(57)【要約】  ある局面において、本発明は、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、および／またはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する、改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞を提供する。本発明はまた、これらの改変された細胞およびこれらの改変された細胞を含む組成物の製造および使用の方法を提供する。
2017522047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、または、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含む、改変された神経系細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞の集団。
【請求項２】
改変された神経系細胞がニューロンである、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
改変されたニューロンが海馬ニューロンである、請求項２に記載の集団。
【請求項４】
ニューロンが、βＩＩＩチューブリン、ＭＡＰ２、タウ、ＮｅｕＮおよび神経フィラメントからなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する、請求項２または３に記載の集団。
【請求項５】
改変された神経系細胞がグリア細胞である、請求項１に記載の集団。
【請求項６】
グリア細胞が、星状細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、放射状グリア、シュワン細胞、衛星細胞、および腸管グリア細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の集団。
【請求項７】
グリア細胞が星状細胞である、請求項５に記載の集団。
【請求項８】
改変されたグリア細胞が、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびＧＬＴ−１からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する、請求項５に記載の集団。
【請求項９】
改変されたグリア細胞が、ＧＦＡＰ陽性星状細胞である、請求項５に記載の集団。
【請求項１０】
改変された神経系細胞が初代神経系細胞である、あるいは、初代神経系細胞に由来する、請求項１に記載の集団。
【請求項１１】
改変された神経系細胞が、幹細胞、前駆細胞、または非神経系細胞に由来する、請求項１に記載の集団。
【請求項１２】
改変された神経系細胞が多能性幹細胞に由来する、請求項１に記載の集団。
【請求項１３】
多能性幹細胞が胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１２に記載の集団。
【請求項１４】
改変された神経系細胞が、非神経系細胞の初期化により生じる、請求項１に記載の集団。
【請求項１５】
改変された神経系細胞が、非神経系細胞の分化転換により生じる、請求項１に記載の集団。
【請求項１６】
改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１に記載の集団。
【請求項１７】
改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞が、ヒト細胞である、請求項１に記載の集団。
【請求項１８】
改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞が、単離された細胞である、請求項１に記載の集団。
【請求項１９】
改変された神経系細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞の実質的に純粋な集団である、請求項１に記載の集団。
【請求項２０】
改変された神経系細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞がインビトロである、請求項１に記載の集団。
【請求項２１】
改変された神経系細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞が、生体中でインビボである、請求項１に記載の集団。
【請求項２２】
インビボの移植手順における、請求項１に記載の細胞集団の使用。
【請求項２３】
神経系細胞異常、神経系細胞欠損、または神経系細胞損傷に関連する疾病、疾患、または症状を処置する方法における、請求項１に記載の細胞集団の使用。
【請求項２４】
請求項１に記載の改変された神経系細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、神経系細胞異常、神経系細胞欠損、または神経系細胞損傷に関連する疾病、疾患、または症状を処置する方法。
【請求項２５】
疾病、疾患または症状が、脳外傷、脊髄損傷、多発性硬化症（ＭＳ）、ウイルス感染後急性脱髄、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、ギラン・バレー症候群、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、クラッベ型白核ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、アレキサンダー病、カナバン病、コケイン症候群、およびペリツェウス・メルツバッヘル病からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
疾病、疾患または症状が、神経変性疾患、神経発達疾患、または脱髄もしくは髄鞘形成異常もしくはニューロンに関連する疾病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の細胞集団とキャリア溶液とを含む、組成物。
【請求項２８】
請求項１に記載の細胞集団と生体への投与に好適なキャリア溶液とを含む、治療用組成物。
【請求項２９】
アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１蛋白質をコードする核酸分子を、１つ以上の神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞に導入し、それによって改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞を生産することを含む、改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞の集団を生産する方法。
【請求項３０】
（ａ）アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞の集団を獲得すること、および（ｂ）当該改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞を培養すること：を含む、改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞の集団を生産する方法。
【請求項３１】
（ａ）１つ以上の神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞を獲得すること、（ｂ）アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子を１つ以上の神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞に導入して、改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞を生産すること、および（ｃ）改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞を培養すること：を含む、改変された神経系細胞、神経幹細胞、または神経前駆細胞の集団を生産する方法。
【請求項３２】
（ａ）アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子を、１つ以上の幹細胞または前駆細胞に導入して、改変された幹細胞または前駆細胞を形成すること、および（ｂ）改変された幹細胞または前駆細胞を神経系細胞に分化させ、それにより改変された神経系細胞の集団を生産すること：を含む、改変された神経系細胞の集団を生産する方法。
【請求項３３】
（ａ）アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む改変された幹細胞または前駆細胞の集団を獲得すること、および（ｂ）１つ以上の改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を分化させて、改変された神経系細胞を生産すること：を含む、改変された神経系細胞の集団を生産する方法。
【請求項３４】
改変された神経系細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞を培養することをさらに含む、請求項２９、３２、または３３に記載の方法。
【請求項３５】
改変された神経系細胞が、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを発現する、請求項２９、３０、３１、３２、または３３に記載の方法。
【請求項３６】
核酸分子を、神経系細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞に、インビトロで導入する、請求項２９、３０、３１、３２、または３３に記載の方法。
【請求項３７】
核酸分子を、神経系細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞に、インビボで導入する、請求項２９または３２に記載の方法。
【請求項３８】
幹細胞または前駆細胞が、神経幹細胞または神経前駆細胞である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３９】
幹細胞が多能性幹細胞である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項４０】
多能性幹細胞が胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
導入ステップが、トランスフェクションによって行われる、請求項２９、３１、または３２に記載の方法。
【請求項４２】
トランスフェクションが、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および微粒子銃からなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
導入ステップが、ウイルス媒介形質導入によって行われる、請求項２９、３１、または３２に記載の方法。
【請求項４４】
ウイルス媒介形質導入が、レンチウイルス媒介形質導入、アデノウイルス媒介形質導入、レトロウイルス媒介形質導入、アデノ随伴ウイルス媒介形質導入およびヘルペスウイルス媒介形質導入からなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
同じ培養容器でニューロン集団と改変されたグリア細胞集団を共に培養することを含む、ニューロン集団を培養するための共培養方法であって、ここで改変されたグリア細胞はアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するか、あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する。
【請求項４６】
改変されたグリア細胞が、培養容器表面上に支持細胞層を形成する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ニューロンが、支持細胞層上に存在する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
改変されたグリア細胞の培養物から獲得されたグリア細胞ならし培地と、ニューロンの集団を接触させることを含む、ニューロンを培養する方法であって、ここで、改変されたグリア細胞はアデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するか、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する。
【請求項４９】
（ａ）アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するか、あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する、改変されたグリア細胞の集団を獲得すること、（ｂ）培養容器中で改変されたグリア細胞を培養すること、（ｃ）培養容器からならし培地を回収すること、（ｄ）当該ならし培地をニューロンの培養物に加えること、および（ｅ）ニューロンを培養することを含む、ニューロンを培養する方法。
