(57)【要約】  マウスモノクローナル抗体、ならびにＣｒｙ１Ｃａデルタエンドトキシンの存在を測定および定量するために有用な方法を本明細書で記載する。特許請求される抗体はコアトキシン領域に特異的に結合するため、天然の完全長Ｃｒｙ１ＣａトキシンならびにアミノコアトキシンおよびＮ末端２９残基欠損型を検出するのに適している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−３４、４−３９、４−４０、４−４１、４−４２、および４−４５からなる抗体の群から選択される、Ｃｒｙ１Ｃａコアトキシンに特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
３−３４の名称を有するハイブリドーマによって生産される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
４−３９の名称を有するハイブリドーマによって生産される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
４−４０の名称を有するハイブリドーマによって生産される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
４−４１の名称を有するハイブリドーマによって生産される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
４−４２の名称を有するハイブリドーマによって生産される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
４−４５の名称を有するハイブリドーマによって生産される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ＰＴＡ−１２１０６１、ＰＴＡ−１２１０６２、ＰＴＡ−１２１０６３、ＰＴＡ−１２１０６４、ＰＴＡ−１２１０６５、およびＰＴＡ−１２１０６６からなる群から選択される受託番号でアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されている、請求項１に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株。
【請求項９】
ＰＴＡ−１２１０６１のＡＴＣＣ受託番号で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
ＰＴＡ−１２１０６２のＡＴＣＣ受託番号で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１１】
ＰＴＡ−１２１０６３のＡＴＣＣ受託番号で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】
ＰＴＡ−１２１０６４のＡＴＣＣ受託番号で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１３】
ＰＴＡ−１２１０６５のＡＴＣＣ受託番号で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１４】
ＰＴＡ−１２１０６６のＡＴＣＣ受託番号で寄託されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１５】
Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質の存在を特定する方法であって、
ａ）請求項１の第１のモノクローナル抗体をアッセイ表面上に固定化し、次いで前記アッセイ表面を洗浄すること、
ｂ）前記アッセイ表面を、Ｃｒｙ１Ｃａを含有すると思われる液体と、結合できる十分な時間接触させ、次いで前記アッセイ表面を洗浄すること、
ｃ）前記アッセイ表面を、レポーティング基とコンジュゲートした請求項１の異なる第２の抗体と、前記第２のコンジュゲートしたモノクローナル抗体が結合できる十分な時間接触させ、次いで前記アッセイ表面を洗浄すること、および
ｄ）前記レポーティング基の有無を検出すること
を含む方法。
【請求項１６】
Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質を定量測定する方法であって、
ａ）Ｃｒｙ１Ｃａ抗血清をアッセイ表面上に固定化すること、
ｂ）前記アッセイ表面を、Ｃｒｙ１Ｃａを含有すると思われる液体と、結合できる十分な時間接触させ、次いで前記アッセイ表面を洗浄すること、
ｃ）前記アッセイ表面を、レポーティング基とコンジュゲートした請求項１の異なる第２の抗体と、前記第２のコンジュゲートしたモノクローナル抗体が結合できる十分な時間接触させ、次いで前記アッセイ表面を洗浄すること、および
ｄ）前記レポーティング基の存在を、較正曲線と比較することによって定量すること
を含む方法。
【請求項１７】
第１のモノクローナル抗体が４−４０であり、第２のコンジュゲートしたモノクローナル抗体が４−４２である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１４年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／９８５，６５４号の優先権および利益を主張する。この出願の内容全体は、参照により本出願に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は一般に免疫学の分野であり、Ｃｒｙ１Ｃａとして知られる殺虫性のデルタ−エンドトキシンに特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、そのような抗体を生産するハイブリドーマ細胞、および幅広い試料中のＣｒｙ１Ｃａタンパク質を検出するための酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）は、胞子形成の過程で、一般にデルタ−エンドトキシンまたはＣｒｙタンパク質と呼ばれるさまざまな結晶性タンパク質トキシンを産生するグラム陽性菌である。これらの多くは幅広い農業上の害虫に対して毒性が強いが、一般に哺乳動物および大部分の他の生物に対しては無害である。そのようなデルタ−エンドトキシンの１種、Ｃｒｙ１Ｃａは、北米および南米のトウモロコシ畑で見られるある種の鱗翅目害虫に対して殺虫性である。
