(57)【要約】  患者由来の流体試料をＨＰＶ１６初期遺伝子タンパク質に対する複数の抗体と接触させ、前記初期遺伝子タンパク質と結合したＨＰＶ１６抗体のパターンを子宮頸癌または中咽頭癌に関連する対照と比較することを含む、ＨＰＶ介在性子宮頸癌または中咽頭癌の検出のための方法およびシステム。【選択図】  図１
2017510801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）介在性子宮頸癌または中咽頭癌を検出するための方法であって、
患者由来の流体試料をＨＰＶ１６初期遺伝子タンパク質に対する複数の抗体と接触させるステップ、および
前記初期遺伝子タンパク質と結合したＨＰＶ１６抗体のパターンを子宮頸癌または中咽頭癌に関連する対照と比較するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記初期遺伝子タンパク質はＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７、ＬｌおよびＬ２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
浸潤性子宮頸癌と対比して子宮頸部高度異形成を診断するための方法であって、
患者由来の流体試料をＨＰＶ１６初期遺伝子タンパク質に対する複数の抗体と接触させるステップ、および
前記初期遺伝子タンパク質と結合したＨＰＶ１６抗体のパターンを浸潤性子宮頸癌と対比して子宮頸部高度異形成に関連する対照と比較するステップを含む、方法。
【請求項４】
前記複数の抗体はＨＰＶｌ６  Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７タンパク質に対する血清ＩｇＧ抗体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
中咽頭癌を診断する方法であって、
患者由来の流体試料をＨＰＶ１６初期遺伝子タンパク質に対する複数の抗体と接触させるステップ、および
前記初期遺伝子タンパク質と結合したＨＰＶ１６抗体のパターンを中咽頭癌に関連する対照と比較するステップを含む、方法。
【請求項６】
前記複数の抗体はＨＰＶｌ６  Ｅ１およびＥ２に対する血清ＩｇＧ抗体を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）介在性癌を診断するためのシステムであって、
基材であって、それに連結されたＨＰＶ１６初期遺伝子タンパク質に対する複数の抗体を有する基材と、
可視化剤と、
ＨＰＶ介在性癌に関連した結合パターンを有する対照であって、前記初期遺伝子タンパク質と結合したＨＰＶ１６抗体の可視化パターンをＨＰＶ介在性癌に関連した前記対照と比較するための対照と、
を含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１４年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／９７１，４２５の優先権を主張する。
米国連邦政府の権利に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所の助成金Ｕ０１  ＣＡ１１７３７４下で政府の支援によってなされたものである。米国連邦政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ＨＰＶ関連疾患の診断および予後に使用するバイオマーカーを含む方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００３】
体液性免疫応答の検出は感染性疾患および自己免疫の診断および予後にとって極めて重要であり、さらに、癌を検出するためのバイオマーカーをもたらしうる。いくつかのプロテオーム多重イムノアッセイが、これらの抗体の検出を容易にするために開発されてきている。スライドベースのアッセイは、具体的に、抗体を検出するための優れた発見ツールであるが、通常の免疫学研究室では一般的には見られない特殊なハイスループット装置を必要とする。
【０００４】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は最も一般的な後天性の性感染症であり、性交経験のある人の７５％までがその生涯のある時点で感染していると推定されている。ＨＰＶによる生殖器感染症は通常初交直後に罹るため、有病率は青年および若年成人で最も高い。ほとんどの場合、感染は一過性で無症状であり、有病率は一般的に年齢とともに下がる。持続的な生殖器感染症は、感染から長年（一般的には数十年）経過した後に発生する浸潤性癌を伴う、腫瘍の進行に関連付けられる可能性が高い。ＨＰＶ１６および１８の感染は明確に中咽頭癌（ＯＰＣ）、子宮頸癌、肛門癌、および他の悪性腫瘍と関連している。実際、西欧諸国におけるＯＰＣのほとんどの症例がＨＰＶ感染と関係しており、その数字が上昇していることは揺るぎのない事実である。
【０００５】
急性ＨＰＶ感染症は最初にＨＰＶ由来潜在タンパク質Ｌ１に対する体液性免疫応答を誘導する。Ｌ１キャプシドタンパク質に対するＡｂはウイルス感染後に誘導され、長期にわたって持続する。子宮頸癌患者の血清および子宮頸部膣分泌物の両方において、さらにＯＰＣ患者の血清において、Ｅ６およびＥ７の両方に対するＡｂは低レベルで検出されている。ＨＰＶ１６  Ｅ６とＨＰＶＩ６  Ｅ７に対するＡｂは、ＩＣＣの過程で遅れて生じ、疾患の結果と相関することが示されている。子宮頸癌の診断に先だって採取した血清の研究では、Ｅ６およびＥ７に特異的な抗体の存在は２．７という子宮頸癌のさらに高い相対危険度と関連しており、診断に先立って最長５年まで検出することができることを示している。血清および／または子宮頸部粘液中の定量的または定性的な抗体レベルにより持続性および進行に対するクリアランスが予測されるかどうかについては知られていない。
