(57)【要約】  本出願は、微生物から核酸を抽出するための過ヨウ素酸塩または過硫酸塩を含む組成物、および核酸抽出のためにその組成物を用いる対応する方法を提供する。組成物および方法は、標準的核酸抽出技術に対して通常は抵抗性である微生物、例えば、マイコバクテリウム属の１つまたは複数の種、結核菌群の１つまたは複数の種、結核菌のＭＤＲ株、クロストリジウム属の１つまたは複数の種、バチルス属の１つまたは複数の種、および頑丈な細胞壁を有する他の微生物などからの核酸の抽出に特に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化剤および緩衝液を含む組成物であって、前記酸化剤が過ヨウ素酸、過ヨウ素酸塩または過硫酸塩である組成物。
【請求項２】
リチウム塩、キレート剤および変性剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記リチウム塩がＬｉＣｌである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記変性剤がアニオン洗剤、カチオン洗剤、または非イオン洗剤である、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記アニオン洗剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）またはラウロイル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記カチオン洗剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムブロミドまたはアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記非イオン洗剤がツイーン、トリトンＸ、またはブリージである、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記キレート化剤がエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
微生物または微生物の混合物から核酸を抽出および／または保存するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
約６．５〜約１３または約８〜約１０．５のｐＨを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記過ヨウ素酸塩がメタ過ヨウ素酸塩、オルト過ヨウ素酸塩またはこれらの混合物を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記過ヨウ素酸塩が過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムまたは過ヨウ素酸リチウムである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記過硫酸塩が過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムまたは過硫酸アンモニウムである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記緩衝液がグリシンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
微生物から核酸を抽出する方法であって、前記微生物を含むと疑われる試料を酸化剤と混合することおよび得られた混合物を加熱することを含み、前記酸化剤が過ヨウ素酸、過ヨウ素酸塩または過硫酸塩である方法。
【請求項１６】
前記過ヨウ素酸塩または過硫酸塩が緩衝液を含む組成物中に存在し、それにより前記組成物が約６．５〜約１３、または約８〜約１０．５のｐＨを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記混合物が、約５０℃以上、または約５０℃〜約１００℃、または約７０℃〜約８０℃の温度に加熱される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記混合物が、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、約１５分〜約６０分、または約１５分〜約２０分の間加熱される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記過ヨウ素酸塩がメタ過ヨウ素酸塩、オルト過ヨウ素酸塩またはこれらの混合物を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記過ヨウ素酸塩が過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムまたは過ヨウ素酸リチウムである、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記過硫酸塩が過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムまたは過硫酸アンモニウムである、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記最終混合物中の前記過ヨウ素酸塩の濃度が約０．１ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約１５ｍＭである、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料にリチウム塩を添加することをさらに含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記リチウム塩がＬｉＣｌである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料に変性剤を添加することをさらに含む、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記変性剤がアニオン洗剤、カチオン洗剤、または非イオン洗剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アニオン洗剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）またはラウロイル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記カチオン洗剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムブロミドまたはアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記非イオン洗剤がツイーン、トリトンＸ、またはブリージである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物が細菌または真菌である、請求項１５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記微生物が細菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細菌がヒト型結核菌、結核菌群の種、スメグマ菌、ウシ結核菌、アフリカ型結核菌、ネズミ型結核菌、マイコバクテリウム・カネッティ、ヒツジ菌、アシカ型結核菌、マイコバクテリウム・マリヌム、癩菌、マイコバクテリウム・レプロマトーシス（らい菌株）、鳥型結核菌、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、ヨーネ菌、マイコバクテリウム・ウルセランス、マイコバクテリウム・ゴルドナエ、バチルス属種、枯草菌、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎クラミジア、トラコーマ病原体、トキソプラズマ原虫、連鎖球菌属種、ブドウ球菌属種、ニ核アメーバ、ボレリア・ブルグドルフェリおよびその他の種、クロストリジウム属種、有核紡錘菌、サルモネラ属種、カンピロバクター属種、ファーミキューテス菌、バルトネラ属種、リケッチア属種、エルシニア属種、フランシセラ属種、ブルセラ属種、ボルデテラ属種、ブルクホルデリア属種、シュードモナス属種、赤痢菌属種、クラミドフィラ属種、レジオネラ属種、リステリア属種、コリネバクテリウム属種、腸球菌属種、大腸菌属種、ヘモフィルス属種、ヘリコバクター属種、レプトスピラ属種、マイコプラズマ属種、ナイセリア属種、トレポネーマ属種、またはビブリオ属種である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物が真菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記真菌がサッカロマイセス、カンジダ、アスペルギルス、ヒストプラズマ、ニューモシスティス、スタキボトリスまたはクリプトコッカス属である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸抽出用のキットであって、（ｉ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で過ヨウ素酸塩または過硫酸塩および約７〜約１３のｐＨで緩衝液を含む抽出組成物；および（ｉｉ）使用のための説明書、を含むキット。
【請求項３６】
前記抽出組成物がリチウム塩、変性剤および／またはキレート剤をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
試薬容器および／または試料受け容器をさらに含む、請求項３５または３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記試薬容器および／または試料受け容器が前記抽出組成物を受けるためのリザーバーおよび試料受容部を含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
試料中の総核酸の定量のための方法であって、
（ｉ）前記試料を酸で処理し、この酸性化試料を加熱すること、
（ｉｉ）前記酸性化試料を中和すること、および
（ｉｉｉ）この中和された試料を逆相カラムを用いるＨＰＬＣに供し、ＵＶ分光法により溶出液をモニターしてアデニンに相当するピークを特定すること、
（ｉｖ）前記試料中の総核酸の尺度として前記アデニンピークの曲線下面積を計算すること、を含む方法。
【請求項４０】
ステップ（ｉ）で、前記試料がＨＣｌを用いて酸性化される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｉｉ）で、前記酸性化試料がＮａＯＨを用いて中和される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
２’−および３’−ＡＭＰに対応するピークの前記曲線下面積を計算することをさらに含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料が微生物を含むかまたは微生物を含むと疑われる、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、核酸抽出の分野に関する。より具体的には、本出願は、細菌、ウイルス、および真菌などの微生物からの核酸抽出を最大化または改善するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
抽出が困難な微生物およびウイルスからの核酸の放出を改善する組成物／方法。
細菌、藻類および真菌を含む微生物は、極めて多様であり、生物圏のあらゆる部分で生息している。一部の微生物は栄養再循環にとって不可欠であり、より大きな生物と密接な相互に利益をもたらす関係を有するが、また一方で、他の微生物は、病原性、感染性であり、時には宿主、すなわちヒト、その他の動物および植物を死に至らしめることもある。微生物、ウイルスおよびプリオンは、ペスト、炭疽病、結核、ハンセン病、マラリア、コレラ、腸チフス熱、睡眠病、破傷風、トキソプラズマ症、ヒストプラズマ症、ボツリヌス症、ジフテリア、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、インフルエンザ、ポリオ、はしか、おたふくかぜ、風疹、Ａ型およびＢ型肝炎、ヘルペス１型および２型、黄熱病、デング熱、狂犬病、乳頭腫／癌（ヒトパピローマウイルスが原因）、アデノウイルス媒介気道感染症、および伝藩海綿状脳症（例えば、クロイツフェルトヤコブ病）などの疾患を引き起こす。
【０００３】
医療関連感染症（ＨＡＩ）または院内感染症は、患者が他の状態に対して保健医療処置を受けている過程でかかる感染症または病院スタッフの間で発生する感染症である。保健医療環境は、長期間生存可能な院内病原菌で高度に汚染される場合がある。これらの予防可能な感染症は大被害を及ぼし、世界中の罹患率と死亡率の大きな原因になることがある。
【０００４】
最近の保健医療では、患者を処置するための、多種多様な侵襲的装置および手技が用いられている。ＨＡＩの２／３は、例えば、中心ライン関連血流感染症、カテーテル関連尿路感染症、および人工呼吸器関連肺炎など、医療手技で使われる装置に関連している。ＨＡＩはまた、手術部位および開放創でも発生する。さらに、クロストリジウム・ディフィシレバクテリアおよび芽胞で汚染された表面は、消化管感染症および重篤な疾病を引き起こす場合がある。ＨＡＩを引き起こす微生物のその他の例としては、アシネトバクター、セパシア菌、カンジダ・アルビカンス、クロストリジウム・ソルデリ、腸内細菌科、大腸菌、Ａ−Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、クレブシエラ、レジオネラ・ニューモフィラ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、マイコバクテリウム・アブセサス、ノロウイルス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、ヒト型結核菌、バンコマイシン媒介および耐性黄色ブドウ球菌、およびステノトロホモナス・マルトフィリアが挙げられる。これらの微生物が原因の感染症は、病院内での患者の滞在を長引かせることにより、保健セクターの少ないリソースを消費する。
【０００５】
ＨＡＩは先進国における重大な公衆衛生上の問題である。米国において、疾病予防管理センター（ＣＤＣ）は、毎年、約１７０万症例のＨＡＩがあると試算し、これらは細菌を含むあらゆるタイプの微生物に由来し、合わせて年間９９，０００人の死亡の原因であるかまたはそれに関与している。ＣＤＣによると、米国では毎日、２０人の入院患者の内のおよそ１人が、医療を受けることが原因の感染症に罹患している。米国単独で、病院に対する全体の年間の直接医療費（入院患者の病院業務を含む）は約４５０億ドルである（ＣＤＣによる２００７年の解析データに基づく；ＲＤ  Ｓｃｏｔｔ  ＩＩ，２００９）。
【０００６】
病院は、ユニフォーム、設備の滅菌、洗浄、および他の予防手段に関する衛生化プロトコルを有している。それぞれの患者との接触の前後における、医療関係者全員の完全な手洗いおよび／または消毒用アルコールの使用は、いくつかのＨＡＩと戦うための最も効果的な方法の１つである。設備および表面上の微生物は、化学薬品、電離放射線、乾性温熱、または加圧水蒸気により死滅させるまたは滅菌することができる。しかし、頑丈な微生物、例えば、ブドウ球菌、ＭＲＳＡおよびバンコマイシン耐性腸球菌などは、「手に触れる」表面（例えば、ベッド柵、電話、呼び出しボタン、床、ベッド脇のカーテン、トイレ、椅子、ドアハンドル、照明スイッチ、ＩＶポール、カウンター、聴診器、ＴＶリモコン、およびテーブルの上面）上で、ならびに空気中およびダスト中で、長期間生存することが知られている。
【０００７】
これらの表面の消毒は、重要であるにもかかわらず、保健医療環境において感染の悪循環を絶つことを考える際に見落とされがちな要素である。二酸化炭素中の非可燃性アルコール蒸気（ＮＡＶ−ＣＯ２）システムなどの最近の消毒方法は、胃腸炎、ＭＲＳＡ、およびインフルエンザ病原体に対して、ある程度効果的であった。また、過酸化水素蒸気は感染率を下げ、特に、アルコールが効果的でないことが明らかになっているクロストリジウム・ディフィシレなどの内生芽胞形成細菌に対して効果的である。したがって、ＨＡＩを回避し、かつ、これと戦うために、よく手に触れる表面、再使用可能医療用具、および医療／歯科用機器を定常的に消毒するための安全で効果的な抗菌剤が、病院、保健医療施設、ナーシングホーム、および長期介護施設で切実に必要とされる。
【０００８】
研究者および感染予防の専門家は、より厳密な洗浄プロトコルおよび方法、ならびに異なる感染性病原体に適合された物質を必要としている。Ｆａｗｌｅｙと共同研究者らは２００１年に、いくつかの汎用の洗剤系（イオン性および非イオン性界面活性剤）の消毒剤が、適切な消毒作用をもたず、環境の汚染を事実上高める場合があることを見出した。また、米国における研究（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）では、定常的な２０〜３０分の洗浄（フェノール性の消毒剤を用いる）は、患者の部屋でのバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）を根絶するには十分でないという結論に至った。医療の集中治療室（ＩＣＵ）からＶＲＥを除去するためには、より徹底した４時間の洗浄プロトコルを要した。現在、有毒なまたは腐食性の化学物質を使用せずに、安全、迅速、効果的、安価で、環境上確実な、設備、ツールおよび接触面の消毒方法に対する要求が存在する。理想的な消毒剤は広範な抗菌範囲を有し、急速な死滅をもたらし、無毒無臭であるべきであり、また、処理面上に抗菌性フィルムを残し、経済的で、水溶性で、安定性であるべきであり、さらに、環境を害してはならない。
【０００９】
保健医療施設で使われる大抵の医療および外科装置は、熱に安定な材料から作製されており、したがって、熱滅菌、主として蒸気滅菌に耐える。しかし、１９５０年以来、低温滅菌が必要な材料から作製される医療装置および器具が増えてきている。過去１５年間の間に、多くの新規低温滅菌システム（例えば、エチレンオキシド（ＥＴＯ）、過酸化水素ガスプラズマ、過酢酸浸漬、オゾン）が開発され、医療装置（例えば、手術器具、インプラント、血液培養チューブ、皮下注射器、生検鉗子）および歯科用器具の殺菌、ならびに微生物学的廃棄物の除染に使用されている。保健医療施設で使用するための開発中であるが、ＦＤＡで認可されていない技術には、気化過酸化水素、気相過酢酸、ガス状二酸化塩素、電離放射線、またはパルス光が挙げられる。スタッフに対するリスクを最小限にし、再生される物品の価値を保存すると同時に、患者を感染症から保護するために、活性な微生物および芽胞に対する優れた殺菌作用を有する新規な、低温で使われる、環境に優しいさらなる技術に対するニーズがある。
【００１０】
結核（ＴＢ）は、例えば、結核菌種、ウシ型結核菌、アフリカ型結核菌、ネズミ型結核菌、マイコバクテリウム・カネッティ、ヒツジ菌およびアザラシ型菌の病原性株などの「結核菌群」メンバーにより引き起こされる主要なヒトの感染症である。ヒト型結核菌（ＭＴ）は、世界の人口の約１／３に感染し、その内の９０％は、感染後数年間無症候のままである。感染集団の５０％を超えるヒトにとってＴＢは致命的であり、多剤耐性（ＭＤＲ）株の出現により、ＴＢの診断と処置が発展途上のアフリカ人集団で最優先とされる。ＭＴはゆっくり増殖し、このことは、この生物体およびその他の臨床的に重要なマイコバクテリアの単離、特定、および薬剤感受性試験が困難で、数週間または数ヶ月を要する場合があることを意味している。このような遠隔地においてバイオセーフティレベル３研究室が利用できない場合には、伝染および疾患発生率を減らすために、処理および分子試験の前に、試料を非感染にする必要性があるため試験の困難さがさらに増幅される。しかし、患者を隔離し、それにより密接な接触者への疾患の拡散を減らすため、かつ適切で効果的な処理の開始を確実にするために、早期の正確なＭＴ感染の診断が不可欠である。抗生物質療法剤の早期の投与は疾患の重症度を大きく低下させ、寛解率を高め、さらにＭＤＲのＴＢの発生を回避することを目的とする。現在の方法は、ＭＴに感染していると疑われる患者からの、「良好な」／代表的試料（例えば、喀痰試料）の安全な収集、輸送、安定化および／または抽出の困難さに関連する欠点を有している。
【００１１】
喀痰を用いるＭＴ感染の診断のための現法は、喀痰を空の容器に収集し、感染の可能性のある喀痰試料を研究室に送り、そこで容器を開け、試料を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）で処理する。ＮａＯＨ／ＮＡＬＣは、喀痰を液化して、ＭＴの生存率を維持しつつ他の微生物のバックグラウンドを減らすために広く使われている。ＭＴは非常に頑丈なため大部分がこの過酷な処理に耐え、この微生物の選択培養を可能にする。しかし、ＭＴはインビトロで極めてゆっくり増殖するため、検出および診断の時間が長くなる。ＮａＯＨ／ＮＡＬＣ処理後、ＭＴ含有沈降物は、ａ）スメア中の「抗酸性」細菌を特定するためのチール・ネールゼン染色、ｂ）従来の微生物培養法、およびｃ）種特定および抗生物質耐性プロファイリングのための分子ベースアッセイを含むさらなる処理の前に濃縮できる。
【００１２】
原理的には、分子診断法の使用により、ＭＴを培養する必要性が回避され、その結果、生存可能な状態で元の試料中で細菌を維持する必要性が回避される。さらに、従来のＭＴのための研究室試験より感受性が高く迅速な、結核のための分子診断試験（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを用いる）を実施して患者の隔離および効果的な治療の早期開始を可能にすることに対する世界的なニーズがある。ＭＴの分子検出用の市販のＦＤＡ認可アッセイ（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｓｅｌ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＡｍｐｌｉｃｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＴｅｓｔおよびＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．の「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（Ｅ−ＭＴＤ）Ｔｅｓｔ」）は、標準化されており再現可能であるという利点を有し、スメア陽性試料における高い感度（９５％超）および高い特異性を示す。しかし、肺結核の全新規症例の半分は、初期診断時にスメア陰性である。残念ながら、ＦＤＡ認可分子アッセイはまた、スメア陰性試料および非呼吸器試料で低感度（４０．０〜９２．９％、ＭＴＤ  ｔｅｓｔ；４０．０〜７３．１％、Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ｔｅｓｔ）を示す。さらに、高い設備および試験コストにより、発展途上国の遠隔にあるリソースの少ない状況下でのこれらの実施が制限される（「Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ」、疾病予防管理センター；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」、ＡＰＭＩＳ（２００４）１１２：７２８−７５２）。ＭＴ検出の感度を高め、したがって分子診断試験の精度を高める１つの手段は、所与の試料からの核酸抽出、特に、臨床試料中の病原菌からのＤＮＡおよびＲＮＡの抽出の効率を高めることである。活動性感染および／または潜伏感染の患者由来の試料、特に、ＨＩＶ／ＴＢ同時感染の個人由来の試料は、濃厚な粘液、多くの場合「固い」粘液中に埋め込まれたほんの少数のマイコバクテリウム属を含む場合がある。高度に効果的な抽出方法は、ＭＴの検出感度を上げて、それにより、早期介入を可能にすることにより、ＴＢの診断および処置を根底から変えてしまうであろう。
【００１３】
マイコバクテリアの蝋状の細胞壁はミコール酸を含み、それは破壊を困難にし、ほとんどの化学的または酵素的抽出プロセスの核酸抽出効率を大きく低下させる。頑強な細菌細胞壁は、細胞溶解および効果的なＤＮＡ抽出の両方を妨害する（Ｋａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。臨床市場では、現状、マイクロアレイなどのＰＣＲおよび他の高度な分子分析に好適な形態で多数の試料から核酸を抽出／単離する効果的な方法がない。微生物／細胞破壊のための物理的方法としては、機械的な細胞粉砕（ビーズビーティング（ｂｅａｄ−ｂｅａｔｉｎｇ）、粉砕および摩砕、湿式粉砕、超音波、水力学的剪断、凍結加圧）、液体または流体力学的剪断（フレンチプレス、チャイコフプレス、ホモジナイザー、湿式ミル、振動ミル、濾過、超音波粉砕）および固体剪断（摩砕、ヒューズプレス）が挙げられる。例えば、Ｅ−ＭＴＤ  ｔｅｓｔでは、超音波処理を使って、標的細胞からマイコバクテリアｒＲＮＡを放出させる。細菌および他の微生物（例えば、真菌）の機械的な破壊では、使われる特定の技術に大きく依存して、放出されるＤＮＡのばらつきが極めて大きい。
【００１４】
ビーズビーティングなどの機械的な手段に比べて、臨床試料中の頑丈な細菌／芽胞のいくつかのタイプの化学的／酵素的溶解は、既存の高スループットの自動試料処理システムおよびワークフロー中に組み込むためには、遥かに容易で安全であろう。微生物／細胞粉砕の化学的方法は細胞壁を変性させることを目的とし、それにより、膨圧の効果により細胞が漏出性になるか破裂する。方法としては、浸透、乾燥および抽出、自己溶菌、細胞壁合成の阻害、細胞壁の酵素攻撃、バクテリオファージおよびその他の溶菌性因子、ならびに電離放射線が挙げられる。
【００１５】
ＭＴの薬剤耐性は通常、寒天培養および液体培養法を使って測定され、結果を得るためには、それぞれ、６〜８週間および４〜５週間を必要とする。ＭＴ陽性検体由来のＲＮＡの信頼性の高い検出は、ＴＢ、特に、多剤耐性結核および広範囲薬剤耐性結核（ＭＤＲ／ＸＤＲ  ＴＢ）の診断および処置を根底から変えると期待される。分子法を用いる薬剤耐性の迅速な検出は１〜２日で行え、このことは効果的治療の早期の開始を可能にしおよびそれによりＭＤＲ  ＴＢ症例の感染性の期間を６週間も短縮し、患者の全体的な転帰を改善できる。これらのいずれもが、ＭＤＲ  ＴＢの管理の取り組みに対し大きな影響を与え得る（「Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｒａｐｉｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｄｒｕｇ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ」、疾病予防管理センター）。
【００１６】