【０００４】
Ｃｒｙ１Ｃａは、トウモロコシにおいて完全長タンパク質として発現させた場合、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）、およびＣｒｙ１Ｆａ耐性ツマジロクサヨトウを効率的に防除することが示された（Sheets, J., et al., Entomological Society of America, Annual Meeting, Nov. 12, 2013, Austin TX）。完全長Ｃｒｙ１Ｃａホロトキシンは、昆虫の腸内の天然酵素によって切断され、昆虫および腸の状態によって約６２４残基のアミノ末端を有するコアトキシンを生ずる。したがって、Ｃｒｙ１Ｃａコアトキシン含有タンパク質および遺伝子は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、キャノーラ、および多くの場合遺伝子組換え（ＧＭ）植物と呼ばれるその他の植物などの組換え作物を開発するための魅力的な候補である。
【０００５】
有益な新しい形質を付与する組換えＤＮＡを含有するＧＭ作物種子を開発し販売する企業は、厳格な化学製品管理計画を考案、実施、および順守することを要求される。これらの管理計画は、形質の遺伝子移入および種子生産能を追跡するため、ならびに収穫時および収穫後にＧＭ形質を監視するために、組換えタンパク質のための、妥当な定量的および定性的タンパク質検出方法の使用を必要とする。これらの検出方法は、医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）および非ＧＬＰ条件下での使用のために十分なほど簡易かつ頑強でなければならない。さらにその方法は、野外の農業従事者、サイロの穀物取引業者、および国境の税関職員によって容易に用いられるほど操作性の良いものでなければならない。したがって、頑強で高品質な、操作性の良いタンパク質検出方法および市販のキットが有用であり必要である。
【０００６】
イムノアッセイは当技術分野でよく知られているが、実験室および野外環境の両方で各種植物組織において特定のトランスジェニックタンパク質産物を再現可能に検出することができる、頑強、高品質、妥当なＥＬＩＳＡ方法を開発することは、ささいなことでも平凡な作業でもない。その上さらに困難なのは、作物のトランスジェニック事象によって発現されたＣｒｙ１Ｃａを検出するためのラテラルフローストリップＥＬＩＳＡの開発に特によく適した抗体ペアを見つけることである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、モノクローナル抗体のパネル（表１）およびそれらを生産するハイブリドーマ細胞株を提供する。下表は、ハイブリドーマ系の名称およびブダペスト条約の条項にしたがってアメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されているそれらに対応するＡＴＣＣデポジット名称を示す。本発明は、Ｃｒｙ１Ｃａ酵素の存在を特定する方法を含み、この方法は、ａ）請求項１の第１のモノクローナル抗体をアッセイ表面上に固定化し、次いで前記アッセイ表面を洗浄すること、ｂ）前記アッセイ表面を、Ｃｒｙ１Ｃａを含有すると思われる液体と、結合できる十分な時間接触させ、次いで前記アッセイ表面を洗浄すること、ｃ）前記アッセイ表面を、レポーティング基とコンジュゲートした本発明の異なる第２の抗体と、前記第２のコンジュゲートしたモノクローナル抗体が結合できる十分な時間接触させ、次いで前記アッセイ表面を洗浄すること、およびｄ）前記レポーティング基の有無を検出することを含む。
【０００８】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｃａを単離するまたは検出するための特許請求されるｍＡｂを用いる方法も含み、この方法は、ａ）表面上に前記抗体を固定化すること、ｂ）前記固定化した抗体を、Ｃｒｙ１Ｃａを含有する混合物と接触させること、ｃ）Ｃｒｙ１Ｃａに結合した、前記固定化した抗体を前記混合物から分離すること、およびｄ）抗体に結合したＣｒｙ１Ｃａを、前記固定化抗体から除去することによってＣｒｙ１Ｃａを回収することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃｒｙ１Ｃａ標準曲線の図である。７段階の濃度の基準Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質を検定し、二次曲線フィッティング分析を用いて直線性があることが示された。ｒ２値が０．９９９であることから、許容可能な相関が示された。
【図２】アミノ欠損および完全長Ｃｒｙ１ＣａのＥＬＩＳＡ標準曲線を比較し、２つの標準の傾きの差を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、表１に示すｍＡｂ、およびｍＡｂを生産しＣｒｙ１Ｃａコアトキシンと特異的に結合するハイブリドーマを含む。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
