(57)【要約】  本発明は、個体における鎌状赤血球症を検出するための方法であって、個体からの血液サンプルを、赤血球を低酸素状態に置くことに好適な赤血球の鎌状化誘導剤と接触させる工程と；該血液サンプルを、鎌状化赤血球を保持しかつ非鎌状化赤血球を通過させるように孔径が決定された多孔質膜で濾過する工程と；濾過工程中および／またはその後に、膜上の残留物の存在を検出し、その存在はその個体が鎌状赤血球症に罹患していることを示す工程とを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における鎌状赤血球症の検査を行う方法であって、以下の連続する工程：
ａ／前記個体からの血液サンプル（４４）を、該血液サンプル中に含まれる赤血球を低酸素状態に置くことができる鎌状赤血球鎌状化誘導剤と接触させる工程と、
ｂ／赤血球を含有する前記血液サンプル（４４）を、前記鎌状化を受けた赤血球（４７）を保持しかつ鎌状化を受けなかった赤血球を通過させることができるように孔径が決定された多孔質膜（２４）で濾過する工程と、
ｃ／前記濾過工程中および／またはその終了時に、前記膜（２４）上の残留物（４７）の存在を検出し、前記存在は前記個体が鎌状赤血球症の特徴を有するという事実に関連している、工程と
を含み、工程ａ／およびｂ／を順次または同時に実施することができることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記鎌状化誘導剤はメタ重亜硫酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜（２４）の孔は、２〜８μｍの間、好ましくは、３〜６μｍの間または６〜７μｍの間である、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記血液サンプル（４４）と前記鎌状化誘導剤との前記接触は、前記血液サンプルを、前記鎌状化誘導剤を含有しかつ細胞溶解剤を含まない、６．８〜７．４の間のｐＨを有する緩衝液と混合することによって実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液は、前記溶液の容量に対して、１重量％〜１０重量％の間、好ましくは、２重量％〜５重量％の間の前記鎌状化誘導剤を含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血液サンプル（４４）と前記鎌状化誘導剤との前記接触は、３０秒以上、好ましくは、１分以上、優先的には、２〜３分の間の期間実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記血液サンプル（４４）と前記鎌状化誘導剤との前記接触は、前記濾過工程ｂ／の前に、前記血液サンプル（４４）を、鎌状化を受けなかった赤血球および前記鎌状化を受けた赤血球（４７）を通過させることができるように決定された孔径を有し、かつ前記鎌状化誘導剤が含浸された多孔質フィルター（４１）上に堆積させることによって実施され、前記多孔質フィルター（４１）は前記膜（２４）上に置かれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記血液サンプル（４４）の容量は１０〜５０μｌの間である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記膜（２４）上の残留物（４７）の存在の検出は、前記膜（２４）の赤色着色を検出することによって実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜（２４）は、吸収性材料で作られている部材（４２）上に置かれ、前記膜（２４）上の残留物（４７）の存在の前記検出は、吸収性材料で作られている前記部材（４２）の着色変化を検出することによって実施され、このような着色変化が存在しないことは、前記膜（２４）上に残留物（４７）が存在することを表している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
血液サンプル中に含まれる赤血球を低酸素状態に置くことができる鎌状赤血球鎌状化誘導剤と、前記鎌状化を受けた赤血球を保持しかつ鎌状化を受けなかった赤血球（４７）を通過させることができるように孔径が決定された多孔質膜（２４）とを含み、細胞溶解剤を含まないことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１２】
吸収性材料で作られている部材（４２）を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記鎌状赤血球鎌状化誘導剤は、細胞溶解剤を含まない、６．８〜７．４の間のｐＨを有する緩衝液中に含まれる、請求項１１または１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
鎌状化を受けなかった赤血球および前記鎌状化を受けた赤血球（４７）を通過させることができるように孔径が決定されかつ前記鎌状化誘導剤が含浸された多孔質フィルター（４１）を含む、請求項１１または１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
濾過モジュール（２０）を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
−前記個体からの血液サンプル（４４）を、前記鎌状赤血球鎌状化誘導剤と接触させるための自動化された手段と、
−前記鎌状赤血球鎌状化誘導剤と接触させる工程の直後に、赤血球を含有する前記血液サンプル（４４）を前記膜（２４）で濾過するための自動化された手段と
