(57)【要約】平面サンプルの元素分析のための質量分析計システムが提供される。いくつかの実施形態では、質量分析計システムは以下を備える：直径１ｍｍ未満である一次イオンビームで平面サンプルのセグメントを照射することが可能な一次イオン源、ｃ）サンプルインターフェースの下流に配置された直交イオンの質量対電荷比分析器であって、前記分析器は、飛行時間によって質量対電荷比に応じて二次元素原子イオンを分離するように構成されている；ｄ）二次元素原子イオンを検出して質量スペクトル測定を生成するための主イオン検出器；及びｅ）シンクロナイザー、ここでシステムは、一次イオンビームが前記平面サンプルを二次元に横切ってスキャンするように構成されており、シンクロナイザーは質量スペクトル測定値を平面サンプル上の位置と関連付ける。
2017511571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平面サンプルの元素分析のための質量分析計システムであって、前記質量分析計システムは：
ａ）平面サンプルを備えた基板を保持するように構成されたホルダーを備えたサンプルインターフェース；
ｂ）直径１ｍｍ未満である一次イオンビームで平面サンプルのセグメントを照射することが可能な一次イオン源であって、前記一次イオン源による前記平面サンプルの照射は前記平面サンプルに関連する染色元素に由来する二次元素原子イオンの生成をもたらす；及び
ｃ）サンプルインターフェースの下流に配置された直交イオンの質量対電荷比分析器であって、前記分析器は、飛行時間によって質量対電荷比に応じて二次元素原子イオンを分離するように構成されている；
ｄ）二次元素原子イオンを検出して質量スペクトル測定値を生成するための主イオン検出器；及び
ｅ）前記質量スペクトル測定値を前記平面サンプル上の位置と関連付けるシンクロナイザー、を備え、
前記システムは、前記一次イオンビームが前記平面サンプルを二次元に横切ってスキャンするように構成されている質量分析計システム。
【請求項２】
前記一次イオンビームが前記平面サンプルを横切ってスキャンするとき、前記一次イオン源は前記平面サンプルを連続的に照射するように構成されている、請求項１に記載の質量分析計システム。
【請求項３】
前記一次イオンビームの直径は１０ｎｍ〜１ｍｍの範囲の選択された直径に調整可能である、請求項１または２に記載の質量分析計システム。
【請求項４】
前記システムは：
第１のデータセットを収集するために前記平面サンプルの第１の領域の第１のスキャンを実行すること；及び
第２のデータセットを収集するために前記平面サンプルの第１の領域の第２のスキャンを実行すること；を行うように構成され、
前記第１のスキャンの前記一次イオンビームの前記直径は、前記第２のスキャンの前記一次イオンビームの前記直径よりも少なくとも２倍大きく、前記シンクロナイザーは、前記質量スペクトル測定値を前記平面サンプル上の位置と前記スキャンのタイミングに関連付ける、請求項１から３のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項５】
前記システムは、前記第２のスキャンの前記ビームの前記直径よりも小さい直径を有する一次イオンビームを使用して、第３のデータセットを収集するために前記平面サンプルの前記第１の領域の第３のスキャンを実行するように構成されている、請求項１から４のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項６】
前記第１のデータセットは１００ｎｍ〜１００μｍの範囲の直径を有する一次イオンビームを使用して収集され、前記第２のデータセットは１０ｎｍ〜１μｍの範囲の直径を有する一次イオンビームを使用して収集される、請求項１から５のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項７】
前記システムは：
ａ）画定された位置に前記平面サンプルを移動させ、それによって前記一次イオンビームに平面サンプル上の第１の領域を提示すること、及び
ｂ）前記第１の領域の複数の質量スペクトル測定値を生成するために、前記第１の領域を横切って前記一次ビームをラスターさせること、を行うように構成される、請求項１から６のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項８】
前記システムは：
ｃ）前記第１の領域の複数の質量スペクトル測定値を収集した後に、第２の画定された位置に前記平面サンプルを移動させ、それによって前記一次イオンビームに前記平面サンプル上の第２の領域を提示すること、及び
ｄ）前記第２の領域の複数の質量スペクトル測定値を生成するために、前記第２の領域を横切って前記一次ビームをラスターさせること、を行うように構成される、請求項７に記載の質量分析計システム。
【請求項９】
十分なデータが収集されるまでステップｃ）及びｄ）を繰返すことをさらに含む、請求項８に記載の分析計システム。
【請求項１０】
前記平面サンプルは導電性基板上に実装され、前記基板の表面は前記二次元素原子イオンを生じる原子が枯渇している、請求項１から９のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項１１】
前記一次イオンビームは前記平面サンプル中で質量タグをイオン化し、前記質量スペクトル測定値は前記質量タグを豊富に含んで識別する、請求項１から１０のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項１２】
前記一次イオンビームは酸素、キセノン、アルゴン、金、ビスマス、ガリウム、ＳＦ６またはＣ６０イオンビームである、請求項１から１１のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項１３】
前記質量タグは２１〜２９、３９〜４７、５７〜７９または８９の原子番号を有する元素を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項１４】
前記システムは、前記二次元素原子イオンを前記分析器によって分離される前に濃縮するように構成されたエネルギーフィルター手段を備える、請求項１から１３のいずれかに記載の質量分析計システム。
【請求項１５】
平面サンプルの画像を再構成する方法であって：
請求項１に記載の質量分析器システムの前記ホルダーに染色元素を含む前記平面サンプルを配置すること；及び
請求項１に記載の質量分析器システムを使用して、前記平面サンプルの領域に対する質量スペクトル測定値を含むデータファイルを生成すること、ここで前記質量スペクトル測定値は前記平面サンプル上の位置に関連している；及び
前記質量スペクトル測定値を使用して前記平面サンプルの画像を再構成すること、を含む方法。
【請求項１６】
遠隔地へ前記データファイル及び／または前記画像を送信することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法であって、前記方法は：
対象領域を識別するために前記平面サンプルのサーベイスキャンを実行すること；及び
前記対象領域を再スキャンすること：
ｉ）前記イオンビームを前記サーベイスキャンよりも高い分解能でラスターすることにより；
ｉｉ）前記サーベイスキャンよりも小さい直径を有する一次イオンビームを使用して；
ｉｉｉ）前記サーベイスキャンよりも長いセグメント取得時間で、それによってセグメントあたりより多くの質量スペクトルまたはセグメントあたりより多くのイオンからのスペクトルを収集する
ｉｖ）前記サーベイスキャンよりも大きな質量範囲で、それによってセグメントあたりより大きな数の元素の同位体の質量を測定する、ことを含む方法。
【請求項１８】
前記対象領域を計算するかまたは手動で初期サーベイスキャンにて識別し；及びサンプルを欠いていることが判明した平面基板の領域を後続の画像解析から除外する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記平面サンプルの視覚画像を、質量対電荷種の個々のまたは組合せたレベルに基づいてカラーまたは濃淡のスケールで再構成する、請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記画像はスクリーン上に表示されるか、または質量対電荷情報を有する画像の電子ファイルが生成される、請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１５の方法によって得られたデータを受信することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された契約ＮＯ．ＣＡ０３４２３３、ＡＩ０５７２２９、ＣＡ１３０８２６、ＥＹ０１８２２８、ＣＡ１１８６８１、ＨＨＳＮ２７２２００７０００３８Ｃ、及び１Ｋ９９ＧＭ１０４１４８−０１の下で政府の支援によって行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