【発明の概要】
【０００６】
浸潤性子宮頸癌（ＩＣＣ）および中咽頭癌（ＯＰＣ）を含む、ＨＰＶ関連疾患の診断および予後の検出具（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として機能することができるバイオマーカーが必要とされている。ＨＰＶ  ＤＮＡ検査は、ＩＣＣに関する現在のスクリーニング方法よりも有意に感度が高く、ＨＰＶワクチンの出現により、費用対効果が高くかつ特異的なワクチンが効かなった子宮頸癌のスクリーニングが必要とされる。
【０００７】
本開示の目的は、ＩＣＣとＯＰＣの早期診断のためのバイオマーカーとして、および予後と危険性評価のためのバイオマーカーとしてＨＰＶ１６に特異的な初期遺伝子抗体の識別特性を決定することである。本発明者らは、ＨＰＶ１６抗体のパターンは、ＩＣＣとＯＰＣの間で著しく異なっており、ＩＣＣにおいては子宮頸部疾患の進行と強く関連するが、ＨＰＶ１６感染との関連は強くないことを見出した。このデータにより、ＨＰＶ抗体応答および抗体シグネチャーはＨＰＶ関連悪性腫瘍の特異的バイオマーカーであり、早期検出、予後、および危険性評価に適用することができるという仮説が支持される。
【０００８】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。前記材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は子宮頸部疾患の患者における複数のＨＰＶ１６抗体の特異的検出を描く。ＨＰＶ１６タンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ上に捕捉した。血清中に検出されたＩｇＧのＭＦＩ比（ＭＦＩ（ＨＰＶ）／ＭＦＩ（ｐ２１−ＧＳＴ）を示す。血清ＩｇＧ応答はＣＩＮ  ０／Ｉ、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩおよび浸潤性子宮頸癌の患者において測定した。Ｅ１、ＮＥ２、Ｅ４、Ｅ６およびＥ７タンパク質に対するＨＰＶ１６特異的Ａｂは、浸潤性子宮頸癌の患者で検出され、前浸潤性疾患ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩまたはＣＩＮ  ０／Ｉ対照の女性と比較される。ＣＩＮ  ０／ＩおよびＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ間に個々の血清学における有意差は見られない。
【００１１】
【図２】図２はＨＰＶ１６  ＩｇＧに対する血清学的アッセイの特異性を示す。Ａ）ＨＰＶ１６＋の症例の血清中のＨＰＶ１６抗体の選択的検出。サブセット分析は、ＨＰＶ１６腫瘍の状態が既知の、浸潤性子宮頸癌５４症例（ＨＰＶ１６＋、ｎ＝３４；ＨＰＶ１６−、ｎ＝２０）に対して行った。
【００１２】
【図３】図３はＨＲ  ＨＰＶ＋中咽頭癌とＨＰＶ１６＋子宮頸癌におけるＨＰＶ１６  Ａｂの比較を図示する。ＨＰＶ１６  Ａｂレベルは、浸潤性子宮頸癌患者（ｎ＝３４）および中咽頭癌患者（ＯＰＣ、ｎ＝５０）の血液中で測定した。ＨＰＶ１６  ＡｂはＨＰＶ１６  Ｅ１、ＮＥ２、ＣＥ２、Ｅ６、およびＥ７に関してＯＰＣでより強く検出された（ｐ＜０．０００１）。
【００１３】
【図４】図４はＨＰＶ１６＋浸潤性子宮頸癌（ＩＣＣ、ｎ＝３４）と中咽頭癌（ＨＰＶＯＰＣ、ｎ＝５０）の患者の血清におけるＨＰＶ１６特異的Ａｂの教師なし階層的クラスタリングを描く。ＩＣＣ患者は、主にＨＰＶ１６  Ｅ７  Ａｂを有する（グループＩ）かＡｂがない（グループＩＩ）のいずれかである。ＨＰＶＯＰＣの患者（グループＩＩＩ）の大多数はＥ１、Ｅ２、Ｅ６、およびＥ７を含む、複数のＨＰＶ特異的Ａｂを有する。強度は対数スケールで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書に記載の実施形態は、血清中の抗体の検出のために近年適合された新規なタンパク質アレイ技術に関する。全長ｃＤＮＡがコードするＨＰＶ１６抗原は、哺乳類インビトロ転写／翻訳を用いて、ｃ末端ＧＳＴ融合タンパク質として発現され、そしてＬｕｍｉｎｅｘビーズアレイ（迅速（ＲＡＰＩＤ）ビーズアレイＥＬＩＳＡ上に捕捉される。ＯＰＣの患者由来の血清を使用して、本発明者らはＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７抗体を含む、複数のＨＰＶｌ６由来抗原に対する抗体を特異的に検出した。さらに、本発明者らが患者の臨床的に同質のコホート内で免疫応答のパターンにおける変動を検出したことにより、ＯＰＣ患者におけるこのウイルスの免疫認識に生物学的な違いがあることが示唆された。
【００１５】
ＨＰＶに対する免疫応答が前浸潤性および浸潤性の子宮頸部疾患における検出および予後に関して潜在的なバイオマーカーであるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＨＰＶ１６由来抗原に対する血清および子宮頸部分泌物ＩｇＧおよびＩｇＡ  Ａｂの検出のために迅速ビーズアレイＥＬＩＳＡを使用した。バイオマーカーとしてのこれらの抗体の潜在的な有用性を評価するために、本発明者らは、中咽頭癌の患者の拡大コホートにおける血清ＩｇＧ  Ａｂの検出とこれらの結果を比較した。本明細書において、本発明者らは、初期遺伝子に対するＨＰＶ１６  ＩｇＧの幅と量が進行性子宮頸部疾患で増加し、初期遺伝子Ａｂは浸潤性ＨＰＶＩ６関連癌腫の特異的なバイオマーカーであることを実証する。
【００１６】
さらに、ＯＰＣの患者由来の血清はＩＣＣと比べてＨＰＶ１６特異的Ａｂの特徴的パターンを有しているため、これら二つの解剖学的部位間のウイルス抗原の発現または免疫監視の病態生理学的な違いが示唆される。
