(57)【要約】  本発明はコドン最適化されるＭＧ５３タンパク質のコードヌクレオチド配列、また、その組換え体及び応用に関する。本発明は遺伝子工学分野／生物医薬の技術分野に属する。具体的には、本発明はコドン最適化されるＭＧ５３タンパク質のコードヌクレオチド配列、該配列を含有する組換えベクター及び宿主細胞に関する。さらに、本発明は、ＭＧ５３タンパク質遺伝子のコドンを最適化することにより、タンパク質の発現量を向上する方法及びその生物医薬における用途にも関する。
2017508445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列は野生型ヒトＭＧ５３タンパク質をコードし、その特徴及びヌクレオチド配列は野生型のヒトＭＧ５３コード配列と異なるＤＮＡ分子。
【請求項２】
ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２のいずれかの遺伝子座に１つ又は複数の同義突然変異を発生することを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
その中に請求項１乃至３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含有する組換えベクター。
【請求項５】
組換えベクターは動物発現ベクターであることを特徴とする請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
動物発現ベクターはアデノウイルスベクターであってもよいことを特徴とする請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
該組換えベクターはｐｃＤＮＡ４／ＴＯ系ベクター又はｐｃＤＮＡ４系ベクターであることを特徴とする請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項８】
該組換えベクターはｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＢベクターであることを特徴とする請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項９】
その中に請求項４乃至８のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子のいずれかの組換えベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１０】
動物細胞である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ＨＥＫ２９３Ｔである請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
野生型ＭＧ５３タンパク質の発現量の向上方法であって、それは、発現に適合する条件で、請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養して野生型ヒトＭＧ５３タンパク質を獲得することを含む野生型ＭＧ５３タンパク質の発現量の向上方法。
【請求項１３】
請求項１乃至３に記載のＤＮＡ分子は心筋損傷の薬物の製造における用途。
【請求項１４】
前記薬物は心筋細胞損傷に関連する疾患を治療する薬物を含み、該疾患は心筋虚血、心臓虚血／再灌流損傷、心筋梗塞、心不全、心整脈、心臓破裂を含むことを特徴とする請求項１３に記載の用途。
【請求項１５】
請求項４乃至８のいずれか一項に記載の組換えベクターの心筋損傷の薬物の製造における用途。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法によって獲得する野生型ヒトＭＧ５３タンパク質は心筋損傷の薬物の製造における用途。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、遺伝子工学分野／生物医薬の技術分野に属する。具体的には、本発明はコドン最適化されたＭＧ５３タンパク質のコードヌクレオチド配列、該配列を含有する組換えベクター及び宿主細胞に関わるものである。さらに、本発明は、ＭＧ５３タンパク質の遺伝子のコドンを最適化することによるタンパク質の発現量の向上方法及びその心臓保護、アポトーシスによる心臓疾患の治療における用途に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
ＭＧ５３は骨格筋特異性タンパク質ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ５３で、略称ＭＧ５３、又はＴＲＩＭ７２である。ｍｉｔｓｕｇｕｍｉｎ５３（ＭＧ５３）は、筋肉特異性ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ ｆａｍｉｌｙ  (ＴＲＩＭ)  タンパク質ファミリーであり（該タンパク質ファミリーは常に３つの特定ドメインを持ち、それぞれ  ＲＩＮＧ、Ｂ−ＢＯＸ、及びコイルドコイルドメインである。これらは、細胞が必要としないタンパク質に共同作用しながら結合し、これらのタンパク質をユビキチン化し、分解する）、これは細胞膜修復の仕組みの中の重要な部分でもある。