平面サンプルは、レーザーを使用してサンプルをアブレーションし、次いで、ＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析計）を使用してアブレーションされた生成物をキャラクタライズすることによって分析することができる。サンプルに関連する元素のアイデンティティと量を保存し、分析することができる。これらのレーザーアブレーション法の値は、例えば、：１）サンプリングのためにレーザーが使用される場合、アブレーションされるセグメントのサイズに物理的制限（波長によって決定される）があり、２）アブレーションは一般的には破壊的であり、サンプルの全厚を気化するので、再分析を妨げる、及び３）大気圧におけるレポーター元素のアブレーション及びイオン化は、質量分析計の真空中への乏しいイオン導入から感度を低下させる、などの複数の理由で、制限される。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、とりわけ、一次イオンビームによる真空中の生物学的マトリックスからのサブミクロンのサンプリング及びイオン化、並びに各サンプリングされたセグメントの元素の同位体成分を測定し定量するための質量分析計を動作させるのに有用な、システム、方法、装置、及びコンピュータープログラムを提供する。動作する記載されるシステム及び方法は、質量及び／または質量電荷比に基づいて、荷電粒子の流れの中の荷電粒子の時間的分離を提供する質量分析計で動作することができる。分析マトリックスは、例えば、元素の情報、または元素としてコードされた二次元の基準を含む生物学的な組織切片または細胞を含む。しかし、本発明は、真空ベースのサンプリング及びイオン化のための一次イオンビーム、並びに元素質量分析及び定量化のためのパルス二次イオン光学系を使用した任意のタイプの二次元基板の分析に関する。
【０００４】
例えば、いくつかの実施形態は、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（ＭＳ）によって個々のサンプルセグメントの質量分析のための検出システムを動作させる方法及び手段を提供する。具体的には、本開示は、連続的に分析される二次元サンプルセグメントからの元素イオンの連続導入に対して複数のＴＯＦ−ＭＳスキャンを実行するとともに、対応する質量情報をそれが生成されたサンプルセグメントとともに登録する方法を提供する。データは、所望の用途に応じて、１つまたは複数の質量スペクトルのサンプリング周期でサンプリングすることができる。二次元の検体のマトリックスのサブミクロンセグメントは、一次イオンビームまたは荷電粒子ビームを使用する元素イオンのサンプルである。検体の特定のセグメントへのビームの適用は、その中の元素成分の二次イオン化をもたらす。
【０００５】
各単一ＴＯＦ−ＭＳスペクトルでサンプリングされた時間ウィンドウは、キャラクタライズされるサンプルマトリックス中に存在する特定の染色元素の同位体のイオンがＴＯＦ−ＭＳ検出器で信号を生成することができる時間ウィンドウに対応することができる。同時に、他の時間ウインドウ（複数可）に入る他の染色されたまたは内在性元素レポーターの検出を、同じ単一の質量スペクトルで達成することができる。組織の「染色」は、例えば（２０１４年３月２６日に出願された米国仮出願シリアル番号Ｎｏ．６１／９７０，８０３、２０１３年９月１３日に出願された米国仮出願シリアル番号Ｎｏ．６１／８７７，７３３及び２０１４年３月２日にオンラインで公開されたＡｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、これらはすべて参照により本明細書に組込まれている）を含む本明細書に開示された方法及び目的と一致する任意の方法によって達成することができる。一連の単一ＴＯＦ−ＭＳスペクトルは、所与のセグメントの全スペクトルが統合される各セグメント上で連続一次イオンビームの滞留時間に同期させることができる。各セグメントに対応する積分時間とスペクトルの数はダイナミックであり、所望の用途に依存するであろう。
【０００６】
いくつかの実施形態では、信号は、質量分離されたデータを提供する質量分析計の主イオン検出器における分析サンプルセグメント中の元素レポーターの存在を示す。そのような場合には、システムは、１つ以上の補助検出器を含むことができ、この信号は、イオン源によって生成されるイオン、光子、または、電子によって、または非イオン化状態でイオン源を介して残存した粒子の中性成分によって誘発され得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、各単一の質量スペクトルにおいてサンプリングされる時間ウィンドウは、染色元素のイオンを含む対象のイオンのすべての質量対電荷比のチャンネルを含む。時間ウィンドウからのすべてのデータは各単一の質量スペクトルに転送されて処理され、ここで特定の質量対電荷比に対応する予め選択された時間ウィンドウ内のすべての信号のそれぞれの質量対電荷比、イオン計数、または加算を含む、処理が実行される。各単一の質量スペクトルについて得られたデータは各質量対電荷比に対する信号強度の複数の単一の積分値を含む。分析サンプルの所与のセグメントについては、各単一の質量スペクトルからの連続した積分情報は、そのセグメント上のイオン源の滞留時間に相当する単一のＭＳスキャンの数に基づいてさらに合成される。
【０００８】
別の実施形態では、各単一の質量スペクトルにおいてサンプリングされる時間ウィンドウは、染色元素のイオンを含み、目的のイオンのすべての予想される到着時間（すなわち、目的のすべての質量対電荷比チャンネル）を含む。しかし、サンプル中で予想される一次検出グループと呼ぶことができる主要な質量対電荷比のチャンネルからのデータのみが、さらなる処理のために転送される。その結果、処理されるデータの量を常に低く保つことができる。
【０００９】
いくつかの実施形態は、個々のサンプルセグメントの元素分析のための質量分析計を提供する。その質量分析計は、質量分析計の真空中に検体の平面部を導入する手段、及びサブミクロンの断面を有する個々のセグメントのイオンを質量分析計に移送することができるイオン源、質量対電荷比に従ってイオンを分離する質量分析器、質量対電荷によって分離されたイオンを検出するイオン検出器、イオン検出器の出力をデジタル化するデジタル化システム、データを転送、処理及び記録する手段、質量分析計からの情報をサンプルの所定のセグメントと関連付ける手段、並びに質量情報を分析サンプルの各セグメントと関連付けることができるイオン化システム、イオン検出器、デジタル化システム、またはデータの転送、処理、及び記録の少なくとも１つを同期させる手段、を備える。
【００１０】
本教示のこれら及び他の特徴は、本明細書に記載されている。
【００１１】
当業者は、以下に記載される図面は、例示の目的のみのためのものであることを理解するであろう。図面は、決して本教示の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】以下により詳細に記載される本発明に従って、一次イオン源によって照射された平面サンプルからの二次イオンを測定することから飛行時間型質量分析装置の例示的実施例を示す模式図。
【図２】平面サンプルの経時的な分析セグメントからの原子質量によってコードされた画像の再構成のためのデータデジタル化及び同期化を表す模式図。
【図３】平面サンプルの表面への一次イオンビーム照射の入射を示す模式図及び本発明の記載に従った所望の断面分解能の記載。
【図４】記載された方法及び装置の実施形態を示すワークフロー模式図。
【００１３】
定義
