この細胞中で、ＲＧまたはＲＧＲプレｓｇＲＮＡから生じたｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を導いてＣＡＮ１標的配列を切断するように機能して、ＮＨＥＪを介したエラープロン修復をもたらす。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧまたはＲＧＲカセットが、Ｃａｓ９媒介切断を標的部位に導く頻度は同じであった（図６）ことから、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いたＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５６：３４３−３４９）の結果に反して、３’リボザイムは、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属における効率的なＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的切断および突然変異に必須でなかったことが示される。
【０２１０】
この実施例から、非従来型酵母、例えばヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属において、リボザイム戦略を用いた場合に、５’フランキングリボザイムのみが、Ｐｏｌ  ＩＩプロモータから機能的ｓｇＲＮＡを生じさせるのに必須であると思われることが実証される。この結果は、従来の酵母である出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において観察されたものと対照的であり、そこでは、５’リボザイムおよび３’リボザイムの双方が、Ｃａｓ９による標的配列の効率的な切断および突然変異に必要とされた（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．、同書）。
【０２１１】
かくして、この実施例からさらに、ＲＮＡ構成要素の５’キャップがリボザイムによって自己触媒的に除去される場合、５’キャップを有していないＲＧＥＮ（例えばＣａｓ９）のＲＮＡ構成要素（例えばｓｇＲＮＡ）の発現により、非従来型酵母におけるＤＮＡ配列のＲＧＥＮ媒介ターゲティングが可能となることが実証される。
【０２１２】
実施例５：Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ誘導ＤＮＡ二本鎖切断の相同組換え（ＨＲ）修復を促進するための、線状ポリヌクレオチド修飾鋳型の使用
この実施例は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化Ｃａｓ９およびプレｓｇＲＮＡ発現カセットを発現することによって生じる二本鎖切断（ＤＳＢ）を、線状ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ配列を用いて修復する、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＨＲ機構の能力についての試験を開示する。３つの異なる線状鋳型配列を生成した。これらはそれぞれ、染色体ＤＮＡ中のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡターゲティング部位の外側の領域に相同である５’アーム配列および３’アーム配列を有した。
【０２１３】
ポリヌクレオチド修飾鋳型配列の最初の２つの型は、相補的である合成オリゴヌクレオチドから生じた。相補的なオリゴヌクレオチドをアニールしてから、エタノール沈殿によって精製した。
【０２１４】
相補的オリゴヌクレオチド（配列番号２８および２９）を用いて、第１のポリヌクレオチド修飾鋳型を生成し、２０ヌクレオチドのＣａｎ１−１標的部位（配列番号１７）、３ヌクレオチドのＰＡＭドメイン、およびＣａｎ１−１標的部位の直ぐ上流の２つのヌクレオチドを欠失させることによって、ＣＡＮ１遺伝子において８つのコドンおよび１つの塩基対を欠失させて、−１ｂｐフレームシフトが生じるように設計した。第１のポリヌクレオチド修飾鋳型は、配列番号２８およびその逆相補体、配列番号２９をアニールすることによってアセンブルした。第１のドナーＤＮＡの相同アーム（それぞれ約５０ｂｐ）は、互いに直接隣り合っている；間に異種起源配列はない。
【０２１５】
相補的オリゴヌクレオチド（配列番号３０および３１）を用いて、第２のポリヌクレオチド修飾鋳型を生成し、ＣＡＮ１オープンリーディングフレームにおいて２つのインフレーム翻訳終止コドン（すなわち、ナンセンス突然変異）を生じさせるように設計した。また、Ｃａｎ１−１標的部位の下流でＰＡＭ配列を分裂させ（ＣＧＧをＡＴＧで置換する）、そしてシード配列の第１のヌクレオチド（すなわち、配列番号１７のＣａｎ１−１標的配列の最後の残基）を分裂させる（ＣをＧで置換する）ように設計した。このポリヌクレオチド修飾鋳型は、配列番号３０およびその逆相補体、配列番号３１をアニールすることによって生成した。上記から読み取ることができるように、第２のドナーＤＮＡの相同アーム（それぞれ約５０ｂｐ）を、数塩基対の異種起源配列によって分離する。
【０２１６】
２つのＰＣＲ産物を生じさせることによって、第３のポリヌクレオチド修飾鋳型を部分的に生じさせた。ＰＣＲ産物（配列番号３２。プライマー配列番号３３［フォワード］および配列番号３４［リバース］を用いて酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ２０３６２ゲノムＤＮＡから増幅した）の１つにおいて、配列番号３２の位置６３８は、ＣＡＮ１オープンリーディングフレーム開始コドンの上流側ヌクレオチド３ｂｐに対応する。リバースプライマー（配列番号３４）は、ＣＡＮ１オープンリーディングフレームの下流側３７ｂｐに存在する配列と相補的な１７ヌクレオチドを加えている。第２のＰＣＲ産物（配列番号３５。プライマー配列番号３６［フォワード］および配列番号３７［リバース］を用いて酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ２０３６２ゲノムＤＮＡから増幅した）は、ＣＡＮ１オープンリーディングフレームの終止コドンの下流側１４塩基対から始まる６３７塩基対を含む。フォワードプライマー（配列番号３６）は、ＣＡＮ１オープンリーディングフレームの上流側２塩基対で終える領域と相補的な２０ヌクレオチドを加えている。上流のＰＣＲ産物（配列番号３２）および下流のＰＣＲ産物（配列番号３５）の双方を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）および濃縮カラムを用いて精製した。これらのＰＣＲ産物（各１０ｎｇ）を、新しいＰＣＲ反応液中に混合した。上流産物の３’側の殆どの３７ヌクレオチドは、下流産物の５’側の殆どの３７ヌクレオチドと同じである。上流フラグメントおよび下流フラグメントを用いて互いをプライムさせて、上流配列および下流配列の双方を含有する、オーバーラップしている末端からの合成によって、単一の産物（配列番号３８）を生じさせた（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５４：１２９−１３３によって記載される技術）。配列番号３８のドナーＤＮＡの相同アーム（それぞれ６００ｂｐを超える）は、互いに直接隣り合っている；間に異種起源配列はない。このポリヌクレオチド修飾鋳型は、Ｃａｎ１−１標的部位中のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介二本鎖切断の領域中のＣＡＮ１オープンリーディングフレーム全体を包含する大きな欠失を可能にする。
【０２１７】