ＴＢ陽性患者の検体中のＭＴ  ＤＮＡレベルの定量的測定値は、大部分の患者において処置の成功に関する信頼性の高いマーカーではない。理由は、ＭＴ  ＤＮＡが、処置の完了後もＴＢ患者の喀痰中に１年間もの長い期間、持続し得るためである。対照的に、原核生物のｍＲＮＡは短い半減期を有し、したがって、生存可能な生物中でのみ見出されることが予測されるであろう。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、ｍＲＮＡに比べて、比較的安定なＲＮＡ標的であり、ｍＲＮＡより実質的に長い半減期およびｍＲＮＡより多い存在量を有し、ｍＲＮＡの全プールの１００倍の量が推定される。したがって、ＲＮＡの安定化、抽出および分析は、従来見逃されてきたスメア陰性のＴＢ陽性試料の診断および処置ならびに新規投薬計画または現状の抗ＴＢ治療の治療限界または有効性の迅速な測定にとって、特に価値があるであろう。ＴＢ陽性患者の喀痰からのＭＴ  ｍＲＮＡの迅速な消失は、それが微生物の生存率の良好な指標であり、治療に対する応答の迅速な評価のための良好なマーカーであることを示唆する（ＬＥ  Ｄｅｓｊａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐｕｔｕｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」（１９９９）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６０：２０３−２１０）。
【００１７】
現在利用可能なＤＮＡ抽出用の「非機械的な」方法としては、「迅速抽出法（Ｒａｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）」（トリス、ＥＤＴＡおよびトリトンＸ−１００を含むリシスバッファーと試料を混合し、１５分間沸騰させ、ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させる）、「有機溶媒抽出法（Ｏｒｇａｎｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）」（フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールと試料を混合し、水層からＤＮＡを沈殿させる）、「シリカベース抽出法（Ｓｉｌｉｃａ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）」（グアニジンチオシアネート、チオシアン酸、ＥＤＴＡおよびトリトンＸ−１００を含むリシスバッファーと試料を混合し、シリカと共にインキュベートし、洗浄し、シリカからＤＮＡを溶出する）、および磁気粒子、例えば、「ＭａｇａＺｏｒｂ（商標）」（プロテイナーゼＫおよびリシスバッファーと試料を混合し、インキュベートし、結合バッファーと磁気粒子を加え、洗浄し、粒子からＤＮＡを溶出する）が挙げられる。現時点では、ＲＮＡは物理的または機械的な破壊（例えば、ビーズビーティング）によってのみＭＴから放出させることができ、ＲＮＡは分解されることが多い。
【００１８】
この背景情報は、出願者が考えている既知の情報を本発明に可能な限り関連づけるために提供されている。前述のいずれかの情報が本発明に対する先行技術となることを承認することを必然的に意図するものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、過ヨウ素酸塩を使って微生物からＤＮＡおよびＲＮＡを放出させるための方法およびシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の一態様では、酸化剤および緩衝液を含む組成物を提供し、この酸化剤は過ヨウ素酸、過ヨウ素酸塩または過硫酸塩である。
【００２１】
本発明の別の態様では、微生物から核酸を抽出する方法が提供され、方法は、微生物を含むと疑われる試料を酸化剤と混合し、得られた混合物を加熱することを含み、酸化剤は過ヨウ素酸、過ヨウ素酸塩または過硫酸塩である。
【００２２】
本発明の別の態様では、核酸抽出用のキットが提供され、キットは、（ｉ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で過ヨウ素酸塩または過硫酸塩および約７〜約１３のｐＨの緩衝液を含む抽出組成物；および（ｉｉ）使用説明書を含む。
【００２３】
本発明の別の態様では、試料中の総核酸の定量用の方法が提供され、方法は、（ｉ）試料を酸で処理し、酸性化試料を加熱すること；（ｉｉ）酸性化試料を中和すること；および（ｉｉｉ）中和された試料を逆相カラムを用いるＨＰＬＣに供し、ＵＶ分光法により溶出液をモニターしてアデニンに相当するピークを特定すること；（ｉｖ）試料中の総核酸の尺度としてアデニンピークの曲線下面積を計算することを含む。
【００２４】
本発明をよりよく理解するために、本発明のその他の態様およびさらなる特徴に加えて、添付図面と併せて使用される以下の記述を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、純粋なＤＮＡからアデニンを放出させるための酸処理からの結果を示すグラフである。
【図２】図２は、未処理の枯草菌細胞の懸濁液中に存在するＤＮＡからのアデニンの放出の結果を、酸濃度の関数として示すグラフである。
【図３】図３は、酸抽出法およびビーズビーティング法により検出された全ＤＮＡの比較の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本出願の組成物を使用して出芽酵母から放出された核酸を示すアガロースゲルの写真である。
【図５】図５は、過ヨウ素酸塩および加熱を使用して枯草菌から放出されたＤＮＡおよびＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。
【図６】図６は、過ヨウ素酸塩および加熱を使用してスメグマ菌から放出されたＤＮＡおよびＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。
【図７】図７は、過ヨウ素酸塩で抽出した芽胞からのボツリヌス菌特異的ＤＮＡの検出を、市販の単離キット（Ｒｏｃｈｅ）と比較して示すグラフである。
【図８】図８は、過ヨウ素酸塩で抽出した芽胞からのクロストリジウム・ディフィシレ菌特異的ＤＮＡの検出を、市販の単離キット（Ｒｏｃｈｅ）と比較して示すグラフである。
【図９】図９は、「過ヨウ素酸塩」法と「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」法のｒｔＰＣＲ感度の比較を示すグラフである。
【図１０】図１０は、低、中および高ＴＢ負荷喀痰試料のｒｔＰＣＲを示すグラフである。
【図１１】図１１は、異なる抽出方法を使用して唾液試料から回収したａＭＴＢ  ＤＮＡのパーセンテージを示すグラフである。
【図１２】図１２は、過ヨウ素酸塩で処理した純粋な膵臓リボヌクレアーゼＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１３】図１３は、過ヨウ素酸塩で処理したスメグマ菌ライセートのＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図１４】図１４は、過ヨウ素酸塩での前処理によるＲＮアーゼＡの阻害を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図１５】図１５は、標準的汚染除去および過ヨウ素酸塩での処理後の炭疽菌芽胞の生存能を示すグラフである。
【図１６】図１６は、標準的汚染除去および過ヨウ素酸塩での処理後のボツリヌス菌芽胞の生存能を示すグラフである。
【図１７】図１７は、標準的汚染除去および過ヨウ素酸塩での処理後のクロストリジウム・ディフィシレ芽胞の生存能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２７】
本明細書および請求項で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数形の指示対象を包含する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、後に続くリストが非包括的であり、任意のその他の追加の適切な項目、例えば、必要に応じて１つまたは複数のさらなる特徴（単一または複数）、構成要素（単一または複数）および／または成分（単一または複数）を含んでも、または含まなくてもよいことを意味するものと理解される。
【００２９】
本明細書で使用される場合「試料」という用語は、任意選択で、注目している核酸、タンパク質またはその他の生体分子である対象物質を含む可能性のある任意の検体を意味すると理解される。「試料」という用語は、水溶液などの溶液、細胞、組織、生検材料、粉末、または１種または複数種のこれらの集団を包含してよい。試料は生物試料、例えば、唾液、喀痰、頬側スワブ試料、血清、血漿、血液、軟膜、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブまたは擦過物、尿、粘液、糞便、直腸スワブ、病変スワブ、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、消化管液、精液／精子、尿道スワブおよび分泌物、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄試料および吸引液、胸水および浸出液、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液または吸引液、腹膜浸出液、細胞培養液および細胞懸濁液、結合組織、上皮、上皮スワブおよびスメア、粘膜、筋組織、胎盤組織、生検材料、滲出液、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、土壌試料、下水、廃水、食糧、食肉加工設備スワブなどであってよい。試料はまた、安定化または保存された試料であってよく、その中で元の核酸含有試料が、限定されないが、例えば、Ｏｒａｇｅｎｅ（登録商標）・ＤＮＡ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎキット、Ｏｒａｇｅｎｅ（登録商標）・ＲＮＡ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎキット、ＯＭＮＩｇｅｎｅ（登録商標）・Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎキット、Ｐｅｒｆｏｒｍａｇｅｎｅ（商標）・ＬＩＶＥＳＴＯＣＫ  ＤＮＡ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎキット、およびＯｒａｇｅｎｅ（登録商標）・Ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎキットなどのキット中に見出されるような貯蔵溶液、または米国特許第７．４８２，１１６号、同８，１５８，３５７号および米国特許出願公開第２０１０／００９９１４９号（これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような組成物と混合されるかまたはそれで処理されている。このような安定化試料中の核酸は、長期間、例えば、試料捕集の時点から試験する研究室までの輸送、および本発明による処理まで、実質的に損なわれないで、また、分解されないで維持されるのが好ましい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、任意の顕微鏡的生物および芽胞を意味すると理解され、これらには、すべての原核生物、すなわち真正細菌および始原細菌、および種々の形態の真核生物が挙げられ、原虫類、真菌（例えば、酵母）、藻類、および輪虫類およびプラナリアなどの動物が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「キレート化剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）」という用語は、特定の金属イオンと可溶で安定な錯体を形成し、それらのイオンを封鎖し、それにより、それらのイオンがその他の成分と正常に反応できないようにする化学薬品を意味するものと理解される。キレート化剤は、例えば、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「変性剤」という用語は、タンパク質がそれらの天然の二次および／または三次構造を失う原因となり得る任意の化学薬品を意味すると理解される。変性剤は、例えば、アニオン洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、またはラウロイル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ））、カチオン洗剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）（これはいくつかの核酸用途に好適であり得る）、セチルピリジニウムブロミドまたはアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリド）、または非イオン洗剤（例えば、ツイーン、トリトンＸ、またはブリージなど）であってよい。
【００３３】
本出願は、微生物から核酸を抽出するための方法、組成物およびシステムを提供する。本方法、組成物およびシステムは、通常は標準的核抽出技術に抵抗性である、例えば、マイコバクテリウム属の１つまたは複数の種、結核菌群の１つまたは複数の種、結核菌のＭＤＲ株、クロストリジウム属の１つまたは複数の種、バチルス属の１つまたは複数の種、および頑丈な細胞壁を有するその他の微生物などの、微生物および芽胞から核酸を放出させることができる。
【００３４】
本抽出方法、組成物およびシステムは結核市場を超える用途がある。この方法、組成物およびシステムは、ヒトおよび動物の医療診断および研究（例えば、微生物進化、毒性、薬剤耐性、および疫学を調査するための集団ゲノム科学）に有用である。さらに、食の安全（食物／肉を加工するプラント）、土壌および水サンプリング（環境試験）、バイオセキュリティーまたはバイオディフェンス（炭疽病芽胞およびその他の生物学的兵器）、動物の飼料試験、農業／植物科学／産業、アルコール生産、などを含む、多くの市場／産業が、強靭な微生物および芽胞をこじ開ける効率的な方法を探している。
【００３５】
新規で急速に拡大している研究の注力対象は、腸内微生物叢または腸マイクロバイオームならびに健康なおよび病気のヒトの便中の微生物の分析である。研究および経済的理由のために、家畜、特に乳製品および肉用に飼育されている動物の反芻胃中の数千の異なる微生物の分析への極めて大きな関心も存在する。
【００３６】
意外にも、本発明者らは、一般的な研究用の化学薬品である過ヨウ素酸塩を弱アルカリ性ｐＨおよび高温で使って、増殖および休眠の両状態にある微生物（例えば、内生胞子および芽胞）から、迅速かつ効率的に核酸を放出させることができることを見出した。この予想外の核酸の放出は、過ヨウ素酸塩に特異的に見え、およびより低い程度で過硫酸塩に特異的であるように見える。ヨウ素酸塩などの関連化合物は、細菌または真菌からの核酸の放出を顕著には高めない。
【００３７】
本発明の化学的組成物および方法は、低温流通体系または高価で時間のかかる試料汚染除去および乳化を必要とせずに、検体調製または微生物の検出のための処理を単純化し、かつ促進する可能性を有する。本発明は、高スループットシステムを備えた中央研究室で、または最小限の研究室インフラおよび設備を備えた地方のまたは移動式医院で使用できる。この実用性により、疫学的なおよび爆発的感染の監視、収集場所での現場の試料からの世界的流行および伝染の追跡、ならびに治療に対する患者の応答の迅速な評価およびモニタリングが容易になる。
【００３８】
マイコバクテリウム属の頑丈な細胞壁は、肉厚で蝋状の疎水性ミコレート層およびペプチドグリカン層から構成され、これらの層は多糖により一緒に保持される。細胞壁の蝋状の成分をはぎ取ることが可能かどうかを決定するために、種々の溶媒（例えば、Ｖａｒｓｏｌ、ＤＭＳＯおよびＨｅｍｏ−Ｄｅ（登録商標））を試したが、ＤＮＡの放出の増加は観察されなかった。同様に、種々の洗剤（例えば、ＳＤＳ）、ギ酸、およびホウ酸塩を高温で試験した。これらの化合物のいずれも、たとえ１００℃においても、マイコバクテリアから１０％を超えるＤＮＡを放出させるとは認められなかった。
【００３９】
微生物からの高比率の放出に加えて、本発明の非機械的抽出組成物および方法は、試料を非感染性にするというさらなる利点を有しており、これは、研究室スタッフの安全性にとって有益であろう。意外にも、実質的に全ＤＮＡが放出される条件下であっても、本発明の組成物および方法は、マイコバクテリアの抗酸性染色および顕微鏡による観察を可能にする。対照的に、発明者らは、本組成物および方法での処理時に酵母は、染色または顕微鏡によるさらなる解析ができなくなるまで、急速に崩壊することを観察した。
【００４０】
本出願の方法およびシステムは、細菌および芽胞からＤＮＡ／ＲＮＡを放出させるのに有用である。細菌は、例えば、ヒト型結核菌、結核菌群の種、スメグマ菌、ウシ結核菌、アフリカ型結核菌、ネズミ型結核菌、マイコバクテリウム・カネッティ、ヒツジ菌、アシカ型結核菌、マイコバクテリウム・マリヌム、癩菌、マイコバクテリウム・レプロマトーシス（らい菌株）、鳥型結核菌、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、ヨーネ菌、マイコバクテリウム・ウルセランス、マイコバクテリウム・ゴルドナエ、バチルス属種、枯草菌、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎クラミジア、トラコーマ病原体、トキソプラズマ原虫、連鎖球菌属種、ブドウ球菌属種、ニ核アメーバ、ボレリア・ブルグドルフェリおよびその他の種、クロストリジウム属種、有核紡錘菌、サルモネラ属種、カンピロバクター属種、ファーミキューテス菌、バルトネラ属種、リケッチア属種、エルシニア属種、フランシセラ属種、ブルセラ属種、ボルデテラ属種、ブルクホルデリア属種、シュードモナス属種、赤痢菌属種、クラミドフィラ属種、レジオネラ属種、リステリア属種、コリネバクテリウム属種、腸球菌属種、大腸菌属種、ヘモフィルス属種、ヘリコバクター属種、レプトスピラ属種、マイコプラズマ属種、ナイセリア属種、トレポネーマ属種、またはビブリオ属種であってよい。
【００４１】
本出願の方法およびシステムは、真菌からＤＮＡ／ＲＮＡを放出させるのに有用である。真菌は、例えば、サッカロマイセス、カンジダ、アスペルギルス、ヒストプラズマ、ニューモシスティス、スタキボトリスまたはクリプトコッカスであってよい。
【００４２】
過ヨウ素酸塩抽出組成物
過ヨウ素酸塩は、多くの形態で存在でき、メタおよびオルト過ヨウ素酸塩（それぞれ、ＩＯ４−およびＩＯ６−５）が含まれ、これらは、ヨウ素および酸素から形成される陰イオンであり、通常、カリウムとの塩（例えば、ＫＩＯ４）またはナトリウムとの塩（例えば、ＮａＩＯ４）として存在する。水溶液では、少なくとも４種の過ヨウ素酸塩、すなわち、オルト過ヨウ素酸（Ｈ５ＩＯ６）、過ヨウ素酸（ＨＩＯ４）、メソ過ヨウ素酸（Ｈ３ＩＯ５）、および三過ヨウ素酸（Ｈ７Ｉ３Ｏ１４）が知られている［Ｎ．Ｎ．Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，ｐｐ．８７２−８７５（１９９８）］。溶液中では、過ヨウ素酸塩は酸化剤となることができ、分子生化学において、サッカライド環の開環およびＲＮＡの標識に利用される。過ヨウ素酸塩は、合成ポリマーおよび天然のポリおよびポリサッカライド中のヒドロキシル基を有する隣接する炭素原子（シスグリコール）の間で結合を切断し、２つのアルデヒド基を生成する。これらのアルデヒドは、一級アミン活性化またはヒドラジド活性化標識／タグ、固定化担体および架橋剤との２つのタイプのカップリング反応に使用できる。過ヨウ素酸はまた、組織学的染色で、組織中のグリコーゲンおよびその他のポリサッカライドを検出するのに使用される染色法である、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で使用される。しかし、発明者らの知る限りでは、過ヨウ素酸塩は、これまで、微生物からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出に使用されたことはない。
【００４３】
過ヨウ素酸塩抽出組成物は、試料と混合する場合、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ〜約３０ｍＭ過ヨウ素酸塩を含み得る過ヨウ素酸塩の水溶液であり、過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸塩、オルト過ヨウ素酸塩またはこれらの任意の組み合わせであってよい。弱アルカリ性ｐＨで５ｍＭ程度の低い濃度の過ヨウ素酸塩を有する組成物は、熱と共に、限定されないが、マイコバクテリウム属、クロストリジウム属およびバチルス属種を含む頑丈な細菌および芽胞から相当量のＤＮＡを放出させる。試料中の２５〜３０ｍＭまでの過ヨウ素酸塩の濃度もまた、上記試料中の微生物からのＤＮＡを効率的に放出することに奏功する。さらに高い濃度の過ヨウ素酸塩でも、成功する可能性が高いが、好ましくない副反応が起こる場合がある。過ヨウ素酸ナトリウムの実用的な最大溶解度は約４００ｍＭであり、このことにより製造目的のために高濃度組成物またはストック溶液を生成するのが困難になる可能性がある。
【００４４】
高濃度での過ヨウ素酸塩の溶解度の問題を回避するために、それらを過ヨウ素酸の形で組成物中に添加でき、過ヨウ素酸塩はＮａＯＨなどの塩基を使って中和され得る。あるいは、過ヨウ素酸塩を、過ヨウ素酸ナトリウム（本明細書では、ＮＰＩと呼ぶこともある）、過ヨウ素酸カリウムまたは過ヨウ素酸リチウムなどの過ヨウ素酸塩の形態で導入する。そのより高い溶解度のため、過ヨウ素酸塩のナトリウム塩（ＮａＩＯ４）の使用は、カリウムおよびリチウム塩よりも好ましい。あるいは、過硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ８）、過硫酸カリウムおよび過硫酸アンモニウムを使って、微生物および芽胞から核酸を放出させることができる。
【００４５】
水中で試料と混合される単なる過ヨウ素酸ナトリウムの溶液が微生物から核酸を抽出するが、過ヨウ素酸塩の作用はｐＨ依存性である。約５〜約１１のｐＨで、ＤＮＡおよびＲＮＡの抽出が観察され、中性に近いｐＨで、ＲＮＡの健全性がより良好に保存される。特定の実施形態では、本出願の抽出組成物は、約６．５〜約１１、または約８．０〜約１０．５、または約９．５〜約１０．５のｐＨに緩衝される。一実施形態では、最適ｐＨ領域を決定するために、抽出組成物は、緩衝剤の組み合わせを使って緩衝される。例えば、組成物は、リン酸（ｐＫａ２．１５、７．２０、１２．３８）、酢酸（ｐＫａ４．７６）およびホウ酸（ｐＫａ９．２４）の組み合わせを使って緩衝され得る。
【００４６】
任意選択で、過ヨウ素酸塩抽出組成物は、リチウム塩類、洗剤および／またはキレート化剤を含む追加の成分を含んでよい。特定の実施形態では、過ヨウ素酸塩抽出組成物は、ＬｉＣｌ、ＳＤＳおよび／またはＣＤＴＡをさらに含む。任意選択で、組成物は、緩衝剤としてグリシンまたはホウ酸塩をさらに含む。有利なことに、これらの追加の成分は、核酸を、微生物からの抽出中およびその後の下流での分子試験（例えば、ＰＣＲ、マイクロアレイ）のための生物試料の処理中に損なわれないままで維持することを確実にする。追加の成分はまた、試料の液化および取り扱い中の安定性の付与を支援し得る。試料がこれらの追加の成分を含む過ヨウ素酸塩組成物中に直ちに収集される場合には、核酸は収集の時点から、試料の輸送および貯蔵中に、最適に保存され、試料の核酸抽出処理を可能にし、目的の試験を完結させるであろう。
【００４７】
任意選択で、過ヨウ素酸塩を含まず、ＬｉＣｌ、ＳＤＳおよび／またはＣＤＴＡおよび／または緩衝剤としてグリシンまたはホウ酸塩を含む抽出組成物を使って、収集の時点から、輸送および貯蔵の間、核酸抽出が必要となるまで試料中の核酸を保存できる。核酸抽出を行う時点で、過ヨウ素酸塩を加え、試料の核酸抽出処理を行い、目的の試験を完結できる。
【００４８】
核酸抽出方法
本出願は、微生物を含む試料から核酸を抽出するための方法をさらに提供する。方法は、微生物を含む試料を過ヨウ素酸塩を含む組成物と接触させ、得られた混合物を加熱することを含む。
【００４９】
特定の実施形態では、方法は、次のステップを含む：
−微生物懸濁液の調製：一例では、例えば、微生物が細菌の液体培養物である場合、細胞を遠心分離により収集し、洗浄（例えば、生理食塩水で２回）して、複合培地中に存在する可能性のある干渉混入物を除去する。洗浄した細胞（約５〜２０ｘ１０８）は、水（例えば、約２００μＬ）中に良好に懸濁されている必要がある。
−過ヨウ素酸塩抽出組成物の添加：典型的には、等容積の抽出組成物を等容積の細胞懸濁液と混合する（例えば、２００μＬの抽出剤を２００μＬの細胞懸濁液と混合する）。
−懸濁液の加熱：加熱ステップは通常、前ステップからの懸濁液を使って閉管中で行われる。通常、加熱ステップは、４５℃以上の温度、または約５０℃〜約１００℃の温度で、約１５分〜約６０分の時間で行われる。より長い時間およびより高い温度は、ＤＮＡの放出においてより効率的であり得るが、放出されたＤＮＡが部分的に分解される可能性がある。過ヨウ素酸塩で処理したスメグマ菌からのほぼ１００％のＤＮＡの放出は、８０℃で約２０分間の加熱により起こり、ＤＮＡの分解は最小限である。
【００５０】
特定の実施形態では、試料は、過ヨウ素酸塩抽出組成物の添加の前に、安定化または前処理組成物で最初に処理される。このような方法の一実施例では、次のステップを行うことができる：
１）（例えば、遠隔にある状況では）周囲条件下で核酸を安定化する、Ｏｒａｇｅｎｅ（登録商標）またはＯＭＮＩｇｅｎｅ（登録商標）などの安定化剤中に、喀痰試料などの試料を収集する；
２）低温流通体系を必要とせずに（例えば、冷蔵なしに）、安定化試料を研究室へ輸送する；
３）安定化試料へ過ヨウ素酸塩組成物を添加する、ならびに強靭な微生物（例えば、結核菌）および芽胞から実質的に全ての核酸を急速に効率的に放出させて、試料を非感染性にするために加熱する；
４）ステップ３で放出された核酸を単離するために処理された試料を迅速に、高コスト効率で処理する；ならびに任意選択で、
５）放出された核酸を使って、１回または複数回の診断試験を実施する。
【００５１】
既存の技術と比較して改善された核酸の放出の結果として、本発明の過ヨウ素酸塩処理は、診断試験の感度の増加およびより正確な診断または治療計画の有効性の判定をもたらし得る。
【００５２】
本出願はＤＮＡ抽出のためのキットをさらに提供する。キットは、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で過ヨウ素酸塩および約７〜約１３のｐＨで緩衝液を含む抽出組成物を含む。上述のように、抽出組成物は、リチウム塩、変性剤および／またはキレート剤を含む追加の成分を含んでよい。キットは、上記の抽出方法を実施するための説明書、試薬容器（単一または複数）および／または試料受け容器をさらに含んでよい。
【００５３】
汚染除去／消毒方法
本出願は、表面、例えば、装置、器具もしくは構造物の表面の汚染除去または消毒のための方法をさらに提供する。方法は、表面を過ヨウ素酸塩を含む組成物と接触させること、およびその表面を加熱することを含む。
【００５４】
本明細書で示してきたように、微生物を過ヨウ素酸塩を含む組成物および熱で処理する方法により、微生物からＤＮＡの放出が生じる。このＤＮＡの放出の結果は、微生物がもはや生存可能ではないということである。下記の実施例１２は、本発明の過ヨウ素酸塩組成物と加熱が、３種の頑丈な細菌を生育不能にする能力を示す。
【００５５】
通常、汚染除去または消毒方法における加熱ステップは、４５℃以上の温度、または約５０℃〜約１００℃の温度にて、約１５分〜約６０分の時間で行われる。ＤＮＡの放出および表面の汚染除去または消毒においてより効率的である可能性があるので、本方法において、より長い時間およびより高い温度を使用してもよい。熱は、限定されないが、加熱ランプ、放射加熱システムおよびオーブンなどの種々の手段を使って表面に加えることができる。
