(57)【要約】  本発明は、対象の網膜変性に関連する疾患の治療に使用するための、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、及びその一部、並びに前記突然変異をコードする核酸に関し、前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、イソメロヒドロラーゼ活性を有する。遺伝子治療を必要とする哺乳類対象における網膜変性に関連する疾患を治療するための遺伝子治療法は、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部をコードする核酸を含むベクターの治療有効量を、前記対象に投与することを含む。そのような治療を必要とする対象における網膜変性に関連する疾患を治療するための方法は、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部の少なくとも１つの治療有効量を前記対象に投与することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７の少なくとも１つと少なくとも９０％の同一性を有し、そして１７０位、及び２９７位の少なくとも１つにおいて、アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部であって、前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、イソメロヒドロラーゼ活性を有する、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項２】
前記１７０位でのアミノ酸置換が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓであり、そして前記２９７位でのアミノ酸置換が、Ｇｌｙ、又はＡｌａである、請求項１に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項３】
２位、３位、及び２６位の少なくとも１つにアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項４】
前記２位でのアミノ酸置換が、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓであり、前記３位でのアミノ酸置換が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＣｙｓであり、そして前記２６位でのアミノ酸置換が、Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＩｌｅである、請求項３に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項５】
２位、３位、２６位、１７０位、及び２９７位にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項６】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、非突然変異ＲＰＥ６５タンパク質よりも高いイソメロヒドロラーゼ活性を有する、請求項１に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項７】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＲＰＥ６５、又は配列番号９のアミノ酸配列を有するウシＲＰＥ６５よりも高いイソメロヒドロラーゼ活性を有する、請求項１に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項８】
医薬的に許容される担体、又はビヒクル中に配置された、請求項１に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部を含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部をコードする核酸。
【請求項１０】
前記１７０位でのアミノ酸置換が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓであり、そして前記２９７位でのアミノ酸置換が、Ｇｌｙ、又はＡｌａである、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、さらに２位、３位、及び２６位の少なくとも１つにアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記２位でのアミノ酸置換が、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓであり、前記３位でのアミノ酸置換が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＣｙｓであり、そして前記２６位でのアミノ酸置換が、Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＩｌｅである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、２位、３位、２６位、１７０位、及び２９７位にアミノ酸置換を含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１４】
ベクター内に配置された、請求項９に記載の核酸。
【請求項１５】
前記ベクターが、前記核酸に作動可能に連結されたプロモーター、若しくはエンハンサー配列を含むか、又は前記核酸の３’に位置する終止コドン、若しくはポリＡ配列を含む、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記ベクターが、前記核酸に作動可能に連結されたＲＰＥ６５プロモーター配列を含む、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１７】
前記ベクターが、前記核酸に作動可能に連結されたＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ‐アクチンプロモーター配列を含む、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１８】
前記ベクターが、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、ナノ粒子、プラスミド、及びレンチウィルスからなる群から選択される、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部をコードする核酸を含む、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項２０】
請求項９〜１７のいずれか1項に記載の核酸を含む、ＡＡＶベクター。
【請求項２１】
前記ベクターが、１つ以上のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）配列を含む、請求項１９、又は２０に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２２】
前記１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ‐２ｉ８ ＡＡＶ血清型のいずれかのＩＴＲ配列、又はそれら由来のＩＴＲ配列の混合物を含む、請求項２１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２３】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶカプシド配列を含む、請求項２１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２４】
前記ＡＡＶカプシド配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ‐２ｉ８のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列と少なくとも９０％の同一性を有する、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３カプシド配列を含む、請求項２３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれか1項に記載のＡＡＶベクターを産生する、細胞。
【請求項２６】
遺伝子治療を必要とする哺乳類対象における網膜変性に関連する疾患を治療するための遺伝子治療法であって、前記治療法が、以下の工程：
突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部をコードする核酸を含むベクターの治療有効量を前記対象に投与する
ことを含み、ここで前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、前記対象の網膜細胞において、インビボで発現し、そしてイソメロヒドロラーゼ活性を有する、治療法。
【請求項２７】
前記核酸によってコードされる前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７の少なくとも１つと少なくとも９０％の同一性を有し、そして１７０位、及び２９７位の少なくとも１つにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の遺伝子治療法。
【請求項２８】
前記１７０位でのアミノ酸置換が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓであり、そして前記２９７位でのアミノ酸置換が、Ｇｌｙ、又はＡｌａである、請求項２７に記載の遺伝子治療法。
【請求項２９】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、さらに２位、３位、及び２６位の少なくとも１つにアミノ酸置換を含む、請求項２７に記載の遺伝子治療法。
【請求項３０】
前記２位でのアミノ酸置換が、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓであり、前記３位でのアミノ酸置換が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＣｙｓであり、そして前記２６位でのアミノ酸置換が、Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＩｌｅである、請求項２７に記載の遺伝子治療法。
【請求項３１】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、非突然変異ＲＰＥ６５タンパク質より高いイソメロヒドロラーゼ活性を有する、請求項２６に記載の遺伝子治療法。
【請求項３２】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＲＰＥ６５、又は配列番号９のアミノ酸配列を有するウシＲＰＥ６５よりも高いイソメロヒドロラーゼ活性を有する、請求項２６に記載の遺伝子治療法。
【請求項３３】
前記ベクターが、前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質をコードする前記核酸に作動可能に連結されたプロモーター、若しくはエンハンサー配列をさらに含むか、又は前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質をコードする前記核酸の３’に位置する終止コドン、若しくはポリＡ配列をさらに含む、請求項２６に記載の遺伝子治療法。
【請求項３４】
前記ベクターが、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、ナノ粒子、プラスミド、及びレンチウィルスからなる群から選択される、請求項２６に記載の遺伝子治療法。
【請求項３５】
前記ベクターが、１つ以上のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）配列を含むＡＡＶベクターを含む、請求項２６に記載の遺伝子治療法。
【請求項３６】
前記ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ‐２ｉ８ ＡＡＶ血清型のいずれかのＩＴＲ配列、又はそれら由来のＩＴＲ配列の混合物を含む、請求項３５に記載の遺伝子治療法。
【請求項３７】
前記ベクターが、ＡＡＶカプシド配列を含む、請求項２６に記載の遺伝子治療法。
【請求項３８】
前記ＡＡＶカプシド配列が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ‐２ｉ８のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列と少なくとも９０％の同一性を有する、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３カプシド配列を含む、請求項３７に記載の遺伝子治療法。
【請求項３９】
前記網膜変性に関連する疾患が、レーバー先天性黒内障、又は網膜色素変性症である、請求項２６に記載の遺伝子治療法。
【請求項４０】
治療を必要とする対象における網膜変性に関連する疾患の治療法であって、前記治療法が、以下の工程：
少なくとも１つの突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部の治療有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象の網膜変性に関連する前記疾患を緩和する
ことを含み、前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、イソメロヒドロラーゼ活性を有する、治療法。
【請求項４１】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７の少なくとも１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、１７０位、及び２９７位の少なくとも１つにアミノ酸置換を有する、請求項４０に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項４２】
前記１７０位でのアミノ酸置換が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓであり、そして前記２９７位でのアミノ酸置換が、Ｇｌｙ、又はＡｌａである、請求項４１に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項４３】
前記突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質が、２位、３位、及び２６位の少なくとも１つにアミノ酸置換をさらに含む、請求項４１に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項４４】
前記２位でのアミノ酸置換が、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓであり、前記３位でのアミノ酸置換が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＣｙｓであり、そして前記２６位でのアミノ酸置換が、Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＩｌｅである、請求項４１に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項４５】
前記網膜変性に関連する疾患が、レーバー先天性黒内障、又は網膜色素変性症である、請求項４０に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項４６】
前記対象がヒトである、請求項２６〜４５のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項４７】
前記対象が、１８才未満、１５才未満、１２才未満、１０才未満、約８才〜１０才の間、約６才〜１０才の間、約４才〜６才の間、約１才〜３才の間、又は１才未満である、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項４８】
前記対象が、ＲＰＥ６５突然変異による網膜変性、又はジストロフィーを有するか、又はＲＰＥ６５突然変異による網膜変性、又はジストロフィーを有するリスクがある、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項４９】
前記ベクターが、前記対象の１つ以上の眼に投与される、請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５０】
前記ベクターが、前記対象の１つ以上の眼の網膜下腔、及び／又は脈絡膜上腔に投与される、請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５１】
前記ベクターが、ＡＡＶベクターを含み、ここで１×１０８個以上のＡＡＶベクターゲノムが、前記対象の１つ以上の眼に投与される、請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５２】
