(57)【要約】  本発明は、呼吸器感染症、特に、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等の基礎をなす呼吸器障害を有する患者における呼吸器感染症を治療又は予防する方法に関する。本発明はまた、COPD又はCOPD増悪を治療又は予防する方法に関する。本発明は、特に、そのような方法におけるNotch3及び/又はNotch4シグナリングの役割並びに治療及びスクリーニング標的としてのNotch3及び/又はNotch4の使用を記載している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、呼吸器感染症を治療又は予防する方法。
【請求項２】
呼吸器感染症が、ウイルス感染症である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
呼吸器感染症が、細菌感染症である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
呼吸器感染症が、二次的細菌感染症である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物が、基礎をなす呼吸器障害を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
障害が、COPDである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、COPDを治療又は予防する方法。
【請求項８】
哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、COPD増悪を治療又は予防する方法。
【請求項９】
Notch3及び/又はNotch4シグナリングが、抗体又は化合物によって阻害される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物が、ヒトである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
呼吸器感染症、COPD若しくはCOPD増悪の治療又は予防のための医薬品の製造における、Notch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤の使用。
【請求項１２】
呼吸器感染症、COPD若しくはCOPD増悪の治療又は予防における使用のためのNotch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤。
【請求項１３】
少なくとも1種の医薬用担体、希釈剤又は賦形剤と共に、Notch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤を含む、呼吸器感染症、COPD若しくはCOPD増悪の治療又は予防における使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
薬剤が、Notch3及び/又はNotch4経路を阻害するか否かを決定するステップを含む、呼吸器感染症、COPD若しくはCOPD増悪の治療又は予防における使用のためのNotch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤についてのスクリーニングの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な治療方法に関する。より詳細には、一態様では、本発明は、呼吸器感染症、特に、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等の基礎をなす呼吸器障害を有する患者において呼吸器感染症を治療又は予防する方法に関する。本発明はまた、COPD又はCOPD増悪を治療する若しくは予防する方法に関する。本発明は、特に、そのような方法におけるNotch3及び/又はNotch4シグナリングの役割及び治療及びスクリーニング目標としてのNotch3及び/又はNotch4の使用を記載している。別の態様では、本発明は、Notch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤を含む、そのような治療方法における使用のための医薬組成物に関する。さらなる態様では、本発明は、前記治療方法に有用なNotch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤についてのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Notchシグナリング(図1)は、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)において最初に発見され、多くの異なる生物において細胞運命決定に影響を与えることが示されている進化的に保存された経路である。哺乳動物では、Jaggedのリガンド(Jagged1及び2)並びにデルタ様リガンド(DLL1 3及び4)ファミリーに結合することができる4つのNotch受容体(Notch1〜4)がある。Notch受容体は、I型膜貫通タンパク質であり、リガンド結合時、タンパク質切断イベントによって、Notchの細胞内ドメイン(NICD)が遊離され、次いで、これがヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子CSL/RBP-Jに結合する核に移動する。NICDの不存在化では、CSL/RBP-Jはリプレッサー複合体を形成し、したがって転写を阻害するが、一方NICDとの相互作用時には、コリプレッサーは置換され、活性化補助因子が動員され、標的遺伝子の転写活性化が生じる。
【０００３】
前述した通り、タンパク質切断イベントターゲティングNotch受容体は、順調なシグナル伝達のために絶対的に重要である。これらは、プロテアーゼのADAMファミリー及び多タンパク質γ-セクレターゼ複合体によって媒介される。γ-セクレターゼ複合体活性の阻害は、Notchシグナリングを治療的に遮断するために及びこの経路の生物学的機能を研究するためのツールとして用いられている。
【０００４】
ウイルス性及び細菌性呼吸器感染症は、気道における過剰な粘液産生及び好中球性炎症に関連する症状の急性の悪化であるCOPD増悪の重要なトリガーである。気道上皮は、病原体を排出し、炎症性メディエーターの発現を介して免疫応答と協調する粘膜毛様体のエスカレーターを提供することにより、呼吸器病原体に対する自然防御において重要な役割を果たす。これらの上皮細胞機能はどちらも、COPDにおいて機能不全となることが示されている。
【０００５】
Notchシグナリングは、生理的状態下で粘液を産生する杯細胞系統への基底細胞の分化を促進することにより、大型の気道上皮細胞における細胞運命決定に関与しているとされてきた(Guseh JSら、Development、2009年5月;Rock JRら、Cell Stem Cells、2011年5月)。
【０００６】
現在、COPD増悪において好中球性炎症及び過剰な粘液産生を同時に治療することが可能である有効な治療はない。CXCR2阻害剤は、粘膜毛様体の応答に対して影響なく好中球性炎症を軽減するのに有効であり得るが、粘液溶解薬は、一般に、あまり有効でなく、炎症に対して影響を与えない。さらに、これらの治療は、上皮の修復に対して長期に影響を与えないはずである。
【０００７】
本発明者らは、例えば、COPDにおけるウイルス性呼吸器感染症によって誘発される増悪中、Notch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害によって、好中球性炎症及び粘液産生を同時に軽減させることができる一方で、本質的な免疫応答を未変化のままにすることを見出した。これによって、病態を緩和し、粘膜毛様体のエスカレーター及び肺のホメオスタシスを回復させ、したがって、二次的細菌感染症のリスクを軽減することができると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Guseh JSら、Development、2009年5月