これらのｍＡｂは、さまざまな植物および植物組織におけるトランスジェニック事象によって発現されたＣｒｙ１ＣａホロトキシンおよびＣｒｙ１Ｃａコアトキシンの両者を検出するために驚くほどよく適している。本発明はさらに本発明の免疫グロブリンを用いて、定量的および定性的イムノアッセイを提供する。２種ｍＡｂサンドイッチＥＬＩＳＡは、トウモロコシ葉組織におけるＣｒｙ１Ｃａタンパク質の定量について評価された。１．５２５〜１００ｎｇ／ｍＬの完全長Ｃｒｙ１Ｃａ標準スタンダード曲線は、二次フィット分析に基づいて直線性があること、および０．９９９の相関であることが確認された。２種類の分析方法（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析）により同様のタンパク質レベルについて諸試料を比較しても、トウモロコシマトリックスに添加したタンパク質の理論的濃度との比較におけるＣｒｙ１Ｃａタンパク質の回収量について諸試料を比較しても、Ｃｒｙ１ＣａのＥＬＩＳＡは正確である。本アッセイは、複数日のアッセイにわたるタンパク質レベルも正確に定量した。トウモロコシ試料を試験した場合、タンパク質レベルの測定結果は、５段階の希釈にわたって平行であったので、トウモロコシ試料に必要な希釈に基づいて偏りのない測定は起きない。
【００１３】
本発明は、生物試料中のＣｒｙ１Ｃａの存在を特定するために特許請求される抗体を用いる方法も含み、この方法は、ａ）アッセイ表面上に前記抗体を固定化すること、ｂ）前記アッセイ表面を、Ｃｒｙ１Ｃａを含有すると思われる液体と接触させ、前記アッセイ表面を適した溶液で洗浄すること、ｃ）前記アッセイ表面を、レポーティング基で標識した抗Ｃｒｙ１Ｃａ抗体と接触させ、前記アッセイ表面を適した溶液で洗浄すること、ｄ）前記レポーティング基の存在を検出することを含む。
【００１４】
本発明は、トランスジェニック植物、特にダイズおよびワタで発現したＣｒｙ１Ｃａトキシンの定量測定のための分析方法をさらに含む。Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質を、ダイズ試料からＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（商標）２０含有リン酸緩衝食塩水溶液）溶液で抽出する。抽出物を遠心分離し、水溶性の上清を回収し希釈する。希釈した試料のアリコートを、酵素コンジュゲート抗Ｃｒｙ１Ｃａモノクローナル抗体とともに、サンドイッチＥＬＩＳＡ様式の抗Ｃｒｙ１Ｃａポリクローナルまたはモノクローナル抗体コート済みプレートのウェル内でインキュベートする。サンドイッチペアの両抗体は試料中のＣｒｙ１Ｃａタンパク質を捕捉する。インキュベーション時間の最後に、ＰＢＳＴで洗浄することによって、非結合の試薬をプレートから除去する。酵素コンジュゲートを酵素基質とインキュベートし、着色産物を生成することによってＣｒｙ１Ｃａの存在を検出する。Ｃｒｙ１Ｃａは抗体サンドイッチ中に結合されるので、発色のレベルは試料中のＣｒｙ１Ｃａ濃度に比例する（すなわち、タンパク質濃度が低いと発色が低くなる）。基準波長（例えば６５０ｎｍ）の吸光度をひいた４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー用いて測定する。較正曲線は二次回帰方程式を用いて７個の標準濃度から見積もられる。本Ｃｒｙ１Ｃａ  ＥＬＩＳＡは、植物組織試料抽出物中のＣｒｙ１Ｃａの定量に十分特異的であり、感度が高い。さらに、本発明の抗体を用いて、標準ウエスタンブロッティング手順でＣｒｙ１Ｃａの存在を確認してもよい。
【００１５】
目的のタンパク質に対する抗体の調製は当技術分野でよく知られている。Galfre and Milstein, Methods in Enzymology, Vol. 73, Academic Press, New York (1981)、James W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, Orlando, Florida (1986)、Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al. ed., Wiley Interscience, New York, (1987)を参照されたい。
【００１６】
目的のタンパク質に反応性の高い抗体を調製するために、タンパク質をまず濃縮または精製しなければならない。タンパク質の比較的粗い抗原性調製物を免疫付与目的に用いてよい。しかし、ハイブリドーマが求められているモノクローナル抗体を生産しているか正確に判定するため、または免疫血清の抗体力価をアッセイするために、高精製タンパク質が必要とされる。
【００１７】
Ｃｒｙ１Ｃａを単離したら、当技術分野でよく知られた従来の方法によって、Ｃｒｙ１Ｃａに特異的な抗体を生成してよい。数週間から数カ月にわたる最適な宿主への反復注射は、免疫応答を引き起こし、有意な抗Ｃｒｙ１Ｃａ血清力価になる。好ましい宿主は哺乳動物種であり、非常により好ましい種は、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスである。そのような免疫付与した動物から採血した血液を、Ｃｒｙ１Ｃａに反応性の高い抗血清（ポリクローナル抗体）を得るための確立された方法によって加工してよい。次いで当技術分野で知られた技術にしたがって、Ｃｒｙ１Ｃａへの吸着によって、抗血清をアフィニティ精製してよい。アフィニティ精製された抗血清を、当技術分野で知られた手順を用いて、抗血清内免疫グロブリンフラクションを単離することによってさらに精製してよい。得られた材料は、Ｃｒｙ１Ｃａに反応性の高い免疫グロブリンの異種集団である。
【００１８】
抗Ｃｒｙ１Ｃａ  ｍＡｂは、精製されたＣｒｙ１Ｃａを用いて容易に調製される。ｍＡｂを生産する方法は、数十年間行われ、当業者によく知られている。アジュバント中のＣｒｙ１Ｃａの腹腔内または皮下の反復注射は、大部分の動物、特にマウスで免疫応答を引き起こす。過免疫Ｂリンパ球は動物から除去され、無限に培養可能な、適した融合パートナー細胞株と融合される。多くの哺乳動物細胞株は、ハイブリドーマ生産の適した融合パートナーである。そのような系の多くは、ＡＴＣＣおよび市販の製造業者で市販されている。
