(57)【要約】  本発明では、抗デスレセプター３（ＤＲ３）アンタゴニストＩｇＧ抗体および該抗体断片が提供され、抗体および該抗体断片は、それらの結合によって、ＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を示すかまたはアゴニスト活性を示さない。それらの抗体または該抗体断片を含む抗体組成物および抗体断片組成物、抗体または該抗体断片をコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列を含むベクター、抗体または該抗体断片のアミノ酸配列、抗体または該抗体断片を産生する方法、並びにその結合によるＤＲ３に対する抗体のアゴニスト能を減少させる方法が提供される。
2017511381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デスレセプター３（ＤＲ３）に結合し、ＴＬ１Ａによって誘導されるＤＲ３の活性化をアンタゴナイズする免疫グロブリンＧ（以下ＩｇＧと称する）抗体または該抗体断片であって、
前記抗体が、前記結合によって、ＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない、
抗体または該抗体断片。
【請求項２】
ＤＲ３のシステインリッチドメイン（以下ＣＲＤと称する）に存在するエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項３】
ＤＲ３のＣＲＤ１またはＣＲＤ４に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項４】
ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ２のヒンジドメインを含むＩｇＧ２抗体バリアント、およびＥＵナンバリングで表される４０９番目のアミノ酸残基がＬｙｓである、ＩｇＧ２とＩｇＧ４との間のドメイン交換抗体から選択される１つである、請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項５】
ＴＬ１Ａリガンドの結合によって誘導されるＤＲ３の活性を中和および／またはアンタゴナイズする、請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項６】
前記アゴニスト活性が、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのリン酸化、ＤＲ３発現細胞からのサイトカインの放出、ＤＲ３発現細胞の増殖、ＤＲ３発現細胞のアポトーシスから選択される少なくとも１つである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項７】
前記抗体が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される少なくとも１つの抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
（ｉ）抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂと競合的にＤＲ３に結合する抗体、
（ｉｉ）抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂによって認識されるエピトープ中に存在するエピトープに結合する抗体および
（ｉｉｉ）抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂによって認識されるエピトープと同一のエピトープに結合する抗体。
【請求項８】
配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７７で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７８で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列、または配列番号２７で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項９】
それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、またはそれぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項１０】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、前記抗体の６つのＣＤＲを含むペプチドおよびＦｃ融合蛋白質から選択される、請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項１１】
前記Ｆｃ融合蛋白質が、Ｆｃ領域に融合したＦａｂまたはｓｃＦｖであり、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される、請求項１０に記載の抗体または該抗体断片。
（ｉ）２つのＦａｂまたはｓｃＦｖがＩｇＧクラスのＦｃ領域に融合した二価抗体、
（ｉｉ）１つのＦａｂまたはｓｃＦｖがＦｃ領域に融合した一価抗体および
（ｉｉｉ）Ｈ鎖とＦｃ領域に融合したＬ鎖（以下ＦＬと称する）とを含む一価抗体、
【請求項１２】
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびそのバリアントから選択される、請求項１１に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項１３】
配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７７で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７８で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列、または配列番号２７で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体または該抗体断片。
【請求項１４】
それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、またはそれぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体または該抗体断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アゴニスト活性が低減された抗デスレセプター３（ＤＲ３）アンタゴニスト抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
デスレセプター３（ＤＲ３）は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５）、リンパ球関連デスレセプター（ＬＡＲＤ）、ＡＰＯ−３、ＴＲＡＭＰおよびＷＳＬ−１として公知である。ＤＲ３は、主にＴ細胞上、並びに内皮細胞、上皮細胞、骨芽細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞および２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２）を含むいくつかの他の細胞上に発現される（非特許文献１）。ＤＲ３の活性化はＴＮＦ様リガンドＴＬ１Ａ（ＴＮＦスーパーファミリー１５、ＴＮＦＳＦ１５）によって介在され、これはリンパ球、形質細胞、樹状細胞、マクロファージおよび単球だけでなく内皮細胞においても発現される（非特許文献２）。ＤＲ３に対するＴＬ１Ａリガンドの結合はＴ細胞の増殖、活性化を誘起し、Ｔ細胞からのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような炎症性サイトカインの分泌を増加させる。ＤＲ３は、インビボのＮＫＴ細胞（非特許文献３）およびＩＬＣ２サイトカインの産生、とりわけＩＬ−１３を制御することも示されている。そのため、導入遺伝子によって介在されるＴＬ１Ａの過剰発現は、マウスにおけるＩＬ−１３依存的な腸の病態を促進する（非特許文献４）。
【０００３】
ＴＬ１ＡおよびＤＲ３の結合は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、喘息および多発性硬化症などの炎症性疾患のようないくつかの炎症性疾患に関連づけられている。
【０００４】
抗ＤＲ３抗体では、Ｗｅｎら（非特許文献５）はＤＲ３に対するアゴニスト活性を有する抗ＤＲ３マウスモノクローナル抗体Ｆ０５を開示しており、ノバス・バイオロジカルズはＥＬＩＳＡに適用可能な抗ＤＲ３マウスモノクローナル抗体１Ｈ２を供給しており（非特許文献６）、Ｙｕら（特許文献１）およびＴｉｔｔｌｅら（特許文献２）はＴ細胞の増殖を阻害する抗ＴＲ３抗体を開示している。他方で、Ｍｉｇｏｎｅら（特許文献３、４）は、マウスモノクローナル抗体１１Ｈ０８がＤＲ３に結合し、ＤＲ３受容体を活性化するということを開示しており、ＤＲ３受容体を介するＴＬ１Ａの活性を阻害し得るモノマー型抗ＤＲ３断片を得るために、１１Ｈ０８の抗ＤＲ３Ｆａｂ断片が作製されている。さらに、Ａｎｄｅｒｓｅｎら（特許文献５）は、ＤＲ３に対するＴＬ１Ａの結合を遮断する、ＤＲ３に対する一価Ｆａｂ断片などのそのアンタゴニスト性のＤＲ３リガンドを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，３５７，９２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，９９４，９７６号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１１／１０６７０７号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１２／００１４９５０号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１２／１１７０６７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Meylan et al, Mucosal Immunol., 2013; doi: 10.1038/mi.2013.1141-11
【非特許文献２】Fang et al, J Exp Med., 2008; 205: 1037-1048
【非特許文献３】Migone at al, Immunity, 2002; 16: 479-492
【非特許文献４】Meylan et al, Mucosal Immunol., 2010; 4; 172-185
【非特許文献５】Wen et al, The Journal of Biological Chemistry, 2003; 278: 39251-39258
【非特許文献６】１Ｈ２マウスモノクローナル抗体カタログ番号Ｈ００００８７１８−Ｍ０８のデータシート
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＤＲ３のアンタゴニズムは炎症性応答を低減することができる。しかしながら、既に公知の二価抗ＤＲ３アンタゴニスト抗体は、全てアゴニスト活性を有することが報告されており、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞によるサイトカインの産生などの有害な炎症性応答を促進することができる。したがって、既に公知の全てのＤＲ３アンタゴニスト抗体は、Ｆａｂの一価フォーマットでのみ抗炎症用途に提案されてきた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＩｇＧ抗体および該抗体断片は一般的には予測可能な組成を見せ、標準化された技法を用いて容易に精製されるので、治療用途のＩｇＧフォーマットまたはＦｃ領域を含む抗体断片の開発または産生は非常に簡易であり、公知の一価フォーマットと比べて相当な利点を提供する。本発明者らは、アゴニスト活性を減少させる／有意なアゴニスト活性を示さない、ＤＲ３に対する強力なアンタゴニスト性のＩｇＧ抗体およびアンタゴニスト性の該抗体断片を発見した。
【０００９】
本発明は次の（１）〜（１４）に関する。
（１）デスレセプター３（ＤＲ３）に結合し、ＴＬ１Ａによって誘導されるＤＲ３の活性化をアンタゴナイズする免疫グロブリンＧ（以下ＩｇＧと称する）抗体または該抗体断片であって、前記抗体は、前記結合によって、ＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない、抗体または該抗体断片。
（２）ＤＲ３のシステインリッチドメイン（以下ＣＲＤと称する）に存在するエピトープに結合する、（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（３）ＤＲ３のＣＲＤ１またはＣＲＤ４に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（４）ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ２のヒンジドメインを含むＩｇＧ２抗体バリアント、およびＥＵナンバリングで表される４０９番目のアミノ酸残基がＬｙｓである、ＩｇＧ２とＩｇＧ４との間のドメイン交換抗体から選択される１つである、（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（５）ＴＬ１Ａリガンドの結合によって誘導されるＤＲ３の活性を中和および／またはアンタゴナイズする、（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（６）アゴニスト活性が、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのリン酸化、ＤＲ３発現細胞からのサイトカインの放出、ＤＲ３発現細胞の増殖、ＤＲ３発現細胞のアポトーシスから選択される少なくとも１つである、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片。
（７）前記抗体が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の抗体または該抗体断片。
（ｉ）抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂと競合的にＤＲ３に結合する抗体、
（ｉｉ）抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂによって認識されるエピトープ中に存在するエピトープに結合する抗体および
（ｉｉｉ）抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂによって認識されるエピトープと同一のエピトープに結合する抗体。
（８）配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７７で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７８で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列、または配列番号２７で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む、（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（９）それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、またはそれぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（１０）前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、抗体の６つのＣＤＲを含むペプチドおよびＦｃ融合蛋白質から選択される、（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（１１）前記Ｆｃ融合蛋白質が、Ｆｃ領域に融合したＦａｂまたはｓｃＦｖであり、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される、（１０）に記載の抗体または該抗体断片。
（ｉ）２つのＦａｂまたはｓｃＦｖがＩｇＧクラスのＦｃ領域に融合した二価抗体、
（ｉｉ）１つのＦａｂまたはｓｃＦｖがＦｃ領域に融合した一価抗体および
（ｉｉｉ）Ｈ鎖とＦｃ領域に融合したＬ鎖（以下ＦＬと称する）とを含む一価抗体。
（１２）前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびそのバリアントから選択される、（１１）に記載の抗体または該抗体断片。
（１３）配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７７で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７８で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列、または配列番号２７で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む、（１０）に記載の抗体または該抗体断片。
（１４）それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列、またはそれぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（１０）に記載の抗体または該抗体断片。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗体および抗体断片は減少したアゴニスト活性を示すかまたはアゴニスト活性を示さないので、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患およびそれらの疾患に関連する症状を治療、予防または軽減するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂの典型的なＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す。センサーグラムの各線は、それぞれ０．３７５〜１２ｎＭの抗ＤＲ３抗体Ｆａｂ断片の各濃度を示す。縦軸はＦａｂ結合（レゾナンスユニット）を示し、横軸はＦａｂ断片注入後の時間を示す。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ抗ＤＲ３抗体のアゴニストおよびアンタゴニスト活性に及ぼすアイソタイプの効果の比較を示す。示されている１４２Ａ２のＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ｖバージョンのＰＢＭＣのＮＦ−κＢ活性化に及ぼす効果を決定した。縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は添加した抗体を示す。ＴＬ１Ａは４０ｎＭの濃度で加え、各抗体は６．６７ｎＭの濃度で加えた。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂのｐ６５リン酸化レベルに関するアゴニズム（図３Ａ）およびアンタゴニズム（図３Ｂ）を示す。図３Ａにおいて、縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。図３Ｂにおいて、縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。ＴＬ１Ａ処理単独後において細胞の５５％がリン酸化ｐ６５陽性であった。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２および１４２Ｓ３８ＢによるＩＬ−１３産生のアゴニズム（図４Ａ）およびアンタゴニズム（図４Ｂ）を示す。図４Ａにおいて、縦軸は正の対照のＴＬ１Ａ−ｆｌａｇによる分泌レベルと比較した分泌ＩＬ−１３濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は抗体濃度（ｎＭ）を示す。図４Ｂにおいて、縦軸は抗体＋ＴＬ１Ａ−ｆｌａｇ（１ｕｇ／ｍＬ）存在下の分泌ＩＬ−１３濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は抗体濃度（ｎＭ）を示す。それぞれ１μｇ／ｍＬのＴＬ１Ａの存在下または非存在下において、ＩＬ−１３産生レベルは１３００ｐｇ／ｍＬおよび７５０ｐｇ／ｍＬであった。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ａ２のｐ６５リン酸化レベルに関するアゴニズム（図５Ａ）およびアンタゴニズム（図５Ｂ）を示す。図５Ａにおいて、縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は抗体濃度（ｎＭ）を示す。図５Ｂにおいて、縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。ＴＬ１Ａ処理単独または培地単独後において、細胞の６９．５％および２．３％がリン酸化ｐ６５陽性であった。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ｓ３８Ｂのｐ６５リン酸化レベルに関するアゴニズム（図６Ａ）およびアンタゴニズム（図６Ｂ）を示す。図６Ａにおいて、縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は抗体濃度（ｎＭ）を示す。図６Ｂにおいて縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。ＴＬ１Ａ処理単独または培地単独後において、細胞の４５％および３％がリン酸化ｐ６５陽性であった。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、抗ＤＲ３抗体ＩｇＧ２、ＩｇＧ４バリアント、ＩｇＧ４２４４バリアントおよびＩｇＧ２４２２バリアントのｐ６５リン酸化レベルに関するアゴニズム（図７Ａ）およびアンタゴニズム（図７Ｂ）を示す。図７Ａにおいて、縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は抗体濃度（ｎＭ）を示す。図７Ｂにおいて、縦軸はＰＢＭＣのｐ６５リン酸化陽性細胞（％）を示し、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。ＴＬ１Ａ処理単独または培地単独後において、細胞の５５％および１．８％がリン酸化ｐ６５陽性であった。
【図８】図８は、抗ＤＲ３モノクローナル抗体Ｆａｂの１４２Ａ２および１４２Ａ２−ＥＱＲによるＩＬ−１３の産生におけるアンタゴニズムを示す。縦軸は抗体＋ＴＬ１Ａ−ｆｌａｇ（１μｇ／ｍＬ）の存在下の分泌ＩＬ−１３濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は抗体濃度（ｎＭ）を示す。全てのサンプルは、プレートに結合した抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ）および可溶性の抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）によって共刺激した。１μｇ／ｍＬのＴＬ１Ａの存在下または非存在下で、ＩＬ−１３の産生レベルはそれぞれ１８４６ｐｇ／ｍＬおよび９７４ｐｇ／ｍＬであった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本明細書において用いられる用語「抗体」としては、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体およびポリクローナル抗体などの任意の抗体が挙げられる。
【００１３】
本明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、同一のアミノ酸配列から構成される、換言すれば一次構造が同じである抗体を言う。さらに、モノクローナル抗体は単一のエピトープ（抗原決定基とも呼ばれる）のみを認識する。
【００１４】
本明細書において用いられる用語「オリゴクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体」とは、２種のモノクローナル抗体よりも多くの複数の抗体を含む抗体組成物を意味する。
【００１５】
本明細書において用いられる用語「抗体」は免疫グロブリン（以下Ｉｇと言う）とも呼ばれ、ヒト抗体はその分子構造の違いに基づいてＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の比較的高い相同性を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４は一般的にＩｇＧと呼ばれる。さらに、本発明の抗体としては、天然の抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む任意の抗体バリアントが挙げられる。本発明の抗体は好ましくはＩｇＧ抗体およびそのバリアント、より好ましくはＩｇＧ２、ＩｇＧ２を起源とする少なくとも１つのドメインを含むＩｇＧ２バリアント、ＩｇＧ２からのヒンジドメインを含むＩｇＧ２バリアント、ＩｇＧ２のヒンジドメインを含むＩｇＧ４抗体バリアントおよびＬｙｓがＥＵナンバリングで表される４０９番目に存在するＩｇＧ２のヒンジドメインを含むＩｇＧ４抗体バリアントである。
【００１６】
本明細書において用いられる用語「天然の抗体」とは、動物に天然に存在する抗体を言い、アロタイプとして定められるいくつかのアミノ酸配列を有する。
【００１７】
抗体分子は、重鎖（以下Ｈ鎖と言う）および軽鎖（以下Ｌ鎖と言う）と呼ばれるポリペプチドからなる。
【００１８】
さらに、Ｈ鎖は、そのＮ末端からＨ鎖可変領域（ＶＨとも言う）およびＨ鎖定常領域（ＣＨとも言う）という領域から構成され、Ｌ鎖は、そのＮ末端からＬ鎖可変領域（ＶＬとも言う）およびＬ鎖定常領域（ＣＬとも言う）という領域から構成される。ＣＨに関しては、α、δ、ε、γおよびμ鎖が各サブクラスとして公知である。ＣＬに関しては、λおよびκが公知である。ＩｇＧ抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖を有し、ＶＨおよびＶＬから構成される２つの抗原結合部位を形成する。したがって、ＩｇＧ抗体は二価抗体である。
【００１９】
ドメインは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能上の構造単位を言う。さらに、本発明のＦｃおよびＦｃ領域は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなるＨ鎖定常領域の部分配列および部分構造を言う。
【００２０】
さらに、ＣＨは、Ｎ末端からＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる。本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックスによるＮ末端からのアミノ酸残基の番号によって同定することができる［Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］。アミノ酸残基の番号はＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに従い、本発明においては、アミノ酸残基の前の番号はポリペプチドの元または親残基を示し、アミノ酸残基の後の番号はポリペプチドの交換または置換されたアミノ酸残基を示す。
【００２１】
具体的には、それぞれ、ＣＨ１はＥＵインデックスで表される１１８〜２１５番目のアミノ酸配列によって同定され、ヒンジはＥＵインデックスで表される２１６〜２３０番目のアミノ酸配列によって同定され、ＣＨ２はＥＵインデックスで表される２３１〜３４０番目のアミノ酸配列によって同定され、ＣＨ３はＥＵインデックスで表される３４１〜４４７番目のアミノ酸配列によって同定される。
【００２２】
本明細書において用いられる用語「組換え抗体」とは、ハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体だけでなく組換えテクノロジーによって産生される組換え抗体をも言う。組換え抗体としては、ヒト抗体定常領域を非ヒト抗体可変領域に結合することによって調製されるキメラ抗体、非ヒト抗体可変領域のＨ鎖およびＬ鎖の相補性決定領域（以下ＣＤＲと略する）をヒト抗体可変領域のフレームワーク領域（以下ＦＲと略する）に移植することによって調製されるヒト化抗体（またはＣＤＲ移植抗体）、並びにヒト抗体産生動物を用いて調製されるヒト抗体などが挙げられる。
【００２３】
本明細書において用いられる用語「キメラ抗体」とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列がヒト抗体の対応するＶＨおよびＶＬに移植された抗体を言う。キメラ抗体は、非ヒト動物に由来するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマからＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得て、ヒトキメラ抗体発現ベクターを構築するように、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用の発現ベクターにそれらを挿入し、その後抗体を発現するように動物細胞に該ベクターを導入することによって産生することができる。
【００２４】
用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列がヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植された抗体を言う。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下ＦＲと言う）と言う。
【００２５】
ヒト化抗体は次の方法で産生することができる。非ヒト抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列とからなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡおよび非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列とからなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築する。ヒト化抗体発現ベクターを構築するように、それらのｃＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用の発現ベクターにそれぞれ挿入する。抗体を発現するように、該ベクターを動物細胞に導入する。
【００２６】
本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」とは、元々は、人体内に天然に存在する抗体を言う。しかしながら、ヒト抗体には、ヒト抗体ファージライブラリー、不死化ヒト末梢血リンパ球のクローニング、または近年の遺伝子工学、細胞工学および発生工学の技術的進歩によって調製されるヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体も含まれる。
【００２７】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するマウス（Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 97, 722-7, 2000）を所望の抗原によって免疫処理することによって得られる。加えて、ヒトＢ細胞からの抗体遺伝子の増幅によって作られたファージディスプレイライブラリーを用いて、所望の結合活性を有するヒト抗体を選別することによって、免疫処理を行うことなしにヒト抗体を得ることができる（Winter G. et al., Annu Rev Immunol. 12: 433-55. 1994）。
【００２８】
その上、ＥＢウイルスを用いてヒトＢ細胞を不死化して、所望の結合活性を有するヒト抗体産生細胞を調製することによって、ヒト抗体を得ることができる（Rosen A. et al., Nature 267, 52-54. 1977）。
【００２９】
人体内に存在する抗体は、例えば次の方法で精製することができる。ヒト末梢血から単離されたリンパ球をＥＢウイルスなどの感染によって不死化した後クローニングを行うことによって抗体を産生するリンパ球を培養することができ、抗体を培養物から精製することができる。
【００３０】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ファージの遺伝子中へのヒトＢ細胞から調製された抗体遺伝子の挿入によって、その表面上にＦａｂおよびｓｃＦｖなどの抗体断片を発現するようにしたファージのライブラリーである。指標として抗原固定化基質に関する結合活性を用いることによって、所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現するファージを該ライブラリーから回収することができる。抗体断片は、遺伝子工学技術によって２つの完全なＨ鎖と２つの完全なＬ鎖とからなるヒト抗体分子にも変換することができる。
【００３１】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、宿主動物の染色体中へのヒト抗体遺伝子の挿入によって得られる動物を言う。具体的には、ヒト抗体遺伝子をマウスＥＳ細胞に導入し、ＥＳ細胞を別のマウスの初期胚に移植して胚を発生させることによってヒト抗体産生トランスジェニック動物を調製することができる。
【００３２】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物からヒト抗体を調製する方法としては、ヒト以外の哺乳動物を用いて実施される通常のハイブリドーマ調製法によって、ヒト抗体産生ハイブリドーマを得て、培養を行うことによってヒト抗体を産生させて培養物中に蓄積させることができる。
【００３３】
具体的には、ハイブリドーマまたは抗体産生細胞によって産生される非ヒト動物抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列が挙げられる。
【００３４】
本発明の抗体のＣＬのアミノ酸配列は、ヒト抗体のアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列の任意のものでよい。ヒト抗体のＣκまたはＣλのアミノ酸配列が好ましい。
【００３５】
