(57)【要約】  本開示は、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質を投与することを含むバイオフィルム関連感染症を治療又は予防する方法並びに留置医療装置、インプラント、及び非医療用表面のバイオフィルム形成を防止及び処理する方法に関する。該タンパク質はグリコシルヒドロラーゼドメインを含む。さらに、本開示は特定の可溶性グリコシルヒドロラーゼ及びその組成物を提供する。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又は全ての：（ｉ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログを、それらを必要としている動物又は植物に投与することを含むバイオフィルム関連感染症を治療又は予防する方法。
【請求項２】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５４〜３０４又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ配列のアミノ酸４３〜２９９又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３若しくはアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインオーソログを含むタンパク質が、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されているＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７若しくはアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されているＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されているＰｇａＢ配列のアミノ酸３１０〜６７２若しくはアミノ酸２２〜６７２又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されているＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されているＥｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオフィルム関連感染症が、前記動物における創傷、熱傷後感染、角膜炎、生物義装具、又は留置医療装置感染の結果である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオフィルム関連感染症が前記動物の肺にあり、前記動物が慢性肺疾患又は肺感染症をもつ請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオフィルム関連感染症が前記植物又は植物部位の表面にある請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオフィルム関連感染症の前記バイオフィルムが、Ｐｅｌ依存性、Ｐｓｌ依存性、ＰＮＡＧ依存性、及び／又はＧＡＧ依存性バイオフィルムである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオフィルム関連感染症が、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、T. asahii、B. cineria、及びFusarium spp.によって引き起こされる請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
抗菌剤を前記それらを必要としている動物又は植物に併用投与することをさらに含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌薬である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの可溶性タンパク質がベクターによって発現され、前記方法が前記ベクターを前記それらを必要としている動物又は植物に投与することを含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターが、前記バイオフィルムの細菌に侵入できるファージベクターである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ベクターが、前記バイオフィルムの真菌に侵入できるマイコウイルスベクターである請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
留置医療装置又はインプラントにおけるバイオフィルム形成を防止する方法であって、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又はすべての：（ｉ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで、それらを必要としている動物に使用する前に、前記装置を被覆することを含む方法。
【請求項２２】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５４〜３０４又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ配列のアミノ酸４３〜２９９又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３若しくはアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質オーソログが、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されているＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７若しくはアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されているＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されているＰｇａＢ配列のアミノ酸３１０〜６７２若しくはアミノ酸２２〜６７２又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されているＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されているＥｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記留置医療装置又はインプラントがカテーテル又は静脈内チューブである請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記留置医療装置又はインプラントが人工関節又は生物義装具である請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記バイオフィルムが、Ｐｅｌ依存性、Ｐｓｌ依存性、ＰＮＡＧ依存性、及び／又はＧＡＧ依存性バイオフィルムである請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記バイオフィルムがP. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、及びFusarium spp.によって引き起こされる請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記留置医療装置又はインプラントを抗菌剤で被覆することをさらに含む請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌薬である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
バイオフィルム形成の影響を受けやすい非医療用表面のバイオフィルム形成を処理又はする方法であって、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又はすべての：（ｉ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで、それらを必要としている動物に使用する前に、前記表面を塗布すること又は前記表面を被覆することを含む方法。
【請求項３８】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５４〜３０４又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ配列のアミノ酸４３〜２９９又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３若しくはアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質オーソログが、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されているＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７若しくはアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されているＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されているＰｇａＢ配列のアミノ酸３１０〜６７２若しくはアミノ酸２２〜６７２又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されているＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されているＥｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記バイオフィルム関連感染症の前記バイオフィルムが、Ｐｅｌ依存性、Ｐｓｌ依存性、ＰＮＡＧ依存性、及び／又はＧＡＧ依存性バイオフィルムである請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記バイオフィルムが、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、及び／又はFusarium spp.によって引き起こされる請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
抗菌剤と併用投与する又は抗菌剤で被覆することをさらに含む請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌薬である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又はすべての：（ｉ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで被覆された留置医療装置又はインプラント。
【請求項５２】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項５３】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５４〜３０４又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項５４】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ配列のアミノ酸４３〜２９９又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項５５】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含むタンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３若しくはアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項５６】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質オーソログが、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されているＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７若しくはアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項５７】
前記ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含むタンパク質が、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されているＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項５８】
前記ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含むタンパク質が、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されているＰｇａＢ配列のアミノ酸３１０〜６７２若しくはアミノ酸２２〜６７２又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項５９】
前記ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含むタンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されているＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項６０】
前記Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されているＥｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項６１】
前記装置又はインプラントがさらに抗菌剤で被覆される請求項５１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項６２】
前記抗菌剤が抗生物質又は抗真菌薬である請求項６１に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項６３】
前記留置医療装置がカテーテル又は静脈内チューブである請求項５１〜６２のいずれか一項に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項６４】
前記留置医療装置が人工関節又は生物義装具である請求項５１〜６２のいずれか一項に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項６５】
前記バイオフィルムが、Ｐｅｌ依存性、Ｐｓｌ依存性、ＰＮＡＧ依存性、及び／又はＧＡＧ依存性バイオフィルムである請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項６６】
前記バイオフィルムが、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.及び／又はFusarium spp.によって引き起こされる請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の留置医療装置又はインプラント。
【請求項６７】
（ｉ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、若しくは（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログ、又はその組み合わせをコードするベクター。
【請求項６８】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項６９】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５４〜３０４又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７０】
前記Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ配列のアミノ酸４３〜２９９又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７１】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３若しくはアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７２】
前記ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質オーソログが、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されているＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７若しくはアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７３】
前記ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されているＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７４】
前記ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されているＰｇａＢ配列のアミノ酸３１０〜６７２若しくはアミノ酸２２〜６７２又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７５】
前記ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されているＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７６】
前記Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質が、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されているＥｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む請求項６７に記載のベクター。
【請求項７７】
前記ベクターが溶菌ファージである請求項６７〜７７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７８】
前記ベクターがマイコウイルスである請求項６７〜７７のいずれか一項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／００８，８３６号に基づく優先権を主張し、該仮出願の内容は参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、グリコシルヒドロラーゼ含有可溶性微生物タンパク質に関する。具体的には、本開示は微生物バイオフィルムの治療及び予防における組成物及び方法並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
微生物バイオフィルム
微生物バイオフィルムの組成物は、株／種及び環境条件の間でさまざまであるが、一般に主な構成成分として、タンパク性のアドヘシン、核酸、及び菌体外多糖を含む（Branda et al 2005, Sutherland 2001a, Vu et al 2009）。菌体外多糖は、多くの微生物の大部分を占めるバイオフィルムマトリックス構成成分であり、バイオフィルム付着、構造、及び耐性に寄与する（Colvin et al 2011, Colvin et al 2012, Ma et al 2009, Ma et al 2006, Mah et al 2003, Matsukawa & Greenberg 2004）。バイオフィルムは、肺上皮細胞又は他の器官などの生物的表面、及び限定されないが、医療装置及びインプラントを含む非生物的表面に形成され、限定されないが、パイプ及び排水設備、水濾過装置、並びに食品接触表面を含む工業的及び商業的環境における生物付着の原因である（Bjarnsholt et al 2013, Kumar & Anand 1998）。慢性のバイオフィルム関連感染症の顕著な特徴は、抗生物質の対する高度な耐性及び宿主免疫系から逃れる能力である（Bjarnsholt 2013, Hoiby et al 2010, Kim et al 2009, Mishra et al 2012, Rybtke et al 2011, Stewart 2003, Stewart & Costerton 2001）。細菌性バイオフィルムの抗生物質及び界面活性剤に対する耐性は、多くの場合、その浮遊するものと比較して１，０００倍高い（Alhede et al 2011, Costerton et al 1987, Costerton et al 1999, Davies 2003）。成熟したバイオフィルムは、栄養素及び老廃物が移動できる高度に複雑な構造を有する（Hall-Stoodley et al 2004, Sutherland 2001b）。バイオフィルムは、多くの病原性細菌種を含む大きな微生物集団を隔離する働きをして、各生物が宿主での生存する力を共生的に利用する（Wolcott et al 2013）。したがって、バイオフィルムを阻害する戦略は、微生物バイオマス全体を減らすという意味合いをもつことになりうる（Bragonzi et al 2012）。
【０００４】
P. aeruginosa及びバイオフィルム形成
感染中、細菌P. aeruginosaは、自由に遊泳する状態から、表面に付着し、マトリックスに埋め込まれたバイオフィルム状態への生活環の変化を経る（図１）。バイオフィルムは抗生物質に対して強い耐性があり、変化する環境に細菌が適応する助けとなるので、バイオフィルムが確立されると、感染症は慢性で且つ治療不可能になる（Colvin et al 2011, Mishra et al 2012, Zegans et al 2012）。ＣＦ患者では、このバイオフィルムは、細菌が肺内に何十年も生き続けることを可能にし（Ma et al 2012, Mann & Wozniak 2012, Starkey et al 2009）、一方創傷では、バイオフィルムは初期コロニー形成及び防御を可能にする。P. aeruginosaバイオフィルムは、主に菌体外多糖；Ｐｓｌ、Ｐｅｌ、及びアルギン酸塩から成る。３種の多糖は全て重要な病原性因子であり、細菌の遺伝的適応の助けとなる（Skurnik et al 2013）。２つの一般的な臨床バイオフィルム形成株、P. aeruginosa  ＰＡ１４及びＰＡＯ１が広く研究されてきた（Hare et al 2012, Kukavica-Ibrulj et al 2008）。ＰＡ１４は世界中で最も多い株（Wiehlmann et al 2007）であり、もともと熱傷分離株中で同定された（Rahme et al 1995）。この株は病原性が強く、Ｐｅｌだけを利用し（Colvin et al 2012）、一方でもう一つの臨床株ＰＡＯ１は、バイオフィルム産生のために主にＰｓｌを利用する中程度に病原性をもつ株（Lee et al 2006）である（Colvin et al 2012）。強制的には、Ｐｓｌの産生が低下した場合ＰＡＯ１はＰｅｌを利用でき（Colvin et al 2012）、宿主中での感染症の維持を可能にする（Byrd et al 2011）。幾つかの最近の研究から、Ｐｅｌ及びＰｓｌはバイオフィルム形成の初期の間に決定的に重要であることが示された。くわえて、ＣＦ患者で示されているように、Ｐｓｌは確立されたバイオフィルムの継続的な維持に重要であることが示されている（Billings et al 2013, Huse et al 2013, Irie et al 2012, Wang et al 2013, Zhao et al 2013）。
【０００５】
Ｐｓｌ多糖
Ｐｓｌは、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、及びＬ−ラムノースの五糖類反復単位から成り、他の既知の多糖と化学的に異なる（図２）。ｐｓｌオペロンは２００４年に発見され（Jackson et al 2004）、１５個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ｐｓｌＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪＫＬＭＮＯから成り、菌体外多糖の生合成に必要な推定タンパク質をコードする。これらのＯＲＦのうち４つ、ｐｓｌＢ、ｐｓｌＭ、ｐｓｌＮ、ｐｓｌＯはＰｓｌ生合成に必要ではない（Byrd et al 2009）。ｐｓｌオペロンは多くのPseudomonas株に存在する（図３）。Ｐｓｌ生合成の最初の初期段階は細胞質で起こるという説が出されており、次いでペリプラズムに移行した後、外膜を通して分泌される（Franklin et al 2011）。
【０００６】
Ｐｓｌは細菌付着のための「分子接着剤」として機能し、非生物的表面及び生物的表面への浮遊又は「自由遊泳」細菌の初期付着に重要である（Byrd et al 2010, Byrd et al 2009, Ma et al 2006）。また、Ｐｓｌは構造安定性及び成熟したバイオフィルムの構造の維持を助ける（Ma et al 2009, Ma et al 2012）。多糖は免疫系に対する保護を与え（Mishra et al 2012）、バイオフィルム発生の初期段階の間、特に多様な標的及び生化学的特性をもつ抗生物質による攻撃に対して防御の最前線である（Billings et al 2013）。例えば、Ｐｓｌ産生バイオフィルムは、P. aeruginosa感染症の治療にクリニックで使用される標準的な抗生物質である、ポリミキシンＢ、トブラマイシン、及びシプロフロキサシンに対する耐性を〜３５〜５０％増加させ、多剤耐性P. aeruginosaに対して最後の手段として用いられる抗生物質の１つであるコリスチンに対する耐性を７５％増加させる（Billings et al 2013）。非Ｐｓｌ産生、抗生物質感受性P. aeruginosa、Escherichia coli、及びStaphylococcus aureusは、Ｐｓｌ含有バイオフィルムに組み入れられることによって抗生物質耐性を獲得する。阻害濃度未満のこれらの抗生物質はさらにバイオフィルム形成を誘導し（Hoffman et al 2005）、感染症を悪化させる。アルギン酸塩が慢性ＣＦ肺感染症の主要な菌体外多糖である一方で、最近のエビデンスから、Ｐｓｌが長期間のコロニー形成（〜４０，０００の細菌発生）の間に同じように重要であることが示唆される（Huse et al 2013）。P. aeruginosa感染症から回復している患者はＰｓｌに対する特異的抗体をもち、Ｐｓｌが感染症の間に臨床的に関連することを示している（Digiandomenico et al 2012）。
【０００７】
Ｐｅｌ多糖
気液界面に形成するバイオフィルムはペリクルと呼ばれる。臨床分離株P. aeruginosa  ＰＡ１４によって形成されるペリクルは７つの遺伝子オペロンｐｅｌＡＢＣＤＥＦＧにコードされ、それらすべてがＰｅｌ依存性バイオフィルム形成に必要である（図４）（Colvin et al 2011, Friedman & Kolter 2004a）。ｐｅｌオペロンは、２００４年にトランスポゾンライブラリ中で最初に発見された（Friedman & Kolter 2004b）。Ｐｅｌ及び結合の化学組成は現在のところわかっていない。その生合成は細胞質で開始されると考えられ、ポリマーはペリプラズムを通る移動に向けて内膜を横切って輸送される。最近の研究から、バイオフィルム形成が生じるには、マルチドメインペリプラズムタンパク質ＰｅｌＡによってＰｅｌ多糖が脱アセチル化又は部分的に脱アセチル化されなければならないことが示唆されている（Colvin et al 2013）。他の株と比較して、P. aeruginosa  ＰＡ１４は付着及び細胞間相互作用に関して主にＰｅｌ多糖を依存する。多糖は細胞間相互作用の維持に決定的に重要であり、バイオフィルム群落のための構造的スキャホールドを形成する（Colvin et al 2011）。またＰｅｌは、広く一般に使用されている抗生物質トブラマイシン及びシプロフロキサシンに対して保護的な役割を担う（Colvin et al 2011）。
【０００８】
グラム陽性及びグラム陰性細菌のＰＮＡＧバイオフィルム
多糖ＰＮＡＧ（図５）は、Staphylococcus epidermidis（Mack et al 1996）、S. aureus（McKenney et al 1999）、E. coli（Wang et al 2004）、Pseudomonas fluorescens（Itoh et al 2005）、Acinetobacter baumannii（Choi et al 2009）、Actinobacillus pleuropneumoniae（Izano et al 2007）、Yersinia pestis（Jarrett et al 2004）、Aggregatibacter actinomycetemcomitans（Izano et al 2008）、Bordetella bronchiseptica（Sloan et al 2007）、Bordetella pertussis（Conover et al 2010）、及びBurkholderia spp.のバイオフィルムに見出されている（Yakandawala et al 2011）。ＰＮＡＧの生合成は、グラム陽性及びグラム陰性細菌においてｉｃａＡＤＢＣ及びｐｇａＡＢＣＤオペロンを必要とする。興味深いことに、ＰＮＡＧの生合成のための標準的な遺伝子座を含まない多種多様な原核病原体及び真核病原体の細胞表面を調べた最近の免疫原性研究から、表面結合ＰＮＡＧの存在が明らかになった（Cywes-Bentley et al 2013）。それには、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus dysgalactiae、Enterococcus faecalis、Listeria monocytogenes、Clostridium difficile、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium smegmatis、Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrheae、nontypable Haemophilus influenzae、Haemophilus ducreyi、Helicobacter pylori、Campylobacter jejuni、Citrobacter rodentium、Salmonella enterica、Candida albicans、Aspergillus flavus、Fusarium solani、Cryptococcus neoformans、Trichomonas vaginalis、Plasmodium berghei、及びPlasmodium falciparum（Cywes-Bentley et al 2013）が含まれた。さらに、ＰＮＡＧに結合するモノクローナル抗体の投与は、多くの病原菌による局所又は全身感染症に対してマウスを保護する補体依存オプソニン食作用又は殺作用を媒介できた（Cywes-Bentley et al 2013）。
【０００９】
ＰＮＡＧ多糖
ＰＮＡＧは、キチンと同様、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンユニットを反復するホモポリマーであるが、ＰＮＡＧはβ（１，６）結合で合成される。成熟した形態のＰＮＡＧは部分的に脱アセチル化され、一般的にｄＰＮＡＧと呼ばれ、多数の細菌においてバイオフィルムの形成に必要とされる（図６）。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の細胞壁構造の違いを考えると、２つの遺伝子座のタンパク質産物の間の配列相同性は、ＩｃａＡとＰｇａＣ、及びＩｃａＢとＰｇａＢのＮ末端ドメインに限られる。ＰｇａＢ、２ドメイン外膜リポプロテイン、及びＩｃａＢ、細胞外単一ドメインタンパク質は、ＰＮＡＧの部分的な脱−Ｎ−アセチル化に必要である（Little et al 2012a, Pokrovskaya et al 2013）。ＰＮＡＧの脱−Ｎ−アセチル化の機能障害はE. coli、S. aureus、及びS. epidermidisにおいてバイオフィルム形成を妨げることが示されている（Cerca et al 2007, Itoh et al 2008, Vuong et al 2004）。
【００１０】
Aspergillus fumigatus及びバイオフィルム形成
