(57)【要約】本発明は、免疫チェックポイント阻害剤もしくはＴ細胞刺激薬またはこれらの組み合せ、および腫瘍関連抗原に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む弱毒化組み換え型生リステリア株を含む組成物を対象としている。本発明は、腫瘍またはガンを治療する、腫瘍またはガンから保護する、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法であって、これを投与する工程を含む方法をさらに対象としている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドが、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項２】
Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドが、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項３】
免疫チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物であって、前記核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドが、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項４】
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記核酸分子が、前記組み換え型リステリア株内の細菌人工染色体内にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸分子が、前記組み換え型リステリア株内のプラスミド内にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
抗生物質選択が無いときに前記プラスミドが前記組み換え型リステリア株内で安定して維持される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記プラスミドが前記組み換え型リステリアに抗生物質抵抗性を与えない、請求項６または７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記異種抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記腫瘍関連抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記腫瘍関連抗原が血管形成抗原である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組み換え型リステリア株が弱毒化されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記弱毒化リステリアが内因性遺伝子内に突然変異を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組み換え型リステリアが内因性ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に突然変異を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組み換え型リステリアが内因性ｐｒｆＡ遺伝子内に突然変異を含む、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ｐｒｆＡ突然変異がＤ１３３Ｖ突然変異である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組み換え型リステリアが、内因性Ｄ−アラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子内に突然変異を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記突然変異が、前記遺伝子の不活性化、短縮、欠失、置換、または破壊を含む、請求項１３〜１５および１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記核酸が第２のオープンリーディングフレームをさらに含有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第２のオープンリーディングフレームが代謝酵素をコードする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされた前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ−８０／８６およびＣＴＬＡ４シグナル伝達経路阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害剤、またはキラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害剤である、請求項１および３〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）と相互作用する分子遮断ＰＤ−１受容体である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する前記分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ＰＤ−１と相互作用する前記分子が抗ＰＤ−１抗体である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＰＤ−１と相互作用する前記分子が、短縮ＰＤ−Ｌ１タンパク質または短縮ＰＤ−Ｌ２タンパク質である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記短縮ＰＤ−Ｌ１タンパク質がＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞質ドメインを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記短縮ＰＤ−Ｌ２タンパク質がＰＤ−Ｌ２タンパク質の細胞質ドメインを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
ＰＤ−Ｌ１と相互作用する前記分子が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、短縮ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−１模倣体、またはＰＤ−Ｌ１に結合する小分子である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
ＰＤ−Ｌ２と相互作用する前記分子が、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、短縮ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−１模倣体、またはＰＤ−Ｌ２に結合する小分子である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
ＰＤ−１ＬおよびＰＤ−２Ｌと相互作用する前記分子が、短縮ＰＤ−１タンパク質である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３２】
前記短縮ＰＤ−１タンパク質がＰＤ−１タンパク質の細胞質ドメインを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記Ｔ細胞刺激薬が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞作動薬である、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記作動薬がＣＤ１３４もしくはそのリガンドもしくはその断片、ＣＤ−１３７もしくはそのリガンドもしくはその断片、または誘導性Ｔ細胞共刺激薬（ＩＣＯＳ）もしくはそのリガンドもしくはその断片である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
被験者内に強化された抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を引き出す方法であって、前記方法が前記被験者に請求項１および４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３８】
被験者内に強化された抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を引き出す方法であって、前記方法が前記被験者に請求項２および４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
被験者内に強化された抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を引き出す方法であって、前記方法が前記被験者に請求項３〜３６のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４０】
前記免疫応答がインターフェロンガンマ産生細胞のレベルを増加することを含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記免疫応答がＴエフェクター細胞による腫瘍浸潤の増加を含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｔエフェクター細胞がＣＤ４５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｆｏｘ３Ｐ−Ｔ細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫応答が脾臓および腫瘍微小環境内での調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度の減少を含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫応答が、脾臓および腫瘍微小環境内での骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の頻度の減少を含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法であって、前記方法が請求項１および４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を前記被験者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４６】
被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法であって、前記方法が請求項２および４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を前記被験者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４７】
被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法であって、前記方法が請求項３〜３６のいずれかに一項に記載の組成物を前記被験者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４８】
被験者の脾臓および腫瘍内でＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法であって、前記方法が請求項１および４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を前記被験者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４９】
被験者の脾臓および腫瘍内でＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法であって、前記方法が請求項２および４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を前記被験者に投与する工程を含む、方法。
【請求項５０】
被験者の脾臓および腫瘍内でＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法であって、前記方法が請求項３〜３６のいずれか一項に記載の組成物を前記被験者に投与する工程を含む、方法。
【請求項５１】
前記免疫原性組成物の前記投与の前、または後に前記抗腫瘍免疫応答を強化するサイトカインを投与することをさらに含む、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記サイトカインが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／ＩＦＮ−β）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫原性組成物の前記投与の前、または後に前記抗腫瘍免疫応答を強化する腫瘍キナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を投与することをさらに含む、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴＫＩが表１から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫原性組成物の前記投与の前、または後にインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤を投与することをさらに含む、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＩＤＯ経路阻害剤が、ＩＤＯと結合または相互作用する小分子、または抗ＩＤＯ抗体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫原性組成物から成る前記チェックポイント阻害剤が、前記組み換え型リステリア株の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に前記被験者に投与される、請求項３７、３９〜４１、４３〜４５、４７〜４８、５０〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫原性組成物から成る前記Ｔ細胞刺激薬が、前記組み換え型リステリア株の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に前記被験者に投与される、請求項３８、４０〜４４、４６〜４７、５０〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫原性組成物から成る前記Ｔ細胞刺激薬および前記チェックポイント阻害剤が、前記組み換え型リステリア株の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に前記被験者に投与される、請求項３９〜４４、４７、５０〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫原性組成物、前記組み換え型リステリア、前記Ｔ細胞刺激薬、または前記チェックポイント阻害剤のブースター用量を前記被験者に投与する工程をさらに含む、請求項３７〜５０および５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記方法が被験者内の腫瘍またはガンを治療することをさらに含む、請求項３７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記方法が被験者内の腫瘍の成長またはガンを防止することをさらに含む、請求項３７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の関与
本発明は部分的に共同研究開発契約（ＣＲＡＤＡ）＃０２６４８によって支援されている。米国政府は本発明に関してある特定の利益を有する場合がある。
【０００２】
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤またはＴ細胞刺激薬、および短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、もしくは腫瘍関連抗原に融合されたＰＥＳＴアミノ酸配列の融合タンパク質を含む弱毒化組み換え型生リステリア株を含む組成物を対象としている。本発明は、腫瘍を治療する、腫瘍から保護する、および腫瘍に対する免疫応答を誘発する方法であって、これを投与する工程を含む方法をさらに対象としている。
【背景技術】
【０００３】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、リステリア症を発生させるグラム陽性の通性細胞内病原体である。宿主細胞に侵入すると、Ｌｍは、血管膜を溶解し、細胞質の中に入ることを可能にして、そこで複製してアクチン重合化タンパク質（ＡｃｔＡ）の移動度に基づいて隣接する細胞に拡散する孔形成タンパク質、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の生成を通してファゴリソソームから脱出しうる。細胞質内では、Ｌｍ−分泌タンパク質はプロテアソームによって分解され、そして小胞体内のＭＨＣクラスＩ分子と関連するペプチドへと加工される。この特有の特徴により、これは大変魅力的なガンワクチンベクターとされ、この中で腫瘍抗原は腫瘍に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化するためにＭＨＣクラスＩ分子を提示されうる。
【０００４】
腫瘍媒介性免疫抑制のいくつかの機構のうちの１つは、腫瘍によるＴ細胞共阻害分子の発現である。それらのリガンドに結合すると、これらの分子は末梢内および腫瘍微小環境内のエフェクターリンパ球を抑制することができる。
【０００５】
Ｄ−１は活性化したリンパ球および骨髄性細胞の表面上で発現される。ＰＤ−Ｌ１は、幅広い非造血細胞に加えて、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、およびマクロファージ上で発現される。ＰＤ−Ｌ１は多数のヒト腫瘍上で上方調節され、またその発現は異なる種類のガンでの生存と逆相関することが示されている。様々な腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ２の発現も実証されてきた。
【０００６】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用の封鎖によって腫瘍撲滅を強化することができることが示されてきた。最近、ワクチンを用いて標的化したＰＤ−１と低用量のシクロホスファミドとの組み合せが抗原特異的な免疫応答を著しく強化し、腫瘍量を減少し、かつ処置したマウスの生存を増加することが実証された。興味深いことに、リステリアによる感染は免疫細胞上でＰＤ−Ｌ１の上方調節をもたらす。
【０００７】
現在のところ、腫瘍の成長およびガンを除去することができる効果的な組み合せ腫瘍標的化方法を提供する必要性がまだある。本発明はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ相互作用の封鎖を用いたリステリアベースのワクチンの組み合せを提供することによってこの必要性に対処する。以下の発明を実施するための形態に示されるように、この組み合せは免疫療法の全体的な抗腫瘍有効性を改善しうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物に関し、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【０００９】
関連する態様では、本発明は、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物に関し、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物に関し、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、プログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤、またはＣＤ−８０／８６ＣＴＬＡ４シグナル伝達経路阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物に関し、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００１２】
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が明らかとなるので、この詳細な説明および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示としてのみ与えられることを理解するべきである。
【００１３】
以下の図面は本明細書の一部分を形成し、かつ本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示した具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つ以上を参照することによって本発明をより良好に理解することができる。本特許ファイルまたは本特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。本特許または本特許出願のカラー図面（複数可）付きの出版物の複製物は、要求に応じ、かつ必要な料金の支払いに応じて米国特許商標局から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｔｒｅｇ頻度の減少を伴うＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して、週に２回腫瘍を測定した。次の式によって腫瘍体積を測定した：長さ×幅×幅／２。腫瘍直径がおよそ２．０ｃｍに達したとき、または２４日目にフローサイトメトリー解析のためにマウスを屠殺した。（図１Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（図１Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（図１Ｃ）生存パーセンテージ。（図１Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図１Ｅ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図１Ｆ）脾臓内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（図１Ｇ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図１Ｈ）腫瘍内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは３つの独立した実験（図１Ａおよび図１Ｂ）からのものであり、これは３つの独立した実験（図１Ｃ〜図１Ｈ）の代表である。
【図１−２】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｔｒｅｇ頻度の減少を伴うＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して、週に２回腫瘍を測定した。次の式によって腫瘍体積を測定した：長さ×幅×幅／２。腫瘍直径がおよそ２．０ｃｍに達したとき、または２４日目にフローサイトメトリー解析のためにマウスを屠殺した。（図１Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（図１Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（図１Ｃ）生存パーセンテージ。（図１Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図１Ｅ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図１Ｆ）脾臓内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（図１Ｇ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図１Ｈ）腫瘍内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは３つの独立した実験（図１Ａおよび図１Ｂ）からのものであり、これは３つの独立した実験（図１Ｃ〜図１Ｈ）の代表である。
【図２−１】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は定着ＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して、週に２回腫瘍を測定した。次の式によって腫瘍体積を測定した：長さ×幅×幅／２。（図２Ａ）ＰＢＳ。（図２Ｂ）ＬｍｄｄＡ。（図２Ｃ）Ｌｍ−Ｅ７。（図２Ｄ）ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７。データは、３つの独立した実験からのものである。
【図２−２】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は定着ＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して、週に２回腫瘍を測定した。次の式によって腫瘍体積を測定した：長さ×幅×幅／２。（図２Ａ）ＰＢＳ。（図２Ｂ）ＬｍｄｄＡ。（図２Ｃ）Ｌｍ−Ｅ７。（図２Ｄ）ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７。データは、３つの独立した実験からのものである。