【０００３】
医学の応用面において、アポトーシスによる心臓疾患に対するＭＧ５３の治療功能はすでに業界内に受け入れられており、かつ先端分野において公知の事柄ともなっている。ＭＧ５３は心臓の保護作用があり、つまり、ＭＧ５３の含有量を増加することにより心臓の損傷を保護することができる。しかし、今のところ既知のヒト野生型ＭＧ５３タンパク質発見遺伝子から体外の真核細胞タンパク発見系を経由して、高いタンパク質量を獲得することはできず、生産コストをさらに低下させることは、該タンパク質の研究と生物医薬の分野での応用においてネックとなっている。
【０００４】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、ヒトＭＧ５３遺伝子のコドン最適化されるヌクレオチド配列、つまり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ :２を提供し、これはすなわちヒト野生型ＭＧ５３の同義突然変異ヌクレオチド配列（ＭＧ５３ｍｕｔ）であって、同じヒトＭＧ５３タンパク質をコードする。ヒト野生型ＭＧ５３ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １。
【０００５】
ＭＧ５３タンパク質は心臓に対して保護作用を持っていることから、ＭＧ５３のタンパク質の含有量を増加することにより、心臓の損傷を保護する。
【０００６】
しかし、多くの実験研究により、体外からヒト野生型ＭＧ５３のタンパク質を人工的に発現することについて、その産量を常に向上させることができず、生産コストを低下させることもできないため、この体外タンパク質発現系の生物医薬分野への応用及び産業化進展においてネックとなっている。
【０００７】
ＭＧ５３はＴＲＩＭファミリー（Ｔｈｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）において新たに発見されたタンパク質であり、そのほかのファミリー成員と異なり、骨格筋と心筋にしか発現しない。初期の研究により、骨格筋と心筋において、ＭＧ５３は構造タンパク質として細胞膜損傷の修復を促進することができると同時に、細胞内の小胞のトランスファーと骨格筋細胞の再生を調整することもできる。また、心筋において、ＭＧ５３は、さらに媒介であるＣａｖｅｏｌｉｎ−３とＰＩ３Ｋとが結合することで、再灌流損傷サルベージキナーゼ経路（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓａｌｖａｇｅｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ,  ＲＩＳＫ  ｐａｔｈｗａｙ）を活性化させる。従って心臓虚血の予処理において重要な保護機能を発揮する。本発明の発明者は多くの実験を行っており、コドンが最適化されるＭＧ５３遺伝子ヌクレオチド配列、つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２を提出し、真核細胞発現ベクターを使用して体外発現を行い、同じ条件にて野生型ＭＧ５３より約３０％高く、該ヌクレオチド配列がヒト野生型ＭＧ５３遺伝子ヌクレオチド配列より優れるという重要な特徴を表している。
【０００８】
本発明は、コドンが最適化されるＭＧ５３ヌクレオチド配列の体外タンパク質発現方法を提供する。該方法は、全遺伝子合成の方法によりＭＧ５３ｍｕｔ遺伝子を合成し、分子クローニングの方式で真核発現ベクターに接続し、真核細胞にトランスフェクションして、適切な培養方法によりＭＧ５３タンパク質を発現する。
【０００９】
本発明の具体的な実施例において、上述した該同義突然変異ＭＧ５３（ＭＧ５３ｍｕｔ）の体外発現方法の過程は以下のとおりである。
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２に提供されるヌクレオチド配列ＭＧ５３ｍｕｔを全遺伝子合成する。鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを使用し、特異性突然変異プライマーを用いてＰＣＲ反応を行って増幅させ、反応産物をアガロースゲル電気泳動で鑑定する。
（２）分子クローニングの方式により、大腸菌コンピテントセルＴＯＰ１０を形質転換し、コンピテントＴＯＰ１０を溶解させ、処理後のＰＣＲ産物を加え、冷しておく。ＬＢ培地に入れ、増殖させ、アンピシリンを含ませたＬＢプレートに接種し、培養した後、プレート上のシングルコロニーを採取し、ＤＮＡ塩基配列決定法で突然変異が陽性結果と検出し、ＭＧ５３ｍｕｔ発現プラスミドが得られる。
（3）前記ＭＧ５３ｍｕｔのプラスミドはＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＡで細胞にトランスフェクションするという方法でＭＧ５３タンパク質を得る。
