(57)【要約】  本発明は、グリピカン３に特異的なＴ細胞受容体に関する。本発明はさらに、可溶性ＴＣＲ構築物、キメラＴＣＲ、該ＴＣＲ又はＴＣＲ構築物を含む二重特異的抗体、核酸、発現構築物、及び細胞に関する。本発明はさらに、好ましくは肝臓癌、特に肝細胞癌、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療における、医薬品としてのＴＣＲ、又は可溶性ＴＣＲ構築物、又はキメラＴＣＲ、又は二重特異的抗体の使用に関する。本発明はさらに、肝臓癌、特に肝細胞癌、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療する方法に関する。本発明はさらに、グリピカン３エピトープ（群）を含むペプチド、及びそれらをコードするそれぞれの核酸、抗体、及び組成物、並びに、（ペプチド）ワクチンとしてのその使用に関する。本発明はさらに、ペプチド（群）を含むワクチンにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列（可変α）、
又は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列（可変β）、
又は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体β鎖
を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２】
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列（マウスα）、
又は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列
をさらに含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列（マウスβ）、
又は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列
をさらに含むＴ細胞受容体β鎖、
及び／あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列（Ｐ２Ａ）
又は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率を有するアミノ酸配列
を含むリンカー若しくはヒンジ領域
を含む、請求項１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項３】
（ｉ）配列番号１（可変α）及び配列番号３（マウスα）のアミノ酸配列を含むか、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列（可変α＋マウスα）を含むか、
又は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２（可変β）及び配列番号４（マウスβ）のアミノ酸配列を含むか、好ましくは配列番号７のアミノ酸配列（可変β＋マウスβ）を含むか、
又は、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）、
を含むＴ細胞受容体β鎖
を含むか、
あるいは、配列番号８のアミノ酸配列（全TCR P1-1のアミノ酸配列）
を含む、請求項１又は２のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項４】
（１）好ましくは互いに共有結合で連結されてＴＣＲヘテロ二量体又は多量体を形成している、
請求項１又は３に定義されているＴ細胞受容体α鎖（群）、
請求項１又は３に定義されているＴ細胞受容体β鎖（群）
の少なくとも１つ、及び
（２）好ましくは、
Ｆｃ受容体及び／又はＦｃドメイン、
サイトカイン、例えばＩＬ−２又はＩＬ−１５、
毒素、
抗体、例えば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ１６抗体、又は抗ＣＤ５６抗体、
又はその組合せ
から選択された融合成分（群）
を含む、可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）構築物であって、
ここで、少なくとも１つのＴ細胞受容体鎖（１）は融合成分（群）（２）に結合し、
ここで、可溶性Ｔ細胞受容体は、好ましくはさらに、標識、例えば放射性核種、フルオロフォア、金粒子を含む、可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）構築物。
【請求項５】
請求項１又は３に定義されているＴ細胞受容体α鎖、
請求項１又は３に定義されているＴ細胞受容体β鎖、又は
請求項１〜３のいずれかのＴ細胞受容体
の少なくとも１つを含む、キメラＴ細胞受容体であって、
ここで、ＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖は、ＣＤ３ゼータ鎖（群）及び／又は他のＴＣＲ刺激ドメイン、例えば細胞内ＣＤ２８、ＣＤ１３７、又はＣＤ１３４ドメインに、好ましくはリンカーを介して融合している、キメラＴ細胞受容体。
【請求項６】
好ましくはリンカーを介して、
（ｂ）リンパ球の表面上の抗原又はエピトープに対して指向される抗体又は一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）
に融合している、
ａ）互いに連結されている、請求項１又は３に定義されているＴＣＲのＴ細胞受容体α鎖及びβ鎖（群）、
を含む、二重特異的抗体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項記載のＴ細胞受容体をコードしているか、又は請求項４記載の可溶性Ｔ細胞受容体構築物をコードしているか、又は請求項５記載のキメラＴ細胞受容体をコードしているか、又は請求項６記載の二重特異的抗体をコードしている、核酸。
【請求項８】
配列番号１（可変α）及び／若しくは配列番号２（可変β）のアミノ酸配列をコードしている核酸、
又は配列番号９（可変α）及び／若しくは配列番号１０（可変β）のヌクレオチド配列、
又はその相補的配列（群）、
又は、配列番号９若しくは１０のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）を含むか、
あるいは、
配列番号６（可変α＋マウスα）及び／若しくは配列番号７（可変β＋マウスβ）のアミノ酸配列をコードしている核酸、
配列番号１１（可変α＋マウスα）及び／若しくは配列番号１２（可変β＋マウスβ）のヌクレオチド配列、
又は、その相補的配列(群)、
又は、配列番号１１若しくは１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）を含むか、
あるいは、
配列番号８のアミノ酸配列（全TCR P1-1のアミノ酸配列）をコードしている核酸、
配列番号１３のヌクレオチド配列（全TCR P1-1）、
又は、その相補的配列(群)、
又は、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）
を含む、請求項７の核酸。
【請求項９】
好ましくはさらにプロモーター及び転写終結配列を含む、細胞内の請求項１〜６のいずれか一項記載の、Ｔ細胞受容体、又は可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又はキメラＴ細胞受容体、又は二重特異的抗体を発現させるための発現構築物。
【請求項１０】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ／デルタ−Ｔ細胞を含むがこれらに限定されないリンパ球から選択された、請求項１〜６のいずれか一項記載のＴ細胞受容体、若しくは可溶性Ｔ細胞受容体構築物、若しくはキメラＴ細胞受容体、若しくは二重特異的抗体、又は請求項７若しくは請求項８の核酸、又は好ましくは請求項１〜６のいずれか一項に記載されたＴ細胞受容体、若しくは可溶性Ｔ細胞受容体構築物、若しくはキメラＴ細胞受容体、若しくは二重特異的抗体を発現している請求項９の発現構築物、を含む、細胞。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項のＴ細胞受容体；
（ｉｉ）請求項４の可溶性Ｔ細胞受容体構築物；
（ｉｉｉ）請求項５のキメラＴ細胞受容体；
（ｉｖ）請求項６の二重特異的抗体；
（ｖ）請求項７若しくは８の核酸（群）又は請求項９の発現構築物；及び／又は
（ｖｉ）請求項１０の細胞
の１つ以上、
及び場合により薬学的賦形剤（群）を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
遺伝子的に改変されたリンパ球、好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞を作製するための、請求項１〜３のＴ細胞受容体、請求項５のキメラＴ細胞受容体、請求項６の二重特異的抗体、請求項７若しくは８の核酸、又は請求項９の発現構築物の使用であって、ここで、好ましくは作製された遺伝子的に改変されたリンパ球、好ましくはＴ細胞は、遺伝子免疫のために、より好ましくは肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療するために使用される、使用。
【請求項１３】
医薬品としての使用のための、請求項１〜３のＴ細胞受容体、請求項４の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、請求項５のキメラＴ細胞受容体、請求項６の二重特異的抗体、請求項７若しくは８の核酸、請求項９の核酸構築物、又は請求項１０の宿主細胞。
【請求項１４】
肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜３のＴ細胞受容体、請求項４の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、請求項５のキメラＴ細胞受容体、請求項６の二重特異的抗体、請求項７若しくは８の核酸、請求項９の発現構築物、又は請求項１０の宿主細胞。
【請求項１５】
患者は好ましくはＨＬＡ−Ａ２陽性である、養子免疫療法、標的細胞特異的免疫療法、又は遺伝子免疫の使用を含む、請求項１３のＴ細胞受容体、核酸、発現構築物、又は細胞。
【請求項１６】
（ａ）患者又は血液ドナーのリンパ球を準備する工程；
（ｂ）（ｉ）請求項１〜３のいずれかのＴ細胞受容体、又は請求項４の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又は請求項５のキメラＴ細胞受容体、又は請求項６の二重特異的抗体、
（ｉｉ）請求項７又は８のいずれかの核酸、
（ｉｉｉ）請求項９の発現構築物、
（ｉｖ）請求項１０の細胞、及び
（ｖ）請求項１１の医薬組成物
の１つ以上を準備する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の（ｉ）から（ｖ）の１つ以上を、工程（ａ）のリンパ球に生体外で導入し、これにより、遺伝子的に改変されたリンパ球を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）の遺伝子的に改変されたリンパ球を、それを必要とする被験者又は患者に投与する工程、
（ｅ）場合により、工程（ｂ）から（ｄ）のいずれかを、放射線照射、チェックポイント阻害剤、又は癌化学療法と組み合わせる工程
を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療する方法であって、
ここで、患者は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２陽性であり、
及び／又は、工程（ａ）で単離されたリンパ球は、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞であり、
及び／又は、工程（ｃ）の生体外での導入は好ましくは、電気穿孔法を介して、又はリポソームなどのトランスフェクション試薬によって行なわれる、方法。
【請求項１７】
（ａ）（ｉ）請求項１〜３のいずれかのＴ細胞受容体、又は請求項４の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又は請求項５のキメラＴ細胞受容体、又は請求項６の二重特異的抗体、
（ｉｉ）請求項７又は８のいずれかの核酸、
（ｉｉｉ）請求項９の発現構築物、
（ｉｖ）請求項１０の細胞、及び
（ｖ）請求項１１の医薬組成物
の１つ以上を準備する工程；
（ｂ）工程（ａ）の（ｉ）から（ｖ）の１つ以上を、好ましくは注射又は注入を介して、それを必要とする被験者又は患者に直接適用する工程、
（ｃ）場合により、工程（ｂ）を放射線照射、チェックポイント阻害剤、又は癌化学療法と組み合わせる工程
を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療する方法であって、
患者は好ましくはＨＬＡ−Ａ２陽性である、方法。
【請求項１８】
患者の（肝臓）癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞を、請求項４の可溶性Ｔ細胞受容体構築物を使用して検出及び／又は破壊する工程を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療する方法であって、ここで、可溶性Ｔ細胞受容体は好ましくは、それぞれ、静脈内、皮下、若しくは筋肉内注入若しくは注射によって、又は、吸入若しくは噴霧によって気道粘膜に適用することによって適用され、
患者は好ましくはＨＬＡ−Ａ２陽性である、方法。
【請求項１９】
標識されている請求項４の可溶性Ｔ細胞受容体構築物を使用することによって、（肝臓）癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞をインビトロで染色する工程を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を検出するための、請求項１８の方法。
【請求項２０】
配列番号１４のアミノ酸配列（ＧＰＣ３ペプチド３６７）を含む少なくとも１つのＧＰＣ３エピトープを含むペプチド。
【請求項２１】
請求項２０記載の少なくとも１つのペプチドをコードしている核酸分子、又は、少なくとも１つのこのような核酸分子を含むプラスミド。
【請求項２２】
請求項２０記載のペプチドに対する抗体。
【請求項２３】
（ｉ）請求項２０記載の少なくとも１つのペプチド又は請求項２１記載の少なくとも１つの核酸、
（ｉｉ）場合により、担体、
（ｉｉｉ）場合により、アジュバント
を含み、
好ましくは請求項２０記載の少なくとも２つのペプチド又は請求項２１記載の少なくとも２つの核酸を含む、組成物。
【請求項２４】
医薬に使用するための、好ましくはワクチンとして使用するための、より好ましくは肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療するための、請求項２０のペプチド、請求項２１の核酸分子、又は請求項２３の医薬組成物。
【請求項２５】
（ｉ）請求項２０記載の少なくとも１つのペプチド、又は請求項２１記載の少なくとも１つの核酸、又は請求項２３の組成物、
（ｉｉ）場合により、賦形剤
を含む、ワクチン。
【請求項２６】
肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）を予防及び／又は治療するための請求項２５のワクチンの使用。
【請求項２７】
