(57)【要約】  標的核酸を検出するための方法およびキットであって、増幅されている核酸を常磁性ビーズなどの粒子と組み合わせることにより、目視検査によって検出され得る凝集複合体が形成される、方法およびキットが提供される。検出することができる核酸試料の量は、数マイクロリットルほどの低い量である。この方法は、標的核酸が存在するかしないかを迅速に判断するために、現地または臨床現場での診断に応用することができる。標的核酸のメチル化ステータスも決定することができる。この方法およびキットは、植物および動物における病気の検出、環境試験、ならびに食物および他の食用製品の汚染の試験への一般的な適用可能性を有し得る。
2017501719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を検出する方法であって、単離核酸と粒子とを組み合わせるステップを含み、前記単離核酸および前記粒子は、目視検査によって検出され得る複合体を形成可能である、方法。
【請求項２】
核酸を検出するためのキットであって、単離核酸との複合体を形成可能な粒子を含み、前記複合体は目視検査によって検出可能である、キット。
【請求項３】
核酸配列増幅用の酵素と、核酸配列増幅用の１つまたは複数のプライマーと、磁石と、核酸抽出用の１つまたは複数の試薬と、フィルタと、１つまたは複数の反応容器とのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記複合体は、前記核酸と前記粒子とのフロキュレーションによって形成される、請求項１に記載の方法、または請求項２または３に記載のキット。
【請求項５】
核酸の存在または相対量は、フロキュレーションが存在しないこと、またはその核酸が存在しない場合、その核酸の量が相対的に少ない場合、もしくはその核酸の濃度が相対的に低い場合において観察されるフロキュレーションと比べ、フロキュレーションが相対的に減少することによって表される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項６】
前記粒子は常磁性粒子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項７】
前記常磁性粒子はＳＰＲＩ粒子である、請求項６に記載の方法またはキット。
【請求項８】
フロキュレーションはフロキュレーション緩衝液中において起こる、請求項７に記載の方法またはキット。
【請求項９】
前記フロキュレーション緩衝液は、（ｉ）ｐＨ７未満、（ｉｉ）約ｐＨ３．６〜５．５、または（ｉｉｉ）約ｐＨ４．４である、請求項８に記載の方法またはキット。
【請求項１０】
前記フロキュレーション緩衝液のｐＨは、フロキュレーション後に半定量のために滴定される、請求項８に記載の方法またはキット。
【請求項１１】
核酸−粒子複合体の視覚的検出を容易にするか、補助するか、または向上させるための呈色剤をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項１２】
前記核酸は、標的核酸の核酸配列増幅によって生成される増幅産物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項１３】
核酸配列増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものである、請求項１２に記載の方法またはキット。
【請求項１４】
核酸配列増幅は、等温核酸配列増幅によるものである、請求項１２に記載の方法またはキット。
【請求項１５】
等温核酸配列増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である、請求項１４に記載の方法またはキット。
【請求項１６】
前記増幅産物は、ステップ（ａ）標的核酸を含む核酸試料の重力濾過、ステップ（ｂ）粒子への前記標的核酸の結合、およびステップ（ｃ）前記粒子からの前記標的核酸の溶離からなる連続したステップによって得られた前記標的核酸から増幅される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）における標的核酸の量は約５〜１０μＬである、請求項１６に記載の方法またはキット。
【請求項１８】
病原性生物または非病原性生物の検出に使用されるための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項１９】
前記病原性生物は植物の病原体である、請求項１８に記載の方法またはキット。
【請求項２０】
前記病原性生物はヒトまたは他の動物の病原体である、請求項１８に記載の方法またはキット。
【請求項２１】
病気または状態に関連する１つまたは複数のバイオマーカを検出するために使用される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のバイオマーカは、腫瘍抗原もしくはマーカ、腫瘍サプレッサ遺伝子、またはその両方を含む、請求項２１に記載の方法またはキット。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のバイオマーカは、ヌクレオチド配列多型を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたは複数のバイオマーカは、１つまたは体細胞突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、またはその両方を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つまたは複数のバイオマーカは、エピジェネティックなイベントであるか、または前記エピジェネティックなイベントと関連する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記エピジェネティックなイベントは、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡヒドロキシメチル化、またはその両方のイベントを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記病気または前記状態は、がん、腫瘍、リンパ腫、白血病、および他の悪性腫瘍と、感染症と、炎症性疾患と、自己免疫疾患と、呼吸器系疾患と、消化器系疾患と、神経系疾患と、生殖器系疾患と、精神疾患とのうちの１つ以上を含む、請求項２１または２２に記載の方法またはキット。
【請求項２８】
前記方法は、環境試料または環境ソース中の前記核酸を検出するために使用される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項２９】
前記環境試料または前記環境ソースは、水と、空気と、土壌試料とのうちの１つ以上である、請求項２８に記載の方法またはキット。
【請求項３０】
前記水の試料は、廃水、廃液、またはその両方である、請求項２９に記載の方法またはキット。
【請求項３１】
前記廃水または前記廃液は、下水、雨水、鉱業または工業廃水である、請求項３０に記
載の方法またはキット。
【請求項３２】
前記水の試料は、飲料水、スイミングプールの水、河、小川、湖、池、または海水である、請求項２９に記載の方法またはキット。
【請求項３３】
食物、飲料、または他の消耗品試料中の前記核酸を検出するために使用される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出に関する。より詳細には、本発明は、比較的少量の核酸試料を使用した核酸の迅速な検出に関し、核酸の検出は目視検査による。
【背景技術】
【０００２】
現場または臨床現場（ＰＯＣ：ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）において最低限の設備により迅速かつ低コストに行うことができる核酸バイオアッセイは、高い需要がある。これを達成することを目的とした多くの試みがあるが、現在のところ実施されているものはない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）１を含む病気のＤＮＡバイオマーカを検出するための技術および方法が知られている。しかしながら、これらの方法は、迅速な指数的ＤＮＡ増幅を達成するにはサーマルサイクラー上での熱サイクリングを必要とし、したがって現地または現場の用途には適していない。それにもかかわらず、この限界を克服するために様々な等温ＤＮＡ増幅法が現在出現している２、３。例えば、ＰＯＣ用途を可能にするために、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）４またはヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）５によって増幅される病原体ＤＮＡが、ラテラルフローストリップおよびポータブル蛍光計上での検出に適合されている６〜９。しかしながら、このような読取り方法は、便利である一方で、依然として比較的精巧な設備の使用に依存しており、依然として世界のオペレータに財務上の障害を提示する場合がある。これに加えて、現地での試料採取、具体的には、下流で使用するために一定量の試料ＤＮＡを最低限の人手による操作と現場のインフラとによって定常的に作製することの検討は、あったとしても、ごくまれである。この些細ではない問題が、任意のアッセイの性能に著しい影響を与える可能性がある。したがって、現場での核酸検出用途のために現地で準備できる包括的アッセイは、依然として達成困難な願望である。
【０００３】
低コストの現場アッセイから利益を得ることができる１つの領域は、農業である。農産業は、世界経済への主要な貢献部門（年間１兆５０００億ドルと推定される）である。しかしながら、作物の病気の発生は、農業に依存している経済圏、特に発展途上国において、推定で年間２２００億ドルの作物の損失を有する主要な問題である１０。現在、病気の発生が一定の境界を越えて広がると、損なわれた作物を救済する方法はない。病気の発生を抑制する理想的な方法は、それが広がる前に現地において早期に検出することによる。作物の病気管理の有効性は、その診断法の迅速さ、感度、および特異性に高度に依存する。伝統的に、病気の識別は、病気に冒されている植物組織における病気の表現型の目視検査によって行われる。しかしながら、これは、経験豊かな植物病理学者を必要とし、かつ比較的主観的である１１。病気の診断をするために、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）１２、１３、イムノブロット法１４、１５、免疫蛍光試験１６、およびＰＣＲに基づくアッセイの様々な反復法１７、１８など、病気の識別を向上させる多くの高感度な診断法が開発されている。しかしながら、これらのすべての検出法は、費用がかかり、かつ精巧な設備が必要とされ、よく訓練された技術者によって実験室においてのみ行われることができる。これに加えて、現場での迅速な検出の欠如は、病気抑制対策の展開の遅れにつながる可能性があり、それは次には作物のさらなる損失にもつながる。したがって、特別な実験設備にアクセスすることを必要とせずに現地において適用可能な新しい病気診断技術を開発することが不可欠である。これに加えて、それらの技術は、安価であり、高感度であり、かつ再現可能であるべきであり、各農家が自らの作物を監視することを可能にするという最終的な目標に対して専門の人材を必要としてはならない。同様に、家畜の病原体の早期の検出は、病気の拡散を回避するために、特に集中生産法を使用する現代の農場において不可欠である。これに加えて、ヒトの病気の早期の診断および検出と、複雑な技術上の要件に依存
しないＰＯＣ方法が利用可能であることによって、特に、台風、津波、または地震などの自然災害の事態後に、開発途上国だけでなく先進国においても無数の命を救うことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、核酸検出の簡単な、信頼できる、迅速な、かつ高価でない方法に対する必要を満たした。したがって、本発明は、比較的小さい試料サイズで核酸を迅速に検出するための方法およびキットを広く提供し、核酸が存在すること、および／または存在しないことを視覚的に検出することができる。この方法の利点は、この方法が遠心分離機、サーマルサイクラー、および分光光度計などの設備に対する必要（これらのすべてが、商用電源またはバッテリーの形態において電力を利用可能であることを必要とする）を好ましい形態において取り除くことである。特定の実施形態では、この方法またはキットは、植物、ヒト、および非ヒト動物の、１つまたは複数の非病原性または病原性生物を検出するのに有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第一の態様において、本発明は、核酸を検出する方法を提供する。前記方法は、単離核酸と粒子とを組み合わせるステップを含み、この単離核酸および粒子は、目視検査によって検出され得る複合体を形成可能である。
【０００６】
好適には、核酸の存在または相対量は、視覚的に検出可能な複合体が存在すること、またはその核酸が存在しない場合、その核酸の量が相対的に少ない場合、もしくはその核酸の濃度が相対的に低い場合において観察されるものと比べ、視覚的に検出可能な複合体のレベルが相対的に増加することによって表される。
【０００７】
