(57)【要約】  本発明は、選択的スプライシングを用いる、宿主細胞におけるポリペプチドの可溶性発現および宿主細胞の表面上のポリペプチドの発現のための発現構築物に関する。抗体、抗体断片および二重特異性抗体のようなポリペプチドの細胞膜発現の量は、発現する可溶性ポリペプチドの量と直接相関する。二重特異性抗体の場合、ヘテロ二量体およびホモ二量体産物の細胞膜発現は、これらの産物の可溶性発現と直接相関し、それにより、所望の産生細胞クローンの選択の助けとなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’方向に、
プロモーターと、
目的のポリペプチドをコードする第１のエクソンと、
イントロン内のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間に第１の停止コドンが位置する、スプライスドナー部位、イントロンおよびスプライスアクセプター部位と、
改変免疫グロブリン膜貫通領域または改変もしくは非改変非免疫グロブリン膜貫通領域から選択される膜貫通領域をコードする第２のエクソンと、
第２の停止コドンと、
ポリ（Ａ）部位と
を含む発現構築物であって、宿主細胞に侵入すると、前記第１および第２のエクソンが転写されることにより、目的のポリペプチドが発現され、所定割合の目的のポリペプチドが宿主細胞膜上に表面表示される、発現構築物。
【請求項２】
前記膜貫通領域が１７〜２９個の間の残基、好ましくは１９〜２６個の間の残基、最も好ましくは２１〜２４個の間の残基を含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項３】
非免疫グロブリン膜貫通領域がヒト血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体、ヒトおよびマウスＢ７−１、ヒトＩＣＡＭ−１、ヒトｅｒｂｂ１、ヒトｅｒｂｂ２、ヒトｅｒｂｂ３、ヒトｅｒｂｂ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４のようなヒト線維芽細胞増殖因子受容体、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトエリスロポエチン受容体、ヒトＰＲＬ−Ｒ、プロラクチン受容体、ヒトＥｐｈＡ１、エフリンＡ型受容体１、ヒトインスリン、ＩＧＦ−１受容体、ヒト受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ、ヒトニューロピリン、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩ（アルファおよびベータ鎖）、ヒトインテグリン（アルファおよびベータファミリー）、ヒトシンデカン、ヒトミエリンタンパク質、ヒトカドヘリン、ヒトシナプトブレビン−２、ヒトグリコフォリン−Ａ、ヒトＢｎｉｐ３、ヒトＡＰＰ、アミロイド前駆体タンパク質、ヒトＴ細胞受容体アルファおよびベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ゼータおよびＣＤ３イプシロンの膜貫通領域からなる群から選択される、請求項１または２に記載の発現構築物。
【請求項４】
非免疫グロブリン膜貫通領域がマウスＢ７−１膜貫通領域（配列番号１７３）、ＡＣＬＶ１（配列番号１７４）、ＡＮＴＲ２（配列番号１７５）、ＣＤ４（配列番号１７６）、ＰＴＰＲＭ（配列番号１７７）、ＴＮＲ５（配列番号１７８）、ＩＴＢ１（配列番号１７９）、ＩＧＦ１Ｒ（配列番号１８１）、１Ｂ０７（配列番号１８０）、ＴＲＭＢ（配列番号１８２）、ＩＬ４ＲＡ（配列番号１８３）、ＬＲＰ６（配列番号１８４）、ＧｐＡ（配列番号１８５）、ＰＴＣＲＡ（配列番号１８６）である、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項５】
前記イントロンがポリ（Ａ）部位を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項６】
前記イントロンのスプライスアクセプター部位がポリ（Ｙ）トラクトを含み、ポリ（Ｙ）トラクトのＹ含量が、それにおけるピリミジン塩基の数を変更することにより改変される、請求項１から５のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項７】
少なくとも１つの分岐点領域を含み、前記少なくとも１つの分岐点領域の配列が、分岐点領域の共通配列ＣＴＲＡＹＹ（配列番号３４７）に関して改変されている、請求項１から６のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項８】
イントロンのスプライスドナー部位の共通配列が改変されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項９】
目的のポリペプチドが抗体重鎖またはその断片を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の発現構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むクローニングまたは発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の１つまたは複数のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
抗体重鎖の発現のための請求項９に記載の発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および抗体軽鎖の発現のための発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
抗体重鎖の発現のための請求項９に記載の発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ｓｃＦＶ−Ｆｃの発現のための請求項８に記載の発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および抗体軽鎖の発現のための発現構築物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ポリペプチドを産生する方法であって、培養物中で請求項１２から１４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、培養物から発現したポリペプチドを単離することとを含む、方法。
【請求項１６】
目的のポリペプチドを発現する宿主細胞を選択する方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の発現構築物を宿主細胞にトランスフェクトすることと、
（ｉｉ）目的のポリペプチドを発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することと、
（ｉｉｉ）目的のポリペプチドの細胞膜発現を検出することと、
（ｉｖ）所望の発現レベルで細胞膜の表面上に目的のポリペプチドを表示する宿主細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項１７】
目的のヘテロ多量体ポリペプチドを発現する宿主細胞を選択する方法であって、
（ｉ）目的の第１のポリペプチドをコードする少なくとも１つの請求項１に記載の発現構築物および目的の第２のポリペプチドをコードする請求項１に記載の発現構築物を宿主細胞にコトランスフェクトすることと、
（ｉｉ）目的のヘテロ多量体ポリペプチドを発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することと、
（ｉｉｉ）目的のヘテロ多量体ポリペプチドの細胞膜発現を検出することと、
（ｉｖ）所望の発現レベルで細胞膜の表面上に所望の目的のヘテロ多量体ポリペプチドを表示する宿主細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項１８】
二重特異性抗体を発現する宿主細胞を選択する方法であって、
（ｉ）抗体重鎖をコードする請求項１に記載の発現構築物、ｓｃＦＶ−Ｆｃをコードする請求項１に記載の発現構築物および抗体軽鎖をコードする発現構築物を宿主細胞にコトランスフェクトすることと、
（ｉｉ）二重特異性抗体を発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することと、
（ｉｉｉ）二重特異性抗体の細胞膜発現を検出することと、
（ｉｖ）所望の発現レベルで細胞膜の表面上に所望の二重特異性抗体を表示する宿主細胞を選択することと
を含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的スプライシングを用いて真核細胞の表面上に目的の分泌タンパク質の一部を発現させるための発現構築物および方法に関する。本発明はまた、目的のタンパク質の膜発現レベルを検出することによって所望のレベルの目的の分泌タンパク質を発現する細胞を選択する方法に関する。本発明はさらに、目的のヘテロ多量体タンパク質の膜発現レベルを検出することによる目的の分泌ヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞の選択に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞においてタンパク質を産生するために、このタンパク質をコードするＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、これが次にタンパク質に翻訳されなければならない。ｍＲＮＡは、まず核内でイントロンおよびエクソンを含むｍＲＮＡ前駆体として転写される。ｍＲＮＡ前駆体の成熟ｍＲＮＡへの成熟中に、イントロンは、スプライセオソームと呼ばれる細胞機構によって切除（「スプライス」）される。エクソンは、ともに融合し、ｍＲＮＡは、その５’末端におけるいわゆるＣＡＰおよびその３’末端におけるポリアデニル化（ポリ（Ａ））尾部の付加により修飾される。成熟ｍＲＮＡは、細胞質に輸出され、タンパク質の翻訳のための鋳型としての役割を果たす。
【０００３】
選択的スプライシングは、同じ転写物が、異なる成熟ｍＲＮＡおよび場合によって異なるタンパク質をもたらす異なる仕方でスプライスされうることを述べる用語である。この機序は、天然ではタンパク質の発現レベルを変化させるために、または発生中の特定のタンパク質の活性を改変するために用いられる（Cooper TA & Ordahl CP (1985)、J Biol Chem、260巻(20号)、11140〜8頁）。選択的スプライシングは、通常多くの因子の複雑な相互作用により制御される（Orengo JPら、(2006) Nucleic Acids Res、34巻(22号)、e148頁）。
【０００４】
選択的スプライシングは、同じＤＮＡ鋳型から２つ（またはそれ以上）の異なるＲＮＡ転写物の産生を可能にする。これは、同じタンパク質またはポリペプチドの２つ（またはそれ以上）のイソ型を産生させるために用いることができる。本明細書を通して、タンパク質およびポリペプチドという用語は同義で用いられるものとする。
【０００５】
天然においては、これは、例えば、ヒト免疫系における活性化Ｂ細胞による抗体産生の過程中に用いられる高度に制御された過程である。抗体の大部分は、細胞外空間に分泌されるが、産生された抗体の一部は、分泌経路から膜結合イソ型の形で外細胞膜に転送される。
【０００６】
膜結合イソ型は、細胞外空間に分泌される抗体と同じアミノ酸配列および構造を有する。差異は、膜貫通ドメインを含む膜貫通領域を有する分泌抗体の重鎖のＣ末端伸長部である。Ｂ細胞では、このドメインは、約４０〜７５アミノ酸の間の長さを有しうる（Major JGら、(1996) Mol. Immunol. 33巻、179〜87頁）。
【０００７】
組換えポリペプチドの生成のための発現システムは、当技術分野で周知である。医薬製剤に用いられるポリペプチドおよびタンパク質の製造のために、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＨＥＫおよびＰＥＲ．Ｃ６などの哺乳類宿主細胞が一般的に用いられている。治療用タンパク質の大規模製造のために、高産生細胞株（high producer cell line）を作製しなければならない。目的のポリペプチドをコードする遺伝子による宿主細胞株のトランスフェクションの後に、異なる特性を有する多くのクローンが得られ、選択される。それは、例えば、選択マーカー、遺伝子増幅および／またはリポーター分子を用いることによって通常行われる。所望の特性を有する適切なクローン、例えば高産生クローンの選択は、時間がかかり、定型的な作業にならないことが多いため、費用がかかる過程である。
【０００８】
二重特異性抗体のようなヘテロ多量体タンパク質の発現のためには、適切な宿主細胞株の作製は、より複雑なものとなる。多量体を構成するタンパク質サブユニットは、別個の細胞株中で発現されて、次に多量体タンパク質への結合のために寄せ集められる可能性もあるし、あるいは異なるサブユニットが同じ細胞株中で発現される可能性もある。同じ細胞株におけるサブユニットの発現は、すべてのタンパク質サブユニットが正しい形に結合するとは限らず、異なる種が混合した物が生ずるという不都合を伴う。二重特異性抗体の作製に関して、所望のヘテロ二量体ではなくかなりのレベルのホモ二量体が生成することが一般的であり、これが二重特異性抗体の産生収率に著しい影響を及ぼす。不要なホモ二量体は、様々な精製技術により除去が可能であるが、下流の処理で浪費される時間と費用を低減するためにヘテロ二量体をホモ二量体より高いレベルで発現させる宿主細胞株を有することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、目的の産物を高レベルで発現する細胞クローンを選択するために、すなわち、量的選択のために用いることができる発現システムが必要である。所望の質の目的の産物、例えば、目的のヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞クローンを選択すること、すなわち、質的選択ができる必要もある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、目的の可溶性ポリペプチドの選択的スプライシングによる発現のための発現構築物または一連の構築物に関し、可溶性ペプチドの一部は、細胞外空間に分泌され、一部は、細胞の外膜上に表示される。
【００１１】
本発明はまた、所望のレベルの目的のポリペプチドをそれらの外膜上に表示する、本発明による１つまたは複数の構築物を含む宿主細胞の選択の方法を含む。
【００１２】
本発明はさらに、本発明による１つまたは複数の構築物を含む細胞上の目的のヘテロ多量体タンパク質の膜表示を検出することによる目的の分泌ヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞の選択に関する。
【００１３】
第１の態様では、本発明は、５’から３’方向に、
プロモーターと、
目的のポリペプチドをコードする第１のエクソンと、
イントロン内のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間に第１の停止コドンが位置する、スプライスドナー部位、イントロンおよびスプライスアクセプター部位と、
修飾免疫グロブリン膜貫通領域または非免疫グロブリン膜貫通領域である膜貫通領域をコードする第２のエクソンと、
第２の停止コドンと
ポリアデニル化部位と
を含む発現構築物であって、宿主細胞に侵入すると、第１および第２のエクソンが転写されることにより、目的のポリペプチドが発現され、所定割合の目的のポリペプチドが宿主細胞の外膜上に表示される、発現構築物を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、構築物の第２のエクソンによりコードされる膜貫通領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基を含む。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、構築物の第２のエクソンによりコードされる膜貫通領域は、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６個以下のアミノ酸残基を含む。
【００１６】
とりわけ、膜貫通領域は、１７〜２９個の間の残基、１９〜２６個の間の残基または２１〜２４個の残基を含みうる。
【００１７】
本発明によれば、修飾免疫グロブリン膜貫通領域または修飾非免疫グロブリン膜貫通領域は、天然に存在する免疫グロブリンまたは非免疫グロブリン膜貫通領域の任意の修飾型でありうる。
【００１８】
発明者らは、多様なグループの膜貫通領域についてその特性が改変され、とりわけ細胞膜へのそれらの組込み、ひいては目的のポリペプチドの表示がモジュレートされるように、それらを改変した。とりわけ、膜貫通領域における非疎水性残基の数が１つまたは複数の残基分減少または増加され、加えて膜貫通領域のサイズが増加または減少されるように、膜貫通領域のアミノ酸組成を変更することができる。
【００１９】
本発明の発明者らは、非免疫グロブリン膜貫通領域、例えば、マウスＢ７−１膜貫通領域（配列番号１７３）の使用が、ＩｇＧ１膜貫通領域を使用する場合に認められるレベルと比較して高いレベルの細胞膜発現をもたらすことを驚くべきことに見いだした。
【００２０】
発明者らは、ＡＣＬＶ１（ＮＰ＿００１０７０８６９．１）配列番号１７４、ＡＮＴＲ２（ＮＰ＿４７７５２０．２）配列番号１７５、ＣＤ４（ＮＰ＿０００６０７．１）配列番号１７６、ＲＴＰＲＭ（ＮＰ＿００２８３６．３）配列番号１７７、ＴＮＲ５（ＮＰ＿００１２４１．１）配列番号１７８、ＩＴＢ１（ＮＰ＿５９６８６７．１）配列番号１７９、ＩＧＦ１Ｒ（ＮＰ＿０００８６６．１）配列番号１８１、１Ｂ０７（ＮＰ＿００５５０５．２）配列番号１８０、ＴＲＭＢ（ＮＰ＿０００３５２．１）配列番号１８２、ＩＬ４ＲＡ（ＮＰ＿０００４０９．１）配列番号１８３、ＬＲＰ６（ＮＰ＿００２３２７．２）配列番号１８４、ＧｐＡ（ＮＰ＿００２０９０）配列番号１８５、ＰＴＣＲＡ（ＮＰ＿００１２３００９７．１）配列番号１８６といった他の膜貫通領域ならびにこれらの膜貫通領域の改変型も試験し、これらが本発明による構築物に用いるのに適することを示した。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、第１の停止コドンは、イントロンのスプライスドナー部位の３’に位置する。
【００２２】
一実施形態では、本発明はまた、ポリペプチドの大部分を可溶性の状態で発現させながら、細胞選択を可能にするのに十分な量のポリペプチドが細胞膜上に表示されるように、所定の構築物について認められるスプライス比を変化させる方法を提供する。
【００２３】
発明者らは、特許請求された発現構築物の様々な成分を試験して、それらが目的のタンパク質の膜表示をモジュレートすることを可能にした。
【００２４】
本発明によれば、可溶性ポリペプチドの発現のレベルは、本明細書で述べる発現構築物のイントロンにポリ（Ａ）部位を含めることにより増大させることができる。
【００２５】
本発明の態様によれば、構築物は、プロモーターと第１のエクソンとの間に位置する構成的イントロンを含みうる。
【００２６】
本発明によれば、細胞膜上に表示される目的のタンパク質の量を増加または減少させるためにスプライスアクセプターおよびスプライスドナーの強度を修正することができる。
【００２７】
とりわけ、構築物に存在するスプライスドナー部位の配列と共通スプライスドナー部位配列（Ｃ／Ａ）ＡＧＧＴ（Ａ／Ｇ）ＡＧＴ（配列番号３４５）との同一性％または類似性％を低下または増大させることにより、スプライスドナー部位の共通配列を改変することができる。
【００２８】
さらなる実施形態では、スプライスドナーの強度を低下させるためにスプライスドナー部位の共通配列を改変する。スプライスドナー部位の共通配列は、代替コドンの使用により、例えば、リシンのＡＡＡコーディングをリシンのＡＡＧコーディングに置き換えることにより改変しうる。これにより、膜発現のレベルが低下する。逆に、共通スプライスドナー部位配列（Ｃ／Ａ）ＡＧＧＴ（Ａ／Ｇ）ＡＧＴ（配列番号３４５）に対するスプライスドナー部位の同一性％または類似性％を増大させることにより、構築物におけるスプライスドナー部位の強度が増大し、膜発現のレベルが増大する。
【００２９】
本発明の態様によれば、スプライスドナー部位は、第１のエクソンの３’末端およびイントロンの５’末端と重なり、イントロンのスプライスアクセプター部位は、イントロンの３’末端に位置する。
【００３０】
本発明の態様によれば、第１の停止コドンは、スプライスドナー部位の３’ に位置する。
【００３１】
発現構築物のイントロンは、スプライスアクセプター部位に含まれたポリ（Ｙ）トラクトを任意選択で含む。発現構築物のイントロンのスプライスアクセプター部位に含まれたポリ（Ｙ）トラクトのＹ含量を改変しうる。ポリ（Ｙ）トラクトにおけるピリミジン塩基（Ｙｓ）の数を変更することにより、目的のポリペプチドの細胞膜発現を減少または増加させることができる。細胞による高レベルの膜発現を有する目的のポリペプチドについては、ポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹｓの数を減少させることにより、膜発現のレベルが低下する。細胞による低レベルの膜発現を有するポリペプチドについては、ポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹｓの数を増加させることにより、膜発現のレベルが増大する。
【００３２】
とりわけ、スプライスアクセプター部位のポリ（Ｙ）含量を変化させることにより、スプライスアクセプター部位の強度を低下させ、目的のポリペプチドの膜表示を減少させるために、スプライスアクセプターのポリ（Ｙ）含量を減少させることができる。
【００３３】
あるいは、スプライスアクセプター部位のポリ（Ｙ）含量を変化させることにより、スプライスアクセプター部位の強度を増大させ、目的のポリペプチドの膜表示を増加させるために、スプライスアクセプターのポリ（Ｙ）含量を増加させることができる。
【００３４】
上記で概説した改変に加えて、膜表示ポリペプチドをもたらす選択的スプライシング事象は、分岐点領域のＤＮＡ（およびしたがってＲＮＡ）配列を改変することによる影響も受けうる。分岐点領域のヌクレオチドは、５’スプライス部位におけるイントロンの第１のヌクレオチドを攻撃することによりスプライス事象を開始し、それに伴ってラリアット中間体を形成する。共通配列（ＣＴＲＡＹＹ配列番号３４７）に対して分岐点領域の配列を変化させることは、スプライス事象の開始の有効性に対して、またそれとともに分泌ポリペプチド対膜表示ポリペプチドの比に対して影響を与えうる。
【００３５】
さらに、イントロンの長さがスプライス比に影響を及ぼしうる。エクソンの直接上流のイントロンが短縮された場合、ＣＤ４４に選択的エクソンを含む可能性が増大することが実証された（Bell M.、Cowper A.、Lefranc M.、Bell J.およびScreaton G.(1998) Influence of Intron Length on Alternative Splicing of CD44、Mol Cell Biol。 18巻(10号)、5930〜5941頁）。したがって、構築物を改変するさらなる手段は、膜表示ポリペプチドの割合を増加させるために選択的スプライシング構築物におけるイントロンの長さを短くすることまたはその逆である。
【００３６】
スプライス事象に影響を及ぼすさらなる機構は、エクソンの包含またはスキッピングをもたらすＲＮＡ結合タンパク質の共発現である。例えば、ＣＵＧ−ＢＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ５Ｆ３Ｔ７）およびｍｕｓｃｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｌｉｋｅ  ３（ＭＢＮＬ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ５ＺＫＷ９）タンパク質は、ＥＧＦＰおよびｄｓＲＥＤを発現する構築物におけるスプライス比に影響を及ぼすことが示された（Orengoら、2006）。
【００３７】
したがって、本発明はまた、エクソンの包含またはスキッピングをもたらすＲＮＡ結合タンパク質をコードする発現性ＯＲＦを含むさらなる改変構築物を提供する。また、方法は、エクソンの包含もしくはスキッピングをもたらすＲＮＡ結合タンパク質をコードする発現性ＯＲＦを含む、本発明による構築物および／またはそのようなＯＲＦを含む別個の構築物の共トランスフェクションを包含する。
【００３８】
さらに大部分の膜タンパク質は、細胞表面に到達する前に小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置を通過する。ＥＲからの輸出は、ＥＲ出口の部位から出芽するコートマー複合体ＩＩ（ＣＯＰＩＩ）輸送小胞によって媒介される選択的過程である。ＣＯＰＩＩ輸送小胞の成分と膜固定タンパク質の細胞質ドメインにおける線状二酸、疎水性および芳香族モチーフまたは構造モチーフを有する短いアミノ酸配列との相互作用は、ＥＲ出口部位におけるカーゴタンパク質を濃縮し、ＣＯＰＩＩ小胞内へのカーゴの動員を増強させる。これらの短い線状または構造アミノ酸配列モチーフは、ＥＲ輸出シグナルと呼ばれる。
【００３９】
したがって、目的のタンパク質の膜表示を調節する別のアプローチは、膜貫通領域と融合した目的のポリペプチドのＥＲ通過を修正するために、ＥＲ輸出シグナルを含めることまたは含めないことである。ＥＲ輸出を増大させるために構築物内に含まれるＥＲ輸出シグナルの修正は、低い半減期または他の安定性もしくは分解の問題を有するタンパク質の膜表示を増加させるのに有用であり、また逆も同様である。
【００４０】
本発明の発明者らは、細胞膜上に表示される目的のポリペプチドの量が可溶性ポリペプチドの発現レベルに正比例することを見いだした。したがって、高力価の目的のポリペプチドを発現する宿主細胞は、低力価のポリペプチドを発現する宿主細胞よりも多くのポリペプチドを膜上に表示する。これにより、高生産性組換え宿主細胞の直接的な同定および単離がされうる。
【００４１】
本発明の態様では、発現構築物によりコードされるポリペプチドは、タンパク質多量体、例えば、組換え抗体またはその断片のようなヘテロ多量体ポリペプチドの一部でありうる。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびｓｃＦｖからなるリストから選択されてもよい。好ましい実施形態では、発現構築物により発現されるポリペプチドは、抗体重鎖またはその断片でありうる。
【００４２】
本発明のさらなる態様では、発現構築物は、宿主細胞における二重特異性抗体の発現のために用いられうる。一実施形態では、発現するポリペプチドは、抗体重鎖である。あるいは、発現するポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域に連結された抗体の断片である。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびｓｃＦｖからなるリストから選択されうる。好ましくは、抗体断片は、ＦａｂまたはｓｃＦｖである。より好ましくは、抗体断片は、ｓｃＦｖである。二重特異性抗体の発現を達成するために、抗体軽鎖の発現のための別個の発現構築物も提供されうる。抗体重鎖および抗体断片−Ｆｃをコードする発現構築物と抗体軽鎖をコードする発現構築物との宿主細胞における共発現は、二重特異性抗体の発現をもたらす。上で述べたように、宿主細胞における二重特異性抗体の発現は、所望のヘテロ二量体の他に多くの不要なホモ二量体種をもたらす。本発明の好ましい実施形態では、これらの二重特異性抗体成分の細胞膜表示は、ヘテロ二量体抗体を主に発現する宿主細胞の直接的な選択を可能にする。
【００４３】
本発明はまた、ポリペプチドの大部分を可溶性の状態で発現させながら、細胞選択を可能にするのに十分な量のポリペプチドが細胞膜上に表示されるようにスプライス比を改変する方法を提供する。
【００４４】
本発明のこの態様によれば、方法は、目的のポリペプチドの膜表示を測定することと、次に目的のポリペプチドを発現する細胞のより適切な選択を可能にするために膜表示を増加または減少させるために目的のポリペプチドの観測された膜表示に基づいて構築物の成分を修正することとを含む。
【００４５】
本発明はまた、目的のタンパク質または目的のタンパク質を含むヘテロ多量体タンパク質の膜発現レベルを検出することによる細胞の選択を含む、本発明による少なくとも１つの構築物を含む細胞を選択する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の選択的スプライシング構築物の概略図である。ポリペプチドの選択的スプライシングは、２つのスプライス産物を生じさせる。スプライス産物１については、２つの最終アミノ酸グリシン（Ｇ）およびリシン（Ｋ）をコードするコドンは、ｍＲＮＡに組み込まれ、ポリペプチドは、細胞から分泌される。スプライス産物２については、ポリペプチドは、２つのアミノ酸ＧおよびＫを含まずに、任意選択の連結領域、膜貫通ドメインおよび任意選択の小細胞内ドメインから構成される膜貫通領域により拡張され、得られたポリペプチドは、分泌されずに、細胞の外膜上に提示される。
【図２】異なる膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（ｃｔｒｌ）。異なる選択的スプライシング構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした対照細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ａ〜Ｄ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｅ）ならびに染色の平均蛍光（Ｇ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｈ）。
【図３】ＩｇＧ４抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ４抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（ＩｇＧ４）。選択的スプライシング構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、分泌ＩｇＧ４抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした対照細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ａ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｂ）ならびに染色の平均蛍光（Ｄ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｃ）。
【図４】選択的スプライシング技術を用いた細胞膜上に表示された二重特異性抗体の特異的検出を示す図である。細胞は、トランスフェクションの１日後に染色した。Ｆｃ断片（ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＨＣ）は、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異抗体を用いて検出した（Ａ〜Ｃ、Ｊ〜Ｌ）。カッパ軽鎖は、マウス抗ヒトカッパＬＣ  ＡＰＣ標識抗体を用いて検出した（Ｄ〜Ｆ、Ｍ〜Ｏ）。ｓｃＦｖ−Ｆｃの染色は、ＦＩＴＣ標識プロテインＡを用いて実施した。トランスフェクト細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示した。第１のトランスフェクションカクテル（Ａ、Ｄ、Ｇ）については、非トランスフェクト細胞について得られたプロファイルは、オーバーレイ（黒色の線）として示した。他のすべて実験（Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＦおよびＨ〜Ｒ）については、陰性対照（膜貫通ドメインを含まないトランスフェクト細胞について得られたプロファイル）は、オーバーレイ（破線）として示した。
【図５】一過性トランスフェクションの６日後の分泌ＢＥＡＴ（登録商標）およびｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体分子の力価を示す図である。
【図６】異なる膜貫通領域および発現構築物の異なる改変を含むＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（対照）。
【図７】ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトしたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のための異なる選択的スプライシング構築物の標準化発現レベルを示す図である。上清は、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ装置およびプロテインＡバイオプローブを用いて解析した（標準ＨＣ：選択的スプライシングを用いない対照）。
【図８】Ｂ７−１膜貫通領域およびスプライスアクセプターのポリ（Ｙ）トラクトの異なるＹ含量を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（ｃｔｒｌ）。異なる選択的スプライシング構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ａ〜Ｇ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｈ）ならびに染色の平均蛍光（Ｊ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｉ）。
【図９】Ｂ７−１膜貫通領域およびスプライスドナーの共通配列の改変を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（ｃｔｒｌ）。異なる選択的スプライシング構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ａ〜Ｃ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｄ）ならびに染色の平均蛍光（Ｆ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｅ）。