前記ベクターが、ＡＡＶベクターを含み、ここで約１×１０８個〜約１×１０１４個のＡＡＶベクターゲノムが、前記対象の１つ以上の眼に投与される、請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５３】
前記ベクターが、ＡＡＶベクターを含み、そして約１×１０９個〜約１×１０１３個のＡＡＶベクターゲノムが、前記対象の１つ以上の眼に投与される、請求項２６〜３９のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５４】
前記ベクター、又は突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、約１０μｌ〜約１０００μｌの容量で投与される、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５５】
前記ベクター、又は突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、約５０μｌ〜約８００μｌの容量で投与される、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５６】
前記ベクター、又は突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、約１００μｌ〜約６００μｌの容量で投与される、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５７】
前記ベクター、又は突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、約２００μｌ〜約５００μｌの容量で投与される、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５８】
前記ベクター、又は突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部が、前記対象の１つ以上の眼の網膜色素上皮の細胞に送達されるか、又は導入される、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の網膜変性に関連する疾患の治療法。
【請求項５９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７の少なくとも１つと少なくとも９０％の同一性を有し、そして野生型ヒトＲＰＥ６５と比較して、イソメロヒドロラーゼ活性の約２倍〜約６倍の増加をもたらす少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、アミノ酸配列を含む、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項６０】
前記イソメロヒドロラーゼ活性の約２倍〜約６倍の増加が、インビトロ イソメロヒドロラーゼ活性アッセイによって決定される、請求項５９に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項６１】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、１７０位でのＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓである、請求項５９に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項６２】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、２９７位でのＧｌｙ、又はＡｌａである、請求項５９に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項６３】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、１７０位でのＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓ置換、及び２９７位でのＧｌｙ、又はＡｌａ置換を含む、請求項５９に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項６４】
前記アミノ酸置換が、野生型ヒトＲＰＥ６５と比較して、イソメロヒドロラーゼ活性の約３．２倍の増加をもたらす、請求項６３に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項６５】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、１７０位でのＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓ置換、２９７位でのＧｌｙ、又はＡｌａ置換、２位でのＴｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓ置換、３位でのＳｅｒ、Ｔｈｒ、又はＣｙｓ置換、及び２６位でのＶａｌ、Ａｌａ、又はＩｌｅ置換を含む、請求項５９に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【請求項６６】
前記アミノ酸置換が、野生型ヒトＲＰＥ６５と比較して、イソメロヒドロラーゼ活性の約４．４倍の増加をもたらす。請求項６５に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本願は、２０１４年７月３１日に出願された米国仮出願第６２／０３１，４７２号に対する優先権を主張し、そして当該出願は、その全体が参照により本明細書中に明確に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所の補助金ＥＹ０１２２３１、ＥＹ０１８６５９、ＥＹ０１９３０９、及びＧＭ１０４９３４（ＩＲＲＦからの助成金）によって補助された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）は、眼の中のビタミンAの代謝、及び正常視力の維持のために不可欠である。それは、視物質の発色団の前駆体である、１１‐シスレチノール（１１ｃＲＯＬ）へのオールトランスレチニルエステルの異性化を触媒する、重要なレチノイド視覚サイクル酵素である。ＲＰＥ６５の変異は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、及び網膜色素変性症（ＲＰ）などの遺伝性網膜ジストロフィーに関連している。以前のＲＰＥ６５遺伝子置換療法は、イヌ、及びマウスモデルのＲＰＥ６５ヌル突然変異体において、網膜変性に有望な効果を示した。しかしながら、ヒトＲＰＥ６５（ｈＲＰＥ６５）のような哺乳類ＲＰＥ６５は、他のレチノイドプロセシング酵素よりも低い比活性を有し、そしてＲＰＥ中の多量のＲＰＥ６５（ウシにおいて、１１μｇ／眼）は、従って、正常な視覚のために十分な１１‐シスレチノイドを生成することを必要とする。高レベルのｈＲＰＥ６５に対するこの要求は、ＲＰＥ６５遺伝子治療の有効性を制限する。
【０００４】
眼組織に、インタクトなＤＮＡ（又はレポーター遺伝子）を送達するために、アデノウィルス（ＡＤ）、組み換えアデノ随伴ウィルス（ｒＡＡＶ）、レンチウィルス、ナノ粒子に組み込まれたプラスミド、及びエレクトロポレーションを伴うプラスミドＤＮＡのような遺伝子送達のためのいくつかのベクターが用いられてきた。ＡＤ、及びＧＦＰを発現するレンチウィルスベクターを用いた網膜下腔への遺伝子送達は、広く分布したＧＦＰ発現を示した。野生型（ｗｔ）のヒトＲＰＥ６５（ｒＡＡＶ‐ｈＲＰＥ６５）を発現するｒＡＡＶを用いた最近のヒト臨床試験は、ＲＰ、及びＬＣＡ患者における視力のわずかな改善しか示さなかった。しかしながら、成功した遺伝子送達にもかかわらず、従前のＲＰＥ６５遺伝子治療法は、完全な視力回復を、成功裏にもたらしたことはない。
【発明の概要】
【０００５】
開示された本発明の概念は、限定されないが、配列番１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７の少なくとも１つと少なくとも９０％の同一性を有し、イソメロヒドロラーゼ（ｉｓｏｍｅｒｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）活性を有し、そして１７０位、及び２９７位の少なくとも１つでアミノ酸の置換を有する、アミノ酸配列を含む、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部を含む。
【０００６】
特定の非限定的な実施態様では、１７０位におけるアミノ酸置換は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓであってもよい。
【０００７】
特定の非限定的な実施態様では、２９７位におけるアミノ酸置換は、Ｇｌｙ、又はＡｌａであってもよい。
【０００８】
特定の非限定的な実施態様では、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、２位、３位、及び２６位における１つ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。
【０００９】
特定の非限定的な実施態様では、２位におけるアミノ酸置換は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓであってもよい。
【００１０】
特定の非限定的な実施態様では、3位におけるアミノ酸置換は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＣｙｓであってもよい。
【００１１】
特定の非限定的な実施態様では、２６位におけるアミノ酸置換は、Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＩｌｅであってもよい。
【００１２】
特定の非限定的な実施態様では、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、２位、３位、２６位、１７０位、及び２９７位のそれぞれにおけるアミノ酸置換を含んでもよく、これらは、例えば、本明細書中に記載のものであってもよい。
【００１３】
特定の非限定的な実施態様では、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、非突然変異ＲＰＥ６５タンパク質よりも優れたイソメロヒドロラーゼ活性を有する。
【００１４】
特定の非限定的な実施態様では、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＲＰＥ６５、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するウシＲＰＥ６５よりも優れたイソメロヒドロラーゼ活性を有する。
【００１５】
本明細書中には、医薬的に許容される担体、又はビヒクル中に配置された、本明細書中に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部を含む、医薬組成物も開示される。
【００１６】
本明細書中には、本明細書中に記載される突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部をコードする核酸も開示される。
【００１７】
特定の非限定的な実施態様では、核酸は、ベクター内に配置されてもよい。
【００１８】
特定の非限定的な実施態様では、ベクターは、核酸に作動可能に連結されたプロモーター、又はエンハンサー配列を含み、及び／又は核酸の３’に位置する終止コドン、又はポリＡ配列を含む。
【００１９】
特定の非限定的な実施態様では、ベクターは、核酸に作動可能に連結されたＲＰＥ６５プロモーター配列を含み、及び／又は核酸に作動可能に連結されたＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ‐アクチンプロモーター配列を含む。
【００２０】
特定の非限定的な実施態様では、ベクターは、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、ナノ粒子、プラスミド、及びレンチウィルスからなる群から選択される。
【００２１】
本明細書中には、本明細書中に記載される核酸を含むＡＡＶベクターも開示される。
【００２２】
特定の非限定的な実施態様では、ベクターは、１つ以上のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）配列を含む。
【００２３】
特定の非限定的な実施態様では、ＡＡＶ ＩＴＲは、任意のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ‐２ｉ８ ＡＡＶ血清型、又はそれらに由来するＩＴＲの混合物のＩＴＲ配列を含む。
【００２４】
特定の非限定的な実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシド配列を含む。
【００２５】
特定の非限定的な実施態様では、ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ‐２ｉ８のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列と、少なくとも９０％の同一性を有する、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３カプシド配列を含む。
【００２６】
開示された本発明の概念のＡＡＶベクターを産生する細胞も、また開示される。
【００２７】
突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部をコードする核酸を含むベクターの医薬的に有効な量を対象に投与することにより、そのような治療を必要とする哺乳類対象における網膜変性に関連する症状を治療する遺伝子治療法が開示され、ここで、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はこの一部は、対象の網膜細胞において、インビボで発現され、そしてイソメロヒドロラーゼ活性を有する。そのような遺伝子治療法に使用されるベクター、核酸、及び突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、本明細書中に記載のものを含んでもよい。
【００２８】
少なくとも１つの本明細書中に記載の突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部の医薬的に有効な量を対象に投与することにより、そのような治療を必要とする対象における網膜変性に関連する症状を治療する方法が開示され、それにより、対象における網膜変性に関連する症状を緩和する。
【００２９】
特定の非限定的な実施態様では、網膜変性に関連する疾患は、レーバー先天性黒内障、又は網膜色素変性である。
【００３０】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、治療対象は、ヒトである。
【００３１】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、対象は、１８歳未満、１５歳未満、１２歳未満、１０歳未満、約８〜１０歳の間、約６〜１０歳の間、約４〜６歳の間、約１〜３歳の間、又は1歳未満である。
【００３２】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、対象は、ＲＰＥ６５突然変異によって引き起こされる網膜変性、又はジストロフィーを有するか、又はそのリスクを有する可能性がある。
【００３３】
本明細書中に記載される方法の特定の非限定的な実施態様では、使用されるベクターは、対象の１つ以上の眼に投与されてもよい。
【００３４】
本明細書中に記載される方法の特定の非限定的な実施態様では、使用されるベクターは、対象の１つ以上の眼の網膜下腔、及び／又は脈絡膜上腔に投与されてもよい。
【００３５】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、使用されるベクターは、ＡＡＶベクターである。
【００３６】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、約１×１０８個以上のＡＡＶベクターゲノムが、対象の1つ以上の眼に投与される。
【００３７】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、約１×１０８個〜約１×１０１４個のＡＡＶベクターゲノムが、対象の１つ以上の眼に投与される。
【００３８】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、約１×１０９個〜約１×１０１３個のＡＡＶベクターゲノムが、対象の1つ以上の眼に投与される。
【００３９】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、ベクター、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、約１０マイクロリットル（μｌ）〜約１０００μｌの容量で投与される。
【００４０】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、ベクター、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、約５０μｌ〜約８００μｌの容量で投与される。
