(57)【要約】  本発明は、植物性食物アレルゲン、より詳細にはアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を加水分解することができるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む医薬または健康補助食品に関し、それによって、ヒトにおける自然免疫応答による疾患を治療するおよび／または前記疾患の発病を遅延させることを可能にする。本発明は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼが、コムギおよび近縁の穀物中に存在するアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を加水分解することができるという発見に関し、前記阻害剤は、自然免疫応答の強い誘発因子となる。さらに、本発明は、アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を加水分解するための方法であって、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼと、アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を含む食用の組成物をインキュベートするステップを含み、阻害剤が、加水分解される方法に関する。本発明はまた、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼおよびさらなる酵素を含む酵素組成物ならびにアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む食料品にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ、プロリルエンドペプチターゼ、および薬学的にまたは食事療法で許容され得る賦形剤を含む健康補助食品または医薬組成物。
【請求項２】
アスペルギロペプシンＩをさらに含む、請求項１に記載の健康補助食品または医薬組成物。
【請求項３】
前記健康補助食品が、錠剤、カプセル、または液体製剤の形態をしている、請求項１または２に記載の健康補助食品または医薬組成物。
【請求項４】
医薬としての使用のためにアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む健康補助食品または医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物が、プロリル−エンドペプチターゼおよび薬学的にまたは食事療法で許容され得る賦形剤をさらに含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記組成物が、アスペルギロペプシンＩをさらに含む、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬が、腸における自然免疫応答に苦しんでいる患者の治療のためのものである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬が、セリアック病、非セリアック病グルテン不耐性、グルテン感受性、過敏性腸症候群、または炎症性腸疾患の治療のためのものである、請求項４〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬が、グルテン感受性の個人における胃腸の快適さを維持もしくは増強するための、またはセリアック病もしくは非セリアック病グルテン感受性の個人における胃腸の不快感の発病を遅延させるための、ならびに健康な個人におけるアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤暴露を減少させるための健康補助食品である、請求項４〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬が、食事の前または後の１時間以内に経口的に投与される、請求項４〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
食物組成物中の植物アレルゲンを分解するための方法であって、植物アレルゲンを加水分解するのに十分な時間、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼと共に、植物アレルゲンを含有する食物組成物をインキュベートするステップを含む方法。
【請求項１２】
植物アレルゲンを加水分解するのに十分な時間、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼと共に、植物アレルゲンを含有する食品を最初にインキュベートすることによって調製される食料品であって、前記食料品は、分解されたアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を含む、食料品。
【請求項１３】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼおよびプロリル−エンドペプチターゼを含むベーキング組成物または生地。
【請求項１４】
少なくとも１つの生地原料に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを追加するステップを含む、生地を調製するための方法。
【請求項１５】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼおよび少なくとも１つのさらなる酵素を含む酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物性食物アレルゲン、より詳細にはアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を加水分解することができるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｇｌｕｔａｍｉｃ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）を含む医薬または健康補助食品に関し、それによって、ヒトにおける自然免疫応答による疾患を治療するおよび／または前記疾患の発病を遅延させることを可能にする。本発明は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼが、コムギおよび近縁の穀物中に存在するアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を加水分解することができるという発見に関し、前記阻害剤は、自然免疫応答の強い誘発因子となる。さらに、本発明は、アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を加水分解するための方法であって、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼと、アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を含む食用の組成物をインキュベートするステップを含み、阻害剤が、加水分解される方法に関する。本発明はまた、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼおよびさらなる酵素を含む酵素組成物ならびにアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む食料品にも関する。
【０００２】
［発明の背景］
植物性食物アレルゲンは、クピン（ｃｕｐｉｎ）およびプロラミン（ｐｒｏｌａｍｉｎ）スーパーファミリーならびに植物防御系のタンパク質性分子を含む、広く存在するグループの植物タンパク質である。プロラミンスーパーファミリーは、マメ科植物、木の実、穀物、果物、および野菜のいくつかの重要なタイプのアレルゲンならびに穀物アルファ−アミラーゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含む。穀物プロラミンは、穀類胚乳の主な貯蔵タンパク質であり、コムギではグルテニンおよびグリアジン、ライムギではセカリン、ならびにオオムギではホルデインと命名されている。タンパク質性アルファ−アミラーゼ阻害剤は、非グルテンタンパク質である。構造的類似性に基づいて、植物起源を有するタンパク質性アルファ−アミラーゼ阻害剤は、レクチン様、ノッチン様、ＣＭタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚ様、ｃ−プロチオニン様、およびタウマチン様を含む６つのファミリーに通常分類される（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９０）。ＣＭ（クロロホルム−メタノール）タンパク質は、１２０〜１６０アミノ酸残基および５つのジスルフィド結合を含有する穀物種子由来の大きなタンパク質ファミリーである。それらは、典型的なダブルヘッドアルファ−アミラーゼ／トリプシンドメインを示す。この特徴は、それらがアルファ−アミラーゼおよびトリプシン様酵素の活性を阻害するのを可能にする。アルファ−アミラーゼ阻害剤０．１９は、このファミリーのうちで最も研究された阻害剤のうちの１つであり、それは、広範な特異性を有し、昆虫、鳥、および哺乳動物由来のアルファ−アミラーゼを阻害する。
【０００３】
さらに、植物防御タンパク質もまた、プロテアーゼ阻害剤を含む。種子および塊茎などのほとんどの植物貯蔵器官は、様々なタイプのプロテアーゼを阻害する様々な生化学的および構造的特性を有するプロテアーゼ阻害剤としてそれらの総タンパク質量のうち１〜１０％を含有する。タンパク質阻害剤は、それらが阻害する酵素のタイプに基づいて分類される：セリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、またはメタロカルボキシプロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｃａｒｂｏｘｙ−ｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤。
【０００４】
国際公開第２０１１／１３７３２２号パンフレットは、コムギおよび近縁の穀物において含有される非グルテンアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤ファミリーのメンバーがヒト腸における自然免疫応答の強い誘発因子となり、それによってセリアック病のような疾患の一因となることを最近開示した。さらに、アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤はまた、グルテン感受性、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患だけではなく、さらに非消化器系の炎症のような疾患または状態に対する重大な要因でもある。
【０００５】
セリアックスプルー、グルテン過敏性腸疾患、またはグルテン不耐性としても知られているセリアック病は、世界的に最もよくある食物不耐性のうちの１つであり、ヨーロッパ、北アメリカおよび南アメリカ、ならびにオーストラリアにおいて有病率が最も高い。セリアック病は、コムギ、オオムギ、ライムギ、およびそれらの交配近縁変種の摂取によって引き起こされ、吸収不良症候群に至る、遺伝的に罹患しやすい人における上部小腸の炎症疾患である。