一実施形態では、粒子は常磁性粒子である。好ましい実施形態では、粒子はＳＰＲＩ粒子である。好適には、この粒子は、単離核酸とｐＨ＜７において複合体を形成する。好ましい実施形態では、そのｐＨは、約３．６〜５．５の範囲にあり、またはより好ましくは約ｐＨ４．４である。この実施形態によれば、複合体は、核酸−粒子複合体のフロキュレーションによって形成される。
【０００８】
さらなる実施形態では、この方法は、核酸−粒子複合体の視覚的検出を容易にするか、補助するか、または向上させるための呈色剤の使用を含むことができる。好適には、呈色剤は核酸に結合し、可視範囲（すなわち約３９０ｎｍ〜約７００ｎｍ）の波長における光学的サインを与える。この光学的サインには、この可視範囲の波長における光の吸収または放射（燐光および／または蛍光を含む）が含まれ得る。
【０００９】
好適には、この単離核酸は、核酸試料中に存在する鋳型核酸の核酸配列増幅によって得られる。一般には、鋳型核酸の核酸配列増幅は、その鋳型核酸に対して少なくとも部分的に特異的な１つまたは複数のプライマーを含む。好ましい形態では、この単離核酸は、等温核酸配列増幅によって得られる。
【００１０】
一実施形態において、等温核酸配列増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）である。
別の実施形態において、等温核酸配列増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ：ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。
【００１１】
好適には、この鋳型核酸は、核酸の任意の生物学的ソースまたは他のソースから得ることができる核酸試料中に存在する。好ましい形態において、その鋳型核酸は、ステップ（
ａ）標的核酸を含む核酸試料の重力濾過、ステップ（ｂ）粒子への標的核酸による結合、およびステップ（ｃ）その粒子からの標的核酸の溶離を含む、１つまたは複数のステップによって得られる。
【００１２】
一般の実施形態において、ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｃ）における標的核酸の量は約１０μＬである。
別の態様において、本発明は、核酸を検出するためのキットを提供する。このキットは、単離核酸との複合体を形成可能な粒子を含み、その複合体は目視検査によって検出可能である。このキットは、核酸配列増幅用の核酸ポリメラーゼと、核酸配列増幅用の１つまたは複数のプライマーと、磁石と、核酸抽出用の試薬と、フィルタと、呈色剤と、１つまたは複数の反応容器とのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００１３】
この方法および／またはキットは、これらに限定されないが、ヒトおよび他の動物と、植物と、原性生物、古細菌、細菌、ウィルス、酵母菌、真菌、寄生虫、および他の無脊椎動物を含む病原性および非病原性生物とを含む、任意の起源の核酸を検出するために使用することができる。
【００１４】
特定の実施形態では、方法およびキットは、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト動物、および植物の病気および状態と、環境試験と、食物、飲料および他の消耗品の試験と、法医学的分析とに関連する核酸を検出するのに有用であり得る。
【００１５】
本明細書全体を通じて別段の指定がない限り、「含む」は、排他的ではなく包含的に使用され、したがって表示された整数または整数群は、１つまたは複数の他の表示されていない整数または整数群を含むことができる。
【００１６】
本発明の非限定的実施形態は、後続の図面を参照して本明細書中に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】一滴ゲノムアッセイの概略図。対象の試料は、簡単な核酸抽出手法によって現場で処理されて狭い濃度範囲にされる。次いで病原体核酸が検出され、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅によって等温的に増幅される。最後にアッセイの結果は、新規なフロキュレーションアッセイによって可視化される。
【図２】精密核酸抽出プロトコル。（Ａ）抽出プロトコルのグラフィック描写。写真は、抽出に使用される可能性のある試料、使い捨て乳鉢および乳棒を使用する試料の手作業による粉砕、および普通のフィルタピペットチップを使用する溶解液からの細胞デブリの除去を示す。（Ｂ）独立して抽出されている４個のＤＮＡ試料のゲル電気泳動。その高い分子量は、抽出ＤＮＡの良好な完全性を示唆する。（Ｃ）抽出核酸の分光分析。上段：ＤＮＡ、下段：ＲＮＡ。
【図３】フロキュレーションアッセイ。（Ａ）ＳＰＲＩ粒子のＤＮＡ仲介フロキュレーションの概念的描写。（Ｂ）過剰なプライマーはフロキュレーションを仲介しない。（Ｃ）１０％以上の増幅のみがフロキュレーションを引き起こす。（Ｄ）増幅されているＤＮＡのカットオフ濃度は、ｐＨに依存する。
【図４】３種類の植物病原体の検出における一滴ゲノム法の性能。（Ａ）キャベツ萎黄病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ）、（Ｂ）灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、（Ｃ）シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、（Ｄ）三重感染のシミュレート。上段横列：感染の様々なステージＳ１〜Ｓ５における葉の写真。Ｈ：健康試料、Ｐｏｓ：陽性対照、ＮｏＴ：鋳型なし対照。中段横列：同じ葉に対して行われている対応するＲＰＡ反応のゲル電気泳動画像。下段横列：このＲＰＡ反応に対応するフロキュレーションアッセイの写真。
【図５】感染の様々なステージにおいて葉から抽出されている５ｎｇのＤＮＡ中のキャベツ萎黄病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ（ＦＯＣ））のｑＰＣＲによる定量。病原体ＤＮＡは、図４においてＲＰＡに対して用いた同じプライマーを使用してステージ３感染以降から検出可能であった。
【図６】様々な界にわたる宿主から複数病原体を検出するための１滴ゲノム法。（Ａ）バナナの茎のパナマ病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｃｕｂｅｎｓｅ）。（Ｂ）関係のない陰性対照としてシュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）を使用している、水中の大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉａｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）。（Ｃ）培養細胞中のＨＩＶプロウィルスＤＮＡ。（Ｄ）血液培養物中の熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）。（Ｅ）トマトの葉のキュウリモザイクウィルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）。ＲＴ：逆転写酵素。（Ｆ）チロシンキナーゼ１、ＴＫＩ遺伝子、および糖タンパク質Ｂ遺伝子を標的にするプライマーを使用している、ウシ細胞中のウシヘルペスウィルス１型（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）。（Ｇ）ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６遺伝子を標的にするプライマーを使用している、培養物中の結核性マイコバクテリア（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を陰性対照として使用した。（Ｈ）培地中のインフルエンザウィルスＨ１Ｎ１。上段横列：ＲＰＡ反応のゲル電気泳動画像、下段横列：このＲＰＡ反応に対応するフロキュレーションアッセイの写真、Ｐｏｓ：陽性（感染している）試料、Ｎｅｇ：陰性（感染していない）試料、ＮｏＴ：鋳型なし対照、ＲＴ：逆転写酵素。
【図７】アッセイの概略図。１）ゲノムＤＮＡは、メチル結合ドメイン（ＭＢＤ：Ｍｅｔｈｙｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）の濃縮に適合するサイズに酵素によって断片化される。２）メチル化ＤＮＡの迅速で厳密性の高い濃縮が氷上（４℃）で行われる、３）対象の領域が等温法により増幅される、４）長鎖増幅ＤＮＡの存在が架橋フロキュレーションを誘発し、架橋フロキュレーションは対象のメチル化の高度に異なる領域（ＨＤＭＲ：ｈｉｇｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）の存在を表す。
【図８】（Ａ）ＥＳＲ１プライマーを使用している、ＲＰＡ産物のゲル電気泳動画像。これは、室温（ＲＴ：ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で行われるアッセイと比べて性能の減損のない、低温（４℃）でのＭＤＢ濃縮の厳密さの改良を実証する。Ｍ：メチル化対照、Ｕ：非メチル化対照。（Ｂ）上段：メチル化の様々なレベルにおけるＤＮＡ投入についての、ＥＳＲ１プライマーを使用しているＲＰＡ反応のゲル電気泳動画像、下段：１０％程度の低いメチル化試料から起こるフロキュレーションを示す写真。
【図９】（Ａ）ＥＳＲ１、（Ｂ）ＧＳＴＰ１、および（Ｃ）ＮＰＹに対する７種類のヒトがん細胞系のメチル化プロファイル。非メチル化対照（Ｕ−Ｃｔｒｌ）はアッセイの厳密さを検証するために含まれた。（Ｄ）２種類の前立腺がん試料（ＰＣ１およびＰＣ２）、および２５人の女性ドナーからプールした正常血液（ＮＢ：ｎｏｒｍａｌ  ｂｌｏｏｄ）ＤＮＡ由来の、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、およびＮＰＹの全血メチル化プロファイル。上段：ＲＰＡ反応のゲル電気泳動画像、下段：メチル化状態の代用となるフロキュレーションを示す写真。
【図１０】ＲＴ−ＲＰＡ後のＤｕＣａｐ  ＲＮＡアンプリコンのＤＮＡ配列決定。抽出されているＤｕＣａｐ  ＲＮＡのＲＴ−ＲＰＡアンプリコンは、ＳＰＲＩ磁気ビーズを使用して精製され、標的ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ領域の増幅を確かめるために配列決定された。
【図１１】患者の尿試料から抽出されているＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。１０人の転移性去勢抵抗性前立腺がん患者および１人の健康な患者の尿試料から抽出されているＲＮＡが、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ検出のためにＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅された。このＲＴ−ＰＣＲアンプリコンは、アガロースゲル上で可視化され、同一の患者群で本発明者らのアッセイのスクリーニング結果を検証するために使用された（図１１ｃ）。
【図１２】全尿および尿沈殿物中のＲＮＡ安定性の比較。試料採集の０、２、および１２時間後に抽出されている、患者の全尿および尿沈殿物のＲＮＡのＲＴ−ＲＰＡ。
【図１３】５ｎｇの全投入ＤＮＡに関して、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＮＡ中の様々な割合のシュードモナス・シリンガエＤＮＡ（０％〜１０％）に対するＲＣＡ−ＳＤＧの検出限界。ＮｏＴ：鋳型なし対照。上段横列：実施されているＲＣＡの反応に対応するゲル電気泳動画像、下段横列：そのＲＣＡの反応に対応するフロキュレーションアッセイの写真。
【図１４】ＲＣＡによるシュードモナス・シリンガエの検出における一滴ゲノム法の性能。上段横列：感染後の様々な時点Ｓ１〜Ｓ５における葉の写真。Ｈ：健康試料、ＮｏＴ：鋳型なし対照。中段横列：同じ葉に対して行われている対応するＲＣＡ反応のゲル電気泳動画像、下段横列：そのＲＣＡ反応に対応するフロキュレーションアッセイの写真。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、９０分未満で迅速に現場においてＤＮＡを検出するための方法およびキットに関する。本発明によれば、１０μＬ程度（すなわち１滴）の小さいＤＮＡ試料サイズが使用され得る。好ましい形態では、固相可逆固定（ＳＰＲＩ：ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）粒子が、高精度濃度範囲まで精製される核酸の高精度試料採取のために使用されることで、下流プロセスの最適性能を確実にすることに加えて、さらなる定量の必要を回避する。次いで、精製された核酸は任意の適している核酸配列増幅システム、例えば等温核酸配列増幅にかけられ、次いでそのＤＮＡを適切なｐＨ条件下で凝集させるＳＰＲＩ粒子を使用するＤＮＡフロキュレーション試験により可視化される。本発明者らは、この方法が、感染の様々なステージにあるシロイヌナズナ中の様々な植物病原体を正確に検出できることを実証した。本発明者らはまた、経済的に重要な病原体に感染している市販のバナナ試料において、健康組織と感染組織とを区別することができた。最後に、この手法の汎用性を実証するために、この方法は、感染組織中の植物ＲＮＡウィルス、大腸菌を加えられている水試料、ＨＩＶに感染している細胞、マラリアに感染している血液、感染細胞中のインフルエンザウィルス、ウシ細胞中のウシヘルペスウィルス１型、およびヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌を検出するために使用された。したがって、本発明は、最低限の設備によって迅速に任意のソース由来のＤＮＡを検出するために使用することができ、それによってヒトおよび類人猿（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｈｕｍａｎｓ）、動物、および植物において現れる疾病の新たな発生を検出するための迅速な応答システムを提供することを含め、臨床現場（ＰＯＣ）または他の現場における用途に理想的に適した方法およびキットを提供する。