他の実施形態では、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）介在性癌を診断するためのシステムが記載される。例えば、システムは、基材（例えば、ペプチドチップ）であって、それに連結されたＨＰＶ１６初期遺伝子タンパク質に対する複数の抗体を有する基材と、可視化剤（例えば、一つ以上の標識された二次抗体）と、ＨＰＶ介在性癌に関連した結合パターンを有する対照であって、前記初期遺伝子タンパク質と結合したＨＰＶ１６抗体の可視化パターンをＨＰＶ介在性癌に関連した前記対照と比較するための対照と、を含むことができる。
【００１７】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００１８】
実施例１
子宮頸部疾患の分析に用いた血清は、ジョージア州アトランタ、ミシガン州デトロイトまたはテキサス州ガルベストンにある都市部の公立病院のコルポスコピー・クリニックを受診した女性から収集した早期発見研究ネットワーク（ＥＤＲＮ）と疾病対策予防バイオレポジトリー・センターから選択した。セットは、コルポスコピー・クリニックに提供した患者を表す、ＣＩＮ  ０１I（ｎ：ｌ２ｌ）とＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ（ｎ：１６２）の患者血清からなる。これらのうち、ＣＩＮ  ０／Ｉ（ｎ：３３）とＣＩＮ  ＩＶＩＩＩ（ｎ＝５２）のサブセットは年齢、人種、およびＨＰＶ１６の状態がマッチした。浸潤性癌の９５人の女性由来の保存された匿名の血清を分析に用いた。ＯＰＣ癌患者の血清は、ダナ・ファーバー癌研究所、ジョンズ・ホプキンス大学病院、およびマウント・シナイ医科大学からえた。全ての試料は、癌の治療に先だってえられており、遡って選択した。研究集団のデモグラフィックを表１に示す。全ての研究において、試料は標準化された試料収集プロトコルを用いて収集し、使用するまで−８０℃で保存した。書面によるインフォームドコンセントは施設内倫理委員会の承認の下に全ての被験者からえた。
【００１９】
子宮頸部分泌物は同ＥＤＲＮのバイオレポジトリーから選択し、前浸潤の比較のために血清を提供する７４人の女性について、および浸潤性子宮頸癌の１３人の女性について使用することができた。収集および処理の方法は先に記載している。簡潔に言えば、子宮頸部分泌物はＷｅｃｋ−Ｃｅｌのスポンジ（エクソメッド（Ｘｏｍｅｄ）外科製品、フロリダ州ジャクソンビル）内への吸収によって収集し、Ｍ−ＰＥＲの抽出試薬で抽出するまで急速凍結し−８０’Ｃで保存した。
【００２０】
ＨＰＶ１６遺伝子は、記載されるようにＨＰＶ１６プラスミドＤＮＡ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州マナサス）由来の遺伝子特異的プライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりえた。ＰＣＲ産物を、製造業者の説明書（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド）によりｐＤＯＮＲ２２１ベクターに挿入し、最大タンパク質発現のためにｐＡＮＴＴ＿ＧＳＴベクター（ｈｔｔｐ：／／ｄｎａｓｕ．ａｓｕ．ｅｄｕ／ＤＮＡＳＵ／Ｈｏｍｅｊｓｐ）に変換した（２４）。ＳｅｒｏＭＡＰカルボキシル化ミクロスフェア（ルミネックス社（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、テキサス州オースティン）には１００万個のビーズに対して抗ＧＳＴ抗血清（ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ニュー・ジャージー州ピスカタウェイ）が５ｍｇの割合で連結されていた。各ＨＰＶ遺伝子は、製造業者推奨のＴ７網状赤血球溶解液（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、５００ｎｇＤＮＡでＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。ｐ２１−ＧＳＴは陰性対照タンパク質として発現させた。ＨＰＶＩ６  Ｅ２はタンパク質発現および抗体検出の両方を著しく向上させる、Ｎ末端ＮＥ２（ｂｐ＃２７５５−３３０３）およびＣ末端ＣＥ２（ｂｐ＃３３０４−３８５２）タンパク質として発現させた。ビーズアレイＥＬＩＳＡは本質的に記載されたように実施した。
【００２１】
インビトロ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）産物をそれぞれマイクロスフェア上に捕捉し、プールし、そしてＰＢＳ−Ｉ％ＢＳＡ中においてそれぞれｌ０％のマウス、ウサギ、ヤギ、ラット由来の正常血清、０．５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、シグマーアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州セントルイス）、０．８％ポリビニルピノリドン（ＰＶＰ、シグマーアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、ミズーリ州セントルイス）、および２．５％Ｓｕｐｅｒｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州ビルリカ）でブロックした。ブロッキング緩衝液中で血清を１：８０に希釈し、そして子宮頸部粘液を１：５に希釈し、一晩前記ビーズとインキュベートした。ビオチン接合ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＡ抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、ペンシルベニア州ウェストグローブ）およびストレプアビジンＲ−ＰＥ（モレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）、オレゴン州ユージーン）をＩｇＧの検出のために使用した。ＥＬＩＳＡのカットオフ値を確立するために、５０の健常対照試料のＭＦＩ比＞（平均＋３標準偏差）を陽性とした。これらのレベルはＥ１：５．４、ＮＥ２：８．５、ＣＥ２：６．８、Ｅ４：２．３、Ｅ．５：４．２、Ｅ６：９．０、Ｅ７：６．６、Ｌ１：９．５、およびＬ２：８．０であった。