より詳細に例示的な実施形態を説明する前に、本明細書で使用される用語の意味と範囲を例示し、定義するために以下の定義を説明する。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「平面サンプル」は、実質的に平面の、すなわち、フラットな、生物学的サンプルを指すのに使用される。そのようなサンプルの例としては、組織切片（例えば、ミクロトームを使用して切片にされたもの）、平坦な表面上に分離された細胞を付着させることによって作られるサンプル、及び平坦な表面上に細胞のシート（例えば、単層）を成長させることによって作られるサンプル、が挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「染色元素」は、開示された装置及び方法によって分析され得る粒子または生物学的細胞中に存在する任意の原子元素または同位体を指す。元素は、サンプルの中に天然に存在することができるか、または平面状のマトリックスに意図的に添加される元素であることができる。例えば、いくつかの細胞は、ＺｎまたはＦｅが豊富であってもよい。あるいは、染色元素は、ＤＮＡを標識するためにメタロインターカレーターを使用することを含むがこれに限定されない、本明細書の開示と一致する任意の方法によって、特異的に加えることができるか、または細胞内に浸透させることができるか、または元素タグ付き抗体によって加えることができる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「質量によってタグ付けされた」は、独自の質量または質量プロファイルまたはそれらの組合せによって識別可能な単一の種類の安定同位体のいずれかでタグ付けされた分子を指し、ここで安定同位体の組合せは識別子を提供する。安定同位体の組合せは、チャンネル圧縮及び／またはバーコード化を可能にする。質量によって識別可能な元素の例としては、貴金属及びランタニドが挙げられるが、他の元素を使用してもよい。元素は、１つまたは複数の同位体として存在することができ、この用語は正及び負の金属の同位体を含む。用語「質量によってタグ付けされた」と「元素としてタグ付けされた」は、本明細書中で互換可能に使用され得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「質量タグ」は、質量によって識別可能な、他の質量タグから区別できる、及び生物学的に活性な物質または検体をタグ付けするために使用される、遷移金属、ポスト遷移金属、ハロゲン化物、貴金属またはランタニドを含む任意の元素の任意の同位体を意味する。質量タグは、分析サンプル中及び対象の粒子中に存在する原子質量と区別できる原子質量を有する。用語「モノアイソトピック」は、（任意の１つのタグは、同じ種類の複数の金属原子を含有してもよいが）タグが単一の種類の金属同位体を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、質量タグは、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＦ付加物を含む、１２〜２３８の原子質量単位の範囲の質量、例えば、２１〜２３８原子質量単位、を有してもよい。いくつかの実施形態では、質量タグは２１〜９０までの範囲の原子番号を有する元素の原子、例えば、２１〜２９、３９〜４７、５７〜７９または８９の原子番号を有する元素、であってもよい。いくつかの場合、元素はランタニドである。特定の実施形態では、標識化は、製造方法が公知である特異的結合試薬、例えば、質量タグとして機能するキレート化原子を含む抗体、を使用して行うことができる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「質量スペクトル」は、例えば単一のイオンビーム変調イベントが質量分析計（以下に記載される例示的飛行時間型装置など）に適用された後に単一のサンプリング周期で収集される生データ（例えば、波形）または波形に関連した処理データを含むデータを含む。例えば、加速領域中のイオンのパケットは、適切に配置された電気パルスにより飛行管にプッシュされる。これは、単一のサンプリング周期の質量スペクトルとも呼ぶことができる。飛行時間サイクルは、連続した単一のイオンビーム変調イベント間の期間である。質量スペクトル測定値は、使用される染色元素の一部である質量タグの識別と存在量を含み得る。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「イオン検出器」は、１つまたは複数の質量スペクトルを収集することができるか、または染色元素によって誘起される信号を収集することができる任意のまたはすべてのデバイスを指す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「データ生成速度」は、単一の質量スペクトルのデジタル化された信号が生成される速度を指す。例えば、単一の質量スペクトルを示す波形は、１０マイクロ秒の持続時間のものであり、その特徴は、時間で１０−２％及び信号強度で０．４％の精度を有する波形のサンプリングを必要とし、上記波形は、１０マイクロ秒で約１００００×８ビット＝１０キロバイト（ｋＢ）のデータ、すなわち秒あたり１ギガバイト（ＧＢ）のデータ生成速度をもたらす、１ナノ秒毎に信号強度がの２５０レベルでサンプリングされるべきである。データ転送速度は、単一の波形のデジタル表示が、例えば、圧縮または記録を含む、更なる処理のためにメモリー記憶装置に転送され得る速度である。スペクトルの発生周波数は、連続した単一の質量スペクトルが生成される周波数である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「サンプルセグメント」または「領域」は、質量分析計による質量分析に適した平面サンプルの任意の離散的な（discrete）場所である。例えば、元素質量分析のためにイオンビームによってイオン化されるサンプルの０．１μｍ×０．１μｍのセクションである。一旦デジタル化されると、元素レポーターの組成が、その個々の画像ピクセルのカラーとして表示され得る。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「直交」は約９０度の方向を指すことを意図している。具体的には、「直交」飛行時間型質量分析計では、イオンは、飛行管に入るとき、前の飛行経路に対して、約９０度だけ方向を変える。特定の場合、イオンビームは、例えば、イオンスライサーを使用して、リボン状に成形することができ、イオンのパケットは、例えば、パルサーを使用して飛行時間の管に方向を変えるよう強制される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「連続照射する」は、実質的に「オン」で何ら中断なくサンプルを照射する一次イオン源を指すことを意図している。後述するように、一次イオン源は、ビーム自体がサンプルを横切って操作する間（例えば、サンプルを移動させることによって、イオン源を移動させることによって、またはイオン光学系、すなわち、電極を使用して）、サンプルを連続的に照射し得る。ビームは、少なくとも１０％のデューティサイクルを有する場合、実質的に「オン」である。
【００２４】
特に規定されない限り、本明細書で使用される用語「移動する」は、相対的な用語である。サンプルを横切るイオンビームの「移動」においては、ビーム源はサンプルに対して移動することができ、サンプルはビーム源に対して移動することができ、またはビームの方向は、イオン光学系によって操作され得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「平面サンプルを横切って二次元でスキャンする」は、ビームがサンプルの領域を横切る一連の実質的に平行な線で前後に動くことを意味することを意図している。「ラスター」はそのようなスキャンの形式である。ビームが移動する速度に応じて、線の間隔は変化してもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「平面サンプルの面内」は、平面サンプルのｘ−ｙ平面を指すことが意図され、ここでｚは平面サンプルの上または下にある。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「スキャンのタイミング」はタイミングの絶対値（例えば、１日の時間）または絶対的な（例えば、１つのスキャンが別のスキャンに対して行われるとき）表示を意図している。いくつかの実施形態では、スキャンのタイミングは、スキャンをスキャンの分解能と関連付けることによって、例えば、高分解能スキャンが低分解能スキャン後に生じる場合、示され得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「平面サンプル上の位置」は、任意の適切な方法、例えば、ｘ−ｙ座標を使用して、または時間によって記載することができ、ここで時間は平面サンプルの位置のｘ−ｙ座標を決定するのに使用することができる。