【０００６】
グルテンは、コムギ、オオムギ、ライムギ、およびそれらの交配近縁変種中に存在する一般的な食物タンパク質である。グルテンは、グルタミンリッチおよびプロリンリッチグルテニンならびにプロラミン分子の複雑な混合物であり、これは、感受性のヒト個人におけるセリアック病誘発の原因因子であると考えられる。それらのまれな構造のために、プロリンおよびグルタミンの含有量が高いと、グルテンタンパク質は、消化器系の酵素に対して部分的に抵抗性となり、これにより、消化器系の免疫系によって感知され得るいくつかの非分解免疫原性ペプチドがもたらされる。感受性の個人によるそのようなタンパク質の摂取は、ペプチドおよび他の栄養素の効率的で広範囲な最終的な消化を担うことが知られている小腸の通常高級なじゅうたん様の上皮内層の平板化をもたらす。セリアックスプルーの臨床症状は、疲労、慢性の下痢、栄養素の吸収不良、体重減少、腹部膨満、貧血、ならびに骨粗鬆症ならびに消化器系の悪性疾患（リンパ腫およびがん）の発症の危険性の実質的な増強を含む。その疾病は、ヨーロッパおよび北アメリカの人口において２００人におよそ１人の発生率を有する。
【０００７】
グルテン不耐性の現在の本質的な治療は、食事からのグルテンの永久的で厳密な回収であり、これは継続が困難である。しかしながら、疾病が消化管における酵素作用によってどのように影響されるかを理解するために２つの分類のグルテン不耐性を定義することは重要である。セリアックスプルーは、自己免疫性の状態、小腸の遺伝的炎症障害である。グルテンタンパク質が消化の間に分解すると、それらは断片化する。これらのタンパク質断片は、ペプチドと呼ばれる。セリアック病罹病者において、小腸における不適切な免疫系応答は、１つのタイプのペプチドによって開始され、腸細胞が損傷を与えられる。
【０００８】
消化管がセリアック病以外の何か−たとえば細菌または酵母感染症の有害な影響によって傷つけられ、さらにはグルテン消化不良に至る、消化器系の酵素の損失がもたらされると、第２のタイプのグルテン不耐性が結果として生じる。酵素の個人への補足は、セリアック病罹病者に有益であるかもしれないが、患者らは、微量のグルテンが未消化で残った場合の自己免疫反応の影響力が可能性としてあるために、グルテンが厳密にない食事を続けなければならない。
【０００９】
栄養補助食品としての特異的な酵素の使用は、グルテン不耐性を発症する危険性がある個人にとって、グルテン感受性の個人にとって、またはグルテン不耐性が消化管損傷によるものである場合、グルテンなしの食事の必要性を最小限にするのに有効となり得る。
【００１０】
グルテン解毒のための外因性タンパク質分解酵素の使用は、セリアック病の管理のための最も有望な戦略のうちの１つであった。そのような酵素は、グルテンを含有する粉の前処理においてもサプリメントとしても使用されてきた。プロリルエンドペプチターゼは、グリアジンペプチドを消化することが示された既知のグルテン消化酵素である（国際公開第２００２／４５５２４号パンフレットおよび国際公開第２００２／４６３８１号パンフレット）。
【００１１】
国際公開第２０１１／１３７３２２号パンフレットは、セリアック病患者を治療するためのアルファ−アミラーゼＣＭ３に対する抗体または食物組成物の使用を開示し、代替物としてプロテアーゼの使用を考慮する。しかしながら、それは、胃腸管においてまたはコムギ、オオムギ、ライムギ、およびそれらの交配近縁変種に由来する食料品の前処理においてアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を効率的に加水分解するための特異的な酵素処理に関して言及していない。
【００１２】
インドリンおよびプロチオニンは、いくつかのイネ科の胚乳中に存在する硫黄が豊富な塩基性低分子量タンパク質のグループを含む。たとえば、コムギ、ライムギ、およびオオムギ由来のアルファ−プロチオニンの配列同一性は、８０％を超える。プロチオニンは、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）−国際免疫学会連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）によって「Ｔｒｉ  ａ  ３７」と指定されるアレルギーファミリーのメンバーであり、コムギ誘発性アナフィラキシーの危険性の増加についての診断マーカーに相当し得る（Ｐａｈｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２（４），ｐｐ１０００−１００３）。
【００１３】
植物アレルゲンへの、より詳細には、ＣＭ３および０．１９などのアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤への消化管の暴露を低下させることによって、セリアック病を治療する、セリアック病もしくは非セリアック病グルテン感受性個人における胃腸の快適さを増強する、または非セリアック病グルテン感受性の健康な個人における胃腸の不快感の発病を遅延させるために、胃腸管においておよびそのような阻害剤を含む食物組成物においてアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を分解するための、安全で、有効で、価格的に競争力のある方法を提供することは望ましいであろう。本発明に従う使用は、グルテン感受性／アレルギーの問題を解決するだけではなく、ビール中のアミラーゼトリプシン阻害剤を分解するために使用された場合に気泡を安定化することを可能にする。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
驚いたことに、本発明者らは、酵素：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼが、個人の消化器系におけるおよび前記阻害剤を含有する食物マトリックスにおける、アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤などの植物アレルゲンを加水分解する大きな可能性を有し、そのため、医薬、健康補助食品として、食物の前処置において、または焼き製品を調製するプロセスにおいて使用することができることを発見した。
【００１５】
本発明は、したがって、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ、プロリルエンドペプチターゼ、および薬学的にまたは食事療法で許容され得る賦形剤を含む健康補助食品または医薬組成物に関する。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）変種マクロスポラス（ｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）（ＥＣ  ３．４．２３．１９）から単離されたアスペルギロペプシンＩＩ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ  ＩＩ）と以前は呼ばれたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ（ＡＧＰ）は、ペプチダーゼファミリーＡ４に属する唯一のプロテアーゼである。この酵素は、典型的なペプシン型酸性プロテアーゼであるファミリーＡ１のペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼと相同性ではなく、したがって、ペプスタチンＡなどのそれらの特異的な阻害剤に対して非感受性である。そのため、この酵素はまた、「ペプスタチン非感受性」酸性プロテイナーゼとしても分類された。これまでに知られているグルタミン酸ペプチダーゼの中で、ＡＧＰは、それが唯一の二鎖酵素であるという点で特徴的である。この酵素のアミノ酸配列は、典型的なアスパラギン酸プロテイナーゼのアミノ酸配列と相同性を有していない。
【００１６】
本発明による用語アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ識別名Ｐ２４６６５）のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する酵素、たとえば、Ｐ２４６６５に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９％の同一性を有する酵素を含む。本発明に従う最も好ましい相同性酵素は、スキタリジウム・リグニコラム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｌｉｇｎｉｃｏｌｕｍ）由来のスキタリドグルタミス（ｓｃｙｔａｌｉｄｏｇｌｕｔａｍｉｓ）ペプチダーゼ、クリフォネクトリア・パラシチカ（Ｃｒｙｐｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）由来の酸性ペプチダーゼＢおよびＣ、ならびにスクレラティーナ・スクレチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）由来の酸性プロテアーゼである。
【００１７】
本明細書において開示される健康補助食品または医薬組成物におけるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、純粋な形態でまたはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む調製物として存在してもよく、プロテアーゼ活性の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼに由来し、活性は、ＨＰＵ（ヒスチジンプロテアーゼ単位）で表現され、１ＨＰＵは、毎分、ある量のヘモグロビンを加水分解する酵素の量であり、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ溶液中１ｍＬ当たり１μｇ  Ｌ−チロシンを含有する溶液の光学濃度に等しい２７５ｎｍの光学濃度を有する溶液がもたらされる。試験の条件は、ｐＨ１．７５、温度４０℃、インキュベーションの間のヘモグロビン濃度１６．７ｇ／Ｌとする。
活性（ＨＰＵ／ｍＬ）＝（ＯＤｓａｍｐｌｅ−ＯＤｂｌａｎｋ／Ｓ）×１１／３０
ここで、
ＯＤｓａｍｐｌｅ：サンプルろ液の光学濃度（２７５ｎｍ）
ＯＤｂｌａｎｋ：サンプルブランクろ液の光学濃度（２７５ｎｍ）
Ｓ：１．１μｇ／ｍＬ（ｍＬ／μｇ）のＬ−チロシン標準溶液のＯＤ
３０：インキュベーション時間（分）
１１：総容積反応混合物（ｍＬ）。
【００１８】
本発明に従うアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  ｅｄｓ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＰｒｅｓｓまたはＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６６８９９号明細書において開示されるように調製することができる。
【００１９】
用語「医薬組成物」は、医薬または薬剤を指すが、用語「健康補助食品」は、単回または複数回用量の単位でパッケージされたヒトの食事の補足のための少量の有効成分を指す。健康補助食品は、一般に、わずかな量のカロリーしか提供しないが、ミネラルまたはビタミンのような他の微量栄養素を含有してもよい。
【００２０】
