(57)【要約】  マイクロスフェアの形態のエクセナチド含有組成物であって、前記マイクロスフェアは原料として酢酸エクセナチドとポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）とを使用し、製造の完了した組成物における酢酸含有量が０．０１％未満である、エクセナチド含有組成物である。また、エクセナチドマイクロスフェアを製造する方法であって、前記方法は、適切な外水相を選択することと、適切な用量の洗浄液でマイクロスフェアを洗浄することと、マイクロスフェアを凍結乾燥した後に適切な再乾燥温度を選択してマイクロスフェアを硬化させることとを含む。前記マイクロスフェアは、安定性が向上し、薬剤の貯蔵期間が長くなり、粒子径が均一で、重合体の残留が少ない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロスフェアの形態であるエクセナチド含有組成物であって、
前記マイクロスフェアは、出発原料として酢酸エクセナチド又はその塩及び類似物とポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）とを使用し、製造完了した組成物における酢酸含有量が０．０１％未満である、エクセナチド含有組成物。
【請求項２】
前記エクセナチドの含有量が、組成物の合計重量に対して２〜１０％、好ましくは３〜８％、より好ましくは４〜６％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）の含有量が、組成物の合計重量に対して９０〜９８％、好ましくは９２〜９７％、より好ましくは９４〜９６％である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）の分子量が、６０００〜４５０００ダルトンであり、好ましくは１００００〜３００００ダルトン、より好ましくは１００００〜２５０００ダルトンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ＰＬＧＡのラクチドとグリコライドのモル比が、９０：１０〜１０：９０、好ましくは７５：２５〜２５：７５、より好ましくは６０：４０〜４０：６０であり、特に好ましくは５０：５０である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ＰＬＧＡの固有粘度が、０．１〜０．４０ｄＬ／ｇであり、好ましくは０．１０〜０．３５ｄＬ／ｇの範囲であり、より好ましくは０．１０〜０．３０ｄＬ／ｇである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
マイクロスフェアが溶媒揮発法によって製造され、マイクロスフェア製造工程は、
有機溶媒を用いてＰＬＧＡを有機溶液になるように調製し、酢酸エクセナチドとＰＬＧＡ有機溶液とを混合し、一次エマルションを形成することと、
一次エマルションを外水相に添加して乳化させ、硬化させて、有機溶媒を揮発させ、さらに洗浄、凍結乾燥を行って、マイクロスフェアを得ることと
を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
適切な割合の洗浄液を選用するとともに所定の再乾燥温度を設定することでマイクロスフェアが得られる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記有機溶媒は、ポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）を溶解可能であり、ＰＬＧＡを溶解可能なジクロロメタン、アセトン、アセトニトリルなどの有機溶媒であってよいが、好ましくはジクロロメタンであり、
前記洗浄において、蒸留水又はアルカリ性緩衝溶液、好ましくは蒸留水を洗浄液として使用し、マイクロスフェアと洗浄液の重量比が１：２５０以上であり、好ましい重量比が１：３３０以上である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記凍結乾燥において、再乾燥温度を酢酸エクセナチドとＰＬＧＡとの混合物のガラス転移点以下に設定する、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記外水相がポリビニルアルコール溶液であり、前記組成物においてポリビニルアルコールの重量パーセントが０．００８％以下である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記外水相であるポリビニルアルコール溶液のポリビニルアルコールの重量体積パーセント濃度（ｇ／１００ｍｌ）が０．５〜１．５％であり、好ましいポリビニルアルコールの重量体積パーセント濃度が１％であり、
溶液のｐＨ値が５．６±１．０であり、好ましい溶液のｐＨ値が５．６±０．５であり、より好ましい溶液のｐＨ値が５．６±０．２である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
酸、アルカリ又は緩衝溶液で外水相のｐＨ値を調整し、前記酸、アルカリ又は緩衝溶液が水溶性の酸、アルカリ又は緩衝溶液であり、好ましくは、前記酸が０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸であり、前記アルカリが０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムであり、前記緩衝溶液がフタル酸塩緩衝溶液（ｐＨ＝５．６）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物においてポリビニルアルコールの平均分子量が１３０００〜２３０００である、請求項１１、１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１５】
マイクロスフェアの形態のエクセナチド含有組成物を製造する方法であって、酢酸エクセナチド又はその塩及び類似物とポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）とを出発原料とし、スフェアは溶媒揮発法を使用して製造され、
マイクロスフェア製造工程は、
有機溶媒を用いてＰＬＧＡを有機溶液になるように調製し、エクセナチドとＰＬＧＡ有機溶液とを混合し、一次エマルションを形成することと、
一次エマルションを外水相に添加して乳化させ、硬化させて、有機溶媒を揮発させ、さらに洗浄、凍結乾燥を行って、マイクロスフェアを得ることと
を含む、マイクロスフェアの形態のエクセナチド含有組成物を製造する方法。
【請求項１６】
適切な割合の洗浄液を選用するとともに所定の再乾燥温度を設定することでマイクロスフェアが得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記有機溶媒は、ポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）を溶解可能であり、ＰＬＧＡを溶解可能なジクロロメタン、アセトン、アセトニトリルなどの有機溶媒であってよいが、好ましくはジクロロメタンであり、
前記洗浄において、蒸留水又はアルカリ性緩衝溶液、好ましくは蒸留水を洗浄液として使用し、