【００１９】
一態様において、本発明は、核酸を検出する方法を提供する。この方法は、単離核酸と粒子とを組み合わせるステップを含み、この単離核酸および粒子は、目視検査によって検出され得る複合体を形成可能である。
【００２０】
別の態様において、本発明は、核酸を検出するためのキットを提供する。このキットは、単離核酸との複合体を形成可能な粒子を含み、この複合体は目視検査によって検出可能である。このキットは、核酸配列増幅用の核酸ポリメラーゼと、核酸配列増幅用の１つまたは複数のプライマーと、磁石と、核酸抽出用の試薬と、フィルタと、１つまたは複数の反応容器とのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００２１】
好適には、このキットは前述の方法に従って使用することができる。したがってこのキットは、１つまたは複数のポリメラーゼ、粒子、緩衝剤、容器、および本明細書中で開示される核酸の調製および視覚的検出を行う他の構成要素を提供することができる。
【００２２】
本発明の目的では「単離」とは、その天然の状態から取り出された、または人間による操作を施された物質を意味する。単離物質は、その天然の状態において通常は伴っている成分を実質上または本質的に含まないか、その天然の状態において通常は伴っている成分
と共に人為的状態になるように操作されるかであってよい。単離物質は、天然の形態、化学作用による形態、合成形態、または組換え形態であることができる。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「核酸」とは、これらに限定されないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡを含む一重鎖および二重鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを指す。核酸は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵ塩基を含むヌクレオチドを一般に含むヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、これらに限定されないが、イノシン、メチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシン、および／またはチオウリジンなどの他の塩基を含むこともできる。
【００２４】
本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」は、８０個以上の連続的なヌクレオチドを有する核酸であり、一方「オリゴヌクレオチド」は、８０個未満の連続的なヌクレオチドを有する。「プローブ」は、例えばノーザンブロット法またはサザンブロット法において相補的配列を検出する目的で好適に標識されている、一重鎖または二重鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであることができる。「プライマー」は、相補的な核酸の「鋳型」にアニール可能であり、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用によって鋳型依存的に伸長可能な、好ましくは１５〜５０個の連続的なヌクレオチドを有する、一般には一重鎖オリゴヌクレオチドである。「鋳型核酸」は、核酸増幅を施される核酸である。
【００２５】
本発明によれば、核酸試料は、動物および植物と、動物および植物の細胞、組織、分泌液、および細胞下オルガネラと、細菌と、古細菌と、原性生物と、真菌と、ウィルスと、飲料水、廃水、スイミングプールの水、河川の水、海水などの環境試料と、食物（例えば食用肉、乳製品など）および他の消耗品から得られる試料とを含む任意のソースから得るまたは抽出することができる。これらのソースは、これらに限定されないが、体液（例えば脳脊髄液、血液、血清、血漿、精液、尿、リンパ液など）、腫瘍、組織または器官の生検材料、子宮頸試料、およびＰＡＰスミアを含む病理学試料の形態であることができる。他のソースとしては、検出可能な核酸を含有することが疑われる法医学的試料が含まれる。植物試料は、葉、茎、樹皮、種子、果実、花、または花の構成要素（例えば花弁、葯、花粉、雄しべなど）、根、および他の任意の植物細胞または組織から採取することができる。その植物は、穀物、豆果、サトウキビなどの農作物、花、ナッツ、種子、油、材木または果実用の収穫できる植物、藻、スイッチグラス、麻および亜麻などのバイオマス用に成長させた植物、農学的、美的、生態学的または営利的価値のある任意の他の植物を含む、植物界の任意のメンバーであることができる。動物は、魚類、鳥類、および哺乳動物を含む任意の脊椎および無脊椎動物であることができる。特定の用途では、動物は、ヒト、非ヒト哺乳動物、または営利的価値のある他の動物、例えば家禽、魚、および甲殻類などであることができる。非ヒト哺乳動物としては、これらに限定されないが、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ）、飼いならされた愛玩動物（例えばネコおよびイヌ）、および興行動物（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｍａｌ）（例えば競走馬、ラクダ）を含むことができる。細菌、古細菌、原性生物、真菌、およびウィルスは、病原性生物でも非病原性生物でもよい。「病原性」とは、その生物が植物または動物の病気または状態と関連しているか、その原因となることを意味する。病原体の非限定的な例には、ＲＮＡウィルスおよびＤＮＡウィルスを含むウィルスと、原生動物と、真菌と、蠕虫、回虫、および環形動物を含む寄生虫と、グラム陽性およびグラム陰性細菌を含む細菌とを含むことができる。
【００２６】
核酸の抽出は、当技術分野で知られている任意の方法によることができる。一般には、核酸の抽出は、非イオン界面活性剤、塩、ｐＨ緩衝剤、およびカオトロピック剤を一般に
含む抽出緩衝液によってすることができる。抽出緩衝液の非限定的な例は、以下でより詳細に提供される。こうして得られるまたは抽出される核酸は、本明細書中では「核酸試料」と呼ばれる。一般に、核酸試料は、望ましくない粒状物質またはデブリを除去するためにその抽出された核酸を遠心分離または他の大きいｇ力（ｇ  ｆｏｒｃｅ）にかけたり、それに非大気圧（例えば真空）を適用したりすることなく、本明細書中で以前に述べたようなソースから抽出することによって得られる。好ましくは、抽出された核酸は、望ましくない粒状物質またはデブリを除去するために重力下でまたは人力で発生させる圧力下で濾過される。特に好ましい実施形態では、核酸試料は、以下でより詳細に述べるように、その核酸試料中の標的核酸に可逆的に結合する粒子を使用して少なくとも部分的に精製される。好適には、この標的核酸は、続いて核酸増幅法によって増幅することができる。
【００２７】
核酸増幅法は、当業者にはよく知られており、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ：ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｑ−βレプリカーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＡＤ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ：ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ：ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、およびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で一般に使用される「増幅産物」とは、核酸増幅法によって作製される核酸産物を指す。
【００２８】
多くの核酸増幅法は、増幅の各期の間に様々な温度（例えば変性のために９５℃、プライマーアニーリングのために７２℃、および鋳型伸長のために４２℃）による核酸配列増幅手順を循環し、したがってその技術のためにはサーマルサイクラーを必要とする。しかしながら、幾つかの核酸増幅法、例えばＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＮＥＡＲ、ＨＡＤ、ＲＣＡ、およびＲＰＡは等温であることができ、それによってサーマルサイクラーの必要を取り除くことができる。したがって、好ましい実施形態では、方法およびキットには等温核酸配列増幅が利用される。等温核酸配列増幅の特定の実施形態は、例えば、これに限定されないが、ツイストＤＸ（ＴｗｉｓｔＤＸ）（商標）システムによって提供されるＲＰＡである。表１では、ＲＰＡによる等温核酸増幅にとって有用なプライマーの非限定的な例を提供する。等温核酸配列増幅の別の特定の実施形態は、ＲＣＡであり、これは下記実施例中でより詳細に述べられる。
【００２９】
しかしながら、それほど好ましくない実施形態では、核酸増幅は、サーマルサイクラーを使用して、または増幅の各期の間に様々な温度による核酸配列増幅の反復循環を含む方法によって行い得ることも理解されるだろう。
【００３０】
好適には、増幅産物は続いて固定化され、次いで、粒子との複合体を形成することによって可視化される。さらなる実施形態では、呈色剤が、核酸−粒子複合体の視覚的検出を容易にするか、補助するか、または向上させるために使用されてもよい。好適には、呈色剤は核酸に結合し、好ましくは可視範囲内の波長（すなわち約３９０ｎｍ〜約７００ｎｍ）において光学的サインを示す。この光学的サインには、この可視範囲内の波長における光の吸収または放射（燐光および／または蛍光を含む）が含まれることができる。
【００３１】
この方法およびキットが、ＤＮＡ、好ましくは二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）などの核酸に結合可能な粒子を利用することが、前述から理解されるだろう。この粒子は、核酸試料の調製後に鋳型核酸に結合可能であり、かつ／または単離核酸との複合体を形成可能であり、その複合体は目視検査により検出することができる。
【００３２】
本発明に一般に関連して、「粒子」は、単離核酸と結合可能な任意のマトリックス、ビーズ、または基体であることができる。好ましい形態では、粒子は、１００個以上の連続的なヌクレオチドを有する単離核酸に選択的に結合する。この特性は、核酸配列増幅プライマー（一般に１００個の連続的なヌクレオチドよりもはるかに短い）および任意のより短い、不完全な、非特異的な、または端を切り取られた増幅産物から、１００個以上の連続的なヌクレオチドを有する増幅産物を選択する。好適には、この粒子は、単離核酸との結合または相互に作用する荷電表面を備える。好ましくは、荷電表面は、負に帯電している単離核酸との結合または相互に作用する正電荷を有する。
【００３３】
幾つかの実施形態では、粒子は、常磁性ビーズであることができる。一般にこの常磁性ビーズは、ポリマーコア（例えばポリスチレン）と、常磁性シェル（例えば、磁鉄鉱、またはモンモリロナイトおよびノントロナイトを含むクレー、黒雲母、菱鉄鋼、黄鉄鋼などの、他の鉄含有常磁性材料）と、適切な条件下で核酸に結合する１つまたは複数の化学的分子部分（例えばカルボキシルを含有する分子部分）を含むコーティングとを含む。非限定的な例には、ＳＰＲＩ粒子およびアンピュアＸＰ（ＡＭＰｕｒｅＸＰ）（商標）粒子が含まれる。好ましい常磁性粒子は、ＳＰＲＩ粒子である。
【００３４】
他の実施形態では、粒子には、これらに限定されないが、金（例えばＤＮＡデル（ＤＮＡｄｅｌ）（商標）ゴールドキャリアパーチクルス（Ｇｏｌｄ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ））などの金属粒子、ヒドロタルサイト（ＨＴ）およびヒドロキシアパタイト（ＨＡ）などの金属水酸化物、珪藻土などのケイ酸塩が含まれることができる。
【００３５】
核酸試料の調製後に鋳型核酸に結合することに関連して、好適には、その粒子は核酸に可逆的に結合可能である。したがって、好適な条件下において、粒子は核酸に結合し、次いで核酸は、その核酸を溶離または開放する条件下において粒子から溶離または解放されることができる。好ましくは、ある量または濃度の粒子が提供され、それによって定常的な再現可能な量または濃度の核酸が結合し、溶離される。
【００３６】
鋳型核酸に可逆的に結合可能な粒子の１つの非限定的な例は、本明細書中で以前に述べたＳＰＲＩ粒子である。