先のリチウムイオン形質転換法を用いて、（ｉ）ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）、（ｉｉ）１μｇのヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧＲプレｓｇＲＮＡ発現カセット（配列番号１８）、および（ｉｉｉ）１ｎｍｏｌの「フレームシフト鋳型」ＤＮＡ（配列番号２８）、１ｎｍｏｌの「点突然変異鋳型」ＤＮＡ（配列番号３０）、または１μｇの「大欠失鋳型」ＤＮＡ（配列番号３８）で、Ｕｒａ−酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞（Ｙ２２２４）を形質転換した。形質転換細胞を、ＣＭ−ｕｒａプレート上で、ウラシルの原栄養体として回収した。ＣＡＮ１突然変異を有するカナバニン耐性細胞を同定するために、ＣＭ＋ｃａｎへのレプリカプレーティングによって、原栄養性コロニーをスクリーニングした。フォワードプライマー（配列番号２２）およびリバースプライマー（配列番号２３）を用いるＰＣＲ増幅を介して、各形質転換由来のＣａｎＲコロニーのＣＡＮ１遺伝子座をスクリーニングした。ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて各ＰＣＲ産物を精製し、配列決定プライマー配列番号２４を用いて配列決定した（サンガー法）。ＣａｎＲコロニーの総数から予測される相同組み換え事象を示すコロニーの頻度（これを考慮して、特定の鋳型ＤＮＡを形質転換に用いた）は、約１５％であった（図７）。
【０２１８】
３つの異なるポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ配列は、ＨＲ修復の効率性が僅かに異なった（図８）。具体的には、各鋳型によるＨＲ頻度は、おおよそ１１％（大欠失およびフレームシフトドナー）から２２％（点突然変異鋳型）であった（図８）ことから、ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡが提供された場合に、Ｃａｎ１−１標的部位での、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡで生じた切断事象の一部が、ＨＲ経路を用いて高い忠実度で修復されたことが示される。
【０２１９】
ＤＮＡ修復の２つの主な経路、ＮＨＥＪまたはＨＲを用いて、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属においてＮＨＥＪについて明らかな偏りが実証され（図７）、これは、従来型酵母におけるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介切断事象時の修復の研究において観察されたものと異なる。例えば、ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：４３３６−４３４３）は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介ＤＮＡ切断の修復にドナーＤＮＡが提供された場合に得られた殆ど全ての出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）突然変異体が、ＨＲを介して生じた一方で、ドナーＤＮＡが提供されなかった場合、頻度が４から５の規模で下がることから、ＨＲへの明らかな偏りが示されることを示した。対照的に、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ（ＲＧＲカセットから発現されるｓｇＲＮＡ）切断部位のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属における総突然変異頻度は、ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡを受け取った、または受け取らなかった形質転換体の間で変化せず（図９。双方の形質転換体型について、約１５％の突然変異率を示す）、ＨＲは、ドナーＤＮＡが提供される場合に生じた突然変異形質転換体の約１５パーセントしか占めない（図７）。かくして、先に観察されるように、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ配列によるＨＲの頻度は、僅か約２．２５％であった。これは、従来型酵母においてドナーＤＮＡで観察されたほぼ１００％のＨＲ媒介突然変異率とは全く対照的である（ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、同書）。
【０２２０】
かくして、この実施例からさらに、ＲＮＡ構成要素の５’キャップがリボザイムによって自己触媒的に除去される場合、５’キャップを有していないＲＧＥＮ（例えばＣａｓ９）のＲＮＡ構成要素（例えばｓｇＲＮＡ）の発現により、非従来型酵母におけるＤＮＡ配列のＲＧＥＮ媒介ターゲティングが可能となることが実証される。この実施例からまた、適切なドナーＤＮＡ（ポリヌクレオチド修飾鋳型）が提供されるならば、非従来型酵母におけるＲＧＥＮ媒介切断が、ＨＲによってある率で修復され得ることが実証される。
【０２２１】
実施例６：Ｃａｓ９およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧＲまたはＲＧプレｓｇＲＮＡの、単一の安定ベクターからの発現は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介標的ＤＮＡ切断を実現する
この実施例において、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧＲまたはＲＧプレｓｇＲＮＡ発現カセットをそれぞれ個々に、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化Ｃａｓ９発現カセットと同じ安定発現プラスミド中に移した。具体的には、配列番号１８（ＲＧＲ発現用）または配列番号２５（ＲＧ発現用）をそれぞれ個々に、ｐＺＵＦＣａｓ９（図３Ａ、配列番号１４）中にクローニングした。これにより、単一構成要素形質転換によって、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＲＧまたはＲＧＲプレｓｇＲＮＡを細胞中で発現させることによって、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介標的部位切断に続いてエラープロンＮＨＥＪ修復を実現することができる。
【０２２２】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ＲＧＲ（配列番号１８）またはＲＧ（配列番号２５）ｓｇＲＮＡ発現カセットを、フォワード（配列番号３９）プライマーおよびリバース（配列番号４０）プライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。各産物を、プラスミドｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）中に、ＰａｃＩ／ＣｌａＩ制限部位にて個々にクローニングして、２つの新しいプラスミドを生成した。これらはそれぞれ、Ｃａｓ９発現、および最適化ＲＧＲプレｓｇＲＮＡ（ｐＲＦ８４、配列番号４１、図１０Ａ）または最適化ＲＧプレｓｇＲＮＡ（ｐＲＦ８５、配列番号４２、図１０Ｂ）のいずれかの発現用の各カセットを有する。
【０２２３】
Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを効果的に発現して、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介標的部位（Ｃａｎ１−１）切断を実現する、ｐＲＦ８４（配列番号４１）プラスミド構築体およびｐＲＦ８５（配列番号４２）プラスミド構築体の能力を試験するために、先のリチウムイオン形質転換法を用いて、Ｕｒａ−酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞（Ｙ２２２４）を、２００ｎｇのｐＲＦ８４（配列番号４１）、ｐＲＦ８５（配列番号４２）、またはｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）で形質転換した。各プラスミドで形質転換した細胞を、ＣＭ−ｕｒａ培地上でウラシル原栄養体として選択した。各形質転換由来のウラシル原栄養体を、ＣＭ＋ｃａｎ上へのレプリカプレーティングによって、ＣＡＮ１突然変異体についてスクリーニングした。ＣＭ＋ｃａｎプレート上で増殖したコロニーの数を利用して、ｐＺＵＦＣａｓ９（Ｃａｓ９のみを発現）、ｐＲＦ８４（Ｃａｓ９およびＲＧＲプレｓｇＲＮＡを発現）、またはｐＲＦ８５（Ｃａｓ９およびＲＧプレｓｇＲＮＡを発現）で形質転換した細胞について、ＣＡＮ１突然変異頻度（図１１）を作成した。ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号１４）で形質転換したヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞は、ＣＡＮ１遺伝子座でのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介突然変異の頻度が０であった一方で、（ｉ）Ｃａｓ９および（ｉｉ）ＲＧＲプレｓｇＲＮＡ（ｐＲＦ８４）またはＲＧ  ｓｇＲＮＡ（ｐＲＦ８５）を発現する細胞は、カナバニン耐性によって示されるように、類似したＣＡＮ１突然変異頻度を有した（約６９％）（図１１）。