マイクロスフェアと洗浄液の重量比が１：２５０以上であり、好ましい重量比が１：３３０以上である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記凍結乾燥において、再乾燥温度を酢酸エクセナチドとＰＬＧＡとの混合物のガラス転移点以下に設定する、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記外水相がポリビニルアルコール溶液であり、
溶液のポリビニルアルコールの重量体積パーセント濃度（ｇ／１００ｍｌ）が０．５〜１．５％であり、好ましいポリビニルアルコールの重量体積パーセント濃度が１％であり、
溶液のｐＨ値が５．６±１．０であり、好ましい溶液のｐＨ値が５．６±０．５であり、より好ましい溶液のｐＨ値が５．６±０．２であり、かつ、
前記組成物におけるポリビニルアルコールの残留重量パーセントが０．００８％以下である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
酸、アルカリ又は緩衝溶液を用いて外水相のｐＨ値を調整し、
前記酸、アルカリ又は緩衝溶液が水溶性の酸、アルカリ又は緩衝溶液であり、
好ましくは、前記酸が０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸であり、前記アルカリが０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムであり、前記緩衝溶液がフタル酸塩緩衝溶液（ｐＨ＝５．６）である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野に属し、マイクロスフェアの形態であるエクセナチド含有組成物に関する。さらに、本発明は、当該マイクロスフェアの製造にも関する。
【背景技術】
【０００２】
エクセナチドは、人工合成されるインクレチンミメティックスＧＬＰ‐１ファミリーの一番目の構成要素である。それは、人体生理状態でＧＬＰ‐１を分泌する生体モデルを模しており、腸内から循環内に放出された後、グルコース依存性インスリンの分泌を増強できる。エクセナチドは、そのアミノ酸配列がヒトＧＬＰ‐１と一部重なり、体内で、既知のヒトＧＬＰ‐１受容体に結合し、それを活性化させることができることが示されており、ｃＡＭＰ及び／又は他の細胞内情報伝達機構を含むことによって、グルコース依存性インスリンを合成させ、膵β細胞による体内でのインスリン分泌を増加させる。グルコースの濃度が上昇すると、エクセナチドは、β細胞内からのインスリンの放出を促進するとともに、ＩＩ型糖尿病患者の空腹時及び食後の血糖濃度を低下させることによって、血糖制御を改善することができる。
【０００３】
エクセナチドの既に市販されている製品には主に注射剤があるが、皮下注射のみに使用され、初期量５μｇを毎日２回投薬することが推奨されている。１ヶ月の治療の後、臨床反応に応じて用量を１０μｇまで増加してもよい。当該製剤は、毎日２回（ｂｉｄ）注射され、平均最高血中濃度到達時間が２．１ｈ、平均消失半減期が２．４ｈであり、主に腎臓で除去される。このような注射剤は頻繁に投薬する必要がある上、ＧＬＰ‐１受容体を活性化し続けることができないので、長期間投薬する必要のある糖尿病患者に対する患者コンプライアンスが劣っている。
【０００４】
従来技術は、相分離法を使用してエクセナチドマイクロスフェアを製造することを含むが、相分離法を使用すると、生産操作のステップが多くなり、設備やプロセスに対する要求も高くなる。無菌性及び溶媒残留などに関する医薬製品の品質標準上の要求により、相分離法の製造プロセスで製造されるマイクロスフェアには、さらに多くの製品処理工程が必要になりうる。相分離で製造されるエクセナチドマイクロスフェアにはこのような欠点があるので、一部の研究機関は、生産設備への要求が低く、作業操作のステップが比較的少なく、より少ない後処理工程を使用して製品を処理しても関連する品質標準上の要求を満たすことができるエクセナチドマイクロスフェアを、溶媒揮発法を使用して製造する研究を進めている。エクセナチドの市販品は、エクセナチド酢酸塩であり、製品標準上の要求は３％≦酢酸含有量≦１２％である。従来技術では、エクセナチドマイクロスフェアの製造工程に関連する酢酸含有量が制御されていなかったが、エクセナチドマイクロスフェアの酢酸含有量は貯蔵期間内のエクセナチドの生体利用度に影響を与え、酢酸含有量が０．０１％を超えると貯蔵期間内のマイクロスフェアにおけるエクセナチドの生体利用度を低下させるという問題が発生しうることが、研究を通して分かっている。
【発明の概要】
【０００５】
従来技術に存在する上記の欠点について、本発明者は、鋭意研究した結果、マイクロスフェアであるエクセナチド含有組成物であって、出発原料としてエクセナチド酢酸塩（市販品、３≦酢酸含有量≦１２％）とポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）とを使用し、前記の製造されたエクセナチドマイクロスフェアにおいて酢酸含有量が０．０１％以下に制御される、エクセナチド含有組成物を提供する。
【０００６】
本発明は、マイクロスフェアの形態のエクセナチド含有組成物であって、前記マイクロスフェア出発原料として酢酸エクセナチドとポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）とを使用し、製造の完了した組成物における酢酸含有量が０．０１％未満である、エクセナチド含有組成物を提供する。
【０００７】
前記エクセナチドの含有量は、組成物の合計重量に対して２〜１０％、好ましくは３〜８％、より好ましくは４〜６％である。ポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）の含有量は、組成物の合計重量に対して９０〜９８％、好ましくは９２〜９７％、より好ましくは９４〜９６％である。
【０００８】
前記ポリラクチドーグリコリド共重合体は、その英文名称がＰｌｏｙ（Ｌａｃｔｉｄｅ‐ｃｏ‐ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）であり、ＰＬＧＡと略称される。本発明では、ポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）の分子量が６０００〜４５０００ダルトン、好ましくは１００００〜３００００ダルトン、より好ましくは１００００〜２５０００ダルトンである。前記分子量は「重量平均分子量」を指し、「分子量」と略称される。ＰＬＧＡのラクチドとグリコライドのモル比は９０：１０〜１０：９０、好ましくは７５：２５〜２５：７５、より好ましくは６０：４０〜４０：６０であり、特に好ましくは５０：５０である。ＰＬＧＡの固有粘度は０．１〜０．４０ｄＬ／ｇであり、好ましい範囲は０．１０〜０．３５ｄＬ／ｇ、より好ましくは０．１０〜０．３０ｄＬ／ｇである。ＰＬＧＡの固有粘度（ｉｎｈｅｒｅｎｔ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）の測定方法は、ＰＬＧＡを約０．５％（ｗ／ｖ）の溶液となるようにクロロホルムで調製し、３０℃でＣａｎｎｏｎ‐Ｆｅｎｓｋｅガラス毛細管のビスコースメータを使用してその固有粘度を測定するというものである。
【０００９】
