(57)【要約】本発明は、トランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の方法及び試薬を提供する。当該方法は、トランスポゼース包埋複合体を用いて核酸に対してランダムな切断を行い、前記トランスポゼース包埋複合体は、トランスポゼース及び、トランスポゼース認識配列を有する第１リンカーを含み、切断された核酸の両端に前記第１リンカーを連結させ且つギャップを形成させるステップ、精製又は化学試薬処理の方法により、後続の反応に対する、系におけるトランスポゼースの影響を除去するステップ、リガーゼを用いて、前記ギャップにおいて、前記第１リンカーの配列と異なる配列の第２リンカーを連結させるステップ、及び、前記第１リンカー及び前記第２リンカーを標的に結合するプライマを用いてＰＣＲ反応を行い、両端にそれぞれ異なるリンカー配列が連結された産物を得るステップを含む。本発明の方法により、切断された核酸の両端に異なるリンカー配列が結合されることができる。切断産物の使用は、両端がトランスポゼース認識配列を有することによって限定されない。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポゼース包埋複合体を用いて核酸に対してランダムな切断を行い、前記トランスポゼース包埋複合体は、トランスポゼース及び、トランスポゼース認識配列を有する第１リンカーを含み、切断された核酸の両端に前記第１リンカーを連結させ、ギャップを形成するステップと、
精製又は化学試薬処理の方法により、後続の反応に対する、系におけるトランスポゼースの影響を除去するステップと、
リガーゼを用いて、前記ギャップで、前記第１リンカーの配列と異なる配列の第２リンカーに連結させるステップと、
前記第１リンカー及び前記第２リンカーを標的として結合するプライマを用いてＰＣＲ反応を行い、両端にそれぞれ異なるリンカー配列が連結された産物を得るステップとを含むことを特徴とするトランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の方法。
【請求項２】
前記第１リンカーには、自己連結を抑止する修飾又は前記第２リンカーとの相互連結を抑止する修飾が付加されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１リンカーの修飾方法は、
前記第１リンカーの３’末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ａ）、
前記第１リンカーの一本の鎖内に、後続のＵＳＥＲ酵素によって過剰のリンカーを酵素消化処理するためのｄＵＴＰを導入するステップ（ｂ）、
前記第１リンカーのトランスポゼース認識配列の外側に１つの塩基対を取り込み、そのうちの３’末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ｃ）、及び、
前記第１リンカーは、内部に３’−５’ホスホジエステル結合が連結された二本鎖配列が相補的に形成された１本の完全な配列から構成されるステップ（ｄ）のいずれか１つ又は複数の組合わせを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１リンカーの修飾方法は、前記第１リンカーの３’末端塩基のジデオキシ修飾であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２リンカーには、自己連結を抑止するための修飾が付加され、
好ましくは、前記第２リンカーの修飾は、３’末端塩基のジデオキシ修飾であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲ反応に用いられるプライマの１つは、ビオチン−ストレプトアビジンの親和性反応により一本鎖分子を取得するための末端ビオチン標識のプライマであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記精製は、磁気ビーズ精製又はカラム精製であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記化学試薬処理は、トランスポゼースの変性又は消化のために標的配列から解離させる処理であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記化学試薬は、第１試薬及び第２試薬を含み、前記第１試薬は、前記トランスポゼースと前記核酸との標的配列の吸着作用を破壊するための、プロテアーゼ溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液及びＮＴ緩衝液の少なくとも１つを含み、前記第２試薬は、前記第１試薬が後続の酵素触媒作用に対する影響を弱めるためのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１試薬は、ＥＤＴＡを有する付加試薬をさらに含み、
好ましくは、前記第２試薬は、ツィーン２０溶液をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸に対してランダムな切断を行うためのトランスポゼース包埋複合体を形成し、切断された核酸の両端に第１リンカーを連結させ、ギャップを形成させるために用いられるトランスポゼース及び、トランスポゼース認識配列を含む第１リンカーと、
前記ギャップで、第２リンカーを連結するための第２リンカー及びリガーゼの成分と、
ＰＣＲ反応を行うために、前記第１リンカー及び前記第２リンカーのそれぞれ標的に結合するものであり、両端に異なるリンカー配列がそれぞれ連結された産物を得るためのＰＣＲプライマとを備えていることを特徴とするトランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の試薬。
【請求項１２】
前記第１リンカーには、自己連結を抑止する修飾又は前記第２リンカーとの相互連結を抑止する修飾が付加されていることを特徴とする請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記第１リンカーの修飾方法は、
前記第１リンカーの３’末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ａ）、
前記第１リンカーの一本の鎖内に、後続のＵＳＥＲ酵素によって過剰のリンカーを酵素消化処理するためのｄＵＴＰを導入するステップ（ｂ）、
前記第１リンカーのトランスポゼース認識配列の外側に１つの塩基対を取り込み、そのうちの３’末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ｃ）、及び、
前記第１リンカーは、内部に３’−５’ホスホジエステル結合が連結された二本鎖配列が相補的に形成された１本の完全な配列から構成されるステップ（ｄ）のいずれか１つ又は複数の組合わせを含むことを特徴とする請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
前記第２リンカー上には、自己連結を抑止するための修飾が付加され、
