(57)【要約】  本発明は、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体、特に、モノクローナル抗体、ならびに前記体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。１つの態様から、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒと結合でき、かつ、ＩＧＦ−１Ｒの内部移行を誘導することによって細胞に内部移行され得る抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、毒素、放射性要素または薬物などの他の抗癌化合物とコンジュゲートしたアドレッシング製品またはビヒクルとしての前記抗体の使用、およびある種の癌の処置のためのそれらの使用を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントを選択するための方法であって、
ｉ）配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、
ｉｉ）配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと、配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外、または４９１番のアスパラギン酸以外のアミノ酸で結合しない
抗体を選択することを含んでなる、方法。
【請求項２】
抗体が配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと、配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸および４９１番のアスパラギン酸以外のアミノ酸で結合しない、請求項１に記載の内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントを選択するための方法。
【請求項３】
内部移行抗体、またはそのＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントを選択することをさらに含んでなり、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合後の内部移行のパーセンテージが少なくとも４０％である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法により得られるような、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合する内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号５２のヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行され、かつ、配列番号８２および／または配列番号９２のＩＧＦ−１Ｒと結合しない、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項６】
前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９４番のヒスチジンアミノ酸および／または配列番号５２の４９１番のアスパラギン酸アミノ酸を含んでなる、請求項５に記載の内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項７】
前記エピトープが少なくとも８アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなる、請求項６に記載の内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項８】
そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後の内部移行のパーセンテージが少なくとも４０％である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項９】
前記配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸がアルギニンであり、かつ／または前記配列番号５２の４９１番のアスパラギン酸以外のアミノ酸がアラニンである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項１０】
６つのＣＤＲを含んでなり、前記ＣＤＲのうち少なくとも１つが、配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３および配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２からなる群において選択される、請求項４〜９のいずれか一項に記載の内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項１１】
６つのＣＤＲを含んでなり、前記ＣＤＲのうち３つが配列番号２のＣＤＲ−Ｈ２、配列番号３のＣＤＲ−Ｈ３および配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２である、請求項１０に記載の内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項１２】
配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項１３】
モノクローナル抗体、組換えモノクローナル抗体、またはそのＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントからなる、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の内部移行抗体、またはそのＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント。
【請求項１４】
ａ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｄ）配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の内部移行抗体。
【請求項１５】
キメラ抗体からなる、請求項１４に記載の内部移行抗体。
【請求項１６】
ａ）配列番号１３の配列または配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号１５の配列または配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号１６の配列または配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される、請求項１５に記載の内部移行抗体。
【請求項１７】
ａ）配列番号１８の配列または配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号２０の配列または配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号２２の配列または配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される、請求項１５に記載の内部移行抗体。
【請求項１８】
ａ）配列番号２３の配列または配列番号２３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号２８の配列または配列番号２８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｂ）配列番号２４の配列または配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号２９の配列または配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｃ）配列番号２５の配列または配列番号２５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３０の配列または配列番号３０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｄ）配列番号２６の配列または配列番号２６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３１の配列の軽鎖または配列番号３１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列とを含んでなる、またはからなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号２７の配列または配列番号２７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３２の配列または配列番号３２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体
から選択される、請求項１５に記載の内部移行抗体。
【請求項１９】
ヒト化抗体からなる、請求項１４に記載の内部移行抗体。
【請求項２０】
ａ）それぞれ配列番号７、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号４４）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４６）に由来するＦＲ４とを有する重鎖と、
ｂ）それぞれ配列番号９、５および１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号４５）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号４７）に由来するＦＲ４とを有する軽鎖
とを含んでなる、請求項１９に記載の内部移行抗体。
【請求項２１】
ａ）配列番号３３の配列または配列番号３３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３４の配列または配列番号３４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される、請求項２０に記載の内部移行抗体。
【請求項２２】
ａ）配列番号３５の配列または配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３６の配列または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５７および６０から選択される配列または配列番号５７または６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される、請求項２０に記載の内部移行抗体。
【請求項２３】
ａ）配列番号３７の配列または配列番号３７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３９の配列または配列番号３９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３８の配列または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列、または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号５７および６０から選択される配列またはと配列番号５７もしくは６０少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される、請求項２０に記載の内部移行抗体。
【請求項２４】
ａ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、前記配列番号３３の配列は残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２および９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる重鎖可変ドメイン；ならびに
ｂ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、前記配列番号３５の配列は残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７および８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる軽鎖可変ドメイン
を含んでなる、請求項２０に記載の内部移行抗体。
【請求項２５】
ｉ）それぞれ、２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日に、ＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６またはＩ−４７７４により産生された抗体；
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープと結合する抗体
から選択される、請求項４〜２４のいずれか一項に記載の内部移行抗体。
【請求項２６】
それぞれ、２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日に、ＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６またはＩ−４７７４から選択される、マウスハイブリドーマ。
【請求項２７】
宿主標的部位に細胞傷害性薬剤を送達するためのアドレッシングビヒクルとして使用するための、前記宿主標的部位がタンパク質ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン、好ましくは、ヒトタンパク質ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（配列番号５１）、より好ましくは、ヒトタンパク質ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインＮ末端（配列番号５２）、またはその任意の変異体配列に局在するエピトープからなる、請求項４〜２５のいずれか一項に記載の内部移行抗体、またはその内部移行抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされた請求項４〜２５のいずれか一項に記載の内部移行抗体、またはその内部移行抗原結合フラグメントを含んでなる、抗体−薬物複合体。
【請求項２９】
薬剤として使用するための、請求項２８に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項３０】
癌の処置のための、請求項２９に記載の使用のための抗体−薬物複合体。
【請求項３１】
ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のための、請求項２９に記載の使用のための抗体−薬物複合体。
【請求項３２】
請求項４〜２５のいずれか一項に記載の内部移行抗体、または請求項２８に記載の抗体−薬物複合体と、少なくとも賦形剤および／または薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項３３】
癌の処置において使用するための、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置において使用するための、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ＩＧＦ−１Ｒ発現癌を処置するための請求項２８に記載の抗体−薬物複合体の、使用。
【請求項３６】
対象においてＩＧＦ−１Ｒ発現癌を処置するための方法であって、前記対象に有効量の少なくとも請求項２８に記載の抗体−薬物複合体または請求項３２に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項３７】
対象のＩＧＦ−１Ｒ発現癌細胞に薬物または薬剤を送達する方法であって、前記対象に有効量の少なくとも請求項２８に記載の抗体−薬物複合体または請求項３２に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る新規な抗体、特に、モノクローナル抗体、ならびに前記抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。１つの態様から、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒと結合でき、かつ、ＩＧＦ−１Ｒの内部移行を誘導することによって細胞に内部移行され得る新規な抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、毒素、放射性要素または薬物などの他の抗癌化合物とコンジュゲートしたアドレッシング製品またはビヒクルとしての前記抗体の使用、およびある種の癌の処置のためのそれらの使用を含んでなる。
【０００２】
ＩＧＦ−ＩＲと呼ばれる（ＩＧＦ１ＲまたはＩＧＦ−ＩＲとも呼ばれる）インスリン様成長因子Ｉ受容体は、チロシンキナーゼ活性を有し、インスリン受容体ＩＲと７０％の相同性を有する受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは、分子量が約３５０，０００の糖タンパク質である。これは、ヘテロ四量体の受容体であり、その半分はそれぞれジスルフィド架橋によって連結しており、細胞外α−サブユニットおよび膜貫通β−サブユニットからなる。ＩＧＦ−ＩＲは、極めて高い親和性（Ｋｄ＃１ｎＭ）でＩＧＦ１およびＩＧＦ２と結合するが、同様にインスリンとも１００分の１〜１０００分の１の親和性で結合し得る。逆に、ＩＧＦは１００分の１の親和性でしかインスリン受容体と結合しないが、ＩＲは極めて高い親和性でインスリンと結合する。α−サブユニット上に存在するシステインに富む領域とβ−サブユニットのＣ末端部分にそれぞれ相同性の低い区域があるが、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼドメインとＩＲのチロシンキナーゼドメインとは極めて高い配列相同性を有している。α−サブユニットに見られる配列の差異はリガンドの結合区域に存在するため、それはＩＧＦとインスリンのそれぞれに対するＩＧＦ−ＩＲとＩＲの相対的親和性の基となっている。β−サブユニットのＣ末端部分における差異は、２つの受容体のシグナル伝達経路における相違をもたらし、ＩＧＦ−ＩＲは細胞分裂促進特性、分化作用および抗アポトーシス作用を媒介し、一方、ＩＲの活性化は主として代謝経路のレベルでの作用に関与する。
【０００３】
細胞質チロシンキナーゼタンパク質は、リガンドが受容体の細胞外ドメインに結合することによって活性化される。キナーゼの活性化は、次に、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＳｈｃおよびＧｒｂ１０を含む種々の細胞内基質の刺激に関与する。ＩＧＦ−ＩＲの２つの主要な基質はＩＲＳおよびＳｈｃであり、これらは下流で多くのエフェクターの活性化によって、ＩＧＦのこの受容体への結合に関連した成長および分化作用の大部分を媒介する。従って、基質の利用度がＩＧＦ−ＩＲの活性化に関連した最終的な生物学的作用を決定し得る。ＩＲＳ−１が優勢である場合には、細胞は増殖し形質転換する傾向にある。Ｓｈｃが優勢である場合には、細胞は分化する傾向にある。アポトーシスに対する保護作用に主として関与する経路は、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）経路であると思われる。
【０００４】
発癌におけるＩＧＦ系の役割は、ここ１０年で集中的な研究の対象となってきている。この関心は、ＩＧＦ−ＩＲが、その細胞分裂促進性および抗アポトーシス性に加えて、形質転換された表現型の確立と維持に必要であると思われるという事実の発見に従ったものである。実際に、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現または構成的活性化が、多様な細胞において、ウシ胎仔血清を含まない培地で補助に依存することなく細胞を成長させ、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成させるということが十分に確認されている。成長因子の多数の受容体を含む、過剰発現した遺伝子の多様な産物が細胞を形質転換し得ることから、このこと自体は固有の特性ではない。しかしながら、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換において果たす主要な役割を明らかに立証した重要な発見は、ＩＧＦ−ＩＲをコードする遺伝子が不活性化されたＩＧＦ−ＩＲ−細胞が、ウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質などの、通常は細胞を形質転換することができる様々な物質、ＥＧＦＲまたはＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ４０のＴ抗原、活性化したｒａｓ、又はこれら最後の２つの因子の組合せなどによる形質転換に全く不応であるということを立証している。
【０００５】
ＩＧＦ−ＩＲは、多様な腫瘍および腫瘍株において発現し、ＩＧＦは、ＩＧＦ−ＩＲへの結合を介して腫瘍成長を増幅する。ＩＧＦ−ＩＲの発癌における役割を支持するその他の論拠は、受容体に対するマウスモノクローナル抗体を用いた、またはＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブを用いた研究から得られる。実際には、ＩＧＦ−ＩＲに対するマウスモノクローナル抗体は、多くの細胞株の培養増殖およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の成長を阻害する。同様に、ＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブが腫瘍増殖を阻害することができるということが示されている。
【０００６】
このような文脈で、ＩＧＦ−１Ｒは長年、腫瘍学において興味深い標的と考えられてきた。癌治療用のＩＧＦ−１Ｒ抗体を開発するためにＩＧＦ−１Ｒ（ヒト化またはヒト抗体または小分子）を標的とする多数のプロジェクトが開始され、様々な適応において７０を越える臨床試験が実施されてきた。しかしながら、現今において、これらのプロジェクトで成功に至ったものは無く、幅広い適応系において多くの患者に関して記載されているこの標的の頻繁な過剰発現にもかかわらず、上市しているＩＧＦ−１Ｒ抗体は無い。
【０００７】
さらに、これらの抗体にＫＲＡＳ突然変異患者を治療できたものは無かったのでＥＧＦＲとＩＧＦ−１Ｒの両方を標的とするために抗ＥＧＦＲ抗体と組み合わせた抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に関する一連の臨床試験は成功を見ていない。
【０００８】
結果として、ＩＧＦ−１Ｒは今や主要な標的とは見なされず、潜在的治療抗体の研究では、ＩＧＦ−１Ｒはもはや特に注目されるものとは考えられていないと思われる。
【０００９】
しかしながらやはり、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を作製するための努力は、裸の抗体、すなわち、それらの固有の特性により有用な抗体に焦点が当てられたことにも留意しなければならない。この意味で、ＩＧＦ−１Ｒは、ＩＧＦ−１Ｒは血管を含む正常な細胞によっても広く発現される標的として記載されているので、抗体−薬物複合体（「ＡＤＣ」と呼称）などのＡＤＣの作出には好適とは言えない標的と考えられる。この意味で、より最近のＩＧＦ−１Ｒ抗体、すなわち、ＡＶＥ１６４２は、薬物アームを持たない裸の抗体として開発されていることに着目できる。それは現在開発中の他のＩＧＦ−１Ｒ抗体と、また、臨床試験で成功を見なかった総てのものと同じである。
【発明の概要】
【００１０】
１つの態様において、本発明は、これらの問題を軽減する傾向にあり、それが薬物アームとして使用されるに好適となるような特定の様式でＩＧＦ−１Ｒと結合し得るＩＧＦ−１Ｒ抗体を記載している。より詳しくは、本発明は、それが免疫複合体に関してアームとして使用するための完全な候補となるような特定の特性を呈するＩＧＦ−１Ｒ抗体に関する。
【００１１】
第１の実施形態では、本発明は、ｉ）ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、ｉｉ）その前記ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合後に内部移行される、抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【発明の具体的説明】
【００１２】
用語「抗体」、「抗体（複数）」、「ａｂ」、「Ａｂ」、または「免疫グロブリン」は、最も広義で互換的に使用され、それらが所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、単離された、操作された、化学的に合成されたまたは組換え型の抗体（例えば、全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびまた抗体フラグメントが含まれる。１つの実施形態では、本発明は、組換え抗体に関する。
【００１３】
より詳しくは、このような分子は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含んでなる糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本発明ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域とを含んでなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本発明ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域とを含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００１４】
本発明による抗体の「ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメント」または「抗原結合フラグメント」とは、抗体の標的（一般には抗原とも呼ばれる）と結合する能力を保持するいずれのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も示すものとする。
【００１５】
１つの実施形態では、このような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディ、またはポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化フラグメント）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコール）などのポリ（アルキレン）グリコールの添加などの化学修飾により、または本発明による抗体の特徴的ＣＤＲのうち少なくとも１つを有する前記フラグメントをリポソーム内に組み込むことによりその半減期が延長されている任意のフラグメントからなる群において選択される。好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列から構成されるか、または含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および標的に対して十分な、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。より好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖の３つのＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と可変軽鎖の３つのＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から少なくとも構成される、または含んでなる。
【００１６】
「結合」、または「結合する」などとは、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定な、抗原との複合体を形成することが意図される。特異的結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とし得る。２分子が結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、および表面プラズモン共鳴などが挙げられる。疑念を避けるため、それは前記抗体が別の抗原と、低レベルで結合または干渉できないことを意味するものではない。しかしながら、１つの実施形態として、前記抗体は前記抗原のみと結合する。
