(57)【要約】非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ｎｃｍｔＲＮＡ）、特に、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）に由来するＲＮＡ分子を作製する方法、単離されたＲＮＡ分子を含有する組成物、細胞をＲＮＡ分子と接触させることによりがん細胞においてアポトーシスを引き起こす方法、ＲＮＡ分子をそれを必要とする被験体に投与することによりがんまたは前がんを処置する方法、およびＲＮＡ分子をそれを必要とする被験体に投与することによりがん幹細胞を除去する方法が、本明細書において提供される。
2017508467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＲＮＡ分子を調製する方法であって、
（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、該１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、
（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、
（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに
（ｄ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、前記単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップ
を含む方法。
【請求項２】
ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子が、配列番号１６４、配列番号１６５、および配列番号１６６からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単離されたＲＮＡ分子が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記単離されたＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列から本質的になる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列から本質的になる、請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列からなる、請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される単離されたＲＮＡ分子。
【請求項１５】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する配列に対応する配列を含む、単離されたＲＮＡ分子。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列を含む合成ＲＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列から本質的になる合成ＲＮＡ分子。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列からなる合成ＲＮＡ分子。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列を含む合成ＤＮＡ分子。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列から本質的になる合成ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列からなる合成ＤＮＡ分子。
【請求項２２】
請求項５に記載の調製されたＲＮＡ分子と同一の１種超の配列を含む、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット。
【請求項２３】
ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の配列を含む、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットであって、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、該１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子の該セットをもたらすステップを含む方法により調製される、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット。
【請求項２４】
請求項１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または請求項１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
薬学的に許容されるビヒクルを含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす方法であって、該腫瘍細胞を、請求項１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または請求項１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子と接触させるステップを含む方法。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞を接触させるステップが、アポトーシスに関与する、該腫瘍細胞におけるタンパク質の発現の阻害をもたらし、該タンパク質の発現の阻害が、該腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が、サバイビン、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ＦＫＢＰ３８、Ｎ−カドヘリン、およびカベオリンからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験体においてがんを処置する方法であって、それを必要とする該被験体に、治療有効量の、請求項１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または請求項１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または請求項２４もしくは２５に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
前記がんが、血液系のがんまたは固形腫瘍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１種または複数種のＲＮＡ分子または医薬組成物を投与するステップが、アポトーシスに関与する、前記腫瘍細胞におけるタンパク質の発現の阻害をもたらし、該タンパク質の発現の阻害が、該腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が、サバイビン、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ＦＫＢＰ３８、Ｎ−カドヘリン、およびカベオリンからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または請求項１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または請求項２４もしくは２５に記載の医薬組成物を含む、がんの処置において使用するためのキット。
【請求項３４】
前記１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または前記医薬組成物の使用のための指示を含む、請求項３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年３月１４日に出願された米国仮出願第６１／９５３，６７２号の優先権の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、単離されたＲＮＡ分子、それを作製する方法、および種々のがんを処置するためのその使用を提供する。かかるＲＮＡ分子および均等物は、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡがプロセッシングされて、中間ＲＮＡ分子、および完全にプロセッシングされたミトコンドリアマイクロＲＮＡをもたらすことにより調製される。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのがんの進行に関与するいくつかの基礎的な原理が存在する。これらは、持続性増殖、不死、成長抑制因子に対する不応性、細胞死に対する抵抗性、浸潤および転移の血管新生能および誘導、ゲノム不安定性、変異、および炎症による促進を含む。がんのかかる顕著な特徴は、種々の経路および機序ががん性細胞をもたらすように、種々の原因および作用の結果である。多くのがんは容易に処置可能であるが、多くの種類の処置に抵抗性であるがんもある。多くのがんに適用可能であるが、正常な細胞に関して副作用をほとんど生じない処置を見出すことが、がん治療の途方もないゴールである。
【０００３】
固有ファミリーの非コードキメラミトコンドリアの長鎖ｎｃＲＮＡ（ｎｃｍｔＲＮＡ）のヒト細胞における差次的発現が認められている。これらのｎｃｍｔＲＮＡは、ステムループ構造を含有する（Villegasら、Nucleic  Acids  Res.、３５巻、７３３６〜７３４７頁、２００７年、Burzioら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、１０６巻、９４３０〜９４３４頁、２００９年）。これらの転写物はまた、ミトコンドリアから細胞質および核に抜け出る（Landererら、Cell  Oncol.、３４巻、２９７〜３０５頁、２０１１年）。１つのかかる転写物、センスｎｃｍｔＲＮＡ（ＳｎｃｍｔＲＮＡ）は、正常な増殖細胞において、および腫瘍細胞において発現されるが、休止細胞において発現されない（Villegasら、上記参照、Burzioら、上記参照、Villotaら、J.  Biol.  Chem.、２８７巻、２１３０３〜２１３１５頁、２０１２年）。正常ヒト増殖細胞はまた、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ、これは、複数の腫瘍細胞株、および異なる患者由来の１７種のがん生検に存在する腫瘍細胞においてダウンレギュレーションされる）も発現する（Burzioら、上記参照）。ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのこのダウンレギュレーションは、がんの別の顕著な特徴を表す（Hannahanら、Cell、１４４巻、６４６〜６７４頁、２０１１年）。ＡＳｎｃｍｔＲＮＡに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、正常細胞に影響することなく、ＨｅＬａ細胞およびいくつかの他の腫瘍細胞株の増殖を低減することが示された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Villegasら、Nucleic  Acids  Res.、３５巻、７３３６〜７３４７頁、２００７年
【非特許文献２】Burzioら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、１０６巻、９４３０〜９４３４頁、２００９年
【非特許文献３】Landererら、Cell  Oncol.、３４巻、２９７〜３０５頁、２０１１年
【非特許文献４】Villegasら、上記参照、Burzioら、上記参照、Villotaら、J.  Biol.  Chem.、２８７巻、２１３０３〜２１３１５頁、２０１２年
【非特許文献５】Hannahanら、Cell、１４４巻、６４６〜６７４頁、２０１１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
全種類のがんに対して使用され得るがん細胞のかかる脆弱性は、万能ながん処置の発見に一歩近づくことになり得る。ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのダウンレギュレーションのこの作用の衝撃は、事実上全てのがんにおいて働くであろう、処置の選択肢の可能性をもたらす。したがって、ヒトがんのこの脆弱性を利用する能力があるさらなる核酸分子を得ることが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
とりわけ、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ｎｃｍｔＲＮＡ）、特に、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）に由来するＲＮＡ分子を作製する方法、単離されたＲＮＡ分子を含有する組成物、細胞をＲＮＡ分子と接触させることによりがん細胞においてアポトーシスを引き起こす方法、ＲＮＡ分子をそれを必要とする被験体に投与することによりがんまたは前がんを処置する方法、およびＲＮＡ分子をそれを必要とする被験体に投与することによりがん幹細胞を除去する方法が、本明細書において提供される。
【０００７】
したがって、一態様では、単離されたＲＮＡ分子を調製する方法であって、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせる、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｄ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法が、本明細書において提供される。
【０００８】
別の態様では、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される、単離されたＲＮＡ分子が、本明細書において提供される。
【０００９】
別の態様では、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に類似の配列を含む、単離されたＲＮＡ分子であって、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、逆反復配列を有するポリヌクレオチドのその５’末端から３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される、単離されたＲＮＡ分子が、本明細書において提供される。
【００１０】
別の態様では、合成マイクロＲＮＡ分子またはその合成ＤＮＡ類似体が本明細書において提供され、合成マイクロＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に類似の配列を含み、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される。
【００１１】
別の態様では、１種または複数種の単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物であって、前記単離されたＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよび５’エキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される、医薬組成物が、本明細書において提供される。
【００１２】
別の態様では、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に類似する配列を含む、１種または複数種の単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物であって、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される、医薬組成物が、本明細書において提供される。
【００１３】
別の態様では、１種または複数種の合成マイクロＲＮＡ分子またはその合成ＤＮＡ類似体を含む医薬組成物であって、前記１種または複数種のＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に類似する配列を含み、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される、医薬組成物が、本明細書において提供される。
【００１４】
別の態様では、腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす方法であって、腫瘍細胞を、本明細書に記載の、１種もしくは複数種の単離されたＲＮＡ分子または１種もしくは複数種の単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物と接触させるステップを含む方法が、本明細書において提供される。
【００１５】
別の態様では、被験体においてがんもしくは前がんを処置する、またはがん幹細胞を除去するための方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量の、本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子もしくは単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。
【００１６】
別の態様では、本明細書に記載の、単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を含む、がんの処置において使用するためのキットが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、キットは、がんの処置における、単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物の使用のための指示を含む。
【００１７】
別の態様では、本明細書に記載の、単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物の単位投薬形態を含む容器、およびがんの処置における単離されたＲＮＡ分子の使用のための指示を含有するラベルのような製造品が、本明細書において提供される。
【００１８】
別の態様では、がんの処置における使用のための、本明細書に記載の、単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
【００１９】
別の態様では、がんの処置用医薬品の製造における使用のための、本明細書に記載の、単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１は、配列番号１のＤＮＡ配列（図１Ａ）、および配列番号１に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６１、図１Ｂ）を提供する図である。
【図１Ｂ】図１は、配列番号１のＤＮＡ配列（図１Ａ）、および配列番号１に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６１、図１Ｂ）を提供する図である。
【００２１】
【図２Ａ】図２は、配列番号２のＤＮＡ配列（図２Ａ）、および配列番号２に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６２、図２Ｂ）を提供する図である。
【図２Ｂ】図２は、配列番号２のＤＮＡ配列（図２Ａ）、および配列番号２に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６２、図２Ｂ）を提供する図である。
【００２２】
【図３Ａ】図３は、配列番号３のＤＮＡ配列（図３Ａ）、および配列番号３に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６３、図３Ｂ）を提供する図である。
【図３Ｂ】図３は、配列番号３のＤＮＡ配列（図３Ａ）、および配列番号３に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６３、図３Ｂ）を提供する図である。
【００２３】
【図４Ａ】図４は、配列番号４のＤＮＡ配列（図４Ａ）、および配列番号４に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６４、図４Ｂ）を提供する図である。
【図４Ｂ】図４は、配列番号４のＤＮＡ配列（図４Ａ）、および配列番号４に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６４、図４Ｂ）を提供する図である。
【００２４】
【図５Ａ】図５は、配列番号５のＤＮＡ配列（図５Ａ）、および配列番号５に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６５、図５Ｂ）を提供する図である。
【図５Ｂ】図５は、配列番号５のＤＮＡ配列（図５Ａ）、および配列番号５に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６５、図５Ｂ）を提供する図である。
【００２５】
【図６Ａ】図６は、配列番号６のＤＮＡ配列（図６Ａ）、および配列番号６に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６６、図６Ｂ）を提供する図である。
【図６Ｂ】図６は、配列番号６のＤＮＡ配列（図６Ａ）、および配列番号６に対応するＲＮＡ配列（配列番号１６６、図６Ｂ）を提供する図である。
【００２６】
【図７】図７は、ループ領域（図７Ａ）または３’一本鎖ステム領域（図７Ｂ）に相補的なオリゴヌクレオチドを使用する、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子のプロセッシングの略図を提供する図である。
【００２７】
【図８】図８は、ループ領域（１５３７Ｓ）または３’一本鎖ステム領域（１２６Ｓ、５５２Ｓ、もしくは１１０７Ｓ）に相補的な典型的なオリゴヌクレオチドの略図を提供する図である。
【００２８】
【図９】図９は、３種の細胞株、がん細胞ＨｅＬａ（図９Ａ）、およびＳＫ−ＭＥＬ−２（図９Ｃ）、および正常ＨＦＫ細胞（図９Ｂ）における、ＡＳＯ−１５３７Ｓでのトランスフェクション後のポリアクリルアミドゲル上でのＡＳ−１またはＡＳ−２ＲＮＡのノックダウンを示す図である。
【００２９】
【図１０】図１０は、処置なし、またはＡＳＯ−Ｃ（対照）が、もしくは非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の細胞増殖を示す図である。
【００３０】
【図１１】図１１は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）が、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞に取り込まれた５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）の相対量を示す図である。
【００３１】
【図１２】図１２は、処理されていない（ＮＴ）、５０ｎＭ、７５ｎＭ、もしくは１００ｎＭ  ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または５０ｎＭ、７５ｎＭ、もしくは１００ｎＭ  非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた％トリパンブルー陽性ＨｅＬａ細胞を示す図である。
【００３２】
【図１３】図１３は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）が、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡの３’ステム領域に相補的なＡＳＯ−１２６Ｓ、ＡＳＯ−５５２Ｓ、もしくはＡＳＯ−１１０７Ｓがトランスフェクトされた％トリパンブルー陽性ＨｅＬａ細胞を示す図である。
【００３３】
【図１４】図１４は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた３種の正常細胞株、ＨＵＶＥＣ（図１４Ａ）、ＨＲＥＣ（図１４Ｂ）、およびＨｎＥＭ（図１４Ｃ）における％トリパンブルー（Ｔｂ）陰性細胞を示す図である。
【００３４】
【図１５】図１５は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジンで処理されたＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリーによる細胞分析を示す図である。細胞は、蛍光プローブテトラメチルローダミンメチルエステルでの処理後に添加されて、ミトコンドリア膜電位ΔΨｍの消散が評価された。
【００３５】
【図１６】図１６は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジンで処理されたＨｅＬａ細胞についてのΔΨｍの％消散（棒の白色部分）を示す図である。
【００３６】
【図１７】図１７は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラジンで処理されたＤＵ１４５（図１７Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１７Ｂ）、またはＨ２９２（図１７Ｃ）細胞のフローサイトメトリーを示す図である。細胞は、蛍光プローブテトラメチルローダミンメチルエステルでの処理後に添加されて、ΔΨｍの消散が評価された。
【００３７】
【図１８】図１８は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてスタウロスポリン（ＳＴＰ）で処理されたＨｅＬａ細胞におけるチトクロムｃおよびβ−アクチンのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００３８】
【図１９】図１９は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてスタウロスポリン（ＳＴＰ）で処理されたＨｅＬａ細胞における％カスパーゼ陽性細胞を示す図である。
【００３９】
【図２０】図２０は、カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋでの事前処理ありまたはなしの、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または、陽性対照としてスタウロスポリン（ＳＴＰ）で処理されたＨｅＬａ細胞における％ヨウ化プロピジウム陽性細胞を示す図である。
【００４０】
【図２１】図２１は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてスタウロスポリン（ＳＴＰ）で処理されたＨｅＬａ細胞における％アネキシンＶ陽性細胞を示す図である。
【００４１】
【図２２】図２２は、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して、あるいは４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色された、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてＤｎａｓｅ  Ｉで処理されたＨｅＬａ（２２Ａ）またはＨＦＫ（２２Ｂ）細胞を示す図である。
【００４２】
【図２３】図２３は、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅｐＧ２、ＳｉＨａ、ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＯＶＣＡＲ−３、ＳＫ−ＭＥＬ−２、Ｃａｃｏ−２、Ａ４９８、およびＵ８７のがん細胞株における％ＴＵＮＥＬ陽性細胞を示す図である。
【００４３】
【図２４】図２４は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてスタウロスポリン（ＳＴＰ）で処理されたＨｅＬａ細胞についての細胞のサブＧ１画分を評価するためのフローサイトメトリー結果を示す図である。
【００４４】
【図２５】図２５は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてスタウロスポリン（staurosorine）（ＳＴＰ）で処理されたＨｅＬａ細胞についての細胞のサブＧ１画分を評価するためのトリプリケート分析のフローサイトメトリー結果を示す図である。
【００４５】
【図２６】図２６は、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた、または陽性対照としてスタウロスポリン（ＳＴＰ）で処理されたＨＦＫ細胞についての細胞のサブＧ１画分を示す図である。
【００４６】
【図２７】図２７は、４種のがん細胞株、ＳＫ−ＭＥＬ−２（図２７Ａ）、ＯＶＣＡＲ−３（図２７Ｂ）、ＨｅＬａ（図２７Ｃ）、およびＳｉＨａ（図２７Ｄ）における、処理されていない（ＮＴ）およびＡＳＯ−Ｃで処理された細胞についての３つのウェルの平均における５０μｍを超えるコロニーの数、ならびにＡＳＯ−１５３７Ｓで処理された細胞についての全３つのウェルについてのかかるコロニーの総数を示す図である。
【００４７】
【図２８】図２８は、２４時間（図２８Ａ）、または３、８、および２２時間における（図２８Ｂ）、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるサバイビンならびにβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００４８】
【図２９】図２９は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるβ−アクチンに正規化されたサバイビン発現を示す図である。
【００４９】
【図３０】図３０は、プロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２（図３０Ａ）またはカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（図３０Ｂ）での事前処理ありまたはなしの、２４時間、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるサバイビンおよびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００５０】
【図３１】図３１は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、ＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるサバイビンｍＲＮＡの相対的発現を示す図である。
【００５１】
【図３２】図３２は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、またはＡＳＯ−Ｃ（対照）、もしくは非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた３種のがん細胞株、ＰＣ３（図３２Ａ）、ＯＶＣＡＲ−３（図３２Ｂ）またはＨ２９２（図３２Ｃ）におけるサバイビンおよびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００５２】
【図３３】図３３は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、またはＡＳＯ−Ｃ（対照）、もしくは非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓがトランスフェクトされた２種のがん細胞株、ＳＫ−ＭＥＬ−２（図３３Ａ）またはＰＣ３（図３３Ｂ）におけるＢｃｌ−２およびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００５３】
