(57)【要約】本発明は、一般に、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄幹細胞（ＢＭＤＳＣ）が子宮内膜再生を誘導し、アッシャーマン症候群および子宮内膜萎縮のような子宮内膜の病変を処置する能力に関する。子宮内膜再生を誘導するための方法が提供され、上記方法は、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）の有効量を、子宮内膜再生が必要な被験体の子宮動脈へと投与して、子宮内膜再生を誘導することを包含する。本開示は、少なくとも部分的に、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）が自己由来の機能的子宮内膜の新規生成をもたらす血管形成を再生し得るという発見に関する。
2017522288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜再生を誘導するための方法であって、該方法は、
自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）の有効量を、子宮内膜再生が必要な被験体の子宮動脈へと投与して、子宮内膜再生を誘導すること
を包含する、方法。
【請求項２】
前記被験体は、アッシャーマン症候群もしくは子宮内膜萎縮を有することが既知である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体は、ホルモン処置に抵抗性である子宮内膜萎縮を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体は、１回もしくはこれより多く、胚着床に以前失敗したことがある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記自己由来ＣＤ１３３＋ＢＭＤＳＣは、
前記被験体に、該被験体の骨髄から末梢血へとＢＭＤＳＣを動員するための薬剤を投与すること；および
ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣを該被験体の末梢血から単離すること、
によって調製される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＢＭＤＳＣを動員するための前記薬剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記自己由来ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、抗ＣＤ１３３抗体を使用するアフェレーシスによって前記被験体の末梢循環から単離される、請求項５〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、カテーテルを介して前記子宮動脈へと投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、前記被験体の子宮螺旋細動脈へと投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
子宮内膜再生を誘導するための方法であって、該方法は、
自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）を、子宮内膜再生が必要な被験体から単離すること；および
該単離されたＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣの有効量を、該被験体の子宮動脈へと投与して、子宮内膜再生を誘導すること
を包含する方法。
【請求項１１】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、前記自己由来ＢＭＤＳＣを単離する前に前記被験体へと投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記自己由来ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、抗ＣＤ１３３抗体を使用するアフェレーシスによって前記被験体の末梢循環から単離される、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、カテーテルを介して前記子宮動脈へと投与される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、前記被験体の子宮螺旋細動脈へと投与される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体は、アッシャーマン症候群もしくは子宮内膜萎縮を有することが既知である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体は、ホルモン処置に抵抗性である子宮内膜萎縮を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体は、１回もしくはこれより多く、胚着床に以前失敗したことがある、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１４年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２/013,121の35U.S.C§119(e)の下での利益を主張し、当該出願の内容全体が、ここで参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、子宮内膜再生を誘導し、アッシャーマン症候群および子宮内膜萎縮のような子宮内膜病変を処置するための自己由来ＣＤ１３３＋骨髄幹細胞（ＢＭＤＳＣ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
生殖可能年齢の女性において、子宮内膜のうちの２層は、区別され得る：（ｉ）子宮腔に隣接する機能的層、および（ｉｉ）子宮筋層に隣接しかつ上記機能的層の下にある基底層。上記機能的な層は、以前の月経周期の第１の部分の間の、月経の終了の後に構築される。増殖は、エストロゲンによって誘導され（月経周期の卵胞期）、この層における後の変化は、黄体に由来するプロゲステロンによって生じる（黄体期）。それは、胚の着床および成長に最適な環境を提供するように適応される。この層は、月経の間に完全に脱落する。対照的に、上記基底層は、上記月経周期の間のいかなるときにも脱落しない。各月経周期における全身性の卵巣ステロイド変化の下でのヒト子宮内膜の再生は、その主要な機能のためのこの器官の準備（すなわち、着床しつつある胚盤胞を迎え入れる（ｈｏｓｔ）ための子宮内膜の着床ウインドウを発生させ、妊娠が起こることを可能にする）に必須である。従って、各月経周期に伴う子宮内膜機能的層の全ての細胞区画の補充は、正常な生殖機能に必須である。
【０００４】