【００４１】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、ベクター、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、約１００μｌ〜約６００μｌの容量で投与される。
【００４２】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、ベクター、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、約２００μｌ〜約５００μｌの容量で投与される。
【００４３】
本明細書中に記載の方法の特定の非限定的な実施態様では、本明細書中に記載のベクター、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部は、対象の１つ以上の眼の網膜色素上皮細胞に送達されるか、又は導入される。
【００４４】
開示された本発明の概念の特定の実施態様は、限定されないが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７の少なくとも１つと少なくとも９０％の同一性を有し、そして野生型ヒトＲＰＥ６５と比較して、イソメロヒドロラーゼ活性の約２倍〜約６倍の増加をもたらす、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、突然変異哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質、又はその一部を含む。
【００４５】
特定の非限定的な実施態様では、イソメロヒドロラーゼ活性の約２倍〜約６倍の増加は、インビトロ イソメロヒドロラーゼ活性アッセイによって決定される。
【００４６】
特定の非限定的な実施態様では、アミノ酸置換は、１７０位でのＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓであり、及び／又は２９７位でのＧｌｙ、又はＡｌａである。
【００４７】
特定の非限定的な実施態様では、アミノ酸置換は、野生型ヒトＲＰＥ６５と比較して、イソメロヒドロラーゼ活性の約３．２倍の増加をもたらす。
【００４８】
特定の非限定的な実施態様では、アミノ酸置換は、１７０位でのＬｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓ置換、２９７位でのＧｌｙ、又はＡｌａ置換、２位でのＴｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓ置換、３位でのＳｅｒ、Ｔｈｒ、又はＣｙｓ置換、２６位でのＶａｌ、Ａｌａ、又はＩｌｅ置換を含む。
【００４９】
特定の非限定的な実施態様では、アミノ酸置換は、野生型ヒトＲＰＥ６５と比較して、イソメロヒドロラーゼ活性の約４．４倍の増加をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
開示される本発明の概念のいくつかの実施態様が、添付図面に示されている。しかしながら、添付の図面は、いくつかの典型的な実施態様を示しているだけであり、従って、本発明の概念の範囲を限定するものではないと考えられることに留意されたい。さらに、添付の図面では、共通、又は類似の要素を識別するために同じ、又は同様の参照番号が使用されてもよく、そのような要素のすべてに番号が付けられているわけではない。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、図の特定の特徴、及び特定の図は、明瞭さ、及び簡潔さのために、縮尺で誇張されているか、概略図で示されている。
【００５１】
【図１】図１は、野生型（ｗｔ）ヒトＲＰＥ６５（ｈＲＰＥ６５）、及びニワトリＲＰＥ６５（ｃＲＰＥ６５）のアミノ酸配列アライメントを示す。ｈＲＰＥ６５のものと同一のｃＲＰＥ６５のアミノ酸残基を、ドット「・」で示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＲＰＥ６５（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＲＰＥ６５（配列番号２）をコードする核酸配列を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ニワトリＲＰＥ６５（配列番号３）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ニワトリＲＰＥ６５（配列番号４）をコードする核酸配列を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、カニクイザルＲＰＥ６５（配列番号５）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、カニクイザルＲＰＥ６５（配列番号６）をコードする核酸配列を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ミドリザルＲＰＥ６５（配列番号７）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ミドリザルＲＰＥ６５（配列番号８）をコードする核酸配列を示す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、ウシＲＰＥ６５（配列番号９）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、ウシＲＰＥ６５（配列番号１０）をコードする核酸配列を示す。
【図２Ｋ】図２Ｋは、ヤギＲＰＥ６５（配列番号１１）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｌ】図２Ｌは、ヤギＲＰＥ６５（配列番号１２）をコードする核酸配列を示す。
【図２Ｍ】図２Ｍは、イヌＲＰＥ６５（配列番号１３）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｎ】図２Ｎは、イヌＲＰＥ６５（配列番号１４）をコードする核酸配列を示す。
【図２Ｏ】図２Ｏは、イエネコＲＰＥ６５（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｐ】図２Ｐは、イエネコＲＰＥ６５（配列番号１６）をコードする核酸配列を示す。
【図２Ｑ】図２Ｑは、ラットＲＰＥ６５（配列番号１７）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｒ】図２Ｒは、ラットＲＰＥ６５（配列番号１８）をコードする核酸配列を示す。
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａ‐３Ｄは、ヒト、及びニワトリ由来のＲＰＥ６５の発現、及び酵素活性を示す。ｗｔ ｈＲＰＥ６５、ｃＲＰＥ６５、及び赤色蛍光タンパク質（ｒｆｐ、陰性対照）を発現するプラスミドを、２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞に別々にトランスフェクトした。ｈＲＰＥ６５、及びｃＲＰＥ６５の発現レベル、及び酵素活性を、ウェスタンブロット分析（Ａ、Ｐｃ；ウシＲＰＥミクロソームタンパク質（２．５μｇ）、Ｎｃ；Ｒｆｐ、Ｈｕｍ；ｈＲＰＥ６５、及びＣｈｋ；ｃＲＰＥ６５、それぞれ２０μｇ）、及びインビトロ イソメロヒドロラーゼ活性アッセイのそれぞれにより、測定した。オールトランス‐［３Ｈ］レチノール（０．２μＭ）を、ｒｅｐ（Ｂ）、ｈＲＰＥ６５（Ｃ）、及びｃＲＰＥ６５（Ｄ）を発現する細胞由来の１２５μｇの全細胞タンパク質と、２時間インキュベートし、そして生じたレチノイドを、ＨＰＬＣにより分析した。ピーク１は、レチニルエステルであり、ピーク２は、１１ｃＲＯＬである。
【図４Ａ−４Ｇ】図４Ａ‐４Ｇは、ＲＰＥ６５のイソメロヒドロラーゼ活性、及びタンパク質レベルに対する部位特異的突然変異の影響を示す。ｗｔ ｈＲＰＥ６５、及びｃＲＰＥ６５を発現するプラスミド、並びに示されたｈＲＰＥ６５突然変異体を、２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞に別々にトランスフェクトし、４８時間培養した（Ａ‐Ｄ）。細胞溶解物（２０μｇ）由来の等量の全タンパク質を、ローディング対照として抗‐β‐アクチンを用い、ＲＰＥ６５に特異的な抗体を使用するウェスタンブロットのために使用した（Ａ；単一、Ｂ；二重、Ｃ；三重、及び四重（第一実験セットにおける突然変異体）、並びにＤ；単一、Ｅ；二重（第二実験セットにおける突然変異体）、Ｐｃ；陽性対照（ウシＲＰＥミクロソームタンパク質、２．５μｇ）、Ｎｃ；陰性対照（赤色蛍光タンパク質）、ＷＴ；ｗｔ ｈＲＰＥ６５）。ＲＰＥ６５レベルを、デンシトメトリーによって半定量化し、β‐アクチンレベルによって正規化した（Ｆ、及びＧ）。インビトロ活性アッセイを、ウェスタンブロット分析のサンプルと同じバッチで実施した。イソメロヒドロラーゼ活性を、３つの独立した測定由来の生じた１１‐［３Ｈ］‐シス レチノールによって定量し、そしてそれらの相対的なＲＰＥ６５タンパク質レベルによって正規化した。値を、相対活性として示す（％ｈＲＰＥ６５活性、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。酵素活性表において（Ｆ、及びＧ）、ヒト（○）、及びニワトリ（●）の残基を、白黒の円でそれぞれ示す。縦の数字は、候補残基の位置を示す。表中のパネルの上下の文字（Ｆ、及びＧ）は、それぞれ示された位置のｈＲＰＥ６５、及びｃＲＰＥ６５アミノ酸残基を表す（例えば、第一実験セット（Ｆ）の表中の「●●○●」は、ｈＲＰＥ６５の三重突然変異体（Ｔ３９Ｒ／Ｎ１７０Ｋ／Ｑ４９７Ｐ）を示す。
【図５Ａ−５Ｃ】図５Ａ‐５Ｃは、キメラヒトＲＰＥ６５突然変異体の模式図、及びそれらの酵素活性を示す。（Ａ）各断片、及び特定の制限部位における候補部位の位置を図に示す（白棒；ｈＲＰＥ６５、灰色棒；ｃＲＰＥ６５、Ｆ１‐Ｆ６；対応するｃＲＰＥ６５断片で置換されたキメラｈＲＰＥ６５）。（Ｂ）ｈＲＰＥ６５、ｃＲＰＥ６５、及びキメラの発現レベルを、ウェスタンブロット分析によって測定し（Ｐｃ；２．５μｇのウシＲＰＥミクロソームタンパク質、Ｈｕｍ由来の２０μｇの全細胞タンパク質；ｈＲＰＥ６５、Ｃｈｋ；ｃＲＰＥ６５、及びＦ１‐Ｆ６）、そしてＲＰＥ６５のタンパク質レベルを、デンシトメトリーで半定量化した（Ｃ）。酵素活性を、インビトロ イソメロヒドロラーゼアッセイにより測定し、そして生じた１１‐［３Ｈ］‐シス レチノールを使用して定量し、そしてそれらの相対的なＲＰＥ６５タンパク質レベルにより正規化した（Ｃ）。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ‐６Ｂは、部位特異的突然変異、及びｃＲＰＥ６５のものとのフラグメント置換の、ｈＲＰＥ６５のタンパク質レベル、及び酵素活性に対する影響を示す。本研究（Ｎ１７０Ｋ、及びＫ２９７Ｇ）、並びにＦ1キメラで同定された部位特異的突然変異体を組み合わせて、突然変異体ｓＩＭＨ（Ｆ１／Ｎ１７０Ｋ／Ｋ２９７Ｇ）を作製した。同定された点突然変異体、及びＲＰＥ６５のＦ１キメラを、２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞で発現させた。トランスフェクションの４８時間後に細胞を採取し、ウェスタンブロット分析によりＲＰＥ６５のタンパク質レベルを確認した（Ａ）。酵素活性を、インビトロ イソメロヒドロラーゼアッセイにより測定し、生じた１１‐［３H］‐シス レチノールにより定量した（Ｂ）。イソメロヒドロラーゼ活性を、生じた１１‐［３H］‐シス レチノールによって定量し（ピコモル／時間）、そして％ｗｔ ｈＲＰＥ６５活性として示した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ‐７Ｃは、ｗｔ ｈＲＰＥ６５、及びｓＩＭＨに対する触媒効率の分析を示す。ｈＲＰＥ６５、及びｓＩＭＨを発現するアデノウィルスを調製した。ｗｔ ｈＲＰＥ６５、及びｓＩＭＨを、ＭＯＩ １００で、２４時間、２９３Ａ（ＬＲＡＴなし）細胞で、別々に発現させ、そしてその発現を、ウェスタンブロット分析によって評価した（Ａ）。インビトロ酵素アッセイにおいて、全細胞タンパク質溶解物（１２５μｇ）を含むリポソーム中の、様々な濃度の基質を適用し、ｗｔ ｈＲＰＥ６５（Ｂ）、及びｓＩＭＨ（Ｃ）のＫｍ、及びＶｍａｘを、それぞれ１１ｃＲＯＬ生成のミカエリス‐メンテンプロットを介して計算した。
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ‐８Ｃは、ＲＰＥ６５の３Ｄ構造モデルにおける、Ａｓｎ１７０、及びＬｙｓ２９７の位置、並びにＦ１断片を示す。同定された２つの重要な残基の位置、及びＦ１断片を、ウシＲＰＥ６５（ＰＤＢ受託番号：３ＦＳＮ）の結晶構造に基づく３Ｄモデルに示す。触媒ドメイン内の鉄結合部位を、オレンジ色の点線の円で示す。パルミチル化（ｐａｌｍｉｔｙｌａｔｅｄ）されたＣｙｓ残基（Ｃｙｓ１１２）を含む、不規則なセグメント（Ｐｈｅ１０９‐Ｖａｌ１２６）を、ピンクの点線で示す。活性部位を含む疎水性トンネルの入口を、赤の点線の円で示す。Ｆ１フラグメントの位置を、黄色の点線で示す。Ａｓｎ１７０、及びＬｙｓ２９７残基は両方とも、潜在的な触媒ドメイン（Ｃ）において、タンパク質（Ａ、及びＢ）の表面上、及び鉄‐ＩＩから２０Å以上離れて位置する。
【図９】図９は、哺乳類ＲＰＥ６５配列の様々な位置における、代替の突然変異置換の非限定的な例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
例示的な説明、実施例、及び結果として、開示された本発明の概念のＲＰＥ６５突然変異体、及び方法の様々な実施態様をより詳細に記載する前に、開示された本発明の概念は、以下の説明に記載されている方法、及び組成の詳細に適用することに限定されないことが理解されるべきである。開示された本発明の概念は、他の実施態様が可能であるか、又は様々な方法で実施、若しくは実行されることが可能である。このように、本明細書中で使用される言語は、可能な限り最も広い範囲、及び意味を与えられるように意図されている。実施態様は例示的であり、網羅的ではないことを意味する。また、本明細書中で使用される表現、及び用語は、説明のためのものであり、そうでないと示されない限り、限定的であると見なされるべきではないことを理解されたい。さらに、以下の詳細な説明では、本開示のより完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が示される。しかしながら、当業者であれば、本発明の概念がこれらの特定の詳細なしに実施されてもよいことは当業者には明らかであろう。他の例では、当業者に周知の特徴は、説明の不必要な複雑化を避けるために詳細には説明されていない。
【００５３】
本明細書中において他に定義されない限り、本発明の概念に関連して使用される科学用語、及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００５４】
本明細書中で言及された全ての特許、公開された特許出願、及び非特許文献は、開示された本発明の概念が関係する当業者の技術水準を示すものである。本願の任意の部分で参照された全ての特許、公開された特許出願、及び非特許文献は、あたかもそれぞれの個々の特許、又は文献が、具体的かつ個々に参照により組み込まれるように示されているのと同じように、それら全体が参照により、明確に本明細書中に組み込まれる。
【００５５】
本明細書中に開示される組成物、その製造方法、及びその適用方法のすべては、本開示に照らして過度の実験をすることなく、作製、及び実行することができる。開示された本発明の概念の組成物、及び方法は、特定の実施態様に関して記載されているが、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載された組成物、及び／又は方法、方法中の工程、又は工程の順序に、変形が適用されてもよいことは、当業者には明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換、及び修飾は、本明細書中で定義される本発明の概念の精神、範囲、及び概念の範囲内であるとみなされる。
【００５６】
開示された方法、及び組成物に従って使用される場合、以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【００５７】
