(57)【要約】センサー基質上にビーズを装填する方法は、ビーズを含む懸濁液をセンサー基質上に画定されたフローセルに適用することを含む。センサー基質は複数のウェルを含む。ビーズは少なくとも部分的に複数のウェル内へ堆積する。方法はまた、フローセルから液体を取り除くことと、例えばフローセルを通して空気を抜くことによって、フローセルから液体を蒸発させることと、水和溶液を前記フローセルに適用することと、を含む。特定の実施例では、ウェルを含むセンサー基質上にビーズを堆積させる前に、ビーズを核酸と複合させる。【選択図】図４
2017522049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センサー基質上にビーズを装填する方法であって、
センサー基質上に画定されたフローセルにビーズを含む懸濁液を適用することであって、前記センサー基質が複数のウェルを含み、前記ビーズが少なくとも部分的に前記複数のウェルの中に堆積し、
前記フローセルから液体を取り除くことと、
前記フローセルから液体を蒸発させることと、
前記フローセルへ水和溶液を適用することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記懸濁液を適用することが、前記ビーズの存在下で前記センサー基質を遠心分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フローセルから前記液体を取り除く前に、前記フローセルを通して、かつ前記センサー基質上に１つ以上の泡を流動させることを更に含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記フローセルから液体を蒸発させることが、少なくとも１５秒間かつ３０分よりも短い期間、前記フローセルを通して気体を抜くことを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記フローセルから液体を蒸発させることが、１００μＬ／分〜１００ｍＬ／分の範囲内の速度で、前記フローセルを通して気体を抜くことを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記センサー基質上に凝縮溶液を適用することを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記凝縮溶液を適用することが、前記フローセルを通して気体を抜いた後に前記凝縮溶液を適用することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記凝縮溶液を適用することが、前記フローセから液体を蒸発させる前に前記凝縮溶液を適用することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記凝縮溶液が凝縮剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記凝縮剤がマグネシウム、ポリエチレングリコールポリマー、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記フローセルを通して、かつ前記センサー基質上に酵素溶液を適用することを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素溶液を適用後に、前記フローセルから液体を取り除くことと、前記フローセルから液体を蒸発させることとを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記センサー基質が半導体配列決定デバイスを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記半導体配列決定デバイスがｐＨセンサーのアレイを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記半導体配列決定デバイスを使用して、配列決定することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビーズがヒドロゲルビーズを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
センサー基質上にビーズを装填する方法であって、
センサー基質上に画定されたフローセルに核酸ビーズを含む懸濁液を適用することであって、前記センサー基質が複数のウェルを含み、前記ビーズが少なくとも部分的に前記複数のウェルの中に堆積する、適用することと、
気／液界面が前記フローセルを通して、かつ前記センサー基質の上を流動させることと、
少なくとも１５秒間かつ３０分よりも短い期間、１００μＬ／分〜１００ｍＬ／分の範囲内の速度で、前記フローセルから液体を蒸発させることと、
前記フローセルを通して凝縮溶液を適用することと、を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記凝縮溶液がマグネシウム塩及びポリエチレングリコールポリマーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記気／液界面を流動させることが、前記フローセルを通して気泡を流動させることを含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記凝縮溶液を適用後に、前記フローセルを通して酵素溶液を適用することを更に含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は分子生物学の分野を対象とし、具体的には核酸及びタンパク質アレイを含む表面上におけるサンプルの改善された装填及び保持を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質等の生体分子を分析するための様々な技術は、それぞれがそのような生体分子に付着する分子のアレイの堆積に依存する。例示的配列決定技術は、ポリヌクレオチド、またはその複製物を含む分子のアレイの、ウェルアレイ内の堆積に依存する。特定の例では、分子またはビーズを特定のセンサーに結合させるため、またこれらの生体分子を分析するための局所環境を提供するために、ウェル内に分子またはビーズを堆積させることができる。他の例では、分子の整列したアレイが表面上に堆積され、ウェルの恩恵なしに分析される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
例示的実施形態において、センサー基質上にビーズを装填する方法は、センサー基質上に画定されるフローセルにビーズを含む懸濁液を適用することを含む。センサー基質は複数のウェルを含む。ビーズは少なくとも部分的に複数のウェル内へ堆積される。また、本方法はフローセルから液体を取り除くことと、フローセルから液体を蒸発させることと、水和溶液をフローセルに適用することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
添付の図面を参照することによって、本開示をよりよく理解することができ、その多くの特徴及び利点が当業者に明らかになる。
【０００５】
【図１】標的ポリヌクレオチドを分析するための例示的方法のブロック流れ図を含む。
【図２】標的ポリヌクレオチドを分析するための例示的方法の図解を含む。
【図３】装填のための例示的方法を例証するブロック流れ図を含む。
【図４】装填のための例示的方法の図解を含む。
【図５】装填のための例示的方法の図解を含む。
【図６】配列決定のための例示的システムの例証図を含む。
【図７】ビーズの堆積後の装置表面の画像を含む。
【図８】堆積するビーズの輝度比を例証するグラフを含む。
【０００６】
異なる図面内での同じ参照記号の使用は、同様または同一の項目を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