請求項２０のペプチド、請求項２１の核酸分子、請求項２３の医薬組成物、又は請求項２５のワクチンを、それを必要とする被験者に投与する工程を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリピカン３に特異的なＴ細胞受容体に関する。本発明はさらに、可溶性ＴＣＲ構築物、キメラＴＣＲ、該ＴＣＲ又はＴＣＲ構築物を含む二重特異的抗体、核酸、発現構築物、及び細胞に関する。本発明はさらに、好ましくは肝臓癌、特に肝細胞癌、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療における、医薬品としてのＴＣＲ、又は可溶性ＴＣＲ構築物、又はキメラＴＣＲ、又は二重特異的抗体の使用に関する。本発明はさらに、肝臓癌、特に肝細胞癌、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療する方法に関する。本発明はさらに、グリピカン３エピトープ（群）を含むペプチド、及びそれらをコードするそれぞれの核酸、抗体、及び組成物、並びに、（ペプチド）ワクチンとしてのその使用に関する。本発明はさらに、ペプチド（群）を含むワクチンにも関する。
【０００２】
発明の背景
肝細胞癌（ＨＣＣ）は最も一般的な原発性肝臓癌であり、世界中の癌関連死の３番目に多い原因である。Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎に慢性的に感染した患者は、ＨＣＣを発症するリスクが高いが、アルコール乱用及び代謝疾患もＨＣＣの発症につながり得る。
【０００３】
４０％未満の患者が、腫瘍摘出又は肝移植のような治癒的処置のための基準を満たす。さらに、腫瘍の再発のリスクは高い。進行したＨＣＣを有する患者は、局所的切除又は多標的キナーゼ阻害剤ソラフェニブなどの対症療法しか受けることしかできない。それにも関わらず、これらの処置により、患者の予想される寿命に対してわずかに有益な効果しかもたらされない。結果として、ＨＣＣの予後は依然として悪く、新規な療法が緊急に必要とされる。
【０００４】
国際公開公報第２０１２／０７０４６８Ａ１号は、ＧＰＣ３を標的化することのできるグリピカン３（ＧＰＣ３）に特異的な抗体及びヒトキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開示している。国際公開公報第２０１２／０７０４６８Ａ１号はさらに、該抗体を使用して、肝臓癌などの脱調節されたＧＰＣ３の発現に関連した疾病を診断及び処置するための組成物及び方法を開示している。
【０００５】
当技術分野において、例えば特異的なＴ細胞を介して又は免疫療法若しくはペプチドを基剤としたワクチンによって、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）を検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療するための改良された手段及び方法が必要とされる。
【０００６】
発明の要約
本発明によると、この目的は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列（可変α）、
又は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列（可変β）、
又は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体β鎖
を含む、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって解決する。
【０００７】
本発明によると、この目的は、
（ｉ）配列番号１８〜２０の群から選択されたアミノ酸配列（３×可変α）、
又は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３２６）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体のα鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列（可変β）、
又は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３２６）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体β鎖
を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって解決する。
【０００８】
本発明によると、この目的は、
（１）好ましくは互いに共有結合で連結されてＴＣＲヘテロ二量体又は多量体を形成している、本明細書において定義されているＴ細胞受容体のα鎖（群）及び／又は本明細書において定義されているＴ細胞受容体のβ鎖（群）の少なくとも１つ、
及び（２）好ましくは、Ｆｃ受容体及び／又はＦｃドメイン、サイトカイン、例えばＩＬ−２又はＩＬ−１５、毒素、抗体、例えば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ１６抗体、又は抗ＣＤ５６抗体、又はその組合せから選択された融合成分（群）
を含む、可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）構築物によって解決され、
ここで、少なくとも１つのＴ細胞受容体鎖（１）は、融合成分（群）（２）に結合している。
【０００９】
本発明によると、この目的は、
本明細書において定義されているＴ細胞受容体のα鎖、
本明細書において定義されているＴ細胞受容体のβ鎖、又は
本発明に記載のＴ細胞受容体
の少なくとも１つを含むキメラＴ細胞受容体によって解決され、ここで、ＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖は、ＣＤ３−ゼータ鎖（群）及び／又は他のＴＣＲ刺激ドメイン、例えば細胞内ＣＤ２８、ＣＤ１３７、又はＣＤ１３４ドメインに好ましくはリンカーを介して融合している。
【００１０】
本発明によると、この目的は、
好ましくはリンカーを介して、
（ｂ）リンパ球の表面上の抗原又はエピトープに対して指向される抗体又は一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）
に融合している、
ａ）互いに連結されている、本明細書において定義されているＴＣＲのＴ細胞受容体α鎖及びβ鎖（群）、
を含む、二重特異的抗体によって解決する。
【００１１】
本発明によると、この目的は、本発明に記載のＴ細胞受容体をコードしているか、又は本発明に記載の可溶性Ｔ細胞受容体構築物をコードしているか、又は本発明に記載のキメラＴ細胞受容体をコードしているか、又は本発明に記載の二重特異的抗体をコードしている、核酸によって解決する。
【００１２】
本発明によると、この目的は、細胞内で本発明に記載のＴ細胞受容体、又は可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又はキメラＴ細胞受容体、又は二重特異的抗体を発現させるための、発現構築物によって解決する。
【００１３】
本発明によると、この目的は、本発明に記載のＴ細胞受容体、若しくは可溶性Ｔ細胞受容体構築物、若しくはキメラＴ細胞受容体、若しくは二重特異的抗体、又は本発明に記載の核酸、又は本発明に記載の発現構築物を含む、細胞によって解決する。
【００１４】
本発明によると、この目的は、
（ｉ）本発明のＴ細胞受容体；
（ｉｉ）本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物；
（ｉｉｉ）本発明のキメラＴ細胞受容体；
（ｉｖ）本発明の二重特異的抗体；
（ｖ）本発明の核酸（群）又は本発明の発現構築物；及び／又は
（ｖｉ）本発明の細胞
の１つ以上、
及び、場合により、薬学的賦形剤（群）
を含む医薬組成物によって解決する。
【００１５】
本発明によると、この目的は、遺伝子的に改変されたリンパ球を作製するための、本発明のＴ細胞受容体、本発明のキメラＴ細胞受容体、本発明の二重特異的抗体、本発明の核酸、又は本発明の発現構築物の使用によって解決する。
【００１６】
本発明によると、この目的は、医薬品としての使用のための、本発明のＴ細胞受容体、本発明のキメラＴ細胞受容体、本発明の二重特異的抗体、本発明の核酸、又は本発明の発現構築物を提供することによって解決する。
【００１７】
本発明によると、この目的は、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療に使用するための、本発明のＴ細胞受容体、本発明のキメラＴ細胞受容体、本発明の二重特異的抗体、本発明の核酸、又は本発明の発現構築物を提供することによって解決する。
【００１８】
本発明によると、この目的は、
（ａ）患者又は血液ドナーのリンパ球を準備する工程；
（ｂ）（ｉ）本発明のＴ細胞受容体、又は本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又は本発明のキメラＴ細胞受容体、又は本発明の二重特異的抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸、
（ｉｉｉ）本発明の発現構築物、
（ｉｖ）本発明の細胞、及び
（ｖ）本発明の医薬組成物
の１つ以上を準備する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の（ｉ）から（ｖ）の１つ以上を、工程（ａ）のリンパ球に生体外で導入し、これにより、遺伝子的に改変されたリンパ球を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）の遺伝子的に改変されたリンパ球を、それを必要とする被験者又は患者に投与する工程、
（ｅ）場合により、工程（ｂ）から（ｄ）のいずれかを、放射線照射、チェックポイント阻害剤、又は癌化学療法と組み合わせる工程
を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療する方法によって解決する。
【００１９】
本発明によると、この目的は、
（ａ）（ｉ）本発明のＴ細胞受容体、又は本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又は本発明のキメラＴ細胞受容体、又は本発明の二重特異的抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸、
（ｉｉｉ）本発明の発現構築物、
（ｉｖ）本発明の細胞、及び
（ｖ）本発明の医薬組成物
の１つ以上を準備する工程；
（ｂ）工程（ａ）の（ｉ）から（ｖ）の１つ以上を、それを必要とする被験者又は患者に、好ましくは注射又は注入を介して直接適用する工程、
（ｃ）場合により、工程（ｂ）を放射線照射、チェックポイント阻害剤、又は癌化学療法と組み合わせる工程
を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療する方法によって解決する。
【００２０】
本発明によると、この目的は、患者の（肝臓）癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞を、本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物を使用して検出及び／又は破壊する工程を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療する方法によって解決する。
【００２１】
本発明によると、この目的は、配列番号１３のアミノ酸配列（ＧＰＣ３ペプチド３６７）を含む、少なくとも１つのＧＰＣ３エピトープを含むペプチドによって解決する。
【００２２】
本発明によると、この目的は、本発明に記載の少なくとも１つのペプチドをコードする核酸分子、又は少なくとも１つのこのような核酸分子を含む、プラスミドによって解決する。
【００２３】
本発明によると、この目的は、本発明に記載のペプチドに対する抗体によって解決する。
【００２４】
本発明によると、この目的は、
（ｉ）本発明に記載の少なくとも１つのペプチド、又は本発明に記載の少なくとも１つの核酸、
（ｉｉ）場合により、担体、
（ｉｉｉ）場合により、アジュバント
を含む、組成物によって解決する。
【００２５】
本発明によると、この目的は、医薬に使用するための、本発明のペプチド、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物を提供することによって解決する。
【００２６】
本発明によると、この目的は、ワクチンとして使用するための、本発明のペプチド、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物を提供することによって解決する。
【００２７】
本発明によると、この目的は、
（ｉ）本発明に記載の少なくとも１つのペプチド、又は本発明に記載の少なくとも１つの核酸、又は本発明の組成物、
（ｉｉ）場合により、賦形剤
を含む、ワクチンによって解決する。
【００２８】
本発明によると、この目的は、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療するための、本発明のワクチンの使用によって解決する。
【００２９】
本発明によると、この目的は、本発明のペプチド、本発明の核酸分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンを、それを必要とする被験者に投与する工程を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療する方法によって解決する。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様の説明
本発明を以下により詳細に記載する前に、本明細書に記載された特定の方法、プロトコール、及び試薬は変更され得るので本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書において使用された用語は、単に特定の実施態様を説明する目的のためであり、本発明の範囲を制限する意図はなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるであろうことを理解されたい。特記しない限り、本明細書において使用された全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書に引用された全ての参考文献はその全体が参照により組み入れられる。
【００３１】
濃度、量、及び他の数字的データは、範囲の形式で本明細書に表現又は提示され得る。このような範囲の形式は、単に簡便性及び簡潔性のために使用され、したがって、範囲の限界として明確に列挙されている数値を含むだけでなく、各々の数値及び部分範囲が明確に列挙されているかのように、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分範囲も含むと柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。一例として、「５〜５０アミノ酸」の数値の範囲は、５〜５０の明確に列挙された数値だけでなく、指定された範囲内の個々の数値及び部分範囲も含むと解釈されるべきである。したがって、この数的範囲に含まれるのは、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、・・・、４８、４９、５０などの個々の数値、及び、９〜５０、５〜２５、９〜２５、１０〜２５、１０〜２０、及び１５〜２５などの部分範囲である。この同じ原則は、「少なくとも８つのアミノ酸」などの唯一の数値を列挙した範囲にも適用される。さらに、このような解釈は、範囲の広さ又は記載されている特徴に関係なく適用されるべきである。