【００１７】
本明細書において使用する場合、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」という表現は、「抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体」と同様に解釈されるべきであり、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体を意味する。
【００１８】
本出願の１つの実施形態では、抗体のエピトープは、ヒトＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメイン（ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤとも呼ばれる）に位置する。
【００１９】
特定の実施形態では、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、１０×１０−１０〜１×１０−１０の間、より優先的には８×１０−１０〜２×１０−１０Ｍの間に含まれるＥＣ５０でＩＧＦ−１Ｒと結合し得る。
【００２０】
この意味で、「ＥＣ５０」は、５０％有効濃度を意味する。用語５０％有効濃度（ＥＣ５０）は、ベースラインと明示されたある暴露時間後の最大値の半分の応答を誘導する薬物、抗体または毒物の濃度に相当する。それは薬物の効力の尺度として慣用されている。従って、漸増用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が見られる化合物の濃度を表す。素量的用量反応曲線のＥＣ５０は、明示された暴露期間の後に集団の５０％が応答を示す化合物の濃度を表す。濃度尺度は一般に、比較的小さな濃度変化で急激に増加するシグモイド曲線を描く。これはベストフィットラインの導出により数学的に決定できる。
【００２１】
好ましい実施形態として、本発明で決定されたＥＣ５０は、ヒト腫瘍細胞上に露出しているＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤに結合する抗体の効力を特徴付ける。ＥＣ５０パラメーターは、ＦＡＣＳ分析を用いて決定される。ＥＣ５０パラメーターは、ヒト腫瘍細胞上で発現されるヒトＩＧＦ−１Ｒ上で最大結合の５０％が得られる抗体濃度を表す。各ＥＣ５０値は、４パラメーター回帰曲線フィッティングプログラム（Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量反応曲線の中点として計算された。このパラメーターは生理学的／病理学的状態を代表するように選択された。
【００２２】
用語「エピトープ」は、抗体を含む抗原結合タンパク質により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的または機能的として定義され得る。機能的エピトープは一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまたコンフォメーション的でもあり得、すなわち、非直鎖アミノ酸から構成され、言い換えれば、コンフォメーションエピトープは不連続のアミノ酸から構成される。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群である決定基を含み得、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴、および／または特定の変化特徴を有し得る。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明は、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントを選択するための方法であって、
ｉ）配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、
ｉｉ）配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと、配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸で、または４９１番のアスパラギン酸（ＡＳＰ）で結合しない、好ましくは、配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと、配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸で、かつ、４９１番のアスパラギン酸（ＡＳＰ）で結合しない
抗体を選択することを含んでなる方法に関する。
【００２４】
より詳しい実施形態では、本発明は、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントを選択するための方法であって、
１）ｉ）配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、
ｉｉ）配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと、配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸で、または４９１番のアスパラギン酸（ＡＳＰ）で結合しない、好ましくは、配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと、配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸で、かつ、４９１番のアスパラギン酸（ＡＳＰ）で結合しない
抗体を選択すること、および次にこのような抗体から
２）そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後の内部移行のパーセンテージが少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％である内部移行抗体、またはそのＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントを選択すること
を含んでなる方法に関する。
【００２５】
別の特定の実施形態では、本発明はヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行される内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントを選択するための方法であって、
１）そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後の内部移行のパーセンテージが少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％である内部移行抗体、またはそのＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントを選択すること、
２）および次にこのような抗体から
ｉ）配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと結合し、かつ、
ｉｉ）配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと、配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸で、または４９１番のアスパラギン酸（ＡＳＰ）で結合しない、好ましくは、配列番号５２のＩＧＦ−１Ｒと、配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸で、かつ、４９１番のアスパラギン酸（ＡＳＰ）で結合しない
抗体を選択すること
を含んでなる方法に関する。
【００２６】
本発明による方法では、その内部移行およびＩＧＦ−１Ｒと結合するかまたはしないという特徴について抗体を選択する工程はいずれの順序で行ってもよい。
【００２７】
特定の実施形態によれば、本発明は、上記に挙げられた本発明による方法により得られるものなどの、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合する内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００２８】
別の特定の実施形態では、本発明は、配列番号５２のヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合し、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行され、かつ、配列番号８２または９２、好ましくは、配列番号８２および９２のＩＧＦ−１Ｒと結合しない内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００２９】
本発明による抗体では、配列番号５２は、４９４番にヒスチジンが存在するヒトＩＧＦ−１Ｒ受容体、すなわち、野生型ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸配列に相当し、配列番号８２は、４９４番にアルギニンが存在するヒトＩＧＦ−１Ｒ受容体の突然変異アミノ酸配列に相当し、配列番号９２は、４９１番にアラニンが存在するヒトＩＧＦ−１Ｒ受容体の突然変異アミノ酸配列に相当する。
【００３０】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９４番にヒスチジンアミノ酸を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３１】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９４番にヒスチジンアミノ酸を含んでなり、前記エピトープが少なくとも８アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３２】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９１番にアスパラギン酸アミノ酸を含んでなり、前記エピトープが少なくとも８アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３３】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９４番にヒスチジンアミノ酸を、４９１番にアスパラギン酸アミノ酸を含んでなり、前記エピトープが少なくとも８アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３４】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９４番にヒスチジンアミノ酸を含んでなり、前記エピトープが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３５】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９４番にヒスチジンアミノ酸を含んでなり、前記エピトープが少なくとも８アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなり、前記エピトープが、
・配列番号５２の４８７番のアミノ酸〜４９４番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８８番のアミノ酸〜４９５番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８９番のアミノ酸〜４９６番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４９０番のアミノ酸〜４９７番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４９１番のアミノ酸〜４９８番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４９２番のアミノ酸〜４９９番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４９３番のアミノ酸〜５００番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列
からなる群において選択されるアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３６】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９１番にアスパラギン酸アミノ酸を含んでなり、前記エピトープが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３７】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９１番にアスパラギン酸アミノ酸を含んでなり、前記エピトープが少なくとも８アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなり、前記エピトープが、
・配列番号５２の４８４番のアミノ酸〜４９１番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８５番のアミノ酸〜４９２番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８６番のアミノ酸〜４９３番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８７番のアミノ酸〜４９４番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８８番のアミノ酸〜４９５番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８９番のアミノ酸〜４９６番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示アミノ酸配列、
・配列番号５２の４９０番のアミノ酸〜４９７番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列
からなる群において選択されるアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３８】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９４番にヒスチジンアミノ酸を、４９１番にアスパラギン酸を含んでなり、前記エピトープが９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００３９】
より詳しい実施形態では、本発明は、前記内部移行抗体のエピトープが配列番号５２の４９４番にヒスチジンアミノ酸を、４９１番にアスパラギン酸を含んでなり、前記エピトープが少なくとも８アミノ酸のアミノ酸配列を含んでなり、前記エピトープが、
・配列番号５２の４８７番のアミノ酸〜４９４番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８８番のアミノ酸〜４９５番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４８９番のアミノ酸〜４９６番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、
・配列番号５２の４９０番のアミノ酸〜４９７番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列、および
・配列番号５２の４９１番のアミノ酸〜４９８番のアミノ酸のアミノ酸配列と同一の、または少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列
からなる群において選択されるアミノ酸配列を含んでなる、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００４０】
別の特定の実施形態では、本発明は、配列番号５２のヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合し、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後に内部移行され、かつ、配列番号８２のＩＧＦ−１Ｒと結合しない、または前記内部移行抗体のエピトープが、配列番号５２の４９４番にヒスチジンアミノ酸を、および／または４９１番にアスパラギン酸アミノ酸を含んでなり、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合の後の前記抗体の内部移行のパーセンテージが少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％である、内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。抗体、またはその抗原結合フラグメントの内部移行のパーセンテージは、例えば本明細書に記載の方法などの当業者に公知のいずれかの方法によって決定可能である。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明は、前記の配列番号５２の４９４番のヒスチジン以外のアミノ酸がアルギニンである（配列番号８２）、本発明による内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明は、前記の配列番号５２の４９１番のアスパラギン酸以外のアミノがアラニンである（配列番号９２）、本発明による内部移行抗体、またはその内部移行ＩＧＦ−１Ｒ結合フラグメントに関する。
【００４３】
１つの実施形態によれば、本発明は、ヒトインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）と結合し、かつ、そのＩＧＦ−１Ｒとの結合後に内部移行され、前記抗体が、
ｉ）配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；および
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープと結合する抗体
から選択される、抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００４４】
ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関する競合は、限定されるものではないが、放射能、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどの当業者に公知のいずれかの方法もしくは技術によって、または本明細書に記載されるものなどの方法に従って決定可能である。
【００４５】
同じエピトープへの結合の決定は、限定されるものではないが、放射能、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどの当業者に公知のいずれかの方法もしくは技術によって、または本明細書に記載されるものなどの方法に従って決定可能である。
【００４６】
上述のように、一般的知識に反して、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ結合後に高い内部移行能を示す特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体に着目する。本明細書で使用される場合、「内部移行される」または「内部移行された」抗体（これらの２つの表現は同様である）は、哺乳動物細胞上のＩＧＦ−１Ｒに結合した際に細胞により取り込まれる（それが入ることを意味する）ものである。このような抗体は免疫−薬物−複合体成分の１つとして着目され、従って、それは連結された細胞傷害剤を標的細胞、好ましくは癌細胞にアドレスする、または向ける。ひと度、内部移行されると、細胞傷害剤は癌細胞死を誘導する。
【００４７】
好ましくは、本発明による抗体は総てＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ２に関しては同じ配列を示し、他の３つのＣＤＲは異なる。この所見は、抗体の結合特異性に関して、ＣＤＲ−Ｈ３が最も重要であり、エピトープの認識に最も関連があると記載されている一般的知識の一部であるので、一貫性があると思われる。
【００４８】
免疫複合体療法で成功するための重要な鍵は、標的抗原の特異性と抗原結合タンパク質複合体の癌細胞への内部移行であると思われる。明らかに内部移行しない抗原は内部移行する抗原よりも細胞傷害性薬剤送達効果が低い。内部移行プロセスは抗原によって異なり、抗体により影響を受け得る複数のパラメーターに依存する。
【００４９】
免疫複合体では、細胞傷害剤が細胞傷害活性をもたらし、使用する抗体が癌細胞に対するその特異性、ならびに細胞傷害剤を適正にアドレスするよう細胞内に入れるためのベクターをもたらす。従って、免疫複合体を改善するために、抗体は標的癌細胞への高い内部移行能を示し得る。抗体により媒介される内部移行の効率は、標的とされるエピトープによって有意に異なる。強力な内部移行性ＩＧＦ−１Ｒ抗体の選択には、ＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションだけではなく、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞への内部移行後を研究する様々な実験データが必要である。
【００５０】
１つの実施形態では、本発明による抗体の内部移行は、免疫蛍光（本出願の下記に例示される通り）または内部移行機構に特異的な当業者に知られている任意の方法もしくはプロセスによって評価することができる。
【００５１】
複合体ＩＧＦ−１Ｒ／抗体は、前記ＩＧＦ−１ＲのＥＣＤへの抗体の結合の後に内部移行され、細胞表面のＩＧＦ−１Ｒ量の減少が誘導される。この減少は、非限定例として、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫蛍光などの当業者に公知のいずれかの方法によって定量することができる。
【００５２】
１つの実施形態では、このように内部移行を反映するこの減少は、好ましくはＦＡＣＳにより測定可能され、４℃で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）と抗体との４時間のインキュベーション後に３７℃で測定されたＭＦＩの間の差またはΔとして表すことができる。
【００５３】
非限定例として、このΔは、ｉ）本明細書に記載の抗体との４時間のインキュベーション後の乳癌細胞ＭＣＦ７と、ｉｉ）Ａｌｅｘａ４８８で標識された二次抗体を用い、非処理細胞および抗体で処理した細胞で得られたＭＦＩに基づいて決定される。このパラメーターは、下式：Δ（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）で算出される通りに定義される。
【００５４】
ＭＦＩは細胞表面で発現されるＩＧＦ−１Ｒに比例するので、このＭＦＩ間の差異は、ＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションを反映する。
【００５５】
有利な態様において、本抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、ＭＣＦ−７上でΔ（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）を惹起する少なくとも２８０、好ましくは少なくとも４００のモノクローナル抗体からなる。
【００５６】
より詳細には、上述のΔは下記の過程に従って測定することができ、それは例示的な非限定例と見なされるべきである：
ａ）対象とする腫瘍細胞を低温（４℃）または温かい（３７℃）完全培養培地中、本発明の抗体で処理し、インキュベートすること；
ｂ）工程ａ）の処理細胞および並行して非処理細胞を二次抗体で処理すること；
ｃ）本発明の抗体と結合し得る二次標的抗体で処理した細胞および非処理の細胞のＭＦＩを測定すること（表面に存在するＩＧＦ−１Ｒの量を代表する）；および
ｄ）Δを非処理細胞で得られたＭＦＩから処理細胞で得られたＭＦＩの減算として計算すること。
【００５７】
このΔＭＦＩから、内部移行パーセンテージ：
１００×（ＭＦＩ  ４℃−ＭＦＩ３７℃）／ＭＦＩ  ４℃
を求めることができる。
【００５８】
本発明による抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、ＭＣＦ７上に、７０％〜９０％、優先的には７５％〜８７％の間に含まれる内部移行パーセンテージで存在する。
【００５９】
本明細書に記載の抗体の特定の利点は、それらの内部移行速度に依存する。
【００６０】
免疫複合体の場合、使用する抗体は急速な、好ましくは、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ投与から２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、いっそうより好ましくは６時間以内の内部移行速度を示すことが望ましいことが一般に知られている。
【００６１】
本発明では、細胞表面結合抗体減少または細胞表面抗体減衰とも呼ばれる内部移行率はｔ１／２（半減期）として表され、ΔＭＦＩの５０％の低下を得るために必要な時間に相当する（この態様は、下記の例に関して明確に理解される）。
【００６２】
特定の利点は、本発明の抗体は、５〜２５分の間、優先的には１０〜２０分の間に含まれるｔ１／２を有する。
【００６３】
本発明の特定の実施形態は、配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体に関する。
【００６４】
１つの実施形態は、配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２および３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列とを含んでなる、またはからなる３つの重鎖ＣＤＲ；ならびに配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５および６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列を含んでなる、またはからなる３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでなる。
【００６５】
別の実施形態では、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、配列番号１、２および３の配列を含んでなる、またはからなる３つの重鎖ＣＤＲ；ならびに配列番号４、５および６の配列を含んでなる、またはからなる３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる。
【００６６】
ＣＤＲ領域またはＣＤＲ（複数）により、ＩＭＧＴによって定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする
【００６７】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造において使用される。
【００６８】
本明細書に相反する記載がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。
【００６９】
ＣＤＲもやはりＫａｂａｔナンバリングシステム(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991,および後続版)に従って定義することができる。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。本明細書では、用語ＣＤＲ（単数または複数）は、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の親和性を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１以上もしくはさらには全体を示すために使用される。本出願の通読を簡単にするために、ＫａｂａｔによるＣＤＲは定義しない。しかしながら、ＩＭＧＴによるＣＤＲの定義を用いてＫａｂａｔによるＣＤＲを定義することは当業者には自明であろう。
【００７０】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２配列間の「同一性パーセンテージ」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）の手段によって行うことができる。
【００７１】