アッシャーマン症候群（ＡＳ）は、反復性のもしくは攻撃的な掻爬術および／または子宮内膜炎によって引き起こされる子宮内膜の破壊が存在する状態である。それは、子宮腔癒着症および多くの領域における機能的子宮内膜の非存在に伴う子宮腔の消滅を生じる。この疾患を有し、同様に萎縮性子宮内膜（＜４ｍｍ）を有する女性は、不妊、月経不順（無月経、過少月経、および再発性妊娠損失（recurrent  pregnancy  loss）を含む）にしばしば悪戦苦闘している。現在では、これら子宮内膜病変に関する具体的処置は存在しない。従って、これら病変を処置するための安全かつ有効な治療を開発することは未だに必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本開示は、少なくとも部分的に、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）が自己由来の機能的子宮内膜の新規生成をもたらす血管形成を再生し得るという発見に関する。よって、本開示の局面は、子宮内膜再生を誘導するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）の有効量を、子宮内膜再生が必要な被験体の子宮動脈へと投与して、子宮内膜再生を誘導することを包含する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、上記被験体は、アッシャーマン症候群もしくは子宮内膜萎縮を有することが既知である。いくつかの実施形態において、上記被験体は、ホルモン処置に抵抗性である子宮内膜萎縮を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、１回もしくはこれより多く、胚着床に以前失敗したことがある。いくつかの実施形態において、上記自己由来ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、上記被験体の骨髄から末梢血へとＢＭＤＳＣを動員するための薬剤を上記被験体に投与すること；およびＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣを上記被験体の末梢血から単離することによって調製される。いくつかの実施形態において、ＢＭＤＳＣを動員するための上記薬剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態において、上記自己由来ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、抗ＣＤ１３３抗体を使用するアフェレーシスによって、上記被験体の末梢循環から単離される。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、カテーテルを介して上記子宮動脈へと投与される。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、上記被験体の子宮螺旋細動脈へと投与される。
【０００７】
本開示のいくつかの局面は、子宮内膜再生を誘導するための方法を提供し、上記方法は、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）を、子宮内膜再生が必要な被験体から単離すること；および上記単離されたＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣの有効量を、上記被験体の子宮動脈へと投与して、子宮内膜再生を誘導することを包含する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、上記自己由来ＢＭＤＳＣを単離する前に上記被験体に投与される。いくつかの実施形態において、上記自己由来ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、抗ＣＤ１３３抗体を使用するアフェレーシスによって、上記被験体の末梢循環から単離される。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、カテーテルを介して上記子宮動脈へと投与される。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、上記被験体の子宮螺旋細動脈へと投与される。いくつかの実施形態において、上記被験体は、アッシャーマン症候群もしくは子宮内膜萎縮を有することが既知である。いくつかの実施形態において、上記被験体は、ホルモン処置に抵抗性である子宮内膜萎縮を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、１回もしくはこれより多く、胚着床に以前失敗したことがある。
【０００９】
本発明の限定の各々は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。従って、いずれか１つの要素もしくは要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各局面に含まれ得ることは、認識される。本発明は、構築の詳細および以下の説明に示されるかもしくは図面の中で図示される構成要素の配置へのその適用に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実施もしくは実行され得る。また、本明細書で使用される語法および用語法は、説明目的であって、限定とみなされないものとする。「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、もしくは「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、包含する、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」および本明細書中のこれらのバリエーションの使用は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびにさらなる項目を包含することが意味される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、研究デザインを示す模式図（Ａ）および図１Ａに示される事象のタイムライン（Ｂ）である。
【００１１】
【図２】図２は、非侵襲性放射線医学を介して、子宮動脈から、上記ＣＤ１３３＋細胞が位置する螺旋細動脈までのプローブの経路を示す血管造影である。
【００１２】
【図３】図３は、自己由来ＢＭＳＣ処置の前、該処置の３〜６ヶ月後および９ヶ月後の、萎縮性子宮内膜を有する１名の患者の子宮腔の子宮鏡検査を示す。
【００１３】
【図４】図４は、自己由来ＢＭＳＣ治療の前および３ヶ月後の、この研究に含まれる萎縮性子宮内膜／アッシャーマン症候群を有する６名の患者における子宮内膜厚を示す。
【００１４】
【図５】図５は、自己由来ＢＭＳＣ処置の前および該処置の３ヶ月後の、平均＋ＳＤ子宮内膜厚を示す。
【００１５】
【図６】図６は、処置前の（ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）基底状態と比較して、自己由来ＢＭＳＣ治療の３ヶ月後に得られる子宮内膜容積の改善を実証する３Ｄ超音波画像を示す。
【００１６】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、術前および術後の子宮鏡検査画像を示す。幹細胞治療前（ファーストルック）、および幹細胞治療の２〜３ヶ月後（セカンドルック）および４〜６ヶ月後（サードルック）の、アッシャーマン症候群（図７Ａ）もしくは子宮内膜萎縮（図７Ｂ）を有する患者における子宮鏡検査の所見。子宮内膜癒着の重症度は、米国不妊学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）分類に従って等級分けされた。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、術前および術後の子宮鏡検査画像を示す。幹細胞治療前（ファーストルック）、および幹細胞治療の２〜３ヶ月後（セカンドルック）および４〜６ヶ月後（サードルック）の、アッシャーマン症候群（図７Ａ）もしくは子宮内膜萎縮（図７Ｂ）を有する患者における子宮鏡検査の所見。子宮内膜癒着の重症度は、米国不妊学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）分類に従って等級分けされた。
【００１７】
