(57)【要約】  本開示は、必要とする対象においてニーマンピックＣ型を治療するための、ブリオスタチン−１を含む組成物、およびブリオスタチン−１を含む組成物を投与することを含む方法に関する。
2017510646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニーマンピックＣ型（ＮＰＣ）を治療するための有効量でブリオスタチン−１を含む組成物であって、前記有効量が、結果として、治療を必要とする対象の脳内での約０．１ｎＭから約１．５ｎＭまでの範囲に及ぶブリオスタチン−１の濃度になる、組成物。
【請求項２】
前記有効量が、結果として、脳内での約１ｎＭのブリオスタチン−１の濃度になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
治療を必要とする対象においてニーマンピックＣ型（ＮＰＣ）を治療するための方法であって、ＮＰＣを治療するための有効量でブリオスタチン−１を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記有効量が、結果として、脳内での約０．１ｎＭから約１．５ｎＭまでの範囲に及ぶブリオスタチン−１の濃度になる、方法。
【請求項４】
前記有効量が、結果として、脳内での約１ｎＭのブリオスタチン−１の濃度になる、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本出願は、２０１４年３月２７日に出願された、米国仮特許出願第６１／９７１，４８０号の優先権を主張し、その内容は参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
ニーマンピックＣ型（ＮＰＣ）は、脂質貯蔵病として知られる遺伝性代謝障害である。ニーマンピックＣ型は、ＮＰＣ１またはＮＰＣ２遺伝子における変異によって引き起こされる。これらの遺伝子から産生されるタンパク質は、細胞間での脂質、たとえば、コレステロールの移動に関与している。遺伝子変異は、コレステロールおよび他の脂質の細胞間の輸送を崩壊させ、結果として、組織および器官内での脂質の過剰蓄積を生じ、最終的に、細胞死および脳を含む主要な器官系の機能障害をもたらす。神経系の進行性悪化により、最終的には死に至る。ＮＰＣは、人生の初期に出現または１０代もしくは成人年齢で発症し得る。罹患した個体は脾臓および肝臓の中程度の肥大を有し、脳損傷は広範囲におよぶ場合もあり、上および下を向けないこと、歩行および嚥下困難、ならびに視力および聴力の進行性損失を引き起こし得る。ＮＩＮＤＳニーマンピック病情報ページ、これは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ／ｎｉｅｍａｎｎ／ｎｉｅｍａｎｎ．ｈｔｍで利用可能である；ニーマンピック病、これは、ｈｔｔｐ：／／ｇｈｒ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ／ｎｉｅｍａｎｎ−ｐｉｃｋ−ｄｉｓｅａｓｅで利用可能である。
【０００３】
ＮＰＣのための治癒法は現在のところない。したがって、その関連症状を治療および／または最小化するための治療剤を開発する必要性がある。さらに、中間径フィラメントのビメンチンがＮＰＣ病の細胞において野生型細胞と比較して低リン酸化状態であること、ならびにこの低リン酸化状態が、特にα、ε、およびβＩＩアイソフォームの低下したプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性に原因があることが報告されている。Ｔａｍａｒｉら、ＰＫＣ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｉｅｍａｎｎ  Ｐｉｃｋ  Ｃ１  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ、第８巻、第８号（２０１３）。Ｔａｍａｒｉらが説明している通り、ビメンチンを欠乏している細胞は、エステル化のためにそれらのリソソームから小胞体へＬＤＬ由来のコレステロールを輸送することができず、低減されたビメンチンのリン酸化は、可溶性ビメンチンの貯蔵を低減させる。同上。ＰＫＣ、特に、α、ε、および／またはβＩＩアイソザイムの上昇した発現は、ＮＰＣ病の細胞においてビメンチンをリン酸化して可溶性ビメンチンのレベルを上昇させ、コレステロール輸送遮断を寛解させる。同上。図７および８に示されているように、ＰＫＣεおよびαは、脳において実質的に検出されており（Ｗｅｔｓｅｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１７巻、１９９２）、これは、ＮＰＣにおいて進行性に重大な変性を受けるところである。したがって、ニーマンピック病を治療するために、特定のＰＫＣアイソフォーム、たとえば、ＰＫＣεおよび／またはαの強力な活性化因子として働く薬剤を発見および開発するさらなる必要性がある。
【０００４】
したがって、本開示は、ＮＰＣを治療するための有効量でブリオスタチン−１を含む組成物を目的とし、ここで、有効量は、結果として、治療を必要とする対象の脳内での約０．１ｎＭから約１．５ｎＭまでの範囲に及ぶブリオスタチン−１の濃度になる。
【０００５】
本開示は、ＮＰＣを治療するのに有効な量でブリオスタチン−１を含む組成物を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象においてＮＰＣを治療するための方法も目的とし、ここで、有効量は、結果として、脳内での約０．１ｎＭから約１．５ｎＭまでの範囲に及ぶブリオスタチン−１の濃度になる。