【００１９】
融合したら、得られたハイブリドーマを選択増殖培地中で１〜２週間培養する。未融合ミエローマ細胞またはミエローマ細胞間融合を混合ハイブリドーマ培養から除外するために、２種類のよく知られた選抜システムが利用できる。選抜システムの選択は、免疫付与したマウス系統および用いたミエローマ融合パートナー次第である。Taggart and Samloff, Science 219, 1228 (1982)に記載されたＡＡＴ選抜システムを用いてよいが、Littlefield, Science 145, 709 (1964)に記載されたＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選抜システムは、上記のマウス細胞および融合パートナーとの適合性から好ましい。
【００２０】
免疫特異的ｍＡｂ分泌について、次いで、使用済みの増殖培地をスクリーニングする。酵素結合免疫吸着法の手順は、この目的のために最適であるが、それにもかかわらず、大量スクリーニングに適したラジオイムノアッセイも許容される。非常に多くの関係のないまたは望まない培養を連続的に排除するように設計された多重スクリーニングを、割合の非常に低い本発明のｍＡｂを単離するために実行しなければならない。Ｃｒｙ１Ｃａに反応性の高いｍＡｂを分泌する培養は、市販のアッセイを用いてアイソタイプを決定した。
【００２１】
単一クローン性および安定性を確立するために、求められている抗Ｃｒｙ１Ｃａ  ｍＡｂを分泌するハイブリドーマ培養を、数回サブクローニングしなければならない。真核性で、非接着性の細胞培養をサブクローニングするためのよく知られた方法は、限界希釈法、軟寒天法および蛍光活性化セルソーティング技術を含む。各々のサブクローニング後、安定な抗体分泌培養を確実に確立するために、抗体分泌およびアイソタイプについて、得られた培養物を再度アッセイしなければならない。
【００２２】
抗体結合部位のいくつかが露出されたままで、Ｃｒｙ１Ｃａに結合することができるように、特許請求される抗Ｃｒｙ１Ｃａ抗体を表面に固定化することができる。抗体を固定化するスキームの幅広い組み合わせは、過去数十年間にわたって開発されてきた。固定化は、所望の表面に直接抗体を共有結合すること、または表面に抗体を架橋することによって達成することができる。
【００２３】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）などの多糖ベースのビーズへの抗体のＣＮＢｒおよびカルボジイミドカップリングは、本発明と一致する直接カップリングスキームを例示する。直接カップリングは一般に、なんらかの特定の形で抗体を配向させることはないが、直接カップリングのいくつかのタイプは、固定化物質へ抗体を再現性よく配向させることができる。
【００２４】
好ましいカップリングスキームは抗体の抗原結合領域が露出したままになるように、抗体を配向させる。そのようなスキームの１つは、抗体の重鎖に見られる天然の炭水化物を利用する。炭水化物部分を、対応するアルデヒドにまず酸化し、次いでアルデヒドを表面の第１級アミノ基と反応させることによって、抗体を有利な配向にすることができる。
【００２５】
多くのタイプの架橋が可能であり、抗体を固定化物質に共有結合する小分子の有機リンカーを含む。そのようなスペーサーアームは許容され、好ましくは、一度架橋が形成されたら、タンパク質と相互作用してはならない。
【００２６】
上記の考察は本発明の範囲を狭く限定することを少しも意味していない。抗体を固定化物質へ結びつける多くの他のよく知られたスキームは本発明と一致する。
【００２７】
レポーティング基で標識された抗体を用いて、さまざまな環境中の抗原の存在を特定することができることはよく知られている。放射性同位体で標識された抗体が、ラジオイムノアッセイにおいて、さまざまな体液中の抗原の存在を高精度かつ高感度で特定するために数十年間用いられてきた。最近になって、一般的なＥＬＩＳＡにおいて酵素標識抗体が放射性標識抗体の代わりに用いられるようになってきた。
【００２８】
本発明の抗体をポリスチレンウェルまたは粒子などの固定化物質に結合させ、イムノアッセイにおいて、試験試料中にＣｒｙ１Ｃａが存在するかどうか決定するために用いることができる。本発明の本実施形態では、試料をイムノアフィニティー表面に接触させ、インキュベートすることができる。洗浄ステップ後、イムノアフィニティー表面に結合しているどのようなＣｒｙ１Ｃａも、レポーティング基で標識された本発明の他の抗体と、表面を接触させることによって検出される。
【００２９】
特許請求される抗体およびアッセイ方法とともにラテラルフローストリップまたはイムノクロマトグラフィーストリップを使用することは、本発明と一致する。ラテラルフローアッセイは当技術分野でよく知られている。例えば米国特許第６，４８５，９８２号明細書を参照されたい。このモードでラテラルフロー試験を、単独または他の分析物と同時にＣｒｙ１Ｃａの定性的または半定量的検出に用いることができる。ラテラルフロー試験は、本明細書に記載のすべての試験様式を使用するために最も簡便であり、植物材料が迅速に溶液中に抽出され、ラテラルフローストリップ上で検定される野外環境において特に有用である。このモードではラテラルフローストリップを液体試料中に置くこと、またはラテラルフローストリップに液体試料を加え、所定の時間後に結果を読み取ることだけが必要である。すべてのラテラルフロー試験は、試験結果を検証するために用いられる、手順コントロールラインまたは試料コントロールラインのどちらかを取り入れるべきである。したがって２つのラインの外観は陽性結果を示し、一方、有効な陰性試験はコントロールラインのみを生じる。試験ラインのみが出現しても、またはラインが出現しなくても無効である。
