(57)【要約】  本発明は、一般に、免疫療法、特に癌免疫療法に使用される白血球、特にＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで調製する方法に関する。より詳細には、本発明は、養子細胞移入に使用される、細胞障害性を示す白血球の調製の方法に関する。本発明はまた、癌治療用の細胞、及びこれらを含む組成物に関する。本発明はまた、免疫療法、特に、癌免疫療法の方法に関する。本発明は、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生する方法に関し、この方法は、ＰＴＰＮ２阻害剤が白血球内のＰＴＰＮ２を不活化させることができる条件下で、白血球をこのＰＴＰＮ２阻害剤に接触させるステップを含み、これにより、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生する。好ましくは、白血球は、Ｔヘルパー細胞の非存在下でＰＴＰＮ２阻害剤に接触される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生する方法において、
ＰＴＰＮ２阻害剤が白血球内のＰＴＰＮ２を不活化させることができる条件下で、前記白血球を前記ＰＴＰＮ２阻害剤に接触させるステップ
を含み、これにより、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生する、方法。
【請求項２】
前記白血球が、Ｔヘルパー細胞の非存在下で、前記ＰＴＰＮ２阻害剤に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記白血球が、癌を有する対象に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、単球、又はリンパ球である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記リンパ球が、腫瘍浸潤リンパ球である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記白血球が、癌抗原に対する特異性を有するように調整される又はエンジニアリングされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記エンジニアリングされた特異性が、組換えキメラ受容体、又は癌抗原に特定的に結合するＴ細胞受容体によって付与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記白血球が、前記ＰＴＰＮ２阻害剤に接触される前又は後で、培地で増殖される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生する方法において、
ＰＴＰＮ２阻害剤が白血球内のＰＴＰＮ２を不活化させることができる条件下で、前記白血球を前記ＰＴＰＮ２阻害剤に接触させるステップ
を含み、これにより、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生し、
前記ＰＴＰＮ２阻害剤が、ＰＴＰＮ２タンパク質の発現又は産生を変更する、好ましくは発現又は産生を低減してＰＴＰＮ２を阻害する、ＰＴＰＮ２を対象とする干渉ＲＮＡである、方法。
【請求項１０】
前記干渉ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２〜１３からなる群から選択される配列、又は配列番号２〜１３のいずれか１つと少なくとも６０％の同一性を有する配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号：１若しくは１４の配列、又は配列番号：１若しくは１４のいずれか１つと少なくとも６０％の同一性を有する配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記干渉ＲＮＡが、レンチウイルスベクターによって供給される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＴＰＮ２阻害剤が、前記白血球内のＰＴＰＮ２遺伝子の全て若しくは一部を除去又は変更するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９システムである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生する方法において、
ＰＴＰＮ２阻害剤が白血球内のＰＴＰＮ２を不活化させることができる条件下で、前記白血球を前記ＰＴＰＮ２阻害剤に接触させるステップ
を含み、これにより、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生し、
前記ＰＴＰＮ２阻害剤が、エチル−３，４−デホスタチン（ｄｅｐｈｏｓｐａｔｉｎ）又は本明細書に記載の化合物８である、方法。
【請求項１６】
前記標的細胞が癌細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌細胞が、既に記載された癌細胞のいずれか１つである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって産生された単離、精製、又は組換え白血球。
【請求項１９】
癌の処置に使用される請求項１８に記載の細胞を含む組成物。
【請求項２０】
細胞を殺すのを促進するためのサイトカインをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
癌を処置する方法において、
・ＰＴＰＮ２阻害剤が白血球内のＰＴＰＮ２を不活化させることができる条件下で、ｅｘ  ｖｉｖｏでの前記ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で処置されるべき癌対象又は前記処置されるべき癌対象の組織適合ドナーからの白血球を培養し、これにより、標的癌細胞を殺す高い能力を有する細胞の組成物を調製するステップ、
・前記細胞の組成物を前記対象に投与するステップ
を含み、これにより癌を処置する、方法。
【請求項２２】
前記癌の処置が、
・癌細胞の数を減少させること；
・原発腫瘍のサイズを縮小させること；
・癌細胞の末梢器官への浸潤を抑制すること；
・腫瘍の転移を抑制すること；
・腫瘍の成長を抑制すること；及び
・癌に関連した１つ以上の症状を軽減することからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、単球、又はリンパ球である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
リンパ球が、腫瘍浸潤リンパ球又は末梢血リンパ球である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記白血球が、処置されるべき癌に対する特異性を有するように調整される又はエンジニアリングされる、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記エンジニアリングされた特異性が、組換えキメラ受容体、又は癌抗原に特定的に結合するＴ細胞受容体によって付与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記白血球が、前記ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で培養される前又は後で、培地で増殖される、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＴＰＮ２阻害剤が、ＰＴＰＮ２タンパク質の発現又は産生を変更する、好ましくは発現又は産生を低減してＰＴＰＮ２を阻害する干渉ＲＮＡである、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記干渉ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２〜１３からなる群から選択される配列、又は配列番号２〜１３のいずれか１つと少なくとも６０％の同一性を有する配列を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号：１若しくは１４の配列、又は配列番号：１若しくは１４のいずれか１つと少なくとも６０％の同一性を有する配列を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記干渉ＲＮＡが、レンチウイルスベクターによって供給される、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＴＰＮ２阻害剤が、エチル−３，４−デホスタチン（ｄｅｐｈｏｓｐａｔｉｎ）又は本明細書に記載の化合物８である、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
細胞内のＰＴＰＮ２のレベルを低下させることができる干渉ＲＮＡ分子をコードする外来性核酸を含む腫瘍抗原特異的細胞。
【請求項３５】
癌の処置用の薬剤の製造における、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって産生される白血球細胞の使用。
【請求項３６】
細胞障害性細胞の組成物であって、前記細胞の２０％超がＰＴＰＮ２の完全又は部分的阻害を有する、組成物。
【請求項３７】
白血球及びエチル−３，４−デホスタチン（ｄｅｐｈｏｓｐａｔｉｎ）又は本明細書に記載の化合物８を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられるオーストラリア国仮特許出願第２，０１４，９０２，２０３号明細書及び同第２，０１５，９０１，１７１号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、一般に、免疫療法、特に癌免疫療法に使用される細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで調製する方法に関する。より詳細には、本発明は、養子細胞移入に使用される細胞障害性を示す白血球、特にＴ細胞の調製の方法に関する。本発明はまた、癌免疫療法用の細胞及びこのような細胞を含む組成物にも関する。本発明はまた、免疫療法、特に癌免疫療法の方法に関する。
【０００３】
［発明の背景］
免疫療法では、患者の免疫系の使用により、患者の免疫系を刺激して悪性腫瘍又はウイルス感染細胞を攻撃する（かつ患者の正常細胞を残す）ことによって疾患、例えば、癌又はウイルス感染を排除する。免疫療法の１つの方式では、（例えば、癌ワクチンを投与することによる）患者の免疫化を利用して、腫瘍細胞を認識して破壊するように患者の免疫系を訓練する。別のアプローチは、治療用抗体の投与を用いて、患者の免疫系を動員して癌細胞を破壊する。細胞を用いる免疫療法は、免疫細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）などが関与する別のアプローチである。
【０００４】
様々な種類の腫瘍細胞又はウイルス感染細胞が、患者自身の免疫系によって許容されるが、これは、これらの細胞が、患者自身の細胞であり（例えば、これらの細胞が自己であり）、患者の免疫系によって有効に認識されず、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞が、適切な調節管理なしで増殖し分裂できるためである。加えて、腫瘍特異的Ｔ細胞は、通常は寛容化されるため、これらの細胞は腫瘍活性に応答しない。従って、患者自身の免疫系は、疾患細胞を攻撃するために刺激を必要とする。
【０００５】
養子細胞移入（ＡＣＴ）は、免疫療法の有効な形式であり、抗腫瘍活性又は抗ウイルス活性を有する免疫細胞の患者への移入を行う。ＡＣＴは、典型的には、抗腫瘍活性又は抗ウイルス活性を有するリンパ球の同定、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこれらの細胞の増幅による増大、及び疾患を有する宿主へのこれらの細胞の注入を含む処置アプローチである。
【０００６】
養子Ｔ細胞療法は、Ｔ細胞のエフェクター機能並びに生着及びホーミング能力を温存したまま、標的抗原特異性を有する細胞を最適に選択する又は遺伝子操作してＴ細胞の増殖を誘導する能力に依存する。しかしながら、臨床試験は、Ｔ細胞の必須機能、例えば、抗原特異的細胞毒性を弱める最適以下の条件であると現在理解されている条件下で培養された養子移入細胞を用いて行われた。
【０００７】
養子細胞療法に使用される細胞の調製に現在使用されている方法は、標的細胞、例えば、腫瘍細胞を殺す期待される能力よりも低い細胞を提供するという点で限定されている。
【０００８】
本明細書におけるいずれの先行技術の参照も、この先行技術が、いずれの権限においても周知の一般知識の一部をなすことの承認又は提案ではないし、またこの先行技術が、当業者によって理解される、適切と見なされる、かつ／または他の先行技術の一部の組み合わせられることが合理的に考えられ得るとの承認又は提案でもない。
【０００９】
［発明の概要］
本発明は、上記概説した１つ以上の問題に取り組む。
【００１０】
本発明は、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生する方法に関し、この方法は、
・ＰＴＰＮ２阻害剤が白血球内のＰＴＰＮ２を不活化させることができる条件下で、白血球をこの阻害剤に接触させるステップ
を含み、これにより、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球を産生する。好ましくは、この白血球は、Ｔヘルパー細胞の非存在下でＰＴＰＮ２阻害剤に接触される。
【００１１】
本発明は、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球細胞を産生する方法に関し、この方法は、
・白血球でＰＴＰＮ２が不活化する条件下で十分な時間、ｅｘ  ｖｉｖｏで白血球をＰＴＰＮ２阻害剤に接触させるステップ
を含み、これにより、標的細胞を殺す高い能力を有する白血球細胞を産生する。好ましくは、白血球は、ｅｘ  ｖｉｖｏでＣＤ４  Ｔヘルパー細胞と接触されない。
【００１２】
本発明は、ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下でのＴ細胞の培養を含む、細胞障害性Ｔ細胞の少なくとも１つの特性を示すＴ細胞の集団をｅｘ  ｖｉｖｏで調製する方法に関する。
【００１３】
本発明は、細胞障害性Ｔ細胞の少なくとも１つの特性を示すＴ細胞の集団をｅｘ  ｖｉｖｏで調製する方法に関し、この方法は：
・ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で生物学的サンプルからのＴ細胞集団を培養するステップ；
・細胞を培養で増殖させるステップ
を含み、これにより、細胞障害性を示すＴ細胞の集団をｅｘ  ｖｉｖｏで調製する。好ましくは、生物学的サンプルは、癌患者に由来する、又は癌に対する特異性を有するように調整される若しくはエンジニアリングされる。
【００１４】
本発明は、抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を含む組成物をｅｘ  ｖｉｖｏで調製する方法に関し、この方法は：
・Ｔ細胞を含む生物学的サンプルを用意するステップ；
・ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で、抗原性物質をＴ細胞集団と共培養するステップ；及び
・細胞を培養で増殖させるステップ
を含み、これにより、抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を含む組成物をｅｘ  ｖｉｖｏで調製する。
【００１５】
本発明は、エフェクター記憶表現型を示すＴ細胞のレベルを対象において上昇させる方法に関し、この方法は：
・ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で、生物学的サンプルからのＴ細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで培養するステップ；
・細胞を培養で増殖させるステップ；
・培養した細胞を対象に投与するステップ
を含み、これにより、エフェクター記憶表現型を示す対象においてＴ細胞のレベルを上昇させる。
【００１６】
本発明はまた、癌の処置に適した免疫応答を対象で誘導するための方法も提供し、この方法は、
・対象又は組織適合ドナー対象からＴ細胞を得るステップ；
・少なくとも１つの細胞障害性Ｔ細胞の特性を示すＴ細胞の集団を産生するための条件下で十分な時間、ｅｘ  ｖｉｖｏで、ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下でＴ細胞を培養し、これにより細胞障害性Ｔ細胞の集団を産生するステップ、
・細胞障害性Ｔ細胞の集団を対象に投与するステップを
含み、これにより、癌の処置に適した免疫応答を対象で誘導する。
【００１７】
本発明はまた、疾患状態を有する対象におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介免疫を高める方法にも関し、この方法は：
・ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、細胞障害性Ｔ細胞の少なくとも１つの特性を示すＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団を産生するための条件下で十分な時間、ｅｘ  ｖｉｖｏでＰＴＰＮ２阻害剤に接触させるステップ；
・ＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団を対象に投与するステップ
を含み、これにより、対象におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介免疫を高める。
【００１８】
本発明はまた、疾患状態を有する対象におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介免疫を高める方法にも関し、この方法は：
・対象のＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団を単離するステップ；
・ＰＴＰＮ２を対象とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードする核酸分子を、単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞に導入し、これによりＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＰＴＰＮ２のレベルを低下させるステップ；及び
・ＣＤ８＋  Ｔ細胞を前記対象に再導入するステップ
を含み、これにより、対象におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介免疫を高める。
【００１９】
本発明は、対象における癌の退縮を促進する方法に関し、この方法は：
・ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で、対象から得たＴ細胞を培養するステップ、
・培養したＴ細胞を対象に投与するステップ
を含み、これにより、癌の退縮が促進される。
【００２０】
本発明は、癌を有する対象の癌の退縮を促進する方法に関し、この方法は：
・ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で、癌によって発現される腫瘍抗原に特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞を培養するステップ、
・培養したＣＡＲ  Ｔ細胞を対象に投与するステップ
を含み、これにより、癌の退縮が促進される。好ましくは、癌は、Ｈｅｒ−２陽性癌であり、ＣＡＲ  Ｔ細胞はＨｅｒ−２に特異的である。
【００２１】
本発明は、癌を有する患者の生存期間を延長する方法に関し、この方法は、
・ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で、癌によって発現される腫瘍抗原に特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞を培養するステップ、
・培養したＣＡＲ  Ｔ細胞を対象に投与するステップ
を含み、これにより、対象の生存期間が延長される。好ましくは、癌は、Ｈｅｒ−２陽性癌であり、ＣＡＲ  Ｔ細胞はＨｅｒ−２に特異的である。
【００２２】
Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球、抗腫瘍Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された末梢血リンパ球、混合リンパ球腫瘍細胞培養（ＭＬＴ）で濃縮された又は自己抗原提示細胞でクローニングされたγδＴ細胞、及び腫瘍由来ペプチドからなる群から選択することができる。リンパ球は、組織適合ドナー又は癌を有する対象から単離することができる。
【００２３】
本発明のいずれの方法でも、リンパ球又はＴ細胞は、ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下での培養の前に精製される又は実質的に精製される。このステップは、生物学的サンプルから他の細胞型を除去することによってリンパ球又はＴ細胞を濃縮する。
【００２４】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｈｅｒ−２特異的ＣＡＲ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。このＴ細胞は、本明細書に記載のいずれか１つ以上の型を含む２つ以上のＴ細胞の型を含む集団であり得る。例えば、Ｔ細胞の集団は、ナイーブの活性化及び／又は記憶Ｔ細胞を含み得る。
【００２５】
本明細書で使用されるＰＴＰＮ２阻害剤は、ＰＴＰＮ２のホスファターゼ活性を阻害するあらゆる分子であり得る。この阻害剤は、ホスファターゼ活性化部位の直接阻害剤であり得、ホスファターゼ活性をアロステリックに阻害するように作用することができる、ＰＴＰＮ２のその基質との相互作用を阻害することができる、又はＰＴＰＮ２遺伝子の転写活性を低下させることによって、若しくは細胞中に存在するＰＴＰＮ２  ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の量を減少させることによってＰＴＰＮ２のレベルを下げることができる。典型的には、この阻害剤は、小分子、例えば、エチル−３，４−デホスタチン（ｄｅｐｈｏｓｐａｔｉｎ）又は本明細書に記載の化合物８、ペプチド、ペプチド模倣体、抑制性又は干渉ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡである。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号１で示される配列を有する。好ましくは、ｓｈＲＮＡは、配列番号２〜１２のいずれか１つに示される配列、又はｓｈＲＮＡが細胞内でのＰＴＰＮ２のレベルを低下させる能力を維持したままの、配列番号２〜１３のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列である。
【００２６】
本発明はまた、干渉ＲＮＡ、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡをコードする外来核酸、細胞内でＰＴＰＮ２のレベルを低下させることができる分子を含む養子免疫療法に使用される腫瘍抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞にも関する。
【００２７】
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞受容体、及び干渉ＲＮＡ、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡをコードする外来核酸、細胞内でのＰＴＰＮ２のレベルを低下させることができる分子を含む単離細胞、精製細胞、又は組換え細胞に関する。好ましくは、ＴＣＲは、癌抗原に特異的であり、この細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球、又は癌に罹患した宿主から単離された末梢血リンパ球であり得る。
【００２８】
本発明は、癌の治療に有効な単離又は精製ＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団を投与するステップを含む対象の癌を処置する方法に関し、このＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞受容体、及び干渉ＲＮＡ、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡをコードする外来核酸、ＰＴＰＮ２を対象とする分子を含む。
【００２９】
本発明はまた、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む細胞の組成物の増殖、濃縮、又は増加の方法も提供し、この方法は、ＰＴＰＮ２阻害剤を含む培地で細胞の組成物を培養するステップを含み、このＰＴＰＮ２阻害剤は、培養中のＣＤ８＋  Ｔ細胞との接触を可能にするために培地に加えられる。好ましくは、増殖、濃縮、又は増加により、少なくとも１つの細胞障害性Ｔ細胞の特性を示すＣＤ８＋  Ｔ細胞の数が２倍になる。より好ましくは、細胞の増加により、少なくとも１つの細胞障害性Ｔ細胞の特性を示すＣＤ８＋  Ｔ細胞の数が３倍又は４倍になる。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加は、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍以上であり得る。この方法は、少なくとも１つの細胞障害性Ｔ細胞の特性を示す組成物中のＣＤ８＋  Ｔ細胞の相対数を増加させることもできる。
