(57)【要約】本発明は、DNAメチル化の状態を評価することによってゲノム機能のエピジェネティックな調節を評価するためのシステム、キット、および方法を含む。本発明は、最初に非メチル化シトシン残基がウラシル残基に変換され、次いで、標的DNAがその後の解析のために捕捉される、変換後捕捉方法を含む。この方法は、溶相捕捉のための新規の捕捉プローブプールを使用する。2017501730.tif 000006
2017501730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3つのタイプの捕捉プローブを含む、関心対象の核酸配列を捕捉するための溶相捕捉プローブプールであって、
第1のタイプは、メチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;
第2のタイプは、メチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;
第3のタイプは、一部のメチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基を含み他のメチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基を含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブである、
前記溶相捕捉プローブプール。
【請求項２】
捕捉プローブの長さが約50bp〜約150bpである、請求項1記載のプローブプール。
【請求項３】
捕捉プローブの長さが約75bpである、請求項1記載のプローブプール。
【請求項４】
捕捉プローブが約50％のG+Cを有する、請求項1記載のプローブプール。
【請求項５】
3つのタイプの捕捉プローブのそれぞれが、プローブプールの約33％である、請求項1記載のプローブプール。
【請求項６】
以下の段階を含む、関心対象の核酸配列のDNAメチル化の状態を評価する方法:
(a)3つのタイプの捕捉プローブを含む捕捉プローブプールを用いて、関心対象の核酸配列の変換され増幅された核酸断片を溶液中で捕捉する段階であって、
第1のタイプは、メチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;
第2のタイプは、メチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;
第3のタイプは、一部のメチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基を含み他のメチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基を含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブである、段階;
(b)捕捉された核酸断片を増幅して、増幅された捕捉核酸断片の集団を得る段階;
(c)増幅された捕捉核酸断片を配列決定して、捕捉された核酸断片のヌクレオチド配列を得る段階;および
(d)捕捉された核酸断片のヌクレオチド配列を解析して、DNAメチル化の状態に関する情報を得る段階。
【請求項７】
段階(a)の前に、ゲノムDNA試料を取得し、該ゲノムDNA試料からDNAライブラリーを調製する段階を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
変換された核酸断片が、変換剤を用いて、DNAライブラリーにおいて非メチル化シトシン残基および/または5-ヒドロキシメチルシトシン残基をウラシル残基に変換することによって得られる、請求項6記載の方法。
【請求項９】
変換剤が、アポリポタンパク質B編集複合体触媒サブユニット1、バイサルファイト、シトシンデアミナーゼ、亜硝酸、および過ルテニウム酸カリウムからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
捕捉された核酸断片のヌクレオチド配列およびメチル化状態を参照ゲノムのヌクレオチド配列およびメチル化状態と比較する段階(e)をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
システムが以下を含む、DNAメチル化の状態を評価するための、キットから作られた構成物(composition):
3つのタイプの捕捉プローブを有する溶相捕捉プローブプールキットであって、第1のタイプが、メチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;第2のタイプが、メチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;第3のタイプが、一部のメチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基を含み他のメチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基を含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブである、前記溶相捕捉プローブプールキット;ならびに
DNA試料採取キット、DNAライブラリー調製キット、DNA変換キット、DNA増幅キット、DNA配列決定キット、ならびにバイオインフォマティクスの設計および解析ソフトウェアからなる群より選択される少なくとも1つの付加的なキット。
【請求項１２】
DNA変換キットが、アポリポタンパク質B編集複合体触媒サブユニット1、バイサルファイト、シトシンデアミナーゼ、亜硝酸、および過ルテニウム酸カリウムからなる群より選択される変換剤を含む、請求項11記載の構成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、全体として、エピジェネティクス、より具体的には、DNAメチル化の状態を評価することを通してゲノム機能のエピジェネティックな調節を評価するシステム、キット、および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エピジェネティクスとはエピゲノムの研究であり、エピゲノムは、基本となるヌクレオチド配列を変更することなく起こるDNAおよびクロマチンの機能に関連する化学修飾を含む。エピゲノムの2つの主要な構成要素は、DNAメチル化およびヒストン修飾である。
【０００３】
エピジェネティックな修飾は、DNA中の遺伝子の発現を調節し、かつ治療物質の代謝および区画化(compartmentalization)に関与する遺伝子の発現を調整することにより、個体間の医学的治療の有効性に影響することができ、さらに治療物質の標的の発現を改変することもできる。異常なエピジェネティックな変化は、例えば、癌、心血管疾患、および神経系疾患などの多くの疾患に関連している。
【０００４】
DNAメチル化は、最初に発見されたエピジェネティックな痕跡(mark)であった。DNAメチル化は、依然として、最もよく研究されている。哺乳動物では、DNAメチル化は、主に、CpGジヌクレオチドのシトシン残基の5位炭素へのメチル(-CH3)基の酵素的付加を伴い、転写因子がそれに結合するのを抑制する。したがって、DNAの著しくメチル化された領域は、転写活性が低い傾向がある。
【０００５】
DNAメチル化は、動物における遺伝子量補償、インプリンティング、ゲノム安定性、および発生(例えば、幹細胞分化および胚形成)に影響を及ぼす。さらに、DNAメチル化は、転移因子サイレンシングおよび宿主と病原体の相互作用にも関係があるとされている。同様に、DNAメチル化は、植物のゲノム完全性にとっても重要である。
【０００６】
DNAメチル化の状態(すなわちメチローム)を評価するための現在の方法は、メチル化に特異的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もしくはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF-MS)などの方法を用いて、個々の遺伝子座に焦点を合わせるか、またはマイクロアレイ、簡約表示(reduced representation)バイサルファイトシーケンシング(RRBS)もしくは全ゲノムショットガンバイサルファイトシーケンシング(WGBS)を用いて、ゲノム全域の規模に焦点を合わせる。WGBSは、一塩基対の解像度でDNAメチル化の状態を測定し、ゲノム中のメチル化可能な各位置におけるメチル化率を評価することを可能にするため、特に魅力的である。しかし、典型的に各ゲノムのごく一部が関心対象である場合、複数の個体のゲノム全体についてそのようなデータを作成することは、それでもなお高価である。
【０００７】
