(57)【要約】本発明は、自己組織化でき、（ナノ繊維状）ヒドロゲルを形成できるペプチド、ペプトイド及び／又はペプチド模倣体のバイオファブリケーションにおける使用に関する。本発明は、さらに、ヒドロゲルを調製する方法、及び連続繊維を調製する方法、及び被定義の正確な形状を有する多細胞構築物を得る方法に関する。本発明は、さらに、ミニヒドロゲルアレイ及び３Ｄオルガノイド構造又は３Ｄ高分子生物学的構築物を得るためのそのようなヒドロゲルの様々な使用に関する。【選択図】図１
2017501136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
Ｚａ−（Ｘ）ｂ−（Ｙ）ｃ−Ｚ’ｄ
（式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり、
ａは、０又は１、好ましくは１であり、
Ｘは、出現ごとに、脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体からなる群から独立して選択され、全体の疎水性は、Ｎ末端からＣ末端へと減少し、
ｂは、１〜７の整数であり、
Ｙは、極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体からなる群から選択され、
ｃは、０、１又は２であり、
Ｚ’は、Ｃ末端極性頭部基であり、
ｄは、１であり、
及びｂ＋ｃは少なくとも２である）
を有する、自己組織化及びヒドロゲルの形成が可能なペプチド及び／又はペプチド模倣体のバイオファブリケーションにおける使用。
【請求項２】
前記脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体、並びに前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体が、Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸のいずれかである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記脂肪族アミノ酸が、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ノルロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）及びグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）からなる群から、好ましくは、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）及びグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記脂肪族アミノ酸のすべて又は一部が、Ｎ末端からＣ末端への方向にアミノ酸サイズが小さくなる順に配列されており、脂肪族アミノ酸のサイズが、Ｉ＝Ｌ＞Ｖ＞Ａ＞Ｇと定義される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記脂肪族アミノ酸が、
ＬＩＶＡＧ（配列番号１）、
ＩＬＶＡＧ（配列番号２）、
ＬＩＶＡＡ（配列番号３）、
ＬＡＶＡＧ（配列番号４）、
ＡＩＶＡＧ（配列番号５）
ＧＩＶＡＧ（配列番号６）
ＶＩＶＡＧ（配列番号７）
ＡＬＶＡＧ（配列番号８）
ＧＬＶＡＧ（配列番号９）
ＶＬＶＡＧ（配列番号１０）
ＩＶＡＧ（配列番号１１）
ＬＩＶＡ（配列番号１２）
ＬＩＶＧ（配列番号１３）
ＩＶＡ（配列番号４７）及び
ＩＶ（配列番号４８）
から選択される配列を有し、任意選択で、Ｎ末端のそのような配列の前にＡがある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ｂが、１〜７の整数、好ましくは２〜７又は２〜６の整数である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記極性アミノ酸が、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、５−Ｎ−エチル−グルタミン（テアニン）、シトルリン、チオ−シトルリン、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、ホモシステイン、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、エチオニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アロトレオニン、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、ホモセリン、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ホモアルギニン、オルニチン（Ｏｒｎ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、Ｎ（６）−カルボキシメチルリシン、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）及びＮ（６）−カルボキシメチルリシンからなる群から選択され、
前記極性アミノ酸が、好ましくは、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、メチオニン、リシン、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）及び２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ｃが２であり、前記極性アミノ酸が同一のアミノ酸であるか、又は
ｃが１であり、前記極性アミノ酸が、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、リシン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）及びヒスチジンのうちの１つ、好ましくは、リシン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）及び２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）のうちの１つを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
（Ｙ）ｂが、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｐ  Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ａｓｐ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ、Ｃｙｓ−Ａｓｐ、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ、Ｃｙｓ−Ｔｈｒ、Ｃｙｓ−Ｏｒｎ、Ｃｙｓ−Ｄａｂ、Ｃｙｓ−Ｄａｐ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ−Ｏｒｎ、Ｌｙｓ−Ｄａｂ、Ｌｙｓ−Ｄａｐ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ、Ｓｅｒ−Ｏｒｎ、Ｓｅｒ−Ｄａｂ、Ｓｅｒ−Ｄａｐ、Ｏｒｎ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ−Ｏｒｎ、Ｏｒｎ−Ｓｅｒ、Ｏｒｎ−Ｔｈｒ、Ｏｒｎ−Ｄａｂ、Ｏｒｎ−Ｄａｐ、Ｄａｂ−Ｌｙｓ、Ｄａｂ−Ｓｅｒ、Ｄａｂ−Ｔｈｒ、Ｄａｂ−Ｏｒｎ、Ｄａｂ−Ｄａｂ、Ｄａｂ−Ｄａｐ、Ｄａｐ−Ｌｙｓ、Ｄａｐ−Ｓｅｒ、Ｄａｐ−Ｔｈｒ、Ｄａｐ−Ｏｒｎ、Ｄａｐ−Ｄａｂ、Ｄａｐ−Ｄａｐから選択される配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
（Ｘ）ａ−（Ｙ）ｂが、
ＬＩＶＡＧＤ（配列番号１４）、
ＩＬＶＡＧＤ（配列番号１５）、
ＬＩＶＡＡＤ（配列番号１６）、
ＬＡＶＡＧＤ（配列番号１７）、
ＡＩＶＡＧＤ（配列番号１８）、
ＬＩＶＡＧＥ（配列番号１９）、
ＬＩＶＡＧＫ（配列番号２０）、
ＩＬＶＡＧＫ（配列番号２１）、
ＬＩＶＡＧＴ（配列番号２２）、
ＡＩＶＡＧＴ（配列番号２３）、
ＡＩＶＡＧＫ（配列番号２４）、
ＬＩＶＡＤ（配列番号２５）、
ＬＩＶＧＤ（配列番号２６）、
ＩＶＡＤ（配列番号２７）、
ＩＶＡＫ（配列番号２８）、
ＩＩＩＤ（配列番号２９）、
ＩＩＩＫ（配列番号３０）、
ＩＶＤ（配列番号４９）、
ＩＩＤ（配列番号５０）、
ＬＶＥ（配列番号５１）、
ＩＶＥ（配列番号５２）、
ＬＶＤ（配列番号５３）、
ＶＩＥ（配列番号５４）、
ＶＩＤ（配列番号５５）、
ＶＬＤ（配列番号５６）、
ＶＬＥ（配列番号５７）、
ＬＬＥ（配列番号５８）、
ＬＬＤ（配列番号５９）、
ＩＩＥ（配列番号６０）、
ＩＤ（配列番号６１）、
ＩＥ（配列番号６２）、
ＬＩＶＡＧＯｒｎ（配列番号３１）、
ＩＬＶＡＧＯｒｎ（配列番号３２）、
ＡＩＶＡＧＯｒｎ（配列番号３３）、
ＬＩＶＡＧＤａｂ（配列番号３４）、
ＩＬＶＡＧＤａｂ（配列番号３５）、
ＡＩＶＡＧＤａｂ（配列番号３６）、
ＬＩＶＡＧＤａｐ（配列番号３７）、
ＩＬＶＡＧＤａｐ（配列番号３８）、
ＡＩＶＡＧＤａｐ（配列番号３９）、
ＩＶＯｒｎ（配列番号６３）、
ＩＶＤａｂ（配列番号６４）、
ＩＶＤａｐ（配列番号６５）、
ＩＶＫ（配列番号６６）、
ＶＩＫ（配列番号６７）、
ＶＩＯｒｎ（配列番号６８）、
ＶＩＤａｂ（配列番号６９）、
ＶＩＤａｐ（配列番号７０）、
ＬＩＶＡＧＤＤ（配列番号４０）、
ＬＩＶＡＧＥＥ（配列番号４１）、
ＬＩＶＡＧＫＣ（配列番号４２）、
ＬＩＶＡＧＳ（配列番号４３）、
ＩＬＶＡＧＳ（配列番号４４）、
ＡＩＶＡＧＳ（配列番号４５）、及び
ＩＬＶＡＧＴ（配列番号４６）
からなる群から選択される配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ａが１であり、前記Ｎ末端保護基Ｚが、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｒを有し、式中Ｒが、Ｈ、非置換又は置換アルキル、及び非置換又は置換アリールからなる群から選択され、式中Ｒが、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル及びイソブチルからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記Ｎ末端保護基Ｚがアセチル基である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記Ｎ末端保護基Ｚが、天然及び合成アミノ酸誘導体を含む、ペプチド模倣体分子であり、前記ペプチド模倣体分子のＮ末端が、カルボン酸、アミド、アルコール、アルデヒド、アミン、イミン、ニトリル、尿素類似体、ホスフェート、カーボネート、スルフェート、ニトレート、マレイミド、ビニルスルホン、アジド、アルキン、アルケン、炭水化物、イミド、ペルオキシド、エステル、アリール、ケトン、スルファイト、ニトライト、ホスホネート及びシランからなる群から選択される官能基で修飾されていてもよい、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記Ｃ末端極性頭部基Ｚ’が、
極性官能基、
例えば（これらに限定されるものではないが）
−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＮＨＲ又は−ＣＯＮＲＲ’（ここで、Ｒ及びＲ’は、Ｈ、非置換又は置換アルキル、及び非置換又は置換アリールからなる群から選択される）、
−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＨＯ、マレイミド、イミドエステル、カルボジイミドエステル、イソシアネート；
小分子、
例えば（これらに限定されるものではないが）糖、アルコール、ヒドロキシ酸、アミノ酸、ビタミン、ビオチン、Ｌ−ドパ、チロキシン；
極性官能基で終わるリンカー、
例えば（これらに限定されるものではないが）エチレンジアミン、ＰＥＧ、カルボジイミドエステル、イミドエステル；
小分子又はビタミンに連結されているリンカー、
例えばビオチン、糖、ヒドロキシ酸
から選択され、
前記極性頭部基Ｚ’が、好ましくはアミド基である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記極性官能基（複数可）を、
生理活性分子又は部分、
例えば成長因子、サイトカイン、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン、プロドラッグ、薬物、ビタミン、抗原、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマーを含むが、これらに限定されない）、サッカリド；
標識（複数可）、色素（複数可）、
例えばイメージング造影剤；
病原体、
例えばウイルス、細菌及び寄生虫；
マイクロ及びナノ粒子；又は
これらの組み合わせ
から選択される少なくとも１つの化合物の化学的結合又は連結のために使用することができ、
前記化学的結合をペプチド及び／又はペプチド模倣体の自己組織化前又は後に行うことができる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記Ｃ末端極性頭部基Ｚ’が、天然及び合成アミノ酸誘導体を含む、ペプチド模倣体分子であり、前記ペプチド模倣体分子のＣ末端が、カルボン酸、アミド、アルコール、アルデヒド、アミン、イミン、ニトリル、尿素類似体、ホスフェート、カーボネート、スルフェート、ニトレート、マレイミド、ビニルスルホン、アジド、アルキン、アルケン、炭水化物、イミド、ペルオキシド、エステル、アリール、ケトン、スルファイト、ニトライト、ホスホネート及びシランからなる群から選択される官能基で修飾されていてもよい、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
ｂ＋ｃが、少なくとも２、好ましくは２〜９、より好ましくは３〜７又は２〜７である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
自己組織化中のペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）の立体構造変化、
好ましくは、ランダムコイル立体構造からヘリックス中間構造へ、そして最終βターン又はクロスβ立体構造への立体構造変化
を含み、
好ましくは、前記立体構造変化が、ペプチド濃度、イオン環境、ｐＨ及び温度に依存する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体が、ヒドロゲルを形成する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の異なるペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）が、ヒドロゲルを形成するために使用される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体の刺激応答性ゲル化を含み、前記刺激（単数／複数）又はゲル化条件（複数可）がｐＨ、塩濃度及び／又は温度から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記ペプチド及び／又はペプチド模倣体が、極性頭部基として塩基性アミノ酸（複数可）、例えば、リシン又はリシン様分子、好ましくはアミド化塩基性アミノ酸（複数可）を含み、
前記ペプチドが、刺激応答性ゲル化、好ましくは、塩の存在下、生理条件（例えば０．９％食塩水及びＰＢＳ）で及び／又は生理的ｐＨより上のｐＨ、好ましくはｐＨ７〜１０でゲル化の増進を示す、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ペプチド及び／又はペプチド模倣体が、極性頭部基として酸性アミノ酸（複数可）を含み、
前記ペプチドが、刺激応答性ゲル化、好ましくは、生理的ｐＨ７未満のｐＨ、好ましくはｐＨ２〜６でゲル化の増進を示し、
前記酸性アミノ酸（複数可）のアミド化又はエステル化が前記ｐＨ感受性を除去する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記ゲル化条件（複数可）（特に、ｐＨ、塩濃度及び／又は温度）が、得られるヒドロゲルの特性、例えば、その機械的剛性、硬さ、多孔度に影響を与える、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体を水に溶解し、得られた溶液を針及びプリントヘッドによって分注してもよい、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
組織化後に、前記ペプチド及び／又はペプチド模倣体への、好ましくは前記極性官能基（複数可）への、さらなる化合物（複数可）の結合又は連結を含み、
前記さらなる化合物（複数可）は、
生理活性分子又は部分、
例えば成長因子、サイトカイン、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン、プロドラッグ、薬物、ビタミン、抗原、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマーを含むが、これらに限定されない）、サッカリド；
標識（複数可）、色素（複数可）、
例えばイメージング造影剤；
病原体、
例えばウイルス、細菌及び寄生虫；
マイクロ及びナノ粒子；又は
これらの組み合わせ
から選択することができる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記ペプチド及び／又はペプチド模倣体が、前記ヒドロゲルの総重量に対して、０．１％〜３０％（重量／重量）、好ましくは０．１％〜２０％（重量／重量）、より好ましくは０．１％〜１０％（重量／重量）、より好ましくは０．１％〜５％（重量／重量）、よりいっそう好ましくは０．１％〜３％（重量／重量）の範囲の濃度で存在する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
ゲル化前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合を含み、
前記細胞が、患者試料（線維芽細胞、髄核）から単離された、幹細胞（間葉系、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞及び初代細胞であってもよく、
好ましくは、ゲル化前又は中に、ヒドロゲルによって共カプセル化されるさらなる化合物（複数可）の添加を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加を含み、前記細胞が、幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよい、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
（１）ゲル化前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合を含み、
（２）その後、プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加を含み、
（１）及び（２）の前記細胞は、同じであり、又は異なり、
幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよい、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３１】
ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）への架橋剤の添加を含み、
前記架橋剤が、好ましくは、短鎖リンカー、直鎖状及び分岐ポリマー、生理活性分子又は部分と結合しているポリマーを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体を水溶液又は極性溶媒に溶解する工程を含む、ヒドロゲルを調製する方法。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体の刺激応答性ゲル化工程を含み、
前記刺激（単数／複数）又はゲル化条件（複数可）がｐＨ、塩濃度及び／又は温度から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体が、極性頭部基として塩基性アミノ酸（複数可）、例えば、リシン又はリシン様分子、好ましくはアミド化塩基性アミノ酸（複数可）を含み、
ゲル化工程が、塩の存在下、生理条件（例えばＰＢＳ又は０．９％食塩水及びＰＢＳ）で及び／又は生理的ｐＨより上のｐＨ、好ましくはｐＨ７〜１０で行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体が、極性頭部基として酸性アミノ酸（複数可）を含み、
ゲル化工程が、生理的ｐＨ７未満のｐＨ、好ましくはｐＨ２〜６で行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
溶解されたペプチド及び／又はペプチド模倣体が、さらに加温又は加熱され、その温度が、２０℃〜９０℃、好ましくは約３０℃〜７０℃、より好ましくは約３７℃〜７０℃の範囲である、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体が、０．０１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解される、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
連続繊維を調製する方法であって、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体を水などの水溶液に溶解する工程と、
得られた溶液を針、プリントヘッド、細管及び／又はマイクロ流体デバイスによってＰＢＳなどの緩衝溶液に分注する工程と
を含む方法。
【請求項３９】
ゲル化／自己組織化工程前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化されるさらなる化合物（複数可）の添加工程を含み、
前記さらなる化合物（複数可）は、
生理活性分子又は部分、
例えば成長因子、サイトカイン、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン、プロドラッグ、薬物、ビタミン、抗原、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマーを含むが、これらに限定されない）、サッカリド；
標識（複数可）、色素（複数可）、
例えばイメージング造影剤；
病原体、
例えばウイルス、細菌及び寄生虫；
量子ドット、ナノ及びマイクロ粒子；又は
これらの組み合わせ
から選択することができる、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ゲル化／自己組織化工程前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合工程を含み、
前記細胞が、患者試料（線維芽細胞、髄核）から単離された、幹細胞（間葉系、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞及び初代細胞であってもよく、
好ましくは、ゲル化工程前又は中に、ヒドロゲルによって共カプセル化されるさらなる化合物（複数可）（例えば、請求項３９に記載のもの）の添加工程を含む、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加工程を含み、前記細胞が、幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよい、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
（１）ゲル化工程前又は中の、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合工程、及び
（２）その後、プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加工程
を含み、
（１）及び（２）の前記細胞が、同じであり、又は異なり、
幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよい、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
ゲル化／自己組織化工程前、中又は後に、ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）への架橋剤の添加工程を含み、
前記架橋剤が、好ましくは、短鎖リンカー、直鎖状及び分岐ポリマー、生理活性分子又は部分（例えば、請求項４０に記載の物）と結合しているポリマーを含み、
前記架橋剤が、自己組織化中に前記ペプチド及び／又はペプチド模倣体（複数可）と静電相互作用することが好ましい、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
異なるペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）の使用を含む、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法によって得られるヒドロゲルの使用であって、
オリゴヌクレオチドがヒドロゲル中にカプセル化され、細胞が前記ヒドロゲル上に共カプセル化又は播種される、基質媒介遺伝子送達のための使用。
【請求項４６】
２Ｄミニヒドロゲルアレイを得るための、
好ましくは、プリンター、ピンツール及びマイクロコンタクトプリンティングを使用することを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用、又は請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法によって得られるヒドロゲルの使用。
【請求項４７】
電流を伝導する電気回路又は圧電面に２Ｄミニヒドロゲルをプリントすることを含む、請求項４２に記載の使用。
【請求項４８】
注射剤としての又は注射剤治療のための、
好ましくは、注射可能な足場、注射可能なインプラント、及び／又はインプラント可能な足場としての、
例えば椎間板変性症の処置のための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用、又は請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法によって得られるヒドロゲルの使用。
【請求項４９】
バイオプリンティング、例えば３Ｄ微小液滴プリンティング、及びバイオ成形を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用、又は請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法によって得られるヒドロゲルの使用。
【請求項５０】
３Ｄオルガノイド構造又は３Ｄ高分子生物学的構築物を得るための、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
３Ｄでヒドロゲルにパターン形成するための鋳型（例えば、シリコーンの鋳型）の使用を含む、請求項４９又は５０に記載の使用。
【請求項５２】
異なる細胞／細胞タイプを含む、
好ましくは、共カプセル化されたさらなる化合物（複数可）（例えば請求項３７に記載のもの）及び／又は架橋剤（例えば請求項３９に記載のもの）を含む、
多細胞構築物を得るための、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
カプセル化された細胞、及びプリントされた／作製された足場の表面に堆積された又はプリントされた細胞を含む、３Ｄ細胞構築物又は足場を得るための、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
多細胞構築物を得るための方法であって、
請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法によってヒドロゲルを調製する工程であり、
ゲル化／自己組織化段階前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化される様々な細胞又は細胞タイプの添加又は混合段階を含み、
前記細胞は、患者試料（線維芽細胞、髄核）から単離された、幹細胞（間葉系、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞及び初代細胞であってもよく、
好ましくは、ゲル化段階前又は中に、ヒドロゲルによって共カプセル化されるさらなる化合物（複数可）（例えば請求項３９に記載のもの）の添加段階を含み、
任意選択で、ゲル化／自己組織化段階前又は中に、ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）への架橋剤（例えば請求項４１に記載のもの）の添加段階を含む工程、
多細胞構築物を得る工程
を含む、方法。
【請求項５５】
多細胞構築物を得るための方法であって、
請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法によってヒドロゲルを調製する工程であり、
（１）ゲル化段階前又は中の、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合段階、及び
（２）その後、プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加段階
