(57)【要約】目的の核酸で覆われたミクロスフェアを所望されないミクロスフェアおよび／または分子から分離するための方法を記載する。これらの分離は、核酸またはミクロスフェア間の非特異的相互作用の存在によって悪影響を受けることがある。分析物を含有する粒子集団の濃縮を改善するための方法および組成物を開示する。この技法には、クローン的に増幅された鋳型を有するビーズを濃縮することを含めた多くの使用が見出され、こうしたものは核酸配列決定を含めた様々なアッセイで使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）複数の増幅用ビーズ、増幅試薬、前記ビーズ上に固定化された第１のプライマー、溶液中の第２のプライマー、および鋳型；ｉｉ）前記増幅用ビーズと異なる、濃縮用ビーズ、ならびにｉｉｉ）一本鎖特異的ヌクレアーゼを用意するステップ；
ｂ）加工されたビーズを作出するために、前記増幅用ビーズの少なくとも一部上の前記鋳型の少なくとも一部を増幅するような条件に、前記増幅用ビーズを曝露するステップ；
ｃ）処理されたビーズを作出するために、前記加工されたビーズを前記一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理するステップ；ならびに
ｄ）前記処理されたビーズを前記濃縮用ビーズと接触させ、増幅された鋳型を含む前記処理されたビーズが、ビーズ複合体集団を作製するように前記濃縮用ビーズに結合し、それによって増幅された核酸を回収するステップ
を含む、増幅された核酸を回収する方法。
【請求項２】
ステップｄ）において、増幅された鋳型を含まない前記処理されたビーズが前記濃縮用ビーズに結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｄ）の前記処理されたビーズの一部がビオチンで標識された増幅産物を含み、前記濃縮用ビーズがストレプトアビジンで被覆されたミクロスフェアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ビオチンで標識された増幅産物を作出するために、ビオチンが、ステップｂ）の増幅中に前記増幅産物中に導入された、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ビオチンで標識された増幅産物を作出するために、ビオチン標識オリゴヌクレオチドが、ステップｃ）の後で前記増幅産物にハイブリダイズされた、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅試薬がＰＣＲ試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ）ｉ）１つまたは複数の水性区画を油中に含むエマルジョンであって、前記区画の少なくとも一部がＰＣＲ試薬、エマルジョンビーズ上に固定化された第１のプライマー、溶液中の第２のプライマー、および鋳型を含む、エマルジョン；ｉｉ）前記区画中の前記エマルジョンビーズとは異なる、濃縮用ビーズ、ならびにｉｉｉ）一本鎖特異的ヌクレアーゼを用意するステップ；
ｂ）前記区画の少なくとも一部中の前記エマルジョンビーズの少なくとも一部上の前記鋳型の少なくとも一部を増幅するような条件に、前記エマルジョンを曝露するステップ；
ｃ）前記エマルジョンを、前記エマルジョンビーズが回収されるような条件下で破壊するステップ；
ｄ）処理されたビーズを作出するために、前記回収されたエマルジョンビーズを前記一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理するステップ；ならびに
ｅ）前記処理されたビーズを前記濃縮用ビーズと接触させることによって、増幅された鋳型を含む処理されたビーズを濃縮するステップであって、増幅された鋳型を含む前記処理されたビーズが、処理されたビーズ−濃縮用ビーズ複合体集団を作製するように前記濃縮用ビーズに結合する、ステップ
を含む、濃縮方法。
【請求項８】
