(57)【要約】  本開示は、標的植物での発現に特によく適している、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドに関わる。
2017504332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の細胞において目的の異種ポリペプチドを発現させる系であって、
前記植物以外の生物のゲノムからの前記目的のポリペプチドをコードする基準ポリヌクレオチドと、
前記目的のポリペプチドをコードする配列であって、前記植物のコドンの偏向に従って低頻度であるすべてのコドンを除去するようにコドン最適化された配列、
ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列
を含む配列を有する合成ポリヌクレオチドと
を含み、前記ポリアデニル化配列が、前記基準ポリヌクレオチドの場合と同じ数で同じ場所に存在し、
前記合成ポリヌクレオチドの配列が、前記基準ポリヌクレオチドの場合とは異なる数でまたは異なる場所に、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択されるいずれのポリアデニル化配列も含まない、系。
【請求項２】
前記合成ポリヌクレオチドが、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群のもの以外のいずれのポリアデニル化配列も含まない、請求項１に記載の系。
【請求項３】
前記目的のポリペプチドが、殺虫性タンパク質、除草剤耐性タンパク質、ストレス耐性関連タンパク質、および油プロファイル修飾タンパク質からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１に記載の系。
【請求項４】
前記目的のポリペプチドが、殺虫性タンパク質である、請求項３に記載の系。
【請求項５】
前記目的のポリペプチドが、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ１（ＡＡＤ１）タンパク質である、請求項３に記載の系。
【請求項６】
前記植物が、ダイズまたはトウモロコシ植物である、請求項１に記載の系。
【請求項７】
前記合成ポリヌクレオチドが、５’非翻訳配列および３’非翻訳領域を含み、前記５’非翻訳配列が、前記目的のポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された植物プロモーターを含み、３’非翻訳配列が、転写終結配列を含む、請求項１に記載の系。
【請求項８】
前記合成ポリヌクレオチドが、植物転写単位である、請求項１に記載の系。
【請求項９】
前記合成ポリヌクレオチドが、植物発現ベクターの中にある、請求項８に記載の系。
【請求項１０】
請求項１に記載の合成ポリヌクレオチドを含有する遺伝子導入植物。
【請求項１１】
請求項１６に記載の遺伝子導入植物からの植物材料であって、検出可能なレベルの前記目的の異種ポリペプチドを含む植物材料。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記植物がダイズまたはトウモロコシである、請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む植物細胞、植物組織、植物材料または植物。
【請求項１４】
目的のポリペプチドを植物細胞に導入する方法であって、
請求項１に記載の系を用意するステップと、
前記植物の細胞を前記合成ポリヌクレオチドで形質転換するステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって生産される植物細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の植物細胞から植物を再生させることを含む、植物において目的のポリペプチドを発現させる方法。
【請求項１７】
目的のポリペプチドを植物に導入する方法であって、
請求項１に記載の系を用意するステップと、
前記植物を前記合成ポリヌクレオチドで形質転換するステップと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記植物を形質転換するステップが、前記植物の細胞を形質転換すること、および前記形質転換された細胞から前記植物を再生させることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法によって生産される植物。
【請求項２０】
前記基準ポリヌクレオチドの場合と同じ数で同じ場所に前記ポリアデニル化配列を含まない合成ポリヌクレオチドで形質転換されている同じ種の植物より多い量の前記目的の異種ポリペプチドを含む、請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
前記目的のポリペプチドが、殺虫性タンパク質、除草剤耐性タンパク質、ストレス耐性関連タンパク質、および油プロファイル修飾タンパク質からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
有害生物を防除する方法であって、請求項２１に記載の方法によって生産された植物から子実を得るステップを含み、前記目的のポリペプチドが殺虫性タンパク質である、方法。
【請求項２３】
有害生物を防除する方法であって、請求項２１に記載の方法によって生産された植物から種子を得るステップを含み、前記目的のポリペプチドが殺虫性タンパク質である、方法。
【請求項２４】
前記種子を発芽させるステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
粗挽き粉、細粉、タンパク質濃縮物および油からなる群から選択される商品生産物である、請求項１９に記載の遺伝子導入植物に由来する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１４年１月１７日に出願された「植物におけるタンパク質発現増加（INCREASED PROTEIN EXPRESSION IN PLANTS）」についての米国特許仮出願第６１／９２８，８５２号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、植物細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改善するための方法および組成物に関する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域は、ネイティブ遺伝子における特定のポリアデニル化配列を同時に保存しつつ、宿主生物からのコドン使用頻度の偏向を反映するように修飾される。
【背景技術】
【０００３】
遺伝コードは、３ヌクレオチドの単位（「コドン」）からなる。可能性のあるコドンは６４あり、各々が２０のアミノ酸の１つまたは転写の終わり（すなわち「終止コドン」）を規定する。したがって、少なくとも一部のコドンは冗長である。生物の圧倒的多数によって用いられているコード系では、２つのアミノ酸が単一コドンによってコードされるが、他のすべてのアミノ酸は２、３、４または６コドンによってコードされ、終止コドンは３つある。２、３または４つコドンを有するアミノ酸は、第３のヌクレオチド位置のコドンが互いに異なる。６コドンを有する３つは、このパターンに従う４コドンの１ブロックと、第３の位置が同じく互いに異なる２コドンの追加の１セットとを有する。６コドンによって表される２つのアミノ酸（ＡｒｇおよびＬｅｕ）は、第２のヌクレオチド位置の変化が互いに異なるブロックによって各々表される。セリン（Ｓｅｒ）のコドン表現は、２つのコドンブロックが非常に小さい点で独特である。２コドンによって表されるアミノ酸は、第３の位置が、両方の場合、プリン（Ａ、Ｇ）またはピリミジン（Ｃ、Ｔ）のいずれかである。
【０００４】
遺伝コードの縮重は、基準ポリヌクレオチドのポリペプチド産物をコードする別のポリヌクレオチドを構築する機会をもたらす。例えば、コドン縮重によって、原ＤＮＡコード配列に使用されているものとは異なるコドンを使用して目的のタンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列を作製することが可能になる。特定のアミノ酸に関して、所与の生物は可能性のあるコドンを同等に使用しない。生物各々がコドン使用頻度の偏向を有する。コドン使用頻度の偏向のパターンは、生物およびその近縁種についてゲノム全体にわたって異なる。例えば、ストレプトマイセス属種（Streptomyces spp.）の場合、高頻度のコドンとしては、一般に、第３のヌクレオチド位置のＧまたはＣが挙げられる。低頻度のコドンとしては、一般に、第３の場所のＡまたはＴが挙げられる。他の生物では、ＡまたはＴが第３の位置において優先的である。特定の種内に、独自のコドンの偏向を有する別個の遺伝子カテゴリーが存在し得る。例えば大腸菌（E. coli）には、おおよそ３つの遺伝子クラスがあり、各々が特有のコドン使用頻度の特徴を有する。１つのクラスは、大量に発現される重要なタンパク質に富み、第２のクラスは、比較的低レベルで発現されるタンパク質を含み、第３のクラスは、他の種から最近獲得された可能性が高いタンパク質を含む。
【０００５】
遺伝子導入植物において異種タンパク質の所望の発現レベルを達成するために、ネイティブ（野生型または原と呼ばれることもある）ＤＮＡコード配列を、様々な方法で、例えばコドン使用頻度が宿主植物種のコドン使用頻度とより厳密にマッチするように、および／またはそのためコード配列のＧ＋Ｃ含有量が宿主植物種のコード配列に典型的に見られるＧ＋Ｃレベルとより厳密にマッチするように、および／またはｍＲＮＡを不安定化する特定の配列が除去されるように改変することは、有益であることが判明した。例えば、植物におけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）結晶タンパク質昆虫毒の発現が、これらのアプローチの１つまたは複数を使用して改善されている。例えば、米国特許第５，３８０，３０１号、同第５，６２５，１３６号、同第６，２１８，１８８号、同第６，３４０，５９３号、同第６，６７３，９９０号および同第７，７４１，１１８を参照されたい。
【０００６】
殆どの合成遺伝子設計戦略における方法は、合成遺伝子のコドン組成をその合成遺伝子が発現されることになる宿主の遺伝子のコドン組成とマッチさせようとする。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号Ａ１を参照されたい。そのような戦略は、一部の状況では、宿主における合成遺伝子の発現増加をもたらすこともある。例えば、酵母におけるコドン最適化は、例えば、アミノアシル−ｔＲＮＡの制限およびＡＴに富む配列での転写終結の効果を最小にするため、異種遺伝子転写物の翻訳を有意に改善することがある。例えば、Daly and Hearn (2004) J. Mol. Recognition 18:119-38を参照されたい。
【０００７】
しかし、何がしかのコドン最適化の必要性に対する当技術分野における一般的な見解の一致にもかかわらず、最適化に用いるべき一般戦略に関しては実施者の意見が食い違う。一部に好まれる１つの戦略は、異種遺伝子の設計中に発現宿主種における高頻度コドンの使用を最大にすることである。他の者に好まれる第２の戦略は、特定のコドン文脈に最大値を課すこと、したがって、発現宿主において高頻度に出現するコドンペアの使用を最大化することである。第３の戦略は、新たな種における新たなコード配列のコドン使用頻度を起源種における基準コード配列のコドン使用頻度に似させることである。この第３の戦略は、転写物ＲＮＡ分子の適正な二次構造を確実なものにするために低頻度コドンについての可能性のある必要条件に関する認識を重視する。加えて、異種配列における同じ頻度で出現するコドンの単純な反復使用は、結局は低頻度コドンの選択と同じ効果を有することが予想され、例えば、対応するｔＲＮＡの過剰使用は、ｔＮＲＡの利用可能性を制限することになる。宿主生物での発現のために遺伝子配列のコドンを最適化しようとする者は、特定の方法論に達するためにこれらの戦略とそれらの根底にある課題とのバランスをとらなければならない。
【０００８】
異種発現タンパク質をコードするヌクレオチド配列の最適化プロセスは、発現収率を改善するための重要なステップであり得る。しかし、可能性のあるいくつかの問題が特定の遺伝子の発現についての最適化の有用性を制限する。例えば、最適化された転写物の二次構造がその転写物の翻訳を制限することがある。Griswold et al. (2003) Protein Expression and Purification 27: 134-42。加えて、異種発現の合成配列において避けることが望ましいいくつかの配列モチーフがあり、それらの配列モチーフには、Ｔ７プロモーターの制御下にある遺伝子についての大腸菌（E. coli）におけるクラスＩおよびＩＩ転写終結部位；シャイン（Shine）・ダルガーノ（Dalgarno）様配列；潜在的スプライスシグナル；リボソームフレームシフトおよび休止を促進する配列；ならびにポリアデニル化シグナルが含まれる。Welch et al. (2010) J. R. Soc. Interface 6:S467-76。特に、植物における合成遺伝子の発現増進を可能にするためにアデニル化ポリシグナル化配列を低減させるべきであるというのが当技術分野における理解である。米国特許第７，７４１，１１８号。
【発明の概要】
【０００９】
当技術分野における理解（例えば米国特許第７，７４１，１１８号参照）に反して、本発明者らは、ポリアデニル化シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡ）の数の低減が、植物における合成遺伝子の発現増進を可能にするために必要でなく、十分なものでもないことを最近発見した。本明細書における実施形態は、これらのポリアデニル化配列がネイティブ配列における出現に関して合成コード配列で保存されることを遺伝子最適化プロセスに利用して異種タンパク質発現を増加させることができるという驚くべき、予想外の結果を実際に用いる。
【００１０】
本明細書における実施形態は、目的の少なくとも１つのポリペプチドをコードする合成核酸を含む。実施形態において、目的の少なくとも１つポリペプチドをコードする合成核酸は、宿主（例えば、植物細胞、植物組織および植物）における核酸からの目的のポリペプチドの発現を一般に増加させる特異的遺伝子設計パラメータの制約に従って設計される。合成核酸配列は、基準核酸配列から、例えば宿主生物における核酸配列の異種発現を最適化するように設計されることもある。
【００１１】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドをコードする合成核酸が、宿主細胞における異種ポリペプチドの発現のために工学的に操作され、ポリペプチドは、宿主細胞のもの以外の種における遺伝子操作されていない細胞において生産され、その細胞における基準ポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、合成核酸は、宿主細胞での発現のために、例えば、基準ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、宿主生物における優先（例えば最優先）コドンであるコドンの実質的にすべてを該配列内に有するように改変することによって、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、コドン最適化合成核酸に関するさらなる分析および工学的操作が、例えば、望ましくない核酸モチーフ（例えば、核酸モチーフから転写されるＲＮＡ分子において望ましくない二次構造を形成する核酸モチーフ）の不在を確認するために、制限酵素認識部位の不在を確認するために、ならびに／またはコドンおよび配列多様性を確かめるために、行われることもある。
【００１２】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドをコードする合成核酸は、異種細胞での発現のためにコドン最適化されているコード配列と、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列とを含み、少なくとも１つのポリアデニル化配列は、コード配列の対応する場所に、基準ポリヌクレオチドにおけるがごとく存在する。特定の実施形態において、合成核酸は、基準ポリヌクレオチドに出現するのと同数の前述のポリアデニル化配列を含む。特定の実施形態において、合成核酸は、基準ポリヌクレオチドに出現するのと同数の前述のポリアデニル化配列を含み、ポリアデニル化配列は、各々がコード配列のそれらの対応する場所に、基準ポリヌクレオチドにおけるがごとく存在する。
【００１３】
いくつかの実施形態は、目的のポリペプチドをコードする合成核酸を作製する方法であって、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列を含む、遺伝子操作されていない細胞における基準ポリヌクレオチドによってコードされている目的のポリペプチドのアミノ酸配列を用意するステップと、基準ポリヌクレオチドにおけるがごとく合成核酸のコード配列の対応する場所に存在する少なくとも１つのポリアデニル化配列を含有する、目的のポリペプチドをコードする合成核酸を生産するステップとを含む方法を含む。特定の実施形態において、合成核酸は、該合成核酸が基準ポリヌクレオチドに出現するのと同数の上述のポリアデニル化配列を含み、ポリアデニル化配列が、各々、合成核酸のコード配列のそれらの対応する場所に、基準ポリヌクレオチドにおけるがごとく存在するように生産される。
【００１４】
他の実施形態は、上述の合成核酸の少なくとも１つを含むベクター（例えば、植物形質転換ベクター）を含む。特定の実施形態は、異種細胞での発現のためにコドン最適化されているコード配列と、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列とを含む、目的のポリペプチドをコードする合成核酸を含む転写単位を含むベクターであって、少なくとも１つのポリアデニル化配列が、基準ポリヌクレオチドにおけるがごとくコード配列の対応する場所に存在する、ベクターを含む。いくつかの例では、そのようなベクターは、例えば、限定ではないが、５’非翻訳配列（例えば、植物プロモーターを含むもの）；合成ＤＮＡ配列；および３’非翻訳領域（例えば、転写終結シグナルを含むもの）を含むことがある。
【００１５】
特定の実施形態は、目的のポリペプチド（例えば、目的の異種ポリペプチド）を発現する植物、植物部位、植物器官、植物種子および／または植物細胞を生成する方法を含む。特定の実施形態による方法は、異種細胞での発現のためにコドン最適化されているコード配列と、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列とを含む、目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つの合成核酸で植物、植物部位、植物器官、植物種子および／または植物細胞を形質転換するステップであって、少なくとも１つのポリアデニル化配列が、基準ポリヌクレオチドにおけるがごとくコード配列の対応する場所に存在する、ステップと、核酸を発現させて、核酸によってコードされた目的のポリペプチドを生産するステップとを含む。例では、前述の合成核酸で形質転換された植物、植物部位、植物器官、植物種子および／または植物細胞は、基準ポリヌクレオチドで形質転換された同じ種の植物、植物部位、植物器官、植物種子および／または植物細胞より大量に目的のポリペプチドを発現することがある。
【００１６】
いくつかの実施形態は、目的のポリペプチドをコードする合成核酸が、異種細胞での発現のためにコドン最適化されているコード配列と、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列とを含む、目的のポリペプチドをコードする合成核酸を含む植物、植物部位、植物器官、植物種子および／または植物細胞であって、少なくとも１つのポリアデニル化配列が、遺伝子修飾されていない生物における目的のネイティブポリペプチドをコードする基準ポリヌクレオチドにおけるがごとくコード配列の対応する場所に存在する、植物、植物部位、植物器官、植物種子および／または植物細胞を含む。
【００１７】
他の実施形態は、植物において望ましい発現表現型を得る方法を含む。いくつかの実施形態による方法は、異種細胞での発現のためにコドン最適化されているコード配列と、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列とを含む、目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つの合成核酸で植物、植物部位、植物器官、植物種子および／または植物細胞を形質転換するステップであって、少なくとも１つのポリアデニル化配列が、基準ポリヌクレオチドにおけるがごとくコード配列の対応する場所に存在し、目的のポリペプチドが、部位、植物器官、植物種子および／または植物細胞において発現され、それによってその表現型を付与する、または向上させるステップを含む。特定の実施形態において得られるまたは向上されることがある表現型の例としては、例えば、限定ではないが、有害生物抵抗性および／または防除、除草剤耐性、修飾された油特性、ならびにストレス耐性が挙げられる。
【００１８】
例えば、いくつかの実施形態における方法は、昆虫毒（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Ｃｒｙタンパク質）をコードする少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドを植物細胞において発現させることによって植物、子実および／または種子における有害生物を防除すること；合成ポリヌクレオチドから昆虫毒を発現する遺伝子導入植物から得られる子実から粗挽き粉または細粉を用意することによって粗挽き粉または細粉における有害生物を防除すること；除草剤耐性ポリペプチド（例えば、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ１）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼおよび５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ）をコードする少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドを植物において発現させることによって植物における除草剤耐性を増加させること；植物における油プロファイルを修飾するポリペプチド（例えば、脂肪酸デサチュラーゼ）をコードする少なくとも１つの合成ポリヌクレオチドを植物において発現させることによって植物における油プロファイルを修飾すること；ならびにストレス耐性遺伝子の産物（例えば、ストレス関連タンパク質（ＳＡＰ１）および／または１−Ｃｙｓペルオキシレドキシン（Ｐｅｒ１）タンパク質）をコードする合成ポリヌクレオチドを植物において発現させることによって植物におけるストレス耐性（例えば、水および／または熱ストレス耐性）を増加させることを含む。特定の実施形態は、形質転換マーカータンパク質（例えば、ＧＦＰおよび／またはβ−ブルクロニダーゼ）をコードする合成ポリヌクレオチドを植物において発現させることによって、植物にレポーター遺伝子を導入する方法を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態には、異種細胞での発現のためにコドン最適化されているコード配列と、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列とを含む、目的のポリペプチドをコードする合成核酸を含有する遺伝子導入植物またはそれらの部位もしくは材料から生産される組成物（例えば商品生産物）であって、少なくとも１つのポリアデニル化配列が、基準ポリヌクレオチドにおけるがごとくコード配列の対応する場所に存在する、組成物も含まれる。特定の実施形態において、組成物は、粗挽き粉、細粉、タンパク質濃縮物および油を含む群から選択される商品生産物である。
【００２０】
上述の特徴および他の特徴は、添付の図に関連して進行する、いくつかの実施形態についての下記の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｃｒｙ１Ａｂトウモロコシ形質転換に使用した３つの例示的バイナリープラスミドの描画を含む図である。すべてのプラスミドは、ｃｒｙ１Ａｂポリヌクレオチドを除いて、同一である。
【図２】Ｃｒｙ１Ａｂ形質転換に使用した構築物によって推定された形質転換頻度を含む図である。ｐＤＡＢ１０９８１２は、陰性対照であり、このプラスミドは、Ｃｒｙ１ＡｂではなくＹＦＰを含有するが、調節エレメントおよび選択可能マーカーカセットに関しては同一である。
【図３】ＪＭＰ統計分析ソフトウェアを使用することによって各バックグラウンドについて得たＴ０形質転換事象の統計分析の要約を含む図である。平均は、バックグラウンド各々の緑色ひし形の中心線である。
【図４】Ｖ５生育期で収穫したトウモロコシ葉組織からのウエスタンブロットの画像を含む図である。レーンの内容は、レーン１＝陰性対照、レーン２＝ＢｉｏＲａｄ  ＭＷＭ、２０μＬ、レーン３＝１０７６４５［１］−０２１．００１ＡＪ．０１６、レーン４＝１０７６４５［１］−０２１．００１ＡＪ．０２１、レーン５＝１０７６４５［１］−０２１．００１  ＡＪ．００６、レーン６＝１１１４４７［１］−００２．００１、レーン７＝１１１４４７［１］−００３．００１、レーン８＝１１１４４７［１］−０３３．００１、レーン９＝１１１４４８［１］−０３０．００１、レーン１０＝１１１４４８［１］−０１３．００１、レーン１１＝１１１４４８［１］−０３２．００１、レーン１２＝１１１４４９［１］−０２０．００１、レーン１３＝１１１４４９［１］−００９．００１、レーン１４＝１１１４４９［１］−０１８．００１、およびレーン１５＝精製細菌Ｃｒｙ１Ａｂ標準物質（１ｎｇ）である。１０７６４５事象は、昆虫バイオアッセイにおいて活性であると判定された完全長Ｃｒｙ１Ａｂを含有するＴ１事象である。
【図５】構築物によるアメリカタバコガ幼虫（ＣＥＷ）損傷率のチューキー（Tukey）・クラマー（Kramer）一元配置分析の要約を含む図である。対照材料、１０９８１２（ＹＦＰ）、Ｂ１０４（非形質転換対照）、およびＨＸ１（ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）をＣｒｙ１Ａｂ事象とともに評価した。Ｃｒｙ１Ａｂを含有する３つのバックグラウンドすべてが、ＣＥＷに対するＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）の防護と同等の防護をもたらした。
【図６】構築物によるアワノメイガ（ＥＣＢ）損傷率のチューキー・クラマー一元配置分析の要約を含む図である。対照材料、１０９８１２（ＹＦＰ）、Ｂ１０４（非形質転換対照）、およびＨＸ１（ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）をＣｒｙ１Ａｂ事象とともに評価した。Ｃｒｙ１Ａｂを含有する３つのバックグラウンドすべてが、ＥＣＢに対するＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）の防護と同等の防護をもたらした。
【図７】構築物によるＣｒｙ１Ｆａ抵抗性アワノメイガ（ｒＥＣＢ）損傷率のチューキー・クラマー一元配置分析の要約を含む図である。対照材料、１０９８１２（ＹＦＰ）、Ｂ１０４（非形質転換対照）、およびＨＸ１（ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標））をＣｒｙ１Ａｂ事象とともに評価した。Ｃｒｙ１Ａｂを含有する３つのバックグラウンドすべてがｒＥＣＢに対する防護をもたらした。
【図８−１】Ｃｒｙ１Ｆａトウモロコシ形質転換実験に使用した１２のバイナリープラスミドのマップを含む図である。ｐＤＡＢ１１０８４２を除くすべてのプラスミドは、Ｃｒｙ１Ｆａをコードするポリヌクレオチド以外、同一である。バイナリープラスミドｐＤＡＢ１１０８４２は、ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ６およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含む、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）製品に最も類似している遺伝子カセットを有する。
【図８−２】Ｃｒｙ１Ｆａトウモロコシ形質転換実験に使用した１２のバイナリープラスミドのマップを含む図である。ｐＤＡＢ１１０８４２を除くすべてのプラスミドは、Ｃｒｙ１Ｆａをコードするポリヌクレオチド以外、同一である。バイナリープラスミドｐＤＡＢ１１０８４２は、ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ６およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含む、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）製品に最も類似している遺伝子カセットを有する。
【図８−３】Ｃｒｙ１Ｆａトウモロコシ形質転換実験に使用した１２のバイナリープラスミドのマップを含む図である。ｐＤＡＢ１１０８４２を除くすべてのプラスミドは、Ｃｒｙ１Ｆａをコードするポリヌクレオチド以外、同一である。バイナリープラスミドｐＤＡＢ１１０８４２は、ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ６およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含む、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）製品に最も類似している遺伝子カセットを有する。
【図８−４】Ｃｒｙ１Ｆａトウモロコシ形質転換実験に使用した１２のバイナリープラスミドのマップを含む図である。ｐＤＡＢ１１０８４２を除くすべてのプラスミドは、Ｃｒｙ１Ｆａをコードするポリヌクレオチド以外、同一である。バイナリープラスミドｐＤＡＢ１１０８４２は、ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ６およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含む、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）製品に最も類似している遺伝子カセットを有する。
【図８−５】Ｃｒｙ１Ｆａトウモロコシ形質転換実験に使用した１２のバイナリープラスミドのマップを含む図である。ｐＤＡＢ１１０８４２を除くすべてのプラスミドは、Ｃｒｙ１Ｆａをコードするポリヌクレオチド以外、同一である。バイナリープラスミドｐＤＡＢ１１０８４２は、ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ６およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含む、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）製品に最も類似している遺伝子カセットを有する。
