(57)【要約】  同一サンプル中の修飾分析物の定量化のために、分析物の濃度を決定するための、種々の色素へ結合している分析物（対象とするその特異的修飾部位を持つ）に結合する修飾部位特異抗体を、別の色素へ結合している非修飾分析物に特異的な抗体と同時に使用して、修飾について分析物を分析するための方法、キットおよび組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはポリペプチドを含む分析されるべきサンプルの分析物中の該タンパク質またはポリペプチドの修飾部位を検出するための方法であって、修飾部位が、リン酸化、自己リン酸化、メチル化、ヒドロキシル化、グリコシル化、ユビキチン化、アセチル化、プレニル化、アミド化またはＮ末端メチオニン検出からなる群から選択され、方法が、
（ａ）該修飾部位に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、検出マーカーとして働く色素と接合されているかまたはそれに結び付けられている、一次捕捉抗体を提供すること、ならびに、
（ｂ）該修飾部位とは異なる部位またはエピトープにおいて、該タンパク質に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、ステップ（ａ）の該色素とは識別可能な検出マーカーと接合されているかまたはそれに結び付けられている、二次抗体を提供すること、
（ｃ）（ａ）で使用されたのとは別の修飾部位に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、ステップ（ａ）および（ｂ）の該色素とは識別可能な検出マーカーとして働く色素と接合されているかまたはそれに結び付けられている、三次捕捉抗体を提供すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
キナーゼインヒビターの存在下における、請求項１に記載の方法によって検出される１以上のキナーゼのリン酸化および自己リン酸化を、該キナーゼインヒビターの不在下と比較して、分析するための方法であって、方法は以下のステップ：
（ａ）血清枯渇によって細胞を飢餓にすること、
（ｂ）キナーゼインヒビターの存在下および不在下において、血清、成長因子および／またはサイトカインを加えることによって、キナーゼの自己リン酸化活性を誘導すること、
（ｃ）細胞を可溶化すること、それによって、細胞ライセートをそこから放出させること、
（ｄ）種々のホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニンと、種々の色素と接合された非修飾部位特異的結合タンパク質とを加えることによって、サンプル中のキナーゼを捕捉すること、
ここで、種々の各結合タンパク質は、特有の色素に結び付けられており、
（ｅ）読出し標識と直接接合されているかまたはビオチンと直接カップリングされているキナーゼ上の非修飾部位特異的領域へ結合する抗体によって、特有の色素を有する自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、ｄ）から同定すること、ここで、抗体が、ｄ）で使用された結合タンパク質とは別の、キナーゼ中の非修飾部位特異的領域へ結合する必要があり、
（ｆ）キナーゼインヒビターの存在下での誘導の結果として生じるｅ）からのリン酸化されたかまたは自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、該キナーゼインヒビターの不在下での誘導の場合と比較すること、ならびに、個々のキャビティにおける非修飾キナーゼレベルとの直接比較において、ｅ）からのリン酸化された／自己リン酸化されたキナーゼを比較すること、これにより、個々の分析物の規格化が可能となること
を含む、前記方法。
【請求項３】
分析された修飾が、ＭｅｔＡＰ１およびＭｅｔＡＰ２酵素活性の確認を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
診断および腫瘍の病期分類のための、
キナーゼインヒビターの不在下で、チロシンキナーゼのリン酸化状態をプロファイリングするための方法であって、
請求項２のｃ）のライセートが、腫瘍試料、疾患に冒された組織、または、同等な動物材料に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）において、キナーゼアクチベーターを試験する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
色素が、蛍光色素またはルミネセンス色素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
マーカーが、蛍光マーカーまたはルミネセンスマーカーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞が、対象の分析物を表すポリペプチドをコードする核酸で、細胞飢餓（ａ）に先立ち形質転換され、前記分析物が、過剰発現によるかまたは該細胞中のキナーゼそれ自体の組み換えペプチドにおける自己活性化突然変異のため、リン酸化を誘導することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、真核細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
キナーゼインヒビターを、キナーゼに結合するというそれらの特異性について、プロファイリングするための、請求項１または２に記載の方法の使用。
【請求項１２】
キナーゼアクチベーターを、キナーゼに結合するというそれらの特異性について、プロファイリングするための、請求項１または２に記載の方法の使用。
【請求項１３】
キナーゼインヒビターの特異性をプロファイリングするための請求項１１または１２に記載の方法における使用のためのキットであって、以下：
（ａ）リン酸化されたキナーゼに結合する種々の捕捉抗ホスホ抗体に結び付けられている１〜５００個の特有の色素を持つミクロスフェアの組成物、および、
（ｂ）リン酸化されたキナーゼの同定のためのａ）における色素とは識別可能な色素で標識されたキナーゼに特異的な抗体
を含む、前記キット。
【請求項１４】
キナーゼアクチベーターの特異性をプロファイリングするための請求項１３に記載の方法における使用のためのキットであって、以下：
（ａ）リン酸化されたチロシンキナーゼに結合する種々の捕捉抗ホスホ抗体に結び付けられている１〜５００個の特有の色素を持つミクロスフェアの組成物、および、
（ｂ）リン酸化されたキナーゼの同定のためのａ）における色素とは識別可能な色素で標識されたキナーゼに特異的な抗体
を含む、前記キット。
【請求項１５】
キナーゼインヒビターの特異性をプロファイリングするための請求項１３に記載の方法における使用のためのキットであって、以下：
（ａ）種々の抗ホスホ抗体に結び付けられている１〜５００個の特有の色素の組成物、
（ｂ）ａ）における色素とは識別可能な色素で標識された抗キナーゼ抗体
を含む、前記キット。
【請求項１６】
キナーゼアクチベーターの特異性をプロファイリングするための請求項１３に記載の方法における使用のためのキットであって、以下：
（ａ）種々の抗ホスホ抗体に結び付けられている１〜５００個の特有の色素の組成物、
（ｂ）ａ）における色素とは識別可能な色素で標識された抗キナーゼ抗体
を含む、前記キット。
【請求項１７】
色素が、蛍光色素またはルミネセンス色素である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
種々の抗キナーゼ抗体に各々結び付けられている１〜５００個の特有の色素を含有する組成物であって、前記抗体が、リン酸化されたキナーゼに特異的に結合する抗体によって捕捉された、一定のキナーゼに特異的に結合する、前記組成物。
【請求項１９】
１〜１００個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
１〜２００個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
１〜３００個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
１〜４００個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明の主題は、特異的な分析物の検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ技法を、種々のサンプルマトリックス（例として細胞ライセート(lysate)、組織ホモジネート、体液）中の微量(rare amounts)の分析物の同定のためのLuminex-xMAP検出技術と組み合わせるアッセイである。検出システムによって、１キャビティ中、最大５００個までの異なる分析物の測定が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
急成長している配列データベースを使用できるようになったことに伴い、ゲノムへの適用によって、細胞中のタンパク質発現のグローバルスクリーニングのための、より早く、かつ、より効率的な方法が要求されている。しかしながら、細胞プロテオームの複雑性は、タンパク質の翻訳後修飾も考慮すると、実質的に拡大している。
【０００３】
タンパク質翻訳後の動的(dynamic)修飾は、タンパク質の構造および機能を維持し、調節するために重要である。今日までに特徴付けられている翻訳後修飾の数百もの異なるタイプのうち、タンパク質のリン酸化は大きな役割を果たしている。酵素に触媒されるタンパク質のリン酸化および脱リン酸化は、生細胞において、肝要な調節事象である。細胞周期、細胞成長、細胞分化および代謝などの複雑な生物学的プロセスは、タンパク質の活性、安定性、相互作用および局在化を調整する可逆的リン酸化事象によって、組織化され、厳しく制御されている。例として恒常的に活性があるかまたは不活性であるタンパク質キナーゼおよびホスファターゼを生成する突然変異による、タンパク質のリン酸化状態における混乱は、発がんに大きな役割を果たしている。ホスホタンパク質におけるリン酸化部位の正確な局在化と組み合わせられた、それらのタンパク質の総合的な分析および同定（「ホスホプロテオミクス」）は、複雑な生物学的システムと、疾患に繋がる分子的特徴とを理解するのに必須の要件である。
【０００４】
タンパク質のリン酸化は、共有結合修飾において最も高頻度で見られるメカニズムの１つに代表されるものである。哺乳動物細胞に存在する全タンパク質の３分の１がリン酸化されており、そのリン酸化の原因となるキナーゼ、酵素が、発現されたゲノムのうち約１〜３％を構成すると推定される。生物は、タンパク質の可逆的リン酸化を使用することで、シグナル伝達、遺伝子発現、細胞周期、細胞骨格調節およびアポトーシスを含む多くの細胞プロセスを制御する。ホスファート基は、セリン、トレオニン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、システイン、グルタミン酸およびアスパラギン酸残基を修飾し得る。しかしながら、セリン（９０％）、トレオニン（１０％）またはチロシン（０．０５％）残基におけるヒドロキシル基のリン酸化が最も高頻度で見られ、代謝、細胞分裂、細胞成長および細胞分化における他のプロセスの中にも関わっている。生命の調節においてリン酸化が中心的役割を占めるため、タンパク質リン酸化を特徴付けるための方法の開発に、多くの努力が注ぎ込まれてきた。これらのリン酸化部位の多くが、重大な生物学的プロセスを調節し、分子医学に重要な診断標的または治療標的であることを証明し得る。例えば、今日までに同定されている１００個を超える優性がん遺伝子のうち、４６個がタンパク質キナーゼである。