【請求項５０】
アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するか、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する、改変されたグリア細胞の培養物から取得された細胞培養ならし培地。
【請求項５１】
改変されたグリア細胞が、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するか、あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する、改変されたグリア細胞集団を含む、インビトロの血液脳関門モデル系。
【請求項５２】
改変されたグリア細胞が星状細胞である、請求項５１に記載のモデル系。
【請求項５３】
（ａ）アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するか、あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する、改変されたグリア細胞の集団、（ｂ）周辺細胞、および（ｃ）内皮細胞：を含む、インビトロの血液脳関門モデル系またはキット。
【請求項５４】
改変されたグリア細胞が星状細胞である、請求項５３に記載のモデルまたはモデル系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月２７日に出願された米国特許仮出願第６２／０１８，０５６号の利益を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
参照による組み込み
参照による組み込みを許可する法域のためだけに、本明細書に引用される全ての文書の文章は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アデノウイルス初期蛋白質４（Ｅ４）領域は、少なくとも６つのオープンリーディングフレーム（Ｅ４ＯＲＦ）を含有する。Ｅ４領域全体は、血管新生を制御し、内皮細胞の生存を促進することが既に示されている（Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12): 11760- 66参照）。Ｅ４領域全体の中で、内皮細胞における生物学的作用を担うのは、Ｅ４ＯＲＦ１配列であることもまた、既に示されている。米国特許第８，４６５，７３２号を参照されたい。Seandel et al. (2008), “Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E40RF１ gene,” PNAS, 105(49): 19288-93もまた参照されたい。しかしながら、出願人の知る限りでは、本発明以前に、アデノウイルスＥ４領域、特にＥ４ＯＲＦ１配列が、ニューロンあるいはグリア細胞のいずれかに有益な効果を有するであろうことを示唆する証拠はなかった。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１配列の発現が、ニューロンおよびグリア細胞（本明細書ではまとめて神経系細胞と呼ぶ）において、ある種の有益な効果を有しうるという驚くべき発見に、部分的に由来する。例えば、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１を発現するグリア細胞が、高い増殖率を示し、Ｅ４ＯＲＦ１を発現しないグリア細胞と比較して多数の集団倍加にわたってインビトロで継代培養できることが、見出されている。同様に、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１を発現するニューロンは、Ｅ４０ＲＦ１を発現しないニューロンと比較して、軸索の長さが長く、短い神経突起（minor process）の数が多く、軸索当たりの枝分かれの数が多いことが見出されている。これらの効果は、神経系細胞の明らかな脱分化あるいは形質転換なしに、達成された：Ｅ４ＯＲＦ１発現ニューロンおよびグリア細胞は、ある種の細胞型特異的マーカーを発現し続け、これらの細胞型の細胞形態特性を維持した。これらの発見を基に、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞を形質転換することなく、あるいは細胞の正常な表現型特性および／または系統同一性を破壊することなく、神経系細胞を獲得、維持、あるいは培養する新規の方法を提供する。同様に、他の実施形態において、本発明は、治療用途を含むがこれに限定されない様々な状況において有用であり得る、新規の改変された神経系細胞を提供する。例えば、ニューロンの軸索の長さおよび短い神経突起や軸索の枝分かれの数を増加させる能力は、ニューロンの再生および／または修復を含む治療用途において利益をもたらし得ると考えられる。同様に、より多くのグリア細胞を生み出す、あるいはより増殖率の高いグリア細胞を生み出す能力はまた、グリア細胞の再生および／または修復を含む治療用途において、利益をもたらし得ると考えられる。本発明のこれらの局面および他の局面は、本開示の以下および全体を通して、さらに詳細に記載されている。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本発明は、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体−本開示の「詳細な説明」に記載し規定しているように）をコードする核酸配列を含む、改変された神経系細胞の集団、あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）を含む改変された神経系細胞の集団を提供する。いくつかのこれらの実施形態において、神経系細胞はニューロンである。他のこれらの実施形態において、神経系細胞はグリア細胞である。他の実施形態において、本発明は、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）をコードする核酸配列を含む改変された神経幹細胞または神経前駆細胞の集団、またはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）を含む改変された神経幹細胞または神経前駆細胞の集団を提供する。いくつかのこれらの実施形態において、神経幹細胞または神経前駆細胞は、ニューロン前駆細胞である。他のこれらの実施形態において、神経幹細胞または神経前駆細胞は、グリア細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞の集団（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞の集団）は単離された細胞集団である。いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞の集団（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞の集団）は、実質的に純粋な細胞集団である。いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞の集団（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞の集団）は、インビトロで、例えば細胞培養されて存在する。いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞の集団（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞の集団）は、インビボで、例えば生体中に存在する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）の集団を含む組成物を提供する。これらの組成物は、生理食塩水などのキャリア溶液を含んでもよい。いくつかの実施形態において、これらの組成物は、改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）の集団と、ヒト対象などの対象に投与するのに好適なキャリア溶液とを含む、治療用組成物であってよい。
【０００７】
本明細書に記載される細胞集団、およびこれらの細胞集団を含む組成物は、（本特許開示の他の部分においてさらに記載されるように）様々な用途において有用であり得る。一般的に、本明細書で提供される改変された神経系細胞および神経幹細胞または神経前駆細胞は、改変されていない（すなわちＥ４０ＦＲｌ非発現）神経系細胞または神経幹細胞または神経前駆細胞が現在用いられている、あるいは用いられ得る、任意の用途に用いられ得る。これらの任意の用途には、基礎的科学研究用途、細胞培養法（ニューロン／グリア共培養法を含む）、神経疾患のモデル系、組織モデル系（例えば血液脳関門モデル系）、標的の発見、創薬、および薬物有効性、毒性、および／または安全性試験が含まれるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）はインビボ細胞移植手順を含むがこれに限定されない治療用途において、有用であり得る。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、神経系細胞においてアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、もしくはフラグメント）をコードする核酸配列の発現、あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）の神経系細胞への送達を含む様々な方法を提供する。いくつかのこれらの実施形態において、神経系細胞はニューロンである。他のこれらの実施形態において、神経系細胞はグリア細胞である。他の実施形態において、本発明は、神経幹細胞または神経前駆細胞における、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）をコードする核酸配列の発現、または、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）の神経幹細胞または神経前駆細胞への送達を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、神経幹細胞または神経前駆細胞は、ニューロン幹細胞またはニューロン前駆細胞であり得る。他の実施形態において、神経幹細胞または神経前駆細胞は、グリア幹細胞またはグリア前駆細胞であり得る。いくつかの実施形態において、神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）は単離された細胞である。いくつかの実施形態において、神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）は、実質的に純粋な細胞集団である。いくつかの実施形態において、神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）は、インビトロで、例えば細胞培養されて存在する。いくつかの実施形態において、神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）は、インビボで、例えば生体中に存在する。
【０００９】