【０２２４】
これらの結果から、同じベクターからＣａｓ９およびプレｓｇＲＮＡを発現することで、予測される切断部位での有意に高いＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介切断率、そして結果的にＮＨＥＪ媒介突然変異に至ることが示される。Ｃａｓ９およびプレｓｇＲＮＡ（ＲＧＲまたはＲＧプレｓｇＲＮＡ）をコードする別々の配列で形質転換したヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞は、約５％の標的突然変異頻度を示した（実施例４、図６）一方、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡコード配列の双方を、形質転換に用いる同じベクター上に配置すると、約６９％の標的突然変異頻度がもたらされた（図１１）。
【０２２５】
かくして、非従来型酵母を形質転換するのに用いた同じ構築体からＣａｓタンパク質およびその対応するＲＮＡ構成要素を発現させると、ＲＧＥＮタンパク質およびＲＮＡ構成要素を発現する別々の構築体を用いた場合と比較して、酵母においてより高いＣａｓ媒介ＤＮＡターゲティング率がもたらされた。
【０２２６】
実施例７：酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）においてＨＤＶリボザイム−ｓｇＲＮＡ融合体を用いた高効率の遺伝子ターゲティング
この実施例は、単一ガイドＲＮＡ（５’末端上にＨＤＶリボザイムがフランキングするｓｇＲＮＡ（リボザイム単一ガイドＲＮＡ融合））の使用について考察する。発現される場合、ＨＤＶリボザイムは、自己の配列の５’を切断して、先行するあらゆる転写産物を除去するが、ＨＤＶ配列をｓｇＲＮＡの５’末端に融合したままにする。
【０２２７】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅおよび以下のプライマー、ＡａｒＩ−ｒｅｍｏｖａｌ−１（ＡＧＡＡＧＴＡＴＣＣＴＡＣＣＡＴＣＴＡＣｃａｔｃｔｃｃＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＴＣＣ、配列番号９０）およびＡａｒＩ−ｒｅｍｏｖａｌ−２（ＧＧＡＡＴＣＧＡＣＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴＣｇｇａｇａｔｇＧＴＡＧＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＡＣＴＴＣＴ、配列番号９１）を用いて、プラスミドｐＺｕｆ−Ｃａｓ９（配列番号１４）に突然変異を起こして、ｐＺｕｆ−Ｃａｓ９（配列番号１４）上のＣａｓ９遺伝子（配列番号１０）中に存在する内在性ＡａｒＩ部位を除去して、ｐＲＦ１０９（配列番号９２）を生成した。修飾Ａａｒ１−Ｃａｓ９遺伝子（配列番号９３）を、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして、ｐＲＦ１０９から、ｐＺｕｆＣａｓ９のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位中にクローニングして、既存のＣａｓ９遺伝子（配列番号１０）をＡａｒ１−Ｃａｓ９遺伝子で置換して、ｐＲＦ１４１（配列番号９４）を生成した。
【０２２８】
高スループットクローニングカセット（図１２Ａ、配列番号９５）を、ｙｌ５２プロモータ（配列番号９６）、ＨＤＶリボザイム（配列番号１６）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）カウンターセレクションカセットｒｐｓＬ（配列番号９７）、ガイドＲＮＡ  ＣＥＲドメインをコードするＤＮＡ（配列番号１）、および出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ４ターミネータ（配列番号８）で構成する。高スループットクローニングカセット（配列番号９５）の末端にフランキングするのは、ＰａｃＩおよびＣｌａＩ制限酵素認識部位である。高スループットクローニングカセットを、ｐＲＦ１４１（配列番号９４）のＰａｃＩ／ＣｌａＩ部位中にクローニングして、ｐＲＦ２９１（配列番号９８）を生成した。ｒｐｓＬカウンターセレクションカセット（配列番号９７）は、Ｓ１２リボソームタンパク質サブユニットをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ｒｐｓＬのＷＴコピーを含有する（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，Ｆｉｒｓｔ  ｅｄ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。Ｓ１２サブユニットにおける一部の突然変異は、抗生物質ストレプトマイシンに対する耐性（Ｏｚａｋｉ  Ｍ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  Ｓ，Ｎｏｍｕｒａ  Ｍ．１９６９．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ  ２２２：３３３−３３９）を劣性様式で（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ  Ｊ．１９５１．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ６１：５４９−５５０）もたらす（ｒｐｓＬ遺伝子の野生型コピーが存在するならば、株はストレプトマイシンに対して表現型的に感受性である）。Ｔｏｐ１０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の一般的なクローニング株は、その染色体上に、細胞がストレプトマイシンに対して耐性を示すようなｒｐｓＬの突然変異コピーを有する。
【０２２９】
ガイドＲＮＡの可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡフラグメントをプラスミド（例えばｐＲＦ２９１）中にクローニングするには、アニールされると、可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡフラグメント、および高スループットクローニングカセット中に存在する２つのＡａｒＩ部位中にクローニングするための正確な突出部を含有する、２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドが必要とされる。２つのオリゴヌクレオチド、Ｃａｎ１−１Ｆ（ＡＡＴＧＧＧＡＣｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃＧＴＴＴ、配列番号９９）およびＣａｎ１−１Ｒ（ＴＣＴＡＡＡＡＣｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａＧＴＣＣ、配列番号１００）を、デュプレックスバッファ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ酢酸ナトリウム）中に１００μＭで再懸濁した。Ｃａｎ１−１Ｆ（配列番号９９）およびＣａｎ１−１Ｒ（配列番号１００）を、単一チューブ中にそれぞれ５０μＭの最終濃度で混合し、９５℃に５分間加熱し、そして０．