２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適にアラインされた２つの配列（この場合、比較する核酸配列またはアミノ酸配列は、それら２配列間の最適なアラインメントのために参照配列と比較して付加または欠失を持ち得る）を比較することにより決定される。同一性パーセンテージは、２配列間、好ましくは２つの全配列の間でアミノ酸ヌクレオチドまたは残基が同一である位置の数を決定し、その同一の位置の数をアラインメントウインドウ内の位置の総数で割り、その商に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
【００７２】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２に関して；選択されるマトリックスは、このプログラムによって提案される例えば「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに使用でき、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムによって直接計算される。
【００７３】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、参照配列、特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含有するものが含まれる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の、また、以下に定義される具体例の、生物活性を変更しないいずれのアミノ酸も示すものとする。
【００７４】
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗原結合タンパク質間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかに基づいて決定され得る。
【００７５】
限定されない例として、下表１は、対応する改変された抗原結合タンパク質の生物活性に有意な改変をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も当然可能である。
【００７６】
【表１】
2017513898.tif 000002
【００７７】
本発明の特定の態様は、抗体、またはその任意の抗原結合のフラグメントがインスリン受容体（ＩＲ）に結合しないというものである。この態様は、本明細書に記載の抗体はＩＲ、すなわち、インスリン代謝に悪影響を持たないので注目される。
【００７８】
別の実施形態では、本発明の抗体のさらに別の有利な態様は、ヒトＩＧＦ−１Ｒにだけでなく、サルＩＧＦ−１Ｒにも、より詳しくはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒにも結合できるということである。この態様もまた、それが毒性および臨床試験を助けるので注目される。
【００７９】
別の実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体からなる。
【００８０】
用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、本明細書で使用される場合、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、その集団の個々の抗体は、わずかな量で見られ得る潜在的な自然突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられている。このようなモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の単一のクローンまたはハイブリドーマにより生産され得る。モノクローナル抗体はまた、組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学または化学合成によっても生産され得る。モノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。加えて、一般に種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。本発明は、単離されたまたは天然源からの精製により得られたまたは遺伝子組換えもしくは化学合成により得られた抗体に関する。
【００８１】
１つの実施形態では、モノクローナル抗体は、本明細書において、以降に記載されるようなマウス、キメラおよびヒト化抗体を含む。
【００８２】
抗体は、微生物培養物の仏国コレクション（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランス）に提出されたマウス起源のハイブリドーマに由来してよく、前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞株の細胞の融合βにより得られたものである。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の抗体は組換え抗体からなる。用語「組換え抗体」は、生細胞内で組換えＤＮＡの発現から得られる抗体を意味する。本発明の組換え抗体は、当業者に周知の遺伝子組換えの実験方法を用いて、生物学的有機体には見られないＤＮＡ配列を作り出すことにより得られる。
【００８４】
別の実施形態では、本発明の抗体は化学的に合成された抗体からなる。
【００８５】
１つの実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体はマウス抗体からなり、従って、ｍ［抗体の名称］と呼ばれる。
【００８６】
１つの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体はキメラ抗体からなり、従って、ｃ［抗体の名称］と呼ばれる。
【００８７】
１つの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体はヒト化抗体からなり、従って、ｈｚ［抗体の名称］と呼ばれる。
【００８８】
疑念を避けるため、以下の明細書において、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」および「［抗体の名称］という表現は同等であり、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体および前記「［抗体の名称］」のマウス型、キメラ型およびヒト化型を含む（相反する記載がない限り）。必要であれば、接頭辞ｍ−（マウス）、ｃ−（キメラ）またはｈｚ−（ヒト化）が使用される。
【００８９】
別の実施形態では、本発明の抗体は、：
ａ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｄ）配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
【００９０】
より明確にするために、下表２に好ましい抗体に関してＩＭＧＴに従って定義されるＣＤＲ配列を示す。
【００９１】
【表２】
2017513898.tif 000003
【００９２】
上記のような６つのＣＤＲのいずれの組合せも本発明の一部と見なされるべきであることは当業者には自明であろう。
【００９３】
この表２から見て取ることができるように、この表に記載の抗体は総て、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ２に関して同じ配列を有し、この特性は上記のように特に注目される。
【００９４】
特定の態様は、抗体がまたマウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とするマウス（ｍ）抗体、または任意の抗原結合フラグメントに関する。
【００９５】
別の特定の態様は、抗体がまたマウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とするキメラ（ｃ）抗体、または任意の抗原結合フラグメントに関する。
【００９６】
本発明の実施形態では、抗体はキメラ抗体からなる。
【００９７】
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を前記の所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
【００９８】
抗体、またはそのキメラフラグメントは、組換え遺伝子の技術を使用することにより製造され得る。例えば、キメラ抗体は、プロモーターおよび本発明の非ヒト、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列およびヒトの抗体定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより作製することができる。１つのこのような組換え遺伝子によりコードされている本発明によるキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域により決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。
【００９９】
限定されるものではないが、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、
ａ）配列番号１３の配列または配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる、またはからなる抗体；
ｃ）配列番号１５の配列または配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる、またはからなる抗体；
ｄ）配列番号１６の配列または配列番号１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる、またはからなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる、またはからなる抗体
から選択される。
【０１００】
「配列番号１３〜１７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの重鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号１、２および３）外の配列番号１３〜１７の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す配列をそれぞれ表すものとし、ここで、「ＣＤＲに相当する配列の外」とは、「ＣＤＲに相当する配列を除く」ためのものである。
【０１０１】
限定されるものではないが、別の好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号１８の配列または配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号２０の配列または配列番号２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号２２の配列または配列番号２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１０２】
「配列番号１８〜２２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号４、５および６の３つの軽鎖ＣＤＲを示す、および加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号４、５および６）外の配列番号１８〜２２の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す配列を表わすものとする。
【０１０３】
本発明の実施形態は、
ａ）配列番号１３の配列または配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１８の配列または配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号１５の配列または配列番号１５と少なくとも、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２０の配列または配列番号２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号１６の配列または配列番号１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２２の配列または配列番号２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される抗体に関する。
【０１０４】
本明細書に記載のキメラ抗体はまた定常ドメインによっても特徴付けることができ、より詳しくは、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの前記キメラ抗体が選択または設計され得る。より好ましくは、本発明に関して、前記キメラ抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
【０１０５】
本発明の実施形態は、形式ＩｇＧ１において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるキメラ抗体に関する。より好ましくは、前記キメラ抗体は、配列番号４３の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
【０１０６】
本発明の実施形態は、形式ＩｇＧ４において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるキメラ抗体に関する。より好ましくは、前記キメラ抗体は、配列番号４４の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
【０１０７】
限定されるものではないが、別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、
ａ）配列番号２３の配列または配列番号２３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号２８の配列または配列番号２８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｂ）配列番号２４の配列または配列番号２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号２９の配列または配列番号２９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｃ）配列番号２５の配列または配列番号２５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３０の配列または配列番号３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｄ）配列番号２６の配列または配列番号２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３１の配列または配列番号３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号２７の配列または配列番号２７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３２の配列または配列番号３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体
から選択される。
【０１０８】
より明確にするために、下表３に好ましいキメラ抗体に関してそれぞれＶＨおよびＶＬの配列を示す。
【０１０９】
【表３】
2017513898.tif 000004
【０１１０】
本発明のさらに別の特定の態様は、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれλまたはκ領域およびγ−１、γ−２またはγ−４領域であることを特徴とするヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０１１１】
本発明の実施形態では、抗体はヒト化抗体からなる。
【０１１２】
「ヒト化抗体」は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子の他の部分は１つの（またはいくつかの）ヒト抗体に由来する抗体を意味する。加えて、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）の一部を、結合親和性を保持するように改変することができる。
【０１１３】
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける予防的および／または治療的処置を含む方法におけるそれらの使用に好ましい。ＰＤＬにより特許ＥＰ０４５１２１６、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７またはＵＳ５，５３０，１０１、ＵＳ６，１８０，３７０、ＵＳ５，５８５，０８９およびＵＳ５，６９３，７６１に記載されている例えば、「ＣＤＲグラフト」技術などの他のヒト化技術もまた当業者に公知である。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用することができる。
【０１１４】
本発明の特定の実施形態として、以下の実施例においてより詳しく解説されるように、本明細書ではｈｚ２０８Ｆ２からなる抗体が記載される。このようなヒト化は、本発明の他の抗体部分にも当てはまり得る。
【０１１５】
好ましい実施形態では、本発明による抗体は、
ｉ）それぞれ配列番号７、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、
ｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号４６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、
ｉｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８）に由来するＦＲ４
を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。
【０１１６】
好ましい実施形態では、本発明による抗体は、
ｉ）それぞれ配列番号９、５および１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、
ｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号４７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、
ｉｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号４９）に由来するＦＲ４
を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなる。
【０１１７】
限定されるものではないが、本発明の好ましい実施形態では、抗体は、
ａ）それぞれ配列番号７、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号４６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８）に由来するＦＲ４とを有する重鎖と、ｂ）それぞれ配列番号９、５および１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号４７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号４９）に由来するＦＲ４とを有する軽鎖
を含んでなる。
【０１１８】
１つの実施形態では、本発明による抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる。前記ヒト化抗体は、以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体」または「Ｖａｒ．」１）と呼ぶ。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明による抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなり、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２および９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる。
【０１２０】
「復帰突然変異（back-mutation or back mutation)」という表現は、生殖細胞系中に存在するヒト残基の突然変異またはマウス配列に元々存在する対応する残基による置換を意味する。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明による抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなり、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２および９５から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の復帰突然変異を含んでなる。
【０１２２】
より明確にするために、下表４に好ましい復帰突然変異を示す。
【０１２３】
【表４】
2017513898.tif 000005
【０１２４】
１つの実施形態では、本発明による抗体は、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７および８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる。
【０１２５】
１つの実施形態では、本発明による抗体は、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７および８７から選択される２、３、４、５、６、７または８の復帰突然変異を含んでなる。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明による抗体は、
ａ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ここで前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２および９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる；と、
ｂ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ここで前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７および８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる
【０１２７】
より明確にするために、下表５に好ましい復帰突然変異を示す。
【０１２８】
【表５】
2017513898.tif 000006
【０１２９】
このような実施形態では、本発明による抗体は、上述の復帰突然変異の総てを含んでなり、配列番号３４の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３６の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる抗体に相当する。前記ヒト化抗体を以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体」または「Ｖａｒ．」３）と呼ぶ。
【０１３０】
別の実施形態では、変異体１〜変異体３の間を含むヒト化型もまた本発明により包含される。言い換えれば、本発明による抗体は、配列番号４１の「コンセンサス」配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号４２の「コンセンサス」配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる抗体に相当する。前記ヒト化抗体を以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体」または「Ｖａｒ．」２）と呼ぶ。
【０１３１】
限定されるものではないが、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、
ａ）配列番号３３の配列または配列番号３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号３４の配列または配列番号３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８  ８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１３２】
「配列番号３３、３４、５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８または８０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの重鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号１、２および３）外の配列番号３３、３４、５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８  ８０の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１３３】
限定されるものではないが、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、
ａ）配列番号３５の配列または配列番号３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号３６の配列または配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５７および６０から選択される配列または配列番号５７もしくは６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１３４】
「配列番号３５、３６、５７または６０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号４、５および６の３つの軽鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号４、５および６）外の配列番号３５、３６、５７または６０の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１３５】
本明細書に記載のヒト化抗体はまた定常ドメインによっても特徴付けることができ、より詳しくは、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの前記ヒト化抗体が選択または設計され得る。より好ましくは、本発明に関して、前記ヒト化抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
【０１３６】
本発明の実施形態は、形式ＩｇＧ１において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるヒト化抗体に関する。より好ましくは、前記ヒト化抗体は、配列番号４３の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
【０１３７】
本発明の実施形態は、形式ＩｇＧ４において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるヒト化抗体に関する。より好ましくは、前記ヒト化抗体は、配列番号４４の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
【０１３８】
本発明のさらに別の実施形態は、
ａ）配列番号３７の配列または配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３９の配列または配列番号３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｂ）配列番号３８の配列または配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号５７  ６０から選択される配列または配列番号５７もしくは６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される抗体に関する。より明確にするために、下表６ａにヒト化抗体ｈｚ２０８Ｆ２の変異体１（Ｖａｒ．１）および変異体３（Ｖａｒ．３）に関するＶＨおよびＶＬの配列の非限定例を示す。それはまた、変異体２（Ｖａｒ．２）のコンセンサス配列も含んでなる。
