(57)【要約】  本開示は、Ｔ細胞エピトープを潜在的に欠いた、免疫応答の低下を誘発する抗体及び免疫複合体の組成物に関する。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、及びそれらの任意の組み合わせ等の抗体断片であってもよい。さらなる実施形態において、抗体は、抗原上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に結合してもよい。別の実施形態において、免疫複合体は、エフェクター分子に付着した抗体を含んでもよく、エフェクター分子は、放射性同位体、抗悪性腫瘍薬、免疫調節物質、生物学的応答調節物質、レクチン、毒素、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む、抗体。
【請求項２】
前記重鎖は、配列番号１に示されるアミノ配列を有し、前記軽鎖は、配列番号２に示されるアミノ配列を有する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項３】
前記重鎖は、配列番号１１に示されるアミノ配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項４】
前記重鎖は、配列番号３１に示されるアミノ配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項５】
前記重鎖は、配列番号３２に示されるアミノ配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項６】
前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、非免疫グロブリン足場、多量体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗体断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記抗体。
【請求項７】
前記抗体は、抗体断片Ｆａｂであり、前記軽鎖及び前記重鎖は、共有結合によって結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記抗体。
【請求項８】
前記共有結合は、ジスルフィド結合である、請求項７に記載の前記抗体。
【請求項９】
前記抗体は、癌細胞抗原に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記抗体。
【請求項１０】
前記癌細胞抗原は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である、請求項９に記載の前記抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記抗体と、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、または安定剤と、を含む、組成物。
【請求項１２】
抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む、エフェクター分子に付着した抗体を含む、免疫複合体。
【請求項１３】
前記重鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の前記免疫複合体。
【請求項１４】
前記重鎖は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の前記免疫複合体。
【請求項１５】
前記重鎖は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の前記免疫複合体。
【請求項１６】
前記重鎖は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の前記免疫複合体。
【請求項１７】
前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、非免疫グロブリン足場、多量体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗体断片である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の前記免疫複合体。
【請求項１８】
前記抗体は、抗体断片Ｆａｂであり、軽鎖及び前記重鎖は、共有結合によって結合している、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の前記免疫複合体。
【請求項１９】
前記共有結合は、ジスルフィド結合である、請求項１８に記載の前記免疫複合体。
【請求項２０】
前記エフェクター分子は、放射性同位体、抗悪性腫瘍薬、免疫調節物質、生物学的応答調節物質、レクチン、毒素、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の前記免疫複合体。
【請求項２１】
前記エフェクター分子は、アブリン、モデクシン、ビスクミン、ゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリオジン、ルフィン、モモルジン、リストリクトシン、シュードモナス外毒素Ａ、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、赤痢菌毒素、コレラ菌毒素、ジフテリア毒素、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される毒素である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の前記免疫複合体。
【請求項２２】
前記抗体は、癌細胞抗原に結合する、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の前記免疫複合体。
【請求項２３】
前記癌細胞抗原は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である、請求項２２に記載の前記免疫複合体。
【請求項２４】
前記エフェクター分子は、シュードモナス外毒素Ａ（配列番号３）である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の前記免疫複合体。
【請求項２５】
前記エフェクター分子は、ボウガニン毒素（配列番号４）である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の前記免疫複合体。
【請求項２６】
前記エフェクター分子は、配列番号３３、配列番号４２、及び配列番号４３から選択されるボウガニン毒素である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の前記免疫複合体。
【請求項２７】
請求項１２〜２６のいずれか一項に記載の前記免疫複合体と、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、または安定剤と、を含む、組成物。
【請求項２８】
癌を有する対象の治療における免疫複合体の使用であって、前記免疫複合体は、エフェクター分子に付着した抗体を含み、前記抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む、前記使用。
【請求項２９】
前記重鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の前記使用。
【請求項３０】
前記重鎖は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の前記使用。
【請求項３１】
前記重鎖は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の前記使用。
【請求項３２】
前記重鎖は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の前記使用。
【請求項３３】
前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、非免疫グロブリン足場、多量体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗体断片である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の前記使用。
【請求項３４】
前記エフェクター分子は、放射性同位体、抗悪性腫瘍薬、免疫調節物質、生物学的応答調節物質、レクチン、毒素、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の前記使用。
【請求項３５】
前記免疫複合体は、皮下、筋肉内、腹腔内、体腔内、くも膜下腔内、腫瘍内、経皮、及び静脈内注射からなる群から選択される非経口投与のための形態である、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の前記使用。
【請求項３６】
前記免疫複合体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／用量〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／用量の剤形である、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の前記使用。
【請求項３７】
１つ以上の抗癌剤の使用をさらに含み、前記抗癌剤は、前記免疫複合体と併用投与、同時投与、または逐次投与される、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の前記使用。
【請求項３８】
前記抗癌剤は、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、酢酸メゲストロール、アナスフロゾール、レトラゾール、ボラゾール、エクセメスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸ゴセレリン、ルプロリド、フィナステリド、ハーセプチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテファン、ビンクリスチン、タキソール、タキソテール、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、イリノテカン、トポテカン、エポチロン、イレッサ、タルセバ、血管新生抑制剤、ＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイトカイン、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２阻害剤、ならびにモノクローナル抗体から選択される、請求項３７に記載の前記使用。
【請求項３９】
前記癌は、肺癌、胃癌、腎癌、甲状腺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、肝細胞癌、食道、膵臓、及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の前記使用。
【請求項４０】
対象における癌を検出または監視する方法であって、
−前記対象から採取した試験試料を抗体と接触させて抗体−抗原複合体を形成するステップであって、前記抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、及び配列番号３２から選択される重鎖アミノ酸配列と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、ステップと、
−前記試験試料中の前記抗体−抗原複合体の量を測定するステップと、
−その結果を対照に対して正規化するステップと、を含む、前記方法。
【請求項４１】
対象における腫瘍を撮像する方法であって、
−配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む抗体を前記対象に投与することと、
−インビボ画像診断によって前記抗体を検出することと、を含む、前記方法。
【請求項４２】
前記抗体は、放射性同位体、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるエフェクター分子をさらに含む、請求項４１に記載の前記方法。
【請求項４３】
前記インビボ画像診断は、近赤外蛍光画像法（ＮＩＲＦ）、蛍光反射率画像法（ＦＲＩ）、蛍光媒介断層撮影法（ＦＭＴ）、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン断層・コンピュータ断層複合撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）、ポジトロン断層・磁気共鳴画像複合撮影（ＰＥＴ／ＭＲＩ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４１または４２に記載の前記方法。
【請求項４４】
前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、非免疫グロブリン足場、多量体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗体断片である、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項４５】
前記抗体は、抗体断片Ｆａｂであり、軽鎖及び前記重鎖は、共有結合によって結合している、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項４６】
前記インビボ画像診断の後に、腫瘍、または臓器の一部を切除することをさらに含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項４７】
癌に罹患した対象を治療する方法であって、
エフェクター分子に付着した抗体を含む治療有効量の免疫複合体を投与することを含み、前記抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む、前記方法。
【請求項４８】
前記重鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の前記方法。
【請求項４９】
前記重鎖は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の前記方法。
【請求項５０】
前記重鎖は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の前記方法。
【請求項５１】
前記重鎖は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の前記方法。
【請求項５２】
前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、非免疫グロブリン足場、多量体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗体断片である、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項５３】
前記エフェクター分子は、放射性同位体、抗悪性腫瘍薬、免疫調節物質、生物学的応答調節物質、レクチン、毒素、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項５４】
前記免疫複合体の前記投与は、皮下、筋肉内、腹腔内、体腔内、くも膜下腔内、腫瘍内、経皮、及び静脈内注射からなる群から選択される経口投与によるものである、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項５５】
前記免疫複合体の投与は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／用量〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／用量の投与量である、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項５６】
前記免疫複合体は、１つ以上の抗癌剤と併用投与、同時投与、または逐次投与される、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項５７】
前記抗癌剤は、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、酢酸メゲストロール、アナスフロゾール、レトラゾール、ボラゾール、エクセメスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸ゴセレリン、ルプロリド、フィナステリド、ハーセプチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテファン、ビンクリスチン、タキソール、タキソテール、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、イリノテカン、トポテカン、エポチロン、イレッサ、タルセバ、血管新生抑制剤、ＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイトカイン、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２阻害剤、ならびにモノクローナル抗体から選択される、請求項５６に記載の前記方法。
【請求項５８】
前記癌は、肺癌、胃癌、腎癌、甲状腺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、肝細胞癌、食道、膵臓、及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項４７〜５７のいずれか一項に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６１／８８５，８１７号及び２０１４年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／０３０，８０５号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の概要
本開示は、Ｔ細胞エピトープを潜在的に欠いた、免疫応答の低下を誘発する抗体及び免疫複合体に関する。一実施形態において、抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含んでもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、非免疫グロブリン足場、多量体、及びそれらの任意の組み合わせ等の抗体断片であってもよい。さらなる実施形態において、抗体は、抗原上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に結合していてもよい。追加の実施形態において、組成物は、本明細書に記載の抗体及び薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、または安定剤を含んでもよい。
【０００３】
別の実施形態において、免疫複合体は、エフェクター分子に付着した抗体（またはその断片）を含んでもよく、抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２から選択されるアミノ酸を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２から選択されるアミノ酸を有する軽鎖とを有してもよい。他の実施形態において、エフェクター分子は、放射性同位体、抗悪性腫瘍薬、免疫調節物質、生物学的応答調節物質、レクチン、毒素、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０００４】
追加の実施形態において、癌に罹患した対象を治療する方法は、エフェクター分子に付着した抗体を含む治療有効量の免疫複合体を投与することを含んでもよく、抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、エフェクター分子は、放射性同位体、抗悪性腫瘍薬、免疫調節物質、生物学的応答調節物質、レクチン、毒素、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。特定の実施形態において、本方法は、対象において免疫複合体を検出または撮像することをさらに含んでもよい。さらなる実施形態において、本方法は、検出または撮像された癌組織を対象から除去することをさらに含んでもよい。
【０００５】
さらなる実施形態において、対象における癌を診断、検出、または監視する方法は、該対象から採取した試験試料を抗体と接触させて抗体−抗原複合体を形成することであって、抗体は、配列番号１、配列番号１１から選択される重鎖アミノ酸配列と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、形成することと、試験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定することと、その結果を対照に対して正規化することとを含む。
【０００６】
別の実施形態において、対象における癌を診断、検出、または監視する方法は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む抗体を対象に投与することと、対象において抗体を検出することと、を含んでもよい。
【０００７】
別の実施形態において、癌を診断、検出、または監視するためのキットは、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２から選択される重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを有する抗体、及びその使用のための指示書を含んでもよい。
【０００８】
別の実施形態において、対象における腫瘍を撮像する方法は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む抗体を対象に投与することと、インビボ画像診断によって抗体を検出することとを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施形態、具体的には、脱免疫化ＶＢ５−８４５  Ｆａｂ断片（ＶＢ５−８４５−ＤＩ）、及びＶＢ５−８４５非脱免疫化Ｆａｂ断片（ＶＢ５−８４５−ＷＴ）の略図である。
【図２】ｉＴｏｐｅ（商標）を使用した配列ＶＨ−ＷＴ（ＶＨ−野生型）の分析を示す。潜在的に免疫原性を有するペプチドを含有する領域は、「高い乱交雑性」及び「中程度の乱交雑性」の列に示される。
【図３】ｉＴｏｐｅ（商標）を使用した配列ＶＨ−ＤＩ（ＶＨ−脱免疫化）の分析を示す。潜在的に免疫原性を有するペプチドを含有する領域は、「高い乱交雑性」及び「中程度の乱交雑性」の列に示される。
【図４】ｉＴｏｐｅ（商標）を使用した配列ＶＬ−ＷＴ（ＶＬ−野生型）の分析を示す。潜在的に免疫原性を有するペプチドを含有する領域は、「高い乱交雑性」及び「中程度の乱交雑性」の列に示される。
【図５】ｉＴｏｐｅ（商標）を使用した配列ＶＬ−ＤＩ（ＶＬ−脱免疫化）の分析を示す。潜在的に免疫原性を有するペプチドを含有する領域は、「高い乱交雑性」及び「中程度の乱交雑性」の列に示される。
【図６】ｉＴｏｐｅ（商標）を使用した単一アミノ酸変化に及ぶ配列ＶＬ−ＤＩ及びＶＬ−ＤＩＦ（ＶＬ−ＤＩ＋さらなるＣ末端）の分析を示す。
【図７】フローサイトメトリーによって測定されたＶＢ５−８４５−ＤＩ及びＶＢ５−８４５−ＷＴのＥｐＣＡＭ陽性Ｃａｌ−２７及びＥｐＣＡＭ陰性Ａ−３７５に対する結合特異性を示す。
【図８】ＶＢ５−８４５−ＤＩのＥｐＣＡＭ陽性Ｈ＆Ｎ扁平上皮癌細胞株Ｃａｌ２７への用量依存性結合を示す。結合は、フローサイトメトリーを用いて、ＰＢＳ対照を超える蛍光中央値の平均上昇倍数として表される。
【図９】フローサイトメトリーによって測定されたＶＢ５−８４５−ＷＴ及びＶＢ５−８４５−ＤＩのＣａｌ−２７細胞に対する結合親和性を示す。
【図１０】フローサイトメトリーを用いて、ＶＢ５−８４５変異体とＶＢ６−８４５との競合アッセイを示す。
【図１１−Ａ】ＶＢ５−８４５−ＤＩのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−Ｂ】ＶＢ５−８４５−ＤＩのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１−Ｃ】ＶＢ５−８４５−ＤＩのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１２−Ａ】Ｋａｂａｔ番号付けを用いて、ＶＢ５−８４５−ＷＴ及びＶＢ５−８４５−ＤＩのＶＨ及びＶＬドメインのアラインメントを示す。
【図１２−Ｂ】Ｋａｂａｔ番号付けを用いて、ＶＢ５−８４５−ＷＴ及びＶＢ５−８４５−ＤＩのＶＨ及びＶＬドメインのアラインメントを示す。
【図１３】ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏを用いたＶＢ６−８４５競合アッセイを開示する（白丸）。黒丸及び黒三角は、それぞれ、ＶＢ５−８４５−ＷＴ及びＶＢ４−８４５に対応する。
【図１４】ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ血清安定性のウエスタンブロット分析を示す。レーン１〜４は、０、３、６、及び２４時間目のＶＢ５−８４５−ＷＴに対応する。レーン５〜８は、０、３、６、及び２４時間目のＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏに対応する。レーン９は、ヒト血清のみである。Ｌ：ラダー、及びＣ：対照。
【図１５】０時間の複製平均のパーセントとして表されるＶＢ５−８４５−ＷＴ（グレー）及びＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ（黒）の熱安定性を示す。
【図１６】ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイの増殖によって測定されたＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの免疫原性プロファイルを示す。
【図１７−Ａ】カバット（Ｋａｂａｔ）番号付けを用いて、ＶＢ５−８４５−ＷＴ及びＶＢ５−８４５  ＡｌｇｏのＶＨ及びＶＬドメインのアラインメントを示す。
