(57)【要約】重鎖定常領域と融合され、体細胞で高頻度変異した軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインを含有する結合タンパク質を作製する、特定する、単離する及び／または作製する方法が提供される。小分子に特異的な例となる結合タンパク質も提供される。本発明は、概して、小分子と結合するＶＬ抗原結合タンパク質、及び／ならびにＶＬ抗原結合タンパク質の相互作用を特徴付けること及びその特徴付けに由来する情報を使用して、従来の抗体によっては示されない結合特性を持つ抗原結合ＶＬタンパク質の選択の指針として使用することができる群にＶＬ抗原結合タンパク質を選別することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、前記第１と前記第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが会合して小分子と特異的に結合する結合ポケットを形成する、前記抗原結合タンパク質。
【請求項２】
前記第１及び／または前記第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインがヒトの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記軽鎖可変ドメインの前記結合ポケットが５０ｎＭ以下の親和性で前記小分子と結合する請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
前記第１及び／または前記第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが第１の免疫グロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
前記第１の免疫グロブリン重鎖定常領域が非ヒト動物に由来する請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記非ヒト動物が、マウス及びラットから選択される齧歯類である請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが、（ａ）Ｖκ４−１遺伝子断片、Ｖκ１−５遺伝子断片、Ｖκ３−１５遺伝子断片、Ｖκ３−２０遺伝子断片、またはＶκ１−３３遺伝子断片、及び（ｂ）Ｊκ１遺伝子断片、Ｊκ３遺伝子断片、Ｊκ４遺伝子断片、またはＪκ５遺伝子断片に由来する第１の再構成された軽鎖可変領域遺伝子によってコードされる請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
前記第１の再構成された軽鎖可変領域遺伝子がＶκ４−１遺伝子断片及びＪκ１遺伝子断片に由来する請求項７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記第１の再構成された軽鎖可変領域遺伝子が、１−５Ｖκ遺伝子断片と、Ｊκ３遺伝子断片、Ｊκ４遺伝子断片及びＪκ５遺伝子断片から成る群から選択されるＪκ遺伝子断片に由来する請求項７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが、ヒトの３−２０Ｖκ遺伝子断片に由来する再構成された軽鎖可変領域遺伝子によってコードされる請求項７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
小分子と特異的に結合するＶＬ抗原結合タンパク質の作出方法であって、
（ａ）遺伝子操作された非ヒト動物を前記小分子で免疫するステップであって、前記遺伝子操作された非ヒト動物が
（ｉ）非ヒトの重鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒトの免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片と、
（ｉｉ）非ヒトの軽鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒトの免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）と軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片とを含む、前記免疫するステップと、
（ｂ）前記免疫された非ヒト動物から細胞またはＶＬ抗原結合タンパク質を単離するステップであって、前記細胞またはＶＬ抗原結合タンパク質は前記小分子と特異的に結合する、前記単離するステップとを含む、前記作出方法。
【請求項１２】
さらに、（ｃ）ベクターの発現に十分な条件にて前記ベクターによって形質移入された細胞を培養することを含み、前記ベクターはヒトの重鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結された核酸を含み、前記核酸はステップ（ｂ）にて単離された前記ＶＬ抗原結合タンパク質の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列と同一であるまたは実質的に同一である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、（ｃ）ハイブリドーマの培養の上清からＶＬ抗原結合タンパク質を回収するステップを含み、前記ハイブリドーマはステップ（ｂ）にて単離された前記細胞から産生される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、（ｄ）ベクターの発現に十分な条件で前記ベクターによって形質移入した細胞を培養することを含み、前記ベクターはヒトの重鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結された核酸を含み、前記核酸はステップ（ｃ）にて回収された前記ＶＬ抗原結合タンパク質の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列と同一であるまたは実質的に同一である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記小分子が、担体に連結されたハプテンまたは分子量が６ｋＤａ未満である有機化合物である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒト動物が哺乳類である請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記非ヒト動物がマウスまたはラットから選択される齧歯類である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の前記方法に従って単離される細胞から作出されるハイブリドーマ。
【請求項１９】
請求項１１に記載の前記方法に従って単離されるＶＬ抗原結合タンパク質の可変ドメインをコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１１に記載の前記方法に従って単離される細胞。
【請求項２１】
遺伝子操作された非ヒト動物であって、
（ａ）そのゲノム内に
（ｉ）非ヒトの重鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒトの免疫グロブリンの軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片と
（ｉｉ）非ヒトの軽鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒトの免疫グロブリンの軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片とを含み、及び
（ｂ）小分子と特異的に結合するＶＬ抗原結合タンパク質を含む、前記遺伝子操作された非ヒト動物。
【請求項２２】
前記非ヒト動物が、参照の非ヒト動物に比べて小分子に特異的な結合タンパク質の力価で２倍以上の増加を示す請求項２１に記載の遺伝子操作された非ヒト動物。
【請求項２３】
従来の抗体に比べて抗原に特徴的な独特の結合を示す１以上のＶＬ抗原結合タンパク質の特定方法であって、
（ａ）抗原と結合する複数の免疫グロブリンタンパク質のそれぞれの１以上の結合特性をプロファイリングすることであって、前記複数の免疫グロブリンタンパク質はＶＬ抗原結合タンパク質及び従来の抗体を含み、
各ＶＬ抗原結合タンパク質は（ｉ）１以上の軽鎖可変領域の遺伝子断片に由来する可変ドメインと（ｉｉ）１以上の重鎖定常領域の遺伝子断片に由来する定常ドメインとを含むハイブリッド免疫グロブリン鎖を含み、
各従来の抗体は１以上の重鎖可変領域に由来する免疫グロブリンの重鎖可変領域と１以上の軽鎖可変領域の遺伝子断片に由来する免疫グロブリンの軽鎖可変領域の遺伝子断片とを含む、プロファイリングすることと、
（ｂ）前記免疫グロブリンタンパク質のそれぞれの少なくとも１つの結合特性に基づいて前記複数の免疫グロブリンタンパク質を１以上の群にビニングすることであって、類似の結合特性を示すＶＬ抗原結合タンパク質及び従来の抗体が同一群にビニングされる、ビニングすることと、
（ｃ）すべてのまたは実質的にすべてのＶＬ抗原結合タンパク質を含む群を特定することとを含む、前記特定方法。
【請求項２４】
前記複数の免疫グロブリンタンパク質それぞれの１以上の結合特性を差別的抗原かく乱によってプロファイリングする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、前記複数の免疫グロブリンタンパク質それぞれが結合する前記抗原の１以上のエピトープをマッピングすることを含み、その際、前記抗原の同一エピトープと結合する免疫グロブリンタンパク質が同一の機能群にビニングされる請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫グロブリンタンパク質それぞれのビニングが主成分分析（ＰＣＡ）を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリンタンパク質それぞれのビニングが階層的クラスタ分析を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
群が、会合定数、解離定数、エピトープ特異性、エピトープ親和性またはそれらの組み合わせを含む結合特性に基づく請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、最後のステップとして、（ｄ）すべてのまたは実質的にすべてのＶＬ抗原結合タンパク質を含むと特定された機能群にビニングされた１以上のＶＬ抗原結合タンパク質を単離することを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、最後のステップとして、（ｅ）単離された前記１以上のＶＬ抗原結合タンパク質が、従来の抗体によって認識されない前記抗原の１以上のエピトープと結合することを確認することを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、単離された前記１以上のＶＬ抗原結合タンパク質の前記ハイブリッド免疫グロブリン鎖の配列を決定することを含む請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／９６８，８９６号、２０１４年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０８８，１１７号、及び２０１４年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／０７９，０７８号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、該出願のそれぞれは参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、小分子と結合するＶＬ抗原結合タンパク質、及び／ならびにＶＬ抗原結合タンパク質の相互作用を特徴付けること及びその特徴付けに由来する情報を使用して、従来の抗体によっては示されない結合特性を持つ抗原結合ＶＬタンパク質の選択の指針として使用することができる群にＶＬ抗原結合タンパク質を選別することに関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、生物学的な診断及び／または治療にとって有望なモダリティとして出現している。たとえば、中和抗体は、病原体が定着し、感染に達する前に病原体を妨害し、不活化することができる。アンタゴニスト抗体は、たとえば、腫瘍の進行または自己免疫において広く行き渡っている調節不全のシグナル伝達に干渉することができ、アゴニスト抗体は免疫応答を高めるのに使用することができる。これらの能力はある程度、抗体が結合する抗原の部位であるエピトープの抗体の特異的な認識及びエピトープへの親和性に基づく。多数の抗体が１つの標的抗原に対して生成されてもよく、各抗体が親和性とエピトープ認識のいずれかまたは双方の点で実質的に異なってもよい。さらに、従来の抗体における抗原結合部位がすべての抗原に上手く適合するわけではないので今までのような抗体に基づく設計は限定され得る。本発明は、免疫グロブリンに基づく治療設計の改善及び多様化に関するニーズが残っているという認識を包含する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書に記載されている種々の態様及び実施形態は、免疫グロブリンの重鎖定常領域に操作可能に連結された軽鎖可変ドメインと免疫グロブリンの軽鎖定常領域に操作可能に連結された軽鎖可変ドメインとを含有する結合タンパク質を発現する遺伝子操作された非ヒト動物が本明細書で認識される種々の課題を解決することができ、及び／または驚くべき結果をもたらすことができるという驚くべき発見にある程度基づく。たとえば、非ヒト動物であって、そのゲノムが（ｉ）再構成されていないヒト軽鎖遺伝子断片（たとえば、ＶＬ及びＪＬの遺伝子断片）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座と（ｉｉ）再構成されていないヒト軽鎖遺伝子断片（たとえば、ＶＬ及びＪＬの遺伝子断片）を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座との双方を含む、非ヒト動物は、さらに多様化した抗原結合タンパク質のレパートリー、たとえば、ＶＬ結合タンパク質を提供することができ、それは従来のヒト化された非ヒト動物から得るのは困難であった。本明細書で開示される遺伝子操作された動物にて生成されるＶＬ抗原結合タンパク質は、従来の抗体によって達成され得るよりも高い親和性で小分子に結合し、さらに従来の抗体によって示されるものとは異なる１以上の結合の特性または特質を示し得る。
【０００５】
一般に、本明細書で開示されるようなＶＬ抗原結合タンパク質は、小分子と特異的に結合し、重鎖定常領域に操作可能に連結される免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むハイブリッド免疫グロブリン鎖を含む。ＶＬ抗原結合タンパク質はまた、第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでもよく、その際、第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは会合して小分子と特異的に結合する結合ポケットを形成する。一部の実施形態では、本発明は、会合して結合ポケットを形成する第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインから本質的に成る抗原結合タンパク質を提供し、その際、該抗原結合タンパク質は小分子と特異的に結合する。
【０００６】
一部の実施形態では、重鎖定常領域に操作可能に連結される第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。このハイブリッドＶＬ−ＣＨ免疫グロブリン鎖は、軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子断片と重鎖定常領域遺伝子に操作可能に連結された軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子断片とに由来する。第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは軽鎖定常領域ドメインに操作可能に連結されてもよい（ＶＬ−ＣＬ）。
【０００７】
一部の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質の各鎖は、免疫グロブリン重鎖可変領域の遺伝子断片によってコードされる及び／またはそれに由来するアミノ酸配列を欠く。
【０００８】
一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、Ｖκ４−１、Ｖκ１−５、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０及びＶκ１−３３から成る群から選択されるヒトＶκ遺伝子断片に由来する再構成された軽鎖可変ドメイン遺伝子によってコードされる。別の実施形態では、Ｊκ１、Ｊκ３、Ｊκ４及びＪκ５から成る群から選択されるＪκ遺伝子断片に由来する第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。別の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ１−５遺伝子断片に由来する。別の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ１−５遺伝子断片に由来し、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ３−２０遺伝子断片に由来する。別の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ１−５遺伝子断片に由来し、Ｊκ遺伝子断片はＪκ３、Ｊκ４及びＪκ５から成る群から選択される。一実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ４−１遺伝子断片に由来する。別の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ４−１遺伝子断片及びＪκ１遺伝子断片に由来する。一実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ４−１遺伝子断片に由来し、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ４−１またはＶκ３−２０遺伝子断片に由来する。一実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ３−２０遺伝子断片に由来する。別の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ３−２０遺伝子断片及びＪκ１またはＪκ２遺伝子断片に由来する。一実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ３−２０遺伝子断片に由来し、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ４−１またはＶκ１−５遺伝子断片に由来する。一実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ３−１５遺伝子断片に由来する。別の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ３−１５遺伝子断片及びＪκ５遺伝子断片に由来する。一実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ３−１５遺伝子断片に由来し、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはＶκ１−３９遺伝子断片に由来する。他の実施形態では、第１及び第２の可変ドメインは表Ａにて示されるようにそれぞれＶκ１：Ｊκ１  Ｖκ２：Ｊκ２の遺伝子断片に由来する。
【表１Ａ】
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【０００９】
一部の実施形態では、ハイブリッドＶＬ−ＣＨ免疫グロブリン鎖のＣＤＲ３の長さは、軽鎖定常ドメインに連結された軽第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−ＣＬ）のＣＤＲ３の長さより短い。一部の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ３は軽鎖のＣＤＲ３よりも少なくともアミノ酸１つ分短い。他の実施形態では、ＣＤＲ３の長さは少なくともアミノ酸２つ分異なる。他の実施形態では、ＣＤＲ３の長さは少なくともアミノ酸３つ分異なる。他の実施形態では、ＣＤＲ３の長さは少なくともアミノ酸４つ分異なる。一部の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン鎖のＣＤＲ３は６アミノ酸長であり、軽鎖のＣＤＲ３はおよそ９アミノ酸長である。
【００１０】
一部のある特定の実施形態では、重鎖定常領域は非ヒト動物に由来する。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は非ヒト動物に由来する。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、及びそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、重鎖定常領域はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、第１及び／または第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、ヒトの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。一部の実施形態では、第１及び／または第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、マウス及びラットから選択される齧歯類に由来する。
【００１２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるＶＬ抗原結合タンパク質は免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変ドメインを含む抗原結合タンパク質よりも高い親和性で小分子と結合する。一部の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質は５０ｎＭ未満のＫＤで小分子と特異的に結合する。他の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質のＫＤは４０ｎＭ未満である。追加の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質のＫＤは３０ｎＭ未満である。別の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質のＫＤは２０ｎＭ未満である。別の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質のＫＤは１０ｎＭ未満である。
【００１３】
一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような小分子と特異的に結合するＶＬ抗原結合タンパク質のハイブリッド免疫グロブリン鎖または軽鎖の可変ドメインをコードする再構成された軽鎖可変領域遺伝子を含む細胞または核酸、及びそのような細胞または核酸を得る方法である。
【００１４】
一部の実施形態では、小分子に特異的なＶＬ抗原結合タンパク質を得るための方法が提供され、それには、小分子と結合するＶＬ抗原結合タンパク質の１以上の免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む及び／またはコードする細胞または核酸配列を得ることが含まれてもよい。方法は一般に、本明細書で開示されるような遺伝子操作された非ヒト動物から小分子と結合するＶＬ抗原結合タンパク質及び／またはＶＬ抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞を単離することを含み、その際、該ＶＬ結合タンパク質は小分子と特異的に結合する。
【００１５】
本明細書で開示される遺伝子操作された非ヒト動物には、たとえば、哺乳類、特定の実施形態では齧歯類（たとえば、マウス、ラットまたはハムスター）が挙げられる。一部の実施形態では、非ヒト動物には鳥類、たとえば、ニワトリが挙げられる。種々の実施形態では、齧歯類はマウス及びラットから選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるような非ヒト動物のゲノムには、（ｉ）再構成されていないヒト軽鎖遺伝子断片（たとえば、ＶＬ及びＪＬの遺伝子断片）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座と（ｉｉ）再構成されていないヒト軽鎖遺伝子断片（たとえば、ＶＬ及びＪＬの遺伝子断片）を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座との双方が含まれる。一部の実施形態では、（ｉ）の再構成されていないヒト免疫グロブリンのＶＬ及びＪＬの遺伝子断片はゲノムにおける内在性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。一部の実施形態では、非ヒト動物は内在性の機能的なＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片すべてを欠く。一部の実施形態では、非ヒト動物は内在性の機能的なＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片すべてを欠き、非ヒト動物はＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子またはその双方を含む。一部のある特定の実施形態では、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子またはその双方はゲノムにて異所的に位置付けられる。
【００１７】
一部の実施形態では、（ｉｉ）の再構成されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬの遺伝子断片は非ヒト動物の内在性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。一部のある特定の実施形態では、内在性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座はκ軽鎖遺伝子座である。
【００１８】
一部の実施形態では、（ｉ）の再構成されていないヒト免疫グロブリンのＶＬ及びＪＬの遺伝子断片はヒトのＶκ及びＪκの遺伝子断片である。一部の実施形態では、（ｉｉ）の再構成されていないヒト免疫グロブリンのＶＬ及びＪＬの遺伝子断片はヒトのＶκ及びＪκの遺伝子断片である。一部の実施形態では、（ｉｉ）の再構成されていないヒト免疫グロブリンのＶＬ及びＪＬの遺伝子断片はヒトのＶκ及びＪκの遺伝子断片であり、軽鎖定常領域の核酸配列はマウスＣκ領域の核酸配列またはラットＣκ領域の核酸配列である。
【００１９】
一部の実施形態では、非ヒト動物は小分子と特異的に結合するＶＬ抗原結合タンパク質を発現する細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、リンパ球、たとえば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞である。一部の実施形態では、細胞はハイブリッドＶＬ−ＣＨ鎖を含むＶＬ結合タンパク質を発現する。一部の実施形態では、ＶＬ結合タンパク質は２つの同一の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、ＶＬ結合タンパク質は異種配列を持つ２つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるような動物から単離される細胞はＢ細胞である。他の実施形態では、細胞はメモリーＢ細胞である。
【００２１】
小分子と特異的に結合するＶＬ抗原結合タンパク質のハイブリッド免疫グロブリン鎖または軽鎖の可変ドメインをコードする再構成された軽鎖可変領域遺伝子を含む核酸は、たとえば、本明細書で開示される非ヒト動物から単離された細胞から、小分子と特異的に結合するＶＬ結合タンパク質の第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第１と第２の核酸配列を特定することによっても単離されてもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されるような細胞及び／または核酸を得る方法は、（ａ）小分子または担体に連結された小分子で非ヒト動物を免疫し、その際、非ヒト動物はそのゲノムに（ｉ）非ヒトの重鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリンの軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片及び（ｉｉ）非ヒトの軽鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリンの軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片を含むことと、（ｂ）免疫した非ヒト動物から細胞を単離し、その際、該細胞は第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第１と第２の核酸配列を含むことと、（ｃ）該細胞から小分子と特異的に結合するＶＬ結合タンパク質の第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第１と第２の核酸配列を特定することとを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、非ヒト動物を免疫することは、小分子または担体に連結された小分子で非ヒト動物を感作することと、非ヒト動物をある期間休ませることと、小分子または担体に連結された小分子で該動物を再免疫することとを含む。一部の実施形態では、期間は、２〜３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも１ヵ月である。一部の実施形態では、非ヒト動物を免疫することは、非ヒト動物に免疫応答を開始させることを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、細胞は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーを介して得られる。一部の実施形態では、細胞は免疫した非ヒト動物の組織から得られ、該組織は脾臓、リンパ節、血液及び骨髄から成る群から選択される。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明の方法はさらに、リンパ球を癌細胞と融合して、たとえば、ハイブリドーマを作製することを含む。一部のある特定の実施形態では、癌細胞は骨髄腫細胞である。従って、本明細書で提供されるのはまた、ハイブリドーマ及びそれから単離される核酸であって、その際、該ハイブリドーマは小分子に特異的なＶＬ結合タンパク質を発現する。