ステップｅ）において、増幅された鋳型を含まない前記処理されたビーズが、前記濃縮用ビーズに結合しない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップｅ）の前記処理されたビーズの一部分がビオチンで標識された増幅産物を含み、前記濃縮用ビーズがストレプトアビジンで被覆されたミクロスフェアを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビオチンで標識された増幅産物を作出するために、ビオチンが、ステップｂ）の増幅中に前記増幅産物中に導入された、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ビオチンで標識された増幅産物を作出するために、ビオチン標識オリゴヌクレオチドが、ステップｃ）の後で前記増幅産物にハイブリダイズされた、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ｆ）増幅された鋳型を含まない前記処理されたビーズの大部分が捕捉されないような条件下で、前記複合体集団の少なくとも一部を捕捉するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｆ）における前記捕捉がサイズ選択を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サイズ選択が密度遠心分離を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイズ選択が、表面上に前記複合体集団の少なくとも一部を捕捉することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面がフィルターの表面を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記フィルターが、単層のナイロンメッシュである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィルターがスピンカラム内に配置される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記捕捉されないビーズの前記フィルターの通過を促進するために、前記スピンカラムがステップｆ）の間に遠心分離される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記濃縮用ビーズが、前記エマルジョンビーズとサイズが異なる、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
前記濃縮用ビーズが、前記エマルジョンビーズより少なくとも５倍、最大で１００倍大きい、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップｇ）：増幅された鋳型を含む前記処理されたビーズを前記濃縮用ビーズから分離するために、増幅された鋳型を含む前記処理されたビーズの大部分が前記濃縮用ビーズから分離するような条件に前記複合体集団を供するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分析物を含有する粒子集団の濃縮を改善するための方法および組成物を開示する。この技法には、クローン的に増幅された鋳型を有するビーズを濃縮することを含めた多くの使用が見出され、こうしたものは核酸配列決定を含めた様々なアッセイで使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
同一の配列決定の実行の中で数百万から数億のリードを生成することができる、次世代配列決定（ＮＧＳ）、すなわち超並列配列決定は、研究および臨床分野で既に非常に多くの用途が見出されてきた新技術である。すべての次世代配列決定方法は、配列決定前に予め核酸断片をクローン増幅することを必要とする。これを実現するために、主要な供給業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａを除く）からのＮＧＳプラットフォームの大半は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による、ミクロスフェアに基づく核酸のクローン増幅を採用している。
【０００３】
単一のライブラリー分子が単一のミクロスフェア上で増幅されることを実現するために、統計的に液滴当たり１つのビーズおよび１つ未満のライブラリー分子を含有する（これによって２つのライブラリー分子を含有する液滴がないことが保証される）マイクロエマルジョンが生成される（エマルジョンＰＣＲ）。結果として、幾らかのミクロスフェアにはエマルジョンＰＣＲの後に増幅産物を欠く（以降、「ヌルビーズ」と呼ぶ）。続くＮＧＳ配列決定反応が確実に高スループットであるようにするために、これらのヌルビーズは「濃縮」と呼ばれるプロセスによって減損され、このプロセスでは、増幅産物含有ミクロスフェア（以降、「実ビーズ」（ｌｉｖｅ  ｂｅａｄ）と呼ぶ）がアフィニティ精製される。
【０００４】
求められているものは、より多くの数の実ビーズが回収されるように、濃縮を向上させる方法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
