(57)【要約】  本発明は、一部、対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤およびＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞を投与することを含む、対象を処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の処置に使用するためのｍＴＯＲ阻害剤であって、該ｍＴＯＲ阻害剤は対象の免疫応答を増強し、ここで、該対象は、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞を受け入れているか、受け入れようとしているか、または受ける予定である、ｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項２】
ｍＴＯＲ阻害剤が低い免疫増強用量である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
次に掲げる工程を含む、ＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞を製造する方法：
ｃ)場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞とｍＴＯＲ阻害剤を接触させる工程および
ｄ)ＣＡＲをコードする核酸を免疫エフェクター細胞に導入する工程；
これらによりＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞を製造し、
ここで、工程ａ)の該接触は、該工程ｂ)の挿入の前、同時または後に行い；
ここで、ｍＴＯＲ阻害剤は次に掲げる結果の１以上をもたらす：
１ａ)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の集団の増加；
１ｂ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の集団の減少；
１ｃ)場合によりＴ細胞であるＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／場合によりＴ細胞であるＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
１ｄ)ナイーブＴ細胞数の増加；
１ｅ)１以上の次に掲げるマーカーの発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２(これは、場合により、記憶Ｔ細胞前駆体である記憶Ｔ細胞上である)；
１ｆ)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
１ｇ)場合により次の特徴の１つまたは組み合わせを有する細胞である、記憶Ｔ細胞前駆体数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、１ａ)、１ｂ)、１ｃ)、１ｄ)、１ｅ)、１ｆ)または１ｇ)は、場合により、免疫エフェクター細胞の非接触集団と比較して、場合により、少なくとも一過性に、生じる。
【請求項４】
接触がエクスビボで行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、
ａ)次のとおり製造された、場合によりＴ細胞である、免疫エフェクター細胞を提供し：
ｉ)次に掲げる現象の１以上が生じるのに十分な時間、場合によりＲＡＤ００１またはラパマイシンであるｍＴＯＲ阻害剤を対象に投与し：
１ａ)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の集団の増加；
１ｂ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の集団の減少；
１ｃ)場合によりＴ細胞であるＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／場合によりＴ細胞であるＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
１ｄ)ナイーブＴ細胞数の増加；
１ｅ)次に掲げるマーカーの１以上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２(これは、場合により、場合により記憶Ｔ細胞前駆体である記憶Ｔ細胞上である)；
１ｆ)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
１ｇ)場合により次の特徴の１つまたは組み合わせを有する細胞である、記憶Ｔ細胞前駆体数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、１ａ)、１ｂ)、１ｃ)、１ｄ)、１ｅ)、１ｆ)または１ｇ)は、対象または対象から採取した場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞の調製物において、場合により、非処置対象と比較して、場合により、少なくとも一過性に生じる；そして
(ii)対象から、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞を採取し；そして
ｂ)ＣＡＲをコードする核酸を、採取した、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞に導入し、
それによりＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞を製造する。
【請求項６】
ＣＡＲが抗原結合ドメイン(これは場合により抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(これは場合により共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項７】
抗原結合ドメインが腫瘍マーカーに結合する、請求項６に記載の使用のための組成物または方法。
【請求項８】
腫瘍マーカーが固形腫瘍マーカーまたは血液癌マーカーである、請求項７に記載の使用のための組成物または方法。
【請求項９】
ｍＴＯＲ阻害剤の投与を、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞の投与前に開始する、請求項１、２または６〜８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
ｍＴＯＲ阻害剤の投与がＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞の投与前に完了する、請求項１、２または６〜９のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項１１】
ｍＴＯＲ阻害剤の投与がＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞の投与と重複する、請求項１、２または６〜９のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞を、場合によりＴ細胞であるＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞レベルまたは場合によりＴ細胞であるＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞／場合によりＴ細胞であるＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞比が、少なくとも一過性に、増加するように、ｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な用量投薬後に投与する、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
ＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞を、対象または対象からの採取物における場合によりＴ細胞であるＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞のレベルまたは場合によりＴ細胞であるＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞／場合によりＴ細胞であるＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞比が、少なくとも一過性に、増加するように、ｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な用量投薬後に採取する、請求項１〜２のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
ｍＴＯＲ阻害剤の投与を、対象がＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞を受けた後継続する、請求項１、２、６〜９または１１〜１３のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
ｍＴＯＲ阻害剤がアロステリックｍＴＯＲ阻害剤である、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項１６】
ｍＴＯＲ阻害剤がＲＡＤ００１である、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項１７】
ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンある、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項１８】
ｍＴＯＲ阻害剤が触媒的阻害剤であり、場合によりキナーゼ阻害剤である、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項１９】
キナーゼ阻害剤がｍＴＯＲに選択的である、請求項１８に記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２０】
キナーゼ阻害剤がＢＥＺ２３５およびＣＣＧ１６８から選択される、請求項１８に記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２１】
処置または接触が、複数のｍＴＯＲ阻害剤での処置または接触を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２２】
ｍＴＯＲ阻害剤を、対象の末梢血または対象から単離したＴ細胞の調製物におけるＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比率の減少、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加のために十分な時間投与または接触させる、請求項１〜２１のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２３】
処置または接触がＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の結合が介在する負の免疫応答の阻害を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２４】
処置または接触が増殖可能なＴ細胞の数の増加を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２５】
処置または接触が細胞毒性機能が可能なＴ細胞の数、サイトカイン分泌または活性化の増加を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２６】
ｍＴＯＲ阻害剤を、次に掲げる現象の１以上が生じるのに十分な時間、ＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の採取前または後)の投与前に投与する：
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)次に掲げるマーカーの１以上の発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii)次の特徴の１つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；および
ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる、請求項１、２および６〜２５のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項２７】
ｍＴＯＲ阻害剤が、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも５の、しかし、９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する用量である、請求項１〜２６のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２８】
ｍＴＯＲ阻害剤が、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも１０％の、しかし、８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する用量である、請求項１〜２７のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項２９】
ｍＴＯＲ阻害剤が、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも１０％の、しかし、４０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する用量である、請求項１〜２８のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３０】
ｍＴＯＲ阻害剤が、場合により週に１回、場合により持続放出性剤形で、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgの用量であり、ｍＴＯＲ阻害剤がＲＡＤ００１である、請求項１〜２９のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３１】
ｍＴＯＲ阻害剤がＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤であり、ｍＴＯＲ阻害剤が場合により週に１回、場合により持続放出性剤形で、週に１回、持続放出性剤形の０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等の用量である、請求項１〜３０のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３２】
ｍＴＯＲ阻害剤が、場合により１日１回、場合により即時放出剤形で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgの用量であり、ここで、ｍＴＯＲ阻害剤がＲＡＤ００１である、請求項１〜３０のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３３】
ｍＴＯＲ阻害剤がＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤であり、ｍＴＯＲ阻害剤が、場合により１日１回、場合により即時放出剤形で、１日１回、即時放出剤形の０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である用量である、請求項１〜３０のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３４】
ｍＴＯＲ阻害剤がＲＡＤ００１であり、約０.１〜３ng／ml、０.３ng／ml未満〜３ng／mlまたは０.３ng／ml未満〜１ng／mlの範囲のＲＡＤ００１のトラフレベルを提供する用量である、請求項１〜３０のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３５】
ｍＴＯＲ阻害剤はＲＡＤ００１以外であり、約０.１〜３ng／ml、０.３ng／ml未満〜３ng／mlまたは０.３ng／ml未満〜１ng／mlの範囲のＲＡＤ００１のトラフレベルを提供するＲＡＤ００１の用量と生物学的同等である用量である、請求項１〜３０のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項３６】
対象が癌を有し、方法が癌に対する対象の免疫応答の促進を含む、請求項１、２または６〜３５のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項３７】
癌における細胞がＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する、請求項３６に記載の使用のための組成物。
【請求項３８】
癌において微小環境における細胞がＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する、請求項３６に記載の使用のための組成物。
【請求項３９】
癌が固形腫瘍を含む、請求項３６に記載の使用のための組成物。
【請求項４０】
癌が血液癌である、請求項３６に記載の使用のための組成物。
【請求項４１】
癌がＣＬＬであり、場合によりＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＤ１９を標的とする、請求項３６に記載の使用のための組成物。
【請求項４２】
癌が黒色腫である、請求項３６〜３８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項４３】
対象がヒトである、請求項３６〜４２のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項４４】
免疫エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項１〜４３のいずれかに記載の使用のための組成物または方法。
【請求項４５】
ＣＡＲをコードする核酸が配置された、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞を対照に導入することをさらに含み、対象は場合により、免疫エフェクター細胞が由来するまたは異なる対象である、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
対象でまたは対象から採ったＴ細胞で、ＰＤ１陰性または場合によりＴ細胞であるＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞のレベルを評価することをさらに含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許出願６２／０２７１５２号(２０１４年７月２１日出願)、米国特許出願６２／０７６１９７号(２０１４年１１月６日出願)および米国特許出願６２／１６４３５７号(２０１５年５月２０日出願)に基づく優先権を主張し、これらの内容をその全体を引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
配列表
本出願は、電子的にASCII形式で提出している配列表を含み、その全体を引用により本明細書に包含させる。該ASCIIコピーは、２０１５年７月２１日に作成し、N2067-7065WO_SL.txtの名称であり、１６９,２５６バイトサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に疾患、例えば、腫瘍マーカーの発現と関係する疾患を処置するために、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の組み合わせの投与に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
機能的かつ有効なＴ細胞応答は、例えば、感染症および癌に対する有効な免疫応答において重要な役割を有する。しかしながら、慢性感染または癌のようなある状況下で、エフェクターＴ細胞は、プログラム細胞死リガンド−１(ＰＤ−Ｌ１)／プログラム細胞死１(ＰＤ−１)相互作用を含む種々の免疫抑制性機構により抑制され得て、Ｔ細胞枯渇に至る(Pen et al. Gene Therapy 21, 262-271, 2014)。プログラム細胞死リガンド−１(ＰＤ−Ｌ１)は、通常大部分の細胞型により発現され、一方その受容体ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞および制御性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞のようなある免疫細胞にしか存在しないと考えられる。また、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１結合は、自己免疫性応答を阻止する末梢Ｔ細胞耐容性の維持に重要であるとも考えられる。他方で、高レベルのＰＤ−１発現は、一般にＴ細胞機能喪失と相関し、ウイルス感染の場合はウイルス負荷の増加に至る(Pen et al. Gene Therapy 21, 262-271, 2014)。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
ここに開示する方法および組成物は、疾患、例えば、癌関連抗原(または腫瘍マーカー)の発現と関係する疾患を処置するための、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の投与に関する。
【０００６】
例えば、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤での部分的ｍＴＯＲ阻害が、対象における免疫機能の改善に有効であり、該対象の処置にＣＡＲ治療と組み合わせることができることが判明した。理論に縛られることを望まないが、低い免疫増強用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能の改善には十分である用量)のｍＴＯＲ阻害剤での処置は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の減少またはＰＤ−１陰性細胞の増加を伴うと考えられる。ＰＤ−１陰性Ｔ細胞ではなく、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞は、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との結合により枯渇させ得る。これに加えてまたはこれとは別に、同様に理論に縛られることを望まないが、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤での処置により、例えば、少なくとも一過性に、例えば、非処置対象と比較して、ナイーブＴ細胞数を増加できると考えられる。これに加えてまたはこれとは別に、同様に理論に縛られることを望まないが、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤での処置は、十分な時間または十分な投与の後、次のマーカーの１以上の発現の増加をもたらすと考えられる：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；および次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；ここで、上記のいずれかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。それゆえに、本発明の態様は、少なくとも一部、例えば、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤での、部分的ｍＴＯＲ阻害が、プログラム細胞死(ＰＤ)−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔリンパ球のパーセンテージの減少と関係するとの認識に基づく。
【０００７】
ある態様において、この試みは、対象における、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の性能の最適化に使用できる。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、内在性、非修飾免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の性能が改善されると考えられる。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作するために採取した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の性能が改善すると考えられる。他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増やすまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増やす量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。
【０００８】
よって、ある面において、本発明は、対象、例えば、ヒト対象の免疫応答を処置する、例えば促進する方法であって、
ａ)対象に低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを投与し、そして
ｂ)対象にＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を投与することを含み、
それにより、対象の免疫応答を処置する、例えば増強する、方法に関する。
【０００９】
ある態様において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、癌関連抗原(または腫瘍マーカー)に結合する。ある態様において、癌関連抗原(または腫瘍マーカー)は、固形癌関連抗原(または固形腫瘍マーカー)である。ある態様において、癌関連抗原(または腫瘍マーカー)は、血液癌マーカーである。
【００１０】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与を、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与前に開始する。
【００１１】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与を、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与前に完了する。
【００１２】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与と重複して行う。
【００１３】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与を、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与後も継続する。
【００１４】
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に、増加するように、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な用量の投与後に投与する。
【００１５】
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に、増加するように、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な用量投与の後に採取する。
【００１６】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、対象の末梢血または対象から単離したＴ細胞の調製物における、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比率の減少、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加に十分な時間の後に投与する。
【００１７】
ある態様において、対象、例えば、ヒト対象における免疫応答を処置する、例えば促進する方法は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の結合が介在する負の免疫応答の阻害を含む。
【００１８】
ある態様において、対象、例えば、ヒト対象における免疫応答を処置する、例えば促進する方法は、増殖が可能なＴ細胞の数の増加を含む。
【００１９】
ある態様において、対象、例えば、ヒト対象における免疫応答を処置する、例えば促進する方法は、細胞毒性機能が可能なＴ細胞の数、サイトカイン分泌または活性化の増加を含む。
【００２０】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、少なくとも１日、５日、１０日、２０日、３０日または６０日、部分的な、しかし完全ではない、ｍＴＯＲの阻害をもたらす。
【００２１】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、次の１以上が生じるのに十分な時間、ＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の採取前または後)の投与の前に投与する：
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
そして、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。ある態様において、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与の開始または完了後、少なくとも５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日または６０日に採取する。
【００２２】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、次の１以上が、例えば、採取細胞または操作細胞(または非採取細胞または両者)で起こるのに十分な時間、ＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の採取前に投与する：
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
そして、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。ある態様において、ＲＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与の開始または完了後、少なくとも５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日または６０日に採取する。
【００２３】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の採取後、次の１以上が生じるのに十分な時間投与する：：
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
そして、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。
【００２４】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲを発現するように操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の投与後、次の１以上が生じるのに十分な時間投与する：
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
そして、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。
【００２５】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＣＡＲを発現するように操作しているまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に、エクスビボで次の１以上が生じるのに十分な時間投与する：
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
vi)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
vii)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
そして、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)は、例えば、非処理細胞と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。
【００２６】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリックｍＴＯＲ阻害剤である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はＲＡＤ００１である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシンある。
【００２７】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、触媒的阻害剤、例えば、キナーゼ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲに選択的である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＥＺ２３５およびＣＣＧ１６８から選択される。
【００２８】
ある態様において、低い免疫増強用量は、複数のｍＴＯＲ阻害剤を含む。ある態様において、用量は、アロステリックおよび触媒的ｍＴＯＲ阻害剤を含む。
【００２９】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも５％の、しかし、９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤ００１を含む。
【００３０】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも１０％の、しかし、８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤ００１を含む。
【００３１】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも１０％の、しかし、４０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤ００１を含む。
【００３２】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、即時放出剤形で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【００３３】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、即時放出剤形で、約５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【００３４】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回の、即時放出剤形の０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の量の、例えば、週に１回、例えば、即時放出剤形での投与を含む。
【００３５】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、即時放出剤形の約５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の量の、週に１回、即時放出剤形での投与を含む。
【００３６】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、徐放性剤形で、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【００３７】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、徐放性剤形で、約１５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【００３８】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、徐放性剤形の０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、週に１回、例えば、徐放性剤形での投与を含む。
【００３９】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、徐放性剤形の約１５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、週に１回、徐放性剤形での投与を含む
【００４０】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、１日１回、例えば、即時放出剤形で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【００４１】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、１日１回、即時放出剤形で、約０.５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【００４２】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、１日１回、即時放出剤形の０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、１日１回、例えば、即時放出剤形での投与を含む。
【００４３】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、１日１回、即時放出剤形の約０.５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、１日１回、即時放出剤形での投与を含む。
【００４４】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、１日１回、例えば、徐放性剤形で、０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【００４５】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、１日１回、徐放性剤形の０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、１日１回、例えば、徐放性剤形での投与を含む。
【００４６】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、徐放性剤形で、０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【００４７】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、徐放性剤形の０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、週に１回、例えば、徐放性剤形での投与を含む。
【００４８】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はＲＡＤ００１であり、用量は、約０.１〜３ng／ml、０.３ng／ml未満〜３ng／mlまたは０.３ng／ml未満〜１ng／mlの範囲のＲＡＤ００１のトラフレベルを提供する。
【００４９】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はＲＡＤ００１以外であり、用量は、約０.１〜３ng／ml、０.３ng／ml未満〜３ng／mlまたは０.３ng／ml未満〜１ng／mlの範囲のＲＡＤ００１のトラフレベルを提供するＲＡＤ００１の用量と生物学的同等である。
【００５０】
ある態様において、対象は癌を有し、方法は、癌に対する対象の免疫応答の促進を含む。ある態様において、対象は、癌を有することに基づき選択した。ある態様において、癌の細胞はＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する。ある態様において、癌微小環境における細胞はＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する。
【００５１】
ある態様において、癌は固形腫瘍を含む。ある態様において、癌は血液癌である。ある態様において、癌は白血病である。ある態様において、癌は慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)である。ある態様において、癌はＣＬＬであり、ここで、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９を標的とする。ある態様において、癌は黒色腫である。
【００５２】
ある態様において、方法は、対象へのさらなる処置、例えば、化学療法、放射線、細胞治療、骨髄移植の適用をさらに含む。ある態様において、方法は、Ｔ細胞を殺すさらなる処置、例えば、放射線または細胞毒性化学療法の適用をさらに含む。ある態様において、方法は、対象にビタミンＥ、ビタミンＡ、抗細菌抗生物質、抗酸化剤、Ｌ−カルニチン、リポ酸、メトホルミン、レスベラトロール、レプチン、非ステロイド抗炎症剤またはＣＯＸ阻害剤のようなｍＴＯＲ経路阻害剤を投与することをさらに含む。ある態様において、方法は、対象にメトホルミンを投与することをさらに含む。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量を、さらなる処置開始の前または後に投与する。ある態様において、方法は、さらに、癌のさらなる処置の適用を含む
【００５３】
ある態様において、対象は免疫不全である。ある態様において、対象はＨＩＶ＋またはＡＩＤｓである。ある態様において、対象は感染性疾患を有する。
【００５４】
ある態様において、対象は、免疫応答障害を有する。ある態様において、対象は免疫老化である。ある態様において、対象は、加齢関連状態を有する。
【００５５】
ある態様において、対象、例えば、ヒト対象における免疫応答を処置する、例えば促進する方法は、さらに、対象における抗体に対する免疫応答の増強を含む。ある態様において、方法は、さらに、対象への抗原またはワクチンの投与を含む。ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与の過程の前に、方法は、抗原に対する免疫応答障害を有する対象を特定する過程を含む。
【００５６】
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、ここに記載する細胞、例えば、ヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞、例えば、ここに記載するヒトＴ細胞またはここに記載するヒトＮＫ細胞である。ある態様において、ヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【００５７】
他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、さらに、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子の例は、例えば、ここに記載するような、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＩＧＩＴのような、阻害分子の第一ポリペプチドまたはこれらのいずれかのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ−１の第一ポリペプチドまたはそのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳまたは４−ＩＢＢシグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
【００５８】
ある態様において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。ある態様において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００５９】
ある態様において、共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、共刺激ドメインは４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１４の配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００６０】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインは、配列番号１８または配列番号２０を含む。
【００６１】
他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、さらに１以上のＣＡＲを発現し得る(例えば、Ｔ細胞は２以上のＣＡＲを含む)。ある態様において、本発明の免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ここに記載するような腫瘍マーカーに結合する抗原結合ドメインを含む第一ＣＡＲおよびＰＤ１細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む第二ＣＡＲを含む。
【００６２】
ある態様において、方法は、さらに、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、他の薬剤と組み合わせて投与することを含む(低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤に加えて)。ある態様において、薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤(例えば、ここに記載する低い免疫増強用量より高用量で、例えば、抗癌効果を提供する用量で投与する)、ＭＮＫ阻害剤またはデュアルｍＴＯＲ／Ｐ１３Ｋキナーゼ阻害剤およびこれらの組み合わせ)であり得る。
【００６３】
ある態様において、方法は、哺乳動物に抗腫瘍免疫を提供することを含む。ある態様において、細胞は自己Ｔ細胞または自己ＮＫ細胞である。ある態様において、細胞は同種異系Ｔ細胞または同種異系ＮＫ細胞である。ある態様において、哺乳動物は、ヒトである。
【００６４】
ある態様において、方法は、癌関連抗原または腫瘍マーカーの発現と関係する疾患を有する哺乳動物の処置を含む。
【００６５】
ある態様において、方法は、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の効果を増強する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤の投与を含む。
【００６６】
ある態様において、方法は、ＣＡＲ分子を発現する細胞、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与と関係する１以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤の投与を含む。
【００６７】
ある態様において、方法は、ここに記載するような癌関連抗原と関係する疾患を処置する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤の投与を含む。
【００６８】
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は２以上のＣＡＲ分子を発現し、例えば、癌を処置するために、それを必要とする対象に投与する。
【００６９】
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、ここに記載する用量および／または投薬スケジュールで投与する。
【００７０】
ある態様において、ＣＡＲ分子を、例えば、インビトロ転写を使用して、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)に導入し、対象(例えば、ヒト)は、ＣＡＲ分子を含む細胞の最初の投与およびＣＡＲ分子を含む細胞の１以上のその後の投与を受け、ここで、１以上のその後の投与を、先の投与の１５日未満、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日後に受ける。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞の１を超える投与を、週あたりに対象(例えば、ヒト)に投与し、例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞の２、３または４投与を週あたりに投与する。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、週あたりＣＡＲ分子を含む細胞の１を超える投与を受け(例えば、週あたり２、３または４投与)(ここではサイクルとも称する)、続いて、１週間ＣＡＲ分子を含む細胞を投与せず、その後ＣＡＲ分子を含む細胞の１以上のさらなる投与(例えば、週あたりＣＡＲ分子を含む細胞の１を超える投与)を対象に投与する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、１を超えるサイクルのＣＡＲ分子を含む細胞を受け、各サイクルの間の時間は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日未満である。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞を、週あたり、隔日で３投与で投与する。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞を、少なくとも２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週またはそれ以上投与する。
【００７１】
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌の第一選択処置として投与する。他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌の第二、第三、第四選択処置として投与する。
【００７２】
ある態様において、ここに記載する細胞の集団を投与する。
【００７３】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤(例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシン)およびＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は単一組成物に存在し、例えば、単一組成物として投与する。ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤(例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシン)およびＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は別々の組成物で存在し、例えば、別々の組成物として投与する。
【００７４】
他の面において、本発明は、医薬として使用するための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクター、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の製剤および本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。
【００７５】
他の面において、本発明は、ここに記載のような癌関連抗原を発現する疾患の処置に使用するための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクター、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の製剤および本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。
【００７６】
ある面において、本発明は、対象の処置に使用するためのｍＴＯＲ阻害剤を提供し、ここで、該ｍＴＯＲ阻害剤は該対象の免疫応答を増強し、ここで、該対象は、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞を受けているか、受けるか、または受ける予定である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、低い免疫増強用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、低い免疫増強用量で投与する。
【００７７】
ある面において、本発明は、対象の処置に使用するためのＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞を提供し、ここで、該対象は、該対象の免疫応答を増強するｍＴＯＲ阻害剤を受けているか、受けるか、または受ける予定である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、低い免疫増強用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、低い免疫増強用量で投与する。
【００７８】
ある態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列、例えば、ここに記載する共刺激ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００７９】
ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される、例えば、ここに記載する、タンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含む。
【００８０】
ある態様において、コードされた４−１ＢＢの共刺激ドメインは、配列番号１４の配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１５のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、コードされたＣＤ２８の共刺激ドメインは、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号９１のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号９１のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ２８の共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号９２のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、コードされたＣＤ２７の共刺激ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ２７の共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、コードされたＩＣＯＳの共刺激ドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされたＩＣＯＳの共刺激ドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号９３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＩＣＯＳの共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号９４のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００８１】
ある態様において、コードされた一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインは、配列番号１８の配列(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号２０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００８２】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【００８３】
ある面において、本発明は、例えば、ここに記載するような、ＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入した自己細胞の集団を含む。ある態様において、ベクターは、レトロウイルスベクターである。ある態様において、ベクターは、本明細書の他の箇所に記載する自己不活性化レンチウイルスベクターである。ある態様において、ベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に送達され(例えば、トランスフェクトまたは電気穿孔により)、そこで、ベクターは、ここに記載するような本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を含み、これはｍＲＮＡ分子のように転写され、本発明のＣＡＲはＲＮＡ分子から翻訳され、細胞表面に発現される。
【００８４】
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞(ＣＡＲＴ細胞)またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載するような第一腫瘍マーカーに結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞およびここに記載するような第二腫瘍マーカーに結合する異なる抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載するような腫瘍マーカーに結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびここに記載するような腫瘍マーカー以外の標的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
【００８５】
他の面において、本発明は細胞の集団を提供し、ここで、集団内の少なくとも１細胞は、ここに記載するような腫瘍マーカーに結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞は他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載する分子であり、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む薬剤である。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータのような阻害分子の、第一ポリペプチドまたはこれらのいずれかのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、例えば、ここに記載するような、例えば、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ−１の第一ポリペプチドまたはそのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
【００８６】
ある態様において、例えば、ここに記載するような、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子は、ｍＲＮＡ分子として発現される。ある態様において、遺伝的に修飾された本発明のＣＡＲ発現細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、細胞に所望のＣＡＲをコードするＲＮＡ分子(例えば、ベクター配列を伴わず)をトランスフェクトまたは電気穿孔により産生できる。ある態様において、本発明のＣＡＲ分子は、取り込まれたらＲＮＡ分子から翻訳され、組み換え細胞表面に発現される。
【００８７】
ある面において、本発明はまた、ＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を製造する方法であって、
ａ)次のものにより産生した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を提供する：
ｉ)対象に、次のものの１以上が生じる十分な時間、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを投与する：
１ａ)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の集団の増加；
１ｂ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の集団の減少；
１ｃ)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比の増加；
１ｄ)ナイーブＴ細胞数の増加；
１ｅ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
１ｆ)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
１ｇ)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、１ａ)、１ｂ)、１ｃ)、１ｄ)、１ｅ)、１ｆ)または１ｇ)は、対象でまたは対象から採取した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団で、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる；および
(ii)対象から免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を採取する；そして
ｂ)ＣＡＲをコードする核酸を、採取した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に挿入し、それによりＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を産生する
ことを含む、方法を提供する。
【００８８】
ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の提供は、次の一方または両方を含む：
対象に、次のものの１以上が生じる十分な時間、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを投与する：
ａ)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の集団の増加；
ｂ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の集団の減少；
ｃ)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比の増加；
ｄ)ナイーブＴ細胞数の増加；
ｅ)１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
ｆ)例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
ｇ)次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、ａ)、ｂ)、ｃ)、ｄ)、ｅ)、ｆ)またはｇ)は、対象でまたは対象から採取した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団で、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる；そして
対象から免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を採取する。
【００８９】
ある面において、本発明はまた次のものを含む、ＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞を製造する方法を提供する：
ａ)場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞とｍＴＯＲ阻害剤を接触させる；そして
ｂ)ＣＡＲをコードする核酸を免疫エフェクター細胞に導入する；
それによりＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された、場合によりＴ細胞である免疫エフェクター細胞を製造し、
ここで、工程ａ)の該接触は、該工程ｂ)の挿入の前、同時または後に起こり；
ここで、ｍＴＯＲ阻害剤は次のものの１以上を生じさせる：
１ａ)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の集団の増加；
１ｂ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の集団の減少；
１ｃ)場合によりＴ細胞であるＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／場合によりＴ細胞であるＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞比の増加；
１ｄ)ナイーブＴ細胞数の増加；
１ｅ)１以上の次のマーカーの発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２(これは、記憶Ｔ細胞上にあり、場合により、記憶Ｔ細胞前駆体上にある)；
１ｆ)例えば、記憶Ｔ細胞上、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体上の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
１ｇ)場合により次の特徴の任意の１つまたは組み合わせを有する細胞である、記憶Ｔ細胞前駆体数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、１ａ)、１ｂ)、１ｃ)、１ｄ)、１ｅ)、１ｆ)または１ｇ)は、場合により、免疫エフェクター細胞の非接触集団と比較して、場合により、少なくとも一過性に、生じる。
【００９０】
ある態様において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、腫瘍マーカーに結合する。ある態様において、腫瘍マーカーは、固形腫瘍マーカーである。
【００９１】
ある態様において、ＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を産生する方法は、さらに、対象、例えば、免疫エフェクター細胞が由来した対象と異なる対象に、その中にＣＡＲをコードする核酸が配置された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を導入することを含み。ある態様において、対象は、免疫エフェクター細胞が由来した対象である。ある態様において、対象は異なる対象である。ある態様において、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。ある態様において、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。
【００９２】
ある態様において、方法は、さらに、対象でまたは対象から採ったＴ細胞で、ＰＤ１陰性またはＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルを評価することを含む。
【００９３】
ある態様において、ここに開示する製造法は、さらに、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードする核酸、例えば、ｈＴＥＲＴを接触させることを含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡであり得る。
【００９４】
ある態様において、ここに開示する製造法は、さらに、２％ｈＡＢ血清を含む血清中の免疫エフェクター細胞の集団の培養を含む。
【００９５】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与を、Ｔ細胞採取の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日または３０日前に開始する。
【００９６】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は対象からの免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の採取少なくとも少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日または３０日前に部分的な、しかし完全ではない、ｍＴＯＲの阻害をもたらす。
【００９７】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリックｍＴＯＲ阻害剤である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はＲＡＤ００１である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシンある。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、触媒的阻害剤、例えば、キナーゼ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲに選択的である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＥＺ２３５およびＣＣＧ１６８から選択される。
【００９８】
ある態様において、ＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を産生する方法は、増殖が可能なＴ細胞の数の増加を含む。
【００９９】
ある態様において、ＣＡＲをコードする核酸がその中に配置された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を産生する方法は、細胞毒性機能が可能なＴ細胞の数、サイトカイン分泌または活性化の増加を含む。
【０１００】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、少なくとも１日、５日、１０日、２０日、３０日または６０日、部分的な、しかし完全ではない、ｍＴＯＲの阻害をもたらす。
【０１０１】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも５％の、しかし、９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤ００１を含む。
【０１０２】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも１０％の、しかし、８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤ００１を含む。
【０１０３】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害により測定して、少なくとも１０％の、しかし、４０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤ００１を含む。
【０１０４】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、即時放出剤形で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【０１０５】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、即時放出剤形で、約５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【０１０６】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、即時放出剤形の０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、週に１回、例えば、即時放出剤形での投与を含む。
【０１０７】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、即時放出剤形の約５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量の、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、週に１回、即時放出剤形での投与を含む。
【０１０８】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、徐放性剤形で、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【０１０９】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、徐放性剤形で、約１５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【０１１０】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、徐放性剤形の０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、週に１回、例えば、徐放性剤形での投与を含む。
【０１１１】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回、徐放性剤形の約１５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量の、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、週に１回、徐放性剤形での投与を含む。
【０１１２】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、１日１回、例えば、即時放出剤形で、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【０１１３】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、１日１回、即時放出剤形で、約０.５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【０１１４】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、１日１回、即時放出剤形の０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、１日１回、例えば、即時放出剤形での投与を含む。
【０１１５】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、１日１回、即時放出剤形の約０.５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、１日１回、即時放出剤形での投与を含む。
【０１１６】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、１日１回、例えば、徐放性剤形で、０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【０１１７】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、１日１回、徐放性剤形の０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、１日１回、例えば、徐放性剤形での投与を含む。
【０１１８】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、週に１回、例えば、徐放性剤形で、０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１の投与を含む。
【０１１９】
ある態様において、対象への低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、週に１回徐放性剤形の０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのＲＡＤ００１と生物学的同等である量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の、例えば、週に１回、例えば、徐放性剤形での投与を含む。
【０１２０】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はＲＡＤ００１であり、用量は、約０.１〜３ng／ml、０.３ng／ml未満〜３ng／mlまたは０.３ng／ml未満〜１ng／mlの範囲のＲＡＤ００１のトラフレベルを提供する。
【０１２１】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はＲＡＤ００１以外であり、用量は、約０.１〜３ng／ml、０.３ng／ml未満〜３ng／mlまたは０.３ng／ml未満〜１ng／mlの範囲のＲＡＤ００１のトラフレベルを提供するＲＡＤ００１の用量と生物学的同等である。
【０１２２】
ある態様において、対象は癌を有する。ある態様において、癌の細胞はＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する。ある態様において、癌微小環境における細胞はＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する。ある態様において、癌は固形腫瘍を含む。ある態様において、癌は血液癌である。ある態様において、癌は慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)である。ある態様において、癌はＣＬＬであり、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９を標的とする。ある態様において、癌は、ここに記載する癌から選択される。ある態様において、癌は黒色腫である。
【０１２３】
ある態様において、対象は免疫不全である。
【０１２４】
ある態様において、対象はＨＩＶ＋またはＡＩＤｓである。
【０１２５】
ある態様において、対象は感染性疾患を有する。
【０１２６】
ある態様において、対象は、免疫応答障害を有する。
【０１２７】
ある態様において、対象は免疫老化である。
【０１２８】
ある態様において、対象は、加齢関連状態を有する。
【０１２９】
ある面において、ヒト免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の調製物もここに記載し、ここで、ヒトエフェクター細胞の調製物ここに記載する方法のいずれかにより製造したＣＡＲをコードする核酸をその中に配置している。ある態様において、対象は癌を有するかまたは免疫不全である。
【０１３０】
タイトル、サブタイトルまたは番号または文字表記、例えば、(ａ)、(ｂ)、(ｉ)などは、読みやすくするためだけのものである。本明細書におけるタイトルまたは番号または文字表記の使用は、当該工程または要素がアルファベット順で実施すべきであることまたは工程もしくは要素が必ず互いに分離していることを必要とするものではない。
【０１３１】
ここに記載するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０１３２】
本発明の他の特性、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１Ａおよび１Ｂはプラセボと比較したインフルエンザワクチン株に対する力価の増強を示すグラフである。図１Ａにおいて、ワクチン接種４週間後、プラセボコホートの増加に対する３インフルエンザワクチン株(Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８)の各々に対するインフルエンザ幾何平均力価のベースラインを超える増加が、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投薬コホートの各々で示される。太黒線は、治験の一次エンドポイントを満たすために、３インフルエンザワクチン株中２株で満たすことが要求されるプラセボに対する力価の１.２倍増加を示す。星印“＊”プラセボに対するＧＭＴ力価の増加が、少なくとも８０％の事後確率で１を超えることを示す。図１Ｂは、ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０を有する対象のサブセットについて図１Ａと同じデータのグラフである。
【０１３４】
【図２】図２はワクチン接種４週間後、各インフルエンザワクチン株に対するＲＡＤ００１濃度対幾何平均力価の増加倍率の散布図を示す。ＲＡＤ００１濃度(投与１時間後)を、対象が４週間投与された後に測定した。薬物動態測定した全対象を解析セットに包含した。ベースラインに対するワクチン接種４週間の幾何平均力価増加倍率をｙ軸に示す。
【０１３５】
【図３】図３はプラセボと比較して、異種インフルエンザ株に対する力価の増加を示すグラフである。Ｔワクチン接種４週間後、プラセボコホートの増加と比較した、インフルエンザワクチンに含まれていない２異種インフルエンザ株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対するインフルエンザ幾何平均力価のベースラインを超える増加が、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投薬コホートの各々について示される。＊は、プラセボに対する力価増加が、事後確率少なくとも８０％で１を超えることを示す。
【０１３６】
【図４】図４Ａおよび４Ｂはインフルエンザワクチン接種前後の、ＩｇＧおよびＩｇＭレベルのグラフである。抗Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭのレベルを、インフルエンザワクチン接種前および４週間後に得た対象の血清で測定した。ＲＡＤ００１とプラセボコホートで、抗Ｈ１Ｎ１インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭレベルにおけるワクチン接種４週間後のベースラインからの変化で有意差は見られなかった(全ｐ値＞クラスカル・ウォリス順位和検定で０.０５)。
【０１３７】
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５ＣはＲＡＤ００１処置後のＰＤ−１陽性ＣＤ４パーセント減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞増加のグラフ表示である。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセントを、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間かつインフルエンザワクチン接種４週間後(１２週目)にＦＡＣＳ分析により決定した。図５Ａは、用量レベル０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)でＲＡＤ００１を受けているコホートにおいて、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、それぞれ０.００２(０.０２)、ｐ＝０.００３(ｑ＝０.０３)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)で、１２週目にＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の有意な減少ｅ(−３７.１〜−２８.５％)があったことを示す。図５Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を用量レベル０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)で受けているコホートで１２週目にＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞が、それぞれｐ＝０.０１(０.０５)、ｐ＝０.００７(ｑ＝０.０４)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)で有意に減少した(−４３.３〜−３８.５％)ことを示す。図５Ｃは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を用量レベル０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)で受けているコホートで１２週目にＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞が、それぞれｐ＝０.０００７(０.０２)、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.０７)およびｐ＝０.０３(ｑ＝０.０８)で有意増加した(３.０〜４.９％)ことを示す。
【０１３８】
【図６】図６Ａおよび６ＢはベースラインＰＤ−１発現の差異で調節したＲＡＤ００１処置後のＰＤ−１陽性ＣＤ４パーセント減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞増加のグラフである。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセントを、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間かつインフルエンザワクチン接種４週間後(１２週目)にＦＡＣＳ分析により決定した。図６Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)で、貯留ＲＡＤコホート(ｎ＝８４)において６週目にＰＤ−１＋  ＣＤ４  Ｔ細胞の３０.２％の有意な減少があることを示す。プラセボコホートと比較した貯留ＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の減少は、３２.７％でｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)である。図６Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)で、貯留ＲＡＤ００１コホート(ｎ＝８４)における６週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の３７.４％の有意な減少を示す。プラセボコホートと比較した貯留ＲＡＤ００１における１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の減少は、４１.４％でｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)である。図６Ａおよび６Ｂは、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃの種々のＲＡＤ００１用量群を、図６Ａおよび６Ｂにおいて単一ＲＡＤ００１処置群に貯留した以外、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃにおけるデータを表す。
【０１３９】
【図７】図７は高齢対象におけるＲＡＤ００１に応答した運動およびエネルギーの増加を示す。
【０１４０】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは細胞におけるＰ７０  Ｓ６Ｋ活性に対するＲＡＤ００１の予測効果を示す。図８Ａは、高用量の毎週および連日のＲＡＤ００１でのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を示す；図８Ｂは、低用量の毎週ＲＡＤ００１でのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を示す。
【０１４１】
【図９】図９はＰＤＬ−１とのＰＤ１相互作用は、Ｊｕｒｋａｔ細胞表面でＰＤ１のクラスタリングをもたらすのに十分であり、ＮＦＡＴ経路の強い活性化を誘発することを示す。
【０１４２】
【図１０】図１０はＣＡＲ発現、形質導入Ｔ細胞の増殖が、細胞培養系における低用量のＲＡＤ００１により増強されることを示す。ＣＡＲＴを、種々の濃度のＲＡＤ００１(nM)の存在下、ＮＡＬＭ６(Ｎａｌｍ−６)細胞と共培養した。ＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(黒色)および総Ｔ細胞(白色)の数を、共培養４日後に評価した。
【０１４３】
【図１１】図１１は、０.３、１、３および１０mg／kg(mpk)での連日ＲＡＤ００１投薬または媒体投薬を用いるＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞の腫瘍増殖測定を示す。丸は媒体を示す；四角は１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；三角は３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示し、逆三角は１mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；菱形は０.３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す。
【０１４４】
【図１２】図１２Ａおよび１２ＢはＮＡＬＭ６腫瘍を有するＮＳＧマウスの血中のＲＡＤ００１の量を示す薬物動態曲線を示す。図１２Ａは、最初の用量のＲＡＤ００１後の０日目のＰＫを示す。図１２Ｂは、最終ＲＡＤ００１用量のちの１４日目のＰＫを示す。菱形は１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；四角は１mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；三角は３mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す；ｘは１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す。
【０１４５】
【図１３】図１３Ａおよび１３ＢはＲＡＤ００１投薬したまたはしていないヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞のインビボ増殖を示す。低用量のＲＡＤ００１(０.００３mg／kg)連日は、正常レベルのｈｕＣＡＲ１９増殖を超える、ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖の増強に至る。図１３ＡはＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞を示す；図１３ＢはＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞を示す。丸はＰＢＳを示す；四角はｈｕＣＴＬ０１９を示す；三角は３mg／kg  ＲＡＤ００１を伴うｈｕＣＴＬ０１９を示す；逆三角は０.３mg／kg  ＲＡＤ００１を伴うｈｕＣＴＬ０１９を示す；菱形は０.０３mg／kg  ＲＡＤ００１を伴うｈｕＣＴＬ０１９を示す；丸は０.００３mg／kg  ＲＡＤ００１を伴うｈｕＣＴＬ０１９を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４６】
詳細な記載
定義
特記しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解される意味を有する。
【０１４７】
単数表現は、文法上の目的が１個以上(すなわち、少なくとも１)をいう。例として、“要素”は、１個の要素または１を超える要素を意味する。
【０１４８】
用語“約”は、量、期間などのような測定可能な値をいうとき、特定した値からの±２０％またはある場合±１０％またはある場合±５％またはある場合±１％またはある場合±０.１％を、このようなばらつきが開示された方法の実施において妥当であるために、包含することを意味する。
【０１４９】
用語“受けようとしている”は、ここで、第一治療剤を受けており、第二治療剤を受けようとしている患者の文脈で使用するとき、患者が、障害(例えば、癌)のための第一治療を受けているかまたは受けたことがあり、ここで患者は、その障害に対する処置過程で第二の治療を受ける予定である、状況をいう。
【０１５０】
用語“アジュバント”は、製剤において特定の免疫原、例えば、ワクチン免疫原と組み合わせて使用したとき、得られる免疫応答を増強するかまたは他に改変、修飾もしくは亢進する化合物をいう。
【０１５１】
用語“同種”は、物質が導入される個体と同じ主の異なる動物に由来する何らかの物質をいう。２以上の個体は、１以上の座位の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系といわれる。ある面において、同じ種の個体由来の同種異系物質は、抗原性に相互作用するのに十分遺伝的に似ていない可能性がある。
【０１５２】
用語“抗癌効果”は、例えば、腫瘍体積減少、癌細胞数減少、転移数減少、余命延長、癌細胞増殖減少、癌細胞生存減少または癌性状態に付随する種々の生理学的症状改善を含むが、これらに限定されない、種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。“抗癌効果”は、本発明の化合物(例えば、ｍＴＯＲ阻害剤)、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体が、そもそも癌の発生を予防する能力によっても顕在化され得る。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、腫瘍細胞増殖減少または腫瘍細胞生存減少を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。
【０１５３】
ここで使用する用語“抗体”は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、複数または一本鎖または完全免疫グロブリンであってよく、天然源由来でも組み換え源由来でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
【０１５４】
用語“抗体フラグメント”は、完全抗体またはその組み換えバリアントの少なくとも一つの部分をいい、抗原のような標的に対する抗体フラグメントの認識および特異的結合を与えるのに十分である、抗原結合ドメイン、例えば、完全抗体の抗原性決定可変領域をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ(ｓｄＦｖ)、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、線形抗体、ｓｄＡｂのような単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨのいずれか)、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２個以上、例えば、２個のＦａｂフラグメントまたは２個以上、例えば、２個の単離ＣＤＲを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成される多特異性分子または連結した抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体フラグメントは、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗体フラグメントは、フィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植もできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。
【０１５５】
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、短柔軟性ポリペプチドリンカーにより隣接して連結され、単一鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、ｓｃＦｖはそれが由来する完全抗体の特異性を保持する。特記しない限り、ここで使用する、ｓｃＦｖは、いずれの順番でＶＬおよびＶＨ可変領域を含んでもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関してｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでも、ＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
【０１５６】