【図１７−Ｂ】カバット（Ｋａｂａｔ）番号付けを用いて、ＶＢ５−８４５−ＷＴ及びＶＢ５−８４５  ＡｌｇｏのＶＨ及びＶＬドメインのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
記載される具体的なプロセス、組成物、または方法論は異なり得るため、本発明はこれらに限定されない。説明に用いられる専門用語は、具体的な型または実施形態を説明する目的のためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のいずれの内容も、本発明が、先行発明のためにそのような開示に先行する資格がないことを承認するものとして解釈されるべきではない。
【００１１】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な指示のない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗酸化剤」への言及は、当業者に既知の１つ以上の抗酸化剤及びその均等物への言及等である。
【００１２】
「約」という用語は、それと共に用いられる数の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。したがって、約５０％は、４５％〜５５％の範囲内を意味する。
【００１３】
本明細書で使用される「動物」、「患者」、または「対象」という用語は、限定されないが、野生動物、飼育動物、及び家畜等のヒト及びヒト以外の脊椎動物を含む。
【００１４】
使用され得る「抗体断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、及びそれらの任意の組み合わせ、ならびに組換え源に由来する断片及び／またはトランスジェニック動物において産生される断片を含む。抗体または断片は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、及びヒトを含む任意の種に由来してもよい。キメラ抗体誘導体、すなわち、ヒト以外の動物の可変領域とヒト定常領域とを組み合わせた抗体分子も、本発明の範囲内で企図される。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラット、または他の種の抗体からの抗原結合ドメインをヒト定常領域とともに含むヒト化抗体を含むことができる。従来の方法を使用してキメラ抗体を作製してもよい。キメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりもヒト対象における免疫原性が低いことが予想される。ヒト化抗体は、例えば国際公開第００／６１６３５号に記載されるようにさらに安定化することができ、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００１５】
「抗癌剤」は、限定されないが、化学剤、他の免疫治療薬、癌ワクチン、抗血管新生化合物、特定のサイトカイン、特定のホルモン、遺伝子療法、放射線療法、外科手術、及び食餌療法を含む、癌を治療または予防するのに効果的な化合物または治療を指す。
【００１６】
「脱免疫化」は、野生型の対応物と比較した場合に、免疫応答の低下が見られないか、または誘発する分子を指す。
【００１７】
「脱免疫化抗体」または「脱免疫化抗体断片」は、野生型の対応物と比較した場合に、１つ以上のＴ細胞エピトープを欠いた、免疫応答の低下を誘発する抗体及び抗体断片を指す。
【００１８】
「脱免疫化ＶＢ５−８４５」は、脱免疫化されていないＦａｂ断片ＶＢ５−８４５（ＶＢ５−８４５−ＷＴ）と比較した場合に、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン上の推定Ｔ細胞エピトープが変異しており、免疫応答の低下を誘発させる可能性があるＥｐＣＡＭ抗体のＦａｂ断片を指す。脱免疫化ＶＢ５−８４５  Ｆａｂ断片（ＶＢ５−８４５−ＤＩ）は、脱免疫化ＶＨ−ＣＨドメイン（配列番号１）及び脱免疫化ＶＬ−ＣＬドメイン（配列番号２）を含む。脱免疫化されていないＶＢ５−８４５  Ｆａｂ断片（ＶＢ５−８４５−ＷＴ）は、野生型ＶＨ−ＣＨドメイン（配列番号５）及び野生型ＶＬ−ＣＬドメイン（配列番号６）を含む。
【００１９】
「有効量」または「治療有効量」は、所望の結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量を意味する。免疫複合体の有効量は、動物の疾患状態、年齢、性別、体重等の要因に応じて変化し得る。治療計画は、最適な治療反応を提供するように調節することができる。例えば、１日に数回の分割用量を投与してもよいか、または治療状況の緊急性によって示唆されるように用量を比例的に低減してもよい。
【００２０】
「ヒト化抗体または抗体断片」は、ヒトフレームワーク領域を含む抗体または断片を意味する。
【００２１】
「免疫複合体」は、エフェクター分子に接合した抗体またはその断片を指す。いくつかの実施形態において、抗体は、全長抗体、または抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、及びそれらの任意の組み合わせ等、ならびに組換え源に由来する断片及び／またはトランスジェニック動物において産生される断片であってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、合成タンパク質、結合タンパク質、またはポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、エフェクター分子は、毒素、放射性ヌクレオチド、放射性医薬品、標識剤、薬物、細胞傷害性薬剤、ペプチド、タンパク質等であってもよい。これらのエフェクター分子は、抗体が抗原に結合したときに、死滅させる、溶解させる、もしくは標識する、または他の効果を誘導することが可能であり得る。
【００２２】
本明細書で使用される「免疫応答を誘発する傾向の低下」は、修飾ＥｐＣＡＭ抗体または抗体断片が、非修飾ＥｐＣＡＭ抗体よりも免疫原性が低いことを意味する。
【００２３】
「免疫応答」は、細胞性免疫反応及び液性免疫応答の両方を含む。
【００２４】
「癌部位に直接投与される」という用語は、限定されないが、腫瘍または腫瘍周囲への免疫複合体の直接的な単回または複数回注入、腫瘍または腫瘍周囲への連続的または不連続的灌流、腫瘍または腫瘍周囲への貯蔵容器の導入、腫瘍または腫瘍周囲への徐放性装置の導入、腫瘍または腫瘍周囲への徐放性製剤の導入、腫瘍上への直接的な塗布、腫瘍の領域に実質的に直接供給する動脈内への直接注入、腫瘍の領域内に実質的に排出するリンパ管への直接注入、実質的に被包化された体腔（例えば、胸膜腔）または内腔（例えば、小胞内）における直接的または実質的に直接的な導入を含む、直接的または実質的に直接的な導入を指す。「腫瘍周囲の」は、限定されないが、触知可能な腫瘍の境界線等の腫瘍の境界線と見なされるものの約１０ｃｍ以内、好ましくは５ｃｍ以内、より好ましくは１ｃｍ以内の領域を説明する用語である。発生の予防または再発の予防に関連して、「直接投与」は、癌の発生または再発のリスクがある部位への直接的な投与として定義される。
【００２５】
「薬学的に許容される」とは、一般的な臨床上の使用、及び／またはＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａに記載されている連邦政府もしくは州政府の規制当局による認可、あるいは関連技術分野の当業者による一般的な承認を指す。
【００２６】
抗体結合に関する「生理的条件」は、ＥｐＣＡＭ結合ポリペプチドがインビボでＥｐＣＡＭ分子に遭遇する状態を反映するが、必ずしも正確にその状態を複製するとは限らない。生理的条件下での結合は、インビボでの結合が起こると合理的に予測できるはずである。
【００２７】
「癌を予防すること」は、癌発生の予防を指す。特定の場合において、予防的処置は、癌の再発を減少させる。他の場合において、予防的処置は、患者が癌を発症するリスクを減少させるか、または前癌状態（例えば、結腸ポリープ）から実際の悪性腫瘍への進行を抑制する。
【００２８】
「低減された用量」は、通常投与される用量及び／または推奨される用量を下回る用量を指す。抗癌剤の通常投与される用量は、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅの最新版等の当該技術分野で周知の参考資料に見出すことができる。
【００２９】
「癌を治療すること」は、癌細胞複製の阻害、アポトーシス、癌の拡散（転移）の抑制、腫瘍増殖の抑制、癌細胞数もしくは腫瘍増殖の低下、癌の悪性度の低下（例えば、分化の増加）、または癌に関連する症状の改善を指す。
【００３０】
「治療薬」は、患者の望ましくない状態、疾患、または症状を阻止する、それと闘う、寛解させる、予防する、または改善するために用いられる薬剤を意味する。
【００３１】
「変異体」は、免疫複合体、抗体もしくは抗体断片、毒素（例えば、シュードモナス毒素）、または本明細書に記載のエフェクター分子の任意の薬学的に許容される誘導体、類似体、または断片を指す。変異体はまた、多量体の１つ以上の成分、個々の成分を含む多量体、個々の成分の倍数を含む多量体（例えば、参照分子の多量体）、化学分解生成物、及び化学分解生成物も包含する。具体的な非限定的な実施形態において、免疫複合体は、参照免疫複合体のＥｐＣＡＭ結合部分及び／または毒素部分における変化（複数可）に基づく参照免疫複合体に対する「変異体」であってもよい。例えば、変異体免疫複合体は、抗体部分及び／または毒素部分の多量体を含有してもよい。分子の毒素部分の変異体は、参照毒素の調製物の毒素を測定するために用いられる標準的なアッセイにおいて、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の毒性を保持する。いくつかの実施形態において、変異体はまた、本発明の免疫複合体と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドも指すことができる。いくつかの実施形態において、変異体抗体は、本発明の抗体の少なくとも３０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指してもよい。いくつかの実施形態において、変異体抗体または免疫複合体は、競合結合アッセイによって測定された場合に、本発明の抗体の少なくとも３０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％結合親和性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指してもよい。
【００３２】
参照免疫複合体のＥｐＣＡＭ結合部分の変異を有する変異体免疫複合体は、生理的件下で少なくとも１０パーセント、及び好ましくは少なくとも３０パーセント、抗ＥｐＣＡＭ参照抗体の結合と競合する（下記参照）。１０パーセントの競合とは、飽和濃度の抗ＥｐＣＡＭ参照抗体がＥｐＣＡＭに結合するアッセイにおいて、当量濃度の変異体抗ＥｐＣＡＭ免疫複合体と均衡に達したときに、これらの結合した参照抗体の１０パーセントが置換されることを意味する。非限定的な例として、抗体間または抗体と免疫複合体との間の競合は、実質的に全てのＥｐＣＡＭ部位が抗体によって結合されるように、標識抗ＥｐＣＡＭ参照抗体を細胞表面上のＥｐＣＡＭまたはＥｐＣＡＭでコーティングした固体基質に結合させ、これらの抗体−抗原複合体を非標識試験抗ＥｐＣＡＭ抗体または非標識試験免疫複合体と接触させ、ＥｐＣＡＭ結合部位から置換された標識抗体の量を測定することによって測定され、遊離した標識抗体の量が生じた競合の量を示す。
【００３３】
「ＶＢ５−８４５」は、毒素複合体を含まないＥｐＣＡＭ抗体のＦａｂ断片を指す。
【００３４】
「ＶＢ６−８４５」は、一般的に修飾ボウガニンタンパク質（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）毒素に結合したＥｐＣＡＭ抗体のＦａｂ断片を指す。
【００３５】
「４Ｄ５ＭＯＣ−Ｂ」または「４Ｄ５」は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第００／６１６３５号に記載されるように、ｓｃＦｖ  ４Ｄ５の人工ヒトコンセンサスフレームワーク上にグラフト化されたヒト化ｓｃＦｖ  ＭＯＣ３１抗体を意味する。４Ｄ５ＭＯＣ−Ｂは、配列番号８によって表される。「ＭＯＣ−３１抗体」は、マウス抗ＥｐＣＡＭまたは抗ＥＧＰ−２抗体を意味し、ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カタログ番号ＭＵ３１６−ＵＣ）、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（カタログ番号１８−０２７０）、またはＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（カタログ番号Ｍ４１６５）等の商業的供給源から入手可能である。
【００３６】
免疫療法は、癌と闘うための強力なツールとして出現した。腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）を標的とするマウス及びヒト化／キメラ抗体、ならびにそれらのそれぞれの抗体断片が、特定のヒト癌の診断及び治療のために使用されてきている。これらの抗体の非複合形態、毒素と複合した形態、及び放射標識形態が、そのような療法に使用されてきた。
【００３７】
免疫療法のための対象となる腫瘍関連抗原の１つは、１７−１Ａ、ＫＳＡ、ＥＧＰ−２、及びＧＡ７３３−２としても知られる上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。Ｅｐ−ＣＡＭは、肺、乳房、卵巣、結腸直腸の癌、及び頭頸部の扁平上皮癌を含む多くの固形腫瘍において高度に発現されるが、ほとんどの正常な上皮組織においては弱く発現される膜貫通タンパク質である。その発現は、細胞増殖の速度と相関している。ＥｐＣＡＭ特異的抗体は、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌に罹患する患者における原発腫瘍及び転移を撮像及び検出するために使用されてきた。
【００３８】
治療タンパク質の有効性が、その治療タンパク質に対する望ましくない免疫反応によって限定される場合が多く存在する。いくつかのマウスモノクローナル抗体は、多数のヒト疾患設定において治療薬としての見込みを示してきたが、特定の症例では、著しい程度のヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の誘導に起因して失敗している。モノクローナル抗体に関しては、ＨＡＭＡ応答を低下させるための試みにおいて多数の技術が開発されてきた。これらの組換えＤＮＡアプローチは、一般的に、最終的な抗体構築物中のヒト遺伝情報を増加させる一方で、最終的な抗体構築物中のマウス遺伝情報を減少させてきた。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、いくつかの症例において、患者の免疫応答をなおも誘発してきた。
【００３９】
免疫応答を誘導する鍵は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上の提示を介してＴ細胞の活性を刺激することができるペプチドのタンパク質中の存在、いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」である。そのようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する任意のアミノ酸残基配列として一般的に定義される。黙示的に、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合したときにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識され得、また少なくとも原理的には、ＴＣＲと会合してＴ細胞応答を促進することによってこれらのＴ細胞の活性化を引き起こすエピトープを意味する。したがって、抗体及び抗体断片からＴ細胞エピトープを特定して除去すること、及び免疫応答の低下を誘発するより優れた抗体／抗体断片を開発することが望ましい。
【００４０】
抗体
癌細胞抗原に結合する脱免疫化抗体及び脱免疫化抗体断片が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、抗原はＥｐＣＡＭであってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。抗体は、全長抗体、または抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、及びそれらの任意の組み合わせ等であってもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態において、軽鎖及び重鎖断片の配列は、抗体がヒトにおいて免疫応答の低下を誘発するように修飾されてもよいかまたは他のアミノ酸と交換されてもよい。ヒト化抗体または抗体断片を作製するために、当該技術分野で既知の任意の方法が用いられ得る。例えば、ヒト抗体断片は、ヒト抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。別の解決法は、ＣＤＲ領域をヒトフレームワーク上にグラフト化することによって、非ヒトモノクローナル抗体の特異性を移植することである。該技術の改善において、改善された結合挙動を有するヒト化抗体または抗体断片は、該非ヒト抗体に由来するさらなる残基を組み込むことによって生成することができる。ヒト化を達成することに加えて、所望の結合親和性及び特異性を有するｓｃＦｖ断片のＣＤＲを、異なる、より優れた挙動のｓｃＦｖのフレームワーク上にグラフト化することによって、準最適な安定性及び／またはフォールディングもしくは収率を有する抗体断片を「修復する」ための技術が用いられてもよい。そのようなヒト化抗体または抗体断片を作製するための方法は、当該技術分野で周知であり、例として、ＳＣＩＤマウスにおける生成、及びインビトロ免疫を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、抗体断はＦａｂであってもよく、軽鎖及び重鎖は共有結合によって結合している。いくつかの実施形態において、共有結合は、ジスルフィド結合であってもよい。いくつかの実施形態において、共有結合は、アジプイミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル等の化学架橋によるものであってもよい。いくつかの実施形態において、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ等のアミノ酸架橋剤が使用されてもよい。本明細書に記載の軽鎖及び重鎖の配列は、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ等を誘導するために使用され得る。種々のタンパク質結合ストラテジーが、二価または二重特異性Ｆａｂ及びｓｃＦｖｓ、ならびに二官能性Ｆａｂ及びｓｃＦｖ融合体を生成するために使用され得る。
【００４４】
本明細書に記載の抗体断片は、大腸菌にクローン化して、生物学的に機能的な形態で発現させることができる。抗体及び抗体断片はまた、細菌または哺乳動物細胞のいずれかを用いた組換えＤＮＡ技術によって生成することもできる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、親和性成熟プロセスが用いられてもよく、それによって、本明細書に記載の抗体の結合特異性、親和性、または結合活性を改変することができる。多数の実験技術が考案されてきており、それによって、抗体断片全体、またはＣＤＲ等の選択された領域のいずれかに種々の突然変異ストラテジーを適用することによってアミノ酸配列の多様性が生み出される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、重鎖及び軽鎖の変異体アミノ酸配列は、配列番号１及び２のそれぞれと、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは９５％の配列同一性を有する。他の実施形態において、重鎖及び軽鎖の変異体アミノ酸配列は、配列番号１１及び１２のそれぞれと、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、及びさらに最も好ましくは９５％の配列同一性を有する。
【００４７】
免疫複合体
いくつかの実施形態において、免疫複合体が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される免疫複合体は、エフェクター分子に付着した抗体であってもよく、抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、及びそれらの任意の組み合わせ等の抗体断片であってもよい。抗体または抗体断片は、本明細書に開示される脱免疫化抗体または脱免疫化抗体断片のいずれであってもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、免疫複合体中の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体中の抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体中の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体中の抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよい。
【００４９】
本明細書に記載の実施形態において、エフェクター分子は、放射性同位体、抗悪性腫瘍薬、免疫調節物質、生物学的応答調節物質、レクチン、毒素、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、エフェクター分子は、アブリン、モデクシン、ビスクミン、ゲロニン、ボウガニン、修飾または脱免疫化ボウガニンタンパク質（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリオジン、ルフィン、モモルジン、リストリクトシン、シュードモナス外毒素Ａ、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、赤痢菌毒素、コレラ菌毒素、ジフテリア毒素、及びそれらの任意の組み合わせ等の毒素であってもよい。実施形態において、毒素は、配列番号４、配列番号９、配列番号３３、配列番号４２、または配列番号４３に示されるｄｅＢｏｕｇａｎｉｎであってもよい。実施形態において、毒素は、配列番号３に示されるシュードモナス外毒素Ａであってもよい。
【００５０】
他の非限定的な実施形態において、毒素は、ＤＮＡを破壊するように作用する物質を含む。したがって、毒素は、限定されないが、エンジイン（例えば、カリチアマイシン及びエスペラミシン）ならびに非エンジイン小分子剤（例えば、ブレオマイシン、メチジウムプロピル−ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ））であってもよい。本発明による有用な他の毒素は、限定されないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ジスタマイシンＡ、シスプラチン、マイトマイシンＣ、エクテイナシジン、ズオカルマイシン／ＣＣ−１０６５、及びブレオマイシン／ペプレオマイシンを含む。他の非限定的な実施形態において、毒素は、チューブリンを破壊するように作用する物質を含む。そのような毒素は、限定されないが、リゾキシン／マイタンシン、パクリタキセル、ビンクリスチン及びビンブラスチン、コルチシン、オーリスタチン、ドラスタチン１０、ペロルシドＡ、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、及びカンプトテシン誘導体を含んでもよい。
【００５１】
他の非限定的な実施形態において、免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、ブスルファン、フタル酸カルボキシ白金、クロランブシル、クロロゾトシン、シスプラチン、クロメゾン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン、ヘプスルファム、ヒカントン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド、ナイトロジェンマスタード、ピぺラジン、ピペラジネジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、テロキシロン、テトラプラチン、トリエチレンメラミン等を含むアルキル化剤であってもよい。
【００５２】
他の非限定的な実施形態において、本発明の免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、アロコルチシン、ハリコンドリンＢ、コルチシン、コルチシン誘導体、マイタンシン、ゾキシン、タキソール、キソール誘導体、チオコルチシン、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、及び硫酸ビンクリスチンを含む有糸分裂阻害剤であってもよい。
【００５３】
他の非限定的な実施形態において、本発明の免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、
ドキソルビシン、アモナフィド、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣｌ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、ミトキサントロン、メノガリル、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール、及びルビダゾントポイソメラーゼＩ阻害剤を含んでもよい。
【００５４】