【０００５】
多くのがんは、がん性細胞の無制御な成長および増殖に繋がる細胞シグナリング経路における崩壊によって特徴付けられる。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、これらのシグナリング経路において極めて重要な役割を果たし、細胞外分子シグナルを、細胞の細胞質および／または核の中へ送る。事実上すべての組織タイプの細胞は、チロシンキナーゼ活性を内在する膜貫通受容体分子を発現し、それを通じて、様々な成長因子および分化因子が、広範な生物学的効果を仲介する（Aaronson, Science 254: 1146-52 (1991)の総説）
【０００６】
チロシンキナーゼの触媒活性は頻繁に、活性化セグメントと呼ばれるキナーゼドメイン領域内の自己リン酸化によって刺激され（Weinmaster et al. (1984) Cell 37, 559-568）、実際にこれは、主要なメカニズム（これを通して、ＲＴＫが活性化される）と見なされてきた（Hubbard and Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69, 373-398 and Hubbard, (1997) EMBO J. 16, 5572-5581）。数種の受容体の単離されたキナーゼドメインの構造分析によって、活性化セグメントがキナーゼ活性をいかにして抑制するかと、リン酸化がこの自己阻害を解除する手段とが明らかとなった。不活性なインスリン受容体の場合、活性化セグメント中のＴｙｒ１１６２は、活性部位中へ突き出ており、活性化セグメントは、ＡＴＰ結合部位へのアクセスをブロックする（Hubbard et al., (1994) Nature 372, 746-754）。
【０００７】
Ｔｙｒ１１６２および２つの近接したチロシン残基の自己リン酸化は、活性化セグメントを再配置し、それによって外来基質を引き込むための活性部位を自由にして、触媒作用に必要な残基を機能的コンホメーション中へ認識させる。対照的に、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体の活性化セグメントは、相対的に動きやすく、受容体活性化の際にリン酸化されるチロシンは、活性部位を占有しない。しかしながら、ＦＧＦＲ１の活性化セグメントのＣ末端は、基質へのアクセスをブロックするように見える（Mohammadi et al. (1996) Cell 86, 577-587）。
【０００８】
本発明の範囲内の受容体チロシンキナーゼは、これらに限定されないが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＰＤＧＦ受容体、インスリン受容体チロシンキナーゼ（ＩＲＫ）、Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、インスリン受容体、インスリン成長因子（ＩＧＦ−１）受容体、ＴｒｋＡ受容体、ＴＩＥ−１、Ｔｅｋ／Ｔｉｅ２、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ−１、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ−２）、ＥＲＢＢ３（ＨＥＲ−３）、ＥＲＢＢ４（ＨＥＲ−４）、Ｒｅｔ、Ｋｉｔ、Ａｌｋ、Ａｘｌ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＥｐｈ受容体を含む。
【０００９】
様々なヒト悪性腫瘍と成長因子−ＲＴＫシグナル経路の崩壊との間に、生物学的な関連性が存在することが知られている。例えば、ＥＧＦＲファミリー受容体の過剰発現は頻繁に、乳癌、膀胱癌、肺癌および胃癌などの侵襲性の強いさまざまなヒト上皮癌で観察される（例としてNeal et al., Lancet 1: 366-68 (1985)；Sainsbury et al., Lancet 1: 1398-1402 (1987)を参照）。同様に、ＨＥＲ２の過剰発現はまた、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、膀胱癌および肺癌を含む他のヒト癌とも相関がある（例としてYokota et al., Lancet 1: 765-67 (1986)；Fukushigi et al., Mol. Cell. Biol. 6: 955-58 (1986) を参照）。
【００１０】
かかるＲＴＫのリン酸化は、それらの細胞質ドメインキナーゼ機能を活性化し、それによって下流のシグナリング分子が順に活性化される。ＲＴＫはしばしば、個別のチロシン残基などの複数の異なる部位にてリン酸化される。これらの酵素は、がんの処置に対する潜在的な薬物標的として評判になりつつある。例えばＥＧＦＲのインヒビターであるIressa（商標）は近頃、乳がんの処置に対する臨床治験に入った。同様に、ＢＣＲ／ＡＢＬのインヒビターであるGleevec（商標）は今や、ＣＭＬの処置のために広く使用されている。従来の化学毒性治療または放射線治療(chemotoxic or radiation therapies)に対する、単一のタンパク質の活性を変えようとする標的治療法(targeted therapeutics)の大きな利点は、それらが、調節解除された細胞を特異的に標的にすることであり、したがって、それらは、広い細胞毒性も、現在の治療に見られる有害な副作用も有するべきではない。細胞の異常な増殖、分化および／または機能不全は、多くの疾患の要因と考えられている。タンパク質キナーゼおよび関連分子は、それらが大変重要な薬物標的となるように、これらの細胞を制御するのに重要な役割を果たす。
【００１１】
タンパク質キナーゼは、細胞増殖および外部刺激に対する他の応答を制御する細胞のシグナリングカスケードの極めて重要な構成要素である。これらのシグナリングカスケードをキナーゼの阻害を通して調整することは、がん、炎症、糖尿病および脳卒中を含む多くの疾患および状態に影響を及ぼす可能性がある。
【００１２】
がんは、西欧諸国において、死因の第２位である。診断および処置の進歩にかかわらず、患者の全生存は不良のままである。近年の科学の進歩によって、がんの生物学の我々の理解が深まりつつある。ヒトタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、ヒト発癌において中心的役割を果たし、有望な新しい標的として浮上してきた。チロシンキナーゼを阻害するためのいくつかのアプローチが開発されている。これらの剤は、前臨床研究における優れた抗がん効果を示し、臨床において有望な剤として現れつつある。慢性骨髄性白血病の処置における、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼインヒビターであるイマチニブ（Gleevec（商標））の目覚ましい成功によって、この分野の精力的な研究がとくに刺激された。少なくとも３０個のインヒビターが、がんの臨床開発の様々なステージにあり、約１２０の臨床治験が世界中で行われている。これらの剤の可能性を十分に評価するための革新的なアプローチが必要とされており、願わくは近い将来、国際的な協力が、がん治療におけるこれらのインヒビターを完全なものにするのに役立つであろう。
【００１３】
タンパク質キナーゼは結果として、創薬にとって最も大きな標的ファミリーの１つとなっている。それ故に、患者の転帰を改善するより新しくより効果的な治療を開発する差し迫ったニーズがある。
【００１４】
近年の急速な科学の進歩は、がんの生物学の我々の理解を深めた。その結果、いくつかの新規標的が同定された。チロシンキナーゼが、がん治療の新しい有望な標的として浮上した。多くの小分子キナーゼインヒビターが現在開発中であり、Gleevec（商標）（Novartis；白血病、胃腸腫瘍）およびIressa（商標）（AstraZeneca；肺がん）は、キナーゼの阻害を非常に有望な治療戦略として、正当なものとして認めた(validated)。
【００１５】
ヒトゲノム配列分析は、約５１８個のヒトタンパク質キナーゼ（全ヒト遺伝子の約１．７％を構成する）を同定した。この大きなタンパク質キナーゼ補集合(complement)内で、少なくとも９０個のチロシンキナーゼ遺伝子が同定された（５８個の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ、表１）および３２個の非受容体チロシンキナーゼ（ＮＲＴＫ、表２））。それらが開始する細胞シグナリング経路は複雑である（Schlessinger J. et al.Cell 103 (2000), pp. 211-225）。簡潔には、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、アミノ末端の細胞外リガンド結合ドメイン（通常グリコシル化されている）、疎水性膜貫通ヘリックスおよび細胞質ドメイン（保存的タンパク質チロシンキナーゼのコアおよび追加の調節配列（極めて重要なＣ末端チロシン残基および受容体調節モチーフを含有する）を含有する）を含有する。
【００１６】
細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へ結合するリガンド（ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−、またはその他のもの）は、受容体の二量体化／オリゴマー化をもたらして、細胞質チロシンキナーゼ活性の活性化およびチロシン残基のリン酸化に繋がる（Schlessinger et al., Neuron (1992) 9:383-391）。自己リン酸化されたチロシン残基は、多様な細胞シグナリング応答を調整する一連の特異的なシグナル伝達タンパク質（ＳＨ２（Src homology 2）およびＰＴＢ（ホスホチロシン結合）ドメインを含有するタンパク質など）の認識および動員のためのプラットホームとして働く。非受容体チロシンキナーゼは、一般的な保存的触媒ドメイン（ＲＴＫと類似する）を、種々のアダプタータンパク質モチーフを有するモジュール式のＮ末端に有する。
【００１７】
