(57)【要約】アレイの複数の領域のデジタルイメージングならびにアレイ上の標識フィーチャーの検出およびカウンティングのための方法、システム、およびプラットフォームが記載されている。いくつかの実施形態では、サンプル中の標的分子の絶対数を計算するための出力ユニットを含むアレイリーダーシステムが記載されている。アレイリーダーシステムは、複数の標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーを含むアレイを読み取るように構成される。
2017504307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的分子の絶対数を計算するための出力ユニットを含むアレイリーダーシステムであって、複数の標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーを含むアレイを読み取るように構成される、アレイリーダーシステム。
【請求項２】
光学イメージングシステムをさらに含む、請求項１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３】
前記計算が、前記光学イメージングシステムにより生成された光学画像データを標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数のカウント値に変換することに基づく、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４】
前記出力ユニットが、デジタルプロセッサーおよび実行可能なソフトウェアを含む、請求項１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項５】
前記実行可能なソフトウェアが、光学画像データを標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数のカウント値に変換するコンピューターコードを含む、請求項４に記載のアレイリーダー。
【請求項６】
前記アレイが、マイクロアレイ、顕微鏡スライド、またはマイクロウェルプレートを含む、請求項１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項７】
前記光学イメージングシステムが、１未満の倍率、１に等しい倍率、または１超の倍率を有する、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項８】
前記光学イメージングシステムが蛍光イメージングシステムを含む、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項９】
前記光学イメージングシステムが燐光イメージングシステムを含む、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１０】
前記光学イメージングシステムが、透過光、反射光、もしくは散乱光のイメージングモードまたはそれらの組合せで動作するイメージングシステムを含む、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１１】
前記光学イメージングシステムが１つ以上のイメージセンサーを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１２】
前記１つ以上のイメージセンサーが少なくとも３２０×２４０ピクセルの解像度を有する、請求項１１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１３】
前記１つ以上のイメージセンサーがＣＣＤイメージセンサーである、請求項１１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１４】
前記１つ以上のイメージセンサーがＣＭＯＳイメージセンサーである、請求項１１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１５】
前記１つ以上のイメージセンサーが１つ以上の回路ボードを含む、請求項１１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１６】
前記光学イメージングシステムが、限定されるものではないが、顕微鏡対物レンズ、カメラレンズ、有限共役レンズ、無限共役レンズ、平凸レンズ、両凸レンズ、平凹レンズ、両凹レンズ、色消し接合二重レンズ、またはバンドパスフィルターを含む群から選択される１つ以上の要素をさらに含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１７】
前記蛍光イメージングシステムが、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはフィコエリトリンフルオロフォアの使用に合わせて設計される、請求項８に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１８】
前記光学イメージングシステムが、少なくとも１つの光源を含む照明システムをさらに含む、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの光源がＬＥＤまたはＬＥＤアセンブリーである、請求項１８に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの光源が前記イメージセンサーと電子的に同期し、前記少なくとも１つの光源は、前記イメージセンサーが画像を取得しているときはオンになり、かつ前記イメージセンサーが画像を取得していないときはオフになる、請求項１８に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２１】
前記照明システムがオフアクシス照明システムである、請求項１８に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２２】
前記オフアクシス照明システムがシャインプルーフ条件を満たす、請求項２１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２３】
前記オフアクシス照明システムがシャインプルーフ条件を満たさない、請求項２１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２４】
前記オフアクシス照明サブシステムがケーラー照明システムである、請求項２１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２５】
前記オフアクシス照明システムがアッベ照明システムである、請求項２１に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２６】
前記照明システムが落射照明システムである、請求項１８に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２７】
前記落射照明システムがケーラー照明システムである、請求項２６に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２８】
前記落射照明システムがアッベ照明システムである、請求項２６に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項２９】
前記照明システムが透過照明システムである、請求項１８に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３０】
前記透過照明システムがケーラー照明システムである、請求項２９に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３１】
前記透過照明システムがアッベ照明システムである、請求項２９に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３２】
前記光学イメージングシステムが並進ステージをさらに含む、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３３】
前記並進ステージが一軸並進ステージである、請求項３２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３４】
前記並進ステージが二軸並進ステージである、請求項３２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３５】
前記並進ステージが多軸並進ステージである、請求項３２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３６】
前記実行可能なソフトウェアが取得画像内のアレイのフィーチャーの位置を自動で決定する、請求項４に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３７】
（ｉ）あらかじめ決められた解析ウィンドウを画像内の各アレイフィーチャーに対してセンタリングし、（ｉｉ）前記フィーチャー内のピクセルのあらかじめ決められたパターンに従ってシグナルピクセルおよびバックグラウンドピクセルの強度値統計量を計算し、かつ（ｉｉｉ）前記シグナル強度値統計量およびバックグラウンド強度値統計量を利用して各フィーチャーのバックグラウンド補正シグナル強度値を計算することにより、前記実行可能なソフトウェアが局所バックグラウンド補正も行う、請求項３６に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３８】
前記実行可能なソフトウェアが、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値のｋ平均クラスタリング解析を行うことにより前記アレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値も決定する、請求項３７に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項３９】
前記実行可能なソフトウェアが、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値のｋメドイドクラスタリング解析を行うことにより前記アレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値も決定する、請求項３７に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４０】
前記実行可能なソフトウェアが、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値の混合モデル統計解析を行うことにより前記アレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値も決定する、請求項３７に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４１】
前記実行可能なソフトウェアが、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値のソーティングに基づく経験的解析を行うことにより前記アレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値も決定する、請求項３７に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４２】
前記実行可能なソフトウェアが、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値のペアワイズ差のソーティングに基づく経験的解析を行うことにより前記アレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値も決定する、請求項３７に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４３】
前記実行可能なソフトウェアが、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値の１つ以上の統計解析を行うことにより前記アレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値も決定し、前記１つ以上の統計解析が、限定されるものではないが、ｋ平均クラスタリング、ｋメドイドクラスタリング、混合モデル統計解析、または経験的解析を含むリストから選択される、請求項３７に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４４】
前記実行可能なソフトウェアが、検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数ならびにポアソン分布の予測に基づいてサンプル中の標的分子の絶対数も計算する、請求項５または３８〜４３のいずれか一項に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４５】
前記実行可能なソフトウェアが標的分子の数の信頼区間も計算する、請求項４４に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４６】
前記光学イメージングシステムおよび出力ユニットが単一のスタンドアロン機器内で組み合わされる、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４７】
前記光学イメージングシステムおよび出力ユニットが個別の機器モジュールとして構成される、請求項２に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４８】
サンプル中の標的分子の絶対数が、検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数ならびにポアソン分布の予測から計算される、請求項３または５に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項４９】
前記実行可能なソフトウェアが、アレイフィーチャーの完全セットの局所バックグラウンド補正シグナル強度の解析を行って動的シグナル強度閾値も決定し、前記解析が、さまざまなモデルパラメーターによりモデル関数を強度データに当てはめることを含む、請求項３７に記載のアレイリーダーシステム。
【請求項５０】
前記実行可能なソフトウェアが、アレイフィーチャーの完全セットの局所バックグラウンド補正シグナル強度の解析を行って動的シグナル強度閾値も決定し、前記解析が、前記閾値超のフィーチャー強度と前記閾値未満のフィーチャー強度との統計的差に関する品質メトリックを最大化することを含む、請求項３７に記載のアレイリーダーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年１０月７日出願の米国仮特許出願第６１／８８７，８５３号明細書（この出願は参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
アレイ技術は、バイオ分子の検出、遺伝子発現レベルのプロファイリングなどのためにバイオメディカル研究で広く使用されてきた。アレイは、典型的には、サンプル中の標的分子に結合またはハイブリダイズすることが可能な固定化プローブを含む。結合イベントまたはハイブリダイゼーションイベントの検出は、多くの場合、光学標識（たとえばフルオロフォア）およびスキャニングまたはイメージング技術（たとえば蛍光スキャニングまたはイメージング）を用いて達成される。アレイ上のフィーチャーとは、所与の標的分子に特異的な固定化プローブ、たとえば、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列にハイブリダイズするプローブの小領域のことである。したがって、ハイブリダイズされたアレイ上の標識フィーチャーのパターンを同定すれば、特定の分子、たとえばサンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関する情報が得られ、ひいてはバイオメディカル研究で価値のあるデータを得ることが可能である。バイオメディカル研究で高品質の定量的データを提供するのに重要な２つの工学的要件は、（ｉ）ハイブリダイズされたアレイを適正に画像化すること、および（ｉｉ）画像を適正に解析して定量的データを抽出することである。既存の光学イメージングシステムは、典型的には、一度にアレイの一領域を画像化するため、多くの異なる領域を画像化する必要がある場合、遅いプロセスとなりうる。その他に、画像解析の現在の方法は、典型的には、各アレイフィーチャーのシグナル強度レベル（すなわちアナログ量）を決定する。強度レベルの測定は、多くの場合、さまざまな機器ドリフト誤差および分析誤差の影響を受けやすいため、標的分子が所与のアレイフィーチャーに結合されるかを決定するための改善された方法およびデータをサンプル中に存在する標的分子の数の定量的尺度に変換するための改善された方法は、バイオメディカル用途でアレイ技術の使用を拡大するのにきわめて重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示に係る方法、システム、およびプラットフォームは、アレイ上の標識フィーチャーをデジタルカウントする手段を提供することにより、確率的標識技術を用いたサンプル中に存在する標的分子の数の定量を可能にする。
【０００４】
本明細書には、（ａ）アレイの１つ以上の領域の画像を生成するように構成された光学機器であって、アレイが複数のフィーチャーを含み、複数のフィーチャーがオリゴヌクレオチドプローブのセットを含み、オリゴヌクレオチドプローブが標識のセットに相補的である、光学機器と、（ｂ）画像解析を行うように構成されたプロセッサーであって、画像解析が、（ｉ）光学機器により生成された画像を読み取る工程と、（ｉｉ）画像内のアレイのフィーチャーの位置を決定する工程と、（ｉｉｉ）各フィーチャーのシグナル強度を測定する工程と、（ｉｖ）各フィーチャーの局所バックグラウンド強度を測定する工程と、（ｖ）シグナル強度および局所バックグラウンド強度を用いて各フィーチャーの局所バックグラウンド補正シグナル強度を計算する工程と、（ｖｉ）フィーチャーの完全セットの局所バックグラウンド補正シグナル強度を解析して標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値を決定する工程と、（ｖｉｉ）検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数ならびにポアソン分布の予測に基づいてサンプル中に存在する標的分子の数を計算する工程とを含む、プロセッサーとを含むイメージングプラットフォームが開示されている。いくつかの実施形態では、光学機器により生成された画像は蛍光画像である。いくつかの実施形態では、光学機器により生成された画像は燐光画像である。いくつかの実施形態では、光学機器により生成された画像は、透過光画像、反射光画像、または散乱光画像である。いくつかの実施形態では、画像解析は、あらかじめ取得されて記憶デバイスに記憶された画像を読み取る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、画像内のアレイのフィーチャーの位置を決定する工程は、アレイ上の所定の基準フィーチャーを同定する工程を含む。いくつかの実施形態では、局所バックグラウンド補正シグナル強度の計算は、（ｉ）あらかじめ決められた解析ウィンドウを画像内の各フィーチャーに対してセンタリングする工程と、（ｉｉ）フィーチャー内のピクセルのあらかじめ決められたパターンに従ってシグナルピクセルおよびバックグラウンドピクセルの強度値統計量を計算する工程と、（ｉｉｉ）シグナル強度値統計量およびバックグラウンド強度値統計量を利用して各フィーチャーの局所バックグラウンド補正シグナル強度を計算する工程と、により行われる。いくつかの実施形態では、各フィーチャーの局所バックグラウンド補正シグナル強度の計算に使用される強度値統計量は、限定されるものではないが、平均値、中央値、シグナル対バックグラウンド強度比を含むリストから選択される。いくつかの実施形態では、フィーチャーの完全セットの局所バックグラウンド補正シグナル強度を解析して動的シグナル強度閾値を決定する工程は、限定されるものではないが、ｋ平均クラスタリング、ｋメドイドクラスタリング、混合モデル統計解析、または経験的解析を含むリストから選択される１つ以上の統計解析を行う工程を含む。いくつかの実施形態では、フィーチャーの完全セットの局所バックグラウンド補正シグナル強度を解析して動的シグナル強度閾値を決定する工程は、さまざまなモデルパラメーターによりモデル関数を強度データに当てはめる工程を含む。いくつかの実施形態では、フィーチャーの完全セットの局所バックグラウンド補正シグナル強度を解析して動的シグナル強度閾値を決定する工程は、閾値超の強度と閾値未満の強度との統計的差に関する品質メトリックを最大化する工程を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、サンプル中の標的分子の絶対数を計算するための出力ユニットを含むアレイリーダーシステムが記載されている。アレイリーダーシステムは、複数の標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーを含むアレイを読み取るように構成される。いくつかの実施形態では、アレイリーダーシステムは、光学イメージングシステムをさらに含みうる。いくつかの実施形態では、サンプル中の標的分子の絶対数の計算は、光学イメージングシステムにより生成された光学画像データをアレイ上の標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数のカウント値に変換することに基づく。いくつかの実施形態では、出力ユニットは、デジタルプロセッサーと実行可能なソフトウェアとを含み、実行可能なソフトウェアは、光学画像データを標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数のカウント値に変換するためのコンピューターコードを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、マイクロアレイ、顕微鏡スライド、またはマイクロウェルプレートを含む。
