(57)【要約】治療的な使用のためのＤＯＴＡＭ誘導体本発明は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、である式Ｉの化合物、およびその薬理学的に許容される塩に関連し、ここでＭは、存在しないかまたは存在し、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９Ｍｏの群からの正に荷電した金属イオンであり、およびＡ１、Ａ２、Ａ３、,およびＡ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４、Ｙ１、Ｙ２、Y３、およびＹ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、請求項において、示される意味を有する。式Ｉの化合物は、有益な薬理活性化合物で、変形性関節症の治療に適している。本発明は、式Ｉの化合物の調製のための方法、それらを含有する医薬、および医薬品組成物としてのそれらの用途にさらに関する。【選択図】  【化１】
2017501214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩、
【化１】
2017501214.tif 000064
ここでＭは、存在しないかまたは存在し、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９Ｍｏの群からの正に荷電した金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から互いに独立して選択され；
ｎは、１および２から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選らばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは、互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−
【化２】
2017501214.tif 000065
から互いに独立して選ばれ、
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●光学的画像化に適している蛍光体；
●ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、光学的画像化に適している蛍光体またはＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）であり；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している１より多い、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表すことはできない。
【請求項２】
立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉｂ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩、
【化３】
2017501214.tif 000066
ここで
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から互いに独立して選択され；
ｎは、１および２から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選らばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは、互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっていて、結合手、解離可能なリンカー、−Ｙ５−（Ｚ５）ｒ、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）
【化４】
2017501214.tif 000067
から互いに独立して選択され、
ここで、ｒは１〜３から選択され、Ｙ５は解離可能なリンカー、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）、Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）から選択され、Ｚ５はＺ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４について定義された通りであり；
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に役立つ化合物；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、上記に定義されているように変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な化合物を表す。
【請求項３】
立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩、
【化５】
2017501214.tif 000068
ここでＭは、存在しないかまたは存在し、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９Ｍｏの群からの正に荷電した金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から互いに独立して選択され；
ｎは、１および２から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選らばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは、互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−
【化６】
2017501214.tif 000069
から互いに独立して選ばれ、
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●蛍光体；
●活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、蛍光体または活性に基づいたプローブ（ＡＢＰ）を表し；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、１より多い、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表すことはできない。
【請求項４】
請求項２に記載の式（Ｉｂ）の化合物、ここで、ＭＭＰ１３のインヒビター、組換え型メタロプロテイナーゼインヒビター−３、ＡＤＡＭＴＳ４／５、カテプシンＤ、カテプシンＫインヒビター、カテプシンＳまたはＢのインヒビター、ｕＰＡ、ｔＰＡ、ＨＴＲＡ１、ＰＡＣＥ４に対するセリンプロテアーゼインヒビター、補体系のインヒビター、Ｃ１ｓ、Ｃ１ｒ、Ｃ３、Ｃ５または膜侵食複合体に対するインヒビター、前炎症性サイトカイン、インターロイキン１転換酵素、組換え型インターロイキン１受容体拮抗剤に対するインヒビター、前炎症性細胞内シグナル伝達経路またはｐ３８−経路に対するインヒビター、ＦＡＫ−シグナル伝達のインヒビター、Ｔｏｌｌ様レセプター、ドキシサイクリン、グルコサミン−ハイドロクロライド、コンドロイチンサルフェートに対するインヒビター、標準的なＷＮＴシグナル伝達のインヒビター、フリズルドレセプターのインヒビター、ＧＳＫ３βのモジュレーター、ＳＧＫ−１、組換え型Ｗｉｆ１、組換え型ＳＦＲＰ、組換えＤＫＫ−１のインヒビター、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６、組換え型Ｓｏｓｔのインヒビター、軟骨細胞肥大化のインヒビター、ＨＤＡＣ−４モジュレーター、ＦＧＦＲ３アゴニスト、組換え型ＰＴＨｒＰ、軟骨細胞同化分子、ＴＧＦβＳｍａｄ２−／３シグナル伝達のアクティベーター、ＢＭＰ−／Ｓａｍｄ１、−5−、−８シグナル伝達のアクティベーター、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のモジュレーター、タイロシンキナーゼインヒビター、シンデカン−４インヒビター、レプチンまたはレプチンシグナル伝達のインヒビター、初発症状治療の治療成分、ＴＲＰＶ１のインヒビター、Ｐ２Ｘ７のインヒビター、Ｎａｖ１．７のインヒビター、ＰＧＥ２−形成のインヒビター、非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、ＴｒｋＡのインヒビター、およびＣＯＸ２インヒビターから、変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な該化合物が選択される。
【請求項５】
請求項１または３に記載の、診断かつモニター剤として使用する為の、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）の化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項６】
請求項２または４に記載の、薬物として使用する為の、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉｂ）の化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の、変形性関節症の処置に使用する為の、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）または（1ｂ）の化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１項に記載の、変形性関節症の予防に使用する為の、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）または（1ｂ）の化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか１項に記載の、変形性関節症と関連した痛みの処置に使用する為の、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）または（1ｂ）の化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）または（1ｂ）の化合物、またはその薬理学的に許容される塩、および薬理学的に許容される担体を有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項２，４、および６〜９のいずれか１項に記載の、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（1ｂ）の化合物、またはその薬理学的に許容される塩、および薬理学的に許容される担体を有する薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドラッグデリバリー剤、診断および造影の剤としての治療的な使用のためのＤＯＴＡＭ誘導体に関する。より具体的には、軟骨と結合することができ、変性関節疾患または炎症プロセス（例えば変形性関節症またはリウマチ）の局所的な診断およびモニタリングができる、標的部分を備えるドラッグデリバリー剤、診断および造影の剤に、本発明は関する。
【０００２】
本発明は、式（Ｉ）の1,4,7,10−テトアラザシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸アミド誘導体に関し、
【化１】
2017501214.tif 000003
ここでＺ１〜４、Ｙ１〜４、Ｌ１〜４、Ａ１〜４、およびＭは、あっても無くても良く、そして、式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）に関して、以下で示される意味を有する。
【０００３】
第１の局面によれば、本発明は、診断および造影の剤としての式（Ｉａ）の化合物に関する。第１の局面によれば、本発明は、ドラッグデリバリー剤としての式（Ｉｂ）の化合物に関する。
【０００４】
本発明は、式（Ｉａ）および（Ｉａ）の化合物の調製のための方法、それらを含有する医薬、および医薬品組成物としてのそれらの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００５】
変形性関節症（ＯＡ）は、最も一般的な関節疾患の１つで、進行期に、関節機能喪失に導く。疾患の進行の間、関節軟骨は下にある骨組織まで連続的に破壊され、それは影響を受けた患者における関節置換術を必要とさせる。軟骨の破壊に加えて、軟骨下骨、滑膜、および靭帯の病理学的変化が、観察されさえもできる。本疾患は、一時的に関節リウマチにおけるような炎症プロセスが付随するが、それとは異なる。疾患の正確な原因はまだ知られていない、しかしながら、いくつかの要因（例えば代謝性変化、機械的ストレス、遺伝的疾患または共同の損傷）は問題になる。当初のトリガーにかかわらず、関節軟骨の破壊はＯＡの一般的な病理学的特徴として発生する。ＯＡの病態の鍵となる特徴は、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲンおよびプロテオグリカンのタンパク質分解解離である。同時に、軟骨細胞表現型損失、細胞死、および機能的な軟骨組織を再生することに失敗することになる試みられた同化作用修復メカニズムのような、多くの他の方法が生じ得る。これらの方法の基礎をなしている正確な分子機構は、まだよく分かっていない。
【０００６】
大人の軟骨の好ましい機能はそのユニークな生体力学的特性によって生じ、重圧に対する耐性ならびに組織の必要な弾力を提供する。決定的な要因は、軟骨組織の特別な構成である。大部分の他の組織とは異なり、軟骨細胞は、細胞外基質（ＥＣＭ）の各々とは直接接触せず、分かれて存在する。このＥＣＭの巨大分子は、関節軟骨および関節の生育性を保証する。コラーゲン型ＩＩ、ＩＸ、およびＸＩのフィブリルにより構成されるネットワークから、ＥＣＭの基本構成は成る。極めて高いオスモティック水の結合能力を生じるＥＣＭに、プロテオグリカン、主にアグリカンは存在する。コラーゲン骨格構造の特性に関連して発生した水圧は、軟骨の特異性を保証する。コラーゲン−主にコラーゲンＩＩ−繊維に結合されているグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖の分解および喪失によって、早期または前症状段階の関節病理は特徴づけられる。これらのＧＡＧ鎖はコラーゲン繊維を過剰なタンパク質分解解離から保護しており、ＧＡＧの喪失の結果、コラーゲン繊維がプロテアーゼ分解酵素に近づくことになり、かつ分解解列／処理がコラーゲンネットワークおよび減少したコラーゲンＩＩ含有量の喪失を引き起こすと信じられている。これらの微妙な生化学変化は柔らかい巣状病変の徴候に移行し、ここでコラーゲンＩＩ繊維は露出し、周囲組織は更なるタンパク質分解解離および破壊へと近づく。
【０００７】
ＯＡの病因の主要な特徴は、関節軟骨組織のＥＣＭの喪失である。最終的に、関節機能は制限されるかまたは失われる。構造的および機能的な退化の他に、ＯＡは痛みによって、特徴づけられる。
【０００８】
特定の生体マーカーの欠如のゆえに、および関節の痛みおよびこわばりのような変形性関節症の臨床症状が、Ｘ線撮影または核磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）技術によって、最終的に診断される疾患の後期、進行期にしばしば対応するという事実のゆえに、疾患の早期の診断およびモニタリングは困難である。
【０００９】
変形性関節症のための治療アプローチは、骨リモデリングおよび症状の改善を目的として、要素を保護または回復する軟骨基質を必要とする。ＯＡの最も早期の組織病理病変に属するＥＣＭ（アグリカンおよびコラーゲン）の分析から、ＭＭＰｓ、Ａｄａｍｔｓ、およびカテプシンに対するプロテアーゼインヒビターの開発が治療に関係する。
【００１０】
特定のマトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター、特にＭＭＰ１３に特異的なインヒビターが発見され、変形性関節症の前臨床モデルにおいて、テストされた(Johnson AR et al. J Biol Chem. 2007 282(38):27781-91.関節繊維増殖の副作用なしでin  vivoで軟骨の損傷を減らすマトリックスメタロプロテアーゼ−１３の新規インヒビターの発見およびキャラクタリゼーション。; Baragi, V. M. et al. 変形性関節症の潜在的治療のための強力なマトリックスメタロプロテイナーゼ１３インヒビターの新しいクラス：ラットモデルにおいて、筋骨格毒性のない組織学的および臨床的有効性の根拠:  Arthritis Rheum. 60, 2008-2018 (2009)）。
【００１１】
Ａｄａｍｔｓ−４および−５を阻害するアグリカナーゼインヒビターが開発され、アグリカナーゼインヒビターＡＧＧ−５２３の臨床試験が始動した(US National Library of Medicine. ClinicalTrials.gov [online],http://www.clinicaltrials.gov/ct2/how/ NCT00427687 (2007))。
【００１２】
カテプシンＫインヒビターは変形性関節症のいくつかの実験モデルでＤＭＯＡＤの可能性を示す（カテプシンＫの抑制は前十字靱帯切断ウサギおよび変形性関節症のネズミのモデルの軟骨退化を減らす、Hayami T et al. Bone. 2012 Jun;50(6):1250-9.;カテプシンＫの阻害は自然発生変形性関節症のギニアピッグモデルのＣＴＸＩＩレベルおよび関節痛を和らげる。McDougall JJ, et al. Osteoarthritis Cartilage. 2010 (10):1355-7.。それぞれ、ニュートラルまたは酸性のｐＨでプロテオグリカンを分解させるそれらの能力のため、カテプシンＢとＤを含む他のカテプシンは其々注目された。特に、酸性条件下での生体外プロテオグリカン破壊軟骨移植片は、高活性のカテプシンＤインヒビターであるペプスタチンで阻害され得る（Dingle, J. T.,et al. Inhibition by Pepstatin of Human CartilageDegradation Biochem. J. (1972) 127, 443 444)。
【００１３】
プロ同化作用成長因子ＢＭＰ７は、ＯＡの進行を阻害することを示し、in  vivoで軟骨を修復する能力を有する。第一相試験は、ヒトのＯＡ患者において、ＢＭＰ−７の安全性を示した(Hunter, D. J. et al. 第一相の症候性膝関節変形性関節症におけるBMP-7の安全性および認容性試験。 BMC Musculoskelet. Disord. 11, 232 (2010).)ネズミのＤＭＯＡＤ活性を有する、ＦＧＦ１８（同化作用成長因子）は、臨床試験が進行している（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｒ．Ｆｌｅｃｈｓｅｎｈａｒ、Ｋ．Ｈｅｌｌｏｔ、Ｓ．およびＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ｆ.１年以内に膝手術を必要がない、初発の膝関節の変形性関節症（ＯＡ）患者の単一であるか多用量増量を使用して、関節内に投与されるｒｈＦＧＦ１８のランダム化、二重盲検、プラセボ対照、多施設共同研究。Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １９（ｓｕｐｐｌ．１）、３５−３６（２０１１）。
【００１４】
骨および軟骨のリモデリングを標的にするいくつかの治療的なアプローチは、種々の段階の臨床試験のフェーズにもある：ストロンチウムラネレート（Reginster, J. Y. et al.膝関節の変形性関節症の治療におけるストロンチウムレネレートの有効性および安全性：二重盲検無作為プラセボ対照試験の結果。Ann. Rheum. Dis. 72, 179-186 (2013).;カルシトニン（Karsdal,M. A. et al.経口カルシトニンは症状緩和効果を示し、且つ軟骨ボリュームを増加させる：膝の変形性関節症を有する患者の２年間の第３相試験からの結果。Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １９（ｓｕｐｐｌ．１）、３５（２０１１）。）、ｉＮＯＳ−インヒビターは、ＯＡの症状の制御し、加えてＯＡの構造的進展に影響を及ぼす潜在能力を有する（Hellio le Graverand, M. P. et al.膝の症候性変形性関節症を有する患者における、経口選択的ｉＮＯＳインヒビターcindunistat (SD-6010)の２年間の無作為二重盲検プラセボ対照多施設共同試験  Ann. Rheum. Dis. 72, 187-195 (2012).)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
注射された薬または治療成分の特徴に応じて、１〜２時間未満の滞留時間が観察される。例えば、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）または溶解されたコルチコステロイドは、典型的には１〜２時間以内に除去され、それゆえに、関節内投与を介した長期持続治療にとってはあまりに短い滞留時間を有する。
【００１６】
薬の滞留時間を拡張／延長する現在利用可能なアプローチは、関節空中に受動的な貯蔵庫を形成し、滑液中への活性成分の放出を遅延させる製剤に依存する。この種の製剤は、例えばリポソーム、ヒドロゲル（ヒアルロン酸およびその改質誘導体）、溶解性の低い薬の結晶性懸濁液、微小粒子およびナノ粒子（例えば乳酸-グリコール酸共重合体／ＰＬＧＡ、ポリ乳酸／ＰＬＬＡ）であると同様に、関節の負荷に対して放出が依存する封入された活性成分の薬放出率の制御の悪さ、ならびに滞留時間の不十分な延長を、これらの多くのアプローチは被る。そのうえ、特にアプローチに基づく粒子、例えば懸濁液および微小粒子は、関節腫脹、細胞浸潤、および軽微なレベルのプロテオグリカンの喪失さえ伴う、痛みを伴う炎症（滑膜炎）のような重篤な副作用を誘発し得る。標的とされたドラッグデリバリーは、他の組織の相対濃度を減らすと共に、関連する組織の薬の濃度および滞留時間を増加させることを意図する。選択的および特異的な分布と共に、治療成績を増強する一方で、全体の毒性を最小化し、その薬理学的応答および安全性の尺度としての薬の治療係数は改善された。
【００１７】
関節空への局所的な投与および沈着による関節軟骨の受動的な標的化とは対照的に、能動的な標的化アプローチは、軟骨組織またはその組織成分、例えばコラーゲンまたはＧＡＧへの明瞭な親和性を有することによって、関節組織中の活性成分を保持することを意図する。
【００１８】
ポリマー相当物質と比較して、小分子をベースとする担体は、明確な分子構造、確定した分子量、およびバッチ間変動のない高純度を含む固有の利点を提供する；
しかしながら、我々の知識によれば、関節中での滞留を増加させるための、小分子をベースとするキャリアは報告されていない。
【００１９】
関節内投与を介した診断薬の局所適用は、全身投与に勝るいくつかの利点を提供し、心血管、腎臓、消化器または中枢神経系への副作用を最小化するかまたは回避するのに適している。原則として、これは経口投与での低い生物学的利用率、初回通過代謝、または特定の分布特性のどれかの故であり、著しく低減された投与量という利点を伴う。全身投与によっては到底達成し得ない標的組織での高レベル（１００％の生物学的利用率）が達成され得る。
【００２０】
そのうえ、大多数のＯＡ患者にとって、関節、例えば関節内投与によってアクセスできる膝、手、または足の一つの関節だけが、疾患により影響を受ける。
【００２１】
しかしながら、疾患の初発部位としての関節空の関節軟骨は、無血管状態であるゆえに、滑液を介した体循環とのみ接触し得る離れた位置にある。しかしながら、関節空は激しく洗い落される小室であり、関節内投与を介した局所投与の後に関節に存在する溶解された小分子は、対流輸送およびリンパへの取り込みによって、数時間以内に急速に取り除かれる。
【００２２】
従って、変形性関節症の早期のまたは前駆症状における関節病理所見の診断を可能にする、軟骨欠損の局所的な軟骨組織選択的モニタリングの為の、およびＯＡの早期のまたは前駆症状における関節病理所見の非常に局所的で持続的な治療を可能にする、軟骨欠損への能動的な軟骨標的とした選択的な薬送達の為の、医学上の必要性が存在することは明らかである。
【００２３】
加えて、その投与時点以降に即座に薬キャリアの運命を、および薬が放出される事実をモニターすることも有益であり、このようなモニタリングが、薬放出が行われるかどうか、いつ、どこで行われるかを前もって決定することが望まれている。このような治療診断剤は、放出された薬の送達のin   vivoでの可視化ならびに治療モニタリングに有用であり得る（治療診断)。その方法において、様々な応用、例えば薬送達、薬放出、治療のモニタリング、および侵襲的撮影が統合され得る。例えば、剤または近赤外標識を含有しているＧａｄｏｌｉｎｉｕｍ（ＩＩＩ）を強調するＭＲＩコントラストの組み込みにより、治療剤の局在化は追跡され得る。(E. Terreno et al. J. Control. Release 161 (2012) 328-337; B. D.Smith et al. Bioconjugate Chem. 23 (2012) 1989-2006; N. Zhang et al.Biomaterials 33 (2012) 5363-5375).
