(57)【要約】本発明は、一般に、遺伝的領域が不妊に関連するか評価するための方法であって、前記領域に変更を有する遺伝子改変マウスを産生するステップと、不妊関連の表現型に関してマウスを評価するステップとを含む方法に関する。さらに、本発明から得られた情報は、ヒトの不妊における治療法調査のためのマウスモデルの作製において使用することができる。本発明は、一般に、哺乳動物種における遺伝子座および表現型特徴の間の関係性を決定するのみならず、ヒトおよびマウスの両方において発現される遺伝子座および対応する表現型も同定するための、遺伝子座および表現型のデータ解析に関する。
2017510250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的領域が不妊に関連するか評価するための方法であって、
その機能が不妊に関連すると疑われる遺伝的領域を同定するステップと、
その機能が不妊に関連すると疑われる前記遺伝的領域が変更された、遺伝子改変マウスを産生するステップと、
不妊関連の表現型の存在に関して前記マウスを評価するステップであって、前記表現型の存在が、前記遺伝的領域が不妊に関連することを示すステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記遺伝的領域が、遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
同定するステップが、
遺伝子座のセットに関するデータを得るステップであって、前記セットが、不妊と関連することが既知の遺伝子座および不妊との従前の関連がない遺伝子座を含むステップと、
前記データにおいてクラスタリング解析を行って、不妊と関連することが既知の１種または複数の遺伝子座とクラスター形成する、不妊との従前の関連がない前記遺伝子座を同定するステップであって、不妊と関連することが既知の遺伝子座とクラスター形成する、不妊との従前の関連がない遺伝子座が、不妊に関連すると分類されるステップと
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
データが、遺伝子発現データ、表現型、遺伝子経路の知識およびこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マウスに治療剤を投与するステップと、
前記表現型に対する前記治療剤の効果を評価するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記不妊関連の表現型の存在が、ヒトにおける不妊に関連する遺伝子座のデータベースにおける前記遺伝子の重要性のランク付けにおける因子として使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記表現型の存在が、前記データベースにおける前記遺伝子のランクを増加させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記表現型の非存在が、前記データベースにおける前記遺伝子のランクを減少させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝的領域に対する変更が、変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異が、一塩基多型、欠失、挿入、再編成、コピー数変種およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト遺伝的変更が、マウスにおける不妊表現型に関連するか評価するための方法であって、
その機能がヒト不妊に関連することが既知であるヒト遺伝的領域を同定するステップと、
その機能がヒト不妊に関連する前記遺伝的領域が変更された、遺伝子改変マウスを産生するステップと、
前記不妊表現型の存在に関して前記マウスを評価するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記遺伝的領域が、遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マウスに治療剤を投与するステップと、
前記表現型に対する前記治療剤の効果を評価するステップと
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記不妊表現型の存在が、ヒトにおける不妊に関連する遺伝子座のデータベースにおける前記遺伝子の重要性のランク付けにおける因子として使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記マウスにおける前記表現型の存在が、前記データベースにおける前記遺伝子のランクを増加させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マウスにおける前記表現型の非存在が、前記データベースにおける前記遺伝子のランクを減少させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝的領域に対する変更が、変異である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異が、一塩基多型、欠失、挿入、再編成、コピー数変種およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年１月２７日に出願された米国仮特許第６１／９３２，２３３号に対する利益および優先権を主張し、その全体は参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に、遺伝的領域が、繁殖力および妊孕性障害に関連するか評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
７組のカップルにおよそ１組が、妊娠に困難を抱える。不妊は、どちらかのパートナーにおける単一の原因、または妊娠が起こるもしくは継続することを防止し得る要因（例えば、遺伝的要因、疾患または環境要因）の組合せによるものとなり得る。全ての女性が、閉経によりその生涯において不妊となるであろう。平均して、卵の質および数は、３５歳で急峻に減退し始める。しかし、一部の女性は、人生のさらに早くにこの減退を経験する一方、多数の女性は、４０代になっても妊娠可能である。同様に、女性の生殖寿命が、例えば、月経期間または生殖内分泌学的分娩後変化に関連する自然不妊の期間を含むことは正常であるが、一部の女性は、異常に延長された不妊期間を経験する。かかる障害は、不妊、繁殖力または妊孕性関連障害と称される。一般に、高齢母体年齢（３５歳およびそれを超える）は、より不良な妊孕性成績に関連するが、より若い女性における卵の質問題を診断する、または特定の女性が、卵の質または保留（ｒｅｓｅｒｖｅ）の減退を経験し始める時期を知る術がない。
【０００４】
女性の繁殖力および妊孕性障害の遺伝的基盤の解明は、臨床医が、患者に効率的かつ有効な処置選択肢を指示するのに役立つであろう、強力、迅速かつ非観血的な診断ツールの開発を可能にする。その上、これらの障害の根底にある鍵となる遺伝子座の発見は、創薬および治療のための新規標的の同定の見込みが大いにある。最後に、ヒト繁殖力および妊孕性の根底にある決定的な分子経路のより十分な理解は、次世代の標的化された非ホルモン性避妊薬をガイドする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、低下した繁殖力、妊孕性、早発閉経または延長された不妊期間に対するリスクおよび／または易罹患性を評価するために、様々な繁殖力および妊孕性関連ゲノム領域の状態を利用する。本発明の方法は、１種もしくは複数の繁殖力もしくは妊孕性関連ゲノム領域における１種もしくは複数の多型、これらの領域のうち１種もしくは複数における変異、またはこれらの領域における発現に影響を与えるエピジェネティック要因が挙げられるがこれらに限定されない、ゲノム情報を利用する。繁殖力または妊孕性関連ゲノム領域における変異は、選択的スプライシング事象、ＲＮＡ発現低減もしくは増加、および／またはタンパク質発現の変更と共に、付随する生理的変化をもたらし得る。本発明の方法は、患者に、ホルモンレベルまたは卵胞数等、年齢または他の関連する表現型因子に関連して、異常に延長された不妊期間または繁殖力低下に対する患者の易罹患性を通知するために有用である。
【０００６】
本発明は、一般に、ゲノム領域が、妊孕性関連状態に関連するか評価するための方法を提供する。本発明の態様は、遺伝子改変マウス等、トランスジェニック動物を使用して達成される。異常繁殖力または延長された不妊期間に関連することが疑われるゲノム領域が同定される。この情報を使用して、本発明は、マウス等、試験動物のゲノム修飾を提供する。次に、この遺伝子改変動物を不妊関連の表現型の存在に関して評価する。この表現型の存在は、選択されたゲノム領域が、不妊関係の状態に関連することを示す。本発明の方法は、繁殖力、妊孕性および不妊の根底にある鍵となるゲノム領域の発見を可能にし、創薬および治療のための新規標的のその後の同定を可能にする。その上、不妊表現型の存在を示す遺伝子変更された試験動物は、治療法検査に有用である。
【０００７】
遺伝子座は、遺伝子、および／または該遺伝子もしくは他の遺伝子座の発現に関与するイントロン、プロモーターその他等の上流および下流エレメントを包含することができる。文献、データベースおよび経験的解析の参照を含む、その機能が、延長された不妊に関連することが疑われる遺伝子座の同定に有用な多数の方法が存在する。本発明のある特定の実施形態において、妊孕性関連ゲノム領域を同定することは、不妊と関連することが既知の座位および不妊との従前の関連がない座位を含む遺伝子座のセットに関するデータを得ることを伴う。次に、このデータにおいてクラスタリング解析を行って、不妊と関連することが既知の１種または複数の遺伝子座とクラスター形成する、不妊との従前の関連がない遺伝子座を同定する。よって、不妊との従前の関連がない遺伝子座が、既知の不妊関連の遺伝子座とクラスター形成することを理由として、不妊関係であると同定される。例えば、遺伝子ノックアウトを有する遺伝子変更されたマウスが産生されて、この遺伝子が、不妊関連の表現型に関係付けられるか決定する。このような様式で、不妊に以前に関連付けられたことがない遺伝子座が、潜在的不妊バイオマーカーとして同定される。
【０００８】
不妊は、単一のゲノム変更の結果ではない可能性があり、むしろ、複数の因子または複数の変更の組合せの結果である可能性がある。本発明の方法は、ヒト妊孕性の根底にある分子経路のより十分な理解を提供する。例えば、不妊関連の表現型の存在は、遺伝子（またはより頻繁には変異）を表現型に関連付けることにより、ヒトにおける不妊に関連する遺伝子座のデータベースにおける遺伝子の重要性のランク付けにおける因子として使用される。遺伝子におけるアレルまたは変異の存在と表現型の間の相関は、表現型に対するゲノム領域の寄与の適中率を増加または減少させる。
【０００９】
その上、本発明は、治療剤を検査するための遺伝子変更されたマウスを提供する。このような実施形態において、本発明の方法は、マウスに治療剤を投与することと、表現型に対する治療剤の効果を評価することとをさらに伴う。表現型をレスキューする、すなわち、野生型妊孕性表現型を回復または部分的に再建する治療剤は、優れた薬物候補である。
【００１０】
本発明の他の態様は、ヒトゲノム変更が、マウスにおける不妊表現型に関連するか評価するための方法を提供する。このような方法は、その機能がヒト不妊に関連することが既知であるヒトゲノム領域を同定することを伴う。本方法はその上、その機能がヒト不妊に関係する遺伝的領域が変更された、遺伝子改変マウスを産生することを伴う。次に、このマウスを不妊表現型の存在に関して評価する。
【００１１】
本発明の使用のための他の態様および代替は、次の本発明の詳細な説明に提供される通り、当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、年齢に伴う妊孕性の減退率および年齢に伴う対応する不妊リスク増加を描写する。陰影区域は、不妊リスクの遺伝的スクリーニング（１０代後半〜４０代半ば）対早発性妊孕性減退の遺伝的スクリーニング（１０代後半〜３０代後半）から恩恵を被る異なる年齢群を表す。
【００１３】
【図２】図２は、表現型変数を利用して、女性の不妊に関係する遺伝的領域の発見を加速することができる仕方の１種を描写する。
【００１４】
【図３】図３は、臨床データをゲノムデータと統合して、処置依存的および非依存的妊孕性成績を予測するための方法論を描写する。
【００１５】
【図４】図４は、不妊のリスクに関連する異なる種類の遺伝的バリアントを描写する。
【００１６】
【図５】図５は、不妊に関係する遺伝的領域の同定のために、全ゲノム配列決定において検出されたバリアントによりフィルタリングするための方法を描写する。
【００１７】
【図６】図６は、Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）データベース、遺伝的領域を不妊リスクと相関させるためのツールの構成成分の一部を描写する（Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）Ｓｃｏｒｅ）。
【００１８】
【図７】図７は、不妊患者における生物学的に興味深く統計的に有意な遺伝的バリアントの同定に使用されるバイオインフォマティクスパイプラインである。
【００１９】
【図８】図８は、ＭＵＣ４遺伝的領域における不妊患者において検出された、異なる種類の生物学的または統計的に有意な遺伝的バリアントを示す。
【００２０】
【図９】図９は、不妊に関連するコピー数変種のＣＧＨアレイデータを示す。
【００２１】
【図１０】図１０は、第１染色体のＧＪＣ２遺伝子において検出された特異的コピー数変種を図解する。
【００２２】
【図１１】図１１は、第１９染色体のＣＲＴＣ１およびＧＤＦ１遺伝子において検出された特異的コピー数変種を図解する。
【００２３】
【図１２】図１２は、第６染色体の非コード領域において検出された特異的コピー数変種を図解する。
【００２４】
【図１３】図１３は、２種の患者群（ＺＡ＝ＩＶＦ処置により妊娠しなかった患者、ＺＢ＝ＩＶＦ処置により妊娠した不妊患者）の集団層別化補正を図解する。
【００２５】
【図１４】図１４は、クラスター解析結果の区域を描写する。
【００２６】
【図１５】図１５は、本発明の方法を実行するためのシステムを図解する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、一般に、マウスモデルを開発するためのヒトおよびマウスにおける不妊に関係する遺伝子座および表現型特徴の同定および決定のための方法に関する。さらに、本発明から得られた情報は、ヒトの不妊における治療法調査のためのマウスモデルの作製において使用することができる。本発明は、一般に、哺乳動物種における遺伝子座および表現型特徴の間の関係性を決定するのみならず、ヒトおよびマウスの両方において発現される遺伝子座および対応する表現型も同定するための、遺伝子座および表現型のデータ解析に関する。ランク付け方法論を用いることにより、ヒトおよびマウスの両方において発現されるバイオマーカーまたは遺伝子座を決定することができる。本発明は、ヒト不妊における治療法調査および戦略開発のためのマウスモデルの開発において使用される強力なデータセットを提供する。
【００２８】
バイオマーカー
バイオマーカーは、一般に、生物学的状況の指標として作用し得る分子を指す。本発明の方法による使用のためのバイオマーカーは、不妊に関連するいずれかのマーカーとなり得る。例示的なバイオマーカーは、遺伝子（例えば、機能的産物をコードするＤＮＡのいずれかの領域）、遺伝的領域（例えば、胎盤性哺乳動物における進化を通して保存された領域に特に焦点を置いた、遺伝子および遺伝子間領域を含む領域）および遺伝子産物（例えば、ＲＮＡおよびタンパク質）を含む。ある特定の実施形態において、バイオマーカーは、不妊関連の遺伝的領域である。不妊関連の遺伝的領域は、変種が妊孕性の変化に関連する、いずれかのＤＮＡ配列である。妊孕性の変化の例として、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：不妊関連の遺伝子座のホモ接合型変異は、妊孕性の完全な喪失をもたらし；不妊関連の遺伝子座のホモ接合型変異は、不完全に浸透性であり、個体間で変動する妊孕性の低下をもたらし；ヘテロ接合型変異は、完全に劣性であり、妊孕性に効果がなく；妊孕性における潜在的な欠損が、遺伝子座の非機能的アレルが不活性Ｘ染色体（バー小体）に位置するか、発現されるＸ染色体に位置するかに依存するように、不妊関連の遺伝子座は、Ｘ連鎖型である。
【００２９】
ある特定の態様によると、本発明の方法は、公開および非公開妊孕性／不妊関係のデータベースから得られるデータに基づく、目的の不妊遺伝的領域の決定を提供する。不妊／妊孕性関連データは、着床の調節に関与する遺伝子座、特発性不妊遺伝子座、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）遺伝子座、卵の質遺伝子座、子宮内膜症遺伝子座および早期卵巣機能不全遺伝子座を含むことができる。後述する通り、次に、進化的保存を使用して不妊／妊孕性関連データを処理して、目的のゲノム領域および変種を同定することができる。
【００３０】
進化的保存解析は、一般に、進化的に近縁および遠縁のゲノムの間の核酸配列を比較して、ゲノムにわたるコードおよび／または非コード領域の間の類似性および差を同定することを伴う。試験されている領域および近縁ゲノムの間の類似性は、保存の程度に相関する。時間を超えてゲノムにわたり高度な類似性を維持する領域（例えば、コード、非コード領域および遺伝子に隣接する遺伝子間領域）は、高度に保存されていると考慮される。試験された領域および近縁ゲノムの領域の間の差は、試験された領域が、時間と共に進化したことを示す。試験された領域が、近縁ゲノム間で保存されている場合、この領域は、一般に、この種に重要な（すなわち、機能的に関連する）機能を示すまたは実行すると考慮される。これは、機能的に重要な領域における遺伝的異常性が、典型的には、この種に有害であり、進化期間にわたり取り除かれるためである。機能的エレメントは、淘汰に付されるため、機能的領域は、非機能的領域よりも遅い速度で進化する傾向がある。機能的に関連すると考慮される保存の程度（例えば、標的ゲノム領域および近縁ゲノムの間の類似性の程度）は、特定の用途に依存する。例えば、機能的に関連する程度の保存は、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％等となり得る。次に、進化的保存により機能的に関連すると同定される遺伝子座の領域を、不妊等、疾患および障害を診断するための目的の領域として使用することができる。
【００３１】
ある特定の実施形態によると、目的の不妊領域は、不妊および／または妊孕性関連データから得られる１種または複数の遺伝子座の進化的保存解析を行うことにより同定される。本発明によると、進化的保存を使用した不妊／妊孕性関連データベースによるフィルタリングのプロセスは、ＡＢＣｏＲＥアルゴリズムと呼ばれる。例えば、不妊／妊孕性関連データベースから得られる核酸データは、不妊関係の核酸の保存を評価するために、遠縁のゲノムと比較することができる。保存されていると決定された核酸の領域は、目的の不妊領域として分類される。一実施形態において、本発明の方法は、コード領域の保存を評価して、目的の不妊領域を決定する。別の実施形態において、本発明の方法は、非コード領域の保存を評価して、目的の不妊領域を決定する。さらなる実施形態において、本発明の方法は、遺伝子間領域（すなわち、遺伝子に隣接する非コード領域）の保存を評価して、目的の不妊領域を決定する。他の実施形態において、コードおよび非コード領域の両方の保存を評価して、目的の不妊領域を決定する。上述の実施形態のいずれかにおいて、コード、非コードおよび遺伝子間領域は、例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％等の保存の程度を有する場合、目的の不妊領域として分類することができる。
【００３２】
特定の態様において、次の方法を用いて、保存解析を使用してゲノム領域が目的の妊孕性領域であるか決定する。先ず、不妊または妊孕性に対応する非公開および／または公開核酸データを得る。次に、該データ由来の１種または複数の遺伝子座を保存に関して試験する。続いて、遺伝子のコード領域（すなわち、エクソン）、遺伝子の非コード領域および／または遺伝子に隣接する領域（試験されている遺伝子から上流および下流の遺伝子間領域）を保存に関して解析する。ある特定の実施形態によると、コード領域が、保存されている（例えば、９０％またはそれを上回る保存の程度）ことが判明した場合、このコード領域は、目的の不妊領域であると考慮される。次に、非コード領域の保存の程度を、コード領域の保存の程度と比較する。非コード領域の保存の程度が、コード領域の保存の程度と同様である場合、非コード領域も目的の不妊領域と分類される。この保存比較の程度を使用して、遺伝子に隣接する遺伝子間領域が、目的の不妊領域として分類されるか決定することもできる。
【００３３】