例示的実施形態では、センサー基質上にビーズを装填する方法は、センサー基質上に画定されるフローセルにビーズを含む懸濁液を適用することを含む。センサー基質は複数の反応位置を含む。例示的反応位置はウェル、チャネル、溝、穴、小さなくぼみ、柱のセット、または他の類似した機能構造を含む。ビーズは少なくとも部分的に複数の反応位置内へ堆積される。また、この方法はフローセルから液体を取り除くことと、フローセルから液体を蒸発させることと、水和溶液をフローセルに適用することとを含む。ビーズを核酸またはタンパク質等の生体分子に複合することができる。ビーズはヒドロゲルビーズであることができる。実施例では、センサー基質は半導体配列決定装置であることができる。
【０００８】
特定の実施例では、ウェルを含むセンサー基質上にビーズを堆積させる前に、ビーズを核酸と複合させる。図１に例証される通り、１０２に例証されるように、方法１００はビーズまたは分子、増幅試薬、及び標的ポリヌクレオチドを増幅溶液に組み合わせることを含む。特に、ビーズ板を親水性ポリマーで形成することができる。実施例では、ビーズは電荷を帯びることができる。代替として、ビーズは中性であることができる。
【０００９】
例えば、ビーズをラジカル重合性モノマーを含むモノマー、例えばビニル系モノマーで形成することができる。実施例では、モノマーはアクリルアミド、酢酸ビニル、メタクリル酸ヒドロキシアルキル、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。特定の実施例では、親水性モノマーはアクリルアミド、例えばヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、またはそれらの組み合わせを含むアクリルアミドである。実施例では、親水性モノマーはアミノアルキルアクリルアミド、アミン末端ポリプロピレングリコール（以下に示すＤ）で官能化されたアクリルアミド、アクリロピペラジン（以下に示すＣ）、またはそれらの組み合わせである。別の実施例では、アクリルアミドはヒドロキシアルキルアクリルアミド、例えばヒドロキシエチルアクリルアミドであることができる。特に、ヒドロキシアルキルアクリルアミドは、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル）アクリルアミド（以下に示すＡ）、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（以下に示すＢ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。更なる実施例では、モノマーの混合物、例えばヒドロキシアルキルアクリルアミドとアミン官能性アクリルアミドの混合物、またはアクリルアミドとアミン官能性アクリルアミドの混合物を使用することができる。実施例では、１００：１〜１：１の範囲、例えば１００：１〜２：１の範囲、５０：１〜３：１の範囲、５０：１〜５：１の範囲、または、更に、５０：１〜１０：１の範囲のヒドロキシアルキルアクリルアミド対アミン官能性アクリルアミド比、またはアクリルアミド対アミン官能性アクリルアミド比で、アミン官能性アクリルアミドを含むことができる。
【化１】
2017522049.tif 000003
【化２】
2017522049.tif 000004
【化３】
2017522049.tif 000005
【化４】
2017522049.tif 000006
【００１０】
特定の実施例では、ビーズはヒドロゲルビーズである。
【００１１】
ビーズのそれぞれは、鋳型ポリヌクレオチドがハイブリッド形成することができるカップリング部位を含むことができる。例えば、カップリング部位はそれぞれ、鋳型ポリヌクレオチドの断片に相補的なカップリングオリゴヌクレオチドを含むことができる。鋳型ポリヌクレオチドは、カップリングオリゴヌクレオチドに相補的なセグメントに加え、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドに相補的なセグメントを含むことができる。
【００１２】
カップリングオリゴヌクレオチドはビーズと複合させることができる。ビーズのポリマーを活性化し、標的検体、例えばオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの複合を促進することができる。例えば、ビーズの官能基を増強し、標的検体または検体受容体と結合することを可能にすることができる。特定の実施例では、親水性ポリマー官能基を求核または求電子置換を受けることができる反応性部分に変換することができる試薬で、親水性ポリマーの官能基を変性させることができる。例えば、ヒドロキシル基の少なくとも一部をスルホン酸基または塩素と置き換えることによって、基質上のヒドロキシル基を活性化させることができる。例示的なスルホン酸基は、トレシル、メシル、トシル、もしくは塩化フォシル、またはそれらの任意の組み合わせから得ることができる。スルホン酸塩は、求核試薬がスルホン酸塩を置き換えることを可能にするように機能することができる。スルホン酸塩は更に、遊離塩素と反応して塩化された基を提供することができ、その塩化された基を、ビーズを複合するプロセス中で使用することができる。別の実施形態では、ビーズ上のアミン基を活性化させることができる。
【００１３】
例えば、標的検体または検体受容体は、スルホン酸基との求核置換を通して、親水性ポリマーに結合することができる。特定の実施例では、標的検体受容体は、求核試薬、例えばアミンまたはチオールで最終処理され、求核置換を受けて、ビーズの表面上のスルホン酸基を置き換えることができる。
【００１４】
別の実施例では、スルホン化ビーズを更に、モノ−、または多官能性モノ−、もしくは多求核性の試薬と反応させることができ、それらはビーズへの付着を形成しながら、求核活性を維持することができ、これによって、オリゴヌクレオチドがマレイミド等の求電子基を含むことができる。その上、多求電子基を含む試薬に付着することによって、残留求核活性を求電子活性に変換することができ、続いて、この多求電子基は、求核基を含むオリゴヌクレオチドに付着することができる。
【００１５】
別の実施例では、モノマーは官能基を含み、重合中に添加可能である。モノマーは、例えば、カルボン酸、エステル、ハロゲン、または他のアミン反応基を含むアクリルアミドを含むことができる。アミン末端オリゴヌクレオチドと反応する前に、エステル基を加水分解することができる。
【００１６】
他の複合技術は、アミンを含むモノマーの使用を含む。アミンは、アミン反応性二官能性ビス−求電子試薬で更に変性することができる求核基であり、この試薬はモノ−官能性求電子基をもたらし、続いて、この単官能性求電子基はビーズに付着する。そのような求電子基を、求核基、例えば、アミンまたはチオール等を有するオリゴヌクレオチドと反応させ、これによって、空位求電子剤との反応によりオリゴヌクレオチドを付着させることができる。
【００１７】
ビーズを、アミノ−ヒドロキシル−アクリルアミドとヒドロキシル−アクリルアミドとの組み合わせから調製する場合、ビーズは、求核アミノ基と中性ヒドロキシル基との組み合わせを含むことができる。アミノ基を、ジイソシアネートまたはビス−ＮＨＳエステル等の二官能性ビス−求電子部分で変性することができ、その結果、親水性分子が求核試薬と反応する。例示的なビス−ＮＨＳエステルは、ビス−スクシンイミジルスベリン酸塩またはビス−スクシンイミジルグルタル酸等の、ビス−スクシンイミジルＣ２−Ｃ１２アルキルエステルを含む。
【００１８】