【図８Ａ−Ｇ】図８Ａ〜８Ｉは、組織分析を示す。自己由来細胞治療の前（図８Ａ）、該治療の３ヶ月後（図８Ｂ）および６ヶ月後（図８Ｃ）の、患者７の子宮内膜における成熟血管の検出に関する免疫組織化学結果。α−ｓｍａ＋、ＣＤ３１＋陽性細胞は、成熟血管を同定する（２０×）。図８Ｄは、α−ｓｍａ染色に関する陽性コントロールとして使用されるヒト子宮筋層を、およびＣＤ３１に関する陽性コントロールとして使用されるヒト扁桃を示す（図８Ｅ）。図８Ｆは、一次抗体の非存在から生じる陰性コントロールを示す。図８Ｇは、図８Ｃにおいて同定された血管の詳細な写真を示す（４０×）。図８Ｈにおいて、細胞治療の前、ならびに３ヶ月後および６ヶ月後の８名の患者の成熟血管の総数の動力学が示され、これは、時間感受性新血管形成効果（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示す。図８Ｉは、処置の前ならびに該処置の３ヶ月後および６ヶ月後の合計成熟血管の平均±ＳＥＭの統計分析を示す。
【図８Ｈ】図８Ａ〜８Ｉは、組織分析を示す。自己由来細胞治療の前（図８Ａ）、該治療の３ヶ月後（図８Ｂ）および６ヶ月後（図８Ｃ）の、患者７の子宮内膜における成熟血管の検出に関する免疫組織化学結果。α−ｓｍａ＋、ＣＤ３１＋陽性細胞は、成熟血管を同定する（２０×）。図８Ｄは、α−ｓｍａ染色に関する陽性コントロールとして使用されるヒト子宮筋層を、およびＣＤ３１に関する陽性コントロールとして使用されるヒト扁桃を示す（図８Ｅ）。図８Ｆは、一次抗体の非存在から生じる陰性コントロールを示す。図８Ｇは、図８Ｃにおいて同定された血管の詳細な写真を示す（４０×）。図８Ｈにおいて、細胞治療の前、ならびに３ヶ月後および６ヶ月後の８名の患者の成熟血管の総数の動力学が示され、これは、時間感受性新血管形成効果（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示す。図８Ｉは、処置の前ならびに該処置の３ヶ月後および６ヶ月後の合計成熟血管の平均±ＳＥＭの統計分析を示す。
【図８Ｉ】図８Ａ〜８Ｉは、組織分析を示す。自己由来細胞治療の前（図８Ａ）、該治療の３ヶ月後（図８Ｂ）および６ヶ月後（図８Ｃ）の、患者７の子宮内膜における成熟血管の検出に関する免疫組織化学結果。α−ｓｍａ＋、ＣＤ３１＋陽性細胞は、成熟血管を同定する（２０×）。図８Ｄは、α−ｓｍａ染色に関する陽性コントロールとして使用されるヒト子宮筋層を、およびＣＤ３１に関する陽性コントロールとして使用されるヒト扁桃を示す（図８Ｅ）。図８Ｆは、一次抗体の非存在から生じる陰性コントロールを示す。図８Ｇは、図８Ｃにおいて同定された血管の詳細な写真を示す（４０×）。図８Ｈにおいて、細胞治療の前、ならびに３ヶ月後および６ヶ月後の８名の患者の成熟血管の総数の動力学が示され、これは、時間感受性新血管形成効果（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示す。図８Ｉは、処置の前ならびに該処置の３ヶ月後および６ヶ月後の合計成熟血管の平均±ＳＥＭの統計分析を示す。
【００１８】
【図９】図９は、研究デザインを示す。ＡＳもしくはＥＡの子宮鏡検査による再確認および等級付けを、増殖相において１名の外科医が行った。ＢＭＤＳＣ動員を、Ｇ−ＣＳＦ注射によって誘導し、５日後に、ＣＤ１３３＋細胞を、末梢血からアフェレーシスを介して単離し、直ぐに、インターベンショナルラジオロジーによって螺旋動脈へと注入した。セカンドルックおよびサードルック子宮鏡検査を行って、幹細胞処置後に子宮腔を評価した。次いで、上記患者は、妊娠しようと試みるように要請された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも部分的に、自己由来幹細胞治療を使用して子宮内膜再生を誘導する新たな治療アプローチの発見に基づく。特に、本出願は、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）が自己由来機能的子宮内膜の新規生成をもたらす血管形成を再生し得るという知見に基づく。ＢＭＤＳＣは、種々の子宮内膜細胞区画（間質、腺上皮、および内腔上皮）における非造血細胞の供給源であることが公知であったものの、ＢＭＤＳＣの亜集団（複数可）が子宮内膜の修復を促進することは公知ではなかった。本出願は、子宮内膜再生を誘導し、アッシャーマン症候群および子宮内膜萎縮のような子宮内膜変性と関連する病変を処置するために安全かつ有効な細胞ベースの治療を提供する。
【００２０】
ヒトの子宮は、子宮内膜および子宮筋層といわれる外側の平滑筋層から主になる。上記ヒト子宮内膜の機能的層は、女性の生殖可能年数の間に増殖、分化および脱落という月に１回のサイクルを行う非常に再生性の組織である。循環するエストロゲンおよびプロゲステロンのレベルの変動は、ヒト子宮内膜のこの劇的なリモデリングを組織化する。子宮内膜再生はまた、分娩および子宮内膜切除の後に起こる。上記基底層からの子宮内膜再生は、上記機能的層の置き換え、続いて、月経および分娩の間のその剥離に寄与する。しかし、上記子宮内膜は、エストロゲンに応答できない可能性があり、ある種の病変、例えば、アッシャーマン症候群および子宮内膜の萎縮では再生しない可能性がある。このような被験体は、異常な子宮内膜増殖を経験し得、不妊になり得る。
【００２１】
アッシャーマン症候群（ＡＳ）（もしくはフリッチュ症候群）は、子宮内腔の拡張掻爬術と最も頻繁に関連する子宮内膜の癒着および／もしくは線維症によって特徴付けられる状態である。多くの他の用語が、以下を含む状態および関連した状態を記載するために使用されてきた：子宮腔癒着症（ＩＵＡ）、子宮／子宮頸管閉鎖症、外傷性子宮萎縮、硬化性子宮内膜、子宮内膜硬化症、および子宮内癒着（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ  ｓｙｎｅｃｈｉａｅ）。子宮内膜基底層への外傷（例えば、流産後、もしくは出産の後に、または医療中絶のために実行される拡張掻爬術（Ｄ＆Ｃ）後の）は、子宮腔を種々の程度まで消滅させ得る癒着を生じる子宮内瘢痕の発生をもたらし得る。極端には、腔全体が瘢痕化および閉塞され得る。比較的瘢痕が少ないとしても、子宮内膜は、エストロゲンに応答できない可能性があり、被験体は、続発性の月経不順（例えば、無月経、過少月経、もしくは希発月経）を経験し得、不妊になり得る。ＡＳはまた、他の骨盤手術（帝王切開術、類線維腫の除去（筋腫摘出）が挙げられる）から、および他の原因（例えば、ＩＵＤ、骨盤照射、住血吸虫症および性器結核）から生じ得る。性器結核に由来する慢性子宮内膜炎は、発展途上国における重症の子宮腔癒着症（ＩＵＡ）の重要な原因であり、処置しがたい子宮腔の完全な消滅をしばしば生じる。
【００２２】
子宮鏡検査は、ＡＳの診断の常套手段である。ソノヒステログラフィーもしくは子宮卵管造影による画像化は、瘢痕形成の程度を明らかにする。重症度の程度に依存して、ＡＳは、不妊、反復性の流産、閉じ込められた血液による疼痛、および将来の産科の合併症を生じ得る。処置されないままであれば、癒着から生じる経血の流れの閉塞は、いくらかの場合には、子宮内膜症をもたらし得る。
【００２３】
子宮内膜萎縮では、子宮内膜は、低いエストロゲンレベルの結果として薄くなりすぎる。萎縮性とみなされるためには、子宮内膜厚は、経膣的超音波スキャンで４〜５ｍｍ未満の厚みでなければならない。子宮体  対  子宮頸管比はまた、低下する傾向にあり、１：１に近くなり得る。ＭＲＩはまた、超音波で観察されるものに類似の子宮内膜厚の低下を明らかに示し得る。子宮内膜萎縮を引き起こし得る要因としては、長期の経口避妊、低エストロゲン状態（卵巣機能不全）およびタモキシフェンの使用が挙げられる。
【００２４】
本発明の一局面によれば、子宮内膜再生を誘導するための方法が提供される。上記方法は、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）の有効量を、子宮内膜再生が必要な被験体の子宮動脈へと投与して子宮内膜再生を誘導することを包含する。