【００３０】
本発明はまた、細胞の２０％超がＰＴＰＮ２の完全又は部分的な阻害を有する細胞障害性細胞の組成物に関する。好ましくは、組成物は、ＰＴＰＮ２の完全又は部分的な阻害を有する細胞を３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８超、又は９９％超含む。一実施形態では、全ての細胞は、ＰＴＰＮ２の完全又は部分的な阻害を有する。
【００３１】
本発明はまた、本明細書に記載の白血球及びＰＴＰＮ２阻害剤を含む組成物にも関する。好ましくは、ＰＴＰＮ２阻害剤は、本明細書に記載の干渉ＲＮＡ、又はエチル−３，４−デホスタチン（ｄｅｐｈｏｓｐａｔｉｎ）、又は本明細書に記載の化合物８である。この組成物は、細胞を殺すのを促進するサイトカイン、例えば、ＩＬ−２又はＩＦＮγをさらに含み得る。好ましくは、この白血球は、ＣＡＲ  Ｔ細胞であり、より好ましくはＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞表面腫瘍抗原に特異的である。典型的には、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｈｅｒ−２に特異的である。
【００３２】
本発明のいずれの態様でも、唯一の阻害は、ＰＴＰＮ２である。言い換えれば、ＰＴＰＮ２以外の遺伝子又は遺伝子産物は阻害されない。例えば、使用される唯一の小分子阻害剤が、ＰＴＰＮ２阻害剤である、又は使用されるｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、若しくはｓｉＲＮＡのみがＰＴＰＮ２を標的とする、又は唯一のゲノム編集が、ＰＴＰＮ２遺伝子で起こる。
【００３３】
特段の記載がない限り、本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及びその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、さらなる添加剤、成分、整数、又はステップを排除することを意図するものではない。また、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同義的に使用され、同様に、さらなる添加剤、成分、整数、又はステップを排除することを意図するものではない。
【００３４】
本発明のさらなる態様及び前の段落に記載された態様のさらなる実施形態は、例として記載される以下の説明及び添付の図面の参照により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＰＴＰＮ２欠損ナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＲＩＰｍＯＶＡマウスのＩ型糖尿病を促進することを示す。（ａ）ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからの精製ナイーブ（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）ＣＤ８＋リンパ節（ＬＮ）Ｔ細胞（８×１０５）をＲＩＰ−ｍＯＶＡ宿主に養子移入して、生存及び糖尿病の発症（尿糖≧５５ｍｍｏｌ／ｌ）を監視した。血糖値を、移入から７〜１０日後に評価した。（ｂ）ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（４×１０５）をＲＩＰ−ｍＯＶＡ宿主に養子移入して、移入から１５日後に血中及び尿中のブドウ糖値を監視した。尿中及び血糖値は、平均±ＳＥＭである。尿中及び血中のブドウ糖値の有意差を、２−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験（ノンパラメトリック）；＊＊Ｐ＜０．０１を用いて決定した。（ａ）（ｐ＜０．０００１）及び（ｂ）（ｐ＝０．００１２）におけるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定法での統計的分析を、自由度１のＬｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）試験を用いて行った。（ｃ）ＰＴＰＮ２欠損ナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスへの養子移入により、１型糖尿病が発症する。ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブ（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）ＣＤ８＋リンパ節（ＬＮ）Ｔ細胞（２．５×１０５）をＲＩＰ−ｍＯＶＡ宿主に養子移入して、移入から１５日後に尿中及び血中のブドウ糖値を監視した。尿中及び血中のブドウ糖値の有意差を、２−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験（ノンパラメトリック）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１を用いて決定した。
【図２】図２は、ＰＴＰＮ２欠損ナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＲＩＰｍＯＶＡマウスへの養子移入により、膵β細胞が破壊されることを示す。ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（８×１０５）をＲＩＰ−ｍＯＶＡ宿主に養子移入した。（ａ）移入から１１日目に、膵臓をホルマリンで固定して、組織学的評価（ヘマトキシリン及びエオシン：Ｈ＆Ｅ）を行った。膵島炎の重症度を組織学的に決定した。グレード０〜４の膵島及び侵襲性膵島炎（グレード３及び４）の膵島の割合を、指定数のマウスに対して決定した。侵襲性膵島炎における有意差（平均±ＳＥＭ）を、２−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ試験；＊＊＊Ｐ＜０．００１を用いて決定した。（ｂ）別法では、固定された膵臓に、インスリン及びグルカゴンの免疫組織学的染色を行った。
【図３】図３は、ＰＴＰＮ２ヘテロ接合ナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスにおいて膵β細胞の破壊及び糖尿病を引き起こすことを示す。ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／＋対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／＋ヘテロ接合マウスからのナイーブＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（８×１０５）をＲＩＰ−ｍＯＶＡ宿主に養子移入した。（ａ）糖尿病の発症（尿糖≧５５ｍｍｏｌ／ｌ）を監視した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定法（ｐ＝０．０４９８）での統計的分析を、自由度１のＬｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）試験を用いて行った。（ｂ）移入から２０日目に、膵臓を摘出し、ホルマリンで固定し、そして組織学的評価を行った。膵島炎の重症度を組織学的に評点した。グレード０〜４の膵島及び侵襲性膵島炎（グレード３及び４）の膵島の割合を、指定数のマウスに対して決定した。侵襲性膵島炎における有意差（平均±ＳＥＭ）を、２−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ試験；＊Ｐ＜０．０５を用いて決定した。
【図４】図４は、ＰＴＰＮ２欠損が、ＲＩＰ−ｍＯＶＡにおけるナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を変更しないことを示す。ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（２×１０６）をＣＦＳＥで染色し、ＲＩＰ−ｍＯＶＡ宿主に養子移入した。移入から３日目に、リンパ球を、膵臓、腎臓、及び鼠径部ＬＮから採取し、ＣＤ８及びＴＣＲ−Ｖα２について染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。２つの独立した実験の代表的なＣＦＳＥヒストグラムが示されている。定量結果は、指定数のマウスについての平均±ＳＥＭであり、２つの独立した実験の典型である。
【図５】図５は、ＰＴＰＮ２欠損ナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスへの養子移入後に高いエフェクター機能を示すことを示す。ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（０．８×１０６）をＲＩＰ−ｍＯＶＡ宿主に養子移入した。移入から１１日目に、リンパ球を（ａ）膵臓及び（ｂ）鼠径部ＬＮから採取し、ＣＤ８、ＴＣＲ−Ｖα２、及びＴＣＲ−Ｖβ５について染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。２つの独立した実験の代表的なドットプロット及び等高線プロットが示されている。（ｃ）ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（２×１０６）をＲＩＰ−ｍＯＶＡ宿主に養子移入した。移入から９日目に、リンパ球を膵リンパ節から採取し、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ／Ｍｏｎｅｎｓｉｎの存在下で、ＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激し、固定し、次いで透過化処理し、ＣＤ８、ＴＣＲ−Ｖα２、ＴＣＲ−Ｖβ５、ＩＦＮγ、及びグランザイムＢ（Ｇｒｚ  Ｂ）に対する蛍光色素結合抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。２つの独立した実験の代表的な等高線プロットが示されている。（ａ）〜（ｃ）の定量結果は、指定数のマウスについての平均±ＳＥＭであり、２つの独立した実験の典型である。（ａ）〜（ｃ）では、有意性を、２−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  Ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１を用いて決定した。
【図６】図６は、ＰＴＰＮ２欠損が、同種ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに曝露されたナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を促進することを示す。（ａ）ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのＣＤ８＋ナイーブＬＮ  Ｔ細胞をＣＦＳＥで染色し、０．１μｇ／ｍｌ  ＳＩＩＮＦＫＬと共に３６時間インキュベートし、そしてフローサイトメトリーによって分析した。２つの独立した実験の代表的なＣＦＳＥヒストグラムが示されている。（ｂ）ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのＣＤ８＋ナイーブＬＮ  Ｔ細胞を１μｇ／ｍｌ  ＳＩＩＮＦＫＬと共に１８時間インキュベートし、アネキシンＶ及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。（ｃ）ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのＣＤ８＋ナイーブＬＮ  Ｔ細胞を０．１μｇ／ｍｌ  ＳＩＩＮＦＫＬと共に３６時間インキュベートし、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６９、及びＣＤ６２Ｌについて染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。２つの独立した実験の代表的なオーバーレイヒストグラムが示されている。（ｂ）及び（ｃ）では、定量結果は、指定数のマウスについての平均±ＳＥＭであり、２つの独立した実験の典型である。（ｃ）では、有意性を、２−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  Ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で決定した。
【図７】図７は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＣＲ誘導及びＩＬ−２誘導ナイーブＣＤ８＋  Ｔの分化を促進することを示す。（ａ）Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのＣＤ８＋ナイーブＬＮ  Ｔ細胞をＣＦＳＥで染色し、そしてプレート結合α−ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。３つの独立した実験の代表的なＣＦＳＥヒストグラムが示されている。（ｂ）Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのＣＤ８＋ナイーブＬＮ  Ｔ細胞をα−ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激し、ＣＤ２５、ＣＤ４４、及びＣＤ６９について染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。２つの独立した実験の代表的なオーバーレイヒストグラムが示されている。（ｃ）Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞をプレート結合α−ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。刺激から２日目に、細胞をＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌについて染色して、フローサイトメトリーにかけた。細胞を、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８の非存在下でＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）と共にさらにインキュベートした。ＩＬ−２刺激から２日目及び４日目に、細胞をＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌについて染色し、そしてフローサイトメトリーにかけてＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏエフェクター／記憶Ｔ細胞の産生を監視した。３つの独立した実験の代表的な等高線プロットが示されている。（ｂ）及び（ｃ）では、定量結果は、指定数のマウスについての平均±ＳＥＭであり、（ｂ）での２つの独立した実験及び（ｃ）での３つの独立した実験の典型である。（ｂ）及び（ｃ）では、有意性を、２−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  Ｔｅｓｔ；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて決定した。
【図８】図８は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるエフェクター／記憶表現型の獲得を促進することを示す。Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（−／−）対Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（＋／＋）マウスからの脾細胞を刺激し、そしてｓｃＦｖ抗Ｈｅｒ−２及びＣＤ２８−ＣＤ３−ζ（α−Ｈｅｒ−２）をレトロウイルスによって同時導入した。培養の８日後に、Ｈｅｒ−２特異的Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（ａ−Ｈｅｒ−２  −／−）対Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対照（ａ−Ｈｅｒ−２  ＋／＋）ＣＡＲ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＤ６２Ｌ対ＣＤ４４に対する蛍光色素結合抗体で染色し、そしてエフェクター／記憶（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）の産生をフローサイトメトリーによって監視した。左側がＰｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（＋／＋）であり、右側がＬｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（−／−）である。
【図９】図９は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｅｘ  ｖｉｖｏでＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を促進することを示す。Ｈｅｒ−２特異的Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（α−Ｈｅｒ−２  ＋／＋）対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（α−Ｈｅｒ−２  −／−）又は非トランスフェクトＰｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（＋／＋）対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（−／−）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、Ｈｅｒ−２発現２４ＪＫ肉腫細胞（２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２）又はプレート結合ａ−ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔ細胞を活性化させる非抗原特異的手段として）と共にインキュベートした。Ｔ細胞の活性化を、ＥＬＩＳＡによる分泌ＩＦＮγの監視によって評価した。
【図１０】図１０は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＴＬ活性を促進することを示す。Ｈｅｒ−２特異的Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（α−Ｈｅｒ−２  ＋／＋）対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＡＲ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（α−Ｈｅｒ−２  −／−）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、クロム（Ｃｒ５１）標識２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２肉腫細胞又はＨｅｒ−２陰性２４ＪＫ肉腫細胞と共にインキュベートし、４時間後にＣｒ５１の放出を測定した。
【図１１】図１１は、ＰＴＰＮ２活性の阻害が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのポリクローナルＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を促進することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離された精製ＣＤ８＋ナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）脾Ｔ細胞を、高度に選択的な可逆ＰＴＰＮ２阻害剤（化合物８）の存在下又は非存在（ビヒクル）下で、プレート結合αＣＤ３／ＣＤ２８と共に４８時間インキュベートした。Ｔ細胞を、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５サブユニット）及びＣＤ６９の表面のレベルを評価するために蛍光色素結合抗体で染色し、そして平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって監視した。
【図１２】図１２は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのナイーブＴ細胞のエフェクター／記憶表現型細胞への変換を促進することを示す。ＣＤ４５．１＋対ＣＤ４５．２＋  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）ＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（２×１０６）を、ｒｅｐｌｅｔｅ  ＣＤ４５．１／２＋宿主に同時に移入した。末梢血を、Ｔ細胞の移入後の指定された時点で収集し、ＣＤ４５．２  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＣＤ４５．１マウスからの養子移入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を、フローサイトメトリーによって決定した。移入から１６週間後に、レシピエントマウスを屠殺し、脾臓、リンパ節（ＬＮ）、肝臓、及び肺からのリンパ球をフローサイトメトリーによって分析した。養子移入された合計及びナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）中心記憶（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ；ＣＭ）及びエフェクター／記憶（ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ；ＥＭ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を決定した。図示されている結果は、指定数のマウスの平均±ＳＥＭである。
【図１３】図１３は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８＋中心／記憶Ｔ細胞のエフェクター／記憶Ｔ細胞への変換を促進することを示す。ＣＤ４５．１＋対ＣＤ４５．２＋  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからの中心記憶（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ、ＣＭ）ＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（０．５×１０６）を、ｒｅｐｌｅｔｅ  ＣＤ４５．１／２＋宿主に同時移入した。末梢血を、Ｔ細胞の移入後の指定された時点で収集し、そしてＣＤ４５．２  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＣＤ４５．１マウスからの養子移入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を、フローサイトメトリーによって決定した。移入から１６週間後に、レシピエントマウスを屠殺し、脾臓、リンパ節（ＬＮ）、肝臓、及び肺からのリンパ球をフローサイトメトリーによって分析した。養子移入された合計及びナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）中心記憶（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ；ＣＭ）及びエフェクター／記憶（ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ；ＥＭ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を決定した。図示されている結果は、指定数のマウスの平均±ＳＥＭである。
【図１４】図１４は、マウスＣＤ８＋  Ｔ細胞のＰＴＰＮ２の阻害により、ＴＣＲ媒介Ｔ細胞活性化及びエフェクター／記憶Ｔ細胞への変換が促進されることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）ＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（１×１０５）を、±様々な濃度のＰＴＰＮ２阻害剤で、プレート結合抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で６０時間刺激した。細胞を回収し、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ６２Ｌに対する蛍光色素結合抗体で染色し、フローサイトメトリーによって平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析した。図示されている結果は、指定数の複製についての平均±ＳＤである。