他の非限定的な実施形態において、免疫複合体の毒素部分は、限定されないが、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、アシビシン、アミノプテリン、アミノプテリン誘導体、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパルテート、ピラゾフリン、トリメトレキサート、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、アフィディコリングリシネート、５−アザ−２’−デオキシシチジン、シクロシチジン、グアナゾール、ヒドロキシウレア、イノシングリコジアルデヒド、マクベシンＩＩ、ピラゾロイミダゾール、チオグアニン、及びチオプリンを含むＲＮＡまたはＤＮＡ代謝拮抗剤であってもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態において、免疫複合体は、シュードモナス外毒素Ａに結合したヒトＥｐＣＡＭの細胞外ドメインに結合するヒト化抗体断片である。具体的には、免疫複合体は、配列番号３に示されるように、シュードモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ  ２５２−６０８アミノ酸）の切断型に融合されたＥｐＣＡＭ抗体の組換え安定化及びヒト化Ｆａｂ断片であってもよい。この免疫複合体は、癌細胞上に発現されるＥｐＣＡＭに結合することができる。一旦結合すると、免疫複合体は内部移行し、シュードモナス外毒素Ａは、細胞を死滅させるか、またはタンパク質合成を阻止し、それによって細胞死をもたらす。重要なことに、ほとんどの正常な粘膜細胞及び線維芽細胞は広くＥｐＣＡＭを発現せず、したがって免疫複合体を内部移行することができないため、それらは外毒素の潜在的な副作用から保護される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、免疫複合体は、シュードモナス外毒素Ａに付着したＦａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、シュードモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ  ２５２−６０８アミノ酸）は、配列番号１のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、シュードモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ  ２５２−６０８アミノ酸）は、配列番号２のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、シュードモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ  ２５２−６０８アミノ酸）は、配列番号１１のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、シュードモナス外毒素Ａ（ＥＴＡ  ２５２−６０８アミノ酸）は、配列番号１２のＣ末端に融合している。
【００５７】
いくつかの実施形態において、免疫複合体は、修飾ボウガニンタンパク質に付着したヒト化ＥｐＣＡＭ抗体断片であってもよく、修飾ボウガニンは、免疫応答を誘発する傾向が低い。好ましい実施形態において、修飾ボウガニンは、Ｔ細胞を活性化する傾向が低く、修飾ボウガニンは、Ｔ細胞エピトープ内の１つ以上のアミノ酸残基で修飾される。いくつかの実施形態において、修飾ボウガニンタンパク質（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）は、配列番号４に示されるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号９に示されるアミノ酸を有してもよい。いくつかの実施形態において、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号３３に示されるアミノ酸を有してもよい。いくつかの実施形態において、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号４２に示されるアミノ酸を有してもよい。いくつかの実施形態において、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号４３に示されるアミノ酸を有してもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態において、免疫複合体は、修飾ボウガニンタンパク質に付着したＦａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号１のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号２のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号１１のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号１２のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号３１のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号１２のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号３２のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有してもよく、修飾ボウガニンタンパク質は、配列番号１２のＣ末端に融合している。
【００５９】
いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号１３に示される第１のポリペプチドと、配列番号２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。第１及び第２のポリペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合によって結合されてもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号１、１１、３１、または３２から選択される第１のポリペプチドと、配列番号１６に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号１４に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号１、１１、３１、または３２から選択される第１のポリペプチドと、配列番号１７に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号３４に示される第１のポリペプチドと、配列番号２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号１、１１、３１、または３２から選択される第１のポリペプチドと、配列番号３５に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号３６に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号１、１１、３１、または３２から選択される第１のポリペプチドと、配列番号３７に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号３８に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４０に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号３９に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４１に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４４に示される第１のポリペプチドと、配列番号２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４４に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号１、１１、３１、または３２から選択される第１のポリペプチドと、配列番号４��に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４６に示される第１のポリペプチドと、配列番号２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４６に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号１、１１、３１、または３２から選択される第１のポリペプチドと、配列番号４７に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４８に示される第１のポリペプチドと、配列番号２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４８に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４９に示される第１のポリペプチドと、配列番号２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、配列番号４９に示される第１のポリペプチドと、配列番号１２に示される第２のポリペプチドとを有するＶＢ６−８４５  Ｆａｂであってもよい。
【００６０】
上記免疫複合体中の本明細書に開示される第１及び第２のポリペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合によって結合されてもよい。
【００６１】
本明細書に記載の抗体または抗体断片は、任意の手段によってエフェクター分子と複合化してもよい。例えば、抗体または抗体断片は、化学的または組換え手段によって毒素に付着させてもよい。融合体または複合体を調製するための化学的手段は、当該技術分野で既知であり、免疫複合体を調製するために用いることができる。抗体または抗体断片及び毒素を複合化するために用いられる手段は、抗体または抗体断片が標的分子に結合する能力に干渉することなく、抗体を毒素と結合させることが可能でなければならない。
【００６２】
一実施形態において、抗体及び毒素は、両方ともタンパク質であり、当該技術分野で周知の技術を用いて複合化することができる。２つのタンパク質を複合化することができる、当該技術分野で開示されている数百個の架橋剤が存在する。架橋剤は、一般的に、抗体または毒素上で利用可能であるか、または挿入される反応性官能基に基づいて選択される。さらに、反応基が存在しない場合、光活性化可能な架橋剤が使用され得る。特定の場合において、抗体と毒素の間にスペーサーを含むことが望ましい場合がある。当該技術分野で既知の架橋剤は、ホモ二官能性剤：グルタルアルデヒド、ジメチルアジピミデート及びビス（ジアゾベンジジン）ならびにヘテロ二官能性剤：ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド及びスルホ−ｍマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドを含む。
【００６３】
エフェクター分子を抗体断片にカップリングするために使用され得る他の架橋剤は、ＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジド及びＴＰＭＰＨ（（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプト−プロピオノヒドラジド）を含む。ＴＰＣＨ及びＴＰＭＰＨは、緩和な過ヨウ素酸処理によって予め酸化しておいた糖タンパク質の糖鎖で反応し、架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸によって生じたアルデヒドとの間でヒドラゾン結合を形成する。ヘテロ二官能性架橋剤ＧＭＢＳ（Ｎ−γ−マリミドブチリルオキシ）−スクシンイミド）及びＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン）は第一級アミンと反応し、そのようにしてマレイミド基を成分上に導入する。このマレイミド基は、その後、以前に述べた架橋剤によって導入され得る他の成分上のスルフヒドリルと反応し、そのようにして成分間に安定なチオエーテル結合を結合することができる。成分間の立体障害がいずれかの成分の活性を妨げる場合、成分間に長いスペーサーアームを導入し、かつｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等の誘導体を含む架橋剤を使用することができる。このように、使用され得る好適な架橋剤が豊富に存在し、それらの各々は、最適な免疫複合体の生成に及ぼす効果に依存して選択される。
【００６４】
抗体−エフェクター分子融合タンパク質はまた、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されてもよい。そのような場合、抗体をコードするＤＮＡ配列は、毒素等のエフェクター分子をコードするＤＮＡ配列に融合され、その結果としてキメラＤＮＡ分子を生じる。キメラＤＮＡ配列は、抗体−エフェクター分子融合タンパク質を発現する宿主細胞にトランスフェクトされる。融合タンパク質は、細胞培養物から回収して、当該技術分野で既知の技術を用いて精製することができる。
【００６５】
免疫複合体の抗体部分は、免疫グロブリン由来であってもよく、すなわち、免疫グロブリン（または抗体）である出発分子まで追跡することができる。例えば、抗体は、当該技術分野で既知の標準的な技術を用いた免疫グロブリン足場の修飾によって生成されてもよい。別の非限定的な実施例において、免疫グロブリンドメイン（例えば、可変重鎖及び／または軽鎖）は、非免疫グロブリン足場に結合されてもよい。さらに、抗体は、限定されないが、化学反応または遺伝的設計によって開発されてもよい。したがって、非限定的な実施例において、免疫複合体は、肝癌細胞に特異的に結合する免疫グロブリン由来ポリペプチド（例えば、抗体ライブラリーから選択される抗体）またはその変異体、及び毒素またはその変異体を含んでもよい。そのような免疫グロブリンポリペプチドは、標的腫瘍関連分子へのそれらの結合特性に影響を及ぼすように、または例えば、それらの物理的特性を改善するように、再設計することができる。
【００６６】
免疫複合体の抗体部分は、免疫グロブリンに基づいている必要はない。したがって、免疫複合体は、肝癌細胞に特異的に結合する非免疫グロブリンポリペプチド（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））またはその変異体、及び毒素またはその変異体を含んでもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、標的腫瘍関連分子に結合するように設計することができる。さらに、非免疫グロブリンポリペプチドは、所望の親和性または結合活性に遺伝子操作することができ、また、極端なｐＨ範囲及び比較的高い温度を含む様々な物理的条件に耐えるように設計することができる。
【００６７】
実際に、薬学的組成物における使用では、生理的条件（例えば、ペプチターゼの存在下で３７℃）で比較的長い半減期を有する非免疫グロブリンポリペプチドの設計が有利であり得る。さらに、そのような分子、またはそれらの変異体は、良好な溶解性、小さなサイズ、適切なフォールディングを示す場合があり、容易に入手可能な、低コストの細菌系において発現させることができ、したがって、商業的に妥当な量で製造することができる。非免疫グロブリンポリペプチドを設計する能力は、当業者の技術の範囲内である。
【００６８】
エピトープ結合ポリペプチドの例は、限定されないが、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むリガンド、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含む反復タンパク質ドメインのアセンブリに基づく結合分子、アンキリン反復等を含む。
【００６９】
他の非限定的な実施形態において、免疫複合体は、配列番号３に示されるシュードモナス外毒素Ａと少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一なアミノ酸配列を有する変異体を含む。
【００７０】
他の実施形態において、免疫複合体は、配列番号４に示されるボウガニンタンパク質と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一なアミノ酸配列を有する変異体を含む。
【００７１】
使用方法
本明細書に記載の抗体、抗体断片、及び免疫複合体を使用する方法が、本明細書に開示される。上記実施形態の各々において、使用される抗体、抗体断片、及び／または免疫複合体は、本明細書に記載の脱免疫化抗体／抗体断片のいずれを含んでもよく、抗体／抗体断片は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態において、癌に罹患した対象を治療する方法は、治療有効量の抗体を投与することを含んでもよく、抗体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、多量体、及びそれらの任意の組み合わせ等の抗体断片であってもよい。抗体または抗体断片は、本明細書に開示される脱免疫化抗体または脱免疫化抗体断片のいずれであってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体に付着したエフェクター分子（集合的に免疫複合体）をさらに含む。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、エフェクター分子は、放射性同位体、抗悪性腫瘍薬、免疫調節物質、生物学的応答調節物質、レクチン、毒素、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、抗体及び免疫複合体は、肺癌、胃癌、腎癌、甲状腺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、肝細胞癌、食道、膵臓、及び前立腺癌等の癌を治療するために使用されてもよい。任意の上皮細胞を起源とする癌もまた、これらの免疫複合体及び抗体によって標的とされ得る。
【００７４】
好ましい非限定的な実施形態において、癌は、抗体または免疫複合体の癌部位への直接投与による治療を受け入れられる。例えば、標的腫瘤は、皮膚の表面近くにあってもよい。別の例において、患部組織は、嚢胞によって被包されていてもよいか、または、限定されないが、内腔を含む実質的に囲い込まれた体腔に見出される。他の実施形態において、癌は、抗体または免疫複合体の静脈内投与による治療を受け入れられる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、癌を診断するためのキットは、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有する抗体またはその断片、及びその使用のための指示書を含んでもよい。いくつかの実施形態において、癌を診断するためのキットは、免疫複合体（該免疫複合体は、エフェクター分子に付着した、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有する抗体またはその断片を含む）、及びその使用のための指示書を含んでもよい。抗体または抗体断片は、本明細書に開示される脱免疫化抗体または脱免疫化抗体断片のいずれであってもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、癌を検出するためのキットは、抗ＥｐＣＡＭ抗体断片を含んでもよく、好ましくは、標識抗Ｉｇ抗体、例えば、アルカリホスファターゼ等の酵素に結合した抗Ｉｇ抗体、または放射標識抗Ｉｇ抗体を含有する試薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、抗ＥｐＣＡＭ抗体断片は、発色団、フルオロフォア、または放射標識リガンドに付着していてもよい。
【００７７】
本明細書に開示される免疫複合体及び抗体は、対象における検出または監視のためにも使用され得る。いくつかの実施形態において、対象における癌を検出または監視する方法は、対象から採取した試験試料を抗体と接触させて抗体−抗原複合体を形成することであって、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、形成することと、試験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定することと、その結果を対照に対して正規化することと、を含んでもよい。試験試料は、血清、リンパ液、腹水滲出液、細胞間液、組織溶解液、唾液、組織切片、細胞、生検試料等であってもよい。抗体−抗原複合体は、例えば、ドットブロット法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、またはサンドイッチＥＬＩＳＡ法等の任意の手段によって検出され得る。また、抗体−抗原複合体は、ビオチン結合抗Ｉｇ抗体との反応、次いでアビジン結合材料との反応等の多段階反応による使用によって検出することもできる。他の実施形態において、対象における癌を検出または監視する方法は、対象から採取した試験試料を免疫複合体と接触させて複合体を形成することであって、免疫複合体は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有する抗体を含む、形成することと、試験試料中の複合体の量を測定することと、その結果を対照に対して正規化することとを含んでもよい。
【００７８】
別の実施形態において、対象における癌を検出または監視する方法は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む抗体を対象に投与することと、抗体を検出することとを含んでもよい。さらなる実施形態において対象における癌を検出または監視する方法は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを有する抗体を含む免疫複合体を対象に投与することと、免疫複合体を検出することとを含んでもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体及び免疫複合体は、対象における腫瘍を撮像するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、対象における腫瘍を撮像する方法は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む抗体または抗体断片を対象に投与することと、インビボ画像診断によって抗体または抗体断片を検出することとを含んでもよい。抗体または抗体断片は、本明細書に開示される脱免疫化抗体または脱免疫化抗体断片のいずれであってもよく、エフェクター分子に付着していてもよい。いくつかの実施形態において、対象における腫瘍を撮像する方法は、配列番号１、配列番号１１、配列番号３１、または配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖とを有する抗体を含む免疫複合体を対象に投与することと、インビボ画像診断によって免疫複合体を検出することとを含んでもよい。免疫複合体は、エフェクター分子をさらに含んでもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態において、癌の検出または腫瘍の撮像に用いられるエフェクター分子は、放射性同位体、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、酵素、金属イオン、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。インビボ画像診断は、近赤外蛍光画像法（ＮＩＲＦ）、蛍光反射率画像法（ＦＲＩ）、蛍光媒介断層撮影法（ＦＭＴ）、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン断層・コンピュータ断層複合撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）、ポジトロン断層・磁気共鳴画像複合撮影（ＰＥＴ／ＭＲＩ）、及びそれらの任意の組み合わせ等の、当該技術分野で既知のいずれの技法によって行われてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本方法は、対象のインビボ画像診断の後に、腫瘍、または臓器の一部等の癌組織を切除することをさらに含んでもよい。外科的切除は、当該技術分野で既知の任意の技術によって行われてもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、腫瘍切除の完全性を測定するために、切除後に抗体または免疫複合体を投与することをさらに含んでもよい。
【００８２】
特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、放射性トレーサーで標識される。放射性トレーサーは、典型的には、容易な検出及び測定を可能にする放射性同位体を含有する物質である。多数の異なる形態の水素、炭素、亜リン酸、硫黄、及びヨウ素が、医療診断において一般的に使用される。本発明の抗体は、任意の好適な放射性トレーサーで標識され得る。好ましい放射性トレーサーは、医用画像診断のための放射性トレーサーを含む。使用される一般的な放射性トレーサーは、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、９９ｍＴｃ、ｍＩｎ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔ１、及び９０Ｙを含む。好ましくは、本明細書に開示される抗体は、１８Ｆ、１２３／１３１Ｉ、ｍＩｎ、９０Ｙ、または９９ｍＴｃで標識される。
【００８３】
本発明の抗体はまた、当該技術分野で既知の任意の蛍光プローブで標識されてもよい。非限定的な例は、フルオレセイン、アミノクマリン酢酸、テトラメチルコーダミンイソシアネート、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ  ３．０、Ｃｙ  ５．０、緑色蛍光タンパク質等を含む。
【００８４】
別の好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体は、造影剤で標識される。造影剤は、ヒトまたは動物の体内の臓器、体液、または解剖学的構造のコントラストを増加させるかまたは修正するために使用される物質である。本発明の抗体は、任意の好適な造影剤で標識されてもよい。好ましい造影剤は、医用画像診断のための造影剤を含む。好ましくは、本発明の抗体は、超常磁性造影剤または常磁性造影剤等のＭＲＩ（磁気共鳴画像法）造影剤で標識される。ＭＲＩ造影剤は、典型的にはキレート化金属またはコロイドである。最も一般的に使用される造影剤は、ガドリニウム−ＤＴＰＡ等のガドリニウム（Ｇｄ）ベースの造影剤、超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯ）及び超微小超常磁性酸化鉄粒子（ＵＳＰＩＯ）等の酸化鉄ベースの造影剤、ならびにＭｎ−ＤＰＤＰ等のマンガンキレートに基づく常磁性造影剤を含む。