特許請求の範囲、及び／又は明細書中の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用される場合、単語「ａ」、又は「ａｎ」の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味してもよいが、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」、及び「１つ又は複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」の意味でも矛盾しない。特許請求の範囲中の用語「又は（ｏｒ）」の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されていない限り、又は本開示は、代替物のみ、及び「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を指す定義を支持するが、代替物が相互に排他的である場合を除いて、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するために使用される。用語「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」の使用は、１つ以上の任意の量を含むと理解され、限定されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、又はそれらに含まれる任意の整数が挙げられる。用語「少なくとも1つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、それが添えられている用語に応じて、１００、又は１０００以上まで拡張されてもよい。また、１００／１０００の量は、より高い限界も満足のいく結果を生み出す可能性があるので、制限するとみなされるべきではない。さらに、用語「Ｘ、Ｙ、及びＺの少なくとも1つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ Ｘ，Ｙ ａｎｄ Ｚ）」の使用は、Ｘのみ、Ｙのみ、及びＺのみ、並びにＸ、Ｙ、及びＺの任意の組み合わせを含むと理解される。
【００５８】
本明細書、及び請求の範囲で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態を含む）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び「有する（ｈａｖｅ）」、及び「有する（ｈａｓ）」などの、有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）、又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）は、包括的、又は無制限であり（ｏｐｅｎ‐ｅｎｄｅｄ）、そして追加の記載されていない要素、又は方法の工程を排除するものではない。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「又はそれらの組み合わせ（ｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、その用語に先行する列挙された項目のすべての順列、及び組み合わせを意味する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組み合わせ（Ａ，Ｂ，Ｃ，ｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図しており、そして特定の状況で順序が重要な場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢも意図する。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの1つ以上の項目、又は用語の繰り返しを含む組み合わせが、明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から特に明白でない限り、典型的には、任意の組み合わせにおける項目、又は用語の数に制限はないことを理解するであろう。
【００６０】
本願を通して、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、値が、組成物、組成物を投与するために使用される方法、又は研究対象の間に存在する変動の固有の変動を含むことを示すために使用される。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、その後に記載される事象、又は状況が完全に起こること、又はその後に記載される事象、又は状況が、ほとんど起こることを意味する。例えば、用語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、後に記載される事象、又は状況が、常に少なくとも90％、常に少なくとも95％、又は常に少なくとも98％、生じることを意味する。
【００６２】
用語「医薬的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、合理的な利益／危険比に見合った毒性、刺激、及び／又はアレルギー反応などの過度の有害な副作用なしに、ヒト及び／又は動物への投与に適した化合物、及び組成物を意味する。
【００６３】
「生物学的に活性な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）」とは、活性剤が、その生理学的効果をどのように有するかに関係なく、生物の生理系を改変する能力を意味する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「純粋な（ｐｕｒｅ）」、又は「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」は、対象種が、存在する優勢な種であることを意味し（すなわち、モル基準で、組成物中の他の対象種よりも豊富である）、そして特に、実質的に精製された分画は、対象種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％超、より詳細には、約８５％超、約９０％超、約９５％超、又は約９９％超を含む。用語「純粋な（ｐｕｒｅ）」、又は「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」はまた、対象種（例えば、ペプチド化合物）が、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも８５％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも9２％（ｗ／ｗ）純度、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも９６％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも９７％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも９８％（ｗ／ｗ）純度、少なくとも９９％（ｗ／ｗ）純度、又は１００％（ｗ／ｗ）である調製物を意味する。
【００６５】
用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、及び「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、本明細書中において互換的に使用され、温血動物、特に、哺乳類を意味すると理解される。この用語の範囲、及び意味内の動物の非限定的な例は、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物園の動物、旧、及び新世界サル、非ヒト霊長類、並びにヒトが挙げられる。ヒトでは、１８歳以上の成人と１８歳未満の子供の両方が、治療に適している。
【００６６】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、治療的な処置を意味する。用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療目的のために、患者に組成物を投与することを意味する。
【００６７】
「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、予防的、又は予防的処置手段を意味する。対象への投与は、疾患によって引き起こされるか、又はそれに関連する有害な症状、状態、合併症などが進行する前に行うことができる。例えば、スクリーニング（例えば、遺伝子）を使用して、開示された本発明の概念の組成物、及び方法の候補対象を特定することができる。従って、そのような対象には、機能的遺伝子産物（タンパク質）の不十分な量、若しくは欠損に関して陽性であるか、又は異常な、部分的に機能的な、若しくは非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を産生するものが含まれる。
【００６８】
用語「治療用組成物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、及び「医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、当該技術分野で公知の方法、又は本明細書中で意図される任意の方法によって対象に投与されてもよい活性剤含有組成物を意味し、組成物の投与は、本明細書中の他の箇所に記載される治療効果をもたらす。また、開示された本発明の概念の組成物は、当該技術分野で周知の製剤技術を使用して、遅延放出、制御放出、長時間放出、及び／又は持続放出を提供するように、設計されてもよい。
【００６９】
用語「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、本発明の概念の態様で使用される場合、合理的な利益／リスク比に見合った過度の有害な副作用（実質的な毒性、刺激、及びアレルギー反応など）なしに、検出可能な治療効果を示すのに十分な活性剤の量を意味する。治療効果は、例えば、これに限定されないが、視力の部分的な、又は完全な回復が挙げられる。例えば、網膜／視覚機能検査に有益な効果を評価するためには、治療の前後に、網膜電図（ＥＲＧＳ）、瞳孔測定、及び行動試験（例えば、光の変化を伴う障害物経過）が挙げられる。
【００７０】
患者のための有効量は、患者のタイプ、患者の大きさ、及び健康状態、治療される状態の性質、及び重症度、投与方法、治療期間、併用療法の性質（存在する場合）、使用される特定の製剤などに依存する。従って、正確な有効量を予め指定することは不可能である。しかしながら、所与の状況に対する有効量は、本明細書中で提供される情報に基づく慣習的な実験を用いて、当業者によって決定されることができる。
【００７１】
用語「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」は、対象の疾患、若しくはその症状の検出可能な、又は測定可能な改善を意味する。検出可能な、又は測定可能な改善は、疾患の発生、頻度、重症度、進行、若しくは期間における主観的、若しくは客観的な低下、減少、阻害、抑制、制限、若しくは制御、病気の根本的な原因、若しくは結果の改善、又は疾患の逆転が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
治療結果が成功すると、対象の疾患の発生、頻度、重症度、進行、若しくは期間、若しくは対象の疾患の結果を、低下、減少、阻害、抑制、制限、制御、若しくは予防する「治療効果（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）」、又は「利益（ｂｅｎｅｆｉｔ）」をもたらすことができる。従って、疾患、又は有害症状の1つ以上の根底にある原因に影響を及ぼす治療法、及び使用は、有益であると考えられる。疾患の安定化などの悪化の減少、又は減少も、治療結果の成功である。
【００７３】
従って、治療上の利益は、疾患、疾患に関連する有害症状、合併症、結果、又は根本的原因のいずれか１つ、大部分、若しくは全ての完全な除去、又は逆転である必要はない。従って、疾患の発生、頻度、重症度、進行、期間、阻害、若しくは逆転における、部分的な低下、減少、阻害、抑制、制限、制御、又は予防などの漸進的な改善（例えば、安定化）が存在する場合、短期間、又は長期間（時間、日、週、月など）にわたり、満足のいくエンドポイントが達成される。潜在的な治療上の利益、若しくは疾患の改善を提供する治療などの方法、又は使用の有効性は、網膜／視覚機能検査（網膜電図（ＥＲＧＳ）、瞳孔測定、及び治療後の行動試験など）などの様々な方法によって確認することができる。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」、又は「％同一性（％ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、対応する天然の基準核酸、又はタンパク質と、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超であってもよい相同性の程度を有する核酸（又はその断片）、又はタンパク質（又はその断片）を意味する。例えば、ペプチド、又はポリペプチドに関して、アラインメントを助けるために１００アミノ酸長において、４つのギャップが導入されてもよい場合、本明細書中に記載の相同性、又は同一性のパーセンテージは、典型的には、比較される配列中の同一のアミノ酸残基と整列する２つの配列のうち小さい方に見られるアミノ酸残基のパーセンテージとして計算される（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７２）Ｖｏｌ．５，ｐ．１２４，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．においてＤａｙｈｏｆｆによって言及されたように）。一実施態様では、上記のパーセンテージ相同性は、（ギャップの導入を伴う）２つの配列のうち大きい方に見出されてもよい２つの配列のうち小さい方に見られる構成のパーセンテージとして計算され、４つの連続したアミノ酸の配列として定義される。天然のタンパク質産物に対する抗体との交差反応性により単離されてもよい任意のタンパク質産物も、実質的に相同なものとして含まれる。配列同一性、又は相同性は、配列ギャップを最小化しながら、重複、及び同一性を最大にするように整列された場合に、配列を比較することによって決定することができる。特に、配列同一性は、複数の数学的アルゴリズムのいずれかを用いて決定することができる。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、２２６４‐２２６８、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０，５８７３‐５８７７のアルゴリズムである。
【００７５】
一実施態様では、「％同一性（％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、同じ活性を有するか、又は類似のタンパク質をコードする２つの配列の対応する位置で同一であるアミノ酸、又はヌクレオチドの数を表す。例えば、それぞれが１００残基を有する２つのアミノ酸配列は、対応する位置の９５のアミノ酸が同じである場合に、９５％の同一性を有する。
【００７６】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの他の例は、Ｍｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ、４，１１‐１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いることができる。局所配列類似性、及びアライメントの領域を同定するためのさらに他の有用なアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５，２４４４‐２４４８に記載されたようなＦＡＳＴＡアルゴリズムである。
【００７７】
他のアルゴリズムは、ＷＵ‐ＢＬＡＳＴ（ワシントン大学ＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェア（いくつかのＵＮＩＸプラットフォーム用のＷＵ‐ＢＬＡＳＴバージョン２．０実行可能プログラム）である。このプログラムは、ＷＵ‐ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいており、そしてパブリックドメインＮＣＢＩ‐ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づく（Ａｌｔｓｃｈｕｌ＆Ｇｉｓｈ（１９９６）Ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ｅｄ．）２６６，４６０‐４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３‐４１０；Ｇｉｓｈ＆Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３：２６６‐２７２；Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３‐５８７７中、これらはすべて、本明細書中に参照として組み込まれる）。
【００７８】