を含み、
（１）及び（２）の前記細胞は異なり、並びに
幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよく、
好ましくは、ゲル化段階前又は中に、ヒドロゲルによって共カプセル化されるさらなる化合物（複数可）（例えば請求項３９に記載のもの）の添加段階を含み、
任意選択で、ゲル化／自己組織化段階前又は中に、ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）への架橋剤（例えば請求項４１に記載のもの）の添加段階を含む工程、
多細胞構築物を得る工程
を含む、方法。
【請求項５６】
得られる多細胞構築物が、鋳型（例えばシリコーンの鋳型）内で形成される、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
好ましくはマイクロドメインを含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法に従って得られる多細胞構築物。
【請求項５８】
請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法によって得られる３Ｄ生物学的構築物、又は請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法に従って得られる多細胞構築物の、
生体分子ライブラリーのスクリーニング、細胞挙動、病原体の感染力及び疾患進行の研究、感染患者試料のスクリーニング、薬効及び毒性の評価のためのオルガノイドモデル、
再生医療のための組織工学によって作製されたインプラント、及び／又は
インビトロの疾患モデル
としての使用。
【請求項５９】
細胞ベースのアッセイの調製、
好ましくは、患者検体を同定するための、より好ましくは、天然表現型を喪失した初代細胞を感染させない病原体（例えばデング、マラリア、ノロウイルス）を含有する患者検体を同定するための、細胞ベースのアッセイの調製；
目的の病原体（複数可）を同定して増殖させるための感染細胞の回収、
好ましくは、感染機序（複数可）を解明するための、並びに／又は病原体感染及び／若しくは複製を阻害する分子の設計を可能にするための前記回収
のための、請求項４９〜５３又は請求項５８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己組織化でき、（ナノ繊維状）ヒドロゲルを形成できるペプチド、ペプトイド及び／又はペプチド模倣体のバイオファブリケーションにおける使用に関する。本発明は、さらに、ヒドロゲルを調製する方法、及び連続繊維を調製する方法、及び被定義の正確な形状を有する多細胞構築物を得る方法に関する。本発明は、さらに、ミニヒドロゲルアレイ及び３Ｄオルガノイド構造又は３Ｄ高分子生物学的構築物を得るためのそのようなヒドロゲルの様々な使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
自己組織化は、秩序ある三次元及び生体適合性ナノ生体材料の設計に向けての洗練された好都合な「ボトムアップ」アプローチである。構成要素間の高特異的相互作用のため、再生可能な高分子ナノ構造を得ることができる。これらの分子間相互作用は超分子構造を構築し、主として非共有結合性静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス力などである。超分子化学又は生物学は、化学種又は生物学的種の会合によって形成される膨大な二又は三次元複合構造及び物体を収集するものである。これらの会合は、分子相補性又は分子認識及び自己組織化の原理によって統制される。分子間会合の規則の知識を用いて、様々な生物医学的又は技術的応用のための膜、薄膜、層、ミセル、細管、ゲルの形態の多分子集合体を設計することができる（Ｊ．−Ｍ．Ｌｅｈｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５、２４００〜２４０３、２００２）。
【０００３】
ペプチドは、超分子構造を作製するための、多目的に利用できる構成要素である。アミノ酸配列による規定に応じて特異的二次構造をとるペプチドの能力は、階層的三次元（３Ｄ）高分子構造、ナノスケール特徴部及び調節可能な物理的性質を有する自己組織化生体材料の設計のユニークなプラットフォームをもたらす（Ｓ．Ｚｈａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、１１７１〜１１７８、２００３）。ペプチドは、例えば、組織化してナノチューブになることができ（米国特許第７，１７９，７８４号）、又は大量の約９８〜９９％固定化された水、すなわち水溶液を伴う三次元足場からなる超分子ヒドロゲルになることができる。ペプチドベースの生体材料は、生物工学、医学での可能性のある応用、及びさらには技術的応用のための強力なツールである。個々の特定に依存して、これらのペプチドベースのヒドロゲルは、組織工学、再生医療のための新規材料の開発において、薬物及びワクチン送達ビヒクルとして、又は薬学研究及び診断用のペプチドチップとして役立つと考えられる（Ｅ．Ｐｌａｃｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、８、４５７〜４７０、２００９）。分子電子デバイスの開発のためのゲルなどのペプチドベースの自己組織化生体材料の使用への関心も高い（Ａ．Ｒ．Ｈｉｒｓｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．、第４７版、８００２〜８０１８、２００８）。
【０００４】
外部操作、例えば、温度、ｐＨ、機械的影響、又は動的膨潤、収縮若しくは分解挙動での他の刺激に反応する、様々な「スマートペプチドヒドロゲル」が生み出された。それにもかかわらず、これらの生体材料は、例えば細胞外マトリクス（ＥＣＭ）又は軟骨組織などのような天然組織の生物学的変動を模倣するほどにはまだ「進歩」していない。ペプチドヒドロゲルの有意義な使用における難題は、代替する天然組織を「空間充填剤」又は機械的足場として模倣することに加えて、生化学的シグナル、及び含有細胞を「インビボ」条件下で正しい位置に保持する生理的要求を理解し、そのようなシグナル及び要求に対処することである（Ｒ．Ｆａｉｒｍａｎ及びＫ．Ａｋｅｒｆｅｌｄｔ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５、４５３〜４６３、２００５）。
【０００５】
好適なヒドロゲルの合理的設計のためにペプチド配列と構造との関係を理解し、制御するための多大な努力がなされてきた。一般に、ヒドロゲルは、絡み合って網目を形成する繊維などの巨視的構造を含有する。ペプチドベースのヒドロゲルの大部分は、繊維に組織化するβプリーツシートを構成要素として用いている（Ｓ．Ｚｈａｎｇら、ＰＮＡＳ、９０、３３３４〜３３３８、１９９３；Ａ．Ａｇｇｅｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３８６、２５９〜２６２、１９９７など）。βシート構造に基づく材料に加えて、αヘリックスペプチドから自己組織化ヒドロゲルを得ることも可能である（Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、３８９〜３９２、１９９８；Ｃ．Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３９７、４１７〜４２０、１９９９；Ｃ．Ｇｒｉｂｂｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７、１０３６５〜１０３７１、２００８；Ｅ．Ｂａｎｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、８、５９６〜６００、２００９など）。
【０００６】
それにもかかわらず、現在既知のペプチドヒドロゲルは、殆どの場合、低い硬さを伴い、場合によっては、好ましくない生理的特性及び／又は複雑性、並びに高い生産コストにつながるそれらの実質的な処理の要求を伴う。したがって、容易に形成され、非毒性であり、標準的な応用に十分な高さの硬さを有するペプチドヒドロゲルの必要性が、広く認知されている。上記ヒドロゲルは、生理活性部分（例えば、核酸、小分子治療薬、化粧品及び抗菌剤）の送達に、並びに／又は細胞のインビボ及びインビトロでの成長を支援し、天然組織の再生を助長する生物模倣型足場としての使用に、並びに／又は２Ｄ及び／又は３Ｄバイオファブリケーションでの使用にも好適であるべきである。
【０００７】
「バイオファブリケーション」は、生体材料構成要素から２Ｄ及び３Ｄ構造を生成するために付加製造（すなわちプリンティング）及び成形などの技術を用いる。ファブリケーションプロセス中に生理活性部分及び細胞を正確に取り込むことができる。「バイオプリンティング」の特定の例では、コンピューター援用デバイスを使用して、層ごとのアプローチを用いて生体材料構成要素（インク）を所定の指定された３Ｄ形状に正確に堆積させる。これらの構造のサイズは、マイクロスケールからより大きい構造に及ぶ。付加要素、例えば、成長因子、サイトカイン、ビタミン、無機物、オリゴヌクレオチド、小分子薬及び他の生理活性部分、並びに様々な細胞タイプも、同時に又は後で正確に堆積させることができる。生物学的に不活性な成分を支持体又は充填剤として利用して、生体組織を模倣するために使える内部空間を作ることができる。その後、そのような生物学的構築物を埋め込むことができ、又は使用して、細胞及び／若しくは生体材料間の相互作用を研究すること、並びに３Ｄ疾病モデルを開発することができる。「成形」の特定の例では、生体材料構成要素を、関連する生理活性部分及び細胞と共に、特定の形及び寸法のテンプレートに堆積させる（Ｍａｌｄａ  Ｊ．ら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．（２０１３）；Ｍｕｒｐｈｙ  Ｓ．Ｖら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏ−ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（２０１２））。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、上記要求の少なくとも一部を現在利用可能なヒドロゲルより高度に満たし、上述の制限によって制約されない、特に、バイオファブリケーションにおける使用に好適である、ヒドロゲルを形成できる生体適合性化合物を提供することが望ましい。
【０００９】
本発明の目的は、一般式Ｉ：
Ｚａ−（Ｘ）ｂ−（Ｙ）ｃ−Ｚ’ｄ        Ｉ
（式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり、
ａは、０又は１、好ましくは１であり、
Ｘは、出現ごとに、脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体からなる群から独立して選択され、全体の疎水性は、Ｎ末端からＣ末端へと減少し、
ｂは、１〜７の整数であり、
Ｙは、極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体からなる群から選択され、
ｃは、０、１又は２であり、
Ｚ’は、Ｃ末端極性頭部基であり、
ｄは、１であり、
及びｂ＋ｃは少なくとも２である）
を有する、自己組織化及び（ナノ繊維状）ヒドロゲルの形成が可能なペプチド及び／又はペプチド模倣体をバイオファブリケーションに使用することによって解決される。
【００１０】
本発明者らは、前記脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体が、ナノ繊維状ヒドロゲルを形成するために前記ペプチド及び／又はペプトイドのＮ末端からＣ末端へと疎水性の総合的減少を示す必要があることを発見した。
【００１１】
用語「ペプトイド」及び「ペプチド模倣体」は、本明細書では同義で用いており、ペプチドを模倣するように設計された分子を指す。ペプトイド又はペプチド模倣体は、既存のペプチドの修飾から生じることもあり、又はペプチドを模倣する類似の系を設計することによって生じることもある。これらの修飾は、天然に存在しないペプチドへの変化（例えば、主鎖改変、及び／又は非天然アミノ酸の組み込み）を含む。
【００１２】
特に、ペプトイドはペプチド模倣体のサブクラスである。ペプトイドの場合、側鎖は、ペプチド主鎖の窒素に、通常のペプチドとは別様に連結されている。ペプチド模倣体は、通常存在するアミノ酸が、類似しているが化学的に異なるアミノ酸と交換されている（例えばロイシンからノルロイシン）だけの、規則的ペプチド主鎖を有することができる。本開示では、これらの用語を同義で用いている。
【００１３】
本明細書において開示するペプチド、ペプチド模倣体及びペプトイドは、バイオプリンティング、（バイオ）成形を含めて、バイオファブリケーションにおいて、インク（複数可）又は（生体材料）構成要素（複数可）として好適である。
【００１４】
「バイオファブリケーション」は、本明細書で用いる場合、生体材料構成要素（すなわち、本発明によるペプチド及び／又はペプチド模倣体）から２Ｄ及び３Ｄ構造又は生物学的構築物を作るための技術、例えば、付加製造（すなわちバイオプリンティング）及び成形の使用を指す。ファブリケーションプロセス中に生理活性部分及び細胞を正確に取り込むことができる。「バイオプリンティング」の特定の例では、コンピューター援用デバイスを使用して、層ごとのアプローチを用いて生体材料構成要素（インク）を所定の指定された３Ｄ形状に正確に堆積させる。これらの構造のサイズは、マイクロスケールからより大きい構造に及ぶ。付加要素、例えば、成長因子、サイトカイン、ビタミン、無機物、オリゴヌクレオチド、小分子薬及び他の生理活性部分、並びに様々な細胞タイプも、同時に又は後で正確に堆積させることができる。生物学的に不活性な成分を支持体又は充填剤として利用して、生体組織を模倣するために使える内部空間を作ることができる。その後、そのような生物学的構築物を埋め込むことができ、又は使用して、細胞及び／若しくは生体材料間の相互作用を研究すること、並びに３Ｄ疾病モデルを開発することができる。「成形」の特定の例では、生体材料構成要素を、関連する生理活性部分及び細胞と共に、特定の形及び寸法のテンプレートに堆積させる（Ｍａｌｄａ  Ｊ．ら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．（２０１３）；Ｍｕｒｐｈｙ  Ｓ．Ｖら、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏ−ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（２０１２）を参照されたい）。
【００１５】
「バイオプリンティング」は、生体機能を向上又は置換するための、細胞、工学及び材料の方法と好適な生化学要素及び生理化学要素との併用である、組織工学分野の一部である。
【００１６】
組織工学は、組織（すなわち骨、軟骨、血管、膀胱、皮膚、筋肉など）の一部又は組織全体を修復又は置換するために用いられる。多くの場合、関係する組織は、適切に機能するために特定の機械的及び構造的特性を必要とする。
【００１７】
用語「バイオプリンティング」は、本明細書で用いる場合、天然に存在する組織の質感及び構造のコンピューターを駆使した模倣に基づいて、単独の又は細胞と混合された足場若しくはインク材料（本発明のペプチド／ペプチド模倣体若しくはそれらのヒドロゲル）を堆積させることにより組織類似体を作製する方法も含む。
【００１８】
バイオプリンティング用の「インク」又は「バイオインク」は、本明細書で用いる場合、高分子足場を構築するために逐次的に堆積された生体材料構成要素を指す。
【００１９】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体、並びに前記極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体は、Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸のいずれかである。
【００２０】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ノルロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）及びグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）からなる群から、好ましくは、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）及びグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）からなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸のすべて又は一部は、Ｎ末端からＣ末端への方向にアミノ酸サイズが小さくなる順に配列されており、脂肪族アミノ酸のサイズが、Ｉ＝Ｌ＞Ｖ＞Ａ＞Ｇと定義される。
【００２２】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸のＮ末端の最初のアミノ酸は、Ｇ、Ｖ又はＡであってもよく、あまり重要ではない。本発明者らは、この具体的な１番目のアミノ酸が、Ｎ末端からＣ末端への疎水性の減少というこの別の必須の要件ほど重要ではないことを発見した。
【００２３】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸は、
ＬＩＶＡＧ（配列番号１）、
ＩＬＶＡＧ（配列番号２）、
ＬＩＶＡＡ（配列番号３）、
ＬＡＶＡＧ（配列番号４）、
ＡＩＶＡＧ（配列番号５）
ＧＩＶＡＧ（配列番号６）
ＶＩＶＡＧ（配列番号７）
ＡＬＶＡＧ（配列番号８）
ＧＬＶＡＧ（配列番号９）
ＶＬＶＡＧ（配列番号１０）
ＩＶＡＧ（配列番号１１）
ＬＩＶＡ（配列番号１２）
ＬＩＶＧ（配列番号１３）
ＩＶＡ（配列番号４７）及び
ＩＶ（配列番号４８）
から選択される配列を有し、任意選択で、Ｎ末端のそのような配列の前にＡがある。
【００２４】
一実施形態において、脂肪族アミノ酸のすべて又は一部は、同一アミノ酸サイズの順序で配列され、この場合、前記同一アミノ酸サイズの順序で配列された脂肪族アミノ酸は２〜４アミノ酸長を有する配列を有することが好ましい。
【００２５】
例えば、前記同一サイズの順序で配列された脂肪族アミノ酸は、ＬＬＬＬ、ＬＬＬ、ＬＬ、ＩＩＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩ、ＶＶＶＶ、ＶＶＶ、ＶＶ、ＡＡＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧ及びＧＧから選択される配列を有する。
【００２６】
一実施形態において、ｂは、１〜７の整数、好ましくは２〜７又は２〜６の整数である。
【００２７】
一実施形態において、前記極性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、５−Ｎ−エチル−グルタミン（テアニン）、シトルリン、チオ−シトルリン、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、ホモシステイン、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、エチオニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アロトレオニン、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、ホモセリン、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ホモアルギニン、オルニチン（Ｏｒｎ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、Ｎ（６）−カルボキシメチルリシン、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）及びＮ（６）−カルボキシメチルリシンからなる群から選択され、
前記極性アミノ酸は、好ましくは、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、メチオニン、リシン、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）及び２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）からなる群から選択される。
【００２８】
一実施形態において、ｃは２であり、前記極性アミノ酸は同一のアミノ酸であるか、又はｃは１であり、前記極性アミノ酸は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、リシン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）及びヒスチジンのうちの１つ、
好ましくは、リシン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）及び２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）のうちの１つを含む。
【００２９】
一実施形態において、（Ｙ）ｂは、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｐ  Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ａｓｐ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ、Ｃｙｓ−Ａｓｐ、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ、Ｃｙｓ−Ｔｈｒ、Ｃｙｓ−Ｏｒｎ、Ｃｙｓ−Ｄａｂ、Ｃｙｓ−Ｄａｐ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ−Ｏｒｎ、Ｌｙｓ−Ｄａｂ、Ｌｙｓ−Ｄａｐ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ、Ｓｅｒ−Ｏｒｎ、Ｓｅｒ−Ｄａｂ、Ｓｅｒ−Ｄａｐ、Ｏｒｎ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ−Ｏｒｎ、Ｏｒｎ−Ｓｅｒ、Ｏｒｎ−Ｔｈｒ、Ｏｒｎ−Ｄａｂ、Ｏｒｎ−Ｄａｐ、Ｄａｂ−Ｌｙｓ、Ｄａｂ−Ｓｅｒ、Ｄａｂ−Ｔｈｒ、Ｄａｂ−Ｏｒｎ、Ｄａｂ−Ｄａｂ、Ｄａｂ−Ｄａｐ、Ｄａｐ−Ｌｙｓ、Ｄａｐ−Ｓｅｒ、Ｄａｐ−Ｔｈｒ、Ｄａｐ−Ｏｒｎ、Ｄａｐ−Ｄａｂ、Ｄａｐ−Ｄａｐから選択される配列を有する。
【００３０】
一実施形態において、（Ｘ）ａ−（Ｙ）ｂは、
ＬＩＶＡＧＤ（配列番号１４）、
ＩＬＶＡＧＤ（配列番号１５）、
ＬＩＶＡＡＤ（配列番号１６）、
ＬＡＶＡＧＤ（配列番号１７）、
ＡＩＶＡＧＤ（配列番号１８）、
ＬＩＶＡＧＥ（配列番号１９）、
ＬＩＶＡＧＫ（配列番号２０）、
ＩＬＶＡＧＫ（配列番号２１）、
ＬＩＶＡＧＴ（配列番号２２）、
ＡＩＶＡＧＴ（配列番号２３）、
ＡＩＶＡＧＫ（配列番号２４）、
ＬＩＶＡＤ（配列番号２５）、
ＬＩＶＧＤ（配列番号２６）、
ＩＶＡＤ（配列番号２７）、
ＩＶＡＫ（配列番号２８）、
ＩＩＩＤ（配列番号２９）、
ＩＩＩＫ（配列番号３０）、
ＩＶＤ（配列番号４９）、
ＩＩＤ（配列番号５０）、
ＬＶＥ（配列番号５１）、
ＩＶＥ（配列番号５２）、
ＬＶＤ（配列番号５３）、
ＶＩＥ（配列番号５４）、
ＶＩＤ（配列番号５５）、
ＶＬＤ（配列番号５６）、
ＶＬＥ（配列番号５７）、
ＬＬＥ（配列番号５８）、
ＬＬＤ（配列番号５９）、
ＩＩＥ（配列番号６０）、
ＩＤ（配列番号６１）、
ＩＥ（配列番号６２）、
ＬＩＶＡＧＯｒｎ（配列番号３１）、
ＩＬＶＡＧＯｒｎ（配列番号３２）、
ＡＩＶＡＧＯｒｎ（配列番号３３）、
ＬＩＶＡＧＤａｂ（配列番号３４）、
ＩＬＶＡＧＤａｂ（配列番号３５）、
ＡＩＶＡＧＤａｂ（配列番号３６）、
ＬＩＶＡＧＤａｐ（配列番号３７）、
ＩＬＶＡＧＤａｐ（配列番号３８）、
ＡＩＶＡＧＤａｐ（配列番号３９）、
ＩＶＯｒｎ（配列番号６３）、
ＩＶＤａｂ（配列番号６４）、
ＩＶＤａｐ（配列番号６５）、
ＩＶＫ（配列番号６６）、
ＶＩＫ（配列番号６７）、
ＶＩＯｒｎ（配列番号６８）、
ＶＩＤａｂ（配列番号６９）、
ＶＩＤａｐ（配列番号７０）、
ＬＩＶＡＧＤＤ（配列番号４０）、
ＬＩＶＡＧＥＥ（配列番号４１）、
ＬＩＶＡＧＫＣ（配列番号４２）、
ＬＩＶＡＧＳ（配列番号４３）、
ＩＬＶＡＧＳ（配列番号４４）、
ＡＩＶＡＧＳ（配列番号４５）、及び
ＩＬＶＡＧＴ（配列番号４６）
からなる群から選択される配列を有する。
【００３１】
一実施形態において、ａは１であり、前記Ｎ末端保護基Ｚは、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｒを有し、式中Ｒは、Ｈ、非置換又は置換アルキル、及び非置換又は置換アリールからなる群から選択され、式中Ｒは、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル及びイソブチルからなる群から選択される。
【００３２】
一実施形態において、前記Ｎ末端保護基Ｚはアセチル基である。
【００３３】
一実施形態において、前記Ｎ末端保護基Ｚは、天然及び合成アミノ酸誘導体を含む、ペプチド模倣体分子であり、前記ペプチド模倣体分子のＮ末端は、カルボン酸、アミド、アルコール、アルデヒド、アミン、イミン、ニトリル、尿素類似体、ホスフェート、カーボネート、スルフェート、ニトレート、マレイミド、ビニルスルホン、アジド、アルキン、アルケン、炭水化物、イミド、ペルオキシド、エステル、アリール、ケトン、スルファイト、ニトライト、ホスホネート及びシランからなる群から選択される官能基で修飾されていてもよい。
【００３４】
一実施形態において、前記Ｃ末端極性頭部基Ｚ’は、
極性官能基、
例えば（これらに限定されるものではないが）
−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＮＨＲ又は−ＣＯＮＲＲ’（ここで、Ｒ及びＲ’は、Ｈ、非置換又は置換アルキル、及び非置換又は置換アリールからなる群から選択される）、
−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＨＯ、マレイミド、イミドエステル、カルボジイミドエステル、イソシアネート；
小分子、
例えば（これらに限定されるものではないが）糖、アルコール、ヒドロキシ酸、アミノ酸、ビタミン、ビオチン、Ｌ−ドパ、チロキシン；
極性官能基で終わるリンカー、
例えば（これらに限定されるものではないが）エチレンジアミン、ＰＥＧ、カルボジイミドエステル、イミドエステル；
小分子又はビタミンに連結されているリンカー、
例えばビオチン、糖、ヒドロキシ酸に連結されているリンカー
から選択され、
前記極性頭部基Ｚ’は、好ましくはアミド基である。
【００３５】
一実施形態において、Ｃ末端アミノ酸は、さらに官能化される。
【００３６】
一実施形態において、前記極性官能基（複数可）を、
生理活性分子又は部分、
例えば成長因子、サイトカイン、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン、プロドラッグ、薬物、ビタミン、抗原、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマーを含むが、これらに限定されない）、サッカリド；
標識（複数可）、色素（複数可）、
例えばイメージング造影剤；
病原体、
例えばウイルス、細菌及び寄生虫；
マイクロ及びナノ粒子；又は
これらの組み合わせ
から選択される少なくとも１つの化合物の化学的結合又は連結のために使用することができ、
前記化学的結合をペプチド及び／又はペプチド模倣体の自己組織化前又は後に行うことができる。
【００３７】
一実施形態において、前記Ｃ末端極性頭部基Ｚ’は、天然及び合成アミノ酸誘導体を含む、ペプチド模倣体分子であり、前記ペプチド模倣体分子のＣ末端は、カルボン酸、アミド、アルコール、アルデヒド、アミン、イミン、ニトリル、尿素類似体、ホスフェート、カーボネート、スルフェート、ニトレート、マレイミド、ビニルスルホン、アジド、アルキン、アルケン、炭水化物、イミド、ペルオキシド、エステル、アリール、ケトン、スルファイト、ニトライト、ホスホネート及びシランからなる群から選択される官能基で修飾されていてもよい。
【００３８】
一実施形態において、ｂ＋ｃは、少なくとも２、好ましくは２〜９、より好ましくは３〜７又は２〜７である。
【００３９】
一実施形態において、本発明による使用は、自己組織化中のペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）の立体構造変化、
好ましくは、ランダムコイル立体構造からヘリックス中間構造（例えばαヘリックス細線維）へ、そして最終βターン又はクロスβ立体構造（例えば、（網目構造を形成する）ナノ繊維にさらに凝集及び／又は凝縮する細線維）への立体構造変化を含み、
上記立体構造変化は、ペプチド濃度、イオン環境、ｐＨ及び温度依存性であることが好ましい。
【００４０】
一実施形態において、本明細書で定義される、少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体は、ヒドロゲルを形成する。
【００４１】
ヒドロゲルは、下記でさらに詳細に説明するように、ペプチド及び／又はペプトイドの自己組織化によって形成する。
【００４２】
一実施形態では、本明細書で定義される、様々なペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）を使用してヒドロゲルを形成する。