DNA配列決定に基づくメチル化評価方法では、メチル化シトシン残基を非メチル化シトシン残基と区別するために化学処理(例えばバイサルファイト(BS))を使用する。簡単に説明すると、BSは、DNA中のシトシン残基をウラシル残基に変換し、これらウラシル残基は、その後の増幅反応または配列決定反応の間にチミン残基に置き換えられる。しかし、5-メチルシトシン(5-mC)残基および5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)残基は、変換せず(resistant)、したがって、シトシン残基として保存される。したがって、BS変換は、個々のシトシン残基のメチル化状態に応じて変わる特異的変化をDNAに導入して、DNA配列のメチル化状態に関して一ヌクレオチドの解像度の情報をもたらす。
【０００８】
残念ながら、BS転換は、厳しい条件によって試料の約90％が分解し得るため、多量のDNA試料(例えば、>10μg)を必要とする。さらに、コード(またはセンス)鎖および非コード(またはアンチセンス)鎖の増幅産物はもはや相補的ではないため、増幅後にゲノムサイズは事実上、倍増する。さらに、一部のメチル化可能なシトシン残基のみが実際にメチル化される部分的変換が起こる場合があり、このため、従来のプローブおよびアッセイ法の設計が複雑になり、後続の解析が混乱する。BS変換によってもたらされる複雑性のために、DNAメチル化の研究を容易にすると思われる標的DNA濃縮方法の開発が遅れていた。
【０００９】
上記の理由から、DNAメチル化の状態を通してゲノム機能のエピジェネティックな調節を評価するための付加的なシステム、キット、および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、標的濃縮シーケンシングによってDNAメチル化の状態を評価する「変換後捕捉(convert-then-capture)」方法を含む。有利なことには、変換後捕捉方法により、高い再現性を実現しつつ、高い分子的複雑性を損なわずに少量のDNAを使用することが可能になり、試料当たりの必要費用および必要時間が減り、その結果、シーケンシングのカバレッジ深度が向上する。変換後捕捉方法により、全ゲノムシーケンシング(WGS)による評価もまた、可能になる。
【００１１】
方法は、標的生物からDNA試料を得ることによって始めることができる。DNA試料が得られた後、方法は、試料からDNAライブラリーを調製する段階を含んでよい。次いで、方法は、バイサルファイト(HSO3-)のような変換剤を用いて、調製されたDNAライブラリー中の非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換する段階を含んでよい。しかし、5-mC残基はウラシル残基に変換されない。あるいはまたはさらに、方法は、過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)のような変換剤を用いて、調製されたDNAライブラリー中の5-hmC残基を5-ホルミルシトシン(5-fC)残基に変換する段階を含んでよい。5-fC残基は、バイサルファイトを用いてウラシル残基に次いで変換することができる、中間体である。やはり、5-mC残基はウラシル残基に変換されない。
【００１２】
シトシンおよび5-hmC残基を変換し、(例えばPCRによって)増幅した後、方法は、本明細書において説明するような溶液をベースとする捕捉プローブプールを用いて、変換されたDNAライブラリーから関心対象の断片を捕捉する段階を含む。捕捉後、方法は、捕捉された核酸断片を増幅および精製し、続いて、配列決定する段階を含んでよい。さらに、方法は、配列を解析してDNAメチル化の状態に関する情報を得る段階を含んでよく、さらに、捕捉された核酸断片の配列およびメチル化状態を参照ゲノムの配列およびメチル化状態と比較する段階を含んでもよい。
【００１３】
1つの態様において、本発明は、次の3つのタイプの捕捉プローブを含む、関心対象の核酸配列を捕捉するための溶相捕捉プローブプールである:第1のタイプは、メチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;第2のタイプは、メチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;第3のタイプは、一部のメチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基を含み他のメチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基を含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブである。この態様の変形例において、捕捉プローブは、長さが約50bp〜約150bp、例えば、長さが約75bpである。これらのプローブは、約50％のG+Cを有してよい。さらに、プローブプール内で、3つのタイプの捕捉プローブのそれぞれは、プローブプールの約33％である。
【００１４】
別の態様において、本発明は、関心対象の核酸配列のDNAメチル化の状態を評価する方法であり、この方法は、3つのタイプの捕捉プローブを含む捕捉プローブプールを用いて、関心対象の核酸配列の変換され増幅された核酸断片を溶液中で捕捉する段階であって、第1のタイプは、メチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;第2のタイプは、メチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;第3のタイプは、一部のメチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基を含み他のメチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基を含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブである、段階;捕捉された核酸断片を増幅して、増幅された捕捉核酸断片の集団を得る段階;増幅された捕捉核酸断片を配列決定して、捕捉された核酸断片のヌクレオチド配列を得る段階;および捕捉された核酸断片のヌクレオチド配列を解析して、DNAメチル化の状態に関する情報を得る段階、を含む。この態様の変形例において、方法は、ゲノムDNA試料を取得し、そのゲノムDNA試料からDNAライブラリーを調製する初期段階をさらに含む。この態様において、変換された核酸断片は、アポリポタンパク質B編集複合体触媒サブユニット1、バイサルファイト、シトシンデアミナーゼ、亜硝酸、および過ルテニウム酸カリウムなどの変換剤を用いて、DNAライブラリーにおいて非メチル化シトシン残基および/または5-ヒドロキシメチルシトシン残基をウラシル残基に変換することによって、得られる。他の変形例において、方法は、さらに、捕捉された核酸断片のヌクレオチド配列およびメチル化状態を参照ゲノムのヌクレオチド配列およびメチル化状態と比較する段階を含む。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、DNAメチル化の状態を評価するためのシステムであり、このシステムは、3つのタイプの捕捉プローブを有する溶相捕捉プローブプールキットであって、第1のタイプが、メチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;第2のタイプが、メチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基のみを含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブであり;第3のタイプが、一部のメチル化可能なシトシン残基の代わりにウラシル残基を含み他のメチル化可能なシトシン残基の代わりにシトシン残基を含む関心対象の配列にハイブリダイズできるプローブである、溶相捕捉プローブプールキット;ならびにDNA試料採取キット、DNAライブラリー調製キット、DNA変換キット、DNA増幅キット、DNA配列決定キット、ならびにバイオインフォマティクスの設計および解析ソフトウェアからなる群より選択される少なくとも1つの付加的なキットを含む。DNA変換キットは、アポリポタンパク質B編集複合体触媒サブユニット1、バイサルファイト、シトシンデアミナーゼ、亜硝酸、および過ルテニウム酸カリウムからなる群より選択される変換剤を含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
（図１）「変換後捕捉」ワークフローを代案の「捕捉後変換」ワークフローと比較する模式図を示す。この模式図は、「分子的支障となる(molecular bottlenecking)」3つの段階(三角形)が連続して存在するため、後者では配列データの重複率が高くなり、多量の投入試料DNAを必要とすることを示唆している。