本明細書中において他に言及されているものに加えて、国立生物工学情報センターによって提供されるプログラムＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴについても言及する。これらのプログラムは、この目的のために当該技術分野で広く使用されており、２つのアミノ酸配列の相同領域を整列させることができる。パッケージソフト内のすべての検索プログラムでは、ギャップのあるアライメントルーチンは、データベース検索自体に不可欠である。必要に応じて、ギャップをオフにすることができる。長さ１のギャップに対するデフォルトペナルティ（Ｑ）は、タンパク質、及びＢＬＡＳＴＰについてはＱ＝９であり、ＢＬＡＳＴＮについてはＱ＝１０であるが、任意の整数に変更されてもよい。ギャップ（Ｒ）を延長するためのデフォルトの残基当たりのペナルティは、タンパク質、及びＢＬＡＳＴＰについてはＲ＝２であり、ＢＬＡＳＴＮについてはＲ＝１０であるが、任意の整数に変更されてもよい。シーケンスギャップを最小限に抑えながら、重複、及び同一性を最大にするようにシーケンスを整列させるために、Ｑ、及びＲに対する任意の値の組み合わせを使用することができる。デフォルトのアミノ酸比較マトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２であるが、ＰＡＭのような他のアミノ酸比較マトリックスを利用することもできる。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド配列（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、又は「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態の、若しくは例えば、クローニングにより得られるか、化学合成技術によって、若しくはそれらの組み合わせによって産生される、ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡが挙げられるDNAの形態のポリヌクレオチドを含む、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質産物をコードする任意のポリヌクレオチド配列を含む。DNAは、二本鎖、又は一本鎖であってもよい。一本鎖DNAは、センス鎖としても知られているコード鎖であってもよく、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、又は突然変異タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチド配列は、生物学的に活性な突然変異タンパク質産物をコードする限り、内因性コード配列のコード配列と実質的に同じであり得る。さらに、突然変異タンパク質、又は突然変異タンパク質の断片は、遺伝子コード、又は対立遺伝子変異の縮重のためにコドン使用頻度が異なるポリヌクレオチド配列を用いて発現されてもよい。
【００８０】
用語「感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」、及び「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、本明細書中では互換的に使用され、コードされたタンパク質産物が発現されるように、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチド配列を、細胞に導入することを意味する。開示された本発明の概念のポリヌクレオチドは、付加配列、例えば、同じ転写ユニット内の付加的なコード配列、制御エレメント、例えば、プロモーターリボソーム結合部位、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、同一、又は異なるプロモーターの制御下の追加の転写ユニット、宿主細胞のクローニング、発現、相同組み換え、及び形質転換を可能にする配列、並びに開示された本発明の概念の実施態様を提供するのに望ましいようなそのような任意の構築物を含んでもよい。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」は、インビボで、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを発現、又は複製する目的で、細胞に外因性ＤＮＡ、又はＲＮＡを導入することによる、ヒト、又は動物における疾患、又は欠乏の治療、又は予防のための、細胞の遺伝子改変を意味する。遺伝子治療は、一般的に、米国特許第５，３９９，３４６号に開示されている。核酸、又はタンパク質の任意の適切な投与経路が、開示された本発明の概念の医薬組成物を対象に提供するために、用いられてもよい。例えば、非経口（皮下、網膜下、脈絡膜上、筋肉内、静脈内、経皮）などの投与形態を採用することができる。投与製剤には、注射、インプラント、又は他の公知の有効な遺伝子治療送達方法が含まれる。
【００８２】
開示された本発明の概念のタンパク質産物をコードする核酸のための遺伝子送達ビヒクル（ベクター）は、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質産物の発現を促進するのに適した任意のベクターを含み、そして任意により、網膜色素上皮細胞に特異的である作動可能に取り付けられたプロモーター配列を含んでもよい（例えば、米国特許第８，７８５，４１３号を参照）。そのような遺伝子送達ビヒクルは、当該技術分野で当業者に周知であり、従って、その詳細な説明はここでは必要とみなされない。例えば、開示された本発明の概念のタンパク質産物をコードする核酸は、アデノ随伴ウィルスベクター（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、第５，４３６，１４６号、及び第５，６２２，８５６号に開示されている）、弱毒化、又はガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウィルスベクター（例えば、Ｍｏｒｓｙ，Ｍ．Ａ．及びＣａｓｋｅｙ，Ｃ．Ｔ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ５：１８‐２４；及び米国特許第５，９３５，９３５号に開示されている）、レンチウィルスベクター（例えば、米国特許第５，６６５，５７７号；第５，９９４，１３６号；及び第６，０１３，５１６号に開示されている)、プラスミド、又は合成（非ウィルス）ベクター（例えば、米国特許第４，３９４，４４８号、及び第５，６７６，９５４号に開示されている）、及び／又はナノ粒子（例えば、米国特許第６，２１７，９１２号、第７，５１４，０９８号、及び第８，３２３，６１８号に開示されている）を含んでもよい。代替的なウィルスベクターとしては、限定されないが、レトロウィルスベクター（米国特許第５，６７２，５１０号、第５，７０７，８６５号、及び第５，８１７，４９１号に開示されている）、ヘルペスウィルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号に開示されている）シンドビスウィルスベクター、及びパピローマウィルスベクター（例えば、欧州特許第８２０７７３号に開示されている）が挙げられる。ベクターは、モノシストロン性、バイシストロン性、又はマルチシストロン性のいずれかであってもよい。
【００８３】
アデノウィルスベクターは、本質的に完全なアデノウィルスゲノムを含んでもよい（Ｓｈｅｎｋら（１９８４）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１−３９）。あるいは、アデノウィルスベクターは、アデノウィルスゲノムの少なくとも一部が欠失している、修飾アデノウィルスベクターであってもよい。アデノウィルスベクターは、Ｈｅら（１９９８）ＰＮＡＳ，９５：２５９０‐２５１４；Ｃｈａｒｔｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：４８０５−４８１０；及びＨｉｔｔら．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３−３０に従って作製されてもよい。アデノウィルスベクターを用いて細胞に遺伝子を導入する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１５９４７に記載されている。遺伝子の細胞への形質導入のために、多数のアデノウィルスベクターが開発されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６‐６２９）。形質導入された遺伝子産物の構成的高レベル発現が、達成された。これらのベクターは、感染のために複製細胞を必要とせず、体細胞遺伝子治療に適したベクターにするという、レトロウィルスベクターに固有の利点を有する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６‐９３２）。培養中の初代ラット肝細胞、及び筋芽細胞におけるアデノウィルス媒介性導入を用いた、グルコース代謝に関連する遺伝子の形質導入の可能性が記載されている（Ｂａｑｕｅら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０４（Ｐｔ３）：１００９‐１０１４；Ｇｏｍｅｚ‐Ｆｏｉｘら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９‐２５１３４）。
【００８４】
開示された本発明の概念の方法において使用されてもよいベクターはまた、Ｎａｒｆｓｔｒｏｍら（２００３）“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ＲＰＥ６５ ｎｕｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｏｇ．”Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４，１６６３‐１６７２；Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９９４）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ａｄｕｌｔ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｉｎａ．”Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３５，２５３５‐２５４２；Ｚｈａｎｇら（２００８）“Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａ．”Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．３３，８１‐９０；Ｗｅｂｅｒら（２００３）“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ４ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｌｏｎｇ‐ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｒａｔ，ｄｏｇ，ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ.”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７，７７４‐７８１；Ｙｏｋｏｉら（２００７）“Ｏｃｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ‐ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４８，３３２４−３３２８；Ａｕｒｉｃｃｈｉｏら（２００１）“Ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ．”Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０，３０７５‐３０８１；Ｐａｎｇら（２００８）“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｓｉｔｅ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．”Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．，４８，３７７‐３８５；Ｙａｎｅｚ‐Ｍｕｎｏｚら（２００６）“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｎｏｎｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１２，３４８−３５３；Ｂｅｍｅｌｍａｎｓら（２００６）“Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＲＰＥ６５ ｒｅｓｃｕｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｌｅｂｅｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ．”ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．，３，１８９２−１９０３；Ｍｉｙｏｓｈｉら（１９９７）“Ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｔｈ�� ｒｅｔｉｎa ｕｓｉｎｇ ａｎ ＨＩＶ‐ｂａｓｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ.”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１０３１９‐１０３２３；Ｆａｒｊｏら（２００６）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｎｏｎ‐ｖｉｒａｌ ｏｃｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐａｃｔｅｄ ＤＮＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１，ｅ３８；Ｋａｃｈｉら（２００５）“Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｏｃｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２，８４３‐８５１；及びＪｏｈｎｓｏｎら（２００８）“Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｂｒｉｅｆ：ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｅｙｅｓ．”Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，１４，２２１１‐２２２６に開示されている。
【００８５】
組み換えベクター（例えば、レンチ、パルボ、ＡＡＶ）配列は、エクスビボ、インビトロ、又はインビボでの細胞のその後の感染（形質導入）のための「粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）」として、本明細書中において、パッケージ化されて呼ばれてもよい。組み換えベクター配列が、ＡＡＶ粒子中にカプシド化、又はパッケージ化される場合、当該粒子は、また、「ｒＡＡＶ」と呼ぶことができる。そのような粒子には、ベクターゲノムをカプシド化、又はパッケージ化するタンパク質が含まれる。特定の例には、ウィルスエンベロープタンパク質、及びＡＡＶの場合には、カプシドタンパク質が含まれる。
【００８６】
ベクター「ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）」は、最終的にパッケージ化されるか、又はカプシド化されてウィルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成する組み換えプラスミド配列部分を意味する。組み換えベクターを構築、又は製造するために組み換えプラスミドを使用する場合、ベクターゲノムは、組み換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」の部分を含まない。組み換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格（ｐｌａｓｍｉｄ ｂａｃｋｂｏｎｅ）」と呼ばれ、プラスミドのクローニング、及び増幅のために重要であるが、組み換えウィルス産生のために必要であるプロセス自体は、ウィルス（例えば、ＡＡＶ）粒子中に、パッケージ化されず、又はカプシド化されない。
【００８７】
従って、ベクター「ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）」は、パッケージ化、又はカプシド化されたベクタープラスミドの部分を意味し（例えば、ＡＡＶ）、そして、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又はその断片をコードする配列を含む。組み換えプラスミドの非ベクターゲノム部分は、プラスミドのクローニング、及び増幅に重要な「プラスミド骨格（ｐｌａｓｍｉｄ ｂａｃｋｂｏｎｅ）」であり、例えば、カナマイシンのような選択マーカーを有するが、それ自体は、ウィルス（例えば、ＡＡＶ）によって、パッケージ化、又はカプシド化されていない。
【００８８】
ＡＡＶベクターは、任意の血清型であり得る。代表的な血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ‐２ｉ８が挙げられる。
【００８９】
ベクターは、さらなる核酸、又はタンパク質要素を含むことができる。例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター中に保持されたＡＡＶゲノムの１つ、又は２つの末端逆位反復（ＩＴＲ）配列を含むことができる。ＩＴＲ配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ‐２ｉ８を含む、任意のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲを含むか、又はそれらに基づくことができる。典型的には、ＡＡＶベクターにおいて、突然変異体ＲＰＥ６５タンパク質、又はその断片（部分）をコードする核酸は、５’及び／又は３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する。
