(57)【要約】本発明は、一般に、ヒトの介入により真核細胞に導入されてその真核細胞の娘細胞へ伝達される単細胞生物を含む真核細胞、およびそのような単細胞生物を真核細胞へ導入する方法に関する。本発明は、娘細胞において維持される表現型を真核細胞へ導入する単細胞生物を提供する。本発明はさらに、磁性細菌を収容した真核細胞を提供する。本発明はさらに、真核細胞のマルチモーダル観察を可能にするために単細胞生物で工学操作した真核細胞を提供する。各イメージング方法（またはモダリティー）は、解剖学および生理学の種々の観点の視覚化を可能にし、かつこれらを組み合わせることにより、イメージングされる対象についてイメージ作成者がより多くを学ぶことができる。【選択図】図１
2017522022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
走磁性細菌を含む真核細胞を調製する、ここで該走磁性細菌はヘテロロガスレポーターを含む；
真核細胞内の走磁性細菌を磁気検出する；および
ヘテロロガスレポーターを検出する；
を含む、マルチモーダル検出方法。
【請求項２】
以下の工程：
走磁性細菌を含む真核細胞を調製する、ここで該走磁性細菌はヘテロロガスレポーターを含む；
真核細胞内の走磁性細菌を磁気イメージングする；および
ヘテロロガスレポーターをイメージングする；
を含む、マルチモーダルイメージング方法。
【請求項３】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物細胞が幹細胞、癌細胞または循環細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が神経幹細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物細胞がマウス細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
循環細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
レポーターが光学レポーターである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
光学レポーターが蛍光レポーターまたは生物発光レポーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
単細胞生物を含む真核細胞であって、超音波イメージング、コンピューター断層撮影イメージング、生物発光イメージング、磁気共鳴イメージング、光干渉断層撮影イメージング、ラジオグラフィーイメージング、核医学イメージング、ポジトロン放射断層撮影イメージング、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、サーマルイメージング、および磁性粒子イメージングからなる群より選択される少なくとも２つのモダリティーにより検出できる真核細胞。
【請求項１２】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１に記載の真核細胞。
【請求項１３】
哺乳動物細胞が幹細胞、癌細胞または循環細胞である、請求項１２に記載の真核細胞。
【請求項１４】
幹細胞が神経幹細胞である、請求項１３に記載の真核細胞。
【請求項１５】
循環細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項１３に記載の真核細胞。
【請求項１６】
走磁性細菌を含むマルチモーダルプローブであって、該走磁性細菌がポジトロン放射断層撮影レポーター、単一光子放射コンピューター断層撮影レポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターからなる群より選択される１以上のヘテロロガスレポーターを発現する、上記マルチモーダルプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
[1]  この出願はU.S. application Serial No. 13/838,717, 2013年3月15日出願の一部継続出願であって、それはU.S. application Serial No. 13/374,799, 2012年1月13日出願の一部継続出願であり、かつこの出願はPCT/US2013/021414, 2013年月日出願の一部継続出願であって、それはU.S. application Serial No. 13/374,799, 2012年1月13日出願の一部継続出願であり、それらの出願の内容全体をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
[2]  本発明は一般に、内部共生(endosymbiosis)、すなわち人工内部共生体(artificial endosymbiont)および走磁性細菌(magnetotactic bacteria)で工学操作した真核細胞の分野に関する。特に、本発明は、走磁性細菌を含めた人工内部共生体などの単細胞生物、それらの単細胞生物を宿した真核細胞、単細胞生物を収容した真核細胞の使用方法、および単細胞生物を真核細胞に導入する方法を提供する。本発明はまた、細胞内単細胞生物で工学操作して真核細胞のマルチモーダル(multimodal)検出を可能にした真核細胞を提供する。
【背景技術】
【０００３】
[3]  ミトコンドリア、クロロプラスト、および他の膜結合した細胞小器官は遺伝性機能、たとえば光合成を、真核細胞に付加する。そのような細胞小器官（それらの痕跡量の環状ＤＮＡにより同定される）は内部共生由来のものであると考えられる。
【０００４】
[4]  種々の真核細胞に存在しない広範な機能性を備えた細菌がある。たとえば、1975年にBlakemoreは、地球磁場に沿って配向および遊泳する走磁性細菌(magnetotactic bacteria)（ＭＴＢ）を同定した(Blakemore, R.,”Magnetotactic bacteria,” Science 24:377-379 (1975)；それをあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。これらの走磁性細菌は、マグネタイト（磁鉄鉱）（Ｆｅ３Ｏ４）またはグレイジャイト（グレグ鉱）（Ｆｅ３Ｓ４）が脂質膜により内包されたものから構成されるマグネトソーム(magnetosome)と呼ばれる磁性構造体を産生する（同著）。彼らの最初の発見以来、多数のＭＴＢ種が同定された（同著）。
【０００５】
[5]  走磁性細菌は物質に選択的に結合して分離するために用いられてきた(U.S. Patent No. 4,677,067, あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。さらに、磁性機能を外部タグにより細胞に付加する試みがなされてきた(Swiston, A.J. et al., “Surface Functionalization of Living Cells with Multilayer Patches,” Nano Lett. 8(12):4446-53 (2008); Vandsburger, M.H. et al., “MRI reporter genes: applications for imaging of cell survival, proliferation, migration and differentiation,” NMR Biomed. 26(7):872-84 (2013); Ahrens, E.T. et al, “Tracking immune cells in vivo using magnetic resonance imaging,” Nature Rev Immunol. 13:755-763 (2013); それらの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。細菌性マグネタイトは細胞融合により赤血球にも導入され(Matsunaga, T. and Kamiya, S., (1988), In: Atsumi, K., Kotani, M., Ueno, S., Katila T., Williamsen, S.J. (Eds) 6th International Conference on Biomagnetisms, Tokyo Denki University Press, Tokyo, pp. 50-51 (1988), それをあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)、ＭＴＢは顆粒球および単球に食作用により導入された(Matsunaga, T. et al., “Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes,” Applied Microbiology and Biotechnology 31(4):401-405 (1989), それをあらゆる目的で全体として本明細書に援用する))。しかし、これらの変更はいずれも娘細胞へ遺伝できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】U.S. Patent No. 4,677,067
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Blakemore, R.,”Magnetotactic bacteria,” Science 24:377-379 (1975)
【非特許文献２】Swiston, A.J. et al., “Surface Functionalization of Living Cells with Multilayer Patches,” Nano Lett. 8(12):4446-53 (2008)
【非特許文献３】Vandsburger, M.H. et al., “MRI reporter 遺伝子: applications for imaging of cell survival, proliferation, migration and differentiation,” NMR Biomed. 26(7):872-84 (2013)
【非特許文献４】Ahrens, E.T. et al, “Tracking immune cells in vivo using magnetic resonance imaging,” Nature Rev Immunol. 13:755-763 (2013)
【非特許文献５】Matsunaga, T. and Kamiya, S., (1988), In: Atsumi, K., Kotani, M., Ueno, S., Katila T., Williamsen, S.J. (Eds) 6th International Conference on Biomagnetisms, Tokyo Denki UniversityPress, Tokyo, pp. 50-51 (1988)
【非特許文献６】Matsunaga, T. et al., “Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes,” Applied Microbiology and Biotechnology 31(4):401-405 (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[6]  現在、イメージング分野において、最小限の宿主細胞操作で真核細胞を標識してＭＲＩまたは他のタイプのイメージング法で追跡できるマルチモーダルプローブに対するニーズがある。ある態様において、本発明の目的は、ヒトの介入により真核細胞に導入された単細胞生物を収容し、それが真核細胞の娘細胞へ、特に少なくとも５回の細胞分裂を通して伝達され、かつそれが娘細胞において十分なコピー数を維持し、したがって単細胞生物により導入された目的機能が娘細胞において維持される、真核細胞を提供することである。本発明のさらなる目的は、娘細胞へ遺伝できる人工内部共生体を収容した真核宿主細胞、およびこれらの真核細胞を使用する方法を提供することである。本発明の目的はまた、人工内部共生体を真核宿主細胞の細胞質ゾルに導入する方法を提供することである。本発明の他の目的は、遺伝可能な磁性表現型を備えた真核細胞を提供することである。本発明の目的はまた、真核細胞を追跡、局在化、操舵、制御または破損する方法を提供することである。本発明の他の目的は、真核細胞のマルチモーダル検出が可能な単細胞生物を収容した真核細胞を提供することである。本発明のさらなる目的は、多重表現型が娘細胞へ遺伝可能である状態で単細胞生物を収容した真核宿主細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[7]  本発明は、人工内部共生体などの単細胞生物を含む真核細胞、そのような真核細胞を使用する方法、およびそのような単細胞生物を真核細胞に導入する方法に関する。１態様において、単細胞生物は真核細胞に希望する機能性を提供する。１態様において、単細胞生物は娘細胞へ遺伝できる人工内部共生体である。他の態様において、人工内部共生体は、マグネトソームを形成し、かつ検出可能な他の遺伝子生成物を発現する走磁性細菌である。１態様において、走磁性細菌は真核細胞に磁性機能を提供する。１態様において、使用方法は真核細胞を検出する方法である。他の態様において、使用方法は真核細胞を磁気により操作またはターゲティングする方法である。他の態様において、使用方法は真核細胞に損傷を与える方法である。１態様において、真核細胞はマルチモーダル検出を可能にする多重表現型をもち、それは単細胞生物により真核細胞に導入できる。１態様において、多重表現型は真核細胞の娘細胞へ遺伝できる。１態様において、走磁性細菌は真核細胞に磁性機能ならびに発光性もしくは吸光性および／または音響特性を提供する。ある態様において、単細胞生物は真核細胞由来の遺伝子生成物と相互作用して検出可能な信号を発生する遺伝子生成物を生成する。１態様において、単細胞生物を収容した真核細胞を真核細胞の検出方法に使用する。
【００１０】
[8]  ある態様において、本発明の人工内部共生体を少なくとも１つの遺伝子の欠失、付加、および／または変異形成により改変することができ、それによって人工内部共生体は内部共生または生体栄養性(biotrophy)に有用な形質を獲得する。人工内部共生体において変異、付加、および／または欠失される遺伝子は、鞭毛アセンブリーの構成要素をコードする遺伝子、ならびに必須高分子、たとえばアミノ酸、ヌクレオチド、ビタミンおよび補因子を合成するための酵素をコードする遺伝子であってもよい。特定の態様において、ＭＴＢはさらに抗生物質耐性遺伝子または他の選択マーカーを発現するように改変されてもよい。特定の態様において、それらの遺伝子は人工内部共生体を特定の細胞内位置へ局在化する。特定の態様において、遺伝子は特定の宿主細胞への人工内部共生体の侵入を増強または遮断する。他の態様において、遺伝子は人工内部共生体またはそれから発現する遺伝子およびタンパク質に対する宿主免疫系応答を抑制または変更する。
【００１１】
[9]  ある態様において、本発明の真核細胞は哺乳動物、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヒト、ブタ、ウシ、またはイヌのものである。他の態様において、人工内部共生体は宿主細胞から後代の娘宿主細胞へ伝達される。他の態様において、本方法はさらに、真核細胞から少なくとも１つの遺伝子を欠失、挿入、および／または変異させることを含む。
【００１２】
[10]  本発明の単細胞生物を、当業者に知られている多数の方法により真核細胞に導入することができ、それにはマイクロインジェクション、自然−食作用、誘導−食作用、マクロピノサイトーシス、他の細胞性インターナリゼーションプロセス、リポソーム融合、赤血球ゴースト融合、またはエレクトロポレーションが含まれるが、これらに限定されない。
【００１３】
[11]  本発明はまた、マルチモーダル検出を用いて、単細胞生物を収容した真核細胞を特性分析する方法に関する。本発明の方法において、単細胞生物を含む真核細胞はその単細胞生物に関係する多重表現型をもつ。ある態様において、多重表現型はマルチモーダル観察方法を用いた真核細胞の検出を可能にする。ある態様において、マルチモーダル検出は真核細胞の非侵襲インビボイメージングのために用いられる。イメージングの方法およびモダリティーはそれぞれ、解剖学および生理学の種々の観点の視覚化を可能にし、これらを組み合わせることによりインビボ環境での真核細胞についてより多くの情報が得られる。
【００１４】
[12]  ある態様において、真核細胞のマルチモーダル検出は、細胞についての多重形態の機能データを同時に取得するために、および／または広範な種々のイメージングデバイスでの検出を可能にするために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】[13]  図１は、イメージング特性を最適化および解明するために寒天プラグに懸濁したｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１について約１０８ＭＴＢ／ｍＬに及ぶロングスケール濃度にわたって１．５Ｔ計測器を用いてＴ１パルスシーケンスで作成したポジティブコントラストを示す。
【図２】[14]  図２は、２細胞胚期でそれの２つの細胞のうちの１つにｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１をマイクロインジェクトした胞胚期マウス胚を示す。生細胞イメージング用の環境制御チャンバーにより囲まれた２０×、０．７ＮＡ対物レンズ、および３×光学ズームのＬｅｉｃａ  ＳＰ２  ＡＯＢＳスペクトル共焦点倒立顕微鏡で、胚をイメージングしている。パネルＡは微分干渉コントラスト(differential interference contrast)（ＤＩＣ）イメージを示し、パネルＢは同じイメージのグレイスケール蛍光捕獲を示す。
【図３】[15]  図３は、共焦点顕微鏡検査により経時測定した４つのマウス胚の総胚ＧＦＰ蛍光の変化を示す。それぞれの胚の２細胞期からの２つの細胞のうちの１つにｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１をマイクロインジェクトし、マイクロインジェクション後、８細胞期から開始して２４時間、それぞれの胚の総ＧＦＰ蛍光を測定した。
【図４】[16]  図４Ａ〜Ｃは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞について取得したイメージを示す。図４Ａは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ヒト乳癌細胞の位相コントラストイメージを示す。図４Ｂは、同じ細胞の蛍光イメージを示し、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１からの蛍光信号を立証する。図４Ｃは、寒天（下半分）およびリン酸緩衝化生理食塩水（上半分）を満たしたチューブのＴ２ｗ  ＭＲＩイメージを示し、その間にｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の層（黒色バンド）がある。図４Ｄ〜Ｆは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含まないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の位相コントラスト、蛍光、およびＭＲＩイメージを示す。
【図５】[17]  図５は、円筒形１００ｍｌチューブ内の寒天ゲルに懸濁したｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を示す。図５Ａは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の目視検査で見たイメージである。図５Ｂは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＲＩイメージを示す。図５Ｃは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の蛍光イメージを示す。
【図６−１】[18]  図６は、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含まない種々の細胞を、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容した細胞と比較して示す。細胞を落射蛍光顕微鏡(epifluorescence microscope)および蛍光イメージングでイメージングしている。ｉＰＳ（人工多能性幹細胞，図６Ａおよび６Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞，図６Ｃおよび６Ｄ）、Ｊ７７４．２細胞（マウスマクロファージ，図６Ｅおよび６Ｆ）、ＢＪ（ヒト線維芽細胞，図６Ｇおよび６Ｈ）、ＨＥＰ１細胞（ヒト肝臓腺癌，図６Ｉおよび６Ｊ）、およびＭＣＦ７（ヒト上皮乳腺癌，図６Ｋおよび６Ｌ）を用いた。図６Ａ、６Ｃ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｉおよび６Ｋはｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容した真核細胞の共焦点顕微鏡イメージであり；図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、６Ｈ、６Ｊおよび６Ｌは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容した真核細胞の蛍光イメージである。
【図６−２】同上
【図６−３】同上
【図７】[19]  図７は、ｌｕｘ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を発光についてイメージングしたもの、またはＭＲＩでイメージングしたものを示す。図７Ａは、ｌｕｘ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞または含まないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から得られた発光信号のチャートである。チャートの単位は発光／分である。図７Ｂは、ｌｕｘ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＲＩイメージ（濃いバンド）を示し、ｌｕｘ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が寒天ベースの上に積層している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[20]  本発明を例により説明するが、それらは限定ではない。この開示において、“ある(an)”または“１つ(one)”または“ある(some)”態様という表記は必ずしも同じ態様を述べたものではなく、そのような表記はすべて少なくとも１つを意味することを留意すべきである。
【００１７】
[21]  単数形“a”、“an”、および“the”は、内容からそうではないと明瞭に示されない限り複数表記を含むことも理解すべきである。同様に、“または”という語は、内容からそうではないと明瞭に示されない限り“および”を含むものとする（逆も成り立つ）。物質の濃度またはレベルに関して挙げた数値限定は概数であるものとする。よって、濃度が少なくとも（たとえば）１０μｇであると指示した場合、その濃度は少なくともおおよそまたは約１０μｇであると解釈するものとする。
【００１８】
[22]  １観点において、本発明は、単細胞生物を収容した真核細胞、たとえば人工内部共生体を宿主細胞の細胞質ゾル中に収容した宿主細胞、および単細胞生物を真核細胞に導入する方法に関する。１態様において、単細胞生物は遺伝子変化させた人工内部共生体である。ある態様において、単細胞生物は走磁性細菌（ＭＴＢ）である。本発明はまた、検出のための多重表現型をもつように単細胞生物で工学操作した真核細胞に関する。そのような検出のための多重表現型は、真核細胞のマルチモーダル観察を可能にする。ある態様において、真核細胞のマルチモーダル検出を非侵襲インビボイメージングのために用いる。各イメージング方法（またはモダリティー）は、解剖学および生理学の種々の観点の視覚化を可能にし、これらを組み合わせることにより、イメージ作成者がイメージングされるターゲットまたは対象についてより多くを知ることができる。
【００１９】
定義
[23]  本開示に関して、本明細書の記載に用いる技術用語および科学用語は、別に具体的に定義しない限り当業者が一般的に理解している意味をもつであろう。したがって、以下の用語は下記の意味をもつものとする。
【００２０】
[24]  本明細書中で用いる用語“ＡＭＢ”または“ＡＭＢ−１”は、マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)ＡＭＢ−１株を表わす。
[25]  本明細書中で用いる用語“人工内部共生体”は、ヒトの介入により真核細胞の細胞質ゾルに導入され、その真核細胞の娘細胞へ伝達された、または伝達できる、単細胞生物を表わす。ある態様において、その単細胞生物は人工内部共生体により導入された表現型が娘細胞において維持されるのに十分なコピー数を娘細胞において維持する。
【００２１】
[26]  本明細書中で用いる用語“細胞周期”は、真核細胞の生長、複製、および分裂を伴う一連の事象を表わす。一般に、それは、細胞が不活発なＧ０、細胞のサイズが増大するＧ１およびＧ２、細胞のＤＮＡが倍増するＳ、ならびに細胞が有糸分裂を行なって分裂するＭとして知られる５つの期に分類できる。