−前記膜（２４）上の残留物（４７）の存在を光学的に検出するための手段と
を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実施するためのデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鎌状赤血球症の検査の分野にある。より具体的には、本発明は、個体からの血液サンプルを用いたこのような検査のための方法、ならびに鎌状赤血球症の検査を行うために本発明による方法を実施するための、一方では、キット、および他方では、自動化されたデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
鎌状赤血球貧血とも呼ばれる鎌状赤血球症は、赤血球に含まれるヘモグロビンの異常、より具体的には、このβ鎖のアミノ酸におけるグルタミン酸からバリンへの突然変異を特徴とするヘモグロビンのβ鎖の構造的異常によって引き起こされる常染色体劣性遺伝性疾患である。
【０００３】
鎌状赤血球症は、世界で最も主要な異常ヘモグロビン症である。実際には、ほぼ１億２０００万人の人々が鎌状赤血球形質の保因者であると考えられている。
【０００４】
鎌状赤血球症は、インド亜大陸の特定の地域、南米および地中海盆地で見られる。熱帯アフリカ、すなわち、南緯１５度線と北緯２０度線の間に位置する地域は、出生６５人あたり鎌状赤血球症およそ１例の割合で最も多く影響を受けている。最も多く影響を受けている国はコンゴ民主共和国、セネガル、ベナンおよびアンゴラである。これらの地帯では、マラリアに対する抵抗性との相関について言及され、このことは、プラスモジウムが鎌状赤血球でそのサイクルを実行することが困難であることから、鎌状赤血球症はマラリアに対する抵抗性による自然選択の過程から生じるという仮説を裏付けている。
【０００５】
仏国では、ホモ接合性鎌状赤血球症は１２００人に１人の出生である。それはイル・ド・フランスでは第１の遺伝的リスクである。西インド諸島では、その割合は２６０人の出生に１例に達している。鎌状赤血球症はまた、アフリカ系アメリカ人にも影響を及ぼし、これは、米国でのこのコミュニティの誕生の歴史的起源、すなわち、三角貿易におけるアフリカ人の国外追放集団、によって容易に説明され、その子孫は現在でも鎌状赤血球症の影響を受けている。
【０００６】
従って、臨床徴候を示さない健康な保因者は、自身が子孫にこの疾患を伝える可能性があることに気付かないことがあるだけに一層、鎌状赤血球症は実際の公衆衛生問題である。世界保健機関は、数十年で、このようなヘモグロビン異常の保因者数が世界の人口の８％の割合に達すると予測している。
【０００７】
現時点では、鎌状赤血球症の検査または診断を行うためのいくつかの検査がある。これらの検査は、特に、ヘモグロビンＳと呼ばれる異常なヘモグロビンの特定の特性に基づく。これらの特性は、例えば、脱酸素化状態での、鎌状化と呼ばれる、溶解度の低下および形状の変化である。低酸素条件下では、赤血球のヘモグロビンは、ゲル化を受け、重合して、赤血球を伸長させることにより変形させ、それによって鎌状の外観を与える繊維になる。
【０００８】
従って、ヘモグロビンの異常な鎌状の性質は、Ｉｔａｎｏ検査と呼ばれる不溶性検査によって、または低酸素誘導による鎌状化検査、例えば、Ｅｍｍｅｌ検査などによって検出することができる。より具体的には、当業者に周知のＥｍｍｅｌ検査は、鎌状赤血球の鎌状化現象を誘発するように、血液サンプルを還元剤と接触させること、および赤血球の形状に及ぼすこの薬剤の影響を顕微鏡下で観察することにある。しかしながら、これらの検査は、特殊な実験装置を必要とする。加えて、それらは自動化できない。
【０００９】
現在使用されている他の同定検査は、電気泳動技術、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術または分子生物学技術、特に、ヘモグロビンのヌクレオチド配列中の制限部位の消失を検出するための技術、もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術に基づいている。これらの検査は特殊で高価な装置、ならびに、オペレーターの専門知識を必要とするという事実に加えて、実行に時間がかかる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、先行技術によって提案された個体の鎌状の性質を検出するための方法、特に、上記で説明したものの欠点を、個体からの血液サンプルを用いた鎌状赤血球症の検査を行う方法を提供することによって克服することを目的とし、これは、信頼性の高い結果を得ることを可能にすると同時に、実施することが容易かつ迅速である。本発明はまた、この方法の実施に関連するコストを低減することを目的とする。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、この方法が、一方では、特殊で複雑な装置または広範なオペレーターの専門知識を必要とすることなく、または他方では、自動化されたデバイスによって実施され得ることである。
【００１２】
この趣旨で、本発明は、有利には、鎌状赤血球症を有する個体によって産生されるヘモグロビンＳの特定の特性、すなわち、赤血球内部で、低酸素条件下で重合する特性を利用する。上述したように、低酸素条件下での細胞内ポリマーの形成は、鎌状化現象だけでなく、赤血球の脱水および硬化にも関与するヘモグロビン細胞骨格改変を引き起こす。これらの赤血球変形能の変化はその疾患の主な合併症である血管閉塞に寄与する。
【００１３】
