(57)【要約】  本発明は、受容体／リガンドペアを同定するための新規な方法、この方法を実施するために有用なトランスジェニック動物、ならびに例えば食品産業、芳香産業および健康産業におけるリガンドとその受容体との間の相互作用を有するリガンドおよび／またはモジュレーターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのリガンドに応答する少なくとも１つの化学受容体を同定する方法であって、
ａ）少なくとも１つの化学受容体を発現する細胞を含む生物学的サンプルを用意する工程であって、前記生物学的サンプルが（ｉ）少なくとも１つの試験化合物に曝露されたものであるか、または（ｉｉ）少なくとも１つの試験化合物に曝露された動物から得られたものである工程と、
ｂ）前記生物学的サンプルにおける少なくとも１つの化学受容体をコードする遺伝子の転写のレベルに比例するシグナルを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において決定したシグナルのレベルを、前記生物学的サンプルまたは前記動物が前記少なくとも１つの試験化合物に曝露されていない陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルと比較する工程と
を少なくとも含んでなり、
工程ｂ）において決定したシグナルのレベルと、陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルとの差異が、前記少なくとも１つの試験化合物が、前記少なくとも１つの化学受容体のリガンドを構成し、そして前記少なくとも１つの化学受容体に結合してその活性をモジュレートすることができることを示すものとすることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記化学受容体が嗅覚受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化学受容体がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記化学受容体がトレースアミン受容体（ＴＡＡＲ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記化学受容体が非ＧＰＣＲである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記化学受容体がにおい受容体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記におい受容体が、下記からなる群：
ＯＲ１０Ａ２、  ＯＲ１３Ｃ８、  ＯＲ２ＡＧ２、  ＯＲ２Ｔ８、  ＯＲ４Ｍ２、  ＯＲ５２Ｌ１、  ＯＲ５Ｍ３、  ＯＲ７Ｇ２、  ＯＲ１０Ａ３、  ＯＲ１３Ｃ９、  ＯＲ２ＡＪ１、  ＯＲ２Ｖ１、  ＯＲ４Ｎ２、  ＯＲ５２Ｍ１、  ＯＲ５Ｍ８、  ＯＲ７Ｇ３、  ＯＲ１０Ａ４、  ＯＲ１３Ｄ１、  ＯＲ２ＡＫ２、  ＯＲ２Ｖ２、  ＯＲ４Ｎ４、  ＯＲ５２Ｎ１、  ＯＲ５Ｍ９、  ＯＲ８Ａ１、  ＯＲ１０Ａ５、  ＯＲ１３Ｆ１、  ＯＲ２ＡＰ１、  ＯＲ２Ｗ１、  ＯＲ４Ｎ５、  ＯＲ５２Ｎ２、  ＯＲ５Ｐ２、  ＯＲ８Ｂ１２、  ＯＲ１０Ａ６、  ＯＲ１３Ｇ１、  ＯＲ２ＡＴ４、  ＯＲ２Ｗ３、  ＯＲ４Ｐ４、  ＯＲ５２Ｎ４、  ＯＲ５Ｐ３、  ＯＲ８Ｂ２、  ＯＲ１０Ａ７、  ＯＲ１３Ｈ１、  ＯＲ２Ｂ１１、  ＯＲ２Ｙ１、  ＯＲ４Ｑ３、  ＯＲ５２Ｎ５、  ＯＲ５Ｒ１、  ＯＲ８Ｂ３、  ＯＲ１０ＡＤ１、  ＯＲ１３Ｊ１、  ＯＲ２Ｂ２、  ＯＲ２Ｚ１、  ＯＲ４Ｓ１、  ＯＲ５２Ｒ１、  ＯＲ５Ｔ１、  ＯＲ８Ｂ４、  ＯＲ１０ＡＧ１、  ＯＲ１４Ａ１６、  ＯＲ２Ｂ３、  ＯＲ３Ａ１、  ＯＲ４Ｓ２、  ＯＲ５２Ｗ１、  ＯＲ５Ｔ２、  ＯＲ８Ｂ８、  ＯＲ１０Ｃ１、  ＯＲ１４Ａ２、  ＯＲ２Ｂ６、  ＯＲ３Ａ２、  ＯＲ４Ｘ１、  ＯＲ５６Ａ１、  ＯＲ５Ｔ３、  ＯＲ８Ｄ１、  ＯＲ１０Ｄ３、  ＯＲ１４Ｃ３６、  ＯＲ２Ｃ１、  ＯＲ３Ａ３、  ＯＲ４Ｘ２、  ＯＲ５６Ａ３、  ＯＲ５Ｖ１、  ＯＲ８Ｄ２、  ＯＲ１０Ｇ２、  ＯＲ１４Ｉ１、  ＯＲ２Ｃ３、  ＯＲ４Ａ１５、  ＯＲ５１Ａ２、  ＯＲ５６Ａ４、  ＯＲ５Ｗ２、  ＯＲ８Ｄ４、  ＯＲ１０Ｇ３、  ＯＲ１４Ｊ１、  ＯＲ２Ｄ２、  ＯＲ４Ａ１６、  ＯＲ５１Ａ４、  ＯＲ５６Ｂ１、  ＯＲ６Ａ２、  ＯＲ８Ｇ１、  ＯＲ１０Ｇ４、  ＯＲ１４Ｋ１、  ＯＲ２Ｄ３、  ＯＲ４Ａ４７、  ＯＲ５１Ａ７、  ＯＲ５６Ｂ３Ｐ、  ＯＲ６Ｂ１、  ＯＲ８Ｇ５、  ＯＲ１０Ｇ６、  ＯＲ１Ａ１、  ＯＲ２Ｆ１、  ＯＲ４Ａ５、  ＯＲ５１Ｂ２、  ＯＲ５６Ｂ４、  ＯＲ６Ｂ２、  ＯＲ８Ｈ１、  ＯＲ１０Ｇ７、  ＯＲ１Ａ２、  ＯＲ２Ｆ２、  ＯＲ４Ｂ１、  ＯＲ５１Ｂ４、  ＯＲ５Ａ１、  ＯＲ６Ｂ３、  ＯＲ８Ｈ２、  ＯＲ１０Ｇ８、  ＯＲ１Ｂ１、  ＯＲ２Ｇ２、  ＯＲ４Ｃ１１、  ＯＲ５１Ｂ５、  ＯＲ５Ａ２、  ＯＲ６Ｃ１、  ＯＲ８Ｈ３、  ＯＲ１０Ｇ９、  ＯＲ１Ｃ１、  ＯＲ２Ｇ３、  ＯＲ４Ｃ１２、  ＯＲ５１Ｂ６、  ＯＲ５ＡＣ２、  ＯＲ６Ｃ２、  ＯＲ８Ｉ２、  ＯＲ１０Ｈ１、  ＯＲ１Ｄ２、  ＯＲ２Ｇ６、  ＯＲ４Ｃ１３、  ＯＲ５１Ｄ１、  ＯＲ５ＡＫ２、  ＯＲ６Ｃ３、  ＯＲ８Ｊ１、  ＯＲ１０Ｈ２、  ＯＲ１Ｄ５、  ＯＲ２Ｈ１、  ＯＲ４Ｃ１５、  ＯＲ５１Ｅ１、  ＯＲ５ＡＮ１、  ＯＲ６Ｃ４、  ＯＲ８Ｊ３、  ＯＲ１０Ｈ３、  ＯＲ１Ｅ１、  ＯＲ２Ｈ２、  ＯＲ４Ｃ１６、  ＯＲ５１Ｅ２、  ＯＲ５ＡＰ２、  ＯＲ６Ｃ６、  ＯＲ８Ｋ１、  ＯＲ１０Ｈ４、  ＯＲ１Ｅ２、  ＯＲ２Ｊ１、  ＯＲ４Ｃ３、  ＯＲ５１Ｆ１、  ＯＲ５ＡＲ１、  ＯＲ６Ｃ６５、  ＯＲ８Ｋ３、  ＯＲ１０Ｈ５、  ＯＲ１Ｆ１、  ＯＲ２Ｊ２、  ＯＲ４Ｃ４６、  ＯＲ５１Ｆ２、  ＯＲ５ＡＳ１、  ＯＲ６Ｃ６８、  ＯＲ８Ｋ５、  ＯＲ１０Ｊ１、  ＯＲ１Ｇ１、  ＯＲ２Ｊ３、  ＯＲ４Ｃ５、  ＯＲ５１Ｇ１、  ＯＲ５ＡＵ１、  ＯＲ６Ｃ７０、  ＯＲ８Ｓ１、  ＯＲ１０Ｊ３、  ＯＲ１Ｉ１、  ＯＲ２Ｋ２、  ＯＲ４Ｃ６、  ＯＲ５１Ｇ２、  ＯＲ５Ｂ１２、  Ｏ���６Ｃ７４、  ＯＲ８Ｕ１、  ＯＲ１０Ｊ５、  ＯＲ１Ｊ１、  ＯＲ２Ｌ１３、  ＯＲ４Ｄ１、  ＯＲ５１Ｈ１Ｐ、  ＯＲ５Ｂ１７、  ＯＲ６Ｃ７５、  ＯＲ８Ｕ９、  ＯＲ１０Ｋ１、  ＯＲ１Ｊ２、  ＯＲ２Ｌ２、  ＯＲ４Ｄ１０、  ＯＲ５１Ｉ１、  ＯＲ５Ｂ２、  ＯＲ６Ｃ７６、  ＯＲ９Ａ２、  ＯＲ１０Ｋ２、  ＯＲ１Ｊ４、  ＯＲ２Ｌ３、  ＯＲ４Ｄ１１、  ＯＲ５１Ｉ２、  ＯＲ５Ｂ２１、  ＯＲ６Ｆ１、  ＯＲ９Ａ４、  ＯＲ１０Ｐ１、  ＯＲ１Ｋ１、  ＯＲ２Ｌ５、  ＯＲ４Ｄ２、  ＯＲ５１Ｌ１、  ＯＲ５Ｂ３、  ＯＲ６Ｊ１、  ＯＲ９Ｇ１、  ＯＲ１０Ｑ１、  ＯＲ１Ｌ１、  ＯＲ２Ｌ８、  ＯＲ４Ｄ５、  ＯＲ５１Ｍ１、  ＯＲ５Ｃ１、  ＯＲ６Ｋ２、  ＯＲ９Ｇ４、  ＯＲ１０Ｒ２、  ＯＲ１Ｌ３、  ＯＲ２Ｍ２、  ＯＲ４Ｄ６、  ＯＲ５１Ｑ１、  ＯＲ５Ｄ１３、  ＯＲ６Ｋ３、  ＯＲ９Ｇ９、  ＯＲ１０Ｓ１、  ＯＲ１Ｌ４、  ＯＲ２Ｍ３、  ＯＲ４Ｄ９、  ＯＲ５１Ｓ１、  ＯＲ５Ｄ１４、  ＯＲ６Ｋ６、  ＯＲ９Ｉ１、  ＯＲ１０Ｔ２、  ＯＲ１Ｌ６、  ＯＲ２Ｍ４、  ＯＲ４Ｅ２、  ＯＲ５１Ｔ１、  ＯＲ５Ｄ１６、  ＯＲ６Ｍ１、  ＯＲ９Ｋ２、  ＯＲ１０Ｖ１、  ＯＲ１Ｌ８、  ＯＲ２Ｍ５、  ＯＲ４Ｆ１５、  ＯＲ５１Ｖ１、  ＯＲ５Ｄ１８、  ＯＲ６Ｎ１、  ＯＲ９Ｑ１、  ＯＲ１０Ｗ１、  ＯＲ１Ｍ１、  ＯＲ２Ｍ７、  ＯＲ４Ｆ１６、  ＯＲ５２Ａ１、  ＯＲ５Ｆ１、  ＯＲ６Ｎ２、  ＯＲ９Ｑ２、  ＯＲ１０Ｘ１、  ＯＲ１Ｎ１、  ＯＲ２Ｓ２、  ＯＲ４Ｆ１７、  ＯＲ５２Ａ５、  ＯＲ５Ｈ１、  ＯＲ６Ｐ１、  ＯＲ１０Ｚ１、  ＯＲ１Ｎ２、  ＯＲ２Ｔ１、  ＯＲ４Ｆ２１、  ＯＲ５２Ｂ１Ｐ、  ＯＲ５Ｈ１４、  ＯＲ６Ｑ１、  ＯＲ１１Ａ１、  ＯＲ１Ｑ１、  ＯＲ２Ｔ１０、  ＯＲ４Ｆ２９、  ＯＲ５２Ｂ２、  ＯＲ５Ｈ１５、  ＯＲ６Ｓ１、  ＯＲ１１Ｇ２、  ＯＲ１Ｓ１、  ＯＲ２Ｔ１１、  ＯＲ４Ｆ３、  ＯＲ５２Ｂ４、  ＯＲ５Ｈ２、  ＯＲ６Ｔ１、  ＯＲ１１Ｈ１、  ＯＲ１Ｓ２、  ＯＲ２Ｔ１２、  ＯＲ４Ｆ４、  ＯＲ５２Ｂ６、  ＯＲ５Ｈ６、  ＯＲ６Ｖ１、  ＯＲ１１Ｈ１２、  ＯＲ２Ａ１、  ＯＲ２Ｔ２、  ＯＲ４Ｆ５、  ＯＲ５２Ｄ１、  ＯＲ５Ｉ１、  ＯＲ６Ｘ１、  ＯＲ１１Ｈ４、  ＯＲ２Ａ１２、  ＯＲ２Ｔ２７、  ＯＲ４Ｆ６、  ＯＲ５２Ｅ２、  ＯＲ５Ｊ２、  ＯＲ６Ｙ１、  ＯＲ１１Ｈ６、  ＯＲ２Ａ１４、  ＯＲ２Ｔ２９、  ＯＲ４Ｋ１、  ＯＲ５２Ｅ４、  ＯＲ５Ｋ１、  ＯＲ７Ａ１０、  ＯＲ１１Ｌ１、  ＯＲ２Ａ２、  ＯＲ２Ｔ３、  ＯＲ４Ｋ１３、  ＯＲ５２Ｅ６、  ＯＲ５Ｋ２、  ＯＲ７Ａ１７、  ＯＲ１２Ｄ２、  ＯＲ２Ａ２５、  ＯＲ２Ｔ３３、  ＯＲ４Ｋ１４、  ＯＲ５２Ｅ８、  ＯＲ５Ｋ３、  ＯＲ７Ａ５、  ＯＲ１２Ｄ３、  ＯＲ２Ａ４、  ＯＲ２Ｔ３４、  ＯＲ４Ｋ１５、  ＯＲ５２Ｈ１、  ＯＲ５Ｋ４、  ＯＲ７Ｃ１、  ＯＲ１３Ａ１、  ＯＲ２Ａ４２、  ＯＲ２Ｔ３５、  ＯＲ４Ｋ１７、  ＯＲ５２Ｉ１、  ＯＲ５Ｌ１、  ＯＲ７Ｃ２、  ＯＲ１３Ｃ２、  ＯＲ２Ａ５、  ＯＲ２Ｔ４、  ＯＲ４Ｋ２、  ＯＲ５２Ｉ２、  ＯＲ５Ｌ２、  ＯＲ７Ｄ２、  ＯＲ１３Ｃ３、  ＯＲ２Ａ７、  ＯＲ２Ｔ５、  ＯＲ４Ｋ５、  ＯＲ５２Ｊ３、  ＯＲ５Ｍ１、  ＯＲ７Ｄ４、  ＯＲ１３Ｃ４、  ＯＲ２ＡＥ１、  ＯＲ２Ｔ６、  ＯＲ４Ｌ１、  ＯＲ５２Ｋ１、  ＯＲ５Ｍ１０、  ＯＲ７Ｅ２４、  ＯＲ１３Ｃ５、  ＯＲ２ＡＧ１、  ＯＲ２Ｔ７、  ＯＲ４Ｍ��、  ＯＲ５２Ｋ２、  ＯＲ５Ｍ１１、  ＯＲ７Ｇ１
より選択されるヒトにおい受容体、および／または、前記ヒトにおい受容体の１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するそれらの任意の変異体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的サンプルが、少なくとも１つの化学受容体を発現する感覚ニューロンを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、少なくとも１つの化学受容体を発現する嗅覚ニューロンを含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが、嗅覚系由来の組織を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的サンプルが、少なくとも１個の外因性化学受容体遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞または組織を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの試験化合物に曝露した後の生物学的サンプルにおける工程ｂ）において決定したシグナルのレベルが、試験化合物に曝露されていない陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルよりも低いことが、前記少なくとも１つの試験化合物が、前記少なくとも１つの化学受容体のアゴニストとして作用するリガンドを構成することを示すものとすることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの試験化合物に曝露した後の生物学的サンプルにおける工程ｂ）において決定したシグナルのレベルが、試験化合物に曝露されていない陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルよりも高いことが、前記少なくとも１つの試験化合物が、前記少なくとも１つの化学受容体のアンタゴニストとして作用するリガンドを構成することを示すものとすることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
化学受容体をコードする少なくとも５個の遺伝子または少なくとも１０個の遺伝子の転写のレベルを決定することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも５個の外因性化学受容体遺伝子を発現する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
少なくとも５個または少なくとも１０個のヒトにおい受容体遺伝子を発現する、請求項１５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のトランスジェニック動物であって、下記からなる群：
ＯＲ１０Ａ２、  ＯＲ１３Ｃ８、  ＯＲ２ＡＧ２、  ＯＲ２Ｔ８、  ＯＲ４Ｍ２、  ＯＲ５２Ｌ１、  ＯＲ５Ｍ３、  ＯＲ７Ｇ２、  ＯＲ１０Ａ３、  ＯＲ１３Ｃ９、  ＯＲ２ＡＪ１、  ＯＲ２Ｖ１、  ＯＲ４Ｎ２、  ＯＲ５２Ｍ１、  ＯＲ５Ｍ８、  ＯＲ７Ｇ３、  ＯＲ１０Ａ４、  ＯＲ１３Ｄ１、  ＯＲ２ＡＫ２、  ＯＲ２Ｖ２、  ＯＲ４Ｎ４、  ＯＲ５２Ｎ１、  ＯＲ５Ｍ９、  ＯＲ８Ａ１、  ＯＲ１０Ａ５、  ＯＲ１３Ｆ１、  ＯＲ２ＡＰ１、  ＯＲ２Ｗ１、  ＯＲ４Ｎ５、  ＯＲ５２Ｎ２、  ＯＲ５Ｐ２、  ＯＲ８Ｂ１２、  ＯＲ１０Ａ６、  ＯＲ１３Ｇ１、  ＯＲ２ＡＴ４、  ＯＲ２Ｗ３、  ＯＲ４Ｐ４、  ＯＲ５２Ｎ４、  ＯＲ５Ｐ３、  ＯＲ８Ｂ２、  ＯＲ１０Ａ７、  ＯＲ１３Ｈ１、  ＯＲ２Ｂ１１、  ＯＲ２Ｙ１、  ＯＲ４Ｑ３、  ＯＲ５２Ｎ５、  ＯＲ５Ｒ１、  ＯＲ８Ｂ３、  ＯＲ１０ＡＤ１、  ＯＲ１３Ｊ１、  ＯＲ２Ｂ２、  ＯＲ２Ｚ１、  ＯＲ４Ｓ１、  ＯＲ５２Ｒ１、  ＯＲ５Ｔ１、  ＯＲ８Ｂ４、  ＯＲ１０ＡＧ１、  ＯＲ１４Ａ１６、  ＯＲ２Ｂ３、  ＯＲ３Ａ１、  ＯＲ４Ｓ２、  ＯＲ５２Ｗ１、  ＯＲ５Ｔ２、  ＯＲ８Ｂ８、  ＯＲ１０Ｃ１、  ＯＲ１４Ａ２、  ＯＲ２Ｂ６、  ＯＲ３Ａ２、  ＯＲ４Ｘ１、  ＯＲ５６Ａ１、  ＯＲ５Ｔ３、  ＯＲ８Ｄ１、  ＯＲ１０Ｄ３、  ＯＲ１４Ｃ３６、  ＯＲ２Ｃ１、  ＯＲ３Ａ３、  ＯＲ４Ｘ２、  ＯＲ５６Ａ３、  ＯＲ５Ｖ１、  ＯＲ８Ｄ２、  ＯＲ１０Ｇ２、  ＯＲ１４Ｉ１、  ＯＲ２Ｃ３、  ＯＲ４Ａ１５、  ＯＲ５１Ａ２、  ＯＲ５６Ａ４、  ＯＲ５Ｗ２、  ＯＲ８Ｄ４、  ＯＲ１０Ｇ３、  ＯＲ１４Ｊ１、  ＯＲ２Ｄ２、  ＯＲ４Ａ１６、  ＯＲ５１Ａ４、  ＯＲ５６Ｂ１、  ＯＲ６Ａ２、  ＯＲ８Ｇ１、  ＯＲ１０Ｇ４、  ＯＲ１４Ｋ１、  ＯＲ２Ｄ３、  ＯＲ４Ａ４７、  ＯＲ５１Ａ７、  ＯＲ５６Ｂ３Ｐ、  ＯＲ６Ｂ１、  ＯＲ８Ｇ５、  ＯＲ１０Ｇ６、  ＯＲ１Ａ１、  ＯＲ２Ｆ１、  ＯＲ４Ａ５、  ＯＲ５１Ｂ２、  ＯＲ５６Ｂ４、  ＯＲ６Ｂ２、  ＯＲ８Ｈ１、  ＯＲ１０Ｇ７、  ＯＲ１Ａ２、  ＯＲ２Ｆ２、  ＯＲ４Ｂ１、  ＯＲ５１Ｂ４、  ＯＲ５Ａ１、  ＯＲ６Ｂ３、  ＯＲ８Ｈ２、  ＯＲ１０Ｇ８、  ＯＲ１Ｂ１、  ＯＲ２Ｇ２、  ＯＲ４Ｃ１１、  ＯＲ５１Ｂ５、  ＯＲ５Ａ２、  ＯＲ６Ｃ１、  ＯＲ８Ｈ３、  ＯＲ１０Ｇ９、  ＯＲ１Ｃ１、  ＯＲ２Ｇ３、  ＯＲ４Ｃ１２、  ＯＲ５１Ｂ６、  ＯＲ５ＡＣ２、  ＯＲ６Ｃ２、  ＯＲ８Ｉ２、  ＯＲ１０Ｈ１、  ＯＲ１Ｄ２、  ＯＲ２Ｇ６、  ＯＲ４Ｃ１３、  ＯＲ５１Ｄ１、  ＯＲ５ＡＫ２、  ＯＲ６Ｃ３、  ＯＲ８Ｊ１、  ＯＲ１０Ｈ２、  ＯＲ１Ｄ５、  ＯＲ２Ｈ１、  ＯＲ４Ｃ１５、  ＯＲ５１Ｅ１、  ＯＲ５ＡＮ１、  ＯＲ６Ｃ４、  ＯＲ８Ｊ３、  ＯＲ１０Ｈ３、  ＯＲ１Ｅ１、  ＯＲ２Ｈ２、  ＯＲ４Ｃ１６、  ＯＲ５１Ｅ２、  ＯＲ５ＡＰ２、  ＯＲ６Ｃ６、  ＯＲ８Ｋ１、  ＯＲ１０Ｈ４、  ＯＲ１Ｅ２、  ＯＲ２Ｊ１、  ＯＲ４Ｃ３、  ＯＲ５１Ｆ１、  ＯＲ５ＡＲ１、  ＯＲ６Ｃ６５、  ＯＲ８Ｋ３、  ＯＲ１０Ｈ５、  ＯＲ１Ｆ１、  ＯＲ２Ｊ２、  ＯＲ４Ｃ４６、  ＯＲ５１Ｆ２、  ＯＲ５ＡＳ１、  ＯＲ６Ｃ６８、  ＯＲ８Ｋ５、  ＯＲ１０Ｊ１、  ＯＲ１Ｇ１、  ＯＲ２Ｊ３、  ＯＲ４Ｃ５、  ＯＲ５１Ｇ１、  ＯＲ５ＡＵ１、  ＯＲ６Ｃ７０、  ＯＲ８Ｓ１、  ＯＲ１０Ｊ３、  ＯＲ１Ｉ１、  ＯＲ２Ｋ２、  ＯＲ４Ｃ６、  ＯＲ５１Ｇ２、  ＯＲ５Ｂ１２、  Ｏ���６Ｃ７４、  ＯＲ８Ｕ１、  ＯＲ１０Ｊ５、  ＯＲ１Ｊ１、  ＯＲ２Ｌ１３、  ＯＲ４Ｄ１、  ＯＲ５１Ｈ１Ｐ、  ＯＲ５Ｂ１７、  ＯＲ６Ｃ７５、  ＯＲ８Ｕ９、  ＯＲ１０Ｋ１、  ＯＲ１Ｊ２、  ＯＲ２Ｌ２、  ＯＲ４Ｄ１０、  ＯＲ５１Ｉ１、  ＯＲ５Ｂ２、  ＯＲ６Ｃ７６、  ＯＲ９Ａ２、  ＯＲ１０Ｋ２、  ＯＲ１Ｊ４、  ＯＲ２Ｌ３、  ＯＲ４Ｄ１１、  ＯＲ５１Ｉ２、  ＯＲ５Ｂ２１、  ＯＲ６Ｆ１、  ＯＲ９Ａ４、  ＯＲ１０Ｐ１、  ＯＲ１Ｋ１、  ＯＲ２Ｌ５、  ＯＲ４Ｄ２、  ＯＲ５１Ｌ１、  ＯＲ５Ｂ３、  ＯＲ６Ｊ１、  ＯＲ９Ｇ１、  ＯＲ１０Ｑ１、  ＯＲ１Ｌ１、  ＯＲ２Ｌ８、  ＯＲ４Ｄ５、  ＯＲ５１Ｍ１、  ＯＲ５Ｃ１、  ＯＲ６Ｋ２、  ＯＲ９Ｇ４、  ＯＲ１０Ｒ２、  ＯＲ１Ｌ３、  ＯＲ２Ｍ２、  ＯＲ４Ｄ６、  ＯＲ５１Ｑ１、  ＯＲ５Ｄ１３、  ＯＲ６Ｋ３、  ＯＲ９Ｇ９、  ＯＲ１０Ｓ１、  ＯＲ１Ｌ４、  ＯＲ２Ｍ３、  ＯＲ４Ｄ９、  ＯＲ５１Ｓ１、  ＯＲ５Ｄ１４、  ＯＲ６Ｋ６、  ＯＲ９Ｉ１、  ＯＲ１０Ｔ２、  ＯＲ１Ｌ６、  ＯＲ２Ｍ４、  ＯＲ４Ｅ２、  ＯＲ５１Ｔ１、  ＯＲ５Ｄ１６、  ＯＲ６Ｍ１、  ＯＲ９Ｋ２、  ＯＲ１０Ｖ１、  ＯＲ１Ｌ８、  ＯＲ２Ｍ５、  ＯＲ４Ｆ１５、  ＯＲ５１Ｖ１、  ＯＲ５Ｄ１８、  ＯＲ６Ｎ１、  ＯＲ９Ｑ１、  ＯＲ１０Ｗ１、  ＯＲ１Ｍ１、  ＯＲ２Ｍ７、  ＯＲ４Ｆ１６、  ＯＲ５２Ａ１、  ＯＲ５Ｆ１、  ＯＲ６Ｎ２、  ＯＲ９Ｑ２、  ＯＲ１０Ｘ１、  ＯＲ１Ｎ１、  ＯＲ２Ｓ２、  ＯＲ４Ｆ１７、  ＯＲ５２Ａ５、  ＯＲ５Ｈ１、  ＯＲ６Ｐ１、  ＯＲ１０Ｚ１、  ＯＲ１Ｎ２、  ＯＲ２Ｔ１、  ＯＲ４Ｆ２１、  ＯＲ５２Ｂ１Ｐ、  ＯＲ５Ｈ１４、  ＯＲ６Ｑ１、  ＯＲ１１Ａ１、  ＯＲ１Ｑ１、  ＯＲ２Ｔ１０、  ＯＲ４Ｆ２９、  ＯＲ５２Ｂ２、  ＯＲ５Ｈ１５、  ＯＲ６Ｓ１、  ＯＲ１１Ｇ２、  ＯＲ１Ｓ１、  ＯＲ２Ｔ１１、  ＯＲ４Ｆ３、  ＯＲ５２Ｂ４、  ＯＲ５Ｈ２、  ＯＲ６Ｔ１、  ＯＲ１１Ｈ１、  ＯＲ１Ｓ２、  ＯＲ２Ｔ１２、  ＯＲ４Ｆ４、  ＯＲ５２Ｂ６、  ＯＲ５Ｈ６、  ＯＲ６Ｖ１、  ＯＲ１１Ｈ１２、  ＯＲ２Ａ１、  ＯＲ２Ｔ２、  ＯＲ４Ｆ５、  ＯＲ５２Ｄ１、  ＯＲ５Ｉ１、  ＯＲ６Ｘ１、  ＯＲ１１Ｈ４、  ＯＲ２Ａ１２、  ＯＲ２Ｔ２７、  ＯＲ４Ｆ６、  ＯＲ５２Ｅ２、  ＯＲ５Ｊ２、  ＯＲ６Ｙ１、  ＯＲ１１Ｈ６、  ＯＲ２Ａ１４、  ＯＲ２Ｔ２９、  ＯＲ４Ｋ１、  ＯＲ５２Ｅ４、  ＯＲ５Ｋ１、  ＯＲ７Ａ１０、  ＯＲ１１Ｌ１、  ＯＲ２Ａ２、  ＯＲ２Ｔ３、  ＯＲ４Ｋ１３、  ＯＲ５２Ｅ６、  ＯＲ５Ｋ２、  ＯＲ７Ａ１７、  ＯＲ１２Ｄ２、  ＯＲ２Ａ２５、  ＯＲ２Ｔ３３、  ＯＲ４Ｋ１４、  ＯＲ５２Ｅ８、  ＯＲ５Ｋ３、  ＯＲ７Ａ５、  ＯＲ１２Ｄ３、  ＯＲ２Ａ４、  ＯＲ２Ｔ３４、  ＯＲ４Ｋ１５、  ＯＲ５２Ｈ１、  ＯＲ５Ｋ４、  ＯＲ７Ｃ１、  ＯＲ１３Ａ１、  ＯＲ２Ａ４２、  ＯＲ２Ｔ３５、  ＯＲ４Ｋ１７、  ＯＲ５２Ｉ１、  ＯＲ５Ｌ１、  ＯＲ７Ｃ２、  ＯＲ１３Ｃ２、  ＯＲ２Ａ５、  ＯＲ２Ｔ４、  ＯＲ４Ｋ２、  ＯＲ５２Ｉ２、  ＯＲ５Ｌ２、  ＯＲ７Ｄ２、  ＯＲ１３Ｃ３、  ＯＲ２Ａ７、  ＯＲ２Ｔ５、  ＯＲ４Ｋ５、  ＯＲ５２Ｊ３、  ＯＲ５Ｍ１、  ＯＲ７Ｄ４、  ＯＲ１３Ｃ４、  ＯＲ２ＡＥ１、  ＯＲ２Ｔ６、  ＯＲ４Ｌ１、  ＯＲ５２Ｋ１、  ＯＲ５Ｍ１０、  ＯＲ７Ｅ２４、  ＯＲ１３Ｃ５、  ＯＲ２ＡＧ１、  ＯＲ２Ｔ７、  ＯＲ４Ｍ��、  ＯＲ５２Ｋ２、  ＯＲ５Ｍ１１、  ＯＲ７Ｇ１