【図８−６】Ｃｒｙ１Ｆａトウモロコシ形質転換実験に使用した１２のバイナリープラスミドのマップを含む図である。ｐＤＡＢ１１０８４２を除くすべてのプラスミドは、Ｃｒｙ１Ｆａをコードするポリヌクレオチド以外、同一である。バイナリープラスミドｐＤＡＢ１１０８４２は、ＺｍＵｂｉ１プロモーターｖ６およびＡｔｕＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含む、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）製品に最も類似している遺伝子カセットを有する。
【図９】ｐＤＡＢ１１１４３６およびｐＤＡＢ１１４３７バックグラウンドからの植物が陰性濃学的表現型を明示したことを示す画像を含む図である。茎および葉材料の赤変、ならびに葉および茎組織の重度の萎縮が検出された。
【図１０】ＪＭＰ統計ソフトウェアを使用する各バックグラウンドについてのＴ０事象の統計分析の要約を含む図である。製品であるＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）は、これらの温室条件下、６０ｎｇ／ｃｍ２でＣｒｙ１Ｆａを発現すると判定された。平均は、バックグラウンド各々の緑色ひし形の中心線である。４０ｎｇ／ｃｍ２のすぐ下に描かれている線は、すべてのバックグラウンドにわたってのすべての事象についての総平均である。
【図１１】Ｖ５生育期で収穫したトウモロコシ葉組織からのウエスタンブロットの画像を含む図である。レーンの内容は、次の通りである：レーン１＝陰性対照、レーン２＝ＢｉｏＲａｄ  ＭＷＭ、２０μＬ、レーン３＝１１１４３４［１］−０１０．００１、レーン４＝１１１４３４［１］−００４．００１、レーン５＝１１１４３４［１］−０１３．００１、レーン６＝１１１４３５［１］−００３．００１、レーン７＝１１１４３５［１］−００６．００１、レーン８＝１１１４３５［１］−０１２．００１、レーン９＝細菌精製Ｃｒｙ１Ｆａ標準物質（２ｎｇ）、およびレーン１０＝精製細菌Ｃｒｙ１Ｆａ標準物質（２０ｎｇ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列表
添付の配列表に収載されている核酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において定義されている、ヌクレオチド塩基の標準文字略語を使用して示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、表示されている鎖への何らかの言及によって相補鎖が含まれると解される。添付の配列表において、
配列番号１は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．１４７１．２と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００２３】
【化１−１】
2017504332.tif 000003
【００２４】
【化１−２】
2017504332.tif 000004
配列番号２は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．１４７１．３と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００２５】
【化２−１】
2017504332.tif 000005
【００２６】
【化２−２】
2017504332.tif 000006
配列番号３は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．１４７１．４と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００２７】
【化３−１】
2017504332.tif 000007
【００２８】
【化３−２】
2017504332.tif 000008
配列番号４は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．３４と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００２９】
【化４−１】
2017504332.tif 000009
【００３０】
【化４−２】
2017504332.tif 000010
配列番号５は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．３５と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００３１】
【化５−１】
2017504332.tif 000011
【００３２】
【化５−２】
2017504332.tif 000012
配列番号６は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．３６と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００３３】
【化６−１】
2017504332.tif 000013
【００３４】
【化６−２】
2017504332.tif 000014
配列番号７は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．３７と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００３５】
【化７−１】
2017504332.tif 000015
【００３６】
【化７−２】
2017504332.tif 000016
配列番号８は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．３８と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００３７】
【化８−１】
2017504332.tif 000017
【００３８】
【化８−２】
2017504332.tif 000018
配列番号９は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．３９と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００３９】
【化９−１】
2017504332.tif 000019
【００４０】
【化９−２】
2017504332.tif 000020
配列番号１０は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．４０と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００４１】
【化１０−１】
2017504332.tif 000021
【００４２】
【化１０−２】
2017504332.tif 000022
配列番号１１は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．４１と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００４３】
【化１１−１】
2017504332.tif 000023
【００４４】
【化１１−２】
2017504332.tif 000024
配列番号１２は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．４２と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００４５】
【化１２−１】
2017504332.tif 000025
【００４６】
【化１２−２】
2017504332.tif 000026
配列番号１３は、本明細書中のいくつかの箇所でＩＲＤＩＧ．５８６．４３と呼ばれるポリヌクレオチド配列を示す：
【００４７】
【化１３−１】
2017504332.tif 000027
【００４８】
【化１３−２】
2017504332.tif 000028
配列番号１４は、本明細書のいくつかの箇所でＣｒｙ１Ｆ  ｔｒｕｎｃ  Ｈｘと呼ぶポリヌクレオチド配列を示す：
【００４９】
【化１４−１】
2017504332.tif 000029
【００５０】
【化１４−２】
2017504332.tif 000030
配列番号１５〜２９は、本明細書における特定の実施形態で用いた例示的プライマーおよびプローブを示す。
【００５１】
発明を実施するための形態
Ｉ．いくつかの実施形態の大要
合成遺伝子がコードされたタンパク質産物の発現増加のために該合成遺伝子を工学的に操作するための組成物および方法を、本明細書において提供する。ネイティブ遺伝子中に存在するポリアデニル化配列を含むように合成遺伝子のヌクレオチド配列を工学的に操作することによって植物細胞における異種タンパク質発現を増加させることができるという予想外の、一般に適用可能な発見を、本明細書において開示する。いくつかの実施形態において、ポリアデニル化配列は、合成遺伝子中に、ネイティブ遺伝子中に存在するのと同じ数で同じ場所に含まれる。そのような合成遺伝子は、従来のアプローチを用いて設計された合成遺伝子と比較して、Ｖ５葉組織における平均タンパク質発現の（例えば約０．５倍〜約１７倍の）増加を明示することが、いくつかの例で驚くべきことに予想外に判明した。
【００５２】
ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドは、例えば、限定ではないが、優先コドン（例えば最優先コドン）での低頻度コドンの置換、既知不安定化因子の除去、二次ステムループ構造を形成すると予想される配列の除去、意図されないオープンリーディングフレームの除去、および不必要な内部制限酵素認識配列の除去を含むプロセスによって、工学的に作製することができる。本明細書における実施形態において、ポリペプチドをコードする、結果として得られるポリヌクレオチドは、同一ヌクレオチド位置に同じポリペプチドをコードするネイティブ遺伝子中に存在する少なくとも１つの特異的ポリアデニル化配列を含むように、例えば指定のポリアデニル化配列の場所および総数を維持するように、さらに修飾される。
【００５３】
本明細書における特異的例は、殺虫性Ｂｔタンパク質をコードする９つの異なる遺伝子およびグリホサート耐性遺伝子を用いてトウモロコシで上述の発見を実証する。本明細書における特定の例では、上述の方法および組成物を用いて、作物植物（例えばトウモロコシおよびダイズ）において異種ポリペプチドを発現するように合成ポリヌクレオチドを工学的に作製する。例えば、切断型ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子の３つの配置の発現をＴ０世代の遺伝子導入トウモロコシにおいて評価した。ネイティブポリアデニル化配列が保存されているｃｒｙ１Ａｂポリヌクレオチドの１つは、評価した他のポリヌクレオチドより有意に高レベルで、安定したＣｒｙ１Ａｂタンパク質を生産することが確認された。さらなる例として、切断型ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子の１２つの配置の発現もＴ０世代のトウモロコシにおいて評価した。２つのｃｒｙ１Ｆａポリヌクレオチドは、評価した他のすべてのポリヌクレオチドより有意に高レベルで、安定したＣｒｙ１Ｆａタンパク質を生産した。
【００５４】
ＩＩ．略語
Ｂｔ    バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）
アメリカタバコガ幼虫    ＣＥＷ
ＥＣＢ    アワノメイガ
ＦＡＷ    ツマジロクサヨトウ
ＧＦＰ    緑色蛍光タンパク質
ＮＣＢＩ    （米国）国立生物学情報センター
ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応
ｒＥＣＢ    Ｃｒｙ１Ｆａ抵抗性アワノメイガ
【００５５】
ＩＩＩ．用語
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」の使用は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の言及対象を含む。例えば、「ポリヌクレオチド（a polynucleotide）」への言及は、複数のポリヌクレオチド（polynucleotides）を含み、「基質（a substrate）」への言及は、複数のそのような基質（substrates）を含み、「変異体（a variant）」への言及は、複数のそのような変異体（variants）を含む等々。
【００５６】
値の範囲が列挙されている場合、その範囲の列挙されている上限と下限の間の介在する各々の整数値およびそれらの各々の分数も、そのような値間の各々の部分範囲とともに、具体的に開示されている。任意の範囲の上限および下限を独立してその範囲に含めるまたは除外することができ、いずれかの制限を含む、いずれの制限も含まない、または両方の制限を含む各々の範囲も本発明に包含される。論じられている値が固有の制限を有する場合（例えば、成分が０〜１００％の濃度で存在することができる場合、または水溶液のｐＨが１〜１４の範囲である場合）には、それらの固有の制限が具体的に開示されている。
【００５７】
値が明示的に列挙されている場合、列挙されている値とほぼ同じ数量または量である値も本発明の範囲内であると解されるものとする。組み合わせが開示されている場合、その組み合わせのエレメントの部分的組み合わせ各々も具体的に開示されており、本発明の範囲内である。逆に、異なるエレメントまたはエレメントの群が個々に開示されている場合、それらの組み合わせも開示されている。本発明のいずれかのエレメントが複数の代替物を有すると開示されている場合、各代替物が個々にまたは他の代替物との組み合わせで除外される本発明の実施例も本明細書によって開示されている（本発明の１つより多くのエレメントは、そのような除外を有することがあり、そのような除外を有するエレメントのすべての組み合わせが本明細書によって開示されている）。
【００５８】
別段の定めがない限り、本明細書において用いるすべての技術および科学用語は、遺伝学、生物情報学および遺伝子設計技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本開示において用いる用語の多くを収録している一般的な辞書は、Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology. 2nd Ed., John Wiley and Sons, New York；およびHale and Marham (1991) The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, New Yorkである。特定の方法および材料は、本明細書において開示するものによって例示されるが、本明細書に記載するものと同様または等価の任意の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験の際に使用してもよい。
【００５９】
コドン使用頻度の偏向：本明細書で用いる場合、用語「コドン使用頻度の偏向」または単に「コドン使用頻度」は、生物体内のアミノ酸をコードする特定のコドンの（他の同義コドンとは対照的に）高頻度の優先的使用を指す。コドン使用頻度の偏向は、例えば同じアミノ酸をコードする他のコドンと比較したときの、特定の生物のゲノムにおいて特定のコドンが使用される率の定量的測定値として表すことができる。
【００６０】
コドン使用頻度の偏向を決定するための様々な方法が当業者に公知である。いくつかの実施形態では、本質的に、ある遺伝子のコドン使用頻度の高度に発現される遺伝子の被定義セットのコドン使用頻度への距離の測定値である、コドン適応指数（ＣＡＩ）方法によって、コドン使用頻度の偏向を決定することができる。Sharp and Li (1987) Nucleic Acids Res. 15：1281-95。コドン使用頻度の偏向を決定するための代替方法としては、ＭＩＬＣ（長さおよび組成の独立した測定）（Supek and Vlahovicek (2005) BMC Bioinformatics 6:182）、およびそのアミノ酸についてのすべての同義コドンの同等の使用頻度から予想される頻度で割った特定のコドンの実測頻度である相対同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）が挙げられる。Sharp et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:5125-43。１．０に近いＲＳＣＵ値は特定のコドンについての偏向がないことを示すが、１．０からの逸脱はコドン使用頻度の偏向を表す。
【００６１】
したがって、コドン使用頻度の偏向は、同じアミノ酸をコードするコドン（「同義コドン」）の使用の相対頻度を含む。偏向は自然に起こることもある。例えば、生物のゲノムにおけるコドンの偏向は、その生物におけるすべての遺伝子中の同義コドンの相対的全使用を表す。偏向を計算アルゴリズムに使用してもよく、その場合、例えば、そのアルゴリズムを用いて、様々な同義コドンがポリヌクレオチド配列の設計における使用に選択される相対頻度を決定してもよい。同様に、ヌクレオチド配列内のポリペプチドをコードするために使用される任意の配列エレメントの「相対」頻度は、所与リーディングフレーム内のポリペプチドにおけるその配列エレメントによってコードされ得る特徴の出現数で割った、その配列エレメントがポリペプチドの特徴をコードするために使用される頻度である。
【００６２】
コドン使用頻度の偏向を特定の発現宿主生物についてのコドン使用頻度表から推論してもよい。多くの発現宿主生物についてのコドン使用頻度表を容易に入手できる。例えば、Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:292（Codon Usage Database−アップデート版はkazusa.or.jp/codonで入手可能）を参照されたい。コドン使用頻度表が入手できない場合、ＮＣＢＩによって保守されているもの（ncbi.nlm.nih.gov/sites/genomeで入手可能）などの公開生物遺伝子データベースからアセンブルしてもよい。いくつかの実施形態では、コドン使用頻度表を特定の発現宿主生物から得られる１セットのコード領域からアセンブルすることもある。いくつかの例では、１セットのコード領域は、特定の発現宿主生物から得られる少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００以上のコード領域を含む。
【００６３】
用語「コドン使用頻度表」または「コドンの偏向表」または「コドン頻度表」は、同義で用いており、特定のアミノ酸をコードするために使用され得る各コドンと、各コドンが、特定の生物において、その生物における指定遺伝子クラス内で、または１つもしくは複数の合成ポリヌクレオチド中でそのアミノ酸をコードするために使用される頻度とを相関させる表を示す。
【００６４】
絶対コドン頻度：本明細書で用いる場合、用語「絶対コドン頻度」は、所与のリーディングフレーム（例えば、目的のポリペプチドをコードするために使用されるリーディングフレーム）内のポリヌクレオチドまたは１セットのポリヌクレオチド中のコドン（例えば、同義コドンと非同義コドン両方）の総数に対する、コドンが現れる頻度を指す。同様に、ポリヌクレオチド中のポリペプチドをコードするために使用される任意の配列エレメントの「絶対」頻度は、その配列エレメントによってコードされ得るものと同じサイズの特徴がポリペプチド中で出現する数で割った、その配列エレメントが前記ポリペプチドの特徴（例えば、アミノ酸、アミノ酸対など）をコードするために使用される頻度である。
【００６５】
コドンの偏向およびコドン頻度に関して本明細書で用いる場合、「低頻度コドン」は、目的の生物において１０％未満の使用頻度を有するコドンである。いくつかの例では、「低頻度コドン」は、生物において５％未満の使用頻度を有するコドンである。本明細書で用いる場合、「優先コドン」は、目的の生物において５％より高い使用頻度を有するコドンである。いくつかの例では、「最優先コドン」は、生物において１０％より高い使用頻度を有するコドン、例えば、生物において特定のアミノ酸のコード化に関して最も高い使用頻度を有するコドンである。
【００６６】
コドン空間（codon space）：本明細書で用いる場合、用語「コドン空間」は、特定のポリペプチド中のアミノ酸をコードするために使用されるコドンを変えることによって、その特定のポリペプチドをコードするために使用することができる可能性のあるすべてのポリヌクレオチド配列を指す。
【００６７】
コドン置換：本明細書で用いる場合、用語「コドン置換」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、コードされたポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸をコードするコドンの１つまたは複数を変更することによる、ヌクレオチドコード配列の改変を指す。
【００６８】
コドン最適化：本明細書で用いる場合、用語「コドン最適化」は、先ず第１に、例えば、コード配列から転写された転写物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように、既存のコード配列を修飾する、またはコード配列を設計するために用いられるプロセスを指す。コドン最適化は、発現宿主生物のコドン優先度に適合するようにコード配列のコドンを選択することを含むプロセスを含むが、これらに限定されない。コドン最適化は、例えば、「コドン調和（codon harmonization）」と呼ばれることもあるプロセスであって、ソース生物において低使用頻度コドンと見なされるコドン配列のコドンが新たな発現宿主において低使用頻度と見なされるコドンに改変されるプロセスも含む。このプロセスは、発現されるポリペプチドが折り重なることを、通常は、翻訳／伸長中に自然で適切な休止期を導入することによって、助長することができる。Birkholtz et al. (2008) Malaria J. 7:197-217。
【００６９】
遺伝コードの冗長性のため複数のＤＮＡ配列が単一のアミノ酸配列をコードするように設計されることがあることは、理解されるであろう。したがって、最適化ＤＮＡ配列は、コドン領域のヌクレオチド配列を最適化すると同時に、例えば、過剰な制限部位および望ましくないＲＮＡ二次構造を除去するように設計されることがあり、その結果、コドン組成は、ＤＮＡが発現されることになる宿主の全コドン組成に似ている。合成ＤＮＡ配列の設計および生産に関するガイダンスは、例えば、ＰＣＴ国際公開特許出願番号ＷＯ２０１３／０１６５４６、ＷＯ２０１１／１４６５４２およびＷＯ１９９７／０１３４０２、ならびに米国特許第６，１６６，３０２号および同第５，３８０，８３１号において見つけることができる。
【００７０】
修飾する：本明細書で用いる場合、用語「修飾する」または「改変する」またはそれらの任意の形態は、修飾する、改変する、置き換える、欠失させる、置換する、除去する、変える、または形質転換することを意味する。
【００７１】
戻し交配：戻し交配方法は、核酸配列を植物に導入するために用いることができる。戻し交配技術は、新たな形質を植物に導入するために数十年にわたって広く使用されてきた。Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。典型的な戻し交配プロトコルでは、目的の原品種（反復親）を、移入すべき目的の遺伝子を有する第２の品種（非反復親）と交配させる。次いで、その交配の結果として生じる後代を反復親と再び交配させ、このプロセスを植物が得られるまで繰り返し、非反復親からの移入遺伝子に加えて、反復植物の所望の形態学的および生理学的特徴の本質的にすべてを転換植物において回収する。
【００７２】
単離された：「単離された」生体成分（例えば、核酸またはタンパク質）は、成分の化学的または機能的変化をもたしつつ、成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生体成分（すなわち、他の染色体または染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離された、そのような生体成分とは別に生産された、またはそのような生体成分から切り離して精製されたものである（例えば、核酸は、染色体から、該核酸と該染色体内の残りのＤＮＡとを連結している化学結合を壊すことによって単離することができる）。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語は、宿主において組み換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドも包含する。
【００７３】
核酸分子：本明細書で用いる場合、用語「核酸分子」は、ヌクレオチドの重合形態（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得る）、および合成形態、ならびに上記のものの混合ポリマーを指すことがある。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドを指すこともあり、デオキシリボヌクレオチドを指すこともあり、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を指すこともある。「核酸分子」は、本明細書で用いる場合、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、別段の規定がない限り、通常は少なくとも１０塩基の長さである。この用語は、１本鎖および２本鎖形態のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチド結合によって互いに連結されている、天然に存在するヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むことができる。
【００７４】
当業者には容易に理解されるであろうが、核酸分子は、化学的もしくは生化学的に修飾されることもあり、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有することもある。そのような修飾としては、例えば、標識、メチル化、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの類似体での置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合、例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバミン酸エステルなど；荷電結合：例えばチオリン酸エステル、ジチオリン酸エステルなど；ペンダント部分：例えばペプチド；挿入剤：例えばアクリジン、ソラレンなど；キレート剤；アルキル化剤；および修飾結合：例えばαアノマー核酸など）が挙げられる。用語「核酸分子」は、１本鎖、２本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン型、環状および南京錠型高次構造をはじめとする任意のトポロジカル高次構造も含む。
【００７５】
作動可能に連結された：第１のヌクレオチド配列と第２の核酸配列は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的関係にある場合、作動可能に連結されている。組み換え生産された場合、作動可能に連結された核酸配列は、一般に、同じリーディングフレーム（例えば、ポリシストロン性ＯＲＦ）内で近接しており、必要に応じて２つのタンパク質コード領域を接続するように近接している。しかし、核酸は、作動可能に連結されるように近接している必要はない。
【００７６】
用語「作動可能に連結された」は、調節配列およびコード配列に関して用いる場合、調節配列が、連結されたコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」または「制御エレメント」は、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または関連コード配列の翻訳のタイミングおよびレベル／量に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、終結配列、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができる。特定の調節配列が、該配列に作動可能に連結されたコード配列の上流および／または下流に位置することもある。また、コード配列に作動可能に連結された特定の調節配列が、２本鎖核酸分子の関連相補鎖上に位置することもある。
【００７７】
プロモーター：本明細書で用いる場合、用語「プロモーター」は、転写開始から上流であり得る、ならびにＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始させる他のタンパク質の認識および結合に関与し得る、ＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、細胞での発現のためにコード配列に作動可能に連結されることもあり、またはプロモーターは、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、ヌクレオチド配列が細胞での発現のためにコード配列に作動可能に連結されることもある。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始させることができるプロモーターであり得る。発生制御下のプロモーターの例としては、特定の組織、例えば葉、根、種子、繊維、木部導管、仮導管または厚壁組織、において転写を優先的に開始させるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターを「組織優先的」と言う。特定の組織においてのみ転写を開始させるプロモーターを「組織特異的」と言う。「細胞タイプ特異的」プロモーターは、１つまたは複数の器官の特定の細胞タイプ、例えば、根または葉の維管束細胞での発現を主として駆動する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあり得るプロモーターであり得る。誘導性プロモーターによって転写を開始し得る環境条件の例としては、嫌気性条件および光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞タイプ特異的および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、殆どの環境条件下で生物の殆どの細胞において活性であり得るプロモーターである。
【００７８】
任意の誘導性プロモーターを本発明のいくつかの実施形態において使用することができる。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-66を参照されたい。誘導性プロモーターを用いると、転写速度が誘導剤に応じて増加する。例示的誘導性プロモーターとしては、銅に応答するＡＣＥＩ系からのプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシからのＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０からのＴｅｔリプレッサー；および転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導され得る、ステロイドホルモン遺伝子からの誘導性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない（Schena et al.（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-5）。
