(57)【要約】【解決手段】毒素の生物活性を増加させる方法。前記毒素を生成するための核酸構造体にプロ領域を導入することにより、農薬毒素の生物活性を増加させる方法。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え毒素の生物活性を増加させる方法において、
（ｉｉ）プロ領域、又はそのフラグメント若しくは変異体に結合する（ｉ）毒素配列、又はそのフラグメント若しくは変異体を含む核酸構造体を提供する工程と、
随意選択的に組換え毒素を発現する工程と、
とを含む、組換え毒素の生物活性を増加させる方法。
【請求項２】
（ｉ）プロ領域、又はそのフラグメント若しくは変異体と、
（ｉｉ）毒素遺伝子配列、又はそのフラグメント若しくは変異体が挿入されており、プロ領域に隣接する部位と、
を含む核酸構造体。
【請求項３】
プロ領域に隣接する部位に挿入された毒素遺伝子配列、又はそのフラグメント若しくは変異体を更に含む、請求項２に記載の核酸構造体。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸構造体を含む、宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞は、酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載の宿主細胞を、組換え毒素の発現に適切な条件下で培養する工程を含む、増加した生物活性を持つ組換え毒素を生成する方法。
【請求項７】
毒素は農薬毒素である、請求項１又は請求項３乃至６の何れかに記載の方法、核酸構造体、又は宿主細胞。
【請求項８】
毒素は、節足動物、軟体動物、又は他の無脊椎動物から生じる、請求項１又は請求項３乃至７の何れかに記載の方法、核酸構造体、又は宿主細胞。
【請求項９】
毒素は、節足動物の毒素であり、随意選択的に、ハドロニッケ・ベルスータ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ）由来のω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ及びκ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃ、メガネヤチグモ（Ｐｉｒｅｎｅｉｔｅｇａ  ｌｕｃｔｕｏｓｕｓ）由来のδ−アマウロビトキシン−Ｐｌ１ａ、クロエンマグモ（Ｓｅｇｅｓｔｒｉａ  ｆｌｏｒｅｎｔｉｎａ）毒素Ｓｆｌ１−８、ブトゥス・メソタムラス（Ｂｕｔｈｕｓ  ｍｅｓｏｔａｍｕｌｕｓ）毒素ＢｕｔａＩＴ、エウクラトセルス・コンストリクタス（Ｅｕｃｒａｔｏｓｃｅｌｕｓ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｕｓ）由来のセラフォキシンＥｃ２ａ、アポマスタス・スクリンゲリ（Ａｐｏｍａｓｔｕｓ  ｓｃｈｌｉｎｇｅｒｉ）からのサートウトキシンＡｓ１ａ、又はロクソスセレス・インターメディア（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）由来のシカリトキシンＬｉ１ａである、請求項１又は請求項３乃至８の何れかに記載の方法、核酸構造体、又は宿主細胞。
【請求項１０】
毒素は、２０乃至１００個のアミノ酸残基のペプチドを含む、請求項１又は請求項３乃至９の何れかに記載の方法、核酸構造体、又は宿主細胞。
【請求項１１】
毒素は、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、又はそのフラグメント若しくは変異体である、請求項１又は請求項３乃至１０の何れかに記載の方法、核酸構造体、又は宿主細胞。
【請求項１２】
毒素は、δ−アマウロビトキシン−Ｐｌ１ａ、又はそのフラグメント若しくは変異体である、請求項１又は請求項３乃至１０の何れかに記載の方法、核酸構造体、又は宿主細胞。
【請求項１３】
プロ領域は、シグナルペプチド配列と成熟タンパク質Ｎ−末端の間の配列であり、
随意選択的に、プロ領域は、
その正常な供給源から単離されたタンパク質に関して測定された配列を、それをコード化する遺伝子による予想された配列と比較する工程と、
最終タンパク質生成物には存在しないＮ−末端配列を同定する工程と、
最終タンパク質生成物には存在しないＮ−末端配列中のシグナルペプチド配列を同定する工程と、
随意選択的に、最終タンパク質生成物には存在しないＮ−末端配列からのシグナルペプチド配列の除去によって、シグナルペプチド配列と成熟タンパク質Ｎ−末端の間のプロ領域配列を同定する工程と、
により同定される、先行する請求項の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項１４】
プロ領域は酸性アミノ酸残基に富む、請求項１乃至１３の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項１５】
プロ領域は、天然起源の配列中の毒素と関連する、請求項１、３乃至１１、１３及び１４の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項１６】
プロ領域は、天然起源の配列中の毒素と関連しない、請求項１又は請求項３乃至１４の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項１７】
プロ領域は、アミノ酸配列ＥＤＴＲＡＤＬＱＧＧＥＡＡＥＫＶＦＲＲ、又はそのフラグメント若しくは変異体を含む、先行する請求項の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項１８】
プロ領域は、アミノ酸配列ＩＳＹＥＥＧＫＥＬＦＱＫＥＲ、又はそのフラグメント若しくは変異体を含む、請求項１乃至１６の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項１９】
核酸構造体は、キャリアタンパク質の配列、又はそのフラグメント若しくは変異体を更に含む、先行する請求項の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項２０】
キャリアタンパク質の配列は、毒素タンパク質配列に融合し、これにより、発現すると融合タンパク質を生成する、請求項１又は請求項３乃至１８の何れかに従属する請求項１９に記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項２１】
キャリアタンパク質はレクチンである、請求項１９又は２０に記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項２２】
キャリアタンパク質は、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、ニンニクレクチン（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、マメレクチン（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｐ−ｌｅｃ）、ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、サヤインゲンレクチン（ＰＨＡ、フィトヘマグルチニン）、又はそのフラグメント若しくは変異体から選択される植物レクチンである、請求項１９乃至２１の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項２３】
キャリアタンパク質はＧＮＡである、請求項１９乃至２２の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項２４】
（ｉ）プロ領域、又はそのフラグメント若しくは変異体と、
（ｉｉ）キャリアタンパク質、又はそのフラグメント若しくは変異体の配列と、
を含む核酸構造体。
【請求項２５】
核酸構造体は発現コンストラクトである、先行する請求項の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項２６】
核酸構造体は、親和性タグをコード化する配列を更に含む、先行する請求項の何れかに記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞。
【請求項２７】
親和性タグは、Ｈｉｓ−タグである、請求項２６に記載の方法、核酸構造体又は宿主細胞
【請求項２８】
請求項１、６乃至２３、２５乃至２７に記載の方法の１つに従って生成された毒素タンパク質を含む農薬組成物。
【請求項２９】
組成物は、溶液、エマルジョン、スプレー、懸濁液、粉末、泡、ペースト、顆粒、エアロゾル、カプセル、細かく若しくは粗雑に分裂したその他の材料、又は、天然若しくは合成材料用の含浸剤の形態である、請求項２８に記載の農薬組成物。
【請求項３０】
組成物は、適切な希釈剤、アジュバント、保存剤、分散剤、溶剤、及び／又は乳化剤と混合したスプレー又は懸濁液の形態である、請求項２８又は請求項２９に記載の農薬組成物。
【請求項３１】
組成物は、他の公知の殺虫剤、成長促進又は制御物質、除草剤、防カビ剤、及び／又は相乗剤を伴った、密接した又は物理的な混合物である、請求項２８乃至３０の何れかに記載の農薬組成物。
【請求項３２】
組成物は、毒素タンパク質を、０．００１重量％と９９重量％の間、好ましくは０．５重量％と９８重量％の間、より好ましくは１．０重量％と９５重量％の間の量で含む、請求項２８乃至３１の何れかに記載の農薬組成物。
【請求項３３】
請求項１、６乃至２３、２５乃至２７に記載の方法の１つに従って生成された毒素タンパク質を、１種以上のキャリア、希釈剤、アジュバント、保存剤、分散剤、溶剤、乳化剤と、殺虫に効果のある量で配合することを含む、請求項２８乃至３２の何れかに記載の農薬組成物を製造する方法。
【請求項３４】
請求項１、６乃至２３、２５乃至２７に記載の方法の１つに従って生成された毒素タンパク質又は請求項２８乃至３２の何れかに従って生成された農薬組成物を、植物又はその成長の座に塗布する工程、或いは、請求項３又は請求項３に従属する請求項７乃至２３、２５乃至２７の何れかに記載された核酸構造体を植物に導入する工程とを含む、植物の有害生物感染を予防する又は処置する方法。
【請求項３５】
有害生物は、軟体動物有害生物であり、随意選択的にナメクジ又はカタツムリ、随意選択的にグレイフィールドスラグである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１、６乃至２３、２５乃至２７に記載の方法の１つに従って生成された毒素タンパク質、及び／又は、請求項２８乃至３２の何れかに記載の農薬組成物を含む、軟体動物駆除餌組成物。
【請求項３７】
請求項３、又は請求項３に従属する請求項７乃至２３、２５乃至２７の何れかに記載の、増加した生物活性を持つ毒素を発現できる核酸構造体を含む、トランスジェニック植物又はその子孫。
【請求項３８】
農薬の製造又はトランスジェニック植物細胞若しくは植物の生成における、請求項３又は請求項３に従属する請求項７乃至２３、２５乃至２７の何れかに記載の核酸構造体、又は請求項１、６乃至２３、２５乃至２７に記載の方法の１つによって生成される毒素タンパク質の使用。
【請求項３９】
１種以上の有害生物を駆除又は衰弱させるための請求項２８乃至３２の何れかに記載の農薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え毒素の生物活性を増加させる方法に関する。本発明は更に、プロ領域と、毒素、特に節足動物の毒素の配列とを含む核酸構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口の増加の背景に対して、食物生産システムをより効率的にする圧力は、常に増え続けている。農作物の保護手段の進歩にも拘わらず、有害生物は、未だに、大きな制約である。上位６種の農作物に関する世界的な潜在的損失は２５〜８０％（４０％はジャガイモ）で変化すると推定される。有害生物及び病気の中には、農薬の施用により制御することができるものもある。しかし、広範な農薬が市販されているにも拘わらず、植物の病気は、今なお、大きな関心事である。
【０００３】
過去において、農薬の研究開発の大半は、この目的のために使用できるであろう化学成分の同定に焦点を当てていた。しかし、これらの非標的特異性（non-target specific）農薬は、しばしば環境破壊を起こし、非標的種（動物種を含む）及びヒトの健康に悪影響を与え得る。その結果、ある種の化学化合物の農薬としての使用を禁止した欧州連合法が承認されている。従って、有害生物管理に使用することができる新しい種類の「バイオ農薬」を見つけることへの移行がなされている。バイオ農薬は、一般に、天然物質（バイオケミカル農薬）、有害生物を制御可能な微生物（微生物農薬）、追加された遺伝物質を含む植物によって生成された殺虫性物質（植物導入保護剤（plant-incorporated protectant））と考えられている。バイオ農薬の開発に対するこのような活動は、植物の病気を防ぐ、環境により優しい選択になることが期待される。
【０００４】
クモや他の節足動物にて毒液として合成される神経ペプチド毒物は、バイオ農薬としての開発研究の課題である。国際公開第２００６／０５２８０６号、国際公開第２００５／０２５３１３号及び米国特許出願公開第２００７／００６６５２９号は、バイオ農薬として使用するために、クモ毒物／毒液ペプチドを使用することを記載しており、Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６は、昆虫の攻撃から植物を守るための、植物におけるクモ毒液／毒物の発現を記載した。本発明者は、過去に、ジョウゴグモＨａｄｒｏｎｃｙｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａから生じる毒物であるω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａが、スノードロップレクチン「キャリア」ＧＮＡのような、無脊椎動物の腸からの融合タンパク質のトランスロケーション（translocation）を媒介し得るタンパク質と融合された場合に、広い範囲の有害生物に対して有効な農薬として機能できることを示している（国際公開第２０１２／１３１３０２号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、本発明者による、組換え毒素を発現するための構造体中にプロ領域を含めることによる、組換え毒素の生物活性に与える効果に関する研究に部分的に基づいている。
【０００６】
本発明者は、インビトロで発現する組換え毒素タンパク質の生物活性の更なる改善方法を確かめたいと思った。これを研究するために、本発明者は、節足動物の毒素をコード化する遺伝子のＤＮＡ配列を分析した。国際公開第２０１２／１３１３０２号で利用されている節足動物の毒素は、数種のスーパーファミリーのタンパク質配列（節足動物以外の有機体からの毒素を含む）に属する、小さなシステインリッチタンパク質である。コード化遺伝子は、最終タンパク質生成物には存在しない２つの配列、即ち、翻訳中に除去された予想Ｎ−末端シグナルペプチドと、当該シグナルペプチドと単離された時のタンパク質の最終配列との間における予想プロ領域とを含む（図１Ａ参照）。プロ領域は、節足動物及び他の有機体における小ペプチド毒素の共通の特徴である（Ｗｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。驚くべきことに、本発明者は、組換え毒素の発現用の構造体にこの予想プロ領域（predicted pro-region）を含めることにより、プロ領域のない構造体から生成した毒素と比べて、より大きな生物活性を得ることを発見した。さらにまた、ゲノムＤＮＡ配列にプロ配列を自然には含まない毒素（例えば、δ−アマウロビトキシン（amaurobitoxin）−Ｐｌ１ａ）の発現用の構造体にプロ配列を含めることにより、プロ配列を欠く構造体から生成される毒素と比較して、より増加した生物活性を得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明の第１の態様では、（ｉｉ）プロ領域、又はそのフラグメント若しくは変異体に結合する（ｉ）毒素配列、又はそのフラグメント若しくは変異体を含む核酸構造体を提供する工程と、随意選択的に組換え毒素を発現する工程と、を含む組換え毒素の生物活性を増加させる方法を提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様では、（ｉ）プロ領域、又はそのフラグメント若しくは変異体と、（ｉｉ）毒素遺伝子配列、又はそのフラグメント若しくは変異体が挿入できるプロ領域に隣接する部位と、を含む核酸構造体を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様による実施形態では、核酸構造体は、さらに、プロ領域に隣接する部位に挿入された毒素遺伝子配列、又はそのフラグメント若しくは変異体を含む。
【００１０】
本発明の第３の態様では、毒素遺伝子配列が挿入されている本発明の第２態様による核酸構造体を含む宿主細胞、又はその任意の実施形態が提供される。
【００１１】
本発明の第４の態様では、生物活性が増加した組換え毒素を生成する方法が提供され、当該方法は、本発明の第３態様で規定される宿主細胞を、組換え毒素の発現に適切な条件下で培養する工程を含む、
【００１２】
本発明の上記の態様における毒素は、農薬毒素である。本発明の好ましい実施形態では、毒素は、節足動物、軟体動物、又は他の無脊椎動物から生じてよい。
【００１３】
本発明のある実施形態では、毒素は節足動物の毒素である。本発明の節足動物の毒素としては、ハドロニッケ・ベルスータ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ）由来のω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ及びκ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃ、メガネヤチグモ（Ｐｉｒｅｎｅｉｔｅｇａ  ｌｕｃｔｕｏｓｕｓ）由来のδ−アマウロビトキシン−Ｐｌ１ａ、クロエンマグモ（Ｓｅｇｅｓｔｒｉａ  ｆｌｏｒｅｎｔｉｎａ）毒素Ｓｆｌ１−８、ブトゥス・メソタムラス（Ｂｕｔｈｕｓ  ｍｅｓｏｔａｍｕｌｕｓ）の毒素ＢｕｔａＩＴ、エウクラトセルス・コンストリクタス（Ｅｕｃｒａｔｏｓｃｅｌｕｓ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｕｓからのセラフォトキシン（ｔｈｅｒａｐｈｏｔｏｘｉｎ）Ｅｃ２ａ、アポマスタス・スクリンゲリ（Ａｐｏｍａｓｔｕｓ  ｓｃｈｌｉｎｇｅｒｉ）からのサートウトキシン（ｃｙｒｔｏａｕｔｏｘｉｎ）Ａｓ１ａ、ロクソスセレス・インターメディア（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）からのシカリトキシン（ｓｉｃａｒｉｔｏｘｉｎ）Ｌｉ１ａ、及び他の類似の毒素が挙げられる。
【００１４】
本発明による毒素は、２０乃至１００のアミノ酸残基のペプチドを含んでもよい。毒素は、内部ジスルフィド結合を形成する複数のシステイン残基を含んでもよい。
【００１５】