本発明に従う健康補助食品または医薬組成物は、医薬として許容される賦形剤をさらに含む。「賦形剤」は、賦形剤、キャリヤ、または希釈剤を意味し、水、任意の起源のゼラチン、植物ガム、リグニンスルホネート、滑石、糖、デンプン、セルロース、結晶セルロース、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、調味料、保存剤、安定剤、乳化剤、バッファー、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、増量剤、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。キャリヤ材料は、経口／非経口／注射可能な投与に適した有機または無機不活性キャリヤ材料とすることができる。
【００２１】
本発明において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ健康補助食品または医薬組成物は、１〜１００ＨＰＵ単位の、好ましくは１回分当たり１０〜５０ＨＰＵのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを提供する。
【００２２】
さらに、本発明に従う健康補助食品または医薬組成物は、プロリル−エンドペプチターゼをさらに含む。哺乳動物プロリル−エンドペプチターゼは、セリンペプチダーゼのクラスに明確に属する大きな細胞質酵素である。それは、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ結合でノナペプチドブラジキニンを分解するオリゴペプチダーゼとしてウサギ脳の細胞質ゾルにおいて最初に記載された。この酵素は、アルファ−メラノサイト刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、アンジオテンシン、ニューロテンシン、オキシトシン、サブスタンスＰ、およびバソプレッシンなどのペプチドホルモンおよび神経ペプチドの成熟および分解に関与する。プロリル−オリゴペプチダーゼは、プロリン残基のＣ−末端側でペプチド結合を切断する。その活性は、１０ｋＤ未満のオリゴペプチドに対する作用に制限され、それは、プロリンの前のペプチド結合のトランス配置を絶対に必要とする。
【００２３】
本発明に従う最も好ましいプロリル−エンドペプチターゼは、真菌アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）プロリル−エンドペプチターゼ酵素（ＡＮ−ＰＥＰ）である。ＡＮ−ＰＥＰは、ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ（Ｄｅｌｆｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から仕入れることができる。ＡＮ−ＰＥＰおよびＡＧＰの両方の組み合わせは、単一の健康補助食品または医薬組成物において、胃腸管においてアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤およびグルテンエピトープの両方の加水分解のための酵素を提供することによって、グルテン不耐性／感受性の両方の側面を扱うことを可能にする。そのような場合、健康補助食品または医薬組成物は、１０，０００〜１００，０００  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐｉｃｏｍｏｌｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのプロリル−エンドペプチターゼ酵素を提供する。プロリンプロテアーゼ単位（ＰＰＵ）は、基質として０．３７ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用し、クエン酸／二ナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ４．６）において３７℃で毎分１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリドを放出する酵素の量として定義される。
【００２４】
本発明に従う健康補助食品または医薬組成物はまた、アスペルギロペプシンＩをさらに含んでいてもよい。アスペルギルス酸性プロテアーゼとも呼ばれるアスペルギロペプシンＩ（ＥＣ  ３．４．２３．１８）は、広範な特異性でタンパク質の加水分解を触媒する。それは、一般に、Ｐ１およびＰ１’における疎水性残基を好むが、さらに、Ｐ１におけるＬｙｓを受け入れ、これによりトリプシノゲンの活性化に至る。本発明のすべての実施形態に適したアスペルギロペプシンＩは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）から単離されてもよい。好ましくは、本発明に従うアスペルギロペプシンＩは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から単離される。そのような場合、健康補助食品または医薬組成物は、１〜１０００ＨＰＵ単位、より好ましくは１回分当たり１〜１００ＨＰＵ単位のアスペルギロペプシンＩ酵素を提供する。
【００２５】
本発明に従う健康補助食品または医薬組成物は、ヒトに投与するのに適した任意の生薬の形態をしていてもよいが、固体または液体の経口形態、たとえば、食物については添加剤／サプリメントなどの固体の形態、錠剤、丸剤、顆粒剤、糖剤、カプセル、ゴム状の製剤、ならびに粉剤および錠剤などの発泡性の製剤が好ましい。食事療法および薬学的組成物は、放出制御（遅効）製剤の形態をしていてもよい。
【００２６】
本発明のすべての実施形態では、本発明に従う健康補助食品または医薬組成物が、好ましくは、錠剤、カプセル、小袋、または液剤製剤を含む任意の他の剤形の形態をしている。より好ましくは、それは、錠剤またはカプセルの形態をしている。カプセル、錠剤、小袋、または他の剤形は、任意の従来の形態を取ってもよい容器中に存在してもよい。たとえば、剤形は、３０日分の供給量、６０日分の供給量、９０日分の供給量、または何であれ所望される任意の量などの所定の量の剤形を含有する瓶、ボトル、ブリキ箱、ポット、ディスペンサー、小袋、またはその他同種のものにおいて販売されてもよい。そのうえ任意選択で、カプセルは、ブリスターパック中に存在してもよく、それぞれのブリスターは、所定の数、通常１回量のカプセルを含有する（典型的に１〜４カプセル）。ブリスター中のカプセルの数の配置、単一のブリスターパックストリップ上のブリスターの数、およびグループで販売されるブリスターパックストリップの数は、任意の好都合な量または構成であってもよい。
【００２７】
本発明に従う食事療法または薬学的組成物は、保護的な親水コロイド（ガム、タンパク質、修飾デンプンなど）、バインダー、被膜剤、カプセル化剤／材料、ウォール／シェル材料、マトリックス化合物、被覆剤、乳化剤、表面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着剤、キャリヤ、増量剤、補助化合物（ｃｏ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動剤、食味マスキング剤、増量化剤、ゲル化剤、ゲル形成剤、酸化防止剤、および抗菌剤をさらに含有してもよい。
【００２８】
本発明の関連において、医薬組成物は、処方せんありまたはなしで販売されるが、健康補助食品は、処方箋なしで店頭で販売され、食物と見なされることになっている。
【００２９】
別の実施形態では、本発明はまた、医薬としての使用のためにアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む健康補助食品または医薬組成物にも関する。したがって、本発明は、疾患の治療のための医薬としてアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む健康補助食品または医薬組成物の使用に関する。好ましくは、医薬は、腸における自然免疫応答に苦しんでいる患者の治療のためのものである。さらにより好ましくは、医薬は、セリアック病、非セリアック病グルテン不耐性、グルテン感受性、過敏性腸症候群、または炎症性腸疾患の治療のためのものである。最も好ましくは、医薬は、グルテン感受性の個人における胃腸の快適さを維持もしくは増強するための、またはセリアック病もしくは非セリアック病グルテン感受性の個人における胃腸の不快感の発病を遅延させるための、ならびに健康な個人におけるアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤暴露を減少させるための健康補助食品であり、それによって消化を支援する。本発明の組成物によって分解されるアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼによるそれらの迅速な分解に基づく植物アレルゲン：ＣＭ２、ＣＭ３、ＣＭ１６、および０．１９、より好ましくはＣＭ３および０．１９である。ＣＭ３アミノ酸配列識別名は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０１０８３であるが、０．１９アミノ酸配列識別名は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ０１０８５である。
【００３０】
本発明に従う医薬または健康補助食品は、植物タンパク質に対して食物アレルギーを発症する危険性を低下させることを望んでおり、セリアックスプルーおよび非セリアック病グルテン不耐性に相関する胃腸の不快感を経験している個人による使用のためのものである。
【００３１】
好ましい実施形態では、医薬が、食事の摂取の前または後の１時間以内に経口的に投与される。
【００３２】
「胃腸の快適さ」は、生活の質の中心となる。胃腸の消化の快適さの促進は、胃腸管を通る輸送時間を調節することおよび消化および関連する障害に関連する痛みの緩和することを含む。
【００３３】
「非セリアック病グルテン感受性」−非セリアック病グルテン感受性は、グルテンに耐えることができず、セリアック病を有する人々に類似する症状を経験するが、さらに、セリアック病において見られるものと同じ抗体および消化器系の損傷がない個人を記載するために造り出された。非セリアック病グルテン感受性は、免疫応答がそれほど特徴付けられない、グルテン不耐性の別の形態である。非セリアック病グルテン感受性は、セリアック病と多くの症状を共有する。しかしながら、Ｓａｐｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によれば、非セリアック病グルテン感受性を有する個人は、頭痛、「ぼんやりした頭」、関節痛、および脚、腕、または指におけるしびれなどの腸外または非胃腸症状が優勢である。症状は、典型的に、グルテンが摂取された数時間または数日後に現れ、これは、非セリアック病グルテン感受性のような自然免疫の状態について典型的な応答である。
【００３４】
「健康な個人」−本発明の関連において使用される場合、健康な個人は、セリアック病を有すると診断されていない。
【００３５】
「発病を遅延させること」は、状態の回復、症状の重症度を小さくすること、初期の介入、および疾患の発病前の期間を延長することを含むことを意味し、患者が胃腸の不快感のいかなる症状をも経験し得ない状況に限定するようには意図されない。
【００３６】