分析物を含有する粒子集団の濃縮を改善するための方法および組成物を開示する。この技法には、クローン的に増幅された鋳型を有するビーズを濃縮することを含めた多くの使用が見出され、こうしたものは核酸配列決定を含めた様々なアッセイで使用することができる。
【０００６】
ミクロスフェアは、基礎生物学の研究、生物医学の研究、応用検査（ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ）、および分子診断の分野における、核酸に基づく用途のための手段として汎用されている。用途として、ミクロスフェアの表面上でのポリメラーゼ連鎖反応法または他の増幅方法による特定のＤＮＡ断片のクローン増幅、およびハイブリダイゼーションに基づく方法による核酸／オリゴ−コンジュゲートミクロスフェアを有する核酸の特異的単離が挙げられるが、これらに限定されない。上の用途の場合の肝心なステップは、目的の核酸で覆われたミクロスフェアを、所望されないミクロスフェアおよび／または分子から分離することである。これらの分離は、核酸またはミクロスフェア間の非特異的相互作用の存在によって悪影響を受けることがある。
【０００７】
ここでは、核酸および／または核酸で覆われたミクロスフェアをミクロスフェアに基づいて単離する間の非特異的相互作用を低減させることによって、それぞれの方法の効率および有効性を改善することができる新規な方法について記載する。本方法は、捕捉用ミクロスフェア（ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）との非特異的結合を引き起こす恐れのある非標的核酸を特異的に分解する一方で、標的核酸は元のままの状態に保つ酵素反応を利用することによって、標的核酸、または標的核酸を含有するミクロスフェアを捕捉する効率および特異性を強化する。
【０００８】
本発明の１つの具体的な用途は、ＮＧＳ用途において、増幅産物で覆われたミクロスフェア（以降、「実ビーズ」と呼ぶ）を、増幅産物で覆われていないミクロスフェア（以降、「ヌルビーズ」と呼ぶ）から濃縮する効率を増大させることである。一実施形態では、実／ヌルビーズ混合物は、ヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない）で前処理される。一実施形態では、本発明は、ビオチン化された実ビーズをストレプトアビジンで被覆されたミクロスフェア（以降、「捕捉用ビーズ（ｃａｐｔｕｒｅ  ｂｅａｄ）」または「濃縮用ビーズ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｂｅａｄ）」と呼ぶ）によって濃縮する前に、一本鎖ＤＮＡからヌクレオチドを３’から５’の方向に取り除くことを触媒するエキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ）を使用することを企図する。一実施形態では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼ、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼからなる群から選択される。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）複数の増幅用ビーズ、増幅試薬、第１のプライマー（例えば、溶液中にあるまたは前記ビーズ上に固定化されている）、第２のプライマー（例えば、第１のプライマーがビーズ上に固定化されているときは、溶液中にあることが好ましい）、および鋳型；ｉｉ）前記増幅用ビーズとは異なる、濃縮用ビーズ、ならびにｉｉｉ）一本鎖特異的ヌクレアーゼを用意するステップ；ｂ）加工されたビーズを作出するために、前記増幅用ビーズの少なくとも一部上の前記鋳型の少なくとも一部を増幅するような条件に、前記増幅用ビーズを曝露するステップ；ｃ）処理されたビーズを作出するために、前記加工されたビーズを前記一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理するステップ；ならびにｄ）前記処理されたビーズを前記濃縮用ビーズと接触させ、増幅された鋳型を含む前記処理されたビーズが、ビーズ複合体集団を作製するように前記濃縮用ビーズに結合し、それによって増幅された核酸を回収するステップ
を含む、増幅された核酸を回収する方法を企図する。
【００１０】