Aspergillus fumigatusは病原真菌であり、免疫機能の低下した人で疾患を引き起こす最も一般的なAspergillus種の１つである（Geiser et al 2007）。Aspergillus種はC. albicansに次いで、ヘルスケアの環境における真菌感染の２番目に多い原因である（Ellis et al 2000）。平均的な人は日々、数百個のA. fumigatus分生子（真菌胞子）を吸い込み、気道を通って、肺胞に堆積される。重要なことには、これらの分生子は全空中浮遊真菌分生子の０．１％未満を占める一方で、A. fumigatus分生子はヒトの侵襲性感染症の＞８０％を占める。正常な肺機能をもつ健常人では、分生子は粘液線毛エレベーター（elevator）によって除去されるか、又は肺胞マクロファージによって急速に貪食され、死滅させられ、感染を防ぐ。しかし、免疫機能の低下した人では、これらの分生子は死滅せず、代わりに肺上皮細胞及びマクロファージに付着した後、宿主細菌内に内部移行し、発芽する（Wasylnka et al 2005, Wasylnka & Moore 2002, Wasylnka & Moore 2003）。発芽に続いて、新たに形成した菌糸は宿主の上皮、内皮、及び免疫細胞と密接に結合したままで、結果として炎症及び組織傷害になることがありうる（Gravelat et al 2013, Wasylnka & Moore 2000）。免疫系が完全である、慢性肺疾患をもつ患者では、Aspergillus胞子が発芽して気道又は既存の肺腔にコロニーを作る菌糸を生じるが、組織の中には侵襲しない。Aspergillus感染症のこれらの形態は、持続性の気道の炎症、アレルギー反応、及び肺機能の低下に関連する。侵襲性及び慢性の肺アスペルギルス感染症の両方において、真菌の菌糸は密集した細胞外マトリックス内に見出される（Loussert et al 2010）。バイオフィルム形成及び菌糸の上皮細胞への付着が、菌体外多糖、ガラクトサミノガラクタン（galactosaminogalactan）（ＧＡＧ）によって媒介されることが示されている（Gravelat et al 2013）。Aspergillus属はまた、創傷及び角膜感染症の原因でもある。他のアスペルギルス種及び非Aspergillus属真菌、例えば病原真菌Fusarium、並びに多くの植物病原真菌がＧＡＧを産生する遺伝的能力をもつ。
【００１１】
ガラクトサミノガラクタン（Galactosaminogalactan）（ＧＡＧ）
ガラクトサミノガラクタン（ＧＡＧ）はα１−４結合ガラクトース及びα１−４結合Ｎ−アセチルガラクトサミンから成る混成直鎖細胞外多糖である（Fontaine et al 2011）。菌体外多糖はA. fumigatusによって分泌されてバイオフィルムを形成し、菌糸を封入し、生物的（上皮細胞及びフィブロネクチン）並びに非生物的（ガラス及びプラスチック）表面の両方への付着を可能にする（Gravelat et al 2013）。くわえて、ＧＡＧはA. fumigatus細胞壁の構成成分であり、静置（static）及び気中菌糸の細胞壁の総多糖の〜２％を構成する（Loussert et al 2010）。A. fumigatus発症機序におけるＧＡＧの機能は次の通りである（Gravelat et al 2013）；A. fumigatus菌糸の生物的表面及び非生物的表面への付着を媒介し（Gravelat et al 2013）、免疫抑制体として作用し（Fontaine et al 2011）、菌糸の表面上のβ−グルカン及び他の病原菌関連分子パターン分子を覆い隠すことを通して宿主免疫応答を変化させる（Gravelat et al 2013）。
【００１２】
菌体外多糖生合成に関与する加水分解酵素
セルロース、アルギン酸塩、Ｐｓｌ、Ｐｅｌ、及びＧＡＧ多糖の系を含む、多くの菌体外多糖生合成の機構系は、推定グリコシルヒドロラーゼ又は機能的に特徴付けられたグリコシルヒドロラーゼをコードする。これらの酵素はバイオフィルム形成が起こるのに必要である可能性があるが、この過程の正確な生物学的役割は依然として定かでない。
【００１３】
推定グリコシルヒドロラーゼＰｓｌＧ（Ｐｓｌ多糖系）
ＰｓｌＧはポリマー産生（Byrd et al 2009）に必須であるが、Ｐｓｌの生合成におけるＰｓｌＧの生物学的役割は十分に分かっていない。グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）はアミノ酸配列に基づいてファミリーに分類されている（Davies & Henrissat 1995, Henrissat & Bairoch 1996）。アミノ酸配列同一性に基づいて、糖質関連酵素データベース（ＣＡＺｙ）（Lombard et al 2014）はＰｓｌＧをＧＨ３９ファミリーのメンバーに分類する。興味深いことに、このファミリーの現在の細菌メンバーはすべて、現時点ではβ−キシロシダーゼとして注釈付けられ、一方でヒトメンバーはα−Ｌ−イズロニダーゼとして注釈付けられる。構造はすべて、保存された活性部位を含有するＮ末端の（β／α）８ＴＩＭバレル及びＣ末端のβ−サンドウィッチドメインから成る。触媒作用に関与する２つの触媒グルタミン酸残基をもつ機構を保持することを介して触媒反は起こる（Vocadlo et al 2002）。
【００１４】
マルチドメインタンパク質ＰｅｌＡ（Ｐｅｌ多糖系）
ＰｅｌＡのバイオインフォマティクス解析から、ＰｅｌＡは３つの潜在的な触媒活性をもつマルチドメインペリプラズムタンパク質であることが示された。Ｐｈｙｒｅ２（Kelley & Sternberg 2009）サーバーは、該タンパク質は、残基４７〜３０３を構成する予想ＴＩＭバレルドメイン、残基３０４〜４０９のレダクターゼドメイン、残基５２０〜８００の脱アセチル化酵素ドメイン、及び残基８４０〜９２７のβ−ジェリーロールフォールド構造（Colvin et al 2013）を含む、５つを超える異なるドメイン（図７）を有することを示唆する（Colvin et al 2013）。脱アセチル化酵素ドメインの推定触媒残基の部位特異的突然変異がバイオフィルム形成を妨げたことが以前に示されている（Colvin et al 2013）。ヒドロラーゼドメインの提案されている触媒機能がＰｅｌ生合成に必要か否かはわかっていない。
【００１５】
ＰｇａＢ／ＢｐｓＢはＰＮＡＧ脱アセチル化酵素及び推定グリコシルヒドロラーゼである
バイオインフォマティクス解析から、ＰｇａＢは触媒脱Ｎ−アセチル化ドメイン及び予想炭水化物結合ドメインをもつｐｇａ生合成オペロン中で唯一のペリプラズムタンパク質であることを示す。ＰＮＡＧの脱Ｎ−アセチル化に必須であることは公知であるが、ＰＮＡＧの脱−Ｎ−アセチル化におけるＰｇａＢ  Ｃ末端ドメイン（ＰｇａＢ３１０−６７２）の生物学的役割はごく最近になって究明されてきた（Little et al 2014）。ＰｇａＢ３１０−６７２はＰＮＡＧオリゴマーに結合することが示され、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、及びＰＮＡＧ六量体をもつ複合体の構造と組み合わせた分子動力学シミュレーションから、該ドメインがｄＰＮＡＧに優先的に結合することが示唆される。Bordetella spp.では、ｐｇａＡＢＣＤオペロンはｂｐｓＡＢＣＤとして知られている（図６）（Parise et al 2007）。B. bronchisepticaのＢｐｓＢは、ＰｇａＢ及びＩｃａＢに対してそれぞれ４０％及び２４％の配列同一性を共有する脱アセチル化酵素ドメインを含むことが予想される（Parise et al 2007）。
【００１６】
最近、ＣＡＺｙデータベース（Lombard et al 2014）は、アミノ酸配列同一性に基づいてＢｐｓＢ及びＰｇａＢＣ末端ドメインの両方をＧＨ１３ファミリーのメンバーとして分類した。このＧＨスーパーファミリーは機能的（β／α）８ＴＩＭバレル触媒ドメインを含む（Little et al 2014, Lombard et al 2014）。構造予測サーバーは該タンパク質がファミリーＧＨ１８及びＧＨ２０と高い構造類似性をもつことが示唆する。しかし、ＰＮＡＧオリゴマー及び人工パラニトロフェニル（ｐＮＰ）グリコシド基質を用いてＰｇａＢ３１０−６７２ヒドロラーゼ活性を示すための、これまで及び現在進行中の試みは不成功であることが判明している（Little et al 2012a）。興味深いことに、ＰｇａＢ３１０−６７２とＧＨ１３、ＧＨ１８、及びＧＨ２０ファミリーメンバーとの配列比較及び構造比較から、触媒コンセンサス配列ＡＥＤ、ＤＸＸＤＸＤＸＥ、又はＧＧＤＥがそれぞれ存在しないことを明らかにされる。
【００１７】
微生物バイオフィルムの臨床的及び経済的意義
バイオフィルム関連感染症はすべての慢性、持続性細菌感染症の６５〜８０％を占め、バイオフィルムを伴う感染症及び病態の数は増え続けている（Bjarnsholt et al 2013, Flemming & Wingender 2010）。P. aeruginosa及びその強い抵抗性を示すバイオフィルムの形成は、３つ具体的な領域；熱傷患者、慢性創傷感染症、及び嚢胞性線維症（ＣＦ）において主要な細菌種である。また、他の細菌、限定されないが、S. epidermis、S. aureus、及びE. coliなども、バイオフィルム形成、特に、医療装置関連感染症に大きな影響を与える。産業では、生物付着−非的生物表面上のバイオフィルムに埋まっている微生物の蓄積−は、非生物的表面と生物的表面の間のバイオトランスファー・ポテンシャル（biotransfer potential）に起因して大きな問題であり（Van Houdt & Michiels 2010）、且つ効力（drag）の増加に起因してパイプ及び他の物体中の流量を減少させる（Tian et al 2014）。
【００１８】
Aspergillus fumigatusは病原真菌であり、免疫機能の低下した人で疾患を引き起こす最も一般的なAspergillus種の１つである。重要なことには、A. fumigatus分生子は全空中浮遊真菌分生子の０．１％未満を占める一方で、A. fumigatus分生子はヒトの侵襲性感染症の＞８０％を占める。侵襲性アスペルギルス症は、特に免疫機能の低下した患者では高い罹病率及び死亡率と関連する（Tong et al 2009）。研究調査では、死亡率は、骨髄移植では８０％を超え、肝臓移植を受けた人では９０％、及び白血病又はリンパ腫の患者では４９％と報告されている（Lin et al 2001, Singh 2000）。A. fumigatusは、C. albicansに次いで、入院患者／ヘルスケアの環境で見られる真菌感染の２番目に多い原因である（Ellis et al 2000）。
【００１９】
菌体外多糖産生真菌は重大な植物病原菌である。Botrytis cinereaは、ブドウ、タマネギ、イチゴ、及び観賞切り花を含む２００種を超える顕花植物及び球根を作る植物に影響を及ぼす（Dean et al 2012）。Botrytis感染症に起因する作物の損失及びこれらの損失に対処する殺真菌剤のコストは経済的に大きな問題である。２００１年には、推定５億４千万ユーロがBotrytis感染症のコントロールのみに費やされた（Dean et al 2012）。さらに、殺真菌剤に対する耐性が増え続けている（Bardas et al 2010, Grabke et al 2014, Leroch et al 2013, Rodriguez et al 2014）。他の病原菌も重大な経済的損失の原因となる。Blumeria graminisは小麦及び大麦の重大な病原体である（Dean et al 2012）。一方、Fusarium oxysporumは１００を超える異なる植物宿主に感染でき、トマト、ワタ、メロン、及びバナナなどの作物の重大な損失に関連する（Michielse & Rep 2009）。
【００２０】
細菌及び真菌バイオフィルムに対する治療
バイオフィルム内の微生物が抗菌剤の作用及び宿主防御に耐える能力は非常に大きな課題を提起する。外科的介入（適切な場合）は別として、抗菌剤が唯一の治療の選択肢として残り、保護的なバイオフィルムバリアを透過し、感染を根絶するために長期間投与される。この方法は細菌及び真菌による抗菌耐性の増加の責任を部分的に負うべきである。非致死量の抗菌剤が持続して存在することは感受性を下げることにつながり、それによって、耐性突然変異菌の選択を誘発する（Hoiby et al 2011）。インビトロでも生体内でも、バイオフィルムの進化的変異率はより速く起こることが示されている。さらに、P. aeruginosa感染症の治療に使用された阻害濃度未満の抗生物質はバイオフィルム形成を誘導し、こられの細菌感染への対処不能をさらに深刻にすることが示されている（Hoffman et al 2005）。
【００２１】
酵素治療が細菌性バイオフィルムに対するに対する実行可能な治療選択肢であるという先例がある。１つの例はグリコシルヒドロラーゼＤｓｐＢ又はＤｉｓｐｅｒｓｉｎＢ（登録商標）（米国特許第７，９８９，６０４号Ｂ２）である（Kaplan et al 2004, Manuel et al 2007）。該酵素は、A. actinomycetemcomitansから最初に単離され、数種の病原生物、例えば、限定されないが、E. coli、S. aureus、及びS. epidermidisによって用いられるバイオフィルム菌体外多糖ポリ−β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミンを分解する（ＰＮＡＧ）（Darouiche et al 2009, Donelli et al 2007, Gawande et al 2014, Kaplan et al 2004, Turk et al 2013）。ＤｓｐＢも該酵素のホモログも、A. actinomycetemcomitansのＰＮＡＧ生合成オペロン内に見出されない。P. aeruginosa又はA. fumigatusはＰＮＡＧを産生する遺伝的能力をもたないので、ＤｉｓｐｅｒｓｉｎＢ（登録商標）はこれらの細菌のバイオフィルムを阻害及び分散する能力をもたない。
【発明の概要】
【００２２】
微生物がバイオフィルムを作ることができないことによって、生物的表面及び非生物的表面への付着が減り、抗菌剤（Davies 2003）及び宿主免疫系（Bakkevig et al 2005, Jain & Ohman 1998, Maharaj et al 1993, Monday & Schiller 1996）に対する微生物の感受性が増加する。本発明の発明者は、細菌タンパク質又は真菌タンパク質：ＰｅｌＡ、ＰｓｌＧ、ＢｐｓＢ、ＰｇａＢ、Ｓｐｈ３、Ｅｇａ３、及びそれらのオーソログを含有する可溶性形態のグリコシルヒドロラーゼを外から適用することが微生物バイオフィルム防止及び／又は阻害をもたらすことを示している。よって、発明者らは、バイオフィルムの形成における任意の微生物種の任意の菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターの使用の結果として生じる、形成された微生物バイオフィルムを阻害し且つ分散させるために、該生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターにある任意の可溶性グリコシルヒドロラーゼタンパク質を使用することを提案した。
【００２３】
したがって、１つの態様では、本開示は、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質を投与することを含むバイオフィルム関連感染症を治療又は予防する方法を提供する。また本明細書で提供されるのは、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質の使用である。さらに提供されるのは、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための薬剤の製造における、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質の使用である。さらに一層提供されるのは、バイオフィルム関連感染症の治療又は予防で用いる、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質である。
【００２４】
１つの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログを、それらを必要としている動物又は植物に投与することを含むバイオフィルム関連感染症を治療又は予防する方法を提供する。また提供されるのは、それらを必要としている動物又は植物における、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログの使用である。さらに提供されるのは、それらを必要としている動物又は植物における、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための薬剤を調製する際の、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログの使用である。さらに一層提供されるのは、それらを必要としている動物又は植物における、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防で用いる、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログである。
【００２５】
ある実施形態では、本明細書で開示される方法又は使用は、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又はすべての可溶性タンパク質を含む。
【００２６】
ある実施形態では、本明細書で開示される方法又は使用は、アルギン酸塩及び／又はセルロースなどのバイオフィルムの他の構成成分を分解する他の可溶性タンパク質を投与することをさらに含む。
【００２７】
１つの実施形態では、バイオフィルム関連感染症は動物における創傷又は熱傷後感染の結果でありうる。
【００２８】
１つの実施形態では、バイオフィルム関連感染症は動物における角膜炎の結果でありうる。
【００２９】
別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症は慢性肺疾患をもつ動物における肺感染症の結果でありうる。
【００３０】
別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症は動物における医療装置若しくはインプラント上の又はそれらの微生物汚染の結果でありうる。
【００３１】
別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症は動物における肺感染症でありうる。例としては、免疫機能の低下した宿主の急性疾患である侵襲性アスペルギルス症又は肺機能が低下した免疫機能正常の人に起こる慢性アスペルギルス感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ある実施形態では、グリコシルヒドロラーゼを含む少なくとも１つの可溶性タンパク質は好中球の微生物殺作用を強化する。特定の実施形態では、可溶性タンパク質は本明細書で開示されるＰｅｌＡタンパク質である。
【００３３】
さらに別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症は、動物又は植物において菌体外多糖鞘（sheath）を産生する真菌によって媒介される。ある実施形態では、植物としては果実又は花などの植物材料が挙げられる。
【００３４】
さらに別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症は、いずれの微生物又はその幾つか若しくはすべてが菌体外多糖、Ｐｅｌ、Ｐｓｌ、ＰＮＡＧ、及び／若しくはＧＡＧ並びにそれらの組み合わせを合成する遺伝的能力をもつ微生物の群によって引き起こされうる。それらの生物としては、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、T. asahii、B. cineria、及びFusarium spp.が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、バイオフィルムは、本明細書で開示される可溶性グリコシルヒドロラーゼによって分解できるいずれの菌体外多糖の分泌に依存しうる。
【００３５】
さらに別の実施形態では、本明細書で開示される方法又は使用は抗菌剤をそれらを必要としている動物又は植物に併用投与することをさらに含む。１つの実施形態では、抗菌剤は抗生物質である。別の実施形態では、抗菌剤は抗真菌薬である。さらに別の実施形態では、抗菌剤は植物で用いる殺真菌剤である。
【００３６】
さらなる実施形態では、少なくとも１つの可溶性タンパク質はベクターによって発現されてよく、本明細書で開示される方法又は使用は、それらを必要としている動物又は植物へのベクター使用又は投与を含む。ある実施形態では、ベクターはバイオフィルムの細菌に入り込むことができる溶菌ファージである。別の実施形態では、ベクターはマイコウイルスである。
【００３７】
別の態様では、本開示は、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質で装置を被覆することを含む留置医療装置又はインプラントにおけるバイオフィルム形成を防止する方法を提供する。
【００３８】
１つの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで、それらを必要としている動物に使用する前に、装置を被覆することを含む留置医療装置又はインプラントにおけるバイオフィルム形成を防止する方法を提供する。ある実施形態では、該方法は、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、又はすべての可溶性タンパク質を含む。
【００３９】
留置医療装置又はインプラントは、動物の体内に挿入され、且つバイオフィルム形成の影響を受けやすいいずれの装置又はインプラントであることができる。ある実施形態では、留置医療装置又はインプラントは、カテーテル、静脈内チューブ、生物義装具、例えば、限定されないが心臓弁又は人工関節などである。
【００４０】
ある実施形態では、バイオフィルムは、菌体外多糖、Ｐｅｌ、Ｐｓｌ、ＰＮＡＧ及び／又はＧＡＧ並びにそれらの組み合わせを合成する遺伝的能力をもついずれの微生物（microorganism）又は複数の微生物（microorganisms）によって引き起こされる。それらの生物としては、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Botrytis spp.、Trichosporon spp.、Acinetobacter spp.、及びFusarium spp.が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、バイオフィルムは、本明細書で開示される可溶性グリコシルヒドロラーゼによって分解できるいずれの菌体外多糖の分泌に依存しうる。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本明細書において開示される方法は、留置医療装置又はインプラントに抗菌剤を被覆することをさらに含む。１つの実施形態では、抗菌剤は抗生物質である。別の実施形態では、抗菌剤は抗真菌薬である。
【００４２】
一層さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、バイオフィルムの影響を受けやすい非医療用表面のバイオフィルムを防止又は処理する方法であって、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質を該表面に被覆又は塗布することを含む方法である。
【００４３】
１つの実施形態では、本開示は、バイオフィルム形成の影響を受けやすい非医療用表面のバイオフィルムを防止又は処理する方法であって、少なくとも１つの（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログを、表面に被覆又は塗布することを含む方法を提供する。ある実施形態では、該方法は、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又はすべての可溶性タンパク質を含む。
【００４４】
さらに別の実施形態では、本明細書において開示される方法は、非医療用表面に抗菌剤を被覆又は塗布することをさらに含む。１つの実施形態では、抗菌剤は抗生物質である。別の実施形態では、抗菌剤は抗真菌薬である。
【００４５】
また本明細書で提供されるのは、本明細書において開示される方法によって作製される留置医療装置又はインプラントである。
【００４６】
ある実施形態では、ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されているＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００４７】
ある実施形態では、ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３若しくはアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００４８】
ある実施形態では、ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質オーソログは、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されているＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７若しくはアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７、又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００４９】
ある実施形態では、ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されているＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００５０】
ある実施形態では、ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されているＰｇａＢ配列のアミノ酸３１０〜６７２若しくはアミノ酸２２〜６７２又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００５１】
ある実施形態では、Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されているAspergillus fumigatusのＳｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００５２】
ある実施形態では、Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されているAspergillus clavatus  ＮＲＲＬ  １のＳｐｈ３ＡＣ配列のアミノ酸５４〜３０４又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００５３】
ある実施形態では、Ｓｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されているAspergillus nidulans  ＦＧＳＣ  Ａ４のＳｐｈ３ＡＮ配列のアミノ酸４３〜２９９又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００５４】
ある実施形態では、Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されているAspergillus fumigatusのＥｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【００５５】
一層さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されているＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３若しくはアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されているＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７若しくはアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されているＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されているＰｇａＢのアミノ酸３１０〜６７２から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されているAspergillus clavatus  ＮＲＲＬ  １のＳｐｈ３ＡＣ配列のアミノ酸５４〜３０４から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されているAspergillus nidulans  ＦＧＳＣ  Ａ４のＳｐｈ３ＡＮ配列のアミノ酸４３〜２９９から成る単離タンパク質、及び／又はアクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されているＥｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８から成る単離タンパク質である。
【００５６】
さらに別の態様では、本開示は、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質をコードするベクターを提供する。１つの実施形態では、ベクターは微生物に入り込むことができる。ある実施形態では、ベクターは溶菌ファージである。別の実施形態では、ベクターはマイコウイルスである。
【００５７】
１つの実施形態では、本開示は、（ｉ）本明細書に記載のＰｓｌＧ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）本明細書に記載のＰｅｌＡ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）本明細書に記載のＢｐｓＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）本明細書に記載のＰｇａＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）本明細書に記載のＳｐｈ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又は（ｖｉ）本明細書に記載のＥｇａ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログ、又はそれらの組み合わせをコードするベクターを提供する。ある実施形態では、ベクターは溶菌ファージである。別の実施形態では、ベクターはマイコウイルスである。
【００５８】
さらに別の態様では、本開示は、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質及び薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、薬理学的に許容される担体はポロクサマーなどのゲルである。
【００５９】
１つの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの、少なくとも２の、少なくとも３の、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又はすべての：（ｉ）本明細書に記載のＰｓｌＧ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）本明細書に記載のＰｅｌＡ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）本明細書に記載のＢｐｓＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）本明細書に記載のＰｇａＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）本明細書に記載のＳｐｈ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）本明細書に記載のＥｇａ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログ、及び薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００６０】
以下の詳細な記載から、本開示の他の特徴及び利点が明らかになるであろう。しかし、この詳細な記載から本開示の趣旨と範囲内のさまざまな変更及び修正が当業者に明らかになるので、詳細な記載及び具体的な例が本開示を実施形態を示す一方で、例示としてのみ与えられていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
以下、次の図面に照らして本開示を記載する。
【００６２】
【図１】図１は、微生物バイオフィルムの描写及び構成を示す。バイオフィルムの形成は４つの異なる段階に分けられることができる。浮遊細胞が肺上皮細胞などの生物的表面に付着する。ここで、細菌は生物的又は非生物的表面への付着を可能にする菌体外多糖を分泌し始め、それによってバイオフィルムを引き起こす。
【００６３】
【図２】図２は、Ｐｓｌの化学構造を示す。Ｐｓｌは、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、及びＬ−ラムノースの五糖類反復単位から成り、他の既知の多糖と化学的に異なる。