【００３２】
ＧＰＣ３に特異的なＴ細胞受容体
上記に考察されているように、本発明は、ＧＰＣ３に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
【００３３】
大半のＴ細胞は、いくつかのタンパク質の複合体として存在しているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体α及びβの遺伝子（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）から産生され、かつα−ＴＣＲ鎖及びβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる、２つの（別々の）ペプチド鎖から構成される。γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面上に明確に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットを示す。しかしながら、γδＴ細胞では、ＴＣＲは、１本のγ鎖と１本のδ鎖からなる。この群のＴ細胞は、αβＴ細胞よりもはるかにより少ない（全Ｔ細胞の２％）。
【００３４】
Ｔ細胞受容体の構造は、軽鎖及び重鎖の組み合わせられた抗体アームとして定義される領域である、免疫グロブリンＦａｂ断片に非常に類似している。ＴＣＲの各々の鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、１つのＮ末端の免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン、１つのＩｇ定常（Ｃ）ドメイン、膜貫通／細胞膜貫通領域、及びＣ末端における短い細胞質側末端を有する。
【００３５】
本発明によると、「Ｔ細胞受容体の可変領域」という用語は、ＴＣＲ鎖の可変ドメインに関する。ＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方の可変ドメインは３つの超可変領域すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、一方、β鎖の可変領域は、抗原と通常は接触せず、それ故、ＣＤＲとは考えられない、追加の超可変領域（ＨＶ４）を有する。
【００３６】
Ｔ細胞の活性化における最初のシグナルは、別の細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示される短いペプチドへのＴ細胞受容体の結合によって提供される。これにより、そのペプチドに対して特異的なＴＣＲを有するＴ細胞のみが確実に活性化される。
【００３７】
肝細胞癌は、多くの他の腫瘍のように、腫瘍関連抗原を発現している。グリピカン−３（ＧＰＣ３）及びα−フェトプロテインは、健康なヒト肝臓には発現されないが、全ての肝細胞癌の最大で７０％及び８０％においてそれぞれ再活性化されている。
【００３８】
ＧＰＣ３ペプチド３６７に特異的なＴＣＲ
本発明者らは、今回、免疫優性ＧＰＣ３エピトープ、すなわちＨＬＡ−Ａ２に結合したＧＰＣ３ペプチド３６７を同定し、ＧＰＣ３ペプチド３６７に対して特異的なＴＣＲをクローニングした。
【００３９】
好ましくは、本発明のＧＰＣ３に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、
（１）各々可変ドメイン及び定常ドメイン（群）を含む、α鎖及びβ鎖を含み、
（２）より高い発現レベルのためにコドンの最適化された可変ドメインを含み、
（３）マウス化されている、すなわち、内因性ＴＣＲ鎖と誤った対を形成することを回避することを助ける、マウス定常ドメインを含む、及び／又は
（４）α鎖及びβ鎖を連結させるためのリンカー又はヒンジ領域を含む。
【００４０】
上記に考察されているように、本発明のＧＰＣ３に特異的なＴＣＲは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列（可変α）、
又は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列（可変β）、
又は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体β鎖
を含む。
【００４１】
本明細書において同義語として使用されているような、「ＴＣＲ配列の任意の変異形、ただし、生物学的活性は保持されている」又は「ＴＣＲ配列の任意の変異形、ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している」という用語は、好ましくはＨＬＡ Ａ２分子に結合している、ＧＰＣ３ペプチド３６７のＴＣＲによる認識に関してその機能的活性を保持している、本発明のＴＣＲ鎖（群）／受容体（群）のアミノ酸配列をいう。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列（マウスα）、
又は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列
をさらに含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列（マウスβ）、
又は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列
をさらに含むＴ細胞受容体β鎖
を含む。
【００４３】
好ましい実施態様では、本発明のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列（Ｐ２Ａ）又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率を有するアミノ酸配列を含む、リンカーからヒンジ領域を含む。
【００４４】
好ましい実施態様では、本発明のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、
（ｉ）配列番号１（可変α）及び配列番号３（マウスα）のアミノ酸配列を含む、
好ましくは配列番号６のアミノ酸配列（可変α＋マウスα）を含む若しくはからなる、
又は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２（可変β）及び配列番号４（マウスβ）のアミノ酸配列を含み、
好ましくは配列番号７のアミノ酸配列（可変β＋マウスβ）を含む若しくはからなるか、
又は、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３６７）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）、
を含むＴ細胞受容体β鎖
を含む。
【００４５】
好ましい実施態様では、本発明のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号８のアミノ酸配列（全TCR P1-1のアミノ酸配列）を含むか又はからなる。
【００４６】
配列番号１は、Ｔ細胞受容体α鎖の可変領域のアミノ酸配列（可変α）を示す。
【表１】
2017522859.tif 000002
【００４７】
配列番号２は、Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域のアミノ酸配列（可変β）を示す。
【表２】
2017522859.tif 000003
【００４８】
配列番号３は、マウス定常ドメインを含む、Ｔ細胞受容体α鎖の定常領域のアミノ酸配列（マウスα）を示す。
【表３】
2017522859.tif 000004
【００４９】
配列番号４は、マウス定常ドメインを含む、Ｔ細胞受容体β鎖の定常領域のアミノ酸配列（マウスβ）を示す。
【表４】
2017522859.tif 000005
【００５０】
配列番号５は、β鎖とα鎖を連結するリンカー又はヒンジ領域のアミノ酸配列を示す：
【表５】
2017522859.tif 000006
【００５１】
配列番号６は、Ｔ細胞受容体α鎖の完全長アミノ酸配列を示す（配列番号１に下線が付されている）：
【表６】
2017522859.tif 000007
【００５２】
配列番号７は、Ｔ細胞受容体β鎖の完全長アミノ酸配列を示す（配列番号２に下線が付されている）：
【表７】
2017522859.tif 000008
【００５３】
配列番号８は、β鎖、リンカー、及びα鎖を含む、Ｔ細胞受容体の完全長アミノ酸配列を示す。
【表８】
2017522859.tif 000009
【００５４】
ＧＰＣ３ペプチド３２６に対して特異的なＴＣＲ
本発明者らはさらに、ＧＰＣ３ペプチド３２６に対して特異的なＴＣＲをクローニングした。
【００５５】
好ましくは、本発明のＧＰＣ３に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、
（１）各々が可変ドメイン及び定常ドメイン（群）を含んでいるα鎖及びβ鎖を含み、
（２）より高い発現レベルのためにコドンが最適化された可変ドメインを含み、
（３）マウス化されている、すなわち、内因性ＴＣＲ鎖との誤った対形成を回避することを助ける、マウス定常ドメインを含む、及び／又は
（４）α鎖とβ鎖を連結させるリンカー又はヒンジ領域を含む。
【００５６】
上記に考察されているように、本発明のＧＰＣ３に特異的なＴＣＲは、
（ｉ）配列番号１８〜２０の群から選択されたアミノ酸配列（３×可変α）、
又は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３２６）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列（可変β）、
又は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３２６）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体β鎖
を含む。
【００５７】
本明細書において同義語として使用されているような、「ＴＣＲ配列の任意の変異形、ただし、生物学的活性は保持されている」又は「ＴＣＲ配列の任意の変異形、ただし、該変異形は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３２６）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している」という用語は、好ましくはＨＬＡ Ａ２分子に結合している、ＧＰＣ３ペプチド３２６のＴＣＲによる認識に関してその機能的活性を保持している、本発明のＴＣＲ鎖（群）／受容体（群）のアミノ酸配列をいう。
【００５８】
好ましい実施態様では、本発明のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、
（ｉ）配列番号２２〜２４の群から選択されたアミノ酸配列（３×マウスα）、
又は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列
をさらに含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列（マウスβ）、
又は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列
をさらに含むＴ細胞受容体β鎖
を含む。
【００５９】
好ましい実施態様では、本発明のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列（Ｐ２Ａ）、
又は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率を有するアミノ酸配列を含む、リンカーからヒンジ領域を含む。
【００６０】
好ましい実施態様では、本発明のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、
（ｉ）（ｉ−１）配列番号１８（可変α）及び配列番号２２（マウスα）のアミノ酸配列、
好ましくは、配列番号２６のアミノ酸配列（可変α＋マウスα）を含むか、若しくは、からなる、
又は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％又は９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
（ｉ−２）配列番号１９（可変α）及び配列番号２３（マウスα）のアミノ酸配列、
好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列（可変α＋マウスα）を含むか、若しくは、からなる、
又は配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
（ｉ−３）配列番号２０（可変α）及び配列番号２４（マウスα）のアミノ酸配列、
好ましくは配列番号２８のアミノ酸配列（可変α＋マウスα）を含むか、若しくは、からなる、
又は配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
の群から選択されたアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１７のアミノ酸配列（ＧＰＣ３ペプチド３２６）を有するエピトープ又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体α鎖、
及び／あるいは
（ｉｉ）配列番号２１（可変β）及び配列番号２５（マウスβ）のアミノ酸配列、
好ましくは配列番号２９のアミノ酸配列（可変β＋マウスβ）を含むか、若しくは、からなる、
又は配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列、
又は、ＴＣＲ配列の任意の変異形（ただし、該変異形は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するエピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３２６）又はそのＨＬＡ−Ａ２結合形と結合するその機能的能力を保持している）
を含むＴ細胞受容体β鎖
を含む。
【００６１】
好ましい実施態様では、本発明のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号３０〜３２（全ＴＣＲ Ｐ２−１の３×アミノ酸配列）の群から選択されたアミノ酸配列を含むか又はからなる。
【００６２】
配列番号１８は、１つのＴ細胞受容体α鎖の可変領域のアミノ酸配列（可変α）を示す。
【表９】
2017522859.tif 000010
【００６３】
配列番号１９は、別のＴ細胞受容体α鎖の可変領域のアミノ酸配列（可変α）を示す。
【表１０】
2017522859.tif 000011
【００６４】
配列番号２０は、別のＴ細胞受容体α鎖の可変領域のアミノ酸配列（可変α）を示す。
【表１１】
2017522859.tif 000012
【００６５】
配列番号２１は、Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域のアミノ酸配列（可変β）を示す。
【表１２】
2017522859.tif 000013
【００６６】
配列番号２２は、マウス定常ドメインを含む、Ｔ細胞受容体α鎖の定常領域のアミノ酸配列（マウスα）を示す。
【表１３】
2017522859.tif 000014
【００６７】
配列番号２３は、マウス定常ドメインを含む、Ｔ細胞受容体β鎖の定常領域のアミノ酸配列（マウスβ）を示す。
