(57)【要約】組織試料の品質を評価するための方法。一部の態様では、ｍＲＮＡおよび／またはリンタンパク質の発現レベルを測定することによって、生物学的試料が冷虚血状態に曝露されていた時間を決定するための方法が、提供される。本発明は、例えば、患者試料の品質を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）該患者試料中の、ＨＳＰ２７タンパク質の発現のレベルおよびＨＳＰ２７タンパク質のＳｅｒ１５のリン酸化のレベルを測定するステップ；および（ｂ）該患者試料中の、ＨＳＰ２７タンパク質リン酸化の百分率に基づいて、該患者試料の該品質を決定するステップ、を含む、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者試料の品質を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）該患者試料中の、ＨＳＰ２７タンパク質の発現のレベルおよびＨＳＰ２７タンパク質のＳｅｒ１５のリン酸化のレベルを測定するステップ；および
（ｂ）該患者試料中の、ＨＳＰ２７タンパク質リン酸化の百分率に基づいて、該患者試料の該品質を決定するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
患者試料の品質を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）該患者試料中の、ＨＳＰ２７、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択される少なくとも２種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを測定するステップ；および
（ｂ）該患者試料中の、該少なくとも２種のタンパク質のリン酸化の百分率に基づいて、該患者試料の該品質を決定するステップ、
を含む、方法。
【請求項３】
前記試料が組織試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が凍結試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、化学的に固定された試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者から試料を取得するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、第三者から取得される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記組織試料が、腫瘍切除試料である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が、結腸直腸癌または肝癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
参照レベルと比較した、前記患者試料中のリン酸化された前記タンパク質の百分率における変化が、前記組織品質を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記参照レベルが、生検試料におけるレベルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生検試料が、前記患者由来である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生検試料および前記患者試料が、同じ組織から取得される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者試料の前記品質を決定するステップが、該試料が冷虚血状態に曝露された期間を推定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者試料中の、リン酸化された少なくとも第２、第３または第４のタンパク質の百分率を決定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２、第３または第４のタンパク質が、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＧＦＲのＴｙｒ１１７３、ＡＫＴのＳｅｒ４７３、ｍＴＯＲのＳｅｒ２４４８、ｐ７０−Ｓ６ＫのＴｈｒ４２１もしくはＳｅｒ４２４、ＧＳＫ３−ベータのＳｅｒ９、ＭＥＫ１／２のＳｅｒ２７１／２２１、またはＥＲＫ１／２のＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４もしくはＴｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７のリン酸化の百分率が決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者試料中の、リン酸化された５、６、７、８、９または１０種のタンパク質の百分率を決定するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料中の、ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＯＸ２およびＳＬＣ６Ａ１４からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍＲＮＡ発現のレベルが、定量的リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによって測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質の前記発現のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法または免疫組織化学検査によって測定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
患者試料の品質を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）該患者試料中の、ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＯＸ２およびＳＬＣ６Ａ１４からなる群から選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現のレベルを測定するステップ；および
（ｂ）該患者試料中の該少なくとも１種のｍＲＮＡの該発現のレベルに基づいて、該患者試料の該品質を決定するステップ、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記患者から試料を取得するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、第三者から取得される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
安定なｍＲＮＡの前記発現のレベルを測定するステップ、および前記少なくとも１種のｍＲＮＡと該安定なｍＲＮＡとの比率を決定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
参照レベルと比較した、前記比率における変化が、組織品質を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記安定なｍＲＮＡがＥＥＦ１Ａ１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者試料中の、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のｍＲＮＡの発現のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者試料中の、リン酸化された少なくとも１種のタンパク質の百分率を決定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種のタンパク質が、ＨＳＰ２７、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者試料中の、リン酸化された少なくとも１種のタンパク質の百分率を決定するステップが、ＨＳＰ２７のＳｅｒ１５、ＥＧＦＲのＴｙｒ１１７３、ＡＫＴのＳｅｒ４７３、ｍＴＯＲのＳｅｒ２４４８、ｐ７０−Ｓ６ＫのＴｈｒ４２１もしくはＳｅｒ４２４、ＧＳＫ３−ベータのＳｅｒ９、ＭＥＫ１／２のＳｅｒ２７１／２２１、および／またはＥＲＫ１／２のＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４もしくはＴｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７におけるリン酸化の百分率を決定するステップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１種のタンパク質がＨＳＰ２７である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が組織試料である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が凍結試料である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が、化学的に固定された試料である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組織試料が、腫瘍切除試料である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍が、結腸直腸癌または肝癌である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記参照レベルが、生検試料におけるレベルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記生検試料が、前記患者由来である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記生検試料および前記患者試料が、同じ組織から取得される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
リン酸化の百分率が、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法または免疫組織化学検査によって決定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｍＲＮＡ発現のレベルが、定量的リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによって測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
患者由来の試料の分析のためのアッセイであって、該患者試料中の、ＨＳＰ２７タンパク質の発現のレベルおよびＨＳＰ２７タンパク質のＳｅｒ１５のリン酸化のレベルを選択的に測定するステップを含む、アッセイ。
【請求項４６】
患者由来の試料の分析のためのアッセイであって、該患者試料中の、ＨＳＰ２７、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択される少なくとも２種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップを含む、アッセイ。
【請求項４７】
前記患者試料が組織試料である、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項４８】
前記患者試料が凍結試料である、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項４９】
前記試料が、化学的に固定された試料である、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項５０】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項４９に記載のアッセイ。
【請求項５１】
前記組織試料が、腫瘍切除試料である、請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５２】
