(57)【要約】  異なる表現型データセットにグループ分けされた配列のセットの間のタンパク質配列の差異を識別するためのコンピュータベースのバイオインフォマティクス方法であって、データベースを照会してタンパク質配列の第一の表現型データセットと別の表現型データセット内の共通配列モチーフを識別し、各データセットに関してモチーフ中のペアワイズ相関を計算し、そして該データセット間の変化を計算して所定のデータセットに保存されている１つ以上のモチーフを識別することによって、そのデータセットの表現型と相関させる、方法（図１）。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる表現型のデータセットにグループ分けされた配列のセットの間のタンパク質配列の差異を識別するためのコンピュータ実装バイオインフォマティクス方法であって、
データベースを照会してタンパク質配列の第一の表現型データセットおよび別の表現型データセット内で共通配列モチーフを識別し、
各データセットに関してモチーフ中のペアワイズ相関を計算し、そして、
該データセット間の変化を計算して、所定のデータセットに保存されている１つ以上のモチーフを識別することにより、そのデータセットの表現型と相関させることを含む、方法。
【請求項２】
前記データベースはモチーフ誘発のためのマルチＥｍスイートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
６個のアミノ酸の最小モチーフ幅および１０個のアミノ酸の最大モチーフ幅が特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ペアワイズ相関はモチーフ・アラインメント・サーチツールを介して計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２つの前記データセット間の各モチーフの頻度の変化は連続性に関するイェーツの補正を用いたカイ二乗検定によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
癌原性が前記表現型データセットの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
異なる表現型のデータセットにグループ分けされたヒトパピローマウイルス配列のセットの間のタンパク質配列の差異を識別するためのコンピュータ実装バイオインフォマティクス方法であって、
データベースを照会してタンパク質配列の第一の表現型データセットおよび別の表現型データセット内で共通配列モチーフを識別し、
各データセットに関してモチーフ中のペアワイズ相関を計算し、そして、
該データセット間の変化を計算して、所定のデータセットに保存されている１つ以上のモチーフを識別することにより、そのデータセットの表現型と相関させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１４年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／９７０，２８７の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は概して、対の表現型（ｂｉｎａｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を表す２つのタンパク質配列セット間のより高い可変性の領域、例えば、高リスクと低リスクの初期遺伝子タンパク質由来のヒト・パピローマウイルス・モチーフを、コンピュータを用いて識別するための方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオインフォマティクスの分野における一つの継続的な探求により、タンパク質配列は類似するが表現型は異なる２つのデータセット間の高い可変性を有する配列部位の検出のために利用されるフレームワークが開発されている。
【０００４】
例えば、１００を超える遺伝子型を伴う、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ヒト病原性ウイルスの非常に複雑なグループであるが、比較的類似したタンパク質配列を有する。ＨＰＶの発癌型は共同因子の存在下で悪性形質転換を誘導する可能性がある。実際、全ての子宮頸癌の９９％超および生殖器癌の大部分は発癌性ＨＰＶ型に起因する。このようなＨＰＶ型は皮膚、喉頭および食道を含む他の上皮癌に次第に関連付られてきている。
【０００５】
ＨＰＶの発癌を調査する研究は、動物モデルにおいて成熟したＨＰＶビリオンを効率的に産生できないため手間がかかる。従って、ＨＰＶに感染した細胞における発癌性を完全に解明するためには依然として限界がある。より一般的には、類似のタンパク質配列に関して異なる表現型を区別する力が非常に有用となる。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、対の表現型データセットにおいて配列の差異を識別するための新規な方法に関する。例えば、前記方法はＨＰＶ初期遺伝子のタンパク質配列内の保存領域を調べ、そして既知の低リスク型におけるそれらの存在をサーチすることによって、高リスクのＨＰＶの潜在的な治療標的を検出することに適用することができる。
【０００７】