【００４３】
様々なペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）は、アミノ酸配列、極性頭部基（複数可）、結合／連結されている化合物（例えば、様々な標識、生理活性分子など）又はそれらの組み合わせが異なる、ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）を指すことが好ましい。
【００４４】
一実施形態において、本発明による使用は、本明細書で定義される、少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体の刺激応答性ゲル化を含み、
前記刺激（単数／複数）又はゲル化条件（複数可）は、ｐＨ、塩濃度及び／又は温度から選択される。
【００４５】
用語「刺激応答性ゲル化」は、本明細書で用いる場合、塩溶液の添加、ｐＨ変化及び／又は温度変化によって開始又は増進される自己組織化を指す。このサブクラスペプチドヒドロゲルの場合、ペプチド溶液は、これらの刺激の存在下で流体からヒドロゲルに移行する。
【００４６】
一実施形態において、ペプチド及び／又はペプチド模倣体は、極性頭部基塩基性アミノ酸（複数可）、例えばリシン又はリシン様分子、好ましくはアミド化塩基性アミノ酸（複数可）を含み、
前記ペプチドは、刺激応答性ゲル化、好ましくは、塩の存在下、生理条件（例えば０．９％食塩水及びＰＢＳ）で及び／又は（例えばＮａＯＨの添加によって）生理的ｐＨより高いｐＨ、好ましくはｐＨ７〜１０でゲル化の増進を示す。
【００４７】
一実施形態において、上記ペプチド及び／又はペプチド模倣体は、極性頭部基として酸性アミノ酸（複数可）を含み、
前記ペプチドは、刺激応答性ゲル化、好ましくは、生理的ｐＨ７未満のｐＨ、好ましくはｐＨ２〜６でゲル化の増進を示し、
前記酸性アミノ酸（複数可）のアミド化又はエステル化は前記ｐＨ感受性を除去する。
【００４８】
一実施形態において、上記ゲル化条件（複数可）（特に、ｐＨ、塩濃度及び／又は温度）は、得られるヒドロゲルの特性、例えば、その機械的剛性、硬さ、多孔度に影響を与える。
【００４９】
一実施形態において、本明細書で定義する少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体を水に溶解し、得られた溶液を針及びプリントヘッドによって分注してもよい。
【００５０】
一実施形態において、本発明による使用は、
組織化後に、上記ペプチド及び／又はペプチド模倣体への、好ましくは上記極性官能基（複数可）への、さらなる化合物（複数可）の結合又は連結を含み、
前記さらなる化合物（複数可）は、
生理活性分子又は部分、
例えば成長因子、サイトカイン、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン、プロドラッグ、薬物、ビタミン、抗原、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマーを含むが、これらに限定されない）、サッカリド；
標識（複数可）、色素（複数可）、
例えばイメージング造影剤；
病原体、
例えばウイルス、細菌及び寄生虫；
マイクロ及びナノ粒子；又は
これらの組み合わせ
から選択することができる。
【００５１】
一実施形態において、上記ペプチド及び／又はペプチド模倣体は、前記ヒドロゲルの総重量に対して、０．１％〜３０％（重量／重量）、好ましくは０．１％〜２０％（重量／重量）、より好ましくは０．１％〜１０％（重量／重量）、より好ましくは０．１％〜５％（重量／重量）、よりいっそう好ましくは０．１％〜３％（重量／重量）の範囲の濃度で存在する。
【００５２】
一実施形態において、本発明による使用は、
ゲル化前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合を含み、
前記細胞は、患者試料（線維芽細胞、髄核）から単離された、幹細胞（間葉系、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞及び初代細胞であってもよく、
好ましくは、ゲル化前又は中に、ヒドロゲルによって共カプセル化されるさらなる化合物（複数可）の添加を含む。
【００５３】
一実施形態において、本発明による使用は、
プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加を含み、前記細胞は、幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよい。
【００５４】
一実施形態において、本発明による使用は、
（１）ゲル化前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合を含み、
（２）その後、プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加を含み、
（１）及び（２）の前記細胞は、同じであり、又は異なり、
幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよい。
【００５５】
一実施形態において、本発明による使用は、
ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）への架橋剤の添加を含み、
前記架橋剤は、好ましくは、短鎖リンカー、直鎖状及び分岐ポリマー、生理活性分子又は部分と結合しているポリマーを含む。
【００５６】
本発明の目的は、ヒドロゲルを調製する方法であって、本明細書で定義される少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体を水などの水溶液又はエタノールなどの極性溶媒に溶解する工程を含む方法によって解決される。
【００５７】
一実施形態において、本発明の方法は、本明細書で定義される少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体の刺激応答性ゲル化を含み、
前記刺激（単数／複数）又はゲル化条件（複数可）は、ｐＨ、塩濃度及び／又は温度から選択される。
【００５８】
一実施形態において、上記少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体は、極性頭部基として塩基性アミノ酸（複数可）、例えば、リシン又はリシン様分子、好ましくはアミド化塩基性アミノ酸（複数可）を含み、
ゲル化工程は、塩の存在下、生理条件（例えばＰＢＳ又は０．９％食塩水及びＰＢＳ）で及び／又は（例えばＮａＯＨの添加によって）生理的ｐＨより上のｐＨ、好ましくはｐＨ７〜１０で行われる。
【００５９】
一実施形態において、上記少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体は、極性頭部基として酸性アミノ酸（複数可）を含み、
ゲル化工程は、生理的ｐＨ７未満のｐＨ、好ましくはｐＨ２〜６で行われる。
【００６０】
一実施形態において、溶解されたペプチド及び／又はペプチド模倣体は、さらに加温又は加熱され、その温度は、２０℃〜９０℃、好ましくは約３０℃〜７０℃、より好ましくは約３７℃〜７０℃の範囲である。
【００６１】
一実施形態において、上記少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体は、０．０１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解される。
【００６２】
本発明の目的は、連続繊維を調製する方法であって、
本明細書で定義される少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチド模倣体を水などの水溶液に溶解する工程と、
得られた溶液を針、プリントヘッド、細管及び／又はマイクロ流体デバイスによってＰＢＳなどの緩衝溶液に分注する工程と
を含む方法によって解決される。
【００６３】
一実施形態において、方法は、ゲル化／自己組織化工程前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化されるさらなる化合物（複数可）の添加工程を含み、
前記さらなる化合物（複数可）は、
生理活性分子又は部分、
例えば成長因子、サイトカイン、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン、プロドラッグ、薬物、ビタミン、抗原、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマーを含むが、これらに限定されない）、サッカリド；
標識（複数可）、色素（複数可）、
例えばイメージング造影剤；
病原体、
例えばウイルス、細菌及び寄生虫；
量子ドット、ナノ及びマイクロ粒子；又は
これらの組み合わせ
から選択することができる。
【００６４】
一実施形態において、方法は、ゲル化／自己組織化工程前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合工程を含み、
前記細胞は、患者試料（線維芽細胞、髄核）から単離された、幹細胞（間葉系、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞及び初代細胞であってもよく、
好ましくは、ゲル化工程前又は中に、ヒドロゲルによって共カプセル化されるさらなる化合物（複数可）（例えば本明細書で定義されるもの）の添加工程を含む。
【００６５】
一実施形態において、方法は、プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加工程を含み、前記細胞は、幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよい。
【００６６】
一実施形態において、方法は、
（１）ゲル化工程前又は中の、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合工程、及び
（２）その後、プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加工程
を含み、
（１）及び（２）の前記細胞は、同じであり、又は異なり、
幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよい。
【００６７】
一実施形態において、方法は、ゲル化／自己組織化工程前、中又は後に、ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）への架橋剤の添加工程を含み、
前記架橋剤は、好ましくは、短鎖リンカー、直鎖状及び分岐ポリマー、生理活性分子又は部分（例えば本明細書で定義されるもの）と結合しているポリマーを含み、
前記架橋剤は、自己組織化中に上記ペプチド及び／又はペプチド模倣体（複数可）と静電相互作用することが好ましい。
【００６８】
一実施形態において、方法は、様々なペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）の使用を含む。
【００６９】
様々なペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）は、アミノ酸配列、極性頭部基（複数可）、結合／連結されている化合物（例えば、様々な標識、性活性分子など）又はそれらの組み合わせが異なる、ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）を指すことが好ましい。
【００７０】
本発明の目的は、本発明による（ヒドロゲルを調製する及び／又は連続繊維を調製する）方法によって得られるヒドロゲルの基質媒介遺伝子送達のための使用であって、
オリゴヌクレオチドがヒドロゲル中にカプセル化され、細胞が共カプセル化されるか、又は前記ヒドロゲル上に播種される、使用によって解決される。
【００７１】
本発明の目的は、２Ｄミニヒドロゲルアレイを得るための、本発明による（バイオファブリケーションのためのペプチド及び／若しくはペプチド模倣体の）使用又は本発明による（ヒドロゲルを調製する及び／若しくは連続繊維を調製する）方法によって得られるヒドロゲルの使用、
好ましくは、プリンター、ピンツール及びマイクロコンタクトプリンティングを使用することを含む上記使用
によって解決される。
【００７２】
本発明のマイクロアレイは、様々な生体分子、薬物、化合物、細胞などをカプセル化するヒドロゲルを含むことが好ましい。
【００７３】
一実施形態において、前記使用は、電流を伝導する電気回路又は圧電面に２Ｄミニヒドロゲルをプリントすることを含む。
【００７４】
本発明の目的は、本発明による（バイオファブリケーションのためのペプチド及び／若しくはペプチド模倣体の）使用又は本発明による（ヒドロゲルを調製する及び／若しくは連続繊維を調製する）方法によって得られるヒドロゲルの、
注射剤としての、又は注射剤治療のための、
例えば椎間板変性症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）の処置のための、
使用によって解決される。
【００７５】
注射剤は、好ましくは、注射可能な足場又は注射可能なインプラント、又はインプラント可能な足場である。
【００７６】
自己組織化特性のために、本発明の刺激応答性超短鎖ペプチドは、注射可能な足場の理想的な候補である。そのような足場は、生体内原位置で完全に組織化するやや粘性の溶液として注射することができる。異常形状の欠損部を十分に埋めて、天然組織との足場の一体化を助長することができる。これらの注射用製剤は、外科的に埋め込まなければならない、エレクトロスピニングなどの、ナノ繊維状足場を調製するエクスビボ技術に比べて有意な利点を提供する。生体内原位置ゲル化プロセス中にゲル化速度を調節できることが、臨床医による皮膚充填剤などの用途に望ましい形状へのヒドロゲル構築物の造形を可能にする。さらに、生体適合性及びインビボ安定性は、数カ月にわたって持続する必要があるインプラントにとって幸先がよい。剛性及び調整可能な機械的特性を考慮に入れて、本発明者らは、機械的に支持する役割を果たす、注射剤治療及びインプラント可能な足場の開発に、特に関心をもっている。
【００７７】
本発明の目的は、バイオプリンティング、例えば３Ｄ微小液滴プリンティング、及びバイオ成形（ｂｉｏｍｏｕｌｄｉｎｇ）を含む、本発明による（バイオファブリケーションのためのペプチド及び／若しくはペプチド模倣体の）使用又は本発明による（ヒドロゲルを調製する及び／若しくは連続繊維を調製する）方法によって得られるヒドロゲルの使用によって解決される。
【００７８】
一実施形態において、前記使用は、３Ｄオルガノイド構造又は３Ｄ高分子生物学的構築物のためのものである。
【００７９】
オルガノイド構造は、器官に似ている構造である。
【００８０】
用語「３Ｄオルガノイド構造」又は「３Ｄ高分子生物学的構築物」は、様々な細胞タイプが、様々な生化学的キュー（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｕｅｓ）を含有する３Ｄ足場に天然組織と似ている様式で組み込まれている試料を指す。これらの構築物は、インプラント、疾患モデル、並びに細胞間相互作用及び細胞−基質相互作用を研究するためのモデルとして使用できる可能性を秘めている。
【００８１】
一実施形態において、前記使用は、３Ｄでヒドロゲルにパターン形成するための鋳型（例えば、シリコーンの鋳型）の使用を含む。
【００８２】
一実施形態において、前記使用は、
異なる細胞／細胞タイプを含む、
好ましくは、共カプセル化されたさらなる化合物（複数可）（例えば本明細書で定義されるもの）及び／又は架橋剤（例えば本明細書において定義するもの）を含む、
多細胞構築物を得るためのものである。
【００８３】
一実施形態において、前記使用は、カプセル化された細胞及びプリントされた／作製された足場の表面に堆積された又はプリントされた細胞を含む、３Ｄ細胞構築物又は足場を得るためのものである。
【００８４】
一実施形態において、前記使用は、
好ましくは、患者検体を同定するための、より好ましくは、天然表現型を喪失した初代細胞を感染させない病原体（例えばデング、マラリア、ノロウイルス）を含有する患者検体を同定するための
細胞ベースのアッセイの調製、
目的の病原体（複数可）を同定して増殖させるための感染細胞の回収、
好ましくは、感染機序（複数可）を解明するための、並びに／又は病原体感染及び／若しくは複製を阻害する分子の設計を可能にするための
上記回収
のためのものである。
【００８５】
本発明の目的は、多細胞構築物を得るための方法であって、
本発明による（ヒドロゲルを調製するための及び／又は連続繊維を調製するための）方法によってヒドロゲルを調製する工程であり、
ゲル化／自己組織化段階前又は中に、ヒドロゲルによってカプセル化される様々な細胞又は細胞タイプの添加又は混合段階を含み、
前記細胞は、患者試料（線維芽細胞、髄核）から単離された、幹細胞（間葉系、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞及び初代細胞であってもよく、
好ましくは、ゲル化段階前又は中に、ヒドロゲルによって共カプセル化されるさらなる化合物（複数可）（例えば本明細書で定義されるもの）の添加段階を含み、
任意選択で、ゲル化／自己組織化段階前又は中に、ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）への架橋剤（例えば本明細書において定義するもの）の添加段階を含む工程、
多細胞構築物を得る工程
を含む、方法によって解決される。
【００８６】
本発明の目的は、多細胞構築物を得るための方法であって、
本発明による（ヒドロゲルを調製するための及び／又は連続繊維を調製するための）方法によってヒドロゲルを調製する工程であり、
（１）ゲル化段階前又は中の、ヒドロゲルによってカプセル化される細胞の添加又は混合段階、及び
（２）その後、プリントされたヒドロゲル上への細胞の添加段階
を含み、
（１）及び（２）の前記細胞は、異なり、並びに
幹細胞（成熟、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）、分化転換した前駆細胞、並びに初代細胞（患者から単離されたもの）及び細胞株（例えば、上皮、ニューロン、造血及び癌細胞）であってもよく、
好ましくは、ゲル化段階前又は中に、ヒドロゲルによって共カプセル化されるさらなる化合物（複数可）（例えば本明細書で定義されるもの）の添加段階を含み、
任意選択で、ゲル化／自己組織化段階前又は中に、ペプチド（複数可）及び／又はペプチド模倣体（複数可）への架橋剤（例えば本明細書で定義されるもの）の添加段階を含む工程、
多細胞構築物を得る工程
を含む、方法によって解決される。
【００８７】
一実施形態において、得られる多細胞構築物は、鋳型（例えばシリコーンの鋳型）内で形成される。
【００８８】
本発明の目的は、本発明による及び本明細書において上記で説明した多細胞構築物を得る方法によって得られる多細胞構築物、
好ましくは、マクロドメインを含む多細胞構築物
によって解決される。
【００８９】
本発明の目的は、本発明による（３Ｄ生物学的構築物を得るための）方法によって得られる３Ｄ生物学的構築物の、又は本発明による（多細胞構築物を得るための）方法によって得られる多細胞構築物の、
生体分子ライブラリーのスクリーニング、細胞挙動、病原体の感染力及び疾患進行の研究、感染患者試料のスクリーニング、薬効及び毒性の評価のためのオルガノイドモデル
再生医療のための組織工学によって作製されたインプラント、及び／又は
インビトロの疾患モデル
としての使用によって解決される。
【００９０】
一実施形態において、前記使用は、
細胞ベースのアッセイの調製、
好ましくは、患者検体を同定するための、より好ましくは、天然表現型を喪失した初代細胞を感染させない病原体（例えばデング、マラリア、ノロウイルス）を含有する患者検体を同定するための、細胞ベースのアッセイの調製；
目的の病原体（複数可）を同定して増殖させるための感染細胞の回収、
好ましくは、感染機序（複数可）を解明するための、並びに／又は病原体感染及び／若しくは複製を阻害する分子の設計を可能にするための回収
のためのものである。
【００９１】
両親媒性ペプチド
一実施形態において、本発明は、一般式Ｉ：
Ｚａ−（Ｘ）ｂ−（Ｙ）ｃ−Ｚ’ｄ      Ｉ
（式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり、
ａは、０又は１、好ましくは１であり、
Ｘは、出現ごとに、脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体からなる群から独立して選択され、全体の疎水性は、Ｎ末端からＣ末端へと減少し、
ｂは、１〜７の整数であり、
Ｙは、極性アミノ酸及び極性アミノ酸誘導体からなる群から選択され、
ｃは、０でなく、１又は２であり、
Ｚ’は、Ｃ末端極性頭部基であり、
ｄは、１であり、
ｂ＋ｃは少なくとも２である）
を有する、自己組織化及び（ナノ繊維状）ヒドロゲルの形成が可能なペプチド、ペプチド模倣体及び／又はペプトイドの使用を提供する。
【００９２】
これらのペプチド、ペプチド模倣体及び／又はペプトイドを、水を捕捉してヒドロゲルを形成する三次元網目構造に自己組織化する、両親媒性ペプチド又はペプチド両親媒性物質と言うことができる。上記ペプチド両親媒性物質は、記載した式を有するペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド又はペプチド結合体であってもよい。
【００９３】
以下に、
ｃが０である
ペプチド、ペプチド模倣体及び／又はペプドイドの実施形態をさらに開示する：
【００９４】
疎水性ペプチド
本発明の目的は、一般式ＩＩを有する、（ナノ繊維状）ヒドロゲルを形成できる疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体によって解決される：
Ｚ−（Ｘ）ａ−Ｚ’ｂ        ＩＩ
（式中、
Ｚは、Ｎ末端保護基であり、
Ｘは、脂肪族アミノ酸の疎水性アミノ酸配列であり、前記脂肪族アミノ酸は、出現ごとに、脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体からなる群から独立して選択され、
ａは、２〜６、好ましくは２〜５の整数であり、
Ｚ’は、Ｃ末端基であり、
ｂは、０又は１である）。
【００９５】
本発明者らは、前記脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体が、前記ペプチド及び／又はペプチド模倣体のＮ末端からＣ末端へと疎水性の総合的減少を示す必要があることを発見した。
【００９６】
用語「ペプトイド」及び「ペプチド模倣体」は、本明細書では同義で用いており、ペプチドを模倣するように設計された分子を指す。ペプトイド又はペプチド模倣体は、既存のペプチドの修飾から生じることもあり、又はペプチドを模倣する類似の系を設計することによって生じることもある。これらの修飾は、天然に存在しないペプチドへの変化（例えば、主鎖改変、及び／又は非天然アミノ酸の組み込み）を含む。上記参照。
【００９７】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸及び脂肪族アミノ酸誘導体は、Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸のいずれかである。
【００９８】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ノルロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）及びグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）からなる群から、好ましくは、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）及びグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）からなる群から選択される。
【００９９】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸のすべて又は一部は、Ｎ末端からＣ末端への方向にアミノ酸サイズが小さくなる順に配列されており、脂肪族アミノ酸のサイズは、Ｉ＝Ｌ＞Ｖ＞Ａ＞Ｇと定義される。
【０１００】
一実施形態において、アミノ酸サイズが小さくなる順番で配列されている前記脂肪族アミノ酸は、反復又は非反復配列である配列を有する。
【０１０１】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸のＮ末端の最初のアミノ酸は、Ｇ、Ｖ又はＡであってもよく、あまり重要ではない。本発明者らは、この特定の１番目のアミノ酸が、Ｎ末端からＣ末端への疎水性の減少というこの別の必須の要件ほど重要ではないことを発見した。
【０１０２】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸の１番Ｎ末端のアミノ酸は、Ｇ、Ｖ又はＡである。
【０１０３】
一実施形態において、前記脂肪族アミノ酸は、
ＩＬＶＡＧ（配列番号１）、
ＬＩＶＡＧ（配列番号２）、
ＩＶＡＧ（配列番号３）、
ＬＶＡＧ（配列番号４）、
ＩＬＶＡ（配列番号５）、
ＬＩＶＡ（配列番号６）、
ＩＶＧ（配列番号１３）、
ＶＩＧ（配列番号１４）、
ＩＶＡ（配列番号１５）、
ＶＩＡ（配列番号１６）、
ＶＩ（配列番号１７）及び
ＩＶ（配列番号１８）
から選択される配列を有し、任意選択で、Ｎ末端のそのような配列の前にＧ、Ｖ又はＡがある、例えば、
ＡＩＶＡＧ（配列番号７）、
ＧＩＶＡＧ（配列番号８）、
ＶＩＶＡＧ（配列番号９）、
ＡＬＶＡＧ（配列番号１０）、
ＧＬＶＡＧ（配列番号１１）、
ＶＬＶＡＧ（配列番号１２）。
【０１０４】
一実施形態において、（Ｘ）ａは、配列番号１〜１８からなる群から選択される配列、
好ましくは、配列番号１及び配列番号２を有する配列を有する。
【０１０５】
一実施形態において、脂肪族アミノ酸のすべて又は一部は、同一アミノ酸サイズの順序で配列され、この場合、前記同一アミノ酸サイズの順序で配列された脂肪族アミノ酸は２〜４アミノ酸長を有する配列を有することが好ましい。
【０１０６】
例えば、前記同一サイズの順序で配列された脂肪族アミノ酸は、ＬＬＬＬ、ＬＬＬ、ＬＬ、ＩＩＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩ、ＶＶＶＶ、ＶＶＶ、ＶＶ、ＡＡＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧ及びＧＧから選択される配列を有する。
【０１０７】
前記Ｎ末端保護基Ｚは、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｒを有し、式中Ｒは、Ｈ、非置換又は置換アルキル、及び非置換又は置換アリールからなる群から選択され、式中Ｒは、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル及びイソブチルからなる群から選択される。
【０１０８】
一実施形態において、前記Ｎ末端保護基Ｚはアセチル基である。
【０１０９】
一実施形態において、前記Ｎ末端保護基Ｚは、天然及び合成アミノ酸誘導体を含む、ペプチド模倣体分子であり、前記ペプチド模倣体分子のＮ末端は、カルボン酸、アミド、アルコール、アルデヒド、アミン、イミン、ニトリル、尿素類似体、ホスフェート、カーボネート、スルフェート、ニトレート、マレイミド、ビニルスルホン、アジド、アルキン、アルケン、炭水化物、イミド、ペルオキシド、エステル、アリール、ケトン、スルファイト、ニトライト、ホスホネート及びシランからなる群から選択される官能基で修飾されていてもよい。
【０１１０】
一実施形態において、前記Ｃ末端基Ｚ’は、非アミノ酸であり、好ましくは、小分子、官能基及びリンカーの群から選択される。そのようなＣ末端基Ｚ’は、本発明のペプチド及び／又はペプチド模倣体を官能化するために使用される極性又は非極性部分であってもよい。
【０１１１】
一実施形態において、前記Ｃ末端基Ｚ’は、
官能基、例えば極性又は非極性官能基、
例えば（これらに限定されるものではないが）
−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＮＨＲ又は−ＣＯＮＲＲ’（ここで、Ｒ及びＲ’は、Ｈ、非置換又は置換アルキル、及び非置換又は置換アリールからなる群から選択される）、
−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＨＯ、マレイミド、イミドエステル、カルボジイミドエステル、イソシアネート；
小分子、
例えば（これらに限定されるものではないが）糖、アルコール、ヒドロキシ酸、アミノ酸、ビタミン、ビオチン、Ｌ−ドパ、チロキシン；
極性官能基で終わるリンカー、
例えば（これらに限定されるものではないが）エチレンジアミン、ＰＥＧ、カルボジイミドエステル、イミドエステル；
小分子又はビタミンに連結されているリンカー、
例えばビオチン、糖、ヒドロキシ酸に連結されているリンカー。
【０１１２】
一実施形態において、前記Ｃ末端基Ｚ’を、
生理活性分子又は部分、
例えば成長因子、サイトカイン、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン、プロドラッグ、薬物、ビタミン、抗原、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマーを含むが、これらに限定されない）、サッカリド；
標識（複数可）、色素（複数可）、
例えば蛍光又は放射性標識（複数可）、イメージング造影剤；
病原体、
例えばウイルス、細菌及び寄生虫；
マイクロ及びナノ粒子；又は
これらの組み合わせ
から選択される少なくとも１つの化合物の化学的結合又は連結のために使用することができ、