本発明者らは、正常な赤血球は、変形し、それらの直径よりもはるかに小さい、特に、この直径よりも数ミクロン小さいサイズの細孔を容易に通過することができるが、一方で、鎌状化現象を受けた鎌状赤血球は、それらの特定の鎌形状およびそれらの特定の剛性特性のために、変形できないかまたはあまり変形せず、同じサイズの細孔を通過することができないことを発見した。従って、本発明者らは、正常な赤血球と比較した鎌状赤血球の変形能の差異によって、鎌状赤血球患者からの血液サンプルを、適当な孔径の膜を通してそのようなサンプルを濾過することにより、正常患者の血液細胞と比較して区別することが可能であることを発見した。
【００１４】
従って、本発明は、個体における鎌状赤血球症の検査を行う方法であって、以下の連続する工程を含み、工程ａ／およびｂ／を順次または同時に実施することができる方法を提供する：
ａ／鎌状赤血球症に罹患しているかどうかを判定するために検査する予定の個体からの、血液サンプルを、鎌状赤血球の鎌状化誘導剤、すなわち、鎌状赤血球の鎌状化を引き起こすようにその血液サンプル中に含まれる赤血球を低酸素条件下に置くことができる薬剤と接触させる工程、
ｂ／赤血球、特に、鎌状化現象を受けた赤血球を含有する血液サンプルを、鎌状化を受けた赤血球を保持しかつ鎌状化を受けなかった赤血球を通過させることができるように孔径が決定された多孔質膜で濾過する工程、ならびに
ｃ／上記濾過工程ｂ／中および／またはその終了時に、上記膜上の残留物の存在を検出する工程、そのような存在は上記個体が鎌状赤血球症の特徴を有するという事実に関連している。
【００１５】
そのような残留物は、赤色で鎌形状の赤血球の凝集体で構成されている、ゼリーの形態で存在する。
【００１６】
本明細書において、「鎌状赤血球症の特徴」という表現は、個体は、ホモ接合性ＳＳ型である、すなわち、その疾患に罹患しているか、またはヘテロ接合性ＡＳ型である、すなわち、その疾患を有するということを意味するものとする。
【００１７】
本発明による方法は、実施が簡単で迅速である。この方法によって、特に、数分で、しかも低コストで鎌状赤血球症の検査を行うことが可能になる。それを実行するのに必要な唯一の消耗品は、上記鎌状化誘導剤および上記膜である。加えて、その信頼性は本発明者らによって広く確認されており、これは、健常個体および鎌状赤血球症罹患個体の両方の多数の個体に関する、同じ個体について実施された先行技術の生物学的検査の結果との比較によるものである。
【００１８】
本発明による方法は、全血サンプルを用いて実施されるため、血液サンプルの事前処理のために複雑な装置を必要としない。この方法を実施するための条件に依存して、このサンプルが受けなければならない場合がある唯一の前処理は、個体から採取される時点でそれを抗凝固剤と、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と、生物学的検査のための血液サンプルに関してそれ自体慣例の方法で接触させることである。
【００１９】
具体的には、本発明による方法は、血液サンプルをサポニンなどの細胞溶解剤と接触させる工程を含まない。実際には、それは、上記濾過工程ｂ／に供した、赤血球を含有する血液サンプルであり、細胞溶解工程によって血液サンプルから得ることができる、ヘモグロビンを含有する溶液でない。
【００２０】
本発明によれば、赤血球を含有するこの血液サンプルは、鎌状赤血球鎌状化誘導剤と接触させる工程と同時に上記濾過工程に供することができる。これに対し、鎌状赤血球鎌状化誘導剤と接触させる工程ａ／の後に血液サンプルを上記濾過工程ｂ／に供する場合、この工程ｂ／は、優先的には、工程ａ／の直後に実施され、すなわち、鎌状化誘導剤と接触させる工程ａ／を実施した後のもの、およびなお赤血球を含む血液サンプルは、処理、遠心分離、特定成分の分離などの中間段階を行わずに、直接、上記濾過工程ｂ／に供する。
【００２１】
本発明による方法は、成人に、また臍帯から採取した血液サンプルを用いて疾患の早期診断を目的に新生児にの両方に適用可能である。具体的には、新生児でも、鎌状赤血球の血液サンプルおよび正常な血液サンプルとの間での、上記濾過工程の終了時の膜の外観の差異は、この血液サンプルが少量である場合を含め、臍帯血中に存在する鎌状赤血球が少量であるにもかかわらず、肉眼で見えることが有利である。本発明による方法は、結果として、新生児にとって、有利には、より包括的で非侵襲的なプロセスの一部であり得る。
【００２２】
本発明による方法のさらなる利点は、上記濾過工程後に得られた、その上に鎌状赤血球で構成されている残留物が検出された膜を、その膜上に位置しているかまたは膜の細孔内に封じ込められているこれらの鎌状赤血球を用いて生物学的検査をその後に実施することを目的として保管できるということである。例えば、これらの赤血球のＤＮＡは、その後、分子生物学技術によるこのＤＮＡの解析のために抽出し得る。これは、特に、遺伝子解析装置をあまり備えていない発展途上国で本発明による検査方法が実施される場合に特に有利であることが判明している。上記濾過工程後、本発明による方法により「疾患に罹患している」状態を確立することが可能になった患者で得られた膜は、追加の調査を実施するために、検査場所から遠隔に位置する参照試験所へ容易に運ぶことができる。
【００２３】
また、本発明による方法の終了時に膜を保管することによって、結果のトレーサビリティを確保することも可能になる。
【００２４】