【００５６】
微生物懸濁液中の全ＤＮＡの定量方法
本出願は、微生物学的試料を含む試料中の全ＤＮＡの定量のための方法を提供する。この方法を使って、本発明の組成物によるＤＮＡの放出の効率を計算するための基準として使用される試料中のＤＮＡの合計量が確定される。
【００５７】
比較的温和な酸の条件への暴露がＤＮＡの分解（主鎖の切断）を起こし得ることはよく知られている。分解は２つのステップで起こる。第１に、酸がＤＮＡの脱プリン、すなわち、プリン核酸塩基（アデニンおよびグアニン）の放出を触媒するが、ピリミジン核酸塩基（チミンおよびシトシン）の放出は触媒しない。この結果は、アプリン酸と呼ばれるかなり安定な構造である。最終的に、主鎖はβ脱離によりアプリン部位で破断し、デオキシリボースおよびリン酸を放出する；このプロセスは、アルカリでの処理または特定の触媒により促進される［例えば、Ｋ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌｕｎｔ，Ｇ．Ｂ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｃ．Ｓｉｅｂｋｅ，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８，ｐｐ．２８−３４（１９６３）］。
【００５８】
対照的に、温和な酸処理によるＲＮＡの脱プリンについては、これまで何ら詳細な調査がされてこなかった。ＲＮＡのプリンはＤＮＡのプリンより安定であると一般に理解されているが、並列的に並べて比較されたことはなかった。逆に、ＲＮＡは温和なアルカリでの処理により容易に分解するが、ＤＮＡの主鎖はこれらの条件下で極めて安定であることが知られている［例えば、Ｇ．Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｔｈａｎｎｈａｕｓｅｒ，Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．１６１，ｐｐ．８３−８９（１９４５）］。ＲＮＡ主鎖のアルカリ触媒破断は、２つのステップで進行する。第１に、１つのヌクレオチドのリボース３’−ヒドロキシルを隣接ヌクレオチドの５’−ヒドロキシルに連結するリン酸ジエステル結合が、最初のヌクレオチドの２’−ヒドロキシルに転移される（切断ではない）。これにより、リン酸エステル結合の加水分解的切断なしに分子鎖切断が生ずる。得られた２’，３’−環状リン酸ジエステルは比較的安定であるが、アルカリによるさらなる処理で、ほぼ同じ比率で２’−ホスホモノエステルまたは３’−ホスホモノエステルへとゆっくりと開裂させることができる。これらの条件下で、ＤＮＡ主鎖は極めて安定である。理由は、ＤＮＡの糖（デオキシリボース）が３’−ヒドロキシルに隣接する２’−ヒドロキシルを欠いており、そのために、容易な第１のステップである２’，３’−環状リン酸ジエステルの形成ができないためである。
【００５９】
この科学文献は、上記の反応に関する一般背景情報を含んでいるが、ＤＮＡのほぼ定量的な脱プリンを生成し、同時に、ＲＮＡの脱プリンをほとんどまたは全く生じない酸処理の詳細な特定の条件は、以前には記載されていない。
【００６０】
アデニンおよびグアニンがＤＮＡから定量的に放出されるが、ＲＮＡからは放出されない明確な条件を把握することは、極めて有用である。それは、現時点では扱いが面倒な、複雑な生物試料および微生物中のＤＮＡの高感度で再現可能な定量を、検出前の増幅ステップを行うことなく、可能にする。例えば、試料の調製およびＤＮＡの精製は、ＵＶ吸光度または蛍光のＤＮＡ結合染料などのアッセイ方法が適用される前に必要な第一ステップである。ジフェニルアミンまたはＤＡＤＢ（ジアミノ安息香酸）をベースにした化学的方法は、複合多糖を含む、生物試料中の化合物により妨害を受けやすい［Ｇ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｇｉｖｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，３６９−３７６（１９７４）；Ｊ．Ｍ．Ｋｉｓｓａｎｅ，Ｅ．Ｒｏｂｉｎｓ，Ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３，１８４−１８８（１９５８）］。意外にも、未処理の微生物の懸濁液中に存在する損なわれていないＤＮＡ（またはＲＮＡ）の量を測定する単純で正確な方法は現時点ではない。このような情報を得ることは、任意の既存のまたは新規な方法または組成物が生物の懸濁液から実際にＤＮＡを放出する効率の決定に不可欠である。抽出効率（Ｅ）は、処理により抽出されたＤＮＡの量（ＤＮＡｅ）を、未処理試料中に最初に存在するＤＮＡの総量（ＤＮＡｔ）により除算した量として定義される。
Ｅ＝ＤＮＡｅ／ＤＮＡｔ
本明細書中に記載する酸抽出／ＨＰＬＣ法はこのような決定を可能にするために開発された。
【００６１】
したがって、本出願は、試料中の全ＤＮＡの決定方法を提供する。この方法は、下記の実施例１に詳細に記載される。一般に、この方法は、ＨＣｌまたは別の酸（例えば、濃縮ギ酸など）と共に試料を含む核酸を加熱するステップ（「酸加水分解」ステップ）、続いて、逆相ＨＰＬＣカラム（例えば、Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸカラム）を用いるＨＰＬＣ分析の前に試料の中和を行うステップを含む。移動相は、使用される特定のカラムに基づいて種々の溶媒または溶媒混合物から選択できる。適切な移動相の選択は、当該技術分野の作業者の標準的能力の範囲内であろう。一実施形態では、移動相は２％メタノール、１ｍＭ  ＣＤＴＡ、３０ｍＭ酢酸アンモニウムである（ナトリウムモノホスフェートでｐＨ６．３に調節）。任意選択で、方法はＲＮＡの定量を可能にするステップをさらに含む。試料中のＲＮＡの量を決定するために、試料をＨＣｌと共に加熱するステップの後で、添加したＨＣｌの量より０．１Ｎ過剰になるまでＮａＯＨが添加され、１００℃で１５分間インキュベートされる。
【００６２】
アデニン（ＤＮＡを表す）および２’または３’アデノシンモノホスフェート（２’−および３’−ＡＭＰ）（ＲＮＡを表す）に対応するＨＰＬＣピークの曲線下面積（「ＡＵＣ」）を、ＴｏｔａｌＣｈｒｏｍ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使って計算した。検量線は、既知の濃度のこれらの純粋な分析物（アデニン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）；２’−、３’−ＡＭＰ（混合物）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を使って作成できる。
【００６３】
本明細書で記載の発明のより良好な理解を得るために、次の実施例が示される。これらの実施例は、単に例示目的であることを理解されたい。したがって、これらの実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００６４】
実施例
実施例１：試料中の全ＤＮＡを測定するための酸抽出ＨＰＬＣ法
表１は、本発明者らにより開発された生のまたは未処理の微生物／試料中の核酸、ならびに本発明による処理で得られるこのような微生物／試料から放出された核酸の合計量を正確に測定するための酸抽出／ＨＰＬＣ法の詳細を示している。
【００６５】
【表１】
2017510284.tif 000002
【００６６】
実施例１Ａ：純粋ＤＮＡ。ＤＮＡからのアデニンの放出のための最適酸抽出条件
この実施例では、純粋なゲノムＤＮＡからのアデニン放出量を、種々の酸処理時間で測定した。４６０ナノグラムの純粋なイヌのＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、６０℃で示した時間、酸抽出法に供した。結果を、図１に示す。エラーバーは３回の繰り返し実験試料のＳＥＭを示す。
【００６７】
結果は、６０℃、６０分のインキュベーションがＤＮＡから最大量のアデニンを放出させるのに十分であることを示す。４０分までに大部分のアデニンが放出され、８０分の処理でさらなるアデニンの放出がなく、６０分までにアデニンの脱プリンが完了したことを示す。
【００６８】
実施例１Ｂ：未処理の細菌細胞からのアデニンの放出のための最適酸濃度
図２に示すように、種々の濃度（ノルマル）のＨＣｌと共に枯草菌細胞を６０℃で６０分間インキュベートした。エラーバー、２回繰り返しの平均および範囲；エラーバーが示されていない場合は、その範囲の値は記号内に入っている。
【００６９】
結果は、未処理の枯草菌からのアデニンの最大放出が、約０．２０〜０．２５Ｎの範囲のＨＣｌ濃度で起こることを示す。
【００７０】
実施例１Ｃ：酸抽出ＨＰＬＣ法と比較したＤＮＡ含量を推定するためのＣＦＵ法
この実験は、細菌細胞の数を計数することによる細菌培養液中に存在するＤＮＡの量（コロニー形成単位（ＣＦＵ）として推定される量）を、酸抽出ＨＰＬＣ法を使ってアデニンのＡＵＣから計算されるＤＮＡの量と比較するために計画した。
【００７１】
ＣＦＵ法は、試料中の生存可能な細菌細胞の数を推定するために使用される古典的な方法である。しかし、この方法は時間がかかり、理論的な制約がある。細菌は通常、小さい凝集塊として増殖する。したがって、目視できる細菌の「コロニー」として数えられるものは、実際には、単一細胞に起因するかまたは２つ以上の細胞の凝集塊に起因する可能性がある。また、培養液中の生育しないいかなる細胞もＤＮＡを含むであろうが、コロニーを形成しないであろう。これらの２つの因子は、懸濁液中の細菌細胞の実際の数を過小評価する傾向がある。細胞数の推定値および「文献」上の細胞当たりのＤＮＡの知識から、細胞懸濁液中のＤＮＡの合計量を計算することができる。
【００７２】
対照的に、酸抽出ＨＰＬＣ法は、細胞懸濁液中のＤＮＡの合計量を推測するための直接的な化学的方法である。発明者らはこの方法を、主に頑丈な微生物および芽胞からの核酸放出に対する本発明の有効性を示すために開発した。この方法（上で詳細に述べられている）は、ＤＮＡからのプリンの放出および細胞からのアデニンの抽出、ならびにその後のＨＰＬＣを用いるアデニンの検出と定量に基づいている。既知の量のアデニンを、ＤＮＡの塩基組成から既知の量のＤＮＡに変換できる。例えば、４８％のＧＣ含量を有するＤＮＡの場合は、アデニンからＤＮＡへの変換係数は１０である。
【００７３】
この実施例は、ＣＦＵと酸抽出ＨＰＬＣ法を、枯草菌の懸濁液中のＤＮＡを測定する能力に関して比較する。ＣＦＵを推定するために、対数期細菌（トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）中で増殖）の懸濁液を２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６の冷溶液で洗浄し、２つの部分に分けた。１つの部分をＴＳＢ中で３組ずつ系列希釈し、トリプチックソイ寒天培地プレートの表面上に拡散した。３７℃で１８時間の増殖後、可視のコロニー数を数えた。もう一方の部分を分割して３つのチューブに入れ、遠心分離した。ペレットを２００μＬの０．２Ｎ  ＨＣｌ中に入れ、６０℃で６０分間インキュベートし、ＡＤＡで中和して、ＨＰＬＣで分析した。
【００７４】
報告されたゲノム配列データから、枯草菌のゲノムサイズを４８８０ｎｇ／１０９細胞とした。
【００７５】
【表２】
2017510284.tif 000003
【００７６】
【表３】
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【００７７】
ＣＦＵおよび酸抽出ＨＰＬＣ法は、枯草菌の純粋培養において極めて類似した細菌数の推定値を与えた。酸加水分解ＨＰＬＣ法は約２０％高い推定値を与え、上記で考察したＣＦＵ法による細胞数の予測される過小評価と一致する。この実施例は、酸抽出ＨＰＬＣ法が細胞内ＤＮＡから効果的にアデニンを放出させ、ＨＰＬＣによるその検出を可能にするという考えを裏付けている。
【００７８】
実施例１Ｄ：酸抽出ＨＰＬＣ法と比較したＤＮＡ含量を推定するためのリゾチーム／洗剤法
この実験は、酵素溶解法によるグラム陽性（すなわち、リゾチーム感受性）枯草菌から放出されるＤＮＡの量を、酸抽出ＨＰＬＣ法を使って未処理細胞中で測定されるＤＮＡの量と比較するために計画された。枯草菌などのグラム陽性菌は、酵素リゾチームによる処理に続くＳＤＳによる処理に対し非常に敏感であることが知られている（例えば、Ｂ．Ｍ．Ｃｈａｓｓｙ．Ａ  ｇｅｎｔｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６８：６０３−６０８（１９７６））。リゾチームは、細菌、特にグラム陽性細菌の細胞壁中に認められるペプチドグリカンを攻撃することにより機能するグリコシド加水分解酵素である。酸抽出ＨＰＬＣ法が本当に効果的であるならば、全細胞の酸処理により放出され、ＨＰＬＣにより検出されるアデニンの量は、リゾチーム＋ＳＤＳによる細胞の溶解により放出される量と同様であるはずである。
【００７９】
リゾチームプロトコル：
−枯草菌を１ｍＬのＬＢ培地中で指数増殖期まで増殖させて、遠心分離により採取した。
−細胞を氷冷ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄した。ペレットを１ｍＬのＴＥ緩衝液に入れ、４つの一定分量に分け、もう一度ＴＥで洗浄した。
−２つのペレットを９５０μＬのリゾチーム（ＴＥ中の１ｍｇ／ｍＬ）中に再懸濁し、３７℃で４５分間インキュベートした。
−５０μＬの１０％ＳＤＳを加えて、０．５％の最終濃度にした。
−ＫＣｌを加えて（最終濃度０．１Ｍ）ＳＤＳを除去し、０℃で５分間インキュベートし、５分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄した。
−試料を酸抽出ＨＰＬＣ法に供した。
−残存する２つの未処理ペレットを５００μＬのＨ２Ｏに入れ、酸抽出ＨＰＬＣ法に供した。
【００８０】
【表４】
2017510284.tif 000005
【００８１】
酸処理により未処理の枯草菌から放出されたアデニンの量は、１００％の細胞の溶解により１００％のＤＮＡの放出が予測される方法である、リゾチーム／ＳＤＳ処理により放出されたアデニンの量と実質的に同じであった。これは、酸抽出ＨＰＬＣ法が、未処理のグラム陽性細菌細胞中のＤＮＡの量を測定するための非常に効果的なツールであるという強力なエビデンスを提供する。
【００８２】
実施例１Ｅ：酸抽出ＨＰＬＣ法と比較した枯草菌からのＤＮＡ含量を推定するためのビーズビーティング法
この調査は、未処理の細菌細胞中のＤＮＡの初期量（酸抽出ＨＰＬＣ法により推定）を、「ビーズビーティング」法を用いる同じ細菌からのＤＮＡの放出量と比較するために行った。酸抽出ＨＰＬＣ法で使用した手順は、上述の通りであった。ビーズビーティング法で使用した手順は、以下にまとめている。
【００８３】
−複数の２ｍＬの一定分量の枯草菌の定常期培養液を遠心分離で採取し、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６（ＴＢＳ）の冷溶液中で遠心分離により２回洗浄した。
−メーカーの指示書にしたがって、Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ−１６（ＢｉｏＳｐｅｃ）中でビーズビーティングを行った。手短に言えば、洗浄した細菌ペレットを５００μＬのＴＢＳ中に懸濁し、約１００μＬの１００μｍガラスビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を含むねじぶた付きポリプロピレンマイクロチューブに移した。
−チューブを装置に固定し、３，４５０振動／分での１分サイクル２回で激しい撹拌を行った。２回のサイクルの間に、氷上で１分間試料を冷却した。
−懸濁液を１．５ｍＬの微量遠心機チューブに移し、微量遠心機で１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、壊れていない細胞および壊死組織片を除去した。
−上清を取り出し、ＨＣｌを加えて０．２Ｎの最終濃度とした。試料を６０℃で６０分間インキュベートした。
−ビーズビーティングにより生成された細胞ライセートに対して、未処理の細胞中のＤＮＡの量を比較するために、一定分量の未処理枯草菌細胞を０．２ＮのＨＣｌ中、６０℃で６０分間インキュベートした（酸抽出法）。
−全試料を１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離して壊死組織片を除去し、その一部の４０μＬを逆相Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に供し、ＨＰＬＣにより分析した。
【００８４】
この調査の結果を図３に示す。エラーバーは２回繰り返し分析の範囲を示す。
【００８５】
「ビーズビーティング」は、細菌細胞を破壊しＤＮＡを放出させることにおいて高効率的であると一般に考えられているが、必ずしもそうではない。この実験は、酸抽出ＨＰＬＣ法が、ビーズビーティングより真実に近い、よりばらつきの少ない、最初の細胞懸濁液中のＤＮＡの実際の量の表現値を与えるという追加の証拠を提供する。他の実験では、ビーズビーティングにより放出されるＤＮＡの量は、１００％まで、すなわち、酸抽出法と同じ量までの範囲にわたった。ビーズビーティング法は、結果が変動するため、未処理の細菌細胞懸濁液中に存在するＤＮＡの量を推定するための信頼できる方法ではない、
【００８６】
実施例２：過ヨウ素酸塩と、他の過ハロゲン化化合物および酸化性化合物の比較
この実施例中では、一連の過ハロゲン化および酸化性化合物を、細菌細胞からの核酸放出におけるそれらの有効性について評価した。（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム四水和物、過塩素酸ナトリウム、過硫酸ナトリウム（それぞれ１５ｍＭ）を使って、一定分量の枯草菌増殖細胞（すなわち、芽胞ではない）懸濁液を処理した。試験化合物と共にまたは無しで、７０℃で２０分間のインキュベーション後、それぞれの懸濁液の上清画分（ならびに、未処理の細菌細胞）を酸加水分解ＨＰＬＣ法に供し、それぞれの処理により細菌から放出されたＤＮＡのパーセンテージを計算した。
【００８７】
実験方法および材料
−ＢＤ緩衝液（２％ＳＤＳ、５ｍＭのＬｉ−ＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）を調製した。
−下記のそれぞれについて、試験化合物の３００ｍＭストック溶液を蒸留水中で新しく調製した：（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ−１８７８）、過ホウ酸ナトリウム四水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号７１８４０）、過塩素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４１０２４１）、および過硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１６２３２）。
−０．８ｍＬのＢＤ緩衝液を含む５つのチューブに１００μＬ（または陰性対照用に１００μＬの水）を移すことにより、上記ステップ由来のそれぞれのストック溶液の１０倍希釈溶液を作製した。
−作業用試験溶液：水（１００μＬ）を各チューブに加え、それぞれのストック溶液の最終濃度を８０％ＢＤ緩衝液中の３０ｍＭにした。
−洗浄したペレットを、等容積の定常期枯草菌懸濁液から調製した。
−それぞれのペレットを３００μＬの水に懸濁した。
−等容積（３００μＬ）のそれぞれの作業用試験溶液（すなわち、８０％ＢＤ緩衝液または水（陰性対照）中の、３０ｍＭの（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム四水和物、過塩素酸ナトリウム、または過硫酸ナトリウム）を、それぞれの細菌懸濁液に加え、よく混合した。
−混合物を７０℃で２０分間加熱した。
−加熱後、各混合物を１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を保持した。不溶性物質のペレットを廃棄した。
−塩酸を上清画分に加えて、０．２Ｎの最終濃度とした。
−混合物を６０℃で６０時間加熱した。
−１５０μＬの一定分量のそれぞれの試料を、１００μＬのＡＤＡ緩衝液、ｐＨ８．０で中和した。
−その後、それぞれの試料をＨＰＬＣで分析してアデニンのＡＵＣを決定した。未処理の細胞の３つの洗浄ペレット（ステップ５）を酸加水分解ＨＰＬＣ法に直接供して、それぞれの細菌ペレット中のＤＮＡ（アデニン）の合計量を決定した。
【００８８】
結果
結果は、下表５にまとめられている。
【００８９】
【表５】
2017510284.tif 000006
【００９０】
結論
単一濃度（１５ｍＭ）で試験した４つの化合物の内、（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムおよび過硫酸ナトリウムのみが対照より多くのＤＮＡ、すなわち、それぞれ、枯草菌の全ＤＮＡの４４％および１５％を放出した。対照的に、その他の過ハロゲン化／酸化性化合物は、対照（６．７％）に満たないＤＮＡを放出した。
【００９１】
本実施例は、過硫酸塩もまた、過ヨウ素酸塩と同様にして核酸放出を増加させるよう機能し得ることを示す。
【００９２】
実施例３：過ヨウ素酸塩抽出に対するｐＨの効果
一連のｐＨ範囲でのＮＰＩ（（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム）の有効性および用量依存性の試験では、（ｉ）緩衝液自体とのＮＰＩの反応の可能性（ｉｉ）異なるｐＨ値で異なる型のＮＰＩが存在する可能性がある（例えば、メタ過ヨウ素酸塩、オルト過ヨウ素酸塩）、および（ｉｉｉ）高ｐＨでＮＰＩの溶解度が低下する、などの各種の要因を考慮する必要があった。
【００９３】
これらの調査のために、一連のｐＫａ値をカバーする３種の異なる緩衝作用弱酸を含み単一塩基を使って目的のｐＨに調節した緩衝系を使用した。酸（ｐＫａ値）は、リン酸（２．１５、７．２０、１２．３８）、酢酸（４．７６）およびホウ酸（９．２４）であった。組み合わせた酸（各２０ｍＭ）の初期溶液は、１．９のｐＨであった（表６）（本明細書においては、「ＰＡＢ」緩衝液と呼ぶ）。ＰＡＢ緩衝液を５ＮのＮａＯＨで調節し、実験用に目的のｐＨ値を得た（表７）。
【００９４】
ｐＨ３．７、５．５、７．４および９．４でＰＡＢ緩衝液を単独および３種の濃度のＮＰＩ（最終濃度：６、１２および１８ｍＭ）と組み合わせて試験した。ＮＰＩを含むまたは含まない緩衝液を、洗浄したスメグマ菌のペレットに加えた。３種の異なる濃度のＮＰＩを試験し、細菌細胞からのＤＮＡの放出に関し、この濃度範囲で用量反応が存在するかどうかを決定した。したがって、スメグマ菌細胞を異なる濃度のＮＰＩを含む一連のｐＨ値のＰＡＢ緩衝液と共に加熱して、本明細書で記載の酸抽出ＨＰＬＣ法を用いて放出されるＤＮＡの量を測定した。
【００９５】
ＰＡＢ緩衝液
表６に挙げた成分を混合し、得られた混合物を一晩撹拌してホウ酸を完全に溶解させた。最初のｐＨは、１．９と測定された。
【００９６】
【表６】
2017510284.tif 000007
【００９７】
【表７】
2017510284.tif 000008
【００９８】
調製後、ＰＡＢ緩衝液を４℃で貯蔵した。
【００９９】
実験方法
新しい作業用溶液（ＰＡＢ緩衝液±ＮＰＩ）を、０、２０、４０または６０μＬの３００ｍＭのＮＰＩストック（水中）を１，０００、９８０、９６０または９４０μＬ（それぞれ）の各ＰＡＢ緩衝液に加えることにより調製した。作業用溶液は調製の３時間以内に使用した。
【０１００】
均等分散して、洗浄したスメグマ菌の懸濁液から洗浄したペレットを調製した（最終洗浄に水を使用した）。
【０１０１】
それぞれのペレットを２００μＬのＰＡＢ緩衝液±ＮＰＩ（最終濃度６、１２および１８ｍＭ）中に、３連で懸濁した。得られた混合物を７０℃で２０分間加熱した。
【０１０２】
混合物を１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を保持し、不溶性物質のペレットを廃棄した。
【０１０３】
ＨＣｌを上清に加え、０．２Ｎの最終濃度とした。酸性化画分を６０℃で６０分間加熱した。
【０１０４】
各１５０μＬの試料を１００μＬのＡＤＡ緩衝液（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）、ｐＨ８．０で中和した。その後、この試料をＨＰＬＣで分析した。
【０１０５】
結果
結果を下表８および９にまとめている。
【０１０６】
【表８】
2017510284.tif 000009
【０１０７】
【表９】
2017510284.tif 000010
【０１０８】
結論
３成分緩衝系を採用して、ＮＰＩが媒介するスメグマ菌からのＤＮＡの放出に対するｐＨ依存性の効果を実証した。ＮＰＩが無い場合には、７０℃で２０分のインキュベーション中に、２．１〜１１．５％のＤＮＡがスメグマ菌から放出された。対照的に、緩衝液への低濃度のＮＰＩ（６ｍＭ）の添加でさえ、同じ微生物から放出される全ＤＮＡの割合を約９倍の３７．４〜５９．４％まで、ｐＨ依存的に、顕著に高めた。意外にも、６ｍＭから１２ｍＭへ、さらには１８ｍＭまでＮＰＩの濃度を高めても、細菌からのＤＮＡの放出はわずかに追加されるだけであり、これは、中性およびアルカリ性のｐＨ値でのみ観察された。
【０１０９】
実施例４：過ヨウ素酸塩を用いる芽胞からの核酸の放出
枯草菌は、成長する増殖状態から極めて頑丈な非分裂性芽胞へと変化でき、生物体が極端な環境条件で生き残ることを可能にするグラム陽性バクテリアである。一般に、芽胞は熱（１００℃で数時間生存可能）、脱水、ＵＶ照射および酸化剤に対して極めて耐性が高い。芽胞形成は、栄養素の欠如が実質的に引き金になる。このバクテリアは非対称の様式で分裂し、非常に強靭な外壁に囲まれたバクテリアのゲノムＤＮＡを含む単一内生胞子の形成が起こる。この状態では、このバクテリアは、長期間にわたり、たとえ何百年間でも、休眠状態であるが生存可能な状態でいることができる。好ましい環境条件下で、内生胞子は再活性化され、成長（増殖）状態に戻ることができる。
【０１１０】
細菌芽胞はこじ開けるのが最も困難な細胞型に属すると考えられている。増殖細胞を破壊する一般的抗菌剤、例えば、家庭用消毒剤（例えば、アルコール、洗剤、第四級アンモニウム化合物）などは内生胞子を死滅させない。芽胞コートはリゾチームに感受性がない。この実施例中では、枯草菌芽胞から核酸を放出させることに関する（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムの有効性を示した。
【０１１１】
芽胞の調製
枯草菌の単一コロニーを２ｍＬのＬ培地（ＬＢ）に入れ、軌道プラットフォーム撹拌機を使って２００ｒｐｍ、３７℃で一晩増殖させた。細菌（１ｍＬ）を１１，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して採取し、上清を廃棄した。細菌を１ｍＬの冷無菌Ｈ２Ｏ中で２回の遠心分離により洗浄して、残留ＬＢを除去した。
【０１１２】
増殖細胞を芽胞に変換するために、細菌を２００μＬのＨ２Ｏ中に懸濁し、０．１ｍＭの塩化マンガンを含む１００ｍＬのコロンビアブロス［Ｊ．Ａ．Ｍｏｒｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｅｌｌｎｅｒ．１９６９．Ｎｅｗ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：６８−０７］に加えた。