【００２４】
磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）は、例えば軟骨のようなヒト軟組織の非侵襲的撮影における主要な進歩である。しかしながらハイコントラストおよび解像度ならびに多平面の可視化の能力にもかかわらず、ＭＲＩは、軟骨組織の変化に関連する中等度から重度の疾患だけをしばしば描出する。コントラストを強調し、組織の異なる領域の間の鮮明度を改善する為に、造影剤、例えばガドペンテテート（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）、ガドテラート（Ｄｏｔａｒｅｍ）、ガドジアミド（Ｏｍｎｉｓｃａｎ）、ガドベナート（ＭｕｌｔｉＨａｎｃｅ）、ガドテリドール（ＰｒｏＨａｎｃｅ）、ガドベルセタミド（ＯｐｔｉＭＡＲＫ）、ガドキセテート（Ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ）およびガドブトロール（Ｇａｄｏｖｉｓｔ）が、現在使用される。これらの低分子量のガドリニウム（ＩＩＩ）複合体は、近傍に位置する陽子の縦方向のＴ１緩和時間および横方向のＴ２緩和時間を短縮する常磁性複合体である。Ｇｄ（ＩＩＩ）で導かれたＴ１短縮は、Ｔ１重みづけ画像におけるシグナル強度を増加させて、これらの画像を明るくさせる。
【００２５】
ＭＲＩの感度およびコントラストを改良するのに適している他のランタニド（ＩＩＩ）イオン複合体は、例えばユウロピウム（ＩＩＩ）またはジスプロシウム（ＩＩＩ）である。
【００２６】
一般に、現在利用可能なＭＲＩ  ＣＡは、ある組織を選択的に標的としてはいない。しかしながら、ＣＡの組織選択的集積化のあり得る影響および有用性は、ＯＡの早期診断の為の、軟骨の遅延ガドリニウムＭＲＩ（ｄＧＭＥＲＩＣ）技術の広範囲にわたる応用により示されることができる。現在、これは、早期の軟骨質変化を評価するのに適している唯一の臨床的に認められた方法で、将来の関節退化が予測できることを証明した。すでに述べたように、早期のＯＡは、減少したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量によって、特徴づけられる。ＧＡＧ（例えば、コンドロイチンスルフェートおよびケラチンスルフェート）は、アグリカンタンパク質骨格構造に結合された強く負に荷電された広範囲な多糖である。
【００２７】
負に荷電されたガドペンテテートＧｄ（ＤＴＰＡ）2−が、正常な軟骨に比べて低下した負電荷の反発のゆえに、ＧＡＧ含有量が減少した軟骨中に豊富され／蓄積されているという事実を、ｄＧＭＥＲＩＣは利用する。早期の生化学的な変化および組織病変の部位に対応する低いＧＡＧ含有量の部位において、より短いＴ１緩和時間またはより高いＭＲＩのシグナル強度という結果を、これはもたらす。このように、ＧＡＧ含有量はＴ１緩和時間に正比例し、設定されたＴ１でのＴ１緩和時間は、ｄＧＭＥＲＩＣインデックスと称される。
ｄＧＭＥＲＩＣインデックスは、ＯＡの早期の軟骨変化を予測可能な、認められた画像生体マーカーである。[A. Bashir et al. Magn Reson Med. 1999;41,857; F. Eckstein et al.Osteoarthritis and Cartilage, 2006, 14, 974; T.E. McAlindon et al.Osteoarthritis and Cartilage, 2011, 19, 399.]
【００２８】
利用できるＣＡの他の大きな欠点は、限られた滞留時間および標的組織、すなわち軟骨中でＣＡが適切な濃度に達する為の困難さである。このような剤の投与の後の画像操作をきわめて短い時間に制限することを要求する、体から急速に消失する傾向が、多くのＣＡはある。類似の条件の下で記録されることができ、明白な診断のために必要である時間およびＭＲＩ画像の数を、これは制限する。ＭＲＩ  ＣＡの非常に望ましい特性は、従って検査部位で高く持続的な濃度に達することである。
【００２９】
組織選択的ＣＡは、診断に関連する部位でコントラストを強調し、罹患部において、より長く留まり、画像処置の完結のための十分な時間を確保する。加えて、このような組織選択的な剤は、所定の設定においてＣＡのより高い局所濃度に達することが可能であり、このように、適切な強調されたシグナルを提供するために必要な全体の量を減らす。
【００３０】
ある組織または細胞コンパートメント中の局所的な疾患に関連したタンパク質の活動度を評価することは、疾患状態の決定または治療手段の成功をモニターすることにとって重要な診断手段でありえる。
【００３１】
多くのタンパク質および酵素が、翻訳後のメカニズムの複雑な配列により制御され、このように発現レベル／量の変化は活性の変化と相関することができないので、これは特に重要である。このために、活動度に基づいたプローブ（ＡＢＰ）が、天然の環境において、標的タンパク質を共有結合でラベルするのに使用され、それにより、疾患に関連した、生理学的に関連した活動部位の異常な酵素活性を評価する強力なツールを提供する。現在まで、このようなＡＢＰは、多くの酵素クラス、例えばセリンヒドロラーゼ（ホスホリパーゼ）、メタロプロテイナーゼ、システイン、セリン、トレオニンおよびアスパラギン酸プロテアーゼ、酸化還元酵素、ホスファターゼ、およびカイネースのために開発されてきた。
【００３２】
原則として、ＡＢＰは、３つの要素から成る：反応性官能基（ウォーヘッド）、該反応性官能基をタグから離して、共有結合的タンパク質−プローブ複合体の可視化および検出を可能にするリンカー。加えて、いくつかのプローブは、追加的な結合基、例えば自然の基質に似ている基、またはプローブの特異性を改良して、特定の残基に対処することにより酵素の関連したサブセットに対して選択性を増強する、認識要素としてのインヒビターを含有できる。酵素の活性部位の触媒残基と反応して、活性部位の求核基と共有結合を形成する求電子基から、反応性官能基は通常成る。このようなＡＢＰのタグは、放射性核種シンチグラフィー断層撮影（例えば９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ）、ポジトロン放射型断層撮影（ＰＥＴ）（例えば６８Ｇａ、６４Ｃｕ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）（例えばＧｄ、Ｙｂ、Ｅｕ、Ｎｄ）、または蛍光ラベル（例えばシアニン染料のような光学的画像成分）のためのγ線エミッタから成ることができる。
【００３３】
ＡＢＰ、蛍光的に消光されたＡＢＰ（ｑＡＢＰ）の更なる開発は、in   vivoでの光学的画像に特に役立つ。これらのプローブは、酵素活性部位との共有結合的反応の際に分離／放出される脱離基を有する反応性官能基を持っている。蛍光消光剤を脱離基に結合させることによって、暗く消光された蛍光発生プローブは得られ、それは、反応している酵素の解離および共有結合による修飾の後に蛍光シグナルを発するだけである。その方法によって、リアルタイムで、非侵襲的な、細胞システムまたは生体系において最大シグナル対バックグラウンドの比を持つ高解像度画像が、得られ得る。反応性官能基を含有し共有結合的に処理酵素を修飾するｑＡＢＰのほかに、このような要素を欠如しているが、天然の基質配列から成る暗く消光された蛍光発生プローブの変種が、導入され有用である事が証明された。このような暗く消光された蛍光発生プローブが、疾患状態を検出して、ＯＡラットモデルの疾患進行を追跡する為にうまく利用されてきた[Kim et al. Amino Acids (2011) 41, 1113; Kim et al. BioconjugateChemstry (2008), 19, 1743.]
【００３４】
より近年、バイモーダルＭＲＩ／光学的画像化ＣＡは、１つの画像化剤において、二重の標識ＭＲＩおよび近赤外蛍光レポーターを使用して導入された。例えばこのようなバイモーダルＣＡを投与することによって、術前ＭＲＩ画像化および手術時の蛍光シグナルは、手術および更に組織学的分析を導くのに有用でありえる。しばしば異なった薬物動態学的特性および画像化時間窓を有している別々の標識薬の投与とは対照的に、バイモーダルＣＡは、同期をとって、同時に通路／間隔の検査を許容する。
【００３５】
単一画像診断法が全体の構造および機能的な情報を提供することができないので、光学的画像およびＭＲＩは、例えば軟骨のような組織および器官に関してより完全な情報を得るために、同時に用いることができる補完的な解析手法である。ＭＲＩは、無制限の深度、高精度、および時間分解能での組織の画像化によって、特徴づけられるが、まだ細胞の画像化のためにはあまりに低い低感度によって、妨げられる。コントラストにおいて、光学的画像化のための蛍光シグナルは高感度を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化への応用を制限する限られた組織浸透性および低解像度を有する。蛍光レポーターの中で、生体系での天然の近赤外（ＮＩＲ）蛍光の欠如、ＮＩＲ光子の低い散乱性、およびＮＩＲ光子が非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のために大きな組織深度を横切ることができるという事実のため、画像化の為のＮＩＲラベルは生物学的応用に適合している。
【００３６】
さらに、細胞内画像化は、今日までに、現在利用可能なＭＲＩ  ＣＡにより達成されることができていない。しかしながら、これは、細胞透過性光学的画像化剤での一般的な手法である。このように、バイモーダル細胞透過性ＣＡは、両方の技術の利点を結合して、より高い解像度および感度での画像診断を可能にする。
【００３７】
バイモーダルＭＲＩ／光学的画像化剤は、同一の薬物動態学および生体分布、同時にＭＲＩおよびＮＩＲ光学的画像化技術を利用して、in   vivoでの分子画像化実験のより正確な解釈を可能にする生体内分布滞留時間、ならびに組織および組織辺縁の正確な外科的除去のための手術時のガイダンスを有する更なる利点を有する。ＭＲＩを通して統合された術前トポグラフィー情報、および疾患のある関節の手術の間の手術時の光学的画像化のための集約的アプローチを提供すること。
【００３８】
Ｊ．Ｈｕｂｂｅｌｌらは、特定のペプチド配列ＷＹＲＧＲＬ（SEQ ID NO:1）［ＴｒｐＴｙｒＡｒｇＧｌｙＡｒｇＬｅｕ］がコラーゲンＩＩ結合を介した軟骨結合特性を表す官能化されたポリマーに基づくナノ粒子を報告した。比較として、非結合性のスクランブル化オリゴペプチド配列ＹＲＬＧＲＷ（(SEQ ID NO:2）が対照として使用された(J. Hubbellet al, Nature materials (2008), 7, 248)。
【００３９】
硫酸化されたおよびカルボキシル化されたＧＡＧの高度に固定された負の電荷密度は、高い親水性環境を生み出し、大量の間質の水を結合する。そのような方法で、圧縮に抵抗しかつ負荷を分散させる組織の、可逆的な弾力性は維持される。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
本発明に従い、この環境で複数の正電荷を持っている剤は、長い滞留時間を呈し、かつ負に荷電されたＧＡＧとの静電引力のゆえにより高い局所的濃度を成し遂げることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ブタ軟骨移植片でのEx Vivo研究である
【図２−１】プローブHHY-306（CP），HHY-312（1TP），HHY-322（1SP），HHY-290（3TP），およびHHY-293（3SP）に基づいたDOTAMのIn vivo薬物動態である
【図２−２】プローブHHY-306（CP），HHY-312（1TP），HHY-322（1SP），HHY-290（3TP），およびHHY-293（3SP）に基づいたDOTAMのIn vivo薬物動態である
【図３】ブタ関節軟骨移植片のグリコサミノグリカン（GAG）放出のEx vivo測定（HHY-327 1P1IとHHY-299 3P1I）である
【図４】HHY-316Gd対対照Gd-DTPAでインキュベートされた軟骨のMRI画像
【図５】造影剤HHY-316-Gd（左）とHHY-341Gd（右）の注射後の24時間後のラット膝のMRI画像である
【図６】T1-強調画像における大腿骨軟骨領域、脛骨成長板領域、注射部位領域、筋領域、骨領域、滑膜領域、及び標準領域の高精度画像である
【図７】HHY-316Gd（左）とHHY-341Gd（右）の注射前後の軟骨と成長板の標準化強度（平均±標準誤差、n＝4）のプロットである
【図８】HHY-316Gd（左）とHHY-341Gd（右）の注射前後の滑膜領域の標準化平均強度である
【図９】HHY-316Gd（左）とHHY-341Gd（右）の注射前後の注射領域の標準化強度（ｎ＝4）のプロットである
【図１０】HHY-316Gd（TCA）（左）とHHY-341Gd（右）の注射前後の骨領域の標準化平均強度（n＝4）のプロットである
【図１１】HHY-316Gd（TCA）（左）とHHY-341Gd（NCA）（右）の注射前後の筋領域の標準化平均強度（n＝4）のプロットである
【図１２】（a）造影剤HHY-316Gd-338Gdの注射24時間後のラット膝のin vivo  MR画像である
【図１３】48時間後の非手術膝関節の関節軟骨中のプローブの分布である
【図１４】2A型プロコラーゲンの免疫蛍光染色である
【発明を実施するための形態】
【００４２】
従って、本発明の他の局面は、生理学的ｐＨ（典型的には５〜８）で正に荷電し、高度に負に荷電したＧＡＧと相互作用することが可能である、（ポリ）カチオン部分の特徴と、ＷＹＲＧＲＬペプチド配列の特性を保持している軟骨との組合せである。カチオン部分は、置換または非置換のアミン、グアニジン、およびアミジンによって、好ましくは導入される。
【００４３】
標的部分、例えばペプチド類の親和性、生体分布、および滞留は、結合されたレポーター基、または結合された薬またはプロドラッグにより影響を受ける。ある場合においては、レポーター基、薬またはプロドラッグは、標識されていないか結合されていない標的部分と比較して、これらの特性に負の影響を与え得る。これは、マルチモーダル造影剤において、いっそう原則としてあてはまる。標的部分と造影剤（ＣＡ）の診断ラベルの間、または、標的部分と結合された薬またはプロドラッグの間の割合を大きくすることによって、標的部分の多量体化を介して、診断ラベルの、または薬またはプロドラッグの負の影響は、軽減され得る。さらに、一価のＣＡと比べて高まった組織選択性、改良された生体分布および滞留時間が得られ得る。診断レポーターのリガンドタンパク相互作用、超加成性現象、およびシールド効果のより高い統計的頻度および確率の様なファクターは、このような改善に貢献でき得る。
【００４４】
対応するテンプレート1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸（ＤＯＴＡ）に任意的には多価で結合され、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）レポーター、光学蛍光レポーターまたは両方に結合された軟骨標的／コラーゲンＩＩ型標的ペプチド配列の合成および応用を、本発明は記載している。
【００４５】
他の局面に従い、対応するテンプレート1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸（ＤＯＴＡ）に任意的には多価で結合され、治療的に活性な薬におよび任意的には磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）レポーターに結合された軟骨標的／コラーゲンＩＩ型標的ペプチド配列の合成および応用を、本発明は記載している。
【００４６】
多価に装飾されたＤＯＴＡ誘導体は、軟骨を能動的に標的し、それに結合し、関節中での局所滞留時間を長引かせることができる、定義された、ペプチドを表す、単量体単位として働く。これらの特徴は、更なる（ポリ）カチオン部分を導入することで、さらにサポートされることができる。このように、急速な排出は、滑液を介して防がれる。変形性関節炎または慢性関節リウマチおよび随伴する合併症の治療のために軟骨と選択的に結合する治療剤または診断剤の局所的な投与のために、本発明の化合物がそれ故用いられることが可能である。記載されている化合物は、能動的に軟骨組織を標的とし結合するよう設計されており、このようにこれらの診断剤および治療剤の重大な全身血漿中濃度および全身への暴露を防ぎ、このように有害な副作用を防止するのに役立つ。
【００４７】
このように、本発明の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩であり、
【化２】
2017501214.tif 000004
ここでＭは、存在しないかまたは存在し、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９Ｍｏの群からの正に荷電した金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から選ばれ；
ｎは、１および２から選択され：
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選らばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Y３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−
【化３】
2017501214.tif 000005
から互いに独立して選ばれ；
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−（SEQ ID NO:1）［ＴｒｐＴｙｒＡｒｇＧｌｙＡｒｇＬｅｕ］SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有する該ポリペプチドであり、ここで該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●光学的画像化に適している蛍光体；
●ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されており；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、光学的画像化に適している蛍光体またはＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）であり；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している１より多い、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表すことはできない。
【００４８】
このように、本発明の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉｂ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩であり、
【化４】
2017501214.tif 000006
ここで
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から互いに独立して選択され；
ｎは、１および２から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選らばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは、互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっていて、結合手、解離可能なリンカー、−Ｙ５−（Ｚ５）ｒ、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）
【化５】
2017501214.tif 000007
から互いに独立して選択され、
ここで、ｒは１〜３から選択され、Ｙ５は解離可能なリンカー、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）、Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）から選択され、Ｚ５はＺ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４について定義された通りであり；
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に役立つ化合物；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、上記に定義されているように変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な化合物を表す。
【００４９】
他の局面に従い、本発明の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、である式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩に従い、
【化６】
2017501214.tif 000008
ここで
Ｍは、存在しないかまたは存在し、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９Ｍｏの群からの正に荷電した金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から互いに独立して選択され；
ｎは、１および２から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選らばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは、互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Y３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−
【化７】
2017501214.tif 000009
から互いに独立して選ばれ、
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●蛍光体；
●活性に基づいたプローブ（ＡＢＰ）；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されており；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、蛍光体または活性に基づいたプローブ（ＡＢＰ）を表し；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、１より多い、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表すことはできない。
【００５０】
更なる局面によれば、本発明は上記に定義されているように式（Ｉｂ）の化合物に関し、ここで、ＭＭＰ１３のインヒビター、組換え型メタロプロテイナーゼインヒビター−３、ＡＤＡＭＴＳ４／５、カテプシンＤ、カテプシンＫインヒビター、カテプシンＳまたはＢのインヒビター、ｕＰＡ、ｔＰＡ、ＨＴＲＡ１、ＰＡＣＥ４に対するセリンプロテアーゼインヒビター、補体系のインヒビター、Ｃ１ｓ、Ｃ１ｒ、Ｃ３、Ｃ５または膜侵食複合体に対するインヒビター、前炎症性サイトカイン、インターロイキン１転換酵素、組換え型インターロイキン１受容体拮抗剤に対するインヒビター、前炎症性細胞内シグナル伝達経路またはｐ３８−経路に対するインヒビター、ＦＡＫ−シグナル伝達のインヒビター、Ｔｏｌｌ様レセプター、ドキシサイクリン、グルコサミン−ハイドロクロライド、コンドロイチンサルフェートに対するインヒビター、標準的なＷＮＴシグナル伝達のインヒビター、フリズルドレセプターのインヒビター、ＧＳＫ３βのモジュレーター、ＳＧＫ−１、組換え型Ｗｉｆ１、組換え型ＳＦＲＰ、組換えＤＫＫ−１のインヒビター、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６、組換え型Ｓｏｓｔのインヒビター、軟骨細胞肥大化のインヒビター、ＨＤＡＣ−４モジュレーター、ＦＧＦＲ３アゴニスト、組換え型ＰＴＨｒＰ、軟骨細胞同化分子、ＴＧＦβＳｍａｄ２−／３シグナル伝達のアクティベーター、ＢＭＰ−／Ｓａｍｄ１、−5−、−８シグナル伝達のアクティベーター、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のモジュレーター、タイロシンキナーゼインヒビター、シンデカン−４インヒビター、レプチンまたはレプチンシグナル伝達のインヒビター、初発症状治療の治療成分、ＴＲＰＶ１のインヒビター、Ｐ２Ｘ７のインヒビター、Ｎａｖ１．７のインヒビター、ＰＧＥ２−形成のインヒビター、非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、ＴｒｋＡのインヒビター、およびＣＯＸ２インヒビターから、変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な該化合物が選択される
【００５１】
変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に役立つ化合物は、タンパク質、ペプチド、ステープルドペプチド、抗体、ナノボディ、ラマ抗体、アプタマー、小分子、小分子のプロドラッグまたは他の形態でありえる。
【００５２】