【０００６】
本開示のさらなる利点は、部分的には後に続く開示に記載され、かつ部分的には開示から明らかになり、または本発明の実施によって習得されていてもよい。本開示の利点は、添付の特許請求の範囲において特に示されている要素および組合せによって実現および達成される。
【０００７】
主張の通り、上記の一般的な説明と以下の詳細な説明の両方は、単に例示的かつ説明的なものであり、本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【０００８】
添付の図面は、本明細書に組み込まれかつその一部を構成するものであり、本開示の１つの（いくつかの）態様を例示し、かつ開示と共に、本開示の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、初代ヒトニューロンにおけるブリオスタチン−１の用量動態およびＰＫＣアイソザイム特異性を示す。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、初代ヒトニューロンにおける０．２５ｎＭのブリオスタチン−１の時間動態およびＰＫＣアイソザイム特異性を示す。
【図２Ｂ】同上
【図３】図３は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における０．２７ｎＭのブリオスタチン−１のＰＫＣアイソザイム特異性を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、多様な濃度の他のＰＫＣ活性化因子（ＤＨＡ−ＣＰ６−ＭＥ（４Ａ）、ＤＣＰ−ＬＡ（４Ｂ）およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ（４Ｃ））によるＰＫＣアイソザイム活性化を示す。
【図４Ｂ】同上
【図４Ｃ】同上
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、マウス脳における多様な用量のブリオスタチン−１による３０分または１２０分後のＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−α活性化を示す。
【図５Ｂ】同上
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、マウス脳における特定の用量のブリオスタチン−１による、それぞれ、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−α活性化の時間経過を示す。
【図６Ｂ】同上
【図７】図７は、Ｗｅｔｓｅｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１７巻（１９９２）において提供される、体内のＰＫＣαおよびＰＫＣεの分布を示す。
【図８】図８は、Ｗｅｔｓｅｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１７巻（１９９２）において提供される、ラット組織におけるＰＫＣアイソザイムの相対的な存在量を示す。
【発明の開示】
【００１０】
本開示の特定の側面は、以下に、より詳細に記載されている。本出願中で使用される場合およびここで明確にされる場合、用語および定義は、本開示の範囲内の意味を表すことが意図される。ここに引用される特許および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ここに提供される用語および定義は、参照によって組み込まれる用語および／または定義と矛盾する場合には、優先される。
【００１１】
単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが示されていない限り、複数の言及を含む。
【００１２】
用語「およそ」および「約」は、測定の性質または精度を考慮に入れて、測定された数量についての許容される程度の誤差を含む言及される数または値とほぼ同じであることを意味する。ここで使用される場合、用語「およそ」および「約」は、示された量、頻度または値の±２０％を包含すると一般に理解されるべきである。ここに示される数量は、他に明記されていない限りおよそのものであり、特に明記されていないときは用語「約」または「およそ」と推測され得ることを意味する。
【００１３】
用語「投与する」、「投与」、または「投与すること」は、ここで使用される場合、（１）医療関係者もしくは彼の委任を受けた者のいずれかによって、または彼の指示の下で、本開示による組成物を提供すること、与えること、投与および／もしくは処方すること、ならびに／または（２）患者すなわち彼自身もしくは彼女自身によって本開示による組成物を注入、摂取または消費することを指す。ここで使用される場合、組成物の「投与」は、経口、静脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内を含む、任意の投与経路を含む。
【００１４】
ここで使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物、すなわち、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を意味する。
【００１５】