【図１５】図１５は、ＰＴＰＮ２欠損が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞でのＴＣＲ媒介活性化誘導細胞死を促進しないことを示す。ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのＣＤ８＋ナイーブＬＮ  Ｔ細胞（２×１０５）を、１μｇ／ｍｌ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｎ４）又は１μｇ／ｍｌ  ＳＩＹＮＦＥＫＬ（Ｙ３）と共に１８時間インキュベートし、アネキシンＶ及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図示されている結果は、指定数のマウスについての平均±ＳＥＭである。
【図１６】図１６は、ＣＤ８＋ヒト血液リンパ球でのＰＴＰＮ２の阻害により、ＴＣＲ媒介Ｔ細胞活性化が促進されることを示す。新しく単離されたヒトＰＢＭＣ（２×１０６）を、プレート結合α−ＣＤ３（１．２５及び２．５μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。ＰＢＭＣを回収し、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８、ＣＤ６９、及びＣＤ１５４に対する蛍光色素結合抗体で染色し、そしてＴ細胞活性化をフローサイトメトリーによって監視した。代表的なＣＤ８対ＣＤ６９及びＣＤ１５４のプロット（線で画定された領域の数字は、ゲート内の相対数である）が示されている。
【図１７】図１７は、マウスＣＤ８＋  Ｔ細胞でのｓｉＲＮＡを用いたＰＴＰＮ２のノックダウンが、ＴＣＲ媒介Ｔ細胞応答の促進をもたらすことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞（１×１０７）を、Ａｍａｘａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ  Ｋｉｔを使用して１００ｎＭ  ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ、又は３０ｎＭ、１００ｎＭ、及び３００ｎＭ  ＰＴＰＮ２  ｓｉＲＮＡ、又は３０ｎＭ  ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏを用いて一晩トランスフェクトした。（Ａ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞のトランスフェクション効率を、フローサイトメトリーによってＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏ（Ｆｌｕｏｒ．Ｏｌｉｇｏ）で監視した。（Ｂ）トランスフェクト脾細胞を、プレート結合α−ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激し、そして蛍光色素結合α−ＣＤ８で染色した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによってＣａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ（商標）で定量した。図示されている結果は、指定数の複製の平均±ＳＤである。
【図１８】図１８は、ＰＴＰＮ２欠損が、養子免疫療法との関連でＨｅｒ−２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍特異的活性を促進し、かつ異種移植マウスの生存期間を延長することを示す。Ｈｅｒ−２特異的Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（α−Ｈｅｒ−２  Ｐｔｐｎ２＋／＋ＣＡＲ  Ｔ細胞）対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（α−Ｈｅｒ−２  Ｐｔｐｎ２−／−ＣＡＲ  Ｔ細胞）（１×１０７）を、Ｈｅｒ−２発現２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２肉腫細胞に感染したＣ５７ＢＬ／６ヒトＨｅｒ−２トランスジェニックマウス（各群に６匹のマウス）に養子移入し、生存を監視した。Ｈｅｒ−２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞でのＰＴＰＮ２欠損が、６匹のマウスのうちの２匹を治療した。
【図１９】図１９は、ＣＤ８＋ヒト血液リンパ球でのＰＴＰＮ２の阻害により、ＴＣＲ媒介Ｔ細胞増殖が促進されることを示す。新しく単離されたヒトＰＢＭＣ（２×１０６）を、ビヒクル対照又はＰＴＰＮ２の阻害剤、化合物８（本明細書に記載）の存在下で、プレート結合α−ＣＤ３で（Ａ）４８時間及び（Ｂ）７２時間刺激した。ＰＢＭＣを回収し、蛍光色素結合α−ＣＤ８で染色した。Ｃａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ（商標）を添加し、Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによって監視した。図示されている結果は、指定数の複製の平均±ＳＤである。
【図２０】図２０は、ＰＴＰＮ２の阻害が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＨｅｒ−２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進することを示す。Ｈｅｒ−２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ビヒクル対照又はＰＴＰＮ２の阻害剤、化合物８（本明細書に記載）の存在下で、Ｈｅｒ−２発現２４ＪＫ肉腫細胞（２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２）又は２４ＪＫ肉腫細胞（２４ＪＫ）と共に、又は培地のみでインキュベートした。細胞の活性化を、供給元の仕様書に従ったＥＬＩＳＡ（Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ，ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標））による分泌ＩＦＮγの監視によって評価した。試験は、３連で行った（±ＳＤ）。
【００３６】
［実施形態の詳細な説明］
本明細書で開示され定義される本発明は、本文又は図面に示される又は本文又は図面から明らかとなる２つ以上の個々の特徴の全ての代替の組み合わせにまで及ぶことを理解されたい。全てのこれらの異なる組み合わせが、本発明の様々な代替の態様を構成する。
【００３７】
ここで、本発明の特定の実施形態の詳細について述べる。本発明は、実施形態に関連して説明されるが、本発明がそれらの実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。むしろ、本発明は、特許請求の範囲によって定められる本発明の範囲に含まれ得る全ての代替、変更、及び等価物を包含するものとする。
【００３８】
当業者であれば、本発明の実施に使用できるであろう本明細書に記載の方法及び材料と同様又は同等の多数の方法及び材料に気付くであろう。本発明は、記載される方法及び材料に一切限定されるものではない。本明細書で開示され定義される本発明は、本文又は図面に示される又は本文又は図面から明らかとなる２つ以上の個々の特徴の全ての代替の組み合わせにまで及ぶことを理解されたい。全てのこれらの異なる組み合わせが、本発明の様々な代替の態様を構成する。
【００３９】
本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
【００４０】
本明細書を理解する上で、単数形で使用される語は、複数形も含み、逆も同様であるとする。
【００４１】
本発明者らは、特に癌免疫療法で養子細胞移入に使用される細胞の効率的な調製の方法を開発した。本発明者らは、驚くべきことに、Ｔ細胞でのＰＴＰＮ２の活性の阻害が、標的細胞を殺す能力を高めることを見出した。さらに、本発明の利点は、寛容化されるが、寛容化されない場合、例えば、腫瘍浸潤リンパ球の場合に腫瘍抗原に特異的であるため、養子細胞移入に有用であり得るＴ細胞を、再活性化させて寛容性を低下できることである。本発明の方法の更なる利点は、Ｔ細胞が、ＣＤ４＋  Ｔ細胞ヘルプの存在を必要とすることなく、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞障害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞系譜で分化できることである。
【００４２】
いかなる理論又は作用機序にも拘束されるものではないが、ＰＴＰＮ２活性の阻害により、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に変化が起き、これにより、寛容性が逆転又は回避され、代わりにＴ細胞の細胞障害性Ｔ細胞系譜での分化が促進される。例えば、ＰＴＰＮ２活性を低下させるために処置された単離ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、以下の機能のいずれか１つ以上を有することになる：増強された免疫応答が望ましいであろう抗原を有する細胞に対する細胞障害活性、維持の促進、及び／若しくは抗原の提示に対する抗原リコール応答を生じさせること、又はエフェクターＴ細胞の機能的及び／若しくは表現型特性を有すること。
【００４３】
ｅｘ  ｖｉｖｏで培養されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の癌免疫療法は、驚くべき有効性を示すことが実証されたが、このような療法は、腫瘍細胞を標的とし、一旦認識するとその腫瘍細胞を殺す能力を有する有効数のＣＤ８＋  Ｔ細胞を得ることが困難であるため、全ての患者に有効であるわけではない。本発明は、標的細胞、例えば、腫瘍細胞を殺す高い能力を有する細胞を産生する手段を提供する。
【００４４】
樹状細胞による抗原交差提示は、侵入病原体及び腫瘍抗原に対する細胞障害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のプライミング、並びに自己抗原に対する末梢寛容の仲介に極めて重要である。タンパク質チロシンホスファターゼＮ２は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞受容体のシグナル伝達を減衰させて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を調整する。本発明者らは、膵臓β−細胞抗原の交差提示後の末梢寛容の維持におけるＰＴＰＮ２の役割を調べた。ＯＶＡ特異的ＯＴＩ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６）の、膵臓β−細胞でＯＶＡを発現するＲＩＰ−ｍＯＶＡレシピエントへの導入では、ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞が同時に導入された場合は、膵島の破壊のみが起こる。本発明者らは、ＲＩＰ−ｍＯＶＡレシピエントに導入されたＰＴＰＮ２欠損ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＴＬ活性を獲得し、これによりβ細胞が破壊され、ＣＤ４＋ヘルプの非存在下で糖尿病が発症することを示している。これらの研究により、ＰＴＰＮ２は、自己抗原の交差提示後にＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を制限する末梢Ｔ細胞寛容に極めて重要なメディエーターとして同定されている。研究結果により、ＰＴＰＮ２の欠損が、寛容原性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を、膵臓β細胞の破壊を引き起ことができるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答に変換し得る機序が明らかにされている。さらに、研究結果は、Ｔ細胞媒介免疫及び／又はＴ細胞養子腫瘍免疫療法を強化するための潜在的なアプローチについての洞察を提供する。
【００４５】
自己反応性能力を有するＴ細胞の除去又は不活化は、胸腺及び抹消寛容機序の両方によって相乗的に媒介される極めて重要な作業である。自己反応性Ｔ細胞の大部分は、陰性選択；胸腺髄質細胞の末梢組織抗原を異所性に発現する能力によって促進されるプロセスにより胸腺で除去される。それでもなお、この選択をすり抜け得る少数の高い自己反応性Ｔ細胞が、後に末梢寛容機序によって除去される。
【００４６】
一連の実験により、未成熟樹状細胞（ＤＣ）が、この文脈で必須の役割を果たすことが立証された。未成熟ＤＣは、非炎症性組織から自己抗原を獲得し、これらをリンパ節に輸送し、制限されたＴ細胞の増殖を誘導して最終的に組織由来抗原に対して強く反応するＴ細胞が消失するように、これらの自己抗原を提示する。侵入病原体に対する細胞障害性Ｔリンパ球免疫応答の誘導は、感染部位の排出を行うＬＮで始まり、成熟抗原提示細胞（ＡＰＣ）による外来抗原のプロセシング及び提示を必要とする。注目すべきことに、ＣＴＬ応答の開始及び自己応答性Ｔ細胞の寛容化の両方は、ＤＣが外来抗原を得て、これらの抗原に由来するペプチドをそれら自体のＭＨＣ−１分子に導く（交差提示と呼ばれるプロセス）能力に依存する場合が多い。
【００４７】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＤＣの成熟を誘導する（Ｔ細胞ライセンスとして知られるプロセス）ことができるため、ＤＣの交差提示及びＴ細胞刺激能力に影響を与えることが分かっている。ＤＣのＴ細胞刺激能力は、強い炎症性刺激の非存在下で、特に重要であると考えられる。さらに、ＣＤ４  Ｔ細胞は、自己抗原提示ＤＣを成熟させ、これにより、これらの寛容潜在性を自己免疫促進細胞に変換することが示されている。
【００４８】
対象からの白血球、好ましくはＴ細胞の解剖学的供給源は、末梢血、腫瘍、悪性滲出液、及び排出リンパ節を含む。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質（腫瘍浸潤リンパ節）又は血液から得ることができ、かつ；抗腫瘍Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作され、混合リンパ球腫瘍細胞培養（ＭＬＴ）で濃縮される、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを用いてクローニングされる。注入に使用されるリンパ球は、好ましくはＨＬＡ適合の同種異系ドナー、又は癌を有する対象から単離することができる。一実施形態では、患者からのリンパ球、好ましくはＴ細胞は、骨髄から得られるものでも、骨髄に由来するものでもない。
【００４９】
本発明のいずれの方法でも、ＰＴＰＮ２阻害剤の存在下で培養された白血球、好ましくはＴ細胞を、細胞を得た同じ哺乳動物に導入することができる。言い換えれば、本発明の方法に使用される細胞は、自己細胞とすることができる、即ち、病状が処置又は予防される哺乳動物から得ることができる。別法では、細胞は、同種異系的に別の対象に導入することができる。好ましくは、対象の病状を処置又は予防する方法では、細胞は、対象の自己細胞である。
【００５０】
癌免疫療法を目的とするＴ細胞の１つの供給源は、例えば、モノクローナル抗体の抗原結合ドメインに由来する人工キメラ受容体を使用することであり得る。適切な細胞内シグナル伝達ドメインに結合されると、これらのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞は、腫瘍細胞標的を殺すことができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、無制限にＭＨＣに作用するという利点を有し、これにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、抗原プロセシング又は提示経路が遮断される腫瘍細胞を標的とすることができる。さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞表面のナノペプチド抗原に導かれることができ、悪性細胞で認識され得る標的構造の範囲を広げることができる。従って、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、ＭＨＣ制限細胞障害性Ｔ細胞を補完して、この細胞免疫療法の全有効性を高めることができる。
【００５１】
ナイーブＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されたペプチド抗原に結合すると、Ｔ細胞受容体のシグナル強度により、Ｔ細胞が、Ｇ１細胞周期チェックポイントを通過して細胞分化に進んだか否か、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を産生してクローン増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）／増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）されたか否か、及び分化して様々なエフェクター機能を獲得したか否かが決定される。ＴＣＲシグナル伝達は、Ｓｒｃファミリータンパク質チロシンキナーゼ、Ｌｃｋ及びＦｙｎ、並びにＳｙｋファミリーＰＴＫ  ＺＡＰ−７０によって媒介されるチロシンリン酸化に依存する。ＴＣＲの結合により、Ｌｃｋが、ＴＣＲの免疫受容体チロシン活性化モチーフをリン酸化することができ、これによりＺＡＰ−７０が動員され、養子タンパク質、例えば、ＬＡＴの活性化及びリン酸化が起こる。これにより、シグナル伝達複合体の核形成、並びに複数のエフェクター経路のリン酸化及び活性化が可能となる。ＴＣＲが結合すると、Ｌｃｋの活性化及び／又は機能が、Ｌｃｋ及びその基質の局在化、並びに免疫学的シナプス内の調節分子の存在度、活性化、及び分離によって調節される。このような調節分子は、Ｌｃｋ  Ｙ５０５阻害部位及びＬｃｋ  Ｙ３９４活性化部位のリン酸化を調節するタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）を含む。
【００５２】
ＰＴＰＮ２（Ｔ細胞ＰＴＰ、ＰＴＮ２、ＰＴＰＴ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＴＣＥＬＬＰＴＰ、及びＴＣＰＴＰとしても知られる）は、Ｔ細胞を含む造血細胞で豊富に発現される遍在ホスファターゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）である。同一のＮ末端及び触媒ドメインを有するが、Ｃ末端が異なるＴＣＰＴＰの２つのスプライス変異体：疎水性Ｃ末端によって小胞体（ＥＲ）を標的とする４８−ｋＤａ型（ＴＣ４８）及び核局在化配列によって核を標的とする４５−ｋＤａ変異体（ＴＣ４５）が発現される。静止細胞における明らかに排他的な核局在化にもかかわらず、ＴＣ４５は、両方の区画における基質にアクセスするために核と細胞質との間を往復することができる。ゲノムワイド関連解析により、ＰＴＰＮ２一塩基多型（ＳＮＰ）が、１型糖尿病、関節リウマチ、クローン病、及びセリアック病を含むいくつかのヒト自己免疫疾患の発症に関連付けられた。特に、イントロンＰＴＰＮ２変異体、ｒｓ１８９３２１７（Ｃ）は、１型糖尿病の発症に関連付けられた。このＳＮＰは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＰＴＰＮ２  ｍＲＮＡの約４０％の減少に関連している。ＰＴＰＮ２は、ナイーブＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＴＣＲシグナル伝達の重要な制御因子であり、かつＬｃｋ及びＦｙｎを脱リン酸化及び不活性化するように機能する。ＰＴＰＮ２はまた、Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ（ＪＡＫ）−１／３並びに転写のシグナル伝達物質及び活性化因子（ＳＴＡＴ）−１／３／５／６を脱リン酸化して、サイトカインシグナル伝達を減衰させる。
【００５３】
ＰＴＰＮ２阻害剤の存在がＰＴＰＮ２を阻害したか否かを決定するために、次のような実験を行うことができる：既に記載された基質としてｐ−ＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸）及びｐ−ｔｙｒ−ＲＣＭＬ（ｐ−ｔｙｒ還元型カルボキシアミドメチル化及びマレイル化リゾチーム）を用いてＰＴＰＮ２免疫沈降物中のＰＴＰＮ２活性を測定する（Ｂｕｋｃｚｙｎｓｋａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００４  Ｊｕｎ  １５；３８０（Ｐｔ  ３）：９３９−４９；  Ｔｉｇａｎｉｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  Ａｕｇ  ２２；２７２（３４）：２１５４８−５７）。別法では、フローサイトメトリー及び免疫ブロット法によるチロシンリン酸化について、ＰＴＰＮ２の既知の基質、例えば、ＳｒｃファミリーキナーゼメンバーＬｃｋ及びＦｙｎ並びに転写因子ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、及びＳＴＡＴ５の分析を行うことができる。
【００５４】
本発明に有用なＰＴＰＮ２阻害剤は、本明細書に記載の１つ以上のＰＴＰＮ２の機能を完全に又は部分的に低下させる阻害剤である。好ましくは、ＰＴＰＮ２阻害剤は、ＰＴＰＮ２のホスファターゼ活性を低下させる（例えば、小分子、ペプチド又はペプチド模倣体）、ＰＴＰＮ２遺伝子の転写活性を低下させる、又は細胞内に存在するＰＴＰＮ２  ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の量を減少させる。ＰＴＰＮ２を阻害し、かつ本発明に有用な例示的な小分子は、エチル−３，４−デホスタチン（ｄｅｐｈｏｓｐａｔｉｎ）又は化合物８である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），ＪＡＣＳ，１３１，１３０７２−１３０７９）。本発明に有用であり得る他の阻害剤は、国際公開第０３／０７３９８７  Ａ２号パンフレット；同第０３／０９７６２１  Ａ１号パンフレット；米国特許出願公開第２０１２／００８８７２０  Ａ１号明細書；米国特許第７，３９３，８６９号明細書；及び米国特許出願公開第２００６／０２３５０６１  Ａ１号明細書に記載のＰＴＰＮ２阻害活性を有する分子を含む。
【化１】
2017524348.tif 000002
エチル−３，４−デホスタチン（ｄｅｐｈｏｓｐａｔｉｎ）の化学構造
【化２】
2017524348.tif 000003
化合物８の化学構造
【００５５】
ＰＴＰＮ２の発現は、ＰＴＰＮ２の転写レベルを低下させるあらゆる手段によって減少させることができる。例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡアプローチを使用することができる。例示的なｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、以下のいずれか１つ以上の配列、又はＰＴＰＮ２若しくは３’ＵＴＲのコード配列を標的にすることによってＰＴＰＮ２の発現を減少させるのに十分な相同性を有する配列を含む。
【００５６】
例示的なｓｉＲＮＡは：
（５＝ＡＡＧＡＵＵＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＵＡＡＵＡＵＵ３＝）配列番号１；及び
（５＝ＡＡＧＣＣＣＡＵＡＵＧＡＵＣＡＣＡＧＵＣＧ３＝）配列番号１４；を含み、
かつ例示的なｓｈＲＮＡは：
ＮＭ＿００１２０７０１３．１のＰＴＰＮ２配列の５８２位で始まるＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴ−ＣＴＣＧＡＧ−ＡＡＡＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＡＴＣ−ＴＴＴＴＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２
；配列番号２のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００００２７８１；
ＮＭ＿００１２０７０１３．１のＰＴＰＮ２配列の１２７３位で始まるＴＧＣＡＡＧＡＴＡＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＴＧＣＡＡＧＡＴＡＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＡ−ＴＴＴＴＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３
；配列番号：３のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００００２７８２；
ＮＭ＿００１２０７０１３．１のＰＴＰＮ２配列の６３６位で始まるＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴ−ＣＴＣＧＡＧ−ＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＴＴＣ−ＴＴＴＴＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４
；配列番号４のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００００２７８３；
ＮＭ＿００２８２８．３のＰＴＰＮ２配列の１５４２位で始まるＧＴＧＣＡＧＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＴＣＡＡの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＧＴＧＣＡＧＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＴＣＡＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＡＣＴＧＣＡＣ−ＴＴＴＴＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５
