(57)【要約】  本発明は、薬剤送達のための両親媒性ブロックコポリマーおよび同じコポリマーを含む制御放出系を提供する。前記コポリマーは少なくとも１つの親水性ブロックおよび少なくとも１つの疎水性ブロックを含み、前記疎水性ブロックは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルエーテルおよびそれらの芳香族誘導体からなる群から選択され、前記少なくとも１つの疎水性ブロックはアリール基を含み、当該アリール基は前記疎水性ブロックに分解性リンカーで結合されている。本発明の制御放出系はインビボで投与された際に高い安定性と高い薬剤保持性を示し、これにより作用部位において蓄積と薬剤の放出が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの親水性ブロックおよび少なくとも１つの疎水性ブロックを含むブロックコポリマーであって、前記疎水性ブロックは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルエーテルおよびそれらの芳香族誘導体からなる群から選択され、前記少なくとも１つの疎水性ブロックは芳香族側基を含み、当該芳香族側基は前記疎水性ブロックに分解性リンカーで結合されており、前記芳香族側基はアリールである、ブロックコポリマー。
【請求項２】
前記アリール基はフェニルまたはナフチルである、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項３】
前記疎水性ブロックは、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、グリセリルメタクリレート、グリシジルメタクリレート、グリセリルアクリレート、グリシジルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドからなるリストから選択されるモノマーを含む、請求項１または２に記載のコポリマー。
【請求項４】
前記疎水性ブロックは、ヒドロキシアルキルメタクリルアミドを含む、請求項１または２に記載のコポリマー。
【請求項５】
前記親水性ブロックはポリアルキレングリコール、より好ましくはポリエチレングリコールを含む、上述の請求項のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項６】
前記分解性リンカーは、エステル、オルトエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、無水物、ケタール、アセタール、ヒドラゾンおよびそれらの誘導体から選択される、上述の請求項のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項７】
前記分解性リンカーは、エステルリンカーまたはヒドラゾンリンカーである、請求項６に記載のコポリマー。
【請求項８】
前記疎水性ブロックのモノマーの２５モル％超が前記芳香族側基を含有する、上述の請求項のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項９】
上述の請求項のいずれか一項に記載のブロックコポリマーおよび少なくとも１つの物理的に封入された活性成分を含む制御放出系。
【請求項１０】
前記ポリマーは疎水性コアを有する高分子ミセルの形態であり、前記活性成分は前記ミセルの前記疎水性コアに物理的に封入されている、請求項９に記載の制御放出系。
【請求項１１】
前記活性成分は疎水性または両親媒性である、請求項９または１０に記載の制御放出系。
【請求項１２】
前記活性成分は治療薬または診断薬である、請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の制御放出系。
【請求項１３】
前記活性成分は、デキサメタゾン、ＤＡＰＴ、ドキソルビシン、イマチニブ、ベダキリン、シクロスポリンＡ、パクリタキセルからなるリストから選択される、請求項９乃至１２のいずれか１項に記載の制御放出系。
【請求項１４】
２つの活性成分を含み、前記２つの活性成分は、２つの治療薬であるか、または、治療薬および診断薬である、請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の制御放出系。
【請求項１５】
前記活性成分はパクリタキセルである、請求項１３に記載の制御放出系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカプセル化及びインビボ薬剤送達のための新規クラスのポリマーに関する。本発明の別の態様は、このようなポリマーを含む活性成分（活性薬剤）の制御された放出系である。
【背景技術】
【０００２】
両親媒性ポリマーは、疎水性薬剤を捕捉することができる疎水性コアを有する水性環境においてミセルの形態でカプセル化システムに使用されることが知られている。
【０００３】
薬剤を担持するミセルの所望の特性は、負荷されたミセルの高い安定性、及び例えば静脈内投によって身体に投与された場合、その後の薬剤の良好な保持（血液中の長期循環）である。
【０００４】
先行技術では、高分子ミセル内での薬剤の  共有結合性のカプセル化のための方法が開発されている。共有結合性のカプセル化において、薬剤分子などの活性成分がポリマー鎖に化学的に結合される。しかしながら、これには、薬剤分子を高分子量ポリマー鎖に結合させるために有機合成を実施する必要があり（結果的に問題を伴う）、また各薬剤分子のための新しいポリマーを開発する必要があるために新しいポリマープラットフォーム技術の適用性が制限されるという欠点がある。共有結合性のカプセル化は架橋結合によっても行うことができるが、これにはいくつかの欠点がある。例えば、薬剤の放出は、薬剤と担体を連結するリンカーの分解によって起こらなければならず、これは時として制御することが困難であり、その結果、目的とする作用部位で薬剤の濃度が不十分になる。
【０００５】
たとえいくつかの系がインビトロで良好な安定性を示すとしても、インビボでの安定性が十分ではないこともある。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、血清タンパク質の中には、ミセルとユニマーの動的平衡を乱す恐れのある両親媒性ポリマー分子に結合することができるものがあると仮定されている。したがって、特定の系がインビボ試験において十分な安定性を示すかどうかを予測することは困難である。
【０００６】
別の重要な特性は、投与後のミセル中の薬剤の十分な保持であり、これは血液中のカプセル化薬剤の長期循環に対応する。多くの薬剤は一般に、ヒトまたは動物の体内で短い半減期を有する。したがって、所望の治療効果を得るためには、複数回の毎日の注射または連続的な注入が必要となる。
【０００７】
このため、制御放出または持続放出のための系がそのような目的に非常に望ましい。したがって、特に疎水性の有効成分をカプセル化するための制御された送達系における使用に適したポリマーを提供することが望まれている。こうした系はインビボで高い安定性を有し、薬剤が体内に投与されたときに良好な保持を示すため、薬剤の共有結合性の封入における欠点を回避できる。