【００６４】
【図３】図３は、幾つかのP. aeruginosa種のＰｓｌオペロンを示す。ｐｓｌオペロンは多くのPseudomonas種で見出されているが（すべてが図示されているわけではない）、すべての種が菌体外多糖を産生するか否かはわかっていない。P. aeruginosa  ＰＡ１４は、その株中の変異に起因して、Ｐｓｌ多糖を合成できないことが示されている。ＰｓｌＧの位置は種にわたってオペロン内の同じ位置（position）にあり、P. aeruginosa  ＰＡＯ１由来のＰｓｌＧに対するそのアミノ酸配列同一性が示されている。配列同一性はP. aeruginosa  ＰＡＯ１由来のＰｓｌＧに対するアミノ酸配列同一性を指す。
【００６５】
【図４】図４は、幾つかの細菌種のＰｅｌオペロンを示す。ｐｅｌオペロンは、Geobacter metallireducens及びRalstonia solanacearumの種を含む多くの細菌種で見出されている（該オペロンを含有するすべての種がこの図に描かれているわけではない）。ＰｅｌＡは各オペロンの最初の部分に位置する。
【００６６】
【図５】図５は、ポリ−β（１，６）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＰＮＡＧ）の化学構造を示す。ＰＮＡＧは、キチンと同様、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンユニットを反復するホモポリマーであるが、ＰＮＡＧはβ（１，６）結合で合成される。バイオフィルムに存在するＰＮＡＧは、多くの場合、部分的に脱アセチル化されている。該ポリマーのこの形態は一般にｄＰＮＡＧと呼ばれ、医学的に関連する形態である。
【００６７】
【図６】図６は、幾つかのグラム陰性種のＰｇａオペロンを示す。ｐｇａオペロンは多くの細菌種で見出されている。
【００６８】
【図７】図７は、ＰｅｌＡのドメイン境界（boundaries）を示す。各ドメインに関するおおよその境界が、各予想領域の残基の数に比例した相対サイズとともにダイアグラム上に示されている。Ｐｈｙｒｅ２（Kelley & Sternberg 2009）によって予想されるように、以下のドメインがＰｅｌＡのドメイン境界である；ＧＨ（ヒドロラーゼ）、還元酵素、炭水化物脱アセチル化酵素、及び予想される機能をもたない領域、β−ジェリーロール。小さい灰色の長方形は、Ｐｈｙｒｅ２が高信頼度の予想をできなかったか、又は全領域をモデル化できなかったＰｅｌＡ４７−３０３タンパク質の領域を示す。
【００６９】
【図８】図８は、ＰｓｌＧ３１−４４２のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの解析は、タンパク質が＞９５％の純度で、分子量が〜４８ｋＤａであることを示し、精製タンパク質の予想分子量と一致する。
【００７０】
【図９】図９は、ＰｓｌＧ３１−４４２のＸ線結晶構造を示す。（Ａ）酵素はＴＩＭバレルドメイン及びβ−サンドウィッチドメインから成る２ドメイン（two-domain）タンパク質である。（Ｂ）提案されている触媒残基を含有する推定活性部位グルーブは、長さが〜４０オングストロームであり、ＴＩＭバレルドメインをエカトリアルに横切る。
【００７１】
【図１０】図１０は、P. aeruginosa  ＰＡＯ１  ｐＢＡＤｐｓｌ株のＰｓｌバイオフィルムの阻害を示す。誘導可能なＰｓｌ産生を用いた静置P. aeruginosa培養物へのＰｓｌＧ３１−４４２の滴定は、＞１０ｎＭのＰｓｌＧ３１−４４２の添加がＰｓｌバイオフィルム形成を阻害するのに十分であることを示す。また、ＰｓｌＧ３１−４４２  Ｅ１６５Ｑ／Ｅ２７６Ｑ（ＥＣ５０＝４６６．５±１．１ｎＭ）の滴定は、バイオフィルム阻害をもたらしたが、野生型酵素（ＥＣ５０＝４．１±１．１ｎＭ）と比べて著しく高い濃度のタンパク質を必要とする。
【００７２】
【図１１Ａ】図１１は、予め形成されたＰｓｌバイオフィルムの分散を示す。（Ａ）８６ｎＭのＰｓｌＧ３１−４４２の予め形成されたＰｓｌバイオフィルムへの添加は、２０分後にはバイオフィルムの顕著な減少をもたらし、３５分後にはバイオフィルムの完全な消失をもたらした。（Ｂ）５８ｎＭのＰｓｌＧ３１−４４２の添加は、バイオフィルムを３０分で分散できた。ＰｓｌＧ３１−４４２  Ｅ１６５Ｑ／Ｅ２７６Ｑ二重触媒バリアントが、非バリアント酵素（５μＭ）と比べて１００倍過剰に加えられたとき、未処理バイオフィルムと比較して有意差は見られなかった。また、単一酵素触媒バリアントはバイオフィルムを破壊する能力が損なわれた。
【図１１Ｂ】同上。
【００７３】
【図１２】図１２は、ＰｅｌＡ４７−３０３のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの解析は、タンパク質が＞９５％の純度で、分子量が〜２８ｋＤａであることを示し、精製タンパク質の予想分子量と一致する。
【００７４】
【図１３】図１３は、ＰｅｌＡ４７−３０３のＸ線結晶構造を示す。コア構造は、薄い灰色のβシート及び濃い灰色のαヘリックスをもつβ８／α７ＴＩＭバレルフォールドである。コア骨格構造内のエキストラループ挿入を薄い灰色で図示した。（Ａ）ＰｅｌＡ４７−３０３のイラスト表現（cartoon representation）の上面図。（Ｂ）２つの主なグループに集まっているエキストラループを示すＰｅｌＡ４７−３０３イラスト表現側面図。（Ｃ）ＴＩＭバレルのコア構造の８つのβシート及び７つのαヘリックスを詳細に示すトポロジー表現。コア構造内に挿入され、ループ１〜ループ４と名前を付けられた４つのループが存在する。薄い灰色の部分は、以下の推定レダクターゼドメインにつながるＣ末端を示す。N末端及びＣ末端はどちらの末端でもそれぞれＮ及びＣで示される。
【００７５】
【図１４】図１４は、ＰｅｌＡ４７−３０３の推定結合クレフトに一列に並んでいる保存された残基を示す。（Ａ）ＣｏｎＳｕｒｆサーバー（Ashkenazy et al 2010）によって提示されたＰｅｌＡ４７−３０３の保存解析結果。保存バー（bar）が示されている。（Ｂ）ＰｅｌＡ４７−３０３の高度に保存された領域のクローズアップ。高度に保存された酸性残基はタンパク質の推定結合クレフトに１列に並ぶ。空間的な間隔は残基のカルボキシル酸素間で測定され、オングストローム単位で示された。
【００７６】
【図１５】図１５は、ＰｅｌＡ４７−３０３によるＰｅｌバイオフィルム形成の阻害を示す。０．５、１、２、４、８、及び１６μＭの増加する濃度での精製されたＰｅｌＡ４７−３０３及びバリアント。０．５％（重量／体積）でアラビノースを加えてＰｅｌ多糖産生を誘導した。各グラフの最初のバーはバッファーＤを含有し、陽性対照を表わす。結果は各プレートのバッファー対照に対して正規化した。３連の反応を周囲温度で４８時間インキュベーションした。エラーバーは平均値の標準誤差を表わす。
【００７７】
【図１６】図１６は、P. protogens  Ｐｆ−５のＰｅｌＡ３５−２９１によるＰｅｌバイオフィルムの阻害を示す。野生型P. aeruginosa  ＰＡＯ１ΔｗｓｐＦΔｐｓｌＰＢＡＤｐｅｌ静置培養におけるP. protogens  Ｐｆ−５のＰｅｌＡ３５−２９１の滴定。P. protogens  Ｐｆ−５のＰｅｌＡ３５−２９１の添加は≧７０ｎＭでバイオフィルム形成を妨げ、ＥＣ５０は６９．３±１．２ｎＭであった。ＰｓｌＧ３１−４４２はバイオフィルム形成を防止できなかった。この阻害が酵素特異的であることが示される。
【００７８】
【図１７Ａ】図１７は、予め形成されたＰｅｌバイオフィルムの分散を示す。（Ａ）P. aeruginosa  ＰＡＯ１のＰｅｌＡ４７−３０３の予め形成されたＰｅｌバイオフィルムへの添加は２時間後にバイオフィルム分散をもたらし、一方で推定触媒バリアントは大部分のバイオフィルムを保持した。（Ｂ）P. protogens  Ｐｆ−５の野生型ＰｅｌＡ３５−２９１予め形成されたＰｅｌバイオフィルムへの滴定は、わずか３０分ほどでバイオフィルム分散できた。
【図１７Ｂ】同上。
【００７９】
【図１８Ａ】図１８は、ＰｓｌＧ３１−４４２及びＰｅｌＡ４７−３０３をポリスチレンプラスチックに被覆することを通したバイオフィルム阻害を示す。（Ａ）１×ＰＢＳバッファー中４０μｇ／ｍＬのＰｅｌＡ４７−３０３又はＢＳＡを用いた４℃での一晩のポリスチレンプレートの処理。細菌を植え付ける前にウェルを洗った。（Ｂ）共焦点顕微鏡法を用いて可視化したところＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ染色を欠くことから、４０μｇ／ｍＬの吸着ＰｓｌＧ３１−４４２でのポリスチレンスライドの処理は細菌細胞付着及びバイオフィルム形成を防いだ。（Ｃ）ＰｓｌＧ３１−４４２のガラスへの共有結合もまた、バイオフィルム形成を防ぐのに効果的であったが、ＢＳＡ（陰性対照）はバイオフィルム形成を防ぐことができなかった。（Ｄ）可視化してＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ染色を欠くことから、ＰｓｌＧ３１−４４２のガラスへの共有結合は細胞付着及びバイオフィルム形成の防止に少なくとも８日間効果的であった。
【図１８ＢＣＤ】同上。
【００８０】
【図１９】図１９は、ＢｐｓＢ構築物のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの解析は、各タンパク質が＞９５％の純度で、分子量がＢｐｓＢ２７−７０１については〜７９ｋＤａ、ＢｐｓＢ３１８−６７０については〜４２ｋＤａであることを示し、各精製タンパク質の予想分子量と一致する。
【００８１】
【図２０】図２０は、ＢｐｓＢ３１８−６７０の結晶構造を示す。酵素は長さが〜４１オングストローム、幅が１１オングストロームの電子陰性グルーブをもつ（β／α）８ＴＩＭバレルフォールドである。
【００８２】
【図２１】図２１は、ＰｇａＢ３１０−６７２のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの解析は、タンパク質が＞９５％の純度で、ＰｇａＢ３１０−６７２に関して分子量が〜４２ｋＤａであることを示し、精製タンパク質の予想分子量と一致する。
【００８３】
【図２２Ａ】図２２は、ＰＮＡＧ依存性バイオフィルムの阻害を示す。（Ａ）E. coliバイオフィルムの阻害のための、植え付け前に加えられたＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７２の滴定曲線。（Ｂ）Staphylococcus carnosusバイオフィルム形成の阻害に関するＢｐｓＢ３１８−６７０の試験。背景染色はゲンタマイシンで処理したS. carnosusである。
【図２２Ｂ】同上。
【００８４】
【図２３Ａ】図２３は、予め形成されたＰＮＡＧ依存性バイオフィルムの分散を示す。（Ａ）６０分間のインキュベーション後の、前形成されたE. coliバイオフィルムに対する、ＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７２の滴定曲線。（Ｂ）ＢｐｓＢによって媒介されるE. coliバイオフィルム分散に関する異なる９６‐ウェルプレートの試験。（Ｃ）他の既知のバイオフィルム分解酵素、ＰｅｌＡ４７−３０３及びＰｓｌＧ３１−４４２と、ＢｐｓＢによって媒介されるE. coliバイオフィルム分散との比較。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【００８５】
【図２４】図２４は、ｄＰＮＡＧに関する還元糖アッセイを示す。ＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７２は、ｄＰＮＡＧを加水分解する。還元糖アッセイを用いて、ＢｐｓＢ２７−７０１及びＢｐｓＢ３１８−６７０は、ＰｇａＢ２２−６７２／ＰｇａＢ３１０−６７２と比べて〜４倍高い率のｄＰＮＡＧ加水分解を示す。
【００８６】
【図２５Ａ】図２５は、ＰｅｌＡ４７−３０３によるＧＡＧ依存性バイオフィルム形成の阻害を示す。（Ａ）バイオフィルム形成前に、精製ＰｅｌＡ４７−３０３及びバリアントをA. fumigatus培養物に加えた。培養物をブレイン培地中で２０時間増殖させた。（Ｂ）精製P. protogens  ＰｅｌＡ３５−２９１を同様に加え、やはりＧＡＧ依存性バイオフィルム形成を防ぐことが示された。増殖後に存在するＧＡＧバイオフィルムの量クリスタルバイオレット染色を用いて評価した。
【図２５Ｂ】同上。
【００８７】
【図２６】図２６は、グリコシルヒドロラーゼＰｅｌＡ４７−３０３及びその不活性触媒バリアントＥ２１８Ａ並びにＳｐｈ３５２−２９８及びその不活性変異体Ｄ１６６ＡでA. fumigatusの精製ＧＡＧを処理したときの還元糖アッセイの結果を示す。還元末端の増加は、酵素がＧＡＧ多糖のグリコシド結合を加水分解できることを示す。アッセイ条件下で、ＰｅｌＡ４７−３０３はＳｐｈ３５２−２９８と比べて〜２倍多くの還元末端を作ることにつながった。ＰｅｌＡはＰｅｌＡ４７−３０３を指し、Ｓｐｈ３はＳｐｈ３５２−２９８を指す。
【００８８】
【図２７】図２７は、ＰｅｌＡ４７−３０３及びP. protogens  ＰｅｌＡ３５−２９１を用いた予め形成されたＧＡＧバイオフィルムの分散を示す。予め形成されたA. fumigatus  ＧＡＧバイオフィルムへのＰｅｌＡ４７−３０３及びP. protogens  ＰｅｌＡ３５−２９１の外からの添加は、クリスタルバイオレットアッセイを通して見られるように、ＧＡＧバイオフィルムの消失をもたらした。比較すると、ＰｅｌＡ４７−３０３バリアントＤ１６０Ａ及びＥ２１８Ａ並びにＢＳＡ対照はバイオフィルムを分散させなかった。
【００８９】
【図２８】図２８は、ＲａｇＡ６１−３１７及びＧｍＰｅｌＡ２３−２７７を用いた予め形成されたＧＡＧバイオフィルムの分散を示す。予め形成されたA. fumigatus  ＧＡＧバイオフィルムへのＲａｇＡ６１−３１７の添加は、クリスタルバイオレットアッセイを通して見られるように、ＧＡＧバイオフィルムの消失をもたらした。推定グリコシルヒドロラーゼＰｅｌＡ４７−３０３が陽性対照として用いられ、一方でＰｅｌＡ４７−３０３バリアントＥ２１８Ａが陰性対照となった。ＧｍＰｅｌＡ２３−２７７は、クリスタルバイオレットアッセイを通して見られるように、ＰｅｌＡ及びＲａｇＡと比べてＧＡＧバイオフィルムをなくすのに効果的ではなかった。
【００９０】
【図２９】図２９はＰｅｌＡ４７−３０３がA. fumigatus感染症によって引き起こされた傷害から上皮細胞を保護することを示す。野生型ＰｅｌＡ４７−３０３の外からの添加は、クロム放出アッセイによって測定されるように、A. fumigatusが肺上皮細胞傷害を誘発する能力を１６時間にわたって妨げた。一方でＰｅｌＡ４７−３０３  Ｅ２１８Ａは上皮細胞傷害を防がなかった。細胞傷害はクロム放出をもたらし、よって少ない傷害は低い％割合のクロム放出によって視覚化される。
【００９１】
【図３０】図３０は、ＰｅｌＡ４７−３０３の存在下でのＨＬ６０好中球様細胞系の殺菌特性が増強されることを示す。ｐｅｌオペロンを過剰に発現するP. aeruginosaのバイオフィルムを２０時間成長させ、好中球様分化ＨＬ６０細胞と２時間インキュベーションした。P. aeruginosa殺作用は定量的ＣＦＵ平板培養によって評価した。ＰｅｌＡ４７−３０３と好中球の存在は、好中球のみと比べて〜２倍の殺菌作用につながった。
【００９２】
【図３１】図３１は、ＰｅｌＡ４７−３０３を熱可逆性ゲルＰＦ−１２７への封入の結果を示す。１×ＰＢＳ又は２０％  ＰＦ−１２７の添加はＰｅｌ依存性バイオフィルムの分散をもたらさなかったが、３つ異なる濃度でのＰｅｌＡ４７−３０３の添加は１時間でバイオフィルムを分散できた。
【００９３】
【図３２】図３２は、ＰｅｌＡ４７−３０３、ＰｓｌＧ３１−４４２、及びこれらの酵素の併用によるP. aeruginosaの臨床分離株及び環境分離株のバイオフィルム分散の結果を示す。ＰｅｌＡ４７−３０３とＰｓｌＧ３１−４４２の組み合わせは、クリスタルバイオレットアッセイを通して見られるように、バイオフィルムバイオマスの≧９０％の減少をもたらした。クラスＩ（Class I）及びクラスＩＩ株はそれぞれＰｅｌ及びＰｓｌ産生のみに依存している。クラスＩＩＩ株は、マイクロタイターディッシュアッセイにおいてバイオフィルム産生を消失させるのにｐｅｌオペロンとｐｓｌオペロンの両方の変異が必要であるので、重複した菌体外多糖マトリックス産生株である。そして最後に、クラスＩＶ株は、Ｐｅｌ及びＰｓｌの過剰産生を特徴とするバイオフィルムを形成するマトリックス過剰産生株である。
【００９４】
【図３３】図３３は、A. fumigatusの第３染色体上のＧＡＧの生合成に必要な遺伝子のダイアグラムを示す。
【００９５】
【図３４】図３４は、Ｓｐｈ３５２−２９８構築物生成を示す。ＴＭＨＭＭサーバーはアミノ酸２０〜４２が膜貫通領域を構成することを示す。残基５２〜２９８から成る構築物を用いて可溶性タンパク質を生成させた。
【００９６】
【図３５】図３５は、Ｓｐｈ３５２−２９８のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの解析は、タンパク質が＞９５％の純度で、分子量が〜３０ｋＤａであることを示し、精製タンパク質の予想分子量と一致する。
【００９７】
【図３６】図３６は、Ｓｐｈ３を用いた予め形成されたＧＡＧバイオフィルムの分散を示す。Ｓｐｈ３５２−２９８の予め形成されたA. fumigatus  ＧＡＧバイオフィルムへの添加は、クリスタルバイオレットアッセイを通して見られるように、ＧＡＧバイオフィルムの消失をもたらした。推定グリコシルヒドロラーゼＰｅｌＡ４７−３０３が陽性対照として用いられ、一方でＰｅｌＡ４７−３０３バリアントＥ２１８Ａが陰性対照となった。
【００９８】
【図３７】図３７は、異なるAspergillus種のオーソログＳｐｈ３５２−２９８及びＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）がＧＡＧ依存性バイオフィルムを分散できることを示す。推定触媒残基の変異は酵素によるバイオフィルム破壊を妨げる。Ｓｐｈ３ＡＣはＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）を指す。
【００９９】
【図３８】図３８は、複数の臨床分離株の予め形成されたバイオフィルムに対する組換えＳｐｈ３５２−２９８の投与量依存的活性を示す。図に示されたA. fumigatus株のバイオフィルムを２４時間成長させ、次に、図に示された濃度のＳｐｈ３５２−２９８とともに１時間インキュベーションした。バイオフィルムの破壊は、静かに洗った後の残りのバイオフィルム質量のクリスタルバイオレット染色によって測定した。
【０１００】
【図３９】図３９は、日和見感染病原真菌Trichosporon asahiiがＧａｌＮＡｃ特異的レクチンによって認識される菌体外多糖を産生することを示し、T. ashaiiの表面のＧＡＧの存在を示している。この菌体外多糖は、０．５μＭ  Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）での３時間の処理によって分解でき、検出可能な表面ＧａｌＮＡｃの完全な消失をもたらした（右上）。真菌をＤＲＡＱ５で対比染色した（下のパネル）。Ｓｐｈ３ＡＣはＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）を指す。
【０１０１】
【図４０】図４０は、組換えヒドロラーゼが病原菌誘導傷害から気道上皮細胞を保護することを示す。（Ａ）クロムを入れた（loaded）気道上皮細胞株Ａ５４９を、Ａｆ２９４３分生子及び組換えヒドロラーゼとともにインキュベーションした。図に示された時点で、上清に放出されたクロムを測定した。活性のあるヒドロラーゼの存在は、より少ないクロム放出がより少ない結果をもたらした。一方で、酵素バリアントは気道細胞を保護できず、対照に等しいクロムを失った。（Ｂ）P. aeruginosaによる上皮細胞傷害は、Ｓｐｈ３ＡＮ（４３−２９９）の存在及び非存在下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の画分を測定することによって測定した。この結果は、Ｓｐｈ３ＡＮ（４３−２９９）が細菌による傷害の防止に効果的であることを示す。
【０１０２】
【図４１−１】図４１は、ヒドロラーゼは抗真菌薬との併用で、A. fumigatusの代謝活性に対する相乗効果をもつことを示す。さまざまな濃度での、図に示された抗真菌薬及びヒドロラーゼの存在下で、３７℃、５％  ＣＯ２にて、A. fumigatus分生子を２０時間生育させ、その代謝活性をＸＴＴアッセイによって測定した。ＭＩＣ５０は、薬物に曝さなかった試料の代謝活性の５０％をもたらす薬物濃度として定義された。Ｓｐｈ３ＡＣはＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）を指し、Ｓｐｈ３ＡＮはＳｐｈ３ＡＮ（４３−２９９）を指し、且つＳｐｈ３ＡＦはＳｐｈ３５２−２９８を指す。ＮＤ：未決定
【図４１−２】同上。
【図４１−３】同上。
【０１０３】
【図４２】図４２は、グリコシルヒドロラーゼＰｓｌＧ３１−４４２及びＰｅｌＡ４７−３０３は、１００μｇ／ｍＬの最終濃度で投与された抗生物質コリスチンの薬効を高めることができることを示す。ＬＢ寒天プレートでは増殖が観察されず（ＮＧ）、グリコシルヒドロラーゼの存在下では、コリスチンは酵素の不在下と比べて＞１００倍強い細菌殺作用をもたらしたことを示した。
【０１０４】
【図４３】図４３は、Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）によるA. fumigatusを被覆するＧＡＧ菌体外多糖の分解が、真菌細胞に浸透する能力を増強することを通して抗真菌剤の活性を増加することを示す。Ｓｐｈ３ＡＣはＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）を指す。
【０１０５】
【図４４−１】図４４は、バイオインフォマティクス解析を通して同定されたＧＡＧ生合成クラスターを含有する真菌のクラスの分類学的関係を示す。
【図４４−２】同上。
【０１０６】
【図４５】図４５は、ＧａｌＮＡｃ特異的レクチンでのBotrytis cinereaの染色がB. cinereaの表面のＧＡＧの存在を検出することを示す。組換えA. clavatus  Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）でのB. cinereaの菌糸の処理は、この菌体外多糖の完全消失をもたらした。Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）が菌糸の表面のＧＡＧを分解できることを示している。Ｓｐｈ３ＡＣはＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）を指す。
【０１０７】
【図４６】図４６は、Ｅｇａ３４６−３１８のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動された（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。グリコシル化に起因してＥｇａ３４６−３１８の見かけの質量が大きいか否かを決定するために、タンパク質の試料をエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）で処理した。ＥｎｄｏＨで処理したＥｇａ３４６−３１８は、３１ｋＤａで非グリコシル化タンパク質の予想質量に近いバンドを生じた。
【０１０８】
【図４７】図４７は、Ｅｇａ３４６−３１８がA. fumigatusバイオフィルムを阻害し、分散させる能力を示す。（Ａ）Ｅｇａ３４６−３１８の存在は、マイクロタイターディッシュにおいてバイオフィルム形成を妨げ、且つバイオフィルムの破壊を可能にした。（Ｂ）未処理の菌糸はＧａｌＮＡｃ特異的蛍光レクチンＳＢＡ−ＦＩＴＣでの広範囲の染色を示す一方で、０．５μＭ  Ｅｇａ３４６−３１８での菌糸の３時間の処理は表面の検出可能なＧａｌＮＡｃの完全な消失をもたらした。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
本発明の発明者は、菌体外多糖：Ｐｓｌ、Ｐｅｌ、ポリ−β（１，６）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＰＮＡＧ）、及びガラクトサミノガラクタン（ＧＡＧ）の生合成に関与する推定ヒドロラーゼを外からの加えること利用して、バイオフィルム形成にこれらの糖ポリマーを用いる微生物バイオフィルムを阻害し、且つ分散させうることを示した。
【０１１０】
定義
別途定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。以下の定義は当該技術分野での用語を補足し、本開示を対象にするもので、いかなる関連事例又は非関連事例に帰属すべきではない。一般に、本明細書に記載されている、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関して使用される術語体系、並びに分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションの技術は、当該技術分野において周知で、よく使用されているものである。本開示で採用される方法及び技術は全体として、当該技術分野において公知の常法に従って、例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)及びAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)などの一般的な参考文献に記載のように実施された。本明細書に記載のものに類似又は同等のいずれの方法及び材料が本発明の実行に使用できるが、特定の材料及び方法が本明細書に記載されている。
【０１１１】
本明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、複数のものを包含する。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「含むこと（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含むこと（comprising）のいずれの形）、「有すこと（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」などの有すこと（having）のいずれの形）、「含むこと（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」などの含むこと（including）のいずれの形）又は「含有すること（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」などの含有すること（containing）のいずれの）という語は、包括的又は非限定的（inclusive or open-ended）であり、記載されていないさらなる構成要素又は方法工程を除外しない。
【０１１３】
「投与すること」という用語は、薬剤（例えば、治療薬）を動物又は植物に効果的な経路によって供給する又は与えることを意味する。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「バイオフィルム」という用語は、生物的又は非生物的表面に形成される微生物株／種の組成物又はマトリックスを指す。これらの微生物は、一般にタンパク質、核酸、及び菌体外多糖を主要構成成分として含むマトリックスに封入されている。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「バイオフィルム関連感染症」という句は、限定されないが、皮膚の上皮細胞、眼、及び肺及び呼吸器系などの器官、並びに植物の表面及び組織を含む生物的表面のバイオフィルムの形成に関連する感染症を指す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「肺感染症」という用語は、呼吸器感染症又は呼吸器疾患を指し、免疫機能の低下した宿主の急性疾患である侵襲性アスペルギルス症又は肺機能が低下した免疫機能正常の人に起こる慢性アスペルギルス感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「慢性肺疾患」という用語は、呼吸器感染症又は呼吸器疾患を指し、嚢胞性線維症及び肺炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる」という用語は、微生物による菌体外多糖の産生に関与するタンパク質をコードする微生物オペロン又は機能遺伝子クラスターの核酸配列を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「グリコシルヒドロラーゼドメイン」又は「ＧＨドメイン」という用語は、既知のグリコシルヒドロラーゼファミリーメンバーと比較することによって同定されうる、推定グリコシルヒドロラーゼをコードするタンパク質ドメインを指す。グリコシルヒドロラーゼ酵素はグリコシド結合を加水分解できる。
【０１２０】
「単離された」という用語は、組み換えＤＮＡ技術で作られた場合は、細胞物質又は培養培地、又は化学的に合成された場合は化学的前駆体となる化学物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない核酸又はタンパク質を指す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「Ｐｓｌ」という用語は、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、及びＬ−ラムノースの五糖類反復ユニットから成る菌体外多糖を指し、他の既知の多糖と異なる（図２）。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「ｐｓｌＧ」という用語は、Ｐｓｌの生合成のために必要なタンパク質をコードするｐｓｌオペロンの７番目のオープンリーディングフレームを指す。ｐｓｌオペロンは幾つかのPseudomonas種で見出されている。本明細書で使用される場合、「ＰｓｌＧ」という用語は、文脈で明らかなように、コードされているタンパク質を指す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「Ｐｅｌ」という用語は、気液界面に形成するバイオフィルムの主要構成成分の１つである菌体外多糖を指し、ペリクルと呼ばれる。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ｐｅｌＡ」という用語は、Ｐｅｌの生合成のために必要なタンパク質をコードするｐｅｌオペロンの１番目のオープンリーディングフレームを指す。ｐｅｌオペロンは多くのPseudomonas 種で見出されている。ｐｅｌＡオーソログとしては、Ralstonia solanacearumのｒａｇＡ及びGeobacter metallireducensのｐｅｌＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ＰｅｌＡ」又は「ＲａｇＡ」という用語は、文脈で明らかなように、コードされているタンパク質を指す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「ＰＮＡＧ」という用語は、キチンと同様、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンユニットを反復するホモポリマーを指すが、ＰＮＡＧはβ（１，６）結合で合成される。部分的に脱アセチル化された形はｄＰＮＡＧと呼ばれる。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「ｂｐｓＢ」という用語は、ＰＮＡＧ生合成のために必要なタンパク質をコードするｂｐｓオペロンの２番目のオープンリーディングフレームを指す。ｂｐｓオペロンはBordetella種で見出されている。本明細書で使用される場合、「ＢｐｓＢ」という用語は、文脈で明らかなように、コードされているタンパク質を指す。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「ｐｇａＢ」という用語は、ＰＮＡＧ生合成のために必要なタンパク質をコードするｐｇａオペロンの２番目のオープンリーディングフレームを指す。ｐｇａオペロンはE. coli及び多くのグラム陰性種で見出され、ｈｍｓオペロンと注釈を付けられることがある。本明細書で使用される場合、「ＰｇａＢ」という用語は、文脈で明らかなように、コードされているタンパク質を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「ＧＡＧ」という用語は、α１−４結合ガラクトース及びα１−４結合の部分的脱アセチル化Ｎ−アセチルガラクトサミンから成る混成直鎖細胞外ポリマーを指す。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「ｓｐｈ３」という用語は、A. fumigatus  Ａｆ２９３の第３染色体上の機能遺伝子クラスターにあるエクソン染色体配座（coordinate）１，９９９，８７１〜１，９９９，６５４及び１，９９９，５４１〜１，９９９，１８４及び１，９９８，９９１〜１，９９８，６７１をもつエクソンコード配列を指し、推定グリコシルヒドロラーゼをコードする。ｓｐｈ３オーソログとしては、Aspergillus clavatusのｓｐｈ３ＡＣ及びAspergillus nidulansのｓｐｈ３ＡＮが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「Ｓｐｈ３」、「Ｓｐｈ３ＡＣ」、又は「Ｓｐｈ３ＡＮ」という用語は、文脈で明らかなように、それぞれコードされているタンパク質を指す。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「ｅｇａ３」という用語は、A. fumigatus  Ａｆ２９３の第３染色体上の機能遺伝子クラスターに位置するエクソン染色体配座１，９９５，８４３〜１，９９６，７９９をもつエクソンコード配列を指し、推定グリコシルヒドロラーゼをコードする。本明細書で使用される場合、「Ｅｇａ３」という用語は、文脈で明らかなように、それぞれコードされているタンパク質を指す。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「可溶性タンパク質」という用語は、シグナル配列又は膜貫通領域を欠くタンパク質を指し、細胞内でヌクレオチド配列から発現された場合、膜又は他の不溶性構成成分に結合しない。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「抗菌剤」という用語は、微生物を死滅させる、又はその増殖を阻害するいずれの物質を指す。これらの抗菌剤としては、抗生物質、抗微生物ペプチド、化学療法剤、抗真菌剤、殺真菌剤、限定されないが、アルコール、アルデヒド、及び銀などの化学消毒剤、抗微生物ペプチド、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、及びクロルヘキシジン（ＣＨＸ）などの殺生物剤、又は抗微生物活性を示すいずれの天然若しくは組換え薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