【００８５】
本発明はまた、手術、及び特定の非限定的な実施形態において、癌を治療するための手術の前、最中、または後に、有効量の免疫複合体を投与することを含む、術後合併症のリスクを低減するための方法も提供する。
【００８６】
本発明はまた、それを必要とする患者に有効量の免疫複合体を直接投与することを含む、癌の発生を予防する、再発を予防もしくは遅延させる、または再発率を低下させるための方法も提供する。
【００８７】
本発明はまた、本発明の免疫複合体を投与することを含む、腫瘍または癌を１つ以上の他の抗癌剤に対して感作させるための方法も提供する。非限定的な実施形態において、他の抗癌剤は、他のＥｐＣＡＭを標的とする免疫複合体を含む。別の非限定的な実施形態において、他の抗癌剤は放射線を含む。他の抗癌剤は、免疫複合体の投与の前、それと重複して、同時に、及び／または後に投与されてもよい。同時に投与される場合、免疫複合体及び他の抗癌剤は、単一の製剤または別々の製剤で投与されてもよく、別々の場合、任意選択的に、異なる投与様式が用いられてもよい。したがって、１つ以上の免疫複合体及び１つ以上の他の抗癌剤の組み合わせは、腫瘍または癌と闘うように相乗的に作用し得る。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、１つ以上の抗癌剤と併用投与、同時投与、または逐次投与されてもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態において、抗癌剤は、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、酢酸メゲストロール、アナスフロゾール、レトラゾール、ボラゾール、エクセメスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸ゴセレリン、ルプロリド、フィナステリド、ハーセプチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテファン、ビンクリスチン、タキソール、タキソテール、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、イリノテカン、トポテカン、エポチロン、イレッサ、タルセバ、ソラフェニブ、血管新生抑制剤、ＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイトカイン、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２阻害剤、及びモノクローナル抗体であってもよい。
【００８９】
別の実施形態において、放射線療法の計画と組み合わせて免疫複合体を投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。治療法はまた、手術及び／または化学療法も含み得る。例えば、免疫複合体は、放射線療法、ならびにシスプラチン（プラチノール）、フルオロウラシル（５−ＦＵ、アドルシル）、カルボプラチン（パラプラチン）、及び／またはパクリタキセル（タキソール）と組み合わせて投与されてもよい。免疫複合体を用いた治療は、より低い線量の放射線に応じた使用及び／またはより少ない頻度の放射線治療を可能にし得、例えば、潜在的に望ましくない体重減少または脱水症状をもたらす嚥下機能を妨害する重度の咽頭痛の発生頻度を低減し得る。
【００９０】
併用療法のための薬学的組成物はまた、限定されないが、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン）、アスパラギナーゼ、ＢＣＧタンパク質、ジフテリア毒素、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、有糸分裂阻害剤、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、抗ヒスタミン剤、制吐剤等も含み得る。
【００９１】
実際に、そのような治療を必要とする患者への有効量の免疫複合体の直接投与は、臨床的に有意な有効性を有する別の抗癌剤の用量を結果的に低減し得る。低減された用量の他の抗癌剤のそのような有効性は、免疫複合体を用いた投与がないと観察され得ない。したがって、本発明は、低減された用量の１つ以上の他の抗癌剤を投与することを含む、腫瘍または癌を治療するための方法を提供する。
【００９２】
さらに、そのような治療を必要とする患者への免疫複合体を含む併用療法は、標準的な治療計画の期間またはサイクルの数と比較した場合に、比較的短い治療期間を可能にし得る。したがって、本発明は、１つ以上の他の抗癌剤を比較的短い期間及び／またはより少ない治療サイクルで投与することを含む、腫瘍または癌を治療するための方法を提供する。
【００９３】
このように、本発明によれば、免疫複合体及び別の抗癌剤を含む併用療法は、癌治療全体の毒性（すなわち、副作用）を軽減し得る。例えば、単剤療法または他の併用療法と比較した場合の毒性の軽減は、低減された用量の免疫複合体及び／または他の抗癌剤を送達した場合、及び／またはサイクルの期間（すなわち、単回投与の期間もしくは一連のそのような投与の期間）を短縮した場合、及び／またはサイクルの数を減少させた場合に、観察され得る。
【００９４】
本発明の抗体または免疫複合体を用いた癌治療の臨床転帰は、医師等の関連技術分野の当業者によって容易に認識される。例えば、癌の臨床マーカーを測定するための標準的な医学的検査は、治療の有効性の有力な指標であり得る。そのような検査は、理学的検査、性能尺度、疾患マーカー、１２誘導心電図、腫瘍測定、組織生検、細胞検査、細胞診、腫瘍計算の最長直径、Ｘ線写真術、腫瘍のデジタル画像診断、バイタルサイン、体重、有害事象の記録、感染エピソードの評価、併用薬の評価、疼痛評価、血液または血清化学、血清マーカーの検出、尿検査、ＣＴスキャン、及び薬物動態分析を含んでもよい。さらに、免疫複合体及び別の抗癌剤を含む併用療法の相乗効果は、単剤療法を受けている患者との比較試験によって決定され得る。
【００９５】
１サイクルの間に投与される抗体または免疫複合体の有効用量は、投与様式に従って変化する。直接投与（例えば、腫瘍内注射）は、免疫複合体の全身性の静脈内投与と比較して、はるかに少ない総全身用量の免疫複合体を必要とする。局所投与が全身用量をより少なくし得ること、及びこれらの状況において、結果的にもたらされる免疫複合体の低い循環血漿量が予想及び所望されることは、当業者には明白であろう。
【００９６】
一実施形態において、抗体または免疫複合体の直接投与による有効用量は、約１０〜３０００、２０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、６０〜５００、７０〜４００、８０〜３００、９０〜２００、または１００〜１５０マイクログラム／腫瘍／日の範囲であってもよい。他の実施形態において、用量は、約１０〜２０、２１〜４０、４１〜８０、８１〜１００、１０１〜１３０、１３１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２８０、２８１〜３５０、３５１〜５００、５０１〜１０００、１００１〜２０００、または２００１〜３０００マイクログラム／腫瘍／日の範囲であってもよい。特定の実施形態において、用量は、少なくとも約２０、４０、８０、１３０、２００、２８０、４００、５００、７５０、１０００、２０００、または３０００マイクログラム／腫瘍／日であってもよい。
【００９７】
他の実施形態において、抗体または免疫複合体の投与は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／用量〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／用量の投与量である。
【００９８】
別の実施形態において、抗体または免疫複合体の有効用量は、約１００〜５０００、２００〜４０００、３００〜３０００、４００〜２０００、５００〜１０００、６００〜９００、または７００〜１５００マイクログラム／腫瘍／月の範囲であってもよい。他の実施形態において、用量は、約１００〜１９９、２００〜３９９、４００〜６４９、６５０〜９９９、１０００〜１７９９、１８００〜２４９９、２５００〜３４９９、３５００〜４９９９、５０００〜７４９９、７５００〜１００００、または１０００１〜２００００マイクログラム／腫瘍／月の範囲であってもよい。特定の実施形態において、用量は、少なくとも約１００、２００、４００、６５０、１０００、１４００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、７５００、１００００、または２００００マイクログラム／腫瘍／月であってもよい。
【００９９】
別の実施形態において、抗体または免疫複合体は、安全性試験において確立された最大耐性用量と等しいかまたはそれよりも少ない１サイクル当たりの総用量で腫瘍内に投与されるが、投与量は腫瘍体積に関連して正規化される。例えば、対象は、１マイクログラム／ｃｍ３〜５００マイクログラム／ｃｍ３腫瘍、または１４ピコモル〜７ナノピコモル／ｃｍ３腫瘍組織に達するのに十分な用量を投与される。用量は、腫瘍体積の約２０〜５０％を超過しない体積で投与される。免疫複合体は、好適な塩溶液に希釈される。例えば、推定体積３ｃｍ３の腫瘍で、１４ピコモル（１マイクログラム／ｃｍ３）の標的用量、及び腫瘍の約１／３の最大注入相対体積の場合、３マイクログラムの免疫複合体が約１ｍｌの希釈剤に希釈される。
【０１００】
１サイクルの間に抗体または免疫複合体と一緒に投与される別の抗癌剤の有効用量も、投与様式に従って変化する。１つ以上の抗癌剤が、腫瘍内に、または他の投与様式によって送達され得る。典型的には、化学療法剤は全身投与される。標準的な投与量及び治療計画は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅの最新版を参照のこと）。
【０１０１】
例えば、一実施形態において、追加の抗癌剤は、約２００〜４０００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でダカルバジンを含む。好ましい実施形態において、用量は、７００〜１０００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲である。
【０１０２】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２５〜５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でフルダラビンを含む。
【０１０３】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２００〜２０００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含む。
【０１０４】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約１．５〜７．５ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でドセタキセルを含む。
【０１０５】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜１５ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でパクリタキセルを含む。
【０１０６】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜２０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でシスプラチンを含む。
【０１０７】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜２０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量で５−フルオロウラシルを含む。
【０１０８】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２〜８ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でドキソルビシンを含む。
【０１０９】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約４０〜１６０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でエピポドフィロトキシンを含む。
【０１１０】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５０〜２００ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量でシクロホスファミドを含む。
【０１１１】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、または１２５〜１５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でイリノテカンを含む。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、抗癌剤は、約３．７〜５．４、５．５〜７．４、７．５〜１１、または１１〜１８．５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でビンブラスチンを含む。
【０１１３】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０．７〜１．４、または１．５〜２ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でビンクリスチンを含む。
【０１１４】
さらに別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約３．３〜５、５〜１０、１０〜１００、または１００〜１０００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でメトトレキサートを含む。
【０１１５】
抗体または免疫複合体との併用療法は、癌または腫瘍を追加の抗癌剤の投与に対して感作させることができる。したがって、本発明は、低減された用量の抗癌剤の前に、後に、またはそれと同時に有効量の抗体または免疫複合体を投与することを含む、癌を予防する、治療する、及び／または癌の再発を予防するための併用療法を企図する。例えば、免疫複合体を用いた初期の治療は、ある用量の抗癌剤を用いたその後の曝露に対する癌または腫瘍の感受性を増加させ得る。この用量は、抗癌剤が単独でまたは抗体もしくは免疫複合体の非存在下で投与される場合の標準的投与量の低い範囲に近いかまたはそれよりも低い。同時投与される場合、抗体または免疫複合体は、抗癌剤とは別々に、また任意選択的に、異なる投与様式によって投与されてもよい。
【０１１６】
したがって、一実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜１０、１１〜２０、２１〜４０、または４１〜７５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、シスプラチン、例えば、ＰＬＡＴＩＮＯＬまたはＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ）を含む。
【０１１７】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２〜３、４〜８、９〜１６、１７〜３５、または３６〜７５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、カルボプラチン、例えば、ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ）を含む。
【０１１８】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０．２５〜０．５、０．６〜０．９、１〜２、３〜５、６〜１０、１１〜２０、または２１〜４０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量で、シクロホスファミド、例えば、ＣＹＴＯＸＡＮ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を含む。
【０１１９】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０．５〜１、２〜４、５〜１０、１１〜２５、２６〜５０、または５１〜１００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、シタラビン、例えば、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｐｊｏｈｎ）を含む。別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、シタラビンリポソーム、例えば、ＤＥＰＯＣＹＴ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を含む。
【０１２０】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約１５〜２５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲、または約０．２〜２ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量で、ダカルバジン、例えば、ＤＴＩＣまたはＤＴＩＣＤＯＭＥ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．）を含む。
【０１２１】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０．１〜０．２、０．３〜０．４、０．５〜０．８、または０．９〜１．５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、トポテカン、例えば、ＨＹＣＡＭＴＩＮ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）を含む。
【０１２２】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約５〜９、１０〜２５、または２６〜５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、イリノテカン、例えば、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）を含む。
【０１２３】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２．５〜５、６〜１０、１１〜１５、または１６〜２５ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、フルダラビン、例えば、ＦＬＵＤＡＲＡ（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む。
【０１２４】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２００〜２０００ｍｇ／ｍ２／サイクル、３００〜１０００ｍｇ／ｍ２／サイクル、４００〜８００ｍｇ／ｍ２／サイクル、または５００〜７００ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含む。
【０１２５】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約６〜１０、１１〜３０、または３１〜６０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、ドセタキセル、例えば、タキソテール（Ｒｈｏｎｅ  Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）を含む。
【０１２６】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約１０〜２０、２１〜４０、４１〜７０、または７１〜１３５ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量で、パクリタキセル、例えば、タキソール（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を含む。
【０１２７】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／サイクル、１〜４ｍｇ／ｋｇ／サイクル、または２〜３ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量で５−フルオロウラシルを含む。
【０１２８】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約２〜４、５〜８、９〜１５、１６〜３０、または３１〜６０ｍｇ／ｋｇ／サイクルの範囲の用量で、ドキソルビシン、例えば、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｐｊｏｈｎ）、ＤＯＸＩＬ（Ａｌｚａ）、ＲＵＢＥＸ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を含む。
【０１２９】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約３．５〜７、８〜１５、１６〜２５、または２６〜５０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、エトポシド、例えば、ＶＥＰＥＳＩＤ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）を含む。
【０１３０】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０．３〜０．５、０．６〜０．９、１〜２、または３〜３．６ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、ビンブラスチン、例えば、ＶＥＬＢＡＮ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）を含む。
【０１３１】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、または０．７ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量で、ビンクリスチン、例えば、ＯＮＣＯＶＩＮ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）を含む。
【０１３２】
別の実施形態において、追加の抗癌剤は、約０．２〜０．９、１〜５、６〜１０、または１１〜２０ｍｇ／ｍ２／サイクルの範囲の用量でメトトレキサートを含む。
【０１３３】
別の実施形態において、免疫複合体は、限定されないが、リツキサン、リツキシマブ、キャンパス−１、ゲムツツマブ、及びトラスツツマブを含む、少なくとも１つの他の免疫療法剤と組み合わせて投与される。
【０１３４】
別の実施形態において、免疫複合体は、限定されないが、アンジオスタチン、サリドマイド、クルングル５、エンドスタチン、セルピン（セルピンプロテアーゼ阻害剤）、フィブロネクチンの２９ｋＤａ  Ｎ末端及び４０ｋＤａ  Ｃ末端タンパク質分解断片、プロラクチンの１６ｋＤａタンパク質分解断片、血小板因子−４の７．８ｋＤａタンパク質分解断片、血小板因子−４の断片に対応する１３アミノ酸ペプチド、コラーゲンＩの断片に対応する１４アミノ酸ペプチド、トロンボスポンジンＩの断片に対応する１９アミノ酸ペプチド、ＳＰＡＲＣの断片に対応する２０アミノ酸ペプチド、及びその薬学的に許容される塩を含むその変異体を含む１つ以上の抗血管新生剤と組み合わせて投与される。
【０１３５】
別の実施形態において、抗体または免疫複合体は、限定されないが、リンホカイン、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子様サイトカイン、リンホトキシン、インターフェロン、マクロファージ炎症性タンパク質、顆粒球単球コロニー刺激因子、インターロイキン（限定されないが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−１８を含む）、及びその薬学的に許容される塩を含むその変異体を含む１つ以上のサイトカインと組み合わせて投与される。
【０１３６】
さらに別の実施形態において、抗体または免疫複合体は、限定されないが、自己細胞または組織、非自己細胞または組織、癌胎児性抗原、α−フェトプロテイン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＢＣＧ生ワクチン、メラノサイト系タンパク質、及び変異型腫瘍特異的抗原を含む癌ワクチンと組み合わせて投与される。
【０１３７】
さらに別の実施形態において、抗体または免疫複合体は、ホルモン療法に関連して投与される。ホルモン治療薬は、限定されないが、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、タモキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ））及びステロイド（例えば、デキサメサゾン、レチノイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）を含む。
【０１３８】
さらに別の実施形態において、抗体または免疫複合体は、癌を治療または予防するための遺伝子治療プログラムに関連して投与される。
【０１３９】