説明上の便宜のため、以下、ラクチドとグリコライドのモル比及び固有粘度を括弧内に表示する。例えば、「ＰＬＧＡ（５０／５０、０．２０、１６０００）」は、ラクチドとグリコライドのモル比が５０：５０であり、固有粘度が０．２０ｄＬ／ｇであり、分子量が１６０００ダルトンである、ポリラクチドーグリコリド共重合体を表す。
【００１０】
本発明で提供する組成物は、溶媒揮発法を用いて製造される。そのため、本発明は、さらにエクセナチド含有組成物の製造方法も提供する。
【００１１】
本発明におけるマイクロスフェアの製造工程は、有機溶媒を用いてＰＬＧＡを有機溶液になるように調製して、酢酸エクセナチドとＰＬＧＡ有機溶液とを混合し、一次エマルションを形成することと、一次エマルションを外水相に添加して乳化させ、硬化させて、有機溶媒を揮発させ、更に洗浄、凍結乾燥を行って、マイクロスフェアを得ることとを含む。
【００１２】
前記有機溶媒は、ポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）を溶解可能であり、ＰＬＧＡを溶解可能なジクロロメタン、アセトン、アセトニトリルなどの有機溶媒であってよいが、好ましくはジクロロメタンである。
【００１３】
製造工程では、適切な割合の洗浄液を選用するとともに所定の再乾燥温度を設定することができる。前記洗浄液には蒸留水又はアルカリ性緩衝溶液を使用するが、好ましくは蒸留水を使用する。マイクロスフェアと洗浄液の重量比は、１：２５０以上であり、好ましい重量比は１：３３０以上である。前記凍結乾燥マイクロスフェアは、再乾燥温度を酢酸エクセナチドとＰＬＧＡとの混合物のガラス転移点以下に設定する。このように調整することにより、本発明で、酢酸含有量が極めて低く、品質標準に適合し、かつ特性の良好なエクセナチドマイクロスフェア製品が得られる。
【００１４】
製造工程では、外水相の濃度とｐＨ値を調整することができる。前記外水相はポリビニルアルコール溶液であり、前記ポリビニルアルコールの平均分子量は１３０００〜２３０００である。溶液のポリビニルアルコールの重量体積パーセント濃度（単位ｇ／１００ｍｌ）は０．５〜１．５％であり、好ましいポリビニルアルコールの重量体積パーセント濃度は１％である。溶液のｐＨ値は５．６±１．０であり、好ましい溶液のｐＨ値は５．６±０．５、より好ましい溶液のｐＨ値は５．６±０．２である。このように調整することにより、本発明で提供される組成物中のポリビニルアルコールの残留量は０．００８％（重量パーセント）以下になる筈である。
【００１５】
具体的には、本発明における前記マイクロスフェアは、溶媒揮発法の以下の例示的な操作によって製造し、得ることができる。一定量のエクセナチド又はその塩及び類似物を秤量するとともに、既知の一定量のラッカー溶媒、プロテイン保護剤、界面活性剤、ポロゲンなどの補助材料を秤量してよく、まず蒸留水を使用してエクセナチド又はその塩及び類似物を溶解可能であり、選用した補助材料を水溶液に溶解させてもよい。一定量のＰＬＧＡを秤量して有機溶媒で溶解させる。前記有機溶媒は、ＰＬＧＡを溶解可能なジクロロメタン、アセトン、アセトニトリルなどの有機溶媒であってよいが、好ましくはジクロロメタンである。エクセナチド及び補助材料を含有する水溶液とＰＬＧＡ有機溶液とを混合して、均一な一次エマルションを形成する。エクセナチド又はその塩及び類似物を含有する一次エマルションを外水相（例えばポリビニルアルコール溶液）に添加して乳化させ、硬化させて、有機溶媒を揮発させ、洗浄、凍結乾燥を行うと、マイクロスフェアが得られる。
【００１６】
以上の操作において、酢酸エクセナチドは、予め水溶液に調製せずに、酢酸エクセナチドとＰＬＧＡ有機溶液を直接混合して一次エマルションを形成してもよい。
【００１７】
マイクロスフェアの製造工程において、前記外水相はポリビニルアルコール溶液である。溶液のポリビニルアルコールの重量体積パーセント濃度は０．５〜１．５％、好ましくは１％である。溶液のｐＨ値は５．６±１．０、好ましくは５．６±０．５、より好ましくは５．６±０．２である。
【００１８】
外水相のｐＨ値は、製造されたマイクロスフェアの特性に対し決定的な役割を果たす。本発明では、酸、アルカリ又は緩衝溶液を用いて外水相のｐＨ値を調整することができ、乳化後にエクセナチド又はその塩及び類似物を含有する油相（一次エマルション）を、選定したｐＨ値の外水相において硬化成形させる。このことが、特性の良好なエクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアを得るための基礎となる。
【００１９】
酸、アルカリ又は緩衝溶液を用いて、外水相のｐＨ値を一定の範囲に安定させることができる。使用される酸は、塩酸、硫酸、酢酸、アミノ酸などの水溶性の酸でありうるが、比較的よく使用されるのは例えば０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸である。使用されるアルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性のアルカリでありうるが、比較的よく使用されるのは例えば０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムである。前記緩衝溶液は、クエン酸塩緩衝溶液、リン酸塩緩衝溶液、酢酸塩緩衝溶液、フタル酸塩緩衝溶液などの緩衝溶液でありうるが、比較的よく使用されるのは例えばフタル酸塩緩衝溶液（ｐＨ＝５．６）である。
【００２０】
以上のような前記酸、アルカリ又は緩衝溶液の調製は『中国薬典２０１０』第２部付録に記載の調整に従ってよい。例えば、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムは付録ＸＶ  Ｆ滴定液の記載に従って調製され、フタル酸塩緩衝溶液（ｐＨ＝５．６）はＸＶ  Ｄ緩衝溶液の記載に従って調製する。
【００２１】
エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造工程において、外水相であるポリビニルアルコールの重量体積パーセント濃度（ｇ／１００ｍｌ）は、製造されたマイクロスフェアの特性に対して重要な役割を果たす。本発明で採用する濃度は０．５〜１．５％、好ましくは１％である。選定した濃度の外水相においてマイクロスフェアを硬化することで、品質標準に適合し、かつ特性の良好なマイクロスフェア製品を得ることができる。
【００２２】
本発明における前記ポリビニルアルコールの平均分子量は１３０００〜２３０００である。この平均分子量のポリビニルアルコールから調製されたポリビニルアルコール水溶液は、製造されたマイクロスフェアの特性において重要な役割を果たす。選定した平均分子量のポリビニルアルコールである外水相においてマイクロスフェアを硬化することで、品質標準に適合し、かつ特性の良好なマイクロスフェア製品を得ることができる。
【００２３】
本発明では、マイクロスフェアの製造工程で、外水相であるポリビニルアルコールの濃度とｐＨ値とを調整してエクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアを製造することによって、マイクロスフェアは、封入率が高く、粒径が均一で、ポリビニルアルコールの残留が少ないという特性に至る。
【００２４】