「被覆」という用語は、当該技術分野で実際に行われている、タンパク質吸収及び化学架橋結合を通して非特異的に、又は組換え若しくは化学的手段、例えば限定されないが、シュタウディンガーライゲーション反応、「クリック」ケミストリー、発現タンパク質ライゲーション、化学的酵素的方法を通して特異的に、又は表面修飾を通して可溶性タンパク質を固体非生物的支持体に固定化することを指す。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「バイオフィルムの影響を受けやすい表面」という句は、細菌コロニー形成、成長、及びバイオフィルム形成の傾向があるいずれの生物的又は非生物的表面を指す。
【０１３５】
「生物付着」という用語は、バイオフィルムの使用を通した非生物的表面の微生物の付着及び蓄積を指す。
【０１３６】
動物に投与するという文脈での「投与すること」という用語は、当業者に公知のように、例えば、バイオフィルムの軽減又は防止に使用するために、薬剤を動物に投与するいずれの従来の経路として定義される。この例としては、非経口（すなわち、皮下、皮内、筋肉内など）を経る投与、粘膜表面経路を経る投与、又はエアロゾル適用を通した、例えば、動物の気道に投与するためのネブライザーの使用を通した投与が挙げられうる。その他の実施形態では、これは動物への経口投与を含みうる。薬剤の投与量は、動物の健康状態、年齢、体重、及び性別などの要因に応じてさまざまでうる。用法（dosage regime）は至適投与量を提供するよう調整されうる。用法は過度な実験なしに決定及び／又は最適化できることを当業者なら理解するであろう。
【０１３７】
植物の文脈での「投与すること」という用語は、植物の表面に噴霧することによって塗布することとして定義される。また、分泌可能な機能的グリコシルヒドロラーゼを産生する能力を植物がもつように、グリコシルヒドロラーゼをコードする遺伝子をゲノム又は植物中のプラスミドに挿入することも含みうる。
【０１３８】
バイオフィルム形成などの活性を「阻害する」又は「抑制する」又は「低下させる」又は「減少させる」ことは、対象となる条件若しくはパラメーターを除いてそれ以外は同じ条件と比較して、又は代替的に別の条件若しくは対照と比較して機能又は活性を減少させることである。
【０１３９】
バイオフィルムなどを「分散させる」ことは、バイオフィルムの一部であるか、又はバイオフィルムに関連するバイオマス由来資源及びそのマトリックス構成成分を、別の条件又は対照と比較して減少、放出、又は分解させることである。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、哺乳類、好適にはヒトを含む動物界のメンバーすべてを含む。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、顕花植物及び球根形成植物などの、植物界のメンバーすべてを含み、全草及び、植物病原菌のバイオフィルムの形成の影響を受けやすい果実などの植物部位を含む。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「治療又は治療すること」という用語は、有益な又は所望の結果、例えば、臨床成果を得るアプローチを意味する。有益な又は所望の臨床成果としては、検出可能であるか検出不能であるかに関わらず、１つ以上の症状又は病態の緩和又は改善、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の拡大の防止、疾患進行の遅延若しくは緩徐化又は疾患状態の緩和、及び（部分的又は完全な）寛解が挙げられることができるが、これらに限定されない。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「バイオフィルム関連感染症を治療する」という用語は、本明細書において、バイオフィルムに浸透すること又はバイオフィルムを分散させてバイオフィルムバイオマスが減少するか又は損なわれることによって、微生物が免疫系による又は抗微生物剤などの性質が化学的若しくは生物学的な外因性薬剤による攻撃に曝され、脆弱になることを指す。
【０１４４】
本開示の組成物の「治療有効量」、「有効量」、又は「十分量」という用語は、例えばヒトなどの哺乳類を含む動物又は植物に投与されたとき、臨床的な結果を含む有益又は所望の結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」又はそれに対する類語は、それが適用されている文脈に依存する。例えば、バイオフィルム形成を阻害する又はバイオフィルムを分散させるという文脈では、該薬剤を投与することなく得られる反応と比較して、そのような阻害又は分散が達成されるのに十分な薬剤の量である。そのような量に相当することになる所与の薬剤の量は、所与の薬剤、製薬処方、投与経路、病態、疾患、又は障害の種類、治療される動物／植物又は宿主の固有の性質などのさまざまな要因に依存して異なることになるが、それでも当業者によって慣用的に決定できる。本明細書で定義される場合、薬剤の治療有効量は当該技術分野において公知の常法で当業者によって容易に決定されうる。
【０１４５】
そのうえ、薬剤の治療有効量での「治療」又は「防止」レジームは単一投与から構成されてもよく、又は代替的に一連の適用を含んでもよい。例えば、薬剤は少なくとも週に１回投与されうる。しかし、別の実施形態では、薬剤は所与の治療のために週に約１回から１日に約１回以上投与されうる。治療期間の長さは、疾患の重症度、動物又は植物の年齢、薬剤の濃度及び活性、又はそれら組み合わせなどのさまざまな要因に依存する。また、治療又は予防に使用される薬剤の有効投与量は特定の治療または予防レジームの間に増加又は減少しうることが理解されるであろう。投与量の変化が結果的に起こり、当技術分野において公知である標準的な診断検査によって明らかになりうる。場合によっては、長期投与を要することがある。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、天然塩基、糖、及び糖間（主鎖）結合から成るヌクレオチド又はヌクレオシド単量体の配列を指し、一本鎖及び二本鎖分子、ＲＮＡ、並びにＤＮＡを含む。また該用語は、「ペプチド核酸」など、同様に機能する非天然単量体又はその部分を含む改変又は置換オリゴマーを包含し、本明細書では「化学的アナログ」及び／又は「オリゴヌクレオチドアナログ」と呼ばれる。そのような改変又は置換核酸は、ヌクレアーゼの存在下で増強された細胞取込み又は高い安定性などの特性をもつので、天然の形のものより好ましいことがある。また該用語は、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するキメラ核酸を包含する。例えば、キメラ核酸は、有益な特性（例えば、増加したヌクレアーゼ耐性、細胞への増加した取込み）を与える修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含有してもよく、又は本開示の２つ以上の核酸は連結してキメラ核酸を形成してもよい。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「単離核酸分子」という用語は、組み換えＤＮＡ技術で作られた場合は、細胞物質又は培養培地、又は化学的に合成された場合は化学的前駆体となる化学物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を指す。また単離核酸分子は、核酸が由来する核酸（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）に本来隣接する配列を実質的に含まない。「核酸」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むことが意図され、二本鎖又は一本鎖のいずれかであることができ、センス鎖又はアンチセンス鎖を表わす。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、実質的に同じように実質的に同じ機能を果たす、本明細書で開示されている核酸又はアミノ酸配列の変形、置換、付加、誘導体、アナログ、断片、又は化学的等価物を含む。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「そのグリコシルヒドロラーゼバリアント」という用語は、対象となるアミノ酸配列に対して少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％配列同一性をもち、微生物バイオフィルムを阻害するか、又は分散させるように機能するアミノ酸配列を意味する。幾つかの実施形態では、ある特定の触媒残基が維持され、その一方で他の残基が変更される。特に触媒機能に関係する残基としては、実施例に開示される残基が挙げられる。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は、核酸分子によってコードされるアミノ酸残基の配列を指す。本開示の文脈内で、本開示のポリペプチドは、１つの実施形態では、一次タンパク質のさまざまな構造形態を含みうる。例えば、本開示のポリペプチドは、酸性若しくは塩基性塩の形態又は中性の形態で存在してよい。くわえて、個々のアミノ酸残基は酸化又は還元によって改変されてもよい。
【０１５１】
また、本開示のタンパク質及びポリペプチドは、微生物バイオフィルムを阻害する、且つ／又は分散させる能力並びに／又はバイオフィルム形成を防止する能力など、本開示のタンパク質又はポリペプチドと実質的に同じ機能をもつ、本明細書に記載されているタンパク質及びポリペプチドの短縮化、アナログ、ホモログ、及びオーソログを含みうる。
【０１５２】
本明細書に記載されているタンパク質のアナログとしては、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含むアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は保存的又は非保存的な性質をもちうる。保存的アミノ酸置換は、同様の電荷、サイズ、及び／又は疎水性特徴のアミノ酸をもつ本開示のタンパク質の１つ以上のアミノ酸を置換することを含む。保存的置換のみがなされた場合、結果として生じるアナログは機能的に等価物でなければならない。非保存的置換は、異なる電荷、サイズ、及び／又は疎水性特徴をもつ１つ以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列１つ以上のアミノ酸を置換することを含む。
【０１５３】
保存的置換は、例えば、米国特許第５，２６４，５５８号などの特許文献に記載されている。例えば、非極性脂肪族中性アミノ酸、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、及びイソロイシンの間で置換が可能であろうことが予想される。同様に、極性脂肪族中性アミノ酸、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン、及びグルタミンの間で置換がなされる可能性がありうる。荷電した塩基性アミノ酸、リジン及びアルギニンの間の置換がなされうるように、荷電した酸性アミノ酸、アスパラギン酸及びグルタミン酸の間の置換が恐らくなされうる。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシン芳香族アミノ酸の間の置換も恐らく可能であろう。他の置換も可能であろう。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つポリペプチド配列又は２つの核酸配列の間の配列同一性の％割合を指す。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するためには、配列は最適に比較する目的でアラインメントされる（例えば、第二のアミノ酸又は核酸配列とのアラインメントを最適にするために、ギャップを第一のアミノ酸の配列又は核酸配列に導入できる）。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列での位置が、第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、配列に共通の同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一重複位置の数／位置の総数×１００％）。１つの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。また、２つの配列の間の同一性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを用いて遂行できる。２つの配列の比較のために利用された数学的アルゴリズムの随意で非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877にあるように改変された、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセット、例えば、スコア＝１００、文字長（wordlength）＝１２で行って、本開示の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターセット、例えば、スコア＝５０、文字長＝３で行って、本開示のタンパク質分子に相同性のあるアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的のためにギャップを含むアラインメントを得るには、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるように利用できる。代替的に、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが使用されて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行できる（同著者）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）初期パラメーターが使用できる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）。配列の比較のための利用される数学的アルゴリズムの別の随意で非限定的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージに一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ（gap length penalty）１２、及びギャップ長ペナルティ（gap penalty）４が用いられることができる。２つの配列の間の同一性パーセントは、ギャップを許容するか又は許容せずに、上記のものと同様のテクニックを用いて決定できる。同一性パーセントを計算するにあたっては、典型的には完全位一致のみがカウントされる。
【０１５５】
「薬理学的に許容される」という用語は、動物、好適にはヒトの治療に適合性があることを意味する。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「細胞（a cell）」という用語は複数の細胞を包含する。組成物を細胞に投与することは、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo）、及びインビトロ処理を含む。
【０１５７】
方法及び使用
１つの態様では、本開示は、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質を投与することを含むバイオフィルム関連感染症を治療又は予防する方法を提供する。また本明細書で提供されるのは、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質の使用である。さらに提供されるのは、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための薬剤の製造における、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質の使用である。さらに一層提供されるのは、バイオフィルム関連感染症の治療又は予防で用いる、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質である。
【０１５８】
また本開示は、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログを、それらを必要としている動物又は植物に投与することを含むバイオフィルム関連感染症を治療又は予防する方法を提供する。
【０１５９】
また提供されるのは、それらを必要としている動物又は植物における、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログの使用である。さらに提供されるのは、それらを必要としている動物又は植物における、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための薬剤を調製する際の、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログの使用である。さらに一層提供されるのは、それらを必要としている動物又は植物における、バイオフィルム関連感染症の治療又は予防で用いる、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログである。
【０１６０】
ある実施形態では、少なくとも２つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６１】
別の実施形態では、少なくとも３つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６２】
さらに別の実施形態では、少なくとも４つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６３】
さらなる実施形態では、少なくとも５つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６４】
さらに別の実施形態では、（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６５】
１つの実施形態では、ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質及びＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６６】
別の実施形態では、ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質並びにＢｐｓＢ及び／若しくはＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６７】
さらに別の実施形態では、ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質及びＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６８】
さらなる実施形態では、ＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質及びＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１６９】
１つの実施形態では、ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質又はそのオーソログ並びにＢｐｓＢ及び／若しくはＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１７０】
さらに別の実施形態では、ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質又はそのオーソログ及びＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１７１】
さらなる実施形態では、ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質又はそのオーソログ及びＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質又はそのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１７２】
１つの実施形態では、ＢｐｓＢ及び／若しくはＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質並びにＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１７３】
別の実施形態では、ＢｐｓＢ及び／若しくはＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質並びにＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログが投与又は使用されうる。
【０１７４】
バイオフィルム関連感染症は、体表面又は医療インプラント又は生物義装具上にバイオフィルムの層を形成している体内のいずれの微生物感染症でありうる。１つの実施形態では、バイオフィルム関連感染症は、創傷、熱傷後感染、又は角膜炎の結果でありうる。別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症は肺感染症でありうる。そこにおいては動物は慢性肺疾患をもつ。別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症は肺感染症でありうる。そこにおいては動物は侵襲性アスペルギルス症をもつ。別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症は慢性肺疾患に由来しうる。
【０１７５】
ある実施形態では、グリコシルヒドロラーゼを含む少なくとも１つの可溶性タンパク質は好中球の微生物殺作用を強化する。特定の実施形態では、可溶性タンパク質は本明細書で開示されるＰｅｌＡタンパク質である。
【０１７６】
別の実施形態では、植物又は植物部位の表面又は内部にバイオフィルムの層を形成している体内のいずれの微生物感染症でありうる。
【０１７７】
ある実施形態では、バイオフィルム関連感染症は、いずれのＰｅｌ依存性、Ｐｓｌ依存性、ＰＮＡＧ依存性、又はＧＡＧ依存性バイオフィルムによって引き起こされうる。１つの実施形態では、バイオフィルム関連感染症は、菌体外多糖、Ｐｅｌ、Ｐｓｌ、ＰＮＡＧ髄腔内及び／若しくはＧＡＧ並びにそれらの組み合わせを合成する遺伝的能力をもついずれの微生物によって引き起こされうる。それらの生物としては、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.Acinetobacter spp.、Trichosporon asahii、Saccharata proteae、Zopfia rhizophila、Phaeosphaeria nodorum、Setosphaeria turcica、Botrytis cinerea、Cryphonectria parasitica、Melanconium sp.、Verticillium dahlia、Nectria haematococca、Neurospora crassa、Leptosphaeria maculans、Pleomassaria siparia、Cochliobolus heterostrophus、Pyrenophora tritici-repentis、Blumeria graminis、Marssonina brunnea、Sclerotinia sclerotiorum、Taphrina deformans、Cercospora zeae-maydis、及びFusarium spp.が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、バイオフィルムは、本明細書で開示される可溶性グリコシルヒドロラーゼによって分解できるいずれの菌体外多糖の分泌に依存しうる。
【０１７８】
本明細書で開示される可溶性タンパク質はバイオフィルムの分散又は分解をもたらし、他の抗菌薬が微生物感染症にアクセスし、且つ微生物感染症を治療する機会を提供する。したがって、別の実施形態では、バイオフィルム関連感染症を治療又は予防するための方法及び使用は、抗真菌剤又は抗細菌剤などの抗菌薬をそれらを必要としている動物又は植物に併用投与することをさらに含む。１つの実施形態では、抗菌薬は抗生物質である。
【０１７９】
微生物感染症を治療するのに有用な他の薬剤と併用して使用された場合、本明細書で開示される薬剤は好適にそれらの他の薬剤と同時に投与される。本明細書で使用される場合、２つの物質の個々の動物又は植物への「同時投与」又は「併用投与」とは、２つの物質がともに個体中で同時に生体活性があるようにそれらの各々を与えることを意味する。投与の正確な詳細は、２つの物質の互いの存在下での薬物動態学に依存することになり、２つの物質を互いに数時間以内に投与すること又は互いの投与の２４時間以内に１つの物質を投与することでさえ包含できる。好適な用法の設計は当業者にとって通常の日常的なことである。特定の実施形態では、２つの物質は実質的に同時に、すなわち、互いに数分以内に、又は両物質を含む単一組成物で投与されることになる。
【０１８０】
ある実施形態では、少なくとも１つの可溶性タンパク質はベクターによって発現され、ベクターはそれらを必要としている動物又は植物に投与される。
【０１８１】
１つの実施形態では、ベクターはバイオフィルムの細菌に入り込むことができる溶菌ファージである。
【０１８２】
１つの実施形態では、ベクターは真菌バイオフィルムに入り込むことができるマイコウイルスである。
【０１８３】
ある実施形態では、本明細書で開示される方法又は使用は、アルギン酸塩及び／又はセルロースなどのバイオフィルムの他の構成成分を分解する他の可溶性タンパク質を投与することをさらに含む。
【０１８４】
さらに別の態様では、留置医療装置又はインプラントにおけるバイオフィルム形成を防止する方法であって、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質で該装置を被覆することを含む方法が提供される。
【０１８５】
ある実施形態では、留置医療装置又はインプラントにおけるバイオフィルム形成を防止する方法であって、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで、それらを必要としている動物に使用する前に、該装置を被覆することを含む方法が提供される。上記の可溶性タンパク質の特定の組み合わせが装置又はインプラントに被覆されてもよい。
【０１８６】
ある実施形態では、少なくとも２つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが装置又はインプラントに被覆されうる。
【０１８７】
別の実施形態では、少なくとも３つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが装置又はインプラントに被覆されうる。
【０１８８】
さらに別の実施形態では、少なくとも４つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが装置又はインプラントに被覆されうる。
【０１８９】
さらなる実施形態では、少なくとも５つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが装置又はインプラントに被覆されうる。
【０１９０】
さらに別の実施形態では、（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが装置又はインプラントに被覆されうる。
【０１９１】
別の実施形態では、装置又はインプラントは、アルギン酸塩及び／又はセルロースなどのバイオフィルムの他の構成成分を分解する他の可溶性タンパク質でさらに被覆される。
【０１９２】
留置医療装置又はインプラントは、動物の体内に挿入され、その表面がバイオフィルム形成の影響を受けやすいことになるいずれの装置又はインプラントでありうる。ある実施形態では、留置医療装置又はインプラントは、カテーテル、静脈内チューブ、人工関節、又は生物義装具でありうる。
【０１９３】
ある実施形態では、バイオフィルムはいずれのＰｅｌ依存性、Ｐｓｌ依存性、ＰＮＡＧ依存性、及び／若しくはＧＡＧ依存性バイオフィルム、又はいずれのそれらの組み合わせによって引き起こされうる。１つの実施形態では、バイオフィルムは、菌体外多糖、Ｐｅｌ、Ｐｓｌ、ＰＮＡＧ、及び／若しくはＧＡＧ並びにそれらの組み合わせを合成する遺伝的能力をもついずれの微生物又は微生物の群によって引き起こされうる。それらの生物としては、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、及びFusarium spp.が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、バイオフィルムは、本明細書で開示される可溶性グリコシルヒドロラーゼによって分解できるいずれの菌体外多糖の分泌に依存しうる。
【０１９４】
さらに別の実施形態では、明細書において開示される方法は、留置医療装置又はインプラントに抗菌剤を被覆することをさらに含む。１つの実施形態では、抗菌剤は抗生物質である。別の実施形態では、抗菌剤は抗真菌薬である。
【０１９５】
さらに別の態様では、非医療用表面のバイオフィルム形成を処理又は防止する方法であって、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質で該表面を被覆又は塗布することを含む方法が提供される。
【０１９６】
また本明細書で提供されるのは、バイオフィルム形成の影響を受けやすい非医療用表面のバイオフィルム形成を処理又は防止する方法であって、少なくとも１つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで、それらを必要としている動物に使用する前に、該表面を被覆又は塗布することを含む方法である。上記の可溶性タンパク質の特定の組み合わせが非医療用表面に塗布又は被覆されてもよい。
【０１９７】
ある実施形態では、少なくとも２つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが非医療用表面に塗布又は被覆されうる。
【０１９８】
別の実施形態では、少なくとも３つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが非医療用表面に塗布又は被覆されうる。
【０１９９】
さらに別の実施形態では、少なくとも４つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが非医療用表面に塗布又は被覆されうる。
【０２００】
さらなる実施形態では、少なくとも５つの：（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログが非医療用表面に塗布又は被覆されうる。
【０２０１】
さらに別の実施形態では、（ｉ）ＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）ＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）ＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）ＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）Ｓｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｉｖ）Ｅｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログが非医療用表面に塗布又は被覆されうる。