【００７９】
例示的構成的プロモーターとしては、植物ウイルスからのプロモーター、例えば、ＣａＭＶからの３５Ｓプロモーター；イネアクチン遺伝子からのプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；およびＡＬＳプロモーター、すなわち、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’側のＸｂａ１／ＮｃｏＩ断片（または前記Ｘｂａ１／ＮｃｏＩ断片とのヌクレオチド配列類似性）（ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９６／３０５３０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
加えて、任意の組織特異的または組織優先的プロモーターを本発明のいくつかの実施形態において用いることができる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む核酸分子で形質転換された植物は、特異的組織において排他的にまたは優先的にコード配列の産物を生産することができる。例示的組織特異的または組織優先的プロモーターとしては、根優先的プロモーター、例えばファゼオリン遺伝子からのもの；葉特異的および光誘導プロモーター、例えばｃａｂまたはｒｕｂｉｓｃｏからのもの；葯特異的プロモーター、例えばＬＡＴ５２からのもの；花粉特異的プロモーター、例えばＺｍ１３からのもの；小胞子優先的プロモーター、例えばａｐｇからのもの；ならびに種子特異的プロモーター（例えば、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰまたはＢｎＮａｐｉｎＣからのプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
異種の：用語「異種の」は、本明細書において核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび遺伝子）に適用する場合、異なる起源の、を意味する。例えば、宿主細胞が、自然界で非形質転換宿主細胞中に存在しない核酸で形質転換される場合には、その核酸は、その宿主にとって異種（および外来性）である。さらに、形質転換する核酸の異なるエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、コード配列、ターミネーターなど）は、互いに異種であることもあり、および／または形質転換される宿主にとって異種であることもある。
【００８２】
ネイティブ：本明細書で用いる場合、用語「ネイティブ」は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の形態であって、自然界で見いだされる生物体内または生物のゲノム内のその天然の場所にある形態を指す。
【００８３】
内在性：本明細書で用いる場合、用語「内在性」は、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドであって、自然界でその分子を通常含む生物体内またはゲノム内に位置するポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを指す。
【００８４】
形質転換：本明細書で用いる場合、用語「形質転換」は、細胞への１つまたは複数の核酸分子の移入を指す。細胞は、細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みまたはエピソーム複製のいずれかによって核酸分子が細胞により安定的に複製された状態になるとき、その細胞に形質導入された核酸によって「形質転換される」。本明細書で用いる場合、用語「形質転換」は、核酸分子をそのような細胞に導入することができるすべての技術を包含する。例としては、ウイルスベクターでの形質転換、プラスミドベクターでの形質転換、エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）、直接ＤＮＡ取り込み、および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
導入遺伝子：宿主のゲノムに組み込まれている産物をコードする外来性ポリヌクレオチド。いくつかの例では、導入遺伝子は、該導入遺伝子のコード配列に作動可能に連結された調節配列（例えばプロモーター）を含有することがある。
【００８６】
ベクター：例えば形質転換細胞を生産するために、細胞に導入されるような核酸分子。ベクターは、該ベクターが宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列、例えば複製起点を含むことがある。ベクターの例としては、プラスミド；コスミド；バクテリオファージ；または細胞に外来性ＤＮＡを運ぶウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子および／または選択可能マーカー遺伝子ならびに当技術分野において公知の他の遺伝エレメントも含むことがある。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換または感染させることができ、それによって、そのベクターによってコードされた核酸分子および／またはタンパク質をその細胞に発現させる。ベクターは、細胞への核酸分子の侵入達成を助長するための物質（例えば、リポソーム、およびタンパク質コーティング）を場合により含む。
【００８７】
発現：本明細書で用いる場合、用語「発現」は、ポリヌクレオチドによってコードされたｍＲＮＡの転写および安定した蓄積を指すこともあり、またはそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。用語「過剰発現」は、本明細書で用いる場合、同じ遺伝子または近縁遺伝子の内在性発現より多い発現を指す。異種遺伝子は、その発現が近縁内在性遺伝子（例えばホモログ）のものより多い場合、過剰発現される。
【００８８】
外来性：用語「外来性」は、本明細書において核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび遺伝子）に適用する場合、１つまたは複数の核酸であって、それらの特異的環境または状況の中で通常存在しない核酸を指す。例えば、宿主細胞が、自然界で非形質転換宿主細胞中に存在しない核酸で形質転換される場合には、その核酸は、その宿主細胞にとって外来性である。用語外来性は、本明細書で用いる場合、宿主細胞に既に存在する核酸と配列が同一であるが、その宿主細胞に既に存在する同じ配列を有する核酸とは異なる細胞状況またはゲノム状況にある、１つまたは複数の核酸も指す。例えば、同じ配列を有する核酸が宿主細胞のゲノムに通常組み込まれるのとは異なる場所でその宿主細胞のゲノムに組み込まれている核酸は、その宿主細胞にとって外来性である。さらに、宿主細胞内のプラスミドまたはベクターに存在する核酸（例えばＤＮＡ分子）は、同じ配列を有する核酸がその宿主細胞のゲノムにしか通常存在しない場合、その宿主細胞にとって外来性である。
【００８９】
配列同一性：用語「配列同一性」または「同一性」は、本明細書において２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの文脈で用いる場合、指定比較ウィンドウにわたって最大に一致するようにアラインしたとき同じである２配列中の残基（それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸）を指すことがある。
【００９０】
本明細書で用いる場合、用語「配列同一性百分率」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２配列（例えば核酸配列およびアミノ酸配列）を比較することによって決定される値を指すことがあり、比較ウィンドウ内の配列の一部は、２配列の最適アラインメントのための（付加または欠失を含まない）基準配列と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。百分率は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を得、そのマッチ位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性百分率を得ることによって算定される。
【００９１】
比較のために配列をアラインする方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482；Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443；Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444；Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44；Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-3；Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90；Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65；Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31；Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列アラインメント方法および相同性計算についての詳細にわたる検討は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10において見つけることができる。
【００９２】
（米国）国立生物学情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）、Altschul et al. (1990)）を、いくつかの配列分析プログラムとともに使用するために、国立生物学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で、入手することができる。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」セクションで入手することができる。核酸配列の比較のために、デフォルトパラメータを使用してＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」機能を用いてもよい。基準配列との類似性がよりいっそう大きい核酸配列は、この方法によって評価したとき、同一性百分率増加を示すことになる。
【００９３】
本明細書で用いる場合、用語「実質的に同一の」は、８５％より高く同一であるヌクレオチド配列を指すことがある。例えば、実質的に同一のヌクレオチド配列は、基準配列と少なくとも８５．５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であることがある。
【００９４】
いくつかの実施形態において、植物における異種核酸の存在は、核酸プローブの使用によって検出されることがある。プローブは、ＤＮＡ分子であることもあり、またはＲＮＡ分子であることもある。ＲＮＡプローブは、当技術分野において公知の手段によって、例えば、ＤＮＡ分子テンプレートを使用して合成することができる。プローブは、異種核酸のヌクレオチド配列のすべてまたは一部と植物ゲノムからの追加の連続ヌクレオチド配列とを含有することがある。これを本明細書では「連続プローブ」と呼ぶ。追加の連続ヌクレオチド配列を、従来理解されているように、植物染色体からのその連続ヌクレオチド配列が異種核酸の５’側にあるのか３’側にあるのかに依存して、異種核酸の「上流」または「下流」と呼ぶ。当業者には分かるように、プローブに含めるための追加の連続ヌクレオチド配列を得るプロセスをほぼ無期限に繰り返し（染色体の長さによってのみ制限される）、それによって染色体に沿って追加の核酸を同定することができる。上記の様々なプローブのいずれかおよびすべてを、本発明のいくつかの実施形態において使用することがある。
【００９５】
プローブは、異種核酸のものに連続していないヌクレオチド配列を含有することもあり、このプローブを本明細書では「非連続プローブ」と呼ぶ。非連続プローブの配列は、染色体上の異種核酸配列の十分近くに位置し、したがって非連続プローブは異種核酸と遺伝的に連鎖している。プローブは、検出される異種核酸の正確なコピーであることもある。プローブは、検出される異種核酸を含む染色体ＤＮＡのクローン化セグメントと実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む、またはそのようなヌクレオチド配列からなる、核酸分子であることもある。
【００９６】
オリゴヌクレオチドプローブ配列は、合成的に調製されることもあり、またはクローニングによって調製されることもある。好適なクローニングベクターは、当業者に周知である。オリゴヌクレオチドプローブは、標識されていることもあり、または未標識であることもある。核酸分子を標識するための多種多様な技術が存在し、そのような技術としては、例えば、限定ではないが、ニックトランスレーションによる放射性標識；ランダムプライミング；末端デオキシトランスフェラーゼでのテーリングなどが挙げられ、用いられるヌクレオチドは、例えば放射性３２Ｐで標識される。使用することができる他の標識としては、例えば、限定ではないが、フルオロフォア、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤などが挙げられる。あるいは、単独でまたは他の反応性薬剤と協力して検出可能なシグナルをもたらす標識を使用する代わりに、受容体が結合するリガンドを使用してもよく、その場合、受容体を（例えば、上に示した標識によって）標識して、単独でまたは他の試薬と協力して検出可能なシグナルをもたらす。例えば、Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9を参照されたい。
【００９７】
プローブは、検出されるマーカーの正確なコピー（「ＤＮＡ標的」）に「特異的にハイブリダイズ可能」または「特異的に相補的」である核酸分子であることもある。「特異的にハイブリダイズ可能」または「特異的に相補的」は、核酸分子とＤＮＡ標的間に安定した特異的な結合が存在するために十分な相補性度を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的配列に１００％相補的である必要はない。核酸分子は、特異的結合が望まれる条件下、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非標的配列への核酸の非特異的結合を回避するために十分な相補性度がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００９８】
特定のストリンジェンシー度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選ばれるハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに依存して変わることになる。一般に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション用緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決めることになるが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響する。特定のストリンジェンシー度を達成するために要するハイブリダイゼーション条件に関する計算は当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11；およびHames and Higgins (eds.)Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985において論じられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な説示およびガイダンスは、例えば、Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993；およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995において見つけることができるだろう。
【００９９】
本明細書で用いる場合、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間に２５％未満のミスマッチがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、特定のストリンジェンシーレベルをさらに含む。したがって、本明細書で用いる場合、「低ストリンジェンシー」条件は、２５％より多くの配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「中ストリンジェンシー」の条件は、１５％より多くのミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」の条件は、１０％より多くのミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「超高ストリンジェンシー」の条件は、６％より多いミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
【０１００】
特定の実施形態において、ストリンジェント条件は、６５℃で６ｘ食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液、５ｘデンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ剪断サケ精巣ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて６５℃で２ｘＳＳＣ緩衝液および０．５％ＳＤＳ、続いて１ｘＳＣＣ緩衝液および０．５％ＳＤＳ、そして最後に０．２ｘＳＣＣ緩衝液および０．５％ＳＤＳ中での１５〜３０分の逐次的洗浄である。
【０１０１】
上で論じたすべてのプローブに関して、プローブは、追加の核酸配列、例えばプロモーター、転写シグナル、および／またはベクター配列を含むことがある。
【０１０２】
タンパク質／ポリペプチド：用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書では同義で用いている。これらの用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の連続分子鎖を指す。これらの用語は、産物の特定の長さを指さない。したがって、「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「タンパク質」は、ポリペプチドの定義に含まれる。これらの用語は、インビボまたはインビトロで作られたポリペプチドの翻訳時および／または翻訳後修飾、例えば、限定ではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ＰＥＧ化および硫酸化を有するポリペプチドを含む。加えて、タンパク質断片、類似体（遺伝コードによってコードされないアミノ酸、例えばホモシステイン、オルニチン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、Ｄ−アミノ酸およびクレアチンを含む）、天然または人工突然変異体、変異体、融合タンパク質、誘導体化残基（例えば、アミン基のアルキル化、カルボキシル基のアセチル化またはエステル化）、および前述のいずれかのものの組み合わせは、ポリペプチドの意味に含まれる。
【０１０３】
典型的に、タンパク質は機能を有する。しかし、タンパク質は、機能的活性を有さないオリゴペプチドおよびより小さい連続アミノ酸配列も包含する。機能性タンパク質の非限定的な例としては、受容体、受容体リガンド、サイトカイン、抗体、免疫修飾分子、シグナル伝達分子、蛍光タンパク質、殺虫または殺生物活性を有するタンパク質、および酵素が挙げられる。酵素の有用な一般クラスとしては、プロテアーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、リガーゼ、ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、エステラーゼ、デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクトシダーゼ、リグニナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスフェラーゼ、グルコースイソメラーゼ、ニトリラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ヒドラーゼ、ポリメラーゼおよびデポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。酵素に加えて、本明細書において開示する合成核酸分子によってコードされ得るタンパク質としては、限定ではないが、転写因子、抗体、受容体、成長因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ、インスリン、ＩＧＦ、ＬＩＦ、オンコスタチン、ＣＳＦなど）、免疫修飾物質、ペプチドホルモン、サイトカイン、インテグリン、インターロイキン、接着分子、血栓調節分子（thrombomodulatory molecule）、プロテアーゼ阻害剤、アンジオスタチン、デフェンシン、分化抗原クラスター、インターフェロン、ケモカイン、抗原（感染性ウイルスおよび生物からのものを含む）、癌遺伝子産物、トロンボポエチン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、および臨床、診断または獣医学的設定での使用に望ましい任意の他の生物活性タンパク質が挙げられる。これらのタンパク質のすべてが文献で（例えば例示的アミノ酸配列によって）十分に定義されており、本明細書においてもそのように定義される。そのようなタンパク質の欠失突然変異体、そのようなタンパク質の個々のドメイン、そのようなタンパク質から作られる融合タンパク質、およびそのようなタンパク質の混合物も含まれる。
【０１０４】
保存的置換：ポリペプチドに関して本明細書で用いる場合、用語「保存的置換」は、あるアミノ酸残基で同じクラスの別のアミノ酸が置換される置換を指す。非保存的アミノ酸置換は、残基が同じクラスに分類されない置換、例えば、塩基性アミノ酸での中性または非極性アミノ酸の置換である。保存的置換を行う目的で定義され得るアミノ酸の置換は、当技術分野において公知である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、保存的置換は、第１の脂肪族アミノ酸での第２の異なる脂肪族アミノ酸の置換を含む。例えば、第１のアミノ酸が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＭｅｔのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＭｅｔから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。特定の例では、第１のアミノ酸が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。疎水性脂肪族アミノ酸の置換を含む特定の例では、第１のアミノ酸が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、保存的置換は、第１の芳香族アミノ酸での第２の異なる芳香族アミノ酸の置換を含む。例えば、第１のアミノ酸が、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。非荷電芳香族アミノ酸の置換を含む特定の例では、第１のアミノ酸が、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、保存的置換は、第１の疎水性アミノ酸での第２の異なる疎水性アミノ酸の置換を含む。例えば、第１のアミノ酸が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。非芳香族疎水性アミノ酸の置換を含む特定の例では、第１のアミノ酸が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。
【０１０８】
他の実施形態において、保存的置換は、第１の極性アミノ酸での第２の異なる極性アミノ酸の置換を含む。例えば、第１のアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。非荷電極性アミノ酸の置換を含む特定の例では、第１のアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、ＧｌｙおよびＰｒｏのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。荷電極性アミノ酸の置換を含む特定の例では、第１のアミノ酸が、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。荷電極性アミノ酸の置換を含むさらなる例では、第１のアミノ酸が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。正電荷を有する（塩基性の）極性アミノ酸の置換を含む特定の例では、第１のアミノ酸が、Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。正電荷を有する極性アミノ酸の置換を含むさらなる例では、第１のアミノ酸が、ＡｒｇまたはＬｙｓである場合、第１のアミノ酸を、ＡｒｇおよびＬｙｓである他のアミノ酸によって置き換えてもよい。負電荷を有する（酸性の）極性アミノ酸の置換を含む特定の例では、第１のアミノ酸が、ＡｓｐまたはＧｌｕである場合、第１のアミノ酸を、ＡｓｐおよびＧｌｕである他のアミノ酸によって置き換えてもよい。
【０１０９】
代替実施形態において、保存的置換は、第１の電気的に中性のアミノ酸での第２の異なる電気的に中性のアミノ酸の置換を含む。例えば、第１のアミノ酸が、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。
【０１１０】
他のさらなる実施形態において、保存的置換は、第１の非極性アミノ酸での第２の異なる非極性アミノ酸の置換を含む。例えば、第１のアミノ酸が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＰｒｏおよびＭｅｔのうちの１つである場合、第１のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＰｒｏおよびＭｅｔから選択される第２の異なるアミノ酸によって置き換えてもよい。
【０１１１】
多くの例では、第１のアミノ酸を置き換えるための保存的置換で使用される特定の第２のアミノ酸の選択を、第１のアミノ酸と第２のアミノ酸の両方が属する上述のクラスの数を最大にするように行うことがある。したがって、第１のアミノ酸がＳｅｒ（極性、非芳香族、および電気的に中性のアミノ酸）である場合、第２のアミノ酸は、別の極性アミノ酸（すなわち、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＡｓｐもしくはＧｌｕ）であってもよいし、別の非芳香族アミノ酸（すなわち、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌもしくはＭｅｔ）であってもよいし、または別の電気的に中性のアミノ酸（すなわち、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＴｙｒ）であってもよい。しかし、この場合の第２のアミノ酸は、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＧｌｙのうちの１つであることが好ましいことがある。なぜならこれらのアミノ酸は、極性、非芳香族性および電気的中性によるすべての分類を共有するからである。保存的置換に使用される特定の第２のアミノ酸を選択するために場合により用いることができるさらなる基準は、当技術分野において公知である。例えば、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＧｌｙが、Ｓｅｒの保存的置換に使用するために利用可能である場合、Ｃｙｓは、望ましくない架橋および／またはジスルフィド結合の形成を回避するために選択から外されることがある。同様に、Ｇｌｙは、アルキル側鎖がないので、選択から外されることがある。この場合、例えば側鎖ヒドロキシル基の官能性を保持するためにＴｈｒが選択されることもある。しかし、保存的置換に使用される特定の第２のアミノ酸の選択は、最終的には当業者の自由裁量の範囲内である。
【０１１２】
植物：用語「植物」は、本明細書で用いる場合、任意の子孫、細胞、組織、種子、種子油、またはそれらの部分を含む。
【０１１３】
形質または表現型：用語「形質」および「表現型」は、本明細書では同義で用いている。本開示では、特に関心の高い形質は、例えば作物植物において発現され得るような（例えば、殺虫性タンパク質の発現）、農耕学的に重要な形質を含む。
【０１１４】
ＩＶ．目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチド
本開示は、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを設計する方法であって、例えば、異種宿主細胞または生物において目的のポリペプチドの発現を増加させるように設計する方法を提供する。本明細書におけるいくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドは工学的に作製され、合成ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのポリアデニル化配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される少なくとも１つのポリアデニル化配列）を含有する基準遺伝子から誘導される。例えば、合成ポリヌクレオチドは、基準遺伝子からの少なくとも１つのポリアデニル化配列を同じ量で、コード配列の同じ場所に含むことがある。
【０１１５】
本明細書における実施形態は、上述に従って工学的に作製された、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを提供する。そのような合成ポリヌクレオチドは、遺伝子導入植物細胞、遺伝子導入植物組織、またはそのような植物細胞を含む植物において目的のポリペプチドを発現させる際の使用に特によく適しているだろう。
【０１１６】