前記化学的結合をペプチド及び／又はペプチド模倣体の自己組織化前又は後に行うことができる。
【０１１３】
一実施形態において、ペプチド及び／又はペプチド模倣体のＣ末端は、（Ｃ末端基又はリンカーを使用することなく）官能化され、例えば、
生理活性分子又は部分、
例えば成長因子、サイトカイン、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン、プロドラッグ、薬物、ビタミン、抗原、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマーを含むが、これらに限定されない）、サッカリド；
標識（複数可）、色素（複数可）、
例えば蛍光又は放射性標識（複数可）、イメージング造影剤；
病原体、
例えばウイルス、細菌及び寄生虫；
マイクロ及びナノ粒子；又は
これらの組み合わせ
から選択される少なくとも１つの化合物の化学的結合又は連結によって官能化され、
前記化学的結合は、ペプチド及び／又はペプチド模倣体の自己組織化前又は後に行うことができる。
【０１１４】
一実施形態において、前記Ｃ末端基Ｚ’は、天然及び合成アミノ酸誘導体を含む、ペプチド模倣体分子であり、前記ペプチド模倣体分子のＣ末端は、カルボン酸、アミド、アルコール、アルデヒド、アミン、イミン、ニトリル、尿素類似体、ホスフェート、カーボネート、スルフェート、ニトレート、マレイミド、ビニルスルホン、アジド、アルキン、アルケン、炭水化物、イミド、ペルオキシド、エステル、アリール、ケトン、スルファイト、ニトライト、ホスホネート及びシランからなる群から選択される官能基で修飾されていてもよい。
【０１１５】
一実施形態において、本発明による疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体は、生理条件で、周囲温度で、１日から少なくとも６カ月まで、好ましくは少なくとも８カ月まで、より好ましくは少なくとも１２カ月までの期間、水溶液中で安定している。
【０１１６】
一実施形態において、本発明による疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体は、生理条件で、９０℃以下の温度で、少なくとも１時間、水溶液中で安定している。
【０１１７】
本発明の目的は、
（ａ）本発明の少なくとも１つの疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体、及び
（ｂ）ヒドロゲルを形成できる少なくとも１つの疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体であって、一般式：
Ｚ−（Ｘ）ａ−Ｎ’ｂ
（式中、
Ｚは、本発明の疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体について本明細書で定義される通りであり、
Ｘは、本発明の疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体について本明細書で定義される通りであり、
ａは、本発明の疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体について本明細書で定義される通りであり、
Ｎ’は、本発明の疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体について本明細書で定義される通りの極性Ｃ末端基であるＺ’とは異なる、非極性Ｃ末端基であり、
好ましくは、カルボン酸、アミド、アルコール、ビオチン、マレイミド、糖及びヒドロキシ酸であり、
ｂは、０又は１である）
を有する疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体を含む組成物又は混合物によって解決される。
【０１１８】
本発明の目的は、本発明の疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体を含むヒドロゲルによって解決される。
【０１１９】
一実施形態において、ヒドロゲルは、周囲温度で、少なくとも７日、好ましくは少なくとも２〜４週間、より好ましくは少なくとも１〜６カ月の期間、水溶液中で安定している。
【０１２０】
一実施形態において、ヒドロゲルは、２より大きい貯蔵弾性率Ｇ’対損失弾性率Ｇ”比を特徴とする。
【０１２１】
一実施形態において、ヒドロゲルは、０．０２Ｈｚ〜１６Ｈｚの範囲の周波数での１００Ｐａ〜８０，０００Ｐａの貯蔵弾性率Ｇ’を特徴とする。
【０１２２】
一実施形態において、ヒドロゲルは、コラーゲン又はその加水分解形態（ゼラチン）より高い機械的強度を有する。
【０１２３】
本発明の目的は、
（ａ）本発明の少なくとも１つの疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体、及び
（ｂ）非極性頭部基を有する少なくとも１つの疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体
を含むヒドロゲルによって解決される。
【０１２４】
「非極性頭部基を有する」前記少なくとも１つの「疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体」は、ヒドロゲルを形成でき、一般式：
Ｚ−（Ｘ）ａ−Ｎ’ｂ
（式中、
Ｚ、Ｘ及びａは、本発明の疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体について本明細書で定義される通りであり、
Ｎ’は、本発明の疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体について本明細書で定義される通りの極性Ｃ末端基であるＺ’とは異なる、非極性Ｃ末端基であり、
好ましくは、カルボン酸、アミド、アルコール、ビオチン、マレイミド、糖及びヒドロキシ酸であり、
ｂは、０又は１である）
を有する。
【０１２５】
一実施形態において、ヒドロゲルは、本発明の疎水性ペプチド及び／若しくはペプチド模倣体の繊維、又は上記で定義する通りの非極性頭部基を有する疎水性ペプチド及び／若しくはペプチド模倣体の繊維を含み、前記繊維が微生物、ウイルス粒子、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、核酸、オリゴ糖、多糖、ビタミン、無機分子、合成ポリマー、小有機分子、マイクロ若しくはナノ粒子又は医薬活性化合物の少なくとも１つを捕捉できる網目構造を規定する。
【０１２６】
一実施形態において、ヒドロゲルは、疎水性ポリマーの繊維の網目構造によって捕捉されている微生物、ウイルス粒子、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、核酸、オリゴ糖、多糖、ビタミン、無機分子、合成ポリマー、小有機分子、マイクロ若しくはナノ粒子又は医薬活性化合物の少なくとも１つを含む。
【０１２７】
一実施形態において、疎水性ポリマーの繊維は、両親媒性ポリマーの繊維の網目構造によって捕捉されている微生物、ウイルス粒子、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、核酸、オリゴ糖、多糖、ビタミン、無機分子、合成ポリマー、小有機分子、マイクロ若しくはナノ粒子又は医薬活性化合物の少なくとも１つに連結されている。
【０１２８】
一実施形態において、ヒドロゲルは、燃料電池、太陽電池、電子セル（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ）、バイオセンシングデバイス、医療機器、インプラント、医薬組成物及び化粧品組成物の少なくとも１つに含まれる。
【０１２９】
一実施形態において、ヒドロゲルは注射可能である。
【０１３０】
本発明の目的は、以下のものの少なくとも１つにおける本発明によるヒドロゲルの使用によって解決される：
医薬活性化合物の放出及び／又は生理活性部分の送達、
医療用具キット、
燃料電池、
太陽電池、
電子セル、
再生医療及び組織再生、
創傷治癒、
２Ｄ及び３Ｄ合成細胞培養基材、
幹細胞治療、
注射剤治療、
バイオセンサー開発、
生体機能化表面、
バイオファブリケーション、例えばバイオプリンティング、並びに
遺伝子治療。
【０１３１】
使用について、本発明者らは、バイオファブリケーションにおける上記使用並びに後続の実施形態及び方法（これらもまた疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体に適用される）に言及する。
【０１３２】
本発明の目的は、ヒドロゲルを調製する方法であって、本発明による疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体を水溶液に溶解する工程を含む方法によって解決される。
【０１３３】
一実施形態では、水溶液に溶解された疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体を、２０℃〜９０℃、好ましくは２０℃〜７０℃の範囲の温度にさらに曝露する。
【０１３４】
一実施形態では、疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体を０．０１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解する。
【０１３５】
本発明の目的は、ヒドロゲルを調製する方法であって、本発明による疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体並びに本明細書で定義されるような非極性頭部基を有する疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体を水溶液に溶解する工程を含む方法によって解決される。
【０１３６】
本発明の目的は、本発明によるヒドロゲルを含む創傷被覆材又は創傷治癒剤によって解決される。
【０１３７】
本発明の目的は、ペプチド及び／又はペプチド模倣体足場を含む外科的インプラント又はステントであって、上記ペプチド及び／又はペプチド模倣体足場が本発明によるヒドロゲルによって形成される、外科的インプラント又はステントによって解決される。
【０１３８】
本発明の目的は、本発明による疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体を含む、医薬及び／若しくは化粧品組成物並びに／又は生物医学デバイス並びに／又は電子デバイスによって解決される。
【０１３９】
本発明の目的は、本発明による疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体並びに本明細書で定義されるような非極性頭部基を有する疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体を含む、医薬及び／若しくは化粧品組成物並びに／又は生物医学デバイス並びに／又は電子デバイスによって解決される。
【０１４０】
一実施形態において、医薬及び／若しくは化粧品組成物並びに／又は生物医学デバイス並びに／又は電子デバイスは、医薬活性化合物をさらに含む。
【０１４１】
一実施形態において、医薬及び／又は化粧品組成物は、局所用ゲル若しくはクリーム、スプレー、粉末、又はシート、パッチ若しくは膜の形態で提供され、又は医薬及び／又は化粧品組成物は、注射用溶液の形態で提供される。
【０１４２】
一実施形態において、医薬及び／又は化粧品組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。
【０１４３】
本発明の目的は、キットオブパーツ（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）であって、キットが、本発明による疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体が入っている第１の容器と、水溶液が入っている第２の容器とを含む、キットオブパーツによって解決される。
【０１４４】
一実施形態において、上記キットは、本明細書で定義されるような非極性頭部基を有する疎水性ペプチド及び／又はペプチド模倣体が入っている第３の容器をさらに含む。
【０１４５】
一実施形態において、第２の容器の水溶液は、医薬活性化合物をさらに含み、並びに／又は疎水性ペプチド及び／若しくはペプチド模倣体が入っている第１及び／若しくは第３の容器は、医薬活性化合物をさらに含む。
【０１４６】
本発明の目的は、
（ａ）本発明によるヒドロゲルを提供するステップと、
（ｂ）前記ヒドロゲルを、再生組織を形成することになる細胞に曝露するステップと、
（ｃ）前記細胞を前記ヒドロゲル上で成長させるステップと
を含む、インビトロ又はインビボの組織再生方法によって解決される。
【０１４７】
一実施形態において、上記方法がインビボである場合、
ステップａ）における前記ヒドロゲルは、組織再生が意図される体内の部位に提供され、
前記ステップａ）は、組織再生が意図される体内の部位に前記ヒドロゲルを注射することによって行われることが好ましい。
【０１４８】
本発明の目的は、創傷処置の及び創傷治癒のための方法であって、
本発明によるヒドロゲル又は本発明による医薬組成物の有効量を創傷に塗布するステップ
を含む前記方法によって解決される。
【０１４９】
本発明の目的は、インビトロ及び／又はインビボで使用するための、
好ましくは、経口適用のための、注射のための、及び／又は局所適用のための、
本発明によるヒドロゲルを含むバイオイメージングデバイスによって解決される。
【０１５０】
本発明の目的は、本発明によるヒドロゲルを含む２Ｄ又は３Ｄ細胞培養基材によって解決される。
【０１５１】
次に図に言及する。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】高分子ナノ繊維状ヒドロゲルへの超短鎖ペプチド／ペプチド模倣体の自己組織化を示す図である。（Ａ）両親媒性ペプチドは、脂肪族アミノ酸がＮ末端から疎水性漸減で配列される、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２によって例示されるような特徴的モチーフを有する。自己組織化中、ペプチドは、逆平行様式で会合し、その結果、円偏光二色性によって検出されるαヘリックス中間構造を生じさせると仮定される。（Ｂ）ペプチド濃度が増すにつれて、ランダムコイル（黒線）からαヘリックス中間体（赤線）へ、そしてβ細線維（青線）への立体構造変化が観察される。挿入図は、後述の立体構造をよりよく示している。この現象は、六量体、例えばＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２、及び三量体（Ａｃ−ＩＶＫ−ＮＨ２）について観察されるが、β細線維への移行濃度は三量体のほうが高い。その後、ペプチド二量体が細線維状に積み重なり、凝集してナノ繊維及びシートになり、水を捕捉してヒドロゲルになる。ｃ、電界放射型走査電子顕微鏡検査を用いて観察したときのナノ繊維構造は、細胞外マトリクスに似ている。上記繊維は、ミリメートル範囲に伸長する。Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２（２ｍｇ／ｍＬ）などの六量体のナノ繊維は容易に凝縮してシートになるが、Ａｃ−ＩＶＫ−ＮＨ２（１５ｍｇ／ｍＬ）については個々の繊維のほうが容易に観察される。上記繊維は、多孔性である内部接続された三次元足場を形成する。
【図２】刺激応答性ゲル化を実証するペプチド／ペプチド模倣体のサブクラスの例を示す図である。
【図３】第一級アミン基を含有するアミド化ペプチド／ペプチド模倣体の刺激応答性ゲル化を示す図である。（Ａ）Ｃ末端に極性残基としてリシンを有する超短鎖ペプチドのサブクラスは、塩溶液中で、より容易にヒドロゲルを形成する−最小ゲル化濃度は有意に低下され、ゲル化動態は加速される。Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２は、水中２０ｍｇ／ｍＬ、食塩水中１２ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ中７．５ｍｇ／ｍＬ、及び１０ｍＭ  ＮａＯＨ中１０ｍｇ／ｍＬでヒドロゲルを形成する。（Ｂ）２０ｍｇ／ｍＬ  Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２ヒドロゲルの、貯蔵弾性率（Ｇ’）によって表される、硬さは、生理食塩水（ＮａＣｌ）に溶解したとき、１ｋＰａでの水と比較して、１０ｋＰａへと１桁増加する。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中では、Ｇ’は４０ｋＰａに増加する。剛性もペプチド濃度に伴って増加する。（Ｃ）水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の添加は、２０ｍｇ／ｍＬ  Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２ヒドロゲルの硬さを水中の１ｋＰａから８０ｋＰａに向上させる。硬さは、ＮａＯＨ濃度に伴って増加する。（Ｄ）同体積のペプチド溶液（例えば、１０ｍｇ／ｍＬ  Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２）とＰＢＳ含有小分子とを混合することにより、様々な寸法のヒドロゲル液滴アレイを得ることができる。生理活性部分をカプセル化することもできる：緑色食用着色料と４８８ｎｍ発光量子ドットとを有する１μＬ液滴、赤色食用着色料と二次抗体に結合した５６８ｎｍ発光フルオロフォアを有する２μＬ液滴、及びメチレンブルーとＤＡＰＩとを有する５μＬ液滴。（Ｅ）５ｍｇ／ｍＬ  Ａｃ−ＩＬＶＡＧＫ−ＮＨ２溶液を２７ゲージ針によって高濃度塩浴に押し出すことにより、ヒドロゲル「ヌードル」が得られる。
【図４】ペプチドヒドロゲルが非常に適合性であり、インビトロで細胞の成長を支持する。分化誘導及びスクリーニングアッセイなどの様々な用途のために、細胞をカプセル化し、ペプチドヒドロゲル内に固定化することができることを示す図である。（Ａ）５ｍｇ／ｍＬ  Ａｃ−ＩＫ６−ＮＨ２ヒドロゲルの２μＬ液滴内にカプセル化されたヒト間葉系幹細胞。（Ａｉ）２５ｍｍカバースリップ上のミニヒドロゲルの写真。（Ａｉｉ）単一ミニヒドロゲルを蛍光顕微鏡法を用いて可視化した、カプセル化された細胞であって、ファロイジン（Ｐｈａｌｌｉｏｄｉｎ）−ＦＩＴＣで染色されており（細胞骨格が緑色に染色されており）、Ｄａｐｉで染色されている（核が青色に染色されている）細胞。（Ａｉｉｉ）カプセル化細胞は、倍率１０Ｘでのこの２Ｄ投影像で実証されるように伸長した形態をとる。細胞を異なる焦点面に配置する。（Ａｉｖ）焦点接着を（赤色で）示す、より高倍率の像（６３Ｘ）。（Ｂ）ヒドロゲルフィルム上で培養したヒト間葉系幹細胞もまた、（Ｃ）ガラス製カバースリップ上で培養したものと比較して伸長した形態をとる。
【図５】オリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを、基質媒介遺伝子送達のためにヒドロゲル中にカプセル化することができる。その後、細胞を共カプセル化することができ、又はこれらのヒドロゲル上に播種することができることを示す図である。（Ａ）ヒドロゲルはオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解から保護する。（Ｂ）ヒドロゲルは、カプセル化されたＤＮＡを、時間をかけてゆっくりと放出する。（Ｃ）ＧＦＰ  ｍＲＮＡをカプセル化するヒドロゲル上で培養された細胞は、目的のタンパク質（ＧＦＰ）を２日後に発現する。
【図６】様々な用途のための２Ｄミニヒドロゲルアレイを示す図である。このような２Ｄアレイは、プライマー、ピンツール及びマイクロコンタクトプリンティングなどの既存の技術を用いて生成することができる。（Ａ）アレイを電気刺激又は磁気刺激、例えば電場又は点刺激に付すことができると予想される。ミニヒドロゲルを電気回路又は圧電面にプリントして電流を流すこともできる。（Ｂ）異なる小分子又はオリゴヌクレオチドをカプセル化して生化学的勾配を生じさせることができる。（Ｃ）異なる細胞を異なるミニヒドロゲルにカプセル化し、バルク媒体に溶解された同じ薬物／生理活性分子で処理することができる。或いは、異なる薬物又は生化学的キューを組み込んで、カプセル化された細胞の遺伝子発現を改変することができる。
【図７】ミニヒドロゲルの安定性及び機械的特性を、短鎖リンカー、直鎖状及び分岐ポリマーをはじめとする架橋剤の添加によってさらに向上させることもできることを示す図である。そのような複合ポリマー−ペプチドヒドロゲルを、超短鎖ペプチドと静電相互作用することができる（Ａ）直鎖状及び（Ｂ）分岐ポリマーを自己組織化中に組み込むことによって生成する。得られるヒドロゲルは、より良好な機械的特性を（架橋及び増加された弾性のため）有し、（Ｃ）免疫及び生理的応答を調節するために生理活性官能基を組み込む機会をもたらす。
【図８】別個の多機能性マイクロニッチを有する生物学的構築物を生じさせるための３Ｄバイオプリンティング又は成形技術を示す図である。ヒドロゲルが異なる細胞タイプを別々に閉じ込めるので多細胞構築物を得ることもできる。
【図９】ヒドロゲルに自己組織化する疎水性ペプチドの新規クラスを示す図である。（Ａ）これらの疎水性ペプチドは、脂肪族アミノ酸がＮ末端から疎水性漸減で配列される、Ａｃ−ＩＬＶＡＧによって例示されるような特徴的モチーフを有する。（Ｂ）Ｃ末端に極性官能基としてカルボン酸を有する、（５ｍｇ／ｍＬの）ペプチドＡｃ−ＩＬＶＡＧからなるヒドロゲル。
【図１０】疎水性ペプチドのＣ末端官能化を示す図である。（Ａ）自己組織化を駆動する特徴的ペプチドモチーフを他の官能基、リンカー及び小分子に連結させて、自己組織化する結合体を得ることができる。（Ｂ）Ａｃ−ＩＬＶＡＧ−ビオチンのＦＥＳＥＭ像は、該Ａｃ−ＩＬＶＡＧ−ビオチンのナノ繊維構造を明示し、それによってＣ末端での官能化がナノ繊維構造を破壊しないことが確認される。
【図１１Ａ】カプセル化されたＨ１ヒト胎性幹細胞が増殖し、該Ｈ１ヒト胎性幹細胞の多能性を維持することを示す、３Ｄでの培養が初代細胞の天然表現型を保存することを実証する図である。（Ａ）適切な幹細胞バイオマーカーに対する一次抗体を使用して染色した試料の共焦点イメージングによって多能性維持が実証された。
【図１１Ｂ】カプセル化されたＨ１ヒト胎性幹細胞が増殖し、該Ｈ１ヒト胎性幹細胞の多能性を維持することを示す、３Ｄでの培養が初代細胞の天然表現型を保存することを実証する図である。（Ｂ）逆転写定量的ＰＣＲを使用する遺伝子発現分析。ペプチドヒドロゲル中にカプセル化されたＨ１胎性幹細胞の３Ｄ培養物は、マトリゲルで培養した細胞（対照）と比較して、より高レベルの多能性マーカー（山中因子を含む）を発現した。
【図１２Ａ】バイオプリントされたヒドロゲルの表面に細胞もプリントすることができる。３Ｄでの培養によって初代細胞の天然表現型が良好に保存され、細胞のより高密度での培養が可能になることを示す図である。（Ａ）電界放射型走査電子顕微鏡法に従って微絨毛構造の存在によって観察すると、ペプチドヒドロゲル上に堆積された腸上皮Ｃａｃｏ２細胞は、腸内の天然腸細胞に類似した表現型形態の特性を発生させていた。比較して、ガラス製カバースリップ上で培養した細胞は、集密な又は顕著な微絨毛を有さなかった。Ｃｏｒｎｉｎｇトランスウェルメンブレン上で培養した細胞を陽性対照として使用した。
【図１２Ｂ】バイオプリントされたヒドロゲルの表面に細胞もプリントすることができる。３Ｄでの培養によって初代細胞の天然表現型が良好に保存され、細胞のより高密度での培養が可能になることを示す図である。（Ｂ）ヒドロゲル上で培養したＣａｃｏ２細胞は、ガラス製カバースリップ上で培養した構築物と比較して、より高レベルの頂端膜側受容体ＦＵＴ２Ａ（赤色染色）も発現した。３μｍトランスウェルメンブレン上で培養した細胞は、陽性対照として役立つ。
【図１２Ｃ】バイオプリントされたヒドロゲルの表面に細胞もプリントすることができる。３Ｄでの培養によって初代細胞の天然表現型が良好に保存され、細胞のより高密度での培養が可能になることを示す図である。（Ｃ）ヒドロゲル上で培養したＣａｃｏ２細胞は、２１日の培養後、連続単層を形成する。該Ｃａｃｏ２細胞の形態は、側底領域の細胞核及び頂端領域の微絨毛構造によって実証されるように、インビボでの細胞に類似している（挿入図）。
【図１３】ペプチドヒドロゲルが良好なインビトロ及びインビボでの生体適合性及び安定性を実証することを示す図である。インビボ生体適合性及び安定性を、３０μＬヒドロゲル円板のＣ５７ＢＬ／６マウスへの皮下埋め込みによって評価した。埋め込み後、ヒドロゲル（黒矢印）をこの典型的なＨ＆Ｅ切片において筋肉層下の非晶質屈折性物質として尚観察することができる。ヒドロゲルは分極性である（白矢印）。皮膚表皮から骨格筋に伸びる炎症路（三角）から明白であるように、埋め込み手術は免疫応答を惹起した。皮下ヒドロゲルインプラントに対する炎症反応は、微小から中等度であった。少数の多核巨細胞組織球（黒矢印）がいくつかのインプラントの付近で観察された。被嚢形成はなく、ヒドロゲルインプラントはマクロファージによって部分的に分解された。
【図１４Ａ−Ｃ】椎間板変性症のウサギモデルにおける注射剤治療の評価を示す図である。（Ａ）この動物モデルにおいて、Ｌ３椎骨とＬ６椎骨の間の３つの腰部椎間板を穿刺し、それらの髄核（ＮＰ）内容物を吸引した。傷害１カ月後、２種の異なる処置剤をＮＰ空間に注射した。第１の処置剤は、ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍＬのＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２と、Ｔ１  ＭＲＩ造影剤であるガドリニウム−ＤＴＰＡ（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）とからなる。第２の治療薬は、ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍＬのＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２中にカプセル化された標識ドナーウサギＮＰ細胞からなる。Ｔ２  ＭＲＩコントラストフォア（ｃｏｎｔｒａｓｔｏｐｈｏｒｅ）であるＦＩＴＣ結合酸化鉄ナノ粒子で細胞を標識した。残りの椎間板は、未処置対照として役立った。（Ｂ）動物Ｒ２４５の矢状切片のエクスビボ磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、異なる椎間板の含水量を明示する（処置２カ月後）。（Ｃ）ＮＰは、冠状ＭＲＩスライス（動物Ｒ２４５）でよりよく可視化される。健常椎間板（Ｎ）のＮＰ（黄色三角）は、より明るいＴ１シグナルによって実証されるように、高い含水量を有する。比較して、損傷した未処置椎間板（Ｄ）のほうが暗い。ヒドロゲル処置（Ｈ）は、一部はＧｄ−ＤＴＰＡの存在に起因して、Ｔ１シグナルを有意に増幅した。Ｔ２強調実験では、より大きいコントラストが細胞治療試料（Ｃ）について観察された。この観察は、注射された標識細胞の存在を含意する。
【図１４Ｄ】椎間板変性症のウサギモデルにおける注射剤治療の評価を示す図である。（Ｄ）ヒドロゲル及び細胞処置剤は組織と一体化するが、免疫応答を惹起しないことを異なる椎間板の組織切片が明示した。健常な椎間板を動物Ｒ２４５（椎間板Ｌ２／Ｌ３）から得たが、損傷した椎間板はＲ３３４（Ｌ４／Ｌ５）からのものであった。イメージングしたヒドロゲル処置椎間板は、Ｒ２４５のＬ３／Ｌ４であり、細胞治療椎間板は、Ｒ３２８のＬ５／Ｌ６である。細胞治療を受けた椎間板については、より高倍率で弱蛍光性細胞が観察できた。
【発明の詳細な説明】
【０１５３】
さらなる定義
別段の定義がない限り、本明細書において用いるすべての専門及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は等価の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験の際に使用することができるが、好ましい方法及び材料を説明する。
【０１５４】
用語「ペプトイド」及び「ペプチド模倣体」は、本明細書では同義で用いており、ペプチドを模倣するように設計された分子を指す。ペプトイド又はペプチド模倣体は、既存のペプチドの修飾から生じることもあり、又はペプチドを模倣する類似の系を設計することによって生じることもある。これらの修飾は、天然に存在しないペプチドへの変化（例えば、主鎖改変、及び／又は非天然アミノ酸の組み込み）を含む。上記参照。
【０１５５】
用語「アミノ酸」は、カルボン酸基が、エステル（オルトエステルを含む）、シリルエステル、アミド、ヒドラジド、オキサゾール、１，３−オキサゾリン又は５−オキソ−１，３−オキサゾリジンの形態で保護基によって保護されている化合物を含む。用語「アミノ酸」は、−ＮＨ２又は−ＮＨＲ１（上記）形態のアミノ基が保護基によって保護されている化合物も含む。好適なアミノ酸保護基としては、カルバメート、アミド、スルホンアミド、イミン、イミド、ヒスチジン、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加体、Ｎ−１，１，３，３−テトラメチル−１，３−ジシルイソインドリン（ｄｉｓｉｌｉｓｏｉｎｄｏｌｉｎｅ）、Ｎ−ジフェニルシリルジエチレン、１，３，５−ジオキサジン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−４，４，４−トリフルオロ−３−オキソ−１−ブテニルアミン、Ｎ−９−ボラビシクロノナン及びニトロアミンが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ基とカルボン酸基の両方を、例えば、２，２−ジメチル−４−アルキル−２−シラ−５−オキソ−１，３−オキサゾリジンの形態で保護する保護基が存在することもある。アミノ酸のα炭素原子は、通常は水素原子をさらに有する。実際にはカルボン酸の連続する主鎖である、α炭素原子に結合しているいわゆる「側鎖」は、直鎖状でもよいし又は分岐していてもよい脂肪族部分である。用語「側鎖」は、ペプチド（上記）中のアミノ酸の存在を指し、主鎖が複数のアミノ酸の連結によって形成されている。したがって、そのようなペプチドに含まれているアミノ酸のα炭素原子に結合している脂肪族部分は、主鎖に対して側鎖を定義する。上記で説明したのと同じことが、アミノ酸のアミノ基に結合している脂肪族部分にも当てはまり、該脂肪族部分は、同様に、ペプチドの主鎖に対して側鎖を定義する。