ここで使用される場合、「プロテインキナーゼＣ活性化因子」または「ＰＫＣ活性化因子」は、プロテインキナーゼＣに結合することによってプロテインキナーゼＣによって触媒される反応の割合を上昇させる物質を意味する。
【００１６】
用語「薬学的に許容される」は、生理学的に認容され、対象に投与されたときに不適切な反応を典型的に生じない分子実体および組成物を指す。
【００１７】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、非受容体型のセリンスレオニンプロテインキナーゼの最も大きな遺伝子ファミリーのうちの１つである。８０年代初期のＰＫＣの発見およびホルボールエステルに関する主要な受容体としてのその同定以降、多数の生理的シグナル伝達機構がこの酵素に帰されてきた。Ｋｉｋｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）、第２５７巻、ｐｐ．１３３４１〜１３３４８；Ａｓｈｅｎｄｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８３）、第４３巻：４３３３〜４３３７。ＰＫＣにおける関心は、増殖および分化因子の作用によってリン脂質代謝と対に形成される作動因子である、カルシウムおよびジアシルグリセロール（およびホルボールエステル模倣体）によってインビトロで活性化されるその固有の能力に起因する。ＰＫＣの活性化は、異なる結合部位における１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および／または１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ホスファチジル−Ｌ−セリン、ＰＳ）の結合を必要とする。ＰＫＣの直接的活性化の代替のアプローチは、ホスホリパーゼ、たとえば、ホスホリパーゼＣγを活性化することによる、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を経由したＳｅｒ／ＴｈｒキナーゼＡｋｔを刺激することによる、または内因性活性化因子であるＤＡＧのレベルを上昇させることによる、ＰＫＣの間接的な活性化を介する。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（２００９）第３４巻、ｐｐ．１３６〜１４５。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤は、たとえば、内因性リガンドジアシルグリセロールのレベルを促進していてもよく、それによってＰＫＣの活性化を生じる。Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ（２００２）、第１３巻、ｐｐ．７２５〜７３３。しかし、ホルボールエステルは、その腫瘍促進活性が理由で最終的な薬物開発に好適な化合物ではない。ｌｂａｒｒｅｔａら  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ（１９９９）、第１０巻、ｐｐ．１０３５〜１０４０）。
【００１８】
ＰＫＣ遺伝子ファミリーは１１遺伝子からなり、それらは以下の４つのサブグループに分けられる：（１）典型的なＰＫＣα、β１、β２（β１およびβ２は、同じ遺伝子の選択的スプライシングされた型である）およびγ；（２）新規なＰＫＣδ、ε、η、およびθ；（３）非典型的なＰＫＣζおよびι／λ；ならびに（４）ＰＫＣμ。ＰＫＣμは、新規なＰＫＣアイソフォームに似ているが、推定上の膜貫通ドメインを有することによって異なる。Ｂｌｏｂｅら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．（１９９４）、第１３巻、ｐｐ．４１１〜４３１；Ｈｕｇら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９３）第２９１巻、ｐｐ．３２９〜３４３；Ｋｉｋｋａｗａら  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９）、第５８巻、ｐｐ．３１〜４４。典型的なＰＫＣアイソフォーム、α、β１、β２、およびγは、Ｃａ2+、リン脂質、およびジアシルグリセロール依存性であるのに対して、他のアイソフォームは、リン脂質、ジアシルグリセロールによって活性化されるが、Ｃａ2+には依存性ではなく、活性化因子は必要ではなさそうである。すべてのアイソフォームは、５つの可変（ＶＩ〜Ｖ５）領域を包含し、α、β、およびγのアイソフォームは、高度に保存された４つの（Ｃ１〜Ｃ４）構造ドメインを含む。ＰＫＣα、β、およびγ以外のすべてのアイソフォームは、Ｃ２ドメインを欠いており、ι／λおよびηのアイソフォームも、ジアシルグリセロールが結合するＣ１にある２つのシステインリッチジンクフィンガードメインのうちの９つを欠いている。Ｃ１ドメインは、すべてのアイソフォーム間で高度に保存された偽基質配列も含み、これは、基質結合部位を遮断して酵素の不活性な高次構造を生じることによって自己調節機能に役立つ。Ｈｏｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）、第２３８巻、ｐｐ．１７２６〜１７２８。
【００１９】
