(57)【要約】本発明は、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを含む組成物、ならびにこれを生成および使用するための方法に関する。本発明は、少なくとも一部は、非真菌細胞株において発現され、酵素を著しくはグリコシル化しない宿主細胞から単離された、トリコデルマ・リーセイ由来のセロビアーゼは、Ｔ．リーセイ由来の内在性セロビアーゼ（グリコシル化され、分泌される）よりも、純粋基質に対し高い比活性を有したという驚くべき発見に基づく。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、またはその機能的断片に対して少なくとも９０％同一性を含む、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、野生型Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ酵素、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む、請求項１に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｃｅｌ３Ａ酵素は、前記アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む（例えば、から構成される）、請求項２に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む（例えば、から構成される）核酸配列によりコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは１つ以上のグリコシル化部位の近位、またはその部位に突然変異を含み、前記突然変異は前記１つ以上のグリコシル化部位でのグリコシル化を防止する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項６】
前記突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の、アミノ酸位置７８のスレオニン、アミノ酸位置２４１のスレオニン、アミノ酸位置３４３のセリン、アミノ酸位置４５０のセリン、アミノ酸位置５９９のスレオニン、アミノ酸位置６１６のセリン、アミノ酸位置６９１のスレオニン、アミノ酸位置２１のセリン、アミノ酸位置２４のスレオニン、アミノ酸位置２５のセリン、アミノ酸位置２８のセリン、アミノ酸位置３８のスレオニン、アミノ酸位置４２のスレオニン、アミノ酸位置３０３のスレオニン、アミノ酸位置３９８のセリン、アミノ酸位置４３５のセリン、アミノ酸位置４３６のセリン、アミノ酸位置４３９のスレオニン、アミノ酸位置４４２のスレオニン、アミノ酸位置４４６のスレオニン、アミノ酸位置４５１のセリン、アミノ酸位置６１９のセリン、アミノ酸位置６２２のセリン、アミノ酸位置６２３のスレオニン、アミノ酸位置６２６のセリン、またはアミノ酸位置６３０のスレオニンの１つ以上に存在する、請求項５に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項７】
前記アグリコシル化されたポリペプチドは、野生型Ｔ．リーセイ由来のグリコシル化されたＣｅｌ３Ａ酵素と比べて、増加したセロビアーゼ活性を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項８】
前記アグリコシル化されたポリペプチドは、野生型Ｔ．リーセイ由来のグリコシル化されたＣｅｌ３Ａ酵素と比べて、増加した基質認識、より活性な基質認識部位、または低減された立体障害を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項９】
前記アグリコシル化されたポリペプチドは、セロビオースなどの炭水化物を１つ以上の単糖、例えば、グルコースに加水分解する、前記請求項のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記セロビアーゼ活性はセロビオースのβ１，４グリコシド結合の加水分解を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項１２】
Ｃｅｌ３Ａ酵素またはその機能的バリアントをコードする核酸配列であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対して少なくとも９０％同一性を含む（例えば、から構成される）、核酸配列。
【請求項１３】
請求項１１および１２のいずれかに記載の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項１４】
さらに、プロモーター、例えば、原核細胞発現、例えば、細菌細胞発現、例えば、大腸菌における発現のためのプロモーターを含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記プロモーター配列は構成的プロモーター配列、誘導性プロモーター配列、または抑制プロモーター配列である、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記プロモーターはＴ７プロモーターである、請求項１４または１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
さらに、タグ、例えば、検出および／または精製のための、および／または別の分子への連結のためのタグ、例えば、Ｈｉｓタグをコードする核酸配列を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
さらに、１つ以上のシグナル配列、例えば、分泌シグナル配列をコードする核酸を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれかに記載の核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項２０】
さらに、選択マーカー、例えば、カナマイシンまたはアンピシリンマーカーをコードする核酸配列を含む、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２２】
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載のベクターを含む、原核細胞または細菌細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する原核細胞または細菌細胞。
【請求項２５】
前記細菌細胞はグリコシル化に対し障害されている、請求項２２または２４に記載の細菌細胞。
【請求項２６】
前記細菌細胞は大腸菌細胞である、請求項２５に記載の細菌細胞。
【請求項２７】
前記大腸菌細胞はｏｒｉｇａｍｉ大腸菌細胞である、請求項２６に記載の細菌細胞。
【請求項２８】
請求項１、２、３、４、７、８、９または１０のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法であって、請求項１、２、３、４、７、８、９または１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞を、前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することを含み、前記細胞は前記ポリペプチドをグリコシル化しない、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、例えば、ｏｒｉｇａｍｉ大腸菌細胞である、方法。
【請求項２９】
請求項１、２、３、４、７、８、９または１０のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドを脱グリコシル化酵素で処理することを含む、方法。
【請求項３０】
前記脱グリコシル化酵素はＰＧＮａｓｅおよびＥｎｄｏＨから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１、２、３、４、７、８、９または１０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞を培養することを含み、前記核酸配列は、コードされるポリペプチドのグリコシル化を防止する１つ以上の突然変異を有する、請求項１、２、３、４、７、８、９または１０のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法。
【請求項３２】
請求項１、２、３、４、７、８、９または１０のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドを発現する細胞を、グリコシル化阻害剤、例えば、ツニカマイシンの存在下で培養するための方法。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含むグリコシル化されたポリペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含むアグリコシル化されたポリペプチドを含み、前記グリコシル化されたポリペプチドおよび前記アグリコシル化されたペプチドはどちらもセロビアーゼ活性を有する、酵素混合物。
【請求項３４】
前記アグリコシル化されたポリペプチドは請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドである、請求項３３に記載の酵素混合物。
【請求項３５】
前記グリコシル化されたポリペプチドおよび前記アグリコシル化されたポリペプチドはどちらも野生型Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ酵素を含む、請求項３３または３４に記載の酵素混合物。
【請求項３６】
さらに、微生物に由来する少なくとも１つの追加の酵素を含み、前記追加の酵素は、セルロース系材料のバイオマス分解活性を有する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の酵素混合物。
【請求項３７】
前記追加の酵素はリグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、およびセロビアーゼから選択される、請求項３６に記載の酵素混合物。
【請求項３８】
前記混合物はさらに、１つ以上のリグニナーゼ、１つ以上のエンドグルカナーゼ、１つ以上のセロビオヒドロラーゼ、１つ以上のキシラナーゼを含む、請求項３３または３４に記載の酵素混合物。
【請求項３９】
前記混合物中の前記アグリコシル化されたポリペプチド対残りの酵素の間の比は少なくとも１：３２、例えば、１：３２〜１：３００である、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載に記載の酵素混合物。
【請求項４０】
前記アグリコシル化されたポリペプチド対グリコシル化されたポリペプチドの比は少なくとも１：３２、例えば、１：３２〜１：３００である、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の酵素混合物。
【請求項４１】
バイオマスから生成物（例えば、水素、糖、アルコール、など）を生成させる（またはバイオマスを生成物に変換させる）方法であって、バイオマスを、例えば、電子ビームによる処理により、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアグリコシル化されたポリペプチドおよび１つ以上のバイオマス分解酵素またはバイオマス分解酵素を含む酵素混合物を生成させる微生物（混合物）と、前記糖生成物の生成に好適な条件下で接触させることを含む、方法。
【請求項４２】
バイオマスを、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の酵素混合物と、前記生成物の生成に好適な条件下で接触させることを含む、バイオマスから生成物（例えば、水素、糖、アルコール）を生成させる方法。
【請求項４３】
前記生成物は糖生成物である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、前記糖生成物を単離することを含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記糖生成物の単離は沈殿、結晶化、クロマトグラフィー、遠心分離、および／または抽出を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記糖生成物はグルコースおよび／またはキシロースである、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記酵素混合物は、Ｂ２ＡＦ０３、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、Ｃｅｌ１ａ、Ｃｅｌ３ａ、Ｃｅｌ５ａ、Ｃｅｌ６ａ、Ｃｅｌ７ａ、Ｃｅｌ７ｂ、Ｃｅｌ１２ａ、Ｃｅｌ４５ａ、Ｃｅｌ７４ａ、ｐａＭａｎ５ａ、ｐａＭａｎ２６ａ、スウォレニン、および表１に列挙される酵素からなる群より選択される酵素の少なくとも２つを含む、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記バイオマスは、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物の１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含み；ここで：
ａ）農産物または農業廃棄物は、サトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせを含み；
ｂ）紙製品または紙屑は紙、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせを含み；
ｃ）林産物はアスペン材、パーティクルボード，木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせを含み；ならびに
ｄ）一般廃棄物は堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
さらに、前記微生物または前記酵素混合物を導入する前に前記バイオマスを処理して、前記バイオマスの不応性を低減させる工程を含み、前記処理は、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、蒸気爆発、化学的処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む、請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
バイオマス分解酵素を生成する前記微生物は、バチルス、コプリナス、ミセリオフソラ、セファロスポリウム、スキタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、ヒュミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウムまたはトリコデルマから選択される属の種に由来する、請求項４１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
バイオマス分解酵素を生成する前記微生物は、アスペルギルス、ヒュミコラ・インソレンス（スキタリジウム・サーモフィルム）コプリヌス・シネレウス、フサリウム・オキシスポルム、ミセリオフソラ・サーモヒラ、メリピウス・ギガンテウス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペルシシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポルム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウム、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーセイ、またはトリコデルマ・コニンギイから選択される、請求項４１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記微生物は、非誘導微生物と比べて、バイオマス分解酵素の生成を増加させるのに好適な条件下で、前記微生物を誘導バイオマス試料と組み合わせることにより、バイオマス分解酵素を生成するように誘導されている、請求項４１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記誘導バイオマス試料は、紙、紙製品、紙屑、紙パルプ、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、綿、木材、パーティクルボード、林業廃棄物、おがくず、アスペン材、木材チップ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、農業廃棄物、サイレージ、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アバカ、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、ダイズストーバー、コーンファイバ、アルファルファ、干し草、ココナツヘア、糖加工残渣、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス、藻類、海藻、堆肥、下水、くず、農業もしくは産業廃棄物、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／０３５，３４６号の恩典を主張し；その全内容はこれにより、参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を含み、これはＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、これによりその全体が参照により組み込まれる。２０１５年８月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＸ２００２−７０００ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは７６，９４９バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般にセロビアーゼ活性を有する組成物および本明細書で記載される組成物を生成させるための方法に関する。本発明はまた、例えば、バイオマス材料を加工処理するためにそのような組成物を使用するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
バイオマス分解酵素、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、およびリグニナーゼは原料などのバイオマスの分解にとって重要である。セルロースおよびリグノセルロース材料は、大量に多くの用途で、生成され、加工処理され、使用される。しばしば、そのような材料は１度使用され、その後廃棄物として捨てられるか、または廃棄材料、例えば、下水、バガス、おがくず、およびストーバーであると単純に考えられる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、少なくとも一部は、非真菌細胞株において発現され、酵素を著しくはグリコシル化しない宿主細胞から単離された、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のセロビアーゼは、Ｔ．リーセイ由来の内在性セロビアーゼ（グリコシル化され、分泌される）よりも、純粋基質に対し高い比活性を有したという驚くべき発見に基づく。さらに、アグリコシル化された（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）セロビアーゼが、他の糖化酵素を含む酵素混合物との糖化反応において使用された場合、アグリコシル化されたセロビアーゼなしの反応と比べて、糖生成物の収率における実質的な増加が観察された。そのため、酵素活性、例えば、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチド、アグリコシル化されたポリペプチドを含む組成物および本明細書で記載される組成物を生成させ、使用するための方法が、本明細書で提供される。
【０００６】
したがって、１つの態様では、本開示は、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを特徴とする。１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、野生型Ｔ．リーセイまたはその変異体、例えばＴ．リーセイＲＵＴＣ３０由来のグリコシル化されたＣｅｌ３Ａ酵素と比べて、増加したセロビアーゼ活性を有する。例えば、アグリコシル化されたポリペプチドは、野生型Ｔ．リーセイ由来のグリコシル化されたＣｅｌ３Ａ酵素と比べて、増加した基質認識またはより活性な基質認識部位を有することができる。１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、野生型Ｔ．リーセイ由来のグリコシル化されたＣｅｌ３Ａ酵素と比べて低減された立体障害を有する。
【０００７】
１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、またはその機能的断片に対し、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を含む。１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む（例えば、から構成される）。別の実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以下のアミノ酸だけ異なる。
【０００８】
１つの実施形態では、ポリペプチドは、野生型Ｔ．リーセイ、またはその変異体、例えばＴ．リーセイＲＵＴＣ３０由来のＣｅｌ３Ａ酵素、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む。
【０００９】
１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、核酸配列によりコードされ、ここで、核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を含む（例えば、から構成される）。１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む（例えば、から構成される）核酸配列によりコードされる。
【００１０】
１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、１つ以上のグリコシル化部位の近位での突然変異またはその部位での突然変異を含む遺伝子により発現され、この場合、突然変異はグリコシル化部位でのグリコシル化を防止する。１つの実施形態では、突然変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸位置７８のスレオニン、アミノ酸位置２４１のスレオニン、アミノ酸位置３４３のセリン、アミノ酸位置４５０のセリン、アミノ酸位置５９９のスレオニン、アミノ酸位置６１６のセリン、アミノ酸位置６９１のスレオニン、アミノ酸位置２１のセリン、アミノ酸位置２４のスレオニン、アミノ酸位置２５のセリン、アミノ酸位置２８のセリン、アミノ酸位置３８のスレオニン、アミノ酸位置４２のスレオニン、アミノ酸位置３０３のスレオニン、アミノ酸位置３９８のセリン、アミノ酸位置４３５のセリン、アミノ酸位置４３６のセリン、アミノ酸位置４３９のスレオニン、アミノ酸位置４４２のスレオニン、アミノ酸位置４４６のスレオニン、アミノ酸位置４５１のセリン、アミノ酸位置６１９のセリン、アミノ酸位置６２２のセリン、アミノ酸位置６２３のスレオニン、アミノ酸位置６２６のセリン、またはアミノ酸位置６３０のスレオニンの１つ以上に存在する。１つ以上のグリコシル化部位の近位の突然変異は、例えば、ポリペプチドのコンフォメーションを変化させる、またはグリコシル化酵素により認識されるコンセンサス部位を変化させることにより、その部位でのグリコシル化を防止することができ、そのため、グリコシル化がグリコシル化部位で起こらないであろう。
【００１１】
１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、炭水化物、例えばグルコースの二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、またはオリゴマ；またはグルコースおよびキシロースのオリゴマを１つ以上の単糖、例えば、グルコースに加水分解する。１つの実施形態では、セロビアーゼ活性は、セロビオースのβ１，４グリコシド結合の加水分解を含む。
【００１２】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドをコードする核酸配列を特徴とする。
【００１３】
１つの実施形態では、核酸配列はＣｅｌ３Ａ酵素またはその機能的断片をコードし、ここで、核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を含む（例えば、から構成される）。１つの実施形態では、核酸配列は、Ｃｅｌ３Ａ酵素をコードし、ここで、核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む（例えば、から構成される）。