【図３−１】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７は、類似のＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、または０．５ＬＤ５０野生型Ｌｍ１０４０３Ｓ（１×１０４ＣＦＵ）で、腹腔内免疫した。マウスを２４日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図３Ａ）脾臓および腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図３Ｂおよび図３Ｃ）脾臓（図１３Ｂ）および腫瘍（図３Ｃ）内のＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図３Ｄおよび図３Ｅ）マウスの脾臓当たり（図３Ｄ）および腫瘍細胞１００万個当たり（図３Ｅ）のＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数。ｎ＝３〜１０。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図３−２】ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７は、類似のＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、または０．５ＬＤ５０野生型Ｌｍ１０４０３Ｓ（１×１０４ＣＦＵ）で、腹腔内免疫した。マウスを２４日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図３Ａ）脾臓および腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図３Ｂおよび図３Ｃ）脾臓（図１３Ｂ）および腫瘍（図３Ｃ）内のＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図３Ｄおよび図３Ｅ）マウスの脾臓当たり（図３Ｄ）および腫瘍細胞１００万個当たり（図３Ｅ）のＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数。ｎ＝３〜１０。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図４−１】Ｌ．モノサイトゲネスは、Ｔｒｅｇ頻度の減少を誘発するのに十分である。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ（１×１０８ＣＦＵ）または０．５ＬＤ５０の野生型Ｌｍ１０４０３Ｓ（１×１０４ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。マウスを２４日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図４Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図４Ｂ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図４Ｃ）脾臓内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（図４Ｄ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図４Ｅ）腫瘍内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図４−２】Ｌ．モノサイトゲネスは、Ｔｒｅｇ頻度の減少を誘発するのに十分である。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ（１×１０８ＣＦＵ）または０．５ＬＤ５０の野生型Ｌｍ１０４０３Ｓ（１×１０４ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。マウスを２４日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図４Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図４Ｂ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図４Ｃ）脾臓内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（図４Ｄ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図４Ｅ）腫瘍内でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図５】Ｌ．モノサイトゲネスは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を優先的に誘発することによってＴｒｅｇ頻度を減少させる。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、各々１×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（１×１０８ＣＦＵ）、ＬｍｄｄＡ（１×１０８ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、または０．５ＬＤ５０野生型Ｌｍ１０４０３Ｓ（１×１０４ＣＦＵ）で、腹腔内免疫した。マウスを２４日目に屠殺し、腫瘍から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。データは平均±標準誤差として提示されている。ｎ＝３〜１０。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図６−１】ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＬ．モノサイトゲネス誘発性増殖はＬＬＯに依存し、かつＬＬＯによって媒介される。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ＰＢＳ（１００μｌ）中、１×１０４ＣＦＵの１０４０３Ｓ、Δｈｌｙ、Δｈｌｙ：：ｐｆｏ、またはｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）を、腹腔内注射した。マウスを注射後７日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図６Ａ）脾臓内のＴ細胞の数。（図６Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図６Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図６Ｄ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。＊Ｐ＜０．０５（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図６−２】ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＬ．モノサイトゲネス誘発性増殖はＬＬＯに依存し、かつＬＬＯによって媒介される。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ＰＢＳ（１００μｌ）中、１×１０４ＣＦＵの１０４０３Ｓ、Δｈｌｙ、Δｈｌｙ：：ｐｆｏ、またはｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）を、腹腔内注射した。マウスを注射後７日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図６Ａ）脾臓内のＴ細胞の数。（図６Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図６Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図６Ｄ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。＊Ｐ＜０．０５（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図７−１】ＬｍｄｄＡ内の短縮ＬＬＯのエピソーム性の発現はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のより高いレベルまでの増殖を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ＰＢＳ（１００μｌ）中、１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡまたはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯを、腹腔内注射した。マウスを注射後７日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図７Ａ）脾臓内のＴ細胞の数。（図７Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図７Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図７Ｄ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（図７Ｅ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図７Ｆ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図７Ｇ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞の蛍光強度。（図７Ｈ）ＬｍｄｄＡおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ存在下、ならびに対照のベクターなし（ＰＢＳ）でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＫｉ−６７発現のレベル。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図７−２】ＬｍｄｄＡ内の短縮ＬＬＯのエピソーム性の発現はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のより高いレベルまでの増殖を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ＰＢＳ（１００μｌ）中、１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡまたはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯを、腹腔内注射した。マウスを注射後７日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図７Ａ）脾臓内のＴ細胞の数。（図７Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図７Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図７Ｄ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（図７Ｅ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図７Ｆ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図７Ｇ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞の蛍光強度。（図７Ｈ）ＬｍｄｄＡおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ存在下、ならびに対照のベクターなし（ＰＢＳ）でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＫｉ−６７発現のレベル。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図７−３】ＬｍｄｄＡ内の短縮ＬＬＯのエピソーム性の発現はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のより高いレベルまでの増殖を誘発する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ＰＢＳ（１００μｌ）中、１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡまたはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯを、腹腔内注射した。マウスを注射後７日目に屠殺し、リンパ球を脾臓から分離し、そして腫瘍をフローサイトメトリーによって解析した。（図７Ａ）脾臓内のＴ細胞の数。（図７Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図７Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図７Ｄ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。（図７Ｅ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図７Ｆ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図７Ｇ）Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞の蛍光強度。（図７Ｈ）ＬｍｄｄＡおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ存在下、ならびに対照のベクターなし（ＰＢＳ）でのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＫｉ−６７発現のレベル。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図８−１】Ｌｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合せは、定着ＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７（５×１０５ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（５×１０７ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７プラス０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯで腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、そして腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。２４日目にマウスの生存を観察するかまたは屠殺し、脾臓から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。（図８Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（図８Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（図８Ｃ）生存パーセンテージ。（図８Ｄ）脾臓内のＴ細胞の数。（図８Ｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図８Ｆ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図８Ｇ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図８−２】Ｌｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合せは、定着ＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７（５×１０５ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（５×１０７ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７プラス０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯで腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、そして腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。２４日目にマウスの生存を観察するかまたは屠殺し、脾臓から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。（図８Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（図８Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（図８Ｃ）生存パーセンテージ。（図８Ｄ）脾臓内のＴ細胞の数。（図８Ｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図８Ｆ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図８Ｇ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図８−３】Ｌｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合せは、定着ＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７（５×１０５ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（５×１０７ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７プラス０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯで腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、そして腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。２４日目にマウスの生存を観察するかまたは屠殺し、脾臓から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。（図８Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（図８Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（図８Ｃ）生存パーセンテージ。（図８Ｄ）脾臓内のＴ細胞の数。（図８Ｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図８Ｆ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図８Ｇ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図９−１】Ｔｒｅｇの養子移植は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の定着ＴＣ−１腫瘍に対する抗腫瘍有効性を損なう。Ｃ５７ＢＬ６マウス（生後１１週）に、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍チャレンジ後９日目にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（１×１０６細胞／各）を静注した。マウスを、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中の０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、そして腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。マウスを注射後２４日目に屠殺し、脾臓から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。（図９Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（図９Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（図９Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図９Ｄ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図９Ｅ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図９Ｆ）脾臓内のＴ細胞の数。（図９Ｇ）腫瘍細胞１００万個当たりのＴ細胞の数。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図９−２】Ｔｒｅｇの養子移植は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の定着ＴＣ−１腫瘍に対する抗腫瘍有効性を損なう。Ｃ５７ＢＬ６マウス（生後１１週）に、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍チャレンジ後９日目にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（１×１０６細胞／各）を静注した。マウスを、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中の０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、そして腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。マウスを注射後２４日目に屠殺し、脾臓から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。（図９Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（図９Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（図９Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図９Ｄ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図９Ｅ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図９Ｆ）脾臓内のＴ細胞の数。（図９Ｇ）腫瘍細胞１００万個当たりのＴ細胞の数。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図９−３】Ｔｒｅｇの養子移植は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の定着ＴＣ−１腫瘍に対する抗腫瘍有効性を損なう。Ｃ５７ＢＬ６マウス（生後１１週）に、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍チャレンジ後９日目にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（１×１０６細胞／各）を静注した。マウスを、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中の０．１ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０８ＣＦＵ）で腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、そして腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。マウスを注射後２４日目に屠殺し、脾臓から分離したリンパ球をフローサイトメトリーによって解析した。（図９Ａ）１０日目〜２４日目の平均腫瘍体積。（図９Ｂ）２４日目の腫瘍体積。（図９Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のフローサイトメトリープロファイル。（図９Ｄ）脾臓内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図９Ｅ）腫瘍内でのＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ。（図９Ｆ）脾臓内のＴ細胞の数。（図９Ｇ）腫瘍細胞１００万個当たりのＴ細胞の数。データは平均±標準誤差として提示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図１０】ＬｍｄｄＡはＬｍ−Ｅ７抗腫瘍活性を増強しない。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各々１×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍チャレンジ後１０日目および１７日目に、ＰＢＳ（１００μｌ）中、０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７（５×１０５ＣＦＵ）、０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡ（５×１０７ＣＦＵ）、または０．０５ＬＤ５０のＬｍ−Ｅ７プラス０．０５ＬＤ５０のＬｍｄｄＡで腹腔内免疫した。電子キャリパーを使用して腫瘍を測定し、腫瘍体積を次の式で計算した：長さ×幅×幅／２。２４日目の腫瘍体積を示す。データは平均±標準誤差として提示されている。
【図１１】Ｌｍ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７感染はマウスＤＣ表面上のＰＤ−Ｌ１発現を上方調節する。（図１１Ａ）異なる濃度のＬｍ−ＬＬＯまたはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いた処置後のマウスＤＣに由来する骨髄上でのＰＤ−Ｌ１発現の、未処置対照に対する倍増。（図１１Ｂ）３つの独立した実験のうちの１つの代表的なヒストグラム。
【図１２−１】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に抗ＰＤ−１  Ａｂを追加すると、治療の効果を強化する。Ａ．治療スケジュール。Ｂ．３〜４日ごとに測定した各治療に対する個別のマウスの腫瘍体積。Ｃ．全生存を示すカプランマイヤープロット。３つの独立した実験から類似の結果が得られた。
【図１２−２】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に抗ＰＤ−１  Ａｂを追加すると、治療の効果を強化する。Ａ．治療スケジュール。Ｂ．３〜４日ごとに測定した各治療に対する個別のマウスの腫瘍体積。Ｃ．全生存を示すカプランマイヤープロット。３つの独立した実験から類似の結果が得られた。
【図１３】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に抗ＰＤ−１  Ａｂを追加すると、抗原特異的免疫応答を強化し、かつ腫瘍浸潤ＣＤ８  Ｔ細胞のレベルを増加する。腫瘍移植後２１日目にマウスが屠殺されたことを除いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たりｎ＝５）は図２Ａに示すように処置された。Ａ．Ｅ７ペプチドの存在または不在下でＩＦＮ−γ産生が脾臓から得られた単細胞浮遊液内で解析された。値は、Ｅ７を再刺激した培養物からのスポットの数から、無関連抗原で再刺激したものの数±標準偏差を引いたものを表す。Ｂ．浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数は、合計腫瘍細胞の１０ｅ６当たりで標準化され、平均値±標準偏差で提示された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１である。２つの独立した実験から類似の結果が得られた。
【図１４−１】Ｌｍ−ＬＬＯ治療は、脾臓および腫瘍浸潤ＭＤＳＣのレベルを減少する。（図１４Ａ）処置したマウスおよび対照マウスＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）からの脾臓のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋ＭＤＳＣのパーセンテージ。（図１４Ｂ）合計腫瘍細胞の１０ｅ６当たりで標準化された浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋ＭＤＳＣの絶対数は平均値±標準偏差として提示される。＊Ｐ＜０．０５。２つの独立した実験から類似の結果が得られた。
【図１４−２】Ｌｍ−ＬＬＯ治療は、脾臓および腫瘍浸潤ＭＤＳＣのレベルを減少する。（図１４Ａ）処置したマウスおよび対照マウスＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）からの脾臓のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋ＭＤＳＣのパーセンテージ。（図１４Ｂ）合計腫瘍細胞の１０ｅ６当たりで標準化された浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋ＭＤＳＣの絶対数は平均値±標準偏差として提示される。＊Ｐ＜０．０５。２つの独立した実験から類似の結果が得られた。
【図１５】Ｌｍ−ＬＬＯ治療は脾臓および腫瘍の浸潤Ｔｒｅｇ細胞のレベルを減少する。（図１５Ａ）実験群および対照群からの脾臓細胞のＣＤ４＋細胞集団内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージ。（図１５Ｂ）合計腫瘍細胞の１０ｅ６当たりで標準化された浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の絶対数は平均値±標準偏差として提示される。＊Ｐ＜０．０５。２つの独立した実験から類似の結果が得られた。
【図１６】Ｌｍ−ＬＬＯ感染は、単球由来ヒトＤＣ表面上のＰＤ−Ｌ１発現を上方調節する。（図１６Ａ）異なる濃度のＬｍ−ＬＬＯを用いた治療後のヒトＤＣ上でのＰＤ−Ｌ１発現の、未治療対照に対する倍増。（図１６Ｂ）異なる濃度のＬｍ−ＬＬＯを用いて治療したヒトDC上のＰＤ−Ｌ１発現の代表的なヒストグラム。３つの独立した実験から類似の結果が得られた。
【００１５】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を提供し、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤または作動薬、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を提供し、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の実施形態では、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞刺激薬の投与は組み換え型リステリア株の投与と同時であってもよい。別の実施形態では、Ｔ細胞刺激薬の投与は組み換え型リステリア株の投与の前であってもよい。別の実施形態では、Ｔ細胞刺激薬の投与は組み換え型リステリア株の投与の後であってもよい。
【００１９】
別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、前記核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤およびＴ細胞刺激薬の投与は組み換え型リステリア株の投与と同時であってもよい。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤およびＴ細胞刺激薬の投与は組み換え型リステリア株の投与の前であってもよい。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤およびＴ細胞刺激薬の投与は組み換え型リステリア株の投与の後であってもよい。
【００２０】
別の実施形態では、プログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００２１】
別の実施形態では、プログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤、またはＣＤ−８０／８６およびＣＴＬＡ４シグナル伝達経路阻害剤、ならびに核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００２２】
別の実施形態では、被験者内に強化された抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、この方法はプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の実施形態では、被験者内に強化された抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、この方法は免疫チェックポイント阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００２４】
別の実施形態では、被験者内に強化された抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、この方法はＴ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００２５】
別の実施形態では、被験者内に強化された抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、この方法は免疫チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００２６】
別の実施形態では、チェックポイント阻害剤の投与は組み換え型リステリア株の投与と同時であってもよい。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤の投与は組み換え型リステリア株の投与の前であってもよい。別の実施形態では、投与は組み換え型リステリア株の投与の後であってもよい。
【００２７】
