(57)【要約】  動物の生態状態システムを決定するための方法であって、その動物からサンプル中高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）のレベルを決定することと、その動物の疾患の危険性、特徴的状態、および進行を決定するために前記レベルを使用することとを含む。共有結合した分子構造、及び前駆体を決定し、ソースとメカニズムを改変して疾患の危険性及び進行を遅らせるための治療の開発方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の疾患状態を決定するための方法であって、その動物からのサンプル中の高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）のレベルを決定することと、標準と前記レベルを比較することとを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、次の特徴、
（ａ）前記ＣＢＳＭ低分子が腸ミクロビオームから供給され、代謝プロセス、環境化学物質刺激もしくは異常な化学物質環境、内在性もしくは外来性微生物、または上の供給源の１つ以上の間のプロセスの相互作用に由来する、
（ｂ）前記高分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、複合糖質、および糖蛋白質からなる群から選択される、
（ｃ）前記疾患状態が、疾患分類、疾患亜分類、疾患進行、疾患を予測するリスク因子の開発、治療の仕様、治療アウトカムの予測、および治療用リードの開発からなる群から選択される、ならびに、
（ｄ）前記動物がヒトである、
の１つ以上を特徴とする、方法。
【請求項３】
高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）の濃度レベルを操作することを含む、動物における疾患への治療的介入のための方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、次の特徴
（ａ）前記高分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、複合糖質、および糖蛋白質からなる群から選択される、
（ｂ）前記低分子が腸ミクロビオームから供給され、代謝プロセス、環境化学物質刺激もしくは異常な化学物質環境、内在性もしくは外来性微生物、または上の供給源の１つ以上の間のプロセスの相互作用に由来する、
（ｃ）前記疾患が、うつ病、統合失調症、および自閉症からなる群から選択される情動疾患、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、軽度認知障害、ＡＬＳ、フリードライヒ（Freidrich）運動失調症、癌、糖尿病、および心血管系疾患からなる群から選択される変性疾患、または代謝の先天的なエラーもしくは遺伝子系疾患からである、
ならびに、
（ｄ）前記動物がヒトである、
の１つ以上を特徴とする、方法。
【請求項５】
疾患リスクを有する動物における疾患を防止または軽減するための介入の方法であって、前記動物の高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）を操作することを含む方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、次の特徴、
（ａ）前記リスクが、うつ病、統合失調症、および自閉症からなる群から選択される情動疾患、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、軽度認知障害、ＡＬＳ、またはフリードライヒ（Freidrich）運動失調症、癌、糖尿病、および心血管系疾患からなる群から選択される変性疾患について、または代謝の先天的なエラーもしくは遺伝子系疾患からである、ならびに、
（ｂ）前記動物がヒトである、
の１つまたは両方を特徴とする、方法。
【請求項７】
動物における生化学的プロセスを模倣するプロセスによって、低分子および高分子の合成の組み合わせを生成および分析することを含む、高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）の供給源の種類を決定するための方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記動物がヒトを含む方法。
【請求項９】
高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）の濃度レベルを操作することを含み、それによって標的遺伝子の発現を増大または減少させる、動物において遺伝子機能を改変するための方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、次の特徴、
（ａ）前記高分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、複合糖質、および糖蛋白質からなる群から選択される、
（ｂ）前記低分子が腸ミクロビオームから供給され、代謝プロセス、環境化学物質刺激もしくは異常な化学物質環境、内在性もしくは外来性微生物、または上の供給源の１つ以上の間のプロセスの相互作用に由来する、