【００２２】
前述のようにＨＰＶ  ＤＮＡをＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ培地に集められた剥離子宮頸部細胞の抽出物において検出した。簡潔に述べると、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ収集培地１６ｍｌをＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ完全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（エピセントレ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ウィスコンシン州マディソン）を用いて抽出した。ＨＰＶ検出および分類は２２の高リスク型および１５の低リスク型を検出するロシュ線形アッセイを用いて行った。
【００２３】
昆虫細胞中でバキュロウイルス発現から調製したＨＰＶ１６  ＶＬＰを、ＩｇＧを検出するために改変直接ＥＬＩＳＡで使用した。抗体に関してＨＰＶ１６国際標準血清（ＩＳ−１６、ＮＩＢＳＣ、英国）に対して較正された参照血清試料（ＩＵ／ｍｌ）を各プレート上でアッセイした。試験および平行線分析法を用いて決定される抗体力価に関して、試験試料を１：１０、１：３１．６、１：１００で３．１６倍に希釈した。インハウス・ブロッキングアッセイまたはｃＬＩＡによって決定されるようなＨＰＶ１６に対する低くかつ陰性の反応性を有するプールされた成人ヒト血清を、陽性対照および陰性対照として使用した。プールされた陰性血清はＨＰＶ１６、１８、６および１１に対する抗体に関して陰性であり、ＩＳ−１６を参照してカットオフ値を出すために使用した。抗体力価は、ＨＰＶ１６国際標準血清（ＮＩＢＳＣ、英国）を参照して、各試料について計算した。前浸潤性子宮頸部疾患由来の総数で７７の血清は、ビーズアレイＥＬＩＳＡとの比較のためにＨＰＶ１６  ＶＬＰ−ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって試験した。
【００２４】
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のＨＰＶ１６偽ビリオン中和（ＰｓＶＮ）アッセイは、機能的Ｌ１ＩＬ２特異的抗体を測定し、いくつかの修正を伴って記載したように行った。血清試料を中和緩衝液［フェノールレッドを含まず、１％非必須アミノ酸、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ウシ胎仔血清、１％抗生物質−抗真菌剤、および１％Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）を含むＤＭＥＭ］で２倍に希釈した。最終試料希釈物は血清に関して１：２０から１：１０２４０の範囲内にあり、ＨＰＶ１６とＢＰＶ１偽ビリオンの両方について試験した。陽性力価は、中和緩衝液のみにおけるＨＰＶ１６偽ウイルスのものと比べてＳＥＡＰ活性の５０％中和を示した最も高い希釈率の逆数として計算した。力価が４０以上であり、同一試料に関するＢＰＶ１中和力価のものと四倍の差があった場合に、血清試料を陽性とみなした。前浸潤性子宮頸部疾患由来の総数で６６の血清を、ビーズアレイＥＬＩＳＡとの比較のために試験した。
【００２５】
ＨＰＶ１６  ＡｂをＬｕｍｉｎｅｘ２００  ＩＳ２．３ソフトウェアを使用してメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。５０の事象が各ビーズ領域について計数された。比較はマン・ホイットニー・ノンパラメトリック分析（グラフパッドプリズムバージョン（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ）５．０ｃ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて行った。コーエンのカッパ係数により、ＨＰＶ１６  ＰｓＶＮアッセイ、ＶＬＰ−ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡおよびビーズアレイＥＬＩＳＡとの間の一致を評価した。さらに、一方の試験が他方の試験よりも陽性である可能性が高い可能性を評価するためにマクネマー検定を行った。抗体陽性反応を有する可能性を予測するためのオッズ比（ＯＲ）も、ロジスティック回帰モデルを用いて推定した。各推定値については、９５％のパーセント信頼区間（ＣＩ）をコンピュータで計算した。これらの試験に関する統計的有意性は、ｐ＜０．０５レベルで達成された。データ分析は、ＶａｓｓａｒＳｔａｔｓ  Ｗｅｂｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ、またはＲバージョン２．９．２を使用して、ＳＰＳＳ統計バージョン１７．０（ＳＰＳＳ社（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．））で行った。
【００２６】