粒子が核酸配列増幅後にｄｓＤＮＡ増幅産物などの核酸に結合することに関連して、好適には、核酸：粒子複合体の形成は、目視検査によって検出、観察、または測定されることができる。これは、ほぼ裸眼の視力を有する人間の観察者が、粒子と核酸との間に形成される複合体が少なくとも存在するかしないかを見ることができることを意味する。視覚的検出により、核酸：粒子複合体の定性的、半定量的、または定量的測定値を与えることができる。目視検査による半定量的または定量的決定または測定により、粒子と核酸との間に形成される複合体の少なくともおよその量または濃度を与えることができる。一例として、定量は、異なる量または濃度の核酸：粒子複合体を含む滴定済参照標準を参照して決定されることができる。目視検査によって検出することができるｄｓＤＮＡとの複合体を形成可能な粒子の１つの非限定的な例は、本明細書中で以前に述べたＳＰＲＩ粒子である。この例によれば、核酸：ＳＰＲＩ粒子複合体は、凝集した複合体として可視化される。一般に、磁石で処理した時の比較的透明または無色の溶液は、凝集した複合体が磁石によって容易に引き付けられる結果として形成される。これは、呈色したまたは濁った溶液を生じさせる核酸：ＳＰＲＩ粒子複合体が存在しないこととは対照的である。相対的に透明であること、または色が欠如していることは、既知の量または濃度の核酸に対して滴定した場合における、核酸の量または濃度の尺度となり得る。好ましい方法は、凝集塊が減少するか、または存在しなくなるまでｐＨを滴定することであり、その加えられた塩基の量が、核酸の量の近似値または推定値である。
【００３７】
しかしながら、この方法が、核酸：粒子複合体の形成の検出、観察、または測定を補助する装置、デバイス、または設備の使用を排除しないこともまた理解されるだろう。装置、デバイス、または設備の非限定的な例としては、これらに限定されないが、比濁計、濁度計、および分光光度計が含まれる。
【００３８】
幾つかの実施形態では、粒子は、ヌクレオチド配列に特異的でない方法で核酸に結合する。基本的に、粒子は、核酸との物理化学的相互作用によって核酸（例えば核酸増幅産物）に結合する。例として、これには、例えばＳＰＲＩ粒子を覆っているカルボキシル含有分子部分によって支援される、負に帯電した核酸と負に帯電した粒子との間の静電気的または電荷相互作用が含まれることができる。これに限定されないが、アミン含有分子部分で覆われている粒子などの正に帯電した粒子もまた使用されることができる。
【００３９】
他の実施形態では、粒子は、ヌクレオチド配列に特異的な方法で核酸に結合する。例として、その粒子は、核酸配列増幅産物とハイブリッドを形成可能なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと結合することができる。ヌクレオチド配列に特異的なこの検出により、様々な対立遺伝子型（ａｌｌｅｌｉｃ  ｆｏｒｍ）、ＳＮＰ、および対象のヌクレオチド配列の他の変異型（例えば、特定の植物または動物の病気と関連するもの）などのヌクレオチド配列多型を区別可能とすることができる。
【００４０】
前述の全般的な実施形態に関連して、この方法の特定の実施形態は、
（ａ）核酸試料を得るステップ、
（ｂ）この核酸試料中に鋳型核酸が存在する場合、この核酸試料を等温核酸配列増幅にかけ、それによって鋳型核酸から核酸配列産物を生成させるステップ、および
（ｃ）その核酸増幅産物と常磁性粒子とを組み合わせるステップ（この単離核酸および粒子は、目視検査によって検出可能な複合体を形成可能である）
を含む。
【００４１】
ステップ（ａ）において、核酸試料は、望ましくない粒状物質またはデブリを除去するために、その核酸試料を遠心分離にかけるか、または真空または高圧下（試料は、人力で操作されるシリンジによるなどの低圧にかけられてもよい）における他の大きいｇ力にかけることなく、本明細書中で以前に述べたようなソースからの抽出によって得られることが好ましい。好適には、この核酸試料は重力下で濾過され、それによって望ましくない粒状物質またはデブリを除去する。幾つかの実施形態において、フィルタは、脱脂綿などの濾過材料によって少なくとも部分的に満たされているマイクロピペットチップまたは他の導管（例えばガラスピペット、カニューレ、または管類）である。続いて、核酸試料は、適している緩衝液中においてＳＰＲＩ粒子などの常磁性粒子と組み合わされ、それによって核酸と常磁性粒子との間に複合体が形成される。これには限らないが、一般に緩衝液は、ポリエチレングリコール、塩、およびｐＨ緩衝剤を含む。一般に、常磁性粒子と組み合わされる核酸試料の量は、ソースからの抽出によって得られる核酸試料の量よりも実質上少ない。常磁性粒子と組み合わされる核酸試料の量は、ソースからの抽出によって得られる核酸試料の量の２０％以下、１０％以下、５％以下、または４％以下、３％以下、２％以下、もしくは１％以下であることができる。好適には、この量は、約５０μＬ以下、約４０μＬ以下、約３０μＬ以下、約２０μＬ以下、または約５〜１０μＬ以下（５μＬ、６μＬ、７μＬ、８μＬ、および９μＬを含む）であることができる。
【００４２】
好適には、この複合体は、続いて磁石によって固定化され、緩衝液は除去され、核酸が粒子から溶離される。溶離は、水（であるが、これに限定されない）などの溶離液を使用して達成されることができる。好適には、溶離される量はより少ないが、約５０μＬ以下、約２０μＬ以下、または約５〜１０μＬ以下（５μＬ、６μＬ、７μＬ、８μＬ、および９μＬを含む）であることができる。核酸試料と組み合わされる常磁性粒子の量、濃度
、比、または相対的比率は、所望の量または濃度の核酸が常磁性粒子から溶離されるように最適に決められる。例えば、望ましい収量は、１０μＬの溶離物中において３〜５ｎｇ／μＬの高分子量ＤＮＡであることができる。
【００４３】
ステップ（ｂ）において、等温核酸配列増幅は、好ましくは約３７℃で行われるＲＰＡによることが好ましいが、これには限定されない。ステップ（ｂ）において、核酸試料中の標的核酸に特異性を与えるプライマーが使用され、それによって、核酸試料中に標的核酸が存在する場合、その標的核酸が優先的に増幅される。プライマーの非限定的な例は表１中に示される。
【００４４】
ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）で生成される増幅産物が、ＳＰＲＩ粒子などの常磁性粒子と組み合わされる。一般には、常磁性粒子と増幅産物との間の、視覚的に検出することができる複合体を形成するフロキュレーション緩衝液中において、その増幅産物は常磁性粒子と組み合わされる。フロキュレーション緩衝液は、好適には７未満のｐＨを有する。好ましくは、ｐＨは３〜６の範囲内、もしくは、より好ましくはｐＨ３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、および５．４を含む約ｐＨ３．６〜５．５の範囲内、またはこれらの明記されたｐＨ値の間の任意の範囲内にある。以下で述べるように、非限定的な例はｐＨ４．４である。例として、フロキュレーション緩衝液は、これらに限定されないが、１つまたは複数の酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、またはリン酸二水素塩であることができるか、またはこれらを含むこともできる。以下でより詳細に述べるようにフロキュレーション緩衝液の非限定的な例は酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）である。
【００４５】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、核酸：粒子のフロキュレーションは、フロキュレーション緩衝液のｐＨを増加させることによって可逆であることを提案する。これは、フロキュレーションがコロイドの非共有結合による可逆的な凝集であることと一致する。したがって、高いｐＨにおいて、ＤＮＡなどの核酸はより負に帯電し、そのためにその粒子（例えばＳＰＲＩ粒子）のカルボン酸で覆われている表面から負に帯電した他の核酸を斥ける可能性がより高い。このｐＨ依存性を利用して、核酸濃度によりこの方法の感度を微調整することができる。フロキュレーション後のｐＨの滴定もまた、核酸濃度の近似値または推定値として使用することができる。
【００４６】
以前に述べたように、呈色剤が、核酸−粒子複合体の視覚的検出を容易にするか、補助するか、向上させるために使用されてもよい。好適には、呈色剤は核酸に結合し、可視範囲（すなわち約３９０ｎｍ〜約７００ｎｍ）の波長において光学的サインを与える。この光学的サインは、この可視範囲の波長における光の吸収または放射（燐光および／または蛍光を含む）を含むことができるか、またはそれから生じることができる。
【００４７】
このような呈色剤は、一般に「ＤＮＡ染料」として知られ、非限定的な例はクリスタルバイオレット、クリスタルバイオレット／メチルオレンジ混合物、メチレンブルー、またはビジュアルバイオレット（Ｖｉｓｕａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ）（商標）である。
【００４８】
本発明の方法およびキットは、核酸検出の分野において数々の用途を有する可能性のある「プラットフォーム」技術を提供する。より具体的には、本発明の方法およびキットは、現地または「臨床現場」において核酸を検出するための高感度なかつ費用効果の高い手段を提供する。好ましい形態では、本発明は、サーマルサイクラー、遠心分離機、分光光度計などの設備の必要を少なくとも最低限にするか、完全に取り除く。例として本発明は、これらに限定されないが、植物および動物の病気の病原体の検出、特定の遺伝形質または遺伝病に対する植物および動物の遺伝性素因の検出、真菌または細菌汚染による腐敗を
検出するための食物および他の消耗品の分析、水質の監視、法医学試料の分析、着床前遺伝子分析、性決定、およびＤＮＡフィンガープリントにおいて有用である可能性がある。
【００４９】
本発明の特定の実施形態は、植物または動物の病気の病原体の検出に関する。
これに関連して、この方法の特定の実施形態は、
（Ｉ）植物または動物のソースから核酸試料を得るステップ、
（ＩＩ）この試料中に鋳型核酸が存在する場合、この核酸試料を等温核酸配列増幅にかけて、鋳型核酸（この鋳型核酸は、植物または動物の病気または状態について、その原因となるか、またはそれと関連する病原体のものであるヌクレオチド配列を含む）から核酸増幅産物を生成させるステップ、および
（ＩＩＩ）核酸増幅産物が存在する場合、その核酸増幅産物を常磁性粒子と組み合わせるステップ（この核酸増幅産物および粒子は、目視検査によって検出され得る複合体を形成可能であり、核酸増幅産物の存在は病原体の存在を表す）
を含む。
【００５０】
したがって、幾つかの実施形態において、本発明は、動物の病気または状態と関連するか、またはその原因となる病原体の不在の存在を判断するために医学的または獣医学的診断に使用することができる。これに関連して、動物としては、これらに限定されないが、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば家畜および愛玩動物）、魚類、甲殻類、鳥類（例えば家禽）を含むことができる。病原体としては、ＲＮＡウィルスおよびＤＮＡウィルスを含むウィルスと、原生動物と、蠕虫、回虫および環形動物を含む寄生虫と、真菌と、原生生物と、古細菌と、細菌とを含むことができる。実施例中でより詳細に述べられるように、この方法は、ＨＩＶおよびインフルエンザなどのウィルス、熱帯熱マラリア原虫などの原生動物、かつ、大腸菌およびヒト型結核菌などの細菌によって引き起こされるヒトの病気の病原体の核酸を検出した。
【００５１】
真菌性、ウィルス性、および／または細菌性の植物病原体の検出もまた、本発明により意図される。植物としては、これらに限定されないが、単子葉および双子葉植物、農作物、穀類、果実、草、樹木、および蔓草を含むことができる。植物病原体の非限定的な例としては、実施例中でより詳細に述べるような、ＲＮＡウィルスであるキュウリモザイクウィルスなどのＤＮＡウィルスおよびＲＮＡウィルスと、シュードモナス・シリンガエなどの細菌と、キャベツ萎黄病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．  ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ）および灰色かび病菌などの真菌とを含むことができる。
【００５２】
しかしながら、本発明は、非病原性生物であろうと、ヒトおよび非ヒト動物または植物の病原体であろうと、任意の生物から得られる核酸試料を使用して広範に実施することができることを理解されるだろう。
【００５３】
本発明の１つの特定の用途は、ヒトまたは動物の集団における、または農作物などの植物の集団における新しい病気の発生に関連する。鳥インフルエンザおよび他のインフルエンザと、またＳＡＲＳとで最近起きたように、遺伝学的に区別できる新しい病原体の菌株または変異株が出現する。このような新しい病原体の菌株または変異株のゲノムを迅速に配列決定することができ、また本発明に従って使用するのに適している核酸配列増幅プライマーを作り出すことができる。これによって、その新しい病原体の菌株または変異株の迅速かつ簡単な検出を実現するために、本発明の方法およびキットは、この核酸配列増幅プライマーを用いた使用に直ちに適合可能である。
【００５４】
本発明の他の特定の実施形態は、特定の病気または状態と関連するバイオマーカの検出に関する。
これに関連して、この方法の特定の実施形態は、
（Ｉ）ヒトまたは非ヒト動物から核酸試料を得るステップ、
（ＩＩ）この試料中に鋳型核酸が存在する場合、この核酸試料を等温核酸配列増幅にかけて、鋳型核酸（この鋳型核酸は、病気または状態と関連するバイオマーカであるか、それをコードするヌクレオチド配列を含む）から核酸増幅産物を生成させるステップ、および