好ましくは、前記第２リンカー上の修飾は、３’末端塩基のジデオキシ修飾であることを特徴とする請求項１１に記載の試薬。
【請求項１５】
前記ＰＣＲプライマの１つは、ビオチン−ストレプトアビジンの親和性反応により一本鎖分子を取得するための末端ビオチン標識のプライマであることを特徴とする請求項１１に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の技術分野に関し、特にトランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
パイロシーケンシング法がロシュ（Ｒｏｃｈｅ）によって発明され、次世代シーケンシングは、開発されて以来、高度成長期を経てきた。しかし、ハイスループットシーケンシングの発展に伴い、高性能且つ低コストのサンプル調製が徐々にシーケンシング分野の重要な考慮要素となっている。種々の原理によるサンプルの処理方法及びその自動化装置が開発され続け、主に、サンプル断片化、核酸分子の末端処理、リンカー連結及び最終ライブラリーの作製がある。
【０００３】
サンプル断片化の方法には、主に物理的方法（例えば、超音波せん断）又は酵素的な方法（即ち、非特異的エンドヌクレアーゼ処理）がある。物理的方法では、特許である適応合焦音響処理（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｆｏｃｕｓｅｄ  Ａｃｏｕｓｔｉｃｓ、ＡＦＡ）技術に基づいたコバリス（Ｃｏｖａｒｉｓ）が中心である。等温条件において、幾何学的集束音響エネルギーを利用して、４００ｋＨｚより大きい球面の固体超音波センサを介して、波長が１ｍｍである音響エネルギーをサンプルに集束させる。当該方法により、核酸サンプルの完全性が確保され、高い回収率が実現される。コバリス機器は、経済的なＭシリーズ、単管高出力のＳシリーズ及びより高スループットのＥシリーズ及びＬシリーズを含む。物理的方法に基づいて切断された断片は、ランダム性が良好であるが、スループットにおいてやはり多数のコバリスの断片化装置に依存し、さらに、後続の末端処理、リンカー付加、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）及び様々な精製操作を単独に行わなければならない。酵素的な方法については、ＮＥＢ会社によって開発されたＮＥＢ  Ｎｅｘｔ  ｄｓＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅがある。当該試薬は、まず二本鎖ＤＮＡで切断部位をランダムに作製し、次に、切断の目的を達成するために別の酵素を使って切断部位を識別することにより、相補ＤＮＡ鎖を切断する。当該試薬は、ゲノムＤＮＡ、全ゲノム増幅産物及びＰＣＲ産物等に用いられることができ、ランダム性も良好である。しかしながら、一部の人工的な短い断片の挿入及び欠損が生じ、また、後続の末端処理、リンカー付加、ＰＣＲ及びその対応する精製操作をも同様に行う必要がある。また、Ｅｐｉｃｅｎｔｒａ会社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ会社によって買収）のＮｅｘｔｅｒａ試薬キットを代表としたトランスポゼース切断試薬キットにより、トランスポゼースを用いてＤＮＡ断片化及びリンカーの添加を同時に完了させ、それにより、サンプル処理の時間が短縮される。
【０００４】
トランスポゼースによる切断方式は、処理能力及び操作の便利性において他の方法よりも遥かに優れるが、このような切断方式なりの欠点をも有する。トランスポゼースの作用は、特定の１９ｂｐ  Ｍｅ配列に依存する。従って、トランスポゼースは、２つの完全に異なるリンカー配列を組み込むことにより、標的配列の５’末端及び３’末端に異なるリンカー配列を付加することができるが、リンカーは特定のＭｅ配列を含む必要があるため、切断によって生成された断片の両端には、Ｍｅ配列がそれぞれ対称に割り当てられ、トランスポゼースの特殊な作用により、標的配列（又は切断された断片）とＭｅ配列との間に９ｎｔ塩基欠失のギャップが生じるという影響を及ぼす。標的配列の隣接する両端が完全一致するＭｅ配列は、下流の一部の技術適用（例えば、連結方法に基づく次世代シーケンシング技術）に影響を与える、その影響は、同一鎖の両側におけるＭｅ配列は、相補配列であるため、一本鎖分子内部においてアニーリングが生じやすく、アンカープライマの結合に不利である。
【０００５】
２０１２年１０月３日に出願公開された関連する特許出願である特許文献１において、切断後の配列に対してエンドヌクレアーゼ消化を行い、これにより、９ｎｔ配列及びＭｅ配列を除去するという解決手段が開示されたが、このような方法は、トランスポゼースによる切断のメリットを用いて核酸配列に対してランダムな切断を行うだけで、別途、追加のリンカーを付加しなければならないという欠点があり、これでは工程が煩雑であり、より高いスループットが求められる応用に適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許出願公告第１０２７０３４２６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで、トランスポゼース技術を採用して標的配列を非常に効率よく且つ急速に切断し、切断後の配列を２つの全く異なる配列に改変することができるという分子生物学実験方法に関する特許及び他の文献は開示されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、トランスポゼースによって切断された後の核酸産物を前記トランスポゼース認識配列と異なる他の配列に導入する、というトランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の方法及び試薬を提供する。これにより、切断された核酸の両端に異なるリンカー配列が結合される。切断産物が適用されるのは、両端にトランスポゼース認識配列が存在する場合に限定されない。
【０００９】
１つの実施様態によれば、本発明に係るトランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の方法は、以下のステップを含む。
【００１０】
トランスポゼース包埋複合体を用いて核酸に対してランダムな切断を行い、前記トランスポゼース包埋複合体は、トランスポゼース及び、トランスポゼース認識配列を有する第１リンカーを含み、切断された核酸の両端に前記第１リンカーを連結させて、両端にギャップを形成させるステップと、
精製又は化学試薬処理により、後続の反応に対する、系におけるトランスポゼースの影響を除去するステップと、
リガーゼを用いて、前記ギャップで、前記第１リンカーの配列と異なる配列の第２リンカーに連結させるステップと、
前記第１リンカー及び前記第２リンカーを標的とするプライマを用いてＰＣＲ反応を行い、両端に異なるリンカー配列がそれぞれ連結された産物を得るステップとを含む。
【００１１】
本発明の好ましい解決手段として、リンカーの自己連結又は相互連結を抑止するために、前記第１リンカーには、自己連結を抑止する修飾又は前記第２リンカーとの相互連結を抑止する修飾がなされている。