【００２５】
一部の実施形態では、小分子に特異的なＶＬ抗原結合タンパク質を作製する方法はまた、小分子と特異的に結合する二量体としての第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現するのに好適な発現系にて小分子に特異的なＶＬ抗原結合タンパク質の第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第１と第２の核酸を発現させることも含む。
【００２６】
提供されるのはまた、非ヒト動物であって、（ａ）そのゲノムにて（ｉ）非ヒトの重鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリンの軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片と（ｉｉ）非ヒトの軽鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリンの軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片とを含み、及び（ｂ）小分子と特異的に結合するＶＬ抗原結合タンパク質を含む、非ヒト動物である。
【００２７】
一部の実施形態では、該非ヒト動物は、参照非ヒト動物よりも、２倍以上、たとえば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、または２０倍、またはそれより多い抗原陽性のＢ細胞を示す。一部の実施形態では、参照非ヒト動物は免疫の際、キメラ抗体を発現し、該キメラ抗体は、ヒトＶＨドメイン及びマウスＣＨドメインを含む重鎖とヒトＶＬドメイン及びマウスＣＬドメインを有する軽鎖とを有する。一部のある特定の実施形態では、参照非ヒト動物は野生型の非ヒト動物である。一部の実施形態では、免疫は、小分子または担体に連結された小分子で非ヒト動物を感作することと、非ヒト動物をある期間休ませることと、小分子または担体に連結された小分子で該動物を再免疫することとを含む。一部の実施形態では、該期間は、２〜３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも１ヵ月である。一部の実施形態では、抗原陽性Ｂ細胞はメモリーＢ細胞である。
【００２８】
一部の実施形態では、非ヒト動物は参照非ヒト動物よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍、またはそれより高い抗体力価を示す。一部のある特定の実施形態では、参照非ヒト動物は遺伝子操作されたマウスであり、それは免疫の際、キメラ抗原結合タンパク質を発現し、該キメラ抗原結合タンパク質はヒトＶＨドメイン及びマウスＣＨドメインを含有する重鎖とヒトＶＬドメイン及びマウスＣＬドメインを有する軽鎖とを含む。一部のある特定の実施形態では、参照非ヒト動物は野生型の非ヒト動物である。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明の小分子はハプテンであり、担体に連結される。一部のある特定の実施形態では、担体は、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ロコガイのヘモシアニン（ＣＣＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ウシ血清アルブミン（ｃＢＳＡ）、または卵白アルブミンを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、本発明の小分子は分子量が６ｋＤａ未満である有機化合物である。
【００３１】
一態様では、本明細書で開示されるのは、従来の抗体によっては示されない結合特性を示す抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質を特定する、及び／または単離する方法、そのように特定され及び／または単離される抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質、それをコードする核酸、及び／またはそれを発現する宿主細胞である。
【００３２】
一実施形態では、本明細書で開示されるような抗原と特異的に結合する従来の抗体によっては示されない抗原に特異的に結合するとき独特の結合特性を示す１以上のＶＬ抗原結合タンパク質を特定する方法は、（ａ）抗原と特異的に結合する複数の免疫グロブリンタンパク質のそれぞれの１以上の結合特性をプロファイリングし、その際、複数の免疫グロブリンタンパク質はＶＬ抗原結合タンパク質と従来の抗体を含み、各ＶＬ抗原結合タンパク質は、（ｉ）１以上の軽鎖可変領域遺伝子断片に由来する可変ドメインと（ｉｉ）１以上の重鎖定常領域遺伝子断片に由来する定常ドメインとを含むハイブリッド免疫グロブリン鎖を含み、各従来の抗体は１以上の重鎖可変領域に由来する免疫グロブリン重鎖可変領域と１以上の軽鎖可変領域遺伝子断片に由来する免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子断片とを含むことと、（ｂ）各免疫グロブリンタンパク質の少なくとも１つの結合特性に基づいて複数の免疫グロブリンタンパク質を１以上の群にまとめ、その際、類似の結合特性を示すＶＬ抗原結合タンパク質及び従来の抗体は同じ群にビニングすることと、（ｃ）ＶＬ抗原結合タンパク質すべてまたは実質的にすべてを含む群を特定することとを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、複数の免疫グロブリンタンパク質それぞれの１以上の結合特性は差別的抗原かく乱によってプロファイリングされる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるような方法はさらに、複数の免疫グロブリンタンパク質それぞれによって結合される抗原の１以上のエピトープをマッピングすることを含み、その際、抗原の同じエピトープと結合する免疫グロブリンタンパク質は同じ機能群にビニングされる。一部の実施形態では、複数の免疫グロブリンタンパク質それぞれによって結合される抗原の１以上のエピトープをマッピングすることは、交差／阻止アッセイ、抗原変異体のアラニン走査、ペプチドブロット、ペプチド切断分析、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学修飾、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるエピトープマッピングアッセイを含む。
【００３４】
本明細書で開示される方法では、複数の抗原結合タンパク質の１以上の結合特性は固体表面に固定化された抗原を用いて決定される。一部の実施形態では、固体表面はバイオセンサーチップまたはポリスチレンビーズを含む。一部の実施形態では、固定化の後、及びプロファイリングに先立って抗原が修飾される。修飾は化学物質（たとえば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ）／ヨードアセトアミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／エタノールアミン、ヨードアセトアミド及びヒドラジン、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール（ＨＰＧ）、過酸化水素、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−アセチルイミダゾール、テトラニトロメタン、アルサニル酸、塩化ダンシル、グルタールアルデヒド、ニンヒドリン、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）、酢酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＮＨＳ−酢酸）、ポリエチルレングリコール５０００（ＰＥＧ−５０００）、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、スクシンイミジルエステル、及びそれらの組み合わせ）及び／または酵素（たとえば、ブタトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、パパイン、サーモリシン、スブチリシン、プロテアーゼＫ、ブロメラインスルフヒドリル特異的プロテアーゼ（フィシン）、及びそれらの組み合わせ）によって達成されてもよい。
【００３５】
本明細書で開示される方法に係るビニングは、主成分分析（ＰＣＡ）及び／または階層的クラスタ分析を含んでもよい。一実施形態では、データを提示するために２つの主成分を選択する。一実施形態では、ビニングは主成分分析を含む。別の実施形態では、ビニングは階層的クラスタ分析を含む。別の実施形態では、ビニングは主成分分析と階層的クラスタ分析の双方を含む。ビニングは、上述のような化学的に及び／または酵素的にかく乱された／修飾された抗原表面のパネルへの各免疫グロブリンタンパク質の結合シグナル強度を含む１以上の結合プロファイルに基づいてもよい。そのようなビニングの結果は、たとえば、会合定数、解離定数、平衡定数、種々の種または同じ種の関連するファミリーメンバーに由来する抗原ホモログに対する結合特異性、機能活性データ（たとえば、リガンドの遮断、抗原のリン酸化及び／または抗原の細胞への内部移行を遮断する能力）、またはそれらの組み合わせのような免疫グロブリンタンパク質の群についての他の典型的なアッセイデータと並べてもよい、たとえば、差別的抗原かく乱の結合データに由来する階層性クラスタ分析系統樹が各免疫グロブリンタンパク質についての他の種々のアッセイデータと並べられる、「系図表」として表示されてもよい整列比較の結果を用いてビンを共有する免疫グロブリンタンパク質の間での挙動パターンを明らかにしてもよい。
【００３６】
本明細書で開示されるような一部のプロファイリング法はさらに、（ｄ）ＶＬ抗原結合タンパク質すべてまたは実質的にすべてを含むと特定された機能群にビニングされている１以上のＶＬ抗原結合タンパク質を単離すること、及び／または（ｅ）単離された１以上のＶＬ抗原結合タンパク質が従来の抗体によって認識されない抗原の１以上のエピトープと結合することを確認することを含む。単離された１以上のＶＬ抗原結合タンパク質が従来の抗体によって認識されない抗原の１以上のエピトープと結合することを確認することは高処理能力の競合結合タンパク質アッセイを含んでもよい。
【００３７】
アミノ酸配列及び／またはそれをコードする核酸配列を、本明細書で開示されるプロファイリング法に従って単離される１以上のＶＬ抗原結合タンパク質のいずれかについて決定してもよい。従って、本明細書で提供されるのはまた、本明細書で開示されるプロファイリング法に従って単離されるＶＬ抗原結合タンパク質、そのように特定され及び／または単離されたＶＬ抗原結合タンパク質のハイブリッド免疫グロブリン鎖の可変領域のＣＤＲをコードする核酸配列を含む単離された核酸、及びそのような核酸を発現する宿主細胞である。
【００３８】
本明細書で提供されるのはまた、本明細書で開示される方法を用いて従来の抗体によっては認識されない抗原のエピトープと結合する１以上のＶＬ抗原結合タンパク質を特定することと、（ｂ）特定された１以上の抗原特異的な抗原結合タンパク質によって認識される１以上のエピトープをマッピングすることとを含む、従来の抗体には覆い隠され、１以上の抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質によって認識される抗原の１以上のエピトープを特定する方法である。
【００３９】
本発明の他の特長、目的及び利点は、以下の詳細な説明にて明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示すが、説明のみの目的で提供されるのであって、限定目的ではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内での種々の変更及び改変は詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【００４０】
以下の図で構成される本明細書に含まれる図面は説明目的のみのためのものであり、限定目的のためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】マウスの重鎖遺伝子座の模式図（正確な尺度ではない）を上に、ヒトのκ軽鎖遺伝子座の模式図（正確な尺度ではない）を下に示す。マウスの重鎖遺伝子座は約３Ｍｂの長さであり、約２００の重鎖可変（ＶＨ）遺伝子断片、１３の重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子断片、及び４の重鎖連結（ＪＨ）遺伝子断片、ならびにエンハンサー（Ｅｎｈ）及び重鎖定常（ＣＨ）領域を含有する。ヒトのκ軽鎖遺伝子座はそれぞれ４４０ｋｂ及び６００ｋｂにわたる異極性の遠位コンティグと近位コンティグに複製される。２つのコンティグの間はＶκ遺伝子断片がないと考えられる約８００ｋｂのＤＮＡである。ヒトのκ軽鎖遺伝子座は、約７６のＶκ遺伝子断片、５のＪκ遺伝子断片、イントロンのエンハンサー（Ｅｎｈ）及び単一の定常領域（Ｃκ）を含有する。
【図２】マウス重鎖遺伝子座への４０のヒトＶκ及び５のヒトＪκの遺伝子断片の段階的挿入の例となる標的化戦略を示す図である。ハイグロマイシン（ｈｙｇ）とネオマイシン（ｎｅｏ）の選択カセットをリコンビナーゼの認識部位（Ｒ１、Ｒ２等）と共に示す。マウスＣＨ領域に操作可能に連結されたヒトのＶκ及びＪκの遺伝子断片を含む修飾されたマウス重鎖遺伝子座を下に示す。
【図３】マウス重鎖遺伝子座へのヒトＶλ及びヒトＪλの遺伝子断片（または４のヒトＪλ遺伝子断片）の段階的挿入の例となる標的化戦略を示す図である。ハイグロマイシン（ｈｙｇ）とネオマイシン（ｎｅｏ）の選択カセットをリコンビナーゼの認識部位（Ｒ１、Ｒ２等）と共に示す。マウスＣＨ領域に操作可能に連結された（１または４の）ヒトのＶλ及びＪλの遺伝子断片を含む修飾されたマウス重鎖遺伝子座を下に示す。
【図４】ＫＯＨマウス（ＭＡＩＤ１７１３／１２４２）及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）から得られた抗原陽性抗体（すなわちＶＬ抗原結合タンパク質）の総数（左）及び百分率（右）を示すグラフである。
【図５】ＫＯＨマウス（ＭＡＩＤ１７１３／１２４２）及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）から得られた抗原Ｂに特異的な抗体の相対的な結合動態を示す図である。
【図６】差別的抗原かく乱（ＤＡＤ）によって測定した、典型的な抗原Ａに特異的な抗体（○）とは異なる少なくとも１つの結合特性を示す抗原Ｃに特異的なＶＬ抗原結合タンパク質（●）のクラスタを強調する、糖タンパク質である抗原Ｃに特異的な７３９の結合タンパク質の二次元主成分分析（ＰＣＡ）のプロットを示す図である。
【図７】（Ａ）ハイブリッド鎖または（Ｂ）軽鎖におけるある特定のＣＤＲ３のアミノ酸長（ｘ軸）を有する、抗原Ａ（
【化１】
2017510273.tif 000003
）、抗原Ｂ（■）または抗原Ｃ（□）に特異的なＶＬ結合タンパク質の数（総数、ｙ軸）を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
本発明は特定の方法、及び記載される実験条件に限定されず、これは、かかる方法及び条件が変化し得るからである。本発明の範囲はクレームによって定義されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであって、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００４３】
別様に定義されない限り、用語または語句が使用される文脈から相違することが明確に示されないまたは明瞭に明らかではない限り、本明細書で使用される用語及び表現はすべて、その用語及び表現について当該技術で確立されている意味を含む。
【００４４】
「抗原結合タンパク質」、「結合タンパク質」、「免疫グロブリンタンパク質」等は、抗原結合部位を含み、体細胞で変異されてもよく、抗原（またはそのエピトープ部分）、たとえば、免疫応答及び特に親和性成熟した免疫グロブリン分子の産生を誘導することができる物質を認識し、それと結合することができる単量体または多量体のペプチド分子を指す。抗原結合タンパク質はＶＬ抗原結合タンパク質及び従来の抗体を包含する。抗原結合タンパク質の「抗原結合部位」は抗原と結合する抗原結合タンパク質の領域を指す。
【００４５】
「ＶＬ抗原結合タンパク質」、「抗原結合ＶＬタンパク質」、「ＶＬ結合タンパク質」等は、重鎖定常領域に操作可能に連結される、抗原結合部位を形成してもよい、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質を指す。「ＶＬ抗原結合タンパク質」には、ＶＬ結合タンパク質が抗原結合部位を形成してもよい２つの軽鎖可変ドメインを含むように軽鎖をさらに含む免疫グロブリン分子が含まれる。一実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質の少なくとも２つの軽鎖可変ドメインは同族である。一部の実施形態では、２つの軽鎖可変ドメインのそれぞれは、軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子断片及び／または軽鎖連結領域（ＪＬ）遺伝子断片によってコードされる、またはそれに由来する。好適な実施形態では、２つの軽鎖可変ドメインの一方はハイブリッド免疫グロブリン鎖の一部であってもよく、２つの軽鎖可変ドメインの他方は免疫グロブリン軽鎖（Ｌ）の一部であってもよい。そのようなＶＬ結合ドメインは記載されている。たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１１年８月２日に出願された米国特許公開第２０１２００９６５７２号を参照のこと。
【００４６】
「抗体」、「従来の抗体」、「典型的な抗体」、「抗原結合抗体」等の用語は一般に、少なくとも、（ｉ）重鎖可変（ＶＨ）遺伝子断片、重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子断片及び／または重鎖連結（ＪＨ）遺伝子断片に由来する重鎖可変ドメインと、（ｉｉ）軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子断片及び／または軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子断片に由来する軽鎖可変ドメインとを含む抗原結合部位を含む免疫グロブリンタンパク質を指す。好適な実施形態では、抗体のＶＨとＶＬのドメインは同族である。従って、抗体、従来の抗体、典型的な抗体等の用語は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、断片抗原結合（Ｆａｂ）領域、Ｆ（ａｂ’）２断片等を包含する。そのような用語はまた、四量体分子、たとえば、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの免疫グロブリン重（Ｈ）鎖と２つの免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖とを有する分子も包含する。
【００４７】
各重鎖は重鎖可変ドメインと重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変ドメインと軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変の領域にさらに細分することができる。各重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置されて含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略記されてもよく；軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と略記されてもよい）。「高親和性」抗体という用語には、約１０−９Ｍ以下（たとえば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、または約１×１０−１２Ｍ）の標的エピトープに関するＫＤを有する抗体が含まれる。一実施形態では、ＫＤは表面プラスモン共鳴、たとえば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定され；別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。
【００４８】
「およそ」という用語には、本明細書で対象とする１以上の値に適用されるとき、言及される参照値に類似する値が含まれる。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語には、別様に述べられない限りまたは文脈から別様に明らかではない限り（そのような数が考えられる値の１００％を超える場合を除く）、言及される参照値のいずれかの方向（超えるまたは未満）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲が含まれる。
【００４９】
「生物学的に活性がある」という用語には、生物系にて、試験管内でまたは生体内で（たとえば、生物にて）活性を有する任意の作用因子の特性が含まれる。たとえば、生物にて存在するとき、その生物の中で生物学的な作用を有する作用因子は生物学的に活性があると見なされる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性がある場合、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を共有するタンパク質またはポリペプチドの部分は通常、「生物学的に活性がある」部分と呼ばれる。
【００５０】
小分子の文脈における「担体」という用語、たとえば、小分子に連結される担体は、小分子が結合されて小分子を免疫原性にしてもよい高分子、一般にタンパク質を指す。
【００５１】
「同族」は、「と同族」という用語、たとえば、第２のＶＬドメイン「と同族」である第１のＶＬドメインの意味で使用されるとき、本発明に従ってマウスによって作られた同じ結合タンパク質に由来する２つのＶＬドメイン間の関係への言及を含むように意図される。たとえば、本発明の実施形態に従って遺伝子操作されたマウス、たとえば、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨの領域をＶＬ及びＪＬの領域で置き換えている重鎖遺伝子座を有するマウスは、第１のヒトＶＬドメインと融合された同じマウスのＣＨ領域（たとえば、ＩｇＧアイソタイプ）で構成される２つの同一のポリペプチド鎖と、第２のヒトＶＬドメインと融合された同じマウスのＣＬ領域で構成される２つの同一のポリペプチド鎖とを有する抗体様の結合タンパク質を作る。マウスにおけるクローン選択の間に、第１と第２のヒトＶＬドメインはクローン選択過程によって選択されて単一の抗体様の結合タンパク質の背景で一緒に出現した。従って、クローン選択過程の結果、単一の抗体様分子にて一緒に出現する第１と第２のＶＬドメインは「同族」であると言われる。対照的に、第１の抗体様分子に出現するＶＬドメインと第２の抗体様分子に出現するＶＬドメインは、第１と第２の抗体様分子が同一の重鎖を有さない限り（すなわち、第１のヒト重鎖領域に融合されたＶＬドメインと第２のヒト重鎖領域に融合されたＶＬドメインが同一でない限り）同族ではない。
【００５２】
「相補性決定領域」とう言う表現または「ＣＤＲ」という用語には、免疫グロブリン分子（たとえば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域における２つのフレームワーク領域の間に通常（すなわち、野生型動物にて）出現する生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、たとえば、生殖細胞系列の配列または再構成された配列若しくは再構成されていない配列によって、及びたとえば、ナイーブなまたは成熟したＢ細胞またはＴ細胞によってコードされ得る。ＣＤＲを体細胞で変異させる（たとえば、動物の生殖細胞系列でコードされた配列とは異なる）ことができ、ヒト化することができ、及び／またはアミノ酸の置換、付加または欠失によって修飾することができる。一部の状況では（たとえば、ＣＤＲ３については）、ＣＤＲは、（たとえば、再構成されていない核酸配列にて）隣接していないが、たとえば、配列をスプライスしたまたは接続した結果（たとえば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ−Ｄ−Ｊの組換え）、Ｂ細胞の核酸配列では隣接する、２以上の配列（たとえば、生殖細胞系列の配列）によってコードされ得る。
【００５３】
「同等の」という用語には、互いに同一でないかもしれないが、観察される差異または類似性に基づいて結論が合理的に引き出され得るようにそれらの間で比較できるほど十分に類似する２以上の作用因子、実体、状況、一連の状態等が含まれる。当業者は背景を考慮して２以上の作用因子、実体、状況、一連の状態等が同等であると見なされるために所与の状況にてどの程度の同一性が必要とされるのかを理解するであろう。
【００５４】
保存的なアミノ酸置換を記載するための「保存的な」という用語には、類似の化学的特性（たとえば、電荷または疎水性）を持つ側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的なアミノ酸置換はタンパク質の対象とする機能的特性、たとえば、リガンドに結合する受容体の能力を大幅に変化させないであろう。類似の化学的特性を持つ側鎖を有するアミノ酸の群の例には、たとえば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンのような脂肪族側鎖；たとえば、セリン及びスレオニンのような脂肪族ヒドロキシル側鎖；たとえば、アスパラギン及びグルタミンのようなアミド含有側鎖；たとえば、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンのような芳香族側鎖；たとえば、リジン、アルギニン及びヒスチジンのような塩基性側鎖；たとえば、アスパラギン酸及びグルタミン酸のような酸性側鎖；ならびに、たとえば、システイン及びメチオニンのようなイオウ含有側鎖が挙げられる。保存的なアミノ酸置換の群には、たとえば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。一部の実施形態では、保存的なアミノ酸置換は、たとえば、アラニン走査変異誘発で使用されるようなタンパク質におけるアラニンによるいずれかの天然残基の置換であることができる。一部の実施形態では、保存的な置換は、参照によって本明細書に組み入れられるＧｏｎｎｅｔら．（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１４４３−４５にて開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有するものである。一部の実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて非負の値を有するならば、「適度に保存的」であると見なされる。
【００５５】
一部の実施形態では、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖における残基の位置は１以上の保存的なアミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能的断片（たとえば、Ｂ細胞からの発現及び分泌を可能にする断片）における残基の位置は、アミノ酸配列が本明細書に載せられている軽鎖と同一ではなく、１以上の保存的なアミノ酸置換によって異なる。
【００５６】
「差別的抗原かく乱」の文脈外で使用される「かく乱」という用語には、（たとえば、相同組換えを介して）ＤＮＡに割り込む事象の結果が含まれる。一部の実施形態では、かく乱は、ＤＮＡ配列（複数可）の欠失、挿入、逆位、修飾、置き換え、置換またはそれらのいかなる組み合わせをも達成してもよいし、または表してもよい。一部の実施形態では、かく乱は、ＤＮＡのコーディング配列（複数可）におけるミスセンス、ナンセンスまたはフレームシフト変異、またはそれらのいかなる組み合わせのような変異の導入を達成してもよいし、または表してもよい。一部の実施形態では、かく乱は細胞にとって内在性である遺伝子または遺伝子座において生じてもよい。一部の実施形態では、挿入には、細胞またはゲノムにおける内在性の部位への遺伝子全体または遺伝子の断片、たとえば、エクソンの挿入が含まれてもよい。一部の実施形態では、挿入により、挿入先の内在性の配列の起源以外の起源のものである配列を導入してもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または（たとえば、遺伝子によってコードされたタンパク質の）遺伝子産物の発現及び／または活性を高めてもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物の発現及び／または活性を低下させてもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物（たとえば、コードされたタンパク質）の配列を変えてもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物（たとえば、コードされたタンパク質）を切り詰めてもよいし、または断片化してもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物を伸長してもよく；一部のそのような実施形態では、かく乱は融合タンパク質の組み立てを達成してもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物のレベルに影響を与えてもよいが、活性には影響を与えなくてもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物の活性に影響を与えてもよいが、レベルには影響を与えなくてもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物のレベルに有意な影響を有さなくてもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物の活性に有意な影響を有さなくてもよい。一部の実施形態では、かく乱は遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれにも有意な影響を有さなくてもよい。
【００５７】