エクセナチドマイクロスフェアの製造工程において、スフェアとなった後の洗浄液の使用量の選択、及び、マイクロスフェアを凍結乾燥する時間と温度は、製造されたマイクロスフェアにおける酢酸含有量の減少に対して決定的な役割を果たす。
【００２５】
本発明では、マイクロスフェアの洗浄のために、蒸留水又は緩衝溶液を洗浄液として使用しうる。マイクロスフェアと洗浄液の重量比は１：２５０以上であり、好ましい重量比は１：３３０以上である。選定した重量比でマイクロスフェアを洗浄することは、酢酸含有量が極めて低いエクセナチドマイクロスフェアを得るための基礎となる。
【００２６】
マイクロスフェアの洗浄のために、蒸留水又はアルカリ性緩衝溶液を洗浄液として使用すると、洗浄液のｐＨ値を一定の範囲に安定させることができる。使用される緩衝溶液は、クエン酸塩緩衝溶液、リン酸塩緩衝溶液、酢酸塩緩衝溶液、フタル酸塩緩衝溶液などの緩衝溶液でありうるが、好ましくは蒸留水である。
【００２７】
本発明におけるエクセナチドマイクロスフェアの製造工程において、凍結乾燥とは冷凍乾燥の略称であり、通常、予備凍結、昇華乾燥、凍結昇華の繰返し、再乾燥の工程を含む。凍結乾燥とは、溶液が凍結されて固体になり、低温低圧の条件下で、液体を経由することなく凍結状態から直接昇華して液体を除去する乾燥方法である。本発明では、再乾燥工程の温度が限定されるが、その他の工程では通常の方法を使用すればよい。
【００２８】
再乾燥は、凍結乾燥工程において昇華乾燥段階が完了した後に残りの液体をできるだけ除去するために必要となるさらなる乾燥プロセスである。凍結乾燥工程における再乾燥温度は、製造されたマイクロスフェアの酢酸含有量に対して重要な役割を果たす。本発明で採用する再乾燥温度は、酢酸エクセナチドとＰＬＧＡとの混合物（乳化完了している）のガラス転移点以下であり、これによって、品質標準に適合し、かつ特性の良好なマイクロスフェア製品を得ることができる。
【００２９】
本発明は、以上の技術的措置を採用して、マイクロスフェアの製造工程で酢酸含有量を制御してエクセナチドマイクロスフェアを製造することで、マイクロスフェアを長い貯蔵期間内に生体利用度が変化しないという特性に至らせ、製品の貯蔵期間を長くする。
【００３０】
本発明は、酢酸エクセナチドを出発原料として使用してマイクロスフェアを製造するものであり、酢酸の濃度を極めて低い含有量まで低下させることで、マイクロスフェアの安定性を向上させ、薬剤の貯蔵期間を長くする。前記製造方法は、スフェアとなった後に洗浄液の使用量の選択と、マイクロスフェアを凍結乾燥する時間及び温度とを特定することで、最終的にマイクロスフェアの酢酸濃度の制御を達成する。前記製造方法は、乳化工程で水相の濃度とｐＨ値とを調整することによって、封入率が高く、粒径が均一で、ポリビニルアルコールの残留が少ないという特性を実現することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、実施例を通じて本発明についてさらに説明するが、本発明はいかなる形態によっても限定されない。
【００３２】
実施例１：外水相が０．５％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝６．５）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００３３】
ポリビニルアルコール溶液（ＰＶＡ溶液）サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が６．５で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００３４】
製造方法
調合量のエクセナチドを秤取し、蒸留水を加え撹拌して溶解させ、調整して溶液にする。調合量のグリコライド‐ラクチド共重合体（ＰＬＧＡ）を秤取し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を加え撹拌して溶解させ、２つの溶液を均一になるように混合すると、一次エマルションが得られる。調製したＰＶＡ溶液を除菌濾過した後、真空乳化撹拌機（以下、「マイクロスフェア製造釜」という）に入れ、７〜１３℃まで冷却し、外水相とする。一次エマルションをマイクロスフェア製造釜に加え、均質乳化速度を４００ｒｐｍとして、原料供給の完了後に６０秒間乳化し続けた後、均質撹拌速度を１５０ｒｐｍに低下させて５ｈ維持すると、マイクロスフェアが硬化した後に、マイクロスフェアが濾過によって収集される。ＰＶＡ残留がないようにマイクロスフェアを水溶液で洗浄して（具体的な方法については、実施例１１を参照可）凍結乾燥皿に移動させ、マンニトール注射液と適量の水溶液とを加え、冷凍乾燥機に入れて凍結乾燥を行う（具体的な方法については、実施例１１を参照可）。凍結乾燥品が篩によって均一に混合され、マイクロスフェアが得られる。
【００３５】
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００３６】
実施例２：外水相が０．８％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝５．１）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００３７】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が５．１で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００３８】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００３９】
実施例３：外水相が１．０％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝５．６）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００４０】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が５．６で安定するまで、フタル酸塩緩衝溶液（ｐＨ＝５．６）を用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００４１】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００４２】
実施例４：外水相が１．２％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝６．１）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００４３】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が６．１で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００４４】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００４５】
実施例５：外水相を１．５％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝４．６）として、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアを製造する