【図１０】２２〜２３個の疎水性アミノ酸の異なる膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陽性対照として、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする選択的スプライシング構築物をトランスフェクトし（（Ａ）における塗りつぶされたヒストグラム）、陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞を、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（（Ａ）における重ね合わせの黒色の線）。異なる膜貫通ドメインを用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｂ〜Ｇ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｈ）ならびに染色の平均蛍光（Ｉ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｇ）。
【図１１】疎水性、極性および荷電残基を含む２１〜２４個の疎水性アミノ酸の異なる膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陽性対照として、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする選択的スプライシング構築物をトランスフェクトし（（Ａ）における塗りつぶされたヒストグラム）、陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（（Ａ）における重ね合わせの黒色の線）。異なる膜貫通ドメインを用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｂ〜Ｈ）。ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインを用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｉ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｊ）ならびに染色の平均蛍光（Ｌ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｋ）。
【図１２】ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインにおける疎水性残基数の変動を有するＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陽性対照として、Ｂ７−１膜貫通領域および野生型ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインを用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする選択的スプライシング構築物をトランスフェクトし（（Ａ）における塗りつぶされたヒストグラム）、陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（（Ａ）における重ね合わせの黒色の線）。ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインの異なる修飾を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、野生型ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｂ〜Ｈ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｉ）ならびに染色の平均蛍光（Ｋ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｊ）。
【図１３】疎水性、極性および荷電残基を含む１７〜１９疎水性アミノ酸の異なる膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陽性対照として、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする選択的スプライシング構築物をトランスフェクトし（（Ａ）における塗りつぶされたヒストグラム）、陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（（Ａ）における重ね合わせの黒色の線）。異なる膜貫通ドメインを用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｂ〜Ｄ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｅ）ならびに染色の平均蛍光（Ｇ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｆ）。
【図１４】疎水性、極性および荷電残基を含む２６〜２７個の疎水性アミノ酸の異なる膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陽性対照として、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする選択的スプライシング構築物をトランスフェクトし（（Ａ）における塗りつぶされたヒストグラム）、陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（（Ａ）における重ね合わせの黒色の線）。異なる膜貫通ドメインを用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｂ〜Ｅ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｆ）ならびに染色の平均蛍光（Ｈ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｇ）。
【図１５】短縮または伸長Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陽性対照として、野性型Ｂ７−１膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする選択的スプライシング構築物をトランスフェクトし（（Ａ）における塗りつぶされたヒストグラム）、陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（（Ａ）における重ね合わせの黒色の線）。異なる膜貫通ドメインを用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、Ｂ７−１野性型膜貫通ドメインを含むＢ７−１膜貫通領域を用いた構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｂ〜Ｅ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｆ）ならびに染色の平均蛍光（Ｈ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いて一過性発現の４日後に決定した（Ｇ）。
【図１６】異なる細胞質ゾル側末端を含むＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陽性対照として、Ｂ７−１細胞質ゾル側末端を含むＢ７−１膜貫通領域を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする選択的スプライシング構築物をトランスフェクトし（（Ａ）における塗りつぶされたヒストグラム）、陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞を、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（（Ａ）における重ね合わせの黒色の線）。異なる細胞質ゾル側末端を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、Ｂ７−１細胞質ゾル側末端を含むＢ７−１膜貫通領域を用いた構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｂ〜Ｎ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｏ）ならびに染色の平均蛍光（Ｑ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｐ）。
【図１７】異なる細胞質ゾル側末端を含むＭ１Ｍ２膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の表示および分泌のために選択的スプライシング構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞の染色プロファイルを示す図である。解析は、トランスフェクションの翌日に実施した。陽性対照として、Ｍ１Ｍ２細胞質ゾル側末端を含むＭ１Ｍ２膜貫通領域を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする選択的スプライシング構築物をトランスフェクトし（（Ａ）における塗りつぶされたヒストグラム）、陰性対照として、ＣＨＯ−Ｓ細胞に、分泌ＩｇＧ１抗体をコードする非スプライシング構築物をトランスフェクトした（（Ａ）における重ね合わせの黒色の線）。Ｂ７−１細胞質ゾル側末端を含むＭ１Ｍ２膜貫通領域を用いた分泌および膜表示ＩｇＧ１をコードする構築物をトランスフェクトした細胞について実施した染色は、塗りつぶされたヒストグラムとして示し、Ｍ１Ｍ２細胞質ゾル側末端を含むＭ１Ｍ２膜貫通領域を用いた構築物をトランスフェクトした細胞の染色は、重ね合わせの黒色の線として含める（Ｂ）。選択的スプライシング構築物および対照の染色細胞の百分率（Ｃ）ならびに染色の平均蛍光（Ｅ）を決定するためにヒストグラムを用いた。分泌抗体の力価は、Ｏｃｔｅｔ装置を用いてトランスフェクションの４日後に決定した（Ｄ）。
【図１８】ＢＥＡＴ二重特異性抗体の３つのサブユニットのアセンブリ変異体を示す図である。
【図１９】図１９は、選択された安定細胞プールのデュアルカッパ軽鎖（ＬＣ）およびＦｃ断片の染色の後に得られたドットプロットの例を示す図である。細胞膜上の染色により検出される可能な分子は、右に示される。Ｆｃ断片は、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異抗体を用いて検出した。カッパ軽鎖は、マウス抗ヒトカッパＬＣ  ＡＰＣ標識抗体を用いて検出した。
【図２０】選択的スプライシングベクターをトランスフェクトした安定プールの表面染色と分泌プロファイルとの間の相関関係を示す図である。プロットしたＱ６＊およびＱ７＊の百分率は、１００％が全生産性細胞集団（Ｑ８を除く）であることを意味する。
【図２１】細胞選別の前の安定細胞プールの表面染色の後に得られたドットプロットを示す図である。染色には、細胞表面上に表示されるバインダーの検出のための可溶性標的１および２を用いている。細胞膜上の染色により検出される可能な分子は、対応する象限に示される。
【図２２】図２２は、１４日流加培養物の上清中に検出されたＢＥＡＴ（登録商標）分子の割合とそれらの細胞表面上にＢＥＡＴ（登録商標）表現型を表示している細胞の割合との間の相関関係を示す図である。
【図２３】選択的スプライシング構築物をトランスフェクトした選択された安定細胞プールについて得られた測定表面Ｆｃプロファイルの例を示す図である。細胞膜上に存在するＩｇＧは、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異抗体を用いて検出した。生存細胞をＦＳＣ対ＳＳＣドットプロットにおいてゲーティングして（Ａにおけるｇ１）、供試選択的スプライシングプールの蛍光分布を表示した（塗りつぶされたヒストグラム、Ｂ）。選択的スプライシング構築物を欠くＩｇＧ分泌クローンの染色を陰性対照として用い、オーバーレイ（破線）として示す。
【図２４】回分法の実施中にアッセイした分泌細胞の表面染色強度と発現レベルとの間の相関関係を示す図であり、補足バッチの１日目における表面強度とＩｇＧ力価との間の相関関係（Ａ）および１日目における表面強度と対数期中（１〜３日目）に測定したｑＰとの間の相関関係（Ｂ）を示す。
【図２５】１日目における表面染色強度が７日目における蓄積分泌ＩｇＧを予測するものであることを示す図である。
【図２６】ＩｇＧ表面表示による高生産性細胞の選択を示す図である。フローサイトメトリー細胞選別によりそれらの膜上に「低」、「中」および「高」密度のＩｇＧを表示する細胞を選択した（Ａ）。選別の２週間後に表面蛍光の分布を決定し（Ｂ）、保管クローンの比生産性を補足バッチにおいて評価した（Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、ポリペプチド、とりわけヘテロ多量体ポリペプチドの細胞膜発現のための発現構築物および方法を提供する。特に、目的のタンパク質は、宿主細胞における選択的スプライシングを用いた組換え抗体もしくはその断片または二重特異性抗体でありうる。細胞膜表示のレベルは、組換え宿主細胞におけるポリペプチドの分泌レベルを示し、ヘテロ二量体抗体については、細胞膜表示は、分泌プロファイル、すなわち、ヘテロ二量体またはホモ二量体発現も示すものである。
【００４８】
本明細書で同義で用いる「発現構築物」または「構築物」という用語は、発現させるべきポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列ならびにプロモーター配列および場合によってはエンハンサー配列のようなその発現を制御する配列を含むシス作用転写制御エレメントの任意の組合せを含む。遺伝子の発現、すなわち、その転写および転写産物の翻訳を制御する配列は、一般的に調節ユニットと呼ばれる。調節ユニットの大部分は、遺伝子のコード配列の上流に位置し、それに作動可能に連結している。発現構築物は、ポリ（Ａ）部位を含む下流３’非翻訳領域も含みうる。
【００４９】
本発明の調節ユニットは、発現させるべき遺伝子に作動可能に連結している、すなわち、転写ユニットか、または例えば、異種遺伝子の５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）のような介在ＤＮＡによってそれから分離されている。好ましくは、発現構築物は、ベクターへの発現構築物の挿入および／またはベクターからのその切除を可能にするために１つまたは複数の適切な制限部位が両端に隣接する。したがって、本発明による発現構築物は、発現ベクター、とりわけ哺乳類発現ベクターの構築に用いることができる。
【００５０】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列」という用語は、本明細書で用いられる場合、遺伝子、好ましくはポリペプチドを発現する異種遺伝子をコードするＤＮＡを含む。
【００５１】
「異種コード配列」、「異種遺伝子配列」、「異種遺伝子」、「組換え遺伝子」または「遺伝子」という用語は、同義で用いる。これらの用語は、宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞において発現させ、さらなる使用のために収集しようとする組換えポリペプチド、とりわけ組換え異種タンパク質産物をコードするＤＮＡ配列を意味する。遺伝子の産物は、ポリペプチド、糖ペプチドまたはリポ糖ペプチドでありうる。異種遺伝子配列は、宿主細胞において天然に存在する可能性がなく、同じまたは異なる種の生物体に由来し、遺伝学的に改変されていてもよい。あるいは、異種遺伝子配列は、宿主細胞において天然に存在する。
【００５２】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、同義で用いられ、隣接残基のアルファアミノ基およびカルボキシ基間のペプチド結合により他のものに連結されている一連のアミノ酸残基を含む。
【００５３】
「プロモーター」という用語は、本明細書で用いられる場合、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合し、ＲＮＡ合成を開始することを誘導することによって転写の開始を媒介する、遺伝子の上流に一般的に位置する調節ＤＮＡ配列を定義するものである。本発明で用いるプロモーターは、例えば、高レベルの発現をもたらすウイルス、哺乳類、昆虫および酵母プロモーター、例えば、哺乳類サイトメガロウイルスもしくはＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたは真核細胞における発現に適する当技術分野で公知の任意のプロモーターを含む。本発明の発現構築物に用いるのに特に適するプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ヒトｔｋプロモーター、ＭＰＳＶプロモーター、マウスＣＭＶ、ヒトＣＭＶ、ラットＣＭＶ、ヒトＥＦ１アルファ、チャイニーズハムスターＥＦ１アルファ、ヒトＧＡＰＤＨ、ＭＹＣ、ＨＹＫおよびＣＸプロモーターを含むハイブリッドプロモーター、転写因子結合部位の転位に基づく合成プロモーターからなるリストから選択しうる。本発明の特定の好ましいプロモーターは、マウスＣＭＶプロモーターである。
【００５４】
「５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）」という用語は、ｍＲＮＡ前駆体または成熟ｍＲＮＡの５’末端における非翻訳セグメントを意味する。成熟ｍＲＮＡでは、５’ＵＴＲは、一般的にその５’末端に７−メチルグアノシンキャップを有し、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質へのｍＲＮＡ輸出、翻訳機構によるｍＲＮＡの５’末端の同定ならびに分解に対するｍＲＮＡの防護などの多くの過程に関与する（Cowling VH (2010) Biochem J、425巻、295〜302頁）。
【００５５】
「イントロン」という用語は、転写され、ｍＲＮＡ前駆体に存在するが、それぞれイントロンの５’および３’末端におけるスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位の配列に基づいてスプライシング機構により切除され、したがって、成熟ｍＲＮＡ転写物には存在しない核酸非コード配列のセグメントを意味する。一般的に、イントロンは、３’スプライス部位の２０〜５０ヌクレオチド上流の間に位置する、分岐点と呼ばれる内部部位を有する。本発明で用いるイントロンの長さは、５０〜１００００ヌクレオチド長の間でありうる。短縮イントロンは、５０以上のヌクレオチドを含みうる。全長イントロンは、１００００を超えるヌクレオチドを含みうる。本発明の発現構築物に用いるのに適するイントロンは、合成もしくは人工イントロン；または−グロビン／ＩｇＧキメライントロン、−グロビンイントロン、ＩｇＧイントロン、マウスＣＭＶ第１イントロン、ラットＣＭＶ第１イントロン、ヒトＣＭＶ第１イントロン、Ｉｇ可変領域イントロンおよびスプライスアクセプター部位（Bothwellら、(1981) Cell、24巻、625〜637頁；ＵＳ５，０２４，９３９）、ニワトリＴＮＴ遺伝子のイントロンならびにＥＦ１アルファの第１イントロンもしくはそれらの改変型等の天然に存在するイントロンからなるリストから選択しうる。
【００５６】
本発明に用いるイントロンは、異なるイントロンに由来するスプライスアクセプターおよびスプライスドナー部位を有しうる。例えば、イントロンは、ヒトＩｇＧイントロンに由来するスプライスドナー部位、例えば、ｉｇｈｇ１遺伝子のスプライスドナー部位およびニワトリｃＴＮＴイントロン４に由来するスプライスアクセプター部位を含みうる。
【００５７】
好ましい実施形態では、イントロンは、ヒトＩｇＧイントロンに由来するスプライスドナー部位およびニワトリｃＴＮＴイントロン４に由来するスプライスアクセプター部位を含む。より好ましくは、ヒトＩｇＧイントロンに由来するスプライスドナー部位ならびにニワトリＴＮＴイントロン４（配列番号６９）およびニワトリＴＮＴイントロン４に由来する構築物（配列番号７０〜７８）からなる群から選択されるスプライスアクセプターを含むイントロンである。
【００５８】
「エクソン」という用語は、ｍＲＮＡに転写され、スプライシングの後に成熟ｍＲＮＡに保持されている核酸配列のセグメントを意味する。
【００５９】
「スプライス部位」という用語は、切断され、かつ／または対応するスプライス部位にライゲートされるのに適する、真核細胞のスプライシング機構により認識されうる特定の核酸配列を意味する。スプライス部位は、ｍＲＮＡ前駆体転写物に存在するイントロンの切除を可能にする。一般的にスプライス部位の５’部分は、スプライスドナー部位と呼ばれ、３’側の対応するスプライス部位は、スプライスアクセプター部位と呼ばれる。スプライス部位という用語は、例えば、天然に存在するスプライス部位、加工されたスプライス部位、例えば、合成スプライス部位、カノニカルもしくはコンセサススプライス部位、および／または非カノニカルプライス部位、例えば、隠れスプライス部位を含む。本発明の発現構築物に用いるのに適するスプライスドナーまたはアクセプター部位は、−グロビン／ＩｇＧキメライントロンに由来するスプライスドナーおよびアクセプター、−グロビンイントロンに由来するスプライスドナーおよびアクセプター、ＩｇＧイントロンに由来するスプライスドナーおよびアクセプター、マウスＣＭＶ第１イントロンに由来するスプライスドナーおよびアクセプター、ラットＣＭＶ第１イントロンに由来するスプライスドナーおよびアクセプター、ヒトＣＭＶ第１イントロンに由来するスプライスドナーおよびアクセプター、Ｉｇ可変領域イントロンおよびスプライスアクセプター配列に由来するスプライスドナーおよびアクセプター（Bothwellら、(1981) Cell、24巻、625〜637頁；ＵＳ５，０２４，９３９）、ニワトリＴＮＴ遺伝子のイントロンに由来するスプライスドナーおよびアクセプターならびにＥＦ１アルファ遺伝子の第１イントロンまたはそれらの融合構築物に由来するスプライスドナーおよびアクセプターからなるリストから選択されうる。好ましい実施形態では、スプライスドナー部位は、ヒトＩｇＧイントロンに由来し、スプライスアクセプター部位は、ニワトリＴＮＴイントロン４（配列番号６９）およびニワトリＴＮＴイントロン４に由来する構築物（配列番号７０〜７８）からなる群から選択される。
【００６０】
スプライスドナー領域の共通配列という用語は、本明細書で用いられる場合、「Molecular Biology of the Cell」（Albertsら、Garland Publishing、New York 1995）に記載されているように配列（Ｃ／Ａ）ＡＧＧＵ（Ａ／Ｇ）ＡＧＵ（下線を引いた配列はイントロンの一部である）配列番号３４５を意味する。
【００６１】
スプライスアクセプター領域の共通配列という用語は、本明細書で用いられる場合、「Molecular Biology of the Cell」（Albertsら、Garland Science、New York 2002）に記載されているように配列ＣＴＲＡＹＹ−−−ポリ（Ｙ）トラクト−−−ＮＣＡＧＧ（下線を引いた配列はイントロンの一部である；イタリック体：分岐点領域）配列番号３４６を意味する。
【００６２】
「停止コドン」という用語は、タンパク質合成の終結を示す３つの停止コドン（ＴＡＡ（ＲＮＡ：ＵＡＡ）、ＴＡＧ（ＲＮＡ：ＵＡＧ）およびＴＧＡ（ＲＮＡ：ＵＧＡ）のいずれか１つを意味する。不完全な終結効率または停止コドンの「漏れ」を避けるために、２つ、３つまたは多数の停止コドンを用いて、タンパク質合成の終結を示しうる。
【００６３】
「膜貫通領域」という用語は、核酸配列によりコードされ、任意選択の細胞外部分、膜貫通ドメインおよび任意選択の細胞質ゾル側末端を含むポリペプチドまたはタンパク質を意味する。膜貫通ドメインは、膜内で熱力学的に安定であり、疎水性アミノ酸から主として構成された膜貫通タンパク質の単一膜貫通アルファらせんを通常含む任意の三次元タンパク質構造である。膜貫通ドメインの長さは、平均して２１アミノ酸であるが、４アミノ酸から４８アミノ酸まで変化しうる（Baeza-Delgadoら、2012）。膜貫通領域は、アミノ酸の任意選択のＮ末端細胞外連結伸長部および膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、Ｃ末端細胞質アミノ酸伸長部または細胞内ドメインをさらに含みうる。例えば、ヒトｉｇｈｇ１遺伝子に見いだされる膜貫通領域は、アミノ酸の連結伸長部とそれに続く２つのドメインＭ１およびＭ２から構成されている（この膜貫通領域は、「Ｍ１Ｍ２」または「ＩｇＧ１膜貫通領域」と呼ぶこととする）。本発明において有用な膜貫通領域は、ヒト血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）遺伝子（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ１６２３４）、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０７３０６）、ヒトおよびマウスＢ７−１（ヒト：ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ３３６８１およびマウス：ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＱ００６０９）、ヒトＩＣＡＭ−１（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０５３６２）、ヒトｅｒｂｂ１（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ００５３３）、ヒトｅｒｂｂ２（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０４６２６）、ヒトｅｒｂｂ３（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２１８６０）、ヒトｅｒｂｂ４（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＱ１５３０３）、ＦＧＦＲ１（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ１１３６２）、ＦＧＦＲ２（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２１８０２）、ＦＧＦＲ３（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２２６０７）、ＦＧＦＲ４（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２２４５５）のようなヒト線維芽細胞増殖因子受容体、ヒトＶＥＧＦＲ−１（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ１７９４８）、ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ３５９６８）、ヒトエリスロポエチン受容体（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ１９２３５）、ヒトＰＲＬ−Ｒ、プロラクチン受容体（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ１６４７１）、ヒトＥｐｈＡ１、エフリンＡ型受容体１（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２１７０９）、ヒトインスリン（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０６２１３）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦＲ１、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０８０６９、配列番号１８１）、ヒト受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＱ１２９１３、Ｐ２３４７１、Ｐ２３４６７、Ｐ１８４３３、Ｐ２３４７０、Ｐ２３４６９、Ｐ２３４６８）、ヒトニューロピリン（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰＯ１４７８６）、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩ（アルファおよびベータ鎖）、ヒトインテグリン（アルファおよびベータファミリー）、ヒトシンデカン、ヒトミエリンタンパク質、ヒトカドヘリン、ヒトシナプトブレビン−２（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ６３０２７）、ヒトグリコフォリン���Ａ（ＧｐＡ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０２７２４、配列番号１８５）、ヒトＢｎｉｐ３（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＱ１２９８３）、ヒトＡＰＰ（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０５０６７）、アミロイド前駆体タンパク質（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０ＤＪＩ８）、ヒトＴ細胞受容体アルファ遺伝子（ＰＴＣＲＡ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰＱ６ＩＳＵ１、配列番号１８６）およびＴ細胞受容体ベータ、ＣＤ３ガンマ（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０９６９３）、ＣＤ３デルタ（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０４２３４）、ＣＤ３ゼータ（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２０９６３）およびＣＤ３イプシロン（ＣＤ３Ｅ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０７７６６、配列番号１９７）、ヒトセリン／トレオニンプロテインキナーゼ受容体Ｒ３（ＡＣＶＬ１、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ３７０２３、配列番号１７４）、ヒト炭疽菌毒素受容体２（ＡＮＴＲ２、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ５８３３５、配列番号１７５）、ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ４（ＣＤ４、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０１７３０、配列番号１７６）、ヒト受容体型チロシンプロテインホスファターゼミュー（ＰＴＰＲＭ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２８８２７、配列番号１７７）、ヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５（ＴＮＲ５、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２５９４２、配列番号１７８）、ヒトインテグリンベータ−１（ＩＴＢ１、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０５５５６、配列番号１７９）、ヒトＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、Ｂ−７アルファ鎖（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０１８８９、配列番号１８０）、ヒトトロンボモデュリン（ＴＲＢＭ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０７２０４、配列番号１８２）、ヒトインターロイキン−４受容体サブユニットアルファ（ＩＬ４ＲＡ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ２４３９４、配列番号１８３）、ヒト低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＯ７５５８１、配列番号１８４）、ヒト高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットアルファ（ＦＣＥＲＡ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ１２３１９、配列番号１９４）、ヒトキラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ２（ＫＩ２Ｌ２、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ４３６２７、配列番号１９５）、ヒトサイトカイン受容体共通サブユニットベータ（ＩＬ３ＲＢ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ３２９２７、配列番号１９６）、ヒトインテグリンアルファ−ＩＩｂ（ＩＴＡ２Ｂ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ０８５１４、配列番号１９８）、ヒトＴ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８（ＣＤ２８、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリＰ１０７４７、配列番号１９９）の膜貫通領域を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明に用いる膜貫通領域は、ヒトＢ７−１膜貫通領域、マウスＢ７−１膜貫通領域、ＰＤＧＦＲ膜貫通領域、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体膜貫通領域およびｅｒｂｂ−２膜貫通領域からなる群から選択される。マウスＢ７−１膜貫通領域がより好ましく、配列番号６６に示すマウスＢ７−１膜貫通領域が最も好ましい。