より選択される少なくとも５個または少なくとも１０個のヒトにおい受容体遺伝子、および／または、前記ヒトにおい受容体遺伝子の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するそれらの任意の変異体を発現する、トランスジェニック動物。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のトランスジェニック動物から単離されてなる、嗅覚ニューロン。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載のトランスジェニック動物の嗅覚系から抽出されてなる、組織サンプル。
【請求項２０】
前記生物学的サンプルが、請求項１６または１７に記載のトランスジェニック動物から単離されてなる生物学的サンプルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、規定の化学分子または化学分子の混合物に応答する化学受容体の同定（すなわち、受容体／リガンドペアの同定）、および食品産業、芳香産業、健康産業を含む任意の産業におけるこのような関係の知識の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物は、外界を知覚するための様々な種類の化学感覚ツールを進化させてきた。これらの中では、味覚系および嗅覚系がある。これらの構造において、特別な化学感覚器が発現される。種に応じて、これらとしては、例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、例えばにおい受容体（ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＯＲ）、鋤鼻受容体（ＶＲ）、トレースアミン受容体（ＴＡＡＲ）、ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）、Ｔ１ＲおよびＴ２Ｒ味受容体、ならびに非ＧＰＣＲ、例えば一過性受容体電位（Ｔｒｐ）チャネル、グアニリルシクラーゼ、ならびにイオンチャネル型嗅覚受容体（ＩＲ）が挙げられ得る（Ｋａｕｐｐ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１１：１８８−２００）。これらの感覚器は、動物が、特にそれらのＯＲを介して非常に様々な外部刺激を受け止めることを可能にし、数十億の異なる分子を検出および区別することを可能にする。これらの受容体をコードする遺伝子レパートリーは、所定の種内において多様であり、サイズおよび内容が種間において変動する。マウスにおいて、例えば、ＯＲレパートリーは１２５０個のメンバーに及び、これはその総遺伝子数の５％超に相当する。すべての嗅覚ニューロンは単一の嗅覚受容体遺伝子を発現するが、これは、数百の機能的に異なる感覚ニューロン集団が鼻腔に共存することを意味する。これらの各集団は、様々なアゴニストによって活性化され得、各アゴニストは、様々なＯＲによって認識され得る。これは、異なる混合物間の区別を可能にするコンビナトリアルコードをもたらす。
【０００３】
過去３０年間、脱オーファン化と称される方法において、ＧＰＣＲの大部分に、リガンドおよびアンタゴニストが割り当てられている。これはＯＲの例外であるが、それらの最大の部分は依然としてオーファンである。例えば、ヒトＯＲの９０％超は依然としてオーファンである（Ｐｅｔｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４３，５２７−５４２）。個々のＯＲの脱オーファン化は重要であるが、さらにより興味深いのは、所定の種における所定の化学物質に対応するＯＲのリストを提供することである。今日、マウスまたはヒトにおいて、同族ＯＲの網羅的なリストが定義されている単一におい分子は知られていない。このような知識は、嗅覚の根底にあるコンビナトリアルコードを理解するために非常に有益であり得るが、商業的用途も有し得る。例えば、所定のにおい物質によって活性化されるＯＲレパートリーの知識は、所定の嗅覚刺激（特に、ヒトにおいてポジティブな快楽的価値を有するもの（例えば、チョコレートまたは花））を模倣するために役立つであろう。あるいは、これは、望ましくないにおいまたは風味（例えば、不快な体臭または下水道のにおい）の知覚を妨げるにおい物質アンタゴニストの発見を可能にし得る。全体として、それは、特定の化学的知覚をモジュレートする能力を促進するであろう。
【０００４】
これまでに脱オーファン化されたＯＲの数が限られているのは、努力不足ではなく、むしろ適切なアッセイの欠如によるものである。最も知られている嗅覚アゴニスト−受容体ペアは、インビトロにおいて同定された。これらのアプローチは、アフリカツメガエル卵母細胞、酵母、卵巣、昆虫細胞、バキュロウイルス、ならびに天然または人工ＨＥＫおよびＨｅｌａ細胞を含む異種系における齧歯類またはヒト化学受容体の発現を伴っていた（Ｐｅｔｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、前掲）。これらの発現系は重大な進歩をもたらし、４１個のヒトＯＲおよび９５個のマウスＯＲの脱オーファン化（少なくとも１つの活性化分子を見出すこと）および特性評価を可能にした。しかしながら、これらの非天然的な方法は、重大な問題を抱えている。第一に、インビトロにおいて生成されたＯＲは、通常は小胞体内に保持されるので、細胞膜に到達することができない。したがって、多くの場合、異種発現のために、非嗅覚タンパク質のセグメントとのそれらの融合が選択されるが、それらの応答プロファイルが改変される可能性がある。第二に、受容体とそれらの潜在的なアゴニストとの間のインタフェースであるにおい結合タンパク質を含有する複合鼻粘液は、インビトロにおいて存在しない。この粘液は、多くのにおい分子を化学的に改変する酵素的役割を果たすので、これは非常に重要である（Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｔｏｕｈａｒａ，２０１０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３０，１６３９１‐１６３９８）。第三に、その天然の伝達カスケードへのＯＲの共役（これは通常は、インビトロにおいて再現されない）は、受容体−におい物質の特異性に影響を与えることが公知である（Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，１１８０７‐１１８１５）。最後に、潜在的なリガンドは、インビトロにおいて気相ではなく液相で提供されるので、自然に鼻前方および鼻後方フラックス中に存在するリガンドとそれらの濃度との関連付けが困難である。
【０００５】
非天然的な異種発現に関する問題のいくつかを回避するために、別のアプローチが採用された。インシリコモデルを開発する努力がなされている（例えば、Ｂａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ９２０６４）。生理学的条件に近づけて、内因性または外因性ＯＲを発現する嗅覚ニューロンの、化学物質に対する応答が研究された（Ａｒａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３，１２４８−１２５５；Ｍａｌｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ  ９６，７１３‐７２３；Ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｅｕｒｏｎ，５２，８５７−８６９）。規定の嗅覚ニューロンが標識された遺伝子ターゲティングマウスに基づく他の方法でも、少数のＯＲについて有効性が証明された。しかしながら、感覚ニューロンに基づくこれらの方法は、エクスビボにおける調製または複雑なマウス手術を伴い、最も重要なことに、一度に１つの受容体の脱オーファン化を可能にするにすぎない。
【０００６】
したがって、インビボにおいて特定のにおい化合物に応答する受容体（特に、悪臭中和分子またはにおいモジュレーターのような特別な価値を有するもの）の迅速かつ容易な同定を可能にする方法が依然として必要である。このような方法はまた、アゴニストおよびアンタゴニストの大規模スクリーニングのための重要なツールを構成するであろう。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、予想外のことに、マウスおよびハエにおいて、インビボまたはエクスビボでの化学刺激への曝露後に、この刺激に応答する嗅覚ニューロンが、それらが発現する嗅覚受容体（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に対応する転写産物の量を迅速にモジュレートする（アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）ことを見出した。これらの知見に基づいて、本発明は、ｍＲＮＡ発現の変化に基づいて、特定の化学刺激に応答する受容体の同定を可能にする簡便で高速かつ効率的な方法を提供する。主に嗅覚受容体／リガンドを用いて説明されているが、本発明は、他の化学受容体／リガンドペア、他の種、および特定の化学受容体を発現するトランスジェニック種に拡張され得る。
【０００８】
本発明の第一の態様は、少なくとも１つのリガンドに対する少なくとも１つの化学受容体を同定する方法であって、
ａ）少なくとも１つの化学受容体を発現する細胞を含む生物学的サンプルを用意する工程であって、前記生物学的サンプルが（ｉ）少なくとも１つの試験化合物に曝露されたものであるか、または（ｉｉ）少なくとも１つの試験化合物に曝露された動物から得られたものである工程と、
ｂ）前記生物学的サンプルにおける化学受容体をコードする少なくとも１個の遺伝子の転写のレベルに比例するシグナルを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において決定したシグナルのレベルを、前記生物学的サンプルまたは前記動物が前記少なくとも１つの試験化合物に曝露されていない陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルと比較する工程と
を少なくとも含んでなり、
工程ｂ）において決定したシグナルのレベルと、陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルとの差異が、前記少なくとも１つの試験化合物が、前記少なくとも１つの化学受容体のリガンドを構成し、そして前記少なくとも１つの化学受容体に結合してその活性をモジュレートすることができることを示すものとすることを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明の第二の態様は、リガンドおよび／または試験薬剤の存在下および非存在下における、化学受容体をコードする遺伝子の転写のレベルの比較に基づいて、その化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートすることができる薬剤を同定する方法に関する。
【００１０】
本発明の第三の態様は、少なくとも５個の外因性化学受容体遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。
【００１１】
本発明の第四の態様は、前記トランスジェニック非ヒト動物から抽出された単離された細胞（例えば、感覚細胞）および／または組織（例えば、嗅覚系に存在する組織）に関する。
【００１２】
本発明の第五および第六の態様は、前記トランスジェニック非ヒト動物を生産するための方法、および本発明の方法におけるその使用に関する。
【００１３】
本発明の第七の態様は、化学受容体に結合するリガンド、ならびにその化学受容体へのリガンドの結合をモジュレートする薬剤であって、本発明の方法によって同定され得る薬剤、ならびに前記リガンドおよび／または薬剤を含む組成物に関する。
【００１４】
本発明の第八の態様は、被験体における少なくとも１つの芳香および／または少なくとも１つの味の知覚をモジュレートするための方法であって、前記芳香および／または味の知覚に関与する少なくとも１つの化学受容体の少なくとも１つのリガンド、および／または、前記化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする少なくとも１つの薬剤の使用を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ＡＢ】ニューロン活性化後の嗅覚受容体の転写モデュレーション。（ａ）：用いたプロトコールの概略図。（ｂ）〜（ｆ）：アセトフェノン（ｂ）、ヘプタナール（ｃ）、テトラデカナール（ｄ）、リラール（ｅ）、イソ酪酸エチル（ｆ）およびバニリン酸（ｇ）による嗅覚刺激後の嗅覚受容体転写産物のレベル。各嗅覚受容体遺伝子について、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、嗅覚受容体遺伝子転写産物のレベルを評価し、曝露マウスにおいて得られた値と、対照マウスにおいて得られた値との間の比を示す。左側の領域に存在する嗅覚受容体は、試験した揮発性物質に応答することが以前に示されたものに対応する。右側の領域に存在するものは、前記化学物質に対して非応答性であることが以前に示された。各ドットは、１匹のマウスを表す。中央値は、黒色の水平バーとして示され、囲み枠は、２５パーセンタイルから７５パーセンタイルに及ぶ。灰色の水平領域は、有意にモジュレートされていないとみなした値に対応する。
【図１ＣＤ】図１ＡＢの説明に同じ。ヘプタナール（ｃ）、テトラデカナール（ｄ）による嗅覚刺激後の嗅覚受容体転写産物のレベル。
【図１ＥＦ】図１ＡＢの説明に同じ。リラール（ｅ）、イソ酪酸エチル（ｆ）による嗅覚刺激後の嗅覚受容体転写産物のレベル。
【図１Ｇ】図１ＡＢの説明に同じ。バニリン酸（ｇ）による嗅覚刺激後の嗅覚受容体転写産物のレベル。
【図２】インビトロにおけるイソ酪酸エチル曝露後の嗅覚受容体転写産物のモデュレーション。各嗅覚受容体遺伝子について、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、嗅覚受容体遺伝子転写産物レベルを評価し、曝露マウスにおいて得られた値と、対照マウスにおいて得られた値との間の比を示す。左側の領域に存在する嗅覚受容体は、試験した揮発性物質に応答することが以前に示されたものに対応する。右側の領域に存在するものは、前記化学物質に対して非応答性であることが以前に示された。
【図３Ａ】アセトフェノン曝露後の嗅覚受容体転写産物のダウンレギュレーションのトランスクリプトーム広範評価。１条件当たり３匹のマウスを曝露し、各マウスについて、ＯＲ遺伝子のライブラリーを配列決定した。黒色／灰色／白色の長方形は、対照マウスに存在するレベルと比べた、転写産物の減少のレベル（０．１＝９０％の減少（黒色）〜１＝０％の減少（白色））を示す。灰色のＯｌｆｒ名は、その産物がインビトロにおいてアセトフェノンに対して応答性であることが以前に示された受容体遺伝子を表す。ＥＮＳＥＭＢＬによれば、Ｏｌｆｒ３９１ｐｓ、Ｏｌｆｒ１０２５ｐｓおよびＯｌｆｒ１１７４ｐｓは偽遺伝子とみなされる。しかしながら、配列特徴に基づく本発明者ら独自の基準にしたがえば、Ｏｌｆｒ３９１ｐｓおよびＯｌｆｒ１０２５ｐｓは、本明細書において、潜在的に機能的なＯＲ遺伝子とみなされ、Ｏｌｆｒ１１７４ｐｓは疑わしいとみなされる。右パネル：５％アセトフェノン曝露後の選択したＯＲ遺伝子候補のＲＴ−ｑＰＣＲ。
【図３Ｂ】図３Ａの説明に同じ。
【図４】その転写産物がにおい物質曝露によってダウンレギュレートされるニューロンは、活性化ニューロンである。受容体転写産物特異的なインサイチューハイブリダイゼーションを実施し、続いて、活性依存性マーカーｐＳ６の免疫標識を実施した。アセトフェノンまたはイソ酪酸エチル曝露後のＯｌｆｒ９８３、Ｏｌｆｒ１７１およびＯｌｆｒ１４５とのＰＳ６共発現の定量。
【図５】アゴニスト刺激後に、ショウジョウバエＯＲ転写産物のレベルは減少している。（ａ）実施例６において記載されている本発明の方法のプロトコールの概略図。５％乳酸エチルまたは５％酢酸ゲラニルに５時間曝露した後にｑＰＣＲによって評価した、ハエの触覚由来のＯＲ６７ｃ（ｂ）およびＯＲ８２ａ（ｃ）ｍＲＮＡの量。各ドットは、１２匹または２５匹のハエを含有するバイアルのプールＲＮＡを表す。ｐ値：＊＊＊（ｐ＜０．００１）、試験ＯＲ遺伝子とすべての対照非応答性受容体遺伝子との間の両側マンホイットニーＵ検定。
【図６】ニューロン活性化後のＴＡＡＲ転写産物のモデュレーション。実施例７において記載されているように、β−フェニルエチルアミンによる４８時間の嗅覚刺激後に、嗅覚受容体遺伝子転写産物のレベルを評価した。各受容体遺伝子について、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、嗅覚受容体遺伝子転写産物のレベルを評価し、曝露マウスにおいて得られた値と、対照マウスにおいて得られた値との間の比を示す。「ＴＡＡＲ」は、β−フェニルエチルアミンに応答することが以前に示された嗅覚受容体遺伝子（トレースアミン受容体遺伝子）に対応し、「ｏｌｆｒ」は、前記化学物質に対して非応答性であることが以前に示された嗅覚受容体遺伝子に対応する。各ドットは、１匹のマウスを表す。中央値は、黒色の水平バーとして示され、囲み枠は、２５パーセンタイルから７５パーセンタイルに及ぶ。灰色の水平領域は、有意にモジュレートされていないとみなした値に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において定義される「化学受容体」（「化学感覚器」とも称される）は、化学応答を細胞応答に変換する感覚受容体である。より一般的には、化学受容体は、環境中の特定の化学刺激を検出する。脊椎動物において、化学受容体としては、におい受容体（ＯＲ）、トレースアミン受容体（ＴＡＡＲ）、鋤鼻受容体１型（Ｖ１Ｒ）、鋤鼻受容体２型（Ｖ２Ｒ）、ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）、一過性受容体電位（Ｔｒｐ）チャネル、グアニリルシクラーゼＤおよびＧ（ＧＣＤ／Ｇ）、味受容体１型（Ｔ１Ｒ）、味受容体２型（Ｔ２Ｒ）、内皮電位非依存性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）、多発性嚢胞腎疾患２様１（ＰＫＤ２Ｌ１）チャネルが挙げられる。昆虫において、化学受容体としては、イオンチャネル型７ＴＭ  ＯＲ、７ＴＭ  ＧＲおよびイオンチャネル型ＩＲが挙げられる（Ｋａｕｐｐ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１１：１８８−２００）。化学受容体としては、例えば、嗅覚系由来の嗅覚受容体、味覚系由来の味（または味覚）受容体、三叉神経系由来のＴｒｐチャネルが挙げられる。「化学受容体」という用語は、動物において天然に見られるものと同じアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに生物学的に活性な（すなわち、化学受容体として機能する）その任意の変異体を包含する。
【００１８】
本明細書において使用される化学受容体の「変異体」という用語は、天然に見られる化学受容体（例えば、ヒト化学受容体またはマウス化学受容体）のアミノ酸配列と高度な類似性または高度な同一性を有するポリペプチドであって、生物学的に活性な（すなわち、化学受容体として機能し、化学シグナルを細胞応答に変換する）ポリペプチドを包含する。特に、化学受容体の「変異体」という用語は、異なる種に見られるオルソログポリペプチドもしくはそのアイソフォーム、突然変異体または断片を含む（例えば、特定のアミノ酸配列によって定義される）参照ポリペプチドと実質的に相同なポリペプチドであって、１つ以上の欠失、挿入または置換のために参照ポリペプチドのものと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。実質的に相同とは、参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の変異体アミノ酸配列を意味する。「変異体」という用語はまた、化学受容体をコードする核酸配列に適用される。核酸配列に適用される場合、実質的に相同とは、参照核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の変異体核酸配列を意味する。２つのアミノ酸配列間または２つの核酸配列間の「同一性の割合」は、目視検査および／または数学的計算によって、あるいはより容易には配列分析に使用される公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８３）によって決定され得る。