チロシンキナーゼは、細胞の発生、分化、増殖、生存、成長、アポトーシス、細胞形状、接着、移動、細胞周期制御、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、血管新生、細胞外刺激に対する応答、神経伝達物質シグナリング、血小板活性化、転写およびグルコースの取り込みを含む、基本的な細胞プロセスの調節において、重大な役割を果たす（Hunter T.Philos. Trans. R. Soc. Lond., B Biol. Sci. 353 (1998), pp. 583-605）。正常なホメオスタシスにおけるそれらの極めて重要な役割を考えると、それらが、発生異常（頭蓋骨癒合症候群など）、免疫不全（重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、遺伝性の無ガンマグロブリン血症）、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、アテローム性動脈硬化、乾癬、腎疾患、神経学的障害、白血病および固形腫瘍を含む、いくつかのヒト障害に関与していることは、おそらく驚くべきことではない（Madhusudan S. and Ganesan TS. Clin Biochem. 2004 Jul;37(7):618-35）。
【００１８】
【表１−１】
2017513002.tif 000002
【００１９】
【表１−２】
2017513002.tif 000003
【００２０】
【表１−３】
2017513002.tif 000004
【００２１】
【表２−１】
2017513002.tif 000005
【００２２】
【表２−２】
2017513002.tif 000006
【００２３】
チロシンキナーゼは、細胞の発がん性形質転換において中心的役割を果たす。これは、いくつかのやり方で達成される（Blume-Jensen P. et al.Nature 411 (2001), pp. 355-365）。ＰＴＫの遺伝子増幅および／または過剰発現（例としていくつかのがんにおいて一般的に見られるＥＧＦＲおよびＨＥＲ−２の過剰発現）は、定量的かつ定性的に変えられた下流のシグナリングによって高められたチロシンキナーゼ活性を引き起こす。ゲノム再編成（染色体転座など）は、恒常的に活性のあるキナーゼ活性を持つ融合タンパク質（例として慢性骨髄性白血病に見られるｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質）をもたらし得る。ＰＴＫのキナーゼドメイン中または細胞外ドメイン中の機能獲得型（ＧＯＦ）突然変異または欠失は、恒常的に活性のあるチロシンキナーゼをもたらす（例として細胞外ドメインのアミノ酸６〜２７３個を欠くＥＧＦＲｖＩＩ突然変異体は、恒常的に活性があり、固形腫瘍中に見られる）。リガンドの過剰発現による自己分泌−傍分泌(autocrine-paracrine)刺激は、持続性のチロシンキナーゼ刺激をもたらす（例としてＴＧＦ−は、膠芽細胞腫および頭頸部がんで過剰発現される（Grandis J.R. et al. J. Cell. Biochem. 69 (1998), pp. 55-62））。最終的に、ＰＴＫに対応するがん原遺伝子のレトロウイルス形質導入によって、構造的変化の調節解除が付随するが、それは高頻度に見られるメカニズムであり、それによって発がん性の形質転換が動物（齧歯動物およびニワトリ）に生じる（Blume-Jensen P. et al.Nature 411 (2001), pp. 355-365）。
【００２４】
相当数のチロシンキナーゼ（受容体および非受容体の両方のタイプ）が、がんと関連する。臨床研究により、チロシンキナーゼの過剰発現／調節解除が、患者の予後／予測に価値があり得る（すなわち、侵襲性の強い腫瘍生物学を示し得るか、または、治療に対する反応不良およびより短期間の生存を予測し得る）ことが示唆される。チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーは、最も広く調査されている。ＥＧＦＲ（ＨＥＲ−１）過剰発現は、卵巣の、頭頸部の、食道の、子宮頸の、膀胱の、乳房の、結腸直腸の、胃の、および、子宮内膜のがんにおける予後不良に関連する（Nicholson R.I et al.Eur. J. Cancer 37 Suppl. 4 (2001), pp. S9-S15）。ＨＥＲ−２過剰発現は、乳房の（Tandon A.K. et al. A.K. Clin. Oncol. 7 (1989), pp. 1120-1128）、卵巣の（Meden H. et al. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 71 (1997)）、前立腺の（Sadasivan R. et al. J. Urol. 150 (1993), pp. 126-131）、肺の（Selvaggi G. et al. Cancer 94 (2002), pp. 2669-2674）および骨の（Zhou H. et al. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 25 (2003), pp. 27-32）がんを持つ患者の転帰がより不良であることと関連する。
【００２５】
Ｃ−ＫＩＴチロシンキナーゼの突然変異は、消化管間質腫瘍を持つ患者の劣った生存と関連し（Taniguchi M. et al. Cancer Res. 59 (1999), pp. 4297-43）、急性骨髄性白血病の再発率に有害な影響を与える（Care R. S. et al. Br. J. Haematol. 121 (2003), pp. 775-777）。小細胞肺がんにおいて、Ｃ−ＫＩＴ発現は、生存の不良と繋がりがあった（Naeem M. et al. Hum. Pathol. 33 (2002), pp. 1182-1187）。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２と一緒のＩＧＦ−１Ｒの発現は、直腸結腸がん患者の下位群の予後に価値を有し得る（Peters G. et al. Virchows Arch. (2003)）。急性骨髄性白血病において、ＦＬＴ３突然変異によって、より高い再発率およびより短期間の無症候生存が予測される（Schnittger S. et al. Blood 100 (2002), pp. 59-66）。ＶＥＧＦは、腫瘍の血管新生に至らせる中心的な成長因子であり、固形腫瘍において重要な予後マーカーである（Fox S. B. et al. Lancet Oncol. 2 (2001), pp. 278-289）。近頃の研究によって、肺がんにおけるＶＥＧＦＲ３発現が、有意に低い生存率と関連すること（Arinaga M. et al. Cancer 97 (2003), pp. 457-464）、および、結腸直腸がんにおいて、それが予後的意義を有し得ること（Parr C. et al. Int. J. Oncol. 23 (2003), pp. 533-539）が示唆される。
【００２６】
Ｔｒｋチロシンキナーゼは、神経芽細胞腫（ＮＢ）に重要なマーカーである。ＴｒｋＡは、有利な生物学的特徴を持つＮＢ中に存在し、患者生存と非常に相関がある一方で、ＴｒｋＢは主に、ＭＹＣＮ増幅を持つ不利で侵襲性の強いＮＢに発現される（Eggert A. et al. Klin. Padiatr. 212 (2000), pp. 200-205）。ＨＧＦＲ（Ｍｅｔ）過剰発現は、疾患の進行、再発と関連し、早期浸潤子宮頸がんにおける劣った生存（Baycal C. et al. Gynecol. Oncol. 88 (2003), pp. 123-129）は、滑膜肉腫の予後不良と相関があり（Oda Y. et al. Hum. Pathol. 31 (2000), pp. 185-192）、肝細胞の癌の５年生存が有意に短期間であることを予測する（Ueki T. et al. Hepatology 25 (1997), pp. 862-866）。Ａｘｌチロシンキナーゼ発現は、急性骨髄性白血病の不良転帰と関連した（Rochlitz C. et al. Leukemia 13 (1999), pp. 1352-1358）。Ｔｉｅ−１キナーゼ発現は、胃がん（Lin W. C. et al. Clin. Cancer Res. 5 (1999), pp. 1745-1751）および初期の慢性期の慢性骨髄性白血病（Verstovsek S. et al. Cancer 94 (2002), pp. 1517-1521）の生存と逆相関がある。
【００２７】
可溶性Ｔｉｅ−２受容体レベルは単独で、頭頸部の扁平上皮細胞の局所領域の再発を予測する（Homer J.J. et al. Head Neck 24 (2002), pp. 773-778）。ＡＬＫタンパク質発現は、生存の独立予測因子であり、未分化大細胞リンパ腫のスペクトル(spectrum)内で特定の疾病の有用な生物学的マーカーとして働く（ALCL, Gascoyne R. D. et al. Blood 93 (1999), pp. 3913-3921）。Ｓｒｃチロシンキナーゼは、全ステージのヒト結腸癌における臨床予後不良の独立した指標である（Aligayer H. et al. Cancer 94 (2002), pp. 344-351）。ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼは、予後に価値があり、慢性骨髄性白血病（Olavarria E. et al. Blood 97 (2001), pp. 1560-1565およびO'Dwyer M., et al. Oncologist 7 Suppl. 1 (2002), pp. 30-38）および急性リンパ芽球性白血病（Gleissner B. et al. Blood 99 (2002), pp. 1536-1543）を含む血液悪性腫瘍の治療に対する応答を予測する。ＦＡＫ過剰発現は、食道扁平上皮細胞癌における腫瘍の浸潤性およびリンパ節転移と相関があり（Miyazaki, T. et al. Br. J. Cancer 89 (2003), pp. 140-145）、Ｓｙｋ遺伝子の発現減少は、乳がんの予後不良と相関がある（Toyama T. et al. Cancer Lett. 189 (2003), pp. 97-102）。
【００２８】
チロシンキナーゼを標的にするいくつかのアプローチが開発されている。チロシンキナーゼドメインインヒビター、チロシンキナーゼ受容体ブロッカー（例としてモノクローナル抗体）、リガンドモジュレーター（例としてモノクローナル抗体）、ＲＮＡ干渉およびアンチセンス技術、遺伝子治療戦略、チロシンキナーゼのインヒビター、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター、下流のシグナル伝達経路インヒビターは、がん治療の潜在的な戦略である。かかるインヒビターの、それらの作用様式に基づく分類は、表３に要約される。受容体チロシンキナーゼは、マルチドメインタンパク質である。触媒ドメイン（Ｍｇ−ＡＴＰ複合体結合部位）は近年、薬物設計に最も有望な標的として浮上してきた。化合物ライブラリーのランダムスクリーニングは最初、触媒ドメインの小分子の化学的インヒビターを同定した。
【００２９】