一実施形態では、被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法が本明細書に提供され、方法は本明細書に提供される免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【００２８】
別の実施形態では、被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法が本明細書に提供され、この方法はプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００２９】
別の実施形態では、被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法が本明細書に提供され、この方法は免疫チェックポイント阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００３０】
別の実施形態では、被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法が本明細書に提供され、この方法はＴ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００３１】
別の実施形態では、被験者内で腫瘍媒介性免疫抑制を阻害する方法が本明細書に提供され、この方法は免疫チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００３２】
別の実施形態では、被験者内の腫瘍の成長もしくはガンを防止または治療する方法が本明細書に提供され、この方法はプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００３３】
別の実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原は天然起源の腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原は合成腫瘍関連抗原である。
【００３４】
一実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍微小環境内で、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、方法は本明細書に提供される免疫原性組成物を投与することを含む。別の実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍内で、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は免疫チェックポイント阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００３５】
別の実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍内で、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、この方法はＴ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００３６】
別の実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍内で、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は免疫チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。
【００３７】
別の実施形態では、被験者内の脾臓および腫瘍微小環境内でＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加することは、前記被験者内のより著明な抗腫瘍応答を可能にする。
【００３８】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。
【００３９】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリアは、ファゴリソソームを避ける能力を有する。
【００４０】
別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、調節性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
【００４１】
一実施形態では、本発明は、腫瘍またはガンを治療する、腫瘍またはガンから保護する、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００４２】
一実施形態では、本発明はヒト被験者内の腫瘍またはガンを防止または治療する方法を提供し、これには免疫チェックポイント阻害剤、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む本明細書に提供される免疫原性組成物株を被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、それにより前記組成物の投与が異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原を含み、それにより組み換え型リステリア株が腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。
【００４３】
一実施形態では、本発明はヒト被験者内の腫瘍またはガンを防止または治療する方法を提供し、これにはＴ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む本明細書に提供される免疫原性組成物株を被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、それにより前記組成物の投与が異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原を含み、それにより組み換え型リステリア株が腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。
【００４４】
一実施形態では、本発明はヒト被験者内の腫瘍またはガンを防止または治療する方法を提供し、これには免疫チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、および核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む本明細書に提供される免疫原性組成物株を被験者に投与する工程を含み、前記核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、それにより前記組成物の投与が異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原を含み、それにより組み換え型リステリア株が腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、Ｔ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は腫瘍またはガンから被験者を保護する方法を提供し、これには本明細書に提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は、被験者内の腫瘍の退縮を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は腫瘍またはガンの発生または再発を減少させる方法を提供し、これには本明細書に提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は被験者内での腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、これには本明細書に提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は被験者内でガンの寛解を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子はリステリアゲノムに組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は前記組み換え型リステリア株内のプラスミドの中にある。別の実施形態では、核酸分子は前記組み換え型リステリア株内の細菌人工染色体の中にある。
【００４６】
一実施形態では、リステリアゲノムは内因性ＡｃｔＡ遺伝子の欠失を含み、これは一実施形態では病毒性因子である。一実施形態では、かかる欠失は、より弱毒化し、ひいてはヒトの使用のためにより安全なリステリア株を提供する。一実施形態では、したがって、異種抗原または抗原性ポリペプチドは、リステリア染色体のＬＬＯとフレーム内に組み込まれる。別の実施形態では、組み込み核酸分子は、ＡｃｔＡ遺伝子座へと組み込まれる。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする染色体の核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。
【００４７】
当業者には当然のことながら、「抗原性ポリペプチド」という用語は、被験者の細胞内に存在するＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上で加工および提示され、宿主内に存在するとき、または、別の実施形態では宿主によって検出されるとき、免疫応答の開始をもたらす上述のようなポリペプチド、ペプチド、または組み換え型ペプチドを指す。
【００４８】
一実施形態では、抗原は外来であってもよく、すなわち、宿主に対して異種であってもよく、本明細書では「異種抗原」と称される。別の実施形態では、異種抗原は、前記抗原を組み換えによって発現する本明細書に提供されるリステリア株に対して異種である。別の実施形態では、異種抗原は、宿主および、本明細書に提供される前記抗原を組み換えによって発現するリステリア株に対して異種である。別の実施形態では、抗原は、自己抗原であり、これは宿主内に存在するが、免疫寛容のために宿主はこれに対する免疫応答を引き出さない。当業者にとっては当然のことながら、異種抗原ならびに自己抗原は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、または血管形成抗原を包含しうる。
【００４９】
一実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮リステリオリシンＯタンパク質（ＬＬＯ）、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、短縮ＬＬＯタンパク質はＮ末端ＬＬＯまたはその断片である。別の実施形態では、短縮ＡｃｔＡタンパク質はＮ末端ＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。
【００５０】
一実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａt）である。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は内因性ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子内の突然変異を含む。別の実施形態では、リステリアはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いている。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節性配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第２のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々はプロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。
【００５２】
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００５３】
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、米国特許第８，１１４，４１４号に記述されるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７株であり、この特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
一実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリアベクターに基づき、これは病毒性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または短縮ＬＬＯ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。
【００５５】
別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｒｆＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＡである。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的な特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はＥＧＤリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では、本発明で使用される株は非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。
【００５６】
一実施形態では、本明細書に開示されるリステリアはリステリアワクチン株である。別の実施形態では、これもまた本明細書に開示されるリステリア株を使用する本明細書に開示される療法は、リステリアベースの免疫療法である。
【００５７】
別の実施形態では、リステリア株は、栄養要求性突然変異体である。別の実施形態では、リステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
【００５８】
一実施形態では、Ｄ−アラニンを欠損したリステリアのＡＡ株の生成は、例えば、欠失突然変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の発生の結果として生じる突然変異生成、タンパク質の中途終始を生じる突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節性配列の突然変異を含む、当業者には周知の数多くの方法で達成されうる。別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ技法を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射、およびそれに続く突然変異体の選択を使用する従来の突然変異生成技術を使用して突然変異生成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰をともなう可能性が低いため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異体は、単純な実験室の培養アッセイでＤ−アラニンの非存在下で成長する能力を試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で成長することができない変異体がさらなる研究のために選択される。
【００５９】
別の実施形態では、本明細書に提供されるように、リステリアの突然変異導入の標的として上述のＤ−アラニン関連遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子が使用されてもよい。
【００６０】
別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型細菌株の染色体の残りのものに欠けている内因性代謝遺伝子を相補する。一実施形態では、内因性代謝遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、内因性代謝遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、前記代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、前記代謝酵素は前記組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、前記代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、前記代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。各々の可能性は本明細書に提供される方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００６１】
一実施形態では、前記栄養要求性リステリア株は、前記栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソームの発現ベクターを含む。別の実施形態では、構成物はエピソームの様式でリステリア株内に含有される。別の実施形態では、外来抗原は組み換え型リステリア株が抱えるベクターから発現される。別の実施形態では、前記エピソームの発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。一実施形態では、本明細書に提供されるように、この方法および組成物の抗原は、短縮リステリオリシンＯタンパク質（ＬＬＯ）、短縮ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列に融合される。別の実施形態では、本明細書に提供されるように、この方法および組成物の抗原は、短縮ＬＬＯに融合される。別の実施形態では、本明細書に提供されるように、この方法および組成物の抗原は、短縮ＡｃｔＡタンパク質に融合される。別の実施形態では、本明細書に提供されるように、この方法および組成物の抗原は、ＰＥＳＴアミノ酸配列に融合される。
【００６２】
別の実施形態では、リステリア株はＡＡ代謝酵素が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が欠損している。ＣｙｓＫ。別の実施形態では、遺伝子はビタミンＢ１２に依存しないメチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
【００６３】
別の実施形態では、リステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ｆｏｌＰである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型サブユニットシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態では、遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。
【００６４】
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
【００６５】
別の実施形態では、リステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩／亜硝酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ共輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はメジャーファシリテイターファミリー輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はテイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。
【００６６】
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に提供される。別の実施形態では、リステリアを形質転換するために使用される本明細書に提供される核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリア内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺伝子を不活性化するために使用される。また別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。病毒性遺伝子は、組み換え型リステリア内で、病毒性と関連付けられる当該技術分野で既知の任意の遺伝子とすることができることが当業者によって理解されるべきである。
【００６７】
また別の実施形態では、リステリア株は、ｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ＡｃｔＡ突然変異体、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態では、リステリアはこれらの遺伝子の個別または組み合せでの欠失または突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、遺伝子のそれぞれ１つずつを欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本明細書に提供されるいずれかの遺伝子のうちの少なくとも１個かつ最高１０個を欠いている。別の実施形態では、ｐｒｆＡ突然変異体はＤ１３３ＶＰｒｆＡ突然変異体である。
【００６８】
一実施形態では、弱毒化生リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、リステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これはプロセスに関与するので、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００６９】
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体および何らかのエピソームの遺伝要素で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、病毒性株のゲノムで欠けている。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００７０】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ａｃｔＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちの任意の単一遺伝子または遺伝子の組み合せの不活性化突然変異を含む。
【００７１】
「突然変異」という用語およびその文法的な同等物は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、これには欠失突然変異、短縮、不活性化、妨害、置き換え、または転座を含むことを当業者は理解するであろう。突然変異のこれらのタイプは当該技術分野でよく知られている。
【００７２】
一実施形態では、本明細書に提供される代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で成長させる。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで増殖することになり、一方でＤ−グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする孤立核酸を含む場合、本発明のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）。
【００７３】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、この細菌は適切な培地上で選択的な圧力の存在の中で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラスミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【００７４】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に適合されることを当業者は理解するであろう。
【００７５】
一実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は、別の実施形態では、相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して動作可能に付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。別の実施形態では、短縮ＬＬＯはＮ末端ＬＬＯに到達するＣ末端において短縮される。本明細書に提供されるように、ＬＬＯを発現する組み換え型リステリア株は脾臓内で、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、短縮ＬＬＯを発現しない組み換え型リステリア株より高いレベルまで予想外に増加させ（実施例５）、これによってＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖がＬＬＯによって直接媒介されることを実証している（実施例６）。本明細書にさらに提供されるように、短縮ＬＬＯをエピソーム的に発現する組み換え型リステリアは、Ｔｒｅｇの数を減少せずにＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔの増殖を誘発することによって、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞（調節性Ｔ細胞、すなわちＴｒｅｇ）に対する比を予想外に増加させ、これによってＴｒｅｇの頻度をそれに比例して減少させる。
【００７６】
一実施形態では、短縮ＡｃｔＡタンパク質および異種抗原は、別の実施形態では、相互に直接融合している。別の実施形態では、短縮ＡｃｔＡタンパク質および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、短縮ＡｃｔＡタンパク質および異種抗原はリンカーペプチドを介して動作可能に付着している。別の実施形態では、短縮ＡｃｔＡタンパク質および異種抗原は異種ペプチドを介して動作可能に付着している。別の実施形態では、短縮ＡｃｔＡタンパク質は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、短縮ＡｃｔＡタンパク質は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。別の実施形態では、短縮ＡｃｔＡタンパク質はＮ末端Ａｃｔに到達するＣ末端において短縮される。
【００７７】
一実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列および異種抗原は、別の実施形態では、相互に直接融合している。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列および異種抗原をコードする遺伝子は、相互に直接融合している。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列および異種抗原は、リンカーペプチドを介して動作可能に付着している。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列および異種抗原は、異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、異種抗原に対するＮ末端である。
【００７８】
一実施形態では、本発明のリステリア内に含まれる核酸分子は組み換え型ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型核酸は、本明細書に提供される組み換え型リステリア株のプラスミド中にある。別の実施形態では、プラスミドは、前記組み換え型リステリア株の染色体に組み込まれないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態では、プラスミドは前記リステリア株の染色体に組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはマルチコピープラスミドである。
【００７９】
一実施形態では、方法は組み換え型リステリアを追加的な療法とともに同時投与する工程を含む。別の実施形態では、追加的な療法は外科手術、化学療法、免疫療法、またはこれらの組み合せである。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与より追加的療法を先に行う。別の実施形態では、組み換え型リステリアの投与に続いて追加的療法を行う。別の実施形態では、追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、抗体療法は、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加し、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するために、組み換え型リステリアは漸増用量で投与される。細胞の免疫応答を強化するために、腫瘍を有する被験者にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当該技術分野で既知の他のサイトカインを含むがこれに限定されないサイトカインを提供することによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることが当業者によって理解されるであろう。これらのうちのいくつかは米国特許第６，９９１，７８５号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
一実施形態では、異種抗原は腫瘍関連抗原である。一実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法の組み換え型リステリア株は腫瘍細胞によって発現される抗原を含む融合ポリペプチドを発現する。
【００８１】