【００２９】
任意の実施形態では、データは「遠隔地」に転送することができ、ここで「遠隔地」は、プログラムが実行される場所以外の場所を意味する。たとえば、遠隔地は、同じ市内の別の場所（例えば、オフィス、研究所、など）、異なる都市の別の場所、異なる州の別の場所、異なる国の別の場所、などであり得る。従って、一つのアイテムが他から「遠隔」であると記載されている場合、意味されることは、２つのアイテムが同じ部屋にあるが分離されている、または少なくとも異なる部屋または異なる建物にあることができる、及び少なくとも１マイル、１０マイル、または少なくとも１００マイル離れることができることである。情報を「通信する」はその情報を表わすデータを適切な通信チャンネル（例えば、私設または公衆のネットワーク）を介して電気信号として送信することに言及している。アイテムを「転送する」は、そのアイテムを輸送することによるかまたは別の方法（可能な場合）によるかによらず、１つの場所から次の場所にそのアイテムを取得する任意の手段を指し、少なくともデータの場合には、そのアイテムを担持する媒体を輸送するかまたはデータを通信することを含む。通信媒体の例としては、無線または赤外線伝送チャンネル並びに別のコンピューターまたはネットワークデバイスへのネットワーク接続、及びインターネットまたは電子メールの送信及びウェブサイトに記録された情報などを含む。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「受信する」は、例えば、図形またはテキストファイルの形で、通常、ヒトが読める形式で、ユーザにコンピューターシステムのメモリーからの情報を送達することを指すのに使用される。この用語は、コンピューターモニターのスクリーンへの画像の送達、及び、電子的手段（例えば、電子メールなど）によるユーザへのファイルの送達を包含することを意図している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下の記載、及び本明細書に記載の実施形態は、本発明の原理の特定の実施形態の実施例の説明のために提供される。これらの実施例は、これらの原理及び本発明の、限定ではなく説明の目的のために提供される。
【００３２】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のみのためのものであり、いかなる方法でも記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。本教示は、様々な実施形態に関連して記載されているが、本教示はそのような実施形態に限定されるものではない。逆に、当業者によって理解されるように、本教示は、様々な代替、改変、及び均等物を包含する。
【００３３】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が特に明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１までの、各介在値、及びその規定範囲内の任意の他の規定値または介在値が、本開示に包含されることが理解される。
【００３４】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料も本教示の実施または試験に用いることができるが、いくつかの例示的な方法及び材料は以下に記載される。
【００３５】
任意の出版物の引用は、出願日前のその開示に対してであり、本特許請求の範囲は、先行発明の理由でそのような刊行物に先行する権利がないということの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があることができる実際の刊行日とは異なることができる。
【００３６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、文脈が明確に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数の対象を含むことが留意されなければならない。さらに、特許請求の範囲は任意の任意選択要素を除外するように起草され得ることが留意される。従って、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載と関連して、「単に」、「のみ」、などの排他的用語の使用、または「否定的」制限の使用に対する先の記載として役立つことを意図している。
【００３７】
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本明細書に記載され図示される個々の実施形態のそれぞれは、本教示の範囲または趣旨から逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態から容易に分離されるかまたはそれらと組合せられ得る個別の要素及び特徴を有する。任意の記載の方法は、記載したイベントの順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実施され得る。
【００３８】
そのような実施形態の説明は、図１に概略的に示される飛行時間型質量分析計の例を使用することにより提供されても良い。図１は、本発明の様々な態様を実施する際に、使用するのに適した質量分析に基づく二次イオン撮像装置の概略的な例を示している。サンプル１０は（例えば半導体ウエハまたは導電性スライドガラスの基板上に実装された、例えばミクロトームによる組織学的組織切片を含む）は、チャンバーアクセスゲート３０を通してサンプルインターフェースの真空チャンバー２０に導入される。サンプルが実装される基板中に存在する元素の汚染から生じる信号のバックグラウンドを低減するために、この基板の一実施形態では、目的のレポーター金属同位体と重なり得る元素成分及びまたはそれらの各酸化物を枯渇させるであろう。平面サンプル１０がロードされている間、追加のインターフェースチャンバーアクセスゲート４０が、真空下にある残りのデバイスを密封する。例えば、Ｃｓ液体金属イオン銃または酸素デュオプラズマトロンの一次イオン源５０が、イオンミーリング、材料堆積のいずれかで表面を改質するか、または表面を画像化する目的のために、試料に集束される。
【００３９】
一旦サンプル１０がインターフェースチャンバー２０にロードされてアクセスゲート３０が閉じられると、インターフェースポンプ８０は、チャンバーアクセスゲート４０が開く前にサンプルインターフェースユニット２０内の真空を回復し、別のセットのポンプ９０（例えばターボ分子ポンプ）によって真空下に保持されたデバイスの残りの部分を露出させる。イオン源５０は、一次イオンビーム１１０として一次イオンでサンプル１０の表面１００を照射する一次イオン照射ユニットとして機能する。保持ユニット６０はサンプル１０を保持する。サンプル中の異なる位置のセグメントが、画像化のために一次イオンビーム１１０の経路内に配置され得るように、保持ユニット６０は、サブミクロンの精度で、サンプル１０のＸ及びＹ座標を調整する能力を有することが望ましい。電位勾配発生器７０は、保持ユニット６０内に配置されている。一次イオン源５０の偏向コントローラーと増幅器に印加される信号は、パターン発生器と集束イオン光学系１２０によって制御されるパターンに従って画像化またはミーリングされる対象領域内で収束イオンビームを移動させる。各サンプル点からの発光は、ビデオモニターに表示される画像を作成するために、最初に荷電粒子の乗算器１５５によって収集され得る。ビームを集束させ、様々な収差１２０に対してビームを調整するために、オペレーターは一次イオン源及びカラム５０内の様々な光学要素に印加される電圧を調整することができる。カラム１２０内の収束光学系は、集束または将来開発される方法のために当該技術分野で公知の機構を含み得る。例えば、２つの円筒対称静電レンズを、円形の仮想光源の縮小画像を生成するために実装することができる。抽出ビームの低い軸方向のエネルギーの広がりのために、色彩ぼけは最少となり、ビームの効率的集束を、低加速電圧（すなわち、低ビームエネルギー）でも達成することができる。適切な集光光学系と併せてこれらの特性を、運動エネルギーの範囲（０．１ｋｅＶ〜５０ｋｅＶ）及び数ピコアンペア〜数マイクロアンペアのビーム電流で、ナノメートルからマイクロメートルの規模のスポットサイズを生成するために使用することができる。
