(57)【要約】  本発明は一般に、微小流体デバイス内で液滴をタグ化するためのシステムおよび方法を含む、かかるデバイスに関する。一部の態様では、微小流体液滴が、種々の異なる条件に液滴（または他の個別の実体）を曝露することによって操作される。液滴中に複数の核酸「タグ」を組み込み、次いで適宜これらの核酸を一緒にライゲーションさせることによって、液滴が曝露された条件は、これらの核酸タグによってコードされ得る。従って、異なる条件に曝露された液滴が一緒に混合される場合であっても依然として、各液滴が遭遇する条件は、例えば、これらの核酸を配列決定することによって決定され得る。
2017513525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の条件に液滴を曝露し、前記液滴に第１の核酸を添加することであって、前記第１の核酸は、前記第１の条件をコードすること；
第２の条件に前記液滴を曝露し、前記液滴に第２の核酸を添加することであって、前記第２の核酸は、前記第２の条件をコードすること；ならびに
前記第１の核酸および前記第２の核酸を一緒にライゲーションさせること
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の条件に前記液滴を曝露し、前記液滴に前記第１の核酸を添加することが、前記液滴を、前記第１の核酸を含む第２の液滴に融合させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の条件に前記液滴を曝露することが、分子種に前記液滴を曝露することを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記分子種に前記液滴を曝露することが、前記液滴を、前記分子種を含む第２の液滴に融合させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の液滴が、前記第１の核酸をさらに含み、それによって、前記液滴に前記第２の液滴が融合される際に、前記液滴に前記第１の核酸が添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の液滴が、前記液滴において誘導された双極子を介して、前記液滴に融合される、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の液滴が、前記液滴上に配置された反対の電荷を介して、前記液滴に融合される、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分子種に記液滴を曝露することが、前記液滴に、前記分子種を含む流体を注入することを含む、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記分子種を含む前記流体が、前記第１の核酸をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分子種および前記第１の核酸が、前記液滴に同時に添加される、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１の核酸が前記液滴に添加される前に、前記分子種が前記液滴に添加される、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１の核酸が前記液滴に添加された後に、前記分子種が前記液滴に添加される、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の条件に前記液滴を曝露することが、外部物理条件に前記液滴を曝露することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
外部物理条件に前記液滴を曝露することが、所定の温度および／または所定の圧力に前記液滴を曝露することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の条件に前記液滴を曝露することが、前記液滴を、７未満のｐＨおよび／または７よりも高いｐＨを有する第２の液滴に融合させることを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記液滴が、約１ｍｍ未満の平均断面直径を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記液滴が複数の液滴のうちの１つであり、前記複数の液滴の約５％以下が、前記複数の液滴の全体的平均直径の約９０％未満の直径または約１１０％よりも大きい直径を有するような直径の分布を、前記複数の液滴が有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第３の条件に前記液滴を曝露し、前記液滴に前記第３の核酸を添加することであって、前記第３の核酸は、前記第３の条件をコードすることをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第３の核酸を、前記第１の核酸および前記第２の核酸のうちの一方または両方に結合させることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の核酸および前記第２の核酸を結合させる行為が、前記液滴内で生じる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記液滴の特性を決定することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記特性に基づいて、前記液滴を選別することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記特性が蛍光性である、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記特性が、前記液滴の平均断面直径である、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記特性が光吸収である、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記特性が、前記液滴内に含まれる薬剤の濃度である、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記特性が、前記液滴内に含まれる細胞の条件である、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記特性が、前記細胞が生きているか死んでいるかである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記特性が、前記細胞によって生成および／または消費される薬剤の濃度である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記液滴から、結合した第１の核酸および第２の核酸を分離することをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記液滴を破裂させることをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記液滴が、前記第１の核酸および前記第２の核酸を結合させた後に破裂される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記液滴が、超音波に前記液滴を曝露することによって破裂される、請求項３１または３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記液滴が細胞を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が癌細胞である、請求項３４または３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が免疫細胞である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が細菌細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、天然に存在する細胞である、請求項３４または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の条件が、前記細胞の型である、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法
【請求項４１】
前記第１の条件が、前記細胞と相互作用することが可能であると疑われる薬物への曝露である、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の条件が、細胞傷害性であると推定される薬物への曝露である、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ライゲーションされた第１および第２の核酸を配列決定することをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記液滴が、微小流体チャネル内に含まれる、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
実質的に各々の液滴が、少なくとも２つの異なる条件に連続的に曝露されるように、複数の条件に複数の液滴を曝露することであって、液滴が条件に曝露される際に、前記条件をコードする核酸が、前記液滴に添加されることを含む方法。
【請求項４６】
液滴内に含まれる前記核酸のうちの少なくとも一部を互いに結合させることをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
液滴内に含まれる前記核酸のうちの少なくとも一部を互いにライゲーションさせることをさらに含む、請求項４５または４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸のうちの少なくとも一部をライゲーションさせることが、前記核酸を互いにライゲーションさせることができる酵素に、前記核酸を曝露することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
条件をコードする核酸が、前記核酸を含む第２の液滴に液滴を融合させることによって前記液滴に添加される、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
条件をコードする核酸が、液滴中に、前記核酸を含む流体を注入することによって前記液滴に添加される、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記条件のうちの少なくとも１つが、外部物理条件への曝露である、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記条件のうちの少なくとも１つが、所定の温度および／または所定の圧力への曝露である、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記条件のうちの少なくとも１つが、分子種への曝露である、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記液滴のうちの少なくとも一部が、細胞を含む、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が実質的に同一である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞が、同じ臓器から生じる、請求項５４または５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が、同じ生物から生じる、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が、異なる生物から生じる、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が、同じ生物学的種から生じる、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞がヒト細胞を含む、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記条件のうちの少なくとも１つが、前記細胞のうちの少なくとも一部と相互作用することが可能であると疑われる薬物への曝露である、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