【図３４】図３４は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、またはＡＳＯ−Ｃ（対照）、もしくは非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるサイクリンＤ１およびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図（図３４Ａ）である。図３４Ｂは、β−アクチンに正規化されたサイクリンＤ１発現を示す図である。
【００５４】
【図３５】図３５は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、あるいはＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓ、もしくは非コードキメラミトコンドリアＲＮＡの３’一本鎖ステム領域の相補的なＡＳＯ−２２６ＳがトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるサイクリンＢ１およびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図（図３５Ａ）である。図３５Ｂは、β−アクチンに正規化されたサイクリンＢ１発現を示す図である。
【００５５】
【図３６】図３６は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、またはＡＳＯ−Ｃ（対照）、もしくは非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７ＳがトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるＮ−カドヘリン、カベオリン、およびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００５６】
【図３７】図３７は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、あるいはＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓ、もしくは非コードキメラミトコンドリアＲＮＡの３’一本鎖ステム領域に相補的なＡＳＯ−２２６ＳがトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるＢｃｌ−２（図３７Ａ）、シャペロンＦＫＢＰ３８（図３７Ｂ）、およびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００５７】
【図３８】図３８は、２４時間、処理されていない（ＮＴ）、あるいはＡＳＯ−Ｃ（対照）、または非コードキメラミトコンドリアＲＮＡのループ領域に相補的なＡＳＯ−１５３７Ｓ、もしくは非コードキメラミトコンドリアＲＮＡの３’一本鎖ステム領域に相補的なＡＳＯ−２２６ＳがトランスフェクトされたＰＣ３細胞におけるＢｃｌ−２（図３８Ａ）、あるいはシャペロンＦＫＢＰ３８（図３８Ｂ）およびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００５８】
【図３９】図３９は、処理されていない（ＮＴ）、あるいはＡＳＯ−Ｃ（対照）、またはＡＳＯ−１５３７Ｓ、もしくはＡＳＯ−ＣおよびＡＳＯ−１５３７Ｓのペプチド性核酸（ＰＮＡ）類似体がトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞における相対的増殖（図３９Ａ）および％トリパンブルー（Ｔｂ）陽性細胞（図３９Ｂ）を示す図である。
【００５９】
【図４０】図４０は、処理されていない（ＮＴ）、あるいはＡＳＯ−Ｃ（対照）、またはＡＳＯ−１５３７Ｓ、もしくはＡＳＯ−ＣおよびＡＳＯ−１５３７Ｓのペプチド性核酸（ＰＮＡ）類似体がトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるＲＴ−ＰＣＲによるＡＳ−１およびＡＳ−２レベルを示す図である。
【００６０】
【図４１】図４１は、処理されていない（ＮＴ）、あるいはＡＳＯ−Ｃ（対照）、またはＡＳＯ−１５３７Ｓ、もしくはＡＳＯ−ＣおよびＡＳＯ−１５３７Ｓのペプチド性核酸（ＰＮＡ）類似体がトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるサバイビンおよびβ−アクチンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。
【００６１】
【図４２】図４２は、細胞質画分の抗ダイサー酵素抗体での免疫沈殿を用いた、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるＡＳ−１およびＡＳ−２のＲＴ−ＰＣＲ増幅のゲル分析を示す図（図４２Ａ）である。免疫沈殿についての陽性対照も含まれる（４２Ｂ）。
【００６２】
【図４３Ａ】図４３は、サバイビンｍＲＮＡ（図４３Ａ）、サイクリンＤ１ｍＲＮＡ（図４３Ｂ）、およびサイクリンＢ１ｍＲＮＡ（図４３Ｃ）の３’ＵＴＲ領域で配列させた、インシリコで生成されたＭｉｔｏ−ｍｉＲを示す図である。
【図４３Ｂ】図４３は、サバイビンｍＲＮＡ（図４３Ａ）、サイクリンＤ１ｍＲＮＡ（図４３Ｂ）、およびサイクリンＢ１ｍＲＮＡ（図４３Ｃ）の３’ＵＴＲ領域で配列させた、インシリコで生成されたＭｉｔｏ−ｍｉＲを示す図である。
【図４３Ｃ】図４３は、サバイビンｍＲＮＡ（図４３Ａ）、サイクリンＤ１ｍＲＮＡ（図４３Ｂ）、およびサイクリンＢ１ｍＲＮＡ（図４３Ｃ）の３’ＵＴＲ領域で配列させた、インシリコで生成されたＭｉｔｏ−ｍｉＲを示す図である。
【００６３】
【図４４】図４４は、マイクロＲＮＡの生成をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するための、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼコード領域（ＯＲＦ）の間のサバイビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含有する構築物（４４Ａ）を示す図である。図４４Ｂは、サバイビンの３’ＵＴＲを含有する構築物で予めトランスフェクトされたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞にトランスフェクトされたとき、ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＨａｓ−ｍｉＲ−２１８（サバイビンの３’ＵＴＲに特異的なｍＲＮＡ）により産生される発光の阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
とりわけ、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ｎｃｍｔＲＮＡ）、特に、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）に由来する単離されたＲＮＡ分子を作製する方法、単離されたＲＮＡ分子を含有する組成物、細胞を単離されたＲＮＡ分子と接触させることによりがん細胞においてアポトーシスを引き起こす方法、および単離されたＲＮＡ分子をそれを必要とする被験体に投与することによりがんを処置する方法が、本明細書において提供される。
Ｉ．一般的技術
【００６５】
本発明の実施は、別段示されていない限り、当業者に周知である、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の通常の技術を利用するであろう。かかる技術は、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、２版（Sambrookら、１９８９年）およびMolecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、３版（SambrookおよびRussel、２００１年）、（本明細書において「Sambrook」として一緒に言及される）、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら、１９８７年版、２００１年までの捕捉を含む）、PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction(Mullisら、１９９４年版)、HarlowおよびLane（１９８８年）Antibodies、A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Publications、New  York、HarlowおよびLane（１９９９年）Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY（本明細書において「HarlowおよびLane」として一緒に言及される）、Beaucageら版、Current  Protocols  in  Nucleic  Acid  Chemistry  John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York、２０００年）、Handbook  of  Experimental  Immunology、４版（D.  M.  WeirおよびC.  C.  Blackwell版、Blackwell  Science  Inc.、１９８７年）、ならびにGene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells（J.  M.  MillerおよびM.  P.  Calos版、１９８７年）のような文献において十分に説明される。他の有用な参考文献は、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine（McGraw  Hill、J.  Isseleacherら版）、Dubois’  Lupus  Erythematosus（５版、D.J.  WallaceおよびB.H.  Hahn版）を含む。
ＩＩ．定義
【００６６】
本明細書において使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段示されない限り、複数の引用用語を含む。
【００６７】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことは理解される。
【００６８】
「被験体」は、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであり得る。哺乳動物は、家畜、スポーツ用動物、愛玩動物、霊長類、マウス、およびラットを含むが、これらに限定されない。被験体はまた、イヌ、およびネコを含むが、これらに限定されない、コンパニオンアニマルを含む。一態様では、被験体はヒトである。
【００６９】
「有効量」または「治療有効量」は、所望の治療効果を生じるのに有効である、１回用量または一連の用量の部分のいずれかとして、被験体に投与される、オリゴヌクレオチドもしくは他の抗がん治療のような、治療化合物の量を指す。
【００７０】
本明細書において使用される「前がん」は、悪性細胞に発展するか、または分化することができる、形質転換された細胞を有することを指す。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡオンコウイルスにより形質転換された細胞は、前がん細胞であり、かかる形質転換された細胞を有する個体は、前がん性であるか、または前がんを有するであろう。本明細書に記載の方法による前がんの処置は、かかる前がん細胞を、それらががん性になる前に、除去するかまたは死滅させることを含む。
【００７１】
本明細書において使用される「がん幹細胞」は、腫瘍細胞の自己再生する開始亜集団、または新たな腫瘍を生じさせる能力があるがん細胞の小集団を指す。がん幹細胞は、乳房、脳、血液、肝臓、腎臓、頸部、卵巣、結腸、および肺がんなどを含むが、これらに限定されない、いくつかのがんにおいて同定された。Pontiら、Cancer  Res、６５巻（１３号）：５５０６〜１１頁、２００５年、Fengら、Oncology  Reports、２２巻：１１２９〜１１３４頁、２００９年、Zhangら、Cancer  Res、６８巻（１１号）：４３１１頁：４３２０頁、２００８年、Singhら、Cancer  Res、６３巻：５８２１〜５８２８頁、２００３年、Clarkeら、Cancer  Res、６６巻：９３３９頁、２００６年、Senduraiら、Cell、１３３巻：７０４頁、２００８年、Ohataら、Cancer  Res、７２巻：５１０１頁、２０１２年、およびMukhopapadhyayら、Plos  One、８巻（１１号）：ｅ７８７２５頁、２０１３年を参照。本明細書に記載の処置の方法を使用して、がん幹細胞のかかる集団が除去され得る。
【００７２】
本明細書において使用される、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、あるいは「Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ」または「Ｍｉｔｏ−ｍｉＲ」は、小さなＲＮＡ分子、例えば、一本鎖当たり１５〜３０個のヌクレオチドであり、それは、ＲＮａｓｅＨ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーによるＡＳｎｃｍｔＲＮＡの連続的な切断から生じる、一本鎖もしくは二重鎖の一部、すなわち、図７Ａおよび７Ｂにおいて記載されるプロセスステップの最終産物であり得る。マイクロＲＮＡ、またはＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡは、図７Ａおよび７Ｂにおいて記載されるプロセスにより調製され得るか、もしくは合成的に調製され得る。二重鎖の一部としてのＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡは、相補的な二重鎖部分、および非相補的な部分を典型的に含み、例えば、ダイサーによりプロセッシングされたＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡは、二重鎖のそれぞれの鎖上に１〜５、また２〜３個のヌクレオチドの一本鎖領域（すなわち、オーバーハング領域）が存在するように、オーバーハング３’末端を有する。
【００７３】
本明細書において使用される、「合成ＲＮＡ分子」または「合成ＲＮＡ」は、化学合成により、例えば、当業者に公知の合成方法により作製されるＲＮＡ分子である。本明細書において提供されるＲＮＡ分子、例えば、図７Ａおよび７Ｂにおいて記載されるプロセスステップの産物はまた、合成的に調製され、本明細書に記載の方法において使用するため単離され得る。合成ＲＮＡ分子は、単離された合成ＲＮＡ分子を含み、二重鎖であることもでき、すなわち、相補鎖は、同様に合成され得、２本の鎖は、厳密な相補体である必要はない。例えば、合成Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡは、相補的二重鎖部分、および非相補的部分を有する二重鎖の一部として調製され得、例えば、ダイサーによりプロセッシングされたＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡに類似の合成Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡが作製され得る、すなわち、二重鎖のそれぞれの鎖上に１〜５、また２〜３個のヌクレオチドの一本鎖領域（すなわち、オーバーハング領域）が存在するように、オーバーハング３’末端を有し得る。
【００７４】
本明細書において使用される、「合成ＤＮＡ分子」または「合成ＤＮＡ」は、化学合成により、例えば、当業者に公知の合成方法により作製されるＤＮＡ分子である。本明細書において提供されるＤＮＡ分子、例えば、図７Ａおよび７Ｂにおいて記載されるプロセスステップの産物のＲＮＡ分子に類似の、特に、最終ステップのＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ産物に類似のＤＮＡ分子はまた、合成的に調製され、本明細書に記載の方法において使用するため単離され得る。
【００７５】
語句「に類似する配列」または「に対応する配列」は、例えば、それが本明細書に記載の合成ＲＮＡ分子に関連するように、ＲＮＡが、本明細書に記載のＲＮＡ分子もしくは類似のＤＮＡ分子と同一であるか、または実質的に同じである、あるいは本明細書に記載の方法、例えば、図７Ａおよび７Ｂにおいて概説される方法により調製される、配列を有することを示す。ある場合では、合成ＲＮＡは、本明細書に記載の方法により調製されるＲＮＡ分子と同一の配列を有する。ある場合では、合成ＲＮＡは、実質的に同じ配列を有することができ、合成ＲＮＡは、３’もしくは５’末端のいずれか、または３’もしくは５’末端の両方にさらなる塩基を有し得るか、あるいは本明細書に記載の方法により調製されるＲＮＡ分子と異なる配列内に１種または複数種のヌクレオチドを有し得る。ある場合では、合成ＲＮＡは、本明細書に記載の方法により調製される単離されたＲＮＡの配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。かかる核酸は、配列中の１種または複数種の塩基と結合する修飾された骨格を有し得るが、語句「に同一の配列」は、ＲＮＡが同一の配列、すなわち、同じ配列の塩基を有することを示す。本明細書において詳述されるＲＮＡ分子は、図７Ａまたは７Ｂにおいて記載されるプロセスのような、特定の方法により調製され、これにより、公知の配列のＲＮＡ分子がもたらされる。したがって、本明細書に記載の、同一の配列を有するＲＮＡ分子、または類似の配列を有するＲＮＡ分子（例えば、ＤＮＡ配列として）は、容易に調製され得る。
【００７６】
この明細書を通じて与えられる全ての最大数値限定は、かかるより小さい数値限定がここで明確に記載されているかのように、全てのより小さい数値限定を含むことが意図される。この明細書を通じて与えられる全ての最小数値限定は、かかるより大きな数値限定がここで明確に記載されているかのように、全てのより大きな数値限定を含むことが意図される。この明細書を通じて与えられる全ての数値範囲は、かかるより狭い数値範囲が全部のここに明確に記載されたものであるかのように、かかるより広い数値範囲内にある、全てのより狭い数値範囲を含むであろう。
ＩＩＩ．単離されたＲＮＡおよび単離されたＲＮＡを産生する方法
【００７７】
単離されたＲＮＡ分子、および単離されたＲＮＡ分子を調製する方法、すなわち、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｄ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法が、本明細書において提供される。
【００７８】
単離されたＲＮＡ分子を調製する方法の一部の実施形態では、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択される配列に対応するＲＮＡ配列を含む。
【００７９】
別の態様では、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される、単離されたＲＮＡ分子が、本明細書において提供される。
【００８０】
別の態様では、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子の配列を含む単離されたＲＮＡ分子であって、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される、単離されたＲＮＡ分子が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に類似の配列から本質的になる。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に類似の配列からなる。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよ��エキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に同一の配列を含む。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に同一の配列から本質的になる。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子と同一の配列からなる。
【００８１】
別の態様では、
5’-ACAGGCAUGCUCAUAAGGUUAA（配列番号７）、
5’-UAAACAGGCGGGGUAAGGUUUG（配列番号８）、
5’AUUGUAGAUAUUGGGCUGUUAA（配列番号９）、
5’-UUGGGCUGUUAAUUGUCAGUUC（配列番号１０）、
5’-ACAUCACCUCUAGCAUCACCAG（配列番号１１）、
5’-UCCCAAACAUAUAACUGAACU（配列番号１２）、
5’-GUACCCUAACCAUGCGAAAG（配列番号１３）、
5’-CCUCACACCCAAUUGGACCAA（配列番号１４）、
5’-GAGCAGUACAUGCUAAGACUU（配列番号１５）、
5’-CGCCUGCCCAGUGACACAUGU（配列番号１６）、
5’-GGUCUUCUCGUCUUGCUGUGU（配列番号１７）、
5’-UGGCUCUCUCCUUGCAAAGUUAU（配列番号１８）、
5’-ACCUUUGCACGGUUAGGGUAC（配列番号１９）、
5’-AACCUUAUGAGCAUGCCUGU（配列番号２０）、
5’-AACCUUACCCCGCCUGUUUA（配列番号２１）、
5’-AACAGCCCAAUAUCUACAAU（配列番号２２）、
5’-ACUGACAAUUAACAGCCCAA（配列番号２３）、
5’-GGUGAUGCUAGAGGUGAUGU（配列番号２４）、
5’-UUCAGUUAUAUGUUUGGGA（配列番号２５）、
5’-UUCGCAUGGUUAGGGUAC（配列番号２６）、
5’-GGUCCAAUUGGGUGUGAGG（配列番号２７）、
5’-GUCUUAGCAUGUACUGCUC（配列番号２８）、
5’-AUGUGUCACUGGGCAGGCG（配列番号２９）、
5’-ACAGCAAGACGAGAAGACC（配列番号３０）、
5’-AACUUUGCAAGGAGAGAGCCA（配列番号３１）、
5’-ACCCUAACCGUGCAAAGGU（配列番号３２）、
5’-AACCUUAUGAGCAUGCCUGUNN（配列番号８３）、
5’-AACCUUACCCCGCCUGUUUANN（配列番号８４）、
5’-AACAGCCCAAUAUCUACAAUNN（配列番号８５）、
5’-ACUGACAAUUAACAGCCCAANN（配列番号８６）、
5’-GGUGAUGCUAGAGGUGAUGUNN（配列番号８７）、
5’-UUCAGUUAUAUGUUUGGGANN（配列番号８８）、
5’-UUCGCAUGGUUAGGGUACNN（配列番号８９）、
5’-GGUCCAAUUGGGUGUGAGGNN（配列番号９０）、
5’-GUCUUAGCAUGUACUGCUCNN（配列番号９１）、
5’-AUGUGUCACUGGGCAGGCGNN（配列番号９２）、
5’-ACAGCAAGACGAGAAGACCNN（配列番号９３）、
5’-AACUUUGCAAGGAGAGAGCCANN（配列番号９４）、
5’-ACCCUAACCGUGCAAAGGUNN（配列番号９５）、
5’-ACCUUAUGAGCAUGCCUGU（配列番号９６）、
5’-ACCUUACCCCGCCUGUUUA（配列番号９７）、
5’-ACAGCCCAAUAUCUACAAU（配列番号９８）、
5’-CUGACAAUUAACAGCCCAA（配列番号９９）、
5’-GUGAUGCUAGAGGUGAUGU（配列番号１００）、
5’-UCAGUUAUAUGUUUGGGA（配列番号１０１）、
5’-UCGCAUGGUUAGGGUAC（配列番号１０２）、
5’-GUCCAAUUGGGUGUGAGG（配列番号１０３）、
5’-UCUUAGCAUGUACUGCUC（配列番号１０４）、
5’-UGUGUCACUGGGCAGGCG（配列番号１０５）、
5’-CAGCAAGACGAGAAGACC（配列番号１０６）、
5’-ACUUUGCAAGGAGAGAGCCA（配列番号１０７）、
5’-CCCUAACCGUGCAAAGGU（配列番号１０８）、
5’-ACCUUAUGAGCAUGCCUGUNNN（配列番号１０９）、
5’-ACCUUACCCCGCCUGUUUANNN（配列番号１１０）、
5’-ACAGCCCAAUAUCUACAAUNNN（配列番号１１１）、
5’-CUGACAAUUAACAGCCCAANNN（配列番号１１２）、
5’-GUGAUGCUAGAGGUGAUGUNNN（配列番号１１３）、
5’-UCAGUUAUAUGUUUGGGANNN（配列番号１１４）、
5’-UCGCAUGGUUAGGGUACNNN（配列番号１１５）、
5’-GUCCAAUUGGGUGUGAGGNNN（配列番号１１６）、
5’-UCUUAGCAUGUACUGCUCNNN（配列番号１１７）、
5’-UGUGUCACUGGGCAGGCGNNN（配列番号１１８）、
5’-CAGCAAGACGAGAAGACCNNN（配列番号１１９）、
5’-ACUUUGCAAGGAGAGAGCCANNN（配列番号１２０）、および
5’-CCCUAACCGUGCAAAGGUNNN（配列番号１２１）（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチド塩基を表し、一部の実施形態では、それぞれのＮはＵである）
からなる群から選択される、配列を含む／ＲＮＡ配列に対応する、１種または複数種の単離されたＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、単離されたＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、単離された二本鎖Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子を含み、鎖の１つは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列を含む／ＲＮＡ配列に対応する。一部の実施形態では、単離されたＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、単離された二本鎖Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子であり、二本鎖ＲＮＡ分子の１本の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列からなる／ＲＮＡ配列に対応する。一部の実施形態では、単離されたＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、配列番号７の配列を有する一方の鎖および配列番号８３または配列番号１０９の配列を有する他方の鎖、配列番号８の配列を有する一方の鎖および配列番号８４または配列番号１１０の配列を有する他方の鎖、配列番号９の配列を有する一方の鎖および配列番号８５または配列番号１１１の配列を有する他方の鎖、配列番号１０の配列を有する一方の鎖および配列番号８６または配列番号１１２の配列を有する他方の鎖、配列番号１１の配列を有する一方の鎖および配列番号８７または配列番号１１３の配列を有する他方の鎖、配列番号１２の配列を有する一方の鎖および配列番号８８または配列番号１１４の配列を有する他方の鎖、配列番号１３の配列を有する一方の鎖および配列番号８９または配列番号１１５の配列を有する他方の鎖、配列番号１４の配列を有する一方の鎖および配列番号９０または配列番号１１６の配列を有する他方の鎖、配列番号１５の配列を有する一方の鎖および配列番号９１または配列番号１１７の配列を有する他方の鎖、配列番号１６の配列を有する一方の鎖および配列番号９２または配列番号１１８の配列を有する他方の鎖、配列番号１７の配列を有する一方の鎖および配列番号９３または配列番号１１９の配列を有する他方の鎖、配列番号１８の配列を有する一方の鎖および配列番号９４または配列番号１２０の配列を有する他方の鎖、ならびに配列番号１９の配列を有する一方の鎖および配列番号９５または配列番号１２１の配列を有する他方の鎖からなる群から選択される単離された二本鎖Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子である。
【００８２】
別の態様では、
5’-ACAGGCAUGCUCAUAAGGUUAA（配列番号７）、
5’-UAAACAGGCGGGGUAAGGUUUG（配列番号８）、
5’AUUGUAGAUAUUGGGCUGUUAA（配列番号９）、
5’-UUGGGCUGUUAAUUGUCAGUUC（配列番号１０）、
5’-ACAUCACCUCUAGCAUCACCAG（配列番号１１）、
5’-UCCCAAACAUAUAACUGAACU（配列番号１２）、
5’-GUACCCUAACCAUGCGAAAG（配列番号１３）、
5’-CCUCACACCCAAUUGGACCAA（配列番号１４）、
5’-GAGCAGUACAUGCUAAGACUU（配列番号１５）、
5’-CGCCUGCCCAGUGACACAUGU（配列番号１６）、
5’-GGUCUUCUCGUCUUGCUGUGU（配列番号１７）、
5’-UGGCUCUCUCCUUGCAAAGUUAU（配列番号１８）、
5’-ACCUUUGCACGGUUAGGGUAC（配列番号１９）、
5’-AACCUUAUGAGCAUGCCUGU（配列番号２０）、
5’-AACCUUACCCCGCCUGUUUA（配列番号２１）、
5’-AACAGCCCAAUAUCUACAAU（配列番号２２）、
5’-ACUGACAAUUAACAGCCCAA（配列番号２３）、
5’-GGUGAUGCUAGAGGUGAUGU（配列番号２４）、
5’-UUCAGUUAUAUGUUUGGGA（配列番号２５）、
5’-UUCGCAUGGUUAGGGUAC（配列番号２６）、
5’-GGUCCAAUUGGGUGUGAGG（配列番号２７）、
5’-GUCUUAGCAUGUACUGCUC（配列番号２８）、
5’-AUGUGUCACUGGGCAGGCG（配列番号２９）、
5’-ACAGCAAGACGAGAAGACC（配列番号３０）、
5’-AACUUUGCAAGGAGAGAGCCA（配列番号３１）、
5’-ACCCUAACCGUGCAAAGGU（配列番号３２）、
5’-AACCUUAUGAGCAUGCCUGUNN（配列番号８３）、
5’-AACCUUACCCCGCCUGUUUANN（配列番号８４）、
5’-AACAGCCCAAUAUCUACAAUNN（配列番号８５）、
5’-ACUGACAAUUAACAGCCCAANN（配列番号８６）、
5’-GGUGAUGCUAGAGGUGAUGUNN（配列番号８７）、
5’-UUCAGUUAUAUGUUUGGGANN（配列番号８８）、
5’-UUCGCAUGGUUAGGGUACNN（配列番号８９）、
5’-GGUCCAAUUGGGUGUGAGGNN（配列番号９０）、
5’-GUCUUAGCAUGUACUGCUCNN（配列番号９１）、
5’-AUGUGUCACUGGGCAGGCGNN（配列番号９２）、
5’-ACAGCAAGACGAGAAGACCNN（配列番号９３）、
5’-AACUUUGCAAGGAGAGAGCCANN（配列番号９４）、
5’-ACCCUAACCGUGCAAAGGUNN（配列番号９５）、
5’-ACCUUAUGAGCAUGCCUGU（配列番号９６）、
5’-ACCUUACCCCGCCUGUUUA（配列番号９７）、
5’-ACAGCCCAAUAUCUACAAU（配列番号９８）、
5’-CUGACAAUUAACAGCCCAA（配列番号９９）、
5’-GUGAUGCUAGAGGUGAUGU（配列番号１００）、
5’-UCAGUUAUAUGUUUGGGA（配列番号１０１）、
5’-UCGCAUGGUUAGGGUAC（配列番号１０２）、