ここで使用する用語“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”は、抗原特異性および結合親和性を与える、抗体可変領域内のアミノ酸の配列をいう。例えば、一般に、各重鎖可変領域に３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３)および各軽鎖可変領域に３ＣＤＲ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３)が存在する。あるＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Ｋａｂａｔ”番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948(“Ｃｈｏｔｈｉａ”番号付けスキーム)またはこれらの組み合わせにより記載のものを含む多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定できる。Ｋａｂａｔ番号付けスキーム下、ある態様において、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)のＣＤＲアミノ酸残基は３１〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けされ；そして軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)におけるＣＤＲアミノ酸残基は２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム下、ある態様において、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸は２６〜３２(ＨＣＤＲ１)、５２〜５６(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けされ；そしてＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基は２６〜３２(ＬＣＤＲ１)、５０〜５２(ＬＣＤＲ２)および９１〜９６(ＬＣＤＲ３)と番号付けされる。複合ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームにおいて、ある態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲまたは両者の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、ある態様において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳動物ＶＨ、例えば、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)；およびＶＬ、例えば、哺乳動物ＶＬ、例えば、ヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)に対応する。
【０１５７】
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲの部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)または例えば、ヒト化抗体または二特異性抗体を含む、例えば、抗原結合ドメインがポリペプチド鎖の一部として発現される、多種多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。あるＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Ｋａｂａｔ”番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948(“Ｃｈｏｔｈｉａ”番号付けスキーム)またはこれらの組み合わせにより記載のものを含む多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定できる。
【０１５８】
ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある態様において、抗体分子は多特異性抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数の中の第一免疫グロブリン可変ドメイン配列は第一エピトープに対する結合特異性を有し、複数の中の第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は第二エピトープに対する結合特性を有する。ある態様において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
【０１５９】
用語“抗体重鎖”は、天然に存在する立体構造の抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいい、通常、当該抗体が属するクラスを決定する。
【０１６０】
用語“抗体軽鎖”は、天然に存在する立体構造の抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２つの主用抗体軽鎖アイソタイプをいう。
【０１６１】
用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を惹起する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫適格細胞の活性化または両者が関与し得る。当業者は、実質的に全タンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子が抗原として働き得ることを理解する。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、それゆえに、“抗原”を、当該用語がここで使用される限り、コードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解する。本発明が、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されず、これらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するポリペプチドをコードするように種々の組み合わせで配置されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が全く“遺伝子”によりコードされる必要がないことを理解する。抗原を合成により製造できるかまたは生物学的サンプルに由来し得るかまたはポリペプチド以外の巨大分子であるかもしれないことは容易に明らかである。このような生物学的サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を伴う液体を含み得るが、これらに限定されない。
【０１６２】
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、表面に主要組織適合抗原(ＭＨＣ)と複合体化した外来抗原を呈示するアクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示する。
【０１６３】
用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体由来のあらゆる物質をいう。
【０１６４】
用語“生物学的同等”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により産生される効果と同等な効果を産生するのに必要な対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量をいう。ある態様において、効果は、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価した、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイで測定した、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により測定した、ｍＴＯＲ阻害のレベルまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定である。ある態様において、効果は、細胞選別により測定した、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の改変である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の改変を達成する量または用量である。
【０１６５】
用語“キメラ抗原受容体”または代替的に“ＣＡＲ”は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義するような刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)を含む、組み換えポリペプチド構築物をいう。ある態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるドメインは同じポリペプチド鎖にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。他の態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるドメインは互いに隣接しておらず、例えば、ここに記載するＲＣＡＲにおいて提供されるように、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。
【０１６６】
ある面において、ＣＡＲの刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体と関係するゼータ鎖である。ある面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン)を含む。ある面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、下に定義するような少なくとも１つの共刺激性分子に由来する１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある面において、共刺激性分子は、４１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選択される。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに１以上の共刺激性分子および刺激性分子由来の２つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに１以上の共刺激性分子および刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメイン由来の少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)に任意のリーダー配列を含む。ある面において、ＣＡＲは、さらに、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、場合により細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化の間に抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から開裂されてよい。ある態様において、ＣＡＲは抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ＣＡＲはカウンターリガンドに特異的な細胞外リガンドドメインを含む。
【０１６７】
ここに記載するような特異的腫瘍マーカーＸを標的とする抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体またはＴＣＲ(例えば、ＴＣＲアルファ結合ドメインまたはＴＣＲベータ結合ドメイン))を含むＣＡＲをＸＣＡＲと称す。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲはＣＤ１９ＣＡＲと称す。ＣＡＲはあらゆる細胞、例えば、ここに記載するような免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)において発現できる。
【０１６８】
用語“癌”は、異常細胞の未制御の増殖により特徴付けられる疾患をいう。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系により体の他の部分に拡散できる。種々の癌の例はここに記載され、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。ある態様において、癌は、癌細胞または腫瘍微小環境へのＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の発現により特徴付けられる。用語“癌”は、病理組織学的タイプまたは侵襲性の段階と無関係に、全ての癌性増殖または発癌過程、転移組織または悪性に添加した細胞、組織または臓器をいう。用語“腫瘍”および“癌”は、ここでは交換可能に使用し、例えば、両用語は固形および液性、例えば、拡散もしくは循環腫瘍を含む。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は、前悪性ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
【０１６９】
用語“癌関連抗原”または“腫瘍マーカー”は、交換可能に、正常細胞と比較して、癌細胞の表面上に、全体的であれフラグメンとしてであれ(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)、優勢に発現される分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいい、これは、薬物の癌細胞への優先的ターゲティングに有用である。ある態様において、癌関連抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現されている、例えば、正常細胞と比較して１倍過発現、２倍過発現、３倍過発現またはそれ以上過発現されている、細胞表面分子である。ある態様において、癌関連抗原は、正常細胞で発現される分子と比較して、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、欠失、付加または変異を含む分子である。ある態様において、癌関連抗原は、癌細胞の表面上に、全体的であれフラグメンとしてであれ(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)、排他的に発現され、正常細胞の表面には合成または発現されない。
【０１７０】
ここで使用する用語“ＣＤ１９”は、白血病前駆体細胞で検出可能な抗原決定基である、表面抗原分類１９タンパク質をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５３９１として見ることができ、ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ＿００１１７８０９８として見ることができる。ここで使用する“ＣＤ１９”は、完全長野生型ＣＤ１９の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病および非ホジキンリンパ腫を含む、大部分のＢ細胞系譜癌で発現される。ＣＤ１９を発現する他の細胞は、“ＣＤ１９の発現と関係する疾患”の定義において下に提供する。これはＢ細胞前駆細胞の初期マーカーでもある。例えば、Nicholson et al. Mol. Immun. 34(16-17): 1157-1165(1997)参照。ある面において、ＣＡＲＴの抗原結合部分は、ＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ＣＤ１９タンパク質は癌細胞に発現される。
【０１７１】
ここで使用する用語“ＣＤ２０”は、Ｂ細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトＣＤ２０は、膜貫通４−ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１(ＭＳ４Ａ１)とも呼ばれる。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿６９０６０５.１およびＮＰ＿０６８７６９.２として見ることができ、ヒトＣＤ２０の転写バリアント１および３をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ受託番号ＮＭ＿１５２８６６.２およびＮＭ＿０２１９５０.３として見ることができる。ある面において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２０タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ＣＤ２０タンパク質は癌細胞に発現される。
【０１７２】
ここで使用する用語“ＣＤ２２”は、白血病前駆体細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔのような公的データベースに見ることができる。例えば、アイソフォーム１〜５ヒトＣＤ２２のアミノ酸配列は受託番号ＮＰ＿００１７６２.２、ＮＰ＿００１１７２０２８.１、ＮＰ＿００１１７２０２９.１、ＮＰ＿００１１７２０３０.１およびＮＰ＿００１２６５３４６.１としてそれぞれ見ることができ、ヒトＣＤ２２のバリアント１〜５をコードするヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ＿００１７７１.３、ＮＭ＿００１１８５０９９.１、ＮＭ＿００１１８５１００.１、ＮＭ＿００１１８５１０１.１およびＮＭ＿００１２７８４１７.１としてそれぞれ見ることができる。ある面において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２２タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ＣＤ２２タンパク質は癌細胞に発現される。
【０１７３】
ここで使用する用語“ＲＯＲ１”は、白血病前駆体細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＲＯＲ１のアイソフォーム１および２前駆体のアミノ酸配列は受託番号ＮＰ＿００５００３.２およびＮＰ＿００１０７７０６１.１としてそれぞれ見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００５０１２.３およびＮＭ＿００１０８３５９２.１としてそれぞれ見ることができる。ある面において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ＲＯＲ１タンパク質は癌細胞に発現される。
【０１７４】
用語“保存的配列修飾”は、当該アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準技術により、本発明の抗体または抗体フラグメントに修飾を導入できる。保存的置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それゆえに、本発明のＣＡＲ内の１以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えてよく、改変したＣＡＲを、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験できる。
【０１７５】
用語“構成的プロモーター”は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞のほとんどのまたは全ての生理学的条件下で、当該細胞内で遺伝子産物の産生を誘発するヌクレオチド配列をいう。
【０１７６】
ここで使用する用語“由来する”は、第一分子と第二分子の関係を示す。一般に第一分子と第二分子の構造的類似性をいい、第二分子に由来する第一分子の過程または源限定を暗示または包含しない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを発生させる能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。細胞内シグナル伝達ドメインを産生する特定の過程の限定を暗示または包含しない、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から出発し、細胞内シグナル伝達ドメインに到達するために望まない配列を削除するかまたは変異させなければならないことを意味しない。
【０１７７】
用語“ここに記載するような腫瘍マーカーの発現と関係する疾患”は、例えば、癌もしくは悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病のような前癌状態のような増殖性疾患を含む、ここに記載するような腫瘍マーカーを発現する細胞と関係する疾患またはここに記載するような腫瘍マーカーを発現するまたはいずれかの時点で発現した細胞と関係する状態；またはここに記載するような腫瘍マーカーを発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含むが、これらに限定されない。ある面において、ここに記載するような腫瘍マーカーの発現と関係する癌は血液癌である。ある面において、ここに記載するような腫瘍マーカーの発現と関係する癌は固形癌である。さらにここに記載するような腫瘍マーカーの発現と関係する疾患は、例えば、ここに記載するような腫瘍マーカーの発現と関係する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載するような腫瘍マーカーの発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
用語“ＣＤ１９の発現と関係する疾患”は、例えば、癌もしくは悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病のような前癌状態のような増殖性疾患を含むＣＤ１９を発現する細胞と関係する疾患またはＣＤ１９を発現するまたはいずれかの時点で発現した細胞と関係する状態；またはＣＤ１９を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含むが、これらに限定されない。誤解を避けるために、ＣＤ１９の発現と関係する疾患は、例えば、ＣＤ１９発現が、例えば、ＣＤ１９を標的とする分子、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲでの処置により下方制御されているために、現在ＣＤ１９を発現しないが、かつてＣＤ１９を発現した細胞と関係する状態を含み得る。ある面において、ＣＤ１９の発現と関係する癌は血液癌である。ある面において、血液癌は白血病またはリンパ腫である。ある面において、ＣＤ１９の発現と関係する癌は、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病(ＢＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(ＴＡＬＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない、１以上の急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病を、例えば含むが、これらに限定されない、癌および悪性腫瘍を含む。ＣＤ１９の発現と関係するさらなる癌または血液状態は、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞−または大細胞−濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、周辺帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄血液細胞の無効な産生(または異形成)により一体化される血液状態の雑多なコレクションである“前白血病”などを含むが、これらに限定されない。さらにＣＤ１９の発現と関係する疾患発現は、例えば、ＣＤ１９の発現と関係する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するまたは何れかの時点で発現した。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは減少したレベルで存在し得る。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質をある時点で産生しており、その後、実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生していない。
【０１７９】
用語“有効量”または“治療有効量”は、ここでは相互交換可能に使用し、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、ここに記載するような化合物、製剤、物質または組成物の量をいう。
【０１８０】
用語“コードする”は、ヌクレオチドの規定された配列(例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)またはアミノ酸の規定された配列のいずれかを有する生物学的過程において他のポリマーおよび巨大分子の合成の鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性およびそれ由来の生物学的特性をいう。それゆえに、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される、ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および非コード鎖の両者を、タンパク質または該遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするとしていうことができる。
【０１８１】
用語“内在性”は、生物、細胞、組織または系に由来するまたはそれらの中で産生されるあらゆる物質をいう。
【０１８２】
用語“外来性”は、生物、細胞、組織または系の外から導入されたまたはそれらの外で産生されるあらゆる物質をいう。
【０１８３】
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
【０１８４】
用語“発現ベクター”は、発現するヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用領域を含み、発現のための他の要素は宿主により細胞またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込むコスミド、プラスミド(例えば、裸のまたはリポソームに含まれた)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含む、当分野で知られる全てのこのようなものを含む。
【０１８５】
ｓｃＦｖの文脈においてここで使用する用語“柔軟性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独でまたは組み合わせで使用されるグリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。ある態様において、柔軟性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の正の整数である)を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０(配列番号２８)。ある態様において、柔軟性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２９)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号３０)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号３１)の複数反復を含む。ＷＯ２０１２／１３８４７５号(引用により本明細書に包含させる)に記載のリンカーも本発明の範囲内に含まれる。
【０１８６】
“完全ヒト”は、分子全体がヒト起源または抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンをいう。
【０１８７】
用語“相同”または“同一性”は、２ポリマー分子間、例えば、２核酸分子間、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子間または２ポリペプチド分子間のブユニット配列同一性をいう。２分子の両者におけるサブユニットが同じモノマーサブユニットで占拠されているとき；例えば、２ＤＮＡの各々におけるある位置がアデニンで占拠されているならば、それらは、その位置で相同または同一である。２配列間の相同性は、マッチしたまたは相同な位置の数の直接関数である；例えば、２配列の位置の半分(例えば、１０サブユニット長ポリマー中５位置)が相同であるならば、２配列は５０％相同である；位置の９０％(例えば、１０中９)がマッチするまたは相同であるならば、２配列は９０％相同である。
【０１８８】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最少配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)である。大部分について、ヒト化抗体および抗体そのフラグメントは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメント性能をさらに精錬および最適化できる。一般に、ヒト化抗体または抗体そのフラグメントは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは相当部分がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１および一般に２可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体または抗体フラグメントは、一般にヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細に関して、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照のこと。
【０１８９】
ここで使用する用語“免疫エフェクター細胞”は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の増強に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞を含む。
【０１９０】
ここで使用する用語“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の、機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅を促進するまたは成長もしくは増殖を阻害するＴ細胞またはＮＫ細胞の特性をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は免疫エフェクター機能または応答の例である。
【０１９１】
用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化された機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
【０１９２】
用語“免疫老化”は、数ある中で、例えば、癌、ワクチン接種、感染性病原体に対する免疫応答の障害をもたらす、免疫機能の減少をいう。これは、感染に応答する宿主の能力および、特にワクチン接種による、長期記憶の発達の両者を含む。この免疫欠損は偏在性であり、経過時間よりむしろ寿命に対する年齢の関数として、長命種および短命種の両者で見られる。高齢者の罹病率および死亡率の頻度を高める主用貢献因子と考えられる。免疫老化は、無作為な低下性現象ではなく、むしろ進化パターンを逆に繰り返すように見え、免疫老化により影響を受けるパラメータの大部分が遺伝子制御下にあるように見える。免疫老化はまたウイルスおよび細菌のような多様な抗原への避けられない暴露の連続的攻撃の結果として考えられ得る場合もある。免疫老化は、例えば、高齢集団に多くの病理学的に顕著な健康問題を起こす、多因子性状態である。造血幹細胞枯渇、貪食細胞およびＮＫ細胞の総数減少および液性免疫の減少のような年齢依存性生物学的変化が、免疫老化の発生に貢献する。ある面において、免疫老化は、免疫細胞におけるテロメア長の測定により、個々に測定できる(例えば、ＵＳ５７４１６７７号参照)。免疫老化はまた、個々に、６５歳以上の対象におけるナイーブＣＤ４および／またはＣＤ８  Ｔ細胞、Ｔ細胞レパートリーまたはワクチン接種に対する応答の正常より低い数値を実証することによっても決定できる。
【０１９３】
用語“免疫応答障害”は、対象が、数あるなかで、例えば、癌、ワクチン接種、病原体感染に対する、適切な免疫応答を有しない状態をいう。ある態様において、免疫応答障害を有する対象は、予防的ワクチン接種後に保護的抗体力価レベルに達すると予測されないまたは患者は療的ワクチン接種後疾患負荷減少を有しない。対象は、対象が、高齢、化学療法処置を受けている対象、無脾症対象、免疫不全対象またはＨＩＶ／ＡＩＤＳを有する対象のような、免疫機能低下が知られる集団のメンバーであるかまたは免疫機能低下の病歴を有するならば、免疫応答障害も有し得る。ここに記載する方法は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤の投与により、免疫応答障害の処置を可能にする。
【０１９４】
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、遺伝子産物を、実質的に細胞にプロモーターに対応するインデューサーが存在するときのみ細胞において産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
【０１９５】
ここで使用する用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。ある態様において、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能の実施を指示する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達の切断された一部を使用する範囲内で、このような切断された一部を、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の代わりに使用してよい。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、それゆえに、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された一部を含むことを意図する。
【０１９６】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、一次刺激または抗原依存的刺激を担う分子に由来するものを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性細胞内ドメインを含み得る。共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインの例は、共刺激性シグナルまたは抗原非依存的刺激を担う分子に由来するものを含む。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激性分子の細胞質配列を含むことができる。
【０１９７】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩおよびＣＤ６６ｄ由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明で特に有用である一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む分子のさらなる例は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ３２のものを含む。
【０１９８】
用語“ゼータ”または代替的にゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲゼータ”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な塩基として定義され、“ゼータ刺激性ドメイン”または代替的に“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン”または“ＴＣＲゼータ刺激性ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分であるゼータ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基として定義する。ある面において、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１の残基５２〜１６４または、その機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を含む。ある面において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメインは配列番号１８として提供される配列である。ある面において、“ゼータ刺激性ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激性ドメインは配列番号２０として提供される配列である。
【０１９９】
用語“共刺激性分子”は、共刺激性リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の同族結合パートナーをいい、それにより、増殖のような、しかし、それに限定されないＴ細胞による共刺激性応答が仲介される。共刺激性分子は、効率的免疫応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激性分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。
【０２００】
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内部分をいう。
【０２０１】
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体または機能的そのフラグメントを含み得る。
【０２０２】
用語“４−１ＢＢ”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２として提供されるアミノ酸配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーをいう；そして“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義される。ある面において、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、配列番号１４として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
【０２０３】
ここで使用する“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されている、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを産生するために使用する鋳型を含む。
【０２０４】
用語“単離”は、自然な状態から変えられたまたは除かれたことを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その自然な状態の併存物質から部分的にまたは完全に離された同じ核酸またはペプチドは、“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在でき、または、例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在できる。
【０２０５】
本発明の文脈において、一般的に生じる核酸塩基について次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンをいい、“Ｃ”はシトシンをいい、“Ｇ”はグアノシンをいい、“Ｔ”はチミジンをいい、そして“Ｕ”はウリジンをいう。
【０２０６】
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でも独特である；それらは、相当量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達でき、それゆえに、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
【０２０７】
用語“レンチウイルスベクター”は、少なくとも一部レンチウイルスゲノムに由来するベクターをいい、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009)において提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸTMを含むが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。
【０２０８】
用語“低い免疫増強用量”は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用したとき、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を一部、しかし完全ではなく、阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量をいう。例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの阻害により、ｍＴＯＲ活性を評価する方法は、ここに記載する。本用量は、完全な免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答の増強に十分である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞数減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比増加をもたらす。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ナイーブＴ細胞の数の増加をもたらす。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、次の１以上をもたらす：
１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；および
次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、上記の何れかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、生じる。
【０２０９】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、９０％を超えない、少なくとも１０％であるが、９０％を超えない、少なくとも１５％であるが、９０％を超えない、少なくとも２０％であるが、９０％を超えない、少なくとも３０％であるが、９０％を超えない、少なくとも４０％であるが、９０％を超えない、少なくとも少なくとも５０％であるが、９０％を超えない、少なくとも６０％であるが、９０％を超えないまたは少なくとも少なくとも７０％であるが、９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
【０２１０】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、８０％を超えない、少なくとも１０％であるが、８０％を超えない、少なくとも１５％であるが、８０％を超えない、少なくとも２０％であるが、８０％を超えない、少なくとも３０％であるが、８０％を超えない、少なくとも４０％であるが、８０％を超えない、少なくとも５０％であるが、８０％を超えないまたは少なくとも６０％であるが、８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、７０％を超えない、少なくとも１０％であるが、７０％を超えない、少なくとも１５％であるが、７０％を超えない、少なくとも２０％であるが、７０％を超えない、少なくとも３０％であるが、７０％を超えない、少なくとも４０％であるが、７０％を超えないまたは少なくとも５０％であるが、７０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
【０２１１】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、６０％を超えない、少なくとも１０％であるが、６０％を超えない、少なくとも１５％であるが、６０％を超えない、少なくとも２０％であるが、６０％を超えない、少なくとも３０％であるが、６０％を超えないまたは少なくとも４０％であるが、６０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
【０２１２】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、５０％を超えない、少なくとも１０％であるが、５０％を超えない、少なくとも１５％であるが、５０％を超えない、少なくとも２０％であるが、５０％を超えない、少なくとも３０％であるが、５０％を超えないまたは少なくとも４０％であるが、５０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
【０２１３】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、４０％を超えない、少なくとも１０％であるが、４０％を超えない、少なくとも１５％であるが、４０％を超えない、少なくとも２０％であるが、４０％を超えない、少なくとも３０％であるが、４０％を超えないまたは少なくとも３５％であるが、４０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
【０２１４】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１０％であるが、３０％を超えない、少なくとも１５％であるが、３０％を超えない、少なくとも２０％であるが、３０％を超えないまたは少なくとも２５％であるが、３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
【０２１５】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、２０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、３５％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、４０％を超えないまたは少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、４５％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
【０２１６】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供する。
【０２１７】
ここに記載するように、ｍＴＯＲ阻害の程度はＰ７０  Ｓ６Ｋ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度を、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性の減少レベル、例えば、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ基質のリン酸化の減少により決定できる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、ここに記載する方法、例えばＢｏｕｌａｙアッセイにより評価できる。
【０２１８】
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。用語タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンにおいて、イントロンを含み得る限り、イントロンも含み得る。
【０２１９】
本発明の文脈において、一般的に生じる核酸塩基について次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンをいい、“Ｃ”はシトシンをいい、“Ｇ”はグアノシンをいい、“Ｔ”はチミジンをいい、そして“Ｕ”はウリジンをいう。
【０２２０】
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態いずれかのデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)およびそのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似する方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた、黙示的に保存的に修飾されたそのバリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列ならびに明示的に示される配列も包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１以上の選択した(または全)コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を賛成することにより達成し得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【０２２１】
用語“操作可能に連結”または“転写制御”は、制御配列と異種核酸配列の間の、後者の発現を生じる機能的連結をいう。例えば、第一核酸配列は、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係におかれたとき、操作可能に連結している。例えば、プロモーターは、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響するならば、コーディング配列に操作可能に連結する。操作可能に連結したＤＮＡ配列は互いに隣接してよく、そして、例えば、２タンパク質コーディング領域を合わせる必要があるとき、同じリーディングフレーム内にある。
【０２２２】
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)または胸骨内、腫瘍内注射または点滴技術を含む。
【０２２３】
用語“ペプチド”、“ポリペプチド,”および“タンパク質”は相互交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基からなる化合物をいう。タンパク質またはペプチドは少なくとも２アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸数の上限の設定はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により連結した２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する本用語は、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとしても一般に呼ばれる短鎖および一般にタンパク質として当分野で呼ばれ、多くのタイプが存在する長鎖の両者をいう。“ポリペプチド”は、とりわけ、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同ポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
【０２２４】
ここで使用する“ポリ(Ａ)”は、ポリアデニル化によりｍＲＮＡに結合した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３４)、好ましくは６４を超え、より好ましくは１００を超え、最も好ましくは３００または４００を超える。ポリ(Ａ)配列は、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡ機能性を調節するために、化学的にまたは酵素的に修飾できる。
【０２２５】
ここで使用する“ポリアデニル化”は、メッセンジャーＲＮＡ分子への、ポリアデニリル部分またはその修飾バリアントの共有結合をいう。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに添加されたアデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に添加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から守るのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核からの排出および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、核でＤＮＡのＲＮＡへの転写直後だけでなく、さらに、細胞質で後に起こり得る。転写が中血された後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂される。開裂部位は、通常、開裂部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡ(配列番号４０)の存在により特徴付けられる。ＭＲＮＡが開裂された後、アデノシン残基は、開裂部位の遊離３’末端に付加される。
【０２２６】
“プロドラッグ”または“プロ・ドラッグ”は、対象体内で、薬物に変換される化合物をいう。ある態様において、変換は、結合、例えば、共有結合の切断または形成を含む。一般に、共有結合の切断が、薬物を遊離させる。
【０２２７】
免疫応答の文脈における用語“促進”または“増強”は、とりわけ、免疫細胞が癌細胞を標的とするおよび／または殺す、病原体および病原体感染細胞を標的とするおよび／または殺す能力およびワクチン接種後の防御免疫の増加のようなのような免疫応答の増加をいう。ある態様において、防御免疫は、同じ抗原を発現する病原体によるその後の感染に対する防御に十分な免疫応答(例えば抗体力価)の存在をいう。
【０２２８】
用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写の開始に必要な、細胞の合成機能または導入された合成機能により認識されるＤＮＡ配列をいう。
【０２２９】
用語“プロモーター／制御配列”は、該プロモーター／制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列をいう。ある例において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例において、この配列はまた遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の制御要素も含んでよい。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的方法で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０２３０】
用語“予防”は、疾患または疾患状態に対する予防または防御的処置を意味する。予防は、完全、例えば、疾患または疾患状態の完全な欠如であり得る。予防は、対象における疾患または疾患状態を発症する可能性が、対象が予防処置を受けていなかったときより低いように、部分的でもあり得る。
【０２３１】
ここで使用する用語“ラパログ”は、ラパマイシンの小分子アナログをいう。
【０２３２】
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現させた抗体のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生させる抗体をいう。本用語はまた抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現するものである抗体を意味するとも解釈すべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり、知られる組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーを使用して得られている。
【０２３３】
ここで使用する５’キャップ(別名ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップ)は、転写開始直後に真核メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一転写ヌクレオチドに連結した末端基からなる。その存在は、リボゾームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結びつき、互いに影響し合うように共転写的に生じる。転写開始直後、合成中のｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多工程生化学反応として進行する。キャッピング部分は、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節するために修飾できる。
【０２３４】
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナルの伝達に役割を有する多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、シグナルを受け、細胞膜を通ってシグナルを伝達できる分子および分子複合体を含む。
【０２３５】
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーの産生によりまたはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、規定されたシグナル伝達経路を経て細胞活性を制御するために、細胞内で情報を伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分をいう。
【０２３６】
用語“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態では通常関係している他の細胞型から離されている細胞もいう。ある例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の均一集団をいう。他の例において、この用語は、単に、その天然の状態で本来関係している細胞から離されている細胞をいう。ある面において、細胞は、インビトロで培養される。他の面において、細胞は、インビトロで培養されない。
【０２３７】
用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する同族結合パートナー(例えば、Ｔ細胞に存在する刺激性および／または共刺激性分子)タンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいうが、その抗体またはリガンドはサンプルにおける他の分子を実質的に認識または結合しない。
【０２３８】
用語“刺激”は、刺激性分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ)とその同族リガンド(またはＣＡＲの場合腫瘍抗原)の結合により誘発され、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を経るシグナル伝達または適切なＮＫ受容体もしくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを経るシグナル伝達を含むが、これらに限定されないシグナル伝達事象を仲介する、一次応答をいう。刺激は、ある分子の発現変更を仲介できる。
【０２３９】
用語“刺激性分子”は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともある面では刺激性方向にＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する、一次細胞質シグナル伝達配列を提供するＴ細胞により発現される分子をいう。ある面において、一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドを載せたＭＨＣ分子の結合により開始され、これは、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の仲介に至る。刺激性方向に作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも呼ばれる)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲにおいて、任意の１以上の本発明のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１８として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号２０として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
【０２４０】
用語“対象”は、免疫応答を惹起できるあらゆる生存生物をいう(例えば、哺乳動物、ヒト)。ある態様において、対象は、ヒトである。対象は、あらゆる年齢であり得る。ある態様において、対象は高齢ヒト対象、例えば、６５歳以上である。ある態様において、対象は、高齢ではない、例えば、６５歳未満のヒト対象である。ある態様において、対象は、ヒト小児科対象、例えば、１８歳以下である。ある態様において、対象は、成人対象、例えば、１８歳を超える。
【０２４１】
ここで使用する用語“治療”は、処置を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解または消失により得られる。
【０２４２】
用語“転移ベクター”は、単離核酸を含み、単離核酸の細胞内部への送達に使用できる組成物をいう。多数のベクターが当分野で知られ、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。それゆえに、用語“転移ベクター”は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への転移を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈すべきである。ウイルス転移ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
【０２４３】
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子によりコードされるまたは特定化されるポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に、細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときにのみ、細胞において遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列をいう。
【０２４４】
用語“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”は、外来性核酸が宿主細胞に伝達または導入される過程をいう。“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”細胞は、外来性核酸が遺伝子導入、形質転換または形質導入されているものである。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
【０２４５】
ここで使用する“一過性”は、数時間、数日または数週間の期間の非統合導入遺伝子の発現をいい、ここで、発現の期間は、宿主細胞におけるゲノムに統合されたときまたは安定プラスミドレプリコン内に含まれるときの遺伝子の発現期間より短い。
【０２４６】
本発明の文脈において、“腫瘍抗原”または“過増殖性障害抗原”または“過増殖性障害と関係する抗原”は、特定の過増殖性障害に共通する抗原をいう。ある面において、本発明の過増殖性障害抗原は、原発性または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などのような腺癌を含むが、これらに限定されない癌由来である。
【０２４７】
用語“ワクチン”は、能動免疫を産生するように注射または他の方法で体内に導入される、通常抗原(例えば、とりわけ不活性化感染因子または感染因子、腫瘍抗原のある部分)を含む、抗原または抗原性部分の懸濁液または溶液のような組成物である。ワクチンを構成する抗原または抗原性部分は、生存または死滅微生物または微生物または腫瘍細胞を含むが、これに限定されない他の細胞から精製された天然産物、合成産物、遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、ポリサッカライドまたは類似産物またはアレルゲンであり得る。抗原または抗原性部分はまたタンパク質、ペプチド、ポリサッカライドまたは類似産物のサブユニットでもよい。
【０２４８】
ここで使用する用語“制御可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、一連のポリペプチド、一般に最も単純な態様で２ポリペプチドをいい、ＲＣＡＲＸ細胞にあるとき、標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および制御可能細胞内シグナル産生または増殖を有するＲＣＡＲＸ細胞を提供し、これはＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター特性を最適化できる。ＲＣＡＲＸ細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインにより結合される抗原を含む標的細胞に対する特性を提供するのを抗原結合ドメインに頼る。ある態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在下、細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。
【０２４９】
ここで使用する用語“膜アンカー”または“膜繋留ドメイン”は、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に繋留するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基をいう。
【０２５０】
ここで使用する“スイッチドメイン”は、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、二量体化分子の存在下、他のスイッチドメインと結合する物、一般にポリペプチドベースの物をいう。結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合した第一の物と、第二スイッチドメインに結合、例えば融合した第二の物の機能的カップリングをもたらす。第一および第二スイッチドメインは、まとめて二量体化スイッチとして呼ばれる。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに同一であり、例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ばれる。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ばれる。ある態様において、スイッチは細胞内である。ある態様において、スイッチは細胞外である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースの物であり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物、例えば、ｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子は、１以上のｍｙｃ  ｓｃＦｖと結合するポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、ｍｙｃリガンドまたはｍｙｃリガンドの多量体である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
【０２５１】
ここで使用する用語“二量体化分子”は、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。ある態様において、二量体化分子は対象に天然に存在しないか、または顕著な二量体化をもたらす濃度で生じない。ある態様において、二量体化分子は小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０２５２】
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある態様において、難治性癌は、処置前または開始時点で処置に耐性であり得る。他の態様において、難治性癌は、処置中に耐性になり得る。難治性癌は、耐性癌とも呼ばれる。
【０２５３】
ここで使用する“再発した”または“再発”は、一定期間の改善または応答後、例えば、先の治療、例えば、癌治療の処置後の、疾患(例えば、癌)または癌のような疾患の兆候および症状の再出現をいう。例えば、応答期間は、癌細胞のレベルの、ある閾値未満、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満への低下を含む。再出現は、癌細胞のレベルの、ある閾値を越える、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％を超える増加を含み得る。
【０２５４】
範囲：本開示をとおして、本発明の種々の面は、範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は単に便宜さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲上の確固たる限定として解釈してはならないと理解されるべきである。よって、範囲の記載は、具体的に記載された全ての可能な下位範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考慮すべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような具体的に開示された下位範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６を有すると解釈すべきである。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する何かを含み、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような下位範囲を含む。これは、範囲の広さと無関係に適用される。
【０２５５】
用語“Ｔ細胞の製剤”は、少なくとも１つのＴ細胞を含む製剤をいう。ある態様において、末梢血と比較してＴ細胞が富化されている。
【０２５６】
用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。
【０２５７】
ここで使用する用語“アフェレーシス”は、ドナーまたは患者の血液をドナーまたは患者から採り、選択した特定の成分を分ける装置を通し、残りをドナーまたは患者の循環に、例えば、輸血により戻す、当分野で認められている体外過程をいう。それゆえに、“アフェレーシスサンプル”は、アフェレーシスを使用して得たサンプルをいう。
【０２５８】
ｍＴＯＲ阻害剤
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する、化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、アロステリック阻害剤である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、触媒的阻害剤である。
【０２５９】
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシンアナログ(ラパログとも称する)およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシンと構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物を含む。
【０２６０】
ラパマイシンは、式Ａに示す構造を有する、ストレプトミセス・ハイグロスコピクスにより産生されるマクロライド抗生物質である。
【化１】
2017528433.tif 000002
【０２６１】
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; 米国特許３,９２９,９９２号参照。ラパマイシンについて種々のナンバリングスキームが提唱されている。混乱を避けるため、特定のラパマイシンアナログをここで命名するとき、名称は、式Ａのナンバリングスキームを使用したラパマイシンを参照して付与する。
【０２６２】
本発明において有用なラパマイシンアナログは、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環上のヒドロキシ基がＯＲ１(ここで、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置き換えられているＯ−置換アナログ；例えば引用によりその内容を本明細書に包含させるＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載のような、エベロリムスとしても知られるＲＡＤ００１である。他の適当なラパマイシンアナログは、２６位または２８位が置換されたものを含む。ラパマイシンアナログは、例えば、内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ６,０１５,８１５号、ＷＯ９５／１４０２３号およびＷＯ９９／１５５３０号に記載のような、上記アナログのエピマー、特に４０位、２８位または２６位が置換され、場合によりさらに水素化されていてよいアナログのエピマーであってよく、例えばゾタロリムスとしても知られるＡＢＴ５７８またはその内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシンアナログ、例えばリダフォロリムスとしても知られるＡＰ２３５７３である。
【０２６３】
ＵＳ５,６６５,７７２号からの、本発明における使用に適するラパマイシンアナログの例は、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロプ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロプ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルベトキサミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０２６４】
本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、ラパマイシンのシクロヘキシル環上のヒドロキシ基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置き換えられたアナログが知られ、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８号に見られるラパマイシンアナログ、例えばテムシロリムスである。
【０２６５】
本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(場合によりヒドロキシ置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルにより置き換えられているおよび／または３９位のメトキシ基が３９炭素と共に除去され、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環になるものを含む；例えばその内容を引用により本明細書に包含させるＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号に記載。アナログは、ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化されおよび／または３２−カルボニルが還元されるようにさらに修飾され得る。
【０２６６】
ＷＯ９５／１６６９１号からの本発明における使用に適するラパマイシンアナログの例は、１６−デメトキシ−１６−(ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０２６７】
ＷＯ９６／４１８０７号からの本発明における使用に適するラパマイシンアナログの例は、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０２６８】
他の適当なラパマイシンアナログは、その内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載のようなウミロリムスである。
【０２６９】
哺乳動物細胞において、ラパマイシンの標的(ｍＴＯＲ)キナーゼは、ｍＴＯＲＣ１複合体またはｍＴＯＲＣ２複合体として記載される多タンパク質複合体として存在し、これは栄養素およびエネルギーの利用能を感知し、増殖因子からのインプットを統合し、シグナル伝達を強める。ｍＴＯＲＣ１複合体はラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤に感受性であり、ｍＴＯＲ、ＧβＬおよびｍＴＯＲの制御性結合タンパク質(ｒａｐｔｏｒ)からなり、ペプチジル−プロリルイソメラーゼＦＫＢＰ１２タンパク質(ＦＫ５０６−結合タンパク質１Ａ、１２kDa)に結合する。対照的に、ｍＴＯＲＣ２複合体は、ｍＴＯＲ、ＧβＬおよびｍＴＯＲのラパマイシン非感受性コンパニオンタンパク質(ｒｉｃｔｏｒ)からなり、インビトロでＦＫＢＰ１２タンパク質に結合しない。
【０２７０】
ｍＴＯＲＣ１複合体は、成長および増殖制御のための増殖因子および栄養素感受性装置として作用する、タンパク質翻訳制御に関与することが示されている。ｍＴＯＲＣ１は、２つの重要な下流基質によりタンパク質翻訳を制御する：順番にリボソームタンパク質Ｐ７０  Ｓ６をリン酸化するＰ７０  Ｓ６キナーゼおよびｅＩＦ４Ｅ制御キャップ依存性翻訳の調節に重要な役割を有する真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１(４ＥＢＰ１)。ｍＴＯＲＣ１複合体は、細胞のエネルギーおよび栄養素ホメオスタシスに応答して細胞増殖を制御し、ｍＴＯＲＣ１の脱制御は多種多様なヒト癌で共通する。ｍＴＯＲＣ２の機能は、Ａｋｔのリン酸化およびアクチン細胞骨格動態の調節により細胞生存の制御に関与する。
【０２７１】
ｍＴＯＲＣ１複合体は、大部分、ＦＫＢＰ１２との細胞内複合体形成およびｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合(ＦＲＢ)ドメインへの結合を含む、ラパマイシンの作用機序により、ラパマイシンおよび誘導体のようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤に感受性である。これは、ｍＴＯＲＣ１の立体構造を起こし、これが、その足場タンパク質ｒａｐｔｏｒとの相互作用を、変え、かつ弱化させ、続いてＰ７０  Ｓ６Ｋ１のような基質がｍＴＯＲに近づき、リン酸化されるのを妨害すると考えられる。ラパマイシンおよびＲＡＤ００１のようなラパログは、良性および悪性両者の増殖障害と関係するｍＴＯＲの過活性の阻害により、臨床的関連が増加している。
【０２７２】
エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオンを有し、次の化学構造を有する。
【化２】
2017528433.tif 000003
【０２７３】
エベロリムスは、進行型腎癌についてＦＤＡが承認した薬剤であり、腫瘍学におけるいくつかの他のフェーズIII臨床試験において試験されている。前臨床試験は、エベロリムスがインビトロおよびインビボの両者で、恐らく、ラパマイシン感受性ｍＴＯＲＣ１機能の抑制により、広範な腫瘍細胞株の増殖を阻害できることを示している。エベロリムスは、ラパマイシンの誘導体として、ｍＴＯＲＣ１機能の一部、すなわちＰ７０  Ｓ６キナーゼ(Ｐ７０  Ｓ６Ｋ)および下流Ｐ７０  Ｓ６Ｋ基質Ｐ７０  Ｓ６の阻害に極めて強力なアロステリックｍＴＯＲ阻害剤である。エベロリムス(および他のラパマイシンアナログ)のようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、ＴＯＲＣ２経路またはその結果的なＡｋｔシグナル伝達の活性化の阻害にはほとんどまたは全く効果を有しない。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９とも呼ばれる)およびリダフォロリムス(ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９)を含む。アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、ゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。
【０２７４】
これとは別にまたはこれに加えて、触媒的、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、かつｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両者を標的とすることが判明している。これらはまた、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを調節するために、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりもｍＴＯＲＣ１の効果的な阻害剤である。
【０２７５】
ＢＥＺ２３５は、２−メチル−２−[４−(３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−フェニル]−プロピオニトリルを有し、次の化学構造を有する触媒的ｍＴＯＲ阻害剤である。
【化３】
2017528433.tif 000004
【０２７６】
ＢＥＺ２３５は、モノトシル酸塩形態としても使用され得る。ＢＥＺ２３５の合成は、ＷＯ２００６／１２２８０６号に記載されている。
【０２７７】
触媒的ｍＴＯＲ阻害剤として、ＢＥＺ２３５は、ラパマイシン感受性(Ｐ７０  Ｓ６Ｋのリン酸化および続くＰ７０  Ｓ６の)機能およびラパマイシン非感受性(４ＥＢＰ１のリン酸化)機能の両者を含む、ｍＴＯＲＣ１複合体の完全機能を廃止できる。ＢＥＺ２３５は、使用する濃度により差次的効果を有し、それによってｍＴＯＲ阻害は低濃度(１００nmol／Ｌ未満)で、しかし、デュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害が比較的高濃度(約５００nmol／Ｌ)で優勢である(Serra et al., 2008)。
【０２７８】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、ＣＣＧ１６８(ＡＺＤ−８０５５としても知られる、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)であり、これは、化学名{５−[２,４−ビス−((Ｓ)−３−メチル−モルホリン−４−イル)−ピリド[２,３ｄ]ピリミジン−７−イル]−２−メトキシ−フェニル}−メタノールを有し、次の化学構造を有する。
【化４】
2017528433.tif 000005
【０２７９】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、次の化学構造を有する３−[２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９号)である。
【化５】
2017528433.tif 000006
【０２８０】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、次の化学構造を有する３−(２−アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール−５−イル)−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン(ＷＯ１００５１０４３号およびＷＯ２０１３０２３１８４号)である。
【化６】
2017528433.tif 000007
【０２８１】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、次の化学構造を有するＮ−(３−(Ｎ−(３−((３,５−ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン−２−イル)スルファモイル)フェニル)−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９号およびＷＯ１２００６５５２号)である。
【化７】
2017528433.tif 000008
【０２８２】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＫＩ−５８７(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)であり、これは、化学名１−[４−[４−(ジメチルアミノ)ピペリジン−１−カルボニル]フェニル]−３−[４−(４,６−ジモルホリノ−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素および次の化学構造を有する。
【化８】
2017528433.tif 000009
【０２８３】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、ＧＳＫ−２１２６４５８(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)であり、これは、化学名２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−メトキシ−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドおよび次の化学構造を有する。
【化９】
2017528433.tif 000010
【０２８４】
文献に記載されている他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、次の化学構造を有する５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＷＯ１０１１４４８４号)である。
【化１０】
2017528433.tif 000011
【０２８５】
文献に記載される他の触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、次の化学構造を有する(Ｅ)−Ｎ−(８−(６−アミノ−５−(トリフルオロメチル)ピリジン−３−イル)−１−(６−(２−シアノプロパン−２−イル)ピリジン−３−イル)−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６号)である。
【化１１】
2017528433.tif 000012
【０２８６】
触媒的ｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、８−(６−メトキシ−ピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル)−１,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２−オン(ＷＯ２００６／１２２８０６号)およびＫｕ−００６３７９４(Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)を含む。Ｋｕ−００６３７９４は、哺乳動物ラパマイシンの標的(ｍＴＯＲ)の特異的阻害剤である。ＷＹＥ−３５４は、触媒的ｍＴｏｒ阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
【０２８７】
本発明によって有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた、前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩そのアナログも含む。
【０２８８】
ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤は、ここに記載する特定の用量に基づき、当分野で十分に確立された方法に基づき送達用に製剤され得る。特に、米国特許６,００４,９７３号(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤で使用できる製剤例を提供する。
【０２８９】
ｍＴＯＲ阻害剤の例は、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス(以前はデフェロリムスとして知られた、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３に記載)；エベロリムス(アフィニトール(登録商標)またはＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９、シロリムス(登録商標))；セマピモド(ＣＡＳ  １６４３０１−５１−３)；エムシロリムス、(５−{２，４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２，３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ  １０１３１０１−３６−４)；およびＮ２−[１，４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号９０)、分子内塩(ＳＦ１１２６、ＣＡＳ  ９３６４８７−６７−１)およびＸＬ７６５を含む。
【０２９０】
他の態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、非処置ＣＡＲ発現細胞または非処置対象と比較して、例えば、培養または対象における、ＣＡＲ発現細胞の増殖の増加もしくは延長または持続をもたらす。ある態様において、増殖の増加または持続は、ＣＡＲ発現細胞の数の増加と関係する。増殖の増加または持続を測定する方法は、実施例６および７に記載する。他の態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与は、例えば、非処置ＣＡＲ発現細胞または非処置対象と比較して、例えば、培養または対象における、ＣＡＲ発現細胞による癌細胞死を増加させる。ある態様において、癌細胞死増加は、腫瘍体積減少と相関する。癌細胞死増加を測定する方法は、例えば、国際出願ＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載され、これは、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０２９１】
あるｍＴＯＲ阻害を測定する方法、用量、処置レジメンおよび適当な医薬組成物は、引用により本明細書に包含する米国特許出願２０１５／０１２４００３６に記載する。
【０２９２】
下流阻害剤
ここに記載する方法の多くは、例えば、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル増加、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル低減、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比増加、ナイーブＴ細胞のレベル増加または記憶Ｔ細胞前駆体数もしくは記憶Ｔ細胞前駆体マーカーの発現レベル増加のために、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の使用に頼る。これらの方法のいずれも低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の代わりに、経路の下流要素の阻害剤、例えば、Ｐ７０  Ｓ６ＫまたはＴＯＲＣ１の投与でも実施できる。Ｐ７０  Ｓ６Ｋの阻害剤の例は、ＰＦ−４７０８６７１(Pfizer)またはＬＹ２５８４７０２トシレート(Eli Lilly)を含む。ｍＴＯＲＣ１の阻害剤の例は、ｍＴＯＲＣ１を特異的に阻害するが、ｍＴＯＲＣ２を阻害しないアロステリックｍＴＯＲ阻害剤を含む。ある態様において、下流阻害剤を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル増加、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル低減、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比増加、ナイーブＴ細胞のレベル増加または記憶Ｔ細胞前駆体数もしくは記憶Ｔ細胞前駆体マーカーの発現レベル増加に有効な用量で投与する。
【０２９３】
ｍＴＯＲ阻害の評価
ｍＴＯＲはキナーゼ  Ｐ７０  Ｓ６をリン酸化し、それによりＰ７０  Ｓ６Ｋを活性化し、その基質をリン酸化させる。ｍＴＯＲ阻害の程度はＰ７０  Ｓ６Ｋ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度を、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性の減少のレベル、例えば、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ基質のリン酸化の減少により決定できる。ＭＴＯＲ阻害のレベルを、阻害剤非存在下、例えば、阻害剤投与前および阻害剤存在下または阻害剤投与後に、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性(Ｐ７０  Ｓ６Ｋが基質をリン酸化する能力)を測定することにより、ｍＴＯＲ阻害のレベルを決定できる。Ｐ７０  Ｓ６Ｋの阻害のレベルは、ｍＴＯＲ阻害レベルを示す。それゆえに、Ｐ７０  Ｓ６Ｋが４０％阻害されたならば、ｍＴＯＲ活性は、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性で測定して、４０％阻害される。ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与間隔全体の阻害レベルの平均である。例として、阻害剤を週に１回与えるならば、阻害のレベルは、その間隔全体、すなわち１週間の平均阻害レベルにより示す。
【０２９４】
引用によりここに包含させるBoulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61は、ｍＴＯＲ阻害のレベルの評価に使用できるアッセイを教示する(ここで、Ｂｏｕｌａｙアッセイと称す)。ある態様において、アッセイは、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与前後の生体サンプルからのＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の測定に頼る。サンプルは、ｍＴＯＲ阻害剤処置後予め選択した時間、例えば、処置２４時間、４８時間および７２時間後に採ることができる。物学的サンプル、例えば、皮膚または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)からの生体サンプルを使用できる。総タンパク質抽出物を、サンプルから調製する。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、タンパク質抽出物から単離する。単離Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの活性を、インビトロキナーゼアッセイで測定できる。単離キナーゼを、４０Ｓ  リボソームサブユニット基質(Ｐ７０  Ｓ６Ｋの内在性基質)およびガンマ−３２Ｐと、基質のリン酸化を可能とする条件下インキュベートする。次いで、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分解し、３２ＰシグナルをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して分析する。４０Ｓリボソームサブユニットサイズに対応する３２Ｐシグナルは、基質リン酸化およびＰ７０  Ｓ６Ｋの活性を示す。キナーゼ活性の増加および減少を、リン酸化基質の３２Ｐシグナルの面積および強度を定量し(例えば、ImageQuant、Molecular Dynamics使用)、任意の単位値を定量したシグナルに割り当て投与後の値を投与前の値または対照値と比較することにより計算する。例えば、キナーゼ活性の阻害パーセントは、次の式で計算できる：１−(投与後得た値／投与前得た値)×１００。上記のように、ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与間隔全体の阻害レベルの平均である。
【０２９５】
キナーゼ活性、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性を評価する方法は、また、引用により本明細書に包含させるＵＳ７,７２７,９５０号にも提供される。
【０２９６】
ｍＴＯＲ阻害のレベルは、ＰＤ１陰性対ＰＤ１陽性Ｔ細胞の比の変化によっても評価できる。末梢血からのＴ細胞を、当分野で知られる方法によりＰＤ１陰性または陽性として同定できる。
【０２９７】
低用量ｍＴＯＲ阻害剤
ここに記載する方法は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパログを含むアロステリックｍＴＯＲ阻害剤を使用する。対照的に、ｍＴＯＲ経路を完全にまたはほぼ完全に阻害する阻害剤のレベルは免疫抑制性であり、例えば、臓器移植拒絶の予防に使用する。加えて、ｍＴＯＲを完全に阻害する高用量のラパログはまた腫瘍細胞増殖も阻害し、多様な癌の処置に使用される(例えば、Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition.  Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2参照)。
【０２９８】
本発明は、少なくとも一部、現在の臨床の現場で使用されるよりはるかに低い用量のｍＴＯＲ阻害剤が、対象における免疫応答の増加およびＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加に優れた効果を有するとの驚くべき発見に基づく。部分的ｍＴＯＲの阻害活性しか生じない低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、効率的にヒト対象における免疫応答の改善およびＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加ができることは驚きであった。
【０２９９】
これとは別にまたはこれに加えて、何らかの理論に縛られることを望まないが、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤が、例えば、少なくとも一過性に、例えば、非処置対象と比較して、ナイーブＴ細胞数を増加できると考えられる。これとは別にまたはこれに加えて、また理論に縛られることを望まないが、ｍＴＯＲ阻害剤の処置の十分な時間または十分な投与の後は、次の１以上をもたらすと考えられる：