実質的に各々の液滴を、少なくとも３つの異なる条件に曝露することを含む、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記液滴の特性を決定することをさらに含む、請求項４５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記特性に基づいて、前記液滴のうちの少なくとも一部を選別することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記特性が蛍光性である、請求項６３または６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記特性が、前記液滴内に含まれる薬剤の濃度である、請求項６３または６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記特性が、前記液滴内に含まれる細胞の条件である、請求項６３または６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記液滴のうちの少なくとも一部から、前記核酸のうちの少なくとも一部を分離することをさらに含む、請求項４５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記液滴のうちの少なくとも一部を破裂させることをさらに含む、請求項４５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸のうちの少なくとも一部を配列決定することをさらに含む、請求項４５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
複数の液滴を含む物品であって、前記液滴のうちの少なくとも一部は、前記少なくとも一部の液滴が曝露される複数の条件をコードする核酸を含む、物品。
【請求項７２】
前記核酸が、少なくとも３つの条件をコードする、請求項７１に記載の物品。
【請求項７３】
前記核酸のうちの少なくとも一部が、前記液滴のうちの少なくとも一部内に含まれる分子種をコードする、請求項７１または７２のいずれか一項に記載の物品。
【請求項７４】
前記液滴のうちの少なくとも一部が、前記核酸によってコードされるそれぞれの前記分子種をさらに含む、請求項７３に記載の物品。
【請求項７５】
実質的に各々の前記液滴が、少なくとも２つの分子種、および前記少なくとも２つの分子種をコードする核酸を含む、請求項７４に記載の物品。
【請求項７６】
実質的に各々の前記液滴が、少なくとも３つの分子種、および前記少なくとも３つの分子種をコードする核酸を含む、請求項７４または７５のいずれか一項に記載の物品。
【請求項７７】
前記液滴のうちの少なくとも一部が、細胞をさらに含む、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の物品。
【請求項７８】
前記細胞が実質的に同一である、請求項７７に記載の物品。
【請求項７９】
前記液滴のうちの少なくとも一部が、ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項７１〜７８のいずれか一項に記載の物品。
【請求項８０】
第１の化学種に、液滴内に含まれる細胞を曝露し、前記液滴に第１の核酸を添加すること；
第２の化学種に前記細胞を曝露し、前記液滴に第２の核酸を添加すること；
前記第１の核酸および前記第２の核酸を一緒にライゲーションさせること；
前記細胞の特性を決定すること；ならびに
前記細胞の特性に基づいて、前記液滴を選別すること
含む方法。
【請求項８１】
前記第１の核酸および前記第２の核酸をライゲーションさせることが、前記第１の核酸および前記第２の核酸を互いにライゲーションさせることができる酵素に、前記第１の核酸および前記第２の核酸を曝露することを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記液滴に前記第１の核酸を添加することが、前記液滴を、前記第１の核酸を含む第２の液滴に融合させることを含む、請求項８０または８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１の分子種に前記液滴を曝露することが、前記液滴を、前記第１の分子種を含む第２の液滴に融合させることを含む、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２の液滴が、前記第１の核酸をさらに含み、それによって、前記液滴に前記第２の液滴が融合される際に、前記液滴に前記第１の核酸が添加される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１の分子種に前記液滴を曝露することが、前記液滴に、前記第１の分子種を含む流体を注入することを含む、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１の分子種を含む前記流体が、前記第１の核酸をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記液滴に、前記第１の核酸を含む第２の流体を注入することをさらに含む、請求項８５または８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
第３の分子種に前記液滴を曝露し、前記液滴に第３の核酸を添加することをさらに含む、請求項８０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記第３の核酸を、前記第１の核酸および前記第２の核酸のうちの一方または両方に結合させることをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記特性が、前記細胞が生きているか死んでいるかである、請求項８０〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記特性が、前記細胞によって生成または消費される薬剤の濃度である、請求項８０〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞の前記特性に基づいて、前記液滴を選別することをさらに含む、請求項８０〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞の前記特性を、前記第１の核酸および前記第２の核酸と関連付けることをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記液滴から、結合した第１の核酸および第２の核酸を分離することをさらに含む、請求項８０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記液滴を破裂させることをさらに含む、請求項８０〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１の核酸および／または前記第２の核酸を決定することをさらに含む、請求項８０〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
ライゲーションされた第１および第２の核酸を配列決定することをさらに含む、請求項８０〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記行為が、列挙された順序で実施される、請求項８０〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
複数の細胞型および複数の核酸を含む液滴のライブラリーを含む物品であって、実質的に各々の前記細胞型が、独自の核酸配列によってコードされる、物品。
【請求項１００】
前記ライブラリーが、少なくとも１０の独自の細胞型を含む、請求項９９に記載の物品。
【請求項１０１】
前記ライブラリーが、少なくとも１００の独自の細胞型を含む、請求項９９または１００のいずれかに一項に記載の物品。
【請求項１０２】
前記ライブラリーが、少なくとも１，０００の独自の細胞型を含む、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の物品。
【請求項１０３】
実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、および前記ただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に複数の細胞型および複数の核酸を封入することを含む方法。
【請求項１０４】
実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、および前記ただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に少なくとも１０の独自の細胞型および複数の核酸を封入することを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、および前記ただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に少なくとも１００の独自の細胞型および複数の核酸を封入することを含む、請求項１０３または１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、および前記ただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に少なくとも１０００の独自の細胞型および複数の核酸を封入することを含む、請求項１０３〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
第１の条件に前記複数の液滴を曝露し、前記液滴に第１の核酸を添加すること、および前記コード核酸および前記第１の核酸を一緒にライゲーションさせることをさらに含む、請求項１０３〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第１の条件が、分子種への曝露である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記分子種が、前記細胞型のうちの少なくとも一部と相互作用することが可能であると疑われる薬物である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記分子種が、複数の分子種から選択される、請求項１０８または１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記分子種が、実質的に各々の液滴が、前記複数の分子種から選択される前記分子種のうちの１つに曝露されるように、複数の少なくとも１０の分子種から選択される、請求項１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記分子種が、実質的に各々の液滴が、前記複数の分子種から選択される前記分子種のうちの１つに曝露されるように、複数の少なくとも１００の分子種から選択される、請求項１１０または１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記分子種が、実質的に各々の液滴が、前記複数の分子種から選択される前記分子種のうちの１つに曝露されるように、複数の少なくとも１，０００の分子種から選択される、請求項１１０〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記液滴内の前記細胞を溶解させることをさらに含む、請求項１０３〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
溶解された細胞によって生成された核酸を、前記液滴内の前記コード核酸にライゲーションさせることをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
溶解された細胞によって生成されたＲＮＡを、前記液滴内の前記コード核酸にライゲーションさせることを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＲＮＡがＲＮＡ転写物である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記核酸のうちの少なくとも一部を配列決定する、請求項１１５〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
デジタルＲＮＡ配列決定を使用して、前記核酸のうちの少なくとも一部を配列決定することを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、および前記ただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に複数の細胞型および複数の核酸を提供すること；
前記液滴内の細胞を溶解させて、前記細胞から細胞性核酸を放出させること；