【００１０】
本発明は、さらに前記ＭＧ５３ｍｕｔが心筋細胞損傷の関連疾患の治療に対処する薬物の製造における用途も提供する。
【００１１】
上述するＭＧ５３ミュータントの用途は、その中に述べた心筋細胞損傷を治療する薬物が心臓虚血、再灌流傷害で起こる疾患を治療／予防する薬物も含む。前記疾患は、さらに、心筋細胞損傷、心筋虚血、心臓虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、心不全、不整脈、心臓破裂などを含む。
【００１２】
ＭＧ５３が心臓損傷／心筋損傷の治療における応用、及び心臓虚血、再灌流傷害に起因する疾患の治療における用途について、２００９１０２４１４５１．３の開示した薬学実験部分の実験方法と実験データをご参照いただきたい。
【００１３】
心筋細胞の中で過剰発現したＭＧ５３は、酸素欠乏に起因する心筋細胞損傷に対して保護作用をもつ。
実験方法のまとめ：
試剤と材料：ａｎｔｉ−Ｍｙｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ４４３９）。特に説明しない限り、そのほかの化学試剤は全部Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ会社からのものである。
【００１４】
同腹兄弟同じ年齢の正常血圧の雄ラットは北京市維通利華会社から提供されたものである。あらゆる動物のプロセスと安楽死は全部中国北京大学動物研究委員会の許可する協議に基づいて実行し、かつ実験動物の飼育と使用手引（１９８５年にアメリカ国家衛生研究所により改訂発行し、発行号が８６−２３）に符合する。あらゆる動物は全部中国北京大学実験動物センターの日照／夜の循環する温度制御ケージの施設で飼育し、自由に食べ物と水を摂らせる。
【００１５】
プラスミドとアデノウイルスベクター：全長の野生型ＭＧ５３配列はヒト筋肉組織に逆転写プロセスにより獲得したが、同義突然変異ＭＧ５３ヌクレオチド配列は全遺伝子合成により獲得する。それぞれＢａｍＨＩとＸｈｏＩの２つの（ＮＥＢ）酵素切断部位からｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｂの発現ベクター(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社より)を挿入する。
【００１６】
細胞の培養、アデノウイルス感染とプラスミドのトランスフェクション：Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（細胞資源センターから、ＩＢＭＳ、中国医学科学院／中国協和医科大学）を、５％の二酸化炭素を含む３７℃の細胞培養ケースの中に置き、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良したＥａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）で培養したら、該培地の中に１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ会社）、０．１１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムと１％のペニシリン  −  ストレプトマイシンが補充された。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の密度が９０％の際、我々はアデノウイルス感染又はプラスミドのトランスフェクションを通して遺伝子導入を行う。それから、細胞が２％のウマ血清の含むＤＭＥＭ培地の中で四日間培養し、筋管に分化する。
【００１７】
共免疫沈降法、ウエスタンブロット：組織又は細胞が氷で破砕緩衝液（ｐＨ７．６の３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．５％ＮＰ−４０と、プロテアーゼインヒビターとの混合物）で１０分間破砕し、破砕物が１３,０００  ｒｐｍで１０分間遠心する。共免疫沈降法とウエスタンブロット検出は既に説明している。
【００１８】
統計方法：統計的有意性の検証グループ間の差異は、一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）又は重複測定の分散分析を利用し、適合の場合にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉでｔ検定する。あらゆるＰ値が０．０５より小さければ有意となる。データはｍｅａｎ+ｓ．ｅ．ｍとして表す。
【００１９】
〔図面の簡単な説明〕
配列表１ ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）野生型ＭＧ５３ ｃＤＮＡ配列
配列表２ ヒトＭＧ５３同義突然変異ｃＤＮＡ配列
