(57)【要約】本発明は、様々な糸球体疾患に罹患している患者の尿サンプルから、腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の集団を高い効率性、純度および再現性で単離するための非侵襲的方法について記載する。前記腎臓前駆体は、その後ポドサイトに分化するように容易に誘導することができる。本発明の方法を用いた腎臓前駆体の単離により、ポドサイトによる遺伝的突然変異のインビトロ研究、または尿細管に対する腎毒性の可能性がある薬剤により引き起こされる腎毒性の研究のための、疾患の細胞モデルとしての前記細胞の使用が可能になる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腎前駆細胞ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の単離、精製および増幅のための方法であって、以下の操作順序：
患者から採取された尿のサンプルを第１の遠心分離に付すステップ；
上清を除去し、ペレットをＰＢＳに再懸濁するステップ；
第２の遠心分離に付すステップ；
前記上清を除去するステップ；
細胞を細胞培養プレートに移し、ＥＧＭ−ＭＶと、２０％ＦＢＳと、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびリファンピシンを含む抗生物質の混合物とを含む培養培地中で増殖するステップ；
培養の５〜７日後、前記培養培地を除去し、前記培養プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで新鮮な前記培養培地を加えるステップ；
前記新鮮な培養培地中で少なくともさらに７〜９日間、次いでその後、腎臓前駆体に特徴的な表面マーカーＣＤ１３３およびＣＤ２４の発現を特徴とする細胞集団がコンフルエントになるまで増殖するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記混合物はペニシリン、ストレプトマイシンおよびリファンピシンからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合物は１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび８ｍｃｇ／ｍＬのリファンピシンからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗生物質の混合物を含む培養培地中の全培養のうち最初の１２〜１６日後、培養は抗生物質の非存在下で維持される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記患者は腎臓病、または腎毒性の可能性がある薬剤による処置を施す必要があるいずれかの疾患に罹患している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記腎糸球体疾患は遺伝性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の腎臓前駆体の単離方法を含む、腎臓病の診断方法。
【請求項８】
腎臓前駆体に特徴的なＣＤ１３３およびＣＤ２４を発現している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により患者の尿から単離された腎前駆細胞。
【請求項９】
腎臓病の処置ための薬剤のスクリーニング、または薬剤の腎毒性の患者別の予測のための、インビトロ細胞モデルとしてポドサイトまたは尿細管表現型に分化した請求項８に記載の細胞の使用。
【請求項１０】
腎臓病に関与している未知の突然変異の機能的役割のインビトロ研究のための、細胞モデルとしてポドサイトまたは尿細管表現型に分化した請求項８に記載の細胞の使用。
【請求項１１】
ＥＧＭ−ＭＶと、２０％ＦＢＳと、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびリファンピシンを含む抗生物質の混合物とを含む培養培地を含む少なくとも１つの容器を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法における同時使用、別々の使用または経時的使用のためのキットのパーツ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿サンプルから多能性細胞を単離するための方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究から、マウスモデルおよびヒト糸球体疾患の両方で立証されたように、糸球体障害の結果として糸球体上皮細胞が剥離し、尿中に喪失することが示された。