前記コード核酸および前記細胞性核酸を一緒にライゲーションさせること；ならびに
ライゲーションされた核酸を配列決定すること
を含む方法。
【請求項１２１】
実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、および前記ただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に複数の細胞型および複数の核酸を提供すること；
実質的に各々の液滴が、複数の化学種のうちの単一の化学種に曝露されるように、前記複数の化学種に前記複数の液滴を曝露し、前記単一の化学種をコードする第１の核酸をそれに添加すること；
前記液滴内の細胞を溶解させて、前記細胞から細胞性核酸を放出させること；
前記コード核酸、前記第１の核酸および前記細胞性核酸を一緒にライゲーションさせること；ならびに
ライゲーションされた核酸を配列決定すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照によって本明細書に組み込まれる、Bernsteinらによる表題「Systems and Methods for Droplet Tagging」の、２０１４年４月１７日出願の米国仮特許出願第６１／９８１，１２３号の利益を主張する。
【０００２】
政府の資金提供
本発明は、National Institutes of Healthによって授与された助成金番号Ｐ０１ＧＭ０９６９７１、ならびにNational Science Foundationによって授与された助成金番号ＤＭＲ−１００６５４６およびＤＭＲ−０８２０４８４の下で、政府の支援によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般に、微小流体デバイス内で液滴をタグ化するためのシステムおよび方法を含む、かかるデバイスに関する。
【背景技術】
【０００４】
各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９１７６３、ＷＯ２００４／００２６２７、ＷＯ２００６／０９６５７１、ＷＯ２００５／０２１１５１、ＷＯ２０１０／０３３２００およびＷＯ２０１１／０５６５４６に開示されるものなどの、微小流体システム内で流体液滴を生成するための種々の技術が存在する。一部の場合には、比較的大きな数の液滴が生成され得、しばしば比較的速いスピードで、例えば、液滴は、少なくとも約１０液滴／秒の速度で生成され得る。これらの液滴は、その中に種々の化学種もまた含み得る。しかし、特に、多数の液滴が生成される場合、および／または液滴が非常に高速度で生成される場合、かかる液滴を正確に追跡することは困難であり得る。さらに、かかる追跡は、液滴が種々の異なる条件に曝露される、異なる化学種を含むなど、液滴が全て同一なわけではないような場合には、複雑なものとなり得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は一般に、微小流体デバイス内で液滴をタグ化するためのシステムおよび方法を含む、かかるデバイスに関する。本発明の主題は、一部の場合には、相互関係のある製品、特定の問題に対する代替的解法、ならびに／または１もしくは複数のシステムおよび／もしくは物品の複数の異なる使用を伴う。
【０００６】
一態様では、本発明は一般に、方法に関し、１セットの実施形態によれば、この方法は、第１の条件に液滴を曝露し、この液滴に第１の核酸を添加することであって、この第１の核酸は、第１の条件をコードすること；第２の条件にこの液滴を曝露し、この液滴に第２の核酸を添加することであって、この第２の核酸は、第２の条件をコードすること；ならびにこの第１の核酸および第２の核酸を一緒にライゲーションさせることを含む。
【０００７】
この方法は、別のセットの実施形態によれば、実質的に各々の液滴が、少なくとも２つの異なる条件に連続的に曝露されるように、複数の条件に複数の液滴を曝露する行為であって、液滴が条件に曝露される際に、その条件をコードする核酸が、その液滴に添加される行為を含む。
【０００８】
なお別のセットの実施形態では、この方法は、第１の化学種に、液滴内に含まれる細胞を曝露し、この液滴に第１の核酸を添加する行為、第２の化学種にこの細胞を曝露し、この液滴に第２の核酸を添加する行為、この第１の核酸および第２の核酸を一緒にライゲーションさせる行為、細胞の特性を決定する行為、ならびにこの細胞の特性に基づいて、液滴を選別する行為を含む。
【０００９】
さらに別のセットの実施形態は、一般に、実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、およびこのただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に複数の細胞型および複数の核酸を封入する行為を含む方法に関する。
【００１０】
この方法は、１セットの実施形態では、実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、およびこのただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に複数の細胞型および複数の核酸を提供する行為、この液滴内の細胞を溶解させて、細胞から細胞性核酸を放出させる行為、このコード核酸および細胞性核酸を一緒にライゲーションさせる行為、ならびにライゲーションされた核酸を配列決定する行為を含む。
【００１１】
別のセットの実施形態では、この方法は、実質的に各々の液滴が、ただ１つの細胞型の１または複数の細胞、およびこのただ１つの細胞型をコードするコード核酸を含むように、複数の液滴中に複数の細胞型および複数の核酸を提供する行為；実質的に各々の液滴が、複数の化学種のうちの単一の化学種に曝露されるように、複数の化学種に複数の液滴を曝露し、この単一の化学種をコードする第１の核酸をそれに添加する行為；この液滴内の細胞を溶解させて、細胞から細胞性核酸を放出させる行為；このコード核酸、第１の核酸および細胞性核酸を一緒にライゲーションさせる行為；ならびにライゲーションされた核酸を配列決定する行為を含む。
【００１２】
別の一態様では、本発明は一般に、複数の液滴に関する。一部の場合には、これらの液滴のうちの少なくとも一部は、これらの少なくとも一部の液滴が曝露された複数の条件をコードする核酸を含む。
【００１３】
本発明は、別の一態様によれば、一般に、複数の細胞型および複数の核酸を含む液滴のライブラリーに関する。一部の実施形態では、実質的に各々のこれらの細胞型は、独自の核酸配列によってコードされる。
【００１４】
別の一態様では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のうちの１または複数を行う方法を包含する。なお別の一態様では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のうちの１または複数を使用する方法を包含する。
【００１５】
本発明の他の利点および新規特徴は、添付の図面と併せて検討したとき、本発明の種々の非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から、明らかとなる。本明細書および参照によって組み込まれる文書が、矛盾する開示および／または一致しない開示を含む場合、本明細書が支配するものとする。参照によって組み込まれる２以上の文書が、互いに対して矛盾する開示および／または一致しない開示を含む場合、より最近の有効日を有する文書が支配するものとする。
【００１６】
本発明の非限定的な実施形態は、模式的であって正確な縮尺を意図していない添付の図面を参照して、例として記載される。図中、示された各同一またはほぼ同一の構成要素は、典型的には、単一の数字によって示される。明確さを目的として、当業者に本発明を理解させるために例示が必要でない場合、全ての構成要素が全ての図において表示されるわけでも、本発明の各実施形態の全ての構成要素が示されるわけでもない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、本発明の種々の実施形態に従う、液滴をタグ化するための種々の方法を模式的に示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、本発明の特定の実施形態における、種々の核酸タグを一緒に繋ぐことを模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は一般に、微小流体デバイス内で液滴をタグ化するためのシステムおよび方法を含む、かかるデバイスに関する。一部の態様では、微小流体液滴は、種々の異なる条件に液滴（または他の実体）を曝露することによって操作される。液滴中に複数の「タグ」、例えば核酸「タグ」を組み込み、これらのタグを一緒に繋ぐことによって、液滴が曝露された条件がコードされ得る。従って、異なる条件に曝露された液滴が一緒に混合される場合であっても依然として、各液滴が遭遇する条件は、例えば、これらの核酸を配列決定することによって決定され得る。
【００１９】
最初に、特定の非限定的な例が、図１を参照して議論される。しかし、他の実施形態では、他の構成も同様に使用され得る。最初に図１Ａを検討すると、種々の条件（例えば、薬物などの化学種）に曝露される液滴が示され、この液滴が条件に曝露されるたびに、その条件をコードする核酸が、この液滴に添加される。この条件は、化学種の添加である必要はなく、特定の温度への曝露などの物理条件でもあり得ることに、留意すべきである。液滴は図１を参照して議論されるが、これは、提示の容易さだけのためであることにさらに留意すべきである；他の実施形態では、マイクロウェルプレート中のマイクロウェルなどの、他の個別の実体が、これらの液滴の代わりに使用され得る。
【００２０】
この例で示されるように、液滴１０は、最初に、化学種Ｘおよび核酸１を含む液滴１２に遭遇し、この液滴１２に融合される。引き続いて、液滴１０は、液滴１３（化学種Ｙおよび核酸２を含む）および液滴１４（化学種Ｚおよび核酸３を含む）に遭遇し、これらに融合される。次いで、酵素Ｅが、例えば別の液滴融合事象の一部として（ここでは液滴１５で示される）、何らかの様式で液滴１０中に導入され得、またはこの酵素は、液滴１０、１２、１３または１４のうちのいずれか１つ中に最初から見出され得る。この酵素は、ライゲーションされた核酸１−２−３で示されるように、核酸１、２および３を一緒にライゲーションさせるために使用され得る。次いで、この液滴は、ライゲーションされた核酸にアクセスするために破裂され得、この核酸は、液滴１０の履歴を決定するために、配列決定または他の方法で決定され得る。
【００２１】
一部の実施形態では、２以上の液滴が、図１Ｂに示されるような様式で処理され得る。例えば、２以上の液滴は、種々の異なる条件に曝露され得、液滴が条件に曝露されるたびに、その条件をコードする核酸が、この液滴に添加される。しかし、異なる履歴を有するかかる液滴が、コンテナ２０中に示されるように、後に組み合わされる（例えば、混合物中で）場合であっても、液滴の各々が曝露された条件は、各液滴中に含まれる異なる核酸を介してなおも決定可能である。これは、液滴自体が破裂される場合であっても、および／または内容物が一緒に混合される場合であっても、当てはまる。例えば、図１Ｂに示されるように、核酸１−２−３、４−５−６および７−８−９を決定することによって、コンテナ２０中の少なくとも１つの液滴が、条件Ａ、ＢおよびＣに曝露され、少なくとも１つの液滴が、条件Ｉ、ＪおよびＫに曝露され、少なくとも１つの液滴が、条件Ｘ、ＹおよびＺに曝露されたことがわかる。さらに、コンテナ２０中の液滴には、他のセットの条件に曝露されたものがなかったことを決定することも可能であり得る。例えば、コンテナ２０中に配列１−２−９が存在しないので、条件Ｘ、ＹおよびＫに曝露された液滴が存在しなかったことを決定することが可能である。
【００２２】
図１Ｃに示されるように、本発明の特定の実施形態では、液滴の試験および／または選別もまた生じ得る。この図に示されるように、異なる条件（種々の番号によって示される、その中に含まれる核酸によってコードされる）に曝露された複数の液滴が、いくつかの基準に基づいて選別され得る。例えば、液滴がさらに細胞を含む場合、この細胞の特性（例えば、細胞が生きているか死んでいるか）が、２（またはそれ超）の集団へとこれらの液滴を選別するために使用され得る。次いで、各集団は、どの条件が異なる集団をもたらした可能性があるかを決定するために、例えば、その中に含まれる核酸を決定することによって、別々に分析され得る。例えば、図１Ｃ中では、液滴３０の集団が、第１の群（Ａ）および第２の群（Ｂ）に選別された。次いで、各群中の核酸は、配列決定され得る。従って、例えば、群Ａのメンバーは各々、条件２および３を共通して有し、群Ｂのメンバーは、条件２および３を共通して有することはない（しかし、群Ｂの液滴のうちの一部には、条件２または３が別々に存在していてもよい）ことが、決定され得る。従って、これらの選別実験は、条件２および３の組み合わせが、ある化学種の影響が生じるのに必要であり（群Ａ）、両方が存在しない場合には、その影響は生じない（群Ｂ）ことを、実証する。