【００１２】
本発明の好ましい解決手段として、前記第１リンカー上の修飾方法は、
前記第１リンカーの３’末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ａ）、
前記第１リンカーの一本の鎖内に、後続のＵＳＥＲ（Ｕｒａｃｉｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｉｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）  酵素によって過剰のリンカーを酵素消化処理するためのｄＵＴＰを導入するステップ（ｂ）、
前記第１リンカーのトランスポゼース認識配列の外側に１つの塩基対を取り込み、うちの３’末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ｃ）、及び、
前記第１リンカーは、内部に３’−５’ホスホジエステル結合が連結された二本鎖配列が相補的に形成された１本の完全な配列から構成されるステップ（ｄ）のいずれか１つ又は複数の組合わせを含む。
【００１３】
ここで、ステップ（ａ）〜ステップ（ｄ）のいずれの修飾方法について、単独で使用してもよく、２つ又は２つ以上の修飾方法を組み合わせて使用してもよい。特に、ステップ（ａ）の修飾方法をステップ（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の修飾方法と組み合わせて使用することにより、リンカーの自己連結又は相互連結を防止する効果がより良好になる。
【００１４】
本発明の好ましい解決手段として、前記第１リンカー上の修飾方法は、前記第１リンカーの３’末端塩基のジデオキシ修飾である。
【００１５】
本発明の好ましい解決手段として、リンカーの自己連結を防止するために、前記第２リンカー上には、自己連結を防止するための修飾が付加されている。
【００１６】
本発明の好ましい解決手段として、前記第２リンカー上の修飾は、３’末端塩基のジデオキシ修飾である。
【００１７】
本発明において、「自己連結」とは、例えば、前記第１リンカーの異なる分子間の連結又は前記第２リンカーの異なる分子間の連結のように、同一種類のリンカーにおける異なる分子間の連結を意味する。「相互連結」というのは、例えば、前記第１リンカーの分子と前記第２リンカーの分子との連結のように、異種類のリンカーの分子間の連結を意味する。
【００１８】
本発明の好ましい解決手段として、ＰＣＲ反応後に後続の操作実験のための一本鎖分子を容易に取得するために、ＰＣＲ反応に用いられるプライマの１つは、ビオチン−ストレプトアビジンの親和性反応により一本鎖分子を取得するための末端ビオチン標識のプライマである。具体的には、ＰＣＲ反応後に、末端にビオチンが標識された一本鎖分子は、磁気ビーズ表面のストレプトアビジンと結合することにより分離される。
【００１９】
本発明の好ましい解決手段として、精製は、磁気ビーズ精製又はカラム精製である。磁気ビーズ精製又はカラム精製によって、系におけるトランスポゼースを徹底的に除去することができる。本発明のもう１つの実施例において、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓを用いて磁気ビーズ精製を行い、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製カラムを用いてカラム精製を行う。明らかに、本発明は、同様の磁気ビーズ精製製品又はカラム精製製品のすべてを用いることができる。
【００２０】
本発明の好ましい解決手段として、化学試薬処理は、トランスポゼースの変性又は消化により、標的配列からトランスポゼースを解離させる処理である。化学性質上、トランスポゼースはタンパク質に属するため、対応する変性又は消化方法を用いてトランスポゼースを標的配列から解離させることができる。このような処理後のトランスポゼースは、系内に依然として存在するが、その生物学的活性が既に失われているため、後続の反応に対して悪影響を及ぼすことはない。
【００２１】
本発明の好ましい解決手段として、化学試薬は、第１試薬及び第２試薬を含む。前記第１試薬は、トランスポゼースと核酸の標的配列との吸着作用を破壊するための、プロテアーゼ溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液及びＮＴ緩衝液の少なくとも１つを含む。前記第２試薬は、前記第１試薬が後続の酵素触媒作用に対する影響を弱めるためのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液を含む。
【００２２】
一般的には、まず前記第１試薬で処理し、その後、前記第２試薬で処理する。具体的には、まず前記第１試薬を用いて核酸がトランスポザーゼによって切断された後の反応産物を処理する。これにより、トランスポゼースと核酸の標的配列との吸着作用が破壊される。これは、従来の複雑且つ高価な磁気ビーズ精製又はカラム精製工程に代わる処理である。次に、前記第２試薬を用いて処理すると、後続の酵素触媒作用に対する前記第１試薬の影響が弱まり、下流（後半）のＰＣＲが順調に増幅することが確保される。
【００２３】
ここで、前記第１試薬は、上述した溶液の１つ又は複数であってよい。複数の場合は、例えば、プロテアーゼ溶液及びＳＤＳ溶液、ＳＤＳ溶液及びＮＴ緩衝液、プロテアーゼ溶液及びＮＴ緩衝液、或いはプロテアーゼ溶液、ＳＤＳ溶液及びＮＴ緩衝液という２つ又は３つであってよい。また、ＮＴ緩衝液として、Ｔｒｕｐｒｅｐ試薬キットＳ５シリーズでセットのＮＴ緩衝液を採用してよい。
【００２４】
本発明の好ましい解決手段として、前記第１試薬がプロテアーゼ溶液を含む場合、前記第１試薬を添加して処理を行った後に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液をさらに添加して処理を行う。ＥＤＴＡは、プロテアーゼ活性を抑制し、プロテアーゼの後続のＰＣＲ反応における酵素に対する分解作用を防止する。
【００２５】
本発明の好ましい解決手段として、前記第２試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を含む。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、トリトンＸ−１００（化学名：ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル）とも言い、非イオン界面活性剤として、前記第１試薬が後続の酵素触媒作用に対する影響を弱める作用を果たしている。
【００２６】
本発明の好ましい解決手段として、前記第１試薬がＳＤＳ溶液を含む場合、前記第２試薬は、ツィーン２０溶液をさらに含む。ツィーン２０の添加によって、ＳＤＳが後続の酵素触媒作用に対する影響をさらに弱めることができ、ＰＣＲ効果が向上する。説明すべきなのは、ツィーン２０とＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００とは、混合する形式で第２試薬として使用されてもよく、分離する形式で個別に提供されてもよく、分離されている場合、第２試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液及びツィーン２０溶液を示す。
