(57)【要約】  ヒトＥＨＤ２タンパク質の発現及び細胞内局在、特に核での発現状況が、顕著に乳がん患者の生存率に相関することから、乳がんの悪性度の診断及び予後の事前判定の一つの分子マーカーとすることができる。本発明では、ヒトＥＨＤ２抗体及びその乳がん免疫組織化学的検出試薬の製造への応用を提供する。前記抗体は、ヒトＥＨＤ２タンパク質を特異的に認識でき、前記認識部位のアミノ酸配列が５０３−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５４３であることを特徴とする。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＥＨＤ２タンパク質に特異な抗体であって、前記ヒトＥＨＤ２タンパク質を特異的に認識でき、前記認識部位のアミノ酸配列が５０３−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５４３である、ことを特徴とするヒトＥＨＤ２タンパク質に特異な抗体。
【請求項２】
ＧｅｎｅＢａｎｋ国際汎用の配列番号がＮＭ＿０１４６０１である遺伝子ＥＨＤ２及びそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法の診断と予後の事前判定への応用であって、前記遺伝子ＥＨＤ２のコード化タンパク質のＧｅｎｅＢａｎｋ国際汎用の配列番号がＮＰ＿０５５４１６である、ことを特徴とする遺伝子ＥＨＤ２及びそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法の診断と予後の事前判定への応用。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体を採用した、ことを特徴とする請求項２に記載の遺伝子ＥＨＤ２及びそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法的な診断と予後の事前判定への応用。
【請求項４】
遺伝子ＥＨＤ２のＧｅｎｅＢａｎｋ国際汎用の配列番号がＮＭ＿０１４６０１である、ことを特徴とする遺伝子ＥＨＤ２及びそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法診断と予後の事前判定用試薬を製造することへの応用。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体を採用した、ことを特徴とする請求項４に記載の遺伝子ＥＨＤ２及びそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法の診断と予後の事前判定用試薬を製造することへの応用。
【請求項６】
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１である、ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列をコア配列として修飾する、ことを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記修飾は、ポリペプチドのＮ末端に一つのシステイン酸を接続することである、ことを特徴とする請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドの、請求項１に記載の抗体を製造することへの応用。
【請求項１０】
抗体に対して抗原精製を行う、ことを特徴とする請求項９に記載の応用。
【請求項１１】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドの、ＥＨＤ２に特異な抗体を製造することへの応用。
【請求項１２】
抗体に対して抗原精製を行う、ことを特徴とする請求項１１に記載の応用。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体を一次抗体又はコア抗体として採用する、ことを特徴とする乳がん診断と予後の事前判定用の免疫組織化学試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に係る。具体的には、ＥＨＤ２の発現及び細胞内局在が、顕著に乳がん患者の生存率に相関することから、乳がんの悪性度の診断及び予後の事前判定の一つの分子マーカーとすることができる。
【背景技術】
【０００２】