１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；および
次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２；
ここで、上記のいずれかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。記憶Ｔ細胞前駆体は、分化プログラムの早期にある記憶Ｔ細胞である。例えば、記憶Ｔ細胞は、次の１以上の特徴を有する：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および／または増加したＢＣＬ２。
【０３００】
よって、ある面において、本発明は、約０.００５〜１.５mg、約０.００５〜１.５mg、約０.０１〜１mg、約０.０１〜０.７mg、約０.０１〜０.５mgまたは約０.１〜０.５mgの濃度で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を含む、例えば、単位剤形で提供される、組成物を提供する。さらなる面において、本発明は、０.００５〜１.５mg、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１mg、０.０１〜０.７mg、０.０１〜０.５mgまたは０.１〜０.５mgの濃度で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を含む組成物を提供する。より詳細には、ある面において、本発明は、約０.００５mg、０.００６mg、０.００７mg、０.００８mg、０.００９mg、０.０１mg、０.０２mg、０.０３mg、０.０４mg、０.０５mg、０.０６mg、０.０７mg、０.０８mg、０.０９mg、０.１mg、０.２mg、０.３mg、０.４mg、０.５mg、０.６mg、０.７mg、０.８mg、０.９mgまたは１.０mgの用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を含む組成物を提供する。ある面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、０.５mg以下の用量である。なおさらなる面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、約０.５mgの用量である。さらなる面において、本発明は、０.００５mg、０.００６mg、０.００７mg、０.００８mg、０.００９mg、０.０１mg、０.０２mg、０.０３mg、０.０４mg、０.０５mg、０.０６mg、０.０７mg、０.０８mg、０.０９mg、０.１mg、０.２mg、０.３mg、０.４mg、０.５mg、０.６mg、０.７mg、０.８mg、０.９mgまたは１.０mgの用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を含む組成物を提供する。ある面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、０.５mg以下の用量である。なおさらなる面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、０.５mgの用量である。
【０３０１】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１について特定した特定の量または用量と生物学的同等である量でＲＡＤ００１ではないｍＴＯＲ阻害剤を含む組成物に関する。
【０３０２】
さらなる面において、本発明は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを８０％以下阻害するのに十分な量のｍＴＯＲ阻害剤を含む組成物に関する。さらなる面において、ここに記載の組成物は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを３８％以下阻害するのに十分な量のｍＴＯＲ阻害剤を含む。
【０３０３】
ある態様において、本発明は、選択した投薬レジメン、例えば、１日１回または週に１回で投与したとき、完全なまたは顕著な免疫抑制とは関係しないが、免疫応答の増強と関係するｍＴＯＲ阻害のレベルと関係する、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤の組成物または剤形に関する。
【０３０４】
さらなる面において、本発明は、対象にｍＴＯＲ阻害剤を投与する過程を含む、免疫応答を増強する、例えば、免疫老化を処置する方法を提供する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、約０.００５〜１.５mg連日、約０.０１〜１mg連日、約０.０１〜０.７mg連日、約０.０１〜０.５mg連日または約０.１〜０.５mg連日の用量で投与できる。さらなる面において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００は、約０.１〜２０mg毎週、約０.５〜１５mg毎週、約１〜１０mg毎週または約３〜７mg毎週の用量で投与できる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、０.００５〜１.５mg連日、０.０１〜１mg連日、０.０１〜０.７mg連日、０.０１〜０.５mg連日または０.１〜０.５mg連日の用量で投与できる日。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、約０.１〜２０mg毎週、０.５〜１５mg毎週、１〜１０mg毎週、３〜７mg毎週または５mg毎週の用量で投与できる。
【０３０５】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１ではないｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＡＤ００１についてここに記載した特定の量または用量と生物学的同等である量で投与する過程を含む、免疫応答を増強する、例えば、免疫老化を処置する方法に関する。
【０３０６】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、例えば、ＲＡＤ００１を、約０.００５mg連日、０.００６mg連日、０.００７mg連日、０.００８mg連日、０.００９mg連日、０.０１mg連日、０.０２mg連日、０.０３mg連日、０.０４mg連日、０.０５mg連日、０.０６mg連日、０.０７mg連日、０.０８mg連日、０.０９mg連日、０.１mg連日、０.２mg連日、０.３mg連日、０.４mg連日、０.５mg連日、０.６mg連日、０.７mg連日、０.８mg連日、０.９mg連日または１.０mg連日の用量で投与できる。ある態様において、ＲＡＤ００１を、２４時間で約０.７mg以下の用量で投与できる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、２４時間で約０.５mg以下の用量で投与できる。ある態様において、ＲＡＤ００１を、連日０.５mg以下の用量で投与できる。ある態様において、ＲＡＤ００１を、０.５mg連日の用量で投与できる。
【０３０７】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＡＤ００１について特定した特定の量または用量と生物学的同等である量で使用できる。
【０３０８】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.１mg毎週、０.２mg毎週、０.３mg毎週、０.４mg毎週、０.５mg毎週、０.６mg毎週、０.７mg毎週、０.８mg毎週、０.９mg毎週、１mg毎週、２mg毎週、３mg毎週、４mg毎週、５mg毎週、６mg毎週、７mg毎週、８mg毎週、９mg毎週、１０mg毎週、１１mg毎週、１２mg毎週、１３mg毎週、１４mg毎週、１５mg毎週、１６mg毎週、１７mg毎週、１８mg毎週、１９mg毎週または２０mg毎週の用量で投与できる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、毎週５mg以下の用量で投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、５mg毎週の用量で投与する。
【０３０９】
ある態様において、本発明は、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＡＤ００１について特定した特定の量または用量と生物学的同等である量で使用できる。
【０３１０】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤を、持続放出製剤で提供できる。ここに記載する組成物または単位剤形のいずれかを、持続放出製剤で提供できる。ある態様において、持続放出製剤は、即時放出製剤より低いバイオアベイラビリティを有する。例えば、ある態様において、即時放出製剤に類する治療効果を達成するために、持続放出製剤は、即時放出製剤に提供される阻害剤の量の約２〜約５倍、約２.５〜約３.５倍または約３倍の量を有する。
【０３１１】
ある態様において、単位剤形あたり、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgを有する、一般に週１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。週１回投与について、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、持続放出形態に対応する。ある態様において、両形態を週１回ベースで投与する。
【０３１２】
ある態様において、単位剤形あたり、０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgを有する、一般に１日１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。１日１回投与について、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、持続放出形態に対応する。週１回投与について、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.１〜３０、０.２〜３０、２〜３０、４〜３０、６〜３０、８〜３０、１０〜３０、１.２〜３０、１４〜３０、１６〜３０、２０〜３０、６〜１２または約１０mgｓのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、持続放出形態に対応する。
【０３１３】
ある態様において、単位剤形あたり、０.０１〜１.０mgを有する、一般に１日１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。１日１回投与について、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０３〜３mgｓのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、持続放出形態に対応する。週１回投与について、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.２〜２０mgｓのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、持続放出形態に対応する。
【０３１４】
ある態様において、単位剤形あたり、０.５〜５.０mg有する、一般に週１回投与に使用する、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。週１回投与について、これらの即時放出形態は、それぞれ、１.５〜１５mgｓのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、持続放出形態に対応する。
【０３１５】
上記のように、ｍＴＯＲ経路の標的の一つはＰ７０  Ｓ６キナーゼである。それゆえに、ここに記載の方法および組成物に有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下のＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性に対して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の８０％以下の阻害を達成するのに十分なものである。さらなる面において、本発明は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下のＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性と比較して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の３８％以下の阻害を達成するのに十分なｍＴＯＲ阻害剤の量を提供する。ある面において、本発明の方法および組成物において有用な用量のｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、例えば、ヒト対象に投与したとき、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％または１０％以下の阻害を達成するのに十分である。
【０３１６】
ある面において、本発明の方法および組成物において有用な用量のｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、例えば、ヒト対象に投与したとき、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の９０±５％(すなわち、８５〜９５％)、８９±５％、８８±５％、８７±５％、８６±５％、８５±５％、８４±５％、８３±５％、８２±５％、８１±５％、８０±５％、７９±５％、７８±５％、７７±５％、７６±５％、７５±５％、７４±５％、７３±５％、７２±５％、７１±５％、７０±５％、６９±５％、６８±５％、６７±５％、６６±５％、６５±５％、６４±５％、６３±５％、６２±５％、６１±５％、６０±５％、５９±５％、５８±５％、５７±５％、５６±５％、５５±５％、５４±５％、５４±５％、５３±５％、５２±５％、５１±５％、５０±５％、４９±５％、４８±５％、４７±５％、４６±５％、４５±５％、４４±５％、４３±５％、４２±５％、４１±５％、４０±５％、３９±５％、３８±５％、３７±５％、３６±５％、３５±５％、３４±５％、３３±５％、３２±５％、３１±５％、３０±５％、２９±５％、２８±５％、２７±５％、２６±５％、２５±５％、２４±５％、２３±５％、２２±５％、２１±５％、２０±５％、１９±５％、１８±５％、１７±５％、１６±５％、１５±５％、１４±５％、１３±５％、１２±５％、１１±５％または１０±５％の阻害を達成するのに十分である。
【０３１７】
対象におけるＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性は、例えば、米国特許７,７２７,９５０号に記載の方法のような当分野で知られる方法、ホスホＰ７０  Ｓ６Ｋレベルおよび／またはホスホＰ７０  Ｓ６レベルのイムノブロット分析またはインビトロキナーゼ活性アッセイにより測定し得る。
【０３１８】
さらなる面において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤を含む組成物に関する。このような組成物中のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の用量は、約３０pM〜４nMの範囲であり得る。ある面において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１は、約５０pM〜２nM、約１００pM〜１.５nM、約２００pM〜１nMまたは約３００pM〜５００pMの範囲である。ある面において、ＲＡＤ００１の用量は、５０pM〜２nM、１００pM〜１.５nM、２００pM〜１nMまたは３００pM〜５００pMの範囲である。さらなる面において、ＲＡＤ００１の用量は、約３０pM、４０pM、５０pM、６０pM、７０pM、８０pM、９０pM、１００pM、１５０pM、２００pM、２５０pM、３００pM、３５０pM、４００pM、４５０pM、５００pM、５５０pM、６００pM、６５０pM、７００pM、７５０pM、８００pM、８５０pM、９００pM、９５０pM、１nM、１.５nM、２nM、２.５nM、３nM、３.５nMまたは４nMである。
【０３１９】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＡＤ００１について特定した特定の量または用量と生物学的同等である量で使用できる。
【０３２０】
本発明は、さらに対象にｍＴＯＲ阻害剤を投与することを含む、方法に関する。このような方法は、約３０pM〜４nMの範囲の用量のｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１を用い得る。さらなる面において、ＲＡＤ００１の用量は、約５０pM〜２nM、約１００pM〜１.５nM、約２００pM〜１nMまたは約３００pM〜５００pMの範囲であり得る。ある面において、ＲＡＤ００１の用量は、５０pM〜２nM、１００pM〜１.５nM、２００pM〜１nMまたは３００pM〜５００pMの範囲である。さらなる面において、ＲＡＤ００１の用量は、約３０pM、４０pM、５０pM、６０pM、７０pM、８０pM、９０pM、１００pM、１５０pM、２００pM、２５０pM、３００pM、３５０pM、４００pM、４５０pM、５００pM、５５０pM、６００pM、６５０pM、７００pM、７５０pM、８００pM、８５０pM、９００pM、９５０pM、１nM、１.５nM、２nM、２.５nM、３nM、３.５nMまたは４nMである。
【０３２１】
さらなる面において、本発明の方法は、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を、ＲＡＤ００１について特定した特定の量または用量と生物学的同等である量で使用できる。
【０３２２】
ｍＴＯＲ阻害剤の用量に関してここで使用する用語“約”は、ｍＴＯＲ阻害剤の量の最大±１０％ばらつきだけでなく、記載された特定用量付近において可変領域がないものを含み得る。
【０３２３】
ある態様において、本発明は、対象に、標的トラフレベル内の用量でｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、トラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用する投薬レジメンと関係するトラフレベルより有意に低い。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌効果を生じるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルをもたらすように投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌適応に使用するための、ＦＤＡ承認添付文書に示されるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルを生じるように投与する。
【０３２４】
ある態様において、ここに開示する方法は、０.１〜１０ng／ml、０.１〜５ng／ml、０.１〜３ｎｇ／ml、０.１〜２ng／mlまたは０.１〜１ng／mlの標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０３２５】
ある態様において、ここに開示する方法は、０.２〜１０ng／ml、０.２〜５ng／ml、０.２〜３ｎｇ／ml、０.２〜２ng／mlまたは０.２〜１ng／mlの標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０３２６】
ある態様において、ここに開示する方法は、０.３〜１０ng／ml、０.３〜５ng／ml、０.３〜３ｎｇ／ml、０.３〜２ng／mlまたは０.３〜１ng／mlの標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０３２７】
ある態様において、ここに開示する方法は、０.４〜１０ng／ml、０.４〜５ng／ml、０.４〜３ｎｇ／ml、０.４〜２ng／mlまたは０.４〜１ng／mlの標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０３２８】
ある態様において、ここに開示する方法は、０.５〜１０ng／ml、０.５〜５ng／ml、０.５〜３ｎｇ／ml、０.５〜２ng／mlまたは０.５〜１ng／mlの標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０３２９】
ある態様において、ここに開示する方法は、１〜１０ng／ml、１〜５ng／ml、１〜３ｎｇ／mlまたは１〜２ng／mlの標的トラフレベルを提供する用量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を対象に投与することを含む。
【０３３０】
ここで使用する用語“トラフレベル”は、次の投与の直前の血漿中の薬物濃度または２投与間の最小薬物濃度をいう。
【０３３１】
ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、約０.１〜４.９ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、約０.１〜３ng／mlの範囲である。ある態様において、標的トラフレベルは３ng／ml以下、例えば、０.３ng／ml未満〜３ng／mlである。ある態様において、標的トラフレベルは３ng／ml以下、例えば、０.３ng／ml未満〜１ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは約２.４〜３ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは約０.１〜２.４ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは約０.１〜１.５ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは０.１〜３ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは２.４〜３ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは０.１〜２.４ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは０.１〜１.５ng／mlの範囲である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.１ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.２ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.３ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.４ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.５ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.６ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.７ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.８ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、０.９ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、１.０ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、１.１ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、１.２ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、１.３ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、１.４ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、１.５ng／mlである。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、５ng／ml以下である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、２.５ng／ml以下である。ある態様において、ＲＡＤ００１の標的トラフレベルは、３ng／ml、２ng／ml、１.９ng／ml、１.８ng／ml、１.７ng／ml、１.６ng／ml、１.５ng／ml、１.４ng／ml、１.３ng／ml、１.２ng／ml、１.１ng／ml、１.０ng／ml、０.９ng／ml、０.８ng／ml、０.７ng／ml、０.６ng／ml、０.５ng／ml、０.４ng／ml、０.３ng／ml、０.２ng／mlまたは０.１ng／ml以下である。。
【０３３２】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１について特定した標的トラフレベルと生物学的同等である標的トラフレベルと関係する量のＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を使用できる。ある態様において、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の標的トラフレベルは、ここに記載するＲＡＤ００１のトラフレベルと同じｍＴＯＲ阻害のレベルをもたらすレベルである(例えば、ここに記載する方法、例えば、Ｐ７０  Ｓ６Ｋの阻害で測定して)。
【０３３３】
低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与と共に使用するＣＡＲおよびＣＡＲ発現細胞
ここに記載するのは、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤とＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を組み合わせた、組み合わせ投与の方法である(細胞は、ＣＡＲを発現するように操作され、ある態様において、それが対象に投与されるまでにＣＡＲを発現する。他の態様において、発現は、投与後に開始する)。ある態様において、細胞は、ＣＡＲを発現するように操作したＴ細胞であり、ここで、ＣＡＲ  Ｔ細胞(“ＣＡＲＴ”)は抗癌特性を示す。
【０３３４】
ここに提供されるのは、ＣＡＲで操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与と組み合わせて使用する、癌のような疾患の処置に使用する組成物および方法である。
【０３３５】
ここに提供されるのは、ここに記載するような腫瘍マーカーへの結合が増強されるように操作した抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)を含む、多数のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)である。ここに提供されるのは、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)であり、ここで、操作した免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍特性を示す。ある面において、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは細胞表面に発現される。ある態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。あるこのような態様において、細胞はＣＡＲを安定に発現し得る。他の態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡで遺伝子導入される。あるこのような態様において、細胞は、ＣＡＲを一過性に発現し得る。
【０３３６】
ある面において、ここに記載するＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。ある面において、このような抗体フラグメントは、例えば、由来するＩｇＧ抗体と等価な結合親和性を保持する、同等な親和性で同じ抗原に結合する点で、機能的である。ある面において、このような抗体フラグメントは、当業者に理解されるように、免疫応答活性化、その標的抗原からのシグナル伝達開始阻害を含むが、これらに限定されない生物学的応答を提供する点で、機能的である。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、それが由来するマウス配列のｓｃＦｖと比較して、ヒト化されているｓｃＦｖ抗体フラグメントである。ある面において、親マウスｓｃＦｖ配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００号(引用により本明細書に包含させる)に提供されるＣＡＲ１９構築物であり、ここに配列番号４３として提供する。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ＷＯ２０１２／０７９０００号に記載されるｓｃＦｖであり、配列番号４３に提供する。
【０３３７】
ある面において、本発明の抗体は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に取り込まれる。ある面において、ＣＡＲは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００号における配列番号１２として提供され、ここに配列番号４２で低児湯するポリペプチド配列を含み、ここで、ｓｃＦｖドメインは、配列番号４４〜５５から選択される１以上の配列で置換される。ある面において、配列番号４４〜５５のｓｃＦｖドメインは、配列番号４３のｓｃＦｖドメインのヒト化バリアントであり、これは、ヒトＣＤ１９に特異的に結合するマウス起源のｓｃＦｖフラグメントである。このマウスｓｃＦｖのヒト化はマウス特異的残基が、ＣＡＲＴ１９処置、例えば、ＣＡＲ１９構築物で形質導入したＴ細胞での処置を受けている患者におけるヒト−抗マウス抗原(ＨＡＭＡ)応答を誘発し得るところの臨床の現場で望まれ得る。
【０３３８】
ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００号における配列番号１２として提供されるＣＤ１９  ＣＡＲは
MALPVTALLLPLALLLHAARPdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (配列番号42)
である。
【０３３９】
ある面において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によりコードされる。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、配列全体が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によりコードされる。コドン最適化は、コーディングＤＮＡにおける同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が、種によって偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮退は、同一ポリペプチドが多様なヌクレオチド配列によりコードされることを可能にする。種々のコドン最適化方法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号に開示された方法を含む。
【０３４０】
ある面において、本発明のＣＡＲは、特異的抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子をあわせる。例えば、ある面において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータ鎖、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある面において、抗原結合ドメインは、ここに記載するような腫瘍マーカーと結合する。
【０３４１】
さらに、本発明は、数ある疾患の中で、癌またはここに記載するような腫瘍マーカーを発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍または自己免疫性疾患を処置するための、ＣＡＲ発現細胞組成物およびｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびその医薬における使用または方法を提供する。
【０３４２】
ある面において、本発明のＣＡＲは、ここに記載するような腫瘍マーカーを発現する正常細胞を根絶し、それにより、細胞移植前に細胞コンディショニング治療としての使用が適用可能であるように、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与と使用できる。ある面において、ここに記載するような腫瘍マーカーを発現する正常細胞は正常幹細胞であり、細胞移植は幹細胞移植である。
【０３４３】
ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供し、ここで、操作した免疫エフェクター細胞は、抗癌特性を示す。好ましい抗原は、ここに記載するような癌関連抗原(すなわち、腫瘍マーカー)である。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化した抗体フラグメントを含む。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化したｓｃＦｖを含む。よって、本発明は、ヒト化抗原結合ドメインを含み、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に設計されたＣＡＲおよび養子治療のためのその使用方法を提供する。
【０３４４】
ある面において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよび任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの細胞内ドメインを含む。ある面において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)またはＣＤ２８以外の１以上の共刺激性分子由来である少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３４５】
本発明のＣＡＲの種々の要素の配列のいくつかの例を表１に記載し、ここで、ａａはアミノ酸を意味し、ｎａは対応するペプチドをコードする核酸を意味する。
【０３４６】
【表１】
2017528433.tif 000013
【表２】
2017528433.tif 000014
【０３４７】
【表３】
2017528433.tif 000015
【表４】
2017528433.tif 000016
【０３４８】
【表５】
2017528433.tif 000017
【表６】
2017528433.tif 000018
【０３４９】
ある態様において、ＣＡＲ  ｓｃＦｖフラグメントは、単一コーディングフレーム内に完全長ＣＡＲ構築物を作るためにレンチウイルスベクター内にコーディングされ、発現のためにプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーター(配列番号１)を使用する。
【０３５０】
癌関連抗原
本発明は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与と組み合わせて投与するための、免疫エフェクター細胞を癌に向ける１以上のＣＡＲを含むように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供する。これは、癌関連抗原に特異的であるＣＡＲ上の結合ドメインにより達成される。本発明のＣＡＲにより標的とされ得る２クラスの癌関連抗原(腫瘍マーカーまたは抗原)がある：(１)癌細胞の表面に発現する癌関連抗原；および(２)それ自体細胞内であるが、このような抗原(ペプチド)のフラグメントは、ＭＨＣ(主要組織適合遺伝子複合体)により癌細胞の表面に存在する癌関連抗原。
【０３５１】
よって、本発明は、次の癌関連抗原(腫瘍マーカー)を標的とするＣＡＲＴを提供する：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１。
【０３５２】
ある態様において、腫瘍抗原は、その全体を引用により本明細書に包含させる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０６０６号に記載の腫瘍抗原である。ある態様において、腫瘍抗原は、次の１以上から選択される：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１(ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９および１９Ａ２４とも呼ばれる)；Ｃ型レクチン様分子−１(ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１)；ＣＤ３３；上皮細胞増殖因子受容体バリアントIII(ＥＧＦＲｖIII)；ガングリオシドＧ２(ＧＤ２)；ガングリオシドＧＤ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−８)ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟(ＢＣＭＡ)；Ｔｎ抗原((Ｔｎ  Ａｇ)または(ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ))；前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１(ＲＯＲ１)；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ＦＬＴ３)；腫瘍関連糖タンパク質７２(ＴＡＧ７２)；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原(ＣＥＡ)；上皮性細胞接着分子(ＥＰＣＡＭ)；Ｂ７Ｈ３(ＣＤ２７６)；ＫＩＴ(ＣＤ１１７)；インターロイキン−１３受容体ｓｕｂ単位アルファ−２(ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２)；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ(ＩＬ−１１Ｒａ)；前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)；プロテアーゼセリン２１(スペルミンまたはＰＲＳＳ２１)；血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)；ルイス(Ｙ)抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)；ステージ特異的胚性抗原−４(ＳＳＥＡ−４)；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)；ムチン１、細胞表面関連(ＭＵＣ１)；上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)；神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)；プロスターゼ；前立腺酸ホスファターゼ(ＰＡＰ)；伸長因子２変異(ＥＬＦ２Ｍ)；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(ＦＡＰ)；インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ−Ｉ受容体)、炭酸脱水酵素IX(ＣＡIX)；プロテアソーム(Prosome, Macropain)サブユニット、ベータ型、９(ＬＭＰ２)；糖タンパク質１００(ｇｐ１００)；易切断領域(ＢＣＲ)およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１(Ａｂｌ)からなる癌遺伝子融合タンパク質(ｂｃｒ−ａｂｌ)；チロシナーゼ；エフリンｔｙｐｅ−Ａ受容体２(ＥｐｈＡ２)；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子(ｓＬｅ)；ガングリオシドＧＭ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)；トランスグルタミナーゼ５(ＴＧＳ５)；高分子量黒色腫関連抗原(ＨＭＷＭＡＡ)；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド(ＯＡｃＧＤ２)；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１(ＴＥＭ１／ＣＤ２４８)；腫瘍内皮マーカー７関連(ＴＥＭ７Ｒ)；クローディン６(ＣＬＤＮ６)；甲状腺刺激ホルモン受容体(ＴＳＨＲ)；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ(ＧＰＲＣ５Ｄ)；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１(ＣＸＯＲＦ６１)；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)；ポリシアル酸；胎盤特異的１(ＰＬＡＣ１)；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド(ＧｌｏｂｏＨ)のヘキササッカライド部分；乳腺分化抗原(ＮＹ−ＢＲ−１)；ウロプラキン２(ＵＰＫ２)；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１(ＨＡＶＣＲ１)；アドレナリン受容体ベータ３(ＡＤＲＢ３)；パネキシン３(ＰＡＮＸ３)；Ｇタンパク質共役受容体２０(ＧＰＲ２０)；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ９(ＬＹ６Ｋ)；Ｏｌ因子ｙ受容体５１Ｅ２(ＯＲ５１Ｅ２)；ＴＣＲガンマ選択的リーディングフレームタンパク質(ＴＡＲＰ)；ウィルムス腫瘍タンパク質(ＷＴ１)；癌／精子抗原１(ＮＹ−ＥＳＯ−１)；癌／精子抗原２(ＬＡＧＥ−１ａ)；黒色腫関連抗原１(ＭＡＧＥ−Ａ１)；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座−バリアント遺伝子６(ＥＴＶ６−ＡＭＬ)；精子タンパク質１７(ＳＰＡ１７)；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ(ＸＡＧＥ１)；アンギオポエチン結合細胞表面受容体２(Ｔｉｅ  ２)；黒色腫癌精子抗原−１(ＭＡＤ−ＣＴ−１)；黒色腫癌精子抗原−２(ＭＡＤ−ＣＴ−２)；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３(ｐ５３)；ｐ５３変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１(ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８)、Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原(ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１)；ラット肉腫(Ｒａｓ)変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害剤(ＭＬ−ＩＡＰ)；ＥＲＧ(膜貫通プロテアーゼ、セリン２(ＴＭＰＲＳＳ２)ＥＴＳ融合遺伝子)；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ(ＮＡ１７)；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３(ＰＡＸ３)；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(ＭＹＣＮ)；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ(ＲｈｏＣ)；チロシナーゼ関連タンパク質２(ＴＲＰ−２)；シトクロムＰ４５０  １Ｂ１(ＣＹＰ１Ｂ１)；ＣＣＣＴＣ−結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(ＢＯＲＩＳまたはBrother of the regulator of imprinted sites)、Ｔ細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原３(ＳＡＲＴ３)；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５(ＰＡＸ５)；プロアクロシン結合タンパク質ｐ３２(ＯＹ−ＴＥＳ１)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(ＬＣＫ)；Ａキナーゼアンカータンパク質４(ＡＫＡＰ−４)；滑膜肉腫、Ｘ切断点２(ＳＳＸ２)；終末糖化産物受容体(ＲＡＧＥ−１)；腎臓遍在性１(ＲＵ１)；腎臓遍在性２(ＲＵ２)；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスＥ６(ＨＰＶ  Ｅ６)；ヒト乳頭腫ウイルスＥ７(ＨＰＶ  Ｅ７)；腸カルボキシルエステラーゼ；ヒートショックタンパク質７０−２変異(ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２)；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１(ＬＡＩＲ１)；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント(ＦＣＡＲまたはＣＤ８９)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２(ＬＩＬＲＡ２)；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ(ＣＤ３００ＬＦ)；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ(ＣＬＥＣ１２Ａ)；骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２(ＥＭＲ２)；リンパ球抗原７５(ＬＹ７５)；グリピカン−３(ＧＰＣ３)；Ｆｃ受容体様５(ＦＣＲＬ５)；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１(ＩＧＬＬ１)。
【０３５３】
ある態様において、コードされたＣＡＲ分子により結合される腫瘍抗原は、次の１以上から選択される：ＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＧＤ３、Ｔｎ  Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１。
【０３５４】
ある態様において、コードされたＣＡＲ分子により結合される腫瘍抗原は、次の１以上から選択される：ＴＳＨＲ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６ＫおよびＯＲ５１Ｅ２。
【０３５５】
ここに記載するようなＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内在性タンパク質由来のペプチドは主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞により構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況におけるウイルスまたは腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体は記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Bood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージ提示ライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングにより特定できる。よって、本発明は、細胞内に発現される上記のあらゆる腫瘍抗原、例えば、ｐ５３、ＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびｃ−ｍｅｔから選択される分子のＭＨＣ提示ペプチドに結合する、抗原結合ドメインを含むＣＡＲ、例えば、ここに記載するＲＣＡＲを艇庫油する。
【０３５６】
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明は、ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞と合わせた、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の使用を包含する。免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする配列を含む組み換えＤＮＡ構築物の挿入によりＣＡＲを発現するように操作でき、ここで、ＣＡＲはここに記載するような癌関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)を含み、ここで、抗体フラグメントの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と同じリーディングフレームと隣接するかその中にある。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含むことができる。共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の少なくとも細胞内ドメインの部分を含むＣＡＲの部分をいう。ある態様において、抗原結合ドメインは、ここに記載するマウス抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントである。
【０３５７】
特定の面において、本発明のＣＡＲ構築物はｓｃＦｖドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖの前に配列番号２に提供されるような任意のリーダー配列があり、後ろに配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０に提供されるような任意のヒンジ配列、配列番号１２に提供するような膜貫通領域、配列番号１４または配列番号１６を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号１８または配列番号２０を含むＣＤ３ゼータ配列があってよく、ここで、ドメインは、単一融合タンパク質を形成するように同じリーディングフレームに隣接するかその中にある。また本発明に包含されるのは、ｓｃＦｖフラグメントの各々のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。ある面において、ＣＡＲ構築物の例は、任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメインおよび細胞内刺激性ドメインを含む。ある面において、ＣＡＲ構築物の例は、任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激性ドメインを含む。
【０３５８】
リーダー配列の例は、配列番号２として提供される。ヒンジ／スペーサー配列の例は、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０として提供される。膜貫通ドメイン配列の例は、配列番号１２として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号１４として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号１６として提供される。ＣＤ３ゼータドメイン配列の例は、配列番号１８または配列番号２０として提供される。
【０３５９】
ある面において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と同じリーディングフレームと隣接するかその中にある、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む。
【０３６０】
ある面において、本発明は、ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含む組み換え核酸構築物の使用を包含し、ここで、核酸分子は抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで、配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と同じリーディングフレームに隣接するかその中にある。ＣＡＲにおいて使用できる細胞内シグナル伝達ドメインの例は、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある例において、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
【０３６１】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用して、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニングにより、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子を誘導化することによりまたはそれを含むことが知られる細胞および組織から直接単離することによるような、組み換え当分野で知られる方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸を、クローン化より合成により産生できる。
【０３６２】
本発明は、細胞に直接形質導入できるＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物の使用を含む。
【０３６３】
本発明はまた細胞に直接遺伝子導入できるＲＮＡ構築物の使用を含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特異的に設計したプライマーの鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイル、一般に５０〜２０００塩基長を含む構築物を産生する(配列番号３２)。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞において効率的に翻訳され得る。ある態様において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある態様において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターは、電気穿孔法によりＴ細胞に形質導入する。
【０３６４】
抗原結合ドメイン
ある面において、本発明において使用するＣＡＲは、抗原結合ドメインとも呼ばれる標的特異的結合要素を含む。選り抜きの部分は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関係する標的細胞の細胞表面マーカーとして作用する高原を認識するよう選択し得る。それゆえに本発明のＣＡＲにおいて抗原結合ドメインのためのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫感染症、自己免疫性疾患および癌細胞と関係するものを含む。
【０３６５】
ある面において、ＣＡＲ介在Ｔ細胞応答は、所望の抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインをＣＡＲに操作する目的で、目的の抗原に指向させ得る。
【０３６６】
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、上記のような腫瘍マーカーを標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０３６７】
ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含む。ある面において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９を標的とする。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Nicholson et al. Mol. Immun. 34(16-17): 1157-1165(1997)に記載のＦＭＣ６３  ｓｃＦｖフラグメントと同じまたは類似する結合特異性を有する。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Nicholson et al. Mol. Immun. 34(16-17): 1157-1165(1997)に記載のｓｃＦｖフラグメントを含む。ＣＤ１９抗体分子は、例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載の抗体分子(例えば、ヒト化抗ＣＤ１９抗体分子)である。ＷＯ２０１４／１５３２７０号はまた、種々のＣＡＲＴ構築物の結合および効力をアッセイする方法も記載する。
【０３６８】
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)およびラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン(ＶＨＨ)のような単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されないその機能的フラグメントならびに組み換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲなどのような、当分野で抗原結合ドメインとして機能することが知られる代替天然スキャフォールドを含むが、これらに限定されない、抗原に結合するあらゆるドメインであり得る。ある例において、抗原結合ドメインがＣＡＲを最終的に使用するのと同じ種由来であることは有利である。例えば、ヒトにおける使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むことが有利であり得る。
【０３６９】
ある態様において、ＣＤ２２に対する抗原結合ドメインに対する抗原結合ドメインは、例えば、Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013); Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (2010); Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013); Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P)に記載のような抗体由来である。
【０３７０】
ある態様において、ＣＳ−１に対する抗原結合ドメインは、エロツズマブ(ＢＭＳ)由来であり、例えば、Tai et al., 2008, Blood 112(4):1329-37; Tai et al., 2007、Blood。110(5):1656-63参照。
【０３７１】
ある態様において、ＣＬＬ−１に対する抗原結合ドメインは、Ｒ＆Ｄ、ebiosciences、Abcamから入手可能な抗体由来である、例えば、ＰＥ−ＣＬＬ１−ｈｕ  Ｃａｔ＃  ３５３６０４(BioLegend)；およびＰＥ−ＣＬＬ１(ＣＬＥＣ１２Ａ)  Ｃａｔ＃  ５６２５６６(ＢＤ)。
【０３７２】
ある態様において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインに対する抗原結合ドメインは、例えば、Bross et al., Clin Cancer Res 7(6):1490-1496(2001)(ゲムツズマブオゾガマイシン、ｈＰ６７.６), Caron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767(1992)(リンツズマブ、ＨｕＭ１９５)、Lapusan et al., Invest New Drugs 30(3):1121-1131 (2012)(AVE9633), Aigner et al., Leukemia 27(5): 1107-1115 (2013) (AMG330, CD33 BiTE), Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012)およびPizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)に記載のような抗体由来である。
【０３７３】
ある態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Mujoo et al., Cancer Res. 47(4): 1098-1104 (1987); Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985), Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987), Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998), Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992)に記載のような抗体由来である。ｍＡｂ  １４.１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４.１８、ｈｕ１４.１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６.１、８Ｈ９、例えば、ＷＯ２０１２０３３８８５号、ＷＯ２０１３０４０３７１号、ＷＯ２０１３１９２２９４号、ＷＯ２０１３０６１２７３号、ＷＯ２０１３１２３０６１号、ＷＯ２０１３０７４９１６号およびＷＯ２０１３８５５５２号参照。
【０３７４】
ある態様において、ＢＣＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２０１２１６３８０５号、ＷＯ２００１１２８１２号およびＷＯ２００３０６２４０１号に記載のような抗体由来である。
【０３７５】
ある態様において、Ｔｎ抗原に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ８,４４０,７９８号、Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010), and Stone et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)に記載の抗体由来である。
【０３７６】
ある態様において、ＰＳＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Parker et al., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)、ＵＳ２０１１０２６８６５６号(Ｊ５９１  ＳｃＦｖ); Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-2232 (2013)(ｓｃＦｖＤ２Ｂ)；ＷＯ２００６１２５４８１号(ｍＡｂｓ  ３／Ａ１２、３／Ｅ７および３／Ｆ１１)および一本鎖抗体フラグメント(ｓｃＦｖ  Ａ５およびＤ７)に記載のような抗体由来である。
【０３７７】
ある態様において、ＲＯＲ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hudecek et al., ClinCancer Res 19(12):3153-3164(2013)；ＷＯ２０１１１５９８４７号；およびＵＳ２０１３０１０１６０７号に記載のような抗体由来である。
【０３７８】
ある態様において、ＦＬＴ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２０１１０７６９２２号、ＵＳ５７７７０８４号、ＥＰ０７５４２３０号、ＵＳ２００９０２９７５２９号に記載のような抗体およびいくつかの市販のカタログ抗体(Ｒ＆Ｄ、ebiosciences、Abcam)由来である。
【０３７９】
ある態様において、ＴＡＧ７２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hombach et al., Gastroenterology 113(4):1163-1170(1997)に記載のような抗体；およびＡｂｃａｍ  ａｂ６９１由来である。
【０３８０】
ある態様において、ＦＡＰに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ostermann et al., Clinical Cancer Research 14:4584-4592(２００８)(ＦＡＰ５)、米国特許公開２００９／０３０４７１８号；シブロツズマブ(例えば、Hofheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003)；およびTran et al., J Exp Med 210(6):1125-1135 (2013)に記載の抗体由来である。
【０３８１】
ある態様において、ＣＤ３８に対する抗原結合ドメインに対する抗原結合ドメインは、ダラツムマブ(例えば、Groen et al., Blood 116(21):1261-1262(2010)参照)；ＭＯＲ２０２(例えば、ＵＳ８,２６３,７４号参照)；またはＵＳ８,３６２,２１１号に記載の抗体由来である。
【０３８２】
ある態様において、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合ドメインは、例えば、Casucci et al., Blood 122(20):3461-3472(2013)に記載のような抗体由来である。
【０３８３】
ある態様において、ＣＥＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Chmielewski et al., Gastoenterology 143(4):1095-1107(2012)に記載のような抗体由来である。
【０３８４】
ある態様において、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３二特異性Ａｂ(例えば、clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596参照)；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ−１；およびアデカツムマブ(ＭＴ２０１)由来である。
【０３８５】
ある態様において、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合ドメインは、ＭＧＡ２７１(Macrogenics)由来である。
【０３８６】
ある態様において、ＫＩＴに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７９１５３９１号、ＵＳ２０１２０２８８５０６号に記載のような抗体およびいくつかの市販のカタログ抗体由来である。
【０３８７】
ある態様において、ＩＬ−１３Ｒａ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２００８／１４６９１１号、ＷＯ２００４０８７７５８号、いくつかの市販のカタログ抗体およびＷＯ２００４０８７７５８号に記載のような抗体由来である。
【０３８８】
ある態様において、ＣＤ３０に対する抗原結合ドメインに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７０９０８４３Ｂ１号およびＥＰ０８０５８７１号に記載のような抗体由来である。
【０３８９】
ある態様において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７２５３２６３号；ＵＳ８,２０７,３０８号；ＵＳ２０１２０２７６０４６号；ＥＰ１０１３７６１号；ＷＯ２００５０３５５７７号；およびＵＳ６４３７０９８号に記載のような抗体由来である。
【０３９０】
ある態様において、ＣＤ１７１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hong et al., J Immunother 37(2):93-104 (2014)に記載のような抗体由来である。
【０３９１】
ある態様において、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、Abcam(cat# ab55262)およびNovus Biologicals(cat# EPR5446)から入手可能な抗体由来である。他の態様において、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合ドメインはペプチドである、例えば、Huang et al., Cancer Res 72(1):271-281 (2012)参照。
【０３９２】
ある態様において、ＰＳＣＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Morgenroth et al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007) (scFv 7F5); Nejatollahi et al., J of Oncology 2013(2013), article ID 839831 (scFv C5-II)；および米国特許公開２００９０３１１１８１号に記載のような抗体由来である。
【０３９３】
ある態様において、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Chinnasamy et al., J Clin Invest 120(11):3953-3968(2010)に記載のような抗体由来である。
【０３９４】
ある態様において、ルイスＹに対する抗原結合ドメインは、例えば、Kelly et al., Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008)(hu3S193 Ab (scFvs)); Dolezal et al., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003)(NC10 scFv)に記載のような抗体由来である。
【０３９５】
ある態様において、ＣＤ２４に対する抗原結合ドメインに対する抗原結合ドメインは、例えば、Maliar et al., Gastroenterology 143(5):1375-1384 (2012)に記載のような抗体由来である。
【０３９６】
ある態様において、ＰＤＧＦＲ−ベータに対する抗原結合ドメインは、Ａｂｃａｍ  ａｂ３２５７０由来である。
【０３９７】
ある態様において、ＳＳＥＡ−４に対する抗原結合ドメインは、ＭＣ８１３(Cell Signaling)および他の市販抗体試薬由来である。
【０３９８】
ある態様において、ＣＤ２０に対する抗原結合ドメインに対する抗原結合ドメインは、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブまたはＧＡ１０１由来である。
【０３９９】
ある態様において、葉酸受容体アルファに対する抗原結合ドメインは、ＩＭＧＮ８５３、ＵＳ２０１２０００９１８１号；ＵＳ４８５１３３２号、ＬＫ２６：ＵＳ５９５２４８４号の抗体要素である。
【０４００】
ある態様において、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)に対する抗原結合ドメインは、トラスツズマブまたはペルツズマブ由来である。
【０４０１】
ある態様において、ＭＵＣ１に対する抗原結合ドメインは、ＳＡＲ５６６６５８の抗体要素由来である。
【０４０２】
ある態様において、ＥＧＦＲに対する抗原結合ドメインは、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブまたはマツズマブ由来である。
【０４０３】
ある態様において、ＮＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、クローン２−２Ｂ：ＭＡＢ５３２４(EMD milipore)由来である。
【０４０４】
ある態様において、エフリンＢ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Abengozar et al., Blood 119(19):4565-4576(2012)に記載のような抗体由来である。
【０４０５】
ある態様において、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ８３４４１１２Ｂ２号；ＥＰ２３２２５５０Ａ１号；ＷＯ２００６／１３８３１５号およびＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２９９５号に記載のような抗体由来である。
【０４０６】
ある態様において、ＣＡIXに対する抗原結合ドメインは、クローン３０３１２３(R&D Systems)由来である。
【０４０７】
ある態様において、ＬＭＰ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７,４１０,６４０号およびＵＳ２００５０１２９７０１号に記載のような抗体由来である。
【０４０８】
ある態様において、ｇｐ１００に対する抗原結合ドメインは、ＷＯ２０１３１６５９４０号またはＵＳ２０１３０２９５００７号に記載のＨＭＢ４５、ＮＫＩベータＢ由来である。
【０４０９】
ある態様において、チロシナーゼに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ５８４３６７４号；またはＵＳ１９９５０５０４０４８号に記載のような抗体由来である。
【０４１０】
ある態様において、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Yu et al., Mol Ther 22(1):102-111(2014)に記載のような抗体由来である。
【０４１１】
ある態様において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７２５３２６３号；ＵＳ８,２０７,３０８号；ＵＳ２０１２０２７６０４６号；ＥＰ１０１３７６１Ａ３号；２０１２０２７６０４６号；ＷＯ２００５０３５５７７号；またはＵＳ６４３７０９８号に記載のような抗体由来である。
【０４１２】
ある態様において、フコシルＧＭ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ２０１００２９７１３８号；またはＷＯ２００７／０６７９９２号に記載のような抗体由来である。
【０４１３】
ある態様において、ｓＬｅに対する抗原結合ドメインは、Ｇ１９３(ルイスＹについて)由来である、Scott AM et al, Cancer Res 60: 3254-61(2000)を参照し、またNeeson et al, J Immunol May 2013 190(Meeting Abstract Supplement) 177.10にも記載されている。
【０４１４】
ある態様において、ＧＭ３に対する抗原結合ドメインは、ＣＡ  ２５２３４４９(ｍＡｂ  １４Ｆ７)由来である。
【０４１５】
ある態様において、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Kmiecik et al., Oncoimmunology 3(1):e27185(2014)(PMID: 24575382)(mAb9.2.27)；ＵＳ６５２８４８１号；ＷＯ２０１００３３８６６号；またはＵＳ２０１４０００４１２４号に記載のような抗体由来である。
【０４１６】
ある態様において、ｏ−アセチル−ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、８Ｂ６由来である。
【０４１７】
ある態様において、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合ドメインは、例えば、Marty et al., Cancer Lett 235(2):298-308 (2006); Zhao et al., J Immunol Methods 363(2):221-232 (2011)に記載のような抗体由来である。
【０４１８】
ある態様において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合ドメインは、ＩＭＡＢ０２７(Ganymed  Pharmaceuticals)由来である、例えば、clinicaltrial.gov/show/NCT02054351参照。
【０４１９】
ある態様において、ＴＳＨＲに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ８,６０３,４６６号；ＵＳ８,５０１,４１５号；またはＵＳ８,３０９,６９３号に記載のような抗体由来である。
【０４２０】
ある態様において、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合ドメインは、ＦＡＢ６３００Ａ(R&D Systems)；またはＬＳ−Ａ４１８０(Lifespan Biosciences)由来である。
【０４２１】
ある態様において、ＣＤ９７に対する抗原結合ドメインに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ６,８４６,９１１号；de Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134(2009)に記載のような抗体；Ｒ＆Ｄからの抗体：ＭＡＢ３７３４由来である。
【０４２２】
ある態様において、ＡＬＫに対する抗原結合ドメインは、例えば、Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571(2010)に記載のような抗体由来である。
【０４２３】
ある態様において、ポリシアル酸に対する抗原結合ドメインは、例えば、Nagae et al., J Biol Chem 288(47):33784-33796(2013)に記載のような抗体由来である。
【０４２４】
ある態様において、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ghods et al., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177に記載のような抗体由来である。
【０４２５】
ある態様において、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合ドメインは、ＶＫ９；または例えば、Kudryashov V et al, Glycoconj J.15(3):243-9(1998), Lou et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487(2014) ; MBr1: Bremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777(1984)に記載のもの由来である。
【０４２６】
ある態様において、ＮＹ−ＢＲ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Jager et al., Appl Immunohitochem Mol Morphol 15(1):77-83(2007)に記載のような抗体由来である。
【０４２７】
ある態様において、ＷＴ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Dao et al., Sci Transl Med 5(176):176ra33(2013)；またはＷＯ２０１２／１３５８５４号に記載のような抗体由来である。
【０４２８】
ある態様において、ＭＡＧＥ−Ａ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Willemsen et al., J Immunol 174(12):7853-7858(2005)(ＴＣＲ様ｓｃＦＶ)に記載のような抗体由来である。
【０４２９】
ある態様において、精子タンパク質１７に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＳSong et al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313); Song et al., Med Oncol 29(4):2923-2931 (2012)に記載のような抗体由来である。
【０４３０】
ある態様において、Ｔｉｅ２に対する抗原結合ドメインは、ＡＢ３３(Cell Signaling Technology)由来である。
【０４３１】
ある態様において、ＭＡＤ−ＣＴ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＭＩＤ：２４５０９５２；ＵＳ７６３５７５３号に記載のような抗体由来である。
【０４３２】
ある態様において、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合ドメインは１２Ｆ９(Novus Biologicals)由来だえる。
【０４３３】
ある態様において、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合ドメインは、ＥＰ２５１４７６６Ａ２号；ＵＳ７,７４９,７１９号に記載のような抗体由来である。
【０４３４】
ある態様において、肉腫転座切断点に対する抗原結合ドメインは、例えば、Luo et al, EMBO Mol. Med. 4(6):453-461(2012)に記載のような抗体由来である。
【０４３５】
ある態様において、ＴＲＰ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Wang et al, J Exp Med. 184(6):2207-16(1996)に記載のような抗体由来である。
【０４３６】
ある態様において、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Maecker et al, Blood 102(9): 3287-3294(2003)に記載のような抗体由来である。
【０４３７】
ある態様において、ＲＡＧＥ−１に対する抗原結合ドメインは、ＭＡＢ５３２８(EMD milipore)由来である。
【０４３８】
ある態様において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合ドメインは、カタログ番号ＬＳ−Ｂ９５号１００(Lifespan Biosciences)由来である。
【０４３９】
ある態様において、腸カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合ドメインは、４Ｆ１２：カタログ番号ＬＳｃＢ６１９０−５０(Lifespan Biosciences)由来である。
【０４４０】
ある態様において、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２に対する抗原結合ドメインは、Lifespan Biossciences：モノクローナル：カタログ番号ＬＳ−Ｃ１３３２６１−１００(Lifespan Biosciences)由来である。
【０４４１】
抗原結合ドメインは、表３からの配列を含み得る。
【０４４２】
【表７】
2017528433.tif 000019
【表８】
2017528433.tif 000020
【０４４３】
【表９】
2017528433.tif 000021
【表１０】
2017528433.tif 000022
【０４４４】
【表１１】
2017528433.tif 000023
【表１２】
2017528433.tif 000024
【０４４５】
ある態様において、抗原結合ドメインは、次のいずれか一つを標的とするまたは特異的に結合する、当分野で知られるあらゆる抗体またはそのフラグメント、例えば、ｓｃＦｖを含む：ＢＣＭＡ(ＴＮＦＲＳＦ１７、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１７またはＢ細胞成熟抗原としても知られる)、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１(Ｃ型レクチン様ドメインファミリー１またはＣＬＥＣＬ１としても知られる)、クローディン−６(ＣＬＤＮ６)またはＷＴ−１(ウィルムス腫瘍１)。抗体またはそのフラグメントは、マウス、ヒト化または完全ヒト抗体またはそのフラグメントであり得る。
【０４４６】
ある態様において、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合ドメインは、表８に記載の可変重鎖および可変軽鎖を含む。可変重鎖と可変軽鎖を連結するリンカー配列はここに記載するリンカー配列のいずれかであり得るまたは代替的にＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号７６)だり得る。
【０４４７】
【表１３】
2017528433.tif 000025
【０４４８】
当分野で知られるＣＤ１９  ＣＡＲ、例えば、任意の既知ＣＤ１９  ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインを、本発明に従い使用できる。例えば、ＬＧ−７４０；米国特許８,３９９,６４５号；米国特許７,４４６,１９０号；Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); および16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ。
【０４４９】
ある態様において、抗原結合ドメインは、上記抗体からの１、２、３(例えば、全３)重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３および／または上記抗体からの１、２、３(例えば、全３)軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、上記抗体の重鎖可変領域および／または可変軽鎖領域を含む。
【０４５０】
ある態様において、抗原結合ドメインは、表３に記載の任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、さらにＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、表３に記載の任意の軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【０４５１】
ある態様において、抗原結合ドメインは、表３に記載の任意の軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１、２または全ておよび表３に記載の任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３の１、２または全てを含む。
【０４５２】
ある態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームまたはこれらの組み合わせにより定義される。
【０４５３】
ある態様において、ｓｃＦｖにおいてＶＬおよびＶＨドメインが現れる順番は変わり(すなわち、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ配向)、ｓｃＦｖドメイン全体を作るように、各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ(配列番号２８)(例えば、(Ｇ４Ｓ)３(配列番号３０)または(Ｇ４Ｓ)４(配列番号２９))を含む３または４コピーの“Ｇ４Ｓ”(配列番号２５)サブユニットが可変ドメインを結合する。あるいは、ＣＡＲ構築物は、例えば、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号９５)を含むリンカーを含み得る。
【０４５４】
種々のｓｃＦｖフラグメントおよび他のＣＡＲ要素の配列例をここに提供する。リーダー配列(例えば、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号３のヌクレオチド配列を伴わない)を伴わないこれらのＣＡＲ要素(例えば、配列番号４２、２６の)もここに提供する。
【０４５５】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ配列は、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激性ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基変化を含む。
【０４５６】
他の面において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。ある面において、非ヒト抗体は、抗体の特定の配列または領域がヒトにおいて天然に産生される抗体またはそのフラグメントに対する類似性を高めるために修飾され、ヒト化される。ある面において、抗原結合ドメインは、ヒト化される。
【０４５７】
ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植(例えば、各々をその全体を引用により本明細書に包含させる、欧州特許ＥＰ２３９,４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許５,２２５,５３９号、５,５３０,１０１号および５,５８５,０８９号参照)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、各々をその全体を引用により本明細書に包含させる欧州特許ＥＰ５９２,１０６号およびＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973参照)、鎖シャッフリング(例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる米国特許５,５６５,３３２号参照)および例えば、各々をその全体を引用により本明細書に包含させる米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４８６１７、米国特許６,４０７,２１３号、米国特許５,７６６,８８６号、国際公開ＷＯ９３１７１０５号、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)に記載の方法を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多様な方法を使用して産生できる。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、抗原結合を変える、例えば改善するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の異常フレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される(例えば、引用により本明細書に包含させるQueen et al.、米国特許５,５８５,０８９号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照)。
【０４５８】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒトである源から残留している１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、一般に“インポート”可変ドメインからとられる、“インポート”残基という。ここに提供されるように、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、フレームワークが完全にまたは大部分ヒト生殖細胞系に由来する、非ヒト免疫グロブリン分子およびフレームワーク領域からの１以上のＣＤＲを含む。抗体または抗体フラグメントのヒト化のための多数の技術が当分野で知られ、本質的に、Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従い、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、すなわち、ＣＤＲ移植(内容を引用によりその全体を本明細書に包含させるＥＰ２３９,４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許４,８１６,５６７号；６,３３１,４１５号；５,２２５,５３９号；５,５３０,１０１号；５,５８５,０８９号；６,５４８,６４０号)により実施できる。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントにおいて、非ヒト種からの対応する配列により置換されるのは実質的に完全より少ないヒト可変ドメインである。ヒト化抗体は、しばしば、あるＣＤＲ残基およびおそらくあるフレームワーク(ＦＲ)残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基により置換される、ヒト抗体である。抗体および抗体フラグメントのヒト化は、ベニアリングまたはリサーフェシング(ＥＰ５９２,１０６号；ＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)))または鎖シャッフリング(米国特許５,５６５,３３２号)によっても達成でき、その内容は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０４５９】
ヒト化抗体を製造するために使用する軽および重両者のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少するためである。いわゆる“ベストフィット”法により、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知ヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯類に最も近いヒト配列を、その後、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させるSims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)参照)。他の使用は、特定のサブグループの軽鎖または重鎖の全抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、数種の異なるヒト化抗体のために使用し得る(例えば、その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照)。ある態様において、フ重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４フレームワーク領域は、ＶＨ４＿４−５９生殖細胞系配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸からの、１、２、３、４または５修飾、例えば、置換を含み得る。ある態様において、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４フレームワーク領域は、ＶＫ３＿１.２５生殖細胞系配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸からの、１、２、３、４または５修飾、例えば、置換を含み得る。
【０４６０】
ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗体フラグメントを含む部分は、標的抗原に対する高親和性および他の有利な生物学的特性を維持しながらヒト化される。本発明のある面によって、ヒト化抗体および抗体フラグメントは、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により製造される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体構造的構造を説明および提示するコンピュータープログラムは利用可能である。これらのディスプレイの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンの標的抗原への結合能に影響する残基の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性増加のような、所望の抗体または抗体フラグメント時調が達成されるように、レシピエントおよびインポート配列から選択および組み合わせできる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合の直接的かつ最も実質的な影響に関与する。
【０４６１】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と類似する抗原性特異性、例えば、本発明において、ここに記載するようなヒト癌関連抗原に結合する能力を保持し得る。ある態様において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ここに記載するようなヒト癌関連抗原への結合の親和性および／または特異性が改善され得る。
【０４６２】
ある面において、本発明の抗原結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的性質または特性により特徴付けされる。例えば、ある面において本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインを含む部分は、ここに記載するような腫瘍マーカーに特異的に結合する。
【０４６３】