【００２７】
本発明に係る第１試薬及び第２試薬は、単一の対象物に限定されず、複数の対象物の組合わせであってもよいことについて理解されたい。また、本発明では、いかなる場合に用いられる“第１”及び“第２”等の概念は、他の対象物と区別するためであって、順序及び技術的意味を有するものとして解釈されるべきではない。
【００２８】
本発明では、第１試薬及び第２試薬の作業濃度は、当業者の経験によって確定されてよい。一般的には、第１試薬において、プロテアーゼの作業濃度は、５０〜５０００ｍＡＵ／ｍＬが好ましく、７５〜３７５０ｍＡＵ／ｍＬがより好ましく、１５００ｍＡＵ／ｍＬがさらに好ましい。ＥＤＴＡの作業濃度は、１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、１４ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。ＳＤＳの作業濃度は、０．０１％〜１．５％（容積比）が好ましく、１％（容積比）がより好ましい。ＮＴ緩衝液の最終濃度は、１×によって使用されればよい。第２試薬において、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の作業濃度は、０．１％〜２％（容積比）が好ましく、１％（容積比）がより好ましい。ツィーン２０の作業濃度は、０．１％〜２％（容積比）が好ましく、０．５％（容積比）がより好ましい。
【００２９】
第２リンカーの配列は、第１リンカーの配列と異なれば、任意の配列であってよく、限定されない。
【００３０】
本発明において、切断される核酸は、ゲノムＤＮＡ、全ゲノム増幅産物又はＰＣＲ産物であってもよく、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。また、核酸の供給源として、動物、植物又は微生物に由来する核酸試料であってよく、限定されない。
【００３１】
もう１つの実施様態によれば、本発明に係るトランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の試薬は、
核酸をランダムに切断するためのトランスポゼース包埋複合体を形成し、切断された核酸の両端に第１リンカーを連結させて、ギャップを形成させるために用いられる、トランスポゼース及びトランスポゼース認識配列を含む第１リンカーと、
前記ギャップにおいて第２リンカーを接続するための第２リンカー及びリガーゼ成分と、
前記第１リンカー及び前記第２リンカーをそれぞれ標的に結合するものであり、ＰＣＲ反応を行うことで両端にそれぞれ異なるリンカー配列が連結された産物を得るためのＰＣＲプライマとを備えている。
【００３２】
本発明の好ましい解決手段として、前記第１リンカーには、自己連結を抑止する修飾又は前記第２リンカーとの相互連結を抑止する修飾がなされている。
【００３３】
本発明の好ましい解決手段として、前記第１リンカーの修飾方法は、
前記第１リンカーの３’末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ａ）、
前記第１リンカーの一本の鎖内に、後続のＵＳＥＲ酵素によって過剰のリンカーを酵素消化処理するためのｄＵＴＰを導入するステップ（ｂ）、
前記第１リンカーのトランスポゼース認識配列の外側に１つの塩基対を取り込み、そのうち３’末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ｃ）、及び、
前記第１リンカーは、内部に３’−５’ホスホジエステル結合が連結された二本鎖配列が相補的に形成された１本の完全な配列から構成されるステップ（ｄ）のいずれか１つ又は複数の組合わせを含む。
【００３４】
本発明の好ましい解決手段として、前記第２リンカーには、自己連結を抑止するための修飾が付加されている。好ましくは、前記第２リンカーの修飾は、３’末端塩基のジデオキシ修飾である。
【００３５】
本発明の好ましい解決手段として、ＰＣＲプライマの１つは、ビオチン−ストレプトアビジンの親和性反応により一本鎖分子を取得するための末端ビオチン標識のプライマである。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の方法によれば、トランスポゼースによって切断された産物の両側の配列は、第２リンカーと連結する方式によって変更されて、最終切断産物又はＰＣＲ産物の構成において両側が異なる特異的配列を有するようになる。これにより、後続の利用過程において、切断された産物の適用は、従来のように両端にトランスポゼース認識配列（１９ｂｐ  Ｍｅ）を有することによって限定されず、例えば、分子環化、酵素消化処理又は連結等により柔軟に適用される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明に係るトランスポゼースによる核酸の切断及びギャップリンカー（即ち、２番リンカー）の連結に関する技術的解決手段のフロー概略図である。
【図２】本発明の実施例１におけるギャップリンカー（即ち、２番リンカー）が連結された後のＰＣＲ産物のゲル電気泳動の検出結果である。ここで、１、単一のリンカー−２を切断し、ギャップリンカーが連結した後の６０℃でのアニーリング産物。２、単一のリンカー−２を切断し、ギャップリンカーが連結した後の５５℃でのアニーリング産物。３、単一のリンカー−３を切断し、ギャップリンカーが連結した後の６０℃でのアニーリング産物。４、単一のリンカー−３を切断し、ギャップリンカーが連結した後の５５℃でのアニーリング産物。５、単一のリンカー−１を切断し、ギャップリンカーが結合した後の６０℃でのアニーリング産物。６、単一のリンカー−１を切断し、ギャップリンカーが連結した後の５５℃でのアニーリング産物。７、二重リンカーを切断し、６０℃で直接にアニーリングしたＰＣＲ産物。８、二重リンカーが切断後に５５℃で直接にアニーリングしたＰＣＲ産物。Ｍ１はＤＬ２０００  ＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒである。Ｍ２は５０ｂｐ  ＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒである。Ｎは陰性対照である。
【図３】本発明の実施例１におけるライゲーションによる配列決定技法（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）による塩基の質量を示す図である。