【０１５６】
用語「脂肪族」は、別段の断り書きがない限り、飽和されていることもあり、又は一若しくは多不飽和であることもあり、及びヘテロ原子を含むこともある、直鎖状又は分岐炭化水素鎖を意味する。用語「ヘテロ原子」は、本明細書で用いる場合、炭素又は水素以外の任意の元素の原子を意味する。不飽和脂肪族基は、１つ又は複数の二重結合及び／又は三重結合（アルケニル又はアルキニル部分）を含有する。炭化水素鎖の分枝は、直鎖はもちろん、非芳香族環状要素も含んでいてもよい。炭化水素鎖、これは、別段の断り書きがない限り、いずれの長さのものであってもよく、いずれの数の分枝を含有してもよい。典型的に、炭化水素（主）鎖は、１から５まで、１０まで、１５まで、又は２０個までの炭素原子を含む。アルケニルラジカルの例は、１つ又は複数の二重結合を含有する、直鎖又は分岐炭化水素ラジカルである。アルケニルラジカルは、一般に、約２〜約２０個の炭素原子と、１つ又は複数、例えば２つの二重結合、例えば、約２〜約１０個の炭素原子と１つの二重結合を含有する。アルキニルラジカルは、通常、約２〜約２０個の炭素原子と、１つ又は複数、例えば２つの三重結合、好ましくは、２〜１０個の炭素原子と１つの三重結合を含有する。アルキニルラジカルの例は、１つ又は複数の三重結合を含有する、直鎖又は分岐炭化水素ラジカルである。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、これらのラジカルのｎ異性体、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、３，３ジメチルブチルである。主鎖及び分枝は両方とも、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ若しくはＳｉのようなヘテロ原子をさらに含有していてもよく、又は炭素原子がこれらのヘテロ原子によって置換されていてもよい。
【０１５７】
脂肪族部分は、１つ又は複数の官能基で置換されていることもあり、又は非置換であることもある。置換基は、例えば、これらに限定されるものではないが、アミノ、アミド、アジド、カルボニル、カルボキシル、ケト、シアノ、イソシアノ、ジチアン、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、有機金属、有機ホウ素、セレノ、シリル、シラノ、スルホニル、チオ、チオシアノ、トリフルオロメチルスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、ブロモベンゼンスルホニル、ニトロベンゼンスルホニル及びメタンスルホニルのような、いずれの官能基であってもよい。
【０１５８】
上記のことから明らかであるように、本明細書に記載するペプチド／ペプトイド中のアミノ酸の側鎖は、０から約５まで、約１０まで、約１５まで、又は約２０個までの炭素原子長のものであってもよい。上記側鎖は、分岐していることもあり、不飽和炭素−炭素結合を含むこともある。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の天然アミノ酸がペプチド又はペプトイドに含まれている。そのような天然アミノ酸は、天然に存在するタンパク質の２０の構成要素の１つであってもよい。
【０１５９】
本明細書において開示するペプチド／ペプトイドを含む、ペプチド又はペプトイドにおいて、個々のアミノ酸は、第１のアミノ酸のカルボン酸基と第２のアミノ酸のアミノ基間がアミド結合によって共有結合で連結されている。
【０１６０】
用語両親媒性は、極性流体と非極性流体の両方に可溶性である化合物を指す。この用語は、多相化合物も包含する。ペプチド及び／又はペプトイドの両親媒特性は、同じペプチド及び／又はペプトイド内の極性部分と非極性部分両方の存在に起因する。この関連で、上記ペプチド及び／又はペプトイドは、界面活性剤性のものであることもある。したがって、本明細書において開示するペプチド及び／又はペプトイドの極性特性は、極性部分に基づく。２つのそのような部分は、−ＣＯＯＨ側基、特に荷電ＣＯＯ−基の形態のもの、及びアミノ基である。さらなるそのような部分は、存在する場合、遊離、無保護形態の、Ｃ末端−ＣＯＯＨ基である。一般に、界面活性剤分子は、非極性、典型的には炭化水素、部分に結合している、極性、典型的には親水性、頭部基を含む。ペプチド又はペプトイドの非極性部分は、官能基を有さない炭化水素鎖を含む。
【０１６１】
両親媒性直鎖状配列は、本明細書において開示するペプチド及び／又はペプトイドに含まれており、したがって、極性部分と非極性部分を含む。極性部分は、極性基、例えば、ヒドロキシル基、チオール基、セレノ基、アミノ基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基又はセレノエーテル基を有する、脂肪族アミノ酸を含む。したがって、極性部分は、プロトンを有する官能性極性基、例えばヒドロキシル、チオール、セレノ、アミン又はアミドを有する、アミノ酸を含んでいてもよい。極性部分は、ペプチド及び／又はペプトイドのＣ末端又はＮ末端も含んでいてもよい。そのような場合、Ｃ末端又はＮ末端は、それぞれ遊離カルボキシル又はアミノ基の形態で、すなわち、保護基がない形態で存在することもある。
【０１６２】
一般に、本明細書において開示する両親媒性ペプチド及び／又はペプトイドの直鎖状両親媒性配列の極性部分は、上記ペプチド／ペプトイドの非極性部分に連結されている、単一のアミノ酸によって、連続する２つのアミノ酸によって、又は連続する３つのアミノ酸によって定義される。したがって、いくつかの実施形態において、ペプチド／ペプトイドの極性部分は、アミド結合を介して共有結合で連結されている２つのアミノ酸であって、両方とも極性ペプチド／ペプトイド側鎖を有する２つのアミノ酸からなる。これら２つのアミノ酸の一方は、ペプチド／ペプトイドのＮ末端又はＣ末端を定義する、ペプチド／ペプトイドの末端アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態において、両親媒性ペプチド／ペプトイドは、極性側鎖を有する単一のアミノ酸を有し、上記ペプチド／ペプトイドの残りの部分が非極性部分を定義する。いくつかの実施形態において、両親媒性ペプチド／ペプトイドは、極性側鎖を有する２つのアミノ酸を有し、その一方で上記ペプチド／ペプトイドの残りの部分は、非極性部分を定義する。それぞれの極性側鎖の３つの説明に役立つ例として、４−メチル−４−チオ−ペンチル、６−エトキシカルボニル−４，５−ジメチル−ヘキシル及び６−ヒドロキシ−４−（１−ヒドロキシエチル）−ヘキシル基が役立つこともある。本明細書で用いる場合、対応するペプチド／ペプトイド側鎖の番号付けは、アミノ酸のα炭素原子に共有結合している炭素原子、又はアミノ酸のアミノ基に共有結合している炭素原子、それぞれにおいて「１」で始まる。極性部分に含まれているアミノ酸は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、４−フルオロ−グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、γ−カルボキシ−グルタミン酸、４−ｔｅｒｔ−ブチルアスパラギン酸、グルタミン、５−Ｎ−エチル−グルタミン（テアニン）、シトルリン、チオ−シトルリン、システイン、ホモシステイン、メチオニン、エチオニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、トレオニン、アロ−トレオニン、セリン、ホモセリン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、リシン、５−ヒドロキシ−リシン及びＮ（６）−カルボキシメチルリシンである又は含んでいてもよいが、これらに限定されない。任意のそのようなアミノ酸は、Ｌ型で存在することもあり、又はＤ型で存在することもある。
【０１６３】
本明細書において開示する両親媒性ペプチド／ペプトイドの両親媒性直鎖状配列を、ｎのアミノ酸を有すると定義することができる。極性側鎖を有する単一のアミノ酸が両親媒性直鎖状配列に含まれている場合には、非極性部分はｎ−１のアミノ酸を有すると考えることができる。この場合、極性部分は、厳密に１つのアミノ酸からなり、そのようなアミノ酸は、前の段落の任意のアミノ酸から選択される。極性側鎖を有する連続する２つのアミノ酸が、ペプチド／ペプトイドの両親媒性直鎖状配列に含まれている場合には、非極性部分はｎ−２のアミノ酸を有すると考えることができる。この場合、極性部分は、厳密に２つのアミノ酸からなる。極性側鎖を有する連続する３つのアミノ酸が両親媒性直鎖状配列に含まれている場合には、非極性部分はｎ−３のアミノ酸を有すると考えることができる。この場合、極性部分は、厳密に３つのアミノ酸からなる。極性部分が２つのアミノ酸からなる実施形態において、極性部分は、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ａｓｐ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｇｌｕから選択される配列を有していてもよい。極性部分が３つのアミノ酸からなる実施形態において、極性部分は、いくつか例を挙げると、Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ、Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ、及びＧｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ  Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ  Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ、から選択される配列を有していてもよい。
【０１６４】
ペプチド／ペプトイドの両親媒性直鎖状配列は、生理的ｐＨで正味電荷を有する。用語「生理的ｐＨ」は、約７．４のｐＨ値を通常は有する血液のｐＨ値を指すことが当業者に公知である。両親媒性直鎖状配列がペプチド／ペプトイドのＣ又はＮ末端に配列されている実施形態では、それぞれの末端は、対応する正味電荷をもたらすことができる。両親媒性直鎖状配列がペプチド／ペプトイドのＣ又はＮ末端に配列されていない実施形態では、上記両親媒性直鎖状配列の極性部分は、生理的ｐＨで荷電している官能基を有する側鎖を有する１つ又は複数のアミノ酸を含む。それぞれの官能基の説明に役立つ例としては、アミノ、ニトロ−、グアニジノ、エステリル、スルホニル又はカルボキシル基が挙げられる。いくつかの実施形態において、両親媒性直鎖状配列の正味電荷は、正又は負電荷として、その両親媒性直鎖状配列の極性部分に含まれているアミノ酸の数以下である。いくつかの実施形態において、両親媒性直鎖状配列の正味電荷は、−３、−２又は−１の１つである。いくつかの実施形態において、両親媒性直鎖状配列の正味電荷は、＋１、＋２又は＋３の１つである。
【０１６５】
アミノ酸（上記）のα炭素原子及び／又は上記アミノ酸のアミノ基に連結されている、極性部分のアミノ酸のそれぞれの極性側鎖は、１〜約２０個（１〜約１５、１〜約１０、又は１〜約５個を含む）の炭素原子を含む主鎖によって通常は定義することができる。明確さのために、用語「側鎖」をペプチド及び／又はペプトイドの主鎖に対して用いることを述べておく。このペプチド及び／又はペプトイド側鎖は、分岐していてもよく、したがって主鎖及び分枝によって定義することができる。ペプチド及び／又はペプトイド側鎖の、存在する場合には、主鎖及び分枝の両方は、１つ又は複数の二重又は三重結合を含んでいてもよい（上記）。側鎖の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、プロペニル、プロピニル、ブチル、ブテニル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ペンテニル、ヘキシル、３，３ジメチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル又はデシル基が挙げられるが、これらに限定されない。官能性極性基は、このペプチド及び／又はペプトイド側鎖に結合している。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、両親媒性直鎖状配列の極性部分は、２つの同一のアミノ酸を含む。これらのアミノ酸が天然に存在するアミノ酸である場合、それらのアミノ酸は、例えば、配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、Ａｒｇ−Ａｒｇ又はＳｅｒ−Ｓｅｒの１つを定義することができる。この文脈における用語「天然に存在する」は、遺伝子コードが任意の生物によって直接翻訳される、２０のアミノ酸を指す。上記の２つの同一の極性アミノ酸は、例えば、非極性部分に隣接していることもある。いくつかの実施形態において、ペプチド／ペプトイドの両親媒性直鎖状配列は、脂肪族アミノ酸の疎水性テールと、少なくとも１つの極性アミノ酸（荷電アミノ酸を含む）頭部基とを有する。
【０１６７】
非極性部分は、アミノ酸、一般に少なくとも２つのアミノ酸を、官能基を有さない炭化水素鎖と共に含む。アミノ酸（上記）のα炭素原子に連結されているそれぞれの側鎖は、０〜約２０又は１〜約２０個（０〜約１５、１〜約１５、０〜約１０、１〜約１０、１〜約５又は０〜約５個を含む）の炭素原子を含む主鎖を有することができる。したがって、非極性部分は、側鎖のないアミノ酸、すなわちグリシン、を含むこともある。ペプチド及び／又はペプトイド側鎖は、分岐していてもよく（上記）、１つ又は複数の二重又は三重結合を含んでいてもよい（上記）。ペプチド及び／又はペプトイド側鎖の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、プロペニル、プロピニル、ブチル、ブテニル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ペンテニル、ヘキシル、３，３ジメチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル又はデシル基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの説明に役立つ例として、非極性部分には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、２−（メチルアミノ）−イソ酪酸、２−アミノ−５−ヘキシン酸のアミノ酸を挙げることができる。そのようなアミノ酸は、任意の望ましい立体配置で存在することができる。ペプチド／ペプトイドのＣ末端又はＮ末端が非極性部分に結合していることもある。そのような場合、Ｃ末端又はＮ末端は、通常は保護基（上記）によって保護されている。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、非極性部分は、サイズ漸増又は漸減で配列されているアミノ酸の配列を含む。したがって、非極性部分のアミノ酸の位置は、サイズ漸増又は漸減一般配列で配列されていてもよい。したがって、Ｎ末端からＣ末端への方向又はＣ末端からＮ末端への方向に関して、この一般配列は、サイズが漸減するものであると考えることができる。サイズ漸増又は漸減「一般配列」という用語は、サイズの全般的な減少又は増加がある限り、隣接アミノ酸がほぼ同じサイズのものである実施形態を含むことを意図したものである。サイズ漸減一般配列内での非極性部分の隣接アミノ酸のサイズは、サイズ漸減一般配列の方向では相応じて同一であるか、又はより小さい。いくつかの実施形態において、サイズ漸減又は漸増一般配列は、非反復配列である。
【０１６９】
説明に役立つ例として、アミノ酸のそれぞれの部分が５アミノ酸の配列である場合、第１のアミノ酸は、３，４−ジメチル−ヘキシル側鎖を有していてもよい。第２のアミノ酸は、ネオペンチル側鎖を有していてもよい。第３のアミノ酸は、ペンチル側鎖を有していてもよい。第４のアミノ酸は、ブチル側鎖を有していてもよい。第５のアミノ酸は、グリシンであってもよい、すなわち、側鎖を有していなくてもよい。ネオペンチル及びペンチル側鎖は同じサイズのものであるが、そのような非極性ペプチド部分の一般配列はサイズが漸減する。非極性部分のサイズが漸減する一般配列の説明に役立つさらなる例として、それぞれの非極性部分は、３アミノ酸の配列であってもよい。第１のアミノ酸は、ｎ−ノニル側鎖を有していてもよい。第２のアミノ酸は、３−エチル−２−メチル−ペンチル側鎖を有していてもよい。第３のアミノ酸は、ｔｅｒｔ−ブチル側鎖を有していてもよい。非極性部分のサイズ漸減一般配列の説明に役立つさらにさらなる例として、非極性部分は、９アミノ酸の配列であってもよい。第１のアミノ酸は、４−プロピル−ノニル側鎖を有していてもよい。第２のアミノ酸は、ｎ−ドデシル側鎖を有していてもよい。第３のアミノ酸は、６，６−ジエチル−３−オクテニル側鎖を有していてもよい。ｎ−ドデシル側鎖及び６，６−ジエチル−３−オクテニル側鎖は、両方とも、１２個の炭素原子を有し、したがって、この場合もやはり同等のサイズを有する。とは言え、６，６−ジエチル−３−オクテニル基は、不飽和炭素−炭素結合を含むため、ドデシル基よりわずかに小さいサイズである。第４のアミノ酸は、２−メチル−ノニル側鎖を有していてもよい。第５のアミノ酸は、３−プロピル−ヘキシル側鎖を有していてもよい。第６のアミノ酸は、ｎ−ヘキシル側鎖を有していてもよい。第７のアミノ酸は、２−ブチニル側鎖を有していてもよい。第８のアミノ酸は、イソプロピル側鎖を有していてもよい。第９のアミノ酸は、メチル側鎖を有していてもよい。
【０１７０】
サイズ漸減（又は漸増）一般配列で配列されている非極性部分のアミノ酸の一部分が、（Ｄ型であろうとＬ型であろうと）天然に存在するアミノ酸しか含有しない場合、そのような部分は、５アミノ酸長、例えば、配列ロイシン−イソロイシン−バリン−アラニン−グリシン又はイソロイシン−ロイシン−バリン−アラニン−グリシンを有していてもよい。天然アミノ酸のみのサイズ漸減一般配列は、４アミノ酸長を有することもある。説明に役立つ例としては、配列イソロイシン−ロイシン−バリン−アラニン、ロイシン−イソロイシン−バリン−アラニン、イソロイシン−バリン−アラニン−グリシン、ロイシン−バリン−アラニン−グリシン、ロイシン−イソロイシン−アラニン−グリシン、ロイシン−イソロイシン−バリン−グリシン、イソロイシン−ロイシン−アラニン−グリシン又はイソロイシン−ロイシン−バリン−グリシンが挙げられる。天然アミノ酸のみのサイズ漸減一般配列は、３アミノ酸長を有することもある。説明に役立つ例としては、配列イソロイシン−バリン−アラニン、ロイシン−バリン−アラニン、イソロイシン−バリン−グリシン、ロイシン−バリン−グリシン、ロイシン−アラニン−グリシン、イソロイシン−アラニン−グリシン又はイソロイシン−ロイシン−アラニンが挙げられる。天然アミノ酸のみのサイズ漸減一般配列は、２アミノ酸長を有することもある。説明に役立つ例としては、配列イソロイシン−バリン、ロイシン−バリン、イソロイシン−アラニン、ロイシン−アラニン、ロイシン−グリシン、イソロイシン−グリシン、バリン−アラニン、バリン−グリシン又はアラニン−グリシンが挙げられる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、上記で定義したサイズ漸減一般配列のサイズ漸減方向は、両親媒性直鎖状配列の極性部分への方向である。したがって、そのような実施形態において、非極性部分のこの一部分の中の隣接アミノ酸サイズは、極性部分の方向では相応じて同一であるか、又はより小さい。したがって、そのような実施形態における一般的傾向として、両親媒性直鎖状配列の極性部分に近いほど、それぞれのサイズ漸減一般配列にわたってペプチド及び／又はペプトイド側鎖の全体サイズが小さくなる。ｎ−ノニル、３−エチル−２−メチル−ペンチル及びｔｅｒｔ−ブチル側鎖を有する３アミノ酸の一般配列についての上記説明に役立つ例では、隣のアミノ酸は、極性官能基を有するペプチド／ペプトイド側鎖を有することで極性であってもよい。説明に役立つ例として、ペプチド／ペプトイド内のｔｅｒｔ−ブチル側鎖に隣接して３−カルボキシ−ｎ−ブチル側鎖があってもよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、両親媒性直鎖状ペプチド及び／若しくはペプトイド又は両親媒性直鎖状配列、それぞれの、非極性部分全体が、サイズ漸減（又は漸増）一般配列からなる。そのような実施形態において、サイズ漸減（又は漸増）一般配列は、ｎ−ｍアミノ酸（上記参照）長を有していてもよい。いくつかの実施形態において、サイズ漸減又は漸増一般配列にはペプチド／ペプトイドの非極性側鎖がさらに隣接している。一実施形態において、サイズ漸減（又は漸増）一般配列は、ｎ−ｍ−１のアミノ酸長を有する。この実施形態では、非極性ペプチド／ペプトイド側鎖をもたらす１つのさらなるアミノ酸がペプチド／ペプトイド中にある。このアミノ酸がサイズ漸減（又は漸増）一般配列と極性アミノ酸の間に位置することもあり、極性アミノ酸がこの追加の非極性アミノ酸とサイズ漸減（又は漸増）一般配列の間に位置することもあり、又はサイズ漸減（又は漸増）一般配列が極性アミノ酸とこの追加の非極性アミノ酸の間に位置することもある。典型的に、サイズ漸減（又は漸増）一般配列は、極性アミノ酸とこの追加の非極性アミノ酸の間に位置する。追加の非極性アミノ酸は、例えば、ペプチド／ペプトイドのＮ末端であって、保護基を定義し、該Ｎ末端は、例えばアミド、例えばプロピオン酸アシル又はアセチル基によって保護されていることもある。上記で定義した通りのサイズ漸減（又は漸増）一般配列と一緒に、追加の非極性アミノ酸がペプチド／ペプトイドの非極性部分を定義することもある。極性アミノ酸は、ペプチド／ペプトイドのＣ末端を定義することがある。したがって、この例では、サイズ漸減（又は漸増）一般配列の一方の側に極性アミノ酸が、及びもう一方の側に追加の非極性アミノ酸が隣接している。一実施形態において、サイズ漸減（又は漸増）一般配列がｎ−ｍ−１アミノ酸長を有する形態の場合、ｎ−ｍアミノ酸の非極性部分の残りの非極性アミノ酸は、アラニン及びグリシンの一方である。
【０１７３】
上記で説明したように、両親媒性直鎖状配列の極性部分は、いくつかの実施形態では、連続する２つ又は３つのアミノ酸によって定義することができる。極性部分は、ｍ脂肪族アミノ酸を含む。ｍ脂肪族アミノ酸の各々は独立して選択され、独立して選択された極性基を有する。記号ｍは、１、２及び３から選択される整数を表す。したがって、少なくとも本質的に非極性部分（上記）は、ｎ−ｍの数、すなわち、ｎ−１、ｎ−２又はｎ−３のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、ｎは、ｍ＋２以上である。したがって、そのような実施形態において、ｍは、ｎ−２以下の数を表す。
【０１７４】
したがって、両親媒性直鎖状ペプチド及び／又はペプトイドの非極性部分全体がサイズ漸減（又は漸増）一般配列（上記）からなる実施形態において、この非極性部分は、ｎ−２又はｎ−３アミノ酸長を有することができる。両親媒性直鎖状ペプチド及び／又はペプトイドがサイズ漸減（又は漸増）非極性部分に加えてさらなる非極性側鎖を有する実施形態において、この追加の非極性側鎖は、サイズ漸減（又は漸増）一般配列のアミノ酸に直接結合しているアミノ酸に含まれていることもある。したがって、上記非極性部分は、サイズ漸減（又は漸増）非極性部分と、非極性側鎖を有するそれぞれのさらなるアミノ酸とによって定義することができる。したがって、１つのそのような実施形態において、ｍ＝１の場合、非極性部分は、ｎ−２アミノ酸長を有していてもよく、サイズが漸減（又は漸増）する非極性部分はｎ−３アミノ酸長を有する。サイズ漸減（又は漸増）一般配列が２つの極性アミノ酸とこの追加の非極性アミノ酸の間に位置することもあり、又は追加の非極性アミノ酸がサイズ漸減（又は漸増）一般配列と２つの極性アミノ酸との間に位置することもある。典型的に、サイズ漸減（又は漸増）一般配列は、２つの極性アミノ酸とこの追加の非極性アミノ酸の間に位置する。上記で述べたように、２つの極性アミノ酸の一方は、ペプチド／ペプトイドのＣ末端を定義することができる。したがって、この例では、サイズ漸減（又は漸増）一般配列の一方の側に２つの連続する極性アミノ酸が、及びもう一方の側に追加の非極性アミノ酸が隣接している。この場合もやはり、いくつかの実施形態において、ｍ＝１の場合、連続する２つの極性アミノ酸はサイズ漸減（又は漸増）一般配列と追加の非極性アミノ酸の間に位置することもあり、この場合、非極性部分は、ｎ−３アミノ酸長を有する第１の部分と１アミノ酸のさらなる部分とを有する。
【０１７５】
両親媒性直鎖状ペプチド及び／又はペプトイドを含む、上記で定義した通りの両親媒性直鎖状配列間の静電力、水素結合及びファンデルワールス力が、これらの両親媒性直鎖状配列を互いに連結させることになる。理論により拘束されるものではないが、その結果、ヒドロゲル形成を可能にする架橋効果が起こる。この関連で、本発明者らは、ヘリックス構造に基づく繊維の形成を観察した。
【０１７６】
本明細書において開示する両親媒性ペプチド及び／又はペプトイドの両親媒性直鎖状配列が形成される繊維は高い機械的強度を通常は示し、このことが、前記繊維を、組織再生用途、例えば損傷組織の置換に特に有用なものにする。本明細書において開示する両親媒性ペプチド及び／又はペプトイドは、コラーゲン線維に似ている繊維構造へと一般に組織化することが観察された。動物体及び人体における軟組織の成分であるコラーゲンは、組織の引張強度の大部分をもたらす線維性タンパク質である。本明細書において開示する両親媒性ペプチド及び／又はペプトイドの繊維の機械的強度は、コラーゲンの加水分解形態であるゼラチンのコラーゲンの機械的強度より通常ははるかに高いことが判明した（例えば図を参照されたい）。それ故、本明細書において開示する両親媒性ペプチド及び／又はペプトイドを、損傷又は罹病組織の永久又は一時的補綴代替物として使用されるヒドロゲルに含めてもよい。
【０１７７】
両親媒性ペプチド／ペプトイド全体を表すこともある（上記）、ペプチド／ペプトイドの両親媒性直鎖状配列は、生理条件で、高温であっても、顕著な安定性を示すことが判明した。前記両親媒性直鎖状配列は、いくつかの実施形態では、生理条件で、周囲温度で、１日〜１カ月以上の範囲の期間にわたって水溶液中で安定している。両親媒性直鎖状配列は、いくつかの実施形態では、生理条件で９０℃で少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間又は少なくとも５時間、水溶液中で安定していることもある。両親媒性直鎖状ペプチド及び／又はペプトイドを含む、両親媒性ペプチド及び／又はペプトイドの両親媒性直鎖状配列は、生理条件下、水溶液中で自己組織化αヘリックス繊維をもたらすことができる。Ｌ型又はＤ型のペプチド／ペプトイド（典型的に３〜７量体）は、コラーゲンなどの生物学的物質を模倣する網目様構造に組織化される超分子ヘリックス繊維に自己組織化することができる。反復アラニン含有配列とアセチル化Ｃ末端とを有する３〜６アミノ酸長のペプチドがヘリックス立体構造をとることは、以前にＸ線結晶解析で観察されている（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｙら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編（２００９）８６９５〜８６９８）。両親媒性配列、Ａｃ−ＬＤ６（Ｌ）、を有するペプチドを使用して、凝集体の形成が、例えば０．１ｍｇ／ｍｌで既に観察されている。ペプチドの濃度が１ｍｇ／ｍｌに増加すると、ペプチド単量体が整列して繊維構造を形成することが判明した。生理条件下、２ｍＭ未満の濃度で繊維の形成が起こることから、ペプチド／ペプトイドは、生理条件下でヒドロゲルを形成することができる注射可能なヒドロゲル材料としてよく適している。組織工学のための上記で定義した通りの両親媒性直鎖状ペプチド及び／又はペプトイド、並びにそれぞれの両親媒性直鎖状ペプチド及び／又はペプトイドを注射することを含めて適用することを含む組織工学方法も、本明細書において開示する。
【０１７８】
ヒドロゲルは、通常は顕著な硬さを特徴とし、一般に、生体適合性であり、非毒性である。選択されるペプチド／ペプトイド配列に依存して、これらのヒドロゲルは熱応答性又はチキソトロピー性を示すことができる。ペプチド／ペプトイド組織化条件に依存して、繊維の厚さ及び長さが異なる。一般に、様々な組織の修復及び置換に有用であり得るペプチド／ペプトイド足場をもたらす様々な初代ヒト細胞の培養によく適している、硬さの大きいヒドロゲルが得られる。これらのヒドロゲルを調製する方法も開示する。細胞培養、組織工学、形成外科、薬物送達、局所適用、化粧品、包装などのような用途でのこれらのヒドロゲルの例示的用法を開示し、例えば、太陽電池又は燃料電池を含んでいてもよい電子デバイスでの使用のような、技術的応用についても開示する。
【０１７９】