別の実施形態では、腫瘍関連抗原はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。別の実施形態では、腫瘍関連抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原はＨｅｒ−２である。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼである。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原はＥ７、Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、ＳＣＣＥ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２から選択される。別の実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、抗原は感染性疾病抗原である。
【００８２】
別の実施形態では、腫瘍関連抗原は血管形成抗原である。別の実施形態では、血管形成抗原は活性化した周皮細胞と腫瘍血管形成血管系内の周皮細胞との両方の上で発現され、これは別の実施形態では、インビボでの新血管形成と関連付けられる。別の実施形態では、血管形成抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、血管形成抗原は当該技術分野で既知のものであり、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１０２１４０号で提供され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
一実施形態では、本発明の組成物はインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本発明のリステリアはインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘発し、一実施形態では、これは抗血管形成特性を有する（Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本発明の方法はインターフェロンガンマ産生細胞のレベルを増加する。一実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  ２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−ガンマ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。
【００８４】
別の実施形態では、本発明の組成物は１つ以上の抗血管形成タンパク質または因子の生産を誘発する。一実施形態では、抗血管形成タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態では、抗血管形成タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本発明のリステリアは、抗血管形成因子の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を被験者に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。各々のリステリア株およびそのタイプは、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８５】
他の実施形態では、抗原は、真菌病原体、細菌、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５からのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩから選択される。
【００８６】
他の実施形態では、抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【００８７】
別の実施形態では、本明細書に提供される異種抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、以下の腫瘍抗原のうちの１つである。ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組み合せである。
【００８８】
一実施形態では、抗原は米国特許第９，０８４，７４７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるキメラＨｅｒ２抗原である。
【００８９】
別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原はＨＥＲ２／ｎｅｕである。別の実施形態では、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態では、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原はＣＥＡである。別の実施形態では、抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態では、抗原はｐ５３である。別の実施形態では、抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態では、抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。別の実施形態では、抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、スルビビン、バキュロウイルスアポトーシス抑制反復配列含有５（ＢＩＲＣ５）、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、またはこれらの組み合せから選択される。
【００９０】
一実施形態では、本発明のリステリアによって発現される融合ポリペプチドは神経ペプチド成長因子拮抗薬を含んでもよく、一実施形態では、これは［Ｄ−Ａｒｇ１、Ｄ−Ｐｈｅ５、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、Ｌｅｕ１１］サブスタンスＰ、［Ａｒｇ６、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、ＮｍｅＰｈｅ８］サブスタンスＰ（６−１１）である。これらの実施形態および関連する実施形態は当業者に理解される。
【００９１】
別の実施形態では、異種抗原は感染性疾病抗原である。一実施形態では、抗原は自己抗原（auto  antigen）または自己抗原（self-antigen）である。
【００９２】
別の実施形態では、異種抗原は、真菌病原体、細菌、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合抱体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５ヒトパピローマウイルスからのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、またはこれらの組み合せから選択される。
【００９３】
別の実施形態では、異種抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳３、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。各々の抗原は本明細書に提供される方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【００９４】
本明細書に提供される方法および組成物によって誘発される免疫応答は、別の実施形態ではＴ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。
【００９５】
一実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法の組み換え型リステリアは、血管形成ポリペプチドまたは血管形成抗原をコードする核酸を含む。別の実施形態では、ガン療法に対する抗血管形成アプローチは大変有望であり、また一実施形態では、かかる抗血管形成療法の１つのタイプは周皮細胞を標的にする。別の実施形態では、血管内皮細胞および周皮細胞上の分子標的は、抗腫瘍療法の重要な標的である。別の実施形態では、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲ−β）シグナル伝達は新たに形成された血管に周皮細胞を動員するために重要である。したがって、一実施形態では、本明細書に提供される血管形成ポリペプチドは周皮細胞シグナル伝達に関与する分子を阻害し、これは一実施形態ではＰＤＧＦＲ−βである。
【００９６】
一実施形態では、本発明の組成物は血管形成因子またはその免疫原性断片を含み、一実施形態では、免疫原性断片は宿主免疫系によって識別される１つ以上のエピトープを含む。一実施形態では、血管形成因子は新たな血管の形成に関与する分子である。一実施形態では、血管形成因子はＶＥＧＦＲ２である。別の実施形態では、本発明の血管形成因子は、アンジオジェニン；アンジオポエチン−１；Ｄｅｌ−１；線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）；ホリスタチン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；レプチン；ミッドカイン；胎盤成長因子；血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；スルビビン；形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）；形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）；腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）である。別の実施形態では、血管形成因子は血管形成タンパク質である。一実施形態では、成長因子は血管形成タンパク質である。一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用する血管形成タンパク質は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲおよびニューロピリン１（ＮＲＰ−１）；アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）およびＴｉｅ２；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；ＢＢホモ二量体）およびＰＤＧＦＲ；形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、エンドグリンおよびＴＧＦ−β受容体；単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）；インテグリンαＶβ３、αＶβ５およびα５β１；ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１；エフリン；プラスミノーゲン活性化因子；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）およびＣＯＸ−２；ＡＣ１３３；またはＩｄ１／Ｉｄ３である。一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用する血管形成タンパク質はアンジオポエチンであり、一実施形態では、これはアンジオポエチン１、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、またはアンジオポエチン６である。一実施形態では、エンドグリンはＣＤ１０５；ＥＤＧ；ＨＨＴ１；ＯＲＷ；またはＯＲＷ１としても知られる。一実施形態では、エンドグリンはＴＧＦベータ共受容体である。
【００９７】
一実施形態では、本明細書に提供される免疫原性組成物は、自己免疫疾患を防止、抑制、阻害、または治療するために有用である。一実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、インシュリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、天疱瘡、アジソン病、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、特発性白血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、男性不妊症、混合性結合組織疾患、重症筋無力症、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性粘液水腫、ライター症候群、スティフマン症候群、甲状腺機能亢進症、潰瘍形成大腸炎、およびヴェーゲナー肉芽腫症を含むがこれに限定されない当該技術分野で既知の任意の自己免疫疾患である。別の実施形態では、本発明は、神経系の炎症性疾患（多発性硬化症など）、粘膜の炎症性疾患（炎症性腸疾患、喘息、または扁桃炎など）、炎症性皮膚疾患（皮膚炎、乾癬、または接触過敏症など）、および自己免疫関節炎（関節リウマチなど）から成る群から選択される炎症性疾患を治療するために使用する本発明によるＩＣＯＳに対する作動薬抗体またはその誘導体にも着目している。
【００９８】
一実施形態では、本明細書に提供される組成物およびその使用方法は、腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を破壊し、そして疾患を撲滅することができるエフェクターＴ細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の使用方法はＴエフェクター細胞による腫瘍浸潤を増加する。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞はＣＤ４＋Ｆｏｘ３Ｐ  Ｔ細胞を含む。
【００９９】
一実施形態では、自然に生じる腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、結腸、卵巣、およびメラノーマなどのいくつかの腫瘍でより良い予後に関連付けられる。結腸ガンでは、微小転移巣の兆候がない腫瘍は免疫細胞の浸潤増加およびＴｈ１発現プロファイルを有し、これは患者の生存の改善と相関する。さらに、Ｔ細胞による腫瘍の浸潤は、前臨床試験と人体試験の両方で免疫療法アプローチの成功に関連付けられている。一実施形態では、リンパ球の腫瘍部位への浸潤は、一般的にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１などの炎症促進性のサイトカインによる、腫瘍血管系の内皮細胞内の接着分子の上方調節に依存する。細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、血管内皮細胞接着分子１（Ｖ−ＣＡＭ−１）、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）およびＥ−セレクチンを含む腫瘍内へのリンパ球浸潤のプロセスにはいくつかの接着分子が暗示されている。しかしながら、これらの細胞接着分子は腫瘍血管系内で一般に下方調節される。したがって、一実施形態では、本明細書に提供されるガンワクチンはＴＩＬを増加し、接着分子（一実施形態では、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＶＡＰ−１、Ｅ−セレクチン、またはこれらの組み合せ）を上方調節し、炎症促進性のサイトカイン（一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、またはこれらの組み合せ）、またはこれらの組み合せを上方調節する。
【０１００】
一実施形態では、ＨＰＶ抗原はＨＰＶ１６である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態では、ＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態では、ＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１０１】
一実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ７はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ６はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ６抗原は、本発明の組成物または方法のＥ７抗原の代わりにまたはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ媒介性疾患、障害、または症状を治療もしくは軽快するために利用される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７の代わりにまたはこれと組み合せて利用される。かかる実施形態では、組み換え型リステリアはＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７を染色体から、ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７をプラスミドから発現してもよく、またはその反対であってもよい。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に提供される組み換え型リステリア内に存在するプラスミドから発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に提供される組み換え型リステリアの染色体から発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は上記の実施形態の任意の組み合せで発現され、これには各々のＨＰＶ株由来の各々のＥ６およびＥ７抗原がプラスミドまたは染色体のいずれかから発現されるものを含む。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書に提供される疾患はガンまたは腫瘍である。一実施形態では、本発明の方法で治療されるガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮頸ガンである。別の実施形態では、このガンはＨｅｒ２を含有するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、これは多形性膠芽腫である。別の実施形態では、このガンは結腸直腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞肺ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。別の実施形態では、このガンは口腔咽頭ガンである。別の実施形態では、このガンは肺ガンである。別の実施形態では、このガンは肛門ガンである。別の実施形態では、このガンは大腸ガンである。別の実施形態では、このガンは食道ガンである。別の実施形態では、このガンは中皮腫である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１０３】
一実施形態では、短縮ＬＬＯはＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号：１）である。別の実施形態では、リステリアから他のＬＭ  ＰＥＳＴ  ＡＡ配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も強化することになる。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は配列番号：２を含む。別の実施形態では、断片はＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、断片は配列番号：３を含む。別の実施形態では、断片は配列番号：３をほぼ含む。別の実施形態では、断片は配列番号：３を本質的に含む。別の実施形態では、断片は配列番号：３に対応する。別の実施形態では、断片は配列番号：３と相同である。別の実施形態では、断片は配列番号：３の断片と相同である。いくつかの実施例で使用されるΔＬＬＯは、システイン４８４を含有する活性化ドメインを含むアミノ末端からの８８個の残基が短縮されたので、４１６  ＡＡ長さ（シグナル配列を含まない）であった。活性化ドメインを有しない、そして特にシステイン４８４を有しない任意のΔＬＬＯは本発明の方法および組成物のために好適であることが当業者には明らかであろう。別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列、配列番号：１を含む、異種抗原の任意のΔＬＬＯへの融合は、媒介される細胞、および抗原の抗腫瘍免疫性を強化する。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１０５】
本発明のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１３１２８、配列番号：４、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１２７に示される）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号：２）。
【０１０７】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は本明細書で利用されるＡＡ２０〜４４２のＬＬＯタンパク質にほぼ対応する。
【０１０８】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号：３）。
【０１０９】
別の実施形態では、「短縮ＬＬＯ」または「ΔＬＬＯ」は推定ＰＥＳＴアミノ酸配列を含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語は推定ＰＥＳＴドメインを含むＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、「短縮ＬＬＯ」および「Ｎ末端ＬＬＯ」という用語は本明細書で互換的に使用される。
【０１１０】
別の実施形態では、この用語はアミノ末端において活性化ドメインを含有せず、システイン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、これらの用語は溶血性でないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、別の場所における欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７１，７０２号に詳細に述べられるように、ＬＬＯは、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【０１１１】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【０１１２】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。
【０１１３】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用されるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＬＬＯ断片である。
【０１１４】
別の実施形態では、相同ＬＬＯは、ＬＬＯ配列（例えば、配列番号：２〜４のうちの１つ）に対する同一性が７０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同ＬＬＯは、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。
【０１１５】
別の実施形態では、「相同性」という用語は、本明細書に提供されるいずれかの核酸配列を参照するとき、対応するネイティブ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを同様に示す。
【０１１６】
一実施形態では、当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対してコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合があり、これらは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどである。
【０１１７】
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が６８％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が７２％より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態では、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい。別の実施形態では、同一性は１００％である。
【０１１８】
別の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介し決定され、その方法は当業者によりよく記述されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  Ｅｄｓ．（１９８５）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙを参照）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、ネイティブカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【０１１９】
本明細書に提供される方法および組成物の別の実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組み合せのストリングを指す。一実施形態では、この用語はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸高分子の単量体単位を指す。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態をとる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述される（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびそこに引用された参考文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態、またはこれらの群の誘導体であってもよい。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖であってもよい。別の実施形態では、この用語は他の種類のバックボーンであるが同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態では、この人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチドバックボーンおよびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に結合することができる。別の実施形態では、このヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は当該技術分野で既知の未変性の核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、また例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記述される。核酸の生産および使用は、当業者には既知であり、また例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記述される。各々の核酸誘導体は、本明細書に提供される別個の実施形態を表す。
【０１２０】
一実施形態では、「ペプチド」という用語は天然ペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチド、または組み換え型ペプチドのいずれか）、ならびに／またはペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドなどのペプチド模倣薬（典型的には、合成的に合成されたペプチド）を指し、これは、例えば、身体中にあるときペプチドをより安定させる、または細胞の中へと浸透する能力をより高める修飾を有してもよい。かかる修飾としては、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨが挙げられるがこれに限定されない）、バックボーン修飾、および残基修飾が挙げられるが、これに限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で特定されている。これに関するさらなる詳細が以下に提供される。
【０１２１】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、＊−ａｚａ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）で置換されてもよく、式中Ｒは、任意のアルキル、例えば、メチル、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）などであり、Ｒは、炭素原子上に自然に存在する「直鎖状の」側鎖である。
【０１２２】
これらの修飾はペプチド鎖に沿った結合のいずれかで生じる可能性があり、またいくつか（２〜３）が同時に生じる可能性さえある。天然の芳香族アミノ酸である、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（naphthylelanine）（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成非天然酸で置換されてもよい。
【０１２３】
上記に追加して、本明細書に提供されるペプチドは１つ以上の修飾アミノ酸または１つ以上の非アミノ酸単量体（例えば、脂肪酸、複合糖質等）も含んでもよい。
【０１２４】
一実施形態では、「オリゴヌクレオチド」という用語は「核酸」という用語と互換的であり、また原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられる場合があるがこれに限定されない分子を指す場合がある。この用語は既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。
