(57)【要約】  本発明は、対象における体脂肪を低減すること、あるいは体脂肪の蓄積を抑制することまたは低減することにおいて有用性を有し、酵素ステアロイル−コエンザイムＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）を阻害する化合物に関する。化合物は、式Ｉを有する：2017508791.tif 000005式中、  Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ８直鎖状、分岐状または環式のアルキル基またはアルケニル基であって、最大で二重結合までを有し、および（ｉ）１つ以上のハロゲン原子、（ｉｉ）式ＯＲ６のアルコキシ基、式ＣＯＯＲ７の（ｉｉｉ）ヒドロキシル基、および（ｉｖ）カルボキシル基から選択される１つ以上の群で置換されていてもよく、  Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’は、独立して、かつそれぞれに対して（ａ）水素、（ｂ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される１つ以上の群により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル、（ｃ）ハロゲン、および（ｄ）Ｃ１〜Ｃ２アルコキシから選択される。Ｒ２およびＲ２’両方が、（ｂ）または（ｄ）のいずれかから選択される場合、Ｒ２およびＲ２’は、連結されていてもよい。Ｒ３およびＲ３’  両方が、（ｂ）または（ｄ）のいずれかから選択される場合、Ｒ３およびＲ３’は、連結されていてもよく、  Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素および上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される１つ以上の群により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、  Ｒ６は、直鎖状、分岐状または環式のＣ１〜Ｃ４アルキルであり、１つ以上のハロゲン原子で置換されていてもよく、  Ｒ７は、水素および直鎖状、分岐状または環式のＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、かつ  ｘは、１〜３の整数である。
2017508791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における体脂肪を減少させるための、あるいは体脂肪の蓄積を予防または減少させるための化合物であって、該化合物が、式Ｉおよびそれらの薬学的に許容可能な塩を有する化合物から選択され、かつ酵素ＳＣＤを阻害する化合物：
【化１】
2017508791.tif 000004
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ８直鎖状、分岐状または環式のアルキル基またはアルケニル基であって、最大で二重結合までを有し、および（ｉ）１つ以上のハロゲン原子、（ｉｉ）式ＯＲ６のアルコキシ基、（ｉｉｉ）ヒドロキシル基、および（ｉｖ）式ＣＯＯＲ７のカルボキシル基から選択される１つ以上の基で置換されていてもよく、
Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’は、独立して、かつそれぞれに対して（ａ）水素、（ｂ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される１つ以上の基により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル、（ｃ）ハロゲン、および（ｄ）Ｃ１〜Ｃ２アルコキシから選択され、ならびにＲ２およびＲ２’両方が、（ｂ）または（ｄ）のいずれかから選択される場合、Ｒ２およびＲ２’は、連結されていてもよく、ならびにＲ３およびＲ３’両方が、（ｂ）または（ｄ）のいずれかから選択される場合、Ｒ３およびＲ３’は、連結されていてもよく、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素および上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される１つ以上の基により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
Ｒ６は、１つ以上のハロゲン原子で置換されていてもよい直鎖状、分岐状または環式のアルキルであり、
Ｒ７は、水素および直鎖状、分岐状または環式のＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され、かつ
ｘは、１〜３の整数である）。
【請求項２】
対象における体脂肪を減少させるための、あるいは体脂肪の蓄積を予防または減少させるための方法であって、式Ｉを有する化合物およびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される化合物の治療的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでなり、かつ該化合物が酵素ＳＣＤを阻害する、方法。
【請求項３】
対象が哺乳類、例えばヒトである、請求項１に記載の化合物、または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象が体重超過または肥満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５】
対象が２５ｋｇ／ｍ２以上の体格指数（ＢＭＩ）を有するヒトである、請求項４に記載の化合物または方法。
【請求項６】
対象における体脂肪の蓄積を回避または低減するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７】
白色脂肪組織を選択的に回避または低減するための、請求項６に記載の化合物または方法。
【請求項８】
体重超過または肥満である対象の治療のための、あるいは、冠状動脈性心臓病、狭心症、高血圧、２型糖尿病、耐糖能障害、インスリン耐性、脳卒中、癌（食道癌、膵臓癌、大腸癌、直腸癌、乳癌、子宮内膜癌、腎臓癌、甲状腺癌、胆嚢癌を含む）、不妊、鬱、肝疾患（非アルコール性脂肪肝疾患および肝硬変など）、腎疾患（慢性腎不全など）、認知症、骨関節炎、胃食道逆流症および睡眠時無呼吸の１つ以上から選択される、肥満または体重超過であることに関連した状態の治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９】