コンビナトリアル・ケミストリー、in-silicoクローニング、構造に基づく薬物設計および計算科学は今や、リード化合物の同定およびこれらのインヒビターの最適化における必須のツールとなっている。インヒビターをスクリーニングするための高感度で正確かつ確実なハイスループットアッセイが開発された（シンチレーション近接アッセイ、蛍光偏光アッセイ、ホモジニアス時間分解蛍光アッセイおよびヘテロジニアス時間分解解離強化(dissociation-enhanced)蛍光技術（F.A. Al-ObeidiおよびK.S. Lam, Oncogene 19 (2000), pp. 5690-5701）を含む）。タンパク質キナーゼの三次構造についての知識が拡張され、５０を超えるタンパク質キナーゼについてＸ線結晶学的構造が解決した。「ＡＴＰ結合部位」の様々な部分（アデニン領域、糖領域、疎水性ポケット、疎水性チャネルおよびホスファート結合領域）の分子相互作用への理解によって創薬が加速した（Fabbro D. et al.. Pharmacol. Ther. 93 (2002), pp. 79-98）。
【００３０】
【表３−１】
2017513002.tif 000007
【００３１】
【表３−２】
2017513002.tif 000008
【００３２】
ＡＴＰ結合部位はチロシンキナーゼの間で高度に保存されているが、キナーゼドメインアーキテクチャーの小さな差は、高度に選択的なインヒビターの開発を可能にした（Levitzki A. Eur. J. Cancer 38 Suppl. 5 (2002), pp. S11-S18）。ＥＧＦＲの、そのインヒビターＯＳＩ−７７４（Tarceva（登録商標））との共結晶化のデータが近頃公開され、この化合物の作用メカニズムへの有益な洞察を提供する（Stamos J. at al. J. Biol. Chem. 277 (2002), pp. 46265-46272）。臨床開発中のほとんどの小分子は、それらの足場(scaffold)の一部を使用することでＡＴＰのアデニン部分の結合を模倣して、それらの標的キナーゼのＡＴＰ結合部位の近くに結合する。ＡＴＰのかかる模倣は、触媒ドメイン内の基質結合部位の競合インヒビターであり（Laird A.D. et al. Expert Opin. Invest. Drugs 12 (2003), pp. 51-64およびFry D.W. Exp. Cell Res. 284 (2003), pp. 131-139）、結合のために内因性ＡＴＰ（細胞中ミリモラーレベルでしばしば存在する）と競合する。
【００３３】
初期の有力なリード化合物は可溶性が低く、最適な標的阻害を必要とする患者において適切な血漿レベルを達成かつ維持するために延長された複数の投薬スケジュールを必要とするものであった。可溶性を上げるため、新しい化合物が生成されたが、それらはキナーゼドメインへの親和性を低下させた。これらの問題を回避するため、選択的インヒビターのキナーゼドメインへの共有結合的付着が完全に触媒活性を消失させ、かつ有力な薬物に転換するであろうという希望を抱きつつ、不可逆的インヒビターは今も開発中である（Denny W.A. et al. Pharmacol. Ther. 93 (2002), pp. 253-261）。かかる２つのインヒビターは、開発が進んだ段階にあり、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ−２夫々に不可逆的に結合するＣＩ−１０３３（Pfizer）およびＥＫＢ−５６９（Wyeth）である。
【００３４】
１以上のチロシンキナーゼを標的にする小分子もまた開発され、それらは、複数の経路をブロックし、かつ強化された抗がん効果を生む可能性がある（表３）。ＰＫＩ−１６６はＥＧＦＲを阻害し、ＨＥＲ−２（Mellinghoff I.K. et al. Cancer Res. 62 (2002), pp. 5254-5259CI-1033）は、汎ＥｒｂＢインヒビターであり（Slichenmyer, W.J. et al. Semin. Oncol. 28 (2001), pp. 80-85）、ＳＵ６６６８は、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲを阻害し（Hoekman K. et al. 7 Cancer J. Suppl. 3 (2001), pp. S134-S13）、ＳＴＩ５７１は、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｃ−ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲおよびＡＲＧを阻害する（Buchdunger, E. et al. Eur. J. Cancer 38 Suppl. 5 (2002), pp. S28-S36.およびNishimura N. et al. Oncogene 22 (2003), pp. 4074-4082）。
【００３５】
１９８０年代に、最初の天然チロシンキナーゼインヒビターであるケルセチンおよびゲニステインが報告された（Akiyama T. et al. J. Biol. Chem. 262 (1987), pp. 5592-5595およびJ. Mendelsohn J. J. Clin. Oncol. 20 (2002), pp. 1S-13S）。
それ以来、圧倒的な数の天然および合成の小分子インヒビターが記載されている。チロシンキナーゼインヒビターは、天然の産物および関連誘導体（ケルセチン、ゲニステイン、スタウロスポリン、エルバスタチン(erbastatins)、クラビラクトン(clavilactones)）；キナゾリン、ピリドピリミジンおよび関連複素環（例としてＺＤ１８３９）；フェニルアミノ−ピリミジン（例としてＳＴＩ５７１）；チロホスチンおよび類似体（例としてＳＵ１４９８、ＳＵ１０１、ＳＵ００２０）；インドールおよびオキシインドール（例としてＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ５４０２；F.A. Al-ObeidiおよびK.S. Lam, Oncogene 19 (2000), pp. 5690-5701）へ、広範囲に分類され得る。
【００３６】
小分子キナーゼインヒビターの開発における大きな差の１つは、特異性である（McMahon et al. (1998) Curr. Op. in Drug Discovery and Dev.1(2), 131-146）。ほとんどの化合物は現在、キナーゼの高度に保存されたＡＴＰ結合部位を標的にしており、したがって、クラスの１種類を超える酵素に結合し阻害する傾向にある。なぜなら、ヒトタンパク質キナーゼは５００個超もあり（Manning et al., Science (2002) 298, 1912）、複数のキナーゼ（または「誤った」キナーゼ）の阻害が有害な結果に繋がり得ることから、化合物の特異性を査定することは重大である。しかしながら、ほとんどの「オフ・ターゲット」相互作用が予測不能であり、キナーゼのための従来の実験的活性アッセイの開発が大変時間がかかり、資源集約的であるという問題が存在する。結果として、化合物の特異性が査定に重大に重要であるとしても、包括的かつ体系的にそうすることは、不可能でないとしても、極端に困難である。
【００３７】
タンパク質キナーゼは、真核細胞中の最も多くの細胞シグナリング経路の肝要な調節因子である。多くのタンパク質キナーゼインヒビターは、シグナリング経路中のかつ潜在的な治療剤としてのキナーゼの特異的な機能を研究するために開発された（Cohen, P. (2002) Nat. Rev. Drug Discov. 1, 309-315）。大きなサイズのタンパク質キナーゼスーパーファミリー（＞５００  ヒト）およびほとんどのキナーゼインヒビターが高度に保存されたＡＴＰ結合ポケット中に結合するという事実のため、キナーゼインヒビターは、１個を超える標的を阻害することが広く認められる（Davies, S. P., Reddy, H., Caivano, M. & Cohen, P. (2000) Biochem. J. 351, 95-105）。結果として、ほとんどよく理解されていないシグナリング経路中のキナーゼの役割を探るための化学的ツールとして使用されるインヒビターは逆説的に、不完全に特徴付けされた特異性がある。同じことがキナーゼアクチベーターにも当てはまる。本発明はまた、１キャビティ中の複数のキナーゼのキナーゼアクチベーターの並行するプロファイリングにも使用可能である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の好ましい態様
上で留意された困難性は、ヒトキナーゼの大変大きな一団（１キャビティ中、最大５００個まで）に対して多くの化合物を試験することを可能にするアッセイ形式(format)によって解決される。キャビティは、マイクロタイタープレート、バイアル、ペトリディッシュまたは方法に記載のアッセイが実施され得る別の容器であり得る。アッセイによって、特異性を効率的、定量的、包括的および体系的に査定することが可能になる。たった少数のキナーゼに対する試験に基づき化合物の特異性を著しく見積もることは、もはや不要である。特異性プロファイリングは、創薬プロセスの早期におよび開発全体の経路に沿って組み込まれ得、特異性は、多くのより多くの化合物に対して体系的かつ迅速に査定され得る。この空前の技量(ability)によって、医薬品化学と分子試験との間の密接なフィードバックが可能となる。有効性および特異性が並行して最適化され得ることで、より短い時間でより質の高い前臨床候補がもたらされる。
【００３９】
既存の後期候補または薬物について包括的に特異性を評価することはまた、証明されたこれらの化合物に対する、今まで知られていなかった標的をも明らかにし得る。いくつかのケースにおいては、新しい標的の同定が、新しい適応症を示唆し得るが、他のケールにおいては、知られている当初の標的によって説明されない副作用の原因を明らかにし得る。
【００４０】
本発明の主題は、小分子キナーゼインヒビターまたはアクチベーターの開発における主要なボトルネックの１つに対処し、かつ、新しい薬物のこの重要なクラスの開発に主要な影響を及ぼす見込みがある、特異性プロファイリングに対する新規なアプローチである。
本発明の主題は、チロシンキナーゼの自己リン酸化の検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）技法を、組織サンプル中の特定タンパク質の同定のためのLuminex（商標）-xMAP検出システムと組み合わせるアッセイである。組織サンプルは、これらに限定されないが、細胞ライセート、生検ホモジネート、腫瘍生検ホモジネート、疾患組織ホモジネート、血液細胞のライセートを意味する。
【００４１】
Luminex-xMAP技術は、３種の蛍光色素の正確な比率を使用することで、各々別の色素を保有し、特有の内部蛍光色素比率により特徴付けられる、５００個の異なるビーズセットまたはミクロスフェアセットを作り出す、実績のある多重化プラットホームである。この色素比率は、各ミクロスフェアセットにつき同定コードとして使用される。この理由によって、各ミクロスフェアセットは、個別に測定され得、したがって、特有の分析物を同時に同定するために使用され得る。これは、理想的な場合において、５００種の分析物が、１キャビティ中または１サンプル中、同じ時点で測定され得ることを意味する。