【００４０】
サンプル１００の表面のセグメントから生成される二次イオン１３０はサンプル１０に対向する抽出電極１４０によって引寄せられ、集束される。抽出電極１４０は、サンプル１００の表面に対向し、サンプル１０から放出された二次イオンを収集する機能を有するように配置されている。抽出電極１４０は、収集された二次イオンを質量分析及び検出のために向けることができるように、サンプル１０とデバイスのイオン輸送セクション１５０の入口の間に配置されている。
【００４１】
図１及び３に示されるように、一次イオン源５０から放出された一次イオンは、０度（すなわち、サンプル１０の表面に平行）〜９０度の範囲の角度Φで入射軸Ａ方向にサンプル表面１００に入射している。一次イオンがサンプル表面１００に斜めに入射すると、入射軸Ａ方向の一次イオンと抽出電極１４０の衝突を回避することができる。図３は、サンプル表面１００における一次イオンビーム１１０の入射と性質を例示している。収束イオン光学系／電極と組合せた一次イオン源５０の開口部は、Φの入射角を有するビーム１１０が１ミクロン以下（例えば、できるだけ低く１０ｎｍ）の断面を維持し得ることを保証するであろう。
【００４２】
複数原子の付加物なしに最も効率的な元素のイオン化を確保し、取得時間を最少にするためには、望ましい実施形態における一次イオンビームは、高エネルギーイオンの連続ビームであり得る。本明細書で使用される場合、連続イオンビームは、例えば、少なくとも１０％、少なくとも４０％、少なくとも７０％、及び１００％までの、ビームがオンにある時間をビームがオン及びオフにある時間の合計で割ることによって定義されるデューティサイクルを有するイオンビームを含み得るが、少なくとも１％のデューティサイクルを有するビームが状況に応じて使用されてもよい。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（４）：１６０６?１６０９、特許ＵＳ８，１６８，９５７、ＵＳ８，０８７，３７９、ＵＳ８，０７６，６５０、ＵＳ７，６７０，４５５、及びＵＳ７，２４１，３６１に記載され、参照により本明細書に組込まれている、Ｏ２、Ｎ２、及びＳＦ６などの任意の不活性ガスまたは反応性ガスを使用する一次イオン源を、この実施形態で使用することができる。従って、適切な一次イオンビームは、酸素、キセノン、アルゴン（アルゴンクラスターを含む）、金（金クラスターを含む）、ビスマスガリウム、ＳＦ６及びＣ６０のイオンビームを含んでもよい。この特定の実施形態では、一次イオン源は、ＳＩＭＳ画像分析のための高輝度、収束イオンビームを生成するために集光光学系と組合せて使用することができる補償ＲＦアンテナに誘導結合されたプラズマから成る。本発明の態様によれば、ＲＦアンテナは、プラズマ管を取囲む螺旋状コイルとして実施することができる。ＲＦ電流源は、管内のプラズマガスのイオン化を誘発するために、アンテナに印加される。インピーダンス整合回路は、プラズマ電位の変調を排除するために、アンテナの両端に適切な位相シフトを有するプラズマへの効率的な電力伝達を可能にするために設けられている。イオン化されたプラズマは、イオンビーム中に抽出され、イオン光学系によって集光される。形成されたイオンビームは、ＲＦアンテナから生じる望ましくないエネルギー振動を実質的に含まない。ＲＦ源はプラズマ電位にわずかな振動のみ与えるかまたは理想的には振動を与えないので、結果としてのそこから生じるビームの軸方向のエネルギーの広がりは小さい。従って、イオン化源は、実質的な色収差が発生させない。さらに、ＲＦ源はプラズマに高いイオン密度を与える。
【００４３】
収束機構と組み合わせると、この高密度ビームは、数ピコアンペアから、１０−１１超、１０−１０アンペア超、１０−９アンペア超、１０−８アンペア超、１０−７超の電流、または数マイクロアンペアの電流のビーム電流を提供することができる。５０ｋｅＶにおいて、少なくとも１０４Ａ／ｃｍ２／ｓｒ、少なくとも１０５Ａ／ｃｍ２／ｓｒ、及び１０６Ａ／ｃｍ２／ｓｒ以上までのソース輝度を達成することができる。軸方向のエネルギーの広がりは、３ｅＶ未満、２．５ｅＶ未満であり、及びできるだけ低く１．５ｅＶであることができる。イオンビームは、数ナノメートルから数十ミクロンまでのビーム直径に収束され得る。
【００４４】
上記のような連続、高輝度一次イオン源は、イオン輸送セクション１５０によって収束され転送される二次イオンの連続放出を生成するのに使用されるであろう。次いで、この連続二次イオン電流は、パルス二次イオン光学系と飛行時間型質量分析によって分析される対象の可能な質量の全範囲にわたってサンプリングされる。本発明の別の実施形態では、元素の二次イオンを生成することができる高輝度の一次イオンビームは、質量イオンのパケットをＴＯＦ質量分析器に直接解放するために、パルス化（スパッター化）されてもよい。
【００４５】
二次イオン１３０を抽出電極１４０に向けて加速する電界は、サンプル１０の電位に対して適切である電位Ｖｅｘを、抽出電極１４０に対して印可することによって生成され得る。この電界が存在しない場合に比べ、これは二次イオンの収集の効率が改善されるということにおいて有利である。
【００４６】
サンプル１０から放出された二次イオンは、抽出電極１４０によって収集され、その後、質量分析のためにイオンを効率的に転送するように、抽出電極１４０と二次イオン搬送セクション１５０の間の電位により所定のエネルギーまで加速される。
【００４７】
サンプルからの二次イオンは、差動排気インターフェース１６０を介して、イオン偏向器１７０、開口部１８０、必要なＲＦの発生手段に接続されたＲＦイオンガイド１９０及び／またはｄｃ電圧２００を備え得るイオン輸送セクション１５０に導入される。イオン偏向器１７０は、プッシュアウトプレート２３０、グリッド２４０〜２４２及びリングのセット２５０を備え得る直交加速器２２０にイオン光学系２１０のセットを介して少なくとも一部のイオンを移送することができるイオンガイド１９０に向けてイオンの少なくとも一部を偏向させることができる。通常の動作では、電圧は、目的のイオンの大部分が直交加速器２２０に輸送されるように、適切な電圧源（図示せず）から、イオン輸送セクション１５０を備える要素に印加される。
【００４８】
各飛行時間サイクルの開始時に、短いプッシュアウト電圧パルスを、プッシュアウトプレート２３０に印加することができ、プルアウト電圧パルスを同時にグリッド２４０に印加することができる；両方ともパルス電子機器２６０から供給され得る。そのようなパルスは、右側グリッド２４２に向けて、加速器２２０を通って横に移動するようにプレート２３０と第１グリッド２４０の間にイオンを存在させ、主にパルス印加時にプレート２２０とグリッド２４０の間にあるイオンからなるイオンの横方向のパケットを短くする。次いで、イオンはグリッド２９０及び３００並びにリング３０５備えることができるイオン反射板２９５に向かって電界フリースペース２７０を通って移動することができる。イオンの少なくとも一部は反射されて戻ることができ、次いで、電界フリースペース２７０中でグリッド３１０を通ってイオン検出器３２０に移動し、ここで、イオンは増幅器３３０によって増幅され得る電子パルスを生成し、単一のスペクトルに対応するイオン信号波形を生成する。
【００４９】
検出器におけるイオンの到着時間は、それらの質量対電荷比、ｍ／ｚに依存する。最大のｍ／ｚを有するイオンは、検出器に最後に到着する。対象の最後のイオンが検出器に到達するのに十分な時間間隔の後、プレート２３０とグリッド２４１の間を移動するようにイオン輸送セクション１５０によって少なくともいくらかが新たに送達されるのに適した電圧でパルス間に保持される、プレート２３０とグリッド２４１に別のセットのパルスを印加することによって、サイクルを再び開始することができる。いくつかの連続飛行時間サイクルで取得された、いくつかの連続したそのようなイオン信号波形が２８０として示されている。当該技術分野で公知の飛行時間機器は、例えば、完全なイオン信号波形のアナログ−デジタル変換によって、連続した単一のスペクトルを完全にサンプリングし、そのような波形を記載するデジタル化データを転送する。いくつかの実施形態では、機器は、所与のセグメントからの染色元素（複数可）の到着時間に相当する比較的短時間のウィンドウ内で、主にすべてのイオン信号波形をサンプリングすることができる手段２９０を備え得る。