【０００６】
開示されたアレイリーダーシステムのいくつかの実施形態では、光学イメージングシステムの倍率は、１未満であるか、１に等しいか、または１超である。いくつかの実施形態では、光学イメージングシステムは蛍光イメージングシステムを含む。いくつかの実施形態では、光学イメージングシステムは燐光イメージングシステムを含む。いくつかの実施形態では、光学イメージングシステムは、透過光、反射光、もしくは散乱光のイメージングモード、またはそれらの組合せで動作するイメージングシステムを含む。いくつかの実施形態では、光学イメージングシステムは１つ以上のイメージセンサーを含み、１つ以上のイメージセンサーは、少なくとも３２０×２４０ピクセルの解像度を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のイメージセンサーはＣＣＤイメージセンサーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のイメージセンサーはＣＭＯＳイメージセンサーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のイメージセンサーは１つ以上の回路ボードを含む。いくつかの実施形態では、光学イメージングシステムは、限定されるものではないが、顕微鏡対物レンズ、カメラレンズ、有限共役レンズ、無限共役レンズ、平凸レンズ、両凸レンズ、平凹レンズ、両凹レンズ、色消し接合二重レンズ、またはバンドパスフィルターを含む群から選択される１つ以上の要素をさらに含む。いくつかの実施形態では、光学イメージングシステムは、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはフィコエリトリンフルオロフォアを併用するように設計された蛍光イメージングシステムを含む。いくつかの実施形態では、光学イメージングシステムは、少なくとも１つの光源を含む照明システムをさらに含み、少なくとも１つの光源は、ＬＥＤまたはＬＥＤアセンブリーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの光源は、イメージセンサーと電子的に同期し、少なくとも１つの光源は、イメージセンサーが画像を取得しているときはオンになり、かつイメージセンサーが画像を取得していないときはオフになる。
【０００７】
開示されたアレイリーダーシステムのいくつかの実施形態では、照明システムは、シャインプルーフ条件を満たすオフアクシス照明システムである。いくつかの実施形態では、照明システムは、シャインプルーフ条件を満たさないオフアクシス照明システムである。いくつかの実施形態では、照明システムは、ケーラー照明システムを含むオフアクシス照明サブシステムである。いくつかの実施形態では、照明システムは、アッベ照明システムを含むオフアクシス照明システムである。いくつかの実施形態では、照明システムは、ケーラー照明システムを含む落射照明システムである。いくつかの実施形態では、照明システムは、アッベ照明システムを含む落射照明システムである。いくつかの実施形態では、照明システムは、ケーラー照明システムを含む透過照明システムである。いくつかの実施形態では、照明システムは、アッベ照明システムを含む透過照明システムである。
【０００８】
開示されたアレイリーダーシステムのいくつかの実施形態では、光学イメージングシステムは、並進ステージをさらに含み、並進ステージは、一軸並進ステージ、二軸並進ステージ、または多軸並進ステージである。
【０００９】
開示されたアレイリーダーシステムのいくつかの実施形態では、光学イメージングシステムおよび出力ユニットは、単一のスタンドアロン機器内で組み合わされる。いくつかの実施形態では、光学イメージングシステムおよび出力ユニットは、個別の機器モジュールとして構成される。
【００１０】
開示されたアレイリーダーシステムのいくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアは、取得画像内のアレイのフィーチャーの位置を自動で決定する。いくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアはまた、（ｉ）あらかじめ決められた解析ウィンドウを画像内の各アレイフィーチャーに対してセンタリングする工程と、（ｉｉ）フィーチャー内のピクセルのあらかじめ決められたパターンに従ってシグナルピクセルおよびバックグラウンドピクセルの強度値統計量を計算する工程と、（ｉｉｉ）シグナル強度値統計量およびバックグラウンド強度値統計量を利用して各フィーチャーのバックグラウンド補正シグナル強度値を計算する工程と、により局所バックグラウンド補正を行う。
【００１１】
開示されたアレイリーダーシステムのいくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアは、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値のｋ平均クラスタリング解析を行うことによりアレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値を決定する。いくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアはまた、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値のｋメドイドクラスタリング解析を行うことによりアレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値を決定する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアは、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値の混合モデル統計解析を行うことによりアレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値を決定する。いくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアはまた、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値のソーティングに基づく経験的解析を行うことによりアレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値を決定する。いくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアは、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値のペアワイズ差のソーティングに基づく経験的解析を行うことによりアレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値を決定する。いくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアモジュールは、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度値の１つ以上の統計解析を行うことによりアレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的シグナル強度閾値を決定し、１つ以上の統計解析は、限定されるものではないが、ｋ平均クラスタリング、ｋメドイドクラスタリング、混合モデル統計解析、または経験的解析を含むリストから選択される。
【００１３】
開示されたアレイリーダーシステムのいくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアは、検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数ならびにポアソン分布の予測に基づいてサンプル中の標的分子の絶対数を計算する。いくつかの実施形態では、実行可能なソフトウェアはまた、標的分子の数の信頼区間を計算する。
【００１４】
また本明細書には、（ａ）アレイの１つ以上の領域の画像を生成するように構成された光学機器であって、アレイが、オリゴヌクレオチドプローブを含む複数のフィーチャーを含み、オリゴヌクレオチドプローブが標識のセットに相補的である、光学機器と、（ｂ）デジタルプロセッサーであって、デジタルプロセッサーが、（ｉ）アレイの１つ以上の領域の標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数を決定する二値出力データを生成するように複数のフィーチャーのバックグラウンド補正シグナル強度を変換する工程と、（ｉｉ）アレイの１つ以上の領域内で検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数に基づいてサンプル中に存在する標的分子の数を計算する工程とを含む画像解析を行うように構成される、デジタルプロセッサーとを含むデジタルイメージングプラットフォームが開示されている。いくつかの実施形態では、画像解析は、画像内のアレイのフィーチャーの位置を自動で決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、画像解析は、各フィーチャーのシグナル強度を局所バックグラウンド強度に対して補正する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、画像解析は、複数のフィーチャーの補正シグナル強度の１つ以上の統計解析を行ってアレイの１つ以上の領域の１つ以上の動的シグナル強度閾値を規定する工程をさらに含み、統計解析は、限定されるものではないが、ｋ平均クラスタリング、ｋメドイドクラスタリング、混合モデル統計解析、または経験的解析を含むリストから選択される。いくつかの実施形態では、サンプル中に存在する標的分子の数の計算は、オンアレイの１つ以上の領域内で検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数ならびにポアソン分布の予測の両方に基づく。
【００１５】
また本明細書には、アレイ上の標識フィーチャーの数を計算するプログラムを記憶する非一時的コンピューター可読媒体が開示されており、アレイは、複数のフィーチャーセットを含み、フィーチャーセットの個別のフィーチャーは、標識のセットにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブのセットを含み、非一時的コンピューター可読媒体は、（ａ）アレイのデジタル画像内のアレイの個別のフィーチャーの位置を決定するコンピューターコードと、（ｂ）１つ以上のフィーチャーのシグナル強度の局所バックグラウンド補正を行うコンピューターコードと、（ｃ）フィーチャーの完全セットの補正シグナル強度データを解析して補正シグナル強度閾値を決定するコンピューターコードと、（ｄ）フィーチャーの補正シグナル強度を二値出力データに変換することによりアレイ上の標識フィーチャーの数のカウント値を提供するコンピューターコードとを含む。いくつかの実施形態では、デジタル画像内のアレイの個別のフィーチャーの位置を決定するコンピューターコードは、アレイ上のあらかじめ決められた基準フィーチャーを同定する工程を含む。いくつかの実施形態では、各フィーチャーのシグナル強度の局所バックグラウンド補正を行うコンピューターコードは、限定されるものではないが、平均値、中央値、またはシグナル対バックグラウンド強度比を含むリストから選択されるシグナル強度およびバックグラウンド強度の統計量を利用する計算を含む。いくつかの実施形態では、フィーチャーの完全セットの補正シグナル強度を解析して補正シグナル強度閾値を決定するコンピューターコードは、限定されるものではないが、ｋ平均クラスタリング、ｋメドイドクラスタリング、混合モデル統計解析、または経験的解析を含むリストから選択される１つ以上の統計解析を行う工程を含む。
【００１６】
また本明細書には、アレイシグナル強度データの局所バックグラウンド補正を行うコンピューター実行方法が開示されており、本方法、（ａ）あらかじめ決められたデータ解析ウィンドウをアレイのデジタル画像内のフィーチャーに対してセンタリングする工程と、（ｂ）アレイフィーチャー内またはその周りのピクセルのあらかじめ決められたパターンに従ってシグナルピクセルおよびバックグラウンドピクセルの強度値統計量を計算する工程と、（ｃ）シグナル強度値統計量およびバックグラウンド強度値統計量を利用してアレイフィーチャーのバックグラウンド補正シグナル強度を計算する工程とを含む。いくつかの実施形態では、コンピューター実行方法は、たとえば、アレイ上の基準フィーチャーのあらかじめ決められたセットを用いてアレイフィーチャーの位置を自動で決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、バックグラウンド補正シグナル強度の計算に使用される強度値統計量は、限定されるものではないが、平均値、中央値、またはシグナル対バックグラウンド強度比を含むリストから選択される。
【００１７】
本明細書には、複数の標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーを含むアレイ上の標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別に使用するための動的画像強度閾値を決定するコンピューター実行方法が開示されており、コンピューター実行方法は、（ａ）アレイの各フィーチャーの画像強度データを測定する工程と、（ｂ）アレイ上の各フィーチャーの画像強度データの局所バックグラウンド補正を行う工程と、（ｃ）アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正画像強度データの１つ以上の統計解析を行ってアレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的画像強度閾値を決定する工程であって、１つ以上の統計解析が、限定されるものではないが、ｋ平均クラスタリング、ｋメドイドクラスタリング、混合モデル統計解析、または経験的解析を含むリストから選択される、工程とを含む。
【００１８】
また、（ａ）クロージャーと、（ｂ）クロージャーを第１の位置に磁気的に保持するハウジングと、（ｃ）クロージャーを第２の位置に磁気的に保持する並進ステージとを含む機構が開示されている。いくつかの実施形態では、機構は、クロージャーとハウジングとの間に位置決めされたガスケットをさらに含む。いくつかの実施形態では、ガスケットは、クロージャーに装着される。いくつかの実施形態では、ガスケットは、ハウジングに装着される。いくつかの実施形態では、クロージャーおよびハウジングは実質的に不透明であり、かつガスケットは、第１の位置でクロージャーとハウジングとの間に実質的に光密シールを形成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のマグネットは、第１の位置でクロージャーをハウジング上に保持するように位置決めされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のマグネットは、第２の位置でクロージャーを並進ステージの第１の表面上に保持するように位置決めされる。いくつかの実施形態では、２対以上の嵌合位置決めフィーチャーにより第２の位置でクロージャーを並進ステージに整合させる。いくつかの実施形態では、２対以上の嵌合位置決めフィーチャーにより第１の位置でクロージャーをハウジングに整合させる。いくつかの実施形態では、対をなす嵌合位置決めフィーチャーは、コニカルピンおよびコニカルホールを含む。いくつかの実施形態では、ハウジングは光学機器を含む。いくつかの実施形態では、並進ステージはサンプルホルダーを含む。いくつかの実施形態では、サンプルホルダーは、顕微鏡スライド、マイクロアレイ、またはマイクロウェルプレートを保持するように設計される。いくつかの実施形態では、クロージャーは蝶着されない。いくつかの実施形態では、クロージャーは、ネジまたはクリップなどのファスナーを用いてハウジングまたは並進ステージのいずれにも装着されない。いくつかの実施形態では、クロージャーは、接着剤を用いてハウジングまたは並進ステージのいずれにも装着されない。いくつかの実施形態では、クロージャーはラッチまたは機械的ロックを使用しない。
【００１９】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に特定的に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｇは、光学システムおよびその要素の一例を示している。図１Ａは、例示的な光学システムの等角投影図を示している。図１Ｂは、光学システムの上面図を示している。図１Ｃは、光学システムの二等角図を示している。図１Ｄは、光学システムの正面図を示している。図１Ｅは、一軸ステージとイメージングシステムと照明システムとを含む例示的な光学システムの側面図を示している。図１Ｆは、光学システムの背面図を示している。図１Ｇは、光学システムの動作を制御する要素を示している。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｇは、光学システムおよびその要素の一例を示している。図１Ａは、例示的な光学システムの等角投影図を示している。図１Ｂは、光学システムの上面図を示している。図１Ｃは、光学システムの二等角図を示している。図１Ｄは、光学システムの正面図を示している。図１Ｅは、一軸ステージとイメージングシステムと照明システムとを含む例示的な光学システムの側面図を示している。図１Ｆは、光学システムの背面図を示している。図１Ｇは、光学システムの動作を制御する要素を示している。
【図２】図２は、イメージングシステムのレンズの例示的なレイアウトを示している。
【図３】図３は、照明システムのレンズの例示的なレイアウトを示している。
【図４】図４は、限定されるものではないが、画像データの例を示しており、この場合、図４Ａは、光学機器から取得されるアレイ画像を示し、図４Ｂは、個別のフィーチャーの強度のヒストグラムを示している。
【図５】図５は、力価測定実験でアレイプローブと標識標的分子とのハイブリダイゼーションで観測されたフィーチャー強度分布を示している。
【図６】図６Ａは、ノイズの多いアレイ画像を示している。図６Ｂは、バックグラウンド調整前の強度分布を示している。図６Ｃは、バックグラウンド調整後の強度分布を示している。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、アレイ上のフィーチャーのデジタルカウント用に設計された機器の外観図を示している。
【図８】図８は、アレイ上のフィーチャーのデジタルカウント用に設計された機器の内観図（正面図、３Ｄ  ＣＡＤモデル）を示している。
【図９】図９は、アレイ上のフィーチャーのデジタルカウント用に設計された機器の内観図（背面図、３Ｄ  ＣＡＤモデル）を示している。
【図１０】図１０は、前面パネルから離れる方向にドアを引き出した拡張（ローディング）位置のサンプルローディングステージを有するシステムの写真を示している。Ｐｉｘｅｌ１６アレイアセンブリーがローディングトレイに示されている。
【図１１】図１１Ａは、サンプルコンパートメントステージに対してドアを位置決めするためにマグネット機構を利用したドアアセンブリーの分解図を示している。図１１Ｂは、ドアとステージとの適正な整合を確保するためのコニカルロケーターフィーチャーを例示したドアアセンブリーの他の分解図を示している。