【００２２】
[27]  本明細書中で用いる用語“細胞質ゾル”は、細胞の膜結合した下部構造体の内部ではない部分の細胞質を表わす。
[28]  本明細書中で用いる用語“娘細胞”は、ある細胞の分裂により形成される細胞を表わす。
【００２３】
[29]  本明細書中で用いる用語“必須分子”は、細胞が増殖または生存のために必要とする分子を表わす。
[30]  本明細書中で用いる用語“遺伝子修飾された”は、希望する細胞特性または特徴が変化するように細胞の遺伝子材料を変化させることを表わす。この用語はヘテロロガス遺伝子材料を細胞に導入することを含む。
【００２４】
[31]  本明細書中で用いる用語“蛍光タンパク質”は、適宜な電磁放射線で励起された際に発光できるタンパク質を表わす。蛍光タンパク質には天然または工学操作したアミノ酸配列をもつタンパク質が含まれる。
【００２５】
[32]  本明細書中で用いる用語“生物発光タンパク質”は、特定の生化学物質、たとえばルシフェリン（天然の発蛍光団）が酵素（たとえば、ルシフェラーゼ）により酸化されて化学発光を生じるエネルギー獲得化学反応の結果として生じる形態の化学発光を表わす。
【００２６】
[33]  本明細書中で用いる用語“宿主細胞”は、それに人工内部共生体が滞在できる真核細胞を表わす。
[34]  本明細書中で用いる用語“イメージモダリティー”は、それを含む系またはターゲットの検出または照会を可能にする電磁放射線、音波、核粒子、もしくは他のタイプのエネルギー（たとえば、電気）、またはその組み合わせの、吸収または放出を表わす。
【００２７】
[35]  本明細書中で用いる用語“細胞内−内部共生体”は、それの自然ライフサイクルの少なくとも一部を真核生物の細胞内で過ごす単細胞生物を表わす。
[36]  本明細書中で用いる用語“細胞内病原体”および“細胞内寄生体”は、宿主生物に感染して宿主生物に自然界で疾患を引き起こす細菌を表わし、感染に際しては若干の細菌が宿主細胞に侵入する。
【００２８】
[37]  本明細書中で用いる用語“リポソーム仲介”は、１以上の脂質層に内包された水性コアをもつ人工ベシクルを宿主細胞への人工内部共生体の輸送に用いることを表わす。
[38]  本明細書中で用いる用語“ルシフェラーゼ”は、化学基質を用いて光子を産生するタンパク質を表わす。ある態様において、ルシフェラーゼは、生物発光を生じる反応を触媒する酵素または発光タンパク質、たとえばオキシゲナーゼを表わす。ルシフェラーゼは組換え体もしくは天然のもの、またはそのバリアントもしくは変異体であってもよい。
【００２９】
[39]  本明細書中で用いる用語“マグネトソーム(magnetosome)”は、個々の粒子または連鎖状の粒子として鞘または膜により内包された磁性鉱物の粒子を表わす。ある態様において、マグネトソーム中の磁性鉱物はマグネタイト（磁鉄鉱）（すなわち、Ｆｅ３Ｏ４）またはグレイジャイト（グレグ鉱）（Ｆｅ３Ｓ４）を含むことができる。
【００３０】
[40]  本明細書中で用いる用語“磁性細菌”は、外部磁場に応答できる細菌を表わす。
[41]  本明細書中で用いる用語“走磁性細菌”または“ＭＴＢ”は、マグネトソームをコードする遺伝子をもつ細菌を表わす。
【００３１】
[42]  本明細書中で用いる用語“哺乳動物”は、温血脊椎動物を表わし、そのすべてが体毛をもち、雌は乳汁を産生する乳腺をもつ。
[43]  本明細書中で用いる用語“マイクロインジェクション”は、宿主細胞内への人工内部共生体の注入を表わす。
【００３２】
[44]  本明細書中で用いる用語“親細胞”は、分裂して２以上の娘細胞を形成する細胞を表わす。
[45]  本明細書中で用いる用語“表現型”は、生物または細胞の観察可能な一組の特徴を表わす。
【００３３】
[46]  本明細書中で用いる用語“受容体仲介された”は、宿主細胞表面の分子構造または部位が細菌またはタグ付き細菌と結合し、続いて細菌をインターナリゼーションすることを表わす。
【００３４】
[47]  本明細書中で用いる用語“レポーター”または“レポーター分子”は、間接的または直接的に検出できる部分を表わす。レポーターには、限定ではなく、発色団、発蛍光団、蛍光タンパク質、受容体、ハプテン、酵素、および放射性同位体が含まれる。
【００３５】
[48]  本明細書中で用いる用語“レポーター遺伝子”は、直接または間接的に検出できるレポーター分子をコードするポリヌクレオチドを表わす。代表的なレポーター遺伝子は、とりわけ、酵素、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、受容体、抗原性エピトープ、およびトランスポーターをコードする。
【００３６】
[49]  本明細書中で用いる用語“レポータープローブ”は、検出可能な標識を含み、レポーター分子の存在（たとえば、発現）を検出するために用いられる分子を表わす。レポータープローブ上の検出可能な標識はいずれの検出可能な部分であってもよく、限定ではなく、同位体（たとえば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴなどにより検出できるもの）、発色団、および発蛍光団を含む。レポータープローブは、レポータープローブに結合するかあるいはレポータープローブによる作用を受けてレポーター分子の検出を可能にする、いずれかの検出可能な分子または組成物であってよい。
【００３７】
[50]  本明細書中で用いる用語“ヘテロロガス(heterologous)”は、核酸またはポリペプチドに関して用いる場合、普通は自然界では存在しない核酸またはポリペプチドを表わす。したがって、宿主細胞に関してヘテロロガスな核酸またはポリペプチドは、自然界ではその宿主細胞に存在しない核酸またはポリペプチドを表わす。たとえば、プロモーターを含む宿主核酸に作動可能な状態で連結した、ポリペプチドをコードする非宿主核酸を含む核酸分子は、ヘテロロガス核酸分子とみなされる。逆に、ヘテロロガス核酸分子は、非宿主（外因性）プロモーターと作動可能な状態で連結した内因性構造遺伝子を含む可能性がある。同様に、非宿主核酸分子によりコードされるペプチドもしくはポリペプチド、または内因性ポリペプチドに非宿主ポリペプチドが融合したものは、ヘテロロガスなペプチドまたはポリペプチドである。
【００３８】
[51]  本明細書中で用いる用語“分泌する”は、分子またはシグナルが膜の一方側から他方側へ通過することを表わす。
[52]  本明細書中で用いる用語“選択剤(selective agent)”は、選択性作用剤(selectable agent)の非存在下で単細胞生物、および／または人工内部共生体、および／または宿主細胞に対して致死性または阻害性である分子、ポリペプチド、または一組の培養条件を表わす。
【００３９】
[53]  本明細書中で用いる用語“タグ付きの人工内部共生体”は、内部共生体の表面にリガンドをもつ人工内部共生体を表わす。
人工内部共生体
[54]  本発明の単細胞生物には、真核細胞内で生存でき、かつその単細胞生物により導入された表現型が娘細胞において観察されるほどのコピー数を維持できる細菌が含まれる。ある態様において、単細胞生物はヒトによるさらなる介入なしに真核宿主細胞を殺すことはない。ある態様において、単細胞生物はある機能性をもち、それをその単細胞生物の導入に伴って真核細胞が獲得する。ある態様において、マルチモダリティーにおける一方または両方のモダリティーが、単なるイメージング以外の追加の機能性を提供する。ある態様において、単細胞生物の機能性は磁性、栄養素、代謝産物、ビタミン、補因子、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、高分子、産業上の前駆体、プロドラッグ、ホルモン、脂肪酸、炭水化物、単糖、シグナル分子、薬理活性化合物、生物活性化合物の産生、除塩(desalinization)、凍結保護物質、窒素固定、光合成、環境攻撃に対する応答、または苛酷な環境攻撃に対する耐性である。ある態様において、機能性は単細胞生物における遺伝子の発現を伴う。ある態様において、機能性は単細胞生物における１以上の遺伝子または一組の遺伝子の発現を伴う。ある態様において、機能性は単細胞生物におけるタンパク質の発現を伴う。ある態様において、機能性は単細胞生物における一組のタンパク質の発現を伴う。ある態様において、機能性は遺伝子または遺伝子生成物の発現を伴い、それが宿主に伝達されてその表現型を発現する。
【００４０】
[55]  磁性には反磁性および常磁性が含まれる。ある態様において、磁性には強磁性が含まれる。ある態様において、真核細胞はその機能性を少なくとも４８時間は維持する。ある態様において、単細胞生物は、表現型を真核細胞の娘細胞において少なくとも２回の細胞分裂、または少なくとも３回の細胞分裂、または少なくとも４回の分裂、または少なくとも５回の分裂、または少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０回の細胞分裂の間、安定に維持することができる。他の態様において、単細胞生物は表現型を真核細胞の娘細胞において３〜５回の分裂、または５〜１０回の分裂、または１０〜１５回の分裂、または１５〜２０回の分裂の間、安定に維持することができる。
【００４１】
[56]  ある態様において、本発明の単細胞生物は遺伝子修飾される。細菌を遺伝子修飾するための方法は当技術分野で周知である。ある態様において、細菌は、真核宿主細胞におけるそれらの生存を改善するために、および／または真核細胞に対する単細胞生物の毒性を低減するために、および／または真核細胞に有用な表現型を付与するために、遺伝子修飾されるであろう。１態様において、単細胞生物が真核宿主細胞においてもはや鞭毛タンパク質を発現できないように、単細胞生物の鞭毛タンパク質を改変する。他の態様において、単細胞生物は必須分子をもはや合成できないように改変され、それは好ましくは真核宿主細胞により供給される。ある態様において、単細胞生物はそれの細胞周期が真核宿主細胞の細胞周期と同調するように遺伝子修飾され、それによりその表現型を娘細胞に付与するのに十分なレベルに単細胞生物のコピー数を維持することができる。ある態様において、遺伝子は人工内部共生体を特定の細胞内位置に局在化する。特定の態様において、遺伝子は特定の宿主細胞への人工内部共生体の侵入の増強または遮断をもたらす。ある態様において、遺伝子は、人工内部共生体または遺伝子およびそれから発現するタンパク質に対する宿主免疫系応答を抑制し、または変化させる。
【００４２】
[57]  本発明の態様は、α−プロテオバクテリア綱(α-Proteobacteria)である単細胞生物を含む。１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づく現在の分類方式では、α−プロテオバクテリアはプロテオバクテリア門(Proteobacteria)内の綱として認識され、７つの主要な亜群または目（カウロバクター(Caulobacterales)、リゾビウム(Rhizobiales)、ロドバクター(Rhodobacterales)、ロドスピリルム(Rhodospirillales)、リケッチア(Rickettsiales)、スフィンゴモナス(Sphingomonadales)、およびパルブルアーキュラ(Parvularculales)）に下位分類される(Gupta, R.S., “Phylogenomics and signature proteins for the alpha Proteobacteria and its main groups,” BMC Microbiol. 7:106 (2007), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００４３】
[58]  α−プロテオバクテリア内の主要群のすべてを含む多数のα−プロテオバクテリアのゲノムが配列決定され、α−プロテオバクテリア内のより高い分類学的群（たとえば、科、目、など）の明瞭な特徴である特異な一組の遺伝子またはタンパク質を同定するために使用できる情報が得られた(Gupta, 前掲; あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００４４】
[59]  人工内部共生体として有用な単細胞生物には、たとえば下記のものが含まれるが、それらに限定されない：アナベナ属(Anabaena)、ノストック属(Nostoc)、ジアゾ栄養生物(Diazotroph)、藍細菌門(Cyanobacteria)、トリコデスミウム属(Trichodesmium)、ベイジェリンキア属(Beijerinckia)、クロストリジウム属(Clostridium)、緑色硫黄細菌(Green sulfur bacteria)、真正細菌科(Azotobacteraceae)、根粒菌(Rhizobia)、フランキア属(Frankia)、フラボバクテリア(flavobacteria)、メタノサルシナ目(Methanosarcinales)、ハロバクテリウム目(Halobacteriales)の好気性好塩性古細菌、ハロアナエロビウム目(Halanaerobiales)の嫌気性菌(フィルミクテス門(Firmicutes)の低G+Cブランド)、赤色好気性サリニバクター(Salinibacter) (バクテロイデス門の枝(Bacteroidetes branch))、マリノバクター属(Marinobacter)、ハロモナス属(Halomonas)、デルマコッカス属(Dermacoccus)、コクリア属(Kocuria)、ミクロモノスポラ属(Micromonospora)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ウィリアムシア属(Williamsia)、ツカムレラ属(Tskamurella)、アルテロモナス属(Alteromonas)、コルウェリア属(Colwellia)、グラシエコラ属(Glaciecola)、シュードアルテロモナス属(Pseudoalteromonas)、シュワネラ属(Shewanella)、ポラリバクター属(Polaribacter)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サイクロバクター属(Psychrobacter)、アンスロバクター属(Athrobacter)、フリゴリバクテリウム属(Frigoribacterium)、サブテルコラ属(Subtercola)、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、ロドッカ属(Rhodoccu)、バチルス属(Bacillus)、バクテロイデス属(Bacteroides)、プロピオニバククテリウム属(Propionibacterium)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、クレブシエラ属(Klebsiella)、レシチナーゼ陽性クロストリジウム綱(Clostridia)、ベイロネラ属(Veillonella)、フソバクテリウム属(Fusobacteria)、クロマチウム科(Chromatiaceae)、クロロビウム科(Chlorobiceae)、ロドスピリラム科(Rhodospirillaceae)、チオバチルス(thiobacilli)、ニトロモナス属(nitrosomonas)、ニトロバクター属(nitrobacter)、メタン生成菌(methanogen)、酢酸生成菌(acetogen)、硫黄還元菌(sulfate reducer)、および乳酸菌。
【００４５】
[60]  下記のものを含めて、これらの多数の単細胞生物のゲノムが配列決定されており、あるいは決定されつつある：たとえばメタノゲニウム・フリギダム(M. frigidum)、メタノコッコイデス・ブルトニイ(M. burtonii)、クロストリジウム・シンビオサム(C. symbiosum)、コルウェリア・サイクレリスラエ(C. psychrerythraea)、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス(P. haloplanktis)、ハロルブラム・ラクスプロファンディ(Halorubrum lacusprofundi)、ビブリオ・サルモニシダ(Vibrio salmonicida)、フォトバクテリウム・プロファンダム(Photobacterium profundum)、ソブラリア・ビオラセア(S. violacea)、シューワネラ・フリギディマリナ(S. frigidimarina)、サイクロバクター属(Psychrobacter)種273-4、シューワネラ・ベンシカ(S. benthica)、サイクロモナス属(Psychromonas)種CNPT3、モリテラ属(Moritella)種、デスルホタレア・サイクロフィラ(Desulfotalea Psychrophila)、(Exiguobacterium 255-15)、フラボバクテリウム・サイクロフィルム(Flavobacterium psychrophilum)、サイクロフレクサス・トークイス(Psychroflexus torquis)、ポラリバクター・フィラメンタス(Polaribacter filamentous)、ポラリバクター・イルゲンシイ(P. irgensii)、レニバクテリウム・サルモニナーラム(Renibacterium salmoninarum)、レイフソニア属(Leifsonia)関連PHSC20-c1、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス(Acidithiobacillus ferrooxidans)、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)、ピクロフィラス・トッリダス(Picrophilus torridus)、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)、およびフェロプラズマ・アシダルマヌス(Ferroplasma acidarmanus)。
【００４６】
[61]  ある態様において、人工内部共生体は細胞内病原体または細胞内−内部共生体であることが知られている単細胞生物を除外する。多くの細胞内病原体のゲノムは、たとえば細胞内病原体がターゲット真核細胞に付着して細胞内病原体の食作用を誘発する接着因子をコードするビルレンス遺伝子(virulence gene)を収容したゲノムアイランド(genomic island)を含む(Juhas, M. et al., “Genomic islands: tools of bacterial horizontal gene transfer and evolution,” FEMS Microbiol Rev. 33:376-393 (2009), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。多くのビルレンス（病原）因子はＩＩＩ型またはＩＶ型分泌系を利用する。あるビルレンス因子は真核宿主細胞内へ分泌されてターゲット真核細胞内のメンブレントラフィック(membrane traffic)を変化させ、あるビルレンス因子はアポトーシスに関与する宿主タンパク質と相互作用する(Dubreuil, R. et al., “Bringing host-cell takeover by pathogenic bacteria to center stage,” Cell Logis. 1:120-124 (2011), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００４７】
[62]  本発明の態様は、走磁性細菌（“ＭＴＢ”）である単細胞生物を含む。1975年のBlakemoreによる発見以来、多数のＭＴＢ種が当業者に知られており(参照：たとえば、Blakemore, R., “Magnetotactic bacteria,” Science 24: 377-379 (1975), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)、一群の微生物をなしている(Faivre, D. et al., “Magnetotactic bacteria and magnetosomes,” Chem Rev. 108:4875-4898 (2008), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。ＭＴＢはプロテオバクテリア門(Proteobacteria)およびニトロスピラ(Nitrospira)門の種々の亜群において同定されており、大部分のフィロタイプ（系統型）(phylotype)はα−プロテオバクテリアに属する。現在、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列類似性によりα−プロテオバクテリアと判定された培養可能なＭＴＢ株には、Blakemoreにより1975年に最初に分離された株が含まれる；マグネトスピリラム・マグネトタクチウム(Magnetospirillum magnetotactium) (以前はアクアスピリラム・マグネトタクチウム(Aquasprillium magnetotactium))、マグネトスピリラム・グライフィスワルデンス(M. gryphiswaldense)、マグネトスピリラム・マグネティカム(M. magneticum) 株AMB-1 (“ＡＭＢ”)、マグネトスピリラム・ポリモルフム(M. polymorphum)、マグネトスピリラム(Magnetosprillum) 種MSM-4およびMSM-6、マグネトコッカス・マリナス(Magnetococcus marinus)、マリンビブリオ(marine vibrio) 株MV-1およびMV-2、マリンスピリラム(marine spirillum) 株MMS-1、およびマグネトコッカス属(Magnetococcus) 種, 株MC-1、ならびにその他。ＡＭＢを含めた多数のＭＴＢを純培養物で入手できる。純培養物におけるＡＭＢの倍増時間はおおよそ８時間であり、一般的な哺乳動物細胞のものに近い。
【００４８】
[63]  標準的なＭＴＢ増殖培地はコハク酸を主炭素源として用いるが、ＭＴＢはフマレート、タルトレート、マレート、ラクテート、ピルベート、オキサロアセテート、マロネート、Ｐ−ヒドロキシブチレートおよびマレエートを唯一の炭素源として増殖できる。これらの代謝産物は真核細胞の内部に存在する。微好気性、通性嫌気性、および絶対嫌気性ＭＴＢ株が同定された。真核細胞の細胞質ゾルにおける酸素濃度は、ミオグロビンなどのタンパク質による捕捉、および特定の細胞位置、たとえばミトコンドリアにおける濃縮のため低く、よってＭＴＢ増殖に必要な微好気性または通性嫌気性の環境が真核細胞内に既に存在する。
【００４９】
[64]  ＭＴＢはそれらが合成する磁性粒子、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）またはグレイジャイト（Ｆｅ３Ｓ４）によっても分類できる。マグネタイト産生菌は微好気性または通性嫌気性であってマグネトソーム合成のために若干の酸素源を必要とし、生理的温度付近に最適増殖温度をもつ。
【００５０】
[65]  ある態様において、本発明の単細胞生物は遺伝子修飾される。ＡＭＢおよびマグネトスピリラム・グライフィスワルデンス(M. gryphiswaldense)株ＭＳＲ−１のＭＴＢの遺伝子操作のための分子生物学ツールが最も徹底的に開発された(Jogler, C. and Schtiler, D., “Magnetoreception and Magnetosomes in Bacteria,” p 134-138, New York, Springer (2007)に概説, あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。あらゆるＭＴＢのうちＡＭＢのゲノムが最初に配列決定されたので、別に特定しない限り、本明細書中でＭＴＢ遺伝子という表記はすべてこのゲノムを表わす。他の２つのマグネトスピリラム(Magnetospirillum)株およびマグネトコッカス属(Magnetococcus)種, 株ＭＣ−１のゲノムも最近になって配列決定された。これらの株または現時点で培養可能もしくは培養不可能な他のＭＴＢ株に由来する遺伝子であって、配列決定されたものまたは配列決定されていないもの、既知または未知のものを本発明に使用できる。
【００５１】
[66]  マグネトソームアイランド(magnetosome island)(ＭＡＩ)として知られるゲノムアイランドのＭＴＢクラスターにおけるマグネトソーム形成に関与する遺伝子。マグネトスピリラム・グライフィスワルデンス(M. gryphiswaldense)において、１３０ｋｂのＭＡＩは一般に下記の構造をもつ：４つのポリシストロン性オペロン(polycistronic operon)：ｍａｍＡＢオペロンは、１６．４ｋｂにわたって広がる１７の同定されたＯＲＦをもつ；ｍａｍＧＦＤＣオペロンは、ｍａｍＡＢの２．１ｋｂおよび１５ｋｂ上流に４つの同定されたＯＲＦをもつ；ｍｍｓ６オペロンは、ｍａｍＧＦＤＣの３．６ｋｂおよび３６８ｂｐ上流に６つの同定されたＯＲＦをもつ；ｍａｍＸＹオペロンは、ｍａｍＡＢの約３０ｋｂ下流に位置する４つの同定されたＯＲＦをもつ；ならびにモノシストロン型ｍａｍＷ遺伝子。Ｍａｌにおいては、タンパク質Ｍａｍ  Ｗ、Ｍｇｌ４５７、Ｍｇｌ４５８、Ｍｇｌ４５９、Ｍｍｓ６、Ｍｇｌ４６２、ＭａｍＧ、ＭａｍＦ、ＭａｍＤ、ＭａｍＣ、ＭａｍＨ、Ｍａｍｌ、ＭａｍＥ、ＭａｍＪ、ＭａｍＫ、ＭａｍＬ、ＭａｍＭ、ＭａｍＮ、ＭａｍＯ、ＭａｍＰ、ＭａｍＡ、ＭａｍＱ、ＭａｍＲ、ＭａｍＢ、ＭａｍＳ、ＭａｍＴ、ＭａｍＵ、およびＭｇｌ５０５が同定され、それらの多くにマグネトソーム形成における特異的機能が与えられている。ＭＡＩ外の４つの遺伝子ｍａｍＹ、ｍｔｘＡ、ｍｍｓＦおよびｍａｍＸがマグネトソーム形成に関連している。ゲノムの組織およびサイズが若干異なる保存されたＭＡＩ類が他のＭＴＢに見出された。これらの遺伝子はＡＭＢ−１についても同定された(参照：Table 2, in Fukuda, Y. et al., “Dynamic analysis of a genomic island in Magnetospirillum sp. Strain AMB-1 reveals how magnetosome synthesis developed,” FEBS Lett. 580:801-812 (2006), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００５２】