ある面において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある面において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２または二機能性(例えば二特異性)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105(1987))。ある面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、ここに記載するような癌関連抗原タンパク質と、野生型のまたは増強した親和性で結合する。
【０４６４】
ある例において、ｓｃＦｖｓは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ＳｃＦｖ分子は、柔軟性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を一緒に連結することにより産生できる。ｓｃＦｖ分子は、最適長および／またはアミノ酸組成を有するリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカーを用いるならば、(例えば、５〜１０アミノ酸)、鎖内折りたたみは阻止される。鎖内折りたたみは、２可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成させるためにも必要である。リンカー配向およびサイズの例は、例えば、引用により本明細書に包含させるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号参照。
【０４６５】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の正の整数である)のような、一連のグリシンおよびセリン反復を含む(配列番号２２)。ある態様において、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２９)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号３０)であり売る。リンカー長の変動は、活性を維持または増強し、活性試験において優れた有効性を生じ得る。
【０４６６】
他の面において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲ(ｓｃＴＣＲ)である。このようなＴＣＲを製造する方法は、当分野で知られる。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)参照(引用文献は、その全体を本明細書に包含させる)。例えば、リンカー(例えば、柔軟性ペプチド)により連結されたＴ細胞クローンからのＶαおよびＶβ遺伝子を含むｓｃＴＣＲが操作され得る。この方法は、それ自体が細胞内であるが、このような抗原(ペプチド)のフラグメントがＭＨＣにより癌細胞の表面に提示される、癌関連標的に対して極めて有用である。
【０４６７】
安定性および変異
ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ分子(例えば、可溶性ｓｃＦｖ)の安定性を、慣用の対照ｓｃＦｖ分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)を参照して評価できる。ある態様において、ヒト化ｓｃＦｖは、記載するアッセイにおいて、対照結合分子(例えば慣用のｓｃＦｖ分子)より、約０.１℃、約０.２５℃、約０.５℃、約０.７５℃、約１℃、約１.２５℃、約１.５℃、約１.７５℃、約２℃、約２.５℃、約３℃、約３.５℃、約４℃、約４.５℃、約５℃、約５.５℃、約６℃、約６.５℃、約７℃、約７.５℃、約８℃、約８.５℃、約９℃、約９.５℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃または約１５℃高い熱安定性を有する。
【０４６８】
ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性の改善は、続いてＣＡＲＴ１９構築物全体に貢献し、ＣＡＲＴ１９構築物の治療的特性改善に至る。ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性は、慣用の抗体と比較して少なくとも約２℃または３℃改善され得る。ある態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、慣用の抗体に対して１℃改善された熱安定性を有する。他の態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、慣用の抗体に対して２℃改善された熱安定性を有する。他の態様において、ｓｃＦｖは、慣用の抗体に対して４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃改善された熱安定性を有する。比較は、例えば、ここに記載するｓｃＦｖ分子と、ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが由来した抗体のｓｃＦｖ分子またはＦａｂフラグメントで行い得る。熱安定性を、当分野で知られる方法を使用して測定できる。例えば、ある態様において、Ｔｍを測定できる。Ｔｍを測定する方法およびタンパク質安定性を決定する他の方法は、下にさらに詳細に記載する。
【０４６９】
ｓｃＦｖにおける変異(可溶性ｓｃＦｖのヒト化または直接変異誘発に起因)は、ｓｃＦｖの安定性を変え、ｓｃＦｖおよびＣＡＲＴ１９構築物の全体的安定性を改善する。ヒト化ｓｃＦｖの安定性を、Ｔｍ、変性温度および凝集温度のような測定を使用して、マウスｓｃＦｖと比較する。
【０４７０】
変異体ｓｃＦｖの結合能力を、実施例に記載するアッセイを使用して決定できる。
【０４７１】
ある態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ変異ｓｃＦｖがＣＡＲ構築物の安定性改善を与えるように、ヒト化過程に起因する少なくとも一つの変異を含む。他の態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＣＡＲ構築物の安定性改善を与えるように、ヒト化過程に起因する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０変異を含む。
【０４７２】
タンパク質安定性を評価する方法
抗原結合ドメインの安定性は、例えば、下記の方法を使用して、評価し得る。このような方法は、最小安定ドメインが最初に変性するまたは協調的に変性する多ドメイン単位(例えば、単一変性遷移を示す多ドメインタンパク質)の全体的安定性閾値を制限する、複数熱的変性遷移の決定を可能にする。最小安定ドメインを、多数のさらなる方法で同定できる。変異誘発を、どのドメインが全体的安定性を制限するか探索するために実施できる。さらに、多ドメインタンパク質のプロテアーゼ抵抗性を、最小安定ドメインが本質的に変性することが知られる条件下、ＤＳＣまたは他のスペクトル方法により実施できる(Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692)。最小安定ドメインが同定されたら、このドメインをコードする配列(またはその部分)を、本方法における試験配列として用い得る。
【０４７３】
ａ)熱安定性
組成物の熱安定性を、当分野で知られる、多数の非限定的生物物理学的または生化学的技術を使用して分析し得る。ある態様において、熱安定性を、分析的スペクトロスコピーにより評価する。
【０４７４】
分析的スペクトロスコピー法の例は示差走査熱量測定(ＤＳＣ)である。ＤＳＣは、大部分のタンパク質またはタンパク質ドメインの変性に付随する熱熱吸収性に感受性である熱量計を用いる(例えばSanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988参照)。タンパク質の熱安定性を決定するために、タンパク質サンプルを熱量計に入れ、ＦａｂまたはｓｃＦｖが変性するまで温度を上げる。タンパク質が変性する温度が、全体的タンパク質安定性の指標である。
【０４７５】
分析的スペクトロスコピー法の他の例は、円二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーである。ＣＤスペクトロメトリーは、組成物の光学活性を温度上昇の関数として測定する。円二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーは、構造的不斉に起因する左手側偏光対右手側偏光の吸収の差異を測定する。障害されたまたは変性した構造は、規則正しいまたは折りたたまれた構造と極めて異なるＣＤスペクトルをもたらす。ＣＤスペクトルは、温度上昇の変性効果に対するタンパク質の感受性を反映し、それゆえに、タンパク質熱安定性の指標である(van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000参照)。
【０４７６】
熱安定性を測定するための分析的スペクトロスコピー法の他の例は、蛍光発光スペクトロスコピーである(van Mierlo and Steemsma, supra参照)。熱安定性を測定するための分析的スペクトロスコピー法のさらに他の例は、核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーである(例えば、van Mierlo and Steemsma, supra参照)。
【０４７７】
組成物の熱安定性は、生化学的に測定できる。熱安定性を評価するための生化学的方法の例は、熱負荷アッセイである。“熱負荷アッセイ”において、組成物を、設定した一定期間、一定範囲の高温に付す。例えば、ある態様において、試験ｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖ分子を含む分子を、例えば、１〜１.５時間、一定範囲の温度上昇に付す。その後、タンパク質の活性を、関連する生化学的アッセイによりアッセイする。例えば、タンパク質が結合タンパク質(例えばｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ含有ポリペプチド)であるならば、結合タンパク質の結合活性を、機能的または定量的ＥＬＩＳＡにより決定できる。
【０４７８】
このようなアッセイは、例えば、大腸菌およびハイスループットスクリーニングを使用するハイスループット形式で行い得る。ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖバリアントのライブラリーを、当分野で知られる方法を使用して作り得る。ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ発現を誘発でき、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを熱負荷に付し得る。負荷試験サンプルを結合についてアッセイでき、安定である、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖをスケールアップし、さらに特徴付けしてよい。
【０４７９】
熱安定性を、上記技術のいずれかを使用して、組成物の融解温度(Ｔｍ)を測定することにより評価する(例えば分析的スペクトロスコピー技術)。融解温度は、組成物の分子の５０％が折りたたまれた状態である、温度遷移曲線の中点の温度である(例えば、Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692参照)。ある態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある態様において、ＩｇＧのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある態様において、多価抗体のＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。
【０４８０】
熱安定性はまた、分析的熱量測定技術(例えばＤＳＣ)を使用して組成物の比熱または熱容量(Ｃｐ)を測定することによっても評価する。組成物の比熱は、１molの水の温度を１℃上げるのに必要なエネルギー(例えばkcal／molで)である。大きなＣｐは、変性または不活性タンパク質組成物の特徴である。組成物の熱容量(ΔＣｐ)の変化を、温度遷移前後の組成物の比熱の決定により測定する。熱安定性は、変性のギブズ自由エネルギー(ΔＧ)、変性のエンタルピー(ΔＨ)または変性のエントロピー(ΔＳ)を含む、熱力学的安定性の他のパラメータの測定または決定によっても評価し得る。上記生化学的アッセイ(例えば熱負荷アッセイ)の１以上を使用して、組成物の５０％がその活性(例えば結合活性)を保持する温度(すなわちＴＣ値)を決定する。
【０４８１】
加えて、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖへの変異は、非変異のここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖと比較して、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性を変える。ここに記載するようなヒト化抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖがＣＡＲＴ１９構築物に取り込まれたとき、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ヒト化ｓｃＦｖは、本発明の抗ＣＡＲ全体に熱安定性を与える。ある態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖに熱安定性を与える単一変異を含む。他の態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖに熱安定性を与える複数変異を含む。ある態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖにおける複数変異は、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性に相加効果を有する。
【０４８２】
ｂ)凝集％
組成物の安定性は、その凝集傾向の測定により決定できる。凝集は、多数の非限定的生化学的または生物物理学的技術により測定できる。例えば、組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を使用して評価し得る。ＳＥＣは、サイズに基づき分子を分ける。カラムを、イオンおよび小分子を内側に入れるが、大きいものは入れないポリマーゲルの半固体ビーズで満たす。タンパク質組成物をカラムの上部に適用したとき、小型の折りたたまれたタンパク質(すなわち非凝集タンパク質)は、大タンパク質凝集が利用可能であるより大量の溶媒に分散される。その結果、大きな凝集体はカラムをより速く移動し、この方法で混合物をその要素に分離または分画できる。各フラクションは、ゲルから溶出するに連れて別々に定量できる(例えば、光散乱による)。よって、組成物の凝集％を、フラクションの濃度と、ゲルに適用したタンパク質の総濃度の比較により決定できる。安定組成物は、本質的に単一フラクションとしてカラムから溶出し、溶出プロファイルまたはクロマトグラムにおいて本質的に単一ピークとして見える。
【０４８３】
ｃ)結合親和性
組成物の安定性を、その標的結合親和性の決定により評価できる。決定結合親和性のための広範な方法が当分野で知られる。結合親和性を決定するための方法の例は、表面プラズモン共鳴を用いる。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)を使用する、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変更の検出により実時間生体分子特異的相互作用の分析を可能にする、光学的現象である。さらなる記載については、U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; およびJohnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277を参照のこと。
【０４８４】
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ここに記載する抗原結合ドメインアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、ここに記載する抗体フラグメントの、ここに記載するような抗癌関連抗原の所望の機能的特性を維持する。ある特定の面において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、その抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
【０４８５】
種々の面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域(例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域の、１以上のアミノ酸の修飾により操作される。ある特定の面において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、その抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
【０４８６】
本発明の抗体または抗体フラグメントが、アミノ酸配列が(例えば、野生型から)違うようにさらに修飾されてよいが、所望の活性は修飾されないことは、当業者には理解される。例えば、“非必須”アミノ酸残基でのアミノ酸置換を生じるさらなるヌクレオチド置換を、タンパク質に行ってよい。例えば、分子における非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えてよい。他の態様において、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順番および／または組成が異なる構造的に類似する一連のもので置き換えることができ、例えば、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられた保存的置換をなし得る。
【０４８７】
塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む、類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。
【０４８８】
２以上の核酸またはポリペプチド配列の状況における同一性パーセントは、同じである、２以上の配列をいう。２配列は、次の配列比較アルゴリズムの一つを使用してまたは手動アラインメントおよび目視により、比較窓または指定領域にわたり、最大対応を比較およびアラインしたとき、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定パーセント有するならば、“実質的に同一”である(特定領域、または、特定されていないとき、配列全体にわたり、例えば、６０％同一性、場合により７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性)。場合により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長の領域またはより好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)長の領域にわたり、同一性が存在する。
【０４８９】
配列比較のために、一般に１配列が対照配列として働き、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および対照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用でき、または代替パラメータを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、対照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のために配列をアラインメントする方法は、当分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444のサーチのための類似法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動アラインメントおよび目視(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)により実施できる。
【０４９０】
配列同一性および配列類似性パーセントの決定に適するアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２.０アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。
【０４９１】
２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ２およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮEプログラム(バージョン２.０)に取り込まれている、Meyers and W. Miller( (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)アルゴリズムを使用しても決定できる。加えて、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用する、ＧＣＧソフトウエアパッケージ(www.gcg.comで利用可能)のＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)アルゴリズムを使用して決定できる。
【０４９２】
ある面において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する、出発抗体またはフラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)アミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、ＣＡＲを構成する、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬは、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の少なくとも約７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾できる。本発明は、機能的に等価な分子を産生するための、ＣＡＲ構築物全体の修飾、例えば、ＣＡＲ構築物における種々のドメインの１以上のアミノ酸配列における修飾を企図する。ＣＡＲ構築物は、出発ＣＡＲ構築物の少なくとも約７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾され得る。
【０４９３】
二特異性ＣＡＲ
ある態様において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第一および第二エピトープは同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)である。ある態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある態様において、第一および第二エピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列ならびに第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
【０４９４】
ある態様において、抗体分子は、多特異性(例えば、二特異性または三特異性)抗体分子である。二特異性またはヘテロ二量体抗体分子を産生するためのプロトコールは当分野で知られる；例えば、ＵＳ５７３１１６８号に記載の、“ノブ・イン・ア・ホール”アプローチ；例えば、ＷＯ０９／０８９００４号、ＷＯ０６／１０６９０５号およびＷＯ２０１０／１２９３０４号に記載のような静電的ステアリングＦｃ対形成；例えば、ＷＯ０７／１１０２０５号に記載のような鎖交換操作ドメイン(ＳＥＥＤ)ヘテロ二量体形成；例えば、ＷＯ０８／１１９３５３号、ＷＯ２０１１／１３１７４６号およびＷＯ２０１３／０６０８６７号に記載のようなＦａｂアーム交換；例えば、ＵＳ４４３３０５９号に記載のような、例えば、アミン反応性基とスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二特異性構造を製造するための、抗体架橋結合による、二重抗体コンジュゲート；例えば、ＵＳ４４４４８７８号に記載のような、２重鎖間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを経る異なる抗体からの半抗体(重−軽鎖対またはＦａｂ)の組み換えにより産生する二特異性抗体決定基；例えば、ＵＳ５２７３７４３号に記載のような、３機能性抗体、スルフヒドリル反応性基により架橋された３Ｆａｂ’フラグメント；例えば、ＵＳ５５３４２５４号に記載のような、生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ末端テイル、好ましくはジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋結合により架橋されたｓｃＦｖの対；例えば、ＵＳ５５８２９９６号に記載のような、二機能性抗体、例えば、置換された定常ドメインを有する、ロイシンジッパー(例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ)により二量体化された異なる結合特性を有するＦａｂフラグメント；例えば、ＵＳ５５９１８２８号に記載のような、二特異性およびオリゴ特異性一価およびオリゴ価受容体、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と他方の一般に軽鎖を伴う抗体のＶＨ領域の間のポリペプチドスペーサーを経て連結した２抗体(２Ｆａｂフラグメント)のＶＨ−ＣＨ１領域；例えば、ＵＳ５６３５６０２号に記載のような、二特異性ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、二本鎖切片のＤＮＡを経た抗体またはＦａｂフラグメントの架橋；例えば、ＵＳ５６３７４８１号に記載のような、二特異性融合タンパク質、例えば、親水性らせん状ペプチドリンカーを間に含み、完全定常領域を含む、２ｓｃＦｖを含む発現構築物；例えば、ＵＳ５８３７２４２号に記載のような、多価および多特異性結合タンパク質、例えば、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第一ドメインおよびＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第二ドメインを有し、一般に二重特異性抗体(二特異性、三特異性、四特異性の分子を作るための高次構造も包含される)と呼ばれるポリペプチドの二量体；例えば、ＵＳ５８３７８２１号に記載のような、二特異性／多価分子を形成するように二量体できる、ペプチドスペーサーでさらに抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域に結合した、連結ＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有するミニボディ構築物；二特異性二重特異性抗体を形成するように二量体を形成できる、いずれかの配向で短ペプチドリンカー(例えば、５または１０アミノ酸)またはによりまたはリンカー無し���連結されたＶＨおよびＶＬドメイン；例えば、ＵＳ５８４４０９４号に記載のような、三量体および四量体；例えば、ＵＳ５８６４０１９号に記載のような、一連のＦＶ(またはｓｃＦｖ)を形成するようにさらにＶＬドメインと結合した、Ｃ末端で架橋可能基とのペプチド結合により連結した一連のＶＨドメイン(またはファミリーメンバーにおけるＶＬドメイン)；および、例えば、ＵＳ５８６９６２０号に記載のような、ｓｃＦＶまたは二重特異性抗体形態の両者を使用して、例えば、ホモ二価、ヘテロ二価、三価および四価構造を形成するように、非共有または化学架橋により多価構造に合わさっている、ペプチドリンカーにより連結してＶＨドメインおよびＶＬドメインの両者を有する一本鎖結合ポリペプチドを、例えば、含むが、これらに限定されない。多特異性および二特異性分子およびそれを製造するためのさらなる例は、例えば、ＵＳ５９１０５７３号、ＵＳ５９３２４４８号、ＵＳ５９５９０８３号、ＵＳ５９８９８３０号、ＵＳ６００５０７９号、ＵＳ６２３９２５９号、ＵＳ６２９４３５３号、ＵＳ６３３３３９６号、ＵＳ６４７６１９８号、ＵＳ６５１１６６３号、ＵＳ６６７０４５３号、ＵＳ６７４３８９６号、ＵＳ６８０９１８５号、ＵＳ６８３３４４１号、ＵＳ７１２９３３０号、ＵＳ７１８３０７６号、ＵＳ７５２１０５６号、ＵＳ７５２７７８７号、ＵＳ７５３４８６６号、ＵＳ７６１２１８１号、ＵＳ２００２００４５８７Ａ１号、ＵＳ２００２０７６４０６Ａ１号、ＵＳ２００２１０３３４５Ａ１号、ＵＳ２００３２０７３４６Ａ１号、ＵＳ２００３２１１０７８Ａ１号、ＵＳ２００４２１９６４３Ａ１号、ＵＳ２００４２２０３８８Ａ１号、ＵＳ２００４２４２８４７Ａ１号、ＵＳ２００５００３４０３Ａ１号、ＵＳ２００５００４３５２Ａ１号、ＵＳ２００５０６９５５２Ａ１号、ＵＳ２００５０７９１７０Ａ１号、ＵＳ２００５１００５４３Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０４９Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０５１Ａ１号、ＵＳ２００５１６３７８２Ａ１号、ＵＳ２００５２６６４２５Ａ１号、ＵＳ２００６０８３７４７Ａ１号、ＵＳ２００６１２０９６０Ａ１号、ＵＳ２００６２０４４９３Ａ１号、ＵＳ２００６２６３３６７Ａ１号、ＵＳ２００７００４９０９Ａ１号、ＵＳ２００７０８７３８１Ａ１号、ＵＳ２００７１２８１５０Ａ１号、ＵＳ２００７１４１０４９Ａ１号、ＵＳ２００７１５４９０１Ａ１号、ＵＳ２００７２７４９８５Ａ１号、ＵＳ２００８０５０３７０Ａ１号、ＵＳ２００８０６９８２０Ａ１号、ＵＳ２００８１５２６４５Ａ１号、ＵＳ２００８１７１８５５Ａ１号、ＵＳ２００８２４１８８４Ａ１号、ＵＳ２００８２５４５１２Ａ１号、ＵＳ２００８２６０７３８Ａ１号、ＵＳ２００９１３０１０６Ａ１号、ＵＳ２００９１４８９０５Ａ１号、ＵＳ２００９１５５２７５Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３５９Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３６０Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８５１Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８６７Ａ１号、ＵＳ２００９２３２８１１Ａ１号、ＵＳ２００９２３４１０５Ａ１号、ＵＳ２００９２６３３９２Ａ１号、ＵＳ２００９２７４６４９Ａ１号、ＥＰ３４６０８７Ａ２号、ＷＯ０００６６０５Ａ２号、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２号、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１号、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２号、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２号、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２号、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２号、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１号、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２号、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１号、ＷＯ９１０３４９３Ａ１号、ＷＯ９３２３５３７Ａ１号、ＷＯ９４０９１３１Ａ１号、ＷＯ９４１２６２５Ａ２号、ＷＯ９５０９９１７Ａ１号、ＷＯ９６３７６２１Ａ２号、ＷＯ９９６４４６０Ａ１号に見ることができる。上に引用した出願の内容は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０４９５】
二特異性抗体分子の各抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)内で、ＶＨは、ＶＬの上流でも下流でもよい。ある態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＬ(ＶＬ１)の上流のそのＶＨ(ＶＨ１)と共に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＬ(ＶＬ２)の上流のそのＶＨ(ＶＨ２)と共に配置され、その結果全体的二特異性抗体分子は、配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。他の態様において、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＨ(ＶＨ１)の上流のそのＶＬ(ＶＬ１)と共に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＨ(ＶＨ２)の上流のそのＶＬ(ＶＬ２)と共に配置され、その結果、全体的二特異性抗体分子は配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。場合により、リンカーは、２抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)の間、例えば、構築物がＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配列されるならば、ＶＬ１とＶＬ２の間または構築物がＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置されるならばＶＨ１とＶＨ２の間に配置される。リンカーは、ここに記載するリンカー、例えば、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)(配列番号２９)であってよい。一般に、２ｓｃＦｖ間のリンカーは、２ｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を避けるのに十分長くなければならない。場合により、リンカーは、第一ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。場合により、リンカーは、第二ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。複数リンカーを有する構築物において、リンカーの任意の２以上は同一でも異なってもよい。よって、ある態様において、二特異性ＣＡＲは、ここに記載するような配置で、ＶＬ、ＶＨおよび場合により１以上のリンカーを含む。
【０４９６】
ある面において、二特異性抗体分子は、第一免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、ｓｃＦｖにより特徴付けられ、これは、第一癌関連抗原に対する結合特性を有し、例えば、ここに記載のような、例えば、表３に記載のようなｓｃＦｖを含むかまたはここに記載するｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲを含み、そして、異なる抗原上に第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。ある面において、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＡＭＬ細胞上に発現された抗原に結合特異性を有する。例えば、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＣＤ１２３に対する結合特異性を有する。他の例として、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＣＤ３３に対する結合特異性を有する。他の例として、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＣＬＬ−１に対する結合特異性を有する。他の例として、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＣＤ３４に対する結合特異性を有する。他の例として、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＦＬＴ３に対する結合特異性を有する。例えば、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、葉酸受容体ベータに対する結合特異性を有する。ある面において、第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｂ細胞に発現される抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１に対する結合特異性を有する。
【０４９７】
キメラＴＣＲ
ある面において、ここに開示する抗体および抗体フラグメント(例えば、表３に開示のもの)をＴ細胞受容体(“ＴＣＲ”)鎖、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖の１以上の定常ドメインに移植して、癌関連抗原に特異的に結合するキメラＴＣＲを作ることができる。理論に縛られないが、キメラＴＣＲは、抗原結合によりＴＣＲ複合体を経てシグナル伝達すると考えられる。例えば、ここに記載するようなｓｃＦｖを、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の定常ドメイン、例えば、少なくとも細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの部分に移植できる。他の例として、抗体フラグメント、例えばここに記載するようなＶＬドメインを、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインに移植でき、抗体フラグメント、例えばここに記載するようなＶＨドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植できる(または代替的に、ＶＬドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植してよく、ＶＨドメインを、ＴＣＲアルファ鎖に移植してよい)。他の例として、抗体または抗体フラグメントのＣＤＲ、例えば、表３に記載の抗体または抗体フラグメントのＣＤＲを、ＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖に移植して、癌関連抗原に特異的に結合するキメラＴＣＲを作り得る。例えば、ここに開示するＬＣ  ＣＤＲをＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインに移植してよく、ここに開示するＨＣ  ＣＤＲをＴＣＲベータ鎖の可変ドメインに移植してよく、またはその逆も可能である。このようなキメラＴＣＲは、任意の適切な方法により産生し得る(例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74)。
【０４９８】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関係する１以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関係する１以上のアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)を含み得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの一つと関係するものであり、例えば、ある態様において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインまたはヒンジドメインが由来したのと同じタンパク質由来であり得る。他の面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインのいずれかが由来したのと同じタンパク質に由来しない。ある例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを避けるように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択またはアミノ酸置換による修飾ができる。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように修飾または置換され得る。
【０４９９】
膜貫通ドメインは、天然由来でも組み換え源由来でもよい。源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質由来であり得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃbp、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｃの少なくとも膜貫通領域を含み得る。
【０５００】
ある例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、ある態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ(例えば、ＩｇＧ４ヒンジおよびＩｇＤヒンジ)、ＧＳリンカー(例えば、ここに記載するＧＳリンカー)、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。ある面において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の膜貫通ドメインを含む(例えば、それからなる)。
【０５０１】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(配列番号６)のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(配列番号７)のヌクレオチド配列によりコードされたヒンジを含む。
【０５０２】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(配列番号８)のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(配列番号９)のヌクレオチド配列によりコードされたヒンジを含む。
【０５０３】
ある面において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、その場合、ロイシンおよびバリンのような疎水性残基を優勢に含む。ある面において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットを、組み換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
【０５０４】
場合により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の間に結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、ある面において、リンカーは、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列(配列番号１０)を含む。ある態様において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCのヌクレオチド配列(配列番号１１)によりコードされる。
【０５０５】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０５０６】
細胞質ドメイン
本発明のＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入される免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも一つの活性化を一般に担う。本発明のＣＡＲにおいて使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して働く共受容体の細胞質配列ならびにこれらのあらゆる誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有するあらゆる組み換え配列を含む。
【０５０７】
ＴＣＲ単独により産生されたシグナルはＴ細胞の完全活性化には不十分であり、二次および／または共刺激性シグナルも必要であることが知られる。それゆえに、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる：ＴＣＲ(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)を介して抗原依存性一次活性化を開始するものおよび二次または共刺激性シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)を提供するように抗原非依存的方法で作用するもの。
【０５０８】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性方向または阻害性方向のいずれかで制御する。刺激性方向で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０５０９】
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても知られる)、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄのものを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０５１０】
本発明で特に有用である一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む分子のさらなる例は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ３２のものを含む。
【０５１１】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して改変された(例えば、増加または減少した)活性を有する、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメイン修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【０５１２】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをそれ自体で含んでよく、またはそれを本発明のＣＡＲの状況において有用である任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分をいう。共刺激性分子は、リンパ球の抗原に対する効率的応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の拡張、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞残留性および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。このような共刺激性分子のさらなる例は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。
【０５１３】
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに無作為にまたは特定の順序で連結し得る。場合により、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間に結合を形成し得る。ある態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。ある態様において、単一アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
【０５１４】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、２以上、例えば、２、３、４、５または以上の共刺激性シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により分けられる。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある態様において、リンカー分子はアラニン残基である。
【０５１５】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１４のシグナル伝達ドメインである。ある面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８(変異体ＣＤ３ゼータ)または配列番号２０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のシグナル伝達ドメインである。
【０５１６】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(配列番号１６)のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(配列番号１７)の核酸配列によりコードされる。
【０５１７】
ある面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的(ここに記載するような癌関連抗原)または異なる標的(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５またはＩＧＬＬ１)に対する、例えば異なる抗原結合ドメインを含む、第二ＣＡＲを含むことができる。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、種々のＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものである。例えば、第一および第二ＣＡＲを発現する細胞は、第二ＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨＨである第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成しない、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとしての第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを有し得る。
【０５１８】
ある態様において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含み、相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当分野のまたは将来的な単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されない任意の種由来であり得る。この用語はまたラクダ科およびサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
【０５１９】
ある面において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清に見られる新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であるような、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ(“ＩｇＮＡＲ”)の可変領域由来の単一ドメイン分子を製造する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載されている。
【０５２０】
他の面によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に記載されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、ここでは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ由来であり得る。ラクダ科以外の他の種は天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、このようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
【０５２１】
ＳＤＡＢ分子は、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生され得る(例えば、ファージディスプレーにより選択)。
【０５２２】
受容体の抗原結合ドメイン間を相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの１以上がその同族抗原に結合することを阻止するため、望ましくない可能性があることも判明した。よって、ここに開示されるのは、このような相互作用を最小化する、抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。またここに開示されるのは、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸ならびにこのような細胞および核酸を製造および使用する方法である。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインの一方はｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。
【０５２３】
ある態様において、本発明は第一および第二ＣＡＲを含み、ここで、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【０５２４】
ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【０５２５】
ある態様において、細胞の表面上に存在するとき、該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第二ＣＡＲ存在下の該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＡＲ非存在下の該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【０５２６】
ある態様において、細胞の表面上に存在するとき、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なく互いに結合する。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく互いに結合する。
【０５２７】
他の面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む薬剤である。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの部分)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、例えば、ここに記載するような、例えば、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの部分)の第一ポリペプチドならびにここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ２０１３／０１９６１５号に記載のような、スイッチ共刺激性受容体を含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転できる。
【０５２８】
ある態様において、細胞外結合ドメインは、カウンターリガンドに特異的な細胞外ドメインである(例えば、細胞外ドメインはＰＤ１からであり、カウンターリガンドはＰＤ１−Ｌ１またはＰＤ１−Ｌ２である)。
【０５２９】
ある態様において、阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む薬剤は、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合できる(ここでは、ＰＤ１  ＣＡＲと称する)。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、ここに記載するＸＣＡＲと組み合わせて使用したとき、Ｔ細胞の残留性を改善する。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号２６に下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (配列番号26)
【０５３０】
ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、下記アミノ酸配列を含む(配列番号３９)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (配列番号39)
【０５３１】
ある態様において、薬剤は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲの核酸配列を下に示し、ＰＤ１  ＥＣＤは下記配列番号２７において下線を引く。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (配列番号27)
【０５３２】
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞の集団、例えば、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与と共に使用するためのＣＡＲ発現細胞を提供する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ここに記載するここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なるここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する、第一細胞で発現されるＣＡＲにおけるここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインと異なる、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含む。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、ここに記載するような、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および第ここに記載するような癌関連抗原以外の標的(例えば、ＣＤ１２３)に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
【０５３３】
他の面において、本発明は細胞の集団を提供し、ここで、集団内の少なくとも１細胞は、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞は他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、ＰＤ−１は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む薬剤である。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメントのような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む))。ある態様において、薬剤は、ＰＤ−１の第一ポリペプチドまたはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの部分)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
【０５３４】
ある面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞の集団、例えば、ＣＡＲＴ細胞、例えば、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を、他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。他の面において、本発明は、集団内の少なくとも１細胞がここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞が他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する細胞の集団を、他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
【０５３５】
ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)ＣＡＲ
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ分子はナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)の１以上の成分を含み、それによりＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ成分は、次のナチュラルキラー細胞受容体のいずれか由来の膜貫通ドメイン、ヒンジドメインまたは細胞質ドメインであり得る：キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞傷害性受容体(ＮＣＲ)、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭ)ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；およびＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用し得る。ＮＫＲ要素を含むＣＡＲ分子の配置および配列の例は国際公開ＷＯ２０１４／１４５２５２号に記載され、その内容を引用により本明細書に包含させる。
【０５３６】
キメラ抗原受容体を制御するための戦略
ＣＡＲ活性が制御され得る多くの方法がある。ある態様において、ＣＡＲ活性が制御できる制御可能ＣＡＲ(ＲＣＡＲ)は、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するために望ましい。例えば、例えば、二量体化ドメインに融合した、カスパーゼを使用するアポトーシスの誘導(例えば、Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を、本発明のＣＡＲ治療における安全スイッチとして使用できる。他の例において、ＣＡＲ発現細胞はまた誘導性カスパーゼ−９(ｉＣａｓｐａｓｅ−９)分子も発現でき、これは、二量体化因子薬物(例えば、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ(ＡＰ１９０３(Bellicum Pharmaceuticals)またはＡＰ２０１８７(Ariad)とも呼ばれる)の投与により、細胞のカスパーゼ−９活性化およびアポトーシスに至る。ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、二量体化(ＣＩＤ)結合ドメインの化学誘導因子を含み、これは、ＣＩＤ存在下で二量体化に介在する。これは、ＣＡＲ発現細胞の誘導的および選択的枯渇に至る。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと別の核酸分子によりコードされる。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと同じ核酸分子によりコードされる。ｉＣａｓｐａｓｅ−９は、ＣＡＲ発現細胞の何らかの毒性を避けるための安全スイッチを提供できる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963; およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83参照。
【０５３７】
本発明のＣＡＲ治療を制御するための代替的戦略は、例えば、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)の誘発により、例えば、ＣＡＲ発現細胞を消失させることにより、ＣＡＲ活性の脱活性化または遮断する小分子または抗体の利用を含む。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、細胞死、例えば、ＡＤＣＣまたは補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原も発現し得る。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた抗体または抗体フラグメントにより標的化され得る受容体も発現し得る。このような受容体の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン(例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν)、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２)、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲおよびその切断バージョン(例えば、１以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１以上の領域を欠くバージョン)を含む。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、シグナル伝達能力を欠くが、ＡＤＣＣを誘発できる分子、例えば、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))により認識されるエピトープを保持する切断型上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)も発現し、その結果、セツキシマブの投与がＡＤＣＣおよび続くＣＡＲ発現細胞の枯渇を誘発する(例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４号およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860参照)。他の戦略は、例えば、ＡＤＣＣによりＣＡＲ発現細胞の選択的枯渇をもたらす、リツキシマブに結合する、ここに記載するＣＡＲ発現細胞におけるＣＤ３２およびＣＤ２０抗原両者からの標的エピトープをあわせる、高度に小型のマーカー／自殺遺伝子の発現を含む(例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287参照)。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を枯渇させる他の方法は、例えば、ＡＤＣＣ誘発により、破壊するために、成熟リンパ球、例えば、ＣＡＲ発現細胞に選択的に結合し、標的とするモノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるキャンパス(登録商標)の投与を含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。ある態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。他の態様において、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体は、細胞致死を誘発する薬剤、例えば、トキシンに結合させ、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことが��きる。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。ある態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。他の態様において、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体は、細胞致死を誘発する薬剤、例えば、トキシンに結合させ、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。あるいは、ＣＡＲ分子自体、下記のように、活性が制御され得る、例えば、活性化または遮断され得るように配置できる。
【０５３８】
ある面において、ＲＣＡＲは、ここに記載する標準的ＣＡＲの要素、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、別々のポリペプチドまたはメンバーに配置された、一連の、一般に最も単純な態様において２つの、ポリペプチドを含む。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子存在下、互いにポリペプチドを結合できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、例えば、引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２０１４１２７２６１号に記載のような二量体化スイッチを利用する。このような制御可能ＣＡＲのさらなる記載および例示定期配置は、ここにおよび、引用により本明細書にその全体を包含させる国際公開ＷＯ２０１５／０９０２２９号に提供される。
【０５３９】
ある面において、ＲＣＡＲは、２ポリペプチドまたはメンバーを含む：１)例えば、ここに記載する一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む胞内シグナル伝達ドメイン、２)例えば、ここに記載するように、ＣＤ１９を標的とする、抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバー。場合により、ＲＣＡＲは、ここに記載する膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上または両者の上に配置できる。(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたは要素がここに記載されるものであるとき、順番は記載したとおりであり得るが、他の順番も同様に含まれる。換言すると、ある態様において、順番は本書に記載のとおりであるが、他の態様において、順番は異なり得る。例えば、膜貫通領域の一端の要素の順番は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの配置は異なって、例えば逆でよい)。
【０５４０】
ある態様において、第一および第二スイッチドメインは、細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同一であるホモ二量体化スイッチでも、例えば、第一および第二スイッチドメインが互いに異なるヘテロ二量体化スイッチでもよい。
【０５４１】
ある態様において、ＲＣＡＲは、“多スイッチ”を含み得る。多スイッチは、ヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。多スイッチは、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のスイッチドメインを、独立して、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバー上に含む。ある態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。ある態様において、第一メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。
【０５４２】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
【０５４３】
ある態様において、抗原結合メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２または３の、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む：４−１ＢＢ−ＣＤ２７；４−１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４−１ＢＢ；４−１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４−１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４−１ＢＢ；または４−１ＢＢ−ＣＤ２８。このような態様において、細胞内結合メンバーはＣＤ３ゼータドメインを含む。このような態様において、ＲＣＡＲは、(１)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび２共刺激ドメインおよび第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバー；および(２)膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインおよび少なくとも一つの一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０５４４】
ある態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞表面に繋留されていないＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、細胞を抗原結合メンバーをコードする配列で形質転換する必要なく、１以上の抗原結合ドメインと好都合に対合することを可能とする。このような態様において、ＲＣＡＲは１)第一スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインを含まず、場合により細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、ＲＣＡＲは、３)第二抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインにより結合されるのと異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメイン；および第二スイッチドメインを含む第二抗原結合メンバーをさらに含み得る。
【０５４５】
またここで提供されるのは、抗原結合メンバーが二特異性活性化およびターゲティング能を含む、ＲＣＡＲである。この態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２、３、４または５抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含んでよく、ここで、各原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原の同一または異なるエピトープに結合する。ある態様において、複数の抗原結合ドメインはタンデムであり、場合により、リンカーまたはヒンジ領域が抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカーおよびヒンジ領域は、ここに記載される。
【０５４６】
ある態様は、増殖のスイッチングが可能な配置を有するＲＣＡＲを提供する。この態様において、ＲＣＡＲは１)場合により、膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメイン；例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０およびスイッチドメインから選択される１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まないまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーｄは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある態様において、二量体化スイッチは細胞外である。
【０５４７】
ここに記載するＲＣＡＲ配置のいずれかにおいて、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するようなＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０５４８】
またここで提供されるのは、ここに記載するＲＣＡＲを含む細胞である。ＲＣＡＲを発現するように操作したあらゆる細胞を、ＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。
【０５４９】
またここで提供されるのは、ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸およびベクターである。ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、同じ核酸、例えば、ベクターに存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別々のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写産物(これは、単一翻訳産物の開裂または２つの別々のタンパク質産物の翻訳により２タンパク質の産生を生じ得る)の使用により、達成できる。ある態様において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。ある態様において、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。これらの態様において、(ｉ)および(ii)は、単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、は、(ｉ)および(ii)が別々のｍＲＮＡとして転写されるように、第一プロモーターは(ｉ)に操作可能に連結し、第二プロモーターは(ii)に操作可能に連結する。
【０５５０】
あるいは、ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列を、種々の核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列を第一核酸、例えば、第一ベクターに配置でき、(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、第二核酸、例えば、第二ベクターに存在できる。
【０５５１】
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは非共有でも共有でもよい。非共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有相互作用を促進する。共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有相互作用を促進する。
【０５５２】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制剤、ラパマイシンのための最初の細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合のために十分であるＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)
【０５５３】
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを使用できる。
【０５５４】
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は次のとおりである。
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (配列番号79)
【０５５５】
ある態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、配列番号７９の下線部分の存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含み、それは
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S  (配列番号80)
である。
【０５５６】
ＦＲＢのアミノ酸配列は次のとおりである。
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK  (配列番号81)
【０５５７】
ここで使用する用語“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号７９または８０のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第一スイッチドメイン；およびラパマイシンまたはラパログの存在下に、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＲＢフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号８１のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。ある態様において、ここに記載するＲＣＡＲは、配列番号７９(または配列番号８０)に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインおよび配列番号８１に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインを含む。
【０５５８】
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば、修飾ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよび二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の間の複合体形成が変えられた、例えば、増強された、修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。ある態様において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８から選択される、１以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を含み、ここで、野生型アミノ酸は、任意の他の天然に存在するアミノ酸への変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２はフェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)、例えば、配列番号８２またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)、例えば、配列番号８３に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｔ２０９８は、フェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)、例えば、配列番号８４に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２およびＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は任意のアミノ酸に変異され、Ｔ２０９８は任意のアミノ酸に変異され、例えば、配列番号８５である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号８６である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号８７である。
【０５５９】
【表１４】
2017528433.tif 000026
【０５６０】
他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供する手引きに従い、このようなスイッチおよび関連する二量体化分子は、当業者に明らかである。
【０５６１】
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は、二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドと、第二スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドの間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子存在下、ここに記載するシステムにおいて測定して、シグナル伝達は１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。
【０５６２】
ラパマイシンおよびラパマイシンアナログ(ラパログと呼ぶこともある)、例えば、ＲＡＤ００１は、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択できる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチで使用するのに適するさらなるラパマイシンアナログは、“組み合わせ治療”なる表題のサブセクションまたは“ｍＴＯＲ阻害剤”なる表題のサブセクションにさらに記載する。
【０５６３】
スプリットＣＡＲ
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、公報ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号により詳細に記載されている。簡潔には、スプリットＣＡＲ系は第一抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４−１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲも発現する。細胞が第一抗原に遭遇したとき、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、殺細胞活性が開始される。それゆえに、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原存在下でのみ完全活性化される。ある態様において、第一抗原結合ドメインはここに記載する癌関連抗原(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５またはＩＧＬＬ１)を認識する。
【０５６４】
ＲＮＡトランスフェクション
ここに開示されるのは、インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲを産生する方法である。本発明はまた、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与と共に使用するために、細胞に直接遺伝子導入できる、ＲＮＡ構築物をコードするＣＡＲも含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号３２)の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生するための、特異的に設計したプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含む。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞において効率的に翻訳され得る。ある面において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。
【０５６５】
ある面において、抗本発明のＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。ある面において、本発明の抗ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ  ＮＫの産生のために、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に導入する。
【０５６６】
ある態様において、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを、一過性トランスフェクションの形として細胞に導入できる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)産生鋳型を使用するインビトロ転写により産生される。任意の源からの目的のＤＮＡを、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型にＰＣＲにより直接変換できる。ＤＮＡの源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列またはＤＮＡのあらゆる他の適切な源であり得る。インビトロ転写のための望ましい鋳型は、本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲのための鋳型は、抗腫瘍抗体の単一鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン)；および例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、細胞質領域を含む。
【０５６７】
ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。ある態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)のいくぶんかまたは全てを含み得る。核酸はエクソンおよびイントロンを含み得る。ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは、天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。人工ＤＮＡ配列の例は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するようにライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。ライゲートされたＤＮＡの部分は、単一生物由来でも１を超える生物由来でもよい。
【０５６８】
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は、当分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。ここで使用する“実質的に相補的”は、プライマー配列の残基の大部分または全てが相補的であるまたは１以上の塩基が非相補的またはミスマッチである、ヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補的配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下で、ＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される(オープンリーディングフレーム)核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーは、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。ある態様において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコーディング領域を増幅するように設計する。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の上流であるＤＮＡ鋳型上にヌクレオチドに対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“上流”は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配に対する５位をいうためにここで使用する。“逆方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の下流である、二本鎖ＤＮＡ鋳型に対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“下流”は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配に対する３位をいうためにここで使用する。
【０５６９】
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼをここに開示する方法で使用できる。試薬およびポリメラーゼは、多数の業者から市販されている。
【０５７０】
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。ＲＮＡは、好ましくは５’および３’ＵＴＲを有する。ある態様において、５’ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加する５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域をアニールするＰＣＲのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない、異なる方法により変わり得る。この試みを使用して、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後、最適翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ＵＴＲ長を修飾できる。
【０５７１】
５’および３’ＵＴＲは、目的の核酸のための天然に存在する、内在性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列を、順方向および逆方向プライマーへのＵＴＲ配列の取り込みによりまたは鋳型の任意の他の修飾により付加できる。目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率の修飾のために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させることが知られる。それゆえに、３’ＵＴＲを、当分野で周知であるＵＴＲの特性に基づき、転写されたＲＮＡの安定性を増加するように選択および設計できる。
【０５７２】
ある態様において、５’ＵＴＲは、内在性核酸のＫｏｚａｋ配列を含み得る。あるいは、目的の核酸に対して内在性ではない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲにより付加するとき、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を、５’ＵＴＲ配列の付加により再設計できる。Ｋｏｚａｋ配列は、あるＲＮＡ転写物の翻訳効率を上げることはできるが、効率的翻訳を可能とするために全ＲＮＡで必要であるようには見えない。多くのｍＲＮＡについてのＫｏｚａｋ配列に対する必要性は、当分野で知られる。他の態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の態様において、種々のヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために、３’または５’ＵＴＲにおいて使用できる。
【０５７３】
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするために、転写のプロモーターは、転写する配列の上流のＤＮＡ鋳型に結合すべきである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列が順方向プライマーの５’末端に結合されたとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれる。ある好ましい態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するような、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列が当分野で知られる。
【０５７４】
好ましい態様において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳開始および細胞におけるｍＲＮＡの安定性を決定する、５’末端および３’ポリ(Ａ)テイルの両者にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡ上で、ＲＮＡポリメラーゼは真核細胞における発現に適しない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されても、真核トランスフェクションに有効ではない正常サイズのｍＲＮＡを生じる。
【０５７５】
直鎖状ＤＮＡ鋳型で、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは鋳型の最後の塩基を越えて転写物の３’末端を伸長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
【０５７６】
ＤＮＡ鋳型に伸びるポリＡ／Ｔの組込みの慣用法は分子クローニングである。しかしながらプラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミド不安定性を生じ得て、これが、なぜ細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型がしばしば欠失および他の異常で高度に汚染されているかの理由である。これによりクローニング工程が骨がおれ、時間かかかるだけでなく、しばしば信頼できないものとなる。これが、クローニングを伴わないポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の産生を可能にする方法が非常に望まれているかの理由である。
【０５７７】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００ＴテイルのようなポリＴテイルを含む逆方向プライマーを使用するＰＣＲ中(配列番号３５)(サイズは５０〜５０００Ｔであり得る(配列番号３６))またはＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組み換えを含むが、これらに限定されない任意の他の方法によりＰＣＲ後に産生できる。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡに安定性を提供し、その分解を減らす。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルは、１００〜５０００アデノシンである(配列番号３７)。