本発明者らの初期目標は、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩに関するＨＲ  ＨＰＶ  ＤＮＡに加えて、検出および危険性評価の特異性を向上させるためのバイオマーカーとして使用するために、ＣＩＮ  ０／Ｉの健常対照女性（ｎ＝１２１）とＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの女性（ｎ＝１６２）との間でＨＰＶ１６特異的Ａｂにおいて量的および質的な差があるかどうかを決定することであった。本発明者らの第二の目標は、異なるＨＰＶ関連悪性腫瘍に関するＨＰＶ１６抗体バイオマーカー頻度の特異性を決定することであった。ＣＩＮ  ０／Ｉ、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ、およびＩＣＣの患者由来の血清および子宮頸部分泌物を疾病対策予防センターでＮＣＩ  ＥＤＲＮのバイオレポジトリーから遡って選択した。全ての試料はスクリーニング・コルポスコピークリニック名で示されるコルポスコピーを受けた女性から遡ってえた。
【００２７】
ＣＩＮ  ０／１およびＩＩ／ＩＩＩ試料は年齢に関してほぼ一致し（表１）、ＨＲ  ＨＰＶに関しては部分的に一致した。ＨＲ  ＨＰＶ＋であったのはＣＩＮ  ０／１よりもＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ症例の方が割合が高く（具体的にＨＰＶ１６＋で、５９．５％に対して９５．７％）、両群のかなりの数の患者には少なくとも２種類の子宮頸部感染があった（表１）。
【００２８】
子宮頸部細胞診スクリーニングが一般的である米国では、浸潤性子宮頸癌（ＩＣＣ）および浸潤性ＯＰＣは共に比較的珍しい悪性腫瘍である。本発明者らはＩＣＣの患者由来のプールされた血漿または血清を遡って選択した；血漿と血清の間で一貫した差異は認められず、それらの結果を分析のためにプールした。これらの試料は過去１０年間でえられた。予想したように、これらの患者はＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの女性よりも高齢であり（平均２９．３歳に対して５０．１歳、表１）、子宮頸部発癌の時間遅延を反映している。ＩＣＣ症例の５０％超がＨＰＶ１６＋であった。浸潤性子宮頸部の症例の有意な割合（１９．４％）がＨＰＶ陰性と報告された。ＨＲ  ＨＰＶ＋ＯＰＣ症例も（血清と血漿が混合され）、臨床診断後、治療開始前にえられた。予想したように、これらの症例の大部分は男性（９３．９％）であった。
【００２９】
ＨＰＶ１６抗原に対する血清ＩｇＧ  ＡｂをＣＩＮ  ０／１、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ、および浸潤性子宮頸癌患者の血液においてビーズアレイＥＬＩＳＡにより測定した（図１）。非特異的およびＧＳＴ特異的自己抗体のバックグラウンドを抑制するために、対照のｐ２１−ＧＳＴ抗原に関するＭＦＩに対する個々のＨＰＶ特異的Ａｂに関するＭＦＩの比を示す（表２ａ）。ＨＰＶ＋ＣＩＮ  ０／Ｉ対照で０／２６（０％）およびＨＰＶ＋ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩで３／９５（３％）と比較して、ＨＰＶ１６＋ＩＣＣ症例で９／３４（２６％）の血清中にＨＰＶ１６  Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、またはＥ７  Ａｂの少なくとも１つが検出された。個々のＨＰＶ１６血清学のＭＦＩ比はＣＩＮ  ０／Ｉの女性とＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの女性では同様であった。
【００３０】
２つのアッセイで検出される異なる抗原構造の表示を示すであろう、ＨＰＶ１６Ｌ１ビーズアレイのシグナル強度、ｃＬＩＡ  ＶＬＰ力価、と偽ビリオン・アッセイの間に有意な相関関係は観察されなかった（データは示さず）。総数で６６の患者試料は、前記ｃＬＩＡとＰｓＶＮアッセイによってアッセイされ、３１はＣＩＮ  ０／Ｉであり、また３５はＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩであった。１６人のＣＩＮ  ０／Ｉ患者はｃＬＩＡ＋であり、さらにそのうちの１３人はＰｓＶＮ＋であった。全てのｃＬＩＡ＋はＨＲ  ＨＰＶ＋であったが、１３人のみがＨＰＶ１６＋であった。３０人のＣＩＮ  ０／Ｉは前記ビーズＥＬＩＳＡによってＬ１−であった。ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩグループのうち、２０人の患者がｃＬＩＡ＋であり、さらに１９人はＰｓＶＮ＋かつＨＲ  ＨＰＶ＋であった。１９人のうち５人はさらに前記ビーズＥＬＩＳＡによってＬ１＋であった。本発明者らのＬ１アッセイでは、ＰｓＶ＋ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩのわずかなサブセット（５／３５）と相関し、不一致（Ｌ１  Ａｂ＋／ＰｓＶ−）症例は１人のみであるが、メルク（Ｍｅｒｃｋ）ｃＬＩＡ  Ｌ１アッセイとは相関しない。
【００３１】
ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩおよびＩＣＣの患者由来の血清におけるＨＰＶ１６  Ａｂの頻度を比較するために、９５人の浸潤性子宮頸癌の患者由来の血液を、ＨＰＶ１６抗体に関して調べた（図１）。浸潤性子宮頸部腫瘍形成では、Ｅ１、ＮＥ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、およびＬ１  Abレベルが上昇する（ｐ＜０．０００１）。ＨＰＶ１６抗体の検出がＨＰＶ１６＋ＩＣＣに特異的であったかどうかを決定するために、本発明者らはＨＰＶ１６＋ＩＣＣ症例（ｎ＝３４、そのうち４人はＨＰＶ１６を含む複数の感染症に罹っていた）であることが知られている子宮頸部腫瘍がある女性、およびＨＰＶ１６陰性対照であることが知られている腫瘍がある女性（ｎ＝２０）由来の試料のサブセット分析を行った（図２ａ）。４１のＩＣＣ腫瘍はＨＰＶ感染状態が不明であったため、これらの血清は分析から除外した。本発明者らは、ＨＰＶ１６Ｅ６  ＡｂがＨＰＶ１６＋ＩＣＣの患者の血液中に特異的に検出されたことを確認した。ＨＰＶ１６＋ＩＣＣ症例において、Ｅ１、ＮＥ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２に対するＡｂが選択的に検出された（１３／３４（３９％）症例が少なくとも１つの初期遺伝子Abを有していた）。
【００３２】
ＨＰＶ１６特異的Ａｂが子宮頸部に分泌されたかどうかを決定するために、子宮頸部スワブを用いて子宮頸部分泌物を収集した。本発明者らは、ＣＩＮ  ０／１、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩおよびＩＣＣの８７人の患者由来の血清および子宮頸部分泌物中のＨＰＶ１６特異的抗体の検出を直接比較した（データは示さず）。ＩＣＣに関しては、子宮頸部分泌物と血清中のＩｇＧの検出の間には強い相関関係があった（Ｒ２＝０．７３〜０．９９）が、子宮頸部ＩｇＧは、平均すると、血清ＩｇＧよりも弱かった。ＩｇＡがＩｇＧよりも分泌物中の濃度が高い可能性があるため、本発明者らはＩＣＣの患者由来の血清（図示せず）および子宮頸部分泌物におけるＨＰＶ１６特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の検出を直接比較した（図２ｂ）。ＩｇＧの検出は、Ｅ６（ｐ＝０．０００４）、Ｅ７（ｐ＝０．０２）、およびＬｌ（ｐ＝０．００７）に関してＩｇＡよりも強かった。他のＨＰＶ１６抗原に対する、またはＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩにおけるＩｇＡ応答の特異的な検出はなかった（データは示さず）。これらの結果により、粘膜ＩｇＧは非浸潤性アッセイとして臨床的有用性を有しうるが、血清ＩｇＧに照らして粘膜ＩｇＧまたはＩｇＡを測定することにメリットはないことが示唆される。
【００３３】
ＨＰＶ  Ａｂに関する血清アッセイについての懸念の一つは、子宮頸部外ＨＰＶ関連悪性腫瘍、例えばＨＰＶ＋ＯＰＣなどの新たに発生する有病率である。本発明者らは最近新たに診断されたＯＰＣ患者の血清において強力なＨＰＶ１６  Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７  Ａｂを同定した。ＩＣＣにおいて同定されていなかったため、患者血清においてＥ１およびＥ２  Ａｂが検出されたことは予期しないことであった。ここで、本発明者らは浸潤性子宮頸癌の患者（ｎ＝９５、そのうち３４人（３６％）が既知のＨＰＶ１６＋であった）とＯＰＣ患者（ｎ＝５０、既知のＨＲ  ＨＰＶ＋、これら５０人のうち、２８人（５６％）が既知のＨＰＶ１６＋であり、残りの＞９０％はＨＰＶ１６＋と推定された）由来のＨＰＶ１６  Ａｂレベルを直接比較した。
【００３４】
予想されたように、ＯＰＣ症例は、子宮頸癌の患者よりも高齢であり（平均５４．７歳）、主に男性であって、臨床発生率と一致していた。本発明者らにより男性と女性のＯＰＣ患者間でのＨＰＶ１６  Ａｂレベルにおける差異は識別されなかった（データは示さず）。これらは遡った試料であり、ＩＣＣとＯＰＣ血清は国の異なる地域から集められた。前記ビーズアレイによって検出されたＡｂは、浸潤性子宮頸部血清に比べて浸潤性ＯＰＣ血清において有意に高かった（図３）。
【００３５】
具体的には、いくつかのＡｂはＩＣＣとＯＰＣ血清：Ｅ１、ＮＥ２、ＣＥ２、Ｅ６、およびＥ７を判別したため（ｐ＜０．００１）、Ｅ１およびＥ２  ＡｂはＯＰＣに関する特異的バイオマーカーでありうることが示唆される。図３に見られるように、強力なＥ７特異的Ａｂの応答が６／３４（１８％）ＨＰＶ１６＋ＩＣＣ症例で検出されたため、これらの患者は初期−遺伝子抗体に対するＩｇＧ応答を上昇させることができたことが示唆される。これらの症例のいずれにも、検出可能なＥ１またはＥ２  Ａｂはなかった。これとは対照的に、Ｅ７  ＡｂでのＨＲ  ＨＰＶ＋ＯＰＣ症例の９２％では、Ｅ１および／またはＥ２  Ａｂがあった。予想されたように、ＯＰＣとＩＣＣ症例間では（増殖感染に対する応答を表す）Ｌ１／Ｌ２の血清学における有意差はなかった。
【００３６】
コルポスコピー・クリニックの設定でＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの症例を識別するためのＨＲ  ＨＰＶ分類でＨＰＶ１６  Ａｂを検出する追加的な効果を評価するために、本発明者らはＨＰＶ１６  ＡｂがＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの検出の特異性を増加させたかどうかを決定するために多変量解析を行った。各ＨＰＶ１６抗原に関する陽性血清学のカットオフ値をＨＰＶや曝露状態が未知の５０人の健康なドナー由来の血清を使用して確立した（表２ｂ）。ＣＩＮ  ０／ＩおよびＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの被験者由来の血清では、このアッセイにおいてＨＰＶ１６抗原（０〜４％）のいずれかに対する抗体検出の頻度は低かった。ＣＩＮ  ０／Ｉ対照の６／１２１（５％）およびＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ症例の１３／１６２（８％）は少なくとも１つの抗体に関して陽性であった。ＨＲ  ＨＰＶ状態なしの全てのAbを使用して、本発明者らは、感度は９５．７％だが特異性はわずか２０．７％であるロジスティック回帰分類子（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）を開発した；一個抜き交差検証研究では、前記分類子は感度は９２．０％で特異性は１７．４％であった。全体的に、ＨＲ  ＨＰＶ  ＤＮＡ分類への抗体レベルの追加により、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの検出に関して感度はより低いが特異性ではわずかな改善がもたらされた。