一実施形態では、ステップｄ）において、増幅された鋳型を含まない前記処理されたビーズは、前記濃縮用ビーズに結合しない。一実施形態では、ステップｄ）の前記処理されたビーズの一部分はビオチンで標識された増幅産物を含み、前記濃縮用ビーズは、ストレプトアビジンで被覆されたミクロスフェアを含む。一実施形態では、前記ビオチンで標識された増幅産物を作出するために、ビオチンが、ステップｂ）の増幅中に前記増幅産物中に導入される。別の実施形態では、前記ビオチンで標識された増幅産物を作出するために、ビオチン標識オリゴヌクレオチドが、ステップｃ）の後で前記増幅産物とハイブリダイズされた。一実施形態では、前記増幅試薬はＰＣＲ試薬を含む。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）１つまたは複数の水性区画を油中に含むエマルジョンであって、前記区画の少なくとも一部がＰＣＲ試薬、エマルジョンビーズ上に固定化された第１のプライマー、溶液中の第２のプライマー、および鋳型を含む、エマルジョン；ｉｉ）前記区画中の前記エマルジョンビーズとは異なる、濃縮用ビーズ、ならびにｉｉｉ）一本鎖特異的ヌクレアーゼを用意するステップ；ｂ）前記区画の少なくとも一部中の前記エマルジョンビーズの少なくとも一部上の前記鋳型の少なくとも一部を増幅するような条件に、前記エマルジョンを曝露するステップ；ｃ）前記エマルジョンを、前記エマルジョンビーズが回収されるような条件下で破壊するステップ；ｄ）処理されたビーズを作出するために、前記回収されたエマルジョンビーズを前記一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理するステップ；ならびにｅ）前記処理されたビーズを前記濃縮用ビーズと接触させることによって、増幅された鋳型を含む処理されたビーズを濃縮するステップであって、増幅された鋳型を含む前記処理されたビーズが、処理されたビーズ−濃縮用ビーズ複合体集団を作製するように前記濃縮用ビーズに結合するステップを含む、濃縮方法を企図する。好ましい実施形態では、ステップｅ）において、増幅された鋳型を含まないエマルジョンビーズは、前記濃縮用ビーズに結合しない。
【００１２】
本発明がエマルジョンビーズの性質によって制限されることは意図していない。様々な種類のビーズを使用することができる。一実施形態では、前記エマルジョンビーズは磁性である。
【００１３】
エマルジョンが破壊される方法によって本発明が制限されることは意図していない。一実施形態では、エマルジョンはイソプロパノールを使用して破壊される。
【００１４】
一実施形態では、本方法は、ｆ）増幅された鋳型を含まない前記エマルジョンビーズの大部分が捕捉されないような条件下で、前記複合体集団の少なくとも一部を捕捉するステップをさらに含む。一実施形態では、ステップｆ）における捕捉は、サイズ選択を含む。一実施形態では、前記サイズ選択は、密度遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を含む。一実施形態では、前記サイズ選択は、表面上に前記複合体集団の少なくとも一部を捕捉することを含む。一実施形態では、前記表面は、フィルターの表面を含む。一実施形態では、前記フィルターは、単層のナイロンメッシュである。一実施形態では、前記フィルターはスピンカラム内に配置される。一実施形態では、前記捕捉されないエマルジョンビーズの前記フィルターの通過を促進するために、前記スピンカラムはステップｆ）の間に遠心分離される。
【００１５】
一実施形態では、前記濃縮用ビーズは、前記エマルジョンビーズとサイズが異なる。一実施形態では、前記濃縮用ビーズは、前記エマルジョンビーズより少なくとも５倍、最大で１００倍大きい。
【００１６】
一実施形態では、本方法は、ステップｆ）の後に、ｇ）増幅された鋳型を含む前記エマルジョンビーズを前記濃縮用ビーズから分離するために、増幅された鋳型を含む前記エマルジョンビーズの大部分が前記濃縮用ビーズから分離するような条件に前記複合体集団を供するステップをさらに含む。実ビーズを濃縮用ビーズから分離するための何らかの特定の条件に、本発明が制限されることは意図していない。一実施形態では、変性条件が使用される。一実施形態では、分離のためにＮａＯＨ変性が使用される。一実施形態では、前記エマルジョンビーズは磁性であり、前記エマルジョンビーズは（前記濃縮用ビーズから分離されたら）磁石に曝露される。
【００１７】
一実施形態では、エマルジョンビーズは、同一の分離デバイス（例えばスピンフィルター）を使用し、増幅されたビーズと濃縮用ビーズの間の相互作用を断つ遊離溶液を使用して遊離される。例えば、捕捉された濃縮用ビーズに付着したエマルジョンビーズを有するスピンフィルターは、新たなチューブ（例えばスピンカラム）に移される。遊離溶液をアプライした後、このチューブを遠心分離すると、増幅産物を有するビーズが溶出し、チューブの底に移動する。濃縮用ビーズは、フィルターに捕集されたままである。増幅産物を有するビーズを収集し、捕集された濃縮用ビーズを有するフィルターを廃棄する。