肥満または体重超過であることに関連した状態が、インスリン耐性および２型糖尿病から選択される、請求項８に記載の化合物または方法。
【請求項１０】
肥満または体重超過であることに関連した状態が、肝疾患（非アルコール性脂肪肝疾患および肝硬変等）から選択される、請求項８に記載の化合物または方法。
【請求項１１】
式Ｉについて以下の１つ以上が適用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物または方法：
（ａ）Ｒ１は、置換されていてもよいＣ３〜Ｃ５の直鎖状、分岐状または環式のアルキルであり、
（ｂ）Ｒ２およびＲ２’は、独立して、かつそれぞれに対して水素および置換されていてもよいＣ１−２アルキルから選択され、
（ｃ）Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ独立して、水素および置換されていてもよいＣ１−２アルキルから選択され、
（ｄ）Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素および置換されていてもよいＣ１−２アルキルから選択される。
【請求項１２】
式Ｉについて以下の１つ以上が適用される、請求項１１に記載の化合物または方法：
（ａ）Ｒ１は、Ｃ４アルキルであり、
（ｂ）ｘは２であり、
（ｃ）全てのＲ２基は、水素であり、かつ２つ以下のＲ２’基が水素以外の、置換されていてもよいＣ１−２アルキルから選択され、
（ｄ）Ｒ３は水素であり、かつＲ３’は水素または未置換のＣ１−２アルキルであり、
（ｅ）Ｒ４およびＲ５は、両方水素である。
【請求項１３】
式Ｉが、ブチオンスルホキシミンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１２に記載の化合物または方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１５】
経口投与のための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は体脂肪を減少させること、あるいは体脂肪の蓄積を予防または減少させることに有用である化合物である。化合物は、体重超過または肥満の対象を治療するため、かつ肥満または体重超過に関連した状態を予防または治療するために使用することができる。
【０００２】
背景技術
肥満は、先進国および発展途上国において、ますます重要な公衆衛生上の懸念であり、かつ糖尿病、心臓病、骨関節炎、および幾つかの癌のリスクの増大を含む多数の健康状態に繋がっている。それは、生活の質にも否定的な影響を与えうる。
【０００３】
肥満ならびに増加したコレステロールおよび脂肪レベルは、食生活の管理および運動レジメンによって規制することができるが、これらは、患者にとって長期の遂行を要求し、しばしば失敗となる。
【０００４】
肥満には、例えば脂肪吸引術、胃緊縛術および肥満手術等の外科的治療が存在する。しかしながら、外科的介入は、感染および予期せぬ合併症のリスクを持ち得る。加えて、患者は、再発を避けるために後の生活様式の変更が要求される。
【０００５】
例えば、オルリスタット（orlistat）（欧州特許第0129748号）およびシブトラミン（sibutramine）（国際公開第９８／１３０３４号パンフレット）等の薬剤が開発されてきた。オルリスタットは、トリグリセリドの吸収性遊離脂肪酸への加水分解を防止し、トリグリセリドが未消化の消化管を介することを引き起こす、膵リパーゼを阻害する。負の副作用として、軟便、便失禁、頻繁なまたは急な排便、および鼓腸が含まれる。シブトラミンは、セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤であり、満腹感を引き起こすことにより空腹感を制御する。関連する副作用として、心臓麻痺および心臓発作を含む有害な心血管系イベントの増加したリスクが含まれる。
【０００６】
食餌性体重増加の減少においてグルタチオンの減少が関わってきて、ここで酵素グルタメート−システインリガーゼ（ＧＣＬ）の修飾因子サブユニットをコードする遺伝子（ＧＣＬＭ）が不足したマウスが、高脂肪の餌を与えられた際に、野生型マウスと比較して体重増加に耐性であることが示された(Kendig et al, Toxicology and Applied Pharmacology, 257, 2011, 338-348)。ＧＣＬは、順々にグリシンの存在下でグルタチオンを産生するグルタメートおよびシステインからのγ−グルタミルシステインの形成に触媒作用を及ぼす。
【０００７】
化合物ＢＳＯ（ブチオニンスルホキシミン）は、グルタチオン生合成阻害剤であり、ＧＣＬを阻害する。それは、化学療法薬としてこれまでにフェイズＩ試験を経たことがある（例えばBailey et al, J. Clin. Onc., 1994, 12 (1), 194-205）。Findeisenらは、Obesity, 19(2), 2011, 2429-2432においてＢＳＯは、マウスにおけるエネルギーの消費および自発運動を増加し、かつ食餌性肥満を低減できると報告した。効果は、グルタチオンの減少に起因すると考えられた。しかしながら、Vigilanzaらは、Journal of Cellular Physiology, 226, 2011, 2016-2024においてＢＳＯは細胞内グルタチオンを減少させるが、含脂肪細胞においてトリグリセリドの蓄積および増加した脂質生成をもたらすと報告した。従って、ＢＳＯがそのグルタチオンの効果を経由して脂肪合成を低減することは明確に確立されていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明によると、対象における体脂肪を低減させるための、あるいは体脂肪の蓄積を予防または減少させるための化合物であって、化合物が、式Ｉ化合物およびそれらの薬学的に許容可能な塩を有する化合物から選択され、かつ酵素ステアロイル−コエンザイムＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）を阻害する化合物が提供される：
【化１】