本発明に従う使用については、医薬または健康補助食品は、食事の前または後の１時間以内に経口的に投与される。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、食物組成物中の植物アレルゲンを分解するための方法であって、植物アレルゲンを加水分解するのに十分な時間、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼと共に、植物アレルゲンを含有する食物組成物をインキュベートするステップを含む方法に関する。当業者は、処理されている食物組成に依存して、食物に追加される酵素の量および食物アレルゲンを分解するために必要とされる時間を推定するであろう。食物アレルゲンの検出は、当技術分野において知られている方法による特異的な抗体の使用または質量分析法によって効率的に実行することができる。ビールマトリックスについては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、５０〜２０００ＨＰＵ／ビール１ヘクトリットル、好ましくは１００〜１０００ＨＰＵ／ビール１ｈｌで追加される。ベーキング組成マトリックスについては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、１０〜５０００ＨＰＵ／組成物１Ｋｇで追加されてもよい。適したベーキング組成マトリックスは、限定を伴うことなく、ベーキング組成物を含む。
【００３８】
驚いたことに、０．５〜５００ｍｇ／ｈｌ、好ましくは１〜５０ｍｇ／ｈｌ、より好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｈｌで含まれる低濃度でビールプロセシングにおいてアスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを使用する場合、ビールの気泡の安定化が生じる。
【００３９】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼによって分解される植物アレルゲンは、好ましくは、アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤などの、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、およびそれらの交配近縁変種において特に見つけられるものであり、より好ましくは、植物アレルゲンは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼによるそれらの迅速な分解に基づいて、ＣＭ２、ＣＭ３、ＣＭ１６、および０．１９、さらにより好ましくはＣＭ３および０．１９である。ＣＭ３アミノ酸配列識別名は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０１０８３であるが、０．１９アミノ酸配列識別名は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ０１０８５である。
【００４０】
本発明の実施形態では、食物組成物は、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、および／またはそれらの交配近縁変種を含む食物である。好ましい食物組成物は、ビール生産に関与する様々なプロセス段階のビール、ベーキング組成物、生地、酸っぱい生地、またはパンなどの焼き製品である。
【００４１】
本発明の方法において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、プロリル−エンドペプチターゼ、好ましくは、さらにグルテンエピトープを分解するためのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）プロリル−エンドペプチターゼおよびさらに任意選択でアスペルギロペプシンＩ酵素が好都合に補充されてもよい。
【００４２】
上記の方法における食物組成物に追加される好ましい量の酵素は、食物マトリックスならびにグルテンおよびアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤の推定量に依存する。
【００４３】
さらに別の実施形態では、本発明は、食品における植物アレルゲンを分解するための上記の方法によって調製される食料品であって、植物アレルゲンを加水分解するのに十分な時間、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼと共に、植物アレルゲンを含有する食物組成物をインキュベートするステップを含み、前記食物組成物は、分解されたアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を含む食料品に関する。好ましい食物は、パンなどの焼き製品、生地、ビールである。
【００４４】
別の実施形態では、本発明はまた、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含むベーキング組成物および酵素組成物または生地にも関する。本発明はまた、少なくとも１つの生地原料に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを追加するステップを含む、生地を調製するための方法にも関する。
【００４５】
焼き製品は、グルテンを含有する粉を使用して作られることが多い。そのため、焼き製品は、グルテン感受性の個人にとって関連し得る食品をもたらす。本発明に従うベーキング組成物は、好ましくは粉の形態をしたコムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、および／またはそれらの交配近縁変種ならびにアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む。ベーキング組成物は、１０〜５０００ＨＰＵアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ／粉１ｋｇを含んでいてもよい。
【００４６】
一態様では、ベーキング組成物が、２０〜３０００ＨＰＵ／粉１ｋｇの量の、一態様では３０〜１０００ＨＰＵ／粉１ｋｇの量の、４０〜５００ＨＰＵ／粉１ｋｇの量の、５０〜２５０ＨＰＵ／粉１ｋｇの量のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む。一態様では、ベーキング組成物が、約１０００〜５００００ＨＰＵ／ｇの範囲の活性を有する１ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む。
【００４７】
一態様では、ベーキング組成物が、約１０００〜５００００ＨＰＵ／ｇの範囲の活性を有する１０〜２００ｐｐｍアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む。
【００４８】
本発明に従うベーキング組成物は、本明細書において記載される少なくとも１つのさらなる酵素を含んでいてもよい。
【００４９】
「さらなる酵素」−本明細書におけるおよび以下の本明細書における用語さらなる酵素は、限定を伴うことなく、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼなどのアミラーゼ；シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；プロテアーゼ、プロリル−エンドペプチターゼ、好ましくは、さらにグルテンエピトープを分解するためのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）プロリル−エンドペプチターゼなどのペプチダーゼ、およびさらに任意選択でアスペルギロペプシンＩ酵素；トランスグルタミナーゼ；トリアシルグリセロールリパーゼ、ガラクトリパーゼ、ホスホリパーゼなどのリパーゼ；セルロース；ヘミセルラーゼ、特にキシラナーゼなどのペントサナーゼ（ｐｅｎｔｏｓａｎａｓｅ）；タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、たとえば国際公開第９５／００６３６号パンフレットにおいて開示されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ；ラッカーゼ；またはヘキソースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルドースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、もしくはＬ−アミノ酸オキシダーゼなどのオキシダーゼ；またはＧ４形成アミラーゼを含む。
【００５０】
本発明に従う酵素組成物の一実施形態では、さらなる酵素が、脂肪分解性酵素、好ましくはホスホリパーゼ、ガラクトリパーゼ、またはホスホリパーゼ活性およびガラクトリパーゼ活性の両方を有する酵素である。
【００５１】
本発明に従う酵素組成物の一実施形態では、さらなる酵素が、国際公開第２００９／１０６５７５号パンフレットにおいて記載されるＤＳＭのＰａｎａｍｏｒｅ（登録商標）である。適した脂肪分解性酵素は、ＮｏｖｏｚｙｍｅｓのＬｉｐｏｐａｎ（登録商標）Ｆ、Ｌｉｐｏｐａｎ（登録商標）５０、およびＬｉｐｏｐａｎ（登録商標）を含んでいてもよい。
【００５２】
本発明の酵素組成物の一実施形態では、さらなる酵素が、国際公開第９８２６０５７号パンフレットにおいて記載されるまたはＵＳ  ＲＥ３８，５０７号明細書において記載されるまたは国際公開第９９４３７９４号パンフレットにおいて、特に欧州特許第１０５８７２４Ｂ１号明細書において記載される酵素である。
【００５３】
本発明に従う酵素組成物の一態様では、さらなる酵素が、米国特許第８４２６１８２号明細書において記載されるアミラーゼである。
【００５４】
さらなる酵素は、Ｇ４形成アミラーゼを含んでいてもよい。Ｇ４形成アミラーゼは、特に、デンプンの分解を触媒することができる酵素である。特に、それは、デンプンにおけるα−Ｄ−（１−＞４）Ｏ−グリコシド連結を切断することができる。それは、グルカン１，４−アルファ−マルトテトラオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６０）と呼ばれてもよい。それはまた、マルトテトラオヒドロラーゼと呼ばれてもよい。適したＧ４形成アミラーゼは、国際公開第９９５０３９９号パンフレット、国際公開第２００５００７８１８号パンフレット、国際公開第２００４１１１２１７号パンフレット、国際公開第２００５００３３３９号パンフレット、国際公開第２００５００７８１８号パンフレット、国際公開第２００５００７８６７号パンフレット、国際公開第２００６００３４６１号パンフレット、国際公開第２００７００７０５３号パンフレット、国際公開第２００７１４８２２４号パンフレット、国際公開第２００９０８３５９２号パンフレット、国際公開第２００９０８８４６５号パンフレットのいずれか１つにおいて記載されるＧ４形成アミラーゼであってもよい。
【００５５】
食品の１つの例は、焼き製品である。
【００５６】