さらに別の実施形態において、ＥｐＣＡＭを標的とする抗体または免疫複合体は、対象とする腫瘍細胞におけるＥｐＣＡＭの発現を増加させる１つ以上の薬剤と組み合わせて投与される。ＥｐＣＡＭの発現は、好ましくは、より多くの数のＥｐＣＡＭ分子が腫瘍細胞表面上で発現されるように増加される。例えば、薬剤は、ＥｐＣＡＭ抗原エンドサイトーシスの正常な周期を阻害し得る。そのような併用療法は、ＥｐＣＡＭを標的とする免疫複合体単独の、または他の抗癌剤もしくは放射線治療と組み合わせた臨床的有効性を向上させ得る。特定の非限定的な実施形態において、腫瘍細胞におけるＥｐＣＡＭの発現を増加させる薬剤は、ビノレルビン酒石酸塩（ナベルビン）及び／またはパクリタキセル（タキソール）である。
【０１４０】
併用療法は、このように、投与される免疫複合体及び／または追加の抗癌剤に対する癌または腫瘍の感受性を増加させることができる。このようにして、より短い治療サイクルが可能であり得、それによって毒性事象を減少させる。したがって、本発明は、有効量の免疫複合体及び少なくとも１つの他の抗癌剤を、それを必要とする患者に短い治療サイクルの間投与することを含む、癌を治療または予防するための方法を提供する。サイクル期間は、約１〜３０、２〜２７、３〜１５、４〜１２、５〜９、または６〜８日の範囲であってもよい。サイクル期間は、使用される特定の抗癌剤に従って変化してもよい。本発明はまた、連続もしくは不連続投与、または数回の部分的投与に分割された１日の用量も企図する。特定の抗癌剤のための適切なサイクル期間は当業者によって認識され、本発明は、各抗癌剤の最適な治療スケジュールの継続的評価を企図する。当業者のための特定のガイドラインは当該技術分野で既知である。
【０１４１】
代替として、より長い治療サイクルが所望される場合もある。したがって、サイクル期間は、約１０〜５６、１２〜４８、１４〜２８、１６〜２４、または１８〜２０日の範囲であってもよい。サイクル期間は、使用される特定の抗癌剤に従って変化してもよい。
【０１４２】
投与経路
本明細書に記載の抗体及び／または免疫複合体は、任意の好適な経路を介して患者に投与され得る。抗体及び／または免疫複合体は、脈管系内への注射によって、または臓器内への注射によって投与されてもよい。好ましい投与経路は、非経口、血管内及び／または静脈内注射を含む。非経口投与は、皮下、筋肉内、腹腔内、体腔内、くも膜下腔内、腫瘍内、経皮、及び静脈内注射を含む。好ましい実施形態において、抗体及び／または免疫複合体は、ボーラスとして静脈内に投与されるか、または一定期間にわたる持続点滴によって投与される。他の実施形態において、抗体及び／または免疫複合体は、癌部位に直接投与されてもよい。
【０１４３】
本発明の免疫複合体及び抗体は、それらが活性である任意の経路によって従来の様式で投与することができる。投与は、全身性、非経口的、局所的、または経口的であり得る。例えば、投与は、限定されないが、非経口、経口、頬側、もしくは眼内経路、または膣内、吸入、デポー注射、またはインプラントであり得る。したがって、本発明の抗体／免疫複合体のための投与様式（単独で、または他の医薬品と組み合わせた）は、限定されないが、舌下、注射液（皮下にまたは筋肉内に注射される短時間作用型、デポー、インプラント、及びペレット形態を含む）、膣クリーム、坐剤、ペッサリー、膣リング、肛門坐剤、子宮内デバイス、ならびにパッチ及びクリーム等の経皮形態であり得る。
【０１４４】
本発明の一態様によれば、抗体もしくは免疫複合体及び／または他の抗癌剤は、直接投与によって患者に送達される。したがって、免疫複合体及び／または他の抗癌剤は、限定されないが、腫瘍への１回以上の直接注入によって、腫瘍への連続的または不連続的灌流によって、免疫複合体の貯蔵容器の導入によって、腫瘍への徐放性装置の導入によって、腫瘍への徐放性製剤の導入によって、及び／または腫瘍上への直接的な塗布によって投与されてもよい。腫瘍への投与様式による、腫瘍の領域へのまたは後に腫瘍の領域に直接流入する血管もしくはリンパ管への免疫複合体及び／または他の抗癌剤の導入もまた企図される。各場合において、薬学的組成物は、少なくともエンドポイントに達するのに十分な量で投与され、必要であれば、薬学的に許容される担体を含む。
【０１４５】
抗体または免疫複合体は、腫瘍内に投与され得る一方で、任意の他の抗癌剤は、他の投与様式（例えば、静脈内）によって患者に送達され得ることが企図される。また、複数の抗癌剤が患者に送達されることが意図される場合、免疫複合体、及び他の抗癌剤のうちの１つ以上は、腫瘍内に送達されてもよく、一方で他の抗癌剤は、他の投与様式（例えば、静脈内及び経口）によって送達されてもよい。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、または安定剤とであってもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載の免疫複合体と、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、または安定剤とであってもよい。本発明による免疫複合体は、薬学的組成物または薬物中に含まれてもよい。直接投与に適合する薬学的組成物は、限定されないが、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び組成物を意図するレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質をさらに含有し得る、凍結乾燥粉末または水性もしくは非水性の滅菌注射液もしくは懸濁液を含む。そのような組成物中に存在し得る他の成分は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、及び植物油を含む。即時注射液及び懸濁液は、滅菌された粉末、顆粒、及び錠剤から調製されてもよい。免疫複合体は、例えば、限定ではないが、患者に投与する前に滅菌水または生理食塩水で再構成される凍結乾燥粉末として供給されてもよい。
【０１４７】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬学的に許容される好適な担体は、薬学的組成物の生物活性の効果に干渉しない、本質的に化学的に不活性な無毒性の組成物を含む。好適な薬学的担体の例は、限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（ｌ（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスホチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びリポソームを含む。そのような組成物は、患者に対する直接投与の形態を提供するために、好適な量の担体と一緒に治療有効量の化合物を含有するべきである。
【０１４８】
別の実施形態において、薬学的組成物は、抗体または免疫複合体及び１つ以上の追加の抗癌剤を、任意選択的に薬学的に許容される担体中に含む。
【０１４９】
組成物は、限定されないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもの等の遊離アミノ基で形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するもの等の遊離カルボキシル基で形成されるものを含む、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【０１５０】
本発明の種々の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、手術中の局所点滴、局所的塗布（例えば、術後の創傷包帯と併せた）、注射、カテーテルの手段、坐剤の手段、またはインプラントの手段によって、腫瘍（複数可）の領域に直接投与される。インプラントは、シラスティック膜等の膜または繊維を含む、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状材料であってもよい。坐剤は、一般的に０．５重量％〜１０重量％の範囲の活性成分を含有する。
【０１５１】
他の実施形態において、制御放出システムは、標的腫瘍に近接して配置することができる。例えば、マクロポンプは、制御用量を腫瘍の領域に直接送達することができ、それによって薬学的組成物のタイミング及び濃度を微調整する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、薬学的担体は、限定されないが、結合剤、コーティング、崩壊剤、増量剤、希釈剤、香味剤、着色剤、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、吸着材、甘味剤、共役リノール酸（ＣＬＡ）、ゼラチン、蜜ろう、精製水、グリセロール、及び魚油または大豆油等を含むがこれらに限定されない任意の種類の油を含んでもよい。抗体／免疫複合体の薬学的組成物はまた、好適な固相またはゲル相の担体または賦形剤も含むことができる。そのような担体または賦形剤の例は、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、及びポリマー、例えば、ポリエチレングリコール等を含む。
【０１５３】
経口投与の場合、免疫複合体及び抗体は、これらの免疫複合体／抗体を、当該技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明の免疫複合体を、治療される患者による経口摂取のための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー等として製剤化することを可能にする。経口的使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤を添加し、任意選択的に、必要に応じて、好適な補助剤を添加した後に、得られた混合物を破砕して顆粒の混合物を処理して錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。好適な賦形剤は、限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、及びソルビトールを含む糖等の増量剤；限定されないが、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等のセルロース調製物を含む。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム等の、崩壊剤が添加されてもよい。
【０１５４】
糖衣錠コアは、好適なコーティングとともに提供され得る。この目的のために、濃縮糖液が使用されてもよく、それは、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶剤、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を任意選択的に含有することができる。異なる組み合わせの抗体／免疫複合体の用量を特定するためまたは特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
【０１５５】
経口的に使用することができる薬学的調製物は、限定されないが、ゼラチンでできたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチン及びグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤でできた密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、例えば、ラクトース等の増量剤、例えば、デンプンなどの結合剤、及び／または例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ならびに任意選択的に安定剤と混合された活性成分を含有することができる。軟カプセルでは、免疫複合／抗体を、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール等の好適な液体に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤が添加されてもよい。経口投与のための全ての製剤は、そのような投与に好適な投与量であるべきである。
【０１５６】
頬側投与の場合、組成物は、従来の様式で製剤化された、例えば、錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることができる。
【０１５７】
吸入による投与の場合、本発明による使用のための組成物は、好適な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスに応じた使用により、加圧パックまたは噴霧吸入器からエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって投薬単位を決定することができる。免疫複合体／抗体と好適な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンとの粉末混合物を含有する、吸入器または注入器に使用するための、例えば、ゼラチンのカプセル及びカートリッジを製剤化することができる。
【０１５８】
本発明の組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または滞留浣腸等の直腸組成物に製剤化することもできる。
【０１５９】
上記の製剤に加えて、本発明の組成物はまた、デポー調製物としても製剤化することができる。そのような長時間作用型の製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与することができる。
【０１６０】
デポー注射は、約１〜約６ヶ月、またはそれよりも長い間隔で投与され得る。したがって、例えば、免疫複合体／抗体は、適切なポリマー性もしくは疎水性材料（例えば、許容される油に中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として、製剤化することができる。
【０１６１】
経皮投与では、本発明の組成物は、例えば、貼付剤に塗布され得るか、または結果的に臓器に供給される経皮治療システムによって適用され得る。
【０１６２】
本発明の組成物はまた、例えば、アジュバント、プロテアーゼ阻害剤、または他の適合する薬物もしくは化合物等の他の活性成分と組み合わせて投与することもでき、そのような組み合わせは、本明細書に記載の方法の所望の効果を達成する上で望ましいかもしくは有利であると考えられる。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、崩壊剤成分は、クロスカルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、クロスポビドン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、食用酸及びアルカリ炭酸塩成分に基づく発泡系、クレー、タルク、デンプン、予備ゼラチン化デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、セルロースフロック、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ケイ酸カルシウム、金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、またはリン酸カルシウムのうちの１つ以上を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、希釈剤成分は、マンニトール、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、ソルビトール、キシリトール、粉末セルロース、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシセルロース、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、予備ゼラチン化デンプン、リン酸カルシウム、金属炭酸塩、金属酸化物、または金属アルミノ珪酸塩のうちの１つ以上を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、最適な滑沢剤成分は、存在する場合、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、フマル酸ステアリルナトリウム、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ベヘン酸グリセリル、鉱油、植物油、パラフィン、ロイシン、シリカ、ケイ酸、タルク、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン−グリセロール脂肪エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリエトキシ化ステロール、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリエトキシ化植物油、または塩化ナトリウムのうちの１つ以上を含む。
【実施例】
【０１６６】
実施例１：ＥｐＣＡＭ抗体断片のＶＨ及びＶＬドメイン上のＴ細胞エピトープをマッピングする方法。
脱免疫化されていないＥｐＣＡＭ抗体断片（Ｆａｂ）ＶＢ５−８４５−ＷＴのＶＨ−ＣＨ及びＶＬ−ＣＬドメインの配列は、配列番号５及び６によって表され、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３３９，０３１号にも開示されている。ｉＴｏｐｅ（商標）を使用した配列の分析は、複数のタンパク質にわたって重複する９ｍｅｒを用いて行い、３４個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の各々に対して検査した。潜在的な「フィット」及びＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用に基づいて各９ｍｅｒをスコア化した。ソフトウェアによって算出されたペプチドスコアは、０〜１である。高い平均結合スコア（ｉＴｏｐｅ（商標）スコア関数で＞０．５５）を出したエピトープを強調した。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの≧５０％（すなわち、３４個の対立遺伝子のうち１７個）が高い結合親和性（スコア＞０．６）を有する場合、そのようなペプチドは、「乱交雑性の高い親和性」のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドとして定義した。スコア＞０．５５を伴って対立遺伝子の≧５０％に結合するＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、「乱交雑性の中程度の親和性」として定義した。配列はまた、以前に特定されたＴ細胞エピトープに対する任意の高い配列相同性を特定するために、ＢＬＡＳＴサーチによってＴＣＥＤ（商標）を調べるためにも使用された。
【０１６７】
脱免疫化されていないＶＨ−ＣＨドメインを野生型（ＷＴ）ＶＨ−ＣＨ（配列番号５）と命名し、脱免疫化ＶＨ−ＣＨドメインを脱免疫化（ＤＩ）ＶＨ−ＣＨ（配列番号１）と命名する。同様に、脱免疫化されていないＶＬ−ＣＬドメインを野生型（ＷＴ）ＶＬ−ＣＬ（配列番号６）と命名し、脱免疫化ＶＬ−ＣＬドメインを脱免疫化（ＤＩ）ＶＬ−ＣＬ（配列番号２）と命名する。可変ドメインのみ−ＶＨ−ＷＴ、ＶＨ−ＤＩ、ＶＬ−ＷＴ、及びＶＬ−ＤＩのペプチドの分析を図２〜６に示す。表１は、ＶＨ−ＤＩを作製するために必要な変異型アミノ酸を示す。表２は、ＶＬ−ＤＩを作製するために必要な変異型酸を示す。
【表１】
2017504621.tif 000002
【０１６８】
【表２】
2017504621.tif 000003
【表３】
2017504621.tif 000004
【０１６９】
他の突然変異も検査したが、それらは発現に失敗したか、または結合試験で不合格となったため、上の表には記載されていない。
【０１７０】
実施例２：脱免疫化ＶＢ５−８４５の調製
コンピュータ上で分子ＶＢ５−８４５を用いてＦａｂの突然変異を評価する一方で、脱免疫化Ｆａｂ単独、及び軽鎖のＣ末端上でｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ毒素のペイロードに融合された脱免疫化Ｆａｂ断片を含有する融合タンパク質の両方を用いて、生物学的特徴付けを行った。ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ毒素のペイロード（配列番号４）を、フローサイトメトリー試験のタグとして、また誘導上清のＥＬＩＳＡによる定量の捕捉ステップとして用いた。
【０１７１】
対応するプライマーを用いたスプライス重複伸長ＰＣＲ法（ＳＯＥ−ＰＣＲ）により、変異型８４５ＶＨ及びＶＬ断片を作製した。各ＶＨ及びＶＬ断片をｐＣＲ２．１ベクターにクローン化し、配列決定のために１０Ｆ大腸菌細胞に形質転換した。正しいインサートを含有するｐＣＲ２．１プラスミドを、ＶＨまたはＶＬのいずれかに特異的な、特定された制限酵素のセットで消化した。
【０１７２】
ＶＨ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで予め消化したｐＩＮＧ３３０２ベクター内でＳａｃＩＩ−ＣＨ−ＶＬ−ＣＬ−ｄｅ−Ｂｏｕｇ−ＸｈｏＩ断片に連結した。化学的にコンピテントな１０Ｆ大腸菌細胞をライゲーション反応により形質転換し、形質転換したコロニーを小規模発現のために増殖させた。
【０１７３】
制限酵素ＳａｌＩ及びＢｓｍＩで消化したＶＬ断片を、同じ制限酵素で予め消化したＶＢ６−８４５／ｐＳＰ７３プラスミドに連結した。ライゲーション反応物を１０Ｆ大腸菌細胞に形質転換し、増幅選択後、一晩増殖させたコロニーからＶＢ６−８４５／ｐＳＶ７３プラスミドを抽出した。ＳｃａＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＸｈｏＩ制限酵素の組み合わせによりＶＢ６−８４５インサートを得、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で予め消化したｐＩＮＧ３３０２ベクター内に連結した。次いで、化学的にコンピテントな１０Ｆ大腸菌細胞をＶＢ６−８４５／３３０２のライゲーション反応により形質転換し、形質転換したコロニーを小規模発現のために増殖させた。
【０１７４】
変異鎖を組み合わせるために、ＶＨ及びＶＬ断片をそれぞれＥｃｏＲＩ-ＳａｃＩＩ及びＳａｃＩＩ-ＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで事前に消化したｐＩＮＧ３３０２プラスミドの存在下で連結した。化学的にコンピテントな１０Ｆ大腸菌細胞をＶＢ６−８４５ＶＨ＋ＶＬ／３３０２のライゲーション反応により形質転換し、形質転換したコロニーを小規模発現のために増殖させた。
【０１７５】
ＶＢ５−８４５−ＤＩ変異体の遺伝子操作
ＶＢ５−８４５ＤＩは、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号１９のヌクレオチド配列を有する重鎖ドメイン、ならびに配列番号２のアミノ酸配列及び配列番号２０のヌクレオチド配列を有する軽鎖ドメインによって表される。ＶＢ５−８４５−ＤＩ変異体を、ＣＬκ鎖に存在する特有の制限酵素部位ＢｓｓＳＩを用いて遺伝子操作した。ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで予め消化したｐＩＮＧ３３０２プラスミド内で、８４５  ＥｃｏＲＩ−ＶＨ−ＣＨ−ＶＬ−ＣＬ−ＢｓｓＳＩ断片をＢｓｓＳＩ−ＣＬκ−ＸｈｏＩ断片と連結した。化学的にコンピテントな１０Ｆ大腸菌細胞を、配列決定及び小規模発現のためにライゲーション反応により形質転換した。
【０１７６】
小規模発現
ＶＢ５−８４５−ＤＩ変異体／３３０２プラスミドを含有する形質転換した１０Ｆ細胞を、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有する５ｍＬの２−ＹＴに播種し、２２５ｒｐｍで絶えず振盪しながら３７℃でインキュベートした。１６時間のインキュベーション後、３００μＬの一晩種培養物を３０ｍＬのＴＢ（１％種菌）に播種し、２．０のＯＤ６００に達するまで２２５ｒｐｍで絶えず振盪しながら３７℃でインキュベートした。培養物を１５０μＬのＬ−アラビノース（最終０．１％）で誘導し、２２５ｒｐｍで絶えず振盪しながら２５℃でインキュベートした。誘導後１６時間目に、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、及びフローサイトメトリーによる分析のために培養物上清を収集した。
【０１７７】
１５Ｌ規模でのＶＢ５−８４５−ＤＩの発現
それぞれ１０ＳＬＰＭ及び１０００ＲＰＭの気流及び撹拌の、水酸化アンモニウムでｐＨを７．０に維持した２８℃の２０Ｌバイオリアクター内で、形質転換したＥ１０４大腸菌細胞のグリセロール最少培地（ＧＭＭ）における培養を行った。端的に述べると、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有するＧＭＭ中で増殖させた１５０ｍＬの種培養物を、２６℃及び２００ＲＰＭに設定した振盪インキュベータ内で、１５ＬのＧＭＭに２．０〜２．５のＯＤ６００まで播種した。２０Ｌバイオリアクター内で、≧９０％までの溶存酸素（ＤＯ）におけるスパイクが、４０％のＤＯセットポイントでｐＯ２ループを介して５０％グリセロールの供給を引き起こし、増殖率を制御した。５０のＯＤ６００で、同じ供給ストラテジーを用いて、Ｌ−アラビノースを含有する５０％グリセロールの供給により培養物を誘導した。４０時間の誘導後、ＶＢ５−８４５−ＤＩを含有する上清を遠心分離とそれに続く精密濾過によって分類し、濃縮し、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０に対して透析濾過した。
【０１７８】
１５Ｌバッチサイズの精製
全てのクロマトグラフィーカラムをＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製の再利用可能なカラムハウジングに充填し、１Ｎ  ＮａＯＨを３５分間カラムに流すことによって脱パイロジェン化し、カラム流出液のｐＨが＜ｐＨ８．０になるまでＷＦＩで洗浄した。
【０１７９】