【００３７】
ＨＰＶ１６＋と確認されたＩＣＣ症例のサブセットのうち、Ｅ７−Ａｂに対して６／３４症例（１８％）が陽性であり、Ｅ４−Ａｂに対して６／３４（１８％）が陽性であり、
Ｅ４−ＡｂまたはＥ７−Ａｂのいずれかに対して１１／３４（３２％）が陽性であった（表２ｂ）。ＨＲ  ＨＰＶ＋ＯＰＣ症例（推定＞９０％がＨＰＶ１６＋）に関しては、Ｅ１、ＮＥ２、ＣＥ２、およびＥ７のそれぞれに対して３６／５０（７２％）が陽性であり、Ｅ４−ＡｂまたはＥ６−Ａｂの検出は低い頻度であった（４０％）。全ての初期遺伝子Ａｂの多重化された評価により検出感度が向上し、ＩＣＣ症例の２１１９５（２２％）、ＩＣＣ  ＨＰＶ１６＋症例の１３／３４（３８％）、およびＨＲ  ＨＰＶ＋ＯＰＣ症例の４７／５０（９４％）で少なくとも１つの抗体に対して陽性であった。
【００３８】
全ての初期遺伝子Ａｂに基づくロジスティック回帰分類子により、子宮頸部疾患と比較してＯＰＣの検出の特異性がさらに向上し、ＣＩＮ  ０／Ｉ対照の４／１２１（３％）およびＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ症例の１１／１６２（７％）と比較して、ＩＣＣ症例の１１９５（１％）、ｉＣＣ  ＨＰＶ１６＋症例の１／３４（２．９％）、およびＨＲ  ＨＰＶ＋ＯＰＣ症例の４６／５０（９２％）で陽性がもたらされた。交差検証研究では、前記分類子によりＩＣＣ症例の２／９５（２％）、ｉＣＣ  ＨＰＶ１６＋症例の２／３４（５．９％）、ＨＲ  ＨＰＶ＋ＯＰＣ症例の４４／５０（８８％）、ＣＩＮ  ０／１対照の４／１２１（３％）およびＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ症例の１１／１６２（７％）で陽性がもたらされた。
【００３９】
子宮頸疾患に関する現在のスクリーニングのガイドラインは、一次細胞学的スクリーニング、例えば、２１歳以上の女性のルーチンのスクリーニングのためのパパニコロー（パップ（Ｐａｐ））テストに依存している。パップテストの感度には限りがあり（５１〜６１％と推定される）、米国でより一般的に使用される液体ベースの細胞学的検査を用いればおそらくそれよりは高くなるであろう。前浸潤性子宮頸部疾患の検出のためのスクリーニング戦略に分子アッセイ、例えばＨＰＶ  ＤＮＡテストを組み込むことは、いくつかの最近の大規模臨床試験の対象である。これらの結果により、ＨＰＶ  ＤＮＡ検査はハイグレードＣＩＮに関する細胞学的スクリーニングよりも著しく感度が高いが、特異性は低いことが実証された。無作為化されたカナダの子宮頸癌スクリーニング試験では、パップテストは３０歳以上の女性に関するＨＰＶ  ＤＮＡ検査（９４．６％）と比較して５５．４％の感度であった。同様に、スウェーデンの無作為化比較対照試験では、ＨＰＶ  ＤＮＡとパップテストスクリーニングを組み合わせることによって、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの発生率の低下をもたらしたが、継続的な二重スクリーニングでは、コストの増加と大腸内視鏡検査を勧められる女性の陽性予測値の減少の両方がもたらされた。液体ベースの細胞学的スクリーニングとＨＰＶ  ＤＮＡの連続同時試験により、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの検出に大きな変化はもたらされなかったが、３０歳以上の女性に対して米国では現在も臨床で使用されている。ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの診断のためにＨＰＶ  ＤＮＡ検査の特異性を向上させるバイオマーカーの開発が、一次スクリーニングのツールとしてＨＰＶ  ＤＮＡ検査の有用性に著しく影響を与える可能性がある。
【００４０】
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８を標的にする有効なＨＰＶワクチンの発達により、ＨＰＶ標的スクリーニング・アッセイの検査前確率が変わることが予測される。ワクチンの癌の発生に対する影響は、感染から腫瘍形成までの長い無症状の段階を経るため高い普及率が達成された後１５年を経過しても出ないであろう。前記ワクチンはフォローアップのためのほとんどの照会となる低悪性度の病変に比べて治療を必要とする高悪性度の病変により大きな影響を与えることになるため、ワクチンが効かなった子宮頸癌のスクリーニングにはさらにより効率的な費用対効果が高くかつ特異的なスクリーニングツールが必要になる。
【００４１】
ここで、ヒト血清におけるＨＰＶ１６特異的ＩｇＧ  Ａｂの検出のための新規なアッセイを使用して、本発明者らはコルポスコピーを勧められた女性のコホートの血清中のＨＰＶ１６特異的初期遺伝子Ａｂの頻度を測定した。本発明者らの結果により、複数のＨＰＶ１６由来初期タンパク質に対するＡｂは、ＣＩＮ  ０１１対照と比較して、ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの未治療患者の血清中に特異的に検出されず、浸潤性癌を伴わない感染症に対して感受性がなかったことが実証される。ＨＰＶ  ＤＮＡは一過、および持続性のＨＰＶ感染を検出しうるが、ＨＰＶ特異的初期遺伝子のＡｂは持続感染または癌の発症の後にのみ生じる可能性がある。本発明者らは、子宮頸癌の最大５５％で検出されるＨＰＶ１６特異性Ａｂの検出に焦点を当てた。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７に対するＨＰＶ１６特異的抗体は、少なくとも１つの抗体に関してＨＰＶ１６＋症例３８％（全体の２２％）陽性の有病率で、浸潤性子宮頸部疾患において検出された。