「内在性の遺伝子座」または「内在性の遺伝子」という表現には、かく乱（本明細書で記載されるような欠失、挿入、逆位、修飾、置き換え、置換またはそれらの組み合わせ）の導入に先立って親生物または参照生物で見いだされる遺伝学的遺伝子座が含まれる。一部の実施形態では、内在性の遺伝子座は自然界で見いだされる配列を有する。一部の実施形態では、内在性の遺伝子座は野生型である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるような内在性の遺伝子座を含有する参照生物は野生型の生物である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるような内在性の遺伝子座を含有する参照生物は操作された生物である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるような内在性の遺伝子座を含有する参照生物は（野生型であろうと操作されていようと）実験室で飼育した生物である。
【００５８】
「内在性プロモーター」という表現には、たとえば、野生型の生物にて内在性の遺伝子と自然に会合するプロモーターが含まれる。
【００５９】
「エピトープ結合タンパク質」という表現には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することができる、たとえば、約１マイクロモル以下（たとえば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、または約１×１０−１２ＭであるＫＤ）であるＫＤでエピトープと結合することができるタンパク質が含まれる。治療用のエピトープ結合タンパク質（たとえば、治療用抗体）はナノモルまたはピコモルの範囲であるＫＤを必要とすることが多い。
【００６０】
たとえば、機能的なポリペプチドに関連した「機能的な」には、通常ネイティブなタンパク質に伴う少なくとも１つの生物活性を保持するポリペプチドが含まれる。別の例では、機能的な免疫グロブリンの遺伝子断片には、機能的な再構成を行って再構成された免疫グロブリン遺伝子配列を生成することができる可変遺伝子断片が含まれてもよい。
【００６１】
「機能的な断片」という表現には、発現され、分泌され、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲でのＫＤでエピトープに特異的に結合することができるエピトープ結合タンパク質の断片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモル範囲、ナノモル範囲またはピコモル範囲であるＫＤを有することが含まれる。
【００６２】
「遺伝子断片」または「断片」という表現には、そのそれぞれが１以上の（重鎖または軽鎖の）定常（Ｃ）遺伝子断片に操作可能に連結されてもよい、（たとえば、内在性リコンビナーゼが介在する）再構成に関与して再構成されたＶ／Ｊまたは再構成されたＶ／Ｄ／Ｊの遺伝子配列を形成することができる免疫グロブリン遺伝子座（たとえば、ヒト及び齧歯類にて）での再構成されていない配列を含む、（重鎖または軽鎖の）可変（Ｖ）遺伝子断片、多様性（Ｄ）遺伝子断片または（重鎖または軽鎖の）連結Ｊ遺伝子断片への言及が含まれる。別様に指示されない限り、Ｖ、Ｄ及びＪの断片は１２／２３ルールに従ってＶ／Ｊ組換えまたはＶ／Ｄ／Ｊ組換えを可能にする組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含む。遺伝子断片にはまた、アイソタイプスイッチングを生じる部位特異的な組換えを可能にするスイッチ領域として知られる反復ＤＮＡを定常領域遺伝子断片の５’末端で含んでもよい、（重鎖または軽鎖の）定常領域遺伝子断片への言及も含まれる。重鎖定常領域の遺伝子配列は、たとえば、生殖細胞系列の組織化において１つの重鎖定常領域遺伝子断片または重鎖定常領域遺伝子断片のクラスタを含んでもよく、そのクラスタは好ましくは、各重鎖定常領域遺伝子断片の５’で、部位特異的な組換えによるアイソタイプスイッチングを可能にするスイッチ領域も含んでもよい。別様に指示されない限り、断片はさらに、それらが自然界で関連する配列またはその機能的な同等物（たとえば、Ｖ断片についてはプロモーター（複数可）及びリーダー（複数可））を含む。
【００６３】
免疫グロブリンの核酸配列に関連して、「生殖細胞系列」という用語には、子孫に引き継ぐことができる核酸配列が含まれる。
【００６４】
「免疫グロブリン重鎖」、「重鎖」等の表現は一般に、アミノ末端からカルボキシ末端までで重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含み、ＣＨ１ドメインを欠き、及び任意でさらにヒンジ領域を欠いている重鎖を含む、完全長の免疫グロブリンタンパク質を指す。免疫グロブリン重鎖の配列は任意の生物に由来してもよい。
【００６５】
「重鎖可変ドメイン」は、一般に重鎖可変（ＶＨ）遺伝子断片（またはその一部）、重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子断片（またはその一部）及び重鎖連結（ＪＨ）遺伝子断片（またはその一部）に由来する配列を含む、好ましくは再構成された重鎖可変領域遺伝子によってコードされる、またはそれに由来するアミノ酸配列を有する免疫グロブリンのドメインを指す。好適な実施形態では、重鎖可変領域の遺伝子配列、たとえば、再構成されたＶＨ、−ＤＨ−ＪＨの遺伝子配列は、生産的な遺伝子再構成を受けることができる、たとえば、連結してインフレームの重鎖可変領域遺伝子配列を形成することができる再構成されていないＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片、好ましくは生殖細胞系列の再構成されていないＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片のレパートリーに由来する。ＶＨ遺伝子断片、ＤＨ遺伝子断片またはＪＨ遺伝子断片には、齧歯類（たとえば、マウス、ラット等）及びヒトを含むが、それらに限定されない任意の生物に由来するＶＨ遺伝子断片、ＤＨ遺伝子断片またはＪＬ遺伝子断片が挙げられる。体細胞突然変異（たとえば、ＶＨ、ＤＨ及び／またはＪＨの遺伝子断片の生殖細胞系列の配列によってコードされていないアミノ酸）を含む重鎖可変ドメイン及びそれをコードする再構成された重鎖可変領域遺伝子はそれにもかかわらず、機能的に再構成されて先ず第１に、たとえば、抗原が介在する増殖に先立って重鎖可変ドメインをコードする遺伝子を形成する、生殖細胞系列のＶＨ、ＤＨ及び／またはＪＨの遺伝子断片またはその一部に由来すると見なされてもよい。
【００６６】
免疫グロブリン重鎖可変ドメインは通常、別様に特定されない限り、アミノ末端からカルボキシ末端までに、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と４つの重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）、たとえば、ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４を含む。ＶＨドメインはまた、重鎖のＮ末端から重鎖定常ドメインのＮ末端まで（Ｎ末端からＣ末端に）伸びる重鎖の部分も指してもよい。
【００６７】
重鎖定常ドメイン（ＣＨ）は、任意の生物に由来する重鎖定常領域の遺伝子断片またはその一部によって好ましくはコードされるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンのドメインを指す。例となる重鎖定常領域の遺伝子断片には、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥの重鎖定常ドメインをコードするＣμ遺伝子断片、Ｃδ遺伝子断片、Ｃγ（たとえば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４）遺伝子断片、Ｃα（たとえば、Ｃα１、Ｃα２）遺伝子断片、またはＣε遺伝子断片が挙げられるが、それらに限定されない。典型的な重鎖定常領域の遺伝子断片は通常、それぞれＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、任意でＣＨ４ドメイン（たとえば、ＩｇＭまたはＩｇＥの場合）、及び任意で膜貫通（Ｍ）ドメイン（たとえば、リンパ球上の膜結合免疫グロブリンの場合）をコードするエクソンを含む。ＣＨドメインはまた、機能的なＣＨ１領域を欠き、任意でさらに機能的なヒンジ領域を欠く重鎖定常領域遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンのドメインも指してもよい。一般に、ＣＨドメインはまた重鎖のＦＲ４の外側から重鎖のＣ末端に向かって（Ｎ末端側からＣ末端側に）伸びる重鎖の部分も指してもよい。ＣＨドメインはまたＦＲ４の外側からハイブリッド鎖のＣ末端に向かって（Ｎ末端側からＣ末端側に）伸びるハイブリッド鎖の部分も指してもよい。
【００６８】
軽微な逸脱、たとえば、Ｃ末端からの１、２、３または数個のアミノ酸の切り詰めを伴った重鎖定常ドメインは、「重鎖定常ドメイン」表現によって包含されることであろうし、配列の修飾、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸置換を伴った重鎖定常ドメインも同様である。アミノ酸置換は、たとえば、（免疫グロブリンの定常ドメイン、たとえば、ヒトＩｇＧの定常ドメインのＥＵの番号付けを参照して）、２２８、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４１、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、及び４３９から選択される１以上の位置で行うことができる。
【００６９】
たとえば、及び限定の目的ではなく、重鎖定常ドメインは修飾されて、向上した血清半減期（列挙される修飾（複数可）を持たない同じ重鎖定常ドメインと比べたとき）を示してもよく、２５０位（たとえば、ＥまたはＱ）；２５０及び４２８位（たとえば、ＬまたはＦ）；２５２位（たとえば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（たとえば、ＳまたはＴ）、及び２５６位（たとえば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における修飾；または４２８位及び／または４３３位（たとえば、Ｌ／Ｒ／Ｐ／ＱまたはＫ）及び／または４３４位（たとえば、Ｈ／ＦまたはＹ）における修飾；または２５０位及び／または４２８位における修飾；または３０７位または３０８位（たとえば、３０８Ｆ，Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４位における修飾を有してもよい。別の例では、修飾は、４２８Ｌ（たとえば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（たとえば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（たとえば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（たとえば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（たとえば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（たとえば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、及び２５６（たとえば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌの修飾（たとえば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；３０７及び／または３０８の修飾（たとえば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含むことができる。残基はＥＵの番号付け方式に従って番号を付けられている。別の非限定例では、重鎖定常ドメインは修飾されて、プロテインＡに対する変化した親和性を示してもよく、これは二重特異性抗体の単離に有用であってもよい。たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５８６，７１３号を参照のこと。
【００７０】
「異種の」という用語には異なる供給源に由来する作用因子または実体が含まれる。たとえば、ポリペプチド、遺伝子または遺伝子産物に関連して使用されるまたは特定の細胞若しくは生物に存在する場合、該用語は、関連するポリペプチド、遺伝子または遺伝子産物が、（１）ヒトの手によって操作された；（２）ヒトの手を介して（たとえば、遺伝子操作を介して）細胞または生物（またはその前駆体）に導入された；及び／または（３）関連する細胞または生物（たとえば、関連する細胞型または生物種）によって天然に産生されないまたはそれに天然に存在しないことを明確にする。
【００７１】
「宿主細胞」という用語には、異種の（たとえば、外来性の）核酸またはタンパク質が導入されている細胞が含まれる。当業者は本開示を読むと、そのような用語が特定の対象細胞を含むだけでなく、その細胞の子孫を含むようにも使用されることを理解するであろう。ある特定の修飾が突然変異または環境のいずれかの影響に起因して後続する世代で生じてもよいので、そのような子孫は実際、親細胞と同一ではなくてもよいが、「宿主細胞」という用語の範囲内に含められることが当業者によって依然として理解される。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり、またはそれを含む。一般に、宿主細胞は、細胞が指定される生命界にかかわらず、異種の核酸またはタンパク質を受け取る及び／または産生するのに好適である任意の細胞である。本開示に従って宿主細胞として利用されてもよい例となる細胞には、原核生物及び真核生物のもの（単細胞または多細胞）、細菌細胞（たとえば、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の株）、マイコバクテリアの細胞、真菌細胞、酵母細胞（たとえば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ等）、植物細胞、昆虫細胞（たとえば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ等）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または、たとえば、ハイブリドーマ若しくはクアドローマのような細胞融合物が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（たとえば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（たとえば、ＣＯＳ−７）、腎細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（たとえば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、（たとえば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株。一部の実施形態では、細胞は１以上のウイルス遺伝子を含み、たとえば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（たとえば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は単離された細胞である、またはそれを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は生物の一部である。
【００７２】
当該技術で理解されている「ヒト化された」という用語には、核酸またはタンパク質であって、構造（すなわち、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）が、自然界で非ヒト動物にて見いだされ、自然界でヒトにて見いだされる対応する型とは区別できる関連する核酸またはタンパク質の型と実質的にまたは完全に同じように対応する部分を含み、及び構造が非ヒト動物の型に存在するものと異なり、代わりにヒト型で見いだされる互換性の構造にさらに密接に対応する部分も含む、核酸またはタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、「ヒト化された」遺伝子は、ヒトのポリペプチド（たとえば、ヒトのタンパク質またはその一部、たとえば、その特徴的な部分）のアミノ酸配列としてのアミノ酸配列を実質的に有するポリペプチドをコードするものである。ほんの一例だけを挙げれば、膜受容体の場合、「ヒト化された」遺伝子は、アミノ酸配列がヒトの細胞外部分のそれと同一であるまたは実質的に同一である細胞外部分を持ち、その残りの配列が非ヒト（たとえば、マウス）のポリペプチドの配列と同一であるまたは実質的に同一であるポリペプチドをコードしてもよい。一部の実施形態では、ヒト化された遺伝子はヒト遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、ヒト化された遺伝子はヒト遺伝子で見いだされるＤＮＡ配列全体を含む。一部の実施形態では、ヒト化されたタンパク質はヒトのタンパク質に出現する部分を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ヒト化されたタンパク質は配列全体がヒトのタンパク質で見いだされるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態（たとえば、ヒト化されたタンパク質が配列全体がヒトのタンパク質で見いだされるアミノ酸配列を有する幾つかを含む）では、ヒト化されたタンパク質は非ヒト動物の内在性の遺伝子座から発現され、内在性の遺伝子座はタンパク質をコードする関連するヒト遺伝子のホモログまたはオルソログに対応する。
【００７３】
配列の比較と関連した「同一性」という用語には、ヌクレオチド及び／またはアミノ酸の配列同一性を測定するのに使用することができる当該技術で既知の多数の様々なアルゴリズムのいずれかによって決定されるような同一性が含まれる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるような同一性は、１０．０の開放ギャップペナルティ、０．１の伸長ギャップペナルティを採用するＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（遅い）配列比較を用い、Ｇｏｎｎｅｔ類似性マトリクス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を用いて決定される。「同一性」という用語には、ポリマー分子間、たとえば、核酸分子（たとえば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及びポリペプチド分子間での全体的な関連性が含まれる。一部の実施形態では、高分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であれば、互いに「実質的に同一である」と見なされる。当業者によって理解されるように、異なる配列にてどの残基が互いに「対応する」かを検討する際、もう１つの配列に比べた一方の配列における指定された長さのギャップを許容することによることを含む、相同性の程度を決定するために配列の比較を可能とする種々のアルゴリズムが利用できる。２つの核酸配列間での同一性パーセントの算出は、たとえば、最適な比較の目的で２つの配列を並べることによって実施することができる（たとえば、最適な配列比較のために第１と第２の核酸配列の一方または双方にギャップを導入することができ、比較目的のために対応しない配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較の目的で並べる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで対応するヌクレオチドの位置でのヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められる場合、そのときは分子はその位置で同一である。２つの配列間での同一性パーセントは、ギャップの数及び２つの配列の最適な配列比較のために導入されることが必要である各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定するのに有用な代表的なアルゴリズム及びコンピュータプログラムには、たとえば、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを用いたＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムが挙げられる。或いは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、たとえば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスを用いたＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。
【００７４】
「単離される」という用語には、（１）最初に産生されたとき（自然界であれ、及び／または実験上の設定であれ）伴っていた成分の少なくとも幾つかから分離されている、及び／または（２）ヒトの手で設計され、作出され、調製され及び／または製造されている物質及び／または実体が含まれる。単離された物質及び／または実体は、それらが当初伴っていた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、または約９９％を超えて分離されてもよい。一部の実施形態では、単離された作用因子は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。物質は、実質的に他の成分を含まなければ、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者によって理解されるように、物質は、たとえば、１以上の担体または賦形剤（たとえば、緩衝液、溶媒、水等）のようなある特定の他の成分と組み合わされた後も、「単離された」またはさらに「純粋である」と依然として見なされてもよく；そのような実施形態では、物質の単離パーセントまたは純度パーセントは、そのような担体または賦形剤を含まないで算出される。ほんの一例を挙げると、一部の実施形態では、自然界に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのような生体高分子は、（ａ）導出の起源または供給源が理由で、自然界にて天然状態でそれに伴う成分の一部またはすべてと会合していない場合、（ｂ）自然界にてそれを産出する種に由来する同じ種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない場合、（ｃ）自然界にてそれを産出する種のものではない細胞または他の発現系に由来する成分によって発現されるまたはそうでなければそれと共にある場合、「単離される」と見なされる。従って、たとえば、一部の実施形態では、化学的に合成されるポリペプチドまたは自然界にてそれを産出するものとは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは「単離された」ポリペプチドであると見なされる。代わりにまたはさらに、一部の実施形態では、１以上の精製法に供されているポリペプチドは、（ａ）自然界でそれに伴う他の成分から及び／または（ｂ）当初産出された際それに伴っていた他の成分からそれが分離されている限り「単離された」ポリペプチドであると見なされてもよい。
【００７５】
「軽鎖可変ドメイン」は、一般に軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子断片（またはその一部）と軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子断片（またはその一部）に由来する配列を含む、再構成された軽鎖可変領域遺伝子によって好ましくはコードされるまたはそれに由来するアミノ酸配列を有する免疫グロブリンのドメインを指す。好適な実施形態では、軽鎖可変領域の遺伝子配列、たとえば、再構成されたＶＬ−ＪＬの遺伝子配列は、再構成されていないＶＬ及び／またはＪＬの遺伝子断片のレパートリー、好ましくは、生産的な遺伝子再構成を受けることができる、たとえば、再構成してインフレームの軽鎖可変領域の遺伝子配列を形成することができる生殖細胞系列の再構成されていないＶＬ遺伝子断片及び／または生殖細胞系列の再構成されていないＪＬ遺伝子断片のレパートリーに由来する。ＶＬ遺伝子断片またはＪＬ遺伝子断片には、齧歯類（たとえば、マウス、ラット等）及びヒトを含むが、これらに限定されない任意の生物に由来するＶＬ遺伝子断片またはＪＬ遺伝子断片が含まれる。体細胞突然変異（たとえば、ＶＬ及び／またはＪＬの遺伝子断片の生殖細胞系列の配列によってコードされないアミノ酸）を含む軽鎖可変ドメイン及びそれをコードする再構成された軽鎖可変領域遺伝子はそれにもかかわらず、生産に再構成されて先ず第１に、たとえば、抗原が介在する増殖に先立って軽鎖可変ドメインをコードする遺伝子を形成する、生殖細胞系列のＶＬ及び／またはＪＬの遺伝子断片またはその一部に由来すると見なされてもよい。
【００７６】
免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインは通常、アミノ末端からカルボキシ末端までに、別様に特定されない限り、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ）、たとえば、ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４を含む。ＶＬドメインは、軽鎖のＮ末端から軽鎖の軽鎖定常ドメインのＮ末端（Ｎ末端からＣ末端に）に伸びる軽鎖の部分も指してもよい。ＶＬドメインはまた、ハイブリッド鎖のＮ末端からハイブリッド鎖の重鎖定常ドメインのＮ末端（Ｎ末端からＣ末端に）に伸びるハイブリッド鎖の部分も指してもよい。
【００７７】
軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、ＣκまたはＣλの遺伝子断片、たとえば、齧歯類またはヒトのＣκまたはＣλの遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列のような、しかし、それらに限定されない、任意の生物に由来する軽鎖定常領域遺伝子によって好ましくはコードされるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンのドメインを指す。そのようなＣκまたはＣλのドメインは当該技術で周知である。一般に、ＣＬドメインはＦＲＬ４の外側から軽鎖のＣ末端まで（Ｎ末端からＣ末端に）伸びる軽鎖の部分も指してもよい。
【００７８】
「マイクロモル範囲」という表現は１〜９９９マイクロモルを意味するように意図され、「ナノモル範囲」という表現は１〜９９９ナノモルを意味するように意図され、「ピコモル範囲」という表現は１〜９９９ピコモルを意味するように意図される。
【００７９】
「免疫グロブリンのハイブリッド鎖」、「ハイブリッド鎖」、「ハイブリッドの免疫グロブリン鎖」等の表現は、アミノ末端からカルボキシ末端までに軽鎖可変ドメイン（体細胞で変異させてもよく、または変異させなくてもよい）と重鎖定常ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質を指す。一般に、ハイブリッド鎖は、重鎖定常領域の遺伝子配列に操作可能に連結された再構成された軽鎖可変領域の遺伝子配列によってコードされる。ハイブリッド免疫グロブリン鎖の軽鎖可変領域の遺伝子配列は一般に、軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子断片（またはその一部）及び軽鎖連結（ＶＪ）遺伝子断片に由来する配列を含んでもよい。好適な実施形態では、ハイブリッド鎖の可変ドメインをコードする軽鎖可変領域の遺伝子配列、たとえば、再構成されたＶＬ−ＪＬの遺伝子配列は、（ａ）生産的な再構成を受けることができる、たとえば、再構成してインフレームの軽鎖可変領域の遺伝子配列を形成することができる、及び（ｂ）１以上の重鎖定常領域の遺伝子断片、たとえば、定常領域の遺伝子断片の再構成されていないクラスタまたは定常領域の遺伝子断片の１つに操作可能に連結される、再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子断片のレパートリー、好ましくは、生殖細胞系列の再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子断片のレパートリーに由来する。
【００８０】
「非ヒト動物」という表現には、ヒトではない脊椎生物が含まれる。一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（たとえば、サメまたはエイ）、両生類、爬虫類、哺乳類または鳥類である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシまたは齧歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、たとえば、ラットまたはマウスのような齧歯類である。
【００８１】
「核酸」という表現には広義で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込むことができる任意の化合物及び／または物質が含まれる。一部の実施形態では、核酸はホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるまたは組み込むことができる化合物及び／または物質である。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、「核酸」には１以上の個々の核酸残基（たとえば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）が含まれ；一部の実施形態では、「核酸」には個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖が含まれる。
【００８２】
「操作可能に連結される」はまた、操作可能に連結された成分がそれらの意図された様式で機能する関係も指す。一例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適正な転写調節を保持するように調節配列（たとえば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーの配列等）に操作可能に連結されてもよい。一例では、免疫グロブリン可変領域（すなわちＶ（Ｄ）Ｊ断片）の核酸配列は、再構成された免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の遺伝子配列への配列間の適正な組換えを可能にするように免疫グロブリンの定常領域の核酸配列に操作可能に連結されてもよい。
【００８３】
「ポリペプチド」という用語にはアミノ酸のいずれのポリマー鎖も含まれる。一部の実施形態では、ポリペプチドは自然界に存在するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは自然界に存在しないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ヒトの手の行動を介して設計される及び／または作出されるという点で操作されているアミノ酸配列を有する。