【００５０】
実施例に示されるような機器については、１０２Ｐｄが例示的な染色元素同位体として与えられている；しかし、もともと存在するまたはサンプル１０に人工的には組込まれる任意の他の元素を使用することができる。手段２９０は、サンプル１０２Ｐｄ＋の到着時間に相当する時間ウィンドウ１１内で主に単一のイオンスペクトルをサンプリングする。時間ウィンドウ１１内の信号強度が、バックグラウンドシグナルを克服して、予め決められた検出器信号閾値３００を超えた後、手段２９０は、少なくとももう一度時間ウィンドウ１２内で単一イオンスペクトルのサンプリングを追加で開始することができる。
【００５１】
ＴＯＦ−ＭＳ検出器の信号を受信して記録し、ＴＯＦ質量情報と定量化を作成するために、パルス状の電子機器２６０のタイミングとそれを適合させる手段２９０によって、ＴＯＦスキャン３１０を、質量セグメント情報３４０の二次元画像３３０を再構成するように一次イオンビーム１１０によって現在アブレーションされているサンプルセグメント３２０と適切に適合させるために、シンクロナイザー１０８０を、手段２９０、一次イオン源５０、及びサンプルインターフェースと適合させる。図２の本明細書の実施例では、ＴＯＦ  ＭＳスキャン２３１、２３２、２３３に対する、検出器信号２８０からの統合された質量情報１１、１２は、サンプルセグメント３２１の各質量チャンネルに対して単一の値に統合される。セグメント３２１の位置情報及びそれに対応する質量情報が記録される。同時に、ＴＯＦ  ＭＳスキャン３１４、３１５、３１６は、セグメント３２２の質量情報を形成するために統合される。この実施例では、サンプルの単一のセグメントへの一次イオン源の照射時間は、３つの連続したＴＯＦ  ＭＳスキャンとほぼ同等である。このタイミング、位置情報及び統合された質量値のデジタル化の適合は、シンクロナイザー１０８０との適合において手段２９０によって行われる。
【００５２】
別の動作モードでは、機器は、対象の質量対電荷比３１１〜３１６のすべてのイオンの到着時間に相当するかまたはそれらをカバーする、１つの長いサンプリングウインドウでまたは複数のサンプリングウインドウで操作される。しかし、質量対電荷比チャンネルの一次検出グループに対応するより短い時間のウィンドウ１１〜１２からのデータのみが、さらなる処理のために転送される。そのようなデータが、サンプルの表面１００の特定のセグメント３２０、３３０を照射する一次イオンビーム１１０に対応するイベントでは、次いで、すべてのサンプリングウインドウからのデータは、手段及び質量と位置情報のシンクロナイザー１０９０によって促進される、処理及び画像再構成３４０のために転送されるであろう。そのようなモードの利点は、平均データ転送速度を低減することができることである。
【００５３】
別の動作モードでは、前の段落で説明したように得られたすべてのデータが転送される；しかしながら、一次質量対電荷比チャンネルからのデータのみが処理するために使用される。ここで、一次質量対電荷比チャンネルにおけるデータの処理２９０と同期（シンクロナイゼーション）１０９０は統合することができ、注記された二次元位置を有するサンプルの各セグメントに対して記録され得る。これは、各セグメントの各質量のチャンネルに対して単一の統合された値をもたらす。従って、データの記憶の平均負荷を低減することができる。
【００５４】
本方法の一実施形態のフローチャートが図４に示されている。装置１０００によって撮像される平面マトリックスのサンプルセグメントは、分析チャンバー内に配置されている。サンプルセグメントに関連する材料は、一次イオン照射ユニット１０１０によって、気化、原子化及びイオン化され、サンプルセグメントに関連する二次イオンが生成される。イオンは、イオンの質量対電荷比分析器１０２０によってそれらの電荷対質量比に応じて分離され、主イオン検出器１０３０が分離されたイオンを検出する。一次イオンビーム１０１０が、平面サンプルの単一セグメントに滞留している時間の間、画像再構成は、そのセグメント１０９０に対して質量測定された信号のすべてを統合している。各滞留時間の間、主イオン検出器１０３０によって収集され、デジタイザー１０４０によってデジタル化され、デジタル化されたデータ転送チャンネル１０５０によって転送され、データプロセッサー１０６０によって処理されたデータは、データレコーダー１０７０によって格納される。一次イオン源の滞留時間に基づいて、各セグメントについて測定されたすべてイオン情報は、各質量チャンネルに対して同期させて統合することができ、同期化ユニット１０８０によって適合させることができ、平面サンプルの各セグメントの質量プロファイルは再構成されたとなる１０９０。従って、シンクロナイザー１０９０は、質量分析計の１つまたは複数の他の要素を一次イオンビームによってイオン化された単一のセグメント内に存在する質量情報と同期させるのに使用することができる。
【００５５】
ここで特定のタイプの実施形態を参照すると、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析におけるイオン信号の検出とデータ処理、並びに特に、個々の粒子の分析のために、飛行時間型質量分析データを収集及び保存するための検出システムと装置の操作の方法が、以下に記載される。
【００５６】
飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ  ＭＳ）は、イオンが一定の距離にわたって移動する時間を計測する原理で動作し、時間はイオンの質量対電荷比の平方根に通常比例するので、検出されるイオンの質量の尺度となる。イオン検出器に到着するイオンは、通常、特定の質量対電荷比（Ｍ／Ｚ）のそれぞれ１つまたは複数のイオンを表わすピークの配列からなる検出器出力信号を生成する。一般に、質量スペクトル中の各ピークの持続時間は１００ナノ秒未満であり、全ての質量のイオンを表わす検出器出力信号（通常単一の質量スペクトルと呼ばれる）の全持続時間は１００マイクロ秒のオーダーである。そのような検出器出力信号は、通常、２つの異なる方法の１つでデジタル化される：時間−デジタル変換または過渡記録。時間−デジタル変換器（ＴＤＣ）では、各到着時刻ウィンドウに関連付けられたカウンターが、イオン到着イベントがこのウィンドウ内で検出されるとインクリメントされる。特定の時間期間内に検出器に到着するイオンのすべてのイベント（ＴＤＣの「デッドタイム」と呼ばれ、一般的に５〜２０ｎｓ）は、１つのイベントとしてのみカウントされ得る。その結果、イオンのカウント技術であるＴＤＣ技術は、測定時のダイナミックレンジによって制限され、一般に急速に変化するイオンビームの高ダイナミックレンジの特性評価には適していない。
【００５７】
急速に変化するイオンビームの一例は、サンプルセグメントがイオン化し、組成及び／またはイオン密度が急速に変化するイオンクラウドを生成したときに生じる。平面状の生物学的サンプルの元素組成、具体的には、（Ａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１４）に記載されているように、ＴＯＦ  ＭＳは、抗体またはそれらの特異的抗原に結合した他の親和性試薬に結合している元素を測定する質量分析計検出器を備えた撮像装置における、イオンクラウドの好ましい分析方法の一例である。具現化された一次イオンビームの滞留時間と１０〜１００００マイクロ秒のようなサンプリングイベントから生成された二次イオンクラウドの持続時間。少なくとも４桁の大きさのダイナミックレンジを有する複数のｍ／ｚのイオンについて、そのような短いイオンクラウドを分析することができることが望ましい。
【００５８】
検出器の出力信号のデジタル化の別の方法は、単一のＴＯＦ質量スペクトル（単一過渡現象）を表わす信号内のすべての情報を捕捉して保存する過渡現象記録装置の使用である。例えば、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）に基づく過渡現象記録装置としては、市販のデジタルストレージオシロスコープを使用することができる（encountered）。