【０１１３】
混合物を軌道プラットフォーム上で１６０ｒｐｍ、３７℃で７２時間震盪させて単位ｍＬ当たり約１０８個の芽胞を生成した。遠心分離により芽胞を採取し、水中の１５％エタノール中に懸濁した。
【０１１４】
使用前に、それぞれの芽胞試料を氷冷水で３回洗浄した。
全ての残存増殖細菌を除去するために、ペレットを１ｍＬの冷水に懸濁させた。リゾチーム溶液（４００μＬの、トリス（１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）中の５ｍｇ／ｍＬストック溶液）を加え、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベートした。芽胞を遠心分離により集め、上清を廃棄した。
【０１１５】
芽胞ペレットを１ｍＬの０．１％ＳＤＳ中に懸濁し、室温で５分間インキュベートした。芽胞のペレットを、９，０００ｒｐｍで４分間遠心分離して集め、上清を廃棄した。
【０１１６】
調製物中の全ての残余無細胞ＤＮＡを除くために、芽胞を、１０μｇの膵臓ＤＮアーゼを含む１ｍＬの１ｘＤＮアーゼ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２）に懸濁させて、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１１７】
芽胞懸濁液を９，０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを水で１回洗浄した。高度に精製された芽胞ペレットを１．２ｍＬのＨ２Ｏに再懸濁した。この調製物の大部分（８００μＬ）を次の実験方法にステップ２で使用した；３つの他の１００μＬの一定分量を酸抽出ＨＰＬＣ法（下記ステップの５〜８）で直接処理して芽胞の全ＤＮＡ含量を推定した；残りの１００μＬの一定分量の芽胞懸濁液をリゾチームおよびＳＤＳで２回目処理（上記ステップ９および１０）して、芽胞から放出されたＤＮＡが増殖状態に変換された細胞によるものではないことを確認した。その後、酸抽出／ＨＰＬＣ分析を行った。
【０１１８】
ＤＮＡ抽出
試薬ＢＡ、ＢＢ、ＢＣおよびＢＤを（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムを含んでおよび含まずに調製した（表１０）。
【０１１９】
一定分量（１００μＬ）の懸濁枯草菌芽胞（上記プロセスからの）を等容積のＢＡ、ＢＢ、ＢＣまたはＢＤと、（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムを含んでおよび含まずに混合した。混合物を７０℃で２０分間加熱し、その後、１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を保持し、不溶性物質のペレットを廃棄した。
【０１２０】
塩酸を上清画分に加えて、０．２Ｎの最終濃度とした。次に、この画分を６０℃で６０分間加熱した。それぞれの試料の一部（１５０μＬ）を１００μＬのＡＤＡ緩衝液、ｐＨ８．０で中和した。試料をＨＰＬＣで分析し、アデニンのＡＵＣを決定した。
【０１２１】
【表１０】
2017510284.tif 000011
【０１２２】
【表１１】
2017510284.tif 000012
【０１２３】
結論
意外にも、中等度の熱処理（７０℃、２０分）と共に、ＢＡＰおよびＢＤＰ試薬中に存在する低濃度の（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムにより、最も頑丈な生物である芽胞から、それぞれ、１０％および８．３％ものＤＮＡを放出させることができた。より高温度およびより長い処理時間が、より多くのＤＮＡを放出することが期待されよう。（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムの非存在下では、ＤＮＡの放出は検出できなかった。
【０１２４】
実施例５：過ヨウ素酸塩を用いる真菌からの核酸の放出
酵母は、真菌界に分類される単細胞の真核微生物である。酵母の１つの種である出芽酵母は、数千年間にわたり多数の用途に広く使用されてきた。発酵プロセスの間に、出芽酵母は単純炭水化物をＣＯ２（二酸化炭素）およびエタノール（エチルアルコール）へと代謝できる。ＣＯ２はパン焼きでの膨張剤として使用され、アルコールはアルコール性飲料の中心成分である。バイオテクノロジー産業は、近年、酵母を利用してバイオ燃料として使われるエタノールへと糖を変換するようになった。いくつかの酵母株は、バイオレメディエーションの分野で利用されている。出芽酵母は、最も完全に研究されている真核微生物の１つであり、依然として遺伝および細胞生物学研究のための重要な生物体である。
【０１２５】
細菌は典型的にはペプチドグリカンからなる細胞壁を有するが、真菌はグルコサミンポリマーであるキチンを含む細胞壁を有する。大抵の真菌類は、３つの層：キチン、他の多糖類（ザイモサン）、およびマンノプロテインからなる細胞壁を有する（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｅｌｌ＿ｗａｌｌ−ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−１１）。この実施例では、出芽酵母は、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）の放出に関するＮＰＩ（（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム）の有効性を試験する発明者らのための真菌界由来のモデル微生物としての役割を果たした。
【０１２６】
実験方法
試薬ＢＡ、ＢＢ、ＢＣおよびＢＤを（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムを含んでおよび含まずに調製した（表１０参照）。
【０１２７】
出芽酵母（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ  Ｂａｋｅｒｓ’  ｙｅａｓｔ）の培養液を、トリプチックソイブロス中で５０ｍＭのグルコースと共に３７℃で一晩増殖することにより調製した。８，０００ｒｐｍで３分間遠心分離することにより、６ｍＬの培養液から細胞を集めた。細胞ペレットを冷ＰＢＳを使って遠心分離により１回洗浄し、冷ＰＢＳに懸濁し、１０個のチューブ中に分配して、遠心分離し、得られたペレットを冷水で再度洗浄した。
【０１２８】
それぞれの洗浄したペレットを２００μＬの水に再懸濁し、ＮＰＩ（最終濃度１５ｍＭ）を含んでまたは含まずに等容積のＢＡ、ＢＢ、ＢＣおよびＢＤ試薬と混合した。懸濁液を７０℃で２０分間加熱した後、室温まで冷却した。懸濁液を１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、透明になった上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄した。
【０１２９】
それぞれの上清の一部の１０μＬを０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色してＤＮＡおよびＲＮＡを可視化した。
【０１３０】
上清画分の残りに対し、ＨＣｌを加えて０．２Ｎの最終濃度とした。試料を６０℃で６０分間加熱した。その後、１５０μＬのそれぞれの試料を１００μＬのＡＤＡ緩衝液、ｐＨ８．０で中和した。
【０１３１】
中和された試料（４０μＬ）をＨＰＬＣで分析し、アデニンのＡＵＣを決定した。
【０１３２】
結果および考察
過ヨウ素酸塩を含むまたは含まない種々の組成物での処理による出芽酵母からのＤＮＡの放出
下表１２に示す結果は、本発明のいくつかの特徴を示す。
【０１３３】
頑丈な単細胞の微生物である出芽酵母は、予想外に、（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムによるＤＮＡの放出に感受性が高い。水中で中性近傍のｐＨの（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム単独（ＢＣＰ）は、水中（ＢＣ）での同じ熱処理に比べて、７０℃で２０分の処理後に４倍多くのＤＮＡを放出させた（表１２）。
【０１３４】
高濃度のＳＤＳ（最終濃度１〜２％）の添加および／またはＬｉＣｌ（１２５ｍＭ）および／またはより高いｐＨおよび／またはキレート剤ＣＤＴＡ（２．５〜２５ｍＭ）は、さらにＤＮＡ放出量を高めた（表１２）。興味深いことに、（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムが無い場合の同一条件下で放出されるＤＮＡの量は、新規試薬のこれらの２次成分による影響を受けなかった（表１２）。
【０１３５】
文献の報告から予測されるように、酵母はＤＮＡに比べて大量のＲＮＡを含み、これはアガロースゲル電気泳動により観察できる（図４）。（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムの非存在下で試薬ＢＡおよびＢＤを用いる処理からの試料中に、明確で強いリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）バンドが認められ、（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムが添加されると（ＢＡＰ、ＢＤＰ）、より多くのＲＮＡが放出されるように見えるが、ＲＮＡは部分的に分解された。これらの実験では、処理条件により出芽酵母から放出されるＲＮＡを安定化する試みは行わなかった。
【０１３６】
ホウ酸塩で緩衝されたＢＢおよびＢＢＰを使って大量のＲＮＡが放出されたが、両方の場合で、ＲＮＡがかなり分解された（図４）。全ての場合で、ＲＮＡの量に比べて、ゲル上にごく少量の高分子量ＤＮＡが認められた（図４）。
【０１３７】
【表１２】
2017510284.tif 000013
【０１３８】
結論
この調査は、頑強な細胞壁を有する原子真核微生物である、出芽酵母からのＤＮＡおよびＲＮＡの両方の放出を、過ヨウ素酸塩を含まない同じ試薬に比べて、過ヨウ素酸ナトリウムを含む試薬での処理により大きく向上させることができることを実証した。出芽酵母からのＤＮＡおよびＲＮＡの放出を調べるためのアガロースゲル電気泳動を使って示されるように、いくつかの過ヨウ素酸塩試薬では、高分子量ＤＮＡおよびＲＮＡが抽出された。
【０１３９】
実施例６：種々の試薬中の枯草菌およびスメグマ菌からの核酸の放出に対する過ヨウ素酸塩および熱処理の効果
この実施例では、いくつかの組成物（表１０）における温度（室温、５０℃、７０℃、８０℃および１００℃）および（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム（最終濃度１５ｍＭ）の効果を、２つの異なる標的微生物、枯草菌およびスメグマ菌を使って評価した。これらの微生物からの核酸の放出を、酸抽出ＨＰＬＣ法、リアルタイムＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を使って評価した。
【０１４０】
枯草菌は、一般に土壌および植生中で見出される頑丈なバクテリアであり、研究室の調査で広く使用される。細胞はグラム陽性の、桿菌様であり、糖およびアミノ酸のポリマーであるペプチドグリカン（ムレイン）からなる堅い細胞壁を有する。有害環境条件下で枯草菌は、極限条件下で生き残ることができる強靭な保護芽胞を形成できる。
【０１４１】
マイコバクテリアは、染色技術により抗酸性として特定されることがある桿菌様細菌である。土壌中で見つかるいくつかの種は、良性であると考えられている。他の種はヒトおよびその他の哺乳動物にとって危険な病原体であり、世界の多くの地域で大被害を与えている疾患である肺結核（ＴＢ）の原因物質である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、いくつかのアフリカの国々における２０１０年のＴＢ感染症の発生率を人口１００，０００人当たり１，０００人と推定した。ＴＢおよびＨＩＶの同時感染は特に致死的な組み合わせである。懸念が高まっている原因は、広範囲にわたるＴＢ薬剤耐性（ＸＤＲ）株の出現であり、これは人の大きな健康上の問題である。
【０１４２】
マイコバクテリウム属種は、ミコール酸と呼ばれる蝋状の物質を含む特徴的で強靭な細胞壁を有し、これは微生物を強力な疎水性にする。この細胞壁は、ミコール酸層、ペプチドグリカン層およびポリサッカライドであるアラビノガラクタンから構成される。抗酸性染色の性質は、ミコール酸層に起因する。グラム陽性細菌は通常、リゾチームに感受性が高いが、マイコバクテリアの細胞壁を攻撃するそのような酵素は知られていない。この種から効果的にＤＮＡを放出させる現在の全ての方法は、何らかの形の機械的な破壊を必要とする。
【０１４３】
複雑な機械的な破壊ステップを完全に回避する本明細書に記載の方法を、これらの種の微生物からＤＮＡを遊離させるその能力に関して評価した。
【０１４４】
実験方法
枯草菌をトリプチックソイブロス中、３７℃で一晩増殖させた。一定分量（１００μＬ）の一晩培養液を使って、４０ｍＬのトリプチックソイブロスに播種し、振盪プラットフォーム上で３７℃にて対数期まで増殖させた。スメグマ菌をトリプチックソイ寒天培地上で３７℃にて３日間増殖させた後、冷Ｈ２Ｏ中に掻き出すことにより採取した。
【０１４５】
枯草菌およびスメグマ菌をそれぞれ２，７００ｇで１５分間遠心分離して集め、上清を廃棄した。細菌ペレットを、冷Ｈ２Ｏを使って２，７００ｇで１５分間の遠心処理と上清の廃棄を２回行うことにより洗浄した。洗浄した細菌ペレットを１５ｍＬの冷Ｈ２Ｏ中に再懸濁した。
【０１４６】
３つの一定分量（各３００μＬ）のそれぞれの細菌懸濁液を酸抽出ＨＰＬＣ法で直接処理し、これらの細胞中の総核酸含量を決定した。
【０１４７】
残りの各細菌懸濁液を１．５ｍＬの試料一定分量に分け、その後、等容積のＢＡ、ＢＢ、ＢＣまたはＢＤ試薬（表１０）と、（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム（試薬中３０ｍＭ、最終濃度１５ｍＭ）を含んでおよび含まずに混合した。
【０１４８】
各３ｍＬの一定分量を均等に（６００μＬ）に５つの微量遠心機チューブに分け、室温、５０℃、７０℃、８０℃または１００℃で２０分間インキュベートした。そのチューブを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。透明化した上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄した。一定分量（１９０μＬ）のそれぞれの上清を、以下のように酸抽出ＨＰＬＣ法により３重で行う直接分析用に取り出した（表１３および１４）：
【０１４９】
塩酸を上清画分に加えて、０．２Ｎの最終濃度とした。この画分を６０℃で６０分間加熱した。それぞれの画分の一定分量（１５０μＬ）を１００μＬのＡＤＡ緩衝液、ｐＨ８．０で中和した。得られた試料をＨＰＬＣで分析し、アデニンのＡＵＣを決定した。
【０１５０】
それぞれの残存する上清画分の３５０μＬの試料を取り出し、プロテイナーゼＫ（１６０μｇ）と共に５０℃で１時間インキュベートした。
【０１５１】
１０μＬの各処理された上清画分をマーカーとして１Ｋｂ＋ＤＮＡラダーと共に、１００Ｖの１．０％アガロースゲル上で４０分間電気泳動した；ゲルを臭化エチジウム（１μｇ／μＬ）で１０分間染色し、ＵＶ透視下でＲＮＡを可視化／撮影した（図５および６）。
【０１５２】
塩化ナトリウム（最終濃度０．１Ｍ）をＢＣおよびＢＣＰ試薬と共にチューブに加えた。２倍量の９５％冷エタノールを全チューブに加えた後、−２０℃で３０分間インキュベートし、核酸を沈殿させた。チューブを１３，０００ｇで遠心分離し、ペレットを冷７０％エタノールで注意深く１回濯いだ。
【０１５３】
ペレットを風乾し、９０μＬの減少したＴＥ（１０ｍＭトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。各溶解したペレットの一部の２μＬを、「汎用」細菌１６ＳリボソームＤＮＡプライマー（ＢａｃｒＲＮＡ１７３−Ｆ  ５’ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ３’およびＢａｃｒＲＮＡ１７３−Ｒ  ５’ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ３’）と共に２５μＬのＰＣＲ反応液に加えて、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、各試験条件に対して枯草菌およびスメグマ菌から放出されたＤＮＡの量を推定した（表１５および１６）。それぞれのＰＣＲ反応液は、２．５μＬの１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５μＬの１０ｘＰＣＲ緩衝液、１．２５μＬの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＬの１０ｐＭ順方向プライマー、０．５μＬの１０ｐＭ逆方向プライマー、０．５μＬの０．５μＭ  Ｓｙｔｏ９、０．２μＬの５Ｕ／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ、１２．３μＬの水を含んだ。枯草菌およびスメグマ菌からの高度精製ＤＮＡを、ＰＣＲ分析用の基準として使用した。陰性対照は、鋳型ＤＮＡを加えない反応液を含んだ。Ｃｔ値は、増幅曲線が検出の閾値と交差する点のサイクル数を意味する。Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ装置ソフトウェアで閾値ラインを設定し、各試料についてＣｔ値を計算した。Ｃｔ値は試料中のＤＮＡの量に反比例する；１のＣｔ値の減少は、検出されるＤＮＡ量が２倍になることに相当する。
【０１５４】
結果および考察
結果を表１３、１４、１５および１６ならびに図５および６に示す。
【０１５５】
【表１３】
2017510284.tif 000014
【０１５６】
【表１４】
2017510284.tif 000015
【０１５７】
過ヨウ素酸塩および８０℃（Ａ）または７０℃（Ｂ）加熱ステップにより枯草菌から上清中に放出されたＤＮＡおよびＲＮＡを示す図５を参照すると、１つのケース（８０℃でのＢＢＰ）を除く全てで過ヨウ素酸塩の存在により高分子量（＞２３ｋｂ）ＤＮＡバンドの強度が顕著に増加した（パネルＡ）。８０℃でのＢＢＰの場合は、７０℃で処理した同じ試料が強いＤＮＡバンドを示した（パネルＢ）ことから考えて、細胞からのＤＮＡの放出後に、何らかの時点でＤＮＡの損失を生じた誤差に起因すると思われた。ＢＢおよびＢＢＰを除く全ての条件において、未処理または実質的に未処理のリボソームＲＮＡが、処理に由来して存在する。
【０１５８】
過ヨウ素酸塩および７０℃加熱ステップによりスメグマ菌から上清中に放出されたＤＮＡおよびＲＮＡを示す図６を参照すると、全てのケースで過ヨウ素酸塩の存在により高分子量（＞２３ｋｂ）ＤＮＡバンドの強度が顕著に増加した。枯草菌に比較して、放出されたＲＮＡの量は少なく、また、それはより大々的に分解された。
【０１５９】
【表１５】
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【０１６０】
【表１６】
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【０１６１】
表１５および１６に示した結果は、ＢＣ試薬（水）ではなく、ＢＡ、ＢＢ、およびＢＤ試薬で処理し、および５０、７０および８０℃で２０分インキュベートした増殖型枯草菌およびスメグマ菌の両方から、過ヨウ素酸塩がＣｔ値を低下させる（すなわち、より多くのＤＮＡを抽出する）ことを示す。重要なことに、過ヨウ素酸塩および熱処理により放出されたＤＮＡの品質はその後のリアルタイムＰＣＲ分析による増幅および特定に好適である。１００℃での加熱を使ってこの調査を繰り返し、ＤＮＡ抽出が成功することを示した。しかし、ｑＰＣＲの結果はＤＮＡが１００℃で変性するという事実により複雑化し、蛍光染料により定量できなかった。
【０１６２】
いくつかの試料が過ヨウ素酸塩処理後に、より低いＣｔ値を示すことができなかったのは、エタノール沈殿ステップの変動するまたは低い効率に起因すると思われる。これらの実験では、このステップは、ｑＰＣＲが行われる前に阻害剤を除去するために必要であった。エタノール沈殿の前に同じ試料をアガロースゲル電気泳動で分析した場合（図５および６）には、全ケースで、過ヨウ素酸塩で処理した試料から放出されたＤＮＡの量の明確な増加が認められた。
【０１６３】
結論
３種の異なる方法（酸抽出ＨＰＬＣ法、アガロースゲル電気泳動およびｑＰＣＲ）を使って、本発明の化学的方法が、標準的核酸抽出方法に対し耐性であることがよく知られているものを含む微生物から核酸を遊離させる有効性を実証した。本発明の方法は、試料の機械的な破壊または煮沸を必要としないので、特に価値がある。過ヨウ素酸塩は、枯草菌およびスメグマ菌の両方からのＤＮＡおよびＲＮＡ放出量を温度依存的に、明らかに増加させた。
【０１６４】
実施例７：種々の試薬中のスメグマ菌添加唾液試料からの核酸の放出に対する過ヨウ素酸塩および熱処理の効果
この実施例では、温度７０℃およびいくつかの組成物（表１０）に加えた（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム（最終濃度１５ｍＭ）の効果を、複雑な生物学的検体の条件をシミュレートするために、ヒト唾液中に添加された既知の量の「生きている」スメグマ菌を使って評価した。複雑な唾液試料中のこの微生物からの核酸の放出を、酸抽出ＨＰＬＣ法およびスメグマ菌特異的プライマーによるリアルタイムＰＣＲを使って評価した。
【０１６５】
前の実施例は、純粋培養物および洗浄した細菌および真菌ペレットを扱った。しかし、大抵の生物学的検体または試料の組成は極めて複雑で、多数の試料特異的物質、および潜在的干渉物質、ならびに宿主細胞および微生物種を含む。例えば、大量の水に加えて、唾液（および喀痰）は、多くの他の物質、例えば、ヒトおよび微生物の両方が起源の、電解質、粘液、多数の酵素、抗菌化合物および細胞を含む。特に、唾液は大量のムチンを含み、これはポリサッカライド側鎖を有するタンパク質である。過ヨウ素酸塩が主に糖環を攻撃し開くことを考慮して、発明者らは、過ヨウ素酸塩（特に、洗浄した微生物のペレットからのＤＮＡ放出に効果のあることが分かった低濃度にて）が、試料中の目的の細菌／真菌の細胞壁の攻撃に利用されるよりも、唾液中に存在する過剰の多糖類との反応によって消費される可能性があることを懸念した。この実施例は、複雑な生物試料中の微生物からの核酸の放出における過ヨウ素酸塩の有効性を実証するために計画された。また、ヒトＤＮＡおよび口腔細菌ＤＮＡの存在下における添加生物体（スメグマ菌）の特異的検出についても評価した。
【０１６６】
実験方法および材料
−１５ｍＬチューブ中に交互につばを吐くことにより、６つの１ｍＬ唾液試料を収集した。その直後に、３種の異なる緩衝液の内の１つ（１ｍＬ）を次のようにそれぞれのチューブに添加した：２つのチューブには、ＢＡ試薬を、２つのチューブにはＢＢ試薬を、残りの２つのチューブにはＢＤ試薬を入れた（表１０）。
−約１０９スメグマ菌の懸濁液を１ｍＬの冷ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で２回遠心分離することにより洗浄し、その後、０．５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁した。
−１００μＬの各細菌懸濁液をＢＡ、ＢＢまたはＢＤ試薬を含む１セットのチューブに加えた；１００μＬのＰＢＳを第２のセットのチューブに添加した。試料をボルテックスすることにより短時間混合した。別の１００μＬの細菌懸濁液（２重で）を酸抽出ＨＰＬＣ法に供し、３種の緩衝液の１つを含むそれぞれの唾液の一定分量中に添加されたスメグマ菌ＤＮＡの量を正確に定量した。既知の濃度のアデニン基準および既知の６７．５％ＧＣ含量のスメグマ菌ＤＮＡを用いてアデニン量をＤＮＡ量に変換して、１００μＬの細菌懸濁液が２３６６ｎｇのスメグマ菌ＤＮＡを含んでいることを決定した。抽出ステップに続けて精製ステップ、例えば、エタノール沈殿（下記で説明）が行われ、このステップは１００％効率ではないために、ＤＮＡの１００％収率は予測しなかった。
−１０μＬのプロテイナーゼＫ（８９μｇ／ｍＬ最終濃度）をそれぞれのチューブに加え、チューブを５０℃で一晩インキュベートした。
−各チューブから１つの２００μＬの一定分量を新しいチューブに移し、１０μＬの３００ｍＭ（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムと混合した。
−各チューブから第２の２００μＬの一定分量を新しいチューブに移した。
−全一定分量を７０℃で２０分間インキュベートした後、室温で３分間冷却した。
−トリス塩酸（１Ｍ、ｐＨ７．１）をそれぞれの一定分量に加えて最終濃度１００ｍＭとし、室温で１５分間インキュベートした。
−酢酸カリウム（３Ｍ、ｐＨ５．５）をそれぞれの一定分量に加えて最終濃度１５０ｍＭとし、氷上で１０分間インキュベートした。
−一定分量を１４，０００ｒｐｍで３．５分間遠心分離した。上清を取り出して、新しいチューブに移し、ペレットを廃棄した。
−２倍量の室温の９５％のエタノールをそれぞれの一定分量に加え、室温で１５分間インキュベートした。
−一定分量を１４，０００ｒｐｍで３．５分間遠心分離した。
−アルコールをそれぞれの一定分量から注意深く取り出し、ＤＮＡペレットを５０μＬのＴＥ、ｐＨ７．５中に溶解した。一部の再溶解ペレットを５倍に希釈し、５μＬの希釈した一定分量をテンプレートとして、スメグマ菌遺伝子特異的ＤＮＡプライマー［ＨＰ−順方向：ＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＴＡＧ；ＨＰ−逆方向：ＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＡＴＴＡＣＧＡＡＧＣ］を含む２５μＬのｑＰＣＲ反応液に加えた。予測産物は、スメグマ菌株ＭＣ２  １５５の「仮定上のタンパク質ＭＳＭＥＩ＿２０９８」をコードする遺伝子の２５０ｂｐ領域である。この微生物を唾液試料中に「添加」後にこの微生物から放出されるＤＮＡの量を、このプライマー対を使って定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により推定した。具体的条件は表１７に挙げている。ｑＰＣＲ反応液は、２．５μＬの１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５μＬの１０ｘＰＣＲ緩衝液、１．０μＬの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、ならびに上記の、０．５μＬの１０ｐＭ順方向プライマー、０．５μＬの１０ｐＭ逆方向プライマー、０．５μＬの０．５μＭ  Ｓｙｔｏ９、０．２μＬの５Ｕ／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ、１１．８５μＬの水を含んだ。スメグマ菌からの高度精製ＤＮＡをｑＰＣＲ分析用の基準として使用した。陰性対照は、鋳型ＤＮＡを加えない反応液を含んだ。Ｃｔ値は、増幅曲線がソフトウェアで生成した検出の閾値と交差する点でのサイクル数を意味する。Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅソフトウェアで閾値を設定し、各試料についてＣｔ値を計算する。Ｃｔ値は試料中のＤＮＡの量に反比例し；１のＣｔ値の減少は、検出されるＤＮＡ量が２倍になることに相当する。