例えば、ある実施形態において、本発明は改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）の集団を生産する方法を提供し、本方法は、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１蛋白質（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）をコードする核酸分子を、１つ以上の神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）に導入し、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチドを発現する改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）を製造することを含む。別の実施形態において、本発明は、インビトロで、改変された神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）の集団を獲得する方法を提供し、本方法は、（ａ）アデノウイルスＥ４０ＲＦ１蛋白質（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）をコードする核酸分子を、１つ以上の神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）に導入し、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチドを発現する改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）を製造すること、および（ｂ）改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）をインビトロで培養することを含む。同様に、別の実施形態において、本発明は、神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）を培養する方法を提供し、本方法は、（ａ）Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）を発現する改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）の集団を獲得すること、および（ｂ）改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）を培養することを含む。さらに別の実施形態において、本発明は、神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）を培養する方法を提供し、本方法は、１つ以上の神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）を獲得すること、（ｂ）アデノウイルスＥ４０ＲＦ１蛋白質（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）をコードする核酸分子を１つ以上の神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）に導入して、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチドを発現する改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）を製造すること、および（ｃ）改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）を培養することを含む。さらに別の例示的な実施形態において、本発明は、（ａ）アデノウイルスＥ４０ＲＦ１蛋白質（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）をコードする核酸分子を、１つ以上の神経幹細胞または神経前駆細胞に導入して、改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を形成すること、および（ｂ）１つ以上の改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を分化させて、Ｅ４０ＲＦ１蛋白質を発現する改変された神経系細胞を生産することを含む方法を提供する。さらに別の例示的な実施形態において、本発明は、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１蛋白質（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）を発現する改変された神経幹細胞または神経前駆細胞の集団を獲得すること、および（ｂ）１つ以上の改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を分化させて、Ｅ４０ＲＦ１蛋白質を発現する改変された神経系細胞を生産することを含む方法を提供する。さらに別の例示的な実施形態において、本発明は（ａ）神経幹細胞または神経前駆細胞の集団を獲得すること、（ｂ）アデノウイルスＥ４０ＲＦ１蛋白質（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）をコードする核酸分子を１つ以上の神経幹細胞または神経前駆細胞に導入し、改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を形成すること、および（ｃ）１つ以上の改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を分化させて、Ｅ４ＯＲＦ１蛋白質を発現する改変された神経系細胞を生産することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明のこれらおよびその他の実施形態は、本特許開示の他の部分でさらに記載されている。加えて、当業者には明らかであるように、本明細書に記載される様々な実施形態の変更および組み合わせは、本発明の範囲内に入る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】グラフは、海馬ニューロンにおける、軸策の長さ（図１Ａ）、ニューロン当たりの短い神経突起の数（図１Ｂ）、および軸索当たりの一次軸索側枝の数（図１Ｃ）に対する、Ｅ４０ＲＦ１発現の効果を示している。データは、Ｅ４０ＲＦ１＋ＧＦＰ（「Ｅ４ＯＲＦ１」）またはＧＦＰ単独（「コントロール」）のいずれかで形質導入した後に、取得された。「＊」の記号は、統計学的有意性を表す（ｐ＜０．０５）。Ｅ４ＯＲＦ１を発現する海馬ニューロンは、軸索の長さ、ニューロン当たりの短い神経突起の数、軸索当たりの一次軸索側枝の数において、コントロールと比較して、統計学的に有意な増加を示した。
【００１２】
【図２】コントロール（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）と、Ｅ４ＯＲＦ１発現海馬ニューロン（図２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆ）の例示的な蛍光顕微鏡の画像。コントロール群およびＥ４０ＲＦ１群の両方のニューロンが、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を発現している。結果として生じる緑色蛍光は、本明細書で提供されるグレースケールバージョンの画像において、明るく／白く（暗い背景に対して）見える。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本特許開示の「本発明の概要」、「図面」、「図面の簡単な説明」、「実施例」および「特許請求の範囲」の部分には、本発明の、いくつかの主な実施形態が記載されている。本「詳細な説明」の部分は、本発明の組成物および方法に関連するさらなる説明を提供するものであり、本特許開示の全ての他の部分と共に読むことが意図されている。さらに、当業者には明らかなことであるが、本特許開示を通して記載される異なる実施形態が、様々な異なる方法で組み合わせられ得、かつ組み合わせられることを意図されている。本明細書に記載される具体的な実施形態のこれらの組み合わせは、本発明の範囲内に入ることが意図されている。
【００１４】
Ｉ．定義
いくつかの定義を、以下に提供する。他の用語は、本特許開示の他の部分で規定されるか、用語が使われている文脈から明らかな意味を有するか、あるいは当業界での通常の意味に従い用いられる。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、「約」および「おおよそ」という用語は、数値に関連して用いられる際は、記載された値の＋または−２０％以内を意味する。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、細胞または細胞群の細胞を説明するために形容詞または名詞として用いられる「コントロール」という用語（例えば、コントロール細胞、コントロール細胞群など）は、その確立された科学的な意味に従い用いられる。例えば、本発明のいくつかの実施形態には、「改変された」細胞と「コントロール」細胞との比較が包含される。これらの実施形態において、「改変された」細胞は、一般的に、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有し、一方、標準的な科学的習慣に従い、「コントロール」細胞は、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含まないが、その他の点では「改変された」細胞と同等である、即ち、「コントロール」細胞は、「改変された」細胞と同じ型の細胞であり（例えば、改変された細胞が星状細胞である場合、コントロール細胞もまた星状細胞であるべきである）、「改変された」細胞と同等に（あるいは、本質的に同一に、もしくは同一に）扱われる。例えば、改変された細胞とコントロール細胞とは、同等の方法で、あるいは本質的に同一の方法で、処理および／または培養されるべきである。いくつかの実施形態において、コントロール細胞は、改変された細胞が由来する細胞の集団を含んでもよく、例えば、コントロール細胞群は、例えばＥ４０ＲＦ１配列の形質導入により後に改変されて、改変された細胞を生産する、出発（starting）細胞集団（例えば、Ｅ４０ＲＦ１配列を形質導入する前の）を含んでもよい。他の実施形態において、コントロール細胞は、改変された細胞が由来する出発細胞集団を含まなくてもよいが、代わりに、改変された細胞と同じ型の細胞の、別の集団を含んでもよい。
【００１７】
本明細書で用いられる「培養する」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での細胞の増殖を指す。「共培養する」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での２つ以上の異なる型の細胞の増殖を指し、例えば、いくつかの実施形態において、ニューロンとグリア細胞とを共培養してもよい。
【００１８】
本明細書で用いられる「Ｅ４ＯＲＦ１」および「アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１」という用語は、アデノウイルス初期蛋白質４（「Ｅ４」）ゲノム領域のオープンリーディングフレーム１（すなわち「ＯＲＦ１」）のことを指し、そのさらなる詳細は、以下に提供している。他に特に記載されない限り、「Ｅ４ＯＲＦ１」または「アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１」への言及は、「Ｅ４ＯＲＦ１」蛋白質／ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、あるいは、「Ｅ４ＯＲＦ１」蛋白質／ポリペプチドに関連し得る。「Ｅ４ＯＲＦ１」ヌクレオチド配列またはポリペプチドを包含する本明細書で提供される実施形態のそれぞれにおいて、これらの実施形態はまた、これらのヌクレオチド配列またはポリペプチドの変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、またはペプチド模倣体が、本明細書に記載される１つ以上の機能特性（グリア細胞で発現された場合の細胞増殖を向上させる能力、およびニューロンで発現された場合の軸索の長さを大きくさせる能力を含むが、これらに限定されない）を有する、または保持するならば、これらの変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、またはペプチド模倣体を用いて、実行され得る。Ｅ４ＯＲＦ１に関するさらなる説明および規定が、以下に提供される。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「有効量」という用語は、本明細書で記載される、特定の物質または細胞集団（例えば、Ｅ４０ＲＦ１核酸分子またはベクター、またはＥ４ＯＲＦ１発現神経系細胞の集団）の量であって、本明細書に記載される１つ以上の望ましい結果に対して検出可能かつプラスの効果を達成するのに十分である量のことを指す。例えば、グリア細胞におけるＥ４ＯＲＦ１の発現の場合、グリア細胞に導入／送達されるべきＥ４０ＲＦ１ヌクレオチド配列（例えばベクターにおいて）またはＥ４０ＲＦ１ポリペプチドの有効量は、コントロール（Ｅ４ＯＲＦ１非発現）細胞と比較して、グリア細胞の増殖率に検出可能な増加をもたらす量であってよい。同様に、ニューロンにおけるＥ４０ＲＦ１の発現の場合、ニューロンに導入／送達されるべきＥ４０ＲＦ１ヌクレオチド配列（例えばベクターにおいて）またはＥ４０ＲＦ１ポリペプチドの有効量は、コントロール（Ｅ４ＯＲＦ１非発現）細胞と比較して、ニューロンの軸索の長さに検出可能な増加をもたらす量であってよい。Ｅ４０ＲＦ１ヌクレオチド配列（例えばベクターにおいて）、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチド、またはＥ４ＯＲＦ１発現神経系細胞を対象に投与することを包含する方法の場合、対象に投与されるべき有効量は、例えばＥ４０ＲＦ１を有さないコントロールと比較して、１つ以上の、所望の生物学的または治療的指標（例えば、ニューロン再生の改善、再ミエリン化の改善など）の検出可能な改善をもたらす量であってよい。任意の個々の場合の適切な「有効量」は、例えば、用量漸増試験などの当業界で知られる標準的な技術を用いて経験的に決定されてよく、また、計画されている用途、計画されている送達／投与の様式、送達／投与の所望の頻度などの要因を考慮して、決定されてよい。さらに、「有効量」は、さまざまな、ニューロンおよびグリア細胞の表現型特徴における効果を評価するための実施例部分に記載されるようなアッセイを用いて、決定されてよい。