コードおよび／または非コード配列の保存は、Ｈａｒｄｉｓｏｎ，  Ｒ．Ｃ．、Ｏｅｌｔｊｅｎ，  Ｊ．、およびＭｉｌｌｅｒ，  Ｗ．１９９７年、Ｌｏｎｇ  ｈｕｍａｎ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ：  Ａ  ｒｅａｓｏｎ  ｔｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７巻：９５９〜９６６頁；Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｓ．、Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ，  Ｂ．、Ｙａｐ，  Ｗ．Ｈ．、Ｃｈｏｕ，  Ｃ．Ｆ．、Ｔａｙ，  Ａ．、Ｐｏｎｎｉａｈ，  Ｓ．、Ｗａｎｇ，  Ｙ．、およびＴａｎ，  Ｙ．Ｈ．２００２年、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｃｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｕｇｕ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｓ．Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９９巻：２９３６〜２９４１頁；Ｋａｒｏｌｃｈｉｋ，  Ｄｏｎｎａら「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＵＣＳＣ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｒｏｗｓｅｒ．」Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年、１７〜３３頁；Ｓａｎｔｉｎｉ，  Ｓｉｍｏｎａ，  Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｌ．  Ｂｏｏｒｅ，  ａｎｄ  Ａｘｅｌ  Ｍｅｙｅｒ．「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｈｏｘ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ．」Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３．６ａ巻（２００３年）：１１１１〜１１２２頁；Ｒｏｔｈ，  Ｆ．Ｐ．、Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｊ．Ｄ．、Ｅｓｔｅｐ，  Ｐ．Ｗ．、およびＣｈｕｒｃｈ，  Ｇ．Ｍ．１９９８年、Ｆｉｎｄｉｎｇ  ＤＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｕｎａｌｉｇｎｅｄ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｂｙ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｍＲＮＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻：９３９〜９４５頁；ならびにＢｌａｎｃｈｅｔｔｅ，  Ｍ．およびＴｏｍｐａ，  Ｍ．２００２年、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２巻：７３９〜７４８頁に記載されている。
【００３４】
特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、母性効果遺伝子である。母性効果遺伝子は、哺乳動物卵母細胞における鍵となる構造および機能をコードすることが判明した遺伝子座である（Ｙｕｒｔｔａｓら、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １３９巻：８０９〜８２３頁、２０１０年）。母性効果遺伝子は、例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７巻：７７８〜８８頁、１９９７年）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７巻：６９３〜６９４頁、２０００年）；Ｘｉａｏら（ＥＭＢＯ  Ｊ  １８巻：５９４３〜５９５２頁、１９９９年）；Ｔｏｎｇら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４５巻：１４２７〜１４３４頁、２００４年）；Ｔｏｎｇら（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６巻：２６７〜２６８頁、２０００年）；Ｔｏｎｇら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０巻：３７２０〜３７２６頁、１９９９年）；Ｔｏｎｇら（Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １７巻：９０３〜９１１頁、２００２年）；Ｏｈｓｕｇｉら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５巻：２５９〜２６９頁、２００８年）；Ｂｏｒｏｗｃｚｙｋら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２００９年）；およびＷｕ（Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２４巻：４１５〜４２４頁、２００９年）に記載されている。これらそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
続いて、次の本発明のランク付けスキームのうち１種または複数を使用して、上述の目的の不妊遺伝的領域を、有意性に従ってランク付けすることができる。
【００３６】
特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、下表１に示す遺伝子から選択される妊孕性に影響する遺伝子（エクソン、イントロン、および前記遺伝子のいずれかの側に隣接するＤＮＡの進化的に保存された領域を含む）である。表１において、利用できる場合、ＨＧＮＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）参照番号が提示される。
【００３７】
下表１は、妊孕性遺伝子における新規または共通変異またはバリアントに関連する相対的不妊、低妊孕率または早発性妊孕性減退リスクのための可能な遺伝子ランク付けスキームの１種を描写する。バリアント数の列は、未解明の不妊女性の試験におけるこれらのバリアントの実験的観察に対応する。このリストにおける最も高度にランク付けされた（上から下）遺伝子は、妊孕性関連遺伝子のリストのうち、タンパク質構造および機能（生物学的に有意な）に有意な影響を与えることが予測された大部分のバリアントを含有した。生物学的に有意であると考慮される遺伝的バリアントは、１）コードされるタンパク質のフォールディングおよび／または構造を変更することが予測される異なるアミノ酸への変化、２）哺乳動物における高度な進化的保存を有する部位に生じる異なるアミノ酸への変化、３）未成熟終止終結シグナルを導入する変化、４）終止終結シグナルを失わせる変化、５）新たな開始コドンを導入する変化、６）開始コドンを失わせる変化、７）スプライシングシグナルを破壊する変化、８）読み枠を変更する変化、または９）コードされるタンパク質もしくはＲＮＡの遺伝子量（ｄｏｓａｇｅ）を変更する変化を生じる変異を含む。再配列決定から検出されるあらゆる遺伝的バリアントは、１本の染色体のみにおいてバリアントアレルが検出される部位（シングルトン）および１個体のみにおいて配列決定される部位を除外する。
【００３８】
【表１−１】
2017510250.tif 000003
【表１−２】
2017510250.tif 000004
【表１−３】
2017510250.tif 000005
【表１−４】
2017510250.tif 000006
【表１−５】
2017510250.tif 000007
【表１−６】
2017510250.tif 000008
【００３９】
特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、下表２に示す遺伝子から選択される妊孕性に影響する遺伝子（エクソン、イントロン、および前記遺伝子のいずれかの側に隣接するＤＮＡの進化的に保存された領域を含む）である。表２において、利用できる場合、ＨＧＮＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）参照番号が提示される。
【００４０】
下表２は、妊孕性遺伝子における新規または共通変異またはバリアントに関連する相対的不妊、低妊孕率または早発性妊孕性減退リスクのための、別の可能な遺伝子ランク付けスキームを描写する。表２は、統計的有意性が最も高いから低い順に収載された１０種の遺伝子を含有し、これらは、これらの遺伝子のコード領域において検出されたバリアントに基づき、未解明の女性の不妊の試験において不妊リスクと統計的に有意に相関すると決定された。Ｐ値＜０．０２５は、統計的に有意と考慮され、あらゆる他の妊孕性遺伝子は、このリストにおける包接およびランク付けのための有意性検定のパスに適合しなかった。コードレベル解析のため、本出願人らは先ず、個体／遺伝子毎のコード領域のコードバリアントスコアを算出する。コードバリアントスコアは、個体のコード領域における遺伝子の可変性を表し、該個体の該遺伝子のコード領域内のバリアント位置の比率の和として算出される。一連の線形回帰モデルが適合し、成績変数は、所定の遺伝子のコードバリアントスコアであり、独立変数は、群（不妊ｖｓ対照）および主要構成成分由来の民族性（連続的）である。群のｐ値は、統計的推論のために使用される。モデルは、遺伝子毎に１回適合する。
【００４１】
【表２】
2017510250.tif 000009
【００４２】
特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、下表３に示す遺伝子から選択される妊孕性に影響する遺伝子（エクソン、イントロン、および前記遺伝子のいずれかの側に隣接するＤＮＡの進化的に保存された領域を含む）である。表３において、利用できる場合、ＨＧＮＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）参照番号が提示される。
【００４３】
下表３は、妊孕性遺伝子における新規または共通変異またはバリアントに関連する相対的不妊、低妊孕率または早発性妊孕性減退リスクのための、別の可能な遺伝子ランク付けスキームを描写する。表３は、統計的有意性が最も高いから低い順に収載された１１種の遺伝子を含有し、これらは、妊孕性遺伝子のコード、非コードならびに保存された上流および下流領域において検出されたバリアントに基づき、未解明の女性の不妊の試験において不妊リスクと統計的に有意に相関すると決定された。Ｐ値＜０．０２５は、統計的に有意と考慮され、あらゆる他の妊孕性遺伝子は、このリストにおける包接およびランク付けのための有意性検定のパスに適合しなかった。遺伝子レベル解析のため、本出願人らは先ず、個体／遺伝子毎に転写物全体および隣接する進化的に保存された領域の遺伝子バリアントスコアを算出する。遺伝子バリアントスコアは、個体における遺伝子の可変性を表し、該個体の該遺伝子および該遺伝子に隣接するその進化的に保存された領域内のバリアント位置の比率の和として算出される。一連の線形回帰モデルが適合し、成績変数は、所定の遺伝子の遺伝子バリアントスコアであり、独立変数は、群（不妊ｖｓ対照）および主要構成成分由来の民族性（連続的）である。群のｐ値は、統計的推論のために使用される。モデルは、遺伝子毎に１回適合する。
【００４４】
【表３】
2017510250.tif 000010
【００４５】
特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、下表４に示す遺伝子から選択される妊孕性に影響する遺伝子（エクソン、イントロン、および前記遺伝子のいずれかの側に隣接するＤＮＡの進化的に保存された領域を含む）である。表４において、利用できる場合、ＨＧＮＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）参照番号が提示される。
【００４６】
下表４は、妊孕性遺伝子における新規または共通変異またはバリアントに関連する相対的不妊、低妊孕率または早発性妊孕性減退リスクのための、別の可能な遺伝子ランク付けスキームを描写する。表４は、妊孕性に影響する該遺伝子におけるバリアントの可能性が最も高いから最も低い順に収載された、上位ランク付けされた１００種の妊孕性遺伝子を含有する。遺伝子は、遺伝子が妊孕性または生殖に関与する見込みを反映する、Ｃｅｌｍａｔｉｘ  Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）Ｓｃｏｒｅ、Ｇ１Ｖｅｒｓｉｏｎ２に従ってランク付けされる。このスコアは、ゲノムにおける遺伝子毎の属性を含有する、マイニングおよびキュレーションされたデータのデータベースを使用して算出される（図５および図６を参照）。このような属性は、次のものを含む：不妊に関係する疾患および障害、分子経路、分子相互作用、遺伝子クラスター、各遺伝子に関連するマウス表現型、生殖組織における遺伝子発現データ、卵母細胞におけるプロテオミクスデータ、ならびにテキストマイニングにより科学刊行物から生じた情報。
遺伝子または遺伝的領域（座位）の妊孕性関連属性をランク付けして、不妊スコアを得るためのプロセスは、ＳＥＳＭｅアルゴリズムと呼ばれる。ＳＥＳＭｅアルゴリズムは、特定の遺伝子を妊孕性に重要なものとし得る特色および属性のデータベースに適用される。アルゴリズムは、各特色にスコアおよび相対的な重みを割り当て、該遺伝的領域に関連する特色および属性に重みを加えることにより、続いて遺伝的領域を重要性が最も高いから最も低いに（または逆もまた同じ）ランク付けする。例えば、該遺伝子に関連する属性の組み合わされた重みを加えられた値をコンパイルすることにより、スコアが、遺伝子に割り当てられる。各遺伝子が、その重みを加えられた属性に基づきスコア付けされた後に、遺伝子座は、そのスコアに従って重要性の順にランク付けすることができる。不妊属性毎の重みを加えられた値は、不妊に対する属性の有意性または重症度を反映する正または負の整数の割り当てが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの様式で縮尺することができる。
【００４７】
ある特定の実施形態において、遺伝子不妊属性の重みを加えられた値は、−１０から＋１０のスケールのものとなり得る。＋１０は、スコア付けされている遺伝子の属性が、この属性が不妊患者集団において蔓延して見出されるため、不妊に高度に関連することを示すことができる。＋４は、そのままでは不妊の原因とはならないが、加齢および喫煙等の外部因子の影響により不妊をもたらし得ることを意味する、潜在性不妊マーカーである属性を表すことができる。＋２は、一部の不妊患者に見出される属性を表すことができる一方、この属性を不妊に直接的に関係付けるものはない。このスケールにおけるゼロは、不妊に向けたいかなる効果またはいかなるマイナス効果を有することも未だ既知ではない属性を含むことができる。−１０は、不妊に少しも影響しないことが示された属性を含むことができる。さらに、実施形態は、不妊患者集団に一般的に見出される属性のために＋１を、不妊患者集団に見出されるものと同様の属性のために０．５を、不妊と因果関係がない属性のために０を含むように重みを加えられたスケールを提供する。
【００４８】
加えて、属性の重みを加えられた値は、不妊に向けた該属性の既知の有意性に基づき正規化することができる。例えば、また、ある特定の実施形態において、特定の遺伝子の属性をスコア付けする際に、各属性に、属性が存在しなければ０を、属性が存在すれば１を割り当てることができる。次に、属性は、該属性の不妊有意性に基づき正規化することができる。例えば、属性が、不妊と関連することが既知の遺伝的変異である場合、該属性は、５倍に正規化することができる。別の例において、属性が、不妊に関連することもあるシグナリング経路欠損である場合、該属性は、２倍に正規化することができる。
【００４９】
下に示す表４は、本発明の方法に従って遺伝子に関連する属性に重みを加えることによりランク付けされた１００種のヒト妊孕性遺伝子を収載する。
【００５０】
【表４−１】
2017510250.tif 000011
【表４−２】
2017510250.tif 000012
【表４−３】
2017510250.tif 000013
【表４−４】
2017510250.tif 000014
【００５１】
特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、下表５に示す遺伝子から選択される妊孕性に影響する遺伝子（エクソン、イントロン、および前記遺伝子のいずれかの側に隣接するＤＮＡの進化的に保存された領域を含む）である。表５において、利用できる場合、ＨＧＮＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）参照番号が提示される。
【００５２】
下表５は、妊孕性遺伝子における新規または共通変異またはバリアントに関連する相対的不妊、低妊孕率または早発性妊孕性減退リスクのための、別の可能な遺伝子ランク付けスキームを描写する。表５は、妊孕性に影響を与える該遺伝子におけるバリアントの可能性が最も高いから最も低い順に収載された、上位ランク付けされた１００種の妊孕性遺伝子を含有する。遺伝子座は、遺伝子が妊孕性または生殖に関与する見込みを反映するＣｅｌｍａｔｉｘ  Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）Ｓｃｏｒｅ、Ｇ１Ｖｅｒｓｉｏｎ３に従ってランク付けされる。このスコアは、ゲノムにおける遺伝子毎の属性を含有する、マイニングおよびキュレーションされたデータのデータベースを使用して算出される（図５および図６を参照）。このような属性は、次のものを含む：不妊に関係する疾患および障害、分子経路、分子相互作用、遺伝子クラスター、各遺伝子に関連するマウス表現型、生殖組織における遺伝子発現データ、卵母細胞におけるプロテオミクスデータ、ならびにテキストマイニングにより科学刊行物から生じた情報。Ｃｅｌｍａｔｉｘ  Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）Ｓｃｏｒｅ、Ｇ１Ｖｅｒｓｉｏｎ３は、スコア計算のための入力としてより多くの妊孕性遺伝子を含有するため、Ｇ１Ｖｅｒｓｉｏｎ２（表４）とは異なる。
【００５３】
【表５−１】
2017510250.tif 000015
【表５−２】
2017510250.tif 000016
【表５−３】
2017510250.tif 000017
【表５−４】
2017510250.tif 000018
【表５−５】
2017510250.tif 000019
【表５−６】
2017510250.tif 000020
【００５４】
特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、下表６に示す遺伝子から選択される妊孕性に影響する遺伝子（エクソン、イントロン、および前記遺伝子のいずれかの側に隣接するＤＮＡの進化的に保存された領域を含む）である。表５において、利用できる場合、ＨＧＮＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）参照番号が提示される。
【００５５】
下表６は、妊孕性遺伝子における新規または共通変異またはバリアントに関連する相対的不妊、低妊孕率または早発性妊孕性減退リスクのための、別の可能な遺伝子ランク付けスキームを描写する。表６は、上述のリスト（表１〜５）のうち１種に遺伝子が出現する頻度に比較に基づき上位ランク付けされた妊孕性遺伝子を含有する。このリストは、女性の不妊、低妊孕率または早発性妊孕性減退の診断に有用性を有する上位２０種の遺伝的領域を表す。これらの標的は、１）パイロット研究におけるコードレベルで統計的に有意な遺伝的変異を保有する因子、２）パイロット研究におけるコードレベルで統計的に有意な遺伝的変異を保有する因子、３）遺伝子の生化学的特性に影響する、本出願人らのパイロット研究における遺伝的変種を保有する因子、４）遺伝子が妊孕性または生殖に関与する見込みを反映する、本出願人らのＣｅｌｍａｔｉｘ  Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）Ｓｃｏｒｅシステムにおいて高度にランク付けされる因子の一覧を使用して同定した。
【表６−１】
2017510250.tif 000021
【表６−２】
2017510250.tif 000022
【表６−３】
2017510250.tif 000023
【００５６】
特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、下表７に示す遺伝子から選択される妊孕性に影響する遺伝子（エクソン、イントロン、および前記遺伝子のいずれかの側に隣接するＤＮＡの進化的に保存された領域を含む）である。表７において、利用できる場合、ＨＧＮＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）参照番号が提示される。
【００５７】
下表７は、女性の不妊の遺伝的研究において表６に描写される遺伝子において検出されるあらゆる生物学的および／または統計的に有意なバリアントを描写する。生物学的に有意であると考慮される遺伝的バリアントは、１）コードされるタンパク質のフォールディングおよび／または構造を変更することが予測される異なるアミノ酸への変化、２）高度に進化的に保存された部位に生じる異なるアミノ酸への変化、３）未成熟終止終結シグナルを導入する変化、４）終止終結シグナルを失わせる変化、５）新たな開始コドンを導入する変化、６）開始コドンを失わせる変化、７）スプライシングシグナルを破壊する変化、８）読み枠を変更する変化、または９）コードされるタンパク質もしくはＲＮＡの遺伝子量を変更する変化を生じる変異を含む。再配列決定から検出されるあらゆる遺伝的バリアントは、該バリアントアレルが１本の染色体のみにおいて検出される（シングルトン）単一ヌクレオチドレベルの部位および１個体のみにおいて配列決定された部位を除外する。生物学的機能に影響する構造バリアントも報告される。不妊女性の試験から得られる標的化再配列決定データに適用されるこれらの判断基準を使用して、本出願人らは、４９０種のバリアントを検出し、そのうち３７９種を表７に収載する。
【００５８】