本発明の抗体のＣＨは免疫グロブリンに属する任意のものでよい。好ましくは、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）およびγ４（ＩｇＧ４）並びにそれらのバリアントのいずれかはヒトＩｇＧクラスに属し、より好ましくはγ２（ＩｇＧ２）およびそのバリアントを用いることができる。
【００３６】
本明細書において用いられる用語「抗体断片」とは、特異的な抗原ＤＲ３に結合し得る任意の抗体断片を言う。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、複数のＣＤＲを含むペプチドおよび抗体の６つのＣＤＲを含むペプチド、さらに、Ｆｃ領域に融合したＦａｂ（Cater et al, Nature Med., 2006; 6; 343-357）、Ｆｃ領域に融合したｓｃＦｖ（Carter et al, Nature Med., 2006; 6; 343-357）、１つのＦａｂがＦｃ領域に融合した一価抗体、抗体のＨ鎖とＦｃ領域に融合したＬ鎖（以下ＦＬ融合ポリペプチドと称する）とからなる一価抗体（米国特許出願公開第２００７／０１０５１９９号明細書）などの任意のＦｃ融合蛋白質などが挙げられる（Labrjin et al, Curr. Opin in Immunol., 2008; 20; 479-485）。
【００３７】
Ｆａｂは、プロテアーゼのパパインによってＩｇＧ抗体を処理することによって得られる断片（Ｈ鎖のアミノ酸残基の２２４番目で切断）のうち、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）によって互いに結合したＮ末端の約半分のＨ鎖および完全Ｌ鎖、約５００００の分子量、並びに抗原結合活性を有する抗体断片を言う。
【００３８】
Ｆ（ａｂ’）２は、プロテアーゼのペプシンによってＩｇＧ抗体を処理することによって得られる断片（Ｈ鎖のアミノ酸残基の２３４番目で切断）のうち、ヒンジ領域のＳ−Ｓ結合によって互いに結合したＦａｂよりもやや長く、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を言う。
【００３９】
Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断することによって得られる抗体断片であり、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する。
【００４０】
ｓｃＦｖは抗原結合活性を有する抗体断片であり、４つのＧｌｙ残基および１つのＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）の任意の個数を連結することによって調製されたリンカーペプチドなどの適切なペプチドリンカー（Ｐ）を用いることによって、１つのＶＨを１つのＶＬに連結することによって得られるＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドである。
【００４１】
ダイアボディは、同じかまたは異なる抗原結合特異性を示すｓｃＦｖ同士から作られる二量体としての抗体断片であり、該抗体断片は同じ抗原に対する二価抗原結合活性を有するか、または異なる種類の抗原に対する２種類の特異的な抗原結合活性を有する。
【００４２】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬのそれぞれの１アミノ酸残基がシステイン（cystine）残基によって置換され、ポリペプチド同士がそれらのシステイン残基間のＳ−Ｓ結合によって連結されたものである。
【００４３】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１つ以上の領域から構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドでは、ＣＤＲは、直接的にまたは適切なペプチドリンカーを介して互いに結合することができる。
【００４４】
ＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、それらのＤＮＡを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを発現用の原核生物または真核生物内に導入することによって調製することができる。ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても調製することができる。
【００４５】
Ｆａｂ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（Ｆａｂ）２−Ｆｃ、１つのＦａｂがＦｃ領域に融合した一価抗体および抗体のＨ鎖とＦＬ融合ポリペプチドとからなる一価抗体などのＦｃ融合蛋白質は、抗体由来の必要な断片とＦｃ領域を融合させたアミノ酸配列を調製し、Ｆｃ融合蛋白質をコードするｃＤＮＡを発現ベクター中に構築し、Ｆｃ融合蛋白質を適切な宿主細胞内で発現させることによって産生させることができる。
【００４６】
本明細書において用いられる用語「バリアント」とは、ＤＲ３ポリペプチド、そのＤＲ３ポリペプチド断片、抗体、または該抗体断片と類似のまたは同一の活性を保持するが、親抗体または該抗体断片（または、元の抗体もしくは該抗体断片）と比較して類似のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを言う。類似のアミノ酸配列を有する抗体バリアントは、抗ＤＲ３抗体または該抗体断片のＶＨもしくはＶＬなどの可変領域またはＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。さらに、本発明のバリアントとしては、抗体の定常領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む任意のバリアントが挙げられる。抗体バリアントは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどの抗体の定常領域の各ドメインの任意のドメイン交換（またはドメインスワッピング）抗体をも含み、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むかまたは含まない。より好ましくは、抗体バリアントは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２を起源とする少なくとも１つのドメインを含むＩｇＧ２バリアント、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体を起源とするドメインを含むＩｇＧ２バリアント、ＩｇＧ２からのヒンジドメインとＩｇＧ４からのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含むＩｇＧ２バリアント、並びにＩｇＧ２からのヒンジドメインとＩｇＧ４からのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含み、ＣＨ３ドメイン内のＥＵナンバリングで表される４０９番目のアミノ酸残基がＬｙｓであるＩｇＧ２バリアントを含む。
【００４７】
本明細書において用いられる用語「エピトープ」とは、抗体が認識および／または結合する抗原の表面に局在した任意のアミノ酸配列および任意の三次元構造を言う。例えば、モノクローナル抗体が認識および結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列の立体配座、糖鎖、アミノ基、カルボキシル基、リン酸または硫酸などの修飾残基が結合したアミノ酸配列、並びに修飾残基が結合したアミノ酸配列の立体配座が挙げられる。立体配座は、蛋白質の天然に存在する三次元構造であり、細胞内または細胞の細胞膜上に発現される蛋白質の立体配座を言う。
【００４８】
本発明のエピトープは、ＤＲ３ポリペプチドの連続したアミノ酸配列から構成される直鎖エピトープ、不連続なアミノ酸配列または立体配座構造であってもよい。一実施形態において、本発明のエピトープは、ＤＲ３ポリペプチドの細胞外領域に存在する１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープである。他の実施形態において、エピトープは、ＴＬ１Ａリガンドに結合したＤＲ３の分子表面に存在するエピトープである。
【００４９】
本明細書において用いられる用語「デスレセプター３」、「ＤＲ３」、「ＤＲ３ペプチド」、「ＤＲ３蛋白質」または「ＤＲ３ポリペプチド」とは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｕｎｉｐｌｏｔ番号Ｑ９３０３８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２またはＵｎｉｐｌｏｔ番号Ｑ９３０３８で示されるアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基（単数または複数）が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を含み、ＤＲ３の活性を有するポリペプチド、配列番号３またはＵｎｉｐｌｏｔ番号Ｑ９３０３８によって表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ＤＲ３の活性を有するポリペプチドおよびＳＮＰｓバリアントを含む関連ポリペプチドなどを言う。関連ポリペプチドは、ＳＮＰバリアント、スプライシングバリアント、断片、置換、欠失および挿入を含み、好ましくは、ＤＲ３の活性／機能を保持する。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５）、リンパ球関連デスレセプター（ＬＡＲＤ）、ＡＰＯ−３、ＴＲＡＭＰおよびＷＳＬ−１もＤＲ３の同義語として公知であり、これらは必然的にＤＲ３と同じである。
【００５０】
さらに、配列番号３またはＮＭ＿００３７９０．２で示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。ＤＲ３をコードする遺伝子として、本発明のＤＲ３をコードする遺伝子には、配列番号３またはＮＭ＿００３７９０．２で示されるヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの欠失（単数または複数）、置換（単数または複数）または付加（単数または複数）を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含有し、且つＤＲ３の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号３またはＮＭ＿００３７９０．２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも６０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、より高い相同性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含有し、且つＤＲ３の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、ストリンジェントな条件下で配列番号３またはＮＭ＿００３７９０．２で示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡからなり、且つＤＲ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する遺伝子なども含まれる。
【００５１】
配列番号４またはＵｎｉｐｌｏｔ番号Ｑ９３０３８で示されるアミノ酸に１つ以上のアミノ酸残基（単数または複数）が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)またはProc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などによって、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することによって得られる。欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の個数は特に限定されず、個数は好ましくは１〜２０などの１〜多数、より好ましくは１〜５などの１〜数個である。
【００５２】
本明細書において用いられる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡ」とは、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイなどによって、配列番号３またはＮＭ＿００３７９０．２で示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡをプローブとして用いて得られるＤＮＡを言う。かかるＤＮＡの具体例としてはハイブリダイゼーションしたコロニーまたはプラーク由来のＤＮＡが挙げられる。該ＤＮＡは、ＰＣＲ産物またはオリゴＤＮＡが固定化されたフィルターまたはスライドガラスを用いて０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムの存在下で６５℃においてハイブリダイゼーションを行い、その後フィルターまたはスライドガラスを６５℃にて０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣ溶液：１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム）によって洗浄することによって同定することができる。ハイブリダイゼーションは、方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)］などによって実施することができる。ハイブリダイゼーション可能なＤＮＡとしては、具体的には、配列番号３またはＮＭ＿００３７９０．２で示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００５３】
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列では、遺伝子多型が多くの場合に認識される。本発明に用いられるＤＲ３遺伝子には、本発明に用いられる遺伝子について該多型による小さな改変をヌクレオチド配列中に生じさせた遺伝子も含まれる。
【００５４】
本発明における相同性は、別段の指定がない限り、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いることによって計算される数であってもよい。ヌクレオチド配列に関しては、相同性は、デフォルトのパラメータによるＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］などを用いることによって計算することができる。アミノ酸配列に関しては、相同性は、ＢＬＡＳＴ２（Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997)、デフォルトのパラメータによるGenome Res., 7, 649 (1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html）などを用いることによって計算することができる。
【００５５】
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（オープンギャップコスト）はヌクレオチド配列では５、アミノ酸配列では１１であり、−Ｅ（エクステンドギャップコスト）はヌクレオチド配列では２、アミノ酸配列では１であり、−ｑ（ヌクレオチドミスマッチのペナルティー）は−３であり、−ｒ（ヌクレオチドマッチのリワード）は１であり、−ｅ（期待値）は１０であり、−Ｗ（語長）はヌクレオチド配列では１１残基、アミノ酸配列では３残基であり、−ｙ［ｂｉｔによるｂｌａｓｔ伸長のドロップオフ（Ｘ）］はｂｌａｓｔｎでは２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７であり、−Ｘ（ｂｉｔによるギャップ付きアラインメントのＸドロップオフ値）は１５であり、−Ｚ（ｂｉｔによるギャップ付きアラインメントの最終Ｘドロップオフ値）はｂｌａｓｔｎでは５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html）。
【００５６】
配列番号４またはＵｎｉｐｌｏｔ番号Ｑ９３０３８で示されるアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公知の方法によって調製することができる。例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、ＤＮＡを含有する発現ベクターが導入された形質転換体を培養することによって調製することができる。また、上記の方法を用いることによって調製されたポリペプチドまたはＤＮＡに基づき、配列番号４またはＵｎｉｐｌｏｔ番号Ｑ９３０３８で示されるアミノ酸配列の部分配列に１つ以上のアミノ酸（単数または複数）が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチドは、上記と同じ方法で調製することができる。加えて、配列番号４もしくはＵｎｉｐｌｏｔ番号Ｑ９３０３８で示されるアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチド、または配列番号４もしくはＵｎｉｐｌｏｔ番号Ｑ９３０３８で示されるアミノ酸配列の部分配列に、１つ以上のアミノ酸（単数または複数）が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチドは、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法またはｔブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって調製することができる。
【００５７】
本発明において、ＤＲ３の細胞外領域としては、例えば、従来公知の膜貫通領域推測プログラムＳＯＳＵＩ（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/SOSUI/SOSUI_submit.）、ＴＭＨＭＭｖｅｒ．２（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）、ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバー（http://Ca.expasy.org/）などを用いることによって、配列番号３で示されるポリペプチドのアミノ酸配列から予測される領域が挙げられる。
【００５８】
本発明におけるＤＲ３の細胞外領域としては、例えば、細胞外ドメイン内の２５〜２０１番目に対応する領域が挙げられる。ＤＲ３は、細胞外ドメイン内にＣＲＤ１〜ＣＲＤ４という４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含み、膜貫通ドメイン、トポロジカルドメインおよび細胞内ドメイン内のデスドメインが続く。各ＣＲＤは、一般的に、３つのジスルフィド結合をドメインの境界面に形成する６つのシステイン残基を含有する。
【００５９】
ＤＲ３の活性／機能は、ＴＬ１Ａリガンドの従事によってＤＲ３がＴ細胞の活性化および増殖を誘導することを言う。ＤＲ３の活性化は、ＮＦ−κＢリン酸化によって、インターロイキン（ＩＬ）−１３、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γを含むサイトカインのＴ細胞からの放出をも誘導する。さらに、ＤＲ３の活性化はいくつかの細胞型のアポトーシスを呈する。
【００６０】
ＤＲ３に対する用語「アゴニズム」、「アゴニスト活性」、「アゴニスト能」または「アゴニスト機能」とは、結合したリガンドまたは抗体によってＤＲ３を活性化または刺激することを言う。そのため、これらの結合因子は、ＮＦ−κＢリン酸化、Ｔ細胞の活性化および増殖、ＤＲ３陽性細胞のアポトーシス、並びにインターロイキン（ＩＬ）−１３、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインのＴ細胞からの放出を誘導することができる。
【００６１】
ＤＲ３に対する用語「アンタゴニズム」、「アンタゴニスト活性」、「アンタゴニスト能」または「アンタゴニスト機能」とは、結合したＴＬ１Ａリガンドによって引き起こされるＤＲ３の活性を阻害するかまたは妨げることを言う。そのため、この特性を有するアンタゴニストは、結合したＴＬ１Ａリガンドによって引き起こされるＤＲ３およびＮＦ−κＢのリン酸化、Ｔ細胞の活性化、増殖、浸潤、ＤＲ３陽性細胞のアポトーシス、並びにインターロイキン（ＩＬ）−１３、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインのＴ細胞からの放出を阻害することができる。
【００６２】
本発明の用語「ＤＲ３の減少した、低下した、低減された／欠失した、無効化したアゴニスト活性、アゴニスト活性を有さない」とは、本発明の抗体が、それら自体の結合によって誘導される最小限のアゴニズムを示すこと、本発明の抗体がそれら自体の結合によってＤＲ３を本質的に活性化、刺激、もしくはアゴナイズしないこと、または本発明の抗体がそれら自体の結合によってＤＲ３を活性化、刺激、もしくはアゴナイズしないことを言う。本発明の特定の一実施形態においては、抗体が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＮＦ−κＢおよび／またはＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのリン酸化を本質的に誘導せず、抗体がＤＲ３発現細胞またはＰＢＭＣにおけるサイトカインの放出を本質的に誘導せず、ならびに抗体がＴ細胞の増殖を本質的に誘導しないことを言う。特定の好ましい一実施形態においては、抗体が、ＰＢＭＣの全細胞と比較して２０％以下、好ましくは１０％以下の細胞のＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのリン酸化を誘導することを言う。
【００６３】
抗デスレセプター３（ＤＲ３）抗体
本発明は、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない抗ＤＲ３アンタゴニストＩｇＧ抗体およびそのバリアント、該抗体を産生するための方法、該抗体のアミノ酸配列、該抗体をコードするヌクレオチド配列、該抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、アンタゴニストＩｇＧ抗体のアゴニスト活性を減少させる方法、並びに該抗体の投与を含む疾患を治療する方法を提供する。また、本発明は、前記抗体に由来する抗体断片、該抗体断片を産生するための方法、該抗体断片のアミノ酸配列、該抗体断片をコードするヌクレオチド配列、該抗体断片をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、アンタゴニストＩｇＧ抗体断片のアゴニスト活性を減少させる方法および該抗体断片の投与を含む疾患を治療する方法を提供する。
【００６４】
本発明の抗ＤＲ３抗体は、ＤＲ３ポリペプチドの細胞外領域に結合し、ＤＲ３ポリペプチドの活性を遮断／中和し、Ｔ細胞の増殖を阻害することができる。その理由としては、抗体それ自体はＤＲ３をほとんど活性化しないかまたはＤＲ３を活性化しないからである。そのため、本発明の抗体はそれ自体の結合によってＤＲ３をほとんど活性化しないかまたはＤＲ３を活性化しない。換言すると、本発明の抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有する／アゴニスト活性を有さない。一実施形態において、本発明の抗体としては、ＤＲ３の中和／遮断活性を有し、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない抗体、ＤＲ３の細胞外領域に結合することができ、ＤＲ３の活性を中和し、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない抗体が挙げられる。ＤＲ３の細胞外領域はポリペプチドのＮ末端から４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に分けられ、ＣＲＤ１ドメインを含むＮ末端領域はプレリガンド集合ドメイン（「ＰＬＡＤ」として公知）として公知であり、ＰＬＡＤドメインは３つのＤＲ３モノマーからなる三量体を形成するための役割を果たす。そのため、本発明の抗ＤＲ３抗体は、ＤＲ３の少なくとも１つのモノマー、ＤＲ３の複数のモノマーおよび／または三量体のＤＲ３（三量体）に結合する。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、ＤＲ３の細胞外領域に含まれる少なくとも１つのエピトープに結合し、ＤＲ３が三量体を形成するのを阻害し、ＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和する抗体を提供し、該抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を示す／アゴニスト活性を示さない。一実施形態において、本発明は、ＤＲ３の細胞外領域に含まれる少なくとも１つのエピトープに結合し、ＤＲ３に結合するＴＬ１Ａを遮断し、ＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和する抗体を提供し、該抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有する／アゴニスト活性を有さない。本発明の好ましい実施形態において、抗体は、ＰＬＡＤドメイン、ＣＲＤ１ドメイン、ＣＲＤ２ドメイン、ＣＲＤ３ドメイン、ＣＲＤ４ドメイン、またはＣＲＤ３およびＣＲＤ４のインタードメインに結合し、ＤＲ３が三量体を形成するのを阻害し、ＴＬ１Ａ結合によるＤＲ３の活性化を中和し、該抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を示す／アゴニスト活性を示さない。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態において、抗体または該抗体断片は、ＰＬＡＤドメイン、ＣＲＤ１ドメイン、ＣＲＤ２ドメイン、ＣＲＤ３ドメイン、ＣＲＤ４ドメイン、並びにＣＲＤ３およびＣＲＤ４のインタードメインから選択される少なくとも１つのドメインに存在するアミノ酸残基を含むエピトープに結合し、ＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和し、該抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有する／アゴニスト活性を有さない。抗体は、ＰＬＡＤドメイン、ＣＲＤ１ドメイン、ＣＲＤ２ドメイン、ＣＲＤ３ドメイン、ＣＲＤ４ドメイン、並びにＣＲＤ３およびＣＲＤ４のインタードメインから選択される少なくとも１つのドメインに存在するエピトープに結合し、ＤＲ３が三量体を形成するのを阻害し、ＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和し、該抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有する／アゴニスト活性を有さない。
【００６７】
本発明の他の実施形態において、抗体は、ＴＬ１Ａが結合するＤＲ３の表面またはＤＲ３の三量体化に関与するＤＲ３の表面に結合し、ＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和し、該抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を示す／アゴニスト活性を示さない。１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体または該抗体断片は、ＰＬＡＤドメインまたはＣＲＤ１ドメインに結合し、ＴＬ１Ａの結合を遮断し、ＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和する抗体であって、該抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有する／アゴニスト活性を有さない。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体はＣＲＤ４ドメインに結合し、ＴＬ１Ａの結合を遮断し、ＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和する抗体であって、該抗体はＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有する／アゴニスト活性を有さない。
【００６８】
より好ましい実施形態において、本発明の抗体または該抗体断片は、ＣＲＤ１ドメイン内に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープ、配列番号４で示される４７〜７１番目のアミノ酸配列、または配列番号４で示される１１７〜１２３番目および１４０〜１７０番目のアミノ酸配列中に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合し、該抗体はＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和し、ＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を示すかまたはアゴニスト活性を示さない抗体が挙げられる。さらに、本発明の抗体または該抗体断片としては、上記の別の特定の抗体と競合的にＤＲ３に結合する抗体、上記の別の特定の抗体によって認識されるエピトープに含まれるエピトープに結合する抗体および上記の別の特定の抗体が結合するエピトープと同一のエピトープに結合する抗体が挙げられる。
【００６９】
本発明の好ましい一実施形態において、抗体または該抗体断片はＤＲ３の活性を中和し、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さず、該抗体は、ＩｇＧ２クラスおよびそのバリアントに由来するＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジドメインのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。ＩｇＧ２サブクラスに由来するＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジドメインのアミノ酸配列の一部が含まれる抗体が、ＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない限り、本発明のＩｇＧ２サブクラスに由来するＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジドメインのアミノ酸配列の一部は、それらの領域の任意の部分を含むことができる。アミノ酸配列の一部は、連続した配列、点在するまたは不連続な配列などの任意のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジドメインが本発明のＩｇＧ２に由来する抗体は、抗体がＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性を中和し得る場合であっても、ＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない。そのため、ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジドメインが本発明のＩｇＧ２に由来する抗体は、ＤＲ３の活性を特異的にアンタゴナイズ、遮断または中和し、ＤＲ３に対する減少または欠失したアゴニズムを有する。
【００７０】
本発明の好ましい一実施形態において、抗体または該抗体断片はＤＲ３の活性を中和し、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さず、抗体はＩｇＧ２  クラスおよびそのバリアントである。本発明のＩｇＧ２クラス抗体は、抗体がＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性を中和し得る場合であっても、ＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない。そのため、全ての公知ＩｇＧ抗体はＤＲ３の活性を中和し、それ自体の結合によるアゴニスト活性を有するが、本発明の抗体は、ＤＲ３の活性を特異的にアンタゴナイズ、遮断または中和し、ＤＲ３に対する減少または欠失したアゴニズムを有する。すなわち、本発明の抗体のアゴニズムは減少しているかまたは無効化されているので、該抗体は純粋にまたは専らＤＲ３に対するアンタゴニズムを有する。このような抗体の特性は、抗ＤＲ３抗体を投与することによってＤＲ３関連疾患に罹患した患者を治療するための大きなメリットを有する。なぜなら、有害事象または低下した治療効果は抗体のアゴニズムによって引き起こされると考えられるからである。別の実施形態において、本発明の抗体としては、全て天然に存在するヒトＩｇＧ２のＧ２（ｎ＋またはｎ−）およびＧ２ｍ（２３）などの任意のＧｍアロタイプが挙げられる（Hougs et al, Immunogenetics, 2001: 52, 242-248、Brusco et al, Imunogenetics, 1995; 42: 414-417）。
【００７１】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体または該抗体断片はＤＲ３の活性を中和し、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さず、該抗体は抗体のＦｃ領域内の２３４、２３５、２３７、２５０、３００、３０９、３３９、３３１および４２８番目から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＩｇＧ２バリアントである。より好ましい実施形態において、抗体はＤＲ３の活性を中和し、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さず、該抗体は、１）ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＶ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、Ｖ３０９Ｌ、Ｔ３３９Ａ、Ｐ３３１ＳおよびＭ４２８Ｌから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体、２）ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＴ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌのアミノ酸置換を含む抗体、３）ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＶ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＰ３３１Ｓのアミノ酸置換を含む抗体、４）ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＦ３００Ｙ、Ｖ３０９ＬおよびＴ３３９Ａのアミノ酸置換を含む抗体、並びに５）ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＶ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、Ｖ３０９Ｌ、Ｔ３３９Ａ、Ｐ３３１ＳおよびＭ４２８Ｌのアミノ酸置換を含む抗体などから選択される。