前記腫瘍が、結腸直腸癌または肝癌である、請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５３】
前記患者から試料を取得するステップをさらに含む、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項５４】
前記試料が、第三者から取得される、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項５５】
参照試料中の、ＨＳＰ２７、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択される少なくとも２種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項５６】
前記参照試料が、生検試料である、請求項５５に記載のアッセイ。
【請求項５７】
前記生検試料が、前記患者由来である、請求項５６に記載のアッセイ。
【請求項５８】
前記生検試料および前記患者試料が、同じ組織から取得される、請求項５６に記載のアッセイ。
【請求項５９】
少なくとも第２、第３または第４のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項６０】
前記第２、第３または第４のタンパク質が、ＨＳＰ２７、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択される、請求項５９に記載のアッセイ。
【請求項６１】
リン酸化のレベルを選択的に測定するステップが、ＨＳＰ２７のＳｅｒ１５、ＥＧＦＲのＴｙｒ１１７３、ＡＫＴのＳｅｒ４７３、ｍＴＯＲのＳｅｒ２４４８、ｐ７０−Ｓ６ＫのＴｈｒ４２１もしくはＳｅｒ４２４、ＧＳＫ３−ベータのＳｅｒ９、ＭＥＫ１／２のＳｅｒ２７１／２２１、および／またはＥＲＫ１／２のＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４もしくはＴｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７におけるリン酸化のレベルを測定するステップを含む、請求項５９に記載のアッセイ。
【請求項６２】
前記患者試料中の、３、４、５、６、７、８、９または１０種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項６０に記載のアッセイ。
【請求項６３】
ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＯＸ２およびＳＬＣ６Ａ１４からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項６４】
前記ｍＲＮＡ発現のレベルが、定量的リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによって測定される、請求項６３に記載のアッセイ。
【請求項６５】
前記タンパク質発現のレベルが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法または免疫組織化学検査によって測定される、請求項４５または４６に記載のアッセイ。
【請求項６６】
患者由来の試料の分析のためのアッセイであって、該患者試料中の、ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＯＸ２およびＳＬＣ６Ａ１４からなる群から選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現のレベルを選択的に測定するステップを含む、アッセイ。
【請求項６７】
前記患者から試料を取得するステップをさらに含む、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項６８】
前記試料が、第三者から取得される、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項６９】
前記試料中の、安定なｍＲＮＡの発現のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項７０】
前記安定なｍＲＮＡがＥＥＦ１Ａ１である、請求項６９に記載のアッセイ。
【請求項７１】
前記患者試料中の、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のｍＲＮＡの発現のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項７２】
前記患者試料中の、少なくとも第１のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項７３】
前記第１のタンパク質が、ＨＳＰ２７、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択される、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項７４】
前記第１のタンパク質がＨＳＰ２７である、請求項７３に記載のアッセイ。
【請求項７５】
少なくとも第１のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを測定するステップが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法または免疫組織化学検査による、請求項７２に記載のアッセイ。
【請求項７６】
前記試料が組織試料である、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項７７】
前記試料が凍結試料である、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項７８】
前記試料が、化学的に固定された試料である、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項７９】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項７８に記載のアッセイ。
【請求項８０】
前記組織試料が、腫瘍切除試料である、請求項７６に記載のアッセイ。
【請求項８１】
前記腫瘍が、結腸直腸癌または肝癌である、請求項８０に記載のアッセイ。
【請求項８２】
参照試料中の、ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＯＸ２およびＳＬＣ６Ａ１４からなる群から選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現のレベルを選択的に測定するステップをさらに含む、請求項６６に記載のアッセイ。
【請求項８３】
前記参照試料が、生検試料である、請求項８２に記載のアッセイ。
【請求項８４】
前記生検試料が、前記患者由来である、請求項８３に記載のアッセイ。
【請求項８５】
前記生検試料および前記患者試料が、同じ組織から取得される、請求項８３に記載のアッセイ。
【請求項８６】
少なくとも１種のｍＲＮＡの発現のレベルを測定するステップが、定量的リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによる、請求項６６に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／０３１，２４７号への優先権の利益を主張し、その全ての内容が、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された、助成金番号ＨＨＳＮ２６１２００８０００００１Ｅのもとの政府支援で行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般に、医学、病理学ならびに細胞生物学および分子生物学の分野に関する。より特には、本発明は、臨床診断学、薬物開発、および予測的バイオマーカーの同定のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍学における個別化医療（個体の疾患リスク、予後および治療選択肢を決定する）の開発は、ヒトがん生体標本中の分子バイオマーカーのハイスループット分析によって促進される（ZatloukalおよびHainaut、２０１０年）。かかる標本の不十分な品質は、偽の結果およびデータ誤解釈をもたらし得る（VaughtおよびLockhart、２０１２年）。生体標本品質は、それが獲得された分析前条件に依存する（Juhl、２０１０年）。決定的に重要なことは、血液供給の低減と組織の取り出しとの間の時間間隔（温虚血時間）、および組織の取り出しとその分子組成の保存との間の時間間隔（冷虚血時間）である（Huangら、２００１年；Spruesselら、２００４年；Espinaら、２００８年；Hatzisら、２０１１年；Gundischら、２０１２年）。さらに、患者（細胞）は、薬物に曝露されるか、および／または発現プロファイルおよび経路活性に影響し得る方法で操作されることから、不正確な分析データを生じる。しかし、分析前因子の影響を分析する体系的な研究は存在しない。手術の間および手術後の処理技術に関連する組織データ可変性の理解は、臨床診断学、薬物開発、および予測的バイオマーカーの同定のために手術標本を試験する場合に望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ZatloukalおよびHainaut、２０１０年
【非特許文献２】VaughtおよびLockhart、２０１２年
【非特許文献３】Juhl、２０１０年
【非特許文献４】Huangら、２００１年
【非特許文献５】Spruesselら、２００４年
【非特許文献６】Espinaら、２００８年
【非特許文献７】Hatzisら、２０１１年
【非特許文献８】Gundischら、２０１２年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、患者試料の品質を決定する方法であって、（ａ）患者試料中の、ＨＳＰ２７タンパク質リン酸化のレベルを測定する（または選択的に測定する）ステップ；および（ｂ）患者試料中のＨＳＰ２７タンパク質リン酸化に基づいて、患者試料の品質を決定するステップ、を含む方法が本明細書で提供される。例えば、一部の態様では、方法は、（ａ）患者試料中のＨＳＰ２７タンパク質の発現のレベルおよびＨＳＰ２７タンパク質のリン酸化（例えば、Ｓｅｒ１５におけるリン酸化）のレベルを測定するステップ；および（ｂ）患者試料中のＨＳＰ２７タンパク質リン酸化の百分率に基づいて、患者試料の品質を決定するステップ、を含む。
【０００７】
さらなる一実施形態では、患者試料の品質を決定する方法であって、（ａ）患者試料中の、ＨＳＰ２７、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４または５種のタンパク質のリン酸化のレベルを測定する（または選択的に測定する）ステップ；および（ｂ）患者試料中の、前記タンパク質のリン酸化に基づいて、患者試料の品質を決定するステップ、を含む方法が提供される。例えば、方法は、（ａ）患者試料中の、ＨＳＰ２７（例えば、Ｓｅｒ１５におけるリン酸化）、ＥＧＦＲ（例えば、Ｔｙｒ１１７３におけるリン酸化）、ＡＫＴ（例えば、Ｓｅｒ４７３におけるリン酸化）、ｍＴＯＲ（例えば、Ｓｅｒ２４４８におけるリン酸化）、ｐ７０−Ｓ６Ｋ（例えば、Ｔｈｒ４２１および／またはＳｅｒ４２４におけるリン酸化）、ＧＳＫ３−ベータ（例えば、Ｓｅｒ９におけるリン酸化）、ＭＥＫ１／２（例えば、Ｓｅｒ２７１および／またはＳｅｒ２２１におけるリン酸化）およびＥＲＫ１／２（例えば、Ｔｈｒ２０２、Ｔｙｒ２０４、Ｔｈｒ１８５および／またはＴｙｒ１８７におけるリン酸化）からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４または５種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを測定するステップ；および（ｂ）患者試料中の、前記タンパク質のリン酸化の百分率に基づいて、患者試料の品質を決定するステップ、を含み得る。種々の態様では、患者試料の品質を決定するステップは、この試料が冷虚血状態に曝露された期間を推定するステップをさらに含み得る。
【０００８】