ある実施形態では、毒素は、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、又はそのフラグメント若しくは変異体である。ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ毒素は、当該分野で公知である（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。それは、ジョウゴグモ、Ｈａｄｒｏｎｃｙｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａから単離された毒素である。ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのアミノ酸配列は、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａをコード化する核酸配列として公知である。ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ毒素は、無脊椎動物のカルシウムチャネルをブロックすることが既に示されている、カルシウムチャネルアンタゴニストであるが、脊椎動物のカルシウムチャネルがブロックしない。殆どの状況で、ヒトや動物への有害作用を避けるために、脊椎動物に対して活性を持たない農薬を使用することが望ましい。
【００１６】
ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを毛虫に限定的に使う場合、それは農薬としてそのままで使用できることは既に報告されている（Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかし、上記文献の筆者らは、それ自体が殺虫性であることが知られているイミダゾールを含む溶液中で、該ペプチドを限定的に使用することを報告している。さらに、ペプチド単独の殺虫力に関する更なる証拠は報告されておらず、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを報告する他の開示は、無脊椎有害生物動物への注射による活性を記載するのみである。
【００１７】
本発明者は、先に、組換えω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの生物活性は、融合タンパク質の創造により改良することができ、それによって、毒素ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを、無脊椎動物の腸からの融合タンパク質のトランスロケーションを媒介することができる「キャリア」ペプチドに融合することを示している（国際公開第２０１２／１３１３０２号）。本発明者は、そのようなキャリアペプチドの例として、植物レクチンＧＮＡを使用した。
【００１８】
組換え毒素融合タンパク質の生物活性の他の改良方法を調べるために、本発明者は、節足動物の毒素をコード化する遺伝子、特にω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＤＮＡ配列を分析した。多くの節足動物遺伝子は、予想プロ領域を含んでおり、当該予想プロ領域は、最終タンパク質には存在せず、融合タンパク質をインビトロで発現するための構造体に予め導入されていないことが分かった。本明細書から理解できるように、本発明者は、プロ領域の配列を、組換え毒素タンパク質の生成のための核酸構造体に導入した。本発明者は、注射により又は食物に含まれることにより様々な無脊椎有害生物に投与されたプロ領域を含む構造体から生成した組換えω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、修飾されていない構造体からの組換えω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（即ち、追加されたプロ領域がないω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ配列を含む）の生成と比較して、麻痺及び死亡を増やす結果となることを発見した。従って、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチド毒素は、この形態で供給されると、無脊椎動物に対する農薬として非常に効果的であり得る。
【００１９】
以下でさらに説明するように、本発明で使用される「農薬」は、任意の有害生物に対して使用される化学物質、生物由来物質（例えば、ウィルス又は細菌）、抗菌剤、殺虫剤、又はデバイスを言う。有害生物としては、昆虫、植物病原菌、雑草、軟体動物、トリ、哺乳動物、サカナ、線虫（回虫）、及び微生物が挙げられ、それらは、産物を破壊し、病気を伝播し、又は、病気のベクターとなる。しかし、本発明の「農薬」においては、有害生物は、産物、特に農産物を破壊する任意の無脊椎動物であることを意味する。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、δ−アマウロビトキシン−Ｐｌ１ａ毒素、又はそのフラグメント若しくは変異体を含んでよい。
【００２１】
毒素であるδ−アマウロビトキシン−Ｐｌ１ａは、クモ、メガネヤチグモ（Ｐｉｒｅｎｅｉｔｅｇａ  ｌｕｃｔｕｏｓａ）に由来し、その内在性遺伝子配列中に予想プロ領域を含まない。驚くべきことに、本発明者は、（グローバルデータベースに存在する類似の配列に基づき設計された）プロ領域を、組換えδ−アマウロビトキシン−Ｐｌ１ａの発現コンストラクトに含ませることにより、組換え毒素の無脊椎有害生物に対する生物活性が増加することを発見した。この予期し得ぬ発見は、プロ領域を設計し、発現コンストラクトに導入することにより、内在性遺伝子配列と関連したプロ領域を含まない組換え毒素の生物活性を増加させるために本発明を使用できることを実証するものである。
【００２２】
理論に拘束されないものの、プロ領域を核酸構造体に含ませることにより、インビトロで発現した場合、毒素のフォールディングは改善されることになると信じられる。
【００２３】
「フラグメント又は変異体」に関しては、フラグメント又は変異体が実質的に毒素の生物活性を保持するのであれば、本発明の毒素配列は、自然発生の配列とは相違してよい。毒素の生物活性の保持とは、フラグメント及び／又は変異体が、天然の毒素と比べて、農薬活性の少なくとも一部を保持することを意味する。通常、フラグメント及び／又は変異体は、少なくとも５０％、例えば、６０％、７０％、８０％又は９０％の活性を保持する。幾つかの例では、フラグメント及び／又は変異体は、天然の毒素より強い農薬活性を持ってよい。幾つかの実施形態では、フラグメント及び／又は変異体は、天然の毒素と比べて、他の生理学的特徴の増加を示してよい。例えば、フラグメント及び／又は変異体は、インビトロ及び／又はインビボでの半減期が天然の毒素と比べて大きくてよい。
【００２４】
配列の「変異」には、保存的又は非保存的な挿入、除去及び置換が含まれる。特に、そのような変化が実質的に毒素の生物活性を変えないヌクレオチド配列の変異が含まれる。当業者は、そのような配列を、生物活性を失うことなく変化できることを知っているであろう。特に、ヌクレオチド配列における唯一の変化は、配列の発現の後のアミノ酸配列の変化とならなくてもよい。さらに、ヌクレオチド配列の変化により代わりのアミノ酸が導入されるが、それぞれのアミノ酸の生理化学的特性が実質的に変化しない場合（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒのような保存的置換）は、それぞれの毒素の官能性は、影響を受けるべきでない。さらに、毒素の非官能性領域内の小さな除去も許容でき、従って、本発明の目的に関して、「変異」と考えられる。また、「変異体」としては、アミノ酸が、例えば、グルコシル化又はジスルフィド結合形成により翻訳後に修飾された組換え毒素タンパク質も挙げられる。本明細書に記載される実験手順は、「変異体」が毒素としてなお機能するかどうかを決定するために、当業者により容易に採用することができる。
【００２５】
変異体が配列を持つ場合、当該配列は、毒素の「天然起源の」ヌクレオチド配列と、少なくとも７５％同一であることが好ましく、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は９７％同一である。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明は、節足動物の毒素に関する。本発明者が調べた節足動物の毒素は、数種のスーパーファミリーのタンパク質配列に属する、小さなシステインリッチタンパク質である。これらの毒素の遺伝子配列の中には、最終タンパク質生成物に存在しない配列を含むものもある。これらの追加の配列は、翻訳中に除去される予想Ｎ−末端シグナルペプチドと、当該シグナルペプチドと単離された時のタンパク質の最終配列の間にある予想プロ領域とを含む（図１Ａ参照）。
【００２７】
最もシステインリッチな小ペプチド毒素は、先ず、より大きな前駆体（７０〜１２０個のアミノ酸）として翻訳される。当該前駆体は、翻訳中に除去される、（約２０個のアミノ酸の）保存Ｎ−末端シグナルペプチドと、タンパク質ファミリー内で重要な配列保存を示す（約１５〜６０個のアミノ酸の）プロ領域と、成熟毒素を作り出して、より変動しやすいＣ−末端毒素コード化領域と、を含む。
【００２８】
プロ領域は、多くの毒素をコード化するｃＤＮＡ配列から予想されており、タンパク質ファミリーの間で比べた場合、成熟毒素配列より遺伝子的に変化しにくいが、シグナルペプチドで発見されたような配列モチーフは同定されていない。しかし、プロ領域は、酸性アミノ酸残基に富むことが多い（Ｔｅｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。例えば、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ毒素に関連するプロ領域のアミノ酸配列は、
ＥＤＴＲＡＤＬＱＧＧＥＡＡＥＫＶＦＲＲ
である（図１Ｂも参照のこと）。
【００２９】
Ａｏ１ｂ毒素に関連するプロ領域のアミノ酸配列は、
ＩＳＹＥＥＧＫＥＬＦＱＫＥＲ
である。
【００３０】
プロ領域は、正常な供給源から単離されたタンパク質に関して測定された配列を、それをコード化する遺伝子によって予想された配列と比較することによって同定できる。そのような比較は、最終タンパク質生成物を得るために、タンパク質分解又は開裂ステップが、翻訳と同時又は翻訳後に（co- or post-translationally）行われたことを示す。プロ領域は、成熟タンパク質のＮ−末端から除去されるが、ポリペプチドを分泌経路へ導くのに関与するシグナルペプチドとは異なる。シグナルペプチドは、遺伝子により予想されるタンパク質配列に基づいて、ＳｉｇｎａｌＰ＊（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）のようなソフトウェアアルゴリズムを使用して同定できる。プロ領域を同定するためには、先ず直接測定したタンパク質配列を予想配列と比較して、ある領域がＮ−末端から除去されることを明らかにし、次いでシグナルペプチドの存在をソフトウェアからの予想によって決定する。その後、プロ領域は、シグナルペプチドと成熟タンパク質Ｎ−末端の間の配列領域として同定される。節足動物の毒素のプロ領域は、先に略述した概念に基づいて、Ａｒａｃｈｎｏｓｅｒｖｅｒデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｃｈｎｏｓｅｒｖｅｒ．ｏｒｇ／ｓｐｉｄｅｒＰ．ｈｔｍｌ、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）上の無料で使用可能なソフトウェア（ＳｐｉｄｅｒＰ）を使用して予想できる。このサポートベクターマシン（ＳＶＭ）方法は、特に局所的及び包括的配列情報の両方を組み合わせるように設計されたアルゴリズムを利用している。
【００３１】
上記の方法を使用して同定したプロ領域は、本発明において利用できる。本発明の上記態様におけるプロ領域は、天然起源の配列において本発明の毒素と関連してよい。或いは、プロ領域の配列は、グローバルデータベースで入手可能な配列に基づいて設計し又は上記方法に基づき同定されて、通常では（即ち、天然起源の配列における）プロ領域と関連しない、又は、天然起源の配列における異なるプロ領域と関連する毒素の核酸構造体に導入されてよい。
【００３２】
本発明のある実施形態では、プロ領域は、アミノ酸配列ＥＤＴＲＡＤＬＱＧＧＥＡＡＥＫＶＦＲＲ、又はそのフラグメント若しくは変異体を含む。
【００３３】
本発明の更なる実施形態では、プロ領域は、アミノ酸配列ＩＳＹＥＥＧＫＥＬＦＱＫＥＲ、又はそのフラグメント若しくは変異体を含む。
【００３４】
プロ領域の「フラグメント又は変異体」に関しては、フラグメント又は変異体が、実質的にプロ領域の生物活性を保持する、即ち、それに関連する毒素の生物活性をなお改良できる場合において、プロ領域の核酸配列は、当該分野で公知のもの及び天然起源のものと異なってよい。
【００３５】
添付している実施例において、本発明者は、最終タンパク質又は融合タンパク質に存在していないように、プロ領域は発現中に除去されてよいことを明らかにしている。しかし、当然のことながら、プロ領域が発現後でも保持されているタンパク質／融合タンパク質も、本発明の範囲内にある。
【００３６】
また、本発明の上記の態様及びその任意の実施形態による核酸構造体はまた、構造体から生成されたタンパク質の無脊椎動物の腸からのトランスロケーションを媒介できるタンパク質の配列（「キャリア」タンパク質）、又はそのフラグメント若しくは変異体を含んでよい。そのような配列は、毒素タンパク質配列に融合し、それによって、融合タンパク質を生成してよい。昆虫の腸に結合する如何なるタンパク質も、キャリアタンパク質としてとして使用でき、腸内条件下での安定であり、哺乳動物に対して非毒性である。
【００３７】
キャリアタンパク質として機能し得る適切なタンパク質として、レクチンが挙げられる。遺伝子的に、昆虫の腸に結合する如何なるレクチンも使用できる。本発明のある実施形態では、キャリアタンパク質は植物レクチンである。
【００３８】
本発明者は、ある種の植物レクチンは、腸タンパク質分解に対して耐性があり、他のペプチドを腸から標的種の循環系へと送達するキャリアとして作用する可能性があることを以前に明らかにしている。また、本発明者は、毒素に植物レクチンを融合することにより、無脊椎有害生物の腸壁を通したトランスロケーションを助け、これにより毒素の生物活性を増加させて、そのような融合タンパク質を農薬として利用できるようにすることも示している。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、キャリアタンパク質は、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、ニンニクレクチン（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、マメレクチン（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｐ−ｌｅｃ）、ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、サヤインゲンレクチン（ＰＨＡ、フィトヘマグルチニン）、又はそのフラグメント若しくは変異体の１又は複数から選択される植物レクチンである。
【００４０】
植物レクチンの「フラグメント又は変異体」に関しては、フラグメント又は変異体が実質的にレクチンの生物活性を保持する、即ち、無脊椎動物の腸からの融合タンパク質のトランスロケーションを媒介できる場合、特定のレクチンの核酸配列は、当該分野で公知のもの及び天然起源のものと異なってよい。
【００４１】
好ましい実施形態では、レクチンはＧＮＡである。驚くべきことに、本発明者は、本明細書の実施例において、プロ領域及びＧＮＡの配列とともに毒素の配列を含む核酸構造体から生成された毒素タンパク質は、毒素単独、ＧＮＡにだけ結合した毒素、及びプロ領域にだけ結合した毒素と比べて、無脊椎有害生物に対する生物活性を増加させることを明らかにした。プロ領域の追加又は他のタンパク質への融合は、それぞれ、組換え毒素の生物活性を増進させると予想されるであろうが、両修飾の組合せにより相加効果を生み出すとは予想されないであろう。これらの修飾は両方とも、同じ結果、即ち、正しいタンパク質のフォールディングとなり、従って、何れか又は両方の修飾は、生物活性の同じような増進を導くと考えられていた。本発明者は、これは事実ではないことを明らかにしている。
【００４２】
理解されるように、（ｉ）節足動物の毒素配列と、（ｉｉ）プロ領域と、（ｉｉｉ）キャリアタンパク質配列とを含む核酸構造体の出発物質は、（ｉ）プロ領域及び（ｉｉ）キャリアタンパク質配列で構成される核酸構造体である。
【００４３】
従って、本発明の第５の態様は、（ｉ）プロ領域又はそのフラグメント若しくは変異体と、（ｉｉ）構造体から生成されるタンパク質（キャリアタンパク質）の無脊椎動物の腸からのトランスロケーションを媒介しうるタンパク質の配列又はそのフラグメント若しくは変異体とを含む核酸構造体を含む。
【００４４】
プロ領域及びキャリアタンパク質は、本発明の上記の態様に関して議論した任意のプロ領域／キャリアタンパク質であってよい。
【００４５】
核酸構造体を生成する方法は、一般的な分子生物学技術を使用する。ポリヌクレオチドを結合して連続する１本鎖又は２本鎖、とりわけ２本鎖ＤＮＡを形成する種々の方法が開発され、例えば、制限酵素を使用する消化により生成された相補的付着末端（complementary cohesive termini）によるものがある。適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第３版に記載されている。当業者はそのような方法を容易に使用し、本発明の第２態様による核酸分子を生成することができる。さらに、本明細書の実施例で、そのような分子をどのようにして生成するかについてさらに詳しく述べる。
【００４６】
本発明の核酸構造体を生成する望ましい方法では、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する。この方法は、例えば、制限酵素による消化に適切な部位を設計することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてよく、又は、当該分野で公知のように、他の有用な方法でＤＮＡを修飾するために使用されてよい。
【００４７】
本発明のある実施形態では、本発明の上記の態様及びその実施形態による核酸構造体は、発現コンストラクトである。
【００４８】
「発現コンストラクト（expression construct）」は、当該分野で周知の用語である。発現コンストラクトは、バイオテクノロジーにおける組換えタンパク質生成の基本的なツールである。発現コンストラクトは、特定の核酸配列を標的細胞、「宿主細胞」に導入するために使用されるプラスミドを一般的に含んでいる。発現コンストラクトが細胞の中に入ると、その核酸配列でコード化されたタンパク質が、細胞転写及び翻訳機械リボソーム複合体により生成される。また、プラスミドは、宿主ゲノムへの組込みによる幾つかのケースでは、ベクターの維持及び増殖に必要な核酸配列を含んでもよい。発現ベクターの目的は、大量の安定なメッセンジャーＲＮＡ、ひいてはタンパク質の生成である。
【００４９】
本発明の核酸構造体は、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント（terminator fragment）、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び／又は他の配列を始めとする適切な制御配列を更に含んでよい。さらに詳細に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第３版を参照のこと。