【００３０】
典型的なラテラルフロー試験ストリップは４つの主要構成要素からなる。試験試料を塗布するサンプルパッド、着色粒子にコンジュゲートした本発明の抗体を含むコンジュゲートパッド（典型的にコロイド金粒子またはラテックス微粒子）、本発明の異なる抗体がキャプチャーゾーンまたはテストラインとして膜を横切ってライン状に固定化された、疎水性のニトロセルロース膜または酢酸セルロース膜などの反応膜、および毛管現象によって反応膜を横切った試料を吸い上げるように設計された廃液リザーバである。
【００３１】
ラテラルフローストリップの構成要素は、通常は不活性な支持材料に固定化され、簡便なディップスティック様式で、またはキャプチャーゾーンおよびコントロールゾーンを示す試料添加窓および反応窓を持つプラスチックケースに入った状態で提示される場合がある。アッセイ実施形態の他のモードでは、Ｃｒｙ１Ｃａを含有すると思われる試験試料を表面上で乾燥させ、固定化試験試料を形成する。次いで、本発明の標識抗体を固定化試験試料と接触させ、インキュベートすることができる。試料がＣｒｙ１Ｃａを含むならば、標識抗体は固定化Ｃｒｙ１Ｃａと結合する。本方法は、本発明の非標識抗体、続いて、すでにＣｒｙ１Ｃａと結合している本発明の抗体と結合する第２の標識抗体を用いて行うこともできる。洗浄後、固定化試験試料を、いずれかのレポーティング基の存在を検出するために測定する。
【００３２】
レポーティング基は、典型的にアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素である。酵素と反応すると、適した基質は色の変化を生じる。その際、色の強さの測定は、分光光度計を用いて定量することができる。レポーティング基が放射性同位体ならば、適切なガンマ線またはベータ線の検出機器を用いてレポーティング基を定量することができる。レポーティング基の強度は、試験試料中のＣｒｙ１Ｃａ量と直接相関がある。
【００３３】
以下の実施例は、本発明がどのように行われるのかの記載を助け、特許請求される抗Ｃｒｙ１Ｃａ抗体およびアッセイの特徴を示す。
【実施例１】
【００３４】
免疫原調製
完全長Ｃｒｙ１Ｃａホロトキシンは、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）タンパク質発現システムを用いて得た。例えばRetallack et al., Protein Expression and Purification; Vol 81, 2, ppl57-165; Feb. 2012、を参照されたい。５〜１０グラムの細胞ペーストを用いて、タンパク質試料を調製した。高発現系（０．５ｇ／ｌまで）では、５ｇの細胞ペーストで十分であった。低発現系では、典型的に１０ｇの細胞ペーストを処理した。宿主細胞を１０〜２０倍量または２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍｌの溶液中でホモジナイザー（Ｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ  Ｐｒｏ３００Ａ）で懸濁し、氷上で１０分間、超音波で分解した（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４５０）。１２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離後、可溶性タンパク質を含む上清を廃棄した。標的タンパク質を含む沈殿物を１００ｍｌの新鮮溶液で洗浄し（前回通りに）、次いで遠心分離した。回収された封入体（ＩＢ）が透明になるまで、本工程を２〜３回繰り返した。１０ｍＭ  ＤＴＴおよび４Ｍ尿素を含む１０ｍｌの５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１１溶液をＩＢ（湿重量）のグラムあたりで添加し、室温で約２時間、ロッキングプレート上でタンパク質を可溶化した。試料を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清をＳｎａｋｅＳｋｉｎ（商標）プリーツ付き透析用チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０ｋＤａカットオフ）へ移し、１０ｍＭ  ＤＴＴを含む１Ｌの５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１１に対して、４℃で一晩透析した。沈殿を除去するために、試料を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【００３５】
上清を回収し、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）Ｑ（ＧＥＨＣ、Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗまたはＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム）上に５ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。カラムを２〜３倍のカラム容量で洗浄し、次いで０〜１００％バッファーＢ（バッファーＡ中に１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１１、１０ｍＭ  ＤＴＴに相当）を用いて２０分以上溶出し、２．５ｍｌのフラクションを回収した。次いでピークの溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。フラクション番号１０〜２０に対応する、２０〜４５ｍＳ／ｃｍの塩から溶出したＣｒｙ１Ｃａ、および２０μｌの試料をゲル分析のために採取した。