一部の態様では、この方法は、試料中の、少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを測定するステップをさらに含み得る。例えば、方法は、ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＯＸ２およびＳＬＣ６Ａ１４からなる群から選択される遺伝子からのｍＲＮＡ発現のレベルを測定するステップを含み得る。したがって、一部の態様では、患者試料の品質を決定するステップは、患者試料中の、１種または複数のタンパク質のリン酸化の百分率および１種または複数のｍＲＮＡの発現レベルに基づく。
【０００９】
一部の態様では、参照レベルと比較した、患者試料中のリン酸化タンパク質の百分率における変化は、組織品質を示し得る。ある特定の態様では、この参照レベルは、正常な非疾患組織中、または既知の疾患状態を有する組織由来の試料中の、リン酸化のレベルであり得る。一部の場合には、参照レベルは、カタログまたは表由来である。さらなる態様では、参照レベルは、参照組織から決定され得る。一部の態様では、この参照組織および試料組織は、同じ患者から取得される（例えば、腫瘍生検試料および隣接正常組織試料など）。
【００１０】
種々の態様では、この方法は、患者試料中の、リン酸化された少なくとも第２、第３または第４のタンパク質の百分率を決定するステップをさらに含み得る。ある特定の態様では、この第２、第３または第４のタンパク質は、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータ、ＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２からなる群から選択され得る。ある特定の態様では、ＥＧＦＲのＴｙｒ１１７３、ＡＫＴのＳｅｒ４７３、ｍＴＯＲのＳｅｒ２４４８、ｐ７０−Ｓ６ＫのＴｈｒ４２１もしくはＳｅｒ４２４、ＧＳＫ３−ベータのＳｅｒ９、ＭＥＫ１／２のＳｅｒ２７１／２２１、またはＥＲＫ１／２のＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４もしくはＴｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７のリン酸化の百分率が、決定され得る。種々の態様では、この方法は、患者試料中の、リン酸化された５、６、７、８、９または１０種のタンパク質の百分率を決定するステップをさらに含み得る。
【００１１】
本発明のさらなる一実施形態では、患者試料の品質を決定するための方法であって、（ａ）患者試料中の、ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＯＸ２およびＳＬＣ６Ａ１４からなる群から選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現のレベルを測定する（または選択的に測定する）ステップ；および（ｂ）患者試料中のこの少なくとも１種のｍＲＮＡの発現のレベルに基づいて、患者試料の品質を決定するステップ、を含む方法が提供される。ある特定の態様では、この方法は、安定なｍＲＮＡの発現のレベルを測定するステップ、およびこの少なくとも１種のｍＲＮＡと安定なｍＲＮＡとの比率を決定するステップ、をさらに含み得る。一部の態様では、参照レベルと比較した、この比率における変化は、組織品質を示し得る。一部の態様では、この安定なｍＲＮＡはＥＥＦ１Ａ１であり得る。種々の態様では、この方法は、患者試料中の、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のｍＲＮＡの発現のレベルを測定するステップをさらに含み得る。
【００１２】
さらなる態様では、これらの実施形態の方法は、患者試料中の、少なくとも１種のタンパク質のリン酸化のレベル（または百分率）を決定するステップをさらに含み得る。例えば、少なくとも１種のタンパク質は、ＨＳＰ２７（例えば、Ｓｅｒ１５におけるリン酸化）、ＥＧＦＲ（例えば、Ｔｙｒ１１７３におけるリン酸化）、ＡＫＴ（例えば、Ｓｅｒ４７３におけるリン酸化）、ｍＴＯＲ（例えば、Ｓｅｒ２４４８におけるリン酸化）、ｐ７０−Ｓ６Ｋ（例えば、Ｔｈｒ４２１および／またはＳｅｒ４２４におけるリン酸化）、ＧＳＫ３−ベータ（例えば、Ｓｅｒ９におけるリン酸化）、ＭＥＫ１／２（例えば、Ｓｅｒ２７１および／またはＳｅｒ２２１におけるリン酸化）およびＥＲＫ１／２（例えば、Ｔｈｒ２０２、Ｔｙｒ２０４、Ｔｈｒ１８５および／またはＴｙｒ１８７におけるリン酸化）からなる群から選択され得る。ある特定の態様では、ＨＳＰ２７リン酸化のレベルが、少なくとも１種のｍＲＮＡの発現レベルに加えて測定される。さらなる態様では、このアッセイは、患者試料中の、５、６、７、８、９または１０種のタンパク質の発現のレベルおよびリン酸化のレベルを選択的に測定するステップをさらに含み得る。したがって、一部の態様では、患者試料の品質を決定するステップは、患者試料中の、１種または複数のタンパク質のリン酸化の百分率および１種または複数のｍＲＮＡの発現レベルに基づく。
【００１３】
一部の態様では、この試料は、組織試料、例えば、固形組織試料（例えば、生検試料）であり得る。これらの実施形態に従う使用のための試料は、新鮮な（凍結されていないまたは固定されていない）試料、凍結試料、または化学的に固定された試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料などであり得る。ある特定の態様では、この組織試料は、固形臓器由来の組織の切片であり得る。一部の態様では、この組織試料は、結腸、乳房、腎臓、肝臓、卵巣、腸、胃、脳、リンパ節、副腎、甲状腺、肺、食道、直腸、皮膚、前立腺、頸部（cervical）または膵臓組織試料である。さらなる態様では、この組織試料は、腫瘍切除試料、例えば、結腸直腸癌または肝癌の試料などであり得る。
【００１４】
一部の態様では、この方法は、（例えば、患者を直接試料採取することによって）患者から試料を取得するステップをさらに含み得る。他の態様では、試料は、第三者、例えば、病院または医療従事者から取得される。
【００１５】
さらなる態様では、方法は、これらの実施形態に従って分析された組織試料の品質を報告するステップ（例えば、組織試料が冷虚血状態に曝露された時間を推定する報告を作成するステップ）を含む。報告するステップは、口頭、書面または電子的報告を作成するステップを含み得る。一部の態様では、かかる報告は、患者、医師、病院または保険会社に提供される。
【００１６】
これらの実施形態の種々の態様は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現またはタンパク質リン酸化を測定することに関する。広範な技術が、当業者に公知であり、かかる測定において使用され得る。ある特定の態様では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、定量的リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションによって測定され得る。一部の態様では、タンパク質の発現またはリン酸化のレベルは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、質量分析、キャピラリー免疫検出方法、等電点電気泳動、免疫沈降法または免疫組織化学検査によって測定され得る。
【００１７】
本明細書で使用する場合、語句「選択的に測定する」とは、試料中の本質的に全てのタンパク質または核酸をアッセイするのではなく、有限の数のタンパク質（例えば、リンタンパク質）または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）マーカーのみが測定される方法を指す。例えば、一部の態様では、核酸またはタンパク質マーカーを「選択的に測定する」とは、１００、７５、５０、２５、１５、１０または５以下の異なる核酸またはタンパク質（例えば、リンタンパク質）マーカーを測定することを指し得る。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味し得る。本明細書における請求項（複数可）で使用されているように、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、単語「含む（comprising）」と併せて使用される場合、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。
【００１９】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すかまたは代替物が相互排他的であることを明示的に示さない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみと「および／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用する場合、「別の」とは、少なくとも第２のまたはそれ超を意味し得る。
【００２０】
本出願を通じて、用語「約」は、値が、値を決定するために使用されているデバイス、方法ごとの固有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになる。しかし、本発明の精神および範囲内の種々の変化および改変が、この詳細な記載から当業者に明らかになるので、詳細な記載および具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、例示のみとして与えられていることを、理解すべきである。
【００２２】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な記載と組み合わせて、これらの図面のうちの１または複数を参照して、より良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、患者登録および組織収集のフローチャートを示す図である。患者は、（Ａ）原発性結腸直腸がんおよび（Ｂ）転移した結腸直腸がんを有した。転移したがんを有する一部の患者は、肝茎（Ｈ．ｐ．）クランプ（hepatic  pedicle  clamping）を有した。組織保存方法は以下であった：液体窒素中凍結（ＦＦ）またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、患者登録および組織収集のフローチャートを示す図である。患者は、（Ａ）原発性結腸直腸がんおよび（Ｂ）転移した結腸直腸がんを有した。転移したがんを有する一部の患者は、肝茎（Ｈ．ｐ．）クランプ（hepatic  pedicle  clamping）を有した。組織保存方法は以下であった：液体窒素中凍結（ＦＦ）またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）。
【００２４】
【図２】図２は、患者、組織型、手術および組織処理時間の間での、遺伝子発現変化の可変性を示す図である。この図は、その発現が、組織供給源ならびに茎クランプおよび手術後処理のタイミングに従って、２倍よりも大きく変化した遺伝子の数を示す：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前（結腸）／肝茎クランプ前（肝臓）；ｐｏｓｔ、クランプ後、１０’、切除の１０分後、２０’、切除の２０分後、および４５’、切除の４５分後。棒は、遺伝子発現変化の平均数を示す。
【００２５】
【図３Ａ】図３Ａは、結腸手術を受けている患者の、異なる時点にわたる正常組織（左）および原発性腫瘍（右）におけるクラスタリングを示す階層的クラスタリングを示す図である。図３Ｂは、肝臓手術を受けている患者の、異なる時点にわたる正常組織（左）および転移性腫瘍（右）におけるクラスタリングを示す階層的クラスタリングを示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａは、結腸手術を受けている患者の、異なる時点にわたる正常組織（左）および原発性腫瘍（右）におけるクラスタリングを示す階層的クラスタリングを示す図である。図３Ｂは、肝臓手術を受けている患者の、異なる時点にわたる正常組織（左）および転移性腫瘍（右）におけるクラスタリングを示す階層的クラスタリングを示す図である。
【００２６】