【０１２５】
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において適切に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、また例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。各々の相同性を決定する方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２６】
一実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株はＨＰＶ−Ｅ７抗原に融合された短縮ＬＬＯの融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、ｔＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質をコードする配列は配列番号：１３：
ａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｔｃｇａｇＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡ（配列番号：１３）を含み、この中で大文字の配列はＥ７をコードし、小文字の配列はｔＬＬＯをコードし、また下線付きの「ｃｔｃｇａｇ」配列は腫瘍抗原をプラスミドの短縮ＬＬＯに連結するために使用されるＸｈｏ  Ｉ制限部位を表す。
【０１２７】
別の実施形態では、Ｅ７に融合されたｔＬＬＯをコードするアミノ酸配列は、配列番号：１４：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲ
ＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬＥＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（配列番号：１４）を含む。
【０１２８】
一実施形態では、配列番号：１４を含むＥ７に融合されたｔＬＬＯをコードする核酸を含む組み換え型リステリアは、ＡＤＸＳ−ＨＰＶと称される。別の実施形態では、「ＡＤＸＳ−ＨＰＶ」と「ＡＤＸＳ１１−００１」とは本明細書で互換的に使用される。
【０１２９】
別の実施形態では、本明細書に提供される構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。相同的組み換えのための技法は当該技術分野で周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ、ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５，  １０９（１−２）：１１−７）；およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ２００５，  ３７（１）：１９−２４）。別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。この場合、Ｅ７を発現する組み換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、また遺伝子産物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含めることによって、Ｅ７遺伝子の染色体組み込みによって作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。
【０１３０】
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組み込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、とりわけ以下のＳｕｎらの文献ＤＰ−Ｌ９６７の構造における（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：  ３７７０−３７７８）に記載されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置が未知であるという不利点を有する。
【０１３１】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３‘端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組み込みの前に利用された付着部位からキュアリングされる。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。別の実施形態では、本発明は、臨床用途のためのファージベースの染色体組み込みシステムをさらに含み、ここでｄ−アラニン・ラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用することができ、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）である。別の実施形態では、「ファージキュアリング工程」を避けるためにＰＳＡに基づくファージ組み込み系を使用する。別の実施形態では、これは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組み込み系の確立を可能にする。代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。
【０１３２】
本明細書に提供される方法および組成物の一実施形態では、「組み換え部位」または「部位特異的な組み換え部位」という用語は、組み換え部位に隣接する核酸区分の交換または切除を媒介するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連するタンパク質とともに）識別される核酸分子内の塩基の配列を指す。リコンビナーゼおよび関連するタンパク質は「組み換え型タンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３：６９９−７０７；１９９３）を参照のこと）。
【０１３３】
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書に提供されるような方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、任意の細胞（原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類の細胞を含む）内で構造的にまたは誘導的に発現する目的の任意のファージベースの組み換え型発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞内で再生すること、および適切な条件下でファージ粒子を生成することの両方を可能にすることができる。この用語は線形または円形の発現系を含み、またエピソームのまま、または宿主細胞ゲノムの中へと組み込まれた両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０１３４】
一実施形態では、本明細書で使用される場合、「動作可能にリンクした」という用語は、転写および翻訳調節性核酸が、転写が開始されるような様式で任意のコード配列に対して位置することを意味する。一般的にこれは、プロモーターおよび転写開始配列または始動配列がコ−ド化領域に対して５’に位置されることを意味することになる。
【０１３５】
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。別の実施形態では、ＯＲＦの開始端および停止端はｍＲＮＡの端部と同等でないが、通常はｍＲＮＡ中に含まれる。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、一実施形態では、内因性のポリペプチドとともにオープンリーディングフレームとして動作可能にゲノムの中へと組み込まれる核酸分子は、内因性のポリペプチドと同一のオープンリーディングフレーム内でゲノムの中へと組み込まれた核酸分子である。
【０１３６】
一実施形態では、本発明はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。一実施形態では、「リンカー配列」は２つの異種ポリペプチドまたはその断片もしくはドメインを結合するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書で使用される場合、リンカーは融合ポリペプチドを形成するためにポリペプチドを共有的にリンクするアミノ酸配列である。リンカーは、典型的には、オープンリーディングフレームおよび表示タンパク質によってコードされたアミノ酸配列を含む融合タンパク質を作り出すために、表示ベクターからのレポーター遺伝子の除去後の残りの組み換えシグナルから翻訳されたアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、リンカーはグリシンおよび他の小さな中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。
【０１３７】
一実施形態では、本明細書で使用される場合、「内因性」は、参照生命体内で発生もしくは創出された、または参照生命体の中で生じたものから発生してきた物品を記述している。別の実施形態では、内因性は、天然であることを指す。
【０１３８】
「ＰＥＳＴアミノ酸配列」または「ＰＥＳＴ配列含有ポリペプチド」または「ＰＥＳＴ配列含有タンパク質」または「ＰＥＳＴ配列含有ペプチド」という用語は、すべて同一の意味および質を有して互換的に使用される場合があり、また短縮ＬＬＯタンパク質（一実施形態ではこれはＮ末端ＬＬＯである）、および短縮ＡｃｔＡタンパク質（一実施形態ではこれはＮ末端ｃｔＡまたはその断片である）を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。ＰＥＳＴアミノ酸配列は、当該技術分野で既知であり、また米国特許第７，６３５，４７９号、および米国特許公開整理番号第２０１４／０１８６３８７号に記述され、これらの両方はその全体を本明細書組み込まれる。
【０１３９】
別の実施形態では、原核生物のＰＥＳＴアミノ酸配列は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対してＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ（ＴＢＳ  ２１：２６７−２７１，１９９６）によって記述されたものなどの方法を用いてルーチン的に同定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のＰＥＳＴアミノ酸配列を同定することもできる。ＰＥＳＴアミノ酸配列が期待される他の原核生物には、他のリステリア種を含むが、これに限定されない。例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓタンパク質ＡｃｔＡは４つのかかる配列を含有する。これらは、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：７）、およびＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：８）である。また、ストレプトコッカス株由来のストレプトリジンＯもＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯはアミノ酸３５〜５１にＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：９）を含み、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯはアミノ酸３８〜５４にＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：１０）を含む。さらに、ＰＥＳＴ配列を抗原性タンパク質の中に埋め込むことができると考えられる。したがって、本発明においては、ＰＥＳＴ配列融合に関する場合、「融合」とは、抗原性タンパク質が抗原の一端にリンクするかまたは抗原の中に埋め込まれるかのいずれかで抗原とＰＥＳＴアミノ酸配列との両方を含むことを意味する。
【０１４０】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、異種抗原またはその断片に融合されたＰＥＳＴアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドコードする核酸配列を用いて、エピソーム性ベクターまたはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、プラスミドは組み換え型リステリアワクチン株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性断片である。
【０１４１】
別の実施形態では、「安定して維持される」とは、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失を伴わずに、核酸分子またはプラスミドを１０世代の間、維持することを指す。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。
【０１４２】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、リステリアゲノムにオープンリーディングフレームとして内因性ＡｃｔＡ配列とともに動作可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、ＡｃｔＡまたは短縮ＡｃｔＡに融合された抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の発現ベクターを含む。一実施形態では、抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列制御下にあり、これはＡｃｔＡ（短縮ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜２３３アミノ酸への融合として発現される。別の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５５，２３８号に記述されるように、短縮ＡｃｔＡは野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態では、米国特許公開番号第２０１４／０１８６３８７号に記述されるように、短縮ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり、この中ではＰＥＳＴモチーフが欠失しており、非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含有する。
【０１４３】
別の実施形態では、「機能的断片」は免疫原性断片であり、単独でまたは本明細書に提供されるワクチン組成物内で被験者に投与されるとき、免疫応答を引き出す。別の実施形態では、当業者は理解するであろうように、また本明細書にさらに提供されるように、機能的断片は生物活性を有する。
【０１４４】
別の実施形態では、被験者に投与される免疫原性組成物中に存在する免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤）の用量は、２週間ごとに５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間ごとに５〜１０ｍｇ／ｋｇ、または３週間ごとに１〜２ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量範囲は毎週１〜１０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量範囲は２週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量範囲は３週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量範囲は４週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１４５】
別の実施形態では、本明細書に提供される免疫原性組成物によって含まれる組み換え型リステリア株の用量は、１×１０７〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量で被験者に投与される。別の実施形態では、用量は１×１０８〜３．３１×１０１０ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１００〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜７０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜２０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜７×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜５×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜５×１０９ＣＦＵである。
【０１４６】
別の実施形態では、用量は１×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は１×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は１×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は６×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は７×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は８×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１０×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３．３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０１０生命体である。
【０１４７】
「ブーストする」という用語が、追加ワクチン、または免疫原性組成物、または組み換え型リステリア株の用量、または免疫チェックポイント阻害剤を単独もしくは組み合せで被験者に投与することを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。本発明の方法の別の実施形態では、２回のブースト（すなわち、合計３回の接種）が投与される。別の実施形態では、３回のブーストが投与される。別の実施形態では、４回のブーストが投与される。別の実施形態では、５回のブーストが投与される。別の実施形態では、６回のブーストが投与される。別の実施形態では、７回以上のブーストが投与される。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に提供される組み換え型リステリア株または免疫チェックポイント阻害剤を用いてヒト被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型リステリア株は初期の「プライミング」接種で使用される株と同一である。別の実施形態では、ブースター株はプライミング株とは異なる。別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型免疫チェックポイント阻害剤は、初期の「プライミング」接種で使用される阻害剤と同一である。別の実施形態では、ブースター阻害剤は、プライミング阻害剤とは異なる。別の実施形態では、プライミング接種とブースティング接種とでは同一の用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより大きい用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより小さい用量が使用される。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースターワクチン接種を実施する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースターワクチン接種は単一のプライミングワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後に単一のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、２回のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、３回のブースターワクチン接種を実施する。一実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンとの間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンとの間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブーストワクチンをプライムワクチンの８〜１０週間後に投与する。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に提供されるＰＤ−１シグナル経路阻害剤および組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を用いて被験者をブーストすることをさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法は本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物のブースター用量を投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に提供されるＴ細胞刺激薬および組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を用いて被験者をブーストすることをさらに含む。別の実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の代替形態である。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースター免疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースター用量は前記免疫原性組成物の単一のプライミング用量の後に続く。別の実施形態では、プライミング用量の後に単一のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に２回のブースター用量を投与する。別の実施形態では、プライミング用量の後に３回のブースター用量を投与する。一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、この用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム用量とブースト用量との間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト用量を免疫原性組成物のプライム用量の８〜１０週間後に投与する。
【０１５０】
異種「プライムブースト」戦略は免疫応答および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１２２６−３１（２００２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−７（２００１）。プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対する免疫応答を最大化するように思われる。ＤＮＡワクチンプライミングの後にアジュバント中のタンパク質用いたブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達が続くのが抗原特異的な抗体およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるようである。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：９５−１０２（２０００）；Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡをプライムでワクチン接種し、ＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）を用いたブーストを後に続けた場合、ＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％  ＰＯＥ）を、ＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えることがＴ細胞応答を強化することを示唆している。ＤＮＡ／ポロクサマーのプライムの後にＡｄ５−ｇａｇブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロクサマーを用いない）プライムの後に続くＡｄ５−ｇａｇブーストで、またはＡｄ５−ｇａｇのみで誘発される応答より大きい。Ｓｈｉｖｅｒ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、Ｂ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られる。さらに、米国特許第６，５００，４３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が０〜１０日間または３〜７日間であるのが好ましい。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（すべての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属からの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が��げられるがこれに限定されない）のものが挙げられる。すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
本発明の方法および組成物の「融合ポリペプチド」という用語は、ある特定の実施形態では、「組み換え型ポリペプチド」という用語と互換的に使用される場合があることが当業者によって理解されるであろう。別の実施形態では、本発明の方法の融合ポリペプチドは組み換え型リステリア株によって発現される。別の実施形態では、発現は組み換え型リステリア株によって担持されるヌクレオチド分子によって媒介される。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組み換え型リステリア株は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、当該技術分野で既知の任意の他のリステリア種の組み換え型株である。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリア株は動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜株の普及を減少する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、継代は本明細書に記述されるように実施される。別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって継代を実施する。
【０１５４】
一実施形態では、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤、本明細書に提供されるＴ細胞刺激薬、および本明細書に提供される組み換え型弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書に提供される免疫原性組成物の各々の構成成分を、本明細書に提供される免疫原性組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与する。
【０１５５】
別の実施形態では、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤および組み換え型弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、および組み換え型弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、一実施形態では、プログラム死１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤は、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する分子である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１はＣＤ２７４またはＢ７−Ｈ１としても知られている。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２もＣＤ２７３またはＢ７−ＤＣとして知られている。別の実施形態では、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。別の実施形態では、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。「相互作用する」という用語、またはその文法的に等価な用語は、別の分子と結合する、または別の分子と接触することを包含する場合がある。別の実施形態では、分子はＰＤ−１に結合する。別の実施形態では、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤は、抗ＰＤ１抗体である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはＰＤ−Ｌ１と結合する小分子である。別の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、またはＰＤ−Ｌ２と結合する小分子である。
【０１５６】