統計的に有意なバリアントレベル解析のため、一連のロジスティック回帰モデルを適合し、成績変数は、所定の位置のバリアント状態のバイナリー指標であり、独立変数は、群（不妊ｖｓ．対照）および主要構成成分由来の民族性（連続的）である。群のｐ値およびオッズ比を統計的推論のために使用する。モデルは、位置毎に１回適合する。Ｐ値＜０．００１は、統計的に有意であると考慮される。本出願人らは、標的化再配列決定によりＳＮＰ関連試験を行い、女性の不妊に有意に関連した合計１４７種のＳＮＰを同定した（そのうち５２種を表７に報告する）。各バリアントを新規または既知として分類した。新規部位は、ｐ値算出から除外する。既知バリアントのため、本出願人らは、一連のロジスティック回帰モデルを適用し、成績変数は、所定の位置のバリアント状態のバイナリー指標であり、独立変数は、群（不妊ｖｓ．対照）および主要構成成分由来の民族性（連続的）である。群のｐ値およびオッズ比を統計的推論のために使用する。０．００１未満のＰ値を有意であると考慮した。位置は、ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３７を参照する。アレルは、フォワード鎖において報告される。Ｒｅｆ＝参照アレル、Ａｌｔ＝バリアントアレル。
【表７−１】
2017510250.tif 000024
【表７−２】
2017510250.tif 000025
【表７−３】
2017510250.tif 000026
【表７−４】
2017510250.tif 000027
【表７−５】
2017510250.tif 000028
【表７−６】
2017510250.tif 000029
【表７−７】
2017510250.tif 000030
【表７−８】
2017510250.tif 000031
【表７−９】
2017510250.tif 000032
【表７−１０】
2017510250.tif 000033
【表７−１１】
2017510250.tif 000034
【表７−１２】
2017510250.tif 000035
【表７−１３】
2017510250.tif 000036
【表７−１４】
2017510250.tif 000037
【表７−１５】
2017510250.tif 000038
【表７−１６】
2017510250.tif 000039
【表７−１７】
2017510250.tif 000040
【表７−１８】
2017510250.tif 000041
【表７−１９】
2017510250.tif 000042
【表７−２０】
2017510250.tif 000043
【表７−２１】
2017510250.tif 000044
【表７−２２】
2017510250.tif 000045
【表７−２３】
2017510250.tif 000046
【表７−２４】
2017510250.tif 000047
【表７−２５】
2017510250.tif 000048
【表７−２６】
2017510250.tif 000049
【表７−２７】
2017510250.tif 000050
【表７−２８】
2017510250.tif 000051
【表７−２９】
2017510250.tif 000052
【表７−３０】
2017510250.tif 000053
【表７−３１】
2017510250.tif 000054
【表７−３２】
2017510250.tif 000055
【表７−３３】
2017510250.tif 000056
【表７−３４】
2017510250.tif 000057
【表７−３５】
2017510250.tif 000058
【表７−３６】
2017510250.tif 000059
【００５９】
ある特定の遺伝子の説明
上の表に記載されている妊孕性遺伝子の一部に関する詳細な説明を下に示す。
【００６０】
ＢＡＲＤ１
ＢＲＣＡ１関連リングドメイン１（ＢＡＲＤ１）は、ＢＲＣＡ１遺伝子とヘテロ二量体複合体を形成する遺伝子であり、この複合体は、有糸分裂における紡錘極アセンブリ、したがって、染色体安定性に要求される。ＢＡＲＤ１のホモ接合型ヌルアレルを保有するマウス胚は、著しく損なわれた細胞増殖のため、胎生期７．５〜胎生期８．５の間に死亡した（ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．２３巻：５０５６〜５０６３頁、２００３年）。
【００６１】
Ｃ６ｏｒｆ２２１（ＫＨＤＣ３Ｌ）
ＫＨドメイン含有３様、皮質下母性複合体メンバー（ＫＨＤＣ３Ｌ）。この遺伝子は、識別子「Ｃ６ｏｒｆ２２１」［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：１５４２８８、ＨＧＮＣ  ｉｄ：３３６９９］も有する。ＫＨドメインは、ＲＮＡ分子に結合するタンパク質ドメインであり、ＫＨＤＣ３Ｌは、遺伝子が親起源特異的様式で発現される現象であるゲノムインプリンティングに関与する可能性がある。ＫＨＤＣ３Ｌ遺伝子発現は、胚胞卵母細胞において最大であり、中期ＩＩ卵母細胞を通して漸減し、その発現プロファイルは、他の卵母細胞特異的遺伝子と同様である［Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１年９月９日；８９巻（３号）：４５１〜４５８頁］。これは、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内にも見出された［Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１０年５月；１３９巻（５号）：８０９〜２３頁］。ＫＨＤＣ３Ｌのホモ接合型ヌルアレルを保有するマウスは、ホモ接合型雌の産仔数減少をもたらす胚発生遅延および紡錘体異常性を有する、胚形成における母性効果欠損を呈する。ヒトにおいて、ＫＨＤＣ３Ｌは、家族性二親性胞状奇胎、母性効果劣性遺伝性障害に関係付けられてきた［Ｒｅｆ：Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１年９月９日；８９巻（３号）：４５１〜４５８頁］。
【００６２】
ＤＮＭＴ１
ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：１７８６、ＨＧＮＣ  ｉｄ：２９７６］は、ＤＮＡにおけるシトシン塩基の５位にメチル基を転移させる酵素の群に属する。ＤＮＡメチル化として公知のこのプロセスは、ＤＮＡ塩基組成を変更しないが、ＤＮＡ領域の生化学的特性に影響を与える「エピジェネティック」修飾をＤＮＡ分子に残す。ＤＮＭＴ１によって媒介されるＤＮＡメチル化は、胚形成における細胞運命の決定において重大である［Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００８年６月１５日；２２巻（１２号）：１６０７〜１６頁、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２００２年１月１日；２４１巻（１号）：１７２〜８２頁］。ＤＮＭＴ１のホモ接合型ヌルアレルを保有するマウス胚は、妊娠中期までしか生存できない。ＤＮＭＴ１遺伝子の発現は、生殖組織において他の細胞型よりも有意に高く、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内に見出される［Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１０年５月；１３９巻（５号）：８０９〜２３頁、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９年８月３日；１０巻：３４８頁］。
【００６３】
ＦＭＲ１
脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）は、脆弱Ｘ症候群（ｓｙｍｄｒｏｍｅ）に関係付けられるＲＮＡ結合タンパク質ＦＭＲＰをコードする。翻訳の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦＭＲ１の機能となることができ、変異体ＦＭＲ１タンパク質がオリゴマー形成できないことが、脆弱Ｘ症候群をもたらす病態生理学的事象に寄与し得る。女性の保因者における脆弱Ｘ前変異は、早期卵巣機能不全のリスク因子であると思われる：完全変異保因者の０名および対照の１名（０．４％）と比較して、前変異保因者の１６％において、閉経は４０歳より前に起こり、早発閉経および前変異保因者状態の間の有意な関連を示す［Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．８３巻：３２２〜３２５頁、１９９９年］。
【００６４】
ＦＯＸＯ３
フォークヘッド（Ｆｏｘｈｅａｄ）ボックスＯ３（ＦＯＸＯ３）は、細胞におけるアポトーシスを誘導するタンパク質をコードし、ＤＮＡ損傷応答および修復経路内に存在する。ＦＯＸＯ３ノックアウト雌マウスは、不妊表現型、特に、異常卵巣濾胞機能を示す。ＦＯＸＯ３遺伝子のエクソン２にホモ接合型非同義置換を保有するマウス変異体は、性的成熟の妊孕性の喪失を示し、早期卵巣機能不全を示す［Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ２２巻：２３５〜２４８頁、２０１１年］。
【００６５】
ＭＵＣ４
ＭＵＣ４は、呼吸器、胃腸および生殖器の上皮表面を保護および潤滑する、高分子量糖タンパク質のファミリーに属する。細胞外ドメインは、細胞表面における上皮増殖因子受容体と相互作用して、細胞成長受容体複合体の活性を安定化および／または増強することにより、下流細胞成長シグナリングをモジュレートすることができる［Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ．４巻（１号）：４５〜６０頁、２００４年］。ＭＵＣ４は、子宮内膜上皮において発現され、胚着床等、子宮内膜症発症および子宮内膜症関係の不妊に関連する［ＢＭＣ  Ｍｅｄ．２０１１年、９巻：１９頁、２０１１年］。
【００６６】
ＮＬＲＰ１１
ＮＬＲファミリー、パイリン（ｐｙｒｉｎ）ドメイン含有１１（ＮＬＲＰ１１）は、炎症に関与する可能性があるタンパク質の大型のファミリーに属するロイシンリッチタンパク質をコードし［Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４巻：９５〜１０４頁、２００３年］、卵巣、精巣および着床前胚において発現される［ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９年８月１４日；９巻：２０２頁、ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１４８−９−２０２］。ＮＬＲＰ１１遺伝子発現は、生殖組織に対し特異性を示す。
【００６７】
ＮＬＲＰ１４
ＮＬＲファミリー、パイリンドメイン含有１４（ＮＬＲＰ１４）は、炎症に関与する可能性があるタンパク質の大型のファミリーに属するロイシンリッチタンパク質をコードし［Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４巻：９５〜１０４頁、２００３年］、卵巣、精巣および着床前胚において発現される［ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９年８月１４日；９巻：２０２頁、ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１４８−９−２０２］。ＮＰＲＬ１４は、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内にも見出される［Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１０年５月；１３９巻（５号）：８０９〜２３頁、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９年８月３日；１０巻：３４８頁］。
【００６８】
ＮＬＲＰ５
ＮＬＲＰ５またはＭＡＴＥＲ（胚が要求する母性抗原）、Ｎｌｒｐ５遺伝子にコードされるタンパク質は、２細胞期を越えた胚発生のためにマウスにおいて必須な、別の高度に豊富な卵母細胞タンパク質である。ＭＡＴＥＲは本来、自己免疫性早期卵巣機能不全のマウスモデルにおいて卵母細胞特異的抗原として同定された（Ｔｏｎｇら、２５  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０巻：３７２０〜３７２６頁、１９９９年）。ＭＡＴＥＲは、ＰＡＤＩ６と同様の発現および細胞下発現プロファイルを実証する。Ｐａｄｉ６ヌル動物と同様に、Ｎｌｒｐ５ヌル雌は、正常な卵形成、卵巣発生、卵母細胞成熟、排卵および受精を示す。しかし、Ｎｌｒｐ５ヌル雌に由来する胚は、２細胞期において発生上の遮断を起こし、正常な胚ゲノム活性化を示すことができない（Ｔｏｎｇら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６巻：２６７〜２６８頁、２０００年；およびＴｏｎｇら、Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ  １１巻：２８１〜２８７頁、２０００ｂ年）。
【００６９】
ＮＬＲＰ８
ＮＬＲファミリー、パイリンドメイン含有８（ＮＬＲＰ８）は、炎症に関与する可能性があるタンパク質の大型のファミリーに属するロイシンリッチタンパク質をコードし［Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４巻：９５〜１０４頁、２００３年］、卵巣、精巣および着床前胚において発現される［ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９年８月１４日；９巻：２０２頁、ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１４８−９−２０２］。ＮＬＲＰ８遺伝子発現は、生殖組織に対し特異性を示す。
【００７０】
ＮＰＭ２
遺伝子ＮＰＭ２［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：１０３６１、ＨＧＮＣ  ｉｄ：７９３０］あるいはヌクレオプラスミン２は、ヒストンに結合するシャペロンであり、卵母細胞侵入後の精子クロマチンリモデリングに関与する［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２年６月；４０巻（１１号）：４８６１〜４８７８頁］。ＮＰＭ２は、着床前胚発生に関与する卵母細胞特異的遺伝子のスクリーニングにおいて見出され［Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ．２００７年７月；２５巻（４号）：２４３〜５１頁］、ヒトにおける最終卵母細胞成熟および初期胚発生において差次的に発現される［Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．２００７年３月；８７巻（３号）：６７７〜９０頁］。ＮＰＭ２は、核および核小体組織化ならびに胚発生に重大な意味を持つ母性効果遺伝子であり、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内に見出される［Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１０年５月；１３９巻（５号）：８０９〜２３頁、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９年８月３日；１０巻：３４８頁］。ＮＰＭ２は、マウスにおける異常卵母細胞形態および妊孕性低下に関連し、ＮＰＭ２の雌マウスホモ接合型ヌルは、卵母細胞および初期胚の核における異常性により、着床前胚発生における欠損を保有する［Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３年４月２５日；３００巻（５６１９号）：６３３〜６頁］。
【００７１】
ＰＡＤＩ６
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６（ＰＡＤＩ６）：Ｐａｄｉ６は本来、その相対的存在量に基づき２Ｄマウス卵プロテオームゲルからクローニングされ、マウスにおけるＰａｄｉ６発現は、卵母細胞および着床前胚にほぼ完全に限定されると思われる（Ｙｕｒｔｔａｓら、２０１０年）。Ｐａｄｉ６は先ず、始原的卵母細胞濾胞において発現され着床前発生から胚盤胞期を通じて、タンパク質レベルで持続する（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２５６巻：７３〜８８頁、２００３年）。Ｐａｄｉ６の不活性化は、マウスにおける雌性不妊をもたらし、Ｐａｄｉ６ヌル発生停止が、２細胞期に起こる（Ｙｕｒｔｔａｓら、２００８年）。
【００７２】
ＰＭＳ２
ＰＭＳ２は、ＤＮＡミスマッチ修復に関与し、受精および着床前発生に関与する。これは、発生に必須な多くの母性効果遺伝子の１種としてノックアウトマウス試験により同定された［Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４巻追補、ｓ４１〜９頁］。
【００７３】
ＳＣＡＲＢ１
スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー１（ＳＣＡＲＢ１）遺伝子は、コレステロール輸送を媒介するための受容体である糖タンパク質をコードする。ＳＣＡＲＢ１ヌルホモ接合型雌マウスは、機能不全卵母細胞による不妊であり［Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１０８巻：１７１７〜１７２２頁、２００１年］、したがって、ＳＣＡＲＢ１における変異は、リポタンパク質代謝を調節することにより女性の妊孕性に影響を与え得る。
【００７４】
ＳＰＩＮ１
スピンドリン（Ｓｐｉｎｄｌｉｎ）１（ＳＰＩＮ１）は、初期胚発生において、卵母細胞から多能性初期胚への移行の際に豊富に発現される遺伝子である。ＳＰＩＮ１は、細胞周期依存的様式でリン酸化され、減数分裂紡錘体に関連する［Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４巻：４９３〜５０３頁、１９９７年］。
【００７５】
ＴＡＣＣ３
トランスフォーミング、酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）。マウスにおいて、ＴＡＣＣ３は、成長している卵母細胞の細胞質において豊富に発現され、中心体における微小管繋留および紡錘体アセンブリおよび細胞生存に要求される（Ｆｕら、２０１０年）。ＴＡＣＣ３は、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内にも見出される［Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１０年５月；１３９巻（５号）：８０９〜２３頁、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９年８月３日；１０巻：３４８頁］。
【００７６】
ＺＰ１
透明帯（Ｚｏｎａ  ｐｅｌｌｕｃｉｄ）糖タンパク質１（ＺＰ１）は、透明帯−卵母細胞および初期胚を囲む細胞外マトリックスの構造的構成成分であるタンパク質をコードする。
【００７７】
ＺＰ２
透明帯糖タンパク質２（ＺＰ２）は、透明帯−卵母細胞および初期胚を囲む細胞外マトリックスの構造的構成成分であるタンパク質をコードする。ＺＰ２は、先体反応した精子に結合し、多精受精の防止において重要である［Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．２００４年７月；１９巻（７号）：１５８０〜６頁］。
【００７８】
ＺＰ３
透明帯糖タンパク質３（ＺＰ３）［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：７７８４、ＨＧＮＣ  ｉｄ：１３１８９］は、透明帯−卵母細胞および初期胚を囲む細胞外マトリックスの構造的構成成分である。これは、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内に見出される［ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９年８月３日；１０巻：３４８頁］。ＺＰ３は、初期卵巣発生から卵母細胞においても発現され、透明帯形成前の始原的濾胞の発生における役割を有する可能性がある［Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００８年７月１６日；２８９巻（１〜２号）：１０〜５頁］。ＺＰ３のヌルアレルを保有する雌マウスは、卵巣サイズおよび重量の減少、異常卵巣濾胞形成および排卵を示し、最終的に雌性不妊をもたらす。
【００７９】
ＺＰ４
透明帯糖タンパク質４（ＺＰ４）は、透明帯−卵母細胞および初期胚を囲む細胞外マトリックスの構造的構成成分であるタンパク質をコードする。ＺＰ４は、タンパク質キナーゼＡを伴うシグナリング経路の一部として先体反応を刺激する［Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．２００８年１１月；７９巻（５号）：８６９〜７７頁］。
【００８０】
ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：１７８６、ＨＧＮＣ  ｉｄ：２９７６］は、ＤＮＡにおけるシトシン塩基の５位にメチル基を転移する酵素の群に属する。ＤＮＡメチル化として公知のこのプロセスは、ＤＮＡ塩基組成を変更しないが、ＤＮＡ領域の生化学的特性に影響を与える「エピジェネティック」修飾をＤＮＡ分子に残す。ＤＮＭＴ１によって媒介されるＤＮＡメチル化は、胚形成における細胞運命の決定において重大である［Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００８年６月１５日；２２巻（１２号）：１６０７〜１６頁、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２００２年１月１日；２４１巻（１号）：１７２〜８２頁］。ＤＮＭＴ１のホモ接合型ヌルアレルを保有するマウス胚は、妊娠中期までしか生存できない。ＤＮＭＴ１遺伝子の発現は、生殖組織において他の細胞型よりも有意に高く、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内に見出される［Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１０年５月；１３９巻（５号）：８０９〜２３頁、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９年８月３日；１０巻：３４８頁］。