2017508791.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ８直鎖状、分岐状または環式のアルキル基またはアルケニル基であって、最大で二重結合までを有し、および（ｉ）１つ以上のハロゲン原子、（ｉｉ）式ＯＲ６のアルコキシ基、（ｉｉｉ）ヒドロキシル基、および（ｉｖ）式ＣＯＯＲ７のカルボキシル基から選択される１つ以上の群で置換されていてもよく、
Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’は、独立して、かつそれぞれに対して、（ａ）水素、（ｂ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される１つ以上の群により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル、（ｃ）ハロゲン、および（ｄ）Ｃ１〜Ｃ２アルコキシから選択される。Ｒ２およびＲ２’両方が、（ｂ）または（ｄ）のいずれかから選択される場合、Ｒ２およびＲ２’は、連結されていてもよい。Ｒ３およびＲ３’両方が、（ｂ）または（ｄ）のいずれかから選択される場合、Ｒ３およびＲ３’は、連結されていてもよく、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素および上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される１つ以上の群により置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。
Ｒ６は、１つ以上のハロゲン原子で置換されていてもよい直鎖状、分岐状または環式アルキルであり、
Ｒ７は、水素および直鎖状、分岐状または環式Ｃ１〜Ｃ４アルキルから選択され、
ｘは、１〜３の整数である）。
【０００９】
ここでは、対象における体脂肪を低減させるための、あるいは体脂肪の蓄積を予防または低減させるための方法であって、式Ｉを有する化合物およびそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される化合物の治療的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでなり、かつ該化合物が酵素ＳＣＤを阻害する方法も提供する。
【発明の具体的説明】
【００１０】
式Ｉの化合物および塩は、体脂肪を制御することに役立つ。特にそれらは、対象における体脂肪を低減させるか、あるいは体脂肪蓄積を予防するまたは低減させることに使用できる。それらは、肥満または体重超過の対象において使用できる。それらは、肥満または体重超過であることに関連した状態を予防または治療することにも使用できる。
【００１１】
式Ｉの化合物および塩は、体脂肪の蓄積を回避または減少することにも使用することができる。これは、体重増加をしやすい対象、例えば肥満または体重超過であるために治療を受けた対象、または心血管疾患（例えば、うっ血性心不全、高血圧およびアテローム（性）動脈硬化症）および真性糖尿病にかかっている対象、同様に特定の癌のタイプ、例えば乳がんおよび前立腺癌に罹患しやすい対象にとって有用である。
【００１２】
酵素ＳＣＤは、肝臓および含脂肪細胞中の脂質の合成、貯蔵および蓄積に関与する。従って、ＳＣＤの活性を低下させることで肝臓および脂肪組織中の脂質の蓄積を制限できる。前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化を防止することにより、脂質組織の形成を回避または低減することは、身体発育の重要段階の対象、特に子どもにおいて有益となり得る。これは、以後の人生において肥満の発病の機会を低減させることに役立ち得る。
【００１３】
本発明の一つの利点は、式Ｉの化合物および塩が、他の体内組織（例えば、筋肉や骨）にはわずかな影響で、脂肪の蓄積を低減または回避するため、非常に選択的であることである。
【００１４】
肥満または体重超過であることに関連した状態は、冠状動脈性心臓病、狭心症、高血圧、２型糖尿病、耐糖能障害、インスリン耐性、脳卒中(stroke)、癌（食道癌、膵臓癌、大腸癌、直腸癌、乳癌、子宮内膜癌、腎臓癌、甲状腺癌、胆嚢癌を含む）、不妊、鬱、肝疾患（非アルコール性脂肪肝疾患および肝硬変等）、腎疾患（慢性腎不全等）、認知症、骨関節炎、胃食道逆流症および睡眠時無呼吸を含む。
【００１５】
対象に投与された際、式Ｉの化合物および塩は、対象が高脂肪の食事を付与されたとしても高レベルのインスリン感受性を確保する。これは、式Ｉの化合物および塩が、インスリン耐性の治療および２型糖尿病の治療に有益であり得ることを意味する。これは、ＢＳＯはラットにおいてインスリン耐性を誘発すると報告した、Ogihara et al, Diabetologica (2005), 47, pp794-805における見解と反対である。Findeisenら（上記を参照のこと）は、ＢＳＯがインスリン感受性を維持することに役立ち得ると報告したが、これはＳＣＤの阻害に対するのではなく、内因性グルタチオンの減少の目的とされた効果に基づくものであった。
【００１６】
本発明において、式Ｉの化合物の投与は、ＳＣＤの阻害をもたらす。ＳＣＤは、小胞体に膜結合していて、関連の脂肪酸−アシルコエンザイムＡの不飽和化を介して脂肪酸の不飽和化に触媒作用する。例として、ステアリン酸からオレイン酸へ、およびパルミチン酸からパルミトレイン酸への転換が挙げられる。ＳＣＤ−１およびＳＣＤ−５の二形態は、ヒトにおいて周知である。マウスにおいては、ＳＣＤ−１〜ＳＣＤ−４の四形態が周知である。齧歯類におけるＳＣＤの欠失は、やせた、代謝亢進の表現型を生産する。これは、未転換の脂肪酸の、トリグリセリドへ転換されることから離れる分流に起因すると信じられ、未転換の脂肪酸は肝臓内のＡＭＰキナーゼの活性を経由してベータ−酸化により分解される代わりに脂肪組織に貯蔵される結果となる。
【００１７】
高齢のヒトにおける増加したＳＣＤ−１活性指標は、肥満および肥満関連疾患と関連づけられてきた（Vinknes et al, Obesity, 21(3), 2013, E294-E302、およびWarensjo et al, Diabetologica, 48, 2005, 1999-2005)。
【００１８】
発明者らは、式Ｉの化合物および塩、特にＢＳＯが、ＳＣＤを阻害するために作用できることを今回見出した。これは、とりわけ肥満および過剰体重ならびに肥満または体重超過であることに関連した状態を抑制する代替のメカニズムを提供する、血漿ｔＣｙｓレベルを抑制することにより達成される。