【００６５】
免疫グロブリン膜貫通領域は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ＩＧＨＡ１（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｍ６０１９３）、ＩＧＨＡ２（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｍ６０１９４）、ＩＧＨＤ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｋ０２８８１）、ＩＧＨＥ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ６３６９３）、ＩＧＨＧ１（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ５２８４７）、ＩＧＨＧ２（ＮＣＢＩアクセスコード：ＡＢ００６７７５）、ＩＧＨＧ３（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｄ７８３４５）、ＩＧＨＧ４（ＮＣＢＩアクセスコード：ＡＬ９２８７４２）、ＩＧＨＧＰ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ５２８４９）、ＩＧＨＭ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ１４９４０）に由来する膜貫通領域ならびにマウス免疫グロブリン遺伝子ＩＧＨＡ１（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｋ００６９１）、ＩＧＨＤ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４５０）、ＩＧＨＥ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ０３６２４、Ｕ０８９３３）、ＩＧＨＧ１（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４５４、Ｊ００４５５）、ＩＧＨＧ２Ａ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４７１）、ＩＧＨＧ２Ｂ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４６２、Ｄ７８３４４）、ＩＧＨＧ３（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ００９１５、Ｖ０１５２６）、ＩＧＨＭ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４４４）に由来する膜貫通領域を含む。
【００６６】
本発明の一実施形態では、用いる膜貫通領域は、免疫グロブリン遺伝子によりコードされる膜貫通領域を含まない非免疫グロブリン膜貫通領域、とりわけ、ヒト免疫グロブリン遺伝子ＩＧＨＡ１（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｍ６０１９３）、ＩＧＨＡ２（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｍ６０１９４）、ＩＧＨＤ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｋ０２８８１）、ＩＧＨＥ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ６３６９３）、ＩＧＨＧ１（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ５２８４７）、ＩＧＨＧ２（ＮＣＢＩアクセスコード：ＡＢ００６７７５）、ＩＧＨＧ３（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｄ７８３４５）、ＩＧＨＧ４（ＮＣＢＩアクセスコード：ＡＬ９２８７４２）、ＩＧＨＧＰ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ５２８４９）、ＩＧＨＭ（ＮＣＢＩ）アクセスコード：Ｘ１４９４０）によりコードされる膜貫通領域を含まず、マウス免疫グロブリン遺伝子ＩＧＨＡ１（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｋ００６９１）、ＩＧＨＤ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４５０）、ＩＧＨＥ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ０３６２４、Ｕ０８９３３）、ＩＧＨＧ１（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４５４、Ｊ００４５５）、ＩＧＨＧ２Ａ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４７１）、ＩＧＨＧ２Ｂ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４６２、Ｄ７８３４４）、ＩＧＨＧ３（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｘ００９１５、Ｖ０１５２６）、ＩＧＨＭ（ＮＣＢＩアクセスコード：Ｊ００４４４）によりコードされる膜貫通領域を含まない非免疫グロブリン膜貫通領域である。
【００６７】
「ポリ（Ｙ）トラクト」という用語は、イントロンの分岐点とイントロン−エクソン境界との間に見いだされるひと続きの核酸を意味する。このひと続きの核酸は、多数のピリミジン塩基ＣまたはＴを意味する、多数のピリミジン（Ｙｓ）を有する。
【００６８】
「３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）」という用語は、ｍＲＮＡ前駆体または成熟ｍＲＮＡの３’末端における非翻訳セグメントを意味する。成熟ｍＲＮＡでは、この領域は、ポリ（Ａ）尾部を有し、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始およびｍＲＮＡ輸出などに多くの役割を有することが公知である（Jia Jら、(2013) Curr Opin Genet Dev、23巻(1号)、29〜34頁）。
【００６９】
「エンハンサー」という用語は、本明細書で用いられる場合、遺伝子の同一性、遺伝子に対する該配列の位置または該配列の配向と無関係に遺伝子の転写を促進するように作用するヌクレオチド配列を定義するものである。本発明のベクターは、任意選択でエンハンサーを含む。
【００７０】
「ポリアデニル化シグナル」、「ポリ（Ａ）シグナル」または「ポリ（Ａ）」または「ポリ（Ａ）部位」という用語は、ｍＲＮＡ転写物に存在する核酸配列であって、ポリ（Ａ）ポリメラーゼが存在する場合に、ポリ（Ａ）シグナルの１０〜３０塩基下流に位置するポリアデニル化部位でｍＲＮＡ転写物をポリアデニル化することを可能にする配列を意味する。多くのポリ（Ａ）シグナルが当技術分野で公知であり、本発明において有用でありうる。例としては、ヒト変異型成長ホルモンポリ（Ａ）シグナル、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルおよびウシ成長ホルモンポリ（Ａ）シグナルがある。
【００７１】
「機能的に連結した」および「作動可能に連結した」という用語は、同義で用い、２つ以上のＤＮＡセグメント間、とりわけ発現させるべき遺伝子配列とそれらの発現を制御する配列との間の機能的関係を意味する。例えば、シス作用転写制御エレメントの組合せを含む、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞または他の発現システムにおけるコード配列の転写を刺激またはモジュレートする場合、コード配列に作動可能に連結している。転写遺伝子配列に作動可能に連結したプロモーター調節配列は、転写配列に物理的に隣接している。
【００７２】
「配向」は、所定のＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの順序を意味する。例えば、別のＤＮＡ配列に対して反対の方向のＤＮＡ配列の配向は、配列が得られたＤＮＡにおける基準点と比較したとき、別の配列に関する該配列の５’から３’への順序が逆である配向である。そのような基準点は、元のＤＮＡにおける他の特定のＤＮＡ配列の転写方向および／または当該配列を含む複製可能ベクターの複製起点を含みうる。
【００７３】
「核酸配列相同性」または「ヌクレオチド配列相同性」という用語は、本明細書で用いられる場合、最大の配列同一性百分率を達成するために、配列を整列させ、必要な場合にギャップを導入した後の比較配列のヌクレオチド配列と同一である候補配列のヌクレオチドの百分率を含む。したがって、配列同一性は、２つのヌクレオチド配列のヌクレオチドの位置の類似性を比較するのに一般的に用いられる標準的な方法によって判定されうる。
【００７４】
「発現ベクター」という用語は、本明細書で用いられる場合、適切な宿主細胞へのトランスフェクションにより、宿主細胞内の適切な発現レベルの組換え遺伝子産物をもたらす単離および精製ＤＮＡ分子を含む。組換えまたは遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に加えて、発現ベクターは、ＤＮＡコード配列のｍＲＮＡへの効率のよい転写および宿主細胞株におけるｍＲＮＡのタンパク質への効率のよい翻訳に必要である調節ＤＮＡ配列を含む。
【００７５】
「宿主細胞」または「宿主細胞株」という用語は、本明細書で用いられる場合、培養物中で成長し、所望の組換え産物タンパク質を発現しうる、任意の細胞、とりわけ哺乳類細胞を含む。
【００７６】
組換えポリペプチドおよびタンパク質は、原核生物（例えば、大腸菌（E. coli））、真核生物（例えば、酵母、昆虫、脊椎動物、哺乳類）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現システムのような様々な発現システムで産生されうる。タンパク質ベースの生物製剤の大規模生産のための最も一般的に用いられる方法は、ＤＮＡベクターのトランスフェクションによる宿主細胞への遺伝物質の導入に依拠している。ポリペプチドの一過性発現は、宿主細胞の一過性トランスフェクションにより達成されうる。宿主細胞ゲノムへのベクターＤＮＡの組込みは、安定にトランスフェクトされている細胞株をもたらし、そのような安定な細胞株の増殖は、ポリペプチドおよびタンパク質の大規模生産に用いてもよい。
【００７７】
選択的スプライシングにより真核細胞中で複数のポリペプチドを産生させる方法は、ＷＯ２００５／０８９２８５に記載されている。２種の異なる発現カセットが単一プロモーターの制御下にあり、発現カセットは、それらの選択的スプライシングおよび所望の比率の２つ以上の独立遺伝子産物としての発現を可能にするスプライス部位を有する。
【００７８】
しかし、本発明者らは、２つの完全に独立したタンパク質が産生され、したがって、原形質膜結合変異体は、可溶性ポリペプチド変異体の所望の産物の質を示さないので、そのようなアプローチは、可溶性ポリペプチド変異体および原形質膜結合変異体の発現に限定されることを見いだした。
【００７９】
異種タンパク質を発現する真核細胞を選択する方法ならびに選択的にスプライシングする可能性のある核酸からの可溶性ポリペプチド変異体および原形質膜結合変異体の発現は、ＷＯ２００７／１３１７７４に記載されている。原形質膜結合変異体は、それを発現する細胞に結合され、成功裏にトランスフェクトされた細胞を単離するためのマーカーとして用いられうる。
【００８０】
しかし、本発明者らは、膜表示ポリペプチドに対する可溶性ポリペプチドの発現の比を制御する手段が存在しないので、そのようなアプローチは限定的なものであることを見いだした。選択的スプライシングは、上で述べたように、ポリペプチドの異なる変異体を発現させうる方法であるが、選択的スプライシング機構は、非常に多様であるので、スプライシング比を制御する能力がなければ、発現するポリペプチド変異体の量も多様となる。
【００８１】
したがって、発現ポリペプチドの一部が細胞膜上に発現するように転送される細胞発現システムは、可溶性ポリペプチドの力価を低減させてきた。ポリペプチドの細胞膜発現は、高発現クローンを単離するための有用なマーカーであるが、細胞膜上に発現するポリペプチドの量の何らかの形の制御がない場合、可溶性ポリペプチドの力価は、かなり低減しうる。さらに、２つのポリペプチドが同じ培養条件下で同じレベルで発現することはなく、したがって、１つのポリペプチドの可溶性および細胞膜発現のために開発された方法がすべてのポリペプチドに適することはありそうもない。
【００８２】
上述の選択的スプライシングアプローチとは対照的に、本出願人らは、細胞クローン選択を可能にするのに十分な量のポリペプチドの細胞膜発現を可能にしながら、発現する可溶性ポリペプチドの量を最適化するために発現構築物の成分を改変しうる、可溶性および細胞膜表示ポリペプチドの両方の発現のための選択的スプライシングアプローチを設計した。
【００８３】
抗体重鎖の発現のための本発明の例示的な発現構築物において、ＩｇＧ１重鎖定常領域は、分泌重鎖のオープンリーディングフレームを終結させる停止コドンの上流の弱いスプライスドナーを含む。膜貫通領域がスプライシングの後にＩｇＧ１重鎖のオープンリーディングフレームを含む枠内にあるように、スプライスアクセプター部位および膜貫通領域をコードするＤＮＡ配列に続いて、停止コドンおよび停止コドンの３’側に位置するポリ（Ａ）部位がある。得られた選択的オープンリーディングフレームは、それぞれ停止コドンおよびポリ（Ａ）部位により終結される。出願人らは、この発現構築物を改変することにより、それらがスプライス比、およびしたがって、可溶性ポリペプチド対膜表示ポリペプチドの量を変化させうることを見いだした。
【００８４】
これらの改変は、例えば、異種膜貫通領域の使用を含みうる。ＩｇＧ１の天然に存在する膜貫通領域は、ひと続きの連結アミノ酸ならびにドメインＭ１およびＭ２により構成されている。非免疫グロブリン膜貫通領域である膜貫通領域によるＩｇＧ１膜貫通領域の置換により、例えば、マウスＢ７−１膜貫通領域による置換により、膜表示ポリペプチドの量を増加させうる。実施例２の図２に示すように、一過性にトランスフェクトした細胞のほぼ４０％が膜表示ＩｇＧ１について陽性であり、これは、ＩｇＧ１膜貫通領域を含む構築物でトランスフェクトした細胞の百分率（２０％まで）と比べて有意な増加である。天然ＩｇＧ１膜貫通領域の使用がＩｇＧ１の細胞膜表示のために最も効果的であって、異種膜貫通領域の使用はそうでないことが予想されることから、そのような結果は、驚くべきことである。好ましくは、本発明の発現構築物に用いる膜貫通領域は、ヒト血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）遺伝子、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体、ヒトおよびマウスＢ７−１、ヒトＩＣＡＭ−１、ヒトｅｒｂｂ１、ヒトｅｒｂｂ２、ヒトｅｒｂｂ３、ヒトｅｒｂｂ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４のようなヒト線維芽細胞増殖因子受容体、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトエリスロポエチン受容体、ヒトＰＲＬ−Ｒ、プロラクチン受容体、ヒトＥｐｈＡ１、エフリンＡ型受容体１、ヒトインスリン、ＩＧＦ−１受容体、ヒト受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ、ヒトニューロピリン、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩ（アルファおよびベータ鎖）、ヒトインテグリン（アルファおよびベータファミリー）、ヒトシンデカン、ヒトミエリンタンパク質、ヒトカドヘリン、ヒトシナプトブレビン−２、ヒトグリコフォリン−Ａ、ヒトＢｎｉｐ３、ヒトＡＰＰ、アミロイド前駆体タンパク質、ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＰＴＣＲＡ）およびＴ−細胞受容体ベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ゼータおよびＣＤ３イプシロンの膜貫通領域からなる群から選択される膜貫通領域を含む。好ましい実施形態では、本発明に用いる膜貫通領域は、ヒトＢ７−１膜貫通領域、マウスＢ７−１膜貫通領域、ＰＤＧＦＲ膜貫通領域、ヒトアシアロ糖タンパク質受容体膜貫通領域およびｅｒｂｂ−２膜貫通領域からなる群から選択される。マウスＢ７−１膜貫通領域がより好ましく、配列番号６６に示すマウスＢ７−１膜貫通領域が最も好ましい。
【００８５】
分泌ポリペプチド対膜表示ポリペプチドとの量のスプライス比を変化させるためのさらなる改変は、膜貫通領域をコードするエクソンの上流のポリピリミジン（ポリ（Ｙ））トラクトにおけるピリミジン塩基の数を変更すること、ならびに／またはスプライスドナーおよびアクセプターの共通配列を改変することを含む。ピリミジン塩基（Ｙｓ）の数を減少させることは、スプライス比を分泌タンパク質の方にシフトさせることが実施例３で示された。ピリミジン塩基が構築物に含まれていない場合、目的のタンパク質の表面発現は存在しない。スプライス比を細胞膜発現から離れる方向にシフトさせるそのような機構は、細胞膜上で強く発現するが、より弱い可溶性発現を示すタンパク質には有用であろう。ポリ（Ｙ）トラクトにおけるピリミジン塩基の数は、０〜３０塩基の間を含みうる。好ましくは、ポリ（Ｙ）トラクトは、２０個以下のピリミジン塩基、より好ましくは１５個以下の塩基、さらにより好ましくは１０個以下の塩基を含みうる。
【００８６】
膜表示タンパク質の量の増加は、可溶性ポリペプチドの力価に負の影響を及ぼしうるので、発明者らは、膜表示ポリペプチドの量に影響を及ぼすことなく宿主細胞における可溶性ポリペプチド発現を増加させうる発現構築物の改変を開発した。イントロンにおけるポリ（Ａ）部位の付加は、有意なレベルの細胞膜表示を維持しながら、可溶性ポリペプチド力価を最大５０％増加させることが見いだされた（Ｍ１Ｍ２膜貫通領域について）。本発明のさらなる実施形態では、ポリ（Ａ）部位は、発現構築物のイントロンに位置する。
【００８７】
本発明のある態様では、発現構築物は、ポリペプチド多量体およびタンパク質、例えば、抗体もしくはその断片または二重特異性抗体もしくはその断片に適している。
【００８８】
「抗体」という用語は、本明細書において、全抗体および任意のその抗原結合断片またはその単鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合断片を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記する）および重鎖定常領域からなっている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインからなっている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記する）および軽鎖定常領域からなっている。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなっている。ＶＨおよびＶＬ領域は、配列が超可変性であり、かつ／または抗原認識に関与し、かつ／または構造的に定義されたループを通常形成し、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域と、これを区切る、フレームワーク領域（ＦＲもしくはＦＷ）と呼ばれる、より保存的である領域と、にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＷから構成されている：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、すべてが一緒になって、本明細書で述べたＶＨまたはＶＬの「非ＣＤＲ領域」または「非延長ＣＤＲ領域」を構成する。
【００８９】
重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。
【００９０】
抗体は、定常領域によって遺伝学的に決定される、アイソタイプとも呼ばれる、クラスに分類される。ヒト定常軽鎖は、カッパ（Ｃκ）およびラムダ（Ｃ）軽鎖と分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはイプシロン（ε）と分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラスは、治療の目的のために最も一般的に用いられる。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスを含む。
【００９１】
「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」という用語は、本明細書で用いられる場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを含む。Ｆａｂは、単独でのこの領域、または全長抗体もしくは抗体断片の中でのこの領域を意味する。
【００９２】
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で用いられる場合、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインに対する柔軟ヒンジＮ末端ドメインを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭについては、Ｆｃは、Ｊ鎖を含みうる。ＩｇＧについては、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃ２およびＣ３）ならびにＣガンマ１（Ｃ１）とＣガンマ２（Ｃ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、そのカルボキシ末端に対する残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと通常定義され、ここでナンバリングは、ＥＵナンバリングシステムに従っている。ヒトＩｇＧ１については、Ｆｃ領域は、そのカルボキシ末端に対する残基Ｐ２３２を含むと本明細書で定義され、ここでナンバリングは、ＥＵナンバリングシステムに従っている（Edelman GMら、(1969) Proc Natl Acad Sci USA、63巻(1号)、78〜85頁）。Ｆｃは、単独でのこの領域、またはＦｃポリペプチド、例えば、抗体の中でのこの領域を意味しうる。
【００９３】
「全長抗体」という用語は、本明細書で用いられる場合、可変および定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を含む。例えば、ヒトおよびマウスを含む大部分の哺乳動物では、ＩｇＧクラスの全長抗体は、四量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなっており、各対が１つの軽および１つの重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１（Ｃ１）、ＣＨ２（Ｃ２）およびＣＨ３（Ｃ３）を含む。一部の哺乳動物、例えば、ラクダおよびラマでは、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖のみからなり、各重鎖は、Ｆｃ領域に結合した可変ドメインを含みうる。
【００９４】
抗体断片は、（ｉ）ＦａｂおよびＦａｂ−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一可変部からなるｄＡｂ断片（Ward ESら、(1989) Nature、341巻、544〜546頁）、（ｖ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｖｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成しうるペプチドリンカーにより連結されている、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird REら、(1988) Science 242:423〜426頁；Huston JSら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:5879〜83頁）、（ｖｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築された「ダイアボディ」または「トリアボディ」、多価または多重特異性断片（Tomlinson I & Hollinger P (2000) Methods Enzymol. 326巻、461〜79頁；ＷＯ９４／１３８０４号；Hollinger Pら、(1993) Proc Natl Acad Sci USA、90巻、6444〜48頁）ならびに（ｉｘ）同じまたは異なる抗体に遺伝学的に融合させたｓｃＦｖ（Coloma MJ & Morrison SL (1997) Nature Biotech、15巻(2号)、159〜163頁）を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
本明細書で述べる発現構築物により発現されうる抗体およびその断片は、ＡＸＬ、Ｂｃ１２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−１Ｌ、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ｍＴＯＲ、ＣＳ１、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ７９、ＣＤ８９、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＡ１２５、ｃＭｅｔ、ＣＣＲ６、ＭＵＣＩ、ＰＥＭ抗原、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、１７−１ａ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＳＧ、ＩｇＥ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＧＤ２−ガングリオシド、ＭＣＳＰ、ＮＧ２、ＳＫ−Ｉ抗原、Ｌａｇ３、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦＲ、ＰＳＭＡ、Ｔｉｍ３、ＴＦ、ＣＴＬＡ４、ＴＬ１Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰａ、ＩＣＯＳ、Ｔｒｅｍ１２、ＮＣＲ３、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＶＬＡ−２および４−１ＢＢからなる群から選択される抗原に結合しうる。
【００９６】
二重特異性またはヘテロ二量体抗体は、多年にわたり当技術分野で利用可能であった。しかし、そのような抗体の作製は、所望の二重特異性抗体の産生収率を著しく低減させ、産物の均一性を達成するための高度な精製処置を必要とする、誤対合副産物の存在をしばしば伴う。免疫グロブリン重鎖の誤対合は、その大部分がＣＨ３ドメインホモ二量体の２つのサブユニット間の人工の相補的ヘテロ二量体インターフェースの設計によるヘテロ二量体化のために抗体重鎖を遺伝子操作する、いくつかの合理的な設計戦略を用いることによって低減することができる。加工されたＣＨ３ヘテロ二量体ドメイン対の最初の報告は、ヘテロ二量体Ｆｃ部分を作製するための「空洞中突起（protuberance-into-cvity）」アプローチを記載したCarterらによって行われた（ＵＳ５，８０７，７０６；「穴中ノブ（knobs-into-holes）」；Merchant AMら、(1998) Nat Biotechnol、16巻(7号)、677〜81頁）。代替設計が最近策定され、ＷＯ２００７１１０２０５に記載されているモジュールのコア組成を改変することによる新規ＣＨ３モジュール対の設計またはＷＯ２００７１４７９０１もしくはＷＯ２００９０８９００４に記載されているモジュール間の相補的塩架橋の設計を含む。ＣＨ３遺伝子組換え戦略の欠点は、これらの技術が依然としてかなりの量の望ましくないホモ二量体の生成をもたらすことである。主としてヘテロ二量体が生成する二重特異性抗体を作製するためのより好ましい技術は、ＰＴＣ公開番号：ＷＯ２０１２／１３１５５５に記載されている。二重特異性抗体は、多くの標的、例えば、腫瘍細胞上にある標的および／またはエフェクター細胞上にある標的に対して作製しうる。好ましくは、二重特異性抗体は、ＡＸＬ、Ｂｃｌ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−１Ｌ、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ｍＴＯＲ、ＣＳ１、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ７９、ＣＤ８９、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＡ１２５、ｃＭｅｔ、ＣＣＲ６、ＭＵＣＩ、ＰＥＭ抗原、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、１７−１ａ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＳＧ、ＩｇＥ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＧＤ２−ガングリオシド、ＭＣＳＰ、ＮＧ２、ＳＫ−Ｉ抗原、Ｌａｇ３、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦＲ、ＰＳＭＡ、Ｔｉｍ３、ＴＦ、ＣＴＬＡ４、ＴＬ１Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰａ、ＩＣＯＳ、Ｔｒｅｍ１２、ＮＣＲ３、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＶＬＡ−２および４−１ＢＢからなる群から選択される２つの標的に結合しうる。
【００９７】
さらなる態様では、本発明は、上述のように発現構築物または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、ヒトまたは非ヒト細胞でありうる。通常、宿主細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞および酵母細胞からなる群から選択される。好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞である。哺乳類宿主細胞の好ましい例は、ヒト胚腎細胞（Graham FLら、(1977) J. Gen. Virol. 36巻、59〜74頁）、ＭＲＣ５ヒト線維芽細胞、９８３Ｍヒト黒色腫細胞、ＭＤＣＫイヌ腎細胞、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから単離されたＲＦ培養ラット肺線維芽細胞、Ｂ１６ＢＬ６マウス黒色腫細胞、Ｐ８１５マウスマスト細胞腫細胞、ＭＴ１Ａ２マウス乳腺癌細胞、ＰＥＲ：Ｃ６細胞（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または細胞株（Puck TTら、(1958)、J. Exp. Med. 108巻、945〜955頁）を含み、これらに限定されない。
【００９８】
とりわけ好ましい実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または細胞株である。適切なＣＨＯ細胞株は、例えば、ＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＨＯ  Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ  ｐｒｏ３−、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  Ｐ１２またはｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞株ＤＵＫ−ＢＩＩ（Urlaub G & Chasin LA (1980) PNAS 77巻(7号)、4216〜4220頁）、ＤＵＸＢＩｌ（Simonsen CC & Levinson AD (1983) PNAS 80巻(9号)、2495〜2499頁）またはＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｌａｎｄ）を含む。
【００９９】
さらなる態様では、本開示は、宿主細胞に上述の発現構築物または発現ベクターをトランスフェクトすることと、宿主細胞を培養することと、目的のポリペプチドの細胞膜発現を検出することと、所望の細胞膜発現を有する宿主細胞クローンを選択することとを含む、目的のポリペプチドを発現する宿主細胞を選択する方法を提供する。さらなるステップにおいて、目的のポリペプチドを宿主細胞から回収しうる。ポリペプチドは、好ましくは異種、より好ましくはヒトポリペプチドである。実施例で示すように、目的のポリペプチドの細胞膜発現のレベルは、発現した可溶性ポリペプチドのレベルに正比例する。したがって、これにより、高レベルの目的のポリペプチドを発現する宿主細胞クローンの定量的選択が可能となる。
【０１００】