【００２５】
本発明の一局面によれば、子宮内膜再生を誘導するための方法が提供される。上記方法は、自己由来ＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）を、子宮内膜再生が必要な被験体から単離すること；および上記単離されたＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣの有効量を、上記被験体の子宮動脈へと投与して、子宮内膜再生を誘導することを包含する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「被験体」は、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒト、および非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限定されない全ての哺乳動物を包含する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、女性である。
【００２７】
子宮内膜再生の必要性のある被験体は、子宮内膜がエストロゲンに応答して再生せず、薄い子宮内膜裏打ちを有する被験体である。このような被験体はしばしば、異常な子宮内膜増殖を経験し、不妊になる。子宮内膜裏打ちの最適な厚みは、１０〜１５ｍｍの間であり、女性の月経周期の２１日目あたりでの着床のときにその最大厚に達する。いくつかの実施形態において、処置の必要性のある被験体は、５ｍｍ未満、４ｍｍ未満、３ｍｍ未満、２ｍｍ未満もしくは１ｍｍ未満である、着床のときの子宮内膜厚を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、出血の流れおよび持続時間の減少によって特徴付けられる月経不順（無月経、過少月経、もしくは希発月経）および／または再発性妊娠損失を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、アッシャーマン症候群もしくは子宮内膜萎縮を有することが既知である。いくつかの実施形態において、上記被験体は、ホルモン処置に抵抗性である子宮内膜萎縮を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、１回もしくはこれより多く、胚着床に以前失敗したことがある。
【００２８】
骨髄由来幹細胞（ＢＭＤＳＣ）は、組織修復および種々の器官および組織の再生への外因性の供給源として寄与することが示された。ヒトおよびマウスの子宮内膜では、ＢＭＤＳＣはまた、種々の子宮内膜細胞区画（間質、腺上皮、および内腔上皮）における非造血細胞の供給源である。それらは、主には子宮内膜の間質区画の細胞（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ）の形成に、およびよりはるかに低い程度には、子宮内膜の腺上皮および内腔上皮区画に寄与する。
【００２９】
ＢＭＤＳＣは、造血幹細胞（ＨＳＣ）、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）を含む。しかし、ＢＭＤＳＣのどの亜集団（複数可）が子宮内膜の修復を促進するかは、未知であった。
【００３０】
本出願の発明者らは、ヒトにおいて、外科手術およびカテーテル送達システムを介して子宮動脈へと送達されるＣＤ１３３＋骨髄由来幹細胞が子宮内膜再生を誘導する能力を初めて実証した。自己由来の循環するＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣを、以前の骨髄動員後に単離し、その同じ患者の子宮の螺旋細動脈へと再移植した。上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、自己由来機能的子宮内膜の新規生成をもたらす血管形成を再生する。ＣＤ１３３は、ヒトおよび齧歯類においてＰｒｏｍｉｎｉｎ  １（ＰＲＯＭ１）としても公知の糖タンパク質である。それは、膜突起に位置し、成体幹細胞（ここでは、それは分化を抑制することによって幹細胞特性を維持することにおいて機能すると考えられる）上でしばしば発現される５回膜貫通コレステロール結合タンパク質である。
【００３１】
本発明のＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、初代幹細胞に由来してもよいし、樹立された幹細胞株に由来してもよい。いくつかの実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、臍帯血幹細胞、体細胞性幹細胞、骨髄もしくは動員された骨髄幹細胞であり得る。好ましい実施形態において、上記幹細胞は、成体幹細胞である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、上記被験体に、ＢＭＤＳＣを上記被験体の骨髄から末梢血へと動員するための薬剤を投与すること；上記被験体の末梢血からＣＤ１３３＋ＢＭＤＳＣを単離することによって調製される。いくつかの実施形態において、上記幹細胞動員薬剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびプレリキサフォル（ＡＭＤ３１００）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記幹細胞動員薬剤は、Ｇ−ＣＳＦである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記自己由来ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、抗ＣＤ１３３抗体を使用するアフェレーシスといわれるプロセスによって上記被験体の末梢循環から単離される（例えば、Ｓｏｖａｌａｔ  Ｈ，  Ｓｃｒｏｆａｎｉ  Ｍ，  Ｅｉｄｅｎｓｃｈｅｎｋ  Ａ，  Ｐａｓｑｕｅｔ  Ｓ，  Ｒｉｍｅｌｅｎ  Ｖ，  Ｈeｎｏｎ  Ｐ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｉｔｈｅｒ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｒ  Ｇ−ＣＳＦ−ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ＣＤ３４（＋）／ＣＤ１３３（＋）／ＣＸＣＲ４（＋）／  Ｌｉｎ（−）ＣＤ４５（−）  ｃｅｌｌｓ，  ｆｅａｔｕｒｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｓｍａｌｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｌｉｋｅ  （ＶＳＥＬ）  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２０１１  Ａｐｒ；３９（４）：４９５−５０５（それらの内容全体は、それらの全体において本明細書で援用される）を参照のこと）。アフェレーシス（これは、当該分野で周知のプロセスである）とは、血液がドナー被験体から引き抜かれ、その構成要素へと分離され、そのうちのいくらかは保持され（例えば、幹細胞集団）、その残りは上記ドナー被験体への輸血によって戻されるプロセスまたは手順をいう。アフェレーシスは、全血供血（ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｎａｔｉｏｎ）より長くかかる。全血供血は、血液を集めるのに約１０〜２０分間かかる一方で、アフェレーシス献血（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｄｏｎａｔｉｏｎ）は、約１〜２時間かかり得る。アフェレーシス産物とは、アフェレーシスのプロセスから集められる細胞の異種集団をいう。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、抗ＣＤ１３３抗体を使用して単離されたＢＭＤＳＣから単離される。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣが少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％もしくは１００％純粋になるまで、抗ＣＤ１３３抗体を使用して選択される。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、少なくとも９５％、９８％、９９％、９９．９％もしくは１００％純粋である。