【図４】図４Ａは、結腸組織におけるタンパク質発現を示す図である。この図は、正常結腸および結腸直腸がん組織において測定された、選択されたタンパク質の総タンパク質発現における、２倍よりも大きい変化を示す。タンパク質発現変化を比較した：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前  切除の１０分後；および４５’、切除の４５分後。図４Ｂは、肝臓組織におけるタンパク質発現を示す図である。この図は、正常肝および転移性組織において測定された、選択されたタンパク質の総タンパク質発現における、２倍よりも大きい変化を示す。タンパク質発現変化を比較した：ｐｒｅ、肝茎クランプ前；ｐｏｓｔ、クランプ後；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。
【００２７】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、組織収集の４つの時点における、正常および腫瘍結腸組織におけるｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＡＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｍＴＯＲおよびＧＳＫ３βの総タンパク質発現（相対単位）を示す図である：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。箱髭図は、５％／９５％信頼区間、中央値および標準偏差を示す。図５Ｃ〜５Ｄは、組織収集の４つの時点における、正常および腫瘍結腸組織におけるｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＡＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｍＴＯＲおよびＧＳＫ３βのタンパク質リン酸化の百分率を示す図である：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。箱髭図は、５％／９５％信頼区間、中央値および標準偏差を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、組織収集の４つの時点における、正常および腫瘍結腸組織におけるｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＡＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｍＴＯＲおよびＧＳＫ３βの総タンパク質発現（相対単位）を示す図である：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。箱髭図は、５％／９５％信頼区間、中央値および標準偏差を示す。図５Ｃ〜５Ｄは、組織収集の４つの時点における、正常および腫瘍結腸組織におけるｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＡＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｍＴＯＲおよびＧＳＫ３βのタンパク質リン酸化の百分率を示す図である：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。箱髭図は、５％／９５％信頼区間、中央値および標準偏差を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｂは、組織収集の４つの時点における、正常および腫瘍結腸組織におけるｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＡＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｍＴＯＲおよびＧＳＫ３βの総タンパク質発現（相対単位）を示す図である：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。箱髭図は、５％／９５％信頼区間、中央値および標準偏差を示す。図５Ｃ〜５Ｄは、組織収集の４つの時点における、正常および腫瘍結腸組織におけるｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＡＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｍＴＯＲおよびＧＳＫ３βのタンパク質リン酸化の百分率を示す図である：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。箱髭図は、５％／９５％信頼区間、中央値および標準偏差を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｂは、組織収集の４つの時点における、正常および腫瘍結腸組織におけるｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＡＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｍＴＯＲおよびＧＳＫ３βの総タンパク質発現（相対単位）を示す図である：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。箱髭図は、５％／９５％信頼区間、中央値および標準偏差を示す。図５Ｃ〜５Ｄは、組織収集の４つの時点における、正常および腫瘍結腸組織におけるｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＡＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｍＴＯＲおよびＧＳＫ３βのタンパク質リン酸化の百分率を示す図である：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。箱髭図は、５％／９５％信頼区間、中央値および標準偏差を示す。
【００２８】
【図６】図６は、ＭＳＤ（登録商標）テクノロジーによって提供されるサンドイッチＥＬＩＳＡ分析を使用して組織溶解物を分析することによって決定された、タンパク質発現において少なくとも２倍の変化（上方調節または下方調節された）を示した患者の下位群における、正常結腸（左）および腫瘍組織（右）におけるＥＧＦＲの発現を示す図である。
【００２９】
【図７】図７は、４つの時点において採取された１人の患者由来のホルマリン固定された結腸がん組織上でのｐＡＫＴについての代表的免疫組織化学検査を示す図である：（Ａ）生検手術前；（Ｂ）切除の１０分後に固定した組織；（Ｃ）切除の２０分後に固定した組織；および（Ｄ）切除の４５分後に固定した組織。
【００３０】
【図８】図８は、（Ａ）正常結腸、（Ｂ）肝臓、（Ｃ）原発性結腸がんおよび（Ｄ）転移性肝臓病変組織における、ＨＳＰ２７についての総タンパク質発現（相対単位）および百分率リン酸化を示す図である。組織を取得した：ｐｒｅ、内視鏡下生検手術前（結腸）／肝茎クランプ前；ｐｏｓｔ、クランプ後；１０’、切除の１０分後；２０’、切除の２０分後；および４５’、切除の４５分後。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、温虚血および冷虚血が組織標本の分子組成に対して有する影響の相関を提供する。本明細書で示すように、結腸および肝臓の切除手術の間に取り出された正常および結腸直腸がん（ＣＲＣ）組織の標本を、手術の開始時および手術後に取得し、組織を、１０、２０および４５分の時点で固定した。原発性ＣＲＣを有する５０人の患者およびＣＲＣの肝内転移を有する４３人の患者由来の標本を、全ゲノム遺伝子発現アレイを使用して分析した。さらに、組織処理時点に関するタンパク質発現およびリン酸化ステータスを、上皮成長因子受容体経路中のタンパク質について定量化した。結腸直腸および肝臓標本から取得された遺伝子およびタンパク質発現データは、手術の間の組織取り扱いおよび手術後処理／虚血時間によって影響されることが決定された。信頼性のある発現データを取得するために、研究および診断目的のための組織処理は、高度に標準化される必要がある。
【００３２】
Ｉ．本発明
製薬会社は、特異的経路阻害剤の開発に大いに取り組んでおり、新たな薬物が、前臨床開発プログラムから多数出現し得る。患者集団における、層別化および予測的バイオマーカーとしての薬物標的の同定は、薬物開発における重要な分野になっている；実際、かかるバイオマーカーは、現在のおよび将来の患者ケアに必須であり、がんケアにおける償還コストの制御における重要な戦略であると考えられる。
【００３３】
ＤＮＡ異常、例えば、特定の遺伝子における活性化変異は、種々の状況下で、ある程度までの薬物標的の同定を可能にするが、このアプローチは、予測的価値が限定されている。調節タンパク質のリン酸化を定量化することによって決定されるタンパク質標的およびがん経路活性の利用は、患者の個々の腫瘍生物学についてのかなり深い洞察を提供できる。しかし、予測的薬物標的の発見および開発のための大きな課題は、患者の腫瘍生物学の実情を真に示す組織試料の必要性である。ほとんどの組織は手術標本であるので、大きな関心事は、手術の間および後の組織操作に起因した、改変された発現レベルのリスクである。がんバイオマーカーに対する手術操作の影響を理解することは、かかるバイオマーカーが患者を利するために完全に利用され得るような知識基盤の重要な一部である。
【００３４】
血液供給を止めることは、低酸素および細胞ストレスを迅速に誘導し、細胞の分子組成、したがって、これらの組織に由来する分析データに影響を与えると考えられる。さらに、手術の間、患者（および当然彼らの細胞）は、麻酔科医によって与えられる種々の種類の薬物に曝露される。
【００３５】
本明細書で提供される研究において、ヒト組織が、手術因子および長期手術後虚血に対して高度に感受性であり、組織の標準化された取り扱いが、引き続く分析にとって重要な因子であることが実証された。ストレスおよび虚血マーカー、例えば、ＨＳＰ２７およびＨＩＦ１Ａを分析すると、正常肝臓組織において、ＨＳＰ２７リン酸化が、肝茎クランプの１０分後に有意に増加し、時間依存的様式で切除後虚血を通じてさらに増加したことが見出された。正常結腸組織では、ＨＳＰ２７リン酸化は、手術後１０分と４５分との間に、ほぼ線形の時間依存的様式で増加した。したがって、ＨＳＰ２７リン酸化は、切除前および切除後の組織品質についてのマーカーであると思われる。結腸直腸腫瘍の手術後１０分におけるＨＩＦ１Ａリン酸化レベルにおける有意な増加もまた、サンドイッチＥＬＩＳＡ検出技術（すなわち、ＭＳＤ（登録商標）テクノロジー）を使用して見出された；しかし、これらのレベルは、後の時点において再度減退した。
【００３６】
個々の患者では、４，０００よりも多い遺伝子の発現が変更され、原発性ＣＲＣを有する患者の最大で６０％が、タンパク質およびそれらのリン酸化における２倍よりも大きい発現変化を示した。一般に、分子組成に対する影響は、正常細胞と比較した腫瘍細胞のより高い活性におそらくは起因して、正常組織と比較して腫瘍組織においてより重度であった。最も著しい変化は、温虚血および初期冷虚血（手術後１０分）の間に観察された；長期冷虚血の間の遺伝子およびタンパク質の発現変化は、驚くべきことに、あまり突出していなかったが、なおも有意であった。興味深いことに、最大で６９０（平均１１８）の遺伝子が、１０分間にわたって肝茎を単にクランプすることによって、個々の患者において既に影響を受けていた。
【００３７】
遺伝子およびタンパク質の発現データに関して、個体間可変性が患者全体にわたり観察された。しかし、これらの患者のほとんどは、類似のパターンの遺伝子発現変化に従うようであった。さらなる遺伝子発現分析のためにこれらの患者を使用することだけによって、システインリッチ血管新生誘導因子６１（ＣＹＲ６１、ＣＣＮ１）およびＧ−タンパク質シグナル伝達の調節因子１（ＲＧＳ１）などの、いくつかの転写因子および細胞外マトリックスのシグナル伝達分子の有意な上方調節が同定された。ＣＹＲ６１は、マトリックス細胞接着分子である。情況に依存して、これは、別個のインテグリンに結合することによって、細胞増殖、生存、アポトーシスまたは血管新生を促進し、創傷修復において重要な役割を果たす（Lauら、２０１１年）。ＲＧＳ１は、ＧＴＰ加水分解を促進することによってＧ−タンパク質のシグナル伝達活性を減弱させ、種々の免疫調節機能を有する（Bansalら、２００７年）。同時に、結腸腸細胞からのいくつかの遺伝子の発現は、下方調節された。
【００３８】