【００４６】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が４．６で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００４７】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００４８】
実施例６：外水相が１．０％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝６．５）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００４９】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が６．５で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００５０】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００５１】
実施例７：外水相が１．０％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝４．７）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００５２】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が４．７で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００５３】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００５４】
実施例８：外水相が１．０％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝５．６）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００５５】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１１００００〜２０００００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が５．６で安定するまで、フタル酸塩緩衝溶液（ｐＨ＝５．６）を用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００５６】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００５７】
比較例１：外水相が１．０％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝９．０）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００５８】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が９．０で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００５９】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００６０】
比較例２：外水相が１．０％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝３．０）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００６１】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が３．０で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００６２】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００６３】
比較例３：外水相が５．０％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝５．８）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００６４】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が５．８で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００６５】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００６６】
比較例４：外水相が０．１％ポリビニルアルコール水溶液（ｐＨ＝５．６）である、エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの製造
【００６７】
ポリビニルアルコール溶液サンプルの調製
ポリビニルアルコール（平均分子量１３０００〜２３０００）の固体を精密に秤量し、体積を計算した水溶液を量り取って、量り取った水溶液の体積の１／２を用いて、秤量したポリビニルアルコールの固体を溶解し、ポリビニルアルコールの固体が溶解した後に残りの水を溶液に加え、均一になるように撹拌し、溶液のｐＨ値を測定し、水溶液のｐＨ値が５．６で安定するまで、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを用いてポリビニルアルコール水溶液のｐＨ値を調整する。
【００６８】
製造方法
実施例１と同じ方法を使用してマイクロスフェアを製造する。
マイクロスフェアの封入率、粒径、重合体の残留について測定すると、具体的に表１〜３の通りになる。
【００６９】
試験例１  エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの封入率の測定
【００７０】
エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの封入率を、次の方法によって測定した。実施例で製造されたエクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアを２０ｍｇ取って、１０ｍｌメスフラスコに入れ、２ｍｌの氷酢酸を加え、澄みきって透明になるまで超音波によって溶解させ、水をゆっくり加えて水で標線まで希釈し、均一に振って、放置して不溶性物質を沈殿させ、上澄み液を取って供試品溶液とする。また、エクセナチド対照物を適量取って、精密に量って水で溶解し、１ｍｌごとに約０．１ｍｇのエクセナチドを含む溶液となるように定量希釈して対照物溶液とする。供試品溶液及び対照物溶液をそれぞれ２０μｌ精密に吸取し、液体クロマトグラフに注入して、クロマトグラムを記録する。標準法によって供試品におけるエクセナチドの含有量をピーク面積で計算することで、封入量を計算する。
【００７１】
封入率は、実際封入量の理論封入量に占めるパーセントとして表される。測定結果は表１の通りになる。
【００７２】