ペプチド／ペプトイドの両親媒性直鎖状配列の場合、ヒドロゲルは、生理条件で、高温であっても、高い安定性を示す。一実施形態において、そのようなヒドロゲルは、周囲温度で、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも１カ月以上、例えば少なくとも１〜約６カ月の期間、水溶液中で安定している。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示するヒドロゲルは、蛍光色素をはじめとするマーカーなどの、特徴的分光又は蛍光特性を有する分子又は粒子（量子ドットを含む）に連結される。それぞれの分子は、例えば、ヒドロゲルの運命、位置及び／又は完全性のモニタリングを可能にすることができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示するヒドロゲルは、微生物、ウイルス粒子、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、核酸、ペプチド、オリゴ糖、多糖、無機分子、合成ポリマー、小有機分子又は薬物などの、選択された標的分子に対して結合親和性を有する分子に連結される。
【０１８２】
用語「核酸分子」は、本明細書で用いる場合、１本鎖、２本鎖又はそれらの組み合わせなどの、任意の可能な立体配置の任意の核酸を指す。核酸は、例えば、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して又は核酸化学を用いて生成されたＤＮＡ又はＲＮＡの類似体、ロックド核酸分子（ＬＮＡ）、及びタンパク質核酸分子（ＰＮＡ）を含む。ＤＮＡ又はＲＮＡは、ゲノム起源であることもあり、又は合成起源のものであることもあり、１本鎖であることもあり、又は２本鎖であることもある。本発明の実施形態の本方法では、必然的にではないが通常は、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を使用することになる。そのような核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ，合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのコポリマー、オリゴヌクレオチドなどであってもよい。それぞれの核酸は、非天然ヌクレオチド類似体をさらに含有していてもよく、及び／又は親和性タグ若しくは標識に連結されていてもよい。いくつかの実施形態において、核酸分子は、単離、濃縮又は精製されていてもよい。核酸分子は、例えば、ｃＤＮＡクローニングによって又はサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離されていてもよい。天然源は、哺乳動物、例えばヒト、血液、精液又は組織であってもよい。核酸は、例えば、トリエステル法によって、又は自動ＤＮＡ合成装置によって、合成されることもある。
【０１８３】
多くのヌクレオチド類似体は既知であり、本発明の例示的実施形態の方法で使用される核酸及びオリゴヌクレオチドに使用することができる。ヌクレオチド類似体は、例えば塩基、糖又はリン酸塩部分の修飾を有するヌクレオチドである。塩基部分の修飾としては、プリン又はピリミジン塩基とは異なる、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ／Ｕの天然及び合成修飾、例えばウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル及び２−アミノアデニン−９−イル、並びに非プリン又は非ピリミジンヌクレオチド塩基の天然及び合成修飾を含む。他のヌクレオチド類似体は、汎用塩基として役立つ。汎用塩基としては、３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールが挙げられる。汎用塩基は、他の任意の塩基と塩基対を形成することができる。塩基修飾は、多くの場合、例えば糖修飾、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルなどと併用して、例えば、２本鎖の安定性増加などの独特の特性を達成することができる。
【０１８４】
ペプチドは、合成起源のものであることもあり、当技術分野において周知の方法によって天然源から単離されることもある。天然源は、哺乳動物、例えばヒト、血液、精液又は組織であってもよい。ポリペプチドを含めてペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成されることもある。ポリペプチドの説明に役立つ例は、抗体、抗体の断片、及び抗体様機能を有するタンパク質様結合分子である。（組換え）抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（Ｉｌｉａｄｅｓ，Ｐ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９９７）４０９、４３７〜４４１）、デカボディ（Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）３１８、８８〜９４）及び他のドメイン抗体（Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）、２１、１１、４８４〜４９０）である。抗体様機能を有するタンパク質様結合分子の例は、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインである（国際公開第０３／０２９４６２号、Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６、１８９８〜１９０３）である。リポカイン、例えば、ビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカイン、ヒトアポリポタンパク質Ｄ又はグリコデリンは、ハプテンとして公知の選択された小タンパク質領域と結合するように修飾することができる天然リガンド結合部位を有する。他のタンパク質様結合分子の例は、いわゆるグルボディ（例えば、国際公開第９６／２３８７９号を参照されたい）、アンキリン足場に基づくタンパク質（Ｍｏｓａｖｉ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１３、６、１４３５〜１４４８）又は結晶性足場の基づくタンパク質（例えば、国際公開第０１／０４１４４号）、Ｓｋｅｒｒａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（２０００）１３、１６７〜１８７に記載されているタンパク質、アドネクチン、テトラネクチン及びアビマーである。アビマーは、いくつかの細胞表面受容体の複数のドメインのストリングとして発生する、いわゆるＡドメインを含有する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３、１５５６〜１５６１）。ヒトフィブロネクチンのドメインに由来するアドネクチンは、標的に対する免疫グロブリン様結合のために改変することができる３つのループを含有する（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｓ及びＤａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）１７、６５３〜６５８）。それぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは、Ｃ型レクチンドメイン内に所望の結合のために改変することができるループ領域を同様に含有する（同書）。所望される場合には、標的物質の任意の又は特定の型、クラスなどに対するそれぞれの部分の親和性をさらに増加させる修飾剤を使用してもよい。
【０１８５】
抗体様機能を有する核酸分子の一例は、アプタマーである。アプタマーは、被定義三次元モチーフにフォールドし、所与の標的構造に対して高い親和性を示す。固相合成などの当技術分野の標準的技法を用いて、特定の標的への親和性を有するアプタマーを相応に形成し、本発明の実施形態の中空粒子上に固定化することができる。
【０１８６】
説明に役立つさらなる例として、親和性タグなどの連結部分を使用して、それぞれの分子を固定化することができる。そのような連結部分は、分子、例えば、窒素基、リン基、硫黄基、カルベン基、ハロゲン基若しくは擬ハロゲン基又はそれらの一部分を含む炭化水素系（高分子系を含む）分子であってもよい。説明に役立つ例として、ヒドロゲルに含まれるペプチド／ペプトイドは、生体分子、例えば、タンパク質、核酸分子、多糖又はそれらの任意の組み合わせなどの分子の共有結合を可能にする官能基を例えば上記ペプチド／ペプトイドの側鎖に含むこともある。所望の条件下で遊離させることができる保護基によって保護されている保護形態でそれぞれの官能基を備えさせることができる。それぞれの官能基の例としては、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、カルボキシ基、エステル、無水物、スルホネート、スルホネートエステル、イミドエステル、シリルハリド、エポキシド、アジリジン、ホスホロアミダイト及びジアゾアルカンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
親和性タグの例としては、ビオチン、ジニトロフェノール又はジゴキシゲニン、オリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ’ペプチド、Ｔ７エピトープ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄの配列Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐのＨＳＶエピトープ、配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａのヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、配列Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕの転写因子ｃ−ｍｙｃの「ｍｙｃ」エピトープ、又はオリゴヌクレオチドタグが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドタグを使用して、相補配列を有する固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。連結部分のさらなる例は、抗体、抗体の断片、又は抗体様機能を有するタンパク質様結合分子である（上記も参照されたい）。
【０１８８】
連結部分のさらなる例は、ククルビツリルであるか、又はククルビツリルと複合体を形成できる部分である。ククルビツリルは、グリコールウリル単位を含み、通常はグリコールウリルとホルムアルデヒドの酸触媒縮合反応から自己組織化した、大環状化合物である。ｎ個のグリコールウリル単位を含むククルビット［ｎ］ウリル（ＣＢ［ｎ］）は、極性ウレイドカルボニル基を有する２つのポータルを通常は有する。これらのウレイドカルボニル基によって、ククルビツリルは目的のイオン及び分子に結合することができる。説明に役立つ例として、ククルビット［７］ウリル（ＣＢ［７］）は、フェロセンメチルアンモニウム又はアダマンチルアンモニウムイオンと強力な複合体を形成することができる。ククルビット［７］ウリル又は例えばフェロセンメチルアンモニウムのいずれかを生体分子に結合させてもよく、さらに、残りの結合パートナー（例えば、フェロセンメチルアンモニウム又はククルビット［７］ウリル、それぞれ）を選択された表面に結合させることができる。その場合、生体分子を表面と接触させることで生体分子が固定化されることになる。アルカンチオレートによって金表面に結合された官能化ＣＢ［７］単位は、例えば、フェロセンメチルアンモニウム単位を有するタンパク質の固定化を生じさせることが明らかになった（Ｈｗａｎｇ，Ｉ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９、４１７０〜４１７１）。
【０１８９】
連結部分のさらなる例としては、オリゴ糖、オリゴペプチド、ビオチン、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン及び金属キレーターが挙げられるが、これらに限定されない（下記も参照されたい）。説明に役立つ例として、標的分子が金属イオンである場合、それぞれの金属キレーター、例えば、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ニトロ酢酸、ＮＴＡとも呼ばれる）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール（ジメルカプロール）、ポルフィン又はヘムを使用することができる。一例として、ＥＤＴＡは、殆どの一価、二価、三価及び四価金属イオン、例えば銀（Ａｇ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、マンガン（Ｍｎ２＋）、銅（Ｃｕ２＋）、鉄（Ｆｅ２＋）、コバルト（Ｃｏ３＋）及びジルコニウム（Ｚｒ４＋）などと錯体を形成するが、ＢＡＰＴＡはＣａ２＋に特異的である。いくつかの実施形態では、それぞれの金属イオン（単数又は複数）との錯体中のそれぞれの金属キレーターが連結部分を定義する。そのような錯体は、例えば、タンパク質に含まれていることもある、被定義配列のペプチドの受容体分子である。説明に役立つ例として、当技術分野において用いられている標準的な方法は、キレーター・ニトリロ四酢酸（ＮＴＡ）によってもたらされる、オリゴヒスチジンタグと銅（Ｃｕ２＋）、ニッケル（Ｎｉ２＋）、コバルト（Ｃｏ２＋）又は亜鉛（Ｚｎ２＋）イオンとの間の錯体形成である。
【０１９０】
例えば、アビジン又はストレプトアビジンを利用してビオチン化核酸を固定化することができ、又は金のビオチン含有単層を利用することができる（Ｓｈｕｍａｋｅｒ−Ｐａｒｒｙ、Ｊ．Ｓ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）７６、９１８）。説明に役立つさらに別の例として、生体分子は、例えば走査型電気化学顕微鏡法によって、例えばピロール−オリゴヌクレオチドパターン（例えば、Ｆｏｒｔｉｎ，Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ（２００５）１７、４９５）によって、局所的に堆積させることができる。他の実施形態では、特に生体分子が核酸である場合、例えば光活性化又は不活性化を用いて、生体分子を固定化単位の表面で直接合成することができる。説明に役立つ例として、選択された表面での核酸又はオリゴヌクレオチドの合成（いわゆる「固相」合成）は、電極を使用して電気化学的反応を用いて行うことができる。Ｅｇｅｌａｎｄ及びＳｏｕｔｈｅｒｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）３３、１４、ｅ１２５）によって記載されたような電気化学的デブロッキングステップを例えばこのために利用してもよい。好適な電気化学的合成は、米国特許出願公開第２００６／０２７５９２７号にも開示されている。いくつかの実施形態では、ＵＶ結合又は光依存性５’脱保護を含む、生体分子の、特に核酸分子の、光指向性合成を行うことができる。
【０１９１】
選択された標的分子に対して結合親和性を有する分子を任意の手段によってナノ結晶上に固定化することができる。説明に役立つ例として、それぞれの部分を含むオリゴ−又はポリペプチドを、例えばω官能化チオールを使用して、チオエーテル結合によってナノ結晶の表面に共有結合で連結させてもよい。選択された結合親和性を有する分子に本発明の実施形態のナノ結晶を連結させることができる任意の好適な分子を使用して、その選択された結合親和性を有する分子をナノ結晶上に固定化してもよい。例えば、（二官能性）連結剤、例えばエチル−３−ジメチルアミノカルボジイミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）３−メルカプト−ベンズアミド、３−アミノプロピル−トリメトキシシラン、３−メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、３−（トリメトキシシリル）プロピル−マレイミド、又は３−（トリメトキシシリル）プロピル−ヒドラジドを使用してもよい。連結剤との反応前に、ナノ結晶の表面を例えばメルカプト氷酢酸での処理によって修飾して遊離メルカプト酢酸基を生じさせることができ、その後、連結剤による分析物結合パートナーとの共有結合での連結に前記遊離メルカプト酢酸基を利用することができる。
【０１９２】
本発明の実施形態は、水膨潤水不溶性ポリマー材料であると考えることができるヒドロゲルも含む。ヒドロゲルは、上記で定義した通りのペプチド及び／又はペプトイド（を含有する及びからなるを含めて）を含む。ヒドロゲルは三次元構造を維持するので、本発明の実施形態のヒドロゲルは、様々な用途に使用することができる。ヒドロゲルは、高い含水量を有し、アミノ酸を含むので、概して、優れた生体適合性のものである。
【０１９３】
本発明の実施形態によるヒドロゲルは、自己組織化によって形成される。本発明者らは、ペプチド／ペプトイドが組織化して網目様構造を形成する繊維になることを観察した。理論により拘束されるものではないが、ペプチド／ペプトイドの非極性部分間の疎水性相互作用がそのような自己組織化プロセスを助長すると考えられる。
【０１９４】
ヒドロゲルを形成する方法は、ペプチド／ペプトイドを水溶液に溶解する工程を含む。撹拌などの混合を含むかき混ぜ、及び／又は超音波処理を利用して、ペプチド／ペプトイドの溶解を助長してもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド／ペプトイドを含有する水溶液を周囲温度より低い温度、例えば、約２℃〜約１５℃から選択される温度に曝露する。いくつかの実施形態では、ペプチド／ペプトイドを含有する水溶液を高温、すなわち、周囲温度より高い温度に曝露する。通常は水溶液を放置して曝露する温度に到達させる。水溶液は、例えば、約２５℃〜約８５℃以上、例えば、約２５℃〜約７５℃、約２５℃〜約７０℃、約３０℃〜約７０℃、約３５℃〜約７０℃、約２５℃〜約６０℃、約３０℃〜約６０℃、約２５℃〜約５０℃、約３０℃〜約５０℃、又は約４０℃〜約６５℃の温度、例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃又は約６５℃の温度などに曝露されてもよい。ペプチド／ペプトイドを含有する水溶液は、この温度で、約５分〜約１０時間以上、例えば、約１０分〜約６時間、約１０分〜約４時間、約１０分〜約２．５時間、約５分〜約２．５時間、約１０分〜約１．５時間、又は約１０分〜約１時間、例えば約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分又は約４５分の期間、維持されてもよい。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示するヒドロゲルは生体適合性であり、医薬的に許容されるヒドロゲルを含む。用語「生体適合性」（「組織適合性」と呼ぶこともできる）は、本明細書で用いる場合、インビボで使用されたとき有害生物学的応答をあったとしてもわずかしか生じさせないヒドロゲルである。したがって、この用語は、ヒドロゲルが、ヒトを含む動物の体内でのものを含めて、細胞における測定可能な有害生物学的応答を促進することができないことを一般に指す。生体適合性ヒドロゲルは、次の特性の１つ又は複数を有することができる：非毒性、非突然変異誘発性、非アレルゲン性、非発癌性、及び／又は非刺激性。最後に、生体適合性ヒドロゲルは無害であってもよく、それぞれの細胞及び／又は身体によって耐容され得る。生体適合性ヒドロゲル自体が、体内の１つ又は複数の機能を向上させることもある。
【０１９６】
ヒドロゲルに含まれているペプチド／ペプトイドに含まれているアミノ酸に依存して、それぞれのヒドロゲルは生体分解性であることもある。生体分解性ヒドロゲルは、一定の期間にわたって、例えば数カ月又は数年以内に、インビボで徐々に分解する又は吸収される。分解は、例えば加水分解によって起こることもあり、酵素によって触媒されることもあり、ヒドロゲルが、組織、血管又はそれらの細胞を含むヒト又は動物体内で曝露される条件によって助長されることもある。ペプチドが天然アミノ酸でもっぱら構成されている場合、それぞれのペプチドは、通常、ヒト／動物体の酵素によって分解され得る。
【０１９７】
本発明の実施形態によるヒドロゲルは、薬物などの医薬活性化合物のデポーとして役立つこともできる。本発明の実施形態によるヒドロゲルを、ヒト又は動物体などの生物の天然細胞外マトリクスを模倣するように設計することができる。それぞれのヒドロゲルを含めて、本発明の実施形態によるペプチド／ペプトイドから形成される繊維は、生物学的足場として役立つことができる。本発明の実施形態によるヒドロゲルをインプラントに含めてもよく、コンタクトレンズに含めてもよく、又は組織工学に使用してもよい。一実施形態において、ペプチドは、通常は３〜７アミノ酸からなり、水又は水溶液に溶解されたときにヒドロゲルとして見られる複雑な繊維状足場に自己組織化することができる。これらのヒドロゲルは、最大９９．９％水を保持することができ、十分に高い機械的強度を有することができる。したがって、これらのヒドロゲルは、免疫原性リスクなしに様々な天然組織の人工代用品としての機能を果たすことができる。本発明によるヒドロゲルは、好適な初代細胞の培養に使用することができ、したがって、注射可能な細胞マトリックス化合物を確立して、インビボで新たに形成される細胞マトリックスを埋め込む又は再び埋め込むことができる。したがって、本発明によるヒドロゲルは、組織再生又は組織工学用途に特に有用である。本明細書で用いる場合、「インプラント」又は「埋め込み」への言及は、ヒト又は動物の、例えば哺乳動物の、体又は肢へのヒドロゲル含有デバイスの外科的又は関節鏡下埋め込みの／ための使用及び応用を指す。関節鏡下技法は、本明細書では外科的技法のサブセットと考えられ、外科手術、外科的などへのいずれの言及も関節鏡下技法、方法及びデバイスを含む。本発明の実施形態によるヒドロゲルを含む外科的インプラントは、ペプチド及び／又はペプトイド足場を含むこともある。このペプチド及び／又はペプトイド足場を、それぞれのヒドロゲルによって定義することができる。本発明の実施形態のヒドロゲルを、創傷の湿潤状態での維持に役立つ創傷カバー、例えば、ガーゼ又はシートに含めて、治癒を促進することもできる。
【０１９８】
ペプチド／ペプトイドに使用されるアミノ酸配列に依存して、ヒドロゲルは温度感受性であることもある。ヒドロゲルは、例えば、より低い臨界溶液温度、又はそのようなより低い臨界溶液温度に対応する温度範囲を有し、その温度又は温度範囲を超えると、水分子がゲルから放出されるにつれて水分子による水素結合が放出されるのでゲルは崩壊する。
【０１９９】
開示する主題は、非常に好適な材料特性を有するペプチド／ペプトイドヒドロゲルへと組織化する、改善されたキラル両親媒性天然系ペプチド及び／又はペプトイドも提供する。これらのペプチド／ペプトイドヒドロゲルの利点は、様々な異なる初代ヒト細胞に許容され、したがって、様々な組織の修復及び置換に有用であり得るペプチド足場をもたらすことである。ペプチド単量体のキラリティーに依存して、ヒドロゲルの特性を、より安定しており、分解を受けにくいが、依然として生体適合性であるように設計することができる。
【０２００】
本明細書に記載するヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイドは、ヒト患者を含む生物に、該ヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイド自体を投与することができ、或いは医薬活性成分又は好適な担体若しくは賦形剤（複数可）を含むこと、又は医薬活性成分又は好適な担体若しくは賦形剤（複数可）と混合されていることがある、医薬組成物で投与することができる。それぞれのヒドロゲル又はペプチド／ペプトイドの製剤及び投与技術は、当技術分野において十分に確立されている低分子量化合物のものと似ている、又は同一である。例示的経路としては、経口、経皮及び非経口送達が挙げられるが、これらに限定されない。ヒドロゲル又はペプチド／ペプトイドを使用してカプセル若しくはチューブに充填してもよいし、又はペレットなどの圧縮形態で提供してもよい。ペプチド／ペプトイド又はヒドロゲルを注射用形態又はスプレー可能な形態で、例えば、それぞれのペプチド／ペプトイドの懸濁液として使用してもよい。
【０２０１】
本発明の実施形態のヒドロゲルを例えば皮膚に又は創傷に塗布してもよい。さらなる好適な投与経路としては、例えば、デポー、経口、直腸、経粘膜又は腸管投与；筋肉内、皮下、静脈内、髄内注射、及びクモ膜下腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻腔内又は眼内注射を含む、非経口送達を挙げることができる。これに関連して、マイクロ粒子の投与に外科手技を必要としないことが留意される。マイクロ粒子が生体分解性ポリマーを含む場合、抗癌剤の放出後にデバイスを除去する必要はない。それにもかかわらず、マイクロ粒子を足場、コーティング、パッチ、複合材料、ゲル又は硬膏剤中又は上に含めることができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイドを全身的にではなく局所的に、例えば注射によって投与することができる。
【０２０３】
本発明の実施形態のヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイドを含む医薬組成物は、それ自体公知である手法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣丸製造、研和、乳化、カプセル化、捕捉又は凍結乾燥法によって製造することができる。
【０２０４】
したがって、本発明の実施形態に従って使用するための医薬組成物は、薬学的に使用することができる製剤へのヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイドの加工を助長する賦形剤及び助剤を含む１種又は複数の生理的に許容される担体を使用して従来の手法で製剤化することができる。適切な製剤化は、選択される投与経路に依存する。
【０２０５】
注射のために、本発明の実施形態のペプチド／ペプトイドを、水溶液中で、例えば生理的に適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンガー溶液又は生理食塩水緩衝液中で製剤化することができる。経粘膜投与のために、浸透させることになるバリアに適している浸透剤を製剤化に使用する。このような浸透剤は、当技術分野において一般に公知である。
【０２０６】
経口投与のために、ヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイドを、当技術分野において周知の医薬的に許容される担体と併せることによって、容易に製剤化することができる。そのような担体によって、ヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイドはもちろん医薬活性化合物を、処置すべき患者による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに、製剤化することが可能になる。経口使用のための医薬品は、固体賦形剤を添加する工程、得られた混合物を任意選択で粉砕する工程、必要に応じて適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して錠剤又は糖衣丸コアを得る工程によって得ることができる。好適な賦形剤は、特に、フィラー、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール若しくはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要に応じて、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加してもよい。
【０２０７】
糖衣丸コアに適切なコーティングを施す。このために、濃縮糖溶液を使用してもよく、前記濃縮糖溶液は任意選択で、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有することもある。識別のために、又は活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣丸コーティングに添加してもよい。
【０２０８】
経口使用することができる医薬品としては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、並びにゼラチン及び可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトール、で作られた密封軟カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、活性成分を、ラクトースなどのフィラー、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び任意選択で安定剤との混合物で含有することができる。軟カプセルの場合、ペプチド／ペプトイドは、好適な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールに懸濁されることもある。加えて、安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した投薬量のものであるべきである。頬側投与のための組成物は、従来の手法で製剤化された錠剤又はトローチ剤の形態をとることもある。
【０２０９】
ヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイドを注射による、例えば、筋肉内注射又はボーラス注射又は持続点滴による、非経口投与用に製剤化することもできる。注射用の製剤を単位剤形で、例えばアンプルで提供してもよく、又は保存薬が添加された複数回投与用容器で提供してもよい。それぞれの組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンなどの形態をとっていてもよく、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有していてもよい。