【非特許文献２】Rock JRら、Cell Stem Cells、2011年5月
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、一態様では、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、呼吸器感染症を治療又は予防する方法が提供される。
【００１０】
別の態様では、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、COPDを治療又は予防する方法が提供される。
【００１１】
別の態様では、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、COPD増悪を治療又は予防する方法が提供される。
【００１２】
別の態様では、少なくとも1種の医薬用担体、希釈剤又は賦形剤と共にNotch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤を含む、呼吸器感染症、COPD又はCOPD増悪の治療若しくは予防における使用のための医薬組成物が提供される。
【００１３】
さらなる態様では、薬剤がNotch3及び/又はNotch4経路を阻害するか否かを決定するステップを含む、呼吸器感染症、COPD又はCOPD増悪を治療若しくは予防における使用のためのNotch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤についてのスクリーニングの方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Notchシグナリング経路を示す図である。
【図２】まれに及び頻繁に増悪する元喫煙者COPD患者から得られた気管支擦過法の遺伝子発現分析を示す図である。Notch3並びにNotch標的遺伝子は、まれに増悪するCOPD患者と比較して頻繁に増悪する患者において増加する。
【図３】HRV16に72時間感染し、γ-セクレターゼ阻害剤CompAで処理したCOPD気管支上皮細胞のマイクロアレイによる全ゲノム転写分析を示す図である。Notchシグナリングの阻害は、繊毛に関連する遺伝子を回復させ、HRV16感染後の杯細胞関連遺伝子のアップレギュレーションを阻害する。興味深いことに、インターフェロン応答は、不変のままである。(A)主成分分析(PCA)では、治療に基づいた上皮細胞転写シグネチャを最も良く分解する2つの成分を示している。(B)ベン図では、COPDドナーにおける上皮細胞応答の大きさを示している。数字は、各治療により調節されるプローブの数を示す。(C)ヒートマップでは、単独の又はCompAと組み合わせてHRV16に感染したCOPDから得られた気管支上皮細胞(BEC)における平均遺伝子発現を示している。
【図４】HRV16に感染し、CompA又はNotch sparing γ-セクレターゼモジュレーターで72時間処理したCOPD BECにおける遺伝子発現の分析を示す図である。Notch sparing γ-セクレターゼモジュレーターは、HRV16感染細胞中のNotch標的遺伝子又は粘膜毛様体のエンドポイントの発現に影響を与えない。(A)棒グラフでは、リアルタイムPCRによるCOPD BECのALI培地中のNotch標的遺伝子の遺伝子発現を示している。(B)棒グラフでは、リアルタイムPCRによるCOPD BECのALI培地中の繊毛細胞及び杯細胞に関連する遺伝子の遺伝子発現を示している。凡例は、濃度(nM)を示す。
【図５】HRV16に感染し、CompAで72時間処理したCOPD BECの粘膜毛様体の応答を示す図である。Notchシグナリングの阻害は、HRV16感染細胞における粘液産生を抑制する。(A)棒グラフでは、リアルタイムPCRによるCOPD BECのALI培地中の杯細胞特異的遺伝子の遺伝子発現を示している。(B)AB/PASで染色したCOPD BECの横断面では、粘液発現を示している。
【図６】72時間にわたる、単独の又はCompAと組み合わせた、HRV16に感染したCOPD BECの粘膜毛様体の応答を示す図である。Notchシグナリングを阻害すると、HRV16に感染後、繊毛を回復する。(A)棒グラフでは、リアルタイムPCRによるCOPD BECのALI培地中の繊毛細胞特異的遺伝子の遺伝子発現を示している。(B)代表的な顕微鏡写真では、単独の又はCompAと組み合わせた、ALIによって培養されたHRV16に感染したCOPD BECにおけるβ-チューブリンIV発現の蛍光免疫染色を示している。
【図７】CompA処理をした又はしなかったHRV16感染の24時間後のCOPD BECにおけるリアルタイムPCRによる免疫メディエーターの遺伝子発現分析を示す図である。Notchシグナリングの阻害は、好中球性ケモカインをコードする遺伝子を転写阻害するが、T-細胞関連ケモカインの遺伝子発現はあまり影響を受けない。(A)好中球性炎症に関連するケモカインの遺伝子発現である。(B)T-細胞動員に関連するケモカインの遺伝子発現である。
【図８】単独の又はCompAと組み合わせた、HRV16感染の72時間後ALIによって培養されたCOPD BECの上清中の免疫メディエーターのタンパク質分泌の定量を示す図である。Notchシグナリングの阻害は、好中球性ケモカインの分泌を減少させるが、T-細胞関連ケモカインの分泌はあまり影響を受けない。(A)好中球性炎症に関連するケモカインのタンパク質濃度である。(B)T-細胞動員に関連するケモカインのタンパク質濃度である。
【図９】未処理の感染試料と比較したとき、好中球走化性が、CompAで処理した上清に応答して低下する図である。T-細胞走化性は、不変である。単独の又はCompAと組み合わせた、HRV16感染の72時間後ALIによって培養されたCOPD BECから回収された上清に応答した健常な好中球(A)及びT-細胞(B)走化性の分析である。
【図１０】HRV1B接種及びγ-セクレターゼ阻害剤CompBで処理後の雌Balb/cマウスの肺における炎症及び粘液遺伝子発現の分析を示す図である。好中球の動員及びムチン遺伝子発現は、感染の8時間後γ-セクレターゼによって処置された動物の肺において減少する。(A)感染の8時間後の肺(BAL)への好中球流入である。(B)感染の8時間後のMuc5acの遺伝子発現である。
【図１１】定常状態下でGSI処理をした及びしなかったCOPD BECにおけるCD66a/c/e(CEACAM1/5/6)の細胞表面発現を示す図である。代表的なヒストグラムでは、48時間、GSIで処理した細胞における減少したCD66a/c/eの発現を示している。
【図１２】フローサイトメトリーによるALIによって培養されたCOPD BECにおけるNotch受容体の発現を示す図である。代表的なヒストグラムでは、定常状態下でCOPD BECにおいてNotch4のレベルがより低いNotch3の細胞表面発現を示している。Notch1及び2は発現されない。
【図１３】免疫組織化学によるCOPD肺におけるNotch受容体の発現を示す図である。(A)安定状態でCOPD肺におけるNotch4のレベルが低いNotch3の発現を示す代表的な顕微鏡写真。Notch1は、発現されない。(B)肺において見出される異なる細胞集団における受容体発現の定量。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明によれば、Notch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害が、好中球性炎症及び粘液産生を同時に軽減させることができることが見出されている。したがって、一実施形態では、本発明は、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、好中球性炎症及び粘液産生を治療又は予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、好中球性炎症を治療又は予防する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、粘液産生を治療又は予防する方法を提供する。