【図１２】図１２は、ドア上の対応するマグネットの対に嵌合するマグネットを有する上側ステージアセンブリーの分解図を示している。
【図１３】図１３は、ドア上の対応するマグネットの対に嵌合するマグネットを有する前面パネルアセンブリーの分解図を示している。
【図１４】図１４は、ガラス基材上に１６ヶ所のアレイ位置を示すアレイの一実施形態でアレイの製造および解析のための目視参照配置を示している。称呼寸法が示されている（ミリメートル単位）。
【図１５】図１５は、アレイの一実施形態でフィーチャーのレイアウトを示している。称呼寸法が示されている（ミリメートル単位）。
【図１６】図１６は、陽性対照（基準物）、陰性対照、およびインデックススポットの位置を含む、サンプル中の標的分子のデジタルカウント用に設計されたアレイのレイアウトを示している。
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、（Ａ）参照配置への変換後のアレイ画像の例ならびに（Ｂ）２つのアレイ画像の画像サイズ（ピクセル単位）およびフィーチャー位置の概略図を示している。
【図１８】図１８Ａ〜Ｂは、アレイ上のフィーチャーのデジタルカウント用に設計された機器を用いて実験を行うためのソフトウェアのワークフローを示している。（Ａ）手動サンプルローディングを用いる一軸システムのワークフローおよび（Ｂ）自動サンプルトレイローディングを用いる二軸システムのワークフロー。
【図１９】図１９は、アレイ中の各フィーチャーに関連する１２×１２ピクセル領域を含む解析ウィンドウを示している。
【図２０】図２０は、アレイ中の各フィーチャーに対して解析ウィンドウ内のピクセル名マップを示している。
【図２１】図２１は、解析ソフトウェアにより同定された異なるカテゴリーのフィーチャーを例示するアレイの画像から得られた強度データの散布図（上側）およびフィーチャー強度データのヒストグラム（下側）を示している。鎖線は、標識（「オン」）フィーチャーと非標識（「オフ」）フィーチャーとを識別するために使用されるソフトウェアにより決定された強度閾値の例を示している。
【図２２】図２２は、アレイの標識（「オン」）フィーチャーと非標識（「オフ」）フィーチャーとを識別する強度閾値（鎖線）の使用を例示するアレイフィーチャー強度データの散布図（上側）およびヒストグラム（中央）を示している。本明細書に記載の解析方法の一実施形態では、閾値は、ソートされた強度データのプロットの最大傾きから決定される（下側）。
【図２３】図２３は、１２８ビンのフィーチャー強度ヒストグラムに対して一実施形態で強度閾値を決定するために使用した３成分分布モデルの当てはめの結果を示している。
【図２４】図２４は、アレイフィーチャー強度データのヒストグラムに対する１つ（左側）または２つ（右側）の正規分布の当てはめについて、逸脱度の計算を例示している。いくつかの実施形態では、逸脱度測定値を品質メトリックとして使用しうる。
【図２５】図２５は、レプリケート実験の出力データを組み合わせる種々の方法について計算された不確実性を示している。
【図２６】図２６は、アレイ上の標識フィーチャーのデジタルカウントを用いてサンプル中の標的ＲＮＡ分子の数を測定するための希釈系列データを示している。
【図２７】図２７は、希釈系列実験でシステムソフトウェアにより提供された出力データのスクリーンショットを示している。希釈系列実験で使用した各アレイに対して、ソフトウェアは、アレイのデジタル表現に重ね合わせてカウントに使用した閾値の値を示す青線と共にフィーチャー強度データのヒストグラムを表示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
アレイ技術は、バイオ分子の検出、遺伝子発現レベルのプロファイリングなどのためにバイオメディカル研究で広く使用されてきた。アレイは、典型的には、サンプル中の標的分子に結合またはハイブリダイズすることが可能な固定化プローブを含む。結合イベントまたはハイブリダイゼーションイベントの検出は、多くの場合、光学標識（たとえばフルオロフォア）およびスキャニングまたはイメージング技術（たとえば蛍光スキャニングまたはイメージング）を用いて達成される。アレイ上のフィーチャーとは、所与の標的分子に特異的な固定化プローブ、たとえば、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列にハイブリダイズするプローブの小領域のことである。したがって、ハイブリダイズされたアレイ上の標識フィーチャーのパターンを同定すれば、特定の分子、たとえばサンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の存在に関する情報が得られ、ひいてはバイオメディカル研究で価値のあるデータを得ることが可能である。バイオメディカル研究で高品質の定量的データを提供するのに重要な２つの工学的要件は、（ｉ）ハイブリダイズされたアレイを適正に画像化すること、および（ｉｉ）画像を適正に解析して定量的データを抽出することである。既存の光学イメージングシステムは、典型的には、一度にアレイの一領域を画像化するため、多くの異なる領域を画像化する必要がある場合、遅いプロセスとなりうる。その他に、画像解析の現在の方法は、典型的には、各アレイフィーチャーのアナログシグナル強度レベル（すなわち、種々の機器および実験パラメーターにより決定されるなんらかの最小値と最大値との間の任意の値を有しうるシグナル）を決定する。アナログ強度レベルの測定は、多くの場合、さまざまな機器のドリフト誤差および分析誤差の影響を受けやすいため、標的分子が所与のアレイフィーチャーに結合されるかを決定するための改善された方法およびデータをサンプル中に存在する標的分子の数の定量的尺度に変換するための改善された方法は、バイオメディカル用途でアレイ技術の使用を拡大するのにきわめて重要である。
【００２２】
本明細書に開示された方法、システム、およびプラットフォームの利点は、（ｉ）より高スループットの画像取得のためのアレイの複数の領域の同時イメージングと、（ｉｉ）アレイの各フィーチャーに対して結合標的分子（または標的分子標識）の存在または不在のデジタル決定を行うように画像データを縮小することにより、いくつかのタイプのアレイ実験、たとえば、サンプル中に存在する標的分子の数の定量のために確率的標識のセットを利用する実験で、改善された定量を提供する改善された方法とを含む。確率的標識技術の使用は、米国特許第８，８３５，３５８号明細書およびＰＣＴ出願米国特許出願公開第２０１１／０６５２９１号明細書（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。標的分子のより定量的な検出を行う手段を提供することに加えて、確率的標識技術の使用により、核酸増幅を含むアッセイでの増幅の偏りの緩和が可能になる。
【００２３】
したがって、本明細書には、（ｉ）アレイの１つ以上の領域の画像を形成するように構成された光学機器と、（ｉｉ）複数のプローブをさらに含む複数のフィーチャーを含むアレイであって、アレイの１つ以上の領域が１つ以上のサブアレイを含みうると共に、アレイまたはサブアレイが確率的標識のセットを併用するように設計される、アレイと、（ｉｉｉ）入力画像データを受け取り、アレイ画像内のアレイフィーチャーの位置を決定し、各フィーチャーに関連するシグナル強度値を局所バックグラウンド強度値に対して補正し、複数のフィーチャーの補正シグナル強度データの統計解析を行うことにより１つ以上のアレイ領域の動的シグナル強度閾値を決定し、フィーチャーの補正シグナル強度データとシグナル強度閾値とを比較することによりアレイの１つ以上の領域で標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数をカウントし、かつアレイの１つ以上の領域で検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数から、１つ以上の標的分子種についてサンプル中の標的分子の数を計算するコンピューター実行方法とを含む、アレイ上の標識フィーチャーのデジタルカウントのための方法、デバイス、システム、およびプラットフォームが開示されている。
【００２４】
いくつかの実施形態では、（ｉ）アレイの１つ以上の領域の画像を形成するように構成された光学機器（またはリーダー）と、（ｉｉ）実行可能な命令を実行しかつデータをメモリーデバイスに記憶するように構成されたデジタルプロセッサーと、（ｉｉｉ）画像データをアレイの１つ以上の領域の標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数のデジタルカウント値に変換するように画像解析を行うコンピューターコードとを含むシステムが記載される。いくつかの実施形態では、コンピューターコードは、アレイの１つ以上の領域で検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数から、１つ以上の標的分子種についてサンプル中の標的分子の数の計算を行うことをさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、（ｉ）確率的標識実験で使用するように設計されたアレイであって、アレイが、複数のプローブをさらに含む複数のフィーチャーを含み、アレイの１つ以上の領域が１つ以上のサブアレイを含みうると共に、アレイまたはサブアレイが確率的標識のセットを併用するように設計される、アレイと、（ｉｉ）アレイの１つ以上の領域の画像を形成するように構成された光学機器（またはリーダー）と、（ｉｉｉ）実行可能な命令を実行しかつデータをメモリーデバイスに記憶するように構成されたデジタルプロセッサーと、（ｉｖ）画像データをアレイの１つ以上の領域の標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数のデジタルカウント値に変換するように画像解析を行うコンピューターコードとを含むプラットフォームが記載される。いくつかの実施形態では、コンピューターコードは、アレイの１つ以上の領域で検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数から、１つ以上の標的分子種についてサンプル中の標的分子の数の計算を行うことをさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、アレイ上の標識フィーチャーの数を決定するソフトウェアアプリケーション（またはコンピューターコード製品）が記載され、ソフトウェアアプリケーションは、次のコンピューター実行方法、すなわち、（ｉ）入力画像データを摂取し、（ｉｉ）アレイ画像内のアレイフィーチャーの位置を決定し、（ｉｉｉ）各フィーチャーに関連するシグナル強度値を局所バックグラウンド強度値に対して補正し、（ｉｖ）複数のフィーチャーの補正シグナル強度データの統計解析を行うことにより１つ以上のアレイ領域の動的シグナル強度閾値を決定し、（ｖ）フィーチャーの補正シグナル強度データとシグナル強度閾値とを比較することによりアレイの１つ以上の領域で標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数をカウントし、かつ（ｖｉ）アレイの１つ以上の領域で検出された標識フィーチャーおよび非標識フィーチャーの数から、１つ以上の標的分子種についてサンプル中の標的分子の数を計算するうちの１つ以上を実行するコードを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、アレイシグナル強度データの局所バックグラウンド補正を行うコンピューター実行方法が記載されており、本方法は、（ｉ）あらかじめ決められたデータ解析ウィンドウをアレイのデジタル画像内の各アレイフィーチャーに対してセンタリングする工程と、（ｉｉ）各アレイフィーチャー内またはその周りのピクセルのあらかじめ決められたパターンに従ってシグナルピクセルおよびバックグラウンドピクセルについて平均値または中央値の強度値を計算する工程と、（ｉｉｉ）平均値または中央値のシグナル強度から平均値または中央値のバックグラウンド強度を引き算して、各アレイフィーチャーのバックグラウンド補正シグナル強度値を決定する工程とを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、アレイ上の複数のフィーチャーの補正画像強度データから動的画像強度閾値を決定するコンピューター実行方法が記載されており、本方法は、（ｉ）アレイの各フィーチャーの画像強度データを収集する工程と、（ｉｉ）任意選択で、アレイ上の各フィーチャーの画像強度データの局所バックグラウンド補正を行う工程と、（ｉｉｉ）アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正画像強度データの１つ以上の統計解析を行うによりアレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的画像強度閾値を決定する工程とを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の統計解析は、限定されるものではないが、ｋ平均クラスタリング、ｋメドイドクラスタリング、混合モデル統計解析、または画像強度値もしくは画像強度値のペアワイズ差のソーティングに基づく経験的解析を含むリストから選択される。本明細書で用いられる場合、「動的強度閾値」という用語は、進行中の実験に由来するデータの分析に基づいて決定されたパラメーターを意味する。アレイの標識フィーチャーと非標識フィーチャーとの識別のための動的画像強度閾値の使用は、機器ドリフトまたは実験手順から生じうるデータ処理誤差の最小化または排除に役立つ。
【００２９】
定義
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる技術用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、文脈上明らかに異なる記述がないかぎり、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、複数の参照語が包含される。本明細書での「または（ｏｒ）」の意味はいずれも、とくに明記されていないかぎり「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を包含することが意図される。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「システム」および「プラットフォーム」という用語は、同義的に用いられる。同様に、「イメージセンサー」、「イメージングセンサー」、「センサーチップ」、および「カメラ」という用語は、画像化目的に使用される二次元フォトセンサーを記述するために同義的に用いられ、「画像強度」および「シグナル強度」という用語の使用もまた、データ解析方法を記述するのに同義的に用いられる。最後に、とくに明記されていないかぎり、「ソフトウェア」、「ソフトウェアアプリケーション」、「ソフトウェアモジュール」、「コンピュータープログラム」、および「コンピューターコード」という用語もまた、同義的に用いられる。
【００３１】
確率的標識方法
確率的標識技術の使用は、米国特許第８，８３５，３５８号明細書およびＰＣＴ出願米国特許出願公開第２０１１／０６５２９１号明細書（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００３２】
簡潔に述べると、高感度単分子デジタルカウンティングは、同一の標的分子のコレクションの確率的標識処理を介して達成されうる。標的分子の各コピーは、ユニークな標識の入った大型の枯渇しないリザーバーを用いてランダムに標識される。各標識標的分子のユニーク性は、ランダム選択の統計により決定され、標識の多様性と比較してコレクション中の同一の標的分子のコピー数に依存する。得られる標識標的分子のセットのサイズは、標識プロセスの確率的性質により決定され、次いで、検知された標識の数の解析は、元のコレクションまたはサンプル中に存在する標的分子の数の計算を可能にする。存在する標的分子のコピー数とユニークな標識の数との比が低い場合、標識標的分子は高度にユニークであり（すなわち、２個以上の標的分子が１個の所与の標識で標識される確率は非常に低い）、デジタルカウント効率は高い。この確率的方法は、分子をカウントする問題を、同一の分子の位置決定および同定の問題から、あらかじめ決められた標識のセットの検出に関する一連のあり／なしのデジタル問題に変換する。いくつかの実施形態では、標識産物はＤＮＡ配列決定により検出される。他の実施形態では、選択された１つ以上の標的分子の標識産物は、本明細書に記載のアレイ読出しシステムを用いて高い特異性で検出される。
【００３３】
アレイおよびフィーチャー
本明細書には、サンプル中の１つ以上の標的分子の確率的カウンティングに使用するように設計されたアレイが開示されている。アレイは、標識標的分子の存在を検出する手段を提供し、標識は、ユニークな標識の大きいさまざまなセットを含む。
【００３４】
多くの実施形態では、アレイは、基材の表面に複数のフィーチャー（またはスポット）を含み、各フィーチャーは、複数の装着されたプローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、アレイは、１つ以上の領域を含みうると共に、そのそれぞれは、複数のフィーチャーまたはサブアレイを含みうる。たとえば、アレイは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれを超える領域を含みうるか、または代わりにアレイは、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはそれを超える領域を含みうる。いくつかの実施形態では、アレイは、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはそれを超える領域を含みうる。他の実施形態では、アレイは、何百、何千、または何万もの領域を含みうる。
【００３５】
アレイの例としては、マイクロタイタープレート、マイクロウェルプレート、１６ウェル顕微鏡スライド、スポットマイクロアレイ、またはｉｎ  ｓｉｔｕ固相合成により作製されたマイクロアレイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アレイの領域は、１６ウェル顕微鏡スライドの１つのウェル、ガラス底９６ウェルプレートの１つのウェル、またはガラス底３８４ウェルプレートの１つのウェルを含みうる。他の選択肢として、アレイの領域は、２つ以上のウェルを含みうる。たとえば、いくつかの実施形態では、領域は、隣接する２つのウェル、隣接する４つのウェル、または互いにごく近接して位置付けられたより多くのウェルを含みうる。いくつかの実施形態では、アレイは、１平方ミリメートル当たり１，０００超のフィーチャーを有する高密度オリゴヌクレオチドアレイを含みうると共に、アレイ上の領域は、アレイ基材表面の選択された領域、たとえば、約１ｍｍ×１ｍｍの領域を含みうる。
【００３６】
以上に述べたように、多くの実施形態では、アレイのフィーチャーのセットに装着されるプローブのセットは、確率的標識研究で使用するように設計されたユニークな標識の特定のセットを検出するように選択される。アレイ基材へのプローブの装着は、共有結合または非共有結合でありうると共に、永久的または一時的でありうる。プローブは、一連の単量体、限定されるものではないが、たとえば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、アミノ酸、合成単量体などでありうるか、または一連のオリゴマー、限定されるものではないが、たとえば、オリゴヌクレオチド（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）、ペプチド配列などでありうる。いくつかの場合、プローブは、高分子、限定されるものではないが、たとえば、抗体、抗体フラグメントなどでありうる。アレイ上の各フィーチャーは、同一の標的分子に結合またはハイブリダイズする同一の分子配列を有する固定化プローブを含むアレイ基材の小領域に対応する。アレイ上の２つ以上のフィーチャーは、同一であるか、類似であるか、または異なりうる。多くの実施形態では、アレイは、確率的標識セットの検出に使用されるフィーチャーセットの他に、整合または配置の目的に使用される１つ以上の基準マークさらには陽性および陰性の対照フィーチャーを含むであろう。陽性対照フィーチャーは、サンプル中に常に存在することが知られている分子に結合もしくはハイブリダイズするプローブ、または制御下でサンプルにスパイクされた分子に結合もしくはハイブリダイズするプローブを含みうる。陰性対照フィーチャーは、サンプル中に不在であることが知られている分子に特異的なプローブを含みうるか、または基材表面に装着されたプローブを有していないフィーチャーを含む。
【００３７】