タンパク質レベルでも、患者間の可変性は高かった。タンパク質レベルおよびそれらのリン酸化ステータスは、異なる患者間および時点間で、増加するおよび減少するレベルを示した。しかし、組織切除および手術後虚血の間に分析された最も一貫した分子変化は、結腸組織由来のＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ３−ベータおよびＥＲＫ１／２について観察された、タンパク質リン酸化における減少またはより低いレベルであった。ＥＲＫ１／２の脱リン酸化は、上方調節された遺伝子発現が二重特異性ホスファターゼ１（ＤＵＳＰ１、ＭＫＰ１）について見出されたという事実に関連して、特に興味深い。このタンパク質は、細胞核においてＭＡＰＫ（ＥＲＫ）を脱リン酸化し得、したがって、ＭＡＰＫシグナル伝達を減弱させる（Lawanら、２０１３年）。
【００３９】
リン酸化ステータスにおける減退は、結腸組織におけるｐＥＲＫ、ｐＡＫＴおよびｐＥＧＦＲについての免疫組織化学的染色によっても観察され、染色強度は、手術前試料と比較して、手術後においてしばしばより低かった。免疫組織化学検査は、個別化処置選択肢を決定するために、個々のがん標本においてシグナル伝達経路の活性化を決定するために頻繁に使用されるので、これは、重要な結果である。切除後標本を分析する病理学者は、冷虚血時間によって誘導され得る変更を承知している必要があり、したがって、組織が獲得された条件についての正確な情報を必要とする。ＤＵＳＰ１、ＣＹＲ６１およびＲＧＳ１の遺伝子発現は、組織切除の際に正常およびＣＲＣ組織の両方において上方調節されたので、これらの遺伝子は、切除後組織品質のバイオマーカーとしての興味深い候補を提示し得る。
【００４０】
本研究はまた、その発現が組織切除および手術後冷虚血によって変更されなかった、候補「ハウスキーピング」遺伝子または比較的安定な遺伝子を同定した。これに関して、ＥＥＦ１Ａ１遺伝子は、特に興味深く思える。そのＣＶは、正常結腸組織およびＣＲＣ組織の両方において、４つ全ての時点にわたって非常に低かった。ＥＥＦ１Ａ１は、多くの組織において種々の条件下で構成的に発現されることが公知であり、遺伝子発現分析のための有用なハウスキーピング遺伝子として記載されている（Maltsevaら、２０１３年）。参照遺伝子としてのさらなる候補が同定されている。興味深いことに、参照遺伝子として頻繁に使用される遺伝子、例えば、ベータ２−ミクログロブリンまたはベータ２−チューブリンは、切除および手術後虚血を通じて構成的な発現を示さなかったので、記載された条件下でのハウスキーピング遺伝子として適切ではないようである。
【００４１】
本明細書に示されるデータは、保存前の異なる虚血条件の結果としての、ヒト腸組織試料におけるタンパク質レベルおよびタンパク質リン酸化のゆらぎを記載した最近の報告と大部分は一致している（Gundischら、２０１２年）。著者らは、タンパク質の上方調節または下方調節に向かう一般的傾向は、顕著な個体間可変性に起因して明らかでなかったことを報告した。本研究において調査した試料の数の多さに起因して、タンパク質の上方調節および下方調節に向かう一般的傾向ならびにそれらのリン酸化ステータスが、高い個体間可変性の存在にもかかわらず実証された。
【００４２】
まとめると、本発明のデータは、腫瘍切除前に結腸内視鏡検査を介して収集された標本と比較した、腫瘍切除後に収集された組織標本の分子組成における有意差を示す。この差は、１０分と４５分との間の種々の切除後時間の間での差よりも大きい。観察された効果は、温虚血および冷虚血、ならびに／または麻酔／手術手順自体、ならびに組織の操作のいずれかに起因する。一般に、キナーゼタンパク質は、脱リン酸化され、これは、免疫組織化学的染色の減少した強度を生じ得る。リン酸化されたＨＳＰ２７タンパク質と総ＨＳＰ２７タンパク質との比率は、全ての分析した組織型において、長期冷虚血時間と共にほぼ線形の増加を実証するので、組織品質についてのマーカーとして浮上した。
【００４３】
この研究は、分析前の時期の間に、すなわち、組織収集手順自体および組織収集前の手術手順によって組織試料中に導入される分子変化の理解への重要な寄与を提示する。初めて、その発現が組織処理および手術操作に起因して（≧２倍の変化で）変更される遺伝子の完全なリストが提供される。さらに、調節経路タンパク質および特異的成長因子受容体、例えばＥＧＦＲの分析は、高度に標準化された迅速な組織処理技術の使用を必要とする。標準化された技術が一旦認証されると、調節経路タンパク質の発現の分析が、標的化治療の予測的マーカーとして有用であり得る。
【００４４】
ＩＩ．バイオマーカー検出
例えば遺伝子および／またはタンパク質発現（例えば、ｍＲＮＡまたはリンタンパク質の発現）であるがこれらに限定されないバイオマーカーの発現は、当該分野で周知の種々の技術によって測定され得る。バイオマーカーのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルを定量化することは、バイオマーカーの発現を測定するために使用され得る。あるいは、バイオマーカーのタンパク質産物のレベルを定量化することが、バイオマーカーの発現を測定するために使用され得る。以下で議論される方法に関するさらなる情報は、Ausubelら（２００３年）またはSambrookら（１９８９年）において見出され得る。当業者は、どのパラメーターが目的のｍＲＮＡまたはタンパク質の検出を最適化するために操作され得るかを知る。
【００４５】
一部の実施形態では、発現情報を取得する前記ステップは、ＲＮＡ定量化、例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティングまたはヌクレアーゼ保護を含み得る。発現情報を取得する前記ステップは、リン酸化などのタンパク質翻訳後修飾のタンパク質定量化（quantification）および／または定量（quantitation）を含み得る。一部の場合には、かかる定量化は、免疫組織化学検査、ＥＬＩＳＡ（例えば、ＭＳＤ（登録商標）テクノロジーの使用などによるサンドイッチＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法、蛍光免疫アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ゲル電気泳動、ウエスタンブロット分析、質量分析的分析、タンパク質マイクロアレイ、キャピラリータンパク質免疫検出系、例えば、ＮａｎｏＰｒｏ１０００（商標）、または関連の技術を実施するステップを含む。
【００４６】
一部の態様では、マーカーレベル（例えば（scuh  as）、リンタンパク質（phosphpoprtein）またはｍＲＮＡレベル）は、対照マーカーのレベルと、または対照試料からの対応するマーカーと比較され得る。例えば、一部の場合には、この対照マーカー（control  maker）は、虚血曝露の間（duint）に一貫した安定なレベルを示すバイオマーカー（例えば、タンパク質、リンタンパク質またはｍＲＮＡ）である。同様に、一部の態様では、対照試料は、虚血に曝露されていないまたは未知の（aknown）期間にわたって虚血であった試料である。
【００４７】
対照マーカーレベルまたは対照試料からのマーカーレベルは、試験試料と同時に（例えば、同じ実験において）決定され得、または、例えば、コンピューター上もしくはコンピューター可読媒体上に記憶された、記憶された値または値のセットであり得る。後者が使用される場合、初期試料または追跡試料から取得された、選択されたマーカー（複数可）についての新たな試料データは、さらなる対照実験の必要なしに、同じマーカー（複数可）についての記憶されたデータと比較され得る。
【００４８】
Ａ．タンパク質検出の方法
一部の態様では、前記遺伝子の発現を測定するステップは、タンパク質発現レベルを測定するステップを含む。タンパク質発現レベルを測定するステップは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学検査、または抗体アレイへの結合を実施するステップを含み得る。ある特定の態様では、試料中のリンタンパク質のレベルを決定するステップは、この試料を、示されたリンタンパク質に対するリン酸化特異的抗体と接触させるステップを含む。
【００４９】
免疫組織化学的染色もまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用され得る。この方法は、タンパク質と特異的抗体との相互作用によって、組織切片の細胞中でのタンパク質の局在を可能にする。これのために、組織は、ホルムアルデヒドまたは別の適切な固定剤中で固定され得、ワックスまたはプラスチック中に包埋され得、ミクロトームを使用して、薄い切片（約０．１ｍｍから数ｍｍの厚さ）へとカットされ得る。あるいは、この組織は、凍結され得、クリオスタットを使用して薄い切片へとカットされ得る。組織の切片は、固体表面上に配置され得、それに貼り付けられ得る（すなわち、組織マイクロアレイ）。組織の切片は、目的の抗原に対する一次抗体と共にインキュベートされ、その後、未結合の抗体を除去するために洗浄される。この一次抗体は、検出系にカップリングされ得るか、またはこの一次抗体は、検出系にカップリングされた二次抗体を用いて検出され得る。この検出系は、フルオロフォアであり得るか、または基質を比色産物、蛍光産物もしくは化学発光産物へと変換できる酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼであり得る。染色された組織切片は、一般に、顕微鏡下でスキャンされる。がんを有する被験体由来の組織の試料は、不均一であり得る、すなわち、一部の細胞は正常であり得、他の細胞はがん性であり得るので、組織中の陽性に染色された細胞の百分率が決定され得る。この測定は、染色の強度の定量化と共に、バイオマーカーについての発現値を生成するために使用され得る。
【００５０】
酵素結合免疫吸着アッセイまたはＥＬＩＳＡは、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用され得る。ＥＬＩＳＡアッセイの多くのバリエーションが存在する。全ては、固体表面、一般にはマイクロタイタープレート上での抗原または抗体の固定化に基づく。元のＥＬＩＳＡ法は、目的のバイオマーカータンパク質を含有する試料を調製するステップ、マイクロタイタープレートのウェルをこの試料でコーティングするステップ、各ウェルを、特異的抗原を認識する一次抗体と共にインキュベートするステップ、未結合の抗体を洗浄して除くステップ、および次いで、抗体−抗原複合体を検出するステップを含む。この抗体−抗体複合体は、直接検出され得る。これのために、一次抗体は、検出可能な産物を産生する酵素などの検出系にコンジュゲートされる。この抗体−抗体複合体は、間接的に検出され得る。これのために、一次抗体は、上記のように、検出系にコンジュゲートされた二次抗体によって検出される。次いで、このマイクロタイタープレートはスキャンされ、生強度データが、当該分野で公知の手段を使用して、発現値へと変換され得る。単一およびマルチプローブキットが、商業的供給元、例えば、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）から入手可能である。これらのキットには、本明細書の実施例で言及されるキットが含まれる。
【００５１】
抗体マイクロアレイもまた、複数のバイオマーカーの差次的発現（および／または差次的リン酸化（differential  phosphoylation））を測定するために使用され得る。これのために、複数の抗体が配置され（arrayed）、マイクロアレイまたはバイオチップの表面に、共有結合で付着される。目的のバイオマーカータンパク質を含有するタンパク質抽出物は、一般に、蛍光色素またはビオチンで標識される。標識されたバイオマーカータンパク質は、抗体マイクロアレイと共にインキュベートされる。未結合のタンパク質を除去するための洗浄の後、このマイクロアレイはスキャンされる。生蛍光強度データは、当該分野で公知の手段を使用して、発現値へと変換され得る。
Ｂ．核酸検出の方法
【００５２】
別の一態様では、前記遺伝子の発現を測定するステップは、ＲＮＡ発現レベルを測定するステップを含む。ＲＮＡ発現レベルを測定するステップは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはアレイハイブリダイゼーションを実施するステップを含み得る。好ましくは、遺伝子の発現レベルを測定するステップは、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）を実施するステップを含む。