【００１４】
１つの態様では、本開示は、本明細書で記載される核酸配列を含む核酸分子を特徴とする。
【００１５】
１つの実施形態では、核酸分子はさらに、プロモーター、例えば、原核細胞発現、例えば、細菌細胞発現、例えば、大腸菌における発現のためのプロモーターを含む。１つの実施形態では、プロモーター配列は構成的プロモーター配列、誘導性プロモーター配列、または抑制プロモーター配列である。１つの実施形態では、プロモーターはＴ７プロモーターである。
【００１６】
１つの実施形態では、核酸分子はさらに、タグ、例えば、検出および／または精製のための、および／または別の分子への連結のためのタグ、例えば、Ｈｉｓタグをコードする核酸配列を含む。
【００１７】
１つの実施形態では、核酸分子はさらに、１つ以上のシグナル配列、例えば、分泌シグナル配列をコードする核酸を含む。
【００１８】
１つの態様では、本開示は、本明細書で記載される核酸配列または本明細書で記載される核酸分子を含む発現ベクターを特徴とする。
【００１９】
１つの実施形態では、ベクターはさらに、選択マーカー、例えば、カナマイシンまたはアンピシリンマーカーをコードする核酸配列を含む。
【００２０】
１つの態様では、本開示は、本明細書で記載されるベクターを含む細胞を特徴とする。
【００２１】
１つの実施形態では、細胞は原核細胞／細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ大腸菌細胞である。
【００２２】
１つの実施形態では、細胞は本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドを発現する。
【００２３】
１つの実施形態では、細胞はグリコシル化に対して障害される。
【００２４】
１つの態様では、本開示は、本明細書で記載されるポリペプチドを発現する細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することを含む、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法を特徴とし、ここで、細胞はポリペプチドをグリコシル化せず、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、例えば、ｏｒｉｇａｍｉ大腸菌細胞である。
【００２５】
１つの態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを脱グリコシル化酵素で処理することを含む、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法を特徴とする。例えば、脱グリコシル化酵素はＰＧＮａｓｅまたはＥｎｄｏＨとすることができる。
【００２６】
１つの態様では、本開示は、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法を特徴とし、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞を培養することであって、核酸はコードされるポリペプチドのグリコシル化を防止する１つ以上の突然変異を有すること、ならびに任意で、アグリコシル化されたポリペプチドを培養物から得ることを含む。
【００２７】
１つの態様では、本開示は、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドを発現する細胞をグリコシル化阻害剤の存在下で培養するための方法を特徴とする。例えば、グリコシル化阻害剤はツニカマイシンである。
【００２８】
１つの態様では、本開示は、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドおよび１つ以上の追加の酵素、例えば１つ以上のグリコシル化された酵素、例えば、真菌細胞由来のセルラーゼを含む酵素混合物を特徴とする。１つの実施形態では、酵素混合物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも７５％、８０％、９５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むグリコシル化されたポリペプチドおよび本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドを含み、ここで、グリコシル化されたポリペプチドおよびアグリコシル化されたペプチドはどちらもセロビアーゼ活性を有する。
【００２９】
１つの実施形態では、酵素混合物はグリコシル化されたポリペプチドおよびアグリコシル化されたポリペプチドを含み、グリコシル化されたポリペプチドおよびアグリコシル化されたポリペプチドのどちらも野生型Ｔ．リーセイまたはその変異体、例えばＴ．リーセイＲＵＴＣ３０由来のＣｅｌ３Ａ酵素を含む。
【００３０】
１つの実施形態では、酵素混合物はさらに、微生物に由来する少なくとも１つの追加の酵素を含み、ここで、追加の酵素はバイオマス分解活性を有する。１つの実施形態では、追加の酵素は、リグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、およびセロビアーゼから選択される。
【００３１】
１つの実施形態では、反応混合物は、少なくとも１：３２、例えば、１：３２〜１：３００のアグリコシル化されたポリペプチドと残りの酵素の間の比を有する。１つの実施形態では、反応混合物は、少なくとも１：３２、例えば、１：３２〜１：３００である、アグリコシル化されたポリペプチド対グリコシル化されたポリペプチドの比を有する。
【００３２】
１つの態様では、本開示は、バイオマスから生成物（例えば、水素、糖、アルコール、など）を生成させる（またはバイオマスを生成物に変換させる）方法を特徴とし、これは、バイオマス、例えば、放射線、例えば、電子ビームからの放射線で処理されたバイオマスを本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドと、糖生成物の生成に好適な条件下で接触させることを含む。１つの実施形態では、方法はさらに、バイオマスを、１つ以上のバイオマス分解酵素またはバイオマス分解酵素を含む酵素混合物、例えば、本明細書で記載される酵素混合物を生成する微生物と接触させることを含む。
【００３３】
１つの態様では、本開示は、バイオマスから生成物（例えば、水素、糖、アルコール、など）を生成させる（またはバイオマスを生成物に変換させる）方法を特徴とし、これは、バイオマスを本明細書で記載される酵素混合物と、生成物の生成に好適な条件下で接触させることを含む。
【００３４】
１つの実施形態では、生成物は糖生成物、例えば、本明細書で記載される糖生成物である。１つの実施形態では、糖生成物はグルコースおよび／またはキシロース、または他の糖生成物、例えば果糖、アラビノース、ガラクトース、およびセロビオースである。
【００３５】
１つの実施形態では、方法はさらに、糖生成物を単離することを含む。１つの実施形態では、糖生成物の単離は沈殿、結晶化、クロマトグラフィー、遠心分離、および／または抽出を含む。
【００３６】
１つの実施形態では、酵素混合物は、Ｂ２ＡＦ０３、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、Ｃｅｌ１ａ、Ｃｅｌ３ａ、Ｃｅｌ５ａ、Ｃｅｌ６ａ、Ｃｅｌ７ａ、Ｃｅｌ７ｂ、Ｃｅｌ１２ａ、Ｃｅｌ４５ａ、Ｃｅｌ７４ａ、ｐａＭａｎ５ａ、ｐａＭａｎ２６ａ、スウォレニン（Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ）、または表１に列挙される酵素のいずれかから選択される酵素の少なくとも２つを含む。１つの実施形態では、上記で列挙される酵素は、酵素を異種的にまたは内因的に発現する細胞、例えば、トリコデルマ・リーセイまたはポドスポラ・アンセリナから単離される。
【００３７】
１つの実施形態では、バイオマスは澱粉質材料またはセルロース成分を含む澱粉質材料を含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物の１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含み；ここで：ａ）農産物または農業廃棄物はサトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせを含み；ｂ）紙製品または紙屑は、紙、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせを含み；ｃ）林産物はアスペン材、パーティクルボード、木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせを含み；ならびにｄ）一般廃棄物は、堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせを含む。１つの実施形態では、方法はさらに、例えば、バイオマスを、電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、蒸気爆発、化学的処理、機械的処理、および／または凍結粉砕により処理することにより、微生物または酵素混合物を導入する前にバイオマスを処理して、バイオマスの不応性を低減させる工程を含む。
【００３８】
１つの実施形態では、バイオマス分解酵素を生成する微生物は、バチルス、コプリナス、ミセリオフソラ、セファロスポリウム、スキタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、ヒュミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウムまたはトリコデルマから選択される属の種に由来する。１つの実施形態では、バイオマス分解酵素を生成する微生物は、アスペルギルス、ヒュミコラ・インソレンス（スキタリジウム・サーモフィルム）、コプリヌス・シネレウス、フサリウム・オキシスポルム、ミセリオフソラ・サーモヒラ、メリピウス・ギガンテウス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペルシシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポルム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウム、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーセイ、またはトリコデルマ・コニンギイから選択される。
【００３９】
１つの実施形態では、微生物は、非誘導微生物と比べて、バイオマス分解酵素の生成を増加させるのに好適な条件下で、微生物を誘導バイオマス試料と組み合わせることにより、バイオマス分解酵素を生成するように誘導されている。１つの実施形態では、誘導バイオマス試料は紙、紙製品、紙屑、紙パルプ、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、綿、木材、パーティクルボード、林業廃棄物、おがくず、アスペン材、木材チップ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、農業廃棄物、サイレージ、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アバカ、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、ダイズストーバー、コーンファイバ、アルファルファ、干し草、ココナツヘア、糖加工残渣、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス、藻類、海藻、堆肥、下水、くず、農業もしくは産業廃棄物、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】大腸菌において発現された精製Ｃｅｌ３ａの写真である。レーン１は分子量マーカーを表す（プレシジョンＰｌｕｓオールブループロテインマーカー、Ｂｉｏｒａｄ）；レーン２は精製Ｃｅｌ３ａ−Ｈｉｓタンパク質を表す。
【図２】Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓ試料のクロマトグラフィープロファイルであり、３１分でのＣｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓの検出を示す。
【図３】３１分での、Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓのクロマトグラフィープロファイルにおけるピークに対する質量スペクトル領域では、グリコシル化の証拠はないことを示すプロファイルである。
【図４】荷電状態エンベロープのデコンボリューションを示すプロファイルであり、主要成分（アグリコシル化されたＣｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓ）および微量成分（修飾されたＣｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓ）の分子量を同定する。
【図５】精製Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓの、セロビアーゼアッセイにより決定されたセロビアーゼ活性を示すグラフである。
【図６】濃度がわかっていないＣｅｌ３ａを有する試料のＣｅｌ３ａの濃度を決定するために使用することができる、公知の濃度のＣｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓに対して作成されたセロビアーゼ活性の検量線を示すグラフである。
【図７】Ｔ．リーセイ由来の内在性セロビアーゼ（Ｌ４１９６）と比べた、組換えＣｅｌ３ａの比活性を示すグラフである。
【図８】アグリコシル化されたセロビアーゼＣｅｌ３ａが添加された標準酵素混合物（Ｌ３３１対照）（Ｌ３３１（０．８ｍｇ／ｍｌＣｅｌ３ａ）と比べた、標準酵素混合物を用いて実施した糖化反応からのグルコース生成物の収率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
定義
別に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、発明が属する当分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４２】
「１つの（ａ、ａｎ）」という用語は、１つまたは１を超える（すなわち、少なくとも１つの）、物品の文法的対象を示す。例として、「１つの要素」は１つの要素または１を超える要素を意味する。
【００４３】
「アグリコシル化された」という用語は、本明細書では、分子がその自然の環境で生成された場合、グリカンが付着されている１つ以上の部位でグリコシル化されていない分子、例えば、ポリペプチドを示す（すなわち、それは、グリコシレート基（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）に付着されていないヒドロキシル基または他の官能基を含む）。例えば、Ｃｅｌ３Ａ酵素は、Ｃｅｌ３Ａ酵素がＴ．リーセイにおいて生成された時に、普通それに付着されたグリカン基を有するタンパク質における１つ以上の部位がその部位に付着されたグリカンを有さない時に、アグリコシル化される。いくつかの実施形態では、アグリコシル化された分子は付着されたグリカンを有さない。１つの実施形態では、分子は分子がグリコシル化され得ないように変化または突然変異されており、例えば、１つ以上のグリコシル化部位は、グリカンがグリコシル化部位に付着され得ないように突然変異される。別の実施形態では、付着されたグリカンは、例えば、酵素プロセスにより、例えば、グリカンを除去するまたは脱グリコシル化活性を有する酵素とインキュベートすることにより分子から除去することができる。さらに別の実施形態では、例えば、グリコシル化阻害剤（グリコシル化酵素を阻害する）の使用により分子のグリコシル化を阻害することができる。別の実施形態では、分子、例えば、ポリペプチドは、グリコシル化しない宿主細胞、例えば、大腸菌により生成させることができる。
【００４４】
「バイオマス」という用語は、本明細書では、任意の非石化、有機物質を示す。バイオマスは、澱粉質材料および／またはセルロース、ヘミセルロース、またはリグノセルロース材料とすることができる。例えば、バイオマスは農産物、紙製品、林産物、またはその任意の中間体、副産物、残渣もしくは廃棄物、または一般廃棄物とすることができる。バイオマスはそのような材料の組み合わせであってもよい。１つの実施形態では、バイオマスは、例えば、本明細書で記載される糖化および／または発酵反応により加工処理され、糖、アルコール、有機酸、またはバイオ燃料などの生成物が生成される。
【００４５】
「バイオマス分解酵素」という用語は、本明細書では、本明細書で記載されるバイオマス物質の成分を中間体または最終生成物に分解する酵素を示す。例えば、バイオマス分解酵素としては、少なくともアミラーゼ、例えば、α、βまたはγアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、キシラナーゼ、およびセロビオヒドロラーゼが挙げられる。バイオマス分解酵素は、多種多様の微生物により生成され、Ｔ．リーセイなどの微生物から単離することができる。バイオマス分解酵素は、内因的に発現され、または異種的に発現され得る。
【００４６】
「セロビアーゼ」という用語は、本明細書では、グルコースの二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、またはオリゴマ、またはグルコースおよびキシロースのオリゴマの、グルコースおよび／またはキシロースへの加水分解を触媒する酵素を示す。例えば、セロビアーゼはβ−グルコシダーゼであり、これは、セロビオース中のβ−１，４結合を触媒し、２つのグルコース分子を放出させる。
【００４７】
「セロビアーゼ活性」という用語は、本明細書では、セロビオースのグルコースへの加水分解を触媒する、例えば、β−Ｄ−グルコースを放出するβ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒するカテゴリのセルラーゼの活性を示す。セロビアーゼ活性は、本明細書、例えば、実施例６で記載されるアッセイに従い決定することができる。セロビアーゼ活性の１単位は、［グルコース］ｇ／Ｌ／［Ｃｅｌ３ａ］ｇ／Ｌ／３０分として規定することができる。
【００４８】
「セロビオヒドロラーゼ」という用語は、本明細書では、セルロース中のグリコシド結合を加水分解する酵素を示す。例えば、セロビオヒドロラーゼは１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼであり、これは、セルロース、セロオリゴ糖、または任意のβ−１，４−連結グルコース含有ポリマ中の１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒し、ポリマ鎖からオリゴ糖を放出させる。
【００４９】
「エンドグルカナーゼ」という用語は、本明細書では、セルロースの内部β−１，４グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素を示す。例えば、エンドグルカナーゼはエンド−１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼであり、これは、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）、リケナン中の１，４−β−Ｄ−グリコシド結合、混合β−１、３グルカン、例えば穀類β−Ｄ−グルカンまたはキシログルカン、およびセルロース成分を含む他の植物材料中のβ−１，４結合のエンド加水分解を触媒する。
【００５０】
「酵素混合物」という用語は、本明細書では、少なくとも２つの異なる酵素、または酵素の少なくとも２つの異なるバリアント（例えば、酵素のグリコシル化された、およびアグリコシル化されたバージョン）の組み合わせを示す。本明細書で言及される酵素混合物は、少なくとも、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを含む。１つの実施形態では、酵素混合物は、セロビアーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、リグニナーゼ、および／またはキシラナーゼの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、酵素混合物は、その酵素の１つ以上を発現する、例えば、分泌する細胞、例えば、微生物を含む。例えば、酵素混合物は、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドおよび、１つ以上の追加の酵素および／またはポリペプチドのバリアントを発現する、例えば、分泌する細胞、例えば、微生物を含むことができる。
【００５１】
「リグニナーゼ」という用語は、本明細書では、例えば酸化反応による、植物の細胞壁において普通に見られるリグニンの分解を触媒する酵素を示す。
【００５２】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は同じ意味で使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびその一本鎖または二本鎖形態のポリマを示す。特に限定されない限り、その用語は、基本核酸と同様の結合特性を有し、天然起源のヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別記されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾バリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列ならびに明確に指定された配列を暗に包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１  （１９９１）；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８  （１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８  （１９９４））。
【００５３】
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書では、制御または調節配列がポリペプチドをコードする核酸配列に関連する位置に配置され、そのため、制御配列は、ポリペプチド（ＤＮＡ配列によりコードされる）の発現に影響する構成を示す。１つの実施形態では、制御または調節配列は、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の上流にある。１つの実施形態では、制御または調節配列はセロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の下流にある。
【００５４】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同じ意味で使用され、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を示す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を占めることができるアミノ酸の最大数には制限はない。ポリペプチドとしては、互いにペプチド結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。「ポリペプチド」は、例えば、生物活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などを含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５５】
「プロモーター」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構、または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列を示す。
【００５６】
「調節配列」または「制御配列」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、核酸産物の発現に必要とされる核酸配列を示す。場合によっては、この配列はプロモーター配列であってもよく、他の場合には、この配列はまた、エンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントを含んでもよい。調節／制御配列は、例えば、核酸産物を調節された様式で、例えば、誘導様式で発現するものであってもよい。
【００５７】
「構成的」プロモーターという用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、細胞のほとんどまたは全ての生理的条件下で細胞においてポリペプチドを生成させるヌクレオチド配列を示す。１つの実施形態では、ポリペプチドはセロビアーゼ活性を有するポリペプチドである。
【００５８】