【００５９】
いくつかの状況では、例えば、１０〜１０００マイクロ秒続くことができる過渡期間の間に、粒子によって生成されるイオンクラウドの元素組成の変化に関する情報を提供することが望ましい。そのような状況では、そのような比較的短い期間の間に、複数の質量スペクトルを収集して格納することが望ましい。単一の質量スペクトルの持続時間は、望ましくは１０〜２０マイクロ秒のオーダーとすることができ、単一のサンプルセグメントに対して１〜１０００スペクトルを収集することを可能にする。約２０マイクロ秒の単一の質量スペクトル持続時間を有する元素のＴＯＦにおける単一の質量のウィンドウの典型的な幅は、１０〜２５ナノ秒である。従って、１ＧＨｚ以上のサンプリング速度がイオンピーク形状を特徴付けるのに望ましい。そのような高いサンプリング速度と１０４のダイナミックレンジ要件は、十分１ＧＢ／秒を超えるデータの生成速度をもたらす。これは、当該技術分野で公知の技術を用いて達成可能な最も速いデータ転送速度（約２５０ＭＢ／秒）よりもはるかに高い。ＴＯＦ−ＭＳにおける最近の進歩は、この測定及びデータ転送ワークフローをよりルーチンにした。（Ｂａｎｄｕｒａ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００９  ８１：６８１３−２２または米国特許Ｎｏ．ＵＳ８２８３６２４、参照により本明細書に組込まれている）に記載のＴＯＦ分析データワークフローを本明細書で使用することができた。
【００６０】
いくつかの実施形態では、サンプルへの一次イオンビームの衝突の結果として生成される非元素二次イオン（例えば、多原子（ｐｏｌｙｌａｔｏｍｉｃ）の二次的な化学種）を、エネルギーフィルターによって二次元素原子イオンに対して抑制することができ、それにより、ＴＯＦ質量分析計による質量分離の前に二次元素原子イオンを濃縮する。エネルギーフィルターは、二次イオンの経路において静電セクタを生成するように構成され、従って分子イオンなどの低エネルギーイオンをＴＯＦ質量分析計から離れて偏向させ、質量スペクトルを主に高いエネルギーを有する二次元素原子イオンから抽出することを可能にする、任意の適切なフィルター手段で達成され得る。例示的なエネルギーフィルターシステムは、例えば、米国特許Ｎｏ．５，１６６，５２８；米国出願Ｎｏ．２００４０２０６８９９及び２００６０２８４０７６に記載されており、これらは参照として本明細書に組込まれる。
【００６１】
質量分析システムは以下を備え得る：ａ）サンプルを備えた基板を保持するためのホルダーを備えた二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）システム、ここでシステムは、（ｉ）サンプルを一次イオンビーム（すなわち、酸素またはアルゴン、など）でスキャンして、サンプルに関連付けられている質量タグの質量固有の存在量の測定値を含むデータセットを生成し、（ｉｉ）データセットを出力するように構成されている。特定の場合、システムは、サンプルの画像を生成するためにデータセットを処理する画像分析モジュールをさらに含み得る。ホルダーは、スキャンを容易にするために、少なくともｘ及びｙ方向に（サンプルの平面内にある）、制御可能に移動させることができる（例えば、ステップ状または連続的に移動させる）可動ステージである。特定の実施形態では、システムは、四重極に、次いでイオンパルサーに、次いで飛行時間（ＴＯＦ）管にリンクされる連続一次イオンビーム（すなわち、連続的な供給源）を備え得る。
【００６２】
いくつかの場合、システムは以下を備える：ａ）平面サンプルを備えた基板を保持するように構成されたホルダーを備えたサンプルインターフェース；ｂ）直径１ｍｍ未満である一次イオンビームで平面サンプルのセグメントを照射することが可能な一次イオン源であって、一次イオン源による平面サンプルの照射は平面サンプルに関連する染色元素に由来する二次元素原子イオンの生成をもたらす；及びｃ）サンプルインターフェースの下流に配置された直交イオンの質量対電荷比分析器であって、分析器は、飛行時間によって質量対電荷比に応じて二次元素原子イオンを分離するように構成されている；ｄ）二次元素原子イオンを検出して質量スペクトル測定値を生成するための主要イオン検出器；及びｅ）シンクロナイザー、ここでシステムは、一次イオンビームが平面サンプルを二次元に横切ってスキャンするように構成されており、シンクロナイザーは質量スペクトル測定値を平面サンプル上の位置と関連付ける。上述のように、システムは、一次イオンビームが平面サンプルを横切ってスキャンする時、一次イオン源が平面サンプルを連続的に照射するように構成され得る。明らかであるように、システムは、出力をデジタル化するデジタイザー、デジタル化されたデータの出力を転送するデータ転送チャンネル、及び上記に記載されていない他の要素を含み得る。
【００６３】
上述のように、一次イオンビームの直径は、例えば、１ｍｍ〜１０ｎｍの範囲で、選択された直径に変更され得るということにおいて、調整可能である。いくつかの場合、一次イオン源は、直径１０μｍ未満、直径１μｍ未満及び直径１００ｎｍ未満の平面サンプルセグメントを照射可能である。これらの実施形態では、システムは、対象領域を識別することができる最初の「サーベイ」スキャンを行い、次いで対象領域内の更なるスキャンを行うように構成され得る。例えば、質量分析計システムは、以下を行うように構成され得る：第１のデータセットを収集するために平面サンプルの第１の領域の第１のスキャンを実行する；及び第２のデータセットを収集するために平面サンプルの第１の領域の第２のスキャンを実行する；ここで第１のスキャンの一次イオンビームの直径は、第２のスキャンの一次イオンビームの直径より、少なくとも２倍大きい、少なくとも５倍大きいかまたは少なくとも１０倍大きい。これらの実施形態では、シンクロナイザーは、質量スペクトル測定値を平面サンプル上の位置とスキャンのタイミングに関連付ける。いくつかの実施形態では、システムは、第２のスキャンのビームの直径より小さい（例えば、その５０％まで、その２０％までまたはその１０％まで）直径を有する一次イオンビームを使用して、第３のデータセットを収集するために平面サンプルの第１の領域の第３のスキャンを実行するように構成され得る。いくつかの実施形態では、第１のデータセットは、１００μｍ〜１ｍｍの範囲内、または１００ｎｍ〜１００μｍの範囲内、例えば、２００ｎｍ〜１０μｍの直径を有する一次イオンビームを使用して収集され、第２のデータセットは、１０ｎｍ〜１００μｍ、例えば、１０ｎｍ〜１μｍを含む、１０ｎｍ〜１０μｍ、１０ｎｍ〜３μｍの範囲内の直径を有する一次イオンビームを使用して収集される。
【００６４】
所定のスキャンのために、平面サンプルの領域が再スキャンされる実施形態では、一次イオン源は、サンプルの上部からどこでも２〜１０ｎｍスパッターオフし得る。この範囲の上限は、より強力な一次イオン源を実装することにより増加し得るであろう。指定された視野の画像化深さは、単位面積当たりの一次イオン電流の合計量によって決定される。これは、一次イオン電流と各ピクセルがスパッターされる時間（滞留時間）の積に比例する、ビームがサンプルに浸透する深さを決定する。従って、イオン電流または滞留時間を増加または減少させると、サンプルへの浸透の深さは変化するであろう。これらの実施形態では、所定の質量チャンネルの合計信号は、その質量の相対量とスパッターされた材料の総量（上記で概説した問題によって決定される）の積によって決定されるはずである。従って、一次イオン電流を一定に維持することは、質量Ｂよりも１００倍多量の質量Ａについては、Ａに対するピクセル滞留時間ｔ／１００がＢに対する滞留時間ｔと同じ量の信号を生成するはずであることを意味する。
【００６５】