2017511371.tif 000002
【００７３】
結果の分析
実施例１〜８で製造されたエクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアは、薬剤と溶液の添加方法がマイクロスフェアの封入率に影響せず、封入率は水相の濃度及びｐＨ値に関係する。水相のｐＨ値と濃度が制御されるときには、マイクロスフェアの封入率がいずれも８５％以上となる。比較例では、同じ方法が採用されているが、水相のｐＨ値と濃度が制御範囲外となる場合、マイクロスフェアの封入率はいずれも７０％未満となる。
【００７４】
試験例２  エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアの粒度及び粒度分布の測定
【００７５】
本品を取って、粒度及び粒度分布測定法（中国薬典２０１０年版２部付録ＩＸ  Ｅ第３法）に従って測定する。０．１％ツイン２０溶液を分散剤として、分散剤約１２０ｍｌを粒度分析器（マルバーンＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００粒度分析器を使用）の測定サンプル分散装置内に置き、回転数制御装置を調節し、２１００回転数／ｍｉｎの撹拌速度で撹拌する。まず、ブランクとして分散剤を測定し、その後、本品１ボトルを取って分散剤に入れ、本品が均一に分散した後、そのＤ９０、Ｄ５０、Ｄ１０の粒径を測定する。３回併行測定し、測定結果から平均値を得る。『中国薬典』２０１０版第２部付録ＸＩＸにあるマイクロカプセル、マイクロスフェア及びリポソーム製剤の指導原則計算方法（スパン＝  （Ｄ９０〜Ｄ１０）／Ｄ５０）を使用して、そのスパンを計算する。
を使用する。
スパンはこの公式により計算され、その測定結果は表２の通りになる。
【００７６】
2017511371.tif 000003
【００７７】
結果の分析
実施例１〜８で製造されたエクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアは、薬剤と溶液の添加方法がマイクロスフェアのスパンに影響せず、マイクロスフェアのスパンは水相の濃度及びｐＨ値に関係する。水相のｐＨ値と濃度が制御されるときにマイクロスフェアのスパンを測定すると、データはスパンがいずれも０．８以下であることを示す。これは、製造されたマイクロスフェアの粒径分布が均一であることを表している。比較例では、水相のｐＨ値と濃度が制御範囲外となる場合、マイクロスフェアのスパンは２．０より大きく、マイクロスフェアの粒径も均一ではない。
【００７８】
試験例３  エクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアにおけるポリビニルアルコールの残留の測定
【００７９】
ポリビニルアルコールの残留の測定方法
クロマトグラフ条件：ゲルクロマトカラム（ＴＳＫ‐ＧＥＬ  Ｇ２０００ＳＷＸＬ）を固定相、ｐＨ７．０のリン酸二水素カリウム緩衝溶液を移動相として、流出速度を０．８ｍｌ／ｍｉｎとし、示差屈折率検出器で測定する。
【００８０】
検量線の調製
ＰＶＡを適量取って、精密に量り、約１．０ｍｇ／ｍｌのＰＶＡ母液を調製する。さらに、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌの溶液となるように別々に希釈して標準溶液とする。標準溶液をそれぞれ１００μｌ取って、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。サンプル濃度を横軸、ピーク面積を縦軸として、検量線を作成し、線形回帰を行って、相関係数を０．９９９以上とする。
【００８１】
測定法
マイクロスフェアを約５００ｍｇ取って、精密に量り、まず２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液５０ｍｌでマイクロスフェアを３６時間分解し、２ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ溶液で中和して、中和された溶液を分画相対分子質量が３５００の透析袋で３６時間透析して、ＰＬＧＡの分解生成物を除去し、得られた溶液を真空で凍結乾燥する。水を加えて再溶解し、２ｍｌまで希釈して供試品溶液とし、１００μｌを取って液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。得られたピーク面積について、検量線を用いてその含有量を計算する。
【００８２】
ポリビニルアルコールの残留は、実際の残留重量のマイクロスフェアの合計重量に占めるパーセントとして表される。測定結果は表３の通りになる。
【００８３】
2017511371.tif 000004
【００８４】
結果の分析
実施例１〜８で製造されたエクセナチド又はその塩及び類似物のマイクロスフェアは、マイクロスフェアにおけるポリビニルアルコールの残留が水相の濃度及びｐＨ値に関係する。水相のｐＨ値と濃度が制御されるときにポリビニルアルコールの残留データを測定すると、実施例１〜７におけるポリビニルアルコールの残留は０．００８％以下であり、マイクロスフェアにおけるポリビニルアルコールの残留は少なく、臨床応用も安全である。比較例では、関連するポリビニルアルコールの残留データが０．０１％を超えており、マイクロスフェアにおけるポリビニルアルコールの残留が比較的多い。
【００８５】
実施例９：（酢酸エクセナチドとＰＬＧＡ）：洗浄液＝１：２５０（重量基準）でのエクセナチドマイクロスフェアの製造
【００８６】
製造方法
酢酸エクセナチド原料を７．５ｇ秤取し、蒸留水を２５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、溶液を調整する。グリコライド‐ラクチド共重合体（ＰＬＧＡ  ５０５０  ２Ａ  １６０００）を１４２．５ｇ秤取し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を６７５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、２つの溶液を均一になるように混合すると、一次エマルションが得られる。調製した１％ＰＶＡ溶液７５Ｌｍｌ（具体的な溶液の調製方法については、実施例３を参照可）を除菌濾過した後、真空乳化撹拌機（以下、「マイクロスフェア製造釜」という）に入れ、７〜１３℃まで冷却し、外水相とする。一次エマルションをマイクロスフェア製造釜に加え、均質乳化速度を４００ｒｐｍとして、原料供給の完了後に６０秒間乳化し続けた後、均質撹拌速度を１５０ｒｐｍに低下させて５ｈ維持すると、マイクロスフェアが硬化した後に、マイクロスフェアが濾過によって収集される。蒸留水３７．５ｋｇを洗浄液として秤量し、マイクロスフェアを洗浄して凍結乾燥皿に移動させ、マンニトール注射液と適量の水溶液を加え、冷凍乾燥機に入れて凍結乾燥を行う。再乾燥温度を４０℃（測定された（酢酸エクセナチド＋ＰＬＧＡの混合物）のガラス転移点は４３℃）に設定して、乾燥時間を３６時間とする。凍結乾燥品が篩によって均一に混合され、マイクロスフェアが得られる。
【００８７】
マイクロスフェアの酢酸含有量を測定すると、具体的に表４の通りになる。
【００８８】
実施例１０：（酢酸エクセナチドとＰＬＧＡ）：洗浄液＝１：３００（重量基準）でのエクセナチドマイクロスフェアの製造