【０５７８】
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後さらに伸長できる。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルの１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドへの長さの延長(配列番号３８)は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加を生じる。さらに、３’末端への異なる化学基の付加は、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログは、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り込まれ得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性をさらに高め得る。
【０５７９】
５’キャップもＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい態様において、ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは当分野で知られ、ここに記載する技術を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
【０５８０】
ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進する、あらゆるイルス、染色体または人工設計配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような細胞透過性および生存能を促進する因子を含み得る、細胞電気穿孔法に適する任意の溶質を包含できる。
【０５８１】
ＲＮＡを、多数の異なる方法、例えば、商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に導入でき、これは、電気穿孔法(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクションまたは“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達系(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)を含むが、これらに限定されない。
【０５８２】
非ウイルス送達方法
ある面において、非ウイルス方法を使用して、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
【０５８３】
ある態様において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(転位因子とも呼ばれる)の使用を含む。ある態様において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入できるＤＮＡの断片、例えば、自己複製性であり、そのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片または長い核酸の外にスプライシングされ、ゲノムの他の場所に挿入されることができるＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆位反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む
【０５８４】
トランスポゾンを使用する核酸送達法の例は、Ｓｌｅｅｐｉng  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系(ＳＢＴＳ)およびｐｉｇｇｙＢａｃ(ＰＢ)トランスポゾン系を含む。例えば、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83(これらは全て引用により本明細書に包含させる)を参照のこと。
【０５８５】
ＳＢＴＳは２要素を含む：１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポサーゼ酵素の源。トランスポサーゼは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)から、宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡにトランスポゾンを転位できる。例えば、トランスポサーゼは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子含有)をプラスミドの外に切り出し、宿主細胞のゲノムに入れる。例えば、Aronovich et al. supra参照。
【０５８６】
トランスポゾンの例は、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、その全てを引用により本明細書に包含させるGrabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。トランスポサーゼの例は、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポサーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポサーゼまたはＳＢ１１トランスポサーゼを含む(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現できる、機能亢進トランスポサーゼ)。例えば、全て引用により本明細書に包含させるAronovich et al.; Kebriaei et al.; およびGrabundzija et al.参照。
【０５８７】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。ここに提供されるのは、例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾン系を使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法である。
【０５８８】
ここに記載する方法によって、ある態様において、ＳＢＴＳ要素を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドが細胞に送達される(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達の標準法、例えば、ここに記載する方法、例えば、電気穿孔法、トランスフェクションまたはリポフェクションにより送達される。ある態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の態様において、例えば、デュアルプラスミド系、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、２核酸の系が提供される。例えば、第一および第二核酸は、宿主細胞に共送達される。
【０５８９】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する、ＳＢＴＳおよび遺伝子編集の遺伝子挿入の組合せを使用して産生される。
【０５９０】
ある態様において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラミングおよび対照への細胞の直接点滴を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、患者集団に見合うために必要な十分量の産生が容易かつ比較的安価であること、保存中の安定性および免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。
【０５９１】
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまたここに記載する１以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を提供する。ある面において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。ある面において、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
【０５９２】
よって、ある面において、本発明はキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、ここに記載するような腫瘍マーカーと結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジにより膜貫通ドメインに結合する。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃbp、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、共刺激ドメインは４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様に��いて、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４の配列または配列番号１６またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号１８の配列または配列番号２０またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。
【０５９３】
他の面において、本発明は、配列番号２のリーダー配列、ここに記載するようなｓｃＦｖドメイン、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０のヒンジ領域(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)、配列番号１２の配列を有する膜貫通ドメイン(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)、配列番号１４の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号１６の配列を有するＣＤ２７共刺激ドメイン(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)および配列番号１８または配列番号２０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を含む、ＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子に関する。
【０５９４】
他の面において、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激性ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子をコードする核酸分子に関し、ここで、該抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択される腫瘍マーカーに結合する。
【０５９５】
ある態様において、コードされたＣＡＲ分子さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。このような共刺激性分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６およびＰＡＧ／Ｃbpを含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１４の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭ��(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃbpの少なくとも膜貫通領域を含み得る。
【０５９６】
ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号１４の配列および配列番号１８の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおよび単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合される。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号４を含む。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号６または配列番号８または配列番号１０を含む。
【０５９７】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用して、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニングにより、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子を誘導化することによりまたはそれを含むことが知られる細胞および組織から直接単離することによるような、組み換え当分野で知られる方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローン化ではなく、合成により産生できる。
【０５９８】
本発明はまた本発明のＤＮＡが挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込みおよび娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスのようなオンコ−レトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点を有する。さらに低免疫原性であるという付加的利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターでもあり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上の(例えば、２)末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのようなウイルス構造的遺伝子を欠き得る。ガンマレトロウイルスベクターの例は、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびそれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載される。
【０５９９】
他の態様において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンを使用して達成できる。引用により本明細書に包含する、下記June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。
【０６００】
概説すると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般に、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその一部をプロモーターに操作可能に連結させ、当該構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
【０６０１】
本発明の発現構築物はまた、標準遺伝子送達プロトコールを使用する、核酸免疫化および遺伝子治療にも使用し得る。遺伝子送達のための方法が当分野で知られる。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる、米国特許５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号参照。他の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０６０２】
核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
【０６０３】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4,  Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
【０６０４】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。次いで、組み換えウイルスが単離され、対象の細胞にインビボまたはエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。ある態様において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。ある態様において、レンチウイルスベクターを使用する。プロモーターの例は、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ある態様において、プロモーターは、ＰＧＫプロモーター、例えば、ここに記載するような切断ＰＧＫプロモーターである。
【０６０５】
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは、開始部位の上流３０〜１１０bpの領域に位置するが、多数のプロモーターが、同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間のスペースはしばしば柔軟性であり、それゆえに、要素が互いに逆になったり移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が落ち始める前、５０bp離れるまで増加し得る。プロモーターによって、個々の要素は、転写を活性化するために協調的または独立的に機能できるように見える。
【０６０６】
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ導入遺伝子の発現ができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う、伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からＣＡＲ発現を駆動するのに有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009)参照。ある面において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１として提供する配列を含む。
【０６０７】
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる、強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターのような、しかしこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部であるとして意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるときに発現を活性化し、発現が望まれないときに発現を遮断することができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０６０８】
プロモーターの他の例は、ホスホグリセラートキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターである。ある態様において、切断ＰＧＫプロモーター(例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較したとき、１以上の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００または４００ヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター)が望ましいことがある。ＰＧＫプロモーター例のヌクレオチド配列を下に提供する。
【０６０９】
ＷＴ  ＰＧＫプロモーター
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT (配列番号96)
【０６１０】
切断ＰＧＫプロモーター例：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG (配列番号97)
【０６１１】
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG (配列番号98)
【０６１２】
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG (配列番号99)
【０６１３】
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG (配列番号100)
【０６１４】
ベクターは、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子から)、エピソーム複製および原核生物における複製を可能にする要素(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)も含み得る。
【０６１５】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクター遺伝子導入またはウイルスベクターによる感染が探求される細胞の集団から発現細胞から発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含んでよい。他の面において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別の断面に担持され、共トランスフェクション法において使用される。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現が可能であるように、適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの、抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０６１６】
レポーター遺伝子は、恐らく遺伝子導入されている細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在または発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間後にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術により製造できまたは商業的に入手できる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用し得る。
【０６１７】
ある態様において、ベクターは、２以上の核酸ＣＡＲをコードする配列、例えば、ここに記載する第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲまたは第二抗原、例えば、ここに記載する他の癌関連抗原に特異的に結合するＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５またはＩＧＬＬ１)を含み得る。このような態様において、ＣＡＲをコードする２以上の核酸配列は、同じフレーム内の単一核分子により、かつ単一ポリペプチド鎖としてコードされる。この面において、２以上のＣＡＲは、例えば、１以上のペプチド開裂部位により分離され得る。(例えば、自己開裂部位細胞内プロテアーゼのためのまたは基質)。ペプチド開裂部位の例は次のものを含み、ここで、ＧＳＧ残基は任意である。
Ｔ２Ａ：(GSG)EGRGSLLTCGDVEENPGP(配列番号１０１)
Ｐ２Ａ：(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号１０２)
Ｅ２Ａ：(GSG)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(配列番号１０３)
Ｆ２Ａ：(GSG)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(配列番号１０４)
【０６１８】
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターの状況において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に、当分野の任意の方法により容易に導入できる。例えば、例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段により、宿主細胞に移入される。
【０６１９】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照)。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０６２０】
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
【０６２１】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散体系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達のような、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
【０６２２】
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の面において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含または複合体化または他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとしてまたは“崩壊”構造を有して存在し得る。それらはまた単に溶液に分散され、恐らく、サイズまたは形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群およびその誘導体を含む。
【０６２３】
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ；コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入された脂質二重層または凝集体の産生により形成される多様な単および多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられる。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるかまたは単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン−核酸複合体もまた考慮される。
【０６２４】
外来性核酸を宿主細胞に導入するまたはそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ、薬剤の同定に使用するための、例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡｓおよびウェスタンブロット)により、特定のペプチドの存在または不在を検出するような“生化学的”アッセイまたは本発明の範囲内に入るここに記載するアッセイを含む。
【０６２５】
本発明は、さらにＣＡＲコード化核酸分子を含むベクターを提供する。ある面において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入できる。ある面において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、１以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重分染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されない、ベクターである。ある面において、ベクターは、哺乳動物免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)におけるＣＡＲ構築物の発現が可能である。ある面において、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。ある面において、哺乳動物ＮＫ細胞はヒトＮＫ細胞である。
【０６２６】
細胞の供給源
増殖および遺伝的修飾または他の修飾の前に、細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の供給源を、対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が惹起できる生存生物(例えば、哺乳動物)を含むことを意図する。対象の例は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
【０６２７】
本開示のある面において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＦｉｃｏｌｌTM分離のような、当業者に知られるあらゆる技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。ある好ましい面において、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、一般にＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含む、リンパ球、赤血球および血小板を含む。ある面において、アフェレーシスにより採取した細胞は血漿画分を除去するために洗浄し、場合により、細胞を続くプロセシング過程のために適切な緩衝液または媒体に入れることができる。ある態様において、細胞を、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよく、または全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。
【０６２８】
カルシウム非存在下の初期活性化過程は、活性化の増強に至り得る。当業者には容易に認識されるように、洗浄工程は、製造業者の指示に従う、半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａまたは他の緩衝剤を含むまたは含まない食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
【０６２９】
本出願の方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、既知培養培地条件および組成物、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に記載のものを用いることができることは認識される。
【０６３０】
ある面において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬTM勾配による遠心分離または対向流遠心溶出法により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
【０６３１】
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、陰性選択技術を使用する、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋  枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えば、Ｔ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
【０６３２】
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去する。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドを、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートするかまたは他に基質、例えば、ビーズ上に被覆させる。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを、ここに記載の基質にコンジュゲートさせる。
【０６３３】
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、ＭｉｌｔｅｎｙｉＴＭからのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。ある態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。ある態様において、例えば、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇のために、５億細胞／mlを使用する。さらなる面において、６億、７億、８億または９億細胞／mlの細胞濃度を使用する。
【０６３４】
ある態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含む。他の面において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０(およびその間の任意の整数値)ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含む。ある態様において、得られたＴ制御性枯渇細胞集団は、２×１０９  Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞またはそれ以下(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７またはそれ以下のＣＤ２５＋細胞)を含む。
【０６３５】
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、例えば、チュービング１６２−０１のような、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。ある態様において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を、例えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２.１のような、枯渇設定において動かす。
【０６３６】
特定の理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象の再発リスクを減らし得る。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇する方法は当分野で知られる。例えば、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(抗ＧＩＴＲここに記載する抗体)、ＣＤ２５枯渇およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０６３７】
ある態様において、製造法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させ、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
【０６３８】
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞採取前にＴＲＥＧ細胞を減らす１以上の治療で前処置されており、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再び必要とするリスクを軽減する。ある態様において、ある態様において、ＴＲＥＧ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中または注入後に行い得る。
【０６３９】
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。
【０６４０】
ある態様において、除去すべき細胞の集団は、制御性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある態様において、このような細胞は、制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順番で除去することが意図される。
【０６４１】
ここに記載する方法は、１を超える選択工程、例えば、１を超える枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを経る細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
【０６４２】
ここに記載する方法は、さらに腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団からの除去を含み、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを同じ基質、例えば、ビーズに結合でき、これを、細胞の除去に使用でき、または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番で生じてもよい。
【０６４３】
チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。代表的チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用でき、または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれ順序の順番で生じてもよい。
【０６４４】
ここに記載する方法は、陽性選択工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(登録商標)Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)結合ビーズと、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間インキュベーションすることにより単離できる。ある態様において、時間は約３０分である。さらなる態様において、時間は３０分〜３６時間またはそれより長い範囲およびその間の任意の整数値である。さらなる態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の態様において、時間は１０〜２４時間、例えば、２４時間である。腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。それゆえに、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を短くするまたは長くするおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比を増加または減少させる(さらにここに記載するとおり)ことにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択される。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択される。
【０６４５】
ある態様において、Ｔ細胞ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載する方法により決定できる。
【０６４６】
陽性または陰性選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある面において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を顕著に低下させる(例えば、細胞濃度を増加させる)ことが望まれ得る。例えば、ある面において、１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／mlまたは５０億／mlの濃度を使用する。ある面において、１０億細胞／mlの濃度を使用する。さらなる面において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。
【０６４７】
高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のまたは多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病性血液、腫瘍組織など)からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有しており、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０６４８】
関連する面において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋  Ｔ細胞より効率的に捕獲される。ある面において、使用する細胞の濃度は５×１０６／mlである。他の面において、使用する濃度は約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびその間の任意の整数値であり得る。
【０６４９】
他の面において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温でローテータでインキュベートし得る。
【０６５０】
刺激のためのＴ細胞はまた洗浄工程後凍結させ得る。理論に縛られることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球およびある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況において有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳまたは１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で−８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する制御凍結の他の方法ならびに直ぐに−２０℃または液体窒素の非制御凍結も使用できる。。
【０６５１】
ある面において、凍結保存細胞をここに記載するように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化の前に室温で１時間休息させる。
【０６５２】
本発明の文脈においてまた企図されるのは、ここに記載する増殖させた細胞が必要である時の前の時点での、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシス産物の採取である。したがって、増殖する細胞の供給源を、必要な任意の時点で採取でき、Ｔ細胞のような所望の細胞を、ここに記載するような免疫エフェクター細胞治療により利益を得るあらゆる疾患または状態のための免疫エフェクター細胞治療へのその後の使用のために単離および凍結できる。ある面において、血液サンプルまたはアフェレーシスを、一般に健常対象から採取する。ある面において、血液サンプルまたはアフェレーシスを、一般に、疾患を発症するリスクにあるが、まだ疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離および凍結する。ある面において、Ｔ細胞を、その後の時点で増殖、凍結および使用し得る。ある面において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患の診断の直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。さらなる面において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような他の免疫除去剤のような、手段での処置を含むが、これらに限定されないあらゆる関連する処置モダリティーの前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離する。
【０６５３】
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置の後、患者から直接得る。ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が通常該処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であるまたは改善されていることが観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ増殖増強について好ましい状態であり得るボ。それゆえに、本発明の状況において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、ある面において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化)およびコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増殖に好都合である条件を、特に、治療後の定められた時間枠中に、対象に形成できる。細胞型の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
【０６５４】
ある態様において、免疫エフェクターＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得る。ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ細胞を、対象または対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後または十分な用量の後に、採取する。
【０６５５】
他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増やすまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増やす量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。
【０６５６】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ  ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないかまたはＤＧＫ活性が低下したまたは阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減または阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処置により産生できる。
【０６５７】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロス  ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないかまたはイカロス活性が低下したまたは阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減または阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処置により産生できる。
【０６５８】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現せずまたはＤＧＫおよびイカロス活性が低下または阻害されている。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、ここに記載する方法のいずれかにより産生できる。
【０６５９】
ある態様において、ＮＫ細胞を対象から得る。他の態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Conkwest)である。
【０６６０】
ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、対象に低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤投与後に対象から得るまたは採取する。
【０６６１】
ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター、例えば、Ｔ細胞数増加後またはＰＤ１陰性免疫エフェクター、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター、例えば、Ｔ細胞比増加が生じた後に、回収する。
【０６６２】
ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ナイーブＴ細胞の数の増加が生じた後に回収する。
【０６６３】
ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、次の１以上が生じた後に回収する。
１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２。
【０６６４】
増加または減少は一過性であり得る。増加または減少は、標準、例えば、未処置対象との比較であり得る。
【０６６５】
ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤と、エクスビボで接触させる(対象またはドナーから除去した後かつ対象への導入前)。
【０６６６】
ある態様において、接触は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター、例えば、Ｔ細胞数増加またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター、例えば、Ｔ細胞比増加がもたらされるレベルである。
【０６６７】
ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ナイーブＴ細胞の数の増加をもたらすレベルで、エクスビボ(対象またはドナーから除去した後かつ対象への導入前)でｍＴＯＲ阻害剤と接触させる。
【０６６８】
ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、次の１以上をもたらすレベルで、エクスビボ(対象またはドナーから除去した後かつ対象への導入前)でｍＴＯＲ阻害剤と接触させる。
１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２。
【０６６９】
増加または減少は一過性であり得る。増加または減少は、標準、例えば、未処置対象との比較であり得る。
【０６７０】
ある態様において、Ｔ細胞の製造を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター、例えば、Ｔ細胞数増加またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター、例えば、Ｔ細胞比増加のレベルについて評価する。
【０６７１】
ある態様において、Ｔ細胞の製造を、ナイーブＴ細胞数増加のレベルについて評価する。ある態様において、Ｔ細胞の製造を、次の１以上について評価する。
１以上の次のマーカーの発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体の、ＫＬＲＧ１の発現減少；または
次の特徴のいずれか一つまたは組み合わせを有する記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、細胞の数の増加：増加したＣＤ６２Ｌ高、増加したＣＤ１２７高、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１および増加したＢＣＬ２。
【０６７２】
増加または減少は一過性であり得る。増加または減少は、標準、例えば、未処置対象との比較であり得る。
【０６７３】
同種異系ＣＡＲ
ここに記載するある態様において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞である。
【０６７４】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように操作され(例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロンおよび／またはＴＣＲゼータの発現がない(または発現の減少を示す)ように操作される)またはその表面に微少の機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異したまたは切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現する。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが、宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
【０６７５】
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１および／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように操作され得る。ある態様において、ＨＬＡの下方制御は、ベータ−２ミクログロブリン(Ｂ２Ｍ)の発現の減少または排除を伴い得る。
【０６７６】
ある態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠き得る。
【０６７７】
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、任意の適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
【０６７８】
ある態様において、同種細胞は、阻害分子を発現しないまたは阻害分子を低レベルで発現する細胞、例えば、ここに記載するいずれかの方法により操作された細胞である。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下できる、阻害分子を発現しないまたは阻害分子を低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害はＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載する、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用できる。
【０６７９】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して、阻害できる。
【０６８０】
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような、任意の慣用の発現系を使用して達成できる。
【０６８１】
ＴＣＲの要素の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開２０１２／０３２１６６７号に開示されている。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開ＵＳ２００７／００３６７７３号に開示されている。
【０６８２】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、一連の群生性等間隔短回文反復配列またはこのような一連の反復を含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、ＴＣＲおよび／またはＨＬ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の発現抑制または変異に使用できる、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系をいう。
【０６８３】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％に見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172。この系は、プラスミドおよびファージのような外来遺伝的要素に対する抵抗性を付与する１種の原核生物免疫系であり、後天性免疫の形態を提供する。Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845。
【０６８４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子エディティング(特定の遺伝子のサイレンシング、増強または変更)に使用するために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8。これは、真核細胞に、特別に設計したＣＲＩＳＰＲおよび１以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
【０６８５】
ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常細菌に対して外来であるプラスミドまたはファージ配列のような配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーはＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
【０６８６】
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質を、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外来性遺伝的要素に対して発現抑制するように導く。Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7。スペーサーは、それゆえに、ｓｉＲＮＡに類似して、ＲＮＡ分子の鋳型として働く。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
【０６８７】
多くの異なるタイプの細菌で自然に生じるように、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置および構造、Ｃａｓ遺伝子の機能および数およびそれらの産物は種毎にいくぶん異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; and Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は、機能的複合体、Ｃａｓｃａｄｅを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅが保持するスペーサー−反復単位に加工する。Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写物を加工する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２を必要としない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、開裂する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系は、二重らせんの各鎖のための２活性切断部位を有するヌクレアーゼであるタンパク質Ｃａｓ９を頼る。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせを、遺伝子エディティングのための系に使用できる。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
【０６８８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を編集でき(塩基対の付加または欠失)または未成熟終止を導入でき、これは、そうしてＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させる。あるいはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、ＲＮＡ干渉のように使用し、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を可逆性形式でオフにできる。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＴＣＲおよび／またはＨＬＡプロモーターに導くことができ、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断する。
【０６８９】
当分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339: 819-823に記載のものを使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を産生できる。例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許８,８７１,４４５号；８,８６５,４０６号；８,７９５,９６５号；８,７７１,９４５号；および８,６９７,３５９号に記載されるもののような、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する当分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も産生できる。
【０６９０】
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
【０６９１】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ開裂ドメインを融合することにより人工的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子の部分を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作できる。操作されたＴＡＬＥとＤＮＡ開裂ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な、制限酵素を産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、そこで、それらはゲノムエディティングのために使用され得る。Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6;およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501。
【０６９２】
ＴＡＬＥは、ザントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、反復した、高度に保存的３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。それらは、それゆえに、所望のＤＮＡ配列と結合するように操作され得る。
【０６９３】
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(Ｎ)と融合する。ＴＡＬＥＮにおいて使用するために、ＦｏｋＩについていくつかの変異が行われており、これらは、例えば、開裂特異性または活性の改善を含む。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793;およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
【０６９４】
ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、適切な配向および間隔を有する標的ゲノムにおける部位のための独特なＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ開裂ドメインの間のアミノ酸残基数および２の個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両者が、高レベルの活性を達成するために重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8。
【０６９５】
ＨＬＡまたはＴＣＲ  ＴＡＬＥＮを細胞内で使用して、二重鎖切断(ＤＳＢ)を産生できる。変異は、修復機構が切断を非相同末端結合により不適切に修復するならば、切断部位に導入できる。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列および染色体配列により、この方法はＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における欠損の補正またはｗｔ  ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子におけるこのような欠損の導入に使用でき、そうして、ＨＬＡまたはＴＣＲの発現を減少させる。
【０６９６】
ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー要素を使用する多様なスキームを含む、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509。
【０６９７】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをいう。
【０６９８】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
【０６９９】
亜鉛フィンガーは、１以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、約３bp配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを合わせて、約６bp、９bp、１２bp、１５bpまたは１８bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッド系および哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー(およびそれらの組み合わせ)を産生するための多様な選択およびモジュラーアセンブリー技術が利用可能である。
【０７００】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを開裂するために二量体化しなければならない。それゆえに、ＺＦＮの対が、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とすることが必要である。２の々のＺＦＮは、そのヌクレアーゼが適切に離れで、ＤＮＡの逆の鎖に結合しなければならない。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5。
【０７０１】
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡに二重鎖切断を創製でき、これは、不適切に修復されたならばフレームシフト変異を創製でき、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量の減少に至る。ＺＦＮはまた、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における変異のために相同組換えと使用もできる。
【０７０２】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許公開２０１１／０１５８９５７号；および米国特許公開２０１２／００６０２３０号参照。
【０７０３】
テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ある態様において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアのために、患者における残留性が短く、したがって、テロメラーゼ遺伝子を用いるトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それゆえに、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴ発現する。ある面において、本開示は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前に、同時にまたは後に核酸と接触させ得る。
【０７０４】
ある面において、本開示は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を製造する方法に関する。ある態様において、本方法は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を接触させ、そして、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下に接触させることを含む。
【０７０５】
ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
【０７０６】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Protein ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有し(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)、次のとおりである。
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(配列番号８８)
【０７０７】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号８８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号８８の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方に欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。
【０７０８】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列によりコードされる(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)。
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa(配列番号８９)
【０７０９】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号８９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸によりコードされる。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号８９の核酸によりコードされる。
【０７１０】
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化および増殖
Ｔ細胞のような免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号；６,９０５,６８０号；６,６９２,９６４号；５,８５８,３５８号；６,８８７,４６６号；６,９０５,６８１号；７,１４４,５７５号；７,０６７,３１８号；７,１７２,８６９号；７,２３２,５６６号；７,１７５,８４３号；５,８８３,２２３号；６,９０５,８７４号；６,７９７,５１４号；６,８６７,０４１号；および米国特許出願公開２００６０１２１００５号に記載する方法を使用して、一般的に活性化および増殖できる。
【０７１１】
引用により本明細書に包含させる米国特許５,１９９,９４２号に記載する造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ増殖のための方法を、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は当分野で知られ、それゆえに本発明は、細胞のエクスビボ増殖の特定の方法に制限されない。簡潔には、Ｔ細胞のエクスビボ培養および増殖は、(１)哺乳動物からの採取した末梢血または骨髄外植体からのＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞回収；および(２)エクスビボでのこのような細胞の増殖を含み得る。米国特許５,１９９,９４２号に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用できる。
【０７１２】
一般に、本発明の免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇細胞を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結合した表面と接触させることにより増殖させ得る。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントまたは抗ＣＤ２抗体との接触またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触により、ここに記載するように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８を含み(Diaclone, Besancon, France)、当分野で一般に知られる他の方法のように使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
【０７１３】
ある面において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより提供し得る。例えば、例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中でも、表面と結合していてよい。表面に結合しているとき、薬剤は同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に結合し得る。あるいは、あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方のが溶液にあってよい。ある面において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中であるかまたは表面と結合する。ある面において、両剤は溶液中にあり得る。ある面において、ある面において、薬剤は不溶性形態であり、Ｆｃ受容体または抗体または薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞のような表面に架橋され得る。この点に関して、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化および増殖のために意図される人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)について、米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照のこと。
【０７１４】
ある面において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、すなわち、“ｃｉｓ”または別のビーズ、すなわち、“ｔｒａｎｓ”で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体または抗原結合そのフラグメントであり、両剤が、等価な分子量で同じビーズに共固定化される。ある面において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明のある面において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。ある特定の面において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、約１〜約３倍増加が観察される。ある面において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は１００：１〜１：１００およびその間の全ての整数値の範囲である。ある面において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合している、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。ある面において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は２：１より大きい。ある特定の面において、ビーズに結合した１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある好ましい面において、ビーズに結合した１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
【０７１５】
１：５００〜５００：１およびその間の任意の整数値の粒子対細胞比を、Ｔ細胞または他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者には容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径による。例えば、小さいサイズのビーズは少ない細胞しか結合できず、大きなビーズはたくさん結合できる。ある面において、細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる面において１：９〜９：１およびその間の任意の整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わりうるが、しかしながらある好ましい値は１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの好ましい比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。ある面において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。ある特定の面において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる面において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、ある面において、粒子対細胞比は、１日目は１：１〜１０：１であり、さらなる粒子をその後１０日目まで連日または隔日で細胞に添加し、最終比１：１〜１：１０である(添加の比の細胞数に基づく)。ある特定の面において、粒子対細胞比は刺激１日目に１：１であり、刺激３日目および５日目に１：５に調節する。ある面において、粒子を、１日目の１：１および刺激３日目および５日目の１：５の最終比に基づき、連日または隔日で添加する。ある面において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目および５日目に１：１０に調節する。ある面において、粒子を、１日目の１：１および３日目および５日目の１：１０の最終比に基づき、連日または隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径ならびに細胞サイズおよびタイプによる。ある面において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１および３：１付近である。
【０７１６】
さらなる面において、Ｔ細胞のような細胞を、薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。異なる面において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離するが、一緒に培養する。さらなる面において、ビーズおよび細胞を、磁気力のような力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
【０７１７】
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。ある面において、細胞(例えば、１０４〜１０９  Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、ＤＹＮＡビーズＳ(登録商標)Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズを１：１比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることは当業者には容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、サンプル中に極めて稀であり、サンプルの０.０１％しか含まれないかまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞で構成され得る。したがって、あらゆる細胞数が本発明の状況と一体となる。ある面において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子および細胞を混合する体積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度を高める)ことが望ましいことがある。例えば、ある面において、約１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／ml、５０億／mlまたは２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある面において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlをの濃度使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用はＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０７１８】
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞を、例えば、ここに記載する方法により増殖する。ある態様において、細胞を、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間の培養により増殖する。ある態様において、細胞は、４〜９日の期間増殖される。ある態様において、細胞は、８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間増殖される。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件で、９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走またはそれらの組み合わせにより規定され得る。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルのｐｇ／mlで、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上増加する。
【０７１９】
Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となるような、数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清(例えば、胎児ウシまたはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５(Lonza))を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネートおよびＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清または適切な量の血清(または血漿)が添加されたまたは規定されたセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)で維持される。
【０７２０】
ある態様において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす１以上のインターロイキンを含む、適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増殖させる。ある態様において、細胞は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)の存在下増殖させる。
【０７２１】
ある態様において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造法は、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団から除去することを含む。細胞集団からＴ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を除去する方法は、ここに記載される。ある態様において、方法、例えば、製造法は、さらに細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞のようなＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと前に接触された細胞集団)とＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の接触を含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている)を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で増殖させる。
【０７２２】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させることを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者の組合せを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【０７２３】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者を含む組成物と接触させる。ある態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存および増殖をもたらす。
【０７２４】
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きいヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目後、Ｔ細胞の集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的によって、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、このサブセットを大きな程度まで増殖させることが有利であり得る。
【０７２５】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中に、顕著に、しかし大部分、再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特異的な目的のために活性化Ｔ細胞産物をあつらえる能力を可能とする。
【０７２６】
他の態様において、ここに開示する製造法は、さらに、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードする核酸、例えば、ｈＴＥＲＴを接触させることを含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡであり得る。
【０７２７】
本発明のＣＡＲが構築されたら、適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続および抗癌活性のような、しかしこれらに限定されない分子の活性を評価するために、種々のアッセイが使用され得る。本発明のＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、下にさらに詳細に記載する。
【０７２８】
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を、単量体および二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の１：１混合物)をインビトロで１０日超増殖させ、続いて溶解および還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。完全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインおよび内因性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する。
【０７２９】
抗原刺激後のＣＡＲ＋  Ｔ細胞のインビトロ増殖を、フローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８ビーズで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下に、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットの培養６日目に、フローサイトメトリーにより評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。あるいは、ＣＤ４＋とＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、洗浄後、ここに記載する癌関連抗原＋  Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２−ここに記載するような癌関連抗原)、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２野生型)または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下ＨＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞(Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８)で、再刺激する。外来性ＩＬ−２を、１００ＩＵ／mlを隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ＋  Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
【０７３０】
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋  Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、平均Ｔ細胞体積(ｆｌ)を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激および１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にCoulter Multisizer粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。
【０７３１】
動物モデルも、ＣＡＲＴ活性の測定に使用できる。例えば、免疫欠損マウスにおける原発ヒトプレＢ  ＡＬＬを処置するための、ここに記載するヒト癌関連抗原特異的ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＡＬＬ確立後、マウスを処置群に無作為化する。ここに記載するような癌関連抗原特異的ＣＡＲで操作したＴ細胞の異なる数を、１：１の等量比でＢ−ＡＬＬを担持するＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスに共注射する。マウスからの脾臓ＤＮＡにおけるここに記載するようなα癌関連抗原−ζおよびここに記載するようなα癌関連抗原−ＢＢ−ζベクターのコピー数を、Ｔ細胞注射後、種々の時点で評価する。動物を、１週間間隔で白血病について評価する。末梢血における癌関連抗原＋Ｂ−ＡＬＬ芽細胞数を癌関連抗原特異的ＣＡＲ＋  Ｔ細胞または偽形質導入Ｔ細胞を注射されたマウスで計数する。ログランク検定を使用して、群の生存曲線を比較する。さらに、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスへのＴ細胞注射４週間後の絶対的末梢血ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞数も分析する。マウスに、白血病性細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰに連結したＣＡＲをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによりＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を注射する。Ｔ細胞を、注入ＧＦＰ＋  Ｔ細胞の４５〜５０％に、注射前に偽形質導入細胞と混合することにより標準化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を、１週間間隔で白血病について評価する。ＣＡＲ＋  Ｔ細胞群の生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。
【０７３２】
用量依存的ＣＡＲ処置応答を評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。例えば、２１日目にＣＡＲ  Ｔ細胞、等しい数の偽形質導入Ｔ細胞で処置したまたはＴ細胞処置なしの、マウスにおいて白血病が確立した後３５〜７０日後に後、末梢血を得る。各群からのマウスを、ここに記載する末梢血癌関連抗原＋  ＡＬＬ芽細胞数の決定のために無作為に採血し、３５日目および４９日目に殺す。残りの動物を５７日目および７０日目に評価する。
【０７３３】
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡潔には、ＣＡＲ介在増殖の評価を、洗浄したＴ細胞と、ここに記載する癌関連抗原(Ｋ１９)またはＣＤ３２およびＣＤ１３７(ＫＴ３２−ＢＢＬ)を発現するＫ５６２細胞と、最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比２：１で混合することによりマイクロタイタープレートにおいて実施する。Ｋ５６２細胞を、使用前にガンマ線で照射する。抗ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および抗ＣＤ２８(クローン９.３)モノクローナル抗体を、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を支持するため、刺激Ｔ細胞増殖について陽性対照として役立つＫＴ３２−ＢＢＬ細胞の培養物に添加する。Ｔ細胞を、製造者により記載のとおり、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔTM蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、培養において数える。ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用するＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋  Ｔ細胞について、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を、ここに記載するビオチニル化組み換え癌関連抗原タンパク質および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従いヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して再刺激２４時間後に回収した上清で実施する。蛍光を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して評価し、データを製造業者の指示に従い分析する。
【０７３４】
細胞毒性を、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、標的細胞(Ｋ５６２株および初代プロＢ−ＡＬＬ細胞)に、５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ４として、New England Nuclear, Boston, MA)を、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、ウェル中で完全ＲＰＭＩ中、標的細胞と種々のエフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)比で混合する。さらなる培地のみ(自発的放出、ＳＲ)またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００洗剤１％溶液(全放出、ＴＲ)を含むウェルも調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。放出された５１Ｃｒを、次いでガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して測定する。各条件を少なくとも３回行い、溶解のパーセントを式：溶解％＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)(式中、ＥＲは各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを示す)を使用して計算する。
【０７３５】
造影テクノロジーを使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−(ＮＳＧ)マウスに、Ｎａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、７日後ＣＡＲ構築物でエレクトロポレーション４時間後Ｔ細胞を注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスをバイオルミネセンスについて造影する。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＣＡＲ＋  Ｔ細胞の単回注射の治療有効性および特異性を、次のように測定できる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入したＮａｌｍ−６を注射し、続いて７日後に本発明のＣＡＲで電気穿孔したＴ細胞を１回尾静脈注射する。動物を、注射後種々の時点で造影する。例えば、５日目(処置２日前)および８日目(ＣＡＲ＋  ＰＢＬ後２４時間)に、代表的マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。