脱免疫化ＶＢ５−８４５の理論上の等電点は８．６５である。２０ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液、２５ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ６．２で事前に平衡化した弱陽イオン交換カラム（例えば、製造業者の指示に従って調製したＣＭセファロース）への結合のために、透析濾過した培養上清のｐＨをｐＨ６．２に調整した。充填後、平衡化緩衝液でカラムをＵＶ２８０ｎｍベースラインまで洗浄し、平衡化緩衝液のｐＨ及びＮａＣｌを２０ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ７．５まで増加することによって、結合したＶＢ５−８４５−ＤＩを溶出した。
【０１８０】
フロースルーモードで操作される陽イオン交換カラム（例えば、製造業者の指示に従って調製したＱ−セファロース）に適用する前に、前のステップで回収された生成物ピークを、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ７．０で３倍希釈し、希釈溶液の最終ｐＨをｐＨ７．５に調整した。２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５でカラムを平衡化した。次いで、プールされたカラムのフロースルー及び洗浄液のｐＨを、第３のカラムに適用するためにｐＨ６．０に調整した。
【０１８１】
次いで、プール試料を２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣl緩衝液、ｐＨ６．０で事前に平衡化した陽イオン交換カラム（例えば、製造業者の指示に従って調製したＳＰセファロース）に流し、生成物を含有する流出液を回収した。流出液のｐＨをｐＨ７．５に調整し、４℃及び−２０℃での長期保存のために濾過滅菌した。
【０１８２】
ＶＢ５−８４５−ＤＩ構築物の発現レベルをウエスタンブロット分析によって推定した。端的に述べると、１６μＬの誘導した培養上清及び４μＬのＬＤＳ試料緩衝液をＮｕＰＡＧＥ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に添加した。次いで、ゲルを４０Ｖで１時間ニトロセルロース膜に転写した。膜をブロック及び洗浄した後、抗κ−西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（１／１０００）を室温で２時間使用してＶＢ５−８４５−ＤＩタンパク質を検出した。ＤＡＢを使用して膜を展開し、ＶＢ５−８４５−ＤＩ構築物の発現レベルをＶＢ６−８４５及びＶＢ５−８４５−ＷＴと比較した。非誘導大腸菌上清を使用して、検出されたバンドの特異性を確認した。
【０１８３】
ＥＬＩＳＡを用いて、誘導した培養上清中に存在するＶＢ６−８４５タンパク質を定量した。端的に述べると、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  １Ｂプレートを１０μｇ／ｍＬのウサギ抗ボウガニンでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄及びブロックした後、１／３２０、１／６４０、及び１／１２８０に希釈したＶＢ６−８４５変異体上清、ならびに精製したＶＢ６−８４５−ＷＴ抗体から調製した検量線試料（２５ｎｇ／ｍＬ〜０．１９５ｎｇ／ｍＬ）をプレートに添加し、２２℃で２時間インキュベートした。抗κ−西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（１／１０００）を２２℃で１時間使用して、結合したＶＢ５−８４５−ＤＩタンパク質を検出した。ＴＭＢを使用してプレートを展開した。ＶＢ６−８４５−ＷＴ及びｐＩＮＧ３３０２プラスミドで誘導した培養上清を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。
【０１８４】
実施例３：インビトロ結合アッセイ
脱免疫化ＶＢ５−８４５（ＶＢ５−８４５−ＤＩ）及び脱免疫化されていないＶＢ５−８４５（ＶＢ５−８４５−ＷＴ）抗体断片の結合を、癌細胞株ＣＡＬ−２７上でフローサイトメトリーによって評価した。精製したＶＢ５−８４５変異体（ＤＩ及びＷＴ）を１μｇ／ｍＬで０．３×１０６腫瘍細胞とともに氷上で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄した後、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（１／２００）を細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−サイクロームを氷上で３０分間添加し、細胞に結合したＶＢ５−８４５タンパク質を検出した（図７）。
【０１８５】
図８は、ＶＢ５−８４５−ＤＩのＥｐＣＡＭ陽性Ｈ＆Ｎ扁平上皮癌細胞株Ｃａｌ−２７への用量依存性結合を示す。ＥｐＣＡＭ陰性メラノーマＡ３７５に対する結合は観察されなかった。結合は、フローサイトメトリーを用いて、ＰＢＳ対照を超える蛍光中央値の平均上昇倍数として表される。
【０１８６】
実施例４：結合親和性
フローサイトメトリーを用いてＶＢ５−８４５−ＷＴ及びＶＢ５−８４５−ＤＩの結合親和性を測定した。端的に述べると、ＶＢ５−８４５タンパク質を３．２ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で０．２×１０６ＣＡＬ２７細胞とともに氷上で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄した後、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−サイクロームを氷上で３０分間添加し、細胞に結合したＶＢ５−８４５を検出した。値及び図式解析は、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）を用いて作成した。決定した蛍光中央値の逆数を抗体濃度の逆数の関数としてプロットし、ラインウィーバー−バーク法によりＫＤを決定した。プロットを作成し、曲線の傾きからＫＤを算出した。次の方程式によって解離定数（ＫＤ）を決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／Ｆａｂ）（式中、Ｆ＝バックグラウンドを差し引いた蛍光中央値であり、Ｆｍａｘはプロットから算出した（図９）。
【０１８７】
実施例５：競合アッセイ
ＣＡＬ２７腫瘍細胞への結合についてＶＢ６−８４５と競合するＶＢ５−８４５変異体（ＶＢ５−８４５−ＤＩ及びＶＢ５−８４５−ＷＴ）の能力を、フローサイトメトリーによって決定した。ＶＢ６−８４５は、脱免疫化ボウガニン毒素に付着した免疫複合体であり、米国特許第７，３３９，０３１号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。１５０μＬ中、ＶＢ５−８４５変異体及びＶＢ６−８４５を、０．２×１０６腫瘍細胞とともに氷上で２時間一緒にインキュベートした。ＶＢ６−８４５の濃度を１μｇ／ｍＬに一定に保持する一方で、ＶＢ５−８４５変異体の濃度を７８１ｎｇ／ｍＬから２５μｇ／ｍＬまで増加させた。マウス抗ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ抗体、続いて、ＦＩＴＣと結合させたヤギ抗マウスＨ＆Ｌを用いて、結合した細胞表面ＶＢ６−８４５を検出した（図１０）。
【０１８８】
実施例６：野生型対脱免疫化クローンのＥｐｉＳｃｒｅｅｎ分析
ドナーＰＢＭＣの調製及び選択
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、ＵＫ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から入手し、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された同意に従って、（２４時間以内に採取された血液からの）健常な地域のドナーのバフィーコートから単離する。ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ，ＵＫ）密度遠心分離によってバフィーコートから単離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を用いて枯渇させる。ドナーは、ＨＬＡ  ＳＳＰ−ＰＣＲに基づく組織タイピングキット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｓｏｌｉｈｕｌｌ，ＵＫ）を用いてＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを特定することによって特徴付ける。対照抗原（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）、［Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｅｒｂｉｏ）、Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ］）、ならびにインフルエンザＡ及びエプスタイン・バーウイルスに由来するペプチドに対するＴ細胞応答もまた決定する。次いで、ＰＢＭＣを凍結し、必要になるまで液体窒素中で保存する。
【０１８９】
世界人口において発現されるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数及び頻度を最もよく表すように、５１人のドナーのコホートを選択する。コホートにおいて発現されるアロタイプを世界人口において発現されるアロタイプに対して分析することにより、＞８０％の網羅率が達成され、全ての主要なＨＬＡ−ＤＲアロタイプ（＞５％の頻度で世界人口において発現される個々のアロタイプ）が十分に表されていることが明らかになる。
【０１９０】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）時間経過Ｔ細胞増殖アッセイ
各ドナーからのＰＢＭＣを解凍し、計数し、生存率を評価する。室温のＡＩＭ−ＶＲ培養培地中で細胞を復活させ、洗浄し、４〜６×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌまでＡＩＭ−ＶＲに再懸濁する。各ドナーにつき、１ｍＬの増殖細胞ストックが２４ウェルプレートの適切なウェルに添加されたバルク培養物を確立する。０．５ｍＬの培養培地及び０．５ｍＬの各希釈試料をＰＢＭＣに添加し、０．３μＭの最終濃度を得る。各ドナーにつき、再現性対照（１００μｇ／ｍｌ  ＫＬＨとともにインキュベートした細胞）、陽性対照（２．５μｇ／ｍｌ  ＰＨＡとともにインキュベートした細胞）、及び培養培地のみのウェルも含まれる。培養物を合計８日間３７℃で５％ＣＯ２とともにインキュベートする。５、６、７、及び８日目に、各ウェルの細胞を穏やかに再懸濁し、３×１００μｌアリコートを丸底９６ウェルプレートの各ウェルに移す。１００μｌのＡＩＭ−ＶＲ培養培地中、０．７５μＣｉ［３Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒＲ、Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ，ＵＫ）で培養物をパルスし、さらに１８時間インキュベートした後、Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏ  ９６Ｓ−１００５６セルハーベスターを使用してフィルターマット（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒＲ）上に収集する。１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｗａｌｌａｃ  Ｔｒｉｌｕｘ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒＲ）上で、ＰａｒａＬｕｘ低バックグラウンド計数のＭｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒＲ）シンチレーション計数により、各ウェルにつき計数／分（ｃｐｍ）を決定する。
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）ＩＬ−２  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
【０１９１】
増殖アッセイに用いたものと同一のドナーをＩＬ−２  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにも用いる。細胞を解凍し、前述のように復活させる。ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を予め湿潤させ、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中のＩＬ−２捕捉試料（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）で一晩コーティングする。次いで、プレートをＰＢＳ中で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）中で一晩インキュベートし、ＡＩＭ−ＶＲ培地中で洗浄する。各ドナーの細胞密度をＡＩＭ−ＶＲ培養培地中で４〜６×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌに調整し、１００μＬの細胞を各ウェルに添加する。５０μＬの試料及び対照を適切なウェル及び５０μＬのＡＩＭＶに添加し、全体積を２００μＬ／ウェルにする。試料を６通りの培養物中で検査し、各ドナーにつき、陰性対照（ＡＩＭＶ  Ｒ培地単独）、無細胞対照、及びマイトジェン陽性対照（２．５μｇ／ｍｌのＰＨＡ、ＥＬＩＳｐｏｔ機能及び細胞生存率の内部試験に使用される）も各プレートに含まれる。８日間のインキュベーション期間後、ｄＨ２Ｏ及びＰＢＳ（×３）中での連続洗浄によってＥＬＩＳｐｏｔプレートを展開した後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中１００μＬの濾過したビオチン化検出試料（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加する。３７℃で１．５時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ中でさらに洗浄し（×３）、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中１００μＬの濾過したストレプトアビジン−ＡＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１．５時間添加する（室温でインキュベーション）。ストレプトアビジン−ＡＰを廃棄し、プレートをＰＢＳ中で洗浄する（×４）。１００μＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートする。ウェル及びウェルの裏側をｄＨ２Ｏで３回洗浄することによってスポットの形成を停止する。乾燥したプレートをＩｍｍｕｎｏｓｃａｎＲアナライザー上で走査し、ＩｍｍｕｎｏｓｃａｎＲバージョン４ソフトウェアを使用してスポット／ウェル（ｓｐｗ）を決定する。
【０１９２】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）データ分析
増殖及びＩＬ−２  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの場合、２に等しいかまたはそれよりも大きい刺激指数（ＳＩ）（ＳＩ≧２．００）の経験的閾値が以前に確立されており、それによってこの閾値を超える応答を誘導する試料は陽性と見なされる（ここでは、ボーダーラインＳＩ≧１．９０も強調されている）。広範なアッセイの開発及び以前の研究により、これは、多数の偽陽性応答を検出することなく、またはわずかな免疫原性事象をもらすことなく、最大感度を可能にする最小のシグナル・ノイズ閾値であることが分かっている。増殖（ｎ＝３）及びＩＬ−２  ＥＬＩＳｐｏｔデータ（ｎ＝６）セットの両方に関して、陽性応答は、次の統計的及び経験的閾値によって定義される：（１）孤立２試料のスチューデントｔ検定を用いて、培地対照ウェルに対して試験ウェルのｃｐｍまたはｓｐｗを比較することによる応答の有意性（ｐ＜０．０５）、（２）２に等しいかまたはそれよりも大きい刺激指数（ＳＩ≧２．００）、ＳＩ＝試験ウェルの平均（ｃｐｍまたはｓｐｗ）／ベースライン（ｃｐｍまたはｓｐｗ）。このように表されるデータはＳＩ≧２．００、ｐ＜０．０５と示される。アッセイ内変動は、複製培養物からの原データの変異係数及び標準偏差（ＳＤ）を算出することによって評価する。
【０１９３】
実施例７：脱免疫化ＶＢ６−８４５（Ａｌｇｏクローン）の分子操作及び発現
実験デザイン
ＶＢ６−８４５変異体の操作
スプライス重複伸長ＰＣＲ法（ＳＯＥ−ＰＣＲ）により、変異型８４５ＶＨ及びＶＬ断片を作製した。各ＶＨ及びＶＬ断片をｐＣＲ２．１ベクターにクローン化し、配列決定のために１０Ｆ大腸菌細胞に形質転換した。正しいインサートを含有するｐＣＲ２．１プラスミドを、特定されたＶＨまたはＶＬのいずれかに特異的な制限酵素のセットで消化した。
【０１９４】
ＶＨ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで予め消化したｐＩＮＧ３３０２ベクター内でＳａｃＩＩ−ＣＨ−ＶＬ−ＣＬ−ｄｅ−Ｂｏｕｇ−ＸｈｏＩ断片に連結した。化学的にコンピテントな１０Ｆ大腸菌細胞をライゲーション反応により形質転換し、形質転換したコロニーを小規模発現のために増殖させた。
【０１９５】
制限酵素ＳａｌＩ及びＢｓｍＩで消化したＶＬ断片を、同じ制限酵素で予め消化したＶＢ６−８４５  ｐＳＰ７３プラスミドに連結した。ライゲーション反応物を１０Ｆ大腸菌細胞に形質転換し、増幅選択後、一晩増殖させたコロニーからＶＢ６−８４５／ｐＳＶ７３プラスミドを抽出した。ＳｃａＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＸｈｏＩ制限酵素の組み合わせによりＶＢ６−８４５インサートを得、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で予め消化したｐＩＮＧ３３０２ベクター内に連結した。次いで、化学的にコンピテントな１０Ｆ大腸菌細胞をＶＢ６−８４５／３３０２のライゲーション反応により形質転換し、形質転換したコロニーを小規模発現のために増殖させた。
【０１９６】
変異鎖を組み合わせるために、ＶＨ及びＶＬ断片をそれぞれＥｃｏＲＩ-ＳａｃＩＩ及びＳａｃＩＩ-ＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで事前に消化したｐＩＮＧ３３０２プラスミドの存在下で連結した。化学的にコンピテントな１０Ｆ大腸菌細胞をＶＢ６−８４５  ＶＨ＋ＶＬ／３３０２のライゲーション反応により形質転換し、形質転換したコロニーを小規模発現のために増殖させた。
【０１９７】
ＶＢ５−８４５  Ａｌｇｏの遺伝子操作
ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ  Ｆａｂは、配列番号１１のアミノ酸配列及び配列番号２３のヌクレオチド配列を有する重鎖ドメイン、ならびに配列番号１２のアミノ酸配列及び配列番号２４のヌクレオチド配列を有する軽鎖ドメインによって表される。ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏを、ＣＬκ鎖に存在する特有の制限酵素部位ＢｓｓＳＩを用いて遺伝子操作した。ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで予め消化したｐＩＮＧ３３０２プラスミド内で、８４５  ＥｃｏＲＩ−ＶＨ−ＣＨ−ＶＬ−ＣＬ−ＢｓｓＳＩ断片をＢｓｓＳＩ−ＣＬκ−ＸｈｏＩ断片と連結した。化学的にコンピテントな１０Ｆ大腸菌細胞を、配列決定及び小規模発現のためにライゲーション反応により形質転換した。
【０１９８】
小規模発現
ＶＢ６−８４５−Ａｌｇｏ／３３０２プラスミドまたはＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ／３３０２プラスミドのいずれかを含有する形質転換した１０Ｆ細胞を、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有する５ｍＬの２−ＹＴに播種し、２２５ｒｐｍで絶えず振盪しながら３７℃でインキュベートした。１６時間のインキュベーション後、３００μＬの一晩種培養物を３０ｍＬのＴＢ（１％種菌）に播種し、２．０のＯＤ６００に達するまで２２５ｒｐｍで絶えず振盪しながら３７℃でインキュベートした。培養物を１５０μＬのＬ−アラビノース（最終０．１％）で誘導し、２２５ｒｐｍで絶えず振盪しながら２５℃でインキュベートした。誘導後１６時間目に、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、及びフローサイトメトリーによる分析のために培養物上清を収集した。
【０１９９】
ウエスタンブロット分析
ＶＢ６−８４５及びＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの発現レベルをウエスタンブロット分析によって推定した。端的に述べると、１６μＬの誘導した培養上清及び４μＬのＬＤＳ試料緩衝液をＮｕＰＡＧＥ  １０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に添加した。次いで、ゲルを４０Ｖで１時間ニトロセルロース膜に転写した。膜をブロック及び洗浄した後、抗κ−西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（１／１０００）を室温で２時間使用してＶＢ６／ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏタンパク質を検出した。ＤＡＢを使用して膜を展開し、ＶＢ６／ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの発現レベルを、それぞれＶＢ６／ＶＢ５−８４５野生型（ＷＴ）と比較した。非誘導大腸菌上清を使用して、検出されたバンドの特異性を確認した。
【０２００】
ＥＬＩＳＡによる定量
ＥＬＩＳＡを用いて、誘導した培養上清中に存在するＶＢ６−８４５タンパク質を定量した。端的に述べると、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  １Ｂプレートを１０μｇ／ｍＬのウサギ抗ボウガニンでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄及びブロックした後、１／３２０、１／６４０、及び１／１２８０に希釈したＶＢ６−８４５上清、ならびに精製したＶＢ６−８４５抗体から調製した検量線試料（２５ｎｇ／ｍＬ〜０．１９５ｎｇ／ｍＬ）をプレートに添加し、２２℃で２時間インキュベートした。抗κ−西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（１／１０００）を２２℃で１時間使用して、結合したＶＢ６−８４５タンパク質を検出した。ＴＭＢを使用してプレートを展開した。ＶＢ６−８４５−ＷＴ及びｐＩＮＧ３３０２プラスミドで誘導した培養上清を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。
【０２０１】
フローサイトメトリーによって測定される結合反応性
ＶＢ６−８４５で誘導した培養上清：ＥｐＣＡＭ陽性ヒト扁平上皮癌ＣＡＬ２７を用いたフローサイトメトリーによって、ＶＢ６−８４５構築物の反応性を評価した。ＥＬＩＳＡによる定量を用いて、ＶＢ６−８４５で誘導した上清の体積を最も低い濃度に調整し、０．２×１０６腫瘍細胞とともに氷上で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄した後、ウサギ抗ボウガニン抗体（１／１００）を細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣと結合させたヤギ抗打ウサギ抗体（１／１００）を添加し、氷上で３０分間添加し、細胞に結合したＶＢ６タンパク質を検出した。ＶＢ６−８４５−ＷＴ及びｐＩＮＧ３３０２プラスミドで誘導した培養上清を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。
【０２０２】
精製ＶＢ５−８４５：精製したＶＢ５−８４５変異体の腫瘍細胞株ＣＡＬ２７への結合反応性をフローサイトメトリーによって測定した。精製したＶＢ５−８４５変異体を１μｇ／ｍＬの濃度で０．３×１０６腫瘍細胞とともに氷上で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄した後、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（１／２００）を細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−サイクロームを氷上で３０分間添加し、細胞に結合したＶＢ５タンパク質を検出した。ＶＢ５−８４５−ＷＴを陽性対照として使用した。
【０２０３】
精製ＶＢ６−８４５：精製した１００ｎｇ／ｍＬのＶＢ６−８４５−Ａｌｇｏの結合反応性を前述のように測定した。ＥｐＣＡＭ陽性及び陰性細胞株を用いたＭＴＳアッセイにより細胞傷害性を測定した。ＶＢ６−８４５−ＷＴを陽性対照として使用した。
【０２０４】
結合親和性
フローサイトメトリーを用いてＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの結合親和性を測定した。端的に述べると、ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏを３．２ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で０．２×１０６ＣＡＬ２７細胞とともに氷上で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄した後、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（１／２００）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−サイクローム（１／１２０）を氷上で３０分間添加し、細胞に結合したＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏを検出した。値及び図式解析は、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）を用いて作成した。決定した蛍光中央値の逆数を抗体濃度の逆数の関数としてプロットし、ラインウィーバー−バーク法によりＫＤを決定した。プロットを作成し、曲線の傾きからＫＤを算出した。次の方程式によって解離定数（ＫＤ）を決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／Ｆａｂ）（式中、Ｆ＝バックグラウンドを差し引いた蛍光中央値であり、Ｆｍａｘはプロットから算出した。