糸球体上皮細胞の尿中への排泄は、様々な糸球体疾患、たとえば巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）およびＩｇＡ腎症に罹患している患者の糸球体疾患の活性を評価するための有用な非侵襲的マーカーとして提案される。最近の知見からは、尿から単離された細胞は均一な集団を構成するのではなく、むしろ、ポドサイトマーカー、およびボーマン嚢壁側上皮細胞に特徴的なマーカーの両方を発現する不均一な集団であることが示唆される。したがってこれらの結果は、糸球体疾患の活性の過程において、ボーマン嚢のレベルに存在するかなりの量の腎臓前駆体が、増殖してその源から離れて反応し得ることを示唆する。腎臓前駆体の尿中への排泄により、糸球体異常に罹患している患者の尿サンプルから腎臓前駆体を単離することができると考えられる。患者の尿から幹細胞が単離されるという仮説に一致して、最近の研究からは、幹細胞がヒト尿サンプルから単離され得ることが示された。これらの細胞は、複数の細胞系譜に分化できる多能性前駆体の特徴をインビトロで示した。しかしながら、これまでに記載されたすべての方法は、採取された前駆体の特定の集団の特徴の解明を十分に行っておらず、精製された幹または前駆体集団の効率および純度が低い。
【０００３】
したがって、後でポドサイトに分化するように容易に誘導することができる腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の集団を高い効率性、純度および再現性で単離するための非侵襲的方法を有することが求められているのは、明らかである。
【０００４】
定義および略語
ＰＢＳ＝リン酸塩緩衝生理食塩水
ＦＢＳ＝ウシ胎仔血清
ＥＧＭ−ＭＶ＝内皮細胞増殖培地−微小血管
ＶＲＡＤ＝１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］−およびオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）補充分化培地
（ＶＲＡＤ）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、患者の腎前駆細胞を単離、精製および増幅するための方法であって、以下の操作順序：
腎臓病に罹患している患者から採取された尿のサンプルを第１の遠心分離に付すステップ；
上清を除去し、ペレットをＰＢＳに再懸濁するステップ；
第２の遠心分離に付すステップ；
上清を除去するステップ、および
細胞を細胞培養プレートに移し、ＥＧＭ−ＭＶと、２０％ＦＢＳと、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびリファンピシンを含む抗生物質の混合物とを含む培養培地中で増殖するステップ；
培養の５〜７日後、培養培地を除去し、培養プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで新鮮な前記培養培地を加えるステップ；
前記新鮮な培養培地中で少なくともさらに７〜９日間、次いでその後、腎臓前駆体に特徴的な表面マーカーＣＤ１３３およびＣＤ２４の発現を特徴とする細胞集団がコンフルエントになるまで増殖するステップ
を含む方法に関する。
【０００６】
本発明の方法により採取される細胞は、高度に精製される。細胞が採取される精製の程度は、当該技術分野において公知の方法で可能であったものより非常に高い。
【０００７】
形態学的特徴の解明から、本発明の方法により尿から単離された細胞は、腎臓組織から単離された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のそれらと形態学的に同一であり、したがって尿が、高度に精製された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の集団を簡単で迅速かつ効率的な非侵襲的方法で単離するための新しい原料であることが立証され得る。
【０００８】
腎障害の再生プロセスの根底にある機序を研究するためにこうした細胞を利用できると、可能な治療処置の新しいターゲットになり得る機序を理解する重要な見通しが立つ。
【０００９】
したがって本発明は、薬剤のスクリーニングのためのまたは腎臓病に関与している未知の突然変異の機能的役割の研究のための細胞モデルとして、将来の診断用に腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の使用を提案する。
【００１０】