【００２３】
また、図１Ｃ中で特筆すべきことは、かかる液滴が曝露される条件の数が、必ずしも同じでないことである；その代わり、これらの条件は、即ち、意図的に、または実験誤差もしくは不確実性に起因して、変動し得る。例えば、液滴２−４は、条件２および４に曝露され、液滴１−２−３−６は、条件１、２、３および６に曝露された。さらに、核酸を液滴から取り出す前の核酸のライゲーションに起因して、各液滴が曝露された条件は、これらの液滴および／または核酸が引き続いて一緒に混合される場合であっても、別々に維持および分析され得ることにも、留意すべきである。従って、図１Ｃに関して、核酸が一緒にライゲーションされていない場合、各群は、この例示的な例では、正確に同じ割合で同じ番号（条件を示す）を含むので、群ＡおよびＢの各々は、同一であるように見える。
【００２４】
従って、本発明の特定の実施形態の１つの驚くべき特徴は、ライゲーションされた核酸により、単一の条件または複数の条件などのより複雑な条件が、容易に決定されることである。これは、例えば、処置または分析の容易さのために、液滴が破裂される場合であっても、または他の方法で一緒に組み合わされる場合であっても、情報の喪失なしに達成され得る。対照的に、ライゲーションもタグを一緒に組み合わせる他の方法も用いずに、種々のタグが液滴中に別々に導入される技術では、これらの条件は、そう容易には分析できない；その代わり、（例えば、異なる液滴を破裂または一緒に融合させることによって）偶発的に組み合わされる任意のタグは情報の喪失を生じるので、液滴の各々を別々に維持することに注意を払わなければならない。
【００２５】
上記議論は、限定を意図しない；本発明の他の実施形態もまた、ここで議論されるように、液滴をタグ化することができる。例えば、本発明の種々の態様は、一般に、例えば、一緒に結合され得る核酸および他の「タグ」を使用して、微小流体デバイス内で液滴をタグ化または同定するためのシステムおよび方法に関する。タグを一緒に結合させることによって、このタグを含む液滴についての情報は、例えば、タグが液滴から分離され、および／または他の異なるタグと組み合わされた後であっても、保持され得る。従って、例えば、異なる液滴（例えば、異なる条件に曝露された）由来の複数のタグは、一緒に組み合わされ分析され得る。
【００２６】
本発明の特定の態様は、例えば、実体の内容物が他の実体の内容物と容易に混合されない場合、複数の液滴または他の個別の実体の使用を伴う。例えば、個別の実体は、運搬流体、マイクロウェルプレートのマイクロウェル、スライドまたは他の表面上の個々のスポットなどの内部に含まれる液滴であり得る。本明細書で議論するように、これらの実体の各々は、他の実体と偶発的に混合することなく、１または複数のタグまたは他の化学種を含み得る特定の場であり得る。これらの実体は、一部の場合には比較的小さくてもよく、例えば、各実体は、約１ｍｌ未満、約３００マイクロリットル未満、約１００マイクロリットル未満、約３０マイクロリットル未満、約１０マイクロリットル未満、約３マイクロリットル未満、約１マイクロリットル未満、約５００ｎｌ未満、約３００ｎｌ未満、約１００ｎｌ未満、約５０ｎｌ未満、約３０ｎｌ未満または約１０ｎｌ未満の容量を有し得る。
【００２７】
一部の実施形態では、この液滴または他の実体は、種々の化学種、例えば、細胞、化学物質などを含み得る。化学種の他の例は、本明細書で議論される。例えば、この液滴または他の実体が１または複数の細胞を含む場合、それらの細胞は、実質的に同一または異なり得る。例えば、液滴または他の実体は、１つよりも多い細胞または他の化学種を含み得、このとき、これらの細胞（または他の化学種）は、同じまたは異なる；異なる液滴または実体中の細胞（または他の化学種）もまた、同じまたは異なり得る。細胞が使用される場合、それらの細胞はまた、一部の実施形態では、細胞の特定の集団由来、例えば、特定の臓器または組織由来（例えば、心臓細胞、免疫細胞、筋肉細胞、癌細胞など）、特定の個体または化学種由来の細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、細菌など）、異なる生物由来の細胞、天然に存在するサンプル（例えば、池の水、土壌など）由来の細胞などであり得る。
【００２８】
従って、非限定的な例として、１つの特定の型の細胞（または複数の特定の型の細胞）に対する１または複数の条件の影響が、研究され得る。別の一例として、細胞の適切な集団に対する１つのある特定の条件（または複数の条件）の影響が、研究され得る。さらに、本発明が細胞の研究のみに限定されないことに留意すべきである。他の実施形態では、例えば、これらの液滴または他の実体は、種々の条件が適用される化学種を含み得る。例えば、この化学種は、化学的試薬、例えば、生物学的または非生物学的な、有機または無機などの試薬であり得る。例えば、この化学種は、ポリマー、核酸、タンパク質、薬物、小分子化合物（例えば、約１０００Ｄａ未満または約２０００Ｄａ未満の分子量を有する）、抗体、酵素、ペプチドなどであり得る。化学種の他の例は、以下でより詳細に議論される。
【００２９】
１または複数のタグが、液滴（または他の実体）内に存在し得、その液滴の正体および／または履歴を決定するために分析され得る。一部の場合には、これらのタグは、液滴または他の実体の他の構成要素と比較して、比較的不活性であるように選択され得る。これらのタグは、液滴もしくは他の実体中に最初から存在し得、および／または、例えば、以下に記載されるようなプロセスを使用して、引き続いて添加され得る。例えば、タグは、液滴または他の実体が１または複数の条件に曝露される際に（またはかかる曝露に時間的に接近して）、添加され得る。一部の場合には、１よりも多いタグが、１つの液滴または他の実体中に存在し得る。
【００３０】
本発明の特定の実施形態では、液滴または他の実体内のタグは、繋がれたタグを生成するために、例えば化学的に、一緒に繋がれ得る。任意の適切な技術が、例えば、液滴または実体からの取り出しの前に、タグを一緒に繋ぐために使用され得る。これらのタグは、任意の適切な技術を使用して繋がれ得る。例えば、これらのタグは、酵素、触媒または反応体を使用して一緒に繋がれ得、任意の適切な技術を使用して、液滴または他の実体に添加され得る。例えば、タグを含む液滴は、化学的薬剤を含む別の液滴に融合され得、または化学的反応体が、例えば、ピペッティングまたは他の技術を使用して、および一部の場合には自動化された技術を使用して、液滴または他の実体中に添加または挿入され得る。
【００３１】
繋がれたタグを生成するために、液滴（または他の実体）中でタグを一緒に繋ぐことによって、この液滴の正体および／または履歴は、タグが液滴から分離されている場合であっても、または異なる液滴由来のタグが一緒に混合される場合であっても、繋がれたタグを維持することにより維持され得る。例えば、種々の液滴または実体由来の繋がれたタグは、一緒に収集され得、分析され得る。一部の実施形態では、一連の液滴または他の実体は、種々の特性に依存して種々の群へと分離され得、各群内のタグは、一緒に操作され得、および／またはかかる特性を有するかかる液滴もしくは実体を同定するために使用され得る。
【００３２】
これらのタグには、例えば、リガーゼなどの、核酸を一緒にライゲーションさせることができる適切な酵素を使用して、一緒に繋ぐまたはライゲーションすることができる核酸が含まれ得る。リガーゼの非限定的な例には、ＤＮＡリガーゼ、例えば、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼなどが含まれる。多くのかかるリガーゼは、商業的に購入され得る。さらに、一部の実施形態では、２以上の核酸が、アニーリングまたはプライマー伸長法を使用して、一緒にライゲーションされ得る。
【００３３】
本明細書で議論するように、核酸の種々の配列が、液滴または他の実体が曝露され得る特定の条件をコードするために使用され得、かかる核酸は、特定の実施形態によれば、条件へのかかる曝露を示すために、それに添加され得る。一部の場合には、液滴または他の実体内の核酸は、取り出し（例えば、液滴の破裂、スライドの洗浄の際など）の前に、一緒にライゲーションされ得る。異なる液滴または実体由来の異なる核酸は、一緒に混合され得る；しかし、かかる混合の後であっても、各核酸は、対応する液滴または実体が曝露された特定の条件を決定するために、個々に配列決定され得る。
【００３４】
任意の適切なシステムが、コード化のために使用され得る。例えば、１セットの実施形態では、核酸タグは、ヌクレオチドのコード領域を含み得、および接続領域を含んでもよい。コード領域中のヌクレオチドは、特定の条件（または条件のセット）に対応し得る。任意の適切な数の条件が、かかる様式で任意にコードされ得、かかるコード領域によってコード可能な条件の数は、このコード領域中のヌクレオチドの数によって決定され得る。従って、例えば、長さｎを有するコード領域は、最大４ｎ個の領域（ヌクレオチドの４つの型に基づく）をコードできる。例えば、第１の条件は、Ａでコードされ得、第２の条件は、Ｔ（または核酸がＲＮＡの場合にはＵ）でコードされ得、第３の条件はＧでコードされ得、第４の条件は、Ｃでコードされ得る、など。より複雑な一例として、３つのヌクレオチドを含むコード領域は、５０を超える異なる条件（４３＝６４であるので）をコードするのに十分である。１または複数のコード領域が使用され得る。さらに、このコード領域は、特定の実施形態では、誤差の検出および／または補正、冗長性などのために使用される他のヌクレオチドもまた含み得る。
【００３５】
核酸タグは、一部の場合には、一緒にライゲーションされる１または複数の接続領域もまた含み得る。例えば、この接続領域は、特定の核酸のみが適切に一緒にライゲーションされ得るように、核酸の「粘着末端」またはオーバーハングを含み得る。例えば、図２Ａに示されるように、第１の核酸タグ２１（第１の条件をコードする）は、第２の核酸タグ２２上の粘着末端には実質的に相補的であるが第３の核酸タグ２３上の粘着末端には相補的でない第１の粘着末端を含み得る；同様に、第２の核酸２２（第２の条件をコードする）は、第３の核酸タグ２３（第３の条件をコードする）上の粘着末端には実質的に相補的であるが第１の核酸２１上の粘着末端には相補的でない粘着末端を含み得る。従って、適切なリガーゼへの曝露の際に、第１、第２および第３の核酸は、核酸が不正確な順序で一緒に不正確にライゲーションされる（例えば、第１の核酸が別の第１の核酸にライゲーションされる）ことなく、引き続く研究に適切な順序で、一緒に繋がれまたはライゲーションされ得る。従って、最終的なライゲーションされた核酸を配列決定することによって、この核酸が、第１、第２および第３の条件に曝露された液滴または他の実体中に存在したことが決定され得る。
【００３６】
しかし、他の実施形態では、核酸タグが特定の構成または順序で一緒にライゲーションされることを確実にする必要性がない場合があることを理解すべきである。例えば、図２Ｂに示されるように、核酸２１、２２および２３は、任意の適切な順序で一緒にライゲーションされ得る；得られたライゲーションされた核酸は、この核酸が核酸２１、２２および２３によってコードされる条件をコードしたことを決定するために、分析され得る。
【００３７】
この核酸タグはまた、用途に応じて、任意の適切な長さまたは数のヌクレオチドを有し得る。例えば、核酸タグは、１０ｎｔ、３０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、３００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、３０００ｎｔ、５０００ｎｔまたは１００００ｎｔなどよりも、短いまたは長い長さを有し得る。一部の場合には、核酸タグの他の部分は、例えば、条件をコードすることに加えて、他の目的のためにも使用され得る。例えば、核酸タグの部分は、核酸タグの嵩を増加させるため（例えば、特異的配列またはナンセンス配列を使用する）、取り扱いを容易にするため（例えば、タグは、ポリＡテイルを含み得る）、結合の選択性を増加させるため（例えば、以下で議論される）、酵素（例えば、適切なリガーゼ）による認識を促進するため、同定を促進するためなどに使用され得る。
【００３８】