【０１３９】
【表６】
2017513898.tif 000007
【０１４０】
限定されるものではないが、別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、
ａ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号５７もしくは６０から選択される配列または配列番号５７もしくまたは６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤとを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５７および６０から選択される配列または配列番号５７もしくは６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１４１】
本発明のさらに別の実施形態は、
ａ）配列番号５８、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９および８１から選択される配列または配列番号５８、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９もしくは８１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖と、
ｂ）配列番号５９および６１から選択される配列または配列番号５９もしくは６１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖
とを含んでなる、またはからなる抗体から選択される抗体に関する。
【０１４２】
本発明のさらに別の実施形態は、
ａ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号５７の配列または配列番号５７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号５６、６４、６８および７８から選択される配列または配列番号５６、６４、６８もしくは７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号６０の配列または配列番号６０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される抗体に関する。
【０１４３】
本発明のさらに別の実施形態は、
ａ）配列番号５８の配列または配列番号５８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｂ）配列番号５８の配列または配列番号５８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６１の配列または配列番号６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｃ）配列番号６３の配列または配列番号６３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９とを含んでなる、またはからなる少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｄ）配列番号６５の配列または配列番号６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｅ）配列番号６５の配列または配列番号６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６１の配列または配列番号６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｆ）配列番号６７の配列または配列番号６７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖を含んでなる、またはからなる抗体；
ｇ）配列番号６９の配列または配列番号６９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは％の同一性示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｈ）配列番号６９の配列または配列番号６９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６１の配列または配列番号６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｉ）配列番号７１の配列または配列番号７１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｊ）配列番号７３の配列または配列番号７３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｋ）配列番号７５の配列または配列番号７５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる、抗体；
ｌ）配列番号７７の配列または配列番号７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｍ）配列番号７９の配列または配列番号７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またもしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体；
ｎ）配列番号７９の配列または配列番号７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６１の配列または配列番号６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなるとを含んでなる、またはからなる抗体；ならびに
ｏ）配列番号８１の配列または配列番号８１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、またはからなる軽鎖とを含んでなる、またはからなる抗体
から選択される抗体に関する。
【０１４４】
より明確にするために、下表６ｂにヒト化抗体ｈｚ２０８Ｆ２の種々の変異体に関するＶＨおよびＶＬ（可変ドメインおよび全長）の配列の非限定例を示す。
【０１４５】
【表７】
2017513898.tif 000008
2017513898.tif 000009
【０１４６】
本発明の別の態様は、
ｉ）それぞれ２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日にＣＮＣＭ、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、パスツール研究所、２５、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  パリ、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６もしくはＩ−４７７４により産生された抗体、ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；およびｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープと結合する抗体から選択される抗体である。
【０１４７】
別の態様によれば、本発明は、それぞれ２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６およびＩ−４７７４から選択されるマウスハイブリドーマに関する。
【０１４８】
本発明の新規な態様は、本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸に関する。
【０１４９】
本明細書において互換的に使用される用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有しない核酸のフラグメントまたは領域を定義し、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドの厳密な配列を意味する。
【０１５０】
本発明の配列は単離および／または精製されており、すなわち、それらは例えば複製により直接的または間接的にサンプリングされたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られた、または化学合成により得られた単離された核酸もまた本明細書に記載されるべきである。
【０１５１】
本発明はまた、本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含んでなるベクターに関する。
【０１５２】
本発明は特に、このようなヌクレオチド配列を含有するクローニングおよび／または発現ベクターを対象とする。
【０１５３】
ベクターは好ましくは、所与の宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。従って、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含まなければならない。ベクターは宿主細胞内で安定に維持可能でなければならず、場合により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特異的シグナルを有してよい。これらの種々のエレメントは使用する宿主細胞に応じて当業者により選択および最適化される。この目的で、ヌクレオチド配列は、選択された宿主内でまたは自己複製するベクターに挿入できるか、または選択された宿主の組み込みベクターであり得る。
【０１５４】
このようなベクターは当業者により一般に使用される方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学法などの標準的方法により好適な宿主に導入することができる。
【０１５５】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。ベクターは本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現するように、宿主細胞を形質転換させるために使用される。
【０１５６】
本発明はまた、上記のベクターにより形質転換された、または上記のベクターを含んでなる単離された宿主細胞に関する。
【０１５７】
宿主細胞は、細菌細胞などの原核生物系または真核生物系、例えば、また、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞（ヒトを除く）などの中から選択され得る。昆虫または植物細胞も使用可能である。
【０１５８】
本発明はまた、形質転換された細胞を有するヒト以外の動物に関する。
【０１５９】
別の態様は、本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメントの生産のための方法に関し、前記方法は、以下の工程：
ａ）培地中、本発明による宿主細胞に好適な培養条件での培養；および
ｂ）このようにして産生された抗体の、またはその抗原結合フラグメントの培養培地からまたは前記培養細胞からの回収
を含んでなることを特徴とする。
【０１６０】
形質転換細胞は、本発明による組換え抗体の生産方法で使用される。本発明によるベクターおよび／またはベクターにより形質転換された細胞を用いて組換え型の抗体を生産するための方法もまた本明細書に含まれる。好ましくは、上記のようなベクターにより形質転換された細胞は、前記抗体の発現および前記抗体の回収を可能とする条件下で培養される。
【０１６１】
既述のように、宿主細胞は、原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系において分泌を促進するヌクレオチド配列を特定することができる。よって、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌される組換えタンパク質の生産に有利に使用できる。実際に、対象とするこれらの組換えタンパク質の精製は、それらのタンパク質が宿主細胞内部ではなく細胞培養の上清中に存在するという事実により容易となる。
【０１６２】
抗体はまた、化学合成によって作製することもできる。このような１つの作製方法もまた、本発明の目的である。当業者は、固相技術または部分的固相技術、フラグメントの縮合による、または溶液中での従来合成によるなどの化学合成のための方法を知っている。化学合成により得られた、また対応する非天然アミノ酸を含有し得るポリペプチドも本発明に含まれる。
【０１６３】
上記の方法により得られる可能性のある抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントもまた、本発明に含まれる。
【０１６４】
特定の態様によれば、本発明は、宿主標的部位に細胞傷害性薬剤を送達するためのアドレッシングビヒクルとして使用するための上記の抗体またはその抗原結合に関し、前記宿主標的部位は、ＩＧＦ−１Ｒ、好ましくは、ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン、より好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（配列番号５０）、いっそうより好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（配列番号５１）に、いっそうより好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインのＮ末端（配列番号５２）、またはその任意の天然変異体配列に局在するエピトープからなる。
【０１６５】
好ましい実施形態では、前記宿主標的部位は、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、より好ましくは、天然にまたは遺伝子組換えの方法によりＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の標的部位である。
【０１６６】
本発明の別の態様は、細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされた上記のような抗体、またはその抗原結合フラグメントを含んでなる抗体−薬物複合体である。
【０１６７】
本発明は、細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされた本明細書に記載されるような抗体を含んでなる免疫複合体に関する。
【０１６８】
「免疫複合体(“immunoconjugate” または “immuno-conjugate”)」とは、一般に、１以上の治療薬と物理的に連結された抗体などのアドレッシング製品を少なくとも含んでなる化合物に関し、従って、高度に標的化された化合物を作り出す。
【０１６９】
好ましい実施形態では、このような治療薬は細胞傷害性薬剤からなる。
【０１７０】
「細胞傷害性薬剤(“cytotoxic agent” または “cytotoxic”)」とは、対象に投与した際に、細胞機能を阻害または回避し、かつ／または細胞死を引き起こすことにより対象の身体における異常な細胞増殖の発生、好ましくは、癌の発生を治療または予防する薬剤を意図する。
【０１７１】
多くの細胞傷害性薬剤が単離または合成されており、細胞増殖を阻害すること、または決定的にではなくとも、少なくとも有意に腫瘍細胞を破壊もしくは減少させることを可能とする。しかしながら、これらの薬剤の細胞傷害活性は腫瘍細胞に限定されず、非腫瘍細胞も影響を受け、破壊される場合がある。より詳しくは、副作用が造血細胞または特に粘膜の上皮細胞などの急速に再生する細胞に見られる。例として、消化管の細胞はこのような細胞傷害性薬剤の使用により大きな影響を受ける。
【０１７２】
本発明の目的の１つはまた、正常細胞に対する副作用を制限すると同時に腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を保持することを可能とする細胞傷害性薬剤を提供することができるということである。
【０１７３】
より詳しくは、細胞傷害性薬剤は、好ましくは、限定されるものではないが、薬物（すなわち、「抗体−薬物複合体」）、毒素（すなわち、「免疫毒素」または「抗体−毒素複合体」）、放射性同位元素（すなわち、「放射性免疫複合体」または「抗体−放射性同位元素複合体」）などからなり得る。
【０１７４】
第１の好ましい実施形態では、免疫複合体は、少なくとも薬物または薬剤に連結された抗体からなる。このような免疫複合体は、抗体−薬物複合体（または「ＡＤＣ」）と呼ばれる。
【０１７５】
第１の実施形態では、このような薬物はそれらの作用様式に関して記載することができる。非限定例として、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、アルキル−スルホネート、ニトロソ尿素、オキシアゾホリン、アジリジンまたはイミン−エチレン、抗代謝産物、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管新生剤、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬、キレート剤、鉄吸収刺激剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＤＮＡ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤、アポトーシス刺激剤、チミジル酸阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、インターフェロン作動薬、リボヌクレオシド３リン酸レダクターゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体拮抗薬、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、タキサン、チューブリン阻害剤、血管新生阻害剤、マクロファージ刺激剤、ニューロキニン受容体拮抗薬、カンナビノイド受容体作動薬、ドーパミン受容体作動薬、顆粒球刺激因子作動薬、エリスロポエチン受容体作動薬、ソマトスタチン受容体作動薬、ＬＨＲＨ作動薬、カルシウム増感剤、ＶＥＧＦ受容体拮抗薬、インターロイキン受容体拮抗薬、破骨細胞阻害剤、ラジカル形成刺激剤、エンドセリン受容体拮抗薬、ビンカアルカロイド、抗ホルモンまたは免疫調節剤または細胞傷害性もしくは毒素の活性基準を満たす他の任意の新規薬物が挙げられる。
【０１７６】
このような薬物は、例えば、ＶＩＤＡＬ  ２０１０の腫瘍学および血液学の「細胞傷害性」の欄に付属した化合物に充てられたページに引用されており、この文書に関して引用されたこれらの細胞傷害性化合物は、本明細書得で好ましい細胞傷害性薬剤として引用される。
【０１７７】
より詳しくは、限定されるものではないが、本発明によれば下記の薬物または薬剤が好ましい：メクロレタミン、クロラムブシル(chlorambucol)、メルファラン(melphalan)、クロリドレート(chlorydrate)、ピポブロマン(pipobromen)、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウム、エストラムスチン、シクロホスファミド、アルトレタミン、トロフォスファミド、スルホフォスファミド、イフォスファミド、チオテパ、トリエチルエナミン、アルテトラミン(altetramine)、カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン(fotemustin）、ロムスチン、ブスルファン、トレオスルファン、インプロスルファン、ダカルバジン、シスプラチナム、オキサリプラチン、ロバプラチン、ヘプタプラチン、ミリプラチン水和物、カルボプラチン、メトトレキサート、ペメトレキセド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ネララビン、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデスオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、テガフール、ペントスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、バルルビシン、塩酸アムルビシン、ピラルビシン、酢酸エリプチニウム、ゾルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびテニポシド、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、サリドマイド、ＣＤＣ  ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、フルタミド、ニルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリド、シメチジン(cimitidine)、ボルテゾミブ(bortezomid)」、ベルケード、ビカルタミド、シプロテロン、フルタミド、フルベストラント(fulvestran)、エキセメスタン、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レチノイド、レキシノイド、メトキサレン(methoxsalene)、メチルアミノレブリネート、アルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフチトクス(denileukin diflitox)、インターロイキン−２、タソネルミン(tasonermine)、レンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリ  Ｉ：Ｃ、プロコダゾール、Ｔｉｃ  ＢＣＧ、コリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)、ＮＯＶ−００２、ウクライン、レバミゾール、１３１１−ｃｈＴＮＴ、Ｈ−１０１、セルモロイキン、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンγ１ａ、インターロイキン−２、モベナキン、レキシン−Ｇ、テセロイキン、アクラルビシン、アクチノマイシン、アルグラビン、アスパラギナーゼ、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダウノマイシン、ロイコボリン、マソプロコール、ネオカルジノスタチン、ペプロマイシン、サルコマイシン、ソラマージン、トラベクテジン、ストレプトゾシン、テストステロン、クネカテキン、シネカテキン、アリトレチノイン、塩酸ベロテカン、カルステロン、ドロモスタノロン、酢酸エリプチニウム、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオキシメステロン、フォルメスタン、ホスフェトロール(fosfetrol)、酢酸ゴセレリン、アミノレブリン酸ヘキシル、ヒストレリン、ヒドロキシプロゲステロン、イキサベピロン、ロイプロリド、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲステロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、ミルテホシン、ミトブロニトール、フェニルプロピオン酸ナドロロン、酢酸ノレシンドロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、テムシロリムス(temsirrolimus)、テストラクトン、トリアムシノロン(triamconolone)、トリプトレリン、酢酸バプレオチド、ジノスタチンスチマラマー、アムサクリン、三酸化ヒ素、塩酸ビサントレン、クロラムブシル、クロルトリアニセン(chlortrianisene)、シス−ジアミンジクロロプラチニウム、シクロホスファミド、ジエチルスチルベストロール、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、レナリドマイド、ロニダミン、メクロレタミン(mechlorethanamine)、ミトタン、ネダプラチン、塩酸ニムスチン、パミドロネート、ピポブロマン、ポルフィマーナトリウム、ラニムスチン、ラゾキサン、セムスチン、ソブゾキサン、メシレート、トリエチレンメラミン、ゾレンドロン酸、メシル酸カモスタット、ファドロゾールＨＣｌ、ナフォキシジン、アミノグルテチミド、カルモフール、クロファラビン、シトシンアラビノシド、デシタビン、ドキシフルリジン、エノシタビン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フトラフール、ウラシルマスタード、アバレリクス、ベキサロテン、ラルチテルキセド(raltiterxed)、タミバロテン、テモゾロミド、ボリノスタット、メガストロール(megastrol)、クロドロネート二ナトリウム、レバミゾール、フェルモキシトール、鉄イソマルトシド、セレコキシブ、イブジラスト、ベンダムスチン、アルトレタミン、ミトラクトール、テムシロリムス、プララトレキサート、ＴＳ−１、デシタビン、ビカルタミド、フルタミド、レトロゾール、クロドロネート二ナトリウム、デガレリクス、クエン酸トレミフェン、二塩酸ヒスタミン、ＤＷ−１６６ＨＣ、ニトラクリン、デシタビン、塩酸イリノテカン(irinoteacn hydrochloride)、アムサクリン、ロミデプシン、トレチノイン、カバジタキセル、バンデタニブ、レナリドマイド、イバンドロン酸、ミルテホシン、ビテスペン、ミファムルチド、ナドロパリン、グラニセトロン、オンダンセトロン、トロピセトロン、アリザプリド、ラモセトロン、メシル酸ドラセトロン、ホスアプレピタントジメグルミン、ナビロン、アプレピタント、ドロナビノール、ＴＹ−１０７２１、リスリド水素マレイン酸塩、エプセラム、デフィブロチド、ダビガトランエテキシレート、フィルグ���スチム、ペグフィルグラスチム、レディタクス、エポエチン、モルグラモスチム、オプレルベキン、シプロイセル−Ｔ、Ｍ−Ｖａｘ、アセチルＬ−カルニチン、塩酸ドネペジル、５−アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、酢酸セトロレリクス、イコデキストリン、ロイプロレリン、メチルフェニデート(metbylphenidate)、オクトレオチド、アンレキサノクス、プレリキサフォル、メナテトレノン、アネトールジチオールチオン、ドキセルカルシフェロール、塩酸シナカルセト、アレファセプト、ロミプロスチム、サイモグロブリン、チマルファシン、ウベニメクス、イミキモド、エベロリムス、シロリムス、Ｈ−１０１、ラソフォキシフェン、トリロスタン、インカドロネート、ガングリオシド、ペガプタニブ八ナトリウム、ベルテポルフィン（vertoporfin）、ミノドロン酸、ゾレンドロン酸、硝酸ガリウム、アレンドロネートナトリウム、エチドロネート二ナトリウム、パミドロン酸二ナトリウム、デュタステライド、スチボグルコン酸ナトリウム、アルモダフィニル、デクスラゾキサン、アミフォスチン、ＷＦ−１０、テモポルフィン、ダルベポエチンアルファ、アンセスチム、サルグラモスチム、パリフェルミン、Ｒ−７４４、ネピデルミン、オプレルベキン、デニロイキンディフチトクス、クリサンタスパーゼ、ブセレリン、デスロレリン、ランレオチド、オクトレオチド、ピロカルピン、ボセンタン、カリケアマイシン、メイタンシノイド、シクロニカートおよびピロロベンゾジアゼピン、特に、ＷＯ２０１１／１３０５９８番として公開されているＰＣＴ出願に開示されているもの。
【０１７８】
別の実施形態では、免疫複合体は、少なくとも放射性同位元素に連結された抗体からなる。このような免疫複合体は抗体−放射性同位元素複合体（または「ＡＲＣ」）と呼ばれる。
【０１７９】
腫瘍の選択的破壊には、抗体は高放射性原子を含んでなり得る。ＡＲＣの生産には、限定されるものではないが、Ａｔ２１１、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、Ｆｌ１９、Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、ｔｃ９９ｍ、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、Ｌｕ、ガドリニウム、マンガンまたは鉄の放射性同位元素などの種々の放射性同位元素が利用できる。
【０１８０】
このような放射性同位元素をＡＲＣに組み込むために、当業者に公知のいずれの方法またはプロセスも使用可能である。非限定例として、ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１はシステイン残基を介して結合させることができる。Ｙ９０はリシン残基を介して結合させることができる。Ｉ１２３はヨードゲン法を用いて結合させることができる。
【０１８１】