【発明の概要】
【０００８】
上記の必要性の少なくともいくつかに対処するために、本発明は、一態様において、少なくとも１つの親水性ブロックおよび少なくとも１つの疎水性ブロックを含むブロックコポリマーであって、前記疎水性ブロックは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルエーテルおよびそれらの芳香族誘導体からなる群から選択され、前記少なくとも１つの疎水性ブロックは芳香族側基を含み、当該芳香族側基は前記疎水性ブロックに分解性リンカーで結合されており、前記芳香族側基はアリールである、ブロックコポリマーを提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、本発明のブロックコポリマーおよび少なくとも１つの物理的に封入された活性成分を含む制御放出系を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】供給ＰＴＸ濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対してプロットされた本発明による負荷されたミセルのカプセル化効率（％）および負荷容量（％）を示す。ＰＴＸはモデル薬剤として使用されるパクリタキセルである。
【００１１】
【図２】負荷されたＰＴＸ濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対してプロットされた、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された本発明による負荷されたミセルのＺ平均動力学的直径（Ｚave，  ｎｍ）および多分散指数（ＰＤＩ）を示す。
【００１２】
【図３】Ａ４３１ヒト腫瘍を有する雌Ｃｒｌ：ＮＵ−Ｆｏｘnu１ｎｕマウスにおける４種の異なるＰＴＸ製剤の静脈内注射後のＰＴＸの血漿濃度を経時的に測定したものを示す。
【００１３】
【図４】ＰＴＸ負荷ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセルの静脈内注射の２４時間後において、マウスの種々の臓器における％／ｇ臓器単位の注射用量（ＩＤ）を示す。
【００１４】
【図５Ａ】注射後の時間（ｈ）に対してプロットされた注射用量（血液中の％ＩＤ）を示す。
【図５Ｄ】注射後の時間（ｈ）に対してプロットされた腫瘍容積に対する注入用量（％ＩＤ／腫瘍のｃｍ3）を示す。
【図５Ｅ】マウスの種々の臓器における臓器容積に対する注入用量（％ＩＤ／ｃｍ3臓器）を示す。モデル薬剤はＰＴＸである。
【００１５】
【図６】本発明のミセルおよび比較対象の系で最初の処置をした後の日数におけるｍｍ3単位の腫瘍サイズの発達を示す。比較対象の系にはタキソール（登録商標）、空のミセル、およびリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ溶液を用いた。
【００１６】
【図７】本発明のＰＴＸを負荷したミセルおよび比較対象の系で最初の処置をした後の日数に対してプロットされた％生存率を示す。比較対象の系にはタキソール（登録商標）、空のミセル、およびリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ溶液を用いた。
【００１７】
【図８】本発明のＰＴＸ（１５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ）を負荷したミセルおよび比較対象の系で最初の処置をした後の日数におけるｍｍ3単位のＭＤＡ−ＭＢ−４６８異種移植片の腫瘍サイズの発達を示す。比較対象の系にはタキソール（登録商標）、空のミセル、およびリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ溶液を用いた。矢印は静脈内注射を示す。
【００１８】
【図９】カプセル化された活性薬剤の化学式を示す。
【００１９】
【図１０】ｍＰＥＧ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）およびｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＢＨＭＰＯ）の化学式を示す。
【００２０】
【図１１】ｐＨ７．４，６．５および５．０におけるｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＢＨＭＰＯ）の空のミセルについて、ＤＬＳによって測定されたサイズおよび光散乱強度を時間の関数として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、芳香族側基を有する特定のポリマーを使用する場合に、高分子ミセルの安定性およびミセル内に物理的に閉じ込められた疎水性薬剤の保持率を高めることができるという賢明な洞察に基づいている。ミセル内に物理的に封入されただけの薬剤について、血液中の循環が長い非常に安定したミセルを得ることは驚くべきことである。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ポリマー鎖上の芳香族側基が薬剤分子との物理的結合の増加をもたらし、それが特に顕著なのは後者が芳香族基を含むことによってポリマー鎖と薬物分子との間の芳香族相互作用が可能である場合であると、本発明者らは考えている。また、ポリマー鎖間の芳香族相互作用は、循環における安定性を助ける。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、用語「コポリマー」は、少なくとも２つのタイプのモノマーが存在するポリマーを意味する。「両親媒性」とは、疎水性および親水性の両方の特性を有することを意味する。
【００２３】
用語「活性成分」は、治療剤および診断剤を含む。治療剤は、ヒトまたは動物の体内で予防的、治療的または薬理学的作用を発揮することができる化合物である。予防的または治療的な作用の下では、通常、ヒトまたは動物の体内の細胞組織との相互作用または細胞組織に対する作用の有益な効果が理解される。適切な診断関連活性成分には、血管造影、ＭＲＩ、ＣＴスキャンイメージング、核磁気共鳴イメージング、ラジオグラフィー、Ｘ線造影イメージング、超音波などに有用なものが含まれる。特定の診断活性成分は、例えば、光増感剤、造影剤（ＭＲＩ造影剤など）、放射性同位体化合物、蛍光化合物、色素である。
【００２４】
「疎水性」とは、１より高いオクタン−水の分配係数ｌｏｇＰを有することを意味する。ｌｏｇＰの定義については、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９７１，  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，  ｎｕｍｂｅｒ  ６を参照されたい。
【００２５】