【００８１】
遺伝子ＮＰＭ２［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：１０３６１、ＨＧＮＣ  ｉｄ：７９３０］、あるいはヌクレオプラスミン２は、ヒストンに結合するシャペロンであり、卵母細胞侵入後の精子クロマチンリモデリングに関与する［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２年６月；４０巻（１１号）：４８６１〜４８７８頁］。ＮＰＭ２は、着床前胚発生に関与する卵母細胞特異的遺伝子のスクリーニングにおいて見出され［Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ．２００７年７月；２５巻（４号）：２４３〜５１頁］、ヒトにおける最終卵母細胞成熟および初期胚発生において差次的に発現される［Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．２００７年３月；８７巻（３号）：６７７〜９０頁］。ＮＰＭ２は、核および核小体組織化ならびに胚発生に重大な意味を持つ母性効果遺伝子であり、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内に見出される［Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１０年５月；１３９巻（５号）：８０９〜２３頁、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９年８月３日；１０巻：３４８号］。ＮＰＭ２は、マウスにおける異常卵母細胞形態および妊孕性低下に関連し、ＮＰＭ２の雌マウスホモ接合型ヌルは、卵母細胞および初期胚の核における異常性により、着床前胚発生における欠損を保有する［Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３年４月２５日；３００巻（５６１９号）：６３３〜６頁］。
【００８２】
卵母細胞発現タンパク質（ＯＯＥＰ）［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：４４１１６１、ＨＧＮＣ  ｉｄ：２１３８２］は、識別子ＫＨＤＣ２、ＦＬＯＰＥＤ、ＨＯＥＰ１９およびＣ６ｏｒｆ１５６という名称でも通じる。ＯＯＥＰは、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内に見出される［Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０１０年５月；１３９巻（５号）：８０９〜２３頁］。ＯＯＥＰは、卵巣において発現されるが、男性の精巣を含む１１種の他の細胞型において検出不能である。卵巣内で、その発現は、成長している卵母細胞に制限される。ＯＯＥＰタンパク質産物は、卵および着床前胚の皮質下部に亜局在化する。ＯＯＥＰホモ接合型ヌル雌マウスは、外見上は正常な卵巣生理学を有し、受精することができる生存可能な卵を産生したが、しかし、このような胚は、卵割期発生を越えて進行せず、したがって、このような雌マウスは、不稔性である。機能するＯＯＥＰが、着床前マウス発生に必須であることが考えられる［Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２００８年９月；１５巻（３号）：４１６〜４２５頁］。
【００８３】
胚発生を可能にする卵母細胞に位置する因子（ＦＬＯＰＥＤ／ＯＯＥＰ）：皮質下母性複合体（ＳＣＭＣ）は、数種類の母性効果遺伝子産物が局在化する、不十分に特徴付けされたマウス卵母細胞構造である（Ｌｉら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １５巻：４１６〜４２５頁、２００８年）。ＰＡＤＩ６、ＭＡＴＥＲ、ＦＩＬＩＡ、ＴＬＥ６およびＦＬＯＰＥＤは、この複合体に局在化することが示されてきた（Ｌｉら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １５巻：４１６〜４２５頁、２００８年；Ｙｕｒｔｔａｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５巻：２６２７〜２６３６頁、２００８年）。この複合体は、ＦｌｏｐｅｄおよびＮｌｒｐ５の非存在下で存在せず、Ｎｌｒｐ５枯渇卵母細胞に起因する胚と同様に、Ｆｌｏｐｅｄヌル卵母細胞に起因する胚は、マウス発生の２細胞期を過ぎて進行しない（Ｌｉら、２００８年）。ＦＬＯＰＥＤは、ＭＯＥＰ１９の名称によって同様に特徴付けされた小型の（１９ｋＤ）ＲＮＡ結合タンパク質である（Ｈｅｒｒら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３１４巻：３００〜３１６頁、２００８年）。
【００８４】
透明帯糖タンパク質３（ＺＰ３）［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：７７８４、ＨＧＮＣ  ｉｄ：１３１８９］は、透明帯−卵母細胞および初期胚を囲む細胞外マトリックスの構造的構成成分である。これは、受精における卵から胚への移行の駆動に重要な母性因子のセット内に見出される［ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９年８月３日；１０巻：３４８頁］。ＺＰ３は、初期卵巣発生から卵母細胞においても発現され、透明帯形成前の始原的濾胞の発生における役割を有する可能性がある［Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００８年７月１６日；２８９巻（１〜２号）：１０〜５頁］。ＺＰ３のヌルアレルを保有する雌マウスは、卵巣サイズおよび重量の減少、異常卵巣濾胞形成および排卵を示し、最終的に雌性不妊をもたらす。
【００８５】
ＦＩＧＬＡ（生殖系列アルファにおける因子）［Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ｉｄ：３４４０１８、ＨＧＮＣ  ｉｄ：］は、遺伝子識別子ＰＯＦ６、ＢＨＬＨＣ８およびＦＩＧＡＬＰＨＡという名称でも通じる。この遺伝子は、卵母細胞遺伝子の活性化因子として作用する塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子である。ＦＩＧＬＡは、全卵巣濾胞期および成熟卵母細胞において発現され、正常な濾胞形成に要求される。ＦＩＧＬＡ発現は、男性の精巣において正常に発現される遺伝子を抑圧するとも考えられ、したがって、出生後卵巣発生において成長している卵母細胞における女性の生殖細胞遺伝的階層を活性化し、男性の生殖細胞遺伝的階層を抑圧することにより、女性的表現型を持続させる［Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０年７月；３０巻（１４号］。ＦＩＧＬＡ変異を有する雌マウスは、卵母細胞数の減少および異常卵巣濾胞形成をもたらす。ＦＩＧＬＡにおけるヘテロ接合型変異は、早期卵巣機能不全女性に関係付けられてきた［Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００８年６月；８２巻（６号）：１３４２〜８頁］。
【００８６】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６（ＰＡＤＩ６）：Ｐａｄｉ６は本来、その相対的存在量に基づき２Ｄマウス卵プロテオームゲルからクローニングされ、マウスにおけるＰａｄｉ６発現は、卵母細胞および着床前胚にほぼ完全に限定されると思われる（Ｙｕｒｔｔａｓら、２０１０年）。Ｐａｄｉ６は先ず、始原的卵母細胞濾胞において発現され、タンパク質レベルで、着床前発生から胚盤胞期を通して持続する（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２５６巻：７３〜８８頁、２００３年）。Ｐａｄｉ６の不活性化は、マウスにおける雌性不妊をもたらし、Ｐａｄｉ６ヌル発生停止は、２細胞期で起こる（Ｙｕｒｔｔａｓら、２００８年）。
【００８７】
胚が要求する母性抗原（ＭＡＴＥＲ／ＮＬＲＰ５）：Ｎｌｒｐ５遺伝子にコードされるタンパク質であるＭＡＴＥＲは、２細胞期を越えた胚発生のためにマウスにおいて必須な、別の高度に豊富な卵母細胞タンパク質である。ＭＡＴＥＲは本来、自己免疫性早期卵巣機能不全のマウスモデルにおける卵母細胞特異的抗原として同定された（Ｔｏｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０巻：３７２０〜３７２６頁、１９９９年）。ＭＡＴＥＲは、ＰＡＤＩ６と同様の発現および細胞下発現プロファイルを実証する。Ｐａｄｉ６ヌル動物と同様に、Ｎｌｒｐ５ヌル雌は、正常な卵形成、卵巣発生、卵母細胞成熟、排卵および受精を示す。しかし、Ｎｌｒｐ５ヌル雌に由来する胚は、２細胞期において発生上の遮断を行い、正常な胚ゲノム活性化を示すことができない（Ｔｏｎｇら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６巻：２６７〜２６８頁、２０００年；およびＴｏｎｇら、Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ  １１巻：２８１〜２８７頁、２０００ｂ年）。
【００８８】
ＫＨドメイン含有３様、皮質下母性複合体メンバー（ＦＩＬＩＡ／ＫＨＤＣ３Ｌ）：ＦＩＬＩＡは、母性遺伝性マウスタンパク質を含有する別の小型のＲＮＡ結合ドメインである。ＦＩＬＩＡは、そのＭＡＴＥＲとの相互作用のために同定および命名された（Ｏｈｓｕｇｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５巻：２５９〜２６９頁、２００８年）。ＳＣＭＣの他の構成成分と同様に、Ｋｈｄｃ３遺伝子産物の母性遺伝は、初期胚発生に要求される。マウスにおいて、Ｋｈｄｃ３の喪失は、一部には初期卵割の際の不適切な染色体整列による異数性の高い発生率により、変動する重症度の発生停止をもたらす（Ｌｉら、２００８年）。Ｋｈｄｃ３枯渇も、紡錘体チェックポイントアセンブリ（ＳＡＣ）不活性化、異常紡錘体アセンブリおよび染色体誤整列により異数性をもたらす（Ｚｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６巻：７４７３〜７４７８頁、２００９年）。
【００８９】
バソヌクリン（Ｂａｓｏｎｕｃｌｉｎ）（ＢＮＣ１）：バソヌクリンは、マウスにおいて試験されたジンクフィンガー転写因子である。これは、ケラチノサイトおよび生殖細胞（雄性および雌性）において発現されることが判明し、ｒＲＮＡ（ポリメラーゼＩによる）およびｍＲＮＡ（ポリメラーゼＩＩによる）合成を調節する（ＩｕｃｈｉおよびＧｒｅｅｎ、１９９９年；Ｗａｎｇら、２００６年）。卵母細胞において発現が低下される量に応じて、胚は、８細胞期を越えて発生することができない。Ｂｓｎ１枯渇マウスにおいて、卵母細胞発生が撹乱される場合であっても、正常数の卵母細胞が排卵されるが、これらの卵母細胞の多くは、生存可能な子孫を生じるまで進むことができない（Ｍａら、２００６年）。
【００９０】
接合子停止１（ＺＡＲ１）：Ｚａｒ１は、マウスにおける卵母細胞から胚への移行において機能することが公知の卵母細胞特異的母性効果遺伝子である。マウス卵母細胞の細胞質において高レベルのＺａｒ１発現が観察され、ホモ接合型ヌル雌は不妊である：Ｚａｒ１ヌル雌由来の成長している卵母細胞は、２細胞期を過ぎて進行しない。
【００９１】
細胞質型ホスホリパーゼＡ２γ（ＰＬＡ２Ｇ４Ｃ）：正常状態下で、マウスＰＬＡ２Ｇ４Ｃオルソログのタンパク質産物であるｃＰＬＡ２γは、発現が、マウスにおける卵母細胞および初期胚に制限される。細胞下レベルでは、ｃＰＬＡ２γは、卵母細胞の皮質領域、核細胞質および多胞体凝集体に主に局在化する。ｃＰＬＡ２γ発現は、健康なマウスにおける卵母細胞および着床前胚に主に限定されると思われるが、発現は、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓに感染したマウスの腸管上皮内で相当に上方調節されることも注目される。この事実は、ｃＰＬＡ２γが、炎症性応答における役割も果たし得ることを示唆する。ヒトＰＬＡ２Ｇ４Ｃは、卵巣において豊富に発現されるというよりもむしろ、心臓および骨格筋において豊富に発現されるという点が異なる。また、ヒトタンパク質は、リパーゼコンセンサス配列を含有するが、他のＰＬＡ２酵素には存在するカルシウム結合ドメインを欠く。したがって、別の細胞質型ホスホリパーゼは、よりヒト妊孕性に関連することができる。
【００９２】
トランスフォーミング、酸性コイルドコイル含有タンパク質３（ＴＡＣＣ３）：マウスにおいて、ＴＡＣＣ３は、成長している卵母細胞の細胞質において豊富に発現され、中心体における微小管繋留および紡錘体アセンブリおよび細胞生存に要求される（Ｆｕら、２０１０年）。
【００９３】
ある特定の実施形態において、この遺伝子は、卵母細胞において発現される遺伝子である。例示的な遺伝子は、ＣＴＣＦ、ＺＦＰ５７、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＥＢＯＸおよびＨＤＡＣ１を含む。
【００９４】
他の実施形態において、この遺伝子は、ＤＮＡ修復経路に関与する遺伝子であり、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１およびＰＭＳ２が挙げられるがこれらに限定されない。他の実施形態において、遺伝子は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２である。
【００９５】
他の実施形態において、バイオマーカーは、不妊関連の遺伝子の遺伝子産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）である。特定の実施形態において、遺伝子産物は、母性効果遺伝子の遺伝子産物である。他の実施形態において、遺伝子産物は、表１の遺伝子の産物である。ある特定の実施形態において、遺伝子産物は、ＣＴＣＦ、ＺＦＰ５７、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＥＢＯＸおよびＨＤＡＣ１の産物等、卵母細胞において発現される遺伝子の産物である。他の実施形態において、遺伝子産物は、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１またはＰＭＳ２の産物等、ＤＮＡ修復経路に関与する遺伝子の産物である。他の実施形態において、遺伝子産物は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２の産物である。
【００９６】
他の実施形態において、バイオマーカーは、メチル化パターン（例えば、ＣｐＧアイランドの高度メチル化）、ヒストンタンパク質のゲノム局在化もしくは翻訳後修飾、またはアセチル化、ユビキチン化、リン酸化その他等のタンパク質の一般的翻訳後修飾等、エピジェネティック要因となり得る。
【００９７】
他の実施形態において、本発明の方法は、リスク不妊を評価するために、不妊関連のバイオマーカーを解析する。
【００９８】
ある特定の実施形態において、バイオマーカーは、細胞巨大分子のメチル化をもたらすある炭素代謝経路および他の経路に関連する、遺伝的領域、遺伝子または遺伝子のＲＮＡ／タンパク質産物である。例示的な遺伝子および遺伝子産物について後述する。
【００９９】
メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）：特定の実施形態において、ＭＴＨＦＲ遺伝子における変異（６７７Ｃ＞Ｔ）は、不妊に関連する。酵素５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼは、葉酸活性を調節する（Ｐａｖｌｉｋら、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ９５巻（７号）：２２５７〜２２６２頁、２０１１年）。６７７ＴＴ遺伝子型は、６０％低下した酵素活性、非効率的葉酸代謝、減少した血中葉酸、上昇した血漿ホモシステインレベルおよび低下したメチル化能力に関連することが本技術分野で公知である。Ｐａｖｌｉｋら（２０１１年）は、制御された卵巣過刺激（ＣＯＨ）後の血清抗ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ）ホルモン（ＡＭＨ）濃度および回収された卵母細胞の数（ＮＯＲ）に対するＭＴＨＦＲ  ６７７Ｃ＞Ｔの効果を調査した。ＩＶＦのためにＣＯＨを受けている２７０名の女性を解析し、１０日間のＧｎＲＨスーパーアゴニスト処置後かつＣＯＨ前に採取した血液試料からそのＡＭＨレベルを決定した。ＴＴ保因者の平均ＡＭＨレベルは、ホモ接合型ＣＣまたはヘテロ接合型ＣＴ個体よりも有意に高かった。ＡＭＨ血清濃度は、試験した全個体におけるＮＯＲと有意に相関した。この試験は、ＭＴＨＦＲ  ６７７ＴＴ遺伝子型が、より高い血清ＡＭＨ濃度に関連するが、ＣＯＨ後のＮＯＲにマイナス効果を逆説的に有すると結論付けた。濾胞成熟が、ＭＴＨＦＲ  ６７７ＴＴ個体において遅滞され得、これがその後、ＡＭＨを産生するより高い比率の最初に動員された濾胞をもたらし得るが、周期性動員へと進行できないことが提案された。ＭＴＨＦＲの組織遺伝子発現パターンは、卵母細胞発現に向かういかなるバイアスも示さない。ＭＴＨＦＲ遺伝子におけるこの変異もしくは他の変異（表１）またはＭＴＨＦＲ遺伝子の産物の異常遺伝子発現に関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１００】
Ｊｅｄｄｉ−Ｔｅｈｒａｎｉら（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６６巻（２号）：１４９〜１５６頁、２０１１年）は、反復性（Ｒｅｃｕｒｒａｎｔ）妊娠喪失（ＲＰＬ）に対するＭＴＨＦＲ  ６７７ＴＴ遺伝子型の効果を調査した。２回の連続的妊娠喪失の経験を有する３５歳より下の女性百名と、少なくとも２回の正常な妊娠の経験を有する健康な女性百名を使用して、ＲＰＬの５種の候補遺伝的リスク因子の頻度を評価した−ＭＴＨＦＲ  ６７７Ｃ＞Ｔ、ＭＴＨＦＲ  １２９８Ａ＞Ｃ、ＰＡＩ１−６７５  ４Ｇ／５Ｇ（プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１プロモーター領域）、ＢＦ−４５５Ｇ／Ａ（ベータフィブリノーゲンプロモーター領域）およびＩＴＧＢ３  １５６５Ｔ／Ｃ（インテグリンベータ３）。多型の頻度を計算し、症例および対照群の間で比較した。両方のＭＴＨＦＲ多型（６７７Ｃ＞Ｔおよび１２９８Ａ＞Ｃ）およびＢＦ−４５５Ｇ／Ａ多型は、ＲＰＬに正に関連することが判明し、ＩＴＧＢ３  １５６５Ｔ／Ｃ多型は、ＲＰＬに負に関連することが判明した。ＰＡＩ−１−６７５４Ｇ／５Ｇ多型のヘテロ接合性ではなくホモ接合性は、ＲＰＬ患者において対照群よりも有意に高かった。ＭＴＨＦＲ遺伝子の両方の変異の存在は、ＲＰＬのリスクを高度に増加させた。ＭＴＨＦＲ遺伝子におけるこれらの変異および他の変異（表１）またはＭＴＨＦＲ遺伝子の産物の異常遺伝子発現に関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１０１】
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）：特定の実施形態において、ＣＯＭＴ遺伝子における変異（４７２Ｇ＞Ａ）は、不妊に関連する。カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）からカテコラミンへとメチル基を転移することにより、カテコラミン神経伝達物質を不活性化する数種類の酵素の１種であることが本技術分野で公知である。ＡＡ遺伝子バリアントは、酵素の熱安定性を変更し、その活性を３〜４倍低下させることが公知である（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ２２巻（４号）：４７６〜４８５頁、２０１１年）。Ｓａｌｉｈら（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ８９巻（５号、追補１）：１４１４〜１４２１頁、２００８年）は、顆粒膜細胞におけるＣＯＭＴ発現の調節を調査し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で、ＪＣ４１０ブタおよびＨＧＬ５ヒト顆粒膜細胞株におけるＤＮＡ増殖およびステロイド産生における２−ＭＥ２（ＣＯＭＴ産物）およびＣＯＭＴ阻害剤の効果を評価した。彼らは、ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）、インスリンおよびＡＴＲＡ（オールトランスレチノイン酸）によるＣＯＭＴ発現の調節をさらに評価した。彼らは、顆粒膜細胞におけるＣＯＭＴ発現が、インスリン、ＤＨＴおよびＡＴＲＡにより上方調節されたと結論付けた。さらに、２−ＭＥ２は、顆粒膜細胞増殖およびステロイド産生を減少させ、ＣＯＭＴ阻害は、これを増加させた。ＣＯＭＴ過剰発現と、その後の２−ＭＥ２のレベル増加が、排卵機能不全をもたらし得ることが仮定された。ＣＯＭＴ遺伝子におけるこの変異またはＣＯＭＴ遺伝子の産物の異常遺伝子発現に関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１０２】
メチオニンシンターゼレダクターゼ（ＭＴＲＲ）：特定の実施形態において、メチオニンシンターゼレダクターゼ（ＭＴＲＲ）遺伝子における変異（Ａ６６Ｇ）は、不妊に関連する。ＭＴＲＲは、酵素メチオニンシンターゼ（ＭＴＲ）の適切な機能に要求される。ＭＴＲは、ホモシステインをメチオニンに変換し、ＭＴＲＲは、ＭＴＲを活性化し、これにより、ホモシステインおよびメチオニンのレベルを調節する。母性バリアントＡ６６Ｇは、ダウン症候群（Ｐｏｚｚｉら、２００９年）および二分脊椎（Ｄｏｏｌｉｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７１巻（５号）：１２２２〜１２２６頁、２００２年）等、初期発生障害に関連付けられてきた。ＭＴＲＲ遺伝子におけるこの変異またはＭＴＲＲ遺伝子の産物の異常遺伝子発現に関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１０３】