乳がんは、女性でよく見られる悪性腫瘍である。毎年、世界中で百万人の女性が罹患し、１９７０年代末から、中国で乳がんの罹患率は今まで女性の腫瘍の首位を占めている。以前、北アメリカ、北欧が乳がん発生率の高い区域であったが、現在、中国での罹患率は、五年前の十万分の十七から去年の十万分の五十二に増加し、迅速に上昇する傾向にあり、かつ発症年齢もますます低年齢化し、年齢が最も小さいのは十四歳だけである。乳がんを誘発する要因は多方面にあり、遺伝要因以外に、環境要因、精神的要因及び仕事のストレスが高いなどの要因もある。かつ、経済が発達した都市ほど罹患率は農村より高い。現在、世界諸国は、積極的な予防対策をとるように大きな精力と物資を投入して該疾患の発生、進行を研究している。
現在、臨床では、主に組織病理学のレベルに基いて腫瘍組織と腫瘍細胞に対して通常の形態観察を行うことにより腫瘍の悪性度を判別し、癌細胞の分化程度と浸潤の特徴に対して高い認識能力を有し、正確率は５０％〜７５％に達することができる。しかしながら、このような形態学に基づいた解読は、病理学の医師の経験などの人的要因に影響され、他方、患者個体の発症要因に関連するより深いレベルの分子レベルでの証拠が足りないため、判断の正確性と特異性を向上させ、特に個別化治療手段と方案の選択に理論的証拠を提供するために、現代の分子技術と組み合わせる必要がある。
【０００３】
腫瘍の発生は多種の要因に関連するが、最終的な根源として、主に遺伝子の増殖、突然変異、欠失、異所発現などを含む遺伝子レベルの異常な変化に起因するため、細胞の正常な生理学的状態を維持することに必要な複数の機能タンパク質が発現レベルの高低、生化学的活性の強弱、さらに細胞内構造での分布などの面で変化し、このような変化により細胞に無制限増殖能力と移転能力を付与し体内外の保護メカニズムで逆転又は殺滅できないと、腫瘍が発生する。したがって、腫瘍の悪性本質を深刻に認識し効果的に抑制するためにこれらの機能タンパク質分子の変異情况を明確にすることは、免疫組織化学的方法を必要とする。
免疫組織化学技術は、免疫学の抗原抗体反応の基本的な原理を用いて、抗体による体内のタンパク質分子抗原の特異性の認識、及び化学的に（ルシフェリン、酵素、金属イオン、アイソトープなど）標識した二次抗体の発色などの作用により、組織細胞におけるターゲット抗原（ポリペプチドとタンパク質）の発現量とその細胞内局在を検出する。近年、免疫組織化学技術が発展し様々な特異的抗体が成功裏に開発され、さらに腫瘍分子メカニズムへの認識がますます深くなるにつれて、免疫組織化学の腫瘍の診断及び鑑別における応用価値は普遍的に認められた。例えば、エストロゲン受容体ＥＲ、プロゲスチン受容体ＰＲ及び上皮成長因子受容体ファミリーのＨｅｒ２は、既に乳がんの臨床分子病理学的診断に広く応用され、乳がんの病理学的分類と臨床投薬で積極的な指導的役割を果たす。これらの成果は腫瘍の基礎研究の進歩に欠かせず、かつ新たな分子マーカーが開示され臨床で応用され、腫瘍の診断治療レベルをさらに向上させることが期待されている。ＥＨＤ２遺伝子とそのコード化タンパク質は、このような新たな分子マーカーとなる可能性がある。
【０００４】
ＥＨＤ２（Ｅｐｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ（ＥＨ）−ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、ＥＨＤタンパク質の一種であり、新規な膜輸送制御タンパク質であり、高度に保守的なＥＨドメインを含有し、このＥＨドメインは約１００個のアミノ酸残基を含有する断片であり、最初、ＥＧＦＲの酵素基質Ｅｐｓｌ５（Ｅｐｄｅｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｌｏｎｅ１５）から発見された。ＥＨＤ２は、細胞膜内輸送、前後封入体の移行及び制御循環経路を含む細胞膜転送の各制御と、消化分解及び循環再生を含む膜及び膜タンパク質の各調節に関与する。細胞膜輸送メカニズム全体の不可欠な重要な一環であり、様々な細胞活動において物質輸送シグナル伝達の動的バランスを維持することに重要な役割を果たし、その異常はシグナルの応答不当、細胞の機能障害をもたらし、さらに病気を引き起こす可能性がある。
非特許文献１には、乳腺腫瘍でＥＨＤ２の遺伝子発現異常が減少することが開示され、該遺伝子が新たな乳がん抑制遺伝子である可能性があることが示唆されている。しかし、免疫組織化学の更なる研究により、ＥＨＤ２の全体的発現量が減少する傾向にあるが、このような傾向は主に核にあり、逆に、細胞質での発現が上昇する傾向にある。また、ＥＨＤ２の核での発現レベルは患者の生存情况と密接に関連する。したがって、ＥＨＤ２に対して免疫組織化学的検出を行うと、腫瘍の異化の本質と患者個体の臨床予後情况をより客観的で正確に反映することができる。
【０００５】