；配列番号５のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００００２７８４；
ＮＭ＿００１２０７０１３．１のＰＴＰＮ２配列の７８１位で始まるＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＡＣＣＴの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＡＣＣＴ−ＣＴＣＧＡＧ−ＡＧＧＴＡＧＴＡＴＡＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧ−ＴＴＴＴＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６
；配列番号６のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００００２７８５；
ＮＭ＿００１２０７０１３．１のＰＴＰＮ２配列の１０６１位で始まるＡＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＴＧＧＣＴＡＴＡＡＴの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＡＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＴＧＧＣＴＡＴＡＡＴ−ＣＴＣＧＡＧ−ＡＴＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧＴＡＴＧＡＧＡＡＴ−ＴＴＴＴＴＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７
；配列番号７のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００３１４６９２；
ＮＭ＿００１２０７０１３．１のＰＴＰＮ２配列の６３５位で始まるＡＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＡＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＴＴＣＴ−ＴＴＴＴＴＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８
；配列番号８のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００３１４６０９；
ＮＭ＿００１１２７１７７．１のＰＴＰＮ２配列の２７０位で始まるＡＴＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＴＴＡＡの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＡＴＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＴＴＡＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＴＡＡＣＡＣＧＡＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＡＴ−ＴＴＴＴＴＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９
；配列番号９のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００２７９３２９；
ＮＭ＿００１２０７０１３．１のＰＴＰＮ２配列の５４０位で始まるＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＣＧＧＴＴＡＡＡの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＣＧＧＴＴＡＡＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＴＴＡＡＣＣＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣ−ＴＴＴＴＴＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０
；配列番号１０のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００３１４６１２
ＮＭ＿００１２０７０１３．１のＰＴＰＮ２配列の３５４位で始まるＴＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＴＴＡＡＡの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＴＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＴＴＡＡＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＴＴＡＡＣＡＣＧＡＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＡ−ＴＴＴＴＴＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１
；配列番号１１のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００３１４６９３
ＮＭ＿００１１２７１７７．１のＰＴＰＮ２配列の８０３１位で始まるＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＡＧＧＴＧＴＣＴＧＴＣＡＡＴＣＴＴＧＧＣ−ＴＴＴＴＴ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２
；配列番号１２のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ０００００２９８９１
ＮＭ＿００２８２８．３のＰＴＰＮ２配列の１５４２位で始まるＧＴＧＣＡＧＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＴＣＡＡの標的配列、及び
５’−ＣＣＧＧ−ＧＴＧＣＡＧＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＴＣＡＡ−ＣＴＣＧＡＧ−ＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＡＣＴＧＣＡＣ−ＴＴＴＴＴＧ−３’：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３
；配列番号１３のヘアピン配列を含むＴＲＣＮ００００３１４５５１を含む。
【００５７】
さらに、ＰＴＰＮ２の阻害は、ＰＴＰＮ２をコードする配列の全て若しくは一部を除去又は改変するゲノム編集も含み得る。例示的なゲノム編集技術はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１；Ｃｏｎｇ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９，８１９−８２３；ａｎｄ  Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ，１５２，１１７３−１１８３）。
【００５８】
ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを、ウイルスベクターを用いて関連するＴ細胞に送達することができる。ヒト遺伝子療法の適用で同定されたウイルスベクターを含め、本発明での使用に適した非常に多数の利用可能なウイルスベクターが存在する。適切なウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスをベースとするベクター、例えば、レトロウイルス由来ベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターを含み、そしてさらに複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えば、レンチウイルス由来ベクターを含む。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＮ−ｌ）由来ベクターは、この分類に属する。他の例としては、ＨＩＮ−２に由来するレンチウイルスベクター、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＮ）、ウマ感染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、及びマエディビスナウイルスが挙げられる。
【００５９】
好ましくは改変レトロウイルス、より一層好ましくは改変レンチウイルスが、特定のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを送達するために使用される。このウイルスは、殺されるべき特定の細胞を標的とするためにキメラ抗原Ｔ細胞受容体をコードする配列も含み得る。従って、ポリヌクレオチド及びあらゆる関連遺伝子要素が、プロウイルスとして宿主細胞のゲノムに組み込まれる。改変レトロウイルスは、ウイルスの作製に必要な配列並びにｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ及び／又はＣＡＲを含むウイルスベクターから、好ましくはパッケージング細胞で作製される。ウイルスベクターは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡの発現を促進する遺伝要素、例えば、プロモーター及びエンハンサー配列も含み得る。標的細胞での複製を防止するために、複製に必要な内在性ウイルス遺伝子を除去することができる。
【００６０】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＰＴＰＮ２阻害剤を含む組成物は、癌特異的抗原及び／又は細胞を殺すのを強める１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２又はＩＦＮγ）をさらに含み得る。単離、濃縮、又は精製ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む組成物中に抗原が存在する場合は、この抗原は、独立した存在物として、又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に存在するＴ細胞受容体又はＣＡＲとこの抗原が相互作用できるあらゆる関連で存在し得る。抗原が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＴＣＲと相互作用できる場合は、このＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化させることができる。抗原がＣＤ８＋  ＴＣＲによって認識され得るように抗原を組成物中に含めることができる様々な実施形態の例は、限定されるものではないが、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、又は特定の活性化された上皮細胞の表面にＭＨＣ−１に結合されて存在する抗原（又は動物モデルでの同等の提示）を含む。別法では、抗原は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＴＣＲによる抗原の認識を容易にし得るその他の天然若しくは合成分子又は他の化合物、複合体、存在物、基質などと物理的に結合することができる。例えば、抗原は、ＭＨＣ−１又は他の適切な分子と複合体を形成してこの抗原をＣＤ８＋  ＴＣＲに提示することができ、このＭＨＣ−１又は他の適切な分子は、基質、例えば、ラテックスビード、任意のプレートのプラスチック表面、又はその他の適切な基質に物理的に結合して、抗原のＣＤ８＋  Ｔ細胞ＴＣＲへの適切なアクセスを容易にすることができ、これにより、抗原がＣＤ８＋  Ｔ細胞によって認識される。
【００６１】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、Ｔ細胞表面マーカーに基づいてＴ細胞を区別して分離するルーチンの細胞選別技術を用いて得ることができ、この細胞選別技術は、本発明の組成物及び方法に使用されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の単離された集団を得るために使用することができる。例えば、血液及び／又は末梢血リンパ球を含む生物学的サンプルは、市販の装置及び試薬を用いてこのサンプルから単離された個々のＣＤ８＋  Ｔ細胞から得ることができ、これにより、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の単離された集団が得られる。マウスＣＤ８＋  Ｔ細胞は、さらなる細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ４４、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１２２、ＣＤ２７、ＣＤ４３、ＣＤ６９、ＫＬＲＧ−１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、ＩＬ−７Ｒα、及びＫＬＲＧ−１の使用によって表現型を基準にさらに特徴付け、かつ／又は単離することができる。ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ１．１＋細胞、Ｂ２２０＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＴＥＲ１１９＋細胞、Ｇｒ−１＋細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、及びＣＤ１９＋細胞の陰性選択によって最初に濃縮することができる。ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４４  ｌｏｗ、ＣＤ６２Ｌ  ｈｉｇｈ、ＣＣＲ７  ｈｉｇｈ、ＣＤ２５  ｌｏｗ、ＣＤ４３  ｌｏｗ、ＣＤ４９ｄ  ｌｏｗ、ＣＤ６９  ｌｏｗ、ＩＬ−７Ｒα  ｈｉｇｈ、及びＣＤ１２２  ｌｏｗとして特徴付けられ、抗原曝露記憶Ｔ細胞は、ＣＤ４４  ｈｉｇｈ、ＣＤ４９ｄ  ｈｉｇｈ、ＣＤ１２２  ｈｉｇｈ、ＣＤ２７  ｈｉｇｈ、ＣＤ４３  ｈｉｇｈ、及びＣＸＣＲ３  ｈｉｇｈである。記憶ＣＤ８＋ＣＤ４４  ｈｉｇｈ  Ｔ細胞は、リンパ組織常在型中心記憶Ｔ細胞（ＣＤ６２Ｌ  ｈｉｇｈ、ＣＣＲ７  ｈｉｇｈ）及び非リンパ組織常在型エフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ６２Ｌ  ｌｏｗ、ＣＣＲ７  ｌｏｗ）にさらに細分することができる（Ｋｌｏｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００４，２０：５５１−５６２）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の単離された集団は、任意の適切な容器、装置、細胞培地、システムなどでＰＴＰＮ２及び／又は抗原と混合することができ、様々な所望の細胞障害性Ｔ細胞の特徴のいずれかを有するようにＴ細胞を増殖させ、かつ／又は成熟させ、かつ／又は分化させるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、かつ／又は１つ以上の抗原及びその他の試薬又は細胞培地に曝露することができる。
【００６２】
ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞型及び／又は集団は、表現型細胞表面マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯを用いて同定することができる（Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９９，４０１：７０８−７１２）。本明細書で使用されるＣＤ８＋  Ｔ細胞型及び／又は集団は、細胞表面マーカーの発現の以下の特徴又はパターンを有する：ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＣＣＲ７＋として特徴付けられ；ＣＤ４５ＲＯ＋中心記憶Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びＣＣＲ７＋として特徴付けられ；ＣＤ４５ＲＯ＋エフェクター記憶Ｔ細胞は、これら５つのマーカー（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ２７−、ＣＤ２８−、ＣＤ６２Ｌ−、及びＣＣＲ７−）の発現の欠損によって定義され；そして最終分化したエフェクター記憶ＣＤ４５ＲＡ＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７−、ＣＤ２７−、ＣＤ２８−、ＣＤ６２Ｌ−として特徴付けられる。最終分化したエフェクター記憶細胞は、マーカー、例えば、ＣＤ５７、ＫＬＲＧ１、ＣＸ３ＣＲ１をさらに上方制御し、かつ、高レベルのグランザイムＡ及びＢ、パーフォリン、並びにＩＦＮγを産生するそれらの能力によって特徴付けられる強い細胞障害性を示す。従って、Ｔ細胞の様々な集団を、それらの発現又はこれらのマーカーの発現の欠損に基づいて他の細胞から、及び／又は互いに分離することができる。この方式では、本発明は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の異なる集団を分離する方法、及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の分離又は単離された集団も提供する。本明細書に記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞型は、当分野で公知のその他の適切な方法で単離することもでき；例えば、特定の１又は複数の抗原が、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を産生するために使用される場合は、これらの細胞は、この１又は複数の抗原を用いる親和性精製によって他の細胞から分離又は単離することができ；適切なプロトコルは当分野で公知である。
【００６３】
異なるＣＤ８＋  Ｔ細胞型はまた、例えば：ＩＦＮγの分泌；ＩＬ−２の分泌；グランザイムＢの産生；ＦａｓＬの発現；及びＣＤ１０７の発現を含む、特定の機能も示し得る。しかしながら、細胞表面マーカーの発現パターンは、本明細書に記載のそれぞれの特定のＣＤ８＋  Ｔ細胞型及び／又は集団の特徴と見なされ、それぞれの細胞型及び／又は集団の機能的属性は、細胞が受ける刺激の程度によって異なり得る。
【００６４】
Ｔ細胞のエフェクター機能又は特性は、これらのＴ細胞受容体の抗原：標的細胞上のＭＨＣ複合体との特定の結合、又はＣＡＲ  Ｔ細胞の場合は、キメラ抗原受容体、例えば、ｓｃＦｖの標的細胞上に発現される抗原との相互作用に応答してこれらが放出するエフェクター分子によって決定することができる。細胞障害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって放出され得る細胞障害性エフェクター分子は、パーフォリン、グランザイムＡ及びＢ、グラニュライシン、並びにＦａｓリガンドを含む。一般に、脱顆粒時に、パーフォリンは、それ自体が標的細胞の原形質膜の中に進入して孔を形成し、グランザイムは、アポトーシス（細胞死の形）を引き起こし得るセリンプロテアーゼであり、グラニュライシンは、標的細胞にアポトーシスを誘導し、かつＦａｓリガンドも、アポトーシスを誘導し得る。典型的には、これらの細胞障害性エフェクター分子は、放出まで細胞内の溶解性顆粒中に保存される。細胞障害性Ｔ細胞によって放出され得る他のエフェクター分子は、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−β、及びＴＮＦ−αを含む。ＩＦＮ−γは、ウイルスの複製を阻害し、マクロファージを活性化させ得る一方、ＴＮＦ−β及びＴＮＦ−αは、マクロファージの活性化及び標的細胞の殺傷に寄与し得る。本発明のいずれの方法でも、ＰＴＰＮ２阻害剤に接触された細胞の投与又は再導入の前に、これらの細胞は、グランザイムＡ及びＢ、パーフォリン、及びＩＦＮγを含む細胞障害性エフェクターＴ細胞を特定する表面及び細胞内マーカーに対する蛍光色素結合抗体を用いるフローサイトメトリーによって、それらの細胞障害活性について評価される。
【００６５】
活性化Ｔ細胞は、既にＧＯ期ではない細胞であり、１つ以上の細胞毒、サイトカイン、及び／又は本明細書に記載の細胞型（例えば、ＣＤ８＋）に特徴的な他の膜関連マーカーを産生し始め、かつ特定のペプチド：その表面のＭＨＣ複合体又は抗原のみを提示し、そのエフェクター分子を放出するあらゆる標的細胞を認識して結合することができる。
【００６６】
Ｔ細胞の細胞障害性Ｔ細胞の集団への分化を促進する本発明の方法は、細胞障害性Ｔ細胞の集団の統計的に有意な増加をもたらす。集団は、適切な対照、例えば、本発明の方法での処置前の集団のサイズなどに対して、細胞が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％多い量で存在する場合は増加している。細胞障害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のエフェクター機能は、適切な対照、例えば、特定の事象又は条件の非存在下での特定のアッセイにおける細胞のサンプルの能力などに対して、細胞が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以上の機能を有する場合は増加している。必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏ機能又は存在を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで対象から単離された細胞を用いて測定することができる。
【００６７】
細胞の「濃縮された」又は「精製された」集団は、例えば、対象の体内に見られる細胞と比較した、又はＰＴＰＮ２阻害剤への曝露前の比率と比較した、特定の細胞の他の細胞に対する比率の増加である。一部の実施形態では、細胞の濃縮された又は精製された集団において、特定の細胞は、全細胞集団の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、又は９９％を含む。細胞の集団は、１つ以上の細胞の表面マーカー及び／又は特性によって定義することができる。
【００６８】
本明細書に記載の細胞障害性Ｔ細胞の少なくとも１つの特性を示すＰＴＰＮ２阻害剤に曝露又は接触されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、対象に投与されると、腫瘍細胞に対して細胞障害性Ｔ細胞応答を引き起こす。好ましくは、腫瘍細胞に対するこのＣＴＬ応答は、標的抗原を有する腫瘍細胞の細胞死、例えば、溶解の誘発に有効である。ＰＴＰＮ２阻害剤に曝露又は接触されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を、例えば、注射、注入、塗布、植え込み、経口摂取、又は局所投与、又はこれらの任意の組み合わせを含む任意の方法によって対象に与えることができる。注射は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内であり得る。過度の実験なしで当業者が決定することができる、癌、その重症度、及び対象の全体的な健康状態によって決まる所与の期間に亘って、単回又は複数回の投与を行うことができる。注射は、複数の部位で行うことができる。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の投与は、単独としても良いし、又は他の治療薬と組み合わせても良い。各用量は、約１０×１０３のＣＤ８＋  Ｔ細胞、２０×１０３の細胞、５０×１０３の細胞、１００×１０３の細胞、２００×１０３の細胞、５００×１０３の細胞、１×１０６の細胞、２×１０６の細胞、２０×１０６の細胞、５０×１０６の細胞、１００×１０６の細胞、２００×１０６、５００×１０６、１×１０９の細胞、２×１０９の細胞、５×１０９の細胞、及び１０×１０９の細胞などを含み得る。投与頻度は、例えば、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回、及び６か月に１回などであり得る。投与が行われる合計日数は、１日、２日、又は３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、又は２０日などであり得る。所与の投与は、同じ日に２回以上の注射を伴うこともあることを理解されたい。投与のために、投与されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％が、細胞障害性Ｔ細胞の少なくとも１つの特性を示す。
【００６９】
本明細書は、特にヒトでの適用について述べるが、本発明は、動物用にも有用であることを明確に理解されよう。従って、全ての態様において、本発明は、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ウマ、及び家禽；ペット、例えば、ネコ及びイヌ；並びに動物園の動物に有用である。従って、「対象」又は「処置されるべき／処置される対象」という一般的な語は、増強された免疫応答を必要とする全ての動物（例えば、ヒト、類人猿、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシ）、例えば、癌を有する対象を含むことを理解されよう。