本明細書における特定の実施形態の方法を用いて、当業者に公知の様々な理由で、例えば、発現を増加させるために、核酸配列を新たな宿主または生物において発現されるように適応させるために、ならびにコードされたポリペプチドに機能性および／または非機能性突然変異を導入するために、合成核酸配列を工学的に作製することができる。典型的に、目的のポリペプチドが天然に存在する遺伝子産物である、または天然に存在する遺伝子産物の一部分（例えば単離されたタンパク質ドメイン）である実施形態では、ポリペプチドをコードする天然に存在する基準ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムデータベースの検索またはソースゲノムからのクローニングによって得ることができる。多くの場合、そのような天然に存在する基準ポリヌクレオチドの相同体またはオルソログは、他の生物のゲノムにおいても見つけることができる。実施形態では、目的のポリペプチドのすべてまたは一部をコードする合成ポリヌクレオチドを、目的の任意のポリペプチドをコードする基準ポリヌクレオチドから設計または誘導することができる。特定の実施形態において、基準ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのポリアデニル化配列を含む。
【０１１７】
本明細書における実施形態において、目的のポリペプチドは、自然界に存在する任意のタンパク質もしくはポリペプチドであることもあり、または例えば、限定ではないが、そのようなタンパク質のプロセシングされた形態を含む、任意の天然に存在する変異体であることもある。目的のポリペプチドは、１つより多くの天然に存在するタンパク質の部分または断片を組み合わせることによって、例えば、機能性タンパク質ドメインの混合およびマッチングによって形成されたタンパク質であることもある。特定の実施形態の合成核酸は、例えば、限定ではないが、殺虫性タンパク質（例えばバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）からのもの）；除草剤、水および／もしくは熱ストレス耐性遺伝子の発現産物；植物油生産、貯蔵および／もしくは代謝に関与するタンパク質；ならびに／またはマーカー遺伝子の発現産物である、目的のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、植物におけるその発現が農耕学的形質である表現型をもたらすものであるか、または農耕学的形質の遺伝子移入または導入に有用なレポータータンパク質である。
【０１１８】
殺虫性タンパク質、例えば、鱗翅目ドライバー有害生物（Lepidoptera driver pest）に対する活性を有するものは、作物改良の極めて重要なツールである。バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）からのＣｒｙ１Ａｂタンパク質は、インビトロ食餌ベースアッセイを用いたとき、アワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（アワノメイガ）およびアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（アメリカタバコガ幼虫（ＣＥＷ））に対する活性を明示した。Ｃｒｙ１Ａｂは、確立された活性物質であり、このタンパク質の一形態は、昆虫抵抗性ＳＭＡＲＴ  ＳＴＡＸ（商標）製品に現在利用されている。ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）も成功した農業ツールである。切断形態のＣｒｙ１Ｆａタンパク質である、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）の活性成分は、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）（ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ））、アワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（アワノメイガ（ＥＣＢ））およびアメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（アメリカタバコガ幼虫(ＣＥＷ））をはじめとする、多くの肝要なトウモロコシ有害生物に対して効果があることが実証されている。
【０１１９】
昆虫は、切断型Ｃｒｙ毒素に結合する、中腸に位置する受容体の変化によって、Ｃｒｙ毒素の活性に対する抵抗性を発現することができる。Van Rie et al. (1990) Science 247(4938):72-4；Heckel et al. (2007) J. Invert. Pathol. 95(3): 192-7。昆虫のＣｒｙ毒素に対する抵抗性の発生を防止するまたは遅らせる１つの方法は、異なる作用様式を有する複数の毒素を植物において発現させることである。Roush (1998) Philos. Trans. B 353: 1777-86；Ives et al. (2011) Ecol. Appl. 21(2):503-15。本明細書における実施形態は、植物において昆虫抵抗性形質の活性を延期するための昆虫管理戦略の一部として、Ｃｒｙ１Ａｂおよび／またはＣｒｙ１Ｆａを昆虫抵抗性ポリペプチドとして用いる。そのような方法は、害虫の毒素抵抗性の発生を遅らせるのに特に都合がよい。
【０１２０】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするネイティブ／野生型遺伝子配列を同定および／または用意し、その後分析して、ポリアデニル化シグナル配列が存在するかどうかを判定する。本明細書における特定の実施形態において、目的のポリペプチドを発現する合成ポリヌクレオチドを工学的に作製する際の１ステップは、ポリヌクレオチドにおける、ＡＴＡＴＡＴ、ＴＴＧＴＴＴ、ＴＴＴＴＧＴ、ＴＧＴＴＴＴ、ＴＡＴＡＴＡ、ＴＡＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴ、ＡＴＴＴＴＴ、ＴＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＡＴＴ、ＴＡＡＴＡＡ、ＡＴＴＴＡＴ、ＴＡＴＡＴＴ、ＴＴＴＴＡＴ、ＡＴＡＴＴＴ、ＴＡＴＴＡＴ、ＴＧＴＴＴＧ、ＴＴＡＴＡＴ、ＴＧＴＡＡＴ、ＡＡＡＴＡＡ、ＡＴＴＴＴＴ、ＴＡＴＴＴＴ、ＴＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＡＴＴ、ＴＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡＴ、ＡＡＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＡ、ＴＡＡＴＴＴ、ＴＴＡＡＴＴ、ＡＡＡＴＴＴ、ＡＡＡＴＡＡ、ＡＴＡＴＴＴ、ＴＴＴＧＴＴ、ＴＴＧＴＴＴ、ＡＴＡＴＡＴ、ＡＴＴＡＴＴ、ＡＴＴＴＴＡ、ＴＴＡＡＴＴおよびＴＴＴＴＡＡからなる群から選択される望ましくないポリアデニル化シグナル配列の数を（基準遺伝子に対して）低減させることを含む。特定の実施形態では、ショー（Shaw）・ケイメン（Kamen）配列、ＡＴＴＴＡの出現も除去する。
【０１２１】
特定の実施形態では組み換えＤＮＡ技術の公知技法を用いて、異種ポリヌクレオチドの発現の制御を、例えば、限定ではないが、宿主細胞中のポリヌクレオチドのコピー数を操作することによって、それらのポリヌクレオチドが転写される効率を操作することによって、得られた転写物が翻訳される効率を操作することによって、および翻訳後修飾の効率を操作することによって改善することがある。さらなる例として、プロモーター配列を遺伝子操作して、宿主での発現レベルを基準プロモーターと比較して改善することもある。したがって、ポリヌクレオチド発現の制御に有用な技法には、例えば、限定ではないが、１つまたは複数の宿主細胞染色体へのポリヌクレオチドの組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えばプロモーター、オペレーターおよびエンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えばリボソーム結合部位およびシャイン・ダルガーノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用頻度に対応するポリヌクレオチドの修飾；および転写物を不安定化させる配列の欠失が含まれる。
【０１２２】
合成中に目的のコードされたポリペプチドの翻訳伸長速度に影響を及ぼし得る因子としては、例えば、ｔＲＮＡ濃度に依存する荷電ｔＲＮＡのレベル（Elf et al.（2003）Science 300: 1718-22）、ｔＲＮＡ荷電率、およびアミノ酸利用率が挙げられる。例えば、宿主生物のコドン使用頻度の偏向に従って低頻度（または非優先）コドンによって誘導される翻訳休止は、異種タンパク質発現速度を低下させることがある。低頻度コドンによって誘導される翻訳休止は、目的のポリヌクレオチド中の、宿主生物において使用頻度が低い、コドンの存在を含み、利用可能なｔＲＮＡプールにそのようなコドンが不足していることからタンパク質翻訳にマイナス影響を及ぼすこともある。これらの因子は、コドン−アンチコドン相互作用の強度、先行コドン（Ｐ部位コドン）、先行コドンのゆらぎ塩基、および読み取られるコドンのゆらぎ塩基に依存する、リボソームｔＲＮＡ選択の速度（解読速度）も含む。リボソーム忠実度に影響を及ぼし得る因子としては、リボソームフレームシフトに影響するもの、例えば、ホモポリマーストレッチ、Ｇ／Ｃアイランド、Ａ／Ｔアイランド、および休止部位付近のホモポリマーストレッチが挙げられる。さらに、一部のポリペプチドは、リボソーム出口チャネルで妨げられることもあり、これは、ポリペプチドの最初の１０〜２０アミノ酸の配列にある程度依存する。上記のことに鑑みて、宿主生物における最適な翻訳を改善する１つの方法は、合成ポリヌクレオチド中の低頻度宿主コドンが修飾される結果となり得る、コドン最適化の実施を含む。
【０１２３】
したがって、望ましくないポリアデニル化シグナル配列およびショー・ケイメン配列を除去することに加えて、合成ポリヌクレオチドが発現されることになる植物種に天然に存在する遺伝子において概して利用される頻度と大体同じ頻度でコドンを利用する、本明細書における合成ポリヌクレオチドを工学的に作製することができる。いくつかの実施形態において、合成ポリヌクレオチド工学的作製プロセスは、配列中の低頻度コドンを優先コドンで置き換えることによって、およびコード配列中の特定のポリアデニル化配列を保存することによって、コドン配列を最適化することを含む。
【０１２４】
表１は、トウモロコシおよびダイズでの使用を意図した合成遺伝子におけるコドン使用頻度の例示的目標百分率を提供するものである。これらの百分率は、例えば、より具体的なコドン使用頻度データが不在の場合に用いることができ、一般に双子葉植物に関しても、または一般に植物に関しても用いることができる。
【０１２５】
【表１−１】
2017504332.tif 000031
【０１２６】
【表１−２】
2017504332.tif 000032
【０１２７】
いくつかの実施形態において、開示する方法は、コードされたポリペプチドの一次構造が不変であるような、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の最適化を含む。コードされたポリペプチドの構造は、最大限、そのポリペプチドのアミノ酸配列によって左右される。したがって、コードされたポリペプチドの所望の構造がそのポリヌクレオチドコード配列に制約を課し、この制約は、遺伝コードの縮重および標準的なコドン使用頻度によって決まる。本発明の特定の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが目的のポリペプチドのすべてまたは一部をコードするコドン空間から選択される特異的コドン最適化配列を含むようにインシリコで工学的に作製され、特定のポリアデニル化配列の数および場所は、ネイティブポリヌクレオチドから合成ポリヌクレオチドへと保存される。選択される特異的ポリヌクレオチド配列の組み込みは、ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列に関連した特定の問題を回避することができ、例えば発現宿主生物のコドン使用頻度の偏向を参照することによって、コドン最適化されているに過ぎないポリヌクレオチドと比較したとき、１つまたは複数の所望の特性（例えば発現増進）を達成することができる。
【０１２８】
所定のパラメータに従って核酸分子（例えば、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）のコード配列を最適化するために様々な方法を当業者は利用することができる。例えば、当業者は、検査によって、例えば、発現宿主生物のコドン使用頻度の偏向によりよく合うように、コード配列を最適化することができる。より一般的には、コンピュータ利用ソフトウェアプログラムを使用して、コード配列を最適化することができる。そのようなソフトウェアプログラムは、目的のコードされたポリペプチドの発現に影響を及ぼし得る因子、転写物の翻訳開始速度に影響を及ぼし得る因子、およびコードされたポリペプチドまたはその前駆体の翻訳伸長速度に影響を及ぼし得る因子を含む群から選択される因子を最適化する、１つまたは複数のアルゴリズムを含むことできる。したがって、いくつかの実施形態では、所定のパラメータに従ってコード配列を最適化することができる、コンピュータ利用ソフトウェアプログラムに、基準ポリヌクレオチドをインポートすることができる。そのようなソフトウェアプログラムの特定の例としては、限定ではないが、ＯＰＴＧＥＮＥ（商標）（Ｏｃｉｍｕｍ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧ（商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（商標）（ワールドワイドウェブのgenomes.urv.es/OPTIMIZERで一般利用のために入手可能）およびＯＰＴＩＭＵＭＧＥＮＥ（商標）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）が挙げられる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドのアミノ酸配列を直接使用して、コドン最適化ポリヌクレオチド配列を得ることができる。特定の実施形態では、目的のポリペプチドのアミノ酸配列（例えば直接得たもの）を使用して、例えば、所定のパラメータに従ってコード配列を最適化することができるコンピュータ利用ソフトウェアプログラムを使用することにより、アミノ酸配列をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを推定すること（例えば、インシリコ逆翻訳）ができる。具体的な例では、標準遺伝コードと、発現宿主生物についての適切なコドン使用頻度の偏向の表とを使用して、コドン最適化ポリヌクレオチドを推定することができる。いくつかの実施形態では、目的の各ポリペプチドをコードする複数のコドン最適化ポリヌクレオチドを推定することが望ましいこともある。したがって、特定の例では、目的のポリペプチドを使用して、その目的のポリペプチドをコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のコドン最適化核酸配列を推定することができる。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードする推定コドン最適化ポリヌクレオチドをコンピュータ利用ソフトウェアプログラムによってテキストファイルにエクスポートすることができ、または実施者のために別様に記録することができる。例えば、コンピュータ利用ソフトウェアプログラムを、目的の単一のポリペプチドをコードする推定コドン最適化ポリヌクレオチドの全セットについての対応する数のテキストファイルにエクスポートすることができる。
【０１３０】
他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを、配列相同性によってアラインすることができる。特定の例では、目的のポリペプチドのポリアデニル化配列のすべてに対応する１つまたは複数の推定コドン最適化ポリヌクレオチドを、目的のポリペプチドをコードするネイティブポリヌクレオチドとアラインする。特定の例では、推定コドン最適化核酸配列は、タンパク質コード領域のセグメントに対応し、「ギャップ」を許さずにアラインメントを実行することができる。
【０１３１】
上述にしたがって、本明細書における方法を用いて、目的のポリペプチドをコードする単一のコドン最適化ポリヌクレオチドを提供することができる。特定の例では、ある方法を用いて、各々が目的のポリペプチドである１セットのコドン最適化ポリヌクレオチドを提供することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択されるポリアデニル化配列を、目的の全ポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドに、目的のポリペプチドの適正なリーディングフレームを維持しながら、選択されるポリアデニル化配列が、目的のポリペプチドをコードするネイティブ核酸配列中の特定のポリアデニル化配列のネイティブ位置に組み込まれるように、組み込むことができる。例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択される１セットのネイティブポリアデニル化配列のすべてのメンバーを、目的の全ポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドに、セットのすべてのメンバーが、全ポリヌクレオチド中の特定のポリアデニル化配列のそれらのネイティブ位置に組み込まれるように、組み込むことができる。したがって、本明細書におけるいくつかの実施形態を使用して、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを生産することができ、この場合、ネイティブポリヌクレオチドのいずれのポリアデニル化配列も、アラインされた合成、最適化ポリヌクレオチドの同じ位置に存在する。
【０１３３】
核酸の最適化は、例えば、異種タンパク質を生産する宿主の能力を改善するステップはもちろん、研究者が発現構築物を効率的に設計するのを支援するステップも含むことがある。核酸の最適化中に考慮され得る因子としては、限定ではないが、目的のコードされたポリペプチドの発現に影響を及ぼし得る因子、転写物の翻訳開始速度に影響を及ぼし得る因子、およびコードされたポリペプチドまたはその前駆体の翻訳伸長速度に影響を及ぼし得る因子を挙げることできる。１セットのコドン最適化配列の設計中に考慮されるこれらの因子の選択は、当業者の自由裁量の範囲内である。
【０１３４】
ポリヌクレオチドによってコードされる目的のポリペプチドの発現に影響を及ぼし得る因子は、ポリペプチドのアミノ酸をコードするために選択される特定のコドンによる影響を受けることもある。テンプレート核酸配列からのｍＲＮＡの生産速度に影響を及ぼす因子としては、転写に使用されるＲＮＡポリメラーゼのタイプ、発現系に存在するＲＮＡポリメラーゼのレベル、および使用される転写プロモーター配列を挙げることができる。ｍＲＮＡレベルもまたｍＲＮＡ分解速度による影響を受けることがあり、そしてまたその分解速度もｍＲＮＡ不安定化モチーフ、ＲＮＡｓｅ認識配列およびポリＡ付加シグナルによる影響を受けることがある。ｍＲＮＡレベルもまた、翻訳開始部位で、リボソーム結合部位で、開始コドンで、および／またはコード配列の最初の１０〜５０コドン付近で（またはオープンリーディングフレーム内、または後の他の箇所で）ｍＲＮＡ；オープンリーディングフレーム前または内に存在する転写終結モチーフ；ならびに転写された配列内のシグナル、例えば、ｍＲＮＡスプライシングおよび／または核輸送を指示、改変または修飾するものによる影響を受けることがある。テンプレート配列からのｍＲＮＡ生産速度に影響を及ぼす因子の特定の例は、ヌクレオチドリピートにより誘導されるポリメラーゼのスリッページである。ヌクレオチドリピートにより誘導されるポリメラーゼのスリッページは、フレームシフト突然変異を生じさせる結果となり得るＤＮＡポリメラーゼのスリッページまたはスタッタリング（stuttering）の原因となることが証明されている、ヌクレオチド配列反復を含む。そのようなヌクレオチドリピートは、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページの原因にもなり得る。例えば、高Ｇ＋Ｃ含有量の偏向を有する生物には、高いＧまたはＣヌクレオチド反復度がある場合がある。したがって、ＲＮＡポリメラーゼスリッページを誘導する可能性を低減させる１つの方法として、ＧまたはＣヌクレオチドの伸長リピートの改変が挙げられる。
【０１３５】
選択的翻訳開始（alternate translational initiation）および干渉ｍＲＮＡ二次構造は、特定の転写物の翻訳開始速度に影響を及ぼすことがある。選択的翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することができる１つまたは複数のモチーフを意図せず含有する合成ポリヌクレオチド配列で起こることがある。これらの部位は、遺伝子内部位からの切断型タンパク質の翻訳開始をもたらすことがある。精製中に除去することが困難であり得る切断型タンパク質を生じさせる可能性を低減させる１つの方法として、最適化ポリヌクレオチドからの推定内部ＲＢＳ配列の修飾が挙げられる。干渉二次構造は、ＲＢＳ配列または開始コドンを離隔することがあり、タンパク質発現の低減との相関関係が証明されている。ステムループ構造も転写減衰および衰弱に関与し得る。それ故、最適化ポリヌクレオチドは、転写および翻訳改善を可能にするためにＲＢＳおよび遺伝子コード領域にできるだけ二次構造を含有しないだろう。
【０１３６】
異種タンパク質発現に影響を及ぼし得るポリヌクレオチド配列エレメントのもう１つのクラスは、制限部位を含むことがある。それ故、本明細書におけるポリヌクレオチドの最適化は、例えば、宿主発現ベクターへの転写単位のその後のサブクローニングに干渉し得る制限部位の修飾を含むことがある。
【０１３７】
ポリヌクレオチド配列のすべてが最適化されることもあり、または一部分が最適化されることもある。いくつかの例において、所望の発現修飾は、ネイティブ遺伝子の特定のポリアデニル化配列を保存しつつ本質的に全遺伝子を最適化することによって達成されることがある。他の例では、所望の修飾は、遺伝子のすべてでなく一部を最適化することによって達成されることもある。そのような最適化の出発点は、発現宿主のコドン使用頻度の偏向に従って、高頻度利用コドンもしくは優先コドンのみからなるコード配列であることもあり、または高頻度コドンと非高頻度コドンの混合物を含有するコード配列であることもある。ポリヌクレオチドの最適化は、遺伝子発現もしくはタンパク質生産にマイナスに作用することもあり、またはプラスに作用することもある。例えば、より高頻度のコドンで低頻度または非優先コドンを置き換えることは、置き換えられたコドンを含む配列から転写されたｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼすことがあり、またはその構造を、その翻訳に干渉するに二次構造を導入することによって改変することもある。したがって、特定の事例では、最適化されたポリヌクレオチドをさらに改変することが必要なこともある。
【０１３８】
いくつかの実施形態の中で、ネイティブ遺伝子の特定のポリアデニル化配列を保存しつつ目的のポリペプチドをコードするコドン最適化配列を含む合成ポリヌクレオチドは、１つより多くの最適化配列を含むことがある。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、本明細書に記載の複数のポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードすることもあり、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドと無関係の配列とを含む融合ポリペプチドをコードすることもある。融合ポリペプチドは、両方の成分ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳を可能にするような標準的技術（化学的コンジュゲーションを含む）を用いて調製することができる。ペプチドリンカー配列を用いて、融合ポリペプチドのポリペプチド成分を、各ポリペプチドが適切な二次構造および三次構造に確実に折り重なるために十分な距離だけ離すことができる。当技術分野における標準的技術を用いて、そのようなペプチドリンカー配列を融合ポリペプチドに組み込むことができる。
【０１３９】
多くの実施形態において、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子の非コード領域も最適化されることがある。例えば、合成ポリヌクレオチドの上流、下流または中（例えばイントロン）のいずれかに特定の非コード配列を含むことが望ましいことがある。したがって、いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドを含む核酸分子に含まれている任意の非コード配列の配列が本明細書における方法では考慮され得る。
【０１４０】
目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含む核酸を、様々な用途での使用のために、例えば、組み換えポリペプチドを生産するために、新たな発現系を発生させるために、発現特性を他の核酸配列のものと比較するために、および診断用途のために発現させることができる。
【０１４１】
Ｖ．分岐、コドン最適化核酸配列の発現
本明細書におけるいくつかの実施形態は、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを植物細胞に導入して目的のポリペプチドを細胞において発現させることを含むプロセスによって、植物、植物組織、植物材料および／または植物全体において望ましい表現型または形質を得る方法を提供する。特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、細胞では通常は見られない異種ポリペプチドである。
【０１４２】
目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含む核酸構築物（例えばベクター）を特定の実施形態では発現宿主の形質転換に用いることができ、この場合、構築物を発現宿主のゲノムに組み込むことができる。構築物は、転写および翻訳開始および終結領域を少なくとも含むことができ、合成ポリヌクレオチドは、その開始領域と終結領域の間に、それらの領域の調節制御下に位置することができる。構築物は、選択マーカーおよび／または他の機能性配列、例えば、限定ではないが、宿主ゲノムへの組み込みのための相同配列、ＰＣＲプライマーにハイブリダイズするための配列、および制限部位をさらに含むこともある。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、発現宿主は、例えば植物組織培養または植物全体の植物細胞などの、植物細胞であり得る。本発明の実施形態は、植物細胞を見つけられる任意の組織またはあらゆる場所（胚、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、茎、および組織培養を含むがこれらに限定されない）からの植物細胞を含むことができる。合成ポリヌクレオチドを適切なベクターに組み込むことができ、当業者に公知の任意の方法で植物細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターでの形質転換、プラスミドベクターでの形質転換、エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）、リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）、マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）、直接ＤＮＡ取り込み、および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）を限定ではないが含む方法によって、核酸分子を植物細胞に導入することができる。
【０１４４】
他の実施形態では、合成ポリヌクレオチドを含むベクターを植物細胞の特定の部分に（例えば、ナノ粒子照射によって）導入することがある。核酸分子を導入することができる植物細胞の特定の部分の例としては、サイトゾル、核、液胞膜、色素体、エチオプラスト、有色体、ロイコプラスト、脂肪体、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１４５】
細胞形質転換（植物細胞形質転換を含む）は、特定の細胞において機能することになる発現ベクターの構築を含むことがある。そのようなベクターは、調節エレメント（例えばプロモーター）の制御下にある遺伝子、または調節エレメント（例えばプロモーター）に作動的に連結された遺伝子を含む、ＤＮＡを含むことがある。発現ベクターは、そのような作動可能に連結された遺伝子／調節エレメントの組み合わせを１つまたは複数含有することもある。ベクターはプラスミドの形態であることがあり、単独で使用して、または他のプラスミドと併用して、導入遺伝子を植物細胞の遺伝子材料に導入するための本明細書に記載の形質転換方法を用いて形質転換細胞をもたらすことができる。
【０１４６】
植物細胞発現ベクターは、調節エレメント（例えばプロモーター）に作動可能に連結された少なくとも１つの遺伝子マーカーを含むことがあり、調節エレメントによって、マーカーを含有する形質転換細胞の負の選択（すなわち、選択可能マーカー遺伝子を含有しない細胞の成長を阻害すること）または正の選択（すなわち、遺伝子マーカーによりコードされた産物についてスクリーニングすること）いずれかによる選択が可能になる。植物形質転換に好適な多くの選択可能マーカー遺伝子が形質転換技術分野では周知であり、例えば、抗生物質もしくは除草剤であり得る選択的化学物質を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害剤に対して非感受性であり得る改変された標的をコードする遺伝子を含む。２、３の正の選択方法も当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、植物形質転換に好適な選択可能マーカー遺伝子としては、カナマイシンに対する抵抗性を付与する、植物調節シグナルの制御下にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子（例えば、Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803参照）；抗生物質、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5:299参照）；ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼおよびブレオマイシン抵抗性決定因子を含む、抗生物質に対する抵抗性を付与する細菌由来のマーカー遺伝子（Hayford et al. (1988) Plant Physiol. 86:1216；Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86；Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:197；およびHille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7：171参照）；グリホサート、グルホシネートまたはブロモキシニルなどの除草剤に対する抵抗性を付与するマーカー遺伝子（Comai et al. (1985) Nature 317:741-744；Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618；およびStalker et al. (1988) Science 242:419-423参照）；ならびに例えばマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、植物５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼおよび植物アセト乳酸シンターゼを含む、細菌由来でないマーカー遺伝子（Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67；Shah et al. (1986) Science 233:478；およびCharest et al. (1990) Plant Cell Rep. 8:643参照）を挙げることができる。