（図２）変換後捕捉概念を用いる場合にプローブ設計および製造
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にとって問題となる、バイサルファイト(BS)変換によって起こる標的配列の複雑性の増大を示す図である。
（図３）製造効率を向上させ、別の方法で実行可能であると思われるものよりも大型で複雑な標的の捕捉を可能にするために「ゆらぎ」ヌクレオチドを使用することの利点を示す図である。
（図４）3種のヒト細胞株に対する、方法の成績を示す。
（図５）様々な量の投入DNAを比較する実験を示す。
（図６）再現性を評価するために、同じ供給源に由来する別々の試料から得られたデータを示す。
（図７）インビトロでメチル化された試料の解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
概要
例示的なシステム、キット、および方法は、DNAメチル化の状態に関する情報を評価(すなわち、捕捉、配列決定、および解析)するために提供され、変換後捕捉概念に基づいている。この概念は、関心対象の核酸配列を最初に捕捉し、次いで、関心対象の核酸配列中の非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換することにおおむね基づいている現行の方法とは対称的である。公知の方法は、捕捉時に単純なプローブセットしか必要としないが、あいにく、これらの方法は、多量のDNA試料を必要とし、一本鎖のDNAに関するDNAメチル化の状態についての情報しか提供しない。このことは、例えば、非メチル化シトシン残基がウラシル残基に完全に変換されていない場合、またはシトシンからチミジンへの(CからTへの)遺伝的多型が核酸配列中に存在する場合、特に問題となる。この場合、他方の鎖に含まれる任意のこのような情報の恩恵を失い、DNAメチル化の状態に関して不正確な情報を得る。全般的にみて、これら公知の方法は、結果として、試料投入量が多くなり(例えば、>10μg)、関心対象の標的領域のデータカバレッジ(data coverage)が不十分になり、分子複雑性が低くなり(すなわち、高い重複リード率)、配列決定費用が高くなり、結果の再現性が低くなる。
【００１８】
したがって、本明細書において説明する研究は、前述の欠点を変換後捕捉概念によって解決できることを初めて示すものである。本発明の概念は、少なくとも3つのタイプの捕捉プローブの混合物を有する溶相捕捉プローブプールによって、欠点を克服する。メチル化DNAを標的とするプローブ(または複数のプローブ)、非メチル化DNAを標的とするプローブ(または複数のプローブ)、およびCまたはTのランダムな組込みの寄与により、両方を認識する「ゆらぎ」プローブ(または複数のプローブ)。さらに、各タイプのプローブは、関心対象の核酸配列の一方または他方の鎖に溶液中で結合する/ハイブリダイズするプローブの混合物を含み、それによって、配列決定の深度および信頼性を向上させることもできる。独特な溶相捕捉プローブプールのゆえに、本発明の方法は、必要とする試料投入量が少なく(例えば、約1μgまたはそれ以下)、DNAメチル化の状態を評価するのに有用である、高い分子複雑性(すなわち、低い重複リード率)、高レベルの試料処理量、および高い再現性を実現する。
【００１９】
これらのシステム、キット、および方法は、様々な用途、例えば、診断法および研究に有用である。診断用途に関して、当業者は、治療的物質(therapeutic)の代謝および区画化に関与する遺伝子の発現を調整するか、またはさらに治療物質の標的の発現を調整する、異常なDNAメチル化を介したエピジェネティックな変化があるかどうかを評価することによって、対象のために適切な医学的治療を決定することができる。同様の様式で、当業者は、DNAメチル化のパターンに治療法が与える影響をモニターして、治療の有効性を判定するか、副作用を予測するか、または薬物耐性の出現を発見することができる。同様に、当業者は、異常なDNAメチル化を介したエピジェネティックな変化に関係があるとされている疾患または障害、例えば、癌、心血管疾患、および神経系疾患に対象が罹患しているかどうかを評価することもできる。あるいは、当業者は、ヒト、または例えば農学的に重要な動物および植物を含む他の生物の正常な表現型形質に関連しているか、またはそれらを予測するメチル化パターンを同定することもできる。さらに、当業者は、環境物質(environmental agent)、例えば、遺伝子発現パターンを変化させることにより有害作用を引き起こす毒素が原因で生じる、生物のメチル化パターンの変化を検出することができる。
【００２０】
調査用途に関しては、当業者は、遺伝子発現、クロマチンの構造および安定性、ならびにエピジェネティック的に受け継がれる形質に対する、DNAの高メチル化または低メチル化の影響を明らかにすることができる。
【００２１】
図面を参照して、本発明は、変換後捕捉概念を含む。図1は、変換後捕捉ワークフローと現在実行されている捕捉後変換ワークフローの比較を提供する。塗りつぶした三角形で示したワークフローの段階は、試料の複雑性、したがって情報の量を減らす選択プロセスが起こっている段階である(「分子的支障」)。例えば、MethylSeqライブラリー調製(Library Prep)の場合、アダプターライゲーションの効率が10％〜50％しかないため、試料DNAが失われる。同様に、BS変換段階では、DNAの約90％が、厳しい化学的工程によって破壊される。さらに、捕捉段階では、標的とされるライブラリー断片のすべてがプローブによって捕捉されるわけではない。捕捉後変換ワークフローは、連続した3つの分子選択段階を有し、これらの段階は付加的であり、ワークフローを通るDNAおよび情報の量を大幅に制限する。変換後捕捉ワークフローは、同じ3段階を含むが、すべてが連続するわけではなく、その結果、最初の2つの選択段階(MethylSeqライブラリー調製、BS変換)に続くPCR増幅段階により、存在するライブラリー断片の絶対コピー数が増加し、その結果、3番目の選択段階(捕捉)が試料の複雑性に与える悪影響が少なくなる。この悪影響は、非常に小さな分子集団から試料採取した場合には引き起こされたと思われる。これらの理由から、変換後捕捉アプローチは、ワークフローの最初に必要とする試料DNA投入量がずっと少なく、より多くの情報を最後まで通過させることができる。
【００２２】
図2は、捕捉前のBS変換が、標的複雑性をどのように増大させるかを示す。CpG環境中に3つのメチル化可能なシトシンを有する仮定上の11bp捕捉標的が示されている。パネルAは、この11bp配列に関して、8つのメチル化パターン(状態)が存在し得ることを示している。パネルBは、BS変換および増幅の後に、元のDNAの娘鎖がもはや相補的ではなく、したがって、潜在的な標的配列の数が再び倍増して16になる仕組み(how)を示している。捕捉後変換の概念では、天然DNAを標的とし、その場合、そのDNAのメチル化状態は捕捉に無関係であり、したがって、この座位を標的とするのに、1つのプローブしか必要とされないと思われる。対照的に、変換後捕捉ワークフローでは、16個のプローブが必要であるはずである。
【００２３】
図3は、オリゴヌクレオチドプローブを製造する際に「ゆらぎ」塩基を使用することにより(パネルB)、標的配列の部分的メチル化パターンの全候補に一致するように個別に(independently)製造されなければならないオリゴヌクレオチドの数が減ることを示している。既存のアプローチ(パネルA)では、部分的メチル化パターンに一致するのに必要とされるオリゴヌクレオチド(プローブ)のすべてが、別々に製造される。「ゆらぎ」アプローチでは、CまたはTをランダムに組み込むことにより、必要な複雑性を生じつつ、使用する個々のオリゴヌクレオチド合成反応ははるかに少なくてすむ。
【００２４】
システム
本発明のシステムは、溶相(または溶液中)捕捉プローブプールキットおよび次の内の少なくとも1つを含むことができる:DNA回収または試料採取キット;DNAライブラリー調製/増幅キット;(例えば、その後の測定用にDNAのエピジェネティックな修飾に「タグ付けする」ための化学的および/または酵素的処理のための)DNA変換キット;増幅/配列決定キット;ならびにバイオインフォマティクスの設計および解析ソフトウェア。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「キット(kit)」または「複数のキット(kits)」とは、本明細書において説明するように、DNAを特異的に増幅するか、捕捉するか、タグ付け/変換するか、または検出するための、核酸プローブまたはプローブプールなどの少なくとも1つの試薬を含む、任意の製造物(例えば、パッケージまたは容器)を意味する。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「プローブ」とは、特異的に対象とされる標的生体分子、例えば、プローブによって結合、捕捉、またはハイブリダイズされる関心対象の核酸配列に、選択的に結合することができる任意の分子を意味する。