【０２０５】
ＶＢ６−８４５またはＶＢ５−８４５−ＷＴを用いた競合アッセイ
ＣＡＬ２７腫瘍細胞への結合についてＶＢ６−８４５と競合するＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの能力を、フローサイトメトリーによって決定した。１５０μＬ中、ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ及びＶＢ６−８４５を、０．３×１０６腫瘍細胞とともに氷上で２時間一緒にインキュベートした。ＶＢ６−８４５の濃度を１μｇ／ｍＬに一定に保持する一方で、ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの濃度を１７．８μｇ／ｍＬから７１μｇ／ｍＬまで増加させた。細胞をＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄し、ウサギ抗ボウガニン抗体（１／１００）を細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣと結合させたヤギ抗ウサギ抗体（１／１００）を氷上で３０分間添加し、細胞に結合したＶＢ６タンパク質を検出した。ＶＢ４−８４５を、腫瘍細胞株ＣＡＬ２７への結合についてＶＢ６−８４５と競合するための陽性対照として使用した。
【０２０６】
血清安定性
ＶＢ５−８４５及びＶＢ６−８４５変異体の血清安定性をウエスタンブロット分析によって決定した。端的に述べると、５００μＬのヒト血清中８０μｇ／ｍＬの濃度で変異体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。０時間目、３時間目、６時間目、及び２４時間目に、試料をボルテックスし、４５μＬのアリコートを除去し、１５μＬのＬＤＳの存在下、−２０°Ｃで保存した。前述のようにウエスタンブロットを行い、２００ｎｇ／ウェルの変異体を添加した。ウサギ抗４Ｄ５抗体（１／１０００）を室温で４５分間使用した後、抗ウサギ−西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（１／２０００）を室温で４５分間使用して、ＶＢ５−８４５またはＶＢ６−８４５タンパク質を検出した。ＤＡＢを使用して膜を展開した。精製したＶＢ５−８４５またはＶＢ６−８４５を陽性対照として使用した。
【０２０７】
熱安定性
フローサイトメトリーを用いてＶＢ５−８４５及びＶＢ６−８４５変異体の熱安定性を決定した。ＶＢ５−８４５及びＶＢ６−８４５変異体をＰＢＳ中８０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。０時間目、３時間目、６時間目、及び２４時間目に、２５μＬのアリコートを除去し、フローサイトメトリーによる分析のために−２０°Ｃで保存した。試験のために、ＶＢ５−８４５及びＶＢ６−８４５変異体試料を、１５０μＬのＰＢＳ−５％ＦＢＳにそれぞれ１μｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬに希釈し、０．３×１０６細胞とともに氷上で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−５％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ビオチン化抗体（１／２００）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＥ−Ｃｙ５ストレプトアビジン蛍光色素（１／１２０）を加え、ＶＢ５−８４５細胞表面の結合を検出した。精製したＶＢ５−８４５−ＷＴ及びＶＢ６−８４５−ＷＴを陽性対照として使用した。
【０２０８】
ＶＢ５−８４５−ＡｌｇｏのＴ細胞増殖
ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ及びＶＢ５−８４５がＴ細胞増殖を誘導する能力を、フローサイトメトリーを用いてＣＤ３＋ＣＤ４＋にゲートをかけることにより測定した。Ｆａｂタンパク質を用いた場合または用いない場合の増殖を、ＤＮＡ取り込みマーカーＥｄＵ−Ａ４８８の蛍光強度によって分析した。データは、Ｆａｂ処理ウェル対未処理ウェル内の活性化されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球の数の比率に対応する刺激指数（ＳＩ値）として表した。
結果
【０２０９】
Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）分析により重鎖及び軽鎖に存在する潜在的なＴ細胞エピトープを特定した。提案される変化は、生殖系列配列に対応するアミノ酸であり、「安全なまたは危険な突然変異」として分類される。変化の数によっては、単一点突然変異が発現及び生物活性に与える影響を評価することは実現不可能であった。したがって、安全な突然変異をグループ化し、２ラウンド連続のＳＯＥ−ＰＣＲによって導入した。しかしながら、位置ＶＨ３８及びＶＬ５０の不確実性のために、変異型または野生型残基のいずれかを含有する鎖を作製した。配列を確認してから、変異鎖をＶＢ６−８４５ジシストロニック単位にクローン化し、それらのそれぞれの野生型対応物の存在下で発現させた。発現レベル及び生物活性がＷＴと同等である場合、変異重鎖及び軽鎖を組み合わせて検査した。「危険な突然変異」の場合、ＶＨ５３、ＶＨ９３、及びＶＨ９８を単一点突然変異として最初に評価した。好適であると判定された場合、それらを最終的なＶＨ構築物に組み込んだ。
【０２１０】
第１世代ＶＢ６−８４５の分子操作
１）第１型ＶＢ６−８４５の「安全な突然変異」の操作及び試験
ＶＨ−ａｌｇｏ：全ての突然変異を導入するために２ラウンド連続のＳＯＥ−ＰＣＲが必要であった。表３に見られるように、ＶＨ−Ｉｒクローンは、ＦＲ１変異、及びＦＲ３変異の一部を含有していた。次いで、ＶＨ−Ｉｒテンプレートを次のＳＯＥ−ＰＣＲ反応に用いて全ての突然変異を含有するＶＨ−ＩＩｒを作製し、ＶＨ−ＩＩｒ−Ｋ３８の場合、位置３８は変化させなかった。最終的なＳＯＥ−ＰＣＲ反応に対して行われた配列決定反応からも、ＩＩｒ−ＣＤＲ１と呼ばれる配列決定したクローンのうちの１つが、ＣＤＲ１及びＦＲ２領域を除く全ての変異型アミノ酸を含有することが明らかになった。ＷＴ軽鎖の存在下における変異重鎖の発現レベルは、ＷＴと同様であった。さらに、フローサイトメトリーによって測定された生物活性は、ＷＴと比較して変化が見られなかった。変異体のうちのいくつかに得られたより高い蛍光中央値は、ＥＬＩＳＡによって得られる濃度の過小評価の結果であり得るということに留意されたい。
【表４】
2017504621.tif 000005
太字のアミノ酸は、変異残基に対応する。報告された蛍光中央値（ＭＦ）は、２つの独立した実験の平均値であり、ＷＴのパーセントとして表される。Ｋａｂａｔ命名法に従う番号付け。
【０２１１】
ＶＬ−Ａｌｇｏ：ＣＤＲ１／Ａ５０−ＣＤＲ２／ＦＲ４またはＣＤＲ１／Ｑ５０−ＣＤＲ２／ＦＲ４突然変異を含有する軽鎖を第１のＳＯＥ−ＰＣＲ反応によって導入した。ＶＨのストラテジーとは対照的に、ＦＲ２突然変異のみを含有する構築物を操作し、別々に検査した。Ｉｒ−Ａ５０クローンの生物活性が有意に減少したことから、Ａ５０突然変異は、ＶＢ６−８４５のＥｐＣＡＭへの結合にとって有害であることが示される。結果として、ＦＲ２突然変異は、Ｉｒ−Ｑ５０軽鎖に付加されたのみであった。検査したときに、ＩＩｒ−Ｑ５０の発現レベル及び生物活性は、それぞれＷＴよりも７０及び４４％低かった。発現レベル及び生物活性は、位置４１をＷＴアミノ酸に戻すことによって一部回復されたのみであってことに留意されたい。
【表５】
2017504621.tif 000006
太字のアミノ酸は、変異残基に対応する。報告された蛍光中央値（ＭＦ）は、２つの独立した実験の平均値であり、ＷＴのパーセントとして表される。Ｋａｂａｔ命名法に従って番号付けした。
【０２１２】
ＶＨ−ＶＬ−ａｌｇｏ：前述の結果に基づいて、ＶＨ−ＩＩｒ及びＶＬ−Ｉｒ−Ｑ５０を選択し、組み合わせて、ＶＢ６−８４５組換え融合タンパク質として発現させた。表５に見られるように、６６％を超える生物活性が失われたことから、いくつかの突然変異がＶＨ−ＶＬ界面に影響を与えたことが示唆される。問題のある領域を特定するために、ＶＨ−Ｉｒ及びＶＨ−ＩＩｒ−ＣＤＲ１もＶＬ−Ｉｒ−Ｑ５０の存在下で操作し、検査した。ＶＢ６−８４５−（ＶＨ−ＩＩｒ−ＣＤＲ１／ＶＬ−Ｉｒ−Ｑ５０）の生物活性が一部回復したことから、ＣＤＲ１領域内の突然変異は、ＶＨ−ＶＬ界面を部分的に変化させた可能性が示唆される。
【表６】
2017504621.tif 000007
報告された蛍光中央値（ＭＦ）は、２つの独立した実験の平均値であり、ＷＴのパーセントとして表される。
【０２１３】
２）ＶＢ６−８４５の「危険な突然変異」の操作及び試験
単一の「危険な」点突然変異を含有するＶＢ６−８４５構築物をＳＯＥ−ＰＣＲによって操作し、検査した。表６に見られるように、位置Ｋ９８Ｑのみが生物活性に影響を与えなかった。
【表７】
2017504621.tif 000008
報告された蛍光中央値（ＭＦ）は、２つの独立した実験の平均値であり、ＷＴのパーセントとして表される。Ｋａｂａｔ命名法に従って番号付けした。
【０２１４】
３）第２型ＶＢ６−８４５の操作及び試験
前述の結果に基づいていくつかの調整が行われた。ＶＨドメインの場合、位置３５をＷＴに戻した。ＶＬドメインの場合、ＦＲ２及び位置５０を突然変異させる困難性から、ＦＲ２及びＣＤＲ２領域の異なる突然変異のセットがもたらされた。
【０２１５】
ＶＨ−ａｌｇｏ、第２型：ＳＯＥ−ＰＣＲ反応におけるＩＩｒインサートをテンプレートとして使用して、位置３５をアスパラギン残基に戻した。予想された通り、野生型軽鎖を用いて操作したときに、発現レベルまたは生物活性に違いは観察されなかった（表７）。同様に、ＣＤＲ３変異Ｑ９８のＩＩｒ−Ｎ３５への付加も、発現または生物活性を変化させなかった。
【表８】
2017504621.tif 000009
太字のアミノ酸は、変異残基に対応する。報告された蛍光中央値（ＭＦ）は、２つの独立した実験の平均値であり、ＷＴのパーセントとして表される。Ｋａｂａｔ命名法に従って番号付けした。
【０２１６】
ＶＬ−ａｌｇｏ、第２型：ＦＲ２（Ｈ３９−Ｓ４２）またはＣＤＲ２（Ｅ５１−Ｈ５３−Ｑ５５）突然変異のいずれかを含有する両方の軽鎖が、ＶＢ６−８４５分子として検査した場合に結合の減少を示した。この影響は、ＣＤＲ１及びＦＲ４突然変異を最終的なＶＬ構築物（ＩＩｒ／ＦＲ２／ＣＤＲ２）として組み合わせたときにさらに増幅された。軽鎖の突然変異は、変異ＶＨの存在下においてのみ機能的であるという可能性もあることに留意されたい。しかしながら、相関度として、Ｔ細胞エピトープの枯渇に最も大きな影響を与えるであろう数個の突然変異のみを含有する軽鎖（ＩＩｒ−ＫＳＨＩ）も操作したところ、生物活性はＶＢ６−８４５ＷＴと同様であることが分かった。
【表９】
2017504621.tif 000010
【表１０】
2017504621.tif 000011
太字のアミノ酸は、変異残基に対応する。報告された蛍光中央値（ＭＦ）は、２つの独立した実験の平均値であり、ＷＴのパーセントとして表される。Ｋａｂａｔ命名法に従って番号付けした。
【０２１７】
ＶＨ−ＶＬ−ａｌｇｏ、第２型：最終的なＶＨ鎖ＩＩｒ−Ｎ３５−Ｑ９８をＶＬ−Ｉｒ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＩＩｒ−ＦＲ２−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＩＩｒ−ＫＳＨＩと組み合わせた。表７に見られるように、組み合わせたＶＨ−ＩＩｒ−Ｎ３５−Ｑ９８及びＶＬ−ＩＩｒ−ＫＳＨＩを含有するＶＢ６−８４５構築物のみがＷＴと同様の発現レベル及び生物活性を有し、ＶＢ６−８４５−Ａｌｇｏと称される。他の組み合わせは、発現及びＥｐＣＡＭへの結合において有意な損失をもたらした。
【表１１】
2017504621.tif 000012
報告された蛍光中央値（ＭＦ）は、２つの独立した実験の平均値であり、ＷＴのパーセントとして表される。Ｋａｂａｔ命名法に従って番号付けした。
【０２１８】
ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの生物活性
ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎによるＴ細胞増殖アッセイへの干渉を避けるために、ＶＢ６−８４５−ＡｌｇｏのＶＢ５−８４５  Ｆａｂ型を作製し、発現させ、精製した。精製したＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ  Ｆａｂタンパク質を種々の生物学的試験に供し、そのデータをＶＢ５−８４５−ＷＴと比較した。
【０２１９】
競合アッセイ
特異性が変化しないことを確実にするために、ＥｐＣＡＭ陽性ＣＡＬ−２７細胞への結合についてＶＢ６−８４５と競合するＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの能力を検査した。図１３に示すように、ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ（白丸）は、ＶＢ６−８４５の結合と競合した。ＶＢ４−８４５及びＶＢ５−８４５−ＷＴを陽性対照として使用した。
【０２２０】
ヒト血清安定性
突然変異がタンパク分解部位を形成しないことを実証するために、ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏ及びＶＢ５−８４５−ＷＴをヒト血清中３７℃で最大２４時間インキュベートした。ＶＢ５タンパク質の安定性をウエスタンブロット分析によって評価した。図１４に示すように、分析によって強度に変化が見られないことが明らかになり、両方のＶＢ５−８４５タンパク質がヒト血清中でインタクトな状態を保ったことが示唆される。
熱安定性
【０２２１】
突然変異がＶＨ−ＶＬ界面の熱安定性に影響を与えないことを確実にするために、１×ＰＢＳ中で０、３、６、及び２４時間３７℃でインキュベートした後、フローサイトメトリーによってＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの生物活性を評価した。データは、０時間目に得られた蛍光中央値のパーセンテージとして表される（図１５）。ＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏは、０時間の対照を超えるわずかな増加を示したことから、Ｆａｂ部分が熱的に安定であることが示唆される。
【０２２２】
結合親和性
ＣＡＬ−２７腫瘍細胞を用いたフローサイトメトリーによって結合親和性を測定した。滴定曲線を用いて、実験デザインに記載されるようにＫＤを決定した（表１０）。
【表１２】
2017504621.tif 000013
【０２２３】
ＶＢ６−８４５−Ａｌｇｏの生物活性
生物活性を評価するために、ＶＢ６−８４５−Ａｌｇｏ（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎを含有する）を精製し、フローサイトメトリー、ならびにＣＡＬ−２７、ＨＴ−２９、ＭＣＦ−７、及びＯＶＣＡＲ−３  ＥｐＣＡＭ陽性細胞株を用いたＭＴＳアッセイによって試験した。ＶＢ６−８４５−Ａｌｇｏの特異性が変化しないことを確実にするために、Ａ−３７５及びＣＯＬＯ−３２０  ＥｐＣＡＭ陰性細胞株も含めた。表１１に示すように、ＶＢ６−８４５−ＡｌｇｏのＥｐＣＡＭ陽性細胞株への結合は、ＶＢ６−８４５−ＷＴ（陽性対照として用いられた）よりも５３％〜３２％低かった。結果として、ＶＢ６−８４５−Ａｌｇｏは、ＷＴと比較して７〜９倍作用が弱かった。予想された通り、ＥｐＣＡＭ陰性細胞株では結合またはＩＣ５０は測定されなかった。
【表１３】
2017504621.tif 000014
２つの独立した実験を代表する数字。上昇倍数（ＦＩ）は、２つの独立した測定値の平均値である。
【０２２４】
免疫原性
ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖によりＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏの免疫原性プロファイルを測定し、ＶＢ５−８４５−ＷＴと比較した。予想された通り、５３人のドナーのうち１２人のドナーがＶＢ５−８４５−ＷＴに応答性であり、それはほぼ２３％を意味する（図１６）。対照的に、２人のドナーのみがＶＢ５−８４５−Ａｌｇｏに応答を示したことから（ほぼ４％）、Ｆａｂ部分の免疫原性プロファイルを有意に減少させたことが実証される。
配列表
配列番号１（脱免疫化ＶＨ−ＣＨまたはＤＩ  ＶＨ−ＣＨ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＡＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
配列番号２（脱免疫化ＶＬ−ＣＬまたはＤＩ  ＶＬ−ＣＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＮＬＥＩＰＲＴＦＧＴＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３（ＥＴＡ毒素２５２−６０８）
ＥＧＧＳＬＡＡＬＴＡＨＱＡＣＨＬＰＬＥＴＦＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＥＱＣＧＹＰＶＱＲＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷＮＱＶＤＱＶＩＲＮＡＬＡＳＰＧＳＧＧＤＬＧＥＡＩＲＥＱＰＥＱＡＲＬＡＬＴＬＡＡＡＥＳＥＲＦＶＲＱＧＴＧＮＤＥＡＧＡＡＳＡＤＶＶＳＬＴＣＰＶＡＡＧＥＣＡＧＰＡＤＳＧＤＡＬＬＥＲＮＹＰＴＧＡＥＦＬＧＤＧＧＤＶＳＦＳＴＲＧＴＱＮＷＴＥＲＬＬＱＡＨＲＱＬＥＥＲＧＹＶＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧＧＶＲＡＲＳＱＤＬＤＡＩＷＲＧＦＹＩＡＧＤＰＡＬＡＹＧＹＡＱＤＱＥＰＤＡＲＧＲＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳＬＰＧＦＹＲＴＧＬＴＬＡＡＰＥＡＡＧＥＶＥＲＬｌＧＨＰＬＰＬＲＬＤＡＩＴＧＰＥＥＥＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡＥＲＴＶＶＩＰＳＡＩＰＴＤＰＲＮＶＧＧＤＬＤＰＳＳＩＰＤＫＥＱＡＩＳＡＬＰＤＹＡＳＱＰＧＫＰＰ
配列番号４  （修飾ボウガニンタンパク質）
ＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＮＡＡＫＡＤＲＫＡＬＥＬＧＶＮＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＡＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＹＧＳＦＫＰＮＦＫＶＬＮＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫ
配列番号５（野生型ＶＨ−ＣＨまたはＷＴ  ＶＨ−ＣＨ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＡＳＡＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
配列番号６（野生型ＶＬ−ＣＬまたはＷＴ  ＶＬ−ＣＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＮＬＥＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７（脱免疫化ＶＢ５−８４５のＤＮＡ配列）
ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡａｔｇａａａｔａｃｃｔａｔｔｇｃｃｔａｃｇｇｃａｇｃｃｇｃｔｇｇａｔｔｇｔｔａｔｔａｃｔｃｇｃｔｇｃｃｃａａｃｃａｇｃｇａｔｇｇｃｇＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＣｇａａＴＣＣＧＧＴｇｇｔＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＣｃｔｇＣＧＴｃｔｇＡＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣｇｃｇＴＡＣＧＧＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＴｃｇｔＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＴＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＣＴＡＣＣＴＡＣＧＣＴＧＡＴＡＧＣｇｔｔＡＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＣＡＣＣａｔｃＡＧＣｇｃｔＧＡＣＡＣＴＡＧＣａａａａａｃａｃｃＧＣＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧａｔｇＡＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＧＣＧＡＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＴＣＴＧｇｔｔＡＣＣＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＴＡＧＣＡＣＴＡＡｇＧＧｃＣＣＧＴＣＣＧＴＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＴＴＡＣＣＧＴＴＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＣＧＡＧＣＡＡＣＡＣＴＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＡＣＴＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＴＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＴＴＣＣＴＴＣＴＣＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＧＣＧＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＧＧＣａｃｃＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡａｔｃＡＡＧＣＧＴＡＣＣＧＴＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＴＣＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＴＡＧＣＧＴＡＧＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＣＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＧＡ
配列番号８（４Ｄ５ＭＯＣ−Ｂ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫ
ＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＮＬＥＩＰ
ＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＲＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＴＳＧＳＥＶＱＬＶＱＳＧＰＧＬＶＱ
ＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＡＳＡＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＳ
配列番号９（修飾ボウガニンタンパク質）
ＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＮＡＡＫＸ１ＤＲＫＸ２ＬＸ３ＬＧＶＸ４ＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＸ５ＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＹＧＳＦＫＰＮＦＫＶＬＮＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫ
位置１２３のＸ１は、ＴｈｒまたはＡｌａまたはＧｌｎであり、位置１２７のＸ２は、ＧｌｙまたはＡｌａであり、位置１２９のＸ３は、ＧｌｎまたはＧｌｙまたはＧｌｕであり、位置１３３のＸ４は、ＡｓｎまたはＡｓｐまたはＴｈｒまたはＡｌａまたはＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕまたはＧｌｙまたはＨｉｓまたはＬｙｓまたはＳｅｒであり、位置１５２のＸ５は、ＧｌｎまたはＡｌａである。
配列番号１０（ＶＢ６−８４５）
ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＥＶＱＬＶＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＡＳＡＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＮＡＡＫＡＤＲＫＡＬＥＬＧＶＮＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＡＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＹＧＳＦＫＰＮＦＫＶＬＮＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＨＨＨＨＨＨＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＮＬＥＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１１（Ａｌｇｏ  ＶＨ−ＣＨ）