（ｃ）前記遺伝子が、うつ病、統合失調症、もしくは自閉症からなる群から選択される情動疾患、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、軽度認知障害、ＡＬＳ、フリードライヒ（Freidrich）運動失調症、癌、糖尿病、心血管系からなる群から選択される変性疾患と関連し、または代謝の先天的なエラーもしくは遺伝子系からである、ならびに、
（ｄ）前記動物がヒトである、
の１つ以上を特徴とする、方法。
【請求項１１】
治療用の発見の方法であって、
同等の遺伝的リスク因子を有する対象のクラスを同定すること、
疾患を発症するかまたはしないこのクラス内のサブクラスを同定すること、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、および蛋白質への共有結合した分子の違いを同定し、これらが前記クラスおよびサブクラスを識別し、システムフィードバックコントロールのエピジェネティックな違いに影響すること、
前記共有結合した識別子の化学物質前駆体供給源および構造を単離および決定すること、ならびに、
前記疾患発症クラスにおいて存在しないかもしくは低下した量である化合物を提供もしくは置換すること、および／または前記疾患発症クラスにおいて上昇しているかもしくは過剰である化合物を抑制すること、
を含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発見の方法であって、前記疾患が、ハンチントン病、パーキンソン病、軽度認知障害、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ（Freidrich）運動失調症、癌、糖尿病、および心血管系疾患からなる群から選択される神経変性疾患、うつ病、統合失調症、および自閉症からなる群から選択される情動障害、または代謝の先天的なエラーもしくは遺伝子系疾患からである方法。
【請求項１３】
疾患リスクの決定、診断ステータス、進行の予測、および治療の開発のための高分子に共有結合した低分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患および健康状態のバイオマーカーの同定および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、正常および疾患プロセスが両方とも高分子への低分子の共有結合をもたらし、低分子のそれらの結合した形態が、疾患および治療アウトカムのバイオマーカーならびに治療用リードの新たなクラスを構成し、これらは広範囲の新たなテクノロジーによって利用可能であり測定可能であるという観察に基づく。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，１９４，２１７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２１０，９７０号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１３／１４８７０９号（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３３９１８号）
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Anal Biochem. 2013 May 15;436(2): 112-20. doi: 10. 1016/j.ab.2013.01.035. Epub 2013 Feb 12.「A novel method for detecting 7-methyl guanine reveals aberrant methylation levels in Huntington disease」, Thomas B, Matson S, Chopra V, Sun L, Sharma S, Hersch S, Rosas HD, Scherzer C, Ferrante R, Matson W
【発明の概要】
【０００５】
本発明の１つの態様においては、ヒトなどの動物の疾患状態を決定するための方法が提供され、これは、その動物からのサンプル中の高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）のレベルを決定することと、標準と前記レベルを比較することとを含む。
【０００６】
１つの実施形態において、ＣＢＳＭ低分子は腸ミクロビオームから供給され、代謝プロセス、環境化学物質刺激もしくは異常な化学物質環境、内在性もしくは外来性微生物、または上の供給源の１つ以上の間のプロセスの相互作用に由来する。
【０００７】
別の実施形態において、高分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、複合糖質、および糖蛋白質からなる群から選択される。
【０００８】
まだ別の実施形態において、疾患状態は、疾患分類、疾患亜分類、疾患進行、疾患を予測するリスク因子の開発、治療の仕様、治療アウトカムの予測、および治療用リードの開発からなる群から選択される。
【０００９】