【００７２】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＩｇＧ２クラス抗体のヒンジドメインを含む抗体または該抗体断片、ＩｇＧ２クラス抗体のヒンジドメインとＩｇＧ４抗体のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含む抗体または該抗体断片、およびＣＨ３ドメイン内のＥＵナンバリングで表される４０９番目のアミノ酸残基がＬｙｓである、ＩｇＧ２クラス抗体のヒンジドメインとＩｇＧ４抗体のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含む抗体または該抗体断片が挙げられる。
【００７３】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体または該抗体断片は、ＩｇＧ２のヒンジドメインを含むＩｇＧ４抗体バリアントおよびＬｙｓがＥＵナンバリングで表される４０９番目に存在する、ＩｇＧ２のヒンジドメインを含むＩｇＧ４抗体バリアントを含む。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明の抗体としては、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２、１４２Ｓ３８Ｂおよびそれらの抗体バリアント、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、それぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、それぞれ配列番号１６、１７、８０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７７で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７８で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号７６で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号２７で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。
【００７５】
他の実施形態において、本発明の抗体としては、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号２１で示されるＶＬ、配列番号７６で示されるＶＨおよび配列番号２１で示されるＶＬ、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７７で示されるＶＬ、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７８で示されるＶＬ、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７９で示されるＶＬ、配列番号７６で示されるＶＨおよび配列番号７９で示されるＶＬ、または配列番号２７で示されるＶＨおよび配列番号３３で示されるＶＬの各アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する抗体、並びに、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、または配列番号２８〜３０のＣＤＲで示されるＶＨおよび配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲの各アミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するＩｇＧ２抗体が挙げられる。その上、本発明の抗体には、任意の種類のスクリーニング方法から得られる任意の親和性の成熟した抗体クローンも含まれる。
【００７６】
他の実施形態において、本発明の抗体としては、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２、１４２Ｓ３８Ｂ、またはそれらの抗体バリアントによって認識されるエピトープに結合する抗体、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、それぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号７６で示されるＶＨおよび配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７７で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７８で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号７６で示されるＶＨおよび配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、または配列番号２７で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。さらに、本発明の抗体としては、上記の別の特定の抗体と競合的にＤＲ３に結合する抗体が挙げられる。
【００７７】
さらに特定の実施形態において、本発明の抗体としては、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２、１４２Ｓ３８ＢおよびＩｇＧ２サブクラスに改変されたそれらの抗体バリアント、ＩｇＧ２のヒンジドメインを含むＩｇＧ２バリアント、ＩｇＧ２のヒンジドメインとＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含むＩｇＧ２バリアント、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＩｇＧ２抗体、それぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列を含むＩｇＧ２抗体、配列番号２７で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列を含むＩｇＧ２抗体が挙げられる。他の実施形態において、本発明の抗体としては、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号２１で示されるＶＬもしくは配列番号２７で示されるＶＨおよび配列番号３３で示されるＶＬの各アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するＩｇＧ２抗体、並びに配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲまたは配列番号２８〜３０のＣＤＲで示されるＶＨおよび配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲの各アミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するＩｇＧ２抗体が挙げられる。その上、本発明の抗体には、任意の種類のスクリーニング方法から得られる任意の親和性の成熟した抗体クローンも含まれる。例えば、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号７６で示されるＶＨおよび配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７７で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７８で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、配列番号１５で示されるＶＨおよび配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体、並びに配列番号７６で示されるＶＨおよび配列番号７９で示されるＶＬのアミノ酸配列を含む抗体は本発明に含まれる。
【００７８】
他の実施形態において、本発明の抗体としては、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２、１４２Ｓ３８Ｂによって認識されるエピトープに結合するＩｇＧ２抗体およびＩｇＧ２バリアント、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＩｇＧ２抗体、それぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＩｇＧ２抗体、配列番号１５で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列を含むＩｇＧ２抗体、または配列番号２７で示されるＶＨのアミノ酸配列および配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列を含むＩｇＧ２抗体が挙げられる。さらに、本発明の抗体には、上記の別の特定の抗体と競合的にＤＲ３に結合するＩｇＧ２抗体も含まれる。
【００７９】
一実施形態において、本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、複数のＣＤＲを含むペプチド、抗体の６つのＣＤＲを含むペプチド、並びに１つのＦａｂがＦｃ領域に融合した一価抗体（Ｆａｂ−Ｆｃ）、２つのＦａｂがＦｃ領域に融合した二価抗体［（Ｆａｂ）２−Ｆｃ］、１つのｓｃＦｖがＦｃ領域に融合した一価抗体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）、２つのｓｃＦｖがＦｃ領域に融合した二価抗体［（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ］および抗体のＨ鎖とＦｃ領域に融合したＬ鎖（以下「ＦＬ」と称する）とからなる一価抗体などのＦｃ融合蛋白質などが挙げられる。本発明の抗体断片は、ＴＬ１Ａによって誘導されるＤＲ３の活性をアンタゴナイズすることができ、抗体断片は減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない。
【００８０】
本発明の１つの好ましい実施形態において、抗体断片としては、ＦａｂまたはｓｃＦｖなどのＶＨおよびＶＬからなる１つまたは２つの抗原結合ドメインを有する一価抗体および二価抗体が挙げられる。本発明の１つのより好ましい実施形態において、一価抗体としては、１つのＦａｂがＦｃ領域に融合した一価抗体（Ｆａｂ−Ｆｃ）、１つのＨ鎖、１つの軽鎖および１つのＦｃ領域からなる一価抗体、１つのｓｃＦｖがＦｃ領域に融合した一価抗体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）、１つのｓｃＦｖ−Ｆｃと１つのＦｃ領域とからなる一価抗体、抗体のＨ鎖とＦＬ融合ポリペプチドとからなる一価抗体が挙げられ、一価抗体はＴＬ１Ａによって誘導されるＤＲ３の活性をアンタゴナイズすることができ、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない。
【００８１】
本発明の別のより好ましい実施形態において、抗体断片は、２つのＦａｂがＩｇＧ２−Ｆｃ領域に融合した二価抗体［（Ｆａｂ）２−ＩｇＧ２Ｆｃ］、２つのｓｃＦｖがＩｇＧ２Ｆｃ領域に融合した二価抗体［（ｓｃＦｖ）２−ＩｇＧ２Ｆｃ］が挙げられ、二価抗体は、ＴＬ１Ａによって誘導されるＤＲ３の活性をアンタゴナイズすることができ、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない。
【００８２】
１つの好ましい実施形態において、本発明の一価抗体としては、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂの６つのＣＤＲ配列を含む一価抗体、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列とを含む一価抗体およびそれぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列とを含む一価抗体が挙げられる。別の好ましい実施形態において、本発明の二価ＩｇＧ２抗体としては、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂの６つのＣＤＲ配列を含む二価ＩｇＧ２抗体、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列とを含む二価ＩｇＧ２抗体およびそれぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列とを含む二価ＩｇＧ２抗体が挙げられる。
【００８３】
本発明の１つの好ましい実施形態において、一価抗体としては、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２または１４２Ｓ３８Ｂの６つのＣＤＲ配列を含む一価抗体、それぞれ配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む一価抗体、並びにそれぞれ配列番号２８〜３０で示されるＶＨのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＶＬのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む一価抗体が挙げられる。
【００８４】
本発明の別の好ましい実施形態において、一価抗体には、下記の各６つのＣＤＲ配列を含む一価抗体も含まれる。配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２〜２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６〜１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８１、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８２、２４で示されるＶＬのＣＤＲ、または配列番号１６、８０、１８で示されるＶＨのＣＤＲおよび配列番号２２、８３、２４で示されるＶＬのＣＤＲ。
【００８５】
一実施形態において、本発明の抗体または該抗体断片としては、任意の翻訳後修飾されたアミノ酸残基が含まれる抗体が挙げられる。抗体は、リジン残基が重鎖のＣ末端で不完全であり（以下「リジンクリッピング」と呼ばれる）、グルタミン残基がポリペプチドのＮ末端でピログルタミンに改変される（ｐｙｒｏＧｌｕ）ような翻訳後修飾が周知である（Beck et al, Analytical Chemistry, 2013; 85: 715-736）。そのため、本発明の特定の一実施形態において、抗体はｐｙｒｏＧｌｕおよび／またはＬｙｓクリッピングを各ポリペプチドのＮ／Ｃ末端に含む。それらの修飾は抗体の活性に本質的には影響せず、本発明の抗体はそれらの修飾なしの抗体と同等の活性を有する。
【００８６】
本発明は、上記の抗体または該抗体断片を含む抗体組成物または該抗体断片組成物をも提供する。一実施形態において、本発明の抗体組成物としては、ＤＲ３の活性を中和し、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない抗体を含む抗体組成物、ＴＬ１Ａの結合を遮断し、ＤＲ３の活性を中和し、減少したアゴニスト活性を有するかまたはアゴニスト活性を有さない抗体を含む抗体組成物、ＤＲ３が三量体を形成するのを阻害し、ＴＬ１Ａの結合によるＤＲ３の活性化を中和することを含み、該抗体がＤＲ３に対する減少したアゴニスト活性を有する／アゴニスト活性を有さない抗体組成物が挙げられる。本発明の一実施形態において、抗体組成物には、ｐｙｒｏＧｌｕおよび／またはＬｙｓクリッピングを各ポリペプチドのＮ／Ｃ末端に含む上記の翻訳後修飾された抗体分子などの可変抗体分子、グライコフォームバリアントなどが含まれていてもよい。
【００８７】
抗体の特性の制御
本発明において、Ｆｃ領域を有する抗体は、Ｆｃ受容体結合または補体結合を介していくつかのエフェクター活性を示し得る。
【００８８】
エフェクター活性は、抗体のＦｃ領域によって介在される抗体依存性の活性を言う。エフェクター活性としては、抗体依存性のＴ細胞の細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）およびマクロファージ、樹状細胞などの食細胞によって引き起こされる抗体依存性の食作用（ＡＤＰ活性）が公知である。本発明において、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は公知の測定法を用いて測定することができる［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1933)］。
【００８９】
ＡＤＣＣ活性は、標的細胞上の抗原に結合した抗体が抗体のＦｃ領域によって免疫細胞のＦｃ受容体に結合することにより、免疫細胞（ナチュラルキラー細胞など）を活性化して標的細胞を損傷させる活性を言う。
【００９０】
Ｆｃ受容体（以下、場合によってはＦｃＲと言う）は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を言い、抗体の結合によって種々の種類のエフェクター活性を誘導する。
【００９１】
ＦｃＲは抗体サブクラスに対応し、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＭはそれぞれＦｃγＲ、ＦｃεＲ、ＦｃαＲおよびＦｃμＲに特異的に結合する。ＦｃγＲはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含むサブタイプを有し、サブタイプはそれぞれＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢを含むアイソフォームを有する。これらの異なる種類のＦｃγＲは、異なる細胞上に存在する［Annu Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)］。ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球に特異的に発現し、ＦｃγＲＩＩＩＡは単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）およびＴ細胞の一部に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡによって引き起こされる抗体結合はＮＫ細胞依存的なＡＤＣＣ活性を誘導する。
【００９２】
ＣＤＣ活性は、標的細胞上の抗原に結合した抗体が、一群の血中の補体関連蛋白質からなる一連のカスケード（補体活性化経路）を活性化することにより、標的細胞を損傷させる活性を言う。補体活性化によって生じた蛋白質断片によって、免疫細胞の遊走および活性化を誘導することができる。抗体のＦｃ領域に対する結合ドメインを有するＣ１ｑがＦｃ領域に結合し、２つのセリンプロテアーゼとしてのＣ１ｒおよびＣ１ｓがそれに結合してＣ１複合体が形成されることによってＣＤＣ活性のカスケードが開始される。
【００９３】
本発明の抗体のエフェクター活性を制御するための方法は次の通り例示することができる。抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、例えば、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃのアミノ酸配列を本発明の抗体のＦｃとして用いて、ＥＵナンバリングで表される２９７番目のＡｓｎに結合する複合型Ｎ−結合糖鎖（以下、場合によっては単純に複合糖鎖と略する）の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に対するα１，６−結合を形成するフコース（コアフコースとも言う）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）または抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を置換することによって活性を制御する方法が挙げられる。
【００９４】
１）糖鎖の修飾による制御
抗体のエフェクター活性は、抗体のＦｃ領域に結合する複合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに付加されるフコース含量を制御することによって増加または減少させることができる。
【００９５】
抗体のＦｃ領域に結合する複合型Ｎ−結合糖鎖に結合するフコース含量を減少させるための方法は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）が欠失したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することによって、フコースが結合していない抗体を得ることである。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。
【００９６】
他方で、抗体のＦｃ領域に結合する複合型Ｎ−結合糖鎖に結合するフコース含量を増加させるための方法は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が導入された宿主細胞を用いて抗体を発現することによって、フコースが結合した抗体を得ることである。フコースが結合した抗体はフコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
【００９７】
本発明の抗体のＦｃ領域には、Ｎ−結合糖鎖がＥＵナンバリングで表される２９７番目のＡｓｎ残基に結合するが、糖鎖が他のＦｃ領域のＡｓｎ残基に結合するという報告はない。したがって、典型的には、２つのＮ−グリコシド結合糖鎖が１つの抗体分子に結合している。
【００９８】
公知のＮ−結合糖鎖は、高マンノース型、複合型およびハイブリッド型糖鎖である。Ｎ−結合糖鎖が該糖鎖に結合しているフコースを有さない限り、該糖鎖にフコースが結合した糖鎖よりも高いＡＤＣＣ活性を有する。
【００９９】
本発明の抗体のＦｃ領域に結合する複合型糖鎖は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）またはガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃと言う）の１つ以上がコア構造（トリマンノシルコア構造）の非還元末端においてマンノース（Ｍａｎ）にα1−２−またはα１−４−結合した糖鎖を含むことができる。また、本発明の抗体のＦｃ領域に結合する複合型糖鎖は、シアル酸、バイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン（以下バイセクト型ＧｌｃＮＡｃと言う）などをＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端に有する複合型糖鎖をも含むことができる。
【０１００】
本発明において、コアフコースまたはα１，６−フコースは、フコース（以下、場合によってはＦｕｃと言う）の１位が、複合型Ｎ−グリコシド結合糖鎖のα結合によって還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（以下、場合によってはＧｌｃＮＡｃと言う）の６位に結合した糖鎖構造を言う。さらに、複合型Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに結合したコアフコースを有さないものは、単純にフコースを有さないまたはコアフコースを有さない糖鎖と言う。
【０１０１】
本発明において、コア構造またはトリマンノシルコア構造は、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を言う。
【０１０２】
本発明の抗体に結合する糖鎖としては、次の化学式によって表される二分岐型Ｎ−グリコシド結合複合糖鎖（二分岐型複合糖鎖とも呼ばれる）が示される。
【化１】
2017511381.tif 000003
【０１０３】
本発明の抗体組成物は、複合型糖鎖が抗体分子の２９７番目のＡｓｎに結合したＦｃ領域を有する抗体分子であり、上記の糖構造を有する限り、単一のまたは複数の異なる糖鎖を有する抗体分子からなり得る。
【０１０４】
換言すれば、本発明の抗体組成物は、単一のまたは複数の異なる糖鎖を有する抗体分子、具体的には、抗体に含まれるＦｃ領域に結合した全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに結合したフコースを有さない糖鎖が５０％以上である抗体からなる組成物を意味する。抗体組成物の別の実施形態において、Ｆｃ領域にフコシル化糖鎖を有する抗体分子が８０％以上の抗体分子からなる抗体組成物である。
【０１０５】
コアフコースを有さない糖鎖の割合は、抗体のＡＤＣＣ活性が増加または減少する限り、抗体組成物中において任意の比とすることができる。増加したＡＤＣＣの割合は、好ましくは５０％以上、より好ましくは５１％〜１００％、さらにより好ましくは８０％〜１００％、特に好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％とすることができる。減少したＡＤＣＣの割合は好ましくは２０％以下である。
【０１０６】
コアフコースを有さない糖鎖の割合が５０％である抗体組成物は、抗体分子の第１及び第２のポリペプチドに結合したＮ−グリコシド結合糖鎖の１つの糖鎖にフコースを有さない抗体分子を１００％含む抗体組成物、並びに抗体分子の第１および第２のポリペプチドに結合したＮ−グリコシド結合糖鎖の両方の糖鎖にフコースを有さない抗体分子を５０％、抗体分子の第１および第２のポリペプチドに結合したＮ−グリコシド結合糖鎖の両方の糖鎖にフコースを有する抗体分子を５０％含む抗体組成物のいずれかとすることができる。
【０１０７】
本発明において、フコースを有さない糖鎖は、フコースが上記化学式の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに結合しない限り、非還元末端に任意の糖鎖構造を有することができる。
【０１０８】
本発明において、糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに結合したフコースを有さない（コアフコースを有さない）ということは、フコースが実質的に結合していないということを意味する。「フコースが実質的に結合していない」抗体組成物とは、フコースが下記の糖鎖分析で実質的に検出され得ない抗体組成物を意味する。「フコースが実質的に検出され得ない」とは、検出限界未満であることを意味する。糖鎖の全てにコアフコースを有さない抗体組成物は最も高いＡＤＣＣ活性を有する。
【０１０９】
Ｆｃ領域に複合型Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合した抗体分子からなる組成物中に含まれる、フコースを有さない糖鎖を有する抗体分子の割合は、ヒドラジン分解または酵素消化などの公知の方法を用いて抗体分子から糖鎖を遊離させ［生物化学実験法２３「糖蛋白質糖鎖研究法」（日本化学会出版）、高橋礼子編（１９８９）］、遊離した糖鎖の蛍光標識または放射性同位体標識を実施した後、標識された糖鎖をクロマトグラフィーによって分離することにより測定することができる。
【０１１０】
また、Ｆｃ領域に複合型糖鎖が結合した抗体分子からなる組成物中に含まれる、フコースを有さない糖鎖が結合した抗体分子の割合は、ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法によって遊離した糖鎖を分析することによって測定することができる［J. Liq. Chromatogr., 6, 1577 (1983)］。
【０１１１】
２）アミノ酸残基の置換による制御
本発明の抗体または該抗体断片のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣ活性は、抗体を構成するＦｃの抗体サブクラスを変えることまたはＦｃ領域のアミノ酸残基を置換することにより増加または減少させることができる。
【０１１２】
例えば、抗体のＣＤＣ活性は、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることにより増加させることができる。また、抗体のＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性は、米国特許第６，７３７，０５６、７，２９７，７７５および７，３１７，０９１号に記載のアミノ酸残基を置換することにより増加または減少させることができる。
【０１１３】
ＡＤＣＣ活性を増加させるための具体的な置換としては、Ｓ２３９Ｄ、Ｐ２４７Ｉ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ｔ３９３Ａ、Ｐ３９６Ｌ、Ｈ４３３Ρなどが挙げられる。一方、ＡＤＣＣ活性を低減するための具体的な置換としては、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ２３８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３３１Ｓなどが挙げられる。
【０１１４】
ＣＤＣ活性はアミノ酸残基の置換を２つ以上組み合わせることにより増加することができ、置換されるアミノ酸残基は目的に応じて増加することができる。ＣＤＣ活性を増加させるためのアミノ酸残基の置換としては、好ましくは、Ｎ２７６Ｋ、Ａ３３９Ｔ、Ｔ３９４ＦおよびＴ３９４Ｙから選択される少なくとも１つの置換、Ｎ２７６ＫおよびＡ３３９Ｔのアミノ酸残基の置換、並びにＫ２７４Ｑ、Ｎ２７６Ｋ、Ｙ２９６Ｆ、Ｙ３００Ｆ、Ａ３３９Ｔ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉのアミノ酸残基の置換などが挙げられる。一方、ＣＤＣ活性を低減するための具体的なアミノ酸残基の置換としては、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３３１Ｓなどから選択される少なくとも１つの置換が挙げられる。
【０１１５】
血中半減期も、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅなどから選択される少なくとも１つの置換をヒトＩｇＧサブクラスのＦｃに加えることによって延長することができる。ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性、ＣＤＣ活性などの細胞の細胞傷害性も、Ｎ−結合糖鎖が２９７番目のＮにおけるアミノ酸変異の導入によって除去されたＦｃ、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブクラスのＦｃ、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のキメラＦｃなどを用いることによって低減することができる。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、抗体または該抗体断片は、少なくともＦ３００Ｙ、Ｖ３０９ＬおよびＴ３３９Ａから選択される置換をヒトＩｇＧ抗体に加えることによって低ｐＨ条件で安定化することができる。
【０１１７】
好ましい実施形態において、本発明の抗体または該抗体断片としては、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域内の２３４、２３５、２３７、２５０、３００、３０９、３３１、３３９、４０９および４２８番目から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＶ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、Ｖ３０９Ｌ、Ｐ３３１Ｓ、Ｔ３３９ＡおよびＭ４２８Ｌから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体、ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＴ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌのアミノ酸置換を含む抗体、ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＶ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＰ３３１Ｓのアミノ酸置換を含む抗体、ヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＦ３００Ｙ、Ｖ３０９ＬおよびＴ３３９Ａのアミノ酸置換を含む抗体、並びにヒトＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＶ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、Ｖ３０９Ｌ、Ｔ３３９Ａ、Ｐ３３１ＳおよびＭ４２８Ｌのアミノ酸置換を含む抗体などが挙げられる。
【０１１８】
一実施形態において、本発明の抗体断片は、次の、
（ｉ）ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域内の２１４、２２０、４３５および４３６番目から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｉｉ）ＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内の２３４、２３５、２３７、２５０、３００、３０９、３３９、３３１、４０９、４２８、４３５および４３６番目から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、または