一実施形態では、ＰＤ−１と相互作用する分子は、短縮ＰＤ−Ｌ１タンパク質である。別の実施形態では、短縮ＰＤ−Ｌ１タンパク質はＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、ＰＤ−１と相互作用する分子は、短縮ＰＤ−Ｌ２タンパク質である。別の実施形態では、短縮ＰＤ−Ｌ２タンパク質はＰＤ−Ｌ２タンパク質の細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する分子は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、短縮ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−１模倣体、またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を結合する小分子である。別の実施形態では、短縮ＰＤ−Ｌ１タンパク質はＰＤ−１タンパク質の細胞質ドメインを含む。
【０１５７】
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＣＤ８０／８６シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＣＤ８０はＢ７．１としても知られている。別の実施形態では、ＣＤ８６はＢ７．２としても知られている。別の実施形態では、ＣＤ８０シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＤ８０と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＤ８０阻害剤は抗ＣＤ８０抗体である。別の実施形態では、ＣＤ８６シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＤ８６と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＤ８６阻害剤は抗ＣＤ８６抗体である。
【０１５８】
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４はＣＤ１５２としても知られている。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＴＬＡ−４と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤は抗ＣＴＬＡ−４抗体である。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、当該技術分野で既知の任意の他の抗原提示細胞：Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤である。
【０１５９】
既知の任意の免疫チェックポイントタンパク質は当該技術分野で既知の任意のチェックポイント阻害剤であってもよいことを当業者は理解するであろう。免疫チェックポイントタンパク質は、以下のものから選択されてもよいがこれに限定されない。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、または細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤タンパク質は、Ｂ７／ＣＤ２８受容体スーパーファミリーに属するものである。一実施形態では、Ｔ細胞刺激薬は抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞作動薬である。別の実施形態では、Ｔ細胞刺激薬は、ＣＤ１３４またはそのリガンドもしくはその断片、ＣＤ−１３７またはそのリガンドもしくはその断片、あるいは誘導性Ｔ細胞共刺激薬（ＩＣＯＳ）またはそのリガンドもしくはその断片である。
【０１６０】
別の実施形態では、本明細書に提供されるＴ細胞刺激薬、および組み換え型弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物が本明細書に提供される。一実施形態では、Ｔ細胞刺激薬は抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞作動薬である。別の実施形態では、Ｔ細胞刺激薬は、ＣＤ１３４またはそのリガンドもしくはその断片、ＣＤ−１３７またはそのリガンドもしくはその断片、あるいは誘導性Ｔ細胞共刺激薬（ＩＣＯＳ）またはそのリガンドもしくはその断片である。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明の組成物はアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法および組成物で使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントであるか、またはこれを含む。
【０１６２】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記組み換え型リステリア株の投与の前または後に免疫チェックポイントタンパク質阻害剤を同時投与する工程をさらに含む。
【０１６３】
一実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、プログラム死１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤は、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する分子である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１はＣＤ２７４またはＢ７−Ｈ１としても知られている。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２もＣＤ２７３またはＢ７−ＤＣとして知られている。別の実施形態では、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。別の実施形態では、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。「相互作用する」という用語、またはその文法的に等価な用語は、別の分子と結合する、または別の分子と接触することを包含する場合がある。別の実施形態では、分子はＰＤ−１に結合する。別の実施形態では、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤は、抗ＰＤ１抗体である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはＰＤ−Ｌ１と結合する小分子である。別の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、またはＰＤ−Ｌ２と結合する小分子である。
【０１６４】
一実施形態では、ＰＤ−１と相互作用する分子は、短縮ＰＤ−Ｌ１タンパク質である。別の実施形態では、短縮ＰＤ−Ｌ１タンパク質はＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、ＰＤ−１と相互作用する分子は、短縮ＰＤ−Ｌ２タンパク質である。別の実施形態では、短縮ＰＤ−Ｌ２タンパク質はＰＤ−Ｌ２タンパク質の細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、ＰＤ−１受容体とＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との相互作用を遮断する分子は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、短縮ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−１模倣体、またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を結合する小分子である。別の実施形態では、短縮ＰＤ−Ｌ１タンパク質はＰＤ−１タンパク質の細胞質ドメインを含む。
【０１６５】
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＣＤ８０／８６シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＣＤ８０はＢ７．１としても知られている。別の実施形態では、ＣＤ８６はＢ７．２としても知られている。別の実施形態では、ＣＤ８０シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＤ８０と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＤ８０阻害剤は抗ＣＤ８０抗体である。別の実施形態では、ＣＤ８６シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＤ８６と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＤ８６阻害剤は抗ＣＤ８６抗体である。
【０１６６】
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４はＣＤ１５２としても知られている。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＴＬＡ−４と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤は抗ＣＴＬＡ−４抗体である。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、当該技術分野で既知の任意の他の抗原提示細胞：Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤である。
【０１６７】
当該技術分野で既知の任意の免疫チェックポイントタンパク質を免疫チェックポイント阻害剤によって標的化することができることを当業者は理解するであろう。免疫チェックポイントタンパク質は、以下のものから選択されてもよいがこれに限定されない。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、または細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤タンパク質は、Ｂ７／ＣＤ２８受容体スーパーファミリーに属するものである。
【０１６８】
一実施形態では、Ｔ細胞刺激薬は抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞作動薬である。別の実施形態では、Ｔ細胞刺激薬は、ＣＤ１３４またはそのリガンドもしくはその断片、ＣＤ−１３７またはそのリガンドもしくはその断片、あるいは誘導性Ｔ細胞共刺激薬（ＩＣＯＳ）またはそのリガンドもしくはその断片である。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物を前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化するサイトカインと同時投与する工程をさらに含む。免疫応答を強化するように機能するサイトカインは周知であり、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／ＩＦＮ−β）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、および免疫応答を強化することが既知の任意の他のサイトカインを含むことを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、サイトカインは炎症性サイトカインである。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるサイトカインを含む。別の実施形態では、サイトカインの投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与の前であってもよい。別の実施形態では、サイトカインの投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与と同時であってもよい。別の実施形態では、サイトカインの投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与の後であってもよい。
【０１７０】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物をインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。ＩＤＯ経路阻害剤は、ＩＤＯ抗体または抗ＩＤＯ抗体と結合または相互作用する小分子を含む。本発明で使用するためのＩＤＯ経路阻害剤としては、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキサルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない当該技術分野で既知の任意のＩＤＯ経路阻害剤を含む。別の実施形態では、ＩＤＯ経路阻害剤の投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与の前であってもよい。別の実施形態では、ＩＤＯ経路阻害剤の投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与と同時であってもよい。別の実施形態では、任意のＩＤＯ経路阻害剤の投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与の後であってもよい。
【０１７１】
別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法は、化学療法または放射線療法レジメンと併せて、その前に、またはそれに続いても使用される。別の実施形態では、ＩＤＯ阻害は化学療法剤の効率を強化する。
【０１７２】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物を、前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化する腫瘍キナーゼ阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。腫瘍キナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、特異的な細胞シグナル伝達経路と干渉するように機能し、したがって選択された悪性腫瘍に対する標的特異的な療法を可能にする。ＴＫＩは周知であり、またＴＫＩが以下の表１に示すものおよび抗腫瘍免疫応答を強化することが知られている任意の他のＴＫＩを含むことを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、ＴＫＩの投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与の前であってもよい。別の実施形態では、ＴＫＩの投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与と同時であってもよい。別の実施形態では、ＴＫＩの投与は本明細書に提供される免疫原性組成物の投与の後であってもよい。
【表１】
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【０１７３】
一実施形態では、上記の化合物または本明細書に提供されるもののいずれでも本発明で化学療法、放射線、または外科手術レジメンとの組合せで使用することができる。
【０１７４】
「免疫原性組成物」が本明細書に提供される組み換え型リステリア、およびアジュバント、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤、Ｔ細胞刺激薬、ＴＫＩ、もしくはサイトカイン、またはこれらの任意の組み合せを含んでもよいことがよく理解されるであろう。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるアジュバントを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供される免疫チェックポイント阻害剤およびＴ細胞刺激薬を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるＴ細胞刺激薬を含む。本明細書にさらに提供されるように、かかる組成物が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比を増加する、または抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
【０１７５】
本明細書に提供される免疫原性組成物の投与に続いて、本明細書に提供される方法は末梢リンパ器官内でのＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在の強化をもたらす。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は末梢リンパ器官におけるＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、Ｔエフェクター細胞の末梢における存在の強化をもたらす。Ｔエフェクター細胞のかかる増殖は、本明細書で実証するように、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、末梢内および腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加をもたらす（実施例参照）。末梢リンパ器官としては、脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイド等が挙げられるが、これに限定されないことを当業者は理解するであろう。一実施形態では、Ｔｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加が末梢で生じる。別の実施形態では、末梢、リンパ器官、および腫瘍部位で、これらの部位でのＴｒｅｇの数に影響を与えずに、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞に対する比の増加が生じる。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞の比の増加はＴｒｅｇの頻度を減少するが、この部位におけるＴｒｅｇの総数は減少しない。別の実施形態では、抗腫瘍Ｔ細胞応答の強化を引き出す本発明の方法は、脾臓および腫瘍微小環境内の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度の減少を含む免疫応答を含む。別の実施形態では、抗腫瘍Ｔ細胞応答の強化を引き出す本発明の方法は、脾臓および腫瘍微小環境内の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の頻度の減少を含む免疫応答を含む。
【０１７６】
一実施形態では、短縮ＬＬＯおよび異種抗原の融合タンパク質を発現する弱毒化組み換え型リステリア株を、同一の抗原を発現する組み換え型リステリアと組み合わせることは、完全な腫瘍退縮をもたらす。
【０１７７】
別の実施形態では、本発明の組み換え型核酸は、リステリア株内のコードしたペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節性配列に動作可能にリンクしている。遺伝子の構造性の発現を駆動するために有用なプロモーター／調節性配列が当該技術分野で周知であり、これらとしては、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明のペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘発性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘発性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド、およびこれに類するものなどの誘発剤に応答して誘発されたプロモーターが利用される。こうして、本発明は、既知または未知のいずれかで、かつこれらに動作可能にリンクする所望のタンパク質の発現を駆動する能力を有する、任意のプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解されるであろう。「異種」という用語が、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することが当業者によって理解されるであろう。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態では、天然ではないかもしくはリステリア株に対して内因性のリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されないポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態では、リステリア株以外の起源からのポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では、異種という用語は同一の種の中の異なる生命体に由来するものを記述するために使用される場合がある。別の実施形態では、異種抗原はリステリアの組み換え型株によって発現され、組み換え型株により哺乳類細胞が感染すると加工されて細胞毒性Ｔ細胞に提示される。別の実施形態では、リステリア種によって発現される異種抗原は、結果として哺乳類で自然に発現される未修飾抗原またはタンパク質を識別するＴ細胞応答をもたらす限り、腫瘍細胞または感染因子内の対応する未修飾抗原またはタンパク質に厳密に適合する必要はない。「異種抗原」という用語は、本明細書では「抗原性ポリペプチド」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」、およびこれに類するものを指す場合がある。
【０１７８】
「エピソーム性の発現ベクター」という用語は、直線状または円形状であってもよく、また通常二本鎖の形態であり、細菌のゲノムまたは細胞のゲノムに組み込まれるのではなく、宿主細菌または細胞の細胞質内に存在するという点で染色体外である核酸ベクターを包含することを当業者は理解するであろう。一実施形態では、エピソーム性の発現ベクターは対象の遺伝子を含む。別の実施形態では、エピソーム性ベクターは細菌細胞質の中の複数のコピー内で持続し、結果として対象の遺伝子の増幅をもたらし、また別の実施形態では、必要なときにウイルス性トランス作用因子が供給される。別の実施形態では、本明細書ではエピソーム性の発現ベクターはプラスミドと称される場合がある。別の実施形態では、「組み込みプラスミド」はその挿入または宿主ゲノムの中に担持される対象の遺伝子の挿入を標的化する配列を含む。別の実施形態では、挿入された対象の遺伝子は中断されない、または細胞ＤＮＡへの組み込みからしばしば生じる調節性の制約を受けない。別の実施形態では、挿入された異種遺伝子の存在は細胞自身の重要な領域の再配列または中断につながらない。別の実施形態では、安定したトランスフェクション手順で、エピソーム性ベクターの使用は、染色体組み込みプラスミドの使用より高いトランスフェクション効率をしばしばもたらす（Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４８６１−４８６６；Ｍａｚｄａ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４，１４３−１５１）。一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物のエピソーム性の発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために用いらる様々な方法のいずれかによってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される場合がある。ベクターも単独で、または被験者の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態で送達される場合がある。
【０１７９】
一実施形態では、「融合された」という用語は共有結合による動作可能な結合を指す。一実施形態では、この用語は（核酸配列またはそのオープンリーディングフレームの）組み換え型融合を含む。別の実施形態では、この用語は化学的結合を含む。
【０１８０】
一実施形態では「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り入れるために細菌細胞を改変することを指す。別の実施形態では、「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することを指す。各々の可能性は本明細書に提供される方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１８１】
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合の方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記述されている。各々の方法は本明細書に提供される方法および組成物の別個の実施形態を代表する。
【０１８２】
一実施形態では、「弱毒化」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌が動物に疾患を生じさせる能力の減退を意味する。つまり、弱毒化されたリステリア株の病原性特徴は野生型リステリアと比較すると低下しているが、弱毒化されたリステリアは培養物中で成長および維持する能力を有する。実施例として弱毒化されたリステリアを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を使用すると、接種した動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ５０）は、野生型リステリアのＬＤ５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがってリステリアの弱毒化された株は、投与された動物を殺さないものであるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺すものである。弱毒化された細菌は、その成長のために必要な栄養素がその中に存在しないために一般的な環境内では複製する能力を有しないものを意味するとも解釈されるべきである。したがって、細菌は必要な栄養素がその中で提供される制御された環境に複製が限定される。したがって、本発明の弱毒化された株は制御されていない複製の能力がないという点で、環境的に安全である。
【０１８３】
別の実施形態では、非経口的に、ガン近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内になどの当業者に既知の任意の方法によって、本発明のワクチンおよび組成物を含有する医薬組成物を被験者に投与する。
【０１８４】
本明細書に提供される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセルを含む。
【０１８５】
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０１８６】
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物のワクチンは、哺乳類であることが好ましく、またヒトであることがより好ましい、宿主脊椎動物に、単独または医薬的に許容される担体との組み合せのいずれかで、投与されてもよい。別の実施形態では、ワクチンは、リステリア株それ自体に、またはリステリア種が発現するように修飾された異種抗原に免疫応答を誘発するのに効果的な量で投与される。別の実施形態では、投与されるべきワクチンまたは免疫原性組成物の量は、本開示を所持している時、当業者によってルーチン的に決定されてもよい。別の実施形態では、医薬的に許容される担体としては、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、または重炭酸塩緩衝液が挙げられるがこれに限定されない。別の実施形態では、選択された医薬的に許容される担体および使用するべき担体の量は、投与のモード、リステリアの株、ならびにワクチン接種を受ける人の年齢および疾患の状態を含むいくつかの因子に依存することになる。別の実施形態では、ワクチンの投与は経口経路によってもよく、またはこれは、非経口的、鼻腔内、筋肉内、血管内、直腸内、腹腔内、または様々な周知の投与の経路のうちの任意の１つであってもよい。別の実施形態では、投与の経路は治療される感染性病原体または腫瘍のタイプに従って選択されてもよい。
【０１８７】
別の実施形態では、本発明は、被験者内の少なくとも１つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法を提供し、方法には本明細書に提供される免疫原性組成物を投与することを含む。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に提供される方法を都合よく実践するためのキットを提供し、これは、本明細書に提供される１つ以上のリステリア株、アプリケーター、および本明細書に提供される方法を実践するためにキット構成要素を使用する方法を記述する取扱説明資料を含む。
【０１８９】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。
【０１９０】
「被験者」という用語は、一実施形態では、症状もしくはその後遺症の療法を必要とする、または症状もしくはその後遺症を受けやすい、ヒトを含む哺乳類を指す。被験者は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウス、ならびにヒトを含んでもよい。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０１９１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【実施例】
【０１９２】
実施例
材料および方法（実施例１〜７）
マウス
メスの生後６〜８週（記載のない限り）のＣ５７ＢＬ／６マウスをＦｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＦＮＬＣＲ）から購入した。マウスを米国国立ガン研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）の動物施設で飼育した。実験用マウスの使用のためのプロトコルは、米国国立衛生研究所の実験動物委員会で承認された。