【００４２】
ビーズまたはミクロスフェアは、分析物に特異的な特有の捕捉分子（例として抗体、ペプチド、受容体タンパク質）とその表面上で結合し得る固相として使用される。分析物が、特異的な捕捉分子へ結合した後、分析物の別の結合部位を標的にする第２分析物特異的分子が、検出のために使用される。この第２分子は直接、読出し標識と接合され得るか、または、高度に特異的なストレプトアビジンが接合された読出し標識によってさらに検出されるビオチンとカップリングされ得る。第４蛍光色素（フィコエリトリン）は一般に、ミクロスフェア同定のための内部色素と区別され得る読出し標識として使用される。
【００４３】
アッセイによって、例として１キャビティ中の細胞ライセートからのリン酸化されていないキナーゼの総量(the total amount)を含む、種々のキナーゼ中の最大５００個までの異なるリン酸化部位に対する潜在的キナーゼインヒビターの存在下で、ＲＴＫまたはＮＴＫの自己リン酸化の存否を検出することが可能となる。アッセイ形式によって、１キャビティ内のリン酸化状態を検出することによる、種々のチロシンキナーゼ中の最大５００個までの異なるリン酸化部位に対する潜在的キナーゼインヒビターのプロファイリングが可能となる。例えばアッセイによって、９６ウェルプレート中サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、１ウェルあたり種々のキナーゼ中の最大５００個までの異なるリン酸化部位の組み合わせに対するＨＴＳからの、９６個の異なる潜在的キナーゼインヒビターについてプロファイリングを実施することが可能となる。例えば最大８個までの異なるリン酸化部位は、１キナーゼにおいて同時に測定され得る。
【００４４】
対象のチロシンキナーゼの活性化（すなわち自己リン酸化）を測定するためのアッセイは、EP0730740に記載されており、以下のステップを含む：
ａ）第１固相が、細胞培養物または動物材料からの実質的に均一な細胞集団を用いて、細胞が第１固相へ付着するように、コートされる。細胞は、内因性チロシンキナーゼを有しているか、あるいは、チロシンキナーゼコンストラクトが細胞膜中または細胞の細胞質中に提示されるように、チロシンキナーゼをコードするＤＮＡで形質転換されてＤＮＡが発現されているか、のいずれかである。ｂ）次いでリガンドが、チロシンキナーゼがリガンドに露出されるように、付着している細胞を有する固相へ加えられる。ｃ）リガンドへの露出の後、付着細胞が可溶化され、それによって細胞ライセートが放出される。ｄ）第２固相が、チロシンキナーゼに対してまたは受容体コンストラクトの場合はポリペプチドエピトープタグに対して特異的に結合する特異抗体としての捕捉剤でコートされる。ｅ）ステップｃ）で得られた細胞ライセートが、付着している捕捉剤を含有するウェルへ、チロシンキナーゼを捕捉するためにウェルへ加えられる。ｆ）次いで洗浄ステップが、結合しない細胞ライセートを除去するために行われ、捕捉されたチロシンキナーゼが放出される。ｇ）捕捉されたチロシンキナーゼコンストラクトは、チロシンキナーゼ中のリン酸化された残基を同定する標識抗ホスホチロシン抗体へ露出される。ｈ）抗ホスホチロシン抗体の、捕捉されたチロシンキナーゼへの結合が測定される。
【００４５】
１ウェル中の最大５００個までのチロシンキナーゼの自己リン酸化状態の並行検出を可能にする本発明に使用される捕捉剤は、Luminex（商標）-xMap技術に由来するものであった。捕捉剤は、結合タンパク質がコートされたビーズまたはミクロスフェアであり得る。結合タンパク質は、ほとんどの場合、典型的には、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの生体分子であろう。生体分子は任意に、天然の、組み換えの、または、合成の生体分子であってもよい。抗体または抗体フラグメントは、タンパク質捕捉剤として非常に好適である。結合タンパク質はまた、アプタマーまたはアンチカリンまたはいずれか他の結合分子でもあり得る。Luminex（商標）-xMap技術は、２つの蛍光色素の正確な比率を使用することで、２つの蛍光色素の比率によって特徴付けられ各々別の色素を保有する１００個の異なるビーズセットまたはミクロスフェアセットを作り出す、実績のある多重化プラットホームである。各セットは、２つの異なる色素の内部蛍光色素比率に基づき区別され、したがって、特定のチロシンキナーゼに対する特異抗体またはモノクローナル抗体としての特有の生物学的試薬に結合し得る。ビーズまたはミクロスフェアの表面に結合された抗体は、前述のサンドイッチＥＬＩＳＡ試験において捕捉試薬として働く。種々のキナーゼに特異的な種々の抗体は、各特異抗体−ミクロスフェア複合体に対し種々の色をもたらす種々の蛍光色素比率で、ビーズ表面と境を接する。蛍光色は、一定のキナーゼの特定のエピトープを認識かつ結合する特異抗体に対する抗原として働く特定のキナーゼに割り当てられ得る。
【００４６】
リン酸化されたチロシンを認識するホスホ特異抗体は一般に、チロシンキナーゼの自己リン酸化の測定のために使用された。ホスホ特異抗体は、ビオチン化されており、ミクロスフェアの蛍光色素とは区別され得る、ストレプトアビジンとカップリングされた第２蛍光標識（例としてフィコエリトリン）によって検出され得る。
【００４７】
修飾部位および非修飾部位の特異抗体は広く市販されており（例として、Cell Signaling Technology、Epitomics、R&D Systems,.；BioSource, Inc.；Santa Cruz；Biotechnology, Inc.；Merck Milliporeから）、当該技術分野において周知の技法によってもまた産生されてもよい。ウサギおよびマウスからのモノクローナル抗体は、それらの特有な標的特異性のため、捕捉抗体として好ましいはずである。
【００４８】
未処理サンプルからの修飾分析物（例としてリン酸化されている、メチル化されている）の検出のための、これまでに唯一の利用可能なアッセイ形式（「標準アッセイ形式」と表される）は、ミクロスフェア上の総分析物に特異的な抗体（非修飾分析物および修飾分析物に対し等しく結合する）による捕捉と、対象の修飾部位に特異的な抗体または標的に非特異的な汎ホスホチロシン検出抗体による検出とを使用するものである。このアッセイ形式における検出閾値は、サンプル中の分析物の総濃度と、非修飾分析物と修飾分析物との間の比率との組み合わせである。ほとんどのサンプル中において修飾分析物が少量(low abundance)であるせいで、結合された分析物の大多数は、非修飾状態にある。この理由から、捕捉された少量(small amount)の修飾分析物は、測定され得なかった。捕捉分子が、修飾分析物または非修飾分析物ともに同一であるという事実から、分析物のことなる形態の測定は、２つの独立したキャビティまたはアッセイにおいて実施される必要がある。つまり、１サンプルにおける同時測定は不可能であり、結果は、２つの異なるアッセイ設定（希釈、操作）によって影響を受けることもあり得る。
【００４９】
好ましい逆(inverse)アッセイ形式は、ミクロスフェアに対して特異的である対象の修飾部位を持つ分析物にしか結合しない修飾部位特異抗体を使用する。別の修飾部位を持つ同じ分析物または非修飾分析物は、このビーズセット上では捕捉されない。ミクロスフェア上に捕捉された分析物を検出するために、分析物上の非修飾部位特異的領域へ結合する抗体が使用されるが、該抗体は、直接的に読出し標識へ接合され得るかまたはビオチンへカップリングされ得る。前記の標準アッセイ形式におけるように、ビオチンはさらに、ストレプトアビジンと接合された読出し標識によって検出される。この第４蛍光色素（フィコエリトリン）は一般に、読出し標識として使用され、ミクロスフェア同定のための内部色素とは識別可能である。修飾部位特異的分子による特異的な捕捉によって、同一であるが非修飾である分析物に結合する別の同定コードを持つ第２ミクロスフェアとの組み合わせが可能である。
【００５０】
この逆アッセイ形式の理由から、非修飾分析物および修飾分析物は、サンプルを処理する必要なく、１キャビティ中で同時に測定され得る。その上、この同じ分析物上の他の修飾部位は、第３の、第４のまたはそれ以上のミクロスフェアセット上で同等に測定され得、同一サンプルにおいて互いに区別され得る。これによって将来、個別の分析物の異なる修飾部位に厳密に依存する活性化状態に関し、そのより複雑な分析が可能となる。特有の多重化の可能性に加えて、修飾分析物のための新しい逆アッセイ形式の感度は、従前の標準アッセイ形式と直接比較すると、劇的に向上されている。この改善された検出閾値は、EP0730740およびUS7981699B1に記載の先行技術の標準アッセイ形式（「標準アッセイ形式」と表される）においては現在不可能な針生検等の大変小さいサンプルサイズの測定を将来可能にするであろう。
【００５１】
捕捉された各キナーゼの自己リン酸化は、特有の蛍光色素で着色された全ミクロスフェアと、ビオチン化された抗ホスホチロシン抗体に結合するストレプトアビジンがカップリングした蛍光マーカーとを検出することが可能である機器によって分析される。これらの機器は、先行技術分野において周知である。Luminex（商標）機器は、種々の蛍光レポーターシグナルを検出する。Luminex（商標）機器において、ビーズは、２つのレーザービームを速やかに通過するが、ここで高速デジタルシグナルプロセッサは、２つの蛍光シグナル（ミクロスフェアからのシグナルと抗ホスホチロシン抗体のシグナル）または１つの蛍光シグナル（ミクロスフェアからのシグナルのみ）を持つビーズ間を区別する。
【００５２】
自己リン酸化事象の場合、ホスホ特異抗体は、特定のビーズに結び付けられた特異抗体によって捕捉されたリン酸化されたキナーゼに結合することが可能であり、２つの蛍光シグナルが検出され得る。自己リン酸化事象を欠く場合、ミクロスフェアシグナルのみが、レーザーによって検出可能である。３つの異なる利用可能なLuminex（商標）機器内において、最大５００個までの異なるミクロスフェアセットの測定のためのFlexMAP 3Dが、高性能アナライザー中に築かれる。この機器はまた、標準９６ウェルプレートに加えて３８４ウェルプレートを測定するためにも作り出される。初代Luminex-200（商標）機器は、１００個の異なるミクロスフェアセット間を区別することができるが、MAGPIXは、５０個の異なる磁性ミクロスフェアセットにしか適さない。この新しい卓上アナライザーは、例えば臨床研究における、より小さなアッセイ形式に好適である。
【００５３】
自己リン酸化をブロックするであろう加えられた特定のキナーゼインヒビターによって阻害される試験細胞ライセート中の全キナーゼは、ミクロスフェアシグナルのみを示し、試験されたキナーゼインヒビターによって阻害されるチロシンキナーゼとして認識され得る。試験されたキナーゼインヒビターは、両シグナル（ミクロスフェアからのシグナルと抗ホスホチロシン抗体のシグナル）を示すキナーゼを阻害しない。キナーゼインヒビターのない同一の対照細胞ライセートにおいて、試験ライセートにおいてたった１つのシグナルしか示さないキナーゼが、両シグナルを示す。これらのキナーゼは、試験された特定のインヒビターによって阻害される細胞ライセート中のキナーゼ群である。