多くの実施形態では、支持体とも呼ばれるアレイ基材は、いくつかの材料から作製されうる。材料は固体でありうる。材料は半固体でありうる。アレイ基材の作製に使用されうる材料の例としては、ガラス、溶融シリカ、シリコン、ポリマー、またはペーパーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、確率的標識研究に使用するためのアレイを記述する。特定的には、アレイであって、確率的標識実験で使用するように設計された標識のセットに相補的な固定化プローブを有する複数のフィーチャーを含み、かつ標識セット中のすべての標識に対して少なくとも１つのフィーチャーがアレイ上に存在する、アレイが記述される。いくつかの実施形態は、（ａ）複数のフィーチャー、任意選択で、複数のサブアレイとして組織化されたものを含むアレイを含み、複数のフィーチャーは、（ｉ）規定の基準配列のオリゴヌクレオチドプローブを含む１つ以上の基準フィーチャーと、（ｉｉ）１つ以上の規定の陽性対照配列のオリゴヌクレオチドプローブを含む１つ以上の陽性対照フィーチャーと、（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブを有していない１つ以上の陰性対照フィーチャーと、（ｉｖ）オリゴヌクレオチドプローブを含む複数の標識セットフィーチャーであって、各個別のフィーチャーが、１つ以上の標的分子の確率的標識用に設計された標識配列のセットから選択されるユニークな配列を含む、標識セットフィーチャーとを含む。いくつかの実施形態では、本開示に記載のアレイは、２５ｍｅｒを含むオリゴヌクレオチドプローブ配列を含み、５’末端は、任意選択で、６炭素原子アミノ修飾剤で標識されうる。いくつかの実施形態では、本開示に記載のアレイは、表１に列挙されたセット９６０のユニークなオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示に記載のアレイは、表１に列挙された配列のセットに対して７０％の相同性、８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、９５％の相同性であるオリゴヌクレオチドプローブのセットを含む。いくつかの実施形態では、本開示に記載のアレイは、表１に列挙された配列の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％、またはそれを超えるオリゴヌクレオチドプローブのセットを含む。
【００３９】
ハイブリダイゼーションおよび検出
本開示の方法、システム、およびプラットフォームの多くの実施形態では、サンプルは、アレイ上の固定化プローブと接触した状態に配置する前に処理されうる。たとえば、サンプル中の標的分子は、サンプル調製工程時に蛍光色素分子および／または確率的標識で標識されうる。オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションの前に、たとえば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、限定されるものではないが、フルオレセイン、Ｃｙ３、またはＣｙ５をはじめとする蛍光染料分子に共有結合されうる。他の選択肢として、標的分子は、アレイ上のプローブへの結合またはハイブリダイジング後に標識されうる。たとえば、標的分子は、アレイ上のプローブとの結合またはハイブリダイゼーションの前にビオチンに共有結合されうる。結合またはハイブリダイゼーション工程の後、次いで、固定化標的分子は、限定されるものではないが、フィコエリトリン、量子ドットナノ粒子、金ナノ粒子、または青色ラテックスビーズをはじめとする光学タグにコンジュゲートされたストレプトアビジンで標識されうる。アレイへの結合またはハイブリダイゼーションの前または後のいずれかで標的分子を標識する多くの方法、ならびに好適な光学標識またはタグに対する多くの可能な選択肢が存在する。
【００４０】
サンプルをアレイに接触させたら、アレイ（またはアレイの１つ以上の領域）は、１つ以上の標識フィーチャーを含みうる。標識標的分子（標的分子は、アレイとの接触の前または後のいずれかで標識される）を含むサンプルに接触したアレイの各領域は、たとえば、０、１、２、またはそれを超える標識フィーチャーを含みうる。他の選択肢として、サンプルに接触したアレイの領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える標識フィーチャーを含みうる。いくつかの実施形態では、サンプルに接触したアレイの領域は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれを超える標識フィーチャーを含みうる。高密度アレイでは、サンプルに接触したアレイの領域は、１００超の標識フィーチャー、１，０００超の標識フィーチャー、１０，０００超の標識フィーチャー、１００，０００超の標識フィーチャー、または１，０００，０００超の標識フィーチャーを含みうる。
【００４１】
光学機器
本明細書に記載本方法、システム、およびプラットフォームは、アレイの１つ以上の領域の有限共役デジタルイメージングに使用される光学機器を含みうる。この場合、機器は、典型的には、照明システム、イメージングシステム、および並進ステージを含む。いくつかの実施形態では、機器は、１未満の倍率を有する「マクロスコープ」として動作する。他の実施形態では、機器は、１超の倍率を有する「ミクロスコープ」として動作する。さらに他の実施形態では、機器は、１に等しい倍率を有する「コンタクトイメージャー」として動作する。倍率の選択は、典型的には、対象領域を画像化するのに必要な視野およびイメージセンサーのサイズに依存するであろう。
【００４２】
限定されるものではないが、例として、アレイの領域が１６ウェル顕微鏡スライドの単一ウェルを含むか、またはガラス底９６ウェルプレートの単一ウェルを含む場合、画像化される領域の寸法は約７ｍｍ×７ｍｍでありうると共に、ピッチ（アレイの２つの隣接する領域間の中心間距離）は約９ｍｍでありうる。いくつかの実施形態では、光学機器は、一度に１つのウェルの画像、または２つの隣接するウェルの画像を同時に、または４（２×２）の隣接するウェルの画像を同時に取り込むように使用されうると共に、それに応じて、必要な視野または画像化領域を調節しうる。同様に、光学機器は、６（３×２もしくは２×３）、８（４×２もしくは２×４）、９（３×３）、１０（５×２もしくは５×２）、または１２（６×２、４×３、３×４、もしくは２×６）の隣接するウェルの画像を同時に生成しうる。
【００４３】
限定されるものではないが、他の例として、アレイの領域がガラス底３８６ウェルプレートの単一ウェルである場合、画像化される領域の寸法は約３ｍｍ×３ｍｍでありうると共に、アレイの２つの隣接する領域間のピッチは約４．５ｍｍでありうる。この場合も、いくつかの実施形態では、光学機器は、一度に１つのウェルの画像、または２つの隣接するウェルの画像を同時に、取り込むために使用されてもよい、または４（２×２）、６（３×２もしくは２×３）、８（４×２もしくは２×４）、１２（４×３もしくは３×４）、または１６（４×４）の隣接するウェルの画像を同時に取り込むように使用されうる。
【００４４】
限定されるものではないが、他の例として、光学機器は、高密度オリゴヌクレオチドアレイ、たとえば、１平方ミリメートル当たり１，０００超のフィーチャーを有するアレイを画像化するために使用されうると共に、たとえば、アレイ上の領域は、約１ｍｍ×１ｍｍの領域でありうる。
【００４５】
イメージングシステム
光学機器の主要素の１つは、イメージングシステムである。イメージングシステムは、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラの他に１つ以上のレンズを含みうる。典型的には、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラは、数十万〜数百万ピクセルの解像度を有するであろう。高解像度カメラは、何千万以上のピクセルを有しうる。
【００４６】
イメージングシステムは、アレイの画像を拡大するように構成されうる。イメージングシステムの必要な倍率は、必要な視野およびＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサーのサイズにより決定可能である。限定されるものではないが、例として、光学機器が１６ウェル顕微鏡スライドの２つの隣接するウェルの画像を同時に取り込むために使用される場合、必要な視野は約１６ｍｍ×８ｍｍである。ＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサーの感光性領域が約４．８ｍｍ×３．６ｍｍである場合、機器はマクロスコープであり、約０．３の倍率が必要とされる。この場合、センサーの中央の４．８ｍｍ×２．４ｍｍのデータのみが使用されるであろう。
【００４７】
限定されるものではないが、例として、０．３の倍率を有する適切なイメージングシステムは、８５ｍｍの焦点距離を有する色消し接合二重レンズおよび２５ｍｍの焦点距離を有する無限共役カメラレンズを用いて構築されうる。スペクトル選択発光フィルターを使用する場合（たとえば、シングルバンド干渉フィルター、マルチバンド干渉フィルター、ロングパス干渉フィルター、またはロングパス色ガラスフィルター）、このフィルターは、典型的には、色消し接合二重レンズとカメラレンズとの間に位置決めされる。０．３の倍率を有するイメージングシステムのさらなる構成が可能である。たとえば、色消し接合二重レンズは省略可能であり、無限共役カメラレンズの代わりに有限共役カメラレンズを使用することが可能である。この場合、スペクトル選択発光フィルターは、好ましくは、カメラレンズの長共役側に位置決めされる。
【００４８】
４．８ｍｍ×３．６ｍｍの感光性領域を有するセンサーは、１／３インチフォーマットセンサーとして知られる。異なるサイズのセンサーを使用する場合、必要とされる倍率は異なるであろう。限定されるものではないが、例として、必要とされる視野が１６ｍｍ×８ｍｍであり、かつ６．４ｍｍ×４．８ｍｍ感光性領域を有するセンサー（１／２インチフォーマットセンサーとして知られる）を使用する場合、必要とされる倍率は０．４である。０．４の倍率を有する適切なイメージングシステムは、たとえば、８５ｍｍの焦点距離を有する色消し接合二重レンズおよび３５ｍｍの焦点距離を有する無限共役カメラレンズを用いて構築可能である。
【００４９】
限定されるものではないが、他の例として、領域の寸法が約０．６６ｍｍ×０．６６ｍｍであり、かつ８．８ｍｍ×６．６ｍｍの感光性領域を有するセンサー（２／３インチフォーマットセンサーとして知られる）を使用する場合、機器はミクロスコープであり、必要とされる倍率は約１０である。この場合、センサーの中央の６．６ｍｍ×６．６ｍｍのデータのみが使用されるであろう。１０の倍率を有する適切なイメージングシステムは、たとえば、スペクトル選択発光フィルターを典型的には顕微鏡対物レンズとチューブレンズとの間に配置して、２０ｍｍの焦点距離を有する無限共役顕微鏡対物レンズおよび２００ｍｍの焦点距離を有する顕微鏡チューブレンズを用いて構築可能である。他の選択肢として、有限共役１０×顕微鏡対物レンズを使用することが可能であり、かつ顕微鏡チューブレンズを省略することが可能である。この場合、スペクトル選択発光フィルターを顕微鏡対物レンズの長共役側に位置決めすることが可能である。
【００５０】
必ずしもカメラレンズまたは顕微鏡対物レンズのいずれかを含むとはかぎらない既製光学エレメントとカスタム光学エレメントとの組合せを用いて、必要とされる任意の倍率のイメージングシステムを構築することが可能である。光学エレメントは、球状、平面状、非球状、または回折性の表面の種々の組合せを有しうる。
【００５１】
照明システム
光学機器の他の主要素は照明システムである。照明システムの目的は、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラの視野内のアレイを照明することである。エッジ効果および不整合に対する感受性を低減するために、照明領域をカメラの視野よりもわずかに大きくすることが望まれうる。限定されるものではないが、例として、視野が約１６ｍｍ×８ｍｍである場合、適正な照明領域は約１８ｍｍ×１０ｍｍでありうる。照明のタイプは、アッベ照明であるか、ケーラー照明であるか、またはアッベ照明でもケーラー照明でもない。アッベ照明およびケーラー照明は周知であり、たとえば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １４  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＰＩＥ  Ｐｒｅｓｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，２００８に記載されている。
【００５２】
いくつかの実施形態では、オフアクシス照明のための照明システムが使用されうる。他の実施形態では、透過照明または落射照明のための照明システムが使用されうる。オフアクシス照明または透過照明のために照明システムが使用される場合、照明システムおよびイメージングシステムは、共有光学要素を有することなく互いに分離される。落射照明のために照明システムが使用される場合、照明システムおよびイメージングシステムは、ビームスプリッターおよびおそらく１つ以上のレンズを共有しうる。ビームスプリッターは、プレートビームスプリッターまたはキューブビームスプリッターでありうる。蛍光イメージングのために光学機器が使用される場合、ビームスプリッターは、典型的には、シングルエッジまたはマルチエッジのロングパスダイクロイックビームスプリッターである。
【００５３】
多くの場合、照明システムは、照明領域がＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラにより画像化される領域と同一の形状を有するように、正方形または長方形のアパーチャーを含有しうる。いくつかの実施形態では、オフアクシス照明が使用される場合、アパーチャーは、正方形または長方形の代わりに台形の形状でありうる。オフアクシス照明システムは、シャインプルーフ条件を満たすものまたは満たさないものでありうる。シャインプルーフ条件は、たとえば、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｗａｒｒｅｎ  Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９９０に記載されている。
【００５４】
いくつかの実施形態では、照明システムは、次のもの、すなわち、球面レンズ、非球面レンズ、長方形もしくは台形の断面を有するソリッドホモジナイズロッド、長方形もしくは台形の断面を有する中空ホモジナイズ光トンネル、マイクロレンズアレイもしくは一対のマイクロレンズアレイ、固定もしくは回転ディフューザー、複合放物面コンセントレーター、複合放物面コンセントレーター以外の非画像化光学エレメント（たとえば、フリーフォーム反射屈折エレメント）、光ファイバー、ファイバーバンドル、または液体光ガイドの１つ以上を含みうる。
【００５５】
照明システムは、限定されるものではないが、１つ以上のＬＥＤ、１つ以上のレーザー、キセノンアークランプ、金属ハロゲン化物ランプ、もしくは白熱ランプ、またはそれらの組合せを含む群から選択される１つ以上の光源を含有しうる。照明システムはまた、限定されるものではないが、シングルバンド干渉フィルター、マルチバンド干渉フィルター、またはショートパス干渉フィルターを含むリストから選択されるスペクトル選択励起フィルターを含有しうる。照明システムが２つ以上の光源を含有する場合、それらは、同一でありうるか（限定されるものではないが、例として、回路ボード上に互いにできるかぎり近くに実装されたＣｙ３色素励起用の約５２５ｎｍのピーク発光波長を有する２つ以上ＬＥＤ）、または異なりうる（限定されるものではないが、例として、回路ボード上に互いにできるかぎり近くに実装された、Ｃｙ３色素励起用の約５２５ｎｍのピーク励起波長を有するＬＥＤ、およびＣｙ５色素励起用の約６２５ｎｍのピーク励起波長を有するＬＥＤ）。二色ＬＥＤアセンブリーまたは多色ＬＥＤアセンブリーは、たとえば、ＬＥＤ  Ｅｎｇｉｎ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手可能である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、照明システムの光源は電子的に制御されうる。限定されるものではないが、例として、光源は、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラが露光を開始するときに光源がオンになり、かつカメラが露光を終了するときにオフになるように、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラと同期されうる。照明システムが２つ以上の光源を含有する場合、それらは、任意選択で一緒にまたは互いに独立して制御されうる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、光源は、連続的にオンのままでありうる。この場合、照明システムは電子制御シャッターを含有しうると共に、シャッターは、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラが露光を開始するときにシャッターが開き、かつカメラが露光を終了するときに閉じるように、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラと同期されうる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、光学機器は、単一の照明システムを含有しうる。他の実施形態では、機器は、同一の２つ以上の照明システムを含有しうる。さらに他の実施形態では、機器は、異なる２つ以上の照明システムを含有しうる。たとえば、限定されるものではないが、Ｃｙ３およびＣｙ５からの蛍光を検出するための光学機器は、Ｃｙ３励起用の１つの照明システムおよびＣｙ５励起用の他の照明システムを含有しうるか、またはＣｙ３およびＣｙ５励起の両方に使用される単一の照明システムを含有しうる。
【００５９】
並進ステージ
光学機器のさらに他の主要素は、１つ以上の並進ステージでありうる。並進ステージの１つの目的は、サンプルホルダーをイメージングシステムの視野内または視野外の移動させることでありうる。並進ステージシステムの他の目的は、できる限り最良の画像を得るために、イメージングシステム、イメージングシステムの要素、照明システム、または照明システムの要素を、サンプルに対してまたは互いに、移動させることでありうる。
【００６０】
このたび開示されたシステムの多くの実施形態では、並進ステージは、サンプルホルダーをさらに含みうる。限定されるものではないが、たとえば、１６ウェル顕微鏡スライドの画像を取り込むために光学機器が使用される場合、並進ステージはスライドホルダーを含有する。９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートの画像を取り込むために光学機器が使用される場合、それはプレートホルダーを含有する。スライドホルダー、プレートホルダー、または他のアレイ支持ホルダーは、当業者に公知のさまざまな方法のいずれかにより並進ステージシステム上に取り付けられうる。
【００６１】
並進ステージは１つ以上の運動軸を有しうる。限定されるものではないが、例として、支持体が１６ウェル顕微鏡スライドであり、かつ機器が２つの隣接するウェルの画像を同時に取り込む場合、１つの運動軸で十分でありうる。限定されるものではないが、他の例として、支持体が９６ウェルプレートであり、かつ機器が２つの隣接するウェルの画像を同時に次いで取り込む場合、少なくとも２運動軸が必要とされるであろう。焦点および傾斜の調整のためのさらなる運動軸もまた、追加されうる。機器が１回の露光で支持体中のすべての領域の画像を取込み可能である場合、並進ステージは光学機器のいくつかの実施形態では省略されうる。
【００６２】
ハウジング
本明細書に記載のシステムおよびデバイスは、デバイスのセンサーによる適切なシグナルの検出を確保するためのフィーチャーを含みうる。たとえば、システムおよびデバイスは、遮光フィーチャーを含みうる。遮光フィーチャーは、一般的には、意図されないシグナルが感光性センサーに達するのを低減する。多くの実施形態では、イメージングシステム、照明システム、並進ステージ、および機器の他の要素の１つ以上は、ハウジングに囲まれる。ハウジングは不透明でありうる。ハウジングは、いくつかの場合、ファラデーケージとして作用可能である。いくつかの場合、システムを遮光するのに単一のハウジングで十分である。単一のハウジングはまた、システムの外部保護を提供可能である。他の選択肢として、複数のハウジングは、機器の１つ以上の要素を個別に含有しうる。いくつかの場合、ハウジングはネステッドハウジングである。種々の実施形態では、ハウジングは、気密および／または液密でありうる。
【００６３】
ハウジングは、ハウジングの内側を遮光可能なアクセスポイントを有しうる。