【００３５】
ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣ、もしくはこのような細胞を含む治療用組成物の、子宮内膜再生が必要な被験体への投与は、例えば、移植（transplantation）、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、上記細胞自体の、もしくはマトリクス−細胞組み合わせの一部としての上記細胞の）、注射（例えば、子宮動脈へと直接）、注入、カテーテルを介した送達、または細胞治療を提供することに関して当該分野で公知の任意の他の手段によって達成され得る。一実施形態において、上記細胞は、動脈内カテーテル法によって送達される。子宮動脈のカテーテル法手順は、広く記載されてきており、子宮筋腫の塞栓術において使用されてきた（Ｒａｖｉｎａ  ＪＨ，  Ｈｅｒｂｒｅｔｅａｕ  Ｄ，  Ｃｉｒａｒｕ−Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｔｅｒｉａｌ  ｅｍｂｏｌｉｓａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｍｙｏｍａｔａ．  Ｌａｎｃｅｔ  １９９５；３４６（８９７６）：６７１−２（その内容全体は、それらの全体において本明細書に援用される）。
【００３６】
上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、上記被験体の子宮動脈へと投与され得る。これら動脈は、子宮へと血液を供給する。いくつかの実施形態において、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、上記被験体の子宮螺旋細動脈へと投与される。螺旋動脈は、月経周期の黄体期の間に子宮の子宮内膜へと血液を一時的に供給する小動脈である。これら動脈は、エストロゲンおよびプロゲステロンに対して非常に感受性であり、子宮内膜の機能的層を貫通し、成長し、その内部に分岐し、非常に異なりかつ特有のパターンを示す。
【００３７】
上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、有効量で投与される。「有効量」とは、所望の生物学的応答（すなわち、子宮内膜再生を誘導すること）を誘起するために十分な量をいう。有効量は、ＡＳもしくは子宮内膜萎縮と関連した１もしくはこれより多くの症状を遅らせるか、低減するか、阻害するか、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）か、もしくは逆転する（ｒｅｖｅｒｓｅ）ために必要なその量を含む。いくつかの実施形態において、このような用語は、以下に言及する：
・上記ＣＤ１３３＋ＢＭＳＣ幹細胞処置後の月経の再開；
・子宮内膜厚の増大；（子宮内膜厚は、子宮内膜腔の底において子宮筋層の上限から下限までの長さとして測定される）。例えば、上記増大は、子宮底において長軸方向の膣超音波によって測定される、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）でこれまで得られた最大厚の５０％の増大であり得る（４〜６ｍｍのｖｇｒ）；
・新規子宮内膜形成の子宮鏡検査によるおよび組織学的な証拠；ならびに／または
・これら患者における胚配置（ｅｍｂｒｙｏ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ）後の生児出生率（ｌｉｖｅ−ｂｉｒｔｈ  ｒａｔｅ）、妊娠および着床率に関する再構築された子宮内膜の機能性。
【００３８】
いくつかの実施形態において、少なくとも４５００万個のＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、上記被験体へと注入される。いくつかの実施形態において、少なくとも５０００万個、５５００万個、６０００万個、６５００万個のＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣが、上記被験体へと注入される。
【００３９】
有効量は、慣用的方法を使用して、当業者によって決定され得る。いくつかの実施形態において、有効量は、処置されている状態における任意の改善を生じる量である。当業者は、例えば、インビトロおよび／もしくはインビボの試験、ならびに／または化合物投与量の他の知見に基づいて使用するために、治療剤の適切な用量および範囲を決定し得る。被験体に投与される場合、上記治療剤の有効量は、当然のことながら、処置されている特定の疾患；疾患の重症度；個々の患者パラメーター（年齢、身体的状態、サイズおよび重量が挙げられる）、現在の処置、処置の頻度、ならびに投与様式に依存する。これら因子は、当業者に周知であり、慣用的な実験のみで対処され得る。いくつかの実施形態において、最大用量が使用される（すなわち、妥当な医学的判断に従う最高の安全な用量）。
【００４０】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証され、実施例は、さらなる限定として決して解釈されないものとする。本出願全体を通じて引用される参考文献（学術文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願が挙げられる）の全ての内容全体は、明示的に参考として援用される。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
（材料および方法）
（デザイン）
以下は、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌｉｎｉｃｏ  ｄｅ  Ｖａｌｅｎｃｉａ（Ｓｐａｉｎ）のＩＲＢによって承認され、Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって資金援助（Ｒｅｆ  ＥＣ  １１−２９９）された、難治性ＡＳを有する１６名の患者における実験的な非対照研究である。ＢＭＤＳＣ動員を、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）（４日間の間に５ｍｇ／ｋｇ／１２時間  ｓｃ）を使用して行った。７日後に、末梢血アフェレーシスとＣＤ１３３＋細胞の単離を、行った。次いで、自己由来ＣＤ１３３＋細胞を、非侵襲性放射線医学介入によって、２．５  Ｆマイクロカテーテルを使用して子宮動脈を介して、螺旋細動脈へと送達した。子宮内膜腔状態を、幹細胞介入の前、ならびに該介入の３ヶ月後、６ヶ月後および９ヶ月後に、子宮鏡検査、膣超音波、および組織学を介して評価した。
（患者および方法）
（包含基準）
【００４２】