【００９０】
核酸配列のさらなる非限定的な例は、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、ポリアデニン配列、終止コドンなどが挙げられる。発現制御エレメントを含むそのような配列は、転写配列の５’（すなわち、「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」）、３’末端（すなわち、「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」）、又はその配列内（例えば、イントロン内）に位置することができる。発現制御エレメントを含むそのような配列は、転写された配列に隣接して、又は転写された配列から離れて（例えば、ポリヌクレオチドから１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜５００、又はそれ以上のヌクレオチド）（たとえかなりの距離であっても）、位置することができる。
【００９１】
発現制御エレメントの特定の例は、通常、転写された配列（突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列）の５’に位置するプロモーターである。発現制御エレメントの他の例は、転写された配列の５’及び／又は３’に位置するか、又は転写された配列内に位置することができるエンハンサーである。
【００９２】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又はその断片をコードするヌクレオチド配列などの配列に隣接して位置する核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を、意味し得る。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、作動可能に連結された、発現される核酸の量を増加させる。「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又はその断片をコードするヌクレオチド配列などの配列に隣接して位置する配列を意味し得る。エンハンサー要素は、典型的には、プロモーター要素の上流に位置するが、機能する場合、プロモーターの下流に位置しても、ＤＮＡ配列内にあってもよい。従って、エンハンサーエレメントは、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又はその断片をコードする配列の、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、又はそれ以上の塩基対上流、又は下流に位置することができる。エンハンサー要素は、また、典型的には、作動可能に連結された配列の発現も増加させる。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能な連結（ｏｐｅｒａｂｌｅ ｌｉｎｋａｇｅ）」、又は「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、意図された様式で機能するように特徴付けられた、構成要素の物理的、又は機能的並置を意味する。核酸と作動可能に連結している発現制御エレメントの例では、制御エレメントが、核酸の発現を調節するような関係である。より具体的には、例えば、作動可能に連結された２つのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の少なくとも１つが、他の配列に生理学的効果を及ぼすことができるような関係で２つのＤＮＡが配置される（シス、又はトランス）ことを意味する。
【００９４】
任意の適切な網膜色素上皮特異的プロモーター配列が、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質をコードする核酸、又は断片をコードする核酸とともに使用されてもよい。使用されるプロモーターの選択は、例えば、眼の状況において、ＲＰＥ６５タンパク質をコードする核酸、又は断片をコードする核酸を発現することができる幅広い数の天然の、構成的、又は誘導性のプロモーターの中から行われてもよい。
【００９５】
一実施態様では、プロモーターは細胞特異的である。用語「細胞特異的（ｃｅｌｌ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」は、選択された導入遺伝子の発現を誘導することができる、組み換えベクターのために選択された特定のプロモーターが、特定の眼細胞型であることを意味する。一例として、プロモーターは、ＲＰＥ細胞における発現に特異的である。他の例として、プロモーターは、光受容体細胞における発現に特異的である。
【００９６】
ＲＰＥ特異的プロモーターの代表的な非限定的な例は、ＲＰＥ‐６５プロモーター、メタロプロテイナーゼ３の組織阻害剤（Ｔｉｍｐ３）プロモーター、及びチロシナーゼプロモーターが挙げられる。さらに他のＲＰＥ特異的プロモーターが、当該分野で公知である（例えば、国際公開第ＷＯ００／１５８２２号に記載のプロモーターを参照のこと）。
【００９７】
光受容体プロモーターの代表的な非限定的な例は、ロッドオプシンプロモーター、赤‐緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、光受容体間結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーター、及びｃＧＭＰ‐β‐ホスホジエステラーゼプロモーターが挙げられる（例えば、国際公開第ＷＯ９８／４８０９７号に記載されているプロモーターである）。
【００９８】
発現制御エレメントは、多くの異なる細胞型において発現を駆動することができる遍在的、又は非特異的プロモーター／エンハンサーを含む。特定の実施態様では、プロモーターは構成的である。構成的プロモーターの代表的な非限定的な例は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／ニワトリβ‐アクチン（ＣβＡ）プロモーター‐エキソン１‐イントロン１エレメント、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列、ＬＴＲプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。
【００９９】
ＡＡＶベクターは、任意の血清型のカプシドを含むことができる。代表的なＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ‐２ｉ８が挙げられる。ＡＡＶベクターは、カプシドキメラ、又は任意の血清型の変異体を含むことができる。特定のＡＡＶカプシド変異体は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ‐２ｉ８の、例えば、アミノ酸置換、欠失、又は挿入／付加を有するカプシド配列の、カプシド変異体が挙げられる。
【０１００】
開示された本発明の概念の特定の実施態様では、変異型ＲＰＥ６５タンパク質（及び／又はその治療的に有効な断片）を含む組成物は、治療的処置において提供される。あるいは、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片をコードするヌクレオチド配列を含む組成物は、遺伝子治療法による治療において提供されてもよい。また、これらの組成物を製造する方法、その使用方法も提供される。一実施態様では、組成物は、対象における、レーバー先天性黒内障、及び網膜色素変性（例えば、常染色体劣性網膜色素変性症）を含むが、これらに限定されない網膜変性関連疾患（ジストロフィー）、又は症状の治療に利用される。上記のように、特定の治療法は、例えば、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、プラスミド、又はナノ粒子による遺伝子治療によるものである。特定の実施態様では、治療は、ヒトなどの哺乳類対象における視力喪失の発生及び／又は重症度の低下をもたらす。
【０１０１】
特定の実施態様では、開示された本発明の概念の治療は、適当な、又は適切な条件下で、又は適切な宿主細胞において、インビボで、所望の突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片を発現するベクターを含む医薬組成物を使用する。医薬組成物は、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片をコードする核酸を含むか、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片をコードする核酸から本質的になるか、又は突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片をコードする核酸からなり、そして発現する、１つ以上のベクター、例えば、発現ベクター（ウィルス、例えば、ＡＡＶ、レンチなど）、例えば、インビボ発現ベクターと医薬的に許容される担体、賦形剤、及び／又はビヒクルを含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなってもよい。特定の実施態様では、ベクターは、医薬的に許容される担体、賦形剤、及び／又はビヒクルにおいて、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片をコードする少なくとも1つの核酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、そして発現する。従って、開示された本発明の概念の一実施態様では、組成物中の他のベクターは、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片をコードする核酸を含む。
【０１０２】
医薬的に許容される担体、ビヒクル、及び／又は賦形剤は、ベクターのトランスフェクションを容易にし、及び/又は保存を向上させる。当技術分野で知られているか、又は本明細書中で企図されている任意の医薬的に許容される担体、ビヒクル、及び賦形剤は、開示された本発明の概念に従って、利用することができる。限定されないが、例えば、医薬的に許容される担体、ビヒクル、又は賦形剤は、水、０．９％ＮａＣｌ（例えば、生理食塩水）溶液、又はリン酸緩衝液であり得る。開示された本発明の概念の方法において使用することができる、他の医薬的に許容される担体、ビヒクル、及び賦形剤は、ポリ（Ｌ‐グルタメート）、又はポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される担体、ビヒクル、又は賦形剤は、ベクターの投与を容易にし、発現レベルを増大させ、及び／又は発現期間を長くする化合物、又は化合物の組み合わせであってもよい。
【０１０３】
投与、及び投与量は、本明細書中の一般的な説明で論じられており、また、過度の実験をすることなく、当技術分野の知識と併せて読まれるこの開示から、当業者が決定することもできる。例えば、投与量は、約０．０１〜約２ｍｌの間、例えば、約０．０２〜約１ｍｌの間とすることができる。より具体的な投与量は、約０．０５〜約０．８０ｍｌの間、約０．１０〜約０．６０ｍｌの間、又は約０．２０〜約０．５０ｍｌの間であり得る。
【０１０４】
非限定的な実施態様では、治療用及び／又は医薬組成物は、例えば、約１０４〜約１０１１個の粒子、約１０５〜約１０１０個の粒子、又は約１０６〜約１０９個の粒子を含む。ＡＡＶベクターとの関連において、ベクターゲノムは、例えば、約１０４〜約１０１４のベクターゲノム、約１０５〜約１０１３のベクターゲノム、約１０６〜約１０１３のベクターゲノム、約１０７〜約１０１３のベクターゲノム、約１０８〜約１０１３のベクターゲノム、又は約１０９〜約１０１３のベクターゲノムを含む。そのような用量／量のＡＡＶベクターは、本明細書中に記載の方法において有用である。
【０１０５】
開示された本発明の概念は、開示された本発明の概念に従って製造された有効量の治療用組成物を、対象に少なくとも１回投与することを企図している。この投与は、限定されるものではないが、筋肉内、皮下、眼内、結膜下、網膜下、脈絡膜上、又は血管内を含む、様々な経路を介して行われてもよい。
【０１０６】
例示として、開示された本発明の概念のタンパク質／核酸に包含される、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片は、限定されないが、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列と全く同じではないヌクレオチド配列によってコードされる、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片を含むが、ヌクレオチド配列の変化がコードされたアミノ酸配列を変化させないか、又は単に、アミノ酸残基の保存的置換、１つ又は複数のアミノ酸の欠失及び／又は付加、コードされたポリペプチドの特性に大幅に影響を及ぼさない、アミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換などをもたらす。保存的アミノ酸置換の例としては、限定されないが、グリシン／アラニン置換；バリン／イソロイシン／ロイシン置換；アスパラギン／グルタミン置換；アスパラギン酸／グルタミン酸置換；セリン／トレオニン／メチオニン置換；リジン／アルギニン／ヒスチジン置換；フェニルアラニン／チロシン／トリプトファン置換が挙げられる。
【０１０７】
従って、開示された本発明の概念に含まれるのは、少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入された、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、及び断片である。タンパク質化学、及び構造の詳細な説明については、Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅら（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．を参照のこと。作製されてもよい置換のタイプは、保存的置換であり、本明細書中において、以下の群：（１）小さい脂肪族、非極性、又はわずかに極性の残基、例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ；（２）極性、負電荷残基、及びそれらのアミド、例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ；（３）極性、正電荷残基：例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓの1つ内の交換体として定義される。Ｐｒｏは、独特な形状のために、鎖をしっかりと拘束する。機能的性質の実質的変化は、上記の基（又は上に示されていない２つの他のアミノ酸基）の内ではなく、間のような、より保存的でない置換を選択することによって行われ、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクを維持することへのそれらの影響の点でより大きく異なるであろう。開示された本発明の概念に従った大部分の置換は、タンパク質の特性に根本的な変化を生じない置換である。そうする前に置換の正確な効果を予測することが困難である場合でさえ、当業者は、その効果が、本明細書中に記載の活性アッセイなど（例えば、イソメロヒドロラーゼ活性アッセイ）のルーチンのスクリーニングアッセイによって評価することができることを理解するであろう。レドックス、又は熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、又は担体、又は多量体と凝集する傾向を含むペプチド特性の改変は、当業者に公知の方法によってアッセイされる。
【０１０８】
上記のような機能的突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片、及びホモログをもたらす他の種類の置換、変化、付加、欠失、及び誘導体もまた、開示された本発明の概念によって包含され、当業者は容易にそのような変異体、又は誘導体の作製、同定、又は選択方法、並びにそれらの変異体、又は誘導体のＲＰＥ６５活性の試験方法を知ることができる。当業者であれば、限定されないが、潜在的なスプライス部位を除去すること、開始コドンの前にコザックコンセンサス配列を導入することによりコドン使用頻度を適合させること、コドン使用頻度を変更すること、又はそれらの任意の組み合わせを含む、当技術分野で公知の任意の方法による発現を改善するために、開示された本発明の概念の突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又はポリペプチド断片の発現を最適化することができる。
【０１０９】
特定の実施態様では、開示された本発明の概念は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、又は配列番号１８の少なくとも１つ以上と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性、又は相同性を有する、核酸変異体を含み、そして配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、又は配列番号１７によりコードされるポリペプチドと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性、又は相同性を有する、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質をコードし、そして本明細書中で記載された少なくとも１つ以上のアミノ酸置換、例えば、図９に記載されたものの１つ以上を含む。