【００５４】
細胞中のキナーゼの活性化は、組織培養研究所において広く使用される周知の技法である。ウシ胎仔血清または他の血清の枯渇によって、細胞が飢餓になるであろう。飢餓の後、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）または他の血清によって、キナーゼの活性化が誘導される。活性化はまた、例としてＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、インスリン、様々なインターロイキンおよびインターフェロンなどの成長因子およびサイトカインによっても誘導され得る。成長因子およびサイトカインは、複数キナーゼ誘導のためのカクテルとして適用される必要がある。活性化によって、種々のキナーゼの自己リン酸化がもたらされる。
【発明の概要】
【００５５】
主要な態様は、タンパク質またはポリペプチドを含む分析されるべきサンプルの分析物中の該タンパク質またはポリペプチドの修飾部位を検出するための方法であって、修飾部位が、リン酸化、自己リン酸化、メチル化、ヒドロキシル化、グリコシル化、ユビキチン化、アセチル化、プレニル化、アミド化またはＮ末端メチオニン検出からなる群から選択され、方法が、
（ａ）該修飾部位に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、検出マーカーとして働く色素と接合されているかまたはそれに結び付けられている、一次捕捉抗体を提供すること、ならびに、
（ｂ）該修飾部位とは異なる部位またはエピトープにおいて、該タンパク質に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、ステップ（ａ）の該色素とは識別可能な検出マーカーと接合されているかまたはそれに結び付けられている、二次抗体を提供すること、
（ｃ）（ａ）で使用されたのとは別の修飾部位に特異的であるかまたはそれへ結合し、かつ、ステップ（ａ）および（ｂ）の該色素とは識別可能な検出マーカーとして働く色素と接合されているかまたはそれに結び付けられている、三次捕捉抗体を提供すること。
【００５６】
別の好ましい態様は、本発明によって分析される修飾が、これらに限定されないが、ＭｅｔＡＰ１およびＭｅｔＡＰ２酵素活性の確認に関する、リン酸化、自己リン酸化、メチル化、ヒドロキシル化、グリコシル化、ユビキチン化、アセチル化、プレニル化、アミド化またはＮ末端メチオニン検出である。本発明によって分析される修飾は、これらに限定されないが、リン酸化、メチル化、ヒドロキシル化、グリコシル化、ユビキチン化、アセチル化、プレニル化またはアミド化である。
【００５７】
本発明の別の好ましい態様は、キナーゼインヒビターの存在下における、上の方法による１以上のキナーゼの自己リン酸化を、該キナーゼインヒビターの不在下と比較して、分析するための方法であって、方法は以下のステップ：
（ａ）血清枯渇によって細胞を飢餓にすること、
（ｂ）キナーゼインヒビターの存在下および不在下において、血清、成長因子および／またはサイトカインを加えることによって、キナーゼの自己リン酸化活性を誘導すること、
（ｃ）細胞を可溶化すること、それによって、細胞ライセートをそこから放出させること、
（ｄ）種々のホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニンと、種々の色素と接合された非修飾部位特異的結合タンパク質とを加えることによって、細胞ライセート中のキナーゼを捕捉すること、
【００５８】
ここで、種々の各結合タンパク質は、特有の色素に結び付けられており、
（ｅ）読出し標識と直接接合されているかまたはビオチンと直接カップリングされているキナーゼ上の非修飾部位特異的領域へ結合する抗体によって、特有の色素を有する自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、ｄ）から同定すること、ここで、抗体が、ｄ）で使用された結合タンパク質とは別の、キナーゼ中の非修飾部位特異的領域へ結合する必要があり、
（ｆ）キナーゼインヒビターの存在下での誘導の結果として生じるｅ）からの自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、該キナーゼインヒビターの不在下での誘導の場合と比較すること、ならびに、個々のキャビティにおける非修飾キナーゼレベルとの直接比較において、ｅ）からの自己リン酸化されたキナーゼを比較すること、これにより、個々の分析物の規格化が可能となる。
【００５９】
別の好ましい態様は、分析された修飾が、ＭｅｔＡＰ１およびＭｅｔＡＰ２酵素活性の確認を検出する、上記方法である。
使用される色素は好ましくは、これらに限定さないが、蛍光色素またはルミネセンス色素である。
本発明の別の部分は、ステップｂ）の下で、キナーゼインヒビターの代わりにキナーゼアクチベーターが試験される方法である。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、受容体チロシンキナーゼの下流の１以上のタンパク質キナーゼのリン酸化を測定するための方法である。これらのリン酸化は、上流キナーゼの自己リン酸化またはリン酸化である。キナーゼは、これらに限定されないが、セリンキナーゼ、トレオニンキナーゼまたはヒスチジンキナーゼであり得る。
【００６１】
本発明のさらなる態様は、キナーゼインヒビターの存在下で、受容体チロシンキナーゼの下流の１以上のタンパク質キナーゼのリン酸化および／または自己リン酸化を、該キナーゼインヒビターの不在下と比較して測定するための方法であって、方法は以下のステップを含む：
（ａ）血清枯渇によって細胞を飢餓にすること、
（ｂ）キナーゼインヒビターの存在下および不在下において、血清、成長因子および／またはサイトカインを加えることによって、キナーゼの自己リン酸化活性を誘導すること、
（ｃ）細胞を可溶化すること、それによって、細胞ライセートをそこから放出させること、
（ｄ）種々のホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニンと、種々のミクロスフェアと接合された非修飾部位特異的結合タンパク質とを加えることによって、細胞ライセート中のキナーゼを捕捉すること、
【００６２】
ここで、種々の各結合タンパク質は、特有の色素に結び付けられており、
（ｅ）読出し標識と直接接合されているかまたはビオチンと直接カップリングされているキナーゼ上の非修飾部位特異的領域へ結合する抗体によって、特有の色素を有する自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、ｄ）から同定すること、ここで、抗体が、ｄ）で使用された結合タンパク質とは別の、キナーゼ中の非修飾部位特異的領域へ結合する必要がある。
（ｆ）キナーゼインヒビターの存在下での誘導の結果として生じるｅ）からの自己リン酸化されたチロシンキナーゼを、該キナーゼインヒビターの不在下での誘導の場合と比較すること、ならびに、個々のキャビティにおける非修飾キナーゼレベルとの直接比較において、ｅ）からの自己リン酸化されたキナーゼを比較すること、これにより、個々の分析物の規格化が可能となる。
【００６３】
色素およびマーカーは夫々、ルミネセンスおよび／または蛍光の色素あるいはマーカーである。
キナーゼインヒビターの不在下で、チロシンキナーゼのリン酸化状態をプロファイリングするための上述の方法であって、
ここで請求項１ｃ）のライセートは、腫瘍試料、疾患に冒された組織、または、同等な動物材料に由来するが、
前記方法は、診断および腫瘍の病期分類のためのものである。
【００６４】
本発明の別の態様は、細胞飢餓に先立ち、細胞中リン酸化を誘導することができるタンパク質またはキナーゼそれ自体のポリペプチドをコードする核酸で形質転換することである。
細胞は真核細胞であり得、好ましい態様において細胞は、哺乳動物細胞である。
別の好ましい態様は、キナーゼインヒビターおよびキナーゼアクチベーターを、特定のキナーゼに結合するというそれらの特異性についてプロファイリングするための上の方法の使用である。
【００６５】
別の好ましい態様は、キナーゼインヒビターの特異性をプロファイリングするための上述の方法のためのキットであって、以下を含む：
（ａ）リン酸化されたキナーゼに結合する種々の捕捉抗ホスホ抗体に結び付けられている１〜５００個の特有の色素を持つミクロスフェアの組成物、および、
（ｂ）リン酸化されたキナーゼの同定のためのａ）における色素とは識別可能な色素で標識されたキナーゼに特異的な抗体。
【００６６】
本発明の別の部分は、キナーゼインヒビターの代わりにキナーゼアクチベーターをプロファイリングするための上述のキットである。
本発明の別の部分は、キナーゼインヒビターの特異性をプロファイリングするための上述の方法における使用のためのキットであって、以下を含む：
（ａ）種々の抗ホスホ抗体に結び付けられている１〜５００個の特有の色素の組成物、
（ｂ）ａ）における色素とは識別可能な色素で標識された抗キナーゼ抗体。
【００６７】
本発明の別の部分は、キナーゼアクチベーターの特異性をプロファイリングするための上述の方法における使用のためのキットであって、以下を含む：
（ａ）種々の抗ホスホ抗体に結び付けられている１〜５００個の特有の色素の組成物、
（ｂ）ａ）における色素とは識別可能な色素で標識された抗キナーゼ抗体。
キットに使用される色素およびマーカーは夫々、ルミネセンスおよび／または蛍光の色素あるいはマーカーである。
【００６８】
本発明の別の側面は、種々のリン酸化部位と組み合わせて１〜５００個の種々のキナーゼからの自己リン酸化を並行して測定するための、捕捉抗体が特異的に結合するエピトープを有するキナーゼ中の一定の修飾または非修飾部位へ特異的に結合する１つの異なる捕捉抗体に各々結び付けられている１〜５００個の特有の色素を含有する組成物である。
特有の色素の数は、種々のリン酸化部位と組み合わせて１〜５００個の種々のキナーゼからの自己リン酸化を並行して測定するために、１個と５００個との間であり得る。
【００６９】
並行して測定され得る個別のキナーゼの好ましい数は、１〜２０個、１〜４０個、１〜６０個および１〜８０個のキナーゼ等である。代わりに、キナーゼＡ中の３個の異なる部位、キナーゼＢ中の５個の異なる部位、キナーゼＣ中の６個の異なる部位は、キナーゼＹ中のさらなるＸ個の異なる部位と組み合わせられ得るが、キナーゼ中の標的部位は、タンパク質中の種々の位置にて非修飾または修飾され得る。
本発明の別の態様は、１〜１００個または１〜２００個または１〜３００個または１〜４００個の特有の蛍光色素で着色されたミクロスフェアを持つ上述の組成物である。
【００７０】
方法、キットおよび組成物は、キナーゼインヒビターの不在下１〜５００個の異なるキナーゼからの自己リン酸化を並行して測定することと比較して、キナーゼインヒビターの存在下１〜５００個の異なるキナーゼからの自己リン酸化を並行して測定することによって、各潜在的キナーゼインヒビターの特異性をプロファイリングするために使用され得る。