少なくとも７回手術で以前処置された難治性アッシャーマン症候群、または再発性着床不全を伴うホルモン処置に抵抗性の子宮内膜萎縮（＜４ｍｍ）と診断された１６名の患者を、上記研究に含めた。全ての患者は、世界中の彼らのそれぞれの医師に付託されて、Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって支援を受けた臨床実験研究に参加した。患者の年齢は、２０〜４５歳齢の範囲に及び、全て、正常な肝機能、心機能および腎機能を有した。自然の周期において、もしくはホルモン補充療法（ＨＲＴ）後に月経による出血がないことを確認した。精神医学的病理、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎、および梅毒がないこと、ならびに上記研究に参加する意志があることもまた確認した。
（排除基準）
【００４３】
患者を、末梢静脈へのアクセスがない場合、または彼らが脾腫を有した場合には、上記研究から排除した。
（方法論）
（１．骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）動員）
【００４４】
動員手順を開始するために、以下の条件を満たした：
・上記患者に、上記手順について情報を与え、上記動員の少なくとも２４時間前に同意書を与えた。
・相当する医学的評価を、関連する補完的触診（ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ）とともに行い、ＢＭＳＣ再収集に責任のある医師が確認した。
・関連する血清学的試験結果（ＨＩＶ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ、梅毒）を利用可能になった。
・静脈を評価して上記手順に彼らが適切であることを決定した。
次いで、末梢血へのＢＭＳＣ動員を、Ｇ−ＣＳＦ（５ｍｃｇ／ｋｇ  ｓｃ  １２時間ごと）によって４日間誘導した。
（２．ＢＭＳＣ再収集）
【００４５】
上記ＢＭＳＣ再収集を、末梢静脈を使用して従来のアフェレーシス手順によって行った。上記ＣＤ１３３＋細胞の陽性選択を、３回の洗浄およびＣＤ１３３＋細胞のその後の選択の適用による、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌiｎｉｃｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏによって承認されたＰＯ−７６１０−０２プロトコルに従って行った。第１に、上記細胞を洗浄し、モノクローナル抗体とともにインキュベートし、次いで、それらをさらに２回洗浄し、最後に、ＣＤ１３３＋選択を受けさせた。
【００４６】
上記選択手順を、最大３時間にわたって、または少なくとも５０００万個のＣＤ  １３３＋細胞が集められるまで行った。
（３．動脈内カテーテル法による子宮螺旋細動脈へのＣＤ１３３＋細胞移植）
【００４７】
それらの単離の２４時間後、自己由来ＣＤ１３３＋細胞を、１５〜３０ｃｃの生理食塩水溶液中に希釈し、次いで、螺旋動脈へと注入した。細胞を、滅菌シリンジを介して容器の中へと集めて、それらの注入前に放射線医学部門へと持って行った。少なくとも４５００万個の細胞を注入した。
【００４８】
子宮動脈のカテーテル法手順は広く記載されてきており、子宮筋腫の塞栓術において使用されてきた。この手順の必要とされる放射線医学設備は、放射線外科用Ｃアームもしくは超音波スキャンを備える血管造影室であった。簡潔には、セルディンガー法を使用して総大腿動脈へのアクセスを得た後、４Ｆカテーテルを、動脈の中に配置し、コブラカーブ２およびＴｅｒｕｍｏガイド０．０３５インチを有する血管造影用カテーテルを使用して、両方の内腸骨動脈（ｈｙｐｏｇａｓｔｒｉｃ  ａｒｔｅｒｙ）にカテーテル挿入するために使用した。マイクロカテーテル２．５  Ｆを、上記コブラカテーテルを介してガイド０．０１４インチとともに配置し、子宮動脈に、上向きの屈曲（ascendant  curve）までもしくは上記マイクロカテーテルがその最も遠位のレベルに達するまで、カテーテル挿入する。いったん上記カテーテルが安定し、その位置をチェックしたら、上記ＣＤ１３３＋  ＢＭＳＣを、生理食塩水懸濁物において注入した。細胞注射のためのカテーテルの直径は、５００〜６００ミクロンであり、１５ｃｃを灌流した。
【００４９】
介入の後、上記患者は一晩入院させ、翌日に合併症なしで退院した。
（応答基準）
【００５０】
この技術は、子宮内膜に起因する再発性着床不全のためにＡＲＴを受けている患者において胚着床を可能にし得る機能的子宮内膜を再構築するために、ＣＤ１３３＋  ＢＭＳＣを使用してアッシャーマン症候群もしくは子宮内膜萎縮に罹患している患者において子宮内膜血管性ニッチを再配置することを目的とする。従って、以下のインジケーターを、成功裡の処置と考えた：
・月経転帰。月経は、上記ＣＤ１３３＋ＢＭＳＣ処置の後に再開しなければならない。
・子宮内膜厚の増大。これまでＨＲＴで得られた最大厚のうちの最小５０％が、子宮底において縦軸方向の（longitudinal  axis）膣超音波によって測定された（４〜６ｍｍのｖｇｒ）。
・形成される新規子宮内膜の子宮鏡検査によるおよび組織学の証拠。
・これら患者における胚移植（ｅｍｂｒｙｏ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）後の生児出生率、妊娠および着床率に関する上記再構築された子宮内膜の機能性。
（結果）
【００５１】
【表１】
2017522288.tif 000003
【００５２】
【表２】
2017522288.tif 000004
【００５３】
これは、ＡＳにおいて血管内に適用されるこの特異的幹細胞処置を使用する最初の症例集積研究である。ＡＳの発生率は、不妊女性のうちの２〜２２％の間で変動する。
【００５４】
Ｇ−ＣＳＦは、自己由来および同種異系ドナーの両方において、ＢＭＳＣ動員のための最も一般的に使用されるサイトカインである。この製品は、一般に十分に耐容性がある。しかし、５ｍｃｇ／ｋｇ／日より高い用量の投与は、上記症例のうちの５０％超において骨筋の疼痛（ｏｓｔｅｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｐａｉｎ）をもたらすことが示された。これが起こる場合、パラセタモールは、Ｇ−ＣＳＦの投与を維持しながら、鎮痛剤として投与されるべきである（５００ｍｇ／８時間）。他のより頻度の低い観察される合併症は、以下である：悪心および嘔吐、片頭痛、ならびに不眠症。各症例において、対症療法が施されるべきである。一般に、上記症状は、Ｇ−ＣＳＦの投与の中止後３〜４日間で消失するが、無力症の感覚は、最後の用量から最大２週間まで続き得る。最後に、健常なドナーにおける脾臓破裂は、Ｇ−ＳＣＦの投与と関連付けられてきた。この事実に起因して、腹部スキャンは、左下肋部に疼痛を示す全ての患者において行われるべきである。それらの症例において検出される脾腫の後には、Ｇ−ＣＳＦの即座の懸濁物が続くべきである。いかなる関連する症状もなしでのアルカリホスファターゼおよびＬＤＨの高レベルは、しばしば検出される。白血球増多症は、極めて一般的であり、値は、通常７０×１０９／Ｌ未満である。
（実施例２）
（研究参加者）
【００５５】
米国不妊学会分類に基づく難治性アッシャーマン症候群（ＡＳ）（Ｎ＝１１）、もしくは子宮内膜萎縮（Ｎ＝５）のいずれかと診断された１６名の患者（３０〜４５歳齢の範囲）に、上記研究に参加するように要請した。重症のアッシャーマン症候群もしくは子宮内膜萎縮のより以前の診断を確認し、増殖相において子宮鏡検査を行った。ＡＳと診断された患者を、子宮癒着のＡＦＳ分類に従って分類し、子宮内膜生検を得た。全ての患者は、彼らの自然な周期の間にもしくはホルモン補充療法（ＨＲＴ）後、ほとんどもしくは全く月経による出血を経験しなかった。上記研究に参加する要件は、以下を包含した：正常な肝機能、心機能、および腎機能、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎、梅毒ならびに精神医学的病理がないこと、上記研究を完了する意志があること。末梢静脈アクセスがないかまたは脾腫がある場合に、患者を排除した。