【００１６】
一態様では、本発明は、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。
【００１７】
治療又は予防することができる呼吸器感染症には、ウイルス感染症、細菌感染症及び/又は他の病原体による感染症が含まれる。
【００１８】
一実施形態では、呼吸器感染症は、ウイルス感染症である。ウイルス感染症には、例えば、インフルエンザ、ライノウイルス、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、ヒトパラインフルエンザウイルス(HPIV)、アデノウイルス及び/又はコロナウイルスによる感染症が含まれる。
【００１９】
別の実施形態では、呼吸器感染症は、細菌感染症である。細菌感染症には、例えば、肺炎球菌(S.Pneumoniae)、インフルエンザ菌(H.Influenzae)、及び/又はモラクセラ・カタラーリス(M.Catarrhalis)による感染症が含まれる。細菌感染症は、ウイルス感染症に対して二次的であり得る。
【００２０】
さらなる実施形態では、呼吸器感染症は、別の病原体による感染症、例えば、アスペルギルス症及び/又はリーシュマニア症である。
【００２１】
本発明はまた、基礎をなす呼吸器障害を伴う哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。基礎をなす呼吸器障害は、例えば、COPD、喘息、嚢胞性線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)及び/又は特発性肺線維症(IPF)であり得る。一実施形態では、基礎をなす障害は、COPDである。さらなる実施形態では、基礎をなす障害は、喘息である。
【００２２】
したがって、一実施形態では、本発明は、COPDを有する哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、COPDを有するヒトにおいてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、COPDを有するヒトにおいてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、ウイルス性呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、COPDを有するヒトにおいてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、細菌性呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、COPDを有するヒトにおいてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、二次的細菌性呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。
【００２３】
COPDを有する患者において呼吸器感染症を治療又は予防することにおけるNotch3及び/又はNotch4シグナリング阻害剤の使用に加えて、好中球性炎症及び粘液産生におけるNotch3及び/又はNotch4シグナリングの役割を考慮して、そのような阻害剤が、基礎をなすCOPDを治療又は予防するのに有用であり得ると考えられる。したがって、一実施形態では、本発明は、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、COPDを治療又は予防する方法を提供する。
【００２４】
COPD増悪は、一般に呼吸器感染症により誘発されるが、増悪の有意な割合はまた、例えば、大気汚染、患者自身の好中球又は確認ができない原因によっても誘発され得る。Notch3及び/又はNotch4シグナリング阻害剤は、原因を問わず、COPD増悪を治療又は予防するのに有用であり得ると考えられる。したがって、一実施形態では、本発明は、哺乳動物においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、COPD増悪を治療又は予防する方法を提供する。
【００２５】
一部のCOPD患者は、増悪への増加した感受性により、「頻繁増悪者」と称される。そのような患者は、通常、肺機能の低下の加速、より低い生活の質並びに入院及び死亡のより高いリスクを患う。したがって、一実施形態では、本発明は、頻繁増悪者であるCOPD患者においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、頻繁増悪者であるCOPD患者においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、COPDを治療する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、頻繁増悪者であるCOPD患者においてNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するステップを含む、COPD増悪を治療又は予防する方法を提供する。
【００２６】
Notch3及び/又はNotch4シグナリングは、任意の適当な阻害剤によって阻害することができる。本明細書で使用される場合、用語「阻害剤」とは、Notch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害することの可能な任意の薬剤、すなわち、受容体:リガンド相互作用又はNotch3及び/又はNotch4受容体の下流のあらゆる他のシグナリングイベントを妨げる任意の化合物又は治療であり得る。一実施形態では、阻害剤は、γ-セクレターゼ阻害剤である。
【００２７】
阻害剤は、天然起源(例えば、植物、動物、真核生物(eukaryatic)、細菌、ウイルス)又は合成起源(例えば、有機、無機、合成若しくは半合成分子)を含めた、様々な性質及び起源のものであり得る。例えば、阻害剤は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は化合物であり得る。
【００２８】
一実施形態では、阻害剤は、Notch3及び/又はNotch4の発現を阻害することが可能なアンチセンス核酸であり得る。アンチセンス核酸は、Notch3及び/又はNotch4受容体の配列、又はそれに相補的な配列のすべて若しくは一部を含むことができる。アンチセンス配列は、DNA、RNA(例えば、siRNA)、リボザイム等であり得る。これは、一本鎖でも二本鎖でもよい。アンチセンス配列はまた、アンチセンス遺伝子によってコードされたRNAであり得る。考慮される遺伝子又はメッセンジャーRNAの配列の一部を含むアンチセンス核酸が用いられる場合、特異的なハイブリダイゼーションを確実にするために、その配列由来の少なくとも10個の連続的な塩基、より好ましくは、少なくとも15個の連続的な塩基を含む部分を用いることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合では、これは、通常、100塩基未満、例えば、10から50塩基のオーダーで含む。このオリゴヌクレオチドは、その安定性、そのヌクレアーゼ抵抗性、その細胞透過性等を改善するために修飾することができる。アンチセンス分子の配列と標的遺伝子又はメッセンジャーRNAの配列との間の完全な相補性(complementarily)は必要とされないが、一般に好ましい。
【００２９】
別の実施形態によれば、阻害剤化合物は、ポリペプチドであり得る。これは、例えば、Notch3及び/又はNotch4受容体の領域を含み、その活性をアンタゴナイズすることが可能であるペプチドであり得る。ペプチドは、有利には、考慮されるNotch3及び/又はNotch4受容体の一次配列の5から50個の連続的なアミノ酸、通常、7から40個を含む。ポリペプチドはまた、Notch3及び/又はNotch4受容体に対する抗体であり得る。
【００３０】