好ましい実施形態では、本発明は、宿主細胞に上述の発現構築物または発現ベクターをトランスフェクトすることと、宿主細胞を培養することと、目的の多量体タンパク質の細胞膜発現を検出することと、所望の細胞膜発現を有する宿主細胞クローンを選択することとにより多量体タンパク質、好ましくはヘテロ二量体抗体を発現する宿主細胞を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法を提供する。さらなるステップにおいて、目的の多量体タンパク質、例えば、ヘテロ二量体抗体を宿主細胞から回収しうる。実施例で示すように、不要のホモ二量体抗体種と比べてより多くのヘテロ二量体抗体を表示する宿主細胞は、容易に選択されうる。すなわち、宿主細胞クローンの定量的な選択を可能にするものであってもよい。
【０１０１】
発現構築物または発現ベクターを本発明による宿主細胞にトランスフェクトするために、所定の宿主細胞型に適切である場合、当技術分野で周知のもののような任意のトランスフェクション技術、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈法、カチオンポリマー媒介トランスフェクション、リポフェクションを用いてもよい。本発明の発現構築物または発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、一過性に又は安定にトランスフェクトされた細胞株であると解釈されることに留意されたい。したがって、本発明によれば、本発現構築物または発現ベクターは、エピソーム的に保持する、すなわち一過性にトランスフェクトすることができ、あるいは宿主細胞のゲノムに安定に組み込む、すなわち安定にトランスフェクトすることができる。
【０１０２】
一過性トランスフェクションは、ベクター上選択マーカーの任意の選択圧の不適用によって特徴付けられる。一般的にトランスフェクション後２日から最大１０日の間継続する一過性発現実験では、トランスフェクトされた発現構築物または発現ベクターは、エピソームエレメントとして保持され、まだゲノムに組み込まれていない。すなわち、トランスフェクトされたＤＮＡは、通常宿主細胞ゲノムに組み込まれない。宿主細胞は、トランスフェクトＤＮＡを失う傾向があり、トランスフェクトＤＮＡを失った細胞は、一過性トランスフェクト細胞プールの培養により集団中でトランスフェクト細胞よりも過剰に成長する傾向がある。したがって、発現は、トランスフェクション直後の期間中に最も強く、時間とともに低下する。好ましくは、本発明による一過性形質移入体は、トランスフェクション後２日から１０日までの期間までの選択圧が存在しない細胞培養物中に維持されている細胞と理解される。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態では、宿主細胞、例えば、ＣＨＯ宿主細胞は、本発明の発現構築物または発現ベクターで安定にトランスフェクトされる。安定トランスフェクションは、ベクターＤＮＡのような新たに導入された外来ＤＮＡが、通常はランダム非相同的組換え事象によって、ゲノムＤＮＡに組み込まれた状態になることを意味する。ベクターＤＮＡのコピー数と同時に遺伝子産物の量は、ベクター配列が宿主細胞のＤＮＡへの組込みの後に増幅された細胞株を選択することによって増加させることができる。したがって、そのような安定組込みは、遺伝子増幅のための選択圧のさらなる増加にさらされることにより、ＣＨＯ細胞における二重微小染色体を生じさせる可能性がある。さらに、安定トランスフェクションは、例えば、ゲノム組込みに際して不必要にされる細菌コピー数制御領域のような組換え遺伝子産物の発現に直接関連しないベクター配列部分の喪失をもたらしうる。したがって、トランスフェクト宿主細胞は、発現構築物または発現ベクターの少なくとも一部または種々の部分をゲノムに組み込んだ。
【０１０４】
さらなる態様では、本開示は、哺乳類宿主細胞からの異種ポリペプチドの発現のための上述の発現構築物または発現ベクターの使用、とりわけ、哺乳類宿主細胞からの異種ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現のための上述の発現構築物または発現ベクターの使用を提供する。好ましい実施形態では、上述の発現構築物または発現ベクターは、哺乳類宿主細胞からのヘテロ二量体抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現のために用いる。
【０１０５】
本発明で述べる発現構築物は、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する組換え宿主細胞を選択する方法に用いられうる。好ましくは、目的のタンパク質は、抗体である。該方法は、
（ｉ）
（ａ）５’から３’方向に、
プロモーターと、
抗体重鎖をコードするエクソンと、
イントロン内のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間に第１の停止コドンが位置する、スプライスドナー部位、イントロンおよびスプライスアクセプター部位と、
改変免疫グロブリン膜貫通領域または改変もしくは非改変非免疫グロブリン膜貫通領域から選択される膜貫通領域をコードする第２のエクソンと、
第２の停止コドンと、
ポリ（Ａ）部位と
を含む発現構築物と、
（ｂ）抗体軽鎖をコードする発現構築物と
を宿主細胞に共トランスフェクトすること、
（ｉｉ）トランスフェクト宿主細胞を抗体の発現に適する条件下で培養することと、
（ｉｉｉ）抗体の細胞膜発現を検出すること、ならびに
（ｉｖ）細胞膜の表面上に抗体を表示する宿主細胞を選択すること
を含む。
【０１０６】
さらに、上述の方法は、ｓｃＦｖ−Ｆｃをコードする第３の発現構築物により、またはマウスＢ７−１膜貫通領域のような非免疫グロブリン膜貫通領域のスプライシングを用いてｓｃＦｖ−Ｆｃをコードする第３の発現構築物により宿主細胞が共トランスフェクトされている、二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞の選択に用いられうる。
【０１０７】
所望の宿主細胞の選択は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。そのような方法は、蛍光、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ラジオイムノアッセイまたは目的のタンパク質を認識し、それに結合するアプタマーなどの抗体もしくは特定の分子を用いることによる方法を含む。好ましくは、宿主細胞の膜上に表示された目的のタンパク質は、蛍光プローブにより検出され、または蛍光標識に連結され、したがって、蛍光活性化細胞選別もしくはＦＡＣＳを用いた選択が可能になる。
【０１０８】
タンパク質の発現および回収は、当業者に公知の方法により行ってもよい。
【０１０９】
さらなる態様では、本開示は、障害の治療用の医薬の調製のための上述の発現構築物または発現ベクターの使用を提供する。
【０１１０】
さらなる態様では、本開示は、障害の治療用の医薬として使用するための上述の発現構築物または発現ベクターを提供する。
【０１１１】
さらなる態様では、本開示は、遺伝子治療に使用するための上述の発現構築物または発現ベクターを提供する。
実施例
【実施例１】
【０１１２】
ベクターのクローニング
導入
調製した選択的スプライシング構築物は、ヒトｉｇｈｇ１遺伝子のスプライスドナー配列を含んでいた。イントロン（スプライスアクセプター部位を含む）は、ニワトリｃＴＮＴイントロン４に由来していたが、エクソンは、ｉｇｈｇ１遺伝子の膜貫通領域（以下ではＭ１Ｍ２と呼ぶ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＰＴＣＲＡ）の膜貫通領域、またはマウスＢ７−１遺伝子に由来していた。いくつかの構築物において、マウスＢ７−１膜貫通ドメインは、天然に存在する膜貫通ドメインおよびこれらの改変を含む、他の膜貫通ドメインにより置換した。さらに、Ｂ７−１膜貫通領域におけるＢ７−１細胞質ゾル側末端は、ＥＲ輸出シグナルを含むまたは含まないいくつかの他の細胞質ゾル側末端により置換した。
【０１１３】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４フォーマットの全長抗体の発現のために、重および軽鎖の同時の発現が必要であった。すべてのサブユニットは、共トランスフェクション戦略を用いて別個のプラスミドを用いて発現させた。選択的スプライシング構築物は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖の発現のために用いた。ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の軽鎖は、同じ発現ベクターの主鎖にクローニングしたが、選択的スプライシングを用いなかった。
【０１１４】
社内で作製された二重特異性抗体フォーマット（ＢＥＡＴ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＷＯ２０１２／１３１５５５号に記載）の発現のために、重鎖、軽鎖およびｓｃＦｖ−Ｆｃの３種の異なるサブユニットを細胞にトランスフェクトしなければならなかった。二重特異性抗体フォーマットの膜表示のための最善の戦略を評価するために、重鎖およびｓｃＦｖ−Ｆｃの発現のためにスプライスおよび選択的スプライシング構築物をクローニングした。軽鎖は、同じ発現ベクターの主鎖にクローニングしたが、選択的スプライシングを用いなかった。表１にこの実施例で作製したすべての構築物を要約する。
【０１１５】
【表１】
2017508459.tif 000002
2017508459.tif 000003
2017508459.tif 000004
*示した配列は、DNA配列については非スプライスORFの最後の5アミノ酸から発現構築物の末端まで、タンパク質配列については同じアミノ酸から融合膜貫通領域までに及ぶ。ただしGSC314(配列番号48)、GSC315(配列番号294)、GSC5607(配列番号296)、GSC5644(配列番号49)、GSC5608(配列番号51)、GSC5540(配列番号302)、GSB59(配列番号79)(完全なORF配列)を除く。
【０１１６】
材料および方法
ＬＢ培養プレート
５００ｍｌの水を１６ｇのＬＢ寒天（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）（１リットルのＬＢは１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキスおよび１０ｇのＮａＣｌを含む）と混合し、沸騰させた。冷却後、それぞれの抗生物質を溶液に加え、これを平板化した（アンピシリンプレートは１００ｇ／ｍｌおよびカナマイシンプレートは５０ｇ／ｍｌ）。
【０１１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
すべてのＰＣＲは、５０ｌの最終容積中１ｌのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰについて１０ｍＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、２５ｎｍｏｌのプライマーＡ（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、Ｂａｌｇａｃｈ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄまたはＯｐｅｒｏｎ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、２５ｎｍｏｌのプライマーＢ（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、Ｂａｌｇａｃｈ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄまたはＯｐｅｒｏｎ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０ｌの５×ＨＦ緩衝液（７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、１．５ｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）および１〜３ｌの鋳型（１０〜２０ｎｇ）を用いて実施した。用いたすべてのプライマーを表２に示す。
【０１１８】
ＰＣＲは、９８℃で３分間の最初の変性により開始し、その後、３５サイクルの９８℃での３０秒の変性、プライマーに固有の温度（ＧＣ含量による）での３０秒のアニーリングおよび７２℃での２分の延長を行った。７２℃で１０分間の最終延長は、冷却し、４℃に維持する前に行った。
【０１１９】
【表２】
2017508459.tif 000005
2017508459.tif 000006
2017508459.tif 000007
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【０１２０】
制限消化
すべての制限消化のために、約１ｇのプラスミドＤＮＡ（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）により定量した）を１０〜２０単位の各酵素、４ｌの対応する１０×  ＮＥＢｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）と混合し、容積を滅菌Ｈ２Ｏで４０ｌとした。反応物を酵素に必要な温度で１時間インキュベートした。
【０１２１】
主鎖の各予備消化の後、１単位のウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ；ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１２２】
ＰＣＲクリーンアップ
消化を可能にするために、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはＧｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（同じキットの新たな商標名）を用いて４０μｌの溶出緩衝液を用いて製造業者の取扱説明書に従って制限消化の前にすべてのＰＣＲ断片を精製した。このプロトコールは、ＤＮＡ試料の緩衝液を交換するためにも用いた。
【０１２３】
ＤＮＡ抽出
ゲル電気泳動は、１〜２％アガロースゲルを用いて実施した。これらは、必要量のＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）および１×トリス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＡＥ、ｐＨ８．３；Ｂｉｏ  ＲＡＤ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製した。ＤＮＡの染色のために１ｌのＧｅｌ  Ｒｅｄ  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｔｕｍ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を１００ｍｌのアガロースゲルに加えた。サイズマーカーとして、２ｌの１ｋｂ  ＤＮＡラダー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いた。電気泳動は、１２５ボルトで約１時間行った。
【０１２４】
目的のバンドをアガロースゲルから切り取り、Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）もしくはＧｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（同じキットの新たな商標名）を用いて、またはＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて４０μｌの溶出緩衝液を用いて製造業者の取扱説明書に従って精製した。
【０１２５】
ライゲーション
各ライゲーションのために、４ｌのインサートを１ｌのベクター、４００単位のリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）および１ｌの１０×リガーゼ緩衝液（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液；ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）と混合し、ＵＨＰ水を用いて１０ｌ最終容積まで満たした。混合物を室温で１〜２時間インキュベートした。
【０１２６】
ライゲーション産物のコンピテント細菌への形質転換
ライゲーション産物の形質転換のために、コンピテント細菌「ＴＯＰ１０」（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０コンピテント大腸菌；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた。２５〜５０ｌの細菌を氷上で５分間解凍した。次いで、３〜５ｌのライゲーション産物をコンピテント細菌に加え、４２℃で１分間の短時間熱ショックの前に氷上で２０〜３０分間インキュベートした。次いで、５００ｌのＳ．Ｏ．Ｃ培地（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を各チューブごとに加え、撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。最後に、細菌をアンピシリンまたはカナマイシンを含むＬＢプレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）上にのせ、３７℃で終夜インキュベートした。
【０１２７】
プラスミドの小規模調製
小規模調製のために、形質転換した細菌のコロニーを２．５ｍｌのＬＢおよびアンピシリンまたはカナマイシン中で３７℃、２００ｒｐｍで６〜１６時間増殖させた。ＤＮＡは、大腸菌用プラスミド精製キット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＱｕｉｃｋＰｕｒｅもしくはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはＱｉａｇｅｎ  ＱｕｉｃｋＬｙｓｅ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて製造業者の取扱説明書に従って抽出した。
【０１２８】
小規模調製によるプラスミドＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、１．８から２の間でなければならなかったＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍの比を評価することによって１回定量した。試料を配列の確認のためにＦａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ（Ｐｌａｎ−ｌｅｓ−Ｑｕａｔｅｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に送る前に対照消化を実施した。
【０１２９】
プラスミドの中規模調製
中規模調製のために、形質転換した細菌を２００ｍｌのＬＢおよびアンピシリン（またはカナマイシン）中で３７℃で終夜増殖させた。次いで、培養物を７２５ｇで２０分間遠心分離し、プラスミドを市販のキット（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ；Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて製造業者の取扱説明書に記載されたプロトコールに従って精製した。
【０１３０】
中規模調製によるプラスミドＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、制限消化により確認された１．８から２の間でなければならなかったＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍの比を評価することによって３回定量した。次いで試料を配列決定のために送った（Ｆａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ、Ｐｌａｎ−ｌｅｓ−Ｏｕａｔｅｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１３１】
プラスミドの大規模調製
大規模調製のために、形質転換した細菌を５００ｍｌのＬＢおよびアンピシリン（またはカナマイシン）中で３７℃で終夜増殖させた。培養物を７２５ｇで２０分間遠心分離し、プラスミドを市販のキット（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  ＰＣ５００またはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍａｘｉ；Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて製造業者の取扱説明書に記載されたプロトコールに従って精製した。
【０１３２】
大規模調製によるプラスミドＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、制限消化により確認された１．８から２の間でなければならなかったＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍの比を評価することによって３回定量した。次いで試料を配列決定のために送った（Ｆａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ、Ｐｌａｎ−ｌｅｓ−Ｏｕａｔｅｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１３３】
プラスミドのギガレベルの調製
ギガレベルの調製のために、形質転換した細菌を１５００ｍｌのＬＢおよびアンピシリン（またはカナマイシン）中で３７℃で終夜増殖させた。培養物を７２５ｇで２０分間遠心分離し、プラスミドを市販のキット（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  ＰＣ１００００；Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて製造業者の取扱説明書に記載されたプロトコールに従って精製した。
【０１３４】
ギガレベルの調製によるプラスミドＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、制限消化により確認された１．８から２の間でなければならなかったＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍの比を評価することによって３回定量した。次いで試料を配列決定のために送った（Ｆａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ、Ｐｌａｎ−ｌｅｓ−Ｏｕａｔｅｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１３５】
結果
ＩｇＧ１抗体の重鎖のクローニング
本特許に用いたＩｇＧ１重鎖をコードする遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）によりチャイニーズハムスター細胞における発現のために最適化された。重鎖の可変部および定常部は、ＧｅｎｅＡｒｔにより２つの異なるプラスミドで提供された。受領後、ＧｅｎｅＡｒｔ構築物を水に可溶化し、重鎖定常領域および重鎖可変領域をＫｐｎＩおよびＡｐａＩ酵素を用いて一緒にクローニングした。この作業は、外部ＣＲＯにより実施され、融合産物がＧｌｅｎｍａｒｋに引き渡された。この融合構築物の配列決定の後、理論配列と比較した重鎖定常領域の配列の変化がＦｃ領域のＣＨ２ドメインに特定された（ＥＥＭＴＫとＤＥＬＴＫ）。メガプライマーＰＣＲによりこの領域を変更するようにプライマーを設計し、オープンリーディングフレームの５’および３’側の好都合な制限部位を同時に導入した。
【０１３６】
プライマーＧｌｎＰｒ４９７（配列番号２）およびＧｌｎＰｒ４９８（配列番号３）を用いた第１のＰＣＲを元の構築物について実施した。得られたアンプリコン（３０４ｂｐｓ）は、鋳型として第２のプライマーＧｌｎＰｒ５０１および元の構築物を用いた、第２のＰＣＲに種々の濃度でメガプライマーとして用いた。最終ＰＣＲ産物をゲル精製し、シャトルベクターｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、インサート配列は正しかったが、オープンリーディングフレームの５’および３’側の制限部位が欠落していたと思われた。したがって、インサートを、プライマーＧｌｎＰｒ５０１（配列番号４）およびＧｌｎＰｒ４９８（配列番号３）ならびにより高いアニーリング温度（６４℃）を用いて再増幅した。アンプリコンをゲル精製し、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。正しい制限パターンを有する１つの小規模調製物を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いてシャトルベクター、ｐＳＥＬ１にサブクローニングするために選択した。小規模調製物のスクリーニングの後、大規模調製物を生成させた。この大規模調製物のインサートを制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて再び切断し、同じ酵素を用いて開き、ＣＩＰで処理した、プラスミドｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）の主鎖にクローニングした。ｐＧＬＥＸ４１は、発現のための標準的な自社製ベクターであり、マウスＣＭＶプロモーターとそれに続く構成的にスプライスされたイントロン、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）およびＳＶ４０ポリ（Ａ）配列からなる発現カセットを含む。小規模調製物のスクリーニングの後、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣの大規模調製物を生成させ、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ３１４を付与した。同じＤＮＡのさらなる中規模調製物またはギガレベルの調製物は、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ３１４ａ、ＧＳＣ３１４ｂ、ＧＳＣ３１４ｃ、ＧＳＣ３１４ｄおよびＧＳＣ３１４ｅを付与した（これらのすべての調製物は、ＤＮＡ配列決定により同一であることが確認され、ＧＳＣ３１４プラスミド（配列番号４８）と呼ぶものとする）。
【０１３７】
ＩｇＧ１抗体の膜表示重鎖用の選択的スプライシング発現ベクターのクローニング
ＩｇＧ１フォーマット抗体の重鎖のコード領域を、プライマーＧｌｎＰｒ１５１８（配列番号１１）、ＧｌｎＰｒ１５１９（配列番号１２）およびＧｌｎＰｒ１５２０（配列番号１３）ならびに鋳型としてのプラスミドｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ（ＧＳＣ３１４、配列番号４８）を用いたＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物は、アンプリコンの５’末端および３’末端におけるＮｈｅＩ制限部位を含んでおり、ｉｇｈｇ１遺伝子（配列番号６５）のＮＣＢＩデータベース入力の最後の４０ｂｐｓならびにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を正確に含めるために改変した。３’末端の改変は、ＩｇＧ１重鎖の定常部のＣ末端領域における天然スプライスドナー部位を再構成するために行った。ＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、同じ酵素およびＣＩＰｅｄを用いて切断したｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）にクローニングした。得られたベクターは、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−ＡＳ（プラスミドバッチ番号ＧＳＣ３８３６、配列番号２８７）と呼び、制限消化および配列解析により確認した。
【０１３８】
ニワトリトロポニン（ｃＴＮＴ）イントロン番号４（配列番号６９）を、その配列を含む自社製プラスミド（ＧＳＣ２８１９、配列番号６７）からプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ１５１７（配列番号１０）を用いて増幅した。トロポニンは、心筋および胚骨格筋においてのみ発現する。９０％を超えるｍＲＮＡが初期胚心および骨格筋においてエクソンを含むのに対して、成体における＞９５％のｍＲＮＡがエクソンを除外する（Cooper & Ordahl (1985) J Biol Chem、260巻(20号)、11140〜8頁）。プライマーは５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、３’末端側にＡｇｅＩ部位とＢｓｔＢＩ部位とを加えた。アプリコンをゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＢＩを用いて消化し、同じ酵素およびＣＩＰｅｄを用いて開いたベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−ＩｇＡＳ（ＧＳＣ３８３６、配列番号２８７）にクローニングした。得られたベクターは、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−ｃＴＮＴイントロン４（プラスミドバッチ番号ＧＳＣ３８４８、配列番号２８９）と呼び、制限消化および配列解析により確認した。
【０１３９】
ヒトｉｇｈｇ１遺伝子の膜貫通領域（Ｍ１Ｍ２）をコードする配列をプラスミドＧｌｎＰｒ１５２１（配列番号１４）およびＧｌｎＰｒ１５２２（配列番号１５）を用いてアセンブルした。これらのプライマーは、部分的に重複しており、ＰＣＲを用いて二本鎖ＤＮＡに完成させた。平滑末端ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングし、プラスミドｐＣＲｂｌｕｎｔ−Ｍ１Ｍ２を得て配列決定により確認した。インサートをプライマーＧｌｎＰｒ１５２３（配列番号１６）およびＧｌｎＰｒ１５２４（配列番号１７）を用いて再増幅して、Ｍ１Ｍ２膜貫通ドメイン配列を完全なものにした。アンプリコンをゲル精製し、ＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩを用いて消化し、ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−ｃＴＮＴイントロン４（ＧＳＣ３８４８、配列番号２８９）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２と命名し、大規模調製物規模で産生させ、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ３８９９を付与し、配列解析により確認した（配列番号３６）。
【０１４０】
発現抗体と膜表示抗体との間のスプライス比を増加させるために、膜貫通領域をコードするエクソンの上流のポリ（Ｙ）トラクトにおけるピリミジンの数を減少させた。このために、Ｉ４（０Ｙ）断片（配列番号７０）を、プライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ１６４９（配列番号１８）を用いて自社製ベクター（ＧＳＣ３４６９、配列番号６８）から増幅した。アンプリコンを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩを用いて消化し、主鎖を同じ酵素を用いて開き、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）の主鎖にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２を調製し、バッチ番号ＧＳＣ４３９８を付与し、配列決定により確認した（配列番号３７）。
【０１４１】
ポリ（Ａ）を、ＩｇＧ１をコードするエクソンと膜貫通領域をコードする選択的エクソンとを分離するイントロンに導入した。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを自社製ベクター（ＧＳＣ３４６９、配列番号３０５）からプライマーＧｌｎＰｒ１６５０（配列番号１９）およびＧｌｎＰｒ１６５１（配列番号２０）を用いて増幅した。アンプリコンを制限酵素ＣｌａＩを用いて消化し、ＣｌａＩおよびＣＩＰｅｄを用いて消化したベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ１４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）にクローニングし、Ｉ４（ポリＡ）イントロン（配列番号７１）を得た。小規模調製物のスクリーニングおよびインサートの正しい配向の確認の後、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（ポリＡ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２中規模調製物を調製し、バッチ番号ＧＳＣ４４０１を付与し、配列決定により確認した（配列番号３８）。
【０１４２】