（ｉｉｉ）ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域内の１３１、１３３、２２８、２３５、４０９、４３５および４３６番目から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、
を含む。
【０１１９】
１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体断片としては、次の、
（ｉ）ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域内のＣ２１４Ｓ、Ｃ２２０Ｓ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｉｉ）ＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内のＣ２２０Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、Ｖ３０９Ｌ、Ｐ３３１Ｓ、Ｔ３３９Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３５ＹおよびＹ４３６Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、または
（ｉｉｉ）ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域内のＣ１３１Ｓ、Ｒ１３３Ｋ、Ｃ２１４Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｒ４０９Ｋ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、
を含む抗体断片が挙げられる。
【０１２０】
最も好ましい実施形態において、本発明の一価抗体としては、次の、
（ｉ）ＩｇＧ１のＨ鎖内のＣ２２０Ｓ置換並びにＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換を含む一価抗体、
（ｉｉ）ＩｇＧ１のＨ鎖内のＣ２２０Ｓ置換、ＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換、並びに２１６〜２２０のＥＰＫＳＣの欠失を含む一価抗体、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ１のＨ鎖内のＣ２２０Ｓ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７ＡおよびＰ３３１Ｓ置換、並びにＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｃ２２０Ｓ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換を含む一価抗体、
（ｉｖ）ＩｇＧ１のＨ鎖内のＣ２２０Ｓ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７ＡおよびＰ３３１Ｓ置換、ＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換、並びに２１６〜２２０のＥＰＫＳＣの欠失を含む一価抗体、
（ｖ）ＩｇＧ２のＨ鎖内のＣ２２０ＳおよびＦ３００Ｙ置換、ＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｆ３００Ｙ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを含む一価抗体、
（ｖｉ）ＩｇＧ２のＨ鎖内のＣ２２０Ｓ、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ置換、ＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを含む一価抗体、
（ｖｉｉ）ＩｇＧ２のＨ鎖内のＣ２２０Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、Ｖ３０９Ｌ、Ｐ３３１Ｓ、Ｔ３３９ＡおよびＭ４２８Ｌ置換、ＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、  Ｖ３０９Ｌ、Ｔ３３９Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを含む一価抗体、
（ｖｉｉｉ）ＩｇＧ２のＨ鎖内のＣ２２０Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、Ｖ３０９Ｌ、Ｐ３３１Ｓ、Ｔ３３９ＡおよびＭ４２８Ｌ置換、ＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｔ２５０Ｑ、Ｆ３００Ｙ、Ｖ３０９Ｌ、Ｔ３３９Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを含む一価抗体、並びに
（ｉｘ）ＩｇＧ４のＨ鎖内のＣ１３１ＳおよびＲ４０９Ｋ置換並びにＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｒ４０９Ｋ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換を含む一価抗体、
（ｘ）ＩｇＧ４のＨ鎖内のＣ１３１Ｓ、Ｒ１３３Ｋ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＲ４０９Ｋ置換並びにＦＬ鎖内のＣ２１４Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｒ４０９Ｋ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換を含む一価抗体、
が挙げられる。
【０１２１】
本発明は、ａ）抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターの宿主細胞への導入、ｂ）細胞を培養して培養上清を回収することおよびｃ）培養上清から抗体を精製することを含む、本発明の抗体および該抗体断片を産生する方法をも含む。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態において、前記方法としては、
ａ）抗体の定常領域におけるＩｇＧ２サブクラス由来のＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジドメインの一部への交換、ｂ）抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターの宿主細胞への導入、ｃ）細胞を培養して培養上清を回収すること、並びにｄ）培養上清から抗体を精製することを含む、抗体を産生する方法、
ａ）抗体のＦｃ領域におけるＩｇＧ２サブクラスへの交換、ｂ）抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターの宿主細胞への導入、ｃ）細胞を培養して培養上清を回収することおよびｄ）培養上清から抗体を精製することを含む、抗体を産生する方法、
ａ）抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターの宿主細胞への導入、ｂ）細胞を培養して培養上清を回収することおよびｃ）培養上清から抗体を精製することを含む、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２抗体バリアントを産生する方法、
ａ）抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターの宿主細胞への導入、ｂ）細胞を培養して培養上清を回収することおよびｃ）培養上清から抗体を精製することを含む、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２抗体バリアントを産生する方法、並びに
ａ）ＩｇＧ抗体のＦｃ領域内の２３４、２３５、２３７、２５０、３００、３０９、３３１、３３９、４０９、４２８、４３５および４３６番目から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体、またはＣＨ３ドメイン内の４０９番目のアミノ酸残基がＬｙｓであるＩｇＧ２抗体のヒンジドメインとＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインとを含むＩｇＧ２抗体バリアントのアミノ酸配列をコードする核酸配列をむ含ベクターの宿主細胞への導入、ｂ）細胞を培養して培養上清を回収すること、並びにｃ）培養上清から抗体を精製することを含む、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２抗体バリアントを産生する方法、が挙げられる。
【０１２３】
本発明は、
ａ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体の抗体断片のアミノ酸配列をコードするベクターの宿主細胞への導入、ｂ）細胞を培養して培養上清を回収することおよびｃ）培養上清から抗体を精製することを含む、本発明の抗体断片を産生する方法、
ａ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を含む抗体断片のアミノ酸配列をコードするベクターの宿主細胞への導入、ｂ）細胞を培養して培養上清を回収することおよびｃ）培養上清から抗体を精製することを含む、本発明の抗体断片を産生する方法、並びに
ａ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を含む一価抗体のアミノ酸配列をコードするベクターの宿主細胞への導入、ｂ）細胞を培養して培養上清を回収することおよびｃ）培養上清から抗体を精製することを含む、本発明の抗体断片を産生する方法も含まれる。さらに、本発明の方法には上記の抗体断片を産生する任意の方法も含まれる。
【０１２４】
本発明の一実施形態において、前記方法としては、
ａ）抗体の定常領域におけるＩｇＧ２サブクラス由来のＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジドメインの一部への交換、ｂ）組換え抗体を産生すること、並びにｃ）抗体のアゴニスト活性を検出すること、を含む抗体のアゴニズムを減少または欠失させる方法、並びに
ａ）抗体のＦｃ領域におけるＩｇＧ２サブクラスまたはＩｇＧ２抗体バリアントへの交換、ｂ）組換え抗体を産生することおよびｃ）抗体のアゴニスト活性を検出すること、を含む抗体のアゴニズムを減少または欠失させる方法、
が挙げられる。
【０１２５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、ａ）抗体のＦｃ領域におけるＩｇＧ２サブクラスまたはＩｇＧ２抗体バリアントへの交換、ｂ）組換え抗体を産生すること、並びにｃ）（ｉ）ＤＲ３のリン酸化、（ｉｉ）ＮＦ−κＢのリン酸化、（ｉｉｉ）Ｔ細胞の増殖、（ｉｖ）ＤＲ３陽性細胞のアポトーシスおよび（ｖ）インターロイキン（ＩＬ）−１３、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインのＴ細胞からの放出から選択される少なくとも１つのアッセイによって抗体のアゴニスト活性を検出すること、を含む、抗体のアゴニズムを減少または欠失させる方法を含む。
【０１２６】
本発明の一実施形態において、前記方法としては、
ａ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４または各抗体バリアントの抗体断片のアミノ酸配列をコードするベクターを構築すること、ｂ）組換え抗体を産生することおよびｃ）抗体のアゴニスト活性を検出すること、を含む抗体断片のアゴニズムを減少または欠失させる方法、
ａ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を含む抗体断片のアミノ酸配列をコードするベクターを構築すること、ｂ）組換え抗体を産生することおよびｃ）抗体のアゴニスト活性を検出すること、を含む抗体断片のアゴニズムを減少または欠失させる方法、並びに
ａ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４または各抗体バリアントのＦｃ領域を含む一価抗体のアミノ酸配列をコードするベクターを構築すること、ｂ）組換え抗体を産生することおよびｃ）抗体のアゴニスト活性を検出すること、を含む抗体断片のアゴニズムを減少または欠失させる方法、
が挙げられる。
【０１２７】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、ａ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４または各抗体バリアントのＦｃ領域を含む一価抗体を再構築すること、ｂ）組換え一価抗体を産生すること、並びにｃ）（ｉ）ＤＲ３のリン酸化、（ｉｉ）ＮＦ−κＢのリン酸化、（ｉｉｉ）Ｔ細胞の増殖、（ｉｖ）ＤＲ３陽性細胞のアポトーシスおよび（ｖ）インターロイキン（ＩＬ）−１３、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインのＴ細胞からの放出から選択される少なくとも１つのアッセイによって一価抗体のアゴニスト活性を検出すること、を含む、抗体のアゴニズムを減少または欠失させる方法を含む。
【０１２８】
本発明の抗体を産生するためのプロセス、疾患を治療するための方法および疾患を診断するための方法を具体的に下で説明する。
【０１２９】
１．モノクローナル抗体の調製法
（１）抗原の調製
抗原としてのＤＲ３ポリペプチドまたはＤＲ３蛋白質を発現する細胞を、ＤＲ３の全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入することにより得られる。また、ＤＲ３は、大量のＤＲ３を発現する種々のヒト腫瘍細胞株、ヒト組織などから精製することができる。腫瘍細胞株および組織は抗原として用いることができる。また、ＤＲ３の部分配列を有する合成ペプチドはＦｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって調製し、抗原として用いることができる。さらに、ヒト、サル、ラット、マウスなどのＤＲ３蛋白質などの任意の種を発現させて調製する。
【０１３０】
本発明に用いられるＤＲ３は、例えばＤＲ３をコードするＤＮＡを宿主細胞内で発現することによって、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載の方法を用いて、次の方法に従って産生することができる。
【０１３１】
第１に、ＤＲ３をコードする領域を含む全長ｃＤＮＡまたはその断片を適切な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって、組換えベクターを調製する。この時点で、必要な場合には、全長ｃＤＮＡに基づくポリペプチドをコードする領域を含有する適切な長さを有するＤＮＡ断片およびＤＮＡ断片が前記全長ｃＤＮＡの代わりに用いることができる。次に、発現ベクターにとって好適な宿主細胞に組換えベクターを導入することによって、ＤＲ３産生形質転換体が得られる。
【０１３２】
発現ベクターは、用いられる宿主細胞内で自律複製し得るベクター、または染色体に挿入され得る、ポリペプチドをコードするＤＮＡが転写され得るような位置に適切なプロモーターを含むベクターを含む。
【０１３３】
宿主細胞は、目的の遺伝子を発現し得る限り任意のものを用いることができる。例えば、大腸菌などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。
【０１３４】
大腸菌などの原核生物が宿主細胞として用いられるときには、本発明に用いられる組換えベクターは原核生物内で自律複製可能であり、プロモーター、リボソーム結合配列、ＤＲ３をコードする部分を含むＤＮＡおよび転写終結配列を含むことが好ましい。組換えベクターは転写終結配列を有する必要はないが、転写終結配列が好ましくは構造遺伝子の直下に設置される。組換えベクターはさらにプロモーターを制御する遺伝子を含んでもよい。
【０１３５】
また、前記組換えベクターは、好ましくは、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガノ配列（ＳＤ配列とも言う）と開始コドンとの間のスペースが適切な距離（例えば、６から１８ヌクレオチド）に調整されたプラスミドである。
【０１３６】
さらに、ＤＲ３をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、宿主細胞内での発現にとって好適なコドンであるように別の塩基によって置換することができ、該置換によって目的のＤＲ３の生産性が改善する。
【０１３７】
用いられる宿主細胞内で機能し得る限り、任意の発現ベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（全てロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）から調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭＢＰ−５４０８）から調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭＢＰ−４００）から調製。特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭＢＰ−６７９８）から調製。特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＭＥ１８ＳＦＬなどが挙げられる。
【０１３８】
用いる宿主細胞内で機能し得る限り、任意のプロモーターを用いることができる。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターおよびＴ７プロモーターなどの大腸菌、ファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、２つのＰｔｒｐがタンデムに連結されたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターおよびｌｅｔＩプロモーターなどの人工的に設計および改変されたプロモーターを用いることができる。
【０１３９】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
【０１４０】
宿主細胞へのＤＮＡ導入法である限り、組換えベクターの任意の導入法を用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)およびMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法］が挙げられる。
【０１４１】
動物細胞を宿主細胞として用いるときには、動物細胞内でその機能を示す限り任意の発現ベクターを用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［特公平３−２２９７９号公報、Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３−３（特公平２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａ１（米国特許第６，００１，３５８号）、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号、国際公開第２０１３／００５６４９号）などが挙げられる。
【０１４２】
動物細胞内で機能し得る限り、任意のプロモーターを用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、モロニー（Molony）マウス白血病ウイルスプロモーターまたはエンハンサーなどが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと一緒に用いることができる。宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ、サルＣＯＳ細胞、ヒト白血病細胞ＰＥＲ．Ｃ６、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968)、Genetics, 55, 513 (1968)、Chromosoma, 41, 129 (1973)、Methods in Cell Science, 18, 115 (1996)、Radiation Research, 148, 260 (1997)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)、Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968)、Cell, 6, 121 (1975)、Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp.883- 900)］、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣのＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣのＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣのＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（ライフテクノロジーズカタログ番号１１６１９）、Ｐｒｏ−３細胞、ラットミエローマＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＹＢ２／０としても公知）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはＨＢＴ５６３７（特開昭６３−０００２９９号公報）などが挙げられる。
【０１４３】
動物細胞にＤＮＡを導入するための方法であれば、任意の組換えベクターの導入法を用いることができる。例えば、エレクトロポレーション［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などが挙げられる。
【０１４４】
ＤＲ３は、ＤＲ３をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有する微生物または動物細胞などに由来する形質転換体を培地中で培養して、ＤＲ３を形成させて培養物中に蓄積させ、培養物から回収することによって産生することができる。形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法により実施する。ＤＲ３を真核生物由来細胞で発現させることにより、糖または糖鎖が結合したＤＲ３が得られる。誘導型プロモーターを含有する組換えベクターによって形質転換された微生物を培養するときには、必要に応じて、誘導物質を培地に添加することができる。例えば、ｌａｃプロモーターを用いる組換えベクターによって形質転換された微生物を培養するときには、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを培地に添加することができる。または、ｔｒｐプロモーターを用いる組換えベクターによって形質転換された微生物を培養するときには、インドールアクリル酸などを添加することができる。
【０１４５】
宿主細胞として動物細胞を用いて得られた形質転換体を培養するときには、培地としては、一般的に用いられるＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)］、イーグルＭＥＭ培地［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology, 8, 396 (1959)］および１９９培地［Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ウシ胎児血清などが添加された培地などが挙げられる。培養は、一般的には、６〜８のｐＨおよび３０〜４０℃にて１〜７日間、５％ＣＯ２存在下で実施される。必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンまたはゲンタマイシンなどの抗生物質を培養時の培地に添加することができる。
【０１４６】
ＤＲ３をコードする遺伝子の発現法に関しては、直接的な発現に加えて、分泌産生、融合蛋白質発現などをMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法によって実施することができる。一実施形態において、ＤＲ３融合蛋白質としては、ＤＲ３−Ｆｃ融合蛋白質、ＤＲ３の細胞外領域−Ｆｃ融合蛋白質、ＣＲＤドメイン−Ｆｃ融合蛋白質、ＤＲ３−ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグと略する）融合蛋白質、ＤＲ３−Ｆｌａｇ融合蛋白質などが挙げられる。いずれにせよ、任意のＤＲ３、ＤＲ３バリアントおよびその断片をＦｃ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグなどに融合して産生することができる。
【０１４７】
ＤＲ３を産生するための方法としては、宿主細胞による細胞内発現の方法、宿主細胞からの細胞外分泌の方法、宿主細胞膜の外膜上の産生の方法などが挙げられる。適切な方法は、用いられる宿主細胞および産生されるＤＲ３の構造を変えることによって選択することができる。
【０１４８】
ＤＲ３が宿主細胞内または宿主細胞膜の外膜上に産生されるときには、ＤＲ３は、Ｐａｕｌｓｏｎらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)］、Ｌｏｗｅらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、特開平５−３３６９６３号公報および国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法によって積極的に細胞外に分泌させることができる。また、ＤＲ３の産生量は、特開平２−２２７０７５号公報に記載の方法によって、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を用いる遺伝子増幅システムを利用して増加させることができる。
【０１４９】
得られたＤＲ３は、例えば次の通り単離し、精製することができる。ＤＲ３が溶解状態で細胞内に発現するときには、培養後の細胞を遠心分離によって回収し、緩衝水溶液中に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザー、ダイノーミルなどを用いて破砕し、細胞不含抽出物を得る。細胞不含抽出物を遠心分離して上清を得て、上清を、溶媒抽出、硫酸アンモニウムなどによる塩析、脱塩、有機溶媒による沈澱、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ダイヤイオンＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などの樹脂を用いるアニオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）などの樹脂を用いるカチオン交換クロマトグラフィー、ブチルセファロースまたはフェニルセファロースなどの樹脂を用いる疎水性クロマトグラフィー、分子篩を用いるゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳動などの電気泳動等の一般的な酵素単離および精製技術などに供することによって精製調製物が得られる。これらは単独または組み合わせて用いることができる。
【０１５０】
ＤＲ３が封入体を形成することによって細胞内に発現されるときには、細胞を同様に回収、破砕および遠心分離し、ＤＲ３の封入体を沈澱画分として回収する。蛋白質の回収封入体を蛋白質変性剤によって可溶化する。可溶化溶液を希釈または透析することによって蛋白質を正常な三次元構造にした後、ＤＲ３の精製調製物を上記と同じ単離精製法によって得る。
【０１５１】
ＤＲ３、そのバリアントまたはグリコシル化産物などのその断片が細胞外分泌されるときには、ＤＲ３またはグルコシル化産物などの誘導体を培養上清から回収することができる。すなわち、培養物を上記と同様に遠心分離などの方法によって処理して、培養上清を得て、ＤＲ３の精製調製物を上記と同じ単離精製法によって培養上清から得る。
【０１５２】
また、本発明に用いられるＤＲ３はＦｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって産生することができる。また、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製または島津製作所社製等のペプチド合成機を用いて化学合成することができる。
【０１５３】
（２）動物の免疫処理および融合用の抗体産生細胞の調製
３〜２０週齢のマウス、ラットまたはハムスターを、上記の（１）で調製した抗原によって免疫処理し、抗体産生細胞を動物の脾臓、リンパ節または末梢血から集める。また、低い免疫原性ゆえに前記動物における十分な力価の増加が認識されるときには、免疫処理される動物としてＤＲ３ノックアウトマウスを用いることができる。
【０１５４】
免疫処理は、適切なアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムゲルの百日咳ワクチンとの組み合わせなど）と一緒に皮下、静脈内、腹腔内またはリンパ節（lympho nodal）内注射によって動物に抗原を投与することによって実施する。抗原が部分ペプチドであるときには、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）などの担体蛋白質などとの複合体を作製し、これを抗原として用いる。
【０１５５】
抗原の投与は、初回投与の後、１週間毎または２週間毎に５〜１０回実施する。各投与後の３〜７日目に、血液サンプルを眼底または尾静脈から集め、抗原に対する血清の反応性を例えば酵素免疫アッセイ［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］などによって試験する。免疫処理に用いられた抗原に対してそれらの血清の十分な抗体力価を示す動物が、融合用の抗体産生細胞の供給源として用いられる。
【０１５６】
抗原の最終投与の３〜７日後に、免疫処理動物から脾臓またはリンパ節（lympho node）などの抗体産生細胞を含有する組織を切除して、抗体産生細胞を集める。脾臓細胞／リンパ節（lympho nodal）細胞を用いるときには、組織を切除（excide）してほぐし、次に遠心分離する。その後、赤血球を除去することによって融合用の抗体産生細胞を得る。
【０１５７】
（３）ミエローマ細胞の調製
マウスから得られた樹立された細胞株は、ミエローマ細胞として用いられる。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［European J. Immunology, 6, 511 (1976)］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Nature, 276, 269 (1978)］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548 (1979)］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495 (1975)］などが挙げられる。
【０１５８】
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシンおよびウシ胎児血清（以下、「ＦＣＳ」と言う）を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地に８−アザグアニンを添加することによって得られる培地）、イスコフ改変ダルベッコ培地（以下「ＩＭＤＭ」と言う）またはダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」と言う）などの適切な培地によって継代培養する。細胞は、正常培地（例えば、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ）で細胞融合前の３〜４日間継代培養して、融合日に２×１０７以上の個数の細胞を確保する。
【０１５９】
（４）モノクローナル抗体を産生するための細胞融合およびハイブリドーマの調製
上記の（２）によって得られた融合用の抗体産生細胞および上記の（３）によって得られたミエローマ細胞を最小必須培地（ＭＥＭ）またはＰＢＳ（１．８３ｇのリン酸水素二ナトリウム、０．２１ｇのリン酸二水素カリウム、７．６５ｇの塩化ナトリウム、１リットルの蒸留水、ｐＨ７．２）によって十分洗浄し、混合して抗体産生細胞：ミエローマ細胞の比＝５〜１０：１とし、次に遠心分離を行った後、上清を捨てる。沈澱した細胞群を十分にほぐした後に、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭおよびジメチルスルホキシドの混合物を、撹拌下、３７℃にて細胞に添加する。加えて、１〜２ｍＬのＭＥＭ培地を１または２分毎に数回添加し、ＭＥＭを添加して、合計量５０ｍＬとする。遠心分離後に上清を捨てる。細胞を穏やかにほぐした後、細胞をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを正常培地に添加した培地）中に穏やかに懸濁する。懸濁液は、５％ＣＯ２インキュベータ中で７〜１４日間、３７℃にて培養する。
【０１６０】
上記のミエローマ細胞が８−アザグアニン耐性株すなわちヒポキサンチン／グアニン／ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株であるときには、融合していないミエローマ細胞およびミエローマ細胞それ自体の融合細胞はＨＡＴ含有培地中で生存することができない。他方で、抗体産生細胞同士の融合細胞および抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞の融合細胞の寿命は限られる。そのため、それらの細胞がＨＡＴ含有培地で継続的に培養される場合には、抗体産生細胞およびミエローマ細胞のハイブリドーマのみが生存することができ、結果として、ハイブリドーマを選別することができる。
【０１６１】
コロニー形状で培養されたハイブリドーマの培地を、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除去することによって得られる培地（以下、「ＨＴ培地」と言う）と交換する。その後、上清の一部を集めた後、後述の抗体力価測定法を用いて抗体産生ハイブリドーマを選別することができる。
【０１６２】