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体およびチオ尿素リンカーキレーターにより結合されたＩｎ１１１またはＹ９０放射性同位元素から構成されるＡＲＣであるゼバリン（商標）；またはカリケアマイシンに連結された抗ＣＤ３３抗体から構成されるマイロターグ（商標）（米国特許第ＵＳ４，９７０，１９８号；同第５，０７９，２３３号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６０６，０４０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，７３９，１１６号；同第５，７６７，２８５号；同第５，７７３，００１号）などのいくつかの例が、ＡＲＣの分野の熟練者の知識を例示するために挙げられる。より最近では、また、ホジキンリンパ腫の処置においてＦＤＡにより最近許諾されたアドセトリス（ブレンツキシマブベドチンに相当する）と呼ばれるＡＤＣも挙げられる。
【０１８２】
別の実施形態では、免疫複合体は、少なくとも毒素に連結された抗体からなる。このような免疫複合体は、抗体−毒素複合体（または「ＡＴＣ」）と呼ばれる。
【０１８３】
毒素は、生物により生産される効果的かつ特異な毒である。毒素は通常、２００程度（ペプチド）〜１０万（タンパク質）の間で分子量が異なり得るアミノ酸鎖からなる。毒素はまた低分子有機化合物でもあり得る。毒素は多くの生物、例えば、細菌、真菌、藻類および植物により生産される。それらの多くは極めて有毒であり、神経薬剤よりも数桁高い毒性である。
【０１８４】
ＡＴＣにおいて使用される毒素としては、限定されるものではないが、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によりそれらの細胞傷害性作用を発揮し得るあらゆる種類の毒素が挙げられる。
【０１８５】
使用可能な酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca Americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれる。
【０１８６】
ドラスタチン、アウリスタチン、特に、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、トリコテセン、およびＣＣ１０６５などの小分子毒素、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体も本明細書において企図される。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管運動、ＧＴＰ加水分解、ならびに核分裂および細胞分裂に干渉し、抗癌活性および抗真菌活性を有することが示されている。
【０１８７】
「リンカー」、「リンカー単位」、または「連結」は、共有結合を含んでなる化学部分または抗体を少なくとも１つの細胞傷害性薬剤に共有結合させる原子の鎖を意味する。
【０１８８】
リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルエン）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、細胞傷害性薬剤とアドレス指定系のコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。他の架橋試薬は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ロックフォード、Ｉｌｌ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）であり得る。
【０１８９】
リンカーは、「切断不能」であってもまたは「切断可能」であってもよい。
【０１９０】
好ましい実施形態では、リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬剤の放出を助ける「切断なリンカー」からなる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが使用可能である。リンカーは、好ましい実施形態では、リンカーの切断が細胞内環境において抗体から細胞傷害性薬剤を放出するように、細胞内条件下で切断可能である。
【０１９１】
例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断因子により切断可能である。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素（限定されるものではないが、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む）により切断されるペプチジルリンカーであり得る。一般に、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断因子はカテプシンＢおよびＤおよびプラスミンを含むことができ、これらは総て、ジペプチド薬誘導体を加水分解して標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすことが知られている。例えば、癌組織で発現の高いチオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂにより切断可能なペプチジルリンカーが使用可能である（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー）。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。細胞傷害性薬剤の細胞内タンパク質分解性放出を使用することの１つの利点は、薬剤がコンジュゲートされた場合には一般に減弱され、かつ、その複合体の血清安定性が一般に高いことである。
【０１９２】
他の実施形態では、切断可能なリンカーはｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値での加水分解に対して感受性である。一般に、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、またはケタールなど）が使用できる。このようなリンカーは、血中などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０以下では不安定である。特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療薬と結合されているチオエーテル）である。
【０１９３】
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを用いて形成可能なものが含まれる。
【０１９４】
切断不能または「還元不能(non reductible)リンカーの非限定例としては、トラスツズマブと、連結された化学療法薬メイタンシンを組み合わせた免疫複合体トラスツズマブ−ＤＭ１（ＴＤＭ１）が挙げられる。
【０１９５】
好ましい実施形態では、本発明の免疫複合体は、例えば、限定されるものではないが、ｉ）抗体の求核基と二価リンカー試薬との反応およびその後の細胞傷害性薬剤との反応、またはｉｉ）細胞傷害性薬剤の求核基と二価リンカー試薬との反応およびその後の抗体の求核基との反応など、当業者に公知のいずれの方法によって作製されてもよい。
【０１９６】
抗体上の求核基としては、限定されるものではないが、Ｎ末端アミン基、側鎖アミン基、例えばリシン、側鎖チオール基、および抗原結合タンパク質がグリコシル化されている場合には糖のヒドロキシル基またはアミノ基が挙げられる。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができ、限定されるものではないが、活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハリド；アルキルおよびベンジルハリド、例えば、ハロアセトアミド；アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基が挙げられる。抗体は、還元可能な鎖内ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有してもよい。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は理論上２つの反応性チオール求核試薬を形成する。当業者に公知の任意の反応を介して抗体に付加的求核基を導入することができる。非限定例として、反応性チオール基は、１以上のシステイン残基を導入することにより抗体に導入され得る。
【０１９７】
免疫複合体はまた、リンカー試薬または細胞傷害性薬剤上の求核置換基と反応し得る求電子部分を導入するための抗体の修飾によっても作製され得る。グリコシル化抗体の糖を酸化してアルデヒドまたはケトン基を形成させてもよく、これはリンカー試薬または細胞傷害性薬剤のアミン基と反応し得る。生じたイミンシッフ塩基群は安定な結合を形成し得るか、または還元して安定なアミン結合を形成させてもよい。一実施形態では、グリコシル化抗体の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応は抗体中に、薬物上の適当な基と反応し得るカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を生じ得る。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有する抗体はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、その結果、最初のアミノ酸に代わってアルデヒドの生成をもたらし得る。
【０１９８】
特定の好ましい実施形態では、リンカー単位は、下記一般式：
−−Ｔａ−−Ｗｗ−−Ｙｙ−−
を有していてよく、式中、
−Ｔ−は、延伸単位であり；
ａは、０または１であり；
−Ｗ−は、アミノ酸単位であり；
ｗは独立に、１〜１２の範囲の整数であり；
−Ｙ−は、スペーサー単位であり；
ｙは、０、１または２である。
【０１９９】
延伸単位（−Ｔ−）は、存在する場合、抗体を、アミノ酸単位（−Ｗ−）と連結する。天然にまたは化学的操作を介して抗体上に存在し得る有用な官能基としては、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、炭水化物のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが含まれる。好適な官能基はスルフヒドリルおよびアミノである。スルフヒドリル基は、存在する場合、抗体の分子内ジスルフィド結合の還元により作製することができる。あるいは、スルフヒドリル基は、抗体のリシン部分のアミノ基と２−イミノチオランまたは他のスルフヒドリル生成試薬との反応により生成することもできる。特定の実施形態では、抗体は、組換え抗体であり、１以上のリシンを有するように操作される。より好ましくは、抗体は、１以上のシステインを有するように操作することができる（ＴｈｉｏＭａｂｓ参照）。
【０２００】
ある特定の実施形態では、延伸単位は、抗体の硫黄原子と結合を形成する。硫黄原子は、還元型の抗体のスルフヒドリル（−−ＳＨ）基に由来し得る。
【０２０１】
他のある特定の実施形態では、延伸単位は、抗体の硫黄原子と延伸単位の硫黄原子の間のジスルフィド結合を介して抗体に連結される。
【０２０２】
他の特定の実施形態では、延伸部の反応性基は、抗体のアミノ基に反応し得る反応性部位を含む。このアミノ基は、アルギニンまたはリシンのものであり得る。好適なアミン反応性部位としては、限定されるものではないが、活性化エステル、例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル；無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。
【０２０３】
さらに別の態様では、延伸部の反応性官能基は、抗体上に存在し得る修飾炭水化物基に反応性のある反応性部位を含む。特定の実施形態では、抗体は、炭水化物部分を提供するように酵素的にグリコシル化されている。炭水化物は過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬で穏やかに酸化されてもよく、結果として得られる酸化炭水化物のカルボニル単位は、ヒドラジド、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバジド、カルボン酸ヒドラジン、またはアリールヒドラジドなどの官能基を含む延伸部と縮合させることができる。
【０２０４】
アミノ酸単位（−Ｗ−）は、スペーサー単位が存在する場合には、延伸単位（−Ｔ−）とスペーサー単位（−Ｙ−）を連結し、スペーサー単位が存在しない場合には、延伸単位と細胞傷害性薬剤を連結する。
【０２０５】
上述のように、−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位であり得る。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸単位は、限定されるものではないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、アセチルまたはホルミルで保護されたリシン、アルギニン、トシルまたはニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチンおよびシトルリンなどのアミノ酸残基を含んでなり得る。例示的アミノ酸リンカー成分としては、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが挙げられる。
【０２０７】
例示的ジペプチドとしては、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇが挙げられる。
【０２０８】
例示的トリペプチドとしては、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓが挙げられる。
【０２０９】
例示的テトラペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号５３）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号５４）が挙げられる。
【０２１０】
例示的ペンタペプチドとしては、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号５５）が挙げられる。
【０２１１】
アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基としては、天然に存在するもの、ならびに微量アミノ酸および非天然アミノ酸類似体、例えばシトルリンが含まれる。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計および最適化することができる。
【０２１２】
リンカーのアミノ酸単位は、限定されるものではないが、腫瘍関連プロテアーゼを含む酵素により酵素的に切断されて細胞傷害性薬剤を遊離し得る。
【０２１３】
アミノ酸単位は、特定の腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計および最適化することができる。好適な単位は、それらの切断がプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、並びにプラスミンによって触媒されるものである。
【０２１４】
スペーサー単位（−Ｙ−）は、存在する場合、アミノ酸単位を細胞傷害性薬剤に連結する。スペーサー単位は、自壊的および非自壊的の２つの一般的タイプのものである。非自壊的スペーサー単位は、免疫複合体からのアミノ酸単位の酵素的切断後にそのスペーサー単位の一部または全部が細胞傷害性薬剤に結合して残るものである。非自壊的スペーサー単位の例としては、限定されるものではないが、（グリシン−グリシン）スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位が挙げられる。細胞傷害性薬剤を遊離させるためには、非依存的加水分解反応がグリシン−薬物単位の結合を切断するように標的細胞内で起こるべきである。
【０２１５】
別の実施形態では、非自壊的スペーサー単位（−Ｙ−）は−Ｇｌｙ−である。
【０２１６】
１つの実施形態では、免疫複合体はスペーサー単位を欠いている（ｙ＝０）。あるいは、自壊的スペーサー単位を含有する免疫複合体は、独立した加水分解工程の必要なく細胞傷害性薬剤を放出することができる。これらの実施形態では、−Ｙ−は、ＰＡＢ基の窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結され、かつ、炭酸基、カルバミン酸基またはエーテル基を介して−Ｄに直接接続されたｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位である。
【０２１７】
自壊的スペーサーの他の例としては、限定されるものではないが、ＰＡＢ基と電気的に等価な芳香族化合物、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールが挙げられる。スペーサーは、アミド結合の加水分解時に容易に環化を受けるもの、例えば、置換および非置換４−アミノ酪酸アミド、適宜置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミドが使用可能である。
【０２１８】
別の実施形態では、スペーサー単位は、分岐型のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これは付加的細胞傷害性薬剤を組み込むために使用可能である。
【０２１９】
薬物負荷量はまた薬物−抗体比（ＤＡＲ）とも呼ばれ、細胞結合剤当たりのＰＢＤ薬物の平均数である。
【０２２０】
抗体ＩｇＧ１アイソタイプの場合、部分的抗体還元の後に薬物がシステインに結合される場合、薬物負荷量は抗体当たり１〜８薬物（Ｄ）の範囲であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、および８つの薬物部分が抗体と共有結合される。
【０２２１】
抗体ＩｇＧ２アイソタイプの場合、部分的抗体還元の後に薬物がシステインに結合される場合、薬物負荷量は抗体当たり１〜１２薬物（Ｄ）の範囲であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２の薬物部分が抗体と共有結合される。
【０２２２】
ＡＤＣの組成物は、一定範囲の、１〜８または１〜１２の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば抗体の集合体を含む。
【０２２３】
薬物がリシンと結合される場合、薬物負荷量は細胞の抗体当たり１〜８０薬物（Ｄ）の範囲であり得るが、上限は４０、２０、１０または８が好ましいものであり得る。ＡＤＣの組成物には、１〜８０、１〜４０、１〜２０、１〜１０または１〜８の薬物の範囲でコンジュゲートされた細胞結合剤の、例えば抗体の集合体が含まれる。
【０２２４】
コンジュゲーション反応からのＡＤＣの調製における抗体当たりの薬物の平均数は、従来の手段によって特徴付けることができる。薬物比に関するＡＤＣの量的分布も決定可能である。一部の抗体−薬物複合体では、薬物比は抗体上の結合部位の数によって制限を受け得る。例えば、抗体はシステインチオール基を１個だけもしくは数個有していてもよく、またはそれを介してリンカーが結合され得る十分に反応性のあるチオール基を１個だけもしくは数個有していてもよい。高い薬物負荷、例えば、薬物比＞５は、特定の抗体−薬物複合体の凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の低下を招く場合がある。
【０２２５】
ある種の抗体は還元可能な鎖内ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は理論上２つの反応性チオール求核部分を形成する。付加的な求核基は、リシンと２−イミノチオラン（トロート試薬）との反応によるアミンのチオールへの変換を介して抗体に導入することができる。反応性チオール基は、１、２、３、４、またはそれを越えるシステイン残基を操作すること（例えば、１以上の非天然システインアミノ酸残基を含んでなる変異型抗体を作製すること）によって抗体（またはそのフラグメント）に導入してもよい。ＵＳ７５２１５４１は、反応性システインアミノ酸の導入による抗体の操作を教示している。
【０２２６】
システインアミノ酸は、抗体中の、鎖内または分子間ジスルフィド結合を形成しない反応性部位で操作し得る（Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729;米国特許第７５２１５４１号；米国特許第７７２３４８５号；ＷＯ２００９／０５２２４９)。操作されたシステインチオールは、マレイミドまたはα−ハロアミドなどのチオール反応性求電子基を有する本発明のリンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応させて、システイン操作抗体とＰＢＤ薬物部分を有するＡＤＣを形成することができる。従って、薬物成分の位置は設計、制御可能であり、既知である。操作されたシステインチオール基は一般に高収率でチオール反応性リンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応するので、薬物負荷量は制御可能である。重鎖または軽鎖上の単一部位における置換によるシステインアミノ酸の導入のためのＩｇＧ抗体の操作から、対称抗体上に２つの新たなシステインが得られる。ほぼ均質なコンジュゲーション産物ＡＤＣで、２に近い薬物負荷量が達成できる。
【０２２７】
加えて、本発明はまた、薬剤として使用するための上記のような免疫複合体または抗体−薬物複合体に関する。
【０２２８】
また、本発明はさらに、癌の処置に使用するための上記のような免疫複合体または抗体−薬物複合体に関する。
【０２２９】
本発明は、薬剤として使用するための上記のような抗体−薬物複合体に関する。特定の実施形態では、本発明は、癌の処置に使用するための上記のような抗体−薬物複合体に関する。より詳しい実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌、またはＩＧＦ−１Ｒ関連癌の処置に使用するための上記のような抗体−薬物複合体に関する。
【０２３０】
ＩＧＦ−１Ｒ関連癌としては、それらの表面でＩＧＦ−１Ｒの全部または一部を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含む。
【０２３１】
より詳しくは、前記癌は、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌および任意の薬物耐性現象である。
【０２３２】
別の態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のための、本発明による抗体−薬物複合体の使用に関する。
【０２３３】
本発明のもう１つの目的は、本明細書に記載されるような本発明による抗体、または抗体−薬物複合体、または免疫複合体を含んでなる医薬組成物である。
【０２３４】
より詳しくは、本発明は、本発明による抗体、または上記の抗体−薬物複合体、または免疫複合体と、少なくとも賦形剤および／または薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。
【０２３５】
本発明は、上記の抗体または抗体−薬物複合体と少なくとも賦形剤および／または薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。
【０２３６】
本明細書において、「薬学上許容可能なビヒクル」または「賦形剤」は、二次反応を誘発せずに医薬組成物中に入り、かつ、１または複数の有効化合物の投与の助長、内体でのその寿命および／またはその有効性の増強、溶液中でのその溶解度の増大またはその保存の改善を可能とする化合物または化合物の組合せを表すものとする。これらの薬学上許容可能なビヒクルおよび賦形剤は周知であり、選択された１または複数の化合物の性質および投与様式の関数として当業者により適合される。
【０２３７】
好ましくは、これらの免疫複合体は、全身経路により、特に、静脈内経路により、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路により、または経口経路により投与される。より好ましい様式では、免疫複合体を含んでなる組成物は、連続的に数回投与される。
【０２３８】
それらの投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、処置に対する忍容性および示される二次的影響など、患者に適合された処置の確立において一般に考慮される基準に従って決定することができる。
【０２３９】
別の態様では、本発明は、癌の処置に使用するための、本発明による抗体、または上記の抗体−薬物複合体、もしくは免疫複合体と少なくとも賦形剤および／または薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。より詳しい態様において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置に使用するための、本発明による抗体、または上記の抗体−薬物複合体、もしくは免疫複合体と少なくとも賦形剤および／または薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。
【０２４０】
本発明はまた、対象における癌の処置のための、特に、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のための方法であって、前記対象に有効量の少なくとも本発明による抗体−薬物複合体を投与することを含んでなる方法に関する。本発明はさらに、対象における癌の処置のための、特に、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のための方法であって、前記対象に有効量の本発明による医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【０２４１】
別の実施形態では、本発明は、対象のＩＧＦ−１Ｒ発現癌細胞に薬物または薬剤を送達する方法であって、前記対象に有効量の少なくとも本発明による抗体−薬物複合体、または本発明による医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【０２４２】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および判例が以下に表される図面とともに本明細書の続きで明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】図１：抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体により捕捉されたｈＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤにおいて３種類の抗体で得られたＢｉａｃｏｒｅ結合特性の例。
【図２】図２：５つのエピトープ基を定義した１５の抗ｈＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体のパネルから定義されたエピトープマッピングスキーム。これらの基の番号は、抗原の配列に関する位置にも３Ｄ構造に関する位置にも関連しない。
【図３】図３Ａ〜３Ｃ：ＦＡＣＳ分析によるヒト天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合。図３Ａは、ＭＣＦ−７細胞株での、各エピトープクラスタリンググループに代表的な１つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図３Ｂは、ＭＣＦ−７細胞株でのマウスおよびキメラ両方の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。図３Ｃは、ＭＣＦ−７細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＢｍａｘを表す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂ：トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞を用いたｈＩＧＦ−１Ｒ認識の評価。図４Ａは、ＩＧＦ−１Ｒ＋細胞株での、各エピトープクラスタリンググループに代表的な１つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図４Ｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ−細胞株での、各エピトープクラスタリンググループに代表的な１つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂ：トランスフェクト細胞を用いたｈＩＧＦ−１ＲとｈＩＲのＡｂの特異性の評価。図５Ａは、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞株でのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。図５Ｂは、ＩＲ＋細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。パネルＡおよびＢでは、ＧＲＯ５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）として記載される市販の抗ｈＩＲ抗体は陽性対照として導入されたものである。