【表１４】
2017522859.tif 000015
【００６８】
配列番号５は、β鎖とα鎖を連結するリンカー又はヒンジ領域のアミノ酸配列を示す。
【表１５】
2017522859.tif 000016
【００６９】
配列番号２４は、配列番号１８及び２２からなるＴ細胞受容体α鎖の完全長アミノ酸配列を示す（配列番号１８に下線が付されている）：
【表１６】
2017522859.tif 000017
【００７０】
配列番号２５は、配列番号１９及び２２からなるＴ細胞受容体α鎖の完全長アミノ酸配列を示す（配列番号１９に下線が付されている）：
【表１７】
2017522859.tif 000018
【００７１】
配列番号２６は、配列番号２０及び２２からなるＴ細胞受容体α鎖の完全長アミノ酸配列を示す（配列番号２０に下線が付されている）：
【表１８】
2017522859.tif 000019
【００７２】
配列番号２７は、Ｔ細胞受容体β鎖の完全長アミノ酸配列を示す（配列番号２１に下線が付されている）：
【表１９】
2017522859.tif 000020
【００７３】
配列番号２８は、β鎖、リンカー、及び配列番号２４のα鎖を含む、１つのＴ細胞受容体の完全長アミノ酸配列を示す。
【表２０】
2017522859.tif 000021
【００７４】
配列番号２９は、β鎖、リンカー、及び配列番号２５のα鎖を含む、別のＴ細胞受容体の完全長アミノ酸配列を示す：
【表２１】
2017522859.tif 000022
【００７５】
配列番号３０は、β鎖、リンカー、及び配列番号２６のα鎖を含む、別のＴ細胞受容体の完全長アミノ酸配列を示す。
【表２２】
2017522859.tif 000023
【００７６】
可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）構築物
上記に考察されているように、本発明は、本発明のＴ細胞受容体／鎖を含む、可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）構築物を提供する。
【００７７】
前記の可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）構築物は、
（１）好ましくは互いに共有結合で連結されてＴＣＲヘテロ二量体又は多量体を形成している、
本明細書において定義されているＴ細胞受容体α鎖（群）、
本明細書において定義されているＴ細胞受容体β鎖（群）
の少なくとも１つ、及び
（２）好ましくは、
Ｆｃ受容体及び／又はＦｃドメイン、
サイトカイン、例えばＩＬ−２又はＩＬ−１５、
毒素、例えば外毒素、例えばシュードモナス外毒素、
抗体、例えば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ１６抗体、又は抗ＣＤ５６抗体、
又はその組合せ
から選択された融合成分（群）
を含み、
ここで、少なくとも１つのＴ細胞受容体鎖（１）は融合成分（群）（２）に結合している。
【００７８】
好ましくは、可溶性Ｔ細胞受容体はさらに、可溶性ＴＣＲに、例えば融合成分（群）（２）に好ましくは共有結合で付着／結合している、標識、例えば放射性核種、金（粒子）、フルオロフォア（例えばフルオレセイン）を含む。
【００７９】
可溶性ＴＣＲは、サイトカイン及びＦｃドメインなどの様々な融合成分（２）を含み得る。
【００８０】
ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖は化学的修飾によって可溶化させることができ、互いに及び他の分子に、例えばＦｃ受容体、サイトカイン、及び毒素に共有結合で連結させることができる（Boulter et al, 2005; Lunde et al 2010に記載のように）。
【００８１】
これらの可溶性ＴＣＲ構築物は、Ｔ細胞を必要とすることなく、肝臓癌細胞、例えば肝細胞癌細胞の検出及び破壊のために直接使用するのに適している。これは、それぞれ静脈内、皮下、又は筋肉内注入若しくは注射による、又は吸入若しくは噴霧による気道粘膜への適用による、患者への可溶性Ｔ細胞受容体構築物の適用によって達成され得る。
【００８２】
１つの実施態様では、本発明の可溶性ＴＣＲ構築物は、組換えタンパク質として使用される。このような組換えタンパク質は、好ましくは大腸菌又は哺乳動物細胞において発現され、次いで、さらなる使用又は適用前に精製される。
【００８３】
本発明は、発現され精製された可溶性ＴＣＲ構築物を提供する。
【００８４】
キメラＴＣＲ
上記に考察されているように、本発明は、
本明細書において定義されているＴ細胞受容体α鎖、
本明細書において定義されているＴ細胞受容体β鎖、又は
本発明のＴ細胞受容体
の少なくとも１つを含むキメラＴ細胞受容体を提供し、ここで、ＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖は、ＣＤ３ゼータ鎖（群）及び／又は他のＴＣＲ刺激ドメイン、例えば細胞内ＣＤ２８、ＣＤ１３７、又はＣＤ１３４ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、又はＣＤ１３４のより細胞内のシグナル伝達ドメインに、好ましくはリンカーを介して融合している。
【００８５】
１つの実施態様では、本発明のキメラＴＣＲは、互いにリンカーを介して融合し、さらにＣＤ３ゼータ鎖（群）に融合している、本発明のＴ細胞受容体α鎖及び本発明のＴ細胞受容体β鎖を含む。
【００８６】
好ましいＣＤ３ゼータ鎖（群）は、Ｔ細胞受容体のヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖（群）である。好ましいＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４シグナル伝達ドメインは、ヒトを起源とする。
【００８７】
キメラＴＣＲは、さらなる成分を含み得る。
【００８８】
キメラＴ細胞受容体及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は当技術分野において公知である。例えば、Han et al. 2013を参照されたい。
【００８９】
二重特異的抗体
上記に考察されているように、本発明は、好ましくはリンカーを介して、
（ｂ）リンパ球の表面上の抗原又はエピトープに対して指向される抗体又は一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）
に融合している、
ａ）互いに連結されている、本明細書に定義されているＴＣＲのＴ細胞受容体α鎖及びβ鎖（群）
を含む、二重特異的抗体を提供する。
【００９０】
１つの実施態様では、抗体又はｓｃＦｖは、Ｔ細胞のＣＤ３又はＣＤ５受容体に対して指向される。
【００９１】
この実施態様では、二重特異的抗体はＴ細胞に結合し、該Ｔ細胞をＧＰＣ３提示腫瘍細胞へと向け直す。
【００９２】
別の実施態様では、抗体又はｓｃＦｖは、Ｔ細胞上の共刺激ＣＤ２８受容体に対して指向される。この実施態様では、二重特異的抗体は、Ｔ細胞に結合して共活性化し、該Ｔ細胞をＧＰＣ３提示腫瘍細胞へと向け直す。
【００９３】
別の実施態様では、ＣＤ３又はＣＤ５及びＣＤ２８に対する抗体又はｓｃＦＶは、四価抗体構築物において組み合わせられる。
【００９４】
１つの実施態様では、抗体又はｓｃＦｖはＮＫ細胞のＣＤ５６受容体に対して指向される。この実施態様では、二重特異的抗体はＮＫ細胞に結合し、該ＮＫ細胞をＧＰＣ３提示腫瘍細胞へと向け直す。
【００９５】
別の実施態様では、抗体又はｓｃＦｖは、ＮＫ細胞上の活性化受容体ＣＤ１６に対して指向される。この実施態様では、二重特異的抗体はＮＫ細胞に結合して活性化し、該ＮＫ細胞をＧＰＣ３提示腫瘍細胞へと向け直す。
【００９６】
別の実施態様では、ＣＤ５６及びＣＤ１６に対する抗体又はｓｃＦＶは、四価抗体構築物において組み合わせられる。
【００９７】
例えば、二重特異的抗体は、抗癌薬としての使用のために研究されている人工的な二重特異的モノクローナル抗体のクラスである、二重特異的Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）であり得る。それらは、癌細胞に対して、宿主の免疫系、より具体的にはＴ細胞の細胞傷害活性を向ける。ＢｉＴＥは、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ＡＧの登録商標である。ＢｉＴＥは、異なる抗体の２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は、約５５ｋＤａの１つのペプチド鎖上の４つの異なる遺伝子に由来するアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。ｓｃＦｖの一方は、例えばＣＤ３受容体を介してＴ細胞に、又はＮＫ細胞活性化のためにＣＤ５６に結合し、他方は腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する（例えばCsoka et al., 1996を参照されたい）。
【００９８】
好ましくは、本発明の二重特異的抗体は、組換えタンパク質として使用される。このような組換えタンパク質は、好ましくは大腸菌又は哺乳動物細胞において発現され、次いでさらなる使用又は適用前に精製される。
【００９９】
本発明は、発現され精製された二重特異的抗体を提供する。
【０１００】
ＧＰＣ３に特異的なＴＣＲを含む核酸、発現構築物、及び細胞
上記に考察されているように、本発明は、本発明に記載のＴ細胞受容体をコードしている核酸を提供する。
【０１０１】
ＧＰＣ３ペプチド３６７に対して特異的であるＴＣＲについての核酸
好ましくは、核酸は、
配列番号１（可変α）及び／又は配列番号２（可変β）のアミノ酸配列をコードしている核酸、
又は、配列番号９（可変α）及び／又は配列番号１０（可変β）のヌクレオチド配列
又は、その相補的配列（群）
又は、配列番号９若しくは１０のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）
を含む。
【０１０２】
配列番号９は、Ｔ細胞受容体α鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示す：
【表２３】
2017522859.tif 000024
【０１０３】
配列番号１０は、Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示す：
【表２４】
2017522859.tif 000025
【０１０４】
１つの実施態様では、核酸は、
配列番号６（可変α＋マウスα）及び／又は配列番号７（可変β＋マウスβ）のアミノ酸配列をコードしている核酸、
配列番号１１（可変α＋マウスα）及び／又は配列番号１２（可変β＋マウスβ）のヌクレオチド配列、
又は、その相補的配列（群）、
又は、配列番号１１若しくは１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）
を含む。
【０１０５】
配列番号１１は、Ｔ細胞受容体α鎖の完全長ヌクレオチド配列を示す（下線は可変領域／配列番号９である）：
【表２５】
2017522859.tif 000026
【０１０６】
配列番号１２は、Ｔ細胞受容体β鎖の完全長ヌクレオチド配列を示す（下線は可変領域／配列番号１０である）：
【表２６】
2017522859.tif 000027
【０１０７】
１つの実施態様では、核酸は、
配列番号８のアミノ酸配列（全TCR P1-1のアミノ酸配列）をコードしている核酸、
配列番号１３のヌクレオチド配列（全ＴＣＲ Ｐ１−1）、
又は、その相補的配列（群）、
又は、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）
を含む。
【０１０８】
配列番号１３は、Ｔ細胞受容体のヌクレオチド配列を示す（下線はリンカー又はヒンジ領域である）：
【表２７】
2017522859.tif 000028
【０１０９】
配列番号９〜１３のヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡに由来するか、又はＤＮＡである。
【０１１０】
配列番号９〜１３のヌクレオチド配列はコドンが最適化されている。
【０１１１】
ＧＰＣ３ペプチド３２６に対して特異的であるＴＣＲについての核酸
好ましくは、核酸は、
配列番号１８〜２０（３×可変α）及び／又は配列番号２１（可変β）の１つのアミノ酸配列をコードしている核酸、
又は、配列番号３１〜３３（３×可変α）及び／又は配列番号３４（可変β）の１つのヌクレオチド配列、
又は、その相補的配列（群）
又は、配列番号３１〜３４の１つのヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）
を含む。
【０１１２】
配列番号３１は、１つのＴ細胞受容体α鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示す：
【表２８】
2017522859.tif 000029
【０１１３】
配列番号３２は、別のＴ細胞受容体α鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示す：
【表２９】
2017522859.tif 000030
【０１１４】
配列番号３３は、別のＴ細胞受容体α鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示す：
【表３０】
2017522859.tif 000031
【０１１５】
配列番号３４は、Ｔ細胞受容体β鎖の可変領域のヌクレオチド配列を示す：
【表３１】
2017522859.tif 000032
【０１１６】
１つの実施態様では、核酸は、
配列番号２４〜２６（可変α＋マウスα）及び／又は配列番号２７（可変β＋マウスβ）の１つのアミノ酸配列をコードしている核酸、
配列番号３５〜３７（可変α＋マウスα）及び／又は配列番号３８（可変β＋マウスβ）の１つのヌクレオチド配列、
又は、その相補的配列（群）
又は、配列番号３５〜３８の１つのヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）
を含む。
【０１１７】
配列番号３５は、１つのＴ細胞受容体α鎖の完全長ヌクレオチド配列を示す（下線は可変領域／配列番号３１である）：
【表３２】
2017522859.tif 000033
【０１１８】
配列番号３６は、別のＴ細胞受容体α鎖の完全長ヌクレオチド配列を示す（下線は可変領域／配列番号３２である）：
【表３３】
2017522859.tif 000034
【０１１９】
配列番号３７は、別のＴ細胞受容体α鎖の完全長ヌクレオチド配列を示す（下線は可変領域／配列番号３３である）：
【表３４】
2017522859.tif 000035
【０１２０】
配列番号３８は、Ｔ細胞受容体β鎖の完全長ヌクレオチド配列を示す（下線は可変領域／配列番号３４である）：
【表３５】
2017522859.tif 000036
【０１２１】
１つの実施態様では、核酸は、
配列番号２８〜３０（全ＴＣＲ Ｐ２−１の３×アミノ酸配列）の１つのアミノ酸配列をコードしている核酸、
配列番号３９〜４１（全ＴＣＲ Ｐ２−１）の１つのヌクレオチド配列
又は、その相補的配列（群）
又は、配列番号３９〜４１の１つのヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０若しくは９５若しくは９９％の同一率を有する配列（群）
を含む。
【０１２２】
配列番号３９は、１つのＴ細胞受容体のヌクレオチド配列を示す（下線はリンカー又はヒンジ領域である）：