他の活性化化学は、特定の官能基を変換して特定の所望の連鎖を適応させるための複数のステップを組み込むことを含む。例えば、いくつかの方法によって、スルホン酸塩で変性されたヒドロキシル基を求核基に変換することができる。実施例では、スルホン酸塩がアジドアニオンと反応して、アジド置換された親水性ポリマーをもたらす。アジドを直接使用して、「クリック」化学を介してアセチレン置換された生体分子に複合させることができるが、この「クリック」化学は、銅触媒を使用して、または使用せずに、実行可能である。任意に、例えば、水素を用いた触媒還元、または有機ホスフィンを用いた還元によって、アジドをアミンに変換することができる。次いで、その結果生じたアミンを、ジイソシアネート、ビス−ＮＨＳエステル、塩化シアヌル、またはそれらの組み合わせ等の様々な試薬を用いて、求電子基に変換することができる。実施例では、ジイソシアネートを使用することによってポリマーとリンカーとの間に尿素連鎖がもたらされ、それによって残留イソシアネート基がもたらされ、この残留イソシアネート基は、アミノ置換された生体分子と反応して、リンカーと生体分子との間に、尿素連鎖をもたらすることができる。別の実施例では、ビス−ＮＨＳエステルを使用することによってポリマーとリンカーと残留ＮＨＳエステル基との間にアミド連鎖がもたらされ、この残留ＮＨＳエステル基は、アミノ置換された生体分子と反応して、リンカーと生体分子との間に、アミド連鎖をもたらすることができる。更なる実施例では、塩化シアヌルを使用することによってポリマーとリンカーと２つの残留クロロ−トリアジン基との間にアミノ−トリアジン連鎖がもたらされ、これら２つの残留クロロ−トリアジン基のうちの１つは、アミノ置換された生体分子と反応して、リンカーと生体分子との間にアミノ−トリアジン連鎖をもたらすることができる。スルホン酸塩を活性化させることによって、他の求核基を分子内に組み込むことができる。例えば、スルホン酸化した分子がチオ安息香酸アニオンと反応し、その結果生じたチオ安息香酸を加水分解することによって、チオールを分子内に組み込み、続いて、そのチオールが、マレイミド置換された生体分子と反応してチオ−スクシンイミド連鎖を生体分子にもたらすことができる。また、チオールは、ブロモ−アセチル基と反応することもできる。
【００１９】
代替として、アクリダイトオリゴヌクレオチドを重合中に使用して、オリゴヌクレオチドを組み込むことができる。例示的なアクリダイトオリゴヌクレオチドは、イオン交換されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００２０】
図１を参照すると、ポリメラーゼまたはリコンビナーゼを含む酵素、ヌクレオチド（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはそれらの類似体）、様々な塩もしくはイオン化合物、またはそれらの組み合わせ等の増幅試薬と共に、ビーズを増幅溶液へ組み込むことができる。特に、生物源から得られるポリヌクレオチド等の標的ポリヌクレオチドが増幅溶液に含まれる。
【００２１】
１０４に例証されるように、分散相として増幅溶液を含む乳濁液を形成する。特に、増幅溶液は水溶液であり、油相等の疎水相中に分散することができる。疎水相はフッ素化液、鉱物油、シリコーンオイル、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。任意に、疎水相は界面活性剤、例えば以下に記載の非イオン性界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を含むことができる。
【００２２】
乳濁液を膜組織に基づく機構を利用して形成することができ、その機構において水溶性増幅溶液及び連続相の疎水性液体を１度以上膜組織に通過させ、増幅溶液の液滴を連続相の疎水性液体内で形成する。代替として、疎水性液体の存在下で、増幅溶液を撹拌することによって乳濁液を形成することができる。別の実施例では、ピペットチップを通して増幅溶液及び疎水性連続相を、繰り返し吸引し排出することによって乳濁液を形成することができる。更なる実施例において、水溶性増幅溶液の液滴を疎水性液体の流れへ注入することができる。
【００２３】
増幅溶液の乳化後、分散相を形成する増幅溶液の液滴は、ビーズ及び標的ポリヌクレオチドを含むことができる。液滴の一部は１つ以上のビーズ及び単一標的ポリヌクレオチドを含むことができる。他の液滴はビーズを含み、ポリヌクレオチドを含まなくてもよい。他の液滴は１つ以上のビーズ及び１つよりも多い標的ポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２４】
例えば、図２に例証されるように、水溶性増幅溶液２２２は標的ポリヌクレオチド２０２及びビーズ２０４を含む。乳化後、乳濁液２２４のいくらかの液滴２０６は、単一標的ポリヌクレオチド及び１つ以上のビーズを含むことができる。乳濁液２２４の他の液滴２０８はビーズを含み、標的ポリヌクレオチドを含まなくてもよい。
【００２５】
図１を参照すると、１０６に例証されるように、核酸ビーズを提供するために増幅反応を実施することができる。核酸ビーズはビーズと核酸の複合された複製物とを含む。増幅反応の条件は要素、例えば数ある要素の中でも、増幅溶液に使用される酵素の性質、個々のヌクレオチドの濃度、塩またはイオン化合物の濃度に依存することができる。実施例では、増幅反応は温度が４０℃〜１００℃の範囲内で複数回循環するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。別の実施例では、増幅反応はレコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）である。そういった反応を４０℃〜９０℃の範囲内の温度で等温的に実施することができる。他の増幅技術、例えば、ポリメラーゼ循環アセンブリ（ＰＣＡ）、非対称性ＰＣＲ、ヘリカーゼ依存型増幅、連結媒介型ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ナノ粒子補助ＰＣＲ、または他の増幅技術を使用することができる。
【００２６】
実施例では、増幅中、対象とする標的配列及びカップリングオリゴヌクレオチドに相補的なセグメントを含む鋳型ポリヌクレオチドが、カップリングオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。カップリングオリゴヌクレオチドが延長し、鋳型ポリヌクレオチドに対する相補体を形成する。鋳型ポリヌクレオチドは、増幅しない基質から増幅した基質の後の分離のために、分離基質と結合するのに有用な捕捉部分を更に含むことができる。
【００２７】
増幅の結果として、標的ポリヌクレオチド及びビーズを含む分散相の液滴は、ビーズに複合された標的ポリヌクレオチドの１つ以上の複製物を含む核酸ビーズを生成する。それに対して、ビーズを含み、標的ポリヌクレオチドを欠く液滴は、標的ポリヌクレオチドの複製物を含むビーズを生成せず、本明細書において非増幅ビーズと称される。
【００２８】
１０８に例証されるように、乳濁液を破壊（ｂｒｅａｋ）し、核酸ビーズを回収し、それによって分散相の液体を連続相から分離する。例えば、破壊溶液（ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）上に乳濁液を適用することができ、任意で撹拌または遠心分離することができる。特に、破壊溶液を通して乳濁液を遠心分離することは、破壊溶液と乳濁液の連続相液との間の界面から破壊溶液へビーズを押し流す。破壊溶液は親水性液体、例えば界面活性剤を含む水溶液になることができ、その水溶液は増加する表面張力を助長し、連続相から分散相を分離する。
【００２９】
実施例では、破壊溶液は０．０１重量％〜２０重量％の範囲内の全濃度を有する１つ以上の界面活性剤を含むことができる。例えば、界面活性剤は０．１重量％〜１５．０重量％の範囲内の量、例えば０．５重量％〜１０．０重量％の範囲、０．５重量％〜５．０重量％の範囲、また更に０．５重量％〜３重量％の範囲で含むことができる。別の実施例では、界面活性剤は５．０％〜２０．０％の範囲内の総量、例えば１０．０％〜２０．０％の範囲、１２．０％〜１８．０％の範囲を含むことができる。
【００３０】