Ｃｒｙ１Ｃａコアタンパク質を含む大半の早く溶出するピークをプールし、５０ＫＤａカットオフフィルターを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮ユニットへ移し、４０００ｒｐｍ、室温で５〜１５分間遠心分離した結果、約１ｍｌの最終試料量になった。試料を２４ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（１０／３００寸法）上に１ｍｌ／分で注入した。サイズカラムを２０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１１、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＤＴＴバッファーで流し、１ｍｌのフラクションを回収した。主要なピークをカバーするフラクションについて、２０μｌの試料アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。典型的に高分子のオリゴマーは１３〜１４分で溶出し、低分子で単量体の標的タンパク質は１６分以降に溶出した。精製されたＣｒｙ１Ｃａトキシンをプールし、−２０℃で保存した。
【００３６】
ホロトキシンのトリプシン切断によるさらなるアッセイ妥当性試験のために、アミノ欠損Ｃｒｙ１Ｃａコアトキシン（２９〜６２８残基）を調製した。精製されたＣｒｙ１Ｃａホロトキシンの試料は、抗Ｃｒｙ１Ｃａポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによって、期待されたサイズの陽性シグナルを示した。Ｃｒｙ１Ｃａを添加した食餌で飼育された生まれたばかりのコナガ幼虫を用いた昆虫バイオアッセイによって、精製されたＣｒｙ１Ｃａホロトキシンおよびアミノ欠損コアトキシンの生物活性を確認した。
【実施例２】
【００３７】
ハイブリドーマ調製
精製されたＣｒｙ１Ｃａでマウスを免疫付与し、標準ハイブリドーマ融合技術を用いて、抗Ｃｒｙ１Ｃａモノクローナル抗体発現ハイブリドーマパネルを調製した。使用済み組織培養培地の試料を、ハイブリドーマ培養を含む各々のウェルから無菌で除去し、以下の抗体キャプチャーＥＬＩＳＡ法を用いて、Ｃｒｙ１Ｃａ反応性をアッセイした。マイクロタイターウェルを１〜１０μｇ／ｍＬの精製されたＣｒｙ１Ｃａ溶液でコートした。ウェルを洗浄し、使用済み組織培地の試料をウェル内に置きインキュベートした。ウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗血清を添加しインキュベートした。プレートを洗浄し、呈色反応を行うために基質を添加し、ＯＤ（吸光度）についてプレートを読み取った。ＯＤ測定値が高いウェルを、もとのハイブリドーマを含む培養ウェルへマップした。培養を拡大した場合に増殖安定性および抗体生産を保証するために、Ｃｒｙ１Ｃａ抗体陽性培養物を抗体生産について継続的にスクリーニングした。数回の限界希釈クローニングを実行し、各培養物の真の単一クローン性を確立した。抗体陽性クローンのさらなるアッセイを行い、植物材料を用いた野外使用のための特許請求される本検出方法において用いられる各抗体の適合性を判定した。Ｃｒｙ１Ｃａホロおよびコアトキシンへの特異性について、モノクローナル抗体をスクリーニングした。交差反応についてすべての抗体を検定したところ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｄａ、およびＣｒｙ１Ｆと交差反応するものは見つからなかった。
【実施例３】
【００３８】
定量的ＥＬＩＳＡ妥当性試験
抗体４−４０をキャプチャー抗体として用い、０．７５％オボアルブミン（ＰＢＳＴ／ＯＶＡ）を含むＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含むリン酸緩衝食塩水溶液）中に１μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルマイクロタイタープレートにコートし、次いで冷蔵保存した。検出抗体、４−４２を、標準技術用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした。抗体コート済みマイクロタイタープレート、液体ＨＲＰコンジュゲート４−４２（１×）、酵素基質溶液、および標準反応停止剤からなるアッセイキットを、本妥当性実験で用いるために調製した。
【００３９】
直線性試験は、すべての濃度にわたって曲線が直線状であるか判定するためにバッファーで希釈したＣｒｙ１Ｃａホロトキシンタンパク質標準曲線で、Ｃｒｙ１Ｃａキットを試験することからなっていた。コート済み抗Ｃｒｙ１Ｃａアッセイプレートを室温に置いた（約３０分間）。Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質標準（ＰＢＳＴ中１００ｎｇ／ｍＬ）を調製した。特に断りのない限り、本実験の希釈バッファーとしてＰＢＳＴを用いた。
【００４０】
２００μＬのＣｒｙ１Ｃａ標準を列Ａのカラム１０〜１２に３連で添加した。１００μＬのＰＢＳＴバッファーをカラム１０〜１２の残りのウェルに添加した。１００μＬの第１の標準を取り、バッファーを含む次のウェルに加えることによって、プレートのカラムで２倍の段階希釈を行い、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、および１．４５２５ｎｇ／ｍＬのＣｒｙ１Ｃａ標準曲線を作成した。プレートをシールし、プレートシェーカーを用いて、室温で１時間振盪した。Ｑｕａｄｒａ  Ｗａｓｈ（商標）２プレートウオッシャー、（Ｔｏｍｔｅｃ）を用いて、プレートを４回ＰＢＳＴで洗浄した。
【００４１】