本発明は、ヒトなどの動物における疾患への治療的介入のための方法をもまた提供し、高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）の濃度レベルを操作することを含む。
【００１０】
１つの実施形態において、高分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、複合糖質、および糖蛋白質からなる群から選択される。
【００１１】
別の実施形態において、低分子は腸ミクロビオームから供給され、代謝プロセス、環境化学物質刺激もしくは異常な化学物質環境、内在性もしくは外来性微生物、または上の供給源の１つ以上の間のプロセスの相互作用に由来する。
【００１２】
１つの実施形態において、疾患は、うつ病、統合失調症、および自閉症からなる群から選択される情動疾患、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、軽度認知障害、ＡＬＳ、フリードライヒ（Freidrich）運動失調症、癌、糖尿病、および心血管系疾患からなる群から選択される変性疾患、または代謝の先天的なエラーもしくは遺伝子系疾患からである。
【００１３】
本発明は、疾患リスクを有するヒトなどの動物における疾患を防止または軽減するための介入の方法をもまた提供し、これは、動物の高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）を操作することを含む。
【００１４】
１つの実施形態において、リスクは、うつ病、統合失調症、および自閉症からなる群から選択される情動疾患、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、軽度認知障害、ＡＬＳ、もしくはフリードライヒ（Freidrich）運動失調症、癌、糖尿病、および心血管系疾患からなる群から選択される変性疾患、または代謝の先天的なエラーもしくは遺伝子系疾患からである。
【００１５】
本発明は、高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）の供給源の種類を決定するための方法をもまた提供し、これは、ヒトなどの動物における生化学的プロセスを模倣するプロセスによって、低分子および高分子の合成の組み合わせを生成および分析することを含む。
【００１６】
本発明は、動物において遺伝子機能を改変するための方法をさらに提供し、高分子に共有結合した低分子（ＣＢＳＭ）の濃度レベルを操作することを含み、それによって標的遺伝子の発現を増大または減少させる。
【００１７】
１つの実施形態において、高分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、複合糖質、および糖蛋白質からなる群から選択される。
【００１８】
別の実施形態において、低分子は腸ミクロビオームから供給され、代謝プロセス、環境化学物質刺激もしくは異常な化学物質環境、内在性もしくは外来性微生物、または上の供給源の１つ以上の間のプロセスの相互作用に由来する。
【００１９】
まだ別の実施形態において、遺伝子は、うつ病、統合失調症、もしくは自閉症からなる群から選択される情動障害、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、軽度認知障害、ＡＬＳ、フリードライヒ（Freidrich）運動失調症、癌、糖尿病、および心血管系疾患からなる群から選択される変性疾患に関連し、または代謝の先天的なエラーもしくは遺伝子系からである。
【００２０】
本発明は、治療用の発見の方法をもまた提供し、
同等の遺伝的リスク因子を有する対象のクラスを同定すること、
疾患を発症するかまたはしないこのクラス内のサブクラスを同定すること、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および蛋白質への共有結合した分子の違いを同定し、これらがクラスおよびサブクラスを識別し、システムフィードバックコントロールのエピジェネティックな違いに影響すること、共有結合した識別子の化学物質前駆体供給源および構造を単離および決定すること、ならびに疾患発症クラスにおいて存在しないかもしくは低下した量である化合物を提供もしくは置換すること、および／または疾患発症クラスにおいて上昇しているかもしくは過剰である化合物を抑制すること、
を含む。
【００２１】
１つの実施形態において、疾患は、ハンチントン病、パーキンソン病、軽度認知障害、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ（Freidrich）運動失調症、癌、糖尿病および心血管系疾患からなる群から選択される神経変性疾患、うつ病、統合失調症、および自閉症からなる群から選択される情動障害、または代謝の先天的なエラーもしくは遺伝子系疾患からである。
【００２２】
最後に、本発明は、疾患リスクの決定、診断ステータス、疾患進行の予測、および治療の開発のための高分子に共有結合した低分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明のさらなる特徴および利点が、添付の図面と併せて次の詳細な説明から分かるであろう。類似の数字は類似の箇所を表す。