ベタイン−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＢＨＭＴ）：特定の実施形態において、ＢＨＭＴ遺伝子における変異（Ｇ７１６Ａ）は、不妊に関連する。ベタイン−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＢＨＭＴ）は、ＭＴＲＲと共に、ホモシステインからメチオニンへの葉酸／Ｂ−１２依存的およびコリン／ベタイン依存的変換に役立つ。高ホモシステインレベルは、女性の不妊に関連付けられてきた（Ｂｅｒｋｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２４巻（９号）：２２９３〜２３０２頁、２００９年）。Ｂｅｎｋｈａｌｉｆａら（２０１０年）は、制御された卵巣過刺激（ＣＯＨ）が、卵胞液におけるホモシステイン濃度に影響を与えると考察する。ＩＶＦ手技に関与する患者由来の胚胞（ｖｅｓｃｉｃｌｅ）卵母細胞を使用して、試験は、ヒト卵母細胞が、ＣＢＳ（シスタチオニン（Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータシンターゼ）ではなく、ＭＴＲおよびＢＨＭＴを使用した再メチル化によりそのホモシステインレベルを調節することができると結論付ける。彼らは、これが、ＩＶＦ手技におけるインプリンティング問題のリスクを調節し得ることをさらに強調する。ＢＨＭＴ遺伝子におけるこの変異またはＢＨＭＴ遺伝子の産物の異常遺伝子発現に関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１０４】
Ｉｋｅｄａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｚｏｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｔ  Ａ：  Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３１３Ａ巻（３号）：１２９〜１３６頁、２０１０年）は、ウシ卵母細胞および着床前胚におけるあらゆるメチル化経路酵素の発現パターンを試験した。ウシ卵母細胞は、ＭＡＴ１Ａ（メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ）、ＭＡＴ２Ａ、ＭＡＴ２Ｂ、ＡＨＣＹ（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ）、ＭＴＲ、ＢＨＭＴ、ＳＨＭＴ１（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）、ＳＨＭＴ２およびＭＴＨＦＲのｍＲＮＡを有することが実証された。８細胞期以降から検出されなかったＭＡＴ１Ａと、８細胞期において検出されなかったＢＨＭＴを除いて、これらの転写物は全て、全発生ステージを通して一貫して発現された。さらに、ウシ胚の着床前発生に対する外因性ホモシステインの効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査した。高濃度のホモシステインは、ゲノムＤＮＡの高度メチル化と、ウシ胚における発生遅滞を誘導した。このような変則的メチル化パターンに関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１０５】
葉酸受容体２（ＦＯＬＲ２）：特定の実施形態において、ＦＯＬＲ２遺伝子における変異（ｒｓ２２９８４４４）は、不妊に関連する。葉酸受容体２は、葉酸（および葉酸誘導体）の細胞への輸送を助ける。ＥｌｎａｋａｔおよびＲａｔｎａｍ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：  ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ａｎｄ  ｖｉｒｔｕａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  １１巻：５０６〜５１９頁、２００６年）は、ＦＯＬＲ２をＦＯＬＲ１と共に、卵巣および子宮内膜がんに関係付ける。ＦＯＬＲ２もしくはＦＯＬＲ１遺伝子における変異またはＦＯＬＲ２もしくはＦＯＬＲ１遺伝子の産物の異常遺伝子発現に関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１０６】
トランスコバラミン２（ＴＣＮ２）：特定の実施形態において、ＴＣＮ２遺伝子における変異（Ｃ７７６Ｇ）は、不妊に関連する。トランスコバラミン２は、コバラミン（ビタミンＢ１２）の細胞への輸送を容易にする。Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋａ−Ｓａｃｈａｄｙｎら（Ｅｕｒ  Ｊ  ＣｌｉｎＮｕｔｒ  ６４巻（１１号）：１３３８〜１３４３頁、２０１０年）は、ＴＣＮ２  ７７６Ｃ＞Ｇ多型ならびに血清Ｂ１２および総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）レベルの両方の間の関係性を評価した。北アイルランド出身の６１３名の男性由来の遺伝子型を使用して、ＴＣＮ２  ７７６ＣＣ遺伝子型が、７７６ＣＧおよび７７６ＧＧ遺伝子型と比較して、より低い血清Ｂ１２濃度に関連したことを示した。さらに、ビタミンＢ１２状態は、ＴＣＮ２  ７７６Ｃ＞Ｇ遺伝子型およびｔＨｃｙ濃度の間の関係性に影響することが示された。ＴＣＮ２  ７７６Ｃ＞Ｇ多型は、低いＢ１２および高い総ホモシステイン表現型に関連する病態のリスクに寄与し得る。ＴＣＮ２遺伝子におけるこの変異またはＴＣＮ２遺伝子の産物の異常遺伝子発現に関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１０７】
シスタチオニン−ベータ−シンターゼ（ＣＢＳ）：特定の実施形態において、ＣＢＳ遺伝子における変異（ｒｓ２３４７１５）は、不妊に関連する。補因子としてのビタミンＢ６により、シスタチオニン−ベータ−シンターゼ（ＣＢＳ）酵素は、含硫基移動経路へと迂回することにより、メチオニン経路からホモシステインを永続的に除去する反応を触媒する。ＣＢＳ活性減少に関連するＣＢＳ遺伝子変異も、血漿ホモシステインレベル上昇をもたらす。Ｇｕｚｍａｎら（２００６年）は、Ｃｂｓノックアウトマウスが不妊であることを実証する。彼らは、Ｃｂｓヌル雌不妊が、子宮環境における高ホモシステイン血症または他の因子（複数可）の結果である子宮不全の結果であることをさらに説明する。ＣＢＳ遺伝子におけるこの変異またはＣＢＳ遺伝子の産物の異常遺伝子発現に関して試料を解析することにより、不妊のリスクを評価することができる。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、バイオマーカーは、女性の不妊に以前に関連付けられた遺伝的領域である。標的化再配列決定によるＳＮＰ関連試験を行って、女性の不妊に関連する新たな遺伝的バリアントを探索した。かかる方法は、広範な疾患に関連する有意なバリアントの同定に成功した（Ｒｅｈｍａｎら、２０１０年；Ｗａｌｓｈら、２０１０年）。簡潔に説明すると、多数の試料および対照における目的の遺伝的領域におけるＳＮＰを採取し、続いて、症例および対照の間で有意な頻度差を示したＳＮＰのそれぞれを検査することにより、ＳＮＰ関連試験を行う。症例および対照の間の有意な頻度差は、ＳＮＰが、目的の状態に関連することを示す。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、マウスモデルにおいて調査するべき遺伝子座は、後述するクラスター解析に由来する。上に記す通り、目的の遺伝的領域を決定するための他の方法、すなわち、文献において発表されたヒト検査結果または知見を用いることができる。
【０１１０】
クラスター解析
上で同定された不妊バイオマーカーの使用に加えて、本発明の方法は、現存する不妊知識ベースをさらに利用して、既知の不妊遺伝子および不妊との従前の関連がない遺伝子の間の共有性を同定する。不妊遺伝子および不妊との従前の関連がない遺伝子の間の共有性を同定することにより、不妊に関連する潜在的遺伝子のリストを拡張し、いかなる遺伝子機能および変化が、不妊に因果的に関連するかに関する理解をガイドすることができる。例えば、既知の不妊遺伝子と共有性を有する遺伝子は、潜在的不妊バイオマーカーとして同定し、不妊に関係する表現型試験（マウスにおいて行われるような）において使用し、これにより、不妊知識ベースの幅を拡張することができる。
【０１１１】
不妊遺伝子および不妊との従前の関連がない遺伝子の間の共有性を決定するために、本発明の方法は、クラスター解析技法を利用する。一般に、クラスター解析は、ある１群にクラスター形成されるある特定のオブジェクトが、別の群またはクラスターにおけるオブジェクトよりも互いに同様となるような仕方でオブジェクトのセットを群分けすることを伴う。本発明の方法は、遺伝子発現、表現型および遺伝的経路等の特色に基づき、不妊と関連しない遺伝子と既知の不妊遺伝子をクラスター形成する。クラスター解析から、不妊遺伝子と高度な類似性（関連性）を有する特色を示す、不妊との従前の関連がない遺伝子を同定することができる。高度な類似性を示す遺伝子（クラスター解析により示される）は、潜在的不妊バイオマーカーとして同定することができる。
【０１１２】
次に、本発明の方法に従った潜在的不妊バイオマーカーの同定に使用されるクラスタリング方法について記載する。本方法は典型的には、コンピュータ実行方法であり、例えば、プロセッサおよびコンピュータ可読記憶媒体を含むコンピュータシステムを利用する。コンピュータシステムのプロセッサは、コンピュータ可読記憶デバイスから得られる命令を実行して、クラスター解析を行う。
【０１１３】
ある特定の態様に従って、本方法は、既知の不妊遺伝子および不妊との従前の関連がない遺伝子の両方を含む遺伝子データセットを得ることを伴う。クラスターデータセット（不妊に関連するものおよび不妊と関連することが既知ではないもの）を形成する遺伝子は典型的には、哺乳動物遺伝子である。哺乳動物遺伝子は、マウス遺伝子、ヒト遺伝子またはこれらの組合せに対応することができる。次に、遺伝子データセットにおいてクラスター解析を行って、不妊に関連しない１種または複数の遺伝子および既知の不妊遺伝子の間の関係性を決定する。不妊に関連しない遺伝子が、既知の不妊遺伝子とクラスター形成することが示される場合、本方法は、潜在的不妊バイオマーカーとしての該遺伝子の同定を提供する。不妊に関連しない遺伝子が、既知の不妊遺伝子とクラスター形成しない場合、該遺伝子は、該既知の不妊遺伝子と同じ／同様の様式で不妊と因果的に関連する可能性が低い。
【０１１４】
本発明の方法は、共有性を決定するために、したがって、共有性に基づき、不妊に関連しない遺伝子を既知の不妊遺伝子とクラスター形成するために、遺伝子の数種類の特色（またはパラメータ）を評価する。ある特定の実施形態において、このような特色は、遺伝子発現、表現型、遺伝子経路およびこれらの組合せを含む。これらの特色の１種または複数は、クラスタリングにおける遺伝子の位置に寄与し得る。
【０１１５】
既知の不妊遺伝子および不妊と関連することが既知でない遺伝子の両方に関して、特色データ（遺伝子発現、表現型、遺伝子経路等）が得られる。特色および遺伝子データをコンパイルして、クラスター解析を示すために使用するマトリックスを形成する。例えば、特色データを前処理して、行として各ドメインおよび列として各特色を表現する（または逆もまた同じ）。遺伝子発現等、連続的な値を有するドメインに関して、特色は、遺伝子発現が測定された個々の組織であり、マトリックス（Ｘｉｊ）における各値は、組織ｊにおける遺伝子ｉの発現を表す。表現型等、カテゴリー的な値を有するドメインに関して、特色は、個々の表現型であり、マトリックス（Ｘｉｊ）における各値は、遺伝子ｉが、表現型ｊに関連するかを表すバイナリー指標である。次に、あらゆるドメイン特異的マトリックスを列に関して組み合わせる。続いて、距離メトリックを、マトリックスにおける行の各ペアおよび列の各ペアに適用する。ある特定の実施形態において、距離メトリックは、「距離＝１−相関」である。しかし、他の標準距離メトリックを使用してよいことが理解される（例えば、ユークリッド）。
【０１１６】
次に、既知の不妊遺伝子および他の遺伝子の間の特色共有性を決定するために、標準階層的クラスタリングを使用して、マトリックスの行および列をクラスター形成した。様々な階層的クラスタリング技法は、本技術分野で公知であり、不妊遺伝子を不妊に関連しない遺伝子とクラスタリングするために、本発明の方法に適用することができる。階層的クラスタリング技法は、例えば、Ｓｔｕｒｎ，  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｊｏｈｎ  Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ、およびＺｌａｔｋｏ  Ｔｒａｊａｎｏｓｋｉ．「Ｇｅｎｅｓｉｓ：  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ．」Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８．１巻（２００２年）：２０７〜２０８頁；Ｙｅｕｎｇ，  Ｋａ  Ｙｅｅ、およびＷａｌｔｅｒ  Ｌ．  Ｒｕｚｚｏ．「Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ．」Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７．９巻（２００１年）：７６３〜７７４頁；Ｅｉｓｅｎ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．ら「Ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９５．２５巻（１９９８年）：１４８６３〜１４８６８頁に記載されている。一般に、クラスタリングは、関連しない１種または複数の遺伝子の特色を１種または複数の既知の不妊の特色と比較することと、この比較に基づき遺伝子を１種または複数の特色群にカテゴリー化することとを伴う。比較後に、クラスター解析は、関連性の程度に基づいて、カテゴリー化された遺伝子に値を割り当てることをさらに伴い得る。例えば、高度に同様または同じ特色を有する共にクラスター形成された遺伝子は、高い値（例えば、正の整数）を割り当てることができる。関連性の程度は、色により得られたクラスターマトリックスにおいて強調することができ、例えば、高い程度の共有性は、赤色で示され、低い程度の共有性は、青色で示される。
【０１１７】
階層的クラスタリング技法が、遺伝子／特色データに適用された後に、遺伝子クラスターは、ある特定の特色カテゴリー（例えば、表現型／遺伝子発現「カテゴリー」）に対して表示され、これを次にクラスター形成して、共有性を反映する。例えば、女性の生殖の表現型は、１クラスターに共に群化され、胚パターン形成、形態および成長の表現型は、別々のクラスターに群化される、等である。次に、クラスター形成された遺伝子の間の関連性または共有性の程度（クラスター解析によって決定）を、得られたクラスターマトリックスにおいて強調することができる。例えば、赤色を使用して、遺伝子が、非常に特異的な１表現型に関連する、および／または反対側の軸に示されている関連する組織／生理系において高レベルで発現されることを示すことができ；一方、青色を使用して、遺伝子が、多数の異なるおよび変動する表現型に関連する、および／または関連する組織において低レベルで発現されることを示すことができる。
【０１１８】
遺伝子を特色特異的群へとクラスタリングし、高度な関連性により遺伝子を色分けすることにより、本発明の得られたクラスターマトリックスは、特定の組織または生理系（すなわち、目的のクラスター）に関係する表現型に強く関連する遺伝子の群の可視化を有利に可能にする。よって、本発明のクラスターマトリックスは、既知不妊バイオマーカーとのその示された関連（クラスター）に基づき、不妊にの従前の関連がない遺伝子を迅速に潜在的不妊バイオマーカーとして同定させることができる。このクラスタリングおよび潜在的不妊バイオマーカーの同定は、Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（不妊に関連するゲノム領域）における位置内の他の遺伝子と遺伝子の近接との相関とは独立的に、それなしで為される。結果として、クラスタリングは、補完のために、目的の不妊遺伝子を同定するための他の技法に加えて使用することができる、目的の不妊遺伝子を同定する追加的な方法を提供する。
【０１１９】
次に、上述のクラスター解析を使用して、不妊と関連することが既知でない遺伝子および既知の不妊遺伝子を相関させる具体例について記載する。
【０１２０】
アクチビン受容体２ｂ（ＡＣＶＲ２Ｂ）は、不妊患者のコホートにおいて同定された有意なコピー数変種である（すなわち、この遺伝子におけるコピー数変種は、ヒトにおける不妊表現型に有意に関連すると同定された）。アクチビン受容体２Ｂは、ヒトおよびマウス生殖および胚発生の両方に関与することが以前に本技術分野で公知のタンパク質である、アクチビンによって結合される受容体である。アクチビン／Ｎｏｄａｌシグナリングは、多能性および初期胚形成におけるパターン形成の数種類の側面を調節する。インヒビンおよびフォリスタチンと共に、アクチビンは、ＦＳＨ分泌を選択的に調節する複雑なフィードバックループにも関与する。
【０１２１】
ＡＣＶＲ２Ｂの特色および不妊と関連することが既知でない複数の遺伝子の特色を比較するクラスター解析を行った。クラスター解析に基づき、機能的および表現型的特色の間の共有性により、複数の遺伝子のうち数種類を、ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子とクラスター形成すると決定した。よって、ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子とクラスター形成した遺伝子を潜在的不妊バイオマーカーとして同定した。図１４は、ＡＣＶＲ２Ｂによるクラスター解析の結果を図解する。
【０１２２】
マウスモデル化に適用できるクラスター解析について、より詳細にさらに後述する。記述されている通り、クラスタリング解析は、表現型および組織発現レベル／パターンを含む属性に従って遺伝子座をクラスターに配置することにより、不妊が疑われる遺伝子座およびバイオマーカーに関してより機能的な情報を提供する。クラスター解析の結果は、クラスターにおける他の座位と新たに予測される関連を有する遺伝子座を明らかにする。先に、文献において直接的な機能的関連の現存する表示は存在しなくてよい。よって、クラスター解析を使用して、マウスモデルにおけるさらなる表現型試験のための新たな遺伝子座を強調することができ、特定の遺伝子座が共にクラスターする仕方に関する知識を作成して、目的の遺伝子（複数可）における変異（複数可）が、不妊の特定の側面に影響を与えるのに十分な分子、細胞および生理的変化をもたらすことができる仕方に関する理解を得ることができる。
【０１２３】
発現、表現型もしくは遺伝子経路の知識またはこれらのいずれかの組合せ等、属性は、クラスタリングにおける遺伝子の位置に寄与し得る。これらのパラメータの１、２またはいずれかの組合せ由来のデータを前処理して、マトリックスとして各ドメインを表現し、遺伝子座を行に、特色を列に入れる。遺伝子発現等、連続的な値を有するドメインに関して、特色は、遺伝子発現が測定された個々の組織であり、マトリックス（Ｘｉｊ）における各値は、組織ｊにおける遺伝子ｉの発現を表す。表現型等、カテゴリー的な値を有するドメインに関して、特色は、個々の表現型であり、マトリックス（Ｘｉｊ）における各値は、遺伝子ｉが、表現型ｊに関連するかを表すバイナリー指標である。次に、あらゆるドメイン特異的マトリックスを列に関して組み合わせる。続いて、距離メトリックをマトリックスにおける行の各ペアおよび列の各ペアに適用するが（例えば、「距離＝１−相関」）、他の標準距離メトリックを使用してもよい（例えば、ユークリッド）。次に、標準階層的クラスタリングを使用して、マトリックスの行および列をクラスター形成することができる。
【０１２４】
遺伝子クラスターは、表現型／遺伝子発現「カテゴリー」等、属性に対して表示され、これは続いて、「クラスター形成」されて、共有性を反映する。例えば、女性の生殖の表現型は、１クラスターにおいて共に群化される。胚パターン形成、形態および成長の表現型は、別々のクラスターにおいて群化される等々。測定値は、色スケールによって示すことができ、例えば、赤色は、遺伝子が、非常に特異的な１表現型に関連する、および／または反対側の軸に示される関連する組織／生理系において高レベルで発現されることを示すことができ；一方、青色は、遺伝子が、多数の異なる変動する表現型に関連する、および／または関連する組織において低レベルで発現されることを示す。したがって、相関は、特定の組織または生理系に関係する表現型に強く関連する遺伝子座の群において可視化することができる。クラスタリングは、染色体上のこれらの遺伝的エレメントの物理的近接に関するいかなる情報とも独立に為される。クラスタリング方法は、遺伝子座の群の狭いおよび広いスケールでの観点の両方を可能にし、特定の表現型（単数および複数可）とのその関連を可能にして、同様の仕方で、場合によっては共に機能して、不妊の特定の側面を調節する可能性がある遺伝子座の群を強調する。
【０１２５】