抗体力価を測定する方法としては、例えば、放射性免疫アッセイ（以下、「ＲＩＡ」と言う）、酵素結合免疫吸着法（以下、「ＥＬＩＳＡ」と言う）、フローサイトメトリーなどの蛍光抗体法および受動血球凝集などの種々の公知技術が挙げられる。これらのうち、検出感度、迅速性、精度、操作自動化の可能性などを鑑みて、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡが好ましい。
【０１６３】
抗体力価測定によって特異的な抗体を産生することが確認されるハイブリドーマを別のプレートに移し、クローニングする。クローニング法としては、例えば、１つのハイブリドーマがプレートの各ウェルに含有されるように希釈することによってハイブリドーマを培養する限界希釈法、ハイブリドーマを軟寒天培地で培養してコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニピュレータを用いることによって細胞を１つずつ取り出し、細胞を培養する方法および単一細胞をセルソーターによって分離する「ソータークローニング」などが挙げられる。限界希釈法はその簡易さゆえに広く用いられる。
【０１６４】
クローニングは、例えば抗体力価が確認されるウェルの限界希釈によって２〜４回繰り返し、抗体力価が安定に確認されるハイブリドーマを抗ヒトＤＲ３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選別する。
【０１６５】
（５）精製モノクローナル抗体の調製
上記の（４）によって得たモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、０．５ｍＬのプリスタンによって処理した８〜１０週齢のマウスまたはヌードマウスに腹腔内注射によって投与する［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン）を腹腔内投与し、次に２週間の給餌を行う］。ハイブリドーマは１０〜２１日で腹水腫瘍を発生する。腹水をマウスから集め、遠心分離して固形分を除去し、４０〜５０％の硫酸アンモニウムによる塩析に供した後、カプリル酸によって沈澱させ、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡカラムまたはゲル濾過カラムに通して、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を精製モノクローナル抗体として集める。
【０１６６】
その後、上記の（４）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地などで培養し、上清を遠心分離によって除去する。沈澱した細胞を、５％ダイゴＧＦ２１を含有するハイブリドーマＳＦＭ培地中に懸濁し、３〜７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離（centrifuse）し、次に、得られた上清をプロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムによって精製し、ＩｇＧ画分を集めることによって精製モノクローナル抗体が得られる。
【０１６７】
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫アッセイによって決定することができる。蛋白質の量はローリー法によってまたは２８０ｎｍの吸光度から決定することができる［１．４（ＯＤ２８０）＝免疫グロブリン１ｍｇ／ｍＬ］。
【０１６８】
（６）モノクローナル抗体の選別
本発明の抗ＤＲ３モノクローナル抗体の結合活性は、オークタロニー法、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などの結合アッセイシステムによって確認することができる。オークタロニー法は簡易であるが、抗体濃度が低いときに濃縮操作が必要である。
【０１６９】
ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを用いる際には、抗原を吸着した固相と培養上清をそのまま結合させ、種々の免疫グロブリンアイソタイプおよびサブクラスに対応する抗体を第２の抗体として用い、抗体のアイソタイプおよびサブクラスを同定することができる。
【０１７０】
精製または部分精製した組換えヒトＤＲ３を、ＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレートなどの固相表面に吸着させ、抗原が吸着していない固相表面は、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と称する）などの抗原と無関係な蛋白質によってブロッキングする。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡプレートは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」と称する）（以下Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと略する）などによって洗浄した後、連続希釈した第１の抗体（例えば、マウス血清、培養上清など）と結合させることによってプレート上に固定化された抗原に抗体を結合させる。
【０１７２】
その後、第二の抗体として、ビオチン、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼＨＲＰ、アルカリホスファターゼＡＬＰなど）、化学発光物質、放射性化合物などによって標識された抗免疫グロブリン抗体をプレートに分注することによって、プレートに結合した第１の抗体と第２の抗体を反応させる。プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳによって十分に洗浄した後、第２の抗体の標識物質によって引き起こされる反応を行うことによって、免疫原と特異的に結合するモノクローナル抗体を選別する。
【０１７３】
抗原発現細胞に対する目的抗体の結合活性はＦＣＭによって測定することができる［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)］。細胞膜上に発現された膜蛋白質に目的抗体が結合する場合には、目的抗体が天然に存在する抗原の三次元構造を認識する抗体であると言える。
【０１７４】
ＳＰＲとしては、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いる速度論的分析が挙げられる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いることによって、対象物質に対する抗原の結合速度論を測定し、その結果を装置付属の分析ソフトウェアによって分析する。抗マウスＩｇＧ抗体をアミンカップリング法によってセンサーチップＣＭ５上に固定化した後に、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの対象物質を流して、対象物質の適切な量が抗体に結合するようにして、既知濃度の種々のレベルの抗原を流し、結合および解離を測定する。得られたデータの速度論的分析を、装置付属のソフトウェアを用いて１：１結合モデルにより行い、種々のパラメータを得る。代替的には、ヒトＤＲ３蛋白質を、例えばアミンカップリング法によってセンサーチップ上に固定化した後、既知濃度の種々のレベルの精製モノクローナル抗体を流し、結合および解離を測定する。装置付属のソフトウェアを用いて二価結合モデルを用いて、得られたデータの速度論的分析を行うことにより、種々のパラメータを得る。
【０１７５】
本発明の抗ＤＲ３抗体と競合してＤＲ３に結合する抗体は、対象抗体を上記の結合アッセイシステムに添加して、抗体を結合することによって得られる。すなわち、対象抗体を添加したときに結合活性が阻害される抗体をスクリーニングすることによって、得られた抗体と競合してＤＲ３の細胞外ドメインに結合する抗体を得ることができる。
【０１７６】
（７）抗ＤＲ３モノクローナル抗体のエピトープの同定
本発明において、抗体が認識するエピトープは次の方法で同定することができる。例えば、部分欠損抗原、種々の異種アミノ酸残基を用いるアミノ酸置換によって得られるアミノ酸置換抗原、またはドメインを改変することによって得られる改変抗原を調製し、欠損抗原またはアミノ酸置換抗原に対する目的抗体の反応性が低下したときには、これは欠損部位およびアミノ酸置換部位が目的抗体によって認識されるエピトープであるということを明確に示す。部分欠損抗原またはアミノ酸置換抗原は、適切な宿主細胞（大腸菌、酵母、植物細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳動物細胞など）から分泌される蛋白質として得られる。宿主細胞表面上に抗原を発現することによって抗原発現細胞を調製することもできる。膜型抗原の場合には、抗原の立体配座構造を保持しながら抗原を発現するように宿主細胞表面上に抗原を発現することが好ましい（天然に存在する立体配座と考えられる）。抗原の一次構造または三次元構造を模倣する合成ペプチドを調製することによって、目的抗体の反応性を確認することもできる。合成ペプチドを調製する方法としては、例えば、公知のペプチド合成技術を用いることによって種々の分子を有する部分ペプチドを調製する方法が挙げられる。
【０１７７】
本発明の抗ＤＲ３抗体に関しては、目的抗体の反応性を確認するように、ヒトおよびマウスＤＲ３の細胞外ドメインのそれぞれのＰＬＡＤドメイン、ＣＲＤドメイン１〜４を組み合わせることによって得られるキメラ蛋白質を調製し、抗体のエピトープを同定することができる。例えば、キメラＤＲ３蛋白質はマウスＤＲ３からのＣＲＤ１およびヒトＤＲ３からのＣＲＤ２〜４からなり、ＣＨＯ細胞上に発現され、キメラＤＲ３は可溶性のＦｃ融合蛋白質として産生させることができる。被験抗体がヒトＤＲ３蛋白質／ヒトＤＲ３発現細胞に結合することができるが、該抗体がＣＲＤ１キメラＤＲ３蛋白質／ＣＲＤ１キメラＤＲ３発現細胞に結合することができない場合には、ＤＲ３の細胞外領域のＣＲＤ１内に存在し、ヒトＣＲＤ１とマウスＣＲＤ１との間で異なるアミノ酸残基である少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープを抗体が有するということが分かる。
【０１７８】
その後、当業者に公知のオリゴペプチド合成技術を用いることによって、対応する部分の種々のオリゴペプチド、ペプチドの変異体などをより詳細に合成し、ペプチドに対する目的抗体の反応性を確認してエピトープを同定する。種々のオリゴペプチドを得る単純な方法としては、市販のキット［例えば、ＳＰＯＴキット（Ｇｅｎｏｓｙｓバイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いる一連のマルチピン／ペプチド合成キット（Ｃｈｉｒｏｎ社製）など］を用いることができる。
【０１７９】
ＤＲ３の細胞外ドメインに結合する本発明の抗体が認識するエピトープと同一のエピトープに結合する抗体は、上記の結合アッセイシステムで得られた抗体のエピトープを同定し、同定されたエピトープの部分合成ペプチド、エピトープの三次元構造を模倣する三次元構造を有する合成ペプチド、組換え蛋白質などを調製し、免疫処理を行うことによって得られる。
【０１８０】
例えば、膜蛋白質の場合には、細胞外ドメイン全体または細胞外ドメインの一部が適切なタグ（ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ蛋白質、抗体のＦｃ領域など）に融合した組換え蛋白質を調製し、組換え蛋白質を免疫処理することによりエピトープ特異的な抗体をより効率的に調製することができる。
【０１８１】
２．組換え抗体の調製
組換え抗体の産生例として、ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体を産生するための手順を以下に示す。
【０１８２】
（１）組換え抗体発現用ベクターの構築
組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬ／Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡが挿入された動物細胞用の発現ベクターであり、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬ／Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡのそれぞれを動物細胞用発現ベクターにクローニングすることによって構築される。
【０１８３】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであってもよい。例えば、γ１、γ２またはγ４サブクラスに属するＣＨ、κクラスに属するＣＬなどが挙げられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしては、ｃＤＮＡを一般的に用いることができ、エキソンおよびイントロンを含む染色体ＤＮＡも用いることができる。動物細胞用の発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を挿入して発現させることができる限り、任意の発現ベクターを用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol., 3, 133 (1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 (1984)］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Cytotechnol., 4, 173 (1990)］、ｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Cytotechnol., 13, 79 (1993)］などが挙げられる。動物細胞用の発現ベクターに用いられるプロモーターおよびエンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)］、免疫グロブリンＨ鎖プロモーター［Cell, 41, 479 (1985)］およびエンハンサー［Cell, 33, 717 (1983)］などが挙げられる。
【０１８４】
組換え抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子および抗体Ｌ鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在する種類（セパレート型）または両方の遺伝子が同じベクター上に存在する種類（タンデム型）のいずれでもよい。タンデム型の組換え抗体発現用ベクターとしては、例えば、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559 (1998)］、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号、国際公開第２０１３／００５６４９号）などが挙げられる。さらに、これらのベクターは、Ｈ鎖またはＬ鎖をコードする各遺伝子がベクターに１つずつ挿入されることによる、Ｈ鎖およびＬ鎖の別々の発現のために用いることができる。
【０１８５】
（２）非ヒト動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の分析
非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の分析は、次の通り行う。
【０１８６】
ｍＲＮＡを非ヒト動物由来の抗体産生ハイブリドーマ細胞から抽出して、ｃＤＮＡを合成する。合成されたｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングして、ｃＤＮＡライブラリーを調製する。プローブとしてマウス抗体のＣ領域またはＶ領域の一部をコードするＤＮＡを用いて、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを含有する組換えファージまたは組換えプラスミドのそれぞれをライブラリーから単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的の非ヒト動物由来のマウス抗体のＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列の全長を決定し、ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の全長をそれぞれヌクレオチド配列から推定する。
【０１８７】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を調製するための非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどが挙げられる。ハイブリドーマ細胞を産生し得る限り、任意の動物を用いてもよい。
【０１８８】
ハイブリドーマ細胞からトータルＲＮＡを調製するための方法としては、例えば、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)］、ＲＮＡｅａｓｙキット（キアゲン社製）のキットの使用などが挙げられる。
【０１８９】
トータルＲＮＡからｍＲＮＡを調製するための方法としては、例えば、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］、オリゴｄＴ３０ｍＲＮＡ精製キット（タカラバイオ社製）などのキットを用いる方法などが挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するためのキットとしては、例えば、ＦａｓｔＴｒａｃｋ−ｍＲＮＡ単離キット（インビトロジェン社製）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ−ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社製）などが挙げられる。
【０１９０】
ｃＤＮＡを合成しｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法としては、例えば、公知の方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)］、ｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプラスミドシステム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのキットを用いる方法などが挙げられる。
【０１９１】
ｃＤＮＡライブラリーを調製するためにハイブリドーマ細胞から抽出されたｍＲＮＡを鋳型として用いて合成されたｃＤＮＡを挿入するベクターは、ｃＤＮＡを挿入し得る限り任意のベクターでよい。例えば、ＺＡＰ−Ｅｘｐｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58 (1992)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０およびλｇｔ１１［DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)］、ＬａｍｂｄａＢｌｕｅＭｉｄ（クロンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌおよびｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］、ｐＵＣ１８［Gene, 33, 103 (1985)］などが挙げられる。
【０１９２】
ファージまたはプラスミドベクターによって構築されたｃＤＮＡライブラリーを導入するための大腸菌は、ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持し得る限り、任意の大腸菌を用いてもよい。例えば、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’［Strategies, 5, 81 (1992)］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440 (1954)］、Ｙ１０８８およびＹ１０９０［Science, 222: 778 (1983)］、ＮＭ５２２［J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)］、ＪＭ１０５［Gene, 38, 275 (1985)］などが挙げられる。
【０１９３】
非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬなどをコードするｃＤＮＡクローンをｃＤＮＡライブラリーから選別するために、同位体または蛍光標識プローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーション法を用いてもよい［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］。
【０１９４】
また、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応［以下「ＰＣＲ」と言う。Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)］によって、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いることによって調製することができる。
【０１９５】
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、選択されたｃＤＮＡを適切な制限酵素などによって消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドに断片をクローニングし、通常用いられるヌクレオチド分析法による反応を実施することによって決定することができる。例えば、ヌクレオチド分析は、ＡＢＩプリズム３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）およびＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサー（ファルマシア社製）などの自動ヌクレオチド配列分析装置を用いることによって、ジデオキシ法などの反応後に実施する［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)］。
【０１９６】
得られたｃＤＮＡが、分泌シグナル配列を含有する抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかどうかは、決定されたヌクレオチド配列からのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の全長を見積もり、それらを公知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の全長と比較することによって確認することができる［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］。分泌シグナル配列およびＮ末端アミノ酸配列の長さは、分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の全長を公知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の全長と比較することによって推定することができ［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］、それらが属するサブグループもまた分かり得る。また、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列は、得られたアミノ酸配列を公知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列と比較することによって調べることができる［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］。
【０１９７】
その上、ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の全長の新規性は、ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の得られた全長を用いて、例えばＢＬＡＳＴ法［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］などによって、任意のデータベース、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの配列との相同性検索を実施することによって調べることができる。
【０１９８】
（３）ヒトキメラ抗体発現用ベクターの構築
非ヒト動物の抗体のＶＨおよびＶＬのそれぞれをコードするｃＤＮＡを、上記の（１）で挙げた組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の上流にクローニングすることにより、ヒトキメラ抗体発現用ベクターを構築する。
【０１９９】
例えば、非ヒト動物の抗体のＶＨまたはＶＬの３’末端のヌクレオチド配列とヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端のヌクレオチド配列とを結合するためには、連結部のヌクレオチド配列によってコードされ制限酵素の適切な認識配列を有するように設計された適切なアミノ酸をコードするように、非ヒト動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードする各ｃＤＮＡを調製する。抗体のＶＨおよびＶＬをコードする得られたｃＤＮＡを、それらのそれぞれが適切な形態で発現されるように、（１）で上述したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の上流にそれぞれクローニングして、ヒトキメラ抗体発現用ベクターを構築する。
【０２００】
加えて、非ヒト動物抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、両端に適切な制限酵素の認識配列を有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲによって増幅し、それらをそれぞれ上記（１）で得られた組換え抗体発現用ベクターにクローニングする。また、組換え抗体のＨ鎖またはＬ鎖をコードするｃＤＮＡを合成するかまたはＰＣＲによって増幅し、各ｃＤＮＡを、上記（１）で得られた組換え抗体発現用ベクターにクローニングする。
【０２０１】
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、次のようにして得ることができる。非ヒト動物抗体由来の抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列が移植されたヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下「ＦＲ」と言う）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。ヒトに由来する限り、ヒト抗体のＦＲの任意のアミノ酸配列を用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されたヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列などおよびヒト抗体のＦＲのサブグループに共通のアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］などが挙げられる。抗体の結合活性の減少を阻害するためには、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列と高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択する。
【０２０２】
その後、元の抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を、それぞれヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲの選択されたアミノ酸配列に移植して、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬの各アミノ酸配列を設計する。設計されたアミノ酸配列は、抗体の遺伝子のヌクレオチド配列中に見出されるコドン使用頻度を考慮することによってＤＮＡ配列に変換し［Kabat et al, Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計されたヌクレオチド配列に基づいて、ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを合成し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、両端に存在する合成ＤＮＡの５’末端に適切な制限酵素の認識配列を導入することによって、（１）で構築されたヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。あるいは、設計されたＤＮＡ配列に基づく全長Ｈ鎖および全長Ｌ鎖のそれぞれをコードする１つのＤＮＡとして、合成ＤＮＡを用いて実施することができる。
【０２０３】
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
非ヒト動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬ内のＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに単純に移植することによってヒト化抗体を産生させるときには、その抗原結合活性は非ヒト動物由来の元の抗体のものよりも低いということが公知である［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)］。ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列のうち、抗原に対する結合に直接的に関係するアミノ酸残基、ＣＤＲ中のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基および抗体の三次元構造を維持し、抗原に対する結合に間接的に関係するアミノ酸残基を同定して、親抗体（元の抗体）中に見出されるアミノ酸残基に改変することにより、減少した抗原結合活性を増加させる。
【０２０４】
ＦＲ中の抗原結合活性に関係するアミノ酸残基を同定するために、抗体の三次元構造を構築し、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)］、コンピュータモデリング［Protein Engineering, 7, 1501 (1994)］などによって分析する。加えて、一般的には種々の試行が必要とされ、例えば、各抗体のいくつかの改変抗体を産生し、改変抗体のそれぞれとその抗体結合活性との間の相関を調べる。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、改変用の種々の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって（４）に記載の通り改変することができる。ＰＣＲによって得られる増幅産物に関して、ヌクレオチド配列は、目的の改変が実施されたかどうかが確認されるように（２）に記載の方法に従って決定される。
【０２０５】
（６）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
構築された組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードする各ｃＤＮＡは、（１）に記載の通り組換え抗体発現用ベクター中のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする各遺伝子の上流にクローニングすることによって、ヒト化抗体発現用ベクターを構築することができる。さらに、ヒト化抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡの適切なベクターへのクローニングによっても構築される。例えば、（４）および（５）においてヒト化抗体のＶＨまたはＶＬの構築に用いられる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適切な制限酵素の認識配列が導入されるときには、（１）に記載の通りヒト化抗体発現用ベクター中のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする各遺伝子の上流に、それらが適切な形態で発現されるようにクローニングすることができる。
【０２０６】
（７）組換え抗体の一過性発現
産生された種々のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現用ベクターまたはその改変発現ベクターを用いて組換え抗体を一過性発現させることができる。宿主細胞が組換え抗体を発現し得る限り、任意の細胞を宿主細胞として用いることができる。一般的には、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣのＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣのＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−Ｓ（ライフテクノロジーズカタログ番号１１６１９）が、その高い発現量を鑑みて用いられる［Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)］。発現ベクターの導入後に、培養上清中の組換え抗体の発現量および抗原結合活性をＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＣＭなどによって測定することができる。
【０２０７】
（８）組換え抗体を安定に発現する形質転換体の取得および組換え抗体の調製