【０１６７】
結果および考察
結果は、下表１７にまとめられている。
【０１６８】
【表１７】
2017510284.tif 000018
【０１６９】
表１７の結果は、過ヨウ素酸塩が、最初に唾液中に「添加」され、その後７０℃で２０分間過ヨウ素酸塩含有ＢＢおよびＢＤ試薬で処理された細胞から放出されるスメグマ菌ＤＮＡの量を劇的に高めたことを示す。より低いＣｔ値は、より多量のスメグマ菌ＤＮＡの反映である。同様であるがあまり劇的でない抽出効率の増加が、過ヨウ素酸塩含有ＢＡ試薬で認められた。最も顕著なケースでは、ＤＮＡの推定量は、ＢＤプラス過ヨウ素酸塩と比べたＢＤ試薬を単独で含む試料中で、反応当たり１５０ｐｇから１６，２３０ｐｇへと、約１００倍増加した。ＢＢを含む試料では、過ヨウ素酸塩の添加がまた、ＤＮＡを、反応当たり７０ｐｇから６，４３０ｐｇへと、１００倍増加させた。ＢＡを含む試料では、過ヨウ素酸塩の添加が、検出されるＤＮＡを、検出不能から反応当たり１，０９０ｐｇへと増加させた。これらの実験は、スメグマ菌から放出され過ヨウ素酸塩およびその他の試薬を含む唾液と混合され、その後加熱されたＤＮＡの質が、スメグマ菌特異的プライマーを用いるｑＰＣＲによるＰＣＲ増幅および微生物特異的特定に好適であることを示す。
【０１７０】
結論
この実施例は、複雑な生物試料中に添加された場合であっても、本発明の化学的組成物および方法がスメグマ菌から核酸を遊離させる効力を示している。唾液中に認められるタンパク質結合多糖類およびその他の潜在的干渉性物質の存在にかかわらず、低濃度の過ヨウ素酸塩は、この非常に頑丈な微生物から大きな比率の核酸を放出させることにおいて非常に効果的であった。これは、過ヨウ素酸塩によるスメグマ菌からのＤＮＡの放出および検出の１００倍の増加が、スメア陰性でＭＴ陽性の試料の検出感度を高めることができ、効果的治療計画の早期開始を可能にし、それによりＭＤＲ  ＴＢ症例の感染期間を短縮し得ることを実証した。
【０１７１】
実施例８：リアルタイムＰＣＲにより測定した、過ヨウ素酸塩およびＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ精製法によりボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞から放出されるＤＮＡ量の比較
クロストリジウム属は、約１００種のグラム陽性細菌種からなる属であり、ファーミキューテス門に属し、ストレスを与えると頑丈な芽胞を形成する。これらの桿菌様細胞は、天然に広く分布し、特に土壌中で蔓延している。クロストリジウム属は、ヒト疾患を引き起こす重要な病原体であり、運動型の偏性嫌気性菌である。ヒト疾患に関与する５つの主要種、すなわち、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシレ、ウェルシュ菌、クロストリジウム・テタニ、およびクロストリジウム・ソルデリが存在する。
【０１７２】
ボツリヌス菌により生成された芽胞は、通常は土壌中で見つかる楕円形の準末端芽胞であり、死滅させるのが極めて難しい。ボツリヌス菌芽胞は、海面レベルで沸騰水温度に生き残ることができ、したがって、多くの食物は、芽胞を死滅させるのに十分なさらに高い温度を実現できる加圧沸騰を行って缶に詰められる。ボツリヌス菌は食物および創傷中でボツリヌス毒素を生成し、これはボツリヌス症に繋がる場合がある。このバクテリアからの芽胞は蜂蜜中で見出すことができ、１２ヶ月以下の小児の乳幼児ボツリヌス症を引き起こす。神経毒の「ボトックス」は、顔面筋肉を麻痺させて老化の兆候を減らすために美容的に用いられ、ならびに多くの治療への応用に使用される。
【０１７３】
２０人の入院患者毎におよそ１人が院内感染（ＨＡＩ）に罹患することになろう。ほとんどのタイプのＨＡＩは減少傾向にあるが、腸の共生生物バクテリアであるクロストリジウム・ディフィシレが原因の爆発的感染は、抗生物質処置が常套的である病院や長期保健医療施設で患者を苦しめる、深刻化している問題である。クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）は糞口経路により伝染し、胃腸管腸内菌共生バランス失調、すなわち、正常な腸微生物または細菌叢の破壊に起因すると考えられている。抗生物質処置は、クロストリジウム・ディフィシレを通常は制御しているＧＩ管中のほとんどの細菌を死滅させる。この変化した環境中では、クロストリジウム・ディフィシレが複製し、腸の内層を攻撃する毒素を産生し、下痢から命に関わる炎症および結腸の内層の出血にまで及ぶ症状を引き起こす。米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によると、クロストリジウム・ディフィシレは、米国内で、１４，０００人／年の死亡に関連している。
【０１７４】
保健医療環境では、クロストリジウム・ディフィシレは人から人へ糞口経路により伝染し、ヒトがよく「手に触れる」表面（例えば、ベッド柵、ドアノブ、トイレ、流し台）から偶然に芽胞を摂取すると、爆発的感染が発生する。クロストリジウム・ディフィシレ芽胞は加熱およびアルコール系ハンドクリーナーを含む大抵の日常的表面洗浄法に対して耐性があり、環境中で数ヶ月から数年間にわたり生き残ることができる。再発性クロストリジウム・ディフィシレ感染症に対する効果的な処置は、広く利用可能にはなっていない。逆説的であるが、今日のクロストリジウム・ディフィシレ感染に対する一次処置は、より多くの抗生物質の投与であり、約２０％の患者が１ヶ月以内に再発し、これらの患者の多くは、反復攻撃を受ける。
【０１７５】
食の安全（食物／肉加工プラント）、保健医療、土壌および水サンプリング（環境試験）、バイオセキュリティーまたはバイオディフェンス、動物の飼料試験、農業／植物科学／産業などを含む、多くの市場および産業が、有害な芽胞（および細菌）を破壊する効率的な方法を探している。細菌および／または芽胞の病原性株の検出およびキャラクタリゼーションを対象とする、診療および疫学的な調査の両方が、優れた感度および特異性、ならびに試験−再試験の信頼性を備えたより迅速な代替法を必要としている。今日、「ゴールドスタンダード」試験は、未だに便培養を含み、これは感受性が高いアッセイであるが、長い所用時間を要し、資源集約的で、組織培養設備を備えた経験豊かな研究室が必要である。対照的に、ＰＣＲアッセイ試験は安価であり、集めた生物試料中に存在する目的の細菌／芽胞から十分な量のＤＮＡが抽出されたと仮定して、短い所用時間、優れた感度、特異性および的中率を有する。
【０１７６】
意外にも、本発明者らは、一般的な研究室の化学薬品である過ヨウ素酸塩を弱アルカリ性ｐＨおよび高温で使って、活性なおよび休眠の両状態にある微生物から、迅速、効率的に核酸を放出させることができることを見出した。この実施例では、芽胞をボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレの培養液から調製し、２つの異なるＤＮＡ分離方法：１）本発明の過ヨウ素酸塩法、および２）市販のＭａｇＮＡ（商標）Ｐｕｒｅ精製法、の有効性を比較した。これらの方法により抽出したＤＮＡを、各々についての生物体に特異的なＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）アッセイを使って定量した。
【０１７７】
実験方法
［ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞調製、ＤＮＡ抽出およびｒｔＰＣＲアッセイを、Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．と共同研究で実施した。］
【０１７８】
ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞調製
Ｂ型ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレの凍結ストック培養液を５％ヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天培地上で培養し、３５℃で２４〜４８時間、嫌気的にインキュベートした。最初のインキュベーション後、これらの培養液を複数（最小１０個）の脳心臓浸出物寒天プレートに移し、３５℃で２週間まで嫌気的にインキュベートした。３〜４日毎に、マラカイトグリーン芽胞染色を行って、細菌のインビトロ芽胞形成をモニターした。マラカイトグリーン染色が生物のほぼ完全な芽胞形成を示した時に、芽胞を５．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に採取し、使用するまで室温で貯蔵した。
【０１７９】
芽胞濃度の測定
ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレのそれぞれの芽胞ストック懸濁液をＰＢＳで１０−２に希釈した。一定分量（１０μＬ）のそれぞれのこれらの最終の希釈物を、２チャンバー血球計数器スライドのそれぞれの清浄なウエル中に添加した。血球計数器チャンバーを芽胞計数のために、オイルを用いずに４０ｘ倍率で観察した。芽胞を丸いまたは楕円形の黒色細胞として、血球計数器の明視野グリッド上で可視化した。ボツリヌス菌、検出限界（ＬＯＤ）＝３０芽胞／反応；クロストリジウム・ディフィシレ、ＬＯＤ＝２０芽胞／反応。
【０１８０】
過ヨウ素酸塩法を用いる芽胞からのＤＮＡの抽出
１．３５０μＬのボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞のストック懸濁液（上記）に、３５０μＬのＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）を加える。
２．ボルテックスして混合する。
３．１００μＬを培養用に取り出す。
４．５０μＬの３００ｍＭの（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムまたはＮＰＩストックを加え（最終濃度３０ｍＭ）、ボルテックスして混合する。
５．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートする。
６．試料を室温で２分間冷却する。
７．１００μＬを培養用に取り出す。
８．２０μＬの１ＭトリスｐＨ７緩衝液を加える（最終濃度５０ｍＭ）。
９．室温で１０分間インキュベートする。
１０．２０μＬの３Ｍ酢酸カリウムｐＨ５．５を加える（最終濃度１５０ｍＭ）。
１１．氷上で１０分間インキュベートする。
１２．１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
１３．上清を清浄な標識チューブに移す。ペレットを廃棄する。
１４．８００μＬの室温の９５％エタノールを加える。
１５．２０回反転させることにより混合する。
１６．室温で１５分間試料をインキュベートし、ＤＮＡを沈殿させる。
１７．１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化する。
１８．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出し、廃棄する。
１９．ペレットを１００μＬのＴＥ中に溶解する。
２０．短時間ボルテックスして、ＤＮＡを完全に懸濁させる。
２１．各生物体に特異的なＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｒｔＰＣＲアッセイを実施する。
【０１８１】
Ｒｏｃｈｅ  ＭａｇＮＡ（商標）Ｐｕｒｅ  ＤＮＡ単離キットを用いる芽胞からのＤＮＡの抽出
１．１０個の２００μＬの分量のボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞懸濁液をそれぞれ目的の濃度で調製する（合計３０チューブ）。
２．３８μＬのプロテイナーゼＫを、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ＤＮＡ単離キットＩＩＩ（細菌、真菌）（カタログ番号０３２６４７８５００１、Ｒｏｃｈｅ）からの２６２μＬの細菌リシスバッファーと混合することにより、各試料に対し、リシスバッファーを調製した。
３．３００μＬのリシスバッファーをそれぞれの２００μＬの芽胞懸濁液に加えた。
４．ボルテックスする。
５．６５℃で２０分間インキュベートする。
６．９５℃で１０分間インキュベートする。
７．試料を室温で冷却させた。
８．冷却後、短時間遠心分離し、エアロゾルを除去する。
９．５００μＬのそれぞれの試料をＲｏｃｈｅ  ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ試料チューブ中に移す。
１０．試料チューブをＲｏｃｈｅ  ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ装置に置く。
１１．ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｌｙｓｉｓプロトコルを用いるスクリーンの指示に従う：試料体積：５００μＬ；溶出体積：１００μＬ。
【０１８２】
Ｂ型ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレのリアルタイムＰＣＲ
全てのｒｔＰＣＲアッセイをＡＢＩ７５００装置で行った。各生物体に特異的なＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｒｔＰＣＲアッセイ（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を使って、それぞれの抽出物から単離したＤＮＡをＢ型ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレに対し１回分析した。
【０１８３】
結果および考察
細菌／芽胞の生物試料または培養物の機械的なビーズビーティングは、微生物をこじ開けるにはかなり効果的であり得るが、それはエアロゾルを生成し、これが、感染性病原体を拡散して研究室職員の健康をリスクにさらす可能性を高める。したがって、強靭な微生物およびそれらの芽胞から総核酸を放出させる非機械的で、化学的な方法を開発することが極めて望ましい。本実施例は、迅速で安価で容易な化学処理である、本発明の「過ヨウ素酸塩」法が、ボツリヌス菌芽胞（図７）およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞（図８）からのＤＮＡの単離において、市販のＤＮＡ単離キット（「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」法）およびＲｏｃｈｅの非常に高価な自動システムよりも非常に効果的（８倍ＤＮＡの増加）であることを示す。ＭａｇＮＡ（商標）Ｐｕｒｅキット（「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」、図７および８）は、リシスバッファー＋磁気ガラス粒子を使用し、一方、本発明の過ヨウ素酸塩法（「過ヨウ素酸塩」、図１Ａおよび１Ｂ）は、頑丈な芽胞からＤＮＡを単離する場合であっても、磁気ビーズまたは、磁気ハンドリング能力を備える複雑な自動システムを必要としない。
【０１８４】
ＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｒｔＰＣＲアッセイは、「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」法に比べて、「過ヨウ素酸塩」法を使用することにより、ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞の両方からのＤＮＡの検出感度が向上（Δ３  Ｃｔ値）する、すなわち、過ヨウ素酸塩処理試料が、ｒｔＰＣＲにおける各ＬＯＤで一貫してより低いＣｔ値をもたらすことを示した。過ヨウ素酸塩法を使用する微生物ＤＮＡ抽出の改善は、他のＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｒｔＰＣＲアッセイで評価される生物試料における検出感度の向上に繋がるはずである。
【０１８５】
実施例９：結核菌に特異的なリアルタイムＰＣＲにより測定した、過ヨウ素酸塩法と従来のビーズビーティング法による結核陽性臨床喀痰試料から放出されるＤＮＡ量の比較
この実施例は、２つの方法により精製されたＴＢ陽性喀痰試料（ＦＩＮＤの厚意により提供された、下記参照）の臨床評価の並列比較を提供する。特に、ＲＤ４結核菌群（ＭＴＢＣ）ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＤ）（遺伝子欠損領域の違い）（Ｈａｌｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を標的とするＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｒｔＰＣＲアッセイの感度に関して、２つの異なるＤＮＡ単離法、１）「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」および２）「過ヨウ素酸塩法」を比較した。
【０１８６】
「過ヨウ素酸塩法」とは対照的に、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」法は、喀痰試料中の細菌をこじ開けるための機械的な方法であるビーズビーティングを含む。機械的なビーズビーティングは生物をこじ開けるのに効果的であり得るが、この方法は、研究室環境中に危険なエアロゾルを生成する。したがって、診断試験の臨床的感度に悪い影響を与えることなく、ヒト型結核菌から安全にＤＮＡを放出するために、効果的で非機械的な化学的方法を開発することが強く望まれている。
【０１８７】
実験方法
ヒト型結核菌陽性喀痰試料の生存率の確認
本実施例のために、ＴＢ陽性患者由来の生の喀痰試料がＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（革新的な新規診断薬に関する基金）（ＦＩＮＤ）結核検体バンクから厚意で提供された。３０人の患者試料から２重で分割量０．５ｍＬが提供され、凍結貯蔵された。培養およびスメア分析を使って、これらの３０個の試料を、「スメア＋、培養＋（強）」、「スメア１＋、培養＋（中）」または「スメア−、培養＋（弱）」ＴＢ陽性としてＦＩＮＤ分類した。
【０１８８】
さらなる分析のために、一定分量を、ＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証臨床検査室である、Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に凍結輸送した。
【０１８９】
Ｗａｄｓｗｏｒｔｈに到着すると、３０人のドナー由来の一定分量を氷上で解凍し、これらの１０個の「強」、１０個の「中」および１０個の「弱」ＴＢ一定分量中のマイコバクテリウム属の生存率を、培養およびスメア顕微鏡で確認した。
【０１９０】
過ヨウ素酸塩法を用いるＴＢ陽性喀痰からのＤＮＡの抽出
１．各０．５ｍＬの喀痰一定分量に、０．５ｍＬのＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）を加え、ボルテックスして混合した。
２．プロテイナーゼＫ（４００μｇ）を加え、水浴中、５０℃で２時間インキュベートした。
３．０．４ｍＬを新しいチューブに移し、ＮＰＩ（最終濃度３０ｍＭ）を加えて、ボルテックスして混合した。
４．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
５．試料を室温で２分間冷却した。
６．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
７．室温で１０分間インキュベートした。
８．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加えた。
９．氷上で１０分間インキュベートした。
１０．１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
１１．上清を清浄な標識チューブに移した。ペレットを廃棄した。
１２．２倍量の室温の９５％エタノールを加えた。
１３．２０回反転させることにより混合した。
１４．試料を室温で１０分間インキュベートし、ＤＮＡを沈殿させた。
１５．１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。
１６．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出し、廃棄した。
１７．ペレットを２００μＬのＴＥに溶解した。
１８．短時間ボルテックスしてＤＮＡを完全に再懸濁させた。
【０１９１】
「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」法を用いるＴＢ陽性喀痰からのＤＮＡの抽出
１．各０．５ｍＬの喀痰一定分量に、０．５ｍＬの３．５％ＮａＯＨを加え、ボルテックスして混合した。
２．室温で１５分間インキュベートした。
３．１０ｍＬになるまで無菌のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えた。
４．５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細菌をペレット化した。上清を廃棄した。
５．０．５ｍＬの無菌のＰＢＳ中にペレットを再懸濁した。
６．３００μＬの再懸濁細菌を培養用に取っておいた。
７．残りの２００μＬの再懸濁細菌に、２００ｍｇの１０５〜１５０ミクロンのガラスビーズを加えた。
８．Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使って、１分間のビーズビーティングを２サイクル行い、続けて１分間氷上に置いた。
【０１９２】
結核菌のリアルタイムＰＣＲおよび抗生物質耐性のパイロシーケンス
それぞれの精製喀痰試料由来の５μＬの「未希釈」および５μＬの希釈した（１：１０）ＤＮＡの２重の反応液を、ＲＤ４結核菌群（ＭＴＢＣ）ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＤ）（Ｈａｌｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を標的とするＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｒｔＰＣＲアッセイを使って、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲ装置で増幅した。３７未満の閾値サイクル（Ｃｔ）値を陽性と報告し、３７より大きいＣｔ値の試料を再試験して、結果が同じであれば、陽性と報告し、結果が同じでない場合は、不確定として報告した。
【０１９３】
結果および考察
従来のビーズビーティング法（「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」）に比べて、本発明の化学的「過ヨウ素酸塩法」は、特に、培養およびスメア顕微鏡で「弱」および「中」ＴＢ陽性として分類された喀痰試料に対し、明確に結核菌特異的な検出の感度を高める。この実施例では、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」法を用いて抽出されたＤＮＡは１０倍希釈されて初めて、「中」および「強」ＴＢ陽性喀痰試料の結核菌を検出できるが（表１８）、一方、「過ヨウ素酸塩法」を用いるＤＮＡ単離後に、８７％の「弱」ＴＢ添加喀痰試料が陽性として検出された（表１８）。
【０１９４】
【表１８】
2017510284.tif 000019
【０１９５】
図９は、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」（ＳＯＣ）法に比較して、「過ヨウ素酸塩法」を使って抽出された全ＴＢ陽性喀痰試料中の著しく改善された結核菌の検出限界を示す。例えば、「弱」ＴＢ陽性喀痰のＣｔ値は、ＳＯＣ法の３８．５〜４５．０に比較して、「過ヨウ素酸塩法」では３１．４〜４５．０の範囲であった；「中」ＴＢ陽性喀痰のＣｔ値は、ＳＯＣ法の２６．８〜４５．０に比較して、「過ヨウ素酸塩法」では２０．９〜３２．３の範囲であった；「強」ＴＢ陽性喀痰のＣｔ値は、ＳＯＣ法の２７〜３９．３に比較して、「過ヨウ素酸塩法」では１９．８〜２８．３の範囲であった。図１０は、ＤＮＡ抽出方法で調整した図９のデータを示す。ＤＮＡが本発明の過ヨウ素酸塩法を使って抽出された場合、全てのＴＢ添加レベルに対し、Ｃｔ値は一貫してより低い。改善されたＤＮＡ抽出により得られるこのより低い検出限界値は、患者の喀痰試料由来の結核菌の正確な診断を確実に行うのに役立つ。
【０１９６】
実施例１０：過ヨウ素酸塩ベースの方法は、Ｑｉａｇｅｎ精製よりも顕著に多くのヒト型結核菌ＤＮＡを放出させる
先進国ならびに発展途上国における結核の再発は、１９８０年以降、ＨＩＶの蔓延、耐性株の出現、および高い疾患流行率の地域からの移住の増加と関連付けられてきた（Ｃｏｒｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。結核は病的状態の最も一般的な原因の１つであり、かつ発展途上国に住んでいるＨＩＶ陽性の成人の最も一般的な死亡原因の１つであるが、予防可能で処置可能な疾患である。ヒトからヒトへの伝染の高いリスクのために、結核菌の迅速な検出は、疾患管理に不可欠である。米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）は、受け取った臨床検体を、培養、抗酸性バチルス（ＦＡＢ）染色、および核酸増幅（ＮＡＡ）プロトコルで同時に分析することを推奨している（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ａｎｄ  ＣＤＣ，２０００）。培養は未だに最終判定のための「ゴールドスタンダード」であるが、これは２〜８週を要する場合がある。ＡＦＢ染色は迅速であるが、結核菌群（ＭＴＢＣ）のメンバーと非結核マイコバクテリア（ＮＴＭ）を区別しないために、感度および特異性が低い。したがって、結核の流行を管理するために不可欠な迅速な特定は、核酸抽出および分子診断試験にますます依存するようになっている。
【０１９７】
ＭＴＢＣメンバーは、毒性、薬剤耐性パターン、および宿主嗜好性が異なる。これらの種の動物由来またはヒト起源の結核を判定するためのまたは直接処置するための迅速な識別は、公衆衛生および患者管理の両方に有益であり得る。Ｈａｌｓｅら（２０１０；２０１１）は、密接に関連する生物である、結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌ＢＣＧ、アフリカ型結核菌、ネズミ型結核菌、およびマイコバクテリウム・カネッティの識別のためのリアルタイムＰＣＲアッセイを開発した。ＭＴＢＣメンバーのゲノム間でのｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＤ）の存在または非存在により、臨床検体中のこれらの種を識別するための安価で迅速な単一チューブ５重リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）アッセイの設計が可能になった。
【０１９８】