（ＢＭＤＳＣ動員および単離）
【００５６】
ＢＭＤＳＣの動員を、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の薬理学的投与によって誘導した（−４日目、−３日目、−２日目および−１日目に１０μｇ／ｋｇ／日）。Ｇ−ＣＳＦは、自己由来および同種異系ドナーの両方においてこの目的のために広く使用されるサイトカインである。上記注射の５日後、ＣＤ１３３＋細胞の単離を、ＣｏｂｅＳｐｅｃｔｒａ分離器（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ，  Ｌａｋｅｗｏｏｄ，  ＣＯ）を使用して末梢静脈を経るアフェレーシスを介して単離した。２〜３個のサンプルを、患者毎に加工処理し、ＣＤ１３３＋細胞の陽性選択を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して確立されたプロトコルに従って得た。上記選択を、５０００万個の細胞が得られるまで、上記収集の３時間以内に行った。単離されたＣＤ１３３＋細胞を、１５〜３０ｃｃの生理食塩水の中へ希釈し、螺旋細動脈への送達のために放射線医学部門へと滅菌シリンジの中に入れて輸送した。
（ＢＭＤＳＣの送達）
【００５７】
成功裡のＣＤ１３３＋単離後に、患者を、ＨＣＵの放射線医学部門に付託し、ここで動脈内カテーテル法を行って、線維腫の塞栓術のために使用する技術を使用して子宮内膜幹細胞ニッチへと上記細胞を送達した。セルディンガー法を使用して総大腿動脈に近づき、ここで４  Ｆ導入器は、血管造影用カテーテルカーブおよびガイドＴｅｒｕｍｏ（０．０３５インチ）で両方の内腸骨動脈のカテーテル法を可能にした。後者のカテーテルを介して、ガイド（０．０１４インチ）付きの２．５  Ｆマイクロカテーテルを導入して、子宮動脈から上記マイクロカテーテルが到達できる最も遠位の螺旋細動脈へとカテーテル挿入した（図９）。いったん上記カテーテル位置が安定しかつ確認された後、上記選択されたＣＤ１３３＋細胞の生理食塩水懸濁物のうちの１５ｃｃ（４２〜２００×１０６細胞、平均１２３．５６×１０６±５７．６４を含む）を、各子宮動脈を通って螺旋細動脈へと注射した。
（追跡）
【００５８】
全ての患者に、細胞治療を受けさせた後に、ホルモン補充療法（ＰｒｏｇｙｌｕｔｏｎＴＭ，  Ｂａｙｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を与えた。子宮内膜腔の状態を、診断的な子宮鏡検査、膣超音波、および組織学によって評価して、細胞治療の前、該治療の２ヶ月後、３ヶ月後、および６ヶ月後の子宮内膜厚および子宮内膜癒着の存在もしくは非存在を決定した。次いで、患者に、ＡＲＴを受けて受胎を試みるように要請した（図９）。
（子宮内膜免疫組織化学）
【００５９】
血管形成を、抗ヒトＣＤ３１（Ｄａｋｏ，  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）と二次Ａｌｅｘａヤギ抗マウス４８８、およびマウス抗ヒトα−ｓｍａ−Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＭＯ，  ＥＥＵＵ）を使用して、パラフィン切片においてＣＤ３１およびα−ｓｍａ−Ｃｙ３免疫組織化学によって評価した。スライドを、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＣＡ，  ＥＥＵＵ）で対比染色した。陽性コントロールは、ＣＤ３１についてはヒト扁桃およびα−ｓｍａについては子宮筋層を含んだ。スライドを、蛍光Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡の下で試験した。３つの別個の２０×視野を使用して、ＩｍａｇｅＪ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって、面積あたりの全血管形成を分析した。データを、細胞治療の前、ならびに該治療の３ヶ月後および６ヶ月後の、あらゆる患者の特異的値として示す。
（統計分析）
【００６０】
統計分析を、ＳＰＳＳ  １７．０ソフトウェア（ＩＢＭ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）を使用して行った。対応のあるサンプルｔ検定を使用して、全成熟血管の計数において観察された差異を分析した。両側検定において得られるｐ値≦０．０５を、統計的有意とみなした。
（結果）
【００６１】
２名の患者を、一方の症例ではＣＤ１３３＋細胞（＜４０００万個）の不十分な動員に起因して、および他方の症例では末梢静脈アクセスがないことに起因して、上記研究から最初に排除した。合計１６名の患者が上記プロトコルを完了した。大きな合併症は報告されなかった。
【００６２】
患者を、難治性ＡＳの診断に伴って研究に付託した（Ｎ＝１１）（表３）。上記患者の月経歴から、２名の患者において無月経が、および９名の患者において僅かな出血（ｓｃａｎｔ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ）が明らかになった。ＡＳの原因は、外傷性拡張掻爬術（Ｄ＆Ｃ）（Ｎ＝９）、子宮鏡検査による筋腫摘出（Ｎ＝１）、および説明不能（Ｎ＝１）であった。以前に試みた修復的外科的（ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）子宮鏡検査の平均数は、２であった。いずれの患者も、外科的処置にも関わらず、彼女の子宮内膜状態の有意な改善を報告しなかった。３名の患者がＡＳグレードＩＩＩとして分類され、４名の患者がグレードＩＩ＋ＥＡとしてスコア付けされ、２名の患者がグレードＩＩとして分類され、１名の患者がＡＳグレードＩとして分類された（図７Ａ）。細胞治療の前にＨＲＴの高用量で達成した最大子宮内膜厚は、４．３ｍｍ±０．７４（２．７〜５ｍｍの範囲）であった（表３）。
【００６３】
【表３−１】
2017522288.tif 000005
【表３−２】
2017522288.tif 000006
【００６４】
この研究に登録したＥＡおよび着床不全を有する患者（Ｎ＝５）（表４）は、無月経（Ｎ＝３）もしくは僅かな出血（Ｎ＝２）という以前の月経歴を有した。この原因は、以前のＤ＆Ｃ（Ｎ＝１）、説明不能（Ｎ＝１）、レボノルゲストレルＩＵＤの使用（Ｎ＝１）、早発卵巣不全（Ｎ＝１）、および以前の子宮鏡検査による筋腫摘出（Ｎ＝１）であった。試みられた以前の修復的外科的子宮鏡検査の平均数は、２であった。重症の子宮内膜萎縮を、全ての症例において観察した（図７Ｂ）。細胞治療の前にＨＲＴの高用量で達した最大子宮内膜厚は、４．２ｍｍ±０．８（２．７〜５ｍｍの範囲）であった（表４）。
【００６５】
【表４】
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（幹細胞治療後の子宮内膜再構築）
【００６６】
自己由来ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣ治療後に、月経周期は、ＥＡを有する１名を除いて、全１６名の患者においてＨＲＴで再開した。しかし、月経の継続時間および強度（使用されるパッドの数によって評価されるとおり）は、細胞治療後の１ヶ月目において平均５．０６日（範囲は３〜７日間）から６ヶ月目において２．１２日（範囲は１〜３日間）へと徐々に減少した（補足図１Ａ）。経血容積はまた、６ヶ月目において１日あたり平均２．６８（範囲は１〜５）から１．５（範囲は１〜４）個のパッドへと減少した。
【００６７】