「誘導性」プロモーターという用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞中に存在する場合のみ、細胞においてポリペプチドを生成させるヌクレオチド配列を示す。１つの実施形態では、ポリペプチドはセロビアーゼ活性を有するポリペプチドである。
【００５９】
「抑制」プロモーターという用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的にプロモーターに対応するリプレッサーが細胞内に存在するまでのみ、細胞においてポリペプチドを生成させるヌクレオチド配列を示す。１つの実施形態では、ポリペプチドはセロビアーゼ活性を有するポリペプチドである。
【００６０】
「キシラナーゼ」という用語は、本明細書では、キシラン含有材料を加水分解する酵素を示す。キシランはキシロース単位を含む多糖である。キシラナーゼは、エンドキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、またはα−グルクロニルエステラーゼとすることができる。
【００６１】
説明
グリコシル化は、酵素構造および機能、例えば酵素活性、溶解度、安定性、フォールディング、および／または分泌において重要な役割を果たすと考えられる。したがって、バイオマスをバイオ燃料および他の生成物に変換するためのプロセスは、セルロースおよび／またはリグノセルロース材料の糖化に使用するための、グリコシル化された酵素、例えば、セロビアーゼの生成および利用に焦点をあてている。糖化に使用するための酵素は典型的には、タンパク質を適正にグリコシル化し、折り畳み、および分泌する真核宿主細胞株、例えばピキア・パストリスにおいて生成される。
【００６２】
本発明は、少なくとも一部は、非真菌細胞株において発現され、酵素を著しくはグリコシル化しない宿主細胞から単離された、Ｔ．リーセイ由来のセロビアーゼは、Ｔ．リーセイ由来の内在性セロビアーゼ（グリコシル化され、分泌される）よりも、純粋基質に対し高い比活性を有したという驚くべき発見に基づく。さらに、アグリコシル化されたセロビアーゼが他の糖化酵素を含む酵素混合物と共に糖化反応において使用された場合、アグリコシル化されたセロビアーゼなしの反応と比べて、糖生成物の収率の実質的な増加が観察された。そのため、酵素活性、例えば、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチド、アグリコシル化されたポリペプチドを含む組成物および本明細書で記載される組成物を生成させ、使用するための方法が、本明細書で提供される。
【００６３】
ポリペプチドおよびバリアント
本開示は、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドはセロビアーゼである。セロビアーゼは、その基質であるセロビオース中のβ−１，４結合を加水分解し、２つのグルコース分子を放出させる酵素である。セロビオースは水溶性のグルコースの１，４−連結二量体である。
【００６４】
Ｃｅｌ３ａ（ＢｇｌＩとしても知られている）は、トリコデルマ・リーセイにおいて同定されたセロビアーゼである。Ｃｅｌ３ａに対するアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＷ＿００６７１１１５３）は、以下に提供される：
ＭＧＤＳＨＳＴＳＧＡＳＡＥＡＶＶＰＰＡＧＴＰＷＧＴＡＹＤＫＡＫＡＡＬＡＫＬＮＬＱＤＫＶＧＩＶＳＧＶＧＷＮＧＧＰＣＶＧＮＴＳＰＡＳＫＩＳＹＰＳＬＣＬＱＤＧＰＬＧＶＲＹＳＴＧＳＴＡＦＴＰＧＶＱＡＡＳＴＷＤＶＮＬＩＲＥＲＧＱＦＩＧＥＥＶＫＡＳＧＩＨＶＩＬＧＰＶＡＧＰＬＧＫＴＰＱＧＧＲＮＷＥＧＦＧＶＤＰＹＬＴＧＩＡＭＧＱＴＩＮＧＩＱＳＶＧＶＱＡＴＡＫＨＹＩＬＮＥＱＥＬＮＲＥＴＩＳＳＮＰＤＤＲＴＬＨＥＬＹＴＷＰＦＡＤＡＶＱＡＮＶＡＳＶＭＣＳＹＮＫＶＮＴＴＷＡＣＥＤＱＹＴＬＱＴＶＬＫＤＱＬＧＦＰＧＹＶＭＴＤＷＮＡＱＨＴＴＶＱＳＡＮＳＧＬＤＭＳＭＰＧＴＤＦＮＧＮＮＲＬＷＧＰＡＬＴＮＡＶＮＳＮＱＶＰＴＳＲＶＤＤＭＶＴＲＩＬＡＡＷＹＬＴＧＱＤＱＡＧＹＰＳＦＮＩＳＲＮＶＱＧＮＨＫＴＮＶＲＡＩＡＲＤＧＩＶＬＬＫＮＤＡＮＩＬＰＬＫＫＰＡＳＩＡＶＶＧＳＡＡＩＩＧＮＨＡＲＮＳＰＳＣＮＤＫＧＣＤＤＧＡＬＧＭＧＷＧＳＧＡＶＮＹＰＹＦＶＡＰＹＤＡＩＮＴＲＡＳＳＱＧＴＱＶＴＬＳＮＴＤＮＴＳＳＧＡＳＡＡＲＧＫＤＶＡＩＶＦＩＴＡＤＳＧＥＧＹＩＴＶＥＧＮＡＧＤＲＮＮＬＤＰＷＨＮＧＮＡＬＶＱＡＶＡＧＡＮＳＮＶＩＶＶＶＨＳＶＧＡＩＩＬＥＱＩＬＡＬＰＱＶＫＡＶＶＷＡＧＬＰＳＱＥＳＧＮＡＬＶＤＶＬＷＧＤＶＳＰＳＧＫＬＶＹＴＩＡＫＳＰＮＤＹＮＴＲＩＶＳＧＧＳＤＳＦＳＥＧＬＦＩＤＹＫＨＦＤＤＡＮＩＴＰＲＹＥＦＧＹＧＬＳＹＴＫＦＮＹＳＲＬＳＶＬＳＴＡＫＳＧＰＡＴＧＡＶＶＰＧＧＰＳＤＬＦＱＮＶＡＴＶＴＶＤＩＡＮＳＧＱＶＴＧＡＥＶＡＱＬＹＩＴＹＰＳＳＡＰＲＴＰＰＫＱＬＲＧＦＡＫＬＮＬＴＰＧＱＳＧＴＡＴＦＮＩＲＲＲＤＬＳＹＷＤＴＡＳＱＫＷＶＶＰＳＧＳＦＧＩＳＶＧＡＳＳＲＤＩＲＬＴＳＴＬＳＶＡＧＳＧＳ
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）
【００６５】
本開示はまた、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチド、例えば、Ｃｅｌ３ａの機能的バリアントを提供する。１つの実施形態では、機能的バリアントは、本明細書で記載されるＣｅｌ３ａ、またはその機能的断片に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性、例えば、本明細書で記載されるＣｅｌ３ａ、またはその機能的断片に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、機能的バリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、またはその機能的断片に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％同一性、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６６】
２つ以上のアミノ酸または核酸配列との関連でのパーセント同一性は、同じである２つ以上の配列を示す。２つの配列は、２つの配列が、下記配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動整列および目視検査により測定される、比較窓、または指定された領域にわたって最大一致に対し比較、整列された場合、同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチド（例えば、特定の領域にわたって、または、特定されない場合、全配列にわたって、６０％同一性、任意で７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性）を有する場合、「実質的に同一」である。任意で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチドの長さである領域にわたって存在する。より好ましくは、同一性は、少なくとも約２００またはそれ以上のアミノ酸、または少なくとも約５００もしくは１０００またはそれ以上のヌクレオチドの長さである領域にわたって存在する。
【００６７】
配列比較では、１つの配列は典型的には、参照配列として機能し、これに対して１つ以上の試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または別のパラメータを指定することができる。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の整列化の方法は当技術分野でよく知られている。配列比較のための最適整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  （１９７０）  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３の相同性整列化アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行により（ＧＡＰ，  ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ，  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または手動整列および目視検査により（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）実施することができる。
【００６８】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７７）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０において記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センターを介して公的に入手可能である。
【００６９】
機能的バリアントは、１つ以上の突然変異を含むことができ、そのため、バリアントはセロビアーゼ活性を保持し、それはＴ．リーセイにより生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の酵素のセロビアーゼ活性よりも良好であり、例えばこれに比べて増加される。１つの実施形態では、機能的バリアントは、大腸菌により生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアグリコシル化されたバージョンとして、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）のセロビアーゼ活性を有する。セロビアーゼ活性は、本明細書で記載される機能アッセイを使用して試験することができる。
【００７０】
別の実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、参照アミノ酸配列、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列とは、わずか１、わずか２、わずか３、わずか４、わずか５、わずか６、わずか７、わずか８、わずか９、わずか１０、わずか１５、わずか２０、わずか３０、わずか４０、またはわずか５０のアミノ酸だけ異なる。
【００７１】
機能的バリアント中に存在する突然変異は、アミノ酸置換、付加、および欠失を含む。突然変異は、当技術分野で知られている標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発により導入することができる。突然変異は保存的アミノ酸置換とすることができ、この場合、アミノ酸残基は同様の側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。このように、本開示のセロビアーゼ活性を有するポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸により置き換えることができ、得られたポリペプチドは、野生型ポリペプチドに匹敵するセロビアーゼ活性（例えば、そのセロビアーゼ活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）を保持する。あるいは、突然変異は、アミノ酸残基が異なる側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換であってもよい。
【００７２】
そのような突然変異はセロビアーゼの様々な酵素特性を変化させ、またはこれに影響を与え得る。例えば、そのような突然変異は、セロビアーゼ活性、熱安定性、反応のための最適ｐＨ、酵素動力学、またはセロビアーゼの基質認識を変化させ、またはこれに影響を与え得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ｔ．リーセイにより生成されるセロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、バリアントのセロビアーゼ活性を増加させる。いくつかの実施形態では、突然変異は、野生型セロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、バリアントの熱安定性を増加または減少させる。１つの実施形態では、突然変異は、野生型セロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、バリアントが最適にセロビアーゼ反応を実施するｐＨ範囲を変化させる。１つの実施形態では、突然変異は、野生型セロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、セロビアーゼ反応の動力学（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭまたはＫＤ）を増加または減少させる。１つの実施形態では、突然変異は、野生型セロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、セロビアーゼの基質（例えば、セロビオース）を認識する、またはこれに結合する能力を増加または減少させる。
【００７３】
本発明はまた、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するポリペプチド、例えば、Ｃｅｌ３ａまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の機能的断片を提供する。当業者であれば、酵素活性に関与する機能ドメインを含む、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するポリペプチドの断片は機能活性、例えば、セロビアーゼ活性を保持することは容易に想定することができるであろう。そのため、そのような断片は本発明に包含される。１つの実施形態では、機能的断片は少なくとも７００アミノ酸、少なくとも６５０アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも５５０アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、または少なくとも５０アミノ酸の長さである。１つの実施形態では、機能的断片は７００〜７４４アミノ酸、６５０〜６９９アミノ酸、６００〜６４９アミノ酸、５５０〜５９９アミノ酸、５００〜５４９アミノ酸、４５０〜４９９アミノ酸、４００〜４４９アミノ酸、３５０〜３９９アミノ酸、３００〜３４９アミノ酸、２５０〜２９９アミノ酸、２００〜２４９アミノ酸、１５０〜１９９アミノ酸、１００〜１４９アミノ酸、または５０〜９９アミノ酸である。上記のアミノ酸長さの範囲に関しては、アミノ酸長さの最小および最高値は、各開示範囲内に含まれる。１つの実施形態では、機能的断片は、野生型Ｃｅｌ３ａまたは大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むポリペプチドとしてのセロビアーゼ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を有する。
【００７４】
セロビアーゼ活性を検出するためのアッセイは当技術分野で知られている。例えば、セロビオースから放出されるグルコースの量の検出は、精製セロビアーゼを基質、例えば、セロビオース、Ｄ−（＋）−セロビオースと共にインキュベートし、反応の完了後に得られた遊離グルコースの量を検出することにより決定することができる。遊離グルコースの量は、当技術分野で知られている様々な方法を用いて決定することができる。例えば、精製セロビアーゼの希釈物が、５０ｍＭクエン酸二水素ナトリウム、ｐＨ５．０  ＮａＯＨを含む緩衝液中で調製される。セロビオース基質が精製セロビアーゼに、反応混合物中のセロビオースの最終濃度が３０ｍＭとなるような量で添加される。反応混合物は、反応が起こるのに好適な条件下で、例えば、振盪機（７００ｒｐｍ）にて、４８℃で３０分間インキュベートされる。反応を停止させるために、反応混合物は５分間１００℃で加熱される。反応混合物は、０．４５μｍフィルタに通して濾過され、濾液が分析され、グルコースおよび／またはセロビアーゼの量が定量される。グルコースなどの分析物を測定するＹＳＩ機器を使用して、反応から生成されたグルコースの濃度を決定することができる。あるいは、ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）を使用して、反応からのグルコースおよびセロビオースの濃度を決定することができる。このアッセイは単一反応または多段反応フォーマット、例えば、９６ウェルフォーマットでフォーマットすることができる。いくつかの実施形態では、多段反応フォーマットが、精製セロビアーゼの異なる濃度に対するセロビアーゼ活性を表す活性曲線を作成するのに好ましい可能性がある。精製セロビアーゼの濃度は、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて決定することができる。精製セロビアーゼアッセイの希釈物は、例えば、２倍希釈で調製され、９６ウェルプレート、例えば、１２ウェルの２倍希釈にアリコートされる。セロビオース基質が前述したように添加され、そのため、反応物中のセロビアーゼの最終濃度は３０ｍＭとなる。プレートは密閉され、セロビアーゼ反応が起こるのに十分な条件下で、その後、反応を停止させる条件下で処理される。反応物はその後、９６ウェルフォーマット０．４５μｍメンブレン（例えば、Ｄｕｒａｐｏｒｅ）に通して濾過され、ＹＳＩおよび／またはＨＰＬＣ法、例えば、ＵＰＬＣにより分析される。
【００７５】
この活性アッセイはまた、既知の濃度を有するＣｅｌ３ａ試料の希釈物の活性の検量線を作成することにより、試料中のＣｅｌ３ａの濃度、または力価を決定するために使用することができる。濃度がわかっていない試料の希釈物の活性が決定され、検量線と比較され、検量線に基づきおおよその濃度が同定される。この方法はさらに詳細に、実施例６において記載される。
【００７６】
他の実施形態では、比色分析／蛍光定量的アッセイが使用され得る。精製セロビアーゼが基質セロビオースと共に、反応が起こる条件下でインキュベートされる。生成グルコースの検出は次の通りである。グルコースオキシダーゼが混合物に添加され、グルコースオキシダーゼはグルコース（生成物）を酸化してグルコン酸および過酸化水素にする。ペルオキシダーゼおよびｏ−ジアニシジンがその後に添加される。ｏ−ジアニシジンは過酸化水素と、ペルオキシダーゼの存在下で反応し、着色生成物を形成する。硫酸を添加し、これは酸化ｏ−ジアニシジンと反応し、より安定な着色生成物を形成する。色の強度は、例えば、分光光度計または比色計により、例えば、５４０ｎｍで測定すると、グルコース濃度に正比例する。そのような比色分析／蛍光定量的グルコースアッセイは、例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．ＧＡＧＯ−２０から市販されている。
【００７７】
上記のセロビアーゼ活性を有するポリペプチドの全てに対して、ポリペプチドは、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法を使用してアグリコシル化される。
【００７８】
グリコシル化は酵素プロセスであり、これにより、炭水化物がグリコシル受容体、例えば、アルギニンまたはアスパルギニン（ａｓｐａｒｇｉｎｉｎｅ）側鎖の窒素あるいはセリン、スレオニン、またはチロシン側鎖のヒドロキシル酸素に付着される。Ｎ−連結およびＯ−連結グリコシル化の２つの型のグリコシル化が存在する。Ｎ−連結グリコシル化は、コンセンサス部位Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒで起こり、ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸とすることができる。Ｏ−連結グリコシル化はＳｅｒ／Ｔｈｒ残基で起こる。グリコシル化部位は、当技術分野で知られている様々なアルゴリズム、例えば、スイスバイオインフォマティクス研究所により公的に入手可能なＰｒｏｓｉｔｅ、および、生化学配列分析センターにより公的に入手可能なＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０またはＮｅｔＯＧｌｙｃ４．０を使用して予測することができる。
【００７９】
複数の実施形態では、機能的バリアントは１つ以上の突然変異を含み、ここで、本明細書で記載される核酸配列により発現されるＣｅｌ３ａポリペプチド中に存在する１つ以上のグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｌｙａｔｉｏｎ）部位は変異され、そのため、グリカンはもはや、グリコシル化部位に付着または連結することはできない。別の実施形態では、機能的バリアントは本明細書で記載される核酸配列により発現されるＣｅｌ３ａポリペプチド中に存在する１つ以上のグリコシル化部位の近位で１つ以上の突然変異を含み、これは、グリカンがもはや、グリコシル化部位に付着または連結することはできないように、変異されている。例えば、グリコシル化部位の近位での突然変異はグリコシル化酵素により認識されるコンセンサスモチーフを変異させ、またはポリペプチドのコンフォメーションを変化させ、そのため、ポリペプチドはグリコシル化され得ず、例えば、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｌａｔｉｏｎ）部位は隠され、または新しいコンフォメーションによる立体障害は、グリコシル化酵素がグリコシル化部位にアクセスしないように防止する。Ｃｅｌ３ａポリペプチドにおけるグリコシル化部位の近位の突然変異はグリコシル化部位からすぐ隣、または少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも４０アミノ酸にあり、グリコシル化部位は近位突然変異の結果として、グリコシル化されない。
【００８０】
１つの実施形態では、Ｃｅｌ３ａ、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の次のグリコシル化部位の１つ以上が変異される：アミノ酸位置７８のスレオニン、アミノ酸位置２４１のスレオニン、アミノ酸位置３４３のセリン、アミノ酸位置４５０のセリン、アミノ酸位置５９９のスレオニン、アミノ酸位置６１６のセリン、アミノ酸位置６９１のスレオニン、アミノ酸位置２１のセリン、アミノ酸位置２４のスレオニン、アミノ酸位置２５のセリン、アミノ酸位置２８のセリン、アミノ酸位置３８のスレオニン、アミノ酸位置４２のスレオニン、アミノ酸位置３０３のスレオニン、アミノ酸位置３９８のセリン、アミノ酸位置４３５のセリン、アミノ酸位置４３６のセリン、アミノ酸位置４３９のスレオニン、アミノ酸位置４４２のスレオニン、アミノ酸位置４４６のスレオニン、アミノ酸位置４５１のセリン、アミノ酸位置６１９のセリン、アミノ酸位置６２２のセリン、アミノ酸位置６２３のスレオニン、アミノ酸位置６２６のセリン、またはアミノ酸位置６３０のスレオニン、またはそれらの任意の組み合わせ。複数の実施形態では、グリコシル化部位はセリンまたはスレオニンからアラニンに変異される。例えば、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドは次の突然変異の１つ以上を有する：Ｔ７８Ａ、Ｔ２４１Ａ、Ｓ３４３Ａ、Ｓ４５０Ａ、Ｔ５９９Ａ、Ｓ６１６Ａ、Ｔ６９１Ａ、Ｓ２１Ａ、Ｔ２４Ａ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２８Ａ、Ｔ３８Ａ、Ｔ４２Ａ、Ｔ３０３Ａ、Ｔ３９８Ａ、Ｓ４３５Ａ、Ｓ４３６Ａ、Ｔ４３９Ａ、Ｔ４４２Ａ、Ｔ４４６Ａ、Ｓ４５１Ａ、Ｓ６１９Ａ、Ｓ６２２Ａ、Ｔ６２３Ａ、Ｓ６２６Ａ、もしくはＴ６３０Ａ、またはそれらの任意の組み合わせ。あるいは、上記のグリコシル化部位の近位の１つ以上のアミノ酸が変異される。
【００８１】
ポリペプチドがグリカンにより修飾されたかどうか（例えば、ポリペプチドがグリコシル化されたか、またはアグリコシル化されたか）を検出するためのアッセイは当技術分野で知られている。ポリペプチドは精製または単離することができ、グリカン部分の検出および定量化のために染色することができ、またはポリペプチドは質量分析により分析することができ、対応する参照ポリペプチドと比較することができる。参照ポリペプチドは試験ポリペプチド（そのグリコシル化状態が決定される）と同じ一次配列を有するが、グリコシル化されているか、またはアグリコシル化されている。
【００８２】
本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドは、対応するグリコシル化されたポリペプチド、例えば、グリコシル化されたＣｅｌ３ａポリペプチドと比べて増加したセロビアーゼ活性を有する。例えば、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドは、グリコシル化された（ｇｌｙｏｃｙｏｓｙｌａｔｅｄ）ポリペプチドと比べて、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または２００％セロビアーゼ活性を有する。
【００８３】
核酸
本発明はまた、本発明のセロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。１つの実施形態では、核酸配列は、本明細書で記載されるアミノ酸配列を有するＣｅｌ３ａ酵素またはその機能的断片をコードする。