（ＩＩＩ）核酸増幅産物が存在する場合、その核酸増幅産物と常磁性粒子とを組み合わせるステップ（この核酸増幅産物および粒子は、目視検査によって検出され得る複合体を形成可能であり、核酸増幅産物の存在はバイオマーカの存在を表す）
を含む。
【００５５】
このバイオマーカは、これらに限定されないが、がん、腫瘍、リンパ腫、白血病、および他の悪性腫瘍と、感染症と、炎症性疾患と、自己免疫疾患と、呼吸器系疾患と、消化器系疾患と、神経系疾患と、生殖器系疾患と精神状態とを含む、ヒトまたは非ヒト動物の任意の病気または状態と関連していることができる。例えばバイオマーカは、これらに限定されないが、腫瘍抗原、サプレッサ遺伝子もしくはマーカ、ならびに／または、遺伝的もしくはエピジェネティックなヌクレオチド配列の多型、変異、修飾もしくは変化（例えば、体細胞突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、および他の遺伝性多型、ヌクレオチド配列の挿入、欠失、再配列、ＤＮＡメチル化、および／またはＤＮＡヒドロキシメチル化イベント）であるか、それらを含むことができる。これらの実施例中でより詳細に述べている１つの特定の実施形態では、本明細書中で開示した方法およびキットは、ＤＮＡメチル化を検出するのに適している。これらの実施例中でより詳細に述べている別の特定の実施形態では、本明細書中で開示した方法およびキットは、前立腺がんのＤＮＡマーカを検出するのに適している。
【００５６】
本発明のさらなる特定の実施形態は、環境試料中の病原体の検出に関する。
これに関連して、この方法の特定の実施形態は、
（１）環境のソースから核酸試料を得るステップ、
（２）この試料中に鋳型核酸が存在する場合、この核酸試料を等温核酸配列増幅にかけて、鋳型核酸（この鋳型核酸は、病原体のヌクレオチド配列を含む）から核酸増幅産物を生成させるステップ、および
（３）核酸増幅産物が存在する場合、その核酸増幅産物と常磁性粒子とを組み合わせるステップ（この核酸増幅産物および粒子は、目視検査によって検出され得る複合体を形成可能であり、核酸増幅産物の存在は病原体の存在を表す）
を含む。
【００５７】
この環境のソースまたは試料は、これらに限定されないが、廃水および廃液（例えば下水、雨水、鉱業および／または工業廃水）と、飲料水と、スイミングプールの水と、河、小川、湖、池、または海水とを含む、水、空気試料、および土壌試料であることができる。
【００５８】
本発明が容易に実施され、かつ実用的効果を与えることができるように、下記の非限定的実施例が参照される。
実施例１：一滴ゲノム法
材料および方法
植物用途の場合、ゲノムＤＮＡは、最適化した溶解緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５Ｍグアニジウム−ＨＣｌ、２％ｗ／ｖ  ＰＶＰ４０、および１％ｖ／ｖトリトン−Ｘ）を使用して１枚の葉（３００ｍｇ）から抽出された。ＤＮＡ用途の場合、４００ｎｇ／μＬのＲＮアーゼＡがこの溶解緩衝液に加えられたが、ＲＮＡ用途の場合には加えない。周囲条件で１０分間インキュベートした後、溶解液は、普通のフィルタ付きピペットチップで作られた低コストの手作り濾過装置を使用して清澄化された。非植物
用途の場合、ＰＶＰ４０なしの溶解緩衝液が使用された。次いで核酸は、修正したＳＰＲＩプロトコル１９、２０を使用して精製された。手短に言えば、清澄化した溶解液の一滴（１０μＬ）が、カルボン酸で覆われている磁気ビーズ（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））（１．８倍量（ｖｏｌｕｍｅ））と共に結合緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０％  ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）中において５分間インキュベートされた。ＤＮＡに結合したビーズは、次いで、磁石により溶解液から分離され、１００％イソプロパノールで２回洗浄され、続いて８０％エタノールで２回洗浄され、１０μＬの水により溶出させた。
【００５９】
ツイストアンプベーシックＲＰＡキット（ＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃ  ＲＰＡ  Ｋｉｔ）（ツイストＤＸ）が、幾つかの修正と共に製造推奨の通りに使用された。手短に言えば、１２．５μＬの反応が、１μＬの核酸抽出物および４８０〜６００ｎＭの各プライマー（表１）を使用して３７℃で３０〜４０分間行われた。ＲＮＡ用途の場合、５０単位のＭＭｕＬＶ逆転写酵素が、そのＲＰＡ反応に加えられた。増幅後、増幅を確かめるために５μＬのＲＰＡ反応物をゲル上で電気泳動させた。別の５μＬは、１．８倍量の磁性ＳＰＲＩビーズ溶液と共に５分間インキュベートすることによるフロキュレーションアッセイに使用した。磁石および８０％エタノール洗浄によるビーズの分離後、３０μＬのフロキュレーション緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．４）がビーズに加えられた。
【００６０】
結果
一滴ゲノム法の考え方
一滴ゲノム法は、最低限の設備による病原性核酸の現場での高感度かつ迅速な検出のための包括的な統合された解決法として着想された。図１は、３つの主要な段階からなるＳＤＧの考え方を手短に示す。第一段階は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを対象のソース、例えば一滴の精製していない葉の抽出物から最低限の設備を使用して狭い濃度範囲で抽出する、高精度試料採取である。第二段階は、ＲＰＡを使用する病原性核酸の高感度かつ迅速な等温増幅である。第三かつ最後の段階は、ＳＰＲＩを使用する増幅ＤＮＡの特異的捕集と、それに続く、フロキュレーション誘発緩衝液中でのそのＳＰＲＩ粒子の事実上設備を使わない目視検査とである。
【００６１】
高精度ＤＮＡ試料採取
現地での試料採取は、あったとしても、ごくまれに検討されるに過ぎない。一定量の試料を定常的に作製するこの些細ではない作業は、任意のアッセイの性能にとって重要である。ここで、本発明者らは、下流のＲＰＡによる増幅に直ちに使用することができる正確な濃度にＤＮＡを定常的に抽出するための、ＳＰＲＩ技術１９と併せて普通のフィルタ付きピペットチップを使用した低コストのＤＮＡ精製について述べる（図２Ａ）。磁性ＳＰＲＩビーズを用いたＤＮＡ抽出は、それが事実上設備を使わずに磁石のみを必要とすることから、ＰＯＣの用途にとって理想的である。これに加えて、ＤＮＡの収量は、一定の試料投入量が与えられている状態において、単にＳＰＲＩ粒子の量を調整することによって正確に制御することができる。この手法の別の利点は、その比較的低いコストである（１回の抽出につきおよそ１０オーストラリアセントである）。２００μＬの溶解緩衝液中においてプラスチックの乳鉢を用いる１枚の葉（およそ３００ｍｇ、すなわち４枚の直径６ｍｍの円板状）の手作業による粉砕の後、その溶解液を単にフィルタ付きピペットチップに通過させることによって植物溶解液から細胞のデブリを除去した。次いでＤＮＡは、ＳＰＲＩを使用して一滴（１０μＬ）の溶解液から精製され、１０μＬの溶離物において典型的には３〜５ｎｇ／μＬの収量の高分子量ＤＮＡを定常的にもたらした。ＤＮＡ収量は分光測定評価（ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ））の検出限界に近いため、ＤＮＡの収量および完全性は臭化エチジウム染色によって推定され（図１Ｂ）、また蛍光（キュービット（Ｑｕｂｉｔ）（登録商標）アッセイ）を使用して検証された。ＤＮＡ評価は分光測
定法では不可能であったが、２３０ｎｍの吸光度は基線付近であり、混入物質が最低限の量であることを示している（図２Ｃ）。ＲＮＡ抽出の場合、典型的な収量は１０μＬの溶離物において３０〜４０ｎｇ／μＬであり、２６０／２８０および２６０／２３０の比はそれぞれ１．９〜２．２および１．８〜２．３であり（図２Ｃ）、良好な純度を示した。
【００６２】
ＤＮＡフロキュレーションアッセイ
凝集アッセイは、標識を含まずかつ設備を使わないバイオ分子の検出などの幾つかの利点を有し、つい最近金のナノ粒子による実証が行われた２１〜２３。本明細書において、本発明者らの知識の限りでは、本発明者らが初めてカルボン酸で覆われているＳＰＲＩ磁性粒子をＤＮＡ検出用に使用したフロキュレーションアッセイについて実証する（図３Ａ）。磁性ＳＰＲＩ粒子の使用は３つの利点、すなわち（１）ＲＰＡにより増幅したＤＮＡに結合すること、（２）過剰のｄＮＴＰ、プライマー、およびプライマー二量体を除去すること、（３）フロキュレーションのための緩衝剤を変更することを有する。現在のＳＰＲＩ条件は１００ｂｐ未満のＤＮＡを排除する１９ため、６００ｎＭ（ＲＰＡに推奨されている最高プライマー濃度）までの過剰のプライマーは凝集を引き起こさない（図３Ｂ）。しかしながら、凝集（陽性応答）は、増幅されているＤＮＡの存在下でのみ起こった（図３Ｃ）。これに加えて、１０％ほどの低い増幅効率が、不法な視覚的に明確に区別できる陽性応答のために必要であった。これは、増幅産物の最大量がその反応におけるプライマー（４８０ｎＭ）の初期量と同じであったと仮定することによって推定された。次いで、フロキュレーションを誘発するために必要な最低限の増幅を決定するように、産物対プライマーの様々な比率が混合された。このアッセイの別の興味深い特徴は、ｐＨ変化に対するその感度である（図３Ｄ）。ｐＨ４．４において、０．５ｎｇ／μＬ（５μＬ量）ほど少量の増幅産物を検出することができる。しかしながら、ｐＨ５．４において、凝集のためのカットオフ濃度は５０ｎｇ／μＬ（５μＬ量）まで１００倍に増加した。したがって、この特徴は、あるレベルの「調整」を提供することができ、所定の用途にとって有益であることがある。これらの観察結果を考慮して、本発明者らは、凝集を引き起こすメカニズムがＳＰＲＩ粒子のＤＮＡ仲介フロキュレーションである可能性が高いと結論を下した２４。
【００６３】
一滴ゲノム法を使用した感染の様々なステージにおける植物病原体の検出
時期を失した病気の診断に起因する農作物の損失が大きい問題である１０ため、本発明者らは、植物病原体を検出することによるその実行可能性のＳＤＧを実証する。これに加えて、農業用途のための現地アッセイは現在欠如している。本発明者らの高精度試料採取の手順を使用して、病原体が接種され、その徴候の発現に基づく感染の様々なステージにあるシロイヌナズナから、ＤＮＡが収集された。ＳＤＧを使用して、シュードモナス・シリンガエを接種した植物について、徴候が明らかとなる前であっても感染のステージ１のような早期を検出することができた（図４Ｃ）。これに加えて、ＳＤＧは、接種された植物中においてキャベツ萎黄病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ）および灰色かび病菌を、その始まった徴候が明らかになる感染のステージ２から検出した（図４Ａおよび図４Ｂ）。本発明者らはまた、ｑＰＣＲを使用して本発明者らのＳＤＧの結果をキャベツ萎黄病菌について確かめることを試みたが、このＲＰＡの手法と同じ量の出発材料の場合、ステージ３〜５が検出できるに過ぎなかった（図５）。三重式検出アッセイを実証するために、異なる病原体を接種した３種類の植物からの葉を、それらの感染のそれぞれのステージにおいて一緒にプールして、三重感染をシミュレートした。ＳＤＧは、ステージ１において病原体の存在を検出することができた（図４Ｄ）。これらの結果はＳＤＧアッセイの実行可能性だけでなく、植物感染の早期の検出（すなわち表現型の徴候がまさに現れ始める時）における感度をも実証する。
【００６４】
ＳＤＧがシロイヌナズナ植物モデル系で良好に機能する一方で、本発明者らは、このアッセイが他の宿主植物系に適用可能であり得るかどうかを考えた。この目的において、本
発明者らは、バナナ病菌を検出するためにＳＤＧをバナナの茎の切り枝（市販の重要品種からの）に適用した。ＳＤＧは、健康な試料と病気の試料を容易に区別することができ、農業用途のための実行可能な現場屋外試験としてのＳＤＧの可能性をさらに裏付けた（図６Ａ）。
【００６５】
一滴ゲノム法：複数種（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ）用途
本発明者らが植物病原体ＤＮＡを成功裡に検出した一方で、ＲＮＡを検出することもまた、ＲＮＡウィルスに対して有用であることができる。この目的において、植物病原体キュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ）についてＤＮＡの代わりにＲＮＡを抽出するように、ＳＤＧ試料採取プロトコルが修正された。次いで、ウィルスＲＮＡの等温、単一ステップのＲＴ−ＲＰＡによる増幅を可能にするために、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）がＲＰＡミックスに加えられた２５、２６。次いで、増幅の成功がフロキュレーションアッセイによって判断され、ゲル電気泳動によって確かめられた。予想されたように、ＲＴ酵素がＲＰＡ反応に含まれている場合、健康な植物ではなくウィルス感染した試料のみが陽性の結果をもたらした（図６Ｅ）。
【００６６】
他の可能性のある農業用途を実証するために、本発明者らは、その注意を畜牛産業に転じた。畜牛農場は、地理的に離れた区域に位置する傾向がある。したがってウシヘルペスウィルス１型などのウシの病気の現場診断は、この産業のためになる可能性がある。感染したウシおよび感染していないウシの細胞がＳＤＧにかけられ、本発明者らは、ウィルスのチロシンキナーゼ１および糖タンパク質Ｂの遺伝子に対するプライマーを使用して、健康な試料と病気の試料を成功裡に区別した（図６Ｆ）。