【００４２】
浸潤性疾患に関して、ＨＰＶ１６特異的Ａｂの検出はＰＣＲによるＨＰＶ１６またはＨＲ  ＨＰＶ  ＤＮＡの症例に関して特異的であった。血清学的アッセイを、他の発癌性ＨＰＶ型に拡張すると、浸潤性癌に関するＡｂアッセイの感度と有用性が改善される可能性がある一方、コルポスコピーに関して危険性が高い患者を選択するために使用される可能性は低いが、浸潤性子宮頸癌の早期発見のための有用性を有しうる。
【００４３】
中咽頭癌の主要かつ支配的な危険因子としてのＨＰＶ１６の出現により、ＨＰＶ特異的初期遺伝子血清Ａｂの検出は、子宮頸部疾患と中咽頭疾患を区別しないことになるという懸念が提起され、結果として、大腸内視鏡検査と耳鼻咽喉科のクリニックへの二重の照会が必要となる。予防ワクチンがＨＰＶ関連中咽頭腫瘍を予防するかどうかは不明であり、代用評価項目として使用できるよく認識された癌前駆体がないため、臨床試験での直接証明は困難である。中咽頭か子宮頸部かにＨＰＶ陽性腫瘍のある人においてＨＰＶタンパク質に対する免疫応答を比較すると、宿主／ウイルスの相互作用およびこれら二つの異なる解剖学的部位の癌の発病のメカニズムにおける類似点または相違点の間接的な証拠を提供しうる。これはまた、早期介入のために、ＯＰＣに関する危険性が高い患者を同定することも可能である。
【００４４】
ここで、本発明者らは浸潤性子宮頸癌および浸潤性中咽頭癌の患者間でＨＰＶ１６  Ａｂの検出を直接比較した。本発明者らはＯＰＣの患者の血清中に検出された強力なＥ１−およびＥ２−特異的Ａｂ間で顕著な違いを検出したが、これは浸潤性子宮頸部疾患の患者では検出されなかった。抗原構造のタンパク質提示の違いはマイナーな寄与因子でありうるが、これらのＡｂが子宮頸癌におけるウイルス・プロテオーム・スクリーニングによっても特徴付けられなかった理由がこれにより説明されうる。ここで試験した浸潤性子宮頸癌およびＯＰＣ患者間の年齢および性別の両方に違いはあったが、Ｅ１／Ｅ２に対するＡｂの検出はＯＰＣにおける年齢または性別には関係がなかった。
【００４５】
ＯＰＣと子宮頸癌との間のＨＰＶウイルス伝播、無症状の段階および病因の直接比較は未だ行われていない。ＯＰＣ腫瘍におけるウイルスＤＮＡおよびウイルス腫瘍性タンパク質の明確な実証により、同一の病原性メカニズムが生じる可能性があることが示唆される。Ｅ１／Ｅ２遺伝子は前記ウイルスの組み込みによって破壊され、Ａｂ検出は抗原発現に通常依存するため、本発明者らのデータにより、ＯＰＣおよび子宮頸癌の間にＥ１／Ｅ２の発現の割合ならびにおそらくはウイルス組み込みおよびエピソームの形態において差があることが示唆され、これら２つのエンティティは臨床的および生物学的の両面で異なる場合があり、これによりＨＰＶ標的療法に影響を与えうることが示唆される。
【表１】
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【表２ａ】
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【表２ｂ】
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【００４６】
実施例２
カスタム・ビーズアレイＥＬＩＳＡを用いて、ＨＰＶ１６プロテオームに対するＡｂを子宮頸部疾患がない（ＣＩＮ  ０、ｎ＝３３）、高悪性度の子宮頸部異形成（ＣＩＮＩＩＩ／ＩＩＩ、ｎ＝５２）、浸潤性子宮頸癌（ＩＣＣ、ｎ＝１３）、および中咽頭癌（ＯＰＣ；ｎ＝１５）の患者由来の血清中で測定した。対照ｐ２１−ＧＳＴ抗原に対する各ＨＰＶ−ＧＳＴ抗原に特異的なＩｇＧのメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）比を決定した。全ての子宮頸部症例および対照はロシュ線形アレイによるＨＰＶ  ＤＮＡに関して分類した。
【００４７】
ＣＩＮ０、ＣＩＮＩＩ／ＩＩＩと比較すると、血清のＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６およびＥ７に対するＡｂのＭＦＩ比は増加した（Ｐ＜０．０５）。ＣＩＮＩＩ／ＩＩＩに関してはＥ１、Ｅ４、およびＥ５に対するＡｂにおける検出可能な差は認められなかった。ＣＩＮＩＩ／ＩＩＩにおいてＬｌおよびＬ２特異的Ａｂの検出の傾向が認められた（ｐ＝０．１）。比較すると、４／１３のＩＣＣの患者由来の血清は、検出可能なＡｂ  Ｅ４、Ｅ６および／またはＥ７を有していた。ＯＰＣ血清はＩＣＣ患者よりもＥ１、Ｅ２、Ｅ６、およびＥ７抗原に対するＡｂの有意に高いＭＦＩ比を有していた（ｐＳ０．０５）。
【００４８】
結論：ＨＰＶｌ６  Ｅ２、Ｅ６、およびＥ７タンパク質に対する血清ＩｇＧ  Ａｂは高悪性度の子宮頸部異形成で検出される。前記した応答はＩＣＣに広がるが、ＩＣＣとは対照的に、ＯＰＣ血清は強力なＥ１およびＥ２  Ａｂを含むため、これら２つのＨＰＶ関連悪性腫瘍の間で抗体応答に反映される生物学の違いが示唆される。
【００４９】
本発明をその詳細な説明に関連して説明してきたが、前述の説明は本発明を例示することを意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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