[67]  ある態様において、単細胞生物に遺伝子修飾を行なう。そのような修飾は、指向性修飾、ランダム変異形成、またはその組み合わせであってもよい。自然−内部共生体は新たな可能性をもつ供与体であり、しばしば宿主から必要な栄養素を得る。
【００５３】
[68]  宿主の共生体による自然コロニー形成は７段階で起きる：１）伝播、２）侵入、３）宿主防御への対抗、４）ポジショニング、５）宿主に対する利点の供与、６）宿主環境での生存、および７）調節。
【００５４】
[69]  ある態様において、単細胞生物と真核細胞の間に相互栄養依存性（生体栄養性）が樹立する可能性がある。１態様において、単細胞生物は必須分子を合成するための酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの欠失または不活性化を含み、それによりその酵素の非存在または不活性酵素の発現が生じ、その必須分子は真核宿主細胞により産生される。必須分子にはアミノ酸、ビタミン、補因子、およびヌクレオチドを含めることができるが、これらに限定されない。たとえば、生体栄養性は単細胞生物がアミノ酸を産生する能力をノックアウトすることにより達成でき、その際、それは宿主から得られるであろう。グリシンは哺乳動物細胞に著しく多量に存在し、細菌アミノ酸バイオジェネシスにおける最終産物であるので妥当な選択である；少なくとも２２の他の可能性がある。酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、アミノ酸生成のための３−ホスホグリセレート生合成経路の最後にセリンをグリシンに変換する。１態様において、単細胞生物は遺伝子ａｍｂ２３３９（酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする）が遺伝子修飾されたＡＭＢである。遺伝子を変異またはノックアウトさせるためには下記を含めて当業者に知られている多数の方法がある：インビトロ変異形成、相同組換えによる目的遺伝子内へのターゲティッドＤＮＡ挿入、または遺伝子（またはオペロン；細菌の遺伝子の大部分がオペロン内にクラスター形成しているので）の欠失、またはエンドヌクレアーゼの使用、ただし、適切な部位がゲノムにおいてターゲットの周囲にのみ存在する場合。
【００５５】
[70]  他の態様において、宿主細胞に対する単細胞生物の栄養依存性は、単細胞生物が種々の代謝産物、補因子、ビタミン、ヌクレオチド、または他の必須分子を合成する能力を排除することによっても樹立できる。
【００５６】
[71]  本発明のある態様において、ＭＴＢは運動および／または分泌に関連する遺伝子に変異および／または欠失をもつ。ＭＴＢは鞭毛をもち、本発明のある態様において、ＭＴＢは、鞭毛と関連する分子機構をコードする少なくとも１つの遺伝子に、磁性細菌が機能性鞭毛を生成しないような欠失および／または変異をもつ。さらに、多くのＭＴＢが、宿主に対して有害であるかあるいは宿主から免疫応答を誘発する種々の化合物、たとえばヒドロキサメートおよびカテコールシデロフォア(catechol siderophore)を分泌する。配列決定されたＡＭＢのゲノムにおいて、４５５９のＯＲＦのうち８３の遺伝子が細胞の運動および分泌に関連していた。鞭毛アセンブリーは下記の遺伝子生成物から構成されることが知られている：ａｍｂ０４９８、ａｍｂ０５００、ａｍｂ０５０１、ａｍｂ０５０２、ａｍｂ０５０３、ａｍｂ０５０４、ａｍｂ０５０５、ａｍｂ０６１０、ａｍｂ０６１４、ａｍｂ０６１５、ａｍｂ０６１６、ａｍｂ０６１７、ａｍｂ０６１８、ａｍｂ０６１９、ａｍｂ０６２８、ａｍｂｌ２８９、ａｍｂ１３８９、ａｍｂ２５５８、ａｍｂ２５５９、ａｍｂ２５７８、ａｍｂ２５７９、ａｍｂ２８５６、ａｍｂ３４９３、ａｍｂ３４９４、ａｍｂ３４９５、ａｍｂ３４９６、ａｍｂ３４９８、ａｍｂ３８２４、およびａｍｂ３８２７。鞭毛は、少なくとも下記の遺伝子生成物から構成される走化性機構により制御される：ａｍｂ０３２２、ａｍｂ０３２３、ａｍｂ０３２４、ａｍｂ０３２５、ａｍｂ０３２６、ａｍｂｌ８０６、ａｍｂｌ９６３、ａｍｂｌ９６６、ａｍｂ２３３３、ａｍｂ２６３５、ａｍｂ２６４０、ａｍｂ２６４８、ａｍｂ２６５２、ａｍｂ２８２６、ａｍｂ２９３２、ａｍｂ３００２、ａｍｂ３００３、ａｍｂ３００４、ａｍｂ３００７、ａｍｂ３１０２、ａｍｂ３３２９、ａｍｂ３５０１、ａｍｂ３５０２、ａｍｂ３６５４、ａｍｂ３８７９、およびａｍｈ３８８０。
【００５７】
[72]  １態様において、抗生物質耐性をコードする遺伝子を単細胞生物のゲノムに挿入する。その抗生物質を含有する培地で培養される真核細胞は、生存のためにその単細胞生物を必要とするであろう。ネオマイシン耐性は２つのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子のうちいずれか１つにより付与され、それは真核生物に一般的に用いられるジェネティシン（Ｇ４１８）に対する耐性も供与する。ハイグロマイシンＢ耐性はハイグロマイシンＢをリン酸化により不活性化するキナーゼにより付与される。ピューロマイシンは哺乳動物細胞培養のために一般的に用いられる抗生物質であり、耐性はピューロマイシン  Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼをコードするｐａｃ遺伝子により付与される。抗生物質濃度の外部制御により、単細胞生物のコピー数を細胞内調節できる。外部因子の化学修飾によりこの因子に対する耐性または耐容性が達成される他のいずれかのシステムも採用できる。真核細胞に対する間接的な栄養上の利点を、ＭＴＢおよび磁気培養法を用いて確立することもできる。この態様において、ＭＴＢを収容した真核細胞に利点を与えるために、磁場を樹立する。これは、培養マトリックスに付着するための手段、必要な増殖因子もしくは培地因子へのアクセスを提供することにより、または細胞継代間での選択により可能である。
【００５８】
[73]  他の態様において、特定の宿主細胞タイプについて宿主防御メカニズムに対する細胞内安定性を高めるために、ＭＴＢゲノムにおいて遺伝子修飾を行なう。真核細胞の多くの内部共生体および内部寄生体、たとえば昆虫のプロテオバクテリア内部共生体、たとえばブフネラ属(Buchnera)、ウィッグルスワルチア属(Wigglesworthia)およびウォルハチア属(Wolhachia）；嫌気性繊毛虫のメタン生成−内部共生体；珪藻類ロパロディア属(Rhopalodia)における窒素固定共生体；無腸チューブワーム(オラビウス属(Olavius)またはジナニドリルス属(Jnanidrillus))の化学合成−内部共生体集合体；海綿類のシアノバクテリア−内部共生体；棘皮動物門(Echinodermata)の現存する５つの綱すべての内部共生体；植物の根粒菌(Rhizobia)内部共生体；種々の内部共生藻類；オオアメーバ(Ameoba proteus)のレジオネラ(Legionella)様Ｘ細菌−内部共生体；多数のサルモネラ属(Salmonella)種、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)などは、しばしばシンビオソーム(symbiosome)と呼ばれる膜結合した小胞(vacuole)内に存在し、これに対し、ある種、たとえばブロッホマニア属(Blochmannia)、リケッチア(rickettsia)、赤痢菌属(Shigella)、腸管組織侵入性大腸菌(enteroinvasive Escherichia coli)、およびリステリア属(Listeria)は細胞質ゾルに生息する能力をもつ。Ｄｏｔ−Ｉｃｍ  ＩＶ型分泌系は、食作用により獲得された多くの細胞内細菌がエンドサイトーシス経路を逃れて宿主細胞内に存続するために利用する。この系はレジオネラ・ニューモフィラ(L. pneumophila)において十分に研究され、下記のタンパク質からなる：ＤｏｔＡ〜ＤｏｔＰ、ＤｏｔＵ、ＤｏｔＶ、ＩｃｍＦ、ＩｃｍＱ〜ＩｃｍＴ、ＩｃｍＶ、ＩｃｍＷおよびＩｃｍＸ。フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)、すなわち線虫の発光性内部共生体において、ＲＴＸ様毒素、プロテアーゼ、ＩＩＩ型分泌系、および鉄獲得系をコードする遺伝子が細胞内での安定性および複製を支持することが示された。遺伝子ｂａｃＡおよび調節系ＢｖｒＲＳは、根粒菌(Rhizobia)と植物の間の共生および哺乳動物細胞におけるブルセラ・アボルタス（ウシ流産菌）(Brucella ahortus)の生存を維持するために必須である。ＰｒｆＡレギュロン(regulon)は、あるリステリア属(Listeria)種がファゴソームを逃れて細胞質ゾルに生息するのを可能にする。細胞内ＭＴＢの希望する細胞内位置（たとえば、シンビオソームまたは細胞質ゾル）は、宿主環境での生存および増殖のためにどの遺伝子がＭＴＢ内で発現する（ゲノムから直接に、または安定ベクターにより）必要があるかを支配するであろう。内因性プラスミドｐＭＧＴはＭＴＢ内で高度に安定であり、多数の他の広範なベクター（ｌｎｃＱ、ＩｎｃＰ、ｐＢＢＲｌなどのものを含む）がＭＴＢ内で安定複製できる。
【００５９】
[74]  他の態様において、単細胞生物を、細菌生育阻止遺伝子（単数または複数）、シデロフォア遺伝子（単数または複数）、代謝要求遺伝子（単数または複数）、自殺遺伝子（単数または複数）、細胞周期調節遺伝子（単数または複数）、トランスポーター遺伝子（単数または複数）などの遺伝子のノックイン、およびファゴソーム遺伝子（単数または複数）からの回避により、遺伝子修飾する。他の態様において、単細胞生物をランダム変異させ、その後、宿主細胞内での統合の増強についてスクリーニングする。ランダム変異は、変異形成化合物による処理、ＵＶ線への曝露、または当業者に知られている他の方法により達成できる。
【００６０】
[75]  他の態様において、真核細胞防御に対抗するために種々の寄生体または内部共生体由来の遺伝子を用いてトランスジェニック修飾（単数または複数）を行なう。他の態様において、宿主メカニズム（栄養素利用能、複製の制御など）の内的利用のバランスおよび抗生物質濃度により、真核宿主細胞における単細胞生物の集団を調節する。
【００６１】
[76]  他の態様において、天然の内部共生体または細胞内寄生体を遺伝子修飾してマグネトソームを産生させる。昆虫の内部共生体、たとえばブフネラ属(Buchnera)、ウィッグルスワルチア属(Wigglesworthia)およびウォルハチア属(Wolhachia）；嫌気性繊毛虫のメタン生成−内部共生体；珪藻類ロパロディア属(Rhopalodia)における窒素固定共生体；無腸チューブワーム(オラビウス属(Olavius)またはジナニドリルス属(Jnanidrillus))の化学合成−内部共生体集合体；海綿類のシアノバクテリア−内部共生体；棘皮動物門(Echinodermata)の現存する５つの綱すべての内部共生体；植物の根粒菌(Rhizobia)内部共生体；種々の内部共生藻類；オオアメーバ(Ameoba proteus)のレジオネラ(Legionella)様Ｘ細菌−内部共生体；多数のサルモネラ属(Salmonella)種、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)など、α−プロテオバクテリアに属するものを遺伝子工学操作して、マグネトソームを産生させることができる。他の態様において、１以上のマグネトソーム遺伝子を発現するように既存の細胞小器官を遺伝子修飾して、人工内部共生体を作製できる。たとえば、それら自身の遺伝子材料を備えたミトコンドリア、プラスチド、ハイドロジェノソーム(hydrogenosome)、アピコプラスト(apicoplast)、または他の細胞小器官を遺伝子変化させることができる。マグネトソームを産生するように改変した細菌には、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、腸チフス菌(Salmonella typhi)、ブルセラ属(Brucella)、レジオネラ属(Legionella)、 マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ノカルジア属(Nocardia)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、エルシニア属(Yersinia)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、クラミジア属(Chlamydia)、リケッチア属(Rickettsia)、コクシエラ属(Coxiella)などを含めることができる。
【００６２】
[77]  好ましい態様において、単細胞生物は真核細胞の培養に際して磁性粒子を産生するＭＴＢであり、それは遺伝子変化されたものであってもよく、遺伝子変化されたものでなくてもよい。
【００６３】
核酸
[78]  本発明の核酸は、発現ベクター、たとえばプラスミド、またはウイルスベクター、または線状ベクター、または染色体ＤＮＡに組み込まれるベクターを含むことができる。発現ベクターは、１以上の選択した宿主細胞内でベクターが複製するのを可能にする核酸配列を含むことができる。そのような配列は多様な細胞について周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大部分のグラム陰性細菌に適している。真核宿主細胞、たとえば哺乳動物細胞において、発現ベクターは宿主細胞の染色体に組み込まれ、次いで宿主染色体と共に複製することができる。同様に、ベクターを原核細胞の染色体に組み込むことができる。
【００６４】
[79]  発現ベクターは、一般に選択遺伝子、すなわち選択マーカーとも呼ばれるものを含む。原核細胞、および本発明の宿主細胞を含めた真核細胞について、選択マーカーは技術分野で周知である。この選択遺伝子は、選択培地中で増殖させる形質転換された宿主細胞が生存または増殖のために必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、その培地中で生存しないであろう。一般的な選択遺伝子は下記のタンパク質をコードする：（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するもの；（ｂ）栄養要求性欠乏を補うもの；または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給するもの、たとえば桿菌(Bacilli)に対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。選択スキームの一例では、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。ヘテロロガス遺伝子による形質転換に成功した細胞は薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、よってその選択法で生存する。細菌または真核生物（哺乳動物を含む）系に使用するための他の選択マーカーは当技術分野で周知である。ある態様において、選択マーカーはターゲットタンパク質であり、あるいは単細胞生物により宿主細胞内へ分泌される核酸によりコードされる。
【００６５】
[80]  ヘテロロガスポリペプチドを産生するための発現ベクターは誘導性プロモーターをも含むことができ、それは宿主ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、ターゲットタンパク質をコードする核酸に作動可能な状態で連結している。適切なエンハンサー、イントロン、および他の調節配列を備えた誘導性または構成性プロモーター（または制御領域）は当技術分野で周知である。
【００６６】
[81]  ある態様において、本発明のポリペプチドを修飾することが望ましい可能性がある。当業者は特定の核酸構築体に変更を作製する多数の方法を認識しているであろう。そのような周知の方法には、部位特異的変異形成、変性オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅、変異形成剤もしくは放射線への核酸含有細胞の曝露、希望するオリゴヌクレオチドの化学合成（たとえば、大型核酸を生成するためにライゲーションおよび／またはクローニングとの組み合わせで）、および他の周知の手法が含まれる。参照：たとえば、Giliman and Smith, Gene 8:81-97 (1979) and Roberts et al., Nature 328: 731-734 (1987), 本明細書に援用する。
【００６７】
[82]  ある態様において、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を修飾して、選択した生物における核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを得ることができる。
[83]  本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同等であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含まれる。本発明によるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より一般的には少なくとも約９０％、よりさらに一般的には少なくとも約９５％の配列同一性をもつことができる。本発明はまた、それらのポリヌクレオチドの相補体であって、上記に示したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より一般的には少なくとも約９０％、よりさらに一般的には少なくとも約９５％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含むものを提供する。ポリヌクレオチドはＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅したもの、または合成したもの）またはＲＮＡであってもよい。そのようなポリヌクレオチドを得るための方法および他のアルゴリズムは当業者に周知であり、たとえば希望する配列同一性をもつポリヌクレオチドをルーティンに単離できるハイブリダイゼーション条件を決定するための方法を含めることができる。
【００６８】
[84]  本発明によるタンパク質アナログ（すなわち、１以上のアミノ酸が野生型ポリペプチドと異なるようにデザインされたもの）をコードする核酸は、部位特異的変異形成、または希望する点変異をプライマー（単数または複数）がもつＰＣＲ増幅を用いて作製できる。適切な変異形成法の詳細な記載については、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、および／またはAusubel et al., editors, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. (1994)を参照されたい。Engels et al., 1989, in Angew. Chem. Intl. Ed., Volume 28, pages 716-734により記載された方法を用いる化学合成も、そのような核酸を作製するために使用できる。
【００６９】
[85]  “組換えバリアント”は、アミノ酸の挿入、欠失および置換により天然ポリペプチドと異なるいずれかのポリペプチドであって、組換えＤＮＡ法を用いて作製したものを表わす。目的とする活性、たとえば酵素活性または結合活性を無効にすることなくどのアミノ酸残基を置換え、付加または欠失させることができるかを決定する際のガイダンスは、そのポリペプチドの配列を相同ペプチドの配列と比較し、相同性の高い領域におけるアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることにより見出すことができる。
【００７０】
[86]  好ましくは、アミノ酸“置換”は１つのアミノ酸を、類似の構造および／または化学的特性をもつ他のアミノ酸で置き換えた、すなわち保存的なアミノ酸の置換えの結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて行なうことができる。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる；正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる；負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００７１】
[87]  “挿入”または“欠失”は、一般に約１〜５個の範囲のアミノ酸においてである。許容されたバリエーションは、組換えＤＮＡ法を用いてポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に行ない、得られた組換えバリアントを活性についてアッセイすることにより、実験的に決定できる。
【００７２】
[88]  あるいは、機能の変更を希望する場合、挿入、欠失または非保存的変更を工学的に行なって、変更されたポリペプチドまたはキメラポリペプチドを作製することができる。そのような変更により、たとえば本発明のポリペプチドの１以上の生物学的機能または生化学的特徴を変更することができる。たとえば、そのような変更により、ポリペプチドの特徴、たとえばリガンド結合親和性または分解／ターンオーバー速度を変化させることができる。さらに、そのような変更は、発現のために選択した宿主細胞における発現、スケールアップなどに、より適したポリペプチドが生成するように選択できる。
【００７３】
[89]  あるいは、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組換えバリアントは、遺伝子コードにおける“冗長性(redundancy)”を利用して合成または選択できる。種々のコドン置換、たとえば種々の制限部位を作製するサイレント変化を導入して、プラスミドもしくはウイルスベクター内へのクローニングまたは特定の原核細胞系もしくは真核細胞系における発現を最適化することができる。ポリヌクレオチド配列における変異を、ポリペプチドにおいて、またはポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインにおいて反映させて、ポリペプチドのいずれかの部分の特性を改変し、リガンド結合親和性または分解／ターンオーバー速度などの特徴を変化させることができる。
【００７４】
[90]  好ましい方法において、新規核酸をコードするポリヌクレオチドは部位特異的変異形成により変化している。この方法は、希望するアミノ酸バリアントのポリヌクレオチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、および変化させる部位のいずれの側でも安定なデュプレックスを形成するのに十分な変化したアミノ酸の両側の隣接ヌクレオチドを用いる。一般に、部位特異的変異形成の手法は当業者に周知であり、この手法は刊行物、たとえばEdelman et al., DNA 2:183 (1983)に例示されている。ポリヌクレオチド配列中に部位特異的変化を生じさせるための万能な効果的方法が、Zoller and Smith, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)に記載されている。
【００７５】
[91]  ＰＣＲも、核酸のアミノ酸配列バリアントを作製するために使用できる。少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として用いる場合、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域とわずかに配列が異なるプライマー（単数または複数）により、希望するアミノ酸バリアントを作製できる。ＰＣＲ増幅は、ターゲットをコードするポリヌクレオチド鋳型とはプライマーにより特定した位置において異なる生成物ＤＮＡフラグメントの集団を生成する。生成物ＤＮＡフラグメントによりプラスミド中の対応する領域を置き換え、これにより希望するアミノ酸バリアントが得られる。
【００７６】
[92]  アミノ酸バリアントを作製するためのさらなる手法は、Wells et al., Gene 34:315 (1985)に記載されるカセット変異形成法、および当技術分野で周知である他の変異形成法、たとえばSambrook et al., 前掲、およびAusubel et al., 前掲中の手法である。
【００７７】
真核細胞
[93]  ある態様において、本発明は、真核細胞内に遺伝性の単細胞生物を含む真核細胞、および単細胞生物を宿主細胞に導入する方法を提供する。
【００７８】