【表３６】
2017522859.tif 000037
【０１２３】
配列番号４０は、別のＴ細胞受容体のヌクレオチド配列を示す（下線はリンカー又はヒンジ領域である）：
【表３７】
2017522859.tif 000038
【０１２４】
配列番号４１は、別のＴ細胞受容体のヌクレオチド配列を示す（下線はリンカー又はヒンジ領域である）：
【表３８】
2017522859.tif 000039
【０１２５】
配列番号３１〜４１のヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡに由来するか、又はＤＮＡである。
【０１２６】
上記に考察されているように、本発明は、本発明に記載の可溶性Ｔ細胞受容体構築物をコードしている核酸を提供する。
【０１２７】
上記に考察されているように、本発明は、本発明に記載のキメラＴ細胞受容体をコードしている核酸を提供する。
【０１２８】
上記に考察されているように、本発明は、本発明に記載の二重特異的抗体をコードしている核酸を提供する。
【０１２９】
本発明に記載の核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、その組合せ又はその誘導体（例えばＰＮＡ）を含む。
【０１３０】
好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のために、好ましくはヒト細胞における発現のためにコドンが最適化されている。二重特異的抗体の作製のために、核酸配列はまた、細菌、酵母、又は昆虫細胞における発現のためにコドンが最適化されていてもよい。コドン最適化は、所与の種の高度に発現されている遺伝子において一般的に稀である関心対象の配列中のコドンを、このような種の高度に発現されている遺伝子において一般的に頻繁に存在するコドン、例えば交換されるコドンと同じアミノ酸をコードしているコドンと交換することをいう。
【０１３１】
本発明の範囲内には、上記のヌクレオチド配列の遺伝子コードの縮重に起因して得られたヌクレオチド配列もある。
【０１３２】
上記に考察されているように、本発明は、細胞内で本発明に記載のＴ細胞受容体を発現させるための発現構築物を提供する。
【０１３３】
上記に考察されているように、本発明は、細胞内で本発明に記載の可溶性Ｔ細胞受容体構築物を発現させるための発現構築物を提供する。
【０１３４】
上記に考察されているように、本発明は、細胞内で本発明に記載のキメラＴ細胞受容体を発現させるための発現構築物を提供する。
【０１３５】
上記に考察されているように、本発明は、本発明に記載の二重特異的抗体を発現させるための発現構築物、並びに、発現され精製された二重特異的抗体を提供する。
【０１３６】
好ましくは、発現構築物はさらに、プロモーター及び転写終結配列を含む。
【０１３７】
「発現構築物又は遺伝子構築物」（両方の用語は、本明細書全体を通して同義語として使用される）は、特定の遺伝子配列を標的細胞に導入するために使用される、核酸構築物、通常発現ベクター又は発現プラスミドをいう。一旦、発現構築物又は遺伝子構築物が細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質が細胞内の転写及び翻訳機械によって産生される。発現構築物又は遺伝子構築物は、エンハンサー及びプロモーター領域として作用し、構築物上に保有されている遺伝子の効率的な転写をもたらすそれぞれの調節配列、例えばプロモーター及び転写終結配列を含有するように設計されている。良く設計された発現構築物又は遺伝子構築物の目標は、大量の安定ｍＲＮＡ、それ故、タンパク質の産生である。あるいは、ＲＮＡは合成されるか又はインビトロで転写され、タンパク質の発現のために直接細胞内に導入される。
【０１３８】
当業者は、発現構築物又は遺伝子構築物のさらに他の適切な成分を選択することができる。
【０１３９】
適切な発現構築物の例は、ウイルスベクター、例えば
−レトロウイルスベクター（Verra et al, 2004; Porter et al, 2011に記載）、例えばＭＰ７１ベクター（Engels et al., 2003に記載）、又はレトロウイルスＳＩＮベクター（Yu et al., 1986に記載）；及び
−レンチウイルスベクター（Josef et al, 2008に記載）又はMiyoshi et al., 1998に記載のようなレンチウイルスＳＩＮベクターである。ＴＣＲをコードしている遺伝子を含有しているウイルスベクターは、リンパ球に感染して、感染したリンパ球において機能的なＴＣＲを発現することができる。好ましいのはＳＩＮベクター構築物である。
【０１４０】
適切な発現構築物の別の例は、眠れる森の美女（ＳＢ）トランスポゾントランスポザーゼＤＮＡプラスミドシステム、ＳＢ ＤＮＡプラスミド（Maiti et al., 2013に記載）である。
【０１４１】
本発明の核酸及び／又は特に発現構築物はまた、一過性ＲＮＡトランスフェクションによっても細胞内に導入することができる。
【０１４２】
本発明の核酸及び／又は特に発現構築物は、適切な宿主細胞内で本発明のＴＣＲの合成／発現を指令することができる。
【０１４３】
上記に考察されているように、本発明は、本発明に記載のＴ細胞受容体、又は本発明に記載の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又は本発明のキメラＴ細胞受容体、又は本発明の二重特異的抗体、又は本発明の核酸（群）、又は本発明の発現構築物を含む、細胞を提供する。
【０１４４】
好ましくは、細胞は、本発明のＴ細胞受容体を発現する。
【０１４５】
好ましくは、細胞は、本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物を発現する。
【０１４６】
好ましくは、細胞は、本発明に記載のキメラＴ細胞受容体を発現する。
【０１４７】
好ましくは、細胞は、本発明に記載の二重特異的抗体を発現する。
【０１４８】
好ましくは、細胞は、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、γ／δ−Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない、リンパ球から選択される。
【０１４９】
好ましくは、可溶性Ｔ細胞受容体又は二重特異的抗体の発現のための細胞は、多量の組換えタンパク質を発現する、大腸菌、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞から選択される。
【０１５０】
例えば（レトロ）ウイルスベクター、ＳＢ ＤＮＡによる、又は一過性ＲＮＡトランスフェクションによる、（初代）Ｔ細胞へのＧＰＣ３特異的ＴＣＲ遺伝子の導入は、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞を作製するための有望な手段及び方法を示す。このような工学操作されたＴ細胞の宿主への養子移植は、肝臓癌、特に肝細胞癌、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の免疫療法のための有望なアプローチを示す。
【０１５１】
ＧＰＣ３に特異的な二重特異的抗体又は可溶性Ｔ細胞受容体の適用は、向け直されたＴ細胞により、又は可溶性Ｔ細胞受容体構築物により、ＧＰＣ３陽性腫瘍細胞を標的化するための代替的で有望な手段及び方法を示す。これは、肝臓癌、特に肝細胞癌、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の免疫療法のための有望なアプローチを示す。
【０１５２】
医薬組成物
上記に考察されているように、本発明は、
（ｉ）本発明のＴ細胞受容体；
（ｉｉ）本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物；
（ｉｉｉ）本発明のキメラＴ細胞受容体；
（ｉｖ）本発明の二重特異的抗体；
（ｖ）請求項７〜１０のいずれか一項の核酸（群）又は本発明の発現構築物；及び／又は
（ｖｉ）本発明の細胞
の１つ以上、
及び場合により、薬学的賦形剤（群）を含む、医薬組成物を提供する。
【０１５３】
ＧＰＣ３に特異的なＴＣＲの医療使用
上記に考察されているように、本発明は、遺伝子的に改変されたリンパ球を作製するための、本発明のＴ細胞受容体、本発明のキメラＴ細胞受容体、本発明の二重特異的抗体、本発明の核酸、又は本発明の発現構築物の使用を提供する。
【０１５４】
好ましくは、遺伝子的に改変されたリンパ球はＴ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞である。
【０１５５】
１つの実施態様では、作製された遺伝子的に改変されたリンパ球、好ましくはＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、遺伝子免疫のために、好ましくは肝臓癌、特に肝細胞癌、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療するために使用される。
【０１５６】
例えば（レトロ）ウイルスベクターによる又は一過性ＲＮＡトランスフェクションによる（初代）Ｔ細胞へのＧＰＣ３に特異的なＴＣＲ遺伝子の導入は、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞を作製するための有望な手段及び方法を示す。このような工学操作されたＴ細胞の宿主への養子移植は、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の免疫療法のための有望なアプローチを示す。新規な治療アプローチは、肝細胞癌の養子Ｔ細胞療法である。導入されたＴ細胞は腫瘍抗原を認識することができ、これにより、腫瘍細胞を特異的に排除することができる。肝細胞癌は、Ｔ細胞療法のための可能性ある標的である。なぜなら、肝細胞癌は、多くの他の腫瘍のように、腫瘍関連抗原、例えばグリピカン−３（ＧＰＣ３）を発現しているからである。
【０１５７】
１つの実施態様では、本発明のキメラＴ細胞受容体（群）は、遺伝子的に改変されたリンパ球、好ましくはＮＫ細胞及び／又はＴ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞を作製するために使用される。
【０１５８】
ＣＤ３ゼータ鎖に連結されたＧＰＣ３特異的ＴＣＲ遺伝子の全部又は一部を含有しているキメラ受容体の、初代ＮＫ細胞への、例えば（レトロ）ウイルスベクターによる又は一過性ＲＮＡトランスフェクションによる導入は、ＧＰＣ３抗原特異的ＮＫ細胞を作製するための有望な手段及び方法を示す。宿主へのこのような工学操作されたＮＫ細胞の養子移植は、肝細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の免疫療法ための有望なアプローチを示す。
【０１５９】
上記に考察されているように、本発明は、医薬品として使用するための、本発明のＴ細胞受容体、本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、本発明のキメラＴ細胞受容体、本発明の二重特異的抗体、本発明の核酸、本発明の発現構築物、又は本発明の宿主細胞を提供する。
【０１６０】
上記に考察されているように、本発明は、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療に使用するための、本発明のＴ細胞受容体、本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物、本発明のキメラＴ細胞受容体、本発明の二重特異的抗体、本発明の核酸、本発明の発現構築物、又は本発明の宿主細胞を提供する。
【０１６１】
Baumhoer et al., 2008によって記載のようなＧＰＣ３を発現している他の癌又は腫瘍も例示されているが、以下に限定されない：
−肺扁平上皮癌、
−精巣非セミノーマ胚細胞腫瘍、
−脂肪肉腫、
−子宮頚部上皮内腫瘍。
【０１６２】
好ましくは、用途は、養子免疫療法、標的細胞特異的免疫療法、又は遺伝子免疫を含む。
【０１６３】
患者は好ましくはＨＬＡ−Ａ２陽性である。
【０１６４】
肝臓癌、特に肝細胞癌、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を検出、予防及び／又は治療する方法
上記に考察されているように、本発明は、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療する方法を提供する。
【０１６５】
１つの実施態様では、前記方法は、
（ａ）患者又は血液ドナーのリンパ球を準備する工程；
（ｂ）（ｉ）本発明のＴ細胞受容体、又は可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又は本発明のキメラＴ細胞受容体、又は本発明の二重特異的抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸、
（ｉｉｉ）本発明の発現構築物、
（ｉｖ）本発明の細胞、及び
（ｖ）本発明の医薬組成物
の１つ以上を準備する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の（ｉ）から（ｖ）の１つ以上を、工程（ａ）のリンパ球に生体外で導入し、これにより、遺伝子的に改変されたリンパ球を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）の遺伝子的に改変されたリンパ球を、それを必要とする被験者又は患者に投与する工程、
（ｅ）場合により、工程（ｂ）から（ｄ）のいずれかを、放射線照射、チェックポイント阻害剤、又は癌化学療法と組み合わせる工程
を含む。
【０１６６】
１つの実施態様では、前記方法は、
（ａ）（ｉ）本発明のＴ細胞受容体、又は可溶性Ｔ細胞受容体構築物、又は本発明のキメラＴ細胞受容体、又は本発明の二重特異的抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸、
（ｉｉｉ）本発明の発現構築物、
（ｉｖ）本発明の細胞、及び
（ｖ）本発明の医薬組成物
の１つ以上を準備する工程；
（ｂ）工程（ａ）の（ｉ）から（ｖ）の１つ以上を、好ましくは注射又は注入を介して、それを必要とする被験者又は患者に直接適用する工程、
（ｃ）場合により、工程（ｂ）を放射線照射、チェックポイント阻害剤、又は癌化学療法と組み合わせる工程
を含む。
【０１６７】
この実施態様では、好ましくは本発明の二重特異的抗体又は可溶性ＴＣＲ構築物が利用される。好ましくは、本発明の二重特異的抗体又は可溶性ＴＣＲ構築物は、組換えタンパク質として使用される。
【０１６８】
この実施態様では、工程（ｂ）では工程（ａ）の（ｉ）から（ｖ）の１つ以上が組換えタンパク質として使用される。
【０１６９】
本発明の組換えタンパク質、好ましくは二重特異的抗体又は可溶性ＴＣＲ構築物を、好ましくは大腸菌又は哺乳動物細胞において発現させ、次いで適用前に精製する。
【０１７０】
Ｔ細胞は、特に抗原に長期間曝露された後に、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）又はプログラム化細胞死１（ＰＤ−１）などの抑制性受容体を発現する。ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１のリガンドであるそれぞれＢ７及びＰＤ−Ｌ１、並びに、ＴＩＭ−３のリガンドであるガレクチン９は、腫瘍組織上に頻繁に発現され、Ｔ細胞寛容誘導に関与し、したがって免疫チェックポイントと呼ばれる。導入されたＧＰＣ３特異的Ｔ細胞のサイレンシングを回避するために、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、又は抗ＰＤ−１抗体によって例示されるがこれらに限定されない、チェックポイント阻害剤又は免疫チェックポイント阻害剤を使用して、腫瘍微小環境内のＴ細胞の抑制を回避することができる（Hamid et al.（2013）に記載）。