【００６７】
次に、水中における大腸菌ＤＮＡを検出するためにＳＤＧが使用された。普通の実験用大腸菌株のワンショットマック１（ＯｎｅＳｈｏｔ  Ｍａｃｈ  １）が、ＯＤ＝０．５まで培養された。次いで、これは１０倍に希釈され、１０μＬがＤＮＡ抽出に使用された。次いで、抽出されたＤＮＡのうちの１μＬが、ｕｉｄＡ遺伝子中の大腸菌特異的配列を標的にするプライマーと共に増幅のステップにおいて使用された２７。増幅特異性は、非特異的対照としてのシュードモナス・シリンガエのｇＤＮＡと、ＤＮＡ鋳型を欠如している対照（ＮｏＴ）とを使用して証明された。この用途の場合のみ、汚染を回避するために数々の予防処置が取られた後であっても、ＮｏＴ対照中にＲＰＡ産物が常に観察された。これに加えて、関係のないＤＮＡ鋳型中において同様のレベルの増幅が観察された。したがって、本発明者らは、ＲＰＡキットが低レベルの汚染大腸菌ＤＮＡを有しており、ＮｏＴ対照における増幅のレベルを基準線とみなすことができると結論を下した。しかしながら、大腸菌陰性試料であってもアンプリコンを生じるため、フロキュレーションアッセイにおいて偽陽性物が生じる場合がある。この欠点を克服するように、本発明者らは、フロキュレーション緩衝液のｐＨを４．５から５に増加させることによってこのアッセイを「調整」した。この条件下で本発明者らは、バックグラウンド増幅を計算に入れて、対照試料における偽検出なしに大腸菌陽性試料を成功裡に検出することができた（図６Ｂ）。
【００６８】
最後に、ＳＤＧは、ＨＩＶ、マラリア、結核、およびインフルエンザなどのヒトの病気を引き起こす病原体にまで拡張された。この目的において、同一のＳＤＧプロトコルを使用して、本発明者らは、ＨＩＶに感染している細胞（プロウィルスＤＮＡ）を健康な細胞と成功裡に区別した（図６Ｃ）。マラリア寄生虫ＤＮＡの存在もまた、感染していない対照中ではなく感染している血液試料中において成功裡に検出された（図４Ｄ）。培養試料中の結核性マイコバクテリアの存在は、２つの異なる標的遺伝子を使用して明確に検出可能であり、大腸菌と区別することができた（図６Ｇ）。最後に、インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１ウィルスは感染している培地中で検出された一方で、感染していない培地は何れの陽性シグナルも示さなかった（図６Ｈ）。総合すると、ＳＤＧは、ＳＤＧ自体を、試料の実験室での処理または精巧な設備を必要とせずに、現地において使用することができる普遍
的な包括的手法として実証しており、多くの用途に適合されることができる。
【００６９】
考察
現地で準備できるＰＯＣゲノムアッセイは、一定量の核酸の定常的な抽出の試料採取プロトコル、迅速かつ高感度な等温増幅法、および設備を使わない読取りによって特徴づけられることができる。本明細書において、本発明者らは、様々な界にわたる複数の病原性および非病原性の種からＤＮＡおよびＲＮＡを検出するための、普遍的な、事実上設備を使わない、低コストの方法の上記特徴のすべてを統合した一滴ゲノム（図１）アッセイについて述べる。
【００７０】
定常的に核酸を一定量で試料採取するための解決策を提供することは、投入材料の量が下流プロセスの性能に著しく影響する可能性があるため、些細な事柄ではない。これを達成するように本発明者らは、グアニジウム−ＨＣｌなどのカオトロピック塩からなる溶解緩衝液を使用して確立されたプロトコルを修正した。グアニジウム塩は、タンパク質および不活性ヌクレアーゼを変成し、こうして核酸の完全性を保存する。溶解を向上させるために、トリトン−Ｘなどの界面活性剤と一緒に細胞膜が破壊される。これに続いて、次に不溶性の細胞デブリが除去され、最後に核酸の抽出および精製が行われる。実験室の設定において、細胞デブリは、遠心分離を使用して便利に除去される。残念ながら、遠心分離機は現地では容易に利用できない。最も安価かつ簡単な解決策は、精製していない溶解液を濾過することである。本発明者らは、また、これを最低限の設備で達成することを追求したことから、本発明者らは、精製していない溶解液を清澄化する手段として普通のフィルタ付きピペットチップを使用することを決定した（図２）。
【００７１】
次いで核酸は、ＳＰＲＩ技術１９を使用して抽出される。これは、それが事実上設備を使わず、磁石のみを必要とするため、ＰＯＣ用途には最も適している。これに加えて、ＤＮＡの収量は、一定の試料投入を仮定すると、単にＳＰＲＩ粒子の量を調整することによって正確に制御することができる。この手法の別の利点は、これが比較的低コストであることである。使用するＳＰＲＩビーズの量については、本発明者らの手法は、数セントかかるに過ぎず、総アッセイコストに有意には寄与しない。本発明者らの溶解緩衝液とＳＰＲＩ技術との独特の組合せにより、本発明者らは、植物の葉の組織からＤＮＡについては３〜５ｎｇ／μＬの収量を、およびＲＮＡについては３０〜４０ｎｇ／μＬの収量を定常的に得た（図２Ｂおよび図２Ｃ）。現地の状況において核酸を定量するための簡単で設備を使わない方法がないために、この精度のレベルは重要である。実践上の目的において、このＤＮＡの濃度は、下流のＲＰＡによる増幅にとっても最適であり、その読取りアッセイを妨げなかった。
【００７２】
ＲＰＡは、比較的新しい等温核酸増幅法である４。これはツイストＤＸによって市販されており、潜在的に単細胞の検出のレベルと、また５重までのＲＰＡ反応とを有する。他の等温手法に優先してＲＰＡを選択する別の主要な要因は、そのキットが凍結乾燥されたペレットとして販売されており、室温において安定であることであり、これは地理的に離れた区域での用途にとってきわめて有用な特徴である。本発明者らが開発したこのＲＰＡアッセイは、植物、動物、およびヒトの試料中の病原性または非病原性ＤＮＡの高感度かつ迅速（３０〜４０分）な検出用に開発され、設計されている。
【００７３】
ＲＰＡキットの唯一の営利的供給業者であるツイストＤＸは、加熱ブロックおよび蛍光計の両方として機能するポータブルな装置を現在市販している。これは可能なＰＯＣの解決策を提供するが、この装置および特殊な化学的修飾を伴うプライマーを購入するための初期支出は、実際に実施する上で制限を課す可能性がある。これに加えて、現実の現地の状況において使用される任意の種類の設備は、極度の熱さおよび寒さ、湿度、汚れ、雨などを含め、機器の耐用年数を大幅に制限することになる不利な気候条件に対して曝される
。これに対処するために、本発明者らは、ほとんどコストをかけず、かつ設備なしでＲＰＡによる増幅を素早く評価することができる読取り方法を開発した。本発明者らの読取り手法は、ＳＰＲＩビーズの高いＤＮＡ結合能力を利用するフロキュレーションアッセイである（図３）。本発明者らの知識によると、磁性ＳＰＲＩ粒子の使用が読取り方法として述べられたのは、これが初めてである。フロキュレーションアッセイは、それが簡単であり、かつ精巧な器具類を必要としないために主にＰＯＣの用途にとって有利であり、また、試験からの単純な不連続（イエス／ノー）の結果が必要とされる用途において有用である。最近、比色バイオセンシングのために金のナノ粒子を使用した様々な実証結果が報告されている２１〜２３。きわめて高感度であることが示されている一方で、高濃度で使用しない限りカラーシフトが相対的にわずかであり、多くの群では凝集を確かめるために分光測定が使用される。対照的に、本発明者らのフロキュレーションアッセイは、より良好な視覚コントラストを有する。これは、ナノサイズの金の粒子と比べたその粒子の大きいサイズ（１μｍ）のためである可能性が高い。粒子はＤＮＡの導入量の増加と共に凝集するため、それらは管の底に素早く沈降する一層大きい塊を形成し、こうして透明な溶液を生じる。他方で、遊離粒子はゆっくり沈降して濁った溶液を生じる。
【００７４】
粒子の凝集はまた、緩衝液のｐＨを増加させることによって可逆であることができ（図３Ｄ）、したがって、定義によりフロキュレーションはコロイドの可逆的非共有結合の凝集である２４ため、これはＤＮＡ仲介フロキュレーションをさらに裏付けた。ｐＨが高いとき、ＤＮＡは一層大きく負に帯電し、そのため、その粒子のカルボン酸で覆われた表面から他のＤＮＡを斥ける可能性がより高い。このｐＨ依存性は、また、ＤＮＡ濃度に対するこのアッセイの感度を調整するために利用されることもできる。この報告において本発明者らは、外因性大腸菌ＤＮＡと、市販の酵素が大腸菌培養物から組換え技術を使用して生成されることにおそらく起因する、ＲＰＡ酵素溶液中に存在する混入大腸菌ＤＮＡとを区別するために、この特徴を利用した（図６Ｂ）。ｐＨを調整してフロキュレーションを制御することによって、本発明者らは、増幅のバックグラウンドレベルを計算に入れることができ、またそのために、外因性大腸菌ＤＮＡから生じる追加の増幅を検出することができた。これは簡単な解決策であり得る一方で、この手法の欠点は、感度および視覚コントラストにおける減損である。フロキュレーションの可能性は存在する高分子量ＤＮＡの量に依存するため、過剰な投入ＤＮＡによるアッセイへの過導入は、疑似凝集または偽陽性にもつながる可能性がある。しかしながら、本発明者らの抽出プロトコルの精度のために、本発明者らはこの状況を効果的に回避した（図２）。
【００７５】
最後に、ＳＤＧの広範囲の用途が、様々な宿主標本から直接に大量の病原体を検出することに成功したことにより実証された（図６）。例えば本発明者らは、植物中の真菌、細菌およびウィルス、ウシ細胞中のヘルペスウィルスＤＮＡ、ヒト組織中のＨＩＶプロウィルスＤＮＡ、マラリア寄生虫、インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１ウィルス、および細菌が加えられている水を検出した。ここに示した複数種の例は、遠隔地での他の現地試験用途のための幅広い可能性および汎用性を実証する。
【００７６】
結論として、この一滴ゲノムアッセイは、農業、ヒトの健康、および全般的生物学的安全性において多くの用途を有する、包括的な、現地で準備できる、普遍的な、設備を使わない、複数種ＤＮＡおよびＲＮＡ検出戦略である。その最新の形態におけるＳＤＧは、現地での評価に利用可能である。
【００７７】
【表１】
2017501719.tif 000003
【００７８】
実施例２：ＤＮＡ仲介架橋フロキュレーションによる遺伝子座特異的ＤＮＡメチル化の迅速かつ少ない資源による評価
病院にＤＮＡメチル化バイオマーカを持ち込むことの課題は、大部分のアッセイが研究目的で開発されているため、簡単な方法が欠如していることである。本明細書中において、本発明者らは、ナノグラム量の投入からの高度にメチル化された遺伝子座特異的領域の迅速かつ厳密性の高い肉眼による二値の評価のための、ＤＮＡ仲介フロキュレーションアッセイと一体となっている高度に修正されているメチル−タンパク質ドメイン（ＭＢＤ）濃縮プロトコルについて述べる。本発明者らの方法についての少ない資源要件は、病院におけるＤＮＡメチル化ベースの診断の広範囲に及ぶ採用を可能にし、かつ小規模研究にとっても有用である可能性がある。
【００７９】
材料および方法
ＤＮＡ試料の調製
全ゲノム増幅（ＷＧＡ：Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）ＤＮＡが、ＲＥＰＬＩ−ｇウルトラファストミニキット（ＲＥＰＬＩ−ｇ  ＵｌｔｒａＦａｓｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して作製され、ＤＮイージーブラッドアンドティッシュキット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ）（キアゲン）を使用して精製された。次いで、高度にメチル化されたゲノムＤＮＡを作製するために、ＷＧＡ  ＤＮＡの分割量がＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼによって一晩処理され、精製された。細胞系由来のＤＮＡも、ＤＮイージーブラッドアンドティッシュキットによって精製された。細胞系は、ＡＴＣＣから購入され、製造推奨に従って培養された。
【００８０】
前立腺がん患者由来の全血ＤＮＡが、修正されたＳＰＲＩプロトコル２８を使用して精製された。手短に言えば、ＥＤＴＡで保存した６０μＬの全血が、１０μＬのプロテイナーゼＫ溶液（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）、ＮＥＢ）、６０μＬの溶解緩衝液（３ＭグアニジンＨＣｌ、２％トリトンＸ）、および２μＬのＲＮアーゼＡ溶液（４ｍｇ／ｍＬ）と共に室温で１０分間インキュベートされた。次いで、その溶解血に、１０μＬのカルボキシルで覆われている磁気ビーズ（サーモ・フィッシャー）および２４０μＬの結合緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００、ｐＨ８．０）が加えられた。室温において１０分間インキュベートした後、ＤＮＡ結合磁気ビーズが磁石によって収集され、洗浄液（４００ｍＭグアニジンＨＣｌ、７０％エタノール）で１回、７０％エタノールで２回洗浄され、最後に３０μＬの水により溶出させた。両血液試料は、収集して２４時間以内に処理された。ヒトの血液試料を使用する認可は、地元の倫理委員会によって与えられた。
【００８１】