[94]  ある態様において、真核細胞は植物細胞である。ある態様において、真核細胞は単子葉植物または双子葉植物の細胞であり、それにはトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コメ、ダイズ、ラッカセイ、エンドウマメ、レンズマメおよびアルファルファ、ワタ、ナタネ、カノラ(canola)、コショウ、ヒマワリ、バレイショ、タバコ、トマト、ナス、ユーカリ、樹木、観賞植物、多年草(perennial grass)、または飼料作物(forage crop)が含まれるが、これらに限定されない。他の態様において、真核細胞は藻類であり、クロレラ属(Chlorella)、クラミドモナス属(Chlamydomonas)、セネデスムス属(Scenedesmus)、イソクリシス属(Isochrysis)、ドゥナリエラ属(Dunaliella)、テトラセルミス属(Tetraselmis)、ナンノクロロプシス属(Nannochloropsis)、またはプロトテカ属(Prototheca)の藻類を含むが、これらに限定されない。ある態様において、真核細胞は真菌細胞であり、それにはサッカロミセス属(Saccharomyces)、クルイベロミセス属(Klyuveromyces)、カンジダ属(Candida)、ピチア属(Pichia)、デバロミセス属(Debaromyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ヤロウィア属(Yarrowia)、チゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)、またはシゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)の真菌が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
[95]  ある態様において、本発明の真核細胞は動物細胞である。ある態様において、真核細胞は哺乳動物、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヒト、ブタ、ウシまたはイヌのものである。マウスは他の哺乳動物のための、最も特別にはヒトのためのモデルとしてルーティンに機能する(参照：たとえば、Hanna, J. et al., “Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin,” Science 318:1920-1923 (2007); Holtzman, D.M. et al., “Expression of human apolipoprotein E reduces amyloid-β deposition in a mouse model of Alzheimer’s disease,” J Clin Invest. 103(6):R15-R21 (1999); Warren, R.S., et al., “Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis,” J Clin Invest. 95:1789-1797 (1995); それらのそれぞれをあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００８０】
[96]  ある態様において、真核細胞はヒト癌細胞である。当業者に周知である多数のヒト癌細胞系があり、それには一般的な上皮腫瘍細胞系、たとえばＣｏｃｏ−２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ７；ならびに非上皮腫瘍細胞系、たとえばＨＴ−１０８０およびＨＬ６０、ならびにＮＣＩ６０細胞系パネルが含まれる(参照：たとえば、Shoemaker, R., “The NCI60 human tumor cell line anticancer drug screen,” Nat Rev Cancer 6:813-823 (2006), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。さらに、当業者は初代ヒト腫瘍から癌細胞を得ることに精通している。
【００８１】
[97]  他の態様において、真核細胞は幹細胞である。当業者は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮神経堤幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、嗅覚成体幹細胞、および精巣細胞を含めた多様な幹細胞タイプに精通している。
【００８２】
[98]  ある態様において、真核細胞はヒト宿主の循環系中に見られる細胞である。たとえば、赤血球、血小板、形質細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞など、およびそれらの前駆細胞。まとめて、これらの細胞は本発明の循環性宿主細胞と定義される。本発明は、これらのいずれの循環細胞についても使用できる。ある態様において、真核宿主細胞はＴ細胞である。他の態様において、真核細胞はＢ細胞である。ある態様において、真核細胞は好中球である。ある態様において、真核細胞は巨大核細胞である。
【００８３】
[99]  他の態様において、真核細胞に由来する少なくとも１つの遺伝子を遺伝子変異させる。ある態様において、真核細胞の遺伝子修飾によって人工内部共生体と真核細胞の間に相互栄養依存性（生体栄養性）を樹立することができる；ターゲット宿主細胞タイプに特異的な当業者に既知の分子生物学的手法を用い、ある必須高分子について単細胞生物に対する真核細胞の依存性を形成し、こうして生体栄養性に対する環境負荷を樹立する。他の態様において、単細胞生物を遺伝子変異させてそれが種々の代謝産物、補因子、ビタミン、ヌクレオチド、または他の必須分子を合成する能力を排除することにより、真核細胞に対する単細胞生物の栄養依存性を樹立することができる。そのような態様において、必須分子を単細胞生物が供給することができる。他の態様において、アミノ酸生成のための３−ホスホグリセリン酸生合成経路の末端でセリンをグリシンに変換する酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする真核細胞遺伝子を修飾することができる。
【００８４】
単細胞生物を真核細胞に導入する方法
[100]  本発明の単細胞生物は、当業者に知られている多数の方法により真核細胞に導入することができ、それにはマイクロインジェクション、自然−食作用、誘導−食作用、マクロピノサイトーシス、他の細胞取込みプロセス、リポソーム融合、赤血球ゴースト融合、エレクトロポレーション、受容体仲介法などが含まれるが、これらに限定されない(参照：たとえば、Microinjection and Organelle Transplantation Techniques, Celis et al. Eds., Academic Press: New York, (1986), およびそれに引用された参考文献; あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００８５】
[101]  １態様において、単細胞生物を宿主細胞の細胞質中へのマイクロインジェクションにより宿主細胞に導入する。多様なマイクロインジェクション法が当業者に知られている。マイクロインジェクションは利用できる最も効率的な伝達法であり（本質的に１００％）、細胞タイプの制限がない(同著; Xi, Z. et al., “Characterization of Wolbachia transfection efficiency by using microinjection of embryonic cytoplasm and embryo homogenate,” Appl Environ Microbiol. 71(6):3199-3204 (2005); Goetz, M. et al., “Microinjection and growth of bacteria in the cytosol of mammalian host cells,” Proc Natl Acad. Sci. USA98:12221-12226 (2001); すべての刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００８６】
[102]  自然−食作用する細胞はＭＴＢを含めた細菌を取り込むことが示された(Burdette, D.L. et al., Vibrio VopQ induces PI3-kinase independent autophagy and antagonizes phagocytosis,” Mol Microbiol. 73:639 (2009); Wiedemann, A. et al., “Yersinia enterocolitica invasin triggers phagocytosis via β1 integrins, CDC42Hs and WASp in macrophages,” Cell Microbiol. 3:693 (2001); Hackam, D.J. et al., “Rho is required for the initiation of calcium signaling and phagocytosis by Fcγ receptors in macrophages,” J Exp Med. 186(6):955-966 (1997); Matsunaga, T. et al., “Phagocytosis of magnetite by leucocytes,” Appl Microbiol Biotechnol. 31(4):401-405 (1989); すべての刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００８７】
[103]  本方法は大規模化できるが、特定の細胞タイプ（たとえば、マクロファージ）に限定される可能性がある。しかし、最近の研究により、種々の因子：培地ならびに化学的因子および生物学的因子（たとえば、バキュロウイルス、タンパク質因子、遺伝子ノックインなど）と共に共培養すると細菌をエンドサイトーシスするように非−食細胞タイプを誘導できることが示された(たとえば、Salminen, M., et al., “Improvement in nuclear entry and transgene expression of baculoviruses by disintegration of microtubules in human hepatocytes,” J Virol. 79(5):2720-2728 (2005); Modalsli, K.R. et al., “Microinjection of HEp-2 cells with coxsackie B1 virus RNA enhances invasiveness of Shigella flexneri only after prestimulation with UV-inactivated virus,” APMIS 101:602-606 (1993); Hayward, R.D. et al., “Direct nucleation and bundling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella,” EMBO J. 18:4926-4934 (1999); Yoshida, S. et al., “Shigella deliver an effector protein to trigger host microtubule destabilization, which promotes Rac1 activity and efficient bacterial internalization,” EMBO J. 21:2923-2935 (2002); Bigildeev et al. J Exp Hematol. 39:187 (2011); Finlay, B.B. et al., Common themes in microbial pathogenicity revisited,” Microbiol Mol Biol Rev. 61:136-169 (1997); すべての刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００８８】
[104]  関連方法であるマクロピノサイトーシス(macropinocytosis)または“飲細胞(cell drinking)”は、細胞内侵入のために多数の細菌およびウイルスが使う方法である(Zhang (2004) : Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) (データベースオンライン); Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2004-2011; 両方の刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。細菌を取り込むように細胞を誘導するために使用できる種々のプロトコルがある。幾つかの作用物、たとえば核酸、タンパク質、薬物および細胞小器官がリポソームに封入されて細胞へ送達された(Ben-Haim, N. et al., “Cell-specific integration of artificial organelles based on functionalized polymer vesicles,” Nano Lett. 8(5):1368-1373 (2008); Lian, W. et al., “Intracellular delivery can be achieved by bombarding cells or tissues with accelerated molecules or bacteria without the need for carrier particles,” Exp Cell Res. 313(1):53-64 (2007); Heng, B.C. et al., “Immunoliposome-mediated delivery of neomycin phosphotransferase for the lineage-specific selection of differentiated/committed stem cell progenies: Potential advantages over transfection with marker genes, fluorescence-activated and magnetic affinity cell-sorting,” Med Hypotheses 65(2):334-336 (2005); Potrykus, Ciba Found Symp, Vol. 1 54:198 (1990); すべての刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。この方法は低価格であり、比較的単純で大規模化可能である。さらに、インキュベーション条件の操作、リポソーム装填量の変更、受容体仲介、および磁性増強により、リポソーム取込みを増強できる(参照：たとえば、Pan et al. Int J Pharm. 358:263 (2008); Sarbolouki, M.N. et al., “Storage stability of stabilized MLV and REV liposomes containing sodium methotrexate (aqueous & lyophilized),” J Pharm Sci Techno. 52(10):23-27 (1998); Elorza, B., et al., “Comparison of particle size and encapsulation parameters of three liposomal preparations,” J Microencapsul. 10(2):237-248 (1993); Mykhaylyk, O. et al., “Liposomal Magnetofection,” Methods Mol Bio. 605:487-525 (2010); すべての刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００８９】
[105]  赤血球仲介による伝達はリポソーム融合に類似し、試験したすべての細胞タイプにわたって高い効率および有効性をもつことが示された(Microinjection and Organelle Transplantation Techniques, Celis et al. Eds.; Academic Press: New York (1986), あらゆる目的で全体として援用する)。一般に、赤血球に浸透圧性ショック法またはエレクトロポレーション法により装填する(Schoen, P. et al., :Gene transfer mediated by fusion protein hemagglutinin reconstituted in cationic lipid vesicles,” Gene Ther. 6:823-832 (1999); Li, L.H. et al., “Electrofusion between heterogeneous-sized mammalian cells in a pellet: potential applications in drug delivery and hybridoma formation,” Biophys J. 71:479-486 (1996); Carruthers, A. et al., “A rapid method of reconstituting human erythrocyte sugar transport proteins,” Biochem. 23:2712-2718 (1984); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。あるいは、造血前駆細胞に単細胞生物を装填し、それらを誘導して単細胞生物を収容した赤血球に分化および拡張させることにより、赤血球に間接的に装填することができる。
【００９０】
[106]  エレクトロポレーションは、因子を細胞へ送達するための一般的に用いられる低価格の方法である(Potrykus, I., “Gene transfer methods for plants and cell cultures,” Ciba Found Symp. 154:198-208, discussion 208-12 (1990); Wolbank, S. et al., “Labeling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking,” Cell Tissue Bank 8:163-177 (2007); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００９１】
[107]  他の態様において、細菌を自然エンドサイトーシスする真核細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ））を用いる。１態様において、改変された単細胞細菌をＣＨＯ培養に直接添加する。ＭＴＢ感染前に、ＣＨＯ細胞を標準法により、たとえば１０％ウシ胎仔血清培地を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地中で培養する。感染後、培地にさらに鉄（４０〜８０μＭ）をリンゴ酸鉄またはＦｅＣｌ３のいずれかとして補充する。多数の他の細胞タイプが細菌をエンドサイトーシス、またはより具体的には食作用によりインターナリゼーションする；内部共生体または寄生体は細胞侵入のためにそれら自身の方法をもち、これらの自然プロセスを人工内部共生体のインターナリゼーションのために利用して、いわゆるシンビオソームを形成させることができる。他の態様において、マイクロインジェクション、細胞小器官移植、およびキメラ法を用いて、ある細胞に由来するシンビオソームを他の細胞タイプ（すなわち、人工内部共生体をエンドサイトーシスできないもの）へ移植することができる。これらの宿主細胞を一般的培地中においてその細胞タイプに特異的な手法で培養する。
【００９２】
[108]  １態様において、単細胞生物を宿主細胞へリポソーム仲介法により導入する。ＭＴＢより大きいミトコンドリアおよびクロロプラストが、リポソームに封入した場合に効率的に真核細胞に導入された(Bonnett, H. T. Planta 131:229 (1976); Giles, K. et al., “Liposome-mediated uptake of chloroplasts by plant protoplasts,” In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 16(7):581-584 (1980); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。多数のリポソーム融合のプロトコルおよび作用物を入手でき、それらを当業者が過度の実験なしに使用できる(参照：たとえば、Ben-Haim, N. et al., “Cell-specific integration of artificial organelles based on functionalized polymer vesicles,” Nano Lett. 8(5):1368-1373 (2008); Lian, W. et al., “Intracellular delivery can be achieved by bombarding cells or tissues with accelerated molecules or bacteria without the need for carrier particles,” Exp Cell Res. 313(1):53-64 (2007); Heng, B.C. et al., “Immunoliposome-mediated delivery of neomycin phosphotransferase for the lineage-specific selection of differentiated/committed stem cell progenies: Potential advantages over transfection with marker genes, fluorescence-activated and magnetic affinity cell-sorting,” Med Hypotheses 65(2):334-336 (2005); Potrykus, Ciba Found Symp, 1(54):198 (1990); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【００９３】
単細胞生物を含む真核細胞の使用方法
[109]  他の観点において、本発明は、本発明の単細胞生物により真核細胞に導入された表現型を使用する方法を提供する。ある態様において、使用する表現型は他の場合にはその真核細胞に存在しない遺伝性機能である。ある態様において、磁性表現型を備えた真核細胞は磁気操作できる。
【００９４】
[110]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は、磁気による検出またはイメージング法を用いて検出およびモニターできる；たとえば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、磁性粒子イメージング（ＭＰＩ）、磁気緩和スイッチング(magnetic relaxation switching)（ＭＲＳ）、磁気共鳴、超伝導量子干渉(superconducting quantum interference)（ＳＱＵＩＤ）、磁力計、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、メスバウアー分光計(Mossbauer spectrometer)、電子常磁性共鳴(electron paramagnetic resonance)（ＥＰＲ）、および磁気円二色性(magnetic circular dichroism)。ＭＲＩは、非侵襲性であり、光学的不透過性対象（マウス、ヒト、および他の哺乳動物を含む）の内部を見ることができ、空間解像度が低くかつ透過深度が制限される傾向をもつ非磁気イメージング（たとえば、光学プローブ）と比較して妥当な程度に高い空間解像度で軟組織間のコントラストを提供するので、広く用いられている臨床診断ツールである。ＭＰＩはＭＲＩと同様に非侵襲性の診断方法である；しかし、それは超常磁性酸化鉄ナノ粒子により発生する磁場を特異的に検出し、きわめて低いバックグラウンドをもつイメージを生じる。一般的ＭＲＩはほぼ例外なく解剖学の視覚化に焦点を当て、いずれか特定の細胞タイプに対する特異性をもたない。一般的ＭＲＩにより用いられる‘プローブ’は、広く存在する運動性水分子中のプロトン１Ｈである。細胞タイプ特異性を得るために造影剤を使用できるが、造影剤は希薄になり、あるいは毒性問題をもち、短期試験に使用できるにすぎない。本発明のある態様は、生きた対象における長期試験のための細胞特異性なＭＲＩ、ＭＰＩまたは他の磁気検出イメージングを容易にする。
【００９５】