5’-GUCCAAUUGGGUGUGAGG（配列番号１０３）、
5’-UCUUAGCAUGUACUGCUC（配列番号１０４）、
5’-UGUGUCACUGGGCAGGCG（配列番号１０５）、
5’-CAGCAAGACGAGAAGACC（配列番号１０６）、
5’-ACUUUGCAAGGAGAGAGCCA（配列番号１０７）、
5’-CCCUAACCGUGCAAAGGU（配列番号１０８）、
5’-ACCUUAUGAGCAUGCCUGUNNN（配列番号１０９）、
5’-ACCUUACCCCGCCUGUUUANNN（配列番号１１０）、
5’-ACAGCCCAAUAUCUACAAUNNN（配列番号１１１）、
5’-CUGACAAUUAACAGCCCAANNN（配列番号１１２）、
5’-GUGAUGCUAGAGGUGAUGUNNN（配列番号１１３）、
5’-UCAGUUAUAUGUUUGGGANNN（配列番号１１４）、
5’-UCGCAUGGUUAGGGUACNNN（配列番号１１５）、
5’-GUCCAAUUGGGUGUGAGGNNN（配列番号１１６）、
5’-UCUUAGCAUGUACUGCUCNNN（配列番号１１７）、
5’-UGUGUCACUGGGCAGGCGNNN（配列番号１１８）、
5’-CAGCAAGACGAGAAGACCNNN（配列番号１１９）、
5’-ACUUUGCAAGGAGAGAGCCANNN（配列番号１２０）、および
5’-CCCUAACCGUGCAAAGGUNNN（配列番号１２１）（ここで、Ｎは任意のヌクレオチド塩基を表し、一部の実施形態では、それぞれのＮはＵである）
からなる群から選択される配列を含む、１種または複数種の合成Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、合成Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、合成二本鎖Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子を含み、鎖の一方は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、合成Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、合成二本鎖Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子であり、二本鎖Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列からなり／ＲＮＡに対応する。一部の実施形態では、合成Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、配列番号７の配列を有する一方の鎖および配列番号８３または配列番号１０９の配列を有する他方の鎖、配列番号８の配列を有する一方の鎖および配列番号８４または配列番号１１０の配列を有する他方の鎖、配列番号９の配列を有する一方の鎖および配列番号８５または配列番号１１１の配列を有する他方の鎖、配列番号１０の配列を有する一方の鎖および配列番号８６または配列番号１１２の配列を有する他方の鎖、配列番号１１の配列を有する一方の鎖および配列番号８７または配列番号１１３の配列を有する他方の鎖、配列番号１２の配列を有する一方の鎖および配列番号８８または配列番号１１４の配列を有する他方の鎖、配列番号１３の配列を有する一方の鎖および配列番号８９または配列番号１１５の配列を有する他方の鎖、配列番号１４の配列を有する一方の鎖および配列番号９０または配列番号１１６の配列を有する他方の鎖、配列番号１５の配列を有する一方の鎖および配列番号９１または配列番号１１７の配列を有する他方の鎖、配列番号１６の配列を有する一方の鎖および配列番号９２または配列番号１１８の配列を有する他方の鎖、配列番号１７の配列を有する一方の鎖および配列番号９３または配列番号１１９の配列を有する他方の鎖、配列番号１８の配列を有する一方の鎖および配列番号９４または配列番号１２０の配列を有する他方の鎖、ならびに配列番号１９の配列を有する一方の鎖および配列番号９５または配列番号１２１の配列を有する他方の鎖からなる群から選択される合成二本鎖Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子である。
【００８３】
別の態様では、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子に類似の１種または複数種の合成ＤＮＡ分子が、本明細書において提供される。一実施形態では、
5’-ACAGGCATGCTCATAAGGTTAA（配列番号５７）、
5’-TAAACAGGCGGGGTAAGGTTTG（配列番号５８）、
5’ATTGTAGATATTGGGCTGTTAA（配列番号５９）、
5’-TTGGGCTGTTAATTGTCAGTTC（配列番号６０）、
5’-ACATCACCTCTAGCATCACCAG（配列番号６１）、
5’-TCCCAAACATATAACTGAACT（配列番号６２）、
5’-GTACCCTAACCATGCGAAAG（配列番号６３）、
5’-CCTCACACCCAATTGGACCAA（配列番号６４）、
5’-GAGCAGTACATGCTAAGACTT（配列番号６５）、
5’-CGCCTGCCCAGTGACACATGT（配列番号６６）、
5’-GGTCTTCTCGTCTTGCTGTGT（配列番号６７）、
5’-TGGCTCTCTCCTTGCAAAGTTAT（配列番号６８）、
5’-ACCTTTGCACGGTTAGGGTAC（配列番号６９）、
5’-AACCTTATGAGCATGCCTGT（配列番号７０）、
5’-AACCTTACCCCGCCTGTTTA（配列番号７１）、
5’-AACAGCCCAATATCTACAAT（配列番号７２）、
5’-ACTGACAATTAACAGCCCAA（配列番号７３）、
5’-GGTGATGCTAGAGGTGATGT（配列番号７４）、
5’-TTCAGTTATATGTTTGGGA（配列番号７５）、
5’-TTCGCATGGTTAGGGTAC（配列番号７６）、
5’-GGTCCAATTGGGTGTGAGG（配列番号７７）、
5’-GTCTTAGCATGTACTGCTC（配列番号７８）、
5’-ATGTGTCACTGGGCAGGCG（配列番号７９）、
5’-ACAGCAAGACGAGAAGACC（配列番号８０）、
5’-AACTTTGCAAGGAGAGAGCCA（配列番号８１）、
5’-ACCCTAACCGTGCAAAGGT（配列番号８２）、
5’-AACCTTATGAGCATGCCTGTNN（配列番号１２２）、
5’-AACCTTACCCCGCCTGTTTANN（配列番号１２３）、
5’-AACAGCCCAATATCTACAATNN（配列番号１２４）、
5’-ACTGACAATTAACAGCCCAANN（配列番号１２５）、
5’-GGTGATGCTAGAGGTGATGTNN（配列番号１２６）、
5’-TTCAGTTATATGTTTGGGANN（配列番号１２７）、
5’-TTCGCATGGTTAGGGTACNN（配列番号１２８）、
5’-GGTCCAATTGGGTGTGAGGNN（配列番号１２９）、
5’-GTCTTAGCATGTACTGCTCNN（配列番号１３０）、
5’-ATGTGTCACTGGGCAGGCGNN（配列番号１３１）、
5’-ACAGCAAGACGAGAAGACCNN（配列番号１３２）、
5’-AACTTTGCAAGGAGAGAGCCANN（配列番号１３３）、
5’-ACCCTAACCGTGCAAAGGTNN（配列番号１３４）、
5’-ACCTTATGAGCATGCCTGT（配列番号１３５）、
5’-ACCTTACCCCGCCTGTTTA（配列番号１３６）、
5’-ACAGCCCAATATCTACAAT（配列番号１３７）、
5’-CTGACAATTAACAGCCCAA（配列番号１３８）、
5’-GTGATGCTAGAGGTGATGT（配列番号１３９）、
5’-TCAGTTATATGTTTGGGA（配列番号１４０）、
5’-TCGCATGGTTAGGGTAC（配列番号１４１）、
5’-GTCCAATTGGGTGTGAGG（配列番号１４２）、
5’-TCTTAGCATGTACTGCTC（配列番号１４３）、
5’-TGTGTCACTGGGCAGGCG（配列番号１４４）、
5’-CAGCAAGACGAGAAGACC（配列番号１４５）、
5’-ACTTTGCAAGGAGAGAGCCA（配列番号１４６）、
5’-CCCTAACCGTGCAAAGGT（配列番号１４７）、
5’-ACCTTATGAGCATGCCTGTNNN（配列番号１４８）、
5’-ACCTTACCCCGCCTGTTTANNN（配列番号１４９）、
5’-ACAGCCCAATATCTACAATNNN（配列番号１５０）、
5’-CTGACAATTAACAGCCCAANNN（配列番号１５１）、
5’-GTGATGCTAGAGGTGATGTNNN（配列番号１５２）、
5’-TCAGTTATATGTTTGGGANNN（配列番号１５３）、
5’-TCGCATGGTTAGGGTACNNN（配列番号１５４）、
5’-GTCCAATTGGGTGTGAGGNNN（配列番号１５５）、
5’-TCTTAGCATGTACTGCTCNNN（配列番号１５６）、
5’-TGTGTCACTGGGCAGGCGNNN（配列番号１５７）、
5’-CAGCAAGACGAGAAGACCNNN（配列番号１５８）、
5’-ACTTTGCAAGGAGAGAGCCANNN（配列番号１５９）、および
5’-CCCTAACCGTGCAAAGGTNNN（配列番号１６０）
（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチド塩基を表し、一部の実施形態では、それぞれのＮはＴである）
からなる群から選択される配列を含む、１種または複数種の合成ＤＮＡ分子が提供される。一部の実施形態では、合成ＤＮＡ分子は、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含み、鎖の１つは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、および配列番号１６０からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、合成ＤＮＡ分子は、合成二本鎖ＤＮＡ分子であり、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、および配列番号６９からなる群から選択される配列からなる。一部の実施形態では、合成ＤＮＡ分子は、配列番号５７の配列を有する一方の鎖および配列番号１２２または配列番号１４８の配列を有する他方の鎖、配列番号５８の配列を有する一方の鎖および配列番号１２３または配列番号１４９の配列を有する他方の鎖、配列番号５９の配列を有する一方の鎖および配列番号１２４または配列番号１５０の配列を有する他方の鎖、配列番号６０の配列を有する一方の鎖および配列番号１２５または配列番号１５１の配列を有する他方の鎖、配列番号６１の配列を有する一方の鎖および配列番号１２６または配列番号１５２の配列を有する他方の鎖、配列番号６２の配列を有する一方の鎖および配列番号１２７または配列番号１５３の配列を有する他方の鎖、配列番号６３の配列を有する一方の鎖および配列番号１２８または配列番号１５４の配列を有する他方の鎖、配列番号６４の配列を有する一方の鎖および配列番号１２９または配列番号１５５の配列を有する他方の鎖、配列番号６５の配列を有する一方の鎖および配列番号１３０または配列番号１５６の配列を有する他方の鎖、配列番号６６の配列を有する一方の鎖および配列番号１３１または配列番号１５７の配列を有する他方の鎖、配列番号６７の配列を有する一方の鎖および配列番号１３２または配列番号１５８の配列を有する他方の鎖、配列番号６８の配列を有する一方の鎖および配列番号１３３または配列番号１５９の配列を有する他方の鎖、ならびに配列番号６９の配列を有する一方の鎖および配列番号１３４または配列番号１６０の配列を有する他方の鎖からなる群から選択される合成二本鎖ＤＮＡ分子である。
【００８４】
アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）に相補的なオリゴヌクレオチドでのがん細胞の処置は、例えば、米国特許第８，３１８，６８６号において記載され、その開示は、全体として、特に、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ、およびアンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドに関して、本明細書において参照により組み込まれる。かかるオリゴヌクレオチドは、可能性のあるがん治療として有効である一方、これらのオリゴヌクレオチドの作用の機序の下流で作用するいくつかのＲＮＡ分子は、がんの処置のためのより有効な治療分子をもたらし得ることが見出された。本明細書において、および米国特許第８，３１８，６８６号において記載されるオリゴヌクレオチドが公知でなかったときに生じる一般的なプロセス、ならびにこのプロセスの発見は、本明細書に記載の有用なＲＮＡ分子の単離をもたらす。一般的なプロセスは、図７Ａおよび７Ｂにおいて示される。ＡＳｎｃｍｔＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドは、ループ領域（図７Ａ）または３’ステム領域（図７Ｂ）のいずれかにおいて、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ上の相補的領域にアニーリングされ、それは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）切断のための基質を提供する。ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された産物は、がんの処置の際に使用するため単離され得るか、または５’エキソヌクレアーゼ切断（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈがループ領域において切断する場所）、もしくは３’エキソヌクレアーゼ切断（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈが３’ステム領域において切断する場所）によりさらにプロセッシングされる。エキソヌクレアーゼ切断の得られた産物は、がんの処置において使用するため単離され得るか、またはダイサー酵素での切断によりさらにプロセッシングされる。ダイサーにより切断された産物は、ミトコンドリアマイクロＲＮＡ分子、またはＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡをもたらす。Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡは、単離され、がんを処置するため使用され得る。本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子のいずれかは、この経路によりプロセッシングされるので、得られたＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡは、腫瘍細胞において作用し、これが細胞死をもたらす。この活性は、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡが、がんの処置にとって理想的な治療をもたらすように、様々な腫瘍細胞に精巧に選択的であることが示される。ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ、またはｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡに類似のＤＮＡは、合成的に調製され得、本明細書に記載のがんを処置するために使用され得る。
Ａ．ヒト非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ｎｃｍｔＲＮＡ）
【００８５】
ヒト細胞は、いくつかの固有のキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を発現する。これらの分子は、非コードであり（すなわち、それらは、タンパク質の翻訳のための鋳型として働くことが公知でない）、５’末端において逆反復配列に共有結合された１６ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む。非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、２種の形態、センスおよびアンチセンスで見られる。
【００８６】
センス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＳｎｃｍｔＲＮＡ）分子は、環状ミトコンドリアゲノムの「Ｈ鎖」から転写された１６ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡに対応する。ミトコンドリアゲノムの「Ｌ鎖」から転写された、１６ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡの逆反復配列に対応するヌクレオチド配列は、このＲＮＡ分子の５’末端に共有結合される。ＳｎｃｍｔＲＮＡ中の逆反復配列のサイズは、次の値の間にある任意の数を含む、約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、もしくは８００個のヌクレオチドまたはそれ超から、約１００〜２００、１５０〜２５０、２００〜３００、２５０〜３５０、４００〜５００、４５０〜５５０、５００〜６００、５５０〜６５０、６００〜７００、６５０〜７５０、または７００〜８００個のヌクレオチドもしくはそれ超まで変動し得る。一実施形態では、ＳｎｃｍｔＲＮＡ中の逆反復配列は、ミトコンドリアゲノムの１６Ｓ遺伝子のＬ鎖から転写されたＲＮＡの８１５個のヌクレオチドの断片に対応する。別の実施形態では、ＳｎｃｍｔＲＮＡは、それぞれ、図１Ａ、図２Ａ、および図３Ａにおいて提供される、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３に対応する配列を含むか、またはＳｎｃｍｔＲＮＡは、それぞれ、図１Ｂ、図２Ｂ、および図３Ｂにおいて提供される、配列番号１６１、配列番号１６２、および配列番号１６３からなる群から選択される配列を含む。
【００８７】
アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）分子は、環状ミトコンドリアゲノムの「Ｌ鎖」から転写された１６ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡに対応する。ミトコンドリアゲノムの「Ｈ鎖」から転写された、１６ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子の逆反復配列に対応するヌクレオチド配列は、このＲＮＡ分子の５’末端に共有結合される。ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ中の逆反復配列のサイズは、次の値の間にある任意の数を含む、約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００個のヌクレオチドもしくはそれ超から、約１００〜２００、１５０〜２５０、２００〜３００、２５０〜３５０、４００〜５００、４５０〜５５０、５００〜６００、５５０〜６５０、６００〜７００、６５０〜７５０、または７００〜８００もしくはそれ超まで変動し得る。別の実施形態では、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡは、それぞれ、図４Ａ、図５Ａ、および図６Ａにおいて提供される、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に対応する配列を含むか、またはＡＳｎｃｍｔＲＮＡは、それぞれ、図４Ｂ、図５Ｂ、および図６Ｂにおいて提供される、配列番号１６４、配列番号１６５、および配列番号１６６からなる群から選択される配列を含む。
【００８８】
非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に関するさらなる情報は、米国特許第８，３１８，６８６号において見ることができる。
Ｂ．ＡＳｎｃｍｔＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド
【００８９】
方法は、本明細書において、または米国特許第８，３１８，６８６号において記載されるアンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）分子に相補的なオリゴヌクレオチドの使用を含む。図７Ａおよび７Ｂにおいて概説されるプロセスの第１のステップは、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子に相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることを含む。本明細書において使用される、オリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができるのに十分な相補性を有する配列を所有するなら、本明細書において言及される、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡの部分に「相補的」である。ハイブリダイズする能力は、オリゴヌクレオチドの相補性の程度および長さ両方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが長いほど、それが含有し、安定な二重鎖を依然形成する、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡと不一致である塩基が多い。一部の態様では、本明細書において開示される方法による抗がん治療として使用するための単離されたＲＮＡ分子の調製において使用されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも８（例えば、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０またはそれ超）塩基長である。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的手順の使用により、不一致の容認可能な程度を確かめることができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子に少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）相補である。一部の実施形態では、相補的なオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の１つまたは複数に対応するＡＳｎｃｍｔＲＮＡに相補的である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、米国特許第８，３１８，６８６号において開示されるオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、126S（5’-AGATGAAAAATTATAACCAA  配列番号３３）、
226S（5’-TAAGACCCCCGAAACCAGAC  配列番号４５）、
552S（5’-TACCTAAAAAATCCCAAACA  配列番号３４）、
1107S（5’-GTCCTAAACTACCAAACC  配列番号３５）、および
1537S（5’-CACCCACCCAAGAACAGG  配列番号３６）からなる群から選択される。
Ｃ．ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡからＲＮＡを産生する方法
【００９０】
本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子を産生する、本明細書において開示される方法は、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ切断を含む。方法は、本明細書において、または米国特許第８，３１８，６８６号において記載される、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）分子に相補的なオリゴヌクレオチドの使用を含む。オリゴヌクレオチドは、図８において示される、３’一本鎖ステム領域またはループ領域を含む、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡの任意の領域に相補的であり得る。
【００９１】
細胞において生じる、図７Ａおよび７Ｂにおいて記載されるプロセスが使用され得、所望のＲＮＡ分子が、細胞から単離され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、適当な緩衝液中でＡＳｎｃｍｔＲＮＡとアニーリングされ、ＲＮａｓｅ  Ｈと合わされ、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡを産生するのに適当な条件下で反応させられ得るので、プロセスは、細胞を使用することなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現され得る。ＲＮａｓｅは、容易に入手可能（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓカタログ番号Ｍ０２９７ＳもしくはＭ０２９７Ｌ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓカタログ番号１５２０２５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１８０２１−０１４）であり、供給業者の指示、または当業者に公知のその改変により、使用され得る。得られたＲＮＡ分子は、単離され、本明細書に記載の方法において使用され得る。当業者に公知の方法により、所望のＲＮＡを合成的に調製することも可能である。
Ｄ．ＲＮａｓｅおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡからＲＮＡを産生する方法
【００９２】
ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断されたＲＮＡ分子は、図７Ａおよび７Ｂにおいて記載される反応により、細胞なしで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらにプロセッシングされ得る。ＲＮａｓｅ  Ｈ切断由来の反応溶液は適当に調整され得、適当なエキソヌクレアーゼが加えられ、次に、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断されるＡＳｎｃｍｔＲＮＡを産生するのに適当な条件下で反応され得る。あるいは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断により産生された単離されたＲＮＡ分子は、エキソヌクレアーゼと適当な緩衝液中で合わされ、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡをもたらす条件下で反応され得る。エキソヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ切断プロセスのため使用されるオリゴヌクレオチドに依存して、３’エキソヌクレアーゼまたは５’エキソヌクレアーゼであり得る。例えば、図７Ａにおいて、オリゴヌクレオチド１５３７について、５’エキソヌクレアーゼが使用される。エキソヌクレアーゼ切断は、ダイサーにより認識され、切断される、二本鎖領域をもたらす。５’または３’エキソヌクレアーゼが利用されてもよく（例えば、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓカタログ番号Ｍ０２９３ＳもしくはＭ０２９３Ｌ）、供給者の指示、または当業者に公知のその改変により、使用され得る。得られたＲＮＡ分子は、単離され、本明細書に記載の方法において使用され得る。当業者に公知の方法により、所望のＲＮＡを合成的に調製することも可能である。
Ｅ．ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡからＲＮＡを産生する方法
【００９３】
連続してＲＮａｓｅ  Ｈおよびキソヌクレアーゼにより切断されたＲＮＡは、図７Ａおよび７Ｂにおいて記載される反応により、細胞なしで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらにプロセッシングされ得る。エキソヌクレアーゼ切断由来の反応溶液は適当に調整され得、適当なダイサーが加えられ、次に、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されるＡＳｎｃｍｔＲＮＡを産生するのに適当な条件下で反応され得る。あるいは、連続的なＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼ切断により産生された、単離されたＲＮＡは、ダイサーと適当な緩衝液中で合わされ、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲまたはＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡとしても言及される、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されるＡＳｎｃｍｔＲＮＡをもたらす条件下で反応され得る。ダイサーは、容易に入手可能（例えば、Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ  Ｄｉｃｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｔカタログ番号Ｔ５１０００２）であり、供給者の指示、または当業者に公知のその改変により、使用され得る。ダイサーにより産生されたＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡは、それぞれの鎖が、１５〜３０ヌクレオチド長、１７〜２７ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、またはおよそ２２ヌクレオチド長である、二本鎖であり、二重鎖分子または分離された鎖として単離され、一本鎖として単離され得る。二重鎖は、１〜５または２〜３個のヌクレオチドのそれぞれの鎖の３’末端において、３’オーバーハング領域、すなわち、一本鎖領域を有する（Parkら、Nature、４７５巻：２０１〜２０５頁、２０１１年、その開示は、全体として本明細書において参照により組み込まれる）。得られたＲＮＡ分子は、単離され、本明細書に記載の方法において使用され得るか、または合成的に調製され得る。当業者に公知の方法により、所望のＲＮＡ分子を合成的に調製することも可能である。例えば、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列を含む、または配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番���１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列からなるＲＮＡは、当業者に周知の合成方法により作製され得る。一部の実施形態では、所望のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡの１つもしくは両方の鎖は、本明細書において考察される適当な改変で合成され得る。一部の実施形態では、類似のＤＮＡを合成して、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子に類似の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子がもたらされ得る。