１℃／分にて２５℃に冷却して、２つのオリゴヌクレオチドをアニールして、Ｃａｎ１−１標的部位（ＰＡＭ配列ＣＧＧを含む配列番号１０１として示す）を標的とすることができるガイドＲＮＡの可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡフラグメントを含有する小さな二重鎖ＤＮＡ分子（図１２Ｂ）を形成した。５０ｎｇのｐＲＦ２９１、Ｃａｎ１−１Ｆで構成される２．５μＭの小さな二重鎖ＤＮＡ、およびＣａｎ１−１Ｒ  １×Ｔ４リガーゼバッファ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．５）、０．５μＭ  ＡａｒＩオリゴヌクレオチド、２ユニットＡａｒＩ、４０ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する単一チューブの消化／ライゲーション反応液を、２０μｌの最終容量で生じさせた。二重化したＣａｎ１−１ＦおよびＣａｎ１−１Ｒ二重鎖を欠く第２のコントロール反応液もアセンブルした。反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。各反応液の１０μｌを、以前に記載されるように（Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．２０１２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、Ｔｏｐ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中に形質転換した。ＡａｒＩ制限部位がフランキングするｒｐｓＬカウンターセレクションマーカーを、Ｃａｎ１−１ＦおよびＣａｎ１−１Ｒの二重鎖が置換した（図１２Ａ）ｐＲＦ２９１の存在について選択するために、細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する１．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏアガーで固めた溶原Ｂｒｏｔｈ上にプレーティングした。高スループットクローニングカセットを含有するｐＲＦ２９１の存在により、プラスミド上のカウンターセレクションカセットの存在のために、抗生物質アンピシリンに対して表現型的に耐性を示すが、抗生物質ストレプトマイシンに対して感受性であるコロニーが生じた。しかしながら、カウンターセレクションカセットがＡａｒＩ酵素を介して除去され、かつＣａｎ１−１二重鎖ＤＮＡが部位中にライゲートされた（ＡａｒＩの認識配列が除去された）場合、プラスミドで形質転換した細胞は、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性表現型を有した（図１２Ａ）。Ｃａｎ１−１可変ターゲティングドメインをコードする（カウンターセレクションカセットを置換した）ＤＮＡフラグメントを含有するｐＲＦ２９１は、組換えＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ発現カセット（配列番号１０２）を生成した。これは、ｙｌ５２プロモータ、これに融合した、ＨＤＶリボザイム（配列番号１６）をコードするＤＮＡ、これに融合した、Ｃａｎ１−１可変ターゲティングドメイン（配列番号１７）をコードするＤＮＡ、これに融合した、ガイドＣＥＲドメイン（配列番号１）をコードするＤＮＡ、これに融合したｓｕｐ４ターミネータ（配列番号８）を含有した。この構築体を含有するプラスミド、ｐＲＦ３０３（配列番号１０３）を用いて、（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと複合させた場合に）酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＣａｎ１遺伝子（配列番号２１）を標的として突然変異を誘発することができるＨＤＶリボザイム−ガイドＲＮＡ（配列番号１０４）をコードさせた。
【０２３０】
酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を、（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍ，Ｑｕｉｊａｎｏ  ＲＲ，Ｂｅｚｚａｔｅ  Ｓ，Ｂｏｒｄｏｎ−Ｐａｌｌｉｅｒ  Ｆ，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ．２００１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８３：３０９８−３１０７に記載されるように）プラスミドと形質転換せず、または１００ｎｇの、ｓｇＲＮＡ発現カセットを有していないプラスミド（ｐＲＦ２９１、配列番号９８）、ＲＧＲ発現カセットを有するｐＲＦ８４プラスミド（配列番号４１）、５’リボザイムがそれ自体をｓｇＲＮＡから除去するＲＧカセットを有するｐＲＦ８５プラスミド（配列番号４２）、もしくはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属においてＣａｎ１−１標的部位を標的とするＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ融合発現カセット（配列番号１０２）を有するｐＲＦ３０３（配列番号１０３）で形質転換した。形質転換体を、ウラシル原栄養性について選択し、アルギニン類似体カナバニンに対する表現型耐性によって、Ｃａｎ１遺伝子中の突然変異について記録した。ＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ融合体を発現するプラスミドは、Ｃａｎ１遺伝子における機能欠失突然変異を、リボザイムから遊離するｓｇＲＮＡを発現するプラスミドと同じ頻度で生じさせ、Ｃａｎ１−１を標的とするｓｇＲＮＡへのＨＤＶリボザイムの５’融合が、ｓｇＲＮＡ機能に影響を及ぼさなかったことが示唆される（表４）。
【０２３１】
【表１２】
2017522897.tif 000017
【０２３２】
いくつかの付加的な標的部位を標的とする可変ターゲティングドメインをコードするいくつかの付加的なＤＮＡフラグメント（表５）を、先に記載したのと同じ戦略を用いて、図１２Ａに示すｐＲＦ２９１（配列番号９８）プラスミド中にクローニングした。挙げられるのは、Ｃａｎ１遺伝子（配列番号１０５）内の、ｃａｎ１−２標的部位（配列番号１０６）、ならびに他の標的部位、例えばｓｏｕ２−１（配列番号１０７）、Ｓｏｕ２−２（配列番号１０８）、Ｔｇｌ１−１（配列番号１１２）、Ａｃｏｓ１０−１（配列番号１１３）、Ｆａｔ１−１（配列番号１１４）、およびＵｒａ３−１（配列番号１１６）を標的とする第２の標的部位を標的とする可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡフラグメントである。
【０２３３】
【表１３】
2017522897.tif 000018
【０２３４】
標的部位の突然変異頻度は、全てのＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ融合体が、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとの複合体を形成することができることを示し、この複合体は次に、各標的部位にて切断を生じさせて、ＮＨＥＪを介して突然変異をもたらした（表６）。
【０２３５】
【表１４】
2017522897.tif 000019
【０２３６】
実施例８：不活化Ｃａｓ９およびＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ融合体を用いた遺伝子サイレンシング。
ＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中に突然変異を含有する、触媒不活化Ｃａｓ９変異体（配列番号１１７）は、ｓｇＲＮＡと相互作用して、標的部位にインビボで結合することはできるが、標的ＤＮＡ鎖を切断することはできない。この作用様式（ＤＮＡに結合するが壊さない）を用いて、永続的な遺伝的変異を生じさせることなく、染色体中の特定の遺伝子座の発現を一時的に減少させることができる。