言及されるように、本発明の特定の態様では、１または複数の条件は、例えば、かかる条件に曝露された液滴または他の実体に添加されるなどして、かかるタグを使用してコードされ得る。従って、例えば、液滴は、第１の条件に曝露され得、第１のタグがこの液滴に添加され得、次いで、この液滴は、第２の条件に曝露され得、第２のタグがこの液滴に添加され得、次いで、この液滴は、第３の条件に曝露され得、第３のタグがこの液滴に添加され得、次いで、この液滴は、第４の条件に曝露され得、第４のタグがこの液滴に添加され得る、など。従って、任意の数の条件が存在し得、例えば、液滴または他の実体は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の条件に曝露され得る。これらのタグはまた、以前に議論したように、この液滴または実体の履歴および／または正体をコードする繋がれたタグを生成するために、一緒に組み合わされ（例えば、一緒にライゲーションされ）得る。
【００３９】
任意の適切な条件が、これらのタグによってコードされ得る。例えば、１セットの実施形態では、この液滴または他の実体の正体は、１または複数のタグを使用してコードされ得る。例えば、各液滴または実体には、独自のタグ、またはタグの独自の組み合わせが割り当てられ得る。別の例として、この条件は、液滴または他の実体が内部からおよび／または外部から曝露される化学種であり得る。広範な種々の化学種のいずれかが、適切なタグによってコードされ得る。例えば、この化学種は、薬物（または疑似薬物）、細胞、ポリマー、ペプチド、タンパク質、酵素、ホルモン、抗生物質、ビタミン、炭水化物、糖、抗体、試薬、ガス、色素、イオン、ウイルス、細菌、ｐＨレベル（例えば、酸性または塩基性条件）などであり得る。従って、例えば、複数の細胞または複数の細胞型は、独自のタグ、またはタグの独自の組み合わせを使用してコードされ得る。任意の数のタグが、用途に応じて、かかる条件をコードするために使用され得る。例えば、本明細書に記載されるもののいずれかなどの、類似の数の適切な条件を実質的にコードする、例えば、少なくとも１０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００またはそれ超の独自のタグが存在し得る。例えば、実質的に各々の液滴が、１つの細胞または１つの細胞型、および関連のタグ、例えば核酸を含むように、第１の条件として、複数の細胞または細胞型を含む液滴のライブラリーがコードされ得る。
【００４０】
さらに、この条件はまた、一部の場合には、外部物理条件であり得る。例えば、この液滴または他の実体は、外部物理条件、例えば、特定のまたは所定の温度、圧力、電気的条件（例えば、電流、電圧など）などに曝露され得、適切なタグは、この外部物理条件への曝露の前、その間またはその後に、液滴または実体中に導入され得る。なお別の例として、この条件は、処理条件、例えば、濾過、沈降、遠心分離などであり得る。
【００４１】
１セットの実施形態では、この条件は、液滴内に含まれ得る細胞を溶解させるために使用される条件であり得る。例えば、この条件は、溶解性の化学物質（例えば、純水、Ｔｒｉｔｏｎ−ＸまたはＳＤＳなどの界面活性剤、リゾチームなどの酵素、リゾスタフィン、ザイモラーゼ（zymolase）、セルラーゼ、ムタノリシン（mutanolysin）、グリカナーゼ、プロテアーゼ、マンナーゼ（mannase）など）または物理条件（例えば、超音波、紫外線、機械的撹拌など）への曝露であり得る。一部の場合には、細胞を溶解させることは、その細胞が、その内容物、例えば、細胞性核酸、タンパク質、酵素、糖などを、放出させることになる。一部の実施形態では、細胞性核酸のうちの一部もまた、液滴内に含まれる１または複数の核酸にライゲーションされ得る。例えば、１セットの実施形態では、典型的には細胞内で生成されるＲＮＡ転写物が放出され得、次いで、核酸タグにライゲーションされ得る。
【００４２】
これらおよび／または他の条件のいずれかの組み合わせもまた企図される。例えば、上述のように、液滴は、第１のタグによってコードされる第１の条件、第２のタグによってコードされる第２の条件、第３のタグによってコードされる第３の条件などに曝露され得る。これらの条件は、同じまたは異なり得る。さらに、液滴または他の実体は、任意の数の条件（例えば、１、２、３、４、５、６など）に曝露され得、異なる液滴または実体は、同じ条件または同じ数の条件に曝露される必要はない。さらに、一部の実施形態では、複数の液滴（または他の実体）が、例えば、全ての液滴が全ての条件に曝露されるとは限らないように、複数の条件にランダムに曝露され得る。上述のように、液滴または他の実体が条件に曝露される際、この条件をコードする核酸は、その液滴または実体の具体的な履歴が予め決定される必要がなく、ランダムに決定され得るように、この液滴または実体に添加され得る。例えば、複数の初期の実質的に同一な液滴（または他の実体）は、各初期の液滴が１または複数の第２の液滴にランダムに融合されるように、異なる化学種（および／または異なる濃度での１もしくは複数の化学種）を含む複数の第２の液滴に曝露され得る。
【００４３】
さらに、一部の実施形態では、液滴または他の実体は、種々の特性に応じて種々の群へと分離または選別され得、各群内のタグは、一緒に操作され得、および／またはかかる特性を有するかかる液滴もしくは実体を同定するために使用され得る。従って、非限定的な例として、液滴（または他の実体）は、反応が液滴内で生じたか否かに応じて、第１の群または第２の群に選別され得、液滴は、液滴内に含まれる細胞または他の化学種の特性に基づいて選別され得る、など。２以上の群中への選別もまた生じ得る。
【００４４】
一部の場合には、液滴（または他の実体）の群のうちの一部または全ては、それらの群内の液滴もしくは実体の特徴を決定するため、および／または他の群からその群を分離する群内の液滴もしくは実体の特徴を決定するために、例えば、その中に含まれるタグを使用して、分析され得る。例えば、群のメンバーは、例えば、図１Ｃに関して上で説明したように、他の群メンバーからそれらの群メンバーを分離する、１もしくは複数のタグ、および／またはタグの１もしくは複数の特定の組み合わせを、共通して有し得る。かかるタグは、例えば、特定の成果を生じる１もしくは複数の条件を同定するため、またはその成果を生じない条件から、特定の成果を生じる１もしくは複数のかかる条件を識別するために、使用され得る。
【００４５】
従って、１セットの実施形態では、液滴または他の実体の特性が決定され、この液滴または他の実体は、その特性に基づいて選別される。この特性はまた、液滴または実体内に含まれる化学種、例えば細胞の特性であり得る。この特性は、決定され得る任意の物理的または化学的特性であり得る。例えば、液滴または他の実体（またはその中に含まれる化学種）の特性、例えば、蛍光性、透明度、密度、サイズ、容量などが、決定され得、選別目的のために使用され得る。一部の場合には、１または複数の試薬もまた、例えば選別目的のために、例えば、決定され得る反応を開始または促進するために、この液滴または他の実体に添加され得る。
【００４６】
一部の場合には、これらの液滴または他の実体は、タグにアクセスするために、破裂または破壊され得る。これは、任意の適切な時点、例えば、タグを一緒にライゲーションまたは繋ぐ前またはその後に、生じ得る。例えば、運搬流体中に含まれた液滴は、機械的破壊または超音波などの技術を使用して、破壊され得る。同様に、表面上の実体は、タグを収集するために、化学的薬剤もしくは界面活性剤への曝露を使用して破壊され得、または洗浄もしくはリンスされ得る。
【００４７】
次いで、これらのタグは、液滴（または他の実体）の正体および／または履歴を決定するために、例えば、その液滴または他の実体が曝露された条件を決定するために、決定され得る。任意の適切な方法が、使用されるタグの型に応じて、タグを決定するために使用され得る。例えば、蛍光粒子は、蛍光測定を使用して決定され得、または核酸は、種々の技術および機器を使用して配列決定され得、その多くは、商業的に容易に入手可能である。かかる技術の例には、鎖終結配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、ダイターミネーター配列決定、鎖終結法、大規模並行シグネチャー（Massively Parallel Signature）配列決定（Lynx Therapeuticｓ）、ポロニー（polony）配列決定、ピロシーケンス、ライゲーションによる配列決定、イオン半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、単一分子リアルタイム配列決定、ナノポア配列決定、微小流体Ｓａｎｇｅｒ配列決定、デジタルＲＮＡ配列決定（「デジタルＲＮＡ−ｓｅｑ」）などが含まれるがこれらに限定されない。
【００４８】
さらに、一部の場合には、１または複数の他の化学種は、例えば、共有結合によってそれと結合またはライゲーションされたタグと関連付けられ得る。例えば、以前に議論したように、一部の場合には、溶解された細胞によって放出された核酸は、１または複数のタグにライゲーションされ得る。これらには、例えば、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ転写物、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡなどが含まれ得る。かかる核酸は、タグ自体を配列決定することに加えて配列決定され得、タグ、または対応する液滴もしくは細胞が曝露された条件と関連付けられ得る、細胞の核酸プロファイルについての情報を生じ得る。従って、非限定的な例として、細胞からのＲＮＡ転写物は、１または複数のタグにライゲーションすることができ、また配列決定し、対応する液滴または細胞が曝露された条件と相関付けて、アポトーシス遺伝子シグネチャー、増殖停止シグネチャー、免疫シグネチャー、代謝遺伝子セット、または他の公知の薬剤に対する感受性もしくは耐性を付与する遺伝子の発現などの情報を決定することができる。
【００４９】
本明細書に記載されるものなどのタグは、種々の情況において、例えば、新たな薬物もしくは他の処置についてスクリーニングもしくはバイオプロスペクティングするため、ハイスループットスクリーニング技術として、種々の曝露条件が有する、細胞に対する影響を研究するためなどに、使用され得る。さらに、本発明が細胞研究のみに限定されないことを理解すべきである。例えば、液滴内に含まれる化学物質は、種々の異なる条件（例えば、潜在的な反応体または触媒、反応条件、イニシエーターなど）、およびその化学物質が関与できる反応を決定または最適化するためにタグ化された異なる条件に曝露され得る。一部の場合には、この化学物質は、生物学的に活性な化学物質（例えば、薬物、タンパク質、ポリマー、炭水化物など）であり得るが、他の場合には、この化学物質は、生物学的に関連する必要はない。例えば、この化学物質は、モノマーまたはポリマー、触媒、半導体材料などであり得る。
【００５０】
非限定的な例として、１セットの実施形態では、複数の実質的に同一な細胞が、いずれの物質が細胞に対して有利な影響または有害な影響を有するかを決定するために、適宜種々の物理条件（例えば、種々の温度）下で、種々の物質（例えば、他の細胞、化学的化合物、土壌サンプル、天然に存在するサンプルなど）に曝露され得る。例えば、実質的に同一な細胞は、単独でもしくは組み合わせて抗癌特性もしくは抗腫瘍特性を有する物質を同定するために物質のパネルに対してスクリーニングされる癌細胞であり得、または実質的に同一な細胞は、それに対する特定の活性が所望される免疫細胞もしくは他の細胞であり得る。このパネルは、例えば、天然に存在する化合物、合成化合物、ライブラリー由来の化合物、特定の特性を共有する化合物などを含み得る。一部の場合には、これらの化合物は、１つよりも多い濃度でも存在し得る。このパネルの各メンバーは、液滴（または他の実体）中の細胞の、パネルメンバーへの曝露の際に、適切な対応するタグが添加されるように、本明細書で議論したようにタグ化され得る。これらのタグはまた、一緒にライゲーションされ得るか、または他の方法で繋がれ得る。従って、例えば、実質的に同一な細胞は、種々の組み合わせで、種々の物質に曝露され得、引き続いて、死細胞から生細胞が選別される；生細胞（および／または死細胞）を含む液滴由来のタグは、これらの細胞を死滅させることができる条件またはパネルメンバーを決定するために、本明細書で議論したように分離および配列決定され得る。さらに、本発明は、実質的に同一な細胞のみに限定されない。例えば、別のセットの実施形態では、異なる細胞（または他の化学種、例えば化学物質）を含む液滴が使用され得る。
【００５１】