【００１９】
以前は、ＢＳＯと肥満の治療との間の一切の関連性は、細胞のグルタチオンレベルを下げることに向けられたその活性に関連していた。グルタチオンの合成はシステインを要求するため、グルタチオンを下げることにより、システインレベルが減少するとは期待されていない。さらに、本発明は、上記で考察されたようにVigilanzaらの教示とは反対に、トリグリセリド形成の回避をもたらす。
【００２０】
式Ｉの化合物は、ＳＣＤ活性を阻害し、１種以上の活性指標を用いて測定することができる。これらは、血漿または血清の異なる脂肪酸成分の測定に基づくことができる。
【００２１】
活性指標は、それぞれの不飽和前駆体に関係する一価不飽和脂肪酸の量に基づく。最も一般的に使用されるＳＣＤ活性指標は、パルミトレイン酸対パルミチン酸の比（「ＳＣＤ１６指標」）、およびオレイン酸対ステアリン酸（「ＳＣＤ１８指標」）の比に由来する。これらの比は、増加したＳＣＤの阻害で低下する。ＳＣＤ指標は、エステル化脂肪酸（例えば、トリグリセリドおよびリン脂質）も含む、血漿／血清の遊離脂肪酸から、または脂肪酸貯留の総計からのいずれかで計算することができる。遊離脂肪酸濃度から計算された指標は、肝臓中のＳＣＤ活性を反映する（Warensjo et al, Lipids Health Dis 2009, 8:37）。齧歯類およびヒトの両方において、ＳＣＤ指標は脂肪量に関連している。
【００２２】
さらに、ＳＣＤ活性は、齧歯類およびヒトの両方において、高いｔＣｙｓ濃度で増加する。ｔＣｙｓとは、システイン（チオール型）、シスチン（ジスルフィド型）、他のチオール化合物とのシステイン混合ジスルフィド、およびペプチド結合中ではないタンパク質結合システイン等の循環システインの全ての天然の形態を指す。血漿または血清中のｔＣｙｓは、例えば国際公開第２０１０／０１０３８３号パンフレットにおいて記載された技術を用いて測定することができる。
【００２３】
式Ｉの化合物の有益な効果の範囲を評価するために、対象において、式Ｉの化合物の投与前および投与後における、ｔＣｙｓの血漿／血清濃度の値および／またはＳＣＤ活性指標を比較することができる。加えてまたは代わりに、式Ｉの化合物を受けた対象と、式Ｉの化合物を受けていない１以上のコントロール対象との間で比較することができる。
【００２４】
他の指標は、典型的には体重に標準化された、対象により消費された酸素の量および／または生産された二酸化炭素の量を含む。式Ｉによる化合物または塩で治療された対象は、式Ｉによる化合物投与前の対象および／またはコントロール対象と比較して、酸素の増加した消費、および二酸化炭素の増加した生産を有する傾向にある。
目的とした性能には、
ａ）体重（ｋｇ）および／または体格指数（ＢＭＩ）（体重（ｋｇ）／身長（ｍ）の二乗として計算される）の減少
ｂ）二重エネルギーＸ−線吸収法、生体電気インピーダンス、ＣＴまたはＭＲＩスキャンにより測定される脂肪量（ｋｇ）の減少
ｃ）体脂肪率の減少（１００＊（脂肪量／全体重）として計算される）
ｄ）胴回りの減少（胴回りが大きいと、より高い心血管リスクに関連する）
ｅ）推定肝デサチュラーゼ活性（脂肪酸プロファイルから計算される）の減少
ｆ）改善された脂質動員プロファイルおよび軽度の炎症における低減
ｇ）非アルコール性脂肪肝疾患の低減
ｈ）肥満関連疾患（上記を参照のこと）の低減
を含む。
【００２５】
活性は、血漿または肝グルタチオン（ＧＳＨ）濃度からも特定できる。式Ｉによる化合物または塩の使用は、血漿または肝臓中の総グルタチオン（ｔＧＳＨ）のより低い濃度、血漿中のより低く低減されたグルタチオン（ｒＧＳＨ）濃度、および／または肝臓中の増加したｒＧＳＨ／ｔＧＳＨ比をもたらし得る。従って、式Ｉの化合物または塩は、肝臓中の低減型より、酸化したグルタチオンを下げるように思われる。低減されたグルタチオンは、抗酸化物質であるため、これでなぜ式Ｉの化合物または塩の使用が、非脂肪肝疾患（non-fatty liver disease）および肝硬変等の肝疾患に対する有益な効果を有するのかが説明できる。これは、患者が、例えば癌等の疾患を治療する際に用いられる投与量より低い投与量を用いて式Ｉの化合物または塩の脂肪制御効果から恩恵を受けることができることも意味する。
【００２６】
本発明は、好ましくは体重超過または肥満の対象における体脂肪の低減に向けられる。対象は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。ヒトにおいて、体重超過であることは典型的には２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する個体に関連する。肥満であることは典型的には３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する者に関連する。本発明は、２８ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有し、かつ関連のリスク因子（例えば、上記の肥満であることに関連する状態）を有するヒト対象者にも有用である。
【００２７】
あるいは、本発明は、対象における脂肪蓄積の回避または低減に向けることが可能であり、対象は好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。
【００２８】
式Ｉの化合物または塩は、多様な手段により、好ましくは投与形態に調整された、式Ｉの化合物またはそれらの塩の治療上有効な単一投与量の形態をとる、医薬組成物の形態として、投与することができる。投与は、多様な手段、例えば経口、腸内または非経口によることができる。
【００２９】
経口投与の場合、組成物は、ピル、タブレット（錠剤）、トローチ、カプセル、粉末、顆粒、シロップ、溶液、懸濁液またはエマルジョン等の固体または液体調製剤に製剤化することができる。別の実施態様において、組成物は、例えば管理された食事療法の一部として対象に提供される栄養製剤または栄養組成物の一部とするなど、食料または飲料と混合されてもよい。
【００３０】