活性成分分子の「物理的」封入は、ここでは「非共有」結合の同義語として用いられる。「非共有相互作用」とは、共有結合ではない任意の相互作用、すなわち電子対の共有を伴わない原子間または結合間の任意の弱い結合を意味する。非共有結合的相互作用の例は、疎水性、芳香族性（π−π）、水素結合、静電的、立体的複合体および金属−イオン相互作用である。封入は、活性成分の結合、負荷またはカプセル化の同義語としても使用されます。
【００２６】
「リンカー」は、分子の異なる部分（またはビルディングブロック）、典型的には２つの部分を連結する機能を有する化学基を意味する。この場合、分解可能とは生分解性を意味する。「加水分解可能」とは、加水分解による分解性を意味する。「生理学的条件」は、本発明の制御放出系で治療される生物に存在する状態であり、ヒトの場合、これらの条件は、約７．４のｐＨおよび約３７℃の温度を包含する。
【００２７】
本発明のコポリマーは、少なくとも１つの親水性ブロックと少なくとも１つの疎水性ブロックとを含むブロックコポリマーである。したがって本発明のコポリマーは両親媒性ブロックコポリマーである。水溶液中では、これらのポリマーは疎水性のコアを有するミセルを形成し、このミセルには特に疎水性の薬剤を負荷することができる。本発明のコポリマーは、制御放出系、標的送達系、およびヒトまたは動物の体内で使用される他の系における使用に適している。いくつかの実施形態では、これは、本発明のコポリマーが生体吸収性ポリマーであるか、または加水分解後に生体吸収性ポリマーに変換することを意味してもよく、このポリマー材料が生体によって安全に吸収され、時間とともに生体から消失することを意味している。
【００２８】
本発明のポリマーは、（マルチ）ブロックコポリマー（ＡＢ、ＡＢＡ、ＡＢＡＢなど）またはグラフトコポリマー、ランダムコポリマーまたはターポリマー、またはポリマーネットワークのような全ての可能なポリマー構造を有することができる。それらの全てが移植されてもよい。
【００２９】
疎水性ブロックは、好ましくはアクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルエーテルおよびそれらの誘導体の群から選択されるモノマーを含む。より好ましくは、疎水性ブロックはメタクリルアミドまたはその誘導体、より好ましくはヒドロキシアルキルメタクリルアミドを含む。誘導体の場合、特に芳香族誘導体が好ましく、これは誘導体が芳香族基、より好ましくはアリールまたは置換アリールを含有することを意味する。好ましいモノマーの例は、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）、グリセリルメタクリレートまたはグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、グリセリルアクリレートまたはグリシジルアクリレート（ＧＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡＡｍ）を含む。
【００３０】
本発明のコポリマーの少なくとも１つの疎水性ブロックは、分解性リンカーを介して結合した芳香族側基を含む。芳香族とは、側基が少なくとも１つの芳香族環を含むことを意味する。芳香族には、ヘテロアリール基およびアリール基が含まれる。ヘテロアリールは、少なくとも１つの環にＮまたはＳなどのヘテロ原子を含み、必要に応じて置換されています。アリールは、本明細書および請求の範囲を通して、場合により置換されていてもよい環炭素原子から水素原子を除去することによって対応するアレーンから誘導される単環式または多環式の芳香族炭化水素基を意味する。適切な芳香族基の例は、フェニル、ナフチル、インドイルおよびそれらの誘導体である。特に適切なアリール基は、例えばフェニルおよびナフチルである。また、アリールアルキル基も適している。例えば、アリールメチル（特にフェニル）、およびアルキル部分にＣ１〜Ｃ４の炭素原子を有する他のアリールアルキル基などである。いくつかの実施形態において、芳香族側基は、好ましくは、アリール基またはアリールアルキル基である。
【００３１】
好ましくは、芳香族基はベンジル、フェニルまたはナフチルまたはそれらの誘導体、より好ましくはフェニルまたはナフチルである。好ましくは、芳香族基は、疎水性ブロックを形成するモノマーの側基の２５モル％より多く、より好ましくは少なくとも５０モル％で存在する。さらにより好ましくは、疎水性ブロックのモノマーの少なくとも７５モル％が芳香族基を含み、最も好ましくは疎水性ブロックのモノマーの１００モル％が芳香族基を含む。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明のコポリマーの疎水性ブロックは、乳酸基を含まない。乳酸基は、モノラクテート、ジラクテートまたはオリゴラクテート基を意味する。乳酸塩を用いてコポリマーに感熱特性を付与することができる。疎水性ブロックの一部としてのＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドモノラクテートを有する感熱性コポリマーは、Ｙ．Ｓｈｉらによる、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，  １４，  １８２６−１８３７に報告されている。しかしながら、本発明者らは、これらのパクリタキセル負荷ミセルをインビボで試験したところ、薬剤の半減期が２分未満であることを観察した。これは、これらの感熱性ミセルの迅速な不安定化および／またはミセルからの薬剤の迅速な放出を指し示す。対照的に、同じ薬剤パクリタキセルを負荷した本発明によるミセルの半減期は約８時間である。本出願の実施例３および図３を参照する。
【００３３】
本発明では、芳香族側基を疎水性ブロックのポリマー主鎖にカップリングさせるための分解性リンカーが使用される。これにより、物理的に封入された活性成分と一緒にこの基の放出が確実に継続される。リンカーは好ましくは生理学的条件下で分解可能であり、より好ましくは生理学的条件下で加水分解可能である。しかし、リンカーはまた、酵素の作用によって加水分解され得る。一般に、エステル、オルトエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、無水物、ケタール、アセタール、ヒドラゾンおよびそれらの誘導体から選択される公知のリンカーを使用することができる。いくつかの実施形態では、好ましくは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−のエステルリンカーが使用される。その場合、フェニル基はエステルリンカーと共にベンゾイル基を形成し、ナフチル基はエステルリンカーと共にナフトイル基を形成する。さらに他の実施形態では、ヒドラゾンリンカーが使用される。ヒドラゾンリンカーは−Ｃ＝Ｎ−Ｎ−基を含む。
【００３４】
本発明の特定の実施形態では、ｐＨ感受性リンカーが使用される。好ましくは、そのようなリンカーは、７未満のｐＨ、より好ましくは６．５以下のｐＨで加水分解する。
【００３５】
ｐＨ感受性リンカーの利点は、いくつかの腫瘍または炎症部位などの酸性度の高い領域で封入された薬剤を選択的に放出することができることである。また、ミセルの分解および封入された薬剤の放出は、薬剤が負荷されたミセルの細胞結合および内在化の後に、より低いｐＨを有するエンドソームまたはリソソームにおいて生じ得る。