図１：突然変異するヒトＭＧ５３（ＭＧ５３ｍｕｔ）のｃＤＮＡ配列と野生型ＭＧ５３  ｃＤＮＡ配列との比較。
【００２０】
同義突然変異したヒトＭＧ５３のｃＤＮＡ配列と野生型ＭＧ５３  ｃＤＮＡ配列との比較。図において、ＭＧ５３ｍｕｔが突然変異した配列を示し、ＭＧ５３が野生型ＭＧ５３配列を示し、ｃｏｎｓｅｎｓｕｓが両者について一致する配列を示す。
【００２１】
図２：ヒト野生型ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔのベクタープラスミドのランニングゲルを示す図である。
【００２２】
細菌増幅により、プラスミドを抽出したヒト野生型ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔとのベクタープラスミドのランニングゲルの図は、プラスミドの濃度と純度を決定する際に用いられる。
【００２３】
図３：組換えＭＧ５３タンパク質を静脈注射してラットの心臓虚血／再灌損傷を保護する。
【００２４】
心臓写真によれば、ＢＳＡを静脈注射することに比べ、ＭＧ５３組換えタンパク質を静脈注射するのは、虚血／再灌流に起因する心筋梗塞（白色領域）を明らかに減少させることができる。図における青色の領域は非虚血領域を示し、その他の領域が虚血領域を示し、虚血領域における赤色の領域が非梗塞領域を示し、白色の領域が梗塞領域を示す。
【００２５】
図４：ＭＧ５３ｍｕｔはヒト野生型ＭＧ５３のベクターにより高いＭＧ５３タンパク質発現効率を有している。
【００２６】
ヒト野生型ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔのベクタープラスミドは細胞にトランスフェクションし、３６−４８時間後に、細胞タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔでＭＧ５３タンパク質発現を検出する。
【００２７】
図における左側の上下の２本の灰色バンドはそれぞれ野生型ＭＧ５３の細胞タンパク質発現量とＧＡＰＤＨ細胞内参照物を表し、右側の上下の２本の灰色バンドはそれぞれ同義突然変異ＭＧ５３配列の細胞タンパク質発現量とＧＡＰＤＨ細胞内参照物を表す。
【００２８】
図５：ＭＧ５３ｍｕｔとヒト野生型ＭＧ５３のベクター発現のＭＧ５３タンパク質は全部心筋細胞に対して保護作用を持つ。
【００２９】
ヒト野生型ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔのベクタープラスミドを利用してＨ９Ｃ２心筋細胞系にトランスフェクションした後に、Ｈ２Ｏ２で酸化ストレス損傷（虚血／再灌流損傷を模擬する）を引き起こして対照ベクター（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べて、細胞培地における細胞損傷マーカー（ＬＤＨ）の濃度は明らかに降下し、かつ、ＭＧ５３ｍｕｔ組の降下が野生型ＭＧ５３組より明らかであることを発見する。２種のベクターで発現するＭＧ５３は全部心筋細胞の酸化ストレス損傷を保護することができ、かつＭＧ５３ｍｕｔ組は強い保護作用を持つことを示す。＊は、図に示すように、ｐ＜０．０５を示す。
【００３０】
バーグラフにおける３種のバーは、充填されないバーは空ベクターでＨ９Ｃ２心筋細胞をトランスフェクションする対照組を示す。傾斜線が充填されたバーは野生型ＭＧ５３組を示し、黒色で充填されるバーは同義突然変異ＭＧ５３組を示す。縦座標が培地内のＬＤＨ濃度（Ｕ／ｍｌ）を示し、左側と右側の３本のバーの値がそれぞれ酸素欠乏環境を作成しない場合と２００μＭ  Ｈ２Ｏ２  ２０時間を使用して作成した酸素欠乏環境を作成した場合での培地ＬＤＨの濃度値を示す。
【００３１】
〔発明を実施するための形態〕
１．ＭＧ５３のクローニング、野生型と同義突然変異発現ベクターの構築。
ヒト筋肉組織はＴＲＩＺＯＬ法を用いてヒト筋肉組織の総ＲＮＡを抽出する。
１)１００ミリグラムの組織見本に１ミリリットルのＴＲＩｚｏｌ試剤を添加し、組織をホモジネートする。
２)室温にて１５分間放置し、０．２ｍＬのクロロホルムを添加し、均一に混合して、室温にて３分間静置する。
３)１２０００ｇ １５分間遠心させ、上層液相を取る。
４)０．５ｍＬイソプロパノールを添加し、４℃で１２０００ｇを１０分間遠心させ、上澄みを取り除き、７５％エタノールでＲＮＡを洗浄する。
５)乾燥した後に、ＲＮＡを溶解してその濃度を測定する。
【００３２】
野生型ＭＧ５３の総ＲＮＡの逆転写過程
抽出した総ＲＮＡを利用して逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成する。ＯｌｉｇｏｄＴを用いてプライマーとして、逆転写酵素を利用して逆転写反応を行うことでｃＤＮＡライブラリーが得られる。
【００３３】
野生型ＭＧ５３ｃＤＮＡ配列の分子クローニング過程
合成したｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、特異性プライマーを利用して、ＰＣＲ方法でＭＧ５３のコード配列を獲得する。