アクセスポイントは、ハウジング内のセンサーに関連するスペクトルの光を吸収する材料を含みうる（たとえば、可視スペクトル域のバンタブラック）。アクセスポイントは、クロージャーデバイスを含みうる。クロージャーデバイスは不透明でありうる。クロージャーデバイスは、たとえば、ドアでありうる。クロージャーデバイスは、閉位置で実質的に光密でありうる。クロージャーは閉位置で光密でありうる。
【００６４】
クロージャーデバイスは、たとえば、１６ウェルスライド、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または他のアレイ支持体の挿入および取出しのために開放可能である。センサー（たとえば、フォトインターラプター）は、クロージャーデバイスが開状態であるかまたは閉状態であるか決定するために使用されうる。機器のソフトウェアまたはエレクトロニックハードウェアは、クロージャーデバイスが開状態のときに照明システムの光源がオンになるのを防止したり、イメージセンサーに力が加わるのを防止したり、および／またはクロージャーデバイスが開状態のときに並進ステージが移動するのを防止したりしうる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ハウジングは、図１０〜１３に例示されるように、クロージャーデバイスの自動開閉のための機構をさらに含みうる。クロージャーデバイスは、ハウジングの内部へのアクセスを提供可能である。クロージャーデバイスは、アレイを機器にロードしたり機器から取り出したりするアクセスを提供可能である。この動作は自動で行うことが可能である。いくつかの場合、クロージャーデバイスは、イメージング時には周囲光を排除可能であり、一方、開状態では確実なローディングを可能にする。
【００６６】
いくつかの場合、クロージャーデバイスはピボット部を含まない。いくつかの場合、クロージャーデバイスはピボット部ともラッチとも相互作用しない。開示されたシステムおよびプラットフォームのいくつかの実施形態では、クロージャーデバイスはマグネットによりハウジングに保持される。マグネットは、閉位置でクロージャーデバイスをハウジングに保持可能である。マグネットは、開位置でクロージャーデバイスをローディングデバイス（たとえばトレイ）に保持可能である。開位置から閉位置への移行時、クロージャーデバイスは、主に磁気的にローディングデバイスに装着された状態から主に磁気的にハウジングに装着された状態に移行可能である。閉位置から開位置への移行時、クロージャーデバイスは、主に磁気的にハウジングに装着された状態から主に磁気的にローディングデバイスに装着された状態に移行可能である。いくつかの場合、開状態と閉状態との間の移行は、磁気的に不安定であり、かかる不安定性は、移行状態からより安定な開位置または閉位置のいずれかへのクロージャーデバイスの移動を引き起こす。
【００６７】
クロージャーデバイスは、ドア上のコニカルフィーチャーにより提供される自己位置決め機能を含みうる。嵌合対の各側でマグネットを支持する部分の厚さおよびそれらの部分内にポケットを保持する深さは、各嵌合対のマグネットの間隔ひいては保持力を規定する。設計ジオメトリーをモーターのパワーに一致させて、高いモータートルクを必要とすることなく十分な保持する力を提供するようにする。さらに、システムは、モーターの電流および速度（つまりトルク）を制御して性能を改善しかつ安全上の問題の発生を回避するように設計される。図１０に示されように、アレイアセンブリーのローディングのためにトレイを外向き移動させる場合、４つのマグネット対のうちの２つを用いてサンプルトレイの前面にドアを一時的に保持する。トレイを内向きに移動させた後（およびプロセス時に他方の２つのマグネット対を分離した後）、他方の２つのマグネット対を用いてドアを前面パネルに対して閉状態に保持する。マグネットのそれぞれの割付けは図１１Ａに示される。ステージの前面の嵌合マグネットは図１２に示される。前面パネルの嵌合マグネットの位置は図１３に示される。安全な掴持（したがって信頼性のある動作）を提供するために、希土類マグネットにより高強度を提供する（たとえば、ネオジムマグネット）。設計のいくつかの実施形態は、軸に平行な磁場を用いて直径約８ｍｍおよび厚さ３ｍｍのディスクマグネットを必要とする。いくつかの実施形態では、各対の一方のマグネットをより弱いマグネットまたは鉄もしくは軟鋼などの磁性材料片で置き換えても十分である。
【００６８】
本明細書に開示されたシステムおよびプラットフォームのいくつかの実施形態では、１つ以上の機器コンパートメントに自動ドアまたはリッドクロージャーを提供する機構が提供され、機構は、（ａ）クロージャーと、（ｂ）クロージャーを第１の位置に磁気的に保持するハウジングと、（ｃ）クロージャーを第２の位置に磁気的に保持する並進ステージとを含む。ある実施形態では、機構は、クロージャーとハウジングとの間に位置決めされたガスケットをさらに含む。機構のいくつかの実施形態では、ガスケットはクロージャーに装着される。他の実施形態では、ガスケットはハウジングに装着される。いくつかの実施形態では、クロージャーおよびハウジングは実質的に不透明であり、かつガスケットは、第１の位置でクロージャーとハウジングとの間に実質的に光密シールを形成する。機構のいくつかの実施形態では、１つ以上のマグネットは、第１の位置でクロージャーをハウジング上に保持するように位置決めされる。機構のいくつかの実施形態では、１つ以上のマグネットは、第２の位置でクロージャーを並進ステージの第１の表面上に保持するように位置決めされる。いくつかの実施形態では、機構は、第２の位置でクロージャーを並進ステージに整合させる２対以上の嵌合位置決めフィーチャーをさらに含む。いくつかの実施形態では、機構は、第１の位置でクロージャーをハウジングに整合させる２対以上の嵌合位置決めフィーチャーをさらに含む。機構のいくつかの実施形態では、対をなす嵌合位置決めフィーチャーは、コニカルピンおよびコニカルホールを含む。いくつかの実施形態では、ハウジングは光学機器を含む。いくつかの実施形態では、並進ステージはサンプルホルダーを含む。いくつかの実施形態では、サンプルホルダーは、顕微鏡スライド、マイクロアレイ、またはマイクロウェルプレートを保持するように設計される。いくつかの実施形態では、クロージャーは蝶着されない。いくつかの実施形態では、クロージャーは、ネジまたはクリップなどのファスナーを用いてハウジングまたは並進ステージのいずれにも装着されない。いくつかの実施形態では、クロージャーは、接着剤を用いてハウジングまたは並進ステージのいずれにも装着されない。
【００６９】
画像データ
アレイ上の１つ以上の標識フィーチャーをカウントするための本明細書に記載の方法、システム、およびプラットフォームは、データ入力またはその使用を含みうる。データ入力は、アレイの１つ以上の領域のイメージング情報および／または画像を含みうる。画像はピクセルデータを含み、ピクセルデータの各ユニットは、限定されるものではないが、たとえば、４、８、１２、１４、１６、３２、６４、１２８、２５６、またはそれを超えるビットによりコードされうる。画像はアレイの１つ以上の領域を包含しうる。画像の空間解像度は、光学機器の空間解像度により決定されうるが、開示された方法およびシステムのいくつかの実施形態では、空間解像度は、限定されるものではないが、たとえば、補間、推定、モデリング、および／または変換に基づいて、デジタル画像処理スキームにより向上させうる。
【００７０】
アレイ上の１つ以上の標識フィーチャーをカウントするための本明細書に記載の方法、システム、およびプラットフォームは、アレイ上の１つ、２つ、またはそれを超える個別の領域の画像の取得および解析を含みうる。いくつかの実施形態では、画像化された２つ以上の領域は、オーバーラップするか、部分的にオーバーラップするか、またはまったくオーバーラップしない。さらに、画像化された２つ以上の領域は隣接または非隣接でありうる。
【００７１】
アレイ上の１つ以上の標識フィーチャーをカウントするための本明細書に記載の方法、ソフトウェア、システム、およびプラットフォームは、アレイの全部または一部の画像の取得および解析を含みうる。いくつかの実施形態では、画像化されるアレイの領域は、アレイの全領域の少なくとも約１％を含みうる。いくつかの実施形態では、画像化されるアレイの領域は、アレイの全領域の少なくとも約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれを超える割合を含みうる。他の実施形態では、画像化されるアレイの領域は、アレイの全領域の少なくとも約１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、またはそれを超える割合を含みうる。さらに他の実施形態では、画像化されるアレイの領域は、アレイの全領域の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、またはそれを超える割合を含みうる。いくつかの実施形態では、画像化されるアレイの領域は、アレイの全領域の少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、またはそれを超える割合を含みうる。
【００７２】
アレイ上の１つ以上の標識フィーチャーをカウントするための本明細書に記載の方法、ソフトウェア、システム、およびプラットフォームは、アレイのフィーチャーの全部または一部の画像の取得および解析を含みうる。いくつかの実施形態では、画像は、アレイ上のフィーチャーの全数の１０％〜１００％を包含しうる。いくつかの実施形態では、画像は、アレイ上のフィーチャーの全数の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を包含しうる。いくつかの実施形態では、画像は、アレイ上のフィーチャーの全数の多くとも９５％、多くとも９０％、多くとも８０％、多くとも７０％、多くとも６０％、多くとも５０％、多くとも４０％、多くとも３０％、多くとも２０％、より１０％、または多くとも５％を包含しうる。画像に包含されるフィーチャーの数は、これらの値のいずれかにより境界付けられる任意の範囲内に含まれうる（たとえば、アレイのフィーチャーの全数の約１５％〜約９０％）。
【００７３】
画像取得
本明細書に記載の方法、システム、およびプラットフォームは、光学機器から画像を取得するためのソフトウェアを含む。いくつかの実施形態では、たとえば、２つ以上のイメージセンサーを含む光学機器で、画像取得は平行モードで動作しうる。すなわち、２つ以上の画像が同時に取得される。他の選択肢として、画像取得は、２つ以上画像が逐次取得される順モードで動作しうる。一般的には、画像取得は、連続方式（すなわち、画像は、１回の露光時間内に取得される）または間欠方式（すなわち、画像は、不連続方式で、たとえば、２つ以上の個別の露光時間を用いて取得され、いくつかの実施形態では、シグナル平均化目的で２つ以上の画像が組み合わされる）で行われうる。
【００７４】
限定されるものではないが、例として、アレイは、１６のウェルを含みうると共に、画像は、各ウェルに対して生成される。画像取得モジュールは、逐次的に１６の画像を読み取りうる。１６の画像の読取りは、連続時間で終了可能であるか、またはシステムは、第１の画像の読取り、続いて第１の画像の解析を行い、次いで、１６番目の画像が解析されるまで、画像の読取りおよび画像の解析の手順を繰り返す。他の選択肢として、画像取得モジュールは、一度に一対の画像の読取りを行い、１６の画像すべてが取得されるまで読取りを繰り返しうる。１６の画像は、単一の時間で逐次的に読み取られうる。いくつかの用途では、一対の画像の読取りの直後に画像解析を行いうる。
【００７５】
画像解析
一般的には、画像の処理および解析を行う目的の１つは、シグナル対ノイズ比および定量を改善することである。理想的なアレイ実験では、結合された標的分子および／または標識を含む標識フィーチャーは、画像化時、均一な非飽和シグナルレベルを生成し、非標識フィーチャーは、ゼロに近いシグナルレベルを有して均一に暗色で現れるであろう。実際には、限定されるものではないが、迷光、バックグラウンド蛍光（蛍光に基づくイメージングの場合）、粒子状汚染物質、およびアッセイ成分の非特異的結合手順を含めて、機器および／またはアッセイの問題に起因するさまざまなアーチファクトが生成されうるため、定量的シグナル強度データを抽出してアレイのどのフィーチャーが標識されたかの確定的なコールを生成する能力が妨害される。したがって、本明細書に開示された方法、システム、およびプラットフォームは、限定されるものではないが、フィーチャー位置決定、画像配置補正、バックグラウンド補正、強度測定、データスケーリング、データ閾値化、およびデータ解析機能を含めて、さまざまな画像処理タスクを行うためのソフトウェアを含みうる。
【００７６】
画像配置およびフィーチャー位置決定。いくつかの実施形態では、アレイのデザインに組み込まれた基準フィーチャーを用いて、カスタム画像解析ソフトウェアにより、画像の配置およびフィーチャーの位置決定を自動で行う。限定されるものではないが、例として、図１５および１６に示されるマイクロアレイパターンは、フィーチャーの３２×３２アレイからなり、上端および下端の行の基準フィーチャーは、デジタル画像中のアレイの位置決定を可能にする。基準フィーチャーは、典型的には、配置を容易に同定可能な非対称パターンで配列される。たとえば、図１６に示されるように、アレイのフィーチャーの上端の行に位置決めされた基準フィーチャーは、行の左端および右端が非対称な特有のパターンを含みうると共に、下端の行の基準フィーチャーのパターンは、典型的には、上端の行のものとは異なる。これにより、アレイの不適正な配置を手動および自動で容易に同定可能になり、さらにはイメージングの問題を容易に検出可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示された方法、システム、およびプラットフォームで使用するように設計されたアレイの特定の実施形態について図１４に示されるように、画像はまた、画像の出現配置が、目視参照配置として参照されることが多いユーザーにより観察される配置に対応するように変換されうる。
【００７７】
フィーチャー位置の精密化。いくつかの実施形態では、アレイ作製誤差を補うように各フィーチャーの測定位置を精密化することにより、いくつかの画像ピクセルのオフセットを生成可能である。初期画像配置およびフィーチャー位置決定工程で得られたフィーチャーの位置を用いて、アレイまたはアレイ領域を解析ウィンドウに細区画しうる。たとえば、アレイを３２×３２解析ウィンドウに分割しうる。この場合、各解析ウィンドウは、図１９に示されるように、各フィーチャーを中心として１２×１２ピクセルの画像領域を含む。使用される解析ウィンドウのサイズは、アレイ上のフィーチャーのサイズに依存し、アレイ上のフィーチャーおよびバックグラウンド領域の位置を適正に決定しかつ識別するのに必要な任意のサイズでありうる。限定されるものではないが、たとえば、解析ウィンドウは、アレイフィーチャーを中心として５×５、７×７、９×９、１５×１５、５１×５１、または１０１×１０１ピクセル領域として規定されうる。ウィンドウ内のフィーチャーの位置は、解析ウィンドウ内のピクセルのシグナル強度分布およびクラスタリングに基づいて決定されうる。フィーチャーの精密化位置は、完全直線状のグリッドにより予測された部位から座標ＸおよびＹでオフセットとして計算される。いくつかの実施形態では、ダストなどの欠陥に起因するフィーチャー位置の歪みは、同一の基材上の異なるアレイ間のプリントアーチファクト間の相関により回避される。プリントアーチファクトは典型的には一貫性があるまで、仮説の直線状グリッドに対する補正もまたはそれ、一貫性がある。所与のフィーチャーのフィーチャー位置最適化結果を解析されるアレイのすべてにわたり組み合わせて、中央値オフセットを後続の解析に用いると、最終実験結果のノイズが大幅に減少する。
【００７８】
局所バックグラウンド補正。フィーチャーピクセルセット「Ｓ」およびバックグラウンドピクセルセット「Ｂ」がアレイ中の各位置に対して規定されたら（たとえば図２０参照）、局所バックグラウンドは、シグナル強度およびバックグラウンド強度の統計量を含む計算により除去される。局所バックグラウンド補正計算に使用するのに好適なシグナルおよびバックグラウンドの強度統計量の例としては、平均値、中央値か、シグナル対バックグラウンドの比が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、以上に記載したように行われたフィーチャー位置精密化の後、解析ウィンドウ内のピクセルは、シグナルおよびバックグラウンドの強度統計量の後続の計算で、シグナルピクセル、バックグラウンドピクセル、または移行ピクセル、すなわち無視されるピクセルに割り当てられる（図２０参照）。開示された方法のいくつかの実施形態では、局所バックグラウンド補正は、限定されるものではないが、以下の実施例に示されるように、対数空間での引き算、すなわち、シグナル対バックグラウンド比の計算によく関連付けられた計算により行われる。規定のフィーチャーおよびバックグラウンド領域に対する１６ビットピクセルデータ測定を考慮して、次に、シグナルピクセルに対する単一の値
【数１】
2017504307.tif 000003
およびバックグラウンドピクセルに対する値
【数２】
2017504307.tif 000004
をそれぞれ計算する。１つの有用な統計量は、ピクセルの各セットに対する中央値である。すなわち
【数３】
2017504307.tif 000005
＝ピクセル「Ｓ」のセットに対するピクセル値の中央値
【数４】
2017504307.tif 000006
＝ピクセル「Ｂ」のセットに対するピクセル値の中央値
【００７９】
この状況で、値のセットの平均値またはセット内の指定百分位などの種々の他の統計量を使用可能である。
【数５】
2017504307.tif 000007
および
【数６】
2017504307.tif 000008
の両方に対して同一の統計量を使用する必要はなく、最適でないこともある。たとえば、以下のものを用いて、「オン」および「オフ」のデータ点間で低いデータノイズおよび強力な分離を得ることが可能である。
【数７】
2017504307.tif 000009
＝ピクセル「Ｓ」のセットに対するピクセル値の中央値、および
【数８】
2017504307.tif 000010
＝ピクセル「Ｂ」のセットに対するピクセル値の２５パーセンタイル
【００８０】
さらなる強調点として、使用される特定の百分位は、設定ファイルにあらかじめ記憶されたパラメーターおよびそれに記憶された再設定可能なパラメーターでありうる。
【００８１】
各スポットに対するバックグラウンド補正強度統計量は以下のとおりである。
【数９】
2017504307.tif 000011
【００８２】
強度データの散布図（強度統計量対フィーチャー数）およびヒストグラムの実施例を図２１に示す。この実施例では、バックグラウンドは、強度メトリックが
【数１０】
2017504307.tif 000012
と
【数１１】
2017504307.tif 000013
との比に関連付けられるように対数の引き算を行うことによりを補正される。いくつかの状況で、線形の引き算（たとえば、
【数１２】
2017504307.tif 000014
）が好ましい。フィーチャーの完全セットに対してバックグラウンド補正強度統計量が計算されたら、その次のタスクは、どのフィーチャーが標識されているか（すなわち「オン」または「陽性」）、どれが非標識であるか（すなわち「オフ」または「陰性」）を決定することである。これは、局所バックグラウンド補正フィーチャー強度の統計解析に基づいてシグナル強度閾値を決定してから、どの程度多くのフィーチャーｋが、この閾値レベルよりも大きいバックグラウンド補正シグナル強度を有するかをカウントすることにより、達成される。本実験のデータを解析して閾値を決定することにより、機器ドリフトおよびアッセイ手順変動などの因子に起因する潜在的誤差を排除するという点で、シグナル強度閾値は、「動的」シグナル強度閾値と考えられうる。
【００８３】
動的シグナル強度閾値の決定。本明細書に開示された方法、システム、およびプラットフォームの多くの実施形態では、動的シグナル強度閾値は、フィーチャーの完全セットに対するバックグラウンド補正シグナル強度データの１つ以上の統計解析を行うことによりアレイの１つ以上の領域に対して決定される。限定されるものではないが、ｋ平均クラスタリング、ｋメドイドクラスタリング、混合モデル統計解析、プローブ参照分布法、またはバックグラウンド補正シグナル強度値のソーティング、バックグラウンド補正シグナル強度値のペアワイズ差のソーティングに基づく経験的解析などを含めて、さまざまな統計的（または経験的）分析技術のいずれかを使用しうる。いくつかの実施形態では、解析の品質を改善することにより、開示された方法の定量的側面を改善するために、複数の解析ウィンドウにわたり、複数のアレイ領域にわたり、または指定の時間にわたり、またはそれらの組合せにわたり、収集された空間的および／または時間的情報を解析に利用しうる。いくつかの実施形態では、限定されるものではないが、たとえば、プローブの位置決定、頻繁に起こるアーチファクトパターン、あらかじめ得られている結果、文献報告、アレイ製造業者の提案、ヒトの知識、および／またはヒトガイダンスを含めて、他の情報源もまた解析に組み込みうる。