【０２０２】
別の実施形態では、非医療用表面は、アルギン酸塩及び／又はセルロースなどのバイオフィルムの他の構成成分を分解する他の可溶性タンパク質でさらに被覆される。
【０２０３】
非医療用表面を被覆する上記の方法は、生物付着を防止又は破壊するのに使用されうる。そのような非生物的表面としては、蛇口、排水溝、パイプ、水濾過関連装置、及び動物界のメンバー例えば哺乳類、好適にはヒトによる消費のための食品の製造、調製、及び提供に関連する食品接触表面が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
ある実施形態では、バイオフィルムは、バイオフィルム、限定されないが、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkolderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.Acinetobacter spp.、及びFusarium spp.を含む生物と、１つ以上の次の菌体外多糖；Ｐｓｌ、Ｐｅｌ、ＰＮＡＧ、及びＧＡＧを産生する遺伝的能力をもつ微生物又は微生物の群によって引き起こされる。別の実施形態では、バイオフィルムは、本明細書で開示される可溶性グリコシルヒドロラーゼよって分解できるいずれの菌体外多糖を産生する遺伝的能力をもつ微生物又は微生物の群によって引き起こされうる。
【０２０５】
さらに別の実施形態では、本明細書で開示される方法は、抗菌剤を非医療用表面に被覆することをさらに含む。１つの実施形態では、抗菌剤は抗生物質である。別の実施形態では、抗菌剤は抗真菌薬である。
【０２０６】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるＰｓｌＧ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号１１で示される）ＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２０７】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号１２で示される）ＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３又はアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号１３で示される）ＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２０８】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質オーソログは、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号１５で示される）ＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７又はアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号１４で示される）ＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２０９】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されている（又はそれぞれ配列番号１９若しくは１８で示される）ＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２１０】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されている（又はそれぞれ配列番号１７若しくは１６で示される）ＰｇａＢ配列のアミノ酸３１０〜６７２若しくはアミノ酸２２〜６７２又はそれらのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２１１】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号２０で示される）Ｓｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２１２】
ある実施形態では、本明細書で開示されるＳｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号２２で示される）Aspergillus clavatus  ＮＲＲＬ  １のＳｐｈ３ＡＣ配列のアミノ酸５４〜３０４又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２１３】
ある実施形態では、本明細書で開示されるＳｐｈ３  ＧＨドメインオーソログを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号２３で示される）Aspergillus nidulans  ＦＧＳＣ  Ａ４のＳｐｈ３ＡＮ配列のアミノ酸４３〜２９９又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２１４】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質は、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されている（若しくは配列番号２１で示される）Ｅｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８又はそのグリコシルヒドロラーゼバリアントを含む。
【０２１５】
本明細書においてさらに記載されるように、可溶性タンパク質は上記のジェンバンクアクセッション番号を用いて参照されるが、配列表、配列番号：１１〜２３で示されるもの及び上記のものと同じである。
【０２１６】
装置
本発明の発明者らは、プラスチック表面を本明細書で開示される可溶性タンパク質で予め被覆することが、表面にバイオフィルム層を形成する微生物の能力を減少させることを示した。
【０２１７】
したがって、本明細書で提供されるのは、グリコシルヒドロラーゼドメインを含む、細菌タンパク質又は真菌タンパク質などの、菌体外多糖生合成オペロン又は機能遺伝子クラスターによってコードされる少なくとも１つの可溶性微生物タンパク質で被覆された留置医療装置又はインプランである。
【０２１８】
また本明細書で提供されるのは、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又は全ての：（ｉ）本明細書に記載のＰｓｌＧ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）本明細書に記載のＰｅｌＡ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）本明細書に記載のＢｐｓＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）本明細書に記載のＰｇａＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）本明細書に記載のＳｐｈ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）本明細書に記載のＥｇａ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそのオーソログで被覆された留置医療装置又はインプラントである。上記の可溶性タンパク質の特定の組み合わせが装置又はインプラントに被覆されてもよい。
【０２１９】
本明細書で開示される可溶性タンパク質は非特異的タンパク質吸収又は化学的架橋を通して固体担体に固定化されうることを当業者なら理解するであろう。くわえて、当該技術分野で実際に行われているように、限定されないが、シュタウディンガーライゲーション反応、「クリック」ケミストリー、発現タンパク質ライゲーション、化学的酵素的方法、又は表面修飾を含む組換え又は化学的手段を通して可溶性タンパク質が改変されて固体担体への付着が可能になる。
【０２２０】
本明細書で開示される可溶性タンパク質は、ポロクサマー、さまざまな物質組成物のヒドロゲル、例えば、限定されないが、タンパク質ベースヒドロゲル、多糖ベースヒドロゲル、及びＤＮＡベースヒドロゲルなどの合成ポリマーなどの局所的送達法を用いて封入されたり、皮膚又は表面創傷に輸送されたりしうることを当業者なら理解するであろう。他の送達方法としては、ナノ粒子、軟膏、ワセリン、送達に適合する他の水溶液が挙げられる。くわえて、可溶性タンパク質は組換え又は化学的手段を通して改変されて、より高い安定性、浸透性、及び送達組成物との適合性を可能にしうる。
【０２２１】
別の実施形態では、装置又はインプラントは、アルギン酸塩及び／又はセルロースなどのバイオフィルムの他の構成成分を分解する他の可溶性タンパク質でさらに被覆される。
【０２２２】
留置医療装置又はインプラントは、バイオフィルム形成の影響を受けやすい表面をもつと思われる体に導入されうるいずれの医療装置でありうる。１つの実施形態では、留置医療装置又はインプラントはカテーテル又は静脈内チューブである。
【０２２３】
別の実施形態では、留置医療装置又はインプラントは、人工関節又は生物義装具、例えば、限定されないが、心臓弁などである。
【０２２４】
表面に形成されうるバイオフィルムは、Ｐｅｌ依存性、Ｐｓｌ依存性、ＰＮＡＧ依存性バイオフィルム、又はＧＡＧ依存性を形成するいずれの微生物又は微生物の群、例えば、限定されないが、P. aeruginosa、S. aureus、E. coli、S. epidermidis、Y. pestis、B. pertussis、Burkholderia spp.、Candida spp.、Aspergillus spp.、Acinetobacter spp.、及びFusarium spp.などによって引き起こされうる。別の実施形態では、バイオフィルムは、本明細書で開示される可溶性グリコシルヒドロラーゼによって分解できる微生物又は微生物の群によって産生されるいずれの体外多糖の蓄積によって引き起こされうる。
【０２２５】
さらに別の実施形態では、留置医療装置又はインプラントは、装置又はインプラントに被覆された抗菌剤をさらに含む。１つの実施形態では、抗菌剤は抗生物質である。別の実施形態では、抗菌剤は抗真菌薬である。
【０２２６】
組成物
また本明細書で提供されるのは、アクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託されているＰｓｌＧ配列のアミノ酸３１〜４４２から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸４７〜３０３若しくはアクセッション番号ＡＡＹ９２２４４．２でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸３５〜２９１から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＣＡＱ６２２０１．１でジェンバンクに寄託されているＲａｇＡ配列のアミノ酸６１〜３１７若しくはアクセッション番号ＡＢＢ３２１９１．１でジェンバンクに寄託されているＰｅｌＡ配列のアミノ酸２３〜２７７から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託されているＢｐｓＢ配列のアミノ酸３１８〜６７０若しくはアミノ酸２７〜７０１から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＡＡＣ７４１０８．１でジェンバンクに寄託されているＰｇａＢ配列のアミノ酸３１０〜６７２から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１でジェンバンクに寄託されているＳｐｈ３配列のアミノ酸５２〜２９８から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＥＡＷ０９３７９．１でジェンバンクに寄託されているAspergillus clavatus  ＮＲＲＬ  １のＳｐｈ３ＡＣ配列のアミノ酸５４〜３０４から成る単離タンパク質、アクセッション番号ＥＡＡ６３５２３．１でジェンバンクに寄託されているAspergillus nidulans  ＦＧＳＣ  Ａ４のＳｐｈ３ＡＮ配列のアミノ酸４３〜２９９から成る単離タンパク質、及び／又はアクセッション番号ＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託されているＥｇａ３配列のアミノ酸４６〜３１８から成る単離タンパク質である。
【０２２７】
さらに別の態様では、本開示は、少なくとも１つの、少なくとも２の、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、又は６つすべての：（ｉ）本明細書に記載のＰｓｌＧ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）本明細書に記載のＰｅｌＡ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）本明細書に記載のＢｐｓＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）本明細書に記載のＰｇａＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）本明細書に記載のＳｐｈ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、及び（ｖｉ）本明細書に記載のＥｇａ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又はそれらのオーソログ；並びに薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物などの組成物を提供する。上記の可溶性タンパク質の特定の組み合わせは組成物に含まれうる。
【０２２８】
薬剤を含有する組成物は、動物、随意にヒトに投与できる薬理学的に許容される組成物を調製する公知の方法によって調製でき、その結果、有効量の活性剤が薬理学的に許容される媒体との混合物に混合される。好適な媒体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (2003 - 20th edition)及び１９９９年に刊行された米国薬局方：国民医薬品集（ＵＳＰ  ２４  ＮＦ１９）に記載される。これに基づいて、組成物は、他を除外しないが、１つ以上の薬理学的に許容される媒体又は希釈剤を伴った、好適なｐＨをもち、生理液と等張の緩衝化溶液に含有される薬剤の溶液が挙げられる。
【０２２９】
本開示の方法及び使用においては、開示された薬剤、その塩、又はその溶媒和物は、当業者なら理解するであろうように、選ばれた投与経路に依存してさまざまな形態で動物、随意にヒトに投与されうる。例えば、経口投与、非経口投与、口腔投与、舌下投与、鼻内投与、経直腸投与、パッチ、ポンプ、又は経皮（局所）投与、及びそれらに応じて製剤される医薬組成物によって、組成物は投与されうる。非経口投与としては、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、経上皮、鼻内、肺内、髄腔内、経直腸、及び局所の投与方式が挙げられる。非経口投与は選択された期間にわたる持続注入による場合がある。
【０２３０】
１つの実施形態では、薬理学的に許容される担体は、ポロクサマーなどのゲルである。
【０２３１】
薬剤を含有する植物に適した組成物は、植物又は植物部位に投与できる許容可能な組成物を調製するための公知の方法で調製できる。
【０２３２】
薬剤は動物又は植物に単独で投与してもよく、又は上で述べたように、薬理学的に許容される担体及び／若しくは抗生物質などの他の医薬活性薬剤と併用して投与してもよく、その併用の割合は、薬剤の溶解度及び化学的性質、選択投与経路、並びに標準的な薬務決定される。
【０２３３】
薬剤及び／又は組成物の投与量は、薬剤の薬力学的特性、投与方法、被投与動物又は植物の年齢、健康状態、及び重量、症状の性質及び程度、治療の頻度、及び同時治療の種類、及びもしあれば、治療する動物又は植物での組成物のクリアランス率などの多くの要因に依存して変更できる。当業者は上記要因の基づいて適切な投与量を決定できる。薬剤は初めは好適な投与量で投与されてよく、その投与量は臨床的な反応に応じて適宜調節されてよい。短時間、例えば、３０分間〜１時間以上の動物細胞の生体外処理には、動物の長期、生体内治療と比べて高い投与量の薬剤が使用されうる。
【０２３４】
本明細書で開示される可溶性タンパク質は幾通りかの方法のいずれか、例えば、限定されないが、組換え法を用いることによって調製されうる当業者なら理解するであろう。
【０２３５】
したがって、本開示のタンパク質をコードする核酸分子は、タンパク質の良好な発現を確実にする適切な発現ベクターに公知のやり方で組み込まれうる。可能性のある発現ベクターとしては、使用される宿主細胞と適合する限り、コスミド、プラスミド、又は改変ウイルス（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターが「宿主細胞の形質転換に適する」とは、発現ベクターが、本願の核酸分子及び発現用に使用される宿主細菌に基づいて選ばれた制御配列を含有することを意味する。その制御配列は核酸分子に作動可能に連結されている。作動可能に連結とは、核酸が発現可能な方法で制御配列に連結されていることを意味することを意図する。
【０２３６】
したがって、本開示は、本明細書で開示される核酸分子及び、挿入されたタンパク質配列の転写及び翻訳のために必要な制御配列を含有する組換え発現ベクターを企図する。
【０２３７】
好適な制御配列は、細菌遺伝子、真菌遺伝子、ウイルス遺伝子、哺乳類遺伝子、又は昆虫遺伝子を含むさまざまな供給源に由来しうる（例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載の制御配列を参照されたい）。適切な制御配列の選択は下記で議論されるように選ばれる宿主細胞に依存し、当業者によって容易に達成されうる。そのような制御配列の例としては、転写プロモーター及びエンハンサー又はＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が挙げられる。くわえて、選ばれた宿主細胞及び採用されるベクターに応じて、複製起点、さらなるＤＮＡ制限酵素認識部位、エンハンサー、及び転写の誘導能を付与する配列などの他の配列が、発現ベクター組み込まれてもよい。
【０２３８】
また、本開示の組換え発現ベクターは、本願の組み換え分子で形質転換又はトランスフェクションされた宿主細菌の選択を容易にする選択可能マーカー遺伝子を含有してもよい。選択可能マーカー遺伝子の例は、ある特定の薬物に対する耐性を与えるＧ４１８及びハイグロマイシンなどのタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、又は免疫グロブリン若しくはその部分、例えば、免疫グロブリン、随意にＩｇＧのＦｃ部分などをコードする遺伝子である。選択可能マーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、又はホタルルシフェラーゼなどの選択可能マーカータンパク質の濃度の変化によってモニターされる。選択可能マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性などの抗生物質に対する耐性を与えるタンパク質をコードする場合、形質転換体細胞はＧ４１８で選択できる。選択可能マーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生存することになり、一方で他の細胞は死滅する。これによって、本願の組換え発現ベクターの発現の可視化及びアッセイが可能になり、特に、発現及び表現型に対する変異の効果を決定することが可能になる。選択可能マーカーは対象となる核酸とは別のベクターに導入できることが理解されよう。
【０２３９】
また、組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現の増加、組換えタンパク質の溶解度の増加、及びアフィニティー精製におけるリガンドとして機能することによる標的組換えタンパク質の精製の補助をもたらす融合部分をコードする遺伝子を含んでもよい。例えば、タンパク質分解の切断部位が標的組換えタンパク質に加えられて、融合タンパク質の精製に続いて組換えタンパク質を融合部分から分離することを可能にしうる。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡをそれぞれ組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．社、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭａｌ（ニュー・イングランド・バイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州）、及びｐＲＩＴ５（ファルマシア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられる。
【０２４０】
組換え発現ベクターは宿主細菌に導入されて、形質転換された宿主細胞を作ることができる。「で形質転換された（transformed with）」、「でトランスフェクションされた（transfected with）」、「形質転換」、及び「トランスフェクション」という用語は、当技術分野において公知である多くの実行可能な技術の１つによって核酸（例えば、ベクター）を細胞に導入することを包含することを意図する。本明細書で使用される場合、「形質転換された宿主細胞」という用語は、本開示の組換え発現ベクターで形質転換されたグリコシル化可能な細胞を含むことも意図する。原核細胞は例えば、エレクトロポーレーション又は塩化カルシウム媒介形質転換によって核酸で形質転換できる。例えば、核酸は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ‐デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポーレーション、又はマイクロインジェクションなどの従来技術を介して哺乳類細胞に導入できる。宿主細菌を形質転換及びトランスフェクションする好適な方法は、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)及び他の実験教科書に見出すことができる。
【０２４１】
好適な宿主細菌としては幅広い種類の真核宿主細菌及び原核細胞が挙げられる。例えば、本開示のタンパク質は酵母細胞又は哺乳類細胞で発現されうる。他の好適な宿主細菌はGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)に見出すことができる。くわえて、本開示のタンパク質はEscherichia coliなどの原核細胞で発現されうる（Zhang et al., Science 303(5656): 371-3 (2004)）。くわえて、P. fluorescensなどのPseudomonas属に基づく発現系が使用できる（米国特許出願公開第２００５／０１８６６６６号、Schneider, Jane C et al.）。
【０２４２】
したがって、本開示の核酸分子を含む宿主細胞も本明細書で提供される。
【０２４３】
また、本開示のタンパク質をコードする核酸分子は、バイオフィルムに見出される細菌に感染できるファージのゲノムに公知のやり方で組み込まれうる。溶菌ファージとしては、１つ以上の菌体外多糖；Ｐｓｌ、Ｐｅｌ、ＰＮＡＧ、及びＧＡＧを産生できる遺伝的能力をもつ細菌を標的とするものが挙げられる。当業者なら標的細菌に特異的な溶菌ファージを容易に特定及び使用するであろう。
【０２４４】
また、本開示のタンパク質をコードする核酸分子は、ＧＡＧバイオフィルムに見出される真菌に感染できるマイコウイルスのゲノムに公知のやり方で組み込まれうる。当業者なら標的細菌に特異的なマイコウイルスを容易に特定及び使用するであろう。
【０２４５】
したがって、（ｉ）本明細書に記載のＰｓｌＧ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｓｌＧグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉ）本明細書に記載のＰｅｌＡ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｅｌＡ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｉｉ）本明細書に記載のＢｐｓＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＢｐｓＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｉｖ）本明細書に記載のＰｇａＢ  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＰｇａＢ  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、（ｖ）本明細書に記載のＳｐｈ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＳｐｈ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、又は（ｖｉ）本明細書に記載のＥｇａ３  ＧＨ可溶性タンパク質若しくはオーソログなどのＥｇａ３  ＧＨドメインを含む可溶性タンパク質、若しくはそのオーソログ、又はそれらの組み合わせをコードする溶菌ファージ又はマイコウイルスが本明細書で提供される。
【０２４６】
上記開示は全体として本願を記載する。より完全な理解が以下の具体的な例を参照することによって得られることができる。これらの例は例示の目的でのみ記載され、本開示の範囲を限定することを意図しない。状況が得策を示唆又は提供する場合、形態の変更及び等価物の置換が企図される。特有の用語が本明細書で用いられてきたが、そのような用語は記述的な意味を表し、限定する目的のためではない。
【０２４７】
以下の非限定的な例は本開示の例示である。
【実施例】
【０２４８】
実施例１−P. aeruginosa  ＰＡＯ１のＰｓｌＧ３１−４４２は可溶性タンパク質である
方法：
P. aeruginosa  ＰＡＯ１のｐｓｌＧのアミノ酸配列は、２０００年８月にアクセッション番号ＡＡＧ０５６２５．１でジェンバンクに寄託され、公開された（Stover et al 2000）。ＴＭＨＭＭサーバーｖ２．０（Krogh et al 2001）は、Pseudomonas aeruginosa  ＰＡＯ１のＰｓｌＧが触媒ドメインを細胞膜に連結する残基５〜２４の膜貫通ヘリックスをもつことを示す。P. aeruginosaのｐｓｌＧ遺伝子の可溶性タンパク質構築物を得るために、ゲノムＤＮＡをプライマーＧＧＧＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号１）及びＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡ（配列番号２）を用いるＰＣＲによって増幅した。
【０２４９】
E. coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をタンパク質発現ベクターで形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１Ｌのルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で３７℃にて増殖させた。細胞培養物のＯＤ６００が０．４〜０．５に達したとき、温度を１８℃に２０〜３０分間下げ、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度に添加することによってタンパク質発現を誘導した。培養物を誘導後、１８℃で一晩振盪しながらインキュベーションし、次に５，０００×ｇにて２０分間、４℃で遠心分離して採取した。
【０２５０】
細胞ペレットを４０ｍＬのバッファーＡ（２０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％（体積／体積）グリセロール、及び１個のＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤錠剤）に再懸濁し、細胞をＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ社）に１００ＭＰａで少なくとも３回通すことによって溶解した。結果として生じた細胞残屑を、３５，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって可溶性タンパク質から分離した。バッファーＡで予め平衡化した５ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ重力カラム（キアゲン社）に上清を載せた。カラムを３カラムボリューム（ＣＶ）のバッファーＡで洗い、発現したタンパク質を２５０ｍＭ  イミダゾールを補充したバッファーＡで溶出した。溶出画分を集め、４ＬのバッファーＢ（５０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２％（体積／体積）グリセロール）に対して４℃で一晩透析した。タンパク質４ｍｇ当たり１ユニットのトロンビン（ノバジェン社）を用いて２５℃で３時間、タンパク質をインキュベーションすることによってＨｉｓタグを取り除いた。バッファーＡで予め平衡化した５ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ重力カラムで精製することによって、タグのないタンパク質をタグ付きのタンパク質から分離した。タグのないタンパク質を回収し、緩衝液をＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによってバッファーＢに交換した。
【０２５１】
結果：
残基３１〜４４２を含む可溶性ＰｓｌＧ構築物を発現させ、精製した。発現タンパク質は細菌培養物１リットル当たり７ｍｇ生じ、分子量は４６．９ｋＤａである（図８）。タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって＞９５％であると判断された。タンパク質を８〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、沈殿又は分解することなく４℃で１か月を超えて保存できた。
【０２５２】
実施例２−ＰｓｌＧ３１−４４２は、異なる活性部位グルーブをもつ２ドメインタンパク質である
方法：
Ｇｒｙｐｈｏｎロボット（Ａｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ社）を９６ウェルＡｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｔｅｌｌｉ−Ｐｌａｔｅｓ（登録商標）（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）及びＭｉｃｒｏｌｙｔｉｃ社のＭＣＳＧ１−４スパースマトリックススクリーンとともに用いて、初期結晶化試験を８ｍｇ／ｍＬ  ＰｓｌＧ３１−４４２で行った。タンパク質（１μＬ）を１：１の割合で沈殿剤と混ぜ、２０℃でシッティングドロップ蒸気拡散法を用いて６０μＬの沈殿剤に対して平衡化した。４８ウェルＶＤＸプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）中で、等量の沈殿剤（１ｍＭ  ＣｄＣｌ２、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、及び５％（重量／体積）ＰＥＧ３３５０）とともに１μＬのタンパク質を用いて最適結晶を成長させ、１３０μＬの沈殿剤に対して２０℃で平衡化した。ＰｓｌＧ３１−４４２結晶を、２５％（体積／体積）エチレングリコールを補充した沈殿剤溶液中で１０秒間凍結保護した後、液体窒素中でガラス化した。回折データをビームラインＸ２９、国立シンクロトロン光源研究所（National Synchrotron Light Source）（ＮＳＬＳ）で１．０７５オングストロームの波長を用いて１００Ｋにて集めた。０．１６ｍｍコリメーターを使用して、ＡＤＳＣ  Ｑｕａｎｔｕｍ−３１５検出器にて２５０ｍｍの結晶検出器間距離及び１画像当たり０．３秒の露出時間で、合計７２０の０．５°振動の画像を含む高い冗長性（redundancy）３６０°データセットを収集した。ビームを弱め、２°振動の９０の画像を１８０°にわたって収集した。ＨＫＬ２０００を用いて、統合データを積分し、縮小し、及びスケーリングした（Otwinowski & Minor 1997）。ＰｓｌＧ３１−４４２については、Ａｕｔｏｓｏｌｖｅ（Terwilliger & Berendzen 1999）を使用して、カドミウム単一波長分散（ＳＡＤ）法を用いて実験的位相を生じさせた。合計で４つのカドミウム結合部位が見つかり、続いてそれらを使用して密度改変マップ（density-modified map）を作成した。各マップの得られた電子密度は質が高く、ＰＨＥＮＩＸ  ＡｕｔｏＢｕｉｌｄが＞９５％のタンパク質を作ることを可能にした。ＣＯＯＴで残りの残基を手作業で作った（Adams et al 2010, Emsley & Cowtan 2004）。ＰＨＥＮＩＸ．ＲＥＦＩＮＥを用いて精密化を行った（Afonine et al 2010）。ＴＬＳグループをＴＬＳＭＤサーバーの使用を通したＰＨＥＮＩＸでの精密化に加えた（Painter & Merritt 2006）。ＰｙＭＯＬ分子グラフィックシステム（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて構造図を作成した（Dolinsky et al 2007）。