【００８４】
１つの実施形態では、Ｃｅｌ３ａをコードする核酸配列は以下の通りである：
ＡＴＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＣＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＣＴＡＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＣＣＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＡＧＧＴＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＧＣＧＧＴＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＧＧＴＣＣＴＴＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＡＴＣＧＣＴＡＴＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧＡＣＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＡＣＴＣＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＴＡＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＴＣＡＡＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＧＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＴＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＧＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴＣＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＴＧＴＣＧＡＴＣＣＡＴＡＴＣＴＣＡＣＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＡＴＣＣＡＧＴＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＡＴＣＣＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＧＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＡＴＡＣＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＣＡＡＴＧＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＣＡＧＴＡＣＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＣＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＣＧＧＴＡＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＴＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＧＧＴＧＡＣＴＣＧＴＡＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＡＣＴＴＧＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＡＴＣＣＧＴＣＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＴＧＴＴＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＣＡＣＧＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＡＡＣＧＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＴＴＧＧＧＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＣＣＧＴＣＡＡＣＴＡＴＣＣＧＴＡＣＴＴＣＧＴＣＧＣＧＣＣＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＡＧＡＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＧＴＣＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＴＣＧＣＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＴＣＧＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＣＣＧＴＴＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＴＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＡＴＣＧＴＴＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＴＡＡＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＡＡＴＡＴＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＧＴＣＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＡＣＴＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＣＧＴＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＧＡＣＴＧＧＧＧＣＣＧＴＴＧＴＧＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＴＧＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＴＣＧＣＧＡＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＧＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＧＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＧＧＡＧＣＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＣＴＣＴＧＴＣＧＧＴＡＧＣＧ
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
【００８５】
本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主細胞における発現を増加させるためにコドン−最適化させることができる。コドン最適化は、コドン利用バイアス、潜在スプライシング部位、ｍＲＮＡ二次構造、未熟ポリＡ部位、コドンとアンチコドンの相互作用、およびＲＮＡ不安定性モチーフを含む因子を考慮して、コードされるポリペプチドの宿主における発現を増加させるために核酸配列を変化させることを含む。コドン−最適化のための様々なアルゴリズムおよび商業サービスは当技術分野で知られており、使用可能である。
【００８６】
Ｃｅｌ３ａをコードするコドン−最適化核酸配列は以下の通りである：
ＡＴＧＣＧＴＴＡＴＣＧＴＡＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＡＣＧＴＧＣＣＧＡＴＡＧＴＣＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＴＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＡＡＧＴＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＧＴＣＣＧＴＧＣＧＴＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＣＧＣＴＡＴＡＧＣＡＣＣＧＧＴＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧＴＴＡＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＧＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＴＴＴＡＴＣＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＴＴＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＣＣＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＴＴＧＡＴＣＣＧＴＡＴＴＴＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＡＴＧＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＴＡＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡＴＡＴＴＡＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＧＡＴＣＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＡＴＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＣＧＡＣＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＡＧＣＴＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣＧＴＧＡＴＧＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＣＣＧＴＴＣＡＧＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＴＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＴＧＣＣＧＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＣＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＡＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＴＣＧＣＧＣＡＡＴＣＧＣＡＣＧＣＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＴＣＴＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＧＴＡＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＣＧＣＣＣＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＣＧＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＡＡＣＴＡＣＣＣＧＴＡＴＴＴＣＧＴＧＧＣＣＣＣＧＴＡＣＧＡＣＧＣＣＡＴＴＡＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＡＡＧＴＡＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＴＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＡＴＴＡＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＡＴＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＧＣＡＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＧＴＧＧＣＡＴＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＡＴＡＧＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＴＧＴＧＧＴＧＣＡＴＡＧＣＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＴＧＴＧＧＧＧＣＧＡＴＧＴＴＡＧＴＣＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＡＣＡＡＴＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＣＧＡＣＴＡＴＡＡＣＡＣＣＣＧＣＡＴＣＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡＴＡＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣＣＣＧＣＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＴＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＧＴＴＴＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴＧＡＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＴＣＣＧＡＧＣＡＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＡＧＴＧＴＧＧＧＴＧＣＡＡＧＴＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＴＴＣＧＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＴＧＣＣ
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
【００８７】
１つの実施形態では、Ｃｅｌ３ａ酵素またはその機能的バリアントをコードする核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対し少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を含む。１つの実施形態では、Ｃｅｌ３ａ酵素またはその機能的バリアントをコードする核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を含む。
【００８８】
本明細書では、上記のアグリコシル化されたポリペプチド、例えば、Ｃｅｌ３ａポリペプチドをコードする核酸配列が提供され、この場合、ポリペプチド中に存在する１つ以上のグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｌｙａｔｉｏｎ）部位は、グリカンがもはや、グリコシル化部位に付着または連結することはできないように、変異されている。別の実施形態では、上記のアグリコシル化されたポリペプチド、例えば、Ｃｅｌ３ａポリペプチドをコードする、本明細書で記載される核酸配列が提供され、この場合、ポリペプチド中に存在する１つ以上のグリコシル化部位の近位での１つ以上の突然変異は、前述したように、グリカンがもはや、グリコシル化部位に付着または連結することはできないように、変異されている。１つの実施形態では、核酸配列は、Ｃｅｌ３ａ、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の次のグリコシル化部位の１つ以上での１つ以上の突然変異を含むポリペプチドをコードする：アミノ酸位置７８のスレオニン、アミノ酸位置２４１のスレオニン、アミノ酸位置３４３のセリン、アミノ酸位置４５０のセリン、アミノ酸位置５９９のスレオニン、アミノ酸位置６１６のセリン、アミノ酸位置６９１のスレオニン、アミノ酸位置２１のセリン、アミノ酸位置２４のスレオニン、アミノ酸位置２５のセリン、アミノ酸位置２８のセリン、アミノ酸位置３８のスレオニン、アミノ酸位置４２のスレオニン、アミノ酸位置３０３のスレオニン、アミノ酸位置３９８のセリン、アミノ酸位置４３５のセリン、アミノ酸位置４３６のセリン、アミノ酸位置４３９のスレオニン、アミノ酸位置４４２のスレオニン、アミノ酸位置４４６のスレオニン、アミノ酸位置４５１のセリン、アミノ酸位置６１９のセリン、アミノ酸位置６２２のセリン、アミノ酸位置６２３のスレオニン、アミノ酸位置６２６のセリン、またはアミノ酸位置６３０のスレオニン、またはそれらの任意の組み合わせ。複数の実施形態では、グリコシル化部位はセリンまたはスレオニンからアラニンに変異される。例えば、本発明の核酸配列は、次の突然変異の１つ以上を含むアグリコシル化されたポリペプチドをコードする：Ｔ７８Ａ、Ｔ２４１Ａ、Ｓ３４３Ａ、Ｓ４５０Ａ、Ｔ５９９Ａ、Ｓ６１６Ａ、Ｔ６９１Ａ、Ｓ２１Ａ、Ｔ２４Ａ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２８Ａ、Ｔ３８Ａ、Ｔ４２Ａ、Ｔ３０３Ａ、Ｔ３９８Ａ、Ｓ４３５Ａ、Ｓ４３６Ａ、Ｔ４３９Ａ、Ｔ４４２Ａ、Ｔ４４６Ａ、Ｓ４５１Ａ、Ｓ６１９Ａ、Ｓ６２２Ａ、Ｔ６２３Ａ、Ｓ６２６Ａ、もしくはＴ６３０Ａ、またはそれらの任意の組み合わせ。当業者であれば、容易に野生型Ｃｅｌ３ａの核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を、当技術分野で知られている方法、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することにより、１つ以上のグリコシル化部位突然変異を有するポリペプチドをコードするように改変することができるであろう。
【００８９】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離またはクローン化するために使用される技術は当技術分野で知られており、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、またはそれらの組み合わせが含まれる。そのようなゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば、よく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または共通構造特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することにより実施することができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  ＰＣＲ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびヌクレオチド配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の増幅手順が使用され得る。核酸配列は、トリコデルマ・リーセイ、例えば、野生型Ｔ．リーセイ、またはＴ．リーセイＲＵＴＣ３０の株、または別のもしくは関連生物からクローン化され得、よって、例えば、核酸配列のポリペプチドコード領域のアレルまたは種バリアントであってもよい。
【００９０】
核酸配列は、核酸配列をその自然の位置から異なる部位へ再配置する、遺伝子操作において使用される標準クローニング手順により得られ得、この場合、それは複製され得る。クローニング手順は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む所望の断片の切除および単離、断片のベクター分子中への挿入、および組換えベクターの宿主細胞中への組み込みを含むことができ、この場合、ヌクレオチド配列の複数のコピーまたはクローンが複製される。ヌクレオチド配列はゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００９１】
発現ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、発現されるポリペプチドの発現、分泌、および／または単離を管理する１つ以上の制御配列に作動可能に連結された、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを提供する。
【００９２】
本明細書では、「発現ベクター」とは、対象となる核酸配列を宿主細胞中に導入し、発現させるための核酸コンストラクトである。いくつかの実施形態では、ベクターは、対象となる核酸配列に作動可能に連結され、これにおいてコードされるポリペプチドの発現を実行することができる好適な制御配列を含む。制御配列は、核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される適切なプロモーター配列であってもよい。１つの実施形態では、対象となる核酸配列は、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列である。
【００９３】
本発明の発現ベクターにおけるプロモーターは、宿主細胞に対して同種または異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られるプロモーター、変異プロモーター、切断型プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含むことができる。
【００９４】
細菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を管理するための好適なプロモーターの例は、大腸菌ｌａｃオペロン、大腸菌ｔａｃプロモーター（ハイブリッドプロモーター、ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ，  １９８３，  ８０：２１−２５）、大腸菌ｒｅｃ  Ａ、大腸菌ａｒａＢＡＤ、大腸菌ｔｅｔＡ、および原核生物β−ラクタマーゼから得られるプロモーターである。好適なプロモーターの他の例としては、ウイルスプロモーター、例えばバクテリオファージ由来のプロモーター、例として、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｍ１３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、１を超えるプロモーター、例えば、大腸菌ｌａｃプロモーターおよびＴ７プロモーターが、対象となる核酸配列の発現を制御する。本発明において使用するのに好適となり得るさらなるプロモーターは、“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，  １９８０，  ２４２：７４−９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８９において記載される。いくつかの好ましい実施形態では、プロモーターは誘導性であり、この場合、分子の添加は下流読み枠の転写および発現を刺激する。
【００９５】
真核宿主細胞、例えば、真菌または酵母細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を管理するための好適なプロモーターの例は、トリコデルマ・リーセイ、メタノール−誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸプロモーター）、アスペルギルス・ニデュランストリプトファン生合成（ｔｒｐＣプロモーター）、クロコウジカビ変種アワモリフルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、サッカロマイセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、またはクルイベロミセス・ラクチスＰｌａｃ４−ＰＢＩプロモーターの遺伝子から得られるプロモーターである。
【００９６】
本発明の発現ベクター中に存在する制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるシグナル配列であってもよく、例えば、分泌シグナル配列である。シグナル配列は内在性シグナル配列であってもよく、例えば、対象となるポリペプチドの起源である生物により内因的に発現される時に、シグナル配列が野生型ポリペプチドのＮ末端に存在する場合である。シグナル配列は、外来性、または異種性、シグナルペプチドであってもよく、この場合、シグナル配列は、発現される対象となるポリペプチドとは異なる生物または異なるポリペプチドに由来する。発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中に向かわせる任意のシグナル配列が本発明で使用され得る。典型的には、シグナル配列は、６〜１３６の塩基性および／または疎水性（ｈｙｃｒｏｐｈｏｂｉｃ）アミノ酸から構成される。