【００１９】
本明細書において使用される「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）」（「７回膜貫通ドメイン受容体」、「７ＴＭ受容体」、「ヘプタヘリックス受容体」、「セルペンチン受容体」および「Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＬＲ）」としても公知である）は、細胞外において分子を感知し、細胞内においてシグナル伝達経路および最終的には細胞応答を活性化する受容体の大きなタンパク質ファミリーを示す。ＧＰＣＲは、酵母および動物を含む真核生物に見られる。これらの受容体に結合してそれを活性化するリガンドとしては、光感受性化合物、におい、フェロモン、ホルモンおよび神経伝達物質が挙げられ、低分子、ペプチド、大型タンパク質によってサイズが異なる。
【００２０】
本明細書において使用される「嗅覚受容体」という用語は、化学的  合図の検出に関与する嗅覚ニューロンの細胞膜において発現される受容体を示す。活性化嗅覚受容体は、脳に伝達される神経インパルスを最終的に生成するシグナル伝達カスケードにおける初期プレーヤーである。これらの受容体のほとんどは、ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーである。嗅覚受容体は、ヒトにおける約４００個の潜在的に機能的な遺伝子、およびマウスにおける約１２５０個の遺伝子からなる多重遺伝子ファミリーを形成する。一般に、哺乳動物において、嗅覚受容体は、におい受容体（ＯＲ）、鋤鼻受容体（Ｖ１ＲおよびＶ２Ｒ）、トレースアミン関連受容体（ＴＡＡＲ）、ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）および膜グアニルシクラーゼＧＣ−Ｄを含むいくつかの受容体ファミリーに分類される。
【００２１】
「嗅覚ニューロン」（ＯＳＮ）は、本明細書において、主嗅上皮（ＭＯＥ）、鋤鼻器官（ＶＮＯ）、中隔臓器（ＳＯ）およびグルーエネベルク神経節（ＧＧ）を含む、嗅覚系を構成する鼻腔区画に見られる高度に特殊な化学感覚細胞を示す。嗅覚ニューロンは、においおよびフェロモンの知覚を可能にする。
【００２２】
本明細書において使用される「味覚受容体」という用語は、Ｔ１Ｒ、Ｔ２Ｒ、ＥＮａＣ、ＰＫＤ２Ｌ１およびＧＲを含む。
【００２３】
「味覚細胞」または「味受容細胞」は、Ｔ１Ｒ、Ｔ２Ｒ、ＥＮａＣ、ＰＫＤ２Ｌ１またはＧＲなどの味覚受容体を発現する細胞を示す。
【００２４】
本明細書において使用される「リガンド」または「化学刺激」という用語は、化学受容体に結合し、前記化学受容体の機能をモジュレートし得る（活性化または阻害し得る）分子を指す。リガンドは、その同族化学受容体（例えば、ＧＰＣＲ）の下流シグナル伝達活性、および／または特定の場合には、嗅覚受容体の全体的な嗅覚応答をモジュレートし得ることになる。分子が化学受容体を活性化する場合、それは、前記受容体の「アゴニスト」として認められる。分子が、その同族化学受容体のアゴニストによる活性化を阻害する場合、前記分子は、前記受容体の「アンタゴニスト」として認められる。化学受容体のリガンドは、ペプチド、ポリペプチド（抗体またはその抗原結合断片を含む）、脂質、炭水化物、核酸、有機低分子または非有機低分子、例えば限定されないが、におい物質、芳香性化合物およびフェロモン、合成源または天然源由来の、例えば化学ライブラリーまたはペプチドライブラリー由来の分子を含む様々な化学構造の分子であり得る。嗅覚受容体の機能をモジュレートし得る化学刺激は、「嗅覚刺激」と称される。
【００２５】
本明細書において使用される「嗅覚刺激」または「におい物質」という用語は、細胞または組織内において発現されたインビボの嗅覚受容体またはインビトロの嗅覚受容体などの嗅覚受容体系と相互作用し得る揮発性または非揮発性で水溶性または非水溶性の任意の分子または分子群を含む。快適なにおい物質および不快なにおい物質の起源および固有性は、非常に多様である。嗅覚刺激は、アルカン、エステル、直鎖テルペン、環状テルペン、芳香族、アミン、アルコール、アルデヒド、ケトン、ラクトン、チオール、ガスなどの分子であり得る。嗅覚刺激の例としては、不快な体臭、例えば呼気（メタンチオール、硫化水素、硫化ジメチルなど）、足（プロパン酸、イソ吉草酸など）または脇（（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、（Ｓ）−３−メチル−３−スルファニルヘキサン−１−オール、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキセン酸、プロピオン酸、アンドロステロンなど）に感じられるものが挙げられる。
【００２６】
化学受容体の「アゴニスト」および「アンタゴニスト」という用語は、本明細書において、前記化学受容体の機能、したがって前記化学受容体に関係する下流シグナル伝達活性、および／または、例えば嗅覚受容体に結合するリガンドの場合には、前記嗅覚受容体に関係する全体的な嗅覚応答をモジュレートする（それぞれ活性化および阻害する）作用物質を指す。化学受容体のアゴニストおよびアンタゴニストは、その化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする（それぞれ増強および阻害する）ことによって作用し得る。前記アゴニストおよび前記アンタゴニストは、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、有機低分子または非有機低分子、例えば限定されないが、におい物質、芳香性化合物およびフェロモン、合成源または天然源由来の、例えば化学ライブラリーまたはペプチドライブラリー由来の分子を含む様々な性質のものであり得る。
【００２７】
本明細書において使用される「導入遺伝子」または「外因性遺伝子」という用語は、人間の介入によって、例えばマイクロインジェクション、電気ショックによって、または組換えウイルスによる感染によって、外来遺伝子を、例えば新たな受精卵、生殖細胞または初期胚に導入することによって、生物（「トランスジェニック生物」と称される）の細胞の１つ以上に配置される外来遺伝子を指す。したがって、トランスジェニック動物の細胞の１つ以上は、このトランスジェニック動物の遺伝物質の一部である少なくとも１個の外来遺伝子（導入遺伝子）を含む。導入遺伝子が動物の子孫に伝達され得るように、それをトランスジェニック動物の生殖系列に含めることが有利である。「外来遺伝子」という用語は、実験操作によって動物のゲノムに導入される任意の核酸（例えば、遺伝子配列）を指す。外来遺伝子は、一般に、前記導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物と異なる動物種由来の遺伝子（例えば、嗅覚受容体などの化学受容体）の遺伝子配列を包含し、例えば、外来遺伝子は、トランスジェニックマウスにおいて発現されるヒト嗅覚受容体遺伝子であり得る。導入遺伝子が、天然に存在する遺伝子と同じ位置に存在しない限り、外来遺伝子はまた、その動物に見られる遺伝子配列を含み得る。外来遺伝子はまた、天然に存在する遺伝子の変異体（例えば、多型または突然変異体）を包含すると定義される「自己遺伝子」であり得る。
【００２８】
化学受容体のリガンド、および／またはその化学受容体に対するリガンドの効果をモジュレートする薬剤を同定する方法
第一の態様において、本発明は、化学受容体を脱オーファン化する（すなわち、少なくとも１つの化学受容体の少なくとも１つのリガンドを同定し、それにより、少なくとも１つのリガンド／化学受容体ペアのメンバーの同定する）方法を提供する。
【００２９】
典型的には、その化学受容体に対するリガンドの結合は、前記化学受容体に関係する下流シグナリング活性、および／または嗅覚受容体に結合するリガンドの場合には、前記嗅覚受容体に関係する全体的な嗅覚応答を発生させる。
【００３０】
一つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのリガンドに対する少なくとも１つの化学受容体を同定する方法であって、
ａ）少なくとも１つの化学受容体を発現する細胞を含む生物学的サンプルを用意する工程であって、前記生物学的サンプルが（ｉ）少なくとも１つの試験化合物に曝露されたものであるか、または（ｉｉ）少なくとも１つの試験化合物に曝露された動物から得られたものである工程と、
ｂ）前記生物学的サンプルにおける化学受容体をコードする少なくとも１個の遺伝子の転写のレベルに比例するシグナルを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において決定したシグナルのレベルを、前記生物学的サンプルまたは前記動物が前記少なくとも１つの試験化合物に曝露されていない陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルと比較する工程と
を少なくとも含んでなり、
工程ｂ）において決定したシグナルのレベルと、陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルとの差異が、前記少なくとも１つの試験化合物が、前記少なくとも１つの化学受容体のリガンドを構成し、そして前記少なくとも１つの化学受容体に結合してその活性をモジュレートすることができることを示すものとすることを特徴とする方法を提供する。
【００３１】
本発明の方法の一つの実施形態によれば、少なくとも１つの試験化合物に曝露した後の生物学的サンプルにおける工程ｂ）において決定したシグナルのレベルが、試験化合物に曝露されていない陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルよりも低い場合、これは、前記少なくとも１つの試験化合物が、前記少なくとも１つの化学受容体のアゴニストとして作用するリガンドを構成することを示す。
【００３２】
本発明の方法の別の実施形態によれば、少なくとも１つの試験化合物に曝露した後の生物学的サンプルにおける工程ｂ）において決定したシグナルのレベルが、試験化合物に曝露されていない陰性対照を用いて同じ条件において決定したシグナルのレベルよりも高い場合、これは、前記少なくとも１つの試験化合物が、前記少なくとも１つの化学受容体のアンタゴニストとして作用するリガンドを構成することを示す。
【００３３】
本発明において、生物学的サンプルは、典型的には、単離された細胞または組織内の細胞を含み、前記細胞は、少なくとも１つの化学受容体を発現し、前記化学受容体をコードする遺伝子は、前記細胞中に天然に存在していたものであるか、または遺伝子工学によって前記細胞内に導入されたものであるか、または本明細書に記載の少なくとも１個の外因性化学受容体遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物から前記細胞が得られたことにより、前記細胞中に存在するものである。
【００３４】
本発明によれば、前記化学受容体は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）または非ＧＰＣＲタンパク質の中から選択される。
【００３５】
本発明の特定の実施形態において、前記化学受容体は、ＧＰＣＲタンパク質、より具体的には嗅覚受容体および味覚受容体からなる群より選択される受容体である。
【００３６】
本発明において有用な非ＧＰＣＲタンパク質としては、Ｔｒｐチャネル、ＧＣＤ／Ｇ、ＥＮａＣ、ＰＣＫＤチャネル、イオンチャネル型７ＴＭ  ＯＲ、７ＴＭ  ＧＲおよびイオンチャネル型ＩＲが挙げられる。
【００３７】
特定の実施形態において、前記化学受容体は、嗅覚受容体である。
【００３８】
ヒトにおい受容体の例としては、以下に列挙されているものが挙げられ、括弧内に示されている参照は、公開データベースにおいて利用可能なそれらのアミノ酸配列および核酸配列へのアクセスを提供する：
ＯＲ２Ｗ１  （ＥＮＳＧ０００００２２９３２８）、  ＯＲ３Ａ３  （ＥＮＳＧ０００００１５９９６１）、  ＯＲ５Ｐ３  （ＥＮＳＧ０００００１８２３３４）、  ＯＲ５ＡＮ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６４９５）、  ＯＲ１１Ｈ４  （ＥＮＳＧ０００００１７６１９８）、  ＯＲ１０Ａ３  （ＥＮＳＧ０００００１７０６８３）、  ＯＲ５２Ｉ２  （ＥＮＳＧ０００００２２６２８８）、  ＯＲ７Ａ５  （ＥＮＳＧ０００００１８８２６９）、  ＯＲ６Ｘ１  （ＥＮＳＧ０００００２２１９３１）、  ＯＲ５２Ｉ１  （ＥＮＳＧ０００００２３２２６８）、  ＯＲ４Ｌ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６２４６）、  ＯＲ５Ａ２  （ＥＮＳＧ０００００１７２３２４）、  ＯＲ５２Ｂ２  （ＥＮＳＧ０００００２５５３０７）、  ＯＲ４Ｋ１７  （ＥＮＳＧ０００００１７６２３０）、  ＯＲ８Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００２６２７９６）、  ＯＲ５Ｐ２  （ＥＮＳＧ０００００１８３３０３）、  ＯＲ５６Ｂ４  （ＥＮＳＧ０００００１８０９１９）、  ＯＲ５Ｔ３  （ＥＮＳＧ０００００２６１８９７）、  ＯＲ５１Ｄ１  （ＥＮＳＧ０００００１９７４２８）、  ＯＲ６Ｍ１  （ＥＮＳＧ０００００１９６０９９）、  ＯＲ２ＡＧ２  （ＥＮＳＧ０００００１８８１２４）、  ＯＲ８Ｋ１  （ＥＮＳＧ０００００２６３３２８）、  ＯＲ８Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２４８７）、  ＯＲ１０Ｋ１  （ＥＮＳＧ０００００１７３２８５）、  ＯＲ４Ｎ５  （ＥＮＳＧ０００００１８４３９４）、  ＯＲ９Ｇ４  （ＥＮＳＧ０００００２６２６４７）、  ＯＲ２Ｈ２  （ＥＮＳＧ０００００２２９６８０）、  ＯＲ４Ｃ１１  （ＥＮＳＧ０００００１７２１８８）、  ＯＲ１Ｊ４  （ＥＮＳＧ０００００２３９５９０）、  ＯＲ５Ｔ２  （ＥＮＳＧ０００００２６２８５１）、  ＯＲ４Ｃ４６  （ＥＮＳＧ０００００１８５９２６）、  ＯＲ１０Ｒ２  （ＥＮＳＧ０００００１９８９６５）、  ＯＲ１Ｎ１  （ＥＮＳＧ０００００１７１５０５）、  ＯＲ５Ｔ１  （ＥＮＳＧ０００００２６２７８４）、  ＡＣ２１３２２３．１  （ＥＮＳＧ０００００２６１９５８）、  ＯＲ１Ｎ２  （ＥＮＳＧ０００００１７１５０１）、  ＯＲ１Ｌ８  （ＥＮＳＧ０００００１７１４９６）、  ＯＲ４Ｍ２  （ＥＮＳＧ０００００１８２９７４）、  ＯＲ５Ｖ１  （ＥＮＳＧ０００００２３３０４６）、  ＯＲ１２Ｄ２  （ＥＮＳＧ０００００２３５９６６）、  ＯＲ２Ｗ１  （ＥＮＳＧ０００００２０４７０４）、  ＯＲ４Ｆ４  （ＥＮＳＧ０００００１７７６９３）、  ＯＲ６Ｃ７５  （ＥＮＳＧ０００００１８７８５７）、  ＯＲ１０Ｗ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２７７２）、  ＯＲ２Ｂ３  （ＥＮＳＧ０００００２０４７０３）、  ＯＲ２Ｄ３  （ＥＮＳＧ０００００１７８３５８）、  ＯＲ５１Ｌ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６７９８）、  ＯＲ８Ｕ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２１９９）、  ＯＲ８Ｈ２  （ＥＮＳＧ０００００１８１７６７）、  ＯＲ１Ｋ１  （ＥＮＳＧ０００００１６５２０４）、  ＯＲ７Ｃ２  （ＥＮＳＧ０００００１２７５２９）、  ＯＲ７Ｇ３  （ＥＮＳＧ０００００１７０９２０）、  ＯＲ２ＡＥ１  （ＥＮＳＧ０００００２４４６２３）、  ＯＲ４Ｐ４  （ＥＮＳＧ０００００１８１９２７）、  ＯＲ８Ｋ３  （ＥＮＳＧ０００００２６２７５５）、  ＯＲ��Ｓ２  （ＥＮＳＧ０００００１７４９８２）、  ＯＲ５２Ａ５  （ＥＮＳＧ０００００１７１９４４）、  ＯＲ２Ｙ１  （ＥＮＳＧ０００００１７４３３９）、  ＯＲ４Ｃ６  （ＥＮＳＧ０００００１８１９０３）、  ＯＲ２Ｖ１  （ＥＮＳＧ０００００１８５３７２）、  ＯＲ８Ｕ８  （ＥＮＳＧ０００００２６２３１５）、  ＯＲ２Ｖ２  （ＥＮＳＧ０００００１８２６１３）、  ＯＲ１Ｄ５  （ＥＮＳＧ０００００２６２６２８）、  ＯＲ２Ｊ３  （ＥＮＳＧ０００００２０４７０１）、  ＯＲ１Ｄ２  （ＥＮＳＧ０００００１８４１６６）、  ＯＲ８Ｋ３  （ＥＮＳＧ０００００１８１６８９）、  ＯＲ４Ｅ２  （ＥＮＳＧ０００００２２１９７７）、  ＯＲ５２Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００１８２０７０）、  ＯＲ７Ｄ２  （ＥＮＳＧ０００００１８８０００）、  ＯＲ１３Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００２５６５７４）、  ＯＲ２Ａ４２  （ＥＮＳＧ０００００２１２８０７）、  ＯＲ２Ａ７  （ＥＮＳＧ０００００２４３８９６）、  ＯＲ４Ａ４７  （ＥＮＳＧ０００００２３７３８８）、  ＯＲ５Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２３２０）、  ＯＲ２Ｊ２  （ＥＮＳＧ０００００２０４７００）、  ＯＲ８Ｂ２  （ＥＮＳＧ０００００２０４２９３）、  ＯＲ６Ｙ１  （ＥＮＳＧ０００００１９７５３２）、  ＯＲ６Ｐ１  （ＥＮＳＧ０００００１８６４４０）、  ＯＲ８Ｂ３  （ＥＮＳＧ０００００１９６６６１）、  ＯＲ１４Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００２３４１９５）、  ＯＲ１０Ａ６  （ＥＮＳＧ０００００１７５３９３）、  ＯＲ２Ｈ１  （ＥＮＳＧ０００００２０４６８８）、  ＯＲ２Ｗ１  （ＥＮＳＧ０００００２０６５２５）、  ＯＲ８Ｂ４  （ＥＮＳＧ０００００１９８６５７）、  ＯＲ８Ｂ８  （ＥＮＳＧ０００００１９７１２５）、  ＯＲ４Ｄ６  （ＥＮＳＧ０００００１６６８８４）、  ＯＲ８Ｈ３  （ＥＮＳＧ０００００１８１７６１）、  ＯＲ２ＡＧ１  （ＥＮＳＧ０００００１７０８０３）、  ＯＲ５６Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００１８０９３４）、  ＯＲ６Ａ２  （ＥＮＳＧ０００００１８４９３３）、  ＯＲ８Ｊ３  （ＥＮＳＧ０００００１６７８２２）、  ＯＲ８Ｄ４  （ＥＮＳＧ０００００１８１５１８）、  ＯＲ８Ｋ５  （ＥＮＳＧ０００００１８１７５２）、  ＯＲ２Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００２２１９７０）、  ＯＲ１Ｅ２  （ＥＮＳＧ０００００１２７７８０）、  ＯＲ４Ｄ５  （ＥＮＳＧ０００００１７１０１４）、  ＯＲ２Ｆ２  （ＥＮＳＧ０００００２２１９１０）、  ＯＲ２Ｂ３  （ＥＮＳＧ０００００２２５７３６）、  ＯＲ６Ｔ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１４９９）、  ＯＲ１０Ｓ１  （ＥＮＳＧ０００００１９６２４８）、  ＯＲ１０Ｇ４  （ＥＮＳＧ０００００２５４７３７）、  ＯＲ１０Ｇ９  （ＥＮＳＧ０００００２３６９８１）、  ＯＲ５２Ｊ３  （ＥＮＳＧ０００００２０５４９５）、  ＯＲ１０Ｇ８  （ＥＮＳＧ０００００２３４５６０）、  ＯＲ１０Ｇ７  （ＥＮＳＧ０００００１８２６３４）、  ＯＲ４Ｋ５  （ＥＮＳＧ０００００１７６２８１）、  ＯＲ１０Ｘ１  （ＥＮＳＧ０００００１８６４００）、  ＯＲ１０Ｚ１  （ＥＮＳＧ０００００１９８９６７）、  ＯＲ５ＡＰ２  （ＥＮＳＧ０００００１７２４６４）、  ＯＲ３Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００１８００９０）、  ＯＲ３Ａ２  （ＥＮＳＧ��００００２２１８８２）、  ＯＲ５２Ｅ２  （ＥＮＳＧ０００００１７６７８７）、  ＯＲ４Ｋ１  （ＥＮＳＧ０００００１５５２４９）、  ＯＲ２Ｂ１１  （ＥＮＳＧ０００００１７７５３５）、  ＯＲ５Ｋ２  （ＥＮＳＧ０００００２３１８６１）、  ＯＲ１０Ｃ１  （ＥＮＳＧ０００００２０４６８９）、  ＯＲ５ＡＲ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２４５９）、  ＯＲ５Ｒ１  （ＥＮＳＧ０００００１７４９４２）、  ＯＲ１０Ｊ５  （ＥＮＳＧ０００００１８４１５５）、  ＯＲ５１Ｂ６  （ＥＮＳＧ０００００１７６２３９）、  ＯＲ８Ｂ１２  （ＥＮＳＧ０００００１７０９５３）、  ＯＲ８Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００１９６１１９）、  ＯＲ８Ｋ１  （ＥＮＳＧ０００００１５０２６１）、  ＯＲ５２Ｄ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１６０９）、  ＯＲ１Ｉ１  （ＥＮＳＧ００００００９４６６１）、  ＯＲ２Ｂ３  （ＥＮＳＧ０００００２０６５２４）、  ＯＲ２Ｃ３  （ＥＮＳＧ０００００１９６２４２）、  ＯＲ１４Ａ２  （ＥＮＳＧ０００００２４１１２８）、  ＯＲ１３Ｇ１  （ＥＮＳＧ０００００１９７４３７）、  ＯＲ１０Ａ５  （ＥＮＳＧ０００００１６６３６３）、  ＯＲ６Ｂ２  （ＥＮＳＧ０００００１８２０８３）、  ＯＲ２Ｚ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１７３３）、  ＯＲ９Ａ２  （ＥＮＳＧ０００００１７９４６８）、  ＯＲ２Ｊ３  （ＥＮＳＧ０００００２０６５２２）、  ＯＲ５Ｍ９  （ＥＮＳＧ０００００１５０２６９）、  ＯＲ６Ｖ１  （ＥＮＳＧ０００００２２５７８１）、  ＯＲ１Ｇ１  （ＥＮＳＧ０００００１８３０２４）、  ＯＲ５１Ｂ５  （ＥＮＳＧ０００００２４２１８０）、  ＯＲ９Ｇ１  （ＥＮＳＧ０００００１７４９１４）、  ＯＲ１３Ｆ１  （ＥＮＳＧ０００００１８６８８１）、  ＯＲ５１Ｑ１  （ＥＮＳＧ０００００１６７３６０）、  ＯＲ１３Ｃ４  （ＥＮＳＧ０００００１４８１３６）、  ＯＲ１３Ｃ３  （ＥＮＳＧ０００００２０４２４６）、  ＯＲ６Ｂ３  （ＥＮＳＧ０００００１７８５８６）、  ＯＲ４Ｎ４  （ＥＮＳＧ０００００１８３７０６）、  ＯＲ１３Ｃ８  （ＥＮＳＧ０００００１８６９４３）、  ＯＲ５１Ｅ１  （ＥＮＳＧ０００００１８０７８５）、  ＯＲ６Ｃ６５  （ＥＮＳＧ０００００２０５３２８）、  ＯＲ４Ｆ３  （ＥＮＳＧ０００００２３０１７８）、  ＯＲ７Ａ１０  （ＥＮＳＧ０００００１２７５１５）、  ＯＲ５ＡＣ２  （ＥＮＳＧ０００００１９６５７８）、  ＯＲ５Ｈ１  （ＥＮＳＧ０００００２３１１９２）、  ＯＲ８Ｈ１  （ＥＮＳＧ０００００２６２６１１）、  ＯＲ５２Ｎ２  （ＥＮＳＧ０００００１８０９８８）、  ＯＲ５２Ｎ５  （ＥＮＳＧ０００００１８１００９）、  ＯＲ５２Ｋ２  （ＥＮＳＧ０００００１８１９６３）、  ＯＲ５Ｂ１７  （ＥＮＳＧ０００００１９７７８６）、  ＯＲ５Ｍ３  （ＥＮＳＧ０００００１７４９３７）、  ＯＲ１３Ｃ５  （ＥＮＳＧ０００００２７７５５６）、  ＯＲ１Ｆ１  （ＥＮＳＧ０００００１６８１２４）、  ＯＲ５２Ｗ１  （ＥＮＳＧ０００００１７５４８５）、  ＯＲ９Ｋ２  （ＥＮＳＧ０００００１７０６０５）、  ＯＲ５１Ｍ１  （ＥＮＳＧ０００００１８４６９８）、  ＯＲ５２Ｅ４  （ＥＮＳＧ０００００１８０９７４）、  ＯＲ５２Ｂ６  （ＥＮＳＧ０００００１８７７４７）、  ＯＲ５１Ｂ２  （���ＮＳＧ０００００１８４８８１）、  ＯＲ５２Ｅ８  （ＥＮＳＧ０００００１８３２６９）、  ＯＲ５２Ｅ６  （ＥＮＳＧ０００００２０５４０９）、  ＯＲ４Ｆ２１  （ＥＮＳＧ０００００１７６２６９）、  ＯＲ５２Ｎ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１００１）、  ＯＲ５６Ｂ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１０２３）、  ＯＲ２Ｆ１  （ＥＮＳＧ０００００２１３２１５）、  ＯＲ１２Ｄ３  （ＥＮＳＧ０００００１１２４６２）、  ＯＲ６Ｃ７６  （ＥＮＳＧ０００００１８５８２１）、  ＯＲ１０Ｃ１  （ＥＮＳＧ０００００２０６４７４）、  ＯＲ１２Ｄ２  （ＥＮＳＧ０００００１６８７８７）、  ＯＲ１０Ｇ２  （ＥＮＳＧ０００００２５５５８２）、  ＯＲ１１Ｈ１２  （ＥＮＳＧ０００００２５７１１５）、  ＯＲ５Ｖ１  （ＥＮＳＧ０００００２４３７２９）、  ＯＲ１１Ｇ２  （ＥＮＳＧ０００００１９６８３２）、  ＯＲ１１Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００２０４６９４）、  ＯＲ１Ｍ１  （ＥＮＳＧ０００００１７０９２９）、  ＯＲ５Ｈ１４  （ＥＮＳＧ０００００２３６０３２）、  ＯＲ５Ｊ２  （ＥＮＳＧ０００００１７４９５７）、  ＯＲ１Ｑ１  （ＥＮＳＧ０００００１６５２０２）、  ＯＲ１Ｂ１  （ＥＮＳＧ０００００１７１４８４）、  ＯＲ７Ｄ４  （ＥＮＳＧ０００００１７４６６７）、  ＯＲ１１Ｈ１  （ＥＮＳＧ０００００１３０５３８）、  ＯＲ１０Ｖ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２２８９）、  ＯＲ５２Ｎ４  （ＥＮＳＧ０００００１８１０７４）、  ＯＲ６Ｃ７０  （ＥＮＳＧ０００００１８４９５４）、  ＯＲ６Ｃ２  （ＥＮＳＧ０００００１７９６９５）、  ＯＲ１Ｅ１  （ＥＮＳＧ０００００１８００１６）、  ＯＲ２ＡＰ１  （ＥＮＳＧ０００００１７９６１５）、  ＯＲ６Ｃ６８  （ＥＮＳＧ０００００２０５３２７）、  ＯＲ６Ｃ４  （ＥＮＳＧ０００００１７９６２６）、  ＯＲ２Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００２２６９３１）、  ＯＲ５１Ａ７  （ＥＮＳＧ０００００１７６８９５）、  ＯＲ５１Ａ４  （ＥＮＳＧ０００００２０５４９７）、  ＯＲ９Ｇ４  （ＥＮＳＧ０００００１７２４５７）、  ＯＲ５１Ｆ１  （ＥＮＳＧ０００００１８８０６９）、
ＯＲ４Ｂ１  （ＥＮＳＧ０００００１７５６１９）、  ＯＲ５１Ｇ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６８７９）、  ＯＲ５１Ｇ２  （ＥＮＳＧ０００００１７６８９３）、  ＯＲ２Ｈ２  （ＥＮＳＧ０００００２０４６５７）、  ＯＲ７Ａ１７  （ＥＮＳＧ０００００１８５３８５）、  ＯＲ１０Ａ７  （ＥＮＳＧ０００００１７９９１９）、  ＯＲ２Ｈ２  （ＥＮＳＧ０００００２０６５１２）、  ＯＲ１１Ｈ６  （ＥＮＳＧ０００００１７６２１９）、  ＯＲ６Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００２５５８０４）、  ＯＲ４Ｃ１３  （ＥＮＳＧ０００００２５８８１７）、  ＯＲ５ＡＵ１  （ＥＮＳＧ０００００１６９３２７）、  ＯＲ４Ｃ１２  （ＥＮＳＧ０００００２２１９５４）、  ＯＲ２Ｊ２  （ＥＮＳＧ０００００１９６２３１）、  ＯＲ５１Ｆ２  （ＥＮＳＧ０００００１７６９２５）、  ＯＲ１Ｌ１  （ＥＮＳＧ０００００１７３６７９）、  ＯＲ１Ｌ３  （ＥＮＳＧ０００００１７１４８１）、  ＯＲ５１Ｓ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６９２２）、  ＯＲ５１Ａ２  （ＥＮＳＧ０００００２０５４９６）、  ＯＲ５２Ｒ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６９３７）、  ＯＲ８Ｓ１  （ＥＮＳＧ０００００１９７３７６）、  ＯＲ６Ｑ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２３８１）、  ＯＲ９Ｉ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２３７７）、  ＯＲ１４Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００２３７７７７）、  ＯＲ５１Ｈ１Ｐ  （ＥＮＳＧ０００００１７６９０４）、  ＯＲ１４Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００２３４１００）、  ＯＲ４Ｄ１０  （ＥＮＳＧ０００００２５４４６６）、  ＯＲ９Ｑ１  （ＥＮＳＧ０００００１８６５０９）、  ＯＲ５１Ｔ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６９００）、  ＯＲ９Ａ４  （ＥＮＳＧ０００００２５８０８３）、  ＯＲ４Ｍ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６２９９）、  ＯＲ４Ｎ２  （ＥＮＳＧ０００００１７６２９４）、  ＯＲ４Ｑ３  （ＥＮＳＧ０００００１８２６５２）、  ＯＲ５１Ｅ２  （ＥＮＳＧ０００００１６７３３２）、  ＯＲ４Ａ１６  （ＥＮＳＧ０００００１８１９６１）、  ＯＲ５１Ｉ２  （ＥＮＳＧ０００００１８７９１８）、  ＯＲ４Ａ１５  （ＥＮＳＧ０００００１８１９５８）、  ＯＲ５２Ｈ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１６１６）、  ＯＲ５１Ｉ１  （ＥＮＳＧ０００００１６７３５９）、  ＯＲ７Ｅ２４  （ＥＮＳＧ０００００２３７５２１）、  ＯＲ５１Ｖ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６７４２）、  ＯＲ１３Ｃ２  （ＥＮＳＧ０００００２７６１１９）、  ＯＲ１０Ａ２  （ＥＮＳＧ０００００１７０７９０）、  ＯＲ２Ｊ３  （ＥＮＳＧ０００００２２９８６６）、  ＯＲ６Ｃ７４  （ＥＮＳＧ０００００１９７７０６）、  ＯＲ１０Ａ４  （ＥＮＳＧ０００００１７０７８２）、  ＯＲ９Ｑ２  （ＥＮＳＧ０００００１８６５１３）、  ＯＲ１３Ｃ９  （ＥＮＳＧ０００００１３６８３９）、  ＯＲ５２Ｋ１  （ＥＮＳＧ０００００１９６７７８）、  ＯＲ４Ｄ１１  （ＥＮＳＧ０００００１７６２００）、  ＯＲ１Ｓ２  （ＥＮＳＧ０００００１９７８８７）、  ＯＲ４Ｄ１  （ＥＮＳＧ０００００１４１１９４）、  ＯＲ５Ｂ３  （ＥＮＳＧ０００００１７２７６９）、  ＯＲ５Ｗ２  （ＥＮＳＧ０００００１８７６１２）、  ＯＲ６Ｂ１  （ＥＮＳＧ０００００２２１８１３）、  ＯＲ５Ｉ１  （ＥＮＳＧ０００００１６���８２５）、  ＯＲ２Ｄ２  （ＥＮＳＧ０００００１６６３６８）、  ＯＲ１Ｓ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２７７４）、  ＯＲ４Ｄ２  （ＥＮＳＧ０００００２５５７１３）、  ＯＲ４Ｋ１５  （ＥＮＳＧ０００００１６９４８８）、  ＯＲ２Ｋ２  （ＥＮＳＧ０００００１７１１３３）、  ＯＲ２Ａ５  （ＥＮＳＧ０００００２２１８３６）、  ＯＲ７Ｇ２  （ＥＮＳＧ０００００１７０９２３）、  ＯＲ６Ｋ２  （ＥＮＳＧ０００００１９６１７１）、  ＯＲ２Ｓ２  （ＥＮＳＧ０００００１２２７１８）、  ＯＲ４Ｄ９  （ＥＮＳＧ０００００１７２７４２）、  ＯＲ５Ｄ１３  （ＥＮＳＧ０００００１９８８７７）、  ＯＲ５Ｈ１５  （ＥＮＳＧ０００００２３３４１２）、  ＯＲ５２Ｂ４  （ＥＮＳＧ０００００２２１９９６）、  ＯＲ７Ｇ１  （ＥＮＳＧ０００００１６１８０７）、  ＯＲ１０Ｃ１  （ＥＮＳＧ０００００２２９４１２）、  ＯＲ１Ｌ４  （ＥＮＳＧ０００００１３６９３９）、  ＯＲ１２Ｄ３  （ＥＮＳＧ０００００２４２０２２）、  ＯＲ１０ＡＧ１  （ＥＮＳＧ０００００１７４９７０）、  ＯＲ２Ａ２５  （ＥＮＳＧ０００００２２１９３３）、  ＯＲ５Ｂ２  （ＥＮＳＧ０００００１７２３６５）、  ＯＲ２Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００２０４７０２）、  ＯＲ５Ｋ３  （ＥＮＳＧ０００００２０６５３６）、  ＯＲ６Ｋ３  （ＥＮＳＧ０００００２０３７５７）、  ＯＲ４Ｋ１４  （ＥＮＳＧ０００００１６９４８４）、  ＯＲ５Ｈ６  （ＥＮＳＧ０００００２３０３０１）、  ＯＲ１０Ｔ２  （ＥＮＳＧ０００００１８６３０６）、  ＯＲ１０Ｋ２  （ＥＮＳＧ０００００１８０７０８）、  ＯＲ２ＡＴ４  （ＥＮＳＧ０００００１７１５６１）、  ＯＲ４Ｘ２  （ＥＮＳＧ０００００１７２２０８）、  ＯＲ５Ｋ４  （ＥＮＳＧ０００００１９６０９８）、  ＯＲ５Ｈ２  （ＥＮＳＧ０００００１９７９３８）、  ＯＲ５Ｄ１４  （ＥＮＳＧ０００００１８６１１３）、  ＯＲ５２Ｍ１  （ＥＮＳＧ０００００１９７７９０）、  ＯＲ１２Ｄ２  （ＥＮＳＧ０００００２３３４８１）、  ＯＲ６Ｋ６  （ＥＮＳＧ０００００１８０４３３）、  ＯＲ１０Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００１９６１８４）、  ＯＲ４Ｋ１３  （ＥＮＳＧ０００００１７６２５３）、  ＯＲ１３Ｄ１  （ＥＮＳＧ０００００１７９０５５）、  ＯＲ５Ｄ１８  （ＥＮＳＧ０００００１８６１１９）、  ＯＲ４Ｘ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６５６７）、  ＯＲ４Ｓ１  （ＥＮＳＧ０００００１７６５５５）、  ＯＲ４Ｃ３  （ＥＮＳＧ０００００１７６５４７）、  ＯＲ４Ｃ５  （ＥＮＳＧ０００００１７６５４０）、  ＯＲ６Ｃ６  （ＥＮＳＧ０００００１８８３２４）、  ＯＲ１Ｊ１  （ＥＮＳＧ０００００１３６８３４）、  ＯＲ４Ｋ２  （ＥＮＳＧ０００００１６５７６２）、  ＯＲ１Ａ２  （ＥＮＳＧ０００００１７２１５０）、  ＯＲ４Ｆ２９  （ＥＮＳＧ０００００２７８５６６）、  ＯＲ２Ｂ２  （ＥＮＳＧ０００００１６８１３１）、  ＯＲ６Ｃ１  （ＥＮＳＧ０００００２０５３３０）、  ＯＲ２Ａ１２  （ＥＮＳＧ０００００２２１８５８）、  ＯＲ２Ａ４  （ＥＮＳＧ０００００１８０６５８）、  ＯＲ６Ｃ３  （ＥＮＳＧ０００００２０５３２９）、  ＯＲ５Ｆ１  （ＥＮＳＧ０００００１４９１３３）、  ＯＲ１Ｌ６  （ＥＮＳＧ０００００１７１４５９）、  ＯＲ５ＡＳ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１７８５）、  ＯＲ５Ｌ２  （ＥＮＳＧ０００００２０５０３０）、  ＯＲ５Ｄ１６  （ＥＮＳＧ０００００２０５０２９）、  ＯＲ５Ｃ１  （ＥＮＳＧ０００００１４８２１５）、  ＯＲ５６Ａ３  （ＥＮＳＧ０００００１８４４７８）、  ＯＲ１Ａ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２１４６）、  ＯＲ１３Ｈ１  （ＥＮＳＧ０００００１７１０５４）、  ＯＲ２Ｊ２  （ＥＮＳＧ０００００２３１６７６）、  ＯＲ５２Ｌ１  （ＥＮＳＧ０００００１８３３１３）、  ＯＲ４Ｆ１７  （ＥＮＳＧ０００００１７６６９５）、  ＯＲ２Ａ２  （ＥＮＳＧ０００００２２１９８９）、  ＯＲ５Ｂ１２  （ＥＮＳＧ０００００１７２３６２）、  ＯＲ６Ｓ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１８０３）、  ＯＲ５６Ａ４  （ＥＮＳＧ０００００１８３３８９）、  ＯＲ５Ｔ２  （ＥＮＳＧ０００００１８１７１８）、  ＯＲ５Ｔ３  （ＥＮＳＧ０００００１７２４８９）、  ＯＲ５Ｍ１１  （ＥＮＳＧ０００００２５５２２３）、  ＯＲ１０ＡＤ１  （ＥＮＳＧ０００００１７２６４０）、  ＯＲ４Ｆ１６  （ＥＮＳＧ０００００２７３５４７）、  ＯＲ６Ｆ１  （ＥＮＳＧ０００００１６９２１４）、  ＯＲ１０Ｄ３  （ＥＮＳＧ０００００１９７３０９）、  ＯＲ５Ｔ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１６９８）、  ＯＲ５Ｍ１０  （ＥＮＳＧ０００００２５４８３４）、  ＯＲ１Ｃ１  （ＥＮＳＧ０００００２２１８８８）、  ＯＲ１４Ａ１６  （ＥＮＳＧ０００００１９６７７２）、  ＯＲ１１Ｌ１  （ＥＮＳＧ０００００１９７５９１）、  ＯＲ８Ｈ１  （ＥＮＳＧ０００００１８１６９３）、  ＯＲ２Ｃ１  （ＥＮＳＧ０００００１６８１５８）、  ＯＲ８Ｉ２  （ＥＮＳＧ０００００１７２１５４）、  ＯＲ２Ｗ３  （ＥＮＳＧ０００００２３８２４３）、  ＯＲ２Ｔ８  （ＥＮＳＧ０００００１７７４６２）、  ＯＲ２ＡＪ１  （ＥＮＳＧ０００００１７７２７５）、  ＯＲ４Ｆ１５  （ＥＮＳＧ０００００１８２８５４）、  ＯＲ４Ｆ６  （ＥＮＳＧ０００００１８４１４０）、  ＯＲ８Ｄ１  （ＥＮＳＧ０００００１９６３４１）、  ＯＲ８Ｄ２  （ＥＮＳＧ０００００１９７２６３）、  ＯＲ２Ｌ３  （ＥＮＳＧ０００００１９８１２８）、  ＯＲ１０Ｐ１  （ＥＮＳＧ０００００１７５３９８）、  ＯＲ２Ｌ１３  （ＥＮＳＧ０００００１９６０７１）、  ＯＲ２Ｌ５  （ＥＮＳＧ０００００１９７４５４）、  ＯＲ２ＡＫ２  （ＥＮＳＧ０００００１８７０８０）、  ＯＲ２Ｌ８  （ＥＮＳＧ０００００１９６９３６）、  ＯＲ１Ｊ２  （ＥＮＳＧ０００００１９７２３３）、  ＯＲ２Ｌ２  （ＥＮＳＧ０００００２０３６６３）、  ＯＲ２Ｍ５  （ＥＮＳＧ０００００１６２７２７）、  ＯＲ２Ｍ２  （ＥＮＳＧ０００００１９８６０１）、  ＯＲ２Ｍ３  （ＥＮＳＧ０００００２２８１９８）、  ＯＲ２Ｍ４  （ＥＮＳＧ０００００１７１１８０）、  ＯＲ２Ｔ３３  （ＥＮＳＧ０００００１７７２１２）、  ＯＲ１０Ｇ３  （ＥＮＳＧ０００００１６９２０８）、  ＯＲ５Ｍ１  （ＥＮＳＧ０００００２５５０１２）、  ＯＲ２Ａ１４  （ＥＮＳＧ０００００２２１９３８）、  ＯＲ５Ｂ２１  （ＥＮＳＧ０００００１９８２８３）、  ＯＲ２Ｔ１２  （ＥＮＳＧ０００００１７７２０１）、  ＯＲ４Ｆ５  （ＥＮＳＧ０００００１８６０９２��、  ＯＲ２Ｍ７  （ＥＮＳＧ０００００１７７１８６）、  ＯＲ１４Ｃ３６  （ＥＮＳＧ０００００１７７１７４）、  ＯＲ６Ｎ２  （ＥＮＳＧ０００００１８８３４０）、  ＯＲ５Ｋ１  （ＥＮＳＧ０００００２３２３８２）、  ＯＲ２Ｔ４  （ＥＮＳＧ０００００１９６９４４）、  ＯＲ２Ｔ６  （ＥＮＳＧ０００００１９８１０４）、  ＯＲ２Ｔ１  （ＥＮＳＧ０００００１７５１４３）、  ＯＲ２Ｔ７  （ＥＮＳＧ０００００２２７１５２）、  ＯＲ２Ｔ２  （ＥＮＳＧ０００００１９６２４０）、  ＯＲ２Ｂ６  （ＥＮＳＧ０００００１２４６５７）、  ＯＲ７Ｃ１  （ＥＮＳＧ０００００１２７５３０）、  ＯＲ２Ｔ３  （ＥＮＳＧ０００００１９６５３９）、  ＯＲ２Ｔ５  （ＥＮＳＧ０００００２０３６６１）、  ＯＲ２Ｇ６  （ＥＮＳＧ０００００１８８５５８）、  ＯＲ２Ｔ２９  （ＥＮＳＧ０００００１８２７８３）、  ＯＲ２Ｔ３４  （ＥＮＳＧ０００００１８３３１０）、  ＯＲ２Ｔ１０  （ＥＮＳＧ０００００１８４０２２）、  ＯＲ２Ｔ３５  （ＥＮＳＧ０００００１７７１５１）、  ＯＲ２Ｔ２７  （ＥＮＳＧ０００００１８７７０１）、  ＯＲ１４Ｉ１  （ＥＮＳＧ０００００１８９１８１）、  ＯＲ４Ｃ１５  （ＥＮＳＧ０００００１８１９３９）、  ＯＲ４Ｃ１６  （ＥＮＳＧ０００００１８１９３５）。
【００３９】
上記ＯＲの配列は、ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇまたはｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ（ＧＲＣｈ３８（ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５）アセンブリ）ウェブサイトから検索され得る。
【００４０】
特定の実施形態において、前記嗅覚受容体は、ヒトにおい受容体、特に以下のものからなる群より選択されるヒトにおい受容体である：