界面活性剤はイオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、またはそれらの組み合わせであることができる。イオン性界面活性剤はアニオン性界面活性剤であることができる。例示的アニオン性界面活性剤は、エステル系界面活性剤、スルホン酸塩界面活性剤、リン酸エステル界面活性剤、カルボキシレート界面活性剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的エステル系界面活性剤は、ドデシル硫酸、ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム、（ＳＤＳ））、またはそれらの組み合わせ等のアルキル硫酸、ラウレス硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウム、もしくはそれらの任意の組み合わせ等のアルキルエーテル硫酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的スルホン酸塩界面活性剤はドデシルスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸アルキル、またはジオクチルソジウムスルホサクシネート等のドクサート、アルキルベンジルスルホン酸（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸またはその塩）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的リン酸エステル界面活性剤はアルキルアリールエーテルリン酸、アルキルエーテルリン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的カルボン酸系界面活性剤は、脂肪酸塩またはステアリン酸ナトリウム等のアルキルカルボン酸塩、ラウロイルサルコシネートナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等の胆汁酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００３１】
別の実施例では、イオン性界面活性剤はカチオン界面活性剤であることができる。例示的カチオン界面活性剤は一級、二級、または三級アミン、四級アンモニウム界面活性剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的四級アンモニウム界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）または塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、セチルピリジニウム塩化物（ＣＰＣ）、牛脂アミンポリエトキシレート（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、ベンゼトニウム塩化物（ＢＺＴ）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＯＤＡＢ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００３２】
例示的両性界面活性剤は一級、二級、または三級アミン、もしくはスルホン酸、カルボン酸塩、またはリン酸アニオンを有する第四アンモニウムカチオンを含む。例示的スルホネート両性界面活性剤は（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン等のスルタイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的カルボン酸塩両性界面活性剤はアミノ酸、イミノ酸、ベタイン、例えばコカミドプロピルベタイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。例示的リン酸塩型両性界面活性剤はレシチンを含む。
【００３３】
別の実施例では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール系界面活性剤、アルキルピロリジン界面活性剤、アルキルイミダゾリジノン界面活性剤、アルキルモルホリン界面活性剤、アルキルイミダゾール界面活性剤、アルキルイミダゾリン型界面活性剤、またはそれらの組み合わせであることができる。特定の実施例では、ポリエチレングリコール系界面活性剤はポリエチレングリコールエーテル、例えばアルキルフェノールポリエトキシレートを含む。別の実施例では、非イオン性界面活性剤は非イオン性フッ素系界面活性剤、例えばエトキシル化フルオロカーボンを含む。更なる実施例において、表面活性剤溶液はオクチルピロリジンを含むことができる。
【００３４】
特に、表面活性剤溶液はそのような界面活性剤の組み合わせを含むことができる。例えば、表面活性剤溶液は、アニオン性界面活性剤を有する非イオン性界面活性剤の組み合わせを含むことができる。特定の実施例では、表面活性剤溶液は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコールエーテル、アルキルピロリジン、または非イオン性フッ素系界面活性剤と、アニオン性界面活性剤、例えばＳＤＳであるエステル系界面活性剤とを含むことができる。特に、表面活性剤溶液はイオン性界面活性剤、例えばアニオン性界面活性剤を０．１％〜２０．０％の範囲内の量、例えば１．０％〜１５．０％の範囲、５．０％〜１５．０％の範囲、または８．０％〜１２．０％の範囲で含むことができる。更に、表面活性剤溶液は非イオン性界面活性剤、例えばアルキルピロリジン（例えば、オクチルピロリジン）を０．０１％〜１０．０％の範囲内、例えば０．０５％〜８．０％の範囲、または１．０％〜６．０％の範囲で含むことができる。別の実施例では、表面活性剤溶液は０．０５％〜３．０％の範囲内の非イオン性界面活性剤を含むことができる。
【００３５】
図２を参照すると、破壊する乳濁液後、残存する水溶液２２６は核酸ビーズ２１０を含む。核酸ビーズ２１０は、標的ポリヌクレオチド２１４の複数の複製物に複合するビーズ２１２を含むことができる。また、溶液は標的ポリヌクレオチドの複製物を含まないビーズ２１２を含むことができ、そのビーズは本明細書において非増幅ビーズと称される。
【００３６】
図１を参照すると、１１０に例証されるように、核酸ビーズを洗浄しかつ濃縮する。実施例では、遠心分離を使用してビーズをペレット化することができ、かつ過剰な溶液を傾瀉することができ、またはペレット化したビーズ上から抜くことができる。別の実施例では、核酸ビーズを固定するために使用する分離基質に核酸ビーズを付着することができ、一方で核酸ビーズの周囲の水溶液を置換する。
【００３７】
例えば、図２に例証されるように、核酸ビーズ２１０は分離基質２２０によって得ることができる。それに対して、ポリヌクレオチドの複製物を含まない非増幅ビーズ２１２は、分離基質２２０に容易に付着しない。したがって、分離基質２２０を固定し、付着した核酸ビーズ２１０を固定するとき、固定しない非増幅ビーズを溶液から実質的に洗浄する。特定の例において、分離基質２１４は磁場を使用して容器壁に固定することができる磁性体基質である。それから、核酸ビーズ２１０は主に核酸ビーズと実質的にわずかな非増幅ビーズとを有する溶液を提供する分離基質２２０から分離することができる。
【００３８】
特定の実施例では、核酸ビーズ２１０は分離基質２２０上の成分と相互作用する捕捉部分を含むことができる。非増幅ビーズは実質的に捕捉部分を有さないことができる。例えば、鋳型ポリヌクレオチドは捕捉部分を用いて最終処理をすることができる。鋳型ポリヌクレオチドにハイブリッド形成しない非増幅ビーズは捕捉部分を欠き、したがって分離基質と結合しない。一旦核酸ビーズ２１０が非増幅ビーズから分離すると、例えば核酸ビーズ２１０に複合し延長したカップリングオリゴヌクレオチドから、鋳型ポリヌクレオチドを融解または剥離することによって、核酸ビーズ２１０を分離基質から分離することができる。
【００３９】
図１を参照すると、１１２に例証されるように、バイオセンサー上に濃縮された核酸ビーズを装填することができる。バイオセンサーの性質次第では、バイオセンサーは核酸ビーズが上に付着する表面を提供することができる。その表面は平坦であることができ、かつ任意で核酸ビーズに対してより誘引性がある部分、または核酸ビーズを固定するために改変された部分を含むことができる。別の実施例では、バイオセンサーは分離部分または模様面、例えば小さなくぼみ、くぼみ、細孔、ウェル、リッジ、または核酸ビーズが整列するチャネルを含む表面を含むことができる。更なる実施例では、図２に例証されるように、バイオセンサーは核酸ビーズ２１０が堆積するウェル２１８を画定する表層構造２１６を含むことができる。
【００４０】