【００２０】
本明細書で細胞に関連して用いられる際、「改変された」という用語は、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ヌクレオチド配列またはＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを発現するように、人によって改変されている細胞のことを指す。「改変された細胞」という用語は、任意の天然の細胞を包含することを意図したものではなく、それよりも、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を、細胞に導入した結果得られる細胞を包含することを意図したものである。これらの改変された細胞を生み出すのに用いられ得る好適な組換えヌクレオチド配列に関するさらなる詳細が、以下に提供される−例えば、好適なＥ４０ＲＦ１配列（例えばｃＤＮＡ）、好適なベクター、好適なプロモーターなどに関する。
【００２１】
細胞または細胞培養という文脈において本明細書で用いられる場合、「増殖」または「増殖する」という用語は、細胞の初期の集団からの、ある型（例えば、グリア細胞またはニューロン）の細胞の数の増加を指し、これらは同一であってもなくてもよい。増殖に用いられる初期の細胞は、増殖の結果生み出される細胞と同じである必要はない。例えば、増殖した細胞は、初期の細胞集団の成長および分化によって生産されてもよい。
【００２２】
「遺伝的修飾」または「遺伝子が修飾された」は、細胞の正常なヌクレオチド配列に対する任意の付加、欠失または破壊を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される神経系細胞はまた、Ｅ４０ＲＦ１配列の含有および／または発現に加えて、１つ以上の他の遺伝的修飾を望み通りに含んでもよい。「遺伝的修飾」という用語は、遺伝子送達媒体の利用を包含し、形質導入（インビボあるいはインビトロいずれかの、レシピエントへの核酸のウイルス媒介導入）、トランスフェクション（単離された核酸の細胞による取り込み）、リポソーム媒介導入および当業界でよく知られる他の手段を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「単離された」という用語は、天然であろうと合成されたものであろうと、それが本来の状態で付随している少なくとも１つの他の生成物、化合物、または組成物から分離された生成物、化合物、または組成物を指す。
【００２４】
「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、示された場合を除いて、哺乳類、例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、並びにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ、および他の哺乳類種のことを指す。
【００２５】
細胞集団と関連して本明細書で用いられる場合、「実質的に純粋な」というフレーズは、ある１つの特定の型の細胞集団（例えば、１つ以上の特定の細胞マーカーの発現、形態学的特徴、または機能的特徴により決定される）、あるいは２つ以上の異なる細胞型が一緒に用いられる実施形態においては複数の特定の型の細胞集団が、細胞集団全体を構成する細胞のうち、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５−８０％、より好ましくは少なくとも約８５−９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％であることを指す。従って、「実質的に純粋な細胞集団」は、特定の種類（１つまたは複数であり得る）の細胞ではない細胞を、約５０％より少なく、好ましくは約２０−２５％より少なく、より好ましくは約１０−１５％より少なく、最も好ましくは約５％より少なく含有する細胞集団のことを指す。
【００２６】
ＩＩ．Ｅ４ＱＲＦ１
Ｅ４０ＲＦ１核酸配列またはＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを包含、または列挙する本発明の各実施形態において、用いられるＥ４０ＲＦ１配列は、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１の配列全体、または、本明細書で記載される機能特性（例えば、グリア細胞において細胞増殖を向上させる能力またはニューロンにおける軸索の長さを大きくさせる能力が挙げられるが、これらに限定されない）を１つ以上有する、その誘導体、変異体、突然変異体、フラグメントもしくはペプチド模倣体を含んでもよい。アデノウイルスＥ４０ＲＦ１配列は当業界で知られており、これらの任意の配列は本発明に従い用いられ得る。例えば、ヒトアデノウイルス５型Ｅ４領域（ＯＲＦ１を含有する）の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋで利用可能である（例えばアクセッション番号Ｄ１２５８７参照）。本発明のある実施形態において、用いられるＥ４０ＲＦ１配列は、当業界でよく知られているヒトアデノウイルス５型のＥ４０ＲＦ１配列であるか、あるいは、ヒトアデノウイルス５型のＥ４０ＲＦ１配列に、８５％を超える配列同一性を有す得る配列である。別の実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１配列の変異体または突然変異体は、本明細書に記載される様々な細胞の生存および増殖を促進する能力を保持する、ヒトアデノウイルス５型のＥ４ＯＲＦ１配列に約８５％の同一性を有するか、あるいは、ヒトアデノウイルス５型のＥ４ＯＲＦ１配列に約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列である。別の実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１のフラグメントは、ヒトアデノウイルス５型のＥ４０ＲＦ１配列と比較して±３０ヌクレオチド、あるいは、ヒトアデノウイルス５型のＥ４０ＲＦ１配列と比較して約±２８ヌクレオチド、±２６ヌクレオチド、±２４ヌクレオチド、±２２ヌクレオチド、±２０ヌクレオチド、±１８ヌクレオチド、±１６ヌクレオチド、±１４ヌクレオチド、±１２ヌクレオチド、±１０ヌクレオチド、±９ヌクレオチド、±８ヌクレオチド、±７ヌクレオチド、±６ヌクレオチド、±５ヌクレオチド、±４ヌクレオチド、±３ヌクレオチド、±２ヌクレオチド、または±１ヌクレオチドの長さの変化があり、これらは全て、本明細書に記載される様々な細胞の生存および増殖を促進する能力を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される特徴を保持し得る。
【００２７】
また、用いられるＥ４０ＲＦ１配列は、他のアデノウイルスタイプまたは株であり得、あるいは、それらに由来し得る。他のアデノウイルスＥ４０ＲＦ１配列の例には、ヒトアデノウイルス９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＩ０５９９１）、ヒトアデノウイルス７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ８９９７７）、ヒトアデノウイルス４６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ７０９４６）、ヒトアデノウイルス５２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＫ３５０６５）、ヒトアデノウイルス３４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＷ３３５０８）、ヒトアデノウイルス１４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＷ３３１４６）、ヒトアデノウイルス５０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＷ３３５５４）、ヒトアデノウイルス２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００１９６）、ヒトアデノウイルス１２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００１４１），ヒトアデノウイルス３５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００６０７）、ヒトアデノウイルス７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００５７０）、ヒトアデノウイルス１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００５３３）、ヒトアデノウイルス１１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００４７４）、およびヒトアデノウイルス３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＢ１７７９２）の配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
いくつかの実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列は、Ｅ４領域由来の１つ以上の他の核酸配列、例えば、Ｅ４０ＲＦ２、Ｅ４０ＲＦ３、Ｅ４０ＲＦ４、Ｅ４０ＲＦ５、および／もしくはＥ４０ＲＦ６配列、またはその変異体、突然変異体、もしくはフラグメント、と連結して用いられ得る。例えば、Ｅ４０ＲＦ１配列は、Ｅ４０ＲＦ１発現細胞の生産のために、Ｅ４領域由来の１つ以上の他の配列と連結して用いられ得る。いくつかの実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１配列は、Ｅ４領域全体の文脈になく、あるいはＥ４領域全体で見られる各ＯＲＦの文脈になく、あるいはＥ４０ＲＦ２、Ｅ４０ＲＦ３、Ｅ４０ＲＦ４、Ｅ４０ＲＦ５、および／またはＥ４０ＲＦ６領域の文脈にない。例えば、Ｅ４０ＲＦ１配列は、他の配列、遺伝子、または翻訳領域（例えば、マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子など）を含有する構築物（例えば、ウイルスベクター）において用いられ得るが、ある種の実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１配列は、Ｅ４領域全体を含有しない構築物、あるいは、Ｅ４領域全体由来の他のＯＲＦ、例えば、Ｅ４０ＲＦ２、Ｅ４０ＲＦ３、Ｅ４０ＲＦ４、Ｅ４０ＲＦ５および／またはＥ４０ＲＦ６を含有しない構築物において、用いられる。
【００２９】
Ｅ４０ＲＦ１配列は、使用目的に応じて、他の様々な配列、遺伝子、または翻訳領域を含む構築物において、用いることができる。例えば、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列は、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子、または発現タグ（例えば、ＧＦＰなど）、または発現することが望ましいであろう他の任意の配列もしくは遺伝子と、連結して用いることができる。Ｅ４０ＲＦ１核酸配列はまた、融合蛋白質の一部として発現することができる。Ｅ４０ＲＦ１配列はまた、用いられることが望まれる発現構築物またはウイルスベクターに存在し得る任意の他の所望の核酸配列、遺伝子、翻訳領域、または非翻訳領域と連結して、あるいは、所望の任意の他の核酸配列、遺伝子、翻訳領域、または非翻訳領域と連結して、用いることができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列は、発現を可能にする１つ以上のプロモーターの制御下であり得る。所望の細胞型において、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列の発現を推進することができる任意のプロモーターが用いられ得る。好適なプロモーターの例には、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−Ｌｔｒ、およびＭＭＬプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、アデノウイルスゲノム、またはその変異体由来のプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、アデノウイルスにおいて、Ｅ４０ＲＦ１の発現を推進するために用いられるプロモーターであり得る。