【図４】本発明の実施例２における１番リンカーの単一のリンカートランスポゼース複合体によって核酸が切断され、２番リンカーが導入された後のＰＣＲ産物の電気泳動検出結果である。ここで、Ｄ２０００は、ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒレーンである。レーン１は、２μＬのプロテアーゼ＋１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の処理結果である。レーン２は、ＮＴ緩衝液＋１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の処理結果である。レーン３は、１％のＳＤＳ  ＋１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００＋０．５％のツィーン２０の処理結果である。レーン４は、２μＬのプロテアーゼ＋１４ｍＭ  のＥＤＴＡ＋１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の処理結果である。レーン５は、１×ＰＢＩ、１．３×Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓの処理結果である。レーン６は、陰性対照（テンプレートなし）の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、具体的な実施例により本発明についてさらに詳細に説明する。特別に説明しない限り、以下の実施例に用いられる技術のすべては、当業者にとって既知な従来技術である。  使用される機器及び試薬等のすべては、例えば市販での購入等のように、当業者が公共のルートを介して所得することができるものである。
【００３９】
本発明に用いられた用語は、以下の通りである。具体的な実施例において、第１リンカーを１番リンカーと称し、第２リンカーを２番リンカー又はギャップリンカーと称し、第１試薬を１番試薬と称し、第２試薬を２番試薬と称する。
【００４０】
図１に示すように、本発明に係る方法についての操作フローは主に以下を含む。ステップ（１）  トランスポゼースにより特定の修飾配列を含むようになった１番リンカーを用いて、ゲノム配列、全ゲノム増幅産物及びＰＣＲ産物配列等の核酸配列をランダムに切断し、切断されたＤＮＡの両端を第１リンカーと連結させ且つ９ｎｔ塩基欠失のギャップを形成させる。ステップ（２）  精製又は化学試薬処理の方法により、後続の反応に対する系におけるトランスポゼースの影響を除去する。ステップ（３）  ９ｎｔギャップにおいて２番リンカーを連結させる方法により２番リンカーを導入し、断片化された標的配列に隣接するリンカー塩基配列を変更し、これにより、標的配列の両側の配列が完全に異なり、一方は、トランスポゼース認識配列を含む１番リンカー配列を保持し、他方は、任意に設計された２番リンカー配列である。ステップ（４）  特殊プライマ（第１リンカー及び第２リンカーとそれぞれ標的結合されたプライマ）が仲介したＰＣＲ反応を直接に行い、それにより、標的配列の両端に完全に異なる配列が連結されたＰＣＲ産物を取得する。当該産物は、後続の分子生物学の実験に用いられてよい。
【００４１】
本発明では、中国国産のトランスポゼース試薬キット（南京諾唯賛（Ｖａｚｙｍｅ）会社のＴｒｕｐｒｅｐキットＳ５０シリーズ）を採用して実験を行う。  この試薬キットは、５ｎｇのゲノムＤＮＡ及び５０ｎｇのゲノムＤＮＡの２種類を含む。
【００４２】
本発明では、複数種類の包埋リンカー配列（第１リンカー）を設計し、トランスポゼース及び当該包埋リンカー配列を用いてトランスポゼース複合体を調製する。
【００４３】
＜実施例１＞
実施例１において、まず、包埋されたトランスポゼース複合体を用いて５ｎｇ又は５０ｎｇの高品質のゲノムＤＮＡに対して切断操作を行った。磁気ビーズ精製又はカラム精製を経た後に、包埋されていない遊離した１番リンカーを除去した。次に、２番リンカー（ギャップリンカー）を独創的に結合させ、精製工程を経て遊離した２番リンカーを除去した。これにより、両端に異なるリンカー配列が連結された線形ゲノム配列が構築された。１番リンカー及び２番リンカーのそれぞれを標的とするＰＣＲプライマを用いてＰＣＲを増幅させ、両端に異なるリンカー配列が連結されたＰＣＲ産物を豊富にさせた。
【００４４】
実施例１におけるＰＣＲ産物の１つの適用として、ビオチン標識によりＰＣＲプライマを標識し、特定の配列の一本鎖分子を取得し、一本鎖環化又は短い核酸配列を仲介としての環化方式により、一本鎖環状分子を調製する。形成された一本鎖環状分子は、固体の緻密なＤＮＡナノスフェアの調製に用いられてよい。
【００４５】
１、１９ｂｐのトランスポゼース認識配列を有する複数ペアのプライマ配列（配列Ａ及び配列Ｂ）を、包埋用の単一のリンカー（１番リンカー）を調製するために設計して購入する。実施例１において、３種類の異なる単一のリンカー配列（即ち、単一のリンカー１配列、単一のリンカー２配列及び単一のリンカー３配列）及び１種類の標準の二重リンカー配列（配列Ａ  ＋配列Ｂ、配列Ａ  ＋配列Ｃ  ）についてテストを行った。
【００４６】
ここで、単一のリンカー１配列の１本の鎖（Ａ鎖）に、ＵＳＥＲ酵素によって過剰のリンカーを酵素消化処理するためのｄＵＴＰを導入する。単一のリンカー２配列の１９ｂｐのトランスポゼース認識配列の外側に１つの塩基対を導入し、ここで、３’末端塩基は、ジデオキシ修飾された塩基である。  単一のリンカー３配列の二本鎖配列全体は、内部に３’−５’ホスホジエステル結合が連結された二本鎖配列が相補的に形成された１本の完全な配列から構成されている。また、上述した３種類の１番リンカーの修飾方法によれば、少なくとも１本の鎖において３’末端ジデオキシ修飾が含まれ、これにより、１番リンカーの自己連結及び２番リンカーとの相互連結がより効果的に抑止される。各１番リンカー配列は、以下のように表示されている。
単一のリンカー１配列Ａ：ＣＴＧＴＣＵＣＴＴＡＵＡＣＡＣＡＴＣ  ｄｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、
単一のリンカー１配列Ｂ：ＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（ＳＥＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、
単一のリンカー２配列Ａ：ＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣ  ｄｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
単一のリンカー２配列Ｂ：ＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ  ｄｄＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
単一のリンカー３配列：
ＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣ  ｄｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、
二重リンカー配列Ａ：ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ（ＳＥＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、