ＭＭＰ１３（例えばＰＧ−１１６８００）のインヒビター、組換え型メタロプロテイナーゼインヒビター−３（ＴＩＭＰ−３）、ＡＤＡＭＴＳ４／５（例えばＡＧＧ−５２３、米国特許出願公開番号第２００７／００４３０６６号）、カテプシンＤ（例えばペプスタチンＡ）、カテプシンＫインヒビター（例えばＯＮＯ−５３３４またはオダナカチブ）、カテプシンＳまたはＢのインヒビター（例えばＡｃ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓｉｎａｌ、ＣＡ−０７４、ＶＢＹ−３７６）、ｕＰＡ、ｔＰＡ、ＨＴＲＡ１、ＰＡＣＥ４に対するセリンプロテアーゼインヒビター、補体系（例えば組換え型Ｃ１インヒビターたんぱく質）のインヒビター、Ｃ１ｓ、Ｃ１ｒ、Ｃ３、Ｃ５または膜侵食複合体（Ｃ５ｂ−９を含むＭＡＣ）に対するインヒビター、前炎症性サイトカイン（例えばＩＬ１βまたはＴＮＦα）、インターロイキン１転換酵素（ＩＣＥ）、組換え型インターロイキン１受容体拮抗剤、前炎症性細胞内シグナル伝達経路（例えばＮｆｋａｐｐａＢ）またはｐ３８−経路対するインヒビター、ＦＡＫ−シグナル伝達のインヒビター、ＴＯＬＬ様受容体拮抗剤（ＴＬＲ−２またはＴＬＲ−４）、ドキシサイクリン、グルコサミン−ハイドロクロライド、コンドロイチンスルフェート、強度標準的なＷＮＴのシグナル伝達インヒビター（ＷＮＴ−β−カテニン）（例えばＷＮＴ−分子のインヒビター（例えばＷｎｔ３ａ、Ｗｎｔ１０ｂ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターのインヒビター、ＧＳＫ３βのモジュレーター、ＳＧＫ−１のインヒビター、組換え型Ｗｉｆ１、組換え型ＳＦＲＰ（ＦｒｚＢ）、組換え型ＤＫＫ−１、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のインヒビター、組換え型Ｓｏｓｔ、軟骨細胞肥大化のインヒビター（例えばＨｉｆ２α、Ｒｕｎｘ２、インドハリネズミ、ｓｉｒｔｕｉｎ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、またはＧＰＥＲのインヒビター）、ＨＤＡＣ−４モジュレーター、ＦＧＦＲ３アゴニスト、組換え型ＰＴＨｒＰ、軟骨細胞同化分子（例えば組換え型ＦＧＦ１８、組換え型ＦＧＦ２、ＢＭＰ−２ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ５、ＴＧＦβ１、−２、−３）、ＴＧＦβ−Ｓｍａｄ２−／３シグナル伝達のアクティベーター、ＢＭＰ−／Ｓａｍｄ１、−5−、−８シグナル伝達のアクティベーター、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のモジュレーター、タイロシンキナーゼインヒビター（例えばＤＤＲ−１またはＤＤＲ２）、シンデカン−４インヒビター、レプチンまたはレプチンシグナル伝達のインヒビター、初発症状治療による治療成分（痛みの緩和）、ＴＲＰＶ１のインヒビター（例えばカプサイシン）、Ｐ２Ｘ７のインヒビター、Ｎａｖ１．７のインヒビター、ＰＧＥ２−形成のインヒビター、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）（例えばアセトアミノフェンジクロフェナク、イブプロフェン、フェンタニル、イブプロフェン、インドメタシン）、トリアムシノロンのようなコルチコステロイド、ＴｒｋＡのインヒビター、およびＣＯＸ２インヒビター（例えばセレコキシブまたはロフェコキシブ）から、変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な該化合物が選ばれる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、コルチコステロイド、ＣＯＸ２インヒビター、例えばセレコキシブまたはロフェコキシブ、または他の非ステロイド性抗炎症薬、ＭＭＰ−１３インヒビター、例えばＡｇｇ−５２３のようなＡＤＡＭＴＳ４／５のインヒビター、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Lysinal、ＣＡ−０７４、ＶＢＹ−３７６のようなカテプシン−Ｂ−インヒビターまたはＰｅｐｓｔａｔｉｎのようなＣａｔｈｅｐｓｉｎＤインヒビター、ＯＮＯ−５３３４またはオダナカチブのようなカテプシンＫインヒビター、ＰＧＥ２合成のインヒビターから、変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な化合物は選択される。
【００５４】
ポリペプチドの機能を損なうことなく、少なくとも一つのアミノ酸が、別のものと置き換えられることを、ポリペプチドの保存的置換は意味し、それは軟骨組織と特異的に結合すべきものである。
【００５５】
語「解離可能なリンカー」はリンカーシステムを記述し、たとえば前記リンカーへのプロテアーゼの作用による酵素的処理、または硫黄または酸素含有残基による求核攻撃、またはｐＨの変化による加水分解、または照射のいずれかにより解離され、それにより興味の部位で薬のより高い濃度を自由にさせる。解離可能なリンカーの例は当業者に公知であり、文献、例えばG. Leriche et al., Bioorg.Med. Chem. 20 (2012) 571-582およびその引用文献に記載されている。
【００５６】
解離可能なリンカーは、下記の表１に示すようなリンカー基から、選択されることもできる。
【表１】
2017501214.tif 000010
【００５７】
酸−標識リンカーシステム、例えば３級−ブチルオキシカルボニル、パラメトキシベンジル、ジアルキルまたはジアリールジアルコキシシラン、オルソエステル、アセタール、ｂ−チオプロパネート、ケタール、ホスフォアミダート、ヒドラゾン、ビニルエーテル、イミン、アコニチル、トリチル、ポリケタール、および例えばLeriche et al., Bioorg. Med. Chem. 20 (2012) 571-582のスキーム８に例示されるリンカーから、解離可能なリンカーは選択されることもできる。
【００５８】
オルト−ニトロベンジル誘導体、フェンアシルエステル誘導体のような光解離可能システム、および他の光解離可能リンカー、例えばオルト−ノートリベンジルをベースとしたリンカー、フェンアシルエステルをベースとしたリンカー、８−キノリニルベンゼンスルホナートリンカー、ジクマリンリンカー、６−ブロモ−７−アルコキシクマリン−４−イルメトキシカルボニル、ビマンをベースにしたリンカー、ビス−アリールヒドラゾンをベースにしたリンカー、例えばLeriche et al., Bioorg.Med. Chem. 20 (2012) 571-582のスキーム８に例示されたリンカーから、解離可能なリンカーは選択されることもできる。
【００５９】
解離可能なリンカーは、P.J. Jaun et al, Angew Chem Int Ed Engl. 2013 Jan 28;52(5):1404-9から選択されることができる。
【００６０】
ジメチルアミノクマリン誘導体、好ましくは７−ジメチルアミノクマリン−４酢酸スクシンイミジルエステル、ダンシル、５／６−カルボキシフルオレセインおよびテトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ−４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／５５０−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−６５０／６６５−Ｘ、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ６３５、Ａｌｅｘａ６４７、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン３Ｂ（Ｃｙ３Ｂ）、シアニン５（Ｃｙ５）、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン７（Ｃｙ７）、シアニン７．５（Ｃｙ７．５）、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  ６００、ＡＴＴＯ  ６５５、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５４７、ＤＹ−６３２、ＤＹ−６４７の群からの化合物を、語「蛍光体」は説明する；蛍光タンパク質、例えば、異なる吸収／放出特性を有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＧＦＰの修飾たんぱく質も有用である。ある希土類金属（例えば、ユーロピウム、サマリウム、テルビウムまたはジスプロシウム）の複合体たとえば蛍光ナノクリスタル（量子ドット）が、ある状況において、用いられる。ジメチルアミノクマリン誘導体、好ましくは７−ジメチルアミノクマリン−４酢酸スクシンイミジルエステル、ダンシル、５／６−カルボキシフルオレセインおよびテトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ−４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／５５０−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−６５０／６６５−Ｘ、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ６３５、Ａｌｅｘａ６４７、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン３Ｂ（Ｃｙ３Ｂ）、シアニン５（Ｃｙ５）、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン７（Ｃｙ７）、シアニン７．５（Ｃｙ７．５）、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  ６００、ＡＴＴＯ  ６５５、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５４７、ＤＹ−６３２、ＤＹ−６４７から成る群から選ばれる蛍光体が、最も好ましい。光学画像化部分の好ましい例は、カルバシアニン、オキサシアニン、チアシアニン、およびアザシアニンの群からのシアニン染料である。シアニン染料は、一重および多重、好ましくは二重結合の炭素−炭素結合が交互に繋がっている奇数個の炭素原子を含有するポリエン鎖により定義される化合物であり、アミノ基によって、両方の末端が終了し、その一つは4級化されている。シアニンおよび類似体アール−リンカー−アリール発色団は、ペンダントまたは縮合環置換基を任意的に担っている。シアニン染料は、多様な分光特性および利用可能な構造のバリエーションのため特に有用である。シアニン染料の範囲は周知で、テストされ、それらは低い毒性を有して、市販である。シアニン染料は、良好な水溶性を有する非常に濃色の染料の一つのファミリーである。それらは、ｐＨ３〜１０の間でｐＨに鈍感であり、低い非特異的結合性を呈し、フルオレセインより光安定である。
【００６１】
蛍光エネルギー共鳴伝達（ＦＲＥＴ）に適している距離で結合され、ＡＢＰ解離可能なリンカーにより結合された２つの適切な蛍光体を含有する残基を、語「ＡＢＰ」（活性に基づくプローブ）は云う。ＡＢＰ解離可能なリンカーは、２〜１２のアミノ酸から成り、ＭＭＰ−１３、ＡＤＡＭＴＳ４／５、ＣａｔｈＤ、または他の関連したタンパク質のような治療的に関連したプロテアーゼにより認識される解離配列を有するペプチドであり、Ｃ１−Ｃ１６−アルキル、ポリエチレングリコール鎖、エーテル、アルキルアミンまたは他の残基を介して置換又は、結合され得る。
【００６２】
Ｚ１が蛍光体である場合の他の実施形態に従い、例えばシステム変化の前記リンカーシステムの蛍光強度の解離が起きると、上記に定義されているように、ＦＲＥＴを可能にする距離で結合され、ＡＢＰ解離可能なリンカーにより連結された第２の蛍光体から、ＡＢＰは成ることができる。
【００６３】
あるいは、ＡＯＭＫ（アシルオキシメチルケトン）、エポキシド、フルオロケトン、または例えば興味のプロテアーゼの活性中心と、例えば新しい共有結合を形成する反応性システインと反応できる当業者に知られている類似物のような、反応性捕獲基を、ABPは含有することができ、それによって、前記酵素を標識し、分子（ＺまたはＤＯＴＡを含有する）の一部を標的タンパク質に結合させる。
【００６４】
例として、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４が 基、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１） − 、例えば−ＣＯ−ＮＨ−を表す場合、前記基はそれぞれＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４、およびＺ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４に、以下のように結合されることが理解されるべきである：
【化８】
2017501214.tif 000011
【００６５】
同じことが、他の全ての置換基の他の全ての定義にあてはまる。
別の例として、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４がポリペプチドＷＹＲＧＲＬ−を表すときに、基が以下の通りにそれぞれＹ１、Ｙ２、Y３、およびＹ４にリンクされることが理解されるべきである：
【化９】
2017501214.tif 000012
【００６６】
本発明は、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物のすべての立体異性体、例えばシス／トランス異性体を含むすべてのエナンチオマーおよびジアステレオマーを包含する。あらゆる割合の、二つ以上の立体異性体、例えばシス／トランス異性体を含むエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物を、本発明は同様に包含する。式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物に含有される不斉中心は、Ｓ配置またはＲ配置を全て互いに独立に含有できる。エナンチオマーとして純粋な形および基本的にエナンチオマーとして純粋な形の、そしてそれらのラセミ体、すなわち１：１のモル比の２つのエナンチオマーの混合物の形の、およびあらゆる割合の２つのエナンチオマーの混合物の形のエナンチオマー（左旋性および右旋性鏡像体の両方）に、本発明は関する。純粋なおよび基本的に純粋なジアステレオマーの形の、そしてあらゆる割合の２以上のジアステレオマーの混合物の形のジアステレオマーに、本発明は同様に関する。純粋な形および基本的に純粋な形の、そしてあらゆる割合のシス異性体とトランス異性体の混合物の形の、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物のすべてのシス／トランス異性体を、本発明は包含しさえする。
シス‐トランス異性は、置換された環において、起こりえる。所望なら、常法に従った混合物の分割によって、例えばクロマトグラフィまたは結晶化によって、または合成で立体化学的に同一の出発化合物を用いて、または立体選択的反応によって、個々の立体異性体の調製を、実施できる。任意的に、立体異性体の分離の前に、誘導体化を、実施できる。立体異性体の混合物の分離は、式（Ｉ）、（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物の段階で、または合成の間の中間体の段階で行われることができる。例えば、不斉中心を含有している式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物の場合、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物のラセミ体を調製し、標準的方法に従いキラル相高速液体クロマトグラフィーでエナンチオマーに分割することによって、またはこのようなクロマトグラフィによって、または光学活性アミンまたは酸によるその塩の結晶化によって、合成経路の中間体のエナンチオマーを、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の最終的な化合物のエナンチオマーの形に変換することによって、またはエナンチオマー選択的合成経路によって、個々のエナンチオマーを、調製できる。本発明は、式（Ｉ）（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物のすべての互変異性体を有しさえする。
【００６７】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の遊離の化合物、すなわち酸性および塩基性の基が塩の形で存在しない化合物の他に、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物の生理学的または毒性的に受け入れられる塩、特にそれらの薬理学的に許容される塩を、本発明は包含し、それらは式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物中の一つ以上の酸性または塩基性基、例えば塩基性複素環の部分に形成されることができる。このように無機または有機塩基によって、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物は酸性基上で非プロトン化されることができ、例えば、アルカリ金属塩の形で使用されることができる。少なくとも一つの塩基性基を有する式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物は、酸付加塩の形、塩酸塩のような例えば無機酸および有機酸を有する薬理学的に許容される塩の形で調製され、使用されることができ、例えばこのようにハイドロクロライドの形で存在する。慣用的な手順に従い、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の酸性および塩基性化合物から、溶媒または希釈液中での酸または塩基との反応により、塩は一般的に調製されることができる。式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物が分子中に酸性のおよび塩基性基を同時に含有する場合、本発明は記載の塩の形態に加えて分子内塩（ベタイン、双極性イオン）を包含さえする。低い生理学的許容度のゆえに、医薬としての使用に直接適していないが、化学反応のための、または生理学的に許容される塩の調製（例えば陰イオン交換または陽イオン交換による）のための中間体として適している式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物のすべての塩を、本発明は包含しもする。
【００６８】
例えば生理学的条件の下に存在している式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物の様々なプロトンの状態を、本発明は包含しさえする。
【００６９】
本発明の他の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、である式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩であり、
【化１０】
2017501214.tif 000013
ここでＭは、存在しないか存在し、正に荷電されたＧｄ金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３,およびＡ４は、互いに独立して、同一であるか異なっており、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−であり、ここでｍ、ｑ、およびｐは互いに独立して同一であるか異なっており、且つ整数０、１、２、３、４および５であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、− （Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１） −、 −Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−から互いに独立して選択され；
Ｒ１は、水素および（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルから互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●光学的画像化に適している蛍光体；
●ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されており；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１つは、光学的画像化に適している蛍光体、またはＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表し；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している１より多い、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表すことはできない。
【００７０】
本発明の他の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、である式（Ｉｂ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩であり、
【化１１】
2017501214.tif 000014
ここで  Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、且つ−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−であり、ここでｍ、ｑ、およびｐは互いに独立して同一であるか異なっており、且つ整数０、１、２、３、４および５であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、− （Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１） −、 −Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−から互いに独立して選択され；
Ｒ１は、水素および（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルから互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に役立つ化合物；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されており；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、上記に定義されているように変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な化合物を表す。
【００７１】
本発明の他の課題は、上記記載の様に式（Ｉｂ）の化合物、それらの立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、およびそれらの薬理学的に許容される塩であり、ここで変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な該化合物は、コルチコステロイド、ＣＯＸ２インヒビター、非ステロイド性抗炎症薬、ＭＭＰ−１３インヒビター、ＡＤＡＭＴＳ４／５インヒビター、カテプシンＢ−インヒビター、ＣａｔｈｅｐｓｉｎＤインヒビター、ＣａｔｈｅｐｓｉｎＫインヒビター、およびＰＧＥ２合成のインヒビターから選択される。
【００７２】
本発明の他の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、である式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩であり、
【化１２】
2017501214.tif 000015
ここで
Ｍは、存在しないか存在し、正に荷電されたＧｄ金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、同一であり且つ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は同一であり、且つ−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−であり、ここで、ｍ、ｑ、およびｐは同一であり且つ２であり；
Ｙ１、Ｙ２、Y３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なり、且つ−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−から互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●光学的画像化に適している蛍光体；
●ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されており；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１つは、光学的画像化に適している蛍光体、またはＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表し；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、ＯＡの発症および進行に関わるたんぱくの異常発現または質活性をモニターするのに適している１より多い、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表すことはできない。
【００７３】
本発明の他の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、である式（Ｉｂ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩であり、
【化１３】
2017501214.tif 000016
ここで
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、同一であり且つ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は同一であり、且つ−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−であり、ここで、ｍ、ｑ、およびｐは同一であり且つ２であり；
Ｙ１、Ｙ２、Y３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なり、且つ−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−から互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に役立つ化合物；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、上記に定義されているように変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な化合物を表す。
【００７４】
本発明の他の課題は式（Ｉｂ）の化合物、それらの立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、およびそれらの薬理学的に許容される塩であり、上記記載の様にここで変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な化合物は、コルチコステロイド、ＣＯＸ２インヒビター、非ステロイド性抗炎症薬、ＭＭＰ−１３インヒビター、ＡＤＡＭＴＳ４／５インヒビター、カテプシンＢ−インヒビター、カテプシンＤインヒビター、カテプシンＫインヒビター、およびＰＧＥ２合成のインヒビターから選択される。
【００７５】
本発明の他の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、である式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩であり、
【化１４】
2017501214.tif 000017
ここでＭは、存在しないか存在し、正に荷電されたＧｄ金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、同一であり且つ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は同一であり、且つ−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−であり、ここで、ｍ、ｑ、およびｐは同一であり且つ２であり；
Ｙ１、Ｙ２、Y３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なり、且つ−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−から互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのポリペプチド配列、ここで、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●光学的画像化に適している蛍光体；
ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列を有するポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されており；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、光学的画像化に適した蛍光体を表す。
【００７６】
本発明の他の課題は、上記のように式（Ｉａ）の化合物であり、ここで光学的画像化に適している蛍光体がシアニン５．５である。
【００７７】
本発明の他の課題は、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれか、である式（Ｉｂ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩であり、
【化１５】
2017501214.tif 000018
ここで
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、同一であり且つ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は同一であり、且つ−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−であり、ここで、ｍ、ｑ、およびｐは同一であり且つ２であり；
Ｙ１、Ｙ２、Y３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なり、且つ−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−から互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのポリペプチド配列、ここで、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●カテプシンＤのインヒビター。
ただし：
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列を表し、ここで、ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されており；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列有しているポリペプチドを表し、ここで、、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、カテプシンDのインヒビターを表す。
【００７８】
本発明の他の課題は、上記のように式（Ｉｂ）の化合物であり、ここでカテプシンＤのインヒビターがペプスタチンＡである。
【００７９】
本発明の他の課題は、下記で概括され、それによって、式Ｉの化合物およびそれらの合成経路において生ずる中間体およびそれらの塩が入手できる、式Ｉの化合物の調製のための方法である。それ自体は当業者に知られている手順および技術を利用することによって、式Ｉの化合物を、調製できる。
【００８０】
ペプチド合成
当業者は本発明に記載されているペプチドを調製するために、様々な異なる方法に気づく。これらの方法は、合成アプローチおよび組換え遺伝子発現を含むが、これに限定されない。このように、これらのペプチドを調製する１つの方法は、溶液中または固体担体上での合成、およびそれに続く単離および精製である。ペプチドを調製する異なる方法は、ペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列が導入された宿主細胞中での遺伝子発現である。あるいは、遺伝子発現は、細胞システムを利用せずに達成されることができる。上記の方法は、いずれかの方法で結合されることもできる。
【００８１】
本発明のペプチドを調製する好ましい方法は、適切な樹脂上の固相合成である。固相ペプチド合成は、確立した方法論である（例えば、：Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce ChemicalCo., Rockford, Ill., 1984; E. Atherton and R. C. Sheppard, Solid Phase PeptideSynthesis. A Practical Approach, Oxford-IRL Press, New York, 1989参照）。解離可能なリンカーを担っている不活性固体担体にカルボキシ末端を有するＮ−末端が保護されたアミノ酸を結合させることにより、固相合成は開始される。この固体担体は、第一のアミノ酸のカップリングを可能にする任意のポリマー、例えばカルボキシ基（またはＲｉｎｋ樹脂の場合にはカルボキサミド）の樹脂への結合が酸（Ｆｍｏｃ戦略が用いられる場合に）に敏感である、トリチル樹脂、塩化トリチル樹脂、ワング（Ｗａｎｇ）樹脂、またはリンク（Ｒｉｎｋ）樹脂であることもできる。ペプチド合成の間、αアミノ基を脱保護するために用いられる条件の下で、該ポリマーまたは高分子体は安定でなければならない。
【００８２】
第一のアミノ酸が固体担体に結合されたあと、このアミノ酸のαアミノ保護基は取り除かれる。残った保護されたアミノ酸はその後適切なアミドカップリング試薬（例えばＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム）、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニウム）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンズトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム）またはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いてペプチド配列により表される順番で次々にカップリングされ、ここでＢＯＰ、ＨＢＴＵ、およびＨＡＴＵが、第三アミン塩基と共に使われる。あるいは、自由にされたＮ末端は、アミノ酸以外の他の基、例えばカルボン酸などによって、官能化されることができる。
【００８３】
通常、アミノ酸の反応性側鎖基は、適切な保護基により保護される。所望のペプチドが組み立てられたあと、これらの保護基は取り除かれる。それらは、同じ条件の下で樹脂からの所望の生成物の解離に付随して取り出される。保護基および保護基を導く方法は、Organic Synthesis, 3d ed., Greene, T. W. and Wuts, P. G. M., Wiley& Sons (New York: 1999)中において、見い出されることができる。
【００８４】
他の側鎖保護基が残ったまま、選択的に取り除かれることができる側鎖保護基を有することが、いくつかの場合においては望ましいかもしれない。この場合、自由にされた官能基は、選択的に官能化されることができる。例えば、酸性条件、例えばジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸に不安定であるＰｍｃ保護基によって、アルギニンを、保護できる。このように、求核塩基に不安定な保護基で、Ｎ末端アミノ基およびすべての側鎖官能基が保護される場合、Ｐｍｃ 2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基はジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸を用いて選択的に取り除かれることができ、例えばアシル化によって、対応する遊離グアニジノ基はその後さらに修飾されることができる。最後に、ペプチドは樹脂から解離される。Ｋｉｎｇのカクテル(D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide ProteinRes. 36, 1990, 255-266)を用いて、これを、達成できる。それから、原材料は、必要に応じてクロマトグラフィ（例えば準備のＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製されることができる。
【００８５】
言及されることができる保護基の例は、ベンジル保護基、例えばヒドロキシ化合物のベンジルエーテルおよびカルボン酸のベンジルエステル（ベンジル基はパラジウム触媒の存在下で、触媒的水素化によって、そこから取り除かれることができる）、３級−ブチル保護基、例えばカルボン酸の３級−ブチルエステル（３級−ブチル基はトリフルオロ酢酸によって、そこから取り除かれることができる）、アシル保護基、例えばヒドロキシ化合物およびアミノ化合物のエステル（それは酸または塩基加水分解で再び解離されることができる）、またはアルコキシカルボニル保護基、例えばアミノ化合物の３級−ブトキシカルボニル誘導体（それはトリフルオロ酢酸での処理で再び解離されることができる）である。式Ｉの化合物は、固相法により調製されることもできる。このような合成アプローチにおいては、固相は保護基の意味を有し、固相からの解離は保護基の除去とみなされることもできる。このような技術の使用は、当業者に知られている(cf. Burgess K (Ed.), Solid Phase Organic Synthesis, New York,Wiley, 2000)。
例えば、フェノール性ヒドロキシ基はトリチル−ポリスチレン樹脂に結合されることができ、それは保護基であって、且つ合成のより後の段階でトリフルオロ酢酸または他の酸での処理により解離される分子として働く。
【００８６】
通常のように、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物の合成の間に実施されるすべての反応にあてはまることであるが、出発化合物および目標化合物の特性および特定の場合の他の特殊性の観点から、溶媒、塩基または酸、温度、添加順序、モル比、および他のパラメータを含む、特定の調製過程において用いられる条件の適切な詳細は、当業者によって、ルーチン的に選ばれる。当業者にも知られているように、本願明細書において記載されているすべてのプロセスが式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）およびそれらの中間体のすべての化合物の調製に同じ様に適しているというわけではなく、調節はされなければならない。式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物の調製のためのすべてのプロセスにおいて、例えば、反応混合物の水でのクエンチ、あるｐＨへの調節、沈殿、抽出、乾燥、濃縮、結晶化、蒸留、およびクロマトグラフィを含む当業者に公知の慣用手段に従って、反応混合物のワークアップおよび本生成物の精製は実施される。式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物の合成に適用できる方法の更なる実施例として、P. Lidstrom, J. Tierney, B. Wathey, J. Westman, Tetrahedron,57(2001), 9225に記載されている様に、反応の速度を上げ、促進し、または可能にする為にマイクロ波による補助が例えば言及される。また、分取高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような最新の分離技術が言及され、いずれかの反応で起こり得る位置異性体の混合物を分離するために、それが使うことができる。また、本製品のキャラクタリゼーションのために、慣用手段、例えばＮＭＲ、ＩＲ、および質量分析が用いられる。
【００８７】
本発明の他の課題は、上記で定義されている様に、立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物の新規出発化合物、およびそれの合成中に生じる中間体、およびそれらの塩、および合成中間体または出発化合物としてのそれらの使用である。式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物についての、上記のすべての一般的な説明、実施形態、および数と基の定義は、上述の中間体および出発化合物に対応してあてはまる。本発明の課題は、特に、本願明細書において記載されている新規な特定の出発化合物および中間体である。遊離の化合物としておよび／または特定の塩として記述されるかどうかとは独立して、遊離の化合物の形および塩の形の両方、加えて特定の塩が記載されている場合はこの特定の塩の形において、それらは本発明の課題である。
【００８８】
従って、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物、およびそれらの薬理学的に許容される塩は、動物において、特に哺乳類において、および特に人間において、それ自体が医薬または薬として、互いの混合物において、または医薬組成物の形で用いられることが可能である。本発明の課題は、医薬として用いられる、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物およびそれらの薬理学的に許容される塩でもある。本発明の課題は、所望の使用のための有効量における、活性成分としての、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の少なくとも一つの化合物、および／またはその薬理学的に許容される塩、および薬理学的に許容されるキャリア、すなわち一つ以上の薬理学的に無害な、または危険でない媒体および／または賦形剤、および任意的には一つ以上の他の薬理学的な活性をもつ化合物を有する医薬品組成物および薬でもある。
【００８９】
経皮投与に適している医薬組成物は、受容個体の真皮に拡げられて密接に接触する、硬膏剤として投与されることができる。局所投与のために、製剤、例えば軟膏、クリーム、懸濁液、ローション剤、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾールまたは油が、用いられることが可能である。目または他の外部の組織（例えば口および皮膚）の処置のために、例えば、適切な製剤は、局所用軟膏またはクリームである。軟膏の場合、パラフィンまたは水溶性クリーム基材によって、主成分は使用されることもできる。あるいは、水中油型クリーム基材または油中水型基材を有するクリームを与えるために、主成分を、製剤化できる。眼への局所適用に適している医薬組成物は点眼を含み、それにおいて、主成分は好適な担体、特に水性溶媒に溶解されるかまたは懸濁される。
【００９０】
本発明による医薬品組成物は、それ自体は公知の方法で、一つ以上の薬理学的に許容される不活性の無機のおよび／または有機ビヒクルおよび賦形剤を式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の１つ以上の化合物および／またはその薬理学的に許容される塩類を混合し、それを投与量および投与のための適切な形にすることによって作られ、これは、ヒトの薬または獣医学において、使うことができる。ピル、錠剤、被覆錠剤、および硬質ゼラチンカプセルの生産のために、例えばラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩を使用することが可能である。ゼラチンカプセルおよび坐薬用油脂、ワックス、半流動および液体ポリオールの生産のために、天然のまたは硬化された油が、例えば使うことができる。注射液のような溶液、または懸濁液またはシロップ水の製造のために、例えば食塩水、アルコール、グリセロール、ポリオール、蔗糖、転化糖、ブドウ糖、植物油が使われることができ、マイクロカプセル、インプラント、またはロッドの製造のために、例えばグリコール酸および乳酸のコポリマーが使うことができる。約０．５％〜９０重量％の式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物および／またはそれらの薬理学的に許容される塩を、医薬品組成物は通常含有する。医薬品組成物中の式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）および/またはそれらの薬理学的に許容される塩の活性成分の量は、通常、１投与あたり約０．５ｍｇ〜約１０００ｍｇであり、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇである。医薬品組成物の種類および特定の場合の他の特色に応じて、その量は示された量から逸脱できる。
【００９１】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の活性成分および／またはそれらの薬理学的に許容される塩、および媒体または担体物質に加えて、賦形剤、または補助剤または添加剤、例えば、充填剤、崩壊剤、バインダー、潤滑油、湿潤剤、安定化剤、乳化剤、防腐剤、甘味料、着色剤、着香料、芳香剤、増粘剤、希釈液、緩衝物質、溶媒、溶解剤、デポ効果を達成するための薬、浸透圧を変えるための塩、コーティング剤、または抗酸化剤を、医薬品組成物は含むことができる。それらは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の二つ以上の化合物、および／またはそれらの薬理学的に許容される塩を含むこともできる。医薬品組成物が式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の二つ以上の化合物を含有する場合に、個々の化合物の選択は、医薬品組成物の特定の包括的な薬理学的プロファイルを目指すことができる。例えば、より短い作用時間を有する高い効力の化合物は、より低い効力の長時間作用化合物と組合わされることができる。式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物の置換基の選択に関して許される融通性は、化合物の生物学的および生理化学的性質の多くの制御を可能にし、このように所望の化合物の選択を可能にする。
【００９２】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の化合物を使用する場合、用量は広い限度の範囲内で変化することができ、慣例のようにまた医師に知られているように、個々の症例の個々の条件に合わせられるべきである。例えば、使用される特定の化合物に、処置される疾患の特性および重篤度に、投与の形態、スケジュールに、処置が急性の状態が慢性の状態かに、または予防処置が施されるかどうかに、それは依存する。適切な投与は、当業者に知られている臨床的なアプローチを使用して確立されることができる。一般に、体重約７５ｋｇの成人において、所望の結果を達成するための１日投与量は、おのおの体重１ｋｇ当りのｍｇとして、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、特に０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。特に比較的大量を投与する場合の場合、１日投与量は、数回、例えば２、３、または４回に分けて、投与できる。通常通り、個体の反応に応じて、指示された１日投与量から逸脱し、増減することが必要であり得る。
【００９３】
本発明に導く研究は、第２４１９１９号の承認の下で、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ＦＰ７−ＨＥＡＬＴＨ−２００９から、資金の援助を受けた。
【００９４】
以下の実施例は、本発明を例示している。
【００９５】
実施例の化合物の合成の最終ステップで、酸、例えばトリフルオロ酢酸または酢酸が用いられた場合、例えば３級−ブチル基を有している、酸に不安定な保護基を取り除くためにトリフルオロ酢酸が使用される場合、またはこのような酸を含有した溶出液を用いたクロマトグラフィによって、化合物が精製される場合、いくつかの場合には、ワークアップ手順、例えば凍結乾燥プロセスの詳細に依存して、使用される酸の塩の形で一部またはすべて、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩の形で、化合物は得られた。実施例の化合物の名前および構造式において、このような含有されたトリフルオロ酢酸または酢酸は言及されない。
略語
arom. = 芳香族の（aromatic）
Ｂｏｃ＝３級−ブチルオキシカルボニル(tert-butyloxycarbonyl)
ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピル−エチルアミン(diisopropyl-ethyl amine)
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド(dimethylformamide)
ＤＣＭ＝ジクロロメタン(dichloromethane)
ＥＳＩ−ＭＳ＝エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（electrospray ionisation mass spectrometry）
equiv. = 当量（equivalents）
Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル（9-fluorenylmethoxycarbonyl）
ＨＦＩＰ＝1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol）
ＨＡＴＵ＝２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（2-(7-Aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate）ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィ（high performanceliquid chromatography）
ＬＣ−ＭＳ＝液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（liquid chromatography mass spectrometry）
ＮＭＲ＝核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance）
Ｐｍｃ＝2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl）
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸（trifluoro-acetic acid）
【００９６】
全体的方法
特に明記されていない場合、すべての試薬が商業的な供給元から購入され、更に精製することなく用いられた。使用されたすべての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであった。反応は、ＬＣ−ＭＳで分析された。逆相ＨＰＬＣは、Ｃ１８カラムＳｕｎ  Ｆｉｒｅ  ５０ｘ１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、またはＸＢｒｉｄｇｅＴＭＰｒｅｐ  Ｃ１８、５μｍ（１０ｘ１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）で実施された。ＬＣ／ＭＳデータはＷａｔｅｒｓまたはＨＰ−Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＭＳＤシステムを用いて取得された。ＮＭＲ−データは、ｄ６−ＤＭＳＯ中でＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−４００システムに記録された。蛍光分析は、Ｔｅｃａｎ  ＳＡＦＩＲＥ  ＩＩ分光計により測定された。
【００９７】
分光学的データおよびクロマトグラフのデータによって、特に質量スペクトル（ＭＳ）および／または核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルで、製造された化合物は一般に特徴づけられた。ＮＭＲキャラクタリゼーションにおいて、化学シフト（ｐｐｍ）、水素原子（Ｈ）の個数、結合定数Ｊ（Ｈｚ）、およびピークの多重線（ｓ：シングレット、ｄ：ダブレット、ｄｄ：ダブルダブレット、ｔ：トリプレット、ｍ：マルチプオレット、ｂｒ：ブロード）が、与えられる。ＭＳキャラクタリゼーションにおいて、分子イオン（Ｍ）のピークの、または関連したイオン、例えばイオン（Ｍ＋１）、すなわちプロトン化分子イオン（Ｍ＋Ｈ）、またはイオン（Ｍ−１）（これは使用するイオン化法に応じて形成される）の質量数（ｍ／ｅ）が与えられる。一般に、イオン化法はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳ＋またはＥＳ−）であった。
【００９８】
固相ぺプチド合成のための一般的手法
標準的なＦ−ｍｏｃ化学を用いた自動化されたペプチドシンセサイザー（ＣＥＭ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を使用し、ペプチドＷＹＲＧＲＬおよびＹＲＬＧＲＷは固形樹脂上で合成された。大過剰の無水酢酸およびＤＩＰＥＡで、両方のペプチドがＮ末端をアセチル化された。完全に保護されたペプチドは、ＤＣＭ中の３０％のＨＦＩＰを使用して樹脂から解離され、ＬＣ−ＭＳによって特徴づけられた。
【００９９】
Ｆｍｏｃで保護された天然のアミノ酸は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｓｅｎｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＢａｃｈｅｍから購入された。以下の標準的なアミノ酸が、合成の全体を通して用いられた：Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-L-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-L-Leu-OH。
化合物ＨＨＹ−２５９Ｂ（標的ペプチド蛍光プローブ）
【化１６】
2017501214.tif 000019
2017501214.tif 000020
【０１００】
ＷＹＲＧＲＬ（３２ｍｇ、２０μmol）、ＨＡＴＵ１当量（７．６ｍｇ、２０μmol）、およびＤＩＰＥＡ２当量（１１μｌ、６０μmol）が、２ｍｌのDMF中に溶解され、室温で１０分間撹拌された。その後、１−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）−3,6−ジオキサ−８−オクタンアミンハイドロクロライド１当量（８ｍｇ、２０μmol）が、該反応混合物に加えられ、室温で１時間、アルゴン下で撹拌された（ＬＣ−ＭＳによる分析）。該溶液は、ＥｔＯＡｃで薄められ、１Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、および塩水によって、順次洗浄された。有機層は、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥された。減圧で溶剤を除去した後、粗生成物ＨＨＹ−２５７が淡黄色の固体として得られ、更に精製することなく次の工程において、使用された。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝９６７．５。
【０１０１】
Ｆｍｏｃ−基の除去のために、ＨＨＹ−２５７（２０μmol）が２ｍｌのＥｔ２ＮＨ／DMF（１／４）に溶解され、反応混合物は室温で１０分間撹拌された。溶媒は、減圧下で除去された。粗生成物ＨＨＹ−２５９Ａが、更に精製することなく、次の工程で使われた。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝８５６．６。