Luminex（商標）機器は、自己リン酸化の測定のために使用され得る。キナーゼインヒビターは、キナーゼインヒビターの不在下でしか自己リン酸化を示さないキナーゼを阻害し得る。
【００７１】
方法は、マイクロタイタープレートにおいて実施され得る。
本発明の方法のための別の使用は、腫瘍試料中の様々なキナーゼの自己リン酸化状態のプロファイリングである。様々なキナーゼからの活性の状態によって、診断と、患者を治すための好適な治療戦略とに対する思慮深いヒントが与えられる（Espina V. et al. (2005) Cancer Invest, 23(1), pp.36-46）。この特定の場合において、分析される必要のあるサンプルは、腫瘍試料または疾患に冒された組織（生検またはレーザー捕捉顕微解剖）または同様に同等な動物材料からのライセートであろう。分析は、キナーゼインヒビターの不在下で上記のとおりになされ得る。
【００７２】
例
例１：細胞のアッセイの説明
腫瘍細胞株を、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１０００００〜２０００００細胞の密度で播き、成長培地中で２４時間培養した。その期間の後、細胞を、０．０５％ＢＳＡを含有する飢餓培地で２回洗浄して、成長培地中に存在するすべての成長因子を除去した。細胞を、飢餓培地（一般にいずれの添加物もない基本培地）の存在下で、もう２０時間終夜培養して、対象の標的分析物のリン酸化状態を低減させた。インヒビターをインキュベーションするため、飢餓培地を、指示濃度のインヒビターを含有する飢餓培地に変え、細胞培養インキュベーター中２４℃にて１時間インキュベートする。対象の標的分析物のリン酸化を誘導するために、細胞を、事前にインキュベートされたインヒビターの存在下でその活性化を誘導することができる最適濃度の成長因子またはサイトカインで刺激した。必要な刺激時間は、各経路に特異的であり、予め見積もる必要がある。刺激後、インキュベーション培地を完全に除去し、細胞を、種々のプロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターを含有する溶解緩衝液中４℃にて溶解させた。細胞ライセートを収集し、最終分析まで、少量のアリコートで−８０℃にて保管した。細胞の最大刺激／リン酸化の算出のため、インヒビターとともにはインキュベートせず、かつ、未処置のままかまたは刺激物のみで刺激する対照を、個別の２４ウェルプレート上に含ませた。
【００７３】
ｃ−Ｍｅｔの分析のため、種々の細胞株を、組み換えヒトＨＧＦで刺激して、ｃ−Ｍｅｔリン酸化を誘導した。細胞を、刺激前に、インヒビターの濃度を１時間上昇させることで処置した。対照細胞を溶媒のみで処置し、対照（ＨＧＦで刺激した）の％を算出するために使用する。飢餓期間後のリン酸化の低減した基礎レベルを実証するために、溶媒で処置された細胞を、ＨＧＦではさらに刺激しなかった（インヒビターなし／ＨＧＦなし）。かかる対照は、自己分泌細胞株をこのセッティングで分析する場合、絶対に必要なものである。なぜなら、これらの細胞は、インヒビターインキュベーション前に有意なリン酸化レベルを誘導し得るＨＧＦを産出することができるからである。
【００７４】
例２：ｃ−Ｍｅｔの逆Luminex多重化アッセイの説明
ｃ−Ｍｅｔキナーゼのために説明する逆アッセイ形式は、３または４個の異なる蛍光色素で着色されたミクロスフェアとカップリングした３または４個の異なる捕捉抗体を使用する。これらの抗体の１つは、受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対して向けられたものであるが、他の抗体は、細胞内キナーゼドメイン中の種々のリン酸化部位（例としてＹ１２３４Ｙ１２３５、Ｙ１３４９およびＹ１００３）に結合する。代わりに、ｃ−Ｍｅｔの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に対して向けられた抗体はまた、この抗体がＩＣＤ中のリン酸化部位を検出する抗体を妨害しない場合、総(total)ｃ−Ｍｅｔ量の検出のためにも使用し得る。
【００７５】
このアプローチによって、異なるリン酸化部位の検出により、同一サンプル中のｃ−Ｍｅｔの総量を、その活性化状態とともに、並行して測定することが可能となる。捕捉するために、サンプルを、高濃度および低濃度の分析物の同時測定を可能にする連続希釈において（測定のダイナミックレンジが十分でない場合）マイクロプレートシェーカー上で連続的にかき混ぜながら、ミクロスフェアとカップリングされた種々の抗体の混合物とともに４℃にて２０時間インキュベートする。マイクロプレートウォッシャーによる３回の洗浄サイクルの後、分析物が捕捉されたミクロスフェアを、検出抗体とともに、マイクロプレートシェーカー上で連続的にかき混ぜながら２２℃にて１時間インキュベートする。この検出抗体は、ｃ−ＭｅｔのＥＣＤへ向けられるものであるが、総ｃ−Ｍｅｔのために使用された捕捉抗体とは異なるエピトープへ結合する。したがって、これら２つの抗体間の競合効果は避けられる。
【００７６】
代わりに、ｃ−ＭｅｔのＥＣＤに対するポリクローナル抗体を使用することもできる。なぜならそれが、種々のエピトープへ結合し、かつ、既に結合した捕捉ＥＣＤ特異抗体を介して影響を受けないからである。最終的に、使用された検出抗体は、ビオチンと接合される必要がある。なぜなら抗種(species)抗体接合体は、異なる種からの捕捉抗体に対して交差反応する可能性があるせいで、有用な選択肢ではない。検出抗体とともにインキュベーションした後、ミクロスフェアを、前に説明したように再度３回洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン接合体とともにインキュベートする。ストレプトアビジンは高親和性を持って、ビオチンと、レポーター色素フィコエリトリンを持つ結合した検出抗体を持つすべての標識ミクロスフェアとへ結合する。
【００７７】
もう２回の洗浄ステップの後、取得(acquisition)緩衝液を、測定のためのミクロスフェアへ加える。結合したフィコエリトリンの量は、個々のミクロスフェア上の結合した検出抗体および分析物の量と等しく、Luminexアナライザーにおいて測定し得る。測定の間中、個別のミクロスフェアは、結合した分析物の量に依存して、個々のフィコエリトリンレポーターシグナルを示し、他の蛍光色素で着色されたミクロスフェアとはその個々の分類シグナルにより区別され得る。
【００７８】
サンプル中の測定されたｃ−Ｍｅｔレベルの正確な定量化のため、組み換えｃ−Ｍｅｔ標準タンパク質を、総ｃ−Ｍｅｔ濃度を決定するために使用する。この標準タンパク質を、サンプルを持つ隣り合った希釈系列（個々のプレート上）で測定し、アッセイの全ダイナミックレンジを定義する。サンプル希釈におけるｃ−Ｍｅｔの測定された濃度に基づき、異なるリン酸化部位の値を、１ｎｇ  ｃ−ＭｅｔあたりのＭＦＩ（蛍光強度の中央値＝Luminex機器からの読出し）に対して規格化し得る。
【００７９】
説明したアッセイを、５０または２５μＬサンプル体積を使用する９６ウェルプレート形式に基づき開発した。FlexMAP 3D Luminexアナライザー上での測定のための３８４ウェルプレート形式へのアッセイの移動の後、サンプル体積をさらに、限定的なヒト生検サンプル材料の測定を初めて可能にする総量で１０〜１２μＬまで低減させることができた。加えて、捕捉ミクロスフェア、検出抗体および接合体以外のすべての試薬もまた、このダウンスケーリングによって確保される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
図の説明
【図１ａ】ｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビターを持つアッセイ設定の比較。Ｕ８７−ＭＧ神経膠腫細胞が、組み換えヒトＨＧＦでin vitroで刺激されて、ｃ−Ｍｅｔリン酸化が誘導された。細胞が刺激前に、２つのｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビター（黒丸／黒三角）の濃度を上昇させて１時間処置された。対照細胞が、溶媒のみで処置され、対照の％を算出するために使用された（黒四角）。細胞ライセートが、２つの異なるアッセイ設定における同一希釈で分析された。標準一重化(single plex)設定（上のグラフ）は、ホスホｃ−Ｍｅｔ検出抗体とともにｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体を使用するが、逆アッセイ設定は、リン酸化部位Ｙ１２３４Ｙ１２３５、Ｙ１３４９およびＹ１００３へ向けられた３つの異なるホスホｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体、ならびに、受容体の細胞外ドメインに特異的な、総タンパク質(a total protein)ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体、ならびに、検出のための別の異なるＥＣＤ特異的ｃ−Ｍｅｔ抗体、を含有する四重化アッセイである（下のグラフ）。標準アッセイ設定における２つの異なるホスホｃ−Ｍｅｔ抗体は、隣り合った２つの異なるアッセイ（１分析物＝１キャビティ）により測定される必要があるが、逆アッセイ設定を持つ四重化形式（４分析物＝１キャビティ）と同じホスホｃ−Ｍｅｔ抗体は、１アッセイにおいて測定された。両方のｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビターの非常に同等なＩＣ５０値が、２つのｃ−Ｍｅｔリン酸化部位であるｃ−ＭｅｔのＹ１２３４Ｙ１２３５（図１ａ）およびｃ−ＭｅｔのＹ１３４９（図１ｂ）のための両方のアッセイ設定から見出されたが、リン酸化部位Ｙ１００３の検出は、Ｕ８７−ＭＧのｃ−Ｍｅｔ発現レベルが低いため、不可能であった。並行して測定されたｃ−Ｍｅｔ総タンパク質は、ｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビターのすべての濃度にて影響がないことを示す。加えて、これらのｃ−Ｍｅｔ値は、測定されたホスホｃ−Ｍｅｔ値を規格化するために使用され得た。