【００５３】
核酸マイクロアレイは、複数のバイオマーカーの差次的発現を定量化するために使用され得る。マイクロアレイ分析は、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）テクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）またはＩｎｃｙｔｅ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用することによって、製造業者のプロトコールに従って、市販の装置を使用して実施され得る。例えば、一本鎖核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）が、マイクロチップ基材上にプレーティングまたは配置され得る。次いで、配置された配列は、目的の細胞からの特異的核酸プローブとハイブリダイズされる。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、目的の細胞から抽出されたＲＮＡの逆転写によって、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドの取込みを介して生成され得る。あるいは、ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって増幅され得、ビオチンなどのマーカーで標識され得る。次いで、標識されたプローブは、高度にストリンジェントな条件下で、マイクロチップ上の固定化された核酸にハイブリダイズされる。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、このチップは、共焦点レーザー顕微鏡法または別の検出方法、例えばＣＣＤカメラによって、スキャンされる。ハイブリダイゼーションファイル中の生蛍光強度データは、一般に、発現値を生成するために、ロバストマルチチップ平均（ＲＭＡ：ｒｏｂｕｓｔ  ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  ａｖｅｒａｇｅ）アルゴリズムを用いて事前処理される。
【００５４】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）もまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用され得る。ｑＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡ鋳型は一般に、ｃＤＮＡへと逆転写され、これは次いで、ＰＣＲ反応を介して増幅される。ＰＣＲ産物の量は、リアルタイムでサイクル毎に追跡され、ｍＲＮＡの初期濃度の決定を可能にする。ＰＣＲ産物の量を測定するために、この反応は、二本鎖ＤＮＡに結合する、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの蛍光色素の存在下で実施され得る。この反応は、増幅されているＤＮＡに特異的な蛍光レポータープローブを用いても実施され得る。
【００５５】
蛍光レポータープローブの非限定的な一例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）である。この蛍光レポータープローブは、クエンチャーがＰＣＲ伸長サイクルの間に除去されると、蛍光を発する。マルチプレックスｑＲＴ−ＰＣＲは、その各々が異なるフルオロフォアを含有する複数の遺伝子特異的レポータープローブを使用することによって、実施され得る。蛍光値は、各サイクルの間に記録され、増幅反応においてその時点までに増幅された産物の量を示す。誤差を最小化し、試料毎のいずれの変動も低減させるために、ｑＲＴ−ＰＣＲは、参照標準を使用して実施され得る。理想的な参照標準は、異なる組織間で一定のレベルで発現され、実験処理によって影響を受けない。適切な参照標準には、ハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンについてのｍＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない、元の試料中のｍＲＮＡのレベルまたは各バイオマーカーの発現における変化倍数は、当該分野で周知の計算を使用して決定され得る。
【００５６】
Ｌｕｍｉｎｅｘ多重化ミクロスフェアもまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用され得る。これらの微小ポリスチレンビーズは、各ビーズが独自のスペクトルシグネチャー（最大で１００存在する）を有するように、蛍光色素で内部が色コードされる。同じシグネチャーを有するビーズは、目的の標的（すなわち、それぞれ、バイオマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質）に結合する特異的オリゴヌクレオチドまたは特異的抗体でタグ付けされる。この標的は、次に、蛍光レポーターでもタグ付けされる。したがって、色の２つの供給源が存在し、一方はビーズ由来であり、他方は標的上のレポーター分子由来である。次いで、これらのビーズは、標的を含有する試料と共にインキュベートされ、そのうち最大で１００が、１つのウェル中で検出され得る。ビーズの小さいサイズ／表面積、および標的へのビーズの３次元曝露は、結合反応の間のほぼ溶液相速度論を可能にする。捕捉された標的は、各ビーズを同定する内部色素およびまたアッセイの間に捕捉された任意のレポーター色素をレーザーが励起させるフローサイトメトリーに基づいて、ハイテクフルイディクスによって検出される。獲得ファイル由来のデータは、当該分野で公知の手段を使用して、発現値へと変換され得る。
【００５７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションもまた、複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するために使用され得る。この方法は、組織切片の細胞中の目的のｍＲＮＡの局在を可能にする。この方法のために、組織は、凍結され得、または固定および包埋され得、次いで、薄い切片へとカットされ得、これらが、固体表面上に配置または貼り付けされる。これらの組織切片は、目的のｍＲＮＡとハイブリダイズする、標識されたアンチセンスプローブと共にインキュベートされる。ハイブリダイゼーションステップおよび洗浄ステップは、一般に、高度にストリンジェントな条件下で実施される。このプローブは、標識されたハイブリッドが顕微鏡下で検出および視覚化され得るように、別のタンパク質または抗体によって検出され得るフルオロフォアまたは小さいタグ（例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン）で標識され得る。各アンチセンスプローブが識別可能な標識を有することを条件として、複数のｍＲＮＡが同時に検出され得る。ハイブリダイズされた組織アレイは、一般に、顕微鏡下でスキャンされる。がんを有する被験体由来の組織の試料は、不均一であり得る、すなわち、一部の細胞は正常であり得、他の細胞はがん性であり得るので、組織中の陽性に染色された細胞の百分率が決定され得る。この測定は、染色の強度の定量化と共に、各バイオマーカーについての発現値を生成するために使用され得る。
【００５８】
ＩＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、用語「生物学的試料」は、その最も広い意味で使用され、被験体（例えば、ヒト）から取得された身体試料を指し得る。例えば、この生物学的試料には、「臨床試料」、すなわち、被験体に由来する試料が含まれ得る。かかる試料には、以下が含まれ得るがこれらに限定されない：細胞を含有していてもいなくてもよい末梢体液、例えば、血液、尿、血漿、粘液、胆汁膵液、上澄み液および血清；組織または細針生検試料；ならびに既知の診断、処置および／またはアウトカム履歴を有する保存試料。生物学的試料には、組織の切片、例えば、組織学的目的のために採取された凍結切片もまた含まれ得る。用語「生物学的試料」は、試料を処理することによって得られた任意の材料もまた包含し得る。得られた材料には、生物学的試料から単離された細胞（またはそれらの子孫）およびこの試料から抽出されたタンパク質が含まれ得るがこれらに限定されない。生物学的試料の処理は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、固定、妨害性成分の不活性化、試薬の添加などのうち、１または複数を含み得る。
【００５９】
「被験体」または「患者」とは、治療または診断試験が所望される任意の単一の被験体を意味する。この場合、被験体または患者とは、一般にヒトを指す。疾患のいずれの臨床徴候も示さない、臨床研究試験に関与した任意の被験体、または疫学的研究に関与した被験体、または対照として使用された被験体が、被験体として含まれることも意図される。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「増加した発現」とは、（例えば、適切な対照マーカー、対照試料または時点と比較した）、試料中のマーカーの発現（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質またはリンタンパク質発現）のレベルの上昇または増加を指し、ここで、遺伝子発現のレベルにおける上昇または増加は、統計的に有意（ｐ＜０．０５）である。対照と比較した試料中のマーカーの発現における増加が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定（例えば、１−試料ｔ検定、２−試料ｔ検定、ウェルチｔ検定）または当業者に公知の他の統計的検定を使用して決定され得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「減少した発現」とは、（例えば、適切な対照マーカー、対照試料または時点と比較した）、試料中のマーカーの発現（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質またはリンタンパク質発現）のレベルの低減または減少を指し、ここで、遺伝子発現のレベルにおける低減または減少は、統計的に有意（ｐ＜０．０５）である。一部の実施形態では、低減または減少したレベルのマーカー発現は、発現の完全な非存在であり得る。対照と比較した試料中のマーカーの発現における減少が統計的に有意であるかどうかは、適切なｔ検定（例えば、１−試料ｔ検定、２−試料ｔ検定、ウェルチｔ検定）または当業者に公知の他の統計的検定を使用して決定され得る。
【実施例】
【００６２】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を示すこと、およびしたがって、本発明の実施のための好ましい様式を構成するとみなされ得ることが、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、多くの変更が、開示された具体的な実施形態においてなされ得、同様または類似の結果がなおも得られることを、理解すべきである。
【００６３】
（実施例１）
試料の収集および調製
原発性結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する５０人の患者およびＣＲＣの肝内転移を有する４３人の患者を、この研究に登録した。原発性腫瘍を有する５０人の患者から、３７０のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料および７８０の液体窒素中凍結（ＦＦ）組織試料を収集し、転移したがんを有する４３人の患者から、５９２のＦＦＰＥ組織試料および６４２のＦＦ組織試料を収集した。全ての試料を、形態学的品質管理に供した（図１Ａ〜１Ｂ）。
【００６４】
腫瘍切除手術が計画された全ての患者は、この研究に登録されるインフォームドコンセントを与えた。直径が３ｃｍよりも大きい腫瘍を有する患者のみを登録した。手術の＜３週間前に化学療法または放射線療法を受けた患者は排除した。特別に訓練した研究看護師が、全ての手術の間にその場にいた。彼らは、手術ユニットにおける組織処理および臨床データ文書化を実施し、同じ標準化された操作手順が全ての患者に適用されたことを保証した。この研究は、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙの３つの場所で実施され、参照番号ＰＶ３３４２の下で、Ｈａｍｂｕｒｇ医師会の適格な倫理審査委員会による承認を受けた。