ＯＲ１０Ａ２、  ＯＲ１３Ｃ８、  ＯＲ２ＡＧ２、  ＯＲ２Ｔ８、  ＯＲ４Ｍ２、  ＯＲ５２Ｌ１、         ＯＲ５Ｍ３、  ＯＲ７Ｇ２、  ＯＲ１０Ａ３、  ＯＲ１３Ｃ９、  ＯＲ２ＡＪ１、  ＯＲ２Ｖ１、  ＯＲ４Ｎ２、  ＯＲ５２Ｍ１、  ＯＲ５Ｍ８、  ＯＲ７Ｇ３、  ＯＲ１０Ａ４、  ＯＲ１３Ｄ１、  ＯＲ２ＡＫ２、  ＯＲ２Ｖ２、  ＯＲ４Ｎ４、  ＯＲ５２Ｎ１、  ＯＲ５Ｍ９、  ＯＲ８Ａ１、  ＯＲ１０Ａ５、  ＯＲ１３Ｆ１、  ＯＲ２ＡＰ１、  ＯＲ２Ｗ１、  ＯＲ４Ｎ５、  ＯＲ５２Ｎ２、  ＯＲ５Ｐ２、  ＯＲ８Ｂ１２、  ＯＲ１０Ａ６、  ＯＲ１３Ｇ１、  ＯＲ２ＡＴ４、  ＯＲ２Ｗ３、  ＯＲ４Ｐ４、  ＯＲ５２Ｎ４、  ＯＲ５Ｐ３、  ＯＲ８Ｂ２、  ＯＲ１０Ａ７、  ＯＲ１３Ｈ１、  ＯＲ２Ｂ１１、  ＯＲ２Ｙ１、  ＯＲ４Ｑ３、  ＯＲ５２Ｎ５、  ＯＲ５Ｒ１、  ＯＲ８Ｂ３、  ＯＲ１０ＡＤ１、  ＯＲ１３Ｊ１、  ＯＲ２Ｂ２、  ＯＲ２Ｚ１、  ＯＲ４Ｓ１、  ＯＲ５２Ｒ１、  ＯＲ５Ｔ１、  ＯＲ８Ｂ４、  ＯＲ１０ＡＧ１、  ＯＲ１４Ａ１６、  ＯＲ２Ｂ３、  ＯＲ３Ａ１、  ＯＲ４Ｓ２、  ＯＲ５２Ｗ１、  ＯＲ５Ｔ２、  ＯＲ８Ｂ８、  ＯＲ１０Ｃ１、  ＯＲ１４Ａ２、  ＯＲ２Ｂ６、  ＯＲ３Ａ２、  ＯＲ４Ｘ１、  ＯＲ５６Ａ１、  ＯＲ５Ｔ３、  ＯＲ８Ｄ１、  ＯＲ１０Ｄ３、  ＯＲ１４Ｃ３６、  ＯＲ２Ｃ１、  ＯＲ３Ａ３、  ＯＲ４Ｘ２、  ＯＲ５６Ａ３、  ＯＲ５Ｖ１、  ＯＲ８Ｄ２、  ＯＲ１０Ｇ２、  ＯＲ１４Ｉ１、  ＯＲ２Ｃ３、  ＯＲ４Ａ１５、  ＯＲ５１Ａ２、  ＯＲ５６Ａ４、  ＯＲ５Ｗ２、  ＯＲ８Ｄ４、  ＯＲ１０Ｇ３、  ＯＲ１４Ｊ１、  ＯＲ２Ｄ２、  ＯＲ４Ａ１６、  ＯＲ５１Ａ４、  ＯＲ５６Ｂ１、  ＯＲ６Ａ２、  ＯＲ８Ｇ１、  ＯＲ１０Ｇ４、  ＯＲ１４Ｋ１、  ＯＲ２Ｄ３、  ＯＲ４Ａ４７、  ＯＲ５１Ａ７、  ＯＲ５６Ｂ３Ｐ、  ＯＲ６Ｂ１、  ＯＲ８Ｇ５、  ＯＲ１０Ｇ６、  ＯＲ１Ａ１、  ＯＲ２Ｆ１、  ＯＲ４Ａ５、  ＯＲ５１Ｂ２、  ＯＲ５６Ｂ４、  ＯＲ６Ｂ２、  ＯＲ８Ｈ１、  ＯＲ１０Ｇ７、  ＯＲ１Ａ２、  ＯＲ２Ｆ２、  ＯＲ４Ｂ１、  ＯＲ５１Ｂ４、  ＯＲ５Ａ１、  ＯＲ６Ｂ３、  ＯＲ８Ｈ２、  ＯＲ１０Ｇ８、  ＯＲ１Ｂ１、  ＯＲ２Ｇ２、  ＯＲ４Ｃ１１、  ＯＲ５１Ｂ５、  ＯＲ５Ａ２、  ＯＲ６Ｃ１、  ＯＲ８Ｈ３、  ＯＲ１０Ｇ９、  ＯＲ１Ｃ１、  ＯＲ２Ｇ３、  ＯＲ４Ｃ１２、  ＯＲ５１Ｂ６、  ＯＲ５ＡＣ２、  ＯＲ６Ｃ２、  ＯＲ８Ｉ２、  ＯＲ１０Ｈ１、  ＯＲ１Ｄ２、  ＯＲ２Ｇ６、  ＯＲ４Ｃ１３、  ＯＲ５１Ｄ１、  ＯＲ５ＡＫ２、  ＯＲ６Ｃ３、  ＯＲ８Ｊ１、  ＯＲ１０Ｈ２、  ＯＲ１Ｄ５、  ＯＲ２Ｈ１、  ＯＲ４Ｃ１５、  ＯＲ５１Ｅ１、  ＯＲ５ＡＮ１、  ＯＲ６Ｃ４、  ＯＲ８Ｊ３、  ＯＲ１０Ｈ３、  ＯＲ１Ｅ１、  ＯＲ２Ｈ２、  ＯＲ４Ｃ１６、  ＯＲ５１Ｅ２、  ＯＲ５ＡＰ２、  ＯＲ６Ｃ６、  ＯＲ８Ｋ１、  ＯＲ１０Ｈ４、  ＯＲ１Ｅ２、  ＯＲ２Ｊ１、  ＯＲ４Ｃ３、  ＯＲ５１Ｆ１、  ＯＲ５ＡＲ１、  ＯＲ６Ｃ６５、  ＯＲ８Ｋ３、  ＯＲ１０Ｈ５、  ＯＲ１Ｆ１、  ＯＲ２Ｊ２、  ＯＲ４Ｃ４６、  ＯＲ５１Ｆ２、  ＯＲ５ＡＳ１、  ＯＲ６Ｃ６８、  ＯＲ８Ｋ５、  ＯＲ１０Ｊ１、  ＯＲ１Ｇ１、  ＯＲ２Ｊ３、  ＯＲ４Ｃ５、  ＯＲ５１Ｇ１、  ＯＲ５ＡＵ１、  ＯＲ６Ｃ７０、  ＯＲ８Ｓ１、  ＯＲ１０Ｊ３、  ＯＲ１Ｉ１、  ＯＲ２Ｋ２、  ＯＲ４Ｃ６、  ＯＲ５１Ｇ２、  ＯＲ５Ｂ１２��  ＯＲ６Ｃ７４、  ＯＲ８Ｕ１、  ＯＲ１０Ｊ５、  ＯＲ１Ｊ１、  ＯＲ２Ｌ１３、  ＯＲ４Ｄ１、  ＯＲ５１Ｈ１Ｐ、  ＯＲ５Ｂ１７、  ＯＲ６Ｃ７５、  ＯＲ８Ｕ９、  ＯＲ１０Ｋ１、  ＯＲ１Ｊ２、  ＯＲ２Ｌ２、  ＯＲ４Ｄ１０、  ＯＲ５１Ｉ１、  ＯＲ５Ｂ２、  ＯＲ６Ｃ７６、  ＯＲ９Ａ２、  ＯＲ１０Ｋ２、  ＯＲ１Ｊ４、  ＯＲ２Ｌ３、  ＯＲ４Ｄ１１、  ＯＲ５１Ｉ２、  ＯＲ５Ｂ２１、  ＯＲ６Ｆ１、  ＯＲ９Ａ４、  ＯＲ１０Ｐ１、  ＯＲ１Ｋ１、  ＯＲ２Ｌ５、  ＯＲ４Ｄ２、  ＯＲ５１Ｌ１、  ＯＲ５Ｂ３、  ＯＲ６Ｊ１、  ＯＲ９Ｇ１、  ＯＲ１０Ｑ１、  ＯＲ１Ｌ１、  ＯＲ２Ｌ８、  ＯＲ４Ｄ５、  ＯＲ５１Ｍ１、  ＯＲ５Ｃ１、  ＯＲ６Ｋ２、  ＯＲ９Ｇ４、  ＯＲ１０Ｒ２、  ＯＲ１Ｌ３、  ＯＲ２Ｍ２、  ＯＲ４Ｄ６、  ＯＲ５１Ｑ１、  ＯＲ５Ｄ１３、  ＯＲ６Ｋ３、  ＯＲ９Ｇ９、  ＯＲ１０Ｓ１、  ＯＲ１Ｌ４、  ＯＲ２Ｍ３、  ＯＲ４Ｄ９、  ＯＲ５１Ｓ１、  ＯＲ５Ｄ１４、  ＯＲ６Ｋ６、  ＯＲ９Ｉ１、  ＯＲ１０Ｔ２、  ＯＲ１Ｌ６、  ＯＲ２Ｍ４、  ＯＲ４Ｅ２、  ＯＲ５１Ｔ１、  ＯＲ５Ｄ１６、  ＯＲ６Ｍ１、ＯＲ９Ｋ２、  ＯＲ１０Ｖ１、  ＯＲ１Ｌ８、  ＯＲ２Ｍ５、  ＯＲ４Ｆ１５、  ＯＲ５１Ｖ１、  ＯＲ５Ｄ１８、  ＯＲ６Ｎ１、  ＯＲ９Ｑ１、  ＯＲ１０Ｗ１、  ＯＲ１Ｍ１、  ＯＲ２Ｍ７、  ＯＲ４Ｆ１６、  ＯＲ５２Ａ１、  ＯＲ５Ｆ１、  ＯＲ６Ｎ２、  ＯＲ９Ｑ２、  ＯＲ１０Ｘ１、  ＯＲ１Ｎ１、  ＯＲ２Ｓ２、  ＯＲ４Ｆ１７、  ＯＲ５２Ａ５、  ＯＲ５Ｈ１、  ＯＲ６Ｐ１、  ＯＲ１０Ｚ１、  ＯＲ１Ｎ２、  ＯＲ２Ｔ１、  ＯＲ４Ｆ２１、  ＯＲ５２Ｂ１Ｐ、  ＯＲ５Ｈ１４、  ＯＲ６Ｑ１、  ＯＲ１１Ａ１、  ＯＲ１Ｑ１、  ＯＲ２Ｔ１０、  ＯＲ４Ｆ２９、  ＯＲ５２Ｂ２、  ＯＲ５Ｈ１５、  ＯＲ６Ｓ１、  ＯＲ１１Ｇ２、              ＯＲ１Ｓ１、  ＯＲ２Ｔ１１、  ＯＲ４Ｆ３、  ＯＲ５２Ｂ４、  ＯＲ５Ｈ２、  ＯＲ６Ｔ１、  ＯＲ１１Ｈ１、  ＯＲ１Ｓ２、  ＯＲ２Ｔ１２、  ＯＲ４Ｆ４、  ＯＲ５２Ｂ６、  ＯＲ５Ｈ６、  ＯＲ６Ｖ１、  ＯＲ１１Ｈ１２、  ＯＲ２Ａ１、  ＯＲ２Ｔ２、  ＯＲ４Ｆ５、  ＯＲ５２Ｄ１、  ＯＲ５Ｉ１、  ＯＲ６Ｘ１、  ＯＲ１１Ｈ４、  ＯＲ２Ａ１２、  ＯＲ２Ｔ２７、  ＯＲ４Ｆ６、  ＯＲ５２Ｅ２、  ＯＲ５Ｊ２、  ＯＲ６Ｙ１、  ＯＲ１１Ｈ６、  ＯＲ２Ａ１４、  ＯＲ２Ｔ２９、  ＯＲ４Ｋ１、  ＯＲ５２Ｅ４、  ＯＲ５Ｋ１、  ＯＲ７Ａ１０、  ＯＲ１１Ｌ１、  ＯＲ２Ａ２、  ＯＲ２Ｔ３、  ＯＲ４Ｋ１３、  ＯＲ５２Ｅ６、  ＯＲ５Ｋ２、  ＯＲ７Ａ１７、  ＯＲ１２Ｄ２、  ＯＲ２Ａ２５、  ＯＲ２Ｔ３３、  ＯＲ４Ｋ１４、  ＯＲ５２Ｅ８、  ＯＲ５Ｋ３、  ＯＲ７Ａ５、  ＯＲ１２Ｄ３、  ＯＲ２Ａ４、  ＯＲ２Ｔ３４、  ＯＲ４Ｋ１５、  ＯＲ５２Ｈ１、  ＯＲ５Ｋ４、  ＯＲ７Ｃ１、  ＯＲ１３Ａ１、  ＯＲ２Ａ４２、  ＯＲ２Ｔ３５、  ＯＲ４Ｋ１７、  ＯＲ５２Ｉ１、  ＯＲ５Ｌ１、  ＯＲ７Ｃ２、  ＯＲ１３Ｃ２、  ＯＲ２Ａ５、  ＯＲ２Ｔ４、  ＯＲ４Ｋ２、  ＯＲ５２Ｉ２、  ＯＲ５Ｌ２、  ＯＲ７Ｄ２、  ＯＲ１３Ｃ３、  ＯＲ２Ａ７、  ＯＲ２Ｔ５、  ＯＲ４Ｋ５、  ＯＲ５２Ｊ３、  ＯＲ５Ｍ１、  ＯＲ７Ｄ４、  ＯＲ１３Ｃ４、  ＯＲ２ＡＥ１、  ＯＲ２Ｔ６、  ＯＲ４Ｌ１、  ＯＲ５２Ｋ１、  ＯＲ５Ｍ１０、  ＯＲ７Ｅ２４、  ＯＲ１３Ｃ５、  ＯＲ２ＡＧ１、  ＯＲ２Ｔ７��  ＯＲ４Ｍ１、  ＯＲ５２Ｋ２、  ＯＲ５Ｍ１１、  ＯＲ７Ｇ１。
【００４１】
別の特定の実施形態において、前記嗅覚受容体は、ヒトにおい受容体の変異体、特に上記ヒトにおい受容体のいずれか１つの変異体、より具体的にはヒトにおい受容体のアミノ酸配列と、特に上記ヒトにおい受容体のいずれか１つと少なくとも８０％同一性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体である。
【００４２】
一つの実施形態において、ＧＰＣＲは、非ＯＲ  ＧＰＣＲである。
【００４３】
特定の実施形態において、前記化学受容体は、ヒト非ＯＲ化学受容体、特に味覚受容体、Ｔｒｐチャネル、Ｖ１ｒまたはＶ２ｒからなる群より選択されるヒト非ＯＲ化学受容体である。
【００４４】
別の実施形態において、前記化学受容体は、無脊椎動物非ＧＰＣＲ、特にイオンチャネル型７ＴＭ  ＯＲ、７ＴＭ  ＧＲおよびイオンチャネル型ＩＲからなる群より選択される昆虫化学感覚器である。
【００４５】
本発明の方法の特定の実施形態において、前記生物学的サンプルおよび前記化学受容体をコードする遺伝子は、同じ種に由来し、例えば、マウス由来の生物学的サンプルは、マウス化学受容体をコードする遺伝子を発現する細胞を含む。
【００４６】
別の特定の実施形態において、所定のリガンドに対する受容体としてのマウス化学受容体の同定は、別の種、特にヒト（マウス受容体とヒト受容体との間の配列相同性が高いため）の１つまたは複数の受容体の同定に拡張され得る。表１は、アミノ酸配列において少なくとも９０％の同一性を示すヒトにおい受容体およびマウスにおい受容体の例を提供する。
【表１】
2017528120.tif 000002
【００４７】
別の実施形態において、前記生物学的サンプルおよび前記化学受容体をコードする遺伝子は、異なる種に由来し、例えば、齧歯類由来の生物学的サンプルは、ヒト化学受容体をコードする遺伝子を発現する細胞を含む。
【００４８】
一つの実施形態において、生物学的サンプルは、上記少なくとも１つの化学受容体を発現する細胞を含む組織を含む。
【００４９】
本発明に好適な組織は、典型的には、感覚ニューロン、例えば嗅覚ニューロン、味覚細胞、または三叉神経系由来のニューロンを含む。
【００５０】
あるいは、本発明に好適な組織は、昆虫の触覚または口肢に由来する感覚子由来の感覚細胞を含み得る。
【００５１】
本発明に好適な組織は、主嗅上皮、鋤鼻器官、中隔器官、グルーエネベルク神経節、三叉神経組織、例えば口腔由来の感覚組織からなる群より選択され得る。
【００５２】
特定の実施形態において、前記組織は、主嗅上皮である。
【００５３】
別の特定の実施形態において、前記組織は、舌由来の味覚上皮である。
【００５４】
別の特定の実施形態において、前記組織は、昆虫の触覚または口肢に由来する感覚子である。
【００５５】
前記組織は、当技術分野において公知の方法にしたがって、動物（本明細書に記載のヒト、非ヒト動物またはトランスジェニック非ヒト動物を含む）の生検から得られ得る。
【００５６】
別の実施形態において、本発明において使用される生物学的サンプルは、上記少なくとも１つの化学受容体を発現する単離された細胞を含む。
【００５７】
本発明に好適な細胞は、典型的には、上記組織の１つから単離される。
【００５８】
本発明に好適な細胞はまた、Ｏｄｏｒａのような嗅覚ニューロン細胞株などの細胞株由来の細胞であり得る（Ｍｕｒｒｅｌ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９（１９）：８２６０−７０）。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明に好適な細胞は、感覚ニューロン、特に動物の主嗅上皮、鋤鼻器官、中隔器官および／またはグルーエネベルク神経節を含む嗅覚系から単離された嗅覚ニューロン、または動物の味覚上皮から単離された味覚細胞である。
【００６０】
別の実施形態において、前記嗅覚ニューロンは、主嗅上皮から単離される。
【００６１】
さらなる実施形態において、前記嗅覚ニューロンは、鋤鼻器官の上皮から単離される。
【００６２】
さらなる実施形態において、前記嗅覚ニューロンはグルーエネベルク神経節から単離される。
【００６３】
別の実施形態において、前記味覚細胞は、動物の舌の味覚上皮から単離される。
【００６４】
代替的な特定の実施形態において、本発明に好適な細胞は、昆虫の触覚または口肢に由来する感覚子から単離された感覚細胞である。
【００６５】
またさらなる実施形態において、前記感覚ニューロンは、本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物由来の組織から単離される。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明に好適な各細胞は、本明細書に記載の１個の化学受容体遺伝子を発現する。
【００６７】
前記嗅覚ニューロンを抽出する方法は当技術分野において公知であり、（Ｂｏｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ，２２（８）：３０３３−３０４３；Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００９  Ｍａｙ  ２８；４５９（７２４６）：５７４−７）に記載の方法が挙げられる。
【００６８】
前記味覚細胞またはニューロンを抽出する方法は当技術分野において公知であり、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．，２５（４）８４３−８４７に記載の方法が挙げられる。
【００６９】
本発明に好適な組織または細胞は、脊椎動物または無脊椎動物であり得る動物から得ることができる。
【００７０】
一つの実施形態において、動物は、哺乳動物などの脊椎動物である。
【００７１】
特定の実施形態において、動物は、ヒト、齧歯類、ブタまたはウシなどの哺乳動物である。
【００７２】
特定の実施形態において、前記動物は、非ヒト動物である。
【００７３】
さらなる特定の実施形態において、前記動物は、マウス、ラットおよびウサギを含む齧歯類である。
【００７４】
別の実施形態において、動物は、ダニ、ハエまたは蚊などの無脊椎動物である。
【００７５】
さらに他の特定の実施形態において、前記非ヒト動物は、本明細書に記載のトランスジェニック動物である。
【００７６】
特定の実施形態において、前記非ヒト動物は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個または少なくとも１０個のにおい受容体（ＯＲ）遺伝子を発現するトランスジェニック動物である。
【００７７】
より具体的には、前記非ヒト動物は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個または少なくとも１０個の異種ＯＲ遺伝子、例えばヒトＯＲ遺伝子を発現するトランスジェニック動物である。
【００７８】
さらなる特定の実施形態において、前記非ヒト動物は、非ＯＲ化学受容体をコードする少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個または少なくとも１０個の遺伝子を発現するトランスジェニック動物である。
【００７９】
より具体的には、前記非ヒト動物は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個または少なくとも１０個の異種非ＯＲ化学受容体遺伝子、例えばヒト非ＯＲ化学受容体遺伝子を発現するトランスジェニック動物である。
【００８０】
本発明によれば、生物学的サンプルまたは動物が曝露された試験化合物は、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、有機低分子または非有機低分子、例えば限定されないが、におい物質、芳香性化合物、嗜好性化合物または非嗜好性化合物、フェロモン、合成源または天然源由来の、例えば化学ライブラリーまたはペプチドライブラリー由来の分子を含む様々な性質のものであり得る。
【００８１】
感覚ニューロンが少なくとも１つの嗅覚受容体を発現する特定の実施形態において、試験化合物は、エステル、直鎖状テルペン、環式テルペン、芳香族アミン、アルコール、アルデヒド、ケトン、ラクトン、チオール、硫酸化化合物アルカン、ガスからなる群より選択される。
【００８２】
感覚ニューロンが少なくとも１つの味覚受容体を発現する特定の実施形態において、試験化合物は、糖、酸または脂肪族化合物からなる群より選択される。
【００８３】
別の実施形態において、一つまたはそれ以上の試験化合物は、いくつかの試験化合物の混合物として試験され得る。
【００８４】
特定の実施形態において、本発明は、以下の試験化合物の混合物を使用する：
−  口臭のにおいを模倣するために：硫化水素、メタンチオール（メチルメルカプタン）、ジメチルスルフィドを含む揮発性硫黄化合物
−  「コーヒー息」のにおいを模倣するために：３−メルカプト−メチルブチルホルメート
−  ニンニク息のにおいを模倣するために：アリルメチルスルフィド
−  鼓腸によって引き起こされるにおいを模倣するために：硫化水素、メタンチオール、硫化ジメチルのような硫黄含有化合物
−  腋窩臭を模倣するために：３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキセン酸、３−メチル−３−スルファニルヘキサン−１−オール
−  足のにおいを模倣するために：メタンチオール、プロパン酸、イソ吉草酸。
【００８５】
本発明の方法に先立って、生物学的サンプルに含まれる細胞を少なくとも１つの試験化合物に曝露する。
【００８６】
前記曝露は、エクスビボにおいて（すなわち、少なくとも１つの化学受容体を発現する細胞または組織が前記試験化合物に曝露される）またはインビボにおいて（すなわち、少なくとも１つの化学受容体を発現する細胞または組織が前記試験化合物に曝露された動物に由来する）行われ得る。
【００８７】
一般に、本発明の方法に先立って、生物学的サンプルまたは動物を試験化合物に曝露し、これを数時間程度（例えば、約５時間）継続する。
【００８８】
本発明の方法の一つの実施形態において、化学受容体をコードする少なくとも１個の遺伝子の転写のレベルが決定される。特に、化学受容体をコードする少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個または少なくとも１００個の遺伝子の転写のレベルが決定される。
【００８９】
本発明の方法の別の実施形態において、化学受容体をコードする約１０〜２０００個の遺伝子、例えば約２０〜約３００個、約２０〜約２００個の遺伝子の転写のレベルが決定される。
【００９０】
遺伝子の転写のレベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｍＲＮＡシークエンシングに基づく方法を含む、前記遺伝子の転写産物の定量に関する分野における標準的な方法にしたがって決定され得る。ＯＲの転写のレベルを決定するための方法の例としては、実施例のセクションにおいて示されているように、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（本明細書において「ＲＴ−ｑＰＣＲ」と略される）およびハイスループットｍＲＮＡシークエンシングが挙げられる。
【００９１】
第二の態様において、本発明は、その化学受容体に対するリガンドの作用をモジュレートすることができる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの化学受容体を発現する細胞を含む同じ生物学的サンプル由来の３つのサブサンプルを用意する工程であって、前記サブサンプルが以下のように処理されている工程と、
（ｉ）第一のサブサンプルは、前記化学受容体のリガンドに曝露されており、
（ｉｉ）第二のサブサンプルは、（ｉ）と同じ前記化学受容体のリガンドおよび試験薬剤に曝露されており、
（ｉｉｉ）第三のサブサンプルは、前記化学受容体のリガンドおよび試験薬剤のいずれにも曝露されておらず、陰性対照を構成する、
（ｂ）前記３つの各サブサンプルにおいて、前記化学受容体をコードする遺伝子の転写のレベルに比例するシグナルを測定する工程と、
（ｃ）前記３つの各サブサンプルについて決定したシグナルのレベルを比較する工程であって、
（ｉ）前記第二のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルが、前記第一のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルよりも低いこと、および前記第一のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルが、前記第三のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルよりも低いことが、前記薬剤が、前記化学受容体に対する前記リガンドの結合を増強し、前記化学受容体のアゴニストであることを示し、
（ｉｉ）前記第二のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルが、前記第三のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルと同等または同程度であること、ならびに前記第二のサブサンプルおよび／または前記第三のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルが、前記第一のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルよりも高いことが、前記薬剤が、前記化学受容体に対する前記リガンドの結合を阻害し、前記化学受容体のアンタゴニストであることを示し、