用語「抗体」は、免疫グロブリン様ドメイン(例えば、IgG、IgM、IgA、IgD又はIgE)を有する分子を指すために本明細書において用いられ、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体及びヘテロコンジュゲート抗体を含めた多特異性抗体;単一可変ドメイン(例えば、VH、VHH、VL、ドメイン抗体(dAb(商標)))、抗原結合抗体フラグメント、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合されたFv、単鎖Fv、ジスルフィド結合されたscFv、二特異性抗体、TANDABS(商標)等及び前述のうち任意の修飾されたバージョン(代替の「抗体」フォーマットの要約については、Holliger and Hudson、Nature Biotechnology、2005年、23巻、9号、1126〜1136頁を参照のこと)が含まれる。代替の抗体フォーマットには、1つ以上のCDRが、適当な非免疫グロブリンタンパク質足場又は骨格に配置され得る代替足場、例えば、affibody、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、avimer(例えば、米国特許出願公開第2005/0053973号、第2005/0089932号、第2005/0164301号を参照のこと)又はEGFドメインが含まれる。さらなる抗体には、mAbdAbs、dAb(商標)コンジュゲート及びdAb(商標)融合体が含まれる。
【００３１】
用語「ドメイン」とは、タンパク質の残りと関係なくその3次構造を保持する折り畳みタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別個の機能上の特性を担い、多くの場合では、タンパク質及び/若しくはドメインの残部の機能を喪失せずに、他のタンパク質に付加し、除去し、又は導入することができる。
【００３２】
用語「単一可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳みポリペプチドドメインを指す。したがって、これには、VH、VHH及びVL等の完全抗体可変ドメイン、例えば、1つ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって置換されている修飾された抗体可変ドメイン、或いは切断されている又はN-若しくはC-末端伸張を含む抗体可変ドメイン、並びに完全長ドメインの結合活性及び特異性を少なくとも保持する可変ドメインのフラグメントが含まれる。単一可変ドメインは、異なる可変領域若しくはドメインと関係ない抗原又はエピトープに結合することが可能である。「ドメイン抗体」又は「dAb(商標)」は、「単一可変ドメイン」と同じと考えることができる。単一可変ドメインは、ヒトの単一可変ドメインであり得るが、(例えば、WO 00/29004に開示された様な)げっ歯類、コモリザメ及びラクダ科のVHH dAbs(商標)等の他の種から得られた単一可変ドメインもまた含まれる。ラクダ科のVHHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグアナコを含めた種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインであり、これは、元々軽鎖がない重鎖抗体を産生する。そのようなVHHドメインは、当技術分野で利用可能な標準的な技法に従ってヒト化することができ、そのようなドメインは、「単一可変ドメイン」と考えられる。本明細書で使用される場合、VHには、ラクダ科のVHHドメインが含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「mAbdAb」とは、さらなる結合ドメイン、特に、ドメイン抗体等の単一可変ドメインに連結されたモノクローナル抗体を指す。mAbdAbは、少なくとも2つの抗原結合部位を有し、そのうち少なくとも1つは、ドメイン抗体から得られ、少なくとも1つは、対のVH/VLドメインから得られる。mAbdAbsは、WO2009/068649に記載されている。
【００３４】
「dAb(商標)コンジュゲート」とは、薬物が、共有結合又は非共有結合によって化学的にコンジュゲートされているdAbを含む組成物を指す。好ましくは、このdAb及び薬物は、共有結合される。そのような共有結合は、ペプチド結合又は修飾された側鎖を介する等の他の手段を通じてなされ得る。非共有結合は、直接的(例えば、静電気的相互作用、疎水的相互作用)でも間接的(例えば、相補的な結合パートナー(例えば、ビオチン及びアビジン)の非共有結合によって、一方のパートナーは、薬物に共有結合し、相補的な結合パートナーは、dAb(商標)に共有結合される)でもよい。相補的な結合パートナーを使用する場合、結合パートナーの一方は、直接又は適当なリンカー成分によって薬物に共有結合することができ、相補的な結合パートナーは、直接又は適当なリンカー成分によってdAb(商標)に共有結合することができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「dAb(商標)融合体」とは、dAb(商標)及びポリペプチド薬(これは、dAb(商標)又はmAbであり得る)を含む融合タンパク質を指す。dAb(商標)及びポリペプチド薬は、単一の連続ポリペプチド鎖の別個の部分(成分)として存在する。
【００３６】
そのような抗体、フラグメント、又は誘導体は、動物を免疫化するステップ及び血清(ポリクローナル)又は脾細胞(適切な細胞株との融合によりハイブリドーマを生成するために)を回収するステップを含む、従来の技法によって産生することができる。
【００３７】
様々な種においてポリクローナル抗体を産生するための方法は、従来技術に記載されている。通常、抗原は、アジュバント(例えば、フロイントアジュバント)と合わせ、通常、皮下注射により動物に投与される。注射は繰り返し行うことができる。血液サンプルが回収され、免疫グロブリン又は血清が分離される。モノクローナル抗体を生成するための従来の方法は、抗原により動物を免疫化し、その後、脾細胞を回収し、次いで、それを骨髄腫細胞等の不死化細胞と融合させるステップを含む。得られたハイブリドーマは、モノクローナル抗体を産生し、個別のクローンを単離するために限界希釈により選択することができる。Fab又はF(ab')2フラグメントは、従来の技法に従ってプロテアーゼ消化により産生することができる。
【００３８】
Notch3及び/又はNotch4を阻害する抗体は、当技術分野で公知である。
【００３９】
さらなる実施形態によれば、阻害剤は、Notch3及び/又はNotch4受容体の発現又は活性を調節することが可能な、天然又は合成起源、特に、有機若しくは無機分子の化合物であり得る。一実施形態では、化合物は、γ-セクレターゼ阻害剤である。別の実施形態では、本化合物は、(S)-2-[2-(3,5-ジフルオロフェニル)-アセチルアミノ]-N-((S)-1-メチル-2-オキソ-5-フェニル-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[e][1,4]ジアゼピン-3-イル)-プロピオンアミドである。さらなる実施形態では、本化合物は、N2-[(2S)-2-(3,5-ジフルオロフェニル)-2-ヒドロキシエタノイル]-N1-[(7S)-5-メチル-6-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[b,d]アゼピン-7-イル]-L-アラニンアミドである。
【００４０】
本発明の一実施形態では、Notch3シグナリングが阻害される。別の実施形態では、Notch4シグナリングが阻害される。さらなる実施形態では、Notch3及びNotch4シグナリングが阻害される。
【００４１】