【図６】図６：ＩＭ−９細胞株でのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。ＧＲＯ５抗ｈＩＲ  Ｍａｂは陽性対照として導入された。
【図７】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃ：サルＩＧＦ−１Ｒの認識の評価。図７Ａは、ＣＯＳ−７細胞株での、各エピトープクラスタリンググループに代表的な１つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図７Ｂは、ＣＯＳ−７細胞株でのマウスおよびキメラの両抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。図７Ｃは、ｈＩＧＦ−１Ｒ＋トランスフェクト細胞およびＣＯＳ−７細胞の両方での、キメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。
【図８】図８：Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いたｈＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤまたはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤいずれかにおけるｃ２０８Ｆ２結合の比較。カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトされたマウス抗Ｔａｇ  Ｈｉｓ抗体１１０００ＲＵ超で活性化したＣＭ５センサーチップを用いたＳＰＲ技術に基づくＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００で得られたセンサーグラム。実験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、２５℃にて３０μｌ／分の流速で行う。図は、分析の最初の注入の開始時にｘ軸上に、また、この最初の注入直前に定義されたベースラインによりｙ軸上に並べた４つの独立したセンサーグラムの重畳を示す。組換え可溶性ＩＧＦ１Ｒのヒトに基づく配列のキャプチャーで得られたセンサーグラムを菱形で示す。組換え可溶性ＩＧＦ−１Ｒのカニクイザルに基づく配列のキャプチャーで得られたセンサーグラムを三角で示す。白い記号はブランクサイクル（ランニングバッファーの５回の注入）に相当し、黒い記号は漸増濃度範囲のｃ２０８Ｆ２（５、１０、２０、４０および８０ｎＭ）の注入に相当する。
【図９】図９：ＩＧＦ１と比較した場合の受容体リン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の固有の効果の評価。
【図１０】図１０：マウス抗ｈＩＧＦ−１ＲによるＩＧＦ−１に応答したＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害。
【図１１】図１１：抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞表面結合は、３７℃でダウンレギュレートされる。ＭＣＦ−７細胞を４℃または３７℃で４時間、１０μｇ／ｍｌの各Ａｂとともにインキュベートした。図は、ΔＭＦＩを表す。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂ：抗体表面減衰。細胞表面結合抗体を３７℃で１０、２０、３０、６０および１２０分後に評価した。図１２Ａは、４℃で測定したシグナル強度と比較した残留ＩＧＦ−１Ｒ％を表す。図１２Ｂは、Ｐｒｉｍｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用い、指数減衰フィッティングを用いた半減期計算を表す。
【図１３】図１３：ＦＡＣＳ分析により評価された抗体内部移行の動態。細胞を１０μｇ／ｍｌのマウスＡｂとともに３７℃で０、３０または６０分間インキュベートした。細胞に透過処理を施し、または施さず、二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８とともにインキュベートした。膜は、シグナル強度ｗ／ｏ透過処理に相当する。全体は、細胞透過処理後のシグナル強度に相当し、細胞質は、内部移行したＡｂに相当する。各評価抗体の名称を各グラフの上に示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂ：Ａｂ内部移行の画像。図１４Ａ：ｍ２０８Ｆ２とともに４℃で２０分間インキュベートし、インキュベーション前［ａ）］、３７℃で１５分［ｂ）］、３０分［ｃ）］および６０分［ｄ）］洗浄したＭＣＦ−７細胞。細胞を固定し透過処理を施した。ｍ２０８Ｆ２  Ａｂは抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ４８８を用いて可視化し、Ｌａｍｐ−１はウサギ抗Ｌａｍｐ−１抗体を二次抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ５５５とともに用いて可視化した。図１４ＢパートＩ〜ＩＩＩ）：ＭＣＦ−７細胞を３７℃で３０分間、他の供試抗ｈＩＧＦ−１Ｒマウス抗体のそれぞれとともにインキュベートした後、上記のように染色した。共局在はＩｍａｇｅＪソフトウエアの共局在ハイライター(highliter)プラグインを用いて確認した。
【図１５】図１５：分解におけるリソソーム経路の関与。
【図１６】図１６：種々のｐＨでの抗ｈＩＧ−１Ｒマウス抗体の結合の評価。種々の抗体の結合のＥＣ５０を、ＭＣＦ−７で、５〜８の範囲の種々のｐＨのバッファーを用いて評価した。
【図１７】図１７：Ｆａｂ−ＺＡＰアッセイにおける、選択された抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの細胞傷害性誘導能の評価。Ａ）ＭＣＦ−７細胞を、ヒトＦａｂ−ＺＡＰキットと組み合わせ、漸増濃度のキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともにインキュベートした。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイを用いて測定した。ｃ９Ｇ４キメラ抗体を無関連抗体として用いた。Ｂ）Ａ）に示した結果からのＩＣ５０。
【図１８】図１８：ｉ）細胞傷害効力、ｉｉ）Ａｂ／ＩＧＦ−１Ｒ結合に及ぼすｐＨの影響、ｉｉｉ）ＩＧＦ−１により誘導されるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対するＡｂの効果およびｉｖ）抗体のクラスタリングの間の相関。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄ：ｃ２０８Ｆ２  Ｍａｂの第１のヒト化型の結合特徴。ｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３／ＶＬ３  ｍＡｂの結合特性をヒト細胞株ＭＣＦ−７（図１９Ａ）、サル細胞株ＣＯＳ−７（図１９Ｂ）およびヒトインスリン受容体を発現するトランスフェクトマウス細胞株（図１９Ｃ）で評価した。マウスおよびキメラの両２０８Ｆ２  ｍＡｂの結合を並行して評価した。トランスフェクト細胞株（図１９Ｄ）でのｈＩＲの発現を確認するために抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を用いた。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄ：ＩＨＣアッセイに使用したＡＦ３０５−ＮＡポリクローナル抗体のＥＬＩＳＡバリデーション。図２０Ａ：ｈＩＧＦ−１Ｒに対する結合、図２０Ｂ：ヒト組換えＩＲに対する結合。これらのｈＩＲトランスフェクト細胞では、対照Ａｂ  ＧＲＯ５（図２０Ｃ）に比べてトランスフェクト細胞（図２０Ｄ）により発現されたｈＩＲ  ＥＤＣおよび細胞ＩＲの認識は無かった。
【図２１】図２１：種々のレベルのｈＩＧＦ−１Ｒを発現する異種移植片からのＦＦＰＥ切片におけるｈＩＧＦ−１Ｒ染色のバリデーション。Ｈｓ７４６Ｔを陰性対照として導入した。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂ：正常ＦＦＰＥ組織切片上でのｈＩＧＦ−１Ｒ発現の評価。胎盤切片を正常組織の陽性対照として用い、ｈＩＧＦ−１Ｒ発現を較正するために各実施で陽性腫瘍異種移植組織を導入した。
【図２３】図２３：ＮＳＣＬ  ＦＦＰＥ組織切片上でのｈＩＧＦ−１Ｒ発現の評価。分析組織の大パネルで見られた強い染色を代表する４つのケース。
【図２４】図２４：乳癌ＦＦＰＥ組織切片上でのｈＩＧＦ−１Ｒ発現の評価。分析組織の供試パネルで見られた強い染色を代表する３つのケース。
【図２５】図２５：種々の腫瘍からのＦＦＰＥ組織切片上でのｈＩＧＦ−１Ｒ発現の評価。
【図２６】図２６：両フローセルにて、流速３０μｌ／分でランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトした１２．０００ＲＵ前後のマウス抗ＴａｇＨｉｓモノクローナル抗体で活性化したＣＭ５センサーチップを用い、２５℃の温度でＳＰＲに基づくＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置で得られたセンサーグラムの重畳。各センサーグラム（第１のものを三角で示し、第２のものを菱形で示す）は全サイクルに相当する。  １−第２のフローセルでの組換えｈ−ＩＧＦ−１Ｒ（１０μｇ／ｍｌ）の溶液の１分間の注入。  ２−第１のセンサーグラムでは：各９０秒で５回のランニングバッファーの注入。  第２のセンサーグラムでは：各９０秒で漸増濃度範囲での抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｃ２０８Ｆ２抗体溶液の５回の注入。  ３−解離動態速度の決定のための３００秒の減衰。  ４−１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファーの４５秒の注入による表面の再生。
【図２７】図２７：漸増濃度範囲の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｃ２０８Ｆ２溶液で得られたセンサーグラムに対するブランクセンサーグラム（ＨＢＳ−ＥＰ＋の５回の注入）の減算に相当するセンサーグラムを灰色で示す。下記パラメーター：ｋｏｎ＝（１．２０６±０．０３６）×１０６Ｍ−１．ｓ−１、ｋｏｆｆ＝（７．８１±０．１８）×１０−５ｓ−１、Ｒｍａｘ＝３０７．６±０．３ＲＵを用いた１：１モデルに相当する理論的センサーグラムを細い黒線で示す。ｃ２０８Ｆ２の算出濃度をグラフに示す：最高濃度（２４ｎＭ）のみを定数と見なす）。
【図２８】図２８：解離定数は各抗体に関して行った４回の実験の平均に相当し、ｐＭ単位で表される比：ｋｏｆｆ／ｋｏｎ×１０１２に相当する。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【図２９】図２９：半減期は、各抗体に関して行った４回の実験の平均に相当し、時間の単位で表される比：Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆ／３６００に相当する。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【図３０】図３０：流速３０μｌ／分、２５℃でｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置にて行う２サイクルの試験に相当する２つのセンサーグラムの重畳。  このサイクルの第１段階は、カルボキシメチルデキストランマトリックスにそのアミン官能基により化学的に連結された１０，５００ＲＵを越えるマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃモノクローナル抗体のグラフトにより活性化したＣＭ５センサーチップの第２のフローセルに１０μｇ／ｍｌ濃度のｃ２０８Ｆ２抗体の溶液を６０秒間注入すること相当する。第２段階は、粗細胞培地上清のｈ−ＩＧＦ−１Ｒ溶液（無修飾の菱形）またはｍ−ＩＧＦ−１Ｒ溶液（白ぬきの菱形）のいずれかの細胞外ドメインを、１２０秒の遅延で１２０秒間注入することに相当する。頭が２つある矢印は、本試験で使用した抗体捕捉レベルおよびＩＧＦ−１Ｒ結合レベルの測定点を示す。
【図３１】図３１：各キメラｈ／ｍ  ＩＧＦ−１Ｒ構築物に関して得られたＩＧＦ−１Ｒ結合レベルと対応するサイクル中にセンサーチップの第２のフローセルに捕捉されたｃ２０８Ｆ２のレベルの間の比を表すヒストグラム。
【図３２】図３２ＡおよびＢ：ｐＨ５〜８に対するｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０７６／Ｌ０２４のＥＣ５０を表すヒストグラム、酸性ｐＨは、ヒト化ＩＧＦ−１Ｒ抗体ｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０７６／Ｌ０２４（Ａ）およびｈｚ２０８Ｆ２（Ｈ０７７／Ｌ０１８（Ｂ）の結合能を低下させる。
【図３３】図３３：１７０ＲＵのｈ−ＩＧＦ１Ｒ（黒い菱形）の可溶形態の野生型のまたは１２０ＲＵのこの受容体の突然変異体Ｃ２９（Ａｓｐ４９１＞Ａｌａ）のいずれかに対するＨｚ２０８Ｆ２（１０μｇ／ｍｌ）の結合。各受容体はＣＭ５センサーチップ上のそれらのＣ末端６６Ｈｉｓ  Ｔａｇにより捕捉される。試験はランニングバッファーとして古典的なＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、２５℃、流速３０μｌ／分で、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置を用いて実施した。
【実施例】
【０２４４】
本発明で述べたハイブリドーマはＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託され、下表７に示される。
【０２４５】
【表８】
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【０２４６】
実施例１：ＩＧＦ−１Ｒ抗体の作製
ヒトＩＧＦ−１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対して生成したマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを１０μｇのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９１−ＧＲ）で３回皮下免疫した。別途、一部の動物で、１０μｇのＩＧＦ−１Ｒマウス細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６６３０−ＧＲ／Ｆｃ）での３回の付加的免疫誘導も行った。初回の免疫誘導はフロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。以降の免疫誘導にはフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。融合３日前に、免疫マウスに１０μｇのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質で追加免疫を行った。次に、脾細胞およびリンパ球をそれぞれ脾臓の灌流および近位リンパ節の細断により調製し、５個体の免疫マウスのうち１個体（総てのマウスの血清力価測定の後に選択）から採取し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合させた。融合プロトコールはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されている。融合細胞に対してＨＡＴ選択を行う。一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製には、特にマニュアル“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術を参照することができる。融合のおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングとして、ハイブリドーマの上清を、ヒト乳房ＭＣＦ７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）および／または細胞表面にサルＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＯＳ７細胞（アフリカミドリザル腎臓ＳＶ４０形質転換）を用いたＦＡＣＳ分析によって、ｒｈＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対して生成したＭａｂの分泌に関して評価した。より厳密には、フローサイトメトリーによる選択のために、１０５細胞（ＭＣＦ７またはＣＯＳ７のいずれか）を９６ウェルプレートの各ウェルの１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後に、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｒｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｓ  Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）で１／５００希釈したＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄後、各試験管に終濃度４０μｇ／ｍｌでヨウ化プロピジウムを加えた後に、ＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により細胞を分析した。細胞単独およびＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート二次抗体ともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。アイソタイプ対照を各実験で使用した（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）。蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を算出するために少なくとも５０００細胞を評価した。
【０２４７】
加えて、内部移行する抗体のみを選択するために内部移行アッセイを行った。このアッセイでは、ＭＣＦ７腫瘍細胞株を試験前にフェノールレッド不含の、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％のＦＡＣＳを含むＲＭＰＩ  １６４０中で３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、１００μｌの細胞懸濁液を４．１０５細胞／ｍｌで、９６マルチウェルプレートのフェノールレッド不含の、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後に、細胞を５０μｌのハイブリドーマ上清または対照抗体溶液（１μｇ／ｍｌの陽性対照およびアイソタイプ対照）に再懸濁させた。４℃で２０分のインキュベーション時間の後、細胞を２０００ｒｐｍで２分遠心分離し、冷（４℃）または温（３７℃）いずれかの完全培養培地に再懸濁させた。次に、細胞を３７℃または４℃のいずれかで２時間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ  ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を２０分間インキュベートし、細胞を３回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞集団でのＦＡＣＳ分析を行った。
【０２４８】
ＦＡＣＳ分析の後、（ｉ）ハイブリドーマ上清とともに、４℃でインキュベートした細胞の表面上で検出された蛍光シグナルと、３７℃でインキュベートした細胞で得られたものとの差異、および（ｉｉ）細胞表面上に残留するＩＧＦ−１Ｒのパーセンテージの、２つのパラメーターを決定した。
【０２４９】
残留ｈＩＧＦ  １Ｒのパーセンテージは、下記のように算出される：
％残留ＩＧＦ−１Ｒ＝（ＭＦＩＡｂ  ３７℃／ＭＦＩＡｂ  ４℃）×１００。
【０２５０】
加えて、組換えヒト（ｈＩＧＦ−１Ｒ）およびマウス（ｍＩＧＦ−１Ｒ）タンパク質、ならびに組換えヒトインスリン受容体（ｈＩＲ）タンパク質への抗体結合を検討するために、３種類のＥＬＩＳＡを行った（クローニング前または後のいずれか）。ｒｈ−ＩＧＦ−１Ｒおよび／またはｒｍ−ＩＧＦ−１Ｒへの結合を示し、ｒｈＩＲには結合しない抗体を分泌するハイブリドーマを保持した。簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を４℃にて一晩、ＰＢＳ中０．６μｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９１−ＧＲ）または１μｇ／ｍｌのｒｍＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６６３０−ＧＲ／Ｆｃ）または１μｇ／ｍｌのｒｈＩＲタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４４−ＩＲ／ＣＦ）１００μｌ／ウェルでコーティングした。次に、これらのプレートを３７℃にて２時間、０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳ（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）でブロッキングした。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出したところで、ウェルに１００μｌの各上清希釈液（無希釈ハイブリドーマ上清も上清連続希釈液も）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、１００μｌセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中１／５０００希釈で３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加える。室温で１０分のインキュベーション時間後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍでの光学密度を測定する。
【０２５１】
対象とする抗体を分泌するハイブリドーマを拡大培養し、限界希釈によりクローニングした。アイソタイプ分類を行ったところで、各コードの１クローンを拡大培養し、凍結させた。さらなる特性決定のため、対象とする各抗体をＣｅｌｌＬｉｎｅ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と呼ばれるｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産系で生産した。
【０２５２】
ＦＡＣＳ分析により結合特異性に取り組むためのさらなるアッセイを、ＩＭ９細胞（ヒトＩＲ発現Ｂリンパ芽球）ならびにｈＩＧＦ−１Ｒトランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞に対して行った。
【０２５３】
選択された抗体に対応するデータを総て表８にまとめた。ｉ）ｈＩＧＦ−１ＲとｈＩＲに対するそれらの選択性およびｉｉ）それらのＩＧＦ−１Ｒの内部移行を誘導する能力に基づいて選択された抗体のうち、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳの両状況でそれらの標的を認識することができるものもあれば、サイトメトリーにより試験した場合には極めて良好な結合剤であるが、ＥＬＩＳＡにより評価した場合に良好とは言えない結合剤であるものもあった。ｍ２８０Ｆ２、ｍ２１２Ａ１１、ｍ２１３Ｂ１０、ｍ２１４Ｆ８およびｍ２１９Ｄ６は後者の群に属し、コーティングされたタンパク質を十分に認識しなかったことに注目することが興味深い。
【０２５４】
【表９】
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【０２５５】
実施例２：ＢｉａｃｏｒｅのＳＰＲに基づく技術を用いたマッピング試験による抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体エピトープクラスタリングの特性決定
ＩＧＦ−１Ｒに対する応答の多様性を検討するために、選択された抗体をＢｉａｃｏｒｅによりマッピングし、競合特性によるこれらの抗体のクラスタリングを行った。
【０２５６】
簡単に述べれば、エピトープマッピング試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ装置にて、抗Ｔａｇ  Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓ捕捉キットＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号２８−９９５０−５６）により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて実施した。１１０００ＲＵを越える抗体を、アミンキット化学を用いてカルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトした。これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈の両バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速１μｌ／分で行った。
【０２５７】
エピトープマッピング試験は同じスキームに従った：
１−可溶型のｈＩＧＦ−１Ｒヘテロ四量体（２本のα鎖と、付加的なＣ末端１０Ｈｉｓタグ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ）とともに発現される２本のβ鎖の細胞外ドメイン）の溶液を１分間両フローセルに５μｇ／ｍｌの濃度で注入する。
２−次に、ｈＩＧＦ−１Ｒ結合部位の飽和（または少なくとも飽和付近）を達成するために、供試する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の溶液（従来５０μｇ／ｍｌ）を、フローセル１にのみ６０〜９０秒の間注入する。
３−潜在的競合因子として使用する第２の抗体の溶液を、同じ条件で両フローセルまたは第２のフローセルにのみ注入する。
４−最後に、第３の抗体の溶液を同じ条件で両フローセル注入してもよい。
５−その後、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファーを３０秒間注入することで表面を再生する。
【０２５８】
この種の試験は、２つの抗体がｈＩＧＦ−１Ｒの同じ分子に同時に結合し得るかどうかを明らかに示し、各抗体の結合領域（エピトープ）がこれを可能とするために十分離れていることを証明する。これに対し、抗体とｈＩＧＦ−１Ｒの結合が第２の抗体の結合を妨げれば、両抗体により同じエピトープが認識されたことが示唆される。最後に、部分的競合の場合には、２つの供試抗体により認識されたエピトープの重なりが推測できる。このようにしてエピトープ領域基が定義される。この結果の複雑性は一般に試験に使用する抗体パネルの大きさとともに増大する。
【０２５９】
図１は、ＳＰＲに基づくＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ装置を用いたエピトープマッピング試験の典型的なサイクルの例を示す。センサーグラムは、フローセル１（黒い菱形）および２（白い菱形）の時間（秒）の関数としての応答（ＲＵ）を示す。第１相で、抗原、すなわち、２つのＣ末端１０−Ｈｉｓタグを有する可溶性組換え型ｈＩＧＦ−１Ｒの溶液を、抗Ｈｉｓ  Ｔａｇマウス抗体をカルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的に連結したＣＭ５センサーチップの両フローセルに、濃度５μｇ／ｍｌ、流速１０μｌ／分で注入する。