【０２１０】
ヒドロゲル及び／又はペプチド／ペプトイドをインプラント又は経皮パッチ又はステントのような他の薬物送達システム用に製剤化してもよい。
【０２１１】
第１の態様において、本発明は、バイオファブリケーションにおけるヒドロゲル形成性ペプチド／ペプトイド／ペプチド模倣体の使用を提供する。
【０２１２】
ペプチド自己組織化は、秩序ある三次元ナノ生体材料の設計に向けての洗練された好都合な「ボトムアップ」アプローチである。自己組織化を支配する高特異的相互作用のため、再生可能な高分子ナノ構造を得ることができる。アミノ酸配列がペプチド二次構造及び他の分子との相互作用を決定し、そしてまたそのような相互作用が、より高次の高分子構造を決定付ける。
【０２１３】
自己組織化ナノ繊維状ペプチド足場は、再生医療での応用にとって重要である。自己組織化ナノ繊維状ペプチド足場のナノ繊維のトポロジーは細胞外マトリックスに似ているので、自己組織化ナノ繊維状ペプチド足場は、細胞成長及び挙動を調節するための空間的及び時間的キューをもたらす生物模倣型足場として広範に利用されている。細胞及び他の生化学的キューを組み込んでいる、空間的に定義された大規模三次元足場を、３Ｄ微小液滴バイオプリンティング及び成形技術によって得ることができる。自己組織化ペプチド、ペプチド模倣体及びペプチド結合体は、カプセル化された細胞の成長を支援する生体適合性高分子足場のプリンティング又は成形のために構成要素として役立つことができる。
【０２１４】
本開示は、水性条件で自己組織化を助長して生体適合性である多孔性ナノ繊維状足場を形成する特徴的なモチーフ（図１）を有する、超短鎖ペプチド／ペプチド模倣体／結合体の新規クラスを記載するものである。いくつかのサブクラスは、刺激応答性ゲル化を実証し（図２）、ミニヒドロゲルアレイ及び３Ｄ器官型生物学的構築物のバイオプリンティングに使用することができる。刺激応答性を活用して、塩溶液浴に押し出すことによりヒドロゲル繊維又は「ヌードル」を生成することもできる。得られた繊維を回収し、使用して、織られて整列した繊維状足場を作ることができる可能性がある。
【０２１５】
自己組織化を駆動する特徴的モチーフは、Ｃ末端に向かって疎水性漸減で配列された、２〜７天然脂肪族アミノ酸のＮ末端「テール」から成る（図１）。Ｃ末端における極性「頭部基」は、以下のものであってもよい：
極性アミノ酸（特に、両親媒性配列を含有しない疎水性ペプチドの場合）、
官能基（例えば、カルボン酸、アミン、エステル、アルコール、アルデヒド、ケトン、マレイミド）、
小分子（例えば、糖、アルコール、ビタミン、ヒドロキシル酸、アミノ酸）
及び／又は
短鎖極性リンカー。
【０２１６】
水性条件での自己組織化は、アミノ酸が対合し、その後、αヘリックス細線維に積み重なると起こる（図１）。ナノ繊維の３Ｄ網目構造への細線維のさらなる凝集によって水が捕捉されると、ヒドロゲルが得られる（図３Ａ）。
【０２１７】
官能基の存在により、組織化前及び後に化学的修飾を行うことができる。例えば、組織化後に、成長因子、脂質、細胞受容体リガンド、ホルモン及び薬物などの生理活性部分を足場に結合させて、官能化ヒドロゲルを生じさせることができる。
【０２１８】
これらのペプチド／ペプチド模倣体／結合体のいくつかのサブクラスは、刺激応答性ゲル化を実証する（図２）。特に、極性頭部基としてのリシン又はリシン様分子を有するペプチドのサブクラスは、塩及び高ｐＨの存在下でゲル化増進及び硬さを示す（図３Ａ、Ｂ及びＣ）。ゲル化継続期間は、ペプチド及び塩濃度を滴定することによって調整することができる。これは、塩溶液の併用注射によってゲル化を制御し、所望の領域に限定することができる、バイオプリンティングの開発への道を開く。
【０２１９】
さらに、ゲル化プロセスはわずかに吸熱性であり、このことが、温度感受性の要素を加え、カプセル化細胞への熱損傷の可能性をなくす。ゲル化プロセス中、ゲル化継続期間を調節できることが、再生医療での利用のためにヒドロゲル構築物を所望の形状に造形することを可能にする。ペプチドヒドロゲルのこのサブクラスの機械的特性は、塩濃度及びｐＨを増加させることによって向上される。剛性及び調整可能な機械的特性は、アミド化ペプチドヒドロゲルのこのサブクラスを、機械的に指示する役割を果たす生物学的構築物の開発の理想的な候補にしている。イオン性緩衝液及び塩基の賢明な添加によって、より少ないペプチドを使用して、細胞遊走を支援する多孔度を維持しながら等価の機械的剛性を達成することができる。機械的特性及び多孔度を調節できることは、天然組織のものと同等の機械的特性を有する器官型構築物の生成に不可欠である。比較して、自己組織化αヘリックス、βヘアピン（Ｇ’≦２ｋＰａ）及びβシート（Ｇ’≦２ｋＰａ）に基づく他のペプチドヒドロゲルは、そのような高い硬さを達成することができない（参考文献：αヘリックス：
Ｂａｎｗｅｌｌ、Ｅ．Ｆ．ら、Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．、Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  ８、５９６〜６００（２００９）。
Ｙａｎ，Ｃ．及びＰｏｃｈａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  ３９、３５２８〜３５４０（２０１０）。
βヘアピン：
Ｙａｎ，Ｃ．ら、Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｓｏｌｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｈｅａｒ−ｔｈｉｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  β−ｈａｉｒｐｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ、Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ６、５１４３  （２０１０）。
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２４、１５０３０〜１５０３７（２００２）。
参考文献：βシート：
Ｚｈａｎｇ，Ｓ．、Ｈｏｌｍｅｓ，Ｔ．、Ｌｏｃｋｓｈｉｎ，Ｃ．及びＲｉｃｈ，Ａ．、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、３３３４〜３３３８（１９９３）。
Ｌｉｕ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｌ．、Ｙａｎｇ，Ｚ．及びＺｈａｏ，Ｘ．、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６、２１４３〜２１５３（２０１１）。
Ａｇｇｅｌｉ，Ａ．ら、Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｌｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔ  ｔａｐｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６、２５９〜２６２（１９９７））。
【０２２０】
概念実証として、ペプチドのこのサブクラスを使用して、スクリーニング及び再生医療のためにミニヒドロゲルアレイ及び３Ｄオルガノイド構造を創り出すバイオプリンティングの実行可能性を実証した。ペプチドのこのサブクラスは、低い粘度を有する溶液を形成する、水への良好な溶解性を実証する。これは、プリンティングを助長し、針／プリンターの目詰まりを防止する。生理的塩溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）と相互作用すると、ペプチド溶液は即座にゲル化する。図３Ｄに示されているように、多数の微小液滴がミニヒドロゲルを形成することになり、ＰＢＳで洗浄すると前記ヒドロゲルはガラス又はポリスチレン表面に付着する。
【０２２１】
上記ペプチド／ペプチド模倣体は、生体適合性である。患者試料（線維芽細胞、髄核）から単離された幹細胞（間葉系、前駆、胎性及び誘導多能性幹細胞）及び初代細胞を分注プロセス中にペプチドと混合することができる（図４）。ゲル化後、細胞は液滴に固定化される。ナノ粒子、小分子薬、オリゴヌクレオチド及びタンパク質を同様に共カプセル化することができる（図４及び５）。
【０２２２】
スライドスキャナを使用するハイスループット組織学的スクリーニングの出現を加味して、この技術を用いて、単一の顕微鏡スライド上の最小の細胞数を使用して異なる試験化合物を評価することができる（図６）。
【０２２３】
架橋剤を組み込むことによって、これらのミニヒドロゲルの機械的安定性を向上させることができる。生理活性官能基もポリマーとの混合又は架橋によって組み込むことができる（図７）。
【０２２４】
様々なペプチド／ペプチド模倣体／結合体を、それらの自己組織化特性を損なわせることなく、混合することができる。このような混合ができることにより、様々な化合物を併用して、結合に様々な官能基を利用することが可能になり、バルク特性を変えることが可能になる。
【０２２５】
３Ｄ微小液滴プリンティング及び成形に上記技術を拡大して、別個の多機能性マイクロニッチを有する生物学的器官型構築物を得ることができる（図８）。ヒドロゲルがプリンティングプロセス中に異なる細胞タイプを別々に閉じ込めることができるので、多細胞構築物も得ることができる。上記ペプチド／ペプチド模倣体／結合体足場は、共カプセル化細胞に機械的安定性を備えさせることになる。遺伝子、小分子及び成長因子を共送達して、細胞生存を増進すること、幹細胞分化を促進すること、及び宿主免疫応答を調節することができる。結果として生じた３Ｄ生物学的構築物を、薬物のスクリーニング、細胞挙動及び疾患進行の研究、並びに再生医療のために組織工学によって作製されるインプラントのためのオルガノイドモデルとして使用することができる。
【０２２６】
微小液滴に加えて、ペプチド溶液を高濃度塩溶液に押し出すことによって得ることができる繊維（「ヌードル」）も得る（図３）。細胞と生理活性部分の共カプセル化を行うことができる。繊維状微小環境は、織られた足場、整列した足場、及び３Ｄパターン形成された共培養足場などの新たな応用例を生じさせることができる。
【０２２７】
本発明のヒドロゲルにカプセル化された細胞、例えばヒト胎性幹細胞は、増殖し、該細胞の多能性を維持し、その結果、３Ｄでの培養が初代細胞の天然表現型を保存することを実証する（図１１を参照されたい）。本発明のバイオプリントされたヒドロゲルの表面に細胞をプリントすることもできる。３Ｄでの培養は、初代細胞の天然表現型をより良く保存し、細胞のより高密度での培養を可能にすることになる（図１２を参照されたい）。
【０２２８】
上記ナノ繊維状ヒドロゲルは生体適合性であり、初代細胞（ウサギ上皮線維芽細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞、及び腎尿細管細胞）及び幹細胞（間葉系、耐性及び誘導多能性幹細胞）の増殖を支援する。上記細胞をヒドロゲルコーティング上で培養することができ、又はヒドロゲル内にカプセル化することができる（図４）。ヒドロゲル内にカプセル化する場合、細胞は、それらの天然状態により類似している３Ｄ形態をとる。ナノ繊維状足場は、細胞付着及び生存を助長する機械的及び組織分布的キューをもたらす。
【０２２９】
天然組織に似ている組織培養物の必要性は、いくつかの方法で病原体感染性及び伝播の研究を限定する。第１に、上記必要性は、試験に利用可能な病原体ストックの量を制限する−病原体をインビボ増殖させなければならず、これは、病原体がヒト宿主のみを感染させる場合、特に難題である。これは、マラリア、デング及びノロウイルスなどの疾患の場合である。第２に、ドナー組織を確認のために得なければならないので、ウイルス感染性の機序（標的細胞への侵入と複製）を特定することは難題である。３Ｄでの培養は、初代細胞の天然表現型をより良く保存し、細胞のより高密度での培養も可能にすることになる。例えば、ガラス製カバースリップ上で培養した構築物と比較した、ペプチド受容体ＦＵＴ２Ａ上で培養したＣａｃｏ２細胞（図１２）。ＦＵＴ２Ａがノロウイルス感染性に関与することにかんがみて、組織培養ポリスチレン及びガラス製カバースリップ上の単層培養物は、ウイルス感染性の研究を支持せず、病原体発現も可能にしない。回転バイオリアクターにおいてサイトデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）マイクロキャリアを使用して、Ｃａｃｏ２細胞を培養し、その後、ウイルスに感染させてウイルスを増幅する試みは、限られた成功しか実証しない。これらのデキストランマイクロキャリアは不透明であり、吸光度及び蛍光ベースの診断アッセイとは相性が悪い。したがって、腸細胞へのウイルス侵入及び複製機序を研究するための細胞モデルの開発は、試験プロトコル、有効な衛生化方法及び迅速な診断試験の開発を助長する。
【０２３０】
肝要な特徴：
ナノ繊維状足場、特に３Ｄナノ繊維状足場に自己組織化することができる２〜７個のアミノ酸だけからなるペプチド／ペプチド模倣体／結合体の新規クラス。有意に短い配列は、他の自己組織化ペプチド／結合体技術と比較して、合成及び精製の低いコスト及び容易さを含意する。
【０２３１】
水性条件及び極性溶媒中での（生物模倣型）ナノ繊維状足場への興味深い自己組織化機序。そのような足場は、細胞及び組織再生のための、並びに／又は細胞増殖、遊走及び挙動に影響を与える、機械的及び組織分布的キューをもたらすことができる。
【０２３２】
異なる方法で製剤化することができる多目的材料。いくつかのサブクラスは刺激応答性であり、このことがバイオプリンティング技術の開発を助長する。いくつかのサブクラスは、様々な用途に活用することができる刺激応答性挙動を実証する。
【０２３３】
ペプチドのサブクラスは塩及びｐＨ応答性ゲル化を実証する。特に、生理学的に適合性の塩溶液に曝露すると即時ゲル化を達成することができる。
【０２３４】
水に溶解したとき、ペプチド溶液は低い粘度を有し、針及びプリントヘッドによって容易に分注することができる。このことによって、目詰まりの可能性が最小限に抑えられる。
【０２３５】
刺激応答性を活用して、ヒドロゲル繊維／「ヌードル」を生成することもできる。その後、これらの繊維を整列させて又は織って、組織工学及び疾病モデルのための革新的足場を作ることができる。
【０２３６】
マクロスケールで、鋳型（例えば、シリコーン製もの）を使用してヒドロゲルに３Ｄ様式でパターン形成することもできる。
【０２３７】
ヒドロゲルは生体適合性であり、細胞をカプセル化するために使用することができる。ゲル化すると、結果として生じるヒドロゲルは安定しており、容易に解離しない。したがって、カプセル化された細胞は逃げることができない。細胞をヒドロゲル内及び／又は上で培養することができる。
【０２３８】
プリントされた／作製された足場上に細胞をプリントする／堆積させることができる。細胞をプリントプロセス中にカプセル化することもでき、その後、その表面に追加の細胞を堆積させることもできる。これは、腸及び皮膚上皮などの現実的な細胞培養モデルを開発するためのその後の利用に有利である。
【０２３９】
初期細胞生存率を最大にし、その後の細胞増殖及び天然組織に似ている組織培養物の開発を促進する、初代細胞の独特な三次元カプセル化方法。ヒドロゲルの機械的特性を天然組織のものにマッチするように調整して、天然表現型の維持を増進することもできる。
【０２４０】
天然組織に似ており、病原体感染及び複製を起こしやすい細胞モデルの開発を可能にする、実現技術。この技術は、病原体進入及び再生に基づき、それによって試験プロトコル、有効な衛生化方法及び迅速な診断試験の開発を可能にすることを助長することができる。これは、ヒト宿主を罹患させる、及び既存の細胞培養及び動物モデルでの複製不良を明示する、マラリア、デング及びノロウイルスなどの疾患に不可欠である。
【０２４１】
細胞培養モデルをことによると薬物スクリーニング及びインビトロ法に応用することができる。
【０２４２】
ペプチドヒドロゲルは、光学的に透明であり、それ故、吸光度測定、蛍光及び明視野イメージングの標準技術の使用を可能にする。細胞の複合コレクションの生物学を解明するための、及び様々な刺激へのそれらの細胞の応答を経時的に定量するための、ハイスループット顕微鏡検査及び生化学的アッセイを用いる細胞ベースの研究も実行可能である。
【０２４３】
構築物は、機械的及び酵素的介入なしに解離しないので長期の培養期間にわたって安定しており、その結果、長期研究が可能になる。
【０２４４】
生理活性部分、例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質（成長因子、抗体及びサイトカイン）及び小分子薬、並びにナノ及びマイクロ粒子を共カプセル化して、細胞挙動に影響を与えることができる。カプセル化された生体分子の放出を、多孔度及び様々な分子相互作用によって調節することもできる。
【０２４５】
官能基の存在のため、組織化後の修飾が実行可能である。成長因子などの生理活性部分を結合体上のペプチド主鎖又は官能基に結合させて生物学的挙動を調節することもできる。
【０２４６】
ペプチドの刺激応答性のため、足場及び幹細胞は、大規模３Ｄ細胞培養、細胞ベースのハイスループットスクリーニング及び再生医療用途のプラットフォーム技術を開発するための特異的形状にバイオプリント又は成形することができる。
【０２４７】
第二の態様において、本発明は、ヒドロゲル形成性疎水性ペプチド／ペプチド模倣体の新規クラスを提供する。
【０２４８】
本発明者らは、親水性アミノ酸（複数可）などの極性頭部基の不在が疎水性アミノ酸のみからなる小ペプチドに与えている利点及び特性を発見した。
【０２４９】
Ｃ末端の極性基の不在は、超短鎖ペプチドの今までに開示されたクラスとは異なる特性を有する自己組織化ペプチドの新規クラスを生じさせる。現状技術をよく知っている人には、アミノ酸の疎水性配列が単独で、繊維状足場に自己組織化して最終的にヒドロゲルになることができることは、明白なことではない。超短鎖ペプチドの現在探求されているタイプの今までに探求された組織化プロセスは、両親媒性配列のみに依存していると考えられた。極性頭部基の不在は、軟質固体材料ではなくミセル様構造を生じさせると予想される可能性がより高かったであろう。加えて、極性頭部基の不在は、新たな材料特性につながり、新規スマート生体材料を創出する今まで未探求の可能性をもたらす。
【０２５０】
材料特性の新たな利点を、小分子、官能基及び短鎖リンカーなどの非アミノ酸の結合による官能化によって設計することができる。これらの小分子／官能基／短鎖リンカーは、生体付着性及び受容体標的化などの新たな材料特性をもたらす。この新たなペプチド配列特性は、新たな（今までに開発されたものとは異なる）用途の開発を可能にする。前記特性は、所望の化合物の精製も単純にする。ペプチド自体と比較して、Ｃ末端の官能基／短鎖リンカーの存在は、官能化の容易性、及び複数の生理活性分子（例えばサイトカイン、プロドラッグなど）を単一のペプチド模倣体／ペプチド結合体に化学的に結合する能力を向上させる。本発明者らは、ペプチド模倣体／ペプチド結合体と目的の生理活性分子との間の望ましくない副反応及び非特異的相互作用もなくすことができる。
【実施例】
【０２５１】
本発明の例示的実施形態の技術的態様を例証するために実験を行った。以下の実施例を実験方法及び結果に記載する。本実施例が、例証を意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことは、当業者には容易に分かるであろう。
【０２５２】
実験方法及び結果
ペプチド
親水性頭部基と疎水性テール基とを含有する両親媒性ペプチド構造を示すようにペプチド配列を設計した。上記ペプチド設計の理論的根拠は、円錐形の構造に似ている漸減サイズのペプチドモノマーを作ることであった。疎水性テールは、異なる脂肪族アミノ酸の使用によって異なる。疎水性テールは、以下の脂肪族アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなっており、親水性頭部基は、１つ又は２つの極性又は荷電アミノ酸からなっている。疎水性テールの配列順序は、異なる脂肪族アミノ酸の使用によって異なった。ペプチドはＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａから商業的に合成された。ペプチドヒドロゲル形成挙動の再現性を検証するために、ペプチドを他の会社（Ｂｉｏｍａｔｉｋ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎａｓｐｅｃ．Ｉｎｃ、ＵＳＡ）からも合成した。  ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び質量分析によって検証された９５％以上の純度を有する。ペプチドストック溶液を５〜１０ｍｇ／ｍｌで水に溶解した。ペプチドの大部分はＮ末端がアセチル化されている。
【０２５３】
ペプチドベースのヒドロゲル調製。
すべてのペプチド（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ、純度≧９８％）を新たに調製して、時期尚早のペプチド凝集を回避した。ペプチドを水に溶解し、室温で放置してヒドロゲルを形成した。ペプチド濃度に依存して、自己組織化プロセスが直ちに、数時間以内に、又はさらには数日（ゲル化の実験時間枠）以内に起こった。より高いペプチド濃度については、ペプチドをボルテックスに付すことによってミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水に溶解した。強制及び加速ヒドロゲル調製を必要とする場合、ペプチド溶液を水浴内での超音波処理に付した（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｌａｂｌｉｎｅ  ９３１９  ＵｌｔｒａｓｏｎｉｃＬＣ６０Ｈ）。自己組織化によって生成されたヒドロゲルと組織化を超音波処理によって冗長したものとの間に有意な構造的相違は観察されなかった。高温、すなわち５０℃で、より容易にヒドロゲルを形成したペプチドは殆どなかった。
【０２５４】
濃度変動の効果を研究するために、ＡｃＬＤ６（Ｌ）ヒドロゲルとＡｃＩＤ３（Ｌ）ヒドロゲルの両方を上に明記したように濃度を変えて調製した。一価及び二価カチオンの効果を研究するために、ペプチドを１０、５０、１００及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及びＣａＣｌ２溶液に溶解することによってＡｃＬＤ６（Ｌ）ヒドロゲルを調製した。ＦＥＳＥＭ及びレオロジー研究をさらに行って、これらのヒドロゲルの形態及び強度を特徴付けた。
【０２５５】
ゼラチン及びコラーゲンゲルの調製：ゼラチン（Ａ型、Ｇ１８９０；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）ヒドロゲルは、先ずゼラチンをミリＱ水に加熱によって溶解し、その後、ゲル化が観察されるまで冷却することによって調製した。コラーゲン（ウシからのＩ型、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ、ＵＳＡ）をＰＢＳ緩衝液で１．５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用して滴定してｐＨ７．４にした。溶液を３７℃で１時間インキュベートすることによってゲル化を果たした。
【０２５６】
円偏光二色性（ＣＤ）分光法
Ａｖｉｖ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、モデル４１０を使用して楕円率スペクトルを測定することによって、二次ペプチド構造を分析した。ＣＤ試料は、ストックペプチド溶液（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）を水で希釈することによって調製した。希釈したペプチド溶液を、１ｍｍの路長を有するキュベットに充填し、スペクトルを取得した。ブランク基準として水を使用し、基準を生データから引いた後、モル楕円率を計算した。計算は、式：［θ］λ＝θｏｂｓ×１／（１０Ｌｃｎ）に基づき、式中、［θ］λは、λでのモル楕円率（ｄｅｇ・ｃｍ２・ｄ／ｍｏｌ）であり、λでの実測楕円率（ｍｄｅｇ）であり、Ｌは、路長（ｃｍ）であり、ｃは、ペプチドの濃度（Ｍ）であり、ｎは、ペプチド中のアミノ酸の数である。二次構造分析は、ＣＤＮＮソフトウェアを使用して行った。
【０２５７】
環境制御型走査電子顕微鏡法（ＥＳＥＭ）
試料をＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ  ２００環境制御型走査電子顕微鏡の試料ホルダー上に配置した。その後、４℃の温度で１０ｋＶの加速電圧を用いて目的の面を検査した。
【０２５８】
電界放射型走査電子顕微鏡法（ＦＥＳＥＭ）
試料を−２０℃で、そしてその後−８０℃で凍結させた。凍結試料をさらに凍結乾燥させた。凍結乾燥サンプルを、導電性テープを使用して試料ホルダー上に固定し、ＪＥＯＬ  ＪＦＣ−１６００高解像度スパッタコーターで上及び側面から白金をスパッタリングした。使用したコーティング電流は３０ｍＡであり、この工程を６０秒間継続した。その後、目的の表面をＪＥＯＬ  ＪＳＭ−７４００Ｆ電界放射型走査電子顕微鏡システムで、５〜１０ｋＶの加速電圧を使用して検査した。
【０２５９】
レオロジー測定
ペプチドベースのヒドロゲルの粘弾特性を判定するために、直径２５．０ｍｍチタン製平行プレート状及び０．８ｍｍの間隙距離を有するＡＲＥＳ−Ｇ２レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、ヒドロゲルを動的時間、歪み及び周波数掃引実験に付した。振動周波数研究を行って、様々なペプチド濃度を有するペプチドベースのヒドロゲルの強度を比較した、又は一価若しくは二価イオンの存在下でペプチドについて比較した。振動周波数掃引研究は、２５℃及び５０℃で０．１〜１００ｒａｄ／ｓの周波数及び０．１％の歪みで行った。
【０２６０】
Ａｃ−ＬＤ６［Ｌ］：
ペプチド配列：Ａｃ−ＬＩＶＡＧＤ−ＣＯＯＨ
分子量：６２９．５６
【０２６１】
（１）Ａｃ−ＬＤ６（Ｌ）についての温度掃引研究：
（ａ）この場合、ペプチド混合物を、レオメーター下方プレート上に配置した。以下のパラメータを最適化した：
２プレート間の間隙：１ｍｍ
歪み：１０％
周波数：６．２８ｒａｄ／秒
温度スキャン：４℃〜６０℃
試料体積：５００μｌ
【０２６２】
（２）Ａｃ−ＬＤ６（Ｌ）についての周波数掃引研究：
周波数掃引研究を行うために必要な最適化パラメータ
２プレート間の間隙：０．８ｍｍ
歪み：０．１％
温度：２５及び５０℃
試料体積：１ｍｌ
周波数スキャン：０．１ｒａｄ／秒〜１００ｒａｄ／秒
ヒドロゲル中のＡｃ−ＬＤ−６（Ｌ）の濃度：１０ｍｇ／ｍｌ
【０２６３】
（３）ゲル強度に対するＡｃ−ＬＤ６（Ｌ）の濃度変動の効果：
ゲル強度を測定するための周波数掃引研究を行うために必要とされる最適化パラメータは次の通りである：
２プレート間の間隙：０．８ｍｍ
歪み：０．１％
温度：２５及び５０℃
試料体積：１ｍｌ
周波数スキャン：０．１ｒａｄ／秒〜１００ｒａｄ／秒
ヒドロゲル中のＡｃ−ＬＤ６（Ｌ）の濃度：水中５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ及び２０ｍｇ／ｍｌ及び３０ｍｇ／ｍｌ。
【０２６４】
（４）Ａｃ−ＬＤ６（Ｌ）のゲル強度に対する塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の効果：
Ａｃ−ＬＤ６（Ｌ）ベースのヒドロゲルに対する塩化ナトリウムの効果は、ヒドロゲルを形成するための最適化手順を用いて様々な濃度のＮａＣｌ溶液、例えば１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ及び１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液に１０ｍｇのＡｃ−ＬＤ−６（Ｌ）を分散させることによって調製したヒドロゲルで周波数掃引研究を行うことによって研究した。ＮａＣｌの存在下でゲル強度を測定するための周波数掃引研究を行うために必要な最適化パラメータは次の通りである：
２プレート間の間隙：０．５ｍｍ及び０．８ｍｍ
歪み：それぞれ１０％及び０．１％
温度：２５℃及び５０℃
試料体積：１ｍｌ
周波数スキャン：０．１ｒａｄ／秒〜１００ｒａｄ／秒
１０ｍｇ／ｍｌのＡｃ−ＬＤ−６（Ｌ）ヒドロゲルを調製するために使用したＮａＣｌ溶液の濃度：１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液。
【０２６５】
Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２［Ｌ］及びＡｃ−ＩＬＶＡＧＫ−ＮＨ２［Ｌ］：
ヒドロゲルの調製。ペプチドヒドロゲルのこのサブクラスを調製するために、凍結乾燥ペプチド粉末を先ず冷ミリＱ水に溶解し、３０秒間ボルテックスにかけることによって混合して均一溶液を得た。その後、１０％体積の９％塩化ナトリウム又は１０倍リン酸緩衝食塩水を添加し、得られた溶液をさらに３０秒間ボルテックスにかけてゲル化を評価した。ゲル化は、用いたペプチド濃度及び緩衝液に依存して、数分〜一晩の間に起こった。ゲル化を超音波処理又は加熱によって助長することができる。
【０２６６】