本発明の目的はまた、糸球体あるいは尿細管の、より詳細には遺伝性の腎臓病に罹患している患者の尿から腎臓前駆体を、本発明の方法により単離することを含む診断方法である。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、前記疾患の処置のための薬剤のインビトロスクリーニングのための、または腎臓病に関与している未知の突然変異の機能的役割のインビトロ研究のための細胞モデルなど、本発明の方法により遺伝性の糸球体または尿細管疾患に罹患している患者の尿から単離された腎臓前駆体の使用である。
【００１２】
本発明の目的はまた、腎毒性の可能性がある薬剤の腎毒性に関する患者別の予測のための診断方法であって、腎毒性の可能性がある薬剤による処置を施す必要があるいずれかの疾患に罹患している患者の尿から、本発明の方法により腎臓前駆体を単離することを含む方法である。
【００１３】
本発明の目的はまた、本発明による方法による同時使用、別々の使用または経時的使用のためのキットのパーツ（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）であって、ＥＧＭ−ＭＶと、２０％ＦＢＳと、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびリファンピシンを含む抗生物質の混合物とを含む培養培地を含む少なくとも１つの容器を含むキットである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の方法を実施するために集めた尿サンプルの総数を示す。
【図２】腎前駆細胞ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の単離を可能にする本発明の方法のフローチャートを示す。
【図３】Ａ）本発明の方法により尿から単離された細胞の形態、およびフローサイトメトリー解析により立証された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋に特徴的な表面マーカー、たとえばＣＤ１３３、ＣＤ２４およびＣＤ１０６の発現を示す。Ｂ）本発明の方法により尿から単離され、共焦点顕微鏡により評価した細胞におけるマーカーＣＤ１３３、ＣＤ２４、サイトケラチン、ビメンチンおよびウロプラキンＩＩＩの発現を示す。Ｃ）本発明の方法により尿から単離された細胞と、腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋とのＧＰＣＲ、炎症性遺伝子およびｍｉＲＮＡの遺伝子発現プロファイルを示すボルケーノプロットを示す。
【図４】Ａ）３例の患者で同定された突然変異の略図例を示す：症例ＦＤ  ＮＰＨＳ２遺伝子の複合ヘテロ接合突然変異、症例ＣＬ  ＮＰＨＳ２遺伝子のホモ接合突然変異；症例ＢＣＷ  ＬＭＸ１Ｂ遺伝子のヘテロ接合突然変異。Ｂ）対照として使用した、糸球体疾患だが遺伝的突然変異を有さない（健康な）患者から採取された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のサンプル、および３例の患者から採取されポドサイトに分化後に変異した腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のサンプルのネフリンの発現を示す。Ｃ）３例の患者から採取されポドサイトに分化後に変異した腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のサンプルにおけるネフリンのｍＲＮＡレベルの評価、および遺伝的突然変異を有さない患者から採取された対照サンプル（ＷＴ）とのそれらの比較を示す。Ｄ）対照として使用した、遺伝的突然変異を有さない（健康な）患者から採取された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のサンプル、および３例の患者から採取されポドサイトに分化の後に変異した腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のサンプルのポドシン（ＮＰＨＳ２）の発現を示す。Ｅ）３例の患者から採取されポドサイトに分化後に変異した腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のサンプルにおけるポドシンのｍＲＮＡレベルの評価、および遺伝的突然変異を有さない患者から採取された対照サンプル（ＷＴ）とのそれらの比較を示す。Ｆ）３例のすべての患者を対象に共焦点顕微鏡で解析した、ファロイジン（緑）染色後の細胞骨格の評価を示す。Ｔｏ−ｐｒｏ−３．ｕ−ＲＰＣによる核の対比染色：尿由来の腎前駆細胞ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋。