これらの構造的特徴のため、多種多様なＰＫＣアイソフォームは、生理的刺激に対する応答ならびに新生物の悪性転換および分化におけるシグナル伝達において極めて特殊な役割を有すると考えられている。Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ、Ｃａｎｃｅｒ（１９８９）、第１０巻、ｐｐ．１８９２〜１９０３；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ、ｌ．Ｆ．Ｋｕｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、１９９４中のＧｌａｚｅｒ、ｐｐ．１７１〜１９８。ＰＫＣ調節因子の考察については、たとえば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８１４１号（ＷＯ９７／４３２６８）ならびに米国特許第５，６５２，２３２号；第６，０８０，７８４号；第５，８９１，９０６号；第５，９６２，４９８号；第５，９５５，５０１号；第５，８９１，８７０号および第５，９６２，５０４号を参照されたく、それぞれは参照によりここにその全体が組み込まれる。
【００２０】
ＰＫＣ活性化因子は、複数のＰＫＣのアイソフォームに作用する、広範囲の活性化因子であってもよく、または特定のアイソフォームに選択的であってもよい。選択的ＰＫＣ活性化因子は、異なるアイソフォームが異なる機能を果たすことができるので、固有の利点を提供しし得る。α、εおよび／またはβＩＩアイソフォームのＰＫＣの上昇した発現は、ニーマンピック病の細胞においてビメンチンをリン酸化して可溶性ビメンチンのレベルを上昇させ、この疾患に関連したコレステロール輸送遮断を寛解させることが示されている。Ｔａｍａｒｉら、ＰＫＣ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｉｅｍａｎｎ  Ｐｉｃｋ  Ｃ１  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ、第８巻、第８号（２０１３）。本発明者は、脳内での０．１ｎＭから１．５ｎＭの範囲内のブリオスタチン−１の濃度は、結果として、ＮＰＣを治療するために特に有利であるＰＫＣアイソザイム活性化サイン（すなわち、ＰＫＣεおよび／またはαを含む、特定のＰＫＣアイソザイムの活性化）につながることを発見した。
【００２１】
したがって、本開示の一側面では、組成物は、ＮＰＣを治療するための有効量でブリオスタチン−１を含み、ここで、有効量は、結果として、治療を必要とする対象の脳内での約０．１ｎＭから約１．５ｎＭまでの範囲に及ぶブリオスタチン−１の濃度になる。たとえば、一部の態様では、有効量は、結果として、脳内での、約０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、またはその間にある任意の値のブリオスタチン−１の濃度になる。
【００２２】
ブリオスタチン−１の血漿濃度は、脳内でのブリオスタチン−１の濃度の約５倍に相当する。したがって、一部の態様では、ＮＰＣを治療するためのブリオスタチン−１の有効量は、結果として、約０．５ｎＭ〜約７．５ｎＭの血漿濃度になる。たとえば、一部の態様では、ブリオスタチン−１の有効量は、結果として、約０．５ｎＭ、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、またはその間にある任意の値のブリオスタチン−１の血漿濃度になる。
【００２３】
一部の態様では、ＮＰＣを治療するためのブリオスタチン−１の有効量は、約５μｇ／ｍ2から約１２０μｇ／ｍ2までの範囲に及ぶ。たとえば、一部の態様では、ＮＰＣを治療するためのブリオスタチン−１の有効量は、約５μｇ／ｍ2、約１０μｇ／ｍ2、約１５μｇ／ｍ2、約２０μｇ／ｍ2、約２５μｇ／ｍ2、約３０μｇ／ｍ2、約３５μｇ／ｍ2、約４０μｇ／ｍ2、約４５μｇ／ｍ2、約５０μｇ／ｍ2、約５５μｇ／ｍ2、約６０μｇ／ｍ2、約６５μｇ／ｍ2、約７０μｇ／ｍ2、約７５μｇ／ｍ2、約８０μｇ／ｍ2、約８５μｇ／ｍ2、約９０μｇ／ｍ2、約９５μｇ／ｍ2、約１００μｇ／ｍ2、約１０５μｇ／ｍ2、約１１０μｇ／ｍ2、約１１５μｇ／ｍ2、約１２０μｇ／ｍ2、またはその間にある任意の値である。
【００２４】
一部の態様では、ここに開示されているブリオスタチン−１の濃度は、ブリオスタチン−１のピーク濃度である。
【００２５】
ここに記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において知られている任意の好適な方法によって調製されていてもよい。一般に、こうした準備の方法は、活性成分、すなわち、ブリオスタチン−１を、担体または１つ以上の他の補助成分と会合させること、次いで、必要な場合または望ましい場合、所望の単回または多回の用量単位中に製品を成形またはパッケージングすることを含む。
【００２６】
ここに提供されている医薬組成物の説明はヒトへの倫理的な投与に好適な医薬組成物を主に目的としているが、こうした組成物がすべての種類の動物への投与に一般に好適であることは当業者によって理解される。種々の動物への投与に好適な組成物を提供するための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変は十分に理解され、通常の知識を有する獣医学領域の薬理学者は、たとえあるとしても、通常の実験だけで、こうした改変を設計および実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が企図される対象は、ヒトおよび他の霊長類、ならびに他の哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