【００５０】
核酸構造体がさらに操作されて、エンハンサー領域及びプロモーター領域として作用し、構造体に乗せられた融合タンパク質配列の効率的な転写を導くような制御配列が含められてよい。制御ユニットの多くの部分は、異種遺伝子のコード配列の上流に位置し、それに操作可能に結合する。さらに、真核生物宿主、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現が予想されるなら、核酸構造体はポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域を下流に含んでもよい。制御配列は、異種コード配列の恒常的又は誘導性発現を誘導することができる。
【００５１】
個々の核酸フラグメントをつなげて本発明の核酸構造体を作るために使用される方法では、２乃至４個の余分なアミノ酸残基をプロ領域のＮ−末端に導入してよく、１２個までのアミノ酸をキャリアタンパク質Ｃ−末端に導入してよい。また、毒素とキャリア配列の間に短い「リンカー」領域が存在してもよい。これらの追加のアミノ酸残基は、コード配列を維持し、毒素又は融合タンパク質の活性に影響しない。
【００５２】
本明細書で使用される用語「生物活性」は、無脊椎有害生物に対する組換え毒素の毒性を言う。生物活性の計算は、ＬＤ５０に基づいてよい。
【００５３】
組換え毒素の発現のための核酸構造体にプロ領域を導入することにより、生物活性は、プロ領域のない核酸構造体から生成された組換え毒素の生物活性と比べて、少なくとも２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％又はそれを超えて増加し得る。本件の場合、そのような生物活性は農薬活性でもよく、これは、有害生物の死、寿命の減少、受精率又は産卵の減少などのような繁殖の限界を始めとする種々の技術により測定することができる。
【００５４】
組換え毒素の発現用の発現コンストラクトにキャリアタンパク質の配列をさらに導入することにより、生物活性は、毒素配列及びプロ領域を含む核酸構造体から生成される組換え毒素の生物活性と比べて、少なくとも２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％又はそれを超えて増加し得る。
【００５５】
本発明の発現系は、原核生物系でも真核生物系でもよい。適切な発現系としては、細菌発現系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母菌発現系（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、糸状菌発現系（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物、動物及び昆虫細胞発現系が挙げられる。しかし、利用する発現系は、酵母ピキア・パストリスが好ましい。ピキアタンパク質発現系は当該分野で周知であり、従って、宿主細胞として使用される細胞を容易に得ることができる。
【００５６】
本発明の宿主細胞は、原核生物細胞でも真核生物細胞でもよい。好ましい原核生物宿主細胞は、通常、大腸菌の株、例えば、大腸菌株ＤＨ５及びＲＲ１である。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母、昆虫及び哺乳動物の細胞が挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、サル、又はヒト線維芽細胞の細胞株から得られる細胞のような脊椎細胞である。酵母宿主細胞として、一般的に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７，ＵＳＡから入手可能なＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００及びＹＰＨ５０１が挙げられる。しかし、宿主細胞は、酵母ピキア・パストリスが好ましい。ピキアタンパク質発現系は、当該分野で周知であり、従って、宿主細胞として使用する細胞は、容易に得ることができる。細胞株は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から得ることができるＳＭＤ１１６８Ｈである場合が特に好ましい。
【００５７】
核酸構造体を持つ適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には使用されるベクターの種類に依存する周知の方法によって達成される。原核生物宿主細胞の形質転換については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第３版を参照のこと。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６に記載されている。
【００５８】
電気穿孔法もまた、細胞を形質転換及び／又は形質移入するために有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞及び脊椎動物の細胞を形質転換する技術において周知である。電気穿孔により酵母を形質転換する方法は、Ｂｅｃｋｅｒ  ＆  Ｇｕａｒｅｎｔｅ、１９９０に開示されている。
【００５９】
形質転換に成功した細胞、即ち、本発明による核酸構造体を含む細胞は、周知の技術により同定できる。例えば、本発明の核酸構造体の導入により得られた細胞を成長させて、毒素融合タンパク質を生成することができる。細胞を採取し、溶解し、ＤＮＡの存在について、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５又はＢｅｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５に記載されるようにしてそれらのＤＮＡ量を調べることができる。
【００６０】
従って、形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明は、栄養培地におけるこれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル培養物、又はモノクローナル培養物から誘導された培養物も考慮している。
【００６１】
本発明の上記の態様の実施形態では、核酸構造体は、一旦発現すると、毒素タンパク質の回収及び精製を助ける親和性タグをコード化する配列を更に含む。
【００６２】
組換えタンパク質の親和性精製を助けるために短いアミノ酸タグ配列を使用することは、当該分野で周知である。実際、多くの市販のタンパク質発現コンストラクトは、そのようなタグをコード化する核酸配列を含む。関心のあるタンパク質は、親和性タグを前記のタンパク質に結合するような方法で、発現コンストラクトに挿入される。種々の異なる親和性タグは当該分野で公知であって、キチン質結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、及びポリヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）が例示される。
【００６３】
Ｈｉｓ−タグは、多くの場合タンパク質のＮ−又はＣ−末端に、少なくとも５個のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基で構成されるタンパク質中のアミノ酸モチーフである。また、ヘキサヒスチジン−タグ、６ｘＨｉｓ−タグ、商品名Ｈｉｓ−タグ（登録商標）としても知られている。これらは、周知の親和性タグであり、Ｈｉｓ−タグを組換えタンパク質に導入する方法も、Ｈｉｓ−タグを持つタンパク質を精製する一般的な方法のように、当該分野で公知である。本発明の好ましい実施形態では、追加の親和性タグ配列は、Ｈｉｓ−タグをコード化する。
【００６４】
本発明の第４態様の方法は、本発明の第３態様（及び本明細書に記載されているその任意の実施形態）に記載されているような宿主細胞を、融合タンパク質の発現を得るように、充分な時間及び適切な条件下で培養培地で培養する工程を更に含んでもよい。
【００６５】
宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を単離する方法は、当該分野で周知である。適切な精製技術の例は、本明細書の実施例にて記載される。先に記載したように、融合タンパク質は、当業者には公知のように、親和性試薬を使用する精製を助けるように親和性タグを含んでもよい。
【００６６】
本発明による生物活性が増加した組換え毒素タンパク質は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを始めとする周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。
【００６７】
或いは、本発明による生物活性が増加した組換え毒素タンパク質は、上澄みから回収されてもよい。この場合、当業者に理解されているように、宿主細胞は、簡単な遠心分離により上澄みから回収する。タンパク質は、上記の技術のような、当該分野で公知の標準的な技術を使用して、培養培地から単離できる。
【００６８】
本発明者は、本発明による生物活性が増加した組換え毒素タンパク質は、農薬として使用できることを見い出した。
【００６９】
本発明の第６の態様は、本発明の第１又は第４態様により生成された毒素タンパク質を含む農薬組成物と、この明細書に記載されるその任意の実施形態とを提供する。
【００７０】
農薬は、任意の有害生物に対して使用される化学物質、生物由来物質（例えば、ウィルス又は細菌）、抗菌剤、殺虫剤、又はデバイスであってよい。有害生物としては、産物を破壊する、病気を伝播する、病気のベクターである、又は害を起こすような昆虫、植物病原菌、雑草、軟体動物、トリ、哺乳動物、サカナ、線虫（回虫）、及び微生物が挙げられる。しかし、本発明の「農薬」においては、有害生物は、産物、特に農産物を破壊する任意の無脊椎動物であることを意味する。
【００７１】
より好ましくは、毒素タンパク質は、以下の種類の有害生物を駆除、又は少なくとも衰弱させることができる：甲虫類、例えば、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ）；カウピーゾウムシ（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）；鱗翅類、例えば、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）；テッポウムシ（Ｃｈｉｌｏ  ｐａｒｔｅｌｌｕｓ）；同翅類、例えば、トビイロウンカ（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ）；ライスグリ−ンリーフホッパー（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｉｔｅｐｓ）；ポテトリーフホッパー（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）；モモアカアグラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）；エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）；双翅類、例えば、キモグリバエ（Ｃｈｌｏｒｏｐ  ｐｕｍｉｌｉｏｎｉｓ）；バッタ類、例えば、コオロギ及びバッタ；等翅類、例えば、シロアリ；総翅類、例えば、アザミウマ；膜翅類、例えば、アリ、及びダニ目の節足有害生物（ダニ）。
【００７２】
特に好ましい有害生物として、鱗翅類ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、甲虫）、ウィートバルブフライ（Ｗｈｅａｔ  ｂｕｌｂ  ｆｌｙ）（デリア・コアルクタタ（Ｄｅｌｉａ  ｃｏａｒｃｔａｔａ）、ハナバエ科）、及び穀類アブラムシ、シトビオン・アベナエ（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ）、同翅類が挙げられる。
【００７３】
また本発明者は、本発明の方法により生成される、生物活性が増加した組換え毒素タンパク質が、軟体動物に対する殺虫活性を有するかどうかについても調べた。本明細書の実施例で示すように、驚くべきことに、ノハラナメクジ（Ｄｅｃｏｃｅｒａｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ、軟体動物）は、本発明により生成された組換え毒素タンパク質の殺虫活性の影響を受けやすいことが分かった。従って、本発明による組換え毒素タンパク質は、ナメクジ及びカタツムリ、特にノハラナメクジを始めとする軟体動物を駆除する、又は少なくとも衰弱させることができる。
【００７４】
好ましくは、本発明による殺虫性組成物は、望ましい任意の形態であって、例えば、溶液、エマルジョン、スプレー、懸濁液、粉末、泡、ペースト、顆粒、エアロゾル、カプセル、細かく若しくは粗雑に分裂したその他の材料、又は、天然若しくは合成材料用の含浸剤である。
【００７５】
好ましい実施形態では、殺虫性組成物は、適切な希釈剤、アジュバント、保存剤、分散剤、溶剤、乳化剤などと混合したスプレー、懸濁液などの形態である。適切な組成物成分は、従来から当該分野で使用されているものであり、特に、現在の経口投与用に適合したものである。組成物は、好ましくは、水、アルコール、鉱油などの適切な溶剤、例えば、カオリン、クレイ、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土、シリカなどの適切な個体キャリアを、方解石、大理石、軽石及び粉砕された天然繊維物質などの顆粒を支持する担体としての個体キャリアを使用して得られてよい。
【００７６】
加えて、本発明に使用するための組成物は、他の公知の殺虫剤、成長促進又は制御物質、除草剤、防カビ剤、相乗剤などを伴っており、密接した又は物理的な混合物として使用してもよい。
【００７７】
組成物は、植物又はその座（locus）に物理的又は化学的に関係しており、病原体による経口取込みに適することが好ましい。
【００７８】
組成物はそれ故に、０．００１重量％と９９重量％の間、好ましくは０．５重量％と９８重量％の間、より好ましくは１．０重量％と９５重量％の間の量で融合タンパク質（毒素）を含んでよい。
【００７９】
先に使用した用語「座」は、作物又は植物が成長する物理的な位置を言う。例えば、農業作物については、座は土地であり、野菜の作物については、座は花壇又は野菜畑であり、鑑賞用植物については、座は植木鉢又は容器であってよい。
【００８０】
本発明の第７の態様は、本発明の第６態様（及びこの明細書に記載されるその任意の実施形態）による農薬組成物を生成する方法であって、本発明（及びこの明細書に記載されるその任意の実施形態）により生成されており、生物活性が増加した毒素タンパク質を、殺虫に効果がある量で、１又は複数の適切なキャリア、希釈剤、アジュバント、保存剤、分散剤、溶剤、乳化剤と混合することを含む方法を提供する。
【００８１】
本発明の第８の態様は、植物の有害生物感染を予防する又は処置する方法であって、本発明により生成された生物活性が増加した毒素タンパク質、又は本発明の第６態様（及びこの明細書に記載されるその任意の実施形態）による農薬組成物を、植物又はその成長座に使用する工程、又は、本発明による核酸構造体を植物に導入する工程を含む方法を提供する。
【００８２】
様々な異なる軟体有害生物、特にノハラナメクジ（Ｄｅｃｏｃｅｒａｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）を、本発明の第８態様の方法を使用して制御できる。従って、本発明の第８態様の方法は、軟体有害生物がナメクジ又はカタツムリ、特にノハラナメクジである場合を含む。
【００８３】
本発明の第９の態様は、軟体有害生物への植物の感染を予防する又は処置する方法であって、本発明により生成された生物活性が増加した毒素タンパク質、又は本発明の第６態様（及びこの明細書に記載されるその任意の実施形態）による農薬組成物を、植物又はその成長座に使用する工程、又は本発明による核酸構造体を植物に導入する工程を含む方法を提供する。
【００８４】
上で列挙した、本発明、さらには、本発明に関連する態様及び実施形態により生成されて生物活性が増加した毒素タンパク質、特に農薬組成物は、軟体動物駆除剤として使用することができる。
【００８５】
軟体動物駆除剤は、消費者が使いやすいように適切に製造及び調合されることは理解されるだろう。例えば、軟体動物駆除剤は、作物に噴霧できる液体として、又は作物及び／又は座に適用できる顆粒として製造されてよい。
【００８６】
軟体動物駆除剤は、通例、餌（又は、ペレット）の形態で存在することは、当該分野で周知である。そのような形態で存在する場合、使用者は、軟体動物駆除剤を、植物又はその座に容易に配置して、軟体動物の害の感染を予防又は処置することができる。
【００８７】
本発明の第１０の態様は、それ故に、本発明により生成されており、生物活性が増加した毒素タンパク質及び／又は本発明の第６態様による農薬組成物を含む軟体動物駆除餌組成物を提供する。
【００８８】
ペレット又は餌は、有害生物が軟体動物駆除剤に曝されるのを助長するような軟体動物誘引剤を含むことができる。軟体動物誘引剤は、軟体動物を誘引する任意のものである。誘引剤は、摂食刺激物質であってもよい。摂食刺激物質は、軟体動物駆除剤を摂取するように腹足動物を誘引するために、ナメクジ及びカタツムリ毒餌配合物に従来から使用され、通常、誘引剤及び／又は食物である。摂食刺激物質と、他の適切な有機及び／又は無機キャリアとの混合物が使用されてもよい。軟体動物駆除剤用の適切な摂食刺激物質としては、穀物類（例えば、小麦粉、大麦粉、ライ麦粉、及びコメ澱粉）、ダイズ粉、魚粉、糖蜜、粉砕された菜種、などが挙げられる。本発明では、摂食刺激物質の混合物が使用されてもよい。他の公知の誘引剤としては、ビール、酵母及び死んだナメクジの抽出物が挙げられる。また、餌組成物は、アントラキノンのような１又は複数のトリ忌避剤を含んでもよい。
【００８９】
組成物は、軟体動物に対する長時間の防護をもたらすように、軟体動物駆除剤の放出を、時間をかけてゆっくりと又は遅らせるように調合されてよい。本配合物に使用され得る適切な緩効性補助剤としては、例えば、樹脂（例えば、ウレア／ホルムアルデヒド樹脂）、ダイズカス、ワックス、ステアリン酸塩及び油類（例えば、ひまし油）が挙げられる。
【００９０】
本発明の餌又はペレット組成物で使用され得る他の補助剤としては、例えば、結合剤（例えば、メチルセロソルブ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、天然ワックス、化学的に修飾されたワックス及び合成ワックス、糖類、デンプン、アルギン酸塩、寒天、リグノスルホネート及びアラビアゴム）、保水剤（例えば多価アルコール、糖類又はグリセロール）、保存剤、冷却剤、及び温血種用の忌避剤が挙げられる。
【００９１】
餌組成物は、被覆されてよく、湿気による劣化から保護される。そのような被覆により、餌組成物の寿命が長くなり、必要とされる再適用の回数が減らされ得る。湿った土壌に適用すると、餌組成物は、早まって劣化しないので適切である。
【００９２】