【０１７１】
被験者又は患者は好ましくはＨＬＡ−Ａ２陽性である。
【０１７２】
好ましくは、工程（ａ）で提供されたリンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１７３】
工程（ａ）で提供されたリンパ球は、被験者又は患者から、例えば血液から、又は同種血液ドナーのリンパ球除去によって得ることができる。
【０１７４】
好ましくは、工程（ｃ）の生体外での導入は、本発明の核酸若しくは本発明の発現構築物の電気穿孔法を介して、又はトランスフェクション試薬、例えばリポソームによって、又は一過性ＲＮＡトランスフェクションによって行なわれる。
【０１７５】
発現構築物は、好ましくは、上記のように、
−ウイルス構築物、好ましくはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又は他の当技術分野の最新技術のウイルスベクターである。
【０１７６】
適切な発現構築物の例は、ウイルスベクター、例えば
−レトロウイルスベクター（Verra et al, 2004; Porter et al, 2011に記載）、例えばＭＰ７１ベクター（Engels et al., 2003に記載）、又はレトロウイルスＳＩＮベクター（Yu et al., 1986に記載）；及び
−レンチウイルスベクター（Josef et al, 2008に記載）又はMiyoshi et al., 1998に記載のレンチウイルスＳＩＮベクターである。
【０１７７】
適切な発現構築物の別の例は、眠れる森の美女（ＳＢ）トランスポゾントランスポザーゼＤＮＡプラスミドシステム、ＳＢ ＤＮＡプラスミド（Maiti et al., 2013に記載）である。
【０１７８】
上記に考察されているように、本発明は、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療する方法を提供する。前記方法は、本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物を使用して、患者の肝臓癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の癌細胞の検出及び／又は破壊を含む。
【０１７９】
好ましくは、可溶性Ｔ細胞受容体構築物は、患者に、静脈内、皮下、若しくは筋肉内注入若しくは注射によってそれぞれ、又は吸入若しくは噴霧による気道粘膜への適用によって適用される。
【０１８０】
可溶性Ｔ細胞受容体構築物は、患者に
−静脈内注入によって、
−皮下注射又は注入によって、
−筋肉内注射によって、
−気道粘膜表面への吸入又は噴霧によって、適用され得る。
【０１８１】
可溶性Ｔ細胞受容体構築物の適用のために適切な用量範囲は、適用法及び適用部位に依存して１mgから１００００mgの間で変動する。可溶性Ｔ細胞受容体は、そのＨＬＡ−Ａ２分子上にＧＰＣ３ペプチドを発現している細胞に、すなわち肝臓癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、（又はＧＰＣ３を発現している他の癌の細胞）（ＧＰＣ３ペプチド３６７又はＧＰＣペプチド３２６が、ＭＨＣＩ分子によって提示されている）に結合することができる。可溶性Ｔ細胞受容体は、連結された放射性核種による放射線照射、又は、シュードモナス外毒素などの毒素による殺滅などの様々な方法を介して細胞の破壊を誘導することができる。さらに、Ｆｃドメインに連結された可溶性Ｔ細胞受容体は、肝癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の細胞の溶解のために、ＮＫ細胞及び／又は単球に向け直しそして活性化することができる。同様に、抗ＣＤ３抗体に連結された可溶性Ｔ細胞受容体は、肝臓癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の細胞の溶解のために、Ｔ細胞に向け直しそして活性化することができる。
【０１８２】
１つの実施態様では、本発明の方法は、標識されている本発明の可溶性Ｔ細胞受容体構築物を使用することによって、肝臓癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の細胞をインビトロで染色する工程を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を検出するためのものである。
【０１８３】
標識は、フルオロフォア（群）、金、及び／又は放射性核種（群）であり得る。
【０１８４】
フルオレセインなどの蛍光分子に連結された可溶性Ｔ細胞受容体を使用して、インビトロで肝臓癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の細胞を染色することができる。この目的のために、肝臓癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の細胞を、インビトロで、可溶性Ｔ細胞受容体構築物と共にインキュベートし、細胞表面上でＨＬＡ−Ａ２／ＧＰＣ３ペプチド複合体を発現している細胞を、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）によるその蛍光に従って又は顕微鏡によって検出することができる。
【０１８５】
あるいは、（例えばフルオロクロム、金、又は放射性核種を用いて）標識された可溶性Ｔ細胞受容体構築物を被験者又は患者に注射し、ＧＰＣ３陽性腫瘍、腫瘍転移、又は腫瘍摘出後の極小の残留疾病の検出及び続けて破壊を可能とする。
【０１８６】
本発明の可溶性ＴＣＲ構築物は、Ｔ細胞を必要とすることなく、肝臓癌細胞、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞、又はＧＰＣ３を発現している他の癌の細胞の検出及び破壊のために直接使用するのに適している。
【０１８７】
被験者又は患者は、好ましくはＨＬＡ−Ａ２陽性である。
【０１８８】
ＧＰＣ３エピトープ及びペプチド及びワクチン及びその使用
上記に考察されているように、本発明は、少なくとも１つのＧＰＣ３エピトープを含むペプチドを提供する。
【０１８９】
本発明者らは、免疫優性ＧＰＣ３エピトープ、特にＨＬＡ−Ａ２に結合したＧＰＣ３ペプチド３６７を同定した。
【０１９０】
少なくとも１つのＧＰＣ３エピトープは、配列番号１４のアミノ酸配列（ＧＰＣ３ペプチド３６７）を含むか又はからなる。
【０１９１】
配列番号１４は、ＧＰＣ３ペプチド３６７のアミノ酸配列を示す：
【表３９】
2017522859.tif 000040
【０１９２】
グリピカン−３は、ヒトにおいてＧＰＣ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、グリピカンファミリーの一員である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００４４８４．３、５８０アミノ酸。ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ５１６５４。
【０１９３】
【表４０】
2017522859.tif 000041
ＧＰＣ３のアミノ酸配列はまた、配列番号１５に示される。
【０１９４】
【表４１】
2017522859.tif 000042
ＧＰＣ３のヌクレオチド配列はまた、配列番号１６に示される。
【０１９５】
１つの実施態様では、エピトープのアミノ酸配列は、少なくとも８アミノ酸の長さを有する。１つの実施態様では、エピトープのアミノ酸配列は、９アミノ酸の長さを有する。好ましくは、エピトープのアミノ酸配列は、８、９、又は１０アミノ酸の長さを有する。
【０１９６】
１つの実施態様では、ペプチドは、５〜５０アミノ酸、好ましくは８〜２５アミノ酸、より好ましくは８〜１５アミノ酸、又は９〜１５アミノ酸の範囲内の長さを有する。１つの実施態様では、ペプチドは、ノナメア（nonamere）であり、すなわち９アミノ酸の長さを有する。
【０１９７】
１つの実施態様では、（好ましい実施態様である）ＭＨＣ Ｉでの提示のために、ペプチドは８〜１０アミノ酸、好ましくは９アミノ酸の長さを有する。１つの実施態様では、ＭＨＣ ＩＩでの提示のために、ペプチドは１５〜２４アミノ酸、好ましくは１８、１９、又は２０アミノ酸の長さを有する。
【０１９８】
１つの実施態様では、本発明のペプチドはさらに、ＧＰＣ３エピトープ（群）、例えば配列番号１７のアミノ酸配列を含むか又はからなるＧＰＣ３エピトープ（ＧＰＣ３ペプチド３２６）を含む。
【０１９９】
例えば、本発明のペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列（ＧＰＣペプチド３６７）及び配列番号１７のアミノ酸配列（ＧＰＣ３ペプチド３２６）を含むか又はからなり得る。
【０２００】
配列番号１７は、ＧＰＣ３ペプチド３２６のアミノ酸配列を示す：
【表４２】
2017522859.tif 000043
【０２０１】
１つの実施態様では、ペプチドはさらに、例えば
−タグ（群）、例えば６−Ｈｉｓ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ
−リンカー、例えばあるペプチド／エピトープを別のペプチド／エピトープに連結させるポリリンカー、
−標識（群）、例えば放射性同位体、酵素、金、発光標識、又は蛍光標識、
−Ｎ末端及び／又はＣ末端の修飾（群）、例えばＮ末端及び／又はＣ末端のアセチル化及び／又はアミド化を含む、
−薬物（群）、例えば腫瘍化学療法剤、キナーゼ阻害剤、
−薬剤（群）、
及び／又はその組合せを含む。
【０２０２】
当業者は適切なさらに他の成分を選択することができるだろう。
【０２０３】
前記のさらに他の成分（群）は、ワクチンのペプチドに共有結合で付着させることができる。
【０２０４】
１つの実施態様では、ペプチドは、修飾されたアミノ酸（群）、非天然アミノ酸（群）、又はペプチド模倣体（群）を含む。
【０２０５】
上記に考察されているように、本発明は、本発明に記載の少なくとも１つのペプチドをコードしている核酸分子、又は、少なくとも１つのこのような核酸分子を含むプラスミドを提供する。
【０２０６】
上記に考察されているように、本発明は、本発明に記載のペプチドに対する抗体を提供する。
【０２０７】
上記に考察されているように、本発明は、
（ｉ）本発明に記載の少なくとも１つのペプチド、又は本発明に記載の少なくとも１つの核酸、
（ｉｉ）場合により、担体、
（ｉｉｉ）場合により、アジュバント
を含む組成物を提供する。
【０２０８】
好ましくは、前記組成物は、本発明に記載の少なくとも２つのペプチド、又は本発明に記載の少なくとも２つの核酸を含む。
【０２０９】
本発明に記載の組成物はさらに、
−担体、及び／又は
−アジュバント
を含むことができる。
【０２１０】
適切なアジュバントは当技術分野において公知である。
【０２１１】
ペプチドは通常、不十分な免疫原であるので、ペプチドを基剤としたワクチンの効力は、免疫系へのエピトープの適切な提示に依存する。当業者は、適切な担体（群）及び／又はアジュバント（群）を選択することができるだろう。
【０２１２】
１つの実施態様では、担体は、ウイルス粒子又はその一部、ウイルスベクター又はウイルス粒子のエンベロープタンパク質、ミセル構造でペプチド（群）を包んでいるナノキャリア又はリポソーム化合物である。
【０２１３】
上記に考察されているように、本発明は、医薬に使用するための、本発明のペプチド、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物を提供する。
【０２１４】
上記に考察されているように、本発明は、ワクチンとして使用するための、本発明のペプチド、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物を提供する。
【０２１５】
上記に考察されているように、本発明は、本発明の少なくとも１つのペプチド、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物を含むワクチンを提供する。
【０２１６】
ワクチンは好ましくはペプチドを基剤としたワクチンである。
【０２１７】
本発明のワクチンはさらに、様々な投与計画（例えば、皮下又は皮内などの注射を介して）にとって必要であり得る、賦形剤（群）、例えば薬学的に許容される賦形剤（群）を含むことができる。
【０２１８】
さらに他の適切な賦形剤（群）は当業者には公知である。
【０２１９】
本発明のペプチド又は本発明のワクチンに含まれるペプチドは、完全長のグリピカン−３（ＧＰＣ３）タンパク質を含まない。
【０２２０】
上記に考察されているように、本発明は、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療するための本発明のワクチンの使用を提供する。
【０２２１】
上記に考察されているように、本発明は、本発明のペプチド、本発明の核酸分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンを、それを必要とする被験者に投与する工程を含む、肝臓癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）、又はＧＰＣ３を発現している他の癌を予防及び／又は治療する方法を提供する。
【０２２２】
好ましい実施態様のさらなる説明
本発明者らは、グリピカン−３を発現している細胞を特異的に認識し、サイトカインの産生及び標的細胞の効果的な殺滅などのエフェクター機能を示す、Ｔ細胞クローンを同定した。Ｔ細胞クローンは、ペプチド又はｍＲＮＡによりパルスされた樹状細胞（ＤＣ）を用いてのＴ細胞の同種拘束性刺激を使用して作製された。
【０２２３】
機能的Ｔ細胞クローンの成功裡の作製及び特徴付けの後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列をシークエンスし、続いてレトロウイルスベクター構築物にクローニングした。レトロウイルスベクターに基づいた以前にクローニングされたＴ細胞受容体の導入を使用して、ＧＰＣ３特異的なエフェクター機能をＴ細胞に装備させることができる。形質導入されたＴ細胞の機能をインビトロで評価した。
【０２２４】
同定されたＧＰＣ３特異的ＴＣＲは、肝細胞癌の養子Ｔ細胞療法に適している。肝細胞癌は、多くの他の腫瘍と同じように腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現し、その中の１つがグリピカン−３（ＧＰＣ３）である。ＴＡＡに天然に応答するであろうＴ細胞は、Ｔ細胞の発達中にネガティブセレクションと呼ばれるプロセスで系から除去される。なぜなら、ＴＡＡは、自己組織に由来するからである。それにも関わらず、Ｔ細胞を、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞受容体のより正確な挿入を遺伝子工学操作することによって腫瘍に対して再活性化させることができる。
【０２２５】