特定の実施例では、ウェルをセンサー上に画定する。ウェルの壁またはセンサーは金属、半金属、それらの酸化物、それらの窒化物、またはそれらの組み合わせから形成された表面を有することができる。実施例では、半金属、例えばケイ素、それらの酸化物、例えば二酸化ケイ素、それらの窒化物、例えば窒化ケイ素、またはそれらの組み合わせでウェルの壁を形成することができる。別の実施例では、少なくとも部分的に金属または金属酸化物でウェルの壁を形成することができる。例示的金属はチタン、タングステン、タンタル、ハフニウム、アルミニウム、ジルコニウム、亜鉛、またはそれらの組み合わせを含む。そのような金属の酸化物または窒化物、例えば、数ある中でも酸化チタン、酸化タンタル、酸化ハフニウム、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、窒化チタン、またはそれらの組み合わせでウェルの壁の一部を形成することができる。更に、ウェルの底面を形成するセンサーは金属、金属酸化物、もしくは窒化金属面、またはそれらの組み合わせを有することができる。例示的金属はチタン、タングステン、タンタル、ハフニウム、アルミニウム、ジルコニウム、もしくは亜鉛、またはそれらの組み合わせを含む。例示的金属酸化物または窒化物は、数ある中でも酸化チタン、酸化タンタル、酸化ハフニウム、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、窒化チタン、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４１】
特定の実施例では、ウェルの壁またはセンサーの表面は、例えば、８〜２０ＯＨ／ｎｍ２の範囲内、例えば８〜１６ＯＨ／ｎｍ２の濃度で、ヒドロキシル基を有することができる。任意で、硫酸塩、リン酸塩、または化合物を含むシランを用いて表面を処理することができる。化合物はウェルの壁の表面、またはセンサーに属するＯＨ基の少なくとも一部に結合することができる。特定の実施例では、化合物は、化合物を含むシラン、例えばブチルアンモニウムトリメトキシシラン（ＢＡＴＳ）または化合物を含むホスホン酸、例えば（１−メチル−３−（ドデシルホスホコリン酸）イミダゾリウム臭化物）（ＩｍＰＡ）であるイミダゾールアルキルホスホン酸を含む。
【００４２】
図１の１１４に例証されるように、バイオセンサーは核酸ビーズの態様を感知することができる。バイオセンサーの性質次第では、標的ポリヌクレオチド内の特定の配列の存在を検出するためにセンサーを利用することができ、または標的ポリヌクレオチドを配列決定するために使用することができる。例えば、バイオセンサーは蛍光ベースの統合による配列決定を利用することができる。別の実施例では、バイオセンサーはヌクレオチド取り込みの副生成物、例えばｐＨもしくはピロリン酸またはリン酸塩の存在を感知することを含む配列決定のための技術を利用することができる。更なる実施例では、バイオセンサーは温度または熱検知を利用することができる。
【００４３】
図２を参照すると、実施例では、ウェルのアレイのウェル２１８を作動的に測定装置に連結することができる。例えば、蛍光発光方法において、ウェル２１８は光検知デバイスに作動的に連結され得る。イオン検出の場合において、ウェル２１８の下面を電界効果トランジスタ等のイオンセンサーのセンサーパッド上に配置することができる。
【００４４】
ヌクレオチド取り込みのイオン性副生成物の検出を通して配列決定に関与する一例示的システムは、ヌクレオチド取り込みの副生物として生成された水素イオンを検出することによって、鋳型核酸を配列するイオンを基にした配列決定システム等の半導体配列プラットホームを含む。典型的には、水素イオンを、ポリメラーゼによる鋳型依存性核酸の合成中に発生するヌクレオチド組み込みの副生成物として放出する。そのようなシーケンサーは、ヌクレオチド組み込みの水素イオン副生成物を検出することによって、ヌクレオチド組み込みを検出する。そのようなシーケンサーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドを含むことができ、それらの鋳型ポリヌクレオチドを配列決定し、それぞれの鋳型をアレイ内のそれぞれの配列決定反応ウェル内に配置する。アレイのウェルをそれぞれ、少なくとも１つのイオンセンサーに連結することができ、そのイオンセンサーは、Ｈ＋イオンの放出、またはヌクレオチド組み込みの副生成物として生成された溶液のｐＨの変化を検出することができる。イオンセンサーは、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を含み、このトランジスタはイオン感応検出層に連結し、この層は、Ｈ＋イオンの存在、または溶液のｐＨの変化を感知することができる。イオンセンサーは、電圧の変化として示すことができるヌクレオチド組み込みを示す出力信号を提供することができ、その変化の大きさは、それぞれのウェルまたは反応チャンバ内のＨ＋イオン濃度と相関する。複数の種類のヌクレオチドを、反応チャンバ内に順次流入させることができ、ポリメラーゼを用いて延長するプライマー（または重合サイト）に、鋳型の配列によって決定された順序で組み込むことができる。反応ウェル内のＨ＋イオンを放出させると同時に、局所ｐＨを変化させることによって、それぞれのヌクレオチド組み込みを達成することができる。センサーのＦＥＴでＨ＋イオンの放出を記録することができ、そのセンサーはヌクレオチド組み込みの発生を示す信号を生成する。特定のヌクレオチド流中に組み込まれなかったヌクレオチドは、信号を生成し得ない。また、ＦＥＴからの信号の振幅も、延長する核酸分子内に組み込まれる特定の種類のヌクレオチドの数と相関し得、それによってホモポリマー領域の解明を可能にする。したがって、シーケンサーの動作中、反応チャンバ内への複数のヌクレオチド流、ならびに多数のウェルまたは反応チャンバにわたる組み込みの観察によって、機器が多数の核酸拡散鋳型の配列を同時に解明することが可能になる。
【００４５】
特定の実施例では、バイオセンサーはセンサー基質及びセンサー基質上に画定されたフローセルを含む。核酸ビーズをセンサー基質に適用し、センサー基質のウェル内へ堆積することができる。フローセルを通して流動する気体にビーズを曝露することができ、任意で凝縮試薬に曝露し、かつ配列決定システム等のバイオセンサーを利用する検出システムに適用する前に付加的処理を受ける。例えば図３に例証される通り、方法３００は、３０２に例証されるようにビーズをセンサー基質に適用することを含む。ビーズ及び任意で塩、緩衝剤、または界面活性剤を含む懸濁液はフローセルを通して適用することができる。任意で、バイオセンサーをボルテックスまたは遠心分離し、センサー基質のウェル内にビーズが堆積するのを更に促進することができる。特定の実施例では、バイオセンサーを３０〜９０°の角度等の少なくとも３０°の回転の面に対しての角度で、通常回転の軸に向かって内方向に向かうウェル開口を用いて遠心分離する。フローセル内に懸濁液を含むバイオセンサーを１分〜１０分にわたる期間等の、３０秒〜１５分にわたる期間遠心分離することができる。
【００４６】
図３の３０４に例証されるように、センサー基質を洗浄し、フローセルから懸濁液を流し、センサー基質のウェルに堆積したビーズを放置することができる。実施例では、洗浄の間、気／液界面は基質上を流動することができる。フローセルを通して断続的に気体と液体を流動させることによって、気／液界面を適用することができ、泡を形成する。別の実施例では、気泡を形成し、複数の気／液界面を生じさせるフローセルを通してその気泡を適用し、センサー基質のウェル上で流動することができる。
【００４７】
図４に例証される通り、センサー基質上にビーズを含む懸濁液を適用するとき、４０２に例証されるように、ビーズ４１８は部分的にウェル４１６内に堆積する。洗浄及び気／液界面の任意の適用後、４０４に例証されるように、ビーズは膨潤することができるが、ウェル４１６内で部分的に結合されたままである。
【００４８】