一態様では、ここに開示されている組成物は、薬学的に許容される投与用担体と共に製剤化されていてもよい。薬学的に許容される担体は、以下のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない：賦形剤；界面活性剤；分散化剤；不活性希釈剤；顆粒化剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；香味剤；着色剤；保存剤；生理学的に分解可能な組成物、たとえば、ゼラチン；水性のビヒクルおよび溶媒；油性のビヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散化剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝液；塩；増粘剤；フィラー；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；ならびに薬学的に許容されるポリマーのまたは疎水性の材料。本開示の医薬組成物中に含まれていてもよい他のさらなる成分は、当技術分野において一般に知られており、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．２０００に、記載されているであろう。これらはいずれも参照によりここに組み込まれる。
【００２８】
一態様では、担体は、水性または親水性の担体である。さらなる一態様では、担体は、水、生理食塩水、またはジメチルスルホキシドであってもよい。別の態様では、担体は、疎水性担体である。疎水性担体は、包接複合体、分散体（たとえば、ミセル、マイクロエマルション、およびエマルション）、およびリポソームを含む。例示的な疎水性担体は、包接複合体、ミセル、およびリポソームを含む。たとえば、参照によりここに組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ  ２００３を参照されたい。さらに、たとえば、製剤を安定化するために、疎水性担体または溶液のいずれかの中に他の化合物が含まれていてもよい。
【００２９】
ここに開示されている組成物は、経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮の経路を含む任意の好適な経路によって投与されていてもよい。非経口経路は、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、髄腔内、および頭蓋内投与を含む。好適な投与の経路は、血液脳関門を通過することを可能にするように選択されていてもよい。Ｒａｐｏｐｏｒｔら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．（２００１）第４２巻、ｐｐ．６７８〜６８５。
【００３０】
組成物は、従来の方法によって製剤化されていてもよく、薬学的に許容される任意の添加物、たとえば、賦形剤、滑沢剤、希釈剤、香味剤、着色剤、緩衝液、および崩壊剤を含んでいてもよい。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．２０００を参照されたい。
【００３１】
一部の態様では、ここに開示される組成物は、固体経口剤形中に製剤化される。経口投与用には、組成物は、薬学的に許容される賦形剤、たとえば、結合剤（たとえば、予めゼラチン状にされたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（たとえば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（たとえば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて従来の手段によって調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとっていてもよい。錠剤は、当技術分野において一般に知られている方法によってコーティングされていてもよい。
【００３２】
一部の態様では、組成物は、液体製剤中に製剤化される。経口投与用の液体製剤は、たとえば、液剤、シロップ剤または懸濁液剤の形態をとっていてもよく、またはそれらは、水もしくは他の好適なビヒクルによる使用前構成用の乾燥製品として提供されていてもよい。こうした液体製剤は、薬学的に許容される添加物、たとえば、懸濁化剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水添食用脂）；乳化剤（たとえば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（たとえば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは精留植物油）、および保存剤（たとえば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）を用いて従来の手段によって調製されていてもよい。製剤は、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含んでいてもよい。
【００３３】