ＭＤＢ濃縮に適合するＤＮＡ断片サイズを作製するために、ＭｓｅＩおよびＭｌｕＣＩ制限酵素（ＮＥＢ）が使用された。手短に言えば、５０ｎｇのＤＮＡが、１０μＬの反応において１単位の各酵素によって３７℃で３０分間消化された。消化後、その反応のうちの２μＬがそれぞれのＭＢＤ濃縮用に使用された。
【００８２】
ＭＢＤの濃縮
エピマークメチル化ＤＮＡ濃縮キット（Ｅｐｉｍａｒｋ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｋｉｔ）（ＮＥＢ）が、推奨されている使用指示に対して大きく変更して使用された。手短に言えば、２μｇのＭＤＢ２ａ−Ｆｃタンパク質が、１０μＬのタンパク質Ａ磁気ビーズと共に室温で１５分間インキュベートされた。次いで、そのＭＢＤ／磁気ビーズミックスのうちの０．５μＬが、１×ＭＢＤ緩衝液中における各５０μＬの濃縮反応に対して使用された。ＮａＣｌは、濃度３００ｍＭに変更した。ＤＮＡとＭＢＤ／磁気ビーズとを氷上で１５分間反応させた。この次に、過剰な、および結合の弱いＤＮＡを除去するために、３００ｍＭに変更したＮａＣｌを有する１×ＭＢＤ緩衝液において、３回の５分間洗浄が続いた。次いで、濃縮されたＤＮＡが、５μＬの２．５Ｍ
ＮａＣｌ溶液によって溶離された。最後に、濃縮されたＤＮＡは、アジェンコートアンピュアＸＰ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）のＳＰＲＩ磁気ビーズ（ベックマンコールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて製造推奨に従って精製され、６μＬの水により溶離された。次いで、１μＬの精製されたＤＮＡが、各ＲＰＡ反応のために使用された。
【００８３】
ＲＰＡによる増幅
ＲＰＡ反応が、推奨されているプロトコルに幾つかの修正を伴ってツイストアンプベーシックキット（ＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｔ）（ツイストＤＸ）を使用して行われた。手短に言えば、５００ｎＭのプライマーが、７ｍＭ  ＭｇＯＡｃを追加されている各１２．５μＬの反応において使用された。迅速な２０分のＲＰＡによる増幅の後、３μＬをゲル上で電気泳動させて増幅を確かめた。残りは、下流のフロキュレーションアッセイを妨げる可能性のあるＲＰＡ反応成分を除去するために行われたＳＰＲＩによる浄化にかけられた。次いで、精製されたアンプリコンが、９．５μＬの水により溶離された。
【００８４】
フロキュレーションアッセイ
フロキュレーションアッセイを行うために、３μＬの精製されたＲＰＡアンプリコンが、６μＬのアジェンコートアンピュアＸＰのＳＰＲＩ磁気ビーズと共に室温で５分間インキュベートされた。次いで、ビーズが磁石によって捕集され、かつ上清が除去された。次いで、直ちに２０μＬのフロキュレーション緩衝液（２００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．４）が加えられ、追加の１分間磁石上でインキュベートされた。次いで、最後に、管が磁石から取り出され、管の側部を静かに叩くことによって撹拌された。陽性試験は、結果としてＤＮＡ／ビーズペレットの凝集塊を生じさせ、一方、ビーズは、陰性試験において容易に溶液中に再分散した。
【００８５】
ＤＮＡにおけるエピジェネティックな変化は、可能性のある病気のバイオマーカである２８。ＤＮＡのエピジェネティックな変化の一形態は、シトシン／グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）中の、具体的には細胞過程を調節するように機能するプロモータ領域のＣｐＧ島（ＣＧＩ：ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ）中のシトシンのメチル化（５ｍＣ）である。しかしながら、大部分の手法は、ＤＮＡの重亜硫酸塩変換２９、３０と、それに続く配列決定の幾つかの形態３１〜３４とを介してＤＮＡメチル化を検出する。重亜硫酸塩変換手法に関連する厄介な問題を回避するために、メチル結合ドメイン（ＭＤＢ）タンパク質、または５−メチルシトシンに対して産出されている抗体を使用するアフィニティーキャプチャー法が、多くの最近のＤＮＡメチル化の検討３５、３６において、一般に次世代シークエンシング（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と一体となって採用されている。これらの方法は研究用には優れている一方で、日常的な診断のために遺伝子特異的メチル化を検出するより簡単かつ便利な方法は、依然として欠如している。重亜硫酸塩処理を回避すると同時に臨床の必要に対処するために親和性に基づく手法に関して様々な戦略が開発されている３４〜４０が、メチル化が異なる領域（ＤＭＲ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を評価するために、すべての手法が依然として光学的読取り方法の幾つかの形態を必要とする。
【００８６】
ＭＢＤ濃縮法の有用な特徴は、適切な塩濃度下におけるそれら酵素のほとんど二値の特異性３５、３６、すなわち、ＭＤＢがメチル化ＤＮＡを捕集するか否かである。この二値の特徴は、病院における病気の結果の前兆である高度に異なるメチル化の領域（ＨＤＭＲ）など、顕著に変化する状況において有用であり得る。したがって、これらのデジタルなイエス／ノーのバイオマーカを監視する読取り方法が有用であり得る。可能性のある二値の読取り手法は、ＤＮＡ重合体仲介架橋フロキュレーションアッセイであることができる。フロキュレーションは一般に相間で不意に起こる４１〜４７ため、ＭＤＢ濃縮アッセイをフロキュレーションに基づく読取りと結びつけることにより、結果としてＨＤＭＲを評価するための迅速でかつ少ない資源による方法をもたらすことができる。
【００８７】
架橋フロキュレーションプロセスの重要な特徴は、長鎖ＤＮＡ重合体セグメントと短鎖ＤＮＡ重合体セグメントを区別することであり、これがこのアッセイを可能にする核心部である。架橋フロキュレーションは肉眼によって簡単に見られるため、従来の方法と比較してきわめて魅力的な少ない資源による評価システムであり、低コストの日常的な病院での使用により適している可能性がある。カラーシフトが一般にわずかであり、確認のために分光測定を必要とするナノ粒子に基づく他の手法２１〜２４とは対照的に、フロキュレーションアッセイにおける濁った溶液から透明な溶液へのシフトは、より良好な視覚コントラストを有し、追加の設備なしで肉眼によって簡単に評価することができる。
【００８８】
結果および考察
本明細書中において、本発明者らは、メチル化ＤＮＡを選択的に濃縮するためのＭＢＤと、それに続く、ＨＤＭＲに特異的なＤＮＡ重合体を大量に作製するための安定した等温リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）４とを使用する新規な方法（図７）について述べる。最後に、この増幅されたＨＤＭＲの存在が、ＤＮＡ仲介架橋フロキュレーションアッセイを介して肉眼によって評価される。ナノグラム量の出発ゲノム材料が必要とされたに過ぎず、このアッセイは、現状では１０％のメチル化の変化に対して高感度であった。このアッセイは、２時間未満で完了し、かつ最低限の設備、すなわちピペット、加熱ブロック、および磁石を必要とするに過ぎなかった。最後に、このアッセイは、３種類の潜在的ながんに関連するＨＤＭＲの存在について試験するために、細胞のパネルおよび全血由来のＤＮＡに適用された。本発明者らは、この方法の速さと、簡単さと、少ない資源要件とが、病院においてＤＮＡメチル化に基づく広い用途を有する可能性があると考えている。
【００８９】
この方法を実現するために（図７）、本発明者らは、まずＭＢＤ濃縮用の５０ｎｇのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ：ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を酵素で断片化した。本発明者らは、投入ＤＮＡの酵素による断片化を選択した。その理由は、これが、時間がかかる可能性があり、特殊な設備を必要とする超音波処理による物理的剪断とは異なり、加熱ブロックのみを必要とする確立されかつ安定した分子技術であるためである。ＭｓｅＩおよびＭｌｕＣＩ制限酵素（認識配列はそれぞれＴＴＡＡおよびＡＡＴＴ）の組合せが選択された。その理由は、これらが、ＨＤＭＲが一般に見出されるＣＧＩの過剰な断片化を回避する一方で、高い頻度でヒトゲノムを切断してＭＢＤ濃縮に適合する断片（平均で１２５ｂｐ）を作製するためである。次いで、磁気ビーズと結合したＭＢＤがその後、塩が比較的多い緩衝液（３００ｍＭ）中においてＨＤＭＲを選択する３６ために、迅速かつ厳密性の高い濃縮を可能にするように氷上（４℃）で結合および洗浄の両ステップを行いながら導入された。ＥＳＲ１遺伝子プロモータ（乳がんにおける既知のＨＤＭＲ２７）と関連するＣＧＩに対してプライマーを使用して、本発明者らは、まず、メチル化対照としてｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル化した５ｎｇの全ゲノム増幅（ＷＧＡ）ＤＮＡと対比して、非メチル化対照として５ｎｇのＷＧＡ  ＤＮＡを用いてＭＢＤ濃縮ステップを試験した。後続の濃縮ＤＮＡのＲＰＡによる増幅によって表されるように、氷上での全ＭＢＤアッセイ（結合および洗浄）を行うことにより、結果として、性能の減損が最低限の、メチル化されたＤＮＡのみの高度に特異的な濃縮が約３０分のうちに生じた（図８Ａ）。これは、低投入量で高い厳密さを達成するために様々なＭＤＢ酵素のカクテルおよび／または４℃における一晩のインキュベートのいずれかが必要とされた前述のプロトコル３６、３８を上回る、速さおよび特異性の両方における顕著な改良であった。これに加えて、ここで使用される安定したかつ迅速な等温増幅は、このアッセイをさらに簡略化し、かつ速めた。
【００９０】
肉眼による評価は、ＭＢＤが濃縮されたＨＤＭＲなどの二値の診断結果に有用である可能性があるため、本発明者らはフロキュレーションアッセイを使用して増幅を評価した。評価には最低限の設備のみが必要とされるため、フロキュレーションアッセイは、少ない資源の設定にも適している場合がある。対象のＨＤＭＲに対するＲＰＡによる増幅の後、本発明者らは、概念実証として、ＤＮＡ精製にカルボキシルで覆われている固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）２８磁気ビーズを使用してビーズの表面にＤＮＡを沈殿させた。次いで、結合したＤＮＡを溶離する代わりに低ｐＨ緩衝液が導入されて、十分な長さを有する多量のＲＰＡアンプリコンが存在する場合（それはさらには、ＭＢＤが濃縮されたＨＤＭＲの存在を意味する）のみ、凝集塊を生じさせた。増幅が起こらない（メチル化の欠如を表す）場合、その１μＬのビーズは容易に溶液中に分散する。本発明者らの知識の限りでは、これはＭＢＤ／ＲＰＡに基づく手法についての初めての架橋フロキュレーションアッセイである。
【００９１】
本発明者らは、ここにＨＤＭＲを高い厳密さで迅速に検出することができたと確信し、本発明者らは、その注意を、このアッセイの検出限界、具体的には（１）凝集塊を生じさせるのに十分なＲＰＡアンプリコンを作製するのに必要な最小投入量、および（２）メチル化ＤＮＡの最小検出可能量の決定に向けた。この目的において、本発明者らは、メチル化の様々なレベル（１００％、５０％、１０％、および０％）に対し滴定された５ｎｇのｇＤＮＡを処理した。本発明者らは、ゲル電気泳動による可視化およびフロキュレーションアッセイの両方においてメチル化されている、全ＤＮＡ投入量のうちの１０％ほどの少ない量からメチル化ＤＮＡの存在を確実に検出することができた（図２Ｂ）。また、これにより、検出可能なシグナルには最小量の０．５ｎｇ（１０％メチル化試料）の出発メチル化ＤＮＡが必要とされることが示唆された。これらのデータを考慮に入れて、本発明者らは、本発明者らの手法がナノグラムの管理形態において高度メチル化ＤＮＡに対して特異的であり、かつ高感度であることを確信した。
【００９２】
最近、ＤＮＡに誘発される磁気共鳴のシフトを使用するオンチップのＭＢＤ／ＲＰＡ手法１０が報告されている。迅速かつ有用ではある一方で、この手法はＲＰＡアンプリコンの存在を評価するために補助設備を必要とする。対照的に本発明者らの手法では、それらの結果は同様の時間枠内でかつより少量の出発材料を用いて肉眼で簡単に評価される。これに加えて、本発明者らは、本発明者らの方法が、定性的ではあるが低レベル（１０％）のメチル化を検出する、およびナノグラム量のＤＮＡ投入から検出する能力も実証した。
【００９３】
最後に、より複雑な生物学的試料への応用を実証するために、本発明者らは、本発明者らのアッセイを拡張して、ヒトがん細胞系のパネルに対して、ＥＳＲ１に加えて２種類の追加の潜在的なバイオマーカＧＳＴＰ１４９〜５１およびＮＰＹ５２〜５４のメチル化のステータスを評価した（図９Ａ〜図９Ｃ）。厳密さを制御するために、非メチル化ＷＧＡ