接触させる血液サンプル中に含まれる赤血球を低酸素条件下に置くことができる鎌状赤血球鎌状化誘導剤は、それ自体慣例のいずれのタイプのものであってもよい。このような特徴に対応する薬剤を、それらの一般的な知識に基づいておよび／または実験的に同定することは当業者の能力の範囲内である。この趣旨で、当業者は、候補鎌状化誘導剤と接触させる血液サンプルについて、酸素分圧または酸素飽和度を評価することができ、低酸素分圧および酸素飽和度の低下は低酸素状態の気体定量的制御である。より具体的には、２０ｍｍＨｇ以下の酸素分圧または３０％〜６０％の間の酸素飽和度は、鎌状赤血球の個体において鎌状化を誘導することができる低酸素状態を表す。
【００２５】
また、鎌状化を受けた赤血球を保持しかつ鎌状化を受けなかった赤血球を通過させることを可能とする多孔質膜の孔径を決定することも当業者の能力の範囲内である。この趣旨で、当業者は、特に、正常な赤血球はおよそ８μｍの直径を有し、その変形能によって２〜３μｍの毛細管を通過することができるが、鎌状赤血球にはこれができないという事実に頼ることができる。適当な孔径の決定は、例えば、この孔径が本発明に従うかどうか、すなわち、正常な赤血球を通過させるが鎌状赤血球の通過を妨げることを確認するために、鎌状赤血球症に関して健常である個体からの血液サンプルおよび鎌状赤血球症に罹患している個体からの血液サンプルを用いて、これらの血液サンプルを、特に、それ自体慣例のＥｍｍｅｌの方法に従って低酸素条件下に置き、所与の孔径の膜上で濾過する試験を実施することにより、当業者により経験的に確認することができる。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明による方法はまた、以下の特徴にも対応し、これらは別個にまたはそれらの技術的に効果のある組合せのそれぞれにおいて実施される。
【００２７】
鎌状赤血球鎌状化誘導剤は、培地中の酸素を消費することによって、好ましくは、該培地中に存在するヘモグロビンが低酸素条件下にあるように、鎌状赤血球鎌状化の反応を引き起こす還元剤である。
【００２８】
本発明の特定の実施形態では、鎌状赤血球鎌状化誘導剤は、メタ重硫酸塩、例えば、メタ重硫酸ナトリウムである。
【００２９】
本発明の変形例では、鎌状赤血球鎌状化誘導剤との血液サンプルの上記接触は、該鎌状化誘導剤を含有する、６．８〜７．４の間のｐＨを有する緩衝液と血液サンプルを混合することによって実施される。この溶液は、特に、サポニンなどの細胞溶解剤を含まない。
【００３０】
この溶液は、該溶液の総容量に対して、１重量％〜１０重量％の間、好ましくは、２重量％〜５重量％の間、例えば、およそ５％の鎌状化誘導剤を含有し得る。
【００３１】
上記溶液中での鎌状化誘導剤のこのような濃度範囲は、有利には、短時間で鎌状赤血球の鎌状化を引き起こすことを可能にする。
【００３２】
本発明の特定の実施形態では、鎌状化誘導剤との血液サンプルの接触は、３０秒以上、好ましくは、１分以上、優先的には、２〜３分の間の期間実施される。鎌状赤血球鎌状化誘導剤との血液サンプルのこのようなインキュベーション期間によって、有利には、上記濾過工程の終了時の膜の外観の差異が肉眼で視覚的に検出可能であるのに十分である鎌状化の程度を得ることが可能になる。
【００３３】
本発明の他の変形例では、上記濾過に使用される膜は、鎌状化誘導剤が予め含浸されるので、鎌状化誘導剤との血液サンプルの上記接触は、上記膜を通して血液サンプルを実際に濾過している間に実施される。従って、本発明による方法の実施に必要な時間はそれに応じて短くなる。
【００３４】
この方法の実施の実現可能性および迅速性に関して特に有利な本発明の他のさらなる変形例では、鎌状化誘導剤との血液サンプルの上記接触は、上記濾過工程ｂ／の前に、血液サンプルを、鎌状化を受けなかった赤血球および上記鎌状化を受けた赤血球を通過させることができるように決定された孔径を有しかつ鎌状化誘導剤が含浸された多孔質フィルター上に堆積させることによって実施される。このフィルターは上記膜上に置かれる。「上に置かれる」という表現は、血液サンプルを毛細管作用によりフィルターを通って上記膜まで通過させるために、上記フィルターが、血液サンプルの流れの方向に、好ましくは、上記膜と接触して、上記膜の上に位置することを意味することを意図している。
【００３５】
このフィルターは、例えば、８μｍより大きい孔径を有し得る。
【００３６】
このようなフィルターは、特に、例えば、繊維、特に、綿繊維に基づいた吸収型のもの、例えば、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）（登録商標）というブランド名で販売されている濾紙などであり得る。
【００３７】
このフィルターは、本発明による方法を実施する前に、またはその予備工程において、鎌状化誘導剤を、例えば、溶液の総容量に対しておよそ２５重量％の濃度で、含有する溶液が含浸されている。この含浸は、特に、フィルターを溶液に浸漬することによって実施することができる。優先的には、その後、そのように含浸したフィルターを、例えば、外気中および周囲温度で、またはわずかに加熱して乾燥させる工程を行う。
【００３８】
乾燥後、このフィルターは、有利には、フィルターの下に置かれた上記膜との接触の前に、毛細管作用によりそれを通過する血液サンプル中に含まれる鎌状赤血球の鎌状化を誘導するのに十分な量の鎌状化誘導剤を保持する。
【００３９】
鎌状化の誘導は、その後、有利には、約数秒の、非常に短い時間で起こる。
【００４０】
本発明による方法は、有利には、非常に少量の、特に、１０〜５０μｌの間、好ましくは、１５〜２５μｌの間、例えば、１２〜１８μｌの間、あるいは２０μｌにほぼ等しい、血液を用いて実施することができる。
【００４１】
