(57)【要約】細胞を含む試料を部分的溶解プロセスによって処理する方法が記載され、細胞は、混合物中の一部の細胞を溶解するビーズビーティング等のプロセスに曝されて、細胞形態学スクリーニングと遺伝子スクリーニングの両方に適した試料混合物を生じる。部分的溶解試料の第１の部分をスライドに載せて異型細胞および細胞学的異常を観察し、部分的溶解試料の第２の部分は頸部がんのリスクに相関することが知られる遺伝子マーカーについてスクリーニングされ得る。部分的溶解プロセスにおけるビーズの存在は、スライドの処理または細胞解析を妨害しない。この方法は、子宮頸部スクリーニングに有用であり、細胞学と遺伝子スクリーニングの組合せによって子宮頸部の健康状態のより詳細な全体像を示し、スクリーニングの精度を犠牲にすることなく両方の種類のアッセイを必要とするプロトコールのための診断プロセスをストリームライン化する。
2017528147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む生物学的試料を評価する方法であって、
対象から生物学的試料を得るステップ、
前記生物学的試料を生物学的試料保存剤と接触するステップであって、保存された生物学的試料を作成するステップ、
前記保存された生物学的試料を部分的に溶解して、溶解した細胞、全細胞、および分子成分を含む混合物を作成するステップ、
前記混合物の第１の部分を、細胞ベースの解析を使用して特徴付けるステップ、および
前記混合物の第２の部分を分子成分についてアッセイするステップ
を含む、方法。
【請求項２】
部分的に溶解するステップが、前記保存された生物学的試料の全体を溶解プロセスに曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞の５０％未満が溶解する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
部分的に溶解するステップが、所定の溶解のレベルまで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
部分的に溶解するステップが、機械的に剪断すること、界面活性剤により溶解すること、浸透圧により溶解すること、化学的に変性すること、遠心分離すること、超音波処理すること、凍結融解すること、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
機械的に剪断することが、シリンジにより剪断すること、ビーズビーティングすること、またはそれらの組合せを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分子成分が、前記生物学的試料中に存在する病原体の成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記病原体が、クラミジア、淋病、トリコモナス症、およびカンジダ症を含む群から選択される疾患に関連する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アッセイするステップが、核酸を検出すること、核酸を定量すること、核酸を識別すること、またはシーケンシングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
識別された核酸を公知のマーカーのデータベースと比較するステップであって、前記対象が公知のマーカーを有するかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記公知のマーカーが、がんのリスクと相関する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記公知のマーカーが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−７３またはＨＰＶ−８２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
細胞ベースの解析が、前記混合物中の全細胞を観察することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞ベースの解析が、全細胞をスライドに載せることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞ベースの解析が、扁平上皮細胞の異常または腺細胞の異常についてスクリーニングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞を含む生物学的試料を評価する方法であって、
対象から細胞を含む生物学的試料を得るステップ、
前記細胞を含む生物学的試料を生物学的試料保存剤と接触させて、保存された生物学的試料を作成するステップ、
前記保存された生物学的試料を容器に入れるステップ、
前記容器中の保存された生物学的試料の全体を溶解プロセスに曝露して混合物を作成するステップ、
前記混合物を、細胞ベースの解析を使用して特徴付けるステップ、および
前記混合物を分子成分についてアッセイするステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
細胞の５０％未満が溶解する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
部分的に溶解することが、所定の溶解のレベルまで実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶解プロセスが、機械的に剪断すること、界面活性剤により溶解すること、浸透圧により溶解すること、化学的に変性すること、遠心分離すること、超音波処理すること、凍結融解すること、またはそれらの組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
機械的剪断が、シリンジにより剪断すること、ビーズビーティングすること、またはそれらの組合せを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物が、全細胞、溶解した細胞、および分子成分を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記分子成分が、前記生物学的試料中に存在する病原体の成分を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記病原体が、クラミジア、淋病、トリコモナス症、およびカンジダ症を含む群から選択される疾患に関連する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイするステップが、核酸を検出すること、核酸を定量すること、核酸を識別すること、またはシーケンシングすることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