【０１４７】
植物形質転換に好適なマーカー遺伝子のもう１つのクラスは、抗生物質などの毒性物質に対する抵抗性についての形質転換細胞の直接遺伝子選択ではなく、推定形質転換植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、特定の組織での遺伝子の空間的発現パターンを定量または可視化するのに特に有用であり得、これらの遺伝子は、遺伝子発現の研究のための遺伝子または遺伝子調節配列に融合することができるので、レポーター遺伝子と呼ばれることが多い。形質転換細胞のスクリーニングに一般に使用される遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。Jefferson（1987）Plant Mol. Biol. Rep. 5:387；Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343；Koncz et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:131；およびDeBlock et al. (1984) EMBO J. 3:1681を参照されたい。植物組織の検出を必要としないインビボＧＵＳ活性を可視化する方法が利用可能である。Molecular Probes publication 2908（1993）IMAGENE GREENTM, pp. 1-4；およびNaleway et al. (1991) J. Cell Biol. 115：151。蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰおよびＹＦＰ）をコードする遺伝子も、原核および真核細胞における遺伝子発現にマーカーとして利用されている。Chalfie et al. (1994) Science 263:802を参照されたい。このように、蛍光タンパク質、および蛍光タンパク質の突然変異をスクリーニング可能マーカーとして使用することができる。
【０１４８】
植物発現ベクターに含まれている合成ポリヌクレオチドの発現は、調節エレメント、例えばプロモーター、を含むヌクレオチド配列によって駆動されることがある。植物細胞において有用なプロモーターのいくつかのタイプが今では形質転換細胞技術分野において周知であり、単独で使用またはそのようなプロモーターと併用することができる他の調節エレメントも周知である。
【０１４９】
用語「プロモーター」は、転写開始から上流であり得るＤＮＡ領域であって、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始させる他のタンパク質の認識および結合に関与し得るＤＮＡの領域を指す。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始させることができるプロモーターであり得る。発生制御下のプロモーターの例としては、特定の組織、例えば葉、根、種子、繊維、木部導管、仮導管または厚壁組織、において転写を優先的に開始させるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターを「組織優先的」と言う。特定の組織においてのみ転写を開始させるプロモーターを「組織特異的」と言う。「細胞タイプ特異的」プロモーターは、１つまたは複数の器官の特定の細胞タイプ、例えば、根または葉の維管束細胞での発現を主として駆動する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあり得るプロモーターであることができる。誘導性プロモーターによって転写に影響を及ぼすことがある環境条件の例としては、限定ではないが、嫌気性条件および光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞タイプ特異的および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、殆どの環境条件下で活性であり得るプロモーターである。
【０１５０】
誘導性プロモーターは、細胞での発現のために本発明の最適化ヌクレオチド配列に作動可能に連結されることがある。場合により、誘導性プロモーターは、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されることがあり、ヌクレオチド配列が、細胞での発現のために本発明のヌクレオチド配列に作動可能に連結されることがある。誘導性プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写速度は、誘導剤に応じて増加し得る。いずれの誘導性プロモーターを本発明において使用してもよい。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366を参照されたい。例示的誘導性プロモーターとしては、銅に応答するＡＣＥＩ系からのもの（Mett et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4567-71）；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシからのＩｎ２遺伝子（Hershey et al. (1991) Mol. Gen Genetics 227:229-37；およびGatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-8）；およびＴｎ１０からのＴｅｔリプレッサー（Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-37）が挙げられるが、これらに限定されない。特に有用な誘導性プロモーターは、植物が通常は応答しない誘導剤に応答するプロモーターであり得る。例示的誘導性プロモーターは、転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導され得るステロイドホルモン遺伝子からの誘導性プロモーターであり得る。Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88：10421-5。
【０１５１】
あるいは、構成的プロモーターが、細胞での発現のために合成ポリヌクレオチドに作動可能に連結されることもあり、または構成的プロモーターが、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、該ヌクレオチド配列が、細胞での発現のために合成ポリヌクレオチドに作動可能に連結されることもある。様々な構成的プロモーターを本発明において用いることができる。例示的構成的プロモーターとしては、植物ウイルスからのプロモーター、例えばＣａＭＶからの３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-2）；イネアクチン遺伝子からのプロモーター（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-71）；ユビキチンからのプロモーター（Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-32；およびChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-89）；ｐＥＭＵからのプロモーター（Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-8）；ＭＡＳからのプロモーター（Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-30）；およびトウモロコシＨ３ヒストンからのプロモーター（Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genetics 231:276-85；およびAtanassova et al. (1992) Plant Journal 2(3):291 -300）が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＬＳプロモーター、すなわち、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’側のＸｂａ１／ＮｃｏＩ断片（または前記Ｘｂａ１／ＮｃｏＩ断片とのヌクレオチド配列類似性）は、特に有用な構成的プロモーターである。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ９６／３０５３０を参照されたい。
【０１５２】
あるいは、組織特異的プロモーターが、細胞での発現のために合成ポリヌクレオチドに作動可能に連結されることもある。場合により、組織特異的プロモーターが、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、該ヌクレオチド配列が、細胞での発現のために合成ポリヌクレオチドに作動可能に連結されることもある。組織特異的プロモーターに作動可能に連結された合成ポリヌクレオチドで形質転換された植物は、特異的組織において排他的にまたは優先的に合成ポリヌクレオチドのタンパク質産物を生産することができる。任意の組織特異的または組織優先的プロモーターを特定の実施形態において用いることができる。例示的組織特異的または組織優先的プロモーターとしては、根優先的プロモーター、例えば、ファセオリン遺伝子からのもの（Murai et al. (1983) Science 23 :476-82；およびSengupta-Gopalan et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-4）；葉特異的および光誘導プロモーター、例えば、ｃａｂまたはｒｕｂｉｓｃｏからのもの（Simpson et al. (1985) EMBO J. 4(11):2723-9；およびTimko et al. (1985) Nature 318:579-82）；葯特異的プロモーター、例えば、ＬＡＴ５２からのもの（Twell et al. (1989) Mol. Gen. Genetics 217:240-5）；花粉特異的プロモーター、例えば、Ｚｍ１３からのもの（Guerrero et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 244: 161 -168）；および小胞子優先的プロモーター、例えばａｐｇからのもの（Twell et al. (1993) Sex. Plant Reprod. 6:217-224）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
合成ポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドの細胞内区画、例えば葉緑体、空胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁もしくはミトコンドリアへの輸送、またはアポプラストへの分泌のための輸送は、ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドの５’および／または３’領域にシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結させることによって果たすことができる。構造遺伝子の５’および／または３’末端に配列を標的化することで、コードされたタンパク質が最終的にどこに区画化されるかを、タンパク質合成およびプロセシング中に決めることができる。あるいは、細胞内区画を標的にするタンパク質をナノ粒子に直接連結させて、目的の分子でコーティングされたナノ粒子を所望の細胞内区画に指向させることができる。多くのシグナル配列が当技術分野において公知である。例えば、Becker et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:49；Close, P. S. (1993) Master's Thesis, Iowa State University; Knox et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:3-17；Lerner et al. (1989) Plant Physiol. 91:124-129；Fontes et al. (1991) Plant Cell 3 :483-496；Matsuoka et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:834；Gould et al. (1989) J. Cell. Biol. 108：1657；Creissen et al. (1991) Plant J. 2:129；Kalderon et al. (1984) Cell 39:499-509；およびSteifel et al. (1990) Plant Cell 2:785-793を参照されたい。
【０１５４】
発現宿主が多細胞生物（例えば植物）である実施形態では、ベクターまたはＤＮＡ構築物を多細胞生物の１つまたは複数の細胞に導入し、そこで発現させることがある。いくつかの例では、導入されたベクターまたはＤＮＡ構築物を含む多細胞生物の１つまたは複数の細胞から生物全体が生産されることもある。例えば、目的の核酸分子で形質転換された植物細胞から植物全体を再生し、そしてその後、核酸分子がゲノムに組み込まれている植物を選択する方法は、当技術分野において公知である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本明細書における実施形態で使用するための発現宿主が、多細胞生物であることに加えて、単細胞原核または真核生物であってもよいことは、理解されるであろう。様々な発現系を本発明の最適化核酸配列からのポリペプチドの発現に使用することができる。発現宿主は、例えば、細菌、藻類、真菌（例えば酵母）、昆虫細胞、動物細胞、バキュロウイルス、および哺乳動物組織培養物を含む群から選択することができる。
【０１５６】
特定の実施形態において、発現系は、例えば、限定ではないが、細菌発現系、例えば大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ属種（Salmonella spp.）、バチルス属種（Bacillus spp.）、ストレプトマイセス属種（Streptomyces spp.）、シュードモナス属種（Pseudomonas spp.）（例えばシュードモナス・フルオレッセンス（P. fluorescens））、ラストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、クラミドモナス属種（Chlamydomonas spp.）；サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）およびカンジダ属種（Candida species）、出芽酵母（S. cerevisiae）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、メチロトーフ酵母（P. methanolica）ならびにＫ．ラクチス（K. lactis）を含む、酵母発現系；クリプトスポリジウム属（Cryptosporidium spp.）およびトリコデルマ属種（Trichoderma spp.）を含む、真菌発現系；糸状菌タンパク質生産系；熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびリーシュマニア（Leishmania）を含む、原生動物発現系；エレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびアフリアツメガエル（Xenopus laevis）を含む、モデル生物；植物細胞（例えば、ダイズ、インゲンマメ、トウモロコシ、ワタ、タバコおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis）を含む）；ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、および線維芽細胞、例えば３Ｔ３細胞を含む、組織培養発現系；アデノウイルスに感染した細胞株；昆虫細胞株、例えば、バキュロウイルスを成長させるためのスポドプテラ属種（Spodptera spp.）に由来するもの；疾患の研究およびＤＮＡワクチンの有効性試験のためのモデル生物、例えば、マカク、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ヤギおよびウサギ；生細胞の抽出物、例えば大腸菌（E. coli）抽出物、小麦胚芽抽出物、ウサギ網状赤血球ライセート抽出液から調製されたインビトロ発現系；ならびに精製された個々の成分の会合によって調製されたインビトロ発現系であってもよい。
【０１５７】
例えば、限定ではないが、植物を含む、遺伝子修飾生物での遺伝子発現方法は、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態は、目的の異種ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター（例えばプラスミド）を含む。組み換えベクターは、選ばれた核酸の操作および／またはそのような核酸の宿主細胞への導入のためのツールとして使用される、工学的に作製された（例えば人工的に生産された）核酸分子である。したがって、組み換えベクターは、含有するポリヌクレオチドを、例えば、該ポリヌクレオチドを発現させることおよび／または該ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達して組み換え細胞を形成することにより、クローニング、シークエンシングおよび／または別様に操作する際の使用に好適であり得る。ベクターは、天然にはクローニングまたは送達されるポリヌクレオチドに隣接して見つからないヌクレオチド配列を含有することがある。ベクターは、ポリヌクレオチドに隣接して天然に見つけられる、またはポリヌクレオチドの発現に有用である、調節核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）を含有することもある。組み込まれたポリヌクレオチドは、染色体プロモーター制御下にあることもあり、ネイティブもしくはプラスミドプロモーター制御下にあることもあり、またはいくつかのプロモーター制御の組み合わせの下にあることもある。ベクターは、ＲＮＡもしくはＤＮＡいずれであってもよく、原核性または真核性のいずれであってもよい。ベクターを染色体外エレメント（例えばプラスミド）として維持することができ、または組み換え生物（例えば微生物、酵母および植物細胞）の染色体に組み込むことができる。ベクター全体を宿主細胞内の適所に維持することができ、または特定の条件下で、目的の異種ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを残して外来性ＤＮＡ（例えば不必要なプラスミド配列）を検出することができる。異種ポリヌクレオチドの単一または複数のコピーを宿主ゲノムに組み込むことができる。本発明の組み換えベクターは、少なくとも１つの選択可能マーカーを含有することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、目的の異種ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、発現ベクター、例えば植物発現ベクターである。そのような実施形態において、生産される産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、組み換え宿主細胞内の核酸配列の転写および翻訳を可能にするベクター中の調節配列にポリヌクレオチドを作動可能に連結させるように組み換えベクターに挿入することができる。様々な生物および細胞の形質転換に有用なベクターが当技術分野において公知である。通常、ベクターは、選択可能マーカーと、所望の宿主における自律複製または染色体組み込みを可能にする配列とを含有する。
【０１５９】
宿主細胞の好適な形質転換方法としては、ＤＮＡを細胞に導入することができる任意の方法、例えば、プロトプラストの形質転換による方法（例えば米国特許第５，５０８，１８４号参照）、乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込みによる方法（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8）、エレクトロポレーションによる方法（例えば米国特許第５，３８４，２５３号参照）、炭化ケイ素線維での撹拌による方法（例えば米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換による方法（例えば米国特許第５，５６３，０５５号、同第５，５９１，６１６号、同第５，６９３，５１２号、同第５，８２４，８７７号、同第５，９８１，８４０号および同第６，３８４，３０１号参照）、およびＤＮＡ被覆粒子の加速による方法（例えば米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、同第６，３９９，８６１号および同第６，４０３，８６５号参照)が挙げられる。これらの方法などの技術の適用により、単子葉植物と双子葉植物の両方を含む事実上あらゆる種の細胞を安定的に形質転換することができる。いくつかの実施形態では、形質転換するＤＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞種の場合、遺伝子導入細胞は、遺伝子導入生物に再生され得る。これらの技術のいずれかを用いて、例えば、目的の異種ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを遺伝子導入のゲノム内に含む遺伝子導入単子葉または双子葉植物を生産することができる。
【０１６０】
植物に発現ベクターを導入するために最も広く用いられている方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然形質転換系に基づく。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝子的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、植物の遺伝子形質転換に責任を負う遺伝子をそれぞれ有する。Ｔｉ（腫瘍誘発）プラスミドは、形質転換植物に移入される、Ｔ−ＤＮＡとして公知の、大きいセグメントを含有する。Ｔｉプラスミドのもう１つのセグメントであるｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ移入に責任を負う。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端リピートに隣接している。修飾バイナリーベクターでは、腫瘍誘発遺伝子が欠失しており、ｖｉｒ領域を用いて外来遺伝子をＴ−ＤＮＡ境界配列に隣接して移入する。Ｔ−領域は、遺伝子導入植物および細胞の効率的回収のための選択可能マーカー、ならびにｄｓＲＮＡコード核酸などの移入用の配列を挿入するための複数のクローニング部位も含有することがある。
【０１６１】
したがって、特定の実施形態において、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば米国特許第４，５３６，４７５号、同第４，６９３，９７７号、同第４，８８６，９３７号および同第５，５０１，９６７号、ならびに欧州特許ＥＰ０１２２７９１参照）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドに由来する。さらなる植物形質転換ベクターとしては、例えば、限定ではないが、Herrera-Estrella et al (1983) Nature 303:209-13、Bevan et al (1983) Nature 304:184-7およびKlee et al (1985) Bio/Technol. 3:637-42によって記載されたもの、欧州特許ＥＰ０１２０５１６に記載されているもの、ならびに前述のいずれかのものから誘導されるものが挙げられる。植物と天然に相互作用する他の細菌、例えばシノリゾビウム（Sinorhizobium）、根粒菌（Rhizobium）およびメソリゾビウム（Mesorhizobium）を、いくつかの多様な植物への遺伝子移入を媒介するように修飾することができる。これらの植物関連共生細菌は、武装解除したＴｉプラスミドと好適なバイナリーベクターの両方の獲得によって遺伝子移入に適任なものになることができる。
【０１６２】
外来性ＤＮＡを受容細胞に供給した後、一般に、形質転換細胞をさらなる培養および植物再生のために同定する。形質転換細胞の同定能力を向上させるために、形質転換体を生成するために使用される形質転換ベクターとともに、前に述べたような選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を用いることが望ましいこともある。選択可能マーカーを使用する場合、形質転換された可能性のある細胞集団の中の形質転換細胞を、選択剤に曝露することによって同定する。スクリーニング可能マーカーを使用する場合、所望のマーカー遺伝子の形質について細胞をスクリーニングすることができる。
【０１６３】
選択剤への曝露を乗り切る細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性スコアを得た細胞は、植物の再生を支援する培地で培養することができる。いくつかの実施形態では、任意の好適な植物組織培養培地（例えばＭＳおよびＮ６培地）を、成長調節物質などのさらなる物質を含めることによって修飾することができる。成長調節物質を含有する基礎培地で、植物再生努力を始めるために十分な組織を利用できるようになるまで、または手作業での選択の反復ラウンド後、組織の形態が再生に好適になるまで（例えば少なくとも２週間）、組織を培養し、その後、芽形成を助長する培地に移してもよい。十分な芽形成が起きてしまうまで、培養物を定期的に移す。芽が形成されたら、根の形成を助長する培地に移す。十分な根が形成されたら、さらなる成長および成熟のために植物を土壌に移すことができる。
【０１６４】
再生する植物中の目的の核酸分子（例えば、目的の異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド）の存在を確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイとしては、例えば、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲならびに核酸シークエンシング；生化学的アッセイ、例えば、タンパク質生成物の存在の、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／もしくはウエスタンブロット）によるまたは酵素的機能による、検出；植物部位アッセイ、例えば、葉または根のアッセイ；ならびに再生植物全体の表現型の分析が挙げられる。
【０１６５】
例えば、ＰＣＲ増幅、例えば目的の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、組み込み事象を分析してよい。ＰＣＲ遺伝子型判定は、ゲノムに組み込まれた目的の核酸分子を含有すると予測される単離された宿主植物カルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、続いて、ＰＣＲ増幅産物の標準的クローニングおよび配列分析を、これらに限定されるものではないが、含むと理解される。ＰＣＲ遺伝子型判定方法は十分に説明されており（例えば、Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53）、任意の植物種（例えば、トウモロコシ（Z. mays）もしくはダイズ（G. max））または組織タイプ（細胞培養物を含む）に由来するゲノムＤＮＡに適用することができる。
【０１６６】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換方法を用いて形成された遺伝子導入植物は、１つの染色体に挿入された単一の組み換えポリヌクレオチドを通常は含有する。この単一の組み換えポリヌクレオチドは、「遺伝子導入事象」または「組み込み事象」と言われる。そのような遺伝子導入植物は、挿入された外来性配列に対してヘテロ接合性である。いくつかの実施形態において、導入遺伝子に対してホモ接合性の遺伝子導入植物は、単一の外来性遺伝子を含有する独立分離個体遺伝子導入植物をそれ自体に、例えばＴ０植物に、性的交配（自家受粉）して、Ｔ１種子を生産することによって得ることができる。生産されるＴ１種子の４分の１は、導入遺伝子に対してヘテロ接合性となる。Ｔ１種子の発芽は、ヘテロ接合性について試験することができる植物をもたらし、この試験には、通常、ヘテロ接合体とホモ接合体間の区別を可能にするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち接合状態アッセイ）を用いる。
【０１６７】
組み換え核酸分子での植物の直接形質転換に加えて、少なくとも１つの遺伝子導入事象を有する第１の植物とそのような事象のない第２の植物を交配することによって、遺伝子導入植物を調製することができる。例えば、目的の異種ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む組み換え核酸分子を、形質転換を受け入れる第１の植物系統に導入して遺伝子導入植物を生産してもよく、この遺伝子導入植物を第２の植物系統と交配させて、ポリヌクレオチドを第２の植物系統に遺伝子移入してもよい。
【０１６８】
組み換え宿主の上述の遺伝子操作は、標準的遺伝子技術およびスクリーニングを用いて行うことができ、遺伝子操作に好適である任意の宿主細胞において行うことができる。いくつかの実施形態において、組み換え宿主は、双子葉植物と単子葉植物の両方を含む高等植物、および作物植物を含む消費用植物である。したがって、任意の植物種または植物細胞を選択することができる。
【０１６９】
本明細書における特定の実施形態は、細胞質および／または細胞の周辺質において目的の異種ポリペプチドを生産する方法を提供する。いくつかの実施形態は、宿主生物（例えば細菌宿主生物）における異種発現のために最適化された合成ポリヌクレオチドを用いる。特定の実施形態では、そのような最適化合成ポリヌクレオチドを発現ベクターに連結させることがあり、最適化ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを発現宿主細胞に（例えば形質転換によって）導入することがあり、その発現宿主細胞においてポリペプチドが最適化合成核酸配列から発現される。