【００８４】
限定されるものではないが、閾値決定の例として、開示された方法のいくつかの実施形態では、バックグラウンド補正シグナル強度閾値は、経験的手法を用いて決定されうる（たとえば、「Ｅ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ」法、図２２参照）。この場合、アレイフィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度データは、セットＩ＝｛Ｉｉ｝を構成する。セットＩを昇順にソートして、順序付けられた補正シグナル強度値のセットｚ＝｛ｚｉ｝＝｛Ｓｏｒｔ［ｙｉ］｝を得る。次に、各ソートされたアレイ値間の差を計算して、ｄ＝｛ｄ１，ｄ２，ｄｉ，．．．，ｄｍ｝（式中、ｄｉ＝ｚｉ＋１−ｚｉ）を得る。次いで、幅ｗの「ウィンドウ」を用いて強度差を平滑化し、平滑化ソートアレイｓを生成する。
【数１３】
2017504307.tif 000015
【００８５】
閾値は、平滑化ソートデータの傾きが最も急である点Ｔである（図２１参照）。
Ｔ＝ｍａｘ（ｓｊ）
【００８６】
「オン」（または標識）であるフィーチャーの数ｋは以下のとおりである。
【数１４】
2017504307.tif 000016
【００８７】
限定されるものではないが、閾値決定の他の例として、いくつかの実施形態では、バックグラウンド補正シグナル強度閾値をさらに２つ以上の仮定分布（すなわち「混合モデル」法）に当てはめることにより、バックグラウンド補正フィーチャー強度データを決定しうる。この場合、仮定分布は、正規分布、一様分布などを含む。混合モデル法は、陽性フィーチャー強度がより高い平均シグナル強度を有する陽性フィーチャー分布から生成され、かつ陰性フィーチャー強度は、より低い平均シグナル強度を有する陰性フィーチャー分布から生成されると仮定することにより、本質的に、データを生成した根底にあるプロセスをモデリングする。この方法は、その他に、各分布により生成されたフィーチャー強度の多様性をモデリングする。それは、陰性フィーチャー強度がかなり変動の低い傾向があり、一方、陽性フィーチャー強度がかなり変動の高い傾向がある場合に有用でありうる。分布の選択は、バックグラウンド補正フィーチャー強度ヒストグラムのデータ曲線の形状により決定される。モデルのパラメーター、たとえば、「オン」および「オフ」のフィーチャーの推定平均強度ならびにそれらの対応する分散は、期待値最大化アルゴリズムなどの方法を用いてデータから推定される。
【００８８】
限定されるものではないが、閾値決定の他の例として、いくつかの実施形態では、バックグラウンド補正シグナル強度閾値は、バックグラウンド補正フィーチャー強度データを３つの仮定分布（すなわち、「３成分モデル」法）を含むモデル関数に当てはめることにより決定される。この場合、仮定分布は、「オフ」スポットに対する対数正規分布Ｄｉｓｔ１、「オン」スポットに対する正規分布Ｄｉｓｔ２、およびフラットオフセットＦｌａｔＬｅｖｅｌを含む。モデルの調整可能なパラメータートシテは、（ｉ）出発ヒストグラムのビン数、（ｉｉ）Ｄｉｓｔ１振幅、（ｉｉｉ）Ｄｉｓｔ１位置、（ｉｖ）Ｄｉｓｔ１標準偏差、（ｖ）Ｄｉｓｔ２振幅、（ｖｉ）Ｄｉｓｔ２位置、（ｖｉｉ）Ｄｉｓｔ２標準偏差、および（ｖｉｉｉ）ＦｌａｔＬｅｖｅｌが挙げられる。ヒストグラムデータに対する当てはめ実施例は図２３に示されている。限定されるものではないが、フィーチャー強度データをかかる分布に当てはめた後で閾値を決定する方法の一例は、次のとおりである。（ｉ）３成分分布をヒストグラムデータに当てはめること、および（ｉｉ）次の値、すなわち、（１）当てはめられた対数正規分布成分の高強度側が１未満（または比較用の規定パラメーター）に低下する強度ｔｌｏｗ、（２）当てはめられた対数正規分布成分の高強度側が当てはめられたＦｌａｔＬｅｖｅｌ未満に低下する強度ｔｓｕｂｆｌａｔ、（３）当てはめられた対数正規分布成分の高強度側がヒストグラムビンで当てはめられた正規分布の値未満に低下する強度ｔｓｕｂｎｏｒｍを計算して、（４）Ｔ＝ｍｉｎ［ｔｌｏｗ、ｔｓｕｂｆｌａｔ、ｔｓｕｂｎｏｒｍ］を選択することにより、閾値Ｔを設定すること。３成分モデル法を用いて閾値を決定する代替法は、当業者には明らかであろう。モデリングプロセスの速度および信頼性を改善するために、モデルパラメーターの出発値を計算することが有益でありうる。これは、ヒストグラム中のドミナントピークを同定する粗検索などの方法を用いてまたは典型的な過去のデータセットに由来する仮定に基づいて達成可能である。
【００８９】
限定されるものではないが、閾値決定の他の例として、いくつかの実施形態では、バックグラウンド補正シグナル強度閾値は、「Ｐｅａｋ  Ｓｐｌｉｔ  Ｆｉｄｕｃｉａｌｓ」法を用いて決定される。この方法は、低品質のデータによく対処し、次のように記述される。最初に、基準行内の「オン」（標識存在）および「オフ」（標識不在）のフィーチャー間の広がりにより必然的に規定されるスケールを用いて、フィーチャー強度データを高強度群および低強度群に分ける。次いで、各群に対してヒストグラムピーク（任意選択で移動平均フィルターなどの標準的方法を用いてデータを平滑化した後）を見いだす。次いで、低強度群ピークの周りの強度データの広がりを調べることにより閾値を決定する。基準強度の上限および下限を次のように定義する。（ｉ）Ｆｏｆｆ＝［オフ基準物の中央値］、（ｉｉ）Ｆｏｎ＝［オン基準物の中央値］、（ｉｉｉ）Ｆｒａｎｇｅ＝Ｆｏｎ−Ｆｏｆｆ。レベルＳｐｌｉｔｖａｌｕｅ＝Ｆｏｆｆ＋ＰｅａｋＳｐｌｉｔ×Ｆｒａｎｇｅで基準スケールに基づいてデータの初期分割を行う。パラメーターＰｅａｋＳｐｌｉｔはＦｒａｎｇｅのパーセントである。次の２つのピークを見いだす。（ｉ）Ｐｅａｋ１＝Ｓｐｌｉｔｖａｌｕｅ未満の強度のすべてのフィーチャーについてヒストグラムが最大である強度ピーク、（ｉｉ）Ｐｅａｋ２＝Ｓｐｌｉｔｖａｌｕｅ超の強度のすべてのフィーチャーについてヒストグラムが最大である強度ピーク。最低強度〜Ｐｅａｋ１＋ＰｅａｋＯｆｆｓｅｔＦｒａｃｔｉｏｎ×（Ｐｅａｋ２−Ｐｅａｋ１）のすべてのインデックスフィーチャーとして定義されるＰｅａｋ１の近傍のすべてフィーチャーの標準偏差Ｓｔｄｅｖ１を計算する。ここで、ＰｅａｋＯｆｆｓｅｔＦｒａｃｔｉｏｎは、調整可能パラメーターである。閾値をＴｐｓｆおよびＴＬｏｃＭｉｎのうちの小さいほうに設定する。それは次のように計算される。（ｉ）Ｔｐｓｆ＝Ｐｅａｋ１＋ＳｔｄｅｖＭｕｌｔｉｐｌｅ×Ｓｔｄｅｖ１（式中、ＳｔｄｅｖＭｕｌｔｉｐｌｅはパラメーターであり、ＯＲ  ＴＬｏｃＭｉｎ＝Ｐｅａｋ１とＴｐｓｆとの間の平滑化ヒストグラム曲線の最小に対応する強度）。各ピークの周りの広がりを決定するためのさまざまな方法を用いた類似の方法を使用することも可能である。
【００９０】
本明細書に開示された方法およびシステムは、アレイ上の１つ以上の領域内の１つ以上の標識フィーチャーを検出する工程を含みうる。いくつかの実施形態では、領域内の標識フィーチャーを検出する工程は、フィーチャーのバックグラウンド補正シグナル強度と、フィーチャーの完全セットのバックグラウンド補正シグナル強度の統計解析により得られた動的シグナル強度閾値とを比較することを含みうる。所与のフィーチャーのバックグラウンド補正シグナル強度が閾値超である場合、フィーチャーは標識フィーチャーとして分類されうる。他の選択肢として、所与のフィーチャーのバックグラウンド補正シグナル強度が閾値未満である場合、フィーチャーは、非標識として分類されうる。フィーチャーの完全セットの補正シグナル強度データへのバックグラウンド補正シグナル強度閾値の適用は、こうして、デジタル出力へのデータの二値変換を構成し、フィーチャーは、標識（「オン」）またはき非標識（「オフ」）として分類される。この二値変換を達成するために適用しうる解析工程のタイプおよび順序には多くの可能な変形形態が存在することとは、当業者であれば分かるであろう。
【００９１】
サンプル中の標的分子の絶対数の計算。以上に記載したように確率的に標的分子が標識されたサンプル中の標的分子の絶対数は、確率的標識セット中の標識に特異的なプローブを含むフィーチャーセットを含むアレイを用いて決定されうる。標的分子または標識標的分子をアレイにハイブリダイズまたは結合させた後、アレイは、以上に記載したようにイメージングおよび処理が行われ、サンプル中の標的分子の数Ｎは、以下のポアソン分布統計に基づいて標識フィーチャーの数ｋから決定される。
【数１５】
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（式中、ｍはフィーチャーの全数（すなわち、確率的標識のセット中のユニークな標識の全数）である）。
【００９２】
品質メトリック。いくつかの実施形態では、実験の成功の評価に役立つように、データの品質の数値尺度を含むことが有益である。ある実施形態では、この高品質測定は、フィーチャーごとの強度データの統計量に基づきうる。１つの単純な品質測定ＱＳｅｐ１は、単純に、バックグラウンド補正およびスケーリングの後の陽性および陰性のフィーチャー強度の平均の差である。すなわち、ＱＳｅｐ１＝（シグナル強度閾値超の強度を有するフィーチャーの平均強度）−（閾値未満の強度を有するフィーチャーの平均強度）である。いくつかの実施形態では、このメトリックはまた、各分布の標準偏差で平均の差をスケーリングすることにより、たとえば、ＱＳｅｐ２＝ＱＳｅｐ１／（閾値強度未満の強度を有するフィーチャーの強度の標準偏差）により、フィーチャー分布の強度の広がりを取り込みうる。他の高品質測定は、実験データに当てはめられるモデル化分布の分離および幅に基づいて構築可能である。いくつかの実施形態では、品質メトリックに逸脱度測定を使用しうる（図２４）。これは、２つの当てはめられた正規分布間の分離度に基づく計算であり、いくつかの実施形態では、品質メトリックを最大化する値に閾値を設定することにより、経験的に動的強度閾値を決定することが好ましい。
【００９３】
信頼区間。本明細書に開示された方法のいくつかの実施形態では、以上に記載の技術を用いて、サンプル中に検出された標的分子の絶対数の推定値を特定する場合、信頼区間（より完全な説明に関しては、Ｄｕｂｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（８）：ｅ２８７６を参照されたい）を規定することが有益である。確率的標識実験からのＮの推定の９５％信頼区間は、ｍの個別の標識の単一のセットを利用した単一の反応のｋから得ることが可能である。Ｎの９５％信頼区間は、Ｎｌｏｗ〜Ｎｈｉｇｈの範囲内であり、それらは以下のとおりである。
【数１６】
2017504307.tif 000018
【００９４】
２つのサンプル中の標的分子のコピー数の比。頻繁に、研究者は、２つ以上のサンプル中の遺伝子発現レベルの比を計算することにより、異なるサンプル中の遺伝子発現レベルを比較しようとする。以上に記載されているような計算を用いて、かかる比の信頼区間を誘導することが可能である。各サンプル中の標的分子の数は、本明細書に開示された方法、システム、およびプラットフォームを用いて決定される。
【００９５】
レプリケート実験。レプリケート実験を行う利点および関連する不確実性の適正な計算は、図２５に例示されている。レプリケート実験の結果（青色の点）を単純に組み合わせることが可能であるが（青色エラーバー）、レプリケートが標識のより大きいプールを構成するとみなしてポアソン統計から不確実性を計算すると、図に例示されるより小さい緑色エラーバーが得られる。この推定の確度は、レプリケート間の一貫性に依存して変動するであろう。また、レプリケート実験の標識を異なる標識のプールと考える際、数値の単純化が利用される。したがって、開示された方法のいくつかの実施形態では、信頼区間を計算するさまざまな方法は、ｋ／ｍの比が大きいとより適切になろう。
【００９６】
ユーザーインターフェース
本明細書に開示された方法、ソフトウェア、システム、およびプラットフォームは、ユーザーインターフェースまたはその使用を含みうる。ユーザーインターフェースは、ユーザーからの１つ以上の入力を提供しうる。ユーザーインターフェースからの入力は、リアルタイムモードで１つ以上の標識フィーチャーをカウントするための命令を含みうる。ユーザーインターフェースからの入力は、１つ以上の画像から１つ以上のフィーチャーをカウントするための命令を含みうる。１つ以上の画像は保管された画像でありうる。１つ以上の画像はライブで取り込まれた画像でありうる。
【００９７】
異なるプラットフォームオペレーターは、画像を解析するタイミングに関して優先度を有しうる。あるプラットフォームオペレーターは、ライブで画像を取り込みながら画像解析を行うことを望みうる。他のプラットフォームオペレーターは、すべての画像が収集された後、画像解析を行いうる。または、他のプラットフォームオペレーターは、保管された画像のセットで画像解析を行いうる。これらの選択肢は、ユーザーインターフェースへの入力を介して選択されうる。
【００９８】
デジタル処理デバイス
本明細書に開示された方法、ソフトウェア、システム、およびプラットフォームは、デジタル処理デバイスまたはその使用を含みうる。デジタル処理デバイスは、デバイスの機能を実行する１つ以上のハードウェア中央処理ユニット（ＣＰＵ）を含みうる。デジタル処理デバイスは、実行可能な命令を行うように構成されたオペレーティングシステムを含みうる。デジタル処理デバイスは、コンピューターネットワークに接続されうる。デジタル処理デバイスは、ワールドワイドウェブにアクセスするようにインターネットに接続されうる。デジタル処理デバイスは、クラウドコンピューティングインフラに接続されうる。デジタル処理デバイスは、イントラネットに接続されうる。デジタル処理デバイスは、データ記憶装置に接続されうる。
【００９９】
好適なデジタル処理デバイスとしては、サーバコンピューター、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、ノートブックコンピューター、サブノートブックコンピューター、ネットブックコンピューター、ネットパッドコンピューター、セットトップコンピューター、ハンドヘルドコンピューター、インターネット家電、モバイルスマートフォン、タブレットコンピューター、パーソナルデジタルアシスタント、ビデオゲームコンソール、および媒体が挙げられうる。いくつかの場合、スマートフォンは、本明細書に記載のシステムで使用するのに好適でありうる。いくつかの場合、任意選択のコンピューターネットワーク接続を備えたセレクトテレビ、ビデオプレーヤー、およびデジタルミュージックプレーヤーは、本明細書に記載のシステムで使用するのに好適でありうる。好適なタブレットコンピューターは、当業者に公知のブックレット、スレート、およびコンバーチブル構成を有するものを含みうる。
【０１００】
デジタル処理デバイスは、実行可能な命令を行うように構成されたオペレーティングシステムを含みうる。オペレーティングシステムは、プログラムおよびデータを含むソフトウェアでありうると共に、デバイスのハードウェアを管理し、アプリケーションの実行サービスを提供する。好適なサーバーオペレーティングシステムとしては、たとえば、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘサーバー（登録商標）、神託（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｅｌｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）が挙げられうるが、これらに限定されるものではない。好適なパーソナルコンピューターオペレーティングシステムとしては、たとえば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、およびＵＮＩＸ（登録商標）ライクのオペレーティングシステム、たとえば、ＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）が挙げられうるが、これらに限定されるものではない。オペレーティングシステムはクラウドコンピューティングにより提供される。好適なモバイルのスマートフォンオペレーティングシステムとしては、たとえば、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎ  Ｍｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｐｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｍｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、およびＰａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）が挙げられうるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
デジタル処理デバイスは、記憶デバイスおよび／またはメモリーデバイスを含みうる。記憶デバイスおよび／またはメモリーデバイスは、一時的または永久的にデータまたはプログラムを記憶するために使用される物理的装置でありうる。デジタル処理デバイスは、記揮発性メモリーでありうると共に、記憶情報を維持する電力を必要としうる。デジタル処理デバイスは、不揮発性メモリーでありうると共に、デジタル処理デバイスに電力供給されないときに記憶情報を保持しうる。不揮発性メモリーは、フラッシュメモリーを含みうる。不揮発性メモリーは、動的ランダムアクセスメモリー（ＤＲＡＭ）を含みうる。不揮発性メモリーは、強誘電体ランダムアクセスメモリー（ＦＲＡＭ（登録商標））を含みうる。不揮発性メモリーは、相変化ランダムアクセスメモリー（ＰＲＡＭ）を含みうる。記憶デバイスとしては、たとえば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリーデバイス、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングベースの記憶装置が挙げられうる。記憶デバイスおよび／またはメモリーデバイスは、本明細書に開示されたようなデバイスの組合せでありうる。
【０１０２】
デジタル処理デバイスは、ディスプレイを含みうる。ディスプレイは、ユーザーにビジュアル情報を送るために使用されうる。ディスプレイは陰極線管（ＣＲＴ）でありうる。ディスプレイは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）でありうる。ディスプレイは薄膜トランジスター液晶ディスプレイ（ＴＦＴ−ＬＣＤ）でありうる。ディスプレイは有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイでありうる。ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブマトリックスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）、アクティブマトリックスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）ディスプレイでありうる。ディスプレイはプラズマディスプレイでありうる。ディスプレイはビデオプロジェクターでありうる。ディスプレイは本明細書に開示されたようなデバイスの組合せでありうる。
【０１０３】
デジタル処理デバイスは、ユーザーから情報を受信する入力デバイスを含みうる。入力デバイスはキーボードでありうる。入力デバイスは、限定されるものではないが、たとえば、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラー、またはスタイラスをはじめとするポインティングデバイスでありうる。入力デバイスは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンでありうる。入力デバイスは、声または他の音入力を取り込むマイクロフォンでありうる。入力デバイスは、動きまたは視覚的入力を取り込むビデオカメラでありうる。入力デバイスは、本明細書に開示されたようなデバイスの組合せでありうる。
【０１０４】
非一時コンピューター可読記憶媒体
本明細書に開示された方法、ソフトウェア、システム、およびプラットフォームは、任意選択でネットワーク接続されたデジタル処理デバイスのオペレーティングシステムにより実行可能な命令を含むプログラムでコードされた１つ以上の非一時コンピューター可読記憶媒体を含みうる。コンピューター可読記憶媒体は、デジタル処理デバイスの具体的要素でありうる。コンピューター可読記憶媒体は、デジタル処理デバイスから任意選択で取外し可能でありうる。コンピューター可読記憶媒体としては、たとえば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリーデバイス、固体メモリー、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスなどが挙げられうるが、これらに限定されるものではない。プログラムおよび命令は、媒体上に永久的に、実質的に永久的に、半永久的に、または非一時的にコードされうる。