洗浄後、１００μＬのＣｒｙ１Ｃａ／ＨＲＰ酵素コンジュゲートをプレートのウェルに添加した。プレートをシールし、室温で３０分間振盪した。次いでプレートを、プレートウオッシャーを用いて洗浄した。１００μＬのＨＲＰ基質溶液を、プレートのウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。１００μＬの停止溶液（０．４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を、プレートのウェルに添加した。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【００４２】
基準のＣｒｙ１Ｃａ標準曲線（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、および１．４５２５ｎｇ／ｍＬ）は、これらの濃度が二次フィット分析に基づいて直線状であることを示した（図１）。この直線性は０．９９９の相関（ｒ２）値に基づいて判定された。この曲線は、本妥当性のためのＥＬＩＳＡによる以降のすべての試験で用いられた。
【００４３】
欠損Ｃｒｙ１Ｃａコアトキシンを用いて上記アッセイを反復し、ホロトキシンの結果と比較した（図２）。ホロトキシンとコアトキシンの間では約１００％サイズが異なるために、完全長トキシンの傾きは、コアトキシンの傾きと著しく異なった。本レベルＩ妥当性試験は、定義されたレベルの性能でＣｒｙ１Ｃａホロまたはコアトキシンのいずれかを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイは、得られた結果において高い信頼性を提供することが必要であることを実証した。
【００４４】
これらの方法の精度は、何日にもわたる標準「添加」実験の結果を用いて判定された。標準を使い捨てバイアルに分配し、試験に用いるまで−８０℃で保存した。標準偏差および変動係数百分率を、６回の合計した添加反復の各々について算出した。表２に示すように、５０〜０．８０ｎｇ／ｍｌの期待された濃度間の２０％未満の許容範囲で、各レベルの強化について変動係数を算出した。
【００４５】
【表２】
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【実施例４】
【００４６】
選択性／マトリックス効果
トランスジェニックトウモロコシ葉組織がないものを、Ｃｒｙ１Ｃａ標準とともにマトリックス干渉について検定した。トウモロコシ葉組織の混合物を４０ｍＬの抽出バッファー（ＰＢＳＴ＋５μｌ／ｍｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、カタログ番号  Ｐ９５９９  Ｓｉｇｍａ）および４０個のＤａｉｓｙ（商標）ＢＢ（４．５ｍｍ）とともに５０ｍＬコニカルチューブに入れた。チューブを改良塗料シェーカーで３分間振盪し、次いで３６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、氷上に置き、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて全可溶性タンパク質について検定した。全タンパク質濃度を定量したら、トウモロコシマトリックスで用いられるように、マトリックスをＰＢＳＴ中に０．２４ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【００４７】
精製されたＣｒｙ１Ｃａタンパク質標準をトウモロコシマトリックス溶液中に１００ｎｇ／ｍＬになるように希釈し、１００μＬをＣｒｙ１Ｃａコート済みマイクロタイターアッセイプレートのウェル、列Ａのカラム１０〜１２に３連で添加した。１００μＬのトウモロコシマトリックス（Ｃｒｙ１Ｃａ標準無し）をプレートの残りのウェルに添加した。アッセイプレートのカラムで２倍の段階希釈を行い、実施例３のＥＬＩＳＡキットを用いて検定した。マトリックス効果は、マトリックスに添加した理論的タンパク質量と比較して、各標準濃度に対するＥＬＩＳＡによって定量した回収率（％）によって定量した。トウモロコシマトリックスが存在する場合、許容レベルでＣｒｙ１Ｃａが検出できるかどうか、トウモロコシマトリックスに添加した基準Ｃｒｙ１Ｃａを用いて判定した。トウモロコシ試料は通常は１：２５で希釈されるので、したがって試料中の全抽出可能な可溶性タンパク質濃度は０．２４ｍｇ／ｍＬである。この濃度はトウモロコシマトリックスを含むすべての試験で用いられる。
【００４８】
ＥＬＩＳＡの結果に基づいて、７種類のＣｒｙ１Ｃａ標準濃度の各々は、マトリックスに添加された理論的タンパク質と比較して許容シグナル（８０〜１２０％）を持っていた（表３）。したがって、検定したトウモロコシマトリックス濃度で、どのＣｒｙ１Ｃａ標準でもマトリックス効果は観察されなかった。
【００４９】
【表３】
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【実施例５】
【００５０】
正確度
ＥＬＩＳＡ結果をウエスタンブロットと比較することによってアッセイの正確度を判定した。Ｃｒｙ１Ｃａホロトキシンを発現するように遺伝子組換えを行ったトウモロコシ植物由来の３つの葉試料を上記のように抽出した。次いで試料を３６００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μＬの上清を除去し、ＥＬＩＳＡで使用するまで氷上に置いた。２００μＬの抽出用バッファーを試料に添加し、抽出工程を繰り返した。次いで、両抽出由来の上清を一緒にプールした。試料を２、４、８、１６、および３２倍に、２連で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。Ｃｒｙ１Ｃａ標準を調製し、プレートに２連で１００ｎｇ／ｍＬから開始して添加した。次いでＥＬＩＳＡアッセイを上記方法に基づいて行った。各試料のすべての希釈を一緒に平均して、各トウモロコシ試料の平均ｎｇ／ｍＬ値を得た。