通常、餌組成物は、顆粒又はペレットの形態で提供される。ペレットの寸法は、標的腹足動物により簡単に食い尽くすことができるような寸法とされて、摂取が保証される。通常、ペレットの長さは、約１ｍｍ乃至約５ｍｍである。
【００９３】
本発明の第１１の態様は、本発明に従って毒素を発現可能であって、本発明による核酸構造体を含むトランスジェニック植物又はその子孫を提供する。
【００９４】
「トランスジェニック植物」に関して、当該植物は、その生殖細胞系に導入された本発明による核酸構造体を有してよく、又は、本発明による外因性核酸構造体を含んでよく、それらの何れかは、植物において発現できる。
【００９５】
本発明による核酸構造体を含むトランスジェニック植物は、正しいやり方で調整されると、本発明の方法に基づいて生物活性が増加した毒素タンパク質を生成することは理解されるだろう。生成されたタンパク質／融合タンパク質は、農薬として機能するであろう。
【００９６】
本発明による核酸構造体を含ませるために、様々な異なる植物種を修飾することができる。
【００９７】
任意の単子葉植物又は双子葉植物を使用できることは当業者であればわかるだろう。双子葉植物は、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ））、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）（ジャケツイバラ科（Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａｃｅａｅ）、ネムノキ科（Ａｅｓａｌｐｉｎｉａｃｅａｅ  Ｍｉｍｏｓａｃｅａｅ）、ソラマメ亜科（Ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ）又はマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ））、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、又はナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）を含むファミリーから選択してもよいが、これらに限定されない。例えば、植物は、レタス、ヒマワリ、シロイヌナズナ、ブロッコリー、ホウレンソウ、スイカ、スカッシュ、キャベツ、トマト、ジャガイモ、トウガラシ、タバコ、綿、オクラ、リンゴ、バラ、イチゴ、アルファルファ、マメ、ダイズ、ソラマメ、エンドウマメ、ヒラマメ、ピーナッツ、ヒヨコマメ、アプリコット、セイヨウナシ、モモ、ブドウのつる又は柑橘種から選択されてもよい。
【００９８】
例えば、サトウキビ、アブラナ／キャノーラ、アマニ、ヤナギ、ポプラ、ポプラ雑種、スイッチグラス、ススキ属、又はタエダマツのような裸子植物等のバイオ燃料及びバイオエネルギー作物も含まれる。また、サイロ用飼料（例えば、飼料用トウモロコシ）、牧草又は飼料（例えば、草、クローバー、サンフォイン（ｓａｎｆｏｉｎ）、ムラサキウマゴヤシ）、繊維（例えば、綿、亜麻）、建築用材（例えば、マツ、オーク）、パルプ材（例えば、ポプラ）、化学工業用の供給原料（例えば、高エルカ酸アブラナ、アマニ）用の作物も含まれる。
【００９９】
単子葉植物は、例えば、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）又はイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）から選択されてもよい。例えば、植物は、穀類作物であってよく、当該穀類作物は、例えば、小麦、コメ、大麦、トウモロコシ、エンバク、モロコシ、ライ麦、タマネギ、ニラ、キビ、ソバ、芝草、イタリアンライグラス、スイッチグラス、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、サトウキビ、又はフェスク属（Ｆｅｓｔｕｃａ）種である。
【０１００】
植物は、作物植物であるのが好ましい。作物植物は、ヒト又は動物の消費又は使用、又は他の非食物／餌用途のために商業的販売で成長させる任意の植物を意味する。好ましい植物は、トウモロコシ、タバコ、小麦、米、アブラナ、モロコシ、ダイズ、ジャガイモ、トマト、大麦、エンドウマメ、マメ、ソラマメ、綿、レタス、ブロッコリー、又は他のアブラナ科の野菜である。
【０１０１】
核酸構造体は、導入遺伝子として植物に導入できる。これは、植物遺伝子工学の分野で公知の種々の方法、例えば、アグロバクテリウムによる形質転換、微粒子銃、電気穿孔又はウィルス形質転換を使用して行うことができる。それらの技術は、当該分野で周知である。本明細書で列挙した植物種の各々に関して特定の技術を使用することも周知である。当該分野の方法が、当業者によって容易に適用されて、本発明による核酸配列を含むトランスジェニック植物又はその子孫を生成することができる。
【０１０２】
本発明のこの態様のトランスジェニック植物を製造するために使用される場合、核酸構造体は、通常、これを植物内の核酸配列の発現を配置するのに適切な「発現カセット」内に置かれる。発現カセットは通常、植物内、例えば、プロモーター領域の核酸の発現を調節するように作用する核酸配列を含むだろう。
【０１０３】
プロモーターの中には、植物における核酸の恒常的発現（constitutive expression）に至らせるものもあり、例えば、周知の３５Ｓプロモーター、１９Ｓプロモーター又はユビキチンプロモーターがある。
【０１０４】
他のプロモーターを使用して、核酸構造体の器官又は組織特異的発現が調節されてよい。「組織特異的プロモーター（tissue-specific promoter）」又は「組織好適プロモーター（tissue-preferred promoter）」は、全ての植物細胞で発現せず、特定の器官（例えば、葉又は種）、特定の組織（例えば、胚又は子葉）、又は特定の細胞型（例えば、葉実質又は種貯蔵細胞）における１又は複数の細胞型でのみ発現する調節プロモーターを言う。これらは、例えば、胚形成の初期又は後期、種又は果実の成長における果実成熟の間、完全に分化した葉、又は配列決定の始まりにおいて、一時的に調節されるプロモーターも含む。適切なプロモーターとしては、ナタネからのナピン遺伝子プロモーター、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）からのＵＳＰ−プロモーター、シロイヌマズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのオレオシンプロモーター、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）からのファゼオリンプロモーター、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からのＢｃｅ４−プロモーター又はレブミンＢ４プロモーター、単子葉植物において種特異的発現を付与するプロモーターが挙げられる。
【０１０５】
プロモーターは、葉及び茎のような緑色組織において転写を行わせるために、光合成組織において活性であり、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ＲｂｃＳ）プロモーター、例えば、アメリカカラマツ（カラマツ族（Ｌａｒｉｘ  ｌａｒｉｃｉｎａ））からのＲｂｃＳプロモーター、マツｃａｂ６プロモーター、コムギからのＣａｂ−１遺伝子プロモーター、ホウレンソウからのＣＡＢ−１プロモーター、イネからのｃａｂｌＲプロモーター、トウモロコシからのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＳＵＣ２スクロース−Ｈ＋シンポータープロモーター（SUC2 sucrose-H+ symporter promoter）が挙げられる。そのようなプロモーターの代表的な核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから当業者に容易に同定することができる。
【０１０６】
植物根組織における優先的な発現に適切なプロモーターとしては、例えば、コーンニコチアナミンシンセターゼ遺伝子から生じるプロモーター及びイネＲＣＣ３プロモーターが挙げられる。
【０１０７】
植物脈管組織における優先的な発現に適切なプロモーターとして、例えば、イネスクロースシンセターゼ−１遺伝子（ＲＳｓ１）が挙げられる。
【０１０８】
誘導プロモーターとしては、非生物的及び生物的環境刺激に応答するプロモーターが挙げられる。非生物的環境刺激としては、光、温度、及び水の利用が挙げられる。生物的環境刺激としては、病原体（例えば、ウィルス誘導、細菌誘導、真菌誘導、昆虫誘導及び線虫誘導プロモーター）、共生生物及び草食動物との相互作用が挙げられる。プロモーターは、動き、接触、組織損傷、及び植物ホルモン（例えば、アブシジン酸、サイトカイニン、オーキシン、ジベレリン、エチレン、ブラシノステロイド、及び、システミンや結節形成ファクターのようなペプチド）にも応答してもよい。時間的プロモーターとして、２４時間周期のプロモーター、及び非２４時間周期時間管理メカニズムに対応するプロモーターが挙げられる。
【０１０９】
遺伝子発現が時間特異的に起こることが望まれる場合には、化学的誘導プロモーターは特に適切である。そのようなプロモーターの例には、サリチル酸誘導プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター、及びエタノール誘導プロモーター（国際公開第９３／２１３３４号）がある。
【０１１０】
植物にける発現を向上させるために、核酸構造体のコドン使用が修飾されてよく、植物細胞内における毒素タンパク質の発現効率を上げるように、技術に従って、同等な修飾された又は人工の遺伝子若しくは遺伝子部分を形成することができる。核酸が、植物のプラスチド（例えば、葉緑体）又はミトコンドリアゲノムに更に挿入されて、適切なプロモーターを使用してそこで発現させてもよい。トウモロコシやイネのような単子葉植物において強化された発現を得るために、イントロン（例えば、単子葉のイントロン）をキメラ遺伝子に更に加えることもできる。
【０１１１】
本発明の（及び本発明の方法における使用に適切な）キメラ核酸は、キメラ核酸配列が成功裏に導入された植物細胞の同定において助けになり得る生成物の発現用の核酸配列を更に含むことが好ましい。この方法に使用してもよい、適切な更なる核酸配列の例は、当業者には明らかであって、例えば、選択のために使用される物質（例えば、抗生物質）に耐性を与える生成物をもたらす核酸や、選択の基準として使用される検出可能な生成物（例えば、色素生成酵素生成物）をもたらすマーカーが挙げられる。
【０１１２】
本発明の更なる態様は、本発明による核酸構造体で形質転換された植物を提供する。
【０１１３】
更なる態様では、本発明は、本発明による核酸構造体を含む植物種を提供する。
【０１１４】
本発明の更なる態様は、農薬又はトランスジェニック植物細胞又は植物の製造において、本発明による核酸構造体を、又は、本発明により生成される毒素タンパク質を使用することを提供する。
【０１１５】
本発明の更なる態様は、１匹以上の有害生物を駆除又は衰弱させるために、本発明（及びこの明細書に記載するその任意の実施形態）の第６態様の農薬を使用することを提供する。
【０１１６】
本発明の更なる態様は、本明細書や配列に記載され、図に図示されたような核酸構造体、毒素タンパク質、組成物、ベクター、宿主細胞、トランスジェニック植物、又はこれらの生成又は使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
本発明は、非限定的な例及び図と関連して説明される。
【０１１８】
【図１】＜図１：プロ領域を含む毒素の遺伝子構造の概略＞（Ａ）プロ領域を含む毒素タンパク質の遺伝子構造の概略図。（Ｂ）クモ毒素、Ｈｖ１ａの配列。四角で囲ったアミノ酸配列は、プロ領域に対応する。
【０１１９】
【図２】＜図２：組換えＨｖ１ａ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ毒素の発現及び精製＞（Ａ）培養上澄みからの組換え連鎖球菌タグ付きＨｖ１ａ毒素の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（２０％アクリルアミド）分析。レーン１及びレーン２は、ＧＮＡ標準物質（それぞれ、０．５及び０．２５μｇ）であり、レーン３及びレーン４は、２．５ｍＭのデスチオビオチンによるストレプタクチン（Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）カラムからの溶出後のピークフラクション（１０μｌ）である。（Ｂ）組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａのＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（１５％アクリルアミド）分析。レーン１及びレーン２は、０．２Ｍのイミダゾールでのニッケル親和性カラムからの溶出後のピークフラクション（１０μｌ）である。矢印は、ヒスチジンタグが開裂したＰｒｏ−Ｈｖ１ａであると予想される主なタンパク質生成物を示す。（Ｃ）抗Ｈｉｓ抗体を使用する（Ｂ）におけるサンプルのウェスタンブロット分析。
【０１２０】
【図３】＜図３：精製Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、及びＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡの凍結乾燥サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析＞融合タンパク質を含む精製組換えＨｖ１ａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１７．５％のアクリルアミドゲル）であり、ゲルは、全タンパク質に関してクーマシーブルーで染色されている。負荷（loading）は以下の通り：レーン１：Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、レーン２：Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、レーン３：ＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡ、レーン４乃至６：それぞれ１、２及び４μｇのＧＮＡ標準物質、レーン７乃至９：１２．５、２５及び５０μｇの凍結乾燥精製Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ（融合タンパク質含量の定量化を可能にするため）。
【０１２１】
【図４】＜図４：組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、及びＨｖ１ａ／ＧＮＡのヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）に対する注射毒性＞組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ又はＨｖ１ａ／ＧＮＡの異なる用量の注射後の第３〜第５齢のヨトウガ幼虫の生存率である。（Ａ）種々の用量のＰｒｏ−Ｈｖａ１の注射後の第５齢幼虫の生存率。（Ｂ）種々の用量のＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ（用量Ａ）又はＨｖ１ａ／ＧＮＡ（用量Ｂ）の注射後の第３〜第４齢幼虫の生存率。（Ｃ）種々の用量のＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ（用量Ａ）及びＨｖ１ａ／ＧＮＡ（用量Ｂ）の注射後の第５齢幼虫の生存率。
【０１２２】
【図５】＜図５：ヨトウガに対する組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、及びＧＮＡの摂取毒性＞２０μｇの精製Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ又はＧＮＡを含む２μｌの単一液滴の摂取後の第３齢ヨトウガ幼虫の生存率である。対照幼虫には、追加のタンパク質を含まない液滴を与えた（１処置当たりｎ＝１０）。
【０１２３】
【図６】＜図６：エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）及びムギヒゲナガアブラムシ（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ）に対する組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、又はＧＮＡの摂取毒素＞０．０５〜０．７５ｍｇ／ｍｌの精製組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、又はＧＮＡを含む人工餌での（Ａ）エンドウヒゲナガアブラムシ（pea aphids）及び（Ｂ）ムギヒゲナガアブラムシ（ｃｅｒｅａｌ  ａｐｈｉｄｓ）の生存率である。
【０１２４】
【図７】＜図７：ノハラナメクジ（Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）に対する組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａ／ＧＮＡの注射毒性＞１００、５０又は２５μｇのＨｖ１ａ／ＧＮＡ又はＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡを注射したノハラナメクジ（２００ｍｇ±４０ｍｇ）の生存率である。対照処置では、ｎ＝１８、１００μｇの用量では、ｎ＝１０、５０及び２５μｇの用量では、ｎ＝８である。
【０１２５】
【図８】＜図８：組換えＰｌ１ａ及びＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ毒素の発現及び精製＞（Ａ）「正常」ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された成熟毒素配列をコード化する構造体から誘導されたＰｌ１ａ毒素。Ｍはマーカーを示し、Ｐｌ１ａの負荷は、５及び１０μｇである。（Ｂ）６Ｍの尿素による変性後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたＰｌ１ａ毒素（５μｇ）。（Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のプロ領域指定Ａｏ１ｂを含む構造体から誘導された組換えＰｌ１ａ毒素。Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａの負荷は２．５μｇである。（Ｄ）抗Ｈｉｓ抗体を使用した精製Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ（２５、５０及び１００ｎｇ）のウェスタンブロット。
【０１２６】