【０１０２】
ＨＨＹ−２５９Ａ（２０μmol）は１．５ｍｌのDMF中に溶解され、続いて３当量のＤＩＰＥＡ（１１μｌ、６０μmol）および０．５当量のＣｙ５．５ＮＨＳエステル（７ｍｇ、１０μmol）が添加された。反応混合物は、室温で１時間アルゴン下で撹拌された（ＬＣ−ＭＳ分析）。その後、DMFはロータリーエバポレーターにより減圧下で取り除かれた。粗生成物ＨＨＹ−２５９が、更に精製することなく、次の工程で使われた。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］2＋＝１１３９．４。
【０１０３】
全ての保護基の除去のために、粗ＨＨＹ−２５９は２ｍｌの９５％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で３時間撹拌された（ＬＣ−ＭＳ分析）。
溶媒はトルエンと共に、３回共蒸発され、ＨＰＬＣにより精製されて、青い粉末としてＨＨＹ−２５９Ｂが与えられた。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］2＋＝７９４．５。
【０１０４】
化合物ＨＨＹ−２５８Ｂ（スクランブル化ペプチド蛍光プローブ）
スクランブル化ペプチド配列ＹＲＬＧＲＷを用いたプローブＨＨＹ−２５９Ｂのために記載されたものと類似の条件の下で、ＨＨＹ−２５８Ｂの調製は実施された。
【０１０５】
ＹＲＬＧＲＷ（３２ｍｇ、２０μmol）、ＨＡＴＵ１当量（７．６ｍｇ、２０μmol）、およびＤＩＰＥＡ）２当量（１１μｌ、６０μmol）が、２ｍｌのDMF中に溶解され、室温で１０分間撹拌された。その後、１−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）−3,6−ジオキサ−８−オクタンアミンハイドロクロライド１当量（８ｍｇ、２０μmol）が、反応混合物に加えられ、室温で１時間、アルゴン下で撹拌された（ＬＣ−ＭＳによる分析）。溶液は、ＥｔＯＡｃで薄められ、１Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、および塩水によって、順次洗浄された。有機層は、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥された。減圧で溶剤を除去した後、粗生成物ＨＨＹ−２５６が淡黄色の固体として得られ、更に精製することなく次の工程において、使用された。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝９６７．３。
【０１０６】
Ｆｍｏｃ−基の除去のために、ＨＨＹ−２５６（２０μmol）が２ｍｌのＥｔ２ＮＨ／DMF（１／４）に溶解され、反応混合物は室温で１０分間撹拌された。溶媒は、減圧下で除去された。粗生成物ＨＨＹ−２５８Ａが、更に精製することなく、次の工程で使われた。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝８５６．６。
【０１０７】
ＨＨＹ−２５８Ａ（２０μmol）は１．５ｍｌのDMF中に溶解され、続いて３当量のＤＩＰＥＡ（１１μｌ、６０μmol）および０．５当量のＣｙ５．５ＮＨＳエステル（７ｍｇ、１０μmol）が添加された。反応混合物は、アルゴン下で、室温で１時間撹拌された（ＬＣ−ＭＳ分析）。その後、DMFはロータリーエバポレーターにより減圧下で取り除かれた。粗生成物ＨＨＹ−２５８が、更に精製することなく、次の工程で使われた。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］2＋＝１１３８．９。
【０１０８】
全ての保護基の除去のために、粗ＨＨＹ−２５８は２ｍｌの９５％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で３時間撹拌された（ＬＣ−ＭＳ分析）。
溶媒はトルエンと共に、３回共蒸発され、ＨＰＬＣにより精製されて、青い粉末としてＨＨＹ−２５８Ｂが与えられた。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］2＋＝７９４．２。
【０１０９】
１−ペプチド結合体のためのキー中間体の合成
【０１１０】
化合物ＨＨＹ−３４３
シクレンの対称性のジ保護は、報告された手順７により実施された。要約すれば、シクレン２．０ｇ（１１．６ｍｍｏｌ）およびCbz-OSu５．８ｇ（２３．２ｍｍｏｌ）が、ＣＨＣｌ３（４０ｍＬ）中に溶解され、溶液は室温で２日間撹拌された。蒸発の後、残渣は１ＭのＮａＯＨの中に懸濁され、水性懸濁液はＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ×５）により抽出された。有機層は、塩水により洗浄され、Ｋ２ＣＯ３で乾燥され、その後蒸発されてジ保護されたシクレン（５．１ｇ、１００％）を産生した。この化合物が、更に精製することなく使用された。ＥＳＩ−ＭＳ  C２４Ｈ３２Ｎ４Ｏ４の計算値：４４０．５、実測値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４４１．３。
【０１１１】
化合物ＨＨＹ−３４４
ＭｅＣＮ（６０ｍＬ）中の化合物ＨＨＹ−３４３（５．１ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（４．０ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）の混合物に、３級−ブチルブロモアセテート（４．１２ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）が加えられた。終夜の還流の後、混合物はセライトのパッドでろ過され、蒸発された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２、０−５％）により精製されて、無色のガムとして化合物ＨＨＹ−３４４（５．１ｇ、６４％）が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ  C36H52N4O8の計算値：668.8、実測値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝669.4。
【化１７】
2017501214.tif 000021
【０１１２】
化合物ＨＨＹ−３４５
ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中の化合物ＨＨＹ−３４４（５．１ｇ、７．４ｍｍｏｌ）と１０％のＰｄ／Ｃ（１００ｍｇ）の混合物は、水素雰囲気下、室温で終夜撹拌された。セライトのパッドによる濾過の後、溶媒の蒸発は、白色固体として化合物ＨＨＹ−３４５（３．０ｇ、１００％）を与えた。この化合物が、更に精製することなく使用された。ＥＳＩ−ＭＳ  C20H40N4O4の計算値：400.5、実測値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝401.3。
【０１１３】
化合物ＨＨＹ−３４６
ＭｅＣＮ（３０ｍＬ）中の化合物ＨＨＹ−３４５（６６０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（０．４６ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の混合物は、ベンジルブロモアセテート（０．６９ｇ、３ｍｍｏｌ）を加えられた。終夜の還流の後、混合物はセライトのパッドでろ過され、蒸発された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２、０−５％）により精製されて、無色のガムとして化合物ＨＨＹ−３４6（0.5ｇ、50％）が与られた。ＥＳＩ−ＭＳ  C38H56N4O8の計算値：696.9、実測値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝697.4。
【０１１４】
化合物ＨＨＹ−３４７
ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中の化合物ＨＨＹ−３４６（０．９８ｇ、１．４ｍｍｏｌ）と１０％のＰｄ／Ｃ（５０ｍｇ）の混合物は、水素雰囲気下、室温で終夜撹拌された。セライトのパッドによる濾過の後、溶媒の蒸発は、白色固体として化合物ＨＨＹ−３４７（０．７３ｇ、１００％）を与えた。この化合物が、更に精製することなく使用された。ＥＳＩ−ＭＳ  C24H44N4O8の計算値：516.6、実測値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝517.43。
【化１８】
2017501214.tif 000022
【０１１５】
化合物ＨＨＹ−３４８
【化１９】
2017501214.tif 000023
化合物ＨＨＹ−３４７  １当量（５１７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ２当量（７６０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ８当量（１．４ｍＬ、８ｍｍｏｌ）が、１０ｍＬのDMF中に溶解された。１０分後、１−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルーアミノ）−３、６−ジオキサ−８−オクタンアミンハイドロクロライド１当量（８１４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）１当量が、反応混合物に加えられ、アルゴン下で、室温で１０分撹拌された。溶液はＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈され、水２×５０ｍＬにより洗浄された。有機層は、ＭｇＳＯ４で乾燥された。減圧での揮発物の除去は淡黄色のオイルを与え、それはＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（０−２０％）のシリカゲルクロマトグラフィにより精製された。収量：６１０ｍｇ、５０％。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz):δ 8.20 (bs, 2H, -NH), 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 4H, -Ar), 7.84 (d, J = 7.6Hz, 4H, -Ar), 7.41 (t, J = 6.8 Hz, 4H, -Ar), 7.35 (t, J = 6.8 Hz, 4H, -Ar), 6.44(bs, 2H, -NH), 3.6-3.4 (m, 6H, -CH2O-, -CHAr-), 2.72-2.58 (m, 48H,-CH2-), 1.40 (s, 18H, -CH3).13C NMR (d6-DMSO,100MHz):δ 170.7, 170.3, 139.5, 137.5, 128.9, 127.3,121.3, 120.0, 109.7, 80.12, 80.05, 69.5, 69.2, 59.8, 58.3, 55.6, 53.8, 53.2,52.0, 51.7, 38.7, 38.3, 31.3, 27.9。
ＥＳＩ−ＭＳ  C66H92N8O14の計算値：1221.5、実測値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝1221.8。
【０１１６】
化合物ＨＨＹ−３４９
【化２０】
2017501214.tif 000024
ｔＢｕー基の除去のために、化合物ＨＨＹ−３４８（６１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）は９５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ１０ｍＬ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で２時間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによってモニターされた。反応が完了したあと、溶媒はトルエンと共に、３回共蒸発された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ  C58H76N8O14の計算値：1109.3、実測値：［Ｍ＋Ｈ］＋＝1110.65。
【０１１７】
化合物ＨＨＹ−３５０
【化２１】
2017501214.tif 000025
化合物ＨＨＹ−３４９  １当量（０．５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ３当量（５７０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ１２当量（１．０５ｍＬ、６ｍｍｏｌ）は、３０ｍＬのDMF中に溶解された。１０分後、Ｂｏｃ−１−アミノ−３．６−ジオキサ−８−オクタンジアミン３当量（３７３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）が、反応混合物に加えられ、アルゴン下で、室温で３０分撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体として化合物ＨＨＹ−３５０（５６５ｍｇ、収率：７２％）が与られた。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz):δ 8.29 (bs, 2H, -NH), 7.94 (bs, 2H, -NH), 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 4H,-Ar), 7.68 (d, J = 7.6 Hz, 4H, -Ar), 7.42 (t, J = 6.8 Hz, 4H, -Ar), 7.32 (t, J= 6.8 Hz, 4H, -Ar), 6.73 (bs, 2H, -NH), 6.27 (bs, 2H, -NH), 3.51-2.50 (m, 78H,-CH2O-, -CHAr-, -CH2-), 1.37 (bs, 18H, -CH3).13CNMR (d6-DMSO, 100MHz):δ 142.5, 139.4, 137.5,128.9, 127.3, 109.7, 77.7, 69.6, 69.5, 69.4, 69.3, 69.2, 68.9, 67.5, 66.6,57.8, 52.8, 38.3, 38.2, 28.2。ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ８０Ｈ１２０Ｎ１２Ｏ２０の計算値：１５６９．９、実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝７８５．７。
【０１１８】
化合物ＨＨＹ−３５１
【化２２】
2017501214.tif 000026
Ｆｍｏｃ−基の除去のために、ＨＨＹ−350 (471 mg, 0.3 mmol)が２ｍｌのＥｔ２ＮＨ／DMF（１／４）に溶解され、反応混合物は室温で3０分間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、減圧下で除去された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ  C50H100N12O16の計算値：1125.4、実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝563.4。
【０１１９】
化合物ＨＨＹ−３３０
【化２３】
2017501214.tif 000027
1,4,7−トリス（３級−ブトキシカルボニルメチル）−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカンハイドロブロマイド（ＨＨＹ−３３０）
Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、６０ｍＬ）中のシクレン（５．００ｇ、２９ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（７．８６ｇ、９６ｍｍｏｌ）の懸濁液へ、DMA(２０ｍｌ）中のｔ−ブチルブロモアセテート（１８．７ｇ、１４．１ｍＬ、９６ｍｍｏｌ）の溶液が、滴下により−２０°Ｃで０．５時間にわたって加えられた。温度は添加の間−２０°Ｃに維持され、その後反応混合物は、室温にされた。２４時間の激しい撹拌の後、反応混合物は水（３００ｍＬ）に注がれて、透明な溶液が与えられた。固体ＫＨＣＯ３（１５ｇ、１５０ｍｍｏｌ）が少しずつ添加され、白色固体として沈澱した。沈殿物は、濾過によって集められて、ＣＨＣｌ３（２５０ｍＬ）に溶解された。溶液は、水（１００ｍＬ）で洗浄され、乾燥され（ＭｇＳＯ４）、濾過され、そして約２０−３０ｍＬまで濃縮された。エーテル（２５０ｍＬ）が添加され、その後ＨＨＹ−３３０は白いふんわりした固形物として結晶化された。収量：１２．５ｇ（７３％）。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝実測値５１５．５（Ｍｏｏｒｅ、Ｄ．Ａ．Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．２００８、８５、１０−１４）。
【０１２０】
化合物ＨＨＹ−３３１
【化２４】
2017501214.tif 000028
トリ−３級ブチル２,２',２'’−（１０−（２−（ベンジルオキシ）−２−オキソエチル）−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリイル）トリアセテート（ＨＨＹ−３３１）。
アセトニトリル中のＨＨＹ−３３０（１２．５ｇ、２４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｋ２ＣＯ３粉末（５．０ｇ、３６ｍｍｏｌ、１．５当量）およびその後ベンジルブロモアセテート（５．６ｇ、２８．８ｍｍｏｌ、１．２当量）が加えられた。反応系は室温で３時間撹拌された。反応過程は、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ（９：１）、ＨＨＹ−３３１：Ｒｆ＝０．８）によって、モニターされた。析出固体は、濾過によって取り除かれ、濾過液は濃縮されて、粗生成物が与えられた。それはＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１００：０→９０：１０）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製されて、ＨＨＹ−３３１の無色固体が与えられた、収量：１２．０ｇ、７５％。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝実測値６６３．５(Strauch, R. C.; Mastarone, D. J.; Sukerkar, P. A.; Song, Y.;Ipsaro, J. J.; Meade, T. J. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 16346−16349)。
【０１２１】
化合物ＨＨＹ−３３２
【化２５】
2017501214.tif 000029
（4,7,10−トリス−３級ブトキシカルボニルメチル−１，４，７，１０テトラアザ−シクロドデク−１−イル）−酢酸
ＨＨＹ−３３１（１．２ｇ、１８ｍｍｏｌ）は、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中で１０％炭素担持パラジウム（１８０ｍｇ）の下で、１２時間加水素分解された。
Ｐｄ／Ｃは濾過により除去され、ＭｅＯＨは蒸発により除去された。化合物はＬＣ  ＭＳにより分析され、更に精製することなしに使用された。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝実測値573.4。
【０１２２】
化合物ＨＨＹ−３３３
【化２６】
2017501214.tif 000030
化合物ＨＨＹ−332 １当量(572 mg, 1 mmol)、ＨＡＴＵ１当量（380ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ４当量（0.7 ml, 4 mmol）が、１０ｍＬのDMF中に溶解された。１０分後、１−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルーアミノ）−３、６−ジオキサ−８−オクタンアミンハイドロクロライド１当量（407ｍｇ、１ｍｍｏｌ）が、反応混合物に加えられ、アルゴン下で、室温で１０分撹拌された。溶液はＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈され、水２×５０ｍＬにより洗浄された。有機層は、ＭｇＳＯ４で乾燥された。減圧での揮発物の除去は淡黄色のオイルを与え、それはＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（０−１０％）のシリカゲルクロマトグラフィにより精製された。収量：５７０ｍｇ、６２％、ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝実測値９２６．７。
1H NMR (d6-DMSO, 400MHz):δ 8.20 (t, J = 4.8 Hz, 1H, -NH),7.89 (d, J = 7.6 Hz, 2H, -Ar), 7.68 (d, J = 7.6 Hz, 2H, -Ar), 7.41 (t, J = 6.8Hz, 2H, -Ar), 7.32 (t, J = 6.8 Hz, 2H, -Ar), 7.29 (t, J = 5.7 Hz, 1H, -NH),4.29 (d, J = 6.8 Hz, 2H, -CH2O-), 4.20 (t, J = 6.8 Hz, 1H, -CHAr-),3.51-2.49 (m, 36H, -CH2-), 1.43-1.41 (m, 27H, -CH3).
13C NMR (d6-DMSO, 100MHz):δ 172.5, 171.6, 162.3, 143.9,140.7, 127.6, 127.0, 125.1, 120.1, 81.1, 80.9, 69.4, 68.9, 40.2, 38.9, 38.2,35.8, 30.8, 27.8, 27.6。
【０１２３】
化合物ＨＨＹ−３３４
【化２７】
2017501214.tif 000031
ｔＢｕー基の除去のために、化合物ＨＨＹ−333 (925 mg, 1 mmol)は９５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ１０ｍＬ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で２時間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによってモニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、３回トルエンと共に共蒸発された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝実測値７５８．４。
【０１２４】
化合物ＨＨＹ−３３５
【化２８】
2017501214.tif 000032
化合物ＨＨＹ−334 １当量(1 mmol)、ＨＡＴＵ３当量(1140 mg, 3 mmol)、およびＤＩＰＥＡ１２当量(2100 μl, 12 mmol)は、３０ｍＬのDMF中に溶解された。１０分後、Ｂｏｃ−１−アミノ−３．６−ジオキサ−８−オクタンジアミン３当量（７４５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）は、反応混合物に加えられ、アルゴン下で、室温で３０分撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体として化合物ＨＨＹ−335 (800 mg, 収率: 55%)が与えられた。
1H NMR (d6-DMSO, 400MHz):δ 8.34 (bs, 3H, -NH), 7.94 (bs,1H, -NH), 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 2H, -Ar), 7.68 (d, J = 7.6 Hz, 2H, -Ar), 7.42(t, J = 6.8 Hz, 2H, -Ar), 7.32 (t, J = 6.8 Hz, 2H, -Ar), 7.29 (t, J = 5.1 Hz,1H, -NH), 6.74 (t, J = 4.78 Hz, 3H, -NH), 4.29 (d, J = 6.8 Hz, 2H, -CH2O-),4.21 (t, J = 6.8 Hz, 1H, -CHAr-), 3.62-3.04 (m, 72H, -CH2-), 1.37(bs, 27H, -CH3).
13C NMR (d6-DMSO, 100MHz):δ 158.12, 158.10, 157.82,158.78, 156.1, 155.6, 143.9, 140.7, 127.6, 127.0, 125.1, 120.9, 118.0, 115.177.6, 69.52, 69.47, 69.4, 69.2, 69.1, 68.8, 65.3, 54.5, 49.6, 46.7, 40.2, 40.0,38.9, 28.2.
ＥＳＩ−ＭＳ  C70H118N12O20の計算値：1447.79、実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝724.6。
【０１２５】
化合物ＨＨＹ−３３６a
【化２９】
2017501214.tif 000033
Ｆｍｏｃ−基の除去のために、ＨＨＹ−335 (724 mg, 0.5 mmol)が２ｍｌのＥｔ２ＮＨ／DM（１／４）に溶解され、反応混合物は室温で3０分間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、減圧下で除去された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝実測値６１３．５。
【０１２６】
化合物ＨＨＹ−３３６
【化３０】
2017501214.tif 000034
ＡｃＷＹＲＧＲＬ１当量（２９５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ１当量（９５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、および２、４、６−コリジン4当量（１３２μｌ、１ｍｍｏｌ）は、２０ｍｌのDMF中に溶解された。１０分後、ＨＨＹ−３３６a  １当量（３０６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）は、反応混合物に加えられ、アルゴン下で、室温で３０分間撹拌された。反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体として化合物ＨＨＹ−336 (400 mg, 収率: 57%)が与えられた。
ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋3Ｈ］3＋＝実測値930.5。
ESI-HRMS C134H219N25O34S2の計算値: 2786.56174; 実測値：2786.56164 ([M+2H]2+ = 1394.28810).