固体組成物は、式Ｉの化合物またはそれらの塩の所望量に加えて以下、ラクトース、スクロースおよびコーンスターチ等の従来の成分を含む薬学上活性な担体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤、ジャガイモでんぷんまたはアルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸またはマグネシウムステアリン酸等の潤滑剤の１種以上を含んでなることができる。場合により、医薬組成物は、式Ｉによる化合物またはそれらの塩が、例えばアクリルポリマーまたはキチンのマトリックス中に組み込まれる、徐放性製剤であり得る。
【００３１】
経口投与の場合の液体組成物の例として、シロップ、香料付きシロップ、水性または油性懸濁液、食用油で任意に香料付けされたエマルジョン、およびエリキシル剤等の水溶液が挙げられる。懸濁液は、合成および天然ゴム等の分散化剤または懸濁化剤（例えば、トラガカント、アカシア、アルギン酸、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンおよびゼラチン）を含むことができる。
【００３２】
非経口投与組成物の場合、式Ｉの化合物またはそれらの塩は、典型的には、例えば水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール等の水混和性溶液、および植物油または動物油等の非水溶性賦形剤を含む好適な液体注入賦形剤で製剤化される。場合により、薬剤は、エマルジョンであり得る。場合により、ｐＨは６〜８、好ましくは６．５〜７．５の範囲内である。場合により、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等の緩衝剤が存在することができる。場合により、アスコルビン酸、ナトリウムビスウルファイト等の抗酸化剤が存在することができる。場合により、シクロデキストリン、リゾレシチン、オレイン酸、ステアリン酸およびデキストリン等の可溶化剤および安定化剤が存在することができる。場合により、塩酸リグノカインおよび塩酸プロカイン等の局部麻酔薬が存在することができる。非経口投与は、例えば筋肉内、静脈内、皮内または皮下であり得る。
【００３３】
式Ｉの化合物およびそれらの塩の好適な投与量は、１日あたり体重１ｋｇあたり０．１〜１００ｍｍｏｌまたは、１日あたり体重１ｋｇあたり０．０２５〜２５ｇの範囲内である。幾つかの実施態様において、ヒトの場合、投与量は１日あたり体重１ｋｇあたり２５〜４５０ｍｇ、例えば１日あたり体重１ｋｇあたり２５〜２５０ｍｇの範囲内である。さらなる実施態様において、ヒトへの投与量は、１日あたり０．９〜１７ｇ／ｍ２、例えば１日あたり０．９〜９ｇ／ｍ２の範囲内である。
【００３４】
式Ｉの化合物およびそれらの塩は、１回量、または１回以上の量、典型的には１日あたり１〜８回の量の範囲内で提供することができる。好ましくは、例えば１日あたり２〜４または２〜３の投与量等、１日あたり最低２回の投与が行われる。
【００３５】
式Ｉによる化合物および塩は、病態の治療における使用に効果的な１種以上の追加的化合物と組み合わせて投与することができる。例えば、式Ｉの化合物または塩は、肥満または体重超過の対象あるいは上記の肥満または体重超過に関連する状態の治療に効果的な１種以上の追加的化合物と組み合わせて投与することができる。一実施態様において、式Ｉの２種以上の化合物を組み合わせて投与することができる。組合せ治療は、異なる化合物を別々に、同時にまたは連続的に投与することを含み得る。２種以上の化合物は、各化合物について別々の医薬組成物を含んでなるキットの形態で提供することができる。あるいは、２種以上の化合物は、単一の医薬組成物に組み入れることができる。
【００３６】
式Ｉの化合物は、公知の手段で合成するか、または商業的供給者から購入することができる。合成手順は、米国特許第５，４７６，９６６号において、HiratakeらによるBiosci. Biotechnol. Biochem., 66(7), 2002, 1500-1514において、およびTokutakeらによる Bioorg. Med. Chem., 6, 1998, 1935-1953において知ることができる。
【００３７】
式Ｉの化合物において、任意のハロゲン置換基は、好ましくはＦまたはＣｌである。
【００３８】
任意のアルキル基、アルケニル基またはアルコキシ基の任意の置換基は、好ましくはハロゲン、好ましくはＦまたはＣｌである。
【００３９】
好ましい実施態様において、Ｒ１は２つ以下の任意の置換基を有する。好ましくは、Ｒ１は、Ｃ３〜Ｃ５直鎖状、分岐状または環式アルキルであり、より好ましくは、未置換である。Ｒ１は、より好ましくは未置換のＣ４アルキル、好ましくはｎ−ブチルである。
【００４０】
ｘは、好ましくは２である。
【００４１】
好ましい実施態様において、Ｒ２およびＲ２のそれぞれに２つ以下の任意の置換基を有する。好ましくは、Ｒ２およびＲ２’は、独立して、かつそれぞれに対して水素および置換されていてもよいＣ１−２アルキルから選択される。さらなる実施態様において、全てのＲ２基は、水素であり、２つ以下のＲ２’基が水素以外、好ましくは置換されていてもよいＣ１−２アルキルから選択される。好ましくは、１つ以下のＲ２’ 基が水素以外である。好ましい実施態様において、全てのＲ２およびＲ２’基は、水素である。好ましくは、（ＣＲ２Ｒ２’）ｘは（ＣＨ２）２である。
【００４２】
Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ好ましくは２つ以下の任意の置換基を含有する。好ましくは、Ｒ３およびＲ３’は、それぞれ独立して、好ましくは水素および置換されていてもよいＣ１−２アルキルから選択される。好ましくは、Ｒ３は、水素であり、かつＲ３’は、水素または未置換のＣ１−２アルキルである。好ましい実施態様において、Ｒ３およびＲ３’は、両方水素である。
【００４３】
好ましくは、Ｒ４およびＲ５のそれぞれに２つ以下の任意の置換基を有する。Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、好ましくは水素または置換されていてもよいＣ１−２アルキルである。より好ましくは、Ｒ４およびＲ５のそれぞれまたは両方は、水素および未置換のＣ１−２アルキルから選択される。最も好ましくは、Ｒ４およびＲ５は、両方水素である。
【００４４】
好ましくは、化合物はブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００４５】
式Ｉの化合物または塩は、ラセミ混合物としてまたは鏡像異性的に精製された形態で使用することができる。Ｌ−異性体（例えば、Ｌ−ブチオニン−スルホキシミン）が好ましい。