【０７３６】
ここでの実施例部分に記載のものならびに当分野で知られるものを含む、他のアッセイも、本発明のＣＡＲ構築物の評価に使用できる。
【０７３７】
ここに開示する方法の代わりにまたはこれと組み合わせて、ＣＡＲリガンドの使用を含む、ＣＡＲ発現細胞(例えば、インビトロまたはインビボ(例えば、臨床モニタリング))、免疫細胞増殖および／または活性化および／またはＣＡＲ特異的選択の１以上の検出および／または定量のための方法および組成物が開示される。一つの例示的態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体である(例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；または細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体)。他の態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子である(例えば、ここに記載のような)。
【０７３８】
ある面において、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量する方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドは、インビトロまたはインビボでＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量に使用できる(例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞の臨床モニタリングまたは患者への投薬)。方法は、
ＣＡＲリガンド(場合により、標識ＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射活性または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド)を提供し；
ＣＡＲ発現細胞を獲得し(例えば、製造サンプルまたは臨床サンプルのようなＣＡＲ発現細胞含有サンプルの獲得)；
ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドを、結合が生じる条件下で接触させ、それにより、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル(例えば、量)を検出することを含む。ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどのような標準技術を使用して検出できる。
【０７３９】
他の面において、増殖および／または活性化細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)の方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞(例えば、第一ＣＡＲ発現細胞または一過性に発現されるＣＡＲ細胞)を提供し)；
該ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンド、例えば、ここに記載するようなＣＡＲリガンドを、免疫細胞拡張および／または増殖が生じる条件下で接触させ、それにより、活性化および／または増殖集団を産生することを含む。
【０７４０】
ある態様において、ＣＡＲリガンドは存在する(例えば、基質、例えば、天然に存在しない基質に固定化または結合される)。ある態様において、基質は、非細胞基質である。非細胞基質は、例えば、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜)、マトリックス、チップまたはビーズから選択される固体支持体であり得る。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、基質に存在する(例えば、基質表面上)。ＣＡＲリガンドを、基質に共有非共有(例えば、架橋)により固定、結合または会合させ得る。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに結合(例えば、共有結合)する。前記態様において、免疫細胞集団をインビトロまたはエクスビボで増殖できる。本方法は、さらに、例えば、ここに記載する方法のいずれかを使用する、ＣＡＲ分子のリガンドの存在下、免疫細胞の集団の培養を含み得る。
【０７４１】
他の態様において、細胞を増殖および／または活性化する方法は、さらに第二刺激性分子、例えば、ＣＤ２８の添加を含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第二刺激性分子を基質、例えば、１以上のビーズに固定し、それにより細胞増殖および／または活性化を増加させ得る。
【０７４２】
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞を選択または富化する方法を提供する。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載のようなＣＡＲリガンドを接触させ、ＣＡＲリガンドの結合に基づき細胞を選択することを含む。
【０７４３】
さらに他の態様において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇する(例えば、減らすおよび／または殺す)方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載するようなＣＡＲリガンドを接触させ、細胞をＣＡＲリガンドの結合に基づき細胞に標的化させ、それによりＣＡＲ発現細胞の数を減らすおよび／または殺すことを含む。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、毒性剤と結合する(例えば、トキシンまたは細胞除去剤)。他の態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を生じ得る。
【０７４４】
ここに開示する方法において使用できる抗ＣＡＲ抗体の例は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号およびJena et al., “Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3 e57838に記載され、その内容を引用により本明細書に包含させる。ある態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、抗ＣＤ１９抗体分子、例えば、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを認識する。例えば、抗イディオタイプ抗体分子は、Jena et al., PLOS March 2013 8:3 e57838に記載のＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と結合について競合でき；ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と同じＣＤＲ(例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せを使用して１以上の、例えば、全ての、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３)を有し得て；ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１のような１以上の(例えば、２)可変領域を有し得るかまたはＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１を含み得る。ある態様において、抗イディオタイプ抗体は、Jena et al.に記載の方法により製造した。他の態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗イディオタイプ抗体分子である。ある態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、１３６.２０.１のようなＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗体分子と同じＣＤＲ(例えば、１以上の、例えば、全ての、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３)を有し；ＷＯ２０１４／１９０２７３号の抗体分子の１以上の(例えば、２)可変領域を有してよくまたは１３６.２０.１のようなＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗体分子を含み得る。他の態様において、抗ＣＡＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載のようなＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域に結合する。ある態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域、例えば、重鎖定常領域(例えば、ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域)または軽鎖定常領域に結合する。例えば、ある態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の２Ｄ３モノクローナル抗体と結合について競合し、２Ｄ３と同じＣＤＲ(例えば、１以上の、例えば、全ての、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３)を有しまたは２Ｄ３の１以上の(例えば、２)可変領域を有しまたはＷＯ２０１４／１９０２７３に記載のような２Ｄ３を含む。
【０７４５】
ある面および態様において、ここでの組成物および方法は、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる、２０１４年７月３１日出願の米国特許出願号に記載のような、Ｔ細胞の特定のサブセットのために最適化される。ある態様において、Ｔ細胞の最適化サブセットは、対照Ｔ細胞、例えば、同じ構築物を発現する異なるタイプ(例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋)のＴ細胞と比較して、残留性の増強を示す。
【０７４６】
ある態様において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ここに記載するＣＡＲを含み、当該ＣＡＲは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に適する(例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む。ある態様において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ここに記載するＣＡＲを含み、当該ＣＡＲは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に適する(例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の共刺激ドメインを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲは、ここに記載する抗原結合ドメインを含む
。
【０７４７】
治療適用
ある面において、本発明は、ここに記載するような癌関連抗原の発現と関係する疾患の処置法を提供する。方法は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与およびＣＡＲを発現するまたは発現できる細胞、例えば、Ｔ細胞の投与を含む。
【０７４８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＸＣＡＲ(を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、Ｘはここに記載するような腫瘍マーカー(または癌関連抗原)である)を発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、該癌細胞は、該Ｘ腫瘍マーカー(または癌関連抗原)を発現する。
【０７４９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ１９ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ１９を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＬＬ(急性リンパ芽球性白血病)、ＣＬＬ(慢性リンパ性白血病)、ＤＬＢＣＬ(びまん性大Ｂ細胞リンパ腫)、ＭＣＬ(マントル細胞リンパ腫またはＭＭ(多発性骨髄腫)である。
【０７５０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＥＧＦＲｖIIIＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＥＧＦＲｖIIIを発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫である。
【０７５１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびメソテリンＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、メソテリンを発現する。ある態様において、処置する癌は中皮腫、膵臓癌または卵巣癌である。
【０７５２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ１２３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ１２３を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０７５３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ２２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ２２を発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０７５４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＳ−１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＳ−１を発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０７５５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＬＬ−１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＬＬ−１を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０７５６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ３３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ３３を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０７５７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＧＤ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＧＤ２を発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫である。
【０７５８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＢＣＭＡＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＢＣＭＡを発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０７５９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴｎＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、Ｔｎ抗原を発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌である。
【０７６０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＳＭＡＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＳＭＡを発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０７６１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＲＯＲ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＲＯＲ１を発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０７６２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＦＬＴ３  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＦＬＴ３を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０７６３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴＡＧ７２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＴＡＧ７２を発現する。ある態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０７６４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ３８ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ３８を発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０７６５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ４４ｖ６ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ４４ｖ６を発現する。ある態様において、処置する癌は頸部癌、ＡＭＬまたはＭＭである。
【０７６６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＥＡＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＥＡを発現する。ある態様において、処置する癌は消化器癌または膵臓癌である。
【０７６７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＥＰＣＡＭＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＥＰＣＡＭを発現する。ある態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０７６８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＢ７Ｈ３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、Ｂ７Ｈ３である。
【０７６９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＫＩＴＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＫＩＴを発現する。ある態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０７７０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＩＬ−１３Ｒａ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＩＬ−１３Ｒａ２を発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫である。
【０７７１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ３０ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ３０を発現する。ある態様において、処置する癌はリンパ腫または白血病である。
【０７７２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＧＤ３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＧＤ３を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７７３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ１７１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ１７１を発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫、卵巣癌、黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌またはＮＳＣＬＣ(非小細胞性肺癌)である。
【０７７４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＩＬ−１１ＲａＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＩＬ−１１Ｒａを発現する。ある態様において、処置する癌は骨肉腫である。
【０７７５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＳＣＡＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＳＣＡを発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０７７６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＶＥＧＦＲ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＶＥＧＦＲ２を発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０７７７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびルイスＹＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ルイスＹを発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌またはＡＭＬである。
【０７７８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ２４ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ２４を発現する。ある態様において、処置する癌は膵臓癌である。
【０７７９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＤＧＦＲ−ベータＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＤＧＦＲ−ベータを発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、前立腺癌、ＧＩＳＴ(消化器間質腫瘍)、ＣＭＬ、ＤＦＳＰ(隆起性皮膚線維肉腫)または神経膠腫である。
【０７８０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＳＳＥＡ−４ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＳＳＥＡ−４を発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫、乳癌、肺癌または幹細胞癌である。
【０７８１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ２０ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ２０を発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０７８２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤および葉酸受容体アルファＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、葉酸受容体アルファを発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、ＮＳＣＬＣ、子宮内膜癌、腎癌または他の固形腫瘍である。
【０７８３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＥＲＢＢ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)を発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌または他の固形腫瘍である。
【０７８４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＭＵＣ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＭＵＣ１を発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、肺癌または他の固形腫瘍である。
【０７８５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＥＧＦＲＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＥＧＦＲを発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫、ＳＣＬＣ(小細胞肺癌)、ＳＣＣＨＮ(頭頸部扁平上皮細胞癌)、ＮＳＣＬＣまたは他の固形腫瘍である。
【０７８６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＮＣＡＭＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＮＣＡＭを発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫または他の固形腫瘍である。
【０７８７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＡIXＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＡIXを発現する。ある態様において、処置する癌は腎癌、ＣＲＣ、子宮頸癌または他の固形腫瘍である。
【０７８８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＥｐｈＡ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＥｐｈＡ２を発現する。ある態様において、処置する癌はＧＢＭである。
【０７８９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＧＤ３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＧＤ３を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７９０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびフコシルＧＭ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、フコシルＧＭを発現する。
【０７９１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｓＬｅＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ｓＬｅを発現する。ある態様において、処置する癌はＮＳＣＬＣまたはＡＭＬを発現する。
【０７９２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＧＭ３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＧＭ３を発現する。
【０７９３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴＧＳ５ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＴＧＳ５を発現する。
【０７９４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＨＭＷＭＡＡＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＨＭＷＭＡＡを発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫、神経膠芽腫または乳癌である。
【０７９５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｏ−アセチル−ＧＤ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ｏ−アセチル−ＧＤ２を発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫または黒色腫である。
【０７９６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤および葉酸受容体ベータＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ１９を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬまたは骨髄腫である。
【０７９７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴＥＭ１／ＣＤ２４８ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８を発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０７９８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴＥＭ７ＲＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＴＥＭ７Ｒを発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０７９９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＬＤＮ６ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＬＤＮ６を発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、肺癌または乳癌である。
【０８００】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴＳＨＲＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＴＳＨＲを発現する。ある態様において、処置する癌は甲状腺癌または多発性骨髄腫である。
【０８０１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＧＰＲＣ５ＤＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＧＰＲＣ５Ｄを発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０８０２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＸＯＲＦ６１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＸＯＲＦ６１である。
【０８０３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ９７ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ９７を発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍、胃癌、膵臓癌、食道癌、神経膠芽腫、乳癌または結腸直腸癌である。
【０８０４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＤ１７９ａＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ１７９ａを発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０８０５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＡＬＫ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＡＬＫを発現する。ある態様において、処置する癌はＮＳＣＬＣ、ＡＬＣＬ(未分化大細胞リンパ腫)、ＩＭＴ(炎症性筋線維芽細胞腫)または神経芽腫である。
【０８０６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびポリシアル酸ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ポリシアル酸を発現する。ある態様において、処置する癌は小細胞肺癌である。
【０８０７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＬＡＣ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＬＡＣ１を発現する。ある態様において、処置する癌はＨＣＣ(肝細胞癌)である。
【０８０８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＧｌｏｂｏＨＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＧｌｏｂｏＨを発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、乳癌または膵臓癌である。
【０８０９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＮＹ−ＢＲ−１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＮＹ−ＢＲ−１を発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌である。
【０８１０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＵＰＫ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＵＰＫ２を発現する。ある態様において、処置する癌は膀胱癌である。
【０８１１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＨＡＶＣＲ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＨＡＶＣＲ１を発現する。ある態様において、処置する癌は腎癌である。
【０８１２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＡＤＲＢ３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＡＤＲＢ３を発現する。ある態様において、処置する癌はユーイング肉腫である。
【０８１３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＡＮＸ３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＡＮＸ３を発現する。ある態様において、処置する癌は骨肉腫である。
【０８１４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＧＰＲ２０ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＧＰＲ２０を発現する。ある態様において、処置する癌はＧＩＳＴである。
【０８１５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＬＹ６ＫＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＬＹ６Ｋを発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、肺癌、卵巣癌または子宮頸癌である。
【０８１６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＯＲ５１Ｅ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＯＲ５１Ｅ２を発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０８１７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴＡＲＰＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＴＡＲＰを発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０８１８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＷＴ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＷＴ１を発現する。
【０８１９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＮＹ−ＥＳＯ−１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する。
【０８２０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＬＡＧＥ−１ａ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＬＡＧＥ−１ａを発現する。
【０８２１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＭＡＧＥ−Ａ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＭＡＧＥ−Ａ１を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８２２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＭＡＧＥ  Ａ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＭＡＧＥ  Ａ１を発現する。
【０８２３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＥＴＶ６−ＡＭＬ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＥＴＶ６−ＡＭＬを発現する。
【０８２４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤および精子タンパク質１７  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、精子タンパク質１７を発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、ＨＣＣまたはＮＳＣＬＣを発現する。
【０８２５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＸＡＧＥ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＸＡＧＥ１を発現する。ある態様において、処置する癌はユーイングまたはラブド肉腫である。
【０８２６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴｉｅ  ２  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、Ｔｉｅ  ２を発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０８２７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＭＡＤ−ＣＴ−１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＭＡＤ−ＣＴ−１を発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌または黒色腫である。
【０８２８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＭＡＤ−ＣＴ−２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＭＡＤ−ＣＴ−２を発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌、黒色腫である。
【０８２９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＦｏｓ関連抗原１  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、Ｆｏｓ関連抗原１を発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠腫、扁平上皮細胞癌または膵臓癌である。
【０８３０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｐ５３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ｐ５３を発現する。
【０８３１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびプロステイン  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、プロステインを発現する。
【０８３２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびサバイビンおよびテロメラーゼＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、サバイビンおよびテロメラーゼを発現する。
【０８３３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＣＴＡ−１／ガレクチン８  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８を発現する。
【０８３４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１を発現する。
【０８３５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＲａｓ変異体ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、Ｒａｓ変異体を発現する。
【０８３６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｐ５３変異体ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ｐ５３変異体を発現する。
【０８３７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｈＴＥＲＴ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ｈＴＥＲＴを発現する。
【０８３８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤および肉腫転座切断点ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、肉腫転座切断点を発現する。ある態様において、処置する癌は肉腫である。
【０８３９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＭＬ−ＩＡＰ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＭＬ−ＩＡＰを発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８４０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＥＲＧＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)を発現する。
【０８４１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＮＡ１７ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＮＡ１７を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８４２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＡＸ３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＡＸ３を発現する。ある態様において、処置する癌は肺胞横紋筋肉腫である。
【０８４３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｎアンドロゲン受容体ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、アンドロゲン受容体を発現する。ある態様において、処置する癌は転移前立腺癌である。
【０８４４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびサイクリンＢ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、サイクリンＢ１を発現する。
【０８４５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＭＹＣＮＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＭＹＣＮを発現する。
【０８４６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＲｈｏＣ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＲｈｏＣを発現する。
【０８４７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＴＲＰ−２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＴＲＰ−２を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８４８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＣＹＰ１Ｂ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＹＰ１Ｂ１を発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、結腸癌、肺癌、食道癌、皮膚癌、リンパ節癌、脳腫瘍または精巣癌である。
【０８４９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＢＯＲＩＳ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＢＯＲＩＳを発現する。ある態様において、処置する癌は肺癌である。
【０８５０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＳＡＲＴ３ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＳＡＲＴ３を発現する。
【０８５１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＡＸ５ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＡＸ５を発現する。
【０８５２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＯＹ−ＴＥＳ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＯＹ−ＴＥＳ１を発現する。
【０８５３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＬＣＫ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＬＣＫを発現する。
【０８５４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＡＫＡＰ−４ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＡＫＡＰ−４を発現する。
【０８５５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＳＳＸ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＳＳＸ２。
【０８５６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＲＡＧＥ−１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＲＡＧＥ−１を発現する。ある態様において、処置する癌はＲＣＣ(腎臓細胞癌)または他の固形腫瘍である。
【０８５７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびヒトテロメラーゼ逆転写酵素ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０８５８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＲＵ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＲＵ１を発現する。
【０８５９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＲＵ２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＲＵ２を発現する。
【０８６０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤および腸カルボキシルエステラーゼＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、腸カルボキシルエステラーゼを発現する。ある態様において、処置する癌は甲状腺癌、ＲＣＣ、ＣＲＣ(結腸直腸癌)、乳癌または他の固形腫瘍である。
【０８６１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびプロスターゼＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、プロスターゼを発現する。
【０８６２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＡＰＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＰＡＰを発現する。
【０８６３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＩＧＦ−Ｉ受容体ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＩＧＦ−Ｉ受容体を発現する。
【０８６４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｇｐ１００  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ｇｐ１００を発現する。
【０８６５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｂｃｒ−ａｂｌ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ｂｃｒ−ａｂｌを発現する。
【０８６６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびチロシナーゼＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、チロシナーゼを発現する。
【０８６７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、フコシルＧＭ１ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、フコシルＧＭ１を発現する。
【０８６８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８６９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＣＤ７９ａ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ７９ａを発現する。
【０８７０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ７９ｂを発現する。
【０８７１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＣＤ７２  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ７２を発現する。
【０８７２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＬＡＩＲ１  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＬＡＩＲ１。
【０８７３】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＦＣＡＲ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＦＣＡＲを発現する。
【０８７４】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＬＩＬＲＡ２  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＬＩＬＲＡ２を発現する。
【０８７５】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＣＤ３００ＬＦ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＤ３００ＬＦを発現する。
【０８７６】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＣＬＥＣ１２Ａ  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する。
【０８７７】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＢＳＴ２  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＢＳＴ２を発現する。
【０８７８】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＥＭＲ２  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＥＭＲ２を発現する。
【０８７９】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＬＹ７５  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＬＹ７５を発現する。
【０８８０】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＧＰＣ３  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＧＰＣ３を発現する。
【０８８１】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＦＣＲＬ５  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＦＣＲＬ５を発現する。
【０８８２】
ある面において、本発明は、処置を必要とする対象に、ＩＧＬＬ１  ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することにより癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は、ＩＧＬＬ１を発現する。
【０８８３】
ある面において、本発明は、癌性腫瘍の増殖が阻害されるように、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびＰＤ１  ＣＡＲを使用する、インビボで対象を処置する方法に関する。ＰＤ１  ＣＡＲを、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用し得る。あるいは、ＰＤ１  ＣＡＲを他のＣＡＲ、免疫原性薬剤、標準的癌処置または他の抗体と組み合わせて使用し得る。ある態様において、対象を、ＰＤ１  ＣＡＲおよびここに記載するＸＣＡＲで処置する。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲを、他のＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲおよびキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用する。
【０８８４】
他の面において、対象を処置する、例えば、対象における過増殖性状態または障害(例えば、癌)、例えば、固形腫瘍、軟組織腫瘍または転移病変を減少するまたは軽減する方法が提供される。ある態様において、方法は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与およびＣＡＲの投与を含む。
【０８８５】
ここに開示する方法で処置できる癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、精巣癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌および該癌の組み合わせを含む。転移癌、例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移癌(Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144)の処置を、ここに記載する抗体分子を使用して実施できる。
【０８８６】
ここに開示する方法で処置できる固形腫瘍の例は、肝臓、肺、乳房、リンパ系、消化器(例えば、結腸)、尿生殖器(例えば、腎臓、尿路上皮性細胞)、前立腺および咽頭を冒すもの、多様な臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌および癌を含む。腺癌は、大部分の結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝癌、肺非小細胞癌、小腸癌および食道癌のような悪性腫瘍を含む。ある態様において、癌は黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。前記癌の転移病変も、本発明の方法および組成物を使用して処置または予防できる。
【０８８７】
ここに記載する方法を、次の癌のいずれかの処置に使用できる。
肛門癌；胆管癌；肝外胆管癌；虫垂癌；カルチノイド腫瘍、消化器癌；結腸癌；小児結腸直腸癌を含む結腸直腸癌；小児食道癌を含む食道癌；胆嚢癌；小児胃(胃体)癌を含む胃(胃体)癌；成人(原発)肝細胞(肝臓)癌および小児(原発)肝細胞(肝臓)癌を含む肝細胞(肝臓)癌；小児膵臓癌を含む膵臓癌；肉腫、横紋筋肉腫；島細胞膵臓癌；直腸癌；および小腸癌のような消化器／胃腸癌；
島細胞癌(内分泌膵臓)；小児副腎皮質癌を含む副腎皮質癌；消化器カルチノイド腫瘍；副甲状腺癌；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；小児甲状腺癌を含む甲状腺癌；小児多発性内分泌腫瘍症候群；および小児カルチノイド腫瘍のような内分泌癌；
眼内黒色腫；および網膜芽細胞腫のような眼癌；
腫瘍のユーイングファミリー；骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫；小児横紋筋肉腫；成人および小児軟組織肉腫を含む軟組織肉腫；腱鞘の明細胞肉腫；および子宮肉腫のような筋骨格癌；
小児および男性乳癌を含む乳癌および妊娠のような乳癌；
小児脳幹神経膠腫；脳腫瘍；小児小脳星状細胞腫；小児脳星状細胞腫／悪性神経膠腫；小児上衣腫；小児髄芽腫；小児松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍；小児視覚経路および視床下部神経膠腫；他の小児脳腫瘍；副腎皮質癌；中枢神経系リンパ腫、原発；小児小脳星状細胞腫；神経芽腫；頭蓋咽頭腫；脊髄腫瘍；中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚性腫瘍；および小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍および下垂体腫瘍のような神経性癌；
小児膀胱癌を含む膀胱癌；腎臓細胞(腎臓)癌；小児卵巣癌を含む卵巣癌；卵巣上皮性癌；卵巣低悪性能腫瘍；陰茎癌；前立腺癌；小児腎臓細胞癌を含む腎臓細胞癌；腎盂および輸尿管、移行細胞癌；精巣癌；尿道癌；膣癌；外陰癌；頸部癌；ウィルムス腫瘍および他の小児腎臓腫瘍；子宮内膜癌；および妊娠性絨毛性腫瘍のような尿生殖器癌；
小児頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；および精巣癌のような胚細胞癌；
口唇癌および口腔癌；小児口腔癌を含む口腔癌；下咽頭癌；小児喉頭癌を含む喉頭癌；潜在性原発巣を伴う転移性扁平上皮癌；口腔癌；鼻腔および副鼻腔癌；小児鼻咽頭癌を含む鼻咽頭癌；口腔咽頭癌；副甲状腺癌；咽頭癌；小児唾液腺癌を含む唾液腺癌；咽喉癌；および甲状腺癌のような頭頸部癌；
非小細胞肺癌；および小細胞肺癌；などの肺癌
悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児期；悪性胸腺腫；小児胸腺腫；胸腺癌；小児気管支腺腫／カルチノイドを含む気管支腺腫／カルチノイド；胸膜肺芽腫；非小細胞肺癌；および小細胞肺癌などの呼吸器がん；
カポジ肉腫；メルケル細胞癌；メラノーマ；および小児皮膚癌のような皮膚癌；
エイズ関連悪性腫瘍；
他の小児癌、小児期の異常な癌および未知の原発部位の癌；
および上記癌の転移もここに記載する方法により処置または予防できる。増殖が阻止され得る代表的癌は、一般に免疫療法に応答性の癌を含む。処置のための癌の非限定的例は、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫)、腎癌(例えば明細胞癌)、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、乳癌、結腸癌および肺癌(例えば非小細胞性肺癌)を含む。さらに、難治性または再発性悪性腫瘍を、ここに記載する分子を使用して処置できる。
【０８８８】
ここに記載する方法を使用して、血液癌または悪性腫瘍または前癌状態、例えば、白血病またはリンパ腫を処置できる。癌は、ここに記載するような癌関連抗原の発現と関連するものであり得る。血液癌および悪性腫瘍は、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(“ＴＡＬＬ”)、成人および小児急性リンパ性白血病を含む急性リンパ性白血病(または急性リンパ芽球性白血病)(ＡＬＬ)を含む１以上の急性白血病；成人および小児急性骨髄性白血病を含む急性骨髄性白血病；１以上の慢性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(または慢性リンパ性白血病)(ＣＬＬ)である。ここに開示する方法で処置できるさらなる癌または血液状態は、例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、慢性骨髄増殖性障害；皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、ホジキンリンパ腫(成人および小児ホジキンリンパ腫および妊娠中のホジキンリンパ腫を含む)、小細胞−または大細胞−濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺帯リンパ腫、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／血漿細胞新生物、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性障害、菌状息肉症、非ホジキンリンパ腫(成人および小児非ホジキンリンパ腫および妊娠中の非ホジキンリンパ腫を含む)、血漿芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、セザリー症候群、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、一次中枢系リンパ腫および骨髄血液細胞の無効な産生(または異形成)により一体化される血液状態の雑多なコレクションである“前白血病”などを含む。さらにここに記載するような癌関連抗原発現と関係する疾患は、例えば、ここに記載するような癌関連抗原の発現と関係する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０８８９】
ある態様において、本発明のＣＡＲ細胞、例えば、ＣＡＲＴで処置できる癌は、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)である。ある態様において、処置できる癌はＣＬＬであり、ＣＡＲはＣＤ１９に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
【０８９０】
ある態様において、本発明のＣＡＲ細胞、例えば、ＣＡＲＴで処置できる癌は多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫は、骨髄における血漿細胞クローンの蓄積により特徴付けられる、血液の癌である。多発性骨髄腫の現在の治療は、サリドマイドのアナログであるレナリドマイドでの処置を含むが、これらに限定されない。レナリドマイドは、抗腫瘍活性、血管形成阻害および免疫調節を含む活性を有する。一般に、骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーにより、ここに記載する癌関連抗原発現は陰性であると考えられる。本発明は、ここに記載するような癌関連抗原を発現する骨髄腫腫瘍細胞の少ないパーセントの認識を包含する。それゆえに、ある態様において、例えば、ここに記載するようなＣＤ１９  ＣＡＲを骨髄腫細胞の標的のために使用し得る。ある態様において、本発明のＣＡＲを、１以上のさらなる治療、例えば、レナリドマイド処置と組み合わせて使用できる。
【０８９１】
ある態様において、リンパ球点滴、例えば同種リンパ球点滴を癌の処置において使用し、ここで、リンパ球点滴は、少なくとも一つの本発明のＣＡＲ発現細胞を含む。ある態様において、癌の処置において自己リンパ球点滴を使用し、ここで、自己リンパ球点滴は、少なくとも一つのここに記載するような癌関連抗原発現細胞を含む。
【０８９２】
ある態様において、対象は先に幹細胞移植、例えば、自己幹細胞移植を受けている。
【０８９３】
ある態様において、対象対象は先にメルファラン投与を受けている。
【０８９４】
ある態様において、癌は、対象におけるＰＤ１＋  Ｔ細胞パーセンテージ増加と関係する。ある態様において、癌は、黒色腫のようなＰＤ−１標的化剤に一般に応答する癌である。ある態様において、癌は、腎臓細胞癌のようなＴ細胞指向免疫療法に一般に応答する癌である。ある態様において、癌は、ＰＤ−１陰性対ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加により処置できるものである。
【０８９５】
本発明は、ここに記載するような癌関連抗原発現細胞集団の増殖阻害または減少のための方法を提供し、方法は、ここに記載するような癌関連抗原を含む細胞の集団と、ここに記載するような癌関連抗原い結合する本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞)を接触させることを含む。特定の面において、本発明は、ここに記載するような癌関連抗原を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するまたは減少する方法を提供し、方法は、ここに記載するような癌関連抗原を発現する癌細胞集団と、癌関連抗原を発現する細胞に結合する本発明のＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。ある態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤で処置した対象であり得る。ある態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)は、ここに記載するように、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞数減少、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞数増加、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比増加、ナイーブＴ細胞数増加、記憶Ｔ細胞前駆体数増加または記憶Ｔ細胞前駆体マーカーの発現レベル増加に十分な量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤と接触されている。ある面において、本発明のＣＡＲは、細胞および／または癌細胞の含量、数、量またはパーセンテージを、陰性対照と比較して、ここに記載するような癌関連抗原と関係する癌(例えば、血液癌)を有する対象または動物モデルで少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％現象させる。ある面において、対象は、ヒトである。
【０８９６】
本発明はまた、ここに記載するような癌関連抗原発現と関係する疾患細胞(例えば、ここに記載するような癌関連抗原と関係する癌、例えば、血液癌)を予防、処置および／または管理する方法も提供し、方法は、それを必要とする対象に、ここに記載するような癌関連抗原を発現する細胞と結合する本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞)を投与することを含む。ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤で処置された対象であり得る。ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、ここに記載ように、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞数減少、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞数増加、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比増加、ナイーブＴ細胞数増加、記憶Ｔ細胞前駆体数増加または記憶Ｔ細胞前駆体マーカーの発現レベル増加に十分量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤と接触されている。ある面において、対象は、ヒトである。
【０８９７】
本発明は、ここに記載するような癌関連抗原と関係する癌の再発を呼ぼうする方法を提供し、方法は、処置を必要とする対象に、ここに記載するような癌関連抗原に結合する本発明のＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞を投与することを含む。ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤で処置された対象であり得る。ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、は、ここに記載するように、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞数減少、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞数増加、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比増加、ナイーブＴ細胞数増加、記憶Ｔ細胞前駆体数増加または記憶Ｔ細胞前駆体マーカーの発現レベル増加に十分量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤と接触されている。
【０８９８】
ある面において、方法は、処置を必要とする対象に、有効量のここに記載するような癌関連抗原を発現する、本発明のＣＡＲ発現細胞またはここに記載するＴ細胞を、有効量の他の治療と組み合わせて投与することを含む。
【０８９９】
ある面において、本発明は、哺乳動物免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)における発現のためにプロモーターと操作可能に連結したＣＡＲを含むベクターに関する。ある面において、本発明は、ここに記載するような癌関連抗原を発現する癌の処置に使用するための、本発明のＣＡＲを発現する組み換えＴ細胞を提供する。ある面において、本発明のＣＡＲＴは、ＣＡＲＴが腫瘍細胞を標的とし、腫瘍増殖を処置するように表面に発現された少なくとも一つの癌関連抗原を有する腫瘍細胞と接触できる。
【０９００】
本発明は、ある種の細胞治療を含み、ここで、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)がキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝的に修飾され、処置を必要とするレシピエントにＣＡＲ  Ｔ細胞が注入され、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤が投与される。注入された細胞は、レシピエントで腫瘍細胞を殺すことができる。抗体療法と異なり、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、インビボで複製でき、持続腫瘍制御に至り得る長期残留性をもたらす。種々の面において、患者に投与された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)または子孫は、患者で、患者にＴ細胞投与後少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年持続する。
【０９０１】
本発明はまた、ある種の細胞治療を含み、ここで、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)が、例えば、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、インビトロ転写ＲＮＡで修飾され、処置を必要とするレシピエントにＣＡＲ発現細胞が注入され、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤が投与される。注入された細胞は、レシピエントで腫瘍細胞を殺すことができる。それゆえに、種々の面において、患者に投与した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、患者にＴ細胞投与後、１ヶ月、例えば、３週間、２週間、１週間未満持続する。
【０９０２】
何らかの特定の理論に縛られないが、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)により惹起される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得るかまたはあるいは直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。ある面において、ＣＡＲ形質導入免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ここに記載する癌関連抗原を発現するヒト癌細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解性活性を示し、可溶性の癌関連抗原阻害に抵抗し、バイスタンダー細胞死に介在し、確立されたヒト腫瘍の退縮に介在する。例えば、癌関連抗原発現腫瘍の不均一な場における低抗原腫瘍細胞は、近辺の抗原陽性癌細胞に対して先に反応している癌関連抗原の再指向免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)による間接的破壊を受け得る。
【０９０３】
ある面において、ある面において、本発明の完全ヒトＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のための１種のワクチンである。ある面において、哺乳動物は、ヒトである。
【０９０４】
エクスビボ免疫化に関して、次の少なくとも１つが、哺乳動物に細胞を投与する前にインビトロで起こる。ｉ)細胞の増殖、ii)細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入またはiii)細胞の凍結保存および場合により、iv)ここに記載するように、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞数減少、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞数増加、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比増加、ナイーブＴ細胞数増加、記憶Ｔ細胞前駆体数増加または記憶Ｔ細胞前駆体マーカーの発現レベル増加に十分な量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤との細胞の接触。
【０９０５】
エクスビボ過程は当分野で周知であり、下によりより詳細に記載する。簡潔には、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに記載するＣＡＲを発現するベクターで遺伝子修飾(すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクト)する。ＣＡＲ修飾細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を提供できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＣＡＲ修飾細胞はレシピエントに対して自己であり得る。あるいは、細は、レシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。
【０９０６】
造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ増殖は、引用により本明細書に包含させる米国特許５,１９９,９４２号に記載されており、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は当分野で既知であり、それゆえに、本発明は、細胞のエクスビボ増殖の特定の方法に制限されない。簡潔には、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)のエクスビボ培養および増殖は、(１)哺乳動物からの採取した末梢血または骨髄外植体からのＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞回収；および(２)エクスビボでのこのような細胞の増殖を含み得る。米国特許５,１９９,９４２号に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用できる。
【０９０７】
エクスビボ免疫化の点で細胞ベースのワクチンを使用するのに加えて、本発明はまた患者における抗原に対する免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。
【０９０８】
一般に、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与およびここに記載するような細胞活性化および増殖は、免疫不全の個体で生じる疾患の処置および予防に利用し得る。特に、本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、ここに記載するような癌関連抗原の発現と関係する疾患、障害および状態の処置に使用する。ある面において、本発明の細胞を、ここに記載するような癌関連抗原の発現と関係する疾患、障害および状態を発症するリスクのある患者の処置に使用する。それゆえに、本発明は、治療有効量の本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に、投与することを含む、ここに記載するような癌関連抗原の発現と関係する疾患、障害および状態を処置または予防する方法を提供する。
【０９０９】
ここに記載するような癌関連抗原の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。
【０９１０】
本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、単独でまたは希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインまたは細胞集団のような他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。
【０９１１】
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用を低減または緩和する薬剤を投与することができる。ＣＡＲ発現細胞の投与に付随する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも呼ばれる血液貪食リンパ組織球増多症(ＨＬＨ)を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛(arthalgias)、悪心、嘔吐、頭痛などの臨床的体質的徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹などの臨床皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢のような臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症のような臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧の増大、低血圧、心拍出量の増加(早期)および心拍出量の低下(後期)などの臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、凝固兆候およびｄ−二量体増加、出血の有無にかかわらず低フィブリノーゲン血などの症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症などの臨床腎徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症などの臨床肝徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態の変化、混乱、せん妄、単語発見困難またはフランク失語、幻覚、振戦、ジメトリア、異常歩行、発作などの臨床的神経徴候および症状を含み得る。よって、ここに記載する方法は、対象にここに記載するＣＡＲ発現細胞を投与し、さらに、ＣＡＲ発現細胞処置に由来する可溶性因子のレベル増加を管理する１以上の薬剤の投与を含み得る。ある態様において、対象で増加し得る可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１以上である。ある態様において、対象において増加する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインの１以上である。それゆえに、これらの副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１以上を中和する薬剤であり得る。ある態様において、これらの可溶性形態の１以上を中和する薬剤は、抗体または抗原結合そのフラグメントである、このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦα阻害剤およびＩＬ−６阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の他の例は、エタネルセプトのような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦα阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ  ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ  １３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１およびＦＭ１０１のような抗ＩＬ−６抗体分子である。ある態様において、抗ＩＬ−６抗体分子は、トシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
【０９１２】
ある態様において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、対象にＣＡＲ細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、点滴)前に、同時にまたは後に投与する。一例において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、対象にＣＡＲ細胞投与前に投与する。例えば、リンパ球枯渇性化学療法剤は、ＣＡＲ細胞点滴終了１〜４日(例えば、１日、２日、３日または４日)前に終了する。ある態様において、例えば、ここに記載するように、複数用量のＣＡＲ細胞を投与する。例えば、単一用量は、約５×１０８  ＣＡＲ細胞を含む。ある態様において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、点滴)前、同時または後に対象に投与する。
【０９１３】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を、癌抗原の発現と関係する疾患、例えば、ここに記載する癌の処置のために、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／０７９０００号に記載のような、例えば、ＣＴＬ０１９と組み合わせて対象に投与する。理論に縛られないが、他のＣＡＲ発現細胞と組み合わせたＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞の投与は、初期細胞系譜癌細胞、例えば、癌幹細胞を標的とすることにより、免疫応答を調節することにより、制御性Ｂ細胞を枯渇することによりおよび／または腫瘍微小環境を改善することにより、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を改善すると考えられる。例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞は、初期細胞系譜マーカー、例えば、癌幹細胞およびＣＤ１９発現細胞を発現する癌細胞を標的とするのに対し、他のここに記載するＣＡＲ発現細胞は、後期細胞系譜マーカー、例えば、ＣＤ３３を発現する癌細胞を標的とする。この前処理アプローチは、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の効果を改善できる。このような態様において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞を、第二ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、点滴)前、同時または後に投与する。
【０９１４】
ある態様において、ＣＤ１９以外の癌抗原を標的とするＣＡＲを発現するＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲも発現する。ある態様において、非ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を、ここに記載する癌、例えば、ＡＭＬの処置ために対象に投与する。ある態様において、一方または両方のＣＡＲ分子の配置は、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、一方または両方のＣＡＲ分子の配置は、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび２以上、例えば、２、３、４または５またはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。このような態様において、非ＣＤ１９  ＣＡＲ分子およびＣＤ１９  ＣＡＲは、同一または異なる一次細胞内シグナル伝達ドメイン、同一または異なる共刺激性シグナル伝達ドメインまたは同数または異なる数の共刺激性シグナル伝達ドメインを有し得る。あるいは、非ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＣＤ１９  ＣＡＲは、スプリットＣＡＲとして配置され、そこで、ＣＡＲ分子の一方は抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４−１ＢＢ)を含み、他のＣＡＲ分子は抗原結合ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を含む。
【０９１５】
血液癌
血液癌状態は、血液、骨髄およびリンパ系に影響する白血病、リンパ腫および悪性リンパ球増殖状態のようなタイプの癌である。
【０９１６】
白血病は急性白血病および慢性白血病に分類できる。急性白血病はさらに急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)として分類され得る。慢性白血病は慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含む。他の関連する状態は、骨髄球性血液細胞の産生不良(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションであり、ＡＭＬに癌化するリスクがある、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ、以前は“前白血病状態”として知られる)である。
【０９１７】
リンパ腫は、リンパ球から生じる血液細胞腫瘍の群である。代表的リンパ腫は非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
【０９１８】
組み合わせ治療
低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与を含むここに記載する方法を、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。
【０９１９】
ここで使用する“組み合わせ”投与は、２(またはそれ以上)の異なる処置を、対象が障害に苦しんでいる過程の間に対象に送達することを意味し、例えば、２以上の処置を、対象が障害と診断された後にかつ障害が治癒または撲滅される前にまたは処置が他の理由で中止される前に送達される。ある態様において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第二の処置の送達開始時にまだ行われている。これは、ここでは“同時の”または“一緒の送達”ということがある。他の態様において、他の態様において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれかの場合のある態様において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第二処置剤はより有効である、例えば、等しい効果が少ない第二処置剤で見られるまたは第二処置剤が、第二処置剤を第一処置剤非存在下で投与したときに見られるよりも大きな程度で症状を軽減するまたは第一処置剤で同様な状況が見られる。ある態様において、送達、障害と関係する症状または他のパラメータの減少が、他方の処置剤の非存在下で一方の処置剤の送達で観察されるより大きい。２処置の効果は一部相加的、完全相加的または相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第一処置の効果が、第二剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。
【０９２０】
ここに記載するＣＡＲ発現細胞、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤および少なくとも一つのさらなる治療剤を同時に、同じまたは別の組成物でまたは逐次的に投与できる。３剤を任意の順番で投与してよい。例えば、逐次投与において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤およびここに記載するＣＡＲ発現細胞をまず投与してよく、さらなる薬剤を次に投与してよく、または投与の順番は逆でよい。
【０９２１】
ＣＡＲ治療および／または他の治療剤、方法またはモダリティーを、活動性障害の期間または寛解または低活動性疾患の期間に投与できる。ＣＡＲ治療を、他の処置の処置前、処置と同時、処置後または障害の寛解中に投与できる。
【０９２２】
組み合わせて投与するとき、ＣＡＲ治療およびさらなる薬剤(例えば、第二または第三の薬剤)または全てを、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または投与より高い、低いまたは同じ量または用量で投与できる。ある態様において、ＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)を生じるＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、同じ治療効果を達成するのに必要な、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低い)。
【０９２３】
さらなる面において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与を、手術、化学療法、放射線、ｍＴＯＲ経路阻害剤、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような他の免疫除去剤のような処置レジメンと組み合わせて使用し得る。Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のようなペプチドワクチン。
【０９２４】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与を、ｍＴＯＲ経路阻害剤、例えば、ｍＴＯＲを含む生物学的経路内にある、ｍＴＯＲ以外の標的に作用することにより、ｍＴＯＲ経路活性化を減少する薬剤と組み合わせて使用し得る。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤を組み合わせることにより、より増強されたｍＴＯＲ阻害が達成できる。ある態様において、ｍＴＯＲ経路阻害剤は、メトホルミンまたはそのアナログ、薬学的に許容される形態またはプロドラッグのようなアデノシンモノホスフェート活性化タンパク質キナーゼ(ＡＭＰＫ)のアクティベーターである。ここでの非限定的な理論により、ＡＭＰＫ(例えば、メトホルミンによる)の刺激は、ｍＴＯＲリボソームＳ６キナーゼ経路の阻害にいたり得る。ある態様において、ｍＴＯＲ経路阻害剤は、ビタミンＥ、ビタミンＡ、抗細菌抗生物質、抗酸化剤、Ｌ−カルニチン、リポ酸、メトホルミン、レスベラトロール、レプチン、非ステロイド抗炎症剤またはＣＯＸ阻害剤またはそのアナログ、薬学的に許容される形態またはプロドラッグからなる群から選択される。ある態様において、ｍＴＯＲ経路阻害剤は、国際出願ＷＯ２０１０／０５６７５４号またはＷＯ２００８／１１０４９１号またはLiu et al, Anticancer Res., 32: 1627-1638 (2012)に記載され、その各々を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０９２５】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与を、化学療法剤と組み合わせて使用できる。化学療法剤の例は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン))、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)のような免疫調節剤を含む。