【０１９３】
細胞株
低いレベルのＥ６およびＥ７を発現するＴＣ−１細胞は、原発性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺上皮細胞から、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７ならびにｒａｓガン遺伝子活性化を用いた形質転換によって派生させた。細胞をＲＰＭＩ  １６４０内で、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μＭの非必須アミノ酸、および０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を補充して、３７℃にて５％ＣＯ２を用いて成長させた。
【０１９４】
Ｌ．モノサイトゲネス株
Ａｄｖａｘｉｓ  Ｉｎｃ（米国ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）で、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７、ならびにその対照ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯおよびＬｍｄｄＡが生成された。ｄａｌ  ｄａｔ  ΔａｃｔＡ株（ＬｍｄｄＡ）は、ｄａｌ  ｄａｔ株から構築されたが、これはＬｍ野生型株１０４０３Ｓに基づいてストレプトマイシン耐性遺伝子を染色体に組み込んだものである。ｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡを突然変異させることによって、ＬｍｄｄＡは高度に弱毒化される。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７株は、ｐｒｆＡ、並びにプラスミド中のクロラムフェニコール耐性遺伝子の欠失後、ｐＴＶ３プラスミドを用いたＬｍｄｄＡの形質転換によって構築された。上述のように、ＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質の発現および分泌がＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７株の培養上清でウエスタンブロットによって確認された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ対照株の構築は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７株のものと類似であるが、ｐＴＶ３プラスミドでｐｒｆＡとＥ７との両方が欠失された。Ｌｍ野生型株である１０４０３Ｓと、Δｈｌｙ、Δｈｌｙ：：ｐｆｏ、およびｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）を含むいくつかの突然変異株は、好意によりＤ．Ｐｏｒｔｎｏｙ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（米国カリフォルニア州Ｂｅｒｋｅｌｅｙ））によって提供された。株ｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃは、野生型Ｌｍの非溶血性突然変異体であり、この中でＴｎ９１７−ｌａｃ融合遺伝子はｈｌｙ遺伝子（ＬＬＯをコードする遺伝子）の中へと挿入され、ＬＬＯ溶血活性を妨害する。ＬＬＯ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）を発現するプラスミドを用いてこの突然変異体がトランスフェクトされたとき、それはＬＬＯを有するので溶血活性を再度獲得する。全長のＥ７遺伝子がＬｍ染色体に組み込まれているＬｍ−Ｅ７株は、好意によりＹ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）によって提供された。細菌をブレインハートインフュージョン培地にストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を加えたものの中で、Ｄ−アラニン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で培養した。
【０１９５】
試薬
蛍光共役抗マウス抗体ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＧＫ１．５）およびＣＤ８−Ｂｒｉｌｌｉｅｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（５３−６．７）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から得た。ＦｏｘＰ３−ＦＩＴＣ（ＦＪＫ−１６ｓ）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から得た。Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）、配列番号：１１を負荷したＨ−２Ｄｂ四量体は、好意により米国国立アレルギー感染病研究所四量体コア施設（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）および米国国立衛生研究所ＡＩＤＳ試薬の研究および寄託プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）によって提供された。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数ビーズはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）から得た。
【０１９６】
腫瘍接種およびマウスのワクチン接種ワクチン接種
０日目にＴＣ−１細胞（１０５細胞／マウス）をマウスの右の脇腹に皮下移植した。１０日目に、腫瘍が直径５〜６ｍｍになったとき、マウスにＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンまたは適正な対照を０．１  ＬＤ５０の用量で腹腔内注射した。１７日目にワクチン接種をブーストした。腫瘍を週に２回電子キャリパーを使用して測定し、腫瘍サイズを次の式によって計算した：長さ×幅×幅／２。腫瘍の直径が２．０ｃｍに達したとき、マウスを安楽死させた。
【０１９７】
フローサイトメトリー
マウスの脾臓細胞または腫瘍から採取した細胞をＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ８−Ｂｒｉｌｌｉｅｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１、およびＨ−２ＤｂＥ７四量体−ＡＰＣで３０分間染色した。細胞を固定し、透過処理して、ＦｏｘＰ３−ＦＩＴＣで一晩染色した。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。リンパ球ゲートを、ＴｒｅｇがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋と識別されたところにセットした。絶対細胞数を計数するためにＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）絶対計数ビーズを添加した。
【０１９８】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの養子移植
Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ））によってマウスの脾臓からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が分離された。腫瘍細胞接種後９日目に、ＴＣ−１腫瘍を持つマウスの中へと細胞を静脈内注射した。Ｔｒｅｇ導入の１日後、マウスにＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７（０．１  ＬＤ５０）を用いて、１週間の間隔で２回腹腔内免疫付与した。腫瘍の成長を監視した。
【０１９９】
統計
非パラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用してデータを解析した。Ｐ＜０．０５で有意性を判定した。
【０２００】
実施例１：ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｔｒｅｇ頻度の減少に付随して起こる定着したＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。
Ｌｍべースのワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、融合タンパク質ＬＬＯ−Ｅ７ならびにＰｒｆＡがリステリアＸＦＬ−７のｐｒｆＡ陰性株中でエピソーム発現されとき、定着したＴＣ−１腫瘍の完全な退縮を誘発したことが以前報告された。ここで、融合タンパク質ＬＬＯ−Ｅ７をｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡ変異型Ｌｍ株中でプラスミドによって生成する、別の高度に弱毒化されたＬｍベースのワクチン、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の抗腫瘍活性を調査した。クロラムフェニコール耐性遺伝子およびＰｒｆＡがプラスミドから除去されているので、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と比較してより弱毒化されている。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同様に、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７も定着したＴＣ−１腫瘍の成長を著しく阻害することが観察された（図１Ａ、図１Ｂ、および図２）。ＴＣ−１腫瘍を持つマウスのおよそ４０％では、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７を２回用いたワクチン接種後に腫瘍は完全に退縮した（図１Ｂおよび図２）。再発し、３か月で死んだ１匹のマウスを除いて、腫瘍退縮を示した他のマウス（全動物の３３％）は再発なしで少なくとも６か月生存した（図１Ｃ）。Ｌｍ−Ｅ７はＴＣ−１腫瘍の成長を遅らせたが、完全な腫瘍退縮を誘発することはできなかった（図１Ａおよび図１Ｂ、ならびに図２）。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ（Ｅ７無し）は、ＴＣ−１腫瘍の成長を著しく阻害することができず（図１Ａおよび図１Ｂ、ならびに図２）、先天的な免疫応答はＴＣ−１腫瘍細胞を撲滅するのに十分ではないことを示唆した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７は脾臓内に類似のＨ−２ＤｂＥ７四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し（図３Ａの上のパネル、図３Ｂ、および図３Ｄ）、これは以前の所見と一致する。次いで、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを解析した。予想外に、ＰＢＳ対照と比較して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯがすべて脾臓内でＴｒｅｇ頻度を著しく減少させ、この減少は腫瘍内でより劇的であったが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯがＬｍ−Ｅ７よりも頻度を減少することが観察された（図１Ｄ〜図１Ｈ）。
【０２０１】
実施例２：Ｌｍは、Ｔｒｅｇ頻度の減少を誘発するのに十分である
最初、Ｔｒｅｇ頻度の減少が短縮ＬＬＯによって媒介されることが疑われた。しかし短縮ＬＬＯの発現無しでも、Ｌｍ−Ｅ７はＴｒｅｇ頻度を減少することができた（図１Ｄ〜図１Ｈ）。この観察は、ＬｍがＴｒｅｇ頻度を減少することができる場合があることを示唆する。実際、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７に対するベクター対照であるＬｍｄｄＡと、野生型Ｌｍ株でかつＬｍ−Ｅ７に対するベクター対照である１０４０３Ｓの両方は、Ｔｒｅｇ頻度を脾臓内で著しく減少し、腫瘍内ではより著しく減少する（図４）。
【０２０２】
実施例３：ＬｍはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を選択的に誘発することによってＴｒｅｇ頻度を減少する
相対的Ｔｒｅｇ頻度（総Ｔ細胞の比率）はＴｒｅｇの数だけではなく、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数によっても決定される。どのようにしてＬｍがＴｒｅｇ頻度を減少するのかを調査するために、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ、ＬｍｄｄＡ、Ｌｍ−Ｅ７、またはＬｍ（１０４０３Ｓ）で処置されたＴＣ−１腫瘍を持つマウス内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量した。驚くべきことに、図５に示すように、ＬｍｄｄＡは腫瘍内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の数を目立って変化させないことが見出された。これは実際にはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増加し、ひいてはＴｒｅｇ頻度を相対的に減少させている。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７内での短縮ＬＬＯのエピソーム性の発現は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増加し、ひいてはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度をさらに減少させる。野生型Ｌｍ  １０４０３ＳおよびＬｍ−Ｅ７は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の数を著しく変化しない一方で、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加も誘発する。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、腫瘍内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を著しく増加させる。これらの結果は、ＬｍがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を選択的に誘発して、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を減少させることを実証する。
【０２０３】
実施例４：Ｌｍに誘発されたＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖はＬＬＯに依存し、それによって媒介される
ｈｌｙ遺伝子によってコードされたＬＬＯは、孔形成細胞溶解素であり、Ｌｍはこれによって宿主細胞ファゴソームの液胞から細胞質の中へと脱出することができる。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、およびすべてのこれらの対照はＬＬＯを生成するので、その中でｈｌｙ遺伝子がシャトルベクターの使用に続く相同的組み換えで欠失される、１０４０３Ｓに由来するＬＬＯ欠損Ｌｍ突然変異体が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発する上でＬＬＯが役割を果たすかどうかを研究するために使用された。ΔｈｌｙＬｍは、単回投与後７日目にマウスの脾臓内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増加することができなかったことが見出され（図６Ａ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘発がＬＬＯに依存することを示した。これはＬＬＯの直接的な効果、またはファゴリソソームから逃れるための要件である可能性がある。この質問に対処するために、ＬＬＯをＰＦＯで置き換えたＬＭが研究された。クロストリジウム・パーフリンジェンスによって生成されたパーフリンゴリジンＯ（ＰＦＯ）は、アミノ酸についてはＬＬＯと４３％同一であり、液胞膜を溶解することもできる。ｈｌｙプロモーターの制御下でＰＦＯをコードするｐｆｏ遺伝子は、Δｈｌｙ株の染色体の中へと遺伝子組み換えされて、Δｈｌｙ：：ｐｆｏ株を形成した。Δｈｌｙ：：ｐｆｏは食作用から逃れて細胞質内に入ることができたが、マウスの脾臓内でＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増加することはできなかった（図６Ａ）。対照的に、ｈｌｙ：：Ｔｎ９１７−ｌａｃ（ｐＡＭ４０１−ｈｌｙ）、野生型Ｌｍの非溶血性Ｔｎ９１７−ｌａｃ突然変異体（その中でＴｎ９１７−ｌａｃ融合遺伝子がｈｌｙ遺伝子の中へと挿入され、ＬＬＯ溶血活性を妨害する）は、ＬＬＯ発現プラスミドｐＡＭ４０１−ｈｌｙで形質転換され、マウスの脾臓のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発した（図６Ａ）。これらの結果はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖がＬＬＯによって直接的に媒介されることを示唆する。ＬｍはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の増殖を有意に誘発しなかったので、Ｌｍで誘発されたＴｒｅｇはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加の結果得られた頻度を減少する（図６Ａ〜図６Ｄ）。
【０２０４】
実施例５：ＬｍｄｄＡ内の短縮ＬＬＯのエピソーム性の発現は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のより高いレベルへの増殖を誘発する
次に、ＬｍｄｄＡおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯを比較し、ここで後者は健康で腫瘍を持っていないマウス内のＴ細胞増殖の誘発で、プラスミドによってエピソーム的に短縮ＬＬＯを生成する。単回投与の７日目にＬｍｄｄＡがマウスの脾臓内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数をわずかに増加することができることが見出されたが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯはより高いレベルへのかかる増加をさらに誘発した（図７Ａ）。対照的に、ＬｍｄｄＡまたはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ感染の後、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の数は著しくは変化しなかった（図１７Ａ）。これらは、ＰＢＳ対照と比較して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ投与後にＴｒｅｇの比例した著しい減少をもたらした（図７Ｂ〜図７Ｄ）。これらの細胞内での細胞増殖マーカーＫｉ−６７の存在を調べた。ＬｍｄｄＡは、Ｋｉ−６７＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＫｉ−６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度および絶対数を増加したが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯは数をより大幅に増加した（図７Ｅ〜図７Ｇ）。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＫｉ−６７発現のレベルもこれに応じて増加した（図７Ｈ）。対照的に、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞内でのＫｉ−６７＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞およびＫｉ−６７発現の頻度および絶対数は、顕著には変化せず、ＬｍｄｄＡおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯがこれらの増殖を誘発しなかったことを示している。
【０２０５】
実施例６：Ｌｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合わせは定着したＴＣ−１腫瘍の退縮を誘発する。
Ｌｍ−Ｅ７ワクチン単独ではＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をあまり誘発しなかった（図５）。これはＴＣ−１腫瘍退縮を誘発できなかったことを説明する可能性がある。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発したので（図５および図７Ａ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯの存在下でＬｍ−Ｅ７の抗腫瘍効果が改善する場合があると考えられる。実際、Ｌｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合せは定着したＴＣ−１腫瘍のほぼ完全な退縮を誘発した（図８Ａ〜図８Ｃ）。対照的に、ＬｍｄｄＡの追加はＬｍ−Ｅ７に誘発された抗腫瘍活性を増強する事ができず（データ非表示）、Ｌｍ−Ｅ７ワクチンの抗腫瘍有効性を改善するうえでの短縮非溶血性ＬＬＯの重要性を示す。予想されるように、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、Ｌｍ−Ｅ７またはＰＢＳで処置したものと比較して組み合せ群のマウスの脾臓内で著しく増加する（図８Ｄ）。この場合もＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋の数は比較的変化しないので、組み合わせたｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとによるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数のより高いレベルまでの増加は、結果としてＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の比率のより大きな減少をもたらす（図８Ｅ〜図８Ｇ）。
【０２０６】
さらにＬｍｄｄＡは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとＬｍ−Ｅ７との同時投与の間に非溶血性短縮ＬＬＯが果たす役割を決定するために、対照としてＬｍ−Ｅ７とも同時投与された。ＬｍｄｄＡ株の追加はＬｍ−Ｅ７誘発性抗腫瘍活性を増強できなかったことが観察され、ＬｍｄｄＡによって生成された内因性ＬＬＯはＬｍ−Ｅ７誘発性抗腫瘍活性を補助することができないことを示した（図１０）。
【０２０７】
実施例７：Ｔｒｅｇの養子移植はＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の定着したＴＣ−１腫瘍に対する抗腫瘍有効性を損なう。
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７はＴｒｅｇの数を著しくは変化しなかったが、Ｔｒｅｇ頻度を減少した（図１Ｄ〜図１Ｈ）。ＴｒｅｇのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比は、Ｔｒｅｇ抑制能力を決定するための広く受け入れられているパラメータである。Ｔｒｅｇの比率がＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の抗腫瘍有効性に何らかの影響を有するかどうかを判定するために、無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスからＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを分離し、これらをＴＣ−１腫瘍を持つマウスに静脈注射し、引き続いてＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン接種を行った。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７はＴｒｅｇの養子移植なしで、マウス内でのＴＣ−１腫瘍の成長を著しく阻害した（図９Ａおよび図９Ｂ）。しかしながら、Ｔｒｅｇを与えられたマウスでは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７は、ＴＣ−１腫瘍の成長を有意に阻害することができなかった（図９Ａおよび図９Ｂ）。Ｔｒｅｇを受容したマウスは、脾臓内でＴｒｅｇの数のわずかな増加を示したが、腫瘍内ではより大きい減少を示した。一方で、Ｔｒｅｇを受容したマウスは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いてワクチン接種した後、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７対照と比較してより少ないＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有し、Ｔｒｅｇの養子移植がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を阻害することを示した（図９Ｆおよび図９Ｇ）。これらを一緒にして、結果としてＴｒｅｇ受容マウス内のＴｒｅｇ頻度の増加をもたらした（図９Ｃ〜図９Ｅ）。
【０２０８】
腫瘍抗原に特異的なＣＴＬは腫瘍細胞を殺すうえで主要な役割を果たし、Ｌｍは細胞内細菌としてＭＨＣクラスＩ分子と関連付けられた抗原を送達してＣＴＬを活性化することができることが周知である。しかしながら、２つのＬｍベースのワクチンである、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７は類似のレベルのＨＰＶ  Ｅ７に特異的なＣＴＬを脾臓内で誘発するにもかかわらず、なぜ異なる抗腫瘍活性を呈し、前者はより強い抗腫瘍効果を誘発するのであろうか（図１Ａ〜図１Ｃ、図２、図３）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７誘発性腫瘍退縮を無効にするので、ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺すことに関与していることは疑いが無い。Ｅ７発現を欠いているＬｍｄｄＡ−ＬＬＯはＴＣ−１腫瘍の成長を有意に阻害することができなかったので、腫瘍細胞を殺すためにはある特定のレベルの腫瘍抗原特異的ＣＴＬが必要であることも明らかである（図１Ａ〜図１Ｃ、および図２）。Ｌｍ−Ｅ７がＴｒｅｇの増加を誘発して宿主免疫応答を抑制し、ひいてはその抗腫瘍免疫性を損なうということが提案されている。しかしながら、ＰＢＳ対照と比較してＴＣ−１腫瘍モデル内で実際にＬｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の両方がＴｒｅｇ頻度を減少することが見出された（図１Ｄ〜図１Ｈ）。さらにＬｍ−Ｅ７もＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７も、ワクチン接種後にＴＣ−１腫瘍内のＴｒｅｇの総数を有意に増加しないことが見出された（図５）。
【０２０９】
事実、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７とＬｍ−Ｅ７との間の主な違いは、前者はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の際立った増加を誘発することができ、一方で後者は増加をずっと少ない程度まで誘発したことであることが見出された（図５）。これは、なぜＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７がＴｒｅｇパーセンテージをＬｍ−Ｅ７より大きい程度まで減少するかを説明する（図１Ｄ〜図１Ｈ）。Ｌｍベクターが、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加するのに十分であることが観察された。しかしながら、短縮ＬＬＯのエピソーム性の発現によって、ＬｍはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数をより高いレベルまで劇的に増加し、ひいてはＴｒｅｇの頻度をなおさらに減少する（図７）。したがって、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加を誘発するうえでＬＬＯは重要な役割を果たすと考えられる。実際、ＬＬＯはＬ．モノサイトゲネスがファゴソームから脱出するために必要なだけでなく、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を直接的に増殖させるが、その理由はＬｍが細胞質に入ることを可能にするＰＦＯを発現する、ＬＬＯ−マイナス（Δｈｌｙ）Ｌ．モノサイトゲネス株もΔｈｌｙ：：ｐｆｏ株のどちらもＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘発には成功しなかったが、ＬＬＯ発現プラスミドを使用した非溶血性ＬＬＯ突然変異Ｌｍ株の形質転換は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を復元したからである（図６）。ＬｍｄｄＡ内での非溶血性短縮ＬＬＯのエピソーム性の発現がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を大いに増強するので、ＬＬＯ誘発性のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、その溶血活性には無関係である（図７）。ＬＬＯによるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との両方の応答の増殖は抗原非特異的アジュバント効果であるように思われるが、ＬＬＯはこれらの２つの細胞タイプの免疫優勢エピトープも含有する場合がある。実際、初期の研究は、ＬＬＯが２つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（それぞれ残基１８９〜２０１および残基２１５〜２２６）と、１つのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（残基９１〜９９）とを持つことを特定した。