二重リンカー配列Ｂ：ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（ＳＥＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、
二重リンカー配列Ｃ：ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。
【００４７】
２、単一のリンカー配列の各ペアを１００μＭまで希釈し、十分に混合した後、遠心分離を行い、ＰＣＲ装置内において以下の手順（表１）でアニーリング処理を行い、包埋複合体を調製するための１番リンカー（−２０℃で保存）を取得する。二重リンカー配列Ａ、Ｂ及びＣを１００μＭまでそれぞれ希釈し、配列Ａ＋配列Ｂの組合わせ及び配列Ａ＋配列Ｃの組合わせを十分に混合した後、遠心分離を行い、ＰＣＲ装置内において以下の手順（表１）でアニーリング処理を行い、包埋複合体を調製するための１番リンカー（−２０℃で保存）を取得する。
【００４８】
【表１】
2017534297.tif 000003
【００４９】
３、１番リンカー及びトランスポゼースを以下の系（表２）に従ってトランスポゼース複合体に包埋し、２０回軽く吹付けて混合させ、３０℃で１時間インキュベートして複合体の包埋を完了させ、  当該複合体を−２０℃で保存する。
【００５０】
【表２】
2017534297.tif 000004
【００５１】
４、５０ｎｇの高品質ゲノム及びトランスポゼース複合体を以下の系（表３）に従って混合させ、２０回軽く吹付け、５５℃で１０分間インキュベートした後に４℃まで冷却し、ゲノムの切断を完了させる。
【００５２】
【表３】
2017534297.tif 000005
【００５３】
５、体積が１倍のＰＢＩ（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製試薬キット）を添加し均等に混合させた後に１．３倍率のＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓで精製（自動操作）する方法１、及び、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製カラムを用いて精製する方法２に従って精製を行う。精製後、純水に溶解させる。
【００５４】
６、切断された単一のリンカー１に対して、ＵＳＥＲ酵素を添加して酵素消化処理を行い、次に、この前のステップと同様な精製方法を行う。消化系は以下の表４の通りである。
【００５５】
【表４】
2017534297.tif 000006
【００５６】
７、精製後の産物を以下の系（表５）に従ってギャップリンカー（即ち、２番リンカー）を連結させ、２５℃で６０分間インキュベートしてリンカー連結を完了させる。
【００５７】
【表５】
2017534297.tif 000007
【００５８】
注：２番リンカー配列は、以下通りである。
２番リンカー配列Ａ：ｐ  ＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴ  ｄｄＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、２番リンカー配列Ｂ：ＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ  ｄｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ここで、ｐは、５’末端リン酸化修飾を示し、ｄｄは、３’末端ジデオキシ修飾を示す。
【００５９】
８、反応後の産物を連結させ、体積が１倍のＰＢＩを添加して均等に混合させた後に１．３倍率のＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓで精製（自動操作）する方法１、及び、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製カラムを用いて精製する方法２に従って精製を行う。精製後、純水に溶解させる。
【００６０】
９、以下のＰＣＲ反応系（表６）及び反応条件（表７）に従ってＰＣＲ増幅を行う。
【００６１】
【表６】
2017534297.tif 000008
【００６２】
注：ＰＣＲプライマ配列は下記通りである。
単一のリンカープライマ１：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
単一のリンカープライマ２：ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、
二重リンカープライマ１：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
二重リンカープライマ２：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
【００６３】
【表７】
2017534297.tif 000009
【００６４】
１０、ギャップリンカー（即ち、２番リンカー）が連結された後のＰＣＲ産物の検出結果は、図２に示すように、ＰＣＲ産物の濃度測定結果は、以下（表）８通りである。
【００６５】
【表８】
2017534297.tif 000010
【００６６】
ＰＣＲ結果説明：本発明の方法により、ギャップリンカーの導入が実現された。
【００６７】
１１、ＰＣＲ産物が一本鎖分離された後に、現行のシーケンシングの汎用方法に従って、標的バンドを一本鎖環化処理し、これにより、ゲノムシーケンシングプラットフォームにおけるローリングサークル型複製によってＤＮＡナノスフェアを調製するために用いられ、また、シーケンシングの連結に用いられる一本鎖環状のＤＮＡ分子を得た。一本鎖分離方法及び環化操作方法は、以下通りである。
（１）ＰＣＲ産物に対して９５℃熱変性処理を行い、次に直ちに５ｍｉｎ氷浴させる。
（２）以下の反応系（表９）に従って３ｐｍｏｌのＰＣＲ産物の変性後の一本鎖分子に対して一本鎖環化操作を行う。
【００６８】
【表９】
2017534297.tif 000011
【００６９】
注：仲介配列は、以下通りである。
単一のリンカー仲介配列：ＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、
二重リンカー仲介配列：ＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）。
【００７０】
（３）環化されていない一本鎖を消化させ、以下の系（表１０）に従って反応系を作製し、均等に混合し、遠心分離を短時間行った後、２０μＬを取ってステップ（２）における反応系に添加し、３７℃で３０分間インキュベートを継続して行った。次に、１．８倍率のＡｍｐｕｒｅ  ＸＰを用いて磁気ビーズ精製を行うことで、シーケンシングを連結するための一本鎖環状分子を調製した。
【００７１】
【表１０】
2017534297.tif 000012
【００７２】