「焼き製品」−焼き製品という用語は、生地から調製した、焼いた食品を指す。本発明によって好都合に産生されてもよい焼き製品の例は、白色、茶色、または全粒のタイプかに関わらず、典型的に塊またはロールの形態をしたパン（特に白パン、全粒パン、またはライ麦パン）、フランスのバゲットタイプのパン、ペストリー、クロワッサン、ブリオッシュ、パネトーネ、パスタ、麺（ゆでたまたはフライにした（炒めた））、ピタパンおよび他の平らなパン、トルティーヤ、タコス、ケーキ、パンケーキ、クッキー、特にビスケット、イーストドーナツを含むドーナツ、ベイグル、パイ皮、蒸しパン、クリスプブレッド、ブラウニー、シートケーキ、スナック食品（たとえばプレッツェル、トルティーヤチップ、組立てスナック、組立てポテトチップス）を含む。焼き製品という用語は、２〜３０ｗｔ％の糖を含有するパン、果物を含有するパン、朝食用シリアル、シリアルバー、卵なしケーキ、ソフトロール、およびグルテンなしのパンを含む。本明細書におけるおよび以下の本明細書におけるグルテンなしのパンは、多くても２０ｐｐｍのグルテンを含有するパンである。いくつかの穀類およびデンプン原料は、無グルテン食に許容され得ると考えられる。頻繁に使用される原料は、ジャガイモ、米、およびタピオカ（キャッサバに由来する）である。焼き製品は、限定を伴うことなく、山型食パン、ひと焼きのパン、ねじりパン、ハンバーガーの丸パンまたは蒸した丸パンなどの丸パン、チャパティ、ラスク、乾燥させた蒸した丸パンのスライス、パン粉、種なしパン、フォカッチャ、メルバトースト、ツヴィーバック、クルトン、ソフトプレッツェル、ソフトおよびハードパン、スティックパン、イースト発酵したおよび化学的に発酵したパン、デニッシュペーストリーなどの薄層を重ね合わせた生地製品、クロワッサンまたはパフペーストリー製品、マフィン、デニッシュ、ベイグル、製菓用コーティング、クラッカー、ウエハース、ピザ生地、トルティーヤ、パスタ製品、クレープ、ワッフル、部分的に焼いた製品、ならびに冷蔵および冷凍生地製品を含む。本明細書におけるケーキは、限定を伴うことなく、たとえばパウンドケーキおよびバターケーキなどの短いケーキを含み、たとえばメレンゲ、スポンジケーキ、ビスケットケーキ、ルーラード、ジェノアーズ、およびシフォンケーキなどの気泡の入ったケーキを含む。
【００５７】
部分的に焼いた製品の１つの例は、限定を伴うことなく、短い数秒の焼きプロセスで販売または消費時点で仕上げられる部分的に焼いたパンを含む。パンは、白色または茶色の食パンであってもよく、そのようなパンは、たとえば、いわゆるＡｍｅｒｉｃａｎ  ｓｔｙｌｅ  Ｓｐｏｎｇｅ  ａｎｄ  Ｄｏｕｇｈ  ｍｅｔｈｏｄまたはＡｍｅｒｉｃａｎ  ｓｔｙｌｅ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｅｔｈｏｄを使用して製造されてもよい。
【００５８】
「生地」−生地という用語は、粉および他の原料、特に生地原料の混合物として本明細書において定義される。一態様では、生地が、練るまたは丸めるのに十分に固い。生地は、できたての、冷凍した、調製済みの、または部分的に焼いたものであってもよい。冷凍生地の調製は、Ｆｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｄｏｕｇｈｓ  ａｎｄ  ＢａｔｔｅｒｓにおいてＫｕｌｐおよびＬｏｒｅｎｚによって記載される。本明細書における生地という用語は、バターを含む。バターは、ケーキを含む様々な食べ物を調製するために使用される、水、牛乳、または卵などの液体と組み合わせられた１つまたは複数の粉の、スプーンから落とすまたは注ぐことができるほど十分に薄い半流動体混合物である。
【００５９】
「生地原料」−生地原料は、粉、卵、水、塩、糖、香料、脂肪（バター、マーガリン、油、およびショートニングを含む）、パン酵母、化学発酵系、牛乳、酸化剤（アスコルビン酸、ブロメート、およびアゾジカルボンアミド（ＡＤＡ）を含む）、還元剤（Ｌ−システインを含む）、乳化剤（モノ／ジグリセリド、モノステアリン酸グリセロール（ＧＭＳ）などのモノグリセリド、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）、ステアロイル乳酸カルシウム（ＣＳＬ）、脂肪酸のポリグリセロールエステル（ＰＧＥ）、ならびにモノおよびジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、ガム（グアーガムおよびザンサンガムを含む）、酸（クエン酸、プロピオン酸を含む）、デンプン、修飾デンプン、グルテン、保湿剤（グリセロールを含む）、ならびに保存剤から選択される任意の構成成分を含む。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼおよび少なくとも１つのさらなる酵素を含む酵素組成物に関する。酵素組成物は、１０〜５０００ＨＰＵアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ／組成物１ｋｇを含んでいてもよい。
【００６１】
一態様では、酵素組成物が、約１０００〜５００００ＨＰＵ／ｇの範囲の活性を有する１ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む。一態様では、酵素組成物が、約１０００〜５００００ＨＰＵ／ｇの範囲の活性を有する１０〜２００ｐｐｍアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを含む。
【００６２】
一実施形態では、本発明に従う酵素組成物が、生地または少なくとも１つの生地原料への容易な追加を可能にするために乾燥形態で提供されるが、液体形態もまた、可能である。
【００６３】
生地を調製するための本発明に従う方法は、少なくとも１つの生地原料にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを追加するステップを含む。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、生地調製の任意のステップにおいて追加されてもよく、１、２、またはそれ以上のステップにおいて追加されてもよい。
【００６４】
１つまたは複数のさらなる酵素が追加されることになっている場合、これらの酵素は、たとえば本発明に従う酵素組成物として、本発明に従うアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼと別々にまたは一緒に追加されてもよい。
【００６５】
本発明は、焼き製品の生産のプロセスであって、本発明に従う生地を焼くステップを含むプロセスにさらに関する。焼き製品の生産のプロセスの一実施形態では、焼き製品が、パンまたはケーキである。
【００６６】
当業者は、生地原料から開始して生地または焼き製品を調製するための方法を知っている。本発明は、本発明に従う焼き製品の生産のプロセスによって得られる焼き製品にさらに関する。
【００６７】
本発明は、焼き製品の生産におけるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼの使用にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、模擬胃条件下での様々なプロテアーゼおよびペプシンとのコムギアルファアミラーゼ阻害剤の様々なインキュベーションの４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）分析を示す図である。さらなる酵素がないペプシン処理の２つのコントロールを含む。矢印は、アルファアミラーゼ調製物中に存在する３つの主なタンパク質産物の位置を示す。−  分子量マーカー：レーン１、２、および１５−  ｔ＝０、レーン３；ｔ＝９０分、レーン４でのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）プロリン特異的エンドプロテアーゼ処理−  ｔ＝０、レーン５；ｔ＝９０分、レーン６でのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ−  ｔ＝０、レーン７；ｔ＝９０分、レーン８でのペプシン−  ｔ＝０、レーン９；ｔ＝９０分、レーン１０でのパパイン−  ｔ＝０、レーン１１；ｔ＝９０分、レーン１２でのＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＰＲ１５  Ｌ−  ｔ＝０、レーン１３；ｔ＝９０分、レーン１４でのアスペルギロペプシンＩ−  ｔ＝０、レーン１６；ｔ＝９０分、レーン１７でのペプシン
【図２】図２は、バンドＢ１〜Ｇ１において存在する最も豊富なタンパク質の性質を同定するためのコムギアルファアミラーゼ阻害剤の調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図３】図３は、模擬胃条件下での増加性のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ（ＡＧＰ）濃度での一定量のコムギグルテンの様々なインキュベーションの４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）分析を示す図である。矢印は、コムギアルファアミラーゼ阻害剤０．１９、ＣＭ２、およびＣＭ１６の位置を示す（実施例１を参照されたい）。−  分子量マーカー（Ｍａｒｋ  １２（商標）  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）：レーン１３−  精製アルファアミラーゼ／プロテアーゼ阻害剤：レーン１４−  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼの追加なし：レーン１＝０、レーン２＝６０分−  ０．０９ｍｇ／ｍｌ  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ追加：レーン３＝０、レーン４＝６０分−  ０．１９ｍｇ／ｍｌ  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ追加：レーン５＝０、レーン６＝６０分−  ０．２８ｍｇ／ｍｌ  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ追加：レーン７＝０、レーン８＝６０分−  ０．３７ｍｇ／ｍｌ  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ追加：レーン９＝０、レーン１０＝６０分−  ０．４７ｍｇ／ｍｌ  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ追加：レーン１１＝０、レーン１２＝６０分
【図４】図４は、模擬胃条件下での様々なプロテアーゼおよびペプシンとのコムギ由来プロチオニンの様々なインキュベーションの４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）分析を示す図である。矢印は、精製プロチオニンの位置を示す。−  分子量マーカー：レーン１、２、９および１０−  ｔ＝０、レーン３；ｔ＝９０分、レーン４でのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ−  ｔ＝０、レーン５；ｔ＝９０分、レーン６でのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）プロリン特異的エンドプロテアーゼ−  ｔ＝０、レーン７およびｔ＝９０分、レーン８でのＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＰＲ  １５  Ｌ（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のアスペルギロペプシンＩ様プロテアーゼ）