【図１ｂ】ｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビターを持つアッセイ設定の比較。Ｕ８７−ＭＧ神経膠腫細胞が、組み換えヒトＨＧＦでin vitroで刺激されて、ｃ−Ｍｅｔリン酸化が誘導された。細胞が刺激前に、２つのｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビター（黒丸／黒三角）の濃度を上昇させて１時間処置された。対照細胞が、溶媒のみで処置され、対照の％を算出するために使用された（黒四角）。細胞ライセートが、２つの異なるアッセイ設定における同一希釈で分析された。標準一重化(single plex)設定（上のグラフ）は、ホスホｃ−Ｍｅｔ検出抗体とともにｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体を使用するが、逆アッセイ設定は、リン酸化部位Ｙ１２３４Ｙ１２３５、Ｙ１３４９およびＹ１００３へ向けられた３つの異なるホスホｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体、ならびに、受容体の細胞外ドメインに特異的な、総タンパク質(a total protein)ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体、ならびに、検出のための別の異なるＥＣＤ特異的ｃ−Ｍｅｔ抗体、を含有する四重化アッセイである（下のグラフ）。標準アッセイ設定における２つの異なるホスホｃ−Ｍｅｔ抗体は、隣り合った２つの異なるアッセイ（１分析物＝１キャビティ）により測定される必要があるが、逆アッセイ設定を持つ四重化形式（４分析物＝１キャビティ）と同じホスホｃ−Ｍｅｔ抗体は、１アッセイにおいて測定された。両方のｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビターの非常に同等なＩＣ５０値が、２つのｃ−Ｍｅｔリン酸化部位であるｃ−ＭｅｔのＹ１２３４Ｙ１２３５（図１ａ）およびｃ−ＭｅｔのＹ１３４９（図１ｂ）のための両方のアッセイ設定から見出されたが、リン酸化部位Ｙ１００３の検出は、Ｕ８７−ＭＧのｃ−Ｍｅｔ発現レベルが低いため、不可能であった。並行して測定されたｃ−Ｍｅｔ総タンパク質は、ｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビターのすべての濃度にて影響がないことを示す。加えて、これらのｃ−Ｍｅｔ値は、測定されたホスホｃ−Ｍｅｔ値を規格化するために使用され得た。
【００８１】
【図２ａ】異なる経路のキナーゼインヒビターによる阻害後のｃ−Ｍｅｔホスホタンパク質検出の特異性。Ａ４３１癌細胞が、組み換えヒトＨＧＦによりin vitroで刺激されて、図１に記載のようにｃ−Ｍｅｔリン酸化が誘導され、図１に記載の種々の特異的キナーゼインヒビターとともにインキュベートされた。細胞ライセートが、経路特異的インヒビターの影響を評価するために総ｃ−Ｍｅｔ（黒丸）、ホスホｃ−ＭｅｔのＹ１２３４Ｙ１２３５（黒四角）、ホスホｃ−ＭｅｔＹ１３４９（白上三角）およびホスホｃ−ＭｅｔのＹ１００３（白逆三角）を含むｃ−Ｍｅｔ四重化アッセイにおいて分析された。ｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビターのみが、すべてのｃ−Ｍｅｔリン酸化部位Ｙ１２３４Ｙ１２３５、Ｙ１３４９およびＹ１００３の用量依存的阻害を示すが（図２ａの上のグラフ）、ＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ；図２ａの下のグラフ）およびＭｅｋ（ＭＡＰＫキナーゼまたはＥｒｋキナーゼ；図２ｂの上のグラフ）、Ｓｒｃ（細胞および肉腫のキナーゼ；図２ｂの下のグラフ）のインヒビターは、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化に対して効果がない。
【図２ｂ】異なる経路のキナーゼインヒビターによる阻害後のｃ−Ｍｅｔホスホタンパク質検出の特異性。Ａ４３１癌細胞が、組み換えヒトＨＧＦによりin vitroで刺激されて、図１に記載のようにｃ−Ｍｅｔリン酸化が誘導され、図１に記載の種々の特異的キナーゼインヒビターとともにインキュベートされた。細胞ライセートが、経路特異的インヒビターの影響を評価するために総ｃ−Ｍｅｔ（黒丸）、ホスホｃ−ＭｅｔのＹ１２３４Ｙ１２３５（黒四角）、ホスホｃ−ＭｅｔＹ１３４９（白上三角）およびホスホｃ−ＭｅｔのＹ１００３（白逆三角）を含むｃ−Ｍｅｔ四重化アッセイにおいて分析された。ｃ−Ｍｅｔキナーゼインヒビターのみが、すべてのｃ−Ｍｅｔリン酸化部位Ｙ１２３４Ｙ１２３５、Ｙ１３４９およびＹ１００３の用量依存的阻害を示すが（図２ａの上のグラフ）、ＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ；図２ａの下のグラフ）およびＭｅｋ（ＭＡＰＫキナーゼまたはＥｒｋキナーゼ；図２ｂの上のグラフ）、Ｓｒｃ（細胞および肉腫のキナーゼ；図２ｂの下のグラフ）のインヒビターは、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化に対して効果がない。
【００８２】
【図３ａ】異なる経路キナーゼインヒビターによる阻害後のＥＧＦ−Ｒホスホタンパク質検出の特異性。Ａ４３１癌細胞が、図１に記載のように、組み換えヒトＥＧＦによりin vitroで刺激されて、ＥＧＦ−Ｒリン酸化が誘導され、図１に記載の種々のキナーゼインヒビターとともにインキュベートされた。細胞ライセートが、経路特異的インヒビターの影響を評価するために総ＥＧＦ−Ｒ（黒丸）およびＥＧＦ−Ｒリン酸化部位Ｙ８４５（黒逆三角）、Ｙ９９８（黒四角）、Ｙ１０８６（白四角）およびＹ１１７３（白逆三角）を含むＥＧＦ−Ｒ五重化アッセイにおいて分析された。ＥＧＦ−Ｒ（図３ａの上のグラフ）およびＥＧＦ−Ｒ／ＥｒｂＢ２二重インヒビター（図３ｂの上のグラフ）は、すべてのＥＧＦ−Ｒリン酸化部位Ｙ８４５、Ｙ９９８、Ｙ１０８６およびＹ１１７３の用量依存的阻害を示すが、Ｍｅｋ（ＭＡＰＫまたはＥｒｋキナーゼ；図３ａの下のグラフ）およびＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ；図３ｂの下のグラフ）のインヒビターは効果がない。Ｓｒｋ（細胞および肉腫キナーゼ；図３ｃ）インヒビターもまた、標的特異的インヒビターとして、明確により高い濃度範囲において、ＥＧＦ−Ｒリン酸化に対して阻害効果がなく、ＥＧＦ−ＲとＳｒｃとの間の側面(lateral)シグナリングにより十分に説明可能である（Dulak et al.: 2011; Oncogene. 2011 August 18; 30(33): 3625-3635）。使用されたすべてのインヒビターは、五重化アッセイにおいて、総ＥＧＦ−Ｒの測定に対する影響を示さず、総ＥＧＦ−Ｒレベルは、リン酸化部位の値の正確な規格化のために使用され得た。
【図３ｂ】異なる経路キナーゼインヒビターによる阻害後のＥＧＦ−Ｒホスホタンパク質検出の特異性。Ａ４３１癌細胞が、図１に記載のように、組み換えヒトＥＧＦによりin vitroで刺激されて、ＥＧＦ−Ｒリン酸化が誘導され、図１に記載の種々のキナーゼインヒビターとともにインキュベートされた。細胞ライセートが、経路特異的インヒビターの影響を評価するために総ＥＧＦ−Ｒ（黒丸）およびＥＧＦ−Ｒリン酸化部位Ｙ８４５（黒逆三角）、Ｙ９９８（黒四角）、Ｙ１０８６（白四角）およびＹ１１７３（白逆三角）を含むＥＧＦ−Ｒ五重化アッセイにおいて分析された。ＥＧＦ−Ｒ（図３ａの上のグラフ）およびＥＧＦ−Ｒ／ＥｒｂＢ２二重インヒビター（図３ｂの上のグラフ）は、すべてのＥＧＦ−Ｒリン酸化部位Ｙ８４５、Ｙ９９８、Ｙ１０８６およびＹ１１７３の用量依存的阻害を示すが、Ｍｅｋ（ＭＡＰＫまたはＥｒｋキナーゼ；図３ａの下のグラフ）およびＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ；図３ｂの下のグラフ）のインヒビターは効果がない。Ｓｒｋ（細胞および肉腫キナーゼ；図３ｃ）インヒビターもまた、標的特異的インヒビターとして、明確により高い濃度範囲において、ＥＧＦ−Ｒリン酸化に対して阻害効果がなく、ＥＧＦ−ＲとＳｒｃとの間の側面(lateral)シグナリングにより十分に説明可能である（Dulak et al.: 2011; Oncogene. 2011 August 18; 30(33): 3625-3635）。使用されたすべてのインヒビターは、五重化アッセイにおいて、総ＥＧＦ−Ｒの測定に対する影響を示さず、総ＥＧＦ−Ｒレベルは、リン酸化部位の値の正確な規格化のために使用され得た。
【図３ｃ】異なる経路キナーゼインヒビターによる阻害後のＥＧＦ−Ｒホスホタンパク質検出の特異性。Ａ４３１癌細胞が、図１に記載のように、組み換えヒトＥＧＦによりin vitroで刺激されて、ＥＧＦ−Ｒリン酸化が誘導され、図１に記載の種々のキナーゼインヒビターとともにインキュベートされた。細胞ライセートが、経路特異的インヒビターの影響を評価するために総ＥＧＦ−Ｒ（黒丸）およびＥＧＦ−Ｒリン酸化部位Ｙ８４５（黒逆三角）、Ｙ９９８（黒四角）、Ｙ１０８６（白四角）およびＹ１１７３（白逆三角）を含むＥＧＦ−Ｒ五重化アッセイにおいて分析された。ＥＧＦ−Ｒ（図３ａの上のグラフ）およびＥＧＦ−Ｒ／ＥｒｂＢ２二重インヒビター（図３ｂの上のグラフ）は、すべてのＥＧＦ−Ｒリン酸化部位Ｙ８４５、Ｙ９９８、Ｙ１０８６およびＹ１１７３の用量依存的阻害を示すが、Ｍｅｋ（ＭＡＰＫまたはＥｒｋキナーゼ；図３ａの下のグラフ）およびＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ；図３ｂの下のグラフ）のインヒビターは効果がない。Ｓｒｋ（細胞および肉腫キナーゼ；図３ｃ）インヒビターもまた、標的特異的インヒビターとして、明確により高い濃度範囲において、ＥＧＦ−Ｒリン酸化に対して阻害効果がなく、ＥＧＦ−ＲとＳｒｃとの間の側面(lateral)シグナリングにより十分に説明可能である（Dulak et al.: 2011; Oncogene. 2011 August 18; 30(33): 3625-3635）。使用されたすべてのインヒビターは、五重化アッセイにおいて、総ＥＧＦ−Ｒの測定に対する影響を示さず、総ＥＧＦ−Ｒレベルは、リン酸化部位の値の正確な規格化のために使用され得た。
【００８３】
【図４】腫瘍生検中のホスホｃ−Ｍｅｔ阻害。ホスホｃ−Ｍｅｔレベルが、３８４ウェル形式における逆三重化ｃ−Ｍｅｔアッセイを使用して、患者の処置前および処置中の腫瘍生検サンプルにおいて定量的に測定された。縮小化によって、０．５ｍｇより小さい生検材料の１サンプル中での、３つの異なる標的特異的アッセイの測定が可能になる。２つのｃ−Ｍｅｔリン酸化部位Ｙ１２３４Ｙ１２３５およびＹ１３４９が分析され、同一サンプル中で測定された総ｃ−Ｍｅｔ濃度により定量的に規格化された。自己リン酸化部位Ｙ１２３４Ｙ１２３５の結果が示されるが、下流のシグナル部位Ｙ１３４９は、標的阻害がわずかに低いという同等な結果を示す。この標的阻害は、評価可能な患者の１９／２１名において観察された。Ｒ３（かつて毎日連続的に投薬した）における用量≧３００ｍｇにより、≧９０％のホスホｃ−Ｍｅｔ阻害が、全生検−評価可能な患者において観察された。
【図１ａ】
2017513002.tif 000009
【図１ｂ】
2017513002.tif 000010
【図２ａ】
2017513002.tif 000011
【図２ｂ】
2017513002.tif 000012
【図３ａ】
2017513002.tif 000013
【図３ｂ】
2017513002.tif 000014
【図３ｃ】
2017513002.tif 000015
【図４】
2017513002.tif 000016
【国際調査報告】
2017513002.tif 000017
2017513002.tif 000018
2017513002.tif 000019