【００３４】
ＰＣＲプロセス：変形温度、９８度  ３ｍｉｎ、循環過程９８度  ３０ｓｅｃ、６５度  ３０ｓｅｃ、７２度  ９０ｓｅｃ、３０サイクル、７２度  ５ｍｉｎ延伸した後、４℃で保存する。野生型ＭＧ５３配列（配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１）を獲得する。
【００３５】
プライマー配列は、
上流プライマー：５’−ａｔａ  ｇｇａｔｃｃ  ｇｃｃａｃｃ  ａｔｇｔｃｇｇｃｔｇｃｇｃｃｃｇｇｃｃｔ−３’；
下流プライマー：５’−ａｔａ  ｃｔｃｇａｇ  ａｃ  ｇｇｃｃｔｃｇｇｃｇｃｃｔｔｃｇｇｇａｃｃ−３’；ＢａｍＨＩ  と  ＸｈｏＩという酵素切断部位を有する。
【００３６】
ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩとＸｈｏＩで二重消化されると同時に、同じ二重消化で空ベクターのプラスミドｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＢを処理し、ゲルを回収してＴ４リガーゼを用いてＰＣＲ産物をベクターに接続する。配列決定法で配列が正確である旨を検証する。
【００３７】
ソフトウェアを利用してＭＧ５３コーディング領域のＤＮＡ配列を分析し、同義突然変異コード配列を設計し、全遺伝子合成の方式で突然変異配列ＭＧ５３ｍｕｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２）を獲得する。ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩとＸｈｏＩで二重消化されると同時に、同じ二重消化で空ベクターのプラスミドｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＢを処理し、ゲルを回収して、Ｔ４リガーゼでＰＣＲ産物をベクターに接続する。配列決定法で配列が正確である旨を検証する。
【００３８】
プラスミドを大量に抽出し、アガロースゲルでプラスミドの質量と濃度を検証する。
【００３９】
１００ｍＬ ＬＢ培地（１ｇペプトン、０．５ｇ酵母エキス、１ｇ  ＮａＣｌ、ＮａＯＨをｐＨ７．５に調製する）にてプラスミドのＴＯＰ１０細菌を増幅して形質転換して、細菌を遠心して収集する。５ｍＬ破砕液Ｉ（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加してボルテックスを行い、新たに調製するアルカリ溶液（２００ｍＭ ＮａＯＨ, １％ ＳＤＳ）を添加して５分間放置し、５ｍｌの冷たい７．５Ｍ酢酸アンモニウム(ｐＨ７．６)を添加して、遠心して上澄みを取る。９ｍＬイソプロパノールを添加して沈殿させ、上澄みを取り除き、さらに５ｍｌの２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．４）により溶解して沈殿させて、遠心して上澄みを取る。５ｍＬイソプロパノールを添加して沈殿させ、フェノール・クロロホルム抽出して、エタノールを添加して沈殿させるとプラスミドＤＮＡが得られる。
【００４０】
１％のアガロースゲル電気泳動でプラスミドの純度と濃度を検出し、結果を図２に示す。
【００４１】
２．ＭＧ５３組換えタンパク質の心臓に対する保護作用。
【００４２】
（１）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いてＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔタンパク質を発現する。
【００４３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１５ｃｍの培養皿に培養し、密度が８０％に達する。また、リポソーム（ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ、ＩｎｃｅｌｌａｒＴＭ）を用いて構築したヒトＭＧ５３野生型と同義突然変異した発現プラスミドとを細胞にトランスフェクションし、具体的な方法は以下のとおりである。
【００４４】
ＤＭＥＭにより２９３Ｔ細胞を培地交換して、１００ｕＬ  ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ  Ａと２０００ｕＬ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとを混合すると同時に、３０ｕｇプラスミドと２０００ｕＬ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとを混合する。５分間後、両者を均一に混合して、室温にて３０分間放置する。培地交換された細胞培養皿に均一に滴下する。４時間後、細胞を正常の培地（１０％ ＦＢＳのＤＭＥＭ）に交換する。３６−４８時間トランスフェクションした後に、細胞を破砕させて、相応する抗体でｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔを行ってタンパク質レベルを検出する。４８時間後に、各培養皿の細胞は１ｍＬ  Ｃｏ−ＩＰ  ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、  ｐＨ７．５、  １００ｍＭ  ＮａＣｌ、  １ｍＭ  ＥＤＴＡ、  ０．５％  ＮＰ４０、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ、０４６９３１３２００１、１錠／５０ｍＬ  ｂｕｆｆｅｒ））で細胞を破砕する。タンパク質のｍｙｃラベルによりタンパク質を精製する。