【００３１】
いくつかの実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列は誘導性プロモーターの制御下に置くことができ、それゆえ、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列の発現を望み通りにオンあるいはオフにすることができる。例えば、テトラサイクリン誘導発現システム、またはホルモン誘導発現システムなどの任意の好適な誘導発現システムを用いることができる。これは、インビボ用途において、有用であり得る。例えば、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列は、必要とされる間は発現され、その後、所望の結果が得られた時、例えば、Ｅ４０ＲＦ１発現細胞が十分成長あるいは増殖した時に、オフに切り替わり得る。Ｅ４０ＲＦ１配列の発現をオフにする能力は、インビボ用途において、有用であろう。
【００３２】
アデノウイルスＥ４０ＲＦ１をコードする核酸配列を含む本発明のこれらの実施形態において、核酸配列は任意の好適な核酸配列であり得る−天然のヌクレオチドから作られたものでも、合成ヌクレオチドから作られたものでも、それらの組み合わせでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡ、例えば細胞内で安定であり、細胞内で直接的に蛋白質発現／生産を導くのに用いられ得る、合成修飾ＲＮＡを含むことができる。他の実施形態において、核酸はＤＮＡを含み得る。ＤＮＡが用いられる実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１をコードするＤＮＡ配列は、細胞内での発現を可能にする（および／または促進する、増強する、または制御する）ように１つ以上の好適なプロモーターおよび／または調節エレメントと作動可能に連結され得、かつ１つ以上の好適なベクターまたは構築物中に存在し得る。Ｅ４ＯＲＦ１をコードする核酸配列は、同じ核酸構築物中において内皮細胞に導入してもよく、あるいは別々の核酸構築物中において導入してもよい。
【００３３】
アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸配列を細胞に導入することを包含する本発明のこれらの実施形態において、Ｅ４ＯＲＦ１をコードする核酸配列は、任意の好適な核酸であり得る−天然のヌクレオチドから作られたものでも、合成ヌクレオチドから作られたものでも、それらの組み合わせでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡ、例えば細胞内で安定であり、細胞内で直接的に蛋白質発現／生産を導くのに用いられ得る、合成修飾ＲＮＡを含むことができる。他の実施形態において、核酸はＤＮＡを含み得る。ＤＮＡが用いられる実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１をコードするＤＮＡ配列は、細胞内での発現を可能にする、および／または促進する、増強する、または制御するように１つ以上の好適なプロモーターおよび／または調節エレメントと作動可能に連結され得、かつ１つ以上の好適なベクターまたは構築物中に存在し得る。Ｅ４ＯＲＦ１をコードする核酸配列は同時に、または別々に導入され得る（一方はある時点で導入され、他方は異なる時点で導入される）。また、Ｅ４ＯＲＦ１をコードする核酸配列は、同じ核酸構築物中において導入してもよく、あるいは別々の核酸構築物中において導入してもよい。
【００３４】
Ｅ４０ＲＦ１配列を導入するステップは、トランスフェクション技術およびウイルス媒介形質導入技術を含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意の好適なシステムを用いて行われ得る。本発明に従い用いられ得るトランスフェクション方法には、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および微粒子銃が含まれるが、これらに限定されない。用いられ得るウイルス媒介形質導入方法には、レンチウイルス媒介形質導入、アデノウイルス媒介形質導入、レトロウイルス媒介形質導入、アデノ随伴ウイルス媒介形質導入およびヘルペスウイルス媒介形質導入が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
細胞にＥ４０ＲＦ１核酸配列をトランスフェクトあるいは形質導入する任意の好適な手段が、用いられ得る。例えば、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列は、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、または微粒子銃を含むがこれらに限定されない、当業界に知られる標準的な方法を用いて、細胞にトランスフェクトされ得る。同様に、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列は、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはヘルペスウイルス送達システムなどのウイルス送達システムを用いて、細胞に送達され得る。ある実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列は、レンチウイルス遺伝子送達システムを用いて細胞に送達される。
【００３６】
本発明はまた、Ｅ４０ＲＦ１核酸配列を含有する、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、これらの配列は、Ｅ４領域全体を伴わない。いくつかの実施形態において、これらの配列は、Ｅ４０ＲＦ２−６などの他のアデノウイルスＥ４０ＲＦを伴わない。ある実施形態において、本発明は、Ｅ４０ＲＦ１配列を含むレンチウイルスベクターを提供する。ある実施形態において、本発明は、Ｅ４領域全体を伴わないＥ４０ＲＦ１配列、あるいは、アデノウイルスＥ４０ＲＦ２、３、４、５および／または６を伴わないＥ４０ＲＦ１配列を含むレンチウイルスベクターを提供する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、もしくはフラグメント）をコードするヌクレオチド配列を用いることができる一方で、他の実施形態において、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチド（またはその変異体、誘導体、突然変異体、フラグメント、もしくはペプチド模倣体）を用いることができる。ペプチド模倣体は、ペプチドを模倣するように設計された小さな蛋白質様の鎖である。当該分子は、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチドを模倣するように設計され得る。ペプチド模倣体を作成するためにペプチドを修飾する様々な異なる方法、あるいはペプチド模倣体を設計する様々な異なる方法が、当業界で知られており、Ｅ４０ＲＦ１ペプチド模倣体を作成するために用いられ得る。
【００３８】
本発明に従い、Ｅ４０ＲＦ１配列の取り扱い、操作、および発現は、分子生物学および細胞生物学の従来技術を用いて行われてもよい。これらの技術は当業界でよく知られている。例えば、ある人は、Ｅ４０ＲＦ１配列の取り扱い、操作、および発現に用いる好適な技術の指針として、Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989); the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.)、または任意の他の標準的なテキストを参照するであろう。
【００３９】
ＩＩＩ．組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含む「改変された神経系細胞」および／または「改変された神経幹細胞または神経前駆細胞」、およびこれらの改変された細胞を含む組成物を提供する。改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を提供する本発明のこれらの実施形態において、これらの細胞は、分化して、改変された神経系細胞（例えば、改変されたニューロンまたはグリア）を形成し得る。反対に、改変された神経系細胞を提供する本発明のこれらの実施形態において、これらの細胞は、神経幹細胞または神経前駆細胞、例えば改変された神経幹細胞または神経前駆細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される神経系細胞および／または神経幹細胞もしくは神経前駆細胞は哺乳動物細胞であり、例えばヒトもしくは非ヒト霊長類細胞、あるいはウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ、もしくは他の哺乳動物細胞である。
【００４０】
本明細書で用いられる場合、「神経系細胞」という用語は、ニューロンおよびグリア細胞の両方を、まとめて指す。本明細書で用いられる場合、「神経幹細胞」および「神経前駆細胞」という用語は、当業界で受け入れられている意味に従い用いられる。幹細胞と前駆細胞は、その発生能に違いがあるが（幹細胞は一般的に少なくとも多能性であるが、前駆細胞は一般的により限定された発生能を有する）、「神経幹細胞」および「神経前駆細胞」という用語は、本明細書で用いられる場合、ニューロンおよびグリア細胞の両方を生産する能力を有する細胞のことを指すのに用いられる。本発明のいくつかの実施形態には、ニューロン前駆細胞およびグリア前駆細胞が包含される。本明細書で用いられる場合、これらの用語は、神経前駆細胞よりも限定された能力を有する前駆細胞、すなわち、ニューロンを生産する能力を有するニューロン前駆細胞と、グリア細胞を生産する能力を有するグリア前駆細胞のことを指す。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される改変された神経系細胞（または神経幹細胞または神経前駆細胞）は、遺伝子が改変されて、Ｅ４０ＲＦ１の発現に加えて、およびＥ４０ＲＦ１の発現とは別に、１つ以上の遺伝的修飾を含む細胞であるか、あるいはこれらの細胞に由来する。例えば、これらの細胞には、神経系細胞に影響する疾病または疾患に関連することが知られているか、あるいは関連する疑いのある遺伝子の修正バージョンが含まれてもよい。
【００４２】
本発明の改変された神経系細胞は、様々な形態で存在してよく、あるいは、提供されてよい。例えば、いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞は、単離された細胞集団などの、細胞集団を含んでよい。いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞は、インビトロの細胞集団を含んでよい。いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞は、実質的に純粋な細胞の集団を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、細胞集団全体を構成する細胞のうち、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５−８０％、より好ましくは少なくとも約８５−９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％が、本発明の改変された神経系細胞、例えば、Ｅ４ＯＲＦ１発現神経系細胞、あるいは少なくとも１つ、２つ、３つ以上の神経系細胞マーカー、ニューロンマーカー、またはグリア細胞マーカー、例えば、本明細書に記載される神経系細胞マーカー、ニューロンマーカー、またはグリア細胞マーカーの１つを発現するＥ４ＯＲＦ１発現神経系細胞であろう。いくつかの実施形態において、改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）は、改変された細胞と１つ以上のさらなる構成成分を含有する組成物の形態で提供され得る。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）の集団と、例えば生理食塩水、細胞懸濁培地、細胞培養培地などのキャリア溶液とを共に含む組成物を提供し得る。いくつかの実施形態において、これらの組成物は、改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）の集団と、対象、例えばヒト対象に投与するのに好適なキャリア溶液とを含む、治療用組成物であってよい。必要に応じて、他の治療上許容される物質が含まれ得る。当業者であれば、意図される用途に基づき、治療用組成物に含まれるべき好適な物質を簡単に選択することができる。いくつかの実施形態において、本発明の改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）は、改変された神経系細胞および１つ以上のさらなる細胞型を含有する組成物（例えば治療用組成物）の形態で提供されてよい。これらのさらなる細胞型は、例えば、改変された神経系細胞の維持または培養において有用である細胞型（例えば、栄養素を生産する細胞である、「支持」細胞など）であってよく、あるいは、例えば、インビトロのモデル系での使用、あるいは対象への同時投与における使用を目的とした、改変された神経系細胞と共に用いられることが意図された細胞型であってよい。これらのさらなる細胞型の例には、他の神経系細胞（例えば、星状細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、および／またはニューロン）、他の神経前駆細胞、内皮細胞、および周皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。内皮細胞が用いられる場合、内皮細胞はまた、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチドを発現するように改変された内皮細胞であってよい。例えば、用いられるＥ４ＯＲＦ１発現内皮細胞は、米国特許第８，４６５，７３２号に記載されるように生み出され得、本文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