【００４６】
式Ｉの任意の化合物の薬学的に許容可能な塩は、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩を含む。さらなる実施例は、第四級−ＮＲ３Ｒ３’基、例えば−［ＮＲ３Ｒ３’Ｒ３’’］Ｘに基づく塩を含む。Ｒ３’’は、Ｒ３およびＲ３’について上記で定義されるとおりであり得、Ｒ３およびＲ３’のいずれかまたは両方と結合していてもよく、ここでＲ３’’および少なくとも１つのＲ３およびＲ３’は、（ｂ）および（ｄ）から選択される。Ｘの例として、ハロゲン化物、水酸化物、硝酸塩、硫酸塩および炭酸塩が挙げられる。
【００４７】
式Ｉの化合物および塩は、脂肪組織の形成を阻害し、体脂肪の形成を阻害し、血漿中の脂肪酸濃度を阻害し、かつ同様に脂肪酸の不飽和を阻害することができる。これは、脂肪性沈着物および脂肪組織の低減を介した減量の進展に役立つ。これは、脂肪酸生合成を阻害し、かつ脂肪性沈着物および脂肪組織の生産および貯蔵を減少させる酵素ＳＣＤを阻害することにより達成される。
【００４８】
式Ｉの化合物および塩は、例えば褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、および赤身、筋組織と比較して、白色脂肪組織の低減にも特異的である。肥満および体重超過であることは、典型的に過剰な白色脂肪組織と関連しているため、式Ｉの化合物および塩は、筋組織およびＢＡＴの損失に関連した悪影響を及ぼすことなく、体重超過および肥満の人間における体重の低減に役立つことに非常に特異的であり得る。ＢＡＴは、しばしば、「有益な」脂肪といわれる。それは、食物を脂肪として貯蔵するのではなく、食物から熱へのエネルギー転換に役立つ、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）を介して肥満を予防する。従って、式Ｉの化合物または塩によるＢＡＴの顕著な低減の欠如は、褐色細胞を傷つけずに、白色脂肪に対する有利な特異的効果を示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
他で示されない限り、線グラフおよび、棒グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１】図１は、高脂肪食における、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスの、時間での平均体重の変化を示すグラフである。
【図２】図２は、エコーＭＲＩを用いて測定された、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、総赤身量および総脂肪量を示す棒グラフである。
【図３】図３は、エコーＭＲＩに基づく、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、赤身量対脂肪量の百分率を示す棒グラフである。
【図４】図４は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、腹部脂肪の量（ｇ）を示す棒グラフである。
【図５】図５は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、褐色脂肪量（ｇ）の量および分布を比較した棒グラフである。
【図６】図６は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスの、体重に標準化された酸素消費および二酸化炭素の生産を比較した棒グラフの集合である。
【図７】図７は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、血漿中におけるアミノ酸濃度を比較した棒グラフである。
【図８】図８は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、血漿ｔＣｙｓ濃度を比較した棒グラフである。
【図９】図９は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、血漿ホモシステイン濃度を比較した棒グラフである。
【図１０】図１０は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、血漿グルタチオン濃度を比較した棒グラフである。
【図１１】図１１は、システインの形成または利用に関与した多様な化合物における血漿濃度に対するＢＳＯ治療の効果を比較した棒グラフである。
【図１２】図１２は、システインおよびグルタチオンの合成、ならびにそれぞれの前駆体および形成された生産物に関与した経路を図式的に説明した図である。
【図１３】図１３は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、血漿の多様なタンパク質関係成分の濃度を比較した棒グラフである。
【図１４】図１４は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、血漿の脂肪酸関係成分を比較した棒グラフである。
【図１５】図１５は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、グルコースおよびグリセロールの血漿濃度を比較した棒グラフである。
【図１６】図１６は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、血漿中の遊離パルミチン酸および遊離パルミトレイン酸の濃度を比較した棒グラフである。
【図１７】図１７は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、血漿中の遊離ステアリン酸および遊離オレイン酸の濃度を比較した棒グラフである。
【図１８】図１８は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、ミリスチン酸、リノレン酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノール酸、リノール酸およびアラキドン酸の遊離脂肪酸血漿濃度を比較した棒グラフである。
【図１９】図１９は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸およびドコサヘキサエン酸の総脂肪酸血漿濃度を比較した棒グラフである（平均およびＳＤ）。