上記濾過工程に使用される上記膜はいずれのタイプのものであってもよく、唯一の条件は、それを形成している材料が血液サンプルの成分に対して不活性であるということである。一例として、使用される上記膜はポリカーボネート製である。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、上記膜の孔径は、２〜８μｍの間、好ましくは、３〜６μｍの間または６〜７μｍの間である。このような孔径は、有利には、正常な個体の血液からの赤血球、さらに白血球を上記膜に通過させると同時に、鎌状化現象を受けた鎌状赤血球が通過することを妨ぐ。
【００４３】
上記膜は、任意の程度の多孔性を有し得る。
【００４４】
濾過膜上の残留物の存在の検出は、特に、肉眼での、その膜の表面の外観の目視観察によって、または赤外線、レーザー光線などのタイプの光学的検出手段によって実施することができる。
【００４５】
本発明の特定の実施形態では、上記膜上の残留物の存在の検出は、上記濾過工程中および／またはその終了時に、上記膜の赤色着色を検出することによって実施される。
【００４６】
そうでなければ、上記濾過膜上の残留物の存在の検出は、鎌状赤血球の集塊が上記膜の細孔を通過することができなかったことから、上記膜の過度の厚さを検出することによって実施することができる。
【００４７】
加えて、濾過中に上記膜上に残ることによって鎌状化を受けた鎌状赤血球は、上記膜の細孔を塞ぐことによって上記膜の目詰まりをもたらし、結果として、濾過流速の低下をもたらす。これにより、サンプル中に鎌状赤血球が存在しない場合よりも長い濾過時間となる。同一濾過条件では、濾過時間のこの差異は、例えば、対照の正常な個体と比較して、検査を実施する個体が状赤血球症に罹患しているかどうかを判定することを可能にするのに十分な約数十秒である。
【００４８】
本発明の特定の実施形態では、上記膜は、吸収性材料で作られている部材上に置かれる。これは、血液サンプルを毛細管作用により上記膜を通って吸収性材料で作られている部材まで通過させるために、吸収性材料で作られている部材は、血液サンプルの流れの方向に、好ましくは、上記膜と接触して、上記膜の下に位置することを意味することを意図している。
【００４９】
上記膜上の残留物の存在の検出は、吸収性材料で作られているこの部材の着色変化を検出することによって実施される。このような着色変化がないことは、上記膜上に残留物が存在すること、および鎌状赤血球症に罹患している個体を表す。赤色へのこのような着色変化が起こることは、それに関する限り、上記膜上に残留物が存在しないこと、および鎌状赤血球症に関して健康である個体を表す。
【００５０】
吸収性材料で作られているこの部材は、例えば、繊維に基づくタイプのもの、例えば、ワットマン（登録商標）というブランド名で販売されている濾紙などであり得る。
【００５１】
そうでなければ、鎌状化誘導剤が含浸されたフィルターが上記膜上に置かれている本発明の有利な構成では、上記膜上の残留物の存在の検出は、上記濾過工程ｂ／の終了時に、このフィルターの赤色着色を検出することによって実施することができる。従って、このような赤色着色が起こることは、上記膜上に残留物が存在すること、および鎌状赤血球症に罹患している個体を表す。このような赤色着色がないことは、それに関する限り、上記膜上に残留物が存在しないこと、および鎌状赤血球症に関して健康である個体を表す。
【００５２】
本発明の特に有利な実施形態では、血液サンプルを鎌状化誘導剤と接触させる工程ａ／を実施する前に、上記膜は、多孔質フィルターと、吸収性材料で作られている上記部材との間に、好ましくは、それらのそれぞれと接触するように、挿入される。
【００５３】
上記濾過工程は、当業者にはそれ自体慣例の方法を用いて、上記膜を通して血液サンプルを、吸引することによって、または押すことによって実施することができる。そうでなければ、それは毛細管作用により移動させることによって実施することができ、上記濾過膜は、例えば、吸収性材料で作られている部材に重ね合わせられている。上記濾過膜が吸収性材料で作られている部材上に重ね合わせられているこのような実施形態では、上記濾過工程ｂ／はまた、上記膜を通して血液サンプルを、吸引することまたは押すことによって補助することができる。
【００５４】
上記濾過工程に使用される圧力は、好ましくは、一定である。その値は、上記濾過工程のために望まれる時間、濾過するサンプルの容量ならびに使用される膜の特性、特に、その孔径およびその多孔性の程度に従って、理論的または経験的に、当業者によって容易に決定することができる。優先的には、本発明による方法の上記条件は、例えば、およそ２分以下の、短い濾過時間を得るように選択される。
【００５５】
本発明による方法は、数マイクロリットル〜数ミリリットルの血液を用いて実施することができる。それは、特に有利には、およそ１０μｌの血液を用いて実施することができ、これは、実質的には、指から採取された血液の一滴の量に相当する。
【００５６】
また、本発明は、本発明による方法を実施するための手段に関する。このような実施手段は、様々なタイプのものであり得、それぞれは特に、本発明による方法が実施されやすいある種の領域の構成に特に好適である。
【００５７】
従って、その態様の１つによれば、本発明は、個体における鎌状赤血球症の検査を行うためのキットに関する。このキットは、血液サンプル中に含まれる赤血球を低酸素状態に置くことができる鎌状赤血球鎌状化誘導剤と、鎌状化を受けた赤血球を保持しかつ鎌状化を受けなかった赤血球を通過させることができるように孔径が決定された多孔質膜とを含む。このキットは細胞溶解剤を含まない。
【００５８】
鎌状化誘導剤および上記膜は、本発明による検査方法を参照して、上述した特性の1つ以上に対応することができる。
【００５９】