【０２５３】
結果：
Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｚｎ、及びＣｄを含む二価金属イオンの存在下でＰｓｌＧ３１−４４２を結晶化し、１ｍＭ  ＣｄＣｌ２の存在下で成長した結晶で２．０オングストロームに回折データを集めた。該タンパク質は４つのカドミウムイオンと結合し、カドミウムＳＡＤ法を用いて構造を解明することができた。精密化によって、良好な形状及びＲ因子をもつ最終モデルが生み出された。ＰｓｌＧは空間群Ｐ４１２１２に晶出し、非対称ユニットに１つのプロモーターを有した。これは、ＰｓｌＧが溶液中で単量体であることを示す較正分析用サイズ排除カラムと一致する。該酵素は２つドメインを含有する：ＴＩＭバレルモチーフ及びＮ末端からの１つのβ鎖及びタンパク質のＣ末端からの数個のβ鎖から成るβ−サンドウィッチドメイン（図９Ａ）。ＴＩＭバレルフォールドは、既知のタンパク質構造のタンパク質データバンク（ＰＤＢ）中で最もよく見られる酵素フォールドである。このフォールドを含有する既知のすべての酵素のうち１０％と推定されている（Wierenga 2001）。推定活性部位はＴＩＭバレルドメインに位置し、該ドメインをエカトリアルに４０オングストローム横切る（図９Ｂ）。ＰａｔｃｈＤｏｃｋを用いた、Ｐｓｌ多糖の分子ドッキングシミュレーション（Schneidman-Duhovny et al 2005）は、このグルーブが理論的に１２〜１５個の糖ユニットを収容できることを示唆する。ＧＨ３９ファミリーの他のメンバーと一致して、ＴＩＭバレルドメインのみを単離する試みは不成功であった（St John et al 2010）。このことは、β−サンドウィッチが適切なタンパク質フォールド及び／又はタンパク質の安定性に決定的に重要であるという仮説を支持する。
【０２５４】
他のＧＨ３９メンバーとＰｓｌＧのアミノ酸配列及び結晶構造の比較から、２つの酸性残基、Ｇｌｕ１６５及びＧｌｕ２７６が高度に保存されていることが示唆される。ＤａｌｉＬｉｔｅ（Holm et al 2008）を用いた構造アラインメントは、Ｇｌｕ１６５及びＧｌｕ２７６は推定活性部位グルーブの中央に位置し、他のＧＨ３９ファミリーメンバーと同じ位置にあることを示す。ＧＨ３９メンバーであるＸｙｎＢの以前の特徴付けから、反応においてＧｌｕ１６５は酸／塩基であり、一方でＧｌｕ２７６は求核体として機能すると思われることを示唆される（Nieman et al 2003, Vocadlo et al 1998）。グルーブに一列に並ぶアミノ酸は遠縁ホモログでは良く保存されていない。ホモログの多くは、Ｐｓｌと異なる多糖、キシランに対して活性を示す。活性部位に保存がないことから、示唆されるのは、ホモログは特異的なポリマーと結合するように進化的に選択され、且つＰｓｌと結合できずＰｓｌの加水分解を触媒できないと思われることである。
【０２５５】
実施例３−ＰｓｌＧ３１−４４２は静置培養におけるバイオフィルム形成を防止できる
方法：
Ｐｓｌ−アラビノースで誘導可能なP. aeruginosa  ＰＡＯ１  ｐＢＡＤｐｓｌを３７℃にて２００ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖させた。培養物をＬＢで１：１００希釈し、アラビノースを０．５％（重量／体積）の最終濃度で加えてＰｓｌ生合成を誘導した。９５μＬの希釈培養物を滅菌９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート（サーモサイエンティフィック社、カタログ番号２４３６５６）に加えて、さまざまな濃度（１ｎＭ〜１０μＭ）のＰｅｌＡ４７−３０３又はＰｓｌＧ３１−４４２を５μＬの分注量で加え、最終体積を１００μＬとした。次の日、一晩培養したものから１：１００の希釈を用いて新鮮な培養物を調製した。９５μＬの希釈培養物を滅菌９６ウェルポリスチレン丸底マイクロタイタープレートに加えて、さまざまな濃度（２ｎＭ〜５μＭ）のＰｓｌＧ３１−４４２を５μＬの分注量で加え、最終体積を１００μＬとした。培養物を２６℃で２４時間静的にインキュベーションしてバイオフィルム形成をさせた。エッジ効果をなくすため、〜２００μＬの滅菌水をすべての外側ウェルに入れ、プレートをパラフィルムで密封した。インキュベーション後、プレートを脱イオン水で十分に洗うことによって非付着細胞及び培地を除去した。ウェルを１５０μＬの０．１％（重量／体積）クリスタルバイオレットで１０分間染色した後、水で洗い流した。残った色素を２００μＬの９５％（体積／体積）エタノールを加えることによって溶かし、１０分間放置した後、吸光度をモレキュラーデバイス社（サニーベール、カリフォルニア州）のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２を用いて５９５ｎｍで測定した。バイオフィルムの量はクリスタルバイオレットでの染色の吸光度に比例する（Merritt et al 2005）。反応はすべて３連で行い、精製ＰｅｌＡ４７−３０３及びバッファーＢを陰性対照として加えた。細胞増殖が起こらないので、バイオフィルム形成前の２．５ｍｇ／ｍＬのカナマイシンの培養物への添加を陽性対照として用いた。
【０２５６】
結果：
臨床的なＰＡＯ１株と比べて、顕著に多くのＰｓｌを産生するP. aeruginosa  ＰＡＯ１  ｐＢＡＤｐｓｌでは、ＰｓｌＧ３１−４４２の添加は≧５０ｎＭでバイオフィルム形成を防止し、ＥＣ５０が４．１±１．１ｎＭであった（図１０）。効果がＰｓｌＧ活性の直接的な結果か否かを調べるために、二重触媒バリアントＰｓｌＧ３１−４４２  Ｅ１６５Ｑ／Ｅ２７６Ｑを構築して試験した。このバリアントの添加によって、ｐＢＡＤｐｓｌ誘導可能株ではＥＣ５０が＞１００倍増加した（図１０）。１０μＭを超える酵素濃度はＰｓｌ依存性バイオフィルム形成を防いだ。別の推定グリコシルヒドロラーゼであるＰｅｌＡ４７−３０３の添加は、Ｐｓｌバイオフィルム形成を阻害しなかった。バイオフィルム阻害はタンパク質特異的であることを示唆している。くわえて、１０μＭのＰｓｌＧ３１−４４２はＰＡＯ１増殖を防がなかった。バイオフィルムの消失は細菌増殖の混乱に起因しないことを示唆している。理論に拘束されるものではないが、酵素バリアントは多糖に結合する能力を持ち続け、それによって非生物的プレートに付着する細菌の能力を減少させる可能性がある。
【０２５７】
実施例４−ＰｓｌＧ３１−４４２は予め形成されたＰｓｌバイオフィルムを分散できる
方法：
Ｐｓｌを発現している細菌培養物を上述のように植え付け、３７℃にて２００ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖させた。培養物をすべてＬＢで１：１００希釈し、アラビノースを０．５％（重量／体積）の最終濃度で加えてＰｓｌ生合成を誘導した。Ｐｓｌ産生培養物を含む培地を２００μｇ／ｍＬ  アンピシリン及び１００μｇ／ｍＬ  カナマイシンで補充した。培養物を２６℃で２４時間静的にインキュベーションしてバイオフィルム形成を可能にした。インキュベーション後、非付着細胞及び培地はプレートを脱イオン水で３回洗うことによって除去した。ウェルに９５μＬの１００ｍＭ  ナトリウムＨＥＰＥＳバッファー  ｐＨ７．０を入れた後、５μＬのさまざまな濃度（２ｎＭ〜５μＭ）の各加水分解酵素を入れた。回転ニューテーター上で最大６０分間２５℃にて反応を進行させ、その後プレートを脱イオン水で洗うことによって反応を止めた。ウェルを２００μＬの０．１％（重量／体積）クリスタルバイオレットで１０分間染色し、水で３回洗った。Ｐｓｌ培養物のクリスタルバイオレット色素を１００μＬの９５％エタノールで回転しながら１０分間溶かし、その後、吸光度をモレキュラーデバイス社（サニーベール、カリフォルニア州）のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２を用いて５９５ｎｍで測定した。バイオフィルムの量はクリスタルバイオレットでの染色の吸光度に比例する（Merritt et al 2005）。反応はすべて少なくとも３連で行い、１００ｍＭ  ナトリウムＨＥＰＥＳバッファー  ｐＨ７．０を未処理対照として用いた。細胞増殖が起こらないので、バイオフィルム形成前の２．５ｍｇ／ｍＬのカナマイシンの培養物への添加を陽性対照として用いた。
【０２５８】
結果：
８６ｎＭのＰｓｌＧ３１−４４２の添加は３５分でバイオフィルムを分散できた（図１１Ａ）。このことから、試験した条件下ではこれらのバイオフィルムを分散させるのに非常に少量のタンパク質しか必要でないことが示唆される。ＰｓｌＧ３１−４４２  Ｅ１６５Ｑ／Ｅ２７６Ｑ二重触媒バリアントを野生型酵素（５μＭ）に対して１００倍過剰で加えた場合、未処理のバイオフィルム非常に少量のタンパク質しかと比べて有意差は見られなかった（図１１Ｂ）。このことから、これらの残基が触媒作用に決定的に重要であることが示唆される。また、バイオフィルム阻害が触媒活性の真の指標ではないことが示される。ＰｅｌＡ４７−３０３のヒドロラーゼドメインの添加は、Ｐｓｌ依存性バイオフィルムの消失をもたらさなかった。分散がタンパク質特異的であることを示唆している。
【０２５９】
実施例５  −P. aeruginosa  ＰＡＯ１由来のＰｅｌＡ４７−３０３並びにそのオーソログであるＲａｇＡ６１−３１７及びＧｍｅｔＰｅｌＡ２３−２７７は高収量の可溶性タンパク質である。
方法：
P. aeruginosa  ＰＡＯ１のｐｅｌＡのタンパク質配列は、２０００年８月にアクセッション番号ＡＡＧ０６４５２．１でジェンバンクに寄託され、公開された（Stover et al 2000）。ＰＲＥＤ−ＴＡＴサーバー（Bagos et al 2010）は、Pseudomonas aeruginosa  ＰＡＯ１のＰｅｌＡが、タンパク質を細胞質基質からペリプラズムに折りたたまれた状態で移行させることを可能にする残基１〜４５のＴＡＴシグナル配列をもつことを示す。可溶性タンパク質構築物ｐｅｌＡ４７−３０３を得るために、遺伝子（残基４７〜３０３）をP. aeruginosa  ＰＯＡ１のゲノムＤＮＡからプライマーＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＧＧＣＣＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＧ（配列番号３）及びＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＧＧＴＴＧＣＡＣＣＴＣＧＡＣＧＴＣ（配列番号４）を用いるＰＣＲによって増幅した。Ralstonia solanacearumのＲａｇＡの残基６１〜３１７をコードする構築物をプライマーＧＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＣＡＴＴＧＣＣ（配列番号５）及びＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＧＣＧＣＣ（配列番号６）を用いて単離し、Geobacter metallireducensのＰｅｌＡの残基２３−２７７をプライマーＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＡＧＣＧＴＧＧＣＣＴＴＧ（配列番号７）及びＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＣＡＴＡＡＣＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＣＣ（配列番号８）を用いて単離して、細胞質基質にタンパク質を発現するためのシグナル配列を除去した。下線は導入したＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＸｈｏＩ制限酵素認識部位である。各遺伝子をＮ末端のＨｉｓタグをコードするｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社）発現ベクターにライゲーションした。ＰｅｌＡ４７−３０３及びそのオーソログのタンパク質発現は実施例１でＰｓｌＧ３１−４４２について記載したのと同じであった。
【０２６０】
細胞ペレットを４０ｍＬのバッファーＣ（２０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（体積／体積）グリセロール、及び１個のプロテアーゼ錠剤（シグマ社））に再懸濁し、細胞をＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ社）に１００ＭＰａで少なくとも３回通すことによって溶解した。結果として生じた細胞残屑を、３５，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって可溶性タンパク質から分離した。バッファーＣで予め平衡化した５ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ重力カラム（キアゲン社）に上清を載せた。カラムを３カラムボリューム（ＣＶ）のバッファーＡで洗浄し、発現したタンパク質を２５０ｍＭ  イミダゾールを補充したバッファーＡで溶出した。溶出画分を集め、４ＬのバッファーＤ（５０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（体積／体積）グリセロール）に対して４℃で一晩透析した。最少培地でのＰｅｌＡ４７−３０３のセレン−メチオニン誘導体の発現を、以前に記載されたように（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）、Ｂ８３４  Ｍｅｔ−E. coli細胞（ノバジェン社）を用いて実施した。（ＳｅＭｅｔ）で標識したＰｅｌＡ４７−３０３及びバリアントの精製を、野生型酵素に関して記載したように完了した。
【０２６１】
結果：
残基４７〜３０３を含むＰｅｌＡ４７−３０３構築物を発現させ、精製した。発現タンパク質は１リットルの細菌培養物当たり〜５０ｍｇ生じ、分子量は２８．２ｋＤａである（図１２）。タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって＞９５％であると判断された。タンパク質を８〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、沈殿又は分解することなく４℃で１か月を超えて保存できた。比較すると、アミノ酸残基４７〜９４８を含む可溶性全長構築物ＰｅｌＡ４７−９４８は、〜１ｍ／Ｌの細菌培養物しか生じない（Colvin et al 2013）。
【０２６２】
実施例６  −ＰｅｌＡ４７−３０３はβ８／α７ＴＩＭバレル構造をもつ
方法：
精製ＰｅｌＡ４７−３０３を２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、市販の結晶化スクリーニングキット（Ｍｉｃｒｏｌｙｔｉｃ社）を用いてスクリーニングした。広く用いられているハンギングドロップ蒸気拡散法で、ネイティブ結晶をセットアップし、成長させた。結晶を１：２のタンパク質対ウェル溶液比を用いて最適化し、２５％（重量／体積）ＰＥＧ  ＭＭＥ  ５Ｋ及び２０℃でｐＨ７．５のビス−トリスから成る溶液スクリーン（solution screen）で結晶化した。セレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）で標識したＰｅｌＡ４７−３０３を同様にセットアップし、その条件が僅かに高いＰＥＧ濃度（２６％（体積／体積））を含んだことを除いて同じスクリーニング条件で結晶化した。１５％（体積／体積）エチレングリコールを補充した結晶溶液を用いて、結晶を凍結保護した後、液体窒素でガラス化した。ビームラインＸ２９でのデータ収集のために、結晶をＮＳＬＳに送付した。セレンＳＡＤ位相決定にはＰｅｌＡ４７−３０３のセレン部位を用いた。すべてのモデル構築及び精密化を、実施例２で前述したように完了した。
【０２６３】
結果：
P. aeruginosaのＰｅｌＡ４７−３０３を発現させ、精製し、結晶化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から明らかなように最終タンパク質試料を精製して均一にし、１Ｌのルリア−ベルターニ培地から〜４０ｍｇのタンパク質の高い収量を生じた。ネイティブタンパク質結晶及びＳｅＭｅｔタンパク質結晶からそれぞれ１．５オングストローム及び１．９オングストロームにて回折データを収集した。ＳＡＤ法を用いて構造を解明し、１．５オングストロームの最終分解能まで精密化した。良好な精密化統計を含んだ。ＰｅｌＡ４７−３０３は直方晶系空間群Ｐ２１２１２で晶出し、非対称ユニットに１つのプロモーターを有した。構造は、ＰｅｌＡ４７−３０３が合計で１２個のβシート及び９個のαヘリックスを含むＴＩＭバレル様のフォールドをもつことを示す（図１３）。推定活性部位はＴＩＭバレルドメインに位置し、エカトリアルにドメインを横切る深い電子陰性グルーブから成る（図１４）。このグルーブの電気陰性度は、Ｐｅｌが以前に提案されていたように（Colvin et al 2011）負に帯電していないことを示唆する。グルコサミン残基のポリマーのＰａｔｃｈＤｏｃｋを用いた分子ドッキングシミュレーション（Schneidman-Duhovny et al 2005）から、このグルーブが理論的に８個の糖ユニットを収容できることが示唆される。
【０２６４】
ＣＡＺｙｍｅｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＣＡＴ）（Park et al 2010）から、ヒドロラーゼドメイン（残基４７〜３０３）がＧＨファミリー１１４に属することを示唆される。推定触媒グルーブでアミノ酸が高度に保存されていることは非常に重要である。触媒残基は現在のところわかっていないが、反応で求核及び触媒酸／塩基として機能しうる高度に保存された数個の酸性残基が存在する（図１４）。
【０２６５】
実施例７−ＰｅｌＡ４７−３０３及びオーソログは静置培養におけるＰｅｌバイオフィルム形成を防止できる
方法：
Ｐｅｌバイオフィルム形成の阻害を調べる方法は、使用した株がP. aeruginosa  ＰＡＯ１  ΔｗｓｐＦΔｐｓｌｐＢＡＤｐｅｌであることを除いて、実施例３でＰｓｌバイオフィルムについて前述したものと同一である。Ｐｅｌの化学組成は現在のところわかっていない。
【０２６６】
結果：
バイオフィルム形成前に外から加えたＰｅｌＡがＰｅｌ多糖バイオフィルム形成を防止できるか否かを調べるために生体外アッセイを採用した。Ｐｓｌ多糖を産生できないＰｅｌ過剰産生株（ＰＡＯ１ΔｗｓｐＦΔｐｓｌＰＢＡＤｐｅｌ）を全ての実験に用いた。この株は、培養培地にアラビノースを添加すると誘導可能にＰｅｌ多糖を過剰発現できる。５００ｎＭのP. aeruginosa  ＰＯＡ１のＰｅｌＡ４７−３０３の添加はＰｅｌ依存性バイオフィルムの形成を防いだ。比較すると、２つの推定触媒バリアント、Ｄ１６０Ａ及びＥ２１８Ａはこの濃度でバイオフィルム形成を防止できなかった（図１５）。P. protogens  Ｐｆ−５のＰｅｌＡ３５−２９１の添加は、バイオフィルム形成を≧７０ｎＭで防止し、ＥＣ５０が６９．３±１．２ｎＭであった（図１６）。ＰｓｌＧ３１−４４２、別の推定グリコシルヒドロラーゼの添加はＰｅｌバイオフィルム形成を阻害しなかった。バイオフィルム阻害がタンパク質特異的であることが示唆される。理論に拘束されるものではないが、酵素バリアントは多糖に結合する能力を持ち続け、それによって非生物的プレートに付着する細菌の能力を減少させる可能性がある。
【０２６７】
実施例８−ＰｅｌＡ４７−３０３及びそのオーソログは予め形成されたＰｅｌバイオフィルムを分散できる
方法：
予め形成されたＰｅｌバイオフィルムを産生させる方法は、使用した株がP. aeruginosa  ＰＡＯ１  ΔｗｓｐＦΔｐｓｌｐＢＡＤｐｅｌであることを除いて、実施例４で記載したＰｓｌバイオフィルムのものと同一である。
【０２６８】
結果：
ＰｅｌＡ４７−３０３並びに２つの推定触媒バリアントＤ１６０Ａ及びＥ２１８Ａを２つの濃度；１．１４ｍｇ／ｍＬ（３８μＭ）及び０．５７ｍｇ／ｍＬ（１９μＭ）でインキュベーションした。２時間インキュベーションした後、ＰｅｌＡ４７−３０３はＰｅｌバイオフィルムを成功裡に分散させた。一方で、Ｅ２１８Ａバリアントはバッファー対照と同様のバイオフィルムレベルを保持した。Ｄ１６０Ａバリアントは、バッファー対照のように〜５０％のバイオフィルムレベルを保持した（図１７Ａ）。このことから、アミノ酸Ｄ１６０及びＥ２１８が触媒反応に重要であることを示唆する。同様の実験をP. protogens  Ｐｆ−５のＰｅｌＡ３５−２９１を用いて完了し、１μＭの酵素は最短３０分でもバイオフィルムを分散でき、１０倍希釈はほとんどすべてのバイオフィルムを１時間で分散できることを明らかにした（図１７Ｂ）。これは両方の野生型ヒドロラーゼドメインがともに触媒として活性があり、効率良く加えられてバイオフィルムを分散できることを示唆する。
【０２６９】
実施例９−加水分解酵素はプラスチックに予め被覆されてバイオフィルム形成を防止できる
方法：
各ウェルに４０μｇ／ｍＬのＰｅｌＡ４７−３０３又はＰｓｌＧ３１−４４２を含む１００μＬの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を４℃で１２時間浸すことによって、滅菌９６−ウェルポリスチレンプレートを予め被覆した。酵素溶液を取り除き、１００μＬの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５分間加えた後、取り除くことによってウェルを洗った。プレートを３７℃で１時間乾燥させ、使用した。最終濃度が４０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照として使用した。次の日、１：１００希釈したP. aeruginosa  Ｐｓｌ又はＰｅｌアラビノース誘導可能培養物をプレートに植え付けた。吸着又は架橋結合のいずれかによるＰｓｌＧ３１−４４２又はＢＳＡの固定化は、耐蝕性の平板ガラススライド上に均一に薄く（０．１７〜０．２５ｍｍ）行った。まず最初に、ガラス表面をピラニア溶液（Ｈ２ＳＯ４：  Ｈ２Ｏ２、３：１）に３０分間浸けて、いずれの有機物質残渣も除去し、表面をヒドロキシル化することによって活性化し、次に再蒸留水で数回洗い流して残留化学物質残留物を除去した。化学的架橋による固定化については、カバーガラスを３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）溶液（８０％（体積／体積）エタノール中０．０５ｇ／ｍＬ）に室温で２時間浸けるシラン処理によって表面をアミン（ＮＨ２）基で官能基化した。表面を８０％（体積／体積）エタノールで３回洗浄して未反応のＡＰＴＭＳを除去した。静かに撹拌する室温の条件下でＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中の４％グルタルアルデヒドに表面を２時間浸けることによって、ＰｓｌＧ３１−４４２を分子カップリング剤、グルタルアルデヒドを介してアミノ官能基化したガラス表面に連結した。次に混合物を３時間、８０％  エタノールで洗い流して未反応のグルタルアルデヒドを除去した。活性化ガラス又は変性ガラス（ＮＨ２−グルタルアルデヒド）を酵素溶液（８０μｇ／ｍＬ）に浸し、４ｏＣで一晩インキュベーションした。最後に、表面をＰＢＳバッファーで数回洗浄して結合していない酵素を除去した。次の日、１：１００希釈したP. aeruginosa  Ｐｓｌ又はＰｅｌアラビノース誘導可能培養物をプレートに植え付けた。培養物を少なくとも２０時間静的に増殖させ、その後バイオフィルム形成を実施例４で前述したクリスタルバイオレット法又はＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎを用いて測定して細菌を共焦点顕微鏡法を介して可視化した。
【０２７０】
結果：
ＰｅｌＡ４７−３０３でウェルを予め被覆することは、試験した条件下でバイオフィルムを完全に妨げた（図１８Ａ）。くわえて、ＢＳＡで処理したウェルはバイオフィルムを減少させなかった。ＰｅｌＡ４７−３０３での被覆は特異的にP. aeruginosaバイオフィルム形成を標的とし、阻害することが示唆される。また、酵素処理は、共焦点顕微鏡法を用いて可視化された細胞及びバイオフィルム付着を防いだので、ＰｓｌＧ３１−４４２はプラスチックに吸着できた（図１８Ｂ）。また、ＰｓｌＧ３１−４４２はグルタルアルデヒドを用いてガラスに化学的に架橋でき、この処理も細胞付着及びバイオフィルム形成を防止した（図１８Ｃ）。ＢＳＡでの処理は、非特異的なタンパク質被覆はバイオフィルム形成を防ぐのに不十分であることを示した。ＰｓｌＧ３１−４４２と共有結合したガラス表面は少なくとも８日間、バイオフィルム形成を防ぐことができた（図１８Ｄ）。理論に拘束されるものではないが、恐らく他の酵素オーソログもプラスチックに吸着でき、細菌付着及びバイオフィルム形成を防ぐのに使用されうるであろう。
【０２７１】
実施例１０−ＢｐｓＢ及び単離されたそのＣ末端ドメインは安定した可溶性タンパク質である
方法：
B. bronchiseptica  ＲＢ５０のｂｐｓＢのタンパク質配列は、２００８年７月にアクセッション番号ＣＡＥ３２２６５．１でジェンバンクに寄託され、公開された。ＳｉｇｎａｌＰサーバーｖ４．０（Petersen et al 2011）は、B. bronchiseptica  ＲＢ５０のＢｐｓＢが、残基１〜２６のペリプラズムシグナル配列をもつことを示す。可溶性タンパク質作成に関して、残基２７〜７０１を含むｂｐｓＢ遺伝子をゲノムＤＮＡから、隣接するＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位とともにインバースＰＣＲによって増幅し、次に切断して、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグをコードするｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社）発現ベクターにライゲーションした。次に、結果として得たプラスミド、ｐＥＴ２８−ＢｐｓＢ２７−７０１を、ＢｐｓＢのＣ末端ドメイン、残基３１８〜６７０をクローニングするための鋳型として用いて、上記と同様の手順でプラスミドｐＥＴ２８−ＢｐｓＢ３１８−６７０を得た。ＢｐｓＢのタンパク質発現はＰｓｌＧ３１−４４２について記載したのと同じであった。
【０２７２】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを製造業者の取扱説明書に従って用いて活性部位アラニンバリアントを作成し、ＢｐｓＢについて前述したように発現させて、精製した。
【０２７３】
細胞ペレットを４０ｍＬのバッファーＥ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、５％（体積／体積）グリセロール、及び１個のＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤錠剤）に再懸濁した。細胞をＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ社）に１００ＭＰａで３回通すことによって溶解した。３０，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって可溶性タンパク質から不溶性残屑及び細胞残屑を除いた。緩衝液Ｆ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）で予め平衡化した３０ｍＬ重力カラムに充填した４ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（キアゲン社）に上清を載せた。カラムを１０カラムボリューム（ＣＶ）の緩衝液Ｆで洗浄し、発現タンパク質を２００ｍＭ  イミダゾールを補充した緩衝液Ｂで溶出した。溶出画分を集め、１ＬのバッファーＧ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して４℃で一晩透析した。タンパク質４ｍｇ当たり１ユニットのトロンビン（ノバジェン社）を用いて２５℃で２時間、タンパク質をインキュベーションすることによってＨｉｓタグを取り除いた。２回目のＮｉ−ＮＴＡ精製によってタグのないタンパク質をタグつきのタンパク質から分離し、フロースルー及び洗浄画分を回収して濃縮し、バッファーＨ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア）に載せた。
【０２７４】
結果：
残基２７〜７０１を含む全長ＢｐｓＢ（ＢｐｓＢ２７−７０１）及び残基３１８〜６７０を含むＣ末端ヒドロラーゼドメイン構築物（ＢｐｓＢ３１８−６７０）を発現させ、精製した。ＢｐｓＢ２７−７０１タンパク質は、１リットルの細菌培養物当たり〜３０ｍｇ生じ、分子量は７８．５ｋＤａであり（図１９）、一方でＢｐｓＢ３１８−６７０は、１リットルの細菌培養物当たり〜５０ｍｇ生じ、分子量は４２．３ｋＤａである。各タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって＞９５％であると判断された。タンパク質を８〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、沈殿又は分解することなく４℃で１か月を超えて保存できた。
【０２７５】
実施例１１  −ＢｐｓＢ３１８−６７０は異なる電子陰性グルーブをもつ（β／α）８バレルをとる
方法：
精製したＢｐｓＢ３１８−６７０を１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、４８ウェルＶＤＸプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）及びＭＣＳＧ１−４  スパースマトリックススイート（Ｍｉｃｒｏｌｙｔｉｃ社）で結晶化条件に対して２０℃でスクリーニングした。初期結晶化ヒットがMCSG-1スイートの条件#77で得られた。８．６ｍｇ／ｍＬ  ＢｐｓＢ３１８−６７０を、２５０μＬの沈殿剤溶液（０．１  Ｍ  ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ‐トリス（ヒドロキシメチル）メタン（ビス−トリス）ｐＨ６．９、及び１．７  Ｍ  硫酸アンモニウム）に対して平衡化した等量のタンパク質及び沈殿剤を含む３μＬの液滴とともに用いて最適結晶を成長させた。液体窒素中でガラス化する前に、ＢｐｓＢ３１８−６７０結晶を、２５％（体積／体積）エチレングリコールを補充した沈殿剤溶液中で１０秒間凍結保護した。回折データを、ＮＳＬＳでビームラインＸ２９上で１．０７５オングストロームの波長を用いて１００Ｋにて集めた。０．１６ｍｍコリメーターを使用して、ADSC Ｑｕａｎｔｕｍ−３１５ｒ検出器にて２２０ｍｍの結晶検出器間距離及び１画像当たり０．４秒の露出時間で、１．０°振動の３６０°データセットを収集した。ビームを弱め、２°振動の９０の画像を１８０°にわたって収集した。ＡｕｔｏＭＲを使用して、ＰｇａＢ残基３１０〜６４６との分子置換を通して位相情報を得た（ＰＤＢ  ４Ｆ９Ｄ）。
【０２７６】
結果：
ＢｐｓＢ３１８−６７０は空間群Ｐ２１で結晶化し、回折データを１．７６オングストローム分解能で集めた。構造を分子置換法を用いて解明し、精密化は良好な形状及びＲ因子をもつ非対称ユニットに２分子を含有する最終モデルを生み出した。分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって、ＢｐｓＢ３１８−６７０が溶液中で単量体であることを示される。ＢｐｓＢ３１８−６７０は、グリコシルヒドロラーゼではよく見られる（β／α）８バレルフォールドをとり（図２０）、既知のタンパク質構造のタンパク質データバンク（ＰＤＢ）中で最もよく見られる酵素フォールドである。推定活性部位は（β／α）８バレルの上部でグルーブ内に位置し、長さが４１オングストロームで、幅が１１オングストロームである（図２０）。ＢｐｓＢ３１８−６７０及びＰＮＡＧのＰａｔｃｈＤｏｃｋを用いた分子ドッキングシミュレーション（Schneidman-Duhovny et al 2005）は、このグルーブが理論的に１０〜１２個の糖ユニットを収容できることを示唆する。
【０２７７】
ＢｐｓＢ３１８−６７０のアミノ酸配列及び結晶構造の他のＧＨ１３、ＧＨ１８、及びＧＨ２０メンバーとの比較から、ＢｐｓＢ３１８−６７０が標準的な触媒配列モチーフを含有しないことが示唆される。ＤａｌｉＬｉｔｅ（Holm et al 2008）を用いた構造アラインメントは、Ｈｉｓ４７３及びＡｓｐ４７４は推定活性部位グルーブの中央に位置し、ＧＨ１３、ＧＨ１８、及びＧＨ２０ファミリーメンバーの触媒Ａｓｐ及びＧｌｕ残基と同じ位置にあることを示す。このことから、ＢｐｓＢ及びＰｇａＢがｄＰＮＡＧ加水分解の新規メカニズムを提示しうるか、ユニークなＧＨファミリーに属することが示唆される。菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
【０２７８】
実施例１２−ＰｇａＢのＣ末端ドメインは安定な可溶性タンパク質である
方法：