【００２４】
【図１】図１は、生物または個体にとっての疾患の状態、働き、およびリスクを決定するシステム生物学フィードバックネットワークを模式的に例示している。
【図２】図２は、蛋白質が共有結合した低分子バイオマーカーならびに質量分析およびヒト血漿中の所在によるその構造同定のための調製フローチャートを模式的に例示している。
【図３Ａ】図３Ａは（低い増幅における）血漿中の配位結合したプロファイルおよび共有結合したプロファイルのＬＣＥＣＡプロットであり、コントロール対象ＣＣ−１７からの血漿蛋白質ペレットから抽出された配位結合した低分子を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは（低い増幅における）血漿中の配位結合したプロファイルおよび共有結合したプロファイルのＬＣＥＣＡプロットであり、ＰＫによる消化後に明らかになった同じペレットからの共有結合した低分子を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、血漿のＰＫ消化物を示す分析用コントロールおよび内部自己切断のためのＰＫ消化物ブランクコントロールのＬＣＥＣＡプロットである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、血漿のＰＫ消化物を示す分析用コントロールおよび内部自己切断のためのＰＫ消化物ブランクコントロールのＬＣＥＣＡプロットである。
【図５Ａ】図５Ａは、アセトニトリル（ＡＣＮ）によって遊離した配位結合したバイオマーカー（左側パネル）およびＡＣＮ沈澱からのペレットのＰＫ消化物について、コントロール（ＣＣ−１７）およびＨＤ（ＣＸ５３）対象の比較を示すＬＣＥＣＡプロットである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、アセトニトリル（ＡＣＮ）によって遊離した配位結合したバイオマーカー（左側パネル）およびＡＣＮ沈澱からのペレットのＰＫ消化物について、コントロール（ＣＣ−１７）およびＨＤ（ＣＸ５３）対象の比較を示すＬＣＥＣＡプロットである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、アセトニトリル（ＡＣＮ）によって遊離した配位結合したバイオマーカー（左側パネル）およびＡＣＮ沈澱からのペレットのＰＫ消化物について、コントロール（ＣＣ−１７）およびＨＤ（ＣＸ５３）対象の比較を示すＬＣＥＣＡプロットである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、アセトニトリル（ＡＣＮ）によって遊離した配位結合したバイオマーカー（左側パネル）およびＡＣＮ沈澱からのペレットのＰＫ消化物について、コントロール（ＣＣ−１７）およびＨＤ（ＣＸ５３）対象の比較を示すＬＣＥＣＡプロットである。
【図６Ａ】図６Ａは、ハンチントン病状態を記述する２つのバイオマーカーを示す、ＨＤおよびコントロール対象からの血漿のＡＣＮ沈澱からの蛋白質ペレットの完全消化を示すＬＣＥＣＡプロットである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ハンチントン病状態を記述する２つのバイオマーカーを示す、ＨＤおよびコントロール対象からの血漿のＡＣＮ沈澱からの蛋白質ペレットの完全消化を示すＬＣＥＣＡプロットである。
【図７Ａ】図７Ａは、ＫＩ−ＣＡＧ１４０ＨＤマウスおよび野生型マウスからのＲＮＡを含有する脳組織の抽出からの画分のＬＣＥＣＡプロットであり、ＲＮＡへの共有結合した低分子の有意な違いの８点を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＫＩ−ＣＡＧ１４０ＨＤマウスおよび野生型マウスからのＲＮＡを含有する脳組織の抽出からの画分のＬＣＥＣＡプロットであり、ＲＮＡへの共有結合した低分子の有意な違いの８点を示している。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、Ｒ６／２マウスおよび野生型の脳組織からのＤＮＡを含有する核画分のプロットであり、共有結合した低分子アダクトの違いの１１点を示している。
【図９Ａ】図９Ａは、図２のフローチャートプロセスの実装（例としてインドール３プロピオン酸（Ｉ３ＰＡ）によって示されている）、共有結合した低分子標準の調製、それらの結合部位の決定、およびＬＣＥＣＡプロファイル中のそれらの所在を例示している。合成の共有結合した低分子調製物の生成を例示しており、反応して高分子に共有結合し得る低分子のフリーラジカル中間体を生成するプロセスによって共有結合した低分子の標準を生成するための技術を模式的に示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図２のフローチャートプロセスの実装（例としてインドール３プロピオン酸（Ｉ３ＰＡ）によって示されている）、共有結合した低分子標準の調製、それらの結合部位の決定、およびＬＣＥＣＡプロファイル中のそれらの所在を例示している。