【００３６】
特に好ましいのは、以下の一般式を有するヒドラゾンリンカーである。
【化１】
2017524791.tif 000002
式中、Ｒ1、Ｒ2は互いに独立してＨまたはアルキル基であり、Ｒ3はアルキル基またはケトン基−Ｃ（Ｏ）−である。好ましくは、アルキル基はＣ1−Ｃ3アルキルである。より好ましくは、Ｒ1またはＲ2はメチル基である。好ましい実施形態では、Ｒ3はケトン基−Ｃ（Ｏ）−である。
【００３７】
本発明のコポリマーの親水性ブロックとして、任意の適切なポリマーを使用することができる。好ましくは、親水性ブロックはポリアルキレングリコール、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００３８】
親水性ブロックに対する疎水性ブロックの重量比は、好ましくは１０：９０から９０：１０、より好ましくは４０：６０から６０：４０の範囲である。
【００３９】
コポリマーは、モノマーの混合物から出発して重合反応を行うことにより調製することができる。好ましくは、コポリマーはラジカル重合により得られる。コポリマーを最初に製造し、続いて適切な基をカップリングさせることによってそれを官能化することも可能である。コポリマーの合成方法は当業者に公知である。モノマーを合成するための適切な方法の例は、Ｙ．Ｓｈｉらによる、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，１８２６−１８３７に記載されている。重合反応において使用することができるマクロ開始剤の合成の例は、Ｄ．Ｎｅｒａｄｏｖｉｃらによる、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，３４（２２），７５８９〜７５９１頁に記載されている。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つの物理的に封入された活性成分をさらに含む制御放出系において、または当該制御放出系としての本発明のコポリマーの使用である。
【００４１】
したがって、別の態様では、本発明は、上述の請求項のいずれか一項に記載のブロックコポリマーおよび少なくとも１つの物理的に封入された活性成分を含む制御放出系を提供する。
【００４２】
好ましくは、ポリマーは疎水性コアを有する高分子ミセルの形態であり、活性成分はミセルの疎水性コアに物理的に封入されている。本発明の両親媒性ブロックコポリマーは、高分子ミセルの形態の制御放出系を形成するのに特に適している。高分子ミセルは、ミセルの疎水性コアに封入することができるため、疎水性活性成分のカプセル化と制御放出および標的放出に特に適している。
【００４３】
本発明のミセルはまた、標的薬剤送達に特に適している。すなわち、それらは、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  増強された浸透性および保持効果；  Ｍａｅｄａ，  Ｈ．；  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｈ．；  Ｆａｎｇ，  Ｊ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１３年、６５巻（１号）、７１〜７９頁）のために炎症を起こした組織のような作用部位に選択的に蓄積することができる。
【００４４】
実施例に示されるように、パクリタキセルを負荷した本発明のミセルは、ミセルからの徐放を示し（約１０日で負荷の５０％）、これはミセル中の薬剤の良好な保持を実証する。このミセルはまた、長い血液循環時間（半減期が約８時間）を示す。ＰＴＸを負荷したミセルは、マウスにおいて腫瘍増殖の完全な阻害を示したが、等用量では、ＰＴＸの商業的に使用されたタキソール（登録商標）製剤ははるかに効果が少なかった。
【００４５】
本発明の高分子ミセルはむしろ単分散である。いくつかの実施形態では、ミセルは２０〜１００ｎｍのサイズを有する。これは、動的光散乱によって測定されるＺ平均流体力学的直径を指す。動的分散によって測定すると、多分散指数ＰＤＩは好ましくは０．３未満、より好ましくは０．１５未満である。
【００４６】
活性成分は、好ましくは治療薬または診断薬である。上記のように、より多くの活性成分を同じ系に負荷（封入）することができる。本発明の特定の実施形態では、制御放出系は２つの活性成分を含む。これらは、例えばいくつかの薬剤が同時に投与される併用療法において特に有用な、２つの治療剤であり得る。別の実施形態は、治療薬および造影剤（例えば、ＭＲＩ造影剤）などの診断薬を含む系である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、活性成分分子が少なくとも１つの芳香族基を含むことが好ましい。このような場合、負荷されたミセルは特に安定であり、インビボで薬剤の高い保持力を有することが観察された。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これは、ポリマー鎖の芳香族側基と薬物分子の芳香族相互作用の増強によって部分的に説明され得ると考えられる。
【００４８】
好ましい実施形態では、封入すべき活性成分のタイプは、例えば（グルコ）コルチコステロイド型またはケモスタット型の薬剤分子、ペプチド／タンパク質、造影剤、遺伝物質またはこれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。特に、薬剤は、好ましくは抗癌剤または細胞増殖抑制剤、コルチコステロイド、抗生物質、抗ウイルス剤を含む。異なる化学起源の活性成分は、本発明の高分子ミセルに封入され得る。特に、本発明は、芳香族基を有するか又は有しない疎水性活性成分を封入するのに有益である。疎水性活性成分は、通常は乏しい水溶性のために送達に重大な問題を有する。芳香族基を有さない疎水性活性成分の例はデキサメタゾンである。芳香族基を有する疎水性活性成分の例は、ベダキリンおよびパクリタキセルである。カプセル化すべき疎水性活性成分は、好ましくは少なくとも１、より好ましくは少なくとも１．５のｌｏｇＰを有する。活性成分の水溶性は、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００４９】
また、非疎水性の活性成分を首尾よくカプセル化することができる。塩などの電荷を有する両親媒性化合物がその例である。この両親媒性化合物の一例は塩酸ドキソルビシンである。本発明のミセルに首尾よく封入されることが見出された活性成分の他の例には、ＤＡＰＴ（ノッチ阻害剤）およびシクロスポリンＡ（免疫抑制剤）が含まれる。
【００５０】
この使用の特に好ましい実施形態において、制御放出系は、活性成分としてパクリタキセルを放出する。
【００５１】