【００９４】
一態様では、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子がもたらされるステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子のセットを単離して、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットをもたらすステップを含む方法により調製される、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットが、本明細書において提供される。
【００９５】
一態様では、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる配列に類似の１種超の配列を含む、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットであって、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に類似の１種超の配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に類似の１種超の配列からなる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に同一の１種超の配列を含む。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に同一の１種超の配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に同一の１種超の配列からなる。
【００９６】
一態様では、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットに類似の全ての配列を含む、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットであって、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子のセットをもたらすステップを含む方法により調製される、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットに類似の全ての配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットに類似の全ての配列からなる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の全ての配列を含む。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の全ての配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の全ての配列からなる。
【００９７】
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡを形成するのに十分に相補的な２本の鎖は、容易に合成され、アニーリングされて、二本鎖ＲＮＡ分子がもたらされ得る。一部の実施形態では、配列番号７の配列を含む鎖および配列番号９６の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号８の配列を含む鎖および配列番号９７の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号９の配列を含む鎖および配列番号９８の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１０の配列を含む鎖および配列番号９９の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１１の配列を含む鎖および配列番号１００の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１２の配列を含む鎖および配列番号１０１の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１３の配列を含む鎖および配列番号１０２の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１４の配列を含む鎖および配列番号１０３の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１５の配列を含む鎖および配列番号１０４の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１６の配列を含む鎖および配列番号１０５の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１７の配列を含む鎖および配列番号１０６の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１８の配列を含む鎖および配列番号１０７の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。一部の実施形態では、配列番号１９の配列を含む鎖および配列番号１０８の配列を含む鎖が、合成され、アニーリングされて、単離された二本鎖ＲＮＡ分子が形成され得る。
【００９８】
一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子から調製された、または合成的に調製された、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する、および／またはそれを含む。一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は二本鎖ＲＮＡであり、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する、および／またはそれを含む。一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は二本鎖ＲＮＡであり、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する、および／またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は二本鎖ＲＮＡであり、二本鎖ＲＮＡ分���の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する、および／またはそれからなる。
【００９９】
本明細書に記載の、単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を含む単離されたＲＮＡ分子、単離されたＲＮＡ分子を作製する方法、キット、製造品、医薬品の製造における使用、がんの処置のための使用を含む単離されたＲＮＡ分子を使用する方法、ならびに腫瘍細胞においてがんを処置するか、またはアポトーシスを引き起こす方法のいずれかの一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子であり得る。一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、単離された一本鎖ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、単離された二本鎖ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する、および／またはそれを含む。一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する、および／またはそれを含む単離された二本鎖ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、単離された二本鎖ＲＮＡ分子であり、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する、および／またはそれからなる。
ａ．オリゴヌクレオチド修飾
【０１００】
ＲＮＡとＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間結合は、３’から５ホスホジエステル結合である。連続的ＲＮａｓｅ  Ｈ処理のためＡＳｎｃｍｔＲＮＡとアニーリングするために使用されるオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＲＮａｓｅ  Ｈにより切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびエキソヌクレアーゼにより切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ、もしくはＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡから生じるＲＮＡに類似の配列を有する本明細書に記載のＲＮＡ分子を含む、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびエキソヌクレアーゼにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ、もしくはＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡから生じるＲＮＡ分子のような、本明細書に記載のＲＮＡ分子は、１個または複数の修飾された、すなわち、非天然に存在するヌクレオシド間結合を有し得る。治療と関連して、修飾されたヌクレオシド間結合は、例えば、細胞の取り込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大のような所望の特性のため、天然に存在するヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドに渡りしばしば選択される。
【０１０１】
修飾されたヌクレオシド間結合を有する、本明細書に記載の、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡ分子または類似のＤＮＡ分子のようなオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合、ならびにリン原子を有しないヌクレオシド間結合を含む。ヌクレオシド間結合を含有する代表的なリンは、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、およびホスホロチオエートを含むが、これらに限定されない。亜リン酸含有および非亜リン酸含有結合の調製の方法は、周知である。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書に記載のＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子に標的化されたオリゴヌクレオチド、または本明細書に記載のＲＮＡ分子もしくは類似のＤＮＡ分子は、１個または複数の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物のそれぞれのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１０３】
当該技術分野において公知である通り、ヌクレオシドは、塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。かかる複素環塩基の２つの最も共通するクラスは、プリン、およびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸塩基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドについて、リン酸塩基は、糖の２’，３’、または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合され得る。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸塩基は、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して、線状高分子化合物が形成される。次に、この線状高分子構造のそれぞれの末端は、さらに結合されて、環状構造が形成され、しかしながら、オープン線状構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸塩基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するとして一般に言及される。ＲＮＡとＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’から５’ホスホジエステル結合である。
【０１０４】
本明細書に記載の方法において有用な、本明細書に記載のＲＮＡ分子または類似のＤＮＡ分子を含む、オリゴヌクレオチドの特定の、だが非限定的な例は、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。この説明において定義される、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格中にリン原子を保持するもの、および骨格中にリン原子を有しないものを含む。この説明の目的のため、および当該技術分野においてときに言及される通り、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有しないそれらの修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、通常の３’−５’結合、これらの２’−５’結合した類似体、および逆の極性を有するものを有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ−エステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート、チオノ−ホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホ−トリエステル、セレノホスフェート、ならびにボラノホスフェートを含み、１個または複数のヌクレオチド間結合は、３’から３’、５’から５’、または２’から２’結合である。逆の極性を有するオリゴヌクレオチドは、３’−大部分のヌクレオチド間結合における１つの３’から３’結合を含み、すなわち、脱塩基であり得る１つの逆位ヌクレオシド残基（核酸塩基は、その場所においてヒドロキシル基を欠くか、または有する）がまた、利用され得る。種々の塩、混合塩、および遊離塩の形態も含まれる。内部にリン原子を含まないオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子とアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは１個もしくは複数の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分由来の一部において形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するもの、ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものを含む。
【０１０６】
他の実施形態では、ヌクレオチド単位の、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格は、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのため維持される。１つのかかるオリゴマー化合物であるオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として言及される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する、代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれは、全体として本明細書において参照により組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsenら、Science、１９９１年、２５４巻、１４９７〜１５００頁において見ることができる。
【０１０７】
上記リン含有およびリンを含有しない結合の調製を教示する、代表的な米国特許は、米国特許第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号、および第５，６２５，０５０号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号、および第５，６７７，４３９号を含むが、それらに限定されず、そのそれぞれは、全体として本明細書において参照により組み込まれる。
【０１０８】
本明細書に記載の、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ分子または類似のＤＮＡ分子のような、修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、１個または複数の置換された糖部分を含有してもよい。例えば、フラノシル糖環は、全体として本明細書において参照により組み込まれる、米国特許第７，３９９，８４５号において記載される、置換基での置換、二環式核酸「ＢＮＡ」を形成するための架橋、およびＳまたはＮ（Ｒ）のようなヘテロ原子での４’−Ｏの置換を含む、いくつかの方法において修飾され得る。ＢＮＡの他の例は、全体として本明細書において参照により組み込まれる、公開された国際特許出願ＷＯ２００７／１４６５１１において記載される。
【０１０９】
本明細書に記載の、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡ分子または類似のＤＮＡ分子のようなオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分を有する１個もしくは複数のヌクレオチドを任意選択で含有し得る。糖修飾は、本明細書に記載の、アンチセンス化合物、およびＲＮＡ分子もしくは類似のＤＮＡ分子に、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、またはいくつかの他の有益な生物学的特性を授け得る。ヌクレオシドのフラノシル糖環は、特に、２’位における置換基の付加、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための２つの非ジェミナル環原子の架橋、および４’位における環の酸素についての−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、もしくは−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）のような原子または基の置換を含むが、これらに限定されないいくつかの方法において修飾され得る。修飾された糖は、置換された糖、特に、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ２（２’−ＯＭｅ）、または２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３（２’−Ｏ−メトキシエチルもしくは２’−ＭＯＥ）置換基を有する２’−置換糖、および４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎ＝１もしくはｎ＝２である）を有する、二環式の修飾された糖（ＢＮＡ）を含むが、これらに限定されない。修飾された糖の調製方法は、当業者に周知である。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、２’−修飾ヌクレオシドは、二環式糖部分を有する。ある特定のかかる実施形態では、二環式糖部分は、アルファ配置のＤ糖である。ある特定のかかる実施形態では、二環式糖部分は、ベータ配置のＤ糖である。ある特定のかかる実施形態では、二環式糖部分は、アルファ配置のＬ糖である。ある特定のかかる実施形態では、二環式糖部分は、ベータ配置のＬ糖である。
【０１１１】
他の実施形態では、二環式糖部分は、２’と４’−炭素原子の間の架橋基を含む。ある特定のかかる実施形態では、架橋基は、１から結合されたビラジカル基までを含む。ある特定の実施形態では、二環式糖部分は、１〜４個の結合されたビラジカル基を含む。ある特定の実施形態では、二環式糖部分は、２または３個の結合されたビラジカル基を含む。ある特定の実施形態では、二環式糖部分は、２個の結合されたビラジカル基を含む。ある特定の実施形態では、結合されたビラジカル基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｓｉ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、および−Ｃ（＝Ｓ）−（式中、それぞれのＲ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換されたＣ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換されたＣ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換されたＣ５〜Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換されたヘテロ−サイクルラジカル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、置換されたＣ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、置換されたオキシ（−Ｏ−）、アミノ、置換されたアミノ、アジド、カルボキシル、置換されたカルボキシル、アシル、置換されたアシル、ＣＮ、チオール、置換されたチオール、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｈ）、置換されたスルホニル、スルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｈ）、または置換されたスルホキシルであり、それぞれの置換基は、独立して、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換されたＣ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換されたＣ２〜Ｃ１２アルキニル、アミノ、置換されたアミノ、アシル、置換されたアシル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルコキシ、置換されたＣ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換されたＣ１〜Ｃ１２アミノアルコキシ、または保護基である）から選択される。
【０１１２】
本明細書に記載の、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡ分子または類似のＤＮＡ分子のようなオリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当該技術分野において単に「塩基」としてしばしば言及される）修飾または置換も含み得る。核酸塩基修飾または置換は、天然に存在する、または合成の修飾されていない核酸塩基と依然機能的に交換可能な、構造上区別可能な形態である。天然および修飾された核酸塩基の両方は、水素結合において関与する能力がある。かかる核酸塩基修飾は、オリゴヌクレオチド化合物に、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、またはいくつかの他の有益な生物学的特性を授け得る。修飾された核酸塩基は、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）のような合成および天然の核酸塩基を含む。５−メチルシトシン置換を含む、特定の核酸塩基置換は、標的核酸（例えば、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）に対するオリゴヌクレオチド化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物）の結合親和性を増大するのに特に有用である。
【０１１３】
さらなる修飾されていない核酸塩基は、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。
【０１１４】
複素環塩基部分はまた、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられるものを含んでもよい。本明細書に記載の、アンチセンス化合物、およびＲＮＡ分子または類似のＤＮＡ分子の結合親和性を増大させるのに特に有用である核酸塩基は、２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。
【０１１５】
本明細書において使用される、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。
【０１１６】
修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらなる修飾された核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）のような三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）のようなＯ−クランプを含む。修飾された核酸塩基はまた、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられるものを含んでもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号において開示されるもの、The  Concise  Encyclopedia  Of  Polymer  Science  And  Engineering、８５８〜８５９頁、Kroschwitz,  J.  I.編、John  Wiley  &  Sons、１９９０年において開示されるもの、Englischら、Angewandte  Chemie、International  Edition、１９９１年、３０巻、６１３頁により開示されるもの、ならびにSanghvi,  Y.  S.、１５章、Antisense  Research  and  Applications、２８９〜３０２頁、Crooke,  S.  T.およびLebleu,  B.編、CRC  Press、１９９３年により開示されるものを含む。
【０１１７】
上で述べられた修飾された核酸塩基、ならびに他の修飾された核酸塩基の特定の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、および第５，６８１，９４１号を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、全体として本明細書において参照により組み込まれる。
ＩＶ．単離されたＲＮＡを使用する方法
Ａ．がん、前がんを処置する、またはがん幹細胞を除去するための方法
【０１１８】
被験体においてがん、前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量の、本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子もしくは単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１１９】
被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法の一部の実施形態では、この方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ハイブリダイズしたＲＮＡとオリゴヌクレオチドをＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される。一部の実施形態では、処置の方法は、少なくとも１種のがん細胞、前がん細胞、またはがん幹細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１２０】
被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法の一部の実施形態では、この方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に類似の配列を含み、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を、エキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に類似の配列から本質的になる。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に類似の配列からなる／ＲＮＡ配列に対応する。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に同一の配列を含む。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に同一の配列から本質的になる。一部の実施形態では、前記単離されたＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子からなる群から選択されるＲＮＡ分子に同一の配列からなる。一部の実施形態では、処置の方法は、少なくとも１種のがん細胞、前がん細胞、またはがん幹細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１２１】
被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法の一部の実施形態では、方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット、または１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットを含む医薬組成物を投与するステップを含み、１種超のＲＮＡ分子の前記単離されたセットは、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子のセットを単離して、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットをもたらすステップを含む方法により調製される。一部の実施形態では、処置の方法は、少なくとも１種のがん細胞、前がん細胞、またはがん幹細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１２２】