上記誘導剤は上記膜に含浸させ得る。
【００６０】
本発明の変形例では、上記キットは、鎌状化誘導剤を含有し、細胞溶解剤を含まない、６．８〜７．４の間のｐＨを有する緩衝液を含む。この溶液は、特に、上述した特性の１つ以上に対応し得る。
【００６１】
例えば、本発明によるキットは、５重量容量％でメタ重亜硫酸ナトリウムを含有する６．８〜７．４の間のｐＨを有する緩衝液と、３．５μｍ、４．５μｍまたは６．５μｍの孔径を有する膜とを含み得る。
【００６２】
本発明の異なる実施形態では、上記キットは、鎌状化誘導剤が含浸された、鎌状化を受けなかった赤血球および鎌状化を受けた赤血球を通過させることができるように孔径が決定された多孔質フィルターを含む。
【００６３】
本発明によるキットはまた、吸収性材料で作られている部材を含んでよく、この部材は、好ましくは、上記膜と接触して、上記膜と重ね合わせることができる。
【００６４】
このフィルターおよび吸収性材料で作られているこの部材はそれぞれ、本発明による鎌状赤血球症の検査を行う方法に関して、それらについて上述した特性の１つ以上に対応し得る。それらは、同じ材料または異なる材料で作られていてよい。
【００６５】
上記膜、上記フィルターおよび吸収性材料で作られている上記部材は、互いに別個にキット内に存在し得る。そうでなければ、それらは、それらが、好ましくは、しっかりとプレスされた構成層を形成する層状アセンブリーの形態でその中に存在し得、上記膜は、上記フィルターと、吸収性材料で作られている上記部材との間に挿入される。このアセンブリーは固相支持体で維持することができる。
【００６６】
本発明の特定の実施形態では、上記キットはまた、例えば、相互に組み立てられるかまたは組み立てることができる：
−濾過するサンプルのためのリザーバー、
−上記濾過膜がすでに配置されていてよく、または置くことが意図されていてよい、膜容器、および
−濾液を排出するため、さらに、好ましくは、上記膜を通じて上記リザーバー中に含まれる混合物の吸引を引き起こす減圧を適用するためのオリフィスを含む末端部
を含むタイプの濾過モジュールを含む。
【００６７】
この濾過モジュールはまた、上記膜、特に、内圧が低下しているチューブ、例えば、バキュテナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（登録商標）チューブなどを通じて、上記リザーバー中に含まれる液体を吸引するための手段を含み得る。
【００６８】
本発明によるキットはまた、個体からの血液サンプルを収集するための容器、例えば、必要に応じて、抗凝固剤、例えば、ＥＤＴＡが入っている、バキュテナー（登録商標）タイプの、穿刺することができる閉鎖部材を含む栓を備えた、内圧が低下しているチューブなどを含み得る。
【００６９】
このキットはまた、本発明による方法を実施するための使用説明書を含み得る。
【００７０】
優先的には、本発明によるキットの構成成分の全ては使い捨てタイプのものである。
【００７１】
このようなキットは、容易に運搬可能であり、医療分析インフラがほとんどない、開発途上国、例えば、アフリカ地域での使用に特に好適である。
【００７２】
その態様の別のものによれば、本発明は、以下を含む本発明による方法を実施するためのデバイスに関する：
−上記個体からの血液サンプルを、鎌状赤血球鎌状化誘導剤と接触させるための自動化された手段、
−上記血液サンプルを鎌状赤血球鎌状化誘導剤と接触させる工程の直後に、すなわち、移動工程以外のいずれの中間段階も行わずに、特に、処理、遠心分離、構成成分の分離などのいずれの中間段階も行わずに、上記膜を通して、赤血球を含有する血液サンプルを濾過するための自動化された手段（これらの自動化された濾過手段は血液サンプルを上記鎌状化誘導剤と接触させるための自動化された手段と同じであり得る）、および
−上記濾過工程中またはその終了時に、上記膜上の残留物の存在を光学的に検出するための手段、例えば、レーザー光線によるタイプの、上記膜を読み取るための手段。
【００７３】
このデバイスはまた、血液サンプルが入った容器を、上記の自動化されたモジュールの１つから別のものへと運搬するための自動化されたモジュール、例えば、「サンプルチェンジャー」という表現によって一般的に示されるモジュールなどと、さらに本発明による鎌状赤血球症の検査を行う方法の工程の１つ以上を実施するための上記の様々なモジュールの１つ以上を自動制御するためのモジュールを含み得る。
【００７４】
このような自動化されたデバイスは、高スループット検査のための高度分析研究所を備えた「工業化された」国での使用に特に好適である。
【００７５】
本発明の特徴および利点は、図１〜４を添えて、単に説明のために示した、本発明を限定するものではない以下の実施例を読むことによってより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、本発明に従う鎌状赤血球症の検査を行うためのキットの構成成分を図示し、このキットによって実施される、本発明に従う鎌状赤血球症の検査を行う方法の様々な工程を示す。
【図２】図２は、血液サンプル、正常な個体からの（Ａ）、鎌状赤血球の個体からの（Ｂ）を用いて、鎌状化誘導剤を含有する溶液での血液サンプルの希釈率、それぞれ、この溶液の総容量８．６ｍｌ中血液サンプル１００μｌ、５０μｌおよび１０μｌについて、本発明による方法を実施した後に得られた膜の写真を示す。
【図３】図３は、（Ａ）正常な個体、（Ｂ）鎌状赤血球の個体についての、血液サンプル１０μｌの容量に相当する、図２の膜の、２００倍の倍率での顕微鏡下で観察によって得られた画像を示す。