図３の３０６に例証されるように、フローセルを通して気体を適用することができ、液体がフローセルから蒸発する。フローセルを通して気体を押すことができる。代替として、フローセルを通して気体を抜き、液体を蒸発することができる。フローセルを通して気体を押すとき、圧力はフローセル内で気圧に対して増加することができる。フローセルを通して気体を抜くとき、フローセル内の圧力は気圧に対して減少することができる。フローセルを通して気体が流動すること、特にフローセルを通して気体を抜くことは、ウェルへビーズを更に押し流し、部分的にウェルを乾燥させ、ウェルから液体を蒸発させると考えられている。代替として、遠心分離を使用してフローセルの外へ液体を回転することができる。気体は窒素、ヘリウムまたはアルゴン等の貴気体、または空気であることができる。４０６の図４に例証されるように、フローセルを通る気体の流動、特にフローセルを通して抜く気体はウェルへビーズを更に抜く。
【００４９】
実施例において、フローセルを通して抜かれるように、フローセルを通して気体は流動することができ、少なくとも１５秒の期間、例えば少なくとも３０秒、少なくとも４５秒、少なくとも１分、少なくとも１．５分、少なくとも２分、または更に少なくとも５分の期間流動することができる。一般に、フローセルを通して２０分未満等、３０分より長く気体は流動しない。気体を１００μＬ／分〜１００ｍＬ／分の範囲内、例えば５００μＬ／分〜６０ｍＬ／分の範囲、５００μＬ／分〜４０ｍＬ／分の範囲、または更に１ｍＬ／分〜２０ｍＬ／分の範囲で適用することができる。
【００５０】
任意で、図３の３０８に例証されるように、気体の流動後にセンサー基質上に凝縮剤を適用することができる。凝縮試薬はウェル内のビーズを更に押すビーズの直径を減少させることができる。４０８において図４に例証されるように、凝縮試薬の適用はビーズにウェル内で更に収縮して抜くことを生じさせる。
【００５１】
例示的凝縮試薬は凝縮剤、例えば金属錯体、アルカリまたはアルカリ土金属塩、非イオン性ポリマー、アルコール、またはそれらの組み合わせを含む。実施例において、凝縮剤は例えばコバルトアミン錯体等のコバルト有機錯化合物を形成するコバルトを含む金属錯体を含む。
【００５２】
代替的にまたはその上、凝縮試薬はビーズのポリマーマトリックスの密度に影響する凝縮剤を含むことができる。例えば、溶液はアルコール、例えばメタノール、エタノール、またはイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を含むことができ、そのアルコールはビーズのポリマーマトリックスの密度に影響することができる。特に、溶液はアルコール、例えばメタノールを０．１体積％〜６０体積％の範囲内の濃度、例えば０．１体積％〜５０体積％の範囲、０．１体積％〜３０体積％の範囲、０．１体積％〜２０体積％の範囲、または更に０．１体積％〜１０体積％の範囲で含むことができる。例えば、溶液内のアルコールの濃度は０．１体積％〜５体積％の範囲内、例えば１体積％〜５体積％であることができる。別の実施例では、溶液はアルコール、例えば０．１体積％〜６０体積％の範囲内の濃度、例えば１．０体積％〜６０体積％の範囲、５．０体積％〜６０体積％の範囲、１０体積％〜６０体積％の範囲、または更に４０体積％〜６０体積％の範囲のエタノールまたはＩＰＡを含むことができる。
【００５３】
別の実施例では、凝縮剤は濃アルカリまたはアルカリ土金属塩、例えばハロゲン塩を含む。付加的実施例では、凝縮剤は塩化マグネシウムを例えば２０ｍＭ〜１Ｍの範囲内の濃度、例えば１００ｍＭ〜８００ｍＭの範囲、または更に１００ｍＭ〜５００ｍＭの範囲で含むことができる。
【００５４】
凝縮剤は更に、非イオン性ポリマー、例えばポリエチレングリコール系ポリマーであることができる。特定の実施例では、ポリエチレングリコール系ポリマーは２０００〜２００００の範囲内、例えば５０００〜１５０００、または８０００〜１２０００の分子量を有する。非イオン性ポリマーを０．１重量％〜２０．０重量％の範囲内の濃度、例えば０．５重量％〜１５．０重量％の範囲、０．５重量％〜１０重量％の範囲、または２．５重量％〜７．５重量％の範囲で含むことができる。
【００５５】
凝縮試薬の残部は緩衝溶液、例えば緩衝生理食塩溶液を含むことができる。例えば、凝縮試薬の残部はリン酸塩緩衝液を含むことができる。特に、この溶液はナトリウムまたはハロゲン化カリウム塩、ナトリウムもしくはリン酸化カリウム塩、またはポリソルベートを含むことができる。そのような塩を１ｍＭ〜５００ｍＭの範囲内の量、例えば５０ｍＭ〜３５０ｍＭの範囲、または１５０ｍＭ〜２５０ｍＭの範囲で含むことができる。実施例では、塩化カリウムは０．５Ｍ〜２Ｍの範囲内の濃度、例えば０．８Ｍ〜１．５Ｍの範囲、または更に０．８Ｍ〜１．２Ｍの範囲で含むことができる。その上または代替として、他の緩衝剤、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンであるアミン系緩衝剤を使用することができる。そのようなアミン緩衝剤を１０ｍＭ〜１Ｍの範囲内の濃度、例えば１００ｍＭ〜１Ｍの範囲、１００ｍＭ〜８００ｍＭの範囲、または更に１５０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲で使用することができる。任意で、凝縮試薬は塩から得られた他のイオン性成分、例えばカルシウムまたはマグネシウムを含むことができる。それ以上に、溶液は６〜９、例えば６．５〜８．５、または７〜８．５のｐＨを有することができる。
【００５６】
凝縮試薬は界面活性剤を含むことができる。例えば、界面活性剤は非イオン性ポリマー界面活性剤、例えばポリエチレングリコールのエーテル、例えばポリエチレングリコールのオクチルフェニルエーテルであることができる。非イオン性ポリマー界面活性剤を０．０１％〜１．０％の範囲内、例えば０．０５％〜０．８％の範囲、０．０５％〜０．５％の範囲、または更に０．０８％〜０．１５％の範囲で含むことができる。例示的界面活性剤はトリトンＸ１００である。
【００５７】
実施例では、凝縮試薬は凝縮剤、例えば２０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲内のＭｇＣｌ２と、塩、例えば０．８Ｍ〜１Ｍの範囲内のＫＣｌと、緩衝剤、例えば１５０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲内のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと、界面活性剤、例えば０．０５％〜０．５％の範囲内のトリトンＸ１００とを含む。ｐＨは７〜９の範囲内である。
【００５８】
別の実施例では、凝縮試薬は凝縮剤の組み合わせ、例えば２０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲内のＭｇＣｌ２、及び０．５重量％〜１０．０重量％の範囲内のポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコールは１０００〜１５０００の範囲内の分子量を有することができる。また、凝縮試薬は０．８Ｍ〜１Ｍの範囲内のＫＣｌ等の塩、１０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲内のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の緩衝剤、または０．０５％〜０．５％の範囲内のトリトンＸ１００等の界面活性剤を含むことができる。ｐＨは７〜９の範囲内である。
【００５９】
凝縮試薬への曝露に応じて、核酸鎖を含む核酸ビーズは直径において減少することができる。例えば、ビーズまたは粒子直径は溶液への曝露に応じて、少なくとも１％まで減少することができる。実施例では、直径は少なくとも５％まで、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、または更に少なくとも１９％減少する。特定の実施例では、直径は７５％未満まで減少する。その上、ビーズまたは分子の密度は凝縮剤への曝露に応じて増加することができる。例えば、密度は少なくとも２％まで、例えば少なくとも８％、少なくとも１４％、少なくとも２１％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、または更に少なくとも８０％増加することができる。特に、密度は７５００％未満まで増加する。
【００６０】