ある特定の実施形態によると、遺伝子境界、エクソン、スプライス部位、推定的非コードＲＮＡの区域およびプロモーターまたはＣｐＧアイランド等の他のエレメント等、機能的アノテーションを含むヒトゲノムの各ヌクレオチドに帰属する特色と、マウスおよびヒトを含む複数の哺乳動物系からの組織特異的転写発現、トランスジェニックマウス系統表現型、異なるヒト疾患に関連付けられた遺伝子座または遺伝的領域における変異、特定の分子または細胞経路に対する特定の遺伝子座の関係性、遺伝子オントロジー、タンパク質−タンパク質相互作用ならびに観察された変異等、これらの領域に関連する特色とを含むデータベースを先ずコンパイルすることにより、クラスター解析を作成する。データの一部は、公開ソースに由来し（例えば、マウス表現型）、一部のデータは、研究試験に由来する（例えば、マウス表現型および目的の非コード区域または不妊患者において観察されるコード領域変異に関係する非公開データ）。
【０１２６】
データベースをアセンブルした後に、遺伝子領域に関するメタ解析を次の仕方で行う。先ず、データを前処理して、遺伝子座を行に、特色を列に有するマトリックスとして各ドメインを表現する。遺伝子発現等、連続的な値を有するドメインに関して、特色は、遺伝子発現が測定された個々の組織であり、マトリックス（Ｘｉｊ）における各値は、組織ｊにおける遺伝子ｉの発現を表す。表現型等、カテゴリー的な値を有するドメインに関して、特色は、個々の表現型であり、マトリックス（Ｘｉｊ）における各値は、遺伝子ｉが、表現型ｊに関連するかを表すバイナリー指標である。各ドメインマトリックスは、Ｒ行およびＣｋ列を有する。
【０１２７】
次に、遺伝子が、平均０および標準偏差１を有するように、各ドメインマトリックスを縮尺する。続いて、あらゆるドメイン特異的マトリックスを列に関して組み合わせ、Ｒ行およびΣＣｋ列を有するマトリックスを得る。
【０１２８】
次に、距離メトリックをマトリックスにおける行の各ペアおよび列の各ペアに適用する。この場合、重みを加えられた相関値は、ピアソン相関であり、より高い重みが特異的特色（列）に適用される。関心は、不妊駆動クラスタリングにあるため、不妊／生殖関連の表現型および組織に、相関値、したがって、距離計算においてより高い重みを与える。代替の重みを使用して、遺伝子情報の他の側面を強調することができる。得られた距離値は、同一アノテーションを有する遺伝子座が０であり、完全に相関していないアノテーションが１である。
【０１２９】
次に、標準階層的クラスタリングを使用して、マトリックスの行および列をクラスター形成する。強度に基づく色分けをマトリックスにおける値に使用し、赤色は、より高い陽性シグナルを示す。遺伝子に関する距離および関連するクラスタリングは、数種類の用途を有する。
【０１３０】
例えば、マウス等、ある哺乳動物種における既知不妊関連の遺伝子座から開始して、同じ種またはオルソロガス遺伝子を含有する別の哺乳動物種における新規不妊関連の遺伝子座を同定することができる。例として、既知ヒト不妊遺伝子ＮＬＲＰ５から開始して、表８は、ＮＬＲＰ５と最も同様（最小距離）の遺伝子を収載する。リストにおける遺伝子の大部分は、発表された試験に基づき不妊と関連があると既に同定されているが（アプローチの検証）、数種類は未だ同定されていない（例えば、ＡＴＡＤ２Ｂ、ＮＲ２Ｅ１）。この例において、ＡＴＡＤ２Ｂ、ＮＲ２Ｅ１は、その不妊関連を確認するための試験／解析の優れた候補である。
【０１３１】
例えば、部分的に特徴付けされた遺伝子から開始して、共に（ｃｏ）クラスター形成した遺伝子座に基づき可能性のある表現型／経路を帰属させる。例として、遺伝子ＣＨＳＴ８は、不妊を含むヒトの生物学的経路および疾患におけるその役割に関して不完全アノテーションを有する。表９は、クラスタリング方法に基づき、ＣＨＳＴ８と機能が最も同様の遺伝子を示す。妊孕性関連遺伝子ＦＳＨＢおよびＬＨＢは、ＣＨＳＴ８と同様であるまたはそれと同様の機能を有すると特徴付けられ、両者共に独立的に十分に特徴付けされる。両者は、女性の妊孕性に重要なホルモンの結合タンパク質をコードする。この例において、ＣＨＳＴ８は、したがって、例えば、トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＨＳＴ８遺伝子の破壊による、これが不妊に関連する仕方を明らかにするための試験／解析の優れた候補である。
【０１３２】
例えば、ヒトにおける不妊アッセイの開発に使用することができる関係する不妊関連の遺伝子座のクラスターを同定する［Ｐｉｔｔｍａｎ，  Ｊｅｎｎｉｆｅｒら「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０１．２２巻（２００４年）：８４３１〜８４３６頁］。図１４は、組織特異的遺伝子発現レベル、特定の表現型（単数および複数可）と遺伝子または遺伝的領域との関連、特定の細胞経路と遺伝子または遺伝的領域との関連およびタンパク質−タンパク質相互作用等が挙げられるがこれらに限定されない、文献における知識からキュレーションされたそれ自身の特定の遺伝子アノテーションをそれぞれ有する遺伝子のクラスターを示す。クラスターにおけるメンバーシップは、このようなドメインにおける同様の属性を実証する遺伝的領域と、収載されている属性によって計算される、特定のクラスター内の遺伝子座の機能的関連性の程度に応じたセクションへのクラスタリングツリーの分岐に基づく。代替的な実施形態において、ｋ平均法等の方法を使用することができる。本方法論は、遺伝子座の各クラスターが、妊孕性の別々の側面（例えば、卵母細胞発生、ホルモンシグナリング、胚着床）に関与し得ることを決定する。次に、このようなクラスターは、ヒト不妊を評価するためのアッセイの基盤、または不妊のモデルを提供するための遺伝子変更マウスの作製の候補と共に、治療薬等によって提供されるものが挙げられるがこれらに限定されない、不妊処置を検査するための手段として機能することができる。クラスターは、不妊の特異的特徴とのその関連を知らずに、メタ遺伝子を作製することにより、経験的に使用することもできる。メタ遺伝子は、遺伝子座のセットの重みを加えられた組合せであり、複数の同様の遺伝子座からの効果を統合するヒト不妊の単一の予測因子として機能する。メタ遺伝子の使用は、予測強度を増加させ、検証される仮説の数を低下させることにより、遺伝的／ゲノム試験の検出力を有意に増加させることができる。
【表８】
2017510250.tif 000060
【表９】
2017510250.tif 000061
【０１３３】
本発明のある態様において、遺伝子座は、ヒトおよびマウスにおけるその発現レベルに従ってランク付けされる。例えば、バイオマーカーが、マウスにおいて発現されるかが決定される。バイオマーカーが、マウスにおいて発現される場合、バイオマーカーは、より高いランク付けを受ける。バイオマーカーが、ヒトにおいても発現される場合、バイオマーカーは、ランク付けシステムによってさらに高くランク付けされる。バイオマーカーが、マウスまたはヒトにおいて発現されない場合、低いランク付けを受けるであろう。バイオマーカーは、マウスまたはヒトのいずれにおいても発現されなかった場合、最低ランク付けを受けるであろう。本技術分野における公知方法を用いて、遺伝的領域をランク付けすることができる。上述されている通り、本発明においていかなる公知ランク付け方法論を利用してもよいことが認められよう。例えば、フリードマン検定、クラスカル・ワリス検定、スピアマンの順位相関係数、ウィルコクソン順位和検定および／またはウィルコクソン符号順位検定は、公知の統計方法である。フリードマン検定は、パラメトリック反復測定ＡＮＯＶＡと同様である；これは、複数の検定試行に及ぶ処理における差の検出に使用される。手順は、各行（またはブロック）を一緒にランク付けすることと、続いて列によりランクの値を考慮することを伴う。Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｍｉｌｔｏｎ（１９３７年１２月）「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒａｎｋｓ  ｔｏ  ａｖｏｉｄ  ｔｈｅ  ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌｉｔｙ  ｉｍｐｌｉｃｉｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）３２巻（２００号）：６７５〜７０１頁を参照されたい。また、スピアマンの順位相関は、ピアソン積率相関のノンパラメトリックバージョンである。スピアマンの相関係数は、２種のランク付けされた変数の間の関連の強度を測定する。Ｌｅｈｍａｎ，  Ａｎｎ（２００５年）Ｊｍｐ  Ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：  Ａ  Ｓｔｅｐ−ｂｙ−ｓｔｅｐ  Ｇｕｉｄｅ．Ｃａｒｙ，  ＮＣ：  ＳＡＳ  Ｐｒｅｓｓ．１２３頁を参照されたい。ウィルコクソン符号順位検定は、２種の関係する試料、マッチした試料または単一の試料の反復的測定を比較して、それらの集団平均ランクが異なるか評価する際に使用される、ノンパラメトリック統計仮説検定である（すなわち、対応差検定である）。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ，  Ｆｒａｎｋ（１９４５年１２月）「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｂｙ  ｒａｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ」Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １巻（６号）：８０〜８３頁を参照されたい。
【０１３４】
本発明のある態様において、別の可能なランク付けスキームは、マウスにおける表現型との相関が決定される場合、統計的有意性が最も高いから最も低い順での遺伝子の収載を用いる。この方法において、信頼区間およびｐ値が用いられ、Ｐ値＜０．０２５が、統計的に有意であると考慮される。一連の線形回帰モデルが適合し、成績変数は、所定の遺伝子の表現型発現スコアであり、独立変数は、群（発現された表現型ｖ．対照）および主要構成成分由来の民族性（ヒトの場合）または系統（マウスの場合）（連続的）である。群のｐ値を統計的推論のために使用する。モデルは、遺伝子毎に１回適合する。
【０１３５】
本発明のある態様において、別の可能な遺伝子ランク付けスキームにおいて、遺伝子座は、遺伝子が妊孕性または生殖に関与する見込みを反映するＣｅｌｍａｔｉｘ  Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）Ｓｃｏｒｅ、Ｇ１Ｖｅｒｓｉｏｎ２に従ってランク付けされる。このスコアは、ゲノムにおける遺伝子毎の属性を含有する、マイニングおよびキュレーションされたデータのデータベースを使用して算出される。このような属性は、次のものを含む：不妊に関係する疾患および障害、分子経路、分子相互作用、遺伝子クラスター、各遺伝子に関連するマウス表現型、生殖組織における遺伝子発現データ、卵母細胞におけるプロテオミクスデータ、ならびにテキストマイニングにより科学刊行物から生じた情報。
【０１３６】
遺伝子または遺伝的領域（座位）の妊孕性関連属性をランク付けして、スコアを得るためのプロセスをＳＥＳＭｅアルゴリズムによって行った。ＳＥＳＭｅアルゴリズムは、特定の遺伝子を妊孕性に重要にし得る特色および属性のデータベースに適用される。アルゴリズムは、該遺伝的領域に関連する特色および属性に重みを加えることにより、各特色にスコアおよび相対的な重みを割り当て、続いて遺伝的領域を重要性が最も高いから最も低いへとランク付けする（または逆もまた同じ）。例えば、該遺伝子に関連する属性の組み合わされた重みを加えられた値をコンパイルすることにより、スコアを遺伝子に割り当てる。その重みを加えられた属性に基づき各遺伝子をスコア付けした後、遺伝子座は、そのスコアに従って重要性の順にランク付けすることができる。不妊属性毎の重みを加えられた値は、不妊に対する属性の有意性または重症度を反映するための正または負の整数の割り当てが挙げられるがこれに限定されない、いずれかの様式で縮尺することができる。
【０１３７】
ある特定の実施形態において、遺伝子不妊属性の重みを加えられた値は、−１０から＋１０のスケールとなり得る。＋１０は、スコア付けされている遺伝子の属性が、不妊患者集団において蔓延して見出されるため、不妊に高度に関連することを示すことができる。＋４は、潜在性不妊マーカーである属性を表すことができ、そのままでは不妊の原因とはならないが、加齢および喫煙等の外部因子の影響により不妊をもたらし得ることを意味する。＋２は、一部の不妊患者に見出される属性を表すことができる一方、この属性を不妊に直接的に関係づけるものはない。このスケールにおけるゼロは、不妊に向けたいかなる効果またはいかなるマイナス効果を有することも未だ既知ではない属性を含むことができる。−１０は、不妊に少しも影響しないことが示される属性を含むことができる。さらに、実施形態は、不妊患者集団において一般的に見出される属性のために＋１を、不妊患者集団に見出されるものと同様の属性のために０．５を、不妊と因果関係がない属性のために０を含むように重みを加えられたスケールを提供する。
【０１３８】
加えて、属性の重みを加えられた値は、不妊に向けた該属性の既知の有意性に基づき正規化することができる。例えば、ある特定の実施形態において、特定の遺伝子の属性をスコア付けする際に、各属性に、該属性が存在しない場合は０を、該属性が存在する場合は１を割り当てることができる。次に、属性は、該属性の不妊有意性に基づき正規化することができる。例えば、属性が、不妊と関連することが既知の遺伝的変異である場合、該属性は、５倍に正規化することができる。別の例において、属性が、不妊に関連することがあるシグナリング経路欠損である場合、該属性は、２倍に正規化することができる。
【０１３９】
本発明のある態様において、別の可能な遺伝子ランク付けスキームは、妊孕性遺伝子における新規または共通変異またはバリアントに関連する不妊、低妊孕率または早発性妊孕性減退リスクの相対的な程度を伴う。遺伝子座は、遺伝子が妊孕性または生殖に関与する見込みを反映する、Ｃｅｌｍａｔｉｘ  Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）Ｓｃｏｒｅ、Ｇ１Ｖｅｒｓｉｏｎ３に従ってランク付けされる。このスコアは、ゲノムにおける遺伝子毎の属性を含有する、マイニングおよびキュレーションされたデータのデータベースを使用して算出される。これらの属性は、次のものを含む：不妊に関係する疾患および障害、分子経路、分子相互作用、遺伝子クラスター、各遺伝子に関連するマウス表現型、生殖組織における遺伝子発現データ、卵母細胞におけるプロテオミクスデータ、ならびにテキストマイニングにより科学刊行物から生じた情報。Ｃｅｌｍａｔｉｘ  Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ（商標）Ｓｃｏｒｅ  Ｇ１Ｖｅｒｓｉｏｎ３は、スコア計算のための入力としてより多くの妊孕性遺伝子座を含有するため、Ｇ１Ｖｅｒｓｉｏｎ２とは異なる。
【０１４０】
マウスモデル
マウスゲノムを工学的に操作する能力は、研究、薬およびバイオテクノロジーにおける種々の適用に有用であると判明した。トランスジェニックマウスは、遺伝的障害をモデル化し、胚発生を理解し、治療を評価するための強力な試薬になった。このようなマウスおよびこれに由来する細胞株は、科学者に、遺伝子座に機能を割り当てさせ、遺伝的経路を精査させ、タンパク質の細胞または生化学的特性を操作させることにより、基礎研究も加速した。
【０１４１】
マウスモデルの作製は、本技術分野におけるいずれか公知の方法により達成することができる。これは、特定の遺伝子の発現または座位群の発現を永続的かつ遺伝的に変更するための、その発生最初期（接合子）における動物のゲノムへのＤＮＡの外因性配列の付加を伴い得るが、これに限定されない。方法論的には、これは、相同組換えにより内在性ＤＮＡ配列を置き換える、したがって、遺伝子または遺伝的領域の変異バージョンをコードするように設計することができる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに由来するオリゴヌクレオチドの短い配列の前核注射を伴い得るが、これらに限定されない。マウスモデルの作製として、ＤＮＡ配列がゲノムにおけるその内在性（正常）コピーを置き換えることを可能にするレトロウイルスベクターへのＤＮＡ配列（その内在性コピーと比較して増強または減弱されたレベルで発現されるように設計された）の挿入を挙げることもできるがこれに限定されない。例えば、Ｂｅｄｅｌｌ，  Ｍ．  Ａ．ら、Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐａｒｔ  Ｉ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１巻、１〜１０頁（１９９７ａ年）；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｎ．、およびＢｒｏｗｎ，  Ｓ．、Ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｓｃｅｎｄｉｎｇ：  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ−ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９巻、９９３〜９９９頁（２００７年）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ４３７；Ｙａｎｇ，  Ｓ．  Ｈ．ら、Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ．、Ｎａｔｕｒｅ  ４５３巻、９２１〜９２４頁（２００８年）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６９７５；Ｙｕ，  Ｙ．、およびＢｒａｄｌｅｙ，  Ａ．、Ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２巻、７８０〜７９０頁（２００１年）を参照されたい。
【０１４２】
これらの方法のいずれかまたは全てを使用して、大型の欠失、転位置または逆位等、ヌルまたは点変異および複雑な染色体再編成を含む、多くの異なる種類の変異をいずれか特定の遺伝的領域に導入することができる（Ｂｅｄｅｌｌら、１９９７ａ年）。動物に導入される変異に応じて、また、本技術分野で理解される通り、遺伝子組換え動物を、「ノックイン」または「ノックアウト」動物と称することができる、あるいは変異それ自体を、「ノックイン」変異または「ノックアウト」変異と称することができる。
【０１４３】
単一の遺伝子が疾患の主因であると示される場合、発現の変更のために特定の遺伝的領域を標的とする方法が特に有用であり、実際に、３，０００種を超える遺伝子が、マウスにおいて標的化され変更されてきた。標的化および変更された遺伝子の大部分は、疾患に関係付けられてきた（ＨａｒｄｏｕｉｎおよびＮａｇｙ、２０００年）。多くの遺伝子変更マウスは、同じ／関係する遺伝的領域に病変を有するヒト患者と同様の、ただし同一ではない表現型を有する。したがって、多くのマウスモデルは、ヒト疾患をモデル化する有用なツールを表す。
【０１４４】
したがって、本発明のある態様において、不妊または生殖生物学の特定の側面に関連して高度にランク付けされると同定され、ヒトまたはマウスにおいてこれらの特徴に以前に直接的に関連付けられたことがない遺伝子座は、不妊のマウスモデルの作製のための優れた候補として機能するであろう。このようなマウスモデルは続いて、特定の分子病因学に関係する不妊のある特定の側面を克服するように設計された治療剤を検査するためのツールを提供するであろう。
治療剤の検査
【０１４５】
続いて、遺伝子変更マウスを評価して、遺伝子またはバイオマーカーが、表現型を発現するか決定する。不妊表現型の存在を示す遺伝子変更試験動物は、治療法検査に有用である。例えば、表現型を発現する遺伝子変更マウスは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（プレグニール、ノバレル（Ｎｏｖａｒｅｌ）、オビドレル（Ｏｖｉｄｒｅｌ）およびプロファシ（Ｐｒｏｆａｓｉ）等）；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（フォリスチム、フェルチネクス（Ｆｅｒｔｉｎｅｘ）、バラベル（Ｂｒａｖｅｌｌｅ）およびゴナル（Ｇｏｎａｌ）−Ｆ等）；ヒト閉経期ゴナドトロピン（ｈＭＧ）（ペルゴナル（Ｐｅｒｇｏｎａｌ）、レプロネクス（Ｒｅｐｒｏｎｅｘ）およびメトロジン（Ｍｅｔｒｏｄｉｎ）等）またはゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）（ファクトレル（Ｆａｃｔｒｅｌ）およびルトレプルセ（Ｌｕｔｒｅｐｕｌｓｅ）等）；ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨアゴニスト）（リュープロン、ゾラデックスおよびシナレル（Ｓｙｎａｒｅｌ）等）；またはゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト（ＧｎＲＨアンタゴニスト）（アンタゴン（Ａｎｔａｇｏｎ）およびセトロチド（Ｃｅｔｒｏｔｉｄｅ）等）等、治療剤を投薬またはこれに曝露して、該治療剤が不妊の克服に有効であるか決定することができる。表現型をレスキューする、すなわち、野生型妊孕性表現型を回復または部分的に再建する治療剤は、優れた薬物候補である。
【０１４６】
適中率
不妊は、単一のゲノム変更の結果ではなく、むしろ、複数の因子または複数の変更の組合せの結果である場合がある。本発明の方法は、ヒト妊孕性の根底にある分子経路のより十分な理解を提供する。例えば、不妊関連の表現型の存在は、遺伝子（またはより頻繁には変異）を表現型に関連させることにより、ヒトにおける不妊に関連する遺伝子のデータベースにおける遺伝子の重要性のランク付けにおける因子として使用される。遺伝子におけるアレルまたは変異の存在と表現型との間の相関は、表現型に対するゲノム領域の寄与の適中率を増加または減少させる。
コンピュータシステム
【０１４７】