【００２７】
DNA試料採取キットは、注射器、メス、綿棒、回収用、調製用、および/もしくは安定化用の緩衝液または安定化材料、ならびに試料容器などの構成要素を含んでよい。DNAを回収または試料採取するためのキットは、例えば、Bode Technology(Lorton、VA)、DNA Genotek Inc.(Ontario、Canada)、Isohelix, Inc.(Kent、United Kingdom)、およびNorgen Biotek Corp.(Ontario、Canada)から市販されている。
【００２８】
DNAライブラリー調製および増幅キットは、シーケンシングアダプター;酵素、例えば、リガーゼ、末端修復酵素混合物、またはポリメラーゼ、ヌクレアーゼ;PCRプライマー、緩衝液、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、精製および/または分離用のカラム、ビーズまたはマトリックス、ならびにライブラリー調製/増幅のための内部対照および品質管理アッセイ法などの構成要素を含んでよい。DNA ライブラリーを調製するためのキットは、例えば、EMD Millipore Corp.(Billerica、Mass.)、Illumina(San Diego、Cal.)、Life Technologies(Grand Island、NY)、Lucigen (Middleton、Wisc.)、New England BioLabs Inc.(Ipswich、Mass.)、Qiagen(Germantown、Md.)、およびRoche Molecular Systems(Pleasanton、Cal.)から市販されている。
【００２９】
DNA変換キットは、変換されたDNA試料を得るための試料を含む。本明細書において使用される場合、「変換されたDNA」とは、1つまたは複数の非メチル化シトシン残基が脱アミノされてウラシル残基になったDNA分子を意味する。「変換されたDNA」とは、1つまたは複数の5-hmC残基が酸化されて5-fmC残基になったDNA分子を意味する。例えば、5-hmCは、BS変換の間、その前駆体である5-mCのように挙動することが示されている。したがって、検出された修飾塩基が5-mC残基または5-hmC残基であるかどうかを確認するために、BSシーケンシングデータを再考する必要がある場合がある。これらのキットは、変換剤、溶解緩衝液、スピンカラムまたは他の反応容器、プロテイナーゼK、およびDNA保護緩衝液のような他の試薬などの構成要素を含んでよいが、それらに限定されるわけではない。シトシン残基を変換するためのキットは、例えば、Life Technologies、New England BioLabs Inc.、Qiagen、およびZymo Research(Irvine、Cal.)から市販されている。
【００３０】
DNA変換キットはまた、5-mC残基と5-hmC残基を区別するために、BSによる変換を受けやすい中間形態に5-hmCを変換するための構成要素を含んでもよい。これらのキットは、対照配列(例えば、5-mC対照および5-hmC対照)、プロテイナーゼK、ヌクレオチド、酵素、例えば、MsplおよびHpaII、T4β-グルコシルトランスフェラーゼ、DNAポリメラーゼ、UDP-グルコース、プライマー、緩衝液、ならびに反応容器などの構成要素を含んでよいが、それらに限定されるわけではない。5-hmC 残基を変換するためのキットは、例えば、Cambridge Epigenetix(Cambridge、United Kingdom)、Enzo Life Sciences(Farmingdale、NY)、New England BioLabs Inc.、およびThermo Scientific(Waltham、Mass.)から市販されている。
【００３１】
DNA配列決定キットは、酵素(ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ)、プライマー、希釈用、反応用、および洗浄用の緩衝液、磁性ビーズ、ならびにヌクレオチドなどの構成要素を含んでよい。核酸分子を配列決定するためのキットは、Affymetrix(Santa Clara、Cal.)、Fisher Scientific、Life Technologies、Pacific Biosciences、およびQiagenから市販されている。
【００３２】
これらのシステムは、バイオインフォマティクスの設計および解析ソフトウェアを含んでよい。例えば、米国特許出願公開第2006/0014164号および同第2010/0161607号を参照されたい。設計ソフトウェアは、標的とされる変換されたゲノム中の関心対象の領域に所望の特異性で結合/ハイブリダイズするプローブをコンピューターで(in silico)で設計するのに使用することができ、反復領域を回避し、増幅後の変換された標的配列の配列複雑性に対処する(address)ために「ゆらぎ」塩基を使用するための方法を含んでよい。解析ソフトウェアを用いて、例えば、実験から得られた配列リード出力物(output)からライブラリーアダプター配列をトリムする(trim)こと、配列リードを参照ゲノム中のそれらの位置にアライン/マッピングすること、個々のメチル化可能部位におけるメチル化率を測定すること、システムに含まれる対照に関連するデータを解析すること、および参照配列と比べて試料DNA中の配列変異体を同定することができる。BS変換されたDNAに由来する配列データを解析するためのソフトウェアは、例えば、Novocraft(Selangor、Malaysia)およびCLC bio(Cambridge、Mass)から市販されている。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「メチル化可能なシトシン残基(methylatable cytosine residue)」または「複数のメチル化可能なシトシン残基(methylatable cytosine residues)」とは、CGジヌクレオチドという文脈での、またはCHGおよびCHH(Hはアデニン(A)、シトシン(C)、またはチミン(T)残基である)といったCGではない文脈での、そのような残基を意味する。
【００３４】
前述した内容に鑑みて、例示的なシステムは、DNA試料採取キット、DNAライブラリー調製/増幅キット、DNA変換キット、増幅/配列決定キット、溶相捕捉プローブプールキット、ならびにバイオインフォマティクスの設計および解析ソフトウェアを必要なだけすべて(full complement)含むことが企図される。
【００３５】
陽性対照および陰性対照をこれらのキットに含めて、本発明の概念に従って使用される試薬の活性および正確な用法を検証することができる。対照には、DNAメチル化の存在について陽性または陰性のいずれかであることが公知である試料、例えば、組織または細胞株に由来するDNA調製物またはRNA調製物などが含まれ得る。対照の設計および使用は、標準的であり、当業者のごく普通の能力で十分に対応できる範囲内である。
【００３６】
キット
上記のように、(別々にまたは前述のシステムの一部分として)本発明を包含するキットは、少なくとも3つのプローブタイプを有する、変換されたDNAを標的とする溶相捕捉のためのプローブプールを含んでよく、これら3つのプローブタイプはそれぞれ、関心対象の核酸配列を対象とし、配列中のCG、CHG、および/またはCHH部位を標的とする(HはA、C、またはT残基である)。
【００３７】
これらのプローブは、当業者によって合成されてもよく、または適切な生物学的調製物に由来してもよい。同様に、これらのプローブは、標識されるように特殊に設計されてもよい。プローブとして使用され得る分子の例には、RNAまたはDNAなどのポリヌクレオチド、ならびにタンパク質、抗体、および有機分子が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３８】