【００８４】
「組換えの」という用語には、組換え手段によって設計される、操作される、調製される、発現される、創製される、または単離されるポリペプチド（たとえば、本明細書で記載されるようなＢ細胞活性化因子タンパク質）、たとえば、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを用いて発現されるポリペプチド、組換えのコンビナトリアルヒトポリペプチドのライブラリから単離されるポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，（１９９７），ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ，Ｈ．，及びＨｉｇｈｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｅ．，（２００２），Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，Ｊ．Ｖ．，及びＬａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．（２００２），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．，及びＣｈａｍｅｓ，Ｐ．（２０００），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１：３７１−３７８）、ヒトの免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（たとえば、マウス）から単離される抗体（たとえば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｓ−Ａ．，及びＧｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．（２００２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（２０００），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１：３６４−３７０を参照のこと）、または選択された配列要素を互いにスプライシングすることが関与するいずれかの他の手段によって調製される、発現される、創製されるまたは単離されるポリペプチドを含むように意図される。一部の実施形態では、そのような選択された配列要素の１以上は自然界で見いだされる。一部の実施形態では、そのような選択された配列要素の１以上はコンピュータによって設計される。一部の実施形態では、１以上のそのような選択された配列要素は、既知の配列要素の変異誘発（たとえば、生体内でまたは試験管内で）から、たとえば、天然の供給源または合成の供給源から生じる。たとえば、一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、対象とする供給源生物（たとえば、ヒト、マウス等）のゲノムに見いだされる配列で構成される。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは変異誘発（たとえば、試験管内で、または生体内で、たとえば、非ヒト動物にて）の結果生じるアミノ酸配列を有するので、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチドの配列を起源とし、それに関連するが、生体内で非ヒト動物のゲノム内には天然に存在しなくてもよい配列である。
【００８５】
「参照」という用語は、対象とする作用因子または値が比較される標準のまたは対照の作用因子または値を記載するのに本明細書で使用される。一部の実施形態では、対象とする作用因子または値の試験または測定と実質的に同時に参照の作用因子が試験され、及び／または参照の値が測定される。一部の実施形態では、参照の作用因子または値は履歴に基づく参照であり、任意で有形の媒体にて具現化される。通常、当業者によって理解されるように、参照の作用因子または値は、対象とする作用因子または値を測定するまたは特徴付けるのに利用されるものと同等の条件下で測定されるまたは特徴付けられる。一部の実施形態では、対照のまたは「参照」の非ヒト動物（たとえば、マウス）が本明細書で提供され、それには、ゲノムが従来の免疫グロブリン分子（すなわち、同族のＶＨとＶＬドメインを有する免疫グロブリン）を発現する遺伝子操作された非ヒト動物が挙げられる。一部のある特定の実施形態では、対照の遺伝子操作された非ヒト動物には、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５０２，０１８号及び同第８，６４２，８３５号を参照のこと）及び／または「ＵＬＣマウス」（ＵＳ２０１１−０１９５４５４Ａ１、ＵＳ２０１２−００２１４０９Ａ１、ＵＳ２０１２−０１９２３００Ａ１、ＵＳ２０１３−００４５４９２Ａ１、ＵＳ２０１３−０１８５８２１Ａ１及びＵＳ２０１３−０３０２８３６Ａ１を参照のこと；その適用はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）が挙げられる。
【００８６】
「置き換え」という用語は、宿主遺伝子座にて（たとえば、ゲノムにて）見いだされる「置き換えられる」核酸配列（たとえば、遺伝子）がその遺伝子座から取り除かれ、異なる「置き換え」核酸がその場に位置する過程を含むように本明細書で使用される。一部の実施形態では、置き換えられる核酸配列と置き換え核酸配列は、たとえば、それらが互いに相同性である及び／または対応する要素（たとえば、タンパク質をコードする要素、調節性要素等）を含有するという点で互いに同等である。一部の実施形態では、置き換えられる核酸配列はプロモーター、エンハンサー、スプライスドナー部位、スプライスレシーバ部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）の１以上を含み；一部の実施形態では、置き換え核酸配列は、１以上のコーディング配列を含む。一部の実施形態では、置き換え核酸配列は置き換えられる核酸配列のホモログである。一部の実施形態では、置き換え核酸配列は置き換えられる核酸配列のオルソログである。一部の実施形態では、置き換え核酸配列はヒトの核酸配列である、またはそれを含む。一部の実施形態では、置き換え核酸配列がヒトの核酸配列である、またはそれを含む場合を含めて、置き換えられる核酸配列は齧歯類の配列（たとえば、マウスの配列）である、またはそれを含む。そのように配置される核酸配列は、そのように配置される配列を得るのに使用される供給源の核酸配列の一部である１以上の調節配列（たとえば、プロモーター、エンハンサー、５’−または３’−非翻訳領域等）を含んでもよい。たとえば、種々の実施形態では、置き換えは、内在性配列の発現ではなく、そのように配置された核酸配列（異種の配列を含む）からの遺伝子産物の作出を生じる、内在性配列の異種配列による置換であり；置き換えは、内在性配列によってコードされるタンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードする核酸配列を持つ内在性のゲノム配列のものである（たとえば、内在性のゲノム配列は可変ドメインをコードし、ＤＮＡ断片は１以上のヒトの可変ドメインをコードする）。種々の実施形態では、内在性の遺伝子またはその断片は対応するヒトの遺伝子またはその断片で置き換えられる。対応するヒトの遺伝子またはその断片は、構造及び／または機能において置き換えられる内在性の遺伝子またはその断片のオルソログである、またはそれに実質的に類似するまたは同じであるヒトの遺伝子またはその断片である。
【００８７】
語句「小分子」という表現には、担体の非存在下での分子量が約６キロダルトン（ｋＤ）未満のサイズであり、天然の供給源から抽出することができるまたは合成で産出することができる（生体異物性）有機化合物を指す。「小分子」は、さらに無機原子、たとえば、金属錯体を含む有機化合物も含んでもよい。「小分子」はハプテン、たとえば、従来の免疫グロブリン形式で抗原結合タンパク質と結合してもよいが、適応免疫応答を引き出すことができない分子を指してもよい。一部の実施形態では、小分子は担体の非存在下では、約５ｋＤ、４ｋＤ、３ｋＤ、約２ｋＤまたは約１ｋＤ未満である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるような小分子の分子量は担体の非存在下では１ｋＤから６ｋＤまでの範囲である。一部の実施形態では、小分子の分子量は担体の非存在下で１．５ｋＤ未満である。一部のある特定の実施形態では、本明細書で記載されるような小分子の分子量は担体の非存在下では、１４００ダルトン（Ｄ）未満、１３００Ｄ未満、１２００Ｄ未満、１１００Ｄ未満、１０００Ｄ未満、９００Ｄ未満、８００Ｄ未満、７００Ｄ未満、６００Ｄ未満、５００Ｄ未満、４００Ｄ未満、３００Ｄ未満、２００Ｄ未満、または１００Ｄ未満である。一部の実施形態では、小分子は担体の非存在下で約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、または約１００Ｄ未満である。一部の実施形態では、小分子は担体の非存在下で約２０００ｇ／モル未満、約１５００ｇ／モル未満、約１０００ｇ／モル未満、約８００ｇ／モル未満、または約５００ｇ／モル未満である。一部の実施形態では、小分子はポリマーではない。一部の実施形態では、小分子はポリマー部分を含まない。一部の実施形態では、小分子はタンパク質またはポリペプチドではない（たとえば、オリゴペプチドまたはペプチドではない）。一部の実施形態では、小分子はポリヌクレオチドではない（たとえば、オリゴヌクレオチドではない）。一部の実施形態では、小分子は多糖類ではない。一部の実施形態では、小分子は多糖類を含まない（たとえば、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質等ではない）。一部の実施形態では、小分子は脂質ではない。一部の実施形態では、小分子は調節剤である。一部の実施形態では、小分子は生物活性がある。一部の実施形態では、小分子は検出可能である（たとえば、少なくとも１つの検出可能な部分を含む）。一部の実施形態では、小分子は治療剤である。
【００８８】
「体細胞で高頻度変異した」という表現には、クラススイッチを受けたＢ細胞に由来する体細胞の核酸配列によってコードされる核酸配列またはアミノ酸配列への言及が含まれ、その際、クラススイッチしたＢ細胞における免疫グロブリン可変領域の核酸配列（たとえば、軽鎖可変ドメインをコードするまたは軽鎖ＣＤＲ若しくはＦＲの配列を含むヌクレオチド配列）は、たとえば、クラススイッチを受けていないＢ細胞とクラススイッチを受けているＢ細胞の間でのＣＤＲまたはフレームワークの核酸配列における差異のように、クラススイッチの前のＢ細胞における核酸配列とは同一ではない。「体細胞変異した」にはまたは、親和性成熟していないＢ細胞における対応する免疫グロブリン可変領域の配列（すなわち、生殖細胞系列の細胞のゲノムにおける配列）とは同一ではない親和性成熟したＢ細胞に由来する核酸配列またはそれによってコードされるアミノ酸配列への言及が含まれる。「体細胞変異した」という表現にはまた、対象とするエピトープにＢ細胞を曝露した後のＢ細胞に由来する免疫グロブリン可変領域の核酸配列への言及も含まれ、その際、核酸配列は対象とするエピトープにＢ細胞を曝露する前の対応する核酸配列とは異なる。「体細胞変異した」という用語には、ヒトの免疫グロブリン可変領域の核酸配列を有する動物、たとえばマウスにて、抗原感作に応答して生成されている、及びそのような動物にて生得的に作動する選択過程の結果生じる免疫グロブリンに由来する配列が含まれる。
【００８９】
「実質的に」という用語には、対象とする特徴または特性の総量または総量に近い度合いまたは程度を示す質的状態が含まれる。生物学技術の当業者は、生物学的な及び化学的な現象は、仮にあるとしても稀にしか、完了まで進まない及び／または完全性に進行しない、または絶対的な結果を達成しない若しくは回避しないことを理解するであろう。従って、「実質的に」という用語は多数の生物学的な及び化学的な現象にて本来存在する完全性の潜在的な欠如をとらえるように本明細書では使用される。
【００９０】
「実質的な相同性」という表現には、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較が含まれる。当業者によって十分に理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置で相同の残基を含有するのであれば、「実質的に相同である」と一般に見なされる。相同の残基は同一の残基であってもよい。或いは、相同の残基は、適切に類似の構造及び／または機能的な特徴を持つ非同一残基であってもよい。たとえば、当業者によって周知のように、ある特定のアミノ酸は通常、「疎水性の」または「親水性の」アミノ酸として、及び／または「極性」側鎖または「非極性」側鎖を有するとして分類される。１つのアミノ酸の同一型のもう１つのアミノ酸への置換は多くの場合「相同性」置換と見なされてもよい。典型的なアミノ酸の分類を表１及び表２にて要約する。
【００９１】
この当該技術で周知のように、アミノ酸配列または核酸配列は、たとえば、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、及びアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ギャップのあるＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのような市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、種々のアルゴリズムのいずれかを用いて比較されてもよい。例となるそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９にて記載されている。相同性の配列を特定することに加えて、上述のプログラムは通常、相同性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くが適切な残基の区間にわたって相同であるならば、実質的に相同であると見なされる。一部の実施形態では、適切な区間は完全な配列である。一部の実施形態では、適切な区間は少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、またはそれより多い残基である。一部の実施形態では、適切な区間には、完全な配列に沿った隣接する残基が含まれる。一部の実施形態では、適切な区間には完全な配列に沿った不連続な残基が含まれる。一部の実施形態では、適切な区間は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれより多い残基である。
【表１】
2017510273.tif 000004
【表２】
2017510273.tif 000005
【００９２】
語句「実質的な同一性」という表現には、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較が含まれる。当業者によって十分に理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置で同一の残基を含有するのであれば「実質的に同一である」と一般に見なされる。この当該技術で周知のように、アミノ酸配列または核酸配列は、たとえば、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、及びアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ギャップのあるＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのような市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、種々のアルゴリズムのいずれかを用いて比較されてもよい。例となるそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９にて記載されている。同一性の配列を特定することに加えて、上述のプログラムは通常、同一性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くが残基の適切な区間にわたって同一であるならば、実質的に同一であると見なされる。一部の実施形態では、適切な区間は完全な配列である。一部の実施形態では、適切な区間は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれより多い残基である。
【００９３】
「ターゲティングベクター」または「ターゲティング構築物」という表現には、ターゲティング領域を含むポリヌクレオチド分子が含まれる。ターゲティング領域は、標的の細胞、組織または動物における配列と同一であるまたは実質的に同一である配列を含み、相同組換えを介した細胞、組織または動物のゲノム内の位置へのターゲティング構築物の組み込みを提供する。部位特異的なリコンビナーゼの認識部位（たとえば、ｌｏｘＰまたはＦｒｔ部位）を用いて標的化するターゲティング領域も含まれる。一部の実施形態では、本発明のターゲティング構築物はさらに、特に対象とする核酸配列または遺伝子、選択可能なマーカー、制御配列及び／または調節配列、及びそのような配列が関与する組換えに役立つまたはそれを促すタンパク質の外からの追加が介在する組換えを可能にする他の核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明のターゲティング構築物はさらに、対象とする遺伝子全体またはその一部を含み、その際、対象とする遺伝子は、内在性の配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有するタンパク質全体をまたはその一部をコードする異種の遺伝子である。
【００９４】
核酸配列に関連した「再構成されていない」という用語には、動物細胞の生殖細胞系列に存在する核酸配列が含まれる。一般に、操作されていない非ヒト動物におけるＢ細胞の発生の間で、再構成されていない遺伝子断片の最初の再構成は重鎖遺伝子座におけるＤＨとＪＨの遺伝子断片の連結であり、プロＢ細胞を生成する。それに続く再構成には、重鎖遺伝子座におけるＶＨ−ＤＨＪＨの連結が含まれ、生産的であれば、軽鎖可変領域の遺伝子断片の再構成、たとえば、軽鎖遺伝子座内でのＶＬ遺伝子断片のＪＬ遺伝子断片との連結が含まれる。再構成は、連結がインフレーム（「生産的」）であれば、「生産的である」と見なされる。一方の対立遺伝子における生産的な再構成が結果的に対立遺伝子排除、たとえば、他方の対立遺伝子のサイレンシングを生じてもよい。「再構成されていない」はまた、機能的再構成を受けて重鎖定常領域の遺伝子断片に操作可能に連結された軽鎖可変領域の遺伝子を形成することができる再構成されていないＶＬ及びＪＬの遺伝子断片も指し、そのような操作可能な連結はハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする遺伝子を生じ、それはまた、１以上の内在性の重鎖対立遺伝子の対立遺伝子排除及び／または１以上の内在性の軽鎖遺伝子座における軽鎖可変領域の遺伝子断片の再構成も生じてもよい。
【００９５】
「可変ドメイン」という表現には、Ｎ末端からＣ末端への順で（特に指示されない限り）以下のアミノ酸領域を含む免疫グロブリンの軽鎖または重鎖（所望のように修飾される）のアミノ酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００９６】
「変異体」という用語には、参照実体と有意な構造上の同一性を示すが、参照実体と比較して１以上の化学部分の存在またはレベルにおいて参照実体と構造的に異なる実体が含まれる。多数の実施形態では、変異体は機能的にもその参照実体と異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「変異体」であると適正に見なされるかどうかは、参照実体との構造上の同一性の程度に基づく。当業者によって十分に理解されるように、いずれの生物学的な及び化学的な参照実体も、ある特定の特徴的な構造要素を有する。定義によれば変異体は、１以上のそのような特徴的な構造要素を共有する異なる化学実体である。ほんの数例を挙げれば、小分子は、小分子の変異体がコアの構造要素及び特徴的なペンダント部分を共有するが、他のペンダント部分及び／またはコア内に存在する結合の型（単結合対二重結合、Ｅ対Ｚ等）で異なるように特徴的なコアの構造要素（たとえば、大員環のコア）及び／または１以上の特徴的なペンダント部分を有してもよく、ポリペプチドは、線状空間または三次元空間にて互いに対して指定された位置を有する及び／または特定の生物機能に寄与する複数のアミノ酸で構成される特徴的な配列要素を有してもよく、核酸は、線状空間または三次元空間にて互いに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基で構成される特徴的な配列要素を有してもよい。たとえば、変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列における１以上の差異及び／またはポリペプチド主鎖に共有結合された化学部分（たとえば、糖質、脂質等）における１以上の差異の結果として参照ポリペプチドと異なってもよい。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である参照ポリペプチドとの全体的な配列同一性を示す。代わりにまたはさらに、一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは参照ポリペプチドと少なくとも１つの特徴的な配列要素を共有しない。一部の実施形態では、参照ポリペプチドは１以上の生物活性を有する。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは参照ポリペプチドの生物活性の１以上を共有する。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは参照ポリペプチドの生物活性の１以上を欠く。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは参照ポリペプチドと比べて１以上の生物活性の低下したレベルを示す。多数の実施形態では、対象ポリペプチドは、対象ポリペプチドが特定の位置での少数の配列変化を別にすれば親と同一であるアミノ酸配列を有するのであれば、親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドの「変異体」であると見なされる。通常、親と比べて、変異体における残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満が置換される。一部の実施形態では、変異体は親と比べて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１の置換された残基を有する。多くの場合、変異体は非常に少数の（たとえば、５、４、３、２または１未満の）置換された機能的な残基（すなわち、特定の生物活性に関与する残基）を有する。さらに、変異体は通常親と比べて、５、４、３、２または１を超える付加または欠失は有さず、付加または欠失を有さないことが多い。さらに、付加または欠失は通常、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６未満、及び一般に約５、約４、約３、または約２未満の残基である。一部の実施形態では、親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドは自然界で見いだされるものである。当業者によって理解されるように、対象となる特定のポリペプチドの複数の変異体は、特に対象となるポリペプチドが感染性作用因子のポリペプチドである場合、一般に自然界で見いだされてもよい。
【００９７】
「ベクター」という用語には、核酸分子であって、それが会合する別の核酸を輸送することができる核酸分子が含まれる。一部の実施形態では、ベクターは、それらが、たとえば、真核細胞及び／または原核細胞のような宿主細胞にて連結される核酸の染色体外の複製及び／または発現が可能である。操作可能に連結された遺伝子の発現を指図することができるベクターは本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００９８】
「野生型」という用語は、「正常な」（変異体、病んだ、変化した等と対比されるような）状態または背景で自然界にて見いだされるような構造及び／または活性を有する実体を含む当該技術で理解される意味を有する。当業者は、野生型の遺伝子及びポリペプチドが複数の異なる形態（たとえば、対立遺伝子）にて存在することが多いことを十分に理解するであろう。
【００９９】
ある特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、とりわけ、軽鎖可変ドメイン（たとえば、ＶＬ領域）コードするヒトの遺伝物質を有する遺伝子操作された非ヒト動物の使用方法を提供する。ある特定の実施形態では、そのような非ヒト動物は、たとえば、従来の免疫グロブリン型を逃れる抗原決定基と結合するヒトＶＬドメインの、及びそのようなヒトＶＬドメインに含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）の作出及び単離に有用である。そのような非ヒト動物は、独特の抗原結合特性を示すヒトＶＬドメインの生成及び親和性成熟のための新規の生体内の系を提供することが企図される。そのような抗原結合タンパク質は天然の免疫グロブリンから逃れてもよい外来抗原を認識する能力を有する。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、対照の遺伝子操作された非ヒト動物と比べて抗原に結合する同族のヒトＶＬドメインを生成することができ；一部の実施形態では、そのような非ヒト哺乳類は、構造で免疫グロブリンに似た結合タンパク質を発現するが、重鎖可変配列を欠いているＢ細胞集団を発生させる及び／または有する。一部の実施形態では、そのような非ヒト動物によって発現される抗原結合タンパク質は、抗原結合部分が専らヒトＶＬドメインで構成されることを特徴とする。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物及び異なる種（たとえば、ヒト）に由来する遺伝物質を含有する内在性の免疫グロブリン重鎖の遺伝子座と非ヒト動物及び異なる種（たとえば、ヒト）に由来する遺伝物質を含有する内在性の免疫グロブリン軽鎖の遺伝子座を含む。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、再構成されていないヒトＶＬ及びＪＬの遺伝子断片を含む免疫グロブリン重鎖の遺伝子座と再構成されていないヒトＶＬ及びＪＬの遺伝子断片を含む免疫グロブリン軽鎖の遺伝子座とを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質の発現は、非ヒトの免疫グロブリン遺伝物質（たとえば、非ヒトの免疫グロブリンのプロモーター及び／またはエンハンサー）の制御下にある。
【０１００】
本発明の種々の態様が以下の節で詳細に記載される。節の使用は本発明を限定することを意図するものではない。各節は本発明の任意の態様に適用することができる。
【０１０１】
小分子に特異的な免疫グロブリン様の結合タンパク質
一態様では、小分子と特異的に結合するＶＬ抗原結合タンパク質が提供される。本明細書で記載されるＶＬ抗原結合タンパク質の態様には、好ましくは再構成されていないヒトのＪＬ遺伝子断片（またはその一部）及びさらに好ましくは１以上の重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されたヒトのＪＬ遺伝子断片（またはその一部）と共に、好ましくは再構成されていないヒトのＶＬ遺伝子断片（またはその一部）及びさらに好ましくは再構成されたヒトのＶＬ遺伝子断片（またはその一部）を含む、またはそれに由来するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子によってコードされるハイブリッド鎖を含むＶＬ抗原結合タンパク質が含まれる。軽鎖遺伝子断片の再構成の際、重鎖定常領域をコードする配列に融合された軽鎖可変領域をコードする配列を含む再構成されたヌクレオチド配列が得られる。この配列は、重鎖定常ドメインに融合された軽鎖定常ドメインを有するハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする。従って、一実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリンは、Ｎ末端からＣ末端までのＶＬドメインとＣＨドメインとから本質的に成る。一実施形態では、ＣＨドメインはＣＨ１領域、ヒンジ、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、及び任意でＣＨ４領域を含む。別の実施形態では、ＣＨ１ドメインは機能的なＣＨ１ドメインを欠き、たとえば、ＣＨ１ドメイン全体またはその一部を欠くが、さらにヒンジ領域を欠いてもよい。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質は、小分子に特異的に結合する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むハイブリッド免疫グロブリン鎖を含み、その際、該免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは重鎖定常領域に操作可能に連結される。一部の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質は、第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含み、その際、第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは会合して小分子と特異的に結合する結合ポケットを形成してもよい。一態様では、会合して結合ポケットを形成する第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインから本質的に成る抗原結合タンパク質が提供され、その際、該抗原結合タンパク質は小分子と特異的に結合する。
【０１０３】
一実施形態では、第１及び／または第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはヒトの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインである。一実施形態では、第１及び／または第２の免疫グロブリン軽鎖ドメインは齧歯類に由来する。一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットから選択される。
【０１０４】
種々の実施形態では、本明細書で開示されるようなＶＬ抗原結合タンパク質、たとえば、本明細書で開示される遺伝子操作された非ヒト動物、たとえば、マウスによって産生されるものは、従来の抗体よりも平均して小さくてもよく、小さなサイズに関連する利点を持ってもよい。より小さなサイズは少なくとも部分的には、通常ＶＨドメインに存在するＤＨ領域によってコードされるアミノ酸配列が存在しないことで実現される。より小さなサイズはまた、たとえば、Ｖκ領域及びＪκ領域に由来するＣＤＲ３の形成において実現することもできる。