本発明によれば、Notch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤は、通常、治療有効量で対象に投与される。本明細書で使用される場合、「有効量」とは、例えば、研究者又は臨床家によって探求されている組織、系、動物又はヒトの生物学的若しくは医学的応答を誘発する薬物又は医薬品の量を意味する。さらに、用語「治療有効量」とは、そのような量を投与されていない対応する対象と比較して、疾患、障害又は副作用の治療、治癒若しくは寛解を改善させる、又は疾患若しくは障害の進行の速度を低下させる任意の量を意味する。本用語はまた、その範囲内で、正常な生理的機能を高めるために有効な量が含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、障害に関連した「治療する」又は「治療」とは、(1)障害又は障害の生物学的徴候の1つ以上を寛解させる若しくは予防すること、(2)(a)障害をもたらす若しくは障害を担う生物学的カスケードにおける1つ以上の点又は(b)障害の生物学的徴候の1つ以上に干渉すること、(3)障害に関連する症状若しくは影響の1つ以上を緩和すること、又は(4)障害若しくは障害の生物学的徴候の1つ以上の進行を遅くすることを意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、障害に関連した「予防する」又は「予防」とは、障害又はその生物学的徴候の可能性若しくは重症度を実質的に減らす、又はそのような障害若しくはその生物学的徴候の発生を遅延させる薬物の予防的投与を意味する。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、障害の治療に関する。さらなる実施形態では、本発明は、障害の予防に関する。
【００４５】
治療法において用いる場合、阻害剤は、未加工の化学物質(raw chemical)として投与することが可能であるが、医薬組成物として有効成分を提供することが可能である。したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも1種の医薬用担体、希釈剤又は賦形剤と共にNotch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤を含む、呼吸器感染症、COPD若しくはCOPD増悪の治療又は予防における使用のための医薬組成物を提供する。担体、希釈剤又は賦形剤は、組成物の他の成分に適合され、そのレシピエントに有害でないという意味で許容可能でなくてはならない。本発明の別の実施形態によれば、阻害剤又は薬学的に許容されるその塩を、少なくとも1種の薬学的に許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤と共に含む医薬組成物を調製するための方法も提供される。医薬組成物は、本明細書に記載した状態のいずれかの治療又は予防において用いることができる。
【００４６】
医薬組成物は、単位投与量当たり所定の量の有効成分を含有する単位投与形態で提供することができる。好ましい単位投与量組成物は、有効成分の1日量若しくは副用量を含有するもの、又は適切なその画分である。したがって、そのような単位投与量は、1日1回以上で投与することができる。そのような医薬組成物は、薬学分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。
【００４７】
医薬組成物は、任意の適切な経路により、例えば、(頬側若しくは舌下を含めた)経口、直腸、吸入、鼻腔内、(頬側、舌下若しくは経皮を含めた)局所、経膣又は(皮下、筋肉内、静脈内若しくは皮内を含めた)非経口経路により、投与に適合することができる。そのような組成物は、薬学分野で公知の任意の方法により、例えば、有効成分を、担体(複数可)又は賦形剤(複数可)と会合させることにより調製することができる。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、吸入経路により投与される。
【００４８】
経口投与に適合された医薬組成物は、カプセル剤又は錠剤;粉剤又は顆粒剤;水性若しくは非水性液体中の溶液又は懸濁液;食用の発泡体又はホイップ;又は水中油型液状乳剤若しくは油中水型液状乳剤等の別個の単位として提供することができる。
【００４９】
例えば、錠剤又はカプセル剤の形態の経口投与の場合、活性薬物成分は、エタノール、グリセロール、水等の、経口の非毒性の薬学的に許容される不活性な担体と組み合わせることができる。粉剤は、化合物を適当な細かいサイズに縮小し、食用の炭水化物、例えば、デンプン又はマンニトール等の同様に調製した医薬用担体と混合することにより調製される。矯味剤、保存剤、分散助剤及び着色剤もまた存在することができる。
【００５０】
カプセル剤は、前述した通り粉末混合物を調製し、成型されたゼラチンシースに充てんすることにより作製される。コロイドケイ酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又は固形ポリエチレングリコール等の流動促進剤(gulidant)及び滑沢剤は、充てん作業前に粉末混合物に加えることができる。カプセル剤が摂取される場合、寒天-寒天、炭酸カルシウム若しくは炭酸ナトリウム等の崩壊剤又は可溶化剤を加えて、医薬品の利用可能性を改善することもできる。
【００５１】
さらに、望まれる場合又は必要な場合、適当な結合剤、流動促進剤、滑沢剤、甘味剤、香料、崩壊剤及び着色剤はまた、混合物に取り込むこともできる。適当な結合剤には、デンプン、ゼラチン、天然の糖、例えばグルコース又はβ-ラクトース等、トウモロコシ甘味剤、天然及び合成ゴム、例えば、アカシア、トラガント又はアルギン酸ナトリウム等、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ろう等が含まれる。これらの剤形に用いられる滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤には、限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。錠剤は、例えば、粉末混合物を調製し、造粒し又はスラッギング(slugging)を行い、滑沢剤及び錠剤分解物質を加え及び錠剤に圧縮成形することにより製剤化される。粉末混合物は、適当に微粉砕された化合物を、前述した通り希釈剤又は基剤と、場合によっては、結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩(aliginate)、ゼラチン、又はポリビニルピロリドン等、溶液遅延剤、例えば、パラフィン等、再吸収促進剤、例えば、第四級塩及び/又は吸収剤、例えば、ベントナイト、カオリン又はリン酸二カルシウム等と混合することにより調製される。粉末混合物は、結合剤、例えば、シロップ、デンプンペースト、アカディア粘液又はセルロース若しくはポリマー材料の溶液で湿潤させる及びスクリーンを通過させることにより造粒することができる。造粒の代替として、粉末混合物は、錠剤機に通すことができ、その結果、顆粒に分解する不完全に形成されたスラッグが生じる。顆粒剤は、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク又は鉱油を加えることにより錠剤形成ダイに付着するのを防止するために潤滑させることができる。次いで、潤滑させた混合物は、錠剤に圧縮される。本発明の化合物はまた、自由流動性のある不活性な担体と合わせ、造粒又はスラッギングステップを経ずに、直接錠剤に圧縮することができる。シェラックのシーリングコーティング、糖若しくはポリマー材料のコーティング及びろうの光沢コーティングからなる透明な若しくは不透明な保護コーティングを提供することができる。色素は、異なる単位投与量を識別するためにこれらのコーティングに加えることができる。
【００５２】
経口用の液体、例えば、溶液、シロップ及びエリキシル剤は、所与の含量が所定の量の化合物を含有するように、投与単位形態で調製することができる。シロップは、適当に風味付けされた水性溶液に化合物を溶解することにより調製することができ、エリキシル剤は、非毒性のアルコールビヒクルを用いることによって調製される。懸濁液は、非毒性のビヒクルに化合物を分散することにより配合することができる。可溶化剤及び乳化剤、例えば、エトキシ化されたイソステアリルアルコール及びポリオキシエチレンソルビトールエーテル等、保存剤、香り添加物、例えば、ハッカ油又は天然甘味料又はサッカリン又は他の人工甘味料等を加えることもできる。
【００５３】