【図９】＜図９：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の特徴付け＞（Ａ）Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質（１０μｇ）及びＧＮＡ標準物質（５μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ｂ）ＰＮＧａｓｅＦ（中抜きの矢印で示された幅）、ＧＮＡ標準物質（５μｇ）を使用したＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の脱グリコシル化。（Ｃ）Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（１、２及び４μｇ）、ＧＮＡ標準物質（５μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ｄ）Ｈｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（１、２及び４μｇ）、ＧＮＡ標準物質（１、２及び４μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【０１２７】
【図１０】＜図１０：ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）に対する組換えＰｌ１ａ及びＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａの注射毒性＞（Ａ）異なる用量の精製組換えＰｌ１ａの注射後の第５齢ヨトウガ幼虫の生存率である。（Ｂ）異なる用量の精製組換えＰｌ１ａ（用量Ａ）又はＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ（用量Ｂ）の注射後の第５齢ヨトウガ幼虫の生存率。
【０１２８】
【図１１】＜図１１：ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）に対する組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡ、Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡの注射毒性＞異なる用量の精製組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡ（Ａ）、Ａｏ１ｂ−ＰｒｏＰｌ１ａ／ＧＮＡ（Ｂ）、又はＰｒｏ−Ｈｖ１ａ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（Ｃ）の注射後の第５齢ヨトウガ幼虫の生存率。１処置当たり、ｎ＝２０である。
【０１２９】
【図１２】＜図１２：ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）に対する組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡ、Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡの摂取毒性＞２０μｇの精製Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（Ａ）、Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（Ｂ）、又はＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（Ｃ）融合タンパク質を含む２μｌの単一液滴の摂取後の第３齢ヨトウガ幼虫の生存率である。対照は、全てのケースで、スクロースだけ（タンパク質は加えず）、３０μｇのＰｌ１ａ毒素（成熟又は修正型）又はＧＮＡであった。
【０１３０】
＜略語＞
ＢＢ：結合緩衝剤
ＥＣＬ：強化化学発光
ＨＲＰ：セイヨウワサビパーオキシターゼ
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＹＰＧ：酵母抽出物ペプトングリセロール
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
＜材料及び方法＞
＜組換えＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質のクローン化＞
成熟Ｈｖ１ａアミノ酸配列をコード化する合成遺伝子を、酵母における発現についてコドン使用が最適化された一連の重複オリゴヌクレオチド（Ｆｉｔｃｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を使用して構築した。成熟Ｈｖ１ａペプチドをコード化する発現コンストラクトを作るために、ＰｓｔＩ部位及びＳａｌＩ部位を持つプライマーを使用してＰＣＲでコード配列を増幅し、メーカーのプロトコルに記載されているように、ＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して切り取ったゲルスライスから精製した。抽出ＤＮＡフラグメントを消化し（ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ）、同様に消化された酵母発現ベクターｐＧＡＰＺαＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。当該ベクターは、インフレームで５’連鎖球菌タグを含むように、酵母α−ファクタープレ−プロ−配列で前もって修飾されていた。得られたプラスミドをエレクトロコンピテント大腸菌細胞に形質転換し、選択したクローンについて、構造体が正確な集合体であるか否かについて、ゲル電気泳動及びＤＮＡ配列決定で調べた。
【０１３２】
Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａコード配列を、ＰｓｔＩ部位及びＸｂａＩ部位を持つプライマー（正方向：ＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴ及び逆方向：ＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＡＣ）を使用してＰＣＲで増幅した。ゲル抽出生成物をＰｓｔＩ及びＸｂａＩで消化し、同様に消化された酵母発現ベクターｐＧＡＰＺαＢに連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、選択したクローンについて、構造体が正確な集合体であるか否か、ゲル電気泳動及びＤＮＡ配列決定で調べた。
【０１３３】
Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ構造体を生成するために、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａコード配列を、ＰｓｔＩ部位及びＮｏｔＩ部位を持つプライマー（正方向：ＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴ及び逆方向：ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＡＣ）を使用してＰＣＲで増幅し、前記のようにゲル電気泳動で精製した。ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩによる制限後、ＰＣＲ生成物を、前もって生成されたｐＧＡＰＺαＢプラスミドに連結した。当該プラスミドは、同じ酵素で消化された成熟ＧＮＡコード配列を含んでいた。Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質をコード化する発現ベクターを含む選択したクローンを、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３４】
Ｈｖ１ａ構造体の配列を以下に示す。
【０１３５】
天然Ｈｖ１ａ：ＳＰＴＣＩＰＳＧＱＰＣＰＹＮＥＮＣＣＳＱＳＣＴＦＫＥＮＥＮＧＮＴＶＫＲＣＤ
【０１３６】
組換えＨｖ１ａ（アルファファクターシグナル配列、Ｈｖ１ａ毒素、連鎖球菌タグ緑色のハイライト領域、プロ領域なし、キャリアなし）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＬＱＳＰＴＣＩＰＳＧＱＰＣＰＹＮＥＮＣＣＳＱＳＣＴＦＫＥＮＥＮＧＮＴＶＫＲＣＤ
【０１３７】
組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ（アルファファクターシグナル配列、Ｈｖ１ａ毒素、プロ領域、キャリアなし（Ｈｉｓ）６タグ）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＡＥＤＴＲＡＤＬＱＧＧＥＡＡＥＫＶＦＲＲＳＰＴＣＩＰＳＧＱＰＣＰＹＮＥＮＣＣＳＱＳＣＴＦＫＥＮＥＮＧＮＴＶＫＲＣＤＡＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ
【０１３８】
組換えＨｖ１ａ／ＧＮＡ（アルファファクターシグナル配列、Ｈｖ１ａ毒素、プロ領域なし、キャリア）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＡＳＰＴＣＩＰＳＧＱＰＣＰＹＮＥＮＣＣＳＱＳＣＴＦＫＥＮＥＮＧＮＴＶＫＲＣＤＡＡＡＤＮＩＬＹＳＧＥＴＬＳＴＧＥＦＬＮＹＧＳＦＶＦＩＭＱＥＤＣＮＬＶＬＹＤＶＤＫＰＩＷＡＴＮＴＧＧＬＳＲＳＣＦＬＳＭＱＴＤＧＮＬＶＶＹＮＰＳＮＫＰＩＷＡＳＮＴＧＧＱＮＧＮＹＶＣＩＬＱＫＤＲＮＶＶＩＹＧＴＤＲＷＡＴＧＶＤ
【０１３９】
組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ（アルファファクターシグナル配列、Ｈｖ１ａ毒素、プロ領域、キャリア、（Ｈｉｓ）６タグ）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＡＥＤＴＲＡＤＬＱＧＧＥＡＡＥＫＶＦＲＲＳＰＴＣＩＰＳＧＱＰＣＰＹＮＥＮＣＣＳＱＳＣＴＦＫＥＮＥＮＧＮＴＶＫＲＣＤＡＡＡＤＮＩＬＹＳＧＥＴＬＳＴＧＥＦＬＮＹＧＳＦＶＦＩＭＱＥＤＣＮＬＶＬＹＤＶＤＫＰＩＷＡＴＮＴＧＧＬＳＲＳＣＦＬＳＭＱＴＤＧＮＬＶＶＹＮＰＳＮＫＰＩＷＡＳＮＴＧＧＱＮＧＮＹＶＣＩＬＱＫＤＲＮＶＶＩＹＧＴＤＲＷＡＴＧＶＤＨＨＨＨＨＨ
【０１４０】
＜組換えＰｌ１ａ及びＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質のクローン化＞
酵母についてコドン使用が最適化されており、成熟Ｐｌ１ａ毒素（Ｐ８３２５６）をコード化した配列を組み込んでいる２本鎖ＤＮＡを、発明者により設計し、合成し、ＳｈｉｎｅｇｅｎｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（上海２０１１０９、中国；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅ．ｃｏｍ／）によってベクターｐＵＣ５７に与えた。他のオリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から得た。
【０１４１】
Ｐｌ１ａコード配列を、ＰｓｔＩ及びＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によりコード配列フラグメントを単離し、次いで同じ酵素で消化されたｐＧＡＰＺαＢに連結することで、ｐＵＣ５７から酵母発現ベクターｐＧＡＰＺαＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。ＤＮＡフラグメントを、ＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して切取ったゲルスライスから精製した。得られた組換えプラスミドを、エレクトロコンピテント大腸菌細胞の形質転換により標準プロトコルを使用してクローン化した。選択したクローンについて、構造体が正確な集合体であるか否かについてＤＮＡ配列決定で調べた。Ｐｌ１ａの発現用の修飾構造体を生成するために、Ｕ３−アガトキシン−Ａｏ１ｂ（Ｑ５Ｙ４Ｖ７）のプロ領域をコード化する２つの相補的合成オリゴヌクレオチドを構築し、Ｐｌ１ａ発現コンストラクトのＰｓｔＩ部位に挿入した。構造体（ＰｒｏＡｏ１ｂ−Ｐｌ１ａ）の正確な集合体であることをＤＮＡ配列決定で調べた。
【０１４２】
Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質をコード化する構造体を生成するため、ｐＧＡＰＺαＢで確認された発現コンストラクトの成熟Ｐｌ１ａコード配列を、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩによる消化によって切取り、アガロースゲル電気泳動で精製した。融合タンパク質構造体Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ（Ｆｉｔｃｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を含むｐＧＡＰＺαＢプラスミドを、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩで消化してＨｖ１ａコード配列を除去し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、精製フラグメントを連結して、得られた組換えプラスミドをクローン化することにより、Ｈｖ１ａコード化領域をＰｌ１ａで置き換えた。Ｕ３−アガトキシン−Ａｏ１ｂのプロ領域を含む、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ用に修飾された発現コンストラクトを生成するために、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ発現コンストラクトを上記のように修飾し、加えて、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ−Ｐｌ１ａとして指定された更なる構造体において、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ毒素のプロ領域を単独で使用した。Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質をコード化する発現ベクターを含む選択したクローンを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。全てのＤＮＡ配列決定は、ＤＢＳ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｕｒｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＫ）によるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３７３０自動化ＤＮＡ配列決定装置を使用して行った。
【０１４３】
Ｐｌ１ａ構造体の配列を以下に示す。
【０１４４】
天然Ｐｌ１ａ：ＧＣＬＧＥＧＥＫＣＡＤＷＳＧＰＳＣＣＤＧＦＹＣＳＣＲＳＭＰＹＣＲＣＲＮＮＳ
【０１４５】
組換えＰｌ１ａ（アルファファクターシグナル配列、Ｐｌ１ａ毒素、プロ領域なし、キャリアなし、（Ｈｉｓ）６タグ）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＡＧＣＬＧＥＧＥＫＣＡＤＷＳＧＰＳＣＣＤＧＦＹＣＳＣＲＳＭＰＹＣＲＣＲＮＮＳＡＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ
【０１４６】
組換えＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ（アルファファクターシグナル配列、プロ領域［Ａｏ１ｂ］、Ｐｌ１ａ毒素、キャリアなし、＋（Ｈｉｓ）６タグ）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＡＩＳＹＥＥＧＫＥＬＦＱＫＥＲＧＣＬＧＥＧＥＫＣＡＤＷＳＧＰＳＣＣＤＧＹＣＳＣＲＳＭＰＹＣＲＣＲＮＮＳＡＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ
【０１４７】
組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡ（アルファファクターシグナル配列、Ｐｌ１ａ毒素、プロ領域なし、キャリア、（Ｈｉｓ）６タグ）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＡＧＣＬＧＥＧＥＫＣＡＤＷＳＧＰＳＣＣＤＧＦＹＣＳＣＲＳＭＰＹＣＲＣＲＮＮＳＡＡＡＤＮＩＬＹＳＧＥＴＬＳＴＧＥＦＬＮＹＧＳＦＶＦＩＭＱＥＤＣＮＬＶＬＹＤＶＤＫＰＩＷＡＴＮＴＧＧＬＳＲＳＣＦＬＳＭＱＴＤＧＮＬＶＶＹＮＰＳＮＫＰＩＷＡＳＮＴＧＧＱＮＧＮＹＶＣＩＬＱＫＤＲＮＶＶＩＹＧＴＤＲＷＡＴＧＶＤＨＨＨＨＨＨ
【０１４８】
組換えＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（アルファファクターシグナル配列、プロ領域［Ａｏ１ｂ］、Ｐｌ１ａ毒素、キャリア、（Ｈｉｓ）６タグ）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＡＩＳＹＥＥＧＫＥＬＦＱＫＥＲＧＣＬＧＥＧＥＫＣＡＤＷＳＧＰＳＣＣＤＧＣＳＣＲＳＭＰＹＣＲＣＲＮＮＳＡＡＡＤＮＩＬＹＳＧＥＴＬＳＴＧＥＦＬＮＹＧＳＦＶＦＩＭＱＥＤＣＮＬＶＬＹＤＶＤＫＰＩＷＡＴＮＴＧＧＬＳＲＳＣＦＬＳＭＱＴＤＧＮＬＶＶＹＮＰＳＮＫＰＩＷＡＳＮＴＧＧＱＮＧＮＹＶＣＩＬＱＫＤＲＮＶＶＩＹＧＴＤＲＷＡＴＧＶＤＨＨＨＨＨＨ
【０１４９】
組換えＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（アルファファクターシグナル配列、プロ領域［Ｈｖ１ａ］、Ｐｌ１ａ毒素、キャリア、（Ｈｉｓ）６タグ）：
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲＥＡＥＡＡＡＥＤＴＲＡＤＬＱＧＧＥＡＡＥＫＶＦＲＲＧＣＬＧＥＧＥＫＣＡＤＷＳＧＰＣＣＤＧＦＹＣＳＣＲＳＭＰＹＣＲＣＲＮＮＳＡＡＡＤＮＩＬＹＳＧＥＴＬＳＴＧＥＦＬＮＹＧＳＦＶＦＩＭＱＥＤＣＮＬＶＬＹＤＶＤＫＰＩＷＡＴＮＴＧＧＬＳＲＳＣＦＬＳＭＱＴＤＧＮＬＶＶＹＮＰＳＮＫＰＩＷＡＳＮＴＧＧＱＮＧＮＹＶＣＩＬＱＫＤＲＮＶＶＩＹＧＴＤＲＷＡＴＧＶＤＨＨＨＨＨＨ
【０１５０】
＜酵母でのＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の発現＞
Ｈｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ配列を含むｐＧＡＰＺαＢプラスミドを、大腸菌中で増幅し、精製し、ＢｌｎＩ（Ｔａｋａｒａ）で直線状にした。直線プラスミドを、製造者のプロトコルに記載されたようにＥａｓｙＣｏｍｐ形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＳＭＤ１１６８Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換酵母クローンを、ゼオシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＧ寒天板（１％の酵母抽出物（ｗ／ｖ）、２％のペプトン（ｗ／ｖ）、４％のグリセロール（ｖ／ｖ）、１．５％寒天（ｗ／ｖ））上で選択した。選択したクローンの発現を、ＹＰＧ−ゼオシン培地、３０℃で２乃至３日成長させた少量振盪フラスコ培養物（１０ｍｌ）の培養上澄みの分析により調べた。上澄みのサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ゲルをニトロセルロース上にブロットし、抗（Ｈｉｓ）６一次抗体（ＢｉｏＲａｄ）又は抗連鎖球菌抗体で探索し、又は、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡに関し、ブロットを抗ＧＮＡ一次抗体で探索し、次いで洗浄し、ＨＲＰ−複合二次抗体（ＢｉｏＲａｄ）で探索し、先述したようにＥＣＬによって結合抗体を検出した（Ｆｉｔｃｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；２０１２）。