従って、一実施形態では、コンピュータ実装バイオインフォマティクス方法により、異なる表現型のデータセットにグループ分けされた配列のセットの間のタンパク質配列の差異が識別される。前記方法は、データベースを照会してタンパク質配列の第一の表現型データセットおよび別の表現型データセット内で共通配列モチーフを識別し、各データセットに関してモチーフ中のペアワイズ相関を計算し、そして、前記データセット間の変化を計算して、所定のデータセットに保存されている１つ以上のモチーフを識別することにより、そのデータセットの表現型と相関させることによって行われる。
【０００８】
特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。前記材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それらの全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は高リスクＨＰＶに関連するモチーフの識別のための戦略を示す。高リスクのモチーフは１３の高リスクＲｅｆＳｅｑの訓練セットにＭＥＭＥを用いて識別した。その後、これらのモチーフはＭＡＳＴを用いて１２の低リスクＲｅｆＳｅｑのセットに適用され、２つのセットにおける各モチーフの結果としてえられる頻度が決定された。加えて、ＮＣＢＩタンパク質データベース、ヒトＯＲＦ、および２つの指定されたリスクのカテゴリ外のＨＰＶ型においてウイルス配列内のこれらのモチーフをサーチするためにＭＡＳＴおよびＢＬＡＳＴが利用された。
【００１１】
【図２】図２はＨＰＶタンパク質の地図を示す。重要な位置の各々の位置は、それらのそれぞれの遺伝子の各々の中で強調されている。また、この分析で検出されたが癌原性に対して有意であるとフィルタリングされなかったこれらのＨＰＶ初期遺伝子内の既知の保存モチーフもマッピングした。これには、Ｅ６およびＥ７の亜鉛結合部位、Ｅ７のｐＲＢ結合部位、およびＥ５の第一ドメインにおけるジ−ロイシンモチーフが含まれる。
【００１２】
【図３】図３は表の形式で、統計的に有意なモチーフ、各データセットにおけるそれらの頻度、ならびに遺伝子および推定機能における位置を示す。イェーツの補正を用いたカイ二乗検定を行い、ＭＥＭＥによって決定された１１２から１０の統計的に有意なモチーフをえた。その後、これらのモチーフはリスクが分類されていない他のＨＰＶ単離物のデータセットにおいて別個に照会され、その頻度も前記表に示される。最後の２列に、ＨＰＶ１６の各モチーフのアミノ酸の範囲も、相対的な推定機能と共に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本研究で利用した計算方法により、類似のタンパク質配列であるが異なる表現型の２つのデータセット間の高い可変性を有する配列部位の検出が可能になる。一実施形態では、これらの方法はＨＰＶの研究に適用される。
【００１４】
以前に検討した配列比較技法により、セット内の配列の系統発生が調べられたが、配列またはデータセット間の変化を明らかにするには限りがある。例えば、ＨＰＶとの関連では、以前の比較ゲノム研究は、１つまたは２つの遺伝子（主に既知の癌遺伝子Ｅ６＆Ｅ７）に焦点を当てるか、一度に少数のＨＰＶ型、一般的にはＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５を調査するかのいずれかになる。
【００１５】
ここで利用されるバイオインフォマティクス手法により、発癌現象に寄与するＨＰＶプロテオーム内の領域を決定するための、体系的、包括的かつ教師なしアプローチが提供される。統計的に有意なモチーフにより、前記プロテオームのそれらのそれぞれの領域内のＨＲ（高リスク）型およびＬＲ（低リスク）型間の変化が示される。そのため、これらの領域を、潜在的に発癌の一因となる部位と見なすことができ、タンパク質領域の推定機能に照らして評価することができる。さらに、このアプローチは、２つの異なるデータセット間の変化を識別するために一般化することができる。
【００１６】
本明細書中の方法の利用は、ＨＰＶに関する治療標的の発見ツールとして使用される可能性がある。これは、悪性転換を防ぐために重要な領域を標的とする薬剤を設計するための前駆ステップとして機能する。その上、これらのプロセスは、他のウイルスまたはタンパク質の異なるクラスを調査するためにＨＰＶを越えて解釈可能な、包括的かつ公平な分析である。
【００１７】
実施形態を以下の実施例においてさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００１８】
前記方法の一実施形態では、計算配列分析ツール、例えば、ＭＥＭＥおよびＭＡＳＴ（ｍｅｍｅ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ｍｅｍｅ／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ）、ならびに統計分析を利用して、ＨＰＶに関して癌原性に重要な配列モチーフを決定した。ＭＥＭＥにより、類似のヌクレオチドまたはタンパク質配列のデータセットに保存されている、短い配列の特徴、モチーフが識別される。ＭＡＳＴは、ユーザーが定義したデータベースまたはパブリック・ナレッジ・ソースにおいてそれらのモチーフをサーチするためにＭＥＭＥの出力を用いるアライメント・サーチツールである。これらの技術と共に、連続性に関するイェーツの補正を使用するカイ二乗検定を、両方のデータセット内に存在する重要なモチーフを見出すために利用した。