【００５１】
上記ＥＬＩＳＡ試験由来の抽出物を用いて、２連で、ウエスタンブロット分析によって、３つのトウモロコシ試料を試験した。上清を回収後、４００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む４×ローディングバッファー（ＮＵＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を試料抽出物に添加し、最終濃度が１×になるようにした。試料を９０℃で５分間加熱した。試料、完全長Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質標準（２０ｎｇ／レーン、１０ｎｇ／レーン）、欠損Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質標準（２０ｎｇ／レーン、１０ｎｇ／レーン）、およびネガティブトウモロコシマトリックスを、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮＵＰＡＧＥ  Ｍｉｎｉ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。ゲルの各レーンにロードしたら、ゲルボックスを２００Ｖで４５分間作動させた。ゲルの分離後、タンク式転写装置で、タンパク質を膜に転写した。ブロットモジュール（Ｘｃｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ（商標）モジュール、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を以下の順序、モジュールの下部（陰極）部分、３個のプレウェットフィルターパッド、１枚のプレウェット濾紙、ミニゲル、膜（ＰＶＤＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１枚のプレウェット濾紙、３個のプレウェットフィルターパッド、およびモジュールの上部（陽極）部分、で組み立てた。次いで転写サンドイッチを転写タンク内に置き、１×Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をタンクの内側および外側チャンバーに添加した。ゲルを低温室で一晩、５Ｖで転写した。転写後、５０ｒｐｍで振盪しながら、６０分間、室温で、膜をＥＣＬ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロックした。ブロッキング溶液を除去し、ブロッキングバッファー中に１μｇ／ｍＬになるように希釈した一次抗体（ウサギ抗Ｃｒｙ１Ｃａ欠損）を膜に添加し、室温で１時間振盪した。一次抗体を除去し、ブロットをＰＢＳＴで２回すすぎ、ＰＢＳＴで５分間、２回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳＴで１：５０００に希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ、ＫＰＬ）を膜に添加し、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。次いで二次抗体を除去し、膜をＰＢＳＴで３回すすぎ、ＰＢＳＴで５分間ずつ４回洗浄し、次いで１×ＰＢＳで３回すすいだ。洗浄後、ブロットを４ｍＬの化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｏｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（商標）およびＳｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に４分間さらした。基質を除去し、ブロットをプラスチックラップで覆った。次いでブロットを暗室へ持っていき、ゲル上に存在するタンパク質を検出するためにフィルムに曝露した。フィルム上にタンパク質画像が表示されたら、フィルムをＳｙｎｇｅｎｅ  ＸＲ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）でスキャンし、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて標準および試料バンドの濃度測定を行った。結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】
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【実施例６】
【００５３】
平行性
試料の多重段階希釈がＣｒｙ１Ｃａ発現トウモロコシ植物の偏りのある測定結果にならないはずのアッセイにおいて、特許請求される抗体が利用可能であることを確実にするために、Ｃｒｙ１Ｃａアッセイの平行性を検定した。Ｃｒｙ１Ｃａを発現するように遺伝子組換えを行ったトウモロコシの６つの葉試料をＥＬＩＳＡによって検定した。表５に示すように、各試料について、５種類の希釈（１：４、１：８、１：１６、１：３２、および１：６４）は標準曲線の定量的範囲内に入り、定量化された結果のＣＶ（変動係数）は２０％未満であることがわかった。各試料は３連で検定し、個別に検定した試料内の各希釈について平均濃度を決定した。ＳＤは標準偏差に相当し、％ＣＶを決定するために用いた。検定した希釈範囲にわたって、タンパク質濃度の増加または減少が推定される傾向はなかった。したがって、Ｃｒｙ１Ｃａ  ＥＬＩＳＡは、Ｃｒｙ１Ｃａ陽性トウモロコシ植物の５種類の希釈にわたって平行性があることを実証した。
【００５４】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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