【０１２７】
化合物ＨＨＹ−３３７（ＨＨＹ−３１６）
【化３１】
2017501214.tif 000035
全ての保護基の除去のために、粗ＨＨＹ−336は９５％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ１０ｍｌ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で３時間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、３回トルエンで共蒸発された。粗生成物はＨＰＬＣにより精製されて、白色粉体としてHHY-337 (収率: 65%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝実測値９００．３。
HRMS C82H143N25O20の計算値: 1798.09412;実測値: 1798.09428 ([M+4H]4+ = 450.53085)。
【０１２８】
ペプスタチンＡ対照プローブＨＨＹ−３２５の合成
【０１２９】
化合物ＨＨＹ−２９８
【化３２】
2017501214.tif 000036
ペプスタチンＡ（２０ｍｇ、３０μmol）、ＥＤＣＩ（５８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、１０当量）およびＮＨＳ（３５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、１０当量）が、フラスコ中に置かれた。
これに無水DMF（２ｍｌ）が加えられ、反応系は終夜撹拌された。DMFは高減圧下において、取り除かれた。固体は、容器の壁からはがされ、水（１０ｍｌ）により洗浄され、濾過によって集められた。固体は、水（５０ｍｌ）によって、そしてジエチルエーテル（５ｍｌ）によって、更に洗浄された。その後、湿った固体は無水Ｐ２Ｏ５で、減圧下で２４時間乾燥された（Org. Biomol. Chem., 2006, 4, 1817-1830）。
【０１３０】
化合物ＨＨＹ−３２５
【化３３】
2017501214.tif 000037
ＨＨＹ−３３６ａ（１２ｍｇ、１０μmol）がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてペプスタチンＡ  ＮＨＳエステルＨＨＹ−２９８  １当量（８ｍｇ、１０μmol）およびＤＩＰＥＡ  5当量（10μｌ、５０μmol）が添加された。反応混合物は、室温で24時間アルゴン下で撹拌された。反応が完了した後、溶媒は蒸発により除去され、残渣は５０％のＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２１０ｍｌ中に溶解された。Ｂｏｃ基の除去は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。３０分後に溶媒はトルエンと共に、共蒸発され、粗生成物はHPLCにより直接精製されて、白色粉体としてＨＨＹ−３２５が与えられた（６ｍｇ、収率３８％）。
ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝７９７．３。HRMS C74H145N17O20の計算値: 1592.08518;実測値: 1592.08514 ([M+2H]2+= 797.04985)。
【実施例１】
【０１３１】
化合物ＨＨＹ−３１２
標的ペプチド蛍光結合体ＡｃＷＹＲＧＲＬ−ＤＯＴＡ−Ｃｙ５．５
【化３４】
2017501214.tif 000038
ＨＨＹ−３１６（１８ｍｇ、１０μmol）がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてCy5.5ＮＨＳエステル１当量(7 mg, 10 μmol)およびＤＩＰＥＡ  5当量（10μｌ、５０μmol）が添加された。反応混合物は、室温で１２時間アルゴン下で撹拌された。反応が完了したあと、溶媒は、減圧下で除去された。反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、青色粉体としてＨＨＹ−312 (15 mg, 収率 63 %)が与えられた。
ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］３＋＝788.9。
ＨＲＭＳ  Ｃ１２２Ｈ１８４Ｎ２７Ｏ２１の計算値：２３６３．４１５４３、実測値：２３６３．４１５１８（［Ｍ＋４Ｈ］5＋＝４７３．４８８８６）。
【実施例２】
【０１３２】
化合物ＨＨＹ−３１６Gｄ
標的ペプチドＭＲＩ画像化結合体ＡｃＷＹＲＧＲＬ−Ｄｏｔａ−［Ｇｄ３＋］
ガドリニウム複合体形成：
化学量論量（１：１）で、ＧｄＣｌ３貯蔵溶液をＤＯＴＡ−ペプチドリガンド溶液に加えることによって、複合体は調製された。１Ｎ−ＮａＯＨを用いてｐＨが６に調製され、４８時間撹拌され、その後遠心分離されて、あり得る沈降Ｇｄ（ＯＨ）３を取り除いた。遊離Ｇｄ３＋の存在は、インジケータとしてキシレノールオレンジを使用して比色法により評価された。結果として生じたペプチド複合体は、ＨＰＬＣによって、更に精製された。精製された複合体溶液は凍結乾燥され、粉末固体としてガドリニウム複合体が与えられた。
【化３５】
2017501214.tif 000039
ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ］３＋＝652.1。HRMS C82H143N25O20Gdの計算値: 1956.01656;実測値:1956.01628 ([M+H]4+= 489.25589)。
【実施例３】
【０１３３】
標的ペプチドバイモーダル画像化結合体ＡｃＷＹＲＧＲＬ−ＤＯＴＡ−Cy5.5-［Ｇｄ３＋］
【化３６】
2017501214.tif 000040
HHY-316Gd(19 mg, 10 μmol)がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてCy5.5ＮＨＳエステル１当量(7 mg, 10 μmol)およびＤＩＰＥＡ  5当量（10μｌ、５０μmol）が添加された。反応混合物は、室温で１２時間アルゴン下で撹拌された。反応が完了したあと、溶媒は、減圧下で除去された。反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、青色粉体としてHHY-338 (13 mg,収率 51 %)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ］４＋＝630.2。HRMS C122H184N28O20Gdの計算値: 2521.33792;実測値:2521.33802 ([M+H]4+= 504.46906)。
【実施例４】
【０１３４】
化合物ＨＨＹ−３２７
標的ペプチド薬結合体ＡｃＷＹＲＧＲＬ−ＤＯＴＡ−ペプスタチンA
【化３７】
2017501214.tif 000041
HHY-316  2当量 (36mg, 20 μmol)がDMF２ｍｌ中に溶解され、続いてペプスタチンＡ  ＮＨＳエステルＨＨＹ−２９８  １当量（８ｍｇ、１０μmol）およびＤＩＰＥＡ  ６当量（10μｌ、６０μmole）が添加された。反応混合物は、アルゴン下、室温で２日間撹拌された。溶媒は分取ＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体としてＨＨＹ−327 (5 mg, 収率 20%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝８２４．７。ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ１１６Ｈ２０４Ｎ３０Ｏ２８の計算値：２４６５．５、実測値：［Ｍ＋３Ｈ］3＋＝８２４．７。
【実施例５】
【０１３５】
化合物ＨＨＹ−３２８
標的ペプチド薬結合体ＡｃＷＹＲＧＲＬ−ＤＯＴＡ−（ペプスタチンA）３
【化３８】
2017501214.tif 000042
HHY-316 １当量(9 mg, 5 μmol)がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてペプスタチンＡ  ＮＨＳエステルＨＨＹ−２９８  ３当量(12 mg, 15 μmol)）およびＤＩＰＥＡ１２当量（10μｌ、６０μmole）が添加された。反応混合物は、アルゴン下、室温で２日間撹拌された。溶媒は分取ＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体としてＨＨＹ−328 (4.3 mg, 収率: 22.6 %)が与えられた。本生成物は、凍結乾燥の後ＤＭＳＯにわずかに溶解するのみである。ＥＳＩ−ＭＳC  184H326N40O44の計算値：3802.9、実測値：［Ｍ＋３Ｈ］3＋＝1268.5。
【０１３６】
実施例１のスクランブル化対照の合成：化合物ＨＨＹ−３２２
ＡｃＹＲＬＧＲＷ−ＤＯＴＡ−Ｃｙ５．５
化合物ＨＨＹ−３３９
【化３９】
2017501214.tif 000043
化合物ＨＨＹ−334 １当量(０．1 mmol)、ＨＡＴＵ３当量(114 mg,０．3 mmol)、およびＤＩＰＥＡ１２当量(210 μl, 1.2 mmol)は、1０ｍＬのDMF中に溶解された。１０分後、Ｎ−［２−［２−［２−アミノ−エトキシ］−エトキシ］−エチル］−アセトアミド３当量（５７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）は、反応混合物に加えられ、アルゴン下で、室温で３０分撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体として化合物ＨＨＹ−339 (90 mg, 収率: 70%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１２７３．９。１H NMR (d6-DMSO, 400MHz):δ 8.32(bs, 3H, -8.20, -NH), 7.90-7.85 (m, 6H, -Ar, -NH), 7.68 (d, J = 7.2 Hz, 2H,-Ar), 7.42 (t, J = 7.2 Hz, 2H, -Ar), 7.34-7.29 (m, 3H, -Ar, -NH), 4.29 (d, J =7.0 Hz, 2H, -CH2O-), 4.21 (t, J = 7.0 Hz, 1H, -CHAr-), 3.68-3.13 (m,72H, -CH2-), 1.80 (bs, 9H, -CH3)。13C NMR (d6-DMSO, 100MHz):δ 127.6, 127.1, 125.1, 120.2, 99.8, 69.6, 69.5, 69.1, 68.8, 40.0,39.8, 39.6, 38.7, 38.5, 22.6。
【０１３７】
化合物ＨＨＹ−３４０
【化４０】
2017501214.tif 000044
Ｆｍｏｃ−基の除去のために、ＨＨＹ−339 (50 μmol)が２ｍｌのＥｔ２ＮＨ／DM（１／４）に溶解され、反応混合物は室温で１０分間撹拌された。溶媒は、減圧下で除去された。粗生成物ＨＨＹ−３４０aが、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ  C46H90N12O15の計算値：1051.3、［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝526.6。
【０１３８】
スクランブル化ペプチド配列ＹＲＬＧＲＷ(79 mg, 50 μmol)、ＨＡＴＵ１当量(19 mg, 50 μmol)、およびＤＩＰＥＡ３当量(26 μl, 150 μmol)が、２ｍｌのDMF中に溶解され、室温で１０分間撹拌された。その後、ＨＨＹ−３４０ａ１当量が反応混合物に加えられ、それはアルゴンの下で室温で１時間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体として化合物ＨＨＹ−340 (81 mg, 収率: 62%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝１３０８．１。ESI-HRMS C125H201N25O31S2の計算値: 2612.43616; 実測値：2612.43666 ([M+2H]2+= 1307.22561)。
【０１３９】
化合物ＨＨＹ−３４１
【化４１】
2017501214.tif 000045
全ての保護基の除去のために、化合物HHY-340 (52 mg、 0.02 mmol)は、９５％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ２ｍｌ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で３時間撹拌された（ＬＣ−ＭＳ分析）。溶媒はトルエンと共に、３回共蒸発され、ＨＰＬＣにより精製されて、白い粉末としてＨＨＹ−341 (17 mg, 収率: 44%)を与えた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］2＋＝９６３．７。ＨＲＭＳ  Ｃ８８Ｈ１４９Ｎ２５Ｏ２３の計算値：１９２４．１２５８１、実測値：１９２４．１２６７１（［Ｍ＋３Ｈ］3＋＝６４２．３８２８５）。
【０１４０】
化合物ＨＨＹ−３２２
【化４２】
2017501214.tif 000046
スクランブル化ペプチド配列ＹＲＬＧＲＷを用いたプローブＨＨＹ−312のために記載されたものと類似の条件の下で、対照プローブＨＨＹ−322の調製は実施された。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］３＋＝７８９．０。ＨＲＭＳ  Ｃ１２２Ｈ１８４Ｎ２７Ｏ２１の計算値：２３６３．４１５４３、実測値：２３６３．４１３６８（［Ｍ＋４Ｈ］5＋＝４７３．４８８５６）。
【０１４１】
化合物ＨＨＹ−３５３
【化４３】
2017501214.tif 000047
全てのBoc基の保護の除去のために、化合物ＨＨＹ−33５は９５％のＴＦＡ／CH2Cｌ２１０ｍｌ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で１時間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、３回トルエンで共蒸発された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ  C55H94N12O14の計算値:1147.43、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝1148.9。
【０１４２】
実施例２のスクランブル化対照の合成：化合物ＨＨＹ−３４１Ｇｄ
ＡｃＹＲＬＧＲＷ−ＤＯＴＡ−［Ｇｄ３＋］
ＥＳＩＭＳ  C88H149N25O23Gdの計算値：2082.57、実測値：2083.4 ([M+H]4+ =521.1)。
【０１４３】
３−ペプチド結合体のためのキー中間体の合成
化合物ＨＨＹ−２６１
【化４４】
2017501214.tif 000048
ＣＨＣｌ３（４０ｍＬ）中の1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン（シクレン）（３．４４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｔ-ブチルブロモアセテート（０．５当量）が、０℃で１時間以内に添加された。撹拌は、追加の1時間継続された。溶液は、曇ってきた（ｃｙｃｌｅｎＨＢｒ）。ＴＬＣの対照は、ｔ−ブチルブロモアセテートの完全な消失を示した。沈殿は濾過され、濾過液は減圧で濃縮された。結果として生じるオイルはＨＰＬＣ（９５％Ｈ２Ｏ−６０％ＣＨ３ＣＮ）により精製されて、無色のものとしてＨＨＹ−２６１（１．４３ｇ、５０％）が産生された（Tetrahedron Letters. 2006, 47, 5985-5988）。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝２８７．３。
【０１４４】
化合物ＨＨＹ−２６４
【化４５】
2017501214.tif 000049
アセトニトリル１００ｍＬ中のＨＨＹ−２６１（１．４３ｇ）と粉末状のＫ２ＣＯ３（８当量）の懸濁液に、アセトニトリル５０ｍＬ中のベンジル−２−ブロモアセテート（４当量）の溶液が、アルゴン下で、１時間にわたって滴下され、反応混合物は室温で一晩放置された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了していたあと、Ｋ２ＣＯ３は濾過により除去され、アセトニトリルは蒸発により除去された。反応系はＤＣＭで希釈され、水で３回および塩水で３回洗浄された。ＤＣＭ中のＭｅＯＨ３％から１５％までの勾配をかけたシリカゲルクロマトグラフィによって、生成物は精製された。収量：１．４６ｇ、４０％。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝７３１．５。
【０１４５】
化合物ＨＨＹ−２６５
【化４６】
2017501214.tif 000050
ＨＨＹ−２６４（１．４６ｇ、２ｍｍｏｌ）は、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中で１２時間、炭素に担持された１０％パラジウム（５０ｍｇ）で加水素分解された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、Ｐｄ／Ｃは濾過により除去され、ＭｅＯＨは蒸発により除去された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４６１．３。
【０１４６】
化合物ＨＨＹ−２８４
【化４７】
2017501214.tif 000051
HHY-265 １当量(230 mg, 0.5 mmol)、ＨＡＴＵ３.1当量(589 mg, 1.55 mmol)、およびＤＩＰＥＡ１２当量（１．０５ｍＬ、６ｍｍｏｌ）は、1０ｍＬのDMF中に溶解された。１０分後、HHY-281  4当量 (741 mg,2 mmol)は、反応混合物に加えられ、アルゴン下で、室温で３０分間撹拌された。溶液は、ＥｔＯＡｃで薄められ、１Ｎ  ＨＣｌ（３回）、飽和ＮａＨＣＯ３、および塩水によって、順次洗浄された。有機層は、ＭｇＳＯ４で乾燥された。
減圧での揮発物の除去により淡黄色のオイルが与えられ、それはＣＨ３ＣＮ−Ｈ２ＯによるＨＰＬＣにより精製されて、白色粉体としてＨＨＹ−２８４（５１０ｍｇ、６７％）が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝７６０．２。
1H NMR (d6-DMSO, 400MHz):δ 8.54 (bs, 2H, -NH), 8.09 (bs,2H, -NH), 7.88 (d, J = 7.6 Hz, 6H, -Ar), 7.74 (bs, 2H, -NH), 7.67 (d, J = 7.6Hz, 6H, -Ar), 7.41 (t, J = 7.5 Hz, 6H, -Ar), 7.31 (t, J = 7.5 Hz, 6H, -Ar),4.29 (d, J = 6.8 Hz, 6H, -CH2O-), 4.20 (t, J = 6.8 Hz, 3H, -CHAr-),3.50-2.99 (m, 60H, -CH2-), 1.39 (s, 9H, -CH3)。
13C NMR (d6-DMSO, 100MHz):δ 156.2, 143.8, 127.6, 127.0,125.1, 120.1, 69.4, 69.0, 68.7, 65.3, 46.7, 40.1, 35.7, 27.8。
【０１４７】
化合物ＨＨＹ−２８５
【化４８】
2017501214.tif 000052
ｔＢｕー基の除去のために、化合物HHY-284 (152 mg, 0.1 mmol)は９５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ３ｍＬ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で２時間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、３回トルエンで共蒸発された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝７３１．６。
【０１４８】
化合物ＨＨＹ−２８６
【化４９】
2017501214.tif 000053
ＨＨＹ−２８５  １当量（１４６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ１．１当量（４２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ６当量（１０５μｌ、０．６ｍｍｏｌ）は、５ｍｌのDMF中に溶解された。３０分後、Ｂｏｃ−１−アミノ−３．６−ジオキサ−８−オクタンジアミン１．５当量(37 mg, 0.15 mmol)は、反応混合物に加えられ、アルゴン下で、室温で３０分撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接かつ迅速に精製されて、白色粉体として化合物ＨＨＹ−286 (113 mg, 67%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝８４６．７。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz):δ 8.34(bs, 4H, -8.20, -NH), 7.88 (d, J = 7.6 Hz, 6H, -Ar), 7.68 (d, J = 7.6 Hz, 6H,-Ar), 7.42 (t, J = 6.8 Hz, 6H, -Ar), 7.34-7.30 (m, 9H, -Ar, -NH), 6.74 (t, J =4.78 Hz, 1H, -NH), 4.29 (d, J = 6.2 Hz, 6H, -CH2O-), 4.21 (t, J =6.2 Hz, 3H, -CHAr-), 3.62-3.04 (m, 72H, -CH2-), 1.37 (bs, 9H, -CH3)。
13C NMR (d6-DMSO, 100MHz):δ 167.2, 158.3, 157.9, 157.6,156.2, 155.6, 143.8, 140.7, 127.6, 127.0, 125.1, 120.7, 120.1, 117.8, 114.9,111.9, 77.6, 69.5, 69.4, 69.39, 69.1, 68.8, 65.3, 54.9, 54.6, 49.6, 40.1, 38.7,31.3, 28.2。
【０１４９】
化合物ＨＨＹ−２８７
【化５０】
2017501214.tif 000054
Ｆｍｏｃ−基の除去のために、化合物HHY-286 (51 mg, 0.03 mmol)がＥｔ２ＮＨ／DM（１／４）２ｍｌに溶解され、反応混合物は室温で１０分間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、減圧下で除去された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０２６．８。
【０１５０】
化合物ＨＨＹ−２８８
【化５１】
2017501214.tif 000055
ペプチドＷＹＲＧＲＬ（ＨＨＹ−２５３Ａｃ）４当量（１９０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ４当量（４６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ１２当量（６３μｌ、０．３６ｍｍｏｌ）は、３ｍｌのDMF中に溶解された。２０分後に、ＨＨＹ−２８７の１当量（３１ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）が、反応混合物に加えられた。アルゴン下で、室温で３０分間撹拌されたあと、溶液は、ＥｔＯＡｃで薄められ、１Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、および塩水によって、順次洗浄された。有機層は、ＭｇＳＯ４で乾燥された。減圧での揮発物の除去により淡黄色のオイルが与えられ、それはＣＨ３ＣＮ−Ｈ２ＯによるＨＰＬＣにより精製されて、白色粉体としてHHY-288 (105 mg, 61%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ］４＋＝1429.6。