【０１５１】
タンパク質生成に関して、組込みＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ発現カセットを含む、選択したピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）クローンを、７．５ＬのＢｉｏＦｌｏ１１０ベンチトップ発酵槽（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、又は５ＬのＢｉｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｙ  ＡＤＩ１０１０ベンチトップ発酵槽（ＡＰＰＬＩＫＯＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、オランダ）の何れかで成長させた。形質転換ピキア・パストリスのＹＰＧ培養物（２００ｍｌ）を、振盪しながら、３０℃で２乃至３日成長させ（ゼオシン抗生物質なし）、その後、２．５ＬのＰＴＭ１塩を補った無菌最少培地に接種した。３０℃、３０％溶存酸素、ｐＨ４．５〜５．０で連続撹拌する培養を、勾配グリセロール供給（５〜１０ｍｌ／時間、合計１．２５ｌ）で４日間行った。続いて、培養上澄みを遠心分離（２０分、８０００ｒｐｍ、４℃）により分離し、２．７μＭ及び０．７μＭガラス繊維フィルター（ＧＦＤ及びＧＦＦ、Ｗｈａｔｍａｎｎ）を通して、ろ過によりきれいにした。Ｈｖ１ａに関し、上澄みだけを、４倍濃縮ストックを加えることにより、ｐＨ８．０で０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液に調整した。組換えＨｖ１ａを、流量０．５ｍｌ／分で、ストレプタクチンカラム（１ｍｌ）で精製した。ｐＨ８．０で０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液でカラムを平衡化した。２．５ｍＭのデスチオビオチン（リン酸緩衝液中、ｐＨ８．０）を使用して、連鎖球菌タグ付きＨｖ１ａをカラムから溶出した。全ての他のタンパク質に関して、４倍濃縮ストック（４倍結合緩衝剤［ＢＢ］）を加えることによって、上澄みを、０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、０．４Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７に調整した。組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａ  Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡを、ニッケル親和性クロマトグラフィーによって、流量２ｍｌ／分で、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐクルードニッケルカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。装填後、カラムをＢＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．４Ｍの塩化ナトリウム）で１回、次いで０．０２５Ｍのイミダゾールを含むＢＢで洗浄し、最後に、結合組換えタンパク質を、０．２Ｍのイミダゾールを含むＢＢで溶出した。全てのケースで、次いで、溶出タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べ、複数の変更をして脱イオン水に対して透析して全小分子を除去し、凍結乾燥した。組換えタンパク質の濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走るＧＮＡ標準物質の既知の量との比較によって、又はＢＣＡ（商標）タンパク質分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＢＣＡ分析によって評価した。
【０１５２】
＜酵母でのＰｌ１ａ及びＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の発現＞
Ｐｌ１ａ及びＰｌ１ａ／ＧＮＡ発現コンストラクトを含むｐＧＡＰＺαＢプラスミドを、大腸菌中で増幅し、精製し、ＢｌｎＩで直線状にした。直線プラスミドを、製造者のプロトコルに記載されたようにＥａｓｙＣｏｍｐ形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ピキア・パストリス株ＳＭＤ１１６８Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換酵母クローンを、ゼオシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＰＧ寒天板（１％の酵母抽出物（ｗ／ｖ）、２％のペプトン（ｗ／ｖ）、４％のグリセロール（ｖ／ｖ）、１．５％寒天（ｗ／ｖ））上で培養及び選択した。選択されたクローン（各構造体に関し少なくとも１０個）の組換えタンパク質の発現を、ＹＰＧ−ゼオシン培地で、３０℃で２乃至３日成長させた少量振盪フラスコ培養物の培養上澄みの分析により調べた。上澄みのサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ゲルをニトロセルロース上にブロットし、抗（Ｈｉｓ）６一次抗体（ＢｉｏＲａｄ）又は抗ＧＮＡ一次抗体で探索し、次いで洗浄し、ＨＲＰ−複合二次抗体（ＢｉｏＲａｄ）で探査し、ＥＣＬによって結合抗体の検出を行った。
【０１５３】
組込みＰｌ１ａ及びＰｌ１ａ／ＧＮＡ構造体を含むピキア・パストリスの選択したクローンを、５ＬのＢｉｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｙ  ＡＤＩ１０１０ベンチトップ発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、オランダ）で成長させた。発酵に関し、毒素又は融合遺伝子を含む２種の１００ｍｌのピキア・パストリスのＹＰＧ培養物を、振盪しながら、３０℃で２乃至３日成長させ、次いで、ＰＴＭ１塩を補った２．５Ｌの無菌最少培地に接種するために使用した。３０℃、３０％の溶存酸素、ｐＨ４．５〜５．０で、連続撹拌する培養を、勾配グリセロール供給（５乃至１０ｍｌ／時間）で４日間続けた。遠心分離（５０００ｇで２０分）によって培養上澄みを細胞から分離し、５倍濃縮ストックを加えることにより、０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、０．４Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４に調整した。組換えタンパク質を、ニッケル親和性クロマトグラフィーによって、流量２ｍｌ／分で、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐクルードニッケルカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。装填後、カラムを、０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、０．４Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で洗浄し、結合タンパク質を同じ緩衝液中の０．２Ｍのイミダゾールで溶出した。溶出タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べ、複数の変更をして脱イオン水に対して透析して全小分子を除去し、凍結乾燥した。組換えタンパク質の濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走るＧＮＡ標準物質の既知の量との比較によって、又はＢＣＡ（商標）タンパク質分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＢＣＡ分析によって評価した。
【０１５４】
＜昆虫のバイオアッセイ＞
第３〜第５齢ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）幼虫（体重約３０乃至５５ｍｇ）を注射バイオアッセイのために使用した。５μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）中のＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｐｌ１ａ、Ａｏ１ｂＰｒｏＰｌ１ａ、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ、Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ、又はＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（１用量当たりｎ＝２０）を種々の用量で幼虫に注射した。対照幼虫には、５μｌの１×ＰＢＳを、注射した。注射から１２乃至９６時間後の麻痺及び死亡率を記録した。
【０１５５】
ヨトウガの第３乃至第５齢幼虫に対するＨｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｐｌ１ａ、Ａｏ１ｂＰｒｏＰｌ１ａ、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ、Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ、又はＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡの経口活性を調べるために、液滴供給アッセイを行った。液滴消費を助長するために、給餌前に、幼虫を約２４時間飢餓状態にした。１０％スクロース（ｗ／ｗ）を含む１×ＰＢＳ溶液中に２０μｇの上記融合タンパク質、３０μｇの毒素又は３０μｇのＧＮＡを含む２μｌ液滴を幼虫に給餌した。対照幼虫には、追加のタンパク質を含まないＰＢＳ／スクロース液滴を与えた。液滴の消費後、処置した幼虫を、標準的な人工餌に置いた。
【０１５６】
Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡのエンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）（cereal aphids）及びシトビオン・アベナエ（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ）（cereal aphids）に対する殺虫効果を、既知の濃度の融合タンパク質（Ｐｒｏｓｓｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｕｇｌａｓ、１９９２）を含む１００μｌの液体人口餌を、２重のパラフィルム袋（途中の餌液滴）を使用して餌を昆虫に供給することによって給餌し、アッセイを行った。実験では、１乃至２日齢のアブラムシを使用し、生存を毎日６日間調べた。
【０１５７】
＜注射バイオアッセイ：ノハラナメクジ（Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）（軟体動物グレイフィールドスラグ（grey field slug））＞
成虫ナメクジ（ノハラナメクジ）に対するＨｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの活性を、成虫ナメクジ（０．２乃至０．３ｇ）への注射によって試験した。ナメクジは、４℃で冷やし（約１５分間）、その後、２０μｌのＰＢＳに再懸濁した２５μｇ、５０μｇ又は１００μｇの精製融合タンパク質を注射した。死亡率を毎日７日間調べた。
【０１５８】
＜統計分析＞
生存データを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析、Ｐｒｉｓｍ（ｖ５）ソフトウェアを使用して分析した。他の全データ分析は、Ｏｒｉｇｉｎ８．５グラフ及びデータ分析ソフトウェアを使用して行った。測定されたパラメーターにおける処置間での任意の有意な装置を測定するために、ＡＮＯＶＡ分析（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｄｕｎｎポストホックテストによる）を行った。
【０１５９】
＜結果＞
本発明者は、毒素の発現コンストラクト内へのプロ領域の含有の、前記毒素の生物活性に対する効果を調べるために、実験を行った。
【０１６０】
＜Ｈｖ１ａの毒性を調べる実験＞
＜序論＞
プロ領域を含ませることによる組換え毒素の毒性に与える影響を調べるために、ω−ヘクサトキシン（Hexatoxin）−Ｈｖ１ａを使用した。ω−ヘクサトキシン−Ｈｖ１ａは、ジョウゴグモ（ハドロニュケ・ベルスタ（Ｈａｄｒｏｎｃｙｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ））から単離された毒素である。ω−ヘクサトキシン−Ｈｖ１ａ（又はω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ）は、カルシウムチャネルアンタゴニストであり、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、無脊椎動物のカルシウムチャネルをブロックできるが、脊椎動物のカルシウムチャネルをブロックできないことが既に分かっている。
【０１６１】
ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを毛虫に限定的に使う場合、それは農薬としてそのままで使用できることは分かっている（Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）が、ペプチド単独での殺虫力に関する更なる証拠は報告されていない。特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０００２８７において、本発明者は、ピキア・パストリスで発現された組換え毒素（ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ）の毒性は、植物レクチンＧＮＡとの融合したタンパク質を発現することによって強化できることを実証している。植物レクチンＧＮＡは、腸上皮を通り、無脊椎動物の腸から循環系へ「パッセンジャー」ペプチドを送達することが既に分かっている。
【０１６２】
インビトロで発現された毒素の効力がどのように改善されるかについて、さらに調べるために、本発明者は、節足動物の毒素をコード化する遺伝子のＤＮＡ配列を分析した。ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０００２８７で利用されている節足動物の毒素は、数種のスーパーファミリーのタンパク質配列（節足動物以外の有機体からの毒素を含む）に属する、小さいシステインリッチなタンパク質である。コード化遺伝子は、最終タンパク質生成物には存在しない２つの配列、即ち、翻訳中に除去された予想Ｎ−末端シグナルペプチドと、シグナルペプチドと単離された時のタンパク質の最終配列との間にある予想プロ領域とを含む（図１Ａ参照）。
【０１６３】
本発明者は、組換えタンパク質の全般的な毒性に対する、発現コンストラクト内にプロ領域を含ませることの効果を調べた。
【０１６４】
先ず、ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは遺伝子配列内に予想プロ領域を含むので、この毒素を使用した（図１Ｂ参照）。
【０１６５】
＜組換えＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの合成遺伝子構造体、発現及び精製＞
組換えＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質構造体を、標的遺伝子発現に導く強い構成型プロモーター（ＧＡＰＤＨ）を有するベクターｐＧＡＰＺαＢを用いて合成した。ｐＧＡＰＺベクターは、発現宿主ピキア・パストリスにおける組込み型ベクターであり、選択された形質転換体は、宿主ゲノムに組込まれた発現コンストラクトを含む。組換えＨｖ１ａ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａを発現するための構造体は、毒素について公開された配列に対応している予想アミノ酸配列を含んでいた。Ｈｖ１ａについては、酵母α−ファクタープレ−プロ−配列及び８個の連鎖球菌タグをコード化するアミノ酸（即ち、３アミノ酸リンカー「ＧＬＱ」を介して成熟Ｈｖ１ａ配列のＮ−末端に結合したＷＳＨＰＱＦＥＫ）を用いて、成熟ペプチドをインフレームでクローン化した。Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａについては、Ｎ−末端プロ領域を、酵母α−ファクタープレ−プロ−配列をコード化する配列にインフレームでＣ−末端にて配置し、構造体は、予想生成物のＣ−末端に、ベクターにより供給されたｍｙｃエピトープ及び（Ｈｉｓ）６タグをコード化する配列を含んでいた。Ｈｖ１ａ／ＧＮＡについては、成熟毒素配列を、３アミノ酸（ＡＡＡ）リンカーペプチドを介して、成熟スノードロップレクチン（ＧＮＡ）の残基１乃至１０５に対応するコード配列のＮ−末端に融合した。Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡについては、合成Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａコード配列を、３アミノ酸（ＡＡＡ）リンカーペプチドを介して、成熟スノードロップレクチン（ＧＮＡ）の残基１乃至１０５に対応するコード配列のＮ−末端に融合した。両方の融合タンパク質構造体はまた、酵母α−ファクタープレ−プロ−配列を用いて、ベクターによって供給された（Ｈｉｓ）６タグをコード化する配列に対しＣ−末端にインフレームで配置した。構造体を、エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡを連結して構築し、クローン化後、ＤＮＡ配列決定により調べた。
【０１６６】
組換えＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ又はＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡを含む配列確認されたクローンを、ピキア・パストリスのプロテアーゼ−欠失株ＳＭＤ１１６８Ｈに形質転換し、抗生物質ゼオシンを使用して選択した。選択したクローンを、３０℃で３乃至４日間、振盪フラスコ培養で成長させ、ウェスタンブロット法を使用して、培養上澄みの組換えタンパク質の発現を分析した。これにより、高発現クローンをベンチトップ発酵による生成用に選択することを可能にした。分析された大部分の形質転換酵母クローンは、ウェスタンブロット上で予想寸法の免疫反応性バンドの存在により判断されたので、タンパク質発現の証拠を示した（結果は示さず）。
【０１６７】