本発明の制御放出系は、炎症および増加した血管透過性を特徴とする疾患の治療に適している。このような疾患には、癌、感染、眼疾患、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、ムコプラズマ感染、寄生虫感染、炎症、皮膚疾患、心臓血管疾患、中枢神経系疾患乾癬、自己免疫疾患、増殖性疾患、関節炎、精神病、乾癬、糖尿病、代謝障害、肺疾患、呼吸器疾患、肺疾患、ＣＯＰＤ、筋骨格系疾患、気腫、浮腫、ホルモン疾患からなる群から選択される疾患が含まれるが、これらには限定されない。本発明の放出制御システムはまた、ワクチン接種に使用される麻酔薬の送達に適しており、治療的または予防的である。
【００５２】
明瞭化および簡潔な説明のために、特徴は、同じまたは別個の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載された特徴のすべてまたは一部の組み合わせを有する実施形態を含み得る。
【００５３】
本発明を以下の非限定的な実施例によって例示する。実施例および説明により言及される部およびパーセンテージは、他に示されない限り重量による。実施例において、ミセルの平均粒子サイズ（Ｚave）および多分散指数（ＰＤＩ）は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＡＬＶ／ＣＧＳ−３ゴニオメーターを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて測定した。Ｇｅｍｉｎｉ  ３００ＭＨｚ分光計（Ｖａｒｉａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．、ＮＭＲ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、パロアルト、カリフォルニア、米国）を用いて1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録した。
【実施例】
【００５４】
実施例１  コポリマー合成
マクロ開始剤としてｍＰＥＧ2−ＡＢＣＰＡおよびモノマーとしてＨＰＭＡｍ−Ｂｚを用いて、コポリマーポリ（エチレングリコール）−ｂ−（Ｎ−（２−ベンゾイルオキシプロピル）メタクリルアミド））（ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ））を合成した。モノマーは、Ｙ．Ｓｈｉらによる、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，  １４，  １８２６−１８３７に記載された手順に従って合成された。フェニル基はエステルリンカーを介してＨＰＭＡモノマーに結合する。マクロ開始剤の合成は、Ｄ．Ｎｅｒａｄｏｖｉｃらによる、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２００１，  ３４（２２），  ７５８９〜７５９１頁に記載されている。
【００５５】
モノマーをアセトニトリル（Ａ４モレキュラーシーブで乾燥）中に０．３ｇ／ｍＬの濃度で溶解し、モノマー対マクロ開始剤のモル比は２００／１であった。溶液を窒素で３０分間フラッシングすることにより脱気した。反応は、窒素雰囲気下、７０℃で２４時間行った。ポリマーをジエチルエーテル中で沈殿させることにより精製し、この溶解／沈殿操作を２回繰り返した。ポリマーを室温で２４時間真空乾燥し、白色粉末として回収した。
【００５６】
合成ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析（ＰＤＩはＭｗ／Ｍｎ  １．７）で２０，０００Ｄａであり、1Ｈ  ＮＭＲ分析により２２，０００Ｄａであった。コポリマー中のＰＥＧ含量は約２３重量％（ＮＭＲ分析に基づいて５，０００ＤａのＰＥＧおよび１７，０００Ｄａの疎水性ブロック）である。Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  ２００４，  ２０（２１），  ｐｐ．  ９３８８−９３９５に報告された方法に従って、ピレンをプローブとして用いて測定したところ、ポリマーの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は１．３μｇ／ｍＬであった。
【００５７】
マクロ開始剤としてｍＰＥＧ2−ＡＢＣＰＡを、モノマーとしてＨＰＭＡｍ−Ｎｔを使用して、ナフトイル誘導体、ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｎｔ）を調製する同様の手順に従った。モノマー対マクロ開始剤のモル比は２５０／１であった。
【００５８】
実施例２  ミセルの調製
空のｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセルは次のように調製した。ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）を２７ｍｇ  ／ｍＬの濃度でＴＨＦに溶解し、続いて１ｍＬの逆浸透（ＲＯ）水に１ｍＬのポリマー溶液を攪拌しながら滴下した。混合物を室温で４８時間インキュベートしてＴＨＦを蒸発させた。得られたミセル分散液を０．４５μｍのナイロン膜（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標））で濾過した。
【００５９】
パクリタキセル（ＰＴＸ）負荷ミセルは以下のように調製した。ＰＴＸおよびｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）（図１０に示す構造）を、ＰＴＸ濃度が３〜１２ｍｇ／ｍＬおよびポリマーが２７ｍｇ／ｍＬになるようにＴＨＦに溶解した。１ｍＬのポリマー溶液を１ｍＬの逆浸透（ＲＯ）水に攪拌しながら滴下した。混合物を室温で４８時間インキュベートしてＴＨＦを蒸発させた。得られたミセル分散液を０．４５μｍのナイロン膜（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標））で濾過した。
【００６０】
ＰＴＸを負荷したミセルの負荷容量、カプセル化効率、サイズおよびサイズ分布（ＤＰＩ）の測定は、Ｙ．  Ｓｈｉらによる、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，  １４，  １８２６−１８３７に記載されている手順に従って行った。結果を図１および図２に示す。
【００６１】
図１は、供給ＰＴＸ濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対する負荷ミセルの封入効率（％）および負荷容量（％）を示す。
【００６２】
図２は、動的光散乱によって測定された負荷されたＰＴＸ濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対する負荷されたミセルのＺ平均動力学的直径（Ｚave、ｎｍ）および多分散指数（ＰＤＩ）を示す。図から分かるように、本発明の高分子ミセルはむしろ単分散であり、好ましくは約７０〜１００ｎｍのサイズを有し、多分散指数ＰＤＩは０．１５未満である。
【００６３】
結果は、１０ｍｇ／ｍｌのＰＴＸの供給濃度まで、薬剤封入効率は非常に良好であり（８０％超）、供給濃度１０ｍｇ／ｍｌで薬剤負荷が高い（約２５％（ｗ／ｗ））製剤が得られた。
【００６４】