【０２３７】
酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）用の触媒不活化Ｃａｓ９発現カセットを生成するために、ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、記載されるように、プライマーＤ１０ＡＦ（ＧＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＴＧＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＧ、配列番号１１８）およびＤ１０ＡＲ（ＣＧＡＣＡＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣ、配列番号１１９）と共に用いて、Ｄ１０Ａ突然変異をプラスミドｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１４）に導入した。これにより、ＲｕｖＣヌクレアーゼを不活化するＤ１０Ａ突然変異を有するヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子（配列番号１２０）、および対応する、構築体を含有するプラスミド、ｐＲＦ１１１（配列番号１２１）が生成された。第２のヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨ）を不活化するために、プライマーＨ８４０Ａ１（ＴＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＴＧＴＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴ、配列番号１２２）およびＨ８４０Ａ２（ＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣＧＴＣＣＡＣＡＴＣＧＴＡＧＴＣＧＣＴＧＡ、配列番号１２３）を用いて、ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の追加のラウンドを実行して、Ｈ８４０Ａ突然変異をヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｄ１０Ａ遺伝子中に導入し、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９不活化遺伝子（配列番号１２４）、およびヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属における発現用の遺伝子を有するプラスミド、ｐＲＦ１４３（配列番号１２５）が生成された。
【０２３８】
酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における遺伝子サイレンシングを評価するために、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓオープンリーディングフレーム（配列番号１２６）を、５’ＮｃｏＩ制限部位および３’ＮｏｔＩ制限部位（配列番号１２７）を有するクローニングフラグメントとして生成した。クローニングフラグメント（配列番号１２７）を、ｐＺｕｆＣａｓ９のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位中にクローニングして、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓクローニングフラグメント（配列番号１２７）に融合したＦＢＡ１プロモータ（配列番号１２）を生じさせて、プラスミドｐＲＦ１６５（配列番号１２９）上に含有されるＦＡＢ１−ｄｓＲＥＤ融合カセット（配列番号１２８）を生成した。染色体中にＦＢＡ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓカセット（配列番号１２８）を組み込むために、カセットを含有するＰｍｅＩ−ＮｏｔＩフラグメント（配列番号１３０）を、組込み型プラスミドｐ２Ｐ０６９（配列番号１３１）のＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ部位中にライゲートして、ＦＢＡ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ発現カセット、ｐＲＦ２０１（配列番号１３２）を有する組込み型ベクターを生成した。ＦＢＡ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合体およびＬｅｕ２遺伝子（配列番号１３３）のコピーを有するｐＲＦ２０１のＳｐｈＩ／ＡｓｃＩフラグメントを、標準的な技術（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍ，Ｑｕｉｊａｎｏ  ＲＲ，Ｂｅｚｚａｔｅ  Ｓ，Ｂｏｒｄｏｎ−Ｐａｌｌｉｅｒ  Ｆ，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ．２００１．Ｔａｇｇｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８３：３０９８−３１０７）を用いて、ロイシン原栄養性について選択することによって、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の染色体中に組み込んだ。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ゲノムにおけるＦＢＡ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ発現カセットの存在を、標準的なＰＣＲ技術、ならびにプライマーＨＹ０２６（ＧＣＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＡＣＣ、配列番号１３４）およびＨＹ０２７（ＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＣＣＣＴ、配列番号１３５）を用いて確かめた。ＦＢＡ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓカセット（配列番号１２８）を含有する２つの独立した株、ＹＲＦ４１およびＹＲＦ４２を、更なる使用のために選択した。
【０２３９】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ発現カセット（配列番号１２８）を標的とするｓｇＲＮＡを生成するために、実施例１２に類似する戦略を用いた。プラスミド構築体、ｐＲＦ１６９（配列番号１３６）は、図１３Ａに示すように、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属カウンターセレクション可能なマーカー由来のＧＰＤプロモータ（配列番号１３７）、ガイドＲＮＡ  ＣＥＲドメインをコードするＤＮＡ（配列番号１）、およびＳｕｐ４ターミネータ（配列番号８）カセット（配列番号１３８）を含有した。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属において標的部位を標的とする、ＨＨリボザイムをコードするＤＮＡフラグメントに結合する、ｓｇＲＮＡの可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡを、実施例１２に示すように、ｐＲＦ１６９（配列番号１３６）中にクローニングした。但し、図１３Ｂに示すように、ＨＨリボザイムをコードするＤＮＡフラグメントは、ハンマーヘッドリボザイムの最初の６ヌクレオチドが、可変ターゲティングドメインの最初の６ヌクレオチドの逆相補体であるようにしたことを除く。正確な突出部を有する二重オリゴヌクレオチドが、ＡａｒＩ部位間のカウンターセレクションカセットを置換すると、リボザイム−ガイドＲＮＡ（ＲＧ）発現カセットが生じた（図１３Ａ）。転写されると、ＨＨリボザイムは、リボザイム−ガイドＲＮＡ分子から５’転写産物およびＨＨリボザイムそれ自体を除去して、細胞中でｓｇＲＮＡを無傷のままにする。ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓオープンリーディングフレーム（配列番号１２６）を標的とする３つのガイドＲＮＡを生成した；鋳型鎖を標的とする２つ、ｄｓ−ｔｅｍｐ−１（配列番号１３９）、ｄｓ−ｔｅｍｐ−２（配列番号１４０）、そして非鋳型鎖を標的とする１つ、ｄｓ−ｎｏｎｔｅｍｐ−１（配列番号１４１）。