【００１９】
図１を参照すると、遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２に関する１３の高リスク型と１２の低リスク型のＨＰＶタンパク質参照配列がＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／）から検索されている。高リスク・データセットは型ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８を含んだが、低リスクのグループは型ＨＰＶ６、１１、４０、４２、４３、４４、５３、５４、６１、７２、７３および８１であった。ＨＰＶ５１ＲｅｆＳｅｑは遺伝子アノテーションを欠き、ＨＰＶ３５に関する参照配列はＥ２に関して誤ったタンパク質出力があった。これら２つのＲｅｆＳｅｑはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔからの全ゲノムエントリＰ２６５５４とＰ２７２２０に置き換えた。
【００２０】
さらに、ＲｅｆＳｅｑエントリの大部分でＥ４およびＥ５遺伝子のアノテーションが限定されているため、選択された参照配列が修正されかつ再度アノテーションが付けられた提出物が含まれるという理由で、それらのそれぞれのタンパク質配列はＮＩＡＩＤ  ＨＰＶ  ｄａｔａｂａｓｅ  ＰａＶｅ（ｐａｖｅ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から検索された。その結果、わずか１３の高リスク型のうち１２および１２の低リスク型のうち９が指定されたＥ５遺伝子をＰａＶｅ内に有していた。
【００２１】
ＨＲ  ＨＰＶプロテオーム内の共通配列モチーフを識別するために、ＭＥＭＥ（モチーフ誘発のためのマルチＥｍ）スイート（ｍｅｍｅ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ｍｅｍｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｅｍｅ．ｃｇｉ）を用いた。各遺伝子について、６個のアミノ酸の最小モチーフ幅と１０個の最大モチーフ幅を特定し、ＭＥＭＥを用いて１３のＨＲ  ＨＰＶ型を評価した。モチーフの反復が可能とされ、モチーフの最大数は遺伝子の大きさに基づいて調整した。これにより、２つの誘発モチーフに０．６０を超えるペアワイズ相関がないことが確実になった。この相関はＭＥＭＥ結果から生じたＭＡＳＴ（モチーフ・アラインメント・サーチツール）結果を経てコンピュータで計算した。ＬＲ  ＨＰＶ型におけるこれらのモチーフの頻度を決定するために、ＨＲ  ＨＰＶ型で識別されたモチーフを使用して１２のＬＲ  ＨＰＶ型について別個のＭＡＳＴサーチを行った。各ウイルスのプロテオームにおけるモチーフの頻度を決定した。
【００２２】
２つのセット（ＨＲ  ＨＰＶおよびＬＲ  ＨＰＶ）間の変化を定量化するために、１２のＬＲ  ＨＰＶ型における個々の高リスク・モチーフの発生の頻度を評価した。ＬＲ  ＨＰＶ配列と比較して、ＨＲ  ＨＰＶ配列に優先的に保存されているモチーフが発癌性を有するであろうことがここで推測された。まず、繰り返し発生に関係なく、各型におけるモチーフの存在を同定した。各モチーフに関して少なくとも１つの発生を有するＨＰＶ型の数の合計を出した。特定のＨＲ  ＨＰＶモチーフを選択するために、２つのデータセット間の各モチーフの頻度に関して連続性に関するイェーツの補正を用いたカイ二乗検定を行った。この保守的な補正は統計的有意性の過大評価を回避するために用いた。
【００２３】
有意性の検定は、前記高リスク・データセット内の所定のモチーフの頻度が前記低リスク・データセットにおいて同じであるという、帰無仮説の下で確立した。従って、前記高リスク・データセット内の所定のモチーフの頻度が前記低リスク・データセットのものを超える場合、前記仮説は否定される（Ｈ１）。１自由度（対のデータセットに関する）を用いて、各モチーフのｐ値（＝０．０５）をコンピュータで計算し、次いで前記モチーフをランク付けするために使用した。
【００２４】
２を超える付加的なセットの評価は可能であるが、先に例示した方法は、対の表現型を表す２つのタンパク質配列のセット間でより高い可変性の領域をコンピュータにより識別するための手法としての役割を果たす。具体的には、これを発癌の原因となりうる高リスクＨＰＶにおける配列因子を決定するのに適用した。これらの部位は危険性の高いＨＰＶ感染の結果としての悪性腫瘍を予防するための治療の標的である可能性がある。このプロセスは、類似のタンパク質の特定の性質を調べることに加えて、ウイルス内の表現型の差異を評価するために推定されうる。
【００２５】
上記の実施例では、記載した機能性を特定するためのコンピュータプログラムを含む非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を使用しうる。
【００２６】
本発明をその詳細な説明に関連して説明してきたが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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