組換え抗体を安定に発現する形質転換体は、（３）および（６）に記載の組換え抗体発現用ベクターを適切な宿主細胞に導入することによって得られる。宿主細胞に発現ベクターを導入するための方法としては、例えば、エレクトロポレーション［特開平２−２５７８９１号公報、Cytotechnology, 3, 133 (1990)］などが挙げられる。組換え抗体発現用ベクターが導入された宿主細胞としては、組換え抗体を産生し得る宿主細胞である限り、任意の細胞を用いることができる。例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣのＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣのＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣのＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（ライフテクノロジーズカタログ番号１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＹＢ２／０とも言う）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇｌ４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（以下「ｄｈｆｒ」と言う）が欠損したＣＨＯ細胞［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216 (1980)］、レクチン（lection）耐性を獲得したＬｅｃ１３［Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)］、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（fucosyltransaferse）遺伝子不全（defected）ＣＨＯ細胞（国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第２００５／３５５８６号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６６２）などが挙げられる。
【０２０８】
その具体例としては、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣのＣＣＬ−６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣのＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣのＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（ライフテクノロジーズカタログ番号１１６１９）、Ｌｅｃ１３細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６６２。またはＹＢ２／０とも呼ばれる）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（以下ｄｈｆｒと言う）欠損ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)］、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ、ＨＢＴ５６３細胞、上記の細胞株の亜株および上記の細胞株を血清不含培地または非接着培養条件で馴化することによって調製される細胞などが挙げられる。
【０２０９】
加えて、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関係する酵素などの蛋白質、フコースの１位が複合型Ｎ−グリコシド結合糖鎖のα−結合によって還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位に結合する糖鎖の修飾に関係する酵素などの蛋白質、またはゴルジ体への細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの輸送に関係する蛋白質の活性が導入され、減少または欠失した宿主細胞、好ましくは国際公開第０５／３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号などに記載の通りα１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞をも用いることができる。
【０２１０】
発現ベクターの導入後に、Ｇ４１８硫酸塩（以下「Ｇ４１８」と言う）、シクロヘキシミド（以下ＣＨＸと言う）などの薬剤を含有する動物細胞培養培地での培養などによって、組換え抗体を安定に発現する形質転換体を選別する。
【０２１１】
動物細胞培養のための培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地、ＥＸ−３０２培地、ＥＸ−３２５ＰＦ（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、ハイブリドーマ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」と言う）などの種々の添加物をこれらの培地に添加することによって得られる培地などが挙げられる。組換え抗体は、選別された形質転換体を培地で培養することによって培養上清中に産生および蓄積させることができる。培養上清中の組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡなどによって測定することができる。また、形質転換体において、組換え抗体の発現量は、特開平２−２５７８９１号公報に開示の方法に従ってＤＨＦＲ増幅システムなどを用いることによって増加させることができる。
【０２１２】
組換え抗体は、プロテインＡカラム［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］を用いることによって形質転換体の培養上清から精製することができる。例えば、組換え抗体はゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、プロテインＧカラムなどの組み合わせによって精製することができる。精製された組換え抗体のＨ鎖若しくはＬ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と言う）［Nature, 227, 680 (1970)］、ウエスタンブロッティング［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］などによって測定する。
【０２１３】
３．精製されたモノクローナル抗体または該抗体断片の活性の評価
本発明の精製されたモノクローナル抗体または該抗体断片の活性は次の方法で評価することができる。ＤＲ３発現細胞株に対する結合活性は、上記１（６）および（７）に記載の結合アッセイシステムを用いて測定することができる。抗原陽性細胞株に対するＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性を公知の測定法によって測定することができる［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)］。
【０２１４】
特異的リガンドＴＬ１Ａ依存的なリン酸化、ＤＲ３またはＮＦ−κＢシグナルの活性化および本発明の抗体によるＴＬ１Ａの中和活性は、次の方法で測定することができる。ＤＲ３発現細胞またはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＲＰＭＩ１６４０（ＦＣＳ不含）のような典型的な培地で継代培養し、ＤＲ３およびＮＦ−κＢリン酸化アッセイ用に安定化する。細胞を、抗ＤＲ３抗体の存在下または非存在下において、数十分間３７℃にて数ｎｇ／ｍＬ〜μｇ／ｍＬのＴＬ１Ａとインキュベーションした後に細胞を溶解または透過処理する。その後、細胞をＤＲ３および／またはＮＦ−κＢのリン酸化レベルについてリン酸化ＤＲ３およびＮＦ−κＢのウエスタンブロッティングによって分析する。その後、細胞抽出物を調製し、それぞれの蛋白質を、抗ＤＲ３特異的抗体、抗ＮＦ−κＢ特異的抗体およびハウスキーピング遺伝子（アクチンなど）特異的抗体を用いて免疫沈降する。沈降させた蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる電気泳動に供し、次にＤＲ３特異的抗体およびリン酸化チロシン特異的抗体を用いることによってウエスタンブロッティングを行うことによりＤＲ３のリン酸化に対する阻害活性を測定することができる。
【０２１５】
代替的には、抗体を加えた培養細胞を、ホルムアルデヒドおよびサポニンを用いる蛋白質固定化および細胞膜透過処理に供し、ＤＲ３特異的抗体、リン酸化ＮＦ−κＢ特異的抗体またはリン酸化チロシン特異的抗体を用いてＦＣＭ分析を実施する。ＤＲ３のリン酸化もこの方法で確認することができる。加えて、ＤＲ３の三量体化に関して、培養および細胞ライセートの調製は、上記のリン酸化を検出するための試験と同じ方法で行い、その後、沈降した蛋白質を検出するために抗ＤＲ３抗体を用いてＤＲ３蛋白質を免疫沈降する。これによって、ＤＲ３の三量体化を検出することができる。
【０２１６】
また、ＴＬ１Ａ依存的なＴ細胞の増殖、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのような炎症性サイトカインの放出も同じ方法で分析する。
【０２１７】
４．本発明の抗ＤＲ３モノクローナル抗体または該抗体断片を用いて疾患を治療するための方法
ＤＲ３の自然の立体配座構造（三次元構造）を特異的に認識して細胞外領域に結合する本発明の抗体または該抗体断片は、ＤＲ３に関連する疾患を治療するために用いることができる。
【０２１８】
一実施形態において、本発明の抗体または抗体組成物は、本明細書に記載の疾患、障害または症状を治療、軽減または予防するために用いることができる。好ましい実施形態において、本発明の抗体はＤＲ３の細胞外ドメインに結合し、ＤＲ３の活性を中和し、自体の結合によってＤＲ３を活性化せず、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患およびそれらの疾患に関連する症状を治療、予防または軽減するために用いられる。
【０２１９】
好ましい実施形態において、ＤＲ３の細胞外領域に結合する本発明の抗体、抗体バリアントまたは該抗体断片は、炎症性包含疾患、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アレルギー、急性または慢性反応性気道疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アトピー性疾患、アトピー型喘息、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、好酸球浸潤型喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、アテローム性動脈硬化、骨粗鬆症、多発性硬化症（ＭＳ）、癌の骨転移、血液癌、頭頸部癌、脳の癌、肺癌、食道癌、消化器癌、胃癌、腸の癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、泌尿器癌、肝臓癌、胆嚢癌、骨癌などの固形癌および癌の転移を治療するために用いることができる。
【０２２０】
自己免疫疾患としては、本発明の抗体または抗体組成物によって治療することができ、次から選択される少なくとも１つの疾患が挙げられる。多発性硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発軟骨炎、リウマチ性心臓病、神経炎、ぶどう膜炎、眼炎、多腺性内分泌不全症、紫斑病［例えば、ヘノッホ（Henloch）・シェーンライン紫斑病］、ライター症候群、スティッフマン症候群、自己免疫性肺炎症、自閉症、ギラン・バレー症候群、インスリン依存型糖尿病（diabetes mellitis）（ＩＤＤＭ）および自己免疫性炎症性眼疾患、自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち橋本病）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、例えば（ａ）グレーブス病、（ｂ）重症筋無力症および（ｃ）インスリン抵抗性などの受容体自己免疫、自己免疫性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を有する強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、不妊、慢性腎不全（ＣＲＦ）、糸球体腎炎（ＧＮ）、ネフローゼ、ＩｇＡ腎症、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、アドレナリン作動薬抵抗性（喘息または嚢胞性線維症）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白班、血管炎、ＭＩ開心術後症候群、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、炎症性ミオパチー、並びに他の炎症性、肉芽腫性（granulamatous）、変性性および萎縮性疾患。また、上記の同定された疾患に関連づけられる任意の合併症も、本発明の医薬により治療し得る症状に含まれる。
【０２２１】
投与経路としては、例えば、口腔内、気管内、直腸内、皮下、筋肉内または経静脈投与などの経口投与および非経口投与が挙げられる。抗体またはペプチド製剤の場合には経静脈投与が好ましい。剤形としては、例えば、スプレー剤、カプセル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、シロップ、エマルション、座薬、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。
【０２２２】
経口投与に好適な医薬製剤としては、エマルション、シロップ、カプセル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤などが挙げられる。エマルションおよびシロップなどの液体製剤は、添加剤として、水、スクロース、ソルビトールおよび果糖などの糖、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、胡麻油、オリーブオイルおよび大豆油などの油、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルなどの防腐剤、イチゴ味およびペパーミントなどの香料などを用いて製造することができる。カプセル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤などは、添加剤として、ラクトース、グルコース、スクロースおよびマンニトールなどの賦形剤、澱粉およびアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの滑剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造することができる。非経口投与に好適な医薬製剤としては、注射剤、座薬、スプレー剤などが挙げられる。注射剤は、塩溶液、グルコース溶液またはその両方の混合物などの担体を用いて調製することができる。座薬は、カカオバター、硬化油脂またはカルボン酸などの担体を用いて調製することができる。スプレー剤は、抗体または該抗体断片をそのまま用いて、または、患者の口腔または気道粘膜を刺激せず、微粒子として分散させることによって化合物の吸収を容易にし得る担体と一緒に用いて調製することができる。担体としてはラクトース、グリセロールなどが挙げられる。エアロゾルおよび乾燥粉末剤などの医薬製剤を製造することができる。加えて、経口製剤の添加剤として例示した成分は非経口製剤にも添加することができる。
【０２２３】
５．本発明の抗ＤＲ３モノクローナル抗体または該抗体断片を用いて疾患を診断するための方法
ＤＲ３に関連する疾患は、本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いてＤＲ３またはＤＲ３発現細胞を検出または測定することによって診断することができる。ＤＲ３に関連する疾患の１つである炎症性疾患の診断は、例えば次の通りのＤＲ３の検出または測定によって実施することができる。
【０２２４】
炎症性疾患の診断は、フローサイトメーター（ＦＣＭ）などの免疫学的方法によって患者体内の細胞上のＤＲ３発現を検出することによって実施することができる。免疫学的方法は、標識した抗原または抗体を用いて抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的方法としては、例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、発光免疫アッセイ、ウエスタンブロッティング法、物理化学的手段などが挙げられる。
【０２２５】
放射性物質標識免疫抗体法としては、例えば、本発明の抗体または該抗体断片を抗原、抗原発現細胞などと反応させた後、放射性標識した抗免疫グロブリン抗体またはその結合断片を反応させて、シンチレーションカウンターなどを用いて測定を行う方法が挙げられる。
【０２２６】
酵素免疫アッセイとしては、例えば、本発明の抗体または該抗体断片を抗原、抗原発現細胞などと反応させた後、抗体標識した抗免疫グロブリン抗体またはその結合断片を反応させ、有色色素を分光測色計によって測定する方法が挙げられ、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡを用いることができる。酵素免疫アッセイに用いられる標識としては、任意の公知の酵素標識（「酵素免疫測定法」医学書院刊、１９８７）を、既に記載の通り用いることができる。例えば、アルカリホスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、ビオチン標識などが挙げられる。
【０２２７】
サンドイッチＥＬＩＳＡは、抗体を固相に結合し、検出または測定される抗原を捕捉し、捕捉された抗原と別の抗体を反応させる方法である。ＥＬＩＳＡでは、検出もしくは測定される抗原を認識し抗原認識部位が異なる２種類の抗体または該抗体断片を調製し、第１の抗体または該抗体断片を先に（９６ウェルプレートなどの）プレート上に吸着させ、第２の抗体または該抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素またはビオチンによって標識する。
【０２２８】
前記抗体が吸着されたプレートを、生体から分離された細胞またはその破砕細胞懸濁液、組織またはその分解溶液、培養細胞、血清、胸水、腹水、点眼液などと反応させた後、標識されたモノクローナル抗体または該抗体断片と反応させて、標識物質に対する検出反応を実施する。試験サンプル中の抗原濃度は、既知濃度の抗原の段階希釈によって調製された検量曲線から計算することができる。サンドイッチＥＬＩＳＡに用いられる抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれかを用いてもよく、またはＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）２などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡに用いられる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体もしくは抗体断片の組み合わせを用いてもよく、またはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体もしくは抗体断片との組み合わせを用いてもよい。
【０２２９】
蛍光免疫アッセイとしては、文献［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third Edition, Academic Press (1996)、「単クローン抗体実験マニュアル」講談社サイエンティフィク（１９８７）］に記載の方法などが挙げられる。蛍光免疫アッセイのための標識としては、公知の蛍光標識のいずれか［「図説蛍光抗体法」川生明、ソフトサイエンス（１９８３）］を既に記載の通り用いることができる。標識としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどが挙げられる。
【０２３０】
発光免疫アッセイは、文献［「生物発光と化学発光」臨床検査、４２、廣川書店（１９９８）］に記載の方法などを用いて実施することができる。発光免疫アッセイに用いられる標識としては、公知の発光標識のいずれかを用いることができる。例えば、アクリジニウムエステルが挙げられ、ロフィンなどを用いることができる。
【０２３１】
ウエスタンブロッティングは、抗原または抗原発現細胞をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し［Antibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)］、ゲルをＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、膜を抗原認識抗体または該抗体断片と反応させ、さらに、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などによって標識された抗マウスＩｇＧ抗体または該抗体断片と反応させ、標識を可視化して反応を確認する方法である。その例を下記において説明する。
【０２３２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する細胞または組織を溶液中に溶解し、還元条件下で、０．１〜３０μｇをレーン当りの蛋白質量としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって電気泳動する。電気泳動された蛋白質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし、１〜１０％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（以下「ＢＳＡ−ＰＢＳ」と言う）と室温にて３０分間、ブロッキングのために反応させる。さらに、本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５〜０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下「Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ」と言う）によって洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧと室温にて２時間反応させる。
【０２３３】
Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳによって洗浄し、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャム社製）などを用いて、モノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。ウエスタンブロッティングの検出に用いられる抗体としては、天然型の三次元構造を有さないポリペプチドに結合し得る抗体を用いる。
【０２３４】
物理化学的方法は、具体的には、抗原としてのＤＲ３を本発明の抗体または該抗体断片と反応させて凝集塊を形成させ、該凝集塊を検出することによって実施する。他の物理化学的方法としては、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法［「臨床検査法提要」金原出版（１９８８）］などが挙げられる。例えば、ラテックス免疫拡散法では、抗体または抗原によって感作された約０．１〜１μｍの粒径を有するポリスチレンラテックスなどの担体を用いることができる。抗原−抗体反応が対応する抗原または抗体を用いて実施するときには、反応溶液の散乱光は増加し、一方、透過光は減少する。かかる変化が吸光度または積分球式濁度として検出されるときには、試験サンプル中の抗原濃度などを測定することができる。
【０２３５】
ＤＲ３発現細胞の検出には公知の免疫学的検出法を用いることができ、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法、蛍光抗体染色法などが用いられる。
【０２３６】
免疫沈降法は、ＤＲ３発現細胞を本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロースなどの免疫グロブリンに対する特異的な結合能力を有する担体を加えて、抗原−抗体複合体が沈降するようにする方法である。また、次の方法を実施することができる。
【０２３７】
本発明の上記の抗体または該抗体断片をＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレート上に固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによってブロッキングする。抗体がハイブリドーマ細胞の培養上清などの未精製状態であるときには、抗マウス免疫グロブリンもしくはラット免疫グロブリンまたはプロテインＡもしくはプロテインＧなどをＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレート上に先に吸着させ、ＢＳＡ−ＰＢＳによってブロッキングし、ハイブリドーマ細胞の培養上清を結合のためにそこに分注する。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てて残さをＰＢＳによって十分に洗浄した後、ＤＲ３発現細胞または組織の溶解溶液との反応を実施する。良く洗浄したプレートからＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプル緩衝液によって免疫沈降物を抽出し、上記のウエスタンブロッティングによって検出する。
【０２３８】
免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、必要な場合には、抗原が発現されている細胞または組織を界面活性剤、メタノールなどによって処理して、抗体を細胞または組織に浸透し易くし、その後本発明のモノクローナル抗体を反応させた後、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識した抗免疫グロブリン抗体または該結合断片と反応させ、標識を顕微鏡下で可視化して観察する方法である。
【０２３９】
加えて、組織の細胞は免疫蛍光染色法によって検出することができ、細胞を蛍光標識抗体と反応させ、フローサイトメーターによって分析し［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third Edition, Academic Press (1996)、「単クローン抗体実験マニュアル」講談社サイエンティフィク（１９８７）］、細胞を蛍光標識抗体と反応させ、フローサイトメーターによって分析する。特に、ＤＲ３の細胞外領域に結合する本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片は、天然型三次元構造を維持するポリペプチドを発現する細胞を検出することができる。
【０２４０】
加えて、蛍光抗体染色法のうちＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステムズ社製）などを用いる場合には、抗原量または抗体量は、形成された抗体−抗原複合体および抗体−抗原複合体の形成に関わっていない遊離の抗体または抗原を分離することなく測定することができる。
【０２４１】
以下、本発明を、実施例によって説明する。しかしながら、本発明は次の実施例に限定されない。
【実施例】
【０２４２】
実施例１．ベクターの構築
以下では、抗体または該抗体断片中のアミノ酸残基の番号は、ＫａｂａｔらによるＥＵナンバリングシステムにより定められる［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］。
【０２４３】
（１）可溶性のヒトＦｌａｇ−ＴＬ１Ａ（ＥＣ）用の発現ベクター
ヒトＴＬ１Ａ（配列番号２）の細胞外ドメイン（ＥＣ）のアミノ末端に融合したＦｌａｇ（登録商標）タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫのアミノ酸配列、以下、単に「Ｆｌａｇ」とも称する）からなる組換え型の可溶性ヒトＴＬ１Ａ蛋白質（ＴＮＦＳＦ１５）（アクセッションＮＭ＿００５１１８．２の７１〜２５１番目のアミノ酸残基）を、次に記載の通り作製した。「オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」法を用いて、ｈＴＬ１Ａ（ＥＣ）に融合したＶＣＡＭシグナルペプチドおよびＦｌａｇ（登録商標）タグ配列（配列番号１）をコードするｃＤＮＡを作製し、同時に、哺乳類発現ベクターにキメラｃＤＮＡ断片を挿入するために後に用いられるフランキング制限部位を付加した。
【０２４４】
ヒトＴＬ１ＡをコードするｃＤＮＡをヒトリンパ腫Ｕ−９３７細胞株（ＡＴＣＣのＣＲＬ−１５９３．２）から単離した。そのためには、製造者の取扱説明書に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（キアゲンカタログ番号７４１０４）を用い、トータルＲＮＡをＵ−９３７細胞から単離した。製造者の取扱説明書に従ってＶＩＬＯｃＤＮＡ合成キット（ライフテクノロジーズカタログ番号１１７５４−０５０）を用いて、逆転写酵素（ＲＴ）反応によってトータルｃＤＮＡを作製した。ヒトＴＬ１ＡのｃＤＮＡを、ＰＣＲによって、次のプライマーｈＴＬ１Ａ＿Ｆ（配列番号４１）およびｈＴＬ１Ａ−３’＿Ｒ（配列番号４２）を用いて、製造者の取扱説明書に従ってＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼキット（Ｎｏｖａｇｅｎ／東洋紡カタログ番号７１０８６−３）によって増幅した。
【０２４５】
哺乳類細胞からの蛋白質の分泌のためには、Ｆｌａｇ配列が直後にあるヒト血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）からのシグナルペプチドを「オーバーラップＰＣＲ」によってｈＴＬ１Ａの５’末端に導入した。ＳａｌＩ制限部位が５’末端に付加され、ｈＴＬ１Ａをコードする１３ヌクレオチドが３’末端に付加されたＶＣＡＭ−ＦｌａｇをコードするＰＣＲ断片を、それぞれフォワードおよびリバースプライマーＶＣＡＭ−Ｆｌａｇ−ＳａｌＩ−Ｆ（配列番号４３）およびＶＣＡＭ−Ｆｌａｇ＿ｈＴＬ１Ａ＿Ｒ（配列番号４６）によって作製した。ｈＴＬ１Ａの７１〜２５１のアミノ酸残基（アクセッションＮＭ＿００５１１８．２）をコードし、Ｆｌａｇタグの末端と同一の１３ヌクレオチドが３’末端に付加され、ＢａｍＨＩ部位が３’末端に付加された第２のＰＣＲ断片を、それぞれフォワードおよびリバースプライマーＶＣＡＭ−Ｆｌａｇ（登録商標）＿ｈＴＬ１Ａ＿Ｆ（配列番号４５）およびｈＴＬ１Ａ−ＥＣ＿ＢａｍＨＩ−Ｒ（配列番号４４）によって作製した。
【０２４６】
２つの前記ＰＣＲ産物を単離し、ＰＣＲ反応１からのフォワードプライマー［ＶＣＡＭ−Ｆｌａｇ−ＳａｌＩ−Ｆ（配列番号４３）］および反応２からのリバースプライマー［ｈＴＬ１Ａ−ＥＣ＿ＢａｍＨＩ−Ｒ（配列番号４４）］と一緒に第３のＰＣＲ反応に添加し、ＶＣＡＭ−Ｆｌａｇ−ｈＴＬ１Ａ蛋白質をコードする全長ｃＤＮＡを得た（配列番号２）。該ＰＣＲ断片を、ｐＫＴＡＢＥＸ−ＴＣ２６発現ベクター（国際公開第２０１３／００５６４９号）のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限部位に、製造者の取扱説明書に従ってＤＮＡリガーゼＭｉｇｈｔｙＭｉｘ（タカラカタログ番号６０２３）を用いてクローニングした。ＤＮＡ配列はサンガーシークエンシングによって確認した（ＧＥＮＥＷＩＺ、カリフォルニア州サンディエゴ）。ＶＣＡＭ−Ｆｌａｇ−ｈＴＬ１Ａ蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むベクターを構築した。
【０２４７】
（２）可溶性のヒトＤＲ３（ＥＣ）−ｈＧ１Ｆｃ用の発現ベクター
ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したヒトＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）のアミノ末端（Ｎ末端）細胞外（ＥＣ）ドメイン（ＮＭ＿００３７９０．２）からなる可溶性のキメラＦｃ融合蛋白質を作製した。ヒトＤＲ３の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、ヒトＴＬ１Ａについて上記の通りＵ−９３７細胞から単離し、ＤＲ３（ＥＣ）−ｈＧ１Ｆｃ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、上記の実施例１．１に記載のオーバーラップＰＣＲによって、ｈＤＲ３＿Ｆ５’（配列番号４７）およびｈＤＲ３−ＥＣ＿Ｒ（配列番号４８）のプライマーを用いて作製した。
【０２４８】
ｈＤＲ３−ＥＣをコードするＤＮＡ配列（配列番号３で示される１〜６０３番目、配列番号４で示される１〜２０１番目のアミノ酸残基をコードする）を、ＰＣＲによって、鋳型のｃＤＮＡ（上記）、フォワードプライマーｈＤＲ３−ＳａｌＩ＿Ｆ（配列番号４９）およびリバースプライマーｈＤＲ３＿ｈＧ１Ｆｃ＿Ｒ（配列番号６０）を用いて増幅した。ＳａｌＩ制限部位およびヒトＩｇＧ１のＦｃの５’末端のヌクレオチドの数個が、それぞれｈＤＲ３の５’末端および３’末端に導入されている。２１６〜４４７番目のアミノ酸残基（ＥＵナンバリング、Ｋａｂａｔら）をコードするヒトＩｇＧ１のＦｃのｃＤＮＡを（配列番号５および６）、上記の通りＰＣＲによって増幅し、ｈＤＲ３（ＥＣ）の３’末端と相同な５’ヌクレオチドと３’のＢａｍＨＩ制限部位とを付加した。それぞれ、プライマーｈＤＲ３＿ｈＧ１Ｆｃ＿Ｆ（配列番号５１）およびｈＧ１Ｆｃ＿ＢａｍＨＩ−Ｒ（配列番号４２）を用いた。完全なｈＤＲ３（ＥＣ）−ｈＧ１ＦｃのｃＤＮＡを、第３のＰＣＲ反応によって、鋳型としてｈＤＲ３（ＥＣ）およびヒトＩｇＧ１のＦｃを用いてこれらを結合させたＰＣＲ産物と、フォワードプライマーｈＤＲ３−ＳａｌＩ＿Ｆ（配列番号４９）およびｈＧ１Ｆｃ＿ＢａｍＨＩ−Ｒ（配列番号５２）とを用いて作製した。得られたＰＣＲ断片をｐＫＴＡＢＥＸ−ＴＣ２６のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングし、ＤＲ３（ＥＣ）−ｈＧ１Ｆｃ蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むベクターを作製した。
【０２４９】
（３）可溶性のヒトＤＲ３（ＣＲＤ１）−マウスＧ１Ｆｃ用の発現ベクター
介在する短鎖ポリグリシンリンカーペプチド（アミノ酸配列ＡＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号８）によってマウスＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したヒトＤＲ３の「システインリッチドメイン（ＣＲＤ）１」（配列番号８で示される１〜７１番目のアミノ酸残基。完全な融合蛋白質配列はシグナルペプチドを含む）を含有するヒトＤＲ３のより短いＮ末端領域からなる、可溶性のキメラＦｃ融合蛋白質を作製した。上記と同様に「オーバーラップＰＣＲ」法を用いた。