ガストリンターミネーター配列を、ｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）と同じ一般的主鎖を共有するが、異なるプロモーターを有する自社製ベクター（ＧＳＣ２３、配列番号３０６）のＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルにあらかじめ付加した。ＳＶ４０ポリ（Ａ）とガストリンターミネーターとの融合物をプラスミド命名法で「ＳＶ４０ｔｅｒ」（配列番号３０６）と呼んだ。ＧＳＣ２３（配列番号３０６）の発現カセット（プロモーター＋コード配列）を、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを除いてｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ１（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）の発現カセット（すなわち、プロモーターおよびコード配列）により置き換えた。インサートを制限酵素ＢｓｔＢＩおよびＮｒｕＩを用いて切り取り、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したＧＳＣ２３（配列番号３０６）の主鎖にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、プラスミドｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−ＳＶ４０ｔｅｒの中規模調製物を調製し、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ４４０２を付与し、配列決定により確認した（配列番号３９）。
【０１４３】
別の好ましい構築物は、イントロンにポリ（Ａ）シグナルをガストリンターミネーターとともに含む。Ｉ４（ＳＶ４０ｔｅｒ）の配列は、配列番号７７に示す。
【０１４４】
ヒトＴ細胞受容体アルファ膜貫通ドメイン（ＰＴＣＲＡ）を用いたＩｇＧ１抗体の膜表示重鎖用の選択的スプライシング発現ベクターのクローニング
選択的スプライシング構築物におけるＭ１Ｍ２膜貫通領域をヒトＴ細胞受容体アルファ（ＰＴＣＲＡ）遺伝子の膜貫通ドメインに置き換えるために、相補的プライマーＧｌｎＰｒ１７９９（配列番号２８）およびＧｌｎＰｒ１７３５（配列番号２６）をインサート断片の作製に用いた。これらのプライマーは、部分的に重複しており、ＰＣＲを用いて二本鎖ＤＮＡに完成させた。インサート断片をＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩを用いて切断し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）の主鎖にクローニングした。インサートの一部が、得られた小規模調製物から欠落していたので、この小規模調製物についてプライマーＧｌｎＰｒ１７９９（配列番号２８）およびＧｌｎＰｒ２６９（配列番号１）を用いて新たな増幅を実施した。増幅されたインサート断片をＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ４３９８、配列番号３７）の主鎖にクローニングした。１つの小規模調製物を配列決定により確認し、プライマーＧｌｎＰｒ１８４０（配列番号３１）およびＧｌｎＰｒ２６９（配列番号１）を用いた別のＰＣＲに用いた。アンプリコンをＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ４３９８、配列番号３７）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（ポリＡ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ４４０１、配列番号３８）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−ＳＶ４０ｔｅｒ（ＧＳＣ４４０２、配列番号３９）の主鎖にクローニングした。ライゲーションにより、それぞれ中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−ＰＴＣＲＡ（ＧＳＣ５８５４、配列番号４０）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−ＰＴＣＲＡ（ＧＳＣ５８５５、配列番号４１）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（ポリＡ）−ＰＴＣＲＡ（ＧＳＣ５８５７、配列番号４２）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−ＰＴＣＲＡ−ＳＶ４０ｔｅｒ（ＧＳＣ５８５６、配列番号４３）がそれぞれ得られた。すべての中規模調製物を配列決定により検証した。
【０１４５】
Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ融合構築物を用いたＩｇＧ１抗体の膜表示重鎖用の選択的スプライシング発現ベクターのクローニング
Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ融合構築物をコードするインサートは、ＧｅｎｅＡｒｔ＿Ｓｅｑ３２（配列番号６４）という名称でＧｅｎｅＡｒｔに発注した。この断片は、Ｔ細胞受容体アルファサブユニット（ＰＴＣＲＡ）の膜貫通ドメインにより置換された膜貫通ドメインを除いて、ＩｇＧ１重鎖の正規のＭ１Ｍ２膜貫通領域を含む。ＧｅｎｅＡｒｔにより提供されたプラスミドを制限酵素ＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩを用いて切断し、精製したインサートは、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ４３９８、配列番号３７）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（ポリＡ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ４４０１、配列番号３８）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−ＳＶ４０ｔｅｒ（ＧＳＣ４４０２、配列番号３９）の主鎖にそれぞれライゲートした。ライゲーションにより、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ６０３０、配列番号４４）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ６０４８、配列番号４５）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（ポリＡ）−Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ６０４７、配列番号４６）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ−Ｍ１Ｍ２−ＳＶ４０ｔｅｒ（ＧＳＣ６０４６、配列番号４７）が得られた。すべての中規模調製物を配列決定により確認した。
【０１４６】
第１のＭ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ融合物を作製したところ、これらの構築物は、ＩｇＧ１の膜表示を可能にし、イントロンの改変に関して、天然Ｍ１Ｍ２構築物と同じ挙動を示した（実施例３における図６参照）。
【０１４７】
膜貫通領域における膜貫通ドメインの改変の影響の正しい解析を可能にするために、さらなる構築物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ−Ｍ１Ｍ２＿ｃｏｒｒｅｃｔｅｄを設計した。
【０１４８】
この構築物について、融合ＰＣＲを実施した。ｃＴＮＴ４イントロンの一部およびＭ１Ｍ２膜貫通領域のＭ１Ｍ２細胞外部分をプラスミドｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）からプライマーＧｌｎＰｒ１２８５（配列番号２５９）およびＧｌｎＰｒ２３７８（配列番号２２１）を用いて増幅した。Ｍ１Ｍ２膜貫通領域の細胞質ゾル側末端ならびにＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを同じ鋳型からプライマーＧｌｎＰｒ２３７９（配列番号２２２）およびＧｌｎＰｒ１６５０（配列番号１９）を用いて増幅した。プライマーＧｌｎＰｒ２３７８（配列番号２２１）およびＧｌｎＰｒ２３７９（配列番号２２２）は、修正ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインを生成する２つのＰＣＲ産物の重複末端の生成を可能にした。次いで、これらの２つの第１のＰＣＲ産物の重複ＰＣＲをプライマーＧｌｎＰｒ１２８５（配列番号２５９）およびＧｌｎＰｒ１６５０（配列番号１９）を用いて実施した。得られた融合ＰＣＲ産物をＡｇｅＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ−Ｍ１Ｍ２＿ｃｏｒｒｅｃｔｅｄを生成させ、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ１１２０６を付与し、配列決定により確認した（配列番号２８４）。
【０１４９】
マウスＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の膜表示重鎖用の選択的スプライシング発現ベクターのクローニング
膜貫通領域をマウスＢ７−１遺伝子の膜貫通領域に変えるために、融合ＰＣＲを実施した。最初に、マウスＢ７−１膜貫通領域をコードする配列を社内構築物（ＧｅｎｅＡｒｔ＿Ｓｅｑ４３としてＧｅｎｅＡｒｔに発注した、配列番号６６）からプライマーＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）およびＧｌｎＰｒ２１０１（配列番号３４）を用いてＰＣＲにより増幅した。ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７のクローニングのために、ｃＴＮＴ−Ｉ４（０Ｙ）をコードする断片を鋳型ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ４３９８、配列番号３７）からプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２１０２（配列番号３５）を用いてＰＣＲにより増幅した。マウスＢ７−１膜貫通領域をコードする配列を社内構築物（ＧｅｎｅＡｒｔ＿Ｓｅｑ４３としてＧｅｎｅＡｒｔに発注した、配列番号６６）からプライマーＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）およびＧｌｎＰｒ２１０１（配列番号３４）を用いてＰＣＲにより増幅した。両ＰＣＲ産物をプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）を用いて融合させた。得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（０Ｙ）−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７の中規模調製物を生成させ、バッチ番号ＧＳＣ７０５７を付与し、制限消化および配列決定により確認した（配列番号５３）。
【０１５０】
ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（ポリＡ）−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７のクローニングのために、ｃＴＮＴ−Ｉ４（ポリＡ）をコードする断片を鋳型ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（ポリＡ）−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ４４０１、配列番号３８）からプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２０９９（配列番号３２）を用いてＰＣＲにより増幅した。マウスＢ７−１膜貫通領域をコードする配列を社内構築物（ＧｅｎｅＡｒｔ＿Ｓｅｑ４３としてＧｅｎｅＡｒｔに発注した、配列番号６６）からプライマーＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）およびＧｌｎＰｒ２１０１（配列番号３４）を用いてＰＣＲにより増幅した。両ＰＣＲ産物をプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）を用いて融合させた。得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、得られたｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４（ポリＡ）−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７中規模調製物にバッチ番号ＧＳＣ７０５８を付与し、制限消化および配列決定により確認した（配列番号５４）。
【０１５１】
ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７のクローニングのために、ｃＴＮＴ−Ｉ４を鋳型ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）からプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２０９９（配列番号３２）を用いてＰＣＲにより増幅した。マウスＢ７−１膜貫通領域をコードする配列を社内構築物（ＧｅｎｅＡｒｔ＿Ｓｅｑ４３としてＧｅｎｅＡｒｔに発注した、配列番号６６）からプライマーＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）およびＧｌｎＰｒ２１０１（配列番号３４）を用いてＰＣＲにより増幅した。両ＰＣＲ産物をプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）を用いて融合させた。得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、得られたｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７中規模調製物にバッチ番号ＧＳＣ７０５６を付与し、制限消化および配列決定により確認した（配列番号５５）。
【０１５２】
ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７−ＳＶ４０ｔｅｒのクローニングのために、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７構築物の場合と同じＰＣＲ産物を用い、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−ＳＶ４０ｔｅｒ（ＧＳＣ４４０２、配列番号３９）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、得られたｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７−ＳＶ４０ｔｅｒ中規模調製物にバッチ番号ＧＳＣ７０５９を付与し、制限消化および配列決定により確認した（配列番号５６）。
【０１５３】
マウスＢ７−１膜貫通領域を用いたＩｇＧ１抗体の分泌および膜表示重鎖のスプライス比のさらなる低下
マウスＢ７−１膜貫通領域を用いたキメラタンパク質の膜表示が高度に効率的であることが示された（Chou W-Cら、(1999) Biotechnol Bioeng、65巻、160〜9頁；Liao K-Wら、(2001) Biotechnol Bioeng、73巻、313〜23頁）。スプライスアクセプターのポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹｓの量を０に減少させることにより、細胞膜上の表示抗体の量が著しく低下したことも本明細書で示された（実施例３における図６Ｆ参照）。
【０１５４】
イントロンのポリ（Ｙ）トラクトにおけるピリミジンの量の減少の効果を評価するために、ＰＣＲ融合によりいくつかの構築物を生成させた。
【０１５５】
【表３】
2017508459.tif 000009
【０１５６】
第１のＰＣＲにより、改変イントロンを含む社内主鎖から所望のイントロンを増幅することが可能であった。各構築物について用いたプライマーおよび鋳型を表３に示す。第２のＰＣＲ（すべての構築物に共通）により、構築物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）からプライマーＧｌｎＰｒ２１０１（配列番号３４）およびＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）を用いてＢ７−１膜貫通ドメインを増幅することが可能であった。これらのＰＣＲ産物の精製の後、イントロンおよび膜貫通ドメインを、プライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２１００（配列番号３３）を用いたオーバーラッピングエクステンションＰＣＲにより融合させた。次いで、精製ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）の主鎖にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物を構築物のそれぞれについて生成させ、配列決定により検証した。各構築物に割り当てられたプラスミドバッチ番号は、以下の通りである。
【０１５７】
【表４】
2017508459.tif 000010
【０１５８】
スプライシングを減少させる別の方法は、スプライスドナー部位を弱めることであった。スプライスドナーは、イントロンの５‘末端を定める共通配列によって特徴付けられる。したがって、スプライスドナーコンセサスのＤＮＡ配列が遺伝子により発現されるタンパク質配列に対する影響を伴わずに改変された、２つの構築物を設計した。
【０１５９】
改変３’末端配列を有するＩｇＧ１重鎖を増幅するＰＣＲを、ＳＤ＿ＣＣＣ構築物についてはプライマーＧｌｎＰｒ１５１８（配列番号１１）およびＧｌｎＰｒ２１６１（配列番号３１３）を、ＳＤ＿ＧＧＣ構築物についてはプライマーＧｌｎＰｒ１５１８（配列番号１１）およびＧｌｎＰｒ２１６０（配列番号３１４）を用いて鋳型ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）について実施した。ＰＣＲをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）の主鎖にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−ＳＤ＿ＣＣＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（プラスミドバッチ番号ＧＳＣ９７６４、配列番号５８）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−ＳＤ＿ＧＧＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（プラスミドバッチ番号ＧＳＣ９７６５、配列番号５７）を生成させ、配列決定により確認された。構築物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−ＳＤ＿ＧＧＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７のイントロン配列を配列番号７８に示す。
【０１６０】
疎水性残基のみを有する同様の長さの膜貫通ドメインによるＢ７−１膜貫通ドメインの置換
膜表示に対する膜貫通ドメインの影響を評価するために、いくつかの構築物を設計した。主として疎水性残基を含む膜貫通らせんは、表面表示の安定化のために有利であると考えられ、したがって、第１のアプローチとして、Ｂ７−１膜貫通領域のＢ７−１膜貫通ドメインを疎水性残基のみを含む他のタンパク質の膜貫通ドメインにより置換した。さらに、膜貫通らせんの長さが表面表示に対して影響を与えうるので、これらの第１の構築物は、Ｂ７−１膜貫通ドメインと同様の長さを有する膜貫通ドメインのみから構成されていた。これらの膜貫通ドメインの配列および特性を表４に要約する。
【０１６１】
【表５】
2017508459.tif 000011
【０１６２】
【表６】
2017508459.tif 000012
【０１６３】
膜貫通ドメインの３’末端を改変するプライマーを用いたｃＴＮＴイントロン４の一部の２ステップＰＣＲ増幅によって異なる膜貫通ドメインを作製した。鋳型は、常にｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）構築物であった。各構築物について、第１ラウンドのＰＣＲは、表５に示す各プライマーを用いて実施した。この第１ラウンドのＰＣＲ産物のクリーンアップの後、第２ラウンドのＰＣＲを表５に示すプライマーを用いて実施した。クリーンアップの後、これらのＰＣＲ産物をＡｇｅＩおよびＣｌａＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）にライゲートした。小規模調製物レベルでの配列の確認の後、各種の構築物の中規模調製物を生成させ、以下のＧＳＣ番号をこれらのプラスミドバッチに割り当てた。
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＡＣＶＬ１−Ｂ７  ＧＳＣ１１２１３（配列番号８１）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＡＮＴＲ２−Ｂ７  ＧＳＣ１１２１４（配列番号８２）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＣＤ４−Ｂ７  ＧＳＣ１１２１０（配列番号８３）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＰＲＭ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２０５（配列番号８４）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＴＮＲ５−Ｂ７  ＧＳＣ１１２１７（配列番号８５）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＩＴＢ１−Ｂ７  ＧＳＣ１１７５６（配列番号８６）
【０１６４】
すべての中規模調製物を配列決定により確認した。
【０１６５】
荷電および／または極性残基を含む同様の長さの膜貫通ドメインによるＢ７−１膜貫通ドメインの置換
疎水性残基のみを含む膜貫通ドメインが表面表示に対する影響を有さない（実施例４における図１０参照）ので、Ｂ７−１膜貫通ドメインと同様の長さを有するが、１つまたは複数の荷電および／または極性残基を含む他の膜貫通ドメインを選択した。これらの膜貫通ドメインの配列および特性を表６に要約する。
【０１６６】
【表７】
2017508459.tif 000013
【０１６７】
【表８】
2017508459.tif 000014
【０１６８】
表７に示す名称を有する、各種膜貫通ドメイン（ＰＴＣＲＡを除く）をＧｅｎｅＡｒｔに発注した。受領した時点に、ＧｅｎｅＡｒｔ構築物を水に再懸濁し、次いでＡｇｅＩおよびＣｌａＩで消化した。得られたインサートを同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物を生成させ、以下のバッチ番号を付与した。
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−１Ｂ０７−Ｂ７  ＧＳＣ１１２９６（配列番号８７）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＩＧＦ１Ｒ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２９５（配列番号８８）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＴＲＢＭ−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９０（配列番号８９）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＩＬ４ＲＡ−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９１（配列番号９０）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＬＲＰ６−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９２（配列番号９１）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＧｐＡ−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９７（配列番号９２）
【０１６９】
構築物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ−Ｂ７については、２ステップＰＣＲを実施した。Ｂ７−１膜貫通領域のＢ７−１細胞外部分を含むｃＴＮＴイントロンをプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２３８０（配列番号２２３）ならびに鋳型としてのｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）を用いて増幅した。得られたＰＣＲ産物をプライマーＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２３８１（配列番号２２４）を用いて再増幅した。プライマーＧｌｎＰｒ２３８０（配列番号２２３）およびＧｌｎＰｒ２３８１（配列番号２２４）により、ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインをＢ７−１膜貫通領域のＢ７−１細胞外部分に融合させることができた。得られたＰＣＲ産物をＣｌａＩおよびＡｇｅＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）に再クローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ−Ｂ７を調製した。それにバッチ番号ＧＳＣ１１２０４を付与し、配列決定により確認した（配列番号９３）。
【０１７０】
ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインにおける荷電残基の改変
ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインは、２１アミノ酸長であり、そのうちの３アミノ酸は、荷電残基である。これらの荷電残基の存在は、表面表示システムにおけるこの特定の膜貫通ドメインの相対的な不良な性能の説明となりうる（実施例４における図１１参照）。したがって、これらの残基の疎水性アミノ酸バリンへの突然変異は、表面表示に関して有益でありうる。
【０１７１】
【表９】
2017508459.tif 000015
【０１７２】
ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインにおける非突然変異および突然変異荷電残基のすべての可能な組合せを、鋳型としてのｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）を用い、フォワードプライマーとしてのＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）および各種構築物について表８に記載したリバースプライマーを用いて２ステップＰＣＲにより作製した。第１ラウンドのＰＣＲの後、ＰＣＲ産物をクリーンアップし、フォワードプライマーとしてのＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）および表８に記載したリバースプライマーを用いて第２ラウンドのＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をクリーンアップし、ＣｌａＩおよびＡｇｅＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、陽性構築物を中規模調製物規模で調製し、配列決定により確認した。それぞれの構築物のバッチ番号は、以下の通りである。
ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ＿Ｒ８Ｖ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２１６（配列番号９４）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ＿Ｋ１３Ｖ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２０３（配列番号９５）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ＿Ｄ１８Ｖ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２１１（配列番号９６）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ＿Ｒ８Ｖ＿Ｋ１３Ｖ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２１２（配列番号９７）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ＿Ｒ８Ｖ＿Ｄ１８Ｖ−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９８（配列番号９８）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ＿Ｋ１３Ｖ＿Ｄ１８Ｖ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２０８（配列番号９９）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＰＴＣＲＡ＿Ｒ８Ｖ＿Ｋ１３Ｖ＿Ｄ１８Ｖ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２９１（配列番号１００）
【０１７３】
荷電および／または極性残基を含む、異なる長さの膜貫通ドメインによるＢ７−１膜貫通ドメインの置換
膜貫通ドメインにおける荷電および残基の存在が表面表示を消失させない（実施例４における図１２参照）ことから、Ｂ７−１膜貫通ドメインより短くもしくは長く、今回は１つもしくは複数の荷電および／または極性残基を含む膜貫通ドメインを用いて膜貫通ドメインの長さを評価した。これらの膜貫通ドメインの配列および特性を表９に要約する。
【０１７４】
【表１０】
2017508459.tif 000016
【０１７５】
【表１１】
2017508459.tif 000017
【０１７６】
各種膜貫通ドメインを表１０に示す名称でＧｅｎｅＡｒｔに発注した。受領した時点に、ＧｅｎｅＡｒｔ構築物を水に再懸濁し、次いでＡｇｅＩおよびＣｌａＩで消化した。得られたインサートを同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物を生成させ、以下のバッチ番号を付与した。
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＦＣＥＲＡ−Ｂ７  ＧＳＣ１１２９７（配列番号１０１）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＫＩ２Ｌ２−Ｂ７  ＧＳＣ１１２９８（配列番号１０２）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＩＬ３ＲＢ−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９３（配列番号１０３）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＣＤ３Ｅ−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９４（配列番号１０４）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＩＴＡ２Ｂ−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９５（配列番号１０５）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−ＣＤ２８−Ｂ７  ＧＳＣ１１３９６（配列番号１０６）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｍ１Ｍ２−Ｂ７  ＧＳＣ１１３８９（配列番号１０７）
【０１７７】
Ｂ７−１膜貫通ドメイン長の改変
表面表示に対する膜貫通長の影響を評価するために、Ｂ７−１膜貫通ドメイン配列の中央部における疎水性残基を除去または追加することにより、Ｂ７−１膜貫通ドメインの種々の変異体を作製した。
【０１７８】
【表１２】
2017508459.tif 000018
【０１７９】
この目的のために、プライマーのアニーリングを実施した。Ｂ７−１膜貫通ドメインの各変異体について、それらの３’末端においてアニールするプライマーを発注した。各構築物について用いたプライマー対を表１１に示す。プライマーをアニールさせ、次いで、ＰＣＲにより配列を完全なものにした。クリーンアップの後、得られたＰＣＲ産物を、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで直接消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）主鎖にクローニングするか、またはｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）シャトルベクターにライゲートした（アニーリング産物が非常に短いので、直接ライゲーションがすべての産物に対して功を奏するとは限らなかった）。第２の状況において、小規模調製物は、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へのアニール産物のライゲーションの後に得られたコロニーから抽出した。配列の確認の後に、陽性の小規模調製物をＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、得られた断片を同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）主鎖にライゲートしクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、各構築物について中規模調製物を調製した。ＧＳＣバッチ番号をこれらの中規模調製物に下記のように付与し、調製物を配列決定により確認した。