しかし、このようなｒｔＰＣＲアッセイの上流では、可能な限り最大量のＤＮＡを回収するように臨床検体が処理されていることが重要である。歴史的には、定量的調査により、染色したスメア中の細菌の検出を可能にするためには、１ｍＬの検体当たり５，０００〜１０，０００桿菌が存在する必要があることが示された（Ｈｏｂｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）。対照的に、陽性培養のためには、１０〜１００生物が必要とされる（Ｙｅａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７）。わずか１０桿菌を含む全検体中のマイコバクテリウム属の分子検出は、アッセイ入力体積が全体検体の小さい比率である場合は特に、診断アッセイにとって真の難題である。培養および染色スメアとは対照的に、分子法は、処置を受けている患者由来の検体中の生存桿菌および死桿菌または臨死桿菌からのＤＮＡを検出し、処置前または処置中のＭＴＢＣ生物の特定を可能にする。
【０１９９】
患者検体中の強靭な微生物からの全てのまたは大部分のＤＮＡの迅速な回収を容易にする、優れた抽出方法の開発に対する明確な要求が存在する。喀痰などの複雑な検体からの改善されたＤＮＡ抽出は、結核、および他の疾患のための診断（Ｄｘ）／ＤＮＡベースアッセイの高感度化、および最終的に適切な薬物療法による迅速な患者の処置に直接繋がる。このニーズは、いくつかの国々における多剤耐性結核菌（ＭＤＲ−ＴＢ）および広範囲型多剤耐性結核菌（ＸＤＲ−ＴＢ）の出現、ならびに南アフリカにおける最近の速やかに死に至るＨＩＶ随伴結核の蔓延により、さらに増している（Ｇｈａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒａｖｉｇｌｉｏｎｅ  ２００６）。劣悪な管理慣行の結果として、いくつかの国では、現在、ＴＢ管理において起こりうる最悪のシナリオの１つ：ＨＩＶ感染症と高度薬剤耐性ＴＢという致死的組み合わせに直面している（Ｒａｖｉｇｌｉｏｎｅ  ２００６）。
【０２００】
実験方法
ヒト型結核菌添加生物試料の調製
結核陽性喀痰をシミュレートするために、健康なドナー由来の唾液試料に５ｘ１０６コロニー形成単位／ｍＬ（ｃｆｕ／ｍｌ）で減弱結核菌（ａＭＴＢ）を添加した。
【０２０１】
過ヨウ素酸塩法を用いる結核陽性唾液からのＤＮＡの抽出［「ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ最適方法」または「オプション１」］
１．等容積のａＭＴＢ添加唾液とＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）とを混合した。
２．室温で１５分間インキュベートした。
３．５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄した。
４．５０％ＢＤ２緩衝液中にペレットを再懸濁した。
５．ＮＰＩを最終濃度３０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
６．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
７．試料を室温で２分間冷却した。
８．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
９．室温で１０分間インキュベートした。
１０．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加えた。
１１．氷上で１０分間インキュベートした。
１２．１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
１３．上清を清浄な標識チューブに移した。ペレットを廃棄した。
１４．８００μＬの室温の９５％エタノールを加えた。
１５．２０回反転させることにより混合した。
１６．室温で１５分間試料をインキュベートし、ＤＮＡを沈殿させた。
１７．１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。
１８．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出し、廃棄した。
１９．ペレットを１００μＬのＴＥに溶解した。
２０．短時間ボルテックスしてＤＮＡを完全に再懸濁させた。
【０２０２】
過ヨウ素酸塩法後に続けてＱｉａｇｅｎ精製を用いる結核陽性唾液からのＤＮＡの抽出［「オプション２」］
１．等容積のａＭＴＢ添加唾液とＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）とを混合した。
２．室温で１５分間インキュベートした。
３．５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄した。
４．５０％ＢＤ２緩衝液中にペレットを再懸濁した。
５．ＮＰＩを最終濃度３０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
６．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
７．試料を室温で２分間冷却した。
８．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
９．室温で１０分間インキュベートした。
１０．等容積のＱｉａｇｅｎ  ＡＬ緩衝液を加えた。
１１．Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（カタログ番号５１３０４）用のＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡＭＰ手順に従った。
【０２０３】
ＢＤ２緩衝液およびＱｉａｇｅｎ精製を用いる結核陽性唾液からのＤＮＡの抽出［「オプション３」］
１．等容積のａＭＴＢ添加唾液とＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）とを混合した。
２．室温で１５分間インキュベートした。
３．５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄した。
４．５０％ＢＤ２緩衝液中にペレットを再懸濁した。
５．等容積のＱｉａｇｅｎ  ＡＬ緩衝液を加えた。
６．Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（カタログ番号５１３０４）用のＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡＭＰ手順に従った。
【０２０４】
標準的水酸化ナトリウム／ＮＡＬＣ方法およびＱｉａｇｅｎ精製を用いる結核陽性唾液からのＤＮＡの抽出［「標準的Ｑｉａｇｅｎ法」または「オプション４」］
１．水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の４％溶液を新しく調製し、オートクレーブで処理した。
２．２．９％クエン酸ナトリウム溶液を新しく調製し、オートクレーブで処理した。
３．使用前に、等容積のＮａＯＨとクエン酸ナトリウム溶液を混合した。
４．Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）粉末を加えて、最終濃度０．５％とした。よく混合し、同じ日に使用した。
５．等容積のａＭＴＢ添加唾液とＮａＯＨ／ＮＡＬＣ／クエン酸塩溶液とを混合した。
６．室温で１５分間インキュベートした。
７．全容積が５０ｍＬになるまで無菌のリンＰＢＳを加えた。
８．５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄する。
９．ＰＢＳ中にペレットを再懸濁した。
１０．等容積のＱｉａｇｅｎ  ＡＬ緩衝液を加えた。
１１．Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（カタログ番号５１３０４）用のＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡＭＰ手順に従った。
【０２０５】
ｒｔＰＣＲ条件
この実施例では、ａＭＴＢ添加唾液試料から単離されたＤＮＡ（上記オプション１〜４）を、マイコバクテリウム属特異的ｒｔＰＣＲアッセイである、ＲＤ４  ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイに供した。ＲＤ４のプライマーは次の通りである：ＲＤ４−順方向５’−ＣＣＡ  ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＣＴＡ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＣＡＡ−３’およびＲＤ４−逆方向５’−ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＴＣＧ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＡＴＣ−３’（Ｈａｌｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１））。
【０２０６】
図１１は、計算されたゲノム当量（ＧＥ）に基づく分子試験により回収されたａＭＴＢ  ＤＮＡのパーセンテージ（回収ＧＥ／入力ＧＥ＊１００）を示す。  
【０２０７】
結果および考察
近年開発された分子アッセイは、培養物質の結果が得られる前に、結核が疑われる患者の初期管理を支援する信頼性の高い結果を与え、かつ、ヒト型結核菌陽性検体中の抗生物質耐性を、早ければ臨床検体の収集から１〜２日で予測することを可能にする。しかし、結核診断法およびＰＣＲベースのシステムは、ＤＮＡの効率的な単離および精製手順を一般に必要とし、これは、喀痰の物理的特性および均質性の欠如、ならびにマイコバクテリア細胞壁の高脂質含量によってさらに複雑である。したがって、マイコバクテリアＤＮＡ抽出に利用可能な全ての技術は操作ステップを必要とし、このことが、予測不可能な出発材料の損失を生じ、これが偽陰性診断に繋がる場合がある。
【０２０８】
本実施例は、生物検体のための複数のＤＮＡ単離および処理方法を比較した。具体的には、健康なドナー由来の唾液試料にａＭＴＢを添加することにより、結核陽性喀痰をシミュレートした。従来の検体のＮａＯＨ／ＮＡＬＣ汚染除去に続く、市販のＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（オプション４）によるＤＮＡ抽出は、わずか２．２％のａＭＴＢ  ＤＮＡの回収をもたらした。対照的に、本発明の過ヨウ素酸塩法（オプション１）は、ａＭＴＢ  ＤＮＡの７１．３％の顕著な回収をもたらし、オプション４に比べると回収が７０％増加した。オプション３は、ＢＤ２緩衝液に続くＱｉａｇｅｎ抽出が元のａＭＴＢ添加量の１．６％しか回収しなかったことから、ＢＤ２緩衝液との検体の最初のインキュベーションがオプション１の劇的な結果に関与しなかったことを示す。過ヨウ素酸塩処理検体がＱｉａｇｅｎのキットで抽出された場合は（オプション２）、ａＭＴＢの２６．４％のみが回収され、これは、従来のＮａＯＨ／ＮａＣｌ／Ｑｉａｇｅｎキット（オプション４）に比べて、２４％のＤＮＡ回収の増加に相当する。
【０２０９】
過ヨウ素酸塩法により、ヒト型結核菌添加検体から大部分のＤＮＡが効率的に単離され、その結果、この方法を使って、診断／分子アッセイのすでによく知られた利益、すなわち、高レベルの特異性および感度、短い所用時間、および費用対効果、を大きく高めることができる。これらの改善により、保健医療システムが培養によりＭＴＢＣの種を識別するための８週間の時間を節約でき、最小限の副作用で、適切かつ迅速な薬物療法を実現するための情報、ならびにＴＢ伝染に対する早期洞察を提供できる。
【０２１０】
実施例１１：過ヨウ素酸塩によるタンパク質の選択的分解
過ヨウ素酸塩は通常、隣接ジオール間のサッカライド環を開くために溶液中で使用され、ＲＮＡの３’−末端の選択的標識を可能にする。意外にも、発明者らは、過ヨウ素酸塩がまた、膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）などの特定の酵素の活性を「消滅させる」または中和するのに非常に効果的であり、いくつかの他のタンパク質も分解することを見出した。
【０２１１】
この実施例では、一本鎖ＲＮＡを開裂する膵臓リボヌクレアーゼであるＲＮアーゼＡが過ヨウ素酸塩の標的であることを示した。ＲＮアーゼの酵素活性を、ＲＮＡ基質である、ヒーラ細胞から精製したＲＮＡを分解するその能力をモニターすることにより評価した。ＲＮアーゼの酵素活性が過ヨウ素酸塩により負に影響を受ける場合には、アガロースゲル電気泳動により評価して、ヒーラ細胞リボソームＲＮＡは実質的に分解されないはずである。
【０２１２】
実験方法および材料
過ヨウ素酸塩による純粋な膵臓リボヌクレアーゼＡの処理
１．純粋な膵臓リボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）（０．１〜０．２μｇ／μＬ）を、１５ｍＭの過ヨウ素酸塩を含んでまたは含まずに、緩衝液（１％ＳＤＳ、２５ｍＭのＬｉ−ＣＤＴＡ、１２５ｍＭのＬｉＣｌ、２５ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）に加えた。
２．混合物を７０℃で１５分間加熱した。
３．１０μＬの混合物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、１６０ボルトで６０分間泳動した。
４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを熱クーマシーブルーで３０分間染色した後、室温で２時間脱染し、可視光下で撮影した（図１２）。
【０２１３】
過ヨウ素酸塩によるスメグマ菌ライセートの処理
１．プレートで増殖させたスメグマ菌の懸濁液から洗浄したペレットを調製した。
２．メーカーの指示書にしたがって、Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ−１６（ＢｉｏＳｐｅｃ）中でビーズビーティングを行った。簡単に説明すると、洗浄した細菌ペレットを１０００μＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁し、約１００μＬの１００μｍガラスビーズを含むねじぶた式ポリプロピレン微量遠心機チューブに移した。
３．チューブを装置に固定し、１分間の激しい撹拌（３，４５０振動／分）を２サイクル行った。サイクルの間に１分間、氷上で試料を冷却した。
４．懸濁液を１．５ｍＬの微量遠心機チューブに移し、微量遠心機で１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、壊れていない細胞および壊死組織片を除去した。
５．上清を取り出し、２つの１．５ｍＬの微量遠心機チューブに均等に分けた。１つの画分を等容積のＰＢＳで希釈した（対照、図１３参照）。２つめの画分を、等容積の緩衝液（１％ＳＤＳ、２５ｍＭのＬｉ−ＣＤＴＡ、１２５ｍＭのＬｉＣｌ、２５ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）と混合し、３つの部分に分け、過ヨウ素酸塩を０、７．５ｍＭまたは１５ｍＭの最終濃度まで加えた。
６．チューブを７０℃で１５分間加熱した。対照試料は加熱しなかった。
７．７．５または１５μＬの混合物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、１６０ボルトで６０分間泳動した。
８．ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを熱クーマシーブルーで３０分間染色した後、室温で２時間脱染し、撮影した（図１３）。
【０２１４】
膵臓リボヌクレアーゼＡおよび過ヨウ素酸塩で処理した精製ヒーラ核酸
１．純粋な膵臓リボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）（ＲＮアーゼＡ）を５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５中に１０μｇ／ｍＬで調製した。
２．この溶液を均等に２つのチューブに分けて、１つの一定分量を１５ｍＭ過ヨウ素酸塩で処理した。
３．両チューブを７０℃で１５分間インキュベートした。
４．処理したＲＮアーゼＡチューブを５０ｍＭのＡＤＡ緩衝液、ｐＨ６．５中で２００〜１０００倍に希釈した。
５．希釈したＲＮアーゼＡをヒーラ核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）と共に５０℃で２０分間インキュベートした。
６．ＳＤＳを０．５％まで添加して、反応を「停止」させた。
７．処理ヒーラＲＮＡの健全性を１．０％アガロースゲル電気泳動を使用して分析した（図１４）。
【０２１５】
結果および考察
図１２は、過ヨウ素酸塩との短時間のインキュベーション後に完全長の精製ＲＮアーゼタンパク質が減少し、分解生成物（より小さいタンパク質断片）はゲル中に観察されなかったという意外な結果を示す。また、図１３を注意深く観察すると、過ヨウ素酸塩とのインキュベーション後に、スメグマ菌の無細胞ライセート中の特定の（未知の）タンパク質バンドの選択的減少が認められる。過ヨウ素酸塩の濃度増加（７．５および１５ｍＭ）の存在下で、いくつかのタンパク質バンドがゲルから選択的に減少または完全に消滅し、これは、過ヨウ素酸塩が複数のタンパク質標的を有することを示す。
【０２１６】
図１４のデータにより示されるように、リボソームＲＮＡは、ＲＮＡとの接触の前にＲＮアーゼＡが過ヨウ素酸塩と共に短時間プレインキュベートされた場合、もはやＲＮアーゼＡによって分解されない。過ヨウ素酸塩によって不活化できなかった少量の残留活性ＲＮアーゼを検出するためには、比較的大量のＲＮアーゼＡ（５０ｎｇ）の添加を必要とした。したがって、総細胞タンパク質に対するその効果に加えて、過ヨウ素酸塩は、特定の分解酵素の酵素作用を標的にし抑制できる。
【０２１７】
実施例１２：過ヨウ素酸塩処理は、炭疽菌、ボツリヌス菌、およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞の生存能力を消滅させる
炭疽病は、通常は土壌中で内生胞子の形態で静止している、桿菌様グラム陽性好気性バクテリア炭疽菌により引き起こされる、急性の、多くの場合致死性の疾患である。ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレのように、炭疽菌は休眠の内生胞子を形成でき、それは根絶が非常に難しく、数十年間あるいは数百年間過酷な条件を生き残る。芽胞が吸入され、摂取され、または宿主の皮膚病変と接触すると、それらは再活性化し、急速に増殖できる。炭疽病芽胞の耐久力およびそれらのインビトロでの製造の容易さが、それらを生物学的兵器としての使用（粉末形態またはエアロゾル形態で）に非常によく適合させる。
【０２１８】
前の実施例は、芽胞から核酸を放出させるための、標準的方法に比べた、過ヨウ素酸塩法の有効性を実証しているが、過ヨウ素酸塩での処理後に何らかの生存可能な芽胞が残存するか否かを知ることも重要である。
【０２１９】
実験方法
炭疽菌、ボツリヌス菌、およびクロストリジウム・ディフィシレ芽胞の調製
Ｂ型ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレの凍結ストック培養液を５％ヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天培地上で培養し、３５℃で２４〜４８時間、嫌気的にインキュベートした。最初のインキュベーション後、これらの培養液を複数（最小１０個）の脳心臓浸出物寒天プレートに移し、３５℃で２週間まで嫌気的にインキュベートした。
【０２２０】
炭疽菌Ｓｔｅｒｎｅ株の凍結ストック培養液を５％ヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天培地上で培養し、３５℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。最初のインキュベーション後、この培養液を複数（最小１０個）のバチルス属芽胞形成寒天プレートに移し、３５℃、ＣＯ２下で２週間まで嫌気的にインキュベートした。
【０２２１】
３〜４日毎に、マラカイトグリーン芽胞染色を行って、細菌のインビトロ芽胞形成をモニターした。マラカイトグリーン染色処理が生物のほぼ完全な芽胞形成を示した時に、芽胞を５．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に採取し、使用するまで室温で貯蔵した。
【０２２２】
芽胞濃度の測定
ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレのそれぞれの芽胞ストック懸濁液をＰＢＳで１０−２に希釈した。炭疽菌Ｓｔｅｒｎｅ株をＰＢＳ中で１０−３に希釈した。一定分量（１０μＬ）のそれぞれのこれらの最終の希釈物を２チャンバー血球計数器スライドのそれぞれの清浄なウエル中に添加した。血球計数器チャンバーを芽胞計数のために、オイルを用いずに４０ｘ倍率で観察した。芽胞を丸いまたは楕円形の黒色細胞として、血球計数器の明視野グリッド上で可視化した。炭疽菌、検出限界（ＬＯＤ）＝５３芽胞／反応；ボツリヌス菌、ＬＯＤ＝３０芽胞／反応；クロストリジウム・ディフィシレ、ＬＯＤ＝２０芽胞／反応。
【０２２３】
標準的方法および過ヨウ素酸塩法を用いる芽胞の処理
１．それぞれの生物体に対し、必要とする濃度で７００μＬの芽胞ストック懸濁液を調製した。
２．それぞれの試料を２ｘ３５０μＬ容量に分割する。
３．ＷＣ  ＢＤＬ標準法（「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」）用の３５０μＬ：
ａ．５０μＬの一定分量を取り出し、５％血液を含むヒツジのトリプチケースソイ寒天培地上で平板培養することにより芽胞が生存可能であることを確認した（下記参照）。
４．過ヨウ素酸塩法用の３５０μＬ：
ａ．３５０μＬのＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）を３５０μＬの炭疽菌、ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレの芽胞ストック懸濁液に加えた。
ｂ．ボルテックスして混合した。
ｃ．１００μＬを培養用に取り出した（「過ヨウ素酸塩処理前」）。
ｄ．５０μＬの３００ｍＭの（メタ）過ヨウ素酸ナトリウムまたはＮＰＩストックを加え（最終濃度３０ｍＭ）、ボルテックスして混合した。
ｅ．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
ｆ．試料を室温で２分間冷却した。
ｇ．１００μＬを培養用に取り出した（「過ヨウ素酸塩処理後」）。
【０２２４】
生存率を測定するための芽胞の培養
炭疽菌：一定分量を５％ヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天培地に直接播種し、３５℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。
【０２２５】
ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレ：一定分量を５％ヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天培地に直接播種し、３５℃で２４〜４８時間、嫌気的にインキュベートした。
【０２２６】
結果および考察
この実施例は、本発明の「過ヨウ素酸塩」法が炭疽菌（図１５）、ボツリヌス菌（図１６）、およびクロストリジウム・ディフィシレ（図１７）由来の頑丈な芽胞の生存率を低下させることにおいて非常に効果的であることを示す。過ヨウ素酸塩処理（過ヨウ素酸塩処理後）は炭疽菌の生存率を劇的に低下させたが、１つの処理で存在する全ての芽胞を根絶しなかった。対照的に、ボツリヌス菌またはクロストリジウム・ディフィシレは、過ヨウ素酸塩処理後の培養により、生存可能ではなかった。興味深いことに、ＢＤ２緩衝液単独（過ヨウ素酸塩処理前）は、ボツリヌス菌およびクロストリジウム・ディフィシレの芽胞生存率に対し大きな影響を有したが、炭疽菌の芽胞生存率に対しては影響を与えず、これは、これらの微生物が炭疽菌より容易に溶解することを示唆している。
【０２２７】
実施例１３：唾液および口腔洗浄検体中のマイコバクテリアを検出するための本発明の使用
世界保健機関によると、世界中で、２０１２年に１３０万人がＴＢで死亡し、８６０万人がＴＢを発病し、推定で５３万人の１５才未満の小児がこの感染症に罹患した。ＴＢは感染した人からの微細な呼吸飛沫を介して伝染する空気伝染病である。ＴＢの人は、密接におよび長期に接触している人、例えば、ファミリーメンバー、友人および共同作業者にそれを広める可能性が最も高い。
【０２２８】
小児科のＴＢ診断は、小児の喀痰試料を得ることの困難さ、および胃吸引または気管支鏡検査などの侵襲的方法をしばしば必要とする小児の疾患の少菌型の性質により妨害される。ＴＢが唾液または口腔試料から診断できたならば、収集は現場または医院で容易に行えるであろう。しかし、従来のＤＮＡ抽出方法では、ＴＢ感染個人の唾液中のＭＴＢの存在量は唾液にしては少なすぎるとみなされ、活性な肺結核の診断用の信頼性の高い試料タイプとは考えられない。
【０２２９】
今日では、診断研究室は、肺結核を診断するために喀痰検体に大きく依存している。しかし、乳幼児を含む多くの患者は、喀痰を吐き出すことができず、ＴＢ診断調査用の代わりの非侵襲的試料を価値のあるものにしている。いくつかの調査で活性ＴＢの検出のための口腔洗浄検体（Ｄａｖｉｓ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）および唾液試料（Ｙａｓｓｅｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が評価された。喀痰を生成できない患者では、唾液試料および／または口腔洗浄検体は、低酸素症の患者にとって不快で危険でありスタッフにとっては時間がかかり有害な場合がある喀痰の誘導に比べて、得るのが容易で安全であると思われる。口腔洗浄検体の収集のためには、対象は力強く５回咳をすることを指示され、その後、１０ｍＬの無菌の食塩水で６０秒間うがいをする。口腔洗浄検体および唾液試料では、喀痰を吐き出すのに比べて、より少ない感染性エアロゾルが生成される。
【０２３０】
疾患を診断するＰＣＲの感度は、ＤＮＡ抽出技術を最適化することにより改善できることはよく知られている。実施例９（上記）は、本発明の過ヨウ素酸塩法は、ビーズビーティングを用いるＳｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ法よりも、喀痰中のＭＴＢから顕著に多くのＤＮＡを放出させることを示している。さらに、実施例１０は、過ヨウ素酸塩ベース法は、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ抽出法よりも、唾液中のＭＴＢ  ＤＮＡを顕著に多く放出させることを示している。したがって、ＭＴＢ  ＤＮＡを抽出するために本発明を使用することにより得られる検出感度の向上は、症候性個人、特に小児での肺結核の予備的診断用試料としての、唾液および／または口腔洗浄検体の広範囲にわたる使用を初めて可能にするであろう。感染して発病した個人の唾液中のＭＴＢの数は少ないが、過ヨウ素酸塩ベース法により得られる検出感度の増加により、この収集が容易な試料タイプを用いるＭＴＢのより信頼性の高い分子検出が可能になることが予測される。唾液および／または口腔洗浄検体は症候性個人から容易に収集されて迅速にＴＢを選別し、初期段階での処置の開始が可能になり、これが次に、この感染症に関連する伝染および罹患率を下げるであろう。