【００１８】
濃縮された実ビーズが引き続きどのように使用されるかに、本発明が制限されることは意図していない。一実施形態では、濃縮されたビーズ上の増幅産物は、配列決定される。一実施形態では、濃縮されたビーズは、合成による配列決定のためにフローセルに架橋結合される。
【００１９】
濃縮用ビーズがどのようにエマルジョンビーズを捕捉するかによって、本発明が制限されることは意図していない。一実施形態では、ステップｅ）の前記エマルジョンビーズの一部分は、ビオチンで標識された増幅産物を含み、前記濃縮用ビーズは、ストレプトアビジンで被覆されたミクロスフェア（またはニュートラアビジンで被覆されたビーズ）を含む。増幅産物がビオチン標識化される方法によって、本発明が制限されることは意図していない。一実施形態では、前記ビオチンで標識された増幅産物を作出するために、ビオチンが、ステップｂ）の増幅中に前記増幅産物中に導入される（例えば、１つまたは複数のビオチン標識プライマーを使用することによって）。一実施形態では、エマルジョンＰＣＲ用の、ビオチン化フォワードプライマーはビーズ上にあり、リバースプライマーは溶液中にある。一実施形態では、前記ビオチンで標識された増幅産物を作出するために、ビオチン標識オリゴヌクレオチドが、ステップｃ）の後で前記増幅産物にハイブリダイズされる。
【００２０】
一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが、エマルジョンＰＣＲ後に実ビーズの濃縮プロトコールに適用される場合、本方法によって濃縮が有意に改善される。エキソヌクレアーゼＩ処理ステップをＧｅｎｅＲａｄ  ＱＩＡｃｕｂｅで実施すれば、現行の機器を著しく変更する必要はない。さらに、他のワークフローおよびエマルジョンＰＣＲの実ビーズ濃縮全般に適用できる可能性がある。
【００２１】
一実施形態では、上に記載した様々な方法およびプロセスが自動化される。例えば、濃縮方法は、自動化試料加工システムを使用して行われてもよい。システムは、特定の仕事、例えば遠心分離のための領域を有していてもよく、そこへおよびそこから、材料、例えばビーズを含有するチューブがロボットアームなどによって移される。この領域は、プラットフォーム、引出し、またはデッキを有していてもよい。Ｑｉａｇｅｎから市販されるＱＩＡｃｕｂｅは、方法ステップのすべてまたは一部分を人間の介入を限定的なものにして行うようにプログラムすることができる、自動化された遠心分離機およびピペット操作システムを備えている。
【００２２】
何らかの特定の自動化システムまたはデバイスに制限されることを意図しているものではないが、システムまたはデバイスはデッキを含んでもよく、デッキは、着脱可能に構成することもできる複数の試料担体構成要素を含むものである。試料担体は、１つの部分としてのまたは部分間での移動および着脱が両方とも可能であってもよい。試料担体は、温度サイクルおよび増幅を可能とするサーモブロックの上方に配置されてもよい。このデッキを後で除去して、磁石の上方に配置された試料担体と入れ替え、磁性粒子、例えば磁性ビーズを容易に分離できるようにしてもよいと考えられる。
【００２３】
試料加工制御システムは、１つまたは複数のチューブまたはプレート（例えばマイクロタイタープレート）を１つまたは複数のプロトコールに従って加工することができるように、試料加工システムを自動化してもよい。この試料加工は、１つまたは複数のサンプリングプロトコールおよびステップ、例えば、（これらに限定されないが）試薬の添加、混合、遠心分離、上清の除去、洗浄緩衝液の添加、再度の遠心分離、上清の除去、ピペット操作などを含んでもよい。
【００２４】
自動加工デバイスは、ロボット動作、一部の実施形態ではデカルト動作を有する、ロボットアームを含んでもよい。アームは、１つまたは複数の構成要素、例えば、シリンジ、ピペットまたはプローブ、センサー構成要素容量の流体（ｓｅｎｓｏｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｖｏｌｕｍｅ  ｆｌｕｉｄ）および／または空気アプリケーター（ａｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ）を含んでもよい。シリンジ、ピペットまたはプローブは、貯留槽または他の容器と流体的に接続されてもよく、リンス剤（例えば緩衝液など）、変性試薬（ＤＮＡ二重鎖を分離するため）、追加材料（ビーズなど）のうち１つまたは複数をアプライしてもよい。シリンジ、ピペットまたはプローブは、試薬を吸引するための、例えば、上清を吸引するための真空装置またはポンプと流体的に接続されてもよい。