本発明のＴＣＲを有するＴ細胞は、ＧＰＣを発現している腫瘍細胞を認識し特異的に排除することができる。本発明のＧＰＣ３特異的ＴＣＲをコードしている遺伝子を、患者のＴ細胞に挿入することにより、それらのＴ細胞が癌細胞、特に肝細胞癌を認識して死滅させることを可能とする。腫瘍組織へのＴ細胞の遊走を改善し、増殖を増強するか、又は腫瘍に由来する免疫抑制因子に対する抵抗性を増強するための、本発明のＴＣＲの遺伝子的改変は任意選択である。さらに、導入されたＴ細胞の排除を可能とする自殺遺伝子の挿入は、有利であり得る。本発明のＴＣＲを生体外で具備したＴ細胞を、患者に戻すことができ、そこでそれらはその抗腫瘍活性を発揮することができる。
【０２２６】
本発明によると、ＭＨＣ−１によって提示されたＧＰＣ３ペプチド３６７は、本発明のＴ細胞受容体を有するＴ細胞によって認識されるか、又はＭＨＣ−１によって提示されたＧＰＣ３ペプチド３２６は、本発明のＴ細胞受容体を有するＴ細胞によってそれぞれ認識される。さらに、ＧＰＣ３＋ヒト肝細胞腫細胞は、該Ｔ細胞によって効果的に死滅することが示された。したがって、本発明のＴＣＲを用いてのＴ細胞養子免疫療法は、グリピカン−３（ＧＰＣ３）を発現している悪性細胞の認識、並びに、細胞傷害性排除を可能とし、これにより本発明のＴＣＲは、肝細胞癌患者を処置する非常に有望なツールとなっている。
【０２２７】
免疫優性ＧＰＣ３ペプチドの同定
ＧＰＣ３のための免疫優性エピトープはまだ記載されていない。この研究では、本発明者らは、Q Exactive質量分析計とオンラインで連結されたUltra Nano HPLCを使用して、ＧＰＣ３及びＨＬＡ−Ａ２陽性肝細胞腫細胞株から網羅的なＨＬＡクラスＩのペプチドームを得た。得られたデータを、MaxQuantバイオインフォマティクスプラットフォームを使用して分析した。
【０２２８】
ＨＬＡ−Ａ２に結合した２つのＧＰＣ３ペプチドが同定され、これらは「ＧＰＣペプチド３６７」（ＧＰＣ３３６７：FIDKKVLKV）及び「ＧＰＣペプチド３２６」（ＧＰＣ３３２６：TIHDSIQYV）と称され、ＧＰＣ３ペプチド３２６は、Komori et al., 2006に記載されている。
【０２２９】
これらの２つのペプチドの知識は、本発明者らが、ＧＰＣ３陽性ＨＣＣ細胞上に提示されたＧＰＣ３エピトープを標的化することを可能とする。図２も参照されたい。
【０２３０】
ペプチドＧＰＣ３３６７に対して特異的なＴ細胞及びＴ細胞受容体
本発明者らは、それぞれのＴ細胞クローンからＧＰＣ３ペプチド３６７に対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定しクローニングした。このＴＣＲはまた、Ｐ１−１とも称される。Ｐ１Ａのα鎖及びβ鎖の可変部分をコードしているＴ細胞受容体配列は、Ｔ細胞へのウイルスによる導入後の発現レベルを高めるためにコドンが最適化された。さらに、定常ドメインをマウス定常ドメインと交換して、内因性ＴＣＲ鎖との誤った対形成を回避し、従って、最適な発現を確実なものとした（図５参照）。
【０２３１】
この最適化されたＧＰＣ３に特異的なTCR P1-1を移植されたＴ細胞は、強力なＧＰＣ３とＭＨＣとストレプタマー（streptamer）の結合を示した。ＧＰＣ３ペプチドが積載された標的細胞又はＧＰＣ３を発現している肝細胞腫細胞株（ＨｅｐＧ２）と共に培養した場合、TCR P1-1の形質導入されたＴ細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ２を分泌し、脱顆粒マーカーＬａｍｐ−１を非局在化させた（図６Ａ及び図８参照）。
【０２３２】
細胞傷害性は、ＧＰＣ３及びＨＬＡ−Ａ２陽性であるＨｅｐＧ２細胞の殺滅によって観察された。細胞傷害性作用は、ＨＬＡ−Ａ２上のＧＰＣ３ペプチド提示に依存する。なぜなら、ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＣ３＋Ｈｕｈ７細胞には殺滅が全く観察されなかったからである（図６Ｂ参照）。標的細胞の殺滅はすでに、０．１：１という低いエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で起こり、１：１のＥ：Ｔ比が使用された場合に最大６０％の殺滅に達した。殺滅能のより詳細な研究は、１：１又はより高いＥ：Ｔ比が使用された場合に標的細胞の約９０％の非常に迅速な殺滅を示した。より低いＥ：Ｔ比では、標的細胞の約５０％が、Ｐ１−１を具備したＴ細胞によって死滅した（図７Ａ）。
【０２３３】
ＴＣＲへの結合力を分析するために、TCR P1-1の形質導入されたＴ細胞を、様々な濃度のペプチドＧＰＣ３ ３６７が積載されたＴ２細胞と共にインキュベートした。明瞭な濃度依存的なＩＦＮγ分泌が観察され、これは、本発明のＴＣＲの中程度の結合力を示した（図７Ｂ）。
【０２３４】
ペプチドＧＰＣ３３２６に対して特異的なＴＣＲ
本発明者らは、それぞれのＴ細胞クローンからＧＰＣ３ペプチド３２６に対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定しクローニングした。このＴＣＲはＰ２−１とも称される。
【０２３５】
以下の実施例及び図面は本発明を説明するが、しかしながら本発明を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１Ａ】TCR P1-1α鎖の配列。ＴＣＲα鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列：下線は可変α領域である。
【図１Ｂ】TCR P1-1β鎖の配列。ＴＣＲβ鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列：下線は可変β領域である。
【図１Ｃ】TCR P1-1配列のヌクレオチド配列：下線はリンカー領域である。
【図１Ｄ】TCR P1-1配列のアミノ酸配列：下線はリンカー領域である。
【図１Ｅ】１つのＴＣＲ Ｐ２−１のヌクレオチド配列：下線はＴＣＲα鎖である。
【図１Ｆ】１つのＴＣＲ Ｐ２−１のアミノ酸配列：下線はＴＣＲα鎖である。
【図１Ｇ】別のＴＣＲ Ｐ２−１のヌクレオチド配列：下線はＴＣＲα鎖である。
【図１Ｈ】別のＴＣＲ Ｐ２−１のアミノ酸配列：下線はＴＣＲα鎖である。
【図１Ｉ】第三のＴＣＲ Ｐ２−１のヌクレオチド配列：下線はＴＣＲα鎖である。
【図１Ｊ】第三のＴＣＲ Ｐ２−１のアミノ酸配列：下線はＴＣＲα鎖である。
【図２】ＨｅｐＧ２細胞上のＭＨＣＩに結合したペプチドの質量分析の図解。ＭＨＣ−Ｉペプチド複合体を、セファロースに結合させた抗ＭＨＣ Ｉ抗体によって全細胞溶解液から単離した。濃縮後、ペプチドをＭＨＣ Ｉから溶出し、続いてQ Exactive質量分析計にオンラインで連結されたUltra Nano HPLCを使用して分析した。
【図３】Ｔ細胞の同種拘束性刺激のためのタイムスケジュール。Wilde et al., 2012によると、樹状細胞を新鮮な血液から調製し、成熟させ、ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡを用いて電気穿孔した。ＧＰＣ３を、ペプチドの形態で積載させることができるか、又は、ＧＰＣ３ ｍＲＮＡをＨＬＡ−Ａ２と一緒に電気穿孔することができる。電気穿孔から１０時間後、ＤＣを、同じＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＣＬＴと共にインキュベートした。１４日目及び２１日目に、ＧＰＣ３に特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞培養液を多量体を用いて染色し、蛍光活性化細胞選別を介して選別した。選別されたＴ細胞を限界希釈培養液にクローニングするか、又は大量な系として増殖させる。その特異的エフェクター機能の評価のための機能的アッセイを行なう。
【図４】Ａ）刺激されたＴ細胞、対応するＴ細胞株、及び１つの例示的なＴ細胞クローンのストレプタマーによる染色（Ｐ１；３６７）。ストレプタマーに結合しているＴ細胞集団は、初代共培養液における０．６％から、Ｔ細胞株における５７％まで強化された。Ｔ細胞クローンは、強力なストレプタマーへの結合を示した。Ｂ）Ｐ１又はＰ２に対して特異的なＴ細胞クローンが、ＩＦＮγ分泌アッセイにおいて同定された。特定のＴ細胞クローンは、ＧＰＣ３ペプチドの積載されたＴ２細胞上でＩＦＮγを放出したが、対照ペプチドを含む又は含まないＴ２細胞上では放出しなかった。
【図５】ＴＣＲの改変：１）より高い発現レベルのためのコドン最適化。２）内因性ＴＣＲ鎖との誤った対形成を回避するためにマウス化された定常ドメイン。
【図６】Ａ）Ｐ１−１の形質導入されたＴ細胞は、ＧＰＣ３ペプチド３６７の積載されたＴ２細胞と共にインキュベートした場合にはＩＦＮγを特異的に分泌したが、他の標的細胞上には分泌しなかった。Ｂ）ＧＰＣ３３６７特異的TCR P1-1の移植されたＴ細胞によるＧＰＣ３＋ヒト肝細胞腫細胞の殺滅。ＧＰＣ３＋ＨＬＡ−Ａ２＋ＨｅｐＧ２細胞及びＧＰＣ３＋ＨＬＡ−Ａ２−Ｈｕｈ７細胞を、様々なエフェクター標的（Ｅ：Ｔ）比でＰ１−１の形質導入されたＴ細胞と共にインキュベートした。Ｐ１−１は、Ｔ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２依存的に低いＥ：Ｔ比で標的細胞を効果的に殺滅することを可能とする。
【図７Ａ】ＧＰＣ３ ３６７特異的TCR P1-1の移植されたＴ細胞によるＧＰＣ３＋ヒト肝細胞腫細胞の殺滅。ＧＰＣ３＋ＨＬＡ−Ａ２＋ＨｅｐＧ２細胞を、様々なエフェクター標的（Ｅ：Ｔ）比で、Ｐ１−１の形質導入されたＴ細胞と共にインキュベートし、標的細胞の生存率を経時的に測定した。Ｐ１−１は、Ｔ細胞が、低いＥ：Ｔ比で標的細胞を迅速に殺滅することを可能とする。
【図７Ｂ】Ｐ１−１の形質導入されたＴ細胞は、ＧＰＣ３ペプチド３６７の積載されたＴ２細胞と共にインキュベートされた場合に、ペプチド濃度依存的にＩＦＮγを分泌する。
【図８】Ｐ１−１の形質導入されたＴ細胞は、ＧＰＣ３ペプチド３６７の積載されたＴ２細胞と共にインキュベートされた場合、ＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αを特異的に分泌し、脱顆粒マーカーＬＡＭＰ−１を非局在化させるが、偽ペプチドの積載された標的細胞上では起こらない。
【０２３７】
実施例
１．材料及び方法
１．１  ＰＭＢＣ及び細胞株
健康なヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離によって単離した。Ｔ２は、ＩＦＮγ放出アッセイにおいて標的として使用された、ＨＬＡ−Ａ２＋ＴＡＰ欠損ヒトリンパ腫細胞株である。ＬＣＬ−Ｂ２７は、非特異的なＴ細胞再刺激のためのフィーダー細胞株として使用された、ＨＬＡ−Ｂ２７＋Ｂリンパ芽球様細胞株である。ヒト胚性腎臓２９３（２９３Ｔ）細胞は、Ｔ細胞形質導入のためのウイルス上清の産生細胞株として使用された。ＨｅｐＧ２は、殺滅アッセイにおいて標的として使用された、ＨＬＡ−Ａ２及びＧＰＣ３を発現しているヒト肝細胞腫細胞株である。哺乳動物細胞培養を無菌細胞培養条件下で行ない、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２３８】
１．２  培地
全てのＴ細胞培養液を、１０％ヒト血清、４mMのＬ−グルタミン、１００IU/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン、６μg/mlのゲンタマイシン、１mMのピルビン酸ナトリウム、及び１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）の補充されたＲＰＭＩ １６４０培地から構成されるヒトＴ細胞培地（ｈＴＣＭ）に維持した。ヒト血清を、健康なドナーから本発明者らの研究室において単離した。樹状細胞培養液を、１．５％ヒト血清、１００IU/mlのペニシリン、及び１００μg/mlのストレプトマイシンの補充された非常に低い内毒素のＲＰＭＩ １６４０培地からなるＤＣ培地に維持した。ＬＣＬ及びＴ２細胞を、１０％ウシ胎児血清、４mMのＬ−グルタミン、１００IU/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン、１mMのピルビン酸ナトリウム、及び１×ＮＥＡＡの補充されたＲＰＭＩ １６４０に維持した。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎児血清、４mMのＬ−グルタミン、１００IU/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン、１mMのピルビン酸ナトリウム、及び１×ＮＥＡＡの補充されたＤＭＥＭ培地に維持した。
【０２３９】
１．３  サイトカイン、ペプチド多量体、及び抗体
組換えヒトＩＬ−４及びＩＬ−６をGellGenixから入手した。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＰＧＥ２、及びＩＬ−２を、それぞれ、Genzyme、Promokine、Peprotech、Miltenyi Biotec、R&D、Pfizer及びNovartisから購入した。ＧＰＣ３（３６７：FIDKKVLKV；３２６: TIHDSIQYV）由来の規定のエピトープを示すＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドはibaによって合成された。ＨＬＡ−Ａ２−ＧＰＣ３多量体は、AG Busch、Institute for Medical Microbiology、Immunology and Hygiene、TU Munic（Knabel et al., 2002）によって作製された。ＭＨＣ−Ｉ多量体の標識のためのStrap-Tactin PEはibaから購入した。抗ヒトＣＤ８抗体−ＡＰＣ、抗ＣＤ８抗体−ＰＥ、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ８３抗体、及び抗ＣＤ８０抗体は、それぞれ、BD、Immunotools、eBioscience及びImmunotechから入手した。ヨウ化プロピジウム（１mg/ml）はRothから入手した。抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）は親切にも、AG Kremmer、Institute for Molecular Immunology、Helmholtz Zentrum Munichによって提供された。
【０２４０】
１．４  Ｔ細胞刺激のための樹状細胞（ＤＣ）の作製
ＤＣを作製するために、健康なＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからのＰＢＭＣをＤＣ培地に再懸濁し、１つの７５cm2ＮＵＮＣ培養フラスコあたり５×１０６個の細胞で播種した。３７℃で１．５時間インキュベートした後、接着していない細胞を、十分な洗浄によって除去した。残留している接着している単球を、１００ng/mlのＧＭ−ＣＳＦ及び２０ng/mlのＩＬ−４を含有している培地中で２４時間培養した。２日目に未成熟なＤＣを、培養液への成熟サイトカイン（１０ng/mlのＴＮＦα、１０ng/mlのＩＬ−１β、１５ng/mlのＩＬ−６、及び１μg/mlのＰＧＥ２）の直接的な添加によって分化させた。ＤＣを、さらに１日間インキュベートし、その後、成熟ＤＣを収集した。成熟は、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ８３抗体、及び抗ＣＤ８０抗体を用いての染色、続いて、フローサイトメトリーＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（BD Biosciences）によって確認された。
【０２４１】