【０２６０】
第２相では、第１の供試抗体（２１９Ｄ６）の、濃度５０μｇ／ｍｌの溶液をフローセル１に注入する。次に、第３相で、第２の抗体（１０１Ｈ８）の、濃度５０μｇ／ｍｌの溶液をフローセル２に注入した後、第４相で、第３の抗体（２０１Ｆ１）の、濃度５０μｇ／ｍｌの溶液を両フローセルに注入する。この注入の応答は、ＩＧＦ−１Ｒへの２０１Ｆ１の結合が１０１Ｈ８によって妨げられるが２１９Ｄ６によっては妨げられないことを明らかに示す。抗体２０１Ｆ１および２１９Ｄ６は、明らかに異なるエピトープ群に属す。１５の選択候補の全分析に対するクラスタリング結果を図２に示し、ｈＩＧＦ−１Ｒによるマウスの免疫誘導が良好な多様性を示す一連の抗体を生成することが実証された。実際に、異なるエピトープを認識する５つの異なるＭａｂ群が生成された。
【０２６１】
実施例３：ＦＡＣＳ分析によるヒト天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合
一連の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合特性をヒトＭＣＦ−７乳腺癌細胞株（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）にて漸増抗体濃度を用い、ＦＡＣＳ分析により評価した。この目的で、細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を４℃にてＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともに２０分間インキュベートした。次に、それらの細胞を３回洗浄し、暗所、４℃にてさらに２０分間、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。各抗体で得られたシグナル強度の最大値をＢｍａｘと呼び、蛍光強度の平均（ＭＦＩ）で表した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０２６２】
各マウスまたはキメラＡｂの力価測定曲線は、生成した総ての抗体が典型的な飽和特性で天然ＩＧＦ−１Ｒ型を認識できることを示した（図３Ａ）。抗体のランク付けを行い、マウスおよびキメラの両Ａｂの結合特性を比較するために、各化合物の結合ＥＣ５０を、非直線回帰分析を用いて決定した。各マウスＡｂとその対応するキメラ型のＥＣ５０の比較は、これら２つの形態が同じ結合特性を示し、Ａｂのキメラ化がＩＧＦ−１Ｒ認識に影響を及ぼさなかったことを示した（図３Ｂ）。ＥＣ５０は１．２×１０−８〜４．４×１０−１０の間の範囲であった。群２に属す抗体および群３ａに属すｃ１０２Ｈ８はとり良好なＥＣ５０を示した。Ｂｍａｘ分析（図３Ｃ）については、３つのＡｂ（４１４Ｅ１（Ｇ３ｂ）、１０５Ｇ２（Ｇ４）および８３２Ｅ５（Ｇ５）が、他のものに比べて低いＢｍａｘを有していた。ＥＣ５０値およびＢｍａｘ値を表９にまとめた。
【０２６３】
【表１０】
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【０２６４】
実施例４：有意なレベルのＩＲを天然に発現するＩＧＦ−１ＲまたはＩＲトランスフェクト細胞またはＩＭ９細胞のいずれかを使用することによる抗体特異性の確認
生成された抗体のｈＩＧＦ−１ＲとｈＩＲに対する特異性を確認するために、ｈＩＧＦ−１ＲまたはｈＩＲのいずれかを発現する安定なトランスフェクト体を、ＦＡＣＳ分析により評価した。簡単に述べれば、漸増濃度のキメラｍＡｂをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、細胞とともにインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０２６５】
ｈＩＧＦ−１Ｒトランスフェクト細胞株（図４Ａ）と非トランスフェクト細胞で得られた力価測定曲線（図４Ｂ）から、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するキメラＡｂの結合特異性が確認された。ＥＣ５０値およびＢｍａｘ値を表１０にまとめた。このアッセイでは、群Ｇ２およびＧ３ａの抗体は最良のＥＣ５０を示した。
【０２６６】
【表１１】
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【０２６７】
ｈＩＲへのマウスおよびキメラの両抗体の結合の不在を確認するために、ヒトＩＲを発現する安定な細胞株を用いた。マウスおよびキメラの両Ａｂによるヒト細胞表面ｈＩＲの認識は、ＦＡＣＳ分析により行った。漸増濃度のマウスまたはキメラいずれのｍＡｂをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃にて２０分間、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞株上でインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。市販の特異的抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、クローンＧＲ１１Ｌおよび抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を陽性対照として用いた。ｃ９Ｇ４を無関連抗体（アイソタイプ対照）として導入した。
【０２６８】
トランスフェクト細胞の細胞表面での高レベルのｈＩＲ発現は、市販の抗ｈＩＲ抗体ＧＲＯ５を用いて確認した。高濃度のマウス（図５Ａ）またはキメラ（図５Ｂ）いずれかの抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂを用いても、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞の細胞表面での結合は見られなかった。これらの結果は、マウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂもキメラ抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  ＡｂもｈＩＲを認識しなかったことを示した。
【０２６９】
ｈＩＧＦ−１ＲとＩＲの認識のこの特異性はまた、ｈＩＲを発現するＢリンパ腫細胞株であるＩＭ９細胞を用いても示された（図６）。このＦＡＣＳ分析では、プロトコールは従前に記載のものと同じであり、抗ヒト二次Ａｂの交差反応性を避けるためにマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた（ＩＭ９細胞はそれらの細胞表面にヒトＩｇを発現する）。図６に示す結果は、ここでも、ＧＲＯ５抗ｈＩＲ抗体を用いた場合にも予想されたシグナルが見られたが、評価したマウス抗体にこの細胞株上で有意な結合シグナルを示したものはなかったことを示した。
【０２７０】
実施例５：ＦＡＣＳ分析およびＢｉａｃｏｒｅ分析によるサル天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合
規制毒性試験の第１の前提条件の１つは、選択された化合物を評価するために適切な動物種を特定することである。本明細書に記載の抗体系列はマウスＩＧＦ−１Ｒを認識できないので、毒性評価に最も可能性のある種は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。
【０２７１】
サルＩＧＦ−１Ｒに対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合を評価するために、マウスおよびキメラの両抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合を、漸増抗体濃度を用い、ＣＯＳ−７細胞株でＦＡＣＳ分析により評価した。細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、最後にＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認される生細胞に対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合をすぐに評価した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０２７２】
ＣＯＳ−７サル細胞株で得られた力価測定曲線は、８３２Ｅ５  ｍＡを除き、総ての抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂがサル細胞株の表面で発現されたＩＧＦ−１Ｒを特異的に認識したことを示した（図７Ａ）。マウスおよびキメラの各Ａｂに関するＥＣ５０の決定は、これらの２形態はサルＩＧＦ−１Ｒに対するそれらの結合特性に関して十分匹敵したことを示した（図７Ｂ）。これらの結果は、ｍＡｂ  ８３２Ｅ５を除き、生成された総ての抗ｈＩＧＦ−１ＲがサルＩＧＦ−１Ｒを認識したことを示した。
【０２７３】
ヒトとサルのＩＧＦ−１Ｒに対するキメラ抗体認識の大きさを確認するために、ＣＯＳ−７細胞とトランスフェクトＩＧＦ−１Ｒ細胞での結合ＥＣ５０の比較を行った。図７Ｂに示される結果は、８３２Ｅ５  ｍＡｂを除き、総ての抗体によるヒトおよびサルＩＧＦ−１Ｒの同等の認識を示した。
【０２７４】
別の種類のサルにおける認識を確認するために、細胞をＩＧＦ−１Ｒ型カニクイザルでトランスフェクトして可溶性サルＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤを作製し、ｈＩＧＦ−１ＲまたはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒのいずれかに対するその結合特性を比較するためにキメラ抗体の１つ（ｃ２０８Ｆ２）を用いてＢｉａｃｏｒｅ試験を行った。
【０２７５】
認識試験は、Ｘ１００装置にて、抗Ｔａｇ  Ｈｉｓ抗体（ＨｉｓキャプチャーキットＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号２８−９９５０−５６）により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて行った。アミンキット化学を用い、１１０００ＲＵを越える抗体をカルボキシメチルデキストラン(carboxymethyldextan)マトリックスに化学的にグラフトした。これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。マカク属ＩＧＦ−１Ｒと比較してｈＩＧＦ−１Ｒに対する２０８Ｆ２抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のキメラ型（ｃ２０８Ｆ２）の結合の速度パラメーターを定義するためにシングルサイクル動態スキームを用いた。
【０２７６】
ヒト（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ−５０）またはカニクイザル（自家作製）のうち１つのいずれかの配列に基づく、２本のβ鎖と、付加的なＣ末端１０Ｈｉｓタグとともに発現される２本のα鎖の細胞外ドメインから構成されるＩＧＦ−１Ｒヘテロ四量体の可溶性組換え型の溶液を、１６０ＲＵ前後の抗原を捕捉するために定義された希釈で第２のフローセルに１分注入した。第２の抗体の溶液を同じ条件で両フローセルまたは第２のフローセルのみに注入する。捕捉相の後、両フローセルにランニングバッファーを５回注入するか（各９０秒注入）、または漸増する５種類の濃度範囲のｃ２０８Ｆ２を注入した（各９０秒注入）。５回目の注入の終了時に、解離速度を定義するためにランニングバッファーを通した。次に、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファーを３０秒間注入して表面を再生した。
【０２７７】
コンピューターで計算されたシグナルは、フローセル２（捕捉されたＩＧＦ−１Ｒを含む）の応答とフローセル１（ＩＧＦ−１Ｒ分子を含まない）の応答の間の差異に相当する（図８）。
【０２７８】
各ＩＧＦ−１Ｒ分子（ヒトまたはカニクイザル）に関して、漸増濃度範囲のｃ２０８Ｆ２の注入によるシグナルを、５回のバッファー注入で得られたシグナル（二重参照）の減算により補正した。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを１：１モデルとともに用いて分析した。動態速度は独立に（各ＩＧＦ−１Ｒに対するｃ２０８Ｆ２の結合の２つの動態速度）または一般に（ヒトおよびカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに対するｃ２０８Ｆ２の結合の同じ動態速度）評価する。フィッティングの質は、０．０５ＲＵ未満のＣｈｉ２／Ｒｍａｘ比により評価した。
【０２７９】
各ＩＧＦ−１Ｒに関して個別に定義された結合の動態速度（表１１参照）は近く、同じ動態速度を有する両センサーグラムのフィッティングは良好な質である。ｃ２０８Ｆ２抗体は、組換えヒトＩＧＦ−１ＲとカニクイザルＩＧＦ−１Ｒを約０．２ｎＭの解離定数（ＫＤ）で同様に認識する。この研究で定義された親和性は、１６０ＲＵ前後の捕捉ヒトおよびカニクイザルＩＧＦ−１Ｒレベルに関しての抗体の機能的親和性（またはアビディティー）に相当する。
【０２８０】
【表１２】
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【０２８１】
実施例６：ＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対する生成抗体の固有の効果
抗体チロシンキナーゼ受容体と結合した際に促進作用を誘導し得ることはよく知られている。本発明者らはこのようなアゴニスト抗体を選択したくはなかったので、キメラ抗体を用いてｈＩＧＦ−１Ｒリン酸化の評価を検討した。
【０２８２】
この目的で、ＭＣＦ−７細胞を無血清培地で一晩インキュベートした。次に、ＩＧＦ−１（１００ｎＭ）または供試Ａｂのいずれかを３７℃で１０分間加えた（１０μｇ／ｍｌ）。培地を排出し、細胞を４℃にて９０分間、ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＮａＣｌ（１Ｍ）、１０％洗剤混合物（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、１個のプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ錠（Ｒｏｃｈｅ）、１％ホスファターゼ阻害剤カクテルＳｅｔ  ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する溶解バッファー（ｐＨ７．５）中でかき集めさせた。これらの溶解液を４℃での遠心分離により明澄化し、１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った後、ＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行った。メンブランをＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をＥＣＬで可視化した。ブロットを、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用いて定量した。ＧＡＰＤＨを用いてホスホタンパク質値を正規化した。ＩＧＦ−１に応答したｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を１００％の刺激と見なした。ｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの効果を、ＩＧＦ−１により誘導されたリン酸化の％として求めた。
【０２８３】
図９に記載される結果は、ＩＧＦ−１と比較した場合の３回の独立した実験のキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂに応答したｐＩＧＦ−１Ｒの％の平均＋／−Ｓ．Ｄ．を表す。示されたように、ＭＣＦ−７細胞が１０μｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂとともにインキュベートされた場合に、ｈＩＧＦ−１Ｒの有意なリン酸化は検出されなかったか、または低い（＜２０％）しか検出されなかった。
【０２８４】
実施例７：マウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体による、ＩＧＦ−１に応答したＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害
選択された抗体の特性決定を行うために、ＩＧＦ１により誘導されたリン酸化を阻害するそれらの能力を検討した。この目的で、ＭＣＦ−７細胞を無血清培地で一晩インキュベートした。次に、細胞をマウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂとともに５分間インキュベートした後、３７℃で２分間ＩＧＦ−１を添加した。培地を排出し、細胞を４℃で９０分間、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＮａＣｌ（１Ｍ）、１０％洗剤混合物（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、１個のプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ錠（Ｒｏｃｈｅ）、１％ホスファターゼ阻害剤カクテルＳｅｔ  ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する溶解バッファー（ｐＨ７．５）中で崩壊させた。これらの溶解液を４℃での遠心分離により明澄化し、１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った後、ＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行った。メンブランをＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をＥＣＬで可視化した。ブロットを、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用いて定量した。ＧＡＰＤＨを用いてホスホタンパク質値を正規化した。ＩＧＦ−１に応答したｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を１００％の刺激と見なした。ｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの効果を、ＩＧＦ−１により誘導されたリン酸化の％として求めた。
【０２８５】
無関連マウス抗体であるｍ１０５Ｇ２、ｍ１０１Ｈ８またはｍ９Ｇ４のいずれかの添加は、ＩＧＦ−１に応答してｈＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害しなかった（図１０）。ｍ２０１Ｆ１の添加は、ＩＧＦ−１に応答してあまり大きくはないがｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を低下させた（約４０％の低下）。他の総ての抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡｂがＩＧＦ−１に応答してｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を強く阻害した（８０％を超える定価）。ＩＧＦ１により誘導されたｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の最良の阻害剤は、ｍ２０８Ｆ２、ｍ２１２Ａ１１およびｍ２１４Ｆ８  Ｍａｂである。
【０２８６】
実施例８：ＦＡＣＳ分析による生成した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合後のＩＧＦ−１Ｒ内部移行の研究
ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのキメラ抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて、二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩとの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを図１１Ａおよび１１Ｂならびに表１２に示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂの内部移行パーセンテージは、次：１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩのように算出され、表１１に示された。各キメラ抗体に関して計算されたΔＭＦＩの最大値（図１１Ａおよび１１Ｂ）は、群と内部移行の最大値の間の相関を示さなかった。
【０２８７】
【表１３】
2017513898.tif 000015
【０２８８】
サルＩＧＦ−１Ｒも認識した抗体がこの受容体を内部移行することができたかどうかを決定するために、同じ内部移行試験を行った。表１３にまとめた結果は、総ての供試抗体がサルＩＧＦ−１Ｒ内部移行を媒介できたことを示した。
【０２８９】
【表１４】
2017513898.tif 000016
【０２９０】
細胞表面結合抗体減少の動態をさらに評価した。この目的で、ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートに播種し、４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのマウスとともにインキュベートした。次に、３７℃にて１０、２０、３０、６０または１２０分間、培地中で細胞を洗浄して結合してない抗体を除去した。各時点で、細胞を遠心分離した後、氷上にて二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８で表面標識して、細胞表面に残留する抗体の量を決定した。各マウスＡｂおよび各時点の蛍光強度を４℃でのシグナル（残留ＩＧＦ−１Ｒ％）により正規化し、指数減衰に当てはめて半減期（ｔ１／２）を求めた。ｔ１／２は、４℃で測定されたシグナルの５０％の低下を得るために必要な時間と考えた。図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、総てのマウスＡｂの表面レベルは最初の３０分で急速に低下し、低下は６０分のインキュベーション後にほぼ最大となった（図１２Ａ）。算出された半減期はマウスＡｂに関して１０〜１８分の間を含んだ（図１２Ｂ）。抗体表面減衰とのＡｂ基の間に相関は存在しなかった。
【０２９１】
細胞表面シグナルの低下がＡｂの内部移行によるものであって、受容体の脱落によるものではなかったことを確認するために、細胞を３７℃で０、３０および６０分間、マウスＡｂとともにインキュベートした（図１３）。次に、細胞結合抗体（ｗ／ｏ透過処理）および細胞表面結合＋内部移行Ａｂ（透過処理有り）に相当する全抗体シグナルを決定するために、細胞を固定し、透過処理を施すか、または施さなかった。内部移行Ａｂ（細胞質）の量は次のように決定した：透過処理後のＭＦＩ−ＭＦＩ  ｗ／ｏ透過処理。この試験は、細胞表面結合Ａｂの減少は細胞質Ａｂの増加によるものであり、Ａｂが内部移行したことを示すということを示した（図１３）。加えて、透過処理後のシグナル（全体）の低下により示されるように、Ａｂの分解は１時間のインキュベーション後に始まった。
【０２９２】
実施例９：共焦点分析による生成した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合後のＩＧＦ−１Ｒ内部移行の研究
抗体の内部移行をさらに確認するため、細胞輸送後の抗体の細胞下分布を評価するために共焦点顕微鏡観察を行った。細胞を抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂ  ３７℃とともにインキュベートし、固定し、透過処理を施した。従って、細胞を、二次抗体Ａｌｅｘａ−４８８をウサギ抗ｌＬａｍｐ−１抗体（二次抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ５５５を用いて可視化した）を用いて染色した。３７℃でのインキュベーション前に、マウス２０８Ｆ２  ＡｂはＭＣＦ−７細胞の膜上に局在し（図１４Ａ）、ＩｍａｇｅＪソフトウエアの共局在ハイライタープラグインを用いてリソソームマーカーｌａｍｐ−１との共局在は見られなかった。細胞表面結合抗体は、１５分のインキュベーション後に劇的に減少した。細胞表面結合抗体の減少と同時に、細胞内抗体が小胞に検出された。ｌａｍｐ−１との共局在はまれにしか見られなかった。３０分のインキュベーション後に、細胞表面結合抗体はほとんど検出されなかった。しかしながら、リソソームでのＡｂの共局在は増加した。１時間のインキュベーション後には、細胞内Ａｂ染色ならびにｌａｍｐ−１との共局在数は低下した。細胞表面結合抗体のこの動態およびその細胞内蓄積は、ＦＡＣＳによる抗体表面減衰尺度の動態と相関していた。加えて、ＦＡＣＳ試験ですでに記載したように、マウスＡｂの分解は、共焦点顕微鏡によれば、１時間のインキュベーション後に始まった。
【０２９３】
他の総ての抗ｈＩＧＦ−１Ｒマウス抗体の内部移行およびそれらのＬａｍｐ−１との共局在もまた評価した（図１４Ｂ）。
【０２９４】
実施例１０：リソソーム阻害剤バフィロマイシンＡ１を用いたＡｂ分解の阻害
抗体がリソソームに到達してそこで分解されることを確認するために、細胞をリソソーム機能の強力な阻害剤であるバフィロマイシンＡ１で処理したか、または非処理とした。次に、細胞を４℃で１０μｇ／ｍｌの供試Ａｂとともにインキュベートし、洗浄し、３７℃で２時間インキュベートした。内部移行したＡｂは細胞透過処理後に二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８  Ａｂを用いて検出された。バフィロマイシンＡ１の添加は細胞内Ａｂの分解を防ぎ（図１５）、このことはＡｂが効果的に内部移行され、リソソームで分解されたことを示す。
【０２９５】
実施例１１：抗体−ＩＧＦ−１Ｒ結合に対するｐＨの影響および細胞傷害効力との相関
抗体はそれらの内部移行能に基づいて選択され、リソソームコンパートメントに入る前に初期エンドソームと共局在することが上記で示されたので、対象とするアプローチは、Ａｂ−ｈＩＧＦ−１Ｒ結合の安定性がｐＨ環境によって調節された抗体、優先的には、ｐＨ環境が酸性となった場合にＩＧＦ−１Ｒから優先的に解離される抗体を選択することからなった。実際に、初期エンドソームとリソソームの間の主要な違いはそれらの管腔ｐＨであり、エンドソームコンパートメントではｐＨはおよそ６であり、リソソームコンパートメントではｐＨは約４．５である。
【０２９６】
リガンド結合（ＩＧＦ１）後にひと度、内部移行されると、ｈＩＧＦ−１Ｒは再循環経路を介して細胞表面に戻ることがよく知られている。
【０２９７】
特定の理論に関連付けるものではないが、本明細書の仮説は、酸性ｐＨで早期にそれらの標的からより放出されやすい抗体はおそらく膜への標的再循環に有利であり、結果として、免疫複合体アプローチのより良い候補と考えられるはずであるというものである。本発明者らの抗体にこのような特性を示すものがあるか、また、この特性が細胞傷害活性と相関するかどうかを検討するために、ＭＣＦ−７細胞株でのマウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ｍａｂの結合を、種々のｐＨのバッファー中で行った。漸増濃度のマウスｍＡｂをＭＣＦ−７細胞株上で４℃にて２０分間、５〜８の範囲の種々のｐＨでインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中で、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした。細胞を暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０２９８】
エピトープクラスター群３Ｂに属す抗ｈＩＧＦ−１ＲのＥＣ５０にｐＨによる有意な影響は無かった（図１６）。エピトープクラスター群３ａに属す抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合能は酸性ｐＨで増強される場合が多かった。これに対して、エピトープクラスター群１、２および４に属す抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合能は、酸性ｐＨで低下した。