【０２４０】
各標的部位について、標的特異的ハンマーヘッドリボザイム、可変ターゲティングドメイン（ＶＴＤ）、およびｐＲＦ１６９のＡａｒＩ部位中へのクローニング用の正確なオーバーラップ末端をコードするＤＮＡ配列を含有する２つのオリゴヌクレオチドを設計した。各部位用のオリゴヌクレオチド；ｄｓ−ｔｅｍｐ−１Ｆ（配列番号１４４）、ｄｓ−ｔｅｍｐ−１Ｒ（配列番号１４５）、ｄｓ−ｔｅｍｐ−２Ｆ（配列番号１４６）、ｄｓ−ｔｅｍｐ−２Ｒ（配列番号１４７）、ｄｓ−ｎｏｎｔｅｍｐ−１Ｆ（配列番号１４８）、およびｄｓ−ｎｏｎｔｅｍｐ−１Ｒ（配列番号１４９）を、ＡａｒＩ突出部中へのクローニング用の正確な突出部が、ｐＲＦ１６９の高スループットカセット中に残るように二重化して、二本鎖ＤＮＡ分子を形成し（図１３Ａおよび図１３Ｂ）、実施例１２に記載するように、ｐＲＦ２９１中へのクローニングを実行した。ｓｇＲＮＡの可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡフラグメントの挿入は、カウンターセレクションカセットを置換して、各標的部位用に新しいプラスミドを生じさせた。これは、ＧＰＤプロモータを有し、これにハンマーヘッドリボザイム−標的部位二重鎖ＤＮＡが融合し、これに、ガイドＲＮＡ  ＣＥＲドメインをコードするＤＮＡが融合し、これにＳｕｐ４ターミネータが融合する（図１３Ａ）。これらの二重鎖を含有するプラスミドは、ｐＲＦ２９６（ｄｓ−ｔｅｍｐ−１、配列番号１５０）、ｐＲＦ２９８（ｄｓ−ｔｅｍｐ−２、配列番号１５１）、ｐＲＦ３００（ｄｓ−ｎｏｎｔｅｍｐ−１、配列番号１５２）である。
【０２４１】
遺伝子サイレンシング用の構築体を生成するために、ｐＲＦ１４３（配列番号１２５）由来の不活化Ｃａｓ９を、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして、標準的な技術を用いて、ｐＲＦ２９６、ｐＲＦ２９８、およびｐＲＦ３００中にクローニングすると、これらのプラスミドのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位中に存在する機能的Ｃａｓ９（配列番号９３）が置換されて、プラスミドｐＲＦ３３９（配列番号１５３）、ｐＲＦ３４１（配列番号１５４）、およびｐＲＦ３４２（配列番号１５５）がそれぞれ生じた。
【０２４２】
株ＹＲＦ４１およびＹＲＦ４２を、標準的な技術を用いて、ｐＲＦ３３９、ｐＲＦ３４１およびｐＲＦ３４３でウラシル原栄養体に形質転換した（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍ，Ｑｕｉｊａｎｏ  ＲＲ，Ｂｅｚｚａｔｅ  Ｓ，Ｂｏｒｄｏｎ−Ｐａｌｌｉｅｒ  Ｆ，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ．２００１．Ｔａｇｇｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８３：３０９８−３１０７）。各形質転換について、１２の形質転換体を、ウラシルを欠くプレート上にストリークして精製して、プラスミドを維持した。各単離物を用いて、２ｍｌのＣＭ−ｕｒａブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ）に植菌して、３０℃、２５０ＲＰＭにて一晩増殖させた。一晩経ったそれぞれ２〜５μｌを、２００μｌのｄｄＨ２Ｏ中に希釈し、ＡｃｃｕｒｉフローサイトメータのｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓチャンネル内で分析し、各細胞内のｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質の量を評価した。各培養由来の７，１５１〜１０，０００個の細胞を分析した。ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ発現カセットのないヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞の平均蛍光を、分析した各培養体の平均蛍光から差し引いて、各株／プラスミド組合せ内の補正平均蛍光を得、これらを平均して標準偏差を求めた（表７）。発現ベクターを介して発現された、リボザイム−ｓｇＲＢＡ（ＲＧ）と組み合わせた不活化Ｃａｓ９は、対象の遺伝子を標的として、遺伝子の発現を２〜１０倍サイレンシングした。サイレンシングの倍数は、標的部位の位置および鎖の数（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）、ならびに／またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞において機能的な形態でＤＮＡポリメラーゼプロモータから発現される、リボザイムがフランキングするｓｇＲＮＡの能力に応じて変化した（表７）。
【０２４３】
【表１５】
2017522897.tif 000020
【０２４４】
実施例９：単一プラスミドから発現されるＣａｓ９およびＨＤＶリボザイム−ｓｇＲＮＡ融合（ＲＧ）を用いた正確な遺伝子編集。
この実施例において、発明者らは、同じ安定ベクターから発現されるＣａｓ９およびＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ融合体の安定した発現が、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の標的部位においてＤＮＡ二本鎖切断を生じさせることができ、相同組換えを介した正確な遺伝子編集のための担体となり得ることを実証する。
【０２４５】
実施例４に記載するＣａｎ１欠失ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡ（配列番号３８）を、標準的な技術を用いて、ＨｉｎＤＩＩＩで消化して、ｐＵＣ１８のＨｉｎＤＩＩＩ部位中にクローニングして、ｐＲＦ８０（配列番号１５６）を生成した。より短いＣａｎ１欠失編集鋳型（配列番号１５７）を、標準的なＰＣＲ技術、ならびにプライマー８０Ｆ（ＡＧＣＴＴＧＣＴＡＣＧＴＴＡＧＧＡＧＡＡ、配列番号１５８）および８０Ｒ（ＴＡＴＧＡＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＴＣＧ、配列番号１５９）を用いて、ｐＲＦ８０から増幅して、大量の編集鋳型を生成した。
【０２４６】
Ｕｒａ栄養要求性ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞を、標準的な技術（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍ，Ｑｕｉｊａｎｏ  ＲＲ，Ｂｅｚｚａｔｅ  Ｓ，Ｂｏｒｄｏｎ−Ｐａｌｌｉｅｒ  Ｆ，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  Ｃ．２００１．Ｔａｇｇｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８３：３０９８−３１０７）を用いて、１００ｎｇの、Ｃａｓ９遺伝子のコピーを有するがｓｇＲＮＡを有していないプラスミドｐＲＦ２９１、ならびにＣａｓ９遺伝子のコピーおよびＣａｎ１−１標的部位ＨＤＶ−ｓｇＲＮＡ発現カセットを有するｐＲＦ３０３（編集鋳型ＤＮＡも１０００ｎｇの短Ｃａｎ１欠失編集鋳型（配列番号１５７）も伴わない）で形質転換した。形質転換体を、ＣＭ−ｕｒａ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）上で選択した。各形質転換について、２０のコロニーをそれぞれ、ＣＭ−ｕｒａ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）上にストリークして精製した。