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＡＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＥＦＳＬＤＴＨＮＳＳＡＹＬＱＩＱＳＬＲＥＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＱＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
配列番号１２（Ａｌｇｏ  ＶＬ−ＣＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＳＡＰＫＬＬＩＹＱＭＳＨＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＮＬＥＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１３（ＤＩ  ＶＨ−ＣＨ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＡＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＫＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＮＡＡＫＡＤＲＫＡＬＥＬＧＶＮＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＡＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＹＧＳＦＫＰＮＦＫＶＬＮＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫ
配列番号１４（Ａｌｇｏ  ＶＨ−ＣＨ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＡＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＥＦＳＬＤＴＨＮＳＳＡＹＬＱＩＱＳＬＲＥＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＱＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＫＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＮＡＡＫＡＤＲＫＡＬＥＬＧＶＮＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＡＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＹＧＳＦＫＰＮＦＫＶＬＮＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫ
配列番号１５（ＷＴ  ＶＨ−ＣＨ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＡＳＡＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＫＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＮＡＡＫＡＤＲＫＡＬＥＬＧＶＮＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＡＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＹＧＳＦＫＰＮＦＫＶＬＮＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫ
配列番号１６（ＤＩ  ＶＬ−ＣＬ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）
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配列番号１７（Ａｌｇｏ  ＶＬ−ＣＬ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＳＡＰＫＬＬＩＹＱＭＳＨＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＮＬＥＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＫＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＮＡＡＫＡＤＲＫＡＬＥＬＧＶＮＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＡＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＹＧＳＦＫＰＮＦＫＶＬＮＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫ
配列番号１８（ＷＴ  ＶＬ−ＣＬ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＮＬＥＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＫＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＮＡＡＫＡＤＲＫＡＬＥＬＧＶＮＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＡＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＹＧＳＦＫＰＮＦＫＶＬＮＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫ
配列番号１９（ＤＩ  ＶＨ−ＣＨのヌクレオチド配列）
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配列番号２０（ＤＩ  ＶＬ−ＣＬのヌクレオチド配列）
ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ａｃｃ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ａｔｃ  ＡＡＧ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＧ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＴＧＡ
配列番号２１（ＷＴ  ＶＨ−ＣＨのヌクレオチド配列）
ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＣＧＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＴＣＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＧＣＣ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＴＧＡ
配列番号２２（ＷＴ  ＶＬ−ＣＬのヌクレオチド配列）
ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＴＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＴＧＡ
配列番号２３（Ａｌｇｏ  ＶＨ−ＣＨのヌクレオチド配列）
ＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧｃａｇＣＡＧＴＣＣＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＴＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣｇｃｇＴＡＣＧＧＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＴｃｇｔＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＴＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＣＴＡＣＣＴＡＣＧＣＴＧＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＣｇａａＴＴＴＡＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴｃａｃａａｃＡＧＣｔｃｔＧＣＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＴｃａｇＴＣＴＣＴＧＣＧＴｇａａＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＧＣＧＡＴＣｃａｇＧＧＴＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＴＣＴＧｇｔｔＡＣＣＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＣＴＡＧＣＡＣＴＡＡｇＧＧｃＣＣＧＴＣＣＧＴＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＴＴＡＣＣＧＴＴＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＣＧＡＧＣＡＡＣＡＣＴＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡ
配列番号２４（Ａｌｇｏ  ＶＬ−ＣＬのヌクレオチド配列）
ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣａａａＡＧＣＡＣＴＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＴＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴｔｃｔＧＣＴＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴｃａｃＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＴＴＣＣＴＴＣＴＣＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＧＣＧＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡａｔｃＡＡＧＣＧＴＡＣＣＧＴＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＴＣＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＴＡＧＣＧＴＡＧＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＣＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＧＣ
配列番号２５（ＤＩ  ＶＨ−ＣＨ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎのヌクレオチド配列）
ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ｇａａ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ｇｇｔ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ｃｔｇ  ＣＧＴ  ｃｔｇ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ｇｃｇ  ＴＡＣ  ＧＧＴ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ｃｇｔ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ｇｔｔ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ａｔｃ  ＡＧＣ  ｇｃｔ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ａａａ  ａａｃ  ａｃｃ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ａｔｇ  ＡＡＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ｇｔｔ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ａａａ  ＴＡＴＡＡＣＡＣＣＧＴＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧ  ＧＴＧ  ＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴＡＣＣＣＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧ  ＣＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＧＴＴＴＣＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＡＡＡＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＴＧＧＴＡＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＡＡＴＧＧＧＡＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＣＧＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＧＴＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＡＧＣＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＣＣＧＴＣＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＴＡＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧ
配列番号２６（Ａｌｇｏ  ＶＨ−ＣＨ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎのヌクレオチド配列）
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配列番号２７（ＷＴ  ＶＨ−ＣＨ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎのヌクレオチド配列）
ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＣＧＴ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＴＣＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＧＣＣ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＴＧＴＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＴＴＧＧ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＡＴＡＡＣＡＣＣＧＴＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡ  ＡＴＡＣＣＣＧ  ＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＧＴＴＴＣＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＡＡＡＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＴＧＧＴＡＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＡＡＴＧＧＧＡＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＣＧＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＴ��ＡＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＧＴＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＡＧＣＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＣＣＧＴＣＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＴＡＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧ
配列番号２８（ＤＩ  ＶＬ−ＣＬ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎのヌクレオチド配列）
ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ａｃｃ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ａｔｃ  ＡＡＧ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＧ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＴＴＧＧＧＡ  ＡＣＡＧａａａ  ＴＡＴＡＡ  ＣＡＣＣＧＴＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＡＴＡＣＣＣＧＡＣＣＴ  ＴＣＡＴＣ  ＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＧＴＴＴＣＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＡＡＡＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＴＧＧＴＡＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＡＡＴＧＧＧＡＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＣＧＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧ���ＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＧＴＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＡＧＣＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＣＣＧＴＣＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＴＡＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧ
配列番号２９（Ａｌｇｏ  ＶＬ−ＣＬ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎのヌクレオチド配列）
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配列番号３０（ＷＴ  ＶＬ−ＣＬ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎのヌクレオチド配列）
ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＴＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＴＧＴ  ＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＣＧ  ＣＧＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＡＣＣＧＴＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣＣＴ  ＧＧＧＴＧＡＧＧＣＧＴ  ＡＴＧ  ＡＡＴＡＣＣＣＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧ  ＣＴＡＡＡＧＧＴ  ＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＧＣＴＧ  ＡＴＧＡＴＡＡＡ  ＣＧＴＴＴＣＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＡＡＡＧＴＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＴＧＧＴＡＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＡＡＴＧＧＧＡＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＣＧＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＡＴＣＡＧ��ＡＡＣＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＧＴＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＴＡＧＣＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＣＣＧＴＣＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＴＡＧＴＴＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧ
配列番号３１（Ａｌｇｏ  ＶＨ（ＣＤＲｓＷＴ）−ＣＨ）
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＥＦＳＬＤＴＨＮＳＳＡＹＬＱＩＱＳＬＲＥＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
配列番号３２（Ａｌｇｏ  ＶＨ（ＣＤＲｓＷＴ＋Ｔｒｅｇ）−ＣＨ）
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＥＦＳＬＤＴＨＮＳＳＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
配列番号３３（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ２）
ＹＮＴＶＳＦＮＬＧＥＡＹＥＹＰＴＦＩＱＤＬＲＮＥＬＡＫＧＴＰＶＣＱＬＰＶＴＬＱＴＩＡＤＤＫＲＦＶＬＶＤＩＴＴＴＳＫＫＴＶＫＶＡＩＤＶＴＤＶＹＶＶＧＹＱＤＫＷＤＧＫＤＲＡＶＦＬＤＫＶＰＴＶＡＴＳＫＬＦＰＧＶＴＮＲＶＴＬＴＦＤＧＳＹＱＫＬＶＨＳＡＥＶＤＲＫＤＬＥＬＧＶＮＫＬＥＦＳＩＥＡＩＨＧＫＴＩＮＧＱＥＩＡＫＦＦＬＩＶＩＱＭＶＳＥＡＡＲＦＫＹＩＥＴＥＶＶＤＲＧＬＨＧＳＦＫＰＤＦＫＶＬＤＬＥＮＮＷＧＤＩＳＤＡＩＨＫＳＳＰＱＣＴＴＩＮＰＡＬＱＬＩＳＰＳＮＤＰＷＶＶＮＫＶＳＱＩＳＰＤＭＧＩＬＫＦＫＳＳＫ
配列番号３４（ＤＩ  ＶＨ−ＣＨ−ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ３）
【表１４】
2017504621.tif 000015
【表１５】
2017504621.tif 000016
【表１６】
2017504621.tif 000017
【表１７】
2017504621.tif 000018
【表１８】
2017504621.tif 000019
【表１９】
2017504621.tif 000020
【表２０】
2017504621.tif 000021
【表２１】
2017504621.tif 000022
【図１】
2017504621.tif 000023
【図２】
2017504621.tif 000024
【図３】
2017504621.tif 000025
【図４】
2017504621.tif 000026
【図５】
2017504621.tif 000027
【図６】
2017504621.tif 000028
【図７】
2017504621.tif 000029
【図８】
2017504621.tif 000030
【図９】
2017504621.tif 000031
【図１０】
2017504621.tif 000032
【図１１−Ａ】
2017504621.tif 000033
【図１１−Ｂ】
2017504621.tif 000034
【図１１−Ｃ】
2017504621.tif 000035
【図１２−Ａ】
2017504621.tif 000036
【図１２−Ｂ】
2017504621.tif 000037
【図１３】
2017504621.tif 000038
【図１４】
2017504621.tif 000039
【図１５】
2017504621.tif 000040
【図１６】
2017504621.tif 000041
【図１７−Ａ】
2017504621.tif 000042
【図１７−Ｂ】
2017504621.tif 000043
【配列表】
2017504621000001.app
【国際調査報告】
2017504621.tif 000044
2017504621.tif 000045
2017504621.tif 000046
2017504621.tif 000047
2017504621.tif 000048
2017504621.tif 000049