酸化型Ｉ３ＰＡの共有結合したキヌレン酸（kynuric acid）断片を含有するペプチド断片の同定を示しており、フェントン反応に供されたＩＰＡおよびアンジオテンシンの合成の混合物において、その一次酸化産物キヌレン酸（kynuric acid）（ＫＹＡ）の結合部位がチロシン部分であり、従ってＬＣＥＣＡによって低いレベルで検出可能であるということを示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図２のフローチャートプロセスの実装（例としてインドール３プロピオン酸（Ｉ３ＰＡ）によって示されている）、共有結合した低分子標準の調製、それらの結合部位の決定、およびＬＣＥＣＡプロファイル中のそれらの所在を例示している。標準として合成的に産生された共有結合した材料を用いるヒト対象における共有結合したＩ３ＰＡの同定を示しており、ＬＣＥＣＡプロファイルの１つのチャンネルの比較を示している。合成的に産生された蛋白質／ＩＰＡの共有結合した産物が、ＨＤ対象よりもコントロールにおいて低いアレイ中の一ピークに対応するということを示している。状態のバイオマーカーの文脈において、配位結合したＩＰＡ（ＨＤにおいてより低い）に対する共有結合したＩＰＡ（ＨＤにおいてより高い）の比が、いずれの区分単独におけるよりもバイオマーカーとして有意に記述的であるということを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
個体の機能的な作動を決める生化学的相互作用のネットワークが図１に模式的に示されている。疾患の本発明者のシステム生物学コンセプトはこのネットワークの含意から生じている。つまり、疾患は症状ではなく、むしろこのネットワーク内のコントロールの不全またはフィードバックの不全である。特に、遅発性の慢性の問題（心血管系疾患、神経変性疾患、情動障害、糖尿病、慢性疲労、および他の誘発性の免疫システムの問題）については、症状または通常疾患と呼ぶものはこのコントロールの不全またはフィードバックの喪失の結果として経時的に生ずる。疾患コントロールの文脈においてそれらのネットワークを明確にするための試みは、バイオマーカーを見いだすためのマルチパラメータ技術に集中して来た。
【００２６】
バイオマーカー（疾患に関係する遺伝子、蛋白質、ＲＮＡ転写物、または低分子を意味する）は、予測バイオマーカー（すなわち、疾患のリスクを示すもの）、状態のバイオマーカー（すなわち、疾患を分類するもの）、進行のバイオマーカー（すなわち、疾患によって進行するもの）、および治療アウトカムのバイオマーカー（すなわち、治療的介入によって変化するバイオマーカー）に一般的には分類され得る。これらの定義に、本発明者は治療的介入戦略を示唆するバイオマーカーをこの度加える。
【００２７】
バイオマーカーの探索はほとんど例外なく特定の「オミクス的」区分（図１中のＡ１〜Ａ４）においてであり、遺伝子、遺伝子発現、転写物、蛋白質、または配位結合した低分子を探して来た。「オミクス的」区分間で技術を開発し相互作用を評価するためにはほとんど何もなされて来なかった。理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明者は、疾患、治療アウトカム、および治療の開発のバイオマーカーを提供することにこれらの相互作用が重要な役割を有するということを信じており、実証した。本発明は、「オミクス的」相互作用測定のこの欠如を部分的に認識し、かかる相互作用を評価するための技術およびデータを提出する。
【００２８】
低分子バイオマーカーは生物サンプル中の高分子に強く配位結合している。低分子バイオマーカー（メタボロミクス）を評価するための技術は典型的には抽出プロトコールを用いて、かかる配位結合した材料を除去および濃縮する。しかしながら、酵素によって駆動されるかあるいは例えばヒドロキシル、オキシ、もしくはニトロフリーラジカル型の正常な／異常なフリーラジカル産生または単純な近距離反応によって駆動されるかいずれかの生物学的／生化学的プロセスは、蛋白質、ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの高分子へのこれらの密接に会合した低分子の共有結合を引き起こすであろう。この結合は遺伝子発現、酵素の働き、および蛋白質のフォールディング／凝集に影響し得る。上のプロセスの全てはリスク因子、疾患プロセス、および疾患進行として指摘されているので、共有結合したもののレベルおよび種類ならびに遊離のおよび配位結合した低分子の分布は、原理的には、単一の遺伝子、転写物、蛋白質、または配位結合したおよび遊離の低分子の総計よりも良く疾患またはリスク因子プロセスを反映する。
【００２９】
再び図１を参照して、本発明者はこの効果を認識し、腸ミクロビオーム区分Ａ５ならびに他のフィードバックプロセス３、４、６、および７を反映するフィードバックのリンク１、２、および５を評価するための方法を設計した。評価に有用なこれらの方法およびプロセスのいくつかは、下でいくつかの限定しない実施例に記載されている。
【実施例１】
【００３０】
プロセス１には、血液〜（血漿、白血球、血小板、ＲＢＣ、溶解細胞、溶解全血）他の体液および組織の蛋白質バイオマーカーへの共有結合した低分子が関わる。
【００３１】