【００４５】
具体的なステップは以下のとおりである。
【００４６】
まず、冷たいＰＢＳでａｎｔｉ−ｍｙｃのｂｅａｄｓ（Ｅ６６５４−１ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）３回洗浄し、冷たいＣｏ−ＩＰ ｂｕｆｆｅｒでｂｅａｄｓ１回洗浄する。ｂｅａｄｓと破砕液とを混合し、４Ｃ°で３時間混合し、その後に、ビードをＣｏ−ＩＰ  ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、できるだけ上澄みを取り除き、０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．８）を用いてタンパク質を溶離し、溶離液はＮａＣｌ（濃度）とＴｒｉｓ−Ｃｌ（濃度）（ｐＨ８．０)で溶離液を中和する。タンパク質は−８０℃で保存しておく。少量のタンパク質を取ってサンプル調製すると同時に、ＢＳＡを取って対照し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにランニングし、クマシーブリリアントブルー染色で濃度と純度を検証する。
【００４７】
（２）ラットの心筋梗塞モデルの作成と評価
ラット（北京市維通利華会社、ＳＤラット、体重２００ｇ）は３０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔をした後に、気管挿管し、第４肋骨間に開胸し、心膜を開け、心臓を露出する。ラットの左前下行枝冠状動脈を４５分間引き結び、その後に緩め、再灌流を始める。
【００４８】
ＭＧ５３治療組に対して、虚血前の５分間と再灌流前の１分間に、それぞれ３ｍｇ／ｋｇのＭＧ５３タンパク質を静脈注射する。
【００４９】
再灌流の４８時間後に、３０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウムを用いてラットを麻酔し、開胸し、心臓を取り外し、主動脈に挿管し、生理食塩水を逆灌流して心臓を洗い出す。その後に、冠状動脈を引き結び始める位置に新たに冠状動脈を引き結び、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染料を灌流し、染色された部分が非虚血領域であり、染色されない部分が虚血領域である。その後に、心臓を横方向に５−６個のシートを切り、１％  ＴＴＣ溶液を用いて３７℃で１５分間染色し、白色の部分が梗塞領域である。
【００５０】
結論：組換えＭＧ５３タンパク質を静脈注射してラットの心臓虚血／再灌流損傷から保護し、結果を図３に示す。
【００５１】
３．ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔ発現ベクターのトランスフェクションと発現検出。
【００５２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は６０ｍｍの培養皿に培養され、密度が８０％に達し、リポソーム（ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ  Ａ；  ＩｎｃｅｌｌａｒＴＭ）を用いて構築したヒトＭＧ５３野生型と同義突然変異した発現プラスミドとを細胞にトランスフェクションし、具体的な方法は以下のとおりである。ＤＭＥＭで２９３Ｔ細胞を培地交換し、１０ｕＬ  ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ  Ａと２００ｕＬ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとを混合すると同時に、３ｕｇプラスミドと２００  ｕＬ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとを混合する。５分後に両者を均一に混合し、室温にて３０分間放置し、培地交換した細胞培養皿に均一に滴下する。４時間後、細胞を正常の培地（１０％  ＦＢＳのＤＭＥＭ）に交換する。３６−４８時間トランスフェクションした後に、細胞を破砕させて、ａｎｔｉ−ｍｙｃ抗体でｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔを行ってタンパク質レベルを検出する。それと同時に、ＧＡＰＤＨ抗体を用いてＷＢを行ってタンパク質の負荷量の情況を検出する。結果を図４に示す。同じ量のプラスミドをトランスフェクションすると、ＭＧ５３ｍｕｔはＷＴ配列のプラスミド発現量より多くなり、３０％に近づく。