【００７０】
本明細書で使用される「ｅｘ  ｖｉｖｏ」又は「ｅｘ  ｖｉｖｏ療法」という語は、細胞が、患者又は適切な代替の供給源、例えば、適切な同種異系ドナーから得られ、そして改変され、これにより、改変された細胞を使用して疾患を処置することができ、この疾患が、改変された細胞によってもたらされる治療効果によって改善される療法を指す。処置は、改変された細胞の患者への投与又は再導入を含む。ｅｘ  ｖｉｖｏ療法の恩恵は、処置による不所望の副作用に患者が曝されずに患者に処置の恩恵を与える能力である。
【００７１】
「投与された」という語は、それぞれの細胞を含む、治療有効量の上述の組成物の個人への投与を意味する。「治療有効量」とは、投与されると効果をもたらす用量のことである。正確な用量は、処置の目的により、公知の技術を用いて当業者が確認することができる。当分野で公知であり、上記記載のように、全身送達か局所送達かの調整、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び状態の重症度が必要であり得、これらは、当業者によるルーチンの実験によって確認することができる。
【００７２】
処置を必要とする対象は、良性の前癌状態の又は非転移性の腫瘍、並びに癌の発生又は再発が防止される腫瘍を既に有する対象を含む。対象は、腹水及び／又はリンパ節に存在する転移性細胞を含む転移性細胞を有し得る。
【００７３】
処置の目的又は結果は、癌細胞の数を減少させること；原発腫瘍のサイズを縮小させること；癌細胞の末梢器官への浸潤を抑制する（即ち、ある程度まで遅くする、好ましくは停止する）こと；腫瘍の転移を抑制し（即ち、ある程度まで遅くする、好ましくは停止し）、腫瘍の成長をある程度まで抑制すること；及び／又は障害に関連した１つ以上の症状をある程度まで軽減することであり得る。
【００７４】
処置の効果は、生存期間、疾患の進行までの時間、奏功率（ＲＲ）、応答期間、及び／又は生活の質を評価することによって測定することができる。
【００７５】
本方法は、疾患の進行までの時間を延ばすのに特に有用である。
【００７６】
本方法は、全生存期間及び無進行生存期間を含むヒトの生存期間を延ばすのに特に有用である。
【００７７】
本方法は、癌の全ての兆候が処置に応答して消失する、治療に対する完全な応答を提供するのに特に有用である。これは、必ずしも癌が治癒したことを意味するものではない。
【００７８】
本方法は、処置に応答して１つ以上の腫瘍若しくは病変のサイズ又は体内の癌の範囲が縮小する、治療に対する部分的な応答を提供するのに特に有用である。
【００７９】
処置の目的又は結果は、以下のずれか１つ以上であり得る：
・癌細胞の数を減少させること；
・原発腫瘍のサイズを縮小させること；
・癌細胞の末梢器官への浸潤を抑制する（即ち、ある程度まで遅くし、好ましくは停止する）こと；
・腫瘍の転移を抑制する（即ち、ある程度まで遅くし、好ましくは停止する）こと；
・腫瘍の成長をある程度まで抑制すること；
・障害に関連した１つ以上の症状をある程度まで軽減すること。
【００８０】
一実施形態では、処置を必要とする動物は、良性の前癌状態の非転移性腫瘍を有する動物を含む。
【００８１】
一実施形態では、癌は、前癌状態又は前新生物である。
【００８２】
一実施形態では、癌は、二次癌又は転移癌である。二次癌は、あらゆる器官又は組織、特に、比較的高い血行力学的圧力を有する器官又は組織、例えば、肺、肝臓、腎臓、脾臓、腸、及び脳に存在し得る。二次癌は、腹水及び／又はリンパ節で検出され得る。
【００８３】
一実施形態では、癌は、実質的に検出不可能であり得る。
【００８４】
「前癌状態」又は「前新生物状態（ｐｒｅ−ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」は、一般に、典型的には癌に進行する又は癌を発症する状態又は成長を指す。「前癌状態」の成長は、細胞周期のマーカーによって決定することができる異常な細胞周期の調節、増殖、又は分化によって特徴付けられる細胞を含み得る。
【００８５】
一実施形態では、癌は、前癌状態又は前新生物である。
【００８６】
一実施形態では、癌は、二次癌又は転移癌である。二次癌は、あらゆる器官又は組織、特に、比較的高い血圧を有する器官又は組織、例えば、肺、肝臓、腎臓、脾臓、腸、及び脳に存在し得る。
【００８７】
一実施形態では、癌は、細胞表面腫瘍抗原Ｈｅｒ−２を発現する。細胞表面腫瘍抗原Ｈｅｒ−２を発現する癌の一例として肉腫が挙げられる。
【００８８】
癌の他の例として、芽細胞腫（髄芽腫及び網膜芽腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫及び滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ及び膵島細胞癌を含む）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、白血病又はリンパ性悪性疾患、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、肺表皮癌（ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌（転移性乳癌を含む）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、並びに頭頚部癌が挙げられる。
【００８９】
前新生物、新生物、及び転移性疾患は、本発明の方法を適用することができる特定の例である。広い例として、乳房腫瘍、大腸腫瘍、腺癌、中皮腫、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、胚細胞腫瘍、肝癌／コロンジオ（ｃｈｏｌｏｎｇｉｏ）、癌腫、神経内分泌腫瘍、下垂体腫瘍、小円形細胞腫瘍、扁平上皮癌、黒色腫、非定型的線維黄色腫、精上皮腫、非精上皮腫、間質ライディッヒ細胞腫、セルトリ細胞腫、皮膚腫瘍、腎腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍、口腔腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍、頸部腫瘍、食道腫瘍、喉頭腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、膣腫瘍、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
【００９０】
特定の癌の他の例として、限定されるものではないが、腺癌、腺腫、腺線維腫、腺リンパ腫、アドントーマ（ａｄｏｎｔｏｍａ）、ＡＩＤＳ関連癌、聴神経腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢癌腫、副腎皮質癌、原発性骨髄線維症、脱毛症、胞状軟部肉腫、エナメル上皮腫、角化血管腫、好酸球性血管リンパ球増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、アプドーマ、肛門癌、血管肉腫、再生不良性貧血、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調、基底細胞癌（皮膚）、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳幹神経膠腫、脳及びＣＮＳ腫瘍、乳癌、鰓腫、ＣＮＳ腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、小児期脳腫瘍、小児期癌、小児期白血病、小児期軟部組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、癌腫（例えばウォーカー癌、基底細胞癌、基底扁平上皮細胞癌、ブラウン・ペアス癌、腺管癌、エーリッヒ腫瘍、クレブス２癌、メルケル細胞癌、ムチン様癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭様癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮細胞癌、及び移行性細胞癌）、癌肉腫、子宮頚部異形成、葉状嚢肉腫、セメント腫、脊索腫、分離腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、胆管細胞腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、隆起性皮膚繊維肉腫、繊維形成性小円形細胞腫、腺管癌、未分化胚細胞腫、内分泌癌、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、眼：黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、ファンコーニ貧血、繊維腫、繊維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、消化管カルチノイド腫瘍、尿生殖器癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛疾患、神経膠腫、婦人科癌、巨細胞腫、神経節神経腫、神経膠腫、グロムス血管腫、顆粒層細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、血液学的悪性疾患、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺伝性乳癌、組織球増殖症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭癌、過誤腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血管肉腫、組織球障害、組織球増殖性悪性疾患、組織球腫、肝細胞腫、汗腺腫、ホンドロ肉腫（ｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）、免疫増殖性小（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ）、オポーマ（ｏｐｏｍａ）、オントラオーキュラー黒色腫（ｏｎｔｒａｏｃｕｌａｒｍｅｌａｎｏｍａ）、島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭癌、平滑筋肉腫、白血病、リ・フラウメニ症候群、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ水腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、レイゴミオ肉腫（ｌｅｉｇｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、白血病（例えばＢ細胞、混合細胞、ヌル細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞慢性、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連、リンパ管肉腫、リンパ球性急性、リンパ球性慢性、肥満細胞、及び骨髄性）、白血肉腫、ライディッヒ細胞腫、脂肪肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、リンパ管腫、リンパ管細胞腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、男性乳癌、悪性腎横紋筋肉腫様腫瘍、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性癌、口腔癌、多発性内分泌腺腫症、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性障害、悪性カルチノイド症候群カルチノイド心疾患、髄芽細胞���、髄膜腫、黒色腫、間葉細胞腫、中腎腫、中皮腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、粘液腫、粘液肉腫、鼻腔癌、鼻咽頭癌、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫症、ナイメーヘン染色体不安定症候群、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫症、神経繊維腫、神経腫、新生物（例えば、骨、乳房、消化系、結腸直腸、肝臓）、眼癌、食道癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、造瘻術卵巣癌、膵臓癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、耳下腺癌、陰茎癌、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体癌、真性赤血球増加症、前立腺癌、骨腫、骨肉腫、卵巣癌、乳頭腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、松果体腫、形質細胞腫、癌原遺伝子、稀な癌及び関連疾患、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロートムント・トムソン症候群、細網内皮症、横紋筋腫、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌（ｓｃｌｃ）、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、扁平上皮癌（皮膚）、胃癌、滑膜肉腫、肉腫（例えば、ユーイング実験的肉腫、カポジ肉腫、及び肥満細胞肉腫）、セルトリ細胞腫、滑膜腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌（膀胱）、移行上皮癌（腎盂／尿管）、栄養膜癌、奇形腫、卵胞膜細胞腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍、尿道癌、尿路系癌、ウロプラキン（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ）、子宮肉腫、子宮癌、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
【００９１】
本明細書で開示され定義される本発明は、上述又は本文若しくは図面から明らかとなる２つ以上の個々の特徴の全ての代替の組み合わせにまで及ぶことを理解されたい。全てのこれらの異なる組み合わせが、本発明の様々な代替の態様を構成する。
【００９２】
［実施例１］
［マウス］
Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（Ｃ５７ＢＬ６）、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（Ｃ５７ＢＬ６）、及びＲＩＰ−ｍＯＶＡ（Ｃ５７ＢＬ６）を、餌及び水を自由に摂取できる状態の温度が制御されたハイバリア設備内で１２時間の明暗サイクルで維持した。６〜１０週齢の雌レシピエントマウス及び３〜６週齢の雄又は雌ドナーマウスを養子移入に使用した。ｅｘ  ｖｉｖｏ実験では、雄又は雌マウスのいずれかを使用した；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＬｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ又は対応するＯＴ−１マウスは性別を合わせた。Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＬｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウス及び対応するＯＴ−１  ＴＣＲトランスジェニックマウスは既に説明した（Ｗｅｉｄｅ  ＦＷ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．）。ＲＩＰ−ｍＯＶＡトランスジェニックマウス（Ｋｕｒｔｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８４（３）：９２３−９３０．）は、Ｂｉｌｌ  Ｈｅａｔｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から提供された。
【００９３】
［材料］
組換えマウスＩＬ−２をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入した。ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ハムスターα−マウスＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）、α−マウスＣＤ２８ε（３７．５１）、及びＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＦｏｘＰ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ及びＣｅｌｌ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（及びタンパク質輸送阻害剤）をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）及び１６４０  ＲＰＭＩをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【００９４】
［フローサイトメトリー］
切除されたばかりのＬＮの単一細胞懸濁液を、既に記載されたフローサイトメトリーにかけた（Ｗｅｉｄｅ  ＦＷ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．）。表面染色では、細胞（１×１０６／１０μｌ）をＤ−ＰＢＳ／２％  ＦＢＳに懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、氷上で２０分間染色した。選別では、細胞を、１５ｍｌファルコンチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ／２％  ＦＢＳで再懸濁し、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析する、又はＩｎｆｌｕｘ  ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。精製されたＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ  Ｔ細胞を、純度（９９％超）についてルーチン的に試験した。データをＦｌｏｗＪｏ７（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いて分析した。
【００９５】
［抗体］
ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からの次の抗体を染色に使用した：フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合又はＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０結合α−ＣＤ４４（ＩＭ７）、フィコエリトリン（ＰＥ）結合又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合α−ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、パシフィック・ブルー結合又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合α−ＣＤ８（５３−６．７）、ＰＥ結合α−ＣＤ２５（ＰＣ６１）、ＰＥ結合ＴＣＲ−Ｖα２（Ｂ２０．１）、ＰＥ結合ＴＣＲ−Ｖβ５．１／５．２（ＭＲ９−４）、及びＰＥシアニン染料７（Ｃｙ７）α−ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）。ＰＥ結合α−ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）及びＦＩＴＣ結合グランザイムＢ（ＧＢ１１）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【００９６】
［ＣＴＬ活性の評価］
３〜４週齢のＯＴ−１マウスのナイーブＣＤ８＋（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）ＬＮ  Ｔ細胞（２０×１０５）をＦＡＣＳによって精製し、これを、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスの尾静脈に静脈注射した。移入から９日後に、脾臓ＬＮを回収してホモジナイズした。細胞を１６４０  ＲＰＭＩ  ｃｏｍｐｌｅｔｅで再懸濁し、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ［ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｃｙｉｎ）、ブレフェルジン、及びモネンシンを含む］で、３７℃で５時間刺激した。細胞を固定し、製造者の取扱説明書に従ってＦｏｘＰ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔで透過処理した。細胞を、ＣＤ８、ＴＣＲ−Ｖα２、ＴＣＲ−Ｖβ５、ＩＦＮγ、及びグランザイムＢに対する蛍光色素結合抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【００９７】
［疾患の評価及び組織学］
ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスにおける糖尿を、Ｄｉａｓｔｉｘ（Ｂａｙｅｒ）を用いて監視し、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ  ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて血糖値を測定した。２日違いの２つの陽性測定値（尿糖≧５５ｍｍｏｌ／ｌ）後にマウスを糖尿病として評点した。膵臓を摘出して、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。膵臓切片を、既に記載されたインスリン又はグルカゴンについて染色した（Ｍｅｒｒｙ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）高脂肪食を与えられた肥満Ｇｐｘ−１欠損マウスは、不完全なインスリン分泌を示すが、肝脂肪変性及び肝臓の損傷から保護されている（Ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｆｅｄ  ｏｂｅｓｅ  Ｇｐｘ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｄａｍａｇｅ）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆ｒｅｄｏｘ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）膵臓切片の盲目組織学的分析を行ってインスリンの程度を決定した（グレード０〜４）。グレード０は、非浸潤を表し、グレード１は、単核細胞の膵管集積を表し、グレード２は、単核細胞の周囲集積を表し、グレード３は、膵島内浸潤を表し、そしてグレード４は、重度の構造的障害及びβ細胞の完全な消失を表す。全ての膵島は、１００μｍ離れた３つの切片から評点した。グレード０〜４の膵島の割合はそれぞれ、評点された膵島の総数のパーセンテージとして決定され示された。
【００９８】
［ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスへの養子移入］
ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスにおけるＩ型糖尿病の導入のために、３〜４週齢のＯＴ−１マウスからの２．５×１０５、８×１０５、又は２０×１０５のＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏナイーブＬＮ  Ｔ細胞をＦＡＣＳで精製し、これをＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスの尾静脈に静脈注射した。ＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞ドナー細胞を、ＣＤ８＋及びＴＣＲ−Ｖα２＋ＴＣＲ−Ｖβ５＋細胞のゲーティングによって同定した。ＯＴ−１マウスからのＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏナイーブＬＮ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖反応を評価するために、３〜４週齢のマウスからの２×１０６のＣＦＳＥ染色細胞を、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスの尾静脈に静脈内導入した。増殖性ドナーＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞を、ＣＤ８＋及びＴＣＲ−Ｖα２＋  ＣＦＳＥ＋細胞のゲーティングによって同定した。
【００９９】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激］
ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１又は非トランスジェニックマウスからのＣＦＳＥ染色又は非染色ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏナイーブＬＮ  Ｔ細胞（１×１０５／ウェル）を、９６ウェル丸底プレートにおいて０．１μｇ／ｍｌ  ＳＩＩＮＦＥＫＬで３６時間、又はプレート結合α−ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。活性化状態を決定するために、細胞を回収し、α−ＣＤ２５、α−ＣＤ４４、及びα−ＣＤ６９に対する蛍光色素結合抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１００】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏアポトーシス］
ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１マウスからのＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏナイーブＬＮ  Ｔ細胞（２×１０５／ウェル）を、９６ウェル丸底プレートにおいて１μｇ／ｍｌ  ＳＩＩＮＦＥＫＬで１８時間刺激した。細胞を回収し、ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。定量のために、Ｃａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をウェルに添加してから細胞を回収した。細胞を、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）−、アネキシンＶ−（生）、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）−アネキシンＶ＋（アポトーシス）、及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）＋アネキシンＶ＋（壊死）として分類した。
【０１０１】
［エフェクター／記憶Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生］
ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏナイーブＬＮ  Ｔ細胞（１×１０５／ウェル）を、９６ウェル丸底プレートにおいて、既に記載されたプレート結合α−ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で刺激した（Ｗｅｉｄｅ  ＦＷ（２０１３）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．）。刺激の４８時間後に、細胞を回収し、洗浄し、細胞数をカウントし、０．５×１０５の細胞／ウェルを、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８の存在下で、平底９６ウェルプレートでマウスＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ＩＬ−２の投与から２日後及び４日後に、細胞をＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌに対する蛍光色素結合抗体で染色し、エフェクター／記憶Ｔ細胞の産生を、フローサイトメトリーによってＣａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で定量した。
【０１０２】
［ＣＦＳＥ染色］
ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）希釈によるＴ細胞の増殖の評価のために、リンパ球（１×１０７／ｍｌ）を、０．１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡが添加されたＤ−ＰＢＳで再懸濁した。ＣＦＳＥを５μＭの最終濃度で添加し、細胞を、室温で５分間インキュベートした。次いで、細胞を、養子移入又はｉｎ  ｖｔｉｒｏ刺激の前に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤ−ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１０３】
［統計分析］
統計分析を、２−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  Ｔｅｓｔを用いるノンパラメトリックを使用するＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで行った。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定法での統計分析を、自由度が１のＬｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）試験を用いて行った。両方の試験では、ｐ＜０．０５は有意とみなした。
【０１０４】
［動物倫理］
全ての実験は、ＮＨＭＲＣ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓに従って行った。全てのプロトコルは、Ｍｏｎａｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された（Ｅｔｈｉｃｓ  ｎｕｍｂｅｒ：  ＭＡＲＰ／２０１２／１２４）。
【０１０５】
［実施例２］
［ＰＴＰＮ２欠損ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ｈｅｌｐの非存在下でＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスの１型糖尿病を促進する］
ＣＤ８＋  Ｔ細胞の交差プライミング（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）におけるＰＴＰＮ２欠損の結果及び自己免疫性糖尿病の発症を調べるために、本発明者らは、ＲＩＰｍＯＶＡマウスを利用した（Ｋｕｒｔｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８４（３）：９２３−９３０．）。ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスは、膵臓のβ細胞及び腎臓の腎近位尿細管細胞で膜結合型のオボアルブミン（ＯＶＡ）を発現する（Ｋｕｒｔｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８４（３）：９２３−９３０．）。しかしながら、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスでの「自己」としてのＯＶＡの胸腺発現は許容される。ＯＴ−Ｉマウスは、ＣＤ８＋単一陽性共線細胞を選択するＯＶＡペプチド２５７ＳＩＩＮＦＥＫＬ２６４（ＫｂクラスＩ  ＭＨＣとの関連で提示される）に特異的なＶα２／Ｖβ５  ＴＣＲを発現する（Ｈｏｇｑｕｉｓｔ  ＫＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７６（１）：１７−２７．）。ナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のみのＲＩＰ−ｍＰＶＡマウスへの養子移入により、「自己反応性」ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の交差提示及び除去が起こる。この交差寛容のプロセスは、ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の共移入によって阻害され、交差プライミングが起こり、β細胞が破壊され、そして１型糖尿病が発症する。以前の研究により、寛容及び１型糖尿病の消失は、Ｒａｇ１−／−背景の多数のＯＴ−ＩドナーＴ細胞の移入によっても引き起こされ得るが、Ｃ５７ＢＬ／６背景のＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞を利用する後の研究により、それ自体のナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、［たとえ、１０×１０６のＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の移入後でも］１型糖尿病を引き起こさないことが分かった。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の交差プライミング及び１型糖尿病の発症に対するＰＴＰＮ２欠損の影響を評価するために、Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＬｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスを、ＯＴ−Ｉ  ＴＣＲトランスジェニック背景で交配した。ナイーブ（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）ＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＲＩＰ−ｍＯＶＡレシピエントに移入して、糖尿病（尿糖＞５０ｍＭ）の発症及び生存を監視した。予想通り、２．５〜８×１０５のＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対照ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取ったマウスは、７０日が経過しても糖尿病／病的状態の一切の兆候を示さず（図１）、末梢寛容の誘導に一致していた。対照的に、８×１０５のＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取ったマウスは、早くも移入から７日後に尿糖値の上昇及び糖尿病を示し、マウスの１００％が、養子移入から１４日以内に重度の脱水症になった（図１  ａ）。
【０１０６】
同様に、４×１０５のＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取った７匹のマウスのうちの４匹は、移入から１５日後までに高血糖及び糖尿／糖尿病を示し（図１  ｂ）、２．５×１０５のＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取った６匹のマウスのうちの４匹は糖尿を示した（図１  ｃ）。移入から１１日後の組織学的分析［ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色］により、８×１０５のＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取ったマウスの糖尿病の発症が、破壊的な膵島炎を伴い、多数の濃縮した核の存在が、残遺膵島の閉塞性病変の近傍の細胞アポトーシス及び著しい免疫細胞の浸潤に一致していることが明らかになった（図２  ａ）。免疫組織化学的分析により、β細胞及び膵島の破壊に一致して、膵島残遺におけるグルカゴン染色の減少と共にインスリン染色が著しく減少したことが明らかになった（図２  ｂ）。対照的に、ＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対照ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取ったマウスは、膵島の２０％のみが破壊的な膵島炎を示し、残りの膵島は、膵島周囲炎又は非浸潤のいずれかを示した（図２）。ＰＴＰＮ２  ＳＮＰと１型糖尿病との関連から、本発明者らは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の交差プライミング及び１型糖尿病の発症に対するＰｔｐｎ２ヘテロ接合性の影響も評価した。８×１０５のＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／＋又はＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＲＩＰ−ｍＯＶＡレシピエントに移入し、糖尿病の発症を監視した。ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取った１２匹のマウスのうちの４匹が、移入から２０日後までに著しい糖尿／糖尿病を示した［ｐ＜０．０５；Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）試験］（図３）。ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取って糖尿病を発症したマウスの移入から２０日後の組織学的評価により、これが、ＯＴ−Ｉ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取ったマウスの２０％と比較して、調べた膵島の５０％超で破壊的な膵島炎に関連していることが明らかになった（図３）。従って、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるホモ接合性又はヘテロ接合性ＰＴＰＮ２欠損は、ＣＤ４＋ｈｅｌｐの非存在下で、寛容の低下をもたらし、β細胞が破壊され、そして自己免疫性糖尿病が発症する。
【０１０７】
［ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスにおけるＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の初期増殖は、ＰＴＰＮ２欠損によって影響されない］
ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスの膵臓及び腎臓の排出リンパ節で交差提示されると、これらは、初期増殖され、次いで寛容化されて除去される。本発明者らは、ＰＴＰＮ２欠損ＣＤ８＋  Ｔ細胞の養子移入に関連した自己免疫性糖尿病の促進が、増殖反応の増強に関係し得るか否かを最初に決定した。ＣＦＳＥ標識ナイーブ（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）ＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＯＴＩ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（２×１０６）をＲＩＰ−ｍＯＶＡレシピエントに移入し、３日後にＣＦＳＥ希釈により細胞増殖を評価した（図４）。細胞増殖を、膵臓、腎臓、及び鼠径部ＬＮに存在するＴ細胞で評価した。細胞増殖において有意差がないことが、膵臓及び腎臓を排出するＬＮにおけるＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞；３日後に同様の数に分裂したＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞から明らかになった（図４）。ＯＶＡの発現を膵臓及び腎臓に制限し続けることにより、本発明者らは、鼠径部ＬＮにおける明確なＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を一切検出しなかった（図４）。従って、ＰＴＰＮ２欠損に関連した寛容性の低下及び自己免疫性糖尿病の発症は、増殖反応の増強が原因ではあり得ない。
【０１０８】
［ＰＴＰＮ２欠損は、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を分化させる］
次に、本発明者らは、ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスへの移入後に明らかになる自己免疫性糖尿病が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８＋  Ｔ細胞の産生の促進に関連し得るか否かを決定した。ナイーブ（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）ＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（８×１０５）をＲＩＰ−ｍＯＶＡに移入し、そしてＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏエフェクター／記憶Ｔ細胞の産生を、膵臓及び鼠径部ＬＮで評価した。１１日後に、本発明者らは、ＰＴＰＮ２欠損が、膵臓ＬＮにおけるＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数及びＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ  ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋エフェクター／記憶Ｔ細胞の総数の両方を増加させたが、鼠径部ＬＮでは増加させなかったことを見出した（図５  ａ〜ｂ）。興味深いことに、鼠径部ＬＮでは、恐らく、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の膵臓への移動の結果として、ＰＴＰＮ２欠損ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数が減少した。これらの結果は、膵臓ＬＮでの交差プライミング後に、ＰＴＰＮ２欠損が、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋エフェクター／記憶Ｔ細胞の産生を促進することに一致している。ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞がＣＴＬ活性を示したか否かを決定するために、本発明者らは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を殺すのに重要な２つのタンパク質であるインターフェロン（ＩＦＮ）γ及びグランザイムＢのレベルを測定した。ＯＴ−Ｉ  ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ナイーブＯＴ−Ｉ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受け取ったＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスの膵臓ＬＮから単離し、そしてＩＦＮγ及びグランザイムＢのレベルを、ＰＭＡ／イオノマイシンでの短い再刺激後に細胞内染色によって評価した（図５  ｃ）。ＰＴＰＮ２欠損は、ＣＤ８＋  ＣＴＬを産生させた（図５  ｃ）。ＩＦＮγのレベルは、ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  Ｔ細胞で２倍に上昇した（図５  ｃ）。さらに、グランザイムＢは、ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞では明確であったが、ＯＴ−Ｉ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対照Ｔ細胞では明確ではなく（図５  ｃ）、ＯＴ−Ｉ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対照Ｔ細胞が寛容化されることに一致している。総合すると、これらの結果は、自己抗原の交差提示後に、ＰＴＰＮ２欠損が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分化を促進し、ＣＴＬを産生させることに一致している。
【０１０９】
［ＰＴＰＮ２欠損は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原誘導ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化及びＩＬ−２媒介分化を促進する］
ＰＴＰＮ２欠損は、ＴＣＲ誘導増殖の閾値を下げ、これにより、ナイーブＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞が、低濃度の同種ペプチド抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬ、又はＴＣＲ親和性が最適以下である変更されたペプチドリガンドに曝露されると増殖が促進される。しかしながら、ＰＴＰＮ２欠損は、高濃度ＳＩＩＮＦＥＫＬに応答したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖は促進しない。ＰＴＰＮ２欠損が、増殖と無関係にＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を促進し得るか否かについて決定するために、本発明者らは、ＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌナイーブ（ＣＤ４４ｌｏ）ＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞を、飽和濃度のＳＩＩＮＦＥＫＬ（０．１μｇ／ｍｌ）で３６時間刺激した（図６）。固着されたクラスＩ  ＭＨＣによって提示されるペプチドによって誘導されるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞によって自己提示される溶出ペプチドが主な原因であり得るため、本発明者らは、ペプチドを培養上清に直接添加した。ＰＴＰＮ２欠損は、高濃度のＳＩＩＮＦＥＫＬに曝露されたＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を変更しなかった（３６時間後のＣＦＳＥ希釈によって評価される）（図６  ａ）。さらに、ＰＴＰＮ２欠損は、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存期間を変更しなかった（アネキシンＶ染色によって評価される）（図６  ｂ）。他方、ＣＤ６９及びＩＬ−２受容体α（ＣＤ２５）サブユニットの細胞表面の発現の監視、並びにフローサイトメトリーによる芽球化（細胞のサイズ）によって評価されるＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化は、ＰＴＰＮ２欠損によって著しく促進された（図６  ｃ）。さらに、細胞表面ＣＤ４４の発現レベルは、分化したＣＤ８＋  Ｔ細胞に一致して増加した（図６  ｃ）。
【０１１０】
ＰＴＰＮ２欠損が、ＴＣＲ誘導ＣＤ２５の発現の促進し、以前の研究が、ＰＴＰＮ２のＩＬ−２−誘導ＳＴＡＴ５シグナル伝達を減衰させる能力を明らかにしていることから、本発明者らは、ＣＤ８＋  エフェクターＴ細胞のＩＬ−２誘導分化に対するＰＴＰＮ２欠損の影響を評価した。ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＤ２８の同時刺激と共に強い刺激で培養し、次いでこの刺激を除去してＩＬ−２と共にインキュベートすると、これらのＴ細胞は、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ  Ｔ細胞に分化し、グランザイムＢ及びＩＦＮγの発現によって特徴付けられるＣＴＬ活性を獲得する。Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＬｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブ（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、飽和濃度のプレート結合α−ＣＤ３ε（１０μｇ／ｍｌ）とα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激し、次いで刺激を除去して２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で２〜４日間培養し、そしてＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの細胞表面の発現を決定した（図７）。これらの飽和濃度のα−ＣＤ３ε／α−ＣＤ２８では、ＰＴＰＮ２欠損は、増殖（ＣＦＳＥ希釈によって評価される）にも細胞表面のＣＤ４４の増加にも影響を与えないが（図７  ａ〜Ｂ）、少量ではあるが、ＴＣＲ媒介活性化の促進に一致してＣＤ２５及びＣＤ６９が増加した（図７  ｂ）。しかしながら、ＰＴＰＮ２欠損は、ＩＬ−２刺激の後にＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏである細胞の数を著しく増加させた（図７  ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞のＴＣＲ及びＩＬ−２媒介分化を誘導するＰＴＰＮ２欠損に一致している。
【０１１１】
ＲＩＰ−ｍＯＶＡモデル及び「高親和性」ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を用いた以前の研究により、組織特異的抗原を、対応する排出ＬＮに存在するＤＣによってナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞に対して構成的かつ選択的に提示し、Ｔ細胞の活性化を制限して寛容を促進することができることが立証された。続く研究により、これが、低親和性から中程度の親和性のＴＣＲを発現するポリクローナルＴ細胞にも当てはまることが立証された。しかしながら、ＣＤ４＋  Ｔ細胞からのヘルプの非存在下で、交差提示されるＣＤ８＋  Ｔ細胞がクローン欠失を受けて、寛容を維持する。このような交差寛容は、ＴＣＲのシグナル伝達を調整して、Ｔ細胞の応答をそれ自体に制限するＴ細胞固有の機序によって少なくとも部分的に誘導することができる。この研究では、本発明者らは、ＲＩＰ−ｍＯＶＡモデル及びＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞を使用して、ホスファターゼＰＴＰＮ２が、交差提示される内在性抗原であるＣＤ８＋  Ｔ細胞の寛容に役立つことを立証した。