【０１０５】
コンピュータープログラム（一般）
本明細書に開示された方法、ソフトウェア、システム、およびプラットフォームは、少なくとも１つのコンピュータープロセッサーまたはその使用を含みうる。コンピュータープロセッサーは、コンピュータープログラムを含みうる。コンピュータープログラムは、特定のタスクを行うように書き込まれた、デジタル処理デバイスのＣＰＵで実行可能な一連の命令を含みうる。コンピューター可読命令は、特定のタスクを実行するかまたは特定の抽象データ型を実装するプログラムモジュールとして、たとえば、ファンクション、フィーチャー、アプリケーションプログラミングインタフェース（ＡＰＩ）、データ構造などとして実装されうる。コンピュータープログラムは、種々の言語の種々のバージョンで書き込まれうる。
【０１０６】
コンピューター可読命令の機能は、種々の環境で要望に応じて組み合わせたり、配布したりしうる。コンピュータープログラムは、命令の１つのシーケンスを含みうる。コンピュータープログラムは、命令の複数のシーケンスを含みうる。コンピュータープログラムは、１つのロケーションから提供されうる。コンピュータープログラムは、複数のロケーションから提供されうる。コンピュータープログラムは、１つ以上のソフトウェアモジュールを含みうる。コンピュータープログラムは、一部または全部として、１つ以上のウェブアプリケーション、１つ以上のモバイルアプリケーション、１つ以上のスタンドアロンアプリケーション、１つ以上のウェブブラウザープラグイン、エクステンション、アドインもしくはアドオン、またはそれらの組合せを含みうる。
【０１０７】
ウェブアプリケーション
コンピュータープログラムはウェブアプリケーションを含みうる。本明細書に提供された本開示に照らして、ウェブアプリケーションが１つ以上のソフトウェアフレームワークおよび１つ以上のデータベースシステムを利用しうることは、当業者であれば分かるであろう。ウェブアプリケーションは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）．ＮＥＴまたはＲｕｂｙ  ｏｎ  Ｒａｉｌｓ（ＲｏＲ）などのソフトウェアフレームワークで生成されうる。ウェブアプリケーションは、限定されるものではないが、たとえば、リレーショナルデータベースシステム、非リレーショナルデータベースシステム、フィーチャー指向データベースシステム、フィーチャー連想データベースシステム、およびフィーチャーＸＭＬデータベースシステムを含めて、１つ以上のデータベースシステムを利用しうる。好適なリレーショナルデータベースシステムとしては、限定されるものではないが、たとえば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）ＳＱＬ  Ｓｅｒｖｅｒ、ｍｙＳＱＬ（商標）、およびＯｒａｃｌｅ（登録商標）が挙げられうる。ウェブアプリケーションが１つ以上の言語の１つ以上のバージョンで書き込まれることは、当業者であれば分かるであろう。ウェブアプリケーションは、１つ以上のマークアップ言語、プレゼンテーション記述言語、クライアント側スクリプト言語、サーバー側コーディング言語、データベースクエリー言語、またはそれらの組合せで書き込まれうる。ウェブアプリケーションは、Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｍａｒｋｕｐ  Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＨＴＭＬ）、Ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ  Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｍａｒｋｕｐ  Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＸＨＴＭＬ）、またはｅＸｔｅｎｓｉｂｌｅ  Ｍａｒｋｕｐ  Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＸＭＬ）などのマークアップ言語である程度書き込まれうる。ウェブアプリケーションは、Ｃａｓｃａｄｉｎｇ  Ｓｔｙｌｅ  Ｓｈｅｅｔｓ（ＣＳＳ）などのプレゼンテーション記述言語である程度書き込まれうる。ウェブアプリケーションは、Ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ  ａｎｄ  ＸＭＬ（ＡＪＡＸ）、Ｆｌａｓｈ（登録商標）Ａｃｔｉｏｎｓｃｒｉｐｔ、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ(登録商標)、またはＳｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）である程度書き込まれうる。ウェブアプリケーションは、Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｅｒ  Ｐａｇｅｓ（ＡＳＰ）、ＣｏｌｄＦｕｓｉｏｎ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ（登録商標）、ＪａｖａＳｅｒｖｅｒ  Ｐａｇｅｓ（ＪＳＰ）、Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰＨＰ）、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｒｕｂｙ、Ｔｃｌ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、ＷｅｂＤＮＡ（登録商標）、またはＧｒｏｏｖｙなどのサーバー側コーディング言語である程度書き込まれうる。ウェブアプリケーションは、構造化照会言語（ＳＱＬ）などのデータベースクエリー言語である程度書き込まれうる。ェブアプリケーションは、ＩＢＭ（登録商標）Ｌｏｔｕｓ  Ｄｏｍｉｎｏ（登録商標）などの企業サーバー製品を取り込みうる。ウェブアプリケーションはメディアプレイヤーエレメントを含みうる。メディアプレイヤーエレメントは、限定されるものではないが、たとえば、Ａｄｏｂｅ（登録商標）フラッシュ（登録商標）、ＨＴＭＬ、リンゴ（登録商標）ＱｕｉｃｋＴｉｍｅ（登録商標）、マイクロソフト（登録商標）Ｓｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）、Ｊａｖａ（登録商標）５、およびＵｎｉｔｙ（登録商標）を含めて、多くの好適なマルチメディア技術の１つ以上を利用しうるが、これらに限定されるものではない。
【０１０８】
モバイルアプリケーション
コンピュータープログラムは、モバイルデジタル処理デバイスに提供されるモバイルアプリケーションを含みうる。モバイルアプリケーションは、製造時にモバイルデジタル処理デバイスに提供されうる。モバイルアプリケーションは、本明細書に記載のコンピューターネットワークを介してモバイルデジタル処理デバイスに提供されうる。
【０１０９】
モバイルアプリケーションは、当技術分野で公知のハードウェア、言語、および開発環境を使用して当業者に公知の技術により作成されうる。モバイルアプリケーションがいくつかの言語で書き込まれることとは、当業者であれば分かるであろう。好適なプログラミング言語としては、たとえば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｆｅａｔｕｒｅｉｖｅ−Ｃ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｐａｓｃａｌ、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｐａｓｃａｌ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、ルビー、ＶＢ．ＮＥＴ、ＣＳＳを利用したまたは利用しないＷＭＬおよびＸＨＴＭＬ／ＨＴＭＬ、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１０】
好適なモバイルアプリケーション開発環境は、いくつかの供給元から入手可能である。市販の開発環境としては、たとえば、ＡｉｒｐｌａｙＳＤＫ、ａｌｃｈｅＭｏ、Ａｐｐｃｅｌｅｒａｔｏｒ（登録商標）、Ｃｅｌｓｉｕｓ、Ｂｅｄｒｏｃｋ、Ｆｌａｓｈ  Ｌｉｔｅ、．ＮＥＴ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ、Ｒｈｏｍｏｂｉｌｅ、およびＷｏｒｋＬｉｇｈｔ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｌａｔｆｏｒｍが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の開発環境としては、たとえば、Ｌａｚａｒｕｓ、ＭｏｂｉＦｌｅｘ、ＭｏＳｙｎｃ、およびＰｈｏｎｅｇａｐなどがコストを伴うことなく入手可能であるが、これらに限定されるものではない。また、モバイルデバイス製造業者は、たとえば、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、アンドロイドの（商標）ＳＤＫ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）ＳＤＫ、ＢＲＥＷ  ＳＤＫ、手掌（登録商標）ＯＳ  ＳＤＫ、Ｓｙｍｂｉａｎ  ＳＤＫ、ｗｅｂＯＳ  ＳＤＫおよびｉＰａｄ（登録商標）（ｉＯＳ）ＳＤＫ、およびＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍｏｂｉｌｅ  ＳＤＫを含めて、ソフトウェア開発者キットを配布しているが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
たとえば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ａｐｐ  Ｓｔｏｒｅ、Ａｎｄｒｏｉｄ（商標）Ｍａｒｋｅｔ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）Ａｐｐ  Ｗｏｒｌｄ、Ａｐｐ  Ｓｔｏｒｅ  ｆｏｒ  Ｐａｌｍ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ａｐｐ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｆｏｒ  ｗｅｂＯＳ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍａｒｋｅｔｐｌａｃｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｂｉｌｅ，  Ｏｖｉ  Ｓｔｏｒｅ  ｆｏｒ  Ｎｏｋｉａ（登録商標）ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）アプリケーション、およびＮｉｎｔｅｎｄｏ（登録商標）ＤＳｉ  Ｓｈｏｐを含めて、モバイルアプリケーションの配布に関して、商用フォーラムを利用可能であることとは当業者であれば分かるであろうが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
スタンドアロンアプリケーション
コンピュータープログラムは、スタンドアロンアプリケーションを含みうる。これは、既存プロセスへのアドオンではなく、たとえば、プラグインンではなく、独立したコンピュータープロセスとして作動しうるプログラムでありうる。スタンドアロンアプリケーションが、多くの場合、コンパイルしうることとは、当業者であれば分かるであろう。コンパイラーは、プログラミング言語で書かれたソースコードをアセンブリー言語またはマシンコードなどのバイナリ―特性コードに変換するコンピュータープログラムでありうる。コンパイルされる好適なプログラミング言語としては、たとえば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｆｅａｔｕｒｅｉｖｅ−Ｃ、ＣＯＢＯＬ、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｅｉｆｆｅｌ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｌｉｓｐ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、およびＶＢ．ＮＥＴ、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。コンパイルは、多くの場合、少なくとも部分的には、実行可能プログラムを生成するように行われうる。コンピュータープログラム、１つ以上の実行可能なコンパイルされたアプリケーションを含みうる。
【０１１３】
ウェブブラウザープラグイン
コンピュータープログラムはウェブブラウザープラグインを含みうる。コンピューター処理時、プラグインは、より大きいソフトウェアアプリケーションに特定の機能を追加する１つ以上のソフトウェアコンポーネントでありうる。ソフトウェアアプリケーションのメーカーは、アプリケーションの拡張、新しい機能の容易な追加、およびアプリケーションサイズの低減を行う能力をサードパーティー開発者に与えられるように、プラグインを支援しうる。支援された場合、プラグインは、ソフトウェアアプリケーションの機能をカスタマイズしうる。たとえば、プラグインは、ビデオの再生、対話性の形成、ウイルススキャン、および特定のファイルタイプの利用を行うために、ウェブブラウザーで通常使用される。当業者であれば、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｆｌａｓｈ（登録商標）Ｐｌａｙｅｒ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｓｉｌｖｅｒｌｉｇｈｔ（登録商標）、およびＡｐｐｌｅ（登録商標）ＱｕｉｃｋＴｉｍｅ（登録商標）を含めて、いくつかのウェブブラウザープラグインを熟知していよう。ツールバーは、１つ以上のウェブブラウザーエクステンション、アドイン、またはアドオンを含みうる。ツールバーは、１つ以上のエクスプローラーバー、ツールバンド、またはデスクバンドを含みうる。
【０１１４】
本明細書に提供された本開示を考慮して、限定されるものではないが、たとえば、Ｃ＋＋、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｊａｖａ（登録商標）、ＰＨＰ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、およびＶＢ．ＮＥＴ、またはそれらの組合せを含めて、種々のプログラミング言語によるプラグインの開発を可能にするいくつかのプラグインフレームワークを利用しうることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１１５】
ウェブブラウザー（インターネットブラウザとも呼ばれる）は、ワールドワイドウェブ上の情報資源の検索、提示、および横断のためにネットワーク接続されたデジタル処理デバイスで使用するように設計されたソフトウェアアプリケーションでありうる。好適なウェブブラウザーとしては、たとえば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（登録商標）、Ｍｏｚｉｌｌａ（登録商標）Ｆｉｒｅｆｏｘ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ｃｈｒｏｍｅ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｓａｆａｒｉ（登録商標）、Ｏｐｅｒａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）Ｏｐｅｒａ（登録商標）およびＫＤＥ  Ｋｏｎｑｕｅｒｏｒが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ウェブブラウザーはモバイルウェブブラウザーでありうる。モバイルウェブブラウザー（マイクロブラウザー、ミニブラウザー、およびワイヤレスブラウザーとも呼ばれる）は、限定されるものではないが、たとえば、ハンドヘルドコンピューター、タブレットコンピューター、ネットブックコンピューター、サブノートブックコンピューター、スマートフォン、ミュージックプレーヤー、パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、およびハンドヘルドビデオゲームシステムを含めて、モバイルデジタル処理デバイスで使用するように設計されうる。好適なモバイルウェブブラウザーとしては、たとえば、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）ブラウザー、ＲＩＭ  ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）ブラウザー、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｓａｆａｒｉ（登録商標）、Ｐａｌｍ（登録商標）Ｂｌａｚｅｒ、Ｐａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）Ｂｒｏｗｓｅｒ、移動体用のＭｏｚｉｌｌａ（登録商標）Ｆｉｒｅｆｏｘ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（登録商標）Ｍｏｂｉｌｅ、Ａｍａｚｏｎ（登録商標）Ｋｉｎｄｌｅ（登録商標）Ｂａｓｉｃ  Ｗｅｂ、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｂｒｏｗｓｅｒ、Ｏｐｅｒａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）Ｏｐｅｒａ（登録商標）Ｍｏｂｉｌｅ、およびＳｏｎｙ（登録商標）ＰＳＰ（商標）ブラウザーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
ソフトウェアモジュール（一般）
本明細書に開示された方法、ソフトウェア、システム、およびプラットフォームは、１つ以上のソフトウェア、サーバー、およびデータベースモジュール、またはそれらの使用を含みうる。本明細書に提供された本開示を考慮して、ソフトウェアモジュールは、当技術分野で公知の機械、ソフトウェア、および言語を用いて、当業者に公知の技術により生成されうる。本明細書に開示されたソフトウェアモジュールは、多くの方法で実装されうる。ソフトウェアモジュールは、ファイル、コードのセクション、プログラミングフィーチャー、プログラミング構造、またはそれらの組合せを含みうる。ソフトウェアモジュールは、複数のファイル、コードの複数のセクション、複数のプログラミングフィーチャー、複数のプログラミング構造、またはそれらの組合せを含みうる。１つ以上のソフトウェアモジュールは、限定されるものではないが、たとえば、ウェブアプリケーション、モバイルアプリケーション、およびスタンドアロンアプリケーションを含みうる。ソフトウェアモジュールは１つのコンピュータープログラムまたはアプリケーションでありうる。ソフトウェアモジュールは２つ以上のコンピュータープログラムまたはアプリケーションでありうる。ソフトウェアモジュールは１つの機械でホストされうる。ソフトウェアモジュールは２つ以上の機械でホストされうる。ソフトェアモジュールはクラウドコンピューティングプラットフォームでホストされうる。ソフトウェアモジュールは１つのロケーションで１つ以上の機械でホストされうる。ソフトウェアモジュールは２つ以上のロケーションで１つ以上の機械でホストされうる。
【０１１７】
データベース
本明細書に開示された方法、ソフトウェア、システム、およびプラットフォームは、１つ以上のデータベースまたはその使用を含みうる。本明細書に提供された本開示を考慮して、多くデータベースがイメージング情報の記憶および検索に好適でありうることとは、当業者であれば分かるであろう。好適なデータベースとしては、ナルデータベース、フィーチャー指向データベース、フィーチャーデータベース、エンティティーリレーションシップモデルデータベース、連想データベース、およびＸＭＬデータベースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。データベースはインターネットベースでありうる。データベースはウェブベースでありうる。データベースはクラウドコンピューティングベースでありうる。データベースは１つ以上のローカルコンピューター記憶デバイスベースでありうる。
【実施例】
【０１１８】
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載の方法、システム、およびプラットフォームの特定の実施形態を表すものであるが、それらになんら限定的されるものではない。
【０１１９】
実施例１  −  光学機器