【０９２６】
低い免疫増強用量のｍＴＯＲおよびＣＡＲ細胞療法と組み合わせて使用する一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))、ブスルファン(マイレラン(登録商標))、ブスルファン注(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、シスプラチン(Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはＮｅｏｓａｒ(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(ＤｅｐｏＣｙｔ(登録商標))、ダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ)、塩酸ダウノルビシン(Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射(ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、Ｒｕｂｅｘ(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、５−フルオロウラシル(アドルシル(登録商標)、エフデックス(登録商標))、フルタミド(Ｅｕｌｅｘｉｎ(登録商標))、テザシチビン、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(ＩＦＥＸ(登録商標))、イリノテカン(Ｃａｍｐｔｏｓａｒ(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(ＥＬＳＰＡＲ(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、６−メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Ｆｏｌｅｘ(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ｐｈｏｅｎｉｘ(イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ)、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０とカルムスチンインプラント(グリアデル(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(ノルバデックス(登録商標))、テニポシド(Ｖｕｍｏｎ(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Ｔｉｒａｚｏｎｅ(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(ハイカムチン(登録商標))、ビンブラスチン(Ｖｅｌｂａｎ(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
【０９２７】
本発明の化合物と組み合わせるための特に興味深い抗癌剤は、アントラサイクリン；アルキル化剤；代謝拮抗剤；カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンまたはｐ７０Ｓ６キナーゼＦＫ５０６)を阻害するまたはｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬剤；ｍＴＯＲ阻害剤(例えば、癌処置に適する用量)；免疫調節剤；アントラサイクリン；ビンカアルカロイド；プロテオソーム阻害剤；ＧＩＴＲアゴニストタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；ＣＤＫ４キナーゼ阻害剤；ＢＴＫ阻害剤；ＭＫＮキナーゼ阻害剤；ＤＧＫキナーゼ阻害剤；または腫瘍溶解性ウイルスを含む。
【０９２８】
代謝拮抗剤の例は、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤)：メトトレキサート(リウマトレックス(登録商標)、Ｔｒｅｘａｌｌ(登録商標))、５−フルオロウラシル(Ａｄｒｕｃｉｌ(登録商標)、エフデックス(登録商標)、フルオロプレクス(登録商標))、フロクスウリジン(ＦＵＤＦ(登録商標))、シタラビン(Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(登録商標)、Ｔａｒａｂｉｎｅ  ＰＦＳ)、６−メルカプトプリン(プリントール(登録商標)))、６−チオグアニン(チオグアニンＴａｂｌｏｉｄ(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、ペントスタチン(Ｎｉｐｅｎｔ(登録商標))、ペメトレキセド(アリムタ(登録商標))、ラルチトレキセド(トムデックス(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、クロファラビン(Ｃｌｏｆａｒｅｘ(登録商標)、クロラール(登録商標))、アザシチジン(ビダーザ(登録商標))、デシタビンおよびゲムシタビン(ジェムザール(登録商標))を含むが、これらに限定されない。好ましい代謝拮抗剤は、シタラビン、クロファラビンおよびフルダラビンを含む。
【０９２９】
低い免疫増強用量のｍＴＯＲおよびＣＡＲ細胞療法と組み合わせて使用するアルキル化剤の例は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼン)：ウラシルマスタード(アミノウラシルマスタード(登録商標)、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ(登録商標)、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ(登録商標)、Ｎｏｒｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ(登録商標)、ウラムスチン(登録商標)、ウラムスチン(登録商標))、クロルメチン(Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｃｌａｆｅｎ(登録商標)、エンドキサン(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、ＲｅｖｉｍｍｕｎｅTM)、イホスファミド(Ｍｉｔｏｘａｎａ(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、ピポブロマン(Ａｍｅｄｅｌ(登録商標)、Ｖｅｒｃｙｔｅ(登録商標))、トリエチレンメラミン(ヘメル(登録商標)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標)、Ｈｅｘａｓｔａｔ(登録商標))、トリエチレンチオホスホロアミン、テモゾロミド(テモダール(登録商標))、チオテパ(Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))、ブスルファン(Ｂｕｓｉｌｖｅｘ(登録商標)、マイレラン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、ロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))を含むが、これらに限定されないロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))。アルキル化剤のさらなる例は、オキサリプラチン(エロキサチン(登録商標))；テモゾロミド(テモダール(登録商標)およびテモダール(登録商標))；ダクチノマイシン(別名アクチノマイシン−Ｄ、コスメゲン(登録商標))；メルファラン(別名Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタード、アルケラン(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))；ベンダムスチン(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))；ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびマイレラン(登録商標))；カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))；ロムスチン(別名ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ(登録商標))；シスプラチン(別名ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)およびＰｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)−ＡＱ)；クロラムブシル(リューケラン(登録商標))；シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびＮｅｏｓａｒ(登録商標))；ダカルバジン(別名ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；イホスファミド(Ｉｆｅｘ(登録商標))；Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ；プロカルバジン(Ｍａｔｕｌａｎｅ(登録商標))；メクロレタミン(別名窒素マスタード、ムスチンおよび塩酸メクロロエタミン、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))；ストレプトゾシン(Ｚａｎｏ���ａｒ(登録商標))；チオテパ(別名チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))；シクロホスファミド(エンドキサン(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ(登録商標))；およびベンダムスチンＨＣｌ(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))を含むが、これらに限定されない。
【０９３０】
低い免疫増強用量のｍＴＯＲおよびＣＡＲ細胞療法と組み合わせて使用する免疫調節剤の例は、例えば、アフツズマブ(Ｒｏｃｈｅ(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(Ｎｅｕｌａｓｔａ(登録商標))；レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、レブリミド(登録商標))；サリドマイド(サロミド(登録商標))、ポマリドミド、ａｃｔｉｍｉｄ(ＣＣ４０４７)；およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、ＣＡＳ  ９５１２０９−７１−５、IRX Therapeuticsから入手可能)を含む。
【０９３１】
低い免疫増強用量のｍＴＯＲおよびＣＡＲ細胞療法と組み合わせて使用するアントラサイクリンの例は、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびＲｕｂｅｘ(登録商標))；ブレオマイシン(ｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))；ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、ノバントロン(登録商標))；エピルビシン(ＥｌｌｅｎｃｅTM)；イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(ムタマイシン(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンを含む。
【０９３２】
低い免疫増強用量のｍＴＯＲおよびＣＡＲ細胞療法と組み合わせて使用するビンカアルカロイの例は、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Ｅｌｄｉｓｉｎｅ(登録商標)))；ビンブラスチン(別名硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ(登録商標)およびＶｅｌｂａｎ(登録商標))；およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
【０９３３】
低い免疫増強用量のｍＴＯＲおよびＣＡＲ細胞療法と組み合わせて使用するプロテオソーム阻害剤の例は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))；カーフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)；イキサゾミブクエン酸エステル(ＭＬＮ−９７０８)；デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)；およびＯ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)を含む。
【０９３４】
低い免疫増強用量のｍＴＯＲおよびＣＡＲ細胞療法と組み合わせて使用するＧＩＴＲアゴニストの例は、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
【０９３５】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて対象に投与する。Ｔｒｅｇ細胞数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与およびＧＩＴＲ機能修飾を含む。理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞投与前に対象におけるＴｒｅｇ細胞数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Ｔｒｅｇ)の数を減らし、対象の再発のリスクを減らすと考えられる。ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞の投与前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレーシス前に投与できる。ある態様において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある態様において、対象は癌(例えば、固形癌またはＡＬＬまたはＣＬＬのような血液癌)を有する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。
【０９３６】
ＧＩＴＲアゴニストの例は、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または、例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号抗ＧＩＴＲ抗体に記載のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
【０９３７】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤およびここに記載するＣＡＲ発現細胞を、キナーゼ阻害剤と組み合わせて使用できる。
【０９３８】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、ＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンである。
【０９３９】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、７−シクロペンチル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２−((５−(ピペラジン−１−イル)ピリジン−２−イル)アミノ)−７Ｈ−ピロロ[２,３−ｄ]ピリミジン−６−カルボキサミド(ＬＥＥ０１１とも呼ばれる)；アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６)；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、塩酸塩(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ジナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ  ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
【０９４０】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、７−シクロペンチル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２−((５−(ピペラジン−１−イル)ピリジン−２−イル)アミノ)−７Ｈ−ピロロ[２,３−ｄ]ピリミジン−６−カルボキサミド(ＬＥＥ０１１とも呼ばれる)または６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、塩酸塩(パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも呼ばれる)のような、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤である。
【０９４１】
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、一定期間、１日約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日間連日または２１日サイクルの７〜１２日間連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のパルボシクリブを投与する。
【０９４２】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２−誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
【０９４３】
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)であり、イブルチニブを、約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の用量で、連日一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のイブルチニブを投与する。
【０９４４】
ここでの方法、使用および組成物のある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、引用によりその全体を本明細書に包含させる国際出願ＷＯ／２０１５／０７９４１７号に記載のＢＴＫ阻害剤である。例えば、ある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【化１２】
2017528433.tif 000027
〔式中、
Ｒ１は水素、場合によりヒドロキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は水素またはハロゲンであり；
Ｒ３は水素またはハロゲンであり；
Ｒ４は水素であり、
Ｒ５は水素またはハロゲンであり；
またはＲ４とＲ５は互いに結合し、結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−；−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−；または−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を意味し；
Ｒ６およびＲ７は互いに独立してＨ、場合によりヒドロキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、場合によりハロゲンまたはヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてよいＣ３−Ｃ６シクロアルキルであり；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１は互いに独立してＨまたは場合によりＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；またはＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１の任意の２個は、それらが結合している炭素原子と一体となって３〜６員飽和炭素環式環を形成してよく；
Ｒ１２は水素または場合によりハロゲンもしくはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルであり；
またはＲ１２とＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０またはＲ１１のいずれか一つは、それらが結合している原子と一体となって、４員、５員、６員または７員アザシクロ環を形成してよく、該環は場合によりハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよく；
ｎは０または１であり；
Ｒ１３は場合によりＣ１−Ｃ６アルキルで置換されていてよいＣ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたは場合によりＣ１−Ｃ６アルキルもしくはＣ１−Ｃ６アルコキシで置換されていてよいＮ,Ｎ−ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノＣ２−Ｃ６アルキニル；または場合によりＣ１−Ｃ６アルキルで置換されていてよいＣ２−Ｃ６アルキレニルオキシドである。〕。
【０９４５】
ある態様において、式ＩのＢＴＫ阻害剤は、Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−エノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−イノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−４−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルプロピオｌアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(４−メトキシ−Ｎ−メチルブト−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−インアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルオキシラン−２−カルボキサミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−８−フルオロ−１−オキソイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドエトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−エチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−(２−フルオロエチル)アクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリルアミドシクロプロピル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドプロポキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(ブト−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブト−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(３−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブト−２−イノイル)ピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オンＮ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−１−オキソ−３,４−ジヒドロイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；２−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オンＮ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−��ル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブト−２−イノイル)−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−３−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｒ,３Ｓ)−１−アクリロイル−３−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；またはＮ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミドから選択される。
【０９４６】
特に断らない限り、上記式ＩのＢＴＫ阻害剤で使用した化学的用語は、引用によりその全体を本明細書に包含させる国際出願ＷＯ／２０１５／０７９４１７号に示す意味に従い使用する。
【０９４７】
ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤なる表題の本明細書の他の箇所における選択肢から選択できる。ここでいう用量は低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤ではなく、抗癌効果を発揮するのに十分な用量であり、例えば、ここに記載する低い免疫増強用量より高い、用量である。それゆえに、ある態様において、２種の異なる用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、免疫エフェクター細胞機能を最適化するための低い免疫増強用量、および抗癌効果を得るための高用量を与える。
【０９４８】
ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、抗癌効果を得るのに十分であり、かつここに記載する低い免疫増強用量より高い用量、例えば、約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)の用量で連日、一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のラパマイシンを投与する。
【０９４９】
ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを、抗癌効果を得るのに十分であり、かつここに記載する低い免疫増強用量より高い用量、例えば、一定期間、１日約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のエベロリムスを投与する。
【０９５０】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
【０９５１】
カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)も使用できる。
【０９５２】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体(例えば、抗ＣＤ２０単−または二重特異的抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。抗ＣＤ２０抗体の例は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１(Genentech)を含むが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43参照。
【０９５３】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与する。ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞内で選択的に複製し、その死を誘発するかまたは増殖を遅延することができる。ある場合、腫瘍溶解性ウイルスは、非癌細胞に効果を有しないか効果が最小である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルスまたは腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス(例えば、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)、腫瘍溶解性麻疹ウイルスまたは腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ))を含むが、これらに限定されない。
【０９５４】
ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、その全体を引用により本明細書に包含させるＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１号に記載のウイルス、例えば、組み換え腫瘍溶解性ウイルスである。ある態様において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１号に記載のような、免疫または炎症性応答の阻害剤をコードする核酸配列(例えば、異種核酸配列)を含む。ある態様において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、例えば、腫瘍溶解性ＮＤＶは、アポトーシス促進性タンパク質(例えば、アポプチン)、サイトカイン(例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、腫瘍壊死因子−アルファ)、免疫グロブリン(例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチンに対する抗体)、腫瘍関連抗原、二特異性アダプタータンパク質(例えば、ＮＤＶ  ＨＮタンパク質およびＣＤ３またはＣＤ２８のようなＴ細胞共刺激性受容体に対する二特異性抗体または抗体フラグメント；またはヒトＩＬ−２およびＮＤＶ  ＨＮタンパク質に対する一本鎖抗体の融合タンパク質)を含む。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるZamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67参照。ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、各々引用によりその全体を本明細書に包含させるＵＳ８５９１８８１Ｂ２号、ＵＳ２０１２／０１２２１８５Ａ１号またはＵＳ２０１４／０２７１６７７Ａ１号に記載のキメラ腫瘍溶解性ＮＤＶである。
【０９５５】
ある態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、排他的に癌細胞において複製するよう設計された、条件的複製アデノウイルス(ＣＲＡｄ)である。例えば、Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27参照。ある態様において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、その全体を引用により本明細書に包含させるAlemany et al.の７２５頁の表１に記載のものを含む。
【０９５６】
腫瘍溶解性ウイルスの例は、次のものを含むが、これらに限定されない。
Ｂ群腫瘍溶解性アデノウイルス(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT02053220参照)；
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)を含むアデノウイルスであるＯＮＣＯＳ−１０２(以前はＣＧＴＧ−１０２と呼ばれた)(Oncos Therapeutics)(例えば、 Clinical Trial Identifier: NCT01598129参照)；
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする遺伝的に修飾された腫瘍溶解性ヒトアデノウイルスであるＶＣＮ−０１(VCN Biosciences, S.L.)(例えば、Clinical Trial Identifiers: NCT02045602およびNCT02045589参照)；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路の脱制御を伴い癌細胞で選択的に複製するように修飾されている野生型ヒトアデノウイルス血清型５(Ｈａｄ５)由来のウイルスである条件的複製アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ−５(Institut Catala d'Oncologia)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01864759参照)；
ＩＣＯＶＩＲ５、腫瘍溶解性アデノウイルスで感染させた骨髄由来自己間葉性幹細胞(ＭＳＣ)を含むCelyvir(Hospital Infantil Universitario Nino Jesus, Madrid, Spain/Ramon Alemany)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01844661参照)；
ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターが必須Ｅ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動し、それによりＲｂ経路欠損腫瘍細ウイルス複製および細胞毒性を制限する、条件複製腫瘍溶解性血清型５アデノウイルス(Ａｄ５)であるＣＧ００７０胞に対する(Cold Genesys, Inc.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT02143804参照)；または
路網膜芽細胞腫(Ｒｂ)経路欠損細胞で選択的に複製し、ある種のＲＧＤ結合インテグリンをより効率的に発現する細胞に感染するように操作されているアデノウイルスであるＤＮＸ−２４０１(以前の名前デルタ−２４−ＲＧＤ)(Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/ DNAtrix, Inc.)(例えば、Clinical Trial Identifier: NCT01956734参照)。
【０９５７】
ある態様において、ここに記載する腫瘍溶解性ウイルスを、注射、例えば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射により投与する。ある態様において、ここに記載する腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍内、経皮、経粘膜、経口、鼻腔内または肺投与により投与する。
【０９５８】
さらなる面において、本発明の細胞組成物を、患者に骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤、体外照射療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはＯＫＴ３またはキャンパスのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて(例えば、前に、同時にまたは後に)投与し得る。ある面において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後に投与する。例えば、ある態様において、対象を、高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付す。ある態様において、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。
【０９５９】
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用を低減または緩和する薬剤を投与することができる。ＣＡＲ発現細胞の投与に付随する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも呼ばれる血液貪食リンパ組織球増多症(ＨＬＨ)を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛(arthalgias)、悪心、嘔吐、頭痛などの臨床的体質的徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹などの臨床皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢のような臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症のような臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧の増大、低血圧、心拍出量の増加(早期)および心拍出量の低下(後期)などの臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、凝固兆候およびｄ−二量体増加、出血の有無にかかわらず低フィブリノーゲン血などの症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症などの臨床腎徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症などの臨床肝徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態の変化、混乱、せん妄、単語発見困難またはフランク失語、幻覚、振戦、ジメトリア、異常歩行、発作などの臨床的神経徴候および症状を含み得る。よって、ここに記載する方法は、対象にここに記載するＣＡＲ発現細胞を投与し、さらに、ＣＡＲ発現細胞処置に由来する可溶性因子のレベル増加を管理する１以上の薬剤の投与を含み得る。ある態様において、対象で増加し得る可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１以上である。ある態様において、対象において増加する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインの１以上である。それゆえに、これらの副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１以上を中和する薬剤であり得る。ある態様において、これらの可溶性形態の１以上を中和する薬剤は、抗体または抗体そのフラグメントである、このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦα阻害剤およびＩＬ−６阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の他の例は、エタネルセプトのような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦα阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ  ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ  １３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１およびＦＭ１０１のような抗ＩＬ−６抗体分子または抗ＩＬ−６受容体抗体分子である。ある態様において、抗ＩＬ−６受容体抗体分子は、トシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
【０９６０】
ある態様において、対象を、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤と投与できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る、例えば、薬剤は、チェックポイント阻害剤である。阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ−１)は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害はＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載のような、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写−アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞の阻害分子の発現を阻害できる。ある態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある態様において、阻害分子はＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの態様において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲの要素、例えば、要素全部をコードする核酸と連結する。
【０９６１】
ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子を、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が、発現、例えば、ＣＡＲ発現細胞内で発現されるようにプロモーター、例えば、Ｈ１またはＵ６駆動プロモーターに操作可能に連結する。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,” Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi)参照。Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸分子を含む、同じベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に存在する。このような態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸に５’または３’に位置するベクター、例えば、レンチウイルスベクターに位置する。Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸と同一または異なる方向で転写され得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、要素の全てをコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞内で一過性に発現される。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定に統合される。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子はＰＤ−１である。
【０９６２】
ある態様において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子と結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る(例えば、イピリムマブ(別名ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１およびヤーボイ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６として既知))。ある態様において、ある態様において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤、例えば、阻害分子の阻害剤を、同種異系ＣＡＲ、例えば、同種異系ここに記載するＣＡＲと組み合わせて投与する(例えば、ここでの同種異系ＣＡＲにおいて記載)。ある態様において、ＰＤ１阻害剤を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞増加またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞をもたらすように低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与の後に、例えば、Ｔ細胞増加／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比の後に投与する。
【０９６３】
ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ−１の２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２がＰＤ−１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転できる。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は知られ、本発明のここに記載するＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ(別名ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６；Bristol-Myers Squibb)は、特異的にＰＤ−１を遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ピディリズマブ(ＣＴ−０１１；Cure Tech)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体はＷＯ２００９／１０１６１１号に開示されている。ペンブロリズマブ(以前はランブロリズマブとして知られ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＭＫ０３４７５とも呼ばれる；Merck)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示されている。ＭＥＤＩ４７３６(Medimmune)は、ＰＤＬ１に結合し、リガンドとＰＤ１の相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ(Genentech/Roche)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＰＤ−Ｌ１に対するＭＤＰＬ３２８０Ａおよび他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許７,９４３,７４３号およびＵ.Ｓ公開２０１２００３９９０６号に記載されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤は、ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０(重鎖および軽鎖可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および２１に示される)およびＭＤＸ−１  １０５(別名ＢＭＳ−９３６５５９および例えば、ＷＯ２００７／００５８７４号に開示される抗ＰＤ−Ｌ１結合剤)である。ＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇ；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ−１抗体は、とりわけ、ＡＭＰ  ５１４(Amplimmune)、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ−１抗体を含む。
【０９６４】
ＴＩＭ３(Ｔ細胞免疫グロブリン−３)も、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４＋  Ｔヘルパー１およびＣＤ８＋  Ｔ細胞毒性１細胞において、Ｔ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞枯渇に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えば、ガレクチン−９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は免疫応答を高め得る。ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用を阻害するためにＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３−２３のヒト化バージョン(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異性抗体はＵＳ２０１３０１５６７７４号に開示されている。
【０９６５】
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体の例は、ＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に開示され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４；または例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に開示のようなその組み換え形態である。他の態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−５と結合するかまたは例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
【０９６６】
理論に縛られることを望まないが、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５のような癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害を仲介すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、そしてＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性および枯渇に役割を有するとしてが記載されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848)。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の共遮断が、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014), supra参照)。他の態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載されるようにＴ細胞耐容性を減少させる。それゆえに、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤)と使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。
【０９６７】
ＬＡＧ−３(リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞枯渇に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ−３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)は、アンタゴニストＬＡＧ−３抗体であり、ＩＭＰ７３１(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は枯渇性ＬＡＧ−３抗体である。他のＬＡＧ−３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分とＭＨＣクラスII分子のＩｇの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化するＩＭＰ３２１(Immutep)である。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示されている。
【０９６８】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば、ここに記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある態様において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または例えば、ここに記載する、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。他の態様において、融合タンパク質は、本発明の抗ＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞により発現される。
【０９６９】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はｍｉＲ−１７−９２である。
【０９７０】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲの活性を増強する薬剤はサイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞増殖、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を受ける対象に投与できるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１またはこれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。サイトカインを、１日１回または１日１回以上、例えば、１日２回、１日３回または１日４回投与できる。サイトカインを、１日以上投与でき、例えば、サイトカインを２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間または４週間投与する。例えば、サイトカインを１日１回、７日間投与する。
【０９７１】
ある態様において、サイトカインをＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与する。サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞と同時にまたは一緒に投与でき、例えば、同じ日に投与する。サイトカインをＣＡＲ発現細胞と同じ医薬組成物に製剤しても、別の医薬組成物に製剤してもよい。あるいは、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与後間もなく、例えば、ＣＡＲ発現細胞投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与してよい。サイトカインを１日を超える投薬レジメンで投与する態様において、サイトカイン投薬レジメンの１日目はＣＡＲ発現細胞の投与と同じ日でよく、またはサイトカイン投薬レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現細胞の投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後であってよい。ある態様において、１日目に、ＣＡＲ発現細胞を対象に投与し、２日目に、サイトカインを１日１回、翌７日間投与する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。
【０９７２】
他の態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与から十分な期間後、例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与から少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上の後に投与する。ある態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。例えば、対対象にここに記載する用量およびレジメンに従い、ＣＡＲ発現細胞を投与する。ＣＡＲＴ治療応答に対する対象の応答を、腫瘍増殖阻止、循環腫瘍細胞減少または腫瘍退縮を含む、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ発現細胞の投与２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後に評価する。ＣＡＲＴ治療に対して十分な応答を示さない対象にサイトカインを投与し得る。ＣＡＲＴ治療に対して応答が最適以下である対象へのサイトカインの投与はＣＡＲＴ有効性または抗腫瘍活性を改善する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞の当の後投与されるサイトカインはＩＬ−７である。
【０９７３】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を、低い免疫増強用量で、癌、例えば、ここに記載する癌を有する対象に、ＣＡＲを有する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞と投与する。対象は、ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて、そのタイプの癌で承認されている薬物のようなさらなる治療剤での処置を受け得る。例えば、下記表２は、種々の癌およびその承認された処置の一覧を提供する。
【０９７４】
【表１５】
2017528433.tif 000028
【表１６】
2017528433.tif 000029
【０９７５】
【表１７】
2017528433.tif 000030
【表１８】
2017528433.tif 000031
【０９７６】
【表１９】
2017528433.tif 000032
【表２０】
2017528433.tif 000033
【０９７７】
【表２１】
2017528433.tif 000034
【表２２】
2017528433.tif 000035
【０９７８】
【表２３】
2017528433.tif 000036
【０９７９】
ある態様において、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ここに記載するタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて低い免疫増強用量で対象に投与する。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムのような、例えば、ここに記載するＳＨＰ−１阻害剤である。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−２阻害剤、例えば、ここに記載するＳＨＰ−２阻害剤である。
【０９８０】
医薬組成物：ｍＴＯＲ阻害剤
ある面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ細胞と組み合わせて使用するために製剤された、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を含む医薬組成物である。
【０９８１】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲ細胞に加えて、例えば、ここに記載するような、他の薬剤と組み合わせて投与するために製剤する。
【０９８２】
一般に、本発明の化合物を、上記のように、通常のかつ許容される当分野で知られる任意の方法により、単独でまたは１以上の治療剤と組み合わせて投与する。
【０９８３】
医薬製剤は、慣用の溶解および混合法を使用して製造できる。例えば、原体物質(例えば、ｍＴＯＲ阻害剤または該化合物の安定化形態(例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知複合化薬物との複合体))を、ここに記載する添加物の１以上の存在下、適当な溶媒に溶解させる。ｍＴＯＲ阻害剤は、一般に薬物の投与量を容易に制御可能とし、患者に洗練され、取り扱いが容易な製品を与えるような、医薬投与形態に製剤される。
【０９８４】
本発明の化合物は、慣用の経路で、特に経腸的に、例えば、経口で、例えば、錠剤またはカプセルの形でまたは非経腸的に、例えば、注射可能溶液剤または懸濁液剤の形で、局所的に、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形でまたは経鼻または坐薬により、医薬組成物として投与され得る。ＭＴＯＲ阻害剤をここに記載する他の薬剤と組み合わせて(同時にまたは別々に)投与するとき、一つの面において、両成分を同じ経路で(例えば、非経腸的に)投与し得る。あるいは、他の薬剤を、ｍＴＯＲ阻害剤と異なる経路で投与し得る。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤を経口で投与してよく、他の薬剤を非経腸的に投与してよい。遊離形態または薬学的に許容される塩形態のｍＴＯＲ阻害剤を、少なくとも１個の薬学的に許容される担体または希釈剤とともに含む医薬組成物は、混合法、造粒法またはコーティング法による通常の方法で製造できる。例えば、例えば、経口組成物は、活性成分とともにａ)希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ)滑沢剤、例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール；錠剤についてはまたｃ)結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびまたはポリビニルピロリドン；場合によりｄ)崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩または起沸性混合物；および／またはｅ)吸収剤、着色剤、香味剤および甘味剤を含む錠剤またはゼラチンカプセル剤であり得る。経口製剤はまた活性成分を２０〜６０％Eudragit EPO、ヒドロキシプロピルセルロースＥＦ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはKollidon VA64および５％までのpluronic F68、Cremophor ELまたはGelucire 44/14とともに含み得る。注射可能組成物は、水性等張溶液剤または懸濁液剤であり、坐薬は脂肪エマルジョンまたは懸濁液から製造できる。組成物は滅菌してよくおよび／または防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調整用塩類および／または緩衝液のようなアジュバントを含んでよい。加えて、さらに、他の治療的に価値ある物質も含み得る。経皮適用に適当な製剤は、本発明の化合物の有効量を担体とともに含む。担体は、宿主の皮膚の通過を助けるために吸収性の薬理学的に許容される溶媒を含み得る。例えば、経皮デバイスは、裏打ち部材、化合物を場合により担体と共に含む貯蔵部、場合により化合物を宿主皮膚に制御されかつ予定された速度で長期間にわたり送達するための速度制御バリアおよび該デバイスを皮膚に固定するための手段を含む、バンデージの形であり得る。マトリックス経皮製剤も使用し得る。さらなる面において、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を、マイクロニードルパッチにより投与し得る。マイクロニードルベースの薬物送達は当分野で周知であり(例えば、米国特許８,１６２,９０１号参照)、当業者は、これらの技術および方法を、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤の投与に応用できる。例えば、皮膚および眼への局所適用のための適当な製剤は、好ましくは当分野��周知の水溶液、軟膏、クリームまたはゲルである。このような製剤は可溶化剤、安定化剤、張性増加剤、緩衝液および防腐剤を含み得る。
【０９８５】
適用のための医薬組成物(または製剤)は、薬物の投与に使用される方法によって、多様な方法で包装され得る。一般に、分配用物品は、適当な形態で医薬製剤が入れられている容器を含む。適当な容器は当業者に周知であり、ビン(プラスチックおよびガラス)、サシェット、アンプル、ビニール袋、金属シリンダーなどのような物質を含む。容器は、包装容器への軽率な接近を阻止するために、不正開封防止機構も含んでよい。加えて、容器は、容器の中身を記載するラベルがそれに付される。標識は適切な警告も含み得る。本発明はまた、ａ)ここに記載するような遊離形態または薬学的に許容される塩形態のｍＴＯＲ阻害剤である第一剤およびｂ)少なくとも一つのさらなる薬剤を含む医薬組み合わせ、例えばキットも提供する。キットは、その投与指示を含んでよい。
【０９８６】
用語“組み合わせ剤”は、１個を超える活性成分の混合または組み合わせに由来する産物を意味し、活性成分の固定されたおよび固定されていない組み合わせの両者を含む。用語“固定された組み合わせ”は、複数活性成分、例えばｍＴＯＲ阻害剤と他の薬剤が、両者とも患者に、同時に一個の物または投与量として投与されることを意味する。用語“非固定されていない組み合わせ”は、複数活性成分、例えばｍＴＯＲ阻害剤と他の薬剤を、別々の物として、同時に、一緒にまたは別々に具体的時間制限なく患者に投与し、ここで、このような投与が、患者の体内で２化合物の治療的有効レベルを提供することを意味する。後者はまたカクテル療法、例えば３種以上の活性成分の投与にも適用される。
【０９８７】
持続放出
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、製品安定性要求を満たすおよび／または平均血漿ピーク濃度減少、薬物吸収の程度および血漿ピーク濃度の患者間および患者内ばらつき減少、Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比減少および／または食効減少のような即時放出(ＩＲ)錠剤より都合よい薬物動態特性を有する、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む経口固体投与形態の形の医薬製剤として提供できる。提供された医薬製剤は、より厳密な用量調節を可能にするおよび／または有害事象の頻度を減少させ、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１での患者のより安全な処置を提供することができる。
【０９８８】
ある態様において、本発明は、多粒子系であり、機能的層およびコーティングを有し得る、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤を提供する。
【０９８９】
ここで使用する用語“持続放出、多粒子製剤”は、長時間にわたり、例えば少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間にわたり、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の放出を可能とする製剤である。持続放出製剤は、活性成分を摂取後長時間にわたり利用可能とするような方法で製剤された、例えば、ここに記載する、特別の添加物からなるマトリクスおよびコーティングを含み得る。
【０９９０】
用語“持続放出”は用語“徐放”(ＳＲ)または“持効性放出”と交換可能に使用する。用語“持続放出”は、錠剤およびカプセル剤についての欧州薬局方(第７版)モノグラフおよびＵＳＰの医薬投与形態についての一般的な章＜１１５１＞の定義に従う、活性薬物物質を、経口投与直後ではなく、長時間にわたり放出する医薬製剤をいう。ここで使用する用語“即時放出”(ＩＲ)は、Guidance for Industry: “Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms” (FDA CDER, 1997)の定義に従い、６０分以内に活性薬物物質の８５％を放出する医薬製剤である。ある態様において、用語“即時放出”は、例えば、ここに記載する溶解アッセイで測定して、エベロリムスの錠剤からの３０分以内の放出を意味する。
【０９９１】
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、ここに記載する溶解アッセイのような当分野で知られるアッセイを使用してインビトロ放出プロファイルにより特徴付けできる。３７℃でドデシル硫酸ナトリウム０.２％を含む９００mLリン酸緩衝液ｐＨ６.８で魅した溶解容器で、それぞれＵＳＰ試験モノグラフ７１１および欧州薬局方試験モノグラフ２.９.３.に従い、ＵＳＰに従い、パドル法で、７５rpmで溶解を行う。
【０９９２】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ放出アッセイで、次の放出明細に従いｍＴＯＲ阻害剤を放出する。
０.５時間：＜４５％または＜４０、例えば、＜３０％
１時間：２０〜８０％、例えば、３０〜６０％
２時間：＞５０％または＞７０％、例えば、＞７５％３時間：＞６０％または＞６５％、例えば、＞８５％、例えば、＞９０％。
【０９９３】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ溶解アッセイで、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分または１２０分より速くｍＴＯＲ阻害剤の５０％を放出しない。
【０９９４】
ある態様において、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定持続放出製剤は、速溶性または分解性担体マトリックスにｍＴＯＲ阻害剤をコーティングと組み合わせて含み、ここで、コーティングの少なくとも一つは、持続放出コーティングである。他の態様において、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定持続放出製剤は、ｍＴＯＲ阻害剤を持続放出特性を有する非分解性担体マトリックスに含み、これは、場合によりさらなるコーティングと組み合わせることができる。
【０９９５】
ある態様において、担体マトリクスはマトリクス形成剤、概してマトリクス形成ポリマーを含み、充填剤、例えば、ラクトース、マンニトール、マルトデキストリン、アルファ化デンプン、リン酸カルシウムまたは微結晶性セルロースおよび崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、クロスカルメロース、デンプングリコール酸ナトリウムまたはクロスポビドン、抗酸化剤、例えば、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルオール、アスコルビルパルミテート、トコフェロール、ビタミンＥポリエチレングリコールスクシネートおよび滑沢剤および流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはフマル酸ステアリルナトリウムのような処理改良剤のようなさらなる添加物を含み得る。用語“マトリクス形成剤”は、一般に、例えば、機械的または結合安定性のような物理的安定性を提供する、薬学的不活性物質に関する。
【０９９６】
速く溶解または崩壊する担体マトリクスに使用するための適当なマトリクス形成ポリマーは当分野で知られ、例えばセルロースまたはデンプン、例えば微結晶性セルロース(“ＭＣＣ”)、例えばＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ  １０１(FMC BioPolymer)、アカシア、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(“ＨＰＭＣ”)、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドン(“ＰＶＰ”)、ＧＰ  ８１２のようなカラゲナンまたはそれらの組み合わせを含む。
【０９９７】
持続放出特性を備えた非崩壊担体マトリクスのための適当なマトリクス形成添加物は当分野で知られ、例えばアカシア、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム(または“ＣＭＣナトリウム”)、メチルセルロース、エチルセルロースおよびセルロースアセテートまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマー(Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ／ＲＬ)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(“ＨＰＭＣ”)、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアセテート、ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドン(“ＰＶＰ”)、例えば、GP 812のようなカラゲナン、モノステアリン酸グリセリル、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、ビタミンＥポリエチレングリコールスクシネートまたはそれらの組み合わせを含む。
【０９９８】
ある態様において、徐放性コーティングは、水不溶性、非崩壊ポリマーから形成される層であり、この層により薬物の浸透による遊離を制御する。
【０９９９】
徐放性コーティングはまた１個以上の多孔形成剤、可塑剤ならびに滑沢剤および固化防止剤のような処理改良剤を含み得る。拡散制御放出を可能にする適当な徐放性コーティング形成ポリマーは当分野で知られ、例えばエチルセルロースおよびセルロースアセテートまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマー(Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ／ＲＬ)、ポリビニルアセテートまたはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、徐放性コーティング形成ポリマーはエチルセルロースまたはセルロースアセテートまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマータイプＡ(Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ)またはアミノメタクリレートコポリマータイプＢ(Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＬ)またはそれらの組み合わせである。さらに、徐放性コーティングはトリアセチン、トリエチルシトレート、ジブチルセバケート、ジエチルセバケート、ポリエチレングリコール３０００、４０００または６０００、アセチルトリエチルシトレート、アセチルトリブチルシトレートまたはジエチルフタレートのような可塑剤および／またはＳｙｌｏｉｄ  ２４４  ＦＰ、タルク、モノステアリン酸グリセリルまたは二酸化チタンのような固化防止剤を含み得る。ある態様において、可塑剤の量は、徐放性ポリマーの量に対して５〜４０％、好ましくは１０〜２５％である。
【１０００】
ある態様において、徐放性コーティングは、水不溶性コーティング形成ポリマーおよび孔形成剤を含む孔形成系である。用語“孔形成剤”は、孔の導入またはコーティングの透過性増加可能とし、活性成分の拡散制御放出を可能とする、易溶解性添加物である。適当な孔形成剤は当分野で知られ、例えばヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ(例えば、ＫｌｕｃｅｌTM  ＥＦ、ＥＸＦ，ＬＦ)またはヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ、例えば、ＭｅｔｈｏｃｅｌTM  Ｅ３／Ｅ５、Ｐｈａｒｍａｃｏａｔ  ６０３TM)、ポリエチレングリコール(例えば、Ｍａｃｒｏｇｏｌ  １５００、３５００、４０００、６０００)、ポロクサマー１８８(Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８TM)またはポビドン(ＰＶＰ、例えば、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  Ｋ２５／Ｋ３０)、糖類、例えば、デキストロース、マンノース、フルクトースのような単糖、スクロースまたはグルコジフルクトースのような二糖またはそれらの組み合わせを含む。好ましくは孔形成剤はヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ  (ＫｌｕｃｅｌTM  ＥＦ、ＥＸＦ、ＬＦ)またはヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ、ＭｅｔｈｏｃｅｌTM  Ｅ３／Ｅ５、Ｐｈａｒｍａｃｏａｔ  ６０３TM)、ポリエチレングリコール(Ｍａｃｒｏｇｏｌ  １５００、３５００、４０００、６０００)、ポロクサマー１８８(Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８TM)またはポビドン(ＰＶＰ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  Ｋ２５／Ｋ３０)またはそれらの組み合わせである。ある態様において、コーティングに含まれる孔形成剤の適当な量は、コーティング形成ポリマーの量に対して、例えば１００：２０〜１００：５０または１００：２０〜１００：１００のコーティングポリマー対孔形成剤の比、好ましくは比１００：３５〜１００：４５、特に比１００：３５〜１００：５０に等しい。ある態様において、包含されるコーティング形成ポリマーの適当な量は、医薬製剤の総重量の例えば、４重量％〜１５重量％、５重量％〜１５重量％、好ましくは５重量％〜１２重量％、より好ましくは６重量％〜１２重量％のポリマー重量増加のパーセンテージに等しい。
【１００１】
他の態様において、非崩壊徐放性担体マトリクスは、ポリマーの水和により活性成分の拡散制御放出を可能にする、マトリクス形成ポリマーを含む。持続放出担体マトリクスは、さらに結合剤およびまたは充填剤のような添加物ならびに滑沢剤および流動促進剤などのような処理改良剤を含み得る。
【１００２】
以下の代表的マトリクス形成ポリマーを拡散制御放出用に使用し得る：アルギン酸ナトリウム、ポリアクリル酸(または“カルボマー”)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、(または“ＣＭＣナトリウム”)、メチルセルロース、エチルセルロースおよびセルロースアセテートまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマー(Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ／ＲＬ)、異なる粘性グレード(すなわち、平均ポリマー鎖長)のヒドロキシプロピルメチルセルロース(“ＨＰＭＣ”)およびそれらの組み合わせ、例えば、ＭｅｔｈｏｃｅｌTM  ＣＲグレード、ヒドロキシプロピルセルロース、例えばＫｌｕｃｅｌTM  ＨＦ／ＭＦ、ポリオキシエチレン、例えば、ＰｏｌｙｏｘTMまたはポリビニルピロリドン(“ＰＶＰ”)、例えば、ＰＶＰ  Ｋ６０、Ｋ９０、ＶｉｓｃａｒｉｎTM  ＧＰ−２０９／ＧＰ−３７９のようなカラゲナンまたはそれらの組み合わせ。マトリクス形成ポリマーの組み合わせは、必要に応じた、活性成分の溶解速度の調節を可能とする。
【１００３】
ある態様において、非崩壊徐放性マトリクスは、制御された浸食により活性成分の放出を可能とする添加物で形成される。浸食制御マトリクスは、親油性マトリクス形成剤およびまたさらに充填剤、崩壊剤および滑沢剤および流動促進剤のような処理改良剤のような添加物を含み得る。このマトリクスタイプに関連する代表的親油性マトリクス形成添加物は、モノステアリン酸グリセリル、例えば、Ｃｕｔｉｎａ  ＧＭＳ、ベヘン酸グリセリル、例えば、Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ  ８８８  ＡＴＯ、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ハードファット(hart fat)、例えば、ＧｅｌｕｃｉｒｅTMまたはビタミンＥポリエチレングリコールスクシネート、例えば、Ｓｐｅｚｉｏｌ  ＴＰＧＳまたはそれらの組み合わせのような親油性添加物を含む。
【１００４】
代表的適当な結合剤、充填剤またはさらなる添加物は、マンニトール、アルファ化デンプン、微結晶性セルロース、ラクトース、リン酸カルシウム、タルク、二酸化チタン、トリエチルシトレート、Ａｅｒｏｓｉｌ、例えば、ＢＨＴのような抗酸化剤、乾燥剤および例えば、クロスポビドンまたはデンプングリコール酸ナトリウム、デンプンまたはクロスカルメロースのような崩壊剤を含むが、これらに限定されない。
【１００５】
ある態様において、安定な徐放性製剤は、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を、速く溶解／崩壊するマトリクスに、例えば、ここに記載する固体分散の形で、機能的層またはコーティングとともに含み、機能的層またはコーティングの少なくとも１個は、活性成分の徐放性を可能とする放出制御行動を有する。他の態様において、安定な徐放性製剤は、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を徐放性マトリクス内に含み、これは、場合により、さらに保護的または徐放性層またはコーティングのような機能的層またはコーティングを含み得る。ある態様において、コーティング、例えば、徐放性コーティングは、１０〜１００μm、例えば、１０〜５０μmの範囲の厚さを有する(共焦点ＲＡＭＡＮスペクトロスコピーで評価)。
【１００６】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、多粒子送達系の形である。ある態様において、多粒子薬物送達系は、複数の、小さく分かれた用量単位からなる経口投与形態である。このような系において、カプセル剤、錠剤、サシェ剤またはスティックパック剤のような薬物物質の投与形態は、概して直径０.０５〜２.００mmの数十から数百または最大数千の球形粒子からなる、複数のサブユニットを含み得る。１.５〜３mmサイズの製剤、例えば、ミニ錠剤は他の代替である。投与形態は、胃で急速に崩壊して、多粒子を遊離するように設計し得る。特定の理論に縛られることを望まないが、多粒が胃腸管腔で拡散し、胃から徐々に空にされて、薬物物質を制御された方式で遊離すると考えられる。
【１００７】
一つの態様において、例えば、多粒子送達系の形の、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、例えば、粒子のコアに溶解または分散された(例えば、ビーズ、ペレット、顆粒またはミニ錠剤)または粒子の不活性コアを囲む層に、ｍＴＯＲ阻害剤を活性成分として含む。活性成分は、好ましくは親水性または親油性マトリクス形成添加物を含む徐放性マトリクスに例えば包埋できまたは速く崩壊および／または溶解するマトリクスに機能的層およびトップコーティングと組み合わせて包埋され、ここで、機能的層またはトップコーティングの少なくとも１個は、活性成分の拡散制御持続放出を可能とするコーティング形成ポリマーを含む。場合により、活性成分の安定性を改善するための保護層は、医薬品の安定性を確実にするために活性物質含有マトリクスを機能的層またはトップコーティングから分離する。
【１００８】
他の態様において、例えば、多粒子送達系の形の、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、活性成分としてのｍＴＯＲ阻害剤および不溶性ポリマーおよび孔形成剤としての可溶性成分および場合によりさらに機能的層を含む外側のコーティング層を含む。本発明の目的で、用語“外側の層”は、粒子の外側に位置する層であり、さらなる層でコーティングされてよくまたはトップコーティングであってよい。用語“外側の層”、“コーティング層”または“トップコート”は、該用語を使用する文脈によって、交換可能に使用し得る。
【１００９】
一つの態様において、粒子は、活性成分の持続放出を可能とする１個〜数個のトップコートを含む。トップコートは、概して多粒子の各々を別々に含む、放出制御行動を備えた最終層である。
【１０１０】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、場合により不溶性ポリマー層への孔形成によりまたはあるいは単に不溶性ポリマーの水和により透過性であるコーティング層を介した薬物の拡散により遊離素制御するまたは孔形成剤および不溶性ポリマーの水和の組み合わせにより遊離を制御する、外側の層またはトップコーティングを含む。ポリマーは、ｐＨと無関係に不溶性であり、場合により水可溶性孔形成剤を含む。放出速度は、孔形成剤が溶解した後の孔の形成程度に影響される。不溶性コーティングポリマーは、エチルセルロースおよびセルロースアセテートのようなセルロースエーテルまたはポリアクリレート、例えば、アミノメタクリレートコポリマー(Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ／ＲＬ)であり得る。適当な孔形成剤は、水可溶性セルロースエーテル、例えばヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ(ＫｌｕｃｅｌTM  ＥＦ、ＥＸＦ、ＬＦ)またはヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ、ＭｅｔｈｏｃｅｌTM  Ｅ３／Ｅ５、Ｐｈａｒｍａｃｏａｔ  ６０３TM)、ポリエチレングリコール(Ｍａｃｒｏｇｏｌ  １５００、３５００、４０００、６０００)、ポロクサマー１８８(Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８TM)またはポビドン(ＰＶＰ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  Ｋ１２、Ｋ２５、Ｋ３０)を含む。例えば、水可溶性孔形成剤を、２：１〜１：１０、例えば１：１〜１：５、１：３または１：５の比で不溶性ポリマーと混合してよい。ある態様において、孔形成剤対不溶性ポリマー比は、ＨＰＣ、例えば、ＫｌｕｃｅｌTM  ＥＦ、ＥＸＦ、ＬＦまたはＨＭＰＣ  ３ｃＰ、例えば、ＭｅｔｈｏｃｅｌTM  Ｅ３のもの、１：１〜１：４、例えば、約１：１、１：１.２、１：１.５または１：２の比である。代表的不溶性ポリマーは、孔形成剤と組み合わせたエチルセルロース(ＥＣ、Aqualon EC N10TM)を含むが、これに限定されない。ある態様において、孔形成剤を用いずに、不溶性ポリマーアミノメタクリレートコポリマータイプＡ(Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ)とアミノメタクリレートコポリマータイプＢ(Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＬ)の組み合わせは、１：２〜９：１、好ましくは１：１〜４：１の比であり得る。
【１０１１】
徐放トップコートは、活性物質の大部分の小腸への遊離を達成し、胃液から活性物質を保護し、活性物質の口腔、食道および胃への暴露を最小にし得る。
【１０１２】
一つの態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、薬物物質含有マトリクス、例えば、速く崩壊および／または溶解するマトリクス層を含むかまたは、例えば、１個以上の成分を含むことができ、活性成分が分散または溶解しているビーズ、ペレットまたは顆粒のような開始コア上の、徐放性マトリクス層に含む。例えば、非晶質または結晶ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を、マトリクス内に重量で１：１００〜１００：１、例えば、重量で１：５０〜５：１；または１：５０〜１：１または１：５〜２：３または重量で１：１０〜１：５(マトリクス形成剤に対して)で分散または溶解できる。
【１０１３】
ある態様において、薬物物質含有マトリクスは、出発コアの表面上に重層される。層は、均一な、規則的サイズおよび形の粒子上に流動床法で、マトリクス成分および薬物物質の分散または溶液を噴霧することにより構築し得る。あるいは、マトリクス成分の粉末混合物を、回転ディスクプロセッサを使用して重層できる。出発コアは、平均粒子径０.１〜２.５mmを有する。単結晶、例えば、スクロースまたは流動床造粒、回転造粒、押し出し、球形化または圧密過程により製造される顆粒状凝集体である。ある態様において、ミニ錠剤を出発コアとして使用できる。特に態様、出発コアは球形であり、スクロースおよびデンプン(Ｓｕｇａｒ  Ｓｐｈｅｒｅｓ、ＳｕｇｌｅｔｓTM、ノンパレイユ)、マンニトール(例えばＭＣｅｌｌｓTM)、ラクトース(例えば、噴霧乾燥ラクトース)または微結晶性セルロース(例えば、ＣｅｌｌｅｔｓTM)のような不活性物質からなる。
【１０１４】
他の態様において、薬物物質含有マトリクスは、粒子のコアに取り込まれる。マトリクス形成添加物、充填剤および処理を改良するための他の成分を薬物物質と混合する。得られた粉末混合物を、湿式押し出しまたは融解押し出しとその後の混合物の球形化を使用して粒子として、またはミニ錠剤への圧密化により製剤する。形成したマトリクスは、速く崩壊／溶解するマトリクスまたは親水性または親油性マトリクス形成添加物で構築された持続放出特性を備えた非崩壊マトリクスである。
【１０１５】
ある態様において、薬物物質またはその固体分散を含む親水性、非崩壊マトリクスからなる多粒子を、活性成分、増量剤、例えば、ラクトースを、親水性、異なる粘性のヒドロゲル形成ポリマー、流動促進剤および滑沢剤と混合することにより製造する。ある態様において、親水性、ヒドロゲル形成ポリマーは、例えば、２重量％水溶液で２０ｍＰａｓ未満の低粘性グレードのヒドロキシプロピルメチルセルロース、例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ５と２重量％水溶液で１００mPasを超える高粘性のヒドロキシプロピルメチルセルロースグレード、例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００の組み合わせであり得る。粉末混合物を次いで打錠機で圧縮して、ミニ錠剤を得る。あるいは、粉末混合物を有機溶媒、例えば、エタノールで湿らせ、押し出し、多粒子を得るために球形化する。
【１０１６】
他の態様において、薬物物質またはその固体分散を含む親油性、非崩壊マトリクスからなる多粒子を、活性成分、親油性、融解可能、マトリクス形成添加物および充填剤の混合により製造できる。混合物を、押し出し機での融解および混合により製造する。得られた伸張した鎖を粒子に切断し、場合により球形化する。使用する親油性添加物は、例えばビタミンＥポリエチレングリコールスクシネート(Vit E TPGS、例えば、BASFからのKolliphor TPGS Pharma)単独またはモノステアリン酸グリセロール(ＧＭＳ、例えば、Ｋｏｌｌｉｗａｘ  ＧＭＳ  ｆｒｏｍＢＡＳＦ)と９：１〜１：９比の混合物である。
【１０１７】
ある態様において、徐放性ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、患者に使用可能な速放性錠剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１速放性錠剤(Final Market Imageまたは“ＦＭＩ”錠剤)と比較して、２４名の健常対象における一回投与後、ピーク濃度(Ｃｍａｘ)対投与２４時間後濃度(Ｃ２４ｈ)比を減少させる。ある態様において、Ｃｍａｘ／Ｃ２４ｈ比は、例えば、薬物動態モデルシミュレーションで測定して減少する。Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比減少の利点は、ＦＭＩ製剤に対するｍＴＯＲ阻害剤のバイオアベイラビリティに基づく適切な用量で、ｍＴＯＲ阻害剤の濃度を、薬物の治療範囲の低い側(十分な有効性)に維持し、同時に薬物の治療範囲の高い側(毒性の濃度領域)から離すことである。それゆえに、ある態様において、徐放性ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の製剤は、その有効性に影響することなく、ｍＴＯＲ阻害剤の安全性プロファイルを改善できる。ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の徐放性製剤を投与されている患者におけるＣｍａｘ／Ｃ２４ｈ(ゆえにＣｍａｘ／Ｃｍｉｎ)比は＜５または＜４、例えば３.５±１または３±０.５である。
【１０１８】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、機能的層またはトップコートから離れた層に含まれ、製剤からの持続放出特性を制御する。このような層は、ｍＴＯＲ阻害剤を分散または溶解するのに適するあらゆる物質から製造され得る。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を含む層は親水性担体マトリクスからなる。担体マトリクスは活性成分を包埋し、分解から保護し得る。適当なマトリクス形成剤は、親水性ポリマー、例えばＨＰＭＣタイプ２９１０またはタイプ２２８０、ＨＰＣ、ＨＥＣ、ＭＥＣ、ＭＨＥＣ、ポビドンを含むが、これらに限定されず、これは、水に溶解できるかまたは急速に分散できる。一つの態様において、マトリクス層は、その各々を全内容を引用により本明細書に包含させる、例えばＷＯ９７／０３６５４号またはＷＯ０３／０２８７０５号に記載の、固体分散の形である。
【１０１９】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１のための速く溶解／崩壊する担体マトリクスは、固体分散の形である。ある態様において、固体分散は担体、例えば、水可溶性ポリマーを含み、例えば次のポリマーの１個または混合物を使用し得る。
− ヒドロキシプロピルメチルセルロース(ＨＰＭＣ)、例えば、Dow ChemicalsのＭｅｔｈｏｃｅｌTM  Ｅまたは信越のＰｈａｒｍａｃｏａｔTMとして入手可能なヒプロメロースタイプ２９１０。良好な結果が、低い見かけの粘性、例えば、２０℃で２重量％水溶液で測定して１００ｃｐs以下、例えば５０cps以下、好ましくは２０cps以下のＨＰＭＣ、例えばＨＰＭＣ  ３cpsを使用して、得られ得る；
− ポリビニルピロリドン(ポビドン、ＰＶＰ)、例えば、ＰＶＰ  Ｋ２５、Ｋ３０またはＰＶＰ  Ｋ１２。ＰＶＰは、例えば、ＢＡＳＦ社からＫｏｌｌｉｄｏｎ(登録商標)としてまたはＩＳＰ社からＰｌａｓｄｏｎｅ(登録商標)として商業的に入手可能である。平均分子量約８,０００〜約５０,０００ダルトンを有するＰＶＰ、例えば、ＰＶＰ  Ｋ３０が好ましい；
− ヒドロキシプロピルセルロース(ＨＰＣ)、例えば、Ｋｌｕｃｅｌ  ＥＦ／ＬＦ／ＪＦまたはその誘導体。ＨＰＣ誘導体の例は、水性媒体、例えば、水中で低動的粘性、例えば、５％水溶液中、２５℃で測定して約４００cps以下を有するものを含む。好ましいＨＰＣ誘導体は、約２００,０００ダルトン以下、例えば、８０,０００〜１４０,０００ダルトンの平均分子量を有する。商業的に入手可能なＨＰＣは、Hercules Aqualon社からのＫｌｕｃｅｌ(登録商標)ＬＦ、Ｋｌｕｃｅｌ(登録商標)ＥＦおよびＫｌｕｃｅｌ(登録商標)ＪＦ；および日本曹達株式会社から入手可能なＮｉｓｓｏ(登録商標)ＨＰＣ−Ｌを含む；
− ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)。例は、１０００〜９０００ダルトン、例えば約１８００〜７０００の平均分子量を有するＰＥＧ、例えばＰＥＧ  ２０００、ＰＥＧ  ４０００またはＰＥＧ  ６０００を含む(Handbook of Pharmaceutical Excipients, p. 355-361)；
− 例えば、Gattefosse社から、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ(登録商標)、例えば、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ(登録商標)４４／１４、５３／１０、５０／１３、４２／１２または３５／１０として入手可能な飽和ポリグリコール化グリセリド；または
− シクロデキストリン、例えばｂ−シクロデキストリンまたはａ−シクロデキストリン。適当なｂ−シクロデキストリンの例は、メチル−ｂ−シクロデキストリン；ジメチル−ｂ−シクロデキストリン；ヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリン；グリコシル−ｂ−シクロデキストリン；マルトシル−ｂ−シクロデキストリン；スルホ−ｂ−シクロデキストリン；ｂ−シクロデキストリンのスルホ−アルキルエーテル、例えばスルホ−Ｃ１-４−アルキルエーテルを含むが、これらに限定されない。ａ−シクロデキストリンの例は、グルコシル−ａ−シクロデキストリンおよびマルトシル−ａ−シクロデキストリンを含むが、これらに限定されない。
【１０２０】
一つの態様において、ｍＴＯＲ阻害剤−含有層は、抗酸化剤を、薬物物質の量に対して１：１０００〜１：１比で含む。抗酸化剤はまた他の機能的層に、例えば、０.１〜１０％、好ましくは０.１〜１％の濃度で使用し得る。適当な抗酸化剤は、ブチルヒドロキシルトルオール、ブチルヒドロキシアニソール、アスコルビルパルミテート、トコフェロール、ビタミンＥポリエチレングリコールスクシネートを含むが、これらに限定されない。特定の態様において、抗酸化剤はブチルヒドロキシルトルオールである。
【１０２１】