プローブとして使用するためのポリヌクレオチドを合成する方法は当技術分野において周知であり、例えば、適切な配列のクローニングおよび消化、ならびに直接的な化学合成(例えば、インクジェット付着および電気化学合成)である。ポリヌクレオチドをクローニングする方法は、例えば、Copeland et al. (2001) Nat. Rev. Genet. 2:769-779; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1995); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (Sambrook & Russell eds., Cold Spring Harbor Press 2001);およびPCR Cloning Protocols, 2nd ed. (Chen & Janes eds., Humana Press 2002)において説明されている。ポリヌクレオチドを直接的に化学合成する方法には、Reese (1978) Tetrahedron 34:3143-3179およびNarang et al. (1979) Methods Enzymol. 68:90-98のリン酸トリエステル法;Brown et al. (1979) Methods Enzymol. 68:109-151のリン酸ジエステル法;Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエチルホスホルアミダート法;ならびにFodor et al. (1991) Science 251:767-773;Pease et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026;およびSingh-Gasson et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:974-978;および米国特許第4,485,066号の固体支持体方法が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、Peattie (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1760-1764;ならびにEP特許第1721908号;国際特許出願公開WO 2004/022770およびWO 2005/082923;米国特許出願公開第2009/0062521号および同第2011/0092685号;ならびに米国特許第6,521,427号;同第6,818,395号;同第7,521,178号、および同第7,910,726号も参照されたい。
【００３９】
特に第3のプローブタイプに関して、プローブプールの複雑性および多様性を考慮すれば、プローブプールのためにこれらのプローブを合成する好ましい方法は、フォトリソグラフィー技術による。
【００４０】
2種類のフォトリソグラフィー技術が当技術分野において公知である。一方の技術では、フォトリソグラフィーマスクが、感光性保護基(PLPG)の局所的脱保護をもたらすように、合成表面の特定の領域に光を向けるために使用される。フォトリソグラフィーに基づいて生体高分子(例えばポリヌクレオチド)マイクロアレイを合成するための基盤を与えるPLPGの使用は、当技術分野において周知である。フォトリソグラフィーに基づく生体高分子合成のために一般に使用されるPLPGには、α-メチル-6-ニトロピペロニル-オキシカルボニル(MeNPOC; Pease et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026)、2-(2-ニトロフェニル)-プロポキシカルボニル(NPPOC; Hasan et al. (1997) Tetrahedron 53:4247-4264)、ニトロベラトリルオキシカルボニル(NVOC; Fodor et al. (1991) Science 251:767-773)、および2-ニトロベンジルオキシカルボニル(NBOC; Patchornik et al. (1970) 21:6333-6335)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、米国特許第7,598,019号、同第7,759,513号、および同第8,445,734号も参照されたい。
【００４１】
したがって、「マスクされる」方法は、基板と結合し(engages)、基板と台(mount)の間に反応器空間(reactor space)を提供する台(例えば「マスク」)を使用してポリマーを合成する段階を含む。例えば、米国特許第5,143,854号および同第5,445,934号を参照されたい。
【００４２】
他方の技術はMASであり、MASでは、デジタルマイクロミラーデバイス(DMD)のようなデジタル投射技術により、合成表面の特定の領域に光が向けられて、PLPGの局所的脱保護がもたらされる。例えば、前記のSingh-Gasson et al. (1999)を参照されたい。小型アルミニウムミラーの固体アレイを使用する典型的なDMDは、約78万6千個〜約420万個の個別の光画素のパターンを付けることができる。このようにして、DMDは、従来のマイクロアレイで使用される物理的マスクに取って代わる「仮想的(virtual)マスク」を作り出す。
【００４３】
これらの仮想的マスクは、コンピューターによって制御される個別に位置指定可能なアルミニウムミラーを用いて、所望のパターンの紫外線(UV)光を反射する。DMDは、例えば、DNA合成装置に連結されている反応チャンバー中の顕微鏡スライド上に投射されるUV光のパターンを制御する。UV光は、次のヌクレオチドが結合される正確な位置で、UV不安定性の保護基を選択的に切断する。これらのパターンは、パラレルなコンビナトリアル様式のDNA合成化学と連携し、その結果、最高で約420万個の独特なプローブフィーチャーを単一のマイクロアレイにおいて合成することができる。米国特許第5,096,279号、同第5,535,047号、同第5,583,688号、同第5,600,383号、同第6,375,903号、同第6,493,867号、同第7,037,659号、同第7,183,406号、同第7,785,863号、同第7,846,660号、同第8,008,005号、同第8,026,094号、同第8,030,056号、および同第8,415,101号、ならびに米国特許出願公開第2001/0010843号、同第2004/0110212号、および同第2007/0140906号を参照されたい。また、Hornbeck, "Digital Light Processing and MEMs: Reflecting the Digital Display Needs of the Networked Society," SPIE/EOS European Symposium on Lasers, Optics and Vision for Productivity and Manufacturing I (Besancon, France Jun. 10-14 1996)も参照されたい。
【００４４】
したがって、MASによって、時間がかかり費用がかかる露光マスクを製造する必要がなくなる。本明細書において開示するシステム、キット、および方法は、前述の様々なプローブ合成技術のいずれかを含み、かつ/または使用してよいことを理解すべきである。しかし、第3のプローブプールの複雑性を考慮すれば、マイクロアレイに対するMASが、好ましい技術である。
【００４５】
合成された後に、核酸プローブは、マイクロアレイ表面から切断され/取り外され、キットに組み込まれる。マイクロアレイ表面から核酸プローブを取り外す方法は、当技術分野において周知であり、化学的切断、酵素的切断、DNAオリゴヌクレオチド鋳型からのRNA転写、およびインサイチューPCRが含まれ得る。例えば、Saboulard et al. (2005) Biotechniques 39:363-368を参照されたい。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「マイクロアレイ」とは、固体支持体または半固体支持体の表面のフィーチャーの二次元配置を意味する。単一のマイクロアレイ、または場合によっては複数のマイクロアレイ(例えば、3個、4個、5個、もしくはそれ以上のマイクロアレイ)が、1つの固体支持体上に配置されてよい。マイクロアレイの大きさは、1つの固体支持体上のマイクロアレイの数に依存する。固体支持体1つ当たりのマイクロアレイの数が多いほど、アレイは、固体支持体上に収まるために、より小型でなければならない。任意の形状のマイクロアレイを設計することができるが、好ましくは、正方形または長方形である。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「フィーチャー」とは、ペプチド、核酸、および炭水化物などの生体分子がそれに結合されている、マイクロアレイの表面の画定された領域を意味する。1つのフィーチャーは、他のフィーチャーと比べた場合に、異なる配列または向きなどの異なる特性を有する生体分子を含んでよい。