例えば、液滴（または液滴内の化学種）を決定する、液滴を選別するなどのための、微小流体システムにおいて液滴を操作するためのシステムおよび方法に関するさらなる詳細は、以下である。例えば、液滴をスクリーニングおよび／または選別するための種々のシステムおよび方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、２００７年１月４日に米国特許出願公開第２００７／０００３４２号として公開された、Linkらによる表題「Electronic Control of Fluidic Species」の、２００６年２月２３日出願の米国特許出願第１１／３６０，８４５号に記載されている。非限定的な例として、第１の電場（またはその一部分）を適用（または除去）することによって、液滴は、第１の領域またはチャネルに導かれ得る；デバイス（またはその一部分）に第２の電場を適用（または除去）することによって、液滴は、第２の領域またはチャネルに導かれ得る；デバイス（またはその一部分）に第３の電場を適用することによって、液滴は、第３の領域またはチャネルに導かれ得る；などであり、ここで、これらの電場は、例えば、強度、方向、周波数、持続時間などにおいて、何らかの方法で異なり得る。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、流体液滴の１または複数の特徴の決定を可能にするような様式で、流体液滴の１もしくは複数の特徴、および／または流体液滴を含む流体システム（例えば、流体液滴を取り囲む液体）の一部分の特徴を感知および／または決定できるセンサーが、提供される。液滴に関して決定可能であり、本発明において使用可能な特徴は、当業者によって同定され得る。かかる特徴の非限定的な例には、蛍光性、分光法（例えば、光学、赤外、紫外など）、放射活性、質量、容量、密度、温度、粘度、ｐＨ、生物学的物質（例えば、タンパク質、核酸など）などの物質の濃度、などが含まれる。
【００５３】
一部の場合には、このセンサーは、プロセッサーに接続され得、このプロセッサーは、次に、例えば以前に記載したように、例えば、液滴を選別し、電荷を付加しまたは液滴から電荷を除去し、液滴を別の液滴に融合させ、液滴を分割し、液滴内で混合を生じさせることなどによって、流体液滴に対してオペレーションが実施されるようにする。例えば、流体液滴のセンサー測定に応答して、プロセッサーは、流体液滴が分割されるようにし、第２の流体液滴と統合されるようにし得る、など。
【００５４】
１または複数のセンサーおよび／またはプロセッサーは、流体液滴と感知連絡するように位置させることができる。「感知連絡」とは、本明細書で使用する場合、流体システム内（例えば、チャネル内）の流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの一部分が、何らかの様式で感知および／または決定され得るように、センサーが任意の場所に位置させることができることを意味する。例えば、センサーは、流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの部分と、流体的に、光学的にまたは視覚的に、熱的に、空気圧で、電子工学的に、などで感知連絡し得る。センサーは、流体システムに接近して位置させることができる、例えば、チャネルの壁内に包埋されもしくはチャネルの壁と一体的に接続され得、または流体システムと離れてではあるが、流体液滴および／もしくは流体液滴を含む流体システム（例えば、チャネルまたはマイクロチャネル、流体液滴を含む液体など）の一部分を感知および／もしくは決定できるように、流体システムと物理的、電気的および／もしくは光学的に連絡するように位置させることができる。例えば、センサーは、液滴を含むチャネルとの物理的接続が全くなくてもよいが、赤外線、紫外線または可視光などの、液滴または流体システムから生じる電磁放射線を検出するように位置させることができる。この電磁放射線は、液滴によって生成され得、および／または流体システムの他の部分から（流体システムの外部から）生じ得、例えば、吸収、反射、回折、屈折、蛍光、リン光、極性における変化、相転移、時間に対する変化などを介して、流体液滴の１または複数の特徴を示すような様式で、流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの部分と相互作用し得る。一例として、レーザーが、流体液滴および／または流体液滴を取り囲む液体に向かって導かれ得、流体液滴および／または取り囲む液体の蛍光性が決定され得る。「感知連絡」はまた、本明細書で使用する場合、直接的または間接的であり得る。一例として、流体液滴からの光は、センサーに導かれ得るか、またはセンサーに導かれる前に、最初に光ファイバーシステム、導波管などを介して導かれ得る。
【００５５】
本発明において有用なセンサーの非限定的な例には、光学または電磁気ベースのシステムが含まれる。例えば、このセンサーは、蛍光センサー（例えば、レーザーによって刺激される）、顕微鏡システム（カメラまたは他の記録デバイスを含み得る）などであり得る。別の例として、このセンサーは、電子センサー、例えば、電場または他の電気的特徴を決定することができるセンサーであり得る。例えば、このセンサーは、流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの部分のキャパシタンス、インダクタンスなどを検出し得る。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「プロセッサー」または「マイクロプロセッサー」は、例えば、数式または電子回路もしくは計算回路を使用することによって、１もしくは複数のセンサーからのシグナルを受信し、シグナルを保存し、および／または１もしくは複数の応答を導く（例えば、上記のように）ことができる、任意の構成要素またはデバイスである。このシグナルは、センサーによって決定される環境因子を示す任意の適切なシグナル、例えば、空気圧シグナル、電子シグナル、光学シグナル、機械的シグナルなどであり得る。
【００５７】
１セットの実施形態では、流体液滴は、液滴上に電荷および／または電気双極子を生じさせ、ＡＣ場、ＤＣ場などであり得る適用された電場を使用して液滴を操向することによって、導かれ得る。一例として、電場は、特定の領域に流体液滴を導く必要に応じて、選択的に適用および除去され得る（または異なる電場、例えば、逆電場が適用され得る）。この電場は、一部の実施形態では、流体液滴を含む液体の流れを実質的に変更することなしに、必要に応じて選択的に適用および除去され得る。例えば、液体は、実質的に定常状態を基準にして（即ち、流体液滴を含む液体の平均流速は、定常状態の流れまたは時間に対する液体の流れの予測された値の、２０％未満または１５％未満逸脱する、一部の場合には、この平均流速は、１０％未満または５％未満逸脱し得る）、または本発明の流体システムを介して（例えば、チャネルまたはマイクロチャネルを介して）他の所定の基準で流れ得、この液体内に含まれる流体液滴は、流体システムを介した液体の流れを実質的に変更することなしに、例えば電場を使用して、種々の領域に導かれ得る。
【００５８】
一部の実施形態では、これらの流体液滴は、液滴を含む液体の流れを変更させることによって、本発明の流体システム内でスクリーニングまたは選別され得る。例えば、１セットの実施形態では、流体液滴は、第１のチャネル、第２のチャネルなどの中に、流体液滴を取り囲む液体を導くことによって、操向または選別され得る。
【００５９】
別のセットの実施形態では、流体システム内、例えば、異なるチャネル内またはチャネルの異なる部分内の圧力は、流体液滴の流れを導くために制御され得る。例えば、液滴は、流れをさらに導く複数の選択肢を含むチャネル分岐合流点に向けて導かれ得る（例えば、適宜、下流のフローチャネルを規定するチャネル中の分枝またはフォークに向けて導かれる）。適宜の下流のフローチャネルのうちの１または複数内の圧力は、チャネルのうちの１つへと液滴を選択的に導くために制御され得、圧力における変化は、各連続的な液滴の下流の流路が独立して制御され得るように、連続的な液滴が分岐合流点に達するのに必要な時間のオーダーに影響を与え得る。１つの配置では、液体リザーバの拡張および／または収縮が、例えば、流体液滴を含む液体の導かれた動きを引き起こすことによって、チャネル中に流体液滴を操向または選別するために使用され得る。これらの液体リザーバは、起動された場合に、起動されたリザーバによって引き起こされる液体の動きが、液体を好ましい方向に流れさせ、流体液滴を好ましい方向に運搬するように、位置させることができる。例えば、液体リザーバの拡張は、リザーバに向かう液体の流れを引き起こし得るが、液体リザーバの収縮は、リザーバから離れる液体の流れを引き起こし得る。一部の場合には、この液体リザーバの拡張および／または収縮は、例えば本明細書に記載されるように、他の流れ制御デバイスおよび方法と組み合わされ得る。液体リザーバの拡張および／または収縮を引き起こすことができるデバイスの非限定的な例には、ピストンおよび圧電性構成要素が含まれる。一部の場合には、圧電性構成要素は、例えば電気的シグナルに応答したその比較的迅速な応答時間に起因して、特に有用であり得る。一部の実施形態では、これらの流体液滴は、２つよりも多いチャネル中に選別され得る。
【００６０】
上述のように、特定の実施形態は、一般に、一部の場合には比較的高速度で、液体中の流体液滴を選別するためのシステムおよび方法に関する。例えば、液滴の特性は、何らかの様式（例えば、本明細書にさらに記載されるとおり）で感知および／または決定され得、次いで、この液滴は、例えば選別目的のために、微小流体チャネルなどのデバイスの特定の領域に向けて導かれ得る。一部の場合には、速い選別スピードは、本発明の特定のシステムおよび方法を使用して達成可能であり得る。例えば、一部の場合には、少なくとも約１０液滴／秒が決定および／または選別され得、他の場合には、少なくとも約２０液滴／秒、少なくとも約３０液滴／秒、少なくとも約１００液滴／秒、少なくとも約２００液滴／秒、少なくとも約３００液滴／秒、少なくとも約５００液滴／秒、少なくとも約７５０液滴／秒、少なくとも約１，０００液滴／秒、少なくとも約１，５００液滴／秒、少なくとも約２，０００液滴／秒、少なくとも約３，０００液滴／秒、少なくとも約５，０００液滴／秒、少なくとも約７，５００液滴／秒、少なくとも約１０，０００液滴／秒、少なくとも約１５，０００液滴／秒、少なくとも約２０，０００液滴／秒、少なくとも約３０，０００液滴／秒、少なくとも約５０，０００液滴／秒、少なくとも約７５，０００液滴／秒、少なくとも約１００，０００液滴／秒、少なくとも約１５０，０００液滴／秒、少なくとも約２００，０００液滴／秒、少なくとも約３００，０００液滴／秒、少なくとも約５００，０００液滴／秒、少なくとも約７５０，０００液滴／秒、少なくとも約１，０００，０００液滴／秒、少なくとも約１，５００，０００液滴／秒、少なくとも約２，０００，０００もしくはそれ超の液滴／秒、または少なくとも約３，０００，０００もしくはそれ超の液滴／秒が、決定および／または選別され得る。
【００６１】
一部の態様では、比較的小さい液滴の集団が使用され得る。特定の実施形態では、非限定的な例として、液滴の平均直径は、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約３００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約３０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約２０マイクロメートル未満、約１５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、約５マイクロメートル未満、約３マイクロメートル未満、約２マイクロメートル未満、約１マイクロメートル未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満または約５０ｎｍ未満であり得る。液滴の平均直径はまた、特定の場合には、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、少なくとも約１マイクロメートル、少なくとも約２マイクロメートル、少なくとも約３マイクロメートル、少なくとも約５マイクロメートル、少なくとも約１０マイクロメートル、少なくとも約１５マイクロメートルまたは少なくとも約２０マイクロメートルであり得る。液滴の集団の「平均直径」は、液滴の直径の算術平均である。
【００６２】
一部の実施形態では、これらの液滴は、特定の用途に応じて、実質的に同じ形状および／もしくはサイズ（即ち、「単分散」）のもの、または異なる形状および／もしくはサイズのものであり得る。一部の場合には、これらの液滴は、断面直径の均一な分布を有し得る、即ち、これらの液滴は、液滴の約５％以下、約２％以下または約１％以下が、複数の液滴の全体的平均直径の約９０％未満（または約９５％未満または約９９％未満）の直径および／または約１１０％よりも大きい（または約１０５％よりも大きいまたは約１０１％よりも大きい）直径を有するような直径の分布を有し得る。液滴の断面直径の均一な分布を生じるためのいくつかの技術は、参照によって本明細書に組み込まれる、２００４年１０月２８日にＷＯ２００４／０９１７６３として公開された、Linkらによる表題「Formation and Control of Fluidic Species」の、２００４年４月９日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３に開示されている。