【０１５１】
化合物ＨＨＹ−２８９
【化５２】
2017501214.tif 000056
全ての保護基の除去のために、化合物HHY-288 (29 mg, 5 μmol)は、９５％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ３ｍｌ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で３時間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、３回トルエンで共蒸発された。粗生成物が、更に精製することなく、次の工程で使われた。
ＥＳＩ−ＭＳ実測値：[M+4H]4+ = 887.9。
【実施例６】
【０１５２】
化合物ＨＨＹ−２９０
標的ペプチド蛍光結合体（ＡｃＷＹＲＧＲＬ）３−ＤＯＴＡ−Ｃｙ５．５
【化５３】
2017501214.tif 000057
HHY-289(15 mg, 4.2 μmol)がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてCy5.5ＮＨＳエステル１.3当量(4 mg, 5.5 μmol)およびＤＩＰＥＡ  6当量（5μｌ、25μmol）が添加された。反応混合物は、室温で１２時間アルゴン下で撹拌された。反応が完了したあと、溶媒は、減圧下で除去された。
反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、青色粉体としてHHY-２９０ (13 mg,収率 ７５%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋3Ｈ］4＋＝1029.0。ＨＲＭＳ Ｃ２０６Ｈ３０２Ｎ５３Ｏ３７の計算値：４１１０．３３７３８、実測値：４１１０．３３８８８（［Ｍ＋５Ｈ］6＋＝６８５．８９５８８）。
【実施例７】
【０１５３】
化合物ＨＨＹ−２９９
標的ペプチド薬結合体（ＡｃＷＹＲＧＲＬ）３−ＤＯＴＡ−ペプスタチンＡ
【化５４】
2017501214.tif 000058
ＨＨＹ−２８９（１０ｍｇ、２．８μmol）は１．５ｍｌのDMF中に溶解され、続いてペプスタチンＡＮＨＳエステルＨＨＹ−２９８の１．５当量（３．３ｍｇ、４．２μmol）およびＤＩＰＥＡ６当量（３μｌ、１７μmole）が添加された。反応混合物は、室温で１２時間アルゴン下で撹拌された。溶媒は分取ＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体としてHHY-299 (3.2 mg, 収率 27.2 %)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ  C200H322N56O4４の計算値：4215.2;実測値: [M+4H]4+ = 1054.7。
【０１５４】
実施例６のスクランブル化対照の合成：化合物ＨＨＹ−２９３
（ＡｃＹＲＬＧＲＷ）３−ＤＯＴＡ−Ｃｙ５．５
【化５５】
2017501214.tif 000059
スクランブル化ペプチド配列ＹＲＬＧＲＷを用いたプローブＨＨＹ−２９０のために記載されたものと類似の条件の下で、対照プローブＨＨＹ−２９３の調製は実施された。
ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋3Ｈ］4＋＝１０２９．１。ＨＲＭＳ Ｃ２０６Ｈ３０２Ｎ５３Ｏ３７の計算値：４１１０．３３７３８、実測値：４１１０．３３７９８（［Ｍ＋５Ｈ］6＋＝６８５．８９５７３）。
【０１５５】
２−ペプチド結合体のためのキー中間体の合成
ＨＨＹ−３５２ＡおよびＨＨＹ−３５２Ｂ
【化５６】
2017501214.tif 000060
ペプチドＷＹＲＧＲＬ（ＨＨＹ−２５３Ａｃ）１当量(140 mg, 0.09 mmol)、ＨＡＴＵ１当量(34 mg, 0.09mmol)、およびＤＩＰＥＡ３当量(46 μl, 0.37mmol)は、DMF７ｍｌ中に溶解された。２０分後に、HHY-351の１当量(100 mg, 0.09 mmol)が、反応混合物に加えられた。アルゴン下で、室温で２時間撹拌されたあと、溶液はＥｔＯＡｃで薄められ、飽和ＮａＨＣＯ３、および塩水によって、順次洗浄された。有機層は、ＭｇＳＯ４で乾燥された。減圧での揮発物の除去により淡黄色のオイルが与えられ、それはＣＨ３ＣＮ−Ｈ２Ｏ(20-95%)によるＨＰＬＣにより精製されて、75 mg(20%)のHHY-352B(129 mg, 54%) とともに、 白色粉体としてのHHY-352A（75mg、20％）が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：HHY-352A [M+2H]2+ = 1345.0。HHY-352B[M+3H]3+ = 1418.1。
【０１５６】
ＨＨＹ−３５２Ｂの収率を上げるために、ＨＨＹ−２５３Ａｃ３当量、ＨＡＴＵ、およびＤＩＰＥＡ９当量が使用されることができる。
【０１５７】
化合物ＨＨＹ−３５７
【化５７】
2017501214.tif 000061
全ての保護基の除去のために、75 mg のHHY-352Bは９５％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ１０ｍｌ中に溶解され、反応混合物はアルゴン下で、室温で３時間撹拌された。反応は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。反応が完了したあと、溶媒は、３回トルエンで共蒸発された。粗生成物はＨＰＬＣにより精製されて、白色粉体としてHHY-357 (収量: 28 mg, 60%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋3Ｈ］3＋＝８９２．１。
【０１５８】
薬理試験
【０１５９】
マウスにおける化合物のin   vivo半減期の測定
１０週齢の雄のＣ５７  ＢＬ／６Ｊマウスは、Harlan  Laboratories(Blackthorn, Bicester,UK)から購入された。マウスは、それぞれ換気されたケージ中で６グループで収容され、１２時間の明／暗サイクルで２１±２°Cに維持されて、食餌は無制限に提供された。すべての実験プロトコルは、実験動物の取扱いおよび使用のための、UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986規則に従って実施された(Home Office project licence PPL no: 70/7288)。
【０１６０】
ガス麻酔剤（２％イソフルオレンおよびＯ２）によって麻酔導入された後、１００ナノモルの各化合物が関節空内に注射された。Kodak In Vivo FX Pro (Carestream, Woodbridge, USA)によって、ガス麻酔（２．５％イソフルオランおよびＯ２）のもと、６３０nmで曝露の１分後に７００nmの発光を捕えることにより示される時点で、膝関節の平面蛍光画像が捕えられた。併行記録のため、平面Ｘ線像が２０秒間のＸ線への暴露によって、得られた。
【０１６１】
関節中の化合物の半減期を算出するために、Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  ＭＩソフトウェア（バージョン５．１）を使用して、蛍光画像は解析された。直径２５ピクセルの興味の円形の部位（ＲＯＩ）は、膝関節を取り囲むように定められ、膝関節はＸ線像の併行記録により定義された。ＲＯＩの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が得られた。示された蛍光画像は、虹スペクトルを使用した疑似色で着色されており、紫は最低値、赤は最高値であり、範囲は図中に示されている。２つの半減期、関節空間からの化合物の消失を表している速い半減期（ｔ１）、および関節軟骨に結合した化合物の消失を表すより遅い半減期（ｔ２）を得るために、二相減衰モデルに、データがフィットされた。結果が表２に示されている。すべての統計解析は、Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）を使用して行われた。
【表２】
2017501214.tif 000062
【０１６２】
基本的に非結合の対照として、３つの保護されたアミノ基を有するプローブＨＨＹ−３０６が参照として合成された。
【０１６３】
凍結切片作製と共焦点画像化
膝関節はマウスから切断されて、液体窒素により冷却されたイソペンタン(VWR, Leistershire, UK)で凍結する前、−８０°Cで終夜貯蔵する前に、ＯＣＴ(Sakura Finetek UK, Thatcham, UK)内に埋められた。LeicaCM1900UV cryotome (Leica Biosystems, Milton Keynes, UK)を使用し、関節は１０μｍの厚さに切断された。
【０１６４】
凍結切片は、空気乾燥される前に氷冷アセトン(VWR, Leistershire, UK)中で固定され、PBS中の５％ウシ血清アルブミンおよび１％ヤギ血清中でブロック化された。第一の抗ヘパランサルッフェートプロテオグリカン（パールカン）抗体(Millipore, Watford, UK)はブロッキング溶液中で、１：１００で切片と共に終夜４°Cでキュベートされた。Ａｌｅｘａ−４８８結合ヤギ抗マウス抗体(LifeTechnologies, Paisley, UK)は、二次抗体として使われた。凍結切片は、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ(Life Technologies, Paisley, UK)を使用して設置された。Ａｌｅｘａ−４８８ラベルを視覚化ための５２５nmの発光フィルタを有する４８８nmの励起レーザー、およびＣｙ５．５ラベルを視覚化するため７００nmの発光フィルタを有する６４０nmの励起レーザーを使用して、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｕ  Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ共焦点顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｅｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、英国）の下で、凍結切片は観察された。
【０１６５】
ブタ関節軟骨移植片によるex   vivo バインディングアッセイ
これらの５つの、ＤＯＴＡＭから誘導された化合物の、軟骨を標的とする親和性を評価するために、我々はブタ関節軟骨移植片で、これらのＣｙ５．５−標識化プローブのex vivoバインディングアッセイを実施した。これらのex vivo実験において、そのままの奥行きのブタ関節軟骨ブロックは、５μMの其々のプローブによって、２４時間インキュベートされ、ＰＢＳ緩衝液で３７°Cで其々１０分間３回洗浄されて、非結合プローブを除かれ、その後、蛍光顕微鏡を使用して撮像された。Ｃｙ５．５からの近赤外蛍光発光の強度は、軟骨に残っているこれらのプローブの関連付けられた量を表す。軟骨に入ったプローブが、マトリックス区画中および軟骨細胞中の両方で観察された。細胞周辺マトリックスおよび細胞核には、プローブが実質的になかった。正電荷およびコラーゲンＩＩ標的ペプチドの数を増加すると、プローブがより大きい程度で軟骨中に固定された事がはっきりわかる。軟骨中の集積された蛍光によるプローブの蓄積の定量化は、非標的化より標的化プローブを劇的に明らかにした（図１）。標的化されないＨＨＹ−３０６に比べて１１．２倍、ＨＨＹ−３１２と同じ正味を含有しているが、特異的コラーゲン標的化ペプチドを欠いている非結合性スクランブル化HHY-322に比べて６．０倍の、１つの標的とされたペプチドを有するプローブＨＨＹ−３１２の平均増加があった。３つの標的とされたペプチドを有するプローブＨＨＹ−２９０では、非標的化ＨＨＹ−３０６より３６．６倍、ＨＨＹ−３１２（２つの末端電荷および１つの標的ペプチドを有する）より３．１倍、および３つのスクランブル化ペプチドを有するＨＨＹ−２９３より１．８倍の軟骨中の平均蓄積があった。
【０１６６】
光学的画像化を使用する軟骨に対するin   vivoでの結合性
光学的画像化を使用して、我々は軟骨へのプローブのin   vivo結合能を、更に評価した。
０．１μmoleの各化合物は経関節的にマウスの膝に注射され、in   vivoにおいて、蛍光顕微鏡およびX線が、局在および保持を定量化するため用いられた。関節からの非結合プローブの迅速な消失と、軟骨からの結合されたプローブの遅い消失を表現するために、二相指数関数的減衰モデルに、シグナルの減衰はフィットされた（ｎ＝５）。
【０１６７】
図２（Ａ）および２（Ｂ）に示されるように、関節内空からの非結合プローブの迅速な消失と、それに続く軟骨結合プローブの遅い第二相を有する二相性消失パターンを、プローブは示した。軟骨中で最も長い保持を示すプローブ、ＨＨＹ−２９０（３ＴＰ）は注射後８日に第一のシグナルの４０％を保持しており、一方非標的ＨＨＹ−３０６（ＣＰ）は急速に消失され、６時間後に２０％未満の保持であった。ＨＨＹ−３２２（１ＳＰ）の１３時間およびＨＨＹ−２９３（３ＳＰ）の1９時間のｔ１／２を有するスクランブル化対照プローブと比較して、ＨＨＹ−３１２（１ＴＰ）の２１０時間およびＨＨＹ−２９０（３ＴＰ）の１２８４時間の、標的プローブのフィットされた第二相半減期（ｔ１／２β）は、非常に長かった。図２（Ｃ）は４８時間後の各プローブの膝関節からの残存する蛍光シグナルを示しており、これは、対照プローブであるＨＨＹ−３０６（ＣＰ）、ＨＨＹ−３２２（１ＳＰ）、およびＨＨＹ−２９３（３ＳＰ）よりも、標的プローブＨＨＹ−３１２（１ＴＰ）およびＨＨＹ−２９０（３ＴＰ）が、それらの高活性の標的化特性の故に、膝関節のコラーゲン区画中で長い保持時間を有することを示している。図２（Ｄ）は、関節内注射の４８時間後の膝関節に残存しているプローブの残存量を示す代表的な蛍光とＸ線の融合画像を含む。
【０１６８】
心強いことに、７日間の処置の間に、副作用は観察されず、プローブは十分に耐えられた。
【０１６９】
カテプシンＤ酵素アッセイ：
カテプシンＤ阻害活性の定量化のために、消光され、蛍光標識され、カテプシンＤで解離され得る、ペプチド基質のターンオーバーを経時的に測定する、酵素アッセイが用いられた。
【０１７０】
具体的には，９６ウェルプレートのウェル当たり、１３ｎｇの精製されたカテプシンＤ酵素（Ｂｉｏｍｏｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓｅ−１９９）が与えられ、興味の物質／インヒビターが加えられ、該混合物が37°Ｃで10分間インキュベートされた。その後、蛍光ラベルされたカテプシンD−基質（７−メトキシクマリン−４−イル）−アセチル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−（３−［2,4−ジニトロフェニル］−Ｌ−2,3−ジアミノプロピオニル）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２（Ｂａｃｈｅｍ  Ｍ−１８９５）が加えられることにより酵素反応が開始された。反応ボリュームは３０μlに達し、５０ｍＭの酢酸、２００ｍＭのＮａＣｌ、および０．００３％のＢｒｉｊ３５を含有しており、酢酸でｐＨ 4,5に調整された。ペプチド鎖の解離により、消光剤、７−メトキシクマリンが放出され、蛍光染料の発光が１０分間、37°ＣでＴｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ−機器で励起／発光波長（３３０ｎＭ／３９０ｎＭ）を使用して測定される。化合物の投与量応答の決定の為に、１０ｍＭのＤＭＳＯ貯蔵溶液は希釈され、30μM最終濃度で始まって10点の3倍希釈シリーズで2度テストされた。各プレート上で平均ポジティブおよびネガティブ対照として実験的に定義された固定された最大値および最小値にフィットされた4つのパラメーター曲線を使用して、データは分析された。本アッセイで決定されたカテプシンDの阻害のＩＣ５０値（ｎＭ、μｍｏｌ／L）は下記の表３に示されている。
【表３】
2017501214.tif 000063
【０１７１】
結合の後、立体化学的制約がおびただしいにもかかわらず、化合物は標的のカテプシンＤにおいて妥協されない活性を示す。
【０１７２】
加えて、化合物ＨＨＹ−３２７の溶解性（ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中で＞５．９２ｍｇ／ｍＬ）は、ペプスタチンＡ（０．８２ｍｇ／ｍＬ）の溶解性と比較して増加されている。
【０１７３】
関節軟骨由来のプロテオグリカン、主にアグリカンの消失は、関節炎の病因の初期の特徴の１つである。軟骨が酸性のｐＨに維持されるときに、組織からのアグリカンの迅速な消失があることが示され、カテプシンＤのｐＨ依存的な活性化がこの消失の原因である事が示唆されてきた。ペプスタチンＡによるカテプシンＤの阻害により、ｐＨ５におけるプロテオグリカンおよび軟骨の分解は軽減される。
【０１７４】
遊離ペプスタチンＡと比較して結合体の、軟骨を標的とする親和性を探索するため、並びに変形性関節症において起こる関節軟骨中のアグリカンの分解におけるこれらのインヒビターの効果を決定する為に、ブタ関節軟骨移植片を用いたex   vivoでのＧＡＧ放出モデルが、実施された。
【０１７５】
軟骨移植片の調製および処置
軟骨分解モデルは、ブタ関節軟骨移植片を使用して実施された。そのままの奥行きのブタ関節軟骨は、小片に切断された（ｄ＝３ｍｍ）。簡潔に言うと、膝関節は、２０−２４週齢のブタから関節軟骨のために切り出された。その後、これらは貯蔵溶液、無血清ＤＭＥＭで二回洗浄される前に、２００単位／ｍｌのペニシリンおよび１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含有しているダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）および５％のＣＯ２中で、37°Ｃで２４時間静置された。ペプスタチンＡ／ＨＨＹ−３２７貯蔵溶液の濃度は、ＤＭＳＯ中で１０ｍＭであった。インヒビターは、ＤＭＥＭ緩衝液で１μＭに希釈された。カテプシンＤインヒビターペプスタチンＡまたはＨＨＹ−３２７と共に、1000μｌのｐＨ７．４の無血清ＤＭＥＭで、丸底の４８ウェルプレートの１つのウェルに各軟骨片は置かれた。37°Ｃ２４時間インキュベートされた後、試料は、37°Ｃにおいて、ＤＭＥＭバッファでそれぞれ１０分間で３回洗浄され、その後対照としてのｐＨ７．４の１ｍＬのＤＭＥＭ、またはｐＨ５．０の０．１Ｍのトリス−アセテート緩衝液と共にインキュベートされた。４時間、８時間、２４時間後、調製培地は回収され、使用するまで−20°Ｃで保存された。すべての実験が、１匹の動物ドナー由来の組織を使用して、ｎ＝８において、実施されたことに留意されるべきである。
【０１７６】
ｓ−ＧＡＧ濃度の測定
硫酸化グリコサミノグリカン（ｓ−ＧＡＧ）は、サメ軟骨コンドロイチンサルフェートＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）、米国）を標準として、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイ（Farndale RW, Buttle DJ, Barrett AJ, Improved quantitation anddiscrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethyleneblue. Biochim Biophys Acta 1986, 883, 173-177.）を使用して決定された。ＤＭＭＢ溶液は、サンプル、標準、および適切なブランク溶液を希釈するために用いられた。得られた溶液の吸光度は、マイクロプレートリーダー分光光度計を使用して、５２５nmで測定された。
【０１７７】
結果が図３に示されている。それは、酸性の（生理的に妥当な）ｐＨ環境におけるＧＡＧの分解を反映する。標的されていない天然のペプスタチンＡが全く効果を示さない一方で、結合され、標的とされた薬、化合物ＨＨＹ−３２７（実施例４、図３の１Ｐ１Ｉ）は非常に印象的な効果を示すことが観察される。
【０１７８】
刺激の２４時間後に、あらかじめインキュベートされた、カテプシンＤインヒビターのないネガティブ対照移植片は、ｐＨ５．０でＧＡＧの放出において、対照（ｐＨ７．４緩衝液）に対してほぼ４０倍の増加を示した。遊離ペプスタチンAのプレインキュベーションは、ＧＡＧの放出に代表されるアグリカンの分解を阻止するのに効果的でなく、それはペプスタチンＡが軟骨移植片中に保持されないことを示す。対照的に、酸で刺激されたＧＡＧの放出は、軟骨を標的とする接合体によって、著しく阻害された。ＨＨＹ−３２７（図３の１Ｐ１Ｉ）は１つの標的部分を担っており、２４時間でＧＡＧの放出の４１％を阻害できたが、分化効果は刺激の４８時間後に観察されることができなかった；一方３つの標的ペプチドに結合されたインヒビターを有する誘導体（ＨＨＹ−２９９、実施例７、図３の３Ｐ１Ｉ）では、２４時間でＧＡＧ放出の３４％および４８時間で１８％の阻害が観察された。ＤＯＴＡＭに基づくインヒビター結合体が、非結合インヒビターにとって可能であるよりもはるかに、効率的に軟骨組織に治療分子を届け、保持できることを、この非常に厳格なモデルでのex  vivo実験は、はっきり証明した。コラーゲン標的部分の利用は、純粋に電荷依存的な効果より優れていると判明した。これはＧＡＧの消失がＯＡの早期から中期でさえ顕著であり、それによって軟骨層の負電荷の包括的な減少という結果になるので、特に重要である。活性軟骨標的特性および結果としての阻害効果は、アダプター上の標的ペプチドの数を１から３に増やすことによって、延長できる。
【０１７９】
ブタ関節軟骨移植片を用いたex vivo MRI検査
１.全深度のブタ関節軟骨（ｄ＝４ｍｍ）は、安定するために、１７時間の培養に維持された。
２.37°Ｃで２４時間、ＭＲＩ造影剤（Ｇｄ−ＤＴＰＡまたはＭｎＣｌ２）でインキュベートされた。最適な浸透条件を達成する為、様々な濃度(0.2 mM, 0.5 mM, 2 mM, 5 mM)が試された。
３.洗い（それぞれ１０分間で３回）あり、または洗わず測定された。
【０１８０】
水中で標的造影剤ＨＨＹ−３１６ＧｄのＴ１シグナルの増大が測定され、臨床用の市販の造影剤としてのＧｄ−ＤＴＰＡ＿ＥＮＲＥＦ＿２７と比較された（図４）。ＨＨＹ−３１６Ｇｄでインキュベートされた軟骨のＴ１測定は、Ｇｄ−ＤＴＰＡと比較して４倍のシグナルの増大を示した（Ｔ１：３４４ｍｓ対１３９９ｍｓ）。シグナル増大のレベルは、ＭＲＩによる視覚化のために、軟骨を標的とするＨＨＹ−３１６Ｇｄの原理の効果を示す。
【０１８１】
市販のＧｄ−ＤＴＰＡ（ＤＯＴＡに基づく）と比較して、開発されたプローブの明白な優位性を、これらのex-vivoの軟骨実験は示す。電荷効果（軟骨を含有するＧＡＧを標的とするための）と高い特異性を有するコラーゲンＩＩ標的ペプチドの独特な組み合わせのみが、この効果の原因となる。
【０１８２】
健康ラットでの in   vivoＭＲＩ検査