ストリーク精製した各コロニーから、それぞれ４つのコロニー（形質転換あたり合計８０）を、６０μｇ／ｍｌのＬ−カナバニンを含有するＣＭ−ａｒｇプレート上にパッチして、Ｃａｎ１遺伝子中の機能対立遺伝子の欠失を含有するコロニーについてスクリーニングした。カナバニンに対する耐性を実証したパッチを記録し、そして遺伝子不活化の頻度を記録した（表８）。どのコロニーが、相同組換えのためにＣａｎ１機能を欠失したか、そしてどのコロニーが、ＮＨＥＪのためにＣａｎ１機能を欠失したかを判定するために、Ｃａｎ１遺伝子座（配列番号１６０）を、Ｃａｎ１−ＰＣＲＦ（ＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＧ、配列番号２２）およびＣａｎ１−ＰＣＲＲ（ＧＴＡＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＣＡＧＧ、配列番号２３）を用いて増幅した。先の実施例において記載する小さなｉｎｄｅｌを有する細胞において、ＰＣＲ産物は、Ｃａｎ１欠失編集鋳型との相同組換えによる欠失を含有する株中のＷＴ  Ｃａｎ１遺伝子座（配列番号１６０）とサイズが非常に類似するはずである（２１２５ｂｐ）。Ｃａｎ１−ＰＣＲＦ（配列番号２２）およびＣａｎ１−ＰＣＲＲ（配列番号２３）によるＰＣＲフラグメント（配列番号１６１）は、より小さいであろう（３９２ｂｐ）。ＰＣＲ産物の２μｌを、標準的な技術を用いて、電気泳動を介して分離して、画像化した（図１４）。編集鋳型（配列番号１６１）による組換えに対応する短いバンドを有する、ストリーク精製直後に１つまたは複数のコロニーを産出した当初の２０のストリークしたコロニーのパーセンテージを用いて、ＨＲの頻度を判定した（表８）。ｐＲＦ３０３（配列番号１０３）を受け取った細胞において、カナバニン耐性コロニーの頻度は、細胞が編集鋳型を受け取ったかどうかに拘らず、類似した（表８）。形質転換細胞の総集団中のｐＲＦ３０３（配列番号１０３）およびＣａｎ１短編集鋳型（配列番号１５７）の双方を受け取った細胞において、約１０分の１は、編集鋳型（配列番号１５７）由来のＣａｎ１遺伝子座の正確な編集（表８）を含有した。
【０２４７】
【表１６】
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【０２４８】
実施例１０：ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＵＲＡ３遺伝子不活化
本実施例は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＵＲＡ３遺伝子不活化用の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼを別々に、または一緒に発現するプラスミドの構築および使用を記載する。ｐＹＲＨ２３５およびｐＹＲＨ２３６はそれぞれ、ＵＲＡ３．１標的配列（５’−ｃｔｇｔｔｃａｇａｇａｃａｇｔｔｔｃｃｔ−３；配列番号１６５）を標的とする、リボザイムがフランキングするプレｓｇＲＮＡ（ＲＧＲ−ＵＲＡ３．１；配列番号１６４）、およびＵＲＡ３．２標的配列（５’−ｔａａｃａｔｃｃａｇａｇａａｇｃａｃａｃ−３’；配列番号１６７）を標的とする、リボザイムがフランキングするプレｓｇＲＮＡ（ＲＧＲ−ＵＲＡ３．２；配列番号１６６）を発現した。ＲＧＲ−ＵＲＡ３．１をコードするＤＮＡフラグメントのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ制限消化フラグメント、およびＲＧＲ−ＵＲＡ３．２をコードするＢｓｐＨＩ−ＮｏｔＩ制限消化フラグメントを、ＦＢＡ１Ｌプロモータ（配列番号１６８）に融合して、ｐＹＲＨ２３５およびｐＹＲＨ２３６をそれぞれ生成した。ｐＹＲＨ２３５およびｐＹＲＨ２３６プラスミドは、スルホニルウレア耐性を付与する単一アミノ酸変化（Ｗ４９７Ｌ）を有する、在来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳまたはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８；配列番号１６９）のマーカー遺伝子を含有した。
【０２４９】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属株ＡＴＣＣ２０３６２のＵｒａ−マイナス誘導体（Ｙ２２２４）を最初に、ＳｐｈＩ−ＢｓｉＷＩ制限消化によって、線状化したｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１４）で形質転換し、形質転換体を、ウラシルを欠く完全最小（ＣＭ）プレート上で選択した。線状化Ｃａｓ９発現カセットを、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ゲノム中にランダムに組み込んだので、形質転換体は少なくとも２コピーのＵＲＡ３遺伝子を含有した。続いて、ｓｇＲＮＡを発現するｐＹＲＨ２３５またはｐＹＲＨ２３６を、Ｃａｓ９発現ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属株中に形質転換して、形質転換体を、６００ｍｇ／Ｌスルホニルウレアを含有するＣＭプレート上で選択した。５０の形質転換体を、ＣＭ−ｕｒａプレートおよび５−ＦＯＡを有するＳＣプレート上にパッチして、ＵＲＡ３について、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡによるＵＲＡ３遺伝子不活化の頻度を見出した。ｐＹＲＨ２３５およびｐＹＲＨ２３６形質転換体のそれぞれ９４％および１００％が、ウラシル栄養要求体になった。
【０２５０】
標的部位ＵＲＡ３．１またはＵＲＡ３．２での突然変異の、配列決定による確認を実行した。ｐＺｕｆＣａｓ９およびｐＹＲＨ２３５の２０の形質転換体を、配列決定分析のためにランダムに選択して、各コロニーを、プラスミドｐＺｕｆＣａｓ９のＵＲＡ３遺伝子の突然変異について、在来ゲノムＵＲＡ３から分析した。プラスミドｐＺｕｆＣａｓ９由来のＵＲＡ３遺伝子を配列決定するために、ＵＲＡ３用のプライマーＲＨＯ７０５（配列番号１７０）およびＦＢＡ１プロモータ配列用のＲＨＯ７１９（配列番号１７１）を、当該領域のＰＣＲ増幅に用い、プライマーＲＨＯ７３３（配列番号１７２）またはＲＨＯ７３４（配列番号１７３）を、ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした配列決定に用いた。在来ゲノム起源のＵＲＡ３遺伝子を配列決定するために、プライマーＲＨＯ７０５（配列番号１７０）およびＲＨＯ７０７（配列番号１７４）をＰＣＲ増幅に用い、プライマーＲＨＯ７３３（配列番号１７２）およびＲＨＯ７３４（配列番号１７３）を、ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした配列決定に用いた。２０コロニーは全て、プラスミド起源のＵＲＡ３遺伝子およびゲノム起源のＵＲＡ３遺伝子の双方で突然変異を含有した（図１５）。５つの代表的なコロニーのプラスミド起源のＵＲＡ３遺伝子およびゲノム起源のＵＲＡ３遺伝子の双方（コロニー１、２、３、５、および６；それぞれ配列番号１７６、１７７、１７８、１７９、および１８０、ならびに配列番号１８１、１８２、１８３、１８４、および１８５）、および野生型ＵＲＡ３．１（配列番号１７５）の配列決定結果のフラグメントアラインメントを、図１５に示す。これらの結果は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属において、同じ細胞中の遺伝子の多重コピーが、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ系によって標的とされ、かつ突然変異したことを示す。
【０２５１】
実施例１１：ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＵＲＡ３遺伝子の突然変異または欠失。
本実施例は、マーカーリサイクルに用いる、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＵＲＡ３遺伝子の突然変異または欠失について、同じベクター系上で２つのｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼを発現するプラスミドの構築および使用を記載する。