【０１０５】
一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変ドメインから形成されるヒト抗原結合タンパク質の結合ポケットよりも高い親和性で小分子と結合する。
【０１０６】
一実施形態では、第１及び／または第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはヒトの軽鎖可変ドメインである。一実施形態では、該軽鎖可変ドメインの結合ポケットはヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変ドメインから形成されるヒト抗体の結合ポケットよりも高い親和性で小分子と結合する。
【０１０７】
一実施形態では、第１の軽鎖可変ドメインは第１の免疫グロブリン重鎖定常領域に連結される。一実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖定常領域は非ヒト動物に由来する。一実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物はニワトリである。一実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４及びそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、第１の免疫グロブリン重鎖定常領域はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。
【０１０８】
一実施形態では、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは第２の免疫グロブリン軽鎖定常領域に連結される。一実施形態では、第２の免疫グロブリン軽鎖定常領域は非ヒト動物に由来する。一実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物はニワトリである。
【０１０９】
一実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質は２つの同一の軽鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質は異種配列を持つ２つの軽鎖可変ドメインを含む。
【０１１０】
小分子と結合するＶＬ抗原結合タンパク質は、本明細書で開示されるような遺伝子操作された非ヒト動物から得てもよいし、または該小分子で免疫した後のそのような動物から単離される細胞及び／または核酸に由来してもよい。
【０１１１】
ＶＬタンパク質を発現する遺伝子操作された非ヒト動物
免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと融合された重鎖定常ドメインを有するハイブリッド免疫グロブリン鎖を含むＶＬ抗原結合タンパク質を発現する非ヒト動物が提供される。さらに、ＶＬ抗原結合タンパク質の一部としてハイブリッド鎖を発現するように、たとえば、ラット及びマウスを含むが、それらに限定されない齧歯類のような非ヒト動物を遺伝子操作する複数の戦略が提供され、その際、該ハイブリッド鎖は、ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されたＶＬ領域をコードする核酸によってコードされる、またはそれに由来する。そのような遺伝子操作された非ヒト動物は、一部の従来の抗体の四量体構造を有するが、今までの抗体と比べて独特の結合特性を示すＶＬ抗原結合タンパク質の集団を生成するための供給源を表す。
【０１１２】
本明細書で記載される操作された非ヒト動物は、ハイブリッド鎖と対合した同族の軽鎖も含んで抗体様である、たとえば、四量体であってもよいＶＬ抗原結合タンパク質であるが、重鎖（または重鎖の対）の代わりに、ＶＬ抗原結合タンパク質がＣＨドメインに融合された、ＶＨドメインではなく、ＶＬドメインを含むハイブリッド鎖（またはハイブリッド鎖の対）を含むＶＬ抗原結合タンパク質を生成してもよい。
【０１１３】
種々の実施形態では、操作された非ヒト動物はＶＬ抗原結合タンパク質を作り、その際、ハイブリッド鎖のＶＬドメインは軽鎖のＶＬドメイン全体にわたる高い程度の体細胞高頻度変異を示す。一部の実施形態では、ハイブリッド鎖のＶＬ領域は、ＣＬ領域と融合されたＶＬ領域よりも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍または５倍、またはそれより多い体細胞高頻度変異を示す。一部の実施形態では、操作された非ヒト動物、たとえば、マウスは、抗原に応答してハイブリッド鎖のＶＬドメインを含む抗原結合タンパク質の集団を提示し、その際、ＶＬ抗原結合タンパク質の該集団は、同じ抗原に応答して野生型マウスが示す抗原結合タンパク質、たとえば、軽鎖のＶＬドメインの集団にて観察されるよりも、ハイブリッド鎖のＶＬドメインにて平均約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍または５倍、またはそれより多い体細胞高頻度変異を示す。
【０１１４】
一実施形態では、ハイブリッド鎖のＶＬドメインにおける体細胞高頻度変異はＣＤＲ３における１以上または２以上のＮ付加を含む。種々の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質は、内在性の軽鎖遺伝子座から再構成された軽鎖について自然界で観察されるよりも多数のＮ付加を含む免疫グロブリン軽鎖の配列によってコードされる可変ドメインを含むハイブリッド鎖を含み、たとえば、ＶＬ遺伝子断片とヒトＪＬ遺伝子断片が再構成して重鎖定常領域の遺伝子に操作可能に連結された再構成された可変領域の遺伝子を形成し、その際、再構成された軽鎖可変領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２，１３、１４、１５、１６、またはそれより多いＮ付加を含む。
【０１１５】
一態様では、免疫グロブリンのハイブリッド鎖の遺伝子座を含む非ヒト動物、たとえば、マウスが提供される。一実施形態では、ハイブリッド鎖の遺伝子座は、内在性の重鎖遺伝子座の中に創られ、その際、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖の遺伝子座における１以上の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）の遺伝子断片、重鎖多様性（ＤＨ）の遺伝子断片、及び重鎖連結（ＪＨ）の遺伝子断片が、１以上の軽鎖可変領域（ＶＬ）の遺伝子断片及び１以上の軽鎖連結領域（ＪＬ）の遺伝子断片によって置き換えられる。一態様では、内在性の免疫グロブリン重鎖の遺伝子座を置き換えるハイブリッド鎖の遺伝子座を含む非ヒト動物が提供され、たとえば、一方または双方の重鎖遺伝子座における内在性のＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片すべてまたは実質的にすべてが、内在性のマウスＣＨ遺伝子と組み換えてＶＬ遺伝子断片、ＪＬ遺伝子断片、及び内在性のマウスＣＨ遺伝子に由来する再構成された遺伝子を形成することができる内在性の重鎖遺伝子座にて再構成されたＶＬ遺伝子配列を形成する１以上のＶＬ遺伝子断片及び１以上のＪＬ遺伝子断片によって置き換えられる。
【０１１６】
非ヒト動物はまた、一部の従来の抗体の四量体構造に類似するが、結合特性で異なる結合タンパク質、たとえば、ＶＬ抗原結合タンパク質の発現を生じ、非ヒト動物の細胞の膜表面に前記ＶＬ抗原結合タンパク質の発現を生じる免疫グロブリン遺伝子座のヒト化も包含する。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、抗原に結合するＶＬ抗原結合タンパク質のハイブリッド鎖及び軽鎖のいずれかまたは双方でヒトＶＬドメインを生成することができ；一部の実施形態では、そのような非ヒト動物は、いかなるＶＨ、ＤＨ及び／またはＪＨの遺伝子断片配列によってもコードされないまたはそれらに由来しない可変ドメインを含む結合タンパク質を発現するＢ細胞集団を発生する及び／または有する。一部の実施形態では、そのような非ヒト動物によって発現されるＶＬ抗原結合タンパク質は、抗原結合部分が専らヒトＶＬドメインで構成されることを特徴とする。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、内在性の免疫グロブリン重鎖の遺伝子座にて非ヒト動物及び異なる種（たとえば、ヒト）に由来する遺伝物質を含み、及び内在性の免疫グロブリン軽鎖の遺伝子座にて非ヒト動物及び異なる種（たとえば、ヒト）に由来する遺伝物質を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、再構成されていないヒトＶＬの遺伝子断片及び／またはヒトＪＬの遺伝子断片を含む免疫グロブリンのハイブリッド鎖の遺伝子座、好ましくは再構成されていないヒトＶＬの遺伝子断片及び／またはヒトＪＬの遺伝子断片を含む免疫グロブリンの軽鎖の遺伝子座を含む。一部の実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質の発現は、非ヒト免疫グロブリンの遺伝物質（たとえば、非ヒト免疫グロブリンのプロモーター及び／またはエンハンサー）の制御下にある。
【０１１８】
一実施形態では、ＶＬ断片はヒトのＶＬである。一実施形態では、ＪＬ断片はヒトのＪＬである。特定の実施形態では、ＶＬ及びＪＬの断片はヒトＶＬ及びヒトＪＬの断片である。
【０１１９】
一実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片が少なくとも６つのヒトＶκの遺伝子断片及び少なくとも１つのＪκ遺伝子断片によって置き換えられる。一実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片が少なくとも１６のヒトＶκの遺伝子断片（ヒトＶκ）及び少なくとも１つのＪκ遺伝子断片によって置き換えられる。一実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片が少なくとも３０のヒトＶκの遺伝子断片及び少なくとも１つのＪκ遺伝子断片によって置き換えられる。一実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片が少なくとも４０のヒトＶκの遺伝子断片及び少なくとも１つのＪκ遺伝子断片によって置き換えられる。一実施形態では、少なくとも１つのＪκ遺伝子断片は２、３、４、または５のヒトＪκの遺伝子断片を含む。
【０１２０】
一実施形態では、ＶＬ断片はヒトのＶκ断片である。一実施形態では、ヒトのＶκ断片は、４−１、５−２、７−３、２−４、１−５、及び１−６を含む。一実施形態では、Ｖκ断片は、３−７、１−８、１−９、２−１０、３−１１、１−１２、１−１３、２−１４、３−１５、１−１６を含む。一実施形態では、ヒトのＶκ断片は、１−１７、２−１８、２−１９、３−２０、６−２１、１−２２、１−２３、２−２４、３−２５、２−２６、１−２７、２−２８、２−２９、及び２−３０を含む。一実施形態では、ヒトのＶκ断片は、３−３１、１−３２、１−３３、３−３４、１−３５、２−３６、１−３７、２−３８、１−３９、及び２−４０を含む。
【０１２１】
一実施形態では、ＶＬ断片はヒトのＶκ断片であり、４−１、５−２、７−３、２−４、１−５、１−６、３−７、１−８、１−９、２−１０、３−１１、１−１２、１−１３、２−１４、３−１５、及び１−１６を含む。一実施形態では、Ｖκ断片はさらに１−１７、２−１８、２−１９、３−２０、６−２１、１−２２、１−２３、２−２４、３−２５、２−２６、１−２７、２−２８、２−２９、及び２−３０を含む。一実施形態では、Ｖκ断片はさらに３−３１、１−３２、１−３３、３−３４、１−３５、２−３６、１−３７、２−３８、１−３９、及び２−４０を含む。
【０１２２】
一実施形態では、ＶＬ断片はヒトのＶλ断片であり、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスタＡの断片を含む。特定の実施形態では、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスタＡの断片はｈＶλ３−２７からｈＶλ３−１に伸びる。
【０１２３】
一実施形態では、ＶＬ断片は、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスタＢの断片を含む。特定の実施形態では、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスタＢの断片はｈＶλ５−５２からｈＶλ１−４０に伸びる。
【０１２４】
一実施形態では、ＶＬ断片は、クラスタＡのゲノム断片とクラスタＢのゲノム断片とを含むヒトλ軽鎖可変領域の配列を含む。一実施形態では、ヒトλ軽鎖可変領域の配列はクラスタＡの少なくとも１つの遺伝子断片とクラスタＢの少なくとも１つの遺伝子断片とを含む。
【０１２５】
一実施形態では、ＶＬ断片はクラスタＢの少なくとも１つの遺伝子断片とクラスタＣの少なくとも１つの遺伝子断片とを含む。
【０１２６】
一実施形態では、ＶＬ断片はｈＶλ３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１１、及び３−１２を含む。特定の実施形態では、ＶＬ断片は、Ｖλ３−１２からＶλ３−１に及ぶヒトλ軽鎖遺伝子座の隣接する配列を含む。一実施形態では、隣接する配列は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のｈＶλを含む。特定の実施形態では、ｈＶλには３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１１、及び３−１２が含まれる。特定の実施形態では、ｈＶλは、Ｖλ３−１２からＶλ３−１に及ぶヒトλ遺伝子座の隣接する配列を含む。
【０１２７】
一実施形態では、ｈＶλは１３〜２８以上のｈＶλを含む。特定の実施形態では、ｈＶλには２−１４、３−１６、２−１８、３−１９、３−２１、３−２２、２−２３、３−２５、及び３−２７が含まれる。特定の実施形態では、ｈＶλはＶλ３−２７からＶλ３−１に及ぶヒトλ遺伝子座の隣接する配列を含む。
【０１２８】
一実施形態では、ＶＬ断片は２９〜４０のｈＶλを含む。特定の実施形態では、ＶＬ断片は、Ｖλ３−２９からＶλ３−１に及ぶヒトλ遺伝子座の隣接する配列と、Ｖλ５−５２からＶλ１−４０に及ぶヒトλ遺伝子座の隣接する配列とを含む。特定の実施形態では、遺伝子操作されたマウスにおけるｈＶλ１−４０とｈＶλ３−２９との間の配列すべてまたは実質的にすべては、ｈＶλ１−４０の遺伝子断片（３’非翻訳部分の下流）の下流にて自然界（たとえば、ヒト集団）で見いだされるおよそ９５９ｂｐのヒトλ配列と、制限酵素部位（たとえば、ＰＩ−ＳｃｅＩ）と、それに続く自然界で見いだされるｈＶλ３−２９遺伝子断片の上流のおよそ３，４３１ｂｐのヒトλ配列から本質的に成る。
【０１２９】
一実施形態では、Ｊκはヒトのものであり、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。特定の実施形態では、ＪκはＪκ１からＪκ５までを含む。
【０１３０】
一実施形態では、ＶＬ断片はヒトＶλ断片であり、Ｊκ遺伝子断片は１２量体のスペーサーを有するＲＳＳを含み、ＲＳＳはＪκ遺伝子断片の上流末端で並置される。一実施形態では、ＶＬ遺伝子断片はヒトＶλであり、ＶＬＨ遺伝子座は、それぞれ１２量体のスペーサーを有するＲＳＳを含む２以上のＪκ遺伝子断片を含み、ＲＳＳは各Ｊκ遺伝子断片の上流末端で並置される。
【０１３１】
特定の実施形態では、ＶＬ断片は、Ｖκ４−１からＶκ２−４０までのヒトκ遺伝子座に及ぶ隣接するヒトκ遺伝子断片を含み、ＪＬ断片はＪκ１からＪκ５までのヒトκ遺伝子座に及ぶ隣接する遺伝子断片を含む。
【０１３２】
一実施形態では、ＶＬ断片がＶλ断片であり、ＶＬ断片とＪ断片の間にＤＨ断片が存在しない場合、ＶＬ断片は２３量体のＲＳＳの下流に隣接し（すなわち、下流側に並置され）、Ｊκ断片は存在するならば、またはＪλ断片は存在するならば、１２量体のＲＳＳの上流に隣接する（すなわち、上流側に並置される）。
【０１３３】
一実施形態では、Ｖ遺伝子断片がＶκ遺伝子断片であり、Ｖ遺伝子断片とＪ遺伝子断片の間にＤＨ遺伝子断片が存在しない場合、Ｖκ遺伝子断片はそれぞれ１２量体のＲＳＳの下流に並置され、Ｊκ断片は存在するならば、またはＪλ断片は存在するならば、２３量体のＲＳＳの上流にそれぞれ並置される。
【０１３４】
一態様では、本明細書で記載されるように操作された免疫グロブリンの遺伝子座を含む細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、全能性細胞、多能性細胞、人工多能性（ｉＰＳ）細胞及びＥＳ細胞から選択される。一実施形態では、ＥＳ細胞は、さらにマウスのκ軽鎖遺伝子断片のヒトκ軽鎖遺伝子断片によるｉｎ  ｓｉｔｕ置換を含有した１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃヘテロ接合体胚に由来するＦ１  ＥＳ株（Ｆ１Ｈ４；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００７，上記）である（たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第６，５９６，５４１号及び同第８，６４２，８３５号を参照のこと）。一実施形態では、遺伝子操作は、ハイブリッドＥＳ細胞株であって、そのゲノムが５０％のＢＡＬＢ／ｃ［Ｔａｃ］、２５％のＣ５７ＢＬ／６Ｎ［Ｔａｃ］及び２５％の１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅ（Ｖ１７）を含むハイブリッドＥＳ細胞株にて実施される。
【０１３５】
特定の実施形態では、細胞はマウスの細胞、たとえば、マウスのＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞は操作される免疫グロブリンの遺伝子座についてホモ接合体である。一実施形態では、細胞はラット細胞、たとえば、ラットＥＳ細胞である（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ−２０１４−０３１０８２８−Ａ１を参照のこと）。
【０１３６】
小分子
一実施形態では、小分子はハプテンであり、小分子は担体に連結される。一実施形態では、担体は、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ロコガイのヘモシアニン（ＣＣＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ウシ血清アルブミン（ｃＢＳＡ）、または卵白アルブミンを含む。一部の実施形態では、小分子は分子量が６ｋＤａ未満である有機化合物である。
【０１３７】
一部の実施形態では、小分子は、大きな担体に連結された場合のみ免疫応答を引き出すが、それ以外は同等の条件下で、担体または他のアジュバントを欠く、たとえば、アジュバントの非存在下にて単独で免疫原として採用される場合、有用なまたは十分な免疫応答を生じないという点でハプテンである。ハプテンの例には、抗生剤、農薬、除草剤、殺虫剤、薬剤、ビタミン、ステロイド、ホルモン、毒素、爆薬、及び染料が挙げられるが、それらに限定されない（たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＧｕｎｔｈｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＳｕｐｅｒＨａｐｔｅｎ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００７，Ｄ９０６−９１０を参照のこと）。ハプテン及び対応するハプテン／担体複合体の包括的なリストは、ハプテンデータベース（Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００６，２２：２５３−２５５）でも見いだすことができ、それはＵＲＬ「ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｈａｐｔｅｎｄｂ／」にてワールド・ワイド・ウェブ（ｗｗｗ）上でインターネットを介してアクセスできる。
【０１３８】
一部の実施形態では、担体はハプテンと結合し、それが免疫応答を誘導するのを可能にする高分子である。一部の実施形態では、担体は分泌タンパク質または細胞表面タンパク質である。一部の実施形態では、担体はポリマーである。一部の実施形態では、担体はスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）である。一部の実施形態では、担体はロコガイのヘモシアニン（ＣＣＨ）の精製調製物である。一部の実施形態では、担体はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。一部の実施形態では、担体は、過剰なエチレンジアミンで天然ＢＳＡを修飾することによって、本質的に負に荷電したカルボキシル基を正に荷電した１級アミンでキャッピングすることによって調製されるカチオン化ＢＳＡ（ｃＢＳＡ）である。一部の実施形態では、担体は卵白アルブミンである。
【０１３９】
一部の実施形態では、小分子は天然のステロイドである。一部の実施形態では、小分子は、４つの環に配置された１７の炭素原子の分子構造を特徴とするステロイドである。本明細書で記載されるようなステロイドの例にはホルモン及びアルカロイドが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４０】
一部の実施形態では、ステロイドは強心性ステロイド（ＣＴＳ）である。一部の実施形態では、ＣＴＳはＮａ＋／Ｋ＋のＡＴＰアーゼの阻害剤である。ＣＴＳの例には、カルデノリド（内在性のウアバイン）、ブファジエノリド、ブファリン、マリノブファゲニン（ＭＢＧ）及びテロシノブファギンが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、ハプテンはマリノブファゲニン（ＭＢＧ）であり、担体はウシ血清アルブミンである。一部の実施形態では、ステロイドはコルチゾールである。
【０１４１】
一部の実施形態では、小分子は、パラチオン、マラチオン、テトラエチルピロリン酸（ＴＥＰＰ）、４，６−ジニトロ−ｏ−クレゾール（ＤＮＯＣ）、メタシド、デメトン（ｓｙｓｔｅｘ）、クロルダン、トキサフェン、アルドリン、六塩化ベンゼン、リンダン、ジエルドリン、ロテノン、ペステックス、ジクロロジフェニルトリクロロエタン（ＤＤＴ）、セレニウム化合物（シロシド）、リン化亜鉛（Ｚｎ３Ｐ２）、ストリキニン化合物、ワーファリン及び三酸化ヒ素を含むが、それらに限定されない毒物または毒性物質である。
【０１４２】
一部の実施形態では、小分子は、向精神薬または向精神剤であって、脳血管関門を交差し、それが脳機能に影響を及ぼす中枢神経系に作用して知覚、気分、意識、認知及び挙動に変化を生じる向精神薬または向精神剤である。一部の実施形態では、小分子は、カフェイン、ニコチン、アンフェタミン及びコカインを含むが、それらに限定されない刺激剤である。一部の実施形態では、小分子は、モルヒネ、コデイン、ヘロイン、フェンタニル、メタドン及びオキシコドンを含むが、それらに限定されないオピオイドアルカロイドである。一部の実施形態では、小分子は、視覚及び音声を含む知覚をゆがめる幻覚剤である。幻覚剤の例には、メサカリン、シロシビン、ジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）、リゼルグ酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、ジメトキシメチルアンフェタミン（ＤＯＭまたは「ＳＴＰ」）、メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡまたは「エクスタシー」）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４３】
一部の実施形態では、小分子は、アセチルコリン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン、セロトニン、グルタミン酸塩、グリシン及びガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含むが、それらに限定されない神経伝達物質である。
【０１４４】
一部の実施形態では、小分子には、フォルスコリン、ソラマリジン、クロシン、マリファナ化合物、アヘンアルカロイド、ギンセノシド、ベルベリン、センノシド、ペオニフロリン、グリチルリジン、ギンコール酸、アコニチンアルカロイド及びバイカリンが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４５】
核酸構築物、細胞及びそれらを作製する方法
一態様では、提供されるのは、小分子と特異的に結合するＶＬ結合ドメインの可変ドメインをコードする核酸、及び該核酸を発現する細胞である。
【０１４６】
一態様では、ヒトの治療剤を製造するために細胞株を作製するための本明細書で記載されるようなマウスに由来する核酸配列の使用が提供される。一実施形態では、ヒトの治療剤は、ヒト重鎖定常配列に融合されたヒト軽鎖可変配列（たとえば、ヒトＶλまたはヒトＶκの断片に由来する）を含む結合タンパク質である。一実施形態では、ヒトの治療剤は、ヒトのλまたはκの免疫グロブリン軽鎖である第１のポリペプチドと、ヒト重鎖定常配列に融合されたヒトのＶλまたはヒトのＶκの可変配列を含む第２のポリペプチドとを含む。
【０１４７】
一態様では、ヒトのＣＨドメインに融合された体細胞変異したヒトＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳類細胞を含む発現系が提供される。
【０１４８】
一実施形態では、該発現系はさらに、ヒトＣＬドメインに融合された免疫グロブリンＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、その際、ヒトＣＬドメインと融合されたＶＬドメインはヒトＣＨドメインと融合されたＶＬドメインとは同族の軽鎖である。
【０１４９】
一実施形態では、好適な細胞は、ウイルスの核酸配列を発現するＢ細胞、ハイブリドーマ、クアドローマ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞及びヒト網膜細胞（たとえば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０１５０】
一態様では、本明細書で開示されるような非ヒト動物から細胞または核酸を単離する、結合タンパク質を作製する方法が提供され、その際、該細胞または核酸は小分子と結合するＶＬ結合タンパク質を含む、またはコードする。一部の実施形態では、方法はさらに、ＶＬ領域の配列をヒトＣＨ領域をコードする遺伝子とインフレームでコードするヌクレオチド配列をクローニングしてヒト結合タンパク質の配列を形成し、好適な細胞にて該ヒト結合タンパク質の配列を発現することを含む。
【０１５１】
一実施形態では、非ヒトは小分子または担体に連結された小分子で免疫されており、ＣＨ領域に融合されたＶＬ領域は小分子のエピトープと（たとえば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤで）特異的に結合する。一実施形態では、ＣＨ領域に融合されたＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列はマウスにて体細胞変異を受ける。
【０１５２】
一態様では、小分子と結合する抗原結合タンパク質を作製する方法が提供され、該方法は、（ａ）非ヒト動物を小分子または担体に連結された小分子で免疫し、その際、非ヒト動物はその生殖細胞系列に（ｉ）非ヒトの重鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリンの軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片と、（ｉｉ）非ヒト軽鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒトの免疫グロブリンの軽鎖可変（ＶＬ）及び軽鎖連結（ＪＬ）の遺伝子断片を含むことと、（ｂ）非ヒト動物が小分子または担体に連結された小分子に対する免疫応答を開始するのを可能にすることと、（ｃ）免疫した非ヒト動物から細胞（たとえば、リンパ球）を単離し、その際、該細胞は第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第１と第２の免疫グロブリン可変領域の核酸配列を含むことと、（ｄ）対合すると、小分子または担体に連結された小分子と特異的に結合する、第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第１と第２の免疫グロブリン軽鎖可変領域の核酸配列を特定することと、（ｅ）小分子と結合する第１と第２の軽鎖可変ドメインの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成するように抗原結合タンパク質を発現するのに好適な発現系で（ｄ）の核酸配列を発現させることとを含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、細胞（たとえば、Ｂ細胞）は動物から（たとえば、脾臓またはリンパ節から）回収される。該細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死のハイブリドーマ細胞株を調製してもよく、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、免疫に用いた抗原に特異的なハイブリッド重鎖を含有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定する。
【０１５４】
一実施形態では、免疫は、小分子または担体に連結された小分子でマウスを抗原刺激することと、ある期間非ヒト動物を休ませることと、小分子または担体に連結された小分子で動物を再免疫することとを含む。一部の実施形態では、該期間は２〜３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも１ヵ月である。
【０１５５】
一態様では、本明細書で記載されるようなマウスにて作られる免疫グロブリン可変領域（ＶＲ）（たとえば、ヒトＪＬと融合させたヒトＶＬ配列を含む）が提供される。特定の実施形態では、免疫グロブリンＶＲは、Ｖκ断片及びＶλ断片から選択される生殖細胞系列のヒト遺伝子断片に由来し、その際、ＶＲは、再構成された配列が体細胞高頻度変異を受けるマウスに由来する再構成された配列によってコードされる。一実施形態では、再構成された配列は１〜５の体細胞高頻度変異を含む。一実施形態では、再構成された配列は少なくとも６、７、８、９または１０の体細胞高頻度変異を含む。一実施形態では、再構成された配列は１０を超える体細胞高頻度変異を含む。一実施形態では、再構成された配列は１以上のヒトまたはマウスの重鎖定常領域の配列（たとえば、ヒトまたはマウスのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びそれらの組み合わせから選択される）と融合される。