実施例３  インビボ研究
ヒトＡ４３１腫瘍異種移植片は、１００μＬのＰＢＳ  ｐＨ  ７．４に懸濁した１×１０6のＡ４３１細胞を用いてマウスの右脇腹に皮下接種することによって確立した。腫瘍はデジタルキャリパーを用いて測定した。腫瘍体積Ｖ（ｍｍ3）は、式Ｖ＝（π／６）ＬＳ2を用いて計算した。ここで、Ｌは最大、Ｓは最小の表面直径である。腫瘍が８０〜１００ｍｍ3の体積に達したとき、マウスを研究に含めた。マウスに尾静脈を介して１００μＬのＰＴＸ負荷ミセル（３．２ｍｇ／ｍＬのＰＴＸおよび２７ｍｇ／ｍＬのポリマー）を注射した。
【００６５】
Ａ４３１ヒト腫瘍を有する雌Ｃｒｌ：ＮＵ−Ｆｏｘnu１ｎｕマウス（２２．５±２．５ｇ）マウス（ｎ＝７〜８）における異なるＰＴＸ製剤の静脈内注射の後のＰＴＸの血漿濃度を経時的に測定した。
【００６６】
使用した４種の製剤は、実施例２に従って得られた本発明のＰＴＸ負荷ミセルｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）と、３種の比較対象の製剤、すなわち感熱性ミセルｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ30−ｃｏ−ＨＰＭＡｍ−Ｌａｃ70）、ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｎｔ25−ｃｏ−ＨＰＭＡｍ−Ｌａｃ75）、および市販のタキソール（登録商標）であり、これらにＰＴＸが負荷された。結果を図３に示す。
【００６７】
図３に見られるように、タキソール（登録商標）または感熱性ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ／  Ｎｔ−ｃｏ−ＨＰＭＡｍ−Ｌａｃ）ミセルを受けたマウスの血液サンプル中のＰＴＸ濃度は、注射の２４時間後に検出限界（０．６μｇ／  ｍＬ血漿）未満であった。感熱性ミセルの製剤として投与された薬剤の半減期は２分未満であると推定されている。
【００６８】
本発明による両親媒性ブロックコポリマーは、負荷されたＰＴＸの優れた保持力を有する安定なミセルを形成すると結論付けることができる。
【００６９】
図４は、ＰＴＸ負荷ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセルの静脈内注射の２４時間後のマウスの種々の臓器における％／ｇ臓器単位の注射用量（ＩＤ）を示す。  タキソール（登録商標）およびＰＴＸ負荷感熱性ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ／Ｎｔ−ｃｏ−ＨＰＭＡｍ−Ｌａｃ）ミセルを受けたマウスの器官（腫瘍、肺、心臓、肝臓、腎臓および脾臓）のＰＴＸ濃度は検出限界（０．４％ＩＤ／ｇ臓器）未満であった（ｎ＝８）。
【００７０】
実施例４  インビボ動態研究
この実施例では、フルオロフォア標識Ｃｙ７およびＣｙ５．５を使用して、ＰＴＸ負荷ミセルの動態特性をインビボで研究する。Ｃｙ７はポリマー鎖に共有結合し、注入されたミセルの最終結果を知らしめる。  Ｃｙ５．５は、ミセルのコアに物理的に負荷され、モデル薬剤として使用された。
【００７１】
ポリマーの疎水性ブロック中に共重合されたＨＰＭＡｍ−Ｂｚに対して２モル％のＡＥＭＡｍ（Ｎ−（２−アミノエチル）メタクリルアミド塩酸塩を用いて実施例１に従ってｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ−ｃｏ−ＡＥＭＡｍ）を合成した。次いで、ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ−ｃｏ−ＡＥＭＡｍ）の第１級アミン側基をＣｙ７  ＮＨＳエステルと反応させた。そのために、Ｃｙ７  ＮＨＳエステルを１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ（４Aモレキュラーシーブ上で乾燥）に溶解した。ポリマー（３１ｍｇ）を乾燥フラスコに移し、Ｃｙ７  ＮＨＳエステル（１０ｍｇ／ｍＬ）および１μＬのＴＥＡ（４Aモレキュラーシーブ上で乾燥）の溶液０．１８ｍＬを加え、５０℃で４８時間反応を行った。非カップリングＣｙ７をＴＨＦ／水（１／１，  ｖ／ｖ）に対する透析により除去し、その際２４時間後に透析液を全部で５回リフレッシュした。凍結乾燥後に最終生成物を集め、凍結乾燥後に暗緑色粉末として得た。
【００７２】
Ｃｙ７で化学的に標識され、物理的にＣｙ５．５が負荷されたｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセルを、実施例２に記載のＰＴＸ負荷ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセルと同様に調製した。簡潔には、２６．６ｍｇの非標識ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）、０．４ｍｇのＣｙ７標識ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）および０．０２ｍｇのＣｙ５．５（物理的に負荷されたモデル薬剤として）の  ＴＨＦ溶液１ｍＬを、撹拌しながら１ｍＬの水に滴下した。ミセル分散液を室温で４８時間インキュベートしてＴＨＦを蒸発させた。次に、得られたミセル分散液を０．４５μｍナイロン膜（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標））で濾過した。
【００７３】
ＣＤ−１ヌード雌マウス（ｎ＝５）にクロロフィルを含まない餌ペレットと水を自由に与え、換気されたケージと臨床的に管理された部屋と雰囲気に閉じ込めた。動物試験は、国内規制によって定められたガイドラインに従って実施され、地元の動物実験倫理委員会によって承認された。実験開始の１５日前に、ＣＤ−１ヌードマウスにＡ４３１腫瘍細胞（４×１０6細胞／１００μＬ  ＰＢＳ  ｐＨ  ７．４）を右脇腹に皮下接種した。これによりおよそのサイズが６〜７ｍｍ幅であるＡ４３１腫瘍異種移植片が発生した。
【００７４】
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃは、それぞれ、モデル薬剤としてＣｙ５．５（ｎ＝５）を負荷したＣｙ７標識ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセルの循環動力学、腫瘍蓄積およびインビボ生体内分布を示す。図５Ａにおいて、注射用量（血液中の％ＩＤ）を注射後の時間（ｈ）に対して示す。図５Ｄにおいて、腫瘍容積に対する注入用量（％ＩＤ／腫瘍のｃｍ3）を注射後の時間（ｈ）に対して示す。図５Ｅは、マウスの種々の臓器における臓器容積に対する注入用量（％ＩＤ／ｃｍ3臓器）を示す。モデル薬剤はＣｙ５．５である。
【００７５】
Ｃｙ７標識はポリマーに共有結合しているので、注入されたミセルの最終結果を知らしめる。ＰＴＸの血漿動態データ（図３）に沿って、ミセルの半減期は約８時間であることは明らかである。Ｃｙ５．５標識はより短い半減期を示す。その理由は恐らく、この化合物はより親水性であり、その結果、ミセル中においてＰＴＸよりも少ない保持を示すためである。