従来の商業化したＥＨＤ２抗体は十数種あり、主流の抗体試薬メーカーのＳａｎｔａ  ＣｒｕｚとＡｂｅａｍなどによって提供されるが、いずれも基礎研究用試薬であり、これらの抗体が我々の抗体のように合格した特異性を有しかつ免疫組織化学的検出に利用できることを証明した依拠がなく、特に、現在、大量の組織標本の免疫組織化学的検証を経てＥＨＤ２の細胞内局在異常に対する検出により腫瘍の悪性度と患者の生存情况について予後の事前判定を行うという目的を達成できることを示したどんなＥＨＤ２抗体もない。本願の抗体に比べて、それらは以下のような欠点がある。
１、当分野における公知の常識により、免疫組織化学（ＩＨＣ）に利用できる抗体であればその使用説明に明らかに標識し明記するわけであるが、これらの抗体の説明に示したように、多数は免疫組織化学的（ＩＨＣ）検出に利用できない。ごく少数の抗体は于免疫組織化学（ＩＨＣ）に利用できると明示したが、詳細に研究するとそうではない。南京森貝伽公司が代理したＥＨＤ２抗体はその１つであるが、膜局在しか検出できないことを明記した。もう１つはＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社の製品番号１１４４０−１−ＡＰの抗体であるが、この抗体の特異性には、まず、免疫ブロット検出で取得した主なシグナルの位置が明らかに６０ｋＤより小さく、７０ｋＤの正常な位置のシグナルが非常に弱いので、ＥＨＤ２を検出できるが、その他の未知の分子がより多く検出されることを示し、次に、その社が公表した該抗体の肺癌組織に対する免疫組織化学画像から見えるように、染色シグナルが明らかな基質成分の非特異性着色であるという問題が存在している。
２、これらの抗体はいずれも研究用試薬であり、大量サンプルの臨床症例で試験又は検証されず、キーとなるＥＨＤ２に対する核局在検出能力がないので、「ＥＨＤ２の細胞内局在異常に対する検出により腫瘍の悪性度と患者の生存情况について予後の事前判定を行うという目的を達成できる」ことの前提と条件はない。
【０００６】
３、いずれも厳しい免疫ブロット特異性の検証、特にＥＨＤ２タンパク質の相同タンパク質のＥＨＤ１、ＥＨＤ３、ＥＨＤ４との交差反応の免疫ブロット実験検証を行っていないが、それらの間に高い相同性（＞７０％）を有するので、これらの検証はＥＨＤ２の免疫組織化学的検出方法にとって特に重要である。
非特許文献２には、その自製のＥＨＤ２抗体が開示され、この抗体は、我々の抗原精製を行っていない抗体を採用し、免疫ブロット検出に用いることができるが、免疫組織化学的検出の高い特異性の要件を満足できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「ＥＨＤ２による不死化乳房上皮細胞の増殖と転位への干渉影響」王洪玉ら、中国腫瘍臨床、２０１１年第３８卷第１１期
【非特許文献２】「ＥＨＤ２低下調節による乳房上皮細胞形質転換促進の研究」田剛ら、現代医学検験雑誌（中国）、２０１２年第２７巻第１期、４９〜５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
我々は、免疫組織化学研究において、正常上皮細胞の中でＥＨＤ２が主に細胞核に分布するとともに、細胞質と膜の中でも少量発現されることを発見した。しかし、乳癌組織の中で、ＥＨＤ２の局在は異変し、核での分布が顕著に降下し、質と膜での分布が上昇する傾向になる。臨床要因の分析結果によると、ＥＨＤ２の核での分布情况が患者の予後と密接に関連し、核発現が低いほど患者の生存情况が悪いことを表明した。これらの発見は、乳がんの悪性度が癌組織細胞の中のＥＨＤ２タンパク質の発現位置及び発現レベルに異変が発生する度合いと密接に関連することを示し、免疫組織化学技術は、このような発現障害の度合いを検出する唯一の信頼できる手段である。したがって、ＥＨＤ２遺伝子の発現生成物の癌細胞内部での異なる位置、特に核での発現情况を検出する方法を提供することは、従来の技術で解決が必要な課題となる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は以下の技術的手段と方法を提供する。
ヒトＥＨＤ２タンパク質に特異な抗体であって、ヒトＥＨＤ２タンパク質を特異的に認識でき、前記認識部位のアミノ酸配列が５０３−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５４３であることを特徴とする。
遺伝子ＥＨＤ２とそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法的診断と予後の事前判定における応用であって、前記遺伝子ＥＨＤ２のＧｅｎｅＢａｎｋ国際汎用の配列番号がＮＭ＿０１４６０１であり、前記遺伝子ＥＨＤ２のコード化タンパク質のＧｅｎｅＢａｎｋ国際汎用の配列番号がＮＰ＿０５５４１６である。