【０２１０】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７の優れた抗腫瘍効果は、これがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の著しい増加を誘発するという事実に起因する可能性がある。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の際立った増加を誘発することができないのは、腫瘍の撲滅におけるその非効率性が原因であり、これはＬｍ−Ｅ７単独と比較してＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を劇的に増加したＬｍ−Ｅ７とＬｍｄｄＡ−ＬＬＯとの組み合わせが、定着ＴＣ−１腫瘍のほぼ完全な退縮を誘発したことで示される（図８）。発明者らのデータは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７が誘発したＴｒｅｇ頻度の減少が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加の結果であることを示している。ＴｒｅｇのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞に対する比、またはＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を抑制するために重要である。実際、Ｔｒｅｇの腫瘍を持つマウスへの養子移植に続くＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７のワクチン接種によってインビボのＴｒｅｇ比を増加することは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害し、その結果としてワクチンの抗腫瘍有効性を損なった（図９）。
【０２１１】
選択的にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘発することに加えて、短縮非溶血性ＬＬＯは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの抗腫瘍有効性の改善にその他の貢献もする。Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の類似の増殖を誘発したが、これは腫瘍の場合にはあてはまらないことが観察された。短縮ＬＬＯ（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７）のエピソーム性の発現により、腫瘍内でより多くのＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘発される傾向があった（図３Ｅ）。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７が、ケモカイン受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３の発現をＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で上方調節することが見出だされたが、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞上では上方調節せず、Ｔｈ１およびＣＤ８＋Ｔ細胞の輸送のためにはＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３が極めて重要であることを示す。これらの結果は、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３の上方調節を通した、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ抗原特異的細胞の腫瘍微小環境への遊走を、ＬＬＯが誘発することを示唆する。さらに、抗原のＬｍからの効率的な分泌のために短縮ＬＬＯが必要であり、またＬｍベクターから分泌されていない抗原は結果としてあまり効果的でない抗腫瘍免疫性の誘発をもたらすことが知られている。したがって、Ｌｍ−Ｅ７ベクターの強力な抗腫瘍活性の欠如は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を効果的に増殖できないことに起因するだけでなく、感染している抗原提示細胞および非効果的な抗原特異的Ｔ細胞応答のプライミングの状況でのＬｍからの抗原の非効率性な分泌にも起因する可能性がある。
【０２１２】
総合的に、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンでの非溶血性短縮ＬＬＯのエピソーム性の発現が、ワクチンの抗腫瘍活性を強化するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を選択的に誘発することが実証された。結論としてこの結果は、効果的な抗腫瘍免疫応答を引き起こすためには、ある特定のレベルの抗原特異的ＣＴＬ、ある特定のレベルの非腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＴｒｅｇ比率の減少などの数多くの因子がすべて必要であり、そして本明細書に提供されるリステリア構築体を用いてこれを遂行することができることを示す。さらに、ＬＬＯはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を選択的に誘発し、ひいては全体的にＴｒｅｇ頻度を減少し好ましい免疫応答を支援して腫瘍細胞を死滅させるという点で、この特許はＬＬＯが有望なワクチンアジュバントであることを示している。
【０２１３】
材料および方法（実施例８〜１２）
動物、細胞株、ワクチン、および他の試薬
生後６〜８週間のメスのＣ５７ＢＬ６マウスをＮＣＩ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋから購入し、病原体の無い条件下に保った。マウスは米国国立ガン研究所の動物の飼育及び使用に関する委員会（ＮＣＩ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコルの下で飼育された。ヒトパピローマウイルス株１６（ＨＰＶ１６）初期タンパク質６および７（Ｅ６およびＥ７）ならびに活性化ｒａｓガン遺伝子の、初代Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺上皮細胞への共トランスフェクションによって派生させたＴＣ−１細胞をＡＴＣＣ（米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から取得し、細胞を、１０％のＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン（各々１００Ｕ／ｍＬ）、ならびにＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０内で、３７℃にて５％ＣＯ２を用いて成長させた。ヒトパピローマウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）Ｅ７（Ｌｍ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）を有するまたは有しないリステリアワクチンベクターがＡｄｖａｘｉｓ  Ｉｎｃ．によって提供された。Ｌｍ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の両方を、５×１０６ＣＦＵ／マウスの用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。抗ＰＤ−１モノクローナル抗体をＣｕｒｅＴｅｃｈ（イスラエル）から入手し、５０μｇ／マウスの用量で静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。フローサイトメトリーのために使用したすべての蛍光標識抗体および適切なアイソタイプ対照は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓ）またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から購入した。
【０２１４】
マウスおよびヒト樹状細胞の分離、精製、ならびにＰＤ−Ｌ１発現の解析
マウス樹状細胞（ＤＣ）は、上述したように骨髄から分離および精製された。ヒトＤＣを得るために、単球を健康成人血液ドナーから分離した（米国国立衛生研究所、血液銀行）。簡潔に述べると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して勾配遠心分離で分離し、洗浄後に組織培養プレートに３７℃にて２時間の間接着させた。非接着性細胞を洗浄によって除去し、接着性単球をプレート内で３７℃にて５％ＣＯ２で、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールから成る完全ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）の存在下で４日間培養し、未成熟ＤＣになった。３日目にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を新鮮な媒体とともに再度追加した。トリパンブルー色素排除プロトコルを使用して培養物中のＤＣの生存能力を評価した。トリパンブルーが陰性の細胞は生きていると見なされた。単球からＤＣを４〜５日間培養した後ＤＣを回収し、６ウェルプレートに移した（１×１０６細胞／ｍｌ）。異なる濃度（０、１０７、１０８、および１０９ＣＦＵ／ｍＬ）のＬｍ−ＬＬＯまたはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を１時間、ＤＣ培養物に追加した後、ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）を追加してリステリアを殺し、そして４８時間培養した。
【０２１５】
マウスおよびヒトの両方のＤＣを適切な蛍光標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＥ抗マウスＰＤ−Ｌ１およびＦＩＴＣ抗ヒトＰＤ−Ｌ１）を用いて染色した。アイソタイプが一致したｍＡｂを陰性対照として使用した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して染色した細胞を解析した。
【０２１６】
腫瘍移植および治療
上述したように腫瘍の成長および生存を解析することを目的とした治療的実験を実施した。簡潔に述べると、０日目に５０，０００個のＴＣ−１細胞／マウスをマウスの右の脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。８日目に（腫瘍サイズの直径が約３〜４ｍｍ）、適切な群からのマウス（群当たり５匹のマウス）に、抗ＰＤ−１Ａｂ静注ありまたはなしでＬｍ−ＬＬＯまたはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を腹腔内注射した。腫瘍移植後１５日目にマウスをワクチンおよび抗ＰＤ−１Ａｂでもう一回処置した。他の群のマウスは未処置のままとした。デジタルキャリパーを使用して３〜４日ごとに腫瘍を測定し、式Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２（式中、Ｖは体積、Ｌは長さ（長直径）、またＷは幅（短直径））を使用して腫瘍体積を計算した。これらの実験では、マウスが瀕死になったとき、腫瘍が潰瘍形成されたとき、または腫瘍体積が１．５ｃｍ３に達したとき、マウスは屠殺された。免疫学的実験では、マウスが第２回目の処置から６日後の２１日目に屠殺されたことを除いて、マウスの同一の群に類似の処置をした。脾臓および腫瘍を分離し、抗原特異的な免疫応答、ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、および骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）について解析された。
【０２１７】
製造業者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）によって示唆されているように、抗原特異的細胞免疫応答、Ｔｒｅｇ、末梢でのＭＤＳＣ、および腫瘍ＥＬＩＳＰＯＴの解析を使用して、処置マウスおよび対照マウス由来のＥ７再刺激（１０μｇ／ｍＬ）脾臓細胞培養物内のＩＦＮγ産生を検出した。スポットを解析するためにＣＴＬ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、米国オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）を使用した。無関連なペプチド（ｈｇｐ  １００２５−３３−ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号：１２）−Ｃｅｌｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国テネシー州Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ）再刺激脾臓細胞からのスポットの数を、Ｅ７再刺激培養物から差し引いた。製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、米国カリフォルニア州Ａｕｂｕｒｎ）によって示唆されているように、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離器および固形腫瘍均質化プロトコルを使用して腫瘍サンプルを加工した。腫瘍浸潤ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（Ｔｒｅｇ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋（ＭＤＳＣ）細胞の数は、上述したようにフローサイトメトリーアッセイを使用してＣＤ４５＋造血細胞集団の中で解析された。同一のフローサイトメトリーアッセイを使用して、腫瘍を持っている処置したマウスおよび対照マウスの脾臓のＴｒｅｇ細胞およびＭＤＳＣのレベルも評価された。
【０２１８】
統計的解析
すべての統計的パラメータ（平均値、ＤＣ上のＰＤ−Ｌ１発現に対するＳＤ、腫瘍体積、ＥＬＩＳＰＯＴ、ならびに末梢および腫瘍浸潤細胞解析）および（末梢および腫瘍浸潤細胞解析に対する）群間の統計的有意性はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して計算された。群間の統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を用いた一元配置分散分析（one-way  ANOVA）によって判定された（Ｐ＜０．０５が統計的有意であると考えられた）。
【０２１９】
結果
実施例８：Ｌｍ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたネズミのＤＣの感染は表面ＰＤ−Ｌ１発現を上方調節する。
Ｌｍによるマウスの脾臓細胞感染が結果として大多数の細胞にＰＤＬ１発現の著しい上方調節をもたらすこと、および
ＰＤ−Ｌ１発現のレベルはＣＤ１１ｃ＋ＤＣで最高であることが以前実証された。
【０２２０】
免疫応答のプライミングおよびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害の役割におけるＤＣの重要性を考慮して、ＤＣ上のＰＤ−Ｌ１発現に対するＬｍ−ＬＬＯおよびＬｍＬＬＯ−Ｅ７の効果を最初に解析することが決定された。混合した細胞集団の中の細胞同士の間の相互作用の、結果精度に対する影響を回避するために、精製したＣＤ１１ｃ＋ＤＣの表面上のＰＤ−Ｌ１発現に対するＬｍ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の異なる濃度の効果を試験した。図１１に示されるように、Ｌｍ−ＬＬＯおよびＬｍＬＬＯ−Ｅ７の両方は、１０８および１０９ＣＦＵ／ｍＬの用量で、用量依存してＰＤ−Ｌ１発現を著しく有意に上方調節する。
【０２２１】
重要なことに、試験されたいずれの用量においても、Ｌｍ−ＬＬＯ−とＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で誘発されたＤＣ上のＰＤ−Ｌ１上方調節との間に差異は検出されず（図１１）、この効果が抗原独立であることを示す。
【０２２２】
実施例９：抗ＰＤ−１はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの治療有効性を強化する
ＤＣ上のＰＤ−Ｌ１発現の上方調節に対するＬｍ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の効果を確認し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害効果を考慮した後、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断とリステリアベースのワクチンとの組み合せは免疫療法の抗腫瘍有効性を改善することができるという仮説が立てられた。この仮説を検定するために、Ｅ７発現肺上皮細胞に基づくＴＣ−１腫瘍モデルでの、腫瘍の成長およびマウスの生存に対する抗ＰＤ−１  ＡｂとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７との組み合せの効果が評価された。ワクチン単独の効果を最小化するために、低用量のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、遅延した治療スケジュール、および数多くの腫瘍細胞の移植が意図的に使用された。０日目に５０，０００個のＴＣ−１細胞をマウスに皮下移植し、腫瘍移植後８日目および１５日目にマウスに抗ＰＤ−１  Ａｂとともにもしくは無しでＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯを注射した（図１２Ａ）。他の群のマウスは未処置のままとした。
【０２２３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチン単独では腫瘍の成長のわずかな阻害をもたらしたが、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７／抗ＰＤ−１の組み合せは腫瘍の成長を著しく遅くし（図１２Ｂ）、結果として生存を延長し、処置したマウスのうちの２０％で完全な腫瘍退縮をもたらした（図１２Ｃ）。これらの実験は、抗ＰＤ−１  ＡｂとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンとの組み合せが実行可能な戦略であり、これらの実験で使用された厳しい条件においてさえも結果として腫瘍の成長阻害および生存の改善をもたらしたことを明らかにした。
【０２２４】
実施例１０：抗ＰＤ−１  ＡｂとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７との組み合せは抗原特異的な免疫応答およびＣＤ８  Ｔ細胞の腫瘍の中への浸潤を著しく強化する
免疫機構を定義し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７／抗ＰＤ−１  Ａｂの組み合せの免疫学的有効性を評価することが、処置した腫瘍を持つマウスからの脾臓および腫瘍浸潤ＣＤ８  Ｔ細胞内の抗原特異的ＩＦＮγ−産生細胞のレベルを決定するために次に評価された。マウスにＴＣ−１細胞を移植し、治療的実験で上述したように処置したが、２回目の処置の６日後にマウスを屠殺し脾臓および腫瘍を採取したことだけは異なっていた。標準的なＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＥ７特異的なＩＦＮγ−産生細胞の解析が実施された。予想されたように、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を単独で用いた処置は対照と比較して有意なレベルのＩＦＮγ産生Ｅ７特異的細胞を誘発した（Ｐ＜０．００１）。とりわけ、抗ＰＤ−１  Ａｂを用いたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７への追加は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７単独と比較したとき、結果として抗原特異的免疫応答のさらに有意な増加をもたらした。（Ｐ＜０．０１）（図１３Ａ）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７／抗ＰＤ−１  Ａｂを組み合わせることによってその治療的効果が発揮される機構をさらに決定するために、腫瘍浸潤ＣＤ８  Ｔ細胞に対する処置の影響を試験した。上述のように処置されたマウスで、腫瘍移植後２１日目に腫瘍浸潤CD8  Ｔ細胞を試験した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７／抗ＰＤ−１  Ａｂは、対照群と比較して腫瘍浸潤ＣＤ８  Ｔ細胞内で有意な増加を示した（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７単独に対してＰ＜０．０５、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７／抗ＰＤ−１  Ａｂに対してＰ＜０．００１）（図１３Ｂ）。末梢免疫応答と同じように、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７処置への抗ＰＤ−１  Ａｂの追加は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７単独と比較してＣＤ８＋  Ｔ細胞腫瘍浸潤の著しい増加をもたらした（Ｐ＜０．０５）（図１３Ｂ）。
【０２２５】
実施例１１：Ｌｍ−ＬＬＯ処置は、抗原または抗ＰＤ−１  Ａｂの存在に関わらず、脾臓ＭＤＳＣと腫瘍浸潤ＭＤＳＣとの両方、およびＴｒｅｇ細胞を著しく減少する
著明な免疫応答阻害活性を有する２つの細胞のサブセットはＭＤＳＣ細胞およびＴｒｅｇ細胞である。したがって、これらのサブセットは、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７／抗ＰＤ−１  Ａｂ組み合せ治療の影響を理解するために末梢および腫瘍微小環境内の両方で解析された。２回目のワクチン接種の６日後に採取した脾臓および腫瘍を、ＭＤＳＣ細胞およびＴｒｅｇ細胞のパーセント（脾臓）および実数（腫瘍）について評価した。腫瘍の無いマウスの脾臓内のＭＤＳＣのパーセントは約２．５％であるが、腫瘍の存在下ではこのパーセントは著しく増加する（約１５％）（図１４Ａ）。驚くべきことに、Ｅ７抗原または抗ＰＤ−１処置の存在に関わらず、Ｌｍ−ＬＬＯを用いた処置は、対照動物と比較して脾臓内のＭＤＳＣのレベルを著しく減少する。（＜０．０５）（図１４Ａ）。同様に、Ｌｍ−ＬＬＯ、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７／抗ＰＤ−１  Ａｂ処置を用いた処置後、腫瘍浸潤ＭＤＳＣの数も著しく減少した（図１４Ｂ）。重要なことに、脾臓（図１５Ａ）と腫瘍（図１５Ｂ）との両方のＴｒｅｇ細胞も、Ｌｍ−ＬＬＯを単独で用いて処置した群またはＥ７または抗ＰＤ−１  Ａｂとともに処置した群のいずれでもわずかではあるが有意に減少した。
【０２２６】
これらのデータは、Ｌｍ−ＬＬＯが、処置されたマウスの脾臓と腫瘍との両方でＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの減少の唯一の原因であり、抗原または抗ＰＤ−１抗体の追加はこれらの細胞のレベルに影響を与えないことを示唆している。
【０２２７】
実施例１２：Ｌｍ−ＬＬＯによるヒトＤＣの感染は表面ＰＤ−Ｌ１発現の上方調節にもつながる
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７／抗ＰＤ−１  Ａｂの組み合せが抗腫瘍効果を発揮する治療有効性および免疫機構を実証した後、Ｌｍ−ＬＬＯがヒトＤＣ上のＰＤ−Ｌ１発現のレベルにも影響するかどうか、および本結果を臨床現場に移行できるかどうかを理解するために試験した。方法の項で記述したように、単球由来ヒトＤＣを健康なボランティアのＰＢＭＣから分離した。ヒトＤＣを異なる濃度のＬｍ−ＬＬＯおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で感染させた。ネズミのＤＣと同様に、Ｌｍ−ＬＬＯとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７との両方の感染が表面ＰＤ−Ｌ１の有意な上方調節をもたらすことが見出された（図１６Ａおよび図１６Ｂ、データ非表示）。ネズミのＤＣに対するのと同様に、ヒトＤＣ上のＰＤ−Ｌ１上方調節は、用量依存性であった。この結果は、リステリアベースのワクチンと抗ＰＤ−１  Ａｂとの組み合せが、強力かつ臨床的に移行可能な免疫療法アプローチである可能性があることを示唆する。
【０２２８】
結論として、上記の結果は、Ｌｍ−ＬＬＯベースのワクチンと抗ＰＤ−１  Ａｂとの組み合せが、抗原特異的免疫応答および腫瘍浸潤ＣＤ８  Ｔ細胞の増加、サプレッサー細胞（Ｔｒｅｇ細胞およびＭＤＳＣ）の減少をもたらし、結果として、処置された動物での腫瘍成長の顕著な阻害および生存の延長／腫瘍の完全退縮をもたらすことを実証する。したがって、Ｌｍ−ＬＬＯベースのワクチンとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断との組み合せは、抗腫瘍免疫療法の有効性の全体的な強化をもたらしうる実行可能かつ移行可能なアプローチであることが示された。
【０２２９】
実施例１３：再発／転移性子宮頸ガンまたはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性の頭頸部ガンを有する患者でのＡＤＸＳ１１−００１またはＭＥＤＩ４７３６免疫療法の単独および組み合せでの第Ｉ相／第ＩＩ相試験
背景
【０２３０】
ガンの増殖および転移について重要である主要なＨＰＶ遺伝子を標的とするアプローチは、子宮頸部または頭頸部のガンと診断された個人の生存を改善しうる。
【０２３１】
ＡＤＸＳ１１−００１は、抗原を提示する能力を有する細胞の短縮ＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質としてＨＰＶ−Ｅ７腫瘍抗原を分泌するように生物工学によって作られた、弱毒化生リステリアモノサイトゲネス（Ｌｍ）−リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）免疫療法である。これは結果としてＨＰＶ特異的Ｔ細胞生成をもたらし、腫瘍微小環境内での腫瘍保護を減少する。ＭＥＤＩ４７３６、抗プログラム死−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）抗体は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１およびＣＤ８への結合を遮断し、ＰＤ−Ｌ１依存性免疫抑制効果の阻害を救援する。ＡＤＸＳ１１−０１１と抗ＰＤ−Ｌ１との組み合せが動物内で腫瘍の成長を有意に遅延し動物の生存を延長することを示した前臨床試験で、ＰＤ−Ｌ１結合の阻害は、ＡＤＸＳ１１−００１の見かけ上の免疫学的効力／活性を増加した。
【０２３２】
方法
これは、非盲検、多施設共同、２パート、無作為化第Ｉ相／第ＩＩ相試験である（ＮＣＴ０２２９１０５５）。再発／転移性設定において以前の１回以上のプラチナベースの療法で進行した、扁平上皮／非扁平上皮子宮頸ガン、または頭頸部のＨＰＶ関連扁平上皮細胞ガンを有する患者（１８歳以上）が適格である。第Ｉ相の主な目的は、ＡＤＸＳ１１−００１＋ＭＥＤＩ４７３６の安全性および忍容性を評価すること、およびこの組み合せに対する推奨第ＩＩ相用量（ＲＰ２Ｄ）を選択することである。第ＩＩ相の主な目的は、ＡＤＸＳ１１−００１およびＭＥＤＩ４７３６の単剤療法としておよび組み合せとしての、腫瘍応答、無進行生存（ＰＦＳ）、および安全性を評価することである。両方の相に対する探索的目的で、免疫学的応答のバイオマーカーと腫瘍応答およびＰＦＳとの間の関連を評価することになる。第Ｉ相では、最大１８人までの患者が、固定用量（１×１０９コロニー形成単位［ＣＦＵ］）のＡＤＸＳ１１−００１を投与され、一方でＭＥＤＩ４７３６の用量が標準的な３＋３デザインに従って増大される（３ｍｇ／ｋｇで開始する）。第ＩＩ相では、患者
【数１】
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が、ＡＤＸＳ１１−００１（１×１０９ＣＦＵ）またはＭＥＤＩ４７３６（１０ｍｇ／ｋｇ）またはこれらの両方のいずれかをＲＰ２Ｄで投与されるように無作為化され（１：１：２）、すべての治療群は疾患によって層別化された。両方の相で、４週間ごとにＡＤＸＳ１１−００１が投与され、２週間ごとにＭＥＤＩ４７３６が投与される。患者は最長１年間、または疾患の進行もしくは許容できない毒性のために中止するまで治療を受ける。有効性パラメータは固形ガン効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）および免疫関連ＲＥＣＩＳＴ基準によって評価され、安全性は有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）を使用して判断される。
【０２３３】
添付の図面を参照して本発明の実施形態を記述してきたが、本発明は詳細な実施形態に限定されず、添付の特許請求に定義される本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、当業者によってこれらに様々な変更および修正がなされうることが理解されるであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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