被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法の一部の実施形態では、この方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット、または１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットを含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる配列に類似の１種超の配列を含み、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法により調製される。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に類似の１種超の配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に類似の１種超の配列からなる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に同一の１種超の配列を含む。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子に同一の１種超の配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分���から生じるＲＮＡ分子に同一の１種超の配列からなる。一部の実施形態では、処置の方法は、少なくとも１種のがん細胞、前がん細胞、またはがん幹細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１２３】
被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法の一部の実施形態では、方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット、または１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットを含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットに類似の全ての配列を含み、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を、エキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子のセットをもたらすステップを含む方法により調製される。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットに類似の全ての配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットに類似の全ての配列からなる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットに類似の全ての配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットに類似の全ての配列からなる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の全ての配列を含む。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の全ての配列から本質的になる。一部の実施形態では、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットは、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の全ての配列からなる。一部の実施形態では、処置の方法は、少なくとも１種のがん細胞、前がん細胞、またはがん幹細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１２４】
被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法の一部の実施形態では、この方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ＲＮＡ分子は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列を含む。被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法の一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列を含む単離された二本鎖ＲＮＡ分子である。被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法、またはがん幹細胞を除去する方法の一部の実施形態では、単離されたＲＮＡ分子は、単離された二本鎖ＲＮＡ分子であり、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列からなる／ＲＮＡ配列に対応する。一部の実施形態では、処置の方法は、少なくとも１種のがん細胞、前がん細胞、またはがん幹細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１２５】
被験体においてがんを処置する方法の一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍または血液系のがん（すなわち、非固形がん）である。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、急性骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病、好塩基球性白血病（basophylic  leukemia）、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリーセル白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（lymphatic  leukemia）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性白血病（lymphogenous  leukemia）、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、マスト細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ型白血病、形質細胞性白血病、プラズマ細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、未分化細胞性白血病、特発性骨髄線維症、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫）、ならびに骨髄異形成症候群からなる群から選択される非固形がん、または扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜のがん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、脳がん、頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、肉腫、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、大腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜もしくは子宮がん、中咽頭がん（oralpharyngeal  cancer）、唾液腺癌腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝細胞癌腫、胃がん、メラノーマ、および種々のタイプの頭部および頸部がんからなる群から選択される固形腫瘍である。
【０１２６】
本明細書に記載のがんを処置する方法はまた、がん（例えば、転移性がん、もしくは再発がん）に関連する症状または状態（身体障害、機能障害）を阻害する方法にも向けられる。かくして、ここで開示される方法の効果は、個体にとって有意な治療の恩恵まで恐らく拡大したが、状態の全ての効果は、完全に予防されるか、または反転されることは要求されない。かくして、治療の恩恵は、必ずしも状態にとって完全な予防または治癒ではないが、むしろ、がん（例えば、転移性がん、もしくは再発がん）から生じる症状を低減するか、または予防すること、かかる症状の出現を（定量的もしくは定性的のいずれかで）低減するか、または予防すること、かかる症状もしくはその生理学的作用の重症度を低減すること、ならびに／あるいはがん（例えば、転移性がん、もしくは再発がん）症状を体験した後、個体の回復を増強することを含む結果を包含し得る。
【０１２７】
本明細書において提供される方法は、様々ながんもしくは前がんの処置、またはがん幹細胞の除去において有効な単離されたＲＮＡ分子を含む。これらの単離されたＲＮＡ分子は、本明細書において、または米国特許第８，３１８，６８６号において記載されるアンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）分子に相補的なオリゴヌクレオチドでのがんの処置により形成される下流のエレメントである。図７Ａおよび７Ｂにおいて概説される、このプロセス中に形成されるＲＮＡは、このプロセスにおけるさらに下流で有用ながん治療をもたらし、がん治療として使用するため容易に単離されるか、または合成的に調製され得る。これらの下流エレメントは、ｉｎ  ｖｉｖｏでより少ないプロセッシングステップをもたらすので、本明細書に記載の方法は、任意のがんもしくは前がんを本質的に処置するか、またはがん幹細胞を除去するためにより正確かつ選択的な治療をもたらす。
【０１２８】
被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法またはがん幹細胞を除去する方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量の、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子から調製された、単離されたＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法の一部の実施形態において。一部の実施形態では、方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子から調製された、単離されたＲＮＡ分子に類似の配列を有する単離された合成ＲＮＡ分子を投与するステップを含む。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子から調製された、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子から調製された、単離されたＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡ分子であり、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列を含み、他の鎖は、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、および配列番号１０８からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子から調製された、単離されたＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡ分子であり、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番��１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列から本質的になる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子から調製された、単離されたＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡ分子であり、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列からなる。一部の実施形態では、処置の方法は、少なくとも１種のがん細胞、前がん細胞、またはがん幹細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１２９】
被験体においてがんもしくは前がんを処置する方法またはがん幹細胞を除去する方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量の、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断されたＡＳｎｃｍｔＲＮＡ分子から調製された、単離されたＲＮＡ分子を投与するステップを含む方法の一部の実施形態では、単離されたＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡであり、一方の鎖は配列番号７の配列を含み、その相補鎖は配列番号９６の配列を含み、一方の鎖は配列番号８の配列を含み、その相補鎖は配列番号９７の配列を含み、一方の鎖は配列番号９の配列を含み、その相補鎖は配列番号９８の配列を含み、一方の鎖は配列番号１０の配列を含み、その相補鎖は配列番号９９の配列を含み、一方の鎖は配列番号１１の配列を含み、その相補鎖は配列番号１００の配列を含み、一方の鎖は配列番号１２の配列を含み、その相補鎖は配列番号１０１の配列を含み、一方の鎖は配列番号１３の配列を含み、その相補鎖は配列番号１０２の配列を含み、一方の鎖は配列番号１４の配列を含み、その相補鎖は配列番号１０３の配列を含み、一方の鎖は配列番号１５の配列を含み、その相補鎖は配列番号１０４の配列を含み、一方の鎖は配列番号１６の配列を含み、その相補鎖は配列番号１０５の配列を含み、一方の鎖は配列番号１７の配列を含み、その相補鎖は配列番号１０６の配列を含み、一方の鎖は配列番号１８の配列を含み、その相補鎖は配列番号１０７の配列を含み、一方の鎖は配列番号１９の配列を含み、その相補鎖は配列番号１０８の配列を含む。一部の実施形態では、処置の方法は、少なくとも１種のがん細胞、前がん細胞、またはがん幹細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１３０】
非限定的な例として、本発明による処置は、２４、１２、８、６、４、もしくは２時間毎、またはその任意の組合せの１回用量もしくは分割用量を使用した、処置の開始、あるいはその任意の組合せ後の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日の少なくとも１回において、またはあるいは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０週の少なくとも１回において、１日当たり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｍｇ／ｋｇの量で単離されたＲＮＡ分子の一日投薬量として提供され得る。
【０１３１】
被験体において、がんもしくは前がんを処置する方法またはがん幹細胞を除去する方法の実施形態のいずれかでは、類似の合成ＲＮＡ分子または類似の合成ＤＮＡ分子、あるいはその医薬組成物は、これらの方法において治療有効量でそれを必要とする被験体に、すなわち、単離されたＲＮＡ分子、またはその医薬組成物について上で記載された通り、投与され得る。
Ｂ．Ｍｉｔｏ−ｍｉＲによるアポトーシスに関与するタンパク質のダウンレギュレーション
【０１３２】
腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす方法であって、腫瘍細胞を、本明細書に記載の、１種もしくは複数種の単離されたＲＮＡ分子または１種もしくは複数種の単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物と接触させるステップを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１３３】
別の態様では、本明細書において考察される通り調製されたＭｉｔｏ−ｍｉＲは、アポトーシス、細胞成長の調節、細胞遊走、細胞浸潤、および転移の１つまたは複数に関与するタンパク質を含む、がん細胞の調節に関与するいくつかのタンパク質の発現と干渉するのに有用である。一実施形態では、タンパク質は、サバイビン、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ＦＫＢＰ３８、Ｎ−カドヘリン、およびカベオリンからなる群から選択される。機序に制限されることなく、本明細書に記載のＭｉｔｏ−ｍｉＲは、様々なかかるタンパク質由来のｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）とハイブリダイズし得る。ＵＴＲへの結合は、タンパク質の発現を阻害し、これが、細胞においてタンパク質の低減をもたらす。アポトーシス、細胞成長の調節、細胞遊走、細胞浸潤、および転移の１つまたは複数に関与するタンパク質を含む、がん細胞の調節に関与するこれらのタンパク質のこのダウンレギュレーションは、がん細胞の死をもたらす。かくして、本明細書に記載のがんの処置は、本明細書に記載の１種もしくは複数種のＭｉｔｏ−ｍｉＲで、または細胞において反応して、本明細書に記載される１種もしくは複数種のＭｉｔｏ−ｍｉＲを形成する、本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子での処置をもたらし、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲは、１種または複数種のタンパク質の発現のダウンレギュレーションをもたらし、腫瘍細胞におけるタンパク質の発現の低減は、細胞死をもたらす。一実施形態では、サバイビン、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ＦＫＢＰ３８、Ｎ−カドヘリン、およびカベオリンからなる群から選択される１種または複数種のタンパク質の発現は、本明細書に記載の、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲまたは他の単離されたＲＮＡ分子での処理により低減される。例えば、サバイビン、サイクリンＤ１、およびサイクリンＢ１のＵＴＲに結合し得る、本明細書に記載のＭｉｔｏ−ｍｉＲは、それぞれ、図４２Ａ〜Ｃにおいて示される。
ａ．サバイビンのダウンレギュレーション
【０１３４】
サバイビンは、タンパク質のアポトーシスの阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーであり、事実上全てのヒトがん細胞においてアップレギュレーションされる。ＩＡＰファミリーのタンパク質は、固有のアポトーシス経路の下流で、がん細胞において重要な細胞保護的機能を果たす（Dohiら、J.  Biol.  Chem.、２００４年、２７９巻：３４０８７〜３４０９０頁、Dohiら、Mol  Cell.、２００７年、２７巻：１７〜２８頁、Altieri,  D.C.、Biochem.  J.、２０１０年、３０巻：１９９〜２０５頁、Kangら、J.  Biol.  Chem.、２０１１年、２８６巻：１６７５８〜１６７６７頁）。サバイビンのダウンレギュレーションは、この抗アポトーシス機能に作用し、がん細胞のアポトーシスをもたらすであろう。本明細書に記載の、腫瘍細胞におけるサバイビンのレベルは、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理により徹底的に低減され（実施例１２、１４を参照）、本明細書に記載のｍｉＲＮＡまたは他の単離されたＲＮＡ分子での処理は、サバイビンレベルを同様に低減し、がん細胞を死滅させるであろう。本明細書に記載の、単離されたＲＮＡ分子での処理は、図４２Ａにおいて示されるもののような、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲの結合をもたらし、それは、サバイビンｍＲＮＡのＵＴＲに相補的であり得る。かかるＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、サバイビンのダウンレギュレーションにおいて選択的であり、正常な細胞に影響することなく、様々ながんの処置の理想である。類似の活性は、サバイビンの発現を調節する公知のｍｉＲで見られた（Diakosら、Blood、２０１０年、１６巻：４８８５〜４８９３頁、Alajezら、Cancer  Res.、２０１１年、７１巻：２３８１〜２３９１頁）。
ｂ．サイクリンＤ１のダウンレギュレーション
【０１３５】
サイクリンＤ１は、細胞成長の調節に関与し、フェーズＧ１からＳへの細胞の移行に要求されることが知られている（Vien  Khach  Laiら、Cell  Cycle、１１巻：７６７〜７７７頁、２０１２年、Jing  Nieら、Carcinogenesis、３３巻：２２０〜２２５頁、２０１２年、Qiong  Jiangら、BMC  Cancer、９巻：１９４〜２０８頁、２００９年）。サイクリンＤ１のダウンレギュレーションは、フェーズＧ１の細胞、および細胞死の増大をもたらす。本明細書に記載の、腫瘍細胞におけるサイクリンＤ１のレベルは、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理により低減され（実施例１５を参照）、本明細書に記載のｍｉＲＮＡまたは他の単離されたＲＮＡ分子での処置は、サイクリンＤ１レベルを同様に低減し、がん細胞を死滅させるであろう。本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子での処置は、図４２Ｂにおいて示されるもののようなＭｉｔｏ−ｍｉＲの結合をもたらし、それは、サイクリンＤ１ｍＲＮＡのＵＴＲに相補的であり得る。かかるＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、サイクリンＤ１のダウンレギュレーションにおいて選択的であり、正常な細胞に影響することなく、様々ながんの処置の理想である。
ｃ．サイクリンＢ１のダウンレギュレーション
【０１３６】
サイクリンＢ１は、細胞成長の調節に関与し、有糸分裂を誘導することが知られている（Debra  J.  Wolgemuth、Cell  Cycle、７巻：３５０９〜３５１３頁、２００８年、Vera  HuangおよびLong-Cheng  Li、RNA  Biology、９巻：２６９〜２７３頁、２０１２年）。サイクリンＢ１のダウンレギュレーションは、有糸分裂の阻害、および細胞死の増大をもたらす。本明細書に記載の、腫瘍細胞におけるサイクリンＢ１のレベルは、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置により低減され（実施例１５を参照）、本明細書に記載のｍｉＲＮＡまたは他の単離されたＲＮＡ分子での処置は、サイクリンＢ１レベルを同様に低減し、がん細胞を死滅させるであろう。本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子での処理は、図４２Ｃにおいて示されるもののようなＭｉｔｏ−ｍｉＲの結合をもたらし、それは、サイクリンＢ１ｍＲＮＡのＵＴＲに相補的であり得る。かかるＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、サイクリンＢ１のダウンレギュレーションにおいて選択的であり、正常な細胞に影響することなく、様々ながんの処置の理想である。
ｄ．ＦＫＢＰ３８のダウンレギュレーション
【０１３７】
Ｂｃｌ２は、ＦＫＢＰ３８の作用によりミトコンドリアにおいて維持されるミトコンドリア抗アポトーシスタンパク質である（Portier,  B.P.およびTaglialatela,  G.、J.Biol.Chem.、２８１巻：４０４９３〜４０５０２頁、２００６年、Shirane,  M.およびNakayama,  K.I.、Nat.  Cell  Biol.、５巻：２８〜３７頁、２００３年、Wang,  H.Q.ら、Human  Mol.  Gen.、１４巻：１８８９〜１９０２頁、２００５年、Bai  Xら、Science、３１８巻：９７７〜９８０頁、２００７年、Xuemin  Wangら、J.Biol.Chem.、２８３巻：３０４８２〜３０４９２頁、２００８年）。ＦＫＢＰ３８のダウンレギュレーションは、Ｂｃｌ２の核への遊走をもたらし、それは前アポトーシスとなり、これが、がん細胞の死をもたらす。本明細書に記載の、腫瘍細胞におけるＦＫＢＰ３８のレベルは、Ｂｃｌ２のレベルに影響することなく、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置により低減され（実施例１６を参照）、本明細書に記載のｍｉＲＮＡまたは他の単離されたＲＮＡ分子での処理は、ＦＫＢＰ３８レベルを同様に低減し、がん細胞を死滅させるであろう。本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子での処置は、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲの結合をもたらし、それは、ＦＫＢＰ３８ｍＲＮＡのＵＴＲに相補的であり得る。かかるＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、ＦＫＢＰ３８のダウンレギュレーションにおいて選択的であり、正常な細胞に影響することなく、様々ながんの処置の理想である。
ｅ．Ｎ−カドヘリンおよびカベオリンのダウンレギュレーション
【０１３８】
Ｎ−カドヘリンならびにカベオリンは、細胞遊走、細胞浸潤、および転移に関与する（L.D.M.  DeryckeおよびM.E.  Bracken、Int.  J.  Dev.  Biol.、４巻：４６３〜４７６頁、２００４年、Lorena  Lobos-Gonzalezら、Pigment  Cell  Melanoma  Res.、２６巻：５５５〜５７０頁、２０１３年、Fiucci,  G.ら、Oncogene、２１巻：２３６５〜２３７５頁、２００２年、Jean-Leon  MaitreおよびCarl-Philipp  Heisenberg、Current  Biology、２３巻：Ｒ６２６〜Ｒ６３３頁、２０１３年）。Ｎ−カドヘリンならびにカベオリンのダウンレギュレーションは、がん細胞のアポトーシスおよび死の確率の増大をもたらす。本明細書に記載の、腫瘍細胞におけるＮ−カドヘリンおよびカベオリンのレベルは、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理により低減され（実施例１５を参照）、本明細書に記載のｍｉＲＮＡまたは他の単離されたＲＮＡ分子での処理は、Ｎ−カドヘリンおよびカベオリンレベルを同様に低減し、がん細胞を死滅させるであろう。本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子での処理は、Ｍｉｔｏ−ｍｉＲの結合をもたらし、それは、Ｎ−カドヘリンまたはカベオリンｍＲＮＡのＵＴＲに相補的であり得る。かかるＭｉｔｏ−ｍｉＲＮＡ分子は、Ｎ−カドヘリンおよびカベオリンのダウンレギュレーションにおいて選択的であり、正常細胞に影響することなく、様々ながんの処置の理想である。
ＩＩＩ．他の抗がん治療との併用した処置の方法
【０１３９】
一部の態様では、本明細書に記載の処置の方法のいずれかは、１種または複数種のさらなる抗がん治療を被験体に施すことを含み得る。様々なクラスの抗がん剤が使用され得る。非限定的な例は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン、抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）またはＧｌｉｖｅｃ（登録商標）））、ホルモン処置、可溶性受容体、および他の抗腫瘍薬を含む。
【０１４０】
トポイソメラーゼ阻害剤はまた、使用され得る別のクラスの抗がん剤である。トポイソメラーゼは、ＤＮＡのトポロジーを維持する必須の酵素である。Ｉ型またはＩＩ型トポイソメラーゼの阻害は、適切なＤＮＡ超らせん形成を乱すことにより、ＤＮＡの転写および複製の両方と干渉する。いくつかのＩ型トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシンであるイリノテカンおよびトポテカンを含む。ＩＩ型阻害剤は、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドを含む。アメリカ・メイアップル（American  Mayapple）（アメリカハッカクレン）の根に天然に存在するアルカロイドであるエピポドフィロトキシンの半合成誘導体が存在する。
【０１４１】
抗腫瘍薬は、免疫抑制剤ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブチル、イホスファミドを含む。抗腫瘍薬化合物は、細胞のＤＮＡを化学的に修飾することにより一般的に働く。
【０１４２】
アルキル化剤は、細胞が存在する条件下で多くの求核性官能基をアルキル化することができる。シスプラチンおよびカルボプラチン、ならびにオキサリプラチンは、アルキル化剤である。それらは、生物学的に重要な分子においてアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、およびリン酸塩基と共有結合を形成することにより、細胞機能を損なう。
【０１４３】
ビンカアルカロイドは、チューブリン上の特異的な部位に結合し、これにより、チューブリンの微小管への集合（細胞周期のＭフェーズ）を阻害する。ビンカアルカロイドは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシンを含む。
【０１４４】
代謝拮抗物質は、プリン（アザチオプリン、メルカプトプリン）またはピリミジンに似ており、これらの物質が、細胞周期の「Ｓ」フェーズ中にＤＮＡに取り込まれることを妨げ、これにより、正常な発生および分裂を停止する。代謝拮抗物質はまた、ＲＮＡ合成に影響する。
【０１４５】
植物アルカロイドおよびテルペノイドは、植物に由来し、微小管機能を妨げることにより、細胞分裂を阻害する。微小管は細胞分裂に不可欠であるので、それらなしで、細胞分裂が生じることができない。主な例は、ビンカアルカロイドおよびタキサンである。
【０１４６】
ポドフィロトキシンは、消化を助けることが報告され、ならびに２つの他の細胞分裂阻害薬、エトポシドおよびテニポシドを産生するのに使用される、植物由来の化合物である。それらは、細胞が、Ｇ１フェーズ（ＤＮＡ複製の開始）およびＤＮＡの複製（Ｓフェーズ）に入ることを妨げる。
【０１４７】
群としてのタキサンは、パクリタキセルおよびドセタキセルを含む。パクリタキセルは、元々タクソールとして公知の、天然の産物であり、タイヘイヨウイチイの木の皮から最初にもたらされた。ドセタキセルは、パクリタキセルの半合成類似体である。タキサンは、微小管の安定性を増強し、分裂後期中の染色体の分離を妨げる。
【０１４８】
一部の態様では、抗がん治療薬は、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチン、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、ギリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキサート、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、タクソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、ＣＰＴ−１１、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ（例えば、ＰＥＧ  ＩＮＴＲＯＮ−Ａ）、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソームダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パシリタキセル、ビンブラスチン、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート、ビアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、エストライヌスチンナトリウムホスフェート（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））、スリンダク、またはエトポシドから選択され得る。
【０１４９】