【００７６】
図６は最初の処置の後の日数における腫瘍サイズの発達をｍｍ3単位で示す。下部の２つの曲線は、ＰＴＸが負荷された本発明のミセルのデータを表す。３つの他の曲線は、市販のタキソール（登録商標）、空のミセルおよびＰＢＳを用いて得られたデータを比較データとして提供する。
【００７７】
雌Ｃｒｌ：ＮＵ−Ｆｏｘnu１ｎｕマウス（２２．５±２．５ｇ）におけるヒトＡ４３１腫瘍増殖を、ＰＢＳの静脈内注射、空のｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセル、タキソール（登録商標）（１５ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ）、およびＰＴＸ負荷ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセル（１５および３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ）で処置した（上部）（ｎ＝１２）。その後、ＰＴＸ製剤または陰性対照で処置したＡ４３１腫瘍を有するマウス（ｎ＝１２）のカプラン−マイヤー生存曲線をプロットした（図７）。
【００７８】
図７は本発明のＰＴＸを負荷したミセルおよび比較対象の系で最初の処置をした後の日数に対してプロットされた％生存率を示す。
【００７９】
結果は、ポリマーミセル製剤の治療効率が印象的であることを示している。高用量のミセル製剤（３０ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇ）を受けた動物では、３６日目に完全な腫瘍退縮が観察された。また、低用量のミセル製剤（１５ｍｇ  ＰＴＸ／ｋｇ）は、等用量の市販のタキソール（登録商標）製剤よりも実質的で優れた抗腫瘍効果を示す。
【００８０】
実施例５  インビボ研究、ゆっくりと増殖する腫瘍
実施例４と同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌異種移植片を有するマウスにおいて、ＰＴＸ負荷ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）ミセルの治療効果を調べた。この研究では、マウスはＡ４３１研究（実施例４）と同様の処置を受けたが、静脈内注射は１日おきに投与するのではなく、１週間に１回投与した。腫瘍細胞を接種してから４週間後、腫瘍が約１００ｍｍ3の体積に達したとき、処置を開始した。
【００８１】
図８は最初の処置の後の日数における腫瘍サイズの発達をｍｍ3単位で示す。下部の２つの曲線は、ＰＴＸが負荷された本発明のミセルのデータを表す。３つの他の曲線は、市販のタキソール（登録商標）、空のミセルおよびＰＢＳを用いて得られたデータを比較データとして提供する。矢印は静脈内注射を表す。
【００８２】
図８によれば、タキソール（登録商標）（１５ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ）はわずかに腫瘍の増殖を抑制したのみであったが、一方でＰＴＸ負荷ミセル（１５および３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ）を受けたマウスの腫瘍は、体積が減少し、６０日後に完全に退縮した。これらの結果は、腫瘍モデルとしてのＡ４３１を用いた研究で観察されたＰＴＸ負荷高分子ミセルの強力な治療効果を裏付けている。
【００８３】
ＰＴＸを負荷した高分子ミセルの反復注射は、一般的に耐容性が良好であり、マウスは、治療有効性試験の過程を通じて有意な体重減少がなかった。さらに、組織病理学的分析により肝臓、脾臓および腎臓について代表的に評価されたように、空またはＰＴＸが負荷された高分子ミセルについて、臓器毒性は観察されなかった。これらの観察結果は、ミセル製剤の好ましい毒性プロフィールを示唆している。
【００８４】
これらの実施例に示されるように、本発明の放出制御システムは、ＰＴＸナノメディシンの開発のための魅力的なキャリアシステムである。高分子ミセルは、化学的架橋または共有薬剤結合体を必要とせずに、直接的でコスト効率の良い方法で製造され、優れた負荷容量、強化された安定性および強力なＰＴＸ保持を特徴とする。ミセルＰＴＸのＩＣ50値は、Ａ４３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の両方について、遊離薬剤（すなわちタキソール（登録商標））のＩＣ50値に匹敵し、ＰＴＸの効力がカプセル化によって損なわれなかったことを示している。ミセルの特徴は、２つのよく知られており、日常的に使用される異種移植モデル（Ａ４３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）において、著しい毒性を誘導せずに、循環動態、実質的な腫瘍蓄積および効率的な腫瘍退縮を確実にし、これにより、この製剤の治療能力（および翻訳能力）が実証されている。
【００８５】
実施例６  種々の活性薬剤のカプセル化
デキサメタゾン、ドキソルビシン塩酸塩（ＤＯＸ．ＨＣｌ）、ベダキリン、ＤＡＰＴおよびシクロスポリンＡのうちの異なる薬剤をカプセル化するために、カプセル化手順に従った。使用されたポリマーは、バッチ番号Ｊ０１（Ｍn４８．０００，［モノマー］／［開始剤］＝６００／１）およびＪ０２（Ｍn５９．０００，［モノマー］／［開始剤］＝１０００／１）を有するｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｂｚ）、およびｍＰＥＧ−ｂｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｎｔ）250（Ｍn３２．０００，［モノマー］／［開始剤］＝２５０／１）であるＪ０３である。分子量ＭｎはＮＭＲにより測定する。活性剤の化学式を図９に示す。
【００８６】
薬剤が負荷されたミセル製剤の調製：
ポリマー５ｍｇと薬剤／薬剤候補１ｍｇを溶解したテトラヒドロフラン１ｍＬを、逆浸透水（ＲＯ）１ｍＬに攪拌しながら滴下し、さらに１分間攪拌を続けた。混合物を一晩フュームフードに入れ、テトラヒドロフランを蒸発させた。薬剤負荷ミセル分散液（ｄｏｘ製剤を除く）を０．４５μｍの膜で濾過し、濾液をＤＬＳで分析（形成されたミセルの大きさ）し、アセトニトリルに溶解した（１容量のミセル分散液を１９容量のアセトニトリルに加えた）。これにより、ＵＶ−可視分光法によるカプセル化効率（ＥＥ）および負荷容量（ＬＣ）の測定を行った（ＨＰＣＬによって分析されたパクリタキセルを除くすべての薬剤）。ＤＯＸ．ＨＣｌを負荷したミセルの場合、製剤をｖｉｖａｓｐｉｎ管を用いて１００００ｇで５分間遠心分離し、濾液中の非負荷薬剤をＵＶ−可視分光法によって定量してＥＥおよびＬＣを計算した。結果を表１に示す。
【表１】
2017524791.tif 000003
【００８７】