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７（１８）−Ｂ７  ＧＳＣ１１６７７（配列番号１０８）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７（２０）−Ｂ７  ＧＳＣ１１６７９（配列番号１０９）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７（２４）−Ｂ７  ＧＳＣ１１４８４（配列番号１１０）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７（２６）−Ｂ７  ＧＳＣ１１２９２（配列番号１１１）
【０１８０】
Ｂ７−１膜貫通領域における細胞質ゾル側末端の改変
細胞質ゾル側末端（ＥＲ輸出シグナルを含むまたは含まない）は、表面表示に対する影響を有しうるので、改変細胞質ゾル側末端を有するいくつかの構築物を設計した。これらの細胞質ゾル側末端の配列および特性を表１２に要約する。
【０１８１】
【表１３】
2017508459.tif 000019
【０１８２】
異なる構築物の長さに応じて異なるクローニング戦略を適用した。最初の構築物は、細胞質ゾル側末端を改変するプライマーを用いたＢ７−１細胞外および膜貫通ドメインを含むｃＴＮＴイントロン４のＰＣＲ増幅により作製した。
【０１８３】
【表１４】
2017508459.tif 000020
【０１８４】
用いたプライマー対を表１３に記載し、用いた鋳型は、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）であった。精製ＰＣＲ産物を表１３に記載の酵素で消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物を生成させ、以下のバッチ番号を付与した。
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−６Ｈｉｓ  ＧＳＣ１１２０７（配列番号１１２）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−ＫＣＦＣＫ  ＧＳＣ１１２０９（配列番号１１３）
ｐＧＬＥＸ４１＿ＧＢＲ２００ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−ＧＡＴｌｎｏＥＲ  ＧＳＣ１１４８３（配列番号１１８）
【０１８５】
すべての中規模調製物を配列決定により確認した。
【０１８６】
Ｍ１Ｍ２細胞質ゾル側末端をＢ７−１膜貫通領域に融合させるために、融合ＰＣＲを実施した。Ｂ７−１細胞外および膜貫通ドメインを含むｃＴＮＴイントロン４を鋳型としてのｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）を用いてＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ２３９１（配列番号２３４）により増幅した。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含むＭ１Ｍ２細胞質ゾル側末端を、鋳型としてのｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）を用いてプライマーＧｌｎＰｒ２３９０（配列番号２３３）およびＧｌｎＰｒ１６５０（配列番号１９）により増幅した。クリーンアップの後、両ＰＣＲ産物を、ＧｌｎＰｒ１５１６（配列番号９）およびＧｌｎＰｒ１６５０（配列番号１９）をプライマーとして用いた第３のＰＣＲで融合させた。得られたＰＣＲ産物をクリーンアップし、ＳｆｏＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｍ１Ｍ２を生成させ、バッチ番号ＧＳＣ１１７５８を付与し、配列決定により確認した（配列番号１１４）。
【０１８７】
一部の構築物について、プライマーのアニーリングの戦略を選択した。各細胞質ゾル側末端について、それらの３’末端においてアニールするプライマーを発注した。各構築物について用いたプライマー対を表１４に記載する。プライマーをアニールさせ、次いで、ＰＣＲにより配列を完全なものにした。クリーンアップの後、得られたＰＣＲ産物を、ＳｆｏＩおよびＢｓｔＢＩで直接消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）主鎖にクローニングするか、またはｐＣＲ−ｂｌｕｎｔシャトルベクター（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にライゲートした（アニーリング産物が非常に短いので、直接ライゲーションがすべての産物に対して功を奏するとは限らなかった）。第２の状況において、小規模調製物は、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へのアニール産物のライゲーションの後に得られたコロニーから抽出した。配列の確認の後に、陽性の小規模調製物をＳｆｏＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、得られた断片を同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）主鎖にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、各構築物について中規模調製物を調製した。ＧＳＣバッチ番号を表１４に記載したようにこれらの中規模調製物に付与し、調製物を配列決定により確認した。
【０１８８】
【表１５】
2017508459.tif 000021
【０１８９】
最後に、最終構築物について、表１５に記載した配列名を有する、配列をＧｅｎｅＡｒｔに発注した。受領した時点に、ＧｅｎｅＡｒｔ構築物を水に再懸濁し、次いでＳｆｏＩおよびＢｓｔＢＩで消化した。得られたインサートを同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物を生成させ、下表に詳述したバッチ番号を付与した。
【０１９０】
【表１６】
2017508459.tif 000022
【０１９１】
Ｂ７−１細胞質ゾル側末端の影響をさらに評価するために、Ｍ１Ｍ２膜貫通ドメインの細胞質ゾル側末端をＢ７−１細胞質ゾル側末端により置換した。この目的のために、Ｂ７−１細胞質ゾル側末端を有するＭ１Ｍ２膜貫通ドメインをＧｅｎｅＡｒｔ＿Ｓｅｑ８２（配列番号２６４）としてＧｅｎｅＡｒｔに発注した。ＧｅｎｅＡｒｔ構築物をＣｌａＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、インサートを、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｂ７を生成させ、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ１１２９４を付与し、配列決定により確認した（配列番号１２５）。
【０１９２】
ＩｇＧ１抗体の軽鎖の発現のためのベクターのクローニング
軽鎖インサート（０７０４９７０ｐＧＡ４）を有するＧｅｎｅＡｒｔから提供されたクローニングベクターを、プライマーＧｌｎＰｒ５０１（配列番号４）およびＧｌｎＰｒ５０２（配列番号５）を用いたＰＣＲの鋳型として用いた。これらのプライマーは、軽鎖のオープンリーディングフレームを増幅し、オープンリーディングフレームにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位５’およびＸｂａＩ制限部位３’を付加する。アンプリコンをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断したシャトルベクターにライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、ギガレベルの調製物を生成させ、これを配列決定および消化により確認した。ＩｇＧ１フォーマットの抗体の軽鎖のコード領域をこのギガレベルの調製物からＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じ酵素で開き、ＣＩＰで処理したプラスミドｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）の主鎖にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、ｐＧＬＥＸ４１＿ＬＣの大規模調製物を生成させ、バッチ番号ＧＳＣ３１５（配列番号２９４）を付与し、配列決定により確認した。その後、同じＤＮＡのいくつかのバッチを中規模調製物またはギガレベルの調製物レベルで生成させ、バッチ番号ＧＳＣ３１５ａ、ＧＳＣ３１５ｂ、ＧＳＣ３１５ｃ、ＧＳＣ３１５ｄおよびＣＧＣ３１５ｅを付与した（すべてのこれらの調製物が配列決定により確認されたので、それらを以下でＧＳＣ３１５プラスミドと呼ぶものとする（配列番号２９４））。
【０１９３】
ＩｇＧ４抗体の軽鎖の発現のためのベクターのクローニング
ＩｇＧ４重鎖をコードする配列をＧｌｅｎｍａｒｋにおいて作製し、シャトルベクターで受け取った。ＩｇＧ４重鎖コード配列をプライマーＧｌｎＰｒ１４８８（配列番号３２８）およびＧｌｎＰｒ１４５２（配列番号３２７）を用いたＰＣＲにより増幅した。精製後、得られたＰＣＲ産物をプライマーＧｌｎＰｒ１４９４（配列番号２６０）およびＧｌｎＰｒ１４５２（配列番号３２７）を用いて再増幅した。これらの２ラウンドのＰＣＲにより、リーダーペプチドが改変され、コード配列の両末端に制限部位が付加される。得られたＰＣＲ産物を精製し、シャトルベクターｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、陽性クローンをＳｐｅＩおよびＣｌａＩで消化して、ＩｇＧ４重鎖コード配列を抽出した。得られたインサートをＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、ギガレベルの調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＩｇＧ４−ＨＣを生成させ、プラスミドバッチ番号ＧＳＢ５９を付与し、配列決定により確認した（配列番号７９）。
【０１９４】
Ｂ７−１膜貫通領域の発現を可能にする選択的スプライシングによるＩｇＧ４抗体の重鎖の発現のためのベクターのクローニング
膜結合ＩｇＧ４の発現のための選択的スプライシングカセットの付加のために、ＩｇＧ４重鎖のコード配列をプライマーＧｌｎＰｒ１４９４（配列番号２６０）およびＧｌｎＰｒ２２９４（配列番号２６１）を用いたＰＣＲによりｐＧＬＥＸ４１＿ＩｇＧ４−ＨＣ（ＧＳＢ５９、配列番号７９）を鋳型として用いて増幅した。得られたＰＣＲ産物をクリーンアップし、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）主鎖にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＩｇＧ４−ＨＣ−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７を調製し、これにプラスミドバッチ番号ＧＳＣ１１２１８を付与し、配列決定により確認した（配列番号８０）。
【０１９５】
ＩｇＧ４抗体の軽鎖の発現のためのベクターのクローニング
ＩｇＧ４軽鎖をコードする配列をＧｌｅｎｍａｒｋにおいて作製し、シャトルベクターで受け取った。３種のプライマーＧｌｎＰｒ１４８７（配列番号３２５）、ＧｌｎＰｒ１４９１（配列番号３２６）およびＧｌｎＰｒ１４９４（配列番号２６０）を用いた単一ラウンドのＰＣＲを用いて、リーダーペプチドを交換し、制限部位をコード配列の両末端に付加した。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＣｌａＩで消化し、ＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩで開き、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）主鎖にライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＩｇＧ４−ＬＣを生成させ、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ３７０４を付与し、配列決定により確認した（配列番号３１９）。
【０１９６】
ＢＥＡＴ（登録商標）二重特異性抗体の分泌重鎖の発現のためのベクターのクローニング
二重特異性抗体の重鎖を二重特異性ＢＥＡＴ（登録商標）フォーマットの一部としてＧｌｅｎｍａｒｋにおいて作製した。２ラウンドのＰＣＲを用いて、コザック配列、シグナルペプチドおよびフランキング制限部位を付加した。第１ラウンドにおいて、プライマーＧｌｎＰｒ１７２６（配列番号２４）およびＧｌｎＰｒ１５００（配列番号７）を用いて鋳型を増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＧｌｎＰｒ１５００（配列番号７）およびＧｌｎＰｒ１７２５（配列番号２３）を用いた第２ラウンドのＰＣＲの鋳型として用いた。得られたアンプリコンを精製し、制限酵素ＳｐｅＩおよびＣｌａＩを用いて切断した。このインサートを、ＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩを用いて開き、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｈｉｓを中規模調製物規模で生成させ、バッチ番号ＧＳＣ５６０７（配列番号２９６）を付与した。配列決定管理および制限消化により、プラスミドを確認した。このプラスミドは、鋳型配列からのＨｉｓタグの除去のためのプライマーＧｌｎＰｒ１７２５（配列番号２３）およびＧｌｎＰｒ１７６０（配列番号２７）を用いた改変ＰＣＲの鋳型として用いた。アンプリコンをＳｐｅＩおよびＣｌａＩで消化し、制限酵素ＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩを用いて開き、ＣＩＰで処理した、ベクターｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）の主鎖にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣにプラスミドバッチ番号ＧＳＣ５６４４を付与し、配列決定により確認した（配列番号４９）。
【０１９７】
二重特異性ＢＥＡＴ（登録商標）抗体の膜表示重鎖用の選択的スプライシング発現ベクターのクローニング
ＢＥＡＴ重鎖をコードする鋳型ベクター（ＧＳＣ５６４４、配列番号４９）をプライマーＧｌｎＰｒ１８００（配列番号２９）およびＧｌｎＰｒ１７２５（配列番号２３）を用いて増幅した。精製産物を制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、酵素ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて開き、ＣＩＰで処理したベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、大規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２にプラスミドバッチ番号ＧＳＣ５５３７（配列番号５０）を付与し、制限消化および配列決定により確認した。
【０１９８】
表面表示のためにＢ７−１膜貫通領域を用いるために、構築物ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ５５３７、配列番号５０）のインサートをＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）に再クローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、大規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７を生成させ、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ１０４８８を付与し、配列決定により確認した（配列番号３２１）。
【０１９９】
二重特異性抗体の分泌ｓｃＦｖ−Ｆｃ用の発現ベクターのクローニング
ｓｃＦｖ−Ｆｃ配列を二重特異性ＢＥＡＴ（登録商標）フォーマットの一部として社内で開発した。増幅は、プライマーＧｌｎＰｒ１６９０（配列番号２２）、ＧｌｎＰｒ１６８９（配列番号２１）およびＧｌｎＰｒ１５０２（配列番号８）を用いて実施した。これらのプライマーは、コザック配列、シグナルペプチドおよび制限部位をアンプリコンに付加する。ＰＣＲ産物をプライマーＧｌｎＰｒ１６８９（配列番号２１）およびＧｌｎＰｒ１５０２（配列番号８）を用いて再増幅し、得られたアンプリコンをＮｈｅＩおよびＣｌａＩを用いて消化した。このインサート断片を、ＮｈｅｌおよびＢｓｔＢＩを用いて切断し、ＣＩＰで処理した主鎖ｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）とライゲートした。小規模調製物のスクリーニングの後、バッチ番号ＧＳＣ５６０８（配列番号５１）を有する中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃを生成させ、制限消化および配列決定により確認した。
【０２００】
二重特異性抗体の膜表示ｓｃＦｖ−Ｆｃ用の選択的スプライシング発現ベクターのクローニング
ｓｃＦｖをコードする鋳型ベクター（ＧＳＣ５６０８、配列番号５１）をプライマーＧｌｎＰｒ１８０１（配列番号３０）およびＧｌｎＰｒ１６８９（配列番号２１）を用いて増幅した。精製産物をＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素を用いて開き、ＣＩＰで処理したベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ３８９９、配列番号３６）にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ５５３８（配列番号５２）を有する中規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２を生成させ、制限消化および配列決定により確認した。
【０２０１】
表面表示のためにＢ７−１膜貫通領域を用いるために、構築物ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（ＧＳＣ５５３７、配列番号５０）のインサートをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化し、ＣＩＰで処理したｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（ＧＳＣ７０５６、配列番号５５）に再クローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、大規模調製物ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７を生成させ、プラスミドバッチ番号ＧＳＣ１０４８７を付与し、配列決定により確認した（配列番号３２３）。
【０２０２】
二重特異性抗体の軽鎖用の発現ベクターのクローニング
軽鎖配列を二重特異性ＢＥＡＴ（登録商標）フォーマットの一部として社内で構築した。増幅は、プライマーＧｌｎＰｒ１６８９（配列番号２１）、ＧｌｎＰｒ１７２７（配列番号２５）およびＧｌｎＰｒ１４３７（配列番号６）を用いて実施した。これらのプライマーは、シグナルペプチド、コザック配列およびフランキング制限部位をアンプリコンに付加する。アンプリコンを精製し、制限酵素ＣｌａＩおよびＮｈｅＩを用いて消化し、ＮｈｅＩおよびＣｌａＩで開き、ＣＩＰで処理したシャトルベクターの主鎖にクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、大規模調製物を調製し、配列決定により検証した。二重特異性構築物の軽鎖をコードするこのシャトルベクターを制限酵素ＮｈｅＩおよびＣｌａＩを用いて消化し、ＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩで開き、ＣＩＰしたベクターｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）にインサートをクローニングした。小規模調製物のスクリーニングの後、ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＬＣの中規模調製物を調製し（プラスミドバッチ番号ＧＳＣ５５４０、配列番号３０２）、プラスミドを制限消化および配列決定により確認した。
【実施例２】
【０２０３】
翻訳産物の表面表示および特異的検出
導入
実施例１では、分泌タンパク質またはＣ末端膜貫通領域（ＴＭ）を有する同じタンパク質をコードする、同じＤＮＡ鋳型からの２つの異なるｍＲＮＡの発現をもたらす選択的スプライシング構築物のクローニングを述べた。定義の項で詳述したように、膜貫通領域は、任意選択のリンカー、膜貫通ドメインおよび任意選択の細胞質ゾル側末端を含む。これらの構築物は、標的タンパク質の効率的な分泌を維持しながら、この技術を細胞膜上にタンパク質の一部を表示するために用いることができるかどうかを判定するためにＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。ＩｇＧ１サブクラスの抗体、ＩｇＧ４サブクラスの抗体およびＢＥＡＴ（登録商標）フォーマットの二重特異性抗体の３種のタンパク質をこの実験に用いた。
【０２０４】
材料および方法
トランスフェクション
懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、５０ｍｌバイオリアクターチューブ（Ｔｕｂｅｓｐｉｎｓ、ＴＰＰ）方式でポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて発現ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を５ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（＃３１９８５−０４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＣＤ−ＣＨＯ培地（＃１０７４３−０１１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に２  Ｅ６個細胞／ｍＬの密度で播種した。ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体を細胞に３（μｇ／μｇ）の重量比で加えた。細胞懸濁液中の最終ＤＮＡ濃度は、２．５μｇ／ｍＬであった。振盪しながら（２００ｒｐｍ）３７℃で５時間インキュベートした後、５ｍＬの新鮮な培養培地を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で３７℃、５％ＣＯ２および８０％湿度でインキュベートした。
【０２０５】
表面染色
細胞の表面染色をトランスフェクション後１日目に実施した。合計１  Ｅ５個の細胞を収集し、９６ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、次いで、検出抗体を含む１００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。カッパ軽鎖の特異的検出は、マウス抗ヒトカッパ軽鎖ＡＰＣ標識抗体（＃５６１３２３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて実施し、赤色レーザー（６４０ｎｍ）により励起し、スペクトル範囲６６１／１９ｎｍで検出した。重鎖およびｓｃＦｖ−Ｆｃの両方は、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異抗体（＃１２−４９９８−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、青色レーザー（４８８ｎｍ）により励起し、スペクトル範囲５８３／２６ｎｍで検出した。ｓｃＦｖ−Ｆｃは、ＦＩＴＣ標識プロテインＡ（＃Ｐ５１４５、Ｓｉｇｍａ）を用いて、青色レーザーにより４８８ｎｍで励起し、スペクトル範囲５２５／３０で特異的に検出した。暗所で室温で２０分間インキュベートした後、細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために２００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞をＧｕａｖａフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。分泌分子の一過性発現レベルは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）およびプロテインＡバイオセンサーを用いてトランスフェクション後４〜６日目に測定した。
【０２０６】
結果
ＩｇＧ１抗体発現のために、軽鎖を発現する発現ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＬＣ（配列番号２９４）およびそれぞれｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（配列番号５５）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（配列番号３６）、ｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−ＰＴＣＲＡ（配列番号４０）またはｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ−Ｍ１Ｍ２＿ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ（配列番号２８４）という名称の第２のベクターを用いて、材料および方法の項で述べたようにＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクトした。対照として、分泌重鎖をコードする非スプライシング構築物を用いた（配列番号４８）。
【０２０７】
トランスフェクションの後、細胞を材料および方法の項で述べたように染色し、フローサイトメトリーにより解析した。分泌型の軽鎖および重鎖を発現する陰性対照（膜貫通領域の選択的スプライシングを用いない）は、低い強度の表面染色をもたらしたにすぎず（染色細胞の百分率については図２Ａにおける塗りつぶされていないヒストグラムおよび図２Ｅ参照）、ＩｇＧ１の比較的に高い分泌レベルを有した（図２Ｆ参照）。これと対照的に、Ｍ１Ｍ２領域を含む構築物（配列番号３６）をトランスフェクトした細胞は、細胞膜上に抗体を表示する有意な陽性集団を示した（図２Ｂにおける塗りつぶされたヒストグラム参照）。ＰＴＣＲＡ膜貫通領域（図２Ｃ参照；配列番号４０）による全Ｍ１Ｍ２膜貫通領域の交換、またはＰＴＣＲＡの膜貫通ドメイン（図２Ｄ参照；配列番号２８４）によるＭ１Ｍ２の膜貫通ドメインの特異的交換は、陽性であるが、弱く染色された細胞の集団をもたらした。マウスＢ７−１膜貫通領域（図２Ａ参照；配列番号５５）は、驚くべき高いレベルの染色を示し、集団の４０％が膜表示ＩｇＧ１について陽性であった。
【０２０８】
選択的スプライシング、したがって、全産生抗体の一部の膜結合発現は、分泌ＩｇＧの力価に負の影響を有すると思われる。それにもかかわらず、Ｍ１Ｍ２膜貫通領域（ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインと組み合わされた場合にも）およびとりわけＢ７−１膜貫通領域は、選択的スプライシングを用いない対照構築物の分泌レベルの最大８０％のレベルをもたらした（図２Ｆ参照）。
【０２０９】
ＩｇＧ４抗体発現のために、軽鎖を発現する発現ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＩｇＧ４−ＬＣ（配列番号３１９）および膜表示のためにＢ７−１膜貫通領域の選択的スプライシングを用いる、重鎖をコードする第２のベクター（配列番号８０）を用いて、材料および方法の項で述べたようにＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクトした。対照として、分泌ＩｇＧ４重鎖をコードする非スプライシング構築物を用いた（配列番号７９）。
【０２１０】
トランスフェクションの後、細胞を材料および方法の項で述べたように染色し、フローサイトメトリーにより解析した。分泌型の軽鎖および重鎖を発現する陰性対照（膜貫通領域の選択的スプライシングを用いない）は、陰性集団のみをもたらし（図３Ａ参照）、約６μｇ／ｍＬのＩｇＧ４の実質的分泌レベルを有していた（図３Ｃ参照）。これと対照的に、Ｂ７−１領域を含む構築物（配列番号８０）をトランスフェクトした細胞は、発現レベルが選択的スプライシングを用いた場合と用いない場合で同様のレベルに維持されていた（図３Ｃ参照）と同時に、細胞膜上に抗体を表示する有意な陽性集団を示した（ヒストグラムについては図３Ａを、染色の百分率については図３Ｂを参照）。
【０２１１】
二重特異性抗体が膜貫通領域（ＴＭ）を介して細胞膜上に表示されうるかどうかを検討するために、二重特異性抗体をコードする実施例１で述べた選択的スプライシング構築物をＣＨＯ細胞において一過性に発現させた。選択的スプライシング構築物は、この実施例でモデルタンパク質として用いた、社内で開発され、ＷＯ２０１２／１３１５５５に記載されている二重特異性抗体フォーマット（「ＢＥＡＴ（登録商標）」と呼ぶ）をコードする。ＢＥＡＴ分子は、ＩｇＧ重鎖（「重鎖」）、カッパ軽鎖（「軽鎖」）および重鎖定常領域に融合したｓｃＦｖ（「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」）の三量体である。ｓｃＦｖ−ＦｃのＦｃ断片のみがプロテインＡに結合することができるように、重鎖のプロテインＡ結合部位を無効にした。該分子の設計および重鎖プロテインＡ結合部位の遺伝子組換えにより、三量体のすべてのサブユニットの特異的検出が可能であった。細胞膜上の表示は、重鎖もしくはｓｃＦｖ−Ｆｃの選択的スプライシング構築物をトランスフェクトすることにより、または両選択的スプライシング構築物をトランスフェクトすることにより、達成された。単一細胞の表面上に表示された膜結合ＢＥＡＴ二重特異性抗体は、フローサイトメトリーにより特異的に検出された。
【０２１２】
以下では、正規の発現構築物をコードするベクターは、ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ（配列番号４９）を「ｐＨＣ」に、ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＬＣ（配列番号３０２）を「ｐＬＣ」に、ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ（配列番号５１）を「ｐＳｃＦｖ−Ｆｃ」と略称する。ＨＣに膜貫通領域を付加する選択的スプライシング構築物は、「ｐＨＣ−Ｍ１Ｍ２」（ｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２；配列番号５０）と呼び、ｓｃＦｖ−Ｆｃに膜貫通領域を付加する構築物は、「ｐＳｃＦｖ−Ｆｃ−Ｍ１Ｍ２」（ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２；配列番号５２）と呼ぶ。ＢＥＡＴ抗体の３つのサブユニットをコードする発現ベクターは、選択的スプライシング発現構築物または正規の発現構築物を用いて異なる組合せで共トランスフェクトした。表１６に実施したトランスフェクションおよび細胞膜上に表示されると予測された種を要約する。
【０２１３】
【表１７】
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【０２１４】
トランスフェクション後１日目に得られたフローサイトメトリープロファイルを図４ＡおよびＢに示す。第１のトランスフェクションカクテル（ｐＨＣ＋ｐＳｃＦｖ−Ｆｃ＋ｐＬＣ）は、細胞膜表示のための膜貫通領域を有する構築物を含まなかった。したがって、このトランスフェクションについて得られたプロファイル（図４Ａ、Ｄ、Ｇ）は、当実験の陰性対照とみなされ、ヒストグラムに破線分布として示す。
【０２１５】
ベクターｐＳｃＦｖ−Ｆｃ−Ｍ１Ｍ２単独のトランスフェクションは、抗Ｆｃ（重鎖を検出する）およびプロテインＡ染色について陽性細胞のみをもたらした（図４Ｋ、Ｎ、Ｑ）。この場合、軽鎖は細胞膜上に検出されず、アッセイの特異性が実証された。ベクターｐＨＣ−Ｍ１Ｍ２およびｐＬＣの共トランスフェクションは、抗Ｆｃおよびカッパ軽鎖染色について陽性細胞をもたらしたが、プロテインＡ結合は、観測することができなかった（図４Ｌ、Ｏ、Ｒ）。これは、プロテインＡ結合部位がＢＥＡＴ分子の重鎖サブユニットにおいて無効にされたという事実と一致していた。したがって、抗ヒトＦｃガンマ抗体は、重鎖に対して特異的でなく、ｓｃＦｖ−Ｆｃも認識したが、軽鎖の検出は、我々が重鎖の発現について結論をくだすことを可能にするものであった。
【０２１６】
すべての３サブユニットをコードするプラスミドカクテルを用いて実施したトランスフェクションは、用いた選択的スプライシング構築物と無関係に、少なくとも１つの膜貫通領域を有するＢＥＡＴ構築物の発現を示した（図４Ｂ、Ｃ、Ｊ、Ｅ、Ｆ、Ｍ、Ｈ、Ｉ、Ｐ）。染色は、軽鎖およびｓｃＦｖ−Ｆｃ、ならびにＦｃ断片（重鎖およびｓｃＦｖ−Ｆｃ）について陽性であり、すべての予測された種が細胞膜上に存在していたことが示された。したがって、完全に折りたたまれた多量体が細胞膜上に存在しており、多量体タンパク質の発現についてのリポーターシステムの有効性が確認された。驚くべきことに、膜貫通領域の位置を問わず、すべての種が検出された。膜貫通領域（ＴＭ）が重鎖（ＨＣ）およびｓｃＦｖ−Ｆｃサブユニットの両方（図４Ｂ、Ｅ、Ｈ）に、ＨＣのみ（図４Ｃ、Ｆ、Ｉ）にまたはｓｃＦｖ−Ｆｃのみ（図４Ｊ、Ｍ、Ｐ）に結合していたかどうかに差は認められなかった。