【図２０】図２０は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、ミリスチン酸、パルミトレイン酸、γ−リノール酸、リノレン酸、ジホモ−γ−リノール酸およびエイコサペンタエン酸の総脂肪酸血漿濃度を比較した棒グラフである（平均およびＳＤ）。
【図２１】図２１は、コントロールマウスおよびＢＳＯ処置されたマウスにおける、不飽和から飽和の、総パルミトレイン酸／パルミチン酸および総オレイン酸／ステアリン酸の、血漿濃度比、それぞれ別の呼び方としてＳＣＤ１６およびＳＣＤ１８活性指標を比較した棒グラフである（平均およびＳＤ）。
【図２２】図２２は、右側に組織像の例を示した、コントロールマウスとＢＳＯ処置されたマウスとの間の、幹細胞における脂肪空胞形成スコアの比較を示した図である。
【図２３】図２３は、ＢＳＯ付与マウスおよびコントロールマウスのグルコース血漿レベル、インスリン血漿レベルおよびレプチン血漿レベルを示した一連の図である。ＨＯＭＡ−ＩＲ（インスリン耐性の恒常的モデル）指標も示している。
【図２４】図２４は、ＢＳＯ付与マウスおよびコントロールマウスの、血漿中および肝臓中における低減したグルタチオンおよび総グルタチオンの濃度を示した図である。低減したグルタチオン／総グルタチオンの比も図示されている。
【００５０】
図２３および図２４において、線は、プロットされたデータのメジアン、第一四分位数および第三四分位数を表す。
【実施例】
【００５１】
雄Ｃ３Ｈマウスを使用した。１２匹のマウスの２群を離乳させ、３．３６ｇ％の脂肪、２２．４５ｇ％のタンパク質および７１．２１ｇ％の炭水化物を含んだ商業的標準の飼料（SDS Rat and Mouse No.3 Breeding diet (RM3)）を、十分に成長するまで与えた。１１週間の年齢で、標準の飼料を高脂肪の飼料（米国、D12492、Research Diets Incの、ラードおよび大豆油からの３５ｇ％の脂肪）と置き換えた。一集団にはそれらの飲料水中にＢＳＯ（３０ｍｍｏｌ／Ｌ）を、高脂肪付与の開始と同時に与え、一方の集団（コントロール群）は治療を受けなかった。マウスをイギリス内務省福祉指針（UK Home Office welfare guidelines）およびプロジェクトライセンス規制に従い、管理した、照明（明期１２時間および暗期１２時間のサイクル、暗期午後７時〜午前７時）、気温（２１°Ｃ±２°）および湿度（５５％±１０％）状態下で保管した。マウスは、実験中、自由に水（１０ｐｐｍ塩素）および食物を利用することができた。
【００５２】
表現型試験を、http://empress.har.mrc.ac.ukより入手可能なEUMORPHIA標準プロトコルのEuropean Phenotyping Resource for Standardised Screens) (EMPReSS)により実行した。体重を、０．０１ｇの目盛り付き測定器で毎日測定した。代謝率を、酸素消費量および二酸化炭素生産量を決定するため、間接的熱量測定法（Columbus Instruments社の Oxymax）を用いて測定した。身体組成（％脂肪組織および％赤身組織）を、エコーＭＲＩ−１００（EchoMRI-100）定量磁器共鳴全身体組成分析器（Echo Medical Systems社、ヒューストン、テキサス州）を用いて評価した。
【００５３】
ＢＳＯ処置された群は、図１で示されるとおり、４週間の治療の過程で体重の低減を示した一方、コントロール群は、顕著な体重増加を示した。
【００５４】
ＢＳＯ処置されたマウスの体脂肪量は、コントロールマウスと比較して実質的に低く、２群間において、赤身量の比較的わずかな差異のみがあった。結果は、ＢＳＯの効果が赤身量と反対に脂肪量に非常に選択的であることを実証している、図２および３において示される。
【００５５】
解剖したマウスの腹部脂肪の分析により、ＢＳＯマウスにおける腹部脂肪の量が、グラムにおいて、および全体重のパーセンテージとして、コントロール群より顕著に低いことが示された（両者においてＰ＜０．００１）。全体重のパーセンテージとしての腹部脂肪量は、図４において示されるとおり、コントロール（Ｐ＝０．０５５）と比較して、ＢＳＯマウスにおいて低下を示す傾向にもある。これは、他の脂肪組織と比較して腹部脂肪量に対してＢＳＯの向上した効果があることを実証する。
【００５６】
図５は、ＢＳＯ処置マウス褐色細胞量がコントロールマウスにおける褐色細胞量と類似であることを実証する（解剖したマウスで測定される）が、全脂肪量のパーセンテージとしてはＢＳＯ処置マウスにおける褐色細胞パーセンテージのほうがより高かった（Ｐ＜０．０５）。これにより、ＢＳＯは、既に説明した抗肥満効果を発揮する、褐色脂肪（ＢＡＴ）を蓄える一方で、白色脂肪（白色脂肪組織）に対して、特に向上した減少効果を有することが実証される。
【００５７】
酸素消費および二酸化炭素生産も測定し、結果を図６に示す。ＢＳＯ処置されたマウスは、単位重量あたり、暗期および明期において（両者においてＰ＜０．００１）顕著なより高い酸素消費、ならびに暗期および明期において（両者においてＰ＜０．００１）より高い二酸化炭素生産を示した。これは、増加したエネルギー消費においても一貫している故、ＢＳＯ処置されたマウスでは脂肪の蓄積が低下している。
【００５８】
図７は、２群の間で僅かな差異がある、血漿中のアミノ酸の濃度（μｍｏｌ／Ｌで）を示し、タンパク質／赤身組織に対するＢＳＯの効果が最小であり、かつＢＳＯ効果が、含硫アミノ酸代謝への特定の活性に由来することを示す。
【００５９】
血漿ｔＣｙｓ濃度に対するＢＳＯの効果は、図８に示されている。濃度は、コントロールマウスと比較して、ＢＳＯ処置されたマウスにおいて顕著にかつ実質的により低い。効果は、システインの全ての測定形態について明白である。
【００６０】
全ホモシステイン濃度、ｔＨｃｙ（即ち、遊離した低減したホモシステイン、均一および混合ジスルフィド、およびタンパク質結合ホモシステイン）も測定され、図９に示されている。ＢＳＯ処置されたマウスは、コントロールマウスと比較して血漿中の高い濃度を示し、これはｔＣｙｓ濃度の低減と、より少ないｔＨｃｙまたはシスタチオニンがシステインに転換されるということにおいて一貫していることになる。
【００６１】
図１０は、ＢＳＯの１つの効果が、血漿グルタチオン濃度を低減することであると確認している。
【００６２】