フィーチャーの大きさは、次の2つの因子によって決定される:(1)アレイ上のフィーチャーの数(アレイ上のフィーチャーの数が多いほど、一つ一つのフィーチャーは小さい);および(2)1つのフィーチャーを照射するために使用される個別に位置指定可能なアルミニウムミラー要素の数。1つのフィーチャーを照射するために使用されるミラー要素の数が多いほど、一つ一つのフィーチャーは大きい。マイクロアレイ上のフィーチャーの数は、DMD中に存在するミラー要素の数(画素)によって制限される。現在、Texas Instruments, Inc.社のDMDは、420万個のミラー要素(画素)を含む。したがって、現在、1つの単一のマイクロアレイ内のフィーチャーの数は、この数によって制限されている。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「固体支持体」または「半固体支持体」とは、有機分子が、結合形成によって結合され得るか、または共有結合もしくは特定の官能基を介した複合体形成などの電子相互作用もしくは静的相互作用によって吸着され得る表面領域を有する、任意の固体材料を意味する。支持体は、ガラス上のプラスチックおよびガラス上のカーボンなど、材料の組合せであることができ、3つのプローブタイプのマイクロアレイを構築するための表面として使用され得る。機能的表面は、単純な有機分子であってよいが、コポリマー、デンドリマー、および分子ブラシなどを含んでもよい。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「プラスチック」とは、有機分子が、共有結合形成によって結合され得るように、または電子相互作用もしくは静的相互作用によって、例えば、官能基を介した結合形成によって吸着され得るように機能付与された表面を有する、有機構成単位(モノマー)のホモコポリマーまたはヘテロコポリマーなどの合成材料を意味する。好ましくは、「プラスチック」は、オレフィンの重合によって誘導されるポリマー(例えば、エチレンプロピレンジエンモノマーポリマー、ポリイソブチレン)である、ポリオレフィンを意味する。より好ましくは、プラスチックは、Topas(登録商標)(Topas Advanced Polymers, Inc.; Florence, Ky.)またはZeonor/Ex(登録商標)(Zeon Chemicals L.P.; Louisville, Ky.)のような、光学的特性が明確にされているポリオレフィンである。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「官能基」は、化学分子の一部分を形成し、特徴的な反応をそれら自体が経験し、かつ分子の残りの部分の反応性に影響する、原子の多数の組合せのいずれかを意味する。典型的な官能基には、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、カルボニル、アミノ、アジド、アルキニル、チオールおよびニトリルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。潜在的に反応性である官能基には、例えば、アミン、カルボン酸、アルコール、および二重結合などが含まれる。
【００５１】
したがって、第1のタイプのプローブは、すべてのシトシン残基がメチル化されておらず、したがって、変換する間にウラシル残基に変換される関心対象の核酸配列の一方の鎖または他方の鎖に結合できるプローブである。プローブの長さの範囲は、約50bp〜約150bpの長さであることができ、約10％〜約90％のG+Cの範囲で、任意のヌクレオチド組成を有することができる。
【００５２】
第2のタイプは、すべてのシトシン残基がメチル化されてり、したがって、ウラシル残基に変換されない関心対象の核酸配列の一方の鎖または他方の鎖に結合できるプローブである。プローブの長さの範囲は、約50bp〜約150bpの長さであることができ、約10％〜約90％のG+Cの範囲で、任意のヌクレオチド組成を有することができる。
【００５３】
第3のタイプは、一部のシトシン残基はメチル化されておらずしたがってウラシル残基に変換され他のシトシン残基はメチル化されておりしたがってウラシル残基に変換されない関心対象の核酸配列の一方の鎖または他方の鎖に結合できるプローブである(すなわち、「ゆらぎ」プローブ)。本明細書において使用される場合、「ゆらぎプローブ(wobble probe)」または「複数のゆらぎプローブ(wobble probes)」とは、CG、CHG、およびCHHのメチル化可能な各部位に相補的な残基が、各プローブ分子について変動的にシトシン残基またはチミン残基から構成されるようなプローブを意味する。これらのプローブの製造は、CまたはTのいずれかがランダムに組み込まれるように、プローブのその位置が合成される際にCヌクレオチドおよびTヌクレオチドの混合物(例えばホスホラミダイト)を導入することによって達成することができる。したがって、ゆらぎプローブは、部分的にメチル化された標的の全候補に相補的なプローブ候補すべてを別々に合成する必要なく、部分的にメチル化されているDNA断片を補足するのに役立つ。プローブの長さの範囲は、約50bp〜約150bpの長さであることができ、約10％〜約90％のG+Cの範囲で、任意のヌクレオチド組成を有することができる。
【００５４】
典型的には、3つのプローブタイプによって標的とされる関心対象の核酸配列は、任意の大きさ、例えば、約100塩基対(bp)〜約250メガ塩基対(Mbp)の範囲であることができる。
【００５５】
捕捉プローブキットの他の構成要素には、ハイブリダイゼーション緩衝液、ブロッキング試薬(例えば、cot1 DNA、ヒトまたは他の生物に由来する全ゲノムDNA、捕捉対照DNA断片またはクローン、アダプターブロッキングオリゴヌクレオチド)、PCRプライマー、酵素および緩衝液、DNA精製カラムまたはビーズ、およびストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズが含まれる。他のタイプのプローブもまた、キットに含まれてよいことが、企図される。他のプローブの例には、対照プローブが含まれるが、それらに限定されるわけではない。陽性対照および/または陰性対照をこれらのキットに含めて、本発明の概念に従って使用される試薬の活性および正確な用法を検証することができる。対照には、1つまたは複数の形態のDNAメチル化の存在について陽性または陰性のいずれかであることが公知である試料、例えば、真核性または原核性いずれかの、組織または細胞株に由来するDNA調製物またはRNA調製物などが含まれ得る。対照の設計および使用は、標準的であり、当業者のごく普通の能力で十分に対応できる範囲内である。
【００５６】
方法
前述のシステムおよびキットを考慮すると、本発明の概念を包含するインビトロの方法は、DNAメチル化の状態を評価する段階(すなわち、DNAを捕捉し、配列決定し、解析する段階)を含む。通常、これらの方法は、動物または植物などの対象からDNA試料を採取または獲得することによって始まる。しかし、場合によっては、DNA試料は、培養細胞またはさらに原核生物もしくはウイルスなどの供給源から得てもよい。他の場合には、DNA試料は、合成核酸分子であってよい。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「試料」とは、ゲノムDNAを抽出または単離できる細胞、組織、器官、または体液の任意の採取物を意味する。同様に、試料は、それからDNAを得ることができる実験室調製物も意味し得る。このような試料の例には、細胞、組織、または器官の標本、体液、および塗抹標本が含まれる。これらの試料は、ある部分をかき取ることもしくは拭き取ること、細胞もしくは体液を吸引するための針を用いること、または組織試料を取り出すことを含む、様々な技術によって、採取または獲得することができる。試料が体液である場合、ゲノムDNAをそれから単離することができる血液、リンパ液、尿、唾液、吸引液、もしくは他の任意の身体分泌物もしくはその派生物が含まれ得る。様々な身体試料または生検標本を採取するための方法は当技術分野において周知であり、詳細に説明する必要はない。
【００５８】
試料のタイプによって、ゲノムDNAを細胞構成要素から抽出または単離する必要がある場合がある。DNAのようなポリヌクレオチドを単離する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Press 2001);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1995)を参照されたい。 
【００５９】