図１は、光学機器の一実施形態を示している。この実施形態は、１６ウェル顕微鏡スライドの２つの隣接するウェルを同時にイメージングするために使用した。各ウェルは、スポットとも呼ばれる１０２４（３２×３２）のフィーチャーを含有していた。それらは蛍光で標識されうる。スポットの直径は約８０ミクロンであった。隣接スポット間の中心間距離は１６１ミクロンであった。機器の目的は各スポットの輝度を決定することであった。図１Ｅは、並進ステージシステム１０５、イメージングシステム１０６、および照明システム１０７を示している。並進ステージシステムは、Ｈａｙｄｏｎ  Ｋｅｒｋの２６０００系リニアアクチュエーターにより駆動される再循環ボールスライドＭｉｓｕｍｉモデルＳＳＥＬＢＷ９−１７０から構築された一軸並進ステージを含有していた。１６ウェル顕微鏡スライドのホルダーは並進ステージ上に取り付けられた。リニアアクチュエーターはＰｅｔｅｒ  Ｎｏｒｂｅｒｇ  ＣｏｎｓｕｌｔｉｎｇモデルＢＣ２Ｄ２０−０７００モーションコントローラーにより制御された。図１Ｇは、ＵＳＢハブ１１２、カスタム回路ボード１１３、およびモーションコントローラー１１４を示している。モーションコントローラーおよびＣＣＤカメラはＵＳＢデバイスであった。ＵＳＢハブは、コンピューターと機器との間の通信が単一のＵＳＢケーブルで行われることを可能にした。カスタム回路ボードは、Ｌｕｘｄｒｉｖｅモデル３０２１−Ｄ−Ｅ−１０００  ＬＥＤドライバーを含んでした。カスタム回路ボードは、ＬＥＤをＣＣＤカメラとを同期させるために（ＣＣＤカメラが露光を開始したときにＬＥＤをオンとし、ＣＣＤカメラが露光を終了したときにオフとする）、かつ機器のドアが開状態のときにＬＥＤがオンとになるのを防止するために論理チップを含有していた。
【０１２０】
イメージングシステムの一実施形態は図２に例示されている。支持体２０５の表面上の色素分子により発せられた光は、色消し接合二重レンズ２０４によりコリメートされ、バンドパスフィルター２０３により濾光され、カメラレンズ２０２によりＣＣＤカメラのセンサー２０１上に焦点を調節された。レンズ２０４（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓモデル４７６４０）は、８５ｍｍの焦点距離および２５ｍｍの直径を有していた。フィルター２０３（ＳｅｍｒｏｃｋモデルＦＦ０１−５９３／４０−２５）は、ｃｙ３またはフィコエリトリン色素に使用される発光バンドパスフィルターであった。レンズ２０２（ＦｕｊｉｎｏｎモデルＨＦ２５ＨＡ−１Ｂ）は、２５ｍｍの焦点距離を有する。レンズ２０２は多素子レンズであったが、多素子レンズの設計の詳細はＦｕｊｉｎｏｎに所有権があったため、微小に薄型単一素子レンズとして図２に示される。レンズ２０２の調整可能な開口紋りは、２．８に設定した。ＣＣＤカメラ（Ｐｏｉｎｔ  Ｇｒｅｙ  ＲｅｓｅａｒｃｈモデルＣＭＬＮ−１３Ｓ２Ｍ−ＣＳ）は１２９６×９６４ピクセルおよび３．７５ミクロンのピクセルサイズであった。この実施形態では、中央の１２８０×６４０ピクセルのみが使用された。カメラのプラスチックハウジングは除去され、カメラの回路ボードは小さいファンにより冷却された。レンズ２０４および２０２は、０．３の倍率を有する有限共役イメージングシステムを形成した。
【０１２１】
照明システムの一実施形態は図３に例示されている。光源３０１により発せられた光は、レンズ３０２によりコリメートされ、次いで、サンプル３０８に到達する前に、アパーチャー３０３、バンドパスフィルター３０４、レンズ３０５、３０６、および３０７を通り抜けた。光源３０１（ＬｅｄＥｎｇｉｎモデルＬＺ４−４０Ｇ１００）は、ピーク発光波長の約５２５のｎｍを有するＬＥＤだった。レンズ３０２（ＴｈｏｒｌａｂｓモデルＡＣＬ２５２０−Ａ）は、２５ｍｍの直径および２０ｍｍの焦点距離を有する非球面レンズであった。アパーチャー３０３（Ｆｏｔｏｆａｂカスタム部分）は、直径２５ｍｍスチールディスク中の矩形穴（１９ｍｍ×７．５ｍｍ）であった。フィルター３０４（ＳｅｍｒｏｃｋモデルＦＦ０１−５３１／４０−２５）は、ｃｙ３またはフィコエリトリン色素に使用される励起バンドパスフィルターであった。レンズ３０５、３０６、および３０７は、２５ｍｍの直径および６０ｍｍ焦点距離を有する平凸レンズであった。レンズ３０１および３０２は、３の倍率を有する有限共役イメージングシステムを形成し、光源３０１をレンズ３０６および３０７の瞳孔上に画像化した。レンズ３０６および３０７は、１の倍率を有する有限共役イメージングシステムを形成し、アパーチャー３０３をサンプル３０８上に画像化した。照明システムはサンプル３０８に対して４５度の傾きであった。照明領域は約１９ｍｍ×１０．６ｍｍであった。１０．６ｍｍ（＝７．５ｍｍ／ｃｏｓｉｎｅ（４５度））。
【０１２２】
実施例４  −  参照プローブの作製
この実験の目的は、アレイ上で起こるハイブリダイゼーションの数をカウントする特別な方法の使用を例示することであった。この実施例では、特定のＤＮＡ配列がアレイに装着されたプローブを使用した。この実験で使用した３２×３２フィーチャーアレイは、３２の陽性対照プローブおよび３２の陰性対照プローブ（図１５および１６参照）と共に９６０の異なる測定スポットを含有する。３２の陽性対照プローブは、ストックオリゴヌクレオチドを用いて起こりうる実際の結合を保証するために使用され、３２の陰性対照プローブは、プローブのまったくない空のスポットを含有していた。画像解析工程では、本発明者らは、設定強度閾値超の強度を有するプローブを考慮して、そのプローブを陽性プローブとして参照し、一方、プローブ強度が設定強度閾値未満であった場合、そのプローブを陰性フィーチャーとして参照味した。陽性プローブは有意量の対応する相補的オリゴヌクレオチドがサンプル中に存在するかの尺度となり、一方、陰性フィーチャーは、不在のオリゴヌクレオチドを表すと仮定した。陽性プローブは、他にサンプル中のオリゴヌクレオチドの９６０コピーを測定する標識として参照され、つまり、９６０までのユニークな標識またはバーコードをカウント可能であり、その後、最初のサンプル中のオリゴヌクレオチドの実際量を予測するようにさらに一般化することが可能である。実験に依存して、Ｍの全標識または９６０の全標識から、本発明者らは、実際に観察されたユニークなバーコードまたは陽性プローブの数ｋからＮを予測することにより、サンプル中のオリゴヌクレオチドのコピー数Ｎの合計を計算することが可能であった。
【０１２３】
実施例５  −  閾値計算
この実験の目的は、アレイ上の標識フィーチャーと非標識フィーチャーとを識別するための閾値を計算する一方法を実証することであった。
Ｉ．強度下限ＩＬＬ、強度上限ＩＵＬ、およびウィンドウサイズｗを設定する。
ＩＩ．利用可能な閾値強度のセットｙ＝｛ｙｉ：ＩＬＬ＜Ｉｉ＜ＩＵＬ｝を得る。
ＩＩＩ．ｙを昇順にソートしてｙ＊を得る。
ＩＶ．ｄ＝｛ｄ１，ｄ２，ｄｉ，．．．，ｄｍ｝（式中、ｄｉ＝ｙｉ＋１＊−ｙｉ＊）を計算する。
Ｖ．観察強度のそれぞれについて統計学的ギャップを計算する。
【数１７】
2017504307.tif 000019
ＶＩ．ｃ＝ｍａｘ（ｘｊ）となる閾値ｃを同定する。
ＶＩＩ．閾値ｃを超えるスポットの数ｋをカウントする。
【数１８】
2017504307.tif 000020
ＶＩＩＩ．所望のシミュレーション回数ｎｓｉｍを仮定し、次の手順をｎｓｉｍ回行う。ｙ＝｛ｙ１，ｙ２，．．．，ｙｍ｝から復元抽出でランダムにｍ個の値を選択してｙｓｉｍを得る。次いで、ｙｓｉｍを用いて工程Ｉ−ＶＩＩを繰返し、最終結果を得る。
ＩＸ．ｎｓｉｍシミュレートカウント値の標準偏差
【数１９】
2017504307.tif 000021
を計算する。
Ｘ．カウント値に対する９５％ＣＩを以下のように計算する。
【数２０】
2017504307.tif 000022
サンプル中の分子カウント値の真の推定値を得るために、以下の変換が必要であることに留意されたい。
【数２１】
2017504307.tif 000023
また、ｍがアレイ上のフィーチャーの全数である場合、９５％ＣＩの上限および下限の値に関しても、同様である。
【０１２４】
実施例６  −  ｋａｎ遺伝子の検出
この実験の目的は、サンプル中のｋａｎ遺伝子のカウント値を決定することであった。ｋａｎ遺伝子を含有するサンプルをアレイにハイブリダイズさせた。図４Ａは、イメージングシステムから得られたアレイの領域を示している。強度が高いスポットではそのスポットにより高い確率で遺伝子が存在すように補正した。画像解析ソフトウェアにより、逸脱度、歪度、尖度、中央値などの強度分布の統計量を調べた。これらの統計量は、自動でソフトウェアがｋａｎ遺伝子の存在を検出する最良の方法を選択するための指針を提供した。この実施例では、図４Ｂに示されるように、混合物モデルアルゴリズムを用いて強度閾値を６．６と決定し、この値により強度分布を最適には「オン」および「オフ」のドメインに分割した。
【０１２５】
実施例７  −  力価測定実験
この実験の目的は、力価測定実験で分子ハイブリダイゼーションの存在を検出することであった。領域の強度測定値を得た後、強度分布を計算した。図５に示されている。当業者であれば、分布が２モードであると同定可能であるが、閾値の正確な値を決定するのは非常に難しかった。本開示に係るソフトウェアを用いてシグナル強度閾値を決定するタスクを自動で行ったところ、６．０２の強度値が標識フィーチャーと非標識フィーチャーとを識別する最適な閾値を提供すると決定された。
【０１２６】
実施例８  −  バックグラウンド調整
この実験の目的は、バックグラウンド除去法を用いて画像を処理することを実証することであった。図６Ａは、顕著なアーチファクトを有する取得画像を示している。系統的バックグラウンド除去を行ってノイズを低減した。本発明者らは、スポットに対してセンタリングされた解析ウィンドウを規定した。次いで、ソフトウェアにより、平均スポット強度
【数２２】
2017504307.tif 000024
、スポット標準偏差σＳ、スポットピクセルの数ｎＳ、バックグラウンド平均
【数２３】
2017504307.tif 000025
、バックグラウンド標準偏差σＢ、およびバックグラウンドピクセルの数ｎＢを計算した。次いで、ソフトウェアにより各スポットに対するｌｏｇ２バックグラウンド除去強度統計量を計算した。
【数２４】
2017504307.tif 000026
ただし、
【数２５】
2017504307.tif 000027
【０１２７】
図６Ｂおよび６Ｃは、それぞれ、バックグラウンド調整の前および後の強度分布を示しており、バックグラウンド補正を行うと、アレイ上の標識フィーチャーの存在を適正に評価するソフトウェアの能力が向上することが実証される。
【０１２８】
実施例９  −  代替的バックグラウンド補正
この実験の目的は、バックグラウンドを調整する代替法であった。本発明者らは、スポットに対してセンタリングされた解析ウィンドウを規定した。次いで、ソフトウェアにより中央値スポット強度
【数２６】
2017504307.tif 000028
および中央値局所バックグラウンド強度
【数２７】
2017504307.tif 000029
を計算した。次いで、ソフトウェアにより各スポットに対するｌｏｇ２バックグラウンド除去強度統計量を計算した。
【数２８】
2017504307.tif 000030
【０１２９】
実施例１０  −  Ｐｉｘｅｌ１６カートリッジおよびカスタムマイクロアレイ
この実施例は、確率的標識実験を行う際に、本開示に係る方法、システム、およびプラットフォームと共に使用されるアレイの一実施形態を例示している。
【０１３０】
Ｐｉｘｅｌ１６カートリッジは、（ｉ）アレイ基材として機能するエポキシシラン官能基化ガラススライドと、（ｉｉ）スライドの官能基化表面上に印刷された、図１４〜１６に記載のカスタムマイクロアレイの１６コピーと、（ｉｉｉ）流体的に分離されかつアレイパターンに位置合せされた１６ウェルを規定する役割を果たす、スライドの印刷側に固着されたポリマーウェルフレームとからなる。ウェルフレームは、ダイカット両面接着材を用いてアレイ印刷に従ってスライドに固着される。
【０１３１】
カスタムＤＮＡマイクロアレイレイアウト。マイクロアレイパターンは、図１５および１６に示されるように３２×３２アレイのスポットからなる。上端行および下端行の基準スポットは、スキャン画像中のアレイの位置決定を可能にする。また、基準スポットは、配置を容易に同定可能な非対称パターンで配置され、上端行は、その両端を識別可能な特有のパターンを有し、下端行は、上端行とは異なる。これにより、Ｐｉｘｅｌ１６の不適正な配置を手動および自動で容易に同定可能になり、さらにはイメージングの問題を容易に検出可能になる。残りの９６０スポットは、それぞれ、表１に列挙されたユニークなプローブ配列の１つに関連付けられる。
【０１３２】
オリゴヌクレオチド配列および溶液成分。オリゴヌクレオチド溶液は、９６ウェルマイクロプレート中で印刷溶液を調製するために提供される。供給濃度はＨ２Ｏ中１００μＭである。印刷前にＴｅｃａｎ  ＧｅｎＭａｔｅを用いて希釈が行われる。希釈は、８８０μＬのストックオリゴ＋１３２０μＬの緩衝液である。使用される希釈緩衝液は、０．００８３３％のサルコシルを含む２５０ｍＭリン酸ナトリウムである。緩衝液は、０．２μｍフィルターを用いて濾過される。各プローブ作製操作で３セットのプレートが作製される。各供給プレートの後、先端部は廃棄される。最終分注溶液は、０．００５％のサルコシルを含む１５０ｍＭリン酸ナトリウム中４０μＭ  ＤＮＡである。基準オリゴは、Ｈ２Ｏ中５００μＭで供給される。基準オリゴヌクレオチド配列は、５’−／５ＡｍＭＣ６／ＴＣＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣＧＡＣ−３’、２５塩基、５’アミノ修飾剤Ｃ６、標準脱塩、Ｈ２Ｏ中５００μＭ供給である。基準物は、１７６μＬの基準物と７０４μＬの水と１３２０μＬの緩衝液とを混合することにより希釈される。最終基準混合物は、０．００５％のサルコシルを含む１５０ｍＭリン酸ナトリウム中４０μＭである。
【０１３３】
オリゴヌクレオチド配列の表。９６０のプローブ配列のオリゴヌクレオチド配列（すなわち、分子カウント実験で使用される確率的標識配列に相補的な配列のセット）を表１に列挙する。
【０１３４】
【表１−１】
2017504307.tif 000031
【０１３５】
【表１−２】
2017504307.tif 000032
【０１３６】
【表１−３】
2017504307.tif 000033
【０１３７】
【表１−４】
2017504307.tif 000034
【０１３８】
【表１−５】
2017504307.tif 000035
【０１３９】
【表１−６】
2017504307.tif 000036
【０１４０】
【表１−７】
2017504307.tif 000037
【０１４１】
【表１−８】
2017504307.tif 000038
【０１４２】
【表１−９】
2017504307.tif 000039
【０１４３】
【表１−１０】
2017504307.tif 000040
【０１４４】
【表１−１１】
2017504307.tif 000041
【０１４５】
【表１−１２】
2017504307.tif 000042
【０１４６】
【表１−１３】
2017504307.tif 000043
【０１４７】
【表１−１４】
2017504307.tif 000044
【０１４８】
【表１−１５】
2017504307.tif 000045
【０１４９】
【表１−１６】
2017504307.tif 000046
【０１５０】
【表１−１７】
2017504307.tif 000047
【０１５１】
【表１−１８】
2017504307.tif 000048
【０１５２】
【表１−１９】
2017504307.tif 000049
【０１５３】
【表１−２０】
2017504307.tif 000050
【０１５４】
【表１−２１】
2017504307.tif 000051
【０１５５】
【表１−２２】
2017504307.tif 000052
【０１５６】
【表１−２３】
2017504307.tif 000053
【０１５７】
【表１−２４】
2017504307.tif 000054
【０１５８】
【表１−２５】
2017504307.tif 000055
【０１５９】
【表１−２６】
2017504307.tif 000056
【０１６０】
【表１−２７】
2017504307.tif 000057
【０１６１】
【表１−２８】
2017504307.tif 000058
【０１６２】
【表１−２９】
2017504307.tif 000059
【０１６３】
【表１−３０】
2017504307.tif 000060
【０１６４】
【表１−３１】
2017504307.tif 000061
【０１６５】
【表１−３２】
2017504307.tif 000062
【０１６６】
【表１−３３】
2017504307.tif 000063
【０１６７】
【表１−３４】
2017504307.tif 000064
【０１６８】
【表１−３５】
2017504307.tif 000065
【０１６９】
【表１−３６】
2017504307.tif 000066
【０１７０】
【表１−３７】
2017504307.tif 000067
【０１７１】
【表１−３８】
2017504307.tif 000068
【０１７２】
【表１−３９】
2017504307.tif 000069
【０１７３】
【表１−４０】
2017504307.tif 000070
【０１７４】
【表１−４１】
2017504307.tif 000071
【０１７５】
【表１−４２】
2017504307.tif 000072
【０１７６】
【表１−４３】
2017504307.tif 000073
【０１７７】
【表１−４４】
2017504307.tif 000074
【０１７８】
【表１−４５】
2017504307.tif 000075
【０１７９】
【表１−４６】
2017504307.tif 000076
【０１８０】
【表１−４７】
2017504307.tif 000077
【０１８１】
【表１−４８】
2017504307.tif 000078
【０１８２】
【表１−４９】
2017504307.tif 000079
【０１８３】
【表１−５０】
2017504307.tif 000080
【０１８４】
【表１−５１】
2017504307.tif 000081
【０１８５】
【表１−５２】
2017504307.tif 000082
【０１８６】
【表１−５３】
2017504307.tif 000083
【０１８７】
【表１−５４】
2017504307.tif 000084
【０１８８】
【表１−５５】
2017504307.tif 000085
【０１８９】
実施例１１  −  力価測定系列または希釈系列
複数の実験を併行して行う能力は、力価実験系列または希釈系列としても知られる一連の開始濃度または標的量を有するサンプルのカウント結果の直接的探究を可能にする。
【０１９０】
標識ＲＰＬＰＯ遺伝子配列の希釈系列データの実施例を図２６に示す。図中のプロットは、各アレイのカウント結果Ｎであり、反応系のｍＲＮＡの公称開始濃度がＸ軸上に示されている。
【０１９１】
同実験に対する解析ソフトウェアのグラフ出力のいくつかを図２７に示す。各アレイに対して、次の要素を有する化合物表示がなされる。（ｉ）インデックススポットの強度ヒストグラム（緑色）、（ｉｉ）ヒストグラムに位置合せされてスポットカウントの動的閾値を示す青線、（ｉｉｉ）各アレイのデジタル表現である３２×３２グリッド。グリッド中の白色部位は、その強度が動的閾値超であるスポットを表し、黒色部位は、その強度が動的閾値未満であることを表し、かつ（ｉｖ）結果Ｎおよび品質スコアＱは、各アレイに対してテキストとして報告される。
【０１９２】
本発明に係る好ましい実施形態を本明細書に提示し説明してきたが、そのような実施形態が例として提供されているにすぎないことは当業者には自明であろう。現時点では、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多くの変形形態、変更形態、および置換形態が考えられよう。本発明を実施する際、本明細書に記載された本発明の実施形態の種々の代替手段を利用しうることを理解すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2017504307.tif 000097
【図７Ａ】
2017504307.tif 000098
【図７Ｂ】
2017504307.tif 000099
【図７Ｃ】
2017504307.tif 000100
【図７Ｄ】
2017504307.tif 000101
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月15日(2016.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017504307000001.app
【国際調査報告】
2017504307.tif 000122
2017504307.tif 000123
2017504307.tif 000124