最も単純な形態においては、配位結合した低分子を評価するための血漿または他の組織の抽出および沈澱を用いる調製に由来する蛋白質ペレットまたは他の高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、複合糖質）が、化学的または酵素的いずれかでさらに消化された。それから、これらの調製物のプロファイルが電気化学的検出による液体クロマトグラフィー（ＬＣＥＣＡ）、質量分析（ＭＳ）、ＬＣＥＣ／ＬＣＭＳのパラレルもしくは直列の組み合わせ、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）などのメタボロミクス的技術によって評価された。
【００３２】
これは、図２のサンプル調製方法論フローチャートの左ブランチ中に示されている。コントロール対象血漿のＬＣＥＣＡプロファイルからの典型例が、配位結合した分子のアセトニトリル抽出可能画分（上）およびプロテイナーゼＫによる消化後の蛋白質ペレットのアセトニトリル抽出（下）について図３Ａ〜３Ｂに示されている。誘導体化（derivitization）プロトコールなしでは、この実験に用いられた構成のＬＣＥＣＡはアミノ酸チロシン、トリプトファン、およびメチオニン、またはそれらのアミノ酸の小ジペプチドにのみレスポンスした。下図中の矢印は、単にアミノ酸または小ペプチドではなく、消化された蛋白質のアミノ酸断片に結合した他の部分に相当するペレット消化からの化合物である。それらの結合化合物は、生物機能の点で、原理的には酵素の性能、蛋白質凝集、成長、または細胞死などの重大なプロセスの作動を改変するであろう。本発明者の以前の特許文献１および特許文献２の教示に従った１つの技術（電気化学的アレイによる液体クロマトグラフィー（ＬＣＥＣＡ）検出）による爾後のプロファイルは、一般的にチロシン、トリプトファン、またはメチオニンの小ジペプチドおよび高分子に共有結合した低分子であり、上のアミノ酸のアダクトとしてレスポンスする１０００超のレスポンスを示した。コントロール例として、同じプロセスを経たヒト血漿の消化物およびＰＫブランクが図４Ａ〜図４Ｂに示されている。
【００３３】
調製のこの型におけるＨＤ対コントロールの見込まれるバイオマーカーの例が図５Ａ〜図５Ｄおよび図６Ａ〜図６Ｂに示されている。特に、コントロール対象ＣＣ１７およびＨＤ対象ＣＸ５３について図５Ａ〜図５Ｂに示されている抽出可能な配位結合した材料のＬＣＥＣＡプロファイルのセグメント中には、統計的に有意である状態の３つの見込まれるバイオマーカーがある。しかしながら、図５Ｃ〜図５Ｄに示されているこれらの対象からの蛋白質ペレットのＰＫ消化物プロファイルにおいて、バイオマーカーはずっと高い有意性があった。さらに、図５Ａ〜図６Ｂに示されているＬＣＥＣＡプロファイルの別の領域中には、疾患およびコントロール対象を識別し、単独で完全に記述的であった状態の２つのバイオマーカーがあった。
【００３４】
プロセスは、サイズまたは他の手段による蛋白質の分画にまで拡張されて、どの特定の蛋白質が低分子の結合を最も受けやすく、疾患もしくは治療アウトカムのより特異的なバイオマーカーまたは治療の開発へのリードを提供し得るかを決定し得る。これは図２のサンプル調製フローチャートの左横に示された。
【００３５】
サンプルは、１Ｍ−３００Ｋ、１００Ｋ−５０Ｋ−１０Ｋ分子量カットオフメンブレンからの順序の積層メンブレンフィルターを通された。直接的に処理または分析されたときの１０Ｋ未満画分は、遊離のメタボロームまたは高分子中の配位結合した画分と平衡にあるものを反映した。連続的な高分子画分は、アセトニトリル／メタノールによる沈澱などの標準的な抽出技術によって処理され、これからの上清が、分子量の関数としての配位結合した分子の分布によって爾後に分析された。
【００３６】
分布データのこの第１のセットの分析は、全ての配位結合した種の合計よりも、見込まれるバイオマーカーの優れた知見を提供した。例えば、その一次代謝物質キヌレニン（kynurinine）に対するトリプトファンの関係は抗鬱薬に対するレスポンスを部分的に記述した。しかしながら、３００〜１００Ｋの高分子画分中のキヌレニン（kynurinine）に対するトリプトファンの関係はより高度に記述的であった。コントロールに対するＡＤ血漿中のインドールプロピオネートの減少は１００〜５０Ｋの高分子画分においてより顕著であり、１００〜５０Ｋ画分中の遊離の材料対結合した材料の比においてさらに顕著であった。
【００３７】
データの第２のセットは高分子沈澱物から得られた。蛋白質沈澱物のケースでは、蛋白質は例えばトリプシン（ＴＰ）またはプロテイナーゼＫ（ＰＫ）またはベータペプチダーゼまたはその組み合わせによって消化され、爾後に各画分からの消化物をＰＫ消化物については１０ＫメンブレンまたはＴＰ消化物については３０Ｋメンブレンに通し、濾液を直接的に分析する。
【００３８】
他の見込まれるマーカーの追加の分離能が、直列中の最後のセンサーとしてホウ素ドープダイヤモンドセンサーを導入することによって電気化学的アレイにおいて得られ、さらなる分離能が、２０１３年３月２６日出願の本発明者の特許文献３の教示に従ってパラレルな質量（ＬＣＭＳ）分析による液体クロマトグラフィーおよびＬＣＥＣＡを利用することによって得られた。ホウ素ドープダイヤモンドセンサーを組み込んだＥＣアレイにおいてペプチドの特徴的なシグネチャーをまたはパラレルＬＣＥＣ／ＬＣＭＳパラレル構成においてペプチドの精密（extract）質量を有さない本質的にいかなるレスポンスも、アミノ酸部分への共有結合した低分子である。