【０２５０】
シグナルペプチドおよびヒトＤＲ３のＣＲＤ１（配列番号７で示される１〜２１３番目のヌクレオチド配列、配列番号８で示されるアミノ酸１〜７１をコードする）を、Ｕ−９３７細胞から単離したｃＤＮＡから、上記の通り、それぞれ５’ＳａｌＩ部位およびフランキング３’ポリグリシンｃＤＮＡを付加するフォワードプライマーｈＤＲ３−ＳａｌＩ＿Ｆ（配列番号４９）およびリバースプライマーｈＤＲ３−ｐＧ−ＮｈｅＩ＿Ｒ（配列番号５３）を用いてＰＣＲ増幅した。マウスＩｇＧ１のＦｃ断片（配列番号７で示される２５６〜９３６番目のヌクレオチド配列）を、それぞれフランキング５’ポリグリシンｃＤＮＡおよび３’ＢａｍＨＩ部位を付加するフォワードプライマーｍＧ１Ｆｃ−ｐＧ−ＮｈｅＩ＿Ｆ（配列番号５４）およびリバースプライマーｍＧ１Ｆｃ＿ＢａｍＨＩ−Ｒ（配列番号５５）によって増幅した。ｈＤＲ３（ＣＲＤ１）およびｍＧ１ＦｃのｃＤＮＡを、第３のＰＣＲによって、上記の通り、プライマーｈＤＲ３−ＳａｌＩ＿Ｆ（配列番号４９）およびｍＧ１Ｆｃ＿ＢａｍＨＩ−Ｒ（配列番号５５）を用いて融合した。ＰＣＲ断片をｐＫＴＡＢＥＸ−ＴＣ２６のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングし、シークエンシング（ＧＥＮＥＷＩＺ、カリフォルニア州サンディエゴ）によって上記の通り確認した。
【０２５１】
（４）表面に結合したヒトまたはマウスＤＲ３ΔＤＤを発現するためのベクター
細胞質「デスドメイン」の多くを欠くヒトまたはマウスＤＲ３蛋白質の細胞表面発現用に、ベクターを構築した。「デスドメイン」は、ヒトＤＲ３の細胞質ドメインの膜遠位カルボキシル末端（Ｃ末端）領域内の３４６〜４１７番目（Migone et al., Immunity, 2002; 16: 479-492）または３３２〜４１２番目（Wang et al., Immunogenetics, 2001, 3553:59-63）のアミノ酸残基として様々に定義され、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５およびＤＲ６を含む他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに共通であり、ＤＲ３が外来性に過剰発現されるときに観察されるこれらの蛋白質の細胞傷害性の原因であることが示されている。ｈＤＲ３ΔＤＤと名付けたこのデスドメイン欠失ヒトＤＲ３（配列番号９で示されるヌクレオチド配列、配列番号１０で示される１〜３４５番目のアミノ酸残基をコードする）を、ＰＣＲによって、フォワードプライマーｈＤＲ３−ＳａｌＩ＿Ｆ（配列番号４９）およびリバースプライマーｈＤＲ３ΔＤＤ−ＢａｍＨＩ＿Ｒ（配列番号５６）並びに先に調製されたＤＲ３（ＥＣ）のｃＤＮＡを鋳型として用いて増幅した。シクロヘキシミド（ＣＨＸ）耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子（ＮＥＯ）に置換されたｐＫＴＡＢＥＸ−ＴＣ２６ベクターにＰＣＲ断片を挿入して、ｈＤＲ３−ΔＤＤ蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むベクターを作製した。
【０２５２】
その上、ＤＤを欠くマウスＤＲ３蛋白質用には、マウスＤＲ３のｃＤＮＡをＣ５７／ＢＬ６マウスの脾臓からプライマーｍＤＲ３＿Ｆｗｄ（配列番号５７）およびｍＤＲ３＿３’＿Ｒ（配列番号５８）を用いて調製し、ｍＤＲ３−ΔＤＤ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによって、フォワードプライマーｍＤＲ３−ＳａｌＩ＿Ｆ（配列番号５９）、リバースプライマーｍＤＲ３（１−３２４）＿ＢａｍＨＩ＿Ｒ（配列番号６０）およびｍＤＲ３のｃＤＮＡを鋳型として用いて調製した。最後に、ｍＤＲ３−ΔＤＤ蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むベクターを前の方法と同様に作製した。
【０２５３】
実施例２．安定発現株の作製
（１）表面ヒトＤＲ３ΔＤＤを発現するマウスＥＬ４安定発現株
発現ベクターを親リンパ腫細胞株ＥＬ４（ＡＴＣＣカタログ番号ＴＩＢ−３９）に導入することによって、組換え表面ヒトＤＲ３を発現するマウス安定発現株を作製した。１×１０７個のＥＬ４細胞を氷冷ＰＢＳによって洗浄して、４００μＬの氷冷ＰＢＳ中に懸濁した後、細胞懸濁液にｈＤＲ３−ΔＤＤ用の１０μｇの発現ベクターおよび２５μｇのＴｏｌ２トランスポゼース発現ベクター（国際公開第２０１３／００５６４９号）を混合し、０．４ｃｍギャップキュベット（バイオラッドカタログ番号１６５−２０８８）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（バイオラッドカタログ番号１６５−２０７５）を用いてエレクトロポレーションした（設定：３００Ｖ、９６０μＦ）。トランスフェクション後２４時間後に、細胞を１ｍｇ／ｍＬジェネティシン（「Ｇ４１８」とも称される、ライフテクノロジーズカタログ番号１０１３１−０３５）による選別下に１９日間置いた。ヒトＤＲ３の細胞表面発現が高い細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤバイオサイエンス）を用いて選別した。そのためには、細胞をビオチン抗ヒトＤＲ３（ＴＲＡＭＰ）抗体（クローンＪＤ３。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０７１０４）、次にストレプトアビジン−フィコエリトリン（ジャクソンイムノリサーチカタログ番号０１６−１１０−０８４）によって染色した。得られた細胞株は、その後、フローサイトメトリーによって、安定で高いｈＤＲ３の表面発現を確認した。
【０２５４】
（２）表面ヒトまたはマウスＤＲ３ΔＤＤを発現するＣＨＯ−Ｋ１安定発現株
組換え表面ヒトまたはマウスＤＲ３を発現する懸濁液のＣＨＯ−Ｋ１安定発現株も、ＥＬ４−ＤＲ３細胞株について記載の通り作製した。簡潔に言えば、３５０Ｖおよび５００μＦを用いる上記の例２（１）の同じベクターのエレクトロポレーションを行い、限界希釈を用いて高発現クローンを選別する前に０．５〜１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８での選別を１７日間行った。
【０２５５】
（３）哺乳類一過性発現による可溶性の組換え蛋白質および抗体の産生
大部分の抗体および蛋白質を産生させるために、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（ライフテクノロジーズカタログ番号Ｒ７９０−０７）またはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞（ライフテクノロジーズカタログ番号Ｒ８００−０７）の懸濁培養液を、製造者の取扱説明書に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸトランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズカタログ番号１６４４７−１００）を用い、１．２５μｇベクターＤΝＡ／μＬ培養液を用いて、１：１（ｗ／ｖ）比のＤΝＡ対Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズカタログ番号３１９８５−０７０）によって希釈されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸトランスフェクション試薬を用いて、所望の発現ベクターによってトランスフェクションした。形質転換体を、その後に、２９３−Ｆ細胞を用いる場合にはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（ライフテクノロジーズカタログ番号１２３３８−０１８）で、またはＣＨＯ−Ｓ細胞を用いる場合にはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ発現培地（ライフテクノロジーズカタログ番号１２６５−０１４）で、６日間培養した。上清を、遠心分離し、次に０．２２μｍ濾過［ミリポアＳｔｅｒｉＣｕｐ（登録商標）フィルターユニット］によって清澄化した。その後、この材料をアッセイに直接的に用いるか、またはＴＬ１Ａ−ｆｌａｇ、ＤＲ３−ｈＧ１Ｆｃ、ＤＲ３−ｍＧ１Ｆｃ、もしくは抗体などの組換え蛋白質を本明細書の他所に記載の通り精製した。
【０２５６】
（４）ＣＨＯ−Ｋ１安定発現株からの可溶性のヒトＤＲ３（ＥＣ）−ｈＧ１Ｆｃの産生
ＣＨＯ−Ｋ１安定発現株を、可溶性のヒトＤＲ３−ｈＧ１Ｆｃ蛋白質のより大スケールの産生用に作製した。４００μＬの氷冷ＰＢＳ中の１×１０７個のＣＨＯ−Ｋ１細胞、１０μｇの発現ベクターｐＫＴＡＢＥＸＴＣ２６−ｈＤＲ３−ｈＧ１Ｆｃおよび２５μｇのＴｏｌ２トランスポゼースベクターを０．４ｃｍギャップキュベットに移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（設定：３５０Ｖ、５００μＦ）を用いてエレクトロポレーションした。細胞を直ちに９６ウェルプレートに移し、３μｇ／ｍＬシクロヘキシミド（ＣＨＸ）（シグマカタログ番号Ｃ４８５９）による選別を４日後に開始した。１４〜２１日間の選別後に、可溶性のＩｇＧのＦｃについてサンドイッチＥＬＩＳＡによってウェルをスクリーニングした。高力価のウェルを増やし、最終的な高発現株が選別されるまで細胞をさらなる力価試験にかけた。
【０２５７】
ＣＨＯ−Ｋ１安定発現株からのヒトＤＲ３（ＥＣ）−ｈＧ１Ｆｃの産生は、流加産生法を用いて、ＣＨＯ−ＣＤ−ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ−ＡおよびＦｅｅｄ−Ｂ（それぞれライフテクノロジーズカタログ番号Ａ１０２３４−０１およびカタログ番号Ａ１０２４０−０１）を用いて行った。細胞を所望の体積までスケールアップし、Ｆｅｅｄ−ＡおよびＦｅｅｄ−Ｂの混合物をフィードした。細胞の生存率が８０％未満に低下したときに培養上清を収集し、遠心分離後、０．２２μｍ濾過によって清澄化した。
【０２５８】
実施例３．抗ＤＲ３モノクローナル抗体の樹立
（１）マウス免疫処理
Ｋｉｒｉｎ−Ｍｅｄａｒｅｘ（ＫＭ）マウス（ヒトＩｇ遺伝子座を含有する）［国際公開第０２／４３４７８号、国際公開第０２／０９２８１２号、Ishida, et al., IBC's 11.sup.th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2000)、Kataoka, S. IBC's 13.sup.th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2002)］を、５０μｇのヒトＤＲ３−Ｆｃ融合蛋白質またはＤＲ３発現ＥＬ４細胞によって、シグマアジュバントシステム（ＳＡＳ）（カタログ番号Ｓ６３２２）で第０、１４および２１日目に免疫処理した。血清抗ｈＤＲ３力価は、典型的には、ヒトＤＲ３発現ＣＨＯ細胞に対するフローサイトメトリーでの結合によって判定した。適切な力価を有するマウス（典型的には１：１０，０００という終点希釈を見せる）を、ＤＲ３−ＦｃまたはＤＲ３−ＥＬ４細胞によって最後に１回だけ免疫処理した。マウスは、最後の追加免疫後、３日後に屠殺した。
【０２５９】
（２）ハイブリドーマの作製
免疫処理したマウスから脾臓を切除し、単細胞の脾臓細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞を１：５でＳｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣのＣＲＬ−１５８１）融合パートナー細胞と混合し、２０ｍＬの加温したＤＭＥＭ（インビトロジェン）によって３回洗浄した。培地を最後の洗浄から吸引し、１ｍＬの加温したＰＥＧ１５００（ベーリンガー・マンハイム）を穏やかな混合をしながら１分間かけて細胞に滴下した。得られたＰＥＧ１５００細胞懸濁液を追加の２分間穏やかに混合し、次に、全て穏やかな撹拌をしながら、一連の加温したＤＭＥＭ滴下を行った（１分間かけて１ｍＬ、その後３分間かけて３ｍＬ、その後１分間かけて１０ｍＬ）。
【０２６０】
融合混合物を５分間３７℃にてインキュベーションした。細胞を遠心分離によってペレット状にし、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０ｐｇ／ｍＬの組換えＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ２０６−ＩＬ−０５０）を補ったＤＭＥＭ中に１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。融合混合物を１００μＬ／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに分け、一晩培養した。翌日に１００μＬのＤＭＥＭ−２×ＨＡＴサプリメント（シグマアルドリッチ）含有培地（以下ＤＭＥＭ／ＨＡＴと称する）を添加し、プレートをさらに３日間培養した。培養培地の７５％を１×ＤＭＥＭ／ＨＡＴと交換し、ハイブリドーマ細胞をさらに２〜４日間培養した。
【０２６１】
（３）抗体の選別
マルチウェルプレートの上清を、ヒトＤＲ３発現ＣＨＯ細胞（以下ＣＨＯ／ＤＲ３とも称する）に対するフローサイトメトリーでの結合によってスクリーニングした。細胞は、１０，０００／ウェルで９６ウェルプレート丸底アッセイプレート中、１５分間、４℃においてハイブリドーマの未希釈上清とインキュベーションした。細胞を遠心分離によってペレット状にし、２００μＬのＰＢＳ／０．５％ウシ胎児血清によって洗浄した。遠心分離後に、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ−フィコエリトリン（ジャクソンイムノリサーチ１０９−１１５−０９８）を含有する２００μＬのＰＢＳ／０．５％ウシ胎児血清中に細胞を再懸濁し、４℃にて１５分間インキュベーションした。細胞を上記の通り洗浄し、２００μＬのＰＢＳ／０．５％ウシ胎児血清中に再懸濁した。＞５０００の細胞をＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター［ベクトン（Beckton）・ディッキンソン］上で取り込んだ。結果はＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）を用いて分析した。その結果、抗ＤＲ３モノクローナル抗体を産生する１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂを含むハイブリドーマクローンを樹立した。
【０２６２】
ＤＲ３結合抗体産生ハイブリドーマ株を増やし、上清の抗体を従来の方法論に従って精製した。抗体蛋白質の精製：ヒトモノクローナル抗体を、培養培地から組換えＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅプロテインＡアフィニティー樹脂（ＧＥヘルスケアライフサイエンス、ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いて精製した。馴化培地を０．２２μｍ吸引フィルターユニット（ミリポア、マサチューセッツ州ベッドフォード）によって濾過し、培地中のヒト抗体の量に合った適切な容量のプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス、ペンシルベニア州ピッツバーグ）にロードした。カラムを５カラム体積のＰＢＳによって完全に洗浄し、抗体を０．１ＭのＧｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ３．６）によって溶出し、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によって中和した。
【０２６３】
画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、陽性画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した（Ｇｉｂｃｏ、ライフテクノロジーズ、ニューヨーク州グランドアイランド）。透析後に、抗体サンプルを遠心濃縮装置［Ｖｉｖａｓｐｉｎ、５０，０００ＭＷＣＯ。ザルトリウス、独国ゲッティンゲン］によって濃縮した。最後に、０．２２μｍ孔径のシリンジフィルターを用いて抗体を濾過滅菌し、抗体濃度をローリー法によって決定した。発熱物質の含量は、ＦＤＡ承認済みのＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳカブトガニアメーバ細胞ライセート（ＬＡＬ）アッセイ（チャールズリバー・ラボラトリーズ）を用いて測定した。該アッセイの検出限界は０．０１ＥＵ／ｍＬである。試験が陰性であった場合には、サンプルをエンドトキシン不含と見なした。
【０２６４】
精製した抗体は、下記の通りＤＲ３アゴニズム／アンタゴニズムについて判定した。いくつかの融合によって、１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂを含む抗ヒトＤＲ３モノクローナル抗体を樹立し、これらの２つの抗体について遺伝子クローニングおよびさらなる特性評価を行った。
【０２６５】
実施例４．抗ＤＲ３モノクローナル抗体の遺伝子クローニング
（１）ハイブリドーマ１４２Ａ２および１４２Ｓ３８ＢからのＶＨおよびＶＬ遺伝子の遺伝子クローニングおよびシークエンシング
シグナルペプチドおよび改変された免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）ドメイン［ＶＨは、本明細書において、ヒトゲノムから組み合わさった可変遺伝子（Ｖ）＋多様性遺伝子（Ｄ）＋連結遺伝子（Ｊ）領域を言う］並びにシグナルペプチドおよび免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン［ＶＬは、本明細書において、ヒトゲノムから組み合わさった可変遺伝子（Ｖ）＋連結遺伝子（Ｊ）領域を言う］をコードするｃＤＮＡを、選別されたハイブリドーマ細胞株１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂから５’−ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ＲＮＡ鋳型５’末端スイッチメカニズム−ｃＤＮＡ末端高速増幅−ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて抽出し、サンガーシークエンシングを行った。
【０２６６】
製造者の取扱説明書に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン社カタログ番号７４１０４）を用いて各ハイブリドーマ細胞からトータルＲＮＡを精製した。単離されたＲＮＡを鋳型として用いて、ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ−ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテックカタログ番号６３４９１４）を１４２Ａ２に、または逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（インビトロジェンカタログ番号１８０６４−０１４）と組み合わせたＳＭＡＲＴｅｒ−ＲＡＣＥ−ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテックカタログ番号６３４９２３）を１４２Ｓ３８Ｂに用いて、ＶＨおよびＶＬドメインを増幅した。製造者の取扱説明書に従って、キット由来のプライマーおよび逆転写酵素によって２μｇのハイブリドーマ由来トータルＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを作製した。
【０２６７】
このｃＤＮＡを、ＶＨまたはＶＬ領域および重鎖または軽鎖の定常領域の短い部分のＰＣＲ増幅用の鋳型として用い、全てのヒトγアイソタイプ（プライマーＩｇＧ１、配列番号６１）またはヒトκ（プライマーｈｋ−５、配列番号６２）の定常ドメイン内にアニーリングする遺伝子特異的リバースプライマーをキット提供のユニバーサルフォワードプライマーと組み合わせて用いた。ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ／東洋紡カタログ番号７１０８６−３）を次のサーマルサイクルプログラムに用いた。９４℃にて４分間；９４℃にて３０秒間を５サイクル、６８℃にて２分間；９４℃にて３０秒間、６６℃にて３０秒間および６８℃にて１分間を５サイクル；９４℃にて３０秒間、６４℃にて３０秒間および６８℃にて１分間を２５サイクル；６８℃にて５分間を１サイクル。不十分な１４２Ａ２のＶＨのｃＤＮＡが前記反応から単離されたため、鋳型として第１のＰＣＲ反応からのＤＮＡを用いて部分的なネステッドＰＣＲの第２ラウンドを行った。同じキット提供の（proved）フォワードプライマーを重鎖定常ドメイン内にアニーリングするネステッドリバースプライマー（プライマーＩｇＧ２、配列番号７１）と対にして、ＰＣＲを前記の通り繰り返した。全ての他の抗体断片は第２ラウンドのＰＣＲを必要としなかった。増幅されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡ断片は、製造者の取扱説明書に従ってＺｅｒｏＢｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェンカタログ番号Ｋ２８２０）を用いてＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯプラスミドにクローニングした。
【０２６８】
ＶＨまたはＶＬのｃＤＮＡインサートを含有する多数のプラスミドをサンガーシークエンシングによってシークエンシングし（ＧＥＮＥＷＩＺ社が行った）、プログラムシーケンチャー（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ社製）を用いてアラインメントした。ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡのコンセンサスアラインメント、ＩＭＧＴ／Ｖ−ｑｕｅｓｔプログラム（Brochet, Lefranc et al. 2008）、ＢＬＡＳＴおよびＩｇＢＬＡＳＴを用いて分析した。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）はＫａｂａｔの定義を用いて同定した［Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］。
【０２６９】
同定された配列は次の通りであった。１４２Ａ２−ＶＨ（配列番号１３で示されるヌクレオチド配列、配列番号１４で示されるシグナルペプチドを含むＶＨ領域のアミノ酸配列、配列番号１５で示されるＶＨ領域のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号１６〜１８で示されるＨＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列）、１４２Ａ２−ＶＬ（配列番号１９で示されるヌクレオチド配列、配列番号２０で示されるシグナルペプチドを含むＶＬ領域のアミノ酸配列、配列番号２１で示されるＶＬのアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２２〜２４で示されるＬＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列）、１４２Ｓ３８Ｂ−ＶＨ（配列番号２５で示されるヌクレオチド配列、配列番号２６で示されるシグナルペプチドを含むＶＨ領域のアミノ酸配列、配列番号２７で示されるＶＨ領域のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号２８〜３０で示されるＨＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列）、１４２Ｓ３８Ｂ−ＶＬ（配列番号３１で示されるヌクレオチド配列、配列番号３２で示されるシグナルペプチドＶＬ領域のアミノ酸配列、配列番号３３で示されるＶＬのアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号３４〜３６で示されるＬＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列）。
【０２７０】
（２）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４発現ベクターへのＶＨおよびＶＬのクローニング
それぞれ各ヒトγ定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４バリアント）またはヒトκ定常ドメイン（配列番号３７）を含有する発現ベクターに、内在性のシグナルペプチドを含むＶＨまたはＶＬドメインをコードする同定されたｃＤＮＡを結合することによって、１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂ両方の全長ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４バリアント抗体バージョン発現用ベクターを構築した。この実施例では、ヒトＩｇＧ４定常領域内のＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＲ４０９Ｋのアミノ酸置換を含むＩｇＧ４バリアントを、ヌルボディ（Nullbody）（登録商標）を言う（アミノ酸位置の番号はＥＵインデックスによって定められる）（米国特許出願公開第２００８／００６３６３５号明細書）。この場合、ヌルボディ（登録商標）型抗体はＩｇＧ４ヌルと言う。ＩｇＧ４抗体バリアントは、より低いｐＨまたは酸性条件において増加した安定性を示し、ＩｇＧ４抗体の元の結合特性を保つ抗体であり、結果として該抗体は抗体精製プロセスによってほとんど凝集しない。可変部から定常部の連結部において得られる翻訳されたアミノ酸がハイブリドーマ由来配列から変わらないようにｃＤＮＡを結合した。
【０２７１】
シグナルペプチドおよびＶＨドメインを、５’フランキングＳａｌＩ制限部位を付加するフォワードプライマー［１４２Ａ２ではプライマー１４２Ａ２−ＶＨ＿ＳａｌＩ＿Ｆ（配列番号６７）、１４２Ｓ３８Ｂではプライマー１４２Ｓ３８Ｂ＿ＶＨＦ＿ＳａｌＩ（配列番号６９）］および３’フランキングＮｈｅＩ制限部位を付加するリバースプライマー［１４２Ａ２ではプライマー１４２Ａ２−ＶＨ＿ＮｈｅＩ＿Ｒ（配列番号６８）、１４２Ｓ３８ＢではプライマーＦ４２９＿ＶＨ＿Ｒ１（配列番号７０）］を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、所望のアイソタイプの免疫グロブリン定常ドメイン（ヒトＩｇＧ１（配列番号３８）、ＩｇＧ２（配列番号３９）またはＩｇＧ４ヌル（配列番号４０）のアミノ酸配列）のｃＤＮＡを含有する発現ベクターｐＫＴＡＢＥＸ−ＴＣ２６中のＳａｌＩおよびＮｈｅＩ制限部位にクローニングした。同様に、各抗体のＶＬドメインを増幅して、ヒトκの定常ドメインのｃＤＮＡを含有する同じかまたは異なるベクターのＢｇｌＩＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位に挿入した。シグナルペプチドおよびＶＬを増幅して５’および３’のフランキングＢｇｌＩＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位を付加するために用いたＰＣＲプライマーは次の通りであった。１４２Ａ２ではフォワードプライマー１４２Ａ２＿ＢｇｌＩＩ＿Ｆ（配列番号６５）およびリバースプライマー１４２Ａ２＿ＢｓｉＷＩ＿Ｒ（配列番号６６）、１４２Ｓ３８Ｂではフォワードプライマー１４２Ｓ３８Ｂ＿ＶＬＦ＿ＢｇｌＩＩ（配列番号６３）およびリバースプライマー１４２Ｐ２０＿ＶＬ１＿ＢｓｉＷＩ＿Ｒ（配列番号６４）。抗体の一過性の産生は、上記の実施例２（３）に記載の通りＣＨＯ−Ｓ細胞を用いて行った。
【０２７２】
実施例５．組換えヒトＤＲ３−ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（ｈｕＤＲ３−ｈｕＦｃ）に対する抗ＤＲ３抗体の結合活性のＢｉａｃｏｒｅに基づく評価
組換えヒトＤＲ３蛋白質に対する抗ＤＲ３ヒト抗体１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂの結合活性を速度論的に分析するために、抗体の結合活性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定した。上記した抗体のＦａｂ抗体断片はＰｉｅｒｃｅＦａｂ調製キット（サーモサイエンティフィックＰｉｅｒｃｅ番号４４９８５）に従って得た。次の操作の全てはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて実施した。組換えｈｕＤＲ３−ｈｕＦｃ蛋白質をアミンカップリング化学反応によってＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）上に固定化した。
【０２７３】
具体的には、中程度の蛋白質固定化レベルを達成するために略２０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の組換え蛋白質をチップ上に固定化することによって、速度論的アッセイを実施した。その後、１２ｎＭ濃度から５段階で希釈した抗ＤＲ３抗体Ｆａｂ断片を３０μＬ／分の流量でチップ上に１２０秒間流した。解離時間を３００秒間として、結合曲線を２５℃にて測定した。
【０２７４】
再生はグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）により６０秒間行った。生データは、捕捉されたリガンドなしの参照フローセルおよび緩衝液ブランクからのシグナルの差し引きによって二重補正した。各濃度に対応するセンサーグラムを得た。分析は、１：１ラングミュアフィットモデルを用い、装置付属の分析ソフトウェアＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００判定ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて実施することにより、組換えｈｕＤＲ３−ｈｕＦｃ蛋白質について結合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］および解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］を計算した。
【０２７５】
このようにして得られた個々の抗体の平衡解離定数ＫＤ（ｋｄ／ｋａ）を表１に示す。各抗体の典型的なセンサーグラムを図１Ａおよび図１Ｂに示す。この分析によれば、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂは、ヒトＤＲ３蛋白質に対する有意により高い親和性を１０-９の桁よりも小さいＫＤ値の大きさで有していた。さらに、１４２Ａ２抗体は１４２Ｓ３８Ｂ抗体よりも高い結合速度定数（ｋａ）を有し、他方で１４２Ｓ３８Ｂ抗体は１４２Ａ２抗体よりも高い解離速度定数（ｋｄ）を有していた。
【０２７６】
【表１】
2017511381.tif 000004
【０２７７】
実施例６．抗ＤＲ３モノクローナル抗体のＤＲ３アゴニズムおよびアンタゴニズム
本発明において樹立された抗ＤＲ３モノクローナル抗体のアゴニズムおよびアンタゴニズムを評価するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるｐ６５（ＲｅｌＡ）ＮＦ−κＢサブユニットのリン酸化レベルがＦＣＭ法によって分析される。フィコールを用いる分画密度遠心分離によって健康なボランティアからＰＢＭＣを精製した。ＰＢＭＣの基底ＮＦ−κＢ活性化レベルを安定化するために、ＰＢＭＣを血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン）（以下ＲＰＭＩと称する）中に３７℃にて３０分間置いた。
【０２７８】
抗ＤＲ３モノクローナル抗体のアンタゴニストおよびアゴニスト活性に及ぼすアイソタイプ効果の比較のために、示されている１４２Ａ２−ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４バリアントバージョンのＰＢＭＣのＮＦ−κＢ活性化に及ぼす効果を、下記の通り決定した。アゴニストアッセイでは、６．６７ｎＭの抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ１、１４２−Ａ２−ＩｇＧ２、もしくは１４２Ａ２−ＩｇＧ４ｖ単独、または正の対照の４０ｎＭのＴＬ１Ａ−ｆｌａｇ単独によって、３７℃にて、３０分間、ＲＰＭＩ中において細胞を処理した。アンタゴニストアッセイでは、ＲＰＭＩ中において３７℃にて３０分間、６．６７ｎＭの抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ１、１４２−Ａ２−ＩｇＧ２または１４２Ａ２−ＩｇＧ４ｖの存在下または非存在下において細胞を前処理した後、４０ｎＭのＴＬ１Ａ−ｆｌａｇを添加し、細胞をＲＰＭＩ中において３７℃にて１０分間インキュベーションした。各インキュベーション後に、細胞を抗リン酸化ｐ６５（ベクトン・ディッキンソンカタログ番号５５８４２３）によって染色し、ベクトン・ディッキンソンＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて分析した。
【０２７９】
抗体の用量依存性に関するアンタゴニストアッセイのために、その後、ＲＰＭＩ中において３７℃にて３０分間、各濃度の抗ＤＲ３モノクローナル抗体の存在下または非存在下において細胞を処理した。その後、１μｇ／ｍＬ（４０ｎＭ）の外来性ＴＬ１Ａ−ｆｌａｇを抗体の存在下で１０分間培地に添加し、次にベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）Ｃｙｔｏｆｉｘによる固定およびＢＤ−ＰｈｏｓＦｌｏｗ透過処理緩衝液ＩＩＩ（ベクトン・ディッキンソンカタログ番号５５４７１４）による透過処理を行った。
【０２８０】
抗体の用量依存性に関するアゴニストアッセイのために、細胞を抗体単独、ＲＰＭＩ単独の負の対照、または４０ｎＭの組換えＴＬ１Ａの正の対照によって１０分間処理し、次に上記の固定および透過処理を行った。細胞を抗リン酸化ｐ６５（ベクトン・ディッキンソン５５８４２３）によって染色し、ベクトン・ディッキンソンＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて分析した。