【００５３】
４．Ｈ９Ｃ２心筋細胞系の酸素欠乏と細胞損傷の検出。
【００５４】
Ｈ９Ｃ２心筋細胞は６ウェルプレートに培養され、細胞が８０％まで成長する時に、プラスミドをトランスフェクションする。Ｃｏｎｔｒｏｌ組はｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＢをトランスフェクションする。ｈｕｍａｎ  ＭＧ５３  ＷＴ組：野生型ＭＧ５３プラスミドをトランスフェクションする。ｈｕｍａｎ  ＭＧ５３  Ｍｕｔ：同義突然変異したＭＧ５３プラスミド。トランスフェクション方法は上記と同じである。３０時間後に、新鮮な培地を交換し、２００ｕＭのＨ２Ｏ２を添加し、細胞を刺激する。２０時間後に、４０ｕＬ培地を取り、ＬＤＨ検出キットを用いて培地におけるＬＤＨの含有量を検出し（乳酸脱水素酵素検出キット、ＬＤＨ０３６０、上海景源医療機器株式会社）、結果を図５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１：突然変異するヒトＭＧ５３（ＭＧ５３ｍｕｔ）のｃＤＮＡ配列と野生型ＭＧ５３  ｃＤＮＡ配列との比較。
【００５６】
同義突然変異したヒトＭＧ５３のｃＤＮＡ配列と野生型ＭＧ５３  ｃＤＮＡ配列との比較。図において、ＭＧ５３ｍｕｔが突然変異した配列を示し、ＭＧ５３が野生型ＭＧ５３配列を示し、ｃｏｎｓｅｎｓｕｓが両者について一致する配列を示す。
【図２】図２：ヒト野生型ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔのベクタープラスミドのランニングゲルを示す図である。
【００５７】
細菌増幅により、プラスミドを抽出したヒト野生型ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔとのベクタープラスミドのランニングゲルの図は、プラスミドの濃度と純度を決定する際に用いられる。
【図３】図３：組換えＭＧ５３タンパク質を静脈注射してラットの心臓虚血／再灌損傷を保護する。
【００５８】
心臓写真によれば、ＢＳＡを静脈注射することに比べ、ＭＧ５３組換えタンパク質を静脈注射するのは、虚血／再灌流に起因する心筋梗塞（白色領域）を明らかに減少させることができる。図における青色の領域は非虚血領域を示し、その他の領域が虚血領域を示し、虚血領域における赤色の領域が非梗塞領域を示し、白色の領域が梗塞領域を示す。
【図４】図４：ＭＧ５３ｍｕｔはヒト野生型ＭＧ５３のベクターにより高いＭＧ５３タンパク質発現効率を有している。
【００５９】
ヒト野生型ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔのベクタープラスミドは細胞にトランスフェクションし、３６−４８時間後に、細胞タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔでＭＧ５３タンパク質発現を検出する。
【００６０】
図における左側の上下の２本の灰色バンドはそれぞれ野生型ＭＧ５３の細胞タンパク質発現量とＧＡＰＤＨ細胞内参照物を表し、右側の上下の２本の灰色バンドはそれぞれ同義突然変異ＭＧ５３配列の細胞タンパク質発現量とＧＡＰＤＨ細胞内参照物を表す。
【図５】図５：ＭＧ５３ｍｕｔとヒト野生型ＭＧ５３のベクター発現のＭＧ５３タンパク質は全部心筋細胞に対して保護作用を持つ。
【００６１】
ヒト野生型ＭＧ５３とＭＧ５３ｍｕｔのベクタープラスミドを利用してＨ９Ｃ２心筋細胞系にトランスフェクションした後に、Ｈ２Ｏ２で酸化ストレス損傷（虚血／再灌流損傷を模擬する）を引き起こして対照ベクター（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べて、細胞培地における細胞損傷マーカー（ＬＤＨ）の濃度は明らかに降下し、かつ、ＭＧ５３ｍｕｔ組の降下が野生型ＭＧ５３組より明らかであることを発見する。２種のベクターで発現するＭＧ５３は全部心筋細胞の酸化ストレス損傷を保護することができ、かつＭＧ５３ｍｕｔ組は強い保護作用を持つことを示す。＊は、図に示すように、ｐ＜０．０５を示す。
【００６２】
バーグラフにおける３種のバーは、充填されないバーは空ベクターでＨ９Ｃ２心筋細胞をトランスフェクションする対照組を示す。傾斜線が充填されたバーは野生型ＭＧ５３組を示し、黒色で充填されるバーは同義突然変異ＭＧ５３組を示す。縦座標が培地内のＬＤＨ濃度（Ｕ／ｍｌ）を示し、左側と右側の３本のバーの値がそれぞれ酸素欠乏環境を作成しない場合と２００μＭ  Ｈ２Ｏ２  ２０時間を使用して作成した酸素欠乏環境を作成した場合での培地ＬＤＨの濃度値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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