選択したクローンの発酵を、制御した環境条件下、バイオリアクターで行った。発現タンパク質の細胞から成長培地への分泌を導くｐＧＡＰアルファファクター分泌シグナルを使用することにより、次に続く、発酵培養上澄みからの組換えタンパク質の精製が可能になった。上澄みは、遠心分離により得、ろ過によりきれいにし、続いて、組換えタンパク質を、親和性クロマトグラフィー（Ｈｖ１ａについてはストレプタクチン、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡについてはニッケル親和性）により精製した。標的タンパク質を含む溶出ピークを、透析及び凍結乾燥により脱塩した。組換えタンパク質の収率に関して、ＢＣＡ定量化による評価で、Ｈｖ１ａが約５乃至１０ｍｇ／Ｌで培養上澄みで生成され、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａが約４０ｍｇ／Ｌで生成され、半定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価で、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡが約４０ｍｇ／Ｌで、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡが約２１ｍｇ／Ｌで生成された。
【０１６８】
図２Ａ（レーン３及びレーン４）に示すように、５’連鎖球菌タグ付き成熟精製Ｈｖ１ａは、５．４７ｋＤａの予想分子質量に匹敵する約６．５ｋＤａの単一タンパク質としてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に分離した（ゲルは、低分子量タンパク質の分離のように最適化されてなかった）。精製組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａを、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して分離し、総タンパク質の染色と、抗Ｈｉｓ抗体を使用するウェスタンブロット法の両方によって分析した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。組換え毒素Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａは、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル上で、約４ｋＤａで主タンパク質バンドを、さらに、６〜１６ｋＤａの分子質量範囲で弱いバンドを示した。約４ｋＤａの主バンドは、抗−（Ｈｉｓ）６抗体との免疫反応性はなく（図２Ｃ）、分子質量は、Ｃ−末端タグ領域の開裂後の予想質量（４．０６ｋＤａ）と一致する。ニッケル親和性カラムからのＨｉｓ−タグ化タンパク質を伴った非Ｈｉｓ−タグ化タンパク質のプルダウンは、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）上澄みから回収された他の組換えタンパク質について、以前に観察されていた。抗−（Ｈｉｓ）６抗体との陽性免疫反応性を示す１０ｋＤａのタンパク質は、プロ領域を含む組換えＨｖ１ａの予想質量（９ｋＤａ）に相当し、プロ領域の開裂は、酵母細胞によるプロセス中は未完成であることを示唆している。Ｃ−末端Ｈｉｓ領域を含むがプロ領域は含まないＨｖ１ａの予想質量が６．７４ｋＤａであるとすれば、抗−（Ｈｉｓ）６抗体と免疫反応性でもある１４ｋＤａのバンドは、Ｈｖ１ａの２量体形態を表しているかもしれない。
【０１６９】
精製Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡの凍結乾燥サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した（図３）。約１９ｋＤａ及び１４ｋＤａの２つのバンドが、全ての融合タンパク質に関して観察された。Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの予想分子質量は１６．２７ｋＤａであり、プロ領域はないが（Ｈｉｓ）６タグを含むＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの予想分子質量は１６．９５であり、両方とも観察された１９ｋＤａバンドより僅かに少ない。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａ／ＧＮＡの全く同じ分離は、プロ領域は、ピキア・パストリス細胞によるプロセッシング中にＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡから開裂されたことを示唆している。無処置ＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡの予想質量は１７．０９ｋＤａであり、それに応じて、このタンパク質は、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡに存在しない追加のヒスチジンタグの存在に起因して、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡと比較して僅かに大きなタンパク質として動く。全てのケースにおいて、より小さな１４ｋＤａバンドは、ＧＮＡ抗体との免疫反応性があり（結果は示さず）、その寸法はＨｖ１ａ毒素が開裂されたＧＮＡに相当する。Ｈｖ１ａ／ＧＮＡについて既に観察されているように（Ｆｉｔｃｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、無処置Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の開裂ＧＮＡに対する比は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でクーマシーブルー染色によって約１：１と評価された。一方で、ＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡにおけるＨｖ１ａ配列の修飾により、無処置融合タンパク質のより高い回収をもたらす（無処置：開裂の比は２：１）。Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の定量化は、図３に示すように、既知濃度のＧＮＡ標準物質との比較バンド強度に基づいている。
【０１７０】
＜組換えＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質のヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）幼虫に対する注射毒性＞
用量が１００μｇまでのＨｖ１ａ注射は、生存が対照と比較できる幼虫死亡率にはならなかった（ｎ＝４０、生存率＞９０％）。これは、Ｎ−末端プロ領域のない成熟Ｈｖ１ａペプチドの発現では、生物学的に非活性な毒素が生成されることを実証し、毒素は、酵母細胞による合成中に、不正確にプロセッシング及び／又はフォールディングされることを示唆している。対照的に、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ、ＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡ又はＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの何れかを、新しく孵化した第３乃至第４齢のヨトウガ幼虫に注射し（約３０乃至４０ｍｇ）、第５齢のヨトウガ幼虫に注射する（約４５乃至５５ｍｇ）と、有意な幼虫死亡率を招いた。
【０１７１】
図４Ａに示すように、第５齢幼虫への注射後における組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａの効果は、用量依存的であった。昆虫１匹あたり１０μｇ及び２０μｇのＰｒｏ−Ｈｖ１ａの注射用量で、注射から２４時間後、完全に死亡し、５μｇ／匹の注射で、注射から２４時間後の死亡率は８０％であった。１．２５μｇ／匹の最も低い用量で、幾つかの麻痺した昆虫は回復したが、全ての昆虫が弛緩性麻痺を示し、一時的に摂食をやめ、注射から２乃至３時間後に摂食を回復できた。これらのアッセイからすると、組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａの推測ＬＤ５０（致死量、４８時間）は、２５μｇ／ｇ体重であった。表１にまとめたように、これは、大腸菌で生成された組換えＨｖ１ａ毒素について以前に公開された値、即ち、ＬＤ５０（７２時間）約６９μｇ／ｇ体重より約３倍低い。
【０１７２】
図４Ｂ及び図４Ｃに示すように、第３乃至４年齢及び第５齢のヨトウガ幼虫へのＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの注射は、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡと比較して、毒性の増加を実証した。例えば、１０μｇのＨｖ１ａ／ＧＮＡを第５齢の幼虫に注射することで、同じ用量のＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの注射から２４時間後に記録された１００％死亡率と比較して、７２時間後に５０％の死亡率という結果となった。有意な幼虫死亡率（７５％）が、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの用量が２．５μｇ／匹で観察された一方、５又は１０μｇのＨｖ１ａ／ＧＮＡの注射では、第５齢の幼虫に関し、いかなる有意なレベルの死亡率にもならなかった。同様の結果が、より小さな第３乃至４齢の幼虫の注射の後に観察された（図４Ｂ）。表１に示すように、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡに関する推測ＬＤ５０値は、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡに関する５５μｇ／ｇ体重のＬＤ５０と比較して、約１０倍低かった（４．６μｇ／ｇ体重）。これは、プロ領域のＨｖ１ａ／ＧＮＡ構造体への追加により、ＧＮＡに融合した成熟毒素配列をコード化する構造体から誘導されたタンパク質に比較して、有意により毒性のある融合タンパク質を生成する結果となることを実証する。より驚くべきことには、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡについて計算した４．６μｇ／ｇ体重のＬＤ５０値は、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａについて求められた２５μｇ／ｇ体重より約５倍低い。これは、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａのＧＮＡへの結合により、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ単独又はプロ領域のないＨｖ１ａ／ＧＮＡより高い生物活性を持つタンパク質となることを示す。Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡについて計算した４．６μｇ／ｇ体重のＬＤ５０値も、天然のＨｖ１ａに関する文献値（組換えＨｖ１ａに対して、表１参照）より２倍を超えて低い。この文献値は、ヨトウガと同じ昆虫目の種であるタバコガ亜科（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）におけるＬＤ５０値を示す。我々は、ＧＮＡをＰｒｏ−Ｈｖ１ａに融合することで、ピキア・パストリス細胞によるＨｖ１ａ毒素の正確なプロセッシング及びフォールディングがさらに促進され、達成される生物活性がさらに増加すると仮定する。４０μｇ／匹の昆虫までのＧＮＡ単独の注射では、ヨトウガ幼虫は死亡しない。
【０１７３】
【表１】
2017501746.tif 000002
【０１７４】
＜Ｈｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質のヨトウガ（Ｍ．  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）幼虫に対する摂取毒性＞
２０μｇの融合タンパク質を含む２μｌの液滴を、新しく孵化した第３齢のヨトウガ幼虫に与えることで、プロＨｖ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａ／ＧＮＡの経口活性を調べた。対照処置は、タンパク質を加えない対照群への２０μｇのＧＮＡ又はＰｒｏ−Ｈｖ１ａであった。図５及び表２に示すように、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡを与えた幼虫のみに有意な効果が観察され、融合タンパク質の単一液滴の摂取から５日後に９０％の死亡率が記録された。対照的に、死亡率は、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質に関して３０％しかなく、ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ処置で観察されたそれぞれ２０％及び１５％の死亡率より僅かに大きかった。同様の結果がアッセイで観察され、そこでは、２０μｇの単一用量のＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質が、４日間で、第５齢の幼虫で３０％の死亡率を引き起こすことが明らかとなり、一方、２０μｇのＨｖ１ａ／ＧＮＡ又はＰｒｏ−Ｈｖ１ａを与えられた幼虫に関しては、死亡は観察されなかった（結果は示さず）。
【０１７５】
【表２】
2017501746.tif 000003
【０１７６】
＜組換えＨｖ１ａ、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質のエンドウヒゲナガアブラムシ（Ａ．ｐｉｓｕｍ）及び穀類アブラムシ（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ）に対する摂取毒性＞
組換えＰｒｏ−Ｈｖ１ａタンパク質、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａ／ＧＮＡのエンドウヒゲナガアブラムシ及び穀類アブラムシに対する経口活性を、０．１２５ｍｇ乃至０．７５ｍｇ／ｍｌ（１２５乃至７５０ｐｐｍ）で人工餌に導入することによって試験した。鱗翅目幼虫で観察されるように、精製Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡは、両アブラムシ種に対して、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡよりもより有意に毒性があることが分かった（図６Ａ及び図６Ｂ）。Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡは、７５０ｐｐｍで、３日後、エンドウヒゲナガアブラムシに、１００％の死亡率を起こし、一方同じ用量のＨｖ１ａ／ＧＮＡは、与えてから８日後で５０％の死亡率しか起こさなかった。より低い５００ｐｐｍの用量を与えてから８日後の死亡率は、エンドウヒゲナガアブラムシでは、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡは２０％であったのに比較して、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡでは１００％であった。
【０１７７】
Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡは、穀類アブラムシに対してＨｖ１ａ／ＧＮＡよりも有意な毒性があることも分かった。図６Ｂで示されるように、２５０ｐｐｍのＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡを含む餌を７日間与えられた穀類アブラムシについて、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡを与えられたアブラムシは６０％であったのに比較して、１００％の死亡率が記録された。穀類アブラムシは、エンドウヒゲナガアブラムシよりも、Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡに対する感受性が強いように見える。何故ならば、死亡率の有意なレベルが、１２５ｐｐｍのＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡと同じ低い濃度で観察され（与えてから２日後に８０％の死亡率）、一方、同じ用量の融合タンパク質を与えられたエンドウヒゲナガアブラムシでは、死亡は記録されなかったからである。
【０１７８】
＜組換えＭＯＤＨｖ１ａ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質のグレイフィールドスラグ（Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）に対する注射毒性＞
ＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡのナメクジ（Ｄ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）に対する活性を、成虫ナメクジ（約０．２ｇ）に注射することにより試験した。ＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡは、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの修正型に相当し、Ｈｖ１ａのＣ−末端の単一のアミノ酸変化が示されており、無処置融合タンパク質の発現を改良するが、Ｈｖ１ａ／ＧＮＡと同等の毒性はない。ナメクジを４℃で冷やして（約１５分間）、その後、２０μｌのＰＢＳに再懸濁した２５μｇ、５０μｇ又は１００μｇの精製Ｈｖ１ａ／ＧＮＡを注射した。死亡率を毎日７日間調べた。図７に、両方の処置に関して観察された用量依存性死亡率を示す。Ｐｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡの死亡率は、注射された全ての用量に関して、ＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡと比べて有意に大きかった（Ｐ＜０．０５、マンテル・コックス検定）。例えば、５０μｇのＭＯＤＨｖ１ａ／ＧＮＡの注射から５日後の死亡率は、１０％であったのに対して、５０μｇのＰｒｏ−Ｈｖ１ａ／ＧＮＡ注射では、３日後で１００％の死亡率が記録された。
【０１７９】
＜Ｐｌ１ａの毒性を調べる実験＞
＜序論＞
Ｈｖａ１／ＧＮＡ融合タンパク質に関して得られた結果は、遺伝子配列が予想プロ領域を含まない毒素タンパク質を選んで、グローバルタンパク質データベース中の類似の配列に基づいて、プロ領域を発現コンストラクトに導入することで拡張された。クモ（メガネヤチグモ（Ｐｉｒｅｎｅｉｔｅｇａ  ｌｕｃｔｕｏｓａ））からの毒素δ−アマウロビトキシン−Ｐｌ１ａを利用した。
【０１８０】
＜組換えＰｌ１ａ及びＰｌ１ａ／ＧＮＡの発現及び精製＞