プラスミドｐＥＴ２８−ＰｇａＢ２２−６７２（Little et al 2012a, Little et al 2012b）を鋳型として用い、ｐｇａＢ特異的プライマーを設計して、インバースＰＣＲを用いて残基遺伝子断片に隣接するＮｄｅＩ及びＸｈｏＩサイトとともに３１０〜６７２をｐＥＴ２８ａ発現ベクター（ノバジェン社）にサブクローニングした。結果として得たプラスミドｐＥＴ２８−ＰｇａＢ３１０−６７２は、トロンビンで切断可能なヘキサヒスチジンタグをもつＰｇａＢのＣ末端ドメインをコードする。精製中はグリセロールを溶解バッファーにのみ含みという修正を加えて、以前に記載されたように（Little et al 2012a, Little et al 2012b）、ＰｇａＢ３１０−６７２を発現させ、精製した。
【０２７９】
結果：
残基２２〜６７２を含むＰｇａＢ（ＰｇａＢ２２−６７２）を作成する方法は以前に記載されている（Little et al 2012a、Little et al 2012b）。本明細書において、ＰｇａＢの残基３１０〜６７２を含むＣ末端ヒドロラーゼドメイン構築物（ＰｇａＢ３１０−６７２）を発現させ、精製した。〜１０ｍ／Ｌの細菌培養物のＰｇａＢ３１０−６７２の収量が得られた。タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって＞９５％であると判断された（図２１）。タンパク質は８〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮できたが、沈殿及び分解最小限にするために０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬで４℃にて２週間保存した。
【０２８０】
実施例１３−ＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７２は静置培養においてバイオフィルム形成を防止できる
方法：
ＰＮＡＧバイオフィルムを阻害する方法は実施例３に記載のＰｓｌバイオフィルムのものと同じである。簡潔に、ＰＮＡＧ過剰産生E. coli又はS. carnosusを３７℃で一晩、２００μｇ／ｍＬ  アンピシリン及び１００μｇ／ｍＬ  カナマイシン、並びに１０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンをそれぞれ補充したＬＢ培地中で２００ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。一晩培養したものから、E. coliにはＬＢ培地、S. carnosusにはトリプチックソイブロスを用いて１：１００の希釈で抗生物質を含む新鮮な培養物を調製した。９５μＬの希釈培養物を滅菌９６ウェルポリスチレン丸底マイクロタイタープレートに加えて、さまざまな濃度（２ｎＭ〜５μＭ）のタンパク質を５μＬの分注量で加え、１００μＬの最終体積を得た。培養物を、E. coliについては２６℃で、S. carnosusについては３７℃で２４時間静的にインキュベーションしてバイオフィルム形成させた。エッジ効果をなくすために、〜２００μＬの滅菌水をすべての外側ウェルに入れ、プレートをパラフィルムで密封した。インキュベーション後、プレートを脱イオン水で３回洗うことによって非付着細胞及び培地を取り除いた。ウェルを１５０μＬの０．１％（重量／体積）クリスタルバイオレットで１０分間染色した後、水で３回洗った。残った色素を１００μＬの３３％（体積／体積）酢酸で１０分間回転しながら溶かし、その後、吸光度をモレキュラーデバイス社（サニーベール、カリフォルニア州）のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２を用いて５９５ｎｍで測定した。バイオフィルムの量はクリスタルバイオレットでの染色の吸光度に比例する（Merritt et al 2005）。反応はすべて少なくとも３連で行い、バッファーＧを未処理対照として加えた。E. coli  ｐｇａＡＢＣＤノックアウト株（ＤＰＧＡ）又はゲンタマイシンで処理したS. carnosusのいずれかを背景染色用の対照として用いた。
【０２８１】
結果：
抗生物質の添加で活性化できるE. coli及びS. carnosusの過剰産生ＰＮＡＧ株を用いた。ＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７０のE. coli培養物への添加はバイオフィルム形成を防止し、ＥＣ５０値がそれぞれ〜４０ｎＭ、〜６０ｎＭ、〜９０ｎＭ、及び〜２３０ｎＭであった（図２２Ａ）。ＰＮＡＧ依存性S. carnosusバイオフィルムに関するバイオフィルム阻害の予備試験は、ＢｐｓＢ３１８−６７０はバイオフィルム形成を５μＭで阻害することを示す（図２２Ｂ）。
【０２８２】
実施例１４−ＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７２は予め形成されたＰＮＡＧ依存性バイオフィルムを分散できる
方法：
以下の異なる点を除いて、ＰＮＡＧ依存性バイオフィルムを形成する方法は、実施例４で記載したＰｓｌのものと同様の方法を利用する。ＰＮＡＧ過剰産生E. coliは３７℃で一晩、２００ｕｇ／ｍＬ  アンピシリン及び１００ｕｇ／ｍＬ  カナマイシンを補充したＬＢ培地中で、２００ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。E. coli  ｐｇａＡＢＣＤノックアウト株を背景染色用の非バイオフィルム形成対照として用いた。異なる製造業者プレートを試験するために、ヌンク社及びザルスタット社の両社の滅菌９６ウェルポリスチレン丸底マイクロタイタープレートを用いて実験を行った。
【０２８３】
結果：
ＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７２が予め形成されたＰＮＡＧバイオフィルムを分解できるか否かを調べるために、E. coliバイオフィルムを一晩増殖させた後、酵素を加えた。酵素反応の触媒反応速度は基質の量及び加えた酵素の量の両方に依存する。したがって、バイオフィルム質量の実験間の変動に留意することが重要である。ＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７２の、６０分間、平均開始ＯＤ５９５が０．５の予め形成されたバイオフィルムへの添加は、バイオフィルムを分解し、ＥＣ５０値がそれぞれ￣１７０ｎＭ、￣９０ｎＭ、＞１０００ｎＭ、及び２００ｎＭであった（図２３Ａ）。また、異なる製造業者のプレートを試験したところ、異なるレベルの付着が生じたが、分散のレベルは同様であった（図２３Ｂ）。最後に、バイオフィルム分解酵素ＰｅｌＡ４７−３０３及びＰｓｌＧ３１−４４２は影響がなかったので、ＰＮＡＧ依存性バイオフィルムの分散は特異的であることが示された（図２３Ｃ）。次のＢｐｓＢのアラニンバリアント：Ｄ３２６Ａ、Ｄ３２８Ａ、Ｈ４７３Ａ、Ｄ４７４Ａ、及びＥ５８５ＡはＰＮＡＧ依存性バイオフィルムを分散できなかった。これらの残基がＰＮＡＧの結合及び／又は加水分解に重要な役割は果たすことが示唆される。菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
【０２８４】
実施例１５  −ＢｐｓＢ２７−７０１、ＢｐｓＢ３１８−６７０、ＰｇａＢ２２−６７２、及びＰｇａＢ３１０−６７２はS. aureusから精製されたｄＰＮＡＧを加水分解できる
方法：
S. aureus株  ＭＮ８ｍ由来の単離ｄＰＮＡＧを６Ｎ  ＨＣｌ中で〜１０ｍｇ／ｍＬに溶かした。１０Ｎ  ＮａＯＨを用いて中性〜ｐＨ７〜８に達するまで再懸濁液を滴定した。５０μＬの反応で、１μＭ  ＢｐｓＢ３１８−６７０を、１〜５ｍｇ／ｍＬのｄＰＮＡＧとともに１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０中で１８時間インキュベーションした。試料を２つの２０μＬの分注量の分け、ＤＴＴ／３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩水和物で処理して、８０℃で１５分間加熱した。０．５％（重量／重量）鉄（ＩＩＩ）硫酸アンモニウム十二水和物、０．５％（重量／重量）スルファミン酸、及び０．２５Ｎ  塩酸の溶液を加えて混合し、室温に冷やした。次に、１００μＬを９６ウェル透明底プレートに移し、吸光度をモレキュラーデバイス社（サニーベール、カリフォルニア州）のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２を用いて６２０ｎｍで測定した。バッファーＨ中のタンパク質及びｄＰＮＡＧを背景対照として用いた。
【０２８５】
結果：
ＢｐｓＢ及びＰｇａＢの抗バイオフィルム活性がＰＮＡＧ多糖の切断に直接起因するか否かを試験するために、還元糖アッセイを行った。２４時間エンドポイントアッセイを用いた結果はバックグラウンドを超えた明らかな信号を示し、酵素が多糖を加水分解できることを示している（図２４）。ｄＰＮＡＧは〜５％  脱アセチル化されていると推定され、ｄＰＮＡＧポリマーの平均の長さ（〜２００ユニット）及び加水分解アッセイで生じた信号から、切断がグルコサミン残基で起こりうることが示唆される。これによって、ポリマーあたり約１０個のさらなる還元末端が生じることになると思われる。理論に拘束されるものではないが、この結果は加水分解がグルコサミン残基で起こりうることを示すので、脱アセチル化酵素ドメインを含むＢｐｓＢ又はＰｇａＢ構築物をもつことは、ｄＰＮＡＧに存在するグルコサミン残基の量を増やし、その結果加水分解の部位を増やすのに有益なはずである。これによって今度は、バイオフィルム阻害及び分解の効率を上がるはずである。くわえて、ＢｐｓＢ２７−７０１及びＢｐｓＢ３１８−６７０は、ＰｇａＢ２２−６７２及びＰｇａＢ３１０−６７２と比べて約４倍の加水分解活性を示した。このアッセイの条件下では、ＢｐｓＢ２７−７０１及びＢｐｓＢ３１８−６７０がより良好なヒドロラーゼであることを示唆している。この結果はバイオフィルムアッセイと相関する（図２３Ａ）。ＢｐｓＢの次のアラニンバリアント：Ｄ３２６Ａ、Ｄ３２８Ａ、Ｈ４７３Ａ、Ｄ４７４Ａ、及びＥ５８５Ａは、ｄＰＮＡＧを加水分解できなかった。これらの残基がｄＰＮＡＧの結合又は加水分解に重要な役割を担っていることを示唆している。上述のように、菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
【０２８６】
実施例１６−ＰｅｌＡ４７−３０３はA. fumigatus  ＧＡＧ依存性バイオフィルムを防止できる
方法：
ＰｅｌＡ４７−３０３がＧＡＧ依存性バイオフィルムの形成を阻害しうるか否かを調べるために、５×１０４個のA. fumigatus分生子／ウェルをＰｅｌＡ４７−３０３を補充したブレイン培地中で３７℃及び５％  ＣＯ２にて２０時間増殖させた。ＧＡＧバイオフィルム形成を定量するために、各ウェルを４００μＬのｄＨ２Ｏで２回洗い、３００μＬの０．１％（重量／体積）クリスタルバイオレットで１０分間染色した（Merritt et al 2005）。この染色に続いて、ウェルを２回洗い、残った色素を３００μＬの９５％（体積／体積）エタノールを加えることによって溶かし、１０分間放置した後、吸光度を６００ｎｍで測定した。
【０２８７】
結果：
バイオフィルム形成前に外から加えたＰｅｌＡがＧＡＧ多糖バイオフィルムを防止できるか否かを調べるために生体外アッセイを採用した。クリスタルバイオレットアッセイを通して見られるように、≧２μＭのＰｅｌＡ４７−３０３の添加はＧＡＧバイオフィルム形成を防止するのに充分であった（図２５Ａ）。また、２つの推定触媒バリアントＤ１６０Ａ及びＥ２１８Ａもこれらの濃度で阻害することが示された。同様の結果がＰｐＰｅｌＡ３５−２９１についても得られた（図２５Ｂ）。理論に拘束されるものではないが、酵素バリアントは多糖に結合する能力を持ち続け、それによって非生物的プレートに付着するA. fumigatusの能力を減少させ可能性がある。
【０２８８】
実施例１７−ＰｅｌＡ４７−３０３はA. fumigatusのＧＡＧ多糖を加水分解できる
方法：
粗ＧＡＧをA. fumigatusバイオフィルムから分離した。２００μＬのＧＡＧ分注量を遠心分離してゼラチン状の画分を沈殿させた。ペレットを３５０μＬのＰＢＳで２回洗った。洗浄手順には、５分間ボルテックスすること、浴内で３分間超音波処理すること、及びピペット操作によって均一に達するまで手動で混ぜることが含まれた。最終ペレットを２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。試料を１０〜２０μＭ  タンパク質で処理し、２６℃でインキュベーションした。２４時間で試料を取り出した。少し修正を加えた、以前に記載されている還元糖アッセイを用いて（Anthon & Barrett 2002）、ＧＡＧ加水分解を定量した。簡潔に、２０μＬの酵素反応を２０μＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨ並びに２０μＬのＭＢＴＨ／ＤＴＴ溶液（１．５ｍ／Ｌ  ３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン（ＭＢＴＨ）及び０．５ｍ／Ｌ  ＤＴＴ）と混ぜた。試料を８０℃で１５分間インキュベーションした後、４０μＬの酸性鉄試薬（０．５％（ＦｅＮＨ４（ＳＯ４）２）・１２Ｈ２Ｏ、０．５％  スルファミン酸、及び０．２５  Ｎ  ＨＣｌ）を加えた。試料を水で２倍に希釈した後、吸光度を６２０ｎｍで定量した。
【０２８９】
結果：
ＰｅｌＡ４７−３０３がＧＡＧ多糖を加水分解できるか否かを決定するために、A. fumigatus株Ａｆ２９３由来の精製ＧＡＧを用いて還元糖アッセイを完了した。未処理試料と比較して、溶液中の還元末端の数は２４時間の反応時間にわたって増加した（図２６）。キチン及びキトサンの放出が背景加水分解より顕著ではなかったので、活性は特異的であった。単一位置バリアントＥ２１８Ａは活性を失った。菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
【０２９０】
実施例１８−ＰｅｌＡ４７−３０３及びオーソログはA. fumigatus  ＧＡＧ依存性バイオフィルムを分散できる
方法：
計５×１０４個のA. fumigatus分生子／ウェルをブレイン培地中で３７℃及び５％  ＣＯ２にて２０時間増殖させて、ＧＡＧを産生させ、滅菌２４ウェルプレートに付着させた。ＧＡＧバイオフィルムの分散を測定するために、培地を吸引し、ＰｅｌＡ４７−３０３又は推定触媒バリアントを０．２８μＭの低濃度で含む培地と交換し、新鮮な培地中でさらに２０時間インキュベーションした。反応を止めるために、各ウェルを４００μＬのｄＨ２Ｏで２回洗い、３００μＬの０．１％（重量／体積）クリスタルバイオレットで１０分間染色した。この染色に続いて、ウェルを２回洗い、残った色素を３００μＬの９５％（体積／体積）エタノールを加えることによって溶かし、１０分間放置した後、吸光度を６００ｎｍで測定した。
【０２９１】
結果：
P. aeruginosa  ＰＡＯ１のＰｅｌＡ４７−３０３及びP. protogensのＰｅｌＡ３５−２９１はＧＡＧバイオフィルムの消失をもたらしたが、一方で推定触媒バリアント及びＢＳＡ対照はバイオフィルムを分散できなかったことが観察された（図２７）。また、ＰｅｌＡオーソログＲａｇＡ６１−３１７はＧＡＧ依存性バイオフィルムを分散できた。一方でG. metallireducensのＰｅｌＡオーソログ（ＧｍｅｔＰｅｌＡ２３−２７７）は効果は少なかったものの（図２８）、それでもなお作用した。
【０２９２】
実施例１９−ＰｅｌＡ４７−３０３はA. fumigatus感染症によって引き起こされる上皮細胞傷害を予防できる
方法：
２４ウェル組織培養プレートで培養した単層を、３ｍＣｉの５１Ｃｒとともに３７℃にて５％  ＣＯ２中で２４時間インキュベーションすることによって、不死化気道上皮細胞株Ａ５４９にクロム５１を入れた。過剰なクロムをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗うことによって取り除いた。次に、標識したＡ５４９細胞を、０．５μＭ  ＰｅｌＡ４７−３０３又はＥ２１８Ａバリアントを含む１ｍＬの血清を含まないＤＦ１２Ｋ培地５×１０５個の分生子で感染させた。発芽管を試験するために、分生子をＳＡＢ培地中で３７℃にて７時間生育させ、次に真菌を集め、ＤＦ１２Ｋ培地に再懸濁した後、０．５μＭのヒドロラーゼを加えた。発芽管をヒドロラーゼと１時間インキュベーションした後、Ａ５４９細胞に加えた。１６、２０、及び２４時間共インキュベーションした後、細胞上部の培地の分注量を取り出し、新鮮な培地と換えた。次に細胞を６Ｎ  ＮａＯＨで溶かし、溶解物を集めた。次いで、培地及び溶解物の５１Ｃｒ含有量をガンマカウンターで測定し、上皮細胞傷害の程度を５１Ｃｒ放出の度合いの関数として計算した。各株を３連で試験して、結果はすべて、非感染上皮細胞による自然発生的なクロム放出に対して補正した。
【０２９３】
結果：
１６時間にわたるクロム放出アッセイによって測定されるように、外からのＰｅｌＡ４７−３０３の添加はA. fumigatusの肺上皮細胞傷害を誘発する能力を阻止した（図２９）。比較すると、以前にＧＡＧ依存性バイオフィルムを分散できなかったことが示されているＰｅｌＡ４７−３０３  Ｅ２１８Ａの外からの添加は上皮細胞傷害を防止しなかった。野生型酵素で観察された保護効果がＧＡＧ依存性バイオフィルムの阻害及び分散における直接的な結果であることが裏付けられる。理論に拘束されるものではないが、本明細書で言及されるＰｅｌＡオーソログは恐らく同じ機能を果たす。上述のように、菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
【０２９４】
実施例２０−ＰｅｌＡ４７−３０３はヒト好中球のP. aeruginosa殺作用を増強できる
方法：
P. aeruginosa  ＰＡＯ１  ΔｗｓｐＦΔｐｓｌｐＢＡＤｐｅｌを一晩培養したものをＬＢ＋０．５％  アラビノースでＯＤ６００が０．０５に希釈して、９６ウェルの組織培養用に処理したプレートに１００μｌ／ウェルの最終体積で植え付けた。プレートを２８℃で２０時間静的にインキュベーションした。上清を吸引し、０．５μＭのＰｅｌＡ４７−３０３を含む１００μＬのフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ＋１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えた。プレートをニューテーター上で室温にて１時間インキュベーションした。ヒドロラーゼで前処理した後、６×１０６個の分化ＨＬ−６０細胞を含む１００μＬ  ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＢＳをウェルに加え、プレートを３７℃、５％  ＣＯ２で９０分間インキュベーションした。ウェルを吸引し、上清を１／２０００００〜１／４０００００に希釈して、ＬＢ寒天上に蒔いた（５０μｌ）。吸引したウェルに、２００μＬの「破壊溶液（disruption solution）」（２μＭのＰｅｌＡ４７−３０３及び２μＭ  ＰｓｌＧ３１−４４２を含むＰＢＳ）を加え、プレートをニューテーター上で室温にて１〜１．５時間インキュベーションした。ウェルを吸引し、希釈し、上記のようにＬＢ寒天上に蒔いた。
【０２９５】
結果：
ヒドロラーゼ処理が免疫殺作用に対する微生物の感受性を増強しうるか否かを判断するために、P. aeruginosaの好中球に対する感受性を増強するＰｅｌＡ４７−３０３の能力を調べた。ＰｅｌＡでのＰｅｌ含有P. aeruginosaバイオフィルムの処理は、ＨＬ−６０好中球細胞株による微生物殺作用の程度を約２２％から４２％に増加させた（図３０）。他の可溶性グリコシルヒドロラーゼもまた、似たように機能して好中球殺作用を強めることが予想される。
【０２９６】
実施例２１−  ＰｅｌＡ４７−３０３はゲル中に製剤されてＰｅｌ依存性P. aeruginosaバイオフィルムを分散できる
方法：
ポロクサマー４０７（商品名プルロニック（登録商標）Ｆ−１２７又はＰＦ−１２７）は親水性非イオン界面活性剤であり、多くの投与経路のための薬物送達システムとして使用されてきた（Escobar-Chavez et al 2006）。ＰＦ−１２７の２０％ゲルを１×ＰＢＳをプルロニック（登録商標）Ｆ−１２７とポリマーが溶けるまで４℃で混ぜることによって調製した。ＰｅｌＡ４７−３０３を、３つの濃度；１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び５００μｇ／ｍＬでこの溶液に加えた。株P. aeruginosa  ＰＡＯ１  ΔｗｓｐＦΔｐｓｌｐＢＡＤｐｅｌのＰｅｌ依存性バイオフィルムを実施例８で記載したように形成した。バッファー、ゲル、及びさまざまな濃度のＰｅｌＡ４７−３０３を含有するゲルをバイオフィルムに加えた。
【０２９７】
結果：
１×ＰＢＳバッファー又は２０％  プルロニック（プルロニック）（登録商標）Ｆ−１２７でのバイオフィルムの処理は、バイオフィルム分散をもたらさなかった。しかし、１時間の処理後のクリスタルバイオレット染色（図３１）を通して明らかなように、３つの濃度のＰｅｌＡ４７−３０３を含むプルロニック（プルロニック）（登録商標）Ｆ−１２７は成功裡にバイオフィルムを分散させた。理論に拘束されるものではないが、同様の送達戦略が、酵素を封入できる薬剤を用いて、本明細書に開示のグリコシルヒドロラーゼのいずれにも利用できると考えられる。
【０２９８】
実施例２２−ＰｓｌＧ３１−４４２及びＰｅｌＡ４７−３０３は組み合わせてP. aeruginosaの臨床分離株及び環境分離株のＰｅｌ及びＰｓｌ含有バイオフィルムを分散できる
方法：
臨床及び環境P. aeruginosa分離株のバイオフィルムを増殖及び分散させる方法は、初めに実施例４で記載した実験室株のものと同一である。この方法の１つの例外は、Ｌ−アラビノースはそれらの株ではバイオフィルムの形成を誘導するのに必要ではなく、したがってバイオフィルム形成能は株特異的なことである。それらの選ばれた株の多様性は以前に報告されており（Wolfgang et al 2003）、それらの株がＰｅｌ及びＰｓｌ多糖を利用する傾向が、ｐｅｌオペロン及びｐｓｌオペロンの遺伝子欠失を用いて特徴付けられた（Colvin et al 2012）。
【０２９９】
結果：
外から加えたＰｓｌＧ、ＰｅｌＡ、及びそれらの組み合わせが利用されて、臨床及び環境P. aeruginosa分離株によって形成されるバイオフィルムを分散できうるか否かを調べるために生体外アッセイを採用した。１００〜１０００ｎＭのＰｓｌＧ３１−４４２、ＰｅｌＡ４７−３０３、又は等モル濃度の両酵素の添加はともに、クリスタルバイオレット染色を通して見られるように、１時間でバイオフィルムバイオマスの≧９０％の減少をもたらした（図３２）。これは、これらのグリコシルヒドロラーゼが組み合わせて適用されて、臨床的に関連する株のバイオフィルムを分散できることを示す。
【０３００】
実施例２３−Ｓｐｈ３５２−２９８は可溶性タンパク質である
方法：
ＧＡＧ産生が損なわれた転写因子変異体の比較トランスクリプトーム解析から、ＧＡＧ生合成に必要なタンパク質をコードすることが予想される５つの同時調節遺伝子のクラスターが特定された。A. fumigatusのＧＡＧ生合成に必要な幾つかの遺伝子は、ゲノムの第３染色体上にコードされる（図３３）。構築されたΔｓｐｈ３ノックアウトは脱アセチル化ＧＡＧを作ることができない。A. fumigatus  Ａｆ２９３のｓｐｈ３及びｅｇａ３のタンパク質コード配列はそれぞれ、アクセッション番号ＥＡＬ９２７８６．１及びＥＡＬ９２７８７．１でジェンバンクに寄託された。Ｓｐｈ３は、膜貫通ヘリックス（アミノ酸２０〜４２）をそのＮ末端に含有することがＴＭＨＭＭサーバーによって予想されている２９８個のアミノ酸のタンパク質である（Krogh et al 2001）。TMHMMは、Ｓｐｈ３は細胞の細胞外表面にＣ末端ドメインをもつＩＩ型膜タンパク質として分類する。構造相同性検索から、Ｓｐｈ３５２−２９８が（β／α）８ＴＩＭバレルフォールドから成ることが示唆されている。Ｐｈｙｒｅ２では、これらのモデルは最高で９６．９％の信頼度でグリコシルヒドロラーゼに基づく（Kelley & Sternberg 2009）。ヌクレオチド配列を用いて、推定膜貫通ヘリックスを除く残基５２〜２９８をコードする領域を増幅することになる遺伝子特異的プライマーを設計した。Ｓｐｈ３について、フォワードプライマー、５’−ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＴＧ  −３’（配列番号９）はＮｄｅＩ部位をコードし、リバース５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＣ  −３’（配列番号１０）はＸｈｏＩ部位を含む（図３４）。ＰＣＲ増幅産物をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩエンドヌクレアーゼを用いて切断し、次にｐＥＴ２８ａベクター（ノバジェン社）にライゲーションした。配列は使用前に、ＡＣＧＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって確認された。
【０３０１】
タンパク質発現プラスミドをE. coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍＬ  カナマイシンを含む１．５Ｌのルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地で３７℃にてＯＤ６００が〜０．３５〜０．４０まで増殖させた。温度を１８℃に下げ、〜０．５〜０．６のＯＤ６００において、タンパク質発現を０．５ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した。誘導後、細胞を一晩増殖させ、４０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって集めた。細胞をプロテアーゼ錠剤（シグマ社）を含むバッファーＩ（５０ｍＭ  ＣＨＥＳ  ｐＨ９．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％（体積／体積）グリセロール、１０ｍＭ  イミダゾール、２ｍＭ  ＴＣＥＰ）に懸濁し、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ３  ホモジナイザーを用いて１５，０００プサイにて溶解した。細胞残屑を３０，０００×ｇで遠心分離することによって沈殿させ、上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン社）に載せた。カラムを１０カラムボリュームのバッファーＩ及び２０ｍＭ  イミダゾールを含む４カラムボリュームのバッファーＡで洗浄した。次に、ヘキサヒスチジンタグタンパク質を２００ｍＭ  イミダゾールを含むバッファーＩを用いて溶出し、結果として得た画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ濾過器（ミリポア社）を用いて２ｍＬの体積に濃縮した。さらに、濃縮したタンパク質をバッファーＪ（５０ｍＭ  ＣＨＥＳ  ｐＨ９．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。
【０３０２】
結果：
残基５２〜２９８を含むＳｐｈ３５２−２９８構築物を発現させ、精製した。発現タンパク質は１リットルの細菌培養物当たり〜１０ｍｇ生じ、分子量は２９．６ｋＤａである。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度が＞９５％であると判断された。タンパク質を８〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、４℃で保存できた（図３５）。
【０３０３】
実施例２４−Ｓｐｈ３５２−２９８はＧＡＧ多糖を加水分解できる
方法：
Ｓｐｈ３５２−２９８を用いるＧＡＧ多糖の加水分解を調べる方法は、ＰｅｌＡ４７−３０３の使用に関して実施例１７で前述したものと同一である。
【０３０４】
結果：
Ｓｐｈ３５２−２９８がＧＡＧ多糖を加水分解できるか否かを判断するために、精製したＧＡＧを用いて還元糖アッセイを完了した。未処理試料と比較して、溶液中の還元末端の数は２４時間の反応期間にわたって増加した（図２６）。単一位置バリアントＤ１６６Ａは活性を失った。菌体外多糖を切断する能力を維持するバリアントはそのような残基が維持されることを恐らく必要とするであろう。代替的に、そのような残基はさらに最適化されうる。当業者ならば変異に際して活性が増加するか減少するかを容易に判断できるであろう。
【０３０５】
実施例２５  −Ｓｐｈ３５２−２９８は、A. fumigatus臨床分離株を含むA. fumigatus  ＧＡＧバイオフィルムを予防及び分散できる
方法：
Ｓｐｈ３５２−２９８を用いるＧＡＧバイオフィルムの分散を調べる方法は、ＰｅｌＡ４７−３０３の使用に関して実施例１８で前述したものと同一である。A. fumigatusの臨床分離株はマギル大学ヘルスセンターの臨床菌学研究室（clinical mycology lab）から入手した。
【０３０６】
結果：
外から加えたＳｐｈ３５２−２９８が予め形成されたバイオフィルムを分散できるか否かを調べるために生体外アッセイを採用した。クリスタルバイオレットアッセイを通してされるように、２８０ｎＭのＳｐｈ３５２−２９８の添加はＧＡＧバイオフィルム形成を防止するのに十分であった（図３６）。このことから、Ｓｐｈ３５２−２９８は、ＰｅｌＡ４７−３０３がP. aeruginosaのＰｅｌ多糖バイオフィルムを分散させるのと同様の方法で、ＧＡＧバイオフィルムを分散できること、及びこの酵素が新規の抗真菌療法でありうることが示唆される。A. fumigatus、A. nidulans、及びA. clavatusの組換えＳｐｈ３はすべて、A. fumigatusバイオフィルムの形成を用量依存的に阻害する。同様に、３つのアスペルギルス種の可溶性Ｓｐｈ３はすべて、前形成されたA. fumigatusのバイオフィルムを用量依存的に破壊した（図３７）。これらの可溶性Ｓｐｈ３タンパク質の触媒ドメインに点変異を導入することは、活性の減少又は消失につながった。これらのタンパク質の抗バイオフィルム活性が酵素活性によって媒介されることが示唆される。A. fumigatusのＳｐｈ３５２−２９８は、A. fumigatusの複数の株に対して活性があることが見出された。これらの薬剤は多様な臨床分離株に対して活性があると思われることが示唆される（図３８）。
【０３０７】
実施例２６−Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）は病原真菌Trichosporon asahiiのＧＡＧバイオフィルムを分散できる
方法：
ヒドロラーゼ処理のTrichosporon asahiiに対する効果を評価するために、１×１０５個のT. asahii酵母細胞又はA. fumigatus分生子をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に植え付け、３７℃、５％  ＣＯ２にてカバーガラス上で１０時間増殖させた。ウェルをハムＦ−１２Ｋ（カイン（Kaighn's））培地（Ｆ１２Ｋ）培地で１回静かに洗い、Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）を０．５μＭの最終濃度でＦ１２Ｋに加えた、３７℃、５％  ＣＯ２にてさらに３時間インキュベーションした。若い菌糸をＰＢＳで２回洗い、ＦＩＴＣタグＳＢＡで１時間染色した。染色した試料をＰＢＳで洗い、４％  ＰＦＡで１５分間固定した。次に、スライドをマウントし、シールし、４８８ｎｍレーザーを備える共焦点顕微鏡（ツァイス）下で撮像した。
【０３０８】
結果：
図３９に示されるように、日和見感染病原真菌Trichosporon asahiiは、Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）によって分解できる、ＧａｌＮＡｃに富む菌体外多糖を産生する。ＳＢＡ−ＦＩＴＣ染色によって判断されるように、A. fumigatusと同様に、未処理T. asahiiは細胞表面にＧａｌＮＡｃ修飾を呈する（左上及び中央）。しかし、０．５μＭ  Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）での３時間の処理は、検出可能な表面ＧａｌＮＡｃの完全な消失をもたらす（右上）。真菌をＤＲＡＱ５で対比染色した（下パネル）。
【０３０９】
実施例２７−Ｓｐｈ３５２−２９８はA. fumigatus感染症及びP. aeruginosa感染症によって引き起こされる上皮細胞傷害を予防できる
方法：
Ｓｐｈ３５２−２９８を用いたA. fumigatusによって引き起こされる上皮細胞傷害を予防する方法は、ＰｅｌＡ４７−３０３の使用に関して実施例１９で前述したものと同一である。P. aeruginosaによって誘発される傷害に関して、０．５μＭのＳｐｈ３ＡＮ（４３−２９９）の存在又は非存在下でＰｅｌ産生P. aeruginosaにＡ５４９を１６時間曝し、哺乳類細胞傷害を乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の上清への放出によって分析した。
【０３１０】
結果：
組換えヒドロラーゼがA. fumigatusによる傷害から宿主細菌を保護できうるか否かを判断するために、クロム放出傷害アッセイを用いてA. fumigatusによるＡ５４９肺上皮細胞株の傷害を評価した。A. clavatus、A. nidulans、又はA. fumigatus由来のＳｐｈ３でのA. fumigatusの処理は上皮細胞への真菌による傷害を減らした（図４０Ａ）。なお注目すべきことに、A. clavatus（Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４））及びA. nidulans（Ｓｐｈ３ＡＮ（４３−２９９））のＳｐｈ３は上皮細胞をA. fumigatusによる傷害から２４時間完全に保護した。また、Ｓｐｈ３ＡＮ（４３−２９９）はP. aeruginosaによって引き起こされる傷害を減らすことができる（図４０Ｂ）。