【図４】図４は、本発明の変形例による鎌状赤血球症の検査を行う方法の工程を図式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本発明による鎌状赤血球症の検査を行うためのキットを図１に図示する。このキットの様々な構成成分の相対的な寸法は実際の典型ではない。
【００７８】
このキットは、本体１１と、セプタムとして知られている、針で穿刺することができる閉鎖部材１３を含む栓１２とを含む、サンプリングチューブと呼ばれる第１のチューブ１０を含む。抗凝固剤、特に、ＥＤＴＡは、チューブ１０の本体１１中に入っている。
【００７９】
このキットはまた、濾過モジュール２０を含む。この濾過モジュールは、特に、本出願人の名義の特許文献ＦＲ−Ａ−２９５２０６９またはＦＲ−Ａ−２９２６０９０に記載されているとおりであり得る。
【００８０】
図式的には、濾過モジュール２０は以下の要素を含む。明確にするために、これらの要素のいくつかは、図１では互いに分離して示されているが、それらは実際には最初は一緒に組み立てられている。
【００８１】
従って、濾過モジュール２０は、第１の端部２１１に、サンプルを供給するための開口部を備えた、濾過するサンプルを受けるためのリザーバー２１を含む。
【００８２】
特に、第１の端部２１１とは反対側の、第２の端部２１２では、リザーバー２１は、濾過膜２４を受容するための部材２５に固定される。この濾過膜２４は、この目的のために、剛性の膜支持体２４１に取り付けられる。
【００８３】
膜２４は、例えば、ポリカーボネートで作られている。これは、例えば、ランダムな細孔分布、３．５μｍの孔径、および細孔１００  ０００個／ｃｍ2の細孔密度を有する。
【００８４】
濾過モジュールはまた、上記膜を受けるために部材２５の周りに可逆的に取り付けられ、かつ濾液を排出し、吸引を適用するために、その端部が開放されたチャネル２３１で穿刺されるセプタムを穿刺するための先端の支持部２３を備えた、中空の末端部２２を含む。
【００８５】
濾過モジュールはまた、本体２７と、セプタム２９を有する栓２８とを含む、収集チューブと呼ばれる、バキュテナー（登録商標）タイプの、内圧が低下しているチューブ２６を含む。収集チューブ２６の内圧は、例えば、最初は７６〜２００ｍｍＨｇの間である。
【００８６】
このキットはまた、１リットルの溶液に対して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）  ８．４１ｇ、ＥＤＴＡ  １．８ｇおよび総容量１０００ｍｌを得るのに十分な量の蒸留水を含有する、還元溶液と呼ばれるｐＨ７．２の緩衝液を含む。そのｐＨは、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で所望の値に調整する。還元剤であるメタ重硫酸ナトリウムは、５％ｗ／ｖの濃度でこの溶液に添加する。
【００８７】
本発明の１つの特定の実施形態による方法は、このキットを用いて、以下のように実施する。
【００８８】
検査する個体については、全血球計算（ＣＢＣ）の教示専用の、血液サンプルを採取するための標準プロトコールに従って、血液サンプルを採取し、サンプリングチューブ１０に収集する。概略的には、腕の上に止血帯を配置した後、真空デバイスを使用して、例えば、サンプリングチューブ１０に連結されたベベルド針を用いて、橈骨静脈または肘静脈を穿刺する。血液１１１の容量、例えば、５ｍｌをサンプリングチューブ１０に収集し、直ちにＥＤＴＡと接触させる。
【００８９】
血液サンプルは、好ましくは、採取後２４時間以内に使用する。
【００９０】
次いで、サンプリングチューブ１０から所望の容量の血液サンプルを採取し、所望の総容量を達成するように、還元溶液で希釈する。その後、血液サンプル中に含まれている可能性がある鎌状赤血球は鎌状化現象を受ける。
【００９１】
１〜２分後、このようにして得られた最終溶液を、図１の３１で示すように、濾過モジュール２０のリザーバー２１に入れる。次いで、末端部２２の先端支持部２３に取り付けられた先端を、図１の３２で示すように、収集チューブ２６のセプタム２９に挿入する。
【００９２】
収集チューブ２６内の減圧により、リザーバー２１の内容物は膜２４を通って吸引される。この膜２４を通過し、収集チューブ２６に集められた濾液３３は、正常な赤血球および白血球を含有する血液を含む。剛性で鎌形状の鎌状赤血球は、それらに関する限り、膜２４によって保持される。
【００９３】
濾過の終了時に、濾過モジュール２０は、図１の３４で示すように、分解し、３５で示すように、膜２４を回収する。
【００９４】
この膜２４を視覚的に観察して、その上において赤色着色を検出しおよび／またはその表面上の過度の厚さの存在を検出する。このような着色および／またはこのような過度の厚さは、鎌状赤血球症に罹患している個体を示す。
【００９５】
本発明によるこのような方法は、鎌状赤血球症に罹患している１６人の患者および１６人の正常患者に対して、以下のように実施した。
【００９６】
鎌状赤血球症の生物学的診断は、アンホラインの存在下での電気泳動（ヘモグロビンのフォーカシングと呼ばれる診断）、またはＨＰＬＣのいずれかによって事前に確立されていた。
【００９７】
各個体からの血液、１００μｌ、５０μｌおよび１０μｌそれぞれの容量を、総容量８．６ｍｌを達成するように、還元溶液で希釈した。
【００９８】
各個体および各希釈について、このようにして得られた希釈サンプルを、濾過モジュール２０のリザーバー２１に入れ、膜２４での濾過に供した。
【００９９】
濾過時間は１〜２分の間であった。
【０１００】
濾過工程の終了時に、各膜を回収し、視覚的に観察した。
【０１０１】