正確な画像診断のための実際的なＭＲＩ造影剤として、軟骨を標的とする剤の可能性を探るために、我々は、健康なラットにおいて、in   vivoでＨＨＹ−３１６Ｇｄを研究した。本質的に非結合の対照として、非結合性スクランブル化ペプチド配列ＹＲＬＧＲＷおよびアセチル化アミン基を有する造影剤ＨＨＹ−３４１Ｇｄ（Ｔ１＝１３６８±１０ｍｓ、ＤＰＢ中０．２ｍＭ）が、対照として使用された。ＭＲＩは、４．７Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃ全身核磁気共鳴映像装置を使用して実施された。雄の骨格的に成熟したルイスラットは、麻酔され（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅによって）、背臥位に固定され、両膝が送信／受信リストコイルの中に置かれた。両膝は同時に視覚化され、片膝と他の膝との比較をすることができ、そこにおいて、異なる２つの造影剤ＨＨＹ−３１６ＧｄおよびＨＨＹ−３４１Ｇｄのラベリング特性および膝関節からのそれらの消失が、経時的にモニターされることがでた。また、４時間以内に関節半月、関  節滑膜、脂肪組織、筋肉、または骨のような関節の非軟骨区画から、両方の造影剤が急速に消失することを、ラット膝関節中の薬動力学的研究は示した。図５は、造影剤の関節内注射の２４時間後に、得られた画像を示す。ＨＨＹ−３１６Ｇｄを適用された膝では、骨関節、および主にコラーゲンＩＩおよびプロテオグリカンから成る成長板軟骨のＭＲＩシグナルの著しい増大がある。関節軟骨および成長板におけるシグナル強度（ＳＩ）は、ＨＨＹ−３１６Ｇｄの投与の２４時間後に８６％および７７％、関節内注射の７２時間後に８４％および８５％、それぞれ増大した（図６−１１）。非標的造影剤ＨＨＹ−３４１Ｇｄの関節内注射の後に得られた結果との比較により、骨関節および成長板軟骨のＭＲＩシグナル強度が、特定の組織へのプローブの標的効果によるＨＨＹ−３１６Ｇｄの蓄積によって生ずるという仮定が、更に確実となる。対照的に、関節部位のＳＩ増大が、ない。ＨＨＹ−３４１Ｇｄの関節内注射の前と７２時間後については、非標的対照の蓄積は、ほとんど観察されなかった。
【０１８３】
ＡＣＬＴ−ｐＭｘラットでの in   vivoＭＲＩ検査研究
研究の終了後に関節スライスの組織学的検査を補助するために、我々は、Ｃｙ５．５部分を含有する第２のプローブＨＨＹ−３３８（Ｔ１＝１１４９３±２７ｍｓ、ＤＰＢＳ中０．２ｍＭ）を共に投与することとした。光学およびＭＲＩに基づく画像化の異なる感受性を説明するために、我々は、蛍光プローブを１％のみ加えることを選択した。１％のＨＨＹ−３３８および９９％のＨＨＹ−３１６Ｇｄの１０ｍＭＤＰＢＳ溶液５０μＬは、手術後の２８日目に、ラット（ｎ＝４）のＡＣＬＴ−ｐＭｘを施した右膝および処置の施されていない対照の左膝に関節内注射された。造影後の画像は投与直後に撮られ、投与後２日にわたり追跡された（図１２ａ）。手術が施行された膝と比較して非手術膝関節においては、関節軟骨および成長板の明白なＭＲＩシグナル増大が観察されることができた。興味深いことには、不安定なＡＣＬＴ−ｐＭｘ膝において、関節軟骨および成長板のＳＩの増大のほかに、より明るいＭＲＩ信号を有する部位が、軟骨瘤／骨棘（赤い輪）の形成を示す内側脛骨平坦部の縁において、観察された。この結果は、組織学的研究によって、更に確認された。投与４８時間後に、ネズミは殺され、そして、膝関節が組織学のために切除され、凍らされ、切断された。軟骨瘤／骨棘部位は、Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｒａｘｓｃａｎ顕微鏡を使用して、サフラニンＯ／ファーストグリーンにより染色された切片において、検討された。（図１２ｂ）。非手術関節は、大腿関節丘または脛骨平坦部において、軟骨瘤／骨棘の形成を示さなかった。対照的に、ＡＣＬＴ−ｐＭｘ関節は、内側脛骨平坦部の縁で、早期の軟骨瘤／骨棘（段階Ｉ）形成を示した。切断された膝スライスの蛍光顕微鏡は、軟骨組織で高度の蛍光シグナルを明らかにし、それはＭＲＩデータと一致しており、固有の標的効果による、軟骨組織中のプローブの選択的且つ高度の蓄積を示す。非手術膝関節において、プローブは均一に分布して関節軟骨に入り、ＮＩＲＦシグナルは、マトリックス区画および軟骨細胞中の両方で観察された。細胞周辺マトリックスおよび細胞核には、シグナルが実質的になかった（図１３）。図１２ｃに示されるように、ＡＣＬＴ−ｐＭｘ関節軟骨において、軟骨領域の他に、軟骨瘤／骨棘領域で、より多くのシグナルは得られた。これはＧＡＧならびにコラーゲンＩＩａ（軟骨前駆体細胞により発現されたコラーゲンＩＩ遺伝子のスプライスバリアントである）の発現によるであろう。
【０１８４】
図１４はＩＩＡ型プロコラーゲンとプローブの共局在下が、骨棘部位にあることを示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図１３】
2017501214.tif 000083
【図１４】
2017501214.tif 000084
【配列表】
2017501214000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月12日(2016.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩、
【化１】
2017501214.tif 000085
ここでＭは、存在しないかまたは存在し、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９Ｍｏの群からの正に荷電した金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から互いに独立して選択され；
ｎは、１および２から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選ばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは、互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−
【化２】
2017501214.tif 000086
から互いに独立して選ばれ、
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●光学的画像化に適している蛍光体；
●ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、光学的画像化に適している蛍光体またはＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）であり；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、ＯＡの発症および進行に関わるたんぱく質の異常発現または活性をモニターするのに適している１より多い、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表すことはできない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉｂ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩、
【化３】
2017501214.tif 000087
ここで
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から互いに独立して選択され；
ｎは、１および２から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選らばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは、互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっていて、結合手、解離可能なリンカー、−Ｙ５−（Ｚ５）ｒ、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）
【化４】
2017501214.tif 000088
から互いに独立して選択され、
ここで、ｒは１〜３から選択され、Ｙ５は解離可能なリンカー、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）、Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）、（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）から選択され、Ｚ５はＺ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４について定義された通りであり；
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に役立つ化合物；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、上記に定義されているように変形性関節症、変形性関節症に関連した合併症、または軟骨関連の障害の治療に有用な化合物を表す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
立体異性体または任意の割合の立体異性体の混合物のいずれかである、式（Ｉａ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩、
【化５】
2017501214.tif 000089
ここでＭは、存在しないかまたは存在し、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｔｂ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９Ｍｏの群からの正に荷電した金属イオンであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｐ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、および−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−から互いに独立して選択され；
ｎは、１および２から選択され；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、−（ＣＨ２）ｍ［−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ］ｑ−から互いに独立して選らばれ；
ｍ、ｑ、およびｐは、互いに独立して同一であるか異なっており、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、互いに独立して同一であるか異なっており、結合手、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ０−Ｃ６）−アルキル−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−、−（Ｃ０−Ｃ４）−アルキル−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−
【化６】
2017501214.tif 000090
から互いに独立して選ばれ、
Ｒ１およびＲ２は、水素、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルからなる組から、互いに独立して選択され；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、互いに独立して同一であるか異なり、以下から互いに独立して選択される：
●水素原子；
●ＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
●蛍光体；
●活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）；
●ただし
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つはＷＹＲＧＲＬ−(SEQ ID NO:1) [TrpTyrArgGlyArgLeu] SEQ ID NO:Iのアミノ酸配列、またはその保存的置換またはその反復配列を有しているポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは軟骨組織と特異的に結合し、該ポリペプチドのＮ末端部分がアセチル化されている；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも一つは、蛍光体または活性に基づいたプローブ（ＡＢＰ）を表し；
○Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は、１より多い、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を表すことはできない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【図１】ブタ軟骨移植片でのEx Vivo研究である。
【図２−１】プローブHHY-306（CP），HHY-312（1TP），HHY-322（1SP），HHY-290（3TP），およびHHY-293（3SP）に基づいたDOTAMのIn vivo薬物動態である。
【図２−２】プローブHHY-306（CP），HHY-312（1TP），HHY-322（1SP），HHY-290（3TP），およびHHY-293（3SP）に基づいたDOTAMのIn vivo薬物動態である。
【図３】ブタ関節軟骨移植片のグリコサミノグリカン（GAG）放出のEx vivo測定（HHY-327 1P1IとHHY-299 3P1I）である。
【図４】HHY-316Gd対対照Gd-DTPAでインキュベートされた軟骨のMRI画像
【図５】造影剤HHY-316-Gd（左）とHHY-341Gd（右）の注射後の24時間後のラット膝のMRI画像である。
【図６】T1-強調画像における大腿骨軟骨領域、脛骨成長板領域、注射部位領域、筋領域、骨領域、滑膜領域、及び標準領域の高精度画像である。
【図７】HHY-316Gd（左）とHHY-341Gd（右）の注射前後の軟骨と成長板の標準化強度（平均±標準誤差、n＝4）のプロットである。
【図８】HHY-316Gd（左）とHHY-341Gd（右）の注射前後の滑膜領域の標準化平均強度である。
【図９】HHY-316Gd（左）とHHY-341Gd（右）の注射前後の注射領域の標準化強度（ｎ＝4）のプロットである。
【図１０】HHY-316Gd（TCA）（左）とHHY-341Gd（右）の注射前後の骨領域の標準化平均強度（n＝4）のプロットである。
【図１１】HHY-316Gd（TCA）（左）とHHY-341Gd（NCA）（右）の注射前後の筋領域の標準化平均強度（n＝4）のプロットである。
【図１２】（a）造影剤HHY-316Gd-338Gdの注射24時間後のラット膝のin vivo  MR画像である。（b）ACLT-ｐMx膝関節スライスの内側面の顕微鏡写真（サフラン0/ファーストグリーン染色）である。（c）ACLT-ｐMx膝関節スライスの蛍光画像（em=695nm)である。
【図１３】48時間後の非手術膝関節の関節軟骨中のプローブの分布である。
【図１４】2A型プロコラーゲンの免疫蛍光染色である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
化合物ＨＨＹ−２９８
【化３２】
2017501214.tif 000091
ペプスタチンＡ（２０ｍｇ、３０μmol）、ＥＤＣＩ（５８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、１０当量）およびＮＨＳ（３５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、１０当量）が、フラスコ中に置かれた。
これに無水DMF（２ｍｌ）が加えられ、反応系は終夜撹拌された。DMFは高減圧下において、取り除かれた。固体は、容器の壁からはがされ、水（１０ｍｌ）により洗浄され、濾過によって集められた。固体は、水（５０ｍｌ）によって、そしてジエチルエーテル（５ｍｌ）によって、更に洗浄された。その後、湿った固体は無水Ｐ２Ｏ５で、減圧下で２４時間乾燥された（Org. Biomol. Chem., 2006, 4, 1817-1830）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
化合物ＨＨＹ−３２５
【化３３】
2017501214.tif 000092
ＨＨＹ−３３６ａ（１２ｍｇ、１０μmol）がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてペプスタチンＡ  ＮＨＳエステルＨＨＹ−２９８  １当量（８ｍｇ、１０μmol）およびＤＩＰＥＡ  5当量（10μｌ、５０μmol）が添加された。反応混合物は、室温で24時間アルゴン下で撹拌された。反応が完了した後、溶媒は蒸発により除去され、残渣は５０％のＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２１０ｍｌ中に溶解された。Ｂｏｃ基の除去は、ＬＣ−ＭＳによって、モニターされた。３０分後に溶媒はトルエンと共に、共蒸発され、粗生成物はHPLCにより直接精製されて、白色粉体としてＨＨＹ−３２５が与えられた（６ｍｇ、収率３８％）。
ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ＋２Ｈ］2＋＝７９７．３。HRMS C74H145N17O20の計算値: 1592.08518;実測値: 1592.08514 ([M+2H]2+= 797.04985)。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
標的ペプチドバイモーダル画像化結合体ＡｃＷＹＲＧＲＬ−ＤＯＴＡ−Cy5.5-［Ｇｄ３＋］
【化３６】
2017501214.tif 000093
HHY-316Gd(19 mg, 10 μmol)がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてCy5.5ＮＨＳエステル１当量(7 mg, 10 μmol)およびＤＩＰＥＡ  5当量（10μｌ、５０μmol）が添加された。反応混合物は、室温で１２時間アルゴン下で撹拌された。反応が完了したあと、溶媒は、減圧下で除去された。反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、青色粉体としてHHY-338 (13 mg,収率 51 %)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ実測値：［Ｍ］４＋＝630.2。HRMS C122H184N28O20Gdの計算値: 2521.33792;実測値:2521.33802 ([M+H]4+= 504.46906)。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
化合物ＨＨＹ−３２８
標的ペプチド薬結合体ＡｃＷＹＲＧＲＬ−ＤＯＴＡ−（ペプスタチンA）３
【化３８】
2017501214.tif 000094
HHY-316 １当量(9 mg, 5 μmol)がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてペプスタチンＡ  ＮＨＳエステルＨＨＹ−２９８  ３当量(12 mg, 15 μmol)）およびＤＩＰＥＡ１２当量（10μｌ、６０μmole）が添加された。反応混合物は、アルゴン下、室温で２日間撹拌された。溶媒は分取ＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体としてＨＨＹ−328 (4.3 mg, 収率: 22.6 %)が与えられた。本生成物は、凍結乾燥の後ＤＭＳＯにわずかに溶解するのみである。ＥＳＩ−ＭＳC184H326N40O44の計算値：3802.9、実測値：［Ｍ＋３Ｈ］3＋＝1268.5。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
化合物ＨＨＹ−２９０
標的ペプチド蛍光結合体（ＡｃＷＹＲＧＲＬ）３−ＤＯＴＡ−Ｃｙ５．５
【化５３】
2017501214.tif 000095
HHY-289(15 mg, 4.2 μmol)がDMF１．５ｍｌ中に溶解され、続いてCy5.5ＮＨＳエステル１.3当量(4 mg, 5.5 μmol)およびＤＩＰＥＡ  6当量（5μｌ、25μmol）が添加された。反応混合物は、室温で１２時間アルゴン下で撹拌された。反応が完了したあと、溶媒は、減圧下で除去された。
反応が完了したあと、反応溶液はＨＰＬＣによって、直接精製されて、青色粉体としてHHY-２９０ (13 mg,収率 ７５%)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ：［Ｍ＋3Ｈ］4＋＝1029.0。ＨＲＭＳ Ｃ２０６Ｈ３０２Ｎ５３Ｏ３７の計算値：４１１０．３３７３８、実測値：４１１０．３３８８８（［Ｍ＋５Ｈ］6＋＝６８５．８９５８８）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
化合物ＨＨＹ−２９９
標的ペプチド薬結合体（ＡｃＷＹＲＧＲＬ）３−ＤＯＴＡ−ペプスタチンＡ
【化５４】
2017501214.tif 000096
ＨＨＹ−２８９（１０ｍｇ、２．８μmol）は１．５ｍｌのDMF中に溶解され、続いてペプスタチンＡＮＨＳエステルＨＨＹ−２９８の１．５当量（３．３ｍｇ、４．２μmol）およびＤＩＰＥＡ６当量（３μｌ、１７μmole）が添加された。反応混合物は、室温で１２時間アルゴン下で撹拌された。溶媒は分取ＨＰＬＣによって、直接精製されて、白色粉体としてHHY-299 (3.2 mg, 収率 27.2 %)が与えられた。ＥＳＩ−ＭＳ  C200H322N56O4４の計算値：4215.2;実測値: [M+4H]4+ = 1054.7。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
ブタ関節軟骨移植片によるex   vivo バインディングアッセイ
これらの５つの、ＤＯＴＡＭから誘導された化合物の、軟骨を標的とする親和性を評価するために、我々はブタ関節軟骨移植片で、これらのＣｙ５．５−標識化プローブのex vivoバインディングアッセイを実施した。これらのex vivo実験において、そのままの奥行きのブタ関節軟骨ブロックは、５μMの其々のプローブによって、２４時間インキュベートされ、ＰＢＳ緩衝液で３７°Cで其々１０分間３回洗浄されて、非結合プローブを除かれ、その後、蛍光顕微鏡を使用して撮像された。Ｃｙ５．５からの近赤外蛍光発光の強度は、軟骨に残っているこれらのプローブの関連付けられた量を表す。軟骨に入ったプローブが、マトリックス区画中および軟骨細胞中の両方で観察された。細胞周辺マトリックスおよび細胞核には、プローブが実質的になかった。正電荷およびコラーゲンＩＩ標的ペプチドの数を増加すると、プローブがより大きい程度で軟骨中に固定された事がはっきりわかる。軟骨中の集積された蛍光によるプローブの蓄積の定量化は、非標的化より標的化プローブを劇的に明らかにした（図１）。標的化されないＨＨＹ−３０６に比べて１１．２倍、ＨＨＹ−３１２と同じ正味電荷を含有しているが、特異的コラーゲン標的化ペプチドを欠いている非結合性スクランブル化HHY-322に比べて６．０倍の、１つの標的とされたペプチドを有するプローブＨＨＹ−３１２の平均増加があった。３つの標的とされたペプチドを有するプローブＨＨＹ−２９０では、非標的化ＨＨＹ−３０６より３６．６倍、ＨＨＹ−３１２（２つの末端電荷および１つの標的ペプチドを有する）より３．１倍、および３つのスクランブル化ペプチドを有するＨＨＹ−２９３より１．８倍の軟骨中の平均蓄積があった。
【国際調査報告】
2017501214.tif 000097
2017501214.tif 000098
2017501214.tif 000099
2017501214.tif 000100
2017501214.tif 000101