遺伝子ＥＨＤ２とそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法的な診断と予後の事前判定における応用であって、前記抗体を採用したことを特徴とする。
【００１０】
遺伝子ＥＨＤ２とそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法診断と予後の事前判定用試薬の製造における応用であって、前記遺伝子ＥＨＤ２のＧｅｎｅＢａｎｋ国際汎用の配列番号がＮＭ＿０１４６０１である製造。  
遺伝子ＥＨＤ２とそのコード化タンパク質の、乳がん免疫組織化学法的診断と予後の事前判定用試薬の製造における応用であって、前記抗体を採用したことを特徴とする。
ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であることを特徴とする。
好ましくは、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドのアミノ酸配列をコア配列として修飾し、前記修飾がポリペプチドのＮ末端に一つのシステイン酸を接続することである。
前記ポリペプチドの、前述の抗体の製造における応用である。
前記応用は、好ましくは抗原として動物に免疫させてＥＨＤ２抗体を製造することである。
前記ポリペプチドの、ＥＨＤ２に特異な抗体の製造における応用である。
前記応用は、好ましくは抗体に対して抗原精製を行うことである。
乳がん診断と予後の事前判定用の免疫組織化学試薬であって、ヒトＥＨＤ２タンパク質に特異な前述の抗体を一次抗体又はコア抗体とすることを特徴とする。
【００１１】
本発明の明細書で用いた用語について、
「遺伝子ＥＨＤ２のコード化タンパク質」は、「ＥＨＤ２タンパク質」である。当業者は、明細書で「ＥＨＤ２の発現」に言及すると、「遺伝子ＥＨＤ２とそのコード化タンパク質の発現」を指すと理解すべきである。
「コア配列」は、ヒトＥＨＤ２タンパク質（ｇｅｎｅｂａｎｋタンパク質番号ＮＰ-０５５４１６）の第５０３〜５４３位置のアミノ酸配列であり、該コア配列に対応するポリペプチド断片は、化学合成後又は組換え発現後に修飾されるか又は修飾せずに、ＥＨＤ２に特異な抗体を生成するように免疫に用いることができる。
「修飾」は、上記コア配列に対応するポリペプチド断片に対して化学的方法又はＤＮＡ組換えなどの従来の方法でアミノ酸を追加し、化学基をカップリングし、又は媒質を精製することであり、免疫に用いて抗体を生成するか又は抗体に対して抗原精製を行うことを目的とする。
【００１２】
我々の研究によると、遺伝子ＥＨＤ２の発現生成物が乳房上皮細胞の癌化の場合に発現の分散が障害する傾向にあり、その障害度合い、特に核発現情况が患者の生存情况と密接に関連し、免疫組織化学技術で検出しかつ結果を人的に解読することがこのような遺伝子の細胞内の異なる位置での発現障害度合いを理解する唯一の信頼できる手段であることを発見した。しかし、従来のＥＨＤ２抗体の多くは免疫組織化学的検出に用いることができず、免疫組織化学的検出に用いることができると主張された抗体は、合格した特異性を示した免疫ブロットの証拠がなく、特にＥＨＤ２の相同タンパク質に対する交差反応性を排除できず、実際の応用で、細胞膜の中のＥＨＤ２タンパク質しかに対して反応せず重要な核の中のＥＨＤ２タンパク質を認識できず、或いは、検出したのが間質成分に対する非特異性シグナルに過ぎないことを発見した。
【００１３】
また、従来の抗体は、いずれも組織レベルで大量サンプルの検出と統計的分析を行ってＥＨＤ２の核発現局在を認識する特性を有しかつ予後の事前判定に用いる作用を示していない。我々は、ＥＨＤ２に特異な抗原精製を経た抗体とその免疫組織化学的検出試薬の製造における応用を提供する。本発明に係るＥＨＤ２抗体は、合格した特異性を有し、免疫ブロット方法テストによると、ＥＨＤ２タンパク質を特異的に認識し高度に相同のその他のタンパク質を認識できず、免疫ブロット方法でＥＨＤ２タンパク質に対して定量的検出を行うことができ、免疫組織化学試薬として製造することにより組織細胞の中のＥＨＤ２の発現と局在情况を判断することに直接的に用いることもできる。特に、細胞核の中のＥＨＤ２の発現局在情况を監視することにより、乳がんの診断と予後の事前判定により上手く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】特異的検出の実施例１において取得された免疫ブロット画像である。
【図２】免疫組織化学的検出の実施例１における正常な組織細胞の免疫組織化学画像である。
【図３】免疫組織化学的検出の実施例１における乳癌細胞の免疫組織化学画像である。