[111]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は哺乳動物癌細胞であり、それにはヒト癌細胞系、たとえばヒト癌細胞系ＮＣＩ  ６０；マウス癌細胞系；およびイヌ癌細胞系が含まれる。これらの磁性癌細胞を免疫無防備状態の哺乳動物、たとえばマウスに注射し、次いで磁気イメージングでモニターして腫瘍進行を経時的に追跡することができる。ある態様において、腫瘍進行をリアルタイムで追跡している期間中に、免疫無防備状態の哺乳動物に抗癌処置または想定処置を施すことができる。ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞の生存性をＭＲＩ、ＭＰＩまたは他の磁気検出手段によりモニターして、薬物処置を含めた種々の条件に対するインビボ細胞応答を査定する。
【００９６】
[112]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は転移性癌細胞であり、注射を含めた方法によりそれらを実験動物に導入する。次いでＭＲＩ、ＭＰＩまたは他の磁気検出を用いて実験動物の全身における転移性癌細胞の転移および移動のプロセスをモニターすることができる。ある態様において、本発明の磁性真核癌細胞を腫瘍保有動物、たとえばマウスに注射し、ＭＲＩ、ＭＰＩまたは他の磁気検出を用いて哺乳動物の全身を循環している転移性細胞を追跡することができる。
【００９７】
[113]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞はマクロファージであり、実験動物に注射される。磁気イメージングを用いて動物の体内におけるマクロファージの何らかの凝集を検出する。マクロファージは、転移を含む悪性病変により引き起こされた可能性がある炎症の部位に凝集する。
【００９８】
[114]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は、ヒト、マウス、ラットおよびブタを含めた哺乳動物種（ただし、これらに限定されない）から得られたＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、または成体幹細胞を含めた幹細胞であり、あるいはそれらの幹細胞から誘導された。幹細胞をターゲット生物に直接導入するか、あるいはまずインビトロで分化させ、次いでターゲット生物に導入することができる。導入した細胞の存在位置、増殖速度および生存性を含めたインビボ動態(fate)を磁気イメージングによりアッセイすることができる。
【００９９】
[115]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は療法用Ｔ細胞である。療法用Ｔ細胞をターゲット生物に直接導入し、導入した細胞の存在位置、増殖速度および生存性を含めたインビボ動態を磁気イメージングによりアッセイすることができる。
【０１００】
[116]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は造血幹細胞または前駆細胞であり、それらを次いで哺乳動物に導入する。造血幹細胞または前駆細胞を哺乳動物に導入すると、これらの細胞は骨髄に滞在するであろう。種々の刺激を受けた際の磁性造血幹細胞または前駆細胞の存在位置、増殖、および血流中への移動を含めたそれらの挙動を磁気イメージングによりモニターすることができる。
【０１０１】
[117]  ある態様において、磁性−人工内部共生体は、それらが滞在する幹細胞性宿主細胞より低速で分裂する。経時的に、より分化した前駆細胞より一般に低速で分裂する幹細胞は、より分化した前駆細胞より長時間、磁性表現型を保持し、これら２タイプの細胞は磁気イメージングした際に測定可能なほど異なるようになるであろう。ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞を希望する細胞タイプの真核細胞系に融合させて、キメラ細胞を作製する。キメラ細胞を動物に導入して磁気イメージングにより追跡することができる。
【０１０２】
[118]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は胚細胞である。ある態様において、胚細胞は妊娠した動物、たとえばマウスまたはラットの卵子である。ある態様において、胚を雌動物に移植し、発生させると、単細胞生物を全身に含む動物が産まれる。産まれた生物から磁性組織を採取し、それらから磁性細胞系を得ることができる。ある態様において、これらの動物を交配し、その磁性表現型を母系遺伝させる。ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞を多細胞胚に導入する。胚の発生に伴って磁性細胞の細胞系統を磁気イメージングにより追跡することができる。ある態様において、人工内部共生体は成体動物に保持されていないが、発生の初期にそれらが存在したことにより、この動物の免疫系は、人工内部共生体、または人工内部共生体を含む宿主細胞を異物とは認識しない。
【０１０３】
[119]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は、真核細胞を磁気誘引することにより運動する。ある態様において、この運動は外部発生させた磁場および磁場勾配を用いて達成される。磁気ターゲティングのための種々のデバイス、たとえば下記に記載のものがレポートされた；U.S. Patent No. 8,159,224、およびRiegler J. et al., “Superparamagnetic iron oxide nanoparticle targeting of MSCs in vascular injury,” Biomaterials 34(8):1987-94 (2013)。ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は、磁石を用いて磁性細胞を誘引することにより非磁性細胞のヘテロロガス集団からインビトロまたはインビボで分離される（生物に導入された後）。
【０１０４】
[120]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞を、ターゲット生物の血流または他の体液に導入する。その生物の目的領域に隣接して配置した磁石により真核細胞をこの領域へ指向させ、そこに局在化させることができる。ある態様において、真核細胞は幹細胞であってもよく、それらを哺乳動物の身体のある領域へ指向させて保持し、そこでそれらは療法効果をもつことができる。ある態様において、真核細胞は免疫細胞であってもよく、それらを腫瘍または傷害部位を含めた哺乳動物の身体の特定位置へ指向させることができる。ある態様において、真核細胞に療法薬を装填し、希望する領域へ磁気誘引した後にそれを放出させることができる。
【０１０５】
[121]  ある態様において、マグネチックハイパーサーミア法(Magnetic Hyperthermia Technique)（ＭＨＴ）と呼ばれる手法のために、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞を交番磁場または交流磁場(alternating magnetic field、alternative magnetic field)（ＡＭＦと呼ぶ）に置く。ＡＭＦおよびＭＨＴは、U.S. Publication No. US20120302819 (U.S. Application No. 13/510,416); およびSilva A.C. et al., “Application of hyperthermia induced by superparamagnetic iron oxide nanoparticles in glioma treatment,” Int J Nanomedicine 6:591-603 (2011)に記載されている; それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。ハイパーサーミアは、細胞構造体の機能性を変化させるために身体組織の温度上昇を促進する療法である。それの活性は、温度上昇は細胞溶解および細胞死を含めた細胞損傷を誘発することができるという事実に基づく。ある態様において、本発明の真核細胞に交番磁場を１、５、１０、２０、３０、４０、５０または６０分間施す。ある態様において、印加するＡＭＦの磁場周波数は５０ｋＨｚ〜１ＭＨｚである。ある態様において、印加するＡＭＦの磁場振幅は１００ｍＴ未満に留まる。ある態様において、ＭＨＴを施す本発明の真核細胞は腫瘍細胞であり、それらは突然の温度上昇に対して正常な周囲細胞より耐容性が低い。ある態様において、本発明の真核細胞は腫瘍細胞であるか、あるいは腫瘍細胞に隣接し、腫瘍の内部温度が４３℃〜４７℃に達するまで交番磁場を施される。
【０１０６】
[122]  ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞を回転磁場に置き、細胞内の単細胞生物の回転、および細胞死を含めた細胞損傷を生じさせる。ある態様において、全細胞集団に交番磁場または回転磁場を施すことにより、非磁性細胞のヘテロロガス集団内の磁性表現型を備えた本発明の真核細胞に選択的に損傷を与える。ある態様において、非磁性細胞のヘテロロガス集団内の磁性表現型を備えた本発明の真核細胞を交番磁場または回転磁場に置き、本発明の真核細胞と本発明の真核細胞の近くにある非磁性細胞の両方に損傷を生じさせる。ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞を動物に導入し、磁気操作または当技術分野で既知である他の形の細胞ターゲティングによりその動物内のある位置へターゲティングさせる。次いで動物内のその位置に交番磁場または回転磁場を施して、磁性細胞の周囲の細胞に損傷を生じさせることができる。ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞を動物に導入し、磁気操作または当技術分野で既知である他の形の細胞ターゲティングによりその動物内の腫瘍部位へターゲティングさせる。その腫瘍に交番磁場または回転磁場を施して、磁性細胞の周囲の腫瘍細胞に損傷を生じさせることができる。ある態様において、磁性表現型を備えた本発明の真核細胞は幹細胞であり、それにはヒト、マウス、ラットおよびブタを含めた（ただし、これらに限定されない）哺乳動物種から得られたＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、または成体幹細胞が含まれる。幹細胞をターゲット生物に直接導入するか、あるいはまずインビトロで分化させ、次いでターゲット生物に導入することができる。導入後、動物に交番磁場または回転磁場を施して、導入した幹細胞およびこれらの幹細胞から生じた系統を死滅させることができる。導入した細胞の存在位置、増殖速度および生存性を含めたインビボ動態を磁気イメージングによりアッセイすることができる。
【０１０７】
マルチモーダル検出
[123]  他の観点において、本発明は、単細胞生物で、たとえば人工内部共生体で工学操作した、真核細胞に関する。単細胞生物は少なくとも１つの希望する表現型を真核細胞に付与することができる。ある態様において、単細胞生物は、ポリペプチド（単数または複数）、核酸（単数または複数）、脂質（単数または複数）、炭水化物（単数または複数）、アミノ酸（単数または複数）、または他の因子（単数または複数）を宿主細胞へ分泌し、および／または宿主細胞から輸送することができる。単細胞生物と宿主細胞の間のこのコミュニケーションにより、真核細胞に対して希望する表現型または複数の表現型を生じさせることができる。そのような希望する表現型または希望する複数の表現型により、真核細胞のマルチモーダル検出または観察を可能にすることができる。よって、ある態様において、単細胞生物は真核細胞のマルチモーダル検出または観察のためのマルチモーダルプローブとして使用できる。
【０１０８】
[124]  ある態様において、マルチモーダルプローブは、マルチモーダル検出のための１以上のレポーターを発現する磁性細菌を含む。ある態様において、磁性細菌はマルチモーダル検出のための１以上のレポーターを発現する走磁性細菌を含む。ある態様において、マルチモーダルプローブとして用いるために、レポータータンパク質をコードするヘテロロガス遺伝子を磁性細菌に導入し、それによりその遺伝子修飾された磁性細菌はそのレポーターを発現する。ある態様において、磁性細菌は単一レポーターを発現するように工学操作される。ある態様において、マルチモーダル検出のために、それぞれ異なるレポーターを発現する異なる磁性細菌を真核細胞に導入する。ある態様において、たとえば２以上のレポーターをコードする単一のベクター構築体の使用により、磁性細菌は２以上のレポーター生成物を発現するように工学操作される。ある態様において、レポーターはヘテロロガスレポーターを含み、検出のために機能性の形態で発現する。レポーター遺伝子の発現により、磁性細菌の磁性表現型に加えて追加のイメージングモダリティーが提供される。
【０１０９】
[125]  たとえば、本開示は、走磁性細菌株マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)（ＡＭＢ−１）を用いる２モダリティーのために有効なレポーター遺伝子発現を示す。レポーター遺伝子を発現するためのある態様において、レポーター遺伝子および適切な耐性遺伝子（たとえば、抗生物質耐性を付与するもの）を含むプラスミドを大腸菌(Escherichia coli)細胞に導入し、その大腸菌細胞をターゲットである走磁性細菌細胞と交配させ、次いで走磁性細菌について選択を実施する。次いで形質転換した走磁性細菌について適切なアッセイを実施して、そのレポーターの存在および陽性発現を確認することができる。ある態様において、取込みについてレポーター遺伝子を選択する際、それが依然として原核細胞の転写および翻訳の機構を使って機能性形態で発現できることを確認することに注意を払う。これらの改変された細菌は磁性表現型およびレポーター遺伝子の表現型をもち、それにより、遺伝子修飾された走磁性細菌を保有する真核細胞のマルチモーダル検出が可能になる。追加のレポーター遺伝子の導入および発現は、異なるイメージングモダリティーを用いて各レポーター遺伝子を検出できる限り、追加のイメージング可能性を提供する。
【０１１０】
[126]  ある態様において、遺伝子修飾された磁性細菌のマグネトソームは、ＭＲＩシステム、磁性粒子イメージング（ＭＰＩ）システム、磁気緩和スイッチング（ＭＲＳ）システム、磁気共鳴分光計、超伝導量子干渉デバイス（ＳＱＵＩＤ）、磁力計、核磁気共鳴（ＮＭＲ）システム、メスバウアー分光計、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）システム、および磁気円二色性システムを用いて検出できる。レポーター遺伝子の生成物は、そのレポーター遺伝子から発現するレポーター生成物のタイプに応じて、いずれか適切な検出法および検出装置により検出できる。たとえば、代表的レポーター遺伝子は発光タンパク質（たとえば、ルシフェラーゼまたはｅＧＦＰ）をコードし、この表現型を光学イメージングにより検出でき、それは非侵襲的に（ＢＬＩおよびＦＬＩについて）、またはある程度の侵襲性で、たとえば生体顕微鏡検査および蛍光腹腔鏡検査で、実施できる(参照：たとえば、Gahlen, J. et al., “Laparoscopic fluorescence diagnosis for intraabdominal fluorescence targeting of peritoneal carcinosis,” Ann Surg. 235:252-260 (2002), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。本明細書中の記載において、レポーターの発現は、コードされたレポーターまたはレポーター分子の発現をもたらす対応するレポーター遺伝子の発現を含むものとする。
【０１１１】
[127]  ある態様において、マルチモーダルプローブは、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、単一光子放射コンピューター断層撮影(single photon emission computed tomography)（ＳＰＥＣＴ）レポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターから選択される１以上のレポーターを発現する磁性（たとえば、走磁性）細菌細胞を含む。
【０１１２】
[128]  ある態様において、マルチモーダルプローブは、前記レポーターのほかに、さらに蛍光レポーターまたは生物発光レポーターを発現する。ある態様において、マルチモーダルプローブは、前記レポーターのほかに、さらに蛍光レポーターおよび生物発光レポーターを発現する。
【０１１３】
[129]  ある態様において、マルチモーダルプローブは少なくとも陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーターを発現する。種々のＰＥＴレポーターを発現させて、マルチモーダルプローブに使用することができる。ある態様において、ＰＥＴレポーターはチミジンキナーゼを含む。ある態様において、チミジンキナーゼは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ、水痘−帯状疱疹ウイルス−チミジンキナーゼ、ヒト−ミトコンドリアチミジンキナーゼ、またはその活性バリアントから選択される(参照：たとえば、Campbell et al., J Biol Chem. 287(1):446-54 (2012))。チミジンキナーゼのＰＥＴ検出は、一般にＰＥＴ特異的レポータープローブを用いて達成される。ＨＳＶチミジンキナーゼのための代表的なＰＥＴレポータープローブには［１８Ｆ］９−（４−［１８Ｆ］−フルオロ−３−ヒドロキシメチルブチル）−グアニン、すなわちフッ素−１８標識したペンシクロビル(penciclovir)アナログが含まれ、それはチミジンキナーゼ（ＴＫ）によりリン酸化されると細胞内に保持された状態になる。他のチミジンキナーゼレポータープローブは５−（７６）Ｂｒ−ブロモ−２’−フルオロ−２’−デオキシウリジンである。ある態様において、いずれの内因性チミジンキナーゼと比較しても優先的にヘテロロガス−チミジンキナーゼの作用を受けるチミジンキナーゼレポータープローブを用いる。
【０１１４】
[130]  マルチモーダルプローブに使用できる他のＰＥＴレポーターには、とりわけ、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、ヨウ化ナトリウムトランスポーター（ＮＩＳ）、デオキシシチジンキナーゼ、ソマトスタチン受容体サブタイプ２、ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）、カンナボイド受容体、グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）、チロシナーゼ、およびその活性バリアントが含まれる。各ＰＥＴレポーターのための関連レポータープローブは当業者に周知である。ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体のための代表的レポータープローブは、３−（２’−［１８Ｆ］フルオロエチル）スピペロン（ＦＥＳＰ）である(MacLaren et al., Gene Ther. 6(5):785-91 (1999))。ヨウ化ナトリウムトランスポーターのための代表的レポータープローブは１２４Ｉであり、それはトランスポーターによる輸送の後、細胞内に保持される。デオキシシチジンキナーゼのための代表的レポータープローブは、２’−デオキシ−２’−１８Ｆ−５−エチル−１−β−ｄ−アラビノフラノシルウラシル（１８Ｆ−ＦＥＡＵ）である。ソマトスタチン受容体サブタイプ２のための代表的レポータープローブは、１１Ｉｎ−、９９ｍ／９４ｍＴｃ−、９０Ｙ−、または１７７Ｌｕ−標識したオクトレオチド(octreotide)アナログ、たとえば９０Ｙ−、または１７７Ｌｕ−標識したＤＯＴＡＴＯＣ(Zhang et al., J Nucl Med. 50(suppl 2):323 (2009))；６８Ｇａ−ＤＯＴＡＴＡＴＥ；および１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡＢＡＳＳ(参照：たとえば、Brader et al., J Nucl Med. 54(2):167-172 (2013), 本明細書に援用する)である。ノルエピネフリントランスポーターのための代表的レポータープローブは、１１Ｃ−ｍ−ヒドロキシエフェドリンである(Buursma et al., J Nucl Med. 46:2068-2075 (2005))。カンナボイド受容体のための代表的レポータープローブは、１１Ｃ−標識したＣＢ２リガンドである１１Ｃ−ＧＷ４０５８３３(Vandeputte et al., J Nucl Med. 52(7):1102-1109 (2011))である。グルコーストランスポーターのための代表的レポータープローブは、［１８Ｆ］フルオロ−２−デオキシ−ｄ−グルコース(Herschman, H.R., Crit Rev Oncology/Hematology 51:191-204 (2004))である。チロシナーゼのための代表的レポータープローブは、Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−１８Ｆ−５−フルオロピコリンアミド(Qin et al., Sci Rep. 3:1490 (2013))である。他のレポータープローブは、たとえばYaghoubi et al., Theranostics 2(4):374-391 (2012)に記載されており、これを 本明細書に援用する。
【０１１５】
[131]  ある態様において、マルチモーダルプローブは少なくとも単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポーターを発現する。代表的なＳＰＥＣＴレポーターには、ヨウ化ナトリウムトランスポーター、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、およびその活性バリアントが含まれる。ある態様において、ＳＰＥＣＴレポーターはＳＰＥＣＴ検出可能なシクロアルカン基質を共有結合することができる修飾ハロアルカンデハロゲナーゼを含む(参照：たとえば、Hong et al., Am J Transl Res. 5(3):291-302 (2013), 本明細書に援用する)。
【０１１６】
[132]  ある態様において、マルチモーダルプローブは少なくとも光音響レポーターを発現する。代表的な光音響レポーターには、とりわけ、チロシナーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが含まれる(参照：たとえば、Krumholz et al., J Biomed Optics. 16(8):1-3 (2011))。チロシナーゼのためのレポータープローブは前記に述べてある。β−ガラクトシダーゼのための代表的レポータープローブは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）である(Li et al., J Biomed Opt. 12(2): 020504 (2007))。
【０１１７】
[133]  ある態様において、マルチモーダルプローブは少なくともＸ線レポーターを発現する。代表的なＸ線レポーターには、とりわけ、ソマトスタチン受容体 2、または他のタイプの受容体ベースの結合剤が含まれる。レポータープローブはレポータープローブに結合した放射線不透過性標識部分をもつことができ、たとえばＸ線またはコンピューター断層撮影によりイメージングされる。代表的な放射線不透過性標識はヨウ素、特にポリヨウ素化された化学基(参照：たとえば、U.S. Patent No. 5,141,739)、および常磁性標識（たとえば、ガドリニウム）であり、それらを一般的手段でレポータープローブに付着させることができる。
【０１１８】
[134]  ある態様において、マルチモーダルプローブは少なくとも超音波レポーターを発現する。代表的な超音波レポーターには、とりわけ、超音波造影剤、たとえばマイクロバブル造影剤を結合できる結合剤が含まれる。たとえば、結合剤は走磁性細菌内で発現してあるペプチドを特異的に指向する抗体を含むことができ、そのペプチドはマイクロバブル造影剤に結合している(参照：たとえば、Kiessling et al., J Nucl. Med. 53:345-348 (2012))。
【０１１９】
[135]  レポーターが蛍光レポーターである本発明の態様において、任意数の蛍光レポーターを使用できる。これらには、たとえばオワンクラゲ(Aequorea victoria)またはウミシイタケ(Renilla reniformis)に由来する緑色蛍光タンパク質、およびその活性バリアント（たとえば、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質など）；ヒドロ虫綱(Hydroid)クラゲ、カイアシ類(Copepod)、有櫛板動物(Ctenophora)、花虫綱（サンゴ虫綱）(Anthrozoas)、およびサンゴイソギンチャク(Entacmaea quadricolor)に由来する蛍光タンパク質、ならびにその活性バリアント；ならびにフィコビリタンパク質(phycobiliprotein)、およびその活性バリアントが含まれる。
【０１２０】
[136]  レポーターが生物発光レポーターである本発明のある態様において、任意数の生物発光レポーターをレポーターとして使用できる。これには、たとえば、限定ではなくエクオリン(aequorin)（および他のＣａ＋２調節−発光タンパク質）、ルシフェリン基質をベースとするルシフェラーゼ、セレンテラジン(Coelenterazine)基質をベースとするルシフェラーゼ（たとえば、ウミシイタケ属(Renilla)、ガウシア属(Gaussia)、メトリディナ属(Metridina))、およびシュプリジナ属(Cypridina)由来のルシフェラーゼ、ならびにその活性バリアントが含まれる。