【００９７】
本発明に好適なシグナル配列の例としては、サッカロマイセス・セレビシエα−因子由来のシグナル配列が挙げられる。
【００９８】
融合タグもまた、本発明の発現ベクターにおいて、発現されるポリペプチドの検出および精製を促進するために使用され得る。好適な融合タグの例としては、Ｈｉｓ−タグ（例えば、３×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、または８×Ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））、ＧＳＴ−タグ、ＨＳＶ−タグ、Ｓ−タグ、Ｔ７タグが挙げられる。他の好適な融合タグとしては、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、および蛍光タンパク質タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。融合タグは、典型的には、発現されるポリペプチドのＮまたはＣ末端に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、融合タグ配列と発現されるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の間にリンカー領域が存在してもよい。１つの実施形態では、リンカー領域は、１〜２０アミノ酸の配列を含み、これは発現されるポリペプチドの発現または機能に影響せず、またはこれを変化させない。
【００９９】
本明細書で記載される融合タグの利用は、発現されたタンパク質の検出を、例えば、ウエスタンブロットにより、タグを特異的に認識する抗体を使用することにより可能にする。タグはまた、発現されたポリペプチドの宿主細胞からの、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にする。例えば、Ｈｉｓ−タグに融合された発現されたポリペプチドは、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより精製することができる。Ｈｉｓタグは、ニッケルイオンに対して親和性を有し、およびニッケルカラムはｈｉｓ−タグ付けされたポリペプチドを保持し、一方、他のタンパク質および細胞デブリは全てカラムを通って流れることができる。例えば、イミダゾールを含む溶離緩衝液を使用する、Ｈｉｓ−タグ付けされたポリペプチドの溶離により、Ｈｉｓ−タグ付けされたポリペプチドがカラムから放出され、実質的に精製されたポリペプチドが得られる。
【０１００】
本発明の発現ベクターはさらに、当業者に一般に知られているコンストラクトで形質転換された遺伝子改変微生物の単離を可能にする、選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質に対する抵抗性、または、そうでなければ、これらの条件下で増殖することができない宿主生物への特定の栄養分が欠如した培地で増殖する能力を付与し得る。本発明は、選択可能なマーカー遺伝子の選択により限定されず、当業者は容易に適切な遺伝子を決定し得る。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ジェネテシン、またはＧ４１８に対する耐性を付与することができ、またはｔｒｐ、ａｒｇ、ｌｅｕ、ｐｙｒ４、ｐｙｒ、ｕｒａ３、ｕｒａ５、ｈｉｓ、またはａｄｅ遺伝子の１つにおける宿主微生物の欠損を補完することができ、またはアセトアミドを唯一の窒素源として増殖する能力を付与することができる。
【０１０１】
本発明の発現ベクターはさらに、当業者に一般に知られている、他の核酸配列、例えば、追加の制御配列、例えば、転写ターミネーター、様々な他の核酸配列を一緒に連結するための合成配列、複製開始点、リボソーム結合部位、マルチクローニング部位（またはポリリンカー部位）、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターに好適なリボソーム結合部位は使用される宿主細胞に依存し、例えば、原核宿主細胞における発現では、原核ＲＢＳ、例えば、Ｔ７ファージＲＢＳが使用され得る。マルチクローニング部位、またはポリリンカー部位は、１つ以上の制限酵素部位を含み、それらは、好ましくは発現ベクターの残りの配列中には存在しない。制限酵素部位は、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列または他の所望の制御配列の挿入のために使用される。本発明の実施は、これらの他の核酸配列の任意の１つ以上、例えば、他の制御配列の存在により限定されない。
【０１０２】
本発明において使用するための好適な発現ベクターの例としては、原核生物における発現のためのベクター、例えば、細菌発現ベクターが挙げられる。本発明において使用するのに好適な細菌発現ベクターはｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）であり、これは次を含む：ウイルスＴ７プロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのみに特異的であり（細菌ＲＮＡポリメラーゼではない）、原核生物ゲノムのいずれにおいても起こらない）、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃリプレッサータンパク質に対するコード配列を含むｌａｃオペレーター（ｌａｃＩ遺伝子）、ポリリンカー、ｆ１複製開始点（そのため、Ｍ１３ヘルパーファージに同時感染した場合に、一本鎖プラスミドが生成され得る）、アンピシリン耐性遺伝子、およびＣｏｌＥ１複製開始点（Ｂｌａｂｅｒ、１９９８）。プロモーターおよびｌａｃオペレーターのどちらもポリリンカーの５’、または上流に位置し、ここで、本明細書で記載されるポリペプチドをコードする核酸配列が挿入される。ｌａｃオペレーターは、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の誘導発現を付与する。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）、ラクトース代謝産物の添加は、ｌａｃオペロンの転写を誘発し、ｌａｃオペレーターの制御下で、核酸配列のタンパク質発現を誘導する。この系の使用には、ベクター発現のためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの宿主細胞への添加が必要とされる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは第２の発現ベクターを介して導入することができ、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するように遺伝子操作された宿主細胞株が使用され得る。
【０１０３】
本発明と共に使用するための例示的な発現ベクターは、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されているｐＥＴベクターである。ｐＥＴ発現系は、米国特許第４，９５２，４９６号；５，６９３，４８９号；ならびに５，８６９，３２０号に記載される。１つの実施形態では、ｐＥＴベクターはＮｏｖａｇｅｎから市販されているｐＥＴ−ＤＵＥＴベクター、例えば、ｐＥＴ−Ｄｕｅｔ１である。本発明において使用するのに好適な他のベクターとしては、Ｈｉｓ−タグ配列を含むベクター、例えば、米国特許第５，３１０，６６３号および５，２８４，９３３号；ならびに欧州特許第２８２０４２号に記載されるものが挙げられる。
【０１０４】
本発明はまた、本発明の核酸配列または発現ベクターを含む宿主細胞に関し、それらはセロビアーゼ活性を有するポリペプチドの組換え生成において使用される。
【０１０５】
本発明の核酸配列を含む発現ベクターは宿主細胞中に導入され、そのため、ベクターは維持され（例えば、染色体組込みにより、または自己複製染色体外ベクターとして）、そのため、ポリペプチドが発現される。
【０１０６】
宿主細胞は原核生物または真核生物であってもよい。宿主細胞は細菌、例えば大腸菌株、例えば、Ｋ１２株ＮｏｖａＢｌｕｅ、ＮｏｖａＢｌｕｅＴ１Ｒ、ＪＭ１０９、およびＤＨ５αであってもよい。好ましくは、細菌細胞は、外因的に発現されたタンパク質を折り畳む、または部分的に折り畳む能力を有し、例えば大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ株、例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ２、およびＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）株である。いくつかの実施形態では、グリコシル化が欠失した、またはグリコシル化経路が障害された宿主細胞を使用することが好ましく、そのため、宿主細胞により発現されたタンパク質は著しくグリコシル化されていない。
【０１０７】
宿主細胞は酵母または糸状菌、特に子嚢菌として分類されるものであってもよい。本発明の修飾されたＴｒＣｅｌ３Ａβ−グルコシダーゼの発現のための宿主微生物として有用な酵母の属としてはサッカロマイセス、ピキア、ハンゼヌラ、クリベロミセス、ヤロウイア、およびアルクスラが挙げられる。本発明のポリペプチドの発現のための微生物として有用な真菌の属としては、トリコデルマ、ヒポクレア、アスペルギルス、フサリウム、ヒュミコラ、ニューロスポラ、クリソスポリウム、ミセリオフソラ、チエラビア、スポロトリカムおよびペニシリウムが挙げられる。例えば、宿主細胞はピキア・パストリスであってもよい。例えば、宿主細胞はトリコデルマ・リーセイの工業菌株、またはその変異体、例えば、Ｔ．リーセイＲＵＴＣ３０であってもよい。典型的には、宿主細胞は親セロビアーゼまたはＣｅｌ３ａを発現しないものである。
【０１０８】
特定の宿主細胞、例えば、細菌細胞または真菌細胞の選択は、発現ベクター（例えば、制御配列）および／または以下にさらに詳細に記載される本発明のアグリコシル化されたポリペプチドを生成するために使用される方法に依存する。
【０１０９】
本発明の発現ベクターは宿主細胞に、微生物の形質転換の当業者に知られている多くの方法、例えば、限定はされないが、形質転換、細胞のＣａＣｌ２、電気穿孔、微粒子銃照射、リポフェクション、およびプロトプラストのＰＥＧ媒介融合による処理（例えばＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ２００５／０９３０７２号（参照により本明細書に組み込まれる））により、導入され得る。発現ベクターを含む組換え宿主細胞を選択した後（例えば、発現ベクターの選択可能なマーカーを使用する選択による）、組換え宿主細胞は、本発明のセロビアーゼ活性を有するポリペプチドの発現を誘導する条件下で培養され得る。
【０１１０】
アグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法
本発明はさらに、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを生成させるための方法を提供する。方法は本発明のポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することを含む。方法はまた、アグリコシル化されたポリペプチドを組換え宿主細胞から回収することを含み得る。
【０１１１】
原核および真核細胞から発現されたポリペプチドを回収するための方法は当技術分野で知られている。複数の実施形態では、ポリペプチドを回収するための方法は、細胞を、例えば、機械的、化学的、または酵素的手段により溶解することを含む。例えば、細胞は、例えば、超音波処理、ミリング（ビーズと共に振盪）、またはせん断力により、物理的に破砕することができる。細胞膜は、透過性にし、細胞の内容物が放出されるように処理することができ、例えば、洗浄剤、例えば、トリトン、ＮＰ−４０、またはＳＤＳによる処理である。細胞壁を有する細胞、例えば、細菌細胞は、酵素、例えばリゾチームまたはリゾナーゼを使用して透過性にすることができる。上記の機械的、化学的、および酵素的技術の任意の組み合わせもまた、この発明との関連で、対象となる発現されたポリペプチドを宿主細胞から回収するのに好適である。例えば、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを細菌細胞、例えば、大腸菌細胞において発現させる場合、細胞は典型的には、細胞培養物を遠心分離し、ペレット化し、リゾチームを含む溶解緩衝液中に再懸濁させることにより溶解される。完全な溶解を確保するために、再懸濁させた細胞を次の方法の１つに供する：超音波処理、ミリング、または均質化。
【０１１２】
１つの実施形態では、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有する、発現されたアグリコシル化されたポリペプチドは、糖化反応のためにバイオマスに添加される前には溶解されない。場合によっては、宿主細胞を溶解するための方法はタンパク質変性および／または酵素活性の減少を引き起こすことがあり、下流加工処理のコストの増加につながる。よって、本発明はまた、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを発現する宿主細胞をバイオマスに、糖化工程前に直接添加するための方法を提供する。
【０１１３】
１つの実施形態では、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを発現する宿主細胞、例えば、大腸菌細胞は、例えば、遠心分離により、単離され、糖化反応、例えば、バイオマスを含む糖化反応器に添加される。細胞はバイオマスからのせん断、羽根車、および上昇した温度の組み合わせにより溶解される。１つの実施形態では、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを発現する宿主細胞、例えば、大腸菌細胞の培養物は直接発酵槽から、糖化槽に直接添加され、遠心分離により細胞をペレット化する必要性が排除される。
【０１１４】
グリコシル化が欠損した宿主細胞の使用
複数の実施形態では、発現ベクターは融合タグに作動可能に連結された、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、細胞、例えば、細菌宿主細胞において発現されるタンパク質を著しくはグリコシル化しない細胞中に導入され、発現される。組換え宿主細胞はポリペプチドの発現のための条件下で培養され、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドが生成される。アグリコシル化されたポリペプチドは宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。
【０１１５】
例えば、この実施形態では、発現ベクターはｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターを、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の上流に含み、宿主細胞はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する能力を有する。セロビアーゼ活性を有するポリペプチドの発現はＩＰＴＧの添加により誘導される。好ましくは、宿主細胞は大腸菌細胞、好ましくは大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ細胞である。この実施形態では、融合タグはＨｉｓ−タグであり、発現されたアグリコシル化されたポリペプチドの精製はニッケルアフィニティークロマトグラフィーを含む。
【０１１６】
グリコシル化能力を有する宿主細胞の使用
別の実施形態では、本明細書で記載されるように、ポリペプチドがグリコシル化されないように、１つ以上のグリコシル化部位突然変異を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターが宿主細胞において発現され、ここで、宿主細胞は細胞、例えば、酵母または真菌宿主細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができる。あるいは、宿主細胞は、細胞、例えば、細菌宿主細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができない。この実施形態では、ポリペプチドは融合タグに作動可能に連結されている。アグリコシル化されたポリペプチドは細菌宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。
【０１１７】
さらに別の実施形態では、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターは宿主細胞で発現され、この場合、宿主細胞は細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができる。細胞は、ポリペプチドの発現およびグリコシル化に十分な条件下で培養される。この実施形態では、ポリペプチドは融合タグに作動可能に連結されている。グリコシル化されたポリペプチドは細菌宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。宿主細胞および他の内在性宿主酵素、例えば、グリコシル化酵素からの精製後、単離されたグリコシル化されたポリペプチドのグリカンは脱グリコシル化酵素とのインキュベーションにより除去することができる。脱グリコシル化酵素としてはＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、ＥｎｄｏＨ（エンドグリコシダーゼＨ）、ＥｎｄｏＳ（エンドグリコシダーゼＳ）、ＥｎｄｏＤ（エンドグリコシダーゼＤ）、ＥｎｄｏＦ（エンドグリコシダーゼＦ）、ＥｎｄｏＦ１（エンドグリコシダーゼＦ１）、またはＥｎｄｏＦ２（エンドグリコシダーゼＦ２）が挙げられる。グリカンの完全除去に十分な酵素を含むタンパク質脱グリコシル化混合物は、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。単離されたポリペプチドは、１つ以上の脱グリコシル化酵素と共に、全てのグリカンをポリペプチドから除去するのに十分な条件下でインキュベートされる。グリカンをポリペプチドから除去するための他の方法が当技術分野で知られており、例えば、弱アルカリまたは弱ヒドラジン分解によるβ−脱離がある。ポリペプチドのグリコシル化状態の評価は、当技術分野で知られているグリカンの染色および可視化のための方法、または質量分析を使用して決定することができる。
【０１１８】
さらに別の実施形態では、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターは宿主細胞で発現され、この場合、宿主細胞は細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができる。細胞は、ポリペプチドの発現に十分な条件下であるが、グリコシル化阻害剤の存在下で培養される。グリコシル化阻害剤は、発現されたポリペプチドがグリコシル化されないような濃度で、十分な時間存在する。この実施形態では、ポリペプチドは融合タグに作動可能に連結されている。得られたアグリコシル化されたポリペプチドは細菌宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。
【０１１９】
この実施形態で使用するのに好適なグリコシル化阻害剤の例としては、ツニカマイシン、ベンジル−ＧａｌＮＡｃ（ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）、２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース、および５’ＣＤＰ（５’シチジラート二リン酸）が挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシル化阻害剤の組み合わせが使用される。好ましくは、この実施形態で使用されるグリコシル化阻害剤の濃度はポリペプチドのグリコシル化を阻害するのに十分であるが、宿主細胞の細胞毒性またはタンパク質発現の阻害を引き起こさない。
【０１２０】
アグリコシル化されたポリペプチドを使用した生成物の生成方法
本発明は、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを使用して、バイオマスを生成物に変換または加工処理するための方法および組成物を提供する。バイオマスを生成物、例えば糖生成物に変換するための方法は、例えば、米国特許出願２０１４／００１１２５８号（その内容は、その全体として参照により組み込まれる）に記載されるように、当技術分野で知られている。簡単に言うと、バイオマスは、例えば、不応性を低減させるために、最適に前処理され、被処理バイオマスをバイオマス分解、またはセルロース分解性酵素と共にインキュベートし、糖（例えば、グルコースおよび／またはキシロース）を生成させることを含む糖化プロセスにより糖化される。糖生成物はその後、さらに、例えば、発酵または蒸留により加工処理することができ、最終生成物が生成される。最終生成物としては、アルコール（例えば、エタノール、イソブタノール、またはｎ−ブタノール）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、またはソルビトール）、または有機酸（例えば、乳酸、ピルビン酸（ｐｙｕｒｖｉｃ  ａｃｉｄ）、コハク酸）が挙げられる。
【０１２１】
本明細書で記載されるプロセスを使用して、バイオマス材料を、１つ以上の生成物、例えばエネルギー、燃料、食品および材料に変換させることができる。生成物の具体例としては、次に挙げられるが、それらに限定されない：水素、糖（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、果糖、セロビオース、二糖、オリゴ糖および多糖）、アルコール（例えば、一価アルコールまたは二価アルコール、例えばエタノール、ｎ−プロパノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールまたはｎ−ブタノール）、水和または含水アルコール（例えば、１０％、２０％、３０％を超える、またはさらに４０％を超える水を含む）、バイオディーゼル、有機酸、炭化水素（例えば、メタン、エタン、プロパン、イソブテン、ペンタン、ｎ−ヘキサン、バイオディーゼル、バイオガソリンおよびそれらの混合物）、共生成物（例えば、タンパク質、例えばセルロース分解性タンパク質（酵素）または単細胞タンパク質）、ならびに、任意の組み合わせまたは相対濃度での、任意で、任意の添加物（例えば、燃料添加物）と組み合わされた、これらのいずれかの混合物。他の例としては、カルボン酸、カルボン酸の塩、カルボン酸およびカルボン酸の塩の混合物およびカルボン酸のエステル（例えば、メチル、エチルおよびｎ−プロピルエステル）、ケトン（例えば、アセトン）、アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド）、αおよびβ不飽和酸（例えば、アクリル酸）およびオレフィン（例えば、エチレン）が挙げられる。他のアルコールおよびアルコール誘導体としては、プロパノール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、糖アルコールおよびポリオール（例えば、グリコール、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、およびポリグリシトールおよび他のポリオール）、ならびにこれらのアルコールのいずれかのメチルまたはエチルエステルが挙げられる。他の生成物としては、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、乳酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、吉草酸、カプロン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、シュウ酸、マロン酸、グルタル酸、オレイン酸、リノール酸、グリコール酸、γ−ヒドロキシ酪酸、およびそれらの混合物、これらの酸のいずれかの塩、それらの酸およびそれらの個々の塩のいずれかの混合物が挙げられる。
【０１２２】
バイオマス
本明細書で記載される方法を用いて加工処理されるバイオマスは澱粉質材料および／またはセルロースを含むセルロース材料、例えば、リグノセルロース材料である。バイオマスはまた、ヘミセルロースおよび／またはリグニンを含み得る。バイオマスは、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物、またはそれらの任意の組み合わせの１つ以上を含むことができる。農産物または農業廃棄物は、例えば、栽培され、収穫され、または使用もしくはヒトまたは動物による消費のために加工処理され得る材料、または栽培、収穫、または加工処理法から生成される任意の中間体、副産物、または廃棄物を含む。農産物または廃棄物としてはサトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。紙製品または紙屑は、紙製品を製造するために使用される材料、任意の紙製品、または紙製品の製造または分解から生成される任意の中間体、副産物もしくは廃棄物を含む。紙製品または廃棄物としては、紙、着色紙、塗被紙、コート紙、段ボール紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。林産物または廃棄物は木材の栽培、収穫、または加工処理により生成される材料、または木材の栽培、収穫、または加工処理から生成される任意の中間体、副産物、もしくは廃棄物を含む。林産物または廃棄物としては、アスペン材、任意の属または種の木由来の木材、パーティクルボード、木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。一般廃棄物としては、堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２３】