【００２５】
試料加工システムは、ある程度まで所望の結果を実現する、事象の適正な順序を実現するように構成される。この順序をある程度まで自動化した様式で実現することにおいて、試料加工システムは自動化試料加工システムとみなされ、少なくとも１つの試料の自動加工を実現する。この自動化された順序だけでなく本発明の他の態様も、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの幾つかの組合せによって制御して、人間がほとんど介入することなく所望の順序を達成してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本明細書において、「増幅産物」は、増幅反応の産物である。増幅産物は、典型的には二本鎖であるが、所望であれば一本鎖にすることができる。増幅産物は、核酸標的の任意の適切なセグメントまたは全長に相当する。
【００２７】
本明細書において、「粒子」は、様々な形状、例えば、球状（例えばビーズ）、カプセル、多面体などであってもよい、小さな個々の物体を指す。粒子は、巨視的であっても、微視的、例えば、微小粒子またはナノ粒子であってもよい。粒子は、非磁性であっても磁性であってもよい。磁性粒子は、強磁性体を含んでもよく、強磁性体は、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、酸化鉄などであってもよい。
【００２８】
本明細書で使用される「ビーズ」は、幾つの数の公知の材料から製作されてもよい。かかる材料の例として、無機物、天然ポリマー、および合成ポリマーが挙げられる。これらの材料の具体例として、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドとのコポリマー、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然海綿、シリカゲル、制御孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、金属、架橋デキストラン（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標））、アガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））、および当業者に公知の他の固相支持体が挙げられる。好ましい実施形態では、エマルジョンビーズは、直径およそ１ミクロンのビーズである。
【００２９】
本発明で使用するために、付着した核酸の鋳型のある又はないエマルジョンビーズは、熱安定性の油中水型エマルジョン中に懸濁される。微小液滴集団の一部分は、１つの鋳型および１つのビーズだけを含むことが企図される。鋳型を含有しないまたはビーズを含有しない液滴が多く存在する可能性がある。同様に、鋳型のコピーを複数含有する液滴も存在する可能性がある。エマルジョンは、当技術分野で公知の任意の適切な方法に従って形成してもよい。エマルジョンを作出する一方法を以下に記載するが、エマルジョンを作製する任意の方法を使用してもよい。これらの方法は当技術分野で公知あり、これらの方法として、アジュバント法、向流法、逆流法、回転ドラム法、および膜法が挙げられる。さらに、マイクロカプセルのサイズは、構成成分の流量および流速を変えることによって調節してもよい。例えば、滴加において、液滴のサイズおよび総送達時間を変えてもよい。好ましくは、エマルジョンは、１マイクロリットル当たりに封入されたビーズ約１０，０００から１，０００，０００個の間の密度を含有する。この数は、ミクロスフェア、液滴のサイズ、およびエマルジョン相の比率（すなわち、油対水性）に応じて異なる。
【００３０】
本明細書に記載する通り、増幅後にエマルジョンは「破壊」される（当技術分野で「解乳化（de-emulsification）」とも呼ばれる）。エマルジョンを破壊する多くの方法がある。エマルジョンを破壊するための先行技術で公知のプロセスとして、無機または有機解乳化剤（de-emulsifier）を使用するプロセス、およびエマルジョンを機械的に処理するプロセスが挙げられる。エマルジョンを破壊する好ましい一方法は、追加の油を使用してエマルジョンを２つの相に分離させる。次いで油相を除去し、適切な有機溶媒を添加する。混合した後、油／有機溶媒相を除去する。このステップは何回か繰り返してもよい。最後に、ビーズの上の水層を除去する。次いで、ビーズを有機溶媒とアニーリング緩衝液（例えば、１つの適切なハイブリダイゼーション緩衝液または「アニーリング緩衝液」は、以降の実施例に記載する）との混合物で洗浄し、再びアニーリング緩衝液中で洗浄する。適切な有機溶媒として、アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。別の実施形態では、エマルジョンは水性相と油／界面活性剤を両方とも可溶化させる有機相を添加することによって破壊され、この均質溶液が遠心分離または磁気分離の後に除去される。通常、次いで追加の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）を有する水性緩衝液、例えばＰＢＳを用いる洗浄によって後処理を行う。