図１５は、本明細書に記載されている方法論の実行に有用なコンピュータシステム４０１を図解する。本発明のシステムは、図１５に示す構成成分のうちいずれか１個またはいずれかの数を含むことができる。一般に、システム４０１は、ネットワーク４１５を介して互いに通信することができるコンピュータ４３３およびサーバーコンピュータ４０９を含むことができる。その上、データは、データベース４０５（例えば、ローカルまたはリモート）から任意選択で得ることができる。一部の実施形態において、システムは、配列読み取りデータの初期処理のためのシーケンサーコンピュータ４５１にカップルすることができる、配列決定データを得るための機器４５５を含む。
【０１４８】
一部の実施形態において、方法は、並列処理によって行われ、サーバー４０９は、並列アーキテクチャを有する複数のプロセッサ、すなわち、本発明の方法により得られる遺伝的データを採取、フィルタリング、処理、解析、ランク付けすることができるプロセッサおよびストレージの分散型ネットワークを含む。本システムは、例えば、１）異なる様式：ａ）１種または複数の不妊データベース４０５（例えば、非公開および公開妊孕性関連データを含む不妊データベース）、ｂ）１種または複数のシーケンサー４５５または配列決定コンピュータ４５１、ｃ）マウスモデル化等から遺伝的データを採取し、２）該遺伝的データをフィルタリングして、遺伝的変種を同定し、３）本願を通して記載されている方法（例えば、フィルタリング、クラスタリング等）を使用して、遺伝的変種を不妊に関連付け、４）本明細書に定義されている（例えば、実施例１８）妊孕性判断基準に基づき遺伝的変種の統計的有意性を決定し、５）該遺伝的変種を不妊バイオマーカーとして特徴付ける／同定するように構成された複数のプロセッサを含むことができる。
【０１４９】
異なるソースにわたって得られる遺伝的データセットを活用し、解析の層（すなわち、フィルタリング、クラスタリング等）を遺伝的データに適用し、該遺伝的データの統計的有意性を定量化／定性化することにより、本発明のシステムは、不妊にいずれかの関連を有すると以前に決定できなかった新たな不妊バイオマーカーを得るおよび同定することができる。例えば、本発明の方法は、異なる様式のデータセットを利用する。データセット範囲は、不妊データベース（例えば、公開および非公開）、配列決定データ（例えば、１種または複数の生物学的試料由来の全ゲノム配列決定）およびマウスモデル化から得られる遺伝的データ等から得られるデータを含む。次に、解析の数種類の層を該遺伝的データに適用して、変種が不妊に潜在的に関連するか同定する。特に、遺伝的データセットは、進化的保存解析、フィルタリング解析に付される（図５を参照）、および／またはクラスタリング解析に付される。これらの解析を適用した後に、次に、不妊に潜在的に関連するバリアントを生物学的および統計的有意性に関して評価する。次に、統計的に有意であると決定されたバリアントを、このバリアントが不妊との従前の関連がなかったとしても、不妊バイオマーカーとして分類する。したがって、本発明のマルチモーダルおよび階層化解析を使用して、標準技法（すなわち、正常、妊娠可能である集団の遺伝的配列に対する異常、不妊集団の遺伝的配列の比較）を使用して、不妊に同定または関連付けられたことがない不妊バイオマーカーを同定することができる。
【０１５０】
他のハイブリッド構成も可能であるが、並列コンピュータにおけるメインメモリは典型的に、単一のアドレス空間において全処理要素の間で共有される、あるいは分散される、すなわち、各処理要素は、それ自身のローカルアドレス空間を有する（分散型メモリは、メモリが、論理的に分散型であるという事実を指すが、多くの場合、同様に物理的に分散型であることも暗示する）。分散型共有メモリおよびメモリ仮想化は、処理要素が、それ自身のローカルメモリおよび非ローカルプロセッサにおけるメモリへのアクセスを有する２種のアプローチを組み合わせる。ローカルメモリへのアクセスは典型的に、非ローカルメモリへのアクセスよりも速い。
【０１５１】
メインメモリの各要素が等しい待ち時間および帯域幅でアクセスできるコンピュータアーキテクチャは、均等メモリアクセス（ＵＭＡ）システムとして公知である。典型的には、これは、メモリが物理的に分散型ではない共有メモリシステムによってのみ達成することができる。この特性を持たないシステムは、不均等メモリアクセス（ＮＵＭＡ）アーキテクチャとして公知である。分散型メモリシステムは、不均等メモリアクセスを有する。
【０１５２】
プロセッサ−プロセッサおよびプロセッサ−メモリ通信は、共有（マルチポート型またはマルチプレックス型のいずれか）メモリ経由、クロスバースイッチ、共有バス、または星型、環状、樹状、ハイパーキューブ、ファット（ｆａｔ）ハイパーキューブ（ノードに２個以上のプロセッサを有するハイパーキューブ）もしくはｎ次元メッシュを含む無数のトポロジーの相互接続ネットワークを含む数種類の仕方でハードウェアにおいて実行することができる。
【０１５３】
相互接続ネットワークに基づく並列コンピュータは、直接的に接続されていないノード間のメッセージのパスを可能にするルーティングを取り込む必要がある。プロセッサ間の通信に使用される媒体は、大型のマルチプロセッサ機械における階層的である可能性がある。かかる資源は、専用の用途の購入のために市販されている、あるいはこのような資源は、「クラウド」、例えば、Ａｍａｚｏｎ  Ｃｌｏｕｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇを経由してアクセスすることができる。
【０１５４】
コンピュータは一般に、メモリにカップルされたプロセッサおよびバスを介した入力−出力（Ｉ／Ｏ）機構を含む。メモリは、ＲＡＭまたはＲＯＭを含むことができ、好ましくは、システムに本明細書に記載されている機能を実行させるための実行可能な命令を記憶する少なくとも１個の有形の非一過性媒体を含む。当業者であれば、本発明の方法の実施に必要または最もよく適すると認識できようが、本発明のシステムは、バスを介して互いに通信する１個または複数のプロセッサ（例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、グラフィックス処理装置（ＧＰＵ）等）、コンピュータ可読記憶デバイス（例えば、メインメモリ、スタティックメモリ等）またはこれらの組合せを含む。
【０１５５】
プロセッサは、Ｉｎｔｅｌ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により登録商標ＸＥＯＮ  Ｅ７で販売されているプロセッサまたはＡＭＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により登録商標ＯＰＴＥＲＯＮ  ６２００で販売されているプロセッサ等、本技術分野で公知のいずれか適したプロセッサとなり得る。
【０１５６】
本発明に係る入力／出力デバイスは、ビデオディスプレイユニット（例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）または陰極線管（ＣＲＴ）モニタ）、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウスまたはトラックパッド（ｔｒａｃｋｐａｄ））、ディスクドライブユニット、信号発生デバイス（例えば、スピーカー）、タッチスクリーン、加速度計、マイクロフォン、セルラー高周波アンテナ、および例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ−Ｆｉカードまたはセルラーモデムとなり得るネットワークインターフェースデバイスを含むことができる。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）
卵母細胞タンパク質の同定
過排卵により雌、例えばマウスから卵母細胞を採取し、酸タイロード液処理により透明帯を除去する。表面に露出した卵母細胞原形質膜（卵細胞膜）タンパク質は、ビオチン標識によりこの点において区別することができる。処理された卵母細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳにおいて洗浄し、溶解バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）３−［（３−コラミドプロピル（ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）、６５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼ阻害剤、−８０℃）で処理する。１次元または２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって卵母細胞タンパク質を分離する。このゲルを染色し、可視化し、スライスする。ゲル片におけるタンパク質を消化し（５０ｍＭ重炭酸アンモニウムにおける１２．５ｎｇ／μｌトリプシン、一晩３７℃）、ペプチドを抽出し、ミクロシークエンシングする。
【０１５８】
（実施例２）
不妊関係の多型の同定のための試料集団
３０名の女性の対象（複数ラウンドのＩＶＦに失敗した１５名対成功した１５名）からゲノムＤＮＡを採取する。特に、全対象は３８歳未満である。対照群のメンバーは、ＩＶＦにより妊娠に成功した。被験群のメンバーは、特発性不妊の臨床診断を有し、３回またはそれを超えるラウンドのＩＶＦに失敗し、以前に妊娠していない。女性は、ＩＶＦのための卵を産生することができ、生殖的に正常な男性のパートナーを有する。卵母細胞欠損に起因する不妊に焦点を合わせるため（また、着床欠損等の因子を排除するため）、卵供与によりその後に妊娠した女性が好ましい。
【０１５９】
（実施例３）
不妊関係の多型の同定のための試料集団
より大規模なコホートの追跡調査試験において、３００名の女性の対象（上述の群と同様のプロファイルを有する群に分ける）からゲノムＤＮＡを採取する。調査するべきＤＮＡ配列多型は、小規模な初期試験の結果に基づき選択される。
【０１６０】
（実施例４）
早期卵巣機能不全（ＰＯＦ）および早期母性加齢多型の同定のための試料集団
異常月経周期または無月経を含む、卵の質および保留における早発性減退の症状を経験している３０名の女性の対象からゲノムＤＮＡを採取する。特に、全対象は、１５〜４０歳の間であり、２０国際単位（ＩＵ）を上回る濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レベルおよび５を下回る基底胞状濾胞数を有する。対照群のメンバーは、ＩＶＦによる妊娠に成功した。被験群のメンバーは、化学療法等、公知の妊孕性を損傷する処置に対する毒性曝露の以前の病歴がない。この群のメンバーは、４０歳より前に閉経を経験した１名または複数の女性の家系員を有することもできる。
【０１６１】
（実施例５）
試料調達および調製
ホルモンレベルの計測等、標準手順のために不妊クリニックにおいて患者から血液を採取し、多くのクリニックは、将来の研究プロジェクトのために同意を得た後にこの材料を寄託する。ＤＮＡは、血液から容易に得られるが、より広範な集団サンプリングは、Ｏｒａｇｅｎｅ  ＤＮＡ自己採取キット（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ）を使用した唾液等、ＤＮＡ採取の在宅の非観血的方法を使用して達成される。
【０１６２】
血液試料−３ミリリットルの全血試料を静脈から採取し、クエン酸ナトリウム抗凝固薬で処理し、ＤＮＡ抽出まで４℃で貯蔵する。
【０１６３】
全唾液−メーカーの説明書に従ってＯｒａｇｅｎｅ  ＤＮＡ自己採取キットを使用して、全唾液を採取する。参加者は、約１５秒間自分の口腔の内側を舌で擦り、続いて、およそ２ｍｌの唾液を採取カップに入れるように求められる。採取カップは、蓋がしっかりと締められると、バイアルの下部区画からの溶液が放出され、唾液と混合するように設計されている。これは、ＤＮＡ単離の初期段階を開始し、室温または低温フリーザーにおける長期貯蔵のために唾液試料を安定化する。全唾液試料は、必要な場合は、室温で貯蔵および輸送する。全唾液は、試料当たり多数の有核細胞（例えば、上皮細胞、白血球）を提供するという、頬側および口内すすぎ等、他の非観血的ＤＮＡサンプリング方法を上回る潜在的な利点を有する。
【０１６４】
血餅−生殖ホルモンレベルのモニタリング等、他の検体検査のための、血清分離による抽出後に通常は廃棄される凝固した血液を採取し、抽出まで−８０℃で貯蔵する。
【０１６５】
試料調製−市販のキット（例えば、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）ｇＤＮＡ血液キットまたはＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋキット）による下流の配列決定適用のために患者血液または唾液からゲノムＤＮＡを調製する。凝血由来のゲノムＤＮＡは、ＤＮＡのプロテイナーゼＫ消化、塩／クロロホルム抽出および９０％エタノール沈殿を伴う標準方法により調製する（その全体が全ての目的で参照により組み込まれる、Ｎ  Ｋａｎａｉら、１９９４年「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｅａｓｉｌｙ  ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｃｌｏｔｔｅｄ  ｂｌｏｏｄ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ４７巻：１０４３〜１０４４頁を参照）。
【０１６６】
（実施例６）
カスタマイズされたオリゴヌクレオチドライブラリーの製造
カスタマイズされたオリゴヌクレオチドライブラリーを使用して、目的のＤＮＡのために試料を濃縮することができる。カスタマイズされたオリゴヌクレオチドライブラリーを製造するための数種類の方法は、本技術分野で公知である。一例において、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉カスタムアレイ設計を使用して、不妊関連の遺伝子座の目的に合わせたカスタマイズされた標的濃縮システムを作製する。オリゴヌクレオチドのカスタマイズされたライブラリーは、表１〜７の遺伝的領域を標的化するように設計される。カスタムＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｍａｓｋｌｅｓｓアレイ合成機（ＭＡＳ）技術により高密度ＤＮＡ  Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉アレイにおいて合成される。Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉アレイシステムワークフローは、アレイベースであり、Ｘ１ミキサー（Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）およびＮｉｍｂｌｅＧｅｎハイブリダイゼーションシステムによりスライドグラス上で行われる。
【０１６７】
同様の例において、ＡｇｉｌｅｎｔのｅＡｒｒａｙ（ウェブベースの設計ツール）を使用して、不妊関連の遺伝子座の目的に合わせたカスタマイズされた標的濃縮システムを作製する。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ標的濃縮システムワークフローは、溶液ベースであり、微量遠心管またはマイクロタイタープレートにおいて行われる。カスタマイズされたオリゴヌクレオチドライブラリーを使用して、目的のＤＮＡのために試料を濃縮する。ＡｇｉｌｅｎｔのｅＡｒｒａｙ（ウェブベースの設計ツール）を使用して、不妊関連の遺伝子座の目的に合わせたカスタマイズされた標的濃縮システムを作製する。カスタマイズされたライブラリーは、表１〜７の遺伝的領域を標的化するように設計される。カスタムＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはベイトは、ストレプトアビジン標識磁気ビーズ上における容易な捕捉のためにビオチン化し、ＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ標的濃縮システムにおいて使用する。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ標的濃縮システムワークフローは、溶液ベースであり、微量遠心管またはマイクロタイタープレートにおいて行われる。
【０１６８】
（実施例７）
ゲノムＤＮＡの捕捉
ゲノムＤＮＡを剪断し、下流で利用されている配列決定機器に特異的なライブラリー形式にアセンブルした。剪断されたＤＮＡにおいてサイズ選択を行い、電気泳動または他のサイズ検出方法によって確認する。
【０１６９】
ゲノムＤＮＡを捕捉する数種類の方法が本技術分野で公知である。一例において、サイズ選択されたＤＮＡを精製し、末端をＩｌｌｕｍｉｎａ製のアニールされたオリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションして、ＤＮＡライブラリーを調製する。ＤＮＡ−アダプタライゲーションされた断片を、Ｘ１ミキサー（Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）およびＲｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎハイブリダイゼーションシステムを使用してＮｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉アレイにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後にこれを洗浄し、アレイに結合されたＤＮＡ断片を溶出バッファーにより溶出させる。次に、捕捉されたＤＮＡを遠心分離により乾燥させ、再水和し、ポリメラーゼによりＰＣＲ増幅する。ＤＮＡの濃縮は、ハイブリダイゼーション前の同じ試料との定量的ＰＣＲ比較により評価することができる。
【０１７０】
同様の例において、サイズ選択されたＤＮＡをビオチン化ＲＮＡオリゴヌクレオチド「ベイト」と共に２４時間インキュベートする。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをストレプトアビジン標識磁気ビーズに固定化し、これを磁気により捕捉する。次に、ＲＮＡベイトを消化し、目的の標的選択されたＤＮＡのみを残し、これを続いて増幅し配列決定する。
【０１７１】
（実施例８）
標的選択されたＤＮＡの配列決定
Ｉｌｌｕｍｉｎａのゲノム分析計を使用したペア化末端（５０ｂｐ）再配列決定手順により、標的選択されたＤＮＡを配列決定する。組み合わせたＤＮＳ標的化および再配列決定は、４５倍の冗長性をもたらし、これは、ＳＮＰ発見のために許容される産業標準よりも大きい。
【０１７２】
（実施例９）
妊孕性と多型の相関
検査対象のプール由来の標的選択されたＤＮＡの配列の中の多型を同定し、遺伝子のプロモーター、スプライス部位またはコード領域においてこれが生じる場所に従って分類することができる。多型は、イントロンおよび上流または下流非コード領域等、明らかな機能がない領域に生じることもできる。かかる多型は、アレルの機能的欠損に関して情報価値がない場合もあるが、それにもかかわらずこの欠損に関連付けられ、不妊の予測に有用である。多型は、統計的に解析されて、検査対象の妊孕性状態とその相関を決定する。統計的解析は、ある特定の多型が、それだけで（ホモ接合型またはヘテロ接合型）不妊を引き起こすのに十分な遺伝子欠損を同定することを示す。他の多型は、妊孕性を低下させるが排除しない遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、他の遺伝子座の特定のバリアントの存在下でのみ妊孕性に明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、特定の表現型の存在下でのみ妊孕性に明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、特定の環境暴露の存在下でのみ妊孕性に明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。さらに他の多型は、他の遺伝子座の特定のバリアント、特定の表現型の存在および特定の環境暴露のいずれかの組合せの存在下でのみ妊孕性に明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。
【０１７３】
（実施例１０）
早期卵巣機能不全（ＰＯＦ）と多型の相関
検査対象のプール由来の標的選択されたＤＮＡの配列の中の多型を同定し、遺伝子のプロモーター、スプライス部位またはコード領域においてこれが生じる場所に従って分類することができる。多型は、イントロンおよび上流または下流非コード領域等、明らかな機能がない領域に生じることもできる。かかる多型は、アレルの機能的欠損に関して情報価値がない場合もあるが、それにもかかわらずこの欠損に関連付けられ、早期卵巣機能不全（ＰＯＦ）の見込みの予測に有用である。多型は、統計的に解析されて、検査対象のＰＯＦ状態とその相関を決定する。統計的解析は、ある特定の多型が、それだけで（ホモ接合型またはヘテロ接合型）ＰＯＦを引き起こすのに十分な遺伝子欠損を同定することを示す。他の多型は、見込みを増加させるが、ＰＯＦを引き起こさない遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、他の遺伝子座の特定のバリアントの存在下でのみＰＯＦに明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、特定の表現型の存在下でのみＰＯＦに明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、特定の環境暴露の存在下でのみＰＯＦに明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。さらに他の多型は、他の遺伝子座の特定のバリアント、特定の表現型の存在および特定の環境暴露のいずれかの組合せの存在下でのみＰＯＦに明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。
【０１７４】
（実施例１１）
早期母性加齢と多型の相関