【０２５２】
ｐＹＲＨ２２２は、ＦＢＡ１プロモータ（配列番号１２）下のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（配列番号１０）、および、ＵＲＡ３．２標的配列（配列番号１６７）を標的とする、リボザイムがフランキングするプレｓｇＲＮＡ（ＲＧＲ−ＵＲＡ３．２；配列番号１６６）をコードするＦＢＡ１Ｌプロモータ駆動ＤＮＡフラグメントを発現する（図１６Ａに示す）。ｐＹＲＨ２２２ベクターは、ハイグロマイシン抗生物質耐性選択マーカー（配列番号１８６）を含有し、これは、ＴＤＨ１（ＧＰＤとも呼ぶ）プロモータ（配列番号１８７）、および自己複製配列（ＡＲＳ１８；配列番号２０８）（プラスミドの染色体外の複製を調整する（ＰＮＡＳ，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，９０：４９１２−４９１６））の下で発現した。ＡＲＳ１８が存在すると、選択圧がない場合に、細胞はプラスミドを失った。
【０２５３】
ｐＹＲＨ２８２は、ｐＹＲＨ２２２に由来した。ｐＹＲＨ２３５由来のＲＧＲ−ＵＲＡ３．１（配列番号１６４）をコードするＤＮＡフラグメントに融合したＦＢＡ１Ｌプロモータ（配列番号１６８）を、プライマーＲＨＯ８０４（配列番号１８８）およびＲＨＯ８０５（配列番号１８９）を用いてＰＣＲ増幅した。その後、ＰＣＲ産物を、ＢｓｉＷＩで消化して、ｐＹＲＨ２２２中にクローニングした。クローニングした遺伝子の向きおよび配列同一性を、配列決定によって確かめ、構築体をｐＹＲＨ２８２と名付けた。
【０２５４】
ｐＹＲＨ２８３は、ｐＹＲＨ２２２に由来した。ＲＧＲ−ＵＲＡ３．３（配列番号１９１）をコードするＤＮＡに融合したＴＤＨ１プロモータ（配列番号１８７）で構成されるＢｓｉＷＩ部位（配列番号１９０）がフランキングする合成ＤＮＡフラグメントを、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）によって合成して、ｐＹＲＨ２２２中にＢｓｉＷＩ部位にてクローニングした。クローニングした遺伝子の向きおよび配列同一性を、配列決定によって確かめ、構築体をｐＹＲＨ２８３と名付けた。
【０２５５】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属株ＡＴＣＣ２０３６２の後代を、ｐＹＲＨ２２２、ｐＹＲＨ２８２、およびｐＹＲＨ２８３で形質転換して、形質転換体を、３００ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含有するＹＰＤプレート上で選択した。バックグラウンドの比較的高い増殖は、ＤＮＡなしコントロールのプレート上で観察されなかった（表９）。各構築体の３０の形質転換体をランダムに選択して、５−ＦＯＡを有するＳＣプレート上にストリークして、ウラシル栄養要求体についてカウンターセレクトした。ＤＮＡなしコントロールプレート由来のコロニーで、増殖は観察されなかった。４〜１１のパッチが、ｐＹＲＨ２２２、ｐＹＲＨ２８２、およびｐＹＲＨ２８３形質転換体で増殖を示した。コロニーＰＣＲを、プライマーＲＨＯ６１０（配列番号１９２）およびＲＨＯ６１１（配列番号１９３）で実行して、ｓｇＲＮＡターゲティング部位を含有するＤＮＡ領域を増幅し、ＰＣＲ増幅された産物は、アガロースゲル上で異なる移動を示した（図１７）。配列決定を、鋳型としてのＰＣＲ産物および配列決定プライマーＲＨＯ７０４（配列番号１９４）で実行した。
【０２５６】
ｐＹＲＨ２２２形質転換体の場合において、１１のうち６体を首尾よく配列決定でき、それらの全てが、ＵＲＡ３．２標的部位にて突然変異していた（図１６Ｂ；配列番号１９５〜２０１）。ｐＹＲＨ２８２の場合において、首尾よく配列決定できたものは全て、標的部位にて突然変異を示し、それらのうち２つは、２つの標的部位間で欠失を示した（図１６Ｃ；配列番号２０２〜２０４）。ｐＹＲＨ２８３について、首尾よく配列決定できた８つのうち７つは、標的部位にて突然変異を示し、それらのうち２つは、２つの標的部位間で欠失を示し（図１６Ｄ；配列番号２０５〜２０７）、ＵＲＡ３遺伝子のほぼ完全な欠失が生じた。
【０２５７】
この実施例は、２つのガイドＲＮＡが、同じプラスミド上で発現して、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ系を用いて、２つの標的部位間で標的欠失をもたらした。同定を、ゲル上でのランによって、または配列決定によって実行した。これらのプラスミド上にＡＲＳ１８（配列番号２０８）が存在すると、選択圧がない場合に、細胞はプラスミドを失うので、プラスミドは、ＵＲＡ３マーカーリサイクルに繰り返し用いることができた。
【０２５８】
【表１７】
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【０２５９】
実施例１２：遺伝子不活化のための、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣｓｙ４（Ｃａｓ６）の使用
本実施例は、非従来型酵母におけるＤＮＡ配列（例えば、限定されないが、ＣＡＮ１）を標的とすることができるＲＧＥＮ複合体を形成することができる、５’キャップのないガイドＲＮＡを生じさせるための、Ｃｓｙ４（Ｃａｓ６とも呼ばれる）の使用を記載する。
【０２６０】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１遺伝子不活化のために、Ｃｓｙ４（Ｃａｓ６としても知られている）をコードする遺伝子を、Ｃａｓ９発現プラスミド上に、２８ｂｐ  Ｃｓｙ４認識部位がフランキングするＣＡＮ１ターゲティングｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡと一緒に導入した。
【０２６１】
ｐＹＲＨ２９０は、ＦＢＡ１プロモータ（配列番号１２）下のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（配列番号１０）を、そしてＦＢＡ１プロモータ（配列番号２１０）下の、Ｃｓｙ４発現（配列番号２０９）用酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化遺伝子を発現した。ｐＹＲＨ２９０もまた、ＣＡＮ１標的配列（配列番号２１４）を標的とする、２８ｂｐ  Ｃｓｙ４エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号２１２）がフランキングするプレｓｇＲＮＡ（配列番号２１３）をコードするＤＮＡフラグメント（ＴＤＨ１：２８ｂｐ−ｇＣＡＮ１−２８ｂｐ；配列番号２１１）を含有した。Ｃｓｙ４によるプロセシングの後、生じたｓｇＲＮＡ（配列番号２２２）は、８ヌクレオチド５’フランキング配列（配列番号２２３）および２０ヌクレオチド３’フランキング配列（配列番号２２４）を含有した。
【０２６２】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属株ＡＴＣＣ２０３６２のＵｒａ−マイナス誘導体（Ｙ２２２４）を、ｐＹＲＨ２９０で形質転換して、形質転換体を、ウラシルを欠くＣＭプレート上で選択した。８６の形質転換体を、カナバニンを含有するＣＭプレートにレプリカプレーティングして、ｃａｎ１突然変異体について選択した。８６の形質転換体のうち４０は、カナバニンを含有するＣＭプレート上で増殖がもたらされた。ＣＡＮ１標的部位（配列番号２１４）での突然変異を確かめるために、４０のカナバニン耐性コロニーのうち１６を配列決定し、１４のコロニーはＣＡＮ１標的部位に突然変異を有することが確かめられた。図１８は、ＣＡＮ１標的部位（配列番号２１５）、ならびに、コロニー１４、１６、１８、１９、２４、および２５におけるＣＡＮ１標的配列での突然変異（それぞれ配列番号２１６〜２２１）を含む野生型ＣＡＮ１遺伝子のフラグメントのアラインメントを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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