適切な場合、経口投与のための投与単位組成物は、マイクロカプセル化することができる。本組成物はまた、例えば、ポリマー、ロウ等で粒子材料をコーティングする又は包埋することにより、放出を延長する又は持続するために調製することもできる。
【００５４】
本発明の化合物はまた、小型単層小胞、大型単層小胞及び多層小胞等のリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、様々なリン脂質、例えば、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンから形成することができる。
【００５５】
経皮投与に適合された医薬組成物は、長期間レシピエントの表皮に本質的に接触したままであることを目的とした別個のパッチとして提供することができる。
【００５６】
局所投与に適合された医薬組成物は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁液、ローション剤、粉剤、溶液、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エアゾール剤又は油として配合することができる。
【００５７】
口中の局所投与に適合された医薬組成物には、ロゼンジ、トローチ剤及び口腔洗浄薬が含まれる。
【００５８】
経鼻又は吸入投与のための剤形は、エアゾール剤、溶液、懸濁剤、点滴薬、ゲル剤又は乾燥粉末剤として好都合には製剤化することができる。
【００５９】
吸入投与に適した及び/又は適合された組成物の場合、薬剤が、粒径が縮小された形態であることが好ましく、より好ましくは、粒径が縮小された形態は、微粒子化により得られる又は得ることが可能である。粒径が縮小された(例えば、微粒子化した)化合物又は塩又は溶媒和物の好ましい粒度は、(例えば、レーザー回折を用いて測定した場合)D50値約0.5から約10ミクロンにより定義される。吸入による投与に適合された組成物には、粒子ダスト又はミストが含まれる。担体が鼻内スプレー剤又は点滴薬として投与するための液体である適当な組成物には、様々なタイプの定量加圧エアゾール剤、ネブライザー又は注入器によって生成することができる有効成分の水性の若しくは油性の溶液/懸濁液が含まれる。
【００６０】
例えば、吸入投与のためのエアゾール製剤は、薬学的に許容される水性若しくは非水性溶媒中の薬剤の溶液又は微細懸濁液を含むことができる。エアゾール製剤は、微粒化デバイス若しくは吸入器で用いるためのカートリッジ又は詰め替え容器の形態をとることができる密封容器中で、無菌の形態で単回投与量又は多回投与量で提供することができる。或いは、密封容器は、単位分配デバイス、例えば、容器の内容物が使い尽くされた後、廃棄を目的としている、絞り弁(定量吸入器)を備えた単回投与鼻吸入器又はエアゾールディスペンサー等であり得る。
【００６１】
剤形がエアゾールディスペンサーを含む場合、これは、好ましくは、圧縮空気、二酸化炭素又はヒドロフルオロカーボン(HFC)等の有機噴射剤等の加圧下で適当な噴射剤を含有する。適当なHFC噴射剤には、1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン及び1,1,1,2-テトラフルオロエタンが含まれる。エアゾール剤形はまた、ポンプ式アトマイザーの形態をとることができる。加圧エアゾール剤は、活性化合物の溶液又は懸濁液を含有することができる。これは、懸濁液製剤の分散特性及び均質性を改善するために追加の賦形剤、例えば、共溶媒及び/又は界面活性剤の取り込みを要し得る。溶液製剤はまた、エタノール等の共溶媒の添加を要し得る。他の賦形剤調節物質はまた、例えば、製剤の安定性及び/又は味及び/又は微粒子質量特性(量及び/又はプロファイル)を改善するために取り込むこともできる。
【００６２】
吸入投与に適した及び/又は適合された医薬組成物の場合、医薬組成物は、吸入可能な乾燥粉末組成物であり得る。そのような組成物は、粉末基剤、例えば、ラクトース、グルコース、トレハロース、マンニトール又はデンプン等、薬剤、(好ましくは、粒径が縮小された形態の、例えば、微粒子化した形態の)、場合によっては、性能調節物質、例えば、L-ロイシン又は別のアミノ酸、セロビオースオクタアセテート等及び/又はステアリン酸の金属塩、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウムを含むことができる。
【００６３】
エアゾール製剤は、エアゾール剤の各定量又は「パフ」が、本発明の化合物の特定の量を含有するように好ましくは構成される。投与は、1日1回又は1日数回、例えば、2、3 4又は8回となってもよく、例えば、毎回1、2又は3つの用量を投与する。カプセル剤及び吸入器又は注入器中のカートリッジによって送達される総1日量及び定量は、一般に、エアゾール製剤の倍になる。
【００６４】
非経口(parental)投与に適合された医薬組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び組成物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性の及び非水性の無菌の注射溶液;並びに懸濁化剤及び増粘剤を含むことができる水性の及び非水性の無菌の懸濁液が含まれる。本組成物は、単位投与又は多回投与容器、例えば、密封アンプル及びバイアルで提供することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば、注射用の水の添加のみを要するフリーズドライされた(凍結乾燥した)状態で保存することができる。即時注射用液剤及び懸濁剤は、無菌の粉剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【００６５】
特に上記の成分に加えて、本組成物が、問題となる製剤のタイプを考慮して、当技術分野では通常の他の薬剤を含むことができ、例えば、経口投与に適したものが、矯味剤を含むことができるということを理解するべきである。
【００６６】
アンチセンス又はRNA干渉分子は、それを必要とする哺乳動物に投与することができる。或いは、それを含めたコンストラクトを投与することができる。そのような分子及びコンストラクトを用いて、目的とするタンパク質の発現を干渉することができ、例えば、Notch3及び/又はNotch4及びそれ自体は、遺伝子発現を修飾する。通常、送達は、当技術分野で公知の手段によってである。
【００６７】
アンチセンス又はRNA干渉分子は、in vitroで細胞に又はin vivoで、例えば、哺乳動物の腫瘍に送達することができる。送達のノード(node)は、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、腹腔内(intraperitoncal)、動脈内、手術中の局所送達、内視鏡的、皮下、及び経口を含めて用いることができる。ベクターは、任意の特定の適用についての所望の特性のために選択することができる。ベクターは、ウイルスでもプラスミドでもよい。アデノウイルスベクターは、この点において有用である。組織特異的、細胞型特異的、そうでない場合、調節可能なプロモーターを用いて、阻害ポリヌクレオチド分子の転写を制御することができる。リポソーム又はナノスフェア等の非ウイルス担体も、やはり用いることもできる。
【００６８】
薬剤の治療有効量は、例えば、対象の年齢及び体重、治療を要する正確な状態及びその重症度、製剤の性質、並びに投与経路を含めた多くの因子に依存し、最終的に、担当医又は獣医師の判断となる。特に、治療しようとする対象は、哺乳動物であり、特にヒトである。
【００６９】
阻害剤は、1日量で投与することができる。この量は、総1日量が同じであるように、1日に単回用量で、又はより通常は、1日に多回(2、3、4、5若しくは6回等)の副用量で投与することができる。
【００７０】
阻害剤は、単独で又は他の治療薬と組み合わせて使用することができる。
【００７１】
本発明による使用のための阻害剤は、1種以上の他の治療薬と組み合わせて又はそれを含めて用いることができ、別々の若しくは合わせた医薬組成物で任意の都合がよい経路により順次又は同時に投与することができる。
【００７２】