識別された核酸を公知のマーカーのデータベースと比較するステップであって、前記対象が公知のマーカーを有するかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記公知のマーカーが、がんのリスクと相関する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記公知のマーカーが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−７３またはＨＰＶ−８２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞ベースの解析が、前記混合物中の全細胞を観察することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
細胞ベースの解析が、全細胞をスライドに載せることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞ベースの解析が、扁平上皮細胞の異常または腺細胞の異常についてスクリーニングすることを含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１４年９月１７日に出願された米国仮出願番号第６２／０５１，６７２号に基づく利益および優先権を主張しており、その内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞形態学スクリーニングと分子成分のスクリーニングの両方のために試料を処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
パパニコロウ（Ｐａｐ）試験は、前がん性およびがん性病変を含む子宮頸部および子宮内膜細胞の異常を検出する子宮頸部スクリーニングとして広く使用されている方法である。Ｐａｐ試験は簡単で侵襲が最小限であり、かつ低コストのため、広く使用されている。試験は一般に、収集デバイスを使用して子宮頸部から細胞試料を採取すること、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の存在の指標であるある特定の診断的特徴について細胞をアッセイすることを含む。子宮頸部の異常を早期に検出することは効果的な処置にとって必須であり、定期的なＰａｐスクリーニングによって、１９５５年にこれが導入されて以来、米国における年間死亡者数が６０％を超えて減少している（国立がん研究所）。
【０００４】
子宮頸部試料を得るため、臨床医は一般にブラシまたはスパチュラを使用して子宮頸部および子宮頸管から細胞を収集する。次いで検体を直接ガラススライドに塗り付ける（即ち従来の「Ｐａｐスメア」）か、または液体ベースの細胞学培地（ＬＢＣ）の中に収集する。ＬＢＣの場合、収集デバイスをＨｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から入手可能なＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液等の保存培地中に浸漬し、撹拌して細胞を培地中に放出する。ＬＢＣ培地に曝露することによって細胞を固定し、細胞形態学について細胞を評価することが可能になる。有用なＬＢＣ培地の詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３１，３１７号に見出すことができる。
【０００５】
現在の標準治療は、細胞形態学評価のため、収集した細胞の一部をスライドに固定することである。スライドは手作業で調製してもよい（「Ｐａｐスメア」）が、ＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）イメージングシステムと組み合わせたＨｏｌｏｇｉｃのＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）Ｐａｐ試験と等の自動化システムを用いて、より優れた結果を得ることができる。この方法論は精度が改善され、疾患の検出が増大するので、従来のＰａｐスメアより優れている（引用−Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｅｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓ（ＳＥＥＲ）Ｐｒｏｇｒａｍ．ＳＥＥＲ  Ｄａｔａｂａｓｅ：Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ−ＳＥＥＲ  ９  Ｒｅｇｓ  Ｐｕｂｌｉｃ−Ｕｓｅ、２００４年１１月提出（１９７３〜２００２年）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＤＣＣＰＳ、Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｂｒａｎｃｈ、２００５年４月発表、２００４年１１月提出に基づく）。いったん細胞を固定すれば、異型扁平上皮細胞、低悪性扁平上皮内病変、高悪性扁平上皮内病変、扁平上皮細胞癌、異型腺細胞、腺癌および他の細胞学的異常について試料をスクリーニングすることができる。たとえばｔｈｅ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙを参照されたい。
【０００６】
遺伝子スクリーニング技術の最近の進歩により、がんまたは感染症の指標となる遺伝子の変化をスクリーニングすることが可能になった。たとえば、子宮頸部試料を収集して、ハイブリッドアッセイ、マルチプレックスＰＣＲ、またはダイレクトシーケンシング等の遺伝子アッセイを使用して、分子診断のためにスクリーニングすることができる。ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−７３またはＨＰＶ−８２についてタイピングすることによって、試料を遺伝子マーカーのデータベースに対してスクリーニングし、子宮頸部がんに対する女性のリスクを識別することができる。スクリーニングはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの一部の組合せに基づくものであってよい。ＨＰＶの診断スクリーニングのための市販のシステムは、たとえばＣｅｒｖｉｓｔａ（登録商標）ＨＰＶまたはＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶアッセイとしてＨｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【０００７】
米国における子宮頸部スクリーニングの標準治療はいまだにＰａｐ試験であるが、米国食品医薬品局は最近、子宮頸部がんについて女性をスクリーニングするために使用する遺伝子検査単独の道を開いた。しかし、米国女性医師会等のグループは、同時に行なう形態学的スクリーニングを伴わない遺伝子検査単独では、ＨＰＶのキャリアであるだけで子宮頸部がんが発症する緊急のリスクが全くない場合に、あまりに多くの女性が処置を受けることになるのではないかとの懸念を表明した。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「ＦＤＡ  ａｐｐｒｏｖｅｓ  Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｓｔ  ａｓ  ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｐａｐ  Ｓｍｅａｒ  ｆｏｒ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｅｓｓ、２０１４