ＤＮＡも、この細胞系に由来するＤＮＡと同時にアッセイされた。予想されたように、３種類のすべてのバイオマーカアッセイについて、非メチル化対照中において無視できるＲＰＡによる増幅が検出され、こうしてアッセイの厳密さを検証した。予想されたように、本発明者らは、７種類のすべての細胞系の試料についてＥＳＲ１、ＮＰＹ、およびＧＳＴＰ１のメチル化状態のプロファイリングに成功した。これに加えて、ここに提示したデータは、文献５５、５６と一致し、したがってこれらは本発明者らの手法の正確さを強調する。最後に、本発明者らは、高度転移性前立腺がんを有する男性から得られている全血由来のｇＤＮＡの２種類の試料、および２５人の正常な女性のプールされている試料からの１つの試料にこのアッセイを適用した（図３Ｄ）。この２種類の前立腺がん試料（ＰＣ１およびＰＣ２）については、凝集塊の存在に基づいて高度にメチル化されたＧＳＴＰ１が検出されたが、ＥＳＲ１およびＮＰＹについては検出されなかった。プールされた正常なＤＮＡ試料（ＮＢ）については、フロキュレーションアッセイによって示されるように３種類のすべてのバイオマーカがメチル化された。正常なＤＮＡ試料についてのこのメチル化プロファイルは予想外であったが、さらなる調査はこの報告の範囲外である。しかしながら、このデータは、特異的メチル化バイオマーカの適切な試料採取ソースの選択の重要性を強調する。それにもかかわらず、これら結果は、一般に日常的な診断に使用される体液（例えば全血）に対する本発明者らのアッセイの実行可能性を実証する。
【００９４】
結論として、本発明者らが初めて、ナノグラム量の投入からのメチル化ＤＮＡの厳密な濃縮のための、ＭＢＤに基づく迅速な方法について述べた。これをＲＰＡと結びつけて、本発明者らは１０％以上メチル化された試料から高感度な検出を達成することができた。次いで、陽性のＭＢＤ／ＲＰＡの結果が簡単なフロキュレーションアッセイにより肉眼で評価され、またこれはメチル化検出のための伝統的なコロイド化学現象の初めての実証である。この方法は、細胞系および全血からとった試料にも拡張され、診断ツールとしてのその実行可能性を実証した。最後に、陽性のＭＢＤ／ＲＰＡ結果を評価するためのフロキュレーションアッセイの使用は、日常的な診断および小規模のＤＮＡメチル化研究にとって有益である可能性のある、少ない資源での用途のための標識を用いない手法を可能にする。
【００９５】
実施例３：前立腺がんにおける尿のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合体の検出
前立腺がんの分子のサブタイプでは、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合体が卓越している。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合体が腫瘍の浸潤を仲介することをかなりの証拠が示唆している。これらは、前立腺上皮内新生組織形成（ＰＩＮ：ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、前立腺がんの前兆病変、および前立腺がん自体の間の決定的な組織学的違いと一致する。したがって、本明細書中で開示する「一滴」核酸検出システムが、臨床現場での診断に有用であり得る方法でＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合体を検出できるか否かを判断することは、価値がある。
【００９６】
等温リコンビナーゼポリメラーゼ増幅が、表２に示すプライマーを使用して基本的には
以前に述べたような条件下で行われた。次いでアンプリコンが、基本的には以前に述べたような条件下でフロキュレーション誘発緩衝液中においてＳＰＲＩ粒子を使用して検出された。
【００９７】
図１０に示すように、ＲＴ−ＲＰＡ後にＤｕＣａｐ  ＲＮＡアンプリコンのＤＮＡ配列決定。抽出したＤｕＣａｐ  ＲＮＡのＲＴ−ＲＰＡアンプリコンは、ＳＰＲＩ磁性粒子を使用して精製されて配列決定され、標的ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ領域の増幅を確かめた。図１１では、１０人の転移性去勢抵抗性前立腺がん患者および１人の健康な患者の尿試料から抽出されているＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを示す。アガロースゲル電気泳動によって可視化されたこのＲＴ−ＰＣＲアンプリコンは、同じ患者群に関するこのフロキュレーションアッセイのスクリーニング結果を検証した（図１１ｃ）。図１２において、全尿および尿沈降物のＲＮＡ安定性の比較は、試料収集の０、２、および１２時間後に抽出された、患者の全尿および尿沈降物のＲＮＡのＲＴ−ＲＰＡを実証する。
【００９８】
要約すると、これらのデータは、本明細書中で開示した「一滴ゲノム法」の考え方が、前立腺がん細胞の潜在的な存在の診断指標としてのＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合体を含む核酸の迅速な、かつ効率のよい検出に理想的に適していることを示す。
【００９９】
【表２】
2017501719.tif 000004
【０１００】
実施例４：一滴ゲノム法のためのアンプリコンのローリングサークル増幅による作製
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、この方法を病気のバイオマーカ検出用に拡張して使用している迅速等温核酸増幅法である５７〜５９。ＲＣＡは長鎖（キロ塩基）のＤＮＡ重合体を作製するため、適切な長さの十分なＤＮＡを必要とするＤＮＡ仲介架橋フロキュレーション読取りに適い得る。ＤＮＡ仲介架橋フロキュレーション読取りアッセイの利点は、その結果を現場において肉眼によって評価することができることであり、したがって少ない資源の設定の用途に有用であることである。この検討において本発明者らは、農業的に重要な病原体であるシュードモナス・シリンガエ（ＰＳＹ）の迅速かつ少ない資源での検出のために、ＲＣＡによる増幅を架橋フロキュレーション読取りと組み合わせる実行可能性を実証した。
【０１０１】
材料および方法
サークルプローブの設計
シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｙ）のゲノム配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から得られた。生物情報分析が行われ、候補の標的Ｐｓｙの配列が同定された。候補配列は、他の生物中の相同ＤＮＡ断片を同定するためにＢＬＡＳＴによる検索にかけられた。そのＰｓｙのゲノム中に存在するが他の生物には存在しない配列を見出すことに、特別な注意が払われた。データバンク中の利用できる任意の配列と相同性を示さない断片が選択された。そのユニーク配列に基づいて、ＣＶｉＰＩＩニッキング部位が同定され、６４ヌクレオチド配列５’−ＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＧＡＴＡＧＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＴＴＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧ−３’（「ニックＰＳＹ」、配列番号２８）を有する一重鎖サークルプローブが設計された。
【０１０２】
サーキュラープローブは、１ＸサークリガーゼＩＩ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ）反応緩衝液（３３ｍＭトリス酢酸（ｐＨ７．５）、６６ｍＭ酢酸カリウム、および０．５ｍＭ  ＤＴＴ）、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、および１Ｍベタインを含有する２０μＬの反応により、１０ｐモルの一重鎖サークルプローブを５ＵのサークリガーゼＩＩ（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））と混合することによって調製された。この反応は、サークリガーゼＩＩを不活性化するために６０℃で１６時間、続いて８０℃で１０分間インキュベートされた。
【０１０３】
ゲノムＤＮＡの消化
５０ｎｇのＰｓｙゲノムＤＮＡおよび植物ゲノムＤＮＡが、１Ｘカットスマート（ＣｕｔＳｍａｒｔ）緩衝液（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ）を含有する２０μＬの反応において、５ＵのＣＶｉＰＩＩニッキング酵素（ＮＥＢ）により消化された。この消化物は、最初に３７℃で９０分間インキュベートされ、続いて６５℃で２０分間の変性ステップにかけられた。
【０１０４】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）
１００ｎＭのサークルプローブが、ニッキング酵素で消化された２５０ｐｇのゲノムＤＮＡと、１Ｘ  Ｐｈｉ２９緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＤＴＴ）中に５Ｕのクレノウ断片（３’→５’ｅｘｏ）（ＮＥＢ）、５ＵのＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、および１２５ｎＭのそれぞれのｄＮＴＰを含有する２０μＬの反応において混合された。この反応混合物は３７℃で３０分間インキュベートされた。この産物が、ホウ酸ナトリウム緩衝液において１．５％アガロースゲルを使用するゲル電気泳動によって分析された。線形ＲＣＡの性質のために、期待産物サイズは、ゲル電気泳動により表されるように２５塩基ほどの短いものから１０を超えるものまでの範囲に及んだ。
【０１０５】
フロキュレーションアッセイ
５μＬのＲＣＡ反応は、１０μＬのアジェンコートアンピュアＸＰのＳＰＲＩビーズと共に室温で５分間インキュベートされ、ＲＣＡ産物を磁気ビーズ表面に結合させた。次いで、ＤＮＡを載せたビーズは磁石によって単離され、７０％エタノールによって１回洗浄され、１分間空気乾燥された。次いで、３０μＬのフロキュレーション緩衝液（１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．４）がビーズに加えられ、もう１分間インキュベートしてから、管の側部を静かに叩くことによって撹拌された。
【０１０６】
結果および考察
この応用法を実現するために、本発明者らは、まずＰＳＹゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を宿主植物ｇＤＮＡ（シロイヌナズナ、図１３）の５ｎｇのバックグラウンドにスパイクした。予想されたように、ラダリング／スメアリングプロファイルによって表される高分子量産物が、ＰＳＹの存在下（１〜１０％）においてのみ作製されたが、植物ＤＮＡ（０％）においては作製されず、これはこのＲＣＡアッセイの特異性を表している。これに加え
て、ＤＮＡ介在性の凝集塊はＲＣＡが成功した場合のみ現れ（１〜１０％のスパイク試料）、したがってＲＣＡによって作製されている産物のフロキュレーション読取りの実行可能性を実証した。
【０１０７】
最後に、実際の農業用途をシミュレートするために、本発明者らは、様々な感染度（Ｓ１〜５、図１４）における表現型を代表する宿主植物の葉を刈り取った。ＲＣＡおよびフロキュレーション読取りを使用して、本発明者らは、発症前の感染のレベルを表すＳ１ほどの早期にＰＳＹの存在を検出することができた。健康（Ｈ）対照および鋳型なし（ＮｏＴ）対照に関しては増幅も、したがって凝集塊も見られず、これはこの手法の特異性を表す。
【０１０８】
結論として、このＤＮＡ仲介架橋フロキュレーション読取りは、ＲＣＡによって作製されている産物に適合し、病原体配列の迅速で、高感度な、少ない資源での検出に有用であることができる。ＲＣＡによって作製されている産物に対するこのフロキュレーションアッセイの応用は、感染している宿主植物の葉におけるＰＳＹの検出の成功によって実証された。
【０１０９】
本明細書全体を通じて、その目的は、いずれか１つの実施形態にまたは特徴の特定の集合に本発明を限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することであった。本発明から逸脱することなく、これら記載および例示した実施形態に対して様々な変更および修正を行うことができる。
【０１１０】
本明細書中で参照される開示の各特許および科学的文献、コンピュータプログラムおよびアルゴリズムは、その全体が参照により援用される。
参照文献
【０１１１】
【表３】
2017501719.tif 000005
【０１１２】
2017501719.tif 000006
【０１１３】
2017501719.tif 000007
【０１１４】
2017501719.tif 000008
【０１１５】
2017501719.tif 000009
【図８】
2017501719.tif 000010
【図９】
2017501719.tif 000011
【図１０】
2017501719.tif 000012
【図１３】
2017501719.tif 000013
【図１４】
2017501719.tif 000014
【図１】
2017501719.tif 000015
【図２】
2017501719.tif 000016
【図３】
2017501719.tif 000017
【図４】
2017501719.tif 000018
【図５】
2017501719.tif 000019
【図６】
2017501719.tif 000020
【図７】
2017501719.tif 000021
【図１１】
2017501719.tif 000022
【図１２】
2017501719.tif 000023
【国際調査報告】
2017501719.tif 000024
2017501719.tif 000025
2017501719.tif 000026
2017501719.tif 000027
2017501719.tif 000028
2017501719.tif 000029
2017501719.tif 000030