【００３９】
組織ＤＮＡ／ＲＮＡ調製物
組織およびＤＮＡ／ＲＮＡ抽出のための標準的な調製プロトコールが用いられ得るが、最適な調製プロトコールは、高分子を最も化学的に損なわれていない状態に保つことを目指す。組織の調製プロトコールには、液体窒素温度におけるサンプルの摩砕などのプロセスによる、または蒸留水もしくは生理食塩水などの許容されるマトリックス中での繰り返しの凍結融解などのプロセスが続く高速「ｔｉｓｓｕｅｍｉｚｅｒ」摩砕機を用いる、または再び好適なマトリックス中でのサイクル高圧破砕の使用による高分子の可溶化が関わる。
【実施例２】
【００４０】
全血の臨床サンプルのための第２のアプローチは、ＬＣＥＣＡおよびパラレルＬＣＭＳプラットフォームが複数シグナルを定量的に分離および比較する能力に基づいた。順次小ポアサイズによる連続濾過によって血液からＤＮＡを単離するプロセスが、ＤＮＡを含有する粗調製物を提供した。これは小分けされて（subaliquoted）１つの画分については一連の抽出調製によって分析され、第２の画分についてはＨＣｌによって直接的に溶解されて塩基プリンおよびピリミジンにまでＤＮＡを破壊し、塩基アダクトとして共有結合した材料を遊離させ得る。爾後に、２つの画分からのプロファイルが比較されて、ＤＮＡに特有の部分を決定した。
【００４１】
ＤＮＡについては、ＤＮＡとのヒストン会合を保つプロトコールが初期の研究にとって好ましい。ヒストンはＰＫ消化によって選択的に除去され得、消化物は共有結合した低分子について上の通り分析される。
【００４２】
ＲＮＡ画分は、全体的に（globally）、またはｔＲＮＡ、ｍＲＮＡエクソソームなどからの画分への結合を評価するためのサイズ分画プロトコールを用いて単離されてのいずれかで評価され得る。組織からの高分子画分は、上に記載されている通り、メタボロームからの配位および共有結合した化合物の種々の蛋白質への分布について評価された。ＤＮＡおよびＲＮＡ画分は、Ｐ１エンドヌクレアーゼもしくはＡＰアルカリホスファターゼが続くＰ１エンドヌクレアーゼによるような酵素的な破壊またはＨＣｌもしくは他の弱酸による消化が続く、配位結合したメタボロームの沈澱／抽出によって評価された。精製されたＤＮＡは、例えば、それらのプロトコール下では、５’一リン酸としての塩基対（Ｐ１）、または塩基対（Ｐ１／ＡＰ）、またはＨＣＬ消化物については塩基グアニン、アデニン、シチジン、チミジンを示した。本発明者の以前の論文において本発明者が報告した通り、７メチルグアニンについての本発明者の以前の論文中のプロファイル全体を概観すると非特許文献１、レスポンスプロファイル中のその他のピーク、さらには７メチルグアニンまたは８ヒドロキシグアニンなどの塩基対の直接的な修飾は、塩基対または塩基対一リン酸または塩基に共有結合した他の分子に直接的に関係する。これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡの溶解のプロセスによってアッセイに利用可能になった。センサーに本来的に（inherently）レスポンスするかまたは異なるクロマトグラフィー分離を示す塩基対へのアダクトとしてレスポンスする種に相当する。
【００４３】
本発明者の以前の論文において、本発明者は、それらの比の変化がエピジェネティックな違いの指標であろうという仮説（hypothesese）に従って、ＤＮＡおよびＲＮＡ中のグアニンおよび７メチルグアニンについて標的指向的な方法を開発するという意図で、脳組織からＲＮＡおよびＤＮＡを単離する技術についてもまた報告した。標的指向的なアッセイの核心はグアニンおよび７メチルグアニンについてクリーンなシグナルを得ることであり、これらは、野生型およびＣＡＧ１４０ＨＤマウスモデルならびにヒトの死後ＨＤおよびコントロール脳におけるエピジェネティックな変化を実際に記述した。これには、配位結合した種の除去およびＬＣＥＣＡのかなりの操作が関わった。しかしながら、共有結合した低分子としての「干渉」の見込まれる重要性を本発明者が認識したとき、本発明者はクロマトグラフィーアウトプット全体を再分析した。
【００４４】
ＫＩ−ＣＡＧ１４０マウスおよび野生型マウスＲＮＡ（メタノール画分）中の有意に異なる８つの他の共有結合した種（図７Ａ〜図７Ｂ）、ならびに野生型およびＲ６／２マウスＤＮＡ（核画分）中の有意に異なる１１個の他の共有結合した種（図８Ａ〜図８Ｂ）が、下で図７Ａ〜図７Ｂおよび図８Ａ〜図８Ｂに示されている。これらの他の共有結合したアダクトは、モデルの一個抜き検定（one out testing）による多変量ＰＬＳ−ＤＡを用いると、遺伝子改変動物から野生型を完全に識別する。ＤＮＡおよびＲＮＡ中の共有結合した種がＲ６／２早発性モデルからＣＡＧ１４０遅発性ＨＤモデルを区別したということもまた観察された。これは、ＨＤにおける表現型移行の時がＤＮＡおよびＲＮＡに結合する特定の種に関係し得、これは翻ってＨＤ遺伝子を保有する対象における症状の発症を遅延させるかまたは防止するための治療的介入を示唆しそれにアプローチするということを示唆している。
【００４５】