一つの態様において、保護層は、活性物質を含む層を、例えば、トップコーティングのような他の機能的層から離し、医薬品の安定性を増強する。薬物物質は、トップコーティングとの直接接触の排除により安定化される。保護層はまた層を通して移動できるトップコーティングにおける何らかの成分、例えば、ポリマー副産物または可塑剤が、活性剤と直接接触することを阻止する拡散バリアとしても作用する。マトリクス形成剤(例えば、上記マトリクス形成剤)としても使用するポリマー以外に、適用したポリマーの量に対して、例えば、１０〜１００％、例えば、２０〜５０％の、高含量の、タルクおよび／または二酸化チタンのような無機色素または固化防止剤はバリア機能に寄与する。保護層厚さは、最適化された薬物製品安定性を得るために調節できる。
【１０２２】
他の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、徐放性担体マトリクスに直接包埋される。
【１０２３】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む製剤は、製剤に閉じ込められた水湿気と結合でき、内部乾燥剤として作用する、強吸湿性の添加物を含む。例えば、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウムまたはデンプンのような吸着剤を使用できる。例えば、ある態様において、クロスポビドンを錠剤崩壊剤として、例えば、２％〜２５％クロスポビドンで使用する。吸着剤、例えば、クロスポビドンは、湿式および融解押し出しで使用する粉末混合物の一部、ミニ錠剤に圧縮する粉末混合物の一部、多粒子を打錠する粉末混合物の一部および／またはサシェ剤またはカプセル剤充填工程で多粒子に直接添加されることが可能である。
【１０２４】
一つの面において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、計５％未満、例えば、計３％未満または計２.５％未満の低水湿気含量の粒子(例えば、０.１〜０.５mm)、ビーズ、ペレット(例えば、０.２〜２mm)またはミニ錠剤(例えば、１.５〜３mm)で存在する。
【１０２５】
ある態様において、医薬組成物、例えば、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の多粒子送達系を、例えば、カプセル剤(例えば、ＨＰＭＣまたはＨａｒｔ  Ｇｅｌａｔｉｎｅカプセル)のような医薬品としてまたは小袋またはスティックパックに包装してまたは崩壊により粒子を放出する錠剤として製剤できる。
【１０２６】
ある態様において、小袋、スティックパック、ブリスターまたはボトルのような一次包装は、貯蔵寿命保存中および／または使用時間中医薬品の水湿気含量を減らすかまたは安定化する水収着成分、例えば、シリカゲルを含み得る。
【１０２７】
提供される製剤は、複数ペレット、顆粒またはミニ錠剤を含みおよび／または遊離し得る。
【１０２８】
ある態様において、提供される製剤、例えば、多粒子製剤は、マトリクス形成添加物と薬物物質の混合物を、熱または湿潤液体の助けを借りて、押し出し、球状化しまたは薬物含有混合物のミニ錠剤を圧密化しまたは薬物含有マトリクス層を流動床または回転造粒工程でコア上に重層することにより製造できる。
【１０２９】
ある態様において、活性物質含有層は、親水性成分および活性物質が分散または溶解した、有機溶媒のスプレー分散をコア物質に噴霧し、同時に、溶媒を加熱、乾燥空気の助けを借りて除去することにより製造できる。この方法で、コアを囲むマトリクス層が形成され、例えば、形成された層は、例えば、ＨＰＭＣ、ＨＰＣ、ＨＥＣのようなポリマー中の活性剤の固体分散である。
【１０３０】
一つの面において、提供される医薬製剤は、次のとおり、製造し得る。親水性ポリマーがコロイド状に分散している有機フィード混合物およびここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を分散または溶解し、これが修飾放出コートでコートされ得るような方法で、溶媒の除去により固体分散の均一な、平滑層として沈殿する。ある態様において、得られた薬物含有多粒子を、さらなる機能的層およびトップコーティングでコーティングし得る。有機溶媒およびそれらの混合物に溶解、分散および懸濁されたコーティングポリマー、滑沢剤、粘着防止剤、孔形成剤および可塑剤を含む噴霧分散を、薬物含有多粒子に噴霧する。処理中、多粒子は、制御された運動または流動化を連続して維持し、一方乾燥、加熱処理ガスを、多粒子表面上の溶媒の蒸発のために製品に適用し、ここで、フィルム層が規定温度で形成される。フィルム層厚さは、噴霧するコーティング分散の量により制御できる。最終乾燥を、重層および被覆多粒子における残存溶媒含量を最小化するために適用する。
【１０３１】
他の面において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、徐放性製剤の一部の高薬物充填部分として製剤し得る。ある態様において、製剤はさらに界面活性剤を含む。用語“界面活性剤”は、“湿潤剤”または“洗剤”と交換可能に使用でき、例えば、非イオン性、イオン性、アニオン性または両性界面活性剤をいう。適当な界面活性剤／湿潤剤の例は、例えば、Pluronicまたはポロクサマー(例えばポロクサマー１８８(Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８)の商品名の下に知られるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーおよびブロックコポリマー、ポリオキシエチレン、Ｔｗｅｅｎの商品名の下に知られるタイプのモノおよびトリラウリル、パルミチル、ステアリルおよびオレイルエステルを含むソルビタン脂肪酸エステル、Ｍｙｒｊの商品名の下に知られるタイプのポリオキシエチレンステアリン酸エステルを含むポリオキシエチレン脂肪酸エステル、Ｂｒｉｊの商品名の下に知られるポリオキシエチレンアルキルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)のようなナトリウムアルキルスルフェートおよびスルホネートおよびナトリウムアルキルアリールスルホネート、水可溶性トコフェリルポリエチレングリコールコハク酸エステル(ＴＰＧＳ)、ポリグリセロール脂肪酸エステル、アルキレンポリオールエーテルまたはエステル、ポリエチレングリコールグリセリル脂肪酸エステル、ステロールおよびその誘導体、エステル交換、ポリオキシエチル化カプリル−カプリン酸グリセリド、糖脂肪酸エステル、ＰＥＧステロールエーテル、リン脂質、脂肪酸の塩、脂肪酸スルフェートおよびスルホネート、脂肪酸の塩、脂肪酸スルフェートおよびスルホネート、中鎖または長鎖アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ１８、アンモニウム塩、胆汁酸またはその塩；例えばコール酸、グリコール酸または塩、例えば、コール酸ナトリウムおよび飽和Ｃ１０−Ｃ２２脂肪酸のポリオキシエチレンモノエステルを含むが、これらに限定されない。特定の態様において、界面活性剤はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーまたはブロックコポリマーまたは水可溶性トコフェリルポリエチレングリコールコハク酸エステル、例えば、水可溶性トコフェリルポリエチレングリコールコハク酸エステル、例えば、ビタミンＥポリエチレングリコール１０００スクシネート(ＴＰＧＳ)である。他の態様において、本医薬製剤中の界面活性剤はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、例えば、ポロクサマー１８８である。さらに他の態様において、医薬製剤は界面活性剤アルキル硫酸ナトリウム、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含む。
【１０３２】
界面活性剤または湿潤剤は、製剤中に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１に対して、重量で１０：１〜１：２００、例えば、重量で１：１〜１：１００、重量で１：２〜１：８、重量で１：４〜１：６の比で存在し得る。
【１０３３】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１は、高薬物負荷含有第一層であり、界面活性剤は第二層であり、ここで、該第二層は第一層の下にあり、場合によりさらなる徐放性コーティングを伴う。このような態様のいくつかにおいて、界面活性剤はポロクサマー１８８およびＴＰＧＳではない。ある態様において、第二層の界面活性剤または湿潤剤は、活性成分含有層を、製剤を覆うコーティングと離す、保護層を形成できる。製剤を覆うコーティンは徐放性コーティングであり得る。
【１０３４】
ＣＡＲ有効性またはサンプル適性を評価するための方法およびバイオマーカー
他の面において、本発明は、対象(例えば、癌を有する対象)におけるＣＡＲ発現細胞療法の有効性またはＣＡＲ治療、例えば、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与を含む治療のためのサンプル(例えば、アフェレーシスサンプル)の適性を評価またはモニタリングする方法に関する。方法は、ＣＡＲ治療またはサンプル適性に対する有効性の値を得て、ここで、該値はＣＡＲ発現細胞療法の有効性または適性の指標である。
【１０３５】
ある態様において、ＣＡＲ治療またはサンプル適性の有効性の値は、次の１、２、３、４、５、６またはそれ以上(全て)の測定を含む。
(ｉ)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル)における休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、若いＴ細胞(例えば、若いＣＤ４またはＣＤ８細胞またはガンマ／デルタＴ細胞)または早期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３またはそれ以上(例えば全)のレベルまたは活性；
(ii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル)における活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、古いＴ細胞(例えば、古いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または後期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３またはそれ以上(例えば全)のレベルまたは活性；
(iii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル)における免疫細胞枯渇マーカー、例えば、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３および／またはＬＡＧ−３)の１、２以上のレベルまたは活性。ある態様において、免疫細胞は、枯渇表現型を有し、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現し、例えば、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３を共発現する。他の態様において、免疫細胞は、枯渇表現型を有し、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現し、例えば、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３を共発現する；
(iv)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプル)における、ＣＤ２７および／またはＣＤ４５ＲＯ−(例えば、ＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−)免疫エフェクター細胞のレベルまたは活性；
(ｖ)ＣＣＬ２０、ＩＬ−１７ａおよび／またはＩＬ−６、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ５７、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１から選択されるバイオマーカーの１、２、３、４、５、１０、２０またはそれ以上のレベルまたは活性；
(vi)ＣＡＲ発現細胞産物サンプルにおけるサイトカインレベルまたは活性(例えば、サイトカインレパートリーの質)；または
(vii)製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプルにおけるＣＡＲ発現細胞の形質導入効率。
【１０３６】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、ＣＡＲ発現細胞療法は、複数(例えば、集団)のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、複数(例えば、集団)のＴ細胞またはＮＫ細胞またはこれらの組み合わせを含む。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞療法は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与を含む。
【１０３７】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の測定は、対象から得たアフェレーシスサンプルから得る。アフェレーシスサンプルは、注入または再注入前に評価できる。
【１０３８】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の測定は、製造ＣＡＲ発現細胞産物サンプルから得る。製造ＣＡＲ発現細胞産物は、注入または再注入前に評価できる。
【１０３９】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、対象を、ＣＡＲ発現細胞療法を受ける前、途中または後に評価する。
【１０４０】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の測定は、遺伝子発現、フローサイトメトリーまたはタンパク質発現の１以上のプロファイルを評価する。
【１０４１】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、方法は、さらに、(ｉ)〜(vii)の１以上の測定に基づき対象を応答者、非応答者、再発者または非再発者として特定することを含む。
【１０４２】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、応答者(例えば、完全応答者)は、非応答者と比較して、ＧＺＭＫ、ＰＰＦ１ＢＰ２またはナイーブＴ細胞の１、２以上(全て)のレベルまたは活性が高いかまたは高いとして同定される。
【１０４３】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、応答者と比較して、ＩＬ２２、ＩＬ−２ＲＡ、ＩＬ−２１、ＩＲＦ８、ＩＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、エフェクターＴ細胞または制御性Ｔ細胞の１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上(例えば、全)のレベルまたは活性が高いかまたは高いとして同定される。
【１０４４】
ある態様において、再発者は、非再発者と比較して、次の遺伝子の１以上(例えば、２、３、４または全)の発現レベルが高いかまたは高いとして同定される患者である：ＭＩＲ１９９Ａ１、ＭＩＲ１２０３、ｕｃ０２１ｏｖｐ、ＩＴＭ２ＣおよびＨＬＡ−ＤＱＢ１；および／または非再発者と比較して、次の遺伝子の１以上(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全)の発現レベルが減少している患者である：ＰＰＩＡＬ４Ｄ、ＴＴＴＹ１０、ＴＸＬＮＧ２Ｐ、ＭＩＲ４６５０−１、ＫＤＭ５Ｄ、ＵＳＰ９Ｙ、ＰＲＫＹ、ＲＰＳ４Ｙ２、ＲＰＳ４Ｙ１、ＮＣＲＮＡ００１８５、ＳＵＬＴ１Ｅ１およびＥＩＦ１ＡＹ。
【１０４５】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、完全応答者は、対照値、例えば、非応答者のＣＤ８＋  Ｔ細胞パーセンテージと比較して、大きい、例えば、統計学的に有意に大きい、ＣＤ８＋  Ｔ細胞パーセンテージを有するかまたは有するとして同定される。
【１０４６】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、完全応答者は、対照値、例えば、非応答者のＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−免疫エフェクター細胞数と比較して、大きなパーセンテージのＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−免疫エフェクター細胞を有するかまたは有するとして同定される。
【１０４７】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、完全応答者または部分的応答者は、対照値、例えば、非応答者ＣＤ４＋  Ｔ細胞パーセンテージと比較して、大きい、例えば、統計学的に有意に大きい、ＣＤ４＋  Ｔ細胞パーセンテージを有するかまたは有するとして同定される。
【１０４８】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、完全応答者は、対照値、例えば、非応答者の休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、若いＴ細胞(例えば、若いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または早期記憶Ｔ細胞数と比較して、大きなパーセンテージの休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、若いＴ細胞(例えば、若いＣＤ４またはＣＤ８細胞またはガンマ／デルタＴ細胞)または早期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３またはそれ以上(例えば全)を有するかまたは有するとして同定される。
【１０４９】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、対照値、例えば、応答者の活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、古いＴ細胞(例えば、古いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または後期記憶Ｔ細胞活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、古いＴ細胞(例えば、古いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または後期記憶Ｔ細胞数と比較して、大きなパーセンテージの活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、古いＴ細胞(例えば、古いＣＤ４またはＣＤ８細胞)または後期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３またはそれ以上(例えば全)を有するかまたは有するとして同定される。
【１０５０】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、免疫細胞枯渇マーカー、例えば、１、２以上の免疫チェックポイント阻害剤(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３および／またはＬＡＧ−３)の大きなパーセンテージを有するかまたは有するとして同定される。ある態様において、非応答者は、応答者からのＰＤ−１またはＬＡＧ−３発現免疫エフェクター細胞のパーセンテージと比較して、大きなパーセンテージのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３発現免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞)(例えば、ＣＡＲ発現ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞)を有するかまたは有するとして同定される。
【１０５１】
ある態様において、非応答者は、大きなパーセンテージの枯渇表現型を有する免疫細胞、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＴＩＭ−３を共発現する免疫細胞を有するかまたは有するとして同定される。他の態様において、非応答者は、大きなパーセンテージの枯渇表現型を有する免疫細胞、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３を共発現する免疫細胞を有するかまたは有するとして同定される。
【１０５２】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、ＣＡＲ発現細胞療法に対する応答者(例えば、完全応答者)と比較して、ＣＡＲ発現細胞集団において大きなパーセンテージのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＬＡＧ−３＋細胞を有するかまたは有するとして同定される。
【１０５３】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、部分的応答者は、ＣＡＲ発現細胞集団において、応答者よりも高いパーセンテージのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＬＡＧ−３＋細胞を有するかまたは有するとして同定される。
【１０５４】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、ＣＡＲ発現細胞集団においてＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１＋  ＣＡＲ＋の枯渇表現型およびＬＡＧ３共発現を有するかまたは有するとして同定される。
【１０５５】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、非応答者は、応答者(例えば、完全応答者)と比較して、ＣＡＲ発現細胞集団における大きなパーセンテージのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＴＩＭ−３＋細胞を有するかまたは有するとして同定される。
【１０５６】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、部分的応答者は、ＣＡＲ発現細胞集団において、応答者より高いパーセンテージのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＴＩＭ−３＋細胞を有するかまたは有するとして同定される。
【１０５７】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、アフェレーシスサンプルにおけるＣＤ８＋  ＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−  Ｔ細胞の存在は、ＣＡＲ発現細胞療法に対する対象の応答の正の予測因子である。
【１０５８】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、アフェレーシスサンプルにおける高いパーセンテージのＰＤ１＋  ＣＡＲ＋およびＬＡＧ３＋またはＴＩＭ３＋  Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現細胞療法に対する対象の応答が不良である負の予測因子である。
【１０５９】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、応答者(例えば、完全または部分的応答者)は、次のプロファイルの１、２、３またはそれ以上(または全)を有する。
(ｉ)対照値、例えば、非応答者のＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞数と比較して、ＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞数が多い；
(ii)(ｉ)対照値、例えば、非応答者のＣＤ８＋  Ｔ細胞数と比較して、ＣＤ８＋  Ｔ細胞数が多い；
(iii)対照値、例えば、非応答者の１以上のチェックポイント阻害剤を発現する細胞数と比較して、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３またはＫＬＲＧ−１または組み合わせから選択される１以上のチェックポイント阻害剤、例えば、チェックポイント阻害剤を発現する免疫細胞数が少ない；または
(iv)対照値、例えば、非応答者の休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、非刺激記憶細胞または早期記憶Ｔ細胞数と比較して、休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、非刺激記憶細胞または早期記憶Ｔ細胞またはこれらの組み合わせの１、２、３、４またはそれ以上(全て)の数が多い。
【１０６０】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(vi)のサイトカインレベルまたは活性は、サイトカインＣＣＬ２０／ＭＩＰ３ａ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＬ２、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９またはＴＮＦαまたはこれらの組み合わせの１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上(全て)から選択される。サイトカインは、ＩＬ−１７ａ、ＣＣＬ２０、ＩＬ２、ＩＬ６またはＴＮＦａの１、２、３、４またはそれ以上(全て)から選択できる。ある態様において、ＩＬ−１７ａおよびＣＣＬ２０から選択される一方または両方のサイトカインのレベルまたは活性の増加は、増加した応答性または減少した再発の指標である。
【１０６１】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(vii)における１５％以上の形質導入効率は、増加した応答性または減少した再発の指標である。
【１０６２】
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、(vii)における１５％未満の形質導入効率は、低下した応答性または増加した再発の指標である。
【１０６３】
ある態様において、ここの方法で同定した応答者、非応答者、再発者または非再発者は、臨床基準によりさらに評価できる。例えば、完全応答者は、処置に対する完全応答、例えば、完全寛解を示す、疾患、例えば、癌を有する対象であるまたはそう同定される。完全応答は、例えば、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ(登録商標)(これは引用により本明細書に包含させる)を使用して、ここに記載のように同定し得る。部分的応答者は、処置に対する部分的応答、例えば、部分的寛解を示す、疾患、例えば、癌を有する対象であるまたはそう同定される。部分的応答は、例えば、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ(登録商標)を使用して、ここに記載のように同定し得る。非応答者は、処置に応答を示さない、例えば、疾患が安定したまたは疾患が進行した、疾患、例えば、癌を有する対象であるまたはそう同定される。非応答者は、例えば、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ(登録商標)を使用して、ここに記載のように同定し得る。
【１０６４】
ここに開示する方法とは別にまたはそれと組み合わせて該値に対する応答は、次の１、２、３、４またはそれ以上を実施する。
例えば、応答者または非再発者に、ＣＡＲ発現細胞療法を投与する；
ＣＡＲ発現細胞療法の別の用量を投与する；
ＣＡＲ発現細胞療法のスケジュールまたはタイムコースを変更する；
例えば、非応答者または部分的応答者に、ＣＡＲ発現細胞療法に加えて、さらなる薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を投与する；
非応答者または部分的応答者に、ＣＡＲ発現細胞療法での処置前に対象の若いＴ細胞の数を増加させる治療を投与する；
例えば、非応答者または部分的応答者として同定された対象について、ＣＡＲ発現細胞療法の製造法を修飾する、例えば、ＣＡＲをコードする核酸導入前に若いＴ細胞を富化するまたは形質導入効率を増加する；
例えば、非応答者または部分的応答者または再発者に対して、別の治療を投与する；または
対象が非応答者または再発者であるまたはそうであると同定されたならば、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体またはこれらの組み合わせ投与の１以上により、ＴＲＥＧ細胞集団および／またはＴＲＥＧ遺伝子サインを減少させる。
【１０６５】
ある態様において、対象は抗ＧＩＴＲ抗体で前処置される。ある態様において、対象は、注入または再注入前に抗ＧＩＴＲ抗体で処置される。
【１０６６】
バイオポリマー送達方法
ある態様において、場合により低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤(例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤)と組み合わせたここに開示する１以上のＣＡＲ発現細胞を、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与または送達し得る。バイオポリマーを、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与または送達し得る。
【１０６７】
適当なバイオポリマーの例は、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸／リン酸カルシウムセメント(ＣＰＣ)、ベータ−ガラクトシダーゼ(β−ＧＡＬ)、(１,２,３,４,６−ペンタアセチルａ−Ｄ−ガラクトース)、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ(３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシ−ヘキサノエート)(ＰＨＢＨＨｘ)、ポリ(ラクチド)、ポリ(カプロラクトン)(ＰＣＬ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(ＰＬＧＡ)、ポリプロピレンオキシド(ＰＰＯ)、ポリビニルアルコール)(ＰＶＡ)、絹、大豆タンパク質および大豆タンパク質単離体の、単独でまたは任意の他のポリマー組成物との、あらゆる濃度およびあらゆる比での混合物を含むが、これらに限定されない。バイオポリマーは、接着または遊走促進分子、例えば、リンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチドおよび／または送達する細胞の送達、増殖または機能、例えば、抗癌活性を増強する刺激分子で増強または修飾され得る。バイオポリマー足場は、注射可能な、例えば、ゲルまたは半固体または固体組成物であり得る。
【１０６８】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象への送達前にバイオポリマー足場上に播種する。ある態様において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに取り込まれたまたはコンジュゲートされた、さらにここに記載する１以上のさらなる治療剤(例えば、他のＣＡＲ発現細胞、抗体または小分子)またはＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を含む。ある態様において、バイオポリマー足場を、例えば、腫瘍内に注射するかまたは腫瘍にまたは抗腫瘍効果を仲介するのに十分に腫瘍に近位に外科的にインプラントする。バイオポリマー組成物およびその送達のための方法さらなる例は、Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101；およびＷＯ２０１４／１１０５９１号に記載される。
【１０６９】
医薬組成物および処置：ＣＡＲおよび組み合わせ
ある面において、本発明は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用するための、ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を含む、医薬組成物に関する。
【１０７０】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞投与前に開始する。ある態様において、ＣＡＲ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に上昇するように、ｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な用量の後に投与する。
【１０７１】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ＣＡＲの発現のために操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の回収前に開始する。ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、採取細胞におけるＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞比が、少なくとも一過性に、増加するように、ｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な用量の後に採取する。
【１０７２】
本発明の医薬組成物は、ここに記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一つの面において静脈内投与用に製剤される。
【１０７３】
本発明の医薬組成物を、処置する(または予防する)疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
【１０７４】
ある態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される汚染物が実質的にない、例えば、検出可能なレベルで存在しない。ある態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
【１０７５】
“免疫学的に有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍阻害有効量”または“治療量”が示されるとき、本発明の組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度または転移および患者(対象)の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。ここに記載する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を含む医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／kg体重、いくつかの例において１０５〜１０６細胞／kg体重の範囲の用量で、これらの範囲内の全整数値を含み、投与し得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物を、また、この用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
【１０７６】
ある面において、活性化免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を対象に投与し、続いて血液を採り(またはアフェレーシスを実施し)、本発明に従いそこからの免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を活性化し、これらの活性化し、かつ増殖させた免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を患者に再注入することが望ましいことがある。この過程を数週間毎に複数回実施できる。ある面において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、１０cc〜４００ccの採血した血液から活性化できる。ある面において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採血した血液から活性化する。
【１０７７】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置または移植を含む、任意の簡便な方法により実施し得る。ここに記載する組成物を、患者に経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に投与し得る。一つの面において、本発明のＴ細胞組成物を、患者に皮内または皮下注射により投与するする。一つの面において、本発明のＴ細胞組成物を、ｉ.ｖ.注射により投与する。免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の組成物を、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射し得る。
【１０７８】
特に代表的な面において、対象は、白血球を採取し、エクスビボで富化または枯渇させて、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択および／または単離する、白血球除去を受け得る。これらのＴ細胞単離体を、当分野で知られる方法により増殖させ、１以上の本発明のＣＡＲ構築物が導入され、それにより本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞が創製されるように処理し得る。処置を必要とする対象を、その後高用量の化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付し得る。ある面において、移植後または移植と同時に、対象は、増殖させた本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞の注入を受ける。さらなる面において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。
【１０７９】
ある態様において、リンパ球枯渇を、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ２０−結合ＣＡＲを発現する１以上の細胞の投与前に対象で実施する。ある態様において、リンパ球枯渇は、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミドおよびフルダラビンの１以上の投与を含む。
【１０８０】
患者に投与すべき上記処置の用量は、処置する状態の正確な性質および処置の受け手により変わる。ヒト投与のためのスケーリングは、当分野で認識されている習慣に従い実施できる。キャンパスの用量は、例えば、概して成人患者に１〜約１００mgの範囲であり、通常連日、１〜３０日の期間投与する。好ましい１日用量は１〜１０mg／日であるが、いくつかの例において最大４０mg／日までの高用量を使用し得る(米国特許６,１２０,７６６号に記載)。
【１０８１】
ある態様において、ＣＡＲを、例えば、インビトロ転写を使用して免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)に導入し、対象(例えば、ヒト)は、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の初期投与と、その後の本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回以上の投与を受け、ここで、その後の１回以上の投与は、先の投与の後、１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に行う。ある態様において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超える投与を、対象(例えば、ヒト)に１週間当たりに行い、例えば、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の２、３または４投与を週あたりに投与する。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の週あたり１回を超える投与を受け(例えば、１週間当たり２回、３回または４回投与)(ここではサイクルとも呼ぶ)、続いて１週間、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)投与されず、その後さらにＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回以上のさらなる投与(例えば、週あたりＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超える投与)を対象に投与する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超えるサイクルの投与を受け、各サイクル間の期間は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日より短い。ある態様において、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、隔日で１週間３回投与する。ある態様において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。
【１０８２】
ある面において、ＣＡＲ発現本発明の細胞を、レンチウイルスのようなレンチウイルスウイルスベクターを使用して産生する。細胞、例えば、この方法で産生されたＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
【１０８３】
ある面において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴを、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、ここに記載するガンマレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを使用して産生する。これらのベクターを使用して産生されたＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
【１０８４】
ある面において、ＣＡＲ発現細胞は、形質導入４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日後、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ  ＣＡＲベクター送達により行われ得る。ある面において、ＣＡＲ  ＲＮＡを、電気穿孔法によりＴ細胞またはＮＫ細胞に導入する。
【１０８５】
一過性にＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)(特にマウスｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴ)を使用して処置される患者で生じ得る可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
【１０８６】
この理論に縛られることを望まないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発達させる患者、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であると考えられる。細胞を産生する患者の抗体が、抗原への暴露の１０〜１４日の中断があるとき、ＩｇＧアイソタイプ(これはアナフィラキシーを生じない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。
【１０８７】
患者が一過性ＣＡＲ治療(例えばＲＮＡ形質導入により完成されたもののような)中に抗ＣＡＲ抗体応答を産生する高リスクにあるならば、ＣＡＲ発現細胞注入中断は１０〜１４日を超えて継続してはならない。
【実施例】
【１０８８】
本発明を、次の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供し、特に断らない限り限定を意図しない。そうして、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ、ここに提供する教示の結果として明らかとなる任意かつ全ての異形を含むと解釈すべきである。
【１０８９】
さらに記載せずとも、当業者は、前の記載および次の説明的実施例を使用して、本発明の化合物を製造および利用し、本願発明方法を実施できると考える。次の作業実施例は、本発明の多様な面を特に示すものであり、本開示を限定するものと解釈されるべきでない。
【１０９０】
実施例１：高齢者における免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害の効果
加齢と最も明確に結びついている経路の一つは、ｍＴＯＲ経路である。ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンがマウスで寿命を延長し、高齢マウスで多様な加齢関連状態を改善することが示されている(Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682; およびFlynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862)。それゆえに、これらの知見は、ｍＴＯＲ阻害剤がヒトにおける加齢および加齢関連状態に有益な効果を有し得ることを示す。
【１０９１】
短い臨床試験時間枠で試験できる年齢関連表現型は免疫老化である。免疫老化は、感染に対する感受性の増加およびインフルエンザワクチン接種を含むワクチン接種に対する応答の減少に至る、高齢者で生じる免疫機能の減少である。年齢による免疫機能の減少は、造血幹細胞(ＨＳＣ)がナイーブリンパ球を産生する能力の減少および抗原刺激に対する応答が不完全な枯渇したＰＤ−１陽性リンパ球数の増加を含む、免疫欠損の蓄積による(Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798; and Shimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812)。高齢マウスでの試験は、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間の処置がＨＳＣ機能を若返らせ、ナイーブリンパ球産生増加、インフルエンザワクチン接種に対する応答改善および寿命延長に至ることを示した(Chen, C et al. (2009) Sci. Signal. 2:ra75)。
【１０９２】
ヒト加齢関連表現型に対するｍＴＯＲ阻害の効果をおよびｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が免疫老化を軽減するかを評価するために、ＲＡＤ００１またはプラセボを投与された高齢ボランティアにおけるインフルエンザワクチンに対する応答を評価した。ここに示す知見は、ＲＡＤ００１が、十分耐容性である用量で高齢ボランティアのインフルエンザワクチンに対する応答を増強したことを示唆する。ＲＡＤ００１はまた年齢とともに蓄積されるプログラム死(ＰＤ)−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔリンパ球のパーセンテージも減少させた。これらの結果は、ｍＴＯＲ阻害が高齢ボランティアにおける免疫老化に有益な効果を有することを示す。
ここに記載するとおり、ラパマイシン類似体であるｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１での６週間処置は、高齢ヒトボランティアにおけるインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善した。
【１０９３】
方法
研究集団
不安定な基礎疾患のない６５歳以上の高齢ボランティアが、ニュージーランドおよびオーストラリアの９箇所で参加した。スクリーニング時の除外基準はヘモグロビン＜９.０ｇ／dL、白血球数＜３,５００／ｍｍ３、好中球数＜２,０００／ｍｍ３または血小板数＜１２５,０００／ｍｍ３、未管理の糖尿病、不安定虚血性心疾患、臨床的に顕著な基礎肺疾患、免疫不全の病歴または免疫抑制性治療歴、凝固障害の病歴または長期抗凝固を必要とする  医学的状態、概算糸球体濾過速度＜３０ml／分、重度の未管理高コレステロール血症(＞３５０mg／dL、９.１mmol／Ｌ)または高トリグリセリド血症(＞５００mg／dL、５.６mmol／Ｌ)の存在を含んだ。
【１０９４】
処置アーム間のベースライン個体群統計学は類似した(表４)。２１８名の参加対象中、２１１名が治験を終了した。７名は治験を中止した。５名は有害事象(ＡＥ)が原因であり、１名は同意の上中止し、１名はプロトコール違反の結果、治験を去った。
【表２４】
2017528433.tif 000037
＊肥満度指数は、身長(ｍ)の二乗で除した体重(kg)である。
【１０９５】
治験設計および遂行
２０１１年１２月から２０１２年４月まで、２１８名の高齢ボランティアが、無作為化、観察者盲検化、プラセボ対照試験に参加した。対象を、各処置アームにおけるＲＡＤ００１対プラセボ比５：２で、検証された自動化無作為化系を使用して処置アームに無作為化した。処置アームは
ＲＡＤ００１  ０.５mg連日またはプラセボ
ＲＡＤ００１  ５mg毎週またはプラセボ
ＲＡＤ００１  ２０mg毎週またはプラセボ
であった。
【１０９６】
ＲＡＤ００１  ０.５mg連日および２０mg毎週コホートにおけるプラセボがこれらのコホートにおけるＲＡＤ００１錠剤とわずかに異なったため、本治験は観察者盲検であった。対象を評価する治験職員は治験薬物を見ておらず、それゆえに完全に盲検式であった。全コホートの処置期間は６週間であり、その間、対象は２週間毎に診療所での安全性評価を受けた。対象が４週間投与された後、ＲＡＤ００１定常レベルを投与前および投与１時間後に測定した。６週間コースの治験薬完了後、対象はＲＡＤ００１が誘発した可能性のある免疫抑制から回復するために２週間休薬させ、その後株Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８を含む２０１２年季節性インフルエンザワクチンを接種した(Ａｇｒｉｐｐａｌ(登録商標), Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italy)。インフルエンザワクチン接種４週間後、対象から血清を採取し、インフルエンザ力価を測定した。３種のインフルエンザワクチン株ならびに２種の異種株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対する抗体力価を、標準血球凝集阻害アッセイにより測定した(Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９特異的ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを、先に記載のとおりインフルエンザワクチン接種前および４週間後に測定した(Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335)。結果を蛍光強度として表した。
【１０９７】
全ての対象にインフォームド・コンセント書類を渡した。治験は、医薬品の臨床試験の実施の基準の原則に従い、適切な倫理委員会および規制当局に承認された。
【１０９８】
安全性
有害事象評価ならびに血液学的および生化学的安全性評価のための採血は、来院日に実施した。有害事象情報は、対象が治験薬を受けている６週間の間、家で記載した日記からも集めた。全有害事象データを、インフォームド・コンセント時から最後の来院日から３０日後まで集めた。事象は治験医により軽度、中程度または重度と分類された。
【１０９９】
統計解析
幾何平均力価比の一次解析を、無情報事前分布を用いる正規ベイズ回帰モデルを使用して行った。このモデルを、対数尺度で各抗体力価に適合させた。各モデルの主要評価項目は８４日目測定値であった。６３日目測定値をアウトカムベクターに包含させた。モデルを、先のステートメントと混ぜたＳＡＳ  ９.２  ｐｒｏｃを使用してフィットさせた。マトリクス共分散構造は、非構造化(選択肢タイプ＝ＵＮ)として考慮した。平らである事前分布を使用した。抗体陽転率の二次解析のために、ロジスティック回帰を使用した。
治療企図集団は、少なくとも１回の完全用量の治験薬を投与され、有効性データに影響する重大なプロトコール逸脱がない全対象と定義された。治験に参加した２１８名の対象中１９９名治験が治療企図集団であった。
【１１００】
免疫表現型検査
末梢血単核細胞を、ベースライン、６週間の治験薬処置後および対象が６週間治験薬物から離れており、インフルエンザワクチン接種した４週間後である治験の最後の３時点に採血した全血から単離した。７６ＰＢＭＣサブセットを、先に記載されたように、Human Immune Monitoring Center at Stanford University, CA, USAで８色免疫表現型検査パネルを使用したフローサイトメトリーにより解析した(Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200)。７６ＰＢＭＣサブセットを、８色凍結乾燥免疫表現型検査パネルを使用するフローサイトメトリーにより解析した(BD Lyoplate、BD Biosciences, San Diego, CA)。生存能＞８０％および２×１０６細胞を超える収量のＰＢＭＣサンプルを解析に入れた。
【１１０１】
ベースラインから治験薬処置６週目までおよびベースラインから治験の最後(１２週目)までの免疫表現型の相対的変化を、各ＲＡＤ００１投薬コホートで計算した。スチューデントＴ検定を行い、ベースラインから２回の採血時点までの免疫表現型の相対的変化が、それぞれ、プラセボ効果について調整した後、各投与群内で０とは有意に異なるかを試験した。処置効果解析における欠損値補完は行わなかった。それゆえに、患者がベースラインで表現型データ欠損があるとき、この患者は、この表現型の解析を行わなかった。患者の６週目または１２週目の表現型データが欠損しているとき、この患者は、影響する時点でのこの表現型の解析に貢献しなかった。
【１１０２】
３投薬群下の７６表現型の６０８試験を行い、プラセボ効果に対する処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した。細胞型群を層別因子として取り、各層内のＦＤＲ(ｑ値)計算をそれぞれ行った。全帰無仮説は、対応するｑ値≦０.１の０.０５有意水準で棄却された。０.０５有意水準および対応するｑ＜０.１で棄却される複数試験調節戦略は、結果の１０％未満が偽であることを確実にした。
【１１０３】
第二の解析において、免疫表現型は、全３のＲＡＤ００１投薬群を合わせたプールした処置群とプラセボ群で変化する。どの免疫表現型変化が処置群とプラセボ群を区別するかを決定するために、各測定した表現型の患者内細胞数比を、ベースラインと治験薬処置６週目およびベースラインと治験終了時(１２週目)で計算した。比を対数変換し、プールした処置およびプラセボ群の間の差異を検出するために、各時点の共分散の解析により分析した。７６表現型の１５２試験を実施して、プラセボ効果に対するプールした処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した(Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300; and Sun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530)。細胞型群を層別因子として取り、ＦＤＲ(ｑ値)計算を、それぞれ各層内で実施した。０.０５有意水準およびｑ値２０％未満での全帰無仮説は棄却された。これは、０.０５未満のＰ値および各観察された有意な結果が複数試験によるものである２０％未満の確率のみを棄却すると解釈できる。
【１１０４】
結果
一般に、ＲＡＤ００１は、特に０.５mg連日および５mg毎週投与レジメンで良好な耐容性であった。治験中に死亡例はなかった。３名の対象は、ＲＡＤ００１と無関係であると評価された４つの重篤な有害事象(ＳＡＥ)を経験した。４つのＳＡＥは、先に６週間５mg毎週ＲＡＤ００１の６週のコースを完了していた正常血小板数の対象の左眼の網膜出血とその後の失明；プラセボ処置対象における重度の背部痛およびプラセボ処置対象における重度の胃腸炎であった。あらゆる処置群における発生率＞２％の処置関連有害事象(ＡＥ)の一覧を表５に提供する。最も一般的なＲＡＤ００１関連ＡＥは、大部分の症例で、軽度であった口腔内潰瘍であった。全体的に、ＲＡＤ００１を投与された対象と、プラセボ処置対照の重度のＡＥ発生率は類似した。１つの重度のＡＥのみがＲＡＤ００１と関連すると評価され、２０mg毎週ＲＡＤ００１処置対象の口腔内潰瘍であった。
【１１０５】
【表２５】
2017528433.tif 000038
【１１０６】
ＲＡＤ００１が高齢ボランティアにおける免疫機能を改善する能力を、２０１２年の季節性インフルエンザワクチンに対する血清学的応答を測定することにより評価した。３種のインフルエンザワクチン株の各々に対するベースラインおよびインフルエンザワクチン接種４週間後の血球凝集阻害(ＨＩ)幾何平均力価(ＧＭＴ)を表６に示す。一次解析変数は、ＨＩ  ＧＭＴ比(ワクチン接種４週間後／ベースライン)であった。治験を、少なくとも３種のインフルエンザワクチン株中２種において、１)プラセボに対して相対的に≧１.２倍ＧＭＴ；および２)８０％以上が、１を超えるプラセボ補正ＧＭＴ比である事後確率の存在を証明できるように強化した。このエンドポイントは、ＭＦ−５９ワクチンアジュバントにより誘発されるインフルエンザＧＭＴ比の１.２倍増加がインフルエンザ疾病の減少と関連するために、選択した(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693)。
【１１０７】
【表２６】
2017528433.tif 000039
４週目はインフルエンザワクチン接種４週間後を示す
Ｎはコホートあたりの対象数である
ＧＭＴは幾何平均力価である
ＧＭＴ比は、ワクチン接種４週目のＧＭＴ／ベースラインのＧＭＴである
ＣＶ％は、変動係数を示す
【１１０８】
治療企図(ＩＴＴ)集団において、高用量(２０mg毎週)コホートではなく、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１(０.５mg連日または５mg毎週)コホートが、治験の主要評価項目に合った(図１Ａ)。これは、低用量でＲＡＤ００１の異なる免疫調節機構が存在し、高用量で、ｍＴＯＲ阻害の既知免疫抑制性効果が発揮されるようになる可能性を示す。さらに、本結果は、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１処置後の高齢者における免疫機能の改善傾向を示唆する。
サブグループ解析において、低ベースラインインフルエンザ力価(≦１：４０)のサブセットの対象は、ＩＴＴ集団より高い力価のＲＡＤ００１関連増加を経験した(図１Ｂ)。これらのデータは、ＲＡＤ００１が、ベースラインで予防的(＞１：４０)力価を有さず、それゆえにインフルエンザ疾病の最高のリスクにある対象のインフルエンザワクチン応答の増強に特に有効であることを示す。
【１１０９】
ＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する力価増加の散布図は、逆暴露／応答相関を示す(図２)。Ｓ６キナーゼ(Ｓ６Ｋ)のｍＴＯＲ介在リン酸化に基づくモデリングおよびシミュレーションは、２０mg毎週投与レジメンがｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋ活性をほぼ完全に阻止し、５mg毎週投与レジメンはＳ６Ｋ活性を５０％を超えて阻止し、０.５mg連日投与レジメンは、Ｓ６Ｋリン酸化を投与の合間に約３８％まで阻止することを予測する(Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602)。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１での、部分的ｍＴＯＲ阻害、例えば、ｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋリン酸化阻害は、高齢者の免疫応答の増強における高用量ＲＡＤ００１でのほぼ完全なｍＴＯＲ阻害よりも有効ではないにしても、有効であり得る。
【１１１０】
インフルエンザワクチン接種４週間後の抗体陽転率も評価した。抗体陽転は、ワクチン接種前力価陰性(すなわち、ＨＩ力価＜１：１０)から、ワクチン接種後ＨＩ力価≧１：４０への変化または非陰性(≧１：１０)ワクチン接種前ＨＩ力価からの少なくとも４倍増加として定義された。治療企図集団、Ｈ３Ｎ２およびＢ株への抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で増加したが、該増加は統計的有意性には合わなかった(表７)。ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０の対象の亜集団において、ＲＡＤ００１処置はまたＨ３Ｎ２およびＢ株に対する抗体陽転率を増加させ、これらの結果は、０.５mg連日投薬コホートでＢ株に対して統計的有意性に達した。これらのデータは、さらにＲＡＤ００１が、高齢者におけるインフルエンザワクチン接種に対する血清学的応答を増強させたことを示す。
【１１１１】
【表２７】
2017528433.tif 000040
＊  ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
【１１１２】
現在の季節性インフルエンザワクチンは、しばしば、以前に広まったウイルスのバリアントとして存在するインフルエンザ株の継続する出現に対して適切な保護を提供しない。しかしながら、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの存在下でインフルエンザに対してワクチン接種したマウスは、プラセボと比較して、インフルエンザに対する広い血清学的応答を発達させた。広い血清学的応答は、ワクチンに含まれないインフルエンザの異種株での感染に対する保護を提供する、複数のサブタイプのインフルエンザにより発現される保存的エピトープに対する抗体を含んだ(Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178)。ＲＡＤ００１が高齢ボランティアにおけるインフルエンザに対する血清学的応答を広幅化するかについて、インフルエンザワクチン(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に含まれないインフルエンザの２種の異種株に対するＨＩ力価を測定した。異種株に対するＨＩ  ＧＭＴ比の増加は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった(図３)。さらに、異種株に対する抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった。５mgおよび２０mg毎週ＲＡＤ００１投薬コホートにおける抗体陽転率の増加は、Ｈ３Ｎ２異種株に対して統計的有意であった(表８)。プールしたＲＡＤ００１コホートについてのＨ３Ｎ２抗体陽転率は３９％であり、それに対しプラセボコホートは２０％であった(ｐ＝０.００７)。ここに示した結果は、ｍＴＯＲ阻害がインフルエンザワクチン接種に対する高齢ボランティアの血清学的応答を広幅化し、季節性インフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザの異種株に対する抗体力価を高めることを示唆する。
【１１１３】
ラパマイシンで処置したマウスにおけるインフルエンザの異種株に対する血清学的応答の広幅化は、Ｂ細胞におけるクラススイッチングの阻止および抗インフルエンザＩｇＭレベルの増加と関係している(Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178)。しかしながら、クラススイッチングの阻止は、ワクチン接種後抗インフルエンザＩｇＭおよびＩｇＧレベルがＲＡＤ００１コホートとプラセボ処置コホート間で差がなかったため、ＲＡＤ００１で処置したヒトにおける広幅化された血清学的応答とは関係しない可能性がある(図４)。
【１１１４】
【表２８】
2017528433.tif 000041
＊  ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
【１１１５】
ＲＡＤ００１が高齢ボランティアにおける免疫機能を増強する機構に取り組むため、免疫表現型検査を、ベースライン、治験薬処置６週間後およびインフルエンザワクチン接種４週間後(治験薬中止６週間後)に対象から得たＰＢＭＣサンプルで実施した。大部分のＰＢＭＣサブセットのパーセンテージはＲＡＤ００１コホートとプラセボの間で差がなかったが、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージは、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で低かった(図５)。ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞は年齢とともに蓄積し、ＰＤ−１がＴ細胞受容体誘発Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解性機能を阻止するため、抗原刺激に対する不完全な応答を有する(Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798)。プラセボコホートにおいてＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージの経時的増加があった。１２週目(ワクチン接種４週間後)で、インフルエンザウイルスがＰＤ−１陽性Ｔ細胞を増加させることが示されているため、この増加はインフルエンザワクチン接種によるものであり得る(Erikson, JJ et al. (2012) JCI 122:2967-2982)。しかしながら、全ＲＡＤ００１コホートでＣＤ４  ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージは６週目および１２週目でベースラインから下がった(図５Ａ)。ＣＤ８  ＰＤ−１陽性細胞のパーセンテージも、２つの低用量ＲＡＤ００１コホートで６週目および１２週目の両者でベースラインから下がった(図５Ｂ)。ＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセンテージを評価し、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１コホートで増加した(図５Ｃ)。
【１１１６】
ＲＡＤ００１コホートからの結果をプールし、ベースラインＰＤ−１発現の差異について調整したより厳密な統計解析下、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)で、６週目にＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の３０.２％の統計的に有意な減少があり、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)であった(図６Ａ)。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の減少は３２.７％であり、ｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)である。図６Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤ００１コホート(ｎ＝８４)における６週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の統計的に有意な３７.４％の減少を示し、ｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)である。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤ００１の１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞減少は４１.４％であり、ｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)である。それゆえに、図５および６の結果は、合わせて、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１関連減少が、免疫機能の増強に貢献している可能性を示唆する。
【１１１７】
結論
結論として、ここに提供したデータは、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、インフルエンザワクチン接種に対する応答で評価して、ヒト高齢者の免疫学的機能における年齢関連減少を軽減し、この改善が許容されるリスク対効果バランスで得られることを示す。高齢マウスでの試験において、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間処置はインフルエンザワクチン接種に対する応答を増加しただけでなく、寿命も延長し、免疫老化の改善は、加齢関連表現型に対するより広範な効果のマーカーであり得ることを示唆する。
【１１１８】
ＲＡＤ００１投薬をワクチン接種２週間前に中断したため、ＲＡＤ００１の免疫増強効果は、薬物処置中止後も残留する適切な細胞集団における変化により介在され得る。ここに示した結果は、ＲＡＤ００１が、プラセボと比較して枯渇したＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージを減少させたことを示す。ＰＤ−１発現はＴＣＲシグナル伝達により誘発され、慢性ウイルス感染を含む永続性抗原刺激の設定で高いままである。理論に縛られることを望まないが、ＲＡＤ００１が高齢ボランティアにおける慢性免疫活性化を減少し、それによりＰＤ−１発現を減少させた可能性がある。ＲＡＤ００１はまたイムノフィリンシクロスポリンＡについて報告されているように、ＰＤ−１発現を直接的にも阻害し得る(Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839)。ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１誘発減少は、Ｔ細胞応答の品質を改善させる可能性がある。これは、ｍＴＯＲ阻害が、マウスおよび霊長類におけるワクチン接種に対する記憶ＣＤ８  Ｔ細胞応答の品質を改善したことを示す試験と先の一致する(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。高齢マウスにおいて、ｍＴＯＲ阻害はまた造血幹細胞の数を増加させ、ナイーブリンパ球の産生増加に至ることも示されている(Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75)。本実施例においてＲＡＤ００１対プラセボコホートでナイーブリンパ球のパーセンテージに有意な差は検出されなかったが、この可能性がある機構をさらに調査し得る。
【１１１９】
ＲＡＤ００１がインフルエンザの異種株に対する血清学的応答を広幅化する機構をさらに調査し得る。ラパマイシンも、インフルエンザワクチン接種後Ｂ細胞におけるクラススイッチングを阻止することが示されている。その結果、抗インフルエンザ抗体の独特のレパートリーが産生され、それがインフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザウイルスサブタイプでの致死的感染に対する株間保護を促進した(Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178)。ここに記載した結果は、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種２週間前にＲＡＤ００１を中止した高齢対象におけるＢ細胞クラススイッチングを改変したことを示さなかった。基礎機構をさらに解明する必要があるが、ここに記載する異種インフルエンザ株に対する血清学的応答の増加は、インフルエンザの季節性ワクチンと地域社会で広まっている株があまり適合していない年のインフルエンザ疾病に対する保護の増強に寄与し得る。
【１１２０】
インフルエンザ抗体力価に対するＲＡＤ００１の効果は、高齢者のインフルエンザワクチン接種に対する応答の増加について承認されているＭＦ５９ワクチンアジュバントの効果と同等であった(Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680)。それゆえに、インフルエンザワクチン接種に対する抗体応答のＲＡＤ００１駆動増強は、高齢者におけるＭＦ５９アジュバント添加インフルエンザワクチンで証明される臨床的利益に翻訳され得る(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693)。しかしながら、ＲＡＤ００１はまた臓器移植患者の免疫応答の抑制にも使用される。これらの外見上逆説的な結果は、ｍＴＯＲ阻害剤の免疫調節効果が用量および／または抗原依存性であり得る可能性を惹起する(Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008)。逆ＲＡＤ００１暴露／ワクチン接種応答相関の傾向がここで見られた。完全なｍＴＯＲ阻害は通常のシクロフィリン−ラパマイシン機構を介して免疫機能を抑制するが、部分的ｍＴＯＲ阻害は、少なくとも高齢者において、異なる加齢関連表現型阻害により免疫機能を増強する可能性がある。興味深いことに、ｍＴＯＲ活性は、高齢動物モデルにおける造血幹細胞を含む多様な組織で増加する(Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 and Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185)。それゆえに、ｍＴＯＲ活性の、若い組織で見られるレベルへの下落が、ｍＴＯＲ活性のより完全な抑制とは逆に、老化減少適応症に臨床的利益があり得る。
【１１２１】
加齢関連適応症の処置におけるＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤の安全性プロファイルは懸念されている。腫瘍学または臓器移植適応症で使用される用量でのＲＡＤ００１の毒性は、多くの加齢関連適応症では許容されないであろう口内炎、下痢、悪心、血球減少、高脂血および高血糖を含む。しかしながら、これらのＡＥは、血中のＲＡＤ００１のトラフレベルに関係する。それゆえに、本治験で使用したＲＡＤ００１投与レジメンは、トラフレベルを最少化するように選択した。０.５mg連日、５mg毎週および２０mg毎週投薬コホートの平均ＲＡＤ００１トラフレベルは、それぞれ０.９ｎｇ／ml、０.３ｎｇ／ml(定量下限)未満および０.７ｎｇ／mlであった。これらのトラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンと関係するトラフレベルより顕著に低い。さらに、６週間の限られた処置コースが有害事象のリスクを減らした。これらの結果は、この治験で使用された投与レジメンが、高齢者のある状態については許容されるリスク対効果を有し得ることを示唆する。それにもかかわらず、ここに記載した試験の対象の相当数が、０.５mg連日ほど低い投薬でも口腔内潰瘍を発症した。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１の安全性プロファイルはさらなる治験を必要とする。現在利用可能なラパログよりも問題のない安全性プロファイルを有するｍＴＯＲ阻害剤は、将来加齢関連状態における良好な治療選択肢を提供し得る。
【１１２２】
実施例２：高齢者対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫機能は高齢者で低下し、感染発生率増加およびワクチン接種に対する応答減少に至る。ｍＴＯＲ阻害がヒトにおいて抗加齢効果を有するかの決定の第一段階として、無作為化プラセボ対照治験を実施し、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、高齢ボランティアにおけるワクチン接種に対する応答により評価された免疫機能の加齢関連低下を反転させるかを決定した応答。全例で、適切な患者同意を得て、治験は国の保健機関により承認された。
【１１２３】
ＲＡＤ００１の次の３投与レジメンを治験で使用した：
２０mg毎週(トラフレベル：０.７ｎｇ／ml)
５mg毎週(トラフレベルは検出限界以下であった)
０.５mg連日(トラフレベル：０.９ｎｇ／ml)
【１１２４】
移植および腫瘍適応症で承認されているＲＡＤ００１の用量より低いトラフレベルのために、これらの投与レジメンを選択した。トラフレベルは、体内の薬物の最低レベルである。１０mg連日腫瘍学投与レジメンに付随するＲＡＤ００１のトラフレベルは約２０ｎｇ／mlである。０.７５〜１.５mg  ｂｉｄ移植投与レジメンに付随するトラフレベルは約３ｎｇ／mlである。対照的に、我々の免疫化治験で使用した投与レジメンに付随するトラフレベルは３〜２０倍低かった。
【１１２５】
ＲＡＤ００１関連ＡＥがトラフレベルと関係するため、３投与レジメンは正常ボランティアに対する適切な安全性を有することが予測された。さらに、３用量は、一定範囲のｍＴＯＲ阻害を与えることが予想された。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ(Ｐ７０  Ｓ６Ｋ)は、ｍＴＯＲによりリン酸化される下流標的である。Ｐ７０  Ｓ６Ｋリン酸化のレベルは、ｍＴＯＲ活性の指標として働く。ＲＡＤ００１の前臨床試験および臨床試験で得たＰ７０  Ｓ６Ｋリン酸化データのモデリングおよびシミュレーションに基づき、２０mg毎週が丸一週間ｍＴＯＲ活性をほぼ完全に阻害すると予測され、一方５mg毎週および０.５mg連日はｍＴＯＲ活性を一部阻害すると予測された。
【１１２６】
６５歳以上の高齢ボランティアを、３つのＲＡＤ００１処置群(５０対象／アーム)またはプラセボ(２０対象／アーム)の一つに無作為化した。対象を治験薬物で６週間処置し、２週間休薬し、インフルエンザワクチン接種(Aggrippal, Novartis)および肺炎球菌ワクチン接種(Pneumovax 23, Merck)をした。インフルエンザワクチン接種に対する応答を、ワクチン接種４週間後、インフルエンザワクチンの３インフルエンザ株(Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢインフルエンザサブタイプ)に対する血球凝集阻害アッセイによる幾何平均力価(ＧＭＴ)の測定により評価した。治験の主要評価項目は(１)安全性および耐容性および(２)ワクチン接種４週間後、プラセボと比較した、インフルエンザワクチン株の２／３のインフルエンザ力価の１.２倍増加であった。このエンドポイントは、インフルエンザ力価の１.２倍増加が、ワクチン接種後のインフルエンザ疾病の減少と関連し、それゆえに臨床的に適切であるために、選択した。５mg毎週および０.５mg  １日用量は十分耐容性であり、２０mg毎週用量と異なり、ＧＭＴ主要評価項目を満たした(図１Ａ)。高齢ボランティアにおいてプラセボと比較して、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善しただけでなく、肺炎球菌ワクチン接種に対する応答も改善した。肺炎球菌ワクチンは、２３種の肺炎球菌血清型からの抗原を含む。血清型の７種に対する抗体力価を我々の対象で測定した。６／７血清型に対する抗体力価が、プラセボと比較して全３つのＲＡＤコホートで増加した。
【１１２７】
合わせたインフルエンザおよび肺炎球菌力価データは、部分的(８０〜１００％未満)ｍＴＯＲ阻害が、完全なｍＴＯＲ阻害よりも免疫機能における加齢関連低下の反転により有効であることを示す。
【１１２８】
実施例３：低用量ｍＴＯＲ阻害はエネルギーおよび運動を増やす
前臨床モデルにおいて、ラパログであるラパマイシンでのｍＴＯＲ阻害は、老齢マウスにおける自発的身体活動性を増加させる(Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82)。興味深いことに、実施例２に記載した０.５mg連日投薬コホートの対象も、投与１年後のアンケートで、プラセボと比較してエネルギーおよび運動能の増加を報告した(図７)。これらのデータは、ラパログでの部分的ｍＴＯＲ阻害が、単なる免疫機能を超えて加齢関連罹病率に対する効果を有し得ることを示唆する。
【１１２９】
実施例４：ＲＡＤ００１でのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害
モデリングおよびシミュレーションを実施し、ｍＴＯＲ活性を部分的に阻害すると予測されるＲＡＤ００１の連日および毎週用量範囲を予測した。上記のとおり、Ｐ７０  Ｓ６ＫはｍＴＯＲによりリン酸化され、Ｐ７０  Ｓ６Ｋのノックアウトが寿命を増加するため加齢とより密接に結びついたｍＴＯＲの下流標的である。それゆえにモデリングを、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性を一部阻害するＲＡＤ００１の用量で行った。≧０.１mgおよび＜２０mgの範囲の毎週投薬がＰ７０  Ｓ６Ｋ活性の部分的阻害を達成すると予測される(図８)。
【１１３０】
連日投薬について、３０ｐＭ〜４ｎＭの濃度のＲＡＤ００１が細胞株におけるＰ７０  Ｓ６Ｋ活性を部分的に阻害する(表９)。これらの血清濃度は、≧０.００５mg〜＜１.５mg連日のＲＡＤ００１の用量で達成されると予測される。
【表２９】
2017528433.tif 000042
【１１３１】
結論
Ｐ７０  Ｓ６Ｋを部分的にしか阻害しない用量のｍＴＯＲ阻害剤を用いる、加齢関連罹患を処置するまたは一般に免疫応答を増強する方法。加齢適応症における低用量のＲＡＤ００１での部分的ｍＴＯＲ阻害の有効性は予想外の発見である。≧０.１mg〜＜２０mg毎週および≧０.００５mg〜＜１.５mg連日のＲＡＤ００１用量範囲が部分的ｍＴＯＲ阻害を達成し、それゆえに加齢関連罹患または免疫応答の増強に有効性を有することが期待される。
【１１３２】
実施例５：ＰＤ−１  ＣＡＲ
本実施例におけるＰＤ−１ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインも融合した阻害分子の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)、プログラム細胞死１(ＰＤ−１)を含む。ある態様において、ＰＤ−１  ＣＡＲを単独で使用できる。ある態様において、ＰＤ−１  ＣＡＲを他のＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲと組み合わせて使用できる。ある態様において、ＰＤ−１  ＣＡＲは、Ｔ細胞の残留性を改善する。ある態様において、ＣＡＲは、Ｔ細胞の持続を改善する。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号２６で下線により示されるＰＤ−１の細胞外ドメインを含むＰＤ−１  ＣＡＲである(ＰＤ−１ドメインを下線を引く)
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr 配列番号26
【１１３３】
ＰＤ−１  ＣＡＲの対応するヌクレオチド配列を下に示し、ＰＤ−１  ＥＣＤを下の配列番号２７で下線を引く(ＰＤ−１ドメインを下線を引く)。
Atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc 配列番号27
【１１３４】
阻害分子の他の例は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転できる。
【１１３５】
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーター(ＪＮＬ)を含むＪｕｒｋａｔ細胞を、ピューロマイシンを０.５μｇ／mlで含むＪｕｒｋａｔ細胞増殖培地で０.５×１０６／ml密度まで増殖させた。各トランスフェクションについて、３×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈させた。構築物あたり４μｇ  ＤＮＡをトランスフェクションあたりに使用した。Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＶおよびサプリメントＩを混合し、１００μlを、ＤＮＡ構築物とチューブに添加した。次いで、混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  II  Ｄｅｖｉｃｅを使用して設定Ｘ−００１の下に実施した。０.５mlの増殖培地をエレクトロポレーション直後に添加し、混合物を、６ウェルプレートの１ウェル中の２ml増殖培地に添加した。２時間後、多様な濃度のラパログ化合物を細胞に添加した。細胞を、標的で被覆された組織培養プレートウェルに適用した。組織培養プレートを５μｇ／mlのＰＤＬ１−ＦｃまたはＩｇＧ１−Ｆｃまたは任意の標的で、２時間、３７℃で被覆し、次いでブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で３０分遮断した。トランスフェクト細胞を、１００μl／ウェルで標的プレートに添加し、さらに１６時間インキュベートした。ウェルあたりLuciferase One Glo試薬１００μlを添加した。サンプルを、５分、３７℃でインキュベートし、発光をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して測定した。
【１１３６】
ＰＤ１  ＣＡＲ構築物は、ＰＤ１−ＥＣＤ−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータを含む。この構築物は、構築物をトランスフェクトした細胞、例えば、ＰＤ１  ＣＡＲをトランスフェクトしたＣＡＲＴ細胞の残留性を改善し得る。
【１１３７】
図９に示すように、ＰＤ１  ＣＡＲは、ＩｇＧ１−Ｆｃによる対照処置と比較して、ＮＦＡＴ誘導性プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性の顕著なＰＤ１誘導活性化を示した。これは、ＰＤＬ−１とのＰＤ１相互作用が、Ｊｕｒｋｅｔ細胞表面におけるＰＤ１のクラスタリングに十分であり、ＮＦＡＴ経路の強い活性化をもたらすことを示す。
【１１３８】
実施例６：低用量ＲＡＤ００１は、細胞培養モデルにおけるＣＡＲＴ増殖を刺激する
インビトロでのＣＡＲ  Ｔ細胞増殖に対するＲＡＤ００１の低用量の効果を、ＣＡＲＴ発現細胞と標的細胞を種々の濃度のＲＡＤ００１存在下で共培養することにより評価した。
【１１３９】
材料および方法
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の産生
ヒト化、抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)レンチウイルス転移ベクターを、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子に封入されたゲノム材料を産生するために使用した。ヒト化抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、２０１４年３月１５日に出願されたＰＣＴ出願、ＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載されたＣＡＲ  １、ＩＤ  １０４８７５であり、そこで配列番号８５および３１とされている。
【１１４０】
レンチウイルス転移ベクターＤＮＡを、３パッケージング要素ＶＳＶｇ  ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖと、リポフェクタミン試薬と組み合わせて混合し、レンチ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトする。培地をその後２４時間および３０時間に交換し、ウイルス含有培地を採取し、濾過し、−８０℃で保存する。ＣＡＲＴを、健常ドナー血液またはｌｅｕｋｏｐａｋの陰性磁気選択により得た新鮮または凍結ナイーブＴ細胞の形質導入により産生する。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと２４時間インキュベーションすることにより活性化し、ウイルス上清または濃縮ウイルス(それぞれ、ＭＯＩ＝２または１０)を培養に添加する。修飾Ｔ細胞を約１０日増殖させる。細胞形質導入のパーセンテージ(細胞表面のＣＡＲを発現)およびＣＡＲ発現レベル(相対蛍光強度、Geo Mean)を、７〜９日目にフローサイトメトリー分析で決定する。増殖速度遅延および約３５０fLに近づくＴ細胞サイズの組み合わせが、Ｔ細胞をその後の分析のために凍結保存する状態を決定する。
【１１４１】
ＣＡＲＴ増殖評価
ＣＡＲＴの機能性を評価するために、Ｔ細胞を融解し、計数し、生存能をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒで評価する。各培養における多数のＣＡＲ陽性細胞を、非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)を使用して標準化する。ＣＡＲＴに対するＲＡＤ００１の影響を、５０nMから開始してＲＡＤ００１のタイトレーションにより試験した。全共培養実験において使用する標的細胞株は、ＣＤ１９を発現し、ルシフェラーゼを発現するように形質導入されたヒト前Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株であるＮＡＬＭ６(Ｎａｌｍ−６)である。
【１１４２】
ＣＡＲＴの増殖を測定するために、Ｔ細胞を標的細胞と１：１比で培養する。アッセイを４日行い、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲ発現について染色する。多数のＴ細胞を、対照としてカウンティングビーズを使用するフローサイトメトリーにより評価する。
【１１４３】
結果
ＣＡＲＴ細胞の増殖能力を、４日共培養アッセイで試験した。多数のＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(濃色棒)および総ＣＤ３陽性Ｔ細胞(薄色棒)を、ＣＡＲ形質導入および非形質導入Ｔ細胞とＮＡＬＭ６(Ｎａｌｍ−６)の培養後評価した(図１０)。ｈｕＣＡＲＴ１９細胞は、０.０１６nM未満のＲＡＤ００１の存在下で培養したとき増殖し、化合物が高濃度ではそれより少なく増殖した。重要なことに、０.００３２および０.０１６nM  ＲＡＤ００１両者で、増殖はＲＡＤ００１非添加で観察されるより高かった。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)は検出可能な増殖を示さなかった。
【１１４４】
実施例７：低用量ＲＡＤ００１はインビボでＣＡＲＴ増殖を刺激する
本実施例は、ｈｕＣＡＲ１９細胞が種々の濃度のＲＡＤ００１存在下でインビボで増殖する能力を評価する。
【１１４５】
材料および方法：
ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞：ＮＡＬＭ６ヒト急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)細胞株は、再発ＡＬＬ患者の末梢血から展開された。その後、細胞はホタルルシフェラーゼでタグ付けされた。これらの懸濁細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩで増殖させた。
【１１４６】
マウス：６週齢ＮＳＧ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)マウスを、Jackson Laboratory(stock number 005557)から得た。
【１１４７】
腫瘍インプラント：ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、インビトロで１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩで増殖および拡張した。次いで、細胞を１５mlコニカルチューブに移し、２回冷滅菌ＰＢＳで洗浄した。ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、次いで、計数し、ＰＢＳ１ミリリットルあたり１０×１０６細胞濃度で再懸濁した。細胞を氷上に置き、直ぐに(１時間以内に)マウスにインプラントした。ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を、１００μl体積で、合計マウスあたり１×１０６細胞で尾静脈に静脈注射した。
【１１４８】
ＣＡＲ  Ｔ細胞投薬：マウスに、腫瘍インプラント７日後５×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与した。細胞を、３７℃水浴で一部溶かし、その後、１mlの冷滅菌ＰＢＳを細胞を含むチューブに添加しながら完全に融解した。融解細胞を１５mlファルコンチューブに移し、ＰＢＳで最終体積１０mlに合わせた。細胞を、各１０００rpmで１０分、２回洗浄し、次いで、血球計数器で計数した。Ｔ細胞を、次いで、冷ＰＢＳ１mlあたり５０×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞濃度で懸濁し、マウスに投薬するまで氷上に維持した。マウスに、１００μlのＣＡＲ  Ｔ細胞を、マウスあたり５×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量で、尾静脈から静脈注射した。群あたり８マウスが、１００μlのＰＢＳ単独(ＰＢＳ)またはヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置された。
【１１４９】
ＲＡＤ００１投薬：１mg  ＲＡＤ００１に相当する５０mg濃縮マイクロエマルジョンを製剤し、投薬時にＤ５Ｗ(デキストロース５％水溶液)に再懸濁した。マウスに、２００μlの所望の用量のＲＡＤ００１を連日経口投与(強制喫食)した。
【１１５０】
ＰＫ分析：マウスに、腫瘍インプラント７日後から開始して、連日ＲＡＤ００１を投薬した。投薬群は次のとおりであった：０.３mg／kg、１mg／kg、３mg／kgおよび１０mg／kg。マウスは最初のおよび最後のＲＡＤ００１投与０日目および１４日後、ＰＫ分析のために次の時点で採血した：１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間および２４時間。
【１１５１】
結果：
ＲＡＤ００１の増殖および薬物動態を、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスで試験した。ＲＡＤ００１単独の連日経口投与は、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍増殖に影響を有しなかった(図１１)。ＲＡＤ００１の薬物動態分析は、腫瘍担持マウスの血中でかなり安定であることを示した(図１２Ａおよび１２Ｂ)。０日目および１４日目両者のＰＫ分析は、血中のＲＡＤ００１濃度が、試験した最低用量(０.３mg／kg)の投薬の２４時間後でも１０nm以上であることを示す。
【１１５２】
これらの用量に基づき、ｈｕＣＡＲ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、これらの細胞の増殖能を決定するために、ＲＡＤ００１を伴いまたは伴わずに投薬した。使用した最高用量は、投薬２４時間後の血中のＲＡＤ００１のレベルに基づき、３mg／kgであった。最後のＲＡＤ００１の投与の２４時間後ＲＡＤ００１濃度が１０nMを超えていたため、いくつかのＲＡＤ００１の低用量を、ＣＡＲ  Ｔ細胞でのインビボ研究に使用した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、連日経口ＲＡＤ００１投薬開始１日前にＩＶ投与した。マウスを、Ｔ細胞増殖についてＦＡＣＳでモニターした。
【１１５３】
最低用量のＲＡＤ００１は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖増加を示す(図１３Ａおよび１３Ｂ)。この増殖増加は、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりもＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞でより明白であり、長い。しかしながら、ＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞で、増殖増加は、ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後最初の時点でしか見ることができない。
【１１５４】
均等物
ここに引用する各および全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は、具体的面を参照して開示しているが、本発明の他の面および異形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく他の当業者により考案され得ることは明らかである。下記特許請求の範囲は、全てのこのような面および等価な異形を含むと解釈されることを意図する。
他の態様は、次の特許請求の範囲内である。
【図１】
2017528433.tif 000043
【図２】
2017528433.tif 000044
【図３】
2017528433.tif 000045
【図４】
2017528433.tif 000046
【図５】
2017528433.tif 000047
【図６】
2017528433.tif 000048
【図７】
2017528433.tif 000049
【図８】
2017528433.tif 000050
【図９】
2017528433.tif 000051
【図１０】
2017528433.tif 000052
【図１１】
2017528433.tif 000053
【図１２】
2017528433.tif 000054
【図１３】
2017528433.tif 000055
【配列表】
2017528433000001.app
【国際調査報告】
2017528433.tif 000056
2017528433.tif 000057
2017528433.tif 000058
2017528433.tif 000059
2017528433.tif 000060
2017528433.tif 000061