本発明による使用のための阻害剤及び医薬組成物は、例えば、コルチコステロイド、NSAID、PI3Kd阻害剤、PDE4阻害剤又は非ステロイド性GRアゴニスト等の抗炎症薬;抗コリン薬又はβ2-アドレナリン受容体アゴニスト等の気管支拡張薬;抗ムスカリン薬;抗生物質若しくは抗ウイルス薬等の抗感染薬;又は抗ヒスタミン薬から選択される、1種以上の他の治療薬と組み合わせて又はそれを含めて用いることができる。
【００７３】
さらなる態様では、本発明は、薬剤がNotch3及び/又はNotch4経路を阻害するか否かを決定するステップを含む、呼吸器感染症、COPD又はCOPD増悪の治療又は予防における使用のためのNotch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤についてのスクリーニングの方法を提供する。
【００７４】
本発明は、初めて、Notch3及び/又はNotch4シグナリングが、呼吸器感染症、COPD若しくはCOPD増悪の治療又は予防のための潜在的な治療標的であることを提案する。したがって、本発明は、Notch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害するこれらの能力に基づき、活性薬剤の同定、バリデーション、選択及び最適化のための新たな標的を提供する。
【００７５】
したがって、本発明は、呼吸器感染症、COPD又はCOPD増悪の治療又は予防における使用のためのNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害することの可能な薬剤を同定する、スクリーニングする、特徴づける又は定義する方法に関係する。これらの方法は、例えば、呼吸器感染症、COPD又はCOPD増悪における臨床使用のための多数の候補化合物をスクリーニングするために用いることができる。
【００７６】
アッセイ(スクリーニング方法)は、細胞ベースの系、動物系において又は無細胞系により実施することができる。そのような技法は、当業者に明らかであり、相互作用の程度(例えば、結合、置換若しくは競合アッセイ)又は活性、転写等の機能の程度に基づくことができる。
【００７７】
したがって、例えば、本発明は、薬剤がNotch3及び/又はNotch4シグナリングを阻害する能力を試験する方法を提供する。
【００７８】
本明細書で提供されるのは、呼吸器感染症、COPD若しくはCOPD増悪の治療又は予防に潜在的に有用であるNotch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤を同定するためのスクリーニング方法である。一方法には、試験物質の存在下及び非存在下で、Notch3及び/又はNotch4受容体若しくはその断片と、アセチル化によって修飾することができるペプチドを接触させるステップと、Notch3及び/又はNotch4活性の阻害剤として試験物質を同定するステップを含む、Notch3及び/又はNotch4シグナリングの阻害剤についてのスクリーニングを含む。Notch3及び/又はNotch4の阻害剤としてのスクリーニングのための試験薬剤(又は試験物質)は、当技術分野で公知の任意の供給源から得ることができる。これらは、天然物、精製物又は混合物、合成化合物、化合物ライブラリーのメンバー等であり得る。試験物質は、生物学的若しくは薬物活性を有することが前もって同定されているもの又は同定されていないものから選択することができる。
【００７９】
さらなる実施形態では、Notch3及び/又はNotch4受容体の阻害剤についてのスクリーニングの方法には、結合アッセイが含まれる。したがって、Notch3及び/又はNotch4受容体のその基質への結合を阻害する化合物は、競合又は直接的な結合アッセイで同定することができる。直接及び競合結合アッセイフォーマットは、イムノアッセイ及び受容体結合アッセイにおいて用いられるフォーマットに類似し、一般に当業者に周知である。
【００８０】
以下の実施例では、本発明に記載されている手法の有効性を実証し、前述の一般的な方法の特定の適用をさらに例示するために記載される。したがって、以下の実施例セクションは、決して本明細書において考えられる本発明の範囲を限定することを目的としていない。
【実施例】
【００８１】
材料及び方法:
細胞及び組織の調製
慢性閉塞性肺疾患(COPD)ドナーから得られた、気相液相界面(ALI)によって培養されたヒト気管支上皮細胞(BEC)を、完全に分化させ(Epithelix Sarl、カタログ番号EP10MD)又は24穴形式でPneumocult方法(StemCell Technologies社、カタログ番号05001)を用いて自社で培養した。自社のALI培養のための初代培養細胞を、Epithelix Sarl、カタログ番号EP18ABから取得した。
【００８２】
気管支擦過法は、University of Manchester Experimental Medicines Unitで行われた実験的気管支鏡検査法により、頻繁に(年に2回を超える)又はまれに(年に0回)増悪するCOPD患者から得られた。気管支擦過法を、下流転写分析のためにトリゾール(商標)試薬(Life Technologies社、カタログ番号15596-026)で保存した。
【００８３】
in-vivo実験の場合、8週齢の雌BALB/cマウスは、合計50μlでヒトライノウイルス血清型1b(HRV1b)ウイルス1×108プラーク形成単位(PFU)を用いて鼻腔内に感染させ、0.5mg/kgの濃度のγ-セクレターゼ阻害剤CompB N2-[(2S)-2-(3,5-ジフルオロフェニル)-2-ヒドロキシエタノイル]-N1-[(7S)-5-メチル-6-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[b,d]アゼピン-7-イル]-L-アラニンアミドで処理した又は処理しなかった。肺への炎症を評価するため、気管支肺胞洗浄液(BALF)を回収し、細胞浸潤物は、Sysmex細胞分析系(Milton Keynes、UK)において分析した。続いて、全肺を、下流遺伝子発現分析のためにトリゾール(商標)試薬1mlに入れた。
【００８４】
ALIによって培養されたCOPD BECのライノウイルス感染
感染前に、ALI細胞を、(Ca2+/Mg2+を含む)温かいPBSで2回洗浄した。続いて、ヒトライノウイルス16を、総体積50μlの培養培地中で感染効率(MOI)1又は5で適用した。ウイルスを穏やかに撹拌しながら、室温で1時間結合させた。結果的に、ウイルスを、(Ca2+/Mg2+を含む)温かいPBSで洗い落とし、細胞を、γ-セクレターゼ阻害剤CompA(S)-2-[2-(3,5-ジフルオロフェニル)-アセチルアミノ]-N-((S)-1-メチル-2-オキソ-5-フェニル-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[e][1,4]ジアゼピン-3-イル)-プロピオンアミド、(Calbiochemカタログ番号565790)を加えて又は加えずに、37℃で指示された時間さらに培養した。
【００８５】
遺伝子発現の分析