細胞治療の２ヶ月後、３ヶ月後および６ヶ月後に行った子宮の観察から、子宮内膜および子宮腔の改善が明らかになった（表３および表４；図７）。具体的には、ステージＩＩＩ  ＡＳと診断された全ての患者は、ステージＩへと改善した一方で、ステージＩＩに罹患した２名の患者のうちの１名は、完全に正常化した子宮内膜腔を示し、他方はステージＩに改善した。その残りの患者（ステージＩと最初に診断された）は、表３に示されるように定性化スコアに関して改善した。観察された最大の術後子宮内膜厚は、６．７ｍｍであった（範囲は３．１〜１２ｍｍ）（表３，図７Ａ）。ＥＡ群において、正常な子宮内膜を、５名の患者のうちの４名において細胞治療後に観察した（表４；図７Ｂ）。細胞治療後に得た最大子宮内膜厚は、５．７ｍｍであった（範囲は５〜１２ｍｍ）（表４）。
【００６８】
形成された成熟血管の総数は、細胞治療の前、ならびに該治療の３ヶ月後および６ヶ月後に行われたＣＤ３１およびα−ｓｍａの共局在によって、８名の患者において評価した（図８）。血管形成の漸増は、処置の３ヶ月後に観察された（患者４、５、７、１２、および１３）一方で、成熟血管の一貫した数が、他方で観察された（患者６、９、および１０）（図８Ｈ）。上記実験の開始時点（コントロールといわれる）とＣＤ１３３＋細胞での特定の処置の３ヶ月後との間で結果を比較するために、上記データの相応する平均およびＳＥＭを調べた。全成熟血管（ＣＤ３１＋／α−ｓｍａ＋）の増大した数を、処置の３ヶ月後の患者において観察した（ｐ＝０．０２１）。これら結果は、６ヶ月後に徐々に減少するＡＳおよびＥＡを有する患者において自己由来のＣＤ１３３＋細胞注射後に特徴的な新血管形成（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を示唆する（図８Ｉ）。
【００６９】
上記再構築された子宮内膜の機能性を、自己由来ＣＤ１３３＋ＢＭＤＳＣ治療後に妊娠する意志のある患者の生殖転帰によって評価した（表３および表４）。２名の患者は、それぞれ、細胞治療の２ヶ月後および４ヶ月後に自然に妊娠し、継続妊娠（患者１５）を、および前期破水に起因して第１７週の間に流産（患者７）を生じた。６名の妊娠陽性を１３の胚移植後に得、３名は生化学的妊娠、１名は流産後に評価された染色体異常の胚に起因して第９週において流産、１名は子宮外妊娠、および１名は継続妊娠（患者１２）を生じた。１症例において、胚の全てにおける染色体異常に起因して胚移植を取りやめ（患者８）、別の症例では、細胞治療の失敗に起因して移植を行わなかった（患者１４）。
（考察）
【００７０】
組織学的観点から、ＡＳは、子宮内膜幹細胞に、および従って、組織機能に影響を及ぼす線維性組織による、子宮内膜間質の置換に相当する。腺は、ホルモン刺激に一般に非応答性である不活性な立方−円柱上皮（ｃｕｂｏ−ｃｏｌｕｍｎａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）によって通常置き換えられ、子宮内膜幹細胞のニッチ、従って、組織機能に影響を及ぼす子宮内膜構造の完全な消失を引き起こす。ＡＳの発見後最初の５０〜６０年の間に、研究者らは、上記状態の有病率、原因、および病理に焦点を当てた。内視鏡検査の出現とともに、上記状態の診断および処置のための新たな方法が開発された；しかし、技術の進歩にも関わらず、上記ＡＳ症例のうちの約５０％は、今日でも、包括的治癒がない。
【００７１】
ここでは、子宮内膜幹細胞ニッチを特異的に標的化する幹細胞治療の最初の例が記載される。定常状態条件下で、循環ＥＰＣ（ｃＥＰ）は、循環中の細胞のうちのわずか０．０１％を表す。従って、罹患した器官における直接注入と合わせたｃＥＰの動員を計画した。自己由来ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣを、Ｇ−ＣＳＦでの動員後に単離し、次いで、非侵襲性の放射線医学的手順を使用して、患者の子宮の螺旋細動脈へと再導入した。ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、血管形成を再生し、子宮内膜増殖を誘導し、自己由来の再構築された子宮内膜の生成をもたらす。ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣは、非造血適用での再生医療に関する臨床試験において近年探索されてきた。
【００７２】
主要目的は、子宮内膜の再構築であり、月経の再開によって最初に評価した。これは、本発明者らの患者の１６名のうちの１５名において起こった。月経の継続時間および強度は、細胞治療の６ヶ月後に徐々に低下したが、幹細胞治療は、子宮内膜形態において即座の差異を生じた。子宮腔の子宮鏡検査による可視化、膣超音波によって測定される子宮内膜厚、および免疫組織化学を介した新血管形成は、子宮内膜の有効であるが一時的異な再構築と一致した。二次的な目的は、受胎を試みることによって、再構築された子宮内膜の機能性を試験することであった。ＡＲＴの使用でのいくつかの自然妊娠が、細胞治療の後に達成され、上記研究で観察された２例の流産は、子宮内膜機能性に関連しなかった。
【００７３】
細胞生着は、主要な関心事であった。なぜならＩＲＢは、上記注射した細胞を追跡するために、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）でのＣＤ１３３＋ＢＭＤＳＣの標識を許容しないからである。代わりに、アッシャーマン症候群のマウス免疫不全実験モデルを、この目的のために利用した。この研究に関与する患者の１００万個のＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣのアリコートを、さらなる特徴付けのために使用し、Ｌｇｒ５＋  細胞およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）活性についてアッセイしたところ、７５．７２±８％  Ｌｇｒ５＋  細胞および７７．４５±７．８１％  ＡＬＤＨ１活性（それぞれ、幹細胞および前駆細胞状態を同定する）を生じた。別の１００万個の細胞アリコートを、５０μｇ／ｍＬ  Ｍｏｌｄａｙ  ＩＯＮ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂとともに１８時間インキュベートしたところ、全ての実験において９７％より高い標識効率を生じた。次いで、ＳＰＩＯ標識細胞を、尾静脈もしくは子宮内注射を介してアッシャーマン症候群の免疫不全マウスモデルに注射した。細胞生着を、プルシアンブルー染色を使用して細胞内鉄沈着の同定によって検出したところ、ＣＤ１３３＋ＢＭＤＳＣが外傷を受けた子宮内膜の子宮内膜血管の周りに主に生着したことが明らかにされた。
【００７４】
以前の症例報告は、骨髄に由来するＣＤ９、ＣＤ４０、およびＣＤ９０細胞の自己由来幹細胞単離および子宮内膜腔へのそれらの配置でＡＳを処置する陽性の結果を示した一方で、別の症例報告は、特徴付けされていない単核幹細胞を子宮内膜下ゾーンへとニードルで直接配置することを記載した。両症例報告は、送達される細胞のタイプおよび標的化される幹細胞ニッチにおいて異なる。
【００７５】
本研究は、ＣＤ１３３＋  ＢＭＤＳＣ自己由来細胞治療が妊娠する意志のある難治性ＡＳおよびＥＡを有する患者を処置するにあたって有用であることを実証する。
参考文献
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【００７６】
本発明の種々の改変は、本明細書で示され、記載されたものに加えて、前述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る。本発明の利点および目的は、本発明の各実施形態によって必ずしも包含されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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