【０１５６】
一態様では、本明細書で記載されるようなマウスで作られる結合タンパク質の免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列が提供される。一実施形態では、ＶＲは、１以上のヒトまたはマウスの重鎖定常領域の配列（たとえば、ヒトまたはマウスのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びそれらの組み合わせから選択される）と融合される。
【０１５７】
一態様では、本明細書で記載されるようなマウスに由来する核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメインが提供される。
【０１５８】
一態様では、本明細書で記載されるようなマウスにて作られる、または本明細書で記載されるようなマウスにて作られる配列に由来する結合タンパク質またはその抗原結合断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）が提供される。
【０１５９】
二重特異性の結合タンパク質
免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと融合された免疫グロブリン重鎖定常領域を含む免疫グロブリン様の結合タンパク質が提供され、同様に軽鎖定常ドメインに融合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと重鎖定常ドメインに融合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを有する結合タンパク質が提供される。そのような結合タンパク質を発現する細胞、それを作るマウス、及び関連する方法及び組成物も提供される。
【０１６０】
本明細書で記載される結合タンパク質及びそれをコードするヌクレオチド配列を用いて、多重特異性の結合タンパク質、たとえば、二重特異性の結合タンパク質を作ることができる。この態様では、ＣＨ領域と融合された第１のＶＬドメインから本質的に成る第１のポリペプチドが、ＣＨ領域と融合された第２のＶＬドメインから本質的に成る第２のポリペプチドと会合することができる。第１のＶＬドメイン及び第２のＶＬドメインが異なるエピトープと特異的に結合する場合、２つのＶＬドメインを用いて二重特異性の結合分子を作ることができる。ＣＨ領域は同一であってもよいし、異なっていてもよい。一実施形態では、たとえば、プロテインＡ結合決定基を取り除くようにＣＨ領域の一方を修飾することができるのに対して他方の重鎖定常領域はそのように修飾されない（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５８６，７１３Ｂ２号を参照のこと）。この特定の配置は、たとえば、ホモ二量体（たとえば、第１または第２のポリペプチドのホモ二量体）の混合物からの二重特異性の結合タンパク質の単離を簡略にする。
【０１６１】
一態様では、ヒトのλまたはκ軽鎖可変ドメインとヒトまたはマウスの重鎖定常領域の配列を含むタンパク質を含む、１以上のκ及び／またはλ軽鎖可変領域の免疫グロブリン配列と免疫グロブリン重鎖定常領域の配列とを含むタンパク質を作るために核酸構築物、細胞、胚、マウス及び方法が提供される。
【０１６２】
一態様では、軽鎖（すなわち、カッパ（κ）及び／またはラムダ（λ））免疫グロブリン可変ドメインに由来するが、完全長の重鎖免疫グロブリン可変ドメインには由来しない免疫グロブリン可変ドメインを含む結合タンパク質が記載される。遺伝子操作されたマウスを含む、結合タンパク質を作るための方法及び組成物も提供される。
【０１６３】
一態様では、本明細書で記載される方法及び組成物を用いて二重特異性の結合タンパク質を作製する。この態様では、ＣＨ領域に融合される第１のＶＬとＣＨ領域に融合される第２のＶＬは、同じアイソタイプ（たとえば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のヒトＩｇＧ配列とインフレームでそれぞれ独立してクローニングされる。第１のＶＬは第１のエピトープと特異的に結合し、第２のＶＬは第２のエピトープと特異的に結合する。第１と第２のエピトープは異なる抗原上にあってもよいし、または同一の抗原上にあってもよい。
【０１６４】
一実施形態では、第１のＶＬに融合されるＣＨ領域のＩｇＧアイソタイプと第２のＶＬに融合されるＣＨ領域のＩｇＧアイソタイプは同じアイソタイプであるが、一方のＩｇＧアイソタイプが少なくとも１つのアミノ酸置換を含むという点で異なる。一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換によって、置換を欠く重鎖と比べて置換を持つ重鎖がプロテインＡと結合できなくなるまたは実質的に結合できなくなる。
【０１６５】
一実施形態では、第１のＣＨ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３ドメインを含み；第２のＣＨ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３ドメインを含み、その際、第２のＣＨ３ドメインは、第２のＣＨ３ドメインのプロテインＡへの結合を減らすまたは取り除く修飾を含む（その全体が参照によって組み入れられる米国特許第８，５８６，７１３Ｂ２号を参照のこと）。
【０１６６】
一実施形態では、第２のＣＨ３ドメインはＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた４３５Ｒの修飾を含む。別の実施形態では、第２のＣＨ３ドメインはＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた４３６Ｆの修飾をさらに含む。
【０１６７】
一実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉから成る群から選択される修飾を含むヒトＩｇＧ１のものである。
【０１６８】
一実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉから成る群から選択される修飾を含むヒトＩｇＧ２のものである。
【０１６９】
一実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉから成る群から選択される修飾を含むヒトＩｇＧ４のものである。
【０１７０】
一実施形態では、結合タンパク質は本明細書で列挙されるような１以上の修飾を有するＣＨ領域を含み、その際、結合タンパク質の定常領域はヒトにおいて非免疫原性である、または実質的に非免疫原性である。特定の実施形態では、ＣＨ領域はヒトにおいて免疫原性エピトープを提示しないアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、結合タンパク質は、野生型のヒト重鎖にて見いだされないＣＨ領域を含み、ＣＨ領域はＴ細胞エピトープを生成する配列を含まない。
【０１７１】
一実施形態では、結果としてエフェクター機能に影響を与える変化したＦｃ受容体結合を有するようにＦｃドメインを修飾することができる。Ｆｃドメインを含む操作された重鎖定常領域（ＣＨ）はキメラであってもよい。したがって、キメラＣＨ領域は１を超える免疫グロブリンのアイソタイプに由来するＣＨドメインを組み合わせる。たとえば、キメラＣＨ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４の分子に由来するＣＨ２ドメインの一部またはすべてを、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４の分子に由来するＣＨ３ドメインの一部またはすべてと組み合わせて含む。キメラＣＨ領域はまたキメラのヒンジ領域も含有することができる。たとえば、キメラのヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けに従った２１６〜２２７位のアミノ酸残基）を、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けに従った２２８〜２３６位のアミノ酸残基）と組み合わせて含んでもよい。一実施形態では、キメラのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４の上部ヒンジに由来するアミノ酸残基とヒトＩｇＧ２の下部ヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。
【０１７２】
ある特定の治療法については、Ｆｃ含有タンパク質（たとえば、抗体）の所望の薬物動態特性に影響を与えることなく正常なＦｃのエフェクター機能のすべて、一部を活性化するように、またはどれも活性化しないようにＦｃドメインが操作されてもよい。キメラＣＨ領域を含み、変化したエフェクター機能を有するタンパク質の例については、その全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年１月３１日に出願された米国特許出願第１４／１７０，１６６号を参照のこと。
【０１７３】
結合特性、ビニング及び関連する方法のプロファイリング
本明細書で開示されるのは、ＶＬ抗原結合タンパク質が、特に本明細書で開示されるようなハイブリッド免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物にて生成されるのであれば、抗原と特異的に結合する場合、１以上の独特のまたは異なる結合特性を、すなわち、同じ抗原と特異的に結合する典型的なまたは従来の抗体によっては示されない結合特性を示し得るという予想外の発見である。そのようなＶＬ抗原結合タンパク質の特定及び／または単離は、そのような抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質の抗原への結合特性を評価する方法を含むが、同じ抗原と特異的に結合する典型的なまたは従来の抗体の結合特性とそれらの結合特性を比較することも含んでもよい。一部の実施形態はさらに、１以上の異なる結合特性を示すＶＬ抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を単離することと、任意で該核酸配列を発現させることとを含む。
【０１７４】
一般的な概説として、抗原結合タンパク質の結合特性をプロファイリングする方法は、（ａ）結合、好ましくは特異的な結合を可能にする条件下で抗原（その断片及び／または修飾されたその断片を含む）に抗原特異的結合タンパク質を接触させることと、（ｂ）あるとしたら、抗原（その断片及び／または修飾されたその断片）と結合タンパク質との間で形成される結合タンパク質／抗原の複合体を検出することとを含む。「結合特性」は本明細書で使用されるとき、感受性、特異性、結合活性、親和性等を含むが、それらに限定されない周知の測定可能な特性のいずれか１つを指す。技量のある熟練者は、これらの一般的な結合特性が特定の結合特性、たとえば、エピトープ特異性、会合定数、解離定数、平衡定数等の組み合わせの結果であってもよいことを認識するであろう。結合プロファイルはそのような結合特性のいずれか１以上を含む。
【０１７５】
「特異的に結合する」、「特異的な結合」、「特異的に結合する」、「抗原特異的な」等は、生理的条件下で相対的に安定である抗原との複合体を形成する抗原結合タンパク質を指す。特異的な結合は、普通低い親和性と中程度から高い能力を有する非特異的な結合と区別されるように高い親和性と中程度から低い能力を特徴とする。通常、結合は会合定数ＫＡが１０６Ｍ−１より高いと特異的であると見なされる。必要に応じて結合条件を変えることによって特異的な結合に実質的に影響を与えることなく非特異的な結合を減らすことができる。たとえば、抗原結合タンパク質の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合にかける時間、ブロッキング剤（たとえば、血清アルブミン、乳カゼイン）の濃度等のような適当な結合条件は日常の技法を用いて技量のある熟練者によって最適化されてもよい。
【０１７６】
抗原に向けられた多数の抗原結合タンパク質をプロファイリングする方法は当該技術で周知であり、それには、日常の交差ブロッキングアッセイ、エピトープマッピング、アラニン走査変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３−６３）、ペプチド切断分析、エピトープ切断及びエピトープ抽出及び抗原の化学修飾（Ｔｏｍｅｒ（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：９：４８７−４９６）が挙げられるが、それらに限定されない。一般に、これらの方法には、抗原（または修飾された断片を含むその断片）の表面への固定化が含まれてもよい。
【０１７７】
一般に、抗原またはその断片を固定化する、それと結合する及び／または連結するのに好適な固形または半固形の支持体（及び抗体を固定化するのに固形支持体を好適にする修飾）は当該技術で周知である。固形支持体の非限定例には、バイオセンサーチップアレイ、ビーズ（たとえば、ポリスチレンビーズ、磁化ビーズ）、マイクロウェルプレート等が挙げられる。従って、たとえば、シリカのシェルに内包されたＣｄＳｅ−ＣｄＳのコアシェルのナノ結晶は抗原またはその断片へのカップリングのために容易に誘導体化することができる（Ｂｒｕｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１３−２０１６）。同様に、高度に蛍光性の量子ドット（硫化亜鉛でキャップしたセレン化カドミウム）が超高感度の生物学的検出で使用するために生体分子に共有結合されている（Ｗａｒｒｅｎ及びＮｉｅ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１６−２０１８）。蛍光標識したビーズはＬｕｍｉｎｅｘ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔから市販されている。加えて、パッド、フィルム、ナノウェル、または微小流体チャンネルも固形支持体としての役割を果たしてもよい。
【０１７８】
一部の実施形態では、抗原またはその断片（修飾されたその断片を含む）をフッ化ポリビニリデン、ニトロセルロース、アガロース及び／またはポリアクリルアミドのゲルパッドのような固形または半固形の表面上に固定化してもよく、それと結合してもよく、または連結してもよい。アルデヒド、ポリリジンまたはホモ官能性クロスリンカーで活性化したガラススライドも使用されてもよい。一部の実施形態では、抗原（複数可）またはその断片（複数可）は三次元アレイ、たとえば、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２４（１５）：２９９８−３００４（１９９６）にて記載された三次元のポリアクリルアミドのゲルパッドマイクロアレイにて配置されてもよい。好適な実施形態では、抗原（複数可）またはその断片（複数可）はバイオセンサーチップの表面、ポリスチレンビーズ等に固定化されてもよい。
【０１７９】
抗原結合のための方法及び条件は当該技術で周知であり、本明細書でさらに記載される。当該技術で周知なのはまた、抗原／結合タンパク質の複合体を検出するための方法及び条件である。抗原／結合タンパク質の複合体の検出は定性的であってもよく及び／または定性的であってもよい。たとえば、セットにおける複数の（一般に多数の）結合タンパク質の結合も検出されてもよい。抗原結合タンパク質の複合体を検出する方法には、たとえば、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫アッセイ、ウエスタン及びドットブロット、免疫沈降、競合ポリペプチドを用いた競合アッセイ、及び焦点免疫アッセイ、表面プラスモン共鳴法（ＳＰＲ）技術、多重検出アッセイ等が挙げられる。
【０１８０】
差別的抗原かく乱
好適な実施形態では、本明細書で開示されるようなプロファイリング法は、一連の独立した安定な変化を高分子に導入した後の該高分子に対する２つの結合タンパク質の応答パターン（たとえば、結合プロファイル）間の類似性の程度は、２つの結合タンパク質によって結合される高分子のエピトープ間の類似性の程度を反映するというプリンシパルにある程度基づく。高分子にて変化がなされた後のそのような高分子の相互作用を評価することは、修飾支援型のプロファイリング（ＭＡＰ）、抗原構造に基づく抗体のプロファイリング（ＡＳＡＰ）または差別的抗原かく乱（ＤＡＤ）として当該技術で既知の方法である。ＤＡＤは、各抗原結合タンパク質の結合プロファイルの化学的にまたは酵素的に修飾された抗原またはその断片への類似性に従って同じ抗原に向けられた多数の抗原結合タンパク質をカテゴリーに分類する方法である（その全体が参照によって本明細書に具体的に組み入れられる米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号；またＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１４：９−２０も参照のこと）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表される結合特性（たとえば、エピトープ）とは明瞭に異なる、またはそれと部分的に重複する結合特性（たとえば、エピトープ）を反映してもよい。この技術によって、遺伝的に同一の抗原結合タンパク質の迅速な選別が可能になるので特徴付けを遺伝的に異なっている抗原結合タンパク質に集中させることができる。ＤＡＤを用いて、本発明のＶＬ抗原結合タンパク質を、たとえば、典型的な抗体に対して覆い隠されているエピトープと結合するＶＬ抗原結合タンパク質を、従来の抗体と比べて独特の結合特性を示す抗原結合タンパク質のグループに選別してもよい。
【０１８１】
好ましくは、抗原タンパク質をバイオセンサーチップの表面またはポリスチレンビーズのいずれかに固定化してもよい。親和性に基づくバイオセンサーは、半導体エレクトロニクスと液相生物学の間での界面でシグナル変換因子として、たとえば、抗体、受容体、リガンド、酵素、糖質または核酸のような生体分子を採用する。これらの生体分子の相互作用の固有の認識特性は、高度な感度と選択性を持つバイオセンサーによって観察することができ、測定することができる（概説については、Ｂａｉｒｄ及びＭｙｓｚｋａ（２００１）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，１４：２６１−２６８を参照のこと）。
【０１８２】
バイオセンサーを使用する利点には、リアルタイムでデータを回収する能力であり、したがって結合反応についての詳細な情報を迅速に提供することであり、第２に、相互作用している生体分子間の結合反応は、結合反応が観察されるために生体分子を、たとえば、蛍光標識または放射性標識で標識することを必要としない。最も確立されたバイオセンサーの機器及び技術は現在のところＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって提供されている。Ｂｉａｃｏｒｅ機器（モデル１０００、２０００、及び３０００）は完全に自動化された、９６穴プレートから直接試料を受け入れることができる、センサーチップに基づくＳＰＲ装置である。これらの機器の１つに結合させると、チップと呼ばれるセンサー表面は個々に操作することができる、または一連の操作ができる４つの独立したフローセルに分割される。このフローセルの構成によって、緩衝液が連続してセンサー表面を通過することが可能になり、それによって検体溶液を緩衝液に交換する場合、時間のかかる洗浄ステップの必要性を軽減する。加えて、連続フロー系は、結合測定の過程の持続時間の間、リガンドが一定の検体濃度に曝露されることを保証する。さらに、各センサーチップ上での４つのフローセルの可用性は、ユーザーが３つの異なる試料を固定化し、同じセンサーチップ内で参照表面を維持することを可能にする。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００及び３０００モデルは、４つのフローセル内すべてで同時に結合相互作用をモニタリングすることができる。順次の各表面への検体の送達はインラインでの参照減算及び改善されたデータの質を可能にする（Ｍｙｓｚｋａ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．１２：２７９−２８４；Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：５４−７１）。たとえば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＳｅｎｓｏｒｓによるＩＡＳＹＳ（登録商標）機器、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｌａｓｅｒ  ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓによるＳＰＲ６７０、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  μＳｙｓｔｅｍｓによるＢｉｏ−Ｓｕｐｌａｒ  ＩＩ、及びＴｅｘａｓ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＳＰＲＥＥＴＡ（商標）のような他のバイオセンサーも本発明の方法を実践するのに使用することもできる。
【０１８３】
ポリスチレンビーズは、たとえば、多重ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，ＴＸ）のようなアッセイで処理されてもよい。ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）の１００までの異なる型のビーズによる多重アッセイを取り扱う能力のために、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）は種々の修飾を伴ったほぼ無限の抗原表面を提供し、結果的に抗原エピトープのプロファイリングにおける分解能を改善する。
【０１８４】
抗原構造の修飾または変化は、抗原タンパク質の特定のアミノ酸残基の側鎖を特に修飾する傾向がある化学処理、または酵素処理のいずれかによって達成されてもよい。修飾はすべて好ましくは、表面、たとえば、バイオセンサーの表面、ポリスチレンビーズ等に固定化される抗原上で行われてもよい。何らかの形で修飾された抗原を含む各表面またはビーズで多数の異なる型の抗原の修飾が実施されてもよい。通常、修飾されない抗原が固定化される適当な対照表面が検体に含まれてもよい。
【０１８５】
化学的な変化または修飾を達成するのに好適である化学物質の非限定例には、スクシンイミジルエステル及びその誘導体、１級アミン含有化合物、ヒドラジン及びカルボヒドラジン、遊離のアミノ酸、２〜２０の残基長を含有するホモ−及びヘテロ−オリゴペプチド、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ）／ヨードアセトアミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／エタノールアミン、ヨードアセトアミド及びヒドラジン、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキサール（ＨＰＧ）、過酸化水素、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−アセチルイミダゾール、テトラニトロメタン、アルサニル酸、塩化ダンシル、グルタールアルデヒド、ニンヒドリン、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）、酢酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＮＨＳ−酢酸）、ポリエチレングリコール５０００（ＰＥＧ−５０００）、及び７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、スクシンイミジルエステルが挙げられる。技量のある熟練者は、さらに多くの他の化学物質がＤＡＤを実施するのに使用されてもよいことを認識するであろう。
【０１８６】
抗原の酵素的な変化または修飾を達成するのに好適である酵素、特にプロテアーゼの非限定例には、修飾されたブタトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、パパイン、サーモリシン、スブチリシン、プロテアーゼＫ、ブロメライン、及びスルフヒドリル特異的プロテアーゼ（フィシン）が挙げられる。ここでも、技量のある熟練者は本発明の方法を実行するのに他のプロテアーゼが使用されてもよいことを容易に認識するであろう。
【０１８７】
ＳＰＲ技術を用いて、各センサーチップの修飾されていない表面１つと３つの修飾された表面を含む表面すべてにて抗原結合タンパク質の複合体を同時に測定することを可能にする実験設定を用いて結合を共鳴単位（ＲＵ）として測定してもよい。３つの修飾された表面それぞれからの結合応答の対照（未修飾の）センサー表面に対する百分率として正規化された応答を算出してもよい。従って、それぞれ未修飾の表面と異なって修飾された３つの表面とを含有する別々に調製された３つのセンサーチップ上で各試料を流すことによって各試料の９つの応答データ（％）を回収してもよい。
【０１８８】
好適な実施形態では、抗原はポリスチレンビーズに固定化されてもよい。当該技術で周知の方法に従って生成される未修飾及び未修飾の抗原を含むビーズ。たとえば、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイのような多重検出アッセイを用いて、抗原結合タンパク質の複合体が平均蛍光強度として測定されてもよく、正規化された応答が算出されてもよい。
【０１８９】
ビニング
特定の及び具体的な適用では、本発明は、抗原結合タンパク質、たとえば、ＶＬ抗原結合タンパク質及び典型的な抗体とそれらが向けられる抗原との間での相互作用を評価する方法を提供し、それは、同胞と呼ばれるメンバーが抗原に対して、たとえば、化学的にまたは酵素的に修飾された抗原に対して固有で類似の結合特性または結合プロファイルを示す機能グループ（クラスタまたはビンとも呼ばれる）に抗原結合タンパク質を選別する迅速な方法を可能にする。その結合特性または結合プロファイルの類似性に基づいてクラスタ化される結合タンパク質は、類似の結合特性を有する、たとえば、同一のエピトープまたは類似のエピトープと結合すると見なされる。それらのクラスタは任意で、マトリクス形式、または系統樹のような「樹状」形式、またはコンピュータ読み取り形式、または任意のデータ入力装置互換性形式で表示されてもよい。クラスタに関する情報はマトリクス、系統樹から、またはコンピュータまたは他の演算装置によって捕捉されてもよい。データの捕捉は視覚的、手動、自動またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０１９０】
本明細書で使用されるとき、「ビン」という用語は、本発明の方法に従って修飾された／かく乱された抗原表面のパネルに類似する結合プロファイルを有すると特定された結合タンパク質のクラスタを指す名詞として使用されてもよい。「ビニングする」という用語は、アッセイによって生じたデータの解析を含む、本発明の方法を実行することを指す動詞としても使用されてもよい。
【０１９１】
ビニングは、本明細書で記載されるとき、１以上の結合特性に、たとえば、それらが認識するエピトープに基づいて結合タンパク質をグループ分けする方法である。さらに詳しくは、ビニングは、エピトープ認識特性に基づいて結合タンパク質をクラスタ化し、異なる結合プロファイルを有する結合タンパク質のビンを特定するための演算プロセスと組み合わせた、様々な結合タンパク質のエピトープ認識特性を識別する方法及び系を含む。従って、実施形態には、本明細書で考察されるような結合タンパク質のエピトープ結合特性を測定するアッセイと、そのようなアッセイから生成されるデータを解析するプロセスが含まれる。
【０１９２】
ビニングは、（１）結合特性をグループ分けする、たとえば、視覚検査によって、示される各抗原結合を目盛り付きの棒（たとえば、各修飾された抗原表面からの対照の百分率）として示す方法；（２）各結合タンパク質のマトリクスの決定因子の値を算出し、算出された決定因子すべてをグループに選別する方法（”Ｃａｌｃｕｌｕｓ−−Ｏｎｅ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅｓ”６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓａｌａｓ  ａｎｄ  Ｅｉｎａｒ，ｐｐ．７１５−７１７，１９９０を参照のこと）；または（３）方法によって生成された結合プロファイルのデータにパターン認識アルゴリズム及び関連する生物情報のソフトウエアを適用し、結合タンパク質を機能グループに分類する方法のいずれかによって達成されてもよい。
【０１９３】
一実施形態では、適当な統計ソフトウエアを用いて、抗原結合タンパク質の複合体について正規化された応答プロファイルをグループに組織化してもよい。グループ分けは、各応答マトリクスの決定因子を算出し、その後、決定因子をグループに選別することによって達成されてもよく、各グループの段階的なカラーバーカラム（プロファイル）を視覚的に検査してグループ分けの結果を検証することによる場合もある。全体的な「グループ分けの過程」は生物情報のパターン認識またはデータマイニング計算のソフトウエアによって達成されてもよい。そのようなソフトウエアの非限定例には、Ｊ−ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｅＮｏｖａ，Ｉｎｃ．Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒソフトウエア（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳｔａｔＳｏｆｔ  ｏｆ  ＳｔａｔｉｓｔｉｃａのようなＤＮＡマイクロアレイ解析によって日常的に使用される市販のプログラム、または技量のある熟練者によって開発された市販ではない他の好適なプログラムが挙げられる。
【０１９４】
種々の技法を採用して上述のように生成されたプロファイルを視覚化してもよい。人間の観察者が意味のある比較を行うために、プロファイルが提示される空間は分かりやすくすべきである。高い次元の空間で意味のある傾向またはクラスタを視覚化するのは難しい可能性があるけれども、一実施形態は、特定のプロファイルに最も関連すると予想される二次元または三次元（結合特性）を含むが、同じ二次元または三次元の空間で他の潜在的に意味のある結合の特徴を見ることが可能でないかもしれない。
【０１９５】
種々の技法を用いてこの課題に対処してもよい。そのような技法は、個々の次元がデータの２以上の特徴を捕捉するさらに低い次元の空間を創り出す。そのような技法の例には、主成分分析（ＰＣＡ）、線形及び非線形の識別分析、多次元スケーリング及び射影追跡法が挙げられる。特に好ましいアプローチにはＰＣＡの使用が関与する。ＰＣＡは、データセットが多次元空間にて最大の変動を示すベクトル（次元）を決定する。第１の主成分はデータの最大の変動の方向を示す。第２の主成分はデータ等における２番目に最大の変動の方向を示す、等である。使用者は、そのデータを描くのに好適なだけ多くの主成分を選択することができる。通常、第１の１、２または３の主成分は人間の観察者に対してデータを提示するために選択される。主成分分析は、双方ともあらゆる目的で参照によって本明細書に組み入れられるＪａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９１），Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；及びＪｏｌｌｉｆｆｅ，Ｉ．Ｔ．（１９８６），Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇにてさらに完全に記載されている。