他の実施形態では、抗がん治療薬は、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロン−アルファ、レナリドミド、メルファラン、ペグ化インターフェロン−アルファ、プレドニゾン、サリドマイド、またはビンクリスチンから選択され得る。
【０１５０】
他の態様では、本明細書に記載の処置の方法のいずれかは、自家または同種間幹細胞移植治療のいずれかを含み得る。自家幹細胞移植は、実質的な心臓、肺、腎臓または肝臓機能障害を有しない、年齢６５歳より下の被験体のため典型的に使用される。
ＩＶ．医薬組成物
【０１５１】
別の態様では、本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子のいずれかのような、１種または複数種の単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列を含む１種または複数種の単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列を含む単離された二本鎖ＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、単離された二本鎖ＲＮＡ分子を含み、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列からなる／ＲＮＡ配列に対応する。
【０１５２】
本明細書に記載の１種または複数種の単離されたＲＮＡ分子と、薬学的に許容されるビヒクルもしくは賦形剤とを含む医薬組成物も、本明細書において提供される。
【０１５３】
抗がん治療、例えば、本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子を投与することによる処置は、医薬組成物の形態で投与され得る。これらのＲＮＡ分子、およびその医薬組成物は、経口、直腸、脳脊髄、経皮、皮下、局所、経粘膜、鼻咽頭（nasopharangeal）、肺、静脈内、腹腔内（intraperitonial）、筋肉内、および鼻腔内を含む、様々な経路により投与され得る。一部の実施形態では、投与は局所投与である。一部の実施形態では、局所投与は、器官への、腔への、組織への、固形腫瘍への投与、および皮下投与からなる群から選択される。一部の実施形態では、投与は全身投与である。一部の実施形態では、全身投与は、静脈内または腹腔内投与である。これらの化合物は、注射可能な組成物および経口組成物の両方として有効である。かかる組成物は、医薬の技術分野において周知の方法で調製され、少なくとも１種の活性化合物を含む。経口組成物として利用されるとき、本明細書において開示されるオリゴヌクレオチドおよび別のものは、薬学的に許容される保護剤により胃での酸消化から保護される。
【０１５４】
有効成分として、本明細書に記載の１種または複数種の単離されたＲＮＡ分子を、１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤または担体と共に含有する医薬組成物も、本明細書において提供される。本発明の組成物の作製において、有効成分は、賦形剤または担体と通常混合されるか、賦形剤または担体により希釈されるか、あるいはカプセル、小袋、紙、もしくは他の容器の形態であり得る、かかる賦形剤または担体内に包含される。賦形剤もしくは担体が希釈剤として作用するとき、それは、固形、半固形、または液体材料であり得、それは、有効成分のためのビヒクル、担体、または媒体として働く。したがって、組成物は、錠剤、ピル剤、粉剤、トローチ剤、サッシェ剤、カシェー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体として、または液体媒体中）、例えば、最大１０重量％有効な化合物を含有する軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル剤、座薬、無菌の注射可能な溶液、ならびに無菌のパッケージ化された粉剤の形態であり得る。
【０１５５】
製剤を調製する際、他の成分と組み合わせることに先立ち、適当な粒子サイズを提供するために、活性凍結乾燥化合物を挽くことを必要としてもよい。活性化合物が実質的に不溶性であるなら、２００未満のメッシュの粒子サイズに普通挽かれる。活性化合物が実質的に水溶性であるなら、粒子サイズは、製剤において実質的に均一な分配、例えば、約４０メッシュをもたらすために挽くことにより、通常調整される。
【０１５６】
適当な賦形剤または担体のいくつかの例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、無菌水、シロップ、およびメチルセルロースを含む。製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような平滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、メチル−およびプロピルヒドロキシ−ベンゾエートのような保存剤、甘味剤、ならびに香味剤をさらに含み得る。本発明の組成物は、当該技術分野において公知の手順を利用することによる患者への投与後、有効成分の即時、持続、または遅延放出をもたらすように製剤化され得る。
【０１５７】
別の態様では、本明細書に記載の、１種もしくは複数種のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子は、個体に送達するためマイクロキャリア内に被包される。一部の実施形態では、マイクロキャリアは、１種超のＲＮＡ分子および／またはＤＮＡ分子種を被包する。一部の実施形態では、マイクロキャリア内に被包される１種もしくは複数種のＲＮＡ分子および／またはＤＮＡ分子種は、配列番号７〜３２からなる群から選択される核酸配列を含む。マイクロキャリアにおいてオリゴヌクレオチドを被包する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、国際特許出願ＷＯ９８／５５４９５において記載される。コロイド分散系、例えば、ミクロスフェア、ビーズ、巨大分子複合体、ナノカプセル剤、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームのような脂質ベースの系は、マイクロキャリア組成物内のオリゴヌクレオチドの有効な被包をもたらし得る。被包組成物は、多種多様な成分のいずれかをさらに含んでもよい。これらは、ミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造（ＬＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびにポリペプチド、糖ペプチド、および多糖のような他の高分子を含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
組成物は、それぞれの投薬量が、いずれかの有効成分、約５ｍｇ〜約１０００ｍｇまたはそれ超、例えば、以下の値の間にある任意の範囲を包括的に含む、約５ｍｇ〜約９００ｍｇ、５ｍｇ〜約８００ｍｇ、約５ｍｇ〜約７００ｍｇ、約５ｍｇ〜約６００ｍｇ、約５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約３０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約４５ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約５００ｍｇを含有する、単位投薬形態に製剤化され得る。用語「単位投薬形態」は、それぞれの単位が、所望の治療効果を生じるために計算された、予め決定された量の活性成分を適当な医薬賦形剤または担体と共に含有する、被験体のための単位投薬量として適当な物理的に別々の単位を指す。
【０１５９】
本明細書において開示される抗がん治療は、広範な投薬量範囲に渡り有効であり、治療有効量で一般に投与される。しかしながら、実際に施される抗がん治療の総量は、処置されるべき状態、選ばれた投与経路、投与される実際の化合物、個々の被験体の年齢、体重、および応答、被験体の症状の重症度などを含む、関連する状況に照らし、医師により決定されることは理解されるであろう。
【０１６０】
錠剤のような固形組成物を調製するため、主な有効成分抗がん治療は、医薬の賦形剤または担体と混合されて、本発明の化合物の均一な混合物を含有する固形前処方設計組成物がもたらされる。均一であるこれらの前処方設計組成物を指すとき、組成物が、錠剤、ピル剤、およびカプセル剤のような均等に有効な投薬形態に容易に分割され得るように、有効成分が組成物を通じて均一に分散されることを意味する。
【０１６１】
本発明の錠剤またはピル剤は、コーティングされるか、またはそうでなければ、組み合わされて、延長性作用の利点をもたらす投薬形態が提供され、抗がん治療（例えば、オリゴヌクレオチド）が胃における酸加水分解から保護され得る。例えば、錠剤またはピル剤は、内部投薬および外部投薬成分を含むことができ、後者は、前者を覆う殻の形態である。２種の成分は、胃での分解に抵抗するよう作用し、内部成分が、十二指腸まで未変化で通過するか、または放出が遅延されることを可能にする、腸溶性の層により分けられ得る。種々の材料は、かかる腸溶性の層またはコーティングのため使用され得、かかる材料は、いくつかのポリマー酸、ならびにポリマー酸のシェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との混合物を含む。
【０１６２】
本発明の新規組成物が、経口または注射による投与のため取り込まれ得る、液体形態は、水溶液、適当には、フレーバーシロップ、水性もしくは油性懸濁液、およびコーン油、綿実油、ゴマ油、ヤシ油、もしくはピーナッツ油のような食用油とのフレーバーエマルジョン、ならびにエリキシル剤および同様の医薬ビヒクルを含む。
【０１６３】
非経口経路の投与は、中心静脈ラインへの直接注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下注射を含むが、これらに限定されない。非経口投与に適当な製剤（例えば、マイクロキャリア製剤における、本明細書に記載のＲＮＡ分子）は、ＵＳＰ水または注射用水において一般に製剤化され、ｐＨ緩衝液、塩充填剤、保存剤、および他の薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。非経口注射のための、例えば、マイクロキャリア複合体または被包物としての、本明細書に記載のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子は、食塩水、および注射用リン酸緩衝食塩水のような薬学的に許容される無菌の等張溶液において製剤化されてもよい。
【０１６４】
吸入または通気のための組成物は、薬学的に許容される、水性もしくは有機溶媒、またはその混合物における溶液および懸濁液、ならびに粉末を含む。液体または固体組成物は、本明細書に記載の、適当な薬学的に許容される賦形剤を含有し得る。組成物は、局所もしくは全身作用のため経口または鼻の呼吸性経路により投与され得る。薬学的に許容される溶媒中の組成物は、不活性なガスの使用により霧状にされ得る。霧状にされた溶液は、噴霧化装置から直接的に吸入され得るか、または噴霧化装置が、フェイスマスクテントもしくは間欠的陽圧呼吸機に備え付けられ得る。溶液、懸濁液、または粉末組成物はまた、製剤を適当な方法で送達する装置から、経口もしくは経鼻的に投与され得る。
Ｖ．キットおよび製造品
【０１６５】
本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を含むキットも提供される。例えば、キットは、単離されたＲＮＡ分子の単位投薬形態、およびがんの処置における組成物の使用のための指示を含有する添付文書を含み得る。一部の実施形態では、キットは、単離されたＲＮＡ分子の単位投薬形態、および少なくとも１種の薬学的に許容されるビヒクルを含む。キット中の使用のための指示は、がんを処置するためであってもよい。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の、単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、上で考察されたがんのいずれかに限定されないが、それのような、がんの処置における単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物の使用のための指示を含む。
【０１６６】
本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物（例えば、製剤および単位投薬量を含む）は、調製され、適当な容器に入れられ、がんの処置のためラベルされ得る。したがって、本明細書に記載の単離されたＲＮＡ分子の単位投薬形態を含む容器、および単離されたＲＮＡ分子の使用のための指示を含有するラベルのような製造品も提供される。一部の実施形態では、製造品は、単離されたＲＮＡ分子の単位投薬形態、および少なくとも１種の薬学的に許容されるビヒクルを含む容器である。製造品は、本開示において提供される医薬組成物を含有する、ビン、バイアル、アンプル、１回使用の使い捨てアプリケーターなどであってもよい。容器は、ガラスまたはプラスチックのような、様々な材料から形成され得、一態様では、がんの処置における使用のための指示を示す容器上の標識、またはそれと関連する標識も含有し得る。有効成分は、化学的および物理的安定性を改善する能力がある任意の材料においてパッケージされてもよいことは理解されるべきである。
【０１６７】
本開示において提供される任意の医薬組成物は、それぞれおよび全ての組成物が、製造品における使用のため具体的および個々に挙げられるのと同様に、製造品において使用され得る。
【実施例】
【０１６８】
（実施例１）
ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのループ領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのＡＳｎｃｍｔＲＮＡのノックダウン
この研究において、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのループ領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド１５３７Ｓ（ＡＳＯ−１５３７Ｓ）での処理により、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）の発現をノックダウンした。
材料および方法
【０１６９】
ＨｅＬａ、ＨＦＫ、またはＳＫ−ＭＥＬ−２細胞を、ＡＴＣＣガイドラインに従い培養し、加湿細胞培養チャンバー中、３７℃および５％ＣＯ２において維持した。５’−ＣＡＣＣＣＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧ（配列番号３６）の配列を有するＡＳＯ−１５３７Ｓ、および５’−ＡＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＧ（配列番号３８）の配列を有する対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ−Ｃ）を、ＩＤＴまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより１００％ホスホロチオエート結合で合成した。１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、１ウェル当たり５０，０００個の細胞（ＨｅＬａ、ＨＦＫ）、または１ウェル当たり１００，０００個の細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２）にて細胞を播種し、製造元の指示に従い、ＨｅＬａ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、およびＨＦＫ細胞それぞれについて、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５μｌ、２．０μｌ、および１．０μｌを使用して、１００ｎＭ（ＨｅＬａ、ＨＦＫ）、または１５０ｎＭ（ＳＫ−ＭＥＬ−２）において、ＡＳＯでの翌日にトランスフェクトしたか、または処理しないままにした。正常培養条件下でトランスフェクションをそのまま進めさせ、処理していない対照試料も同様にし、最大４８時間まで所望の時間ポイントにおいて細胞を回収した。
【０１７０】
細胞を回収し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＲＮＡを抽出した（Villegasら、Nucleic  Acids  Res.、２００７年、３５巻：７３３６〜７３４７頁、Burzioら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、２００９年、１０６巻：９４３０〜９４３４頁、Villotaら、J.  Biol.  Chem.、２０１２年、２８７巻：２１３０３〜２１３１５頁）。ＲＮＡ調製物をＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理して、ＤＮＡコンタミネーションを除去した。ＲＮＡ５０〜１００ｎｇ、ランダムヘキサマー５０ｎｇ、０．５ｍＭ各ｄＮＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｕ／μｌＲｎａｓｅ−ｏｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｒｅｖｅｒｓｅ２５ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｍ−ＭＬＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００Ｕで、従来ＲＴ−ＰＣＲを行った。反応液を２５℃で１０分間、３７℃で５０分間、および６５℃で１０分間インキュベーションした。ｃＤＮＡ２μｌ、０．４ｍＭ各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＧｏＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２Ｕ、ならびに１μＭ各フォワードまたはリバースプライマー（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ−１（ＡＳ−１）、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ−２（ＡＳ−２）、および添加対照として１８Ｓ）を含有する５０μｌにおいて、ＰＣＲを行った。使用したプライマーを、以下の表において提供する。
【表１】
2017508467.tif 000003
増幅プロトコールは、９４℃において５分間、９４℃、５８℃、および７２℃でそれぞれ１分間の３０サイクル、続いて、７２℃において１０分間からなった。１８Ｓ試料は、１５サイクル増幅したのみであった。サイズを見積もるための１００ｂｐラダーと共に、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加した。
結果
【０１７１】
図９Ａ、９Ｂ、ならびに９Ｃは、ＡＳＯ−Ｃに対するＡＳＯ−１５３７Ｓによる、２種のがん細胞株、ＨｅＬａ（９Ａ）およびＳＫ−ＭＥＬ−２（９Ｃ）におけるＡＳ−１ならびにＡＳ−２のノックダウン、ならびに正常ＨＦＫ細胞（９Ｂ）と比較した処理していない試料を示す。
（実施例２）
ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのループ領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのＡＳｎｃｍｔＲＮＡのノックダウンによるＨｅＬａ細胞増殖の阻害およびＨｅＬａ細胞死の誘導
【０１７２】
この研究において、アンチセンスオリゴヌクレオチド１５３７Ｓ（ＡＳＯ−１５３７Ｓ）でのアンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）の発現のノックダウンは、ＨｅＬａ細胞における細胞死を誘導することが示された。
材料および方法
【０１７３】
実施例１において記載した通り、ＨｅＬａ細胞を培養し、ＡＳＯ−Ｃ、ＡＳＯ−１５３７Ｓ、ＡＳＯ−１５３７Ｓ５’−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８をトランスフェクトするか、または処理しなかった。
【０１７４】
ＡＳＯ−１５３７Ｓ、ＡＳＯ−Ｃ、または処理していない細胞のトリプリケート試料を、２４、３６、および４８時間において回収し、細胞をカウントして、細胞増殖を評価した。同様に処理した細胞をトリプリケートで調製し、４８時間において回収して、製造元の指示に従い、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、続いて、２時間のＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）の添加を使用して、細胞増殖を評価した。細胞をＤＡＰＩで共染色して、細胞の総数を評価し、ＥｄＵ取り込みを、ＥｄＵ陽性細胞対総細胞として測定した。ＡＳＯ−１５３７Ｓ５’−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識で処理した試料を４８時間において回収した。蛍光マーカーを有する回収した細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１蛍光顕微鏡において分析した。ＡＳＯ−１５３７Ｓ、ＡＳＯ−Ｃ、および処理していない細胞の別のセットにおいて、細胞を４８時間において回収し、位相差顕微鏡において観察して、基質から分離した細胞を評価した。別の研究において、処理していない細胞と共に、ＡＳＯ−１５３７ＳならびにＡＳＯ−Ｃを、２５、５０、および１００ｎＭでトランスフェクトした。細胞を４８時間において回収し、トリパンブルー（Ｔｂ）で染色し、カウントした。％Ｔｂ陽性細胞は、細胞死の量を示した。
結果
【０１７５】
ＡＳＯ−１５３７Ｓ５’−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８をトランスフェクトした細胞は、９０％より多くの細胞を２４時間においてトランスフェクトしたことを示した。図１０は、ＡＳＯ−Ｃおよび処理されていない細胞と比較して、ＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトした細胞において細胞増殖の統計的に有意な阻害を示す（平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０１）。図１１は、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞についてのＥｄＵ取り込みが、ＡＳＯ−Ｃまたは処理していない試料と比較して、有意に低減したことを示す（＊ｐ＜０．０１）。分離した細胞の分析の結果は、ＡＳＯ−１５３７Ｓにより誘導される大量の細胞分離を、ＡＳＯ−Ｃまたは処理していない細胞において観察しなかったことを示す。図１２は、４８時間において回収した細胞の％Ｔｂ陽性細胞用量応答、ＡＳＯ−１５３７Ｓにより誘導された細胞死は、１００ｎＭにおいて６０％を超えたことを示す（＊ｐ＜０．０１）。
（実施例３）
ＡＳｎｃｍｔＲＮＡの３’一本鎖領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのＡＳｎｃｍｔＲＮＡのノックダウンによるＨｅＬａ細胞死の誘導
【０１７６】
この研究において、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡの３’一本鎖領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド：１１０７Ｓ（ＡＳＯ−１１０７Ｓ）、５２２Ｓ（ＡＳＯ−５２２Ｓ）、または１２６Ｓ（ＡＳＯ−１２６Ｓ）での処理により、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ）の発現をノックダウンした。
材料および方法
【０１７７】
実施例１において記載した通り、ＨｅＬａ細胞を培養した。５’−ＧＴＣＣＴＡＡＡＣＴＡＣＣＡＡＡＣＣ（配列番号３５）の配列を有するＡＳＯ−１１０７Ｓ、５’−ＴＡＣＣＴＡＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＡ（配列番号３４）の配列を有するＡＳＯ−５５２Ｓ、および５’−ＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＣＡＡ（配列番号３３）の配列を有するＡＳＯ−１２６Ｓを、ＩＤＴまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより１００％ホスホロチオエート結合で合成した。ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例１において記載した通り、１００ｎＭ  ＡＳＯ−１１０７Ｓ、ＡＳＯ−５２２Ｓ、ＡＳＯ−１２６Ｓ、ＡＳＯ−Ｃをトランスフェクトしたか、または処理しなかった。細胞を４８時間において回収し、トリパンブルー（Ｔｂ）で染色し、カウントした。％Ｔｂ陽性細胞は、細胞死の量を示していた。
結果
【０１７８】
図１３は、４８時間において回収した％Ｔｂ陽性細胞、ここで、ＡＳＯ−１１０７Ｓ、ＡＳＯ−５５２Ｓ、またはＡＳＯ−１２６Ｓで誘導された細胞死は、７０％を超えたことを示す（＊ｐ＜０．０１）。
（実施例４）
ＡＳＯ−１５３７Ｓ５’−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８での種々の細胞トランスフェクション
【０１７９】
この研究において、ＡＳＯ−１５３７Ｓ５’−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８での様々ながん細胞株ならびに正常細胞のトランスフェクションを示す。
材料および方法
【０１８０】
プールした新生児ヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）をＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入し、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＫＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。全ての他の細胞株をＡＴＣＣから得て、ＡＴＣＣガイドライン毎に培養した。全ての細胞培養物を、加湿細胞培養チャンバー中、３７℃および５％ＣＯ２において維持した。がん細胞株、ＨＰＶ１６−形質転換子宮頸部（ＳｉＨａ）、乳癌腫（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、前立腺癌腫（ＤＵ１４５）、肺癌腫（Ｈ２９２）、メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ−２）、腎癌腫（Ａ４９８）、および卵巣癌腫（ＯＶＣＡＲ−３）、ならびに正常細胞株、ＨＦＫ、ヒト腎上皮細胞（ＨＲＥＣ）、およびヒトメラノサイト（ＨｎＥＭ）を、１ウェル当たり５０，０００個の細胞にて培養し、実施例１において記載される通り、以下の表（続く実施例において使用するため、さらなる細胞株を含んだ）において提供したＡＳＯおよびリポフェクタミンの量と共に、ＡＳＯ−１５３７Ｓ５’−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８をトランスフェクトした。
【表２】
2017508467.tif 000004
細胞を２４時間において回収し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１蛍光顕微鏡において分析した。
結果
【０１８１】
全ての細胞株は、トランスフェクションの２４時間後において細胞の９０％より多くのトランスフェクションを示した。
（実施例５）
ＡＳＯ−１５３７Ｓでの処置は正常細胞に影響しない
【０１８２】
この実施例において、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト腎上皮細胞（ＨＲＥＣ）、およびヒトメラノサイト（ＨｎＥＭ）細胞にＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトし、トリパンブルー染色により評価した。
材料および方法
【０１８３】
２０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌヘパリン、５０μｇ／ｍｌ内皮細胞成長添加剤（ＥＣＧＳ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を添加したＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）において、ＨＵＶＥＣ細胞を培養し、実施例４において記載した通り、ＨＲＥＣならびにＨｎＥＭを培養した。ＨＵＶＥＣ、ＨＲＥＣ、およびＨｎＥＭ細胞を、１ウェル当たり５０，０００個の細胞にて培養し、実施例３において記載した通り、全てトリプリケートで、ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−Ｃをトランスフェクトしたか、または処理しなかった。トランスフェクションの４８時間後において細胞を回収し、トリパンブルーで染色し、カウントした。
結果
【０１８４】
ＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトした試料の全てが、対照および処理していない細胞に匹敵し、これは、図１４Ａ、１４Ｂ、ならびに１４Ｃにおいて見られる通り、９０％を超える細胞Ｔｂ陰性を伴った。
（実施例６）
ＡＳＯ−１５３７Ｓにより誘導されるミトコンドリア変化およびアポトーシス
【０１８５】
この実施例において、ＨｅＬａ細胞をＡＳＯ−１５３７Ｓで処理し、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を測定した。
材料および方法
【０１８６】
ＨｅＬａ細胞を１ウェル当たり５０，０００個の細胞にて培養した。ΔΨｍを評価するために、トランスフェクションの２４時間後において、２０ｎＭテトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１５分間、３７℃において添加し、回収し、ＢＤＳ−ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおけるフローサイトメトリーにより分析した。陽性対照として、１０μＭカルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間、３７℃において細胞を処理し、その後、ＴＭＲＭで染色した。実施例４において記載した通り、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＨ２９２細胞をトランスフェクトし、ΔΨｍについて同様にアッセイした。
結果
【０１８７】
ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した試料のΔΨｍは、陽性対照に匹敵した。トリプリケートでアッセイした試料は、ＡＳＯ−１５３７Ｓが、ＣＣＣＰについて７０％と比較してΔΨｍの約５５％の消散、および対照および処理していない細胞について約１０〜１５％の消散を誘導したことを示した。図１５は、ＨｅＬａ細胞についてのフローサイトメトリープロットを示し、図１６は、トリプリケートのそれぞれの試料についての％ΔΨｍ（棒の白色部分）を示す。ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１、およびＨ２９２についてのフローサイトメトリー結果を、図１７Ａ〜Ｃにおいて示す。結果として、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した試料は、アポトーシスの初期の顕著な特徴である、ΔΨｍの顕著な崩壊を誘導した。