非常に豊富なマーカー、（例えば、細胞化学またはＩＨＣ）を使用したサーベイスキャンは、短いピクセル滞留時間を使用することができる。例えば、ヘマトキシリンに対する信号は、多くのＩＨＣマーカーより１Ｅ３まで強いので、サーベイスキャンは非常に短いピクセル滞留時間で取得することができるであろう。これは、迅速に画像を取得するばかりでなく、滞留時間が非常に短いため、スパッター深さは非常に浅くてサンプル表面はほとんど消耗されず、基本的にすべてのＩＨＣマーカーを後続のスキャンに無傷で残すという利点を有する。サーベイスキャンは、より大きなピクセルサイズを使用しても実施され得る。電流密度が一定である限り、ビーム径（Ｄ）を変化させることによって達成することができる速度のゲインはＤ＾２に比例するので、１μｍビームスポットサイズでの画像は、２５０ｎｍビームスポットサイズでの画像より１６倍速く取得され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、システムは、画定された位置に平面サンプルを移動させ、それによって一次イオンビームに平面サンプル上の第１の領域を提示し、及び第１の領域の複数の質量スペクトル測定値を生成するために、第１の領域を横切って一次ビームをラスターさせるように構成され得る。これらの実施形態では、第１の領域は０．１ｍｍｘ０．１ｍｍ〜１ｍｍｘ０．１ｍｍの範囲、例えば、約０．５ｍｍｘ０．５ｍｍであり得る。これらの実施形態では、システムはさらに、ｃ）第１の領域の複数の質量スペクトル測定値を収集した後に、第２の画定された位置に平面サンプルを移動させ、それによって一次イオンビームに平面サンプル上の第２の領域を提示し、及びｄ）第２の領域の複数の質量スペクトル測定値を生成するために、第２の領域を横切って一次ビームをラスターさせるように構成され得る。平面サンプル上の対象領域のかなりの部分は、この方法で、すなわち、最初に対象領域内の選択された領域がビームの視野内にあるように基板を移動させ、次いで、その領域を通してビームをラスターさせることによって、スキャンすることができる。
【００６７】
元素分析の分解能と使用することができる元素同位体の数により、スペクトル／信号の重なりを経験することなく、単一のセグメント（ピクセル）内で１００以上のパラメータまで同時に測定することが可能である。上述したように、質量分析計システムは、生物学的材料の平面サンプルにおける複数の質量タグの存在量と位置を独立して測定するのに使用することができる。これらの実施形態では、データ出力は、いくつかの質量タグ（例えば、２超の質量タグ、５までの質量タグ、１０までの質量タグ、２０までの質量タグ、５０までの質量タグ、１００までの質量タグ、２００以上までの質量タグ）の存在量と位置を含んでもよい。画像分析モジュールは、複数のスキャン領域から得られたデータセットを単一のデータセットに組合せることができ、ここで、複数のスキャン領域のそれぞれは互いにオフセットされる。隣接するスキャン領域の端部付近の同様の質量タグ強度を有するピクセルの重なりが大きくなるように、画像解析モジュールは、隣接するスキャン領域間のオフセットを調整することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、平面サンプルの少なくとも一部の画像は、上述の質量分析計システムのホルダーに染色元素を含む平面サンプルを配置し；及び質量分析計システムを使用して平面サンプルの領域に対する質量スペクトル測定値を含むデータファイルを生成し、ここで質量スペクトル測定値は平面サンプル上の位置に関連付けられている；及び質量スペクトル測定値を使用して平面サンプルの画像を再構成することによって構築され得る。画像のデータファイル（例えば、ｐｄｆまたはｇｉｆ）を遠隔地に転送してもよい。いくつかの実施形態では、画像をスクリーンに表示することができる。
【００６９】
画像分析モジュールは、データセットを１つまたは複数の着色画像（例えば、疑似カラー、疑似明視野、擬似免疫蛍光）に変換することができる。画像は、任意の適切な画像ファイルフォーマットであってよい（例えば、ＪＰＥＧ、Ｅｘｉｆ、ＴＩＦＦ、ＧＩＦ、ＰＮＧ、ＩｍａｇｅＪなどの画像分析ソフトウェアによって読取り可能なフォーマット、など）。特定の実施形態では、画像分析モジュールは、１つまたは複数の質量タグの存在量（例えば、測定された強度）を画像内の個々のピクセルにおいて１つまたは複数の着色の強度に変換することにより画像を生成することができる。質量タグの強度と対応する着色の強度の関係は、線形または非線形（例えば、対数関数、指数関数、など）であってよい。
【００７０】
特定の実施形態では、システムは、サンプルの表面上の領域に結合された質量タグの複数の存在量の空間的にアドレス可能な測定値を含む多重化されたデータセットを生成するように構成されている。
画像分析モジュールは、複数の着色画像を生成するために、複数の質量タグの測定値を変換することができる。画像分析モジュールは、多重化された着色画像を得るために複数の着色画像を重ねることができる（例えば、各ピクセルでの着色を重ね合せる）。例えば、複数の質量タグのそれぞれに関連した特異的結合試薬の結合によって特徴づけられる、目的の生物学的特徴を表わすように、複数の質量タグの測定値を、単一の着色（例えば、重み付けなしまたは重み付けされた）に変換することができる。着色は、ユーザからの手動入力に基づいて、質量タグまたは質量タグの組合せに割り当てることができる。あるいはまたはさらに、スーパーバイズなし（unsupervised）アプローチを、単一の着色で表わされる、質量タグのグループを決定するのに使用ことができる。スーパーバイズなし（unsupervised）アプローチでは、共局在している及び／または近傍にある質量タグをグループ化して（例えば、任意の適切なクラスタリングアルゴリズムによって）、分散を最大にするがグループの数を最少にする（例えば、主成分分析（ＰＣＡ）によるなど）質量タグのグループを識別することができ、または単一の着色で表わされる質量タグをグループ化する任意の他の適切な方法を使用することができる。特定の態様では、画像は、核分画における質量タグなど、目的の特徴に関連した質量タグの強度にのみ関連する着色を含むことができる。
【００７１】
画像分析モジュールはさらに、畳み込み演算（例えば、質量タグ強度または着色のぼかしまたは鮮明化など）を実行するために、または画像を強調するために任意の他の適切な動作を行うために、質量タグの強度または着色の強度及び／またはコントラストを調整する（例えば、規格化する）ように構成されてもよい。特定の態様では、画像分析モジュールは、セルの３Ｄモデルの画像を生成するために、複数の２Ｄスキャンから生成されたデータセットをコンパイルすることができる。画像分析モジュールは、３Ｄモデルを生成するために、連続した２Ｄスキャンから得られたピクセルを整列させるように、及び／または連続した２Ｄスキャンから得られた画素にわたる質量タグの強度または着色をぼかすかまたは平滑にするように、上記の操作を実行することができる。
【００７２】
特定の実施形態では、本方法は：対象領域を識別するために平面サンプルのサーベイスキャンを実行すること；及び対象領域を再スキャンすること：イオンビームをサーベイスキャンよりも高い分解能でラスターすることにより；サーベイスキャンよりも小さい直径を有する一次イオンビームを使用して；サーベイスキャンよりも長いセグメント取得時間で、それによってセグメントあたりより多くの質量スペクトルまたはセグメントあたりより多くのイオンからのスペクトルを収集するまたはサーベイスキャンよりも大きな質量範囲で、それによってセグメントあたりより大きな数の元素の同位体の質量を測定することを含むことができる。この方法では、対象領域を計算するかまたは手動で初期サーベイスキャンで識別し；及び／またはサンプルを欠いていることが判明した平面基板の領域を後続の画像解析から除外する。
【００７３】
これらの実施形態では、平面サンプルの視覚画像を、質量対電荷種の個々のまたは組合せたレベルに基づいてカラーまたは濃淡のスケールで再構成することができる。
【００７４】
画像分析方法は、コンピューターに実装することができる。特定の実施形態では、汎用コンピューターを、本明細書に開示される方法及びプログラムの機能的配置に構成することができる。そのようなコンピューターのハードウェアアーキテクチャーは、当業者に周知であり、１つまたは複数のプロセッサー（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）内部または外部データ記憶媒体（例えば、ハードディスクドライブ）、などのハードウェアコンポーネントを備えることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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