【図４】免疫組織化学的検出の実施例１における乳癌細胞の免疫組織化学画像である。
【図５】免疫組織化学的検出の実施例１における乳癌細胞の免疫組織化学画像である。
【図６】免疫組織化学的検出の実施例１における２６０個のサンプルの無増悪生存曲線図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面と実施例を参照しながら本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００１６】
抗体製造の実施例１：ＥＨＤ２に特異な抗体の製造
（１）試料の由来
ニューイングランドウサギは上海強耀生物から購入され、
ポリペプチドＣＤＥＥＦＡＬＡＳＨＬＩＥＡＫＬＥＧＨＧＬＰＡＮＬＰＲＲＬＶＰＰＳＫＲＲＨＫＧＳＡＥ（該ポリペプチドは、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であるポリペプチドをコア配列として修飾して得られ、その修飾方法はＮ末端に一つのシステイン酸を接続することである）は天津賽爾生物技術有限公司にカスタムしかつＫＬＨとカップリングされ、
ＣＮＢｒで活性化したゲルビーズ、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入される。
（２）動物免疫
３匹の４月齢のニューイングランドウサギに対して、１００ｕｇの抗原のポリペプチドを０．２ｍｌの０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解し、同体積の完全フロイントアジュバントと十分に混合し、腹部皮下で多点注射する。第一回免疫後の１５日と２９日に、それぞれ１００ｕｇのポリペプチド／０．２ｍｌのＰＢＳを同体積の不完全フロイントアジュバントと十分に混合した後に免疫を強化する。
【００１７】
（３）ＥＨＤ２抗血清の製造
免疫が終了した１週間後に頸動脈から採血し、３７℃で３時間静置した後に遠心分離して血清を取得する。
（４）抗原ゲルビーズの製造
ＣＮＢｒで活性化したゲルビーズを１ｍＭのＨＣｌに３０分間浸漬し、カップリング緩冲液（０．１ＭのｐＨ８．３のＮａＨＣＯ３と０．５ＭのＮａＣｌを含む）で洗浄し、１ｍｇのポリペプチドあたりに１ｍｌのゲルを添加する割合で反応系を混合し、４度で一晩カップリングし、１Ｍのエタノールアミンで３時間浸漬した後に洗浄液１（５０ｍＭのＴｒｉｓと１ＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０である）と洗浄液２（５０ｍＭのグリシンと１ＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ３．５である）で交代して８回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（５）ＥＨＤ２抗体の精製
血清と上記抗原ゲルビーズを２０：１の体積比で混合し、混合後の系と同体積のＰＢＳを添加し、均一に１時間混合した後に遠心分離し、ＰＢＳでゲルビーズを洗浄し、ｐＨ３のクエン酸ナトリウム溶液でゲルビーズにカップリングされた抗体を溶離し、ｐＨを６．５〜７．５に調節して、精製されたＥＨＤ２抗体を得る。
【００１８】
検出の実施例１：ＥＨＤ２抗体に対して免疫ブロット法で特異的検出を行う。
（１）試料の由来
２９３Ｔ細胞はアメリカのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）社から購入され、ＲＰＭＩ１９４０培養液、ＢＳＡ、ＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体、Ｌｉｐｏ２０００トランスフェクション試薬、ＲＩＰＡ熱分解液、ＢＣＡタンパク質濃度検出試薬、ＥＣＬ化学発光検出試薬などはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、ＥＨＤ１、ＥＨＤ２、ＥＨＤ３及びＥＨＤ４の発現プラスミドは自制である。
（２）細胞培養
２９３Ｔ細胞をＲＰＭＩ１９４０培養液に培養し、３７℃、５％のＣ０２で培養して単層で成長させ、細胞が継代する時にまず培養液を除去し、次にリン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．０５％のトリプシンを添加して２分間消化し、培養基を添加して消化を停止する。細胞は良好な状態を保ち、２日間で１代継代する。トランスフェクションの時にＥＨＤ１、ＥＨＤ２、ＥＨＤ３及びＥＨＤ４を発現するプラスミド及びトランスフェクション試薬をそれぞれ添加し、２日間後に細胞を収集して免疫ブロット実験をする。
【００１９】
（３）免疫ブロット方法