【０１１２】
ＰＴＰＮ２のレベルは、ＴＣＲ親和性（ＣＤ５のレベルによって監視される）に直接相関してＰＴＰＮ２で増加する、胸腺を離れるナイーブＴ細胞で上昇し、これにより、リンパ球減少に関連した自己抗原に対してより強く応答する親和性の高いＴ細胞がＰＴＰＮ２を増加させた。ＰＴＰＮ２の非存在下で、リンパ球減少環境で急速にＴＣＲ媒介増殖されたナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞が、抗原曝露エフェクター細胞の特徴を獲得して、自己免疫の発達を促進する。この研究では、本発明者らは、ＰＴＰＮ２欠損が、β細胞自己抗原によるＣＤ８＋  Ｔ細胞の交差プライミングを可能にして寛容を回避してＣＴＬ活性を獲得し、従ってβ細胞の破壊及び１型糖尿病の発症を促進することを見出した。ＰＴＰＮ２の非存在下では、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のみが、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスにおける糖尿病を促進することができ；これは、たとえ極少数のＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（２．５×１０５）が移入された場合でも起きた。重要なことに、これは、排出膵臓ＬＮでのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖の増大に関連しておらず、むしろ、ナイーブＴ細胞のＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ  ＣＴＬへの分化の増加に関連していた。本発明者らのｅｘ  ｖｉｖｏ研究は、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ  ＣＴＬの産生の促進が、ＴＣＲ誘導及びＩＬ−２誘導応答の増強が原因であろうことを示唆している。感染との関連では、ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＩＬ−２シグナル伝達は、最終分化したＣＴＬの発達に必須である。ここで、本発明者らは、飽和条件下で、ＴＣＲ誘導増殖における差異が明らかではないが、ＴＣＲ誘導ＣＤ２５のレベルが上昇した場合、ＰＴＰＮ２が、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＩＬ−２誘導産生を悪化させることを示した。ＴＣＲ誘導Ｔ細胞活性化の促進以外では、ＰＴＰＮ２は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＦＮγ誘導シグナル伝達をそれぞれ媒介するＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３、及びＳＴＡＴ１を含むＳＴＡＴファミリーメンバーを脱リン酸化する能力も有する。このようなサイトカインは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖、分化、及び生存期間の調節に極めて重要な役割を果たす。例えば、過剰なＩＦＮγは、近年、自己免疫疾患を発症しやすいＲｏｑｕｉｎ機能獲得型マウス（Ｒｏｑｕｉｎ  ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ）における短命エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞の蓄積を増加させることを示した。従って、ＰＴＰＮ２欠損は、ＩＬ−２シグナル伝達を含むサイトカインシグナル伝達を直接促進することによって自己免疫関連ＣＴＬの発達に少なくとも部分的に寄与し得る。
【０１１３】
本発明者らによる結果は、交差提示ＣＤ８＋  Ｔ細胞の寛容を阻害して自己免疫の発達に寄与する、負の調節因子、例えば、ＰＴＰＮ２の変更の結果としてのＴＣＲ調整における変更の可能性を明らかにしている。１型糖尿病関連ＰＴＰＮ２  ＳＮＰ［（ｒｓ１８９３２１７（Ｃ）］は、Ｔ細胞におけるＰＴＰＮ２メッセージの約４０％の減少に関連している。本発明者らの研究は、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＰＴＰＮ２ヘテロ接合性が、ＲＩＰ−ｍＯＶＡマウスの交差提示によって誘導される末梢寛容を抑制するのに十分であることを示唆している。従って、本発明者らの研究は、ＰＴＰＮ２  ＳＮＰが自己免疫の発達に寄与し得る機序を明らかにしている。
【０１１４】
末梢寛容への寄与以外では、抗原交差提示は、腫瘍における病原体及び抗原に対するＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞応答のプライミングに極めて重要である。多数の第Ｉ相及び第ＩＩ相試験が、抗ウイルス又は抗腫瘍処置としてＤＣワクチン接種又は養子Ｔ細胞療法を用いて行われてきた。重要なことに、ヒト腫瘍から単離されたＴ細胞は、疲弊又は寛容化Ｔ細胞の多数の特徴を示し；腫瘍から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抑制性受容体、例えば、ＰＤ−１を発現し、かつサイトカインの産生不良を示す。
【０１１５】
［実施例３］
以下は、レトロウイルス感染を用いるＣＡＲ−Ｔ細胞を産生するための例示的な方法である（Ｃｈｅａｄｌｅ  ＥＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；１８４：１８８５−１８９６）。特異的なＣＡＲを発現させるこのアプローチはまた、ＣＡＲ−Ｔ細胞又は本明細書に記載のその他のＴ細胞型においてｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを発現させてＰＴＰＮ２の発現を低減するのにも適している。この方法は、マウスの設定で適用するように設計されているが、例えば、Ｔｈｅｍｅｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（１），ｐｐ  ９２８−９３３（関連するオンラインの方法を含む）及びＴｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４４，ｐｐ６４１−６４５に記載の方法に基づいてヒトでの適用のために変更することができる。
【０１１６】
［０日目−Ｔ細胞の単離］
１．脾細胞を単離するために、脾臓をＢｌ／６マウスから摘出する
２．ＥｔＯＨをマウス及び器具（ハサミ／鉗子）に噴霧する。
３．マウスの背中に切開部を形成して、指で皮膚を後方に引っ張る。脾臓は、左側にあり、明るい赤紫色である。
４．脾臓を腹部に付着させている脂肪を切り取って、脾臓をペトリ皿（非被覆）に入れる
５．５ｍｌのダルベッコＰＢＳ又は培地を脾臓に添加する。
６．シリンジを開けて、プランジャー端部を滅菌状態に維持する。この端部を使用して脾臓をすり潰して、単一細胞懸濁液−約１×１０８の細胞／脾臓にする。
７．ナイロン７０μＭ篩を５０ｍｌファルコンチューブに入れ、この混合物をこの篩にかける。脂肪組織が、篩に残る。
８．別の５ｍｌのＰＢＳ又は培地をペトリ皿に加えて残りの細胞を収集し、合計１０ｍｌを超える脾細胞−ＲＢＣ及びＷＢＣを篩にかける。
９．１２５０ｒｐｍで５分間回転させてペレットを得る。
１０．吸引により上清を廃棄する。
１１．ペレットを３ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液で懸濁する（一番上の棚−室温）。この緩衝液からＲＢＣを除去する。
１２．反転させて手で４分間前後に揺する。
１３．１５ｍｌのＲＰＭＩ（１０％＋Ｌｏｔ）培地を加える。
１４．回転中の細胞数のカウントのためにこの混合物を１０μｌのアリコートにして、フィルターチップ内に維持する。
１５．１２５０ｒｐｍで５分間回転させる。
１６．吸入装置を用いて上清を廃棄すると、ペレットはもはや赤色でないはずである。
１７．ＸｍｌのＲＰＭＩ培地をペレットに加えて、２．５×１０７の細胞／ウェルで再懸濁する。
１８．サイトカインを加える−フィルターチップを使用して滅菌を維持する：
（細胞数カウント用顕微鏡の下のフリーザー内の新鮮なアリコート、冷蔵庫内の作業ストック溶液を４℃で最大１か月間保存することができる）
１９．混合する。
２０．５ｍｌ／ウェル（通常は６ウェルプレート）（２．５×１０７の細胞／ｍｌ）のアリコートにする。
２１．プレートに細胞（Ｃ５７脾細胞）、培地、名称、日付、５×１０６の細胞／ｍｌを表示する
２２．インキュベーター（５％  ＣＯ２）に一晩入れておく。
【０１１７】
［細胞数のカウント］
１．ステップ１５で収集した１０μｌの細胞を、顕微鏡に近い９６ウェルプレートに入れる。
２．１０μｌのトリパンブルー（ｔｒｙｐｔａｎ  ｂｌｕｅ）をウェルに入れる（２倍の希釈）。
３．正方形のカバーガラスを細胞数カウント用スライドガラスの上部に乗せる（最初にこのスライドガラスに息を吹きかけてカバーガラスがスライドガラスの上を良くスライドするようにする）。
４．細胞をスライドガラスにアリコートし、顕微鏡下で観察する。
５．死んだ細胞はトリパンブルー（ｔｒｙｐｔａｎ  ｂｌｕｅ）を取り込むが、生きている細胞は取り込まない。
６．細胞数をカウントする−細胞が十分に間隔が空いているようであれば、底部の５つの正方形をカウントし、全グリッドをカバーするようにこの値に５を乗じる。
【０１１８】
［レトロネクチンプレート］
１．レトロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）
１００μｌのアリコート／チューブ−１チューブ／プレート−１００μｌ／１０ｍｌ  ＰＢＳ
２．６ウェルプレート
３．１．５ｍｌ／ウェル（レトロネクチン／ＰＢＳを再使用することができる）にピペットする。
４．４℃で一晩（又は４℃に設定するのを忘れた場合は３７℃で２時間）維持する。
【０１１９】
［ウイルスパッケージングライン（ｖｉｒａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｌｉｎｅ）］
１．ウイルスパッケージングラインを回収して、６×１０６の細胞／培地で、２５ｍｌの培地を含むフラスコに播種する。
【０１２０】
［１日目］
［ウイルスパッケージングライン］
１．ウイルスパッケージングラインを含むフラスコをインキュベーター（１０％  ＣＯ２）から取り出す。
２．ウイルス粒子を含む上清を６０ｍｌシリンジに注入し、表示された５０ｍｌファルコンチューブに濾過して入れる−各パッケージングラインが約２５ｍｌの総量となるようにするべきである。
３．フラスコの培地を新鮮なＲＰＭＩ（１０％＋Ｌｏｔ）培地（２５ｍｌ）に取り替えて、フラスコをインキュベーター（５％  ＣＯ２）に戻す。
【０１２１】
［レトロネクチンプレート］
１．プレートを傾けて、吸入によりレトロネクチンを除去する。
２．２．５ｍｌのウイルスパッケージングラインの上清（ｐＬＸＳＮ及びＥｒｂ）をウェルに加える。
３．プレートをポリエチレンラップでしっかりと包装して、縁がしっかりと密封されるようにする。余分なポリエチレンラップは、プレートの上部に乗せることができる。
４．遠心分離機に入れて、プレートが正確に平衡を保てるようにし、１２００×ｇで３０分間、室温で回転させる（プログラム４）。
【０１２２】
［Ｔ細胞を回収する］
１．Ｔ細胞を含む６ウェルプレート（５ｍｌの培地／ウェル）をインキュベーター（５％  ＣＯ２）から取り出して、顕微鏡下で観察する。
２．プラスチックピペットを使用して細胞を各ウェルの底部から除去してＴ細胞を回収する。ピペットを（３〜４回）上下させて、「全てＴ細胞」と表示された新しい５０ｍｌファルコンチューブに移す。総量＝３０ｍｌ
３．各５０ｍｌファルコンチューブの溶液が３０ｍｌを超えないようにする。
４．１０ｍｌ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（室温の棚）をピペットの最も遅い速度で、「全てＴ細胞」を含むファルコンチューブの底部にピペットする。この段階では勾配が存在するはずであり、ゲルがチューブの底部に沈んでいる。
５．１８００ｒｐｍ、加速／減速６で１０分間遠心分離する。
６．新しい５０ｍｌファルコンチューブに「生きているＴ細胞」と表示する。
７．Ｆｉｃｏｌｌ−ｐｌａｑｕｅにより生細胞を死細胞から分離する。Ｆｉｃｏｌｌ−ｐｌａｑｕｅゲル勾配でのＴ細胞の遠心分離により、死細胞がゲルの底部に残り、生細胞が、上清の下のゲルのすぐに上にくる。Ｔ細胞に近づきすぎないように注意して、できる限り多くの培地上清を吸引する。１ｍｌピペットを使用して、生Ｔ細胞を取り出して、「生Ｔ細胞」ファルコンチューブに入れる。
８．生Ｔ細胞を１０ｍｌの新鮮なＲＰＭＩ（１０％＋Ｌｏｔ）培地で再懸濁する。
９．１０μｌの細胞をフィルターチップにアリコートし、細胞数のカウントのために（顕微鏡に近い）９６ウェルプレートに移す。
１０．例えば、２×５ｍｌのＬＸＳＮ＋Ｅｒｂであるパッケージングラインの数によって、１０ｍｌの容量の再懸濁Ｔ細胞をファルコンチューブに分ける。
１１．５０ｍｌファルコンチューブを１２５０ｒｐｍで５分間回転させる（プログラム１）。
１２．回転の後、Ｔ細胞のペレットを廃棄しないように注意して、上清を吸引により廃棄する。
１３．Ｘｍｌのウイルス上清を正確に表示されたペレットに加え、再懸濁する。
１４．（レトロネクチンプレートを考慮して）サイトカインを加える
１５．２．５ｍｌ／ウェル（３ウェル／ｓｕｐｅ型）をピペットする。
１６．プレートを前述同様にポリエチレンラップで包装して、１２００×ｇで１．５時間回転させる（プログラム４、時間を変更）。
１７．回転が完了したら、注意深くポリエチレンラップを除去して、プレートをインキュベーター（５％  ＣＯ２）に入れる。
【０１２３】
［２日目］
１．ウイルスパッケージングラインを含むフラスコをチェックする（５％  ＣＯ２インキュベーター）。
２．ウイルス粒子を含む上清を６０ｍｌシリンジに注入し、表示された５０ｍｌファルコンチューブに濾過して入れる−各パッケージングラインが約２５ｍｌの総量となるようにするべきである。
３．回転中に細胞を大きいフラスコに分けてラインの成長を維持する。
【０１２４】
［レトロネクチンプレートからのＴ細胞の回収］
４．レトロネクチンプレート−Ｔ細胞＋ｐＬＸＳＮ／Ｅｒｂ  ｓｕｐｅ（３ウェル／サンプル−２つのプレート）（５％  ＣＯ２インキュベーター）をチェックする。
５．プラスチックピペットを使用して細胞を各ウェルの底部から除去してＴ細胞を回収する。ピペットを（３〜４回）上下させて、新しい５０ｍｌファルコンチューブに移す。総量＝１５ｍｌの各サンプル。
６．全ての細胞が除去されていない場合は、ＰＢＳ洗浄を行うこともできる。
７．ペレットにする準備ができるまでこれらのファルコンチューブを５％  ＣＯ２インキュベーターで維持する。＊
８．（ステップ３〜４からの）レトロネクチンプレートを「空にする」ために、２．５ｍｌの（ステップ２からの）ウイルス上清を加え−上清の正確に表示されたプレートへのアリコートをチェックする。
９．１日目にしたようにポリエチレンラップに包装し、１２００×ｇで３０分間回転させる（プログラム４）。
【０１２５】
［細胞を分ける］
１０．ウイルス細胞がコンフルエント（分ける必要性よりも重要である）であったため、パッケージングライン［ｐＬＸＳＮ及びＥｒｂ］を含むフラスコに細胞を分ける。
１１．０．５ｍｌのｔｒｙｐｌｅ（４℃で保存）（ｔｒｙｓｉｎ）をフラスコに加え、緩やかに揺り動かして細胞がｔｒｙｐｌｅで被覆されるようにする。
１２．吸入によりｔｒｙｐｌｅを廃棄する。
１３．フラスコを室温で５〜１０分間放置する、又はインキュベーター（５％  ＣＯ２）に入れて、フラスコに付着した細胞を除去するプロセスを速める。
１４．３０ｍｌの培地（ＲＰＭＩ）を新しい大きいフラスコに入れる。
１５．細胞が分離されたら、１０ｍｌのＲＰＭＩ培地を加え、ピペットを上下させて細胞をフラスコの底部に移動させる。
１６．これを１ｍｌ取って、１：１０を超える希釈で新しい大きいフラスコにピペットする（表示をチェックする）−細胞は３〜４日でコンフルエントになる。チェックして、８０％コンフルエントを超えたら分ける。
１７．フラスコを５％  ＣＯ２インキュベーターに入れる。
【０１２６】
［＊Ｔ細胞を回収する（続き）］
１８．Ｔ細胞を含む５０ｍｌファルコンチューブを１２５０ｒｐｍで５分間回転させる（プログラム１）。
１９．回転の次に、Ｔ細胞のペレットを廃棄しないように注意して、上清を吸引により廃棄する。
２０．＊７．５ｍｌの（３つのウェルの）ウイルス上清を正確に表示されたペレットに加えて、軽く再懸濁する。余分な上清を廃棄することができる。
２１．（レトロネクチンプレートを考慮して）サイトカインを加える：
ＩＬ２を１５μｌ
ＩＬ７を３０μｌ
２２．２．５ｍｌ（Ｔ細胞−ウイルス複合体）／ウェルをレトロネクチンプレート（３つのウェル／プレート＞＞５×１０６の細胞／ウェル）にピペットする。
２３．プレートを前述同様にポリエチレンラップで包装して、１２００×ｇで１．５時間回転させる（プログラム４、時間を変更）。
２４．回転が完了したら、注意深くポリエチレンラップを除去して、プレートをインキュベーター（５％  ＣＯ２）に４．５時間入れる。
２５．プラスチックピペットを使用して細胞を各ウェルの底部から除去してＴ細胞を回収する。ピペットを（３〜４回）上下させて、新しい５０ｍｌファルコンチューブに移す。総量＝各サンプルの１５ｍｌ。
２６．ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行っている場合はＰＢＳ洗浄して、最大量の細胞を収集するのが良い。
２７．５０ｍｌファルコンチューブを１２５０ｒｐｍで５分間回転させる（プログラム１）。
２８．回転の次に、Ｔ細胞のペレットを廃棄しないように注意して、上清を吸引により廃棄する。
２９．１５ｍｌのＲＰＭＩ培地をファルコンチューブ＋サイトカイン（１５μｌのＩＬ２及び３０μｌのＩＬ７）に加える。素早く回転させる。
３０．５ｍｌ／ウェル（３つのウェル／サンプル）を新しい表示された通常の６ウェルプレートにアリコートする。
３１．２日後により多くのサイトカインを加える、又は分割／増加する状態になるまで５％  ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。
【０１２７】
［４日目／５日目］
形質導入Ｔ細胞をチェックし、分割する準備ができていない場合は、別の５ｍｌの新鮮なＲＰＭＩを、サイトカインと共に各ウェル（ウェル内に既にある培地の上に）に加える。
６つのウェル全て（３つのＬＸＳＮ＋３つのＥｒｂ）＝３０ｍｌが必要
＋３０μｌのＩＬ２及び６０μｌのＩＬ７
７〜８日目に回収する準備ができるまで５％  ＣＯ２の３７℃のインキュベーターでインキュベートする。
【０１２８】
［７〜８日目］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために形質導入Ｔ細胞を回収する。
【０１２９】
［実施例４］
Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（−／−）対Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（＋／＋）マウスからの脾細胞を刺激して、ｓｃＦｖ−抗Ｈｅｒ−２及びＣＤ２８−ＣＤ３−ζ（α−Ｈｅｒ−２）を用いてレトロウイルスにより同時形質導入する。培養が８日経過したら、Ｈｅｒ−２特異的Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（α−Ｈｅｒ−２  −／−）対Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対照（ａ−Ｈｅｒ−２  ＋／＋）ＣＡＲ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＤ６２Ｌ対ＣＤ４４に対する蛍光色素結合抗体で染色し、エフェクター／記憶（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）の産生をフローサイトメトリーによって監視した。図８の結果は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター／記憶表現型の獲得を促進することを示している。
【０１３０】
［実施例５］
Ｈｅｒ−２特異的Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（α−Ｈｅｒ−２  ＋／＋）対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞（α−Ｈｅｒ−２  −／−）又は非トランスフェクトＰｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（＋／＋）対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（−／−）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、Ｈｅｒ−２発現２４ＪＫ  肉腫細胞（２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２）又はプレート結合ａ−ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔ細胞を活性化させる非抗原特異的手段として）と共にインキュベートした。Ｔ細胞の活性化を、ＥＬＩＳＡによる分泌ＩＦＮγの監視によって評価した。図９の結果は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を促進することを示している。
【０１３１】
［実施例６］
Ｈｅｒ−２特異的Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（α−Ｈｅｒ−２  ＋／＋）対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＡＲ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（α−Ｈｅｒ−２  −／−）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、クロム（Ｃｒ５１）標識２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２肉腫細胞又はＨｅｒ−２陰性２４ＪＫ肉腫細胞と共にインキュベートし、４時間後にＣｒ５１の放出を測定した。図１０の結果は、ＰＴＰＮ２欠損が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＡＲ  Ｔ細胞ＣＴＬの活性を促進することを示している。
【０１３２】
［実施例７］
Ｃ５７ＢＬ／６から単離された精製ＣＤ８＋ナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）脾Ｔ細胞を、高度に選択的な可逆ＰＴＰＮ２阻害剤（本明細書に化合物８として記載）の存在下又は非存在下（ビヒクル）で、プレート結合αＣＤ３／ＣＤ２８と共に４８時間インキュベートした。Ｔ細胞を、蛍光色素結合抗体で染色して、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５サブユニット）、及びＣＤ６９の表面のレベルを評価し、そして平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって監視した。図１１の結果は、ＰＴＰＮ２の阻害の非遺伝学的方法がＴ細胞の活性を促進し得ることを示している。ここに記載される研究は、小分子によるＰＴＰＮ２活性の阻害が、ｅｘ  ｖｉｖｏでのポリクローナルＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を促進することを示している。
【０１３３】
本明細書に記載の結果は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性をＰＴＰＮ２の阻害によって促進できることを示している。さらに、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞培養中のＰＴＰＮ２の化合物による阻害は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのポリクローナルＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を促進する。これらの結果は、ＰＴＰＮ２の阻害が、自己Ｔ細胞／ＣＡＲ  Ｔ細胞の養子細胞療法において特定の適用を見出すことができる、Ｔヘルパー非依存性の細胞毒性の獲得を可能にすることを示している。
【０１３４】
［実施例８］
［マウス］
Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（Ｃ５７ＢＬ６）及びＬｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（Ｃ５７ＢＬ６）若しくは対応するＯＴ−１マウス又はＣＤ４５．１及びＣＤ４５．１／２コンジェニックマウスを、餌及び水を自由に摂取できる状態の温度が制御されたハイバリア設備内で１２時間の明暗サイクルで維持した。週齢及び性別が合わせられた６〜８週齢の雌レシピエントマウス及び６週齢の雌ドナーマウスを養子移入実験に使用した。ｅｘ  ｖｉｖｏ実験では、雄マウス又は雌マウスの何れかを使用した。Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＬｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及び対応するＯＴ−Ｉ  ＴＣＲトランスジェニックマウスの作製では、Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ及びＬｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウス又はＯＴ−１；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスとＯＴ−１；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスとを交配させた。ＣＤ４５．１／２マウスの作製では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＤ４５．１マウスとを交配させた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景のＬｃｋ−Ｃｒｅ（Ｊａｍｅｓ  Ｄ．Ｍａｒｔｈ’ｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＣＳＤ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡが起源である）及びＴＣＲ（ＯＴ−Ｉ及びＯＴ−ＩＩ）トランスジェニックマウスは、Ｗ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）及びＷ．Ｈｅａｔｈ（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から提供された。ＣＤ４５．１マウスは、ＷＥＨＩ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｋｅｗ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６ヒトＨｅｒ−２トランスジェニックマウスは、Ｐｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍで育種され、これを６〜１６週間で実験法に使用した。
【０１３５】
［材料］
ＳＩＩＮＦＥＫＬ及びＳＩＹＮＦＥＫＬペプチドをＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ハムスターα−マウスＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）、α−マウスＣＤ２８ε（３７．５１）、及びＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）及び１６４０  ＲＰＭＩをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【０１３６】
［フローサイトメトリー］
切除された脾臓及びリンパセルからの単一細胞懸濁液を、すりスライドガラス間で軽く圧縮することによって得て、これを、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ＣＳＬ）が添加された冷却ＰＢＳで洗浄した。細胞懸濁液は、遠心分離（３００×ｇ、４℃で５分間）によって回収し、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞数を決定した。肝臓及び肺リンパ節を、潅流した肝臓及び肺から分離し、これを小片にカットして２００μｍの篩で濾し、次に室温で３３％Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）勾配にかけた。赤血球細胞を、赤血球細胞溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて除去した。
【０１３７】
表面染色のために、細胞（１×１０６／１０μｌ）をＤ−ＰＢＳ／２％  ＦＢＳで再懸濁し、氷上で２０分間、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。選別のために、細胞を氷上で３０分間、１５ｍｌファルコンチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞を洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ／２％  ＦＢＳで再懸濁し、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）若しくはＣｙＡｎ  ＡＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析する、又はＩｎｆｌｕｘ  ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。精製ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ  Ｔ細胞を、純度（９９％超）についてルーチン的に試験した。データをＦｌｏｗＪｏ７（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いて分析した。
【０１３８】
［抗体］
ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からの次の抗体を染色に使用した：フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合又はＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０結合α−ＣＤ４４（ＩＭ７）、フィコエリトリン（ＰＥ）結合又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合α−ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、パシフィック・ブルー結合又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合α−ＣＤ８（５３−６．７）、ＰＥ結合α−ＣＤ２５（ＰＣ６１）、及びＰＥシアニン染料７（Ｃｙ７）α−ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、ＡＰＣ結合ヒトα−ＣＤ６９（ＦＮ５０）、及びＡＰＣ−Ｃｙ７結合ヒトα−ＣＤ１５４（ＴＲＡＰ−１）。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの次の抗体を染色に使用した：ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ  ＦＩＴＣ結合ヒトα−ＣＤ８（ＢＷ１３５／８０）及びＶｉｏＢｌｕｅ結合ヒトα−ＣＤ８（Ｔ６Ｄ１１）。
【０１３９】
［一次マウスＴ細胞におけるＲＮＡ干渉］
Ｐｔｐｎ２を、Ｐｔｐｎ２（ＡＡＧＣＣＣＡＵＡＵＧＡＵＣＡＣＡＧＵＣＧ、配列番号１４）；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて一次マウスＴ細胞で一過性にノックダウンし；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；ＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣｄＴｄＴ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）ｓｉＲＮＡを対照として使用した。一次マウスＴ細胞に、製造者の取扱説明書に従ってＡｍａｘａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、３０ｎＭ、１００ｎＭ、及び３００ｎＭ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの効率をフローサイトメトリーによって監視するために、脾細胞にも、３０ｎＭ  ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をトランスフェクトした。一晩のインキュベーション後に、Ａｍａｘａトランスフェクション培地を、１６４０  ＲＰＭＩ完全培地に取り替えて、Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレート内でプレート結合α−ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）を用いて４８時間刺激した。Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーによって監視した。定量のために、細胞を回収する前にＣａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をウェルに添加した。
【０１４０】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激］
ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏナイーブＬＮ  Ｔ細胞（１×１０５／ウェル）を、９６ウェル丸底プレート内でプレート結合α−ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）を用いて６０時間刺激した。ＰＴＰＮ２阻害剤を、１日２回培養物に添加した。活性化の状態を決定するために、細胞を回収し、α−ＣＤ２５、α−ＣＤ４４、α−ＣＤ６２Ｌ、及びα−ＣＤ６９に対する蛍光色素結合抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【０１４１】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏアポトーシス］
ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１からのＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏナイーブＬＮ  Ｔ細胞（２×１０５／ウェル）を、９６ウェル丸底プレート内で１μｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬ又は１μｇ／ｍｌのＳＩＹＮＦＥＫＬを用いて１８時間刺激した。細胞を回収し、ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、そしてプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋（アポトーシス）細胞をフローサイトメトリーによって分析した。定量のために、細胞を回収する前にＣａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をウェルに添加した。
【０１４２】
［養子細胞療法の実験］
Ｃ５７ＢＬ／６ヒトＨｅｒ−２トランスジェニックマウスに、１×１０６の２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２細胞（Ｄｒ．Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｈｗｕ；ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤによって提供された）に皮下注射して第４乳腺脂肪体に注入する。次いで、マウスを、ｓｃＦｖ−抗Ｈｅｒ−２形質導入Ｔ細胞（１×１０７）の移入の前に、腫瘍注入の７日後にｇ線照射（５Ｇｙ）の亜致死量で前処置した。対照群は未処置のままにした。マウスに、Ｔ細胞移入後に投与される９用量の５０，０００  ＩＵ／２００ｍｌを含む、１日２回の組換えヒトＩＬ−２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｂｒａｎｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）の腹腔内注射をした。
【０１４３】
［ヒトＰＢＭＣの単離及び刺激］
ヒト血液を、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）を含む１５ｍｌガラス管に収集した。末梢血単球（ＰＢＭＣ）を、遠心分離（２２００×ｒｐｍ、室温で２０分間）によって回収した。ＰＢＭＣを、無血清ＲＰＭＩ  １６４０中でＰＴＰＮ２阻害剤と共に、３７℃で２時間インキュベートし、プレート結合ヒトα−ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ：クローンＯＫＴ−３）で２４時間刺激した。細胞を回収し、α−ＣＤ８、α−ＣＤ４５ＲＡ、α−ＣＤ１５４、及びα−ＣＤ６９に対する蛍光色素結合抗体で染色し、そしてこれらの活性状態を決定するためにフローサイトメトリーによって分析した。Ｔ細胞の増殖を監視するために、細胞が回収される前にＣａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ（商標）をウェルに添加した。
【０１４４】
［結果］
図１２は、ｒｅｐｌｅｔｅ  ＣＤ４５．１／２＋宿主に同時移入された、ＣＤ４５．１＋対ＣＤ４５．２＋  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）ＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（２×１０６）の結果を示している。末梢血を、Ｔ細胞移入後の指定の時点で収集し、そしてＣＤ４５．２  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＣＤ４５．１マウスからの養子移入ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を、フローサイトメトリーによって決定した。移入から１６週間後に、レシピエントマウスを屠殺して、脾臓、リンパ節（ＬＮ）、肝臓、及び肺からのリンパ球をフローサイトメトリーによって分析した。養子移入された合計及びナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）中心記憶（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ；ＣＭ）及びエフェクター／記憶（ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ；ＥＭ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を決定した。図示されている図１２の結果は、指定数のマウスについての平均±ＳＥＭである。これらの結果は、野生型と比較してＰＴＰＮ２ノックアウト細胞では、ｉｎ  ｖｉｖｏでのナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞のエフェクター記憶型Ｔ細胞への変換の促進を示している。ＰＴＰＮ２の非存在が、エフェクター記憶表現型Ｔ細胞の生存期間の延長ももたらすと考えられる。
【０１４５】
図１３は、ｒｅｐｌｅｔｅ  ＣＤ４５．１／２＋宿主に同時移入されたＣＤ４５．１＋対ＣＤ４５．２＋  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからの中心記憶（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ，ＣＭ）ＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（０．５×１０６）の結果を示している。末梢血を、Ｔ細胞移入後の指定の時点で収集し、そしてＣＤ４５．２  Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＣＤ４５．１マウスからの養子移入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率をフローサイトメトリーによって決定した。移入から１６週間後に、レシピエントマウスを屠殺して、脾臓、リンパ節（ＬＮ）、肝臓、及び肺からのリンパ球をフローサイトメトリーによって分析した。養子移入された合計及びナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）中心記憶（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ；ＣＭ）及びエフェクター／記憶（ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ；ＥＭ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を決定した。図示されている結果は、指定数のマウスについての平均±ＳＥＭである。ＰＴＰＮ２欠損は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの中心記憶Ｔ細胞のエフェクター記憶表現型への変換を促進する。
【０１４６】
総合すると、図１２及び図１３の結果は、細胞の出発集団が、ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞、中心記憶表現型細胞、又はこれらの両方の混合物であってもなくても、宿主細胞への移入が、エフェクター記憶表現型への変換を可能にすること、及びこの変換がＰＴＰＮ２の非存在下で促進されることを示している。エフェクター記憶表現型細胞は、特に腫瘍の処置での養子移入に有用な細胞の集団である。
【０１４７】
図１４では、プレート結合抗ＣＤ３（５μｇｍｌ）及び抗ＣＤ２８（５μｇｍｌ）で６０時間、±様々な濃度のＰＴＰＮ２阻害剤（化合物８）で刺激された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）ＣＤ８＋  ＬＮ  Ｔ細胞（１×１０５）の結果が示されている。細胞を回収し、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ６２Ｌに対する蛍光色素結合抗体で染色し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって分析した。図示されている結果は、指定数の複製についての平均±ＳＤである。図１４の結果は、ＰＴＰＮ２阻害剤がナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激して活性化表現型にすることを示している。
【０１４８】
ＯＴ−Ｉ：Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ対ＯＴ−Ｉ；Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌマウスからのＣＤ８＋ナイーブＬＮ  Ｔ細胞（２×１０５）を、１μｇ／ｍｌ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｎ４；高親和性ペプチド）又は１μｇ／ｍｌ  ＳＩＹＮＦＥＫＬ（Ｙ３；低親和性ペプチド）と共に１８時間インキュベートし、アネキシンＶ及びプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図１５）。図示されている結果は、指定数のマウスについての平均±ＳＥＭである。図１５の結果は、ＰＴＰＮ２欠損が活性化誘導細胞死をもたらさないことを示している。本明細書の他の部分、特に図１２〜図１４で示されている結果と合わせて、ＰＴＰＮ２欠損又は阻害は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）による細胞死を増加させることなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでのナイーブ又は中心記憶型Ｔ細胞のエフェクター記憶表現型への変換を促進する。ＡＩＣＤは、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の繰り返しの刺激により生じ、かつ末梢免疫寛容を維持するのに役立つ活性化Ｔリンパ球の負の調節因子である。本明細書に示される実験は、ＰＴＰＮ２欠損又は阻害Ｔ細胞は、強くて、野生型細胞よりもＡＩＣＤが起こりにくくなっていることを実証している。
【０１４９】
図１６の結果は、ＣＤ８＋  ヒト血液リンパ球における小分子阻害剤、化合物８によるＰＴＰＮ２の阻害により、ＴＣＲ媒介Ｔ細胞活性化が促進されることを示している。新しく単離されたヒトＰＢＭＣ（２×１０６）を、プレート結合α−ＣＤ３（１．２５及び２．５μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。ＰＢＭＣを回収し、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８、ＣＤ６９、及びＣＤ１５４に対する蛍光色素結合抗体で染色し、そしてＴ細胞の活性化をフローサイトメトリーによって監視した。代表的なＣＤ８対ＣＤ６９及びＣＤ１５４プロット（線で画定された領域の数字は、ゲート内の相対数である）が示されている（図１６）。これらのデータは、末梢血から単離された細胞を含むヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞でのＰＴＰＮ２の阻害が、Ｔ細胞受容体媒介Ｔ細胞活性化の促進を示すことを裏付けている。
【０１５０】
マウスＣＤ８＋  Ｔ細胞でのｓｉＲＮＡを用いたＰＴＰＮ２のノックダウンは、細胞数の用量反応性の増加によって示される、ＴＣＲ媒介Ｔ細胞応答の促進をもたらす（図１７）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞（１×１０７）を、Ａｍａｘａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ  Ｋｉｔを用いて１００ｎＭ  ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ又は３０ｎＭ、１００ｎＭ、及び３００ｎＭ  ＰＴＰＮ２  ｓｉＲＮＡで一晩トランスフェクトした。トランスフェクト脾細胞を、プレート結合α−ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）及びα−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激し、そして蛍光色素結合α−ＣＤ８で染色した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞数をフローサイトメトリーによって定量した。図示されている結果は、指定数の複製の平均±ＳＤである。
【０１５１】
ＰＴＰＮ２欠損は、養子免疫療法との関連でＨｅｒ−２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍特異的活性を促進し、かつ異種移植マウスの生存期間を延長する（図１８）。Ｈｅｒ−２特異的Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ（α−Ｈｅｒ−２  ＋／＋）対Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（α−Ｈｅｒ−２  −／−）（１×１０７）を、Ｈｅｒ−２発現２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２肉腫細胞に感染したＣ５７ＢＬ／６ヒトＨｅｒ−２トランスジェニックマウス（各群に６匹のマウス）に養子移入して生存を監視した。１００日後に、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ；Ｐｔｐｎ２ｆｌ／ｆｌ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（α−Ｈｅｒ−２  −／−）が養子移入された６匹のマウスのうちの２匹がまだ生存していた。
【０１５２】
ＣＤ８＋ヒト血液リンパ球でのＰＴＰＮ２の阻害により、ＴＣＲ媒介Ｔ細胞増殖が促進された（図１９）。新しく単離されたヒトＰＢＭＣ（２×１０６）を、ビヒクル対照又はＰＴＰＮ２の阻害剤、化合物８（本明細書に記載）の存在下で、プレート結合α−ＣＤ３で（Ａ）４８時間及び（Ｂ）７２時間刺激した。ＰＢＭＣを回収して、蛍光色素結合α−ＣＤ８で染色した。Ｃａｌｉｂｒｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ（商標）を添加して、Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによって監視した。図示されている結果は、指定数の複製の平均±ＳＤである。
【０１５３】
ＰＴＰＮ２の阻害は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＨｅｒ−２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍特異的活性化を促進する（図２０）。Ｈｅｒ−２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ビヒクル対照又はＰＴＰＮ２の阻害剤、化合物８（本明細書に記載）の存在下で、Ｈｅｒ−２発現２４ＪＫ肉腫細胞（２４ＪＫ−Ｈｅｒ−２）又は２４ＪＫ肉腫細胞（２４ＪＫ）と共に、又は培地のみでインキュベートした。Ｔ細胞の活性化を、供給元の仕様書に従ってＥＬＩＳＡ（Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ，ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標））による分泌されたＩＦＮγの監視によって評価した。試験は、３連で行った（±ＳＤ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2017524348.tif 000020
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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