【０１９６】
主成分分析を行うための種々の市販のツールが利用可能である。ＰＣＡを行うための例となる統計計算のパッケージは、ワシントン州シアトルのＩｎｓｉｇｈｔｆｕｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（以前のＭａｔｈＳｏｆｔ）またはミズーリ州セントルイスのＰａｒｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、たとえば、Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅから入手可能であってもよい。主成分分析は単純な方法での定量的な結合プロファイルに適用することができる。しかしながら、それらを主成分分析に提示する前にプロファイルのデータセットを正規化することが一般に必要である。これは、プロファイルの個々の特徴を含む種々のスカラーが非常に異なるスケールで存在するためである。意味のあるＰＣＡ解析のためにこれら種々の特徴を比較可能なスケールにするには、データを正規化する変換を行ってもよい。好まれる一実施形態では、次元のそれぞれは、その次元に沿ったデータすべてを検討し、そのデータの平均値を差し引き、標準偏差で割ることによって増減される。これは正規化のためにデータを効果的に増減する。
【０１９７】
好適な実施形態では、差別的抗原破壊から生成されたデータは以下の方法で正規化されてもよい。修飾された抗原表面（またはビーズセット）への抗原結合タンパク質の結合シグナルを未修飾の抗原表面（またはビーズセット）への同じ抗原結合タンパク質の結合シグナルで割ることによって生データを正規化してもよい。それに続いて、所与の表面（またはビーズセット）についてのすべての値をその表面（またはビーズセット）への結合タンパク質すべてからの平均値で割ってもよい。最終的に、２を底として対数を用いてすべての値を変換してもよい。
【０１９８】
別の実施形態では、結合プロファイルは、高処理能力競合結合タンパク質アッセイ、たとえば、多重競合抗体ビニング（ＭＣＡＢ）アッセイによって生成され、競合パターン認識（ＣＰＲ）法を用いて、入力データを解析するが、その双方とも米国特許第８，５６８，９９２号（その全体が本明細書に組み入れられる）にて記載されている。
【０１９９】
結合プロファイル、たとえば、シグナル強度を正規化したら、種々の周知の演算法を用いて複雑なデータの根底にあるパターンを特定してもよい。大きな生物データセットの解析に有益であると判明している方法の１つは階層的クラスタ分析である。この方法を適用して、結合タンパク質が、その非類似性の値に基づいてネスト化したサブセットの厳格な階層に強制的に入れられてもよい。例示的な実施形態では、最低の非類似性の値を持つ結合タンパク質の対が先ず、一緒にグループ分けされる。これに次ぐ最小の非類似性（または平均の非類似性）の値を持つ結合タンパク質の対またはクラスタ（複数可）が次に一緒にグループ分けされる。この過程はクラスタ１つが残るまで繰り返して反復される。このようにして、他の結合タンパク質と比較されて結合タンパク質はその結合プロファイルがどれくらい類似するかに従ってグループ分けされる。一実施形態では、結合タンパク質は、枝の長さが２つの結合タンパク質の結合パターンの間での類似性の程度を表す系統樹（ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）（「系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅ）」と呼ばれることがある）にグループ分けされる。２つの結合タンパク質間の長い枝の長さは、それらが異なるエピトープに結合する可能性が高いことを示す。短い枝の長さは２つの結合タンパク質が同一エピトープについて競合する可能性が高いことを示す。
【０２００】
本明細書で開示される方法に従って特定される機能グループは、同じ機能グループにおける結合タンパク質は独特のまたは異なる結合特性を共有するはずであるという原理に従って周知の方法を用いて検証されてもよい。一実施形態では、単一のビンにおける結合タンパク質の独特のまたは異なる結合特性は、抗原の同一エピトープ（複数可）と結合するそのビンの結合タンパク質または抗原の同一エピトープ（複数可）についての競合を生じ、その際、異なる機能グループを表す結合タンパク質は抗原の同一エピトープと結合するべきではなく、または抗原の同一エピトープ（複数可）について競合するべきではない。この実施形態では、ＥＬＩＳＡ、競合アッセイ、エピトープマッピングアッセイ、ペプチドアレイ等すべて、本明細書で決定されるビンを検証するために用いてもよい。
【０２０１】
ビンまたは機能グループは、ビンが少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％のＶＬタンパク質を含む場合、すべてのまたは実質的にすべてのＶＬ抗原結合タンパク質を含む。一実施形態では、ビンは１００％のＶＬ抗原結合タンパク質を含む。一実施形態では、十分な数の抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質及び従来の抗体が意味のある比較及びビニングのためにプロファイリングされる。一実施形態では、ＶＬ抗原結合タンパク質を発現し、抗原で免疫されている非ヒト動物の血清におけるまたはそれから単離される結合タンパク質がプロファイリングされ、同じ抗原で免疫されている対照非ヒト動物の血清におけるまたはそれから単離される結合タンパク質の結合プロファイルと比較される。一実施形態では、免疫は、初めて非ヒト動物を抗原刺激する、たとえば、抗原を投与することと、非ヒト動物をある期間、たとえば、２〜３日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間等休ませることと、非ヒト動物に１回以上抗原を再投与することとを含む。
【実施例】
【０２０２】
以下の非限定の実施例は、本明細書で記載される非ヒト動物をどのように作製し、使用し、その理解にどのように役立つのかについて完全な開示及び説明を当業者に提供するように示されるのであって、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実施されたすべてのまたは唯一の実験であることを示すことを意図するものでもない。実施例には、当業者に周知であろう従来の方法（分子クローニング法等）の詳細な説明は含まれない。使用された数（たとえば、量、温度等）に関して精度を保証するように努力を行ってきたが、一部の実験的な誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０２０３】
実施例１．操作された免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒト動物の生成
この実施例は、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖のＶＬ及びＪＬの遺伝子断片を含む免疫グロブリン重鎖の遺伝子座と、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖のＶＬ及びＪＬの遺伝子断片を含む免疫グロブリン軽鎖の遺伝子座とを含有するように非ヒト動物の免疫グロブリン遺伝子座を操作する例となる方法を説明する。
【０２０４】
マウスの免疫グロブリン重鎖の遺伝子座にヒトの軽鎖Ｖ及びＪの遺伝子断片（たとえば、Ｖκ及びＪκ）を挿入するための例となるターゲティングベクターの構築が以下に記載される。図２は、相同組換えを用いてマウスの免疫グロブリン重鎖の遺伝子座に挿入するための複数のヒトκ軽鎖の遺伝子断片を含有する例となる４つのターゲティングベクターを説明する。
【０２０５】
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（たとえば、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ａ．Ｎ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．，Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｒｏｊａｓ，Ｊ．，Ｙａｓｅｎｃｈａｋ，Ｊ．，Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｓｋｙ，Ｒ．，Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｅｌｓａｓｓｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｅｓａｕ，Ｌ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｓｕ，Ｈ．，Ｘｕｅ，Ｙ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｉ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｒ．，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｅ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．，ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．（２００３）．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，６５２−６５９を参照のこと）を用いて種々のターゲティング構築物を作製し、マウスのゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリを修飾した。マウスのＢＡＣのＤＮＡを相同組換えによって修飾し、再構成されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子断片のその後の挿入のために内在性のＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片を欠失させてもよい。或いは、機能的な可変領域を形成する内在性の遺伝子断片の組換えが阻害されるように（たとえば、遺伝子断片の逆位またはかく乱によって）、内在性のＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片をインタクトなまま残し、不活化してもよい。
【０２０６】
遺伝子操作されたマウスであって、そのゲノムが免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結された再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬの遺伝子断片を含む免疫グロブリン重鎖の遺伝子座を含有するマウス及びそれを作る方法は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１２−００９６５７２Ａ１号にて記載されている。図２に示すように、当該技術で認識される標準の分子技法を用いて、４つのターゲティングベクターを操作して不活化されたマウスの重鎖遺伝子座（たとえば、欠失した内在性のＶＨ、ＤＨ及びＪＨの遺伝子断片）に４０のヒトＶκ遺伝子断片及び５のヒトＪκ遺伝子断片を段階的に挿入した。表３は、マウス免疫グロブリン重鎖の遺伝子座に挿入するための種々のヒトκ軽鎖の遺伝子断片を含有する各ターゲティングベクターに含まれるヒトＤＮＡのサイズを示す。任意の数のヒトＶκ及びＪκの遺伝子断片がターゲティングベクターに含まれてもよい。図２で示された例となるターゲティングベクターには、生殖細胞系列のヒトκ軽鎖遺伝子座の近位コンティグで天然に見いだされるヒトκ軽鎖遺伝子断片が含まれる（図１）。４つすべてのターゲティングベクターの段階的挿入の後の得られた内在性の重鎖遺伝子座を図２の下で示す。
【表３】
2017510273.tif 000006
【０２０７】
類似のアプローチを用いて、マウス重鎖定常領域の背景でヒト軽鎖可変ドメインの他の組み合わせを構築してもよい。追加の軽鎖可変ドメインはヒトのＶλ及びＪλの遺伝子断片に由来してもよい。様々な数のヒトのＶλ及びＪλの遺伝子断片を含むヒトＤＮＡを含む例となるターゲティングベクターを図３にて示す。
【０２０８】
ヒトのλ軽鎖遺伝子座は１，０００ｋｂにわたって伸び、可変（Ｖ）または連結（Ｊ）の断片をコードする８０を超える遺伝子を含有する。公開された報告によれば、ヒトのλ軽鎖遺伝子座の７０のＶλ遺伝子断片のうちで、３０〜３８の範囲が機能的な遺伝子断片であると思われる。７０のＶλ配列は３つのクラスタに配置され、そのすべてが異なるＶ遺伝子ファミリー群の異なるメンバーを含有する（クラスタＡ、Ｂ及びＣ）。ヒトのλ軽鎖遺伝子座の範囲内では、観察されるＶλドメインすべての半分を超えるものが遺伝子断片１−４０、１−４４、２−８、２−１４及び３−２１によってコードされる。７のＪλ遺伝子断片があり、そのうちの４つ、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３及びＪλ７だけが一般に機能的なＪλ遺伝子断片と見なされる。幾つかの対立遺伝子では、第５のＪλ−Ｃλ遺伝子断片対は報告によれば偽遺伝子（Ｃλ６）である。本明細書で記載されるように、ハイブリッド重鎖遺伝子座への複数のヒトＪλ遺伝子断片の組み入れはデノボ合成によって構築されてもよい。このように、生殖細胞系列の構成で複数のヒトＪλ遺伝子断片を含有するゲノムの断片を複数のヒトＶλ遺伝子断片で操作して重鎖定常領域の背景で正常なＶ−Ｊ組換えを可能にする。複数のＶλ遺伝子断片を含む例となるターゲティングベクターを図３にて示す（ターゲティングベクター１’）。
【０２０９】
重鎖定常領域との軽鎖可変ドメインの結合は、非ヒト動物にてヒトＶＬ領域を持つ独特のＶＬ抗原結合タンパク質を生成するための多様性の潜在的に豊富な供給源を表す。マウスにてヒトλ軽鎖遺伝子座（または上述のようなヒトκ遺伝子座）のこの多様性を活用することは、独特のハイブリッド重鎖の操作を結果的に生じ、遺伝子操作された動物の免疫レパートリーに対する別の次元の結合タンパク質を生じ、治療剤の生成のための次世代のプラットフォームとしてのその後の使用を生じる。
【０２１０】
上述のターゲティングベクターを用いてマウスの胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションして、ＶＬ抗原結合タンパク質（すなわち、マウスの重鎖定常領域に操作可能に連結されたヒトの軽鎖遺伝子断片）を発現するキメラマウスを創り出すための改変ＥＳ細胞を創出する。定量的ＰＣＲアッセイであるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｌｉｅ及びＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４３−４８）によって、再構成されていないヒト軽鎖遺伝子断片の挿入を含有するＥＳ細胞が特定される。ヒト配列及び関連する選択カセットの挿入、マウス重鎖配列の喪失及び内在性重鎖遺伝子座に隣接するマウス配列の保持のために特異的なプライマーのセット及びプローブを設計する。
【０２１１】
ヒトの軽鎖遺伝子断片の挿入によって導入された任意の望ましくない選択カセットを取り除くために、リコンビナーゼを発現する構築物によってヒト軽鎖遺伝子断片（たとえば、Ｖκ及びＪκ）を持つＥＳ細胞に形質移入することができる。任意で、リコンビナーゼを発現するマウスに交配することによって選択カセットが取り除かれてもよい（たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ６，７７４，２７９）。任意で選択カセットはマウスにて保持される。
【０２１２】
上述の標的化されたＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（たとえば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，Ｈｉｃｋｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｅｓｃａｒａｖａｇｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｓａｕ，Ｌ．，Ｄｏｒｅ，Ａ．Ｔ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．，Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．（２００７），Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２５，９１−９９を参照のこと）によって８細胞期のマウス胚に導入する。マウスの免疫グロブリン重鎖の遺伝子座にてヒトの軽鎖遺伝子断片を独立して持つＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）は、内在性の免疫グロブリン重鎖の遺伝子座での独特のヒト軽鎖遺伝子断片の存在を検出する対立遺伝子アッセイの改変（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．、上記）を用いた遺伝子型決定によって特定される。仔の遺伝子型を決定し、ＶＬ含有重鎖の発現を特徴付けるために、遺伝子操作された免疫グロブリン重鎖の遺伝子座についてヘテロ接合体またはホモ接合体の仔を選択する。
【０２１３】
マウスの重鎖の遺伝子座へのヒトのκ軽鎖遺伝子断片の導入は、さらにヒトκ軽鎖遺伝子断片によるマウスκ軽鎖遺伝子断片のｉｎ  ｓｉｔｕ置換を含有する１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃとＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃのヘテロ接合体胚に由来するＦ１  ＥＳ株（Ｆ１Ｈ４；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００７、上記）（たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，５９６，５４１号及び同第８，６４２，８３５号を参照のこと）にて実施した。
【０２１４】
重鎖の遺伝子座にて再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬの遺伝子断片を含有する遺伝子操作された重鎖の遺伝子座を含むマウス（ＫＯＨマウス：ＭＡＩＤ１７１３：４０のヒトＶκ遺伝子断片及び５のヒトＪκ遺伝子断片；ＭＡＩＤ１９９４：４０のヒトＶκ遺伝子断片及び５のヒトＪκ遺伝子断片、及び組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子）は上述のように生成された。手短には、ＫＯＨマウスにて、内在性の機能的な重鎖可変遺伝子断片すべてを欠失させ、４０の再構成されていないヒトＶκ遺伝子断片と５の再構成されていないヒトＪκ遺伝子断片で置き換え、それを免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に操作可能に連結した。
【０２１５】
ホモ接合体ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３：その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，６４２，８３５号及び同第８，５０２，０１８Ｂ２号）をホモ接合体ＫＯＨマウス（ＭＡＩＤ１７１３またはＭＡＩＤ  １９９４）と交配して修飾された軽鎖の対立遺伝子とＫＯＨの対立遺伝子についてヘテロ接合体のマウスを作出した。この交配で生成されたＦ１ヘテロ接合体マウスを互いに交配して各対立遺伝子（ＭＡＩＤ１７１３ＨＯ  １２４２ＨＯ，  ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ  １２４２ＨＯ）についてホモ接合体のマウスを得た。そのようなマウスは、免疫グロブリンの構造に類似するが、そのような結合タンパク質が重鎖可変ドメインを欠くという点で異なる構造を有するＶＬ抗原結合タンパク質を発現する。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝子座における遺伝子操作された対立遺伝子の存在は上述の特異的なプローブやプライマーを用いたＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニング及び染色体分析によって確認した。ホモ接合体のＫＯＨマウスは、内在性の可変重鎖Ｖ、Ｄ及びＪの遺伝子断片すべてが欠失しているマウス重鎖遺伝子座への本明細書で記載されるような再構成されていないヒト軽鎖遺伝子断片（たとえば、ヒトＶκ及びＪκ）の挿入と、マウスＶκ及びＪκの遺伝子すべてが欠失しているマウスカッパ（κ）軽鎖遺伝子座への再構成されていないヒト軽鎖遺伝子断片（たとえば、ヒトＶκ及びＪκ）の挿入を含む。一部の実施形態では、ＫＯＨマウスはさらに、組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子を含む。
【０２１６】
マウスであって、そのゲノムが（ｉ）４０の再構成されていないヒトＶκ及び５のＪκ遺伝子断片の挿入を、ヒトＶκ及びＪκの遺伝子断片が内在性の重鎖定常領域に操作可能に連結されるように含有する免疫グロブリン重鎖対立遺伝子と、（ｉｉ）４０の再構成されていないヒトＶκ及び５のＪκ遺伝子断片の挿入を、ヒトＶκ及びＪκの遺伝子断片が内在性の軽鎖定常領域に操作可能に連結されるように含有する免疫グロブリン軽鎖対立遺伝子とを含むマウスは、ＭＡＩＤ１７１３／１２４２「ＫＯＨマウス」と呼ばれる（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２−００９６５７２Ａ１号を参照のこと）。それを有し、組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子を有するマウスは、ＭＡＩＤ１９９４／１２４２（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３−０２１２７１９Ａ１号を参照のこと）と呼ばれる。
【０２１７】
実施例２．ＶＬ抗原結合タンパク質の生成及び特徴づけ
本実施例は、特異的に操作されて、（上述のように）免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含み、且つ重鎖可変ドメインを欠いている、免疫グロブリン様分子を発現するように遺伝子操作されたマウスから抗原結合タンパク質を作出することを記載する。本実施例は、小分子（たとえば、ステロイド及び天然物アルカロイド）に特異的で、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常ドメインに連結された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをそれぞれ含む２つのポリペプチドと、（ｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常ドメインに連結された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをそれぞれ含む２つのポリペプチドとを含有する例となる抗原結合タンパク質の生成を具体的に説明する。
【０２１８】
ＶＬ抗原結合タンパク質は、遺伝子操作されたマウスであって、そのゲノムが、それぞれ内在性の重鎖及び軽鎖の定常領域に操作可能に連結された再構成されていないヒト軽鎖の遺伝子断片（たとえば、ＶＬ及びＪＬの遺伝子断片）をそれぞれ含有する免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝子座を含むマウスから得られる。そのようなマウスは、野生型マウス及び／または対照の遺伝子操作されたマウスに比べて非タンパク質様の標的に対して抗原結合タンパク質を作るための頑強な生体内の系を提供する。
【０２１９】
免疫
一般に、本明細書で記載されるようなマウスを抗原に曝露し、その動物から（たとえば、脾臓またはリンパ節から）細胞（たとえば、Ｂ細胞）を回収する。細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死のハイブリドーマ細胞株を調製してもよく、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、免疫に使用した抗原に特異的なハイブリッド重鎖を含有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定する。ハイブリッドの重鎖及び軽鎖のヒトＶκ領域をコードするＤＮＡを単離し、望ましい定常領域、たとえば、重鎖及び／または軽鎖に連結してもよい。マウス重鎖定常領域に融合されたヒトＶκの遺伝子断片の存在に起因して、独特の抗体様のレパートリーが作出され、創り出された独特の抗体様の型の結果、免疫グロブリンのレパトアの多様性は劇的に増加する。これは、免疫の際、抗原に特異的なレパートリーに追加のレベルの多様性を付与する。得られたクローン化された配列はその後、ＣＨＯ細胞のような細胞で産生されてもよい。或いは、抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質または可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的なリンパ球から直接単離してもよい（たとえば、Ｂ細胞、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ７，５８２，２９８Ｂ２を参照のこと）。
【０２２０】
最初に、ヒトのＶκ領域とマウスの定常領域を有する高親和性のＶＬ抗原結合タンパク質を単離する。上述のように、ＶＬ抗原結合タンパク質を特徴づけし、親和性、選択性、エピトープ等を含む望ましい特性について選択する。マウスの定常領域を所望のヒトの定常領域で置き換えて、本発明の再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座に由来する体細胞変異したヒトＶκドメインを含有する独特の完全にヒトのＶＬ抗原結合タンパク質を生成してもよい。好適なヒト定常領域には、たとえば、野生型のまたは修飾したＩｇＧ１、またはＩｇＧ４または代わりにＣκまたはＣλが挙げられる。
【０２２１】
ＫＯＨマウスの別々のコホートを天然物アルカロイド（抗原Ａ）及びステロイド（抗原Ｂ）で別々に免疫した。「ＶＩ３」マウス（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス、米国特許第８，６４２，８３５号及び同第８，５０２，０１８Ｂ２号を参照）及び「ＵＬＣ」マウス（その出願は全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２０１１−０１９５４５４Ａ１、ＵＳ２０１２−００２１４０９Ａ１、ＵＳ２０１２−０１９２３００Ａ１、ＵＳ２０１３−００４５４９２Ａ１、ＵＳ２０１３−０１８５８２１Ａ１及びＵＳ２０１３−０３０２８３６Ａ１を参照）の別々のコホートも免疫し、同等の疫応答プロファイルを提供した。
【０２２２】
手短には、抗原ＡをＫＬＨに結合させ、免疫原として使用してＫＯＨマウス、ＶＩ３マウス及びＵＬＣマウスを免疫した。抗原Ｂについては、ＢＳＡ複合体を免疫原として使用し、ＫＯＨ及びＶＩ３の系統を免疫した。最初の免疫に先立って、各マウスから免疫前血清を採取した。２５μＬの体積でアジュバントとしての１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した最初の抗原刺激免疫のための２．３５μｇの複合体で足蹠（ｆ．ｐ．）注射を介して免疫原を投与した。その後、３、６、１１、１３、１７、２０日目に合計６回、アジュバントとして１０μｇのＣｐＧ及び２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と共に２．３５μｇの各免疫原で同じ経路を介してマウスに追加免疫をした。それぞれ４回目と６回目の追加免疫の後１５日目と２２日目にマウスから採血した。抗原ＡのＫＬＨ複合体に対する力価について抗血清をアッセイした。抗原Ｂについては、ＢＳＡに結合した抗原Ｂ及びＢＳＡにて力価をアッセイした。ＫＯＨマウスについては、６回の追加免疫の完了後、マウスに４〜５週間の休止期を与え、それに続いて、免疫原による４回のさらなる追加免疫を投与した。マウスから採血し、抗血清の力価をアッセイした。
【０２２３】
所望の免疫応答が達成されると、脾細胞を採取し、マウスの骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存能力を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成する。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質を産生する細胞株を特定する。この技法を用いて、幾つかの抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質（すなわち、マウス重鎖及び軽鎖の定常ドメインの背景にてヒトＶκドメインを持つ結合タンパク質）が得られる。
【０２２４】
或いは、抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質は、その全体が参照によって具体的に本明細書に組み入れられる米国特許第７，５８２，２９８号に記載されているように、骨髄腫細胞に融合させることなく、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離される。この方法を用いて、幾つかの完全にヒトの抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質（すなわち、ヒトＶκドメインとヒト定常領域を持つ抗体）が得られた。
【０２２５】
抗血清の力価の測定