十分の数の様々な細胞を遠心管に残し、遠心分離した後にＲＩＰＡ熱分解液で細胞を熱分解し、サンプルを煮込んで、さらに遠心分離する。サンプルを製造した後、ＢＣＡ検出試薬でタンパク質濃度の測定を行う。
各サンプルからそれぞれ総量８０ｕｇのタンパク質を取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行う。電気泳動が終了した後、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ膜に電気泳動で転写し、室温で５％の牛乳で１時間密封する。洗浄した後、一次抗体（実施例１において製造した抗体に１：２０００でＰＢＳと５％のＢＳＡを添加する）と室温で１時間培養する。次に１：５０００で希釈した抗ウサギ二次抗体と室温で１時間培養する。最後に化学発光検出試薬で検出し、検出結果は図３を参照する。その図から見えるように、本発明に係るＥＨＤ２に特異な抗体は、ＥＨＤ２タンパク質を特異的に認識できるが、相同のその他のＥＨＤタンパク質を認識できない。
【００２０】
（４）結果：
抗ＥＨＤ２抗体はＥＨＤ２タンパク質に対する特異的免疫認識能力を有し、かつその他の相同タンパク質に対して交差反応しない。検出結果は図１を参照し、図面において、サンプルＶｅは空の発現ベクターであり、シグナルがなく、サンプル１はＥＨＤ１タンパク質を過剰発現し、シグナルがなく、サンプル２はＥＨＤ２タンパク質を過剰発現し、分子量７０ｋｄに対応する位置で一本の主なバンドが出現し、シグナルが明瞭であり、かつその他の明らかなバックグラウンドのバンドがなく、サンプル３はＥＨＤ３タンパク質を過剰発現し、シグナルがなく、サンプル４はＥＨＤ４タンパク質を過剰発現し、シグナルがない。以上から、本実施例に係る抗体は、正常な位置７０ｋｄで強烈なシグナルを有し、またその他の位置でいずれもシグナルがなく、その結果、本発明に係る抗体が優れた特異性を有することを示す。
【００２１】
免疫組織化学的検出の実施例１：ＥＨＤ２免疫組織化学的検出
（１）試料の由来：
乳がん切片は天津市腫瘍病院の腫瘍組織サンプルバンクから入手され、通常のようにパラフィンを脱去し、サンプルの数が２６０である。一次抗体希釈液、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した汎用二次抗体、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質及び基質希釈液などは中杉金橋から購入される。
（２）免疫組織化学的検出試薬の配合条件とサンプル組織の中のＥＨＤ２発現及び局在の検出方法
方法の主なステップは、組織切片のパラフィンを脱去して水で浸漬し、抗原を修復し、内在性ペルオキシダーゼをブロッキングし、１：２００で実施例（１）で製造された抗体を一次抗体として滴下し、４℃で一晩培養し、緩冲液で５ｍｉｎ×３回洗浄し、汎用のＨＲＰ酵素標識二次抗体を滴下し、室温で３０分間培養し、緩冲液で５ｍｉｎ×３回洗浄し、ＤＡＢが発色すると、再度染色し、脱水して切片を封止した後に顕微鏡で染色状況を観察することである。
【００２２】
（３）結果：
正常組織の中のＥＨＤ２は、上皮細胞核での発現が陽性であり、質又は膜での発現が弱陽性である。癌組織の中で、ＥＨＤ２発現は障害し、かつ核発現が弱くなる傾向にある。典型的な免疫組織化学画像は図２〜図５を参照し、図２は正常組織の免疫組織化学画像であり、正常細胞ＥＨＤ２の上皮細胞核での発現を示し、図３〜図５は異なる乳がん組織サンプルの免疫組織化学画像であり、図３に示された乳がん組織サンプルの中のＥＨＤ２は、癌細胞の核と質でいずれも発現され、図４に示された乳癌組織サンプルの中のＥＨＤ２は、がん細胞核で発現されず、質で強く発現され、図４に示された乳がん組織サンプルの中のＥＨＤ２は、乳癌細胞での発現が全体的に欠失し、ＥＨＤ２の癌細胞での発現が障害しかつ核発現が減少することを示す。２６０例のサンプルの無増悪生存曲線図は図６を参照し、該図の凡例について、０は核発現陰性であり、１は核発現陽性であり、ｃｅｎｓｏｒｅｄは死亡を示す。横座標は無増悪生存月であり、縦座標は無増悪生存症例パーセントである。
【００２３】
以上の実験結果によると、本発明に係る抗体をコアとした免疫組織化学的検出方法を用いると、乳がん組織細胞の中のＥＨＤ２の発現量と発現位置をより上手く検出し、免疫組織化学画像からＥＨＤ２の癌組織細胞核での局在と発現情况を直接的に解読して乳がんの悪性度と患者生存の見通しを事前に判定できることを表明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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