単離されたDNA試料を得た後に、方法は、メチル化(または非メチル化)アダプターおよびウラシルに寛容なポリメラーゼを用いて、DNA試料からDNAライブラリーを調製する段階を含んでよい。メチル化パターンを配列決定するためのDNAライブラリーを調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Carless (2009) Methods Mol. Biol. 523:217-234; Feng et al. (2011) Methods Mol. Biol. 733:223-238;およびZhang et al. (2009) Methods Mol Biol. 507:177-187を参照されたい。典型的には、DNAライブラリーを調製する方法は、次の段階に分けることができる:(1)DNA試料を断片化する段階;(2)必要な場合には、断片化したDNA試料を平滑末端化する段階;(3)メチル化オリゴヌクレオチドアダプターまたは非メチル化オリゴヌクレオチドアダプターを関心対象の核酸配列にライゲーションする段階;(4)アダプターがライゲーションされた関心対象の核酸配列を精製する段階;および(5)例えば、ウラシルに寛容なポリメラーゼを用いて、精製された、アダプターがライゲーションされた関心対象の核酸配列を、増幅する段階。メチル化アダプターは後続の変換の影響を受けないため、好ましくは、メチル化アダプターが使用される。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「ウラシルに寛容なポリメラーゼ」とは、増幅(例えばPCR)の間、dUTPを含む核酸鋳型を寛容に扱うことができる(すなわち、増幅バイアスが減少しているか、または先読み機能が改善されている)酵素を意味する。ウラシルに寛容なポリメラーゼは、例えば、Cambridge Epigenetix(Cambridge, UK)、Enzymatics Inc. (Beverly、Mass.)、およびKapa Biosystems(Woburn、Mass.)から市販されている。
【００６１】
3つのプローブタイプの標的となる関心対象の核酸配列は、ヒトゲノムに由来してよく、あるいはその部分的もしくは全部のゲノムDNAまたは部分的もしくは全部の転写配列が、入手可能であるか、または関連する生物から推測することができる、他の任意の生物に由来してもよい。同様に、3つのプローブタイプの標的となる関心対象の核酸配列は、1つまたは複数の遺伝子のコード領域または調節領域を含んでよく、通常、ヒトまたは他の脊椎動物では、特に、不可欠な経路に関与している遺伝子の中または近くの複数のCpG部位を含むと考えられる。
【００６２】
本発明の方法において、約0.5μg〜約1.0μgのDNAが、出発原料として使用され得る。例えば、BS変換または捕捉プロセスそれ自体の有効性をモニターするのに使用される対照核酸を、この時点に加えることができる。既に断片化されていない場合、機械的剪断法(例えば超音波処理)を用いて、試料中のDNAを約180bp〜約220bpの平均サイズまで断片化することができる。ポリメラーゼおよび他の酵素の混合物(例えば、DNAポリメラーゼおよびクレノウ断片)を用いて、断片の末端を修復して、平滑末端にした5'-リン酸化断片を作製することができる。dsDNAライブラリー断片の3'末端にdAMPを付加して(すなわち、「末端へのA付加(A-tailing)」)、メチル化ライブラリーアダプターのその後のライゲーションを容易にすることができる。次いで、3'-dTMPオーバーハングを有するメチル化dsDNAライブラリーアダプターを、末端にA付加したライブラリー断片にライゲーションすることができる。
【００６３】
DNA ライブラリーを調製した後、方法は、変換剤を用いた変換によって、アダプターがライゲーションされた関心対象の核酸配列中の非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換する段階を含んでよい。非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831; Hayatsu et al. (1970) J. Am. Chem. Soc. 92:724-726; Hayatsu et al. (1970) Biochem. 9:2858-2865; Shapiro et al. (1970) J. Am. Chem. Soc. 92:422-424;およびShiraishi & Hayatsu (2004) DNA Res. 11:409-415を参照されたい。また、Boyd & Zon (2004) Anal. Biochem. 326:278-280; Callinan & Feinberg (2006) Hum. Mol. Genet. 15:R95-R101; El-Maarri (2003) Adv. Exp. Med. Biol. 544:197-204; Fraga & Esteller (2002) BioTechniques 33:632, 634, 636-649; Grunau et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:E65; Ivanov et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41:e72; Laird (2003) Nat. Rev. Cancer 3:253-266; Hayatsu et al. (2004) Acids Symp. Ser. (Oxf) 261-262; Mill et al. (2006) Biotechniques 41:603-607;およびShiraishi & Hayatsu (2004) DNA Res. 11:409-415も参照されたい。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「変換剤」とは、シトシン残基を脱アミノしてウラシル残基にする作用物質を意味する。したがって、変換剤は、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、5-mC残基は変換しない。変換剤の例には、アポリポタンパク質B編集複合体触媒サブユニット1(APOBEC1)、バイサルファイト、シトシンデアミナーゼ、および亜硝酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６５】
場合によっては、例えば、5-mC残基と5-hmC残基を区別する場合、付加的な変換剤を使用してよい。典型的には、5-hmC残基を変換する方法は、次の段階に分けることができる:(1)変性させる段階、(2)変換する段階、および(3)変換された核酸配列を洗浄/精製する段階。5-hmCを5-fmCに変換するための変換キットは、市販されており、TrueMethyl(商標)キット(Cambridge Epigenetix)、BioArray(商標)5-hmCメチル化キット(Enzo Life Sciences)、EpiMark(登録商標)5-hmCおよび5-mC解析キット(New England BioLabs)、EpiJET 5-hmC解析キット(Thermo Scientific)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６６】
非メチル化シトシン残基(および/または5-hmC残基)をウラシル残基に変換した後、変換されたDNAライブラリーは、ウラシルに寛容なポリメラーゼを用いるライゲーションを介したPCR(LM-PCR)によって増幅することができる。
【００６７】
増幅後、方法は、本明細書において説明するように、溶相捕捉プローブプールキットを用いて、増幅され変換されたDNAライブラリーから関心対象の1つまたは複数の核酸配列/断片を溶液中で捕捉する段階を含んでよい。典型的には、変換された核酸配列を捕捉する方法は、次の段階に分けることができる:(1)変性させる段階、(2)捕捉する段階、および(3)精製/分離する段階。溶液中で捕捉する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許出願公開第2009/0105081号および同第2009/0246788号において説明されている。
【００６８】
次いで、変換され捕捉された核酸配列/断片を増幅することができる。核酸配列を増幅する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Saiki et al. (1988) Science 239: 487-491; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1995); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (Sambrook & Russell eds., Cold Spring Harbor Press 2001);およびPCR Cloning Protocols, 2nd ed. (Chen & Janes eds., Humana Press 2002)を参照されたい。