ｉ．ニューロン
ニューロンを提供するか、あるいは包含する本発明のこれらの実施形態において、ニューロンは、中枢神経および末梢神経のニューロンを含む、任意のタイプのニューロンであってよい。いくつかの実施形態において、ニューロンは、特に海馬ニューロンである。いくつかの実施形態において、ニューロンは一次ニューロンであるか、あるいはそれに由来する。他の実施形態において、ニューロンは、幹細胞、前駆細胞、または非ニューロンに由来する。例えば、いくつかの実施形態において、ニューロンは、神経幹細胞または神経前駆細胞、またはニューロン前駆細胞に由来してもよい。いくつかの実施形態において、ニューロンは、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞由来であってもよい。同様に、いくつかの実施形態において、ニューロンは、分化転換によって、分化した非ニューロンなどの他の分化細胞に由来してもよい。いくつかの実施形態において、ニューロンは、Ｅ４０ＲＦ１の発現に加えて、およびＥ４０ＲＦ１の発現とは別に、遺伝子が修飾されているか、または、１つ以上の遺伝的修飾を含む細胞であるか、あるいはこれらの細胞に由来する。例えば、これらの細胞は、ニューロンに影響する疾病または疾患に関連することが知られているか、あるいは関連する疑いのある遺伝子の修正バージョンを含んでもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明の改変された（Ｅ４ＯＲＦ１発現）ニューロンは、コントロールニューロンの軸索よりも、平均で（あるいは平均で約）１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％または２００％を超えて長い、軸索の長さを有する。いくつかの実施形態において、本発明の改変された（Ｅ４ＯＲＦ１発現）ニューロンは、コントロールニューロンの軸索の１００μｍ当たりの軸索側枝の数よりも、平均で（あるいは平均で約）１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、または２００％を超えて多い、軸索の１００μｍ当たりの軸索側枝の数を有する。いくつかの実施形態において、本発明の改変された（Ｅ４ＯＲＦ１発現）ニューロンは、コントロールニューロンのニューロン当たりの突起の数よりも、平均で（あるいは平均で約）１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、あるいは２００％を超えて多い、ニューロン当たりの突起の数を有する。いくつかの実施形態において、本発明の改変された（Ｅ４ＯＲＦ１発現）ニューロンは、コントロールニューロンの軸索側枝の数よりも、平均で（あるいは平均で約）１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、あるいは２００％を超えて多い、軸索側枝の数を有する。いくつかのこれらの実施形態において、上記で言及した測定結果は、改変された細胞のＥ４０ＲＦ１配列による形質導入またはトランスフェクションの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後に取得される。いくつかのこれらの実施形態において、上記で言及した測定結果は、これらのニューロンの特性を測定するために、当業界で知られる任意の標準的な方法を用いて取得される。いくつかのこれらの実施形態において、上記で言及した測定結果は、本明細書の実施例２に記載される方法、あるいは当該方法の好適な改変法を用いて、取得される。
【００４５】
ニューロン細胞型を含む多くの細胞型は、培養して成長させた場合、特に培養での成長を促進するように形質転換された場合、正常な表現型特徴のいくつかを失う傾向にある。例えば、細胞を培養して成長させた場合、細胞はより分化しなくなり得、および／または、１つ以上の通常の表現型特徴の減少または欠失を示し得る。本発明の改変されたニューロンが、ニューロン内でアデノウイルスＥ４０ＲＦ１配列が発現した際でさえ、ある種の典型的なニューロン細胞特異的表現型特徴を維持することは、本発明の特別な利点である。例えば、ある種の実施形態において、本発明に従い改変されたニューロンは、汎神経マーカーのβＩＩＩチューブリン、ＭＡＰ２、ｔａｕ、ＮｅｕＮおよび／または神経フィラメントを含むがこれらに限定されない、１つ以上のニューロンのサブタイプにより通常発現される１つ以上のマーカーを発現する。本発明の改変されたニューロンはまた、ニューロンの１つ以上の他の特徴を保持し、当該特徴には、系列同一性、形態学的／構造学的特徴（例えば、軸索、樹状突起、シナプス終末の存在、ニューロン間のシナプス結合およびその他の結合、グリア細胞との形態学的相互作用など）、電気生理学的な、または他の生理学的な特徴（電気興奮性、イオンチャネル活性、神経伝達物質受容体活性、活動電位伝達、シナプス伝達、シナプス可塑性、長期増強などを含む）、生化学的特徴（例えば、神経伝達物質の発現および／または放出、神経伝達物質受容体の発現および／または活性化、ニューロンマーカー蛋白質の発現など）、および／または当業界で知られるニューロンの他の任意の生物学的特徴が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
ｉｉ．グリア細胞
グリア細胞を包含する本発明の実施形態において、グリア細胞は、星状細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、放射状グリア、シュワン細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、またはミクログリア細胞であってよい。いくつかの実施形態において、グリア細胞は特に星状細胞である。いくつかの実施形態において、グリア細胞は、一次グリア細胞であるか、これに由来する。他の実施形態において、グリア細胞は、幹細胞、前駆細胞、または非グリア細胞に由来する。例えば、いつくかの実施形態において、グリア細胞は、神経幹細胞または神経前駆細胞、またはグリア細胞前駆細胞に由来してもよい。いくつかの実施形態において、グリア細胞は、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの、多能性幹細胞に由来してもよい。同様に、いくつかの実施形態において、グリア細胞は、分化転換によって、分化した非グリア細胞などの他の分化細胞に由来してもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態において、グリア細胞は、Ｅ４０ＲＦ１の発現に加えて、およびＥ４０ＲＦ１の発現とは別に、遺伝子が修飾されているか、または、１つ以上の遺伝的修飾を含む細胞であるか、あるいはこれらの細胞に由来する。例えば、これらの細胞は、グリア細胞に影響する疾病または疾患に関連することが知られているか、あるいは関連する疑いのある遺伝子の修正バージョンを含んでもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本発明の改変された（Ｅ４ＯＲＦ１発現）グリア細胞は、コントロールグリア細胞よりも、平均で（あるいは平均で約、少なくとも平均で、または少なくとも平均で約）１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、あるいは１０倍を超えて高い増殖率を有する。いくつかの実施形態において、本発明の改変された（Ｅ４０ＲＦ１発現）グリア細胞は、Ｅ４０ＲＦ１の形質導入またはトランスフェクション後約３週間の時点で、コントロールグリアの細胞数よりも４倍、５倍、６倍、または６倍を超えて、あるいは約、少なくとも、または少なくとも約４倍、５倍、６倍、または６倍を超えて、大きな細胞数の増加を示す。いくつかの実施形態において、本発明の改変された（Ｅ４ＯＲＦ１発現）グリア細胞は、高い生存率を維持しながら、および／またはグリア表現型（例えば、形態および／またはグリアマーカー（例えば星状細胞の場合、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ））の発現により決定される）の維持を継続しながら、２回を超える、３回を超える、あるいはさらに好ましくは４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回を超える継代数で、培養で維持され得る。いくつかの実施形態において、本発明の改変された（Ｅ４ＯＲＦ１発現）グリア細胞は、コントロールグリア細胞と比較して、生存率が有意に減少することなく、および／またはグリア表現型（例えば、形態および／またはＧＦＡＰなどのグリアマーカーの発現により決定される）が有意に欠損することなく、より多くの継代数にわたり、培養で維持され得る。いくつかのこれらの実施形態において、増殖率および細胞数の測定、およびグリア細胞における継代培養の成功の評価は、これらの特徴の測定／評価のための、当業界で知られる任意の標準的な方法を用いて、実施してもよい。いくつかのこれらの実施形態において、上記で言及した測定結果は、本明細書の実施例１に記載された方法、あるいは当該方法の任意の好適な改変法を用いて取得される。
【００４９】
本発明の改変されたグリア細胞が、グリア細胞内でのアデノウイルスＥ４０ＲＦ１配列の発現の際でさえ、ある種の典型的なグリア細胞特異的表現型特徴を維持することは、本発明の特別な利点である。例えば、ある種の実施形態において、本発明に従い改変されたグリア細胞は、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびＧＬＴ−１が含まれるがこれらに限定されない、グリア細胞の１つ以上のサブタイプにより通常発現される１つ以上のマーカーを発現する。例えば、グリア細胞が星状細胞である実施形態においては、グリア細胞はＧＦＡＰを発現してもよい。本発明の改変されたグリア細胞はまた、グリア細胞に典型的な、１つ以上の他の表現型特徴を保持してもよい。例えば、改変された星状細胞の場合、維持され得る表現型特徴には、形態学的／構造学的特徴（例えば、星状細胞の典型的な星型の枝分かれ形態、ニューロンのシナプスとの会合、毛細血管の壁に星状細胞を結合させる「血管足（vascular feet）」など）、電気生理学的な、および他の生理学的な特徴（イオンチャネル活性、細胞外間隙でのイオン濃度制御など）、生化学的特徴（例えば、グルタミン酸塩などの神経伝達物質の発現および／または放出および／または取り込み、星状細胞マーカー蛋白質の発現、ニューロンへの代謝支援など）、ニューロン誘導、グリア瘢痕組織の形成、および／または当業界で知られる星状細胞の任意の他の生物学的特徴が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
ＩＶ．方法および用途