（ｉｉｉ）前記第一のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルが、前記第二のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルと同等または同程度であること、ならびに前記第一のサブサンプルおよび／または前記第二のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルが、前記第三のサブサンプルにおいて決定したシグナルのレベルよりも低いことが、前記薬剤が、前記化学受容体に対する前記リガンドの結合をモジュレートしないことを示すものとすることを特徴とする工程と
を少なくとも含んでなる方法を提供する。
【００９２】
特定の実施形態において、その化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートすることができる薬剤を同定する前記方法は、前記生物学的サンプルを、前記化学受容体のリガンド単独に、および、試験薬剤と組み合わせて前記化学受容体のリガンドに曝露する工程をさらに含む。
【００９３】
より具体的な実施形態において、その化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートすることができる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの化学受容体を発現する細胞を含む生物学的サンプルを用意する工程と、
（ｂ）前記生物学的サンプルを３つのグループに分ける工程と、
（ｃ）（ｉ）前記生物学的サンプルの第一のグループを、前記化学受容体のリガンドに曝露する工程と、
（ｉｉ）前記第一のグループにおいて、前記化学受容体をコードする遺伝子の転写のレベルに比例するシグナルを測定する工程と、
（ｄ）（ｉ）前記生物学的サンプルの第二のグループを、（ｃ）と同じ前記化学受容体のリガンドおよび試験薬剤に曝露する工程と、
（ｉｉ）前記第二のグループにおいて、前記化学受容体をコードする遺伝子の転写のレベルに比例するシグナルを測定する工程と、
（ｅ）（ｉ）前記化学受容体のリガンドおよび試験薬剤のいずれにも曝露せずに、前記生物学的サンプルの第三のグループを陰性対照として保持する工程、
（ｉｉ）前記第三のグループにおいて、前記化学受容体をコードする遺伝子の転写のレベルに比例するシグナルを測定する工程と、
（ｆ）工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）において決定したシグナルのレベルを比較する工程であって、
（ｉ）工程（ｄ）において決定したシグナルのレベルが、工程（ｃ）において決定したシグナルのレベルよりも低いこと、および工程（ｃ）において決定したシグナルのレベルが、工程（ｅ）において決定したシグナルのレベルよりも低いことが、前記薬剤が、前記化学受容体に対する前記リガンドの結合を増強し、前記化学受容体のアゴニストであることを示し、
（ｉｉ）工程（ｄ）において決定したシグナルのレベルが、工程（ｅ）において決定したシグナルのレベルと同等または同程度であること、ならびに工程（ｄ）および／または（ｅ）において決定したシグナルのレベルが、工程（ｃ）において決定したシグナルのレベルよりも高いことが、前記薬剤が、前記化学受容体に対する前記リガンドの結合を阻害し、前記化学受容体のアンタゴニストであることを示し、
（ｉｉｉ）工程（ｃ）において決定したシグナルのレベルが、工程（ｄ）において決定したシグナルのレベルと同等または同程度であること、ならびに工程（ｃ）および／または（ｄ）において決定したシグナルのレベルが、工程（ｅ）において決定したシグナルのレベルよりも低いことが、前記薬剤が、前記化学受容体に対する前記リガンドの結合をモジュレートしないことを示すものとすることを特徴とする工程と
を少なくとも含んでなる方法が提供される。
【００９４】
本発明の第一の態様について上記に詳述されている化学受容体、生物学的サンプル、組織、細胞、化学受容体をコードする遺伝子の転写のレベルの決定に関する特定の実施形態は、この第二の態様の本発明の方法についても同様に適用される。
【００９５】
その化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートすることができる薬剤を同定する本発明の方法の特定の実施形態において、前記生物学的サンプルは、感覚ニューロンを含み、または、感覚ニューロン、特に嗅覚ニューロンを含む組織を含み、または、嗅神経細胞を含む組織を含む。
【００９６】
前記方法の別の特定の実施形態において、前記化学受容体は、嗅覚受容体、より具体的にはヒト嗅覚受容体である。
【００９７】
前記方法のさらなる特定の実施形態において、前記生物学的サンプルは、嗅覚ニューロンを含み、または、嗅覚ニューロンを含む組織を含み、前記ニューロンは、少なくとも１個、少なくとも５個または少なくとも１０個のヒト嗅覚受容体遺伝子を発現する。
【００９８】
特定の実施形態において、試験薬剤および／またはリガンドへの曝露の持続時間は、数時間程度、例えば約５時間である。
【００９９】
本発明の方法において試験すべき薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、有機低分子または非有機低分子、例えば限定されないが、におい物質、芳香性化合物およびフェロモン、合成源または天然源由来の、例えば化学ライブラリーまたはペプチドライブラリー由来の分子を含む様々な性質のものであり得る。
【０１００】
トランスジェニック動物およびその使用
本発明はまた、少なくとも１個の外因性化学受容体遺伝子、例えばヒト化学受容体遺伝子、例えばヒトにおい受容体遺伝子もしくはヒト非におい受容体遺伝子、または前記非ヒト動物において通常発現されない化学受容体遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【０１０１】
当業者であれば理解するように、トランスジェニック動物が少なくとも１個の外因性化学受容体遺伝子を発現するとの記載は、前記動物のゲノム、または前記動物の少なくともいくつかの細胞が、前記少なくとも１個の外因性化学受容体遺伝子またはそのコード配列を含むことを意味する。
【０１０２】
特定の態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、脊椎動物または無脊椎動物である。
【０１０３】
より具体的な態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、哺乳動物を含む脊椎動物である。
【０１０４】
より具体的な態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、齧歯類、ブタまたはウシなどの哺乳動物である。
【０１０５】
より具体的な態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、マウスまたはラットなどの齧歯類である。
【０１０６】
より具体的な実施形態において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、マウスである。
【０１０７】
別の特定の態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、無脊椎動物、特にハエおよび蚊を含む昆虫である。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１個、特に少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、例えば１０〜２０００個、より具体的には約２０〜約３００個または約２０〜約２００個の外因性化学受容体遺伝子を発現する。
【０１０９】
より具体的な実施形態において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも５個または少なくとも１０個の外因性化学受容体遺伝子を発現する。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、下記からなる群：
ＯＲ１０Ａ２、  ＯＲ１３Ｃ８、  ＯＲ２ＡＧ２、  ＯＲ２Ｔ８、  ＯＲ４Ｍ２、  ＯＲ５２Ｌ１、  ＯＲ５Ｍ３、  ＯＲ７Ｇ２、  ＯＲ１０Ａ３、  ＯＲ１３Ｃ９、  ＯＲ２ＡＪ１、  ＯＲ２Ｖ１、  ＯＲ４Ｎ２、  ＯＲ５２Ｍ１、  ＯＲ５Ｍ８、  ＯＲ７Ｇ３、  ＯＲ１０Ａ４、  ＯＲ１３Ｄ１、  ＯＲ２ＡＫ２、  ＯＲ２Ｖ２、  ＯＲ４Ｎ４、  ＯＲ５２Ｎ１、  ＯＲ５Ｍ９、  ＯＲ８Ａ１、  ＯＲ１０Ａ５、  ＯＲ１３Ｆ１、  ＯＲ２ＡＰ１、  ＯＲ２Ｗ１、  ＯＲ４Ｎ５、  ＯＲ５２Ｎ２、  ＯＲ５Ｐ２、  ＯＲ８Ｂ１２、  ＯＲ１０Ａ６、  ＯＲ１３Ｇ１、  ＯＲ２ＡＴ４、  ＯＲ２Ｗ３、  ＯＲ４Ｐ４、  ＯＲ５２Ｎ４、  ＯＲ５Ｐ３、  ＯＲ８Ｂ２、  ＯＲ１０Ａ７、  ＯＲ１３Ｈ１、  ＯＲ２Ｂ１１、  ＯＲ２Ｙ１、  ＯＲ４Ｑ３、  ＯＲ５２Ｎ５、  ＯＲ５Ｒ１、  ＯＲ８Ｂ３、  ＯＲ１０ＡＤ１、  ＯＲ１３Ｊ１、  ＯＲ２Ｂ２、  ＯＲ２Ｚ１、  ＯＲ４Ｓ１、  ＯＲ５２Ｒ１、  ＯＲ５Ｔ１、  ＯＲ８Ｂ４、  ＯＲ１０ＡＧ１、  ＯＲ１４Ａ１６、  ＯＲ２Ｂ３、  ＯＲ３Ａ１、  ＯＲ４Ｓ２、  ＯＲ５２Ｗ１、  ＯＲ５Ｔ２、  ＯＲ８Ｂ８、  ＯＲ１０Ｃ１、  ＯＲ１４Ａ２、  ＯＲ２Ｂ６、  ＯＲ３Ａ２、  ＯＲ４Ｘ１、  ＯＲ５６Ａ１、  ＯＲ５Ｔ３、  ＯＲ８Ｄ１、  ＯＲ１０Ｄ３、  ＯＲ１４Ｃ３６、  ＯＲ２Ｃ１、  ＯＲ３Ａ３、  ＯＲ４Ｘ２、  ＯＲ５６Ａ３、  ＯＲ５Ｖ１、  ＯＲ８Ｄ２、  ＯＲ１０Ｇ２、  ＯＲ１４Ｉ１、  ＯＲ２Ｃ３、  ＯＲ４Ａ１５、  ＯＲ５１Ａ２、  ＯＲ５６Ａ４、  ＯＲ５Ｗ２、  ＯＲ８Ｄ４、  ＯＲ１０Ｇ３、  ＯＲ１４Ｊ１、  ＯＲ２Ｄ２、  ＯＲ４Ａ１６、  ＯＲ５１Ａ４、  ＯＲ５６Ｂ１、  ＯＲ６Ａ２、  ＯＲ８Ｇ１、  ＯＲ１０Ｇ４、  ＯＲ１４Ｋ１、  ＯＲ２Ｄ３、  ＯＲ４Ａ４７、  ＯＲ５１Ａ７、  ＯＲ５６Ｂ３Ｐ、  ＯＲ６Ｂ１、  ＯＲ８Ｇ５、  ＯＲ１０Ｇ６、  ＯＲ１Ａ１、  ＯＲ２Ｆ１、  ＯＲ４Ａ５、  ＯＲ５１Ｂ２、  ＯＲ５６Ｂ４、  ＯＲ６Ｂ２、  ＯＲ８Ｈ１、  ＯＲ１０Ｇ７、  ＯＲ１Ａ２、  ＯＲ２Ｆ２、  ＯＲ４Ｂ１、  ＯＲ５１Ｂ４、  ＯＲ５Ａ１、  ＯＲ６Ｂ３、  ＯＲ８Ｈ２、  ＯＲ１０Ｇ８、  ＯＲ１Ｂ１、  ＯＲ２Ｇ２、  ＯＲ４Ｃ１１、  ＯＲ５１Ｂ５、  ＯＲ５Ａ２、  ＯＲ６Ｃ１、  ＯＲ８Ｈ３、  ＯＲ１０Ｇ９、  ＯＲ１Ｃ１、  ＯＲ２Ｇ３、  ＯＲ４Ｃ１２、  ＯＲ５１Ｂ６、  ＯＲ５ＡＣ２、  ＯＲ６Ｃ２、  ＯＲ８Ｉ２、  ＯＲ１０Ｈ１、  ＯＲ１Ｄ２、  ＯＲ２Ｇ６、  ＯＲ４Ｃ１３、  ＯＲ５１Ｄ１、  ＯＲ５ＡＫ２、  ＯＲ６Ｃ３、  ＯＲ８Ｊ１、  ＯＲ１０Ｈ２、  ＯＲ１Ｄ５、  ＯＲ２Ｈ１、  ＯＲ４Ｃ１５、  ＯＲ５１Ｅ１、  ＯＲ５ＡＮ１、  ＯＲ６Ｃ４、  ＯＲ８Ｊ３、  ＯＲ１０Ｈ３、  ＯＲ１Ｅ１、  ＯＲ２Ｈ２、  ＯＲ４Ｃ１６、  ＯＲ５１Ｅ２、  ＯＲ５ＡＰ２、  ＯＲ６Ｃ６、  ＯＲ８Ｋ１、  ＯＲ１０Ｈ４、  ＯＲ１Ｅ２、  ＯＲ２Ｊ１、  ＯＲ４Ｃ３、  ＯＲ５１Ｆ１、  ＯＲ５ＡＲ１、  ＯＲ６Ｃ６５、  ＯＲ８Ｋ３、  ＯＲ１０Ｈ５、  ＯＲ１Ｆ１、  ＯＲ２Ｊ２、  ＯＲ４Ｃ４６、  ＯＲ５１Ｆ２、  ＯＲ５ＡＳ１、  ＯＲ６Ｃ６８、  ＯＲ８Ｋ５、  ＯＲ１０Ｊ１、  ＯＲ１Ｇ１、  ＯＲ２Ｊ３、  ＯＲ４Ｃ５、  ＯＲ５１Ｇ１、  ＯＲ５ＡＵ１、  ＯＲ６Ｃ７０、  ＯＲ８Ｓ１、  ＯＲ１０Ｊ３、  ＯＲ１Ｉ１、  ＯＲ２Ｋ２、  ＯＲ４Ｃ６、  ＯＲ５１Ｇ２、  ＯＲ５Ｂ１２、  Ｏ���６Ｃ７４、  ＯＲ８Ｕ１、  ＯＲ１０Ｊ５、  ＯＲ１Ｊ１、  ＯＲ２Ｌ１３、  ＯＲ４Ｄ１、  ＯＲ５１Ｈ１Ｐ、  ＯＲ５Ｂ１７、  ＯＲ６Ｃ７５、  ＯＲ８Ｕ９、  ＯＲ１０Ｋ１、  ＯＲ１Ｊ２、  ＯＲ２Ｌ２、  ＯＲ４Ｄ１０、  ＯＲ５１Ｉ１、  ＯＲ５Ｂ２、  ＯＲ６Ｃ７６、  ＯＲ９Ａ２、  ＯＲ１０Ｋ２、  ＯＲ１Ｊ４、  ＯＲ２Ｌ３、  ＯＲ４Ｄ１１、  ＯＲ５１Ｉ２、  ＯＲ５Ｂ２１、  ＯＲ６Ｆ１、  ＯＲ９Ａ４、  ＯＲ１０Ｐ１、  ＯＲ１Ｋ１、  ＯＲ２Ｌ５、  ＯＲ４Ｄ２、  ＯＲ５１Ｌ１、  ＯＲ５Ｂ３、  ＯＲ６Ｊ１、  ＯＲ９Ｇ１、  ＯＲ１０Ｑ１、  ＯＲ１Ｌ１、  ＯＲ２Ｌ８、  ＯＲ４Ｄ５、  ＯＲ５１Ｍ１、  ＯＲ５Ｃ１、  ＯＲ６Ｋ２、  ＯＲ９Ｇ４、  ＯＲ１０Ｒ２、  ＯＲ１Ｌ３、  ＯＲ２Ｍ２、  ＯＲ４Ｄ６、  ＯＲ５１Ｑ１、  ＯＲ５Ｄ１３、  ＯＲ６Ｋ３、  ＯＲ９Ｇ９、  ＯＲ１０Ｓ１、  ＯＲ１Ｌ４、  ＯＲ２Ｍ３、  ＯＲ４Ｄ９、  ＯＲ５１Ｓ１、  ＯＲ５Ｄ１４、  ＯＲ６Ｋ６、  ＯＲ９Ｉ１、  ＯＲ１０Ｔ２、  ＯＲ１Ｌ６、  ＯＲ２Ｍ４、  ＯＲ４Ｅ２、  ＯＲ５１Ｔ１、  ＯＲ５Ｄ１６、  ＯＲ６Ｍ１、           ＯＲ９Ｋ２、  ＯＲ１０Ｖ１、  ＯＲ１Ｌ８、  ＯＲ２Ｍ５、  ＯＲ４Ｆ１５、  ＯＲ５１Ｖ１、  ＯＲ５Ｄ１８、  ＯＲ６Ｎ１、  ＯＲ９Ｑ１、  ＯＲ１０Ｗ１、  ＯＲ１Ｍ１、  ＯＲ２Ｍ７、  ＯＲ４Ｆ１６、  ＯＲ５２Ａ１、  ＯＲ５Ｆ１、  ＯＲ６Ｎ２、  ＯＲ９Ｑ２、  ＯＲ１０Ｘ１、  ＯＲ１Ｎ１、  ＯＲ２Ｓ２、  ＯＲ４Ｆ１７、  ＯＲ５２Ａ５、  ＯＲ５Ｈ１、  ＯＲ６Ｐ１、  ＯＲ１０Ｚ１、  ＯＲ１Ｎ２、  ＯＲ２Ｔ１、  ＯＲ４Ｆ２１、  ＯＲ５２Ｂ１Ｐ、  ＯＲ５Ｈ１４、  ＯＲ６Ｑ１、  ＯＲ１１Ａ１、  ＯＲ１Ｑ１、  ＯＲ２Ｔ１０、  ＯＲ４Ｆ２９、  ＯＲ５２Ｂ２、  ＯＲ５Ｈ１５、  ＯＲ６Ｓ１、  ＯＲ１１Ｇ２、  ＯＲ１Ｓ１、  ＯＲ２Ｔ１１、  ＯＲ４Ｆ３、  ＯＲ５２Ｂ４、  ＯＲ５Ｈ２、  ＯＲ６Ｔ１、  ＯＲ１１Ｈ１、  ＯＲ１Ｓ２、  ＯＲ２Ｔ１２、  ＯＲ４Ｆ４、  ＯＲ５２Ｂ６、  ＯＲ５Ｈ６、  ＯＲ６Ｖ１、  ＯＲ１１Ｈ１２、  ＯＲ２Ａ１、  ＯＲ２Ｔ２、  ＯＲ４Ｆ５、  ＯＲ５２Ｄ１、  ＯＲ５Ｉ１、  ＯＲ６Ｘ１、  ＯＲ１１Ｈ４、  ＯＲ２Ａ１２、  ＯＲ２Ｔ２７、  ＯＲ４Ｆ６、  ＯＲ５２Ｅ２、  ＯＲ５Ｊ２、  ＯＲ６Ｙ１、  ＯＲ１１Ｈ６、  ＯＲ２Ａ１４、  ＯＲ２Ｔ２９、  ＯＲ４Ｋ１、  ＯＲ５２Ｅ４、  ＯＲ５Ｋ１、  ＯＲ７Ａ１０、  ＯＲ１１Ｌ１、  ＯＲ２Ａ２、  ＯＲ２Ｔ３、  ＯＲ４Ｋ１３、  ＯＲ５２Ｅ６、  ＯＲ５Ｋ２、  ＯＲ７Ａ１７、  ＯＲ１２Ｄ２、  ＯＲ２Ａ２５、  ＯＲ２Ｔ３３、  ＯＲ４Ｋ１４、  ＯＲ５２Ｅ８、  ＯＲ５Ｋ３、  ＯＲ７Ａ５、  ＯＲ１２Ｄ３、  ＯＲ２Ａ４、  ＯＲ２Ｔ３４、  ＯＲ４Ｋ１５、  ＯＲ５２Ｈ１、  ＯＲ５Ｋ４、  ＯＲ７Ｃ１、  ＯＲ１３Ａ１、  ＯＲ２Ａ４２、  ＯＲ２Ｔ３５、  ＯＲ４Ｋ１７、  ＯＲ５２Ｉ１、  ＯＲ５Ｌ１、  ＯＲ７Ｃ２、  ＯＲ１３Ｃ２、  ＯＲ２Ａ５、  ＯＲ２Ｔ４、  ＯＲ４Ｋ２、  ＯＲ５２Ｉ２、  ＯＲ５Ｌ２、  ＯＲ７Ｄ２、  ＯＲ１３Ｃ３、  ＯＲ２Ａ７、  ＯＲ２Ｔ５、  ＯＲ４Ｋ５、  ＯＲ５２Ｊ３、  ＯＲ５Ｍ１、  ＯＲ７Ｄ４、  ＯＲ１３Ｃ４、  ＯＲ２ＡＥ１、  ＯＲ２Ｔ６、  ＯＲ４Ｌ１、  ＯＲ５２Ｋ１、  ＯＲ５Ｍ１０、  ＯＲ７Ｅ２４、  ＯＲ１３Ｃ５、  ＯＲ２ＡＧ１、  ＯＲ２Ｔ７、  Ｏ��４Ｍ１、  ＯＲ５２Ｋ２、  ＯＲ５Ｍ１１、  ＯＲ７Ｇ１
より選択される少なくとも１個、特に少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、例えば１０〜３８４個のヒトにおい受容体遺伝子、および／または、前記ヒトにおい受容体遺伝子の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するそれらの任意の変異体を発現する。
【０１１１】
さらなる特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、下記からなる群：
ＯＲ１Ｉ１、  ＯＲ１０Ｈ５、  ＯＲ８Ｈ１、  ＯＲ１３Ｇ１、  ＯＲ８Ｇ５、  ＯＲ２Ｓ２、  ＯＲ１０ＡＤ１、  ＯＲ５Ｔ１、  ＯＲ６Ｙ１、  ＯＲ５２Ｂ２、  ＯＲ７Ｃ１、  ＯＲ４Ｄ９、  ＯＲ８Ｈ２、  ＯＲ１１Ｌ１、  ＯＲ４Ｄ２、  ＯＲ１１Ｈ１、  ＯＲ５Ｂ３、  ＯＲ５２Ａ１、  ＯＲ８Ｇ１、  ＯＲ１３Ｃ５、  ＯＲ１Ｊ１、  ＯＲ１０Ｗ１、  ＯＲ６Ｂ２、  ＯＲ２Ｔ６、  ＯＲ１３Ａ１、  ＯＲ１３Ｃ９、  ＯＲ１０Ｋ１、  ＯＲ５Ｐ３、  ＯＲ２Ｌ３、  ＯＲ１３Ｃ２、  ＯＲ１Ｌ４、  ＯＲ１Ｌ１、  ＯＲ２Ｖ２、  ＯＲ５Ｂ２１、  ＯＲ１１Ｈ１２、  ＯＲ４Ｄ１、  ＯＲ２Ｙ１、  ＯＲ４Ｑ３、  ＯＲ２Ｍ２、  ＯＲ９Ａ４、  ＯＲ１３Ｃ４、  ＯＲ７Ｄ４、  ＯＲ２Ｔ２９、  ＯＲ１０Ｚ１、  ＯＲ１１Ｈ２、  ＯＲ５Ｃ１、  ＯＲ５Ｍ３、  ＯＲ４Ｆ１５、  ＯＲ２Ｔ５、  ＯＲ５Ｍ９、  ＯＲ１０Ａ６、  ＯＲ４Ｍ２、  ＯＲ２Ｌ２、  ＯＲ４Ｋ１、  ＯＲ５２Ｗ１、  ＯＲ２Ｔ１１、  ＯＲ６Ｋ３、  ＯＲ１Ｑ１、  ＯＲ１１Ｈ４、  ＯＲ５１Ｂ４、  ＯＲ１３Ｃ３、  ＯＲ１Ｋ１、  ＯＲ１１Ｈ６、  ＯＲ５Ｐ２、  ＯＲ８Ｂ２、  ＯＲ４Ｋ２、  ＯＲ４Ｋ１７、  ＯＲ５２Ｌ１、  ＯＲ２Ｈ２、  ＯＲ１０Ａ５、  ＯＲ４Ｋ１３、  ＯＲ５６Ａ４、  ＯＲ１１Ａ１、  ＯＲ２Ｄ２、  ＯＲ４Ｆ２１、  ＯＲ２Ｔ１０、  ＯＲ１４Ｊ１、  ＯＲ５１Ｅ２、  ＯＲ５ＡＮ１、  ＯＲ１Ｄ２、  ＯＲ２Ｊ２、  ＯＲ５１Ｉ１、  ＯＲ４Ｆ１７、  ＯＲ４Ｎ５、  ＯＲ２Ｊ３、  ＯＲ５１Ｑ１、  ＯＲ５１Ｌ１、  ＯＲ５６Ａ３、  ＯＲ６Ｃ１、  ＯＲ８Ｊ３、  ＯＲ５１Ｇ２、  ＯＲ５１Ｍ１、  ＯＲ５２Ｅ６、  ＯＲ２Ｃ１、  ＯＲ２Ｔ３３、  ＯＲ５１Ｂ２、  ＯＲ５Ｋ３、  ＯＲ１２Ｄ２、  ＯＲ２ＡＪ１、  ＯＲ６Ａ２、  ＯＲ２Ｆ１、  ＯＲ１３Ｊ１、  ＯＲ２Ｔ８、  ＯＲ６Ｃ７０、  ＯＲ６Ｂ１、  ＯＲ１０Ｇ３、  ＯＲ２Ｂ１１、  ＯＲ４Ｆ１６、  ＯＲ２Ａ５、  ＯＲ６Ｆ１、  ＯＲ４Ｆ４、  ＯＲ２Ｖ１、  ＯＲ３Ａ２、  ＯＲ５ＡＵ１、  ＯＲ２Ｄ３、  ＯＲ７Ａ１７、  ＯＲ１Ｃ１、  ＯＲ４Ｋ１４、  ＯＲ６Ｂ３、  ＯＲ４Ｆ５、  ＯＲ２Ｆ２、  ＯＲ９Ｋ２、  ＯＲ１３Ｄ１、  ＯＲ９Ｑ１、  ＯＲ２Ａ２５、  ＯＲ１０Ａ３、  ＯＲ９Ａ２、  ＯＲ９Ｑ２、  ＯＲ２Ａ１４、  ＯＲ１０Ａ４、  ＯＲ６Ｃ４、  ＯＲ１０Ｈ１、  ＯＲ４Ｅ２、  ＯＲ２ＡＧ１、  ＯＲ６Ｃ２、  ＯＲ２ＡＫ２、  ＯＲ５２Ｂ４、  ＯＲ１Ｍ１、  ＯＲ３Ａ１、  ＯＲ２Ｔ２７、  ＯＲ６Ｖ１、  ＯＲ８Ｂ１２、  ＯＲ１０Ｑ１、  ＯＲ５２Ｂ６、  ＯＲ５２Ｉ２、  ＯＲ２Ｋ２、  ＯＲ１０Ｋ２、  ＯＲ５１Ｉ２、  ＯＲ２Ｍ３、  ＯＲ２Ｍ４、  ＯＲ５１Ｅ１、  ＯＲ７Ｄ２、  ＯＲ４Ｆ３、  ＯＲ１Ｌ６、  ＯＲ５６Ｂ４、  ＯＲ２ＡＧ２、  ＯＲ５Ｋ２、  ＯＲ１Ｌ３、  ＯＲ５６Ａ１、  ＯＲ７Ａ５、  ＯＲ５２Ｉ１、  ＯＲ１Ｂ１、  ＯＲ５２Ｅ４、  ＯＲ２Ｇ６、  ＯＲ５Ｋ１、  ＯＲ１Ｎ２       、  ＯＲ５２Ｎ２、  ＯＲ２Ｌ１３、  ＯＲ５Ｈ１５、  ＯＲ１Ｎ１、  ＯＲ５２Ｎ１、  ＯＲ２Ｃ３、  ＯＲ４Ｆ２９、  ＯＲ２ＡＴ４、  ＯＲ５２Ｎ５、  ＯＲ１０Ｓ１、  ＯＲ５Ｈ１４、  ＯＲ５２Ａ５、  ＯＲ５６Ｂ１、  ＯＲ８Ｄ１、  ＯＲ７Ｅ２４、  ＯＲ５Ａ１、  ＯＲ５２Ｎ４、  ＯＲ８Ｂ３、  ＯＲ２Ｗ３、  ＯＲ５Ａ２、  ＯＲ５ＡＫ２、  ＯＲ１４Ａ１６、  ＯＲ１Ｊ４、  ＯＲ５Ｂ��２、  ＯＲ６Ｔ１、  ＯＲ５２Ｋ１、  ＯＲ５Ｖ１、  ＯＲ５Ｂ２、  ＯＲ８Ｄ４、  ＯＲ２Ｌ８、  ＯＲ２ＡＥ１、  ＯＲ９Ｉ１、  ＯＲ５２Ｄ１、  ＯＲ８Ｂ８、  ＯＲ４Ｄ１０、  ＯＲ６Ｑ１、  ＯＲ５２Ｈ１、  ＯＲ１Ｊ２、  ＯＲ１０Ｇ４、  ＯＲ９Ｇ４、  ＯＲ８Ｋ３、  ＯＲ６Ｎ１、  ＯＲ５Ｍ１０