【００６３】
当業者は、例えば、レーザー光散乱または他の公知の技術を使用して、液滴の集団の平均直径を決定することができる。そうして形成された液滴は、球状、または特定の場合には非球状であり得る。非球状液滴における液滴の直径は、非球状液滴と同じ容量を有する数学的に完全な球の直径と解釈され得る。
【００６４】
一部の実施形態では、１または複数の液滴は、液体によって取り囲まれた流体上に、液体内の個々の液滴へと流体を分離させ得る電荷を生じさせることによって、チャネル内で作製され得る。一部の実施形態では、電場を流体に適用して、液滴形成を引き起こすことができる。この流体は、液体内に、一連の個々の荷電した液滴および／または電気的に誘導可能な液滴として存在し得る。電荷は、任意の適切な技術を使用して、例えば、電場（ＡＣ、ＤＣなどであり得る）内に流体を配置すること、および／または流体が電荷を有するようにする反応を引き起こすことによって、液体内の流体において生じさせることができる。
【００６５】
電場は、一部の実施形態では、電場ジェネレーター、即ち、流体に適用され得る電場を生じさせることができるデバイスまたはシステムから生成される。この電場ジェネレーターは、ＡＣ場（即ち、時間に対して周期的に変動するもの、例えば、正弦波、のこぎり波、矩形波など）、ＤＣ場（即ち、時間に対して不変のもの）、パルス場などを生成し得る。適切な電場（ＡＣ、ＤＣなどであり得る）を生成するための技術は、当業者に公知である。例えば、一実施形態では、電場は、電場の少なくとも一部分がチャネルと相互作用するようにチャネルに接近して位置させることができる一対の電極間に電圧を適用することによって生成される。これらの電極は、銀、金、銅、炭素、白金、銅、タングステン、スズ、カドミウム、ニッケル、酸化インジウムスズ（「ＩＴＯ」）などならびにそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の適切な電極材料（単数または複数）から作られ得る。
【００６６】
別のセットの実施形態では、流体の液滴は、流体を誘導して個々の液滴を形成させることができる様式で、チャネル寸法を変更することによって、チャネル内で液体によって取り囲まれた流体から作製され得る。このチャネルは、例えば、流体がチャネル壁に付着せず、その代わりに個々の液滴を形成するように、例えば、流れの方向に対して拡張するチャネル、または例えば、流体が個々の液滴へと合体するように仕向けられるように、流れの方向に対して狭まるチャネルであり得る。一部の場合には、チャネル寸法は、個々の液滴の形成を引き起こすような様式で、時間に対して（例えば、機械的にまたは電気機械的に、空気圧で、など）変更され得る。例えば、このチャネルは、液滴形成を引き起こすために機械的に収縮（「圧搾」）され得、または流体流は、例えば、バッフルを動かすこと、刃を回転させることなどの使用を介して、液滴形成を引き起こすために機械的に破壊され得る。
【００６７】
特定の実施形態は、一般に、１つの液滴を２以上の液滴へと分割するためのシステムおよび方法に関する。例えば、液滴は、適用された電場を使用して分割され得る。この液滴は、取り囲む液体よりも高い電気伝導率を有し得、一部の場合には、この液滴は、中性に荷電され得る。特定の実施形態では、適用された電場中で、電荷は、液滴の内部から表面へと移動して、その上に分布するように促され得、それによって、液滴の内部で受ける電場を相殺し得る。一部の実施形態では、液滴の表面上の電荷は、反対の極性を有する電荷を反対の方向に移動させる、適用された電場に起因した力もまた経験し得る。この電荷移動は、一部の場合には、小滴を２つの別々の液滴へと引き離し得る。
【００６８】
本発明の一部の実施形態は、一般に、例えば、２以上の液滴が、通常、例えば、組成、表面張力、液滴サイズ、界面活性剤の存在または非存在などに起因して、融合または合体することができない場合の、２以上の液滴を１つの液滴に融合または合体させるためのシステムおよび方法に関する。特定の場合には、液滴のサイズに対する液滴の表面張力もまた、液滴の融合または合体が生じるのを防止し得る。
【００６９】
非限定的な例として、２つの液滴には、液滴の融合または合体がそれらの反対の電荷に起因して生じ得るように、２つの液滴の電気的相互作用を増加させ得る反対の電荷（即ち、同じ大きさである必要はない、正および負の電荷）が与えられ得る。例えば、電場が液滴に適用され得、これらの液滴はコンデンサーを通過し得、化学反応が液滴を荷電させ得る、など。これらの液滴は、一部の場合には、界面活性剤が液滴の表面張力を低下させるために適用される場合であっても、融合することができない可能性がある。しかし、液滴が反対の電荷（同じ大きさであってもよいが、同じ大きさである必要はない）で電気的に荷電している場合、これらの液滴は、融合または合体できる可能性がある。別の例として、これらの液滴には、反対の電荷が必ずしも与えられない可能性があり（および、一部の場合には、いずれの電荷も与えられない可能性がある）、液滴を合体させる、液滴中で誘導された双極子の使用を介して融合され得る。また、合体される２以上の液滴は、「真正面から」ぶつかる必要は必ずしもない。液滴の少なくとも一部の融合が最初に生じる限り、どのような接触の角度でも十分である。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００７年８月２３日に米国特許出願公開第２００７／０１９５１２７号として公開された、Ahnらによる表題「Fluidic Droplet Coalescence」の、２００７年１月２４日出願の米国特許出願第１１／６９８，２９８号もまた参照のこと。
【００７０】
１セットの実施形態では、流体は、液滴中に注入され得る。この流体は、一部の場合には、例えば、マイクロニードルまたは他のかかるデバイスを使用して、液滴中に微量注入され得る。他の場合には、この流体は、液滴が流体チャネルと接触するときに、その流体チャネルを使用して液滴中に直接注入され得る。流体注入の他の技術は、例えば、各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１０年１２月２９日にＷＯ２０１０／１５１７７６として公開された、Weitzらによる表題「Fluid Injection」の、２０１０年６月２５日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０００６；または２０１０年７月１５日にＷＯ２０１０／０８０１３４として公開された、Weitzらによる表題「Particle-Assisted Nucleic Acid Sequencing」の、２００９年１２月１８日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００６６４９に開示されている。
【００７１】
本発明の特定の実施形態に従う種々の材料および方法は、例えば、微小流体チャネルなどのチャネル、チャンバーなどの、本明細書に記載されるような物品または構成要素を形成するために使用され得る。例えば、種々の物品または構成要素は、固体材料から形成され得、ここで、チャネルは、微細加工、フィルム蒸着プロセス、例えば、スピンコーティングおよび化学的蒸着、レーザー製作、フォトリソグラフィー技術、湿式化学プロセスまたはプラズマプロセスを含むエッチング法などを介して形成され得る。例えば、Scientific American, 248:44-55, 1983 (Angell, et al)を参照のこと。
【００７２】
１セットの実施形態では、本明細書に記載される物品の種々の構造または構成要素は、ポリマー、例えば、エラストマー性ポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）、ポリテトラフルオロエチレン（「ＰＴＦＥ」またはTeflon（登録商標））などで形成され得る。例えば、一実施形態によれば、微小流体チャネルは、ＰＤＭＳまたは他のソフトリソグラフィー技術を別々に使用して流体システムを製作することによって、実施され得る（この実施形態に適切なソフトリソグラフィー技術の詳細は、Annual Review of Material Science, 1998、第２８巻、１５３〜１８４頁で公開された、Younan Xia and George M. Whitesidesによる表題“Soft Lithography”ならびにAnnual Review of Biomedical Engineering, 2001、第３巻、３３５〜３７３頁で公開された、George M. Whitesides, Emanuele Ostuni, Shuichi Takayama, Xingyu Jiang and Donald E. Ingberによる表題"Soft Lithography in Biology and Biochemistry,"の参考文献において議論されている；これらの参考文献の各々は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
潜在的に適切なポリマーの他の例には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化ポリマー、シリコーン、例えばポリジメチルシロキサン、ポリ塩化ビニリデン、ビス−ベンゾシクロブテン（「ＢＣＢ」）、ポリイミド、ポリイミドのフッ素化誘導体などが含まれるがこれらに限定されない。上記のものを含むポリマー伴う組み合わせ、コポリマーまたはブレンドもまた、想定される。このデバイスは、複合材料、例えば、ポリマーおよび半導体材料の複合物からも形成され得る。
【００７４】
一部の実施形態では、物品の種々の構造または構成要素は、ポリマー性および／または可撓性および／またはエラストマー性材料から製作され、硬化可能な流体から簡便に形成されて、成形（例えば、レプリカ成型、射出成型、鋳造成型など）を介した製作を促進し得る。この硬化可能な流体は、流体ネットワークにおけるおよび流体ネットワークとの使用のために企図された流体を含むおよび／または輸送することが可能な固体へと凝固するように誘導され得るまたは自発的に凝固する、本質的に任意の流体であり得る。一実施形態では、この硬化可能な流体は、ポリマー液体または液体ポリマー前駆体（即ち、「プレポリマー」）を含む。適切なポリマー液体には、例えば、それらの融点を上回って加熱された、熱可塑性ポリマー、熱硬化性ポリマー、ワックス、金属、またはそれらの混合物もしくは複合物が含まれ得る。別の例として、適切なポリマー液体には、適切な溶媒中の１または複数のポリマーの溶液が含まれ得、この溶液は、例えば蒸発による溶媒の除去の際に、固体ポリマー性材料を形成する。例えば、融解状態から、または溶媒蒸発によって凝固され得るかかるポリマー性材料は、当業者に周知である。その多くがエラストマー性である種々のポリマー性材料が適切であり、鋳型マスターの一方または両方がエラストマー性材料から構成される実施形態について、鋳型または鋳型マスターを形成するのにも適切である。かかるポリマーの例の非限定的なリストは、シリコーンポリマー、エポキシポリマーおよびアクリレートポリマーの一般的なクラスのポリマーを含む。エポキシポリマーは、エポキシ基、１，２−エポキシドまたはオキシランと一般に称される３員環式エーテル基の存在を特徴とする。例えば、芳香族アミン、トリアジンおよび脂環式骨格に基づく化合物に加えて、ビスフェノールＡのジグリシジルエーテルが使用され得る。別の例には、周知のＮｏｖｏｌａｃポリマーが含まれる。本発明に従う使用に適切なシリコーンエラストマーの非限定的な例には、クロロシラン、例えば、メチルクロロシラン、エチルクロロシラン、フェニルクロロシラン、ドデシルトリクロロシランなどを含む前駆体から形成されるものが含まれる。
【００７５】
特定の実施形態では、シリコーンエラストマーポリジメチルシロキサンなどのシリコーンポリマーが使用される。ＰＤＭＳポリマーの非限定的な例には、Dow Chemical Co.、Midland、ＭＩによって商標Ｓｙｌｇａｒｄの下で販売されているもの、特に、Ｓｙｌｇａｒｄ  １８２、Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４およびＳｙｌｇａｒｄ  １８６が含まれる。ＰＤＭＳを含むシリコーンポリマーは、本発明の種々の構造の製作を単純化するいくつかの有益な特性を有する。例えば、かかる材料は、安価であり、容易に入手可能であり、熱によるキュアリングを介してプレポリマー液体から凝固され得る。例えば、ＰＤＭＳは、例えば約１時間の曝露時間にわたる、約、例えば約６５℃〜７５℃の温度へのプレポリマー液体の曝露によって、典型的にはキュアリングさせることができる。また、ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマーは、エラストマー性であり得、従って、本発明の特定の実施形態において必要な比較的高いアスペクト比を有する非常に小さい特徴を形成するために有用であり得る。可撓性（例えば、エラストマー性）の鋳型またはマスターは、これに関して有利であり得る。