検査対象のプール由来の標的選択されたＤＮＡの配列の中の多型を同定し、遺伝子のプロモーター、スプライス部位またはコード領域においてこれが生じる場所に従って分類することができる。多型は、イントロンおよび上流または下流非コード領域等、明らかな機能がない領域に生じることもできる。かかる多型は、アレルの機能的欠損に関して情報価値がない場合もあるが、それにもかかわらずこの欠損に関連付けられ、卵巣保留および卵の質の早発性減退（すなわち、母性加齢）の見込みの予測に有用である。多型は、統計的に解析されて、検査対象の母性加齢状態とその相関を決定する。統計的解析は、ある特定の多型が、それだけで（ホモ接合型またはヘテロ接合型）早期母性加齢を引き起こすのに十分な遺伝子欠損を同定することを示す。他の多型は、見込みを増加させるが、早期母性加齢を引き起こさない遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、他の遺伝子座の特定のバリアントの存在下でのみ早期母性加齢に明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、特定の表現型の存在下でのみ早期母性加齢に明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。他の多型は、特定の環境暴露の存在下でのみ早期母性加齢に明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。さらに他の多型は、他の遺伝子座の特定のバリアント、特定の表現型の存在および特定の環境暴露のいずれかの組合せの存在下でのみ早期母性加齢に明らかな効果を有する遺伝的バリアントを同定する。
【０１７５】
（実施例１２）
診断およびカウンセリング
アレイ形式における核酸のライブラリーが、不妊診断のために提供される。ライブラリーは、遺伝的標的の濃縮のための選択された核酸からなり、標的における多型は、妊孕性における変種と相関する。患者核酸試料（適切に切断およびサイズ選択された）がアレイにアプライされ、固定化されていない患者核酸が洗浄除去される。次に、目的の固定化された核酸が溶出され、配列決定されて、多型を検出する。検出された多型に従って、患者の妊孕性状態が評価および／または定量化される。これに従って、患者は、不妊治療の適合性および成功の見込みまたは特定の体外受精手技の適合性もしくは必要性に関して助言される。
【０１７６】
（実施例１３）
診断およびカウンセリング
表１〜７における遺伝子のうちいずれかの数またはその全ての完全ＤＮＡ配列は、標的化再配列決定プロトコールを使用して決定される。検出された多型ならびに報告された表現型形質および環境暴露に従って、患者の妊孕性状態が評価および／または定量化される。これに従って、患者は、不妊治療の適合性および成功の見込みまたは特定の体外受精手技の適合性もしくは必要性に関して助言される。
【０１７７】
（実施例１４）
診断およびカウンセリング
アレイ形式における核酸のライブラリーが、不妊診断のために提供される。ライブラリーは、遺伝的標的の濃縮のための選択された核酸からなり、標的における多型は、妊孕性における変種と相関する。患者核酸試料（適切に切断およびサイズ選択された）がアレイにアプライされ、固定化されていない患者核酸が洗浄除去される。次に、目的の固定化された核酸が溶出され、配列決定されて、多型を検出する。検出された多型ならびに報告された表現型形質および環境暴露に従って、患者のＰＯＦ状態または将来的ＰＯＦ発生率の見込みが評価および／または定量化される。これに従って、患者は、予防的な卵または卵巣保存が示されているかに関して助言される。
【０１７８】
（実施例１５）
診断およびカウンセリング
表１〜７における遺伝子のうちいずれかの数またはその全ての完全ＤＮＡ配列は、標的化再配列決定プロトコールを使用して決定される。検出された多型ならびに報告された表現型および環境暴露に従って、患者の妊孕性状態が評価および／または定量化される。検出された多型ならびに報告された表現型形質および環境暴露に従って、患者のＰＯＦ状態または将来的ＰＯＦ発生率の見込みが評価および／または定量化される。これに従って、患者は、予防的な卵または卵巣保存が示されているかに関して助言される。
【０１７９】
（実施例１６）
診断およびカウンセリング
アレイ形式における核酸のライブラリーが、不妊診断のために提供される。ライブラリーは、遺伝的標的の濃縮のための選択された核酸からなり、標的における多型は、妊孕性における変種と相関する。患者核酸試料（適切に切断およびサイズ選択された）がアレイにアプライされ、固定化されていない患者核酸が洗浄除去される。次に、目的の固定化された核酸が溶出され、配列決定されて、多型を検出する。検出された多型ならびに報告された表現型形質および環境暴露に従って、患者の母性加齢状態または将来的早期母性加齢発生率の見込みが評価および／または定量化される。これに従って、患者は、予防的な卵もしくは卵巣保存、アルコール摂取もしくは喫煙等、ある特定の環境暴露の最小化、またはより若いときに子供を産む等、ある特定の表現型の軽減が示されているかに関して助言される。
【０１８０】
（実施例１７）
診断およびカウンセリング
表１〜７における遺伝子のうちいずれかの数またはその全ての完全ＤＮＡ配列が、標的化再配列決定プロトコールを使用して決定される。検出された多型ならびに報告された表現型形質および環境暴露に従って、患者の妊孕性状態が評価および／または定量化される。検出された多型ならびに報告された表現型および環境暴露に従って、患者の母性加齢状態または将来的早期母性加齢発生率の見込みが評価および／または定量化される。これに従って、患者は、予防的な卵もしくは卵巣保存、アルコール摂取もしくは喫煙等、ある特定の環境暴露の最小化、またはより若いときに子供を産む等、ある特定の表現型の軽減が示されているかに関して助言される。
【０１８１】
（実施例１８）
女性の不妊バイオマーカー発見のための全ゲノム配列決定
全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）は、個体のゲノムの完全核酸配列の特徴付けを可能にする。ＷＧＳから得られるデータ量により、遺伝的バイオマーカー発見のための優れた潜在力をもたらす個体の遺伝的変種の網羅的コレクションを得ることができる。ＷＧＳから得られるデータを有利に使用して、女性の不妊バイオマーカーを同定および特徴付けする能力を拡張することができる。しかし、膨大なＷＧＳデータセット内の妊孕性有意性の未知変種を同定する能力は、干し草の山の中から針を見つけ出すことに似た難易度の高い仕事である。
【０１８２】
本発明の方法は、ある特定の実施形態によると、不妊有意性の変種を同定および優先順位付けするために、ＷＧＳデータによりフィルタリングするためのバイオインフォマティクスに頼る。特に、本発明は、臨床表現型データおよび不妊知識ベースの組合せに頼って、目的のゲノム領域および異なる妊孕性障害におけるその可能性のある影響をランク付けおよび／またはスコア付けする。ある特定の態様において、フィルタリングアプローチは、配列決定データを評価して、ゲノム変種を同定するステップと、不妊に関連するゲノム領域に存在するとして変種のうち少なくとも１種を同定するステップと、この少なくとも１種の変種が、生物学的に有意な変種および／または統計的に有意な変種であるか決定するステップと、決定するステップに基づき、少なくとも１種の同定された変種を不妊バイオマーカーとして特徴付けするステップとを伴う。不妊に関連するゲノム領域は、その変種が妊孕性の変化に関連するいずれかのＤＮＡ配列である。かかる領域は、遺伝子（例えば、機能的産物をコードするＤＮＡのいずれかの領域）、遺伝的領域（例えば、胎盤性哺乳動物における進化を通じて保存された領域に特に焦点を置いた、遺伝子および遺伝子間領域を含む領域）および遺伝子産物（例えば、ＲＮＡおよびタンパク質）を含むことができる。特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、上述の通り、母性効果遺伝子である。特定の実施形態において、不妊関連の遺伝的領域は、妊孕性に影響する遺伝子（エクソン、イントロンおよび前記遺伝子のいずれかの側に隣接するＤＮＡの進化的に保存された領域を含む）である。
【０１８３】
このフィルタリングアプローチは、妊孕性有意性のゲノム領域内の機能的に関連するバリアントの迅速な同定を容易にする。ＷＧＳデータから得られる不妊有意性を有する同定された変種は、診断検査において使用することができ、最終的に医師のデータ解釈に役立ち、不妊治療をガイドし、一部の患者が処置に応答していない理由を明らかにする。次に、本発明の方法に従って目的のバリアントを同定するためのＷＧＳデータの使用を図解する。
【０１８４】
図５は一般に、不妊有意性の変種を同定するための、ＷＧＳ配列決定データから得られる変種によるフィルタリングを図解する。図５に示す通り、第１のステップは、全ゲノム配列における配列バリアントを同定することである。典型的な全ゲノムは、最大４百万種のバリアントを含むことができる。次のフィルタリングステップは、女性の妊孕性のために目的の領域の外側のバリアントを排除することを伴う（約百万種のバリアントに達する）。次に、フィルタリング方法は、本明細書においてＦｅｒｔｉｌｏｍｅ核酸（すなわち、卵の質および妊孕性を制御するヒトゲノムの領域）として記載する、女性の妊孕性のための目的の領域内のバリアントを単離する。Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ核酸内に位置する変種は、１００，０００番台の数となり得る。Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ核酸内の変種をさらにフィルタリングして、不妊有意性の変種を同定およびスコア付けする（かかる変種は典型的には、２桁で存在する）。特に、不妊有意性の変種は、生物学的機能をもたらすまたは不妊もしくは処置失敗に統計的相関を示すことが予測される領域内の変種を含む。
【０１８５】
Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ核酸内の生物学的に有意な変種は、１）コードされたタンパク質のフォールディングおよび／または構造を変更することが予測される異なるアミノ酸への変化、２）哺乳動物における高い進化的保存を有する部位に生じる異なるアミノ酸への変化、３）未成熟終止終結シグナルを導入する変化、４）終止終結シグナルを失わせる変化、５）新たな開始コドンを導入する変化、６）開始コドンを失わせる変化、または７）スプライシングシグナルを破壊する変化をもたらす変異を含む。Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ核酸内の統計的に有意な変種は、表２および３に関して記載され、これに収載されている。統計的または生物学的に有意なものとして変種を分類するための他の方法は、不妊知識ベースを使用して、変種をスコア付けするステップを含む（上の表５〜７および下の図６に関して記載）。不妊知識ベースは、不妊に関連する属性に基づき遺伝子座をランク付けする。属性は、次のものを含む：不妊に関係する疾患および障害、分子経路、分子相互作用、遺伝子クラスター、各遺伝子に関連するマウス表現型、生殖組織における遺伝子発現データ、卵母細胞におけるプロテオミクスデータ、ならびにテキストマイニングにより科学刊行物から生じた情報。ランク付けされた目的の遺伝子のリストを表５〜７に示す。
【０１８６】
図６は、ある特定の実施形態によると、全ゲノム配列決定データを解析するために、不妊知識ベースへと統合される様々なデータソースを図解する。図６に示す通り、情報は、非公開および公開妊孕性関連データから得られる。非公開および／または公開妊孕性関連データは、着床の過程を調節する遺伝子座、特発性不妊遺伝子座、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）遺伝子座、卵の質遺伝子座、子宮内膜症遺伝子座および早期卵巣機能不全遺伝子座を含むことができる。次に、非公開および／または公開妊孕性関連データは、ＡＢＣｏＲＥアルゴリズムに付されて、他の妊孕性関連情報と共に、妊孕性データベース証拠マトリックスへと導入することができる目的のゲノム領域および変種をもたらす。詳細な説明に記載されている通り、ＡＢＣｏＲＥアルゴリズムは、非公開および／または公開妊孕性関連データから得られる１種または複数の遺伝子座の進化的保存解析を行うことにより、目的の妊孕性領域を同定する。他の妊孕性関連情報は、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、経路相互作用、遺伝子オルソログおよびパラログ、ゲノム「ホットスポット」、遺伝子タンパク質発現およびメタ解析、ならびにゲノム試験由来のデータを含む。演算において、全ゲノム配列決定データは、妊孕性データベース証拠マトリックスにおけるコンパイルされたデータと比較されて、妊孕性に重要な潜在的遺伝的領域の同定を容易にする。妊孕性データベース証拠マトリックスは、ＷＧＳバリアントによりフィルタリングして、妊孕性有意性のバリアントを同定する。ある特定の実施形態において、全ゲノム配列決定データは、女性の妊孕性の異なる側面に対する重要性が最も高いから最も低いへと各遺伝的領域をランク付けするＳＥＳＭｅアルゴリズムにも付される。
【０１８７】
図７は、ある特定の実施形態によると、不妊に関連するバイオマーカーを同定するための、ＷＧＳデータによるフィルタリングに使用されるバイオインフォマティクスパイプラインを図解する。図７に示す通り、試料は、全ゲノム配列決定、マッピングおよびアセンブリに付される。次に、ＷＧＳデータを解析して、ＳＮＰ、小型のインデル、移動性エレメント、コピー数変種および構造変種等、遺伝的バリアントを発見する。次に、同定された変種を統計的有意性に関して評価する（例えば、上の表２および３を参照）。これは、集団層別化、変種レベル有意性検定および遺伝子レベル有意性検定のための補正を含む。加えて、ＷＧＳバリアントの生物学的有意性は、ＳｎｐＥｆｆおよびＶａｒｉａｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）エンジンを使用して決定される（例えば、上の表１を参照）。次に、妊孕性バイオマーカーとしてバリアントを分類するために、生物学的および統計的有意性のバリアントを不妊知識ベース（すなわち、Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅデータベース）に入れる。
【０１８８】
次に、本発明の方法に従って目的のバリアントを同定するためのＷＧＳデータの使用を図解する。
【０１８９】
大学の生殖医療センターで不妊治療を受けている女性の患者から試料を採取し、特発性不妊または原発性卵巣不全（ＰＯＩ）試験群へとカテゴリー化した。電子健康記録から＞２００種の変数をマイニングすることにより、患者毎に表現型情報を採取した。血液試料から抽出したゲノムＤＮＡは、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＷＧＳを受けた。ＷＧＳ由来の遺伝的バリアントの解析は、刊行物、データリポジトリ（タンパク質−タンパク質相互作用および組織発現パターンを含む）、これらのデータのメタ解析および動物モデル表現型に基づき、その可能性のある異なる妊孕性障害における影響を予測するスコア付けアルゴリズムによりランク付けされた＞８００種の目的のゲノム領域（ＲＯＩ）を有する不妊知識ベースにより支援された。
【０１９０】
採取された女性の試料を、図５〜７に描写されているプロセス／アルゴリズムに付した（より詳細に上述）。このような女性の試料により、ｓｂＳＮＰ参照等、データベースにおいて以前に報告されたことがない妊孕性有意性を有すると、およそ５０，０００種の新規バリアント（観察された総バリアントのおよそ１．６％）を同定した。同定された妊孕性関連バリアントは、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、コピー数変種、逆位および転位置を含む。ＳＮＰのうち、その一部は、知識ベースに基づき推定的機能的有意性を有すると予測される。例えば、知識ベースは、潜在的な機能喪失またはタンパク質構造変化により、有害な変異として一部のＳＮＰをスコア付けした。
【０１９１】
ある特定の態様において、患者／対象集団のＷＧＳデータ等、ゲノムデータは、集団層別化補正に付される。集団層別化補正は、恐らくは異なる祖先による、集団における亜集団間のアレル頻度における系統的な差の存在を説明する。集団層別化を行う場合、データは、１０００ゲノムプロジェクト（１００Ｇ）の一部として、多くの（例えば、１，０００名の）民族的に多様な個体と比較される。主成分分析（ＰＣＡ）をモデルに適用し、祖先の差を同定する。加えて、算出された関連統計学を、最初の２個の主成分に対し調整する。
【０１９２】
図１３は、２種の患者群の集団層別化補正を図解する。患者群は、非ドナー体外受精（ＩＶＦ）サイクルを受けている女性の患者を含む。患者は、登録時に３８歳またはそれより若く、ＩＶＦ処置前に第１の期間を越えて妊娠の経歴がなかった。各患者は、完全病歴、身体検査、内分泌プロファイルおよび親密なパートナーの精子解析の結果の評価後に、不妊の明らかな原因を欠いた（すなわち、未解明）。患者を２群に分けた。群Ａは、３またはそれを超えるＩＶＦサイクル後に生児出生または最初の三半期を越えた妊娠を経験しなかった１１名の患者を含んだ。群Ｂは、ＩＶＦ治療法の使用により生児出生または最初の三半期を越えた妊娠を経験した１８名の患者を含んだ。集団層別化補正により、群ＡおよびＢ患者は、図１３の主成分分析チャートに示す通り、東アジア人、アフリカ人、ヒスパニック系およびヨーロッパ人の個体とクラスター形成する（黒い点として示す）。このデータは、民族性が、不妊に関連付けられ得る、あるいはある特定のゲノム変種が、ある特定の民族集団においてより蔓延していることを示す。したがって、本発明の態様は、個体による自己報告（例えば、アンケートによる）または個体の遺伝的民族性に関係する公知バイオマーカーを探すアッセイのいずれかにより、個体の民族性を評価することを伴う。該民族性データ（遺伝的または自己報告）を使用して、ある特定の民族集団に関連することが公知のある特定のゲノム変種がチェックされることを確実にすること等により、検査をガイドすることができる。
【０１９３】
（実施例１９）
妊娠に困難を経験するカップルのおよそ１５％が、特発性不妊と診断される。遺伝的多型は、細胞下レベルで存在し得る卵母細胞の質または子宮の受容性に対する破壊を明らかにすることにより、このような現在未解明の症例の多くに光を当てることができる。
【０１９４】
ある特定の態様に従って、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アレイを使用して、女性の妊孕性におけるその効果に関してコピー数変種を試験する。ＣＧＨは、１種または複数の対象ゲノムまたはその一部における核酸配列（例えば、不妊マーカー）のコピーの相対数を、参照ゲノム（例えば、正常ヒトゲノム）におけるこれらの配列の位置の関数として決定する方法を提供する。結果として、ＣＧＨは、特異的な染色体異常性の予備知識なしで、ゲノム全体にわたる核酸コピー数の喪失および獲得のマップを提供する。本発明の方法は、未解明の不妊を有する患者集団内の不妊有意性を有する潜在的変異を検出するために、予備知識の必要なくコピー数変種を検出する能力を十分に利用する。
【０１９５】
次に、本発明の方法に従って目的のコピー数バリアントを同定するためのＣＧＨアレイの使用を図解する。
【０１９６】
本試験は、非ドナー体外受精（ＩＶＦ）サイクルを受けている女性の患者を試験した。患者は、登録時に３８歳またはそれより若く、ＩＶＦ処置前に第１の期間を越えて妊娠の経歴がなかった。各患者は、完全病歴、身体検査、内分泌プロファイルおよび親密なパートナーの精子解析の結果の評価後に、不妊の明らかな原因を欠いた（すなわち、未解明）。患者を２群に分けた。群Ａは、３またはそれを超えるＩＶＦサイクル後に、生児出生または最初の三半期を越えた妊娠を経験しなかった１１名の患者を含んだ。群Ｂは、ＩＶＦ治療法の使用により生児出生または最初の三半期を越えた妊娠を経験した１８名の患者を含んだ。
【０１９７】
図９は、不妊に関連する統計的に有意な領域内の、試験集団において検出されたコピー数変種（すなわち、Ｆｅｒｔｉｌｏｍｅ核酸内のコピー数変種）のＣＧＨアレイデータを提供する。図１０は、群ＡおよびＢ内における、第１染色体のＧＪＣ２遺伝子において検出された特異的コピー数変種を図解する。この領域は、卵母細胞および脳の両方において特異的に発現され、胚問題に関連することが公知である。図示されている通り、ＧＪＣ２内の領域は、大部分の不妊患者において欠失を示した。図１１は、群ＡおよびＢ内における、第１９染色体のＣＲＴＣ１およびＧＤＦ１遺伝子において検出された特異的コピー数変種を図解する。ＣＲＴＣ１は、卵巣、卵母細胞、子宮内膜および胎盤発現に関連する。ＧＤＦ１は、前腸内胚葉および中胚葉の形成における欠損に関連する。図示されている通り、両方の患者群は、これらの遺伝子におけるコピー数欠失を示す。図１２は、第６染色体の非コード領域において検出された特異的コピー数変種を図解する。図示されている通り、両方の患者群は、該領域におけるコピー数重複を示す。
【０１９８】
参照による組み込み
特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツ等、他の文書の参照および引用が、本開示を通して為された。全てのかかる文書は、その全体が全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
均等
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特異的な形態で具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載されている本発明に限定的というよりも、説明的であると考慮するべきである。よって、本発明の範囲は、前述の記載よりも添付の特許請求の範囲によって示され、したがって、特許請求の範囲の均等の意義および範囲内に収まるあらゆる変更は、それに包含されることが企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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