本発明により提供される改変された神経系細胞および／または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞は、様々な異なる用途において、それらを有用にすることができる特徴を有する。同様に、これらの改変された神経系細胞および／または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を作成するための本明細書で提供される方法は、様々な異なる状況で用いられ得る。一般に、本明細書で提供される改変された神経系細胞および神経幹細胞または神経前駆細胞は、改変されていない（すなわちＥ４０ＦＲ１非発現）神経系細胞または神経幹細胞または神経前駆細胞が現在用いられている、あるいは用いられ得る任意の用途に用いられ得る。例えば、改変された神経幹細胞または神経前駆細胞の場合、神経幹細胞または神経前駆細胞が現在用いられているか、あるいは用いられ得る任意の用途（研究目的および／または治療目的、例えば再生医療のための対象への移植目的、例えばパーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経系に影響を与える他の疾病又は疾患の処置目的を含むがこれらに限定されない）に用いられてもよく、あるいは、改変された分化した神経系細胞の集団を生み出すために用いられてもよく、それらはその後、分化した神経系細胞が現在用いられているか、あるいは用いられ得る任意の用途に用いられてもよく、当該任意の用途には、神経幹細胞および前駆細胞に対して上述された用途と同様に、研究目的および治療目的が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
コントロール（すなわちＥ４ＯＲＦ１非発現）グリア細胞と比較してＥ４ＯＲＦ１発現グリア細胞が示した細胞増殖率および継代数の増加は、様々な方法において、他のグリア細胞の代わりに本発明の改変されたグリア細胞を使用することを、有利にすることができる。様々な方法には、グリア細胞の培養物を生み出すかまたは維持する方法、幹細胞または前駆細胞からグリア細胞を得る方法、分化した非グリア細胞からグリア細胞を得る方法（例えば、分化転換により）、基礎的科学研究用途、標的発見用途、創薬用途、および薬物有効性、毒性、および／または安全性試験用途が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の改変されたグリア細胞は、例えばグリア細胞とニューロンとの共培養を包含する共培養方法において、用いられてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の改変されたグリア細胞は、疾病モデルあるいは他の生物学的モデル系、例えば血液脳関門モデル系において、用いられてもよい。さらに、いくつかの実施形態において、改変されたグリア細胞は、改変されていないグリア細胞が用いられるか、あるいは用いられ得る治療用途において、有用であり得る。当該治療用途には、例えば再生医療用途のインビボ細胞移植手順が含まれるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、改変されたグリア細胞または神経幹細胞または神経前駆細胞は、インビボ移植手順に関連して、例えば、グリア細胞異常、グリア細胞欠損、またはグリア細胞損傷に関連した疾病、疾患または症状を処置するために、生み出されるか、あるいは用いられてもよい。これらの疾病、疾患、および症状の例には、脳外傷、脊髄損傷、神経変性疾患、神経発達疾患に関連する疾病、疾患、および症状、およびニューロンの脱髄または髄鞘形成異常に関連する疾病が含まれるが、これらに限定されず、多発性硬化症（ＭＳ）、ウイルス感染後急性脱髄、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、ギラン・バレー症候群、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、クラッベ型白核ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、アレキサンダー病、カナバン病、コケイン症候群、およびペリツェウス・メルツバッヘル病が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
同様に、コントロール（すなわちＥ４ＯＲＦ１非発現）ニューロンと比較してＥ４ＯＲＦ１発現ニューロンが示す、軸索の長さの増加、短い神経突起の数の増加、および軸索当たりの枝分かれの数の増加は、様々な方法において、他のニューロン（あるいは前駆細胞の神経幹細胞）の代わりに、本発明の改変されたニューロン（あるいは、改変されたニューロンになり得る前駆細胞の神経幹細胞）を使用することを、有利にすることができる。様々な方法には、ニューロンの培養物を生み出すか、あるいは維持する方法、幹細胞または前駆細胞からニューロンを得る方法、分化した非ニューロンからニューロンを得る方法（例えば、分化転換による）、基礎的科学研究用途、標的発見用途、創薬用途、および薬物有効性、毒性、および／または安全性試験用途が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の改変されたニューロンは、例えばグリア細胞とニューロンとの共培養を包含する、共培養方法において、用いられてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の改変されたニューロンは、疾病モデルあるいは他の生物学的モデル系、例えば血液脳関門モデル系において、用いられてもよい。さらに、いくつかの実施形態において、改変されたニューロン（または、改変されたニューロンになり得る前駆細胞の神経幹細胞）は、改変されていないニューロンまたはニューロンの幹細胞または前駆細胞が用いられるまたは用いられ得る治療用途（再生医療用途が含まれるがこれに限定されない）において、有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、改変されたニューロンまたは神経幹細胞または神経前駆細胞は、例えばニューロン異常、ニューロン欠損またはニューロン損傷に関連する疾病、疾患、または症状を処置するために、インビボ移植手順において、用いられてもよい。これらの疾病、疾患、および症状の例には、脳外傷、脊髄損傷、神経変性疾患および神経発達疾患に関連する疾病、疾患、および症状が含まれるが、これらに限定されず、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
上述したように、いくつかの実施形態において、本発明の改変された細胞は、様々な治療用途において用いられ得る。従って、いくつかの局面において、本発明は、有効量の改変されたＥ４０ＲＦ１発現神経系細胞（または改変されたＥ４ＯＲＦ１発現神経系細胞を含む組成物）、または有効量の改変された神経幹細胞または神経前駆細胞を、それを必要とする対象に投与することによって、当該対象を処置する方法などの、様々な治療方法を提供する。これらの処置方法において、細胞は、当業界で知られる任意の好適な手段を用いて、対象に投与され得る。例えば、細胞は、所望の部位で、血流または組織に、注射または注入により、投与され得る。例えば、神経系の疾病、疾患、または症状の処置の場合、本発明に従い改変された細胞は、影響を受けた神経系の領域に直接投与されてもよく、あるいはその近くに投与されてもよい。特定の神経損傷または神経病変の処置の場合、細胞は、損傷または病変の部位、例えば脊髄損傷または脊髄病変の部位に、直接投与されてもよく、あるいはその近くに投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の改変された神経系細胞（または改変された神経幹細胞または神経前駆細胞）は、１つ以上のさらなる細胞型と共に投与されてもよい。これらのさらなる細胞型は、例えば、改変された神経系細胞の維持または生存を支援するのに有用な細胞型（例えば、「支持」細胞、栄養素を生産する細胞など）、および／または何らかのさらなる治療効果を提供し得る細胞型であってよい。これらのさらなる細胞型の例には、他の神経系細胞（例えば、星状細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、および／またはニューロン）、他の神経前駆細胞、内皮細胞、および周皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。内皮細胞が用いられる場合、内皮細胞はまた、Ｅ４０ＲＦ１ポリペプチドを発現するように改変された内皮細胞であってよい。これらのＥ４ＯＲＦ１発現内皮細胞は、米国特許第８，４６５，７３２号に記載されるように生み出され得、本文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。改変された細胞は、単回投与で、あるいは複数回投与で、投与され得る。当業者は、所望の用途に従い好適な投与方法を選択することができ、また所望の用途に基づき好適な投与計画を選択することができるであろう。
【００５４】
同様に、他の実施形態において、本発明の改変された細胞は、様々な治療用途においてインビボで作られ得る。従って、いくつかの局面において、本発明はそれを必要とする対象を処置する方法などの、様々な治療方法を提供し、当該治療方法には、Ｅ４０ＲＦ１をコードするヌクレオチド配列（例えば好適なベクターにおいて、および／または好適なプロモーターの制御下で）の有効量を、当該対象に投与し、その結果、対象の神経系細胞が、Ｅ４０ＲＦ１配列によりトランスフェクトあるいは形質導入され、インビボの改変された神経系細胞になることが含まれる。これらの処置方法において、ヌクレオチド分子は、当業界で知られる任意の好適な手段を用いて対象に投与され得る。例えば、ヌクレオチド分子（例えば好適なベクターにおいて）は、所望の部位で、血流または組織に、注射または注入により投与され得る。例えば、神経系の疾病、疾患、または症状の処置の場合、核酸分子は、神経系の患部に直接、あるいはその近くに、投与され得る。特定の神経損傷または特定の神経病変の処置の場合、核酸分子は、核酸分子は損傷または病変の部位、例えば脊髄損傷または脊髄病変の部位に、直接、またはその近くに投与され得る。核酸分子は、単回投与または複数回投与で、投与され得る。当業者は、所望の用途に従い好適な投与方法を選択することができ、また所望の用途に基づき好適な投与計画を選択することができるであろう。
【００５５】
多くの神経系細胞を、不死化することなく、あるいは支持細胞を用いることなく、培養して成長または維持させることは、難しいことで有名である。これらの細胞におけるアデノウイルスＥ４０ＲＦ１の発現を通して、本発明は、細胞の表現型の完全性または系列同一性を損なうことなく、これらの細胞型の培養を促進する手段を提供し得る。例えば、改変されたＥ４０ＲＦ１発現神経系細胞が、細胞培養を促進し得るか、あるいは優れた細胞培養物の産生をもたらし得る特徴を有することは、本発明の特別な利点である。例えば、本発明の改変されたグリア細部は、コントロールグリア細胞よりも高い増殖率を有し、改変されたグリア細胞は、コントロール神経系細胞と比較して、改善された形態学的特徴を有する。細胞を培養する方法は、当業界でよく知られており、任意の好適な細胞培養法が用いられ得る。例えば、本発明の改変されたグリア細胞は、改変されていないグリア細胞を培養するのに有用であることが知られている方法を用いて培養することが可能であり、本発明の改変されたニューロンは、改変されていないニューロンを培養するのに有用であることが知られている方法を用いて培養することが可能である。いくつかの実施形態において、細胞培養は血清非存在下で、あるいは外来性の増殖因子非存在下で、あるいは血清および外来性の増殖因子が共に非存在下で、行われ得る。本発明の改変された細胞はまた、凍結保存され得る。当業者は、当業者に知られる方法、例えば、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000) by R. Ian Freshney (「Freshney」)（本文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を用いて、簡単に、本発明のＥ４０ＲＦ１発現神経系細胞などの細胞を培養および凍結保存することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の改変された神経系細胞を含むか、またはそれに由来し、他の細胞、例えば他の神経系細胞（改変されていない神経系細胞を含む）の生存または成長を支援するのに有用であり得る支持細胞、ならし培地、および細胞産物を提供する。例えば、ある実施形態において、改変されたグリア細胞の集団は、ニューロンの成長を支援する支持細胞として用いられ得、あるいは、改変されたニューロンの集団は、グリア細胞の成長を支援する支持細胞として用いられ得る。同様に、他の実施形態において、本発明は、本発明の改変された神経系細胞の培養物から取得した細胞培養ならし培地、あるいは、本発明の改変された神経系細胞の培養物から取得された細胞産物（例えば全細胞可溶化物、細胞画分、あるいは特定の細胞産物）を提供することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明は、ニューロンの集団を培養するための共培養方法を提供し、本方法は、同じ培養容器で、ニューロン集団と、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する改変されたグリア細胞集団を共に培養することを含む。