【００６９】
次いで、増幅され捕捉された核酸配列/断片を、当業者に公知である任意の方法によって配列決定して、関心対象の領域のDNAメチル化パターンを研究することができる。配列決定した後、捕捉された断片を解析してDNAメチル化の状態に関する情報を得ることができ、かつ捕捉された核酸断片の配列およびメチル化状態を参照ゲノムの配列およびメチル化状態と比較する段階をさらに含んでもよい。上記のように、バイオインフォマティクス解析ソフトウェアは、当技術分野において周知である。
【実施例】
【００７０】
実施例1
変換後捕捉概念の技術的性能の評価(benchmarking)
約0.5μg〜約1.0μgのDNAが、出発原料として使用され得る。例えば、BS変換または捕捉プロセスそれ自体の有効性をモニターするのに使用される対照核酸を、この時点に加えることができる。機械的剪断法(例えば超音波処理)を用いて、DNA試料を約180bp〜約220bpの平均サイズまで断片化することができる。ポリメラーゼおよび他の酵素の混合物(例えば、DNAポリメラーゼおよびクレノウ断片)を用いて、断片の末端を修復して、平滑末端にした5'-リン酸化断片を作製することができる。dsDNAライブラリー断片の3'末端にdAMPを付加して(すなわち、「末端へのA付加」)、メチル化ライブラリーアダプターのその後のライゲーションを容易にすることができる。次いで、ライゲーション緩衝液、末端にA付加したDNA、DNAリガーゼ(通常、1ユニット)、および3'-dTMPオーバーハングを有するメチル化dsDNAライブラリーアダプター(通常、最終濃度1〜5μM)を含む反応物中で、3'-dTMPオーバーハングを有するメチル化dsDNAライブラリーアダプターを、末端にA付加したライブラリー断片にライゲーションすることができる。ライゲーション反応物は、約20℃で約20分間、インキュベートしてよい。アダプターが連結した(adapted)ライブラリー断片は、DNA精製カラムまたはビーズを用いて、緩衝液、塩、およびライゲーションされていないアダプターから精製することができる。
【００７１】
DNAライブラリーを調製した後、方法は、変換剤、例えば、アポリポタンパク質B編集複合体触媒サブユニット1(APOBEC1)、BS、シトシンデアミナーゼ、および亜硝酸を用いた変換によって、アダプターがライゲーションされた関心対象の核酸配列中の非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換する段階を含んでよい。場合によっては、例えば、5-mC残基と5-hmC残基を区別する場合、付加的な変換剤を使用してよい。
【００７２】
非メチル化シトシン残基(および/または5-hmC残基)をウラシル残基に変換した後、変換されたDNAライブラリーは、約20ulの変換されたDNAライブラリー、約25ulの2倍(2×)のウラシルに寛容なポリメラーゼのマスターミックス(ポリメラーゼ、dNTP、および緩衝液を含む)、約3ulのLM-PCRプライマー2種の混合物の混合物(ストック濃度5uM:プライマー配列:
2017501730.tif 000004
)、ならびに約2ulの水を含む反応物中で、ウラシルに寛容なポリメラーゼを用いるライゲーションを介したPCR(LM-PCR)によって増幅することができる。
【００７３】
例示的な熱サイクル条件は、以下のとおりであることができる:
・段階1:約95℃で約2分;
・段階2:約98℃で約30秒;
・段階3:約60℃で約30秒;
・段階4:約72℃で約4分;
・段階5:段階2に戻り、11(11)回繰り返す。
・段階6:約72℃で約10分;および
・段階7:約4℃で維持。
【００７４】
増幅後、方法は、本明細書において説明するように、溶相捕捉プローブプールキットを用いて、増幅され変換されたDNAライブラリーから関心対象の1つまたは複数の核酸配列/断片を溶液中で捕捉する段階を含んでよい。次いで、変換され捕捉された核酸配列/断片は、(体積を小さく保つために)2つの同一の反応物中でPCRによって増幅することができ、その際、各反応物は、約20ulの捕捉されたDNAライブラリー、約25ulの2倍(2×)のウラシルに寛容なポリメラーゼのマスターミックス(ポリメラーゼ、dNTP、および緩衝液を含む)、および約5ulのLM-PCRプライマー2種の混合物の混合物(ストック濃度5uM：
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)を含むことができる。
【００７５】
例示的な熱サイクル条件は、以下のとおりであることができる:
・段階1:約98℃で約45秒;
・段階2:約98℃で約15秒;
・段階3:約60℃で約30秒;
・段階4:約72℃で約30秒;
・段階5:段階2に戻り、15(15)回繰り返す。
・段階6:約72℃で約1分;および
・段階7:約4℃で維持。
【００７６】
次いで、増幅され捕捉された核酸配列/断片を、当業者に公知である任意の方法によって配列決定して、関心対象の領域のDNAメチル化パターンを研究することができる。配列決定した後、捕捉された断片を解析して、DNAメチル化の状態に関する情報を得ることができる。
【００７７】
実施例2
一連のヒト細胞株への本発明の方法の適用
実施例1で説明した方法を、いくつかのヒト細胞株から単離したDNAに適用した。ヒトゲノムhg19中の関心対象の領域に対して、3.2Mbpの捕捉設計(capture design)を作成した。関心対象の領域は、細胞株IMR90(正常ヒト肺線維芽細胞)からロードマップ(roadmap)のMethylC Seqによって予測されるメチル化占拠(methylation occupancy)範囲の全域に、500個の遺伝子プロモーターを含んでいた。図4は、捕捉アッセイ法の成績を示す。このアッセイ法により、431個の予測された二価ドメインが捕捉され、遺伝子CDKN2A、H19-IGF2、XIST、およびY染色体上のある領域中に、4つの大きな連続したインプリンティング領域が同定された。
【００７８】
実施例3
3種のヒト細胞株におけるメチル化パターンの比較
図5は、3種のヒト細胞株IMR90(線維芽細胞)、NA04671(バーキットリンパ腫)、およびNA12762(正常なBリンパ球)中のメチル化配列の同定に関するデータを示す。本質的に、実施例1で説明したようにして、DNA試料およびその混合物を解析した。データは、ほぼ理想的な成績であること(実現可能な最大値である972倍に対して、822倍の濃縮);ゲノムDNAの最小許容投入量(750ug)が少ないこと;重複リード率が低いこと(<10％);わずか2.6Mのリードを用いて、リード深度が10倍を超える標的区域(space)のカバレッジが83％を超えること、を示す。これらの結果から、IMR90に関して公開されているデータ(Lister et al. (2009) Nature 462:315-322)と比べて、カバレッジが2.5倍であることが示される。さらに、この方法により、正常細胞と比べた、癌の場合の高メチル化領域および低メチル化領域が明らかになった(データ不掲載)。図6は、同じ供給源(NA04671)に由来する別々の試料から得られたデータの再現性が高いことを示している。
【００７９】
実施例4
インビトロでメチル化されたDNAへの方法の適用
本実施例では、遺伝子DNMT1およびDNMT3Aを二重ノックアウトした、メチル化欠損ヒト結腸直腸癌細胞株HCT116を使用した。この細胞株から単離されたDNAを、CGメチルトランスフェラーゼと共に0分、15分、および60分間インキュベートして、様々な程度のメチル化を達成した。本質的に、実施例1で説明したようにして、得られたDNA試料およびその混合物(0分インキュベーション＋60分インキュベーションの50/50混合物)を解析した。図7の結果は、CGメチルトランスフェラーゼとの段階的に長くした(increased)インキュベーションの後に、メチル化程度の予想された上昇が認められたことを示している。
【００８０】
具体的な例を参照して本発明を詳細に説明したが、本発明の範囲内で様々な修正を加えてよいことが、当業者には明らかであると考えられる。したがって、本発明の範囲は、本明細書において説明する例ではなく、以下に提示する特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年8月30日(2016.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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