【０１２１】
[137]  ある態様において、マルチモーダルプローブは、蛍光レポーター、生物発光レポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターから選択される少なくとも２種類もしくはそれ以上のレポーター、少なくとも３種類もしくはそれ以上のレポーター、少なくとも４種類もしくはそれ以上のレポーター、または少なくとも５種類もしくはそれ以上のレポーターを発現する。
【０１２２】
[138]  ある態様において、マルチモーダルプローブは、蛍光レポーター、生物発光レポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターから選択される少なくとも２種類のレポーターを発現する。
【０１２３】
[139]  ある態様において、マルチモーダルプローブは、蛍光レポーター、生物発光レポーター、ＰＥＴレポーター、ＳＰＥＣＴレポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターから選択される少なくとも３種類のレポーターを発現する。
【０１２４】
[140]  ある態様において、マルチモーダルプローブのためのレポーター遺伝子は、多重イメージングモダリティーにより検出できるレポーター、たとえば、光音響イメージング（ＰＡＩ）、ＭＲＩおよびＰＥＴ（適切なラジオトレーサーを用いる）信号を発生することが示されたチロシナーゼをコードする(参照：たとえば、Qin, C. et al., “Tyrosinase as a multifunctional reporter gene for photoacoustic/MRI/PET triple modality molecular imaging,” Scientific Rep. 3:1490 (2013), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。あるいは、レポーター遺伝子は、互いに連結した２以上のレポーターを含む融合タンパク質（たとえば、ルシフェラーゼ−ＧＦＰ−チミジンキナーゼ三重融合レポーター）であってもよい(Ray P. et al., “Imaging tri-fusion multimodality reported gene expression in living subjects,” Cancer Res. 64:1323-1330 (2004), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。ある態様において、レポーターはそれぞれ異なるレポーターを含み、各レポーターは異なるイメージングモダリティーにより検出できる。
【０１２５】
[141]  ある態様において、ヘテロロガスレポーターを発現する遺伝子は、たとえば自己複製するプラスミド、コスミド(cosmid)またはバクミド(bacmid)の一部として染色体外にあってもよい。ある態様において、レポーターを発現する遺伝子を、たとえば相同組換え、またはリコンビナーゼ、たとえばＣｒｅ−ｌｏｘＰ、Ｄｒｅ−ｒｏｘ、酵母フリッパーゼ(flippase)（ＦＬＰ）により仲介される組込み、およびａｔｔＴｎ７ベースの組込みによって、細菌染色体に組み込むことができる(Choi et al., Appl Environ Microbiol. 72(1):753-758 (2008))。ある態様において、レポーター遺伝子は他のタンパク質に融合していない機能性レポーターを発現するように構築される。ある態様において、レポーター遺伝子は、融合体、すなわち他のヘテロロガスタンパク質またはその走磁性細菌のタンパク質への融合体として機能性レポーターを発現するように構築される。
【０１２６】
[142]  ある態様において、遺伝子修飾された磁性細菌を真核細胞へマルチモーダル検出のために導入する。真核細胞の内部に入ると、遺伝子修飾された磁性細菌は自己複製する能力をもち、よって細胞分裂事象の後ですらそれらのレベルを維持し、これによりそれらは長期間の細胞追跡および他のイメージング可能性のための強力なツールになる。走磁性細菌のマグネタイトベースの鉄コアは、強力なインビボＭＲＩ信号を発生することができる。さらに、遺伝子修飾された磁性細菌は、真核細胞に取り込まれる前に、たとえば遺伝子修飾された磁性細菌の、および遺伝子修飾された磁性細菌で標識された細胞のマルチモーダルイメージングによるイメージングを可能にするレポーター遺伝子を追加することにより、追加の機能性をもつことができる。マルチモーダルプローブを含む真核細胞には、植物細胞および動物細胞を含めた前記細胞のいずれかを含めることができる。ある態様において、マルチモーダルプローブを含む真核細胞は哺乳動物細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞にはマウス（ネズミ）、ラット、ウサギ、ハムスター、ヒト、ブタ、ウシ、またはイヌの細胞を含めることができる。ある態様において、哺乳動物細胞は癌細胞または幹細胞であり、それには本開示に記載する特定の癌細胞、幹細胞、および胚細胞が含まれる。
【０１２７】
[143]  したがって、ある態様において、真核細胞は膜に内包されたマグネトソームおよび少なくとも１種類の発現したレポーターを含むことができる。ある態様において、真核細胞は磁性細菌を含むことができ、その細菌は１種類以上のレポーターを発現できるかまたは発現する。ある態様において、真核細胞は走磁性細菌を含むことができ、その細菌は１種類以上のレポーターを発現できるかまたは発現する。ある態様において、レポーターは下記のものから選択される：本明細書に記載する蛍光レポーター、生物発光レポーター、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーター。
【０１２８】
[144]  ある態様において、真核細胞は磁性細菌を含み、その細菌は少なくとも２種類またはそれ以上のレポーターを発現する。ある態様において、２種類以上のレポーターは蛍光レポーター、生物発光レポーター、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターから選択される。
【０１２９】
[145]  ある態様において、真核細胞は磁性細菌を含み、その細菌は少なくとも３種類またはそれ以上のレポーターを発現する。ある態様において、３種類以上のレポーターは蛍光レポーター、生物発光レポーター、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターから選択される。
【０１３０】
[146]  ある態様において、真核細胞は磁性細菌を含み、その細菌は下記のものから選択される少なくとも１種類のレポーターを発現する：陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーター。ある態様において、上記レポーターのうち１種類以上を発現する走磁性細菌は、蛍光レポーター、生物発光レポーター、または蛍光レポーターと生物発光レポーターの両方をも発現することができる。
【０１３１】
[147]  ある態様において、真核細胞は単細胞生物を含み、その際、真核細胞は多重イメージングモダリティーにより検出できる。イメージングモダリティーは超音波イメージング、コンピューター断層撮影イメージング、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、光干渉断層撮影イメージング、ラジオグラフィーイメージング、核医学イメージング、ポジトロン放射断層撮影イメージング、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、サーマルイメージング、蛍光透視イメージング、生物発光イメージング、および蛍光イメージング、磁性粒子イメージング、ならびに磁気共鳴分光法から選択できる。ある態様において、真核細胞は前記イメージングモダリティーのうち少なくとも２もしくはそれ以上、３以上、４以上、または５以上により検出できる。
【０１３２】
[148]  ある態様において、真核細胞は多重モダリティーにより検出でき、その際、少なくとも１つのモダリティーは磁気共鳴イメージングである。すなわち、真核細胞は第１モダリティーにより検出でき、その際、第１モダリティーは磁気共鳴イメージングである。ある態様において、真核細胞は超音波イメージング、コンピューター断層撮影イメージング、光学イメージング、光干渉断層撮影イメージング、ラジオグラフィーイメージング、核医学イメージング、ポジトロン放射断層撮影イメージング、単一光子放射コンピューター断層撮影、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、サーマルイメージング、蛍光透視イメージング、生物発光イメージング、および蛍光イメージング、磁性粒子イメージング、ならびに磁気共鳴分光法から選択される第２モダリティーにより検出できる。
【０１３３】
[149]  ある態様において、真核細胞は多重モダリティーにより検出でき、その際、少なくとも１つのモダリティーは磁性粒子イメージングである。言い換えると、真核細胞は第１モダリティーにより検出でき、その際、第１モダリティーは磁性粒子イメージングである。ある態様において、真核細胞は超音波イメージング、コンピューター断層撮影イメージング、光学イメージング、光干渉断層撮影イメージング、ラジオグラフィーイメージング、核医学イメージング、ポジトロン放射断層撮影イメージング、単一光子放射コンピューター断層撮影、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、サーマルイメージング、蛍光透視イメージング、生物発光イメージング、蛍光イメージング、および磁気共鳴分光法から選択される第２モダリティーにより検出できる。
【０１３４】
[150]  ある態様において、真核細胞を磁気共鳴イメージングまたは磁性粒子イメージングにより検出できる場合、第２モダリティーは蛍光イメージングである。ある態様において、第２モダリティーは生物発光イメージングである。ある態様において、第２モダリティーはＰＥＴイメージングである。ある態様において、第２モダリティーは光音響イメージングである。ある態様において、第２モダリティーはＸ線イメージングである。ある態様において、第２モダリティーは超音波イメージングである。ある態様において、真核細胞は第３モダリティー、第４モダリティー、第５モダリティー、第６モダリティーまたはそれ以上のモダリティーにより検出でき、その際、各モダリティーは異なる。
【０１３５】
[151]  １種類以上のレポーター遺伝子を発現する磁性細菌の使用はフレキシビリティーをもたらすが、ある態様において、真核細胞自体が１種類以上のレポーターを発現することもできる。特に、真核細胞は磁性細菌を含み、その真核細胞が１種類以上のレポーターを発現する。磁性細菌を含む真核細胞において、本明細書に記載したいずれかのレポーターを発現させることができる。ある態様において、真核細胞は、蛍光レポーター、生物発光レポーター、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターから選択されるレポーターを発現できる。
【０１３６】
[152]  走磁性細菌を含む真核細胞のある態様において、真核細胞が１種類以上のレポーターを発現することができ、かつ走磁性細菌が１種類以上のレポーターを発現することができる。ある態様において、真核細胞により発現される一組のレポーターは磁性細菌により発現される一組のレポーターと異なる。ある態様において、真核細胞と走磁性細菌による異なるレポーターの発現は、走磁性細菌を収容した真核細胞から真核細胞を識別する方法を提供する。
【０１３７】
[153]  本発明の態様において、マルチモーダルプローブを用いて、マルチモーダルプローブを含むいずれかの細胞、組織または臓器をイメージングすることができる。特に、マルチモーダルプローブを真核細胞に、たとえば人工内部共生体として導入し、その真核細胞を本明細書に記載するいずれかの方法によりイメージングすることができる。マルチモーダルプローブを含む真核細胞を、単離した状態で、または組織もしくは臓器の一部として、イメージングすることができる。
【０１３８】
[154]  したがって、ある態様において、下記を含むマルチモーダルイメージング方法に組成物を使用できる：（ａ）１種類以上のヘテロロガスレポーターを発現している走磁性細菌を磁気イメージングする、および（ｂ）非磁気イメージングモダリティーを用いてレポーターをイメージングする。
【０１３９】
[155]  ある態様において、マルチモーダルイメージング方法は下記を含むことができる：（ａ）走磁性細菌を含む真核細胞を磁気イメージングする、および（ｂ）少なくとも１つの非磁気イメージングモダリティーを用いて、１種類以上の発現したレポーターのイメージングにより真核細胞をイメージングする。本開示に記載するいずれかのレポーターをこれらのイメージング方法に使用できる。これらには、蛍光レポーター、生物発光レポーター、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポーター、Ｘ線レポーター、光音響レポーター、および超音波レポーターから選択されるレポーターが含まれる。
【０１４０】
[156]  ある態様において、真核細胞は、磁気イメージング、たとえば磁気共鳴イメージングまたは磁性粒子イメージング、および適宜な光学イメージング法を用いて、マルチモーダルに検出できる。ある態様において、光学イメージング法は、蛍光レポーター、たとえば緑色蛍光タンパク質またはその活性バリアントの発現に基づく。
【０１４１】
[157]  ある態様において、真核細胞は、磁気イメージング、たとえば磁気共鳴イメージングまたは磁性粒子イメージング、および適宜なＰＥＴイメージング法を用いて、マルチモーダルに検出できる。ある態様において、ＰＥＴイメージング法は、ＰＥＴレポーター、たとえばチミジンキナーゼまたはシチジンキナーゼの発現に基づく。この態様において、真核細胞は、ＭＲＩおよびＰＥＴイメージングを用いてマルチモーダルに検出できる。
【０１４２】
[158]  ある態様において、真核細胞は、磁気イメージング、たとえば磁気共鳴イメージングまたは磁性粒子イメージング、および適宜な光音響イメージング法を用いて、マルチモーダルに検出できる。ある態様において、光音響イメージング法は、光音響レポーター、たとえばチロシナーゼまたはβ−ガラクトシダーゼの発現に基づく。この態様において、真核細胞は、ＭＲＩおよび光音響イメージングを用いてマルチモーダルに検出できる。
【０１４３】
[159]  本明細書中で考察するように、マルチモーダルなプローブおよびイメージング法を用いて真核細胞をイメージングすることができ、それには組織または多細胞生物の一部である真核細胞が含まれる。ある態様において、組織または多細胞生物をイメージングするためのマルチモーダルイメージング方法は下記を含む：（ａ）走磁性細菌を含む真核細胞を第１イメージングモダリティーによりイメージングする；その際、真核細胞は組織または多細胞生物の構成要素であり、走磁性細菌は１種類以上のヘテロロガスレポーターを発現し、第１イメージングモダリティーは磁気モダリティーである；（ｂ）第２イメージングモダリティーを用いて１種類以上の発現したレポーターをイメージングすることにより、真核細胞を光学的にイメージングする；その際、第２モダリティーは非磁気モダリティーである；そして（ｃ）組織または生物を第３イメージングモダリティーによりイメージングする。ある態様において、真核細胞を工程（ｂ）に従ってイメージングする。当業者に明らかなように、ある態様において、走磁性細菌において発現できる多重レポーターからみて、第２イメージングモダリティーは１種類以上のイメージング方法、すなわちイメージングモダリティーを含む。
【０１４４】
[160]  組織または多細胞生物をイメージングする方法のある態様において、第１イメージングモダリティーは磁性粒子イメージングまたは磁気共鳴イメージングである。ある態様において、第２イメージングモダリティーは、超音波イメージング、コンピューター断層撮影イメージング、光学イメージング、光干渉断層撮影イメージング、ラジオグラフィーイメージング、核医学イメージング、ポジトロン放射断層撮影イメージング、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、サーマルイメージング、蛍光透視イメージング、生物発光イメージング、および蛍光イメージングから選択される非磁気イメージングモダリティーを含む。
【０１４５】
[161]  組織または多細胞生物をイメージングする方法のある態様において、第３イメージングモダリティーは第１イメージングモダリティーと異なる。ある態様において、第３イメージングモダリティーは非磁気イメージングモダリティーである。ある態様において、第３イメージングモダリティーは超音波イメージング、コンピューター断層撮影イメージング、光学イメージング、光干渉断層撮影イメージング、ラジオグラフィーイメージング、核医学イメージング、ポジトロン放射断層撮影イメージング、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、サーマルイメージング、蛍光透視イメージング、生物発光イメージング、および蛍光イメージングから選択される。
【０１４６】
[162]  ある態様において、マルチモダリティーを非侵襲インビボイメージングのために用いる。一般に、イメージングモダリティーはそれらが提供する情報に関して解剖学的または機能的のいずれかとして記述できる。解剖学的モダリティーにはＸ線コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）および超音波（ＵＳ）が含まれ、これらは対象の解剖学的構造の種々の観点（たとえば、ＣＴについては物質密度の変動、ＭＲＩについてはプロトン環境、およびＵＳについては音響反射率）を表示する。機能的モダリティーには、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、蛍光イメージング（ＦＬＩ）および生物発光イメージング（ＢＬＩ）、あるタイプのＭＲＩ（たとえば、拡散強調型(Diffusion Weighted)（ＤＷ）またはダイナミック造影増強型(Dynamic Contrast Enhanced)（ＤＣＥ））、磁性粒子イメージング（ＭＰＩ）、光音響イメージング（ＰＡＩ）、造影増強超音波（ｃｅＵＳ）、ラマンイメージング（ＲＩ）、造影増強ＣＴ（ｃｅＣＴ）およびＸ線蛍光ＣＴ（ＸＦＣＴ）が含まれ(Kuang, Y. et al., “First demonstration of multiplexed X-ray fluorescence computed tomography (XFCT) imaging,” IEEE Trans Med Imaging 32:262-267 (2012), それをあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)、宿主細胞内（単細胞生物を収容している）で起きている具体的な生物学的プロセスを表示する(James, M.L. et al., “A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications,” Physiol Rev. 92:897-965 (2012); Molecular Imaging: Principles and Practice, Eds. Weissleder, R., Ross, B.D., Rehemtulla A. and Gambhir, S.S., People’s Medical Publishing House, USA, (2010); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。これが行なわれるのは測定される信号が特定のプローブ分子により発生するからであり、その分子は化学薬品（造影剤）またはタンパク質（レポータータンパク質）であってもよい。造影剤は外因性のものであってスキャン前に対象に投与され、これに対しレポータータンパク質は宿主細胞または単細胞生物内へ遺伝子コードされているレポーター遺伝子により産生される。
【０１４７】
[163]  ある態様において、本開示のマルチモーダルイメージングを用いて真核細胞をインビボで追跡する。多世代の真核細胞について細胞を追跡するためには、真核細胞が分裂するのに伴ってプローブが検出可能な濃度を維持できる必要がある。前記のナノ粒子法を含めた造影剤法は、数ラウンドの細胞分裂後に検出不可能なレベルにまで急速に薄まるので、一般にこの要件を満たさない。検出可能なレポーターを発現するレポーター遺伝子は持続的な検出可能レベルを維持できるが、真核細胞の多大な遺伝子工学操作を必要とする。さらに、ＭＲＩによる長期間の細胞イメージングに有用なレポーター遺伝子選択肢はほとんど存在しない。研究者らはフェリチン重鎖遺伝子を用いたＭＲＩレポーター遺伝子(参照：たとえば、Cohen, B. et al., “Ferritin as an endogeneous MRI reporter for noninvasive imaging of gene expression in C6 glioma tumors,” Neoplasia 7:109-117 (2005), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)、および走磁性細菌由来の遺伝子、たとえばＭａｇＡ(Goldhawk D.E. et al., “Magnetic resonance imaging of cells overexpressing MagA, an endogeneous contrast agent for live cell imaging,” Mol Imaging 8:129-139 (2009); Zurkiya, O. et al., “MagA is sufficient for producing magnetic nanoparticles in mammalian cells, making it an MRI reporter,” Magnet Reson Med. 59:1225-1231 (2008), それらをそれぞれあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)について実験したが、この方法から得ることができるコントラストは一般に弱く、得られる検出可能性は乏しい。本明細書に記載するマルチモーダルプローブ、たとえば１種類以上のレポーターを発現する磁性細菌の利点は、その遺伝子修飾された磁性細菌を容易に真核細胞に導入でき、真核細胞内のその磁性細菌は娘細胞へ遺伝でき、したがってレポーターレベルを維持できることである。
【０１４８】
[164]  マルチモーダルイメージングのためのある態様において、マルチモーダルプローブ、またはマルチモーダルプローブを含む真核細胞を、対応する発現したレポーター、たとえばＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、光音響、Ｘ線または超音波レポーターの存在を検出するのに適した条件下で適宜なレポータープローブと接触させる。細胞の追跡またはイメージングが組織またはインビボでの動物におけるものである場合、組織または動物に適宜なレポータープローブを投与して、対応するレポーターの発現を検出および／またはイメージングすることができる。対応するレポーターについて代表的なレポータープローブおよびイメージング方法を前記に述べた。レポータープローブを組織または動物宿主に種々の経路で投与できる。ある態様において、適切なレポータープローブを経口または非経口投与することができる。この観点における非経口投与には下記による投与が含まれる：静脈内、筋肉内、皮下、眼内(ophthalmic)、滑液包内、経上皮（経皮を含む）、眼(ocular)、舌下および口腔内；吸入、エアゾールによる局所投与：眼内、皮膚、眼、直腸および鼻吸入を含む；ならびに直腸全身。医薬的に許容できる賦形剤またはキャリヤーを含む配合物を含めた多様な形態でレポータープローブを投与する。医薬的に許容できる賦形剤およびキャリヤーは実質的に無毒性であり、かつ医薬的に許容できる純度のものである。ある態様において、注射に適した形態には、たとえば無菌の液剤または分散液剤、および無菌の注射用液剤または分散液剤を即時調合するための無菌散剤を含めることができる。ある態様において、レポータープローブを経口投与用に、たとえば経口投与用の液剤、錠剤、カプセル剤または散剤として調製できる。
【０１４９】
[165]  ある態様において、前記に述べたように、マルチモーダルイメージングは幾つかの方法で実施できる。第１は、異なるイメージングモダリティーを用いて対象またはターゲットをイメージングし、こうして多重タイプのイメージを取得し、次いで対象のイメージングした各部分に及ぶ異なるイメージを比較できるようにそれらを整合することである。ある態様において、代表的な組み合わせは解剖学的スキャン（たとえば、ＣＴ）および機能性スキャン（たとえば、ＰＥＴ）である；これにより機能性データを解剖学的概念に入れることが可能になるからである。ある態様において、２以上のイメージタイプを同時に取得するためにマルチモーダルスキャナーを使用できる。一般的に用いられる２例は、組み合わせＰＥＴ／ＣＴスキャナー、ＦＬＩ、ＢＬＩおよび広域イメージの取得が可能な光学イマージャー、ならびに光音響イメージング（ＰＡＩ）も行なうＵＳスキャナーである。多種多様な組み合わせのイメージタイプの取得が可能であることを理解すべきである。
【０１５０】