【０２１７】
したがって、ここに示したアプローチは、細胞膜上に表示されたヘテロ二量体（例えば、重鎖＋ｓｃＦｖ−Ｆｃサブユニット＋軽鎖）とホモ二量体（重鎖＋軽鎖またはｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体）との間の区別を可能にする。二重特異性抗体のような多量体タンパク質の発現との関連において、この情報の質は、途方もなく有用である。
【０２１８】
分泌ＢＥＡＴおよびｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体の濃度をトランスフェクション後６日目にプロテインＡバイオセンサーを用いてＯｃｔｅｔ  ＱＫ機器により測定した。結果を図５に示す。予想通り、得られる産物（重鎖−軽鎖ホモ二量体）がプロテインＡに結合しないので、発現ベクターｐＨＣ−Ｍ１Ｍ２−ｐＬＣを用いたトランスフェクションではプロテインＡバイオセンサーを用いて発現を測定することができなかった。発現ベクターｐＳｃＦｖ−Ｆｃ−Ｍ１Ｍ２用いたトランスフェクションでは、分泌産物のみをもたらす対照トランスフェクションと比較して、より低い発現レベルが観測された。選択的スプライシング構築物を用いたすべてのトランスフェクションでは、ＢＥＡＴ分子またはｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体を上清中に検出することができた。これにより、ＢＥＡＴヘテロ二量体がすでに実証したように細胞膜上に表示されただけでなく、細胞の分泌経路を用いて成功裏に分泌されことも確認される。より重要なことに、選択的スプライシング構築物を用いて得られた発現レベルは、対照（ｐＨＣ＋ｐＳｃＦｖ−Ｆｃ＋ｐＬＣ）と同等であった。分泌レベルに対する有意な影響がこの実験構成で測定されなかったことから、これは、ほんのわずかのタンパク質が表面表示のために分泌経路から逸脱したことを示唆するものであった。
【０２１９】
要約
これらの結果に基づいて、選択的スプライシング構築物が産生された抗体の一部を選択的スプライシングにより細胞膜に成功裏に偏向させたと結論することができる。表面染色は、ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインを含む構築物で低かったが、染色は、Ｍ１Ｍ２膜貫通領域を含む構築物をトランスフェクトした細胞で高く、Ｂ７−１膜貫通領域を含む構築物でさらにより高かった。シグナル強度に加えて、Ｍ１Ｍ２膜貫通領域がＢ細胞の進化中の抗体の効率的な膜表示のために選択され、したがって、免疫グロブリンの膜表示のための最も効率的な構築物であることを考慮すると、染色されうる細胞集団の百分率は、Ｂ７−１構築物によるトランスフェクションで驚くべきほど高かった。
【０２２０】
分泌抗体の一部が細胞膜に転送された場合、全体的な抗体発現レベルが低下したが、種々の構築物において非スプライス対照の発現レベルの約８０％が達成された。
【０２２１】
ＢＥＡＴ（登録商標）構築物の例により実証されたように、本発明の選択的スプライシング構築物を用いて２つを超えるサブユニットを有する分子も細胞膜上に表示することに成功することができた。これらの構築物は、膜貫通領域をほんのわずかの発現タンパク質に融合させた。二重特異性抗体（ＢＥＡＴ）を例として用いた場合、分泌タンパク質のみをもたらす対照トランスフェクションと比較して分泌レベルの有意な差を認めることができなかった。発現レベルに対する選択的スプライシングの影響が全くなかった、またはごくわずかな影響があったという所見により、該技術は、産業上の利用に受け入れることができるものである。さらに、本明細書で述べたアプローチによって細胞膜上に表示された多量体の特異的検出が可能であったことを示すことができた。驚くべきことに、分泌タンパク質の表面表示または発現レベルに対する影響を伴うことなく、膜貫通領域を重鎖もしくはｓｃＦｖ−Ｆｃにまたは両サブユニットに付加することができた。
【０２２２】
選択的スプライシングにより細胞膜上に表示された多量体分子が特定の細胞の分泌多量体タンパク質の産物組成を反映するので、この技術は、単一細胞レベルでの分泌プロファイルのサイトメトリーに基づく定性的予測を可能にするものであろう。これは、実施例５において実証される。
【実施例３】
【０２２３】
イントロン配列の改変による細胞表面表示および発現力価のモジュレーション
導入
実施例２で実証されたように、膜貫通領域の選択的スプライシングにより、さもなければ正常に分泌される抗体の一部が細胞表面に転送される。それにもかかわらず、分泌過程のこの改変は、抗体の分泌レベルに対する負の影響を有しうる。分泌抗体と膜表示抗体との間のスプライシング比を微調整することは、非スプライス抗体構築物（選択的スプライシング膜貫通領域を含まない）で認められる発現レベルに回復する助けとなりうる。これは、以下の実施例で実証される。
【０２２４】
材料および方法
トランスフェクション
懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、５０ｍｌバイオリアクターチューブ（Ｔｕｂｅｓｐｉｎｓ、ＴＰＰ）方式でポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて発現ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を５ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（＃３１９８５−０４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に２  Ｅ６個細胞／ｍＬの密度で播種した。ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体を細胞に３（μｇ／μｇ）の重量比で加えた。細胞懸濁液中の最終ＤＮＡ濃度は、２．５μｇ／ｍＬであった。振盪しながら（２００ｒｐｍ）３７℃で５時間インキュベートした後、５ｍＬの新鮮な培養培地を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で３７℃、５％ＣＯ２および８０％湿度でインキュベートした。
【０２２５】
表面染色
細胞の表面染色をトランスフェクション後１日目に実施した。合計１  Ｅ５個の細胞を収集し、９６ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、次いで、検出抗体を含む１００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。重鎖の特異的検出は、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（＃５１２−４９９８−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、青色レーザー（４８８ｎｍ）により励起し、スペクトル範囲５８３／２６ｎｍで実施した。暗所で室温で２０分間インキュベートした後、細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために２００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞をＧｕａｖａフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。分泌分子の一過性発現レベルは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）およびプロテインＡバイオセンサーを用いてトランスフェクション後４〜６日目に測定した。
【０２２６】
結果
軽鎖を発現する発現ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＬＣ（配列番号２９４）およびＭ１Ｍ２膜貫通ドメイン（配列番号３６〜３９）、ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメイン（配列番号４０〜４３）、Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ融合膜貫通ドメイン（配列番号４４〜４７）またはＢ７−１膜貫通ドメイン（配列番号５３〜５６）を含む、重鎖をコードし、改変型のイントロンを含む第２のベクターを用いて、材料および方法の項で述べたようにＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクトした。対照として、選択的スプライシングを用いない分泌重鎖を用いた（配列番号４８）。
【０２２７】
トランスフェクションの後、細胞を材料および方法の項で述べたように染色し、フローサイトメトリーにより解析した。実施例２で既に認められたように、分泌型の軽鎖および重鎖を発現する陰性対照（膜貫通領域の選択的スプライシングを用いない）は、低い割合の染色細胞（図６参照）しかもたらさなかった一方で、相当なレベルのＩｇＧ１分泌もたらした（図７参照）。これと対照的に、Ｍ１Ｍ２領域（配列番号３６、図６Ａ）およびＢ７−１膜貫通ドメイン（配列番号５５、図６Ｍ）を含む構築物をトランスフェクトした細胞は、細胞膜上に抗体を表示する有意な陽性集団を示した。ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメイン（配列番号４０、図６Ｅ）またはＭ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡ融合膜貫通ドメイン（配列番号４４、図６Ｉ）を含む場合、陽性集団が弱く染色された。
【０２２８】
イントロンのポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹ含量の減少は、スプライスアクセプターを弱めることが示されたので、スプライス比を分泌抗体側へとシフトさせるために導入した。表示の成功をもたらす両膜貫通領域（Ｍ１Ｍ２およびＢ７−１）について、イントロンのポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹを含まない構築物（配列番号３７および配列番号５３）は、細胞の表面染色を示さなかった（図６ＢおよびＮ参照）。これは、スプライシングの比が分泌抗体側へとほとんどシフトしたことを示唆するものであった。
【０２２９】
マウス免疫グロブリンμ一次転写物のイントロンにおける付加的なポリ（Ａ）部位の存在は、選択的スプライシング事象に影響を及ぼし、より高い割合の分泌産物（Galliら、1987）およびより低い膜表示抗体をもたらすことが示された。この所見に基づいて、スプライス比を抗体分泌側へとシフトさせるためにＳＶ４０ポリ（Ａ）を分泌ポリペプチドの停止コドンの３’およびイントロンの分岐点の５’に導入した。イントロンにおけるＳＶ４０ポリ（Ａ）部位の付加により、抗体の分泌レベルは、最初のＩ４構築物と比較してＭ１Ｍ２構築物で有意に増加した（図７参照）。同時に、Ｍ１Ｍ２構築物の膜表示抗体の割合（図６Ｃ参照）が増加した。Ｂ７−１細胞の染色が既に非常に高かったので、膜表示に対するポリ（Ａ）の影響に関する結論を引き出すことはできなかった（図６Ｏ参照）。
【０２３０】
発現カセットに近接する他のスプライスアクセプターによる異常なスプライス事象を避けるために、ガストリンターミネーター部位（ｍＲＮＡ転写を終結させると報告された）を発現カセットのポリ（Ａ）部位の３’に直接導入した。ガストリンターミネーター構築物は、とりわけＭ１Ｍ２構築物についての膜表示抗体の割合を増加させた（図６Ｄ）が、分泌レベルの有意な増加をもたらさなかった。再び、Ｂ７−１細胞について結論を引き出すことはできなかった（図６Ｐ）。
【０２３１】
選択的スプライシング、したがって、全産生抗体の一部の膜結合発現は、全体の分泌ＩｇＧ力価に負の影響を有すると思われる。それにもかかわらず、Ｍ１Ｍ２膜貫通領域（ＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインと組み合わせても）およびとりわけＢ７−１膜貫通領域は、選択的スプライシングを用いない対照構築物の分泌レベルの最大８０％のレベルをもたらした（図７参照）。さらに、イントロンにおけるポリ（Ａ）シグナルの付加は、細胞膜上の有意な染色を維持すると同時に、ＩｇＧ分泌に有利であることがわかった。他方でガストリンターミネーターはそれぞれの参照構築物と比較して、分泌に対し軽微な影響しか示さなかった（図７参照）。
【０２３２】
以前の実験で、イントロン配列の種々の改変は、構築物の膜貫通領域に無関係に、選択的スプライシングの効率に対する同様な影響を示した。したがって、選択的スプライス比および抗体分泌レベルに対するイントロン配列の改変の影響をさらに明らかにするために、Ｂ７−１膜貫通領域を選択した。その理由は、それが最高レベルの染色をもたらしたからである。
【０２３３】
細胞表面表示抗体の量を減少させ、対照構築物の発現レベルに回復させるために、分泌産物側へとスプライス比を変化させた。すなわち、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位を弱めた。スプライスアクセプターの共通配列に存在するポリ（Ｙ）トラクトは、スプライスアクセプター強度に重要な役割を果たすことが公知である（ポリ（Ｙ）トラクトが短いほど、スプライスアクセプター部位が弱くなる）。先行する実験で、ポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹ含量のゼロへの完全な減少が抗体の表面表示を消失させることが示された。天然ニワトリＴＮＴイントロン４ポリ（Ｙ）トラクトは、２７個のＹを含む。それらのポリ（Ｙ）トラクトにおける減少した数のＹを含む改変イントロンを有する一連の構築物を前述のＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした（配列番号５３、５５、５９〜６３）。表面染色およびＯｃｔｅｔ装置およびプロテインＡバイオセンサーを用いた発現レベルの推定の後に、抗体の細胞表面表示に対するポリ（Ｙ）トラクトの影響を明確に確認することができ、ポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹが９個未満であった場合、染色細胞の百分率（図８Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ参照）ならびに染色強度（図８Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｊ参照）が劇的に減少した。残念ながら、細胞表面表示のこの減少は、全体的な発現レベルに影響を及ぼさず、発現レベルは、すべての構築物で対照より低いままであった（図８Ｉ参照）。
【０２３４】
スプライシング比を分泌産物側に高める他の方法は、スプライスドナーのＤＮＡ配列を変化させることによって、選択的にスプライシングしたイントロンの５’末端におけるスプライスドナーの強度を低下させることである。元の構築物と同じアミノ酸配列をコードする２種のＤＮＡ構築物（ＳＤ＿ＣＣＣ、配列番号５８およびＳＤ＿ＧＧＣ、配列番号５７）を同じアミノ酸をコードする選択的コドンを利用して作製することができた。スプライスドナーの共通配列（ＳＤ＿ＣＣＣ、配列番号５８）の第１の改変は、染色細胞の百分率、染色の強度または発現レベルに対する効果をもたらさなかった（図９参照）が、第２の改変（ＳＤ＿ＧＧＣ、配列番号５７）は、表面表示（百分率と強度の両方、図９Ｃ、ＤおよびＦ参照）の劇的な減少を示した。この表面表示の減少は、選択的膜貫通ドメインを含まない対照のレベルまでの、発現力価の明らかな増加と相関していた（図９Ｅ参照）。さらに、天然ニワトリＴＮＴイントロン４配列と比較した場合、細胞表面表示が劇的に減少したが、膜貫通ドメインを含まない対照と比較した場合、有意な染色を観測することができた（図９Ｃ参照）。
【０２３５】
要約
ガストリンターミネーターは、とりわけＭ１Ｍ２構築物について細胞膜上のＩｇＧに陽性に染色された細胞の割合を増加させたが、標準構築物と比較して分泌ＩｇＧのより高い発現をもたらさなかった。イントロンにおける付加的なポリ（Ａ）の挿入は、構築物Ｍ１Ｍ２における膜表示抗体の割合を増加させた（Ｂ７−１については結論を引き出すことができなかった）。付加的なポリ（Ａ）を含むＭ１Ｍ２構築物は、高いレベルの分泌ＩｇＧも示した（非スプライス対照構築物の発現の最大８０％）。
【０２３６】
ポリ（Ｙ）トラクトの減少は、スプライスアクセプターを弱め、膜表示スプライス変異体の発現を減少させると予測された。これは、すべての４種の基礎構築物（Ｍ１Ｍ２、ＰＴＣＲＡ、Ｍ１Ｍ２−ＰＴＣＲＡおよびＢ７−１）について確認することができた。さらに、表面表示のレベルは、Ｂ７−１膜貫通ドメインを用いた実施例により示されたように、ポリ（Ｙ）トラクトの長さと直接相関することが認められた。ポリ（Ｙ）トラクトにおける最小限５Ｙがこの状況における有意な表面染色に必要であることが見いだされた。同時に、分泌抗体の発現レベルの増加を観測することができなかった。したがって、選択的スプライシングの移動は、分泌産物の蓄積に恩恵をもたらさなかった。予期しないことに、スプライスドナーの共通配列の特定の改変が、分泌抗体のレベルを増加させると同時に、表面染色のレベルを低下させた。表面表示のレベルは、かなり低かったが、対照構築物と比較して依然として有意であり、分泌レベルは、対照と同じであることが見いだされた。
【０２３７】
発明者らは、選択的スプライシング事象の頻度がスプライスドナー部位の強度によって決定されることを考慮した。対応するスプライスアクセプターが十分に強い（ポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹが５個を超える）場合、選択的スプライシングは、膜貫通領域を含む構築物をコードする選択的ｍＲＮＡの形成、およびしたがって、膜表示を引き起こす。ポリ（Ｙ）トラクトにおけるＹの量を５Ｙ未満に低くすることによってスプライスアクセプターが弱められる場合、非スプライスｍＲＮＡ、およびしたがって、分泌レベルに対する影響は認められないが、スプライシング事象は、効率がより低くなり、選択的ｍＲＮＡ前駆体が分解されうる。これと一致するものとして、スプライスアクセプターが弱められた後により低い膜表示が観測されたが、分泌レベルに対する影響は認められなかった。他方でスプライスドナーの強度を低下させることにより、選択的スプライシング事象の頻度が低下しうる。結果として、より多くのｍＲＮＡが非スプライスｍＲＮＡの分泌産物をコードすること、分泌抗体の観測される増加をもたらす。強いスプライスアクセプターは、ｍＲＮＡの効率的な選択的スプライシングをもたらすが、弱いスプライスドナーに起因してより低い頻度であり、これは、観測される有意であるが、弱い膜表示の説明となりうる。
【０２３８】
要約すると、スプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター配列の改変により、表面表示のレベルおよび選択的スプライシングを用いずに発現させた抗体の分泌レベルまでの抗体の分泌レベル両方の調節が可能であった。したがって、提示した構築物は、選択的スプライシングの効率を調節することによって所望のレベルまでの表示および分泌レベルの微調整を可能にするものである。
Galli GI、Guise J、Tucker PW、Nevins JR (1988)、Poly(A) site choice rather than splice site choice governs the regulated production of IgM heavy-chain RNAs、Proc Natl Acad Sci USA、4月、85巻(8号)、2439〜43頁
【実施例４】
【０２３９】
細胞表面表示への膜貫通領域の影響
導入
細胞により産生される抗体の一部の膜表示のための選択的スプライシングシステムは、膜貫通領域の特性によって改変される可能性がある。例えば、膜貫通ドメインの長さおよび構造が膜表示の有効性に影響を及ぼしうることを推測することができよう。さらに、膜貫通領域の細胞質ゾル側末端は、ＥＲ輸出シグナルの存在または非存在によって細胞表面表示に影響を及ぼしうる。以下の実施例では、我々は、膜貫通ドメインのアミノ酸組成も、その長さも、膜貫通領域の細胞質ゾル側末端も、表面表示および分泌に対する重大な影響を有しないことを示す。
【０２４０】
材料および方法
トランスフェクション
懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、５０ｍｌバイオリアクターチューブ（Ｔｕｂｅｓｐｉｎｓ、ＴＰＰ）方式でポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて発現ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を５ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（＃３１９８５−０４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に２  Ｅ６個細胞／ｍＬの密度で播種した。ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体を細胞に３（μｇ／μｇ）の重量比で加えた。細胞懸濁液中の最終ＤＮＡ濃度は、２．５μｇ／ｍＬであった。振盪しながら（２００ｒｐｍ）３７℃で５時間インキュベートした後、５ｍＬの新鮮な培養培地を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で３７℃、５％ＣＯ２および８０％湿度でインキュベートした。
【０２４１】
表面染色
細胞の表面染色をトランスフェクション後１日目に実施した。合計１  Ｅ５個の細胞を収集し、９６ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、次いで、検出抗体を含む１００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。重鎖の特異的検出は、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（＃５１２−４９９８−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、青色レーザー（４８８ｎｍ）により励起し、スペクトル範囲５８３／２６ｎｍで検出した。暗所で室温で２０分間インキュベートした後、細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために２００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞をＧｕａｖａフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。分泌分子の一過性発現レベルは、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）およびプロテインＡバイオセンサーを用いてトランスフェクション後４〜６日目に測定した。
【０２４２】
結果
軽鎖を発現する発現ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＬＣ（配列番号２９４）および異なる膜貫通領域を含む重鎖をコードする第２のベクターを用いて、材料および方法の項で述べたようにＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクトした。対照として、選択的スプライシングを用いない分泌重鎖を用い（配列番号４８）、Ｂ７−１膜貫通領域を含む構築物（配列番号５５）を陽性対照として用いた。
【０２４３】
トランスフェクションの後、細胞を材料および方法の項で述べたように染色し、フローサイトメトリーにより解析した。
【０２４４】
膜貫通ドメインの長さおよび組成
細胞表面表示および抗体分泌レベルに対する膜貫通ドメインの影響を解析するために、Ｂ７−１膜貫通ドメインを疎水性残基のみを含む同様の長さ（２２〜２３アミノ酸）の膜貫通ドメイン（配列番号８１〜８６参照）により置き換えた。膜貫通ドメインの交換は、抗体の細胞表面表示または分泌に対する影響を有さなかった（図１０参照）。
【０２４５】
Ｂ７−１膜貫通ドメインを、疎水性残基だけでなく、極性または荷電残基も含む同様の長さ（２１〜２４アミノ酸）の膜貫通ドメイン（配列番号８７〜９３参照）により置き換えた場合、ＰＴＣＲＡに由来する膜貫通ドメイン（配列番号９３）を除いて、表面表示または分泌に対する影響は認められなかった。この膜貫通ドメインは、細胞表面上に産物を示す細胞の割合を変化させることなく、分泌レベルに対するいかなる影響も伴わずに産物の表面密度を劇的に低下させた（図１１Ｈ、Ｊ、ＫおよびＬ参照）。
【０２４６】
膜貫通ドメインは、疎水性脂質相により囲まれている。膜の疎水性環境中にイオン性基を挿入するエネルギーコストは、非常に高く、したがって、膜貫通ドメインにおける荷電アミノ酸に対する強いバイアスがあるはずである（WhiteおよびWimley、1999）。膜貫通らせんの統計解析により、膜貫通ドメインが、とりわけ膜貫通領域の疎水性コアにおいて、主として疎水性アミノ酸残基により構成されていることが確認された（Beza-Delgado、2012）。この所見に基づいて、我々は、観測された弱い染色強度に対するＰＴＣＲＡ膜貫通ドメインにおける３つの荷電残基（Ｒ８、Ｋ１３およびＤ１８、番号付けは膜貫通らせんの始めから始める）の影響を確認することを望んだ。種々の荷電残基をバリンアミノ酸（膜貫通ドメインにおける４つの最も高頻度のアミノ酸のうちの１つ（Baeza-Delgadoら、2012））と交換した、いくつかのＰＴＣＲＡ構築物を設計し、ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした（配列番号９４〜１００）。これらのトランスフェクションの結果により、表面染色強度に対する荷電残基の影響が確認された。単一アミノ酸Ｒ８Ｖ（配列番号９４）、Ｋ１３Ｖ（配列番号９５）またはＤ１８Ｖ（配列番号９６）の突然変異は、表面表示抗体の密度を有意に増加させたが、抗体の分泌レベルに対して有意な影響を与えなかった（図１２Ｂ、Ｃ、ＤおよびＪ参照）。単一突然変異の結果から予期された通り、２つの突然変異荷電残基の組合せ（Ｒ８ＶおよびＫ１３Ｖ（配列番号９７）、Ｒ８ＶおよびＤ１８Ｖ（配列番号９８）またはＫ１３ＶおよびＤ１８Ｖ（配列番号９９））は、表面表示のレベルおよびＰＴＣＲＡの膜貫通ドメインと同様の分泌レベルを示した（図１２Ｅ、Ｆ、ＧおよびＪ参照）。最後に、すべての３つの荷電残基のバリンへの突然変異（配列番号１００）は、予期された通り、対照と比較して高い表面表示を引き起こした。予期しないことに、分泌抗体の発現レベルならびに染色細胞の百分率は、この構築物でわずかにより低かった（図１２ＨおよびＪ）。分泌および染色レベルの低下の原因は、現在のところ不明である。
【０２４７】
Ｂ７−１膜貫通ドメインを、疎水性残基だけでなく、極性または荷電残基も含むより短い膜貫通ドメイン（１７〜１９アミノ酸）（配列番号１０１〜１０３）により置き換えた場合、異なる効果を確認することができた。結果は、図１３に示される。ＦＣＥＲＡ（配列番号１０１）およびＫＩ２Ｌ２（配列番号１０２）の膜貫通ドメインは、染色細胞の百分率に軽微な有害効果をもたらした（図１３Ｂ、ＣおよびＥ）が、ＦＣＥＲＡに由来する膜貫通ドメインのみが染色の強度に対して負の影響を与えた（図１３ＣおよびＧ）。さらに、両膜貫通ドメイン（ＦＣＥＲＡおよびＫＩ２Ｌ２）は、分泌レベルに対する軽微な好ましい効果をもたらした（図１３Ｆ）。他方でＩＬ３ＲＢに由来する膜貫通ドメイン（配列番号１０３）については、染色細胞の百分率および分泌レベルに関してはＢ７−１参照構築物と比較して変化が認められず（図１３Ｄ、Ｅ、Ｆ）、染色強度のわずかな低下のみが認められた（図１３Ｇ）。これにより、短い膜貫通ドメインが産物の表面表示の微調整のためのツールとなる可能性があるということとなる。
【０２４８】
Ｂ７−１膜貫通ドメインを、疎水性残基だけでなく、極性または荷電残基も含むより長い膜貫通ドメイン（配列番号１０４〜１０７）により置き換えた場合、Ｂ７−１膜貫通ドメインを含む参照構築物と比較して染色細胞の百分率に対する影響も、染色強度に対する影響も認められなかった（図１４Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＨ参照）。それにもかかわらず、分泌は、Ｂ７−１を含む場合よりすべてのこれらの膜貫通ドメインを含む場合の方がわずかに良好であった（図１４Ｇ参照）。
【０２４９】
１つの膜貫通ドメインから別のものに切り替えずに膜貫通ドメインの長さの影響をより明確な方法で評価するために、改変されたＢ７−１膜貫通ドメインを含む構築物を設計した。いくつかの疎水性アミノ酸をＢ７−１膜貫通ドメインの疎水性中心から除去またはそれに付加した（配列番号１０８〜１１１）。Ｂ７−１を１８アミノ酸（配列１０８）に短縮することは、染色細胞の百分率に関して有益であったが、染色強度に関してわずかに有害であった（図１５Ｂ、ＦおよびＨ参照）。３つの他の構築物（それぞれ２０（配列番号１０９）、２４（配列番号１１０）および２６（配列番号１１１）アミノ酸）は、染色細胞の百分率または染色強度に有意な影響を及ぼさなかった（図１４Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＨ参照）。分泌レベルに関しては、膜貫通ドメインの長さを短縮することは、有益であることがわかったが、伸長膜貫通ドメインを含む構築物は、天然Ｂ７−１を含む構築物と同等の分泌レベルを示した（図１４Ｇ参照）。
【０２５０】
一般的に、染色強度は、より長い膜貫通ドメインと比較してわずかに低減しうるが、染色細胞の百分率および抗体の分泌に関しては、より短い膜貫通ドメインが好ましいと思われる。
【０２５１】
細胞質ゾル側末端
文献で、Ｂ７−１細胞質ゾル側末端における構造的非線状ＥＲ輸出シグナルの存在が示唆されている（Linら、2013）。著者らは、細胞表面に向けての膜貫通タンパク質の細胞質ゾルドメインにおけるＥＲ輸送シグナルの存在は、細胞表面上のタンパク質の量に対する正の影響を有しうることを見いだした。高い代謝回転を有するタンパク質の場合、ＥＲから膜への加速輸出が原形質膜からのタンパク質分解性切断を補いうる。
【０２５２】
ＥＲ輸出シグナルが我々のシステムにおける膜表示に関連するかどうかを評価するために、Ｂ７−１細胞質ゾル側末端を、ＥＲ輸出シグナルを含むことが公知のいくつかの膜貫通タンパク質およびＥＲ輸出シグナルを含まない欠失変異体の細胞質ゾル側末端により置き換えた（配列番号１１２〜１２４）。
【０２５３】
図１６Ｐに示すように、ＥＲ輸出シグナルの非存在は、分泌抗体のレベルに関してはわずかに有利であることがわかったが、染色細胞の百分率（図１６Ｂ〜ＮおよびＯ）および染色強度（図１６Ｂ〜ＮおよびＱ）は、有意な影響を受けなかった。したがって、我々の膜表示抗体は、速やかな代謝回転を受けない可能性がある。
【０２５４】
これらの構築物に加えて、Ｍ１Ｍ２膜貫通ドメインにおけるＢ７−１細胞質ゾル側末端によるＭ１Ｍ２細胞質ゾル側末端の交換を実施した（配列番号１２５）。図１７Ｅに示すように、この交換は、蛍光の強度をわずかに増大させたが、染色細胞の百分率（図１７Ｃ）に対しても、分泌レベル（図１７Ｄ）に対しても影響を及ぼさなかった。
【０２５５】
要約
総合すると、データから、我々の選択的スプライシングシステムにおける膜貫通ドメインの長さまたはアミノ酸組成は、抗体の分泌レベルおよび細胞膜上の産物表示に対して軽微な影響を与えたにすぎなかったことが示唆される。選択的スプライシングシステムの微調整に用いられる可能性がある、分泌産物と膜表示産物との比のわずかな変化が認められた。構築物のすべてが、抗体の有意な表面表示を、および適切な分泌レベルシフトも、もたらした。興味深いことに、細胞表面表示の蛍光レベルに対する膜貫通ドメインの大きな影響が認められた。疎水性アミノ酸の存在または非存在は、平均蛍光の制御を可能にするものであったが、分泌レベルまたは細胞表面表示を示す細胞の百分率に影響を及ぼさなかった。
【０２５６】
細胞質側末端におけるＥＲ輸出シグナルは、対照抗体の細胞表面表示に必要でないことが見いだされた。グリシン−アラニンリンカーおよび６ヒスチジンからなる最小細胞質側末端またはＢ７−１末端の最初の５アミノ酸は、細胞表面表示のために十分なものであった。これは、速やかな代謝回転を受ける他の抗体またはタンパク質については異なる可能性がある。したがって、細胞質ゾル側末端は、目的のタンパク質の表面表示を調節するための興味深いツールでありうる。
【０２５７】
総合すると、実施例２〜４からのデータから、表面表示レベルおよび分泌レベルは、選択的スプライシングおよび膜結合タンパク質の膜組込みに関与する種々の配列による影響を受けることが示唆される。スプライスドナー部位の特定の改変により、対照非選択的スプライシング構築物と同じ分泌レベルを回復することができた（実施例３の図９参照）が、表面染色は、Ｂ７−１膜貫通領域を用いた場合に有意に減少した。他方で、Ｍ１Ｍ２膜貫通領域を用いる場合にイントロンにＳＶ４０（Ａ）を付加することにより、分泌および表面表示レベルの両方が増加した（実施例３の図６および７参照）。さらに、１８または２０アミノ酸に短縮させたＢ７−１のようなＢ７−１膜貫通ドメインの改変（図１５参照）は、分泌レベルおよび表面表示レベルの両方に対する正の影響を有していた。最後に、６ＨｉｓまたはＫＣＦＣＫのようなＥＲ輸出シグナルを含まない細胞質ゾル側末端によりＢ７−１細胞質ゾル側末端を置き換えることによっても表面表示および分泌レベルの両方が改善された。最後に、発現に対する発現カセットの末端におけるガストリンターミネーターの影響は、正であり、イントロンに配置した場合、より有利でありうる。したがって、これらの種々の特徴を兼ね備えた構築物は、より有利であり、細胞選択のために望まれる高いダイナミックレンジの細胞表面表示及び最善の分泌レベルの両方をもたらしうる。
【０２５８】
これらの構築物の主鎖は、ｐＧＬＥＸ４１（ＧＳＣ２８１、配列番号３０４）であり、非スプライスＯＲＦの最後の５アミノ酸から発現構築物の末端までの配列は、ＤＮＡ配列ならびにＦｅｈｌｅｒ！  Ｕｎｇｕｌｔｉｇｅｒ  Ｅｉｇｅｎｖｅｒｗｅｉｓ  ａｕｆ  Ｔｅｘｔｍａｒｋｅにおけるタンパク質配列と同じ、融合膜貫通領域を含むアミノ酸から始まるタンパク質配列として示す。
【０２５９】
【表１８】
2017508459.tif 000024