【０１７０】
目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含む核酸分子を当業者に公知の方法によって生産することができる。例えば、いくつかの実施形態では、所望の核酸配列の比較的短いセグメントを確実に合成し、その後、連鎖させることができる。ＤＮＡ合成分野における進歩によって、比較的短いポリヌクレオチドばかりでなく、より長いポリヌクレオチドの確実な生産も可能になった。合成技術によって塩基数３００以上のかなり正確なオリゴヌクレオチド合成が可能になる。したがって、他の実施形態では、より長いポリヌクレオチドが合成されることがあり、その結果、濃縮を必要としないこともある。しかし、化学的に生産された合成オリゴヌクレオチドは、通常は２０ｂｐ〜１００ｂｐの間の長さである。いくつかの実施形態では、最終所望配列をコードするように設計された合成交互および重複センスおよびアンチセンスオリゴマー（例えば長さが９０〜１１０ｂｐ）のアニールおよび伸長による段階的ＰＣＲを用いて、合成遺伝子または遺伝子断片を調製することができる。
【０１７１】
オリゴヌクレオチド生産は、固相合成のようなホスホロアミダイトプロトコルによって行われるオリゴ合成を含むことがある。簡単に言うと、ＤＭＴ基によって保護された５’−ＯＨ官能基を有する第１のヌクレオチドを固相としてのポリスチレンビーズに結合させることができる。次に、ＤＭＴ基を酸処理によって除去して、遊離５’−ＯＨ基を生成することができる。その後、選ばれたホスホロアミダイトを添加し、弱酸性条件で反応性中間体に転化させ、遊離５’−ＯＨ基に結合させて新規亜リン酸結合を生成することができる。これらの反応をＴＨＦまたはＤＭＳＯ中で行うことができる。付加されたヌクレオチドの５’−ＯＨは保護されたままであるので、１つのヌクレオチドしか成長鎖に付加されない。反応しない５’−ＯＨ基は、合成プロセスに参加し続けることができないように、および欠失があるオリゴヌクレオチドを生成できないように、キャップすることができる。このキャッピングを酢酸および１−メチルイミダゾールでの処理後のアセチル化によって果たすことができる。最後に、水およびヨウ素を添加して亜リン酸結合をリン酸ジエステル結合に酸化することができる。ステップ間に、生産系を好適な溶媒での洗浄によってコンディショニングすることができる。この一連のステップを必要に応じて反復した後、最後にオリゴヌクレオチドをカラムから切断し、高温の水酸化アンモニウムで処理してすべての残存保護基を除去することができる。このプロセスは、例えばＮＩＭＢＬＥＧＥＮ（商標）（Ｆｅｂｉｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供されているような、フォトリソグラフィーアプローチの使用によって、より効率的にすることができる。
【０１７２】
短いオリゴヌクレオチドを固相合成によって生産した後、それらのオリゴヌクレオチドからより大きいＤＮＡ断片、例えば約５００ｂｐのサイズをアセンブルすることができる。これは、様々な酵素援用方法の１つによって通常は果たされる。例えば、短い重複オリゴヌクレオチドペアを使用して、クレノウ（Klenow）伸長反応によってより長いｄｓＤＮＡ分子を生成することができる。対応するオリゴヌクレオチドを混合し、ハイブリダイズし、その後、ＰＣＡによってより長い構築物へと転化させることができる。ＰＣＡ反応には、標的２本鎖ＤＮＡ断片を一緒に表すすべてのオリゴヌクレオチドが存在する。融解および再ハイブリダイゼーションを反復することによって、特定の集団が所望の長さに達するまでオリゴヌクレオチドを段階的に伸長させてより長い切片にする。この反応が過剰な末端オリゴヌクレオチドなしに行われ、そのため増幅反応ではないことに留意されたい。もっと正確に言えば、すべての完全長断片はオリゴヌクレオチドおよびそれらの伸長部分からなり、その結果、ポリメラーゼ反応によって誤りが導入される機会が低減される。ＰＣＡの代替方法論は、末端プライマーをオリゴヌクレオチドプールに加え、その結果、オリゴヌクレオチドの特異的サブセットのみを増幅する、ポリメラーゼアセンブリ多重化（ＰＡＭ）である。ＰＡＭ反応の第２ラウンドでは、新規プライマーセットを使用することにより複数のオリゴヌクレオチドを単一ＤＮＡ分子に組み換えることができる。
【０１７３】
大きいオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＡ、ＰＭＡなどによって生産されるオリゴヌクレオチド）から、例えば制限消化およびライゲーションによって、よりいっそう大きいＤＮＡをアセンブルすることができる。
【０１７４】
アミノ酸反復領域を含む目的のポリペプチドを原核細胞または発現系において発現させることになる実施形態では、目的のポリペプチドをコードする最適化されたポリヌクレオチドを、核酸配列挿入のためのベクター（複製起点と、ポリリンカーを含み得る適便な制限部位とを有するベクター）を直線化することによって、先ず原核生物ベクターにクローニングすることができる。ベクターは、抗生物質抵抗性を付与することまたは別の識別特性（例えば発色団またはフルオロフォア形成）をもたらすことができる、選択のためのマーカー遺伝子も有することもある。マーカー援用選択に用いることができる様々な抗生物質試薬（例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アクチノマイシン、ネオマイシン、アンピリシン、ハイグロマイシン、重金属など）がある。他のマーカーとしては、発現されると基質Ｘ−ｇａｌを転化させて青色をもたらす、□−ガラクトシダーゼが挙げられる。細菌でのクローニング用の非常にいくつかのベクターが市販されており、これらのベクターは当業者に周知である。いくつかの実施形態では、その後、目的のポリペプチドをコードする１つまたは複数の最適化合成ポリヌクレオチドを含む原核細胞ベクターを、リン酸カルシウム沈殿ＤＮＡ、融合、トランスフェクションおよび接合を限定ではないが含む任意の適便な手段によって、適切なクローニング宿主に導入することができる。その後、細胞を適切な選択的栄養培地で成長させることができる。生存細胞を回収し、溶解し、プラスミドを単離することができる。
【０１７５】
原核細胞発現ベクターは、適切な発現宿主において通常はエピソームの維持のために機能する複製起点と、選択のためのマーカーとを有することを特徴とし得る。組み込まれていないベクターまたは構築物については、複製起点は、多コピー、例えば、平均で少なくとも５コピーを普通はもたらすことになる。発現ベクターは、発現宿主において機能するプロモーターも有することになる。いくつかのプロモーターが利用可能であり、特定のプロモーターは、例えば、高レベルの誘導性転写または構成的転写いずれかをもたらすことができる。いくつかの実施形態において有用であり得る説明に役立つプロモーターとしては、限定ではないが、□−ラクタマーゼ、□−ガラクトシダーゼ、□ＰＩまたは□ΡＲプロモーター、ｔｒｐＥプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター（特に遺伝子９および１０）、およびｃＩｔｓが挙げられる。
【０１７６】
最適化ポリヌクレオチドを含む核酸分子と直線化ベクターとをハイブリダイゼーション、例えばライゲーションによって結合させることができる。最適化ポリヌクレオチドが開始コドンを有さない場合、そのようなコドンを付加させることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、ベクター中（適切なリーディングフレーム内）に存在するコード配列に、プロモーターの転写制御下で挿入することができる。シグナル配列をコード配列の５’末端に含めて、細胞膜周辺腔へのポリペプチド産物の選択を可能にすることができる。一般に、この産物は細胞内生産されることになる。
【０１７７】
導入されたベクターまたはＤＮＡ構築物を含む発現宿主細胞を培養（例えば発酵）で適切な培地において成長させることができる。細胞を適切な密度に成長させた後、細胞を回収し、溶解し、発現産物をその物理的および化学的特性に従って単離することができる。いくつかの実施形態において、発現産物は、中温で水性媒体に不溶性であることがあり、軽度に上昇させた温度での洗浄剤抽出によって精製されることがある。米国特許第５，２３５，０４１号を参照されたい。必要に応じて、その後、粗製のまたは精製された発現産物をその所期の目的に使用することができる。
【０１７８】
本明細書における実施形態は、目的の任意のポリペプチドの発現を可能にする。いくつかの例では、目的のポリペプチドは、それ自体が施用（例えばポリマー）に望ましいことがある。他の例では、目的のポリペプチドを宿主において発現させて、さらに望ましいポリペプチド、小分子または他の物質（例えば酵素）を生産することができ、宿主に所望の表現型を導入することができる。特定の例では、目的のポリペプチドは、発現宿主の細胞では通常は見つけられないタンパク質；農耕学的遺伝子産物；有害生物または疾病に対する抵抗性を付与するポリペプチド；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質；レクチン；ビタミン結合タンパク質（例えばアビジン）；酵素阻害剤；昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン；特定の生物に特異的であるペプチドまたは神経ペプチド；毒液；モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または他の非タンパク質分子の高度集積の原因となる酵素；生理活性分子の、翻訳後修飾を含む、修飾に関与する酵素（例えば、オメガ−３脂肪酸合成に関与する酵素）；シグナル伝達分子またはシグナル伝達を刺激する分子（例えばカルモジュリン）；疎水性モーメントペプチド；膜透過酵素、輸送体またはチャネル；チャネル形成剤またはチャネル遮断剤；ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素；抗体または免疫毒素（例えばウイルス特異的抗体）；発育抑止タンパク質；除草剤、殺真菌剤または他の有害小分子に対する抵抗性を付与するポリペプチド；足場タンパク質；および特定の機能（例えば、結合タンパク質などのアミノ酸リピート領域または物理的特性に起因し得る機能）を有するように設計されている合成ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドを自然界から使うことができる。他の実施形態では、目的のポリペプチドは、自然界で通常見つけられないポリペプチド、例えば、目的のネイティブポリペプチドのアミノ酸配列に保存的突然変異を含む突然変異型ポリペプチドであり得る。
【０１７９】
特定の実施形態では、異なるパラメータを使用する配列最適化によって生成された２つ以上の異なる候補配列（例えば、コドン使用頻度が異なる配列）を生成し、所望の特定を有するかどうかを判定することができる。候補配列を評価して、例えば、サイレンサーもしくはエンハンサーなどの調節配列の存在を探索してもよいし、またはそのような調節エレメントに変換され得るコード配列の領域の存在をコドン使用頻度の変化によって探索してもよい。さらなる基準としては、特定のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、ＧもしくはＵ）についての濃縮（例えば、特定のアミノ酸についてのコドンの偏向）、特定のｍＲＮＡ二次もしくは三次構造の存在もしくは不在、および／またはさらなるポリアデニル化配列の存在もしくは不在を挙げることができる。さらなる発現のための候補配列の調整をそのような基準に基づいて行うことができる。
【０１８０】
有望な候補配列を構築し、実験に基づいて評価することができる。複数の候補を互いに独立して評価してもよく、またはその評価プロセスは、最も有望な候補を新たな出発点として使用することによる、または２つ以上の候補の領域を組み合わせて新規雑種を生産することによる、反復的なものであることができる。さらなる修飾および評価ラウンドが望ましいこともある。
【０１８１】
本明細書における他の実施形態は、植物細胞、植物組織、植物材料および／または植物全体において望ましい表現型または形質を得る方法であって、望ましい表現型が例えば昆虫毒素の発現であり、望ましい形質が有害生物耐性および／または抵抗性であり得る方法を提供する。いくつかの例では、植物における有害生物を防除する方法は、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを植物細胞において発現させるステップを含み、合成ポリヌクレオチドは、昆虫毒素、例えば、限定ではないが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Ｃｒｙタンパク質をコードする。粗挽き粉または細粉における有害生物を防除する方法の特定の例は、合成ポリヌクレオチドを含有する植物から子実または種子を得るステップを含み、植物は昆虫毒素を発現する。昆虫毒素を発現する遺伝子導入植物は、植物の細胞中の防除量の対象殺虫性タンパク質（またはその変異体）の存在のおかげで昆虫標的有害生物による攻撃に対して抵抗性であり得る。例えば、Ｂｔ殺虫性毒素の殺虫特定を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物のゲノムに導入することにより、昆虫標的有害生物（例えば、成虫または幼虫）は、その植物材料の摂取後、死ぬことになる。
【０１８２】
本明細書における特定の実施形態は、植物細胞、植物組織、植物材料および／または植物全体において望ましい表現型または形質を得る方法であって、望ましい表現型が例えば除草剤耐性および／または抵抗性遺伝子の発現であり、望ましい形質が除草剤物耐性および／または抵抗性であり得る方法を提供する。いくつかの例では、植物に除草剤耐性をもたらす方法は、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを植物細胞において発現させるステップを含み、合成ポリヌクレオチドは、除草剤耐性酵素、例えば、限定ではないが、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ１）（ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ２００５／１０７４３７参照）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、または５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼ）酵素をコードする。
【０１８３】
本明細書における特定の実施形態は、植物細胞、植物組織、植物材料および／または植物全体において望ましい表現型または形質を得る方法であって、望ましい表現型が例えば植物油形質に関与するタンパク質の発現であり、望ましい形質が植物における修飾された油プロファイルであり得る方法を提供する。いくつかの例では、植物の油プロファイルを修飾する方法は、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを植物細胞において発現させるステップを含み、合成ポリヌクレオチドは、植物における油プロファイルを修飾するための１つまたは複数の酵素、例えば、限定ではないが、脂肪酸デサチュラーゼ（例えばＦＡＤ２およびＦＡＤ３）をコードする。
【０１８４】
本明細書における特定の実施形態は、植物細胞、植物組織、植物材料および／または植物全体において望ましい表現型または形質を得る方法であって、望ましい表現型が例えばストレス耐性遺伝子の発現であり、望ましい形質が例えば水および／または熱ストレスに対するストレス耐性であり得る方法を提供する。いくつかの実施例では、植物にストレス耐性をもたらす方法は、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを植物細胞において発現させるステップを含み、合成ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のストレス耐性タンパク質、例えば、限定ではないが、ストレス関連タンパク質（ＳＡＰ１）（米国特許出願公開第２０１０／０２７５３２７号）および１−Ｃｙｓペルオキシレドキシン（１−ＣｙｓＰｒｘ）タンパク質（Mowla et al. (2002) Planta 215:716-26）をコードする。
【０１８５】
本明細書における特定の実施形態は、植物細胞、植物組織、植物材料および／または植物全体において望ましい表現型または形質を得る方法であって、望ましい表現型が例えばマーカータンパク質の発現であり、望ましい形質がマーカー選択であり得る方法を提供する。いくつかの実施例では、植物にマーカー選択をもたらす方法は、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを植物細胞において発現させるステップを含み、合成ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の形質転換マーカータンパク質、例えば、限定ではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはβ−グルクロニダーゼ酵素をコードする。
【０１８６】
ＶＩ．目的のポリペプチドを含む遺伝子導入植物
本開示は、目的のポリペプチドをコードする異種、合成ポリヌクレオチドを含む、遺伝子修飾生物も提供する。本明細書におけるいくつかの実施形態は、目的のポリペプチドをコードする異種、合成ポリヌクレオチドを含む遺伝子導入植物であって、例えば、合成ポリヌクレオチドを含む核酸で形質転換された植物細胞からの植物の再生によって生産され得るような植物を提供する。目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを、前に説明したように、生物に適している調節配列（例えばプロモーター）に作動可能に連結することができる。特定の実施形態において、生物は、目的のポリペプチドを発現することができる。本明細書における特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、最適化されたポリペプチドから、同様に最適化されていない同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、同じ宿主での発現についてコドン最適化されているが、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＣＴＡ、ＡＴＡＡＡＡ、ＡＴＧＡＡＡ、ＡＡＧＣＡＴ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＴＡＣＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡからなる群から選択されるポリアデニル化配列が保存されていないポリヌクレオチド、によって発現されるものの少なくとも１１０％、１５０％、２００％、５００％、１，０００％、５，０００％またはさらには１０，０００％であるレベルで発現され得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドをコードする異種、合成ポリヌクレオチドを含む遺伝子修飾生物は、遺伝子修飾植物であり、遺伝子修飾植物の細胞の少なくとも一部は、異種、合成ポリヌクレオチドの１つまたは複数を含む。ある実施形態の１つの例では、目的のポリペプチドをコードする異種、合成ポリヌクレオチドと選択可能マーカーとを含むプラスミドを、植物細胞に、例えば本明細書において前に列挙した方法のいずれかによって導入する。合成ポリヌクレオチドおよび／または選択可能マーカーが安定的に組み込まれている好適な形質転換体をそのような植物細胞から選択することができる。他の実施形態では、合成ポリヌクレオチド（例えば、選択された安定な形質転換体）を含む植物細胞を増殖させて、合成ポリヌクレオチドを含む新たな植物細胞を生産することができる。合成ポリヌクレオチドを含む植物細胞は、植物細胞を再生するために使用することができる再生可能細胞であり得る。そのような植物細胞およびそれらから生成された植物全体は、合成ポリヌクレオチドによってコードされている目的のポリペプチドを発現することができる。
【０１８８】
これらの実施形態およびさらなる実施形態において、合成ポリヌクレオチドを含む再生可能植物細胞を（例えば、組織培養での使用のために）創製する方法を提供することができる。組織培養は、再生可能細胞と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生できる可能性がある。そのような組織培養での再生可能細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さやまたは茎であり得る。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の組織培養から再生された植物を提供する。
【０１８９】
目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含む安定化植物系統を生成する方法であって、安定化植物系統の細胞が、ポリヌクレオチドによってコードされている目的のポリペプチドを発現することができる方法も、本明細書において提供する。安定化植物系統を生成する方法は当業者に公知であり、自家受粉、戻し交配、雑種生産、および個体群の交配などの（しかしこれらに限定されない）技術を含み得る。本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含むすべての植物および植物細胞は自然界に存在せず、例えば、同様に最適化されていない目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含む植物または植物細胞と比較したとき、目的の異種ポリペプチドの有利な発現特性を示すことができる。合成ポリヌクレオチドを含む植物細胞を他の異なる植物細胞との交配に使用して、優れたまたは望ましい特性を有する第一世代（Ｆ１）雑種細胞、種子および／または植物を生産することができる。
【０１９０】
本明細書に記載する方法によって最適化された合成ポリヌクレオチドから目的のポリペプチドを発現する任意の植物もしくは植物細胞、またはそのようなポリペプチドを含む植物材料は、特定の実施形態に含まれる。特定の実施形態では、合成ポリヌクレオチドを用いて遺伝子修飾セイヨウアブラナ（Brassica napus）植物を生産する。さらなる実施形態において、合成ポリヌクレオチドを使用して生産される遺伝子修飾植物は、例えば、限定ではないが、高等植物、双子葉植物、単子葉植物、消費用植物（例えば、油が使用される作物植物）、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリ、タバコ、マメ科（Fabaceae）［マメ科（Leguminosae）、マメ科（legume family）、マメ科（pea family）、マメ科（bean family）またはマメ科（pulse family）］の植物、ダイズ属［例えば、Ｇ．アルビカンス（G. albicans）、Ｇ．アフィロノタ（G. aphyonota）、Ｇ．アレナイ（G. arenari）、Ｇ．アルギレア（G. argyrea）、Ｇ．カネッセンス（G. canescens）、Ｇ．クランデスチン（G. clandestine）、Ｇ．クルバタ（G. curvata）、Ｇ．クリトロバ（G. cyrtoloba）、Ｇ．ファルカテ（G. falcate）、Ｇ．グラセイ（G. gracei）、Ｇ．ヒルチカウリス（G. hirticaulis）、Ｇ．ヒルチカウリス亜種レプトサ（G. hirticaulis subsp. leptosa）、Ｇ．ラクトビレンス（G. lactovirens）、Ｇ．ラチフォリア（G. latifolia）、Ｇ．ラトロベアナ（G. latrobeana）、Ｇ．ミクロフィラ（G. microphylla）、Ｇ．モンチス・ダグラス（G. montis-douglas）、Ｇ．ペラトサ（G. peratosa）、Ｇ．ペスカドレンシス（G. pescadrensis）、Ｇ．ピンダニカ（G. pindanica）、Ｇ．プレニイ（G. pullenii）、Ｇ．ルビギノサ（G. rubiginosa）、Ｇ．ステノフィタ（G. stenophita）、Ｇ．シンデチカ（G. syndetika）、ＴＧ．タバシナ（G. tabacina）、Ｇ．トメンテラ（G. tomentella）、ツルマメ（G. soja）およびダイズ（G. Max）（ダイズ）］の植物、ピーナッツ、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ソラマメ（Vicia faba）およびエンドウマメ（Pisum sativum）であり得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、遺伝子修飾植物は、医薬品、着香剤、栄養補助剤、機能性食品製品もしくは美容活性薬剤として使用される化合物を生産することが公知である植物、またはこれらの化合物／薬剤を生産するように遺伝子操作されている植物である。
【０１９２】
他の実施形態において、遺伝子修飾植物は、油糧種子および／またはそれらからの油が同じ種の野生型植物に対して修飾された油プロファイル（例えば、普通でない量、オメガ油含有量および増加した油含有量のＬＣ−ＰＵＦＡの発現）を有する、油糧種子植物である。
【０１９３】
代替実施形態において、本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードする異種、合成ポリヌクレオチドを含む遺伝子導入植物または種子は、そのゲノムに少なくとも１つの他の遺伝子導入事象も含むことがあり、それらの事象としては、限定でないが、殺虫性タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫性タンパク質）をコードする遺伝子、除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホサートに対する耐性をもたらす遺伝子）、および遺伝子導入植物における望ましい表現型、例えば収穫量増加、脂肪酸代謝改変または細胞質雄性不稔の回復の一因となる遺伝子が挙げられる。特定の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドと、そのような追加の導入遺伝子とを、組み換えＤＮＡ技術によって、または追加の導入遺伝子を既に含む植物を用いる従来の育種によって、組み合わせる。
【０１９４】
いくつかの実施形態には、本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードする異種、合成ポリヌクレオチドを含む植物の部位も含まれる。そのような植物部位としては、例えば、限定ではないが、種子（成熟種子および未成熟種子を含む）、組織、花粉、胚、花、果実、芽、葉、根、茎および外植片を含む、植物の任意の部位が挙げられる。特定の実施形態は、本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードする異種、合成ポリヌクレオチドを含む植物の子孫を含む。
【０１９５】
以下の実施例は、若干の特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供するものである。これらの実施例が本開示を例示する特定の特徴または実施形態に限定すると解釈すべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【０１９６】
切断型Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質をコードする複数のＤＮＡ配列のＴ０トウモロコシにおける遺伝子発現に対する影響についての評価
同一の切断型Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質をコードする３つの異なるＤＮＡ配列を評価した。異なる３バージョンのｃｒｙ１Ａｂ遺伝子を均一バイナリー植物形質転換ベクターで試験した。同じ選択可能マーカーカセットを有する同一遺伝子発現カセットにこれらの遺伝子をクローニングした。各プラスミドの唯一の可変要素は、切断型ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子をコードする実際のＤＮＡ配列であった。
【０１９７】
材料および方法
合成Ｃｒｙ１Ａｂ  ＤＮＡ配列の設計。この研究で使用する切断型Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質は、ネイティブＣｒｙ１Ａｂ完全長タンパク質の位置１〜６１９で見られるものに対応するアミノ酸からなる。アミノ酸１〜６１９をコードする切断型のネイティブｃｒｙ１Ａｂ遺伝子を１６の別個のポリアデニル化配列の存在について分析した。表２。ネイティブｃｒｙ１Ａｂ遺伝子において同定されたこれら１６の配列の場所および組成を記録し、そのような位置および組成を、評価するｃｒｙ１Ａｂ切断型遺伝子配列の設計に含めた。
【０１９８】
遺伝子設計に関する様々な概念を用いて、３つの異なるＤＮＡ配列を設計し、創製した。各バージョンのｃｒｙ１Ａｂ遺伝子を、アミノ酸１〜６１９からなる対応するタンパク質を生じさせるようにトリミングし、ネイティブ遺伝子で見られる上述の１６のポリアデニル化配列を含むように、およびさらなる推定不安定性配列を除去するようにＤＮＡ組成を変更し、塩基１６３９で始まる１７のポリアデニル化配列をこの設計に組み込んだ。この配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．１４７１．４」と呼ぶ。
【０１９９】
新たな２バージョンの遺伝子を設計して、異なる再設計仮説を試験した。ＯＰＴＧＥＮＥ（商標）２．０ソフトウェア（Ｏｃｉｍｕｍ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂａｎｊａｒａ  Ｈｉｌｌｓ  Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）を使用して、Ｃｒｙ１Ａｂコア毒素をコードする野生型ＤＮＡ配列を対応するアミノ酸配列に翻訳し、その後、各アミノ酸の最優先コドンを使用して逆翻訳した。得られたＤＮＡ配列を分析し、必要に応じて、表２で識別される配列を回復するように、不必要なオープンリーディングフレームを除去するように、不必要な制限部位を除去するように、および可能な場合にはＧ＋ＣコドンまたはＡ＋Ｔコドンいずれかの連続鎖を壊すような塩基の置換によってＧ＋ＣおよびＡ＋Ｔの伸長した並びを除去するようにコドンを変更した。得られたコード化アミノ酸配列は、ネイティブアミノ酸配列と一致した。この配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．１４７１．２」と呼ぶ。
【０２００】
第２の配列設計は、８００を超えるトウモロコシ遺伝子のアミノ酸コドンの分布を包含するトウモロコシコドン分布表に基づいた。コアＣｒｙ１Ａｂタンパク質に対応するアミノ酸配列を、平均トウモロコシ遺伝子中に存在する各コドンのレベルに対応するアミノ酸コドン分布表を使用して、逆翻訳した。低頻度コドン（すなわち、１０パーセント以下の確率で存在するコドン）は含めなかった。得られたＤＮＡ配列を分析し、必要に応じて、不必要なオープンリーディングフレームを除去するように、不必要な制限部位を除去するように、表２で識別される配列を回復するように、および可能な場合はＧ＋ＣおよびＡ＋Ｔの伸長した並びを除去するようにコドンを変更した。得られたコード化アミノ酸配列は、ネイティブアミノ酸配列と一致した。この配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．１４７１．３」と呼ぶ。