３つの希釈レベルで、正常な個体（Ａ）および鎌状赤血球の個体（Ｂ）について得られた膜の例を図２に示している。これらの結果は、検査した個体の各カテゴリーを表している。
【０１０２】
鎌状赤血球の個体からの膜の着色ははっきりと認められ、これは１０μｌの容量を含む血液サンプルの初期容量全てに存在する。この着色は実際には濃赤色である。健常個体からの膜には着色は認められない。
【０１０３】
血液サンプルの初期容量１０μｌで得られた膜の顕微鏡観察を行った。得られた画像を図３に示している。そこには、正常な血液サンプルの濾過に使用した膜はその表面に赤血球を含まず、鎌状の血液サンプルの濾過に使用した膜はその表面に赤血球凝集体を含むことが認められる。
【０１０４】
これらの結果は、検査した個体の２つのカテゴリーそれぞれについて、得られた結果の全てを表している。血液が罹患している患者に由来する場合、採取したサンプルの全てについて、膜の表面に赤血球の堆積が認められた。血液が健常個体に由来する場合、この堆積は全く認められなかった。従って、メタ重亜硫酸ナトリウムによって誘導された鎌状化によって鎌状赤血球は、剛性で変形不可能となり、正常な個体からの赤血球が浸透するように、変形能によって膜の細孔を通る浸透ができなくなった。
【０１０５】
これは、鎌状赤血球症の検査を行うための本発明に従う方法の信頼性を明確に示している。血液サンプルを容量１０μｌで用いても、この方法により疾患に罹患している個体と健常個体とを区別することが可能である。
【０１０６】
図４は、以下の連続する構成層：多孔質フィルター４１と、膜２４と、吸収性材料で作られている部材４２とを有する層状濾過アセンブリー４０を含む、本発明に従うキットを用いた、本発明の特に有利な実施形態を示している。この図では、これらの様々な層は、明確にするために、互いに離間して表している。それらは実際には互いに接触している。さらに、これらの様々な層の相対的な厚さは、決して実際の典型ではない。
【０１０７】
膜２４は上述した特性に対応する。
【０１０８】
フィルター４１および吸収性材料で作られている部材４２は、同じ材料、または異なる材料で作ることができる。
【０１０９】
フィルター４１は、鎌状化を受けなかった赤血球および鎌状化を受けた赤血球を通過させるのに十分な孔径を有する。
【０１１０】
例えば、フィルター４１および吸収性材料で作られている部材４２は、両方、厚さ２２μｍ、坪量９５ｇ／ｍ2および保持粒子径８μｍを有する、綿繊維に基づいた、ワットマン（登録商標）Ｎｏ．４０の濾紙である。
【０１１１】
このフィルター４１および吸収性材料で作られているこの部材４２は、例えば、特に、直径が８ｍｍ〜２ｃｍの間、例えば、およそ９ｍｍの円盤状のものである。
【０１１２】
フィルター４１は、鎌状化誘導剤、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムを２５％ｗ／ｖの濃度で含有する溶液に浸漬することによりで予め含浸させ、その後、乾燥させた。
【０１１３】
鎌状赤血球症の検査を行う方法は、このような濾過アセンブリー４０によって、以下のように実施することができる。
【０１１４】
図４の４３で示す第１の工程では、血液サンプル４４はフィルター４１の上面に堆積する。この血液サンプル４４の容量は、例えば、およそ１５μｌであり、つまり、血液の一滴の量にほぼ等しい。
【０１１５】
このサンプルは、毛細管作用によりフィルター４１を通過する。この段階の間に、それは鎌状化誘導剤と接触している。この接触により、血液サンプル４４中に含まれている可能性がある鎌状赤血球は鎌状化現象を受ける。
【０１１６】
血液サンプルが鎌状赤血球症に罹患している個体に由来するかまたはこの疾患に関して健康である個体に由来するかに応じて、その後、以下の事象が起こる。
【０１１７】
個体が鎌状赤血球症に関して健康である場合、図４の４５で示すように、鎌状化を受けた赤血球を含まない血液サンプル４４は、なお毛細管作用により膜２４を通過し、吸収性材料で作られている部材４２によって吸収される。その部材は赤色に変色する。フィルター４１はそれに関する限りその最初の着色を保持する。従って、鎌状赤血球症の特徴の欠如についての検査は、フィルター４１および／または吸収性材料で作られている部材４２の観察によって行われ、第１のものはその最初の着色を維持し、第２のものは赤色になる。
【０１１８】
個体が鎌状赤血球症に罹患している場合、図４の４６で示すように、血液サンプル４４中に含まれる、鎌状化を受けた赤血球４７は、膜２４によって遮断される。数秒後の、吸収性材料で作られている部材４２の観察では、赤血球は上記部材まで達しなかったため、部材はその最初の着色を保持したことを示している。フィルター４１は、それに関する限り、なお鎌形状の赤血球４７と接触しており、その一部は、図４に示されているものとは違って、まだその細孔内に閉じ込められたままである。その結果として、それは、赤色に着色している。従って、鎌状赤血球症の特徴を有することについての検査もまた、フィルター４１および／または吸収性材料で作られている部材４２の観察によって行われ、第１のものは赤色になり、第２のものはその最初の着色を維持する。
【０１１９】
この検査は、有利には、そしてさらには、非常に少量の血液を用いて実施することが、極めて簡単で迅速であった。
【図１】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図４】
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【国際調査報告】
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