任意で、図３の３０４に例証されるように、センサー基質を洗浄し、３０６に例証されるように、フローセルを通して気体を流動させ、または３０８に例証されるように、凝縮試薬を適用するプロセスを全体的または部分的に１度以上繰り返すことができる。
【００６１】
配列決定の適用、または酵素の使用が関与する他の生体分子の適用の場合において、３１０に例証されるように、センサー基質上に堆積するビーズ上へ酵素を装填することができる。特に、フローセルを通して酵素を含む溶液を適用し、ウェル内に堆積するビーズに接触することができる。一般に、そのような酵素との接触はビーズの動的直径、または大きさにおいて上昇を生じさせる。
【００６２】
任意で、酵素を装填後、フローセルを通して気体を流動させるプロセスを、３１２に例証されるように、上記に記述されるように流量と期間を使用し再度繰り返すことができ、例えばフローセルから液体を蒸発させる。酵素が装填されるとき、ビーズは大きさを増加する。例えば、４１０において図４で例証されるように、酵素を装填することは、結果としてビーズの初期膨潤を生じさせることができ、かつ４１２に例証されるように酵素の存在下での更なる温置は、更なるビーズの膨潤を引き起こすことができる。フローセルを通して気体を更に抜き取ることは、図４の４１４に例証されるように、酵素の存在下における温置に応じてビーズが膨潤した後、部分的にビーズをウェルの中へ抜くことができる。
【００６３】
図３の３１４に例証されるように、更なる処理のためにセンサー基質を作成するため、または試験手順の一部としてのいずれかで、添加の試薬または他の溶液はフローセルを通して流動することができる。例えば、ヌクレオチドを含む試薬溶液は、配列決定反応中にセンサー基質上を流動することができる。
【００６４】
図５において例証される更なる例示的方法では、５０２に例証されるように、ビーズ５２０は初期にセンサー基質上のウェル５１８内へ回転することができる。ビーズ５２０を洗浄することができ、５０４に例証されるように、任意でセンサー基質に気／液界面（例えば、気泡形で）を適用することができ、初期にビーズ５２０の大きさを増加する。５０６に例証されるように凝縮剤を適用することができ、かつ液体を取り除くことができ、それから液体を蒸発することができ、５０８に例証されるように、収縮してウェル５１８へビーズ５２０をより深く押し流す。液体を取り除くことは、気泡を適用しフローセルから液体を押し流すこと、またはフローセルを回転させ液体を吹き、空気を吸い込むことを含むことができる。フローセルから液体を蒸発させることを、センサー基質のフローセルを通して空気または乾燥窒素を抜くこと、またはフローセルを通して空気または窒素を押すことによって達成することができる。
【００６５】
液体を取り除いた後、５１０に例証させるように、ビーズ５２０を洗浄することができる。５１２に例証されるように、凝縮剤を再度適用することができ、液体を蒸発させる（例えば、気体を適用）。洗浄、凝縮及び蒸発を０〜２回繰り返すことができる（５２２）。
【００６６】
５１４に例証されるように、ビーズ５２０内へ酵素を装填することができ、５１６に例証されるように、任意でビーズを洗浄することができ、気体を適用する。
【００６７】
ウェルを含むセンサー基質上にビーズを装填するための上記の方法の実施形態は、ビーズ、特に核酸またはタンパク質へ複合したものをセンサー基質ウェルへ抜く技術的利点を提供する。そのようなビーズのウェルへのより良い固定及び堆積は、キー信号における増加、または信号雑音比における減少を提供する。そのようなプロセスは更にヒドロゲルビーズ及び表面上のＯＨ基を示すウェルの壁、またはセンサー表面を利用するシステムを組み込むシステムに特に適する。そのようなＯＨ基が部分的に表面塗料によって遮断される場合においてさえも、上記の方法の実施形態は改善された装填、より高いキー信号またはより高い信号雑音比を備える。
【００６８】
上記のように、核酸ビーズをバイオセンサー内へ装填し、核酸ビーズの特徴を決定することができる。特に、核酸ビーズへ複合された標的配列の配列決定のために核酸ビーズを使用することができる。例えば、配列決定はラベルフリーのＤＮＡ配列決定、特にｐＨに基づくＤＮＡ配列決定を含むことができる。鋳型ＤＮＡを含み、プライマーを含む基質及び動作可能に結合されたポリメラーゼを、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の添加及び洗浄の繰り返しのサイクルを実行する前に、反応チャンバ（例えばマイクロウェル）内へ装填する。そのような鋳型を典型的に、微粒子、ビーズ、または類似物等のクローン集団として基質に付着させ、そのようなクローン集団を反応チャンバ内へ装填する。サイクルの各添加ステップにおいて、鋳型における次の塩基が添加されたｄＮＴＰの相補体であるとき、添加されたｄＮＴＰを組み込むことによってポリメラーゼはプライマーを延長する。１つの相補的塩基があるとき、１つの結合があり、２つあるとき、２つの結合があり、３つあるとき、３つの結合があるなどである。そのような結合のそれぞれを用いて、放出される水素イオンがあり、また合わせて水素イオンを放出する鋳型の集団は、電子センサーによって検出される反応チャンバの局所ｐＨに非常にわずかな変化を引き起こす。
【００６９】
図６は図表でｐＨに基づく核酸配列決定を実行するための装置を例証する。装置の各電子センサーは、基準電圧の値に依存する出力信号を生成する。図６では、流体回路（６０２）を含むハウジング（６００）は注入口によって試薬貯蔵器（６０４、６０６、６０８、６１０、及び６１２）及び廃棄物貯蔵器（６２０）へ連結し、流体接点（６３０）をフローセル（６３４）の注入口（６３８）へ連結する通路（６３２）によってフローセル（６３４）へと連結する。貯蔵器（６０４、６０６、６０８、６１０、及び６１２）からの試薬は圧力、シリンジポンプ等のポンプ、重力供給物、及び類似物を含む様々な方法によって、流体回路（６０２）へ押し流すことができ、バルブ（６１４）の制御によって選択される。制御系（６１８）は電気的接続（６１６）を通して、開口及び閉鎖するための信号を生成するバルブ（６１４）のための制御装置を含む。また、制御系（６１８）はシステムの他の構成要素のための、（６２２）によってそれに連結された洗浄溶液バルブ（６２４）等の制御装置と、基準電極（６２８）とを含む。また、制御系（６１８）はフローセル（６３４）のための制御と情報取得機能を含むことができる。一作動形態において、選択された試薬の流動との間で流体回路（６０２）が刺激され洗浄されるように、流体回路（６０２）は選択された試薬（１、２、３、４、または５）の配列を、制御系（６１８）のプログラム制御下においてフローセル（６３４）へと加え、フローセル（６３４）を洗浄する。フローセル（６３４）へ入る液体は放水口（６４０）を通って出ていき、廃棄物貯蔵器（６３６）に堆積する。そのような操作を通して、基準電極（６２８）が断続的、即ち中断されていないフローセル（６３４）を有する電解質の経路を有するが、洗浄溶液のみと物理的接触があるため、フローセル（６３４）に起こる反応及び測定値は安定的な基準電圧を有する。
【実施例】
【００７０】
核酸に複合させたヒドロゲルポリアクリルアミドビーズを、０．７μｍのウェル直径を有するセンサー基質上に堆積させる。ウェルを窒化ケイ素壁で形成する。下のセンサーパッド及び壁の一部を、ＩｍＰＡで処理されたチタン表面で形成する。ビーズは約０．６８μｍの平均的直径を有し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄの蛍光色素を用いて染色する。
【００７１】
図７の画像１に例証されるように、基質表面上にビーズを含む懸濁液を適用し、ウェル内にビーズを少なくとも部分的に堆積させる。その画像はウェルを有さないより明るい中央帯を含み、組織内の表面上に堆積したビーズを表す。より低い輝度を有する中央帯のいずれかの側面上に堆積するビーズは、少なくとも部分的にウェル内に堆積する。組織内の中央帯上のビーズの比率に対する、ウェル内のビーズの平均輝度の比率はビーズが堆積したウェル内の深度を示す。図８の棒１に例証されるように、平均的ビーズは０．３〜０．３５の輝度比（組織内の表面上のビーズの比率に対する、堆積したビーズの平均輝度の比率）を有する。図７の画像２及び図８の棒２に例証されるように、フローセルを通して気体を抜き、ウェルから液体を蒸発後、ウェル内に堆積する平均的ビーズはより低い輝度比を示す。輝度比におけるそのような減少は、ウェル内へビーズを更に抜くことを表す。