【０２８１】
図２Ａに示すように、正の対照としてのＴＬ１Ａ単独はＰＢＭＣのリン酸化ｐ６５陽性細胞を約４５％まで増加させ、他方で、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ１および抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ４ｖもリン酸化ｐ６５陽性細胞を対照の約８０％または７０％まで増加させた。しかしながら、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ２はリン酸化ｐ６５陽性細胞を対照の１０分の１未満増加させただけであった。したがって、二価ＩｇＧ抗体フォーマットでは、ＩｇＧ２クラスの改変が抗ＤＲ３モノクローナル抗体結合によるアゴニズム能を減少または欠失させ得ることが分かった。この結果から、ＩｇＧ２クラスの抗ＤＲ３モノクローナル抗体は、異常なＤＲ３の活性化によって引き起こされる疾患の治療におけるＤＲ３抗原の純粋なアンタゴニズムに有用となり得ることが分かった。
【０２８２】
その上、図２Ｂに示すように、ＰＢＭＣ中のリン酸化ｐ６５陽性細胞を約５５％増加させるＴＬ１Ａと比較して、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の全ての抗ＤＲ３モノクローナル抗体は、ＴＬ１Ａの結合によって誘導されるｐ６５のリン酸化をほとんど完全に阻害した。したがって、ＩｇＧ２クラスの抗ＤＲ３モノクローナル抗体が、低下したアゴニズムを有するかまたはアゴニズムを有さずに、ＤＲ３のアンタゴニズムを示すといった意外な特性を有することが分かった。これらの結果は、異常なＤＲ３の活性化に関連する疾患に対する純粋なアンタゴニストの１つの候補としてＩｇＧ２クラスの抗ＤＲ３モノクローナル抗体を選択し得るということを明確に示している。
【０２８３】
他方で、図３Ａに示すように、抗ＤＲ３のＩｇＧ４抗体バリアント１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂは、抗体用量依存的にＰＢＭＣのｐ６５のリン酸化を増加させた。したがって、これらの抗体はＤＲ３に対するアゴニスト活性を示し、Ａ２−ＩｇＧ４ｖのアゴニスト活性はＳ３８−ＩｇＧ４ｖよりも高い活性であった。一方、ＩｇＧ２の定常領域を有するＡ２−ＩｇＧ２およびＳ３８−ＩｇＧ２は、最も高い抗体濃度であってもＰＢＭＣのｐ６５のリン酸化を増加させなかった。したがって、これらのＩｇＧ２抗体はアゴニスト活性を欠いていた。
【０２８４】
また、図３Ｂに示すように、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４バリアント定常領域を有する全ての抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂは、ＴＬ１Ａによって誘導されるｐ６５リン酸化を減少させたことから、ＤＲ３に対するアンタゴニスト活性を有することが分かった。１４２Ａ２抗体のアンタゴニスト活性は１４２Ｓ３８Ｂ抗体のものと比較して高いアンタゴニスト活性であった。ＩｇＧ４サブクラスからＩｇＧ２サブクラスへの改変は１４２Ａ２抗体のアンタゴニスト能をやや減少させ、他方で、１４２Ｓ３８Ｂ抗体のアンタゴニスト能をやや増加させた。
【０２８５】
従来より公知の二価抗ＤＲ３アンタゴニスト抗体とは対照的に、ＩｇＧ２改変抗ＤＲ３抗体はＤＲ３アンタゴニズムを保持するが、有意なアゴニスト活性を減少させるかまたは欠いていた。したがって、二価ＩｇＧ２はＤＲ３を有意に刺激することなしにＤＲ３機能を阻害するのに有用であることが分かった。
【０２８６】
実施例７．ＴＬ１Ａによって介在されるＩＬ−１３産生阻害のアンタゴニズム
抗ＤＲ３モノクローナル抗体存在下または非存在下におけるＴ細胞からの炎症性サイトカイン分泌を分析するために、炎症性サイトカインの１つとしてＩＬ−１３の分泌を評価した。Ｔ細胞を、ヒトＰＢＭＣ（上記の通りフィコールによって単離）から磁気活性化セルソーティングによってミルテニーＰａｎ−Ｔ細胞単離キットＩＩ（ミルテニーバイオテック１３０−０９５−１３０）を用いて精製した。単離したＴ細胞を、９６ウェルの抗ＣＤ３コーティングプレート（２×１０５細胞／ウェル、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１６−００３７−８５）に１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（ベクトン・ディッキンソンカタログ番号５５６６２０）および上記の実施例２（４）で調製された１μｇ／ｍＬの組換えＴＬ１Ａ−ｆｌａｇと一緒に播種した。種々の濃度の抗ＤＲ３抗体を添加し、細胞を３７℃にて７２時間培養した。上清のＩＬ−１３レベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズカタログ番号Ｄ１３００Ｂ）によって評価した。
【０２８７】
図４Ａに示すように、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ２および１４２Ｓ３８Ｂ−ＩｇＧ２はＰＢＭＣからのＩＬ−１３の分泌を増加させず、分泌量は培地単独のＩＬ−１３の分泌と同じであった。したがって、ｐ６５リン酸化の分析結果と一致して、ＩｇＧ２クラスの抗ＤＲ３モノクローナル抗体は炎症性サイトカインの放出について何らかのアゴニスト能を有さなかったということが示された。さらに、図４Ｂに示すように、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ２および１４２Ｓ３８Ｂ−ＩｇＧ２は、ＰＢＭＣからのＩＬ−１３のＴＬ１Ａによって誘導される分泌を用量（does）依存的な方法で阻害した。
【０２８８】
したがって、ＩｇＧ２クラスの抗ＤＲ３モノクローナル抗体の上記分析のとおり、ＩｇＧ２クラスの改変は、抗ＤＲ３モノクローナル抗体のアゴニズム能を完全に無効化した。それゆえに、ＩｇＧ２クラスの抗ＤＲ３モノクローナル抗体は、異常なＤＲ３の活性化による炎症性サイトカインの放出に関連する疾患に対する１つの純粋なアンタゴニストとなり得る。
【０２８９】
実施例８．抗ＤＲ３モノクローナル抗体断片の調製
（１）抗ＤＲ３一価抗体の構築
抗体のＦｃ領域を含む抗体断片を産生するために、Ｈ鎖とＦｃに融合したＬ鎖（ＦＬ融合ポリペプチド）とからなる一価抗体（以下ｍｖＡｂとも称する）を１つの抗体断片として設計した。抗ＤＲ３一価抗体を構築するための親抗体クローンとして抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２および１４２Ｓ３８Ｂを用い、抗体のＶＨのアミノ酸配列を、Ｃ１３１Ｓ、Ｒ１３３Ｋ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＲ４０９Ｋ置換が含まれるヒトＩｇＧ４抗体の定常領域のアミノ酸配列に連結することによってｍｖＡｂ用のＨ鎖を構築した。
【０２９０】
その後、Ｃ２１４Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｒ４０９Ｋ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換が含まれるヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ４抗体のＦｃ領域に続くヒトκ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列に抗体のＶＬのアミノ酸配列を連結することにより、ＦＬ融合ポリペプチドを構築した。
【０２９１】
１４２Ａ２抗体または１４２Ｓ３８Ｂ抗体由来のＶＨおよびＶＬの各アミノ酸配列（配列番号１５および２１、または２７および３３）を、Ｃ１３１Ｓ、Ｒ１３３Ｋ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＲ４０９Ｋ置換を含むＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列（１４２Ａ２／ｍｖＧ４＿ＨＣ、配列番号７２および１４２Ｓ３８Ｂ／ｍｖＧ４＿ＨＣ、配列番号７３）またはＣ２１４Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｒ４０９Ｋ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換を含むヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなるヒトＩｇＧ４重鎖のＦｃ領域に続くヒトκ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列（１４２Ａ２／ｍｖＧ４＿ＬＣ、配列番号７４および１４２Ｓ３８Ｂ／ｍｖＧ４＿ＬＣ、配列番号７５）にそれぞれ接合した。Ｈ鎖とＦＬ融合ポリペプチドとの各対は、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ａ２および抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ｓ３８ＢＡを構成する。
【０２９２】
制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩによって認識される各配列を５’末端および３’末端に導入した１４２Ａ２／ｍｖＧ４＿ＨＣ（配列番号７２）または１４２Ｓ３８Ｂ／ｍｖＧ４＿ＨＣ（配列番号７３）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）上記のＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位にそれぞれ挿入した。
【０２９３】
さらに、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩによって認識される各配列を５’末端および３’末端に導入した１４２Ａ２／ｍｖＧ４＿ＬＣ（配列番号７４）または１４２Ｓ３８Ｂ／ｍｖＧ４＿ＬＣ（配列番号７５）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、ＦＬ鎖ポリペプチドを含む発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３にそれぞれ挿入した。結果として、抗ＤＲ３一価抗体の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３／１４２Ａ２／ｍｖＧ４およびｐＫＡＮＴＥＸ９３／１４２Ｓ３８Ｂ／ｍｖＧ４を構築した。
【０２９４】
（２）抗ＤＲ３一価抗体の産生および精製
抗体のＦｃ領域を含む抗体断片を産生するために、チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（Somatic Cell Mol. Genet., 12, 555, 1986）を用いた。細胞培養は３７℃にて５％ＣＯ２インキュベータ中で行った。種々の一価抗体を発現するために、発現ベクターの導入を次の方法で行った。
【０２９５】
８μｇの種々の一価抗体発現ベクターを２．０×１０７個のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に加え、遺伝子をエレクトロポレーション法によって導入した［Cytotechnology,3, 133(1990)］。２ｍｍギャップのキュベットを氷上に５分間保持した後、３５０Ｖ、２５０μＦの条件下で電気パルスを行った。パルス後に、１０％の透析済みウシ胎児血清（以下ｄＦＢＳと略する）を含有する１５ｍＬのＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）（以下ＩＭＤＭ−（１０）と略する）によって細胞を回収し、各細胞をＩＭＤＭ−（１０）で２日間培養し、その後、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８硫酸塩（ナカライテスク社）を含有するＩＭＤＭ−（１０）（以下ＩＭＤＭ−（１０Ｇ）と略する）と培地を交換して培養を続け、Ｇ４１８耐性細胞株を得た。
【０２９６】
前記培養で得られたＧ４１８耐性細胞株をＩＭＤＭ−（１０Ｇ）中に懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ中でコンフルエントになる時間培養し、その後細胞をハイパーフラスコ（商標）（コーニングカタログ番号１００２０）に移し替え、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８および１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補ったＥｘｃｅｌｌ３０２（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）で７〜１１日間培養した後、培養上清を回収した。抗ＤＲ３一価抗体１４２Ｓ３８Ｂ／ｍｖＧ４については、実施例２の項（３）に記載したのと同様に一過性蛋白質発現システムを実施した。トランスフェクション細胞の培養の結果として、１４２Ａ２ｍｖＧ４および１４２Ｓ３８ＢｍｖＧ４の培養上清を得た。
【０２９７】
ｍｖＡｂの精製のために、前記の種々の一価抗体についての培養上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ミリポア社製）担体を充填した０．５ｍＬ体積カラムに０．５〜１．０ｍＬ／分の流量で通した。カラムをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって２回洗浄し、１４２Ａ２／ｍｖＧ４では０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、１４２Ｓ３８Ｂ／ｍｖＧ４では０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）をそれぞれ各溶出に用い、各溶出画分を２ＭのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）によって直ちに中和した。
【０２９８】
高い蛋白質濃度を示す溶出画分を、水酸化ナトリウムによってｐＨが６．０に調整された１０ｍＭクエン酸と１５０ｍＭ塩化ナトリウムとを含有する緩衝液（以下クエン酸緩衝液と略する）に対して２回透析した。サンプルを回収し、低濃度サンプルを限外濾過フィルター（ミリポア社製）によって濃縮し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を用いて滅菌した。
【０２９９】
サンプルはゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製し、インビトロの活性試験に用いた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００−１０／３００−ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社製）を高速液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡエクスプローラ（explore）１０Ｓ（ＧＥヘルスケア社製）に接続し、カラム内の水溶液をクエン酸緩衝液によって変え、緩衝液をランニング緩衝液として用いた。抗体溶液の５５０μＬの調製体積をマニュアルでカラムに加え、１．５カラム体積の緩衝液を０．５ｍＬ／分の流量（１．５ＭＰａの許容圧力設定）でカラムに通した後、０．５ｍＬの各画分を回収した。
【０３００】
２５〜３０分間あたりのメインピークとして検出された画分を回収し、分析に用いた。精製したサンプルを０．２２μｍフィルターによって濾過し、４℃にて保存した。蛋白質濃度は２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ２８０）から計算した。結果として、精製された抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ａ２およびｍｖ１４２Ｓ３８Ｂを得た。
【０３０１】
実施例９．抗ＤＲ３モノクローナル抗体断片のＤＲ３アゴニズムおよびアンタゴニズム
本発明の抗体のＦｃ領域を含む抗体断片として樹立された抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ａ２およびｍｖ１４２Ｓ３８Ｂのアゴニズムおよびアンタゴニズムを判定するために、ヒトＰＢＭＣにおけるｐ６５（ＲｅｌＡ）ＮＦ−κＢサブユニットのリン酸化のレベルを、上記の実施例６に記載のＦＣＭ法によって分析した。
【０３０２】
結果として、ＴＬ１Ａ単独（正の対照）および培地単独（負の対照）のＰＢＭＣのリン酸化ｐ６５陽性細胞の値がそれぞれ６９．５および２．３％であったということと比較して、抗ＤＲ３モノクローナルＩｇＧ４抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ４は抗体用量依存的に細胞数を明らかに増加させ、他方で、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ａ２はいずれの抗体用量でも細胞数をほとんど増加させなかった（図５Ａ）。
【０３０３】
したがって、抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ４と比較して、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ａ２はＤＲ３に対する低下したアゴニスト活性を明らかに示すかまたはほとんどアゴニスト活性を示さないということがわかった。他方で、正の対照および負の対照と比較して、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ａ２および抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ａ２−ＩｇＧ４は、ＴＬ１Ａリガンドによって誘導されるリン酸化ｐ６５陽性細胞数をＰＢＭＣにおいて抗体用量依存的に減少させ、ｍｖ１４２Ａ２の阻害は１４２Ａ２−ＩｇＧ４のものよりもやや弱まった（図５Ｂ）。
【０３０４】
そのため、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ａ２は、ヒトＰＢＭＣにおいてＴＬ１Ａによって誘導されるＤＲ３の活性化に対するアンタゴニスト活性を示しており、抗体はＤＲ３の活性に対する減少したアゴニスト能を有するかまたはアゴニスト能を有さない。ｍｖ１４２Ａ２のアンタゴニスト活性は１４２Ａ２−ＩｇＧ４抗体よりもやや減少していた。
【０３０５】
抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ｓ３８Ｂに関しては、この実験の正（ＴＬ１Ａ単独、４５％）および負（培地単独、３％）の対照の値と比較して、抗ＤＲ３モノクローナルＩｇＧ４抗体１４２Ｓ３８Ｂ−ＩｇＧ４は、１４２Ａ２−ＩｇＧ４と同様に、抗体用量依存的にＰＢＭＣのリン酸化ｐ６５陽性細胞を明らかに増加させた。他方で、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ｓ３８Ｂはいずれの抗体用量でもリン酸化ｐ６５陽性細胞数を増加させなかった（図６Ａ）。
【０３０６】
他方で、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖＳ３８Ｂおよび抗ＤＲ３モノクローナル抗体１４２Ｓ３８Ｂ−ＩｇＧ４は、１４２Ａ２抗体クローンと同様に、ＰＢＭＣのリン酸化ｐ６５陽性細胞数を同等に減少させた（図６Ｂ）。この結果から、抗ＤＲ３一価抗体ｍｖ１４２Ｓ３８Ｂは、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＬ１Ａによって誘導されるＤＲ３の活性化に対するアンタゴニスト活性を示し、抗体は減少したアゴニスト能を有するかまたはアゴニスト能を有さないことが分かった。
【０３０７】
したがって、抗ＤＲ３一価抗体は、有意なアゴニスト能を示すことなく、ＴＬ１Ａによって誘導されるＤＲ３の活性化をアンタゴナイズすることができる。さらに、抗体のＦｃ領域を含む抗体断片は、単なるＦａｂなどの以前に公知の抗ＤＲ３抗体断片と比較して、抗体のＦｃ領域を含有することによってヒト血清中での長い半減期および高い安定性を有すると考えられる。それゆえに、本発明のＨ鎖とＦｃ領域に融合したＬ鎖とからなる一価抗体を含む抗体断片は、異常なＤＲ３の活性化に関連する疾患に対する純粋なアンタゴニストの１つの候補として選択され得る。
【０３０８】
実施例１０.ヒンジ領域をスワッピングしたＩｇＧバリアントの作製
アゴニスト活性の無効化に必須であるＩｇＧ２抗体由来の領域を決定するために、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブクラス間のヒンジ領域をスワッピングしたＩｇＧバリアントを作製した。ＩｇＧ４抗体に関しては、ヒンジ領域内の２２８番目（ＥＵナンバリング）のＳｅｒ残基はハーフボディ（half-body）などのＩｇＧ４分子の不安定性に関係することが公知であるが、先に記載の「ヌルボディ」に含まれるＳ２２８Ｐ置換を含むＩｇＧ４ヒンジ領域を用いた。ＩｇＧ４抗体由来のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとＩｇＧ２抗体由来のヒンジドメインとを含むＩｇＧバリアントは「４２４４」バリアントと名付け、ＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとＩｇＧ４抗体由来のヒンジドメインとを含むＩｇＧバリアントは「２４２２」バリアントと名付けた。
【０３０９】
ＩｇＧ４ヌル抗体のヒンジがヒトＩｇＧ２のヒンジと交換された１４２Ａ２−ＩｇＧ４２４４バリアント重鎖定常領域の産生のために、発現ベクターを作製した。ヒト「ＩｇＧ４ヌル」重鎖定常内のヒンジドメイン（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ）をコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ２重鎖定常のヒンジドメイン（ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ）をコードするｃＤＮＡと交換し、１４２Ａ２−ＩｇＧ４２４４バリアントをコードするｃＤＮＡを先に記載の通り発現ベクター上の適切な制限部位に挿入した。ＩｇＧ４２４４バリアントと同様に、１４２Ａ２−ＩｇＧ２４２２バリアントをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを作製した。最後に、実施例１および２に記載の上記手順と同様に精製された各抗体を得た。
【０３１０】
これらの得られた１４２Ａ２抗体バリアントを、実施例６に記載したアンタゴニストおよびアゴニストアッセイによって評価した。図７に示すように、全ての１４２Ａ２抗体およびそれらのバリアントは、ＴＬ１Ａリガンドによって誘導されるｐ６５リン酸化に関して強いアンタゴニスト活性を示したが、特にＩｇＧ４２４４およびＩｇＧ２４２２バリアントは各親ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体バリアントと比較して高いアンタゴニスト活性を示した（図７Ｂ）。他方で、ＩｇＧ４およびＩｇＧ２４２２抗体バリアントは有意なアゴニスト活性を示したが、ＩｇＧ２抗体およびＩｇＧ４２４４抗体バリアントは顕著に低減されたアゴニスト活性を示した（図７Ａ）。
【０３１１】
これらの結果は、ＩｇＧ定常領域からＩｇＧ２サブクラスへの改変が、アンタゴニスト活性の低減なしに抗ＤＲ３抗体１４２Ａ２のアゴニスト活性を低減するということを明確に示している。さらに、ＩｇＧ２クラス抗体のヒンジ領域は、抗ＤＲ３抗体のアゴニスト活性を低減するための改変の必須部分を含有している。したがって、ＩｇＧ２サブクラスを起源とするヒンジ領域を有する抗ＤＲ３抗体は純粋なアンタゴニスト活性を示し、有意な低減されたアゴニスト活性を有する非常に有用な抗体であるということが分かった。
【０３１２】
実施例１１．１４２Ａ２抗体バリアントの樹立
親和性が増加した抗体バリアントを樹立するために、標準的な縮重オリゴヌクレオチド手法を用いて、１４２Ａ２バリアント単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを構築した。変異は１４２Ａ２抗体の全ての６つのＣＤＲ領域を選好的に導入した。まず、ＤＲ３結合活性を有するファージバリアントを、上記実施形態で得られた固定化された組換えＤＲ３−Ｆｃ融合蛋白質によってパニングすることによって同定した。
【０３１３】
スクリーニングされたｓｃＦｖファージクローンの解離定数（ＫＤ）を、競合的結合ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎによってProc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-4010に記載の通り評価した。親の１４２Ａ２−ｓｃＦｖと比べてＫＤが増加した変異体を細菌発現ベクターにサブクローニングし、ｓｃＦｖ蛋白質を標準的な分子生物学技術を用いて精製した。抗体バリアントのＣＤＲ外の全ての変異は、親抗体クローン由来のアミノ酸配列を維持するために親の１４２Ａ２アミノ酸配列に戻し、一方で、ＣＤＲ変異はさらなる試験のために保持された。さらに、ＶＨでは、１１２番目のＧｌｙをＡｒｇによって置換した。
【０３１４】
その結果、ＶＨ＿Ｇ１１２Ｒ（配列番号７６）、ＶＬ＿Ａ５１Ｅ（配列番号７７）、ＶＬ＿Ｌ５４Ｑ（配列番号７８）およびＶＬ＿Ａ５１Ｅ／Ｌ５４Ｑ（配列番号７９）などのＶＨおよびＶＬの各アミノ酸配列が樹立された。変異したＣＤＲの各アミノ酸配列は、ＨＣＤＲ＿Ｇ１１２Ｒ（配列番号８０）、ＬＣＤＲ２＿Ａ５１Ｅ（配列番号８１）、ＬＣＤＲ２＿Ｌ５４Ｑ（配列番号８２）およびＬＣＤＲ２＿Ａ５１Ｅ／Ｌ５４Ｑ（配列番号８３）として表す（表２）。
【表２】
2017511381.tif 000005
【０３１５】
１４２Ａ２ＶＬ＿Ａ５１Ｅ、ＶＬ＿Ｌ５４Ｑおよび／もしくはＶＨ＿Ｇ１１２Ｒまたはその組み合わせを含む組換えＩｇＧ１バージョンを構築し、Ｆａｂ断片を上記の通り作製した。これらの１４２Ａ２バリアントのＤＲ３結合親和性を、上記と同じ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定した。全ての作製した１４２Ａ２抗体バリアントは、親の１４２Ａ２と比較してＤＲ３蛋白質に対する結合親和性が向上した（表３）。Ａ５１Ｅ、Ｌ５４Ｑおよび／またはＧ１１２Ｒ置換をＶＨおよびＶＬ中に含む各抗体バリアント（Ａ２−Ｅ、Ｑ、ＥＱ、ＥＲまたはＥＱＲ）は、特に他のバリアントよりもＤＲ３蛋白質に対する最も高い結合親和性を有し、それぞれ略１．８、１．２、１．９、２．０または２．２倍の増加を示した。したがって、ＤＲ３アンタゴニスト療法の非常に有望な候補である。
【表３】
2017511381.tif 000006
【０３１６】
また、１４２Ａ２バリアントＡ２−ＥＱＲはアンタゴニスト活性能を分析した。Ｆａｂ抗体断片のそれらのアンタゴニスト活性は、上記実験と同じアッセイで決定される。結果として、それらの抗体は用量依存的にＩＬ−１３の放出を阻害し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の組み合わせの存在下、１０ｎＭで、ＴＬ１Ａリガンドによって誘導されるＩＬ−１３の分泌を完全に阻害した。さらに、Ａ２−ＥＱＲ抗体バリアントは親のＡ２抗体と比較してかなり高いアンタゴニスト活性を有していた。したがって、抗ＤＲ３アンタゴニスト抗体バリアントＡ２−ＥＱＲは、ＴＬ１Ａリガンドによって誘導されるＴ細胞の活性化を阻害するために非常に有用であるということが分かった。
【０３１７】
本発明を、その特定の実施形態を参照して詳細に説明したが、その種々の変更および改変がその趣旨および範囲を逸脱することなしになされ得るということは当業者には明らかであろう。本願は米国仮出願第６１／９７５，２１４号（２０１４年４月４日出願）に基づき、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０３１８】
配列番号１−ＴＬ１Ａ−ｆｌａｇのヌクレオチド配列
配列番号２−合成コンストラクト
配列番号５−ｈＤＲ３−Ｆｃのヌクレオチド配列
配列番号６−合成コンストラクト
配列番号７−ｈＤＲ３−ｍＧ１Ｆｃのヌクレオチド配列
配列番号８−合成コンストラクト
配列番号９−ｈＤＲ３−ＤＤのヌクレオチド配列
配列番号１０−合成コンストラクト
配列番号１１−ｍＤＲ３−ＤＤのヌクレオチド配列
配列番号１２−合成コンストラクト
配列番号１３−１４２Ａ２−ＶＨｆｕｌｌのヌクレオチド配列
配列番号１４−合成コンストラクト
配列番号１５−１４２Ａ２−ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１６−１４２Ａ２−ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１７−１４２Ａ２−ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１８−１４２Ａ２−ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１９−１４２Ａ２−ＶＬｆｕｌｌのヌクレオチド配列
配列番号２０−合成コンストラクト
配列番号２１−１４２Ａ２−ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２２−１４２Ａ２−ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２３−１４２Ａ２−ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２４−１４２Ａ２−ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２５−１４２Ｓ３８Ｂ−ＶＨｆｕｌｌのヌクレオチド配列
配列番号２６−合成コンストラクト
配列番号２７−１４２Ｓ３８Ｂ−ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２８−１４２Ｓ３８Ｂ−ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２９−１４２Ｓ３８Ｂ−ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３０−１４２Ｓ３８Ｂ−ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３１−１４２Ｓ３８Ｂ−ＶＬｆｕｌｌのヌクレオチド配列
配列番号３２−合成コンストラクト
配列番号３３−１４２Ｓ３８Ｂ−ＶＬのアミノ酸配列
配列番号３４−１４２Ｓ３８Ｂ−ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３５−１４２Ｓ３８Ｂ−ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３６−１４２Ｓ３８Ｂ−ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３７−ｈＣＬκのアミノ酸配列
配列番号３８−ｈＩｇＧ１＿ＣＨのアミノ酸配列
配列番号３９−ｈＩｇＧ２＿ＣＨのアミノ酸配列
配列番号４０−ｈＩｇＧ４バリアントのアミノ酸配列
配列番号４１−ｈＴＬ１Ａ＿Ｆのヌクレオチド配列
配列番号４２−ｈＴＬ１Ａ−３’Ｒのヌクレオチド配列
配列番号４３−ＶＣＡＭ−ＦＬＡＧＲ−ＳａｌＩＦのヌクレオチド配列
配列番号４４−ｈＴＬ１Ａ−ＥＣ＿ＢａｍＨＩ−Ｒのヌクレオチド配列
配列番号４５−ＶＣＡＭ−ＦＬＡＧ＿ｈＴＬ１Ａ＿Ｆのヌクレオチド配列
配列番号４６−ＶＣＡＭ−ＦＬＡＧ＿ｈＴＬ１Ａ＿Ｒのヌクレオチド配列
配列番号４７−ｈＤＲ３＿Ｆ５’のヌクレオチド配列
配列番号４８−ｈＤＲ３−ＥＣ＿Ｒのヌクレオチド配列
配列番号４９−ｈＤＲ３−ＳａｌＩ＿Ｆのヌクレオチド配列
配列番号５０−ｈＤＲ３＿ｈＧ１Ｆｃ＿Ｒのヌクレオチド配列
配列番号５１−ｈＤＲ３＿ｈＧ１Ｆｃ＿Ｆのヌクレオチド配列
配列番号５２−ｈＤＲ３＿ｈＧ１Ｆｃ＿ＢａｍＨＩ−Ｒのヌクレオチド配列
配列番号５３−ｈＤＲ３−ｐＧ−ＮｈｅＩ＿Ｒのヌクレオチド配列
配列番号５４−ｍＧ１Ｆｃ−ｐＧ−ＮｈｅＩ＿Ｆのヌクレオチド配列
配列番号５５−ｍＧ１Ｆｃ＿ＢａｍＨＩ−Ｒのヌクレオチド配列
配列番号５６−ｈＤＲ３ΔＤＤ＿ＢａｍＨＩ＿Ｒのヌクレオチド配列
配列番号５７−ｍＤＲ３＿Ｆｗｄのヌクレオチド配列
配列番号５８−ｍＤＲ３＿３’＿Ｒのヌクレオチド配列
配列番号５９−ｍＤＲ３−ＳａｌＩ＿Ｆのヌクレオチド配列
配列番号６０−ｍＤＲ３（１−３２４）＿ＢａｍＨＩのヌクレオチド配列
配列番号６１−ＩｇＧ１プライマーのヌクレオチド配列
配列番号６２−ｈｋ５プライマーのヌクレオチド配列
配列番号６３−１４２Ｓ３８ＢＡ＿ＶＬＦ＿ＢｇｌＩのヌクレオチド配列
配列番号６４−１４２Ｐ２０＿ＶＬ１＿ＢｓｉＷＩのヌクレオチド配列
配列番号６５−１４２Ａ２＿ＢｇｌＩＩ＿Ｆのヌクレオチド配列
配列番号６６−１４２Ａ２＿ＢｓｉＷＩ＿Ｒのヌクレオチド配列
配列番号６７−１４２Ａ２−ＶＨ＿ＳａｌＩ＿Ｆのヌクレオチド配列
配列番号６８−１４２Ａ２−ＶＨ＿ＮｈｅＩ＿Ｒのヌクレオチド配列
配列番号６９−１４２Ｓ３８ＢＡ＿ＶＨＦ＿ＳａｌＩのヌクレオチド配列
配列番号７０−Ｆ４２９＿ＶＨ＿Ｒ１のヌクレオチド配列
配列番号７１−ＩｇＧ２プライマーのヌクレオチド配列
配列番号７２−１４２Ａ２＿ｍｖＧ４＿ＨＣのアミノ酸配列
配列番号７３−１４２Ａ２＿ｍｖＧ４＿ＬＣのアミノ酸配列
配列番号７４−１４２Ｓ３８Ｂ＿ｍｖＧ４＿ＨＣのアミノ酸配列
配列番号７５−１４２Ｓ３８Ｂ＿ｍｖＧ４＿ＬＣのアミノ酸配列
配列番号７６−１４２Ａ２−ＶＨ＿Ｇ１１２Ｒのアミノ酸配列
配列番号７７−１４２Ａ２−ＶＬ＿Ａ５１Ｅのアミノ酸配列
配列番号７８−１４２Ａ２−ＶＬ＿Ｌ５４Ｑのアミノ酸配列
配列番号７９−１４２Ａ２−ＶＬ＿Ａ５１Ｅ／Ｌ５４Ｑのアミノ酸配列
配列番号８０−１４２Ａ２−ＨＣＤＲ＿Ｇ１１２Ｒのアミノ酸配列
配列番号８１−１４２Ａ２−ＬＣＤＲ２＿Ａ５１Ｅのアミノ酸配列
配列番号８２−１４２Ａ２−ＬＣＤＲ２＿Ｌ５４Ｑのアミノ酸配列
配列番号８３−１４２Ａ２−ＬＣＤＲ２＿Ａ５１Ｅ／Ｌ５４Ｑのアミノ酸配列
配列リスト
【図１】
2017511381.tif 000007
【図２】
2017511381.tif 000008
【図３】
2017511381.tif 000009
【図４】
2017511381.tif 000010
【図５】
2017511381.tif 000011
【図６】
2017511381.tif 000012
【図７】
2017511381.tif 000013
【図８】
2017511381.tif 000014
【配列表】
2017511381000001.app
【国際調査報告】
2017511381.tif 000015
2017511381.tif 000016