【０２３１】
同様に、本発明の組成物はまた、気管支肺胞洗浄液検査試料、尿、糞便および胃吸引物でも使用されてＭＴＢからＤＮＡを抽出し、分子診断試験におけるＴＢ検出感度の増加をもたらし、および識別されるＴＢ症例数を増加させると予想される。
【０２３２】
実施例１４：広範囲の微生物から核酸を放出させるための過ヨウ素酸塩の使用
この実施例では、グラム陽性細菌（バチルス・チューリンゲンシス、黄色ブドウ球菌、スメグマ菌）、グラム陰性菌（カタル球菌、クレブシエラ肺炎杆菌、緑膿菌、エンテロコリチカ菌、フランシセラ・フィロミラジア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ））および酵母（カンジダ・アルビカンス）を含む、様々な一連の微生物を過ヨウ素酸塩で処理した。これらの微生物からの核酸の放出を、２つの異なる方法、すなわち、酸抽出ＨＰＬＣ法およびリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使って評価した。
【０２３３】
実験方法
細菌および酵母を次の推奨増殖培地および推奨温度で増殖させた：ＹＥＰＤブロス（カンジダ・アルビカンス）、０．１％システイン含有トリプチックソイブロス（フランシセラ・フィロミラジア）、脳心臓浸出物ブロス（エンテロコリチカ菌、カタル球菌）またはトリプチックソイブロス（バチルス・チューリンゲンシス、黄色ブドウ球菌、スメグマ菌、クレブシエラ肺炎杆菌、緑膿菌）。エンテロコリチカ菌およびカンジダ・アルビカンスは３０℃で増殖させ、その他の微生物は３５℃で増殖させた。
【０２３４】
一晩増殖後、７，５００ｇで８分間遠心分離して細胞を集め、上清を廃棄した。細菌ペレットを冷リン酸塩緩衝生理食塩水で、７，５００ｇで６分間の遠心処理および上清廃棄を１回行うことにより洗浄した。洗浄した細菌ペレットを１．５ｍＬの冷水中に再懸濁した。
【０２３５】
１８０μＬの細胞懸濁液を２００μＬのＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）と混合し、および２０μＬの３００ｍＭ過ヨウ素酸塩またはＲＮアーゼ不含／ＤＮアーゼ不含の水（対照）を過ヨウ素酸塩を受けない試料に加えた。試料を３５℃、７０℃または８０℃で２０分間インキュベートした。試料を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄した。
【０２３６】
全ての試料を１６μＬのＴＫ緩衝液（５００ｍＭトリス、１．５Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．５）の添加により精製し、最初に室温で５分間、続けて氷上で１５分間インキュベートした後、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。それぞれの試料の半分の容積を２倍量の冷９５％エタノールを使って−２０℃で１時間沈殿させ、残りの半分を０．２Ｎの最終濃度になるまでＨＣｌを加えることにより酸加水分解に供し、６０℃で６０分間インキュベートした。全ての酸加水分解試料に、ＮａＯＨを０．１Ｎ過剰になるまで添加し、続けて１００℃で１０分間インキュベートした。逆相ＨＰＬＣ用の試料を中和するために、３００μＬの５００ｍＭのＡＤＡ  ｐＨ６．５を試料に加え、試料を１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清をＨＰＬＣで分析し、全ての不溶性物質を廃棄した。
【０２３７】
エタノール中の試料を１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を取り出し、ペレットを５０μＬの冷ＲＮアーゼ不含／ＤＮアーゼ不含の水に溶解した。１μＬの精製物質を２重で２５μＬのＰＣＲ反応液中でテンプレートとして使用した。汎用細菌プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲの条件については、実施例６を参照されたい。
【０２３８】
汎用真菌プライマーは、Ｆ：５’−ｇｃａｔｃｇａｔｇａａｇａａｃｇｃａｇｃ−３’およびＲ：５’−ｔｃｃｔｃｃｇｃｔｔａｔｔｇａｔａｔｇｃ−３’であった。それぞれの２５μＬのＰＣＲ反応液は、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．０μＭ  Ｓｙｔｏ９、４．０ｐＭ汎用真菌プライマーＦ、４．０ｐＭ汎用真菌プライマーＲ、２．０μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ＵのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）および１Ｘ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＰＣＲマスターミックスを含んだ。汎用真菌プライマー用のサイクル条件は以下の通りであった：９５℃で２分ｘ１、（９５℃で２０秒、５６．５℃で３０秒、７２℃で２５秒）ｘ３８。
【０２３９】
結果および考察
リアルタイムＰＣＲ（表１９〜２１）および酸抽出ＨＰＬＣ法（表２２〜３０）の両方により示されるように、過ヨウ素酸塩の存在下において、それが存在しない場合よりも明らかに、顕著により多くのＤＮＡが多様な微生物から放出された。この過ヨウ素酸塩の効果は温度依存性であるように見え、最適核酸放出が７０〜８０℃で起こった。過ヨウ素酸塩は、グラム陽性およびグラム陰性菌ならびに真菌から核酸を放出させた。興味深いことに、過ヨウ素酸塩は、ＨＰＬＣ法による検出では、黄色ブドウ球菌から比較的少量の核酸を放出させたが、リアルタイムＰＣＲではそうではなかった。
【０２４０】
【表１９】
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【０２４１】
【表２０】
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【０２４２】
【表２１】
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【０２４３】
【表２２】
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【０２４４】
【表２３】
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【０２４５】
【表２４】
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【０２４６】
【表２５】
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【０２４７】
【表２６】
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【０２４８】
【表２７】
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【０２４９】
【表２８】
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【０２５０】
【表２９】
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【０２５１】
【表３０】
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【０２５２】
実施例１５：様々な生物試料タイプ中に存在する結核菌からＤＮＡを放出させるための過ヨウ素酸塩の使用
種々の天然環境、宿主生物および生物試料中で微生物を見つけることが可能である。この実施例は、本発明の化学的なＤＮＡ抽出「過ヨウ素酸塩法」が、様々な複雑性を有する生物試料から結核菌などの頑丈な生物を検出するために好適であることを示す。特に、結核菌ＤＮＡをヒト尿および糞便試料から回収した。
【０２５３】
実験方法
ヒト型結核菌添加生物試料の調製
結核陽性試料をシミュレートするために、健康なドナー由来の１ｍＬの尿または糞便（２ｍＬの糞便ホモジナイゼーション緩衝液（米国特許仮出願第６１／９４９，６９２号）中に収集した約４００ｍｇの糞便の調製物からの）試料に、最終濃度が約３ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌとなるよう減弱結核菌（ａＭＴＢ）を添加した。
【０２５４】
「過ヨウ素酸塩法」を用いる結核菌陽性尿および糞便からのＤＮＡの抽出
１．２００μＬのａＭＴＢ添加尿または糞便を、等容積のＢＤ２緩衝液と混合した。
２．４０μＬのＮＰＩ（最終濃度３０ｍＭ）を加え、ボルテックスして混合し、７０℃で２０分間インキュベートする。
３．試料を室温で２分間冷却する。
４．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加える。
５．室温で１０分間インキュベートする。
６．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加える。
７．氷上で１０分間インキュベートする。
８．１５，０００ｘｇで５分間遠心分離する。
９．上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄する。
１０．８００μＬの室温の９５％エタノールを加え、２０回反転させて混合する。
１１．室温で１５分間試料をインキュベートし、ＤＮＡを沈殿させる。
１２．１５，０００ｘｇで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化する。
１３．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を注意深く取り出し、廃棄する。
１４．１００μＬのＴＥを加えて、ペレットを再水和する。
【０２５５】
リアルタイムＰＣＲ
実施例９および１０で記載のように、ａＭＴＢ添加尿または糞便から単離したＤＮＡをＲＤ４  ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイに使用した。アッセイの前に、糞便のＤＮＡを１：１００に希釈し、それぞれのケースで５μＬを使用した。
【０２５６】
結果および考察
この実施例では、「過ヨウ素酸塩法」を使って抽出されたＤＮＡは、試験したケースの１００％でＴＢ陽性として検出され（表３１）、本発明が、低い複雑さ（主として水性の均質な、ｐＨ中性溶液）からより高い複雑さ（半固体の不均一な、ｐＨ変動複合物）までの範囲の試料から機能性ＤＮＡを放出させるのに効果的であることを示す。
【０２５７】
【表３１】
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【０２５８】
実施例１６：感染性試料のバイオセーフティのための過ヨウ素酸塩の使用  
世界的なＴＢ感染症の増加が続いていることから、検出、処置および予防を含むしっかりとした医学的対応が必要である。このようなフレームワークは、高度に感染性の試料の取り扱いに積極的に関与する研究室および関連科学者たちの大きなネットワークに依存する。ＴＢが容易に伝染することを考慮して、取り扱いのために高性能の高レベル生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）が必要である。さらに、これらの作業者は、潜在的により高い感染リスクを有する。これらの試料を迅速に「バイオセーフ」にする、すなわち、もはや生存可能ではなくして、その結果、下流での分析のためにより基礎的な研究室への移動が安全であるようにする能力のある組成物は、この分野で明確な利点を有する。
【０２５９】
この実施例では、過ヨウ素酸塩を含むまたは含まない処理プロトコル後に得られた細菌沈降物を、バイオセーフティの観点から評価し、ＢＳＬ−２（バイオセーフティーレベル２）研究室の分子ユニット中での分析のために、その物質をＢＳＬ−３（バイオセーフティーレベル３）研究室から安全に移動できることを保証した。
【０２６０】
実験方法
ヒト型結核菌添加生物試料の調製
結核陽性喀痰をシミュレートするために、健康なドナー由来の唾液試料に、次の大凡のストック濃度を有する減弱結核菌（ａＭＴＢ）を添加した：
１．７．５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌ（高レベル添加）
２．７．５ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌ（中レベル添加）
【０２６１】
以下の群に従って添加唾液試料を調製し、各群は高レベル添加ストック濃度または中レベル添加ストック濃度を使って調製した：
Ａ．１．０ｍＬ唾液＋１．０ｍＬのＢＤ２緩衝液＋１００μＬのａＭＴＢストック：ＮＰＩ処理なし
Ｂ．２．０ｍＬ唾液＋１００μＬのａＭＴＢストック：ＮＰＩ処理なし
Ｃ．２．０ｍＬ唾液＋１００μＬのａＭＴＢストック：ＮＰＩ処理
Ｄ．１．０ｍＬ唾液＋１．０ｍＬのＢＤ２緩衝液＋１００μＬのａＭＴＢストック：ＮＰＩ処理
【０２６２】
各群のａＭＴＢの最終濃度は、約３．７５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ（高レベル添加試料）または約３．７５ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ（中レベル添加試料）であった。それぞれのチューブを短時間ボルテックスして混合し、試料を次のように処理した：
【０２６３】
Ａ群およびＢ群試料に対するプロトコル
１．それぞれの試料を３つの新しい１．５ｍＬの遠心管にチューブ当たり５００μＬで均等に分ける。
２．３５００ｘｇでチューブを２０分間遠心分離する。
３．上清を取り出し、廃棄する。
４．沈降物を５０μＬの無菌ＰＢＳに再懸濁する。
５．ＰＢＳ沈降物混合物をレーヴェンシュタイン・ヤンセン培地チューブ（ＬＪスラント）の上端に注意深く加え、左右に静かに揺らして試料を分布させる。
６．３５℃で４２日間インキュベートし、増殖を記録する。
【０２６４】
Ｃ群およびＤ群試料に対するプロトコル
１．それぞれの試料を３つの新しい１．５ｍＬの遠心管にチューブ当たり５００μＬで均等に分ける。
２．３５００ｘｇでチューブを２０分間遠心分離する。
３．上清を取り出し、廃棄する。
４．沈降物を５００μＬの５０％ＢＤ２緩衝液に再懸濁する。
５．５０μＬのＮＰＩ（最終濃度３０ｍＭ）を加え、ボルテックスして混合し、７０℃で２０分間インキュベートする。
６．試料を室温で２分間冷却する。
７．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加える。
８．３５００ｘｇでチューブを２０分間遠心分離する。
９．上清を取り出し、廃棄する。
１０．５００μＬの無菌ＰＢＳ中で沈降物を洗浄する。
１１．３５００ｘｇでチューブを２０分間遠心分離する。
１２．上清を取り出し、廃棄する。
１３．沈降物を５０μＬの無菌ＰＢＳに再懸濁する。
１４．ＰＢＳ沈降物混合物をレーヴェンシュタイン・ヤンセン培地チューブ（ＬＪスラント）の上端に注意深く加え、左右に静かに揺らして試料を分布させる。
１５．３５℃で４２日間インキュベートし、増殖を記録する。
【０２６５】
結果および考察
【０２６６】
【表３２】
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【０２６７】
表３２は、ＮＰＩの存在下でのＴＢ生存能力の阻止を示す。ＮＰＩの存在しないＡ群およびＢ群では、８〜１０日後にＴＢコロニーが現れ始め（Ａ群）、また、１日以内に汚染バックグラウンド細菌叢がＬＪ培地を圧倒した（Ｂ群）。対照的に、ＮＰＩが添加されているＣ群およびＤ群では、ＴＢ陰性状態を決定するための現在の培養標準である４２日間のインキュベーション後であっても、どのような微生物の増殖も観察されなかった。これは、ＴＢの生存能力の阻止には、ＮＰＩが必要であることを示す。この効果はまた、バックグラウンド細菌叢の除去のための最初のリシスバッファーの非存在下（ＢＤ２；Ｃ群）でも認められ、ＴＢの生存能力の阻止にはＮＰＩ単独で十分であることを示している。これは、それによりＴＢ陽性試料を取り扱う個人が素早く、効果的に試料をバイオセーフにできるので、現在の最先端技術に対する明確な改善である。個人に対するリスクがこのように低減され、かつＤＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲなどのさらなる分析のために、これらのＮＰＩ処理試料を制限的なＢＳＬ３環境からＢＳＬ２研究室に移動できる（実施例９参照）。
【０２６８】
実施例１７：ＮａＯＨ−ＮＡＬＣ喀痰試料中での直接的なＭＬの試験活性
ＮａＯＨ／ＮＡＬＣは、喀痰を液化するために広く使われている。この実施例は、ＮａＯＨ／ＮＡＬＣで処理された喀痰試料中で過ヨウ素酸塩がまだ活性である、すなわち、ＭＴＢから核酸を放出させることを実証する。
【０２６９】
実験方法
ヒト型結核菌添加喀痰試料の調製
結核陽性喀痰をシミュレートするために、喀痰試料（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｓｃｏｔｌａｎｄから購入）に大凡９ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌの減弱結核菌Ｈ３７Ｒａ（ａＭＴＢ）を添加し、２つの部分に分けた。１つめの部分は等容積のＮａＯＨ／ＮＡＬＣにより室温で１５分間処理し、２つめの部分は等容積のＢＤ２緩衝液（５０ｍＭグリシン、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１２．５ｍＭのＬｉ−ＣＤＴＡ、２％ＳＤＳ、ｐＨ１０．５）と混合した。ＢＤ緩衝液処理喀痰を５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、ペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、これに１ｍＬのＢＤ２緩衝液を加えた。
【０２７０】
最適過ヨウ素酸塩法を用いるＮａＯＨ／ＮＡＬＣまたはＢＤ緩衝液中のａＭＴＢ陽性喀痰からのＤＮＡの抽出
１．３つの２００μＬ分割量のＮａＯＨ／ＮＡＬＣ処理喀痰またはＢＤ２緩衝液処理喀痰（上記）をＮＰＩで最終濃度３０ｍＭまで処理し、ボルテックスして混合した。
２．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
３．一定分量を室温で２分間冷却した。
４．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
５．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加えた。
６．氷上で１０分間インキュベートした。
７．１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
８．上清を清浄なチューブに移した。ペレットを廃棄した。
９．４００μＬの室温の９５％エタノールを加えた。２０回反転させることにより混合した。
１０．試料を室温で１５分間インキュベートし、ＤＮＡを沈殿させた。
１１．１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。
１２．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出し、廃棄した。
１３．ペレットを２００μＬのＴＥに溶解した。短時間ボルテックスしてＤＮＡを完全に再懸濁させた。
【０２７１】
短縮過ヨウ素酸塩法を用いるＮａＯＨ／ＮＡＬＣ中のａＭＴＢ陽性喀痰からのＤＮＡの抽出
１．３つの２００μＬ分割量のＮａＯＨ／ＮＡＬＣ処理喀痰（上記）をＮＰＩで最終濃度３０ｍＭまで処理し、ボルテックスして混合した。
２．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
３．一定分量を室温で２分間冷却した。
４．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
５．室温で１０分間インキュベートした。
６．２倍量の室温の９５％エタノールを加えた。２０回反転させることにより混合した。
７．試料を室温で１５分間インキュベートし、ＤＮＡを沈殿させた。
８．１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。
９．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出し、廃棄した。
１０．ペレットを２００μＬのＴＥに溶解した。短時間ボルテックスしてＤＮＡを完全に再懸濁させた。
【０２７２】
ｒｔＰＣＲ条件
この実施例では、ａＭＴＢ添加喀痰試料（上記）から単離されたＤＮＡを、マイコバクテリウム属特異的ｒｔＰＣＲアッセイである、ＲＤ４  ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイに供した（実施例１０を参照されたい）。
【０２７３】
結果および考察
上で概略を述べたように、ＮａＯＨ／ＮＡＬＣ処理喀痰のための抽出プロトコルは、ＢＤ２緩衝液処理試料からＳＤＳを沈殿させるために必要な酢酸カリウムおよび遠心分離ステップを除くことにより短縮できる。本実施例は、結核菌に特異的なリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、過ヨウ素酸塩がＮａＯＨ／ＮＡＬＣで処理後の喀痰中のａＭＴＢから核酸を放出させることができることを示す（表３３）。本発明の方法である、ＢＤ２緩衝液処理に続く過ヨウ素酸塩を用いるＤＮＡ抽出と比べて、過ヨウ素酸塩を用いるＤＮＡ抽出の前に喀痰がＮａＯＨ／ＮＡＬＣで処理された場合、Ｃｔ値は２サイクル大きいだけであった。
【０２７４】
【表３３】
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【０２７５】
実施例１８：ヒト型結核菌の分子検出のためのＳｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ法と比較した過ヨウ素酸塩法
ＣＤＣは、臨床検体を、培養、抗酸性バチルス（ＦＡＢ）染色、および核酸増幅プロトコルで同時に分析することを推奨している（Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ，２００９）。培養はＴＢ陽性の最終判定のための「ゴールドスタンダード」であるが、これは時間がかかり、８週間も要する場合がある。ＡＦＢ染色は迅速であるが、結核菌群（ＭＴＢＣ）のメンバーと非結核マイコバクテリア（ＮＴＭ）を区別しないために、感度および特異性が低い。したがって、疾患の蔓延を管理するために不可欠な迅速な特定は、ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの核酸増幅プロトコルおよびシーケンシングに依存している。
【０２７６】
結核菌感染患者における抗生物質耐性の評価は、患者の管理および疾患の蔓延を抑制するために極めて重要である。結核菌の薬剤感受性試験（ＤＳＴ）の標準的方法は、結果を得るのに数週間〜数ヶ月を要する場合がある。多剤耐性結核（ＭＤＲ−ＴＢ）および広範囲型多剤耐性結核菌（ＸＤＲ−ＴＢ）の出現が原因で、迅速な分子的手法が開発されてきた。ｒｐｏＢ遺伝子内の変異がリファンピン（ＲＩＦ）耐性に関連し、ｋａｔＧおよびｉｎｈＡ遺伝子の変異がイソニアジド耐性に関連している。Ｈａｌｓｅら（２０１０）は、リアルタイムＰＣＲにより結核菌群（ＭＴＢＣ）陽性の臨床検体を直接分析する抗生物質耐性遺伝子パイロシーケンス分析を利用する、２段階分子手法を開発した。
【０２７７】
この実施例では、２つの異なる方法により処理されたＴＢ陽性喀痰試料（革新的な新規診断薬に関する基金（ＦＩＮＤ）結核検体バンクから厚意で提供された）の臨床評価の並列比較を行った。特に、１）水酸化ナトリウム処理に続くビーズビーティングからなる「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」法、および２）本発明の方法を、ＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｑＰＣＲアッセイ（ＲＤ４  ＭＴＢＣ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＤ））（Ｈａｌｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）および抗生物質耐性遺伝子パイロシーケンスアッセイ（Ｈａｌｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）における感度の観点から比較した。本発明の方法では、ＤＮＡの単離およびアッセイ試験のまえに、ＴＢ陽性喀痰試料をＢＤ２緩衝液および過ヨウ素酸塩で処理して検体中の細胞の化学的溶解を容易にした。
【０２７８】
本発明とは対照的に、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」は、喀痰試料中の細菌をこじ開けるための機械的な方法であるビーズビーティングを含む。機械的なビーズビーティングは生物をこじ開けるのに効果的であり得るが、この方法は、研究室環境中で危険なエアロゾルを生成する。したがって、診断試験の臨床的感度に悪い影響を与えることなく、ヒト型結核菌から安全にＤＮＡを放出させるために、効果的で非機械的な化学的方法を開発することが強く望まれている。
【０２７９】
実験方法
ヒト型結核菌陽性喀痰試料
本実施例のために、確立されたＴＢ陽性患者由来の生の喀痰試料が、革新的な新規診断薬に関する基金（ＦＩＮＤ）結核検体バンクから厚意で提供された。
スメアおよび培養分析を使って、これらの試料を、「弱」、「中」および「強」ＴＢ陽性検体としてＦＩＮＤ分類した。３０人の患者試料から２重で分割量０．５ｍＬの提供を受け、凍結貯蔵した。さらなる分析のために、一定分量をＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証臨床検査室である、Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ａｌｂａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）へ凍結輸送した。
【０２８０】
３０人のドナー由来の２重の一定分量を氷上で解凍し、ＤＮＡの単離の前に、１セットの一定分量を「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」法（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ法）を使って処理し、２つめのセットをＢＤ２緩衝液および過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸塩法）で処理した。
【０２８１】
「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」法を用いるＴＢ陽性喀痰の処理
１．各０．５ｍＬの喀痰一定分量（ｎ＝６）に、０．５ｍＬの３．５％ＮａＯＨを加え、ボルテックスして混合した。
２．室温で１５分間インキュベートした。
３．１０ｍＬになるまで無菌のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えた。
４．５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細菌をペレット化した。上清を廃棄した。