ピキア・パストリスにおける組換えタンパク質の生成用発現コンストラクトは、ベクターｐＧＡＰＺαＢに基づいている。それは、組換えタンパク質の組換えの発現を導くために使用される強い構成型プロモーターを含んでおり、ＧＡＰＤＨ座で宿主ゲノムに組込むように設計されており、安定な形質転換物を与える。組換えＰｌ１ａの生成用の発現コンストラクトは、毒素指定Ｐｌ１ａの公開されたアミノ酸配列に相当しており、酵母α−ファクタープレ−プロ−配列をコード化する配列に対してＣ−末端にインフレームで配置された合成コード配列を含んでいた。毒素プロ領域を含む構造体は、酵母α−ファクタープレプロ−配列とＰｌ１ａ毒素配列との間に挿入されたこれらを有していた。使用されたプロ領域は、密接に関係している毒素である、クモ（アジェレナ・オリエンタリス）（Ａｇｅｌｅｎａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のＵ３−アガトキシン−Ａｏ１ｂ（プロ領域を含むＰｌ１ａのｃＤＮＡ配列は入手できない）指定Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａと、Ｈｖ１ａアトラコトキシン（ａｔｒａｃｏｔｏｘｉｎ）のプロ領域の先に記載したような指定Ｈｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａとから得られた。また、発現コンストラクトは、ベクターにより供給されたｍｙｃエピトープ及び（Ｈｉｓ）６タグをコード化するＣ−末端配列も含んでいた。
【０１８１】
組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の生成のために３種の発現コンストラクトを作った。これらは全て、成熟Ｐｌ１ａコード配列を含んでおり、当該配列は、３アミノ酸リンカーペプチドを介して、成熟スノードロップレクチン（ＧＮＡ）の残基１乃至１０５に対応するコード配列のＮ−末端に融合していた。再び、融合タンパク質は、α−ファクタープレ−プロ−配列に対してＣ−末端に、ベクターにより供給された（Ｈｉｓ）６タグをコード化する配列に対してＮ−末端にインフレーム配置されていた。また、修飾融合タンパク質構造体は、酵母α−ファクタープレプロ−配列とＰｌ１ａの成熟コード配列との間に挿入された、先に記載したようなＡｏ１ｂ及びＨｖ１ａのプロ領域も含んでいた。これらは、指定Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡであった。構造体は、制限連結により構築され、クローン化後、ＤＮＡ配列決定により調べられた。
【０１８２】
発現コンストラクトの確認されたクローンを、形質転換体の抗生物質（ゼオシン）選択を使用して、プロテアーゼ−欠損ピキア・パストリス株ＳＭＤ１１６８Ｈに形質転換した。各発現コンストラクトにつき、約５０個の耐性コロニーが得られた。Ｐｌ１ａ及びＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質を最高濃度で生成するクローンを選択するために、振盪フラスコ培養で成長した選択クローンの培養上澄みを、組換えタンパク質の生成に関して、ウェスタンブロット法により分析した。多数の形質転換酵母クローンのスクリーニングは必要ではなかった。何故ならば、培養上澄みのウェスタンブロット上での予想サイズの免疫反応性バンドの存在（結果は示さず）から判断されるように、ほとんどのクローンは発現組換えタンパク質であったからである。
【０１８３】
各構造体について、少量培養物においてスクリーニングされた構造体の最高発現クローンを、ベンチトップ発酵による大規模タンパク質生成のために選択した。培養上澄みをニッケル親和性クロマトグラフィーにより精製し、溶出ピークを透析により脱塩し、凍結乾燥した。最適化の前に、組換えタンパク質の収率を他の融合タンパク質と比較した。半定量的分析で測って、Ｐｌ１ａは約２６ｍｇ／Ｌ、Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａは約３２ｍｇ／Ｌ、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡは約２１ｍｇ／Ｌ、Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡは約３２ｍｇ／Ｌ、及びＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａは約１３ｍｇ／Ｌで生成された。
【０１８４】
精製組換えＰｌ１ａ毒素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット方法によって分析した（図８）。添加プロ領域のない構造体によって生成された組換え毒素Ｐｌ１ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を約１８ｋＤａの表示分子量で、近接２重バンドとして動き（図８Ａ）、両バンドとも抗（Ｈｉｓ）６抗体に免疫反応性であった。タグ配列を含む組換えＰｌ１ａの予想分子量は、６．８７ｋＤａである。毒素の２重バンドは、電気泳動前に、異なるゲル、サンプルで還元剤の使用により再生できたが、恐らくＳＤＳのポリペプチドに対する弱い結合力の結果として、ゲルシステムの人工産物であると考えられた。同じサンプルを６Ｍの尿素で再処置すると、Ｐｌ１ａは１４ｋＤａの表示分子量で単一バンドをもたらし（図８Ｂ）、移動相でのシフトは、ゲル人工産物を示し、単一バンドは生成物の同一性を示す。尿素含有ゲルでの更なる分析は、Ｐｌ１ａの単一バンドを与えた。システイン残基のブロックなしで、表示分子量は約１１ｋＤａであり、システイン残基をブロックするヨードアセトアミドでの処置後は、約９ｋＤａであった。これらの結果は、残りの二次構造と、電気泳動前又はその間のシステイン残基間での相互作用とに起因して「正常」条件下での不正確な分子量を診断する。Ｎ−末端配列決定によって、Ｋｅｘ２ｐＧＡＰＺαＢ開裂部位が不完全にプロセッシングされたことを確認した。これは、Ｎ−末端における追加のグルタミン酸及びアラニン残基と、７．０７ｋＤａの予想生成物質量とをもたらす。興味深いことに、プロ領域を導入する修飾構造体（Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ）により生成されたＰｌ１ａは、「正常」ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、約９ｋＤａで近接２重バンドとして動き、より高い分子量でぼやけたバンドがある証拠があった（図８Ｃ）。追加のプロ領域を含むペプチドの予想分子質量は、８．６ｋＤａである。Ｎ−末端配列決定によって、プロ領域はタンパク質生成物中に存在し、開裂は、アラニンとＡｏ１ｂプロ領域イソロイシンの一次残基の間で起こって、８．４６ｋＤａの予想分子質量を与えることが確認された。
【０１８５】
「正常」Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質（即ち、追加のプロ領域を含まない構造体から誘導されたものである）は、表示サイズが１８及び２１ｋＤａである２種類の主タンパク質としてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した（図９Ａ）。抗ＧＮＡ抗体に免疫反応性のある１８ｋＤａのタンパク質（結果は示さず）の質量は、組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡに関し予想されるものに相当していた（１７．１ｋＤａ）。２１ｋＤａのタンパク質も抗ＧＮＡ抗体に免疫反応性があり、１８ｋＤａバンドと同一のＮ−末端配列を有していた。Ｎ−グリコシド結合を介してＡｓｎ残基に結合する炭水化物側鎖を開裂する、脱グリコシル化酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆを使用する処置によってこのバンドを除去する一方、該処置の結果、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の「正確な」バンドの強度は増加した（図９Ｂ）。この結果は、余分なバンドは、合成及び分泌中におけるピキア・パストリスによる融合タンパク質の「核」グルコシル化に起因することを示唆している。ＧＮＡは、潜在的なＮ−グルコシル化部位は含まないが、Ｐｌ１毒素配列は、Ａｓｎ−３５に潜在的なＮ−グルコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）を含む。単一バンドのＮ−末端配列は、ピキア・パストリスからの翻訳及び分泌の間、酵母α−ファクタープレプロ領域の除去後に、融合タンパク質に関して予測されるように、Ｅ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−として決定された。また、抗ＧＮＡ抗体に免疫反応性である（結果は示さず）、組換えＧＮＡに類似する表示分子量（１２．７ｋＤａ）での少量のバンドは、生成及び精製中に、融合タンパク質のその成分への開裂が少量起きたことを示唆している。無処置Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の開裂ＧＮＡに対する比を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルクーマシーブルー染色により判断して約３０：１と評価した。
【０１８６】
追加のプロ領域配列を含む構造体から生じるＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の両方（即ち、Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ）は、約１７及び２１ｋＤａの２種類の染色バンドとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した（図９Ｃ及び図９Ｄ）。小さい１７ｋＤａのタンパク質の質量は、プロ領域の除去後のＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ（１６．９４ｋＤａ）について予想されるものに相当し、これは、両方の場合で、プロ領域は、酵母細胞によるプロセッシング中に除去されることを示唆している。大きな２１ｋＤａのタンパク質バンドは、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡで観察されたようにして、グルコシル化タンパク質を示す可能性が最も高い。Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ及びＨｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡの両方は、毒素とＧＮＡ配列の間の開裂についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法による証拠がなく、１００％無傷な（intact）融合タンパク質として発現した。
【０１８７】
＜組換えＰｌ１ａ及びＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａタンパク質のヨトウガ（Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）幼虫に対する注射毒性＞
毒素及び融合タンパク質のインビボ活性を調べ、比較するために、ヨトウガの新しく孵化した第５齢の幼虫（体重約４５乃至５５ｍｇ）に、精製組換えタンパク質を注射した。図１０Ａは、Ｐｌ１ａの注射後の幼虫の生存を示し、図１０Ｂは、Ｐｌ１ａ及びＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａの比較用量の注射後の生存を示す。Ｐｌ１ａ毒素を注射された幼虫は全て１乃至２時間以内に弛緩性麻痺を示した（動きは少なく、摂餌はほとんどなし）。最高死亡率は、最初の２４時間以内に観察された。麻痺期間後、回復の進行を見せ、摂餌を再び始めることができる昆虫もいた。Ｐｌ１ａの効果は用量依存的であり、２４時間後の死亡率は、２０μｇ毒素／昆虫での７５％から１．２５μｇ毒素／昆虫での２０％の範囲であった。高用量の毒素でさえ、７２時間後の完全死亡率は観察されなかった。これらのアッセイから、組換えＰｌ１ａの推測ＬＤ５０（４８時間）は、５０ｍｇの平均幼虫体重に基づいて４．１μｇ／匹又は８２μｇ／ｇ体重であった（表３参照）。天然のＰｌ１ａ（組換えＰｌ１ａに対して）ＬＤ５０の文献値は９．５μｇ／ｇである。この文献値は、この文献値は、ヨトウガと同じ昆虫目の種であるスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）におけるＬＤ５０値を示す。
【０１８８】
修飾発現コンストラクトから生成されており、Ｕ３−アガトキシン−Ａｏ１ｂからのプロ領域を含む組換えＰｌ１ａは、Ｐｌ１ａに類似する毒性作用を示したが、追加の配列のない構造体から生成されたＰｌ１ａより低い用量で、一貫してより効果的であった（図１０Ｂ）。再び、死亡率におけるＡｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａの大きな効果が、最初の２４時間の間に観察され、死亡率は、１０μｇ毒素／昆虫の８０％から１．２５μｇ毒素／昆虫の３０％の範囲であった。これらのアッセイでは、修飾構造体により生成された毒素が原因の死亡率は、７２時間まで増え続ける傾向があり、毒素の最高用量（１０μｇの毒素／匹の昆虫）は、７２時間にて１００％の死亡率を起こした。修飾されていない構造体により生成されたＰｌ１ａを使用する同時に行ったアッセイでは、先のアッセイと似た結果が得られ、同じアッセイにおける２つのサンプルの間の直接比較で、修飾されていない構造体及び修飾構造体で生成されたＰｌ１ａの間での相違は、同じ用量生存曲線を分析する場合、統計的に有意であることが示された（図１０Ｂ）。修飾構造体から生成された組換えＰｌ１ａ（Ａｏ１ｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ）の推測ＬＤ５０（４８時間）は、５０のｍｇ平均幼虫体重に基づいて約１．０μｇ／匹、又は２１μｇ／ｇ体重であった。これは、約４倍の毒性の増加と同等である（表３参照）。
【０１８９】
【表３】
2017501746.tif 000004
【０１９０】
Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質も、ヨトウガ幼虫に注射する麻痺及び死亡を引き起こし、毒素単独より有意に効果的であった（図１１Ａ）。１．２５乃至１０μｇ融合タンパク質／昆虫（組換えＰｌ１ａの分子量はＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の分子量の約０．４０４であるから、０．５０乃至４．０μｇＰｌ１ａ／昆虫と同等）を幼虫に注射すると、全ての用量で有意な死亡率が観察され、２４時間後の完全死亡は、最も高い用量で観察された（図１１Ａ）。Ｐｌ１ａと同様に、最高死亡率がアッセイの最初の２４時間以内に観察され、効果は用量依存的であり、死亡率の範囲は、１０μｇ融合タンパク質／昆虫の１００％の死亡率から１．２５μｇ融合タンパク質／昆虫での３５％であった。この最低用量の融合タンパク質での死亡率は７２時間後に６５％に増加し、一方、１．２５μｇの毒素だけの注射による死亡率は、２４時間と７２時間の間で、２０％から変化しなかった。これらのアッセイから、組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質の推測ＬＤ５０（４８時間）は、５０ｍｇの平均幼虫体重に基づいて１．４μｇ／匹又は２８μｇ／ｇ体重であった。ＬＤ５０は、１匹の昆虫当たり０．５６μｇのＰｌ１ａ毒素と同等であり、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質を、修飾されていない構造体で生成された毒素よりもモル比で約７倍、修飾Ａｏ１ｂ−Ｐｒｏ−Ｐｌ１ａ構造体によって生成された毒をより約２倍活性にした。同じ比は、死亡率値（figure）を使用すると７２時間で得られる。同じ用量の毒素及び融合タンパク質により起こされた死亡を直接比較することにより、３つの処置は、ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ）で、互いに異なり、また対照とも異なることが示される。これらアッセイの全てにおいて、コントロール注射された昆虫の死亡は７２時間を超えて観察されなかった。
【０１９１】
Ｐｌ１ａ毒素で観察されたように、Ａｏ１ｂプロ領域のＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質発現コンストラクトへの付加により、強化された生物活性を持つタンパク質生成物が得られた（図１１Ｂ）。この構造体から誘導された融合タンパク質生成物の推測ＬＤ５０（４８時間）は０．９４μｇ／匹であり、すべての用量で死亡率の増加は最高となることが期待された。天然のＰｒｏ−Ｈｖ１ａ毒素からの代替プロ領域のＰｌ１ａ／ＧＮＡ発現コンストラクトへの付加でも、得られた融合タンパク質の生物活性は強化された（図１１Ｃ）。全ての死亡率は、Ｐｒｏ−Ａｏ１ｂ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質に類似していたが、このタンパク質の推測ＬＤ５０（４８時間）は、＜０．６μｇ／匹であった。これらのデータは、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡに関する発現コンストラクトにおいてプロ領域を含ませることによって、毒性の２倍の増加を得ることができることを示唆する。
【０１９２】
＜ヨトウガ（Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）幼虫に対する組換えＰｌ１ａ／ＧＮＡ、ＡｏＩｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡ及びＰｒｏ−Ｈｖ１ａＰｌ１ａ／ＧＮＡタンパク質の摂取毒性＞
注射アッセイで得られたものと同様のプロ領域を含む発現コンストラクトから誘導された融合タンパク質の毒性増加は、第３齢ヨトウガ幼虫を使用した液滴供給アッセイにおいても観察された（図１２）。２０μｇの融合タンパク質を含む２μｌの単一液滴の摂取後、５日後の死亡率は、Ｐｌ１ａ／ＧＮＡで４０％、ＡｏＩｂＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡで５０％、Ｈｖ１ａＰｒｏ−Ｐｌ１ａ／ＧＮＡで７０％であった（データを表４にまとめる）。幼虫に３０μｇの毒素又はＧＮＡを与えた対照処置では、生存率の最小の減少（０乃至２０％）が観察され、対照の生存曲線は、融合タンパク質処置とは有意に異なっていた。これは、さらに、プロ領域のＰｌ１ａ／ＧＮＡ構造体への付加により、生物活性を増加させる結果となるという証拠も与える。注射の実験については、Ｈｖ１ａプロ領域を使用することにより、修飾されていないＰｌ１ａ／ＧＮＡ融合タンパク質を超えて、毒性の最も大きな強化をもたらすようであった。
【０１９３】
【表４】
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【０１９４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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