[166]  ある態様において、２以上のイメージングモダリティーで観察可能な信号を発生するプローブを用いて、マルチモーダルイメージングを行なうことができる。これは、イメージ作成者が広範なイメージング方法を用いてプローブをイメージングできるという利点をもち、イメージング試験をデザインする際により大きなフレキシビリティーが可能である；マルチモーダルプローブを用いて希望する表現型を対象またはターゲットに導入でき、それによって対象またはターゲットの希望するイメージングモダリティーを使用できるからである。この目的で、ある態様において、マルチモーダルプローブは、たとえば２種類のレポーター遺伝子を発現する二重融合レポーター構築体の使用により、少なくとも２種類のレポーターを発現でき、それによって少なくとも２つのイメージングモダリティーの使用が可能になる。ある態様において、マルチモーダルプローブは、たとえば３種類のレポーター遺伝子を発現する三重融合レポーター構築体の使用により少なくとも３種類のレポーターを発現でき、それにより、それを発現するように工学操作された細胞を少なくとも３つのイメージングモダリティー、たとえばＦＬＩ、ＢＬＩおよびＰＥＴを用いてイメージングすることができる。ある態様において、プローブは２以上のイメージングモダリティーで観察可能な信号を発生する単一プローブであってもよい。２以上のイメージングモダリティーでイメージングできる代表的プローブは、レポーターであるチロシナーゼであり、それはＰＥＴ、ＭＲＩおよび光音響イメージング法を用いてイメージングできる。本発明のガイドラインからみて、この方法に多数の変更を行なうことができ、それらを本開示に明白に記載する。
【０１５１】
[167]  ある態様において、マルチモーダルイメージを収集し、それらは下記のタイプのイメージうち少なくとも２つを含む：細胞から放射される光に対応する１以上のイメージ、細胞により伝達される光に対応する１以上のイメージ、および細胞により散乱される光に対応する１以上のイメージ。そのようなマルチモードイメージングは下記のいずれかのタイプのイメージまたは組み合わせを含むことができる：（１）１以上の蛍光イメージおよび少なくとも１つの明視野イメージ；（２）１以上の蛍光イメージおよび少なくとも１つの暗視野イメージ；（３）１以上の蛍光イメージ、少なくとも１つの明視野イメージおよび少なくとも１つの暗視野イメージ；ならびに（４）明視野イメージ。複数の異なる蛍光イメージ（スペクトルにより分離）の同時収集、および複数の異なる明視野イメージの同時収集（２つの異なるスペクトルフィルターによる透過光を使用）も有益な可能性がある。好ましくは、マルチモードイメージを同時に収集する。
【０１５２】
[168]  ある態様において、マルチモーダルイメージングは、低い信号を他の検出モダリティーからの低い信号に空間的に整合した解剖学的イメージングデータと組み合わせることによって、きわめて低い信号を補うことができる。ある態様において、異なるイメージング方法（またはモダリティー）は真核細胞およびそれの環境の異なる観点を視覚化することができ、これらの多重モダリティーを組み合わせることによってその真核細胞およびそれの環境についてより多くを知ることができる。
【０１５３】
[169]  ある態様において、前記方法のいずれかにおけるいずれか１つのモダリティーにより取得したイメージを多様な方法で処理すること、たとえばそのイメージデータを比較および再構築することができる。ある態様において、１つのモダリティーを用いて得られた１つのイメージを、異なるモダリティーを用いて得られたイメージと比較することができる。ある態様において、比較および／または再構築は、１つのモダリティーから取得したイメージを異なるモダリティーから取得したイメージに重ねることにより実施できる。比較および／または再構築は、２以上のイメージ、３以上のイメージ、４以上のイメージ、５以上のイメージ、または６以上のイメージについて実施でき、その際、各イメージは異なるモダリティーから取得される。一般にイメージはピクセルイメージの形態である。たとえば、（ａ）１種類以上のヘテロロガスレポーターを発現する走磁性細菌を磁気イメージングすること、および（ｂ）そのレポーターを非磁気モダリティーによりイメージングすることを含むマルチモーダルイメージング方法において、その方法はさらに、（ａ）から取得／捕獲したイメージと（ｂ）から取得／捕獲したイメージを重ね合わせることを含むことができる。ある態様において、（ａ）におけるイメージおよび（ｂ）におけるイメージはピクセルイメージを含む。異なるモダリティーにより得られたイメージを比較または再構築することを含めて、イメージ処理のための種々の方法が、たとえばU.S. patent publication No. 20110262016および20130177224に記載されている。
【０１５４】
[170]  検出のためのレポーターのレベルを維持した状態でレポーターを発現する真核細胞を構築するという要求を克服する、真核細胞内の磁性細菌の遺伝性という利点に加えて、マルチモーダルプローブとしての磁性細菌をベースとするマルチモーダルイメージングの使用によって存在位置のイメージングおよび真核細胞の追跡を増強することができ、それにはたとえばその真核細胞を含む組織内における細胞動態の変化のイメージングが含まれる。この付加された特質は、細胞およびそのような細胞を含む組織を追跡する能力を増強する。
【０１５５】
[171]  たとえば、ある態様において、マルチモーダルプローブを癌細胞に導入し、改変された癌細胞を実験動物に導入して、たとえばその動物における癌細胞の転移および移動を追跡することができる。種々の療法処置後に癌細胞を追跡およびイメージングして、その処置の有効性を査定し、処置の前後の癌細胞の生存性および移動の動態を調べることもできる。
【０１５６】
[172]  ある態様において、マルチモーダルプローブを幹細胞に導入して、その幹細胞の存在位置、増殖速度および生存性を含めたインビボでの動態を追跡することができる。幹細胞が造血幹細胞または前駆細胞である場合、マルチモーダルプローブを収容した幹細胞を哺乳動物に導入し、異なる刺激を受けた際のその磁性造血幹細胞または前駆細胞の存在位置、増殖、および血流中への移動を含めたそれらの挙動をマルチモーダルイメージングによりモニターする。これを幹細胞の移植およびホーミング(homing)を促進するための種々のタイプの処理手段とカップリングさせることができる。マルチモーダルイメージング方法の他の用途は本開示に提示するガイダンスからみて明らかであろう。
【０１５７】
[173]  本明細書に開示する発明は、以下の実験詳細からより良く理解されるであろう。ただし、考察する特定の方法および結果は後記の特許請求の範囲にさらに十分に記載する本発明の例示にすぎないことを当業者は容易に認識するであろう。
【実施例】
【０１５８】
実施例１：マウス細胞へのｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１のマイクロインジェクション
Ａ．  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１の構築
[174]  ｅＧＦＰ配列の発現ベクター、すなわちｇｆｐ遺伝子の上流にシャイン−ダルガルノ配列を含むものおよびシャイン−ダルガルノ配列を含まないものを、潜在(cryptic)広域宿主ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２内へクローニングした(Kovach, M.E. et al., “Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes,” Gene 166, 175-176, (1995), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。ＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ  ７００２６４）をこの構築体で形質転換した(参照：たとえば、Matsunaga, T. et al., “Complete genome sequence of the facultative anaerobic magnetotactic bacterium Magnetospirillum sp. strain AMB-1,” DNA Res. 12, 157-166 (2005); Burgess J.G., et al., “Evolutionary relationships among Magnetospirillum strains inferred from phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences,” J Bacteriol. 175:6689-6694 (1993); Matsunaga T, et al., “Gene transfer in magnetic bacteria: transposon mutagenesis and cloning of genomic DNA fragments required for magnetosome synthesis,” J Bacteriol. 174: 2748-2753 (1992); Kawaguchi R, et al., “Phylogeny and 16s rRNA sequence of Magnetospirillum sp. AMB-1, an aerobic magnetic bacteria,” Nucleic Acids Res. 20:1140 (1992); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【０１５９】
[175]  ドナー大腸菌株を用いるコンジュゲーションにより形質転換を達成した。(参照：Goulian, M. et al., “A simple system for converting lacZ to gfp reporter fusions in diverse bacteria,” Gene 372:219-226 (2006); Scheffel, A. Schueler, D., “The Acidic Repetitive Domain of the Magnetospirillum gryphiswaldense MamJ Protein Displays Hypervariability but Is Not Required for Magnetosome Chain Assembly,” J Bacteriol. 189(17):6437-6446 (2007); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。これらの交配反応物を、規定した微好気性条件下でＤＡＰの非存在下に１０日間培養して、陽性形質転換体を選択した。
【０１６０】
[176]  コンジュゲーションの後、シャイン−ダルガルノ配列を含むｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１形質転換体および含まないものがＧＦＰ蛍光を示すのに成功した。シャイン−ダルガルノ配列を収容した形質転換体は、この配列を含まない形質転換体より高いレベルのＧＦＰ蛍光を示した。生じた蛍光は、４８８ｎｍで励起して１００×の倍率で観察した際、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞から離れなかった。
【０１６１】
[177]  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１の磁性をＭＲＩにより分析した。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を寒天プラグに懸濁し、１．５Ｔ計測器を用いてイメージング特性を最適化および解明した。図１は、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１について約１０８ＭＴＢ／ｍＬに及ぶロングスケール濃度にわたってＴ１パルスシーケンスで作成したポジティブコントラストを示す。信号強度は濃度に関係していた。
【０１６２】
Ｂ．  マウス胚細胞内へのマイクロインジェクション
[178]  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を２細胞期の１７０のマウス胚それぞれの１細胞にマイクロインジェクトした。５６５ｎｍにおける光学濃度により推定して細胞当たり約１０５  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１に及ぶロングスケール濃度にわたる６種類の濃度をインジェクトした。マイクロインジェクション後の細胞の致死率は、インジェクトした種々の濃度にわたって一定であった。最高濃度（１０５ＭＴＢ／細胞）をインジェクトした細胞の蛍光イメージおよび微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）イメージを重ねたイメージを比較した。インジェクトしなかった対照は低レベルの自発蛍光を示した。特定時点での８細胞期胚の異なる水平面における切片を比較した。それぞれの胚において、インジェクトした細胞に由来する４つの細胞すべてが有意の蛍光を示したが、インジェクトしなかった内部対照に由来する細胞はいずれも有意の蛍光を示さなかった。
【０１６３】
[179]  インジェクション後、３日間、胚を発生させた。それぞれの濃度レベルで、胚は全３日間生存して２５６細胞の胞胚期まで発生し、移植するのに十分なほど健康に見えた。それぞれの胞胚内の多数の細胞が有意の蛍光を示し、それは、真核宿主細胞を含む胚が胞胚期まで発生するのに伴って人工内部共生体が多数回の細胞分裂を経て娘細胞へ伝達されたことを立証する。そのような胞胚のひとつを図２に示す；パネルＡは胞胚の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）イメージを示し、パネルＢ）は同じイメージのグレイスケール蛍光捕獲を示し、胞胚全体の多数の細胞に蛍光を示す。
【０１６４】
[180]  共焦点顕微鏡検査を用い、胚の８細胞期に開始して胚全体のＧＦＰ蛍光を種々の時点で経時測定することにより、４つの個々の胚全体のＧＦＰの総発現を定量した。図３は胚の蛍光の経時変化を示す。これは、人工内部共生体のコピー数が娘細胞において少なくとも７世代維持され、それにより胚が２細胞期から２５６細胞の胞胚期まで経過するのに伴って宿主細胞の蛍光表現型が維持されたことを示す。
【０１６５】
[181]  これらの結果は、マイクロインジェクションにより送達された場合、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１が直ちに消失または分解することはなく、また３日間の実験経過にわたって発生中の胚に対して有毒でなかったことを立証する。マイクロインジェクトされた胚は正常に分裂し、それはｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１が病原性マーカーを提示せず、あるいは有毒化合物を分泌しないことを示唆する。それらは多数回の細胞分裂にわたって娘細胞へ伝達され、細胞質に内包され、点状に良好に分布し、娘宿主細胞内でコピー数を維持し、それにより真核宿主細胞の蛍光表現型が娘細胞において少なくとも７世代を通して維持された。これらの結果は、ＡＭＢ−１は細胞内で安定に維持でき、かつ少なくとも７回の細胞分裂にわたって娘細胞へ伝達されることを立証する。
【０１６６】
実施例２：ＡＭＢ−１の食作用型侵入
[182]  受容体仲介型：ｉｎｌＡＢ遺伝子をリステリア・モノサイトゲネス(L. monocytogenes)ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  １９１１４）から増幅し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５、すなわちｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２のゲンタマイシン同族体(see Kovach, M.E., et al., “Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes,” Gene 166, 175-176, (1995))に挿入して、ｇｆｐ＋  ｉｎｌＡＢ＋  ＡＭＢ−１を作製する。このｇｆｐ＋  ｉｎｌＡＢ＋  ＡＭＢ−１を、一般的な上皮腫瘍細胞系Ｃｏｃｏ−２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ７、非上皮腫瘍細胞系、たとえばＨＴ−１０８０およびＨＬ６０、ならびにマウス幹細胞を含めた、真核宿主細胞と共培養する。蛍光顕微鏡検査およびＦＡＣＳを用いてインターナリゼーションおよび細胞内位置をモニターおよび定量する。
【０１６７】
[183]  ＡＭＢ−１におけるポア形成性の溶血素(haemolysin)（ｈｌｙＡ）発現は、リステリア・モノサイトゲネスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  １９１１４）由来のｈｌｙＡの増幅により達成される。増幅したｈｌｙＡをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−３（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２のテトラサイクリン同族体）に挿入し、次いでそれを用いてｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を形質転換する。得られたＡＭＢ−１株を、自然−食作用できるマウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４に曝露する。ゲンタマイシン処理を用いてインターナリゼーションしていない細菌を除去し、ｈｌｙＡ−  ＡＭＢ−１を陰性対照として用いる。蛍光顕微鏡検査を用いてＡＭＢ−１の細胞内での動態および存在位置をモニターする。
【０１６８】
[184]  細菌がファゴソーム内に閉じ込められたままであれば、細胞質ゾル内へのリステリア・モノサイトゲネスの脱出に関係することが示されている２つの遺伝子ｐｌｃＡおよびｐｌｃＢを導入する(Smith, G. A. et al., Infection and immunity 63:4231 (1995); Camilli, A. et al., J Exp Med. 173:751 (1991); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。細菌が脱出に成功したけれども増殖できなければ、ｈｐｔを導入する(参照：Goetz, M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 98:12221 (2001); Chico-Calero, I. et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:431 (2002); それぞれの刊行物をあらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。リステリア・モノサイトゲネスにおいて、ｈｐｔは細胞質ゾルからのグルコース−６−リン酸の取込みに関与するトランスポーターをコードする。リステリア・モノサイトゲネス由来の他の遺伝子（ｇｌｎＡおよびｇｌｔＡＢおよびａｒｇＤ）が宿主内での増殖を持続するのに関与することが示されており、これらを必要に応じて系統的に導入する(Joseph, B. et al., J Bacteriol. 188:556 (2006), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【０１６９】
実施例３：ＡＭＢ−１増殖の調節
[185]  胚性幹細胞におけるＡＭＢ−１増殖の調節は下記に従って調節できる。コレオプテリシン−Ａ(coleoptericin-A)（ＣｏｌＡ）をコクゾウムシ(Sitophilus oryzae)の総ｃＤＮＡから増幅する。コクゾウムシ属(Sitophilus)の甲虫におけるＣｏｌＡの発現は、これらの甲虫との密接な共生関係を自然界で発達させて菌細胞(bacteriocyte)と呼ばれる特殊な細胞内に滞在するガンマプロトバクテリア綱(γ-Protobacterium)の力価を調節する(Login, F.H. et al., “Antimicrobial peptides keep insect endosymbionts under control,” Science 334(6054):362-365 (2011), あらゆる目的で全体として本明細書に援用する)。
【０１７０】
[186]  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むマウス胚性幹細胞を、神経分化プロトコルにより処理する。ＭＴＢ発現レベルをｑＰＣＲおよび蛍光顕微鏡検査により定量する。増幅したｃｏｌＡを次いでｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１胚性幹細胞において発現させる。最適ＣｏｌＡ発現レベルが得られるようにプロモーターを選択する。
【０１７１】
実施例４：ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したマウス細胞の磁性表現型
[187]  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を導入したマウス腹水固形腫瘍に由来するマクロファージ細胞系Ｊ７７４．２からの細胞を磁気カラムに適用し、カラムに保持させた。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１の導入後にＪ７７４．２マウス細胞は磁気により濃縮され、磁気により採集されたので、これらの結果はそれらが磁気により検出され、磁気により操作されたことを立証する。
【０１７２】
実施例５：ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＧｆｐ＋  ＡＭＢ−１
[188]  Ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１、Ｇｆｐ＋  ＩｎｌＡ／Ｂ＋  ＡＭＢ−１、およびＧｆｐ＋  Ｐｌａ１＋  ＡＭＢ−１をそれぞれ、ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に導入した。９０％を超えるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、Ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１、Ｇｆｐ＋  ＩｎｌＡ／Ｂ＋  ＡＭＢ−１、およびＧｆｐ＋  Ｐｌａ１＋  ＡＭＢ−１それぞれの導入後、４８時間、ＧＦＰ蛍光が検出された。Ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１におけるＧＦＰ蛍光は、これらのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１導入の少なくとも１３日後、導入後の第４継代ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、すなわちそれぞれの継代間で３〜４回倍増したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞集団において観察された。ＧＦＰ蛍光は、細胞分裂の過程で導入されたｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含む、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の両方の形成娘細胞に観察された。
【０１７３】
[189]  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１の導入後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）  レッドＤＮＤ−９９色素（リゾソームに特異的）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）で染色した。緑色ＧＦＰ蛍光は個々のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内に、赤色のリゾソーム染色および青色の核染色とは別に局在した状態で観察され、これはＡＭＢ−１が細胞質に局在し、リゾソーム経路により消化されなかったことを示唆する。
【０１７４】
[190]  導入後２４時間目および７２時間目に、プレーティングしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびプレーティングした対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＰＢＳ洗浄後にホルマリンおよびグルタルアルデヒド中に固定した。細胞を次いでプルシアンブルーで染色し、顕微鏡検査により倍率４０×で観察した。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を導入した若干のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において鉄染色が観察されたが、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を導入していない対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においては観察されなかった。鉄染色を示した細胞の割合は、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞導入後７２時間目のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞導入後２４時間目のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の間で類似していた。