【０３１１】
実施例２８−グリコシドヒドロラーゼＰｓｌＧ３１−４４２、ＰｅｌＡ４７−３０３、並びにＳｐｈ３５２−２９８、並びにそのオーソログＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）、及びＳｐｈ３ＡＮ（４３−２９９）はP. aeruginosa感染症及びA. fumigatus感染症の治療に使用される抗微生物化合物を増強できる
方法：
抗真菌剤と、Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）又はＰｅｌＡ４７−３０３との併用治療のA. fumigatus分生子の生育に対する効果をマルチタイタープレートアッセイを用いて判定した。ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン−スルホン酸）（フィッシャー）で緩衝化したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）（ＲＰＭＩ−ＭＯＰＳ）中の休眠A. fumigatus分生子を、組織培養用に処理したマルチタイタープレート（ＢＤファルコン社）に加えた。分生子を３７℃、５％  ＣＯ２にて９時間インキュベーションした。抗真菌剤のストック溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で調製し、さらにＲＰＭＩ−ＭＯＰＳで希釈した。ヒドロラーゼのストック溶液をＲＰＭＩ−ＭＯＰＳで調製及び希釈した。抗真菌化合物を、横列にわたって２倍段階希釈し、０．５μＭのＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）又はＰｅｌＡ４７−３０３を加えた。次に、プレートを３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベーションし、１５時間後に倒立光学顕微鏡（ツァイス社）下で観察し、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ２カメラ（ルメネラ社）を用いて画像を取得した。続いて、真菌の生存性を測定するために、ＸＴＴ［２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド］（シグマ社）代謝アッセイを行った。メナジオン（シグマ社）をＸＴＴ溶液に加え、さらにＲＰＭＩ−ＭＯＰＳで希釈した。溶液を菌糸に加え、９０分間インキュベーションした。分光光度計（ＡＳＹＳ  ＵＶＭ  ３４０）を用いてＯＤ４５０を測定した。
【０３１２】
抗生物効力増強に対するＰｅｌＡ４７−３０３及びＰｓｌＧ３１−４４２の効果を調べるために、Ｐｅｌ依存性及びＰｓｌ依存性バイオフィルムを、それぞれ１μＭ  のＰｅｌＡ４７−３０３又はＰｓｌＧ３１−４４２の非存在下又は存在下で、実施例４で前述したように増殖させた。２４時間後、試料をすべて１００μｇ／ｍＬのコリスチンで処理し、２５℃で２４時間インキュベーションした。この処理の後、浮遊細胞をピペット操作で取り除き、残ったバイオフィルムを緩衝液に懸濁し、実施例４で概説したヒドロラーゼ処理に供した。浮遊バイオマス及びバイオフィルムバイオマスを集め、コロニーカウント用ＬＢ寒天プレート上に段階希釈した。
【０３１３】
結果：
組換えヒドロラーゼでの処理が抗微生物剤の活性を増強しうるか否かを判断するために、Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）及びＰｅｌＡ４７−３０３のA. fumigatusの抗真菌剤感受性に対する効果を調べた。Ｓｐｈ３ＡＦ、Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）、Ｓｐｈ３ＡＮ（４３−２９９）、又はＰｅｌＡ４７−３０３でのA. fumigatusバイオフィルムの処理は、抗真菌剤サコナゾール、アンホテリシンＢ、及びキャスポファンギンの最小発育阻止濃度のポ≧５０％の減少をもたらした（図４１）。A. fumigatusの感受性株及び耐性株に関して、同様のＭＩＣの減少が見られた。
【０３１４】
また、ＰｅｌＡ４７−３０３及びＰｓｌＧ３１−４４２も１００μｇ／ｍＬの最終濃度で投与された抗生物質コリスチンを増強できた。ＬＢプレート上で増殖が見られなかったように、いずれかの酵素の添加は殺菌作用の１００倍を超える増加につながる（図４２）。理論に拘束されるものではないが、抗生物質保護における菌体外多糖の関与を考えれば、異なる作用機序をもつ他のクラスの抗生物質も、どのグリコシルヒドロラーゼによっても恐らく効力が増強されるであろう。
【０３１５】
実施例２９−Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）でのA. fumigatusの処理は抗真菌薬の浸透を増加させる
方法：
赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するＡｆ２９３の菌糸を、０．５μＭ  Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）ヒドロラーゼで９０分間前処理した後、ボディピー結合ポサコナゾール（ＢＤＰ−ＰＣＺ）で処理した。異なる時点で、試料を固定し、蛍光共焦点顕微鏡法を用いて撮像して、菌糸の薬物浸透の速度論を決定した。
【０３１６】
結果：
組換えグリコシルヒドロラーゼの存在下での抗真菌薬の感受性の増加が、菌体外多糖の非存在下の細胞への浸透の増強に由来するか否かを判断するために、A. fumigatusによるポサコナゾールの取り込みの速度をＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）の存在又は非存在下で調べた。共焦点顕微鏡法によって可視化されたように、Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）での菌糸の処理は、蛍光標識したポサコナゾールの取り込みの速度及び程度を増加させた（図４３）。まとめると、これらのデータは、組換えヒドロラーゼによる菌体外多糖の分解は、真菌細胞を浸透する能力を増強することを通して抗真菌薬の活性を増加できることを示す。
【０３１７】
実施例３０−ＧＡＧを合成し、ＧＡＧ依存性バイオフィルムを形成する遺伝的能力を有する他の種の同定
方法：
バイオインフォマティクス解析のために、ＧＡＧ生合成クラスター：ＡＦＵ＿３Ｇ０７８６０（Ｇｔｂ３）、ＡＦＵ＿３Ｇ７８７０（Ａｇｄ３）、ＡＦＵ＿３Ｇ７８９０（Ｅｇａ３）、ＡＦＵ＿３Ｇ７９００（Ｓｐｈ３）、及びＡＦＵ＿３Ｇ７９１０（Ｕｇｅ３）内の遺伝子のアミノ酸配列をAspergillus属ゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）から入手し、ＮＣＢＩタンパク質データベースのＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で照会した。保存ドメインデータベース（Conserved Domain Database）（ＣＤＤ）を使用して各推定タンパク質の機能ドメインを予想した。クラスター遺伝子に類似するドメインをもつタンパク質のアミノ酸配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）を用いた多重整列（ＭＳＡ）によってアラインメントした。ＴｒｅｅＶｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｓｕｐｆａｍ．ｃｓ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／ＴｒｅｅＶｅｃｔｏｒ／）を用いてクラスターの各メンバーを視覚化するために、得られた系統関係結果（output）をエクスポートし、フォーマットし、描写した。分類学的解析に関して、ＧＡＧクラスターを含有する真菌のクラスを選択し、ＰｈｙｌｏＴ（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｙｌｏｔ．ｂｉｏｂｙｔｅ．ｄｅ）を用いて視覚化した。
【０３１８】
Trichosporon asahiiのＧＡＧ産生をダイズ凝集素（ＳＢＡ）レクチン染色を用いて評価した。簡潔に、１×１０５個のT. asahii酵母細胞又はA. fumigatus分生子をＲＰＭＩ１６４０に植え付け、３７℃、５％  ＣＯ２にてカバーガラス上で９時間増殖させる。ポリ−Ｄ−リジンで被覆したカバーガラス（コーニング社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）上で、（カナダ農務・農産食品省、サン・ジャン・シュル・リシュリュー、ケベック州のＣａｒｉｓｓｅ博士及びＴｒｅｍｂｌａｙ博士からの）Botrytis cinerea分離株７ｂ１を６×１０３個の分生子／ｍＬの濃度で５００μｌのブレイン培地に、１７時間、室温にて暗中で植え付けた。結果として生じた若い菌糸を４％  ＰＦＡで３０分間固定し、ＰＢＳで洗い、ＦＩＴＣタグ付きＳＢＡで２時間染色した。染色試料をＰＢＳで洗い、マウントし、シールし、４８８ｎｍレーザーを備える共焦点顕微鏡（オリンパス社）で撮像した。
【０３１９】
結果：
バイオインフォマティクス解析から、多くの子嚢菌及び担子菌Trichosporonの真菌内にＧＡＧ生合成の遺伝子クラスターが存在することが明らかになった（図４４）。これらに真菌としては、植物病原菌種:Saccharata proteae、Zopfia rhizophila、Phaeosphaeria nodorum、Setosphaeria turcica、Botrytis cinerea、Cryphonectria parasitica、Melanconium sp.、Verticillium dahlia、Nectria haematococca、Neurospora crassa、Leptosphaeria maculans、Pleomassaria siparia、Cochliobolus heterostrophus、Pyrenophora tritici-repentis、Blumeria graminis、Marssonina brunnea、Sclerotinia sclerotiorum、Taphrina deformans、Cercospora zeae-maydis、並びにヒト病原真菌:Fusarium、Trichosporon、及びAspergillus種が挙げられる。これらのクラスターの他の真菌での存在がＧＡＧの産生を予想することを確かめるために、T. asahiiの菌糸（図３９）、及びB. cinerea（図４５）をＧａｌＮＡｃ特異的レクチンで染色してＧＡＧの存在を検出した。これらの種のゲノム内にＧＡＧ生合成のクラスターが存在することと一致して、両生物においてレクチン染色はＧＡＧ様の菌体外多糖の産生を示した。
【０３２０】
実施例３１−Botrytis cinereaはＳｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）によって消化できるＧＡＧ依存性バイオフィルムを産生できる
方法：
ポリ−Ｄ−リジンを被覆したカバーガラス（コーニング社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）上で、Botrytis cinerea分離株７ｂ１を６×１０３個の分生子／ｍＬの濃度で５００μｌのブレイン培地に、１７時間、室温にて暗中で植え付けた。１μＭ  Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）の存在下又は非存在下で試料をインキュベーションした。次に培地を除去し、菌糸を１μＭ  Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）を含むＰＢＳ又は含まないＰＢＳ中で室温にて１時間インキュベーションした。試料をＰＢＳで２回洗い、３０μｇ／ｍＬの、フルオレセインに結合したWisteria fluoribunda（ＷＦＬ）レクチンで４℃にて２時間染色した。試料をＰＢＳで２回洗い、４％  パラホルムアルデヒドで１０分間、４℃で固定した。試料を１回洗い、１：１０００希釈のＤＲＡＱ５（商標）（イーバイオサイエンス社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で室温にて５分間染色した。試料をＰＢＳで１回洗い、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）Ｇｏｌｄ褪色防止剤（ライフテクノロジーズ（商標）、ユージーン、オレゴン州）を用いて顕微鏡スライドにマウントし、マニキュア液でシールした。ＢＡ５０５−５２５及びＢＡ６５０ＩＦフィルターとそれぞれ連結した４８８及び６３３ｎｍレーザーを用いてオリンパスＦｌｕｏｖｉｅｗ共焦点レーザー顕微鏡で画像を取得した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所）を用いて、０．２μｍづつの増加のｚスタックを取り込み、３Ｄレンダリングした。
【０３２１】
結果：
Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）でのB. cinereaの菌糸の処理は、その菌体外多糖の完全な消失をもたらした（図４５）。理論に拘束されるものではないが、このデータは組換えヒドロラーゼが他の真菌種のＧＡＧバイオフィルムを消化できることを示唆する。
【０３２２】
実施例３２−Ｅｇａ３４６−３１８は可溶性タンパク質である
方法：
バイオインフォマティクス予想は、Ｅｇａ３がアミノ酸２３〜４５の単一膜貫通（ＴＭ）ヘリックスをもつことを示唆する。アミノ酸４６〜３１８を含むＣ末端ドメインはＴＭＨＭＭによって細胞外にあることが予想されている。Ｐｈｙｒｅ２構造相同性認識サーバーは、タンパク質が（β／α）８ＴＩＭバレルを含有し、グリコシルヒドロラーゼファミリーＧＨ１１４に合致すると予想する。E. coliでの発現に最適化されたｅｇａ３遺伝子コドンを含有するプラスミドをＧｅｎｅＡｒｔ社から入手した。予想される細胞外ドメイン、アミノ酸４６〜３１８をコードする配列をｐＥＴ２８ベクターのＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にサブクローニングした。ＭｌｙＩ部位をコードするフォワードプライマー、５’−ＧＧＧＡＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号  ２４）及びＫｐｎＩ部位を含有したリバース、５’−ＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＣＡ−３’（配列番号２５）を用いて、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグをもつＥｇａ３４６−３１８構築物を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をＭｌｙＩ及びＫｐｎＩエンドヌクレアーゼを用いて切断し、次にエンドヌクレアーゼＳｔｕＩ及びＫｐｎＩで予め切断したｐＰｉｎｋα−ＨＣベクター（インビトロジェン社）にライゲーションした。配列は使用前に、ＡＣＧＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって確かめられた。
【０３２３】
タンパク質発現プラスミドを、ピキアアデニンドロップアウト（ＰＡＤ）選択プレート上に蒔いたPichia pastoris（ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ株４）に形質転換して、形質転換コロニーを特定した。コロニーを選択し、２ｍＬの緩衝化複合グリセロール培地（buffered complex methanol medium）（ＢＧＭＹ）培地中で３０℃にて生育させた。接種菌（Starters）を用いて５００ｍＬのＢＭＧＹに植え付け、次に２６℃で一晩増殖させた。この多量培養物を採取し、次に４５０ｍＬの緩衝化複合メタノール培地（buffered complex methanol medium）（ＢＭＭＹ）培地に再懸濁し、タンパク質発現のために２６℃で振盪しながら増殖させた。４８時間後に、４０００×ｇで２０分間遠心分離することによって細胞を採取した。培養上清を３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン社）に載せた。カラムを１０カラムボリュームのバッファーＫ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール）で洗った。次に、ヘキサヒスチジンタグタンパク質を２００ｍＭ  イミダゾールを補充したバッファーＫを用いて溶出し、結果として得た画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ濾過器（ミリポア社）を用いて２ｍＬの体積に濃縮した。さらに、濃縮したタンパク質をバッファーＬ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。
【０３２４】
結果：
残基４６〜３１８を含むＥｇａ３４６−３１８構築物を発現させ、精製した。発現タンパク質は１リットルの酵母培養物当たり〜３ｍｇ生じ、分子量は３１．８ｋＤａである。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって＞９５％の純度であると判断された（図４６）。タンパク質グリコシル化は、P. pastorisにおいて組み換えタンパク質発現及び分泌の間に良く起こる。グリコシル化に起因してＥｇａ３４６−３１８の見かけの質量がより大きいか否かを判断するために、タンパク質の試料をエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）で処理した。処理後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＥｎｄｏＨで処理したＥｇａ３４６−３１８は、３１ｋＤａで非グリコシル化タンパク質の予想質量に近いバンドを生じた。
【０３２５】
実施例３３−Ｅｇａ３４６−３１８はA. fumigatusのＧＡＧバイオフィルムを阻害及び分散できる
方法：
A. fumigatus分生子を、ポリスチレンの丸底２４ウェルプレートに、ＤＭＥＭ培地中１０５個の分生子／ウェルの濃度で植え付けた。バイオフィルム形成の阻害を評価するために、１μＭの最終濃度でＥｇａ３４６−３１８を加え、分生子を３７℃、５％  ＣＯ２にて１８時間インキュベーションした。次に、結果として生じたバイオフィルムを静かに蒸留水で２回洗い、０．１％  クリスタルバイオレットで１０分間染色した。試料を水で２回洗い、ウェルを撮像した。
【０３２６】
ヒドロラーゼの効果が前形成されたバイオフィルムに及ぶか否かを決定するために、ウェル当たり１０５個のA. fumigatus分生子を、上記のように、但しヒドロラーゼの非存在下でＤＭＥＭ培地に植え付けた。３７℃、５％  ＣＯ２にて１８時間インキュベーションした後、ニューテーター上で室温にて、結果として生じたバイオフィルムをＥｇａ３４６−３１８で１μＭの最終濃度にて１．５時間処理した。次に、バイオフィルムを洗い、上記のように染色した。
【０３２７】
結果：
未処理の１８時間増殖A. fumigatusバイオフィルムが、静かに洗った後にポリスチレンに付着したままであった一方で、１μＭ  Ｅｇａ３４６−３１８の存在下で増殖させた分生子は全く付着しないことが見出された（図４７）。また、１μＭの濃度でのＥｇａ３４６−３１８の、前形成された、１８時間、A. fumigatusバイオフィルムへの添加及び室温での１．５時間のインキュベーションは、バイオフィルムの破壊をもたらした。図４７から、Ｅｇａ３４６−３１８がA. fumigatusの表面からＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基を分解できることが示唆される。蛍光レクチンＳＢＡ−ＦＩＴＣで染色したとき、未処理の菌糸が広い範囲の表面ＧａｌＮＡｃ修飾を示す一方で（左上）、０．５μＭ  Ｅｇａ３４６−３１８での菌糸の３時間の処理は表面の検出可能なＧａｌＮＡｃの完全な消失をもたらした（右上）。菌糸をＤＲＡＱ５で対比染色した（下パネル）。両試料はともにA. fumigatus分生子の同じ密度で植え付け、Ｅｇａ３４６−３１８での処理は結果として付着の消失、すなわち保持された菌糸の消失をもたらしたことに留意することは重要である。
【０３２８】
本開示は現在のところ例とみなされることを参照して記載されてきたが、本開示は開示されている例に限定されないことが理解されるべきである。それとは反対に、本開示は添付の請求項の趣旨と範囲内に含まれるさまざまな修正及び同等の構成をカバーすることを意図する。
【０３２９】
刊行物、特許、及び特許出願はすべて、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照によりその全体が組み込まれることが具体的且つ個々に示された場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３０】
配列表
ＰｓｌＧ３１−４４２（P. aeruginosa  ＰＡＯ１）
ＥＩＱＶＬＫＡＰＲＡＶＶＷＫＤＦＬＧＶＮＡＱＦＬＷＦＳＰＥＲＹＮＫＱＩＤＲＬＱＤＬＧＬＥＷＶＲＬＤＬＨＷＤＲＬＥＴＡＥＤＱＹＱＬＡＳＬＤＱＬＶＫＤＬＥＡＲＱＬＫＳＶＦＹＬＶＧＳＡＲＦＩＴＴＡＰＦＹＳＰＦＱＤＱＹＰＰＲＤＰＥＶＦＡＲＲＭＡＭＬＳＱＲＹＰＳＶＡＡＷＱＶＷＮＥＰＮＬＩＧＦＷＲＰＫＡＤＰＥＧＹＡＫＬＬＱＡＳＴＩＡＬＲＭＶＤＰＥＫＰＶＶＳＡＧＭＡＦＦＳＥＭＰＤＧＲＴＭＦＤＡＬＧＨＬＧＶＥＳＬＧＴＩＡＴＹＨＰＹＴＱＬＰＥＧＮＹＰＷＮＬＤＦＶＳＨＡＮＱＩＮＲＡＬＲＮＡＧＶＰＡＩＷＳＴＥＷＧＷＳＡＹＫＧＰＫＥＬＱＤＩＩＧＶＥＧＱＡＤＹＶＬＲＲＬＡＬＭＳＡＬＤＹＤＲＩＦＬＦＴＬＳＤＬＤＱＲＡＳＶＲＤＲＤＹＧＬＬＤＬＤＡＮＰＫＰＶＹＬＡＬＱＲＦＬＫＶＴＧＰＫＬＲＰＡＤＰＰＶＴＥＤＬＰＤＧＳＦＳＩＧＷＴＲＥＤＧＲＮＶＷＬＦＷＳＡＲＧＧＮＶＲＬＰＫＬＫＥＡＴＬＨＤＰＬＳＧＫＶＴＰＬＳＧＳＤＧＬＥＶＰＶＫＳＳＬＱＭＬＶＷＥ（配列番号１１）
ＰｅｌＡ４７−３０３（P. aeruginosa  ＰＡＯ１）
ＧＧＰＳＳＶＡＦＷＹＡＥＲＰＰＬＡＥＬＳＱＦＤＷＶＶＬＥＡＡＨＬＫＰＡＤＶＧＹＬＫＥＱＧＳＴＰＦＡＹＬＳＶＧＥＦＤＧＤＡＡＡＩＡＤＳＧＬＡＲＧＫＳＡＶＲＮＱＡＷＮＳＱＶＭＤＬＡＡＰＳＷＲＡＨＬＬＫＲＡＡＥＬＲＫＱＧＹＡＧＬＦＬＤＴＬＤＳＦＱＬＱＡＥＥＲＲＥＧＱＲＲＡＬＡＳＦＬＡＱＬＨＲＱＥＰＧＬＫＬＦＦＮＲＧＦＥＶＬＰＥＬＰＧＶＡＳＡＶＡＶＥＳＩＨＡＧＷＤＡＡＡＧＱＹＲＥＶＰＱＤＤＲＤＷＬＫＧＨＬＤＡＬＲＡＱＧＭＰＩＶＡＩＤＹＬＰＰＥＲＲＤＥＡＲＡＬＡＡＲＬＲＳＥＧＹＶＰＦＶＳＴＰＡＬＤＹＬＧＶＳＤＶＥＶＱＰ（配列番号１２）
ＰｅｌＡ３５−２９１（P. protogens  Ｐｆ−５）
ＡＡＰＡＳＶＧＦＷＹＡＥＱＰＰＬＱＥＬＡＱＦＥＷＡＶＶＥＰＧＨＭＡＳＡＤＶＡＴＬＲＫＬＧＳＱＰＦＡＹＬＳＶＧＥＦＤＧＮＲＡＡＬＡＫＱＡＬＡＱＧＡＳＰＶＲＮＫＡＷＤＳＱＶＭＤＩＡＴＰＡＷＲＥＨＬＦＫＲＡＫＡＬＱＤＱＧＹＡＧＬＦＬＤＴＬＤＳＦＱＬＬＰＥＡＤＲＥＰＱＲＫＡＬＡＳＦＬＲＥＬＨＳＲＬＰＮＬＫＬＦＦＮＲＧＦＥＶＬＧＥＬＤＧＶＡＳＡＶＡＶＥＳＩＨＡＧＷＤＡＳＡＫＲＹＲＰＶＳＥＡＤＲＴＷＬＥＧＥＬＫＰＬＲＡＲＮＩＰＬＶＡＩＤＹＬＰＡＮＲＲＥＥＡＲＫＬＶＲＱＬＳＱＥＧＦＩＰＶＶＴＴＰＤＬＮＡＬＳＭＳＴＶＥＶＱＰ（配列番号１３）
ＰｅｌＡ２３-２７７（Geobacter metallireducens）
ＰＰＬＳＶＡＬＹＹＧＫＱＰＰＶＮＤＬＨＡＦＤＩＶＶＩＤＰＤＳＧＬＴＰＳＥＹＧＳＧＲＳＥＬＦＡＹＶＳＶＧＥＡＤＴＡＲＳＹＴＫＱＭＰＤＲＷＩＩＧＫＮＰＶＷＫＳＫＩＶＤＶＳＳＥＥＷＫＱＦＦＬＤＤＶＶＥＰＬＷＱＡＧＹＲＧＦＦＬＤＴＬＤＳＹＬＩＡＡＰＴＥＡＨＰＲＭＥＡＧＬＶＳＶＶＲＡＩＲＱＲＨＰＥＡＲＬＩＬＮＲＧＦＥＩＦＤＲＶＫＤＬＶＹＡＶＡＡＥＳＬＦＱＮＦＮＴＶＳＧＫＹＧＡＶＤＤＫＤＲＳＷＬＴＳＲＬＮＶＩＲＥＴＧＶＰＶＩＡＩＤＹＶＤＰＧＮＲＰＬＭＲＥＴＡＤＫＩＲＳＬＧＦＴＰＷＶＴＤＫＤＬＡＧＬＧＩＧＳＶＥＶＭＰＲＴＶＬＧＬＹＤＧＧＥＧＡＧ（配列番号１４）
ＲａｇＡ６１−３１７（Ralstonia solanacearum  ＧＭＩ１０００）
ＡＤＡＰＮＩＡＷＦＹＧＤＫＰＰＶＡＱＬＲＡＦＤＡＶＶＶＥＰＤＨＧＦＤＰＳＲＡＫＴＰＴＴＱＷＦＡＹＶＳＶＧＥＶＡＰＥＲＲＷＹＫＥＬＰＫＡＷＬＡＧＳＮＡＡＷＡＳＨＶＩＤＱＳＱＰＱＷＰＡＦＹＶＤＲＶＩＡＰＬＷＤＲＧＹＲＧＦＦＬＤＴＬＤＳＹＱＬＶＡＫＤＤＡＡＲＡＡＱＥＡＧＭＶＲＶＩＲＡＩＫＡＲＹＰＥＡＫＬＩＦＮＲＧＦＥＩＬＰＱＶＨＤＬＡＹＡＶＡＦＥＳＬＹＲＡＷＤＱＧＮＫＱＹＲＥＶＮＤＡＤＲＡＷＬＭＧＱＡＲＫＩＱＤＥＹＨＬＰＶＩＳＩＤＹＣＰＰＡＤＲＡＣＡＲＥＴＡＫＲＩＫＡＱＧＬＩＰＹＶＴＤＰＡＬＳＴＩＧＶＧＲＩＥＶＬＰ（配列番号１５）
ＰｇａＢ２２−６７２（Escherichia coli  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５）
ＩＳＱＳＲＴＳＦＩＰＰＱＤＲＥＳＬＬＡＥＱＰＷＰＨＮＧＦＶＡＩＳＷＨＮＶＥＤＥＡＡＤＱＲＦＭＳＶＲＴＳＡＬＲＥＱＦＡＷＬＲＥＮＧＹＱＰＶＳＩＡＱＩＲＥＡＨＲＧＧＫＰＬＰＥＫＡＶＶＬＴＦＤＤＧＹＱＳＦＹＴＲＶＦＰＩＬＱＡＦＱＷＰＡＶＷＡＰＶＧＳＷＶＤＴＰＡＤＫＱＶＫＦＧＤＥＬＶＤＲＥＹＦＡＴＷＱＱＶＲＥＶＡＲＳＲＬＶＥＬＡＳＨＴＷＮＳＨＹＧＩＱＡＮＡＴＧＳＬＬＰＶＹＶＮＲＡＹＦＴＤＨＡＲＹＥＴＡＡＥＹＲＥＲＩＲＬＤＡＶＫＭＴＥＹＬＲＴＫＶＥＶＮＰＨＶＦＶＷＰＹＧＥＡＮＧＩＡＩＥＥＬＫＫＬＧＹＤＭＦＦＴＬＥＳＧＬＡＮＡＳＱＬＤＳＩＰＲＶＬＩＡＮＮＰＳＬＫＥＦＡＱＱＩＩＴＶＱＥＫＳＰＱＲＩＭＨＩＤＬＤＹＶＹＤＥＮＬＱＱＭＤＲＮＩＤＶＬＩＱＲＶＫＤＭＱＩＳＴＶＹＬＱＡＦＡＤＰＤＧＤＧＬＶＫＥＶＷＦＰＮＲＬＬＰＭＫＡＤＩＦＳＲＶＡＷＱＬＲＴＲＳＧＶＮＩＹＡＷＭＰＶＬＳＷＤＬＤＰＴＬＴＲＶＫＹＬＰＴＧＥＫＫＡＱＩＨＰＥＱＹＨＲＬＳＰＦＤＤＲＶＲＡＱＶＧＭＬＹＥＤＬＡＧＨＡＡＦＤＧＩＬＦＨＤＤＡＬＬＳＤＹＥＤＡＳＡＰＡＩＴＡＹＱＱＡＧＦＳＧＳＬＳＥＩＲＱＮＰＥＱＦＫＱＷＡＲＦＫＳＲＡＬＴＤＦＴＬＥＬＳＡＲＶＫＡＩＲＧＰＨＩＫＴＡＲＮＩＦＡＬＰＶＩＱＰＥＳＥＡＷＦＡＱＮＹＡＤＦＬＫＳＹＤＷＴＡＩＭＡＭＰＹＬＥＧＶＡＥＫＳＡＤＱＷＬＩＱＬＴＮＱＩＫＮＩＰＱＡＫＤＫＳＩＬＥＬＱＡＱＮＷＱＫＮＧＱＨＱＡＩＳＳＱＱＬＡＨＷＭＳＬＬＱＬＮＧＶＫＮＹＧＹＹＰＤＮＦＬＨＮＱＰＥＩＤＬＩＲＰＥＦＳＴＡＷＹＰＫＮＤ（配列番号１６）
ＰｇａＢ３１０−６７２（Escherichia coli  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５  ）
ＥＫＳＰＱＲＩＭＨＩＤＬＤＹＶＹＤＥＮＬＱＱＭＤＲＮＩＤＶＬＩＱＲＶＫＤＭＱＩＳＴＶＹＬＱＡＦＡＤＰＤＧＤＧＬＶＫＥＶＷＦＰＮＲＬＬＰＭＫＡＤＩＦＳＲＶＡＷＱＬＲＴＲＳＧＶＮＩＹＡＷＭＰＶＬＳＷＤＬＤＰＴＬＴＲＶＫＹＬＰＴＧＥＫＫＡＱＩＨＰＥＱＹＨＲＬＳＰＦＤＤＲＶＲＡＱＶＧＭＬＹＥＤＬＡＧＨＡＡＦＤＧＩＬＦＨＤＤＡＬＬＳＤＹＥＤＡＳＡＰＡＩＴＡＹＱＱＡＧＦＳＧＳＬＳＥＩＲＱＮＰＥＱＦＫＱＷＡＲＦＫＳＲＡＬＴＤＦＴＬＥＬＳＡＲＶＫＡＩＲＧＰＨＩＫＴＡＲＮＩＦＡＬＰＶＩＱＰＥＳＥＡＷＦＡＱＮＹＡＤＦＬＫＳＹＤＷＴＡＩＭＡＭＰＹＬＥＧＶＡＥＫＳＡＤＱＷＬＩＱＬＴＮＱＩＫＮＩＰＱＡＫＤＫＳＩＬＥＬＱＡＱＮＷＱＫＮＧＱＨＱＡＩＳＳＱＱＬＡＨＷＭＳＬＬＱＬＮＧＶＫＮＹＧＹＹＰＤＮＦＬＨＮＱＰＥＩＤＬＩＲＰＥＦＳＴＡＷＹＰＫＮＤ（配列番号１７）
ＢｐｓＢ２７−７０１（Bordetella bronchiseptica  ＲＢ５０  ）
ＹＫＶＤＭＬＰＰＰＤＰＤＤＧＬＴＦＲＶＬＣＭＨＤＶＲＤＮＬＲＡＳＦＡＤＭＰＤＱＦＡＩＥＴＲＴＬＴＤＬＦＥＷＩＲＶＫＧＦＮＰＩＳＭＱＱＩＩＤＳＲＡＧＶＲＰＬＰＰＲＰＩＬＬＴＦＤＤＧＹＡＳＴＹＴＫＶＦＰＬＬＫＫＦＮＹＰＡＶＶＡＶＶＴＳＷＴＤＡＰＡＧＴＫＩＲＬＳＰＫＩＥＶＰＨＤＦＦＭＴＷＡＱＬＲＥＭＡＱＳＧＬＶＥＬＡＳＨＳＨＮＬＨＲＧＶＬＡＮＰＱＧＮＥＱＰＡＡＳＳＲＱＹＬＰＡＳＧＲＹＥＮＤＡＥＹＲＡＲＶＲＱＤＬＫＴＳＡＤＬＩＲＥＨＴＧＶＴＩＲＳＩＶＷＰＹＧＡＨＮＲＤＴＤＱＶＡＡＥＶＧＬＮＩＧＬＴＬＱＰＧＰＮＴＰＤＶＡＬＴＱＩＲＲＳＬＶＤＹＥＶＮＶＡＴＶＡＲＡＭＲＥＰＶＳＹＨＧＱＶＲＰＩＥＲＩＶＱＶＤＬＤＹＩＹＤＰＤＰＥＱＱＮＲＮＬＧＱＬＩＤＲＭＫＤＬＡＰＳＡＶＹＬＱＡＦＡＤＰＫＧＤＧＤＩＴＥＶＹＦＰＮＲＨＬＰＭＲＡＤＬＦＮＲＶＡＷＱＬＫＴＲＡＧＶＭＶＹＡＷＬＰＶＬＴＦＳＶＰＰＧＮＰＡＹＧＫＶＶＱＳＴＴＲＫＰＧＥＲＧＬＧＳＰＴＲＬＳＰＦＨＰＤＡＨＲＶＩＳＥＩＹＥＤＬＡＫＡＡＨＦＤＧＬＬＦＨＤＤＡＶＬＤＤＴＥＤＳＳＰＥＡＬＡＴＹＱＧＷＧＬＰＰＤＩＡＡＩＲＡＤＰＫＬＡＱＱＷＳＫＧＫＩＲＹＬＩＤＦＴＭＨＬＲＨＩＶＳＧＹＱＮＤＲＤＭＶＶＡＲＮＬＹＡＱＰＶＬＤＰＶＳＥＡＷＹＧＱＳＬＰＥＦＬＫＳＹＤＦＶＡＬＭＡＭＰＮＭＥＧＡＡＲＰＥＱＷＭＲＱＬＶＡＡＶＡＲＱＫＧＬＤＲＴＩＦＥＬＱＡＲＤＷＲＶＧＫＰＩＤＴＥＩＬＲＲＱＭＶＱＬＲＳＬＧＡＩＮＹＧＹＹＰＤＤＦＩＡＮＨＰＤＡＥＡＬＲＤＶＭＳＬＫＳＴＬＥＫＲＲＬＴＫＡＱＥＬＳＲＱＴＴＬＹＧＳＡＳＱＡＥＰＴＱＲ（配列番号１８）
ＢｐｓＢ３１８−６７０（Bordetella bronchiseptica  ＲＢ５０  ）
ＰＩＥＲＩＶＱＶＤＬＤＹＩＹＤＰＤＰＥＱＱＮＲＮＬＧＱＬＩＤＲＭＫＤＬＡＰＳＡＶＹＬＱＡＦＡＤＰＫＧＤＧＤＩＴＥＶＹＦＰＮＲＨＬＰＭＲＡＤＬＦＮＲＶＡＷＱＬＫＴＲＡＧＶＭＶＹＡＷＬＰＶＬＴＦＳＶＰＰＧＮＰＡＹＧＫＶＶＱＳＴＴＲＫＰＧＥＲＧＬＧＳＰＴＲＬＳＰＦＨＰＤＡＨＲＶＩＳＥＩＹＥＤＬＡＫＡＡＨＦＤＧＬＬＦＨＤＤＡＶＬＤＤＴＥＤＳＳＰＥＡＬＡＴＹＱＧＷＧＬＰＰＤＩＡＡＩＲＡＤＰＫＬＡＱＱＷＳＫＧＫＩＲＹＬＩＤＦＴＭＨＬＲＨＩＶＳＧＹＱＮＤＲＤＭＶＶＡＲＮＬＹＡＱＰＶＬＤＰＶＳＥＡＷＹＧＱＳＬＰＥＦＬＫＳＹＤＦＶＡＬＭＡＭＰＮＭＥＧＡＡＲＰＥＱＷＭＲＱＬＶＡＡＶＡＲＱＫＧＬＤＲＴＩＦＥＬＱＡＲＤＷＲＶＧＫＰＩＤＴＥＩＬＲＲＱＭＶＱＬＲＳＬＧＡＩＮＹＧＹＹＰＤＤＦＩＡＮＨＰＤＡＥＡＬＲＤＶＭＳＬＫＳ（配列番号１９）
Ｓｐｈ３５２−２９８（Aspergillus fumigatus  Ａｆ２９３）
ＳＫＶＦＶＰＬＹＶＹＰＡＰＧＡＷＴＰＬＥＤＶＩＳＫＨＰＤＶＮＦＴＶＶＩＮＰＧＳＧＰＧＰＮＡＬＰＤＧＮＹＴＲＥＩＰＫＬＡＳＹＥＮＶＲＬＬＧＹＶＡＴＴＹＡＫＲＮＩＳＬＶＲＲＤＩＥＴＹＡＡＷＰＴＮＳＳＮＰＡＬＡＶＲＧＩＦＦＤＥＴＰＱＱＹＤＥＤＡＬＡＹＬＱＥＬＴＤＶＶＫＮＴＰＧＬＧＰＤＨＹＶＶＨＮＰＧＡＩＰＤＳＲＹＬＳＴＡＤＳＴＶＶＦＥＡＴＹＤＴＦＱＥＲＨＧＡＫＬＦＥＡＩＰＤＳＮＲＳＱＬＣＡＶＩＨＳＶＰＥＳＶＥＧＳＡＬＲＳＬＶＫＱＶＲＫＶＡＤＥＩＦＩＴＨＬＤＴＤＹＹＡＳＦＧＲＱＷＰＥＦＶＤＬＭＧＫ（配列番号２０）
Ｓｐｈ３ＡＣ（５４−３０４）（Aspergillus clavatus  ＮＲＲＬ  １）
ＭＧＰＫＳＫＶＦＶＰＬＹＶＹＰＡＰＧＡＷＤＰＬＥＤＶＩＳＫＨＰＤＶＮＦＴＶＶＩＮＰＧＳＧＰＧＰＥＡＬＰＤＧＮＹＴＲＥＩＰＫＬＡＳＹＥＮＶＲＬＬＧＹＶＡＴＴＹＡＫＲＮＩＳＥＶＲＲＤＩＥＴＹＡＡＷＰＴＱＳＳＮＡＮＬＡＶＲＧＩＦＦＤＥＴＰＱＱ  ＹＤＡＤＩＬＡＹＬＲＥＬＴＤＶＶＫＧＴＳＧＬＧＰＤＨＹＶＶＨＮＰＧＡＩＰＤＳＲＹＬＳＴＡＤＳＴＶＶＦＥＡＴＹＡＴＦＱＥＲＨＧＡＥＬＦＤＴＩＰＤＳＨＲＤＱＬＣＡＶＩＨＳＶＰＴＳＶＥＧＳＤＬＲＧＬＶＫＱＶＲＱＶＡＤＥＩＦＩＴＨＬＥＴＤＹＹＡＧＦＧＧＱＷＳＥＦＶＤＬＭＡＳ（配列番号２２）
Ｓｐｈ３ＡＮ（４３−２９９）（Aspergillus nidulans  ＦＧＳＣ  Ａ４）
ＲＲＫＮＮＮＭＧＰＫＡＫＶＦＶＰＬＹＶＹＰＡＰＧＡＷＤＰＬＶＮＶＩＴＡＨＰＤＶＮＦＴＶＶＶＮＰＧＳＧＰＧＰＮＰＬＰＤＲＮＹＴＱＥＩＰＲＬＴＡＨＤＮＶＲＶＬＧＹＶＡＴＴＹＡＫＲＮＩＳＳＶＲＮＤＩＥＴＹＡＡＷＰＴＩＳＡＮＰＫＬＡＶＲＧＩＦＦＤＥＴＰＱＱＹＮＡＳＤＬＡＹＬＥＥＬＴＳＶＶＫＮＴＰＧＬＧＰＤＨＦＶＦＨＮＰＧＶＶＰＤＰＲＹＬＳＴＡＤＳＴＶＶＦＥＡＴＹＤＴＦＱＤＲＤＧＡＲＬＦＥＴＩＰＮＳＮＲＳＱＬＣＡＶＶＨＳＶＰＤＳＶＥＧＳＥＬＲＫＦＶＫＱＡＲＲＶＡＤＥＩＦＶＴＨＬＳＴＮＹＹＡＳＦＧＤＫＷＤＤＦＶＲＬＭＡＱ（配列番号２３）
Ｅｇａ３４６−３１８Aspergillus fumigatus  Ａｆ２９３）
ＧＬＧＧＧＧＧＧＥＧＥＥＧＳＧＧＥＴＴＰＰＥＧＮＹＴＴＡＫＷＱＰＡＶＧＴＫＷＱＩＥＬＬＹＡＬＮＤＴＳＶＤＡＥＩＹＤＩＤＬＦＩＮＤＫＳＴＩＡＧＬＱＲＡＧＲＫＶＩＣＹＦＳＡＧＳＹＥＮＷＲＰＤＫＤＫＦＫＤＳＤＬＧＨＤＬＤＤＷＰＧＥＫＷＬＮＩＳＳＡＮＶＲＱＩＭＬＤＲＬＤＭＡＲＤＫＧＣＤＧＶＤＰＤＮＶＤＧＹＤＮＤＮＧＬＤＬＴＱＡＤＳＩＳＦＶＮＦＬＡＮＡＡＨＡＲＮＭＳＩＧＬＫＮＡＧＤＩＩＰＳＶＩＫＮＭＱＷＳＶＮＥＱＣＡＱＹＮＥＣＤＴＹＡＶＦＰＱＮＧＫＰＶＦＨＩＥＹＰＫＧＤＫＴＮＮＤＬＳＶＴＡＳＱＫＮＡＡＣＤＦＡＧＳＡＮＦＳＴＶＩＫＮＭＮＬＮＮＷＶＥＹＣ（配列番号２１）
【０３３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８ＢＣＤ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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