【０２９９】
酸性ｐＨが免疫複合体により誘導される細胞傷害性にプラスの影響を持つかどうかを決定する目的で、市販のＦａｂ−ＺＡＰヒトアッセイ（ＡＴＳ  ＢＩＯ）を使用した。簡単に述べれば、ＭＣＦ７細胞を９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルで播種し、一晩放置して接着させた。翌日、細胞を０．４５μｇ／ｍｌのＦａｂ−ＺＡＰおよび漸増濃度のキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂで処理した。細胞表面に結合しないｃ９Ｇ４モノクローナル抗体を陰性対照として用いた。６日目に、細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ（メディソン、Ｗｉ）からのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ細胞生存率アッセイを用いて測定した。図１７Ａに示されるように、群４および５の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡｂはＭＣＦ−７に対して細胞傷害性を誘導しなかったが、他の群では中等度の細胞傷害性（群１、３ａおよび３ｂ）から高い細胞傷害性（群２）が測定された。図１７Ｂでは、ＩＣ５０の測定により、群２が最高の細胞傷害効力を有し、これらの抗体がＡＤＣ（抗体薬物複合体）またはＡＴＣアプローチに最も好適であることが示唆された。
【０３００】
図１７にまとめられた結果は、評価した１５のキメラｍａｂのうち、最良の細胞傷害作用は、総て群２に属すｃ２０８Ｆ２、ｃ２１９Ｄ５、ｃ２１２Ａ１１、ｃ２１３Ｂ１０およびｃ２１４Ｆ８で達成されたことを示した。しかしながら、ＩＧＦ−１Ｒ結合に関して酸性ｐＨ感受性も示す群１および４の他の抗体も、細胞傷害性の最良の候補としてクラスタリングされず、この特性は群２の抗体の特定の特性を説明するには必要ではあるが十分でないことが示唆された。この抗体セット特定の特徴をより良く理解するために、生成された抗体の総てについて利用できるデータに関して相関試験を行った。この分析の結果は、最良の細胞傷害活性を得るにはリン酸化の阻害と酸性ｐＨ環境でのｈＩＧＦ−１Ｒへの結合能の低下の両方が必要であることを示唆した（図１８）。実際に、酸性ｐＨ環境で結合が低下したが不十分なリン酸化阻害剤であった１０１Ｈ８（Ｇ１）、２０１Ｆ１（Ｇ１）および１０５Ｇ２（Ｇ４）は、低い細胞傷害活性を示した。他方、１０２Ｈ８（Ｇ３ａ）、１１０Ｇ９（Ｇ３ａ）、４１５Ａ８（Ｇ３ａ）、４１０Ｇ４（Ｇ３ｂ）、４１４Ｅ１（Ｇ３ｂ）および４３３Ｈ９（Ｇ３ｂ）は、ＩＧＦ１により誘導されるリン酸化の強力な阻害剤であったがｐＨ変動に感受性が無かったか、またはその結合が酸性ｐＨで増強され、Ｆａｂ−ＺＡＰヒトアッセイで中等度の細胞傷害活性を示すに過ぎなかった。
【０３０１】
ＭＣＦ−７細胞株でのヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｍａｂの結合は種々のｐＨで行った。漸増濃度のヒト化ｍＡｂをＭＣＦ−７細胞株上で４℃にて２０分間、５〜８の範囲の種々のｐＨでインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中で、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした。細胞を暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。図３２Ａおよび３２Ｂに示されるように、ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は酸性ｐＨでより低い結合能を示した。
【０３０２】
実施例１２：２０８Ｆ２  Ｍａｂのヒト化型の評価
１２．１  第１のヒト化型ｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３／ＶＬ３（ｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０２６／Ｌ０２４とも呼称）の結合および内部移行の評価
ｃ２０８Ｆ２  ｍＡｂの第１のヒト化型の結合をＭＣＦ−７、ＣＯＳ−７およびＮＩＨ  ３Ｔ３  ＩＲ＋細胞株で評価した。漸増濃度のｍ２０８Ｆ２、ｃ２０８Ｆ２またはｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３ＶＬ３を各細胞株に４℃で２０分間加えた。次に、細胞を洗浄し、供試ｍＡｂの結合を、対応する二次抗体を用いて可視化した。トランスフェクト細胞株上でのヒトＩＲの発現を確認するために、市販の抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を用い、その認識特性を例示した（図１９Ｄ）。
【０３０３】
ＭＣＦ−７細胞（図１９Ａ）またはサルＣＯＳ−７（図１９Ｂ）細胞でヒト化型とマウス型またはキメラ型のいずれかと比較したところ、供試したこれら３つの型に近似した特性が示された。ヒト化のプロセスは、ヒトインスリン受容体に対する交差反応性に関してマウス型およびキメラ型に完全に匹敵する抗体の認識特異性を改変しなかった（図１９Ｃ）。
【０３０４】
ヒト細胞株ＭＣＦ−７およびサル細胞株ＣＯＳ−７に対するｃ２０８Ｆ２の第１のヒト化型の算出ＥＣ５０は、２０８Ｆ２のマウス型またはキメラ型のいずれで決定されたものとも同等であった。
【０３０５】
ｍＡｂ  ｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３／ＶＬ３の内部移行能をフローサイトメトリーにより評価した。ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌの抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを表１４ａに示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂにおける内部移行のパーセンテージは、次の：１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩのように算出され、表１４ａに示す。よって、ヒト化ｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３／ＶＬ３は、対応するマウスおよびキメラ２０８Ｆ２抗体で測定されたものと同等の結合および内部移行特性を有していた。
【０３０６】
【表１５】
2017513898.tif 000017
【０３０７】
１２．２  後続ｈｚ２０８Ｆ２ヒト化型の結合の評価
ｍＡｂ  ２０８Ｆ２をヒト化し、１６のヒト化変異体（１２．１に記載の第１の型と含む）の結合特性を評価した。ヒト化変異体の結合特性は、ＦＡＣＳ分析により、ヒトＭＣＦ−７乳腺癌細胞株およびサル細胞株Ｃｏｓ−７にて、漸増抗体濃度を用いて評価した。この目的で、細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を４℃で２０分間、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中で、抗ＩＧＦ−１Ｒヒト化抗体とともにインキュベートした。次に、これらの細胞を３回洗浄し、暗所、４℃にてさらに２０分間、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０３０８】
ヒト化変異体のＥＣ５０は、総てのヒト化変異体がヒトおよびサルの両細胞株で同等の結合特性を示したことを示した。
【０３０９】
ヒト化抗体のＥＣ５０を表１４ｂにまとめた。
【０３１０】
【表１６】
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【０３１１】
１２．３  別のｈｚ２０８Ｆ２ヒト化型の内部移行の評価
ＭＣＦ−７細胞を、４℃にて２０分間、１０μｇ／ｍｌのヒト化抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを表１４ｃに示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂにおける内部移行のパーセンテージは、次：１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩ。のように算出されたヒト化抗体ｈｚ２０８Ｆ２  Ｈ０７７／Ｌ０１８は、ＩＧＦ−１Ｒの有意な内部移行を誘導することができる。
【０３１２】
【表１７】
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【０３１３】
実施例１３：免疫複合体アプローチのための標的としてのＩＧＦ−１Ｒ
ＩＨＣ試験を免疫複合体アプローチのための標的としてのｈＩＧＦ−１Ｒをバリデートするために設定した。実際に、このようなアプローチに有用な標的は、正常細胞に比べて腫瘍細胞での有意な過剰発現を要する。免疫複合体アプローチのために適当な標的の別の特性は、多くの適応症において、有意なパーセンテージの患者集団でその過剰発現が優勢なことである。
【０３１４】
ｈＩＧＦ−ＩＲが免疫複合体アプローチのための適当な標的と見なされ得るかどうかを評価するために、ｈＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＥＤＣ）に特異的であるとされている市販のポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＡＦ３０５−ＮＡ）とｈＩＲを選択した。本発明者らのプロセスの第１工程は、ｈＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤに対するＡＦ３０５−ＮＡの特異性およびそれがｈＩＲを認識しないことを確認することであった。この目的で、上記ですでに詳説したプロトコールを用い、ヒトＩＧＦ−１ＲおよびｈＩＲ  ＥＣＤの両タンパク質で一連のＥＬＩＳＡ試験を行った。
【０３１５】
図２０Ａに示された結果は、ポリクローナル抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体がｈＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤを効率的に認識したことを実証した。陽性対照として使用したＧＲ１１Ｌ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）からは予想された特性が示された。供給者により記載されているように、図２０Ｂは、ＡＦ３０５−ＮＡが、ＥＬＩＳＡにおいて陽性対照として使用した抗ｈＩＲ  ＧＲＯ５  Ｍａｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とは対照的にｈＩＲを認識しないことを示した。同様に、ＦＡＣＳ分析によるｈＩＲ＋トランスフェクト細胞に対するポリクローナルＡＦ３０５−ＮＡの結合評価から、それが細胞型のｈＩＲを認識しないが（図２０Ｄ）、抗ｈＩＲ  ＧＲＯ５抗体（図２０Ｃ）はトランスフェクト細胞に対して予想された特性を呈することが確認され、それらが高レベルのｈＩＲを発現することを示した。予想されたように、ｈＩＧＦ−１Ｒを発現し、本試験に陰性対照として導入されたＧＲ１１Ｌは、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞に対して何のシグナルも示さない（図２０Ｃ）。
【０３１６】
ＡＦ３０５−ＮＡ抗体はｈＩＧＦ−１Ｒ分布試験に関して十分にバリデートされたことから、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｌｔｒａ自動染色機ＶｅｎｔａｎａでＩＨＣプロトコールを設定した。簡単に述べれば、脱脂後にＥＤＴＡ  ｐＨ８バッファーに相当するＣＣ１を用いて９６℃で３２分間、抗原の賦活化を行った。一次抗体（ＡＦ３０５−ＮＡ）を３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ポリマーＨＲＰ−ＯＭａｐ抗ヤギＩｇＧ（Ｖｅｎｔａｎａ）を３７℃で１６分間インキュベートした後、ＤＡＢ色素原を用いて可視化した。最後に、ヘマトキシリンを用いて組織を対比染色した。次に、スライドをオイキット媒体に封入した。ＩＨＣ染色をバリデートするために、異種移植片由来の腫瘍組織のパネルをそれらのｈＩＧＦ−１Ｒのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現に関して選択した。図２１に示されるように、強い膜染色が３つの陽性組織（ＭＣＦ−７、ＮＣＩ−Ｈ２３およびＮＣＩ−Ｈ８２）で見られた。陰性腫瘍として選択したＨｓ７４６ｔでは膜染色は見られなかった。染色分析に関しては、スライドを、Ｒｏｃｈｅ  ＶｅｎｔａｎａからのＨＴスキャナーを用いてスキャンし、ＩＧＦ−１Ｒ染色を、Ｖｉｒｔｕｏｓｏソフトウエア（Ｒｏｃｈｅ  Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて定量した。組織分析に関しては、アルゴリズムの統計精度を高めるために、腫瘍当たり４視野（ＦＯＶ）で、可能であれば５０を越える細胞を用いてスコアを取った。組織を、ＨＥＲ２膜アルゴリズムに従い、＋＋＋（３＋とも記載される）、＋＋〜＋＋＋（２＋〜３＋または＋＋／＋＋＋とも記載される）、＋＋（２＋とも記載される）、＋（１＋とも記載される）とスコア化した。スコアはＣＡＰ／ＡＳＣＯ試験ガイドラインに従って、弱いもしくは不完全な膜染色またはサンプル中の１０％未満の細胞における弱い、完全な膜染色を（＋）と定義した。（＋＋）のスコアは、不均一もしくは弱いが少なくとも１０％の細胞における明確な周辺分布を伴う完全な膜染色、または３０％以下の腫瘍細胞における強い完全な膜染色とされた。（＋＋＋）のスコアは、３０％を越える(more that)浸潤性腫瘍細胞の均一な強い膜染色に相当する。腫瘍が（＋＋）〜（＋＋＋）のスコアを有した場合、それは分析された腫瘍組織の不均一性を表し、（−）はｈＩＧＦ−１Ｒの発現が検出されなかったことを意味し、（ｃ）は染色がもっぱら細胞質であることを意味する。細胞質染色は膜染色の不在を特徴とし、単離細胞となる。
【０３１７】
次に、上記プロトコールを用いて正常組織および腫瘍組織で拡張試験を行った（図２２  ＡおよびＢ）。
【０３１８】
これらの試験については、Ｓｕｐｅｒｂｉｏｃｈｉｐｓからのヒト正常および腫瘍ＴＭＡを用いて分布および有病率試験を行った。各自動染色機サイクルに２つの異なる対照を導入した。１つの対照は、そのＩＧＦ−１Ｒ発現に関して陽性対照であることが知られている胎盤切片であり、正常ＴＭＡ組織とともに供給した。第２系統の対照は〜を提示する  スコア２＋または３＋を示す３スライドの腫瘍異種移植組織（それぞれＭＣＦ−７およびＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ８２）からなった。この後者の対照は、発現を較正するために各染色実施しに加える。
【０３１９】
予想されたように、胎盤および異種移植片由来の組織はｈＩＧＦ−１Ｒ陽性であった。強い膜染色がこれら４つの対照で見られた。第１ヒト正常組織パネルにおいて（図２２Ａ）、１＋を越えないＩＧＦ−１Ｒの若干の膜検出が消化管（食道、小腸、結腸および直腸）で見られた。他の総ての分析組織について、ＩＧＦ−１Ｒの膜発現が見られた。第２の正常ヒト組織パネルでは（図２２Ｂ）、１＋を越えないＩＧＦ−１Ｒの若干の膜検出が腎臓構造に見られた。強い膜性染色（＋＋）が上皮および尿路上皮に見られた。これらの両組織意外には、強い膜染色は見られなかった。この発現パターンは、ｈＩＧＦ−１ＲがＡＤＣまたはＡＴＣアプローチのための良好な標的であり得ることを強く示唆した。
【０３２０】
ＩＧＦ−１Ｒを標的とする免疫複合体の潜在的適応を決定するために、患者由来の肺、乳房、頭頸部、膀胱および腎臓腫瘍サンプルを、上記のプロトコールを用いてそれらのＩＧＦ−１Ｒ発現に関して分析した。
【０３２１】
試験した６９の肺サンプルのうち、６７症例が解釈可能であった。ＩＧＦ−１Ｒ発現は上記のように定量した。図２３に示されるように、本発明者らが正常組織に関してすでに上記したものと一致して陰性である、正常隣接組織に比べて多くの癌で強い膜発現が検出される。総ての分析症例を表１５にまとめた。肺癌の全サブタイプを含め５５％の＋＋または＋＋＋いずれかの症例が見られる。扁平上皮細胞肺癌は最もｈＩＧＦ−１Ｒの発現の高い腫瘍であり、７０％が＋＋、＋＋／＋＋＋、または＋＋＋症例であり、４３％が＋＋＋単独＋＋／＋＋＋腫瘍を維持している。これらの結果は、扁平上皮細胞肺癌患者における高頻度の多染色体性またはｈＩＧＦ−１Ｒ増幅を記載した、公開されているデータと一致している。
【０３２２】
【表１８】
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【０３２３】
ＩＧＦ−１Ｒ発現の別の試験を１０種の乳癌サンプル系統で行った。図２４に示す結果は、ＩＧＦ−１Ｒは隣接正常組織に比べて癌組織で発現が高いことを示した。表１６にまとめた染色データは、分析症例の６６％が＋＋、＋＋／＋＋＋または＋＋＋であり、分析症例の２２％が＋＋＋または＋＋／＋＋＋であったことを示した。
【０３２４】
【表１９】
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【０３２５】
最後に、頭頸部、膀胱および腎臓を含む腫瘍系統でＩＧＦ−１Ｒの過剰発現が示された（図２５）。ここでも、正常隣接組織よりも腫瘍サンプルでＩＧＦ−１Ｒの高い過剰発現が見られた。
【０３２６】
これらの結果を考え合わせると、肺、乳房、頭頸部、膀胱および腎臓を含む多くのＩＧＦ−１Ｒ陽性腫瘍を治療するための免疫複合体アプローチと一致する。
【０３２７】
実施例１４：可溶性組換えヒトＩＧＦ−１Ｒに対する２０８Ｆ２抗体の５つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ｃ２０８Ｆ２、ｃ２１３Ｂ１０、ｃ２１２Ａ１１、ｃ２１４Ｆ８およびｃ２１９Ｄ６）およびヒト化型（ＶＨ３／ＶＬ３）の結合の解離定数（ＫＤ）の定義
組換え可溶性ヒト−ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の結合の解離定数（ＫＤ）は、解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）の間の比により定義した。動態試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置にて、マウス抗Ｔａｇ  Ｈｉｓモノクローナル抗体により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて行った。１２０００ＲＵ前後の抗体を、アミンキット化学を用いてカルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトする。
【０３２８】
これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。
【０３２９】
その２つのＣ末端１０ヒスチジンタグにより捕捉された可溶性組換えヒトＩＧＦ−１Ｒへの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合の動態パラメーターを定義するためにシングルサイクル動態スキームを用いた。
【０３３０】
１−  ２本のα鎖と付加的Ｃ末端１０−Ｈｉｓタグとともに発現される２本β鎖の細胞外ドメインのヒトＩＧＦ−１Ｒヘテロ四量体の可溶性組換え型（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ−５０）の溶液を第２のフローセルに１０μｇ／ｍｌの濃度で１分間注入した。本試験で実現した２４サイクルのそれぞれにおいて平均５８７ＲＵ（標準偏差２４ＲＵ）の可溶性受容体が捕捉された。
【０３３１】
２−  この捕捉相の後、両フローセルにランニングバッファーを５回注入するか（各９０秒注入）、または漸増する５種類の濃度範囲の、６種類の抗体のうちの１つを注入した（各９０秒注入）。５回目の注入の終了時に、解離速度を定義するためにランニングバッファーを５分間通した。
【０３３２】
３−  次に、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５のバッファーを４５秒間注入して表面を再生した。
【０３３３】
コンピューターで計算されたシグナルは、フローセル２（捕捉されたＩＧＦ−１Ｒを含む）の応答とフローセル１（ＩＧＦ−１Ｒ分子を含まない）の応答の間の差異に相当する。
【０３３４】
各ＩＧＦ−１Ｒ分子に関して、漸増濃度範囲の１つの抗体の注入によるシグナルを、５回のバッファー注入で得られたシグナル（二重参照）の減算により補正した（図２６参照）。
【０３３５】
得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを１：１モデルとともに用いて分析した。
【０３３６】
各抗体について、２つの異なる濃度範囲、すなわち、各抗体について実施した最初の２回の試験では４０、２０、１０、５および２．５ｎＭおよびあとの２回の試験では２４、１２、６、３および１．５ｎＭを用いて４回の試験を行った。
【０３３７】
本試験で供試した６つの抗体について、試験データは、より高い濃度が定数と定義された場合に有意なｋｏｆｆ値を有する１：１モデルによく適合し、他の４つの濃度が計算される（図２７参照）。
【０３３８】
比：ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される解離定数（ＫＤ）および比：Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆとして算出されるそれらの複合体の半減期を図２８および２９に示す。これらは各抗体について行った４回の独立した試験の平均に相当する。エラーバーは値の標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【０３３９】
解離定数は１０〜１００ｐＭの範囲である。ｃ２０８Ｆ２抗体は、ｈ−ＩＧＦ−１Ｒに対してより弱い親和性（より高い解離定数値）を示し（ＫＤ  ７５ｐＭ前後）、そのヒト化型は少なくともキメラ型と同等に良好である（ＫＤ  ６０ｐＭ前後）。他の４つの抗ＩＧＦ−１Ｒキメラ抗体は、ｈＩＧＦ１−Ｒに対して全く同等の親和性を示す（ＫＤ  ３０ｐＭ前後）。この親和性の違いは主として解離速度または結果としての複合体の半減期に関連している。２０８Ｆ２では、キメラ型およびヒト化型（ＶＨ３／ＶＬ３）の場合、複合体の半減期は２〜３時間の間である。他の４つのキメラ抗体では、平均半減期は７．０〜９．４時間の間である。
【０３４０】
これらの極めて緩慢な解離速度は、それらの両Ｆａｂアームにより２つの隣接するｈ−ＩＧＦ−１Ｒ分子に同時に結合できる抗体の二価構造に明らかに関連している。この場合、捕捉されたＩＧＦ−１Ｒ分子のレベルは解離速度に影響を持ち得る。本試験で定義された親和性は、捕捉された６００ＲＵ前後のｈ−ＩＧＦ−１Ｒのレベルに対する抗体の機能的親和性（アビディティー）に相当する。上記に示されるデータ（表１０）と実施例１３に示される値の間に見られるＫＤの３倍の違いは、ｈＩＧＦ−１Ｒの捕捉レベルの違い（実施例５では６００ＲＵと１６０ＲＵ）に関連している。
【０３４１】
実施例１５：可溶型のキメラｈ／ｍ  ＩＧＦ−１Ｒ組換えタンパク質を用いてｃ２０８Ｆ２の結合を妨げるマウスＩＧＦ−１Ｒ特異的残基の定義
ｃ２０８Ｆ２抗体試験での可溶型のキメラｈ／ｍ  ＩＧＦ−１Ｒ組換えタンパク質の結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置にて、マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  モノクローナル抗体により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて実施した。１０，５００ＲＵを越える抗Ｆｃ抗体を、アミンキット化学を用いて、両フローセルのカルボキシメチルデキストラン(carboxymethyldextan)に化学的にグラフトする。
【０３４２】
これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈溶液としてＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーを用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。
【０３４３】
試験の設定は次の通りであった：
１−  １０μｇ／ｍｌ濃度のｃ２０８Ｆ２の溶液を第２のフローセルに６０秒間注入した。
２−  供試したＩＧＦ−１Ｒ構築物は、ランニングバッファーで１０倍希釈した培養培地の濃縮上清に相当する。１つの構築物を各サイクルにおいて１２０秒の遅延で１２０秒間注入した。
３−  両フローセルを１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．７バッファーの３０秒の注入により再生した。
【０３４４】
図３０は、２サイクルの重畳を示す。ｈ−ＩＧＦ−１Ｒ上清およびｍ−ＩＧＦ−１Ｒ上清をそれぞれ第１サイクルおよび第２サイクル中に注入した。この試験は、ｍ−ＩＧＦ−１Ｒがｃ２０８Ｆ２抗体に結合できないことを明らかに示し、ｃ２０８Ｆ２捕捉レベルとＩＧＦ−１Ｒ結合レベルの決定に用いた点は頭が２つある矢印により示される。
【０３４５】
ＩＧＦＲの細胞外ドメイン（シグナルペプチドを含まない）は、ヒトおよびマウス配列ではそれぞれ８０５および８０６アミノ酸から構成される。
【０３４６】
８６９残基（９６％）が両構造で同一である。マウス配列の３７残基が、対応するヒト配列と異なっている。１つの違いはギャップに相当する。
【０３４７】
図３１に示されるように、供試した７つのキメラ構築物４（Ｃ１（配列番号８３）、Ｃ４（配列番号８６）、Ｃ７（配列番号８８）およびＣ８（配列番号８９））がｈ−ＩＧＦ−１Ｒと同様にｃ２０８Ｆ２に結合し、３つの構築物（Ｃ２（配列番号８４）、Ｃ３（配列番号８５）およびＣ６（配列番号８７））がｍＩＧＦ−１Ｒ（配列番号９１）と同様にｃ２０８Ｆ２に結合しない。
【０３４８】
このＣ１の結合およびＣ２の結合の欠如は、ｃ２０８Ｆ２の結合を遮断するマウス特異的残基はこのタンパク質のＮ末端半分に位置することを示唆する。従って、Ｃ末端半分に位置する最後の１１の特異的マウスアミノ酸はｃ２０８Ｆ２の結合に影響を及ばさない。
【０３４９】
Ｃ３の結合の欠如は、４９４番におけるＨｉｓに代わっての１つのマウス特異的残基Ａｒｇの主要な寄与を示す。この結果は、２つのマウス特異的残基：Ｈｉｓ４９４＞ＡｒｇおよびＳｅｒ５０１＞Ｔｒｐを含むＣ６の結合の欠如によって確認される。
【０３５０】
Ｃ４の結合は、このキメラＩＧＦ−１Ｒの５０１番における唯一のマウス特異的残基ＴｒｐはＣ２およびＣ６の結合の欠如の原因ではないことを示唆する。
【０３５１】
Ｃ７の結合は、この構築物中に存在する１７のマウス特異的残基にｃ２０８Ｆ２の結合の遮断に加重を持つものはないことを示唆する。
【０３５２】
同様に、Ｃ８の結合は、他の４つのマウス特異的残基を除外する。
【０３５３】
Ｌ１ドメイン中の３つのマウス残基、すなわち、２８番のＴｙｒに代わるＰｈｅ、１２５番のＶａｌに代わるＩｌｅおよび１５６番のＭｅｔに代わるＬｅｕを呈するヒトＩＧＦ１ＲのＣ１２突然変異体は、ナノモル下の解離定数でｃ２０８Ｆ２と結合する。この試験から、Ｌ１ドメインは抗体の結合に関与しないこと、または少なくともマウス配列とヒト配列を分化させたこれら３つの位置マウス型のＩＧＦ１Ｒへ抗体が結合しないことの原因ではないことが確認される。
【０３５４】
図３３に示されるように、ｈｚ２０８Ｆ２は、その６Ｈｉｓ  Ｃ末端タグによりＣＭ５センサーチップに捕捉された１２０ＲＵの、可溶型ｈ−ＩＧＦ１ＲのＣ２９突然変異体（Ａｓｐ４９１＞Ａｌａ）に結合することができないが（白い菱形）、同じ抗体溶液が１７０ＲＵのこの可溶性受容体の野生型とは明らかに結合する（黒い菱形）。Ｈｉｓ  ４９４と同様に、Ａｓｐ  ４９１はｈｚ２０８Ｆ２のＩＧＦ１Ｒに対する親和性に重要である。結晶学的データは、両残基がＦｎＲ３ドメインにおいて受容体表面に露出していることを示す。
【０３５５】
これらの結果を考え合わせると、ｈｚ２０８Ｆ２はＩＧＦ−１ＲのＦｎＲ３ドメインと結合すること、およびこの抗体により認識されるエピトープが抗体結合に重要であるＨｉｓ  ４９４およびＡｓｐ  ４９１を含むことが証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１４Ｂ−３】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ−１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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