本開示の他の態様では、組成物は、非経口投与、たとえば、ボーラス注射または連続注入用に製剤化されていてもよい。注射用の製剤は、たとえば、アンプル中または多回容量容器中で、添加された保存剤と共に、単位剤形で提供されていてもよい。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液剤、液剤、分散剤、または乳剤のような形態をとっていてもよく、製剤化剤、たとえば、懸濁化、安定化および／または分散化剤を含んでいてもよい。
【００３４】
一部の態様では、組成物は、デポー製剤として製剤化されていてもよい。こうした製剤は、埋め込み（たとえば、皮下または筋肉内）によってまたは筋肉内注射によって投与されていてもよい。たとえば、組成物は、好適なポリマーのもしくは疎水性の材料と共に（たとえば、許容される油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、またはやや難溶の誘導体として、たとえば、やや難溶の塩として製剤化されていてもよい。
【００３５】
別の態様では、組成物は、小胞、たとえば、ミセル、リポソーム、または人工の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子中で送達されていてもよい。たとえば、米国特許第７，６８２，６２７号を参照されたい。
【００３６】
別の側面では、本開示は、ＮＰＣを治療するための有効量でブリオスタチン−１を含む組成物を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象においてＮＰＣを治療するための方法を目的とし、ここで、有効量は、結果として、約０．１ｎＭから約１．５ｎＭまでの範囲に及ぶブリオスタチン−１の濃度になる。たとえば、一部の態様では、有効量は、結果として、脳内での、約０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、またはその間にある任意の値のブリオスタチン−１の濃度になる。
【００３７】
上述の通り、ブリオスタチン−１の血漿濃度は、脳内でのブリオスタチン−１の濃度の約５倍に相当する。したがって、一部の態様では、ＮＰＣを治療するためのブリオスタチン−１の有効量は、結果として、約０．５ｎＭ〜約７．５ｎＭの血漿濃度になる。たとえば、一部の態様では、ブリオスタチン−１の有効量は、結果として、約０．５ｎＭ、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、またはその間にある任意の値のブリオスタチン−１の血漿濃度になる。
【００３８】
一部の態様では、ＮＰＣを治療するためのブリオスタチン−１の有効量は、約５μｇ／ｍ2から約１２０μｇ／ｍ2までの範囲に及ぶ。たとえば、一部の態様では、ＮＰＣを治療するためのブリオスタチン−１の有効量は、約５μｇ／ｍ2、約１０μｇ／ｍ2、約１５μｇ／ｍ2、約２０μｇ／ｍ2、約２５μｇ／ｍ2、約３０μｇ／ｍ2、約３５μｇ／ｍ2、約４０μｇ／ｍ2、約４５μｇ／ｍ2、約５０μｇ／ｍ2、約５５μｇ／ｍ2、約６０μｇ／ｍ2、約６５μｇ／ｍ2、約７０μｇ／ｍ2、約７５μｇ／ｍ2、約８０μｇ／ｍ2、約８５μｇ／ｍ2、約９０μｇ／ｍ2、約９５μｇ／ｍ2、約１００μｇ／ｍ2、約１０５μｇ／ｍ2、約１１０μｇ／ｍ2、約１１５μｇ／ｍ2、約１２０μｇ／ｍ2、またはその間にある任意の値である。
【００３９】
一部の態様では、ここに開示されているブリオスタチン−１の濃度は、ブリオスタチン−１のピーク濃度である。
【００４０】
ここに記載の組成物および方法は、以下の例によってさらに説明される。
【００４１】
［実施例］
例１
初代ヒトニューロンにおけるブリオスタチン−１の用量動態およびＰＫＣアイソザイム特異性。
【００４２】
初代ヒトニューロンにおける多様な濃度のブリオスタチン−１によるＰＫＣアイソザイム活性化が評価された。１ヶ月齢の初代ヒトニューロンが、０ｎＭ、０．０６０ｎＭ、０．１２５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭおよび１．０ｎＭのブリオスタチン１で２４時間処理された。ニューロンは、可溶性画分と膜画分に分離され、ＰＫＣαおよびＰＫＣεに対して免疫ブロットされた。ＰＫＣ活性化は、膜における総タンパクの百分率として測定され、対照に対する百分率として報告された。ＰＫＣ染色レベルは、濃度測定的に測定された。データは、３回の独立した実験の平均±標準誤差として表される（スチューデントのｔ検定、*Ｐ＜０．０５および**Ｐ＜０．００５）。
【００４３】
図１にある結果に示されているように、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣεとＰＫＣαの両方を活性化した。低濃度において、ブリオスタチン−１は、強力なＰＫＣε活性化を示した。約１ｎＭにおいて、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣεとＰＫＣαの両方の強力な活性化を示した。
【００４４】
例２
初代ヒトニューロンにおける０．２５ｎＭのブリオスタチン−１の時間動態およびＰＫＣアイソザイム特異性。
【００４５】
初代ヒトニューロンにおける０．２５ｎＭのブリオスタチン−１によるＰＫＣアイソザイム活性化が評価された。１ヶ月齢の初代ヒトニューロンが、エタノール（Ｃ）、ブリオスタチン１（０．２５ｎＭ）で１時間、４時間および２４時間処理された。ニューロンは、可溶性（Ｓ）画分と膜（Ｐ）画分に分離され、ＰＫＣα、ＰＫＣεおよびＰＫＣδに対して免疫ブロットされた。ＰＫＣ活性化は、膜における総タンパクの百分率として測定され、対照に対する百分率として報告された。ＰＫＣ染色レベルは、濃度測定的に測定された。