【図５】Ａ）尿細管表現型に分化後の、尿から単離された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のサンプル（ｎ＝８）における尿細管特異的マーカーのｍＲＮＡレベルの評価を示す。Ｂ）尿細管表現型に分化前（０日目）および分化後（２１日目）の、尿から単離された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の培養物における尿細管マーカーの発現を示す。Ｔｏ−Ｐｒｏ−３による核の対比染色。バー２０μｍ。Ｃ）尿細管細胞に分化し、様々な用量のドキソルビシンに２４時間曝露した腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のサンプルの死細胞の割合の評価を、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色の細胞蛍光測定分析（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）解析により示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
好ましくは、本発明の方法の遠心分離は１２００〜１８００ｒｐｍで、一層好ましくは１４００〜１５００ｒｐｍで３〜１５分にわたる時間行われる。好ましくは、第１の遠心分離は１４００ｒｐｍで１０分間、第２の遠心分離は１４００ｒｐｍで５分間行ってもよい。
【００１６】
本発明による方法の培養培地は、ＥＧＭ−ＭＶ、２０％ＦＢＳおよび抗生物質の混合物を含む。抗生物質の前記混合物は、好ましくはペニシリン、ストレプトマイシンおよびリファンピシンからなる。一層好ましくは、前記混合物は１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび８ｍｃｇ／ｍＬのリファンピシンからなる。
【００１７】
培養から最初の６日後、培地を除去し、プレートを洗浄し、ＥＧＭ−ＭＶ、２０％ＦＢＳおよび抗生物質の混合物をやはり含む新鮮培地を加える。
【００１８】
第１の培養培地の除去および洗浄後、培養プレートから非接着細胞および培養片（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅｂｒｉｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）の除去を行う。
【００１９】
抗生物質混合物の存在下での培養の段階は、合計約１５日間行われる。
【００２０】
抗生物質製剤の存在下でのこの細胞培養の段階の終了時、（多くの場合、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）群に属する細菌の）細菌汚染のない選択された細胞培養物を採取する。
【００２１】
抗生物質の混合物の存在下での培養の１５日後、培養を抗生物質の非存在下で維持することができる。
【００２２】
培養の次の段階は、腎臓前駆体が驚くほど高純度で既に選択されており、前記細胞の増幅培養となる。
【００２３】
本発明の方法により単離された腎前駆細胞は好ましくは、尿路上皮に特徴的なマーカー、ウロプラキンＩＩＩの発現の非存在を示し、したがって、尿から単離された細胞が腎臓由来であることが立証される。これらは好ましくは、ＣＤ１０６をさらに、一層好ましくはマーカーサイトケラチンおよびビメンチンをさらに発現する。
【００２４】
したがって本発明の目的はまた、個々の患者ごとにその疾患（およびその患者）に特異的な腎臓前駆体の群を、完全に非侵襲的方法により採取することを初めて可能にする本方法により採取された細胞である。
【００２５】
本発明の考えられる臨床応用は、腎臓病、さらに遺伝性腎臓病に罹患している患者、好ましくは小児患者、たとえばポドシン遺伝子（ＮＰＨＳ２）、および多くのポドサイト遺伝子の発現を調節する転写因子であるＬＭＸ１Ｂ遺伝子の突然変異に関連するステロイド抵抗性ネフローゼ症候群の小児の尿サンプルからの腎臓前駆体ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋の単離に基づく。
【００２６】
腎臓病、特に遺伝性疾患、たとえばステロイド抵抗性ネフローゼ症候群の患者の尿からの腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の単離により、腎臓病の根底にある既知および未知の突然変異の作用に関するインビトロ研究のための細胞モデルを得ることが最終的に可能になる（図４）。これにより、突然変異が未知であっても、こうした細胞を疾患のモデルとして臨床現場で使用して遺伝性疾患の原因診断が可能になる。
【００２７】
好ましくは、本発明の方法は、遺伝的突然変異に関連するステロイド抵抗性ネフローゼ症候群に罹患している患者由来の尿サンプルに適用することができる。一層好ましくは、前記患者は小児である。
【００２８】