免疫原に対する血清の力価は標準のＥＬＩＳＡによって測定した。以下はアッセイを詳細に記載する。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ，Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）における抗原Ａ（置換された芳香族天然物アルカロイド）または抗原Ｂ（ステロイド）のＢＳＡ複合体のいずれか２μｇ／ｍＬで９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を４℃にて一晩コーティングした。翌日プレート洗浄器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で４回プレートを洗浄した。次いで２５０μＬのＰＢＳ中０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でプレートをブロックし、室温で１時間インキュベートした。次いでＰＢＳ−Ｔで４回プレートを洗浄した。免疫したマウスの血清及び免疫前の血清を１：３００または１：１０００で出発して０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで３倍連続希釈し、ブロックしたプレートに２つ組で加え、次いで室温で１時間インキュベートした。最後の２つのウェルはブランクのままにして二次抗体の対照（バックグランド対照）として使用した。プレート洗浄器を用いて再びＰＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：５０００／１：１０，０００の希釈でプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次いでＰＢＳ−Ｔによってプレートを８回洗浄し、基質としてＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を用いて発色させた。基質を２０分間インキュベートし、２Ｎの硫酸（Ｈ２ＳＯ４、ＶＷＲ、カタログ番号ＢＤＨ３５００−１）または１Ｎのリン酸（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、カタログ番号７６６４−３８−２）で反応を止めた。４５０ｎｍにて分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でプレートを読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウエアを用いて力価を算出した。
【０２２６】
注射した免疫原に対するマウスで誘導された免疫応答は力価として測定され、それは抗原結合の吸光度がバックグランドより２倍高い時の最高の血清希釈の逆数として定義される。免疫過程の終了時、ＫＯＨマウス及びＶＩ３マウスは双方とも同等の高い力価を引き出した。
【０２２７】
Ｌｕｍｉｎｅｘによる結合タンパク質の特定
スクリーニングのための抗原結合ビーズを調製するために、ｐＨ６．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、カタログ番号４０１１−０１）中の０．１２ｍＬのＬｕｍｉｎｅｘビーズ浮遊液（カルボキシル化ミクロスフェア、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を、５０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号０３４４９）１５μＬ及び５０ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２４５１０）１５μＬの添加とそれに続く室温での１０分間のインキュベートによって活性化した。それに続いて、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５（ＡＣＲＯＳ、カタログ番号３２７７６５０００）における２０μｇ／ｍＬのＢＳＡに結合した抗原Ａ（置換された芳香族天然物アルカロイド）０．５ｍＬを活性化されたビーズに加え、１級アミンカップリング反応を２時間進め、ビーズ上の残りの反応基は、１／１０体積の１Ｍトリス溶液、ｐＨ８（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｔ１０８０）の添加によってクエンチした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号６５５２０５）を含有するＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−１４４）でビーズを洗浄し、２％ｗ／ｖのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ４５０３）を含有するＰＢＳ緩衝液にて保存した。同じ方法で、ＢＳＡタンパク質をカップリングした陰性対照のビーズのバッチも調製した。
【０２２８】
結合タンパク質をスクリーニングするために、３０００の抗原Ａ−ＢＳＡビーズを含有する７５μＬのアリコートを９６穴フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＳＢＶＮ１２５０）の事前に水和した各ウェルに分配した。各結合タンパク質試料（２５μＬ）を各ウェルに加え、プレート振盪器上でプレートを４℃にて一晩インキュベートした。２日目の朝、真空マニホールドを用いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）でビーズを洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中の０．１ｍＬの１．２５μｇ／ｍＬのＲ−フィコエリスリンと結合したヤギ抗ヒトＩｇκ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０６３−０９）と共にビーズを室温で３０分間インキュベートすることによって、ビーズに結合したタンパク質を検出した。次いでビーズを洗浄し、０．１５ｍＬのＰＢＳ−Ｔに懸濁させ、Ｌｕｍｉｎｅｘフローサイトメトリーに基づいたアナライザで中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。同様の方法で、ＢＳＡに結合した抗原Ｂ（ステロイド）ビーズを調製し、結合タンパク質を含有する試料をスクリーニングした。
【０２２９】
相対的な結合動態
スクリーニングの開始の前に、２００ｎＭのビオチン標識した抗原と共に５０ｎＭのニュートラアビジンを少なくとも２４時間、事前インキュベートした。小分子へのニュートラアビジンのタグ付けは、小分子の全体重量を増やすことによって結合タンパク質の粗精製上清の高処理能力親和性スクリーニングの感度を向上させた。最初に抗ヒトＦｃまたは抗マウスＦｃに特異的な抗体が固定化されたＢｉａｃｏｒｅセンサーの表面を用いて粗精製馴化培地から抗体を捕捉した。次いで小分子／ニュートラアビジンの溶液を結合タンパク質が捕捉された表面上に２分間注入し、その後、１０分間、結合した複合体を解離させた。実験はランニング緩衝液としてＨＢＳＴを用い、２５℃で実施した。
【０２３０】
図４は、ＫＯＨマウス及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスから得られた抗原陽性抗体（すなわち、ＶＬ抗原結合タンパク質）の総数（左）及び百分率（右）を示す。図５は、ＫＯＨマウス及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスから得られた抗原Ｂに対する抗体の例となる結合動態を示す。
【０２３１】
結果は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）が５２８の結合タンパク質試料のうち抗原Ａビーズで１０００超のＭＦＩを有する１０の結合タンパク質試料を生じることを示した。抗原Ｂビーズについては、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）は、３５０のうちたった２の結合タンパク質試料が１０００を上回るＭＦＩを有することを示した。それに対して、ＫＯＨマウスは５２８のうちの４５３の試料が抗原Ａビーズで１０００超のＭＦＩを有することを示した。抗原Ｂビーズでは、ＫＯＨマウスは３３９のうち７４の試料が１０００超のＭＦＩを有することを示した。抗原陽性の試料はすべて陰性対照のＢＳＡビーズに最小限のまたは無視できる結合（たとえば、ＭＦＩ約１１８）を示した。
【０２３２】
ヒトのκ遺伝子断片の使用
本発明に従ってマウスで産生された抗抗原Ａまたは抗抗原ＢのＶＬ抗原結合タンパク質をさらに特徴づけるために、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１にて記載されたものから適合させた方法を用いて、ヒトＶκドメイン（ＶＬ抗原結合タンパク質の重鎖及び軽鎖の双方に由来する）をコードする核酸をクローニングし、配列決定した。抗体の核酸配列及び予測されたアミノ酸配列から、抗原Ａまたは抗原Ｂ（上記に記載された）で免疫したマウスから得られた、選択され及び精製されたＶＬ抗原結合タンパク質のハイブリッド重鎖可変領域について、遺伝子使用を特定した。表４は、選択された抗抗原ＡのＶＬ抗原結合タンパク質に由来するヒトのＶκ及びＪκの遺伝子断片の使用を示す。表５は、選択された抗抗原ＢのＶＬ抗原結合タンパク質に由来するヒトＶκ及びＪκの遺伝子断片の使用を示す。
【０２３３】
遺伝子使用のデータは、本発明に係るマウスが小さな抗原に対して独特のハイブリッド重鎖可変領域を生成することができ、それは免疫グロブリンの重鎖遺伝子座における種々のヒトＶκ及びＪκの遺伝子断片に由来することを示している。ヒトＶκ及びＪκの遺伝子断片の使用はさらに、その遺伝子座の範囲内でならびに軽鎖Ｖκ及びＪκの遺伝子断片との比較において多様で変化に富んだ再構成を明らかにしている。さらに、ハイブリッドの重鎖と軽鎖の間での遺伝子断片の使用において多様性は明らかである。
【表４】
2017510273.tif 000007
【表５】
2017510273.tif 000008
【０２３４】
親和性の測定
選択された抗原Ｂに特異的な及び精製されたＶＬ抗原結合タンパク質の上清についての平衡解離定数（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳＰＲ（表面プラスモン共鳴）によって測定した。データはすべて試料緩衝液及びランニング緩衝液としてＤＰＢＳ＋０．１％ＤＭＳＯを用いて２５℃で得られた。
【０２３５】
手短には、標準のアミンカップリング化学反応を用いて、高密度のプロテインＡで予め誘導体化したＣＭ５センサーチップの表面に各精製したＶＬ抗原結合タンパク質を置いた。捕捉ステップの間に、５μＬ／分の流速で合計３〜４分間、プロテインＡ表面にわたり、精製した抗抗原ＢのＶＬ抗原結合タンパク質を注入した。捕捉ステップには、ランニング緩衝液または検体の２７０μＭ〜１３．７ｎＭの３倍希釈濃度範囲のストック溶液での流速１００μＬ／分での１．５分間の注入が続いた。捕捉された精製ＶＬ抗原結合タンパク質からの抗原の解離を少なくとも５分間モニターした。１０ｍＭ、ｐＨ１．５のグリシンの短時間の注入によって捕捉された精製ＶＬ抗原結合タンパク質を取り除いた。検体のセンサーグラムから緩衝液注入のセンサーグラムを差し引くことによりセンサーグラムすべてを二重参照し、それによって捕捉表面からの精製ＶＬ抗原結合タンパク質の解離が原因で生じるアーチファクトを除いた。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウエアｖ２．１を用いて各精製ＶＬ抗原結合タンパク質の結合データを物質移行による１：１の結合モデルに適合させた。表６は、抗原Ｂに特異的な市販の抗体、１１の抗原Ｂに特異的な精製ＶＬ抗原結合タンパク質、及び対照ＶＩ３動物から得た３つの対照抗体についての結合データを提供する。
【表６】
2017510273.tif 000009
【０２３６】
１１の抗抗原Ｂの精製ＶＬ抗原結合タンパク質の結合親和性は様々であったが、すべて約４．４ｎＭ〜１．９３μＭの範囲でのＫＤを示した。とりわけ、１１のうち７のＶＬ抗原結合タンパク質は約１０ｎＭ以下のＫＤを示した。それに対して、市販の抗体は約５７ｎＭの抗原Ａに対する結合親和性を有し、対照動物から単離された３つの抗体はいずれもナノモル範囲でのＫＤを示さなかった。低ナノモル範囲でのＫＤを示す精製ＶＬ抗原結合タンパク質についてのＴ１／２の測定値は１５〜１５６秒の間で変化した。特定の理論に束縛されることを望まないが、表６で示した精製ＶＬ抗原結合タンパク質の結合プロファイルにおける変動、及び特に精製ＶＬ抗原結合タンパク質の一部による低親和性または結合の欠如は、担体に連結された時のみ存在する抗原Ａのエピトープを１以上のＶＬ抗原結合タンパク質が認識する結果であり得る。にもかかわらず、精製抗体を用いた親和性のデータは、高親和性である、クローン選択された、体細胞変異した、高効率で小分子と結合することができ、したがって治療上適切な、重鎖及び軽鎖の定常領域に連結された再構成されたヒト軽鎖可変ドメインの組み合わせ関係（表４に記載された）から生じるＶＬ抗原結合タンパク質に一致する。
【０２３７】
実施例３：結合特性のプロファイリング
免疫
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入したヒトの分泌性糖タンパク質（抗原Ｃ）でＫＯＨマウスのコホートを別々に免疫した。「Ａｄａｍ６／ＶＩ３」（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子を有する米国特許第８，６４２，８３５号及び同第８，５０２，０１８Ｂ２号を参照）、「ＵＬＣ」マウス（ＵＳ２０１１−０１９５４５４Ａ１、ＵＳ２０１２−００２１４０９Ａ１、ＵＳ２０１２−０１９２３００Ａ１、ＵＳ２０１３−００４５４９２Ａ１、ＵＳ２０１３−０１８５８２１Ａ１及びＵＳ２０１３−０３０２８３６Ａ１を参照；その適用はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）、及び野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスの別々のコホートも免疫して同等の免疫応答プロファイルを提供した。
【０２３８】
ハプテンに結合した抗原Ｃを免疫原として用いてＫＯＨマウス、Ａｄａｍ６／ＶＩ３マウス、ＵＬＣマウス及びＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。免疫の開始に先立ってマウスから免疫前の血清を採取した。２５μＬの体積にて足蹠（ｆ．ｐ．）注射を介してアジュバントとしての１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した最初の抗原刺激免疫用の２．３５μｇの複合体で免疫原を投与した。その後、３、６、１１、１３、１７、２０日目に合計６回、アジュバントとして１０μｇのＣｐＧ及び２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と共に２．３５μｇの各免疫原で同じ経路を介してマウスを追加免疫した。それぞれ４回目と６回目の追加免疫の後１５日目と２２日目にマウスから採血した。抗原Ｃのハプテン複合体に対する抗体力価について抗血清をアッセイした。ＫＯＨマウスについては、６回の追加免疫の完了後、マウスに４〜５週間の休止期を与え、それに続いて免疫原による４回のさらなる追加免疫を投与した。マウスから採血し、抗血清力価をアッセイした。
【０２３９】
ビーズ上の抗原Ｃの調製及び修飾
スクリーニング用の抗原と結合したビーズを調製するために、ｐＨ６．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、カタログ番号４０１１−０１）中の０．１２ｍＬのＬｕｍｉｎｅｘビーズ懸濁液（カルボキシル化ミクロスフェア、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を、５０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号０３４４９）１５μＬ及び５０ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２４５１０）１５μＬの添加とそれに続く室温での１０分間のインキュベートによって活性化した。それに続いて、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５（ＡＣＲＯＳ、カタログ番号３２７７６５０００）における２０μｇ／ｍＬの抗原Ｃ０．５ｍＬを活性化されたビーズに加え、１級アミンカップリング反応を２時間進め、ビーズ上の残りの反応基は、１／１０体積の１Ｍトリス溶液、ｐＨ８（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｔ１０８０）の添加によってクエンチした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号６５５２０５）を含有するＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−１４４）でビーズを洗浄し、２％ｗ／ｖのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ４５０３）を含有するＰＢＳ緩衝液にて保存した。同じ方法で、陰性対照のビーズのバッチも調製した。
【０２４０】
抗原Ｃに結合させた１９のビーズセットを以下の差別的抗原かく乱試薬：トリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、スルホ−ＮＨＳ酢酸、ＥＤＣ／エタノールアミン、ＴＣＥＰ／ヨードアセトアミド、ＰＥＧ−５０００、パパイン、サーモリシン、スブチリシン、プロテアーゼＫ、ブロメライン、フィシン、及びＨ１１９３または７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、スクシンイミジルエステルの１つで個々に処理した。化学処理は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に新しく溶解した１０ｍＭの反応化学物質にてビーズセットを室温で９０分間インキュベートすることを含んだ。タンパク質分解処理は、ＰＢＳまたは他の推奨された緩衝液に新しく溶解した１０〜１００ｍｇの酵素にてビーズセットを室温で９０分間インキュベートすることを含んだ。追加の１つのビーズセットをＰＢＳにて室温で９０分間インキュベートし、このビーズセットに結合させた抗原Ｃは未修飾のままだった。上記のインキュベートの後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でビーズセットを洗浄し、５％ＢＳＡと０．０２％アジ化ナトリウムを伴ったＰＢＳにて保存した。
【０２４１】
結合タンパク質をスクリーニングするために、上述のような１９の修飾された抗原ビーズ及び未修飾の対照抗原ビーズをプールした。９６穴フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＳＢＶＮ１２５０）の事前に水和させた各ウェルに３０００のビーズを含有する７５μＬのアリコートを分配した。各抗体試料（２５μＬ）を各ウェルに加え、プレート振盪器上で４℃にてプレートを一晩インキュベートした。２日目の朝、真空マニホールドを用いてＰＢＳ−Ｔでビーズを洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中の０．２ｍＬの１．２５μｇ／ｍＬのＲ−フィコエリスリンと結合したヤギ抗マウスまたはヒトＩｇＧ抗体と共にビーズを室温で４５分間インキュベートすることによってビーズに結合した抗体を検出した。次いでビーズを洗浄し、０．２ｍＬのＰＢＳ−Ｔに懸濁させ、Ｌｕｍｉｎｅｘ蛍光分光光度計で中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。結合データを上述のような生物情報データ解析に供した。
【０２４２】
図６は、差別的抗原かく乱のエピトープのプロファイリングデータに基づいた７３６の抗原Ｃ結合タンパク質のクラスタの２Ｄ  ＰＣＡ表示を提供する。長方形により強調されたのは調べた従来の抗体とエピトープ結合の特徴を共有しない独特のエピトープのクラスタである。この独特のエピトープのビンのメンバーは、１以上の重鎖定常領域の遺伝子によってコードされた重鎖領域に操作可能に融合された１以上の軽鎖可変領域の遺伝子断片によってコードされた可変領域を有するハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする免疫グロブリン遺伝子座を含むマウスにて生成されたＶＬ抗原結合タンパク質である。
【０２４３】
バイオセンサー表面上の修飾された抗原Ｃの調製
標準のＮＨＳ／ＥＤＣ介在性のアミンカップリング法によって分泌性糖タンパク質である抗原ＣをＣＭ５バイオセンサーチップの表面に結合させる。各フローセルの表面に結合される抗原Ｃの量は３０００〜１０，０００ＲＵの間である。込み合い効果を最小限にするために、好ましい結合密度は５０００ＲＵ前後である。注意を払ってほぼ同一量の抗原Ｃを４つのフローセルすべてに結合させ、３つの修飾されたフローセルのシグナルと未修飾の対照フローセルの表面への結合の間で公平な比較を行うことができるようにする。
【０２４４】
６つの配列決定グレードのタンパク質分解酵素：第１のバイオセンサーチップのフローセル２、３、及び４を修飾するトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ及びエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、並びに第２のバイオセンサーチップのフローセル２、３、及び４を修飾するキモトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃを用いて結合された各抗原Ｃ表面を修飾する。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００を２μＬ／分の流速で単一フローセルモードに設定し、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の２００μｇ／ｍＬのトリプシン６０μＬをフローセル２に注入する。典型的なタンパク質分解消化のプロファイルとして下向きに曲がるセンサーグラムが観察されてもよく、それはトリプシンがトリプシン消化可能な塊を特異的に除いていることを示している。安定な表面が形成されるまで同じ用量の酵素を繰り返しフローセルに注入する。トリプシン消化がフローセル２で完了すると、トリプシンと同じ緩衝液中の５０μｇ／ｍＬのエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ６０μＬをフローセル３に注入する。再び、安定な表面が形成されるまで同じ用量の酵素を繰り返し同じフローセルに注入する。同様の方法で、同じ緩衝液中の５０μｇ／ｍＬのエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ６０μＬをフローセル４に注入して安定なエンドＡｓｐ−Ｎで修飾した表面を創り出す。酵素処理の終了時にＢｉａｃｏｒｅ  ２０００を全フローセルモードに設定する。再生緩衝液を４つの抗原Ｃの表面全体にわたって流し、安定な最終的な機能する表面を生成する。
【０２４５】
修飾された免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒト動物及び実施例２で記載されたような対照動物にて生成された抗原Ｃに特異的な結合タンパク質、ならびに抗原Ｃに特異的な、予め特徴づけされた市販の抗体を新しい９６穴マイクロタイタープレートに移し、７５μＬの２×希釈緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＰ−２０、４０ｍｇ／ｍｌのＣＭＤＸ）と混合する。２×希釈緩衝液と混合した適切な対照培地を陰性対照として使用する。
【０２４６】
各結合タンパク質試料を４つのフローセルすべてに注入し、各フローセルからの結合シグナル（ＲＵ）を注入の終了時に記録し、表面を再生する。各抗体試料についての結合／再生のサイクルはＢｉａｃｏｒｅの製造元によって提供される自動化Ｗｉｚａｒｄプログラムによって制御される。
【０２４７】
同一量の抗原Ｃを含有する第２のチップのフローセル２、３及び４は、第１のチップの調製で上述されたのと同様の方法でそれぞれ、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃによって消化される。同じセットの結合タンパク質試料を４つのフローセルすべてに注入し、その結合シグナル（ＲＵ）を第１のチップと同様の方法で回収する。
【０２４８】
標準のアルデヒドカップリングプロトコール（ＢＩＡ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４．５）によって第３のＣＭ５チップの４つのフローセルすべてに同一量の抗原Ｃを結合させる。各フローセル表面に結合される抗原Ｃの量は３０００〜１０，０００ＲＵの間であるが、込み合い効果を最小限とするのに好適なカップリング量は５０００ＲＵ前後である。構造を変性させることなく抗原Ｃのリジンのεアミンを修飾するために、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した５ｍＭのスルホ−ＮＨＳ−酢酸を５μＬ／分で２０分間、フローセル２に注入する。抗原Ｃの任意のグルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基の任意のカルボン酸基をその構造を変性させることなく修飾するために、Ｈ２Ｏに溶解した２００ｍＭのＥＤＣを同じ流速で７分間フローセル３に注入し、その後Ｈ２Ｏに溶解した５０ｍＭのヒドラジンを７分間注入する。抗原Ｃの変性処理については、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解した１００ｍＭのＴＣＥＰを同じ流速で２０分間フローセル４に注入し、その後、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解した１００ｍＭのヨードアセトアミドを注入する。処理の終了時、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００を全フローセルモードに設定する。再生緩衝液を４つの抗原Ｃ表面すべてに３回注入して安定な最終的な機能する表面を生成する。
【０２４９】
９の修飾された抗原Ｃの表面及び３の未修飾の抗原Ｃの表面を含有する３つの別々のチップの結合データが回収される場合、９の修飾された抗原Ｃの表面に対する各結合タンパク質の９の応答ＲＵ値のすべては未修飾対照の値への応答比に変換される。調べた結合タンパク質調製物すべての応答データは上記で記載されたような生物情報データ解析に供される。
【０２５０】
エピトープのクラスタ分布の結果は典型的なパターン認識（非管理の）表示法によって示される。そのような表示法の１つは、結合タンパク質のクラスタ関係を樹状配置で説明する階層木（デンドログラム）である。階層木では、エピトープを共有する可能性のある結合タンパク質は相対的に短い「アーム」によって連結され、エピトープを共有しそうにないものは相対的に長い「アーム」により連結されるであろう。
【０２５１】
エピトープマッピングによる結合タンパク質クラスタの検証
ＤＡＤによって決定されるような２つの異なる機能グループ（またはクラスタまたはビン）に由来する結合タンパク質は、ＥＬＩＳＡ、競合アッセイ等のような他の方法によって検証することができる。エピトープマッピングのアッセイは通常ＢｉａｃｏｒｅまたはＯｃｔｅｔの機器によって実施される。２つの異なる機能グループに由来する抗体は同一エピトープと相互作用しないはずである。従って、一方のクラスタに由来する第１の抗体の固定化された抗原への結合は、異なるクラスタに由来する第２の抗体の結合を有意な程度には妨害しないはずである。逆に、同一クラスタに由来する抗体はそれらの抗原に結合する際、互いにほぼ完全な競合を示すはずである。
【０２５２】
ＤＡＤを用いて特定された機能グループは、抗原Ｃの一次配列に由来するペプチドアレイによっても検証される。抗原Ｃの配列全体を網羅する抗原Ｃに由来するペプチドまたは重複するペプチドは、ＰＶＤＦ膜上にドットアレイとして調製される、または典型的なタンパク質マイクロアレイのスライド上にプリントされる。異なる機能グループを示す結合タンパク質または同一機能グループに由来する結合タンパク質をペプチドアレイと共にインキュベートし、その後、標準のドットブロットまたはタンパク質アレイ結合を行い、染色手順を行う。同一エピトープを認識する、同一機能グループに由来する結合タンパク質は、ペプチドアレイのシートまたはスライド上で同一の、または、ほぼ同一の結合パターンを示すはずである。逆に、抗原Ｃ上の異なるエピトープを認識する、異なる機能グループに由来する結合タンパク質はペプチドアレイに対して異なる結合パターンを示すはずである。
【０２５３】
実施例４．小分子に特異的なＶＬ結合タンパク質の評価
実施例１〜３で開示されたような抗原Ａ、抗原Ｂ及び抗原Ｃに対して生成されたＶＬ結合タンパク質を構造的特徴について評価した。特に、抗原Ａ（アルカロイド小分子；ｎ＝１３２）、抗原Ｂ（ステロイド小分子；ｎ＝８７）または抗原Ｃ（糖タンパク質高分子；ｎ＝６１）に特異的なＶＬ結合タンパク質のハイブリッド鎖及び軽鎖のＣＤＲ３の長さを決定した。表７は、抗原Ａ、抗原Ｂまたは抗原Ｃに特異的なＶＬ結合タンパク質に由来する６、７、８、９、１０、１１または１２のＣＤＲ３のアミノ酸の長さを有するハイブリッド鎖の数を示す。表８は同じＶＬ結合タンパク質に由来する７、８、９または１０のＣＤＲ３のアミノ酸の長さを有する軽鎖の数を示す。図７は棒グラフ形式でこのデータを提供する。
【表７】
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【表８】
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【０２５４】
ＶＬ結合タンパク質の軽鎖におけるＣＤＲ３の長さは抗原特異性にかかわらず、一貫して約９アミノ酸であった。それに対して、評価されたＶＬ結合タンパク質のハイブリッド鎖におけるＣＤＲ３の長さは、特に小分子に特異的なＶＬ結合タンパク質についてさらに可変性であった。糖タンパク質である抗原Ｃに特異的なＶＬ結合タンパク質のハイブリッド鎖は約１０〜１１アミノ酸長のＣＤＲ３の長さを有し、いくつかが１０未満のアミノ酸を有した。それに対して、小分子、たとえば、抗原Ａまたは抗原Ｂに特異的なＶＬ結合タンパク質に由来するハイブリッド鎖のＣＤＲ３は１０未満のアミノ酸長である可能性が高い。抗原Ｂに特異的なＶＬ結合タンパク質の半分弱（約４０％）は６アミノ酸のＣＤＲ３の長さを有した。
【０２５５】
総合すれば、これらの実施例は、本明細書で記載されるようなＶＬ抗原結合タンパク質を産生するように遺伝子操作された非ヒト動物、たとえば、特に齧歯類及びマウスが、通常の抗体によって示されない結合特性、たとえば、従来の抗体による結合に上手く適合していない小分子上の新規のパラトープまたは結合表面の使用を多分介して高親和性で小分子と結合する能力を示す抗原特異的なＶＬ抗原結合タンパク質の効率的な生成のための頑強な生体内の系を提供することを明らかにしている。
【０２５６】
同等物
本発明の少なくとも一実施形態の幾つかの態様をこうして記載したが、種々の変更、改変及び改善が容易に当業者に想到することが当業者によって十分に理解されるべきである。そのような変更、改変及び改善は本開示の一部であることが意図され、本発明の精神及び範囲内にあることが意図される。従って、前述の記載及び図面は例示のみの目的であり、本発明は後に続くクレームによって詳細に記載される。
【０２５７】
本発明のいずれもの実施形態または態様は、具体的な除外が明細書に記されるかどうかにかかわらず、クレームから明白に除外できることも理解されるべきである。
【０２５８】
当業者は、本明細書で記載されるアッセイまたは他のプロセスで得られた値に起因する典型的な標準偏差または標準誤差を十分に理解するであろう。
【０２５９】
本発明の背景を記載するのに及びその実践に関する追加の詳細を提供するのに本明細書で参照される出版物、ウェブサイト及び他の参照資料は参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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