【００６５】
麻酔の導入後、原発性ＣＲＣを有する患者は結腸内視鏡検査を受け、その際、３つの生検を腫瘍から採取し、３つの生検を隣接正常組織から採取した（手術前）（図１Ａ〜１Ｂ）。ＣＲＣの肝転移を有する患者については、４片の組織を、肝臓切除の開始前、すなわち、肝動脈のクランプの直前に、正常肝臓実質から採取した（手術前）。肝茎クランプの約１０分後（クランプ後）、別の４つの組織試料を、正常肝臓実質から収集した（手術後）。
【００６６】
全ての患者について、１２の組織試料を、腫瘍および隣接正常組織の切除後に、腫瘍組織および隣接正常組織から各々収集した。これら２４の試料を、３つの群に分け、各々を、それぞれ、１０分間（１０’）、２０分間（２０’）および４５分間（４５’）の冷虚血時間に曝露した。全ての組織試料が、５×５×５ｍｍの適切なサイズおよび１２０ｍｇの適切な重量を有した。各時点および組織型（正常または腫瘍）について、組織の半分を、液体窒素の気相において即座に貯蔵し、他方の半分を、４％緩衝化ホルムアルデヒド中で浸漬固定した（図１Ａ〜１Ｂ）。
【００６７】
ホルムアルデヒド中の全ての組織標本を、１６〜７２時間にわたって浸漬固定した。その後、これらを計量し、さらなる処理まで、最長で２４時間にわたって７０％エタノール中に置いた。処理を、パラフィン（Ｐａｒａｐｌａｓｔ）中での組織の包埋を生じる、自動システム（Ｍｉｃｒｏｍ組織プロセッサーＳＴＰ  ４２０  Ｄ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。
【００６８】
各ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織標本および液体窒素中凍結（ＦＦ）組織標本から、１つの切片を、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、それぞれ、腫瘍および正常組織の存在を検証するために、光学顕微鏡下で評価した。腫瘍含量は、腫瘍試料中では１０％〜９０％、全ての隣接正常試料中では０％であった。
【００６９】
組織学的品質管理後、ＦＦＰＥ試料およびＦＦ試料を、以下の分子分析のために選択した：ｉ）中スループット酵素結合免疫吸着アッセイ技術（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ［ＭＳＤ］）による、総タンパク質およびリン酸化タンパク質の定量化、ｉｉ）免疫組織化学検査によるタンパク質発現の半定量的評価、ならびにｉｉｉ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘホールゲノムチップを使用した総ＲＮＡ抽出物についての遺伝子発現プロファイリング（図１Ａ〜１Ｂ）。
【００７０】
（実施例２）
タンパク質の定量化
４０のＦＦ標本を使用した。組織溶解物を、各ＦＦ標本から２０μｍスライスをカットしホモジナイズすることによって調製した。得られた組織溶解物を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（ＢＣＡキット；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に供して、タンパク質濃度を決定した。タンパク質の定量化を、ＭＳＤ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）のアッセイプラットフォームに基づいて、捕捉抗体を用いて９６ウェルプレートを使用して実施した。以下のアッセイキットを使用した：ＨＩＦ１アルファシングルプレックス、ＨＳＰ２７／ｐＨＳＰ２７（Ｓｅｒ１５）デュプレックス、ＥＧＦＲ／ｐＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１１７３）デュプレックス、ＡＫＴ／ｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）デュプレックス、ｍＴＯＲ／ｐｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）デュプレックス、ｐ７０−Ｓ６Ｋ／ｐｐ７０−Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ４２１、Ｓｅｒ４２４）デュプレックス、ＧＳＫ３−ベータ／ｐＧＳＫ３−ベータ（Ｓｅｒ９）デュプレックス、ＭＥＫ１／２／ｐＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）デュプレックスおよびＥＲＫ１／２／ｐＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｔｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７）デュプレックス。
【００７１】
アッセイを、製造業者の指示に従って１０μｇの組織溶解物を使用して実施し、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒプラットフォーム（ＭＳＤ）を用いて分析した。分析を、３連で実施し、算術平均値を計算した。手術後試料の平均値を、同じ患者由来の手術前試料に対して比較した。リン酸化の百分率を、以下の式に従って計算した：リン酸化（％）＝（ＤＦ×リン酸化タンパク質）／（リン酸化タンパク質＋総タンパク質）×１００、分配率（ＤＦ）＝２。リン酸化（％）が＞１００であった場合、ＤＦを調整した。実行対照として、刺激されたヒト細胞の溶解物を作製し、陽性および陰性対照として使用した。
【００７２】
（実施例３）
免疫組織化学検査
ＦＦＰＥ組織由来の５μｍ切片を、ガラススライド上にマウントし、５６℃で一晩風乾し、自動プラットフォーム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）を使用した免疫染色に供した。以下の一次抗体および希釈物を使用した：ｐＥＲＫ１／２  １：３００、ｐＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）１：３０、ｐＥＧＦＲ  １：１１０、ｐｍＴＯＲ  １：１３０、ｐＨｅｒ３  １：７０（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡから）。染色後、切片を、上昇するエタノール濃度およびキシレンで処理し、最後にＰｅｒｔｅｘ（Ｍｅｄｉｔｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でカバーした。切片は、病理学者が光学顕微鏡下で試験した。腫瘍細胞染色を、非存在、弱い、中程度または強いと分類し、染色スコアを、以下の式に従って染色の程度に基づいて計算した：スコア＝３×強く染色された腫瘍細胞の百分率＋２×中程度に染色された腫瘍細胞の百分率＋１×弱く染色された腫瘍細胞の百分率。
【００７３】
（実施例４）
遺伝子発現に対する、組織処理時点の影響
遺伝子発現分析のために、総ＲＮＡを、全ての凍結組織ブロックから２連で抽出した。簡潔に述べると、組織をホモジナイズし、ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、フェノールクロロホルム抽出およびＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して２ステップで単離した。ＲＮＡ品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１８Ｓおよび２８ＳのリボソームＲＮＡピークに基づいて評価した。≧７のＲＮＡ完全性数を有するＲＮＡ試料のみを、遺伝子発現分析に使用した。ＲＮＡ試料を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）テクノロジー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に基づいて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０）を使用して反復で分析した。
【００７４】
肝動脈の１０分間のクランプ時間は、正常肝臓において、最大で６９０（平均１１８）の遺伝子の発現を有意に変化させた。影響を受けた遺伝子の数は、手術時間と共に増加した（図２）。一部の遺伝子は（対第１の生検）正規化したが、他の遺伝子は、長期にわたる手術および手術後組織処理時間につれて、発現レベルにおける有意な変化を有する。正常肝臓および正常結腸中の影響を受けた遺伝子の数は、類似していた（以下の表１を参照のこと）。
【表１】
2017528699.tif 000002
【００７５】
正常組織とは対照的に、手術および手術後処理時間に関する遺伝子発現の可変性は、がん組織において有意により高かった。手術後１０分以内および４５分以内に、転移性肝臓ＣＲＣ腫瘍において最大で３，０８７（平均８３０）の遺伝子が、発現において≧２倍の有意差を示した。原発性ＣＲＣ組織では、手術前と手術後１０分との間での生検の比較は、最大で３，７９２（平均１，２３４）の遺伝子を同定し、手術後４５分の生検は、最大で４，１１６（平均１，５５３）の遺伝子を同定した。表２〜５（以下）は、手術および手術後処理の間に発現において有意な≧２倍の変化を示した全ての遺伝子をまとめる。
【表２−１】
2017528699.tif 000003
【表２−２】
2017528699.tif 000004
【表２−３】
2017528699.tif 000005
【表２−４】
2017528699.tif 000006
【表３−１】
2017528699.tif 000007
【表３−２】
2017528699.tif 000008
【表３−３】
2017528699.tif 000009
【表３−４】
2017528699.tif 000010
【表４−１】
2017528699.tif 000011
【表４−２】
2017528699.tif 000012
【表４−３】
2017528699.tif 000013
【表４−４】
2017528699.tif 000014
【表４−５】
2017528699.tif 000015
【表４−６】
2017528699.tif 000016
【表４−７】
2017528699.tif 000017
【表４−８】
2017528699.tif 000018
【表５−１】
2017528699.tif 000019
【表５−２】
2017528699.tif 000020
【表５−３】
2017528699.tif 000021
【表５−４】
2017528699.tif 000022
【表５−５】
2017528699.tif 000023
【表５−６】
2017528699.tif 000024
【表５−７】
2017528699.tif 000025
【表５−８】
2017528699.tif 000026
【表５−９】
2017528699.tif 000027
【表５−１０】
2017528699.tif 000028
【表５−１１】
2017528699.tif 000029
【表５−１２】
2017528699.tif 000030
【表５−１３】
2017528699.tif 000031
【表５−１４】
2017528699.tif 000032
【表５−１５】
2017528699.tif 000033
【００７６】
（実施例５）
潜在的なＲＮＡベースの組織品質バイオマーカーの同定
階層的クラスタリングを使用して、遺伝子発現データをさらに評価し、異なる患者群を分類した。結腸手術を有した患者由来のデータのクラスタリング（別々に、正常および腫瘍組織クラスタリング）は、７つの異なるパーティションを生じた（図３）。ほとんどの患者（正常組織で８９％）は、手術前の時点が手術後１０分、２０分および４５分の時点から分離したことを意味するパーティション［手術前／１０分２０分４５分］に入った。
【００７７】