【００４６】
これらの結果は、図２Ａ（ウエスタンブロット）および図２Ｂ（活性化の時間経過）に示されている。ブリオスタチン−１（Ｆ（３，８）＝２２．５；ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０００３）は、１時間、４時間および２４時間においてＰＫＣ−ε活性化を誘導した。データは、３回の独立した実験の平均±標準誤差として表される（スチューデントのｔ検定、*Ｐ＜０．０５および**Ｐ＜０．００５）。
【００４７】
例３
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における０．２７ｎＭのブリオスタチン−１のＰＫＣアイソザイム特異性。
【００４８】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における０．２７ｎＭのブリオスタチン−１によるＰＫＣアイソザイム活性化が評価された。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ヒト由来の細胞系であり、ニューロンの機能および分化のインビトロモデルとして頻繁に使用される。細胞は、ブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）で、０、５、１５、３０および６０分間処理された。試料は、サイトゾル画分と膜画分に分画され、ＰＫＣアイソフォーム特異的抗体で分析された。３回の独立した実験が各試料について行われた。
【００４９】
これらの結果は、図３に示されている。ブリオスタチン−１は、ＰＫＣεとＰＫＣαの両方を活性化した。グラフ中のデータは、平均±標準誤差を表す。（スチューデントのｔ検定  *Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．００５および***Ｐ＜０．０００５）。
【００５０】
例４
他のＰＫＣ活性化因子によるＰＫＣアイソザイム活性化。
【００５１】
他のＰＫＣ活性化因子によるＰＫＣアイソザイム活性化が評価された。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ、異なる濃度のＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル（ドコサヘキサエン酸誘導体）およびＤＣＰＬＡ（リノール酸誘導体）についての結果を示す：
【００５２】
【化１】
2017510646.tif 000003
【００５３】
。ＤＨＡ−ＣＰ６−ＭＥおよびＤＣＰＬＡは、組換えＰＫＣアイソザイム（α、βＩＩ、γ、δ、および／またはε）と共に４℃で５分間インキュベートされた。ＰＫＣ活性は、３２Ｐ−ＡＴＰからヒストンへの３２Ｐ−無機リン酸の取り込みを測定することによって酵素的に測定された。
【００５４】
図４Ｃは、異なる濃度のＤＣＰＬＡ−ＭＥについての結果を示す：
【００５５】
【化２】
2017510646.tif 000004
【００５６】
。ＰＫＣ活性化の測定には、組換えＰＫＣα、εおよびδが使用された。ＤＣＰＬＡ−ＭＥで誘導される活性化は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）の非存在下で測定された。それぞれの酵素は、１０ｕＭのヒストン、４．８９ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのＥＧＴＡ、４％のグリセロール、８ｕｇ／ｍｌのアプロチニン、８ｕｇ／ｍｌのロイペプチン、２ｍＭのベンズアミジンおよび０．５ｕＣｉの［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で３７℃で１５分間インキュベートされた。［３２Ｐ］リン酸化タンパク質形成は、ホスホセルロース上への吸着によって測定された。データは、３回の独立した実験の平均±標準誤差として表される（スチューデントのｔ検定、*Ｐ＜０．０５および**Ｐ＜０．００５）。
【００５７】
例５
マウス脳におけるブリオスタチン−１によるＰＫＣ活性化。
【００５８】
マウスは、３、５、１０、２０、および４０μｇ／ｍ2の用量のＤＭＳＯ中ブリオスタチン−１で尾静脈に注射された。３０または１２０分後、脳は凍結され、次いで、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中でホモジナイズされた。ホモジェネートは、超遠心分離によってサイトゾル画分と膜画分に分画された。画分は、アイソザイム特異的抗体を使用したウエスタンブロッティングによって分析された。これらの結果は、図５Ａ（３０分）および５Ｂ（１２０分）に示されている。
【００５９】
例６
マウス脳におけるブリオスタチン−１によるＰＫＣ活性化の時間経過。
【００６０】
マウスは、１０または１５μｇ／ｍ2の用量のＤＭＳＯ中ブリオスタチン−１で尾静脈に注射された。１５、３０、６０、または１２０分後、脳は凍結され、次いで、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中でホモジナイズされた。ホモジェネートは、超遠心分離によってサイトゾル画分と膜画分に分画された。画分は、ＰＫＣイプシロン特異的抗体（図６Ａ）またはＰＫＣアルファ特異的抗体（図６Ｂ）を使用したウエスタンブロッティングによって分析された。ＰＫＣ染色レベルは、濃度測定的に測定された。
【００６１】