いくつかのこれらの実施形態において、改変されたグリア細胞は、培養容器表面に支持細胞層を形成し、ニューロンは、支持細胞層上に置かれてもよい。別の実施形態において、本発明は、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する改変されたグリア細胞の培養物から取得されたグリア細胞ならし培地と、ニューロンの集団とを接触させることを含む、ニューロンを培養する方法を提供する。同様に、別の実施形態において、本発明は、（ａ）アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する、改変されたグリア細胞の集団を獲得すること、（ｂ）培養容器中で改変されたグリア細胞を培養すること、（ｃ）培養容器からならし培地を回収すること、（ｄ）当該ならし培地をニューロンの培養物に加えること、および（ｅ）ニューロンを培養することを含む、ニューロンを培養する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明はまた、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する改変されたグリア細胞の培養物から取得された細胞培養ならし培地を提供する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明の改変された神経系細胞は、インビトロの血液脳幹門モデル系において有用であり得る。例えば、このようなシステムは、アデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する、改変されたグリア細胞の集団を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはアデノウイルスＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを含有する、改変されたグリア細胞の集団、（ｂ）周皮細胞、および（ｃ）内皮細胞：を含むインビトロの血液脳関門モデル系またはキットを提供する。これらの実施形態のそれぞれにおいて、改変されたグリア細胞は星状細胞であり得る。
【００５９】
Ｖ．キット
本発明はまた、本明細書に記載される様々な方法を実行するための、および／または、本明細書で提供される改変された細胞を生産するためのキットを提供する。これらのキットは、本明細書に記載される構成成分のいずれも含有することができ、当該キットには、Ｅ４０ＲＦ１配列（例えばベクター上の）、神経系細胞（例えばニューロンまたはグリア）、改変された神経系細胞の集団（例えば改変されたニューロンまたはグリア）、コントロールの改変されていない神経系細胞、サンプルの／標準的な改変された神経系細胞、Ｅ４０ＲＦ１配列またはＥ４０ＲＦ１ポリペプチドを検出するための手段または組成物（例えば、核酸プローブ、抗体など）、神経系細胞または改変された神経系細胞を維持するかあるいは増やすのに有用な培地または組成物、改変されたグリア細胞によりならされた培地、対象に改変された神経系細胞を投与するための手段または組成物、またはこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明は、インビトロの血液脳関門モデル系で使用するための、星状細胞などの改変されたグリア細胞を含むキットを提供する。例えば、ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載される改変された星状細胞の集団、並びに周辺細胞、および内皮細胞を含むキットを提供する。これらのキットは全て、場合により、使用説明書、容器、培養容器などを含んでもよい。ラベルがキットに添付されてよく、ラベルは、任意の記述または記録媒体を含んでよく、これらは、キットの内容物を使用するための使用説明書または他の情報を提供する、電子的な、またはコンピューターが読み込み可能な形式（例えば、ディスク、光ディスク、メモリチップ、またはテープ）であってよい。
【００６０】
本発明のある種の局面は、以下の非限定的な実施例において、さらに記載され得る。
【実施例】
【００６１】
実施例１：Ｅ４ＯＲＦ１発現星状細胞の産生および特徴解析
方法。１０−１２ Ｐ１の生後の子マウスを屠殺し、その脳を解離用培地（dissection medium）に単離した。２つの大脳半球をピンセットで離し、髄膜と嗅球を丁寧に除去した。鋭いはさみで、当該組織を刻んで小片にした（直径約０．５ｍｍ）。小さな組織片を収集し、解離用培地と一緒に１５ｍｌのコニカルチューブに移した。組織片を定着させ（約１〜２分）、その後解離用培地から丁寧に除去した。６−８ｍｌのＴｒｙｐＬＥをコニカルチューブに加え、キャップをきつく閉めた。チューブを３回上下に反転させ、その後チューブを３７℃のウォーターバスに入れ、時々チューブを回転させた。その後、立方体状の組織を乱すことなくＴｒｙｐＬＥを除去し、１−２ｍｌの星状細胞培養培地を加えた。頻繁なタッピングによりチューブを攪拌しながら、ＤＮＡｓｅを１分間加えた。組織片を、その後、星状細胞培養培地で３回リンスした。その後、組織片と培地をプラスチック製のＰ１０００のピペットチップの中を１５回上下に通過させることにより、組織片を約１ｍｌの星状細胞培養培地中ですりつぶし、その後、火炎研磨したガラスピペットを用いて組織と培地を１度トリチュレートした。トリチュレートした細胞懸濁液を、その後、４００ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した。細胞ペレットを５ｍｌの星状細胞培養培地に再懸濁した後、細胞をＴ２５フラスコ上に蒔いて、通常の細胞培養インキュベーターで培養した。フラスコを５−８回しっかりとたたいて、弱く付着した非アストログリア細胞を取り除いた後、培地を新しい星状細胞培養培地に、毎日、６日間置き換えた。７日目に、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ、抗生物質なしの培地）を用いて細胞をＥ４０ＲＦ１レンチウイルス（４０−５０μｌの濃縮ウイルス）で形質導入した。２４時間後、感染培地を、通常の星状細胞培養培地で置換した。細胞を、コンフルエンスに達するまで継代培養した。
【００６２】
材料。Ｐ１ Ｂ６生後子マウスを使用した。解離用培地は、１×Ｂ２７栄養補助剤と１×ペニシリン／ストレプトマイシンとを補ったＬ１５培地であった。星状細胞培養培地は、１０％ウマ血清、０．６％グルコース、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを補った、ＭＥＭ Ｍｅｄｉｕｍであった。Ｔ２５／Ｔ７５培養フラスコ、ＴｒｙｐＬＥ／Ａｃｃｕｔａｓｅ、およびＤＮＡｓｅもまた使用した。
【００６３】
結果。Ｅ４０ＲＦ１形質導入の一週間後、Ｅ４ＯＲＦ１発現星状細胞は、Ｅ４０ＲＦ１を形質導入されていないコントロール星状細胞と比較して、細胞数が３−５倍の増加を示した。Ｅ４０ＲＦ１形質導入後３週間までに、Ｅ４０ＲＦ１発現星状細胞は、コントロール星状細胞と比較して、細胞数が５−６倍の増加を示した。Ｅ４０ＲＦ１星状細胞はまた、コントロールよりも多数の集団倍加にわたって、悪影響が認められることなく、継代培養することができた。Ｅ４０ＲＦ１星状細胞は、４回継代後に、高い生存率を維持し、アストログリアの表現型を維持しているように見えた。Ｅ４０ＲＦ１星状細胞は、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現し、その形態および形態学的異質性は、コントロール細胞と匹敵していた。ＮＧ２もＣＤ３１も発現は検出されなかった。
【００６４】
実施例２：Ｅ４ＯＲＦ１発現ニューロンの産生および特徴解析
方法。胚性期１８日目（Ｅ１８）のマウス胎仔を屠殺して、その脳を解離用培地に単離した。２つの大脳半球をピンセットで離し、髄膜と嗅球を丁寧に除去した。海馬を半球から丁寧に単離した。鋭いはさみを用いて、当該組織を刻んで小片にした（直径約０．５ｍｍ）。小さな組織片を収集し、解離用培地と一緒に１５ｍｌのコニカルチューブに移した。組織片を定着させ（約１〜２分）、その後解離用培地から丁寧に除去した。６−８ｍｌのＴｒｙｐＬＥをコニカルチューブに加え、キャップをきつく閉めた。チューブを３回上下に反転させ、その後チューブを３７℃のウォーターバスに入れ、時々チューブを回転させた。その後、立方体状の組織を乱すことなくＴｒｙｐＬＥを除去し、１−２ｍｌのニューロンプレーティング培地を加えた。頻繁なタッピングによりチューブを攪拌しながら、ＤＮＡｓｅを１分間加えた。組織片を、その後、ニューロンプレーティング培地で３回リンスした。その後、組織片と培地をプラスチック製のＰ１０００のピペットチップの中を１０回上下に通過させることにより、組織片を約１ｍｌのニューロンプレーティング培地中でトリチュレートし、その後、火炎研磨したガラスピペットを用いて組織と培地を１度トリチュレートした。トリチュレートした細胞懸濁液は、その後、４００ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した。細胞ペレットを５ｍｌのニューロンプレーティング培地に再懸濁した後、ポリ−Ｌ−リジンで覆われた２４ウェルプレート表面またはポリリジンで覆われたガラスのカバーガラス上に細胞を蒔き（２４ウェルプレートのウェル中のカバーガラス当たり、１００，０００個の細胞）、その後通常の細胞培養インキュベーターで培養した。翌日（３日目）、ポリブレンを用いて（８μｇ／ｍｌ、抗生物質なしの培地）、Ｅ４０ＲＦ１レンチウイルスを形質導入するか（２μｌ濃縮ウイルス）、あるいはｔｕｒｂｏＧＦＰレンチウイルスを伴ってＥ４０ＲＦ１レンチウイルスを形質導入した（Evrogen Inc.、全体で５−１０μｌの濃縮ウイルス）。ｔｕｒｂｏＧＦＰのみを形質導入したニューロンは、コントロールとして役立った。１６時間または２４時間後、感染培地を、通常のニューロンプレーティング培地またはラミニン添加（０．０１ｍｇ／ｍｌ）ニューロンプレーティング培地で置換した。培養培地の容量の半分を、４−５日ごとに交換した。イメージングに用いられる細胞は、４−５日保管した後、共焦点顕微鏡によって固定化およびイメージングした。
【００６５】
材料。Ｅ１８妊娠Ｂ６マウス。解離用培地は、１×Ｂ２７栄養補助剤と１×ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＬ１５培地であった。プレーティング培地は、５％ＦＢＳ、０．６％グルコース、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、および１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×Ｂ２７栄養補助剤を補ったＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍであった。ポリ−Ｌ−リジン（ｌｍｇ／ｍｌ）で覆った２４ウェルプレート、ＴｒｙｐＬＥ、およびＤＮＡｓｅもまた、用いられた。
【００６６】
結果。Ｅ４０ＲＦ１を発現しているニューロンは、Ｅ４０ＲＦ１を発現していないニューロンと比較して、軸索の長さが大きいこと（平均の軸索の長さが、コントロールの８３５．３±１４６．２μｍと比較して１２５４．５±１３７．２μｍ）（図１Ａ参照）、Ｅ４０ＲＦ１を発現していないニューロンと比較して、ニューロン当たりの短い神経突起の数が多いこと（コントロールのニューロン当たり４．０４±０．３８と比較して、ニューロン当たり５．７３±０．４３）（図１Ｂ参照）、およびＥ４０ＲＦ１を発現していないニューロンと比較して、軸索当たりの一次軸索側枝の数が多いこと（コントロール群の２．９１±０．３３と比較して、６．７４±０．７１）（図１Ｃ参照）が、分かった。これらの違いは全て、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。下記の表１、２、３および４は、これらの実験から得られた、いくつかのさらなるデータを提供している。改変された（Ｅ４ＯＲＦ１発現）海馬ニューロンは、典型的なニューロンの形態を維持していることが分かり、βＩＩＩチューブリン、ＭＡＰ２、ｔａｕ、ＮｅｕＮおよび神経フィラメントなどの汎神経マーカーを発現していた。図２は、コントロール（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）とＥ４ＯＲＦ１発現ニューロン（図２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆ）の、例示的な顕微鏡イメージをいくつか提供している。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００６７】
本発明は、以下の特許請求の範囲によって、さらに述べられる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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