この表は、ｌｏｇＰ＞１の薬剤および薬剤候補が、高いＥＥおよびＬＣを有する高分子ミセルにうまく負荷できることを示している。これらに含まれるものは、芳香族基を有する薬剤（ＰＴＸ、ベダキリン、ＤＯＸ．ＨＣｌ、ＤＡＰＴおよびイマチニブ遊離塩基）、芳香族基を有さない疎水性薬剤（デキサメタゾンおよびシクロスポリンＡ）、芳香族基および荷電基を有する薬剤（ＤＯＸ．ＨＣｌ、イマチニブ遊離塩基およびベダキリン）である。異なる分子量のベンゾイル基を有するポリマーに加えて、この表は、パクリタキセルのナフチル基で修飾されたポリマー（ＰＥＧ−ｐ（ＨＰＭＡｍ−Ｎｔ）250）の良好なＥＥおよびＬＣを示す。
【００８８】
実施例７  ｐＨ感受性ミセル
１−［２−（２−ベンゾイルヒドラゾノ）プロピルアミノ］  −２−メチル−２−プロペン−１−オン（ＢＨＭＰＯ）の合成
１８０℃で一晩乾燥したフラスコに、１−（アセトニルアミノ）−２−メチル−２−プロペン−１−オン（ＡＭＰＯ、６７７ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）および４−メトキシフェノール（重合禁止剤、６ｍｇ；  ０．０５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、室温で、１４６ｍＬのメタノール（Ａ４モレキュラーシーブ上で乾燥）に溶解した。ＡＭＰＯは、ＡＣＳ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ，  Ｓｃｉ．  Ｅｎｇ，  ２０１５，  １（６），  ３９３〜４０４頁に記載の方法に従って合成した。  この溶液にＢＨ（６２６ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）を加えた。５分間撹拌した後、７．５ｍＬの氷酢酸を溶液に添加し、反応物を窒素雰囲気下で室温で２４時間撹拌し続けた。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（１／９、ｖ／ｖ）の溶出液を用いるシリカカラムクロマトグラフィー（４０ｇ）により精製した。Ｒｆが０．４の化合物（ヘキサン／酢酸エチル（１／１、ｖ／  ｖ））を含む画分を集め、溶媒を減圧下で除去した。最終生成物を収量８３４ｍｇ（７１％）の黄色粉末として回収し、示差走査熱量測定（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した融点は１６４℃であった。ＤＭＳＯ−ｄ６を溶媒として用い、Ｇｅｍｉｎｉ  ３００ＭＨｚ分光計（Ｖａｒｉａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．  ＮＭＲ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して1Ｈ  ＮＭＲ分析により構造を確認した。  ２．５２ｐｐｍのＤＭＳＯピークを基準線として使用した。化学シフト（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．３（ｓ，Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−ＣＯ）、８．７（ｔ，ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２）、７．９（ｄ，２Ｈ，  芳香族ＣＨ）、７．５（ｍ，３Ｈ，芳香族ＣＨ）、５．７および５．４（ｓ，ＣＨ２＝Ｃ）、４．０（ｄ，ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ）、２．０（ｓ，ＣＨ３−Ｃ＝Ｃ）、１．９（ｓ，ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）＝Ｎ）。
【００８９】
ｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＢＨＭＰＯ）の合成
マクロ開始剤としてｍＰＥＧ2−ＡＢＣＰＡを、モノマーとしてＢＨＭＰＯを用いて、マクロ開始剤経路を介してｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＢＨＭＰＯ）のブロックコポリマーを合成した。モノマーをＤＭＳＯ（Ａ４モレキュラーシーブ上で乾燥）中に０．３ｇ／ｍＬの濃度で溶解し、モノマー対マクロ開始剤のモル比は２００／１であった。溶液を窒素で３０分間フラッシングすることにより脱気した。反応は、窒素雰囲気下、７０℃で２４時間行った。ポリマーをジエチルエーテル中で沈殿させることにより精製し、この溶解／沈殿操作を２回繰り返した。ポリマーを真空下、室温で２４時間乾燥させ、淡黄色の粉末として回収した。
【００９０】
製剤の調製
以下のようにして、パクリタキセル（ＰＴＸ）を負荷したｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＢＨＭＰＯ）（２３ｋＤａ、ＮＭＲによる；図１０に示す構造）ミセルを調製した：ＴＨＦ  ／  ＭｅＯＨ（＝テトラヒドロフラン／メタノール）（１／１、ｖ／ｖ）中のＰＴＸ（４ｍｇ）およびポリマー（２７ｍｇ）の溶液１ｍＬを攪拌しながらＲＯ水１ｍｌに滴下し、１０μＬのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４（１Ｍ）を混合物に添加して、ｐＨを７．４に調整した。ミセル分散液を室温で２４時間インキュベートして、有機溶媒を蒸発させた。次に、ミセル分散液を０．４５μｍの膜を通して濾過した。動的光散乱分析を用いて形成されたミセルのサイズを測定し、ＰＴＸ負荷をＨＰＬＣによって測定した。ＰＴＸ濃度は、３．３ｍｇ／ｍｌ、カプセル化効率は（ＥＥ）８３％、粒子サイズは８３ｎｍ、ＰＤＩは０．０８であると測定された。
【００９１】
空のｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＢＨＭＰＯ）ミセルのｐＨ依存性安定性
空のｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＢＨＭＰＯ）ミセルは、ＰＴＸを添加せずに、上記の方法を用いて調製した。ミセル分散液のｐＨを、ｐＨ５．０の１５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液またはｐＨ６．５のＮａＨ2ＰＯ4緩衝液中で５回希釈することによって、それぞれ５．０または６．５に調整した。異なるｐＨ値および３７℃での空のｍＰＥＧ−ｂ−ｐ（ＢＨＭＰＯ）ミセルのｐＨ依存安定性を、ＤＬＳを用いてミセルのサイズおよび光散乱強度をモニターすることによって研究した。結果を図１１に示す。
【００９２】
図１１に見られるように、ベンゾイル基とポリマー主鎖との間のヒドラゾン結合は、酸性ｐＨ値（６．５および５．０）に対して感受性があり、中性ｐＨ（７．４）では安定である。したがって、ミセルは、血液循環において安定であり、腫瘍組織および細胞において特異的に分解することが予想され、ミセルに負荷されたＰＴＸを放出して腫瘍細胞を殺すことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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