実験手順
初代ヒト皮質ニューロンの培養：ヒト初代ニューロン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたプレート上に播種され、ニューロン増殖サプリメント（ＮＧＳ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で補われたニューロン培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で維持された。ニューロンの維持のために、培地の半分が３日毎に交換された。培地交換毎に新しい活性化因子が添加された。
【００６２】
細胞培養および処理：ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロブラストーマ細胞（ＡＴＣＣ）は、４５％のＦ１２Ｋ、４５％のＤＭＥＭおよび１０％のＦＢＳ中で培養された。
【００６３】
細胞溶解およびウエスタンブロット分析：細胞は、１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＦおよび２０μＭのロイペプチンを含むホモジナイジングバッファー（ＨＢ）中に回収され、超音波処理によって溶解された。ホモジェネートは、１００，０００×ｇで４℃で１５分間遠心分離され、サイトゾル画分（上清）および膜（ペレット）が得られた。ペレットは、超音波処理によってＨＢ中に再懸濁された。タンパク質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して測定された。定量後、各試料からの２０μｇのタンパク質が、４〜２０％勾配トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけられた。分離されたタンパク質は、次いで、ニトロセルロース膜に移された。膜は、ＢＳＡでブロッキングされ、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートされた。インキュベーション後、それは、ＴＢＳ−Ｔ（トリス−緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄され、アルカリホスファターゼがコンジュゲートされた１：１００００希釈の二次抗体と共に４５分間さらにインキュベートされた。この膜は、ＴＢＳ−Ｔで３回最終的に洗浄され、１ステップＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して現像された。ブロットはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＲＴ−ＥＣＬ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において画像化され、濃度測定による定量化はＩＭＡＬソフトウェアを使用して行われた。タンパク質の発現を定量化するために、目的のタンパク質についての濃度測定値は、ベータ−アクチン（ローディング対照）に対して標準化された。
【００６４】
ＰＫＣアッセイ：ＤＣＰＬＡ−ＭＥによるＰＫＣ活性化の測定には、組換えＰＫＣアルファ、ＰＫＣイプシロンおよびＰＫＣデルタ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）の活性化が使用された。ＤＣＰＬＡ−ＭＥで誘導される活性化は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）の非存在下で測定された。それぞれの酵素は、１０ｕＭのヒストン、４．８９ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのＥＧＴＡ、４％のグリセロール、８ｕｇ／ｍｌのアプロチニン、８ｕｇ／ｍｌのロイペプチン、２ｍＭのベンズアミジンおよび０．５ｕＣｉの［ガンマ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で３７℃で１５分間インキュベートされた。［３２Ｐ］リン酸化タンパク質形成は、ホスホセルロース上への吸着によって測定された。
【００６５】
本発明の他の態様は、本明細書の熟考およびここに開示されている本発明の実施から当業者に明らかとなる。本明細書および例は単に例示的なものとしてみなされることが意図され、本発明の真の範囲および趣旨は添付の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
2017510646.tif 000005
【図２Ａ】
2017510646.tif 000006
【図２Ｂ】
2017510646.tif 000007
【図３】
2017510646.tif 000008
【図４Ａ】
2017510646.tif 000009
【図４Ｂ】
2017510646.tif 000010
【図４Ｃ】
2017510646.tif 000011
【図５Ａ】
2017510646.tif 000012
【図５Ｂ】
2017510646.tif 000013
【図６Ａ】
2017510646.tif 000014
【図６Ｂ】
2017510646.tif 000015
【図７】
2017510646.tif 000016
【図８】
2017510646.tif 000017
【国際調査報告】
2017510646.tif 000018
2017510646.tif 000019
2017510646.tif 000020