より選択される少なくとも１個、特に少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、例えば１０〜２０９個のヒトにおい受容体遺伝子、および／または前記ヒトにおい受容体遺伝子の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するそれらの任意の変異体を発現する。
【０１１２】
２０９個の遺伝子の上記リストは、ほとんどのヒトにおいて発現されるＯＲ群に対応する。
【０１１３】
さらなる実施形態において、本発明の前記トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１個のヒト非ＯＲ化学受容体遺伝子、例えば少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個のヒトＴＡＡＲ受容体遺伝子を発現する。より具体的には、本発明の前記トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも５個のヒト非ＯＲ化学受容体遺伝子を発現する。
【０１１４】
またさらなる実施形態において、本発明のトランスジェニック動物は、上記群から選択される少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、例えば１０〜２０９個のヒトにおい受容体遺伝子を発現するマウスである。より具体的な実施形態において、本発明の前記トランスジェニック動物は、上記群から選択される少なくとも５個のヒトにおい受容体遺伝子を発現するマウスである。
【０１１５】
少なくとも１個の外因性化学受容体遺伝子を発現する本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、エレクトロポレーション、ウイルスベクター、リポフェクションまたはトランスフェクションによって、前記少なくとも１個の化学受容体遺伝子を含む少なくとも１つの核酸を卵母細胞の前核に注入し、または卵母細胞もしくは生殖細胞に送達した後に、前記少なくとも１個の化学受容体遺伝子が前記動物のゲノムに組み込まれることを含め、当技術分野における標準的な手順によって作製され得る。
【０１１６】
限定されないが、受精卵の前核への導入遺伝子のマイクロインジェクションおよび胚性幹細胞の操作を含むいくつかの技術が、導入遺伝子を動物の遺伝物質に導入するために使用され得る（例えば、Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，１９８６，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，２０：４６５−４９９）。トランスジェニック動物は、それらの全細胞において導入遺伝子を有し得るか、または遺伝的にモザイクであり得る。
【０１１７】
従来の遺伝子導入方法によれば、正常遺伝子または改変遺伝子の追加コピーが接合子の前核の１つに注入され、レシピエント動物のゲノムＤＮＡに組み込まれる。確立されたトランスジェニック系統において、導入遺伝子は、メンデル様式によって伝達される。導入遺伝子は、構成的に発現され得るか、または組織特異的であり得るか、もしくは特に外因性薬物に対して応答性であり得る。１個の導入遺伝子または複数の導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物は、それらの子孫がすべての導入遺伝子を有して発現するように、第二の導入遺伝子または複数の導入遺伝子を発現する第二のトランスジェニック動物と交配され得る。
【０１１８】
一つの態様によれば、本発明のトランスジェニック動物は、本発明の方法にしたがって、特定のリガンドに応答する化学受容体を同定するためのツールとして使用される。
【０１１９】
したがって、さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの外因性化学受容体を発現するトランスジェニック動物を作製するための方法であって、少なくとも１つの外因性化学受容体遺伝子またはそのコード配列を含む核酸を前記動物のゲノムに導入することを含む方法を提供する。
【０１２０】
特定の実施形態において、前記少なくとも１個の外因性化学受容体遺伝子を含む前記核酸は、典型的には前記少なくとも１個の化学受容体遺伝子を含む８０〜３００ｋｂの細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。
【０１２１】
より具体的な実施形態において、前記少なくとも１個のヒトにおい受容体遺伝子を含む前記核酸は、典型的には前記少なくとも１個のヒトにおい受容体遺伝子を含む８０〜３００ｋｂの細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。
【０１２２】
代替的な実施形態において、前記少なくとも１個の外因性化学受容体遺伝子を含む前記核酸は、前記化学受容体遺伝子のプロモーター、続いて５’ＵＴＲ、イントロン、前記化学受容体遺伝子のコード配列およびポリＡシグナルを含む短い導入遺伝子である。
【０１２３】
特定の実施形態において、前記少なくとも１個のヒトにおい受容体遺伝子を含む前記核酸は、前記ヒトにおい受容体遺伝子のプロモーター、続いて５’ＵＴＲ、イントロン、前記ヒトにおい受容体遺伝子のコード配列およびポリＡシグナルを含む短い導入遺伝子である。
【０１２４】
特定の実施形態において、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個のヒトにおい受容体遺伝子を発現する本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、下記からなる群：
ＣＴＤ−２１８４Ｇ２、ＲＰ１１−１６０Ｅ１０、  ＲＰ１１−３７８Ｉ２０、  ＲＰ１１−６３５Ｉ２０、  ＲＰ１１−８１Ｈ２１、  ＲＰ１１−１０００Ｉ９、  ＲＰ１１−１６３Ｅ６、  ＲＰ１１−３７９Ｆ１、  ＲＰ１１−６５２Ｆ７、  ＲＰ１１−８２６Ｆ２、  ＲＰ１１−１００Ｆ１、  ＲＰ１１−１７７Ｄ５、  ＲＰ１１−３８２Ａ１２、  ＲＰ１１−６５６Ｉ１８、  ＲＰ１１−８４６Ｇ１２、  ＲＰ１１−１０２９Ｅ１６、  ＲＰ１１−２０３Ｇ１４、  ＲＰ１１−３８４Ｃ２１、  ＲＰ１１−６５９Ｍ２３、  ＲＰ１１−９１０Ｐ５、  ＲＰ１１−１０４０Ｎ１４、  ＲＰ１１−２０６Ｄ２４、  ＲＰ１１−４０９Ｃ１、  ＲＰ１１−６５Ａ１０、  ＲＰ１１−９１８Ｈ８、  ＲＰ１１−１０４２Ｊ１３、  ＲＰ１１−２１Ｎ２、  ＲＰ１１−４２９Ｊ１３、  ＲＰ１１−６６１Ｍ１３、  ＲＰ１１−９４７Ｈ５、  ＲＰ１１−１０４４Ｈ１５、  ＲＰ１１−２３６Ｌ１２、  ＲＰ１１−４２Ｇ１５、  ＲＰ１１−６６３Ｋ１、  ＲＰ１１−９５０Ａ２、  ＲＰ１１−１０５Ｂ１６、  ＲＰ１１−２３Ｆ９、  ＲＰ１１−４３０Ｉ１５、  ＲＰ１１−６８１Ｄ１０、  ＲＰ１１−９５２Ｉ８、  ＲＰ１１−１０６９Ｊ２１、  ＲＰ１１−２４２Ｃ５、  ＲＰ１１−４３２Ｅ１８、  ＲＰ１１−６９６Ｐ１８、  ＲＰ１１−９６０Ｌ８、  ＲＰ１１−１１０５Ａ４、  ＲＰ１１−２４３Ｎ６、  ＲＰ１１−４３８Ｈ８、  ＲＰ１１−６９Ｅ１７、  ＲＰ１１−９８Ｎ２２、  ＲＰ１１−１１０７Ｃ１８、  ＲＰ１１−２４Ｎ１７、  ＲＰ１１−４５２Ｇ２２、  ＲＰ１１−６９Ｎ１５、  ＲＰ１１−９８Ｐ１９、  ＲＰ１１−１１０Ａ１２、  ＲＰ１１−２５２Ｉ５、  ＲＰ１１−４５４Ｏ２２、  ＲＰ１１−７２０Ｈ１９、  ＲＰ４−６６９Ｌ１７、  ＲＰ１１−１１１５Ｍ８、  ＲＰ１１−２５９Ｎ２、  ＲＰ１１−４５６Ｄ１、  ＲＰ１１−７４Ｂ１５、  ＲＰ１１−１１４４Ｅ１２、  ＲＰ１１−２７Ｎ２、  ＲＰ１１−４６２Ｃ５、  ＲＰ１１−７５９Ｐ１７、  ＲＰ１１−１１５０Ｂ２３、  ＲＰ１１−２９７Ｄ１２、  ＲＰ１１−４６６Ｆ２２、  ＲＰ１１−７５Ｊ４、  ＲＰ１１−１１５Ｈ４、  ＲＰ１１−２９９Ｉ２、  ＲＰ１１−５８５Ｆ１、  ＲＰ１１−７６Ｋ１８、  ＲＰ１１−１２０５Ｈ２４、  ＲＰ１１−３０Ｈ２１、  ＲＰ１１−５９９Ｏ３、  ＲＰ１１−７７７Ｋ２２、  ＲＰ１１−１２６Ｐ２３、  ＲＰ１１−３２０Ａ１４、  ＲＰ１１−６２Ｃ２３、  ＲＰ１１−７９Ｎ３、  ＲＰ１１−１４４Ｃ１６、  ＲＰ１１−３４５Ａ２４、  ＲＰ１１−６３０Ｄ１４、  ＲＰ１１−８０６Ｈ４、  ＲＰ１１−１４６Ｃ１０、  ＲＰ１１−３６１Ｉ１９、  ＲＰ１１−６３２Ｅ１９、  ＲＰ１１−８０６Ｐ５
より選択される少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも９０個の細菌人工染色体を前記動物のゲノムに組み込むことによって作製される。
【０１２５】
上記ＢＡＣの配列は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｏｎｅ／の公開データベースから検索され得る。
【０１２６】
さらなる特定の実施形態において、上記２０９個のヒトにおい受容体遺伝子を発現する本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、上記９４個の細菌人工染色体を前記動物のゲノムに組み込むことによって作製される。
【０１２７】
本発明のさらなる態様は、前記トランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞、特に感覚ニューロン（例えば、前記トランスジェニック非ヒト動物から単離された嗅覚ニューロン）、および前記トランスジェニック非ヒト動物から抽出された組織サンプル、特に前記トランスジェニック動物の嗅覚系から抽出された組織サンプルを提供する。
【０１２８】
前記細胞および組織は、先のセクションにおいて記載されているように単離され得る。
【０１２９】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのリガンドに対する少なくとも１つの化学受容体を同定する本発明の方法における、および／または、その化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートすることができる薬剤を同定する本発明の方法における、本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその細胞もしくは組織の使用を提供する。
【０１３０】
本発明において有用な組成物
別の態様において、本発明は、化学受容体、特に嗅覚受容体に結合するリガンド、およびその化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする薬剤（これらは、本発明の方法によって同定され得る）を提供する。
【０１３１】
少なくとも１つの化学受容体のリガンド、およびその化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする薬剤は、本発明の方法によって同定されるもののように、知覚される芳香および／または味を制御するために有用である。例えば、望ましくない芳香は、嗅覚受容体のアンタゴニストを使用することによって遮断、遮蔽または変化され得、望ましい芳香は、嗅覚受容体のリガンドおよび／またはアゴニストを使用することによって増強され得る。
【０１３２】
少なくとも１つの嗅覚受容体のリガンド、およびその嗅覚受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする薬剤は、本発明の方法によって同定されるもののように、化学受容体が関与する障害を治療および／または予防する方法において有用である。
【０１３３】
したがって、本発明は、少なくとも１つの化学受容体の少なくとも１つのリガンド、および／またはその化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする少なくとも１つの薬剤を含む組成物を提供する。
【０１３４】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における芳香および／または味の知覚を模倣または軽減する組成物であって、（ａ）少なくとも１つの第一の化学受容体に対する少なくとも１つのリガンド、および／または、第一の化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする少なくとも１つの薬剤を含む組成物を提供する。
【０１３５】
本発明のリガンドおよび薬剤の使用
本発明は、被験体における少なくとも１つの芳香および／または少なくとも１つの味の知覚をモジュレートするための方法であって、前記芳香および／または味の知覚に関与する少なくとも１つの化学受容体の少なくとも１つのリガンド、および／または、前記化学受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする少なくとも１つの薬剤の使用を少なくとも含んでなる方法を提供する。
【０１３６】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における少なくとも１つの芳香の知覚をモジュレートするための方法であって、前記芳香の知覚に関与する少なくとも１つの嗅覚受容体の少なくとも１つのリガンド、および／または、前記嗅覚受容体に対するリガンドの結合をモジュレートする少なくとも１つの薬剤の使用を少なくとも含んでなる方法を提供する。
【０１３７】
より具体的な実施形態において、本発明は、被験体における少なくとも１つの芳香の知覚を増強するための方法であって、前記芳香の知覚に関与する少なくとも１つの嗅覚受容体の少なくとも１つのリガンド、および／または、前記嗅覚受容体の少なくとも１つのアゴニストの使用を少なくとも含んでなる方法を提供する。
【０１３８】
別の特定の実施形態において、本発明は、被験体における少なくとも１つの芳香の知覚を軽減するための方法であって、前記芳香の知覚に関与する少なくとも１つの嗅覚受容体の少なくとも１つのアンタゴニストの使用を少なくとも含んでなる方法を提供する。
【０１３９】
被験体における少なくとも１つの芳香および／または少なくとも１つの味の知覚をモジュレートするための本発明の方法において、前記被験体を前記リガンドおよび／またはアンタゴニストに曝露するための様々な手段が使用され得、例えば、前記成分をエアロゾル形態に微粉化すること、または固体形態もしくは液体形態の前記成分を前記被験体の食料もしくは飲料に組み込むことが挙げられる。
【０１４０】
本明細書において使用される被験体は、ヒト、齧歯類、ウシ、ブタまたは昆虫を含む任意の動物を包含する。
【０１４１】
特定の実施形態において、前記リガンドおよび／または前記アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、本明細書に記載の本発明の方法を用いて同定されたものである。
【０１４２】
本明細書に引用される参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態（これは、本発明の個々の態様の単なる例示を意図する）によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等な方法および要素は本発明の範囲内である。実際、上記説明および添付の図面から、当業者であれば、本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の様々な改良が明らかになるであろう。このような改良は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【０１４３】
本発明についてこれまで説明してきたが、以下に本発明を限定しない実施例を例示する。
【実施例】
【０１４４】
動物
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ｗｗｗ．ｃｒｉｖｅｒ．ｃｏｍ）に発注した。到着後、それらを、二重フィルタを備える使い捨てプラスチック製ケージ（Ｉｎｎｏｖｉｖｅ）に５〜６つのグループで５日間入れた。それらを、「実験的におい物質を含まない」加圧室において飼育した。５日後、実験に必要になるまで、マウスを同一のケージに分離した（１〜７日間）。
【０１４５】
ショウジョウバエ（Ｗ１１１８）は、孵化の０〜１４時間後に収集した。オスおよびメスを別個に曝露した。性別はそれらの応答に影響を与えず、両方の性別に関するデータをプールした。
【０１４６】
におい物質の曝露
インビボでのにおい物質への曝露：実験の４８時間前から、マウスを、純粋ＤＭＳＯを含むコットンボールに慣れさせた。２００μｌをコットンに直接ピペッティングしてケージに入れ、巣作りのためにケージ内に既に存在していたコットンと交換した。次いで、ＤＭＳＯコットンボールを、実験開始まで毎日交換した。
【０１４７】
実験日に、におい物質を投与したマウスを別の部屋に移し、純粋ＤＭＳＯによって希釈した２００μｌのにおい物質を付着させたコットンボールに曝露した。午前８〜１０時（すなわち、日の出の２時間後）に曝露を開始し、午前１〜３時にマウスを屠殺および解剖した。マウスは、におい物質またはＤＭＳＯのみを含有するコットンボールに対して異なる応答をしなかった。同じ実験において、いくつかの異なるにおい物質を試験する場合、においの相互汚染を防ぐために、各におい物質について、別の加圧室を常に使用する。
【０１４８】
インビトロでのにおい物質への曝露：生きている脊椎動物または最近死亡した脊椎動物の嗅覚粘膜を採取し、インビトロにおいて生存状態で維持した。感覚ニューロンを放置または解離する。次いで、チューブ内の液相中において、におい物質への曝露をインビトロにおいて実施する。生理学的媒体（例えば、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース）中において、外植片／ニューロンを生存状態で維持する。次いで、インビボ曝露に使用したものと類似する手順では、採取した感覚ニューロンを２つの別個の集団に分けて、これらの集団の一方を活性化し（２〜５時間、しかしこれは変動し得る）、他方を陰性対照として使用する。次いで、２つの集団間のｍＲＮＡレベルの潜在的なモデュレーションを、ｑＰＣＲ（図２）、ＲＮＡｓｅｑまたは他の技術によって評価して、活性化した受容体を同定する。
【０１４９】
ＲＮＡ抽出
におい物質への曝露後に、頚椎脱臼によってマウスを殺処分し、直ぐに断頭した。主嗅上皮（ＭＯＥ）全体を回収し、６００μｌの溶解緩衝液およびβ−メルカプトエタノール（ＲＮＡｅａｓｙ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ、製造業者のプロトコールに従う）ならびに直径０．５ｃｍのスチールボールを含むチューブに移し、次いで、氷上に置いた。次いで、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）２４  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して、サンプルを６ｍ／秒で３０秒間ホモジナイズし、氷上に置いた。製造業者の説明書にしたがってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（登録商標）ｋｉｔを使用して、すべてのサンプルにおいて、ＲＮＡ抽出を同時に実施した。すべてのサンプルにおいて、２回のＤＮａｓｅ処理を実施した：最初に、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（登録商標）を使用し、次いで、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｍｂｉｏｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（登録商標）ｋｉｔを使用する。次いで、ＲＮＡサンプルを等分し、−８０℃において保存した。
【０１５０】