図１１は、システインの形成に関与する多様な化合物に対するＢＳＯ治療の効果を示する。システインは、酵素システインジオキシナーゼによりタウリンに転換されるため、コントロール群と比較して血漿中における低いｔＣｙｓレベルと実質的に低いタウリン濃度とが一貫している。図１２は、システインおよびグルタチオンの合成ならびにそれぞれの前駆体および形成された生産物に関与する経路を図式的に説明している。点が付された線は、経路を示し、明白にするため中間体は省略されている。
【００６３】
セラチニン、アルブミン、タンパク質およびＡＬＴ（非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の肝臓酵素および肝臓マーカー）の血漿濃度を図１３に示す。２集団における主な差異は、ＡＬＴ濃度にあり、ＢＳＯ処置されたマウスはコントロールマウスと比較して実質的に低い濃度を有する。これは、ＮＡＦＬＤによる肝臓損傷からの保護（以下の肝臓組織像により確認された）、ならびに糖尿病およびメタボリックシンドロームの低リスク（Schindhelm et al, Diab Metab Res Rev 2006; 22 (6), 437-443）を示す。
【００６４】
図１４は、血漿の脂肪成分および脂質成分の差異（即ち、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、総コレステロール(total cholesterol)、非エステル化脂肪酸（non-esterified fatty acids）、およびトリグリセリド）を比較している。濃度は、全ての場合においてＢＳＯ処置されたマウスのほうが低く、特にトリグリセリド濃度が低い。上昇した血漿トリグリセリドは、心筋梗塞、虚血性心疾患、ならびに男性および女性の死亡の独立したリスク要因である（Nordestgaard et al, JAMA 2007; 28 (3), 299-308.）。
【００６５】
図１５は、ＢＳＯ処置されたマウスおよびコントロールマウスにおけるグルコースおよびグリセロールの血漿濃度を比較している。グルコースおよびグリセロールは、ＢＳＯ処置されたマウスにおいて減少している。グルコース濃度が低ければ低いほど、ＢＳＯ処置されたマウスのインスリン感受性がよいことを示し、ＢＳＯ処置されたマウスの方が、２型糖尿病に耐性であり得ることを意味している。グリセロール濃度が低ければ低いほど、非必須脂肪酸が低いことと一貫していて、それはインスリン耐性を引き起こす役割を果たしている。
【００６６】
血漿中のＣ１６脂肪酸プロファイルを図１６において比較している。パルミチン酸およびパルミトレイン酸濃度は、ＢＳＯ処置されたマウスの血漿においてより低く、パルミチン酸とパルミトレイン酸の比もＢＳＯ処置されたマウスにおいてより低く、ＳＣＤ阻害と一致している。Ｃ１８ステアリン酸およびオレイン酸におけるＳＣＤ阻害は、ＢＳＯ処置されたマウスにおいてステアリン酸とオレイン酸の比がより低い図１７に示された結果からも実証されている。
【００６７】
図１８〜２０は、多くのＣ１４〜Ｃ２２脂肪酸においてＢＳＯ処置されたマウスのより低い脂肪酸血漿濃度についての証拠をさらに示し、かつ図２１は、より低い不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸比を総脂肪酸濃度、ならびに自由脂肪酸濃度に対して示している。
【００６８】
肝臓脂肪空胞形成へのＢＳＯの効果が図２２において示され、ＢＳＯ処置されたマウスおよびコントロールマウスの脂肪細胞を比較している。ＢＳＯ処置されたマウスにおいて脂肪空胞形成はなく、高脂肪食により誘発され、肝硬変にかかりやすくなるヒトにおける肥満の一般的合併症である、非アルコール性脂肪肝疾患に対する保護を示す。
【００６９】
図２３は、グルコースおよびインスリンのレベルに対するＢＳＯ効果の更なる結果を示している。従って、ＢＳＯ処置されたマウスは、コントロールマウスと比較して、低いグルコース血漿レベルおよび低いインスリン濃度を有していた。さらに、ＨＯＭＡインスリン−耐性（ＩＲ）指数は、ＢＳＯ付与されたマウスにおいてコントロールマウスと比較して顕著に低かった。ＨＯＭＡ  ＩＲ指数は、空腹時血糖値およびインスリン血漿レベルに基づくインスリン耐性で計算し、計算は当業者において公知である。レプチン血漿レベルも示されている。血漿レプチンレベルが高いほど、肥満の増加に相互に関連し、故にこれらは、肥満を低減するＢＳＯの有用な効果をさらに実証する結果となる。
【００７０】
図２４は、血漿および肝臓グルタチオンレベルに対するＢＳＯの効果を示している。血漿内では、総グルタチオン（ｔＧＳＨ）および低減したグルタチオン（ｒＧＳＨ）の両方がＢＳＯ付与されたマウスの方が低い。ｒＧＳＨ／ｔＧＳＨ比も類似している。これは、酵素ＧＣＬ（グルタメートシステインリガーゼ）の阻害の結果であり得る。
【００７１】
肝臓内では状況が異なる。ＢＳＯ付与されたマウスのほうがｔＧＳＨレベルは低いが、ｒＧＳＨレベルは類似であるため、ＢＳＯ付与されたマウスのほうがｒＧＳＨ／ｔＧＳＨ比が高い。これは、肝臓中におけるＢＳＯの効果が、ＧＳＨの酸化形態に対してより特異的であることを示唆し、ＧＳＨの低減した形態（活性抗酸化形態）が、減量を促進するのに必要な用量でのＢＳＯによっては落とされていないことを示している。このようなＢＳＯ用量は、化学療法でのアジュバントとして使用されるものより実質的に低く、故に、このような用量ではｒＧＳＨのレベルが維持されるため、ＢＳＯ（および式Ｉの他の化合物）は低毒性を有すると期待することができる。これにより、なぜＢＳＯおよび式Ｉの他の化合物が、肝臓病変および脂肪肝疾患（例えば、非アルコール性脂肪肝疾患および肝硬変）から保護するのかも説明することができる。
【００７２】
図２３および２４に提示された結果について、実験は、マウスをＢＳＯで８週間処置したこと、ならびにインスリン、グルコースおよびレプチン分析用の血漿をＢＳＯ処置６週間後の６時間断食後に引き出したことを除いて、上記の同じ条件を用いて実施された（即ち、同じマウス系統、マウス年齢、飼料、および実験計画）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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2017508791.tif 000031
2017508791.tif 000032
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