【０１１０】
いくつかの実施態様では、突然変異ＲＰＥ６５タンパク質、又は断片をコードするＤＮＡは、本明細書中に記載の野生型ＤＮＡ（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、又は配列番号１８）と、ストリンジェントな条件で、ハイブリダイズするＤＮＡである。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ（ＤＮＡ ｗｈｉｃｈ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ ｕｎｄｅｒ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」とは、ＲＰＥ６５タンパク質をコードするＤＮＡを使用する、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、又はサザンブロットハイブリダイゼーションによって得られるＤＮＡを意味し、具体的には、ハイブリダイゼーション後同定されたＤＮＡを含み、コロニー、又はプラーク由来のＤＮＡが、０．７〜１．０Ｍ ＮａＣｌの存在下、６５℃で、固定化されるフィルターを使用して、そして得られたフィルターを、０．１×〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）を使用して、６５℃で洗浄することにより得られる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。
【０１１１】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語、及び科学用語は、開示された本発明の概念が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと類似、又は同等の方法、及び材料が、開示された本発明の概念の実施、又は試験において使用され得るが、適切な方法、及び材料が、本明細書中に記載される。
【０１１２】
本明細書中で使用される略語には、１１ｃＲＯＬ、１１‐シスレチノール；ＡＤ、アデノウィルス；ＢＴＰ、１，３‐ビス［トリス（ヒドロキシメチル）‐メチルアミノ］プロパン；ｃＲＰＥ６５、ニワトリＲＰＥ６５；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ｈＲＰＥ６５、ヒトＲＰＥ６５；ＬＣＡ、レーバー先天性黒内障；ＰＶＤＦ、ポリフッ化ビニリデン；ｒＡＡＶ、組み換えアデノ随伴ウィルス；ＲＦＰ、赤色蛍光タンパク質；ＲＰＥ、網膜色素上皮；ＲＰＥ６５、ＲＰＥ特異的６５ｋＤａタンパク質；ＲＰ、網膜色素変性症；ＴＢＳＴ、０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０を含むトリス緩衝生理食塩水；ｗｔ、野生型が挙げられる。
【０１１３】
本明細書中に引用された全ての出願、刊行物、特許、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用、及びＡＴＣＣの引用は、その全体が参照として組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む明細書が支配する。
【０１１４】
本明細書中に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書中に開示された各特徴は、同じ、均等の、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置換されてもよい。従って、特に明記しない限り、開示された特徴（例えば、核酸、ベクター、プラスミド、組み換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、ベクターゲノム、又はウィルス粒子）は、均等、又は類似の特徴の属の例である。
【０１１５】
上記のように、本明細書中で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「及び（ａｎｄ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明白に示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「核酸（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」への言及は、複数のそのような核酸を含み、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」への言及は、複数のそのようなベクターを含み、「ウィルス（ａ ｖｉｒｕｓ）」、又は「粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）」への言及は、複数のそのようなウィルス粒子／粒子を含む。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、全ての数値、又は数値範囲は、文脈上他に明示しない限り、その範囲内の整数、及びその範囲内の値、又は整数の分数を含む。従って、説明するために、８０％以上の同一性の言及には、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％など、８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％など、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％などが含まれる、
【０１１７】
より多くの（より大きい）、又はより小さい整数の言及は、参照番号より大きい、又は小さい任意の数をそれぞれ含む。従って、例えば、１００未満の言及は、９９、９８、９７などを、一番下に至るまで含み、そして１０未満は、９、８、７などを、一番下に至るまで含む。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、文脈でそうでないことが明確に示されていない限り、全ての数値、又は範囲は、その範囲内の値、及び整数の分数、及びその範囲内の整数の分数を含む。従って、説明するために、１〜１０のような数値範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等が挙げられる。従って、１〜５０の範囲の言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０など、５０までを含み、並びに１．１，１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５などを含む。
【０１１９】
一連の範囲への言及は、一連の範囲内の異なる範囲の境界の値を組み合わせる範囲を含む。従って、一連の範囲への言及を説明するために、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０００、２０００〜２５００、２５００〜３０００、３０００〜３５００、３５００〜４０００、４０００〜４５００、４５００〜５０００、５５００〜６０００、６０００〜７０００、７０００〜８０００、又は８０００〜９０００は、1〜２０、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１０００、１０００〜３０００、２０００〜４０００などを含む。
【０１２０】
開示された本発明の概念は、以下の実施例、及び実施態様を参照することによって、より容易に理解され、そして以下の実施例、及び実施態様は、開示された本発明の概念の特定の態様、及び実施態様の説明のためにのみ含まれ、限定することを意図するものではない。以下の詳細な実施例、及び方法は、開示された本発明の概念の種々の突然変異タンパク質を作製、及び使用する方法を記載しており、上記のように、単なる例示であり、決して本開示を限定するものではない。当業者は、本明細書中に記載の材料、及び手順からの適切な変形を直ちに認識するであろう。
【実施例】
【０１２１】
錐体視細胞優性ニワトリＲＰＥ６５（ｃＲＰＥ６５‐配列番号３）は、ヒトＲＰＥ６５（ｈＲＰＥ６５‐配列番号１）、ウシＲＰＥ６５（ｂＲＰＥ６５‐配列番号9）、又は他の哺乳類ＲＰＥ６５タンパク質のイソメロヒドロラーゼ活性よりも実質的に大きいイソメロヒドロラーゼ活性を有することが知られている。以下に詳細に説明するように、ｃＲＰＥ６５、ｈＲＰＥ６５、及びｈＲＰＥ６５の突然変異体の酵素活性を、インビトロ イソメロヒドロラーゼ活性アッセイによって測定し、レチノイド生成物をＨＰＬＣで分析した。本明細書中において分析される開示された本発明の概念の突然変異体のうち、ｈＲＰＥ６５の２つの点突然変異体、Ｎ１７０Ｋ、及びＫ２９７Ｇ、並びに二重突然変異体Ｎ１７０Ｋ／Ｋ２９７Ｇは、野生型ｈＲＰＥ６５のものよりも、有意に高い触媒活性を示した。また、ｈＲＰＥ６５のＮ１７０Ｋ／Ｋ２９７Ｇ二重突然異体のアミノ末端断片（アミノ酸１Ｍｅｔ‐３３Ａｒｇ）を、対応するn末端ｃＲＰＥ６５３３残基断片で置換した場合、イソメロヒドロラーゼ活性を、ｃＲＰＥ６５のものと同様のレベルまでさらに増加させた。本開示の特定のＲＰＥ６５遺伝子治療の実施態様において、この高効率のイソメロヒドロラーゼ突然変異の組み合わせ（Ｓ２Ｙ／Ｉ３Ｓ／Ｌ２６Ｖ／Ｎ１７０Ｋ／Ｋ２９７Ｇ‐さらに以下に記載する）は、限定されないが、ヒトのＲＰＥ６５突然変異によって生じる網膜変性を有するか、又は有するリスクのある哺乳類対象における視力を改善するために、使用することができる。
【０１２２】
開示されている本研究では、部位特異的突然変異誘発を用いて、ｈＲＰＥ６５のいくつかの残基を、それらの位置相当物であるｃＲＰＥ６５（図1に示すアライメント）で置換し、生成したｈＲＰＥ６５突然変異体のイソメロヒドロラーゼ活性を評価した。結果を以下に示し、議論する。
【０１２３】
実験手順
部位特異的突然変異誘発
野生型（ｗｔ）ｈＲＰＥ６５タンパク質（配列番号１）、及びｃＲＰＥ６５タンパク質（配列番号３）をコードするｃＤＮＡを、以前に記載されているようにクローニングベクターにサブクローニングした（Ｍｏｉｓｅｙｅｖら（２００５）“ＲＰＥ６５ Ｉｓ ｔｈｅ Ｉｓｏｍｅｒｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｃｙｃｌｅ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２，１２４１３−１２４１８；及びＭｏｉｓｅｙｅｖら（２００８）“ＲＰＥ６５ ｆｒｏｍ Ｃｏｎｅ−ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｉｓ ａ Ｍｏｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｓｏｍｅｒｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｈａｔ ｆｒｏｍ Ｒｏｄ−ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３，８１１０−８１１７）。ｈＲＰＥ６５中の選択された残基を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って用いて、ｃＲＰＥ６５中のそれらの対応物で置換した。導入された突然変異は、ＡＢＩ‐３７３０ ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、両方の鎖からの配列決定により確認し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングした。配列確認後、発現構築物をＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。さらに、ｈＲＰＥ６５ｃＤＮＡ（配列番号２）、及びｃＲＰＥ６５ｃＤＮＡ（配列番号４）を、個々にｐＵＣ１８にサブクローニングした。ｈＲＰＥ６５、及びｃＲＰＥ６５の６つの制限断片を作製するために、アミノ酸配列を変えることなく独特の制限酵素部位を導入した（図５Ａ参照）。導入された制限酵素部位を用いて、ｈＲＰＥ６５の各断片を、その対応するｃＲＰＥ６５で置換した。この研究で使用した全てのプライマーセット（配列番号１９〜４２）を表１に示す。
【０１２４】
【表１】
2017522895.tif 000002
【０１２５】
プラスミドトランスフェクション
ｗｔ ｈＲＰＥ６５、ｃＲＰＥ６５、及びｈＲＰＥ６５突然変異体を発現する構築されたプラスミドを、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製し、Ｆｕｇｅｎｅ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ；１ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ７．４，２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比）を用いて、２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞、ヒトＬＲＡＴを安定に発現する細胞株（４５）にトランスフェクトし、そして培地を、トランスフェクション後６時間で取り換えた。トランスフェクションの４８時間後、細胞を細胞スクレーパーで採取し、氷冷ＰＢＳで２回すすいだ。ｗｔ ｈＲＰＥ６５、及びその突然変異体のタンパク質レベル、及び酵素活性を、ウェスタンブロット分析、及びインビトロ イソメロヒドロラーゼ活性アッセイによって確認した。
【０１２６】
ウェスタンブロット分析
全細胞内タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを用いて測定した。ｗｔ ｈＲＰＥ６５、ｃＲＰＥ６５、及びｈＲＰＥ６５突然変異体を発現する２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞の等量の全細胞内タンパク質（２０μｇ）、並びに陽性対照として、ウシＲＰＥミクロソームタンパク質（２．５μｇ）を、８％トリス‐グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルを介して、電気泳動により分離し、そして特に指定されない限り、イモビロン（ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に、電気泳動で転写した。膜を、ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０を含むトリス緩衝生理食塩水）中の５％（重量／体積）の脱脂粉乳で３０分間ブロッキングし、続いて重要な残基を同定するために、１：１０００希釈の抗‐ＲＰＥ６５ポリクローナル抗体（例えば、Ｍａら（２００１）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ＭＡＬＤＩ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＰＥ６５．”Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４２，１４２９‐１４３５を参照のこと）、及び１：５００００希釈の抗‐β‐アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、４℃で一晩インキュベートした。本発明者等は、ｃＲＰＥ６５とキメラ突然変異体ＲＰＥ６５との発現レベルを比較するために、他のＲＰＥ６５抗体（Ｍｏｉｓｅｙｅｖら（２００８）“ＲＰＥ６５ ｆｒｏｍ Ｃｏｎｅ‐ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｉｓ ａ Ｍｏｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｓｏｍｅｒｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｈａｔ ｆｒｏｍ Ｒｏｄ‐ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３，８１１０‐８１１７）を使用し、フラグメント３の免疫反応性の違いを避けた。ＴＢＳＴで４回洗浄した後、膜を遮光容器中で１．５時間、１：２５０００希釈のＤｙＬｉｇｈｔ‐５４９コンジュゲートヤギ抗‐マウスＩｇＧ、及びＤｙＬｉｇｈｔ‐６４９コンジュゲートヤギ抗‐ウサギＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でインキュベートし、そしてバンドを、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｑイメージングシステム（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を用いて検出した。シグナル強度を、Ａｌｐｈａ Ｖｉｅｗ Ｑソフトウェア（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を用いた濃度測定によって半定量化し、少なくとも3回の独立した実験から平均化した。