ハエの場合、曝露後に、動物を含むバイアルを、−８０℃の冷凍庫に逆さまにして５分間置き、次いで、解剖まで−２０℃の冷凍庫内において保持した。手によって頭部全体を切除し、１ｍｌのトリゾール（Ａｍｂｉｏｎ）および直径０．５ｃｍのスチールボールを含むスクリューキャップチューブに入れ、氷上において保持した。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）による６ｍ／秒、１５秒間のランを４回使用して、サンプルをホモジナイズした。各ランの間に、サンプルを氷上において冷却した。製造業者の説明書のトリゾールプロトコールにしたがって、５μｇのＲＮａｓｅフリーグリコーゲンをＲＮＡ沈殿のキャリアとして使用して、ＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡペレットを２０μｌのＲＮａｓｅフリー水に再懸濁し、ＤＮＡｓｅ処理（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｍｂｉｏｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（登録商標））を実施した。
【０１５１】
ｑＰＣＲ
Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ（登録商標）３１００  Ｐｒｏ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して、ＲＮＡ濃度を決定し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）を用いて、ＲＮＡの品質を評価した。Ｔａｋａｒａ  Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ｋｉｔを使用して、１０μｌの最終容量において、０．５μｇのＲＮＡを用いて、各逆転写を実施した。逆転写用のプライマーは、ポリＴヌクレオチドおよびランダムヘキサマーの等量混合物であった。各サンプルについて、（逆転写酵素を除いた）陰性対照を実施した。ｃＤＮＡ調製物の１／１４を、トリプリケートの各ｑＰＣＲ反応に使用した。ｑＰＣＲ反応を行うための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを以下の表２に示した。
【表２】
2017528120.tif 000003
【０１５２】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の７９００ＨＴ  ＳＤＳ（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒによって、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。すべての反応をトリプリケートで体系的に行った。条件は、以下の通りであった：ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）ｄｙｅを使用して、５０℃において２分間、９５℃において１０分間、（９５℃において１５秒間、６０℃において１分間）を４０回。
【０１５３】
ＳＤＳ（登録商標）２．２．１  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、生データを分析した。検出閾値は、ΔＲｎ＝０．３（この限界は常に、遺伝子の２ｎ指数関数的増幅期内にある）に設定した。非特異的生成物について解離曲線をチェックし、このような生成物が検出された場合には、サンプルを廃棄した。
【０１５４】
独自に開発したＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）のマクロファイルを使用して、ｑＰＣＲのＣｔ値を分析した。トリプリケートの値を比較し、異常値（最近傍に対して０．５Ｃｔよりも高い差異を有する値）を除外した。外れ値の条件の数は常に、条件の総数の１０％未満であった。所定の各遺伝子について、Ｃｔ値を、最大値に対する量に変換した。次いで、ｇｅＮｏｒｍ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍを使用して、選択した参照遺伝子を分散分析した。嗅覚組織特異的遺伝子ＯｍｐおよびＡｄｃｙ３を用いて、すべての値を正規化した。サンプル間の解剖の差異をコントロールするために、非組織特異的な参照遺伝子として、β−アクチンを使用した。
【０１５５】
ＲＮＡｓｅｑ
（前記のように）ＲＮＡ抽出前に、動物を５％アセトフェノンに５時間曝露した。ポリＡ含有ｍＲＮＡの選択後に、Ｔｒｕｓｅｑ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔｓを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ＲＮＡｓｅｑ多重化のためのアダプタをｃＤＮＡに加えた。ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを配列決定した。２８ｂｐシードのＢｏｗｔｉｅ２を使用して、１００ｂｐのリードをマッピングした。ＤＥＳｅｑ２を用いて、差次的遺伝子発現分析を実施した。ＯＲ遺伝子パラログ間の配列類似性は高いので、いくつかのリードは、複数のＯＲ遺伝子にマッピングされる。これらのリードを分析から除外した。
【０１５６】
実施例１：インビボでのにおい物質への曝露を用いた、マウスにおけるにおい受容体を脱オーファン化するための本発明の方法
成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５％イソ酪酸エチルに５時間曝露し、材料および方法のセクションにおいて記載されているように、これらのマウス由来の嗅覚上皮の抽出物において、におい受容体遺伝子の転写産物のレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。
【０１５７】
成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの感覚神経上皮において、５％イソ酪酸エチルに５時間曝露すると、Ｏｌｆｒ１７１およびＯｌｆｒ１６７のｍＲＮＡ濃度は有意に減少した（イソ酪酸エチルは、Ｏｌｆｒ１７１およびＯｌｆｒ６７のアゴニストであることが以前に示された）（非曝露対照と比べてそれぞれ７４％および４７％、ｎ＝マウス７匹）（図１ａ、ｆ）。対照におい受容体遺伝子（８個の遺伝子）の濃度はいずれも、イソ酪酸エチルへの曝露によって影響を受けなかった（インビボ曝露アプローチについて、対照マウスと比べて±２０％の誤差は、非有意であるとみなした、図１の灰色の領域）。
【０１５８】
活性化によって誘導される転写産物のダウンレギュレーションが、イソ酪酸エチル応答性嗅覚ニューロンに特異的であったか、または、活性化嗅神経細胞に共通の一般的特徴であったかを試験するために、７個のさらなるにおい受容体遺伝子の転写応答を評価した。
【０１５９】
これらの遺伝子の産物は、アゴニスト（５０μＭ未満のＥＣ５０を有する）、アセトフェノン（Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６およびＯｌｆｒ９８３は、ＨＥＫ細胞において発現される場合にこれに対して応答性であり、Ｏｌｆｒ１６０は、解離ニューロンにおいてこれに対して応答性である）、ヘプタナール（Ｏｌｆｒ２は、ＨＥＫ細胞においてこれに応答する）、リラール（Ｏｌｆｒ１６は、解離ニューロンにおいてこれに応答する）およびバニリン酸（Ｏｌｆｒ６０９は、ＨＥＫ細胞においてこれに対して応答性である）であることが以前に示された。マウス（ｎ＝２１）を上記４つの各５％化合物に個々に５時間曝露した。曝露の直後に、それらの対応する受容体のｍＲＮＡ濃度をＲＴ−ｑＰＣＲによって評価した。７つの受容体−リガンドペアについて、非曝露対照と比べたｍＲＮＡレベルの減少が観察された（図１ｂ〜ｅ）。対照受容体遺伝子（その産物は、特定のリガンドに応答しないことがインビトロにおいて以前に示された）のいずれにおいても、本発明者らは、におい受容体転写産物のレベルのこのような減少を観察しなかった（１条件当たり６〜９個の遺伝子、図１）。
【０１６０】
次いで、リガンド曝露を４８時間継続した以外は、ＯＲに使用したものと同じ方法を使用して、ＴＡＡＲ遺伝子（これは、哺乳動物の鼻粘膜に存在する第二のクラスの嗅覚受容体をコードする）のアゴニスト曝露に対する電位応答を試験した。
【０１６１】
β−フェニルエチルアミンによる４８時間の嗅覚刺激後に、嗅覚受容体遺伝子転写産物のレベルを評価した。各受容体遺伝子について、嗅覚受容体遺伝子転写産物のレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって評価し、曝露マウスにおいて得られた値と、対照マウスにおいて得られた値との比を図６に示す。ＴＡＡＲ３およびＴＡＡＲ４をコードする転写産物の数の減少が観察された（２個のＴＡＡＲ遺伝子は、このリガンドに応答することが以前に示された）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．２０１３，３３（７），３２２８−３２３９）。陰性対照ＴＡＡＲ６およびＯｌｆｒ５５６は、β−フェニルエチルアミンによって影響を受けなかった（図６）。
【０１６２】
これらの結果は、インビトロにおいて同定した受容体／リガンドペアと、対応する受容体遺伝子を発現するニューロンに対してこれらの各リガンドが与えた特定のインビボ転写効果と間の顕著な相関関係を証明している。したがって、これは、転写産物ベースの受容体脱オーファン化アプローチを使用して、インビボにおいて新規受容体／リガンドペアを同定し得ること、および本技術は、受容体型全体にわたる非常に多種多様な化学受容体に適用されることを実証している。
【０１６３】
実施例２：エクスビボでのにおい物質への曝露を用いた、マウスにおけるにおい受容体を脱オーファン化するための本発明の方法
マウス嗅覚上皮を採取し、インビトロにおいてＡＣＳＦ培地中において維持し、５０μＭイソ酪酸エチルに２時間曝露した。次いで、Ｏｌｆｒ遺伝子の転写産物の数をｑＰＣＲによって評価したところ、アゴニスト曝露後において、Ｏｌｆｒ１６７およびＯｌｆｒ１７１のものは両方とも抑制されていた。イソ酪酸エチルは、Ｏｌｆｒ１６７およびＯｌｆｒ１７１のアゴニストであることが以前に示された。
【０１６４】
実施例３：本発明の方法によるにおい受容体の大規模な脱オーファン化
実施例１および２は、嗅神経細胞の活性化と、嗅覚受容体ｍＲＮＡのダウンレギュレーションとの間の確かな相関関係を実証している。本実施例は、嗅覚刺激後の受容体の大規模な脱オーファン化方法としての本発明の方法の実行可能性を実証することを目的とした。嗅覚受容体遺伝子転写産物の潜在的なモデュレーションを評価するために、ＲＮＡｓｅｑアプローチを選択した。
【０１６５】
Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６、Ｏｌｆｒ９８３およびＯｌｆｒ１６０のメッセンジャーレベルをダウンレギュレートするアセトフェノンを試験した（図１）。
【０１６６】
マウス（ｎ＝６）を５％アセトフェノンまたは「中立」対照条件に５時間曝露した。各動物に対応する嗅覚ｃＤＮＡライブラリーをディープシークエンシングし、対照に対するにおい受容体ｍＲＮＡ濃度の比をプロットした（図３）。一貫して２０％超の転写減少を示したにおい受容体遺伝子をダウンレギュレートされたとみなした。アセトフェノン曝露後にＲＮＡｓｅｑによって観察された転写ダウンレギュレーションレベルに基づいて、２６個の応答性ＯＲ候補のリストを決定した（図３）（対照と比べて７４％の減少（Ｏｌｆｒ１４５）またはさらに８０％超の減少（Ｏｌｆｒ１６９）に達した）。同定した受容体遺伝子のうち、以前から公知の最も感受性の高いアセトフェノン受容体に対応する４個（Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６、Ｏｌｆｒ９８３およびＯｌｆｒ１６０）はすべてダウンレギュレートされており、実施例１においてＲＴ−ｑＰＣＲによって得られたデータとよく一致していた（図１ｂ）。ＲＮＡｓｅｑによって得られた２６個の嗅覚受容体候補のうちの２１個の転写産物のダウンレギュレーションを、ｑＰＣＲによって確認した。残りの５個の候補は、偽ＲＮＡｓｅｑ陽性候補（すなわち、アセトフェノン曝露後に実際にはｍＲＮＡがダウンレギュレートされなかったＯＲ候補）であった（表３）。
【０１６７】
ＲＮＡｓｅｑアプローチを用いて得られたアセトフェノン受容体の同一性を独立して検証するために、アセトフェノン曝露後の神経活性マーカー（リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）（Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ，１５１，１１２６−１１３７）および特定の嗅覚受容体の潜在的な共局在性を評価した。この目的のために、受容体ｍＲＮＡをターゲティングするプローブを用いて、嗅覚組織の切片において、インサイチューハイブリダイゼーションを実施し、続いて、ｐＳ６の免疫標識を実施した。使用したプローブは、（公知のアセトフェノン受容体をコードする）Ｏｌｆｒ９８３転写産物、（公知のイソ酪酸エチル受容体をコードする）Ｏｌｆｒ１７１転写産物、およびＲＮＡｓｅｑによって新たに同定した受容体をコードするＯｌｆｒ１４５転写産物を含め、応答性であると決定したほとんどのＯＲの転写産物に対するものであった。分析前に、マウスを５％アセトフェノン、５％イソ酪酸エチルまたは陰性対照条件のいずれかに６０分間曝露した。結果は、イソ酪酸エチル曝露が、ｐＳ６のシグナルを示す多数のＯｌｆｒ１７１発現ニューロンをもたらした（６７％）一方、Ｏｌｆｒ９８３およびＯｌｆｒ１４５発現ニューロンは、各ケースのわずか１２％および２８％においてｐＳ６の共標識を示したことを示している（図４）。ニューロンの６６％（Ｏｌｆｒ９８３）および７０％（Ｏｌｆｒ１４５）が、アセトフェノン曝露後にｐＳ６陽性であった一方、Ｏｌｆｒ１７１発現ニューロンのわずか１１％が、この化合物への曝露後にｐＳ６陽性であった。におい物質刺激後に神経活性化を示した（すなわち、一部のニューロンにおけるｐＳ６シグナルが、対照と比べて１５％超であった）ＯＳＮ集団（すなわち、同じにおい受容体遺伝子を発現するＯＳＮ）のリストを表３に示す。嗅覚ｍＲＮＡの減少とｐＳ６陽性シグナルとの間の完全な対応が、試験した全１５個のＯＳＮ集団について観察され、ｍＲＮＡモデュレーションおよびｐＳ６シグナルは、試験した全５個のＯＳＮ集団について観察されなかった。
【０１６８】
したがって、まとめると、本発明の脱オーファン化アプローチは、インビボにおいてアゴニストとして揮発性化学物質に応答するニューロンを忠実に同定する。
【０１６９】
したがって、本発明の方法は、嗅覚刺激後の受容体の大規模な脱オーファン化方法である。
【表３】
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【０１７０】
実施例４：少なくとも１０個のヒトにおい受容体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの生産
少なくとも１０個のヒトにおい受容体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製する。ヒトにおい受容体遺伝子（本明細書の段落０１１０に引用されている３８４個の遺伝子）を使用し得る。特に、少なくとも２５０個の遺伝子のＯＲ遺伝子レパートリーを有するヒトの９０％超において発現される２０９個のヒトにおい受容体遺伝子（本明細書の段落０１１１に引用されている）を標的とする。
【０１７１】
この目的のために、２つの別個の独立したアプローチを採用した：
１）標準的な手順にしたがって、ヒトＯＲを含む８０〜３００ｋｂの細菌人工染色体（ＢＡＣ）をマウスゲノムに組み込む。
【０１７２】
核酸を卵母細胞の前核に注入する（あるいは、卵母細胞または生殖細胞のエレクトロポレーション、ウイルス送達、リポフェクションまたはトランスフェクションによって、核酸を細胞に送達し得る）。レシピエント種は必ずしもマウスではなく、任意の脊椎動物種、特にラットであり得る。導入遺伝子は、頭尾がオーガナイズされる際に組み込まれることが多い。異なる導入遺伝子がゲノムに同時挿入されるので、これらの多量体挿入物は、百〜数百個の異種性の導入遺伝子を含有する。使用すべき標的は、１０〜２００個の導入遺伝子を含む挿入物であり得る（１５匹のファウンダーの約１匹において起こることが公知の状況）。すべてのＦ０ファウンダーを多重組み込みについて試験し、組み込みの同一性を定義する。相補的ファウンダーを交配して、ほとんどのヒトＯＲ遺伝子を発現する単一マウスを作製する。
【０１７３】
目的の２０９個のにおい受容体遺伝子をカバーするために、９４個のＢＡＣを同時注入する。
【０１７４】
２）それぞれがＯＲプロモーター、続いて５’ＵＴＲ（例えば、Ｖａｓｓａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｅｕｒｏｎ，３５（４）：６８１−９６）、イントロン、ヒトＯＲコード配列（２０９個のＯＲ遺伝子の１個）およびポリＡシグナルを含む従来の導入遺伝子も作製する。プロモーターはキメラであり得、例えば、Ｖａｓｓａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４６：３８１−９６におけるエンハンサー／安定化／選択要素を含み得る。ヒトＯＲ遺伝子のほとんどを発現するマウスを得るために、これらの導入遺伝子を、上記のようにマウスの卵母細胞に同時注入する。
【０１７５】
実施例５：マウスにおけるにおい受容体のアンタゴニストを同定するための本発明の方法
成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５％アセトフェノンに５時間曝露し、材料および方法のセクションにおいて記載されているように、これらのマウス由来の嗅覚上皮の抽出物において、におい受容体遺伝子の転写産物のレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。５％アセトフェノンに曝露すると、Ｏｌｆｒ１１７８およびＯｌｆｒ７３０のｍＲＮＡ濃度は有意に増加した（１．５および１．４の倍率変化がそれぞれ観察された）。
【０１７６】
実施例６：ショウジョウバエにおける化学受容体を脱オーファン化するための本発明の方法
２４時間齢のキイロショウジョウバエをプラスチックチューブ内において飼育し、ＤＭＳＯによって希釈した５％乳酸エチル、またはＤＭＳＯによって希釈した５％酢酸ゲラニルのいずれかに曝露した。におい物質を紙にスポットし、これをプラスチックチューブに入れた。１条件当たり１０匹のハエを使用した（１条件当たり８つの独立した抽出物）。曝露の５時間後に頭部を回収し、ＲＮＡを抽出した。
【０１７７】
Ｏｒ６７ｃ（乳酸エチルの公知の受容体）およびＯｒ８２ａ（酢酸ゲラニルの公知の受容体）の転写産物のレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって評価した。乳酸エチル曝露後に、Ｏｒ６７ｃ  ｍＲＮＡレベルは、対照ＯＲと比べてダウンレギュレートされており（０．７倍）、酢酸ゲラニル曝露後に、Ｏｒ８２ａ  ｍＲＮＡレベルは、対照ＯＲと比べてダウンレギュレートされていた（０．６倍）（図５）。
【０１７８】
ＯＲ６７ｃおよびＯＲ８２ａは、それぞれ乳酸エチルおよび酢酸ゲラニルに応答することが以前に示されており（Ｈａｌｌｅｍ  ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，２００６，Ｃｅｌｌ，１２５（１）：１４３−６０）、分析した３個の陰性対照嗅覚受容体のうち、Ｏｒ２ａは、３つのエステルにのみ弱く応答することが以前に示されており、Ｏｒ４９ｂは、いくつかの芳香族化合物に応答し、Ｏｒ６７ａは、いくつかのにおい物質（酸、アルデヒド、ケトン、芳香族、アルコールおよびエステル）に強く応答した（Ｈａｌｌｅｍ  ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，２００６、前掲）。
【０１７９】
これらの昆虫ＯＲは非ＧＰＣＲ嗅覚受容体であるので、これらのデータは、本技術が、無脊椎動物を含む種全体にわたる非常に多種多様な化学受容体に適用されることを示している。
【表４】
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【図１ＡＢ】
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【図１ＣＤ】
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【図１ＥＦ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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