【００７６】
ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマーから、微小流体構造またはチャネルなどの構造を形成することの１つの利点は、例えば、空気プラズマなどの酸素含有プラズマへの曝露によって酸化されて、その酸化された構造が、その表面において、他の酸化されたシリコーンポリマー表面と、または種々の他のポリマー性および非ポリマー性材料の酸化された表面と架橋することが可能な化学基を含むようになる、かかるポリマーの能力である。従って、構造は、製作され得、次いで酸化され得、別々の接着剤または他の密封手段を必要とすることなく、他のシリコーンポリマー表面に、または酸化されたシリコーンポリマー表面と反応性の他の基材の表面に、本質的に不可逆的に密封され得る。ほとんどの場合、密封は、密封を形成するために補助的な圧力を適用する必要なしに、酸化されたシリコーン表面を別の表面に接触させることによって、簡単に完了され得る。即ち、予め酸化されたシリコーン表面は、適切なあわせ面に対するコンタクト接着剤として作用する。具体的には、それ自体に対して不可逆的に密封可能であることに加えて、酸化されたシリコーン、例えば酸化されたＰＤＭＳは、ＰＤＭＳ表面と類似の様式で（例えば、酸素含有プラズマへの曝露を介して）酸化された、例えば、ガラス、ケイ素、酸化ケイ素、石英、窒化ケイ素、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス状炭素およびエポキシポリマーを含む、それ自体以外の広範な酸化された材料にも、不可逆的に密封され得る。本発明に関して有用な酸化および密封の方法、ならびに全体的成型技術は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、表題“Rapid Prototyping of Microfluidic Systems and Polydimethylsiloxane”、Anal. Chem.、７０：４７４〜４８０、１９９８（Duffy et al.）の論文中で、当該分野で記載されている。
【００７７】
従って、特定の実施形態では、物品の設計および／または製作は、例えば、比較的周知のソフトリソグラフィーおよび本明細書に記載されるものなどの他の技術を使用することによって、比較的簡単であり得る。さらに、一部の実施形態では、物品の迅速なおよび／またはカスタマイズされた設計が、例えば、幾何学に関して可能である。１セットの実施形態では、この物品は、例えば、物品が、放射活性、毒性、有毒、反応性、バイオハザード性などである物質と共に使用される実施形態、および／または物質のプロファイル（例えば、毒物学プロファイル、放射活性プロファイルなど）が未知である実施形態では、使い捨てであるように生成され得る。酸化されたシリコーンポリマーからチャネルまたは他の構造（または内部の流体接触表面）を形成することの別の利点は、これらの表面が、典型的なエラストマー性ポリマーの表面よりもかなり高い親水性になり得ることである（親水性内部表面が所望される場合）。従って、かかる親水性チャネル表面は、典型的な未酸化のエラストマー性ポリマーまたは他の疎水性材料から構成された、構造ができるよりも、より容易に満たされ湿らされ得る。
【００７８】
以下の文書は、全ての目的のために、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９１７６３、表題「Formation and Control of Fluidic Species」、Linkら；国際特許出願公開ＷＯ２００４／００２６２７、表題「Method and Apparatus for Fluid Dispersion」、Stoneら；国際特許出願公開ＷＯ２００６／０９６５７１、表題「Method and Apparatus for Forming Multiple Emulsions」、Weitzら；国際特許出願公開ＷＯ２００５／０２１１５１、表題「Electronic Control of Fluidic Species」、Linkら；国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０５６５４６、表題「Droplet Creation Techniques」、Weitzら；国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０３３２００、表題「Creation of Libraries of Droplets and Related Species」、Weitzら；米国特許出願公開第２０１２−０１３２２８８号、表題「Fluid Injection」、Weitzら；国際特許出願公開ＷＯ２００８／１０９１７６、表題「Assay And Other Reactions Involving Droplets」、Agrestiら；および国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１５１７７６、表題「Fluid Injection」、Weitｚら。
【００７９】
Bernsteinらによる、表題「Systems and Methods for Droplet Tagging」の、２０１４年４月１７日出願の米国仮特許出願第６１／９８１，１２３号もまた、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態が、本明細書で記載および説明されているが、当業者は、機能を果たすためおよび／または結果を得るための、種々の他の手段ならびに／あるいは構造ならびに／または本明細書に記載される１もしくは複数の利点を容易に想定し、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本発明の範囲内であると判断される。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメーター、寸法、材料および構成が、例示を意味すること、ならびに実際のパラメーター、寸法、材料および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途（単数または複数）に応じることを、容易に理解する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、認識するまたは確認できる。従って、上述の実施形態が、例として提示されているに過ぎないこと、ならびに添付の特許請求の範囲およびそれに対する均等物の範囲内で、具体的に記載および特許請求されたものとは別の方法で本発明が実施され得ることを、理解すべきである。本発明は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。さらに、２以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に矛盾しない限り、本発明の範囲内に含まれる。
【００８１】
本明細書で定義および使用される全ての定義は、辞書的定義、参照によって組み込まれる文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味を超えて支配すると理解すべきである。
【００８２】
不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、明確に逆を示さない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
【００８３】
語句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、そのように結合された要素、即ち、ある場合には結合して存在するが、他の場合には分離して存在する要素の、「いずれかまたは両方」を意味すると理解すべきである。「および／または」を伴って列挙された複数の要素は、同じ様式で、即ち、そのように結合された要素の「１または複数」と解釈され得る。「および／または」節によって具体的に指定された要素以外の他の要素が、具体的に指定された要素と関連しても関連しなくても、存在してもよい。従って、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（comprising）」などのオープンエンドの語と併せて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を含んでもよい）；別の一実施形態では、Ｂのみ（Ａ以外の要素を含んでもよい）；なお別の一実施形態では、ＡおよびＢの両方（他の要素を含んでもよい）；などを指し得る。
【００８４】
本明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、「または」は、上に定義したような「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的である、即ち、いくつかの要素または要素のリストのうちの少なくとも１つを含むが、１つよりも多くもまた含み、列挙されていないさらなる項目もまた含んでもよいと解釈するものとする。明確にこれに反することを示す用語、例えば、「〜のうちの１つだけ」もしくは「〜のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用する場合には「〜からなる」だけが、いくつかの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、用語「または」は、本明細書で使用する場合、排他性の用語、例えば、「いずれか」、「〜のうちの１つ」、「〜のうちの１つだけ」または「〜のうちの正確に１つ」が先行する場合にのみ、排他的選択肢（即ち、「一方または他方であるが、両方ではない」を示すと解釈するものとする。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【００８５】
本明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用する場合、語句「少なくとも１つ」とは、１または複数の要素のリストを参照して、要素のリスト中の要素のうちの任意の１または複数から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解すべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙された各々および全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に指定された要素と関連しても関連しなくても、語句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内の具体的に指定された要素以外の要素が適宜存在し得ることを許容する。従って、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態では、Ｂの存在を伴わない、１よりも多いＡを含んでもよい、少なくとも１つのＡ（およびＢ以外の要素を含んでもよい）を指し得；別の一実施形態では、Ａの存在を伴わない、１よりも多いＢを含んでもよい少なくとも１つのＢ（およびＡ以外の要素を含んでもよい）を指し得；なお別の一実施形態では、１よりも多いＡを含んでもよい、少なくとも１つのＡ、および１よりも多いＢを含んでもよい少なくとも１つのＢ（および他の要素を含んでもよい）を指し得る；など。
【００８６】
明確にこれに反することを示さない限り、１つよりも多いステップまたは行為を含む本明細書で特許請求された任意の方法において、この方法のステップまたは行為の順序は、この方法のステップまたは行為が列挙された順序に必ずしも限定されないこともまた、理解すべきである。
【００８７】
特許請求の範囲ならびに上記本明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保有する（carrying）」、「有する（having）」、「含む（containing）」、「関与する（involving）」、「保持する（holding）」、「〜から構成される（composed of）」などは、オープンエンド、即ち、〜を含むがそれらに限定されないことを意味すると理解すべきである。移行句「〜からなる」および「〜から本質的になる」のみが、米国特許庁の審査基準のセクション２１１１．０３に示されるように、それぞれ、クローズまたは半クローズの移行句とされる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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