*示した配列は、非スプライスORFの最後の5アミノ酸から発現構築物の末端までに及ぶ
【０２６０】
出版物：
Lin Y.、Chen B.、Wei-Cheng Lu W. Chien-I Su C.、Prijovich Z.、Chung W.、Wu P.、Chen K.、Lee, I.、Juan T.およびRoffler, S. (2013). The B7-1 Cytoplasmic Tail Enhaces Intracellular Transport and Mammalian Cell Surface Display of Chimeric Proteins in the Absence of a Linear ER Export Motif PLoS One. 9月20日、8巻(9号)
Baeza-Delgado, C1、Marti-Renom, MA、Mingarro, I. (2012). Structure-based statistical analysis of transmembrane helices. Eur Biophys J. 2013年3月、42巻(2〜3号)、199〜207頁
White, SHおよびWimley、 WC (1999). Membrane protein folding and stability: physical principles. Annu Rev Biophys Biomol Struct.、28巻、319〜65頁。
【実施例５】
【０２６１】
表面表示のための選択的スプライシングを用いた産物分泌の定性的予測
導入
細胞のトランスフェクションは、組換えタンパク質発現のための安定細胞株の樹立のための最初のステップである。多くの理由（不均質な初期細胞集団、ゲノムにおけるプラスミドが組み込まれる遺伝子座が異なること、翻訳後機構が異なることおよび発現のえぴジェネティックな調節）のために、このステップは、一般的に、発現および分泌レベルに関してだけでなく、タンパク質フォールディング、グリコシル化および他の翻訳後修飾のような産物の質の特性に関しても不均質な細胞集団を生じさせる。二重特異性抗体は、すべての可能な組合せでアセンブルしうる最大４つの異なるサブユニット（２つの重鎖および２つの軽鎖）により構成されている。プラスミド組込み、転写および翻訳の調節ならびにＥＲにおけるフォールディングの有効性次第で、特定のクローンは、不要の副産物の代わりに正しくアセンブルされた産物を好ましくは分泌しうる。この所望の分泌パターンを有するクローンの選択は、分泌タンパク質の広範なスクリーニングおよび特性評価を必要とする。目的の産物および最小限の副産物を産生する細胞株を得るために必要なスクリーニングの量を低減することは、大きな進歩であろう。
【０２６２】
選択的スプライシング技術を用いて細胞膜表示のために分泌タンパク質の一部を分泌経路から逸脱させることができることが先に実施例２〜４で実証された。細胞膜上に表示されたタンパク質の特異的検出がフローサイトメトリーによって可能であることも示された。
【０２６３】
この実施例の目的は、細胞膜上の産物パターン表示がクローンの分泌プロファイルを予測するものであることを実証することであった。この目的のために、実施例２で提示したヘテロ三量体二重特異性ＢＥＡＴ（登録商標）抗体をモデルとして用いた。該分子は、以下において「標的１」および「標的２」と呼ばれる２つの異なる可溶性分子に結合する。図１８の構造Ａで、分子の概略図を確認することができる。それは、下文で「ＢＥＡＴ」と略記する。トランスフェクション後、ＢＥＡＴ分子だけでなく、「標的１」に結合する単一特異性重鎖−軽鎖二量体も分泌される。この分子は、Ｆａｂホモ二量体（「Ｆａｂ−ＤＩＭ」と略記）と呼ばれる。第２の副産物は、「標的２」に結合する単一特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体（「ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭ」と略記）である。これらの副産物は、図１８における構造ＢおよびＣとして確認することができる。
【０２６４】
発現ベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（配列番号５０）、ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（配列番号５２）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＬＣ（配列番号３０２）を用いた、またはｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＬＣ（配列番号３０２）、ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（配列番号３２３）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（配列番号３２１）を用いた細胞の安定トランスフェクション後、クローンを表面染色によりスクリーニングした。それに続き細胞の表面の表現型を特徴付けるための２つのアプローチを行った。最初に軽鎖およびＦｃ断片の二重表面染色を実施した。この染色は、すべての産生された種の検出を可能にするとは限らなかった（ＢＥＡＴとＦａｂ−ＤＩＭとの区別をしない）が、単一特異性混入物ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭを検出した。この方法は、すべての種類のＢＥＡＴ分子に普遍的に適用できる。第２のアプローチは、より特異的であり、それぞれの結合アームの検出のための可溶性標的を必要とした。この場合、すべての３つの可能な産物が表面染色により明確に検出された。組換えプールおよびクローンは、それぞれ限界希釈法およびフローサイトメトリー細胞選別により得られた。回分または流加培養を実施し、上清中に蓄積された産物をキャピラリー電気泳動により解析した。最終的に上清中で測定された分泌プロファイル（ＢＥＡＴ、Ｆａｂ−ＤＩＭまたはｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭ断片）を組換え細胞の細胞膜上に表示された産物プロファイルと比較した。
【０２６５】
材料および方法
安定プールの確立
安定トランスフェクトＣＨＯ細胞は、二重特異性ヘテロ二量体ＢＥＡＴの発現のための前述のベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（「ｐＨＣ−Ｍ１Ｍ２」と略記；配列番号５０）、ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（「ｐｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｍ１Ｍ１」と略記；配列番号５２）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＬＣ（「ｐＬＣ」と略記；配列番号３０２）ならびにそれぞれ抗生物質ピューロマイシンおよびジェネティシンに対する耐性を付与するタンパク質の発現のための２つの自社開発ベクターのコトランスフェクションにより作製した。懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、５０ｍｌバイオリアクター方式でポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて線状化ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を５ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（＃３１９８５−０４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に２  Ｅ６個細胞／ｍＬの密度で播種した。ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体を細胞に３（μｇ／μｇ）の重量比で加えた。２．５μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度を細胞に加えた。振盪しながら（２００ｒｐｍ）３７℃で細胞をＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体とともに５時間インキュベートした後、５ｍＬの培養培地ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（＃ＢＥ１２−７７１Ｑ、Ｌｏｎｚａ）を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で３７℃、５％ＣＯ２および８０％湿度でインキュベートした。トランスフェクションの１日後に細胞を、安定なプールの増殖を可能にする濃度のピューロマイシン（＃Ｐ８８３３−２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）およびジェネティシン（＃１１８１１−０９８、Ｇｉｂｃｏ）を含む選択培地中に各種濃度（０．７、０．５および０．４  Ｅ５個細胞／ｍＬ）で９６ウエルプレートに播種した。静的条件下での１４日間の選択の後に１５の生産性安定プールをウエルから採取し、ＴｕｂｅＳｐｉｎバイオリアクター中に拡大した。
【０２６６】
組換えクローンの確立
クローンは、二重特異性ヘテロ二量体ＢＥＡＴの発現のための前述のベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＨＣ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（「ｐＨＣ−Ｂ７」と略記、配列番号３２１）、ｐＧＬＥＸ４１＿ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｉ４−Ｂ７−Ｂ７−Ｂ７（「ｐｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｂ７」と略記、配列番号３２３）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＢＥＡＴ−ＬＣ（「ｐＬＣ」と略記、配列番号３０２）ならびにそれぞれ抗生物質ピューロマイシンおよびジェネティシンに対する耐性を付与するタンパク質の発現のための２つの自社開発ベクターのコトランスフェクションにより作製した。トランスフェクションおよび安定な形質転換体の選択は、前述のように実施した。静的条件下での１４日間の選択の後にすべての安定な形質転換体を収集し、プールし、動的条件（オービタル振盪）下で１週間にわたり継代した。単一細胞選別は、パルスプロセシングにより細胞ダブレットを除外した生存細胞においてゲーティングすることによりＦＡＣＳＡｒｉａＩＩを用いて実施した。
【０２６７】
細胞表面上に表示された産物のＬＣおよびＦｃ染色
安定細胞上の軽鎖（ＬＣ）およびＦｃ断片の二重表面染色は、実施例２で詳細に述べたように回分播種後２日目に実施した。手短かに述べると、合計１  Ｅ５個の細胞を収集し、９６ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで１００μＬの検出抗体中に再懸濁した。カッパ軽鎖の特異的検出は、マウス抗ヒトカッパＬＣ  ＡＰＣ標識抗体（＃５６１３２３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて実施し、Ｆｃ断片は、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異抗体（＃１２−４９９８−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出した。暗所で室温で２０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために２００μＬに再懸濁した。細胞は、Ｇｕａｖａフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて解析した。
【０２６８】
細胞表面上に表示された特異的バインダーの染色
この染色のために、細胞表面上に表示された分子の結合アームの検出のための可溶性標的を用いた。手短かに述べると、合計１  Ｅ５個の細胞を収集し、９６ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで１００μＬのビオチニル化標的１およびＨｉｓタグ付き標的２の混合物に再懸濁した。暗所で室温で２０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、ＡＰＣとコンジュゲートしたストレプトアビジン（＃５５４０６７、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＰＥで標識した抗Ｈｉｓタグ抗体（＃ＩＣ０５０、ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む１００μＬの混合物に再懸濁した。暗所で室温で２０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、Ｇｕａｖａフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたフローサイトメトリー解析のために２００μＬに再懸濁した。
【０２６９】
細胞分泌プロファイルの解析
組換えプールは、補足増殖培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、８ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１５％Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１５％Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中０．５  Ｅ６個細胞／ｍＬの細胞密度でＴｕｂｅＳｐｉｎｓに播種した。クローンは、増殖培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中０．５  Ｅ６個細胞／ｍＬの細胞密度でＴｕｂｅＳｐｉｎｓに播種し、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  Ａ＆Ｂフィード、（＃Ｕ０５０−０７８、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ）の供給を毎日実施した。回分または流加培養の１４日目に上清を遠心分離により収集し、０．２μｍシリンジフィルター（＃９９７２２、ＴＰＰ）を用いてろ過した。粗上清を直接分析するか、またはＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａビーズ（＃１７−１２８１−０２、ＧＥ）を用いて精製した。タンパク質をＣａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩタンパク質アッセイを用いて解析した。異なる種をそれらの分子量により同定し、各産物の割合を決定する。
【０２７０】
結果
ｐＨＣ−Ｍ１Ｍ２、ｐＳｃＦｖ−Ｆｃ−Ｍ１Ｍ２およびｐＬＣ構築物を用いたトランスフェクションの後に合計１５の安定プールが得られた。これらのプールの分泌プロファイルを測定するために補足バッチを開始した。プールにおける軽鎖およびＦｃ断片（ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび重鎖）の二重表面染色をバッチ播種後２日目に実施した。図１９に補足バッチの２日目に二重染色により測定したプールの１つの表面プロファイルの例を示す。ドットプロットは、カッパＬＣ染色の強度（ｙ軸）対ヒトＦｃ染色の強度（ｘ軸）を示す。象限は、陰性染色細胞と陽性染色細胞との間の限界を任意に確定するものである。象限Ｑ８は、細胞膜上にタンパク質を発現しない細胞、例えば、非産生細胞の亜集団の割合を示す。Ｑ７は、Ｆｃ断片について陽性であるが、カッパＬＣについて陰性であり、したがって、細胞膜上にｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭを示す細胞に対応する細胞の割合である。Ｑ６における二重陽性細胞は、細胞膜上にＬｃおよびＦｃ断片の両方、例えば、ＢＥＡＴまたはＦａｂ−ＤＩＭ分子を表示する細胞である。
【０２７１】
解析により、３３．８％の非産生細胞（Ｑ８）、５０．３％のｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭ分泌体（Ｑ７）および１５．８％の潜在的なＢＥＡＴまたはＦａｂ−ＤＩＭ分泌体（Ｑ６）の不均質な細胞集団が示された。表面染色と分泌産物との相関を計算することができるために、生産性集団のみを考慮に入れた。したがって、生産性細胞の割合（Ｑ６＋Ｑ７）内のＢＥＡＴおよびＦａｂ−ＤＩＭ産生細胞の割合ならびにｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭ産生細胞の割合を非産生細胞の割合Ｑ８を除いて再計算した（この割合をＱ６＊およびＱ７＊と呼ぶものとする）。例えば、図１７に示す解析において、集団を以下のように計算した。
Ｑ６＊＝Ｑ６／（Ｑ６＋Ｑ７）＝２３．９％およびＱ７＊＝Ｑ７／（Ｑ６＋Ｑ７）＝７６．１％。
この解析を１５のすべての生産性安定プールについて実施し、図２０に示す相関に用いた。
【０２７２】
ＢＥＡＴ、Ｆａｂ−ＤＩＭおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭ産生細胞の割合は、選択的スプライシングによる細胞膜上の種の表示に応じた表面染色によって明らかにすることができた。次いで、結果を解析プールの実際の分泌プロファイルと比較した。この目的のために、１５の生産性安定プールの上清を１４日目にプロテインＡにより精製し、各分泌分子を分子量により同定し、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩタンパク質アッセイにより定量した。これらの精製条件下では、Ｆａｂ−ＤＩＭ分子がプロテインＡ結合部位を欠いているので、プロテインＡ結合種のみ、すなわち、ＢＥＡＴおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭ分子が上清から精製されることを注意すべきである。図２０に分泌分子の百分率と表面染色により同定された対応する細胞の割合との間の関係を示す。
【０２７３】
データから、表面表示および分泌プロファイルがＢＥＡＴおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭ分泌の両方について高度に相関（Ｒ２＝０．９）していることがわかる。しかし、関係の性質は、線形性でない。線形回帰の欠如は、この実験で実施した表面染色ではＢＥＡＴとＦａｂ−ＤＩＭとが区別されず、その一方で、精製分泌産物がＦａｂ−ＤＩＭの割合を除くものであるという事実により説明することができる。上清中の分泌ＢＥＡＴおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭの百分率は、わずかに過大評価される可能性がある。それにもかかわらず、実験により、特定の分子の表面表示について陽性の細胞の割合が高いほど、上清中のこの分子の割合が高くなることが明らかに実証された。この例では、供試安定プールが２０％より高い百分率の陽性細胞を含んでいた場合、分泌ＢＥＡＴ分子の割合が直線的に増加した。７５％を超える二重陽性細胞（Ｑ６）を含む安定プールの選択により、９０％を超える所望のＢＥＡＴ分子を産生する分泌細胞集団の選択が可能である。二重陽性表現型を有するクローン集団、例えば、ＬＣおよびＦｃ表面染色の両方について陽性の細胞集団の１００％について、約１００％に近い、より高い割合のＢＥＡＴ分泌を期待することは、妥当である。
【０２７４】
方法の感度を高くし、表面表示と分泌パターンとの間の直線関係を実証すために、可溶性標的を検出試薬として含む異なる検出方法を適用した。この方法ですべての３つの可能な産物がそれらの結合パターンによって明確に同定される。図２１に細胞選別の前に測定したプールの表面プロファイルの例を示す。ドットプロットは、標的１に対するバインダーの細胞表面密度（ｙ軸）対標的２に対するバインダーの細胞表面密度（ｘ軸）を示す。象限は、陰性染色細胞と陽性染色細胞との間の任意限界を確定するものである。Ｑ１は、標的１結合について陽性であるが、標的２結合ついて陰性の細胞の割合であり、したがって、細胞膜上にＦａｂ−ＤＩＭを示す細胞に対応する。Ｑ２における二重陽性細胞は、細胞膜上に標的１および２に対する両バインダーを表示する細胞であり、したがって、膜上にＢＥＴＡを表示する細胞に対応する。Ｑ３は、標的２バインダーのみ、したがって、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭに対応するバインダーを表示する細胞である。象限Ｑ４は、細胞膜上にタンパク質を発現しない細胞、例えば、非産生細胞の亜集団の割合を表す。これらの細胞は抗体の分泌に寄与しなかったので、それらを解析から除外した。
【０２７５】
ｐＨＣ−Ｂ７、ｐＳｃＦｖ−Ｆｃ−Ｂ７およびｐＬＣ構築物によるトランスフェクション後のフローサイトメトリー細胞選別により得られたすべての生産性クローン（２８）をこのアプローチを用いて解析した。前述のように、ＢＥＡＴ、Ｆａｂ−ＤＩＭおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＤＩＭ産生細胞の割合は、選択的スプライシングによる細胞膜上の種の表示に応じた表面染色によって明らかにすることができた。各クローンの実際の分泌プロファイルは、流加培養の１４日目にＣａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩタンパク質アッセイにより上清中で直接測定した。
【０２７６】
図２２に上清中に検出されたＢＥＡＴ分子の割合とそれらの細胞表面上にＢＥＡＴ表現型を表示する細胞の割合（Ｑ２の％）との間の相関を示す。この特異的染色を用いて、良好な線形相関（Ｒ２＝０．８）が得られた。データから、ＢＥＡＴ分子を分泌するクローンの能力は、細胞膜上で検出された産物パターンにより予測することができることが明確に示された。
【０２７７】
結論
この実施例では、細胞膜表示と組み合わせた選択的スプライシング技術は、単一細胞の分泌プロファイルの定性的予測のための有効なリポーターシステムであることが実証された。ＬＣおよびＦｃ表面検出に基づく一般的検出方法または分子の可溶性標的を含む産物特異染色法を用いてトランスフェクト細胞の細胞膜表示パターンと実際の分泌プロファイルとの間の明らかな相関が見いだされた。該アプローチは、回分または流加培養中の細胞の能力の時間のかかるスクリーニングも、分泌産物の収集、精製および広範な特性評価も必要としない。
【０２７８】
結論として、ここで述べたリポーターシステムは、ヘテロ三量体分子の特定の分泌プロファイルを有する細胞クローンの信頼できる高処理スクリーニングツールを提供する。
【０２７９】
分泌プロファイルの定性的予測に加えて、特定の細胞クローンの分泌レベルの定量的予測は、細胞株の開発の目的のために非常に興味深いものである。以下の実施例では、選択的スプライシングアプローチ用いた膜結合、表面表示産物のレベルがクローンの分泌レベルと相関していたかどうかを検討した。
【実施例６】
【０２８０】
表面表示のための選択的スプライシングを用いた分泌レベルの定量的予測
導入
細胞株の開発プロセスの主要な課題は、例えば、良質の組換えタンパク質の高分泌速度を得るための、高能力クローンの時間効果的な選択である。選択的スプライシングによる発現タンパク質の一部の細胞膜表示がクローンの実際の定性的分泌プロファイルを示すことが上で実証された。この実施例では、細胞膜表示のレベルがクローンの分泌レベルと定量的に相関すること、および表面表示の強度に基づいて高生産性細胞を選択することができることを実証すこととする。
【０２８１】
材料および方法
安定細胞株の開発
安定トランスフェクトＣＨＯ細胞は、ヒト化ＩｇＧ１抗体の発現のためのベクターｐＧＬＥＸ４１＿ＨＣ−Ｉ４−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２−Ｍ１Ｍ２（配列番号３６）およびｐＧＬＥＸ４１＿ＬＣ（配列番号２９４）ならびにそれぞれ抗生物質ピューロマイシンおよびジェネティシンに対する耐性を付与するタンパク質の発現のための２つの自社開発ベクターのコトランスフェクションにより作製した。
【０２８２】
懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞に、５０ｍｌバイオリアクター方式でポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて線状化ベクターをトランスフェクトした。この目的のために、対数増殖期細胞を５ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（＃３１９８５−０４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に２  Ｅ６個細胞／ｍＬの密度で播種した。ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体を細胞に３（μｇ／μｇ）の重量比で加えた。２．５μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度を細胞に加えた。振盪しながら（２００ｒｐｍ）３７℃で細胞をＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体とともに５時間インキュベートした後、５ｍＬの培養培地ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（＃ＢＥ１２−７７１Ｑ、Ｌｏｎｚａ）を細胞懸濁液に加えた。次いで、細胞を振盪プラットフォーム上で３７℃、５％ＣＯ２および８０％湿度でインキュベートした。トランスフェクションの１日後に細胞を、４μｇ／ｍＬピューロマイシン（＃Ｐ８８３３−２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）および４００μｇ／ｍＬジェネティシン（＃１１８１１−０９８、Ｇｉｂｃｏ）を含む選択培地中各種濃度（０．７、０．５および０．４  Ｅ５個細胞／ｍＬ）で９６ウエルプレートに播種した。静的条件下での１４日間の選択の後に１５の生産性安定プールをウエルから採取し、発現レベルの評価のためにＴｕｂｅＳｐｉｎバイオリアクター中に拡大した。
【０２８３】
発現レベルの評価
補足バッチを２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、８ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、１５％Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ（＃Ａ１０２３４０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１５％Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＦｅｅｄＢ（＃Ａ１０２４００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＰｏｗｅｒＣＨＯ２（＃ＢＥ１２−７７１Ｑ、Ｌｏｎｚａ）中に０．５Ｅ６個細胞／ｍＬの細胞密度で播種した。生存細胞数（ＶＣＣ）および生存能をＧｕａｖａフローサイトメーターのＶｉａＣｏｕｎｔアッセイを用いて１、３および７日目にモニターした。ＩｇＧ力価をＯｃｔｅｔ  ＱＫ機器を用いて１、３および７日目に測定した。安定プールの比生産性ｑＰを１日目から３日目の間に以下の式により計算した。
【０２８４】
【数１】
2017508459.tif 000025
式中、
ｑＰ＝比分泌速度または生産性［ｐｇ／細胞／日］
ＩｇＧ＝３日目および１日目のＩｇＧ力価「ｐｇ／ｍＬ」
ｔ＝培養時間［日］
ＶＣＣｍｅａｎｄ１−ｄ３＝１日目から３日目までの平均生存細胞数［細胞／ｍＬ］。
【０２８５】
細胞膜上の表示ＩｇＧｓの定量は、以下に述べるように対数増殖期中１日目に実施した。
【０２８６】
細胞の染色
安定プール上のＦｃ断片の染色は、バッチ播種後１日目に実施した。手短かに述べると、合計１  Ｅ５個の細胞を収集し、９６ウエルプレートの丸底ウエルに移した。細胞を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、次いで、１００μＬの検出抗体に再懸濁した。Ｆｃ断片の特異的検出は、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異抗体（＃１２−４９９８−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて実施した。暗所で室温で２０分間インキュベートした後、細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、フローサイトメトリー解析のために２００μＬに再懸濁した。細胞をＧｕａｖａフローサイトメーターを用いて解析した。
【０２８７】
フローサイトメトリー細胞選別
クローンは、前述のように確立した安定形質転換体の不均質なプール（「安定細胞株の開発」の項参照）からフローサイトメトリー細胞選別により得た。この目的のために、Ｆｃ断片の表面染色を前述のプロトコールに従って実施した。選別は、パルスプロセシングにより細胞ダブレットを除外した生存細胞においてゲーティングすることによりＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩを用いて実施した。３つのゲートを表面蛍光強度（「低」、「中」および「高」）に従って定義し、単一細胞を２００μＬのクローニング培地を含む９６ウエルプレートに分配した。静的条件下での２週間の増殖の後、細胞を動的条件下で拡大し、選択されたクローンの能力を前述のように評価した。
【０２８８】
結果
安定プールの表面染色プロファイルの解析を図２３に示す。領域ｇ１（図２３、プロファイルＡ）におけるゲーティングされた生存細胞の表面蛍光をヒストグラム（図２３、プロットＢ）として表示し、分布の平均蛍光（平均［ＲＦＵ］）を計算した。平均蛍光は、細胞膜上に発現したＩｇＧレベルの尺度として用いた。この解析は、すべての得られた安定プールについて実施し、表面ＩｇＧのレベルを上清において測定した分泌ＩｇＧの実際のレベルと比較した。
【０２８９】
図２４に補足バッチの１日目に測定したすべての安定プールの表面蛍光強度と分泌レベルとの間の相関を示す。良好な相関（Ｒ２＞０．８）が表面ＩｇＧ発現と力価との間（図２４、プロットＡ）ならびに表面ＩｇＧ発現と比生産性との間（図２４、プロットＢ）に認められた。データは、選択的にスプライスされた膜貫通ＩｇＧの表面発現が安定トランスフェクト細胞の実際の分泌レベルをレポートしたことを実証している。同様の良好な相関（Ｒ２＞０．８）が１日目のプールの表面蛍光と７日間回分工程における容積生産性との間に認められた（図２５参照；このバッチでは、７日目が静止期の終了に対応する）。データは、回分工程の終了時のプールの能力が、検出された表面ＩｇＧ発現により早期に予測することができたことを示している。回分工程では、細胞の生理的状態は、変化しつつある培地環境によって連続的に変化している。したがって、選択的スプライシングによるリポーターＩｇＧの表面表示と回分工程における実際の分泌レベルとの間の相関は、細胞の生理的状態（対数増殖または静止）および回分工程段階（増殖または生産）と無関係である。
【０２９０】
仮説を検証するために細胞表面上に表示された抗体の密度に従ったフローサイトメトリー細胞選別によりクローンを得た。この目的のために、安定プールを、抗ヒトＦｃ  ＰＥ標識抗体を用いて表面ＩｇＧについて染色した。細胞の表面蛍光に従って３つの領域を定義し（「低」、「中」および「高」）、単一細胞をそれに応じて９６ウエルプレートにクローニングした。ゲーティング戦略は、図２６Ａに示す。約２週間後にクローンを増殖させ、選別された表現型がクローニング後に実際に得られたことを確認するために細胞の表面強度を再び測定した。すべてのクローンの表面強度の分布は、図２６Ｂで確認することができる。３つの異なる選別群の表面ＩｇＧ分布が予測された表現型「低」、「中」および「高」と対応していたので、全体的に選別は成功であった。例えば、おそらく選別の前の染色のアーチファクトのため、高い表面蛍光を示す「低」群におけるいくつかの外れ値が検出された。得られたクローンの能力をその後、補足バッチで評価した。図２６Ｃに各群の比生産性ｑＰの分布を示す。元のプールのｑＰも４連で評価し、図に対照として示す。最良の能力が「高」表面蛍光群内で明確に認められ、ｑＰの中央値は、約１０ｐｇ／細胞／日であった。元のプール（約５ｐｇ／細胞／日）と比較して、生産性は、２〜６倍有意に改善され、最良のクローンは、３０ｐｇ／細胞／日超に達した。対照的に「低」および「中」カテゴリーのクローンは、全般的に低パーフォーマーであり、ｑＰの中央値は、０ｐｇ／細胞／日に近かった。いくつかの外れ値は、＞２０ｐｇ／細胞／日に達したが、これらの表現型は、フローサイトメトリーにより検出されたＩｇＧの高い表面密度も示していた。
【０２９１】
結論
この実施例では、細胞膜上に選択的スプライシングにより発現するＩｇＧのレベルが組換え細胞の実際の分泌レベルをレポートするものであることが実証された。産物の特異的に検出後の細胞膜蛍光は、上清中の蓄積ＩｇＧ濃度およびトランスフェクト安定細胞のｑＰと相関する。また該相関は、回分生産工程の段階にかかわりなく、有効であったことが実証された。総合すると、これらのデータにより、組換え細胞の定量的分泌レベルは、本明細書で述べた選択的スプライシング表面表示リポーターシステムにより予測することができることが示された。これは、フローサイトメトリー細胞選別を用いて細胞表面上に表示されたＩｇＧの密度に従ってクローンを選択することによって確認された。実際、高産生細胞をこのアプローチを用いて選択することができ、産業上適切な比生産性を示すクローンを時間効率的に得ることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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