１つの実施形態では、バイオマスは農業廃棄物、例えばトウモロコシ穂軸、例えば、コーン・ストーバーを含む。別の実施形態では、バイオマスは草を含む。
【０１２４】
１つの実施形態では、バイオマスは、本明細書で記載される組成物との接触前に処理される。例えば、バイオマスは、バイオマスの不応性を低減させるために、その嵩密度を低減させるために、および／またはその表面積を増加させるために処理される。好適なバイオマス処理プロセスとしては、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：電子による衝撃、超音波処理、酸化、熱分解、蒸気爆発、化学的処理、機械的処理、および凍結粉砕。好ましくは、処理方法は電子による衝撃である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、電子衝撃は、バイオマスが少なくとも０．５Ｍｒａｄ、例えば少なくとも５、１０、２０、３０、または少なくとも４０Ｍｒａｄの総線量を受けるまで実施される。いくつかの実施形態では、処理は、バイオマスが、約０．５Ｍｒａｄ〜約１５０Ｍｒａｄ、約１Ｍｒａｄ〜約１００Ｍｒａｄ、約５Ｍｒａｄ〜約７５Ｍｒａｄ、約２Ｍｒａｄ〜約７５Ｍｒａｄ、約１０Ｍｒａｄ〜約５０Ｍｒａｄ、例えば、約５Ｍｒａｄ〜約５０Ｍｒａｄ、約２０Ｍｒａｄ〜約４０Ｍｒａｄ、約１０Ｍｒａｄ〜約３５Ｍｒａｄ、または約２０Ｍｒａｄ〜約３０Ｍｒａｄの線量を受けるまで実施される。いくつかの実行では、２５〜３５Ｍｒａｄの総線量が好ましく、理想的には数秒にわたって、例えば、５Ｍｒａｄ／パスで適用され、各パスは約１秒間適用される。７〜９Ｍｒａｄ／パスを超える線量の適用は、場合によっては原材料の熱分解を引き起こす。
【０１２６】
バイオマス材料（例えば、植物バイオマス、動物バイオマス、紙、および自治体廃棄バイオマス）が、有用な中間体および生成物、例えば有機酸、有機酸の塩、無水物、有機酸のエステルおよび燃料、例えば、内燃機関のための燃料または燃料電池のための供給原料を製造するための原料として使用され得る。原料として、容易に入手できるが、しばしば、加工処理するのが困難となり得るセルロースおよび／またはリグノセルロース材料、例えば、自治体廃棄物ストリームおよび紙屑ストリーム、例えば新聞紙、クラフト紙、段ボール紙またはこれらの混合物を含むストリームを使用することができるシステムおよびプロセスが本明細書で記載される。
【０１２７】
バイオマスを、容易に加工処理することができる形態に変換させるために、原料中のグルカンまたはキシラン含有セルロースを、低分子量炭水化物、例えば糖に、糖化剤、例えば、酵素または酸、糖化と呼ばれるプロセスにより加水分解することができる。低分子量炭水化物はその後、例えば、既存の製造プラント、例として単細胞タンパク質プラント、酵素製造プラント、または燃料プラント、例えば、エタノール製造施設において使用することができる。
【０１２８】
バイオマスを、酵素、例えば、バイオマス分解酵素を使用して、材料と酵素を溶媒、例えば、水溶液中で合わせることにより加水分解することができる。酵素は、本明細書で記載される方法に従い生成／誘導することができる。
【０１２９】
具体的には、バイオマス分解酵素は、バイオマス（例えば、バイオマスのセルロースおよび／またはリグニン部分）を分解することができる、または様々なセルロース分解酵素（セルラーゼ）、リグニナーゼまたは様々な小分子バイオマス分解性代謝産物を含むまたは生成させる生物、例えば、微生物により供給させることができる。これらの酵素は相乗的に、バイオマスの結晶セルロースまたはリグニン部分を分解するように作用する酵素の複合物であってもよい。セルロース分解酵素の例としては次のものが挙げられる：エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびセロビアーゼ（β−グルコシダーゼ）。
【０１３０】
糖化中、セルロース基質は最初に、エンドグルカナーゼによりランダムな位置で加水分解させることができ、オリゴマ中間体が生成される。これらの中間体はその後、エキソ開裂グルカナーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼのための基質となり、セロビオースがセルロースポリマの端から生成される。セロビオースはグルコースの水溶性１，４−連結二量体である。最後に、セロビアーゼはセロビオースを切断し、グルコースが得られる。このプロセスの効率（例えば、加水分解および／または加水分解の完了までの時間）は、セルロース材料の不応性に依存する。
【０１３１】
糖化
不応性が低減されたバイオマスは、上記のバイオマス分解酵素により、一般に、不応性が低減されたバイオマスとバイオマス分解酵素を流体媒質、例えば、水溶液中で合わせることにより処理される。場合によっては、原料は糖化前に、２０１２年４月２６日に公開されたＭｅｄｏｆｆおよびＭａｓｔｅｒｍａｎによる米国特許出願公開２０１２／０１００５７７  Ａ１号（その全内容は本明細書に組み込まれる）に記載されるように、熱水中で煮沸され、浸され、加熱処理される。
【０１３２】
本明細書で記載される糖化プロセスで使用するための、バイオマスを分解することができる酵素の混合物、例えば、バイオマス分解酵素の酵素混合物が、本明細書で提供される。
【０１３３】
糖化プロセスは部分的に、または完全に製造プラントにおける槽（例えば、少なくとも４０００、４０，０００、または５００，０００Ｌの体積を有する槽）中で実施することができ、および／または、部分的に、または完全に、輸送中、例えば、鉄道車両、タンクローリ、または超大型タンカーまたは船倉において実施することができる。完全な糖化に必要とされる時間は、プロセス条件ならびに使用されるバイオマス材料および酵素に依存するであろう。糖化が製造プラントにおいて制御された条件下で実施される場合、セルロースは、糖、例えば、グルコースに約１２〜９６時間で実質的に完全に変換され得る。糖化が部分的に、または完全に輸送中に実施される場合、糖化にはより長い時間がかかり得る。
【０１３４】
好ましい実施形態では、糖化反応は、酵素反応が起こるのに最適なｐＨ、例えば、バイオマス分解酵素の活性に最適なｐＨで起こる。好ましくは、糖化反応のｐＨはｐＨ４〜４．５である。好ましい実施形態では、糖化反応は、酵素反応が起こるのに最適な温度、例えば、バイオマス分解酵素の活性に最適な温度で起こる。好ましくは、糖化反応の温度は４２℃〜５２℃である。
【０１３５】
槽内容物は糖化中に、例えば、２０１０年５月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５３３１号（英語でＷＯ２０１０／１３５３８０号として公開され、米国を指定しており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ジェット混合を使用して混合されることが一般に好ましい。
【０１３６】
界面活性剤の添加は糖化速度を増強することができる。界面活性剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレングリコール界面活性剤、イオン性界面活性剤、または両性界面活性剤が挙げられる。
【０１３７】
糖化から得られる糖溶液の濃度は比較的に高く、例えば、４０重量％を超える、または５０、６０、７０、８０、９０重量％を超える、さらに９５重量％を超えることが一般に好ましい。水は、例えば、蒸発により除去され得、糖溶液の濃度が増加する。これにより、輸送される体積が低減し、また、溶液中での微生物増殖が阻害される。
【０１３８】
あるいは、より低い濃度の糖溶液が使用され得、この場合、抗菌添加物、例えば、広域スペクトル抗生物質を、低濃度、例えば、５０〜１５０ｐｐｍで添加することが望ましい可能性がある。他の好適な抗生物質としては、アンホテリシンＢ、アンピシリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、ストレプトマイシンが挙げられる。抗生物質は、輸送および貯蔵中の微生物の増殖を阻害し、適切な濃度、例えば、重量で１５〜１０００ｐｐｍ、例えば、２５〜５００ｐｐｍ、または５０〜１５０ｐｐｍで使用することができる。所望であれば、たとえ、糖濃度が比較的に高くても抗生物質を含有させることができる。あるいは、抗菌または保存特性を有する他の添加物が使用され得る。好ましくは、抗菌添加物（複数可）は食品グレードである。
【０１３９】
バイオマス材料に酵素と共に添加する水の量を制限することにより、比較的に高い濃度の溶液を得ることができる。濃度は、例えば、どのくらいの糖化が起こるかを制御することにより制御することができる。例えば、濃度は、より多くのバイオマス材料を溶液に添加することにより増加させることができる。溶液中で生成される糖を保持するために、界面活性剤、例えば、上記のもののうちの１つを添加することができる。溶解度はまた、溶液の温度を増加させることにより増加させることができる。例えば、溶液は４０〜５０℃、６０〜８０℃、またはさらにそれ以上の温度で維持することができる。
【０１４０】
本明細書で記載されるプロセスでは、例えば糖化後、糖（例えば、グルコースおよびキシロース）は単離することができる。例えば、糖は、沈殿、結晶化、クロマトグラフィー（例えば、疑似移動床クロマトグラフィー、高圧クロマトグラフィー）、遠心分離、抽出、当技術分野で知られている任意の他の単離方法、およびそれらの組み合わせにより単離することができる。
【０１４１】
糖化のための酵素混合物
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を含むグリコシル化されたポリペプチド、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を含むアグリコシル化されたポリペプチドを含む酵素混合物を提供し、ここで、グリコシル化されたポリペプチドおよびアグリコシル化されたポリペプチドのどちらもセロビアーゼ活性を有する。セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドは、例えば、本明細書で記載される方法を使用して生成された、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドのいずれかである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を含むグリコシル化されたポリペプチドは、内因的にポリペプチドを発現する微生物から単離または取得することができる。
【０１４２】
１つの実施形態では、グリコシル化されたポリペプチドおよびアグリコシル化されたポリペプチドはどちらも、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、野生型Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ酵素である。
【０１４３】
複数の実施形態では、酵素混合物はさらに、微生物に由来する少なくとも１つの追加の酵素を含み、ここで、追加の酵素は、バイオマスまたはセルロース系材料分解活性を有し、例えば、追加の酵素はセルロース分解酵素、例えば、セルラーゼである。例えば、追加の酵素はリグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、およびセロビアーゼである。１つの実施形態では、混合物はさらに、１つ以上のリグニナーゼ、１つ以上のエンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃｏｎａｓｅ）、１つ以上のセロビオヒドロラーゼ、および１つ以上のキシラナーゼを含む。複数の実施形態では、追加のバイオマス分解酵素はグリコシル化されている。複数の実施形態では、酵素混合物はさらに、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の、本明細書で記載される追加のバイオマス分解酵素を含む。例えば、酵素混合物はさらに、表１に列挙される酵素の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５または全てを含む。
【０１４４】
例えば、酵素混合物はさらに、微生物、例えば、真菌細胞、例えば野生型Ｔ．リーセイ、またはその変異体、例えば、Ｔ．リーセイＲＵＴＣ３０により生成される追加のバイオマス分解酵素の混合物を含む。１つの実施形態では、追加のバイオマス分解酵素は、微生物から単離される。１つの実施形態では、混合物は、次のバイオマス分解酵素の１つ以上を含む：Ｂ２ＡＦ０３、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、Ｃｅｌ１ａ、Ｃｅｌ３ａ、Ｃｅｌ５ａ、Ｃｅｌ６ａ、Ｃｅｌ７ａ、Ｃｅｌ７ｂ、Ｃｅｌ１２ａ、Ｃｅｌ４５ａ、Ｃｅｌ７４ａ、ｐａＭａｎ５ａ、ｐａＭａｎ２６ａ、またはスウォレニン、またはそれらの任意の組み合わせ。例えば、上記に列挙される、追加のバイオマス分解酵素は、酵素（下記表１で列挙される）の起源となる微生物、例えば、真菌細胞から、内因的に発現され、単離され得る。あるいは、例えば、上記に列挙される、追加のバイオマス分解酵素は、本明細書で記載される宿主細胞において同様の発現方法を使用して異種的に発現され、宿主細胞から単離され得る。１つの実施形態では、異種的に発現された追加のバイオマス分解酵素は、酵素のＣまたはＮ末端でＨｉｓタグによりタグ付けされ、当技術分野で知られているニッケルアフィニティークロマトグラフィー技術により単離される。例えば、追加のバイオマス分解酵素は下記表１から選択することができる。
【表１】
2017524363.tif 000002
【０１４５】
表１に列挙されるバイオマス分解酵素に対するアミノ酸配列は、以下の通りである。
Ｂ２ＡＦ０３（ポドスポラ・アンセリナ）
ＭＫＳＳＶＦＷＧＡＳＬＴＳＡＶＶＲＡＩＤＬＰＦＱＦＹＰＮＣＶＤＤＬＬＳＴＮＱＶＣＮＴＴＬＳＰＰＥＲＡＡＡＬＶＡＡＬＴＰＥＥＫＬＱＮＩＶＳＫＳＬＧＡＰＲＩＧＬＰＡＹＮＷＷＳＥＡＬＨＧＶＡＹＡＰＧＴＱＦＷＱＧＤＧＰＦＮＳＳＴＳＦＰＭＰＬＬＭＡＡＴＦＤＤＥＬＬＥＫＩＡＥＶＩＧＩＥＧＲＡＦＧＮＡＧＦＳＧＬＤＹＷＴＰＮＶＮＰＦＫＤＰＲＷＧＲＧＳＥＴＰＧＥＤＶＬＬＶＫＲＹＡＡＡＭＩＫＧＬＥＧＰＶＰＥＫＥＲＲＶＶＡＴＣＫＨＹＡＡＮＤＦＥＤＷＮＧＡＴＲＨＮＦＮＡＫＩＳＬＱＤＭＡＥＹＹＦＭＰＦＱＱＣＶＲＤＳＲＶＧＳＩＭＣＡＹＮＡＶＮＧＶＰＳＣＡＳＰＹＬＬＱＴＩＬＲＥＨＷＮＷＴＥＨＮＮＹＩＴＳＤＣＥＡＶＬＤＶＳＬＮＨＫＹＡＡＴＮＡＥＧＴＡＩＳＦＥＡＧＭＤＴＳＣＥＹＥＧＳＳＤＩＰＧＡＷＳＱＧＬＬＫＥＳＴＶＤＲＡＬＬＲＬＹＥＧＩＶＲＡＧＹＦＤＧＫＱＳＬＹＳＳＬＧＷＡＤＶＮＫＰＳＡＱＫＬＳＬＱＡＡＶＤＧＴＶＬＬＫＮＤＧＴＬＰＬＳＤＬＬＤＫＳＲＰＫＫＶＡＭＩＧＦＷＳＤＡＫＤＫＬＲＧＧＹＳＧＴＡＡＹＬＨＴＰＡＹＡＡＳＱＬＧＩＰＦＳＴＡＳＧＰＩＬＨＳＤＬＡＳＮＱＳＷＴＤＮＡＭＡＡＡＫＤＡＤＹＩＬＹＦＧＧＩＤＴＳＡＡＧＥＴＫＤＲＹＤＬＤＷＰＧＡＱＬＳＬＩＮＬＬＴＴＬＳＫＰＬＩＶＬＱＭＧＤＱＬＤＮＴＰＬＬＳＮＰＫＩＮＡＩＬＷＡＮＷＰＧＱＤＧＧＴＡＶＭＥＬＶＴＧＬＫＳＰＡＧＲＬＰＶＴＱＹＰＳＮＦＴＥＬＶＰＭＴＤＭＡＬＲＰＳＡＧＮＳＱＬＧＲＴＹＲＷＹＫＴＰＶＱＡＦＧＦＧＬＨＹＴＴＦＳＰＫＦＧＫＫＦＰＡＶＩＤＶＤＥＶＬＥＧＣＤＤＫＹＬＤＴＣＰＬＰＤＬＰＶＶＶＥＮＲＧＮＲＴＳＤＹＶＡＬＡＦＶＳＡＰＧＶＧＰＧＰＷＰＩＫＴＬＧＡＦＴＲＬＲＧＶＫＧＧＥＫＲＥＧＧＬＫＷＮＬＧＮＬＡＲＨＤＥＥＧＮＴＶＶＹＰＧＫＹＥＶＳＬＤＥＰＰＫＡＲＬＲＦＥＩＶＲＧＧＫＧＫＧＫＶＫＧＫＧＫＡＡＱＫＧＧＶＶＬＤＲＷＰＫＰＰＫＧＱＥＰＰＡＩＥＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
ＣＩＰ１（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＶＲＲＴＡＬＬＡＬＧＡＬＳＴＬＳＭＡＱＩＳＤＤＦＥＳＧＷＤＱＴＫＷＰＩＳＡＰＤＣＮＱＧＧＴＶＳＬＤＴＴＶＡＨＳＧＳＮＳＭＫＶＶＧＧＰＮＧＹＣＧＨＩＦＦＧＴＴＱＶＰＴＧＤＶＹＶＲＡＷＩＲＬＱＴＡＬＧＳＮＨＶＴＦＩＩＭＰＤＴＡＱＧＧＫＨＬＲＩＧＧＱＳＱＶＬＤＹＮＲＥＳＤＤＡＴＬＰＤＬＳＰＮＧＩＡＳＴＶＴＬＰＴＧＡＦＱＣＦＥＹＨＬＧＴＤＧＴＩＥＴＷＬＮＧＳＬＩＰＧＭＴＶＧＰＧＶＤＮＰＮＤＡＧＷＴＲＡＳＹＩＰＥＩＴＧＶＮＦＧＷＥＡＹＳＧＤＶＮＴＶＷＦＤＤＩＳＩＡＳＴＲＶＧＣＧＰＧＳＰＧＧＰＧＳＳＴＴＧＲＳＳＴＳＧＰＴＳＴＳＲＰＳＴＴＩＰＰＰＴＳＲＴＴＴＡＴＧＰＴＱＴＨＹＧＱＣＧＧＩＧＹＳＧＰＴＶＣＡＳＧＴＴＣＱＶＬＮＰＹＹＳＱＣＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ＣＩＰ２（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＡＳＲＦＦＡＬＬＬＬＡＩＰＩＱＡＱＳＰＶＷＧＱＣＧＧＩＧＷＳＧＰＴＴＣＶＧＧＡＴＣＶＳＹＮＰＹＹＳＱＣＩＰＳＴＱＡＳＳＳＩＡＳＴＴＬＶＴＳＦＴＴＴＴＡＴＲＴＳＡＳＴＰＰＡＳＳＴＧＡＧＧＡＴＣＳＡＬＰＧＳＩＴＬＲＳＮＡＫＬＮＤＬＦＴＭＦＮＧＤＫＶＴＴＫＤＫＦＳＣＲＱＡＥＭＳＥＬＩＱＲＹＥＬＧＴＬＰＧＲＰＳＴＬＴＡＳＦＳＧＮＴＬＴＩＮＣＧＥＡＧＫＳＩＳＦＴＶＴＩＴＹＰＳＳＧＴＡＰＹＰＡＩＩＧＹＧＧＧＳＬＰＡＰＡＧＶＡＭＩＮＦＮＮＤＮＩＡＡＱＶＮＴＧＳＲＧＱＧＫＦＹＤＬＹＧＳＳＨＳＡＧＡＭＴＡＷＡＷＧＶＳＲＶＩＤＡＬＥＬＶＰＧＡＲＩＤＴＴＫＩＧＶＴＧＣＳＲＮＧＫＧＡＭＶＡＧＡＦＥＫＲＩＶＬＴＬＰＱＥＳＧＡＧＧＳＡＣＷＲＩＳＤＹＬＫＳＱＧＡＮＩＱＴＡＳＥＩＩＧＥＤＰＷＦＳＴＴＦＮＳＹＶＮＱＶＰＶＬＰＦＤＨＨＳＬＡＡＬＩＡＰＲＧＬＦＶＩＤＮＮＩＤＷＬＧＰＱＳＣＦＧＣＭＴＡＡＨＭＡＷＱＡＬＧＶＳＤＨＭＧＹＳＱＩＧＡＨＡＨＣＡＦＰＳＮＱＱＳＱＬＴＡＦＶＱＫＦＬＬＧＱＳＴＮＴＡＩＦＱＳＤＦＳＡＮＱＳＱＷＩＤＷＴＴＰＴＬＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
Ｃｅｌ１ａ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＬＰＫＤＦＱＷＧＦＡＴＡＡＹＱＩＥＧＡＶＤＱＤＧＲＧＰＳＩＷＤＴＦＣＡＱＰＧＫＩＡＤＧＳＳＧＶＴＡＣＤＳＹＮＲＴＡＥＤＩＡＬＬＫＳＬＧＡＫＳＹＲＦＳＩＳＷＳＲＩＩＰＥＧＧＲＧＤＡＶＮＱＡＧＩＤＨＹＶＫＦＶＤＤＬＬＤＡＧＩＴＰＦＩＴＬＦＨＷＤＬＰＥＧＬＨＱＲＹＧＧＬＬＮＲＴＥＦＰＬＤＦＥＮＹＡＲＶＭＦＲＡＬＰＫＶＲＮＷＩＴＦＮＥＰＬＣＳＡＩＰＧＹＧＳＧＴＦＡＰＧＲＱＳＴＳＥＰＷＴＶＧＨＮＩＬＶＡＨＧＲＡＶＫＡＹＲＤＤＦＫＰＡＳＧＤＧＱＩＧＩＶＬＮＧＤＦＴＹＰＷＤＡＡＤＰＡＤＫＥＡＡＥＲＲＬＥＦＦＴＡＷＦＡＤＰＩＹＬＧＤＹＰＡＳＭＲＫＱＬＧＤＲＬＰＴＦＴＰＥＥＲＡＬＶＨＧＳＮＤＦＹＧＭＮＨＹＴＳＮＹＩＲＨＲＳＳＰＡＳＡＤＤＴＶＧＮＶＤＶＬＦＴＮＫＱＧＮＣＩＧＰＥＴＱＳＰＷＬＲＰＣＡＡＧＦＲＤＦＬＶＷＩＳＫＲＹＧＹＰＰＩＹＶＴＥＮＧＴＳＩＫＧＥＳＤＬＰＫＥＫＩＬＥＤＤＦＲＶＫＹＹＮＥＹＩＲＡＭＶＴＡＶＥＬＤＧＶＮＶＫＧＹＦＡＷＳＬＭＤＮＦＥＷＡＤＧＹＶＴＲＦＧＶＴＹＶＤＹＥＮＧＱＫＲＦＰＫＫＳＡＫＳＬＫＰＬＦＤＥＬＩＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
Ｃｅｌ３ａ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＲＹＲＴＡＡＡＬＡＬＡＴＧＰＦＡＲＡＤＳＨＳＴＳＧＡＳＡＥＡＶＶＰＰＡＧＴＰＷＧＴＡＹＤＫＡＫＡＡＬＡＫＬＮＬＱＤＫＶＧＩＶＳＧＶＧＷＮＧＧＰＣＶＧＮＴＳＰＡＳＫＩＳＹＰＳＬＣＬＱＤＧＰＬＧＶＲＹＳＴＧＳＴＡＦＴＰＧＶＱＡＡＳＴＷＤＶＮＬＩＲＥＲＧＱＦＩＧＥＥＶＫＡＳＧＩＨＶＩＬＧＰＶＡＧＰＬＧＫＴＰＱＧＧＲＮＷＥＧＦＧＶＤＰＹＬＴＧＩＡＭＧＱＴＩＮＧＩＱＳＶＧＶＱＡＴＡＫＨＹＩＬＮＥＱＥＬＮＲＥＴＩＳＳＮＰＤＤＲＴＬＨＥＬＹＴＷＰＦＡＤＡＶＱＡＮＶＡＳＶＭＣＳＹＮＫＶＮＴＴＷＡＣＥＤＱＹＴＬＱＴＶＬＫＤＱＬＧＦＰＧＹＶＭＴＤＷＮＡＱＨＴＴＶＱＳＡＮＳＧＬＤＭＳＭＰＧＴＤＦＮＧＮＮＲＬＷＧＰＡＬＴＮＡＶＮＳＮＱＶＰＴＳＲＶＤＤＭＶＴＲＩＬＡＡＷＹＬＴＧＱＤＱＡＧＹＰＳＦＮＩＳＲＮＶＱＧＮＨＫＴＮＶＲＡＩＡＲＤＧＩＶＬＬＫＮＤＡＮＩＬＰＬＫＫＰＡＳＩＡＶＶＧＳＡＡＩＩＧＮＨＡＲＮＳＰＳＣＮＤＫＧＣＤＤＧＡＬＧＭＧＷＧＳＧＡＶＮＹＰＹＦＶＡＰＹＤＡＩＮＴＲＡＳＳＱＧＴＱＶＴＬＳＮＴＤＮＴＳＳＧＡＳＡＡＲＧＫＤＶＡＩＶＦＩＴＡＤＳＧＥＧＹＩＴＶＥＧＮＡＧＤＲＮＮＬＤＰＷＨＮＧＮＡＬＶＱＡＶＡＧＡＮＳＮＶＩＶＶＶＨＳＶＧＡＩＩＬＥＱＩＬＡＬＰＱＶＫＡＶＶＷＡＧＬＰＳＱＥＳＧＮＡＬＶＤＶＬＷＧＤＶＳＰＳＧＫＬＶＹＴＩＡＫＳＰＮＤＹＮＴＲＩＶＳＧＧＳＤＳＦＳＥＧＬＦＩＤＹＫＨＦＤＤＡＮＩＴＰＲＹＥＦＧＹＧＬＳＹＴＫＦＮＹＳＲＬＳＶＬＳＴＡＫＳＧＰＡＴＧＡＶＶＰＧＧＰＳＤＬＦＱＮＶＡＴＶＴＶＤＩＡＮＳＧＱＶＴＧＡＥＶＡＱＬＹＩＴＹＰＳＳＡＰＲＴＰＰＫＱＬＲＧＦＡＫＬＮＬＴＰＧＱＳＧＴＡＴＦＮＩＲＲＲＤＬＳＹＷＤＴＡＳＱＫＷＶＶＰＳＧＳＦＧＩＳＶＧＡＳＳＲＤＩＲＬＴＳＴＬＳＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
Ｃｅｌ５ａ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＮＫＳＶＡＰＬＬＬＡＡＳＩＬＹＧＧＡＡＡＱＱＴＶＷＧＱＣＧＧＩＧＷＳＧＰＴＮＣＡＰＧＳＡＣＳＴＬＮＰＹＹＡＱＣＩＰＧＡＴＴＩＴＴＳＴＲＰＰＳＧＰＴＴＴＴＲＡＴＳＴＳＳＳＴＰＰＴＳＳＧＶＲＦＡＧＶＮＩＡＧＦＤＦＧＣＴＴＤＧＴＣＶＴＳＫＶＹＰＰＬＫＮＦＴＧＳＮＮＹＰＤＧＩＧＱＭＱＨＦＶＮＤＤＧＭＴＩＦＲＬＰＶＧＷＱＹＬＶＮＮＮＬＧＧＮＬＤＳＴＳＩＳＫＹＤＱＬＶＱＧＣＬＳＬＧＡＹＣＩＶＤＩＨＮＹＡＲＷＮＧＧＩＩＧＱＧＧＰＴＮＡＱＦＴＳＬＷＳＱＬＡＳＫＹＡＳＱＳＲＶＷＦＧＩＭＮＥＰＨＤＶＮＩＮＴＷＡＡＴＶＱＥＶＶＴＡＩＲＮＡＧＡＴＳＱＦＩＳＬＰＧＮＤＷＱＳＡＧＡＦＩＳＤＧＳＡＡＡＬＳＱＶＴＮＰＤＧＳＴＴＮＬＩＦＤＶＨＫＹＬＤＳＤＮＳＧＴＨＡＥＣＴＴＮＮＩＤＧＡＦＳＰＬＡＴＷＬＲＱＮＮＲＱＡＩＬＴＥＴＧＧＧＮＶＱＳＣＩＱＤＭＣＱＱＩＱＹＬＮＱＮＳＤＶＹＬＧＹＶＧＷＧＡＧＳＦＤＳＴＹＶＬＴＥＴＰＴＧＳＧＮＳＷＴＤＴＳＬＶＳＳＣＬＡＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｃｅｌ６ａ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＩＶＧＩＬＴＴＬＡＴＬＡＴＬＡＡＳＶＰＬＥＥＲＱＡＣＳＳＶＷＧＱＣＧＧＱＮＷＳＧＰＴＣＣＡＳＧＳＴＣＶＹＳＮＤＹＹＳＱＣＬＰＧＡＡＳＳＳＳＳＴＲＡＡＳＴＴＳＲＶＳＰＴＴＳＲＳＳＳＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＲＶＰＰＶＧＳＧＴＡＴＹＳＧＮＰＦＶＧＶＴＰＷＡＮＡＹＹＡＳＥＶＳＳＬＡＩＰＳＬＴＧＡＭＡＴＡＡＡＡＶＡＫＶＰＳＦＭＷＬＤＴＬＤＫＴＰＬＭＥＱＴＬＡＤＩＲＴＡＮＫＮＧＧＮＹＡＧＱＦＶＶＹＤＬＰＤＲＤＣＡＡＬＡＳＮＧＥＹＳＩＡＤＧＧＶＡＫＹＫＮＹＩＤＴＩＲＱＩＶＶＥＹＳＤＩＲＴＬＬＶＩＥＰＤＳＬＡＮＬＶＴＮＬＧＴＰＫＣＡＮＡＱＳＡＹＬＥＣＩＮＹＡＶＴＱＬＮＬＰＮＶＡＭＹＬＤＡＧＨＡＧＷＬＧＷＰＡＮＱＤＰＡＡＱＬＦＡＮＶＹＫＮＡＳＳＰＲＡＬＲＧＬＡＴＮＶＡＮＹＮＧＷＮＩＴＳＰＰＳＹＴＱＧＮＡＶＹＮＥＫＬＹＩＨＡＩＧＰＬＬＡＮＨＧＷＳＮＡＦＦＩＴＤＱＧＲＳＧＫＱＰＴＧＱＱＱＷＧＤＷＣＮＶＩＧＴＧＦＧＩＲＰＳＡＮＴＧＤＳＬＬＤＳＦＶＷＶＫＰＧＧＥＣＤＧＴＳＤＳＳＡＰＲＦＤＳＨＣＡＬＰＤＡＬＱＰＡＰＱＡＧＡＷＦＱＡＹＦＶＱＬＬＴＮＡＮＰＳＦＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
Ｃｅｌ７ａ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＹＲＫＬＡＶＩＳＡＦＬＡＴＡＲＡＱＳＡＣＴＬＱＳＥＴＨＰＰＬＴＷＱＫＣＳＳＧＧＴＣＴＱＱＴＧＳＶＶＩＤＡＮＷＲＷＴＨＡＴＮＳＳＴＮＣＹＤＧＮＴＷＳＳＴＬＣＰＤＮＥＴＣＡＫＮＣＣＬＤＧＡＡＹＡＳＴＹＧＶＴＴＳＧＮＳＬＳＩＧＦＶＴＱＳＡＱＫＮＶＧＡＲＬＹＬＭＡＳＤＴＴＹＱＥＦＴＬＬＧＮＥＦＳＦＤＶＤＶＳＱＬＰＣＧＬＮＧＡＬＹＦＶＳＭＤＡＤＧＧＶＳＫＹＰＴＮＴＡＧＡＫＹＧＴＧＹＣＤＳＱＣＰＲＤＬＫＦＩＮＧＱＡＮＶＥＧＷＥＰＳＳＮＮＡＮＴＧＩＧＧＨＧＳＣＣＳＥＭＤＩＷＥＡＮＳＩＳＥＡＬＴＰＨＰＣＴＴＶＧＱＥＩＣＥＧＤＧＣＧＧＴＹＳＤＮＲＹＧＧＴＣＤＰＤＧＣＤＷＮＰＹＲＬＧＮＴＳＦＹＧＰＧＳＳＦＴＬＤＴＴＫＫＬＴＶＶＴＱＦＥＴＳＧＡＩＮＲＹＹＶＱＮＧＶＴＦＱＱＰＮＡＥＬＧＳＹＳＧＮＥＬＮＤＤＹＣＴＡＥＥＡＥＦＧＧＳＳＦＳＤＫＧＧＬＴＱＦＫＫＡＴＳＧＧＭＶＬＶＭＳＬＷＤＤＹＹＡＮＭＬＷＬＤＳＴＹＰＴＮＥＴＳＳＴＰＧＡＶＲＧＳＣＳＴＳＳＧＶＰＡＱＶＥＳＱＳＰＮＡＫＶＴＦＳＮＩＫＦＧＰＩＧＳＴＧＮＰＳＧＧＮＰＰＧＧＮＰＰＧＴＴＴＴＲＲＰＡＴＴＴＧＳＳＰＧＰＴＱＳＨＹＧＱＣＧＧＩＧＹＳＧＰＴＶＣＡＳＧＴＴＣＱＶＬＮＰＹＹＳＱＣＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