【０１２７】
イソメロヒドロラーゼ活性アッセイ
２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞を、ｗｔヒト、及びニワトリＲＰＥ６５、並びにｈＲＰＥ６５突然変異体を発現するプラスミドで、別々にトランスフェクトした。赤色蛍光タンパク質（ｒｆｐ）を発現する２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞を、陰性対照として使用した。反応緩衝液（１０ｍＭ １，３‐ビス［トリス（ヒドロキシメチル）‐メチルアミノ］プロパン（ＢＴＰ）、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で、超音波処理することによって細胞を溶解させた。Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド中のオールトランス［１１，１２‐３Ｈ]‐レチノール（１ｍＣｉ／ｍｌ，４５．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、イソメロヒドロラーゼアッセイの基質として使用した。各反応について、全細胞内タンパク質（１２５μｇ）を、０．２μＭのオールトランスレチノール、１％ＢＳＡ、及び２５μＭの細胞レチナールアルデヒド結合タンパク質を含む、２００μｌの反応緩衝液（１０ｍＭ、ＢＴＰ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に添加した。反応を停止し、レチノイドを３００μｌの冷メタノール、及び３００μｌのヘキサンで抽出した。生成したレチノイドを、順相ＨＰＬＣで分析した。各レチノイド異性体のピークを、その特徴的な保持時間、及びレチノイド標準の吸収スペクトルに基づいて同定した。イソメロヒドロラーゼ活性を、合成１１‐シス［３Ｈ］‐レチノールを標準として、Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ ６１０ＴＲソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、１１ｃＲＯＬピークの面積から計算した。トランスフェクション効率の変動を最小限に抑えるために、突然変異体の全てのインビトロ活性アッセイを、ｗｔ ｈＲＰＥ６５と並べて実施し、そして指定しない限り、触媒活性を、ｗｔ ｈＲＰＥ６５の値と比較した値として表した。
【０１２８】
結果
ｈＲＰＥ６５及びｃＲＰＥ６５の発現及び酵素活性の比較
赤色蛍光タンパク質（ｒｆｐ；陰性対照）、ｈＲＰＥ６５、及びｃＲＰＥ６５を発現するプラスミドを、２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞に別々にトランスフェクトし、４８時間培養した。ｈＲＰＥ６５、及びｃＲＰＥ６５の発現レベル、及び酵素活性を、ウェスタンブロット分析（図３Ａ）、及びインビトロ イソメロヒドロラーゼアッセイによって確認した。陰性対照タンパク質ｒｆｐではなく、ｈＲＰＥ６５、及びｃＲＰＥ６５の両方が、オールトランスレチニルエステルを、イソメロヒドロラーゼの産物である１１ｃＲＯＬに変換した（図３Ｂ〜３Ｄ）。ｃＲＰＥ６５は、そのＲＰＥ６５タンパク質レベルへの正規化後に、ｗｔ ｈＲＰＥ６５よりも実質的に高いレベルの１１ｃＲＯＬを生成し、ｃＲＰＥ６５のより高い酵素活性を示した。
【０１２９】
突然変異体の選択
ｈＲＰＥ６５とｃＲＰＥ６５との間のイソメロヒドロラーゼ活性の差を調べるために、ｃＲＰＥ６５中の様々な位置由来の８残基を選択した（図１参照）。これらの残基のイソメロヒドロラーゼ活性への寄与を評価するために、ｈＲＰＥ６５中の８つの候補残基の一連の点突然変異を、部位特異的突然変異誘発によって生じさせた。インビトロでの酵素活性アッセイのために、ｈＲＰＥ６５の３９位でのＴｈｒ、１７０位でのＡｓｎ、３３０位でのＣｙｓ、及び４９７位でのＧｌｎの置換の効果を、第1の実験セットで調べた。１０６位でのＣｙｓ、２９７位でのＬｙｓ、５１０位でのＬｅｕ、及び５３３位でのＳｅｒの置換を、第２の実験セットで調べた。
【０１３０】
ｈＲＰＥ６５のタンパク質レベル及び触媒活性に及ぼす部位特異的点突然変異の影響
ｈＲＰＥ６５、及びｃＲＰＥ６５を発現するプラスミド、並びに部位特異的突然変異を２９３Ａ‐ＬＲＡＴ細胞に別々にトランスフェクトし、そしてトランスフェクトした細胞を４８時間培養した。ウェスタンブロット分析（試験したＲＰＥ６５突然変異体の相対的発現レベルを表２に示す）により、タンパク質発現を確認し、そしてインビトロ イソメロヒドロラーゼ活性アッセイのために、全細胞内タンパク質の同じバッチを使用した。単一、二重、及び多重突然変異体を含むｈＲＰＥ６５突然変異体の全てついて、ＲＰＥ６５の発現レベルは同等であったが（図４Ａ〜４Ｅ）、２つの単一点突然変異体Ｎ１７０Ｋ、及びＫ２９７Ｇは、全ＲＰＥ６５の発現レベルで正規化後、ｗｔ ｈＲＰＥ６５の酵素活性と比較して、それぞれ１．６倍、及び１．７倍高い酵素活性を示した（図４Ｆ及び４Ｇ）。さらに、各実験セットにおいて、Ｎ１７０Ｋ（又はＫ２９７Ｇ）を有する試験された二重、三重、又は多重突然変異体は、ＲＰＥ６５の触媒活性をさらに増強しなかった。これらの結果は、ｈＲＰＥ６５中のＮ１７０Ｋ、及びＫ２９７Ｇの変異が、その酵素活性を増加させるために重要であり得ることを示唆する。
【０１３１】
【表２】
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【０１３２】
キメラヒトＲＰＥ６５の構築及びそのタンパク質レベル及び触媒活性への影響
ｈＲＰＥ６５の触媒活性をさらに改善するために、本発明者等は、ｈＲＰＥ６５のペプチド断片を、ｃＲＰＥ６５の対応物（図５Ａ、断片Ｆ１〜Ｆ６）で置き換えることによって、キメラＲＰＥ６５を構築した。トランスフェクションの４８時間後、ウェスタンブロット分析、及びインビトロ イソメロヒドロラーゼアッセイのために、細胞を採取した。ウェスタンブロット分析は、Ｆ１キメラ（置換された断片１）を除くキメラ突然変異体が、ｗｔ ｈＲＰＥ６５、及び他のキメラ突然変異体（図５Ｂ〜５Ｃ）よりも、高いタンパク質レベルのＲＰＥ６５を示したことを示した。興味深いことに、Ｆ１、及びＦ３キメラ突然変異体は、ｗｔ ｈＲＰＥ６５より、約１．５〜２倍高い触媒活性を示したが、Ｆ２、Ｆ４、及びＦ５キメラ突然変異体は、ｈＲＰＥ６５の触媒活性を実質的に低下させた。ＲＰＥ６５タンパク質レベルによる正規化後、Ｆ１キメラ突然変異体は、ｗｔ ｈＲＰＥ６５の触媒活性に匹敵する触媒活性（ｗｔ ｈＲＰＥ６５の１０６．９％）を示し、Ｆ１キメラの触媒活性の増加は、Ｆ１ ＲＰＥ６５キメラのタンパク質レベルの増加に起因するであろうことが示唆された（図５Ｂ、５Ｃ）。Ｆ３キメラは、おそらくＮ１７０Ｋ突然変異（ｗｔ ｈＲＰＥ６５の１５２％）に起因して、ｗｔ ｈＲＰＥ６５よりも高い正規化酵素活性を示したことに留意すべきである。これは、Ｎ１７０Ｋ単一突然変異体の結果とよく相関している。ｃＲＰＥ６５のＦ１断片は、ｈＲＰＥ６５（Ｓ２Ｙ、Ｉ３Ｓ、及びＬ２６Ｖ）の対応する残基と異なる２位、３位、及び２６位の残基を含む。
【０１３３】
高活性突然変異体の組み合わせによるスーパーイソメロヒドロラーゼ（ｓＩＭＨ）の生成
一連の部位特異的点突然変異体、及びキメラ突然変異体の研究から見出された３つの高度に活性な突然変異体の組み合わせを作成した。上記のように、２つの単一突然変異体（Ｎ１７０Ｋ、及びＫ２９７Ｇ）は、それらの発現レベルがｗｔ ｈＲＰＥ６５のものと同様であったとしても（図６Ａ）、ｗｔ ｈＲＰＥ６５よりも有意に高い触媒活性を示した（図６Ｂ）。図６に示すように、ｈＲＰＥ６５の二重突然変異体（Ｎ１７０Ｋ／Ｋ２９７Ｇ）は、ｗｔ ｈＲＰＥ６５よりも、３．２倍高い酵素活性を示した。また、Ｆ１キメラ（３つの置換を有する）とＮ１７０Ｋ突然変異体との組み合わせは、Ｎ１７０Ｋ単一突然変異体よりもさらに高い（２．２倍）タンパク質レベル、及び触媒活性を示した。これらの突然変異（Ｓ２Ｙ／Ｉ３Ｓ／Ｌ２６Ｖ／Ｎ１７０Ｋ／Ｋ２９７Ｇ）の全てを単一突然変異体（ｓＩＭＨ）に入れた後、突然変異体の触媒活性は、ｗｔｈＲＰＥ６５の触媒活性の４．４倍であることが判明し、そしてそれは、ｗｔｃＲＰＥ６５の活性に匹敵する（同じアッセイにおいて５．８倍、図６Ｂ）。
【０１３４】
代替変異体
表3に示すように、ｈＲＰＥ６５とｃＲＰＥ６５との間の相違に基づくある種の突然変異、例えば、２２０位、及び３０２位では、いずれも活性を改善せず、活性を低下させ、又は１７０位、及び２９７位での突然変異によって誘導される改善を減少させた。
【０１３５】
【表３】
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【０１３６】
特に２つの点突然変異、Ｎ１７０Ｋ、及びＫ２９７Ｇは、ｈＲＰＥ６５の酵素活性を実質的に高めた。これらの突然変異（Ｎ１７０Ｋ／Ｋ２９７Ｇ）の両方を含む突然変異体は、ｈＲＰＥ６５のさらに高められた触媒活性（ｗｔ ＲＰＥ６５の３．２倍）を示した。さらに、この二重突然変異体の活性は、ｃＲＰＥ６５（１Ｍｅｔ‐３３Ａｒｇ；３つの異なる残基：２位にＹ、３位にＳ、及び２６位にＶを含む）からのＦ１断片の置換によってさらに強化された。その結果、このスーパーイソメロヒドロラーゼ突然変異体（ｓＩＭＨ；Ｆ１／Ｎ１７０Ｋ／Ｋ２９７Ｇ）の触媒活性は、同じ実験条件下でのｗｔ ｈＲＰＥ６５の触媒活性の約４．４倍であり、そしてそれは、１．９倍の触媒活性プラス２．３倍高いタンパク質レベルによって寄与した。ｓＩＭＨによる１１ｃＲＯＬの産生は、ｗｔｃＲＰＥ６５のレベルに似通っていた（ｗｔ ｈＲＰＥ６５の５．８倍）。
【０１３７】
ｓＩＭＨの酵素活性の増強のさらなる確認として、本発明者等は、ｗｔ ｈＲＰＥ６５、及びｓＩＭＨの触媒効率を評価した（図7）。計算されたＫｍ、及びＶｍａｘは、ｓＩＭＨのより高いＶｍａｘが、主にそのより高い酵素活性に寄与することを示唆した（図７Ｃ）。
【０１３８】
ｃＲＰＥ６５のより高い触媒活性に対する同定された重要な残基の潜在的な寄与を理解するために、本発明者等は、ＳｗｉｓｓＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒバージョン４．０１（／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｄｂｖ／）によって、ウシＲＰＥ６５（ＰＤＢ受入：３ＦＳＮ）の３Ｄ構造を分析し、そしてＰＯＶ‐Ｒａｙバージョン３．６１（ｗｗｗ．ｐｏｖｒａｙ．ｏｒｇ／）で結果を表示した。３Ｄモデルにおいて、Ａｓｎ１７０、及びＬｙｓ２９７残基の両方は、ＲＰＥ６５分子（図８Ａ、Ｂ）の表面に局在化し、そしてＲＰＥ６５触媒部位の補因子鉄とは離れており（図８Ｃ）、これらの２つの残基は、基質の触媒作用に直接関与する可能性は低い。理論に拘束されるものではないが、本発明者等は、これらの残基置換が、例えば、より効率的な基質取り込み、及び／又は産物（１１ｃＲＯＬ）放出のために、ＲＰＥ６５膜結合を改善することができると考える。あるいは、これら２つの残基は、ＲＰＥ６５の適切な折りたたみに寄与して、膜と会合したときに、その活性コンフォメーションを達成する可能性がある。興味深いことに、Ｆ１キメラ（２位、３位、及び２６位で置換された）は、ＲＰＥ６５のタンパク質レベルの増加によるｈＲＰＥ６５の触媒活性の有意な改善も明らかにした。他の２つの残基置換とは異なり、Ｆ１断片のみがｃＲＰＥ６５のものに置き換えられたＦ１キメラは、ＲＰＥ６５タンパク質レベルによる正規化後のｗｔ ｈＲＰＥ６５の触媒活性と同様の活性を示した。Ｆ１断片は、３３アミノ酸を含み、そしてｈＲＰＥ６５とｃＲＰＥ６５とで異なる３残基のみを含む。Ｆ１断片中のこれらの残基は、ｈＲＰＥ６５突然変異体のタンパク質安定性を高めるために適切な折りたたみに寄与する可能性がある。他の可能性は、ヌクレオチド配列の相違の寄与である。Ｆ１断片中の３３アミノ酸をコードする９９塩基対のうち、ｈＲＰＥ６５とｃＲＰＥ６５との間に１９の異なるヌクレオチドが存在する。これらのヌクレオチド置換は、ｈＲＰＥ６５ ｍＲＮＡの安定性を改善するか、又はより効率的なコドン使用頻度に寄与し、高レベルの発現を導くことができる。
【０１３９】
上記のことから分かるように、本発明は、少なくとも1つの実施態様では、野生型の５残基（２位、３位、２６位、１７０位、及び２９７位）を、ｃＲＰＥ６５の対応するアミノ酸位置の残基で置換することにより、より高い活性のｈＲＰＥ６５突然変異体を生じた（本明細書中において、スーパーイソメロヒドロラーゼ（ｓＩＭＨ）として設計された）。このｓＩＭＨは、全細胞内タンパク質レベルによる正規化後に、より高い触媒活性（ｗｔ ＲＰＥ６５よりも４．４倍高い）を示した。一実施態様では、このｓＩＭＨ突然変異体は、ヒト対象における網膜ジストロフィーのより効果的な治療のためのＲＰＥ６５遺伝子補充療法に使用することができる。他の哺乳動物ＲＰＥ６５配列（本明細書中に記載の他の哺乳類ＲＰＥ６５配列を含むが、これに限定されない）に基づいて、開示された本発明の概念の他の突然変異体を形成するためになされてもよい他の置換には、これに限定されないが、図9に示されたものである。例えば、1つ以上の非限定的な実施態様では、２位において、Ｐｈｅ、又はＨｉｓは、Ｔｙｒの代わりに、３位で置換されたアミノ酸として使用され得、Ｔｈｒ、又はＣｙｓは、Ｓｅｒの代わりに、２６位で置換アミノ酸として使用され得、Ａｌａ、又はＩｌｅは、１７０位で、Ｖａｌの代わりに置換されたアミノ酸として使用され得、Ａｒｇ、又はＨｉｓは、２９７位で、Ｌｙｓの代わりに置換されたアミノ酸として使用され得、Ａｌａは、Ｇｌｙの代わりに置換されたアミノ酸として使用され得る。例えば、配列番号１に基づいて形成された突然変異体のいずれも、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、又は配列番号１７の哺乳類ＲＰＥ６５配列のいずれかで作製することができる。
【０１４０】
示された突然変異体のインビトロ活性アッセイを本明細書中に記載のように実施し、そしてイソメロヒドロラーゼ活性をＲＰＥ６５レベルの正規化後の相対活性として表した（％ｗｔ ｈＲＰＥ６５活性、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【０１４１】
開示された本発明の概念は、その態様をより完全に理解し認識することができるように、特定の実施態様に関連して本明細書中に記載されているが、開示された本発明の概念は、これらの特定の実施態様に限定されるものではない。それどころか、すべての代替、変更、及び均等物は、本明細書中で定義される開示された本発明の概念の範囲内に含まれることが意図される。従って、特定の実施態様を含む上記の実施例は、開示された本発明の概念の実施を説明する役割を果たすが、示された事項は例示であり、開示された本発明の概念の特定の実施態様の説明的な議論の目的のためのみであり、本発明の概念の原理、及び概念的側面だけでなく、手順の最も有用で容易に理解される記述であると考えられるものを提供するために提示される。本明細書中に記載された様々な組成物の処方、本明細書中に記載の方法、又は本明細書中に記載の方法の工程、若しくは一連の工程において、開示された本発明の概念の精神、及び範囲から逸脱することなく変更がなされてもよい。さらに、開示された本発明の概念の様々な実施態様が、以下の特許請求の範囲に記載されているが、開示された本発明の概念が、これらの特定の特許請求の範囲に限定されることは意図されていない。
【図１】
2017522895.tif 000005
【図２Ａ】
2017522895.tif 000006
【図２Ｂ】
2017522895.tif 000007
【図２Ｃ】
2017522895.tif 000008
【図２Ｄ】
2017522895.tif 000009
【図２Ｅ】
2017522895.tif 000010
【図２Ｆ】
2017522895.tif 000011
【図２Ｇ】
2017522895.tif 000012
【図２Ｈ】
2017522895.tif 000013
【図２Ｉ】
2017522895.tif 000014
【図２Ｊ】
2017522895.tif 000015
【図２Ｋ】
2017522895.tif 000016
【図２Ｌ】
2017522895.tif 000017
【図２Ｍ】
2017522895.tif 000018
【図２Ｎ】
2017522895.tif 000019
【図２Ｏ】
2017522895.tif 000020
【図２Ｐ】
2017522895.tif 000021
【図２Ｑ】
2017522895.tif 000022
【図２Ｒ】
2017522895.tif 000023
【図３Ａ−３Ｄ】
2017522895.tif 000024
【図４Ａ−４Ｇ】
2017522895.tif 000025
【図５Ａ−５Ｃ】
2017522895.tif 000026
【図６Ａ−６Ｂ】
2017522895.tif 000027
【図７Ａ−７Ｃ】
2017522895.tif 000028
【図８Ａ−８Ｃ】
2017522895.tif 000029
【図９】
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【配列表】
2017522895000001.app
【国際調査報告】
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2017522895.tif 000032
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