【図５】図５は、模擬胃条件下での様々なプロテアーゼおよびペプシンとのコムギ由来プロチオニンの様々なインキュベーションの４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）分析を示す図である。矢印は、精製プロチオニンの位置を示す。−  分子量マーカー：レーン１−  精製コムギプロチオニン：レーン２−  ｔ＝０、レーン３、ｔ＝９０分、レーン４でのＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＰＲ  １５  Ｌ（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のアスペルギロペプシンＩ様プロテアーゼ；ｈｔｔｐ／／ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｕｐｏｎｔ．ｃｏｍ）−  ｔ＝０、レーン５；ｔ＝９０分、レーン６での９０％（ｗ／ｗ存在する酵素タンパク質）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＰＲ  １５  Ｌおよび１０％  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼの混合物−  ｔ＝０、レーン７；ｔ＝９０分、レーン８でのプロクターゼ（およそ８５％のアスペルギロペプシンＩを組み込むＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）によって分泌されるプロテアーゼの非ＧＭＯ混合物）
【００６９】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。
【００７０】
［実施例］
［実施例１：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、模擬胃条件下でコムギ由来アルファアミラーゼ／トリプシン阻害剤を効率的に切断するが、他の酸性エンドプロテアーゼは効率的ではない。］
［材料および方法］
［アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からのアスペルギロペプシンＩの生産］
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアスペルギロペプシンＩについての遺伝子（ｐｅｐＡ；Ａｎ１４ｇ０４７１０）を、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットにおいて記載されるなどの方法を使用して、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主において過剰発現させた。国際公開第９８／４６７７２号パンフレットは、アセトアミドを含有する寒天プレート上で形質転換体を選択するおよび標的多コピー組み込み体を選択する方法を開示する。発現カセットの複数のコピーを含有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換体を、サンプル材料のさらなる生成に選択した。形質転換Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、修飾ＣＳＭ発酵培地、ｐＨ６．２（４０ｇ／ｌマルトース、３０ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−ｓｏｙｔｏｎｅ、７０ｇ／ｌクエン酸三ナトリウム二水和物、１５ｇ／ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌ  Ｌ−Ａｒｇ、０．２５ｍｌ／ｌ  Ｃｌｅｒｏｌ  Ａｎｔｉｆｏａｍ）において発酵させた。得られた培養ブロスは、ろ過し、滅菌ろ過し、次いで、限外ろ過によって濃縮した。５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．６中のＱ−セファロースＸＫ  ２６／１０カラムに酵素を加え、その後、塩勾配での溶出によって、クロマトグラフィーを実行した。様々な画分におけるアスペルギロペプシンＩタンパク質の存在は、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の後に着色したタンパク質バンドの強度を判断することにより定量化した。
【００７１】
［酵素アッセイ］
インキュベーションは、３７℃で９０分間、ｐＨ４．０の５０ｍｍｏｌ／ｌ  クエン酸Ｎａ中で実行した。すべての関連するインキュベーションにおいて、ペプシンは、０．２ｍｇ／ｍｌの酵素タンパク質濃度で存在した。プロリン特異的エンドプロテイナーゼは、０．５ｍｇ酵素タンパク質／ｍｌの濃度で試験し、他の酸性エンドプロテイナーゼは、０．０５ｍｇ酵素タンパク質／ｍｌの濃度とした。アミラーゼ阻害剤は、最後に追加し、２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在した。
【００７２】
ｔ＝０に、１００マイクロリットルの反応混合物を、４００マイクロリットル２５％ＴＣＡの中に移した。３７℃での９０分間のインキュベーションの後に、もう１００マイクロリットルを、４００マイクロリットルの新たなＴＣＡ溶液の中に移した。４℃で２時間後、サンプルを、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離後、６５マイクロリットルのリン酸バッファーｐＨ７、２５マイクロリットルのリチウム硫酸ドデシル（ＬｉＤＳ）、および１０マイクロリットルのサンプル還元剤を追加した。サンプルを４℃で一晩保存し、次いで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ）に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥのために調製した。
【００７３】
［Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ活性（ＨＰＵ）の決定］
ウシ血液由来の２０．０ｇヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ製品Ｈ２６２５）を、室温で１０分間撹拌することによっておよそ７００ｍＬの水に懸濁した。３．７３ｇ塩化カリウム（ＫＣｌ）の追加後、ｐＨを０．５ｍｏｌ／Ｌの塩酸により１．７５に調節した。ヘモグロビン懸濁液の容量を水により１Ｌに調節した。ｐＨをもう一度確認し、ｐＨ１．７５に調節した。
【００７４】
酵素溶液は、２．０ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌによりｐＨ１．７５に調節した３．７３ｇ／ｌ  ＫＣｌを含有するＫＣｌ／ＨＣｌバッファーにおいて、上記に開示されるように産生した精製アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを溶解することによって調製した。アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ活性を試験するために、５ｍｌのヘモグロビン溶液を４０℃で加熱し、続いて、反応を開始するために、５〜２５ヒスチジンプロテアーゼ単位（ＨＰＵ／ｍＬ）の活性を有する１ｍＬ酵素溶液を追加した。３０分後、より大きなペプチド断片を沈殿させるために、５ｍＬトリクロロ酢酸溶液（１４０ｇ／Ｌ）を追加することによって反応を停止させた。ブランクの測定は、５ｍＬヘモグロビン溶液および５ｍＬトリクロロ酢酸溶液の混合物に１．０ｍＬ酵素サンプルを追加することによって行った。沈殿を終えるために、３０分間４０℃でチューブをインキュベートした。遠心分離後、小さなペプチドを含有する透明な上清の光学濃度を２７５ｎｍで測定した。結果を、１μｇ／ｍＬのＬ−チロシン溶液と比較した。
【００７５】
１ＨＰＵは、毎分、ある量のヘモグロビンを加水分解する酵素の量であり、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ溶液中１ｍＬ当たり１μｇ  Ｌ−チロシンを含有する溶液の光学濃度に等しい２７５ｎｍの光学濃度を有する溶液がもたらされる。試験の条件は、ｐＨ１．７５、温度４０℃、インキュベーションの間のヘモグロビン濃度１６．７ｇ／Ｌとする。
活性（ＨＰＵ／ｍＬ）＝（ＯＤｓａｍｐｌｅ−ＯＤｂｌａｎｋ／Ｓ）×１１／３０
ここで、
ＯＤｓａｍｐｌｅ：サンプルろ液の光学濃度（２７５ｎｍ）
ＯＤｂｌａｎｋ：サンプルブランクろ液の光学濃度（２７５ｎｍ）
Ｓ：１．１μｇ／ｍＬ（ｍＬ／μｇ）のＬ−チロシン標準溶液のＯＤ
３０：インキュベーション時間（分）
１１：総容積反応混合物（ｍＬ）。
【００７６】
［ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析］
［インビトロにおける消化］
サンプルを、ＭｉｌｌｉＱ水に１ｍｇ／ｍｌまで溶解した。溶液を、１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）中に１０×に希釈した。サンプルは、ＤＴＴ、５ｍＭの追加、室温での３０分間のインキュベーションによって還元し、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、５．５ｍＭの追加、暗中、室温での３０分間のインキュベーションによってアルキル化した。トリプシンによる消化を、一晩、３７℃で実行した。
【００７７】
［インゲル消化］
ゲルバンドは、ＥｘＱｕｅｓｔスポットカッター（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してゲルから切り取り、ｌｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄ  ＭＴＰ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）の中に移した。ゲル片は、膨脹させるための７５μｌ  ５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３および収縮させるための７５μｌアセトニトリルを追加することによって洗浄し、合計３回洗浄した。洗浄したゲル片は、トリプシン消化により消化し、一晩３７℃でのインキュベーションを行った。サンプルを１分間超音波処理し、上清を注入バイアルの中に収集した。
【００７８】
［ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析］