【００８９】
製造方法
酢酸エクセナチド原料を７．５ｇ秤取し、蒸留水を２５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、溶液を調整する。グリコライド‐ラクチド共重合体（ＰＬＧＡ  ５０５０  ２Ａ  １７０００）を１４２．５ｇ秤取し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を６７５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、２つの溶液を均一になるように混合すると、一次エマルションが得られる。調製した１％ＰＶＡ溶液７５Ｌ（具体的な溶液の調製方法については、実施例３を参照可）を除菌濾過した後、真空乳化撹拌機（以下、「マイクロスフェア製造釜」という）に入れ、７〜１３℃まで冷却し、外水相とする。一次エマルションをマイクロスフェア製造釜に加え、均質乳化速度を４００ｒｐｍとして、原料供給の完了後に６０秒間乳化し続けた後、均質撹拌速度を１５０ｒｐｍに低下させて４ｈ維持すると、マイクロスフェアが硬化した後、マイクロスフェアが濾過によって収集される。蒸留水４５ｋｇを洗浄液として秤量し、マイクロスフェアを洗浄して凍結乾燥皿に移動させ、マンニトール注射液と適量の水溶液を加え、冷凍乾燥機に入れて凍結乾燥を行う。再乾燥温度を４０℃（測定された酢酸エクセナチド＋ＰＬＧＡの混合物のガラス転移点は４３℃）に設定して、乾燥時間を３６時間とする。凍結乾燥品が篩によって均一に混合され、マイクロスフェアが得られる。
【００９０】
マイクロスフェアの酢酸含有量を測定すると、具体的に表４の通りになる。
【００９１】
実施例１１：（酢酸エクセナチドとＰＬＧＡ）：洗浄液＝１：３３０（重量基準）でのエクセナチドマイクロスフェアの製造
【００９２】
製造方法
酢酸エクセナチド原料を７．５ｇ秤取し、蒸留水を２５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、溶液を調整する。グリコライド‐ラクチド共重合体（ＰＬＧＡ  ５０５０  ２Ａ  １６０００）を１４２．５ｇ秤取し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を６７５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、２つの溶液を均一になるように混合すると、一次エマルションが得られる。調製した１％ＰＶＡ溶液７５Ｌ（具体的な溶液の調製方法については、実施例３を参照可）を除菌濾過した後、真空乳化撹拌機（以下、「マイクロスフェア製造釜」という）に入れ、７〜１３℃まで冷却し、外水相とする。一次エマルションをマイクロスフェア製造釜に加え、均質乳化速度を４００ｒｐｍとして、原料供給の完了後に６０秒間乳化し続けた後、均質撹拌速度を１５０ｒｐｍに低下させて４ｈ維持すると、マイクロスフェアが硬化した後、マイクロスフェアが濾過によって収集される。蒸留水４９．５ｋｇを洗浄液として秤量し、マイクロスフェアを洗浄して凍結乾燥皿に移動させ、マンニトール注射液と適量の水溶液を加え、冷凍乾燥機に入れて凍結乾燥を行う。再乾燥温度を４０℃（測定された酢酸エクセナチド＋ＰＬＧＡの混合物のガラス転移点は４３℃）に設定して、乾燥時間を３６時間とする。凍結乾燥品が篩によって均一に混合され、マイクロスフェアが得られる。
【００９３】
マイクロスフェアの酢酸含有量を測定すると、具体的に表４の通りになる。
【００９４】
実施例１２：（酢酸エクセナチドとＰＬＧＡ）：洗浄液＝１：４００（重量基準）でのエクセナチドマイクロスフェアの製造
【００９５】
製造方法
酢酸エクセナチド原料を７．５ｇ秤取し、蒸留水を２５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、溶液を調整する。グリコライド‐ラクチド共重合体（ＰＬＧＡ  ５０５０  ２Ａ  １６０００）を１４２．５ｇ秤取し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を６７５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、２つの溶液を均一になるように混合すると、一次エマルションが得られる。調製した１％ＰＶＡ溶液７５Ｌ（具体的な溶液の調製方法については、実施例３を参照可）を除菌濾過した後、真空乳化撹拌機（以下、「マイクロスフェア製造釜」という）に入れ、７〜１３℃まで冷却し、外水相とする。一次エマルションをマイクロスフェア製造釜に加え、均質乳化速度を４００ｒｐｍとして、原料供給の完了後に６０秒間乳化し続けた後、均質撹拌速度を１５０ｒｐｍに低下させて４ｈ維持すると、マイクロスフェアが硬化した後、マイクロスフェアが濾過によって収集される。蒸留水６０ｋｇを洗浄液として秤量し、マイクロスフェアを洗浄して凍結乾燥皿に移動させ、マンニトール注射液と適量の水溶液を加え、冷凍乾燥機に入れて凍結乾燥を行う。再乾燥温度を４０℃（測定された酢酸エクセナチド＋ＰＬＧＡの混合物のガラス転移点は４３℃）に設定して、乾燥時間を３６時間とする。凍結乾燥品が篩によって均一に混合され、マイクロスフェアが得られる。
【００９６】
マイクロスフェアの酢酸含有量を測定すると、具体的に表４の通りになる。
【００９７】
実施例１３：３８℃の再乾燥温度設定を使用したエクセナチドマイクロスフェアの製造
【００９８】
製造方法
酢酸エクセナチド原料を７．５ｇ秤取し、蒸留水を２５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、溶液を調整する。グリコライド‐ラクチド共重合体（ＰＬＧＡ  ５０５０  ２Ａ  １６０００）を１４２．５ｇ秤取し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を６７５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、２つの溶液を均一になるように混合すると、一次エマルションが得られる。調製した１％ＰＶＡ溶液７５Ｌ（具体的な溶液の調製方法については、実施例３を参照可）を除菌濾過した後、真空乳化撹拌機（以下、「マイクロスフェア製造釜」という）に入れ、７〜１３℃まで冷却し、外水相とする。一次エマルションをマイクロスフェア製造釜に加え、均質乳化速度を４００ｒｐｍとして、原料供給の完了後に６０秒間乳化し続けた後、均質撹拌速度を１５０ｒｐｍに低下させて４ｈ維持すると、マイクロスフェアが硬化した後、マイクロスフェアが濾過によって収集される。蒸留水４９．５ｋｇを洗浄液として秤量し、マイクロスフェアを洗浄して凍結乾燥皿に移動させ、マンニトール注射液と適量の水溶液を加え、冷凍乾燥機に入れて凍結乾燥を行う。再乾燥温度を３８℃（測定された酢酸エクセナチド＋ＰＬＧＡの混合物のガラス転移点は４３℃）に設定して、乾燥時間を９６時間とする。凍結乾燥品が篩によって均一に混合され、マイクロスフェアが得られる。
【００９９】
マイクロスフェアの酢酸含有量を測定すると、具体的に表４の通りになる。
【０１００】
比較例５：酢酸含有量が０．０１％を超えるエクセナチドマイクロスフェアの製造
【０１０１】