１２、５’末端及び３’末端からシーケンシングを行ってよく、両端に異なる配列が連結された標的断片は、１９ｂｐのトランスポゼース認識配列が片端のみに存在するため、両端の１９ｂｐのトランスポゼース認識配列の特異的アニーリングによるシーケンシングリンカーとの競合が回避され、シーケンシングの質が大幅に改善された。その結果を図３に示している。図３に示したデータのほとんどが８０〜９０の間であり、通常、７５以上であれば許容できる範囲とみなされる。両端に１９ｂｐのトランスポゼース認識配列を有する従来の方法でのシーケンシング結果によるデータは、一般的にこのように高くなく、３０〜４０の間にしかないものもある。これを鑑みると、本発明に係る１９ｂｐ配列相補のシーケンシングプローブは、シーケンシングテンプレートに良好にマッチしている。これにより、シーケンシングに対する、トランスポゼースにおける２本の１９ｂｐ逆相補配列の影響が解決される。
【００７３】
＜実施例２＞
実施例２において、まず、包埋されたトランスポゼース複合体を用いて５０ｎｇの高品質のゲノムＤＮＡに対して切断操作を行い、プロテアーゼ、ＳＤＳ、ＮＴ又はプロテアーゼとＥＤＴＡとの組成物を用いて処理し、ＤＮＡに結合したトランスポゼースタンパク質を除去する。ギャップリンカーを介して連結された後、ＰＣＲプライマを用いて直接増幅し、ＰＣＲ反応系に所定濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた。
【００７４】
１、１９ｂｐのトランスポゼース認識配列を有する１ペアのプライマ配列（配列Ａ及び配列Ｂ）を、包埋用の１番リンカーの単一のリンカーを調製するために設計して購入する。
１番リンカーの単一のリンカー配列Ａ：ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
１番リンカーの単一のリンカー配列Ｂ：ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣｄｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ｄｄは、ジデオキシ修飾を示す）。
【００７５】
２、配列Ａ及び配列Ｂを１００μＭまで希釈し、十分に混合した後、遠心分離を行い、ＰＣＲ装置内において以下の手順（表１１）でアニーリング処理を行い、包埋複合体を調製するための１番リンカー（−２０℃で保存）を取得した。
【００７６】
【表１１】
2017534297.tif 000013
【００７７】
３、１番リンカー及びトランスポゼースを以下の系（表１２）に従ってトランスポゼース複合体に包埋し、２０回軽く吹付けて混合させ、３０℃で１時間インキュベートして複合体の包埋を完了させる。当該複合体を−２０℃で保存する。
【００７８】
【表１２】
2017534297.tif 000014
【００７９】
４、５０ｎｇの高品質ゲノム及びトランスポゼース複合体を以下の系（表１３）に従って混合させ、２０回軽く吹付け、５５℃で１０分間インキュベートした後に４℃まで冷却し、ゲノムの切断を完了させる。
【００８０】
【表１３】
2017534297.tif 000015
【００８１】
５、切断後のサンプルに対する処理方法は、以下から選択されてよい。方法１、０．１〜５μＬのプロテアーゼ（７５０ｍＡＵ／ｍＬ）を添加して処理を行った。本実施例では、プロテアーゼを２μＬとすることが好ましい。プロテアーゼ０．１μＬ及び５μＬのそれぞれで試験した。方法２、最終濃度の市販の１×ＮＴ緩衝液（Ｔｒｕｐｒｅｐ試薬キットＳ５シリーズでセットの試薬）を添加した。方法３、０．０１％〜１．５％（容積比）のＳＤＳを添加した。本実施例では、ＳＤＳを１％（容積比）とすることが好ましい。ＳＤＳ０．０１％（容積比）及び１．５％（容積比）のそれぞれで試験した。方法４、０．１〜５μＬのプロテアーゼを添加して処理を行い、次に、最終濃度が１〜５０ｍＭのＥＤＴＡを添加した。本実施例では、プロテアーゼを２μＬとし、最終濃度が１４ｍＭのＥＤＴＡを点かすることが好ましい。０．１μＬのプロテアーゼと１ｍＭのＥＤＴＡとの混合、及び、５μＬのプロテアーゼと５０ｍＭのＥＤＴＡとの混合について試験した。方法５、体積が１倍のＰＢＩ（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製試薬キットである１種類の市販試薬）を添加し均等に混合させた後に１．３倍率のＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓで精製し、純水で溶解する。
【００８２】
６、上述した処理後の産物に０．１％〜２％（容積比）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加した。好ましくは、本実施例の１％（容積比）である。試験では、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を０．１％（容積比）及び２％（容積比）とした。
【００８３】
７、上述したＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の処理後の産物を以下の系（表１４）に従ってギャップリンカー（即ち、２番リンカー）を連結させ、２５℃で６０分間インキュベートしてリンカー連結を完了させた。
【００８４】
【表１４】
2017534297.tif 000016
【００８５】
注：２番リンカー配列Ａ：５’−ｐＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴ  ｄｄＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、２番リンカー配列Ｂ：５’−ＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ  ｄｄＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）（ｐはリン酸化修飾を示し、ｄｄはジデオキシ修飾を示す。）。
【００８６】
８、以下のＰＣＲ反応系（表１５）及び反応条件（表１６）に従ってＰＣＲ増幅を行う。ＳＤＳを添加した実験群では、当該ＰＣＲ系に特定の濃度のツィーン２０をも添加して、ＰＣＲの効率を部分的に向上させる必要がある。  ツィーン２０の作業濃度について、０．１％（容積比）及び２％（容積比）で試験したが、異なるように調製してもよく、例えば０．１％〜２％（容積比）としてもよい。好ましくは本サンプルの０．５％である。
【００８７】
【表１５】
2017534297.tif 000017
【００８８】
注：１番リンカーの単一のリンカープライマ１：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＧＧＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＧＡＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、１番リンカーの単一のリンカープライマ２：ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）。
【００８９】
【表１６】
2017534297.tif 000018
【００９０】