サンプルを１％ギ酸に酸性化し、Ａｃｃｅｌａ−ＬＴＱ−Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。クロマトグラフィーによる分離は、２．１×１００ｍｍ  １．８マイクロメートルの粒径、８０Åポアサイズ、Ｃ−１８  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｚｏｒｂａｘカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、移動相として（Ａ）０．１％ギ酸を含有するＬＣ−ＭＳ級水Ｂ）０．１％ギ酸溶液を含有するＬＣ−ＭＳ級アセトニトリル（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ  ＢＶ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）による勾配溶離を使用して実現した。勾配は、８３分間５〜４０％  Ｂとした。流速は、２５μｌの注入量を使用して、０．４ｍｌ／分に保ち、カラム温度は５０℃にセットした。ＭＳデータ収集は、ダイナミックエクスクルージョン（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を使用し、電荷状態２および３のみを含め、質量範囲４００〜２０００ｍ／ｚによる上位１０のデータ依存性の収集を使用して実行した。ＭＳ／ＭＳ実験を、３．０にセットした単離幅で実行し、標準衝突エネルギーは３５にセットした。データベース検索は、好ましい酵素としてトリプシンを使用し、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ  ２（Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（商標）−ＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標））検索エンジンおよびＴｒａｎｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ＴＰＰ）を使用して実行した。信頼度＞９０％で同定されたタンパク質のみを考慮した。データは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに対して検索した。
【００７９】
［結果］
本発明の実施例において、発明者らは、模擬胃条件下で、多くの酸性エンドプロテイナーゼの中でアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼのみが、様々なコムギアルファ・アミラーゼ阻害剤（コムギ種子由来のアルファアミラーゼ阻害剤、１型、Ｓｉｇｍａ）を組み込む精製調製物を効率的に分解することができることを実証する（図１を参照されたい）。実験において、以下の酵素の効率を、ペプシン（コントロール）の存在下において比較した：
−  ペプシン（ブタ胃粘膜、Ｓｉｇｍａ）、
−  アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテイナーゼ（ＭａｘｉＰｒｏ  ＰＳＰ、ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
−  パパイン（Ｃｏｌｌｕｐｕｌｉｎｅ、ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、
−  アスペルギロペプシンＩＩとも呼ばれるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ（ＭａｘｉＰｒｏ  ＨＳＰ、ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、
−  アスペルギロペプシンＩ（材料および方法を参照されたい）、
−  Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＰＲ  １５  Ｌ（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のアスペルギロペプシンＩ様プロテアーゼ；ｈｔｔｐ／／ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｕｐｏｎｔ．ｃｏｍ）。
【００８０】
結果（図１参照）は、精製コムギグルテンアルファアミラーゼ阻害剤調製物が、およそ１２ｋＤａ（矢印を参照されたい）のサイズを有する３つの主なタンパク質バンドを組み込むことを示す。これらのデータはまた、模擬胃状態下でおよびペプシンおよび等量の様々なプロテイナーゼの存在下において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼが、アルファアミラーゼ阻害剤の精製調製物中に存在するこれらの主な３本のバンドを分解するのに最も有効であることをも示す。
【００８１】
これらのバンドのそれぞれの１つに存在する異なるタンパク質の性質を確認するために、ゲルバンドのサンプルを切り取り、抽出し、存在するタンパク質を、上記の材料および方法において記載されるようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用して同定した。
【００８２】
この場合、１０ｍｇ／ｍｌのＳｉｇｍａアルファアミラーゼ阻害剤溶液を、水で１０倍に希釈した。次いで、６５マイクロリットルのこの溶液を、２５マイクロリットルのＬｉＤＳサンプルバッファーおよび１０マイクロリットルのサンプル還元剤と混合し、７０℃で１０分間加熱し、この後、タンパク質を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコールに従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。次いで、ゲルを、５０％メタノール／７％酢酸により１時間固定し、脱塩水により２回すすぎ、一晩Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙにより染色した。ゲルサンプルは、３つの、おそらくアルファアミラーゼ阻害剤である、図２において示されるバンドから得た。抽出タンパク質から得たＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータによれば、バンドＣ１およびＢ１中に存在する最も豊富なタンパク質は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｐ１７３１４（ＣＭ３）およびＰ１６１５９（ＣＭ１６）を有するコムギアルファアミラーゼ阻害剤、バンドＥ１およびＤ１では、コムギアルファアミラーゼ阻害剤Ｐ０１０８５（０．１９）、Ｐ１６８５１（ＣＭ２）、およびＰ１６１５９（ＣＭ１６）、ならびにバンドＧ１およびＦ１では、Ｐ０１０８３（ＣＭ３）である。
【００８３】
このデータは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼが、驚いたことに、胃条件下で、コムギ由来アルファアミラーゼ阻害剤、最も著しくは、コムギアルファアミラーゼ阻害剤：ＣＭ２、ＣＭ３、ＣＭ１６、および０．１９を分解するのに最も効果的であることを実証する。
【００８４】
［実施例２：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは、ビール中のアルファアミラーゼ／トリプシン阻害剤を切断し、気泡を安定化する］
それらのアミノ酸配列によれば、オオムギは、コムギ中に存在するアルファアミラーゼ阻害剤に非常に類似するアルファアミラーゼ阻害剤を組み込む。そのため、ビールは、グルテン感受性の個人に関連し得る食品をもたらす。ビールにおいて、他の食品におけるように、アルファアミラーゼ阻害剤は、完全な分子または免疫応答を誘起するのに十分に大きなペプチドとして存在する。たとえば、１６種の異なるビールのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析において、発明者らは、アルファアミラーゼ阻害剤に帰する配列を有する９アミノ酸よりも大きな約３３００種の異なるペプチドを同定した。この発見は、グルテン感受性の個人についてのアルファアミラーゼ阻害剤の関連の可能性、それによって、ビール生産についてのアスペルギログルタミン酸ペプチダーゼの関連を示す。
【００８５】
ビール発酵期の間またはそれ以降のプロテアーゼの使用は、いわゆる寒冷混濁の予防に非常に一般的である。プロクターゼまたはパパインのような広範な特異性を有する歴史的に酸性のプロテアーゼは、この目的に使用されたが、最近、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘと呼ばれるプロリン特異的エンドプロテアーゼが、好ましい選択肢をもたらす。そのような広範な特異性の酵素から非常に特異的なＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ製品に変える主な理由は、広範な特異性酵素の適用が、不良な気泡力を有するビールをもたらす傾向があるからである。したがって、ビール気泡へのいかなるマイナスの影響も、ビール生産の間のタンパク分解処理についての認容性の前提条件となる。ビール気泡形成に対するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼの効果を試験するために、以下の実験を実行した。
【００８６】
大規模で国際的なブランドの瓶ビールを、地方のスーパーマーケットから得た。瓶を注意深く開き、関連する酵素を追加し、直ちに、新たな王冠を使用して、瓶を再び密封した。注意深く混合した後、瓶を２０℃で保存した。上記の実施例１において示されるデータは、アルファアミラーゼ阻害剤を破壊するために必要とされるアスペルギログルタミン酸ペプチダーゼの濃度が、プロリン特異的エンドプロテアーゼの濃度の少なくとも１０分の１であることを示す。市販のプロリン特異的Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ製品の典型的な産業上の使用レベルは、ビール１ｈｌ当たり１５０ｍｇの純粋な酵素タンパク質に相当する３グラム／ビール１ｈｌである。本発明の実験において、プロリン特異的エンドプロテアーゼもまた、この濃度で追加したが、他の２つのプロテアーゼは、ビール１ｈｌ当たりわずか１５ｍｇの純粋な酵素タンパク質の濃度で追加した。１週間のインキュベーションの後に、すべてのビールの気泡安定性は、Ｈａｆｆｍａｎｓ機器（Ｆｏａｍ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｅｒ  Ｎｉｂｅｍ  ＴＰＨと組み合わせたＩｎｐａｃｋ  ２０００  Ｓａｍｐｌｅｒ、Ｈａｆｆｍａｎｓ  ＢＶ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、Ａｎａｌｙｔｉｃａ−ＥＢＣ法９．４２に従って測定した。インキュベーション当たり２つの複製物の平均気泡値を表１に示す。
【００８７】
予想通り、寒冷混濁予防に適した濃度（つまり１５０ｍｇ／ｈｌ）で追加したプロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートしたビールの気泡安定性は、参照製品（プロテアーゼを追加しなかった市販のビール）について得られたデータと同等であった。驚くべき観察は、低濃度のアスペルギログルタミン酸ペプチダーゼまたはアスペルギロペプシンＩ様酵素の追加に際して、それがプロリン特異的エンドプロテアーゼの産業上使用されるレベルと組み合わせて適用されても、ビール気泡の安定性が有意に増加するというものである。この結果は、たとえばアルファアミラーゼ阻害剤の大きなペプチドを破壊する目的による、アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼの追加が、望ましい副作用としてビール気泡が安定化することを示唆する。
【００８８】
【表１】
2017504581.tif 000002
【００８９】
[実施例３：ペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼは用量依存的な方法でアルファアミラーゼ／トリプシン阻害剤を切断する。］