【０２０１】
【表２】
2017504332.tif 000033
【０２０２】
異なる３バージョンの切断型ｃｒｙ１Ａｂを総計Ｇ＋Ｃ含有量について評価した。総計は、５０．９％〜５９．５％Ｇ＋Ｃの範囲であった。表３。上に記載した３バージョンの切断型ｃｒｙ１Ａｂ各々を合成した（ＤＮＡ２．０；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）。
【０２０３】
【表３】
2017504332.tif 000034
【０２０４】
植物発現ベクター構築。ｃｒｙ１Ａｂ発現カセットを含有するエントリーベクターの構築には標準的クローニング方法を用いた。ｃｒｙ１Ａｂ発現カセットを含有するバイナリープラスミドを、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて工学的に作製し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介植物形質転換に使用した。制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ（登録商標）；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションに使用した。１つのエントリーベクターと１つのディスティネーションベクターをアセンブルするためにＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）反応を行った。プラスミド調製は、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を供給業者の説明書に従って使用して行った。アガローストリス−酢酸ゲル電気泳動後にＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＤＮＡ断片を単離した。
【０２０５】
上述のＤＮＡ設計での切断型Ｃｒｙ１Ａｂをコードする３つの合成遺伝子をプラスミドＤＡＳＤＮＡ４１１〜ＤＡＳＤＮＡ４４３において得た。植物発現ベクター構築を、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ断片のＺｍＵｂｉ１プロモーターとＺｍＰｅｒ５  ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の間のｐＤＡＢ１０１５５７への各合成ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子の挿入で開始して、エントリーベクターｐＤＡＢ１１１４４４〜ｐＤＡＢ１１１４４６を生成した。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術を用いて、エントリーベクターｐＤＡＢ１１１４４４〜ｐＤＡＢ１１１４４６各々を、選択可能マーカーカセットＳＣＢＶ（ＭＡＭ）プロモーターｖ２／ＡＡＤ−１  ｖ３／ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有するディスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５と組み換えて、最終バイナリーベクターｐＤＡＢ１１１４４７〜ｐＤＡＢ１１１４４９をそれぞれ創製した。
【０２０６】
アセンブルされたすべてのプラスミドのコロニーをミニプレプＤＮＡの制限消化によって最初にスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを商業シークエンシング供給業者（ＥＵＲＯＦＩＮＳ（商標）ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）との契約によってシークエンシングした。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、配列データをアセンブルし、分析した。プラスミドマップは、正確な配列を反映する。図１。
【０２０７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株生産。植物形質転換用のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株を発生させるために使用した大腸菌（E. coli）由来プラスミドＤＮＡの詳細を表４に提供する。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のｒｅｃＡ−ターナリー株であるＤＡｔ１３１９２が、これらの植物形質転換株の発生のために選択した基本株であった。標準的形質転換プロトコルをこれらの株の発生に用いた。目的のバイナリーベクターで安定的に形質転換された新たなＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株の発生を各株の制限消化によって確認して、各構築物について少なくとも１つのコロニーの確証を得た。
【０２０８】
【表４】
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【０２０９】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始。宿主Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＤＡｔ１３１９２株（ＲｅｃＡマイナスターナリー株）におけるプロジェクトベクターのグリセロールストックを得、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物をグリセロールストックからＡＢ最小培地に画線し、２０℃で、暗所で、２〜３日インキュベートした。その後、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物をＹＥＰ培地のプレートに画線し、２０℃で、暗所で、１日、インキュベートした。
【０２１０】
実験当日、接種培地とアセトシリンゴンの混合物を実験の構築物数に適した体積で調製した。表５。接種培地を滅菌、使い捨て２５０ｍＬフラスコにピペットで移した。１００％ジメチルスルホキシド中のアセトシリンゴンの１Ｍストック溶液を、接種培地が入っているフラスコに、２００μＭの最終アセトシリンゴン濃度にするために適した体積で添加した。
【０２１１】
【表５】
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【０２１２】
各構築物について、１〜２ループのアグロバクテリウム（Agrobacterium）をＹＥＰプレートから滅菌、使い捨て５０ｍＬ遠心チューブ内の１５ｍＬ接種培地／アセトシリンゴン混合物に懸濁させ、分光光度計で６００ｎｍでの溶液の光学密度（ＯＤ６００）を測定した。その後、さらなる接種培地／アセトシリンゴン混合物を使用して懸濁液を希釈して０．２５〜０．３５ＯＤ６００にした。その後、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液のチューブを、約７５ｒｐｍに設定したプラットフォームシェーカーに室温で１〜４時間の間、水平に載せておき、その後、使用した。
【０２１３】
穂の滅菌および胚の単離。トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４からの穂を温室施設で生産し、受粉１０〜１２日後に収穫した。収穫した穂を脱穀し、層流フード内で、商業用漂白剤（ＵＬＴＲＡ  ＣＬＯＲＯＸ（登録商標）Ｇｅｒｍｉｃｉｄａｌ  Ｂｌｅａｃｈ、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム）の２０％溶液および２滴のＴＷＥＥＮ（商標）２０に２０分間浸漬し、その後、滅菌脱イオン水で３回すすぐことによって表面滅菌した。未成熟接合胚（１．８〜２．２ｍｍ長）を各穂から無菌切除し、２μｌの１０％ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤を添加した２．０ｍＬアグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液が入っている１本または複数のマイクロ遠心チューブに分配した。
【０２１４】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養。胚単離活動完了後、胚のチューブを閉じ、ロッカープラットフォームに５分間、載せておいた。その後、チューブの内容物を共培養培地のプレートに注ぎ入れ、液体アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁物を滅菌、使い捨てホールピペットで除去した。顕微鏡を使用して胚を胚盤が上を向く方向にした。その後、胚を有するその共培養プレートを、蓋を少し開けてさらに１５分間、層流フードの後部に置いておいた。その後、プレートを閉じ、３Ｍマイクロポアテープで密封し、おおよそ６０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、明期２４時間／日で、２５℃のインキュベーターに入れておいた。
【０２１５】
カルス選択および遺伝子導入事象の再生。共培養期間後、胚を休止培地に移した。３６以下の胚を各プレートから除去した。プレートに３Ｍマイクロポアテープを巻きつけ、２７℃で、明期２４時間／日で、おおよそ５０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、７〜１０日間、インキュベートした。その後、カルス化した胚を選択Ｉ培地に移した。１８以下のカルス化した胚を選択Ｉの各プレートから除去した。プレートに３Ｍマイクロポアテープを巻きつけ、２７℃で、明期２４時間／日で、おおよそ５０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、７日間、インキュベートした。その後、カルス化した胚を選択ＩＩ培地に移した。１２以下のカルス化した胚を選択ＩＩの各プレートから除去した。プレートに３Ｍマイクロポアテープを巻きつけ、２７℃で、明期２４時間／日で、おおよそ５０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、１４日間、インキュベートした。
【０２１６】
この時期に、抵抗性カルスを予備再生培地に移動した。９以下のカルスを予備再生培地の各プレートに移動した。プレートに３Ｍマイクロポアテープを巻きつけ、２７℃で、明期２４時間／日で、おおよそ５０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、７日間、インキュベートした。その後、再生中のカルスをＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）の中の再生培地に移し、２５．５℃で、１日１６時間明期／８時間暗期で、おおよそ９０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で７〜１４日間、または芽が出るまでインキュベートした。５以下のカルスを各ＰＨＹＴＡＴＲＡＹ（商標）に入れた。その後、小さい芽を一次根とともに単離し、芽伸長培地に移した。約６ｃｍ以上の高さの根付いた小植物を土壌に移植し、寒さに慣れさせるために栽培箱に移動した。
【０２１７】
ＰＣＲのための植物組織からのゲノムＤＮＡ単離。組織サンプル（標準的クラフトパンチを使用して２回葉をパンチしたのと同等の葉の引き裂き）を９６ウェル回収プレート（ＱＩＡＧＥＮ＃１９５６０）に回収した。ステンレス鋼ビーズ１個を伴うＢＩＯＳＰＲＴＩＮＴ９６（商標）ＡＰ１溶解緩衝液中、ＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）で、組織破壊を行った。組織解離後、ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６（商標）抽出ロボットを使用してＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６（商標）Ｐｌａｎｔ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、＃６９１８１）をハイスループット形式で使用してゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡを２：３  ＤＮＡ／Ｈ２Ｏで希釈した後、ｑＰＣＲ反応を起こして適切なＣｐスコアを得た。
【０２１８】
ｑＰＣＲ。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してリアルタイムＰＣＲによって加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子検出を行った。ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（商標）と、ＺｍＵｂｉ１プロモーター（ｚｍＵｂｉＬＮＫ）の３’領域と、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ｓｐｅｃＲ）を使用し、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０を使用して、ＡＡＤ−１用のアッセイを設計した。アッセイを内部参照アッセイインバターゼで多重化して、ｇＤＮＡが各アッセイに確実に存在するようにした。増幅のために、０．４μＭプライマーと０．２μＭプローブとを含有する１０μＬ容量のマルチプレックス反応において１Ｘ最終濃度でＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃０４７０７４９４００１）を調製した。表６。蛍光を収集しながら６０℃で４０秒間伸長する、２ステップ増幅反応を行った。表６。
【０２１９】
フィットポイントアルゴリズム（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５）およびＲＥＬＡＴＩＶＥ  ＱＵＡＮＴ（商標）モジュール（ΔΔＣｔ方法に基づく）を使用して蛍光シグナルがバックグラウンド閾値を交差する点であるＣｐスコアを用いてリアルタイムＰＣＲデータの分析を行った。
【０２２０】
【表６】
2017504332.tif 000037
【０２２１】
【表７】
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【０２２２】
タンパク質抽出。バイオアッセイ収集日のうちにＶ３〜Ｖ５期で植物葉組織をサンプリングした。２つの６ｍｍ径葉サンプルを９６ウェルクラスターチューブラックに−８０℃で分析日まで保存した。２つのＤＡＩＳＹ（商標）スチールＢＢおよび３００μＬ抽出用緩衝液（０．０５％ＴＷＥＥＮ（商標）２０と５μＬ／ｍＬプロテアーゼ阻害剤とを含有するＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ（商標）カタログ番号９５９９）を各チューブに添加した。サンプルをＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機で、最大設定で、３分間、サンプルを粉砕した。８５μＬ  ＮｕＰＡＧＥ（商標）変性サンプル緩衝液および１５μＬ  ＤＴＴを各サンプルチューブに添加した。サンプルを穏やかに混合し、５分間９０℃で加熱し、その後、３，０００ｒｃｆで遠心した。上清を除去し、同日に試験した。
【０２２３】
ウエスタンブロット生成。従来の電気泳動およびブロッティング方法（Gallagher et al. (2008) Curr. Prot. Immolunol. 8(10):1-28）を、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）デバイスおよび基礎試薬とともに使用した。ウサギ抗Ｃｒｙ１Ａｂコア抗体が、化学発光検出システムとともに用いた一次抗体であった。
【０２２４】
定量的方法。この研究でＣｒｙ１Ａｂ定量に使用したＥＬＩＳＡは、Ｃｒｙ１Ａｂ精製タンパク質を標準物質として使用する、ＥＮＶＩＲＯＬＯＧＩＸ（商標）カタログ番号ＡＰ００３であった。
【０２２５】
Ｔ０昆虫バイオアッセイ。遺伝子導入植物からの葉の上の鱗翅目新生幼虫を用いて行ったバイオアッセイで、単一Ｂｔ遺伝子を含有する遺伝子導入植物を殺虫活性について試験した。アッセイした鱗翅目種は、アワノメイガ、オストリニア・ヌビラリス・ヒュブナー（Ostrinia nubilalis Hubner）（ＥＣＢ）、およびアメリカタバコガ幼虫、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（ＣＥＷ）であった。
【０２２６】
３２ウェルトレイ（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）を２％寒天溶液で部分的に満たし、寒天を凝固させた。葉切片（おおよそ１インチ２）を各植物から採取し、３２ウェルトレイのウェルに個々に入れた。１葉片を各ウェルに入れ、２葉片を植物ごとにおよび昆虫ごとに試験した。絵筆を使用して１０匹の新生幼虫を各ウェルに入れて、昆虫を大量に群がらせた。試験中の換気を可能にする穴の開いた粘着蓋でトレイを封止した。トレイを、２８℃、４０％ＲＨ、１６：８時間の明期：暗期で３日間、置いておいた。試験期間の後、各葉片について損傷率スコアをつけた。各試験の損傷スコアを平均し、タンパク質発現分析と併用して相関分析を行った。
【０２２７】
Ｔ１種子生産。遺伝子コピー数、ＥＬＩＳＡによって測定したタンパク質発現レベル、葉バイオアッセイでの防護、および総合的植物健康状態に基づいて、３つすべてのバックグラウンドからの選択事象を次世代への進行用に特定した。スペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ＳｐｅｃＲ）を含有する事象を必ずしも進行から外さなかったが、書き留めた。これらの事象を温室で試験したが、冬季苗床または圃場実験で使用した。
【０２２８】
進行に選択した事象を１８．９２リットルのポットに移植した。定期的に観察記録を取ってあらゆる異常表現型を追跡した。トウモロコシの毛が出現する前に苗条用袋を苗条の上に配置して、散在する花粉による相互汚染を防止した。カバーをする前にトウモロコシの毛を生産した苗条を書き留め、苗条を除去した。その後、２番目の苗条にカバーをし、受粉に使用した。異常な苗条を生産したまたは苗条を生産しなかった植物をデータベースに記録した。トウモロコシの毛を受粉の前日に刈り込んで、花粉を受け入れるように均一にブラシがけした。自殖栽培品種Ｂ１０４からの花粉をすべての受粉に使用した。可能な場合には相反交配を行った。追跡目的で受粉情報をデータベースに記録した。受粉の２１日後に穂を剥ぎ取ってドライダウンを増進し、その後、受粉の４２日後に完全に収穫した（植物から穂を除去した）。穂を１週間、乾燥器内に置き、その後、種子を処理した（殻から取り出し、計数し、事前に印刷された封筒に包装した）。
【０２２９】
表８は、上述のプロトコルで使用した様々な培地の成分を記載するものである。
【０２３０】
【表８】
2017504332.tif 000039
【０２３１】
結果および考察
形質転換の結果。形質転換頻度を各構築物について推定した。表９。各構築物の形質転換頻度は、いつでも単離できる植物を少なくとも１つ生産した事象数（全再生可能事象）をアグロバクテリウム（Agrobacterium）で感染させたすべての胚の合計（処理した全胚）で割ることによって推定した。加えて、表９は、試験した総数の中からの陰性のｑＰＣＲ結果を有した植物の数を収載している。図２に示すように４．９％〜３０．０％の幅がある推定形質変換頻度の広い変動度が存在する。
【０２３２】
【表９】
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【０２３３】
コピー数検出のためのｑＰＣＲアッセイ。加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子検出を、ＡＡＤ−１遺伝子のコピー数を特定するために設計したリアルタイムＰＣＲアッセイによって行った。３つの異なるＤＮＡ配列を実装したので、ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子は、加水分解プローブアッセイの標的ではなかった。その代わりに、すべてのバックグラウンドに存在するｃｒｙ１Ａｂ遺伝子カセットの領域を用いた。ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子の上流に位置し、ＺｍＵｂｉ１イントロン１の一部分（クローニングを助長するポリリンカー、および翻訳開始部位の前にあるコザック配列）からなる領域を同定した。この領域の存在の確認は、ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子カセットの存在を示し、単にこの領域の存在または不在に過ぎず、コピー数の判定には使用しなかった。
【０２３４】
これら２つのアッセイ（ＡＡＤ−１およびＣｒｙ１Ａｂリンカー）を内部参照アッセイインバターゼ遺伝子で多重化して、ｇＤＮＡが各アッセイに確実に存在するようにした。加えて、ｓｐｅｃＲ遺伝子の存在を同定するためにアッセイを設計して、どの事象を圃場試験での使用のために次世代に進めるべきかを判定した。この実験過程を通して、分子分析データを実装して、ネイティブ事象またはＡＡＤ−１遺伝子のコピーを３つ以上含有する事象を集団から除去し、ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子とＡＡＤ−１遺伝子の両方を有する低コピー事象のみをさらなる試験のためにＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）および温室に進めた。バックグラウンドのすべてが、少なくも２０の低（１〜２）コピー事象を生じさせた。しかし、ｐＤＡＢ１１１４４７バックグラウンドは、最高の単一コピー事象百分率（すなわち３２．３％）を生じさせた。表１０。
【０２３５】
【表１０】
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【０２３６】
タンパク質分析。３つのバックグラウンドの各々からの分子分析スクリーニングに合格した低コピー事象すべてをＣｒｙ１Ａｂタンパク質レベルについて分析した。高ＧＣバックグラウンドであるｐＤＡＢ１１１４４７は、他の２つのバックグラウンドと比較して、４５．３ｎｇ／ｃｍ２の値であるＣｒｙ１Ａｂの有意に高い平均発現レベルを示した。トウモロコシのコドンに偏向があるバックグラウンドであるｐＤＡＢ１１１４４８は、２３．８ｎｇ／ｃｍ２の平均発現を有し、米国特許出願公開第２０１２／０２６６３５号Ａ１に記載されているタンパク質（ｐＤＡＢ１１１４４９）は、５．８ｎｇ／ｃｍ２の平均発現レベルを有した。各バックグラウンドからのＴ０事象において検出されたＣｒｙ１Ａｂタンパク質レベルの統計分析を図３に示し、表１１に要約する。
【０２３７】
【表１１】
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【０２３８】
各バックグラウンドから選択した事象に関してウエスタンブロットを完了して、タンパク質が安定しており、適正なサイズであることを保証した。完全長Ｃｒｙ１Ａｂを含有するＴ１対照（ｐＤＡＢ１０７６４５）、ならびにｐＤＡＢ１１１４４４７、ｐＤＡＢ１１１４４８およびｐＤＡＢ１１１４４９からのＴ０事象からのサンプルからなる代表ウエスタンブロットを図４に示す。切断型Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質を、２０および１８ｋＤのサイズの分解産物とともに、各々のバックグラウンドからの事象において検出することができた。完全長Ｃｒｙ１Ａｂ  Ｔ１対照がバイオアッセイにおいて活性であること、および抗体の検出レベルより低くＣｒｙ１Ａｂを発現することは既知である。
【０２３９】
Ｔ０事象のバイオアッセイの結果。ｐＤＡＢ１１１４４７、ｐＤＡＢ１１１４４８およびｐＤＡＢ１１１４４９バックグラウンドを代表する事象からの葉材料をＶ５発育期で回収し、ＣＥＷ、ＥＣＢ、およびＣｒｙ１Ｆａ抵抗性アワノメイガ（ｒＥＣＢ）幼虫に曝露した。アッセイは３日にわたり、それらの葉材料がＶ５生育期に達したときＴ０事象を評価した。その後、それらのサンプルを葉組織への損傷について等級分けした。図５〜７は、ＣＥＷ、ＥＣＢおよびｒＥＣＢについてのバイオアッセイの結果をそれぞれ含む。３つの構築物からの事象は、３種すべての有害生物に対して同等によく機能した。各々が、ＣＥＷおよびＥＣＢに対してＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）対照と同様によく機能し、各々が、ｒＥＣＢに対して２０％未満の葉損傷を有した。
【０２４０】
受粉。ＡＡＤ−１分析によって判定して高度に発現する単一コピー事象であって、Ｃｒｙ１Ａｂ遺伝子カセットについて陽性であると判定もされた事象は、Ｔ１世代への進行について考慮した。ＳｐｅｃＲ遺伝子を含有する事象は、進行プロセスから外した。各バックグラウンドからの１０事象をＴ１世代に進めた。それらの植物を相反様式でＢ１０４ドナー事象と交雑受粉して、Ｔ１世代での評価のための種子を確実に回収した。Ｔ１種子生産に進めた事象を表１２に示す。
【０２４１】
【表１２】
2017504332.tif 000043
【０２４２】
結論
切断型Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質をコードするであろう複数のＤＮＡ配列を評価し、ｐＤＡＢ１１１４４７（ネイティブ遺伝子ＤＮＡ組成で同定されたポリアデニル化配列の特異的セットを再構築遺伝子中の同一のヌクレオチド位置に含むようにさらに修飾されている）を予想以上に優れている遺伝子として同定した。この遺伝子を地上鱗翅目防除遺伝子スタックに用いることにする。様々なＤＮＡ設計方法論を含む、３つの異なるＤＮＡ配列を、Ｔ０世代のトウモロコシで評価した。ＤＮＡ配列３つすべてを、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の発現のための同一成分からなるバイナリー植物形質転換プラスミドと組み合わせた。ＤＮＡ配列自体のみを構築物間で変えた。
【０２４３】
タンパク質発現には、Ｔ０集団における平均発現について、（ｐＤＡＢ１１４４９バックグラウンドで観察された）５．８ｎｇ／ｃｍ２という低レベルから、ｐＤＡＢ１１４４７バックグラウンドで検出されたような４５．３ｎｇ／ｃｍ２という高レベルまで幅があった。このように、ｐＤＡＢ１１４４７は８倍増加をもたらす。個々の事象を記録して、ｐＤＡＢ１１４４７バックグラウンドで６８ｎｇ／ｃｍ２ほどもの多い量でＣｒｙ１Ａｂタンパク質を発現させた。ｐＤＡＢ１１４４７は、他の２つのバックグラウンドと比較して最大百分率の単一コピー事象も生じさせた。しかし、ｐＤＡＢ１１４４７での形質転換効率は、他の２つのバックグラウンド（両方とも約２５％）と比較して、はるかに低かった（４．５％）。
【０２４４】
ｐＤＡＢ１１４４７バックグラウンドからの事象で測定されたＣｒｙ１Ａｂタンパク質の総合的発現、ならびに昆虫葉バイオアッセイにおけるＣＥＷ、ＥＣＢおよびｒＥＣＢに対する活性は、地上鱗翅目有害生物遺伝子スタックに対してこのＤＮＡ配列を進展させる上で肝要な因子であった。このバージョンの切断型Ｃｒｙ１Ａｂをいくつかの例示的遺伝子スタックのＣｒｙ１Ｆａ遺伝子と組み合わせることにする。
【実施例２】
【０２４５】
切断型Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする複数のＤＮＡ配列のＴ０トウモロコシにおける遺伝子発現に対する影響についての評価
この実験は、同一の切断型Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする１１の異なるＤＮＡ配列を評価した。異なる１１バージョンの切断型ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を均一バイナリー植物形質転換ベクターで試験した。同じ選択可能マーカーカセットを有する同一遺伝子発現カセットにこれらの遺伝子をクローニングした。各プラスミドの唯一の可変要素は、切断型Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする実際のＤＮＡ配列である。
【０２４６】
材料および方法
合成Ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子の設計。この研究で使用した切断型Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質は、ネイティブＣｒｙ１Ｆａ完全長タンパク質の位置１〜６０５で見られるものに対応するアミノ酸からなる。アミノ酸１〜６０５をコードする切断型のネイティブｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を１６の別個のポリアデニル化配列の存在について分析した。表１３。これらの２２配列の場所および組成を記録し、そのような場所および組成を、評価するｃｒｙ１Ｆａ切断型遺伝子配列の設計に含めた。
【０２４７】
１１の異なるｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を設計して、異なる再設計仮説を試験した。既存バージョンのｃｒｙ１Ｆａは、トウモロコシのコドンに偏向のある配列と、植物のコドンに偏向のある配列２つと、米国特許出願公開第２０１２／０２６６３３５号Ａ１に記載のものとを含む。各バージョンのｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を、アミノ酸１〜６０５からなる対応するタンパク質を生じさせるようにトリミングし、ネイティブ遺伝子で見られる上述の２２のポリアデニル化配列を含むようにＤＮＡ組成を変更した。
【０２４８】
いくつかの新たなバージョンの遺伝子を設計して、異なる再設計仮説を試験した。ＯＰＴＧＥＮＥ（商標）２．０ソフトウェア（Ｏｃｉｍｕｍ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂａｎｊａｒａ  Ｈｉｌｌｓ  Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）を使用して、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素をコードする野生型ＤＮＡ配列を対応するアミノ酸配列に翻訳し、その後、各アミノ酸の最優先コドンを使用して逆翻訳した。得られたＤＮＡ配列を分析し、必要に応じて、表１３で識別される配列を回復するように、不必要なオープンリーディングフレームを除去するように、および不必要な制限部位を除去するように、コドンを置換した。Ｇ＋ＣおよびＡ＋Ｔの伸長した並びをこの初期遺伝子設計では無視した。アミノ酸配列を保存し、得られたＤＮＡ配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．３４」と呼ぶ。ＩＲＤＩＧ．５８６．３４を、可能な場合にはＧ＋ＣコドンまたはＡ＋Ｔコドンいずれかの連続鎖を壊すような塩基の置換によってさらに修飾して、６塩基以上伸長しているＧ＋ＣおよびＡ＋Ｔの並びを除去した。前と同様に、アミノ酸配列組成を保存した。得られたＤＮＡ配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．３５」と呼ぶ。