外れ値とみなされた５人の患者を排除して、正常組織において手術前／手術後１０分２０分４５分のパーティションに従う患者のみを使用して、手術前と手術後１０分の時点との間、および手術前と手術後４５分の時点との間での複数のｔ検定を用いて、遺伝子発現強度レベルを比較した。正常結腸組織では、７０のプローブが、両方の比較において差次的発現を示した。これらのうち、７つのプローブ（５つの異なる遺伝子をコードする）は、両方の比較において≧２倍の対数倍変化を有した（以下の表６を参照のこと）。別の５つの遺伝子の発現は、手術前対手術後４５分の比較のみにおいて、≧２対数倍の変化を示したが、この対数倍変化は、手術前対手術後１０分の比較において僅かに低かった。正常結腸組織の切除の際に有意に上方調節された遺伝子は、転写因子（ＥＧＲ１、ＦＯＳ）、細胞外マトリックスのシグナル伝達分子（ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＳＧＫ１）、および二重特異性ホスファターゼ１（ＤＵＳＰ１、ＭＡＰＫ１を脱リン酸化するタンパク質）を含んだ。粘膜タンパク質、例えば、デュアルオキシダーゼ２（ＤＵＯＸ２、抗菌防御において役割を果たすタンパク質）、溶質キャリアファミリー６（ＳＬＣ６Ａ１４、アミノ酸トランスポートを媒介するタンパク質）、およびバニン１（ＶＮＮ１、ビタミンＢ５リサイクルに関与するタンパク質）についての遺伝子発現は、下方調節された。結腸腫瘍組織では、類似の遺伝子発現変化が、ＣＹＲ６１、ＲＧＳ１、ＤＵＳＰ１、ＤＵＯＸ２およびＳＬＣ６Ａ１４について見出されたが、対数倍変化は、正常組織と比較して一般により低かった（以下の表６を参照のこと）。
【００７８】
影響を受けた遺伝子の数が低いことおよび発現のより多様な変化に起因して、同じアプローチは、正常肝臓組織には適用不能であった。
【表６−１】
2017528699.tif 000034
【表６−２】
2017528699.tif 000035
【００７９】
（実施例６）
手術および組織処理／虚血によって影響を受けないハウスキーピング遺伝子の同定
遺伝子発現データを、変動係数（ＣＶ）に従ってソートした。正常組織における４つ全ての時点にわたって最も低いＣＶを有する１０個のプローブセットが、以下の表７に列挙される。一部のプローブセットは、調査が不十分なタンパク質をコードしたが、それらのうち、非常に構成的に発現された遺伝子は、遺伝子発現分析のための潜在的なハウスキーピング遺伝子として公知の、高コピー数で広く発現される遺伝子、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＥＦ１Ａ１）であった（Rienzoら、２０１３年）。低いＣＶを有するさらなる周知のハウスキーピング遺伝子は、リボソームタンパク質Ｌ１３およびＳ１８、ベータ−グルクロニダーゼ、ならびにベータ−アクチンであり、他の頻繁に使用されるハウスキーピング遺伝子、例えば、ベータ−２−ミクログロブリンおよびベータ２Ｂ−チューブリンは、構成的には発現されなかった。
【００８０】
同じ仕事を、ＣＲＣ組織における遺伝子発現について実施した。再び、ＥＥＦ１Ａ１発現は、非常に低いＣＶを示し、これは、正常組織および新生物性結腸直腸組織の両方において、ＥＥＦ１Ａ１が参照遺伝子として機能し得ることを示唆している。
【表７−１】
2017528699.tif 000036
【表７−２】
2017528699.tif 000037
【表７−３】
2017528699.tif 000038
【００８１】
（実施例７）
ＥＧＦＲ経路タンパク質のリン酸化
ＥＧＦＲならびにＡＫＴおよびＭＡＰＫ経路のその下流の重要なシグナル伝達タンパク質を、総タンパク質濃度およびリン酸化ステータスに関して調査した。手術前生検の発現レベルを参照として使用して、タンパク質発現における≧２倍の変化（上方または下方）が実証された。正常肝臓組織では、クランプ前組織生検を参照として使用した。
【００８２】
全体として、ＥＧＦＲ経路タンパク質のリン酸化における変化は、正常肝臓においては最も低く、正常結腸においてはより高く、がん組織において最も高かった（図４Ａ〜４Ｂ）。肝臓組織では、総タンパク質発現における変化は観察されなかったが、正常結腸組織では、ＥＧＦＲ発現は、手術前と手術後４５分との間で、患者の１０％において≧２倍変化したが、下流タンパク質ｐ７０−Ｓ６Ｋの発現は、患者の３５％において＞２倍変化した。ＣＲＣ組織では、ＥＧＦＲ関連タンパク質における発現変化は著しかった。手術前と手術後１０分との間に、ＥＧＦＲ総タンパク質発現は、全ての患者の２０％において＞２倍変化し、さらなる３５分以内（手術前／手術後４５分）に、全ての患者の３０％において＞２倍変化した。引き続いて、ｐ７０−Ｓ６Ｋなどの下流タンパク質の発現は、患者の６０％よりも多くにおいて、手術前から手術後４５分に＞２倍変化した。
【００８３】
総タンパク質レベルにおける変化は、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＥＲＫ１／２、ＧＳＫ３Ｂ、ｐ７０−Ｓ６Ｋ、ＨＩＦ１ＡおよびＥＧＦＲなどの他のタンパク質について統計的に有意になり（図５Ａ〜５Ｂ）、個々の患者において上方調節および下方調節を示したが、一部の患者では不安定な発現をなおも示し、これは、統計的に有意ではなかった（図６）。
【００８４】
（実施例８）
ＡＫＴおよびＭＡＰＫ経路内の重要なシグナル伝達分子ならびにＨＳＰ２７のリン酸化に対する、組織処理時点の影響
重要なシグナル伝達タンパク質のリン酸化ステータスは、ほとんどの患者において、正常組織と比較して腫瘍組織においてより高い程度まで、有意に影響を受けた。本発明者らは、リン酸化カスケードの一部においては活性化を示し他の部分においては不活性化を示す、一続きのリン酸化事象を見出した。手術前の試料と手術後１０分の試料との間での最も重要な調節タンパク質における統計的に有意な変化、および手術後冷虚血時間の間の一部のタンパク質についてのさらなる変化が、見出された。これには、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＥＲＫ１／２およびＭＥＫが含まれた（図５Ｃ〜５Ｄ）。
【００８５】
正常結腸および肝臓組織では、ほとんどのタンパク質の総レベルは、時点間で有意には異ならなかった。しかし、ＣＲＣ組織では、ＡＫＴおよびｍＴＯＲについて手術後１０分において統計的に有意な増加が存在した。タンパク質リン酸化は、正常結腸およびＣＲＣ腫瘍組織において、温虚血および冷虚血で有意に減少した（図５Ｃ〜５Ｄ）。
【００８６】
タンパク質リン酸化における上述の減退は、免疫組織化学検査の際の減少した染色強度とおおむね関連し、これは、リン酸化されたＥＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２について統計的に有意であった。虚血時間と関連した、結腸がんを有する患者におけるｐ−ＡＫＴの検出についての免疫組織化学検査の画像例は、図７に示される。
【００８７】
ＨＳＰ２７は、その発現が細胞ストレスに応答することが公知であるので（Benndorfら、１９９７年）、これを評価した。総ＨＳＰ２７タンパク質レベルは、全ての群にわたって類似するはずであるが、リン酸化されたＨＳＰ２７対総ＨＳＰ２７の百分率は、ほとんどの患者において、手術前から手術後４５分に、ほぼ線形の様式で経時的に増加し、これは、手術前／クランプ前の試料対長期冷虚血後に採取された試料との間での、統計的に有意差を実証している（図８）。冷虚血の手術後４５分の後に、ＨＳＰ２７リン酸化の割合は、手術前レベルと比較して８倍増加した。正常肝臓組織では、これは２倍増加した。
【００８８】
（実施例９）
統計的分析
ＭＳＤプラットフォーム上で測定したタンパク質含量の統計的分析および免疫組織化学検査から得られた染色スコアの統計的分析を、ソフトウェアシステムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較検定を用いて実施した。有意レベルは０．０５であった。
【００８９】
遺伝子発現における変化の統計的分析の前に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ−Ｐｏｗｅｒ−Ｔｏｏｌｓおよびｌｏｇ２変換を使用する正規化を行った。データの対称性を、平均対平均（mean  vs.  average）分析および箱髭図によって検証した。統計的データ分析に向かう第１のアプローチとして、階層的クラスタリングを、スピアマンの相関係数を距離測定として使用して実施した。ウォード−連結法（ward-linkage  method）を使用して、デンドログラムを生成した。技術的反復を、ほぼ全ての場合において一緒にクラスタリングしたので、これらの反復を平均し、その平均を、さらなる条件クラスタリングにおいて使用して、正常組織由来の試料と腫瘍に起源する試料とを分離した。その後、４つ全ての時点にわたる別々のデータを、個々の患者についてクラスタリングして、患者を別個のパーティションにグループ分けした。
【００９０】
ＣＲＣ組織試料から正常結腸組織を分離して、最も大きいパーティション群由来の患者のみを使用して、手術前と手術後１０分の時点との間および手術前と手術後４５分の時点との間で、強度レベルを比較した。ｔ検定を実施し、ｐ値を計算した。ｐ＞０．００１を有するプローブセットを、強度における＜２対数倍の変化を有するプローブセットであるとして排除した。両方の比較からの重複を、温虚血および冷虚血に対して特に脆弱である遺伝子のリストとして同定した。最も小さい変動係数（ＣＶ）に従ってソートした全ての遺伝子のリストを使用して、温虚血および冷虚血に対して見かけ上脆弱ではなかった遺伝子を同定した。
【００９１】
３つの異なる冷虚血時間間隔の間での詳細な比較のために、生検時に採取した全ての試料を、結腸直腸データプールから排除した。排除後、残り３つの時点にわたるクラスターデンドログラムを生成して、患者を別個のパーティションにグループ分けした。最も大きいパーティション群由来の患者を使用して、手術前と手術後１０分の時点との間および手術前と手術後４５分の時点との間で、強度レベルを比較した。ｔ検定を実施し、ｐ値を計算した。
【００９２】
本明細書に開示され特許請求された方法の全ては、本開示に照らせば、過度の実験なしに実施および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、バリエーションが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなしに、本明細書に記載される方法に、および方法のステップまたは一連のステップにおいて適用され得ることが、当業者に明らかである。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連するある特定の作用物質（agent）が、同じまたは類似の結果を達成する限り、本明細書に記載される作用物質の代わりに用いられてもよいことが、明らかである。当業者に明らかな全てのかかる類似の代用物および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【００９３】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されるものに対して補助的な、例示的な手順上の詳細または他の詳細をそれらが提供する程度において、参照によって本明細書に具体的に取り込まれる。
【化１】
2017528699.tif 000039
【図１Ａ】
2017528699.tif 000040
【図１Ｂ】
2017528699.tif 000041
【図２】
2017528699.tif 000042
【図３Ａ】
2017528699.tif 000043
【図３Ｂ】
2017528699.tif 000044
【図４】
2017528699.tif 000045
【図５Ａ】
2017528699.tif 000046
【図５Ｂ】
2017528699.tif 000047
【図５Ｃ】
2017528699.tif 000048
【図５Ｄ】
2017528699.tif 000049
【図６】
2017528699.tif 000050
【図７Ａ）】
2017528699.tif 000051
【図７Ｂ）】
2017528699.tif 000052
【図７Ｃ）】
2017528699.tif 000053
【図７Ｄ）】
2017528699.tif 000054
【図８】
2017528699.tif 000055
【国際調査報告】
2017528699.tif 000056
2017528699.tif 000057
2017528699.tif 000058
2017528699.tif 000059
2017528699.tif 000060
2017528699.tif 000061
2017528699.tif 000062