本発明の実施例において、発明者らは、模擬胃条件下で、１グラムのコムギグルテン中に存在するアルファアミラーゼ／プロテアーゼ阻害剤を加水分解するために必要とされるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ酵素タンパク質の量を決定する。その目的のために、コムギ由来のグルテン（Ｓｉｇｍａ）を、９．３５ｍｇ／ｍｌの濃度で５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ｐＨ４．０中で可溶化した。この完全に撹拌した混合物に、ペプシン酵素タンパク質を追加し、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に達し、次いで、６つの１ｍｌサンプルを得た。これらの６つのサンプルに、増加性の量の純粋なＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ酵素を追加した。サンプル１にはＡＧＰを追加せず、サンプル２には０．０９ｍｇ、サンプル３には０．１９ｍｇ、サンプル４には０．２８ｍｇ、サンプル５には０．３７ｍｇ、最後のサンプルには０．４７ｍｇを追加した。次いで、様々なサンプルを、摂氏３７度で６０分間インキュベートし、それぞれのサンプルから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の一定分量を、ｔ＝０分およびｔ＝６０分に得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコールに従って実行した。
【００９０】
結果（図３参照）は、０．２８ｍｇの純粋なＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼを追加することによって、９．３５ｍｇのコムギグルテン中に存在するアルファアミラーゼ／プロテアーゼ阻害剤を、１時間以内に加水分解することができることを示す。これは、３０ｍｇの純粋なＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ（１５０００ＨＰＵに相当する）が、そのような模擬胃条件下で１グラムのコムギグルテンをうまく処理することができることを暗示する。したがって、経口Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ調製物によるアルファアミラーゼ／プロテアーゼ阻害剤の部分的な断片化の後に、新しく生成されたペプチド性インヒビターは、胃通過の間にペプシンによって、十二指腸に移行した後、トリプシンおよびキモトリプシンなどの膵臓プロテアーゼによって、非免疫原性オリゴペプチドにさらに分解されるであろう。
【００９１】
［実施例４：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のアスペルギロペプシンＩホモログは、胃条件下でコムギ由来プロチオニンを切断することができる。］
［材料および方法］
プロチオニンを、いくらか修飾してＯｈｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８２，７５３−７６７（１９７７））によって記載されるように単離した。コムギ上清は、２０ミリモル／ｌリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２により平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でクロマトグラフィーによって分離し、同バッファー中０〜１．０モル／ｌ  ＮａＣｌの直線勾配により溶出した。様々な画分におけるおよそ５ｋＤａの分子量を有する純粋なプロチオニンの存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって追った。単一のタンパク質バンドを示す画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  ３ｋＤａ膜を使用して濃縮し、次いで、凍結乾燥した。単離されたタンパク質の特徴および純度は、Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースを使用して、本質的に実施例１において記載されるように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した。
【００９２】
［酵素アッセイ］
様々なプロテアーゼとの精製プロチオニンのインキュベーションは、本出願の実施例１において指定される条件と同様に３７℃で９０分間ｐＨ４．０の５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａクエン酸中で実行した。すべての関連するインキュベーションにおいて、ペプシンは、０．２ｍｇ／ｍｌの酵素タンパク質濃度で存在した。アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ、プロリン−特異的エンドプロテイナーゼ、およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＰＲ  １５  Ｌは、０．１１ｍｇ酵素タンパク質／ｍｌの濃度で試験した。コムギプロチオニンは、最後に追加し、０．４４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在した。
【００９３】
［結果］
実験において、以下の酵素の効率を、ペプシンの存在下において比較した：
−  アスペルギロペプシンＩＩとも呼ばれるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ（ＭａｘｉＰｒｏ  ＨＳＰ、ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、
−  アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテイナーゼ（ＭａｘｉＰｒｏ  ＰＳＰ、ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
−  Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＰＲ  １５  Ｌ（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のアスペルギロペプシンＩ様プロテアーゼ；ｈｔｔｐ／／ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｕｐｏｎｔ．ｃｏｍ）。
【００９４】
得られた結果（図４参照）は、模擬胃状態下でおよび等量の様々なプロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のアスペルギロペプシンＩ様プロテアーゼが、コムギ由来プロチオニンを有効に分解することを示す。
【００９５】
［実施例５：条件下でのコムギ由来プロチオニンの切断。］
［材料および方法］
プロチオニンは、実施例４において記載されるようにコムギから単離した。プロクターゼは、明治（Ｍｅｉｊｉ）（東京（Ｔｏｋｙｏ）、日本（Ｊａｐａｎ））から得た。
【００９６】
［結果］
図５におけるコムギプロチオニンの消化産物によって示されるように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアスペルギロペプシンＩまたはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のそのホモログを組み込む酵素産物は、模擬胃条件下でコムギプロチオニンを加水分解することができる。
【００９７】
［実施例６：それらの有効量では、アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼおよびアスペルギロペプシンＩ様酵素は、ビール気泡に対して有害作用を有していない。］
ビールは、コムギ中に存在するアレルゲン性アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤に非常に相同性であることが知られているオオムギ由来アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を組み込む（Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００８，５６，１４５８−１４６４）。本出願の実施例１において示される結果は、アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼが様々なアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤を有効に加水分解することができることを示す。そのため、ビールへのアスペルギログルタミン酸ペプチダーゼの追加に際して、オオムギ由来のアルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤もまた加水分解されることを期待することができる。実施例２では、発明者らは、関連する酸性プロテアーゼの追加が、ビール気泡の質にマイナスの効果を有していないことを示す。本発明の実施例において、発明者らは、アルファ−アミラーゼ／トリプシン阻害剤およびタンパク質Ｚ（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｓａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０８（４），ｐｐ６４７−６４９）のような既知のビールアレルゲンを加水分解するために必要とされるアスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ、アスペルギロペプシンＩ、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のアスペルギロペプシンＩホモログの適量の酵素が、ビール気泡安定性に対して有害作用を有していない、寒冷混濁を予防するために必要とされる多量のプロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＭａｘｉＰｒｏ  ＰＳＰ、ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と組み合わせてでさえ有していないことを示す。
【００９８】
大規模で国際的なブランドの瓶ビールを、地方のスーパーマーケットから得た。瓶を注意深く開き、関連する酵素を追加し、直ちに、新たな王冠を使用して、瓶を再び密封した。注意深く混合した後、瓶を１週間２０℃で保存した。気泡安定性を実施例２において記載されるように測定し、インキュベーション当たり２つの複製物の平均気泡値を表２に示す。得られたデータは、追加された多量の様々な酸性プロテアーゼが、形成された気泡に対して有害作用を有していないことを明らかに実証する。
【００９９】
【表２】
2017504581.tif 000003
【図１】
2017504581.tif 000004
【図２】
2017504581.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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