ALIによって培養されたCOPD BECから得られたリボ核酸(RNA)を、Promega全RNA単離系(Promega社、カタログ番号Z3505)に供給されたRLT緩衝液に細胞を溶解することにより調製した。次いで、RNAを、製造業者のプロトコールを用いることにより自動的に抽出した。マウス全肺RNAを、トリゾール(商標)試薬1mlで肺を最初にホモジナイズし、次いで、その後、1-ブロモ-3-クロロプロパン(BCP)(MRC社、カタログ番号BP151)で相分離を行うことにより単離した。次いで、水性相を70%エタノールで混合し、最終のRNA抽出を、自動化したPromega全RNA単離系を用いて達成した。相補デオキシリボ核酸(cDNA)を、製造業者のプロトコールに従ってMultiScribe(商標)逆転写酵素及びランダムプライマー(Applied Biosystems社、カタログ番号4368814)を用いた逆転写により合成した。特定の標的の増幅を、TaqMan(登録商標)遺伝子発現系(Applied Biosystems社、カタログ番号4369510)及び既製のTaqMan(登録商標)プライマー/プローブ(表1)を用いて定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)により行った。全般的遺伝子発現分析を、Human Genome U133 Plus 2.0遺伝子チップを用いたマイクロアレイにより行い、Epistem Ltd.(Manchester、UK)又はExpression Analysis、Inc(Durham、US)により行った。データ解析を、GC-RMA正規化アルゴリズムによるArray Studioソフトウェア(OmicSoft Corporation、Cary、US)を用いて行った。強度が幾何平均64未満のプローブを廃棄した。続いて、任意の条件間の少なくとも1.2倍の調節(気管支擦過法データセット)又は2倍の調節(ALI培養データセット)の基準を満たしたプローブをさらなる分析のために取り出した。カットオフフィルターがp≦0.05である分散分析(ANOVA)を行うことにより、最終遺伝子リストを生成した。
【００８６】
タンパク質発現の分析
分泌タンパク質の検出を、製造業者のプロトコールに従ってMeso Scale Discovery(MSD(登録商標))プラットフォームにおいて行った。特異的なアッセイのリストを、表2に示す。ケモカインCXCL6及びCCL5を、R&D systemsから購入した、カタログ番号がそれぞれDY333及びDRN00Bの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットにより検出した。タンパク質の細胞表面発現の分析を、フローサイトメトリーにより行った。簡単にいうと、ALIで成長した細胞を37℃で20分間StemPro Accutase処理により剥離した(Life Technologies社、カタログ番号A1110501)。次いで、細胞濃度を4×106細胞/mlに調整し、Alexa Fluor(登録商標)488にコンジュゲートされたCD66a/c/e(クローンASL-32、Biolegend社)、Brilliant Violet(登録商標)421にコンジュゲートされたCD271(C40-1457、BD Pharmingen)、アロフィコシアニン(APC)にコンジュゲートされたCD133(クローンAC133、Miltenyi Biotec社)及びAPC-Cy7にコンジュゲートされたCD56(クローンHCD56、Biolegend社)によって染色を行った。すべての抗Notch受容体抗体は、コンジュゲートされず、したがって、フィコエリトリン(PE)にコンジュゲートされたストレプトアビジン(Biolegend社)又はヤギ抗ウサギ抗体(Life Technologies社)による二次染色によって明らかにされた。場合によっては、PE-Cy7にコンジュゲートされた抗マウスIgG1を用いた(クローンRMG1-1、Biolegend社)。抗Notch受容体抗体の詳細を、表3に示す。分析フローサイトメトリーを、FACSCanto II(Beckton Dickinson社)を用いて行い、FlowJoソフトウェア(Tree Star、Inc. Ashland、US)を用いて分析した。
【００８７】
組織像及びイメージング
ALIによって培養されたBECを、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で終夜固定した。粘液負荷を、アルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ(AB/PAS)染色をした組織学的セクションによって評価し、GSK PTS組織学的コア施設(histological core facility)によって行った。繊毛を検出するため、固定された膜を抗β-チューブリンIV抗体(クローンONS.1A6、Sigma Aldrich社)で染色し、ロバ抗マウスIgG Alexa Fluor(登録商標)488抗体(Life Technologies社)によって明らかにした。像をZeiss社によって製造されたAxioskop 2 Plus顕微鏡で記録した。
【００８８】
免疫組織化学
肺生検を、パラフィン(parafin)ブロックで固定し、続いて、RM2235ミクロトーム(Leica Biosystems社)で3μm厚さに切開した。スライドを加工し、BenchMark ULTRAプラットフォーム(Ventana Medical Systems社)で染色し、像をZeiss社によって製造されたAxioskop 2 Plus顕微鏡で記録した。抗体の詳細を、表4に示す。
【００８９】
【表１】
2017528501.tif 000002
【００９０】
【表２】
2017528501.tif 000003
【００９１】
【表３】
2017528501.tif 000004
【００９２】
【表４】
2017528501.tif 000005
【００９３】
結果
Notch経路の成分は、COPD患者からの気管支上皮ブラッシングにおいて差次的に発現され、Notch経路、特にNotch3経路が、COPDにおける上皮細胞の病原性の表現型において役割を果たし得ることが示唆される(図2)。
【００９４】
(CompAによる処理による)γ-セクレターゼ阻害によってNotchシグナリングを干渉すると、気相液相界面(ALI)で培養され、ヒトライノウイルス16(HRV16)に感染した健常及びCOPDヒト気管支上皮細胞(BEC)において粘液分泌が減少し、繊毛の喪失を予防することが実証された(図5及び図6)。さらに、Notch阻害によって、これらの細胞による好中球関連ケモカインのHRV16誘導発現が減少するが、T-細胞ケモカイン及び抗ウイルス1型インターフェロン応答は、未変化のままである(図3、図7及び図8)。結果として、T-細胞でなく好中球の走化性が、Notchによって阻害された上皮細胞から得られた上清に応答して減少する(図9)。Notch受容体に対する活性がない、Notch sparing γ-セクレターゼモジュレーターが、Notch標的遺伝子を阻害せず、さらに、HRV16感染後粘膜毛様体の応答を変更しなかったため、これらの効果は、Notch経路に特異的であり、繊毛及び粘液産生の調節は、Notchシグナリングによって制御されることが示唆される(図4)。
【００９５】
Notchシグナリングの阻害が、in-vivoでHRV1bに感染したマウスの肺において好中球増加及びムチン発現を減少させることも実証された(図10)。また、Notch阻害が、in vitroでのBECにおける遺伝子及びタンパク質レベルでの細菌性の接着受容体の発現を減少させ、これは二次的細菌感染症への潜在的影響を示唆している(図3及び図11)。
【００９６】
最後に、上皮前駆細胞が、COPD肺における発現を反映してin vitroでNotch3受容体を優勢に発現し(図12)、Notch3の発現が高く、それより低い程度で、Notch4が検出されたこともまた見出された。Notch1及び2は、in vitroで又はin vivoで検出されなかった(図12、13及びHuman Protein Atlas Database:(http://www.proteinatlas.org/ENSG00000134250-NOTCH2/tissue)。さらに、NOTCH3及び他のNotch標的遺伝子(HES5及びHEY1)の発現は、in vitro及びin vivoでのNotch阻害に応答して特異的に調節される。
【００９７】
総合すると、これらのデータは、Notch3若しくはNotch4又はNotch3及び4シグナリングの組合せが、COPD気道上皮細胞のウイルス感染の間に病的な粘膜毛様体及び炎症反応を特異的に調節すること、並びにNotch3若しくはNotch4又はNotch3及び4の組合せ阻害が、本質的な免疫応答を未変化のまま、COPD増悪の特徴を減らす強力な治療的介入を提供することができることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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