【０２４９】
既存のトウモロコシのコドンに偏向のあるｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を、アミノ酸配列を保存しながら表１３で識別される配列を回復することによって修飾した。得られたＤＮＡ配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．３６」と呼ぶ。ＤＮＡを分析し、必要に応じて、不必要なオープンリーディングフレームを除去するようにおよびアミノ酸配列を保存しながら不必要な制限部位を除去するようにコドンを変更することによって、ＩＲＤＩＧ５８３．３６をさらに修飾した。得られたＤＮＡ配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．３７」と呼ぶ。
【０２５０】
既存の植物のコドンに偏向のある２バージョンのｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を、この場合もやはり表１３で識別される配列を回復させることによって修飾した。各々のアミノ酸配列を保存した。得られたＤＮＡ配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．３８」および「ＩＲＤＩＧ．５８６．４２」とそれぞれ呼ぶ。ＤＮＡを分析し、必要に応じて、不必要なオープンリーディングフレームを除去するようにおよび不必要な制限部位を除去するようにコドンを変更することによって、ＩＲＤＩＧ．５８６．３８をさらに修飾した。アミノ酸配列を保存した。得られたＤＮＡ配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．３９」と呼ぶ。
【０２５１】
米国特許出願公開第２０１２／０２６６３３５号Ａ１に記載されている切断型Ｃｒｙ１Ｆａ配列を比較のために用いた。この配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．４０」と呼ぶ。コードされた産物のアミノ酸配列を保存しながらＧ＋ＣコドンまたはＡ＋Ｔコドンいずれかの連続鎖を壊すような塩基の置換によってＩＲＤＩＧ．５８６．４０をさらに修飾して、６塩基以上伸長しているＧ＋ＣおよびＡ＋Ｔの並びを除去した。得られたＤＮＡ配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．４１」と呼ぶ。
【０２５２】
各コドンが平均トウモロコシ遺伝子に存在するレベルに対応するアミノ酸コドン分布表を使用する逆翻訳によって、さらなる配列を特異的に設計した。低頻度コドン（すなわち、１０％以下存在するコドン）は含めなかった。得られたＤＮＡ配列を分析し、必要に応じて、不必要なオープンリーディングフレームを除去するように、不必要な制限部位を除去するように、表１３で識別される配列を回復するように、および可能な場合は伸長されたＧ＋ＣおよびＡ＋Ｔの並びを除去するようにコドンを変更した。得られたＤＮＡ配列を本明細書では「ＩＲＤＩＧ．５８６．４３」と呼ぶ。
【０２５３】
【表１３】
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【０２５４】
異なる１１バージョンの切断型ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を総計Ｇ＋Ｃ含有量について評価した。総計には、ＩＲＤＩＧ．５８６．３８での４６．９％Ｇ＋Ｃという低レベルからＩＲＤＩＧ．５６８．３６での６４．１％Ｇ＋Ｃという高レベルまで幅があった。ＨＥＲＣＵＬＥＳ（登録商標）Ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子（すなわち「Ｃｒｙ１Ｆ  ｔｒｕｎｃ  ＨＸ」）を含めて、各バージョンの遺伝子のＧ＋Ｃ含有量は、表１４で見つけられる。
【０２５５】
【表１４】
2017504332.tif 000045
【０２５６】
上に記載した１０の切断型ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子（ＩＲＤＩＧ．５６８．３４〜ＩＲＤＩＧ．５６８．４３）の各々を合成した（ＤＮＡ２．０；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）。
【０２５７】
植物発現ベクター構築。ｃｒｙ１Ｆａ発現カセットを含有するエントリーベクターの構築には標準的クローニング方法を用いた。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ndEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。ｃｒｙ１Ｆａ発現カセットを含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）バイナリープラスミドを、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて工学的に作製し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介植物形質転換に使用した。制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ（商標）；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションに使用した。ＰＣＲ増幅は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（ＩＤＴ（商標）、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成されたＰＨＵＳＩＯＮ（商標）ＨＩｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）およびプライマーを使用して行った。１つのエントリーベクターと１つのディスティネーションベクターをアセンブルするためにＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）反応を行った。プラスミド調製は、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を供給業者の説明書に従って使用して行った。アガローストリス−酢酸ゲル電気泳動後にＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＤＮＡ断片を単離した。
【０２５８】
上述のＤＮＡ設計によるＣｒｙ１Ｆａをコードする１０の合成遺伝子をプラスミドＤＡＳＤＮＡ４２６〜ＤＡＳＤＮＡ４３５において得た。ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ断片のＺｍＵｂｉ１プロモーターとＺｍＰｅｒ５  ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の間のｐＤＡＢ１０１５５７への各合成ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子の挿入で植物発現ベクター構築を開始して、エントリーベクターｐＤＡＢ１１１４２４〜ｐＤＡＢ１１１４４３をそれぞれ生成した。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術を用いて、エントリーベクターｐＤＡＢ１１１４２４〜ｐＤＡＢ１１１４３３各々を、選択可能マーカーカセットＳＣＢＶ（ＭＡＭ）プロモーターｖ２／ＡＡＤ−１  ｖ３／ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有するディスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５と組み換えて、最終バイナリーベクターｐＤＡＢ１１１４３４〜ｐＤＡＢ１１１４４３をそれぞれ創製した。
【０２５９】
２つのさらなる植物発現ベクターを、ｐＭＹＣ２４０５からの切断型ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を用いてアセンブルした。これらのうちの第１のものは、プライマーｐＭＹＣ２４０５Ｆ（ＧＡＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＴＧＣ；配列番号２８）およびｐＭＹＣ２４０５Ｒ（ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣ；配列番号２９）を用いてｐＭＹＣ２４０５からＰＣＲ増幅したｃｒｙ１Ｆａ含有断片を含んだ。その１８６９ｂｐ増幅断片をＮｃｏＩ／ＳａｃＩで消化し、ｐＤＡＢ１０１５５７に挿入してエントリーベクターｐＤＡＢ１１０８３０を創製し、その後、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術を用いてエントリーベクターをディスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５と組み換えてｐＤＡＢ１１０８３９を創製した。ｐＭＹＣ２４０５からのＳａｃＩ平滑末端化ＥｃｏＲＩ断片をｐＤＡＢ１１０８３１に挿入してエントリーベクターｐＤＡＢ１１０８３３を創製することによって、最終プラスミドをアセンブルした。ｐＤＡＢ１１０８３３およびｐＤＡＢ１０９８０５とのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組み換え反応は、ｐＤＡＢ１１０８４２をもたらした。
【０２６０】
アセンブルされたすべてのプラスミドのクローンをミニプレプＤＮＡの制限消化によって最初にスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをシークエンシングし（ＥＵＲＯＦＩＮＳ（商標）ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して、配列データをアセンブルし、分析した。プラスミドマップは、正確な配列を反映する。図８。
【０２６１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株生産。植物形質転換用のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株を発生させるために使用した大腸菌（E. coli）由来プラスミドＤＮＡの詳細を表１５に提供する。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のｒｅｃＡ−ターナリー株であるＤＡｔ１３１９２が、標準的形質転換プロトコルを用いてこれらの植物形質転換株を発生させために選択した基本株であった。目的のバイナリーベクターで安定的に形質転換された新たなＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株の発生を、各株の制限消化によって確認して、各構築物について少なくとも１つのコロニーの確証を得た。
【０２６２】
【表１５】
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【０２６３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始、穂滅菌、胚単離、ならびに接種および共培養は、実質的に実施例１に記載の通りに行った。
【０２６４】
カルス選択および遺伝子導入事象の再生。共培養期間後、胚を休止培地に移した。３６以下の胚を各プレートに移した。プレートに３Ｍマイクロポアテープを巻きつけ、２７℃で、明期２４時間／日で、おおよそ５０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、７〜１０日間、インキュベートした。その後、カルス化した胚を選択Ｉ培地に移した。１８以下のカルス化した胚を選択Ｉの各プレートから除去した。プレートに３Ｍマイクロポアテープを巻きつけ、２７℃で、明期２４時間／日で、おおよそ５０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、７日間、インキュベートした。その後、カルス化した胚を選択ＩＩ培地に移した。１２以下のカルス化した胚を選択ＩＩの各プレートから除去した。プレートに３Ｍマイクロポアテープを巻きつけ、２７℃で、明期２４時間／日で、おおよそ５０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、１４日間、インキュベートした。
【０２６５】
この時期に、抵抗性カルスを予備再生培地に移動した。９以下のカルスを予備再生の各プレートに移動した。プレートに３Ｍマイクロポアテープを巻きつけ、２７℃で、明期２４時間／日で、おおよそ５０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で、７日間、インキュベートした。その後、再生中のカルスをＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）の中の再生培地に移し、２５．５℃で、１日１６時間明期／８時間暗期で、おおよそ９０μｍｏｌ・ｍ−２ｓ−１の光強度で７〜１４日間、または芽が出るまでインキュベートした。６以下のカルスを各ＰＨＹＴＡＴＲＡＹ（商標）に入れた。その後、小さい芽を一次根とともに単離し、芽／根用の培地に移した。約６ｃｍ以上の高さの根付いた小植物を土壌に移植し、栽培箱に入れた。
【０２６６】
Ｔ０植物の温室への移転および温室内での定着。遺伝子導入植物に固有の識別子（事象ごとに１植物）を割り当て、定期的に温室に移した。植物をＰＨＹＴＡＴＲＡＹ（商標）から、成長培地（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｔｅｃｈ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｒｏｍｉｘ  ＢＸ、０５８１Ｐ）を満たした小さいポット（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ、３．５”ＳＶＤ、７０００２２Ｃ）に移植し、ヒューミドーム（humidome）を被せて、温室環境（照光タイプ：フォトライトまたは同化ライト；ハイライトリミット：１２００ＰＡＲ；昼の長さ１６時間；昼２７℃／夜２４℃）への植物の気候順化を助長した。
【０２６７】
ゲノムＤＮＡ単離、ｑＰＣＲ（表７参照）、タンパク質抽出、ウエスタンブロット生成、および定量的分析は、実質的に実施例１に記載の通りに行った。
【０２６８】
Ｔ１種子生産。遺伝子コピー数、ＥＬＩＳＡによって測定したタンパク質発現レベル、および総合的植物健康状態に基づいて、１２のプラスミドの各々を含有する選択事象を次世代への進行に選択した。ＳｐｅｃＲ遺伝子を含有する事象は、温室で試験したが、冬季苗床または圃場実験には使用しなかった。進行に選択した事象を１８．９２リットルのポットに移植した。定期的に観察記録を取ってあらゆる異常表現型を追跡した。トウモロコシの毛が出現する前に苗条用袋の上に配置して、散在する花粉による相互汚染を防止した。カバーをする前にトウモロコシの毛を生産した苗条を書き留め、苗条を除去した。その後、２番目の苗条にカバーをし、受粉に使用した。異常な苗条を生産したまたは苗条を生産しなかった植物をデータベースに記録した。トウモロコシの毛を受粉の前日に刈り込んで、花粉を受け入れるように均一にブラシがけした。自殖栽培品種Ｂ１０４からの花粉をすべての受粉に使用した。可能な場合には相反交配を行った。追跡目的で受粉情報を記録した。受粉の２１日後に穂を剥ぎ取ってドライダウンを増進し、その後、受粉の４２日後に完全に収穫した（植物から穂を除去した）。穂を１週間、乾燥器内に置き、その後、種子を処理した（殻から取り出し、計数し、事前に印刷された封筒に包装した）。
【０２６９】
結果および考察
形質転換。各構築物の形質転換効率を計算し、表１６にまとめた。４％〜２３％の幅がある形質変換頻度の広い変動度が存在する。ｐＤＡＢ１１１４３４およびｐＤＡＢ１１１４３６バックグラウンドは、最低形質転換効率（それぞれ５％および４％）を有したが、ｐＤＡＢ１１１４３５およびｐＤＡＢ１１０８３９バックグラウンドは、（各々２３％に達する）最高形質転換率を示した。ｐＤＡＢ１１１４３６およびｐＤＡＢ１１１４３７から出芽した小植物は、芽および葉の変色、ならびに葉および茎の上偏生長を明示した。図９。これらの事象の大部分は生残せず、分子分析によって分析しなかった。
【０２７０】
【表１６】
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【０２７１】
様々なｃｒｙ１Ｆ含有バックグラウンドを比較して、形質転換に対して及ぼしたＤＮＡ配列の効果の統計的有意性を判定した。生じたイベントの数を、処理した胚の総数の百分率として比較して、形質転換頻度を生成した。ＪＭＰ（商標）統計ソフトウェアを使用して状況変異分析を完了することにより、バックグラウンドｐＤＡＢ１１１４３５、ｐＤＡＢ１１０８３９およびｐＤＡＢ１１１４４２を、０．０５有意性レベルで、形質転換頻度について統計的に同等であると判定した。ｐＤＡＢ１１０８４２、ｐＤＡＢ１１１４４０、ｐＤＡＢ１１１４４３、ｐＤＡＢ１１１４３７、ｐＤＡＢ１１１４３８およびｐＤＡＢ１１１４３９に関する形質転換頻度は、すべて統計的に同等であった。加えて、ｐＤＡＢ１１１４４１、ｐＤＡＢ１１１４３４およびｐＤＡＢ１１１４３６は、すべて、最低形質転換頻度をもたらすＤＮＡ配列と統計的に同等であった。
【０２７２】
コピー数検出のためのｑＰＣＲアッセイ。加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子検出をリアルタイムＰＣＲによって行った。ＡＡＤ−１遺伝子のコピー数を特定するためにアッセイを設計した。１１の異なるＤＮＡ配列を用いたので、ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子は、加水分解プローブアッセイの標的ではなかった。その代わりに、すべてのバックグラウンドに存在するｃｒｙ１Ｆａ遺伝子カセットの領域を用いた。ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子の上流に位置し、ＺｍＵｂｉ１イントロン１の一部分（クローニングを助長するポリリンカー、および翻訳開始部位の前にあるコザック配列）からなる領域を同定した。この領域の存在の確認は、ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子カセットの存在を示し、コピー数の判定には使用しなかった。これら２つのアッセイ（ＡＡＤ−１およびＣｒｙ１Ｆａリンカー）を内部参照アッセイインバターゼ遺伝子で多重化して、ｇＤＮＡが各アッセイに確実に存在するようにした。加えて、ｓｐｅｃＲ遺伝子の存在を同定するためにアッセイを設計して、どの事象を圃場試験での使用のために次世代に進めるべきかを判定した。ネイティブ事象、およびＡＡＤ−１遺伝子のコピーを３つ以上含有する事象を、集団から除去し、ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子とＡＡＤ−１遺伝子の両方を有する低コピー事象のみをさらなる試験のためにＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）および温室に進めた。表１７は、各バックグラウンドからの事象に関して行った分析の要約を含む。
【０２７３】
ｐＤＡＢ１１１４３５バックグラウンドからの事象（形質転換頻度２３％）は、最高の単一コピーおよび低コピー事象率（それぞれ５１．４％および９１．９％）も有し、事象の２４％は、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子についての試験で陽性であった。ｐＤＡＢ１１１４３６は、最低単一コピー事象百分率（５．３％；１事象）を有し、バックボーン汚染のある事象の百分率も最高であった（５２．６％）。
【０２７４】
【表１７】
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【０２７５】
様々なｃｒｙ１Ｆ含有バックグラウンドを比較して、単一コピー事象の発生に対するＤＮＡ配列の効果の統計的有意性を判定した。加水分解プローブアッセイによって測定してＡＡＤ−１の単一コピーを含有した事象の数を、全事象数の百分率として比較し、ＪＭＰ（商標）統計ソフトウェアを使用して状況変異分析を完了した。状況変異分析により、バックグラウンドｐＤＡＢ１１１４３５、ｐＤＡＢ１１０８３９、ｐＤＡＢ１１１４３４、ｐＤＡＢ１１１４３８、ｐＤＡＢ１１１４４１およびｐＤＡＢ１１１４４２によって生じた１コピー事象の数は、１コピー事象の百分率に５１．４％〜２１．９％の幅があるとはいえ、有意性レベル０．０５で統計的に同等であった。
【０２７６】
タンパク質分析。１２のバックグラウンドの各々からの分子分析スクリーニングに合格した低コピー事象すべてを定量的Ｃｒｙ１Ｆａ  ＥＬＩＳＡアッセイによってタンパク質発現について評価した。図１０は、１２のバックグラウンドの各々からの事象の平均タンパク質発現を示す。温室内でのＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）におけるＣｒｙ１Ｆａ発現レベルは、６０ｎｇ／ｃｍ２であると判定された。バックグラウンドのうちの２つ（ｐＤＡＢ１１１４３４およびｐＤＡＢ１１１４３５）は、Ｔ０事象のすべてについてＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）のものと同等である平均発現レベルをもたらしたが、いくつかの事象は、相当高いレベルでＣｒｙ１Ｆａを発現した。ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）バージョンのＣｒｙ１ＦａおよびＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）遺伝子カセットをそれぞれ含有するｐＤＡＢ１１０８３９およびｐＤＡＢ１１０８４２バックグラウンドは、それぞれ４３．８ｎｇ／ｃｍ２および４５．１ｎｇ／ｃｍ２の平均Ｃｒｙ１Ｆａ発現レベルをもたらした。他のすべてのバックグラウンドからのＴ０事象についての平均Ｃｒｙ１Ｆａ発現レベルは、ｐＤＡＢ１１０８３９およびｐＤＡＢ１１０８４２について見られたものより低かったが、ｐＤＡＢ１１１４３７、ｐＤＡＢ１１１４３８およびｐＤＡＢ１１１４３９からの特異的事象は、６０ｎｇ／ｃｍ２より高い発現レベルであると判定された。表１８。
【０２７７】
【表１８】
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【０２７８】
各バックグラウンドから選択した事象に関してウエスタンブロットを完了して、タンパク質が安定しており、適正なサイズであることを保証した。ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）対照を含めて、殆どのバックグラウンドからの事象で、２つの異なるタンパク質バンドを検出することができた。大きい方のバンド（６８ｋＤａ）は、切断型Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質に対応し、小さい方の産物（６６ｋＤａ）は、完全にプロセシングされた活性Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素に対応する。ｐＤＡＢ１１１４３４およびｐＤＡＢ１１１４３５事象からのサンプルからなる代表ウエスタンブロットを図１１に提供する。
【０２７９】
受粉。ＡＡＤ−１  ＰＣＲ分析によって判定して高度に発現する単一コピー事象であって、ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子カセットについて陽性であると判定もされた事象は、Ｔ１世代への進行について考慮した。殆どのバックグラウンドに関して、ｓｐｅｃＲ遺伝子を含有する事象を外した。しかし、バックグラウンドｐＤＡＢ１１１４３７、ｐＤＡＢ１１１４４２およびｐＤＡＢ１１１４４３では、ｓｐｅｃＲのない単一コピー事象が十分になかったので、各バックグラウンドからｓｐｅｃＲを含有する事象を１つだけ含めた。これらの事象からの植物は、いずれのタイプの圃場試験にも含めず、温室での試験に限定した。加えて、ｐＤＡＢ１１１４３６バックグラウンドには利用可能な１コピー事象がった１つしかなく、そのため４つの多コピー事象を進行に選択した。他の状況では、各バックグラウンドから５事象を、相反様式でＢ１０４ドナー事象との交雑受粉のためにＴ１世代に進めた。
【０２８０】
結論
切断型Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をコードするであろう複数のＤＮＡ配列を評価して、ｃｒｙ１Ｆａ  ＤＮＡ配列を予想以上に優れている遺伝子として同定した。この遺伝子を地上鱗翅目防除遺伝子スタックに用いることにする。様々なＤＮＡ設計方法論を含む、１１の異なるＤＮＡ配列を、Ｔ０世代のトウモロコシで評価した。１１のＤＮＡ配列すべてを、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質の発現のための同一成分からなるバイナリー植物形質転換プラスミドと組み合わせた。ＤＮＡ配列自体のみを変えた。
【０２８１】
いくつかのパラメータがｃｒｙ１Ｆａ  ＤＮＡ配列による影響を受けた。タンパク質発現には、Ｔ０集団における平均発現について、（ｐＤＡＢ１１１４４０バックグラウンドで観察された）４ｎｇ／ｃｍ２という低レベルから、発現の１５倍増加を表す６２．６ｎｇ／ｃｍ２（ｐＤＡＢ１１１４３４バックグラウンド）という高レベルまで幅があった。個々の事象を記録して、ｐＤＡＢ１１１４３４バックグラウンドとｐＤＡＢ１１１４３５バックグラウンドの両方で１２０ｎｇ／ｃｍ２ほどもの多量のＣｒｙ１Ｆａタンパク質を発現させた。形質転換頻度は、それぞれ、４％（ｐＤＡＢ１１１４３６）〜２３％（ｐＤＡＢ１１０８３９とｐＤＡＢ１１１４３５の両方）の幅があった。形質転換頻度のこの差は、統計的に有意であった。選択に関する別の因子は、品質事象、特に、ｃｒｙ１Ｆａ遺伝子カセットの単一コピーを有する事象の数である。単一コピー事象を有するバックグラウンドには、それぞれ、５％（ｐＤＡＢ１１１４３６）〜５１％（ｐＤＡＢ１１１４３５）の幅があった。形質転換頻度、ＤＮＡコピー数（高品質事象）およびタンパク質発現についてのこの広い範囲は、さらなるスタッキング実験に進めるための単一バックグラウンドの同定のための３つのはっきりと区別できる領域をもたらした。
【０２８２】
ｐＤＡＢ１１１４３４およびｐＤＡＢ１１１４３５バックグラウンドからの事象で測定されたＣｒｙ１Ｆａタンパク質の総合的発現は、他のバックグラウンドより大きかった。さらに、２つのバックグラウンドの各々は、最高Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質発現レベルを有する個々の事象を有した。これら２つのバックグラウンドからのＤＮＡ配列は非常に類似している。ｐＤＡＢ１１１４３４からのＤＮＡ配列を、６塩基以上であるＧ＋ＣおよびＡ＋Ｔの並びの数を低減させるように修飾して、ｐＤＡＢ１１１４３５を創製した。ｐＤＡＢ１１１４３４のｃｒｙ１Ｆａ遺伝子とｐＤＡＢ１１１４３５のｃｒｙ１Ｆａ遺伝子間には合計３２塩基の差があり、ＤＮＡは９８．２％同一である。結果として生じるタンパク質発現は、それぞれほぼ同一である（６２．６および６０．８ｎｇ／ｃｍ２）。しかし、これら２つのバックグラウンド間には、形質転換効率（５％および２３％）の有意な差がある。加えて、加水分解プローブアッセイによって検出して、単一コピー事象生成の品質の差も統計的に有意であった；ｐＤＡＢ１１１４３４では３２．３％、およびｐＤＡＢ１１１４３５では５１．４％。
【０２８３】
ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）バージョンのｃｒｙ１Ｆａ遺伝子を含有する２つのバックグラウンドである、ｐＤＡＢ１１０８３９（遺伝子のみ）およびｐＤＡＢ１１０８４２（遺伝子カセット）各々が、比較的同等のレベル、それぞれ４３．８および４５．１ｎｇ／ｃｍ２、でＣｒｙ１Ｆａタンパク質を発現した。これら２つのバックグラウンドは、同一バージョンのＤＮＡ配列を有したが、遺伝子に関連した調節エレメントが異なった。ｐＤＡＢ１１０８４２におけるプロモーターの前にあるポリリンカーは、ｐＤＡＢ１１０８３９と比較して、２４塩基対欠失を含む。異なるバージョンのトウモロコシユビキチン１プロモーターを、配列が７塩基異なる各バックグラウンドで使用した。プロモーターをＡＴＧ翻訳開始に連結させるリーダー配列には５塩基対の食い違いがあり、ｐＤＡＢ１１０８３９バックグラウンドに１９の追加の塩基がある。最後に、両方の遺伝子カセットの３’ＵＴＲ領域は異なり、ｐＤＡＢ１１０８３９バックグラウンドはトウモロコシ（Zea mays）Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲを有するが、ｐＤＡＢ１１０８４２はＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＯＲＦ２５  ３’ＵＴＲを有する。
【０２８４】
構造的相違に加えて、これら２つのバックグラウンドで検出された形質転換効率および単一コピー事象百分率も異なった。ｐＤＡＢ１１０８３９バックグラウンドは、ｐＤＡＢ１１０８４２バックグラウンド（それぞれ１４％および１９％）と比較して、統計的に高い形質転換効率（２３％）および単一コピー事象頻度（３０．６％）をもたらした。
【０２８５】
残りのバックグラウンドは、各々、ＨＥＲＣＵＬＥＸ（登録商標）対照より概して低くＣｒｙ１Ｆａを発現した。ｐＤＡＢ１１１４３６およびｐＤＡＢ１１１４３７の場合、カルスおよび幼小植物期の間の発現上昇が、集団から単一コピー高発現事象を排除することもあり、その結果、より低い形質転換率となり、Ｃｒｙ１Ｆａ発現が低減された集団となった。これらの事象からのいくつかの小植物は、最終的には植物健康状態不良をもたらす、葉および茎の赤変と葉および茎構造の重度の萎縮を有すると報告された。これらの配列と、トウモロコシユビキチン１より弱いプロモーターの併用は、より低い全発現の原因となることもあった。ｐＤＡＢ１１１４３６およびｐＤＡＢ１１１４３７は、タンパク質発現に関して望ましいＤＮＡ配列であり得る。
【０２８６】
特定の宿主における導入遺伝子発現に最適なＤＮＡ配列を有することは、発現目標の達成に重要であり得る。異なるバックグラウンドからの平均タンパク質発現は、（ｐＤＡＢ１１１４４０で測定された）４ｎｇ／ｃｍ２という低レベルから（ｐＤＡＢ１１１４３４で測定された）６２．８ｎｇ／ｃｍ２という高レベルまで多岐にわたった。単一事象の発現は、不良なトウモロコシゲノム位置への組み込みが遺伝子設計にかかわらず無発現をもたらす場合があるという条件で、すべてのバックグラウンドで検出された０ｎｇ／ｃｍ２から、ｐＤＡＢ１１１４３４およびｐＤＡＢ１１１４３５バックグラウンドでの１２０ｎｇ／ｃｍ２という高レベルまで幅があった。しかし、本明細書中の特定の例によって実証したように、組み込みが遺伝子発現に好適な位置で起こると、宿主での最適な発現のために設計した遺伝子を、さほど最適でない遺伝子と比較して有意に高いレベルで発現することができ、この発現レベルには１０ｎｇ／ｃｍ２（ｐＤＡＢ１１１４４０）〜１２０ｎｇ／ｃｍ２（ｐＤＡＢ１１４３４およびｐＤＡＢ１１１４３５）の幅がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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