【０１７５】
[191]  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞導入後４８時間目に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁した。これらの細胞のうち１試料をスライドガラスチャンバーに入れた。磁石をチャンバーの側面に配置し、細胞の運動を倍率２０×の顕微鏡下で観察した。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は磁石の方向への運動を示したが、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を導入していない対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は示さなかった。これらの細胞の他の試料を小チューブに入れ、それらを１時間、磁石に貼りつけておいた。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を導入していない対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はチューブの底に沈降した。しかし、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はチューブの磁石側に整列した。
【０１７６】
[192]  これらの結果は、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１がヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から直ちには消失しなかったことを示す。それらは少なくとも１２回の細胞分裂にわたって娘細胞へ伝達され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内でリゾソームおよび核の両方の外側に滞在した。これらの結果は、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞の導入後少なくとも４８時間は、提示したｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が磁気検出および磁気操作されたことをも立証する；それらは磁気により運動し、磁気によりある位置にターゲティングされ、磁気により濃縮され、かつ磁気により採集されたからである。さらに、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞の導入後少なくとも７２時間、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は観察可能な量の鉄を含有していた。
【０１７７】
実施例６：ヒト人工多能性幹細胞におけるＧｆｐ＋  ＡＭＢ−１
[193]  ヒト人工多能性幹（“ＩＰＳ”）細胞において、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１をＩＰＳに導入した後の少なくとも８日間、ＩＰＳ細胞の第２継代でＧＦＰ蛍光が観察された。これらの結果は、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１がヒトＩＰＳ細胞から直ちには消失せず、娘細胞へ伝達されたことを示す。
【０１７８】
実施例７：マウス腫瘍内の細胞イメージング
[194]  ２つの皮下腫瘍を、１つはその左脇腹に、１つはその右脇腹に保有するマウスにおいて、細胞視覚化を試験した。導入されたｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞１．５×１０６個を、マウスの左脇腹の腫瘍に直接注射した。細胞を導入していない同数の対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をマウスの右脇腹に注射した。Ｔ２ｗパルスシーケンスの卓上型１Ｔ  ＭＲＩを用いてマウスをイメージングした。得られたイメージは、マウスの右側の腫瘍、すなわち導入されたｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の注射部位に暗領域を示したが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を左側の腫瘍に注射したマウスの右側の腫瘍には信号がなかった。
【０１７９】
実施例８：マウス腫瘍のモニタリング
[195]  Ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞をＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ヒト癌細胞に導入する。得られた磁性細胞およびそれらの娘細胞を、免疫無防備状態のマウスのグループの乳腺脂肪体に注射する。腫瘍の増殖を規則的間隔でＭＲＩイメージングによりモニターする。樹立した腫瘍をもつマウスを、実験グループまたは対照グループのいずれかに配属した。実験グループのマウスを有効な抗腫瘍療法化合物で処理し、これに対し対照グループのマウスを不活性ビヒクルで処理する。処理後、ＭＲＩを用いて腫瘍のサイズおよび増殖を非侵襲的にモニターして、腫瘍への対抗における被験化合物の有効性を査定する。
【０１８０】
実施例９：磁気による細胞保持の増強
[196]  Ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞をラットの心臓由来幹細胞(Cardiac-Derived Stem Cell)（ＣＤＣ）に導入する。得られた磁性ＣＤＣ細胞を虚血／再潅流モデルに用いる。ラットをCheng K. et al., “Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion,” Cell Transplant. 21(6):1121-35 (2012)の記載に従って処理する。次いで、処理したラットの左心室腔内へ磁性ＣＤＣ細胞を導入する。注射の途中と後に１．３Ｔの磁石を心臓の上方に置く。動物の胸部を閉じ、回復させる。ラットにおける標識ＣＤＣの短期および長期挙動を規則的にＭＲＩイメージングによりモニターする。
【０１８１】
実施例１０：ＡＭＦ腫瘍の処理
[197]  Ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１細胞をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に導入する。得られた細胞を、４Ｔ１細胞によりヌードマウスに形成された皮下腫瘍に注射する。非処理対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、各動物の反対側の脇腹の腫瘍に注射する。処理後に各動物を交番磁場（３０．６ｋＡ／ｍ，１１８ｋＨｚ）に３０分間置き、この操作の後、回復させる。動物を規則的間隔でと殺し、磁性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を注射したマウスと対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を注射したマウスの両方からの腫瘍について組織学的分析を行なう。実験マウスにおいて、標識した細胞および周囲の腫瘍が損傷を受けて、経時的な腫瘍損傷を生じる。
【０１８２】
実施例１１：生物発光性ＡＭＢ−１
[198]  フォトラブダス・ルミネッセンス(Photorhabdus luminescens)ｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンの遺伝子配列をｐＸｅｎ−１３プラスミド（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，マサチュセッツ州）からＰＣＲ増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国カリフォルニア州マウンテンビュー）の使用によりｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２内へクローニングした。正確なサイズの挿入配列であることを制限消化により示し、発光リーダーにより発光を検出することによって、陽性クローンを確認した。精製プラスミドを交配株である大腸菌ＷＭ３０６４に導入した。ＡＭＢ−１とＷＭ３０６４株をプラスミド伝達のために交配し、カナマイシン耐性ＡＭＢ−１株を選択した。発光陽性株を液体ＭＧ培地中で培養した。ｌｕｘ＋  ＡＭＢ−１のみについて卓上型ルミノメーターを用いて蛍光を確認した。ＣＭａｇ測定を用いて磁性を確認した。共遠心または細胞容器に強力な磁石を隣接させた状態でのインキュベーションにより、株を真核細胞に導入した。ＭＲＩファントム(phantom)により、また顕微鏡での磁気感度の観察により、または磁気カラムにトラップされることにより、磁性を確認した。
【０１８３】
実施例１２：蛍光ＡＭＢ−１の作製
[199]  ある態様において、自殺プラスミドｐＪＱ２００に挿入した増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を用いて、ＦＬＩによる検出が可能な遺伝子修飾された走磁性細菌を作製し、ジアミノピメリン酸栄養要求性大腸菌株に導入し、それをＡＭＢ−１との交配に用いた。ゲンタマイシン耐性株を選択し、蛍光顕微鏡検査により蛍光を確認した。ゲンタマイシン培地中で３回継代した後、抗生物質選択なしに細胞をさらに３回継代増殖させた。次いでそれらを１％スクロースの存在下で６日間増殖させ、単一コロニーをＭＧＢ寒天平板に接種した。単一コロニーをＧＦＰについて検査した。Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｓ倒立落射蛍光顕微鏡を用い、ＦＩＴＣフィルターおよび４０×対物レンズを用いて検出を行なった。蛍光性らせん形細菌を４０×の倍率で観察できる。
【０１８４】
[200]  ＧＦＰ陽性ＡＭＢ−１を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、ｈＡＭＳＣ、Ｊ７７４．２、ＭＣＦ−７（およびその他）細胞に挿入した。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１標識細胞および非標識細胞を蛍光顕微鏡により観察し、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１標識細胞についてはしばしば点状パターンを伴う細胞蛍光の明瞭な増強が観察され、それは細胞内ベシクルにおける局在化を示唆する。
【０１８５】
[201]  図６Ａ〜Ｌは、下記の共焦点顕微鏡検査および蛍光のイメージを示す：ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したｉＰＳ細胞（多能性幹細胞）、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌）、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＪ７７４．２細胞（マウスマクロファージ）、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＢＪ細胞（ヒト線維芽細胞）、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＨＥＰ１細胞（ヒト肝臓腺癌）、およびｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＣＦ−７細胞（ヒト上皮乳腺癌）。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１をこれらの細胞系に挿入し、位相コントラスト光学素子またはＦＩＴＣ蛍光フィルターを備え、４０×倍率のレンズを備えたＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｓ落射蛍光顕微鏡を用いて、顕微鏡検査イメージを取得した。図６Ａ−Ｂは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したｉＰＳ細胞（多能性幹細胞）の位相コントラストイメージおよび蛍光イメージを示す。図６Ｃ−Ｄは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌）の位相コントラストイメージおよび蛍光イメージを示す。図６Ｅ−Ｆは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＪ７７４．２細胞（マウスマクロファージ）の位相コントラストイメージおよび蛍光イメージを示す。図６Ｇ−Ｈは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＢＪ細胞（ヒト線維芽細胞）の位相コントラストイメージおよび蛍光イメージを示す。図６Ｉ−Ｊは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＨＥＰ１細胞（ヒト肝臓腺癌）の位相コントラストイメージおよび蛍光イメージを示す。図６Ｋ−Ｌは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＣＦ−７細胞（ヒト上皮乳腺癌）の位相コントラストイメージおよび蛍光イメージを示す。これらの細胞タイプはすべて、細胞がｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容した場合、増強された蛍光を示した。
【０１８６】
実施例１３：ＰＥＴ検出可能なＡＭＢ−１の作製
[202]  ＰＥＴ可能な遺伝子修飾された走磁性細菌を作製するために、ヒト単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−Ｔｋ）の遺伝子配列を、選択遺伝子（たとえば、カナマイシンまたはゲンタマイシン抗生物質耐性について）を含む適宜なプラスミドによりＷＭ３０６４に導入し、それをその後、プラスミド伝達のためにＡＭＢ−１と交配させることができる。抗生物質耐性ＡＭＢ−１株を次いで選択することができる。放射性標識ＨＳＶ１−Ｔｋ基質である３Ｈ−ＰＣＶ（ペンシクロビル(penciclovir))を添加し、ＡＭＢ−１取込みをシンチレーション計数計で定量することにより、レポーターの陽性発現を評価することができる。
【０１８７】
[203]  ＰＥＴレポーター陽性ＡＭＢ−１を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、ｈＡＭＳＣ、Ｊ７７４．２、ＭＣＦ−７（およびその他）細胞に挿入することができる。ＡＭＢ−１標識細胞および非標識細胞を生きた対象に注射し、次いで対象にＨＳＶ１−ＴＫレポーター遺伝子に対する放射性基質（たとえば、１８Ｆ−ＦＨＢＧ）を注射することができる。１時間後、対象のＰＥＴスキャンはＡＭＢ−１標識細胞の領域に顕著な取込みを示す。
【０１８８】
実施例１４：ＡＭＢ−１を収容した真核細胞の蛍光イメージングおよびＭＲＩによる検出
[204]  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を集密状態まで増殖させた。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含まないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を共焦点顕微鏡検査および蛍光イメージングでイメージングした。位相コントラスト光学素子またはＦＩＴＣ蛍光フィルターを備え、４０×倍率のレンズを備えたＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｓ落射蛍光顕微鏡を用いて、位相コントラストイメージおよび蛍光イメージを取得した。蛍光イメージは０．５秒間、露光された。図４Ａおよび４Ｄは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１および含まないものの位相コントラストイメージを示す。図４Ｂおよび４Ｅは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１および含まないものの蛍光イメージングを示す。図４Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内のｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１からの蛍光信号を立証する。
【０１８９】
[205]  ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および含まない細胞を、下記に従ってＭＲＩによるイメージング用に調製した。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および含まない細胞をトリプシン処理し、２００万個の細胞を１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液を、予め凝固させた１００μｌの１％アガロースを入れたＰＣＲチューブにピペットで添加した。ＰＣＲチューブをシールし、１０分間放置して細胞をアガロース／ＰＢＳ境界に沈降させた。Ｖａｒｉａｎ  ７Ｔ  ３００ＭＨｚ  水平ボア(Horizontal Bore)前臨床ＭＲシステムを用いた。スキャナーは４０Ｇ／ｃｍ  １２０ｍｍの高デューティーサイクルグラディエントコイル(High Duty Cycle Gradient Coil)の形状であった。ｖｎｍｒｊ  ４．０イメージ取得ソフトウェアでイメージを取得した。２Ｄ  Ｔ２ｗ  ＭＥＭＳシーケンス（ＴＲ  ３０００ｍｓ，ＴＥ  Ｍｉｎ  ７ｍｓ，ＮＥ  ４８，ＮＥＸ  １，１２８×１２８，４０×４０ｍｍ  ＦＯＶ，１ｍｍ断面厚さ，冠状面像  を用いてファントムチューブ(Phantom tube)をイメージングし、Ｒａｐｉｄ  Ｆ１９ボリュームコイル(volume coil)を用いてチューブをイメージングした。ＭＲＩイメージを図４Ｃ（ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および４Ｆ（ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含まないＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に示す。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１の位置を確認する黒色バンドが図４Ｃに見える。図４Ｆにはそのようなバンドは見えない。
【０１９０】
[206]  図５Ａ〜Ｃは、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の低倍率のＭＲＩ、蛍光および目視検査イメージングの例を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１で標識し、２４時間後に洗浄し、トリブシン処理し、４８時間目に採集し、遠心機で遠心沈降させ、得られたペレットを円筒形１００ｃｃチューブ内の１％アガロースゲルに懸濁した。蛍光イメージは、ＩＶＩＳ  ４９蛍光イマージャーで、Ｃｙ５．５フィルターおよび１秒間の取得時間を用いて得られた。ＭＲＩイメージは、Ｔ２ｗ  ＲＡＲＥパルスシーケンス（ＴＲ  １５００ｍｓ，ＴＥ  ９６ｍｓ，ＦＡ  １８０度，取得時間５分間，ＦＯＶ  ３．５ｃｍ，１２８×１２８，断面厚さ１．２５ｍｍ，断面間ギャップ１．００ｍｍ）で、直径２．５ｃｍのラットコイル(rat coil)を備えたＢｒｕｋｅｒ  ＩＣＯＮ  １Ｔ前臨床ＭＲＩスキャナーにより得られた。図５Ａ〜Ｃは、アガロースに懸濁した、ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含む同じＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の異なるモダリティーの検出を示す。図５Ａは、プラスチックチューブの目視検査により見たＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を示す。図５Ｂは、同じチューブ内のｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＲＩイメージを示す。図５Ｃは、同じチューブ内のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の蛍光イメージを示す。ｇｆｐ＋  ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＭＲＩおよび蛍光イメージングを用いて検出できる。
【０１９１】
実施例１５：蛍光およびＭＲＩによるＡＭＢ−１の検出
[207]  ＡＭＢ−１をｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２  ｌｕｘプラスミドで形質転換して、発光性ＡＭＢ−１を作製した。これらの発光性ＡＭＢ−１をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に導入した。ｌｕｘ＋  ＡＭＢ−１を収容したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を集密状態まで増殖させ、１００万個の細胞をＴＤ−２０／２０ルミノメーターで製造業者のプロトコルを用いて光度測定した。１分間、測定値を求め、結果をＯＤ４００＝１に対して標準化した。図７Ａは、ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの発光信号を、ＡＭＢ−１を含まないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比較したチャートを示す。ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＡＭＢ−１を含まないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比較して有意の発光信号を示した。
【０１９２】
[208]  発光性ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＲＩイメージを下記に従って得た。発光性ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をトリプシン処理し、２００万個の細胞を１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液を、予め凝固させた１００μｌの１％アガロースを入れたＰＣＲチューブにピペットで添加した。ＰＣＲチューブをシールし、１０分間放置して細胞をアガロース／ＰＢＳ境界に沈降させた。能動遮蔽型(actively shielded)Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＭＲ９０１前臨床７Ｔ  ＭＲＩでイメージを取得した；ボア直径−３１０ｍｍ，勾配：（１２０ｍｍ  ＩＤ，６００ｍＴ／ｍ，６０００Ｔ／ｍ／ｓ），８つの受信チャンネル；チャンネル当たり１６ビットで１ＭＨｚ。Ｔ２＊ｗ  ＧＲＥシーケンスをイメージングサンプルとして用いた（ＴＲ  ３００ｍｓ，ＴＥ  ３０ｍｓ，ＮＥＸ  ２，２５６ｘ２５６，３０ｍｍ  ＦＯＶ）。図７Ｂは、発光性ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＲＩイメーを示す。発光性ＡＭＢ−１を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、チューブの中間に黒色バンドとして見える。
【０１９３】
[209]  本明細書中で考察および引用したすべての刊行物、特許および特許出願を全体として本明細書に援用する。記載された特定の方法、プロトコルおよび材料は変更できるので、開示した発明はそれらに限定されないことを理解すべきである。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で用いた名称は特定の態様を記述する目的のためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも理解すべきである。
【０１９４】
[210]  当業者はルーティン程度の実験を用いて、本明細書に記載する特定の態様の多数の均等物を認識し、あるいは確認できるであろう。そのような均等物は下記の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
2017522022.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【国際調査報告】
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