酢酸エクセナチド原料を７．５ｇ秤取し、蒸留水を２５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、溶液を調整する。グリコライド‐ラクチド共重合体（ＰＬＧＡ  ５０５０  ２Ａ）を１４２．５ｇ秤取し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を６７５ｍｌ加え撹拌して溶解させ、２つの溶液を均一になるように混合すると、一次エマルションが得られる。調製した１％ＰＶＡ溶液７５Ｌ（具体的な溶液の調製方法については、実施例３を参照可）を除菌濾過した後、真空乳化撹拌機（以下、「マイクロスフェア製造釜」という）に入れ、７〜１３℃まで冷却し、外水相とする。除菌濾過された油相をマイクロスフェア製造釜に加え、均質乳化速度を４００ｒｐｍとして、原料供給の完了後に６０秒間乳化し続けた後、均質撹拌速度を１５０ｒｐｍに低下させて４ｈ維持すると、マイクロスフェアが硬化した後、マイクロスフェアが濾過によって収集される。蒸留水３０ｋｇを洗浄液として秤量し、マイクロスフェアを洗浄して凍結乾燥皿に移動させ、マンニトール注射液と適量の水溶液を加え、冷凍乾燥機に入れて凍結乾燥を行う。再乾燥温度を３８℃（測定された酢酸エクセナチド＋ＰＬＧＡの混合物のガラス転移点は４３℃）に設定して、乾燥時間を３６時間とする。凍結乾燥品が篩によって均一に混合され、マイクロスフェアが得られる。
【０１０２】
マイクロスフェアの酢酸含有量を測定すると、具体的に表４の通りになる。
【０１０３】
試験例４  異なるエクセナチドマイクロスフェアにおける酢酸含有量の測定
【０１０４】
測定方法
ガスクロマトグラフィー［中国薬典２０１０年版２部付録ＶＥ第（３）法］に従って測定する。
【０１０５】
クロマトグラフ条件とシステム適用性試験
クロマトカラムは、長さが１０ｍ、内径が０．３２ｍｍであり、内層に０．３３μｍのＦＦＡＰ‐ＣＢが塗布された溶融石英キャピラリーカラムである。サンプリング口温度は２２０℃、測定器温度は２５０℃、分流比は１００：１である。カラム温度のプロファイルは、開始温度が５０℃、滞在時間が０．１０分間、昇温速度が３０℃／分、最終温度が２３０℃、滞在時間が５分間である。サンプリング量は１μｌである。理論段数は酢酸ピークで計算すると５０００以上となり、酢酸ピークと内部標準ピークとの分離度は、基準に適合しなければならない。
【０１０６】
補正ファクターの測定：ｎ−ヘキサデカン１．０ｍｌを５０ｍｌメスフラスコに取り、ジメチルホルムアミド３０ｍｌを加え溶解して標線まで希釈し、均一に振って、内部標準溶液とする。また、酢酸対照物を約６２５ｍｇ取って、精密に量り、１００ｍｌメスフラスコに入れ、ジメチルホルムアミドを用いて溶解して標線まで希釈し、均一に振ると、使用することができる。上記の溶液１０ｍｌを精密に量り取って、１００ｍｌメスフラスコに入れ、内部標準溶液５ｍｌを精密に加え、ジメチルホルムアミドを用いて溶解して標線まで希釈し、均一に振る。１μｌを取ってガスクロマトグラフに注入し、サンプリングを３〜５回連続で行い、平均ピーク面積に基づいて補正ファクターを計算する。
【０１０７】
供試品溶液の製造と測定
実施例１で製造されたゴセレリンマイクロスフェアを約５０ｍｇ取って、精密に量って２ｍｌメスフラスコに入れ、ジメチルホルムアミドを１ｍｌ加えて溶解させ、内部標準溶液１００μｌを精密に加え、ジメチルホルムアミドを使用して標線まで希釈し、均一に振る。１μｌを取ってガスクロマトグラフに注入し、内部標準法で計算すると、測定結果は表４の通りになる。
【０１０８】
2017511371.tif 000005
【０１０９】
結果の分析
実施例９〜１３で製造されたエクセナチドマイクロスフェアは、（酢酸エクセナチド＋ＰＬＧＡ）：洗浄液＝１：２５０以上でエクセナチドマイクロスフェアを洗浄し、凍結乾燥をする再乾燥温度を酢酸エクセナチドとＰＬＧＡの混合物のガラス転移点以下とすることで、マイクロスフェアにおける酢酸含有量がいずれも０．０１％以下となる。比較例では、同じ方法が採用されているが、（酢酸エクセナチド＋ＰＬＧＡ）２５０倍よりも低い洗浄液を使用してエクセナチドマイクロスフェアを洗浄するため、マイクロスフェアにおける酢酸含有量が０．０１％より高くなる。
【０１１０】
試験例５  安定性実験の前後におけるエクセナチドマイクロスフェアの体内放出の比較試験
【０１１１】
試験材料
試験薬剤：比較例５、実施例１１、１３で製造されたエクセナチドマイクロスフェアの製造を完了させ、安定性考察（温度４０℃、湿度７５％の条件で６ヶ月放置）の終了後に、サンプルの体内放出の比較試験を行う。測定結果は表５の通りになる。
【０１１２】
実験動物
ＳＤラット（山東緑葉製薬有限公司動物室）。
【０１１３】
実験器具
イオン噴霧イオン化源が装着されたＱＴＲＡＰ５５００型マススペクトログラフ（米国・アプライドバイオシステムズ社製）、
二次元輸液ポンプ、自動サンプリング装置、カラムオーブンを含むＡｇｉｌｅｎｔ１２９０高速液体クロマトグラフィー、
Ａｎｋｅ  ＴＧＬ‐１６Ｇ飛鴿テーブル式遠心機（上海安亭科学儀器廠製）、
Ｔｕｒｂｏ  ＶａｐＬＶ窒素ブロー（バイオタージ社製）。
【０１１４】
実験方法
ａ．実験動物：ＳＤラット、体重２４０±２０ｇ、雄、各組１６匹
ｂ．投薬経路及びその量：投薬量２ｍｇ／ｋｇ、腹部に皮下注射
ｃ．採血タイミング：投薬前（０時間）及び投薬後１ｈ、６ｈ、１ｄ、２ｄ、３ｄ、５ｄ、７ｄ、９ｄ、１１ｄ、１４ｄ、１６ｄ、１８ｄ、２１ｄ、２３ｄ、２５ｄ、２８ｄ
ｄ．生体サンプルの測定：酵素免疫測定法
【０１１５】
結果は表５の通りになる。
【０１１６】
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【０１１７】
結果
マイクロスフェアの製造工程における酢酸エクセナチドは、酢酸含有量が製品貯蔵期間における生体利用度に大きく影響し、安定性考察後（温度４０℃、湿度７５％の条件で６ヶ月放置）に体内放出に変化が見られた。酢酸含有量が０．０１％未満のマイクロスフェアはその体内放出に変化がなかった一方で、酢酸含有量が制御されないマイクロスフェアの生体利用度は２０％以上低下していた。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明は、マイクロスフェアの形態のエクセナチド含有組成物であって、マイクロスフェアの出発原料として酢酸エクセナチドとポリラクチドーグリコリド（ＰＬＧＡ）とを使用し、製造の完了した組成物における酢酸含有量が０．０１％未満である、エクセナチド含有組成物を提供する。エクセナチドマイクロスフェアの製造工程において適切な洗浄液及びその使用量を選択し、マイクロスフェアの凍結乾燥工程において適切な再乾燥温度を選択してマイクロスフェアを硬化することで、品質標準に適合し、かつ特性の良好なマイクロスフェア製品が得られ、マイクロスフェアの安定性が向上して、薬剤の貯蔵時間が長くなる。エクセナチドマイクロスフェアの製造工程において適切な外水相を選択することで、製造されたマイクロスフェアの粒径が均一になり、重合体の残留が少ない特性を生じ、臨床応用のための品質が更に優れた製品を提供することができる。本発明は、産業上の利用に適している。
【国際調査報告】
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