Ｃｅｌ７ｂ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＡＰＳＶＴＬＰＬＴＴＡＩＬＡＩＡＲＬＶＡＡＱＱＰＧＴＳＴＰＥＶＨＰＫＬＴＴＹＫＣＴＫＳＧＧＣＶＡＱＤＴＳＶＶＬＤＷＮＹＲＷＭＨＤＡＮＹＮＳＣＴＶＮＧＧＶＮＴＴＬＣＰＤＥＡＴＣＧＫＮＣＦＩＥＧＶＤＹＡＡＳＧＶＴＴＳＧＳＳＬＴＭＮＱＹＭＰＳＳＳＧＧＹＳＳＶＳＰＲＬＹＬＬＤＳＤＧＥＹＶＭＬＫＬＮＧＱＥＬＳＦＤＶＤＬＳＡＬＰＣＧＥＮＧＳＬＹＬＳＱＭＤＥＮＧＧＡＮＱＹＮＴＡＧＡＮＹＧＳＧＹＣＤＡＱＣＰＶＱＴＷＲＮＧＴＬＮＴＳＨＱＧＦＣＣＮＥＭＤＩＬＥＧＮＳＲＡＮＡＬＴＰＨＳＣＴＡＴＡＣＤＳＡＧＣＧＦＮＰＹＧＳＧＹＫＳＹＹＧＰＧＤＴＶＤＴＳＫＴＦＴＩＩＴＱＦＮＴＤＮＧＳＰＳＧＮＬＶＳＩＴＲＫＹＱＱＮＧＶＤＩＰＳＡＱＰＧＧＤＴＩＳＳＣＰＳＡＳＡＹＧＧＬＡＴＭＧＫＡＬＳＳＧＭＶＬＶＦＳＩＷＮＤＮＳＱＹＭＮＷＬＤＳＧＮＡＧＰＣＳＳＴＥＧＮＰＳＮＩＬＡＮＮＰＮＴＨＶＶＦＳＮＩＲＷＧＤＩＧＳＴＴＮＳＴＡＰＰＰＰＰＡＳＳＴＴＦＳＴＴＲＲＳＳＴＴＳＳＳＰＳＣＴＱＴＨＷＧＱＣＧＧＩＧＹＳＧＣＫＴＣＴＳＧＴＴＣＱＹＳＮＤＹＹＳＱＣＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
Ｃｅｌ１２ａ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＫＦＬＱＶＬＰＡＬＩＰＡＡＬＡＱＴＳＣＤＱＷＡＴＦＴＧＮＧＹＴＶＳＮＮＬＷＧＡＳＡＧＳＧＦＧＣＶＴＡＶＳＬＳＧＧＡＳＷＨＡＤＷＱＷＳＧＧＱＮＮＶＫＳＹＱＮＳＱＩＡＩＰＱＫＲＴＶＮＳＩＳＳＭＰＴＴＡＳＷＳＹＳＧＳＮＩＲＡＮＶＡＹＤＬＦＴＡＡＮＰＮＨＶＴＹＳＧＤＹＥＬＭＩＷＬＧＫＹＧＤＩＧＰＩＧＳＳＱＧＴＶＮＶＧＧＱＳＷＴＬＹＹＧＹＮＧＡＭＱＶＹＳＦＶＡＱＴＮＴＴＮＹＳＧＤＶＫＮＦＦＮＹＬＲＤＮＫＧＹＮＡＡＧＱＹＶＬＳＹＱＦＧＴＥＰＦＴＧＳＧＴＬＮＶＡＳＷＴＡＳＩＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
Ｃｅｌ４５ａ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＫＡＴＬＶＬＧＳＬＩＶＧＡＶＳＡＹＫＡＴＴＴＲＹＹＤＧＱＥＧＡＣＧＣＧＳＳＳＧＡＦＰＷＱＬＧＩＧＮＧＶＹＴＡＡＧＳＱＡＬＦＤＴＡＧＡＳＷＣＧＡＧＣＧＫＣＹＱＬＴＳＴＧＱＡＰＣＳＳＣＧＴＧＧＡＡＧＱＳＩＩＶＭＶＴＮＬＣＰＮＮＧＮＡＱＷＣＰＶＶＧＧＴＮＱＹＧＹＳＹＨＦＤＩＭＡＱＮＥＩＦＧＤＮＶＶＶＤＦＥＰＩＡＣＰＧＱＡＡＳＤＷＧＴＣＬＣＶＧＱＱＥＴＤＰＴＰＶＬＧＮＤＴＧＳＴＰＰＧＳＳＰＰＡＴＳＳＳＰＰＳＧＧＧＱＱＴＬＹＧＱＣＧＧＡＧＷＴＧＰＴＴＣＱＡＰＧＴＣＫＶＱＮＱＷＹＳＱＣＬＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
Ｃｅｌ７４ａ（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＫＶＳＲＶＬＡＬＶＬＧＡＶＩＰＡＨＡＡＦＳＷＫＮＶＫＬＧＧＧＧＧＦＶＰＧＩＩＦＨＰＫＴＫＧＶＡＹＡＲＴＤＩＧＧＬＹＲＬＮＡＤＤＳＷＴＡＶＴＤＧＩＡＤＮＡＧＷＨＮＷＧＩＤＡＶＡＬＤＰＱＤＤＱＫＶＹＡＡＶＧＭＹＴＮＳＷＤＰＳＮＧＡＩＩＲＳＳＤＲＧＡＴＷＳＦＴＮＬＰＦＫＶＧＧＮＭＰＧＲＧＡＧＥＲＬＡＶＤＰＡＮＳＮＩＩＹＦＧＡＲＳＧＮＧＬＷＫＳＴＤＧＧＶＴＦＳＫＶＳＳＦＴＡＴＧＴＹＩＰＤＰＳＤＳＮＧＹＮＳＤＫＱＧＬＭＷＶＴＦＤＳＴＳＳＴＴＧＧＡＴＳＲＩＦＶＧＴＡＤＮＩＴＡＳＶＹＶＳＴＮＡＧＳＴＷＳＡＶＰＧＱＰＧＫＹＦＰＨＫＡＫＬＱＰＡＥＫＡＬＹＬＴＹＳＤＧＴＧＰＹＤＧＴＬＧＳＶＷＲＹＤＩＡＧＧＴＷＫＤＩＴＰＶＳＧＳＤＬＹＦＧＦＧＧＬＧＬＤＬＱＫＰＧＴＬＶＶＡＳＬＮＳＷＷＰＤＡＱＬＦＲＳＴＤＳＧＴＴＷＳＰＩＷＡＷＡＳＹＰＴＥＴＹＹＹＳＩＳＴＰＫＡＰＷＩＫＮＮＦＩＤＶＴＳＥＳＰＳＤＧＬＩＫＲＬＧＷＭＩＥＳＬＥＩＤＰＴＤＳＮＨＷＬＹＧＴＧＭＴＩＦＧＧＨＤＬＴＮＷＤＴＲＨＮＶＳＩＱＳＬＡＤＧＩＥＥＦＳＶＱＤＬＡＳＡＰＧＧＳＥＬＬＡＡＶＧＤＤＮＧＦＴＦＡＳＲＮＤＬＧＴＳＰＱＴＶＷＡＴＰＴＷＡＴＳＴＳＶＤＹＡＧＮＳＶＫＳＶＶＲＶＧＮＴＡＧＴＱＱＶＡＩＳＳＤＧＧＡＴＷＳＩＤＹＡＡＤＴＳＭＮＧＧＴＶＡＹＳＡＤＧＤＴＩＬＷＳＴＡＳＳＧＶＱＲＳＱＦＱＧＳＦＡＳＶＳＳＬＰＡＧＡＶＩＡＳＤＫＫＴＮＳＶＦＹＡＧＳＧＳＴＦＹＶＳＫＤＴＧＳＳＦＴＲＧＰＫＬＧＳＡＧＴＩＲＤＩＡＡＨＰＴＴＡＧＴＬＹＶＳＴＤＶＧＩＦＲＳＴＤＳＧＴＴＦＧＱＶＳＴＡＬＴＮＴＹＱＩＡＬＧＶＧＳＧＳＮＷＮＬＹＡＦＧＴＧＰＳＧＡＲＬＹＡＳＧＤＳＧＡＳＷＴＤＩＱＧＳＱＧＦＧＳＩＤＳＴＫＶＡＧＳＧＳＴＡＧＱＶＹＶＧＴＮＧＲＧＶＦＹＡＱＧＴＶＧＧＧＴＧＧＴＳＳＳＴＫＱＳＳＳＳＴＳＳＡＳＳＳＴＴＬＲＳＳＶＶＳＴＴＲＡＳＴＶＴＳＳＲＴＳＳＡＡＧＰＴＧＳＧＶＡＧＨＹＡＱＣＧＧＩＧＷＴＧＰＴＱＣＶＡＰＹＶＣＱＫＱＮＤＹＹＹＱＣＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
ｐａＭａｎ５ａ（ポドスポラ・アンセリナ）
ＭＫＧＬＦＡＦＧＬＧＬＬＳＬＶＮＡＬＰＱＡＱＧＧＧＡＡＡＳＡＫＶＳＧＴＲＦＶＩＤＧＫＴＧＹＦＡＧＴＮＳＹＷＩＧＦＬＴＮＮＲＤＶＤＴＴＬＤＨＩＡＳＳＧＬＫＩＬＲＶＷＧＦＮＤＶＮＮＱＰＳＧＮＴＶＷＦＱＲＬＡＳＳＧＳＱＩＮＴＧＰＮＧＬＱＲＬＤＹＬＶＲＳＡＥＴＲＧＩＫＬＩＩＡＬＶＮＹＷＤＤＦＧＧＭＫＡＹＶＮＡＦＧＧＴＫＥＳＷＹＴＮＡＲＡＱＥＱＹＫＲＹＩＱＡＶＶＳＲＹＶＮＳＰＡＩＦＡＷＥＬＡＮＥＰＲＣＫＧＣＮＴＮＶＩＦＮＷＡＴＱＩＳＤＹＩＲＳＬＤＫＤＨＬＩＴＬＧＤＥＧＦＧＬＰＧＱＴＴＹＰＹＱＹＧＥＧＴＤＦＶＫＮＬＱＩＫＮＬＤＦＧＴＦＨＭＹＰＧＨＷＧＶＰＴＳＦＧＰＧＷＩＫＤＨＡＡＡＣＲＡＡＧＫＰＣＬＬＥＥＹＧＹＥＳＤＲＣＮＶＱＫＧＷＱＱＡＳＲＥＬＳＲＤＧＭＳＧＤＬＦＷＱＷＧＤＱＬＳＴＧＱＴＨＮＤＧＦＴＩＹＹＧＳＳＬＡＴＣＬＶＴＤＨＶＲＡＩＮＡＬＰＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
ｐａＭａｎ２６ａ（ポドスポラ・アンセリナ）
ＭＶＫＬＬＤＩＧＬＦＡＬＡＬＡＳＳＡＶＡＫＰＣＫＰＲＤＧＰＶＴＹＥＡＥＤＡＩＬＴＧＴＴＶＤＴＡＱＶＧＹＴＧＲＧＹＶＴＧＦＤＥＧＳＤＫＩＴＦＱＩＳＳＡＴＴＫＬＹＤＬＳＩＲＹＡＡＩＹＧＤＫＲＴＮＶＶＬＮＮＧＡＶＳＥＶＦＦＰＡＧＤＳＦＴＳＶＡＡＧＱＶＬＬＮＡＧＱＮＴＩＤＩＶＮＮＷＧＷＹＬＩＤＳＩＴＬＴＰＳＡＰＲＰＰＨＤＩＮＰＮＬＮＮＰＮＡＤＴＮＡＫＫＬＹＳＹＬＲＳＶＹＧＮＫＩＩＳＧＱＱＥＬＨＨＡＥＷＩＲＱＱＴＧＫＴＰＡＬＶＡＶＤＬＭＤＹＳＰＳＲＶＥＲＧＴＴＳＨＡＶＥＤＡＩＡＨＨＮＡＧＧＩＶＳＶＬＷＨＷＮＡＰＶＧＬＹＤＴＥＥＮＫＷＷＳＧＦＹＴＲＡＴＤＦＤＩＡＡＴＬＡＮＰＱＧＡＮＹＴＬＬＩＲＤＩＤＡＩＡＶＱＬＫＲＬＥＡＡＧＶＰＶＬＷＲＰＬＨＥＡＥＧＧＷＦＷＷＧＡＫＧＰＥＰＡＫＱＬＷＤＩＬＹＥＲＬＴＶＨＨＧＬＤＮＬＩＷＶＷＮＳＩＬＥＤＷＹＰＧＤＤＴＶＤＩＬＳＡＤＶＹＡＱＧＮＧＰＭＳＴＱＹＮＥＬＩＡＬＧＲＤＫＫＭＩＡＡＡＥＶＧＡＡＰＬＰＧＬＬＱＡＹＱＡＮＷＬＷＦＡＶＷＧＤＤＦＩＮＮＰＳＷＮＴＶＡＶＬＮＥＩＹＮＳＤＹＶＬＴＬＤＥＩＱＧＷＲＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
スウォレニン（トリコデルマ・リーセイ）
ＭＡＧＫＬＩＬＶＡＬＡＳＬＶＳＬＳＩＱＱＮＣＡＡＬＦＧＱＣＧＧＩＧＷＳＧＴＴＣＣＶＡＧＡＱＣＳＦＶＮＤＷＹＳＱＣＬＡＳＴＧＧＮＰＰＮＧＴＴＳＳＳＬＶＳＲＴＳＳＡＳＳＳＶＧＳＳＳＰＧＧＮＳＰＴＧＳＡＳＴＹＴＴＴＤＴＡＴＶＡＰＨＳＱＳＰＹＰＳＩＡＡＳＳＣＧＳＷＴＬＶＤＮＶＣＣＰＳＹＣＡＮＤＤＴＳＥＳＣＳＧＣＧＴＣＴＴＰＰＳＡＤＣＫＳＧＴＭＹＰＥＶＨＨＶＳＳＮＥＳＷＨＹＳＲＳＴＨＦＧＬＴＳＧＧＡＣＧＦＧＬＹＧＬＣＴＫＧＳＶＴＡＳＷＴＤＰＭＬＧＡＴＣＤＡＦＣＴＡＹＰＬＬＣＫＤＰＴＧＴＴＬＲＧＮＦＡＡＰＮＧＤＹＹＴＱＦＷＳＳＬＰＧＡＬＤＮＹＬＳＣＧＥＣＩＥＬＩＱＴＫＰＤＧＴＤＹＡＶＧＥＡＧＹＴＤＰＩＴＬＥＩＶＤＳＣＰＣＳＡＮＳＫＷＣＣＧＰＧＡＤＨＣＧＥＩＤＦＫＹＧＣＰＬＰＡＤＳＩＨＬＤＬＳＤＩＡＭＧＲＬＱＧＮＧＳＬＴＮＧＶＩＰＴＲＹＲＲＶＱＣＰＫＶＧＮＡＹＩＷＬＲＮＧＧＧＰＹＹＦＡＬＴＡＶＮＴＮＧＰＧＳＶＴＫＩＥＩＫＧＡＤＴＤＮＷＶＡＬＶＨＤＰＮＹＴＳＳＲＰＱＥＲＹＧＳＷＶＩＰＱＧＳＧＰＦＮＬＰＶＧＩＲＬＴＳＰＴＧＥＱＩＶＮＥＱＡＩＫＴＦＴＰＰＡＴＧＤＰＮＦＹＹＩＤＩＧＶＱＦＳＱＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）
【０１４６】
混合物中の本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドと他のバイオマス分解酵素の間の比は、例えば、少なくとも１：１；１：２；１：４；１：８；１：１６；１：３２；１：５０；１：７５；１：１００、１：１５０；１：２００；１：３００、１：４００または１：５００とすることができる。１つの実施形態では、混合物中の本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチド対他の酵素の比は１：３２である。本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドとグリコシル化されたポリペプチドの間の比は、例えば、少なくとも１：１；１：２；１：４；１：８；１：１６；１：３２；１：５０；１：７５；１：１００、１：１５０；１：２００；１：３００、１：４００、または１：５００である。
【０１４７】
本発明の酵素混合物で使用するための好適なバイオマス分解酵素の他の例としては、バチルス、コプリナス、ミセリオフソラ、セファロスポリウム、スキタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、ヒュミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウムおよびトリコデルマ属における種由来の酵素が挙げられ、とりわけ、アスペルギルス種（例えば、欧州特許公開第０  ４５８  １６２号を参照）、ヒュミコラ・インソレンス（スキタリジウム・サーモフィルムとして再分類、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照）、コプリヌス・シネレウス、フサリウム・オキシスポルム、ミセリオフソラ・サーモヒラ、メリピウス・ギガンテウス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム種（限定はされないが、Ａ．ペルシシナム、Ａ．アクレモニウム、Ａ．ブラキペニウム、Ａ．ジクロモスポルム、Ａ．オブクラバタム、Ａ．ピンケルトニエ、Ａ．ロセオグリセウム、Ａ．インコロラタム、およびＡ．フラタムが含まれる）から選択される株により生成されるものである。好ましい株としては、ヒュミコラ・インソレンスＤＳＭ１８００、フサリウム・オキシスポルムＤＳＭ２６７２、ミセリオフソラ・サーモヒラＣＢＳ１１７．６５、セファロスポリウム種ＲＹＭ−２０２、アクレモニウム種ＣＢＳ４７８．９４、アクレモニウム種ＣＢＳ２６５．９５、アクレモニウム・ペルシシナムＣＢＳ１６９．６５、アクレモニウム・アクレモニウムＡＨＵ９５１９、セファロスポリウム種ＣＢＳ５３５．７１、アクレモニウム・ブラシペニウムＣＢＳ８６６．７３、アクレモニウム・ジクロモスポルムＣＢＳ６８３．７３、アクレモニウム・オブクラバタムＣＢＳ３１１．７４、アクレモニウム・ピンケルトニエＣＢＳ１５７．７０、アクレモニウム・ロセオグリセウムＣＢＳ１３４．５６、アクレモニウム・インコロラタムＣＢＳ１４６．６２、およびアクレモニウム・フラタムＣＢＳ２９９．７０Ｈが挙げられる。バイオマス分解酵素はまた、クリソスポリウム、好ましくはクリソスポリウム・ラクノウェンスの株から得ることができる。使用することができる追加の株としては、トリコデルマ（特に、Ｔ．ビリデ、Ｔ．リーセイ、およびＴ．コニンギイ）、好アルカリ性バチルス（例えば、米国特許第３，８４４，８９０号および欧州特許公開第０  ４５８  １６２号を参照）、およびストレプトマイセス（例えば、欧州特許公開第０  ４５８  １６２号を参照）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４８】
複数の実施形態では、微生物は、非誘導微生物と比べて、バイオマス分解酵素の生成を増加させるのに好適な条件下で、本明細書で記載されるバイオマス分解酵素を生成するように誘導される。例えば、本明細書で記載されるバイオマスを含む誘導バイオマス試料は、バイオマス分解酵素の生成を増加させるために微生物と共にインキュベートされる。誘導プロセスのさらなる説明は米国２０１４／００１１２５８号（その内容は、これによりその全体が参照により組み込まれる）において見出すことができる。
【０１４９】
前記微生物により生成および／または分泌されるバイオマス分解酵素は単離することができ、本発明の酵素混合物に添加することができる。あるいは、１つの実施形態では、本明細書および上記のバイオマス分解酵素を発現する、前記微生物または宿主細胞は糖化反応の追加前に溶解されない。
【０１５０】
１つの実施形態では、酵素混合物は、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを発現する宿主細胞、および本明細書で記載される１つ以上の追加のバイオマス分解酵素を含む。１つの実施形態では、酵素混合物は、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを発現する宿主細胞、および本明細書で記載される１つ以上の追加のバイオマス分解酵素を発現する１つ以上の宿主細胞を含む。例えば、
【０１５１】
セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを含む本明細書で記載される酵素混合物の使用により、バイオマス分解酵素の標準混合物（例えば、ＲＵＴＣ３０カクテル、例えば、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドの添加なし）を使用した糖化から得られた糖生成物の収率と比べて、糖化からの糖生成物の収率の増加が得られる。糖生成物の収率は、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドが糖化プロセスに添加されると、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％増加する。
【０１５２】
さらなる加工処理
別の生成物を生成させるために、糖化により生成された糖に対しさらなる加工処理工程が実施され得る。例えば、糖は、水素化され、発酵され、または他の化学薬品で処理され、他の生成物を生成させることができる。
【０１５３】
グルコースは、ソルビトールに水素化することができる。キシロースは、キシリトールに水素化することができる。水素化は、触媒（例えば、Ｐｔ／γ−Ａｌ２Ｏ３、Ｒｕ／Ｃ、ラネーニッケル、または当技術分野において知られている他の触媒）をＨ２と組み合わせて、高圧（例えば、１０〜１２０００ｐｓｉ）下で使用することにより達成することができる。ソルビトールおよび／またはキシリトール生成物は、当技術分野で知られている方法を使用して、単離および精製することができる。
【０１５４】
糖化からの糖生成物はまた、発酵させることができ、アルコール、糖アルコール、例えばエリスリトール、または有機酸、例えば、乳酸、グルタミン酸もしくはクエン酸またはアミノ酸が生成される。
【０１５５】
例えば、酵母およびザイモモナス細菌は、糖（複数可）のアルコール（複数可）への発酵または変換のために使用することができる。他の微生物は以下に記載される。発酵のための最適ｐＨは約ｐＨ４〜７である。例えば、酵母のための最適ｐＨは約ｐＨ４〜５であり、一方、ザイモモナスのための最適ｐＨは約ｐＨ５〜６である。典型的な発酵時間は約２４〜１６８時間（例えば、２４〜９６時間）であり、温度は２０℃〜４０℃（例えば、２６℃〜４０℃）の範囲であるが、しかしながら、好熱性微生物はより高い温度を好む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、例えば、嫌気性生物が使用される場合、発酵の少なくとも一部は酸素なしで、例えば、Ｎ２、Ａｒ、Ｈｅ、ＣＯ２またはそれらの混合物などの不活性ガスのブランケット下で実施される。加えて、混合物は、発酵の一部または全ての間、槽を通って流れる不活性ガスの一定パージを有し得る。場合によっては、嫌気性条件は、発酵中の二酸化炭素生成により達成し、維持することができ、追加の不活性ガスは必要とされない。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、発酵プロセスの全てまたは一部は、低分子量糖が完全に生成物（例えば、エタノール）に変換される前に中断させることができる。中間発酵生成物は、糖および炭水化物を高濃度で含む。糖および炭水化物は、当技術分野で知られている任意の手段により単離することができる。これらの中間発酵生成物は、ヒトまたは動物消費のための食品の調製において使用され得る。加えてまたはその代わりに、中間発酵生成物は、ステンレス鋼ラボラトリミルにおいて微粒子サイズに粉砕することができ、小麦粉様物質が生成される。
【０１５８】
ジェット混合が発酵中に使用され得、場合によっては、糖化および発酵は同じ槽で実施される。
【０１５９】
微生物のための栄養分、例えば、２０１１年７月１５日に出願された米国特許出願公開２０１２／００５２５３６号（その全開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載される食品系栄養分パッケージは、糖化および／または発酵中に添加されてもよい。
【０１６０】
「発酵」は、２０１２年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５７９，５５９号、および２０１２年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５７９，５７６号（そのどちらの内容も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において開示される方法および生成物を含む。
【０１６１】
可動性発酵槽は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７４０２８号（２００７年７月２０日に出願され、英語でＷＯ２００８／０１１５９８号として公開され、米国を指定した）（その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる）において記載されるように、使用することができる。同様に、糖化設備は可動性とすることができる。さらに、糖化および／または発酵は、一部または完全に、輸送中に実施され得る。
【０１６２】
発酵において使用される微生物（複数可）は、天然起源微生物および／または操作微生物とすることができる。例えば、微生物は、細菌（限定はされないが、例えば、セルロース分解性細菌が挙げられる）、真菌、（限定はされないが、例えば、酵母が挙げられる）、植物、原生生物、例えば、原虫または真菌様原生生物（限定はされないが、例えば、粘菌が挙げられる）、または藻類とすることができる。生物が適合する場合、生物の混合物が使用され得る。
【０１６３】
好適な発酵微生物は、炭水化物、例えばグルコース、果糖、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、オリゴ糖または多糖を発酵生成物に変換する能力を有する。発酵微生物は、サッカロマイセス属種（限定はされないが、Ｓ．セレビシエ（パン酵母）、Ｓ．ジアスタティカス（ｄｉｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ウバラムが挙げられる）、クリベロミセス属（限定はされないが、Ｋ．マルキシアヌス、Ｋ．フラジリスが挙げられる）、カンジダ属（限定はされないが、Ｃ．シュードトロピカリス、およびＣ．ブラシカが挙げられる）、ピキア・スティピティス（カンジダ・シハタエの近縁種）、クラビスポラ属（限定はされないが、Ｃ．ルシタニエおよびＣ．オプンティアエが挙げられる）、パキソレン属（限定はされないが、Ｐ．タンノフィルスが挙げられる）、ブレタノミセス属（限定はされないが、例えば、Ｂ．クラウセニイが挙げられる（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，  Ｇ．  Ｐ．，  １９９６，  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｗｙｍａｎ，  Ｃ．  Ｅ．，  ｅｄ．，  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  １７９−２１２））の株を含む。他の好適な微生物としては、例えば、ザイモモナス・モビリス、クロストリジウム種（限定はされないが、Ｃ．サーモセラム（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ、１９９６、上記）、Ｃ．サッカロブチルアセトニカム、Ｃ．サッカロブチリカム、Ｃ．パニセウム、Ｃ．ベイジェリンキ（ｂｅｉｊｅｒｎｃｋｉｉ）、およびＣ．アセトブチリカムが挙げられる）、モニリエラ・ポリニス、モニリエラ・メガチリエンシス、ラクトバチルス種ヤロウイア・リポリティカ、アウレオバシジウム種、トリコスポロノイデス種、トリゴノプシス・バリアビリス、トリコスポロン種、モニリエラ・アセトアブタンス種、チフラ・バリアビリス、カンジダ・マグノリアエ、ウスチラジノマイシーテス種、シュードジーマ・ツクバエンシス、ザイゴサッカロミセス属の酵母種、デバリオマイセス、ハンゼヌラおよびピキア、および黒色（ｄｅｍａｔｉｏｉｄ）トルラ属の真菌が挙げられる。
【０１６４】
例えば、クロストリジウム種が、エタノール、ブタノール、酪酸、酢酸、およびアセトンを生成させるために使用され得る。ラクトバチルス種が乳酸を生成させるために使用され得る。
【０１６５】
多くのそのような微生物株が、商業的にまたは保管所、例えば、数例を挙げると、ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、ＵＳＡ）、ＮＲＲＬ（農業研究サービス系統保存機関、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）、またはＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  ドイツ）を介して公的に入手可能である。
【０１６６】
市販の酵母としては、例えば、Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ（登録商標）／Ｌｅｓａｆｆｒｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ／Ｌｅｓａｆｆｒｅ、ＵＳＡから入手可能）、ＦＡＬＩ（登録商標）（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ  Ｙｅａｓｔ、Ｂｕｒｎｓ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｃ．の部、ＵＳＡから入手可能）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ、現在Ｌａｌｅｍａｎｄから入手可能）、ＧＥＲＴ  ＳＴＲＡＮＤ（登録商標）（Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、スウェーデンから入手可能）およびＦＥＲＭＯＬ（登録商標）（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓから入手可能）が挙げられる。
【０１６７】
バイオマス材料を糖化し、糖を生成させるために使用することができる多くの微生物はまた、それらの糖を発酵させ、有用な生成物に変換するために使用することができる。
【０１６８】
発酵後、得られた流体は、例えば、「ビールカラム」を使用して蒸留することができ、エタノールおよび他のアルコールが大部分の水および残留固体から分離される。ビールカラムから出て行く蒸気は、例えば、３５重量％エタノールとすることができ、精留カラムに送ることができる。精留カラムからの共沸に近い（９２．５％）エタノールおよび水の混合物は、気相モレキュラーシーブを用いて純粋（９９．５％）エタノールに精製することができる。ビールカラム底部は、３効用蒸発器の第１のエフェクトに送ることができる。精留カラム還流冷却器は、この第１のエフェクトのために熱を提供することができる。第１のエフェクト後、固体は遠心分離機を用いて分離することができ、回転乾燥機内で乾燥させることができる。遠心分離機排出物の一部（２５％）は、発酵にリサイクルさせることができ、残りは、第２および第３の蒸発器エフェクトに送ることができる。蒸発器凝縮物のほとんどはかなり清浄な凝縮物として、プロセスに戻すことができ、ごく一部が廃水処理に分離され、低沸点化合物の蓄積が防止される。
【０１６９】