発明の説明
【００３１】
分析物を含有する粒子集団の濃縮を改善するための方法および組成物を開示する。この技法には多くの使用が見出され、このような使用として、クローン的にＰＣＲ増幅された鋳型（「実ビーズ」）を有するエマルジョンビーズの濃縮、所望のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基配列を有するビーズの濃縮、ならびにミクロスフェアを有する特定のＤＮＡおよびＲＮＡ標的の捕捉が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを採用することによって、クローン的に増幅された核酸の濃縮を改善するための方法を企図する。一実施形態では、本発明は、親和性に基づく核酸含有ミクロスフェアの単離の特異性を増大させるため、および核酸含有ミクロスフェアの非特異的なビーズ間相互作用を減少させるための、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩなどのエキソヌクレアーゼの使用を企図する。Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼ（Exonulcease）Ｉは、一本鎖ＤＮＡからヌクレオチドを３’から５’の方向に取り除くことを触媒する、高度にプロセッシブな酵素である。それによって、溶液中にまたはミクロスフェアに結合して存在し、非特異的相互作用を引き起こす恐れのある、一本鎖ＤＮＡ断片（例えばＰＣＲプライマー）は特異的に分解されるが、その一方で、相互作用および単離を媒介する二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは影響を受けない。
【実施例】
【００３３】
プライマーがコンジュゲートしたミクロスフェア（ＬｉｆｅＴｅｃｈから購入したＭｙＯｎｅストレプトアビジン被覆磁性ビーズをビスビオチン化フォワードプライマーで飽和させたもの）上での固相エマルジョンＰＣＲによって、ＮＧＳライブラリーをクローン的に増幅した。簡潔に述べると、ＰＣＲ微小区画（エマルジョン）を生成するために、ビーズ、ＰＣＲ構成成分およびわずかに希釈した鋳型をＧｅｎｅＲｅａｄ  ＱｉａＣｕｂｅで油相と混合し、乳化させた。次いで、エマルジョンをＰＣＲに供した。ＰＣＲに次いで、すべての油相区画を除去した後、ミクロスフェアのおよそ１０％が鋳型ＤＮＡを含有していた。鋳型を含有するミクロスフェアの単離を容易にするため、エマルジョンＰＣＲの間に生成された増幅産物に特異的なビオチン標識オリゴヌクレオチド（エマルジョンＰＣＲの間またはハイブリダイゼーションによって追加した）を使用した。
【００３４】
次に濃縮実験を行い、その実験では、ビオチンで標識された増幅産物を有するミクロスフェアを、ストレプトアビジンで被覆されたポリスチレンビーズを使用して単離した。エキソヌクレアーゼＩの効果は、エマルジョンＰＣＲの間に生成されたミクロスフェアを、エキソヌクレアーゼ緩衝液中２Ｕ／μｌのエキソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２９３Ｌ）またはエキソヌクレアーゼ緩衝液のみを用いて、以下の条件で前処理することによって試験した。
−  ビーズ（磁気スタンド上で溶液／上清を除去した後）
１０μｌ  １０×ＥｘｏＩ反応緩衝液（ＮＥＢ）
１０μｌ  エキソヌクレアーゼＩ（２０Ｕ／μｌ）
８０μｌ  Ｈ２Ｏ
−  インキュベーション条件：３７℃で１時間
【００３５】
表１に示すように、エキソヌクレアーゼＩで処理すると、増幅産物を持つミクロスフェアの濃縮の特異性が有意に改善した。表１中のデータについて、実ビーズはＦＡＣＳ分析によって検出された。
【表１】
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【国際調査報告】
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