成熟ＤＣに、ＲＮＡ電気穿孔法によってＧＰＣ３及びＨＬＡ−Ａ２をトランスフェクトした。２×１０６個の細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ培地 ２００μlに再懸濁し、ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡ ２５μg及びＧＰＣ３ ＲＮＡ ５０μgと混合した。ＤＣ−ＲＮＡ混合物を０．４cmの電気穿孔用キュベットに入れ、氷上で３分間インキュベートした。電気穿孔を、３００Ｖ及び１５０μＦで指数関数的な電気穿孔プロトコールを使用してGene Pulser Xcell（Bio-Rad）を用いて行なった。ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡ及びＧＰＣ３ ＲＮＡを、mMESSAGE mMACHINE T7キット及びPoly(A) tailingキット（どちらもAmbion）を使用して製造業者の説明書に従ってインビトロ（ivt）で転写した。ＨＬＡ−Ａ２及びＧＰＣ３の発現をフローサイトメトリーを介して評価した。
【０２４２】
１．５  Ｔ細胞の同種拘束性刺激
ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、InvitrogenのDynabeads（登録商標）Untouched（商標）ヒトＣＤ８Ｔ細胞キットを使用してネガティブセレクションを介して全ＰＢＭＣから濃縮した。初代培養液は、２４ウェルの組織培養プレートの１ウェルあたり、ｈＴＣＭ培地 ２ml中に、１×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞、及び１×１０５個のＨＬＡ−Ａ２及びＧＰＣ３ ｉｖｔ−ＲＮＡでパルスされた成熟ＤＣを含有していた。５ng/mlのＩＬ−７を、０日目に直ちに刺激のために加えた。５０IU/mlのＩＬ−２を２日目に加え、その後、３日間毎に加えた。初回刺激されたＴ細胞を、新たに作製されたｉｖｔ−ＲＮＡでパルスされた成熟ＤＣを使用して７日後に再刺激した。
【０２４３】
１．６  多量体の染色及びＴ細胞のクローニング
Ｔ細胞刺激から１４日後、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＧＰＣ３特異的Ｔ細胞を、ＭＨＣ−Ｉ−多量体の染色によって検出した。ＧＰＣ３ ＭＨＣ−多量体を、染色前にstreptactin-PEを用いて標識した。各々の１×１０６個のＴ細胞のために、ＰＥで標識されたＧＰＣ３ ＭＨＣ−多量体 ０．２μgを使用した。Ｔ細胞を、氷上及び暗所で、ＰＢＳ ５０μl＋０．５％ヒト血清中で２０分間、ＰＥで標識されたＧＰＣ３ ＭＨＣ−多量体と共にインキュベートした。ＡＰＣで標識された抗ヒトＣＤ８抗体を加え、さらに２０分間インキュベートし、その後、洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。死滅細胞を、ヨウ化プロピジウム染色によって排除した。選別するために、最大１０×１０６個の細胞を上記のように染色し、FACS Aria選別装置（BD Biosciences）で選別した。選別されたＣＤ８＋ＧＰＣ３ ＭＨＣ−多量体＋Ｔ細胞を、限界希釈によってクローニングした。それ故、０．３ ＣＤ８＋ＧＰＣ３ ＭＨＣ−多量体＋Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレートの１ウェルあたりに播種した。さらに、各ウェルは、ｈＴＣＭ ２００μl中に、１×１０５個の同種ＰＢＭＣ（３５Ｇｙまで照射）、１×１０４個のＬＣＬ−Ｂ２７（５０Ｇｙまで照射）、３０ng/mlのＯＫＴ３、及び５０IU/mlのＩＬ−２からなるフィーダー混合物を含有していた。３７℃で２週間インキュベートした後、増殖中の細胞を含有しているウェルのアリコートを、ＩＦＮ−γ放出アッセイにおいて及び上記のような多量体染色によってそのＧＰＣ３特異性に関して分析した。ＧＰＣ３特異的ＣＤ８＋ＧＰＣ３ ＭＨＣ多量体＋Ｔ細胞をさらに、記載のようなフィーダー混合物を用いての再刺激によって増殖させた。
【０２４４】
１．７  ＩＦＮ−γ放出アッセイ
標的として使用された、Ｔ２細胞に、ＧＰＣ３ペプチド ５μMを１．５時間かけて積載し、その後、Ｔ細胞と共にインキュベートした。２×１０３個のＴ細胞を、１×１０４個のペプチドの積載されたＴ２細胞と共に、丸底９６ウェルプレート中で共インキュベートし、それにより、０．２：１というエフェクターと標的の比が得られた。偽ペプチドの積載されたＴ２細胞と共にインキュベートされたＴ細胞は、陰性対照として作用した。２４時間の共培養後、上清を収集し、標準的な抗ヒトＩＦＮ−γ抗体のＥＬＩＳＡ（BioLegend）によって調べた。
【０２４５】
１．８  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の分析及び反応性ＴＣＲのクローニング
ＧＰＣ３特異的Ｔ細胞クローンのＴＣＲ分析のために、ＲＮＡをトリアゾールを用いてＴ細胞クローンから抽出し、ｃＤＮＡを、superscript II逆転写酵素（Invitrogen）を使用して合成した。α鎖及びβ鎖の可変部分を、ＴＣＲ可変遺伝子セグメントファミリーの９９％を網羅する変性プライマー（表１）を用いて増幅し、続いてアガロースゲルで精製し、ＤＮＡシークエンスにかけた（ＧＡＴＣ）。
【０２４６】
【表４３】
2017522859.tif 000044
【０２４７】
ＧＰＣ３特異的ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の可変部分は、改善された遺伝子発現のためにコドンが最適化され（Geneart）、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位を介してレトロウイルスベクターｐＭＰ７１にクローニングされた。トランスジェニックＴＣＲの対形成を改善するために定常鎖はマウス化され、α鎖及びβ鎖はＰ２Ａ配列を介して連結された。
【０２４８】
１．９  ヒトＰＢＭＣへのレトロウイルスによるＴＣＲの導入
２９３Ｔ細胞に、レトロウイルスプラスミドｐＭＰ７１−ＧＰＣ３−ＴＣＲ ２μg、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｍｏ−ＭＬＶ １μg、ｐＡＬＦ−１０Ａ１ １μgを用いて同時トランスフェクトし、後者は、それぞれｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖについてのレトロウイルス遺伝子を有するプラスミドを示している。トランスフェクションは、標準的なリポフェクタミントランスフェクションプロトコールに従って、リポフェクタミン １０μlを用いて行なわれた。新たに単離されたヒトＰＢＭＣを、抗ＣＤ２８抗体及びＯＫＴ３でコーティングされた２４ウェルプレート上の、３００IU/mlのＩＬ−２の補充されたｈＴＣＭ中で、２日間かけて活性化した。活性化されたＰＢＭＣを２回、３日目と４日目に形質導入した。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のウイルス含有上清を、トランスフェクションから２日後に収集し、RetroNectinでコーティングされた２４ウェル培養プレートに加えた。ウイルスを、３２℃及び２０００ｇで２時間かけて遠心にかけた。遠心分離後、培地を、１００IU/mlのＩＬ−２の補充されたｈＴＣＭ中の１×１０６個の活性化Ｔ細胞／ウェルと交換した。Ｔ細胞を、３２℃で１０分間、１０００ｇで遠心にかけた。２４時間インキュベートした後、培地を、５０IU/mlのＩＬ２を含有している新鮮な培地と交換し、Ｔ細胞をさらに４８時間インキュベートした。形質導入されたＰＢＭＣをＧＰＣ３ ＭＨＣ−多量体の染色によって及び機能的アッセイにおいて複数の時点でアッセイした。
【０２４９】
１．１０  機能的アッセイ
形質導入されたＰＢＭＣを、上記のように様々な標的細胞との共インキュベート後に、そのＩＦＮ−γ分泌能に関して分析した。ペプチド濃度及びエフェクター対標的の比は変化させた。形質導入されたＰＢＭＣの殺滅能を評価するために、細胞を、E-plate 96培養プレート（Roche）上に播種されたＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートした。標的細胞の生存率を経時的にXCelligence（Roche）で測定した。あるいは、cell titre blueアッセイを、共インキュベートの２４時間後に行なった。
【０２５０】
２．結果
２．１  ヒト肝細胞腫細胞のＭＨＣクラスＩ分子上に提示された免疫優性ＧＰＣ３ペプチドの同定
ＧＰＣ３についての免疫優性エピトープはまだ記載されていない。この研究において、本発明者らは、Q Exactive質量分析計とオンラインで連結されたUltra Nano HPLCを使用して、ＧＰＣ３及びＨＬＡ−Ａ２陽性肝細胞腫細胞株から網羅的なＨＬＡクラスＩペプチドームを得た。得られたデータを、MaxQuantバイオインフォマティクスプラットフォームを使用して分析した。ＨＬＡ−Ａ２に結合した２つのＧＰＣ３ペプチドを同定することができ、本明細書において
−ＧＰＣ３ペプチド３６７又はＧＰＣ３３６７又はＧＰＣ３−Ｐ１：
FIDKKVLKV［配列番号１４］
及び、ＧＰＣ３ペプチド３２６又はＧＰＣ３３２６又はＧＰＣ３−Ｐ２：（Komori et al., 2006に記載）
TIHDSIQYV［配列番号１６］と称する。これらの２つのペプチドの知識により本発明者らは、ＧＰＣ３陽性ＨＣＣ細胞上に提示されるＧＰＣ３エピトープを標的化することが可能となる。
【０２５１】
２．２  グリピカン３ｍＲＮＡのインビトロでの産生、及びｍＲＮＡの電気穿孔後の樹状細胞におけるＧＰＣ３の発現
ＧＰＣ３を含有している構築物をクローニングし、これからＧＰＣ３ｍＲＮＡを産生することができる。グリピカン３の発現が、２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後にプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）ＧＰＣ３から示された。樹状細胞の電気穿孔後のこの構築物からのＧＰＣ３の発現を最適化した。本発明者らは、樹状細胞の電気穿孔後にＧＰＣ３を検出することができた。ＧＰＣ３はまた、ＨＬＡ−Ａ２と共に電気穿孔した場合にも発現された。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、少なくとも２４時間安定であった。これに対して、ＧＰＣ３は、電気穿孔から２時間後までしか検出することができず、その後は迅速に分解した。
【０２５２】
２．３  Ｔ細胞の同種拘束性刺激
腫瘍反応性の高い結合力のＴ細胞を単離するために、同種拘束性刺激アプローチ（図３参照）を、Wilde et. al., 2012に記載のように使用した。ナイーブＴ細胞の刺激のために、自己樹状細胞に、ＧＰＣ３及びＨＡＬ−Ａ２ ＲＮＡを同時トランスフェクトし、抗原提示細胞として使用した。ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーのナイーブＴ細胞レパートリーからのＴ細胞を、これらのＨＬＡ−Ａ２＋ＧＰＣ３＋ＤＣと共に培養し、その上で増殖させた。２週間後、両方の標的化されたＧＰＣ３エピトープに対して特異的なＭＨＣストレプタマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した（１％未満）。本発明者らは、これらの細胞集団を、さらに５７％のＧＰＣ３−Ｐ１−ＭＨＣストレプタマー陽性Ｔ細胞株及び３５％のＧＰＣ３−Ｐ２−ＭＨＣストレプタマー陽性Ｔ細胞株まで強化することができ、それらからＴ細胞クローンを増殖させた。ＧＰＣ３−Ｐ１／−Ｐ２ペプチドの積載されたＴ２細胞との共培養において、本発明者らは、ＩＦＮγ分泌によって特定のエフェクター機能を示しているＴ細胞クローンを同定した（図４参照）。特定のエフェクター機能は、ＩＦＮγ及びＴＮＦαについての細胞内サイトカイン染色で確認することができた。さらに、Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−Ａ２＋ＧＰＣ３＋肝細胞腫細胞（ＨｅｐＧ２）と共に培養した場合にＩＦＮγを分泌した。機能的なＴ細胞クローンは、強力なＧＰＣ３とＭＨＣとストレプタマーの結合を示した。
【０２５３】
２．４  ペプチドＧＰＣ３３６７に対して特異的なＴ細胞
本発明者らは、本発明者らのＴ細胞クローンからＧＰＣ３ペプチド３６７に対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定しクローニングした。このＴＣＲはまたＰ１−１とも称される。Ｐ１−１のα鎖及びβ鎖の可変部分をコードしているＴ細胞受容体配列は、Ｔ細胞へのウイルスによる導入後に発現レベルを高めるためにコドンが最適化された。さらに、内因性ＴＣＲ鎖との誤った対形成を回避し、したがって、最適な発現を確実とするために、定常ドメインをマウス定常ドメインと交換した（図５参照）。
【０２５４】
この最適化されたＧＰＣ３特異的ＴＣＲの移植されたＴ細胞は、強力なＧＰＣ３とＭＨＣとストレプタマーの結合を示した。ＧＰＣ３ペプチドの積載された標的細胞又はＧＰＣ３を発現している肝細胞腫細胞株（ＨｅｐＧ２）と共に培養した場合、ＧＰＣ３ ＴＣＲの形質導入されたＴ細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、及び脱顆粒マーカーＬａｍｐ−１を分泌した（図６Ａ参照、データは示されていない）。さらに、細胞傷害性は、ＨｅｐＧ２細胞の最大６０％の殺滅によって観察された（図６Ｂ参照）。
【０２５５】
前記の明細書、特許請求の範囲、及び／又は添付の図面に開示された特徴は、別々に及びそのいずれかの組合せの両方において、その多様な形態で本発明を実現するための材料であり得る。
【０２５６】
参考文献
【表４４】
2017522859.tif 000045
2017522859.tif 000046
【図１Ａ】
2017522859.tif 000047
【図１Ｂ】
2017522859.tif 000048
【図１Ｃ】
2017522859.tif 000049
【図１Ｄ】
2017522859.tif 000050
【図１Ｅ】
2017522859.tif 000051
【図１Ｆ】
2017522859.tif 000052
【図１Ｇ】
2017522859.tif 000053
【図１Ｈ】
2017522859.tif 000054
【図１Ｉ】
2017522859.tif 000055
【図１Ｊ】
2017522859.tif 000056
【図２】
2017522859.tif 000057
【図３】
2017522859.tif 000058
【図４】
2017522859.tif 000059
【図５】
2017522859.tif 000060
【図６】
2017522859.tif 000061
【図７Ａ】
2017522859.tif 000062
【図７Ｂ】
2017522859.tif 000063
【図８】
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【配列表】
2017522859000001.app
【国際調査報告】
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2017522859.tif 000066
2017522859.tif 000067
2017522859.tif 000068
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