９、単一のリンカー包埋複合体の切断及びギャップリンカーの連結後のＰＣＲ産物の検出結果を図４に示し、ＰＣＲ産物の濃度の測定結果を表１７に示している。
【００９１】
【表１７】
2017534297.tif 000019
【００９２】
上記内容は、具体的な実施例と共に本発明について詳細に説明したものであり、本発明の具体的な実施はこれらの説明に限定されない。本発明が属する分野の当業者は、本発明の概念から逸脱しない限り、ほかの複数の簡単な演繹又は置換を行うことができる。
【図１】
2017534297.tif 000020
【図２】
2017534297.tif 000021
【図３】
2017534297.tif 000022
【図４】
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【配列表】
2017534297000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月20日(2017.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポゼース包埋複合体を用いて核酸に対してランダムな切断を行い、前記トランスポゼース包埋複合体は、トランスポゼース及び、トランスポゼース認識配列を有する第１リンカーを含み、切断された核酸の両端に前記第１リンカーを連結させ、ギャップを形成するステップと、
精製又は化学試薬処理の方法により、後続の反応に対する、系におけるトランスポゼースの影響を除去するステップと、
リガーゼを用いて、前記ギャップで、前記第１リンカーの配列と異なる配列の第２リンカーに連結させるステップであり、前記第２リンカーには、自己連結を抑止するための修飾が付加され、前記第２リンカーの修飾は、３'末端塩基のジデオキシ修飾であるステップと、
前記第１リンカー及び前記第２リンカーを標的として結合するプライマを用いてＰＣＲ反応を行い、両端にそれぞれ異なるリンカー配列が連結された産物を得るステップとを含むことを特徴とするトランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の方法。
【請求項２】
前記第１リンカーには、自己連結を抑止する修飾又は前記第２リンカーとの相互連結を抑止する修飾が付加されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１リンカーの修飾方法は、
前記第１リンカーの３'末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ａ）、
前記第１リンカーの一本の鎖内に、後続のＵＳＥＲ酵素によって過剰のリンカーを酵素消化処理するためのｄＵＴＰを導入するステップ（ｂ）、
前記第１リンカーのトランスポゼース認識配列の外側に１つの塩基対を取り込み、そのうちの３'末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ｃ）、及び、
前記第１リンカーは、内部に３'−５'ホスホジエステル結合が連結された二本鎖配列が相補的に形成された１本の完全な配列から構成されるステップ（ｄ）のいずれか１つ又は複数の組合わせを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１リンカーの修飾方法は、前記第１リンカーの３'末端塩基のジデオキシ修飾であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲ反応に用いられるプライマの１つは、ビオチン−ストレプトアビジンの親和性反応により一本鎖分子を取得するための末端ビオチン標識のプライマであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記精製は、磁気ビーズ精製又はカラム精製であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記化学試薬処理は、トランスポゼースの変性又は消化のために標的配列からトランスポゼースを解離させる処理であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記化学試薬は、第１試薬及び第２試薬を含み、前記第１試薬は、前記トランスポゼースと前記核酸との標的配列の吸着作用を破壊するための、プロテアーゼ溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液及びＮＴ緩衝液の少なくとも１つを含み、前記第２試薬は、前記第１試薬が後続の酵素触媒作用に対する影響を弱めるためのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１試薬は、ＥＤＴＡを有する付加試薬をさらに含み、
好ましくは、前記第２試薬は、ツィーン２０溶液をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸に対してランダムな切断を行うためのトランスポゼース包埋複合体を形成し、切断された核酸の両端に第１リンカーを連結させ、ギャップを形成させるために用いられるトランスポゼース及び、トランスポゼース認識配列を含む第１リンカーと、
前記ギャップで、第２リンカーを連結するための第２リンカー及びリガーゼの成分と、
ＰＣＲ反応を行うために、前記第１リンカー及び前記第２リンカーのそれぞれ標的に結合するものであり、両端に異なるリンカー配列がそれぞれ連結された産物を得るためのＰＣＲプライマとを備え、
前記第２リンカー上には、自己連結を抑止するための修飾が付加され、前記第２リンカー上の修飾は、３'末端塩基のジデオキシ修飾であることを特徴とするトランスポゼースによる核酸の切断及びリンカー付加の試薬。
【請求項１１】
前記第１リンカーには、自己連結を抑止する修飾又は前記第２リンカーとの相互連結を抑止する修飾が付加されていることを特徴とする請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
前記第１リンカーの修飾方法は、
前記第１リンカーの３'末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ａ）、
前記第１リンカーの一本の鎖内に、後続のＵＳＥＲ酵素によって過剰のリンカーを酵素消化処理するためのｄＵＴＰを導入するステップ（ｂ）、
前記第１リンカーのトランスポゼース認識配列の外側に１つの塩基対を取り込み、そのうちの３'末端塩基に対してジデオキシ修飾するステップ（ｃ）、及び、
前記第１リンカーは、内部に３'−５'ホスホジエステル結合が連結された二本鎖配列が相補的に形成された１本の完全な配列から構成されるステップ（ｄ）のいずれか１つ又は複数の組合わせを含むことを特徴とする請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記ＰＣＲプライマの１つは、ビオチン−ストレプトアビジンの親和性反応により一本鎖分子を取得するための末端ビオチン標識のプライマであることを特徴とする請求項１０に記載の試薬。
【国際調査報告】
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