ヒドロゲル試料をポリジメチルシロキサン鋳型内で作製して、厚さおおよそ１ｍｍ、直径８ｍｍの円板を得た。８ｍｍチタン製平行プレート形状を有するＡＲＥＳ−Ｇ２レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、動的歪み及び振動周波数掃引実験を行った。粘弾特性に対するいくつかのパラメータを変えることの効果を次の通り研究した：
（１）濃度を変えることの効果
（２）溶液のイオン強度を変えること（水対食塩水対ＰＢＳ）の効果
（３）ｐＨを変えることの効果
【０２６７】
２７ゲージ針からの押し出し
４℃で５ｍｇ／ｍＬのＡｃ−ＩＬＶＡＧＫ−ＮＨ２溶液を、２７ゲージ針を有する１ｍＬシリンジから室温の１０Ｘ  ＰＢＳ溶液に押し出した。
【０２６８】
ヒドロゲル液滴の調製
本発明者らは、ペプチド溶液の少量の液滴（０．５、１、２、５、１０及び２０μＬ）を単に分注し、その後、混合する又はＰＢＳでの洗浄することによって、ヒドロゲルアレイを得た。粘度及び硬さは、ゲル化すると有意に増加し、それによって高い形状忠実度がもたらされ、堆積部位にヒドロゲル液滴を局在させること、内部組成を制御すること、及びカプセル化された細胞又は生理活性部分を保留すること（バイオインクの２つの重要な基準）が可能になる。今日までに、本発明者らは、小分子、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ナノ粒子、タンパク質及び細胞をカプセル化する、様々な体積のヒドロゲル液滴アレイを生成した。
【０２６９】
ヒト間葉系幹細胞のカプセル化
ヒト間葉系幹細胞をＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手し、２０％ウシ胎仔血清、２％  Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ培地で培養した。トリプシン処理することにより、細胞をＰＢＳに懸濁させ、その後、（ＰＢＳ中の）ペプチド溶液中又は上に添加した。次いで、構築物を３７℃で１５分間放置してゲル化させた後、培地を添加した。
【０２７０】
ナノ繊維状ヒドロゲルに自己組織化する疎水性ペプチド
材料。この研究に使用したすべてのペプチドは、固相ペプチド合成を用いてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により手動で合成され、ＨＰＬＣによって＞９５％に精製された。アミノ酸及びペプチド含有量分析が行われた。
【０２７１】
ヒドロゲルの調製。ペプチドヒドロゲルを調製するために、凍結乾燥ペプチド粉末を先ずミリＱ水に溶解し、３０秒間ボルテックスにかけることによって混合して均一溶液を得た。ゲル化は、ペプチド濃度に依存して、数分〜一晩の間に起こった。ゲル化を超音波処理又は加熱によって助長することができる。
【０２７２】
Ｃ末端の官能化。Ｃ末端を官能化するために、ビオチン及びＬ−ドパを、固相ペプチド合成中に先ずＦｍｏｃ保護前駆体をＷａｎｇ又はＲｉｎｋ−アミド樹脂と反応させることによって組み込んだ。ＨＰＬＣ／ＭＳを使用して最終生成物を精製し、凍結乾燥させ、ゲル化について評価した。
【０２７３】
電界放射型走査電子顕微鏡法。ヒドロゲル試料を液体窒素で急速冷凍し、その後、凍結乾燥させた。凍結乾燥試料にＪＥＯＬ  ＪＦＣ−１６００高解像度スパッタコーターで白金をスパッタリングした。３ラウンドのコーティングを異なる角度で行って確実に完全にコーティングした。その後、コーティングされた試料を、ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−７４００Ｆ  ＦＥＳＥＭシステムで２〜５ｋＶの加速電圧を使用して検査した。
【０２７４】
実施例２
２．１  方法
材料。この研究に使用したすべてのペプチドは、固相ペプチド合成を用いてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により手動で合成され、ＨＰＬＣによって＞９５％に精製された。アミノ酸及びペプチド含有量分析が行われた。すべての細胞試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。
【０２７５】
ヒドロゲルの調製。ペプチドヒドロゲルを調製するために、凍結乾燥ペプチド粉末を先ず冷ミリＱ水に溶解し、３０秒間ボルテックスにかけることによって混合して均一溶液を得た。その後、１０％体積の９％塩化ナトリウム又は１０倍リン酸緩衝食塩水を添加し、得られた溶液をさらに３０秒間ボルテックスにかけてゲル化を評価した。ゲル化は、用いたペプチド濃度及び緩衝液に依存して、数分〜一晩の間に起こった。ゲル化を超音波処理又は加熱によって助長することができる。
【０２７６】
円偏光二色性分光法。ペルチェ温度コントローラを装着したＡｖｉｖ  ４１０ＣＤ分光光度計で、５ｍｍの光路長を有する長方形石英スプラジル（ｓｕｐｒａｓｉｌ）キュベットを使用して、ＣＤスペクトルを収集した。データ収集は、１．０ｎｍのステップで１９０〜２６０ｎｍの波長範囲と１．０ｎｍのスペクトル幅で行った。試料を測定ごとに新しく調製し、キュベット内の試料体積を１．６ｍＬで一定に保った。ミリＱ水をベースラインとして使用してすべてのスペクトルをベースライン補正した。
【０２７７】
電界放射型走査電子顕微鏡法。ヒドロゲル試料を液体窒素で急速冷凍し、その後、凍結乾燥させた。凍結乾燥試料にＪＥＯＬ  ＪＦＣ−１６００高解像度スパッタコーターで白金をスパッタリングした。３ラウンドのコーティングを異なる角度で行って確実に完全にコーティングした。その後、コーティングされた試料を、ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−７４００Ｆ  ＦＥＳＥＭシステムで２〜５ｋＶの加速電圧を使用して検査した。
【０２７８】
レオロジー。ヒドロゲル試料をポリジメチルシロキサン鋳型内で作製して、厚さおおよそ１ｍｍ、直径８ｍｍの円板を得た。８ｍｍチタン製平行プレート形状を有するＡＲＥＳ−Ｇ２レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、動的歪み及び振動周波数掃引実験を行った。
【０２７９】
細胞培養。ヒト間葉系幹細胞をＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手し、２０％ウシ胎仔血清、２％  Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ培地で培養した。実験に使用した細胞は２継代〜６継代の間であった。ウサギ髄核細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅから、承認された動物実験実施計画のもとで入手した。Ｂｉｏｐｏｌｉｓ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（Ａ＊ＳＴＡＲ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにおいてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０顕微鏡を使用して共焦点顕微鏡検査を行った。
【０２８０】
インビボ生体適合性。３０μＬヒドロゲル試料をオスＣ５７ＢＬ６マウスに最長２カ月間皮下埋め込みすることによって、生体適合性を評価した。安楽死させた後、インプラント部位を組織学的分析のために切除した。実験は、Ａ＊ＳＴＡＲのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって承認されたＩＡＣＵＣ実験実施計画のもとで行った。モルモットマキシマイゼーション研究は、医薬品開発業務受託機関Ｔｏｘｉｋｏｎによって、ＩＳＯ規格１０９９３−１０に概説されているＧＬＰ条件下で行われた。
【０２８１】
誘導椎間板変性ウサギモデル。動物１匹当たり３つの腰部椎間板（Ｌ３／Ｌ４、Ｌ４／Ｌ５及びＬ５／Ｌ６）において椎間板変性症をシミュレートするために、ニュージーランドホワイトウサギの線維輪を穿刺し、髄核を吸引によって採集した２７。実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅによって承認されたＩＡＣＵＣ実験実施計画のもとで行った。傷害１カ月後、ヒドロゲル及び細胞治療処置剤を損傷した２つの椎間板に注射し、１つは未処置対照として残した。傷害２カ月後、動物を安楽死させ、組織試料をエクスビボＭＲＩ実験及び組織学的検査のために採集した。ＭＲＩ実験は７Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｌｉｎｓｃａｎ  ＭＲＩシステムで行い、Ｔｒａｎｓｍｉｔ／Ｒｅｃｅｉｖｅ  ７２ｍｍボリュームコイルを使用して画像を取得した。Ｔ１及びＴ２強調画像は、次の取得パラメータを用いて取得した：それぞれ、ＴＲ／ＴＥ＝４００／１２ｍｓ、及びＴＲ／ＴＥ＝１５００／６７ｍｓ。他の関連実験パラメータは、７０ｍｍ  ＦＯＶ、１ｍｍ  スライス厚を含み、最終画像は４つの平均であった。
【０２８２】
２．２  インビトロ及びインビボでの生体適合性
ペプチドヒドロゲルは、インプラントの重要な考慮事項である、良好なインビボ安定性を実証した。理想的には、ヒドロゲルは、生理条件下で少なくとも６〜１２カ月間安定したままであるべきであり、それによって、短い時間枠内での反復処置が必要なくなる。健常Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのヒドロゲル円板の皮下埋め込みは、少なくとも２カ月間持続し、筋肉層下の非晶質好酸性分極性物質として観察された（図１３）。偏光顕微鏡検査下で観察された複屈折は、ペプチド繊維が、磁場又は電場などの外部刺激の不在下であっても整列していることを示唆している。同様の観察が他の自己組織化ペプチド両親媒性物質についても行われている（Ｗａｌｌ，Ｂ．Ｄ．ら、Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ  ２３、５００９〜５０１４、２０１１；Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ら、Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  ９、５９４〜６０１、２０１０）が、本発明者らの超短鎖ペプチドのほうが、合成が有意に安価であり、容易である。
【０２８３】
特に、インプラントに対する免疫応答は微小から中等度であり、埋め込み手術に起因した。同様の炎症反応が、偽手術を受けたマウスについて観察されたからである。少数の多核巨細胞組織球がいくつかのインプラントの付近で観察された（図１３）。大量のヒドロゲルは、重篤な免疫活性化を惹起せず、２カ月後でさえ被嚢形成はなかった。ペプチドヒドロゲルを埋め込んだ動物と対照動物の間に赤血球又は白血球数の観察可能な差もなかった。血清酵素及び代謝物濃度の分析は、ペプチドが肝機能を損なわせないことをさらに示唆した。Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２の優れた生体適合性は、モルモットで行ったＫｌｉｇｍａｎマキシマイゼーションアッセイによって肯定された。Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２の局所適用及び皮内注射は、２４時間後、刺激もアレルギー反応も惹起せず、２７日後の後続の免疫負荷後にも反応は観察されなかった（表１）。動物は、全身性の毒性徴候を一切示さなかった。併用遺伝毒性アッセイによってＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２は非突然変異誘発性であることを証明した（表２）。要約すると、本発明者らの超短鎖ペプチドはインビトロ及びインビボで生体適合性であり、このことが、本発明者らの超短鎖ペプチドをバイオインク、細胞培養基質及び埋め込み可能な足場としての利用に非常に適したものにする。
【０２８４】
表１．  Ｋｌｉｇｍａｎマキシマイゼーションアッセイによって、Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２はインビボで生体適合性であること、及びモルモットにおいて免疫原性及び生理学的有害事象を惹起しないことを証明した。Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２及び食塩水の局所適用及び皮内注射は、２７日後に後続の負荷を行っても、感作も免疫反応も一切生じさせなかった。ペプチド及び食塩水対照で処置した動物に目に見える変化は観察されなかった。ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）で処置したすべての動物は、パッチ（グレード１）から中等度（グレード２）の紅斑を実証し、１００％感作のスコアを示した。
【表１】
2017501136.tif 000003
【０２８５】
表２．  Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２によって例示されるようなアミド化ペプチドは、非突然変異誘発性である。チャイニーズハムスター卵巣細胞を使用して代謝活性化因子の（ａ）不在及び（ｂ）存在下で染色体異常アッセイを行った。評価した異常の様々なタイプは、染色分体ギャップ（ＴＧ）、染色体ギャップ（ＳＧ）、染色分体切断（ＴＢ）、染色体切断（ＳＢ）、欠失（Ｄ）、三放射状再配列（ｔｒｉｒａｄｉａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）（ＴＲ）、四放射状再配列（ｑｕａｄｒａｄｉａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）（ＱＲ）、複合再配列（ＣＲ）、リング再配列（Ｒ）、二動原体染色体（ＤＣ）、二重微小染色体（ＤＭ）、及び微粉砕（ＰＶ）を含む。いくつかの細胞は、１タイプより多くの異常を含有する。
【表２】
2017501136.tif 000004
【０２８６】
２．３  注射可能な足場
自己組織化特性のために、刺激応答性超短鎖ペプチドは、注射可能な足場の理想的な候補である。そのような足場は、生体内原位置で完全に組織化するやや粘性の溶液として注射することができる。異常形状の欠損部を十分に埋めて、天然組織との足場の一体化を助長する。これらの注射用製剤は、外科的に埋め込まなければならない、エレクトロスピニングなどの、ナノ繊維状足場を調製するエクスビボ技術に比べて有意な利点を提供する。生体内原位置ゲル化プロセス中にゲル化速度を調節できることが、臨床医による皮膚充填剤などの用途に望ましい形状へのヒドロゲル構築物の造形を可能にするであろう。さらに、生体適合性及びインビボ安定性は、数カ月にわたって持続する必要があるインプラントにとって幸先がよい。剛性及び調整可能な機械的特性を考慮に入れて、本発明者らは、機械的に支持する役割を果たす、注射剤治療及びインプラント可能な足場の開発に、特に関心をもっている。比較して、自己組織化αヘリックス、βヘアピン（Ｇ’≦２ｋＰａ）及びβシート（Ｇ’≦２ｋＰａ）に基づく他のペプチドヒドロゲルは、そのような高い硬さを達成することができない。
【０２８７】
本発明者らは、早期椎間板変性症用の最小侵襲性処置剤を製剤化することを選択した。この慢性疾患には５０歳より高齢の人口の８５％が罹患しており、この慢性疾患は、腰部椎間板の進行性構造及び機能変性に起因する（Ｏ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｄ．Ｍ．及びＰａｎｄｉｔ，Ａ．Ｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  １３、１９２７〜１９５４、２００７）。髄核（ＮＰ）ＥＣＭの加齢性変化（図１４ａ）は椎間板安定性に影響を与えて、脊髄神経が隣接する椎骨によって圧迫されると、重篤な腰痛及び下肢のしびれをもたらす。介入的処置法はなく、現行の処置選択肢は、脊椎固定術又は金属若しくはセラミックインプラントでの椎間板置換術の形の外科的介入を必要とすることが多い（Ｌｅｗｉｓ、Ｇ．、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  １００、１７０２〜１７２０、２０１２）。理想的な介入療法は、最小侵襲性、生体適合性でなければならず、なおかつ、疾患進行を遅らせるために変性した椎間板に暫定的な機械的支持をもたらすことができなければならない。
【０２８８】
機械的特性及びゲル化動態は、適切なペプチド候補を選択する上での主要考慮事項である。ヒドロゲルの機械的特性は、ペプチド配列、濃度、対イオン、及び溶液の塩濃度を変えることによって天然組織のものを模倣するように調節することができる。Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２及びＡｃ−ＩＬＶＡＧＫ−ＮＨ２の貯蔵弾性率は、ヒトＮＰについての２〜１０ｋＰａの文献報告値のものに近似している。本発明者らは、おおよそ１００ＰａであるブタＮＰの硬さを以前に測定した（Ｍｉｓｈｒａ，Ａら、Ｎａｎｏ  Ｔｏｄａｙ  ６、２３２〜２３９、２０１１）。それにもかかわらず、本発明者らは、必要に応じて、ペプチドヒドロゲルの硬さを大型動物モデルのものにマッチするように低減させることができる。現在開発中の他の注射剤治療（Ｏ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｄ．Ｍ．及びＰａｎｄｉｔ，Ａ．Ｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  １３、１９２７〜１９５４、２００７）は、天然及び修飾ポリマー、例えばアルジネート、コラーゲン、ゼラチン及びヒドロキシブチルキトサンを概して利用する。これらの生体材料の多くは動物源から得られるので、化学組成に関して十分に定義されておらず、潜在的免疫原性及びバッチごとのばらつきのため規制当局の承認に影響を与えることがある。それらの生体材料の機械的特性も匹敵するものではない−コラーゲンＩ及びゼラチンの貯蔵弾性率は１００Ｐａ未満である（Ｍｉｓｈｒａ，Ａら、Ｎａｎｏ  Ｔｏｄａｙ  ６、２３２〜２３９、２０１１）。ヒドロゲルの剛性が大きいほど、圧縮、及び変性ＥＣＭとの混合に起因する希釈効果によく耐えることがでるので、多くの利点をもたらすことになる。さらに、本発明者らは、経時的にヒドロゲルの硬さが低下することもあることを予想している。しかし、これは、組織が回復するにつれてＥＣＭ生産により補償されると予想される。
【０２８９】
本発明者らは、後に生体内原位置でゲル化する低粘度溶液として本発明者らの刺激応答性ペプチドＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２を投与する注射剤治療を設計した。この治療を誘導椎間板変性ウサギモデルにおいて評価した。３つの椎間板のＮＰを吸引し（Ｈｏ，Ｇ．、Ｌｅｕｎｇ，Ｖ．Ｙ．、Ｃｈｅｕｎｇ，Ｋ．Ｍ．及びＣｈａｎ，Ｄ．、Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ４９、１５〜２１、２００８）、椎間板変性をシミュレートした。傷害１カ月後、ウサギをペプチドヒドロゲルのみ又はウサギＮＰ細胞をカプセル化しているヒドロゲルのいずれかで処置した（表３）。ＰＢＳに溶解した２０ｍｇ／ｍＬのＡｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２を、ゲル化時のその高い硬さ、及び温度感受性ゲル化にかんがみて選択した。氷上で保持することで、ペプチド溶液の流動性を維持した。低い粘度によって直径がより小さい（２５Ｇ）ゲージの針を使用することができ、したがって周囲線維輪への付帯的損傷を低減させることができた。おおよそ１００μＬのペプチド溶液を損傷したＮＰに注射すると、５分以内にゲル化が起こり、それによって臨床医は針を適切な位置に配置することができ、流体はＮＰ空間を完全に埋めることができた。針を抜いたとき、周囲組織への漏出はなかった。
【０２９０】
表３．  ３つの腰部椎間板において椎間板変性症を誘導した６匹のウサギに施した処置についての実験設定
２種の異なる処置剤を評価した：（１）２０ｍｇ／ｍＬ  Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２ペプチドヒドロゲル、及び（２）ドナーウサギ髄核（ＮＰ）細胞をカプセル化した２０ｍｇ／ｍＬ  Ａｃ−ＬＩＶＡＧＫ−ＮＨ２ペプチドヒドロゲル。この実験ではインプラントのモニタリングを促進するためにペプチドヒドロゲルにＴ１  ＭＲＩ造影剤であるガドリニウム−ＤＴＰＡ（Ｇｄ３＋−ＤＴＰＡ）を負荷し、その一方で、移植するＮＰ細胞は、Ｔ２強調実験のためにＦＩＴＣ結合酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＤＥＸ）で標識した。異なる動物の所与の椎間板に注射する処置剤を変えて、実験による偏りをなくした。
【表３】
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【０２９１】
インビボイメージングが組織工学によって作製されたインプラント及び細胞インプラントのモニタリングに益々有意な役割を果たしていることにかんがみて、本発明者らのヒドロゲル構築物を標識できることにより、ペプチドの体内分布を推断すること及び疾患環境でのインビボ安定性を評価することが可能になる。磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、椎間板疾患進行をモニターするために一般に用いられている非侵襲的診断である。従来、ＭＲＩは組織内の含水量に頼り、シグナル強度は水の縦（Ｔ１）及び横（Ｔ２）緩和時間に依存する。ＭＲ画像は、造影剤を使用して向上させることができる。この実験ではインプラントのモニタリングを助長するために、ペプチドヒドロゲルに、画像を明るくするＴ１  ＭＲＩ造影剤であるガドリニウム−ＤＴＰＡ（Ｇｄ３＋−ＤＴＰＡ）を負荷した。移植するＮＰ細胞は、Ｔ２強調実験においてより暗い画像を生成する、ＦＩＴＣ結合酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＤＥＸ）コントラストフォア（ｃｏｎｔｒａｓｔｏｐｈｏｒｅ）で、標識した（図１４ｂ）。
【０２９２】
処置２カ月後、動物を安楽死させ、それらの椎骨をエクスビボＭＲＩのための採取した（図１４ｃ）。健常ＮＰは高い含水量を有し、それ故、冠状Ｔ１スライスから可視化すると明るいシグナルを与える。ヒドロゲルで処置した損傷椎間板は、Ｇｄ３＋−ＤＴＰＡのためより明るく見えるが、未処置椎間板は、同一の取得パラメータのため相対的に低いＴ１コントラストを示す。ヒドロゲル処置検体におけるより明るいシグナルは、造影剤の漏出がないこと、したがってＮＰ空間内でのヒドロゲルの保持を示唆する。そのより明るいシグナルは、患者のヒドロゲルの長いモニタリング期間にわたって診断用イメージング剤を取り込んでいることができることも裏付ける。この概念を外装して、細胞増殖及びＥＣＭ生産のための生理活性部分のカプセル化を包含することができる。小分子治療、診断薬、核酸及びナノ粒子をペプチド溶液に組み込むことができる可能性がある。生体内原位置でのゲル化後、ヒドロゲルは、ＮＰ再生を刺激する治療薬の持続性制御放出のためのレザーバとしての役割を果たすことになる。
【０２９３】
ＭＳＣ及びドナーＮＰ細胞などの細胞を併用投与して組織再生を刺激することができる。自家又は同種異形ＭＳＣは、より多くのＥＣＭを分泌するように、又はＮＰ細胞に分化するように、天然細胞を刺激する因子を分泌することができる可能性があると予想される。健常ドナーＮＰ細胞は、変性ＮＰを再配置させることができる可能性があると予想される３３。ＮＰの無血管性のため、ＮＰには免疫特権があり、異種組織移植片は十分耐容される。第２の実験処置は、標識ドナー（ウサギ）ＮＰ細胞と併用投与されるペプチドヒドロゲルからなる細胞治療であった。対照椎間板と比較してＩＯＤＥＸ患者によって示されるＴ２コントラストが処置ＮＰにおける標識細胞の存在を裏付ける（図１４ｃ）。本発明者らの実験は、ヒドロゲルに包埋された標識細胞をトラッキングする可能性を明示している。２つの椎間板を切開すると、細胞を組み込んでいるヒドロゲルで処置した椎間板について有意なＮＰ量が観察された。比較して、未処置損傷椎間板は目に見えるＮＰ含有量を一切有さず、さらに、ヒドロゲル処置椎間板の内容物はより流動性であった。これは、細胞治療が、ＮＰ再生を促進する点でより効果的であること、及びヒドロゲルがドナーＮＰ細胞の生存率を有効に維持できることを示唆していた。処置したＮＰの組織切片を検査したところ、ペプチドヒドロゲル処置と細胞治療処置の両方が十分に耐容された。有害な細胞免疫反応は観察されず、組織球は不在であった。注射したペプチド溶液は、処置した椎間板すべてについて天然ＥＣＭと一体化した（図１４ｄ）。細胞治療を施した損傷椎間板については、２カ月後に、埋め込んだ細胞の生存を含意する弱蛍光性細胞を観察することができた。
【０２９４】
リシン残基での超短鎖ペプチドの塩強化特性を活用して、本発明者らは、容易に製造、滅菌及び投与することができる、椎間板変性症のための注射可能な処置剤を開発した。ペプチドをやや粘性の流体として注射することができ、該流体が一切の欠損部を埋め、宿主組織と十分に一体化することになる。ゲル化は、体温で又は生理学的緩衝食塩水の併用注射によって開始させる（そして数分以内に完了する）ことができる。結果として得られるナノ繊維状ヒドロゲルは安定しており、生体適合性であり、併用投与した細胞の成長を支援する。この注射剤治療は、今日診療所で利用できる外科的代替法と比較して相当侵襲性が低く、外科手術の必要を遅らせるための早期介入処置として提供することができる可能性がある。
【０２９５】
ペプチドの短さにもかかわらず、上記ヒドロゲルは、変性した椎間板に暫定的な機械的支持をもたらす高い機械的剛性を有する。さらに、ペプチド配列、濃度及びイオン環境を調節することによって機械的特性を宿主組織のものにマッチするように調整することができる。貯蔵弾性率を３桁分調整できることを考えると、これらの生物模倣型ヒドロゲルを様々な組織タイプに適用することができる。イメージング造影剤を組み込んで、埋め込んだ／注射した構築物のモニタリングを助長することができ、並びに細胞及び他の生理活性試薬を組み込んで組織再生を促進することができる。小分子、短鎖ペプチドモチーフ、サイトカイン、成長因子及びオリゴヌクレオチドを結合又はカプセル化することによって、細胞付着、増殖及び分化を増進させることができる。今後は、機械的安定性を向上させることができ、生理活性特性を架橋（Ｓｅｏｗ，Ｗ．Ｙ．及びＨａｕｓｅｒ，Ｃ．Ａ．、Ａｄｖ  Ｈｅａｌｔｈｃ  Ｍａｔｅｒ  ２、１２１９〜１２２３、２０１３）及び官能化（Ｌｏｏ，Ｙ．、Ｚｈａｎｇ，Ｓ．及びＨａｕｓｅｒ，Ｃ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ３０、５９３〜６０３、２０１２；Ｗｕ，Ｅ．Ｃ．、Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｇ．及びＨａｕｓｅｒ，Ｃ．Ａ．、Ｅ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２２、４５６〜４６８、２０１２）によって組み込むことができる。
【０２９６】
刺激応答性ペプチドのこのサブクラスは、組織工学のための生物模倣型インプラントへの薬物送達用のマトリックスから、幹細胞のための化学的に十分に定義された合成細胞培養基質まで、そしてハイスループットスクリーニング用の多細胞構築物、器官型疾患モデル及びインプラントについてのバイオプリンティングのためのペプチドインクまで、様々な生物医学的応用の刺激的なプラットフォーム技術である。
【０２９７】
本明細書における以前に発行された文献の列挙又は論述を、上記文献が最先端技術の一部であること又は一般常識であることを認めるものであると必ずしも解釈すべきではない。列挙するすべての文献は、あらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０２９８】
本明細書に説明的に記載する本発明の例示的実施形態は、本明細書において具体的に開示していない、何らかの要素（単数又は複数）、制限（単数又は複数）の不在下で好適に実施されることもある。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、制限なく、広く読むものとする。加えて、本明細書で用いる用語及び表現は、説明用語として用いており、限定用語として用いておらず、そのような用語及び表現の使用には、示されている及び記載されている特徴又はそれらの一部のいずれの等価物も除外する意図がなく、様々な変更形態が請求項に記載の本発明の範囲内で可能であると認識される。したがって、本発明を例示的実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示したが、本明細書において開示する本発明で具現される本発明の変更形態及び変形形態が当業者によって用いられ得ること、及びそのような変更形態及び変形形態が本発明の実施形態の範囲内であると考えられることは理解されるはずである。
【０２９９】
本発明を本明細書に広く、一般的に記載した。上記一般的開示の範囲内に入るより狭い種及び亜属分類の各々も本発明の一部を構成する。これは、削除される物質が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の対象物を除去するという条件又は負の制限付きで、本発明の一般的記載を含む。
【０３００】
他の実施形態は、下記の特許請求の範囲の範囲内である。加えて、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、本発明が、マーカッシュ群の任意の個々の構成員又は構成員の亜群によっても記載されていることは、当業者には理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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