本明細書で記載されるプロセスからの生成物の他の型の化学変換、例えば、有機糖由来生成物（例えば、フルフラールおよびフルフラール由来生成物）の生成が使用され得る。糖由来生成物の化学変換は２０１２年７月３日に出願された米国仮特許出願第６１／６６７，４８１号（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される。
【０１７０】
実施例
本発明についてさらに、下記実験例を参照することにより詳細に記載する。これらの実施例は説明目的のためだけに提供され、他に特に規定がなければ、限定することを意図しない。よって、本発明は決して、下記実施例に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全ての変形を包含するものと解釈されるべきである。
【０１７１】
さらなる説明なしで、当業者は、前の説明および下記例示的な例を使用して、本発明の化合物を生成させ、利用することができ、特許請求される方法を実施することができると考えられる。下記実用的実施例は具体的に、本発明の様々な態様を指摘しており、決して本開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１７２】
実施例１：Ｃｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓの発現ベクターへのクローニング
Ｃｅｌ３ａの成熟配列（アミノ酸２０−７４４）を合成し、Ｇｅｎｅｗｉｚにより大腸菌発現に対してコドン−最適化した。下記実施例において言及されるＣｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓは、８×Ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）タグをＣ末端に有するＣｅｌ３ａのコドン−最適化成熟配列（ａａｓ２０−７４４）を示す。下記プライマーを使用して、Ｃｅｌ３ａ−Ｃ’ＨｉｓをｐＥＴ−Ｄｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログＮｏ．７１１４６）にクローン化した：
（化１）
順方向５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＴＣＡＣＡＧＴＡＣＣＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
逆方向３’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＣＡＡＣＡＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
（ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位には下線が施されており；開始および終止コドンは太字であり；ポリヒスチジン（８−Ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））タグ；ならびにグリシン−セリン（ＧＳＧＳ）リンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）がイタリックである）
増幅反応を、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログＮｏ．６００６７２）を使用して実施した。
【０１７３】
増幅されたＤＮＡを制限消化により、ＮｃｏＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒ３１９３）およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒ３１０４）を用いて、製造者により示唆された条件下でクローン化させた。消化され、増幅されたＤＮＡをｐＥＴＤｕｅｔベクター内のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位中に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２０２）を使用して連結させ、続いて、大腸菌クローニング宿主Ｔｏｐ１０  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。プラスミド精製を、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製キットを用いて実施した。
【０１７４】
実施例２：Ｃｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓの発現および精製
Ｃｅｌ３Ａ−Ｃ’Ｈｉｓコンストラクトを、大腸菌発現宿主Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログＮｏ．７０８３７）に形質転換させ、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ１７６０）、１５μｇ／ｍｌカナマイシン（ｋａｎａｍｙｓｉｎ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ９０６）および１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｅｄ、カタログＮｏ．ＢＰ９１２）を含むプレート上でストリークさせた。組換えＤＮＡを有するコロニーを２ｍｌ種菌の接種のためにプレートから選び取り、一晩３７℃で増殖させ、そうしてその後、適切な抗生物質を含むＬＢ培地１００ｍｌに接種するために使用した。培養物を３７℃でＯＤ６００が０．８に達するまで増殖させた。
【０１７５】
タンパク質発現を誘導するために、５００μＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ１７５５）を添加した。発現培養物をもう４時間３７℃で、さらに増殖させた。細胞を４０００ｇ、室温（ＲＴ）での２０分間の遠心分離により、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｓｔ１６ローターＴＸ４００を使用して収穫し；ならびにペレットを−８０℃で貯蔵した。
【０１７６】
タンパク質抽出のために、細胞ペレットを氷上で解凍させ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１％トリトンＸ−１００、５ｍＭイミダゾール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．Ｏ３１９６）、および１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ５３５）を含む２ｍｌの非変性溶解緩衝液中に再懸濁させ、その後、氷上で２０分間インキュベートした。試料中のＤＮＡを消化させるために、２μｌのリゾナーゼ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログＮｏ．７１２３０）を添加し、さらに１０分間インキュベートした。試料をその後、微量遠心機にて、最大速度で１０分間、４℃にて回転させた。清澄ライセートを、１００μｌの前平衡Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ（Ｂｉｏｒａｄ）ＮｉチャージＩＭＡＣレジンスラリー（Ｂｉｏｒａｄ、カタログＮｏ．７３２−４６１４）を含む新しい管に移した。非変性結合緩衝液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、および５μＭイミダゾールから構成された。タンパク質を１時間、ＲＴでバッチ結合させ、その後、２５μＭイミダゾールを含む非変性緩衝液で洗浄した。タンパク質を、２００μＭイミダゾールを含む３００ｍｌの非変性緩衝液中で溶離させた。以上で記載される発現および精製プロセスからの精製Ｃｅｌ３ａタンパク質を図１に示す。
【０１７７】
実施例３：バイオリアクターにおけるＣｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓの発現
この実施例では、Ｃｅｌ３ａの発現および精製は３リットルおよび５リットルバイオリアクターまで拡大される。当業者は本明細書で記載されるプロセスを容易に使用して、さらに、例えば、３Ｌおよび７Ｌバイオリアクターまで拡大することができる。
【０１７８】
各バイオリアクター稼働で、ｐＥＴ  Ｄｕｅｔ−１  Ｃｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓコンストラクトを大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）宿主細胞株に形質転換させ、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ１７６０）、１５μｇ／ｍｌカナマイシン（ｋａｎａｍｙｓｉｎ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ９０６）および１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ９１２）を含むプレート上でストリークさせる。
【０１７９】
第１日に、組換えＤＮＡを有するコロニーを、２００ｍｌ種菌の接種のために、プレートから選び取り、一晩、３７℃で増殖させた。バイオリアクターを調製し、例えば、適切な抗生物質と共に、１．５ＬのＬＢ培地を各３Ｌ反応器に添加し、４ＬのＬＢ培地を各５Ｌ反応器に添加した。各反応器はｐＨプローブ、溶存酸素（ＤＯ）プローブ、および凝縮器を有する。
【０１８０】
第２日に、一晩接種材料のＯＤを分光光度計により６００ｎＭで測定した。分光光度計は、ＬＢ培地を用いてブランクとすることができる。バイオリアクターを３７℃、３００ｒｐｍ、および２．５ｖｖｍに設定した。バイオリアクターが３７℃に到達するとすぐに、適切なｍｌの一晩接種材料を、０．０５の標的開始ＯＤ値に対して、各１．５Ｌおよび各４Ｌ培養物に添加した。反応器のＯＤを、時折、エタノールおよび滅菌ピペットを用いて上面からサンプリングすることにより測定した。ＯＤが０．８に近づくにつれ、試料をより頻繁に取得した。
【０１８１】
反応器のＯＤが０．７〜０．８に到達した時に（接種後およそ２〜４時間）、バイオリアクターの温度を２０℃まで下げ、培養物をＩＰＴＧでＣｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓタンパク質発現のために誘導した。７５０ｍｌのＩＰＴＧを各１．５Ｌ反応器に添加し、１．５ｍｌのＩＰＴＧを各５Ｌ反応器に添加した。反応器を一晩稼働させた。
【０１８２】
第３日に、午前中、細胞を清浄な２Ｌ遠心ボトルに収穫し、４２００ｒｐｍで４５分間回転させた。上清を廃棄し、ペレットを確保し、ペレットの重量を記録した。ＰＢＳ緩衝液を使用して、ペレットを５０ｍＬ円錐遠心管に移した。５０ｍＬ管を４５００ｒｐｍで４５分間、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｓｔ−１６  卓上遠心分離機において回転させた。上清を廃棄し、ペレットを−２０℃で、精製の準備ができるまで凍結させ、または精製のためにすぐに加工処理した。
【０１８３】
実施例４：細胞からのタンパク質抽出
次のものを含む、ＥＤＴＡを有する溶解緩衝液を調製した：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１％トリトンＸ−１００、１％グリセロール、５ｍＭイミダゾール、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む脱イオン水。細胞ペレットを５ｍＬ体積の、ＥＤＴＡを有する溶解緩衝液中に再懸濁させた。１０μｌのリゾナーゼ（ＤＮＡｓｅ）を試料に添加した。試料をその後、１時間室温でインキュベートした。
【０１８４】
その後、試料を氷上で３回の１分間隔で超音波処理した（例えば、合計３分間、Ｓｏｒｖａｌｌ超音波処理器、設定１７）。
【０１８５】
この時点で、１０００μｌアリコートを、抽出および精製プロセスからのＣｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓタンパク質の収率および活性を分析するために、抽出プロセスの各画分から確保した。アリコートは、単離された総タンパク質を表すために、超音波処理した試料から取得した（試料Ａ）。試料をその後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。アリコートを、上清から取得し（試料Ｄ）、これは可溶性画分を表す。残りのペレットを１０００μｌの溶解緩衝液＋ＥＤＴＡ中に再懸濁させ、その後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、アリコートを、上清から取得し（試料Ｅ）、これは可溶性洗浄画分を表す。残りのペレットを確保し（試料Ｃ）、これは不溶性画分を表す。全ての試料を冷蔵庫内で（例えば、４℃）分析まで保存した。
【０１８６】
セロビアーゼ活性アッセイを、例えば、実施例６に記載されるように、総タンパク質アリコート（試料Ａ）を使用して実施した。
【０１８７】
試料Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥはまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析した。試料を２．００ＯＤまで希釈し、正規化した。１７．５μｌのＬＤＳ試料緩衝液（３７５μｌのＬＤＳ緩衝液および１５０μｌのＮｕＰＡＧＥ還元剤を混合し、５２５μｌのＬＤＳ試料緩衝液を調製した）を３２．５μｌの各試料に添加した。試料を５分間煮沸し、２０μｌの各試料を各ゲルウェルにロードした。標準（分子量ラダー）もまた、ゲルウェルにロードした。
【０１８８】
実施例５：精製Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓの質量分析
Ｎ末端にＨｉｓ−タグを有するＣｅｌ３ａ（Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓ）を、実施例１〜４において上記と同様の方法を用いて、クローン化し、大腸菌で発現させ、収穫した。Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’ＨｉｓをｐＥＴ−Ｄｕｅｔ１ベクターにクローン化させた。発現されたＣｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓを、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＮｉチャージＩＭＡＣレジンスラリーを含むアフィニティーカラムにより精製し、溶解緩衝液中に２００ｍＭイミダゾールを含む溶離緩衝液を使用して溶離した。
【０１８９】
精製Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．５Ｍ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中で透析させた。透析させたタンパク質をその後、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）インタクト質量分析に供した。
【０１９０】
試料濃度を、例えば、ＢｒａｄｆｏｒｄアッセイおよびＮａｎｏｄｒｏｐアッセイにより決定した。試料濃度は約４ｍｇ／ｍＬであった。１０×および１００×希釈試料をＬＣＭＳに対して、０．１％ギ酸を含む脱イオン水を用いて調製し、０．４ｍｇ／ｍＬおよび０．０４ｍｇ／ｍＬ試料を用意した。
【０１９１】
ＬＣ条件は下記の通りとした：
−Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＢＥＨ３００  Ｃ４カラム、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ（ｐ／ｎ：１８６００４４９７）
−カラム温度：４５℃
−ＭＰＡ：０．１％ＦＡを含む水
−ＭＰＢ：０．１％ＦＡを含むＡＣＮ
【０１９２】
質量分析計条件は下記の通りとした：
−源温度：１２５℃
−脱溶媒和温度：４５０℃
−コーン電圧：４０Ｖ
−較正：Ｃｓｌ（５００−５０００Ｄａ）
−ロックマス：Ｃｓｌ
【０１９３】
試料のクロマトグラフィープロファイルを図２に示す。プロファイルは、対象となる３つの領域を示す：３１分での大きなピーク、３８〜４０分の間のピークの一団、および約４５分でのより小さなピーク。約４５分でのピークおよび約３９分でのピーク団の質量スペクトルのマニュアルデコンボリューションにより、主ピークは荷電状態エンベロープの一部ではないが、むしろ、ポリマシリーズであり（繰り返し単位として４４ａｍｕを有する）、このように、溶解緩衝液において使用されるトリトン−Ｘに由来する可能性があることに起因したことが示される。
【０１９４】
３１分で検出されるピークに対する質量スペクトル領域の分析はタンパク質荷電状態エンベロープを示し、重要なことには、グリコシル化の証拠はない（図３）。荷電状態エンベロープの拡大は主要成分よりわずかに大きい２〜３の微量タンパク質の存在を示す。荷電状態エンベロープのデコンボリューションは、主要成分が７８，０５２の分子量を有したことを示し（図４）、これはＣｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓの予想分子量に対応する。微量成分は次の分子量を有し：７８，１００、７８，１８２、および７８，２２９（図４）、そのため、Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓタンパク質のわずかな改変が示される。
【０１９５】
主成分に対する荷電状態の中には、より小さなペプチド断片に対応するいくつかのシグナルが存在した。これらは、より広く離れた同位体ピークにより識別される。同定された断片のいくつかは８，４９１、９，２６１、および１１，６２９の分子量を有する。これらの断片はＭＳ源において生成されることもあり、または試料を起源とすることもある。
【０１９６】
この実験からの結果により、アグリコシル化されたセロビアーゼ、Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈは、本発明により包含される方法を用いてクローン化され、発現され、単離されたことが証明される。
【０１９７】
実施例６：セロビアーゼ活性アッセイ
Ｈｉｓ−タグ付けされたＣｅｌ３ａ（例えば、ＮまたはＣ末端にＨｉｓ−タグを有するＣｅｌ３ａ）をＩＭＡＣ技術を用いて精製した。精製された、Ｈｉｓ−タグ付けされたＣｅｌ３ａの量（力価）を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイおよび／またはｎａｎｏｄｒｏｐを用いて決定した。ｎａｎｏｄｒｏｐ定量では、モル吸光係数を、標的形態のＣｅｌ３ａのアミノ酸配列をＥｘＰＡＳｙ  ＰｒｏｔＰａｒａｍオンラインツールに挿入することにより推定した。
【０１９８】
活性アッセイでは、Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓを含む試料の２倍段階希釈を９６ウェルプレートフォーマットで実施した。希釈物を、５０ｍＭクエン酸二水素ナトリウム緩衝液中のＤ−（＋）−セロビオース（Ｆｌｕｋａ）基質溶液と、ｐＨ５．０、４８℃で３０分間インキュベートした。３０分後、試料を１００℃まで１０分間加熱し、反応を停止させた。試料をグルコースおよびセロビオースに対して、ＹＳＩ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ分析計（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および／またはＨＰＬＣ方法を用いて分析した。精製Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓのタンパク質活性を、３０分あたりのセロビオースのグルコースへのパーセント変換として記録した（図５）。
【０１９９】
Ｃｅｌ３ａの量がＢｒａｄｆｏｒｄアッセイおよび／またはｎａｎｏｄｒｏｐを使用することによりアッセイできない試料、例えば、粗ライセート試料では、活性アッセイを使用して、Ｃｅｌ３ａの力価を決定することができる。既知の濃度を有する精製Ｃｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓの試料のセロビアーゼ活性の検量線を作成する。既知の濃度を有するＣｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓの２倍段階希釈を、９６ウェルプレートの１つの列、例えば、１２の２倍段階希釈で調製した。他の列は、その力価が決定される他の残りの試料、例えば、粗ライセート試料の２倍段階希釈を含んだ。希釈物を、５０ｍＭクエン酸二水素ナトリウム緩衝液中のＤ−（＋）−セロビオース（Ｆｌｕｋａ）基質溶液と共に、ｐＨ５．０、４８℃で３０分間インキュベートした。３０分後、試料を１００℃まで１０分間加熱し、反応を停止させた。試料をグルコースおよびセロビオースに対して、ＹＳＩ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ計（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および／またはＨＰＬＣ方法を使用して分析した。既知の濃度のＣｅｌ３ａ−Ｎ’Ｈｉｓ試料を使用して、検量線を、アッセイの直線範囲内のデータ点を用いて作成する（図６）。未知のＣｅｌ３ａ力価を有する試料から検出されたセロビアーゼ活性を、検量線と比べて、試料中のＣｅｌ３ａの力価を決定することができる。
【０２００】
活性の単位は、アッセイの直線範囲内の値を使用して計算した場合に相対的なものにすぎない。アッセイの直線範囲は、元の可溶性基質ロードの３０％未満であるグルコース値を用いて規定される。加えて、０．０５ｇ／Ｌ未満のグルコース値は計測手段報告レベルのために省略される。１単位のセロビアーゼ活性は、３０分あたりのＣｅｌ３ａの量あたりのグルコースの量として規定される：［グルコース］ｇ／Ｌ／［Ｃｅｌ３ａ］ｇ／Ｌ／３０分。
【０２０１】
大腸菌から精製されたアグリコシル化されたＣｅｌ３とＴ．リーセイ由来の内在性（グリコシル化された）セロビアーゼＣｅｌ３ａの間の活性の比較を、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を使用して実施した。結果を図７に示す。この図は、組換えＣｅｌ３ａ（大腸菌から精製されたアグリコシル化されたＣｅｌ３ａ；図７においてＣｅｌ３ａと表示）は、内在性Ｃｅｌ３ａ（図７においてＬ４１９６と表示）と比べて、セロビオースをグルコースに変換するのにより高い比活性を示したことを示す。具体的には、０．２ｍｇ／ｍＬのセロビアーゼより低い濃度では、組換えＣｅｌ３ａは３０分後、内在性Ｃｅｌ３ａよりも多くの量のグルコースを生成することができた。
【０２０２】
実施例７：アグリコシル化されたセロビアーゼの添加は糖化プロセスからの生成物を増加させる
この実施例では、グルコース収率を２つの糖化反応間で比較した。１つの糖化反応では、表１で記載される酵素を含む酵素混合物をバイオマスに添加した。第２の糖化反応では、０．８ｍｇ／ｍｌの、大腸菌から精製されたアグリコシル化されたＣｅｌ３ａを表１に記載される酵素を含む酵素混合物に添加し、バイオマスに添加した。糖化反応を本明細書で記載される条件下で実施し、試料を反応の０と８０分の間の複数の時間点で入手した。得られたグルコースを当技術分野における方法、例えばＹＳＩ機器またはＨＰＬＣにより測定し、定量し、図８に示されるように、時間に対してプロットした。これらの結果から、アグリコシル化されたＣｅｌ３ａの添加は糖化反応における糖生成物、例えば、グルコースの収率を増加させたことが示される。
【０２０３】
等価物
本明細書で引用される各および全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、これにより、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この発明について特定の態様を参照して開示してきたが、この発明の他の態様および変更は、当業者により、発明の真の精神および範囲から逸脱せずに考案することができることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価の変更を全て含むと解釈されることが意図される。
【図１】
2017524363.tif 000003
【図２】
2017524363.tif 000004
【図３】
2017524363.tif 000005
【図４】
2017524363.tif 000006
【図５】
2017524363.tif 000007
【図６】
2017524363.tif 000008
【図７】
2017524363.tif 000009
【図８】
2017524363.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月23日(2017.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017524363000001.app
【国際調査報告】
2017524363.tif 000011
2017524363.tif 000012
2017524363.tif 000013