（実施例７）
チトクロムｃのミトコンドリアからの放出およびカスパーゼの活性化
【０１８８】
ΔΨｍの消散は、チトクロムｃの放出、続いて、カスパーゼの活性化を誘導する（Heerdtら、Cancer  Res.、６６巻：１５９１〜１５９６頁、Houstonら、Int.  J.  Cell  Biol.、２０１１年、論文９７８５８３、Gottliebら、Cell  Death  Differ.、２００３年、１０巻：７０９〜７１７頁）。この研究において、チトクロムｃの細胞質への放出について、およびカスパーゼの活性化について、ＡＳＯ−１５３７Ｓまたはスタウロスポリン（ＳＴＰ、アポトーシス対照）で処理したＨｅＬａ細胞を評価する。
材料および方法
【０１８９】
ＨｅＬａ細胞を１ウェル当たり５０，０００個の細胞で培養し、実施例１において記載した通り、１００ｎＭ  ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−Ｃをトランスフェクトし、スタウロスポリンで処理したか、または処理しなかった。２４時間後、細胞を回収し、氷冷ＰＢＳにおいて洗浄し、次に、１０００×ｇにおいて１０分間、室温において遠心分離した。ペレットを、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよびタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する放射性免疫沈殿アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）において懸濁した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ−ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｅｎ５ＴＭ  ＥＰＯＣＨ（ＢｉｏＴｅＫ）で定量し、試料をウエスタンブロットにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の１レーン当たりタンパク質３０μｇにて試料を添加し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移した。チトクロムｃに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１０００）で、添加対照としてマウスモノクローナル抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１：４０００）で、膜をプローブ処理した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、１：５０００）で、ブロットを明らかにした。ＥＺ−ＥＣＬ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）でブロットを検出した。
【０１９０】
同様に調製した試料を、活性化されたカスパーゼに結合する蛍光発生カスパーゼ阻害剤としてＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、カスパーゼ活性化についてアッセイした（Garcia-Calvoら、J.  Biol.  Chem.、１９９８年、２７３巻：３２６０８〜３２６１３頁）。ＳＴＰで処理した対照に加えて、壊死についての陽性対照として１００μＭ  Ｈ２Ｏ２で細胞を処理する。トランスフェクション、ＳＴＰ処理、または１０μＭでのＨ２Ｏ２処理後、ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋを加え、２０分間、３７℃においてインキュベーションした。細胞を回収し、ＰＢＳにおいて洗浄し、３．７％ｐ−ホルムアルデヒドにおいて１５分間、室温において固定し、蛍光画像を得た。カスパーゼ不活性化が細胞死に関与したことを確認するために、トランスフェクション、またはＨｅＬａ細胞について２５μＭの濃度のＳＴＰ処置の２時間前に加えた非蛍光カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、アポトーシスの阻害を行った。ヨウ化プロピジウム染色により細胞死をアッセイした。
結果
【０１９１】
チトクロムｃの存在についてのウエスタンブロット分析は、ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＳＴＰで処理したそれらの細胞のみが、細胞質画分中にチトクロム（cytocrhome）ｃを有したことを示した（図１８）。図１９は、ＡＳＯ−１５３７Ｓまたはアポトーシス陽性対照ＳＴＰで処理した細胞の約５０％が、活性化カスパーゼを含有し、これは、対照および処理していない細胞において非常に僅かであることを示す。図２０は、ＡＳＯ−１５３７Ｓについてｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで予め処理した細胞およびＳＴＰで処理した細胞の％ＰＩ陽性細胞の統計的に有意な低減を示し、これは、細胞死におけるカスパーゼ活性の関与を示している。
（実施例８）
ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理したＨｅＬａ細胞におけるアネキシンＶの測定
【０１９２】
この実験において、アポトーシスの指標である、細胞膜の外層へのホスファチジルセリンの移行を評価した。蛍光標識したアネキシンＶに結合させることにより、細胞の表面上のホスファチジルセリンを検出した。
材料および方法
【０１９３】
実施例１および７において記載した通り、ＨｅＬａ細胞に、ＡＳＯ−１５３７Ｓ、ＡＳＯ−Ｃ、ＳＴＰをトランスフェクトしたか、または処理せず、培養した。処置の２４時間後、製造元の指示に従い、アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＰＯｔａｒｇｅｔ  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を標識し、ヨウ化プロピジウムで染色した。
結果
【０１９４】
ＳＴＰおよびＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞の両方について、アネキシンＶ陽性細胞を観察した。トリプリケートでアッセイした試料について、％アネキシンＶ陽性細胞を図２１において示し、これは、ＡＳＯ−１５３７ＳおよびＳＴＰで処理した細胞について４０％（＊ｐ＜０．０１）および７０％（＊ｐ＜０．００５）アネキシンＶ陽性細胞の統計的に有意な画分を、それぞれ、処理していない細胞およびＡＳＯ−Ｃ対照で処理した細胞における＜１０％アネキシンＶ陽性細胞と共に示している。
（実施例９）
ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞におけるＤＮＡ断片化の評価
【０１９５】
この実験において、がん細胞株、ＭＣＦ７（乳癌腫）、ＰＣ３（前立腺癌腫）、ＨｅｐＧ２（ヘパトーマ）、Ｃａｃｏ−２（結腸癌腫）、Ｕ８７（神経膠芽腫）、ＳｉＨａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＤＵ１４５、ＳＫ−ＭＥＬ−２、Ａ４９８、ＯＶＣＡＲ−３、およびＨｅＬａにおける、ならびに正常細胞株ＨＦＫにおける末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬアッセイ）により、ＤＮＡ断片化を測定する。
材料および方法
【０１９６】
実施例４において記載した通り、細胞株に、ＡＳＯ−Ｃ、ＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトしたか、または処理せず、培養した。ＨｅＬａおよびＨＦＫ細胞も、陽性対照としてＤｎａｓｅ  Ｉで処理した。４８時間後、細胞を回収し、固定し、ＴＵＮＥＬアッセイに付した。製造元の指示に従い、断片化した核酸のフルオレセイン（fluorscein）−１２−ｄＵＴＰ標識をもたらす、Ｄｅａｄ  Ｅｎｄ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、試料を評価した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）でも細胞を染色して、ＴＵＮＥＬアッセイにより標識された細胞を、標識されていない細胞から区別した。
結果
【０１９７】
図２２Ａは、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰおよびＤＡＰＩで染色されたＨｅＬａ細胞を示し、陽性対照およびＡＳＯ−１５３７Ｓのみがフルオレセインで染色され、これは、ＡＳＯ−Ｃで処理した試料において観察されない顕著なＤＮＡ断片化を示している。比較により、図２２Ｂは、ＨＦＫ細胞が、ＡＳＯ−１５３７Ｓ処理により影響されず、ＤＮａｓｅ  Ｉで処理した試料のみがフルオレセインで染色されたことを示す。さらなるがん細胞株はＰＩで染色され、図２３において、％ＴＵＮＥＬ陽性細胞を示す。全てのがん細胞株において、トリプリケート分析は、細胞の統計的に有意な画分（６０〜８０％）が、ＡＳＯ−Ｃで処理した細胞と比較して、ＴＵＮＥＬ陽性であったことを示した。
（実施例１０）
ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞におけるサブＧ１画分の評価
【０１９８】
この実験において、アポトーシスの指標である低二倍体現象の測定として、サブＧ１フェーズの細胞の画分を評価する。
材料および方法
【０１９９】
ＨｅＬａまたはＨＦＫ細胞株にＡＳＯ−Ｃ、ＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトし、または処理せず、１ウェル当たり１００，０００個の細胞にて培養した。ＨｅＬａおよびＨＦＫ細胞も、アポトーシスについての陽性対照として５μＭの濃度のＳＴＰで処理した。２４時間（ＨｅＬａ）または４８時間（ＨＦＫ）後、細胞を回収し、６００×ｇにおいて５分間遠心分離し、ペレットを１００％エタノールにおいて懸濁し、−２０℃において２４時間保存した。次に、１ｍｇ／ｍｌ  Ｒｎａｓｅ  Ａで１時間、室温で細胞を処理した。細胞をＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより評価した。
結果
【０２００】
図２４は、ＨｅＬａ細胞についてのフローサイトメトリー結果を示し、これは、ＡＳＯ−１５３７Ｓおよび陽性対照ＳＴＰで処理した細胞についてのサブＧ１画分の増大を示すが、ＡＳＯ−Ｃまたは処理していない細胞での増大を示さない。ＨｅＬａ細胞中のサブＧ１の割合のトリプリケートの試料の分析は、ＳＴＰでの処理（５０％、＊＊ｐ＜０．００５）に匹敵する、ＡＳＯ−１５３７Ｓでの処理における有意なサブＧ１画分（４５％、＊ｐ＜０．０１）を示す（図２５）。図２６は、ＳＴＰで処理した細胞のみが、有意なサブＧ１画分増大（５５％、＊ｐ＜０．０１）を示す、ＨＦＫ細胞中のサブＧ１画分の割合を、ＡＳＯ−Ｃおよび処理していない細胞と類似のＡＳＯ−１５３７Ｓと共に示す。これは、ＡＳＯ−１５３７Ｓ処理が、正常細胞に影響することなく、がん細胞のアポトーシスをもたらすことを再度示す。
（実施例１１）
ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞における足場非依存性成長の評価
【０２０１】
この実験において、軟寒天におけるＳＫ−ＭＥＬ−２、ＯＶＣＡＲ−３、ＨｅＬａ、およびＳｉＨａがん細胞のコロニー形成を足場非依存性成長の測定として評価する。これは、腫瘍形成能（tumorogenicity）のパラメーターとみなされる（Bertottiら、J.  Cell  Biol.、２００６年、１７５巻：９９３〜１００３頁）。
材料および方法
【０２０２】
実施例４において記載した通り、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＯＶＣＡＲ−３、ＨｅＬａ、およびＳｉＨａに、ＡＳＯ−Ｃ、ＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトし、または処理せず、培養した。４８時間後に、細胞を回収し、カウントし、軟寒天上の１２ウェルプレートにおいてトリプリケートで、トリパンブルー排除により決定した、ＨｅＬａおよびＳｉＨａについて１ウェル当たり２００個の細胞、ＯＶＣＡＲ−３についての１ウェル当たり５００個の細胞、ならびにＳＫ−ＭＥＬ−２について１ウェル当たり２０００個の細胞で播種した。２〜３週間後、５０μｍを超える測定のコロニーをカウントした。
結果
【０２０３】
図２７Ａ〜Ｄは、処理していない細胞およびＡＳＯ−Ｃで処理した細胞についての５０μｍを超えるコロニーの数、平均を示し、一方、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞についての数は、全３つのウェルにおけるコロニーの総数である。これは、ＡＳＯ−１５３７Ｓが足場非依存性成長を阻害することを非常に明確に示す。
（実施例１２）
ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理したＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるサバイビンのダウンレギュレーション
【０２０４】
この実験において、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した、対照で処理した、または処理していないＳＫ−ＭＥＬ−２細胞を、ウエスタンブロット分析により、サバイビン発現について評価する。
材料および方法
【０２０５】
実施例４において記載した通り、ＳＫ−ＭＥＬ−２に、１５０ｎＭ  ＡＳＯ−ＣまたはＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトしたか、または処理せず、２４時間培養した。サバイビンに対する抗体（ウサギポリクローナル、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、１：１０００）を使用して、実施例７において記載した通り、ウエスタンブロット分析のため、回収した細胞を処理した。これをトリプリケートで繰り返し、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）を使用して、それぞれのバンドの画像強度を測定することにより、バンドを定量し、添加対照としてのβ−アクチンレベルに対して正規化した。ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞について、さらなる試料を調製し、トランスフェクションの３、８、および２２時間後に回収し、サバイビンレベルを、処理していない対照と比較して評価した。
【０２０６】
サバイビンダウンレギュレーションがプロテオソーム分解に起因するかどうかを評価するために、２６Ｓプロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２での処理ありまたはなしで、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞にＡＳＯ−１５３７ＳもしくはＡＳＯ−Ｃをトランスフェクトした（Linら、J.  Biol.  Chem.、２８３巻：２１０７４〜２１０８３頁、２００８年）。サバイビンが活性化されたカスパーゼにより分解されるかどうかを評価するために（Igarashiら、Nucleic  Acids  Res.、３５巻：Ｄ５４６〜９頁、２００７年）、カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋありまたはなしで、ＳＫＭＥＬ−２細胞にＡＳＯ−１５３７ＳもしくはＡＳＯ−Ｃをトランスフェクトした。
結果
【０２０７】
図２８Ａは、対照および処理していない細胞と比較して、２４時間において、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞でのサバイビン発現の顕著な阻害を示す。図２８Ｂは、トランスフェクションの３時間後でさえサバイビン発現の阻害を示し、これは後の時間ポイントにおいて阻害レベルの増大を伴った。図２９は、β−アクチンに対して正規化したサバイビンバンドでの、３種の独立した実験由来のブロットの濃度測定の分析を示す。サバイビンレベルは、２４時間において８０％低減した（＊ｐ＜０．０１）。図３０Ａおよび３０Ｂは、それぞれ、ＭＧ１３２処置もしくはｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ処置ありまたはなしでのサバイビン発現の阻害を示し、これは、プロテオソーム分解も活性化カスパーゼのいずれも、サバイビン発現の阻害に関与しないことを示唆している。
（実施例１３）
ｍＲＮＡ分解に起因しないＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞におけるサバイビンのダウンレギュレーション
【０２０８】
この実験において、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞におけるｍＲＮＡの相対的レベルを、対照で処理したＳＫ−ＭＥＬ−２細胞と比較した。
材料および方法
【０２０９】
ＳＫ−ＭＥＬ−２に１５０ｎＭ  ＡＳＯ−ＣもしくはＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトしたか、または処理せず、ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＲＮＡ５００ｎｇおよびランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５０ｎｇを使用して、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＱＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、ｃＤＮＡを合成した。反応液を２５℃において１０分間、４５℃において１時間、９５℃において５分間インキュベーションした。ＲＮａｓｅ  Ｈ（２Ｕ）を加え、試料を３７℃において２０分間インキュベーションした。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００ＰＴＭ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、１：５ｃＤＮＡ希釈の、１×ＧｏＴａｑ  Ｆｌｅｘｉ  Ｂｕｆｆｅｒ３μｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ各ｄＮＴＰ、ＧｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕ、０．５μＭ各フォワードおよびリバースプライマー、ならびに０．２５μＭ  Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅで、容量２５μｌにて、サバイビンについてリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。サイクルパラメーターは、９５℃において２分間、ならびに９５℃、１５秒間、５４℃、１５秒間、および６２℃、４５秒間の４０サイクルであった。使用したプライマーおよびプローブを、以下の表において提供し、ＲＰＬ２７ｍＲＮＡおよび１８ＳｒＲＮＡを使用して、結果を正規化する。
【表３】
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結果
【０２１０】
図３１は、ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−Ｃで処理した細胞、および処理していないＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるサバイビンｍＲＮＡの相対的発現を示す。ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞における相対的サバイビンｍＲＮＡは、処理していない細胞および対照細胞に匹敵し、これは、サバイビンタンパク質発現の低減が、ｍＲＮＡ分解に起因しないことを示唆している。
（実施例１４）
ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理したＰＣ３、ＯＶＣＡＲ−３、およびＨ２９２細胞におけるサバイビンのダウンレギュレーション
【０２１１】
この実験において、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した、対照で処理した、または処理していないＰＣ３、ＯＶＣＡＲ−３、またはＨ２９２細胞を、ウエスタンブロット分析によりサバイビン発現について評価する。
材料および方法
【０２１２】
実施例４において記載した通り、ＰＣ３、ＯＶＣＡＲ−３、またはＨ２９２細胞に、ＡＳＯ−ＣまたはＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトし、または処理せず、２４時間培養した。実施例１２において記載した通り、サバイビンレベルについて試料をアッセイし、同様に、Ｂｃｌ−２に対する抗体（ウサギポリクローナル、Ａｂｃａｍ、１：１０００）を使用して、Ｂｃｌ−２発現レベルについてアッセイした。
結果
【０２１３】
図３２Ａ〜Ｃは、サバイビン発現が、対照細胞および処理していない細胞と比較して、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理したＰＣ３、ＯＶＣＡＲ−３、およびＨ２９２細胞において同様に阻害されることを示す。図３３Ａおよび３３Ｂは、対照細胞および処理していない細胞と比較して、Ｂｃｌ−２の発現に対するＳＫ−ＭＥＬ−２またはＰＣ３細胞のＡＳＯ−１５３７Ｓ処置の注目すべき（noticable）作用を示さない。
（実施例１５）
ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−２２６Ｓで処理したＳＫ−ＭＥＬ−２細胞における他のタンパク質のダウンレギュレーション
【０２１４】
この実験において、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞を、ＡＳＯ−１５３７Ｓ、ＡＳＯ−２２６Ｓ（ＡＳｎｃｍｔＲＮＡの３’一本鎖領域に相補的）、ＡＳＯ−Ｃで処理したか、または処理せず、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、Ｎ−カドヘリンおよびカベオリンのレベルをウエスタンブロット分析により評価した。サイクリンＤ１は、細胞のフェーズＧ１からＳへの移行に必要とされ、サイクリンＤ１レベルの低減は、Ｇ１フェーズ細胞の増大をもたらす。サイクリンＢ１は、有糸分裂の公知の誘導物質であり、有糸分裂の阻害は、周期のＧ２フェーズにおける休止を導き、細胞死を増大した。Ｎ−カドヘリンおよびカベオリンは、細胞遊走、細胞浸潤、および転移に関与し、それらのダウンレギュレーションは、これらのがん細胞特性を阻害する。
材料および方法
【０２１５】
５’−ＴＡＡＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣ（配列番号４５）の配列を有するＡＳＯ−２２６Ｓを、１００％ホスホロチオエート結合（ＩＤＴ、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）で合成した。実施例４において記載した通り、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞に１５０ｎＭ  ＡＳＯ−ＣまたはＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトしたか、または処理せず、２４時間培養した。ＡＳＯ−２２６Ｓをトランスフェクトした細胞において、サイクリンＢ１も評価した。サイクリンＤ１に対する抗体（モノクローナル、ＢＣ  ＰＨａｒｍａｇｅｎ、１：２５０）、サイクリンＢ１に対する抗体（モノクローナル、ＢＤ  Ｐｈａｒｍａｇｅｎ、１：５００）、Ｎ−カドヘリンに対する抗体（ウサギポリクローナル、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：１０００）、またはカベオリンに対する抗体（ウサギポリクローナル、Ａｂｃａｍ、１：１０００）を使用して、実施例７において記載した通り、ウエスタンブロット分析のため、回収した細胞を処理した。それぞれをトリプリケートで繰り返し、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）を使用して、それぞれのバンドの画像強度を測定することにより、バンドを定量し、添加対照としてのβ−アクチンレベルに対して正規化した。
結果
【０２１６】
図３４Ａは、図３４Ｂにおいて示すバンドの定量化での、サイクリンＤ１についてのウエスタンブロット結果を示す。サイクリンＤ１のレベルは、対照細胞および処理していない細胞と比較して、ＡＳＯ  １５３７Ｓで処理した細胞について、有意に低減された（＊ｐ＜０．０１）。図３５Ａは、図３５Ｂにおいて示すバンドの定量化での、サイクリンＢ１についてのウエスタンブロット結果を示す。サイクリンＢ１のレベルは、対照細胞および処理していない細胞と比較して、ＡＳＯ  １５３７ＳまたはＡＳＯ−２２６Ｓで処理した細胞について、有意に低減された（＊ｐ＜０．０１）。図３６は、Ｎ−カドヘリンおよびカベオリンについてのウエスタンブロット結果を示す。Ｎ−カドヘリンおよびカベオリンのレベルは、対照細胞および処理していない細胞と比較して、ＡＳＯ  １５３７Ｓで処理した細胞について低減された。
（実施例１６）
Ｂｃｌ−２およびＦＫＢＰ３８のレベルに対するＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−２２６ＳでのＳＫ−ＭＥＬ−２ならびにＰＣ３細胞の処置の効果
【０２１７】
この実験において、ＳＫ−ＭＥＬ−２ならびにＰＣ３がん細胞株を、ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−２２６Ｓで処理し、Ｂｃｌ−２およびＦＫＢＰ３８のレベルを、ウエスタンブロット分析により評価した。Ｂｃｌ−２は、ＦＫＢＰ３８の作用によりミトコンドリアにおいて維持される、ミトコンドリア抗アポトーシスタンパク質である。ＦＫＢＰ３８の発現の低減は、Ｂｃｌ−２の核への遊走をもたらし、ここで、前アポトーシスになる。
材料および方法
【０２１８】
実施例４において記載した通り、ＳＫ−ＭＥＬ−２およびＰＣ３細胞にＡＳＯ−Ｃ、ＡＳＯ−２２６ＳまたはＡＳＯ−１５３７Ｓをトランスフェクトしたか、または処理せず、２４時間培養した。Ｂｃｌ−２に対する抗体（ウサギポリクローナル、Ａｂｃａｍ、１：１０００）、またはＦＫＢＰ３８に対する抗体（ウサギモノクローナル、Ａｂｃａｍ、１：１０００）を使用して、実施例７において記載した通り、ウエスタンブロット分析のため、回収した細胞を処理した。
結果
【０２１９】
図３７Ａおよび３７Ｂは、それぞれ、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるＢｃｌ−２およびＦＫＢＰ３８についてのウエスタンブロットの結果を示す。ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−２２６Ｓで処理したＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるＢｃｌ−２のレベルは、対照細胞および処理していない細胞に匹敵し、一方、ＦＫＢＰ３８のレベルは、対照細胞および処理していない細胞と比較して、ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−２２６Ｓで処理したＳＫ−ＭＥＬ−２細胞において低減された。図３８Ａおよび３８Ｂは、それぞれ、ＰＣ３細胞におけるＢｃｌ−２およびＦＫＢＰ３８のウエスタンブロットの結果を示す。ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−２２６Ｓで処理したＰＣ３細胞におけるＢｃｌ−２のレベルは、対照細胞および処理していない細胞に匹敵し、一方、ＦＫＢＰ３８のレベルは、対照細胞および処理していない細胞と比較して、ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−２２６Ｓで処理したＰＣ３細胞において低減された。
（実施例１７）
ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞におけるサバイビンのダウンレギュレーションおよび細胞死はＲＮａｓｅ  Ｈに依存する
【０２２０】
この実験において、ＡＳＯ−１５３７ＳまたはＡＳＯ−Ｃで処理したＳＫ−ＭＥＬ−２細胞について、細胞増殖、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ（ＡＳ−１またはＡＳ−２）のノックダウン、およびサバイビンレベルを評価し、ＡＳＯ−１５３７ＳおよびＡＳＯ−Ｃのペプチド性核酸（ＰＮＡ）類似体で処理した細胞と比較した。
材料および方法
【０２２１】
ＳＫ−ＭＥＬ−２に、１５０ｎＭ  ＡＳＯ−ＣまたはＡＳＯ−１５３７Ｓ、ＡＳＯ−ＣおよびＡＳＯ−１５３７ＳのＰＮＡ類似体をトランスフェクトしたか、または処理しなかった。トランスフェクションの２４時間後において、細胞を回収し、カウントするか、またはトリパンブルーで染色し（実施例２を参照）、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ（ＡＳ−１、ＡＳ−２）レベルを、ＲＴ−ＰＣＲにより評価したか（実施例１を参照）、またはウエスタンブロット分析によりサバイビンレベルについて評価した（実施例１２を参照）。
結果
【０２２２】
図３９Ａおよび３９Ｂは、それぞれ、細胞カウント、および％トリパンブルー（Ｔｂ）陽性細胞による相対的増殖を示す。結果は、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞が、対照試料、処理していない試料、およびＰＮＡ類似体で処理した試料と比較して、細胞死を誘導したことを示す。同様に、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞のみが、対照試料、処理していない試料、およびＰＮＡ類似体で処理した試料と比較して、Ｔｂ陽性であった。これは、ハイブリダイズしたＡＳ−１（またはＡＳ−２）とＡＳＯ１５３７ＳＰＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解をもたらさない、ＰＮＡ類似体が、細胞死をもたらさないことを示す。図４０は、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞においてのみ、ＡＳ−１およびＡＳ−２の両方のノックダウンを示し、これは、ＰＮＡ類似体で処理した細胞におけるノックダウンの欠如を伴う。図４１は、ＡＳＯ−１５３７Ｓで処理した細胞においてのみ、サバイビンのレベルの低減を示す。これらの結果は、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断が、細胞死を誘導するのにＡＳＯ−１５３７Ｓに必須であることを示唆する。
（実施例１８）
ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞におけるダイサーのＡＳｎｃｍｔＲＮＡ−１およびＡＳｎｃｍｔＲＮＡ−２への結合
【０２２３】
この実験において、ダイサー特異的モノクローナル抗体で、ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞の細胞質画分を免疫沈殿させた。免疫沈殿物からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ増幅を使用して、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのレベルを評価する。
材料および方法
【０２２４】
ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞２×１０７を、氷冷無菌ＰＢＳ１０ｍｌにおいて洗浄し、掻爬し、３００×ｇにて５分間、４℃において沈殿させた。タンパク質分解酵素阻害剤０．５μｌ、およびＲＮａｓｅ阻害剤（ＭａｇｎａＲＩＰ  ｋｉｔ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）０．２５μｌを含有するＲＩＰ溶解緩衝液１００μｌにおいて、細胞を溶解した。それぞれの溶解液１０ｍｌのアリコートを、−８０℃においてインプット試料として使用するため保存した。溶解液の試料１００μｌを、抗ダイサーモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）もしくはポリクローナル抗ＳＮＲＮＰ７０、または対照マウスもしくはウサギＩｇＧ（ＭａｇｎａＲＩＰ  ｋｉｔ）５μｇを予め添加した、磁気ビーズの懸濁液９００μｌと混合した。試料を、室温で３０分間、回転させながら、続いて、４時間、４℃において回転させながらインキュベーションした。ＲＮＡ／タンパク質複合体を、磁気分離により取り除き、ＩＰ洗浄緩衝液５００μｌにおいて洗浄し、続いて、ＲＩＰ洗浄緩衝液において５回洗浄した。回収した免疫沈殿物およびインプット試料を、５５℃において３０分間、プロテイナーゼＫ緩衝液（１％ＳＤＳおよび１．８ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含有するＲＩＰ洗浄緩衝液）１５０μｌ中、一定の撹拌下でインキュベーションした。磁気ビーズを分離し、上清を異なるチューブに移した。ＲＩＰ洗浄緩衝液のアリコート２５０μｌを上清に加え、続いて、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（１２５：２４：１、ｐＨ４．５）４００μｌを混合しながら加えた。試料を、２１，０００×ｇにおいて１０分間、室温で遠心分離した。水性相を取り除き、３００μｌを、塩溶液Ｉ  ５０μｌ、塩溶液ＩＩ  １５μｌ、沈殿物エンハンサー（ＭａｇｎａＲＩＰ  ｋｉｔの塩全部分と共に）５μｌ、およびエタノール８５０μｌと混合した。ＲＮＡを、終夜４℃において沈殿させ、２１，０００×ｇにおいて３０分間、４℃における遠心分離により回収した。ペレットを、氷冷７０％エタノールにおいて２回洗浄し、続いて、２１，０００×ｇにおいて１５分間、４℃において遠心分離（entrifugation）した。ＲＮＡペレットを、ヌクレアーゼを含まない水に懸濁し、試料６０ｎｇを、ＭａｇｎａＲＩＰ  ｋｉｔにおいて供給されるプライマーを使用したＵ１  ｓｎＲＮＡ対照増幅で、実施例１に記載した通り、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＡＳ−１およびＡＳ−２の増幅のため使用したプライマーは次の通りであった。
【表４】
2017508467.tif 000006
結果
【０２２５】
図４２Ａは、ゲルの結果を示し、これは、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ−１またはＡＳｎｃｍｔＲＮＡ−２が抗ダイサー抗体で免疫沈殿したことを示し、一方、対照ＩｇＧ試料は、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡ−１またはＡＳｎｃｍｔＲＮＡ−２のいずれの証拠も示さなかった。免疫沈殿についての陽性対照を図４２Ｂにおいて示す。
（実施例１９）
インシリコでのＡＳｎｃｍｔＲＮＡの二本鎖領域のダイサー切断により生じたＭｉｔｏ−ｍｉＲ
【０２２６】
この実施例において、ＲＮａｓｅ  ＨによるＡＳＯ／ＡＳｎｃｍｔＲＮＡの推定切断、続いて、５’−３’エキソヌクレアーゼ切断後に残るＡＳｎｃｍｔＲＮＡの得られた二本鎖領域を、ダイサーによりさらに切断する。
材料および方法
【０２２７】
ＡＳｎｃｍｔＲＮＡを、ダイサー切断から生じる推定ｍｉＲとして約２２塩基対の断片を生じさせるためのモデリングに適用することができる（Parkら、Nature、４７５巻：２０１〜２０５頁、２０１１年）。ｂｌａｓｔｎアライメントを使用して、ＴａｒｇｅｔＳＣａｎ（Lewisら、Cell、１２０巻：１５〜２０頁、２００５年）およびｍｉＲｂａｓｅ（Griffiths-Jonesら、Nucleic  Acids  Res.、３６巻：Ｄ１５４〜１５８頁、２００８年、Kozomaraら、Nucleic  Acids  Res.、３９巻：Ｄ１５２〜Ｄ１５７．３７頁、２０１１年）、推定断片を同定した。
結果
【０２２８】
図４３Ａ〜Ｃは、それぞれ、サバイビンｍＲＮＡ、サイクリンＤ１ｍＲＮＡ、およびサイクリンＢ１ｍＲＮＡの部分でのｍｉＲの一方の鎖のアライメントを示し、ここで、ｍｉＲの５’末端シード領域が、サバイビンｍＲＮＡ、サイクリンＤ１ｍＲＮＡ、およびサイクリンＢ１ｍＲＮＡの３’非翻訳領域３’ＵＴＲにおいて添加したｍｉＲ認識エレメントと相互作用することができる（それぞれ、図４３Ａ〜４３Ｃにおいて青色で示す）（Lewis、上記参照、Ghildiyalら、Nat.  Rev.  Genet.、１０巻：９４〜１０８頁、２００９年、Shinら、Mol.  Cell、３８巻：７８９〜８０２頁、２０１０年、Thomasら、Nat.  Struct.  Mol.  Biol.、１７巻：１１６９〜１１７４頁、２０１０年、Park、上記参照）。
（実施例２０）
ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのノックダウンはサバイビンタンパク質の発現の阻害をもたらす
【０２２９】
この実施例は、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのノックダウンが、サバイビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲと相互作用するｍｉＲＮＡを誘導し、これにより、タンパク質の発現を阻害することを示す。
材料および方法
【０２３０】
サバイビンのフォワードプライマー３’ＵＴＲを使用した、トータルＳＫ−ＭＥＬ−２細胞ＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲにより、サバイビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲを増幅した。次のプライマーを使用したＳＫ−ＭＥＬ−２細胞のトータルＲＮＡから、ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅した。
【表５】
2017508467.tif 000007
これを、ｐｍｉＲＧＬＯ  ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のホタルルシフェラーゼＯＲＦの下流の固有のＸｂａＩ部位にクローニングした（図４４Ａ）。
【０２３１】
ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞を、１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）において密度５０，０００個の細胞／ウェルで蒔いた。翌日、リポフェクタミン２０００を使用して、０．５μｇ／ウェルのサバイビン３’ＵＴＲを含有するｐｍｉＲＧＬＯベクター（図４４Ａ）で、細胞をトランスフェクトした。２４時間後において、リポフェクタミン２０００をまた使用して、１５０ｎＭ  ＡＳＯ−ＣまたはＡＳＯ−１５３７Ｓで、細胞をトランスフェクトした。２０ｎＭサバイビンｓｉＲＮＡまたはｍｉｍｉｃ（Ｈａｓ−ｍｉＲ−２１８）での陽性対照を含んだ。ＡＳＯのトランスフェクションの２４時間後、トリプシン処理により、細胞をはがし、３００×ｇにて５分間、室温で沈殿させ、最終容量１００μｌに置いた。それぞれの細胞懸濁液７５μｌを、発光のため９６ウェルの白色プレートのウェルに置き、製造元の指示に従い、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、およびＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、連続して決定した。相対的ルシフェラーゼ活性として値を表す。
結果
【０２３２】
図４４Ｂは、ＡＳＯ−１５３７ＳをトランスフェクトしたＳＫ−ＭＥＬ−２細胞のルシフェラーゼの相対的活性が、ＡＳＯ−Ｃをトランスフェクトした対照細胞の約６０％の割合であったことを示す（６回の独立した実験で）。同様に、サバイビンｍｉＲＮＡ（Ｈａｓ−ｍｉＲ−２１８）をトランスフェクトした細胞の割合は、対照の約５０％であった。まとめると、これらの結果は、ＡＳｎｃｍｔＲＮＡのノックダウンが、サバイビンの３’ＵＴＲと相互作用するｍｉＲＮＡを誘導し、これにより、ＩＡＰファミリーのメンバーの発現が阻害されることを強く示す。
【０２３３】
実施例は、本発明の単なる典型例であることが意図され、それ故、本発明を決して制限しないとみなされ、また、上で考察された態様および実施形態を記載し、詳述する。前述の実施例および詳細な説明は、説明の目的で提示され、制限の目的で提示されない。本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、および特許は、それぞれの個々の刊行物、特許出願、または特許が、参照により取り込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照により組み込まれる。特に、本明細書において引用される全ての刊行物は、本発明と関連して使用され得る組成物および方法論を記載するおよび開示する目的のため、参照により本明細書に明確に組み込まれる。前述の発明は、明瞭に理解させる目的のため、説明および例の目的で幾分詳細に記載されたが、本発明の教示に照らし、特定の変更および修飾が、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、それに成され得ることは、当業者にとって容易に明らかであろう。
【図１Ａ】
2017508467.tif 000008
【図１Ｂ】
2017508467.tif 000009
【図２Ａ】
2017508467.tif 000010
【図２Ｂ】
2017508467.tif 000011
【図３Ａ】
2017508467.tif 000012
【図３Ｂ】
2017508467.tif 000013
【図４Ａ】
2017508467.tif 000014
【図４Ｂ】
2017508467.tif 000015
【図５Ａ】
2017508467.tif 000016
【図５Ｂ】
2017508467.tif 000017
【図６Ａ】
2017508467.tif 000018
【図６Ｂ】
2017508467.tif 000019
【図７】
2017508467.tif 000020
【図８】
2017508467.tif 000021
【図９Ａ】
2017508467.tif 000022
【図９Ｂ】
2017508467.tif 000023
【図９Ｃ】
2017508467.tif 000024
【図１０】
2017508467.tif 000025
【図１１】
2017508467.tif 000026
【図１２】
2017508467.tif 000027
【図１３】
2017508467.tif 000028
【図１４】
2017508467.tif 000029
【図１５】
2017508467.tif 000030
【図１６】
2017508467.tif 000031
【図１７】
2017508467.tif 000032
【図１８】
2017508467.tif 000033
【図１９】
2017508467.tif 000034
【図２０】
2017508467.tif 000035
【図２１】
2017508467.tif 000036
【図２３】
2017508467.tif 000037
【図２４】
2017508467.tif 000038
【図２５】
2017508467.tif 000039
【図２６】
2017508467.tif 000040
【図２７】
2017508467.tif 000041
【図２８Ａ】
2017508467.tif 000042
【図２８Ｂ】
2017508467.tif 000043
【図２９】
2017508467.tif 000044
【図３０Ａ】
2017508467.tif 000045
【図３０Ｂ】
2017508467.tif 000046
【図３１】
2017508467.tif 000047
【図３２Ａ】
2017508467.tif 000048
【図３２Ｂ】
2017508467.tif 000049
【図３２Ｃ】
2017508467.tif 000050
【図３３Ａ】
2017508467.tif 000051
【図３３Ｂ】
2017508467.tif 000052
【図３４】
2017508467.tif 000053
【図３５】
2017508467.tif 000054
【図３６】
2017508467.tif 000055
【図３７Ａ】
2017508467.tif 000056
【図３７Ｂ】
2017508467.tif 000057
【図３８Ａ】
2017508467.tif 000058
【図３８Ｂ】
2017508467.tif 000059
【図３９】
2017508467.tif 000060
【図４０】
2017508467.tif 000061
【図４１】
2017508467.tif 000062
【図４２】
2017508467.tif 000063
【図４３Ａ】
2017508467.tif 000064
【図４３Ｂ】
2017508467.tif 000065
【図４３Ｃ】
2017508467.tif 000066
【図４４】
2017508467.tif 000067
【図２２】
2017508467.tif 000068
【配列表】
2017508467000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月15日(2016.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＲＮＡ分子を調製する方法であって、
（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、該１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、
（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、
（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに
（ｄ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、前記単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップ
を含む方法。
【請求項２】
ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子が、配列番号１６４、配列番号１６５、および配列番号１６６からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単離されたＲＮＡ分子が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記単離されたＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列から本質的になる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列から本質的になる、請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列からなる、請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される単離されたＲＮＡ分子。
【請求項１５】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する配列に対応する配列を含む、単離されたＲＮＡ分子。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列を含む合成ＲＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列から本質的になる合成ＲＮＡ分子。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列からなる合成ＲＮＡ分子。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列を含む合成ＤＮＡ分子。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列から本質的になる合成ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列からなる合成ＤＮＡ分子。
【請求項２２】
請求項５に記載の調製されたＲＮＡ分子と同一の１種超の配列を含む、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット。
【請求項２３】
ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の配列を含む、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットであって、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、該１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子の該セットをもたらすステップを含む方法により調製される、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット。
【請求項２４】
請求項１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または請求項１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
薬学的に許容されるビヒクルを含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こすための、請求項１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または請求項１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子を含む組成物であって、該組成物は該腫瘍細胞と接触させられることを特徴とする、組成物。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞の接触が、アポトーシスに関与する、該腫瘍細胞におけるタンパク質の発現の阻害をもたらし、該タンパク質の発現の阻害が、該腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記タンパク質が、サバイビン、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ＦＫＢＰ３８、Ｎ−カドヘリン、およびカベオリンからなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
被験体においてがんを処置するための、請求項１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または請求項１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または請求項２４もしくは２５に記載の医薬組成物を含む、組成物。
【請求項３０】
前記がんが、血液系のがんまたは固形腫瘍である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物の投与が、アポトーシスに関与する、前記腫瘍細胞におけるタンパク質の発現の阻害をもたらし、該タンパク質の発現の阻害が、該腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記タンパク質が、サバイビン、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ＦＫＢＰ３８、Ｎ−カドヘリン、およびカベオリンからなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
請求項１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または請求項１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または請求項２４もしくは２５に記載の医薬組成物を含む、がんの処置において使用するためのキット。
【請求項３４】
前記１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または前記医薬組成物の使用のための指示を含む、請求項３１に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
別の態様では、がんの処置用医薬品の製造における使用のための、本明細書に記載の、単離されたＲＮＡ分子または単離されたＲＮＡ分子を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
単離されたＲＮＡ分子を調製する方法であって、
（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、該１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、
（ｂ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、
（ｃ）任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに
（ｄ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、および／または任意選択で、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離して、前記単離されたＲＮＡ分子をもたらすステップ
を含む方法。
（項目２）
ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子が、配列番号１６４、配列番号１６５、および配列番号１６６からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記単離されたＲＮＡ分子が、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された前記非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子を単離することによりもたらされる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記単離されたＲＮＡ分子が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記単離されたＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列から本質的になる、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択される配列に対応する配列からなる、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列を含む、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列から本質的になる、項目１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記１種または複数種のオリゴヌクレオチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号４５からなる群から選択される配列に対応する配列からなる、項目１１のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
項目１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される単離されたＲＮＡ分子。
（項目１５）
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、および配列番号１２１からなる群から選択される配列に対応する配列に対応する配列を含む、単離されたＲＮＡ分子。
（項目１６）
項目１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列を含む合成ＲＮＡ分子。
（項目１７）
項目１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列から本質的になる合成ＲＮＡ分子。
（項目１８）
項目１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子と同一の配列からなる合成ＲＮＡ分子。
（項目１９）
項目１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列を含む合成ＤＮＡ分子。
（項目２０）
項目１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列から本質的になる合成ＤＮＡ分子。
（項目２１）
項目１〜１３のいずれかに記載の方法により調製される前記ＲＮＡ分子に類似の配列からなる合成ＤＮＡ分子。
（項目２２）
項目５に記載の調製されたＲＮＡ分子と同一の１種超の配列を含む、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット。
（項目２３）
ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じる１種超のＲＮＡ分子のセットと同一の配列を含む、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセットであって、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、（ａ）１種または複数種のオリゴヌクレオチドを非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とアニーリングさせ、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップであって、該１種または複数種のオリゴヌクレオチドは、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子とハイブリダイズすると安定な二重鎖を形成するのに十分に該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子に相補的であり、該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子は、その５’末端において、逆反復配列を有するポリヌクレオチドの３’末端に共有結合されたアンチセンス１６ｓミトコンドリアリボソームＲＮＡを含む、ステップ、（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈにより切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をエキソヌクレアーゼで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をもたらすステップ、ならびに（ｃ）ＲＮａｓｅ  Ｈおよびエキソヌクレアーゼにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子をダイサーで消化して、ＲＮａｓｅ  Ｈ、エキソヌクレアーゼ、およびダイサーにより逐次切断された該非コードキメラミトコンドリアＲＮＡ分子から生じるＲＮＡ分子の該セットをもたらすステップを含む方法により調製される、１種超のＲＮＡ分子の単離されたセット。
（項目２４）
項目１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または項目１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子を含む、医薬組成物。
（項目２５）
薬学的に許容されるビヒクルを含む、項目２４に記載の医薬組成物。
（項目２６）
腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす方法であって、該腫瘍細胞を、項目１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または項目１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子と接触させるステップを含む方法。
（項目２７）
前記腫瘍細胞を接触させるステップが、アポトーシスに関与する、該腫瘍細胞におけるタンパク質の発現の阻害をもたらし、該タンパク質の発現の阻害が、該腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記タンパク質が、サバイビン、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ＦＫＢＰ３８、Ｎ−カドヘリン、およびカベオリンからなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
被験体においてがんを処置する方法であって、それを必要とする該被験体に、治療有効量の、項目１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または項目１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または項目２４もしくは２５に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
（項目３０）
前記がんが、血液系のがんまたは固形腫瘍である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記１種または複数種のＲＮＡ分子または医薬組成物を投与するステップが、アポトーシスに関与する、前記腫瘍細胞におけるタンパク質の発現の阻害をもたらし、該タンパク質の発現の阻害が、該腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記タンパク質が、サバイビン、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ＦＫＢＰ３８、Ｎ−カドヘリン、およびカベオリンからなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目１４〜１８、２２、および２３のいずれかに記載の１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または項目１９〜２１のいずれかに記載の１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または項目２４もしくは２５に記載の医薬組成物を含む、がんの処置において使用するためのキット。
（項目３４）
前記１種もしくは複数種の単離されたもしくは合成ＲＮＡ分子、または１種もしくは複数種の合成ＤＮＡ分子、または前記医薬組成物の使用のための指示を含む、項目３１に記載のキット。
【国際調査報告】
2017508467.tif 000069
2017508467.tif 000070
2017508467.tif 000071
2017508467.tif 000072