【００７２】
１００ｍｍｏｌの塩化マグネシウム及び約１０，０００の分子量を有する５重量％のポリエチレングリコールを含む凝縮試薬を用いて、ビーズを更に処理する。図７の画像３及び図８の棒３に例証されるように、凝縮剤を用いた処理後、輝度比は著しく低下する。
【００７３】
図７の画像４または図８の棒４に例証されるように、凝縮試薬の存在下で更に遠心機上でビーズを回転することができる。凝縮剤の存在下でのそのような回転は、輝度比に対して限定された影響を有し、かつ実際に輝度比を増加することができる。
【００７４】
酵素の存在下でビーズを温置することができる。図７の画像５及び図８の棒５に例証される通り、酵素の存在下でのそのような温置はビーズの膨潤を生じさせ、したがって輝度比に増加を引き起こす。図７の画像６及び図８の棒６に例証される通り、酵素を装填し、液体をウェルから蒸発後、装填する酵素に伴い、フローセルを通して気体を更に抜き、結果としてわずかに少ない輝度比を有するビーズを生じさせる。
【００７５】
第１の態様では、センサー基質上でビーズを装填する方法は、センサー基質上に画定されたフローセルへビーズを含む懸濁液を適用することを含み、センサー基質は複数のウェルを含み、ビーズは少なくとも部分的に複数のウェル内に堆積する、適用することと、フローセルから液体を取り除くことと、フローセルから液体を蒸発させることと、フローセルへ水和溶液を適用することとを含む。
【００７６】
第１の態様の実施例では、懸濁液を適用することは、ビーズの存在下でセンサー基質を遠心分離することを含む。
【００７７】
第１の態様の別の実施例及び上記の実施例では、その方法はフローセルから液体を蒸発させる前に、１つ以上の泡をフローセルを通して、かつセンサー基質上に流動させることを更に含む。
【００７８】
第１の態様の更なる実施例及び上記の実施例では、フローセルから液体を蒸発させることは、フローセルを通して気体を少なくとも１５秒間かつ３０分よりも短い期間抜くことを含む。
【００７９】
第１の態様の付加的実施例及び上記の実施例では、フローセルから液体を蒸発させることは１００μＬ／分〜１００ｍＬ／分の範囲内の速度で、フローセルを通して気体を抜くことを含む。
【００８０】
第１の態様の別の実施例及び上記の実施例では、その方法はセンサー基質上に凝縮溶液を適用することを更に含む。例えば、凝縮溶液を適用することは、フローセから液体を蒸発させた後に凝縮溶液を適用することを含む。実施例では、凝縮溶液を適用することは、フローセから液体を蒸発させる前に凝縮溶液を適用することを含む。別の実施例では、凝縮溶液は凝縮剤を含む。例えば、凝縮剤はマグネシウム、ポリエチレングリコールポリマー、またはそれらの組み合わせを含む。
【００８１】
第１の態様の更なる実施例及び上記の実施例では、その方法はセンサー基質上に酵素溶液を適用することを更に含む。例えば、その方法はフローセルから液体を取り除くこと、及び酵素溶液を適用した後にフローセルから液体を蒸発することを更に含む。
【００８２】
第１の態様の付加的実施例及び上述の実施例では、センサー基質は半導体配列決定デバイスを含む。実施例では、半導体配列決定デバイスはｐＨセンサーのアレイを含む。例えば、その方法は半導体配列決定デバイスを使用する配列決定を更に含む。
【００８３】
第１の態様の別の実施例及び上記の実施例では、ビーズはヒドロゲルを含む。
【００８４】
第２の態様では、センサー基質上でビーズを装填する方法は、センサー基質上に画定されたフローセルへ核酸ビーズを含む懸濁液を適用することを含み、センサー基質は複数のウェルを含み、ビーズは少なくとも部分的に複数のウェル内に堆積する、適用することと、気／液界面をフローセルを通して、かつセンサー基質上に流動することと、フローセルから少なくとも１５秒間かつ３０分よりも短い期間、１００μＬ／分〜１００ｍＬ／分の範囲内の速度で液体を蒸発させることと、フローセルを通して凝縮溶液を適用することとを含む。
【００８５】
第２の態様の実施例では、凝縮溶液はマグネシウム塩とポリエチレングリコールポリマーとを含む。
【００８６】
第２の態様の別の実施例及び上記の実施例では、気／液界面を流動させることは、フローセルを通して気泡を流動させることを含む。
【００８７】
第２の態様の更なる実施例及び上記の実施例では、その方法は凝縮溶液を適用した後に、フローセルを通して酵素溶液を適用することを含む。
【００８８】
一般的な説明または実施例で上述された活動の全てが要求されているわけではなく、特定の活動の一部が要求されず、特定の活動の一部が要求されない場合があり説明された活動に加えて１つ以上の更なる活動が実行される可能性があることに留意されたい。更には、活性を記載する順序は、必ずしも活性が行われる順序ではない。
【００８９】
上述の明細書には、特定の実施形態を参照して概念を記載した。しかしながら、当業者であれば、以下の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な修正及び変更を加えることができることを理解する。したがって、本明細書及び図面は、限定的な意味ではなく例示的な意味であるとみなされるべきであり、そのような全ての修正は本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、またはそれらの他の変形は、非排他的包含を網羅することを意図する。例えば、プロセス、方法、物品、または装置は、特徴部のリストを含むが、必ずしもそれらの特徴部のみに限定されず、明確に記載されていない特徴部、またはそのようなプロセス、方法、物品、または装置に固有の他の特徴部を含んでもよい。更に、それとは反対に、明確に記載されない場合、「または」は、排他的な「または」ではなく、包括な「または」を指す。例えば、以下のうちの任意の１つによって条件ＡまたはＢが満たされる：Ａが真であり（または存在する）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）かつＢが真である（または存在する）、ならびにＡ及びＢのいずれもが真である（または存在する）。
【００９１】
また、「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」の使用は、本明細書に記載される要素または構成要素を記載するために用いられる。これは、単に便宜上行われるものであり、本発明の範囲の一般的な意味合いをもたらすものである。それらの記載は、１つまたは少なくとも１つを含んでいると解釈されるべきであり、他に意味することが明らかではない限り、単数形はまた、複数形も含んでいる。
【００９２】
利益、他の利点、及び問題の解決策が実施形態に関して上述しされている。しかしながら、任意の利益、利点、または解決策をもたらし得るか、またはそれらをより明白にし得る利益、利点、問題解決策、及び任意の特徴部（複数可）は、任意のまたは全ての特許請求の範囲の重要な、必須の、または必要不可欠な特徴と解釈されるべきではない。
【００９３】
当業者であれば、本明細書を読んだ後に、ある特定の特徴部が、個別の実施形態との関連で明確にするために本明細書に記載されており、単一の実施形態に組み合わせでも提供され得ることを理解するであろう。反対に、単一の実施形態との関連で簡潔にするために記載される様々な特徴部が、個別に、または任意の部分組み合わせでも提供され得る。更に、範囲内の記載される値への言及は、その範囲内のありとあらゆる値を含む。
【図１】
2017522049.tif 000007
【図２】
2017522049.tif 000008
【図３】
2017522049.tif 000009
【図４】
2017522049.tif 000010
【図５】
2017522049.tif 000011
【図６】
2017522049.tif 000012
【図７】
2017522049.tif 000013
【図８】
2017522049.tif 000014
【国際調査報告】
2017522049.tif 000015
2017522049.tif 000016