５．０．５ｍＬの無菌のＰＢＳ中にペレットを再懸濁した。
６．培養して結核菌の生存率を確認するために、３００μＬの再懸濁細菌を取っておいた。
７．残りの２００μＬの再懸濁細菌に、２００ｍｇの１０５〜１５０ミクロンのガラスビーズを加えることにより、細菌を溶解した。
８．Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使って、１分間のビーズビーティングとそれに続く１分間の氷上静置を２サイクル行った。
【０２８２】
過ヨウ素酸塩法を用いるＴＢ陽性喀痰の処理
１．各０．５ｍＬの喀痰一定分量（ｎ＝６）に、０．５ｍＬのＢＤ２緩衝液（２％ＳＤＳ、１２．５ｍＭのＣＤＴＡ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）を加え、ボルテックスして混合した。
２．プロテイナーゼＫ（４００μｇ）を加え、水浴中、５０℃で２時間インキュベートした。
３．ＮＰＩを最終濃度３０ｍＭまで加え、ボルテックスして混合した。
４．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
５．試料を室温で２分間冷却した。
６．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
７．室温で１０分間インキュベートした。
８．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加えた。
９．氷上で１０分間インキュベートした。
１０．１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
１１．上清を清浄な標識チューブに移した。ペレットを廃棄した。
１２．２倍量の室温の９５％エタノールを加え、２０回反転させることにより混合した。
１３．試料を室温で１５分間インキュベートし、ＤＮＡを沈殿させた。
１４．１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。
１５．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出し、廃棄した。
１６．ペレットを２００μＬのＴＥに溶解した。
１７．短時間ボルテックスしてＤＮＡを完全に再懸濁させ、室温で最低３０分間静置した。
【０２８３】
結核菌のためのリアルタイムＰＣＲおよび抗生物質耐性のためのパイロシーケンス
５μＬの「未希釈」および５μＬの希釈（１：１０）のそれぞれ精製喀痰試料（上記）由来のＤＮＡの２重の反応液を、ＲＤ４  ＭＴＢＣのｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＤ）（Ｈａｌｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を標的とするＣＬＩＡ／ＣＬＥＰ認証ｑＰＣＲアッセイを使って、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲ装置で増幅した。３７未満の閾値サイクル（Ｃｔ）値を陽性と報告し、３７より大きいＣｔ値の試料を再試験して、結果が同じであれば陽性と報告し、結果が同じでない場合は不確定として報告した。
【０２８４】
リファンピン耐性用の標的（ｒｐｏＢ）（Ｈａｌｓｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）およびイソニアジド耐性用の追加の標的（ｉｎｈＡおよびｋａｔＧ）に対する以前に報告されたパイロシーケンス法を使って抗生物質耐性プロファイリングを行った。両法から得たＤＮＡを別々のＰＣＲ反応で使用して、ｒｐｏＢ、ｉｎｈＡおよびｋａｔＧ遺伝子の特定の領域を増幅した。これらの領域の変異は、リファンピンおよび／またはイソニアジド抗生物質に対する耐性の可能性があることを示す。
【０２８５】
結果および考察
今日では、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ法は、水酸化ナトリウム（またはＮａＯＨ／ＮＡＬＣ）による喀痰の液化と、それに続く機械的ビーズビーティングを用いる細菌からのＤＮＡの単離を含む。本発明の方法は、過ヨウ素酸塩を含む単純な化学的処理により細菌を溶解する点で異なる。重要なことに、本発明の組成物および方法は、その後の結核菌特異的ＤＮＡおよび抗生物質耐性マーカーの検出に繋げるという観点で、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ法に比べて、より効果が大きいというほどでなくても、同様に効果的であると思われた。
【０２８６】
【表３４】
2017510284.tif 000035
【０２８７】
従来の方法（「Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ」法、表３４）に比べて、本発明の化学的方法（「過ヨウ素酸塩」法、表３４）は、培養およびスメア顕微鏡により「弱」および「中」ＴＢ陽性として以前に分類されている２重の喀痰試料中のｑＰＣＲによる結核菌特異的検出の臨床的感度の向上をもたらした。この実施例では、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ」法を用いて抽出されたＤＮＡが１０倍希釈されて初めて、「中」および「強」のＴＢ陽性喀痰試料中の結核菌がｑＰＣＲにより検出された（表３４）。全てのＴＢ添加レベルに対し、表１は、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ法（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ法）に比べて、本発明の方法（過ヨウ素酸塩法）を使って処理した全てのＴＢ陽性喀痰試料中の結核菌検出限界の顕著な改善（ｑＰＣＲによる、より低いＣｔ値）を示す。この検出のより低い限界は、患者の喀痰試料由来の結核菌の正確な診断を確実に行うのに役立つ。
【０２８８】
同様に、本発明の組成物および方法は、結核陽性検体中の抗生物質耐性を予測する産業標準検査に適合する。Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ法および過ヨウ素酸塩法で得られたパイロシーケンス分析結果は、試験した６つの臨床ＴＢ陽性喀痰検体に関して、１００％一致した。重要なことに、これらの６つの喀痰検体から、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ法ではなく、本発明の過ヨウ素酸塩法が、抗生物質耐性マーカー（ｉｎｈＡおよびｒｐｏＢ）を有する２人の患者（ＦＩＮＤ  ０１  ０１  ２０７２およびＦＩＮＤ  ０１  ０１  ２１３７）を検出した（表３４）。ゴールドスタンダード培養試験でさえ、インビトロ５２日後にこれらの２人の患者の試料中のマイコバクテリアの増殖を示すことができなかった。
【０２８９】
試験時点でのマイコバクテリアＤＮＡの回収の増加の効果は、パイロシーケンスデータにより最も強調される。過ヨウ素酸塩で処理された試料は、試験０日目に抗生物質耐性マーカーについて試験するのに十分な量で利用可能なＤＮＡを有していた。対照的に、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ法は、０日目にＰＣＲで陰性であった試料についてパイロシーケンスを繰り返すことが可能になる前に、ＭＧＩＴ培養が陽性になるのに平均１４日を要した。患者の抗生物質プロファイルは症例管理に不可欠であり、かつ適切な抗生物質療法によるより早期の介入は感染率を減らし、回復の確率を高めるであろう。したがって、本発明は、リアルタイムＰＣＲによるＭＴＢＣの迅速な同日特定のために価値があり、かつ、培養によるマイコバクテリアの検出を待つことなく、結核菌の抗生物質耐性マーカーを検出するための十分な感度を有する。
【０２９０】
実施例１９：喀痰スワブ試料からのＭＴＢの検出
結核の最適管理のためには、早期診断が不可欠である。数人の研究者は、患者試料中の結核菌群（ＭＴＢＣ）の種々の標的配列および薬剤耐性遺伝子の迅速な検出をもたらすリアルタイムＰＣＲアッセイを開発した。臨床試料中のＭＴＢＣを検出するこれらのアッセイの能力は、選択される標的配列およびＤＮＡ抽出方法の効率の両方に依存する。前の実施例は、本発明がＭＴＢなどの微生物からの核酸抽出を実質的に向上させて、ヒト喀痰中の結核菌検出の感度を高めることを示した。
【０２９１】
全喀痰検体を処理する代わりに、生のまたは未処理状態にある、すなわち、水酸化ナトリウムおよび／またはＮＡＬＣによる汚染除去の前に、それぞれの検体のわずかな画分から、直接核酸を抽出することにより、さらに高い効率を得ることができる。この実施例は、市販のスワブを使って、少ない一定分量（スワブ当たり、約１００〜２００マイクロリットル）の未処理喀痰をうまく捕捉して移すことができることを示す。本発明により得られた抽出効率と組み合わせて、全検体のわずかな画分の処理は、研究室中での検体の取り扱い、ならびに診断までの時間を大きく改善できる。
【０２９２】
材料と方法
３ｍＬの凍結未処理喀痰試料（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．）を１つ解凍し、９ｘ１０７ＣＦＵ／ｍＬの減弱ＭＴＢ  Ｈ３７Ｒａ（ａＭＴＢ）を添加した。１つずつ、８ＦＬＯＱ（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．；カタログ番号５０２ＣＳ０１）スワブおよび８Ｈｙｄｒａ  Ｆｌｏｃｋ（Ｐｕｒｉｔａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．，ＬＬＣ；カタログ番号２５−３４０６−Ｈ）スワブをａＭＴＢ添加喀痰中に浸漬し、１０秒間かき混ぜ、その後、５００μＬのＢＤ２緩衝液（５０ｍＭグリシン、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１２．５ｍＭのＬｉ−ＣＤＴＡ、２％ＳＤＳ、ｐＨ１０．５）を含むチューブ中に移した。室温で２時間後、スワブを取り出し、チューブを３，５００ｇで２０分間遠心分離し、ペレットを１００μＬのＰＢＳに再懸濁した。各スワブ由来の２つの再懸濁試料をＭ７Ｈ１０寒天プレート上に播種し、３５℃で２１日間インキュベートしてａＭＴＢの生存率を確認した。各スワブ由来の６つの再懸濁試料を１００μＬのＢＤ２緩衝液と混合した後、過ヨウ素酸塩を含んでおよび含まずに核酸抽出を行った（下記参照）。
【０２９３】
過ヨウ素酸塩法を用いるａＭＴＢ陽性喀痰からのＤＮＡの抽出
１．５つの２００μＬ分割量（スワブ１〜５；上記）をＮＰＩで最終濃度３０ｍＭまで処理し、ボルテックスして混合した。１つの２００μＬ分割量（スワブ６）はＮＰＩで処理しなかった。
２．水浴中、７０℃で２０分間インキュベートした。
３．一定分量を室温で２分間冷却した。
４．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度５０ｍＭまで加えた。
５．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）を最終濃度１５０ｍＭまで加えた。
６．氷上で１０分間インキュベートした。
７．１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
８．上清を清浄なチューブに移した。ペレットを廃棄した。
９．４００μＬの室温の９５％エタノールを加えた。２０回反転させることにより混合した。
１０．試料を室温で１５分間インキュベートし、ＤＮＡを沈殿させた。
１１．１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡをペレット化した。
１２．ペレットを掻き乱さないように注意して上清を静かに取り出し、廃棄した。
１３．ペレットを２００μＬのＴＥに溶解した。短時間ボルテックスしてＤＮＡを完全に再懸濁させた。
【０２９４】
ｒｔＰＣＲ条件
この実施例では、ａＭＴＢ添加喀痰試料（上記）からから単離されたＤＮＡを、マイコバクテリウム属特異的ｒｔＰＣＲアッセイである、ＲＤ４  ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイに供した（実施例１０を参照されたい）。
【０２９５】
結果および考察
スワブで収集したａＭＴＢ添加喀痰は培養で生存可能であった。培養の２１日後、Ｃｏｐａｎスワブから単離されたａＭＴＢは菌叢を生成し、Ｐｕｒｉｔａｎスワブから回収されたａＭＴＢはプレート当たり約２００コロニーを生成した。
【０２９６】
単一ＣｏｐａｎまたはＰｕｒｉｔａｎスワブで収集されたａＭＴＢのＤＮＡの量は、ＭＴＢ特異的ｒｔＰＣＲを用いて容易に検出された（スワブ６；表３５参照）。ＤＮＡ抽出プロトコルに過ヨウ素酸塩を含めた場合（スワブ１〜５；表３５）、Ｃｔ値は、Ｃｏｐａｎスワブに対しては、２７．７５から２４．０２へ、また、Ｐｕｒｉｔａｎスワブに対しては、２７．６２から２３．６９へ３サイクル超減少し、これは、スワブ当たり回収されたａＭＴＢ特異的ＤＮＡの量の１０倍の増加に対応する。さらに、無希釈対希釈ＤＮＡ（１：１０）を用いるｒｔＰＣＲは、予測された３サイクルの差異を示し、これは、抽出したＤＮＡがＰＣＲの阻害剤をほとんどまたは全く含まないことを示している。
【０２９７】
したがって、スワブの未処理喀痰検体中への浸漬により、中陽性〜強陽性検体中の結核菌の存在を迅速に診断するのに十分な試料（１００〜２００μＬ）を提供できる。重要なことに、ＤＮＡ抽出プロトコル中に過ヨウ素酸塩を含めることにより、この検出の感度が少なくとも１０倍高められ、このことは弱陽性〜中陽性検体に対し重要な波及効果を有する。
【０２９８】
【表３５】
2017510284.tif 000036
【０２９９】
追加の参考文献
・“Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂＤｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，”  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．
・“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，”  Ｉ．Ｃ．Ｓｈａｍｐｕｔａ，Ｌ．Ｒｉｇｏｕｔｓ，Ｆ．Ｐｏｒｔａｅｌｓ，ＡＰＭＩＳ（２００４）１１２：７２８−７５２．
・“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐｕｔｕｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”  Ｌ．Ｅ．Ｄｅｓｊａｒｄｉｎ，Ｍ．Ｄ．Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｋ．Ｗｏｌｓｋｉ，Ｓ．Ｈａｕｎ，Ｌ．Ｔｅｉｘｅｉｒａ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｊ．Ｅｌｌｎｅｒ，Ｒ．Ｄｉｅｔｚｅ，Ｊ．Ｂａｔｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｃａｖｅ，Ｋ．Ｄ．Ｅｉｓｅｎａｃｈ（１９９９）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６０：２０３−２１０．
・Ｎ．Ｎ．Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，ｐｐ．８７２−８７５（１９９８）．
・Ａ．Ａｆｋｈａｍｉ，Ｔ．Ｍａｄｒａｋｉａｎ，Ａ．Ｒ．Ｚａｒｅｉ，“Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｏｄａｔｅ，ｉｏｄａｔｅ  ａｎｄ  ｂｒｏｍａｔｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｏｄｉｄｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００１）１７：１１９９−１２０２．
・Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ  Ｄ，Ｈａｎｎｅｔｔ  ＧＥ，Ｂｏｐｐ  ＤＪ，Ｄｕｍｙａｔｉ  ＧＫ，Ｈａｌｓｅ  ＴＡ，Ｄｕｍａｓ  ＮＢ，Ｍｕｓｓｅｒ  ＫＳ（２００９）Ｒａｐｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎ  ｓｔｏｏｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７（７）：２４２−２１４８．
・Ｈａｌｓｅ  ＴＡ，Ｅｓｃｕｙｅｒ  ＶＥ，Ｍｕｓｓｅｒ  ＫＡ（２０１１）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｔｕｂｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４９（７）：２５６２−５２６７．
・Ｈａｌｓｅ  Ｔ  Ａ，Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｊ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＰＬ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ  ＷＪ，Ｄｕｍａｓ  ＮＢ，Ｅｓｃｕｙｅｒ  ＶＥ，Ｍｕｓｓｅｒ  ＫＡ（２０１０）Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｒｐｏＢ  ｇｅｎｅ  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｆａｍｐｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８：１１８２−１１８８．
・Ｃｏｒｂｅｔｔ  ＥＬ，Ｗａｔｔ  Ｃ  Ｊ，Ｗａｌｋｅｒ  Ｎ，Ｍａｈｅｒ  Ｄ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＢＧ，Ｒａｖｉｇｌｉｏｎｅ  ＭＣ，Ｄｙｅ  Ｃ（２００３）Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：ｇｌｏｂａｌ  ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＨＩＶ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ．Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １６３：１００９−１０２１．
・Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（２０００）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６１：１３７６−１３９５．
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・Ｙｅａｇｅｒ  ＨＪ  Ｊｒ，Ｌａｃｙ  Ｊ，Ｓｍｉｔｈ  Ｌ，ＬｅＭａｉｓｔｒｅ  Ｃ（１９６７）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｐｕｔｕｍ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａ．Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ  ９５：９９８−１００４．
・Ｇｈａｎｄｉ  ＮＲ，Ｍｏｌｌ  Ａ，Ｐａｗｉｎｓｋｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（Ａｕｇｕｓｔ  ２００６）Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（ＸＤＲ）ＴＢ  ｉｎ  ＴＢ／ＨＩＶ  ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｒｕｒａｌ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ．Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ：Ｌａｔｅ  Ｂｒｅａｋｅｒ  Ｓｅｓｓｉｏｎ，ＸＶＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，１３−１８  ［Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＴＨＬＢ０２１０］．
・Ｒａｖｉｇｌｉｏｎｅ  Ｍ（２００６）ＸＤＲ−ＴＢ：ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔ−ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｅｒａ？  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｕｂｅｒｃ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓ  １０（１１）：１１８５−１１８７．
・Ｄａｖｉｓ  ＪＬ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ，Ｋｏｖａｃｓ  ＪＡ，Ｍａｓｕｒ  Ｈ，Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ，Ｈａｖｌｉｒ  ＤＶ，Ｗｏｒｏｄｒｉａ  ＷＯ，Ｃｈａｒｌｅｂｏｉｓ  ＥＤ，Ｓｒｉｋａｎｔｉａｈ  Ｐ，Ｃａｔｔａｍａｎｃｈｉ  Ａ，Ｈｕｂｅｒ  Ｃ，Ｓｈｅａ  ＹＲ，Ｃｈｏｗ  Ｙ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＳＨ（２００９）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃＡ１  ｏｎ  ｓｐｕｔｕｍ  ｏｒ  ｏｒａｌ  ｗａｓｈ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ４８：７２５−７３２．
・Ｙａｓｓｅｎ  Ｇ，Ｎｏｏｒｉ  Ｊ，Ｙａｓ  ＮＳ（２０１２）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ｆａｓｔ  ｂａｃｉｌｌｉ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊ  Ｂａｇｈ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  ２４（３）：５９−６２．
・Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ（２００９）  Ｕｐｄａｔｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  ５８：７−１０．
・Ｈａｌｓｅ  ＴＡ，Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｊ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＰＬ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ  ＷＪ，Ｄｕｍａｓ  ＮＢ，Ｅｓｃｕｙｅｒ  ＶＥ，Ｍｕｓｓｅｒ  ＫＡ（２０１０）Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｒｐｏＢ  ｇｅｎｅ  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｆａｍｐｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８（４）：１１８２−１１８８．
・Ｈａｌｓｅ  ＴＡ，Ｅｓｃｕｙｅｒ  ＶＥ，Ｍｕｓｓｅｒ  ＫＡ（２０１１）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４９（７）：２５６２−２５６７．
・Ｓｃｏｔｔ  ＩＩ  ＲＤ（２００９）  Ｔｈｅ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｕ．Ｓ．Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．
・Ｆａｗｌｅｙ  ＷＮ，Ｗｉｌｃｏｘ  ＭＨ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｎｄｅｍｉｃ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  １２６（３）：３４３−３５０．ＩＳＳＮ  ０９５０−２６８８．
・Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．Ａ．，Ｒｕｔｈａｚｅｒ，Ｒ．，Ｈａｎｓｊｏｓｔｅｎ，Ｋ．，Ｂａｒｅｆｏｏｔ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｎｙｄｍａｎ，Ｄ．Ｒ．（２００３  Ｓｅｐ）．“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃａｒｅ  ｕｎｉｔ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．１６３（１６）：１９０５−１２．
【０３００】
本明細書で言及した全ての出版物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示し、あたかもそれぞれの全ての出版物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０１】
本発明は前述のように記載されているが、同内容は様々な方法で変更可能であることは明らかであろう。このような変更は、本発明の趣旨および範囲からの乖離であると見なされるべきものではなく、また、全てのこのような修正は、当業者には明らかであるように、次の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【配列表フリーテキスト】
【０３０２】
配列番号１：  ユニバーサル細菌１６ＳリボゾーマルＤＮＡプライマー  ＢａｃｒＲＮＡ１７３−Ｆ
配列番号２：  ユニバーサル細菌１６ＳリボゾーマルＤＮＡプライマー  ＢａｃｒＲＮＡ１７３−Ｒ
配列番号３：  Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ遺伝子特異的ＤＮＡプライマー（ＨＰ−フォワード）
配列番号４：  Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ遺伝子特異的ＤＮＡプライマー（ＨＰ−リバース）
配列番号５：  ＲＤ４−フォワードプライマー
配列番号６：  ＲＤ４−リバースプライマー
配列番号７：  ユニバーサル菌糸類プライマー  フォワード
配列番号８：  ユニバーサル菌糸類プライマー  リバース
【図１】
2017510284.tif 000037
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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