理論によって束縛されることを望むものではないが、これらの種の全てはＤＮＡおよびＲＮＡの働きにおそらく関わっており、結果的に、
図１に示されているネットワークの作動を反映し且つ決定するということが信じられる。このネットワークの働きは翻って個体のアウトカムまたは疾患の運命を決定する。
【実施例３】
【００４６】
共有結合した材料の供給源を同定するための戦略：
高分子に低分子を共有結合するためのプロセスの多くには、例えばニトロソラジカルのヒドロキシルによる攻撃による中間体低分子ラジカルの生成が関わる。本発明者は、キヌレニン（kynurinine）またはインドールプロピオン酸などの低分子によって配位部位が飽和した種々の蛋白質、ＲＮＡ、およびＤＮＡの調製物を作った。これらの調製物はフェントン反応の種々の変形を用いるフリーラジカル攻撃に供され（過酸化水素、過酸化水素／硝酸）、爾後に上の通り処理された。これは、図４〜図８に示されている通りレスポンスの多くの供給源の同定を可能にした。本発明者はこのプロトコールを用いて、インドールプロピオン酸に対するフリーラジカル攻撃および蛋白質への爾後の結合によって形成される化合物として血漿のＰＫ消化物中に一種を同定した。このプロセスは図９Ａ〜図９Ｃに例示されている。先ず、図９Ａに模式的に示されている通り、高分子の存在下において低分子の中間体フリーラジカルを生成することによって、低分子が高分子（蛋白質もしくはペプチド断片、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）に結合された。この例において、本発明者は従来のフェントン型反応を用いてフリーラジカルを生成した。他の応用においては、電気化学的酸化（すなわち、ヒドロキシインドールのため）またはＵＶ照射（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡへの電気化学的に活性でないアダクトのため）などの中間体フリーラジカルを生成する他の手段が、好ましいアプローチであろう。第２に、図９Ｂに示されている通り、調製された材料が濃縮され、質量分析に供されて、蛋白質またはペプチド中のアミノ酸およびＤＮＡまたはＲＮＡ中の塩基対の結合部位を決定した。この例においては、Ｉ３ＰＡがその反応性中間体キヌレン酸（kynuric acid）の産物としてチロシンに結合することが示された。第３に、合成の標準がこの特定の研究のための適切な蛋白質によって調製された。このケースでは、ヒト血漿蛋白質のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を評価した。配位結合した材料が血漿調製物と同様に抽出され、ヒト血漿中の共有結合種を同定するために用いられた。この例において、本発明者は、ハンチントン病対象に対してコントロールにおいて配位結合したＩ３ＰＡのより低いレベルを同定した。これは疾患における酸化ダメージのより高いレベルと矛盾しない。
【００４７】
本発明者の分析は、共有結合した低分子バイオマーカー（ＣＢＳＭ）が状態の強力な識別子であり、動物データにおいて進行の予測因子であるということを示した。他の研究の蛋白質中のＣＢＳＭの分布は、それらもまたうつ病および統合失調症の治療のアウトカム、ハンチントン病における表現型移行の時、および軽度認知障害からアルツハイマー病への移行を予測すると結論づけるよう本発明者を導いた。それゆえに、それらは状態、リスク、治療のモニタリング、および予測のバイオマーカーとして広範囲の障害または障害の恐れに応用可能であると信じられる。
【００４８】
ＣＢＳＭは治療的介入および医薬開発にもまた用いられ得る。これの理論的根拠は、多くの低分子が高分子に比較的強く配位結合しているということである。早期のリスク状態は、遺伝性であるかまたは湾岸戦争退役軍人における筋萎縮性側索硬化症または殺虫剤／除草剤に曝露された農業従事者におけるパーキンソン病のより高い罹患率のケースのように環境性因子によってもしくは遺伝性および環境性因子の相互作用によって誘導されるかにかかわらず、例えばＤＮＡまたは重大な蛋白質へのそれらの低分子の結合をもたらし得る。この結合は翻ってゲノム（エピジェネティクス）の作動または酵素の働きに影響するであろう。例えば後者の効果の可能性は、うつ病の発症または治療のアウトカムに影響するキヌレニン（kynurinine）経路の酵素への低分子の結合であろう。理論によって束縛されることを望むものではないが、この結合は、この経路上の化合物のレベルの違いがうつ病と相関している理由であり得るということが信じられる。どの化合物が高分子に結合しているかを理解することは、配位結合をもたらすフリーラジカルまたは化学的プロセスを受けやすくない化合物によってそれらの配位部位からそれらを取り除くための化合物または戦略の設計へのルートを提供する。
【００４９】
あるいは、ＤＮＡと共有結合した化合物を理解することは、ゲノムの働きを特異的に変化させ、例えば、エピジェネティックな共有結合によって乳癌リスク遺伝子の機能をシャットダウンするための化合物の設計のための戦略を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【国際調査報告】
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