好ましくは、本発明の方法は、化学療法処置を必要とする腫瘍性疾患に罹患している患者由来の尿サンプルに適用することができる。一層好ましくは、前記患者は小児である。
【００２９】
次いで、上記のように本発明の方法により採取された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋は、ポドサイト表現型に分化することができる。分化は、腎前駆細胞ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋を、ビタミンＤ３およびレチノイン酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる分化培地（ＶＲＡＤ）で約４８時間増殖させることにより行うことができる。
【００３０】
化学療法処置後の腎毒性は、予測するのが難しい一般的な現象であり、腎尿細管細胞を薬剤の有害作用に対して感受性にする患者特異的遺伝因子に主に影響される。腎臓前駆体は尿細管細胞に分化することができ、かつ腎毒性薬剤の作用に対する感受性は、薬剤スクリーニングの個別モデルを必要とすると考えられる遺伝的に決定された現象であるため、腎毒性の可能性がある薬剤を用いた処置を施される患者から精製された腎臓前駆体の培養物は、患者別の機能アッセイを行うための革新的な細胞モデルであり得ると本発明者らは考える。
【００３１】
したがって、上記のように本発明の方法により採取された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋は、尿細管表現型に分化することができる。こうした分化は、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を補充した分化培地ＲＥＧＭを約３週間使用することにより達成される。腎臓前駆体が尿細管表現型に分化すると、尿細管の様々な部分に特徴的な一連のマーカー、たとえばチャネルＮａ／Ｈ交換輸送体（Ｎａ／Ｈ）、アクアポリン３（ＡＱ３）、Ｎａ／Ｋ／Ｃｌ輸送体（Ｎａ／Ｋ／Ｃｌ）およびアミノ酸輸送体（ＳＬＣ３Ａ１）のｍＲＮＡレベルの発現が増加する（図５Ａ）。さらに、尿細管に分化した腎臓前駆体は、タンパク質レベルでそれぞれ近位および遠位曲尿細管に特徴的なｌｅｃｔｉｎａＴｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（ＬＴＡ）への結合、および尿細管マーカー上皮膜抗原−１（ＥＭＡ−１）の発現という性質を獲得する（図５Ｂ）。
【００３２】
分化を確認後、細胞モデルがクリニックで観察される薬剤の有害作用を完全に模倣できることを立証するため、尿細管細胞を腎毒性の可能性がある薬剤、たとえば、ドキソルビシンに用量を増やしながら曝露する。薬剤の毒性は、腎毒性の可能性がある化合物への曝露から２４時間後に、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いたフローサイトメトリーによって死細胞の割合を評価することにより決定される（図５Ｃ）。したがって腎臓前駆体の培養物は、薬剤処置のタイプおよび投与量に対する個々の患者の感受性に焦点を当てた細胞毒性の可能性を予測するインビトロ細胞モデルとして使用してもよい。上記の方法により、患者に使用される化学療法薬剤のより慎重な選択が可能となり、所望の治療効果を決定するため適切な投与量を判定し、腎臓に対する毒性の長期的副作用を抑えることも可能になる。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法における同時使用、別々の使用または経時的使用のためのキットのパーツであって、ＥＧＭ−ＭＶと、２０％ＦＢＳと、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびリファンピシンを含む抗生物質の混合物とを含む培養培地を含む少なくとも１つの容器を含むキットである。
【００３４】
前記キットにおいて、好ましくは、培養培地は、ＥＧＭ−ＭＶと、２０％ＦＢＳと、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびリファンピシンからなる抗生物質の混合物からなる。一層好ましくは、抗生物質の前記混合物は１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび８ｍｃｇ／ｍＬのリファンピシンからなる。
【００３５】
前記キットは好ましくは、抗ＣＤ１３３抗体を含む少なくとも１つの容器、および抗ＣＤ２４抗体を含む少なくとも１つの容器、および任意に抗ＣＤ１０６抗体を含む少なくとも１つの容器をさらに含む。本発明によるキットは好ましくは、ポドサイト表現型への分化のためビタミンＤ３およびレチノイン酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる分化培地（ＶＲＡＤ）を含む少なくとも１つの容器、または尿細管表現型への分化のためＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を補充した分化培地ＲＥＧＭの少なくとも１つの容器をさらに含む。
【００３６】
本発明は、以下の実施形態によって理解が深まるであろう。
【実施例】
【００３７】
実施例１−尿サンプル
０〜１７歳の様々な糸球体疾患に罹患している４７例の小児科患者から合計７９の尿サンプルを集めた。対照として、１〜１３歳の健康な小児から尿を集めた（図１の表１）。
【００３８】
実施例２−腎臓前駆体の単離、精製および増幅
尿サンプルを１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したら、それらを１×ＰＢＳ中、１５００ｒｐｍで５分間第２の遠心機にかけた（図２のフローチャートを参照）。最後に、上清を除去後、細胞をＥＧＭ−ＭＶ  ２０％ＦＢＳに再懸濁した。尿中の細胞の大部分は培養プレートに付着せず、培養の６日後の培地の交換時に除去された。プレーティング後、ごく一部の細胞がコンパクトで均一なクラスターを形成する。細菌汚染はこの種のサンプルで多く見られる現象であるため、得られたすべての培養物について、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の存在をＰＣＲで評価した。続いて、ＰＣＲ産物をシーケンシングに供し、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列をＧｅｎＢａｎｋにあるそれと比較すると、腸球菌の群に属する細菌と９５％の相同性を示した。ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍＬ）およびリファンピシン（８μｇ／ｍＬ）からなる抗生物質の特定の混合物を、得られたすべての培養物に加え、処理の２週後に細菌のリボソームＲＮＡの存在についてさらなる解析を繰り返した。この期間の終了時に、細胞に細菌汚染がない場合、抗生物質を除去した。この処理を、図２に示すように尿サンプルから細胞培養物を調製するための本発明による標準化プロトコルに含めた。この尿からの細胞の単離方法により、高い効率および再現性（患者４７例のうち患者１８例、３８．３％）で初代培養物を得ることが可能になり、特に細胞培養物を無限に増殖させ得る指数増殖速度の細胞培養物を１３例の患者から採取した。表１に示すように、対照患者では細胞培養物が得られなかった（図１）。
【００３９】
実施例３−尿から単離された腎臓前駆体の特徴の解明
本発明の方法により尿から単離された細胞は、腎臓組織から単離された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の形態に類似した形態を示し（図３Ａ）、腎臓前駆体に特徴的な表面マーカー、たとえばＣＤ１３３、ＣＤ２４およびＣＤ１０６を、フローサイトメトリー解析後に立証されたように、通常９０％より高いパーセンテージの高い強度で発現する（図３Ａ）。これらの結果から、本発明による単離方法により、極めて均一な腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋の集団を高純度で採取することができることが示される。さらに、共焦点顕微鏡解析後、尿から単離された細胞は、マーカーサイトケラチンおよびビメンチンの発現が均一であることも示した一方（図３Ｂ）、尿路上皮に特徴的なマーカーウロプラキンＩＩＩを発現しないことから、したがって、尿から単離された細胞の腎臓由来が立証された（図３Ｂ）。さらに、細胞について、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）（３８０遺伝子）、炎症に特徴的な遺伝子（９２遺伝子）およびマイクロＲＮＡ（１６８遺伝子）のその遺伝子発現プロファイルを評価し、本発明の方法により尿から単離された細胞の遺伝子プロファイルは、図３Ｃに示すように腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋のそれと有意差がないことが明らかになり、したがってそれは同じ集団である。
【００４０】
実施例４−尿から単離された腎臓前駆体のポドサイトへの分化と、ポドシン遺伝子（ＮＰＨＳ２）およびＬＭＸ１Ｂ遺伝子の突然変異の機能的役割の研究
患者１（症例ＦＤ）は、一方の対立遺伝子の既知のミスセンス変異、およびコード配列のフレームシフトを引き起こす、他方の対立遺伝子の未知の突然変異からなるＮＰＨＳ２遺伝子の複合ヘテロ接合突然変異（ＮＰＨＳ２  ｃ．［４１３Ｇ＞Ａ］＋［４６７＿４６８ｉｎｓＴ］）を有した。この後者の突然変異により、Ｃ末端部の切断型ポドシンの翻訳につながるＳＴＯＰコドンが出現する。患者２（症例ＣＬ）は、Ｃ末端部の切断型タンパク質の翻訳につながるＳＴＯＰコドンの出現を決定するコード配列のフレームシフトを決定することができるＮＰＨＳ２遺伝子の既知のホモ接合突然変異（ＮＰＨＳ２  ｃ．［４１９ｄｅｌＧ］＋［４１９ｄｅｌＧ］）を有した。患者３（症例ＢＣＷ）は、ＬＭＸ１Ｂ遺伝子の未知のヘテロ接合ミスセンス変異（ＬＭＸ１Ｂ  ｃ．［８３３Ｃ＞Ｔ］＋［＝］）を有した（図４Ａ）。ポドサイトのこれらの突然変異の機能的役割を研究するため、本発明の方法により３例の患者の尿から採取した腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋をポドサイトに分化させ、その後分化後のネフリンおよびポドシンタンパク質の発現の獲得について評価した。腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋をポドサイト表現型に分化させるため、細胞を、ビタミンＤ３およびレチノイン酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる分化培地（ＶＲＡＤ）で４８時間培養した。３例のすべての患者において、ネフリンおよびポドシンの発現を評価した（図４Ｂ、Ｄ）。ネフリンは通常レベルで発現した一方、ポドシンの発現は、遺伝的突然変異を有さない小児科患者から採取され、ポドサイトに分化した腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋で観察された発現に比較して、ＮＰＨＳ２遺伝子の突然変異を有する患者で大きく減少するか、またはＬＭＸ１Ｂ遺伝子の突然変異を有する患者で若干減少した（図４Ｂ、Ｄ）。タンパク質の発現で観察されたものとは異なり、ＮＰＨＳ２およびＬＭＸ１Ｂ遺伝子の突然変異を有する３例の患者では、遺伝的突然変異を有さない小児科患者から採取された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋と比較して、ネフリンおよびポドシンのｍＲＮＡレベルの統計学的に有意な差は認められなかった（図４Ｃ、Ｅ）。細胞骨格線維の適切な構造の維持においてポドシンおよびＬＭＸ１Ｂが果たす重要な役割を考慮して、ポドシン発現の減少によりポドサイトの細胞骨格アーキテクチャが変化し得るかどうかを評価した。３例のすべての患者において、ファロイジン染色により評価した細胞骨格の解析により、細胞骨格のアクチンフィラメントの適切な構造がひどく障害され、アクチンフィラメントの数が大きく減少することが示されたことから、ポドシンおよび転写因子ＬＭＸ１Ｂがポドサイトの細胞骨格の適切なアーキテクチャの維持において果たす重要な役割が立証された（図４Ｆ）。
【００４１】
実施例５−尿から単離された腎臓前駆体の尿細管への分化、およびそれに関する化学療法薬の毒性の研究
上記のように本発明の方法により採取された腎臓前駆体ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋は、その後尿細管表現型に分化することができる。特に、尿は、腎毒性の可能性がある薬剤を用いた治療を行わなければならない患者から集め、腎臓前駆体を単離する。患者別の腎臓前駆体の培養物は、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を補充した分化培地ＲＥＧＭで腎臓前駆体を約３週間維持することにより尿細管細胞に分化する。腎臓前駆体は尿細管表現型に分化すると、分化した尿細管細胞のマーカーを獲得する（図５Ａ、Ｂ）。分化を確認後、細胞モデルがクリニックで観察される薬剤の有害作用を完全に模倣できることを立証するため、尿細管細胞を腎毒性の可能性がある薬剤、たとえば、ドキソルビシンに用量を増やしながら曝露する。薬剤の毒性は、腎毒性の可能性がある化合物への曝露から２４時間後に、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いたフローサイトメトリーによって死細胞の割合を評価することにより決定される（図５Ｃ）。したがって腎臓前駆体の培養物は、薬剤処置のタイプおよび投与量に対する個々の患者の感受性に焦点を当てた細胞毒性の可能性を予測するモデルとして使用してもよい。上記の方法により、患者に使用される腎毒性の可能性がある薬剤のより慎重な選択が可能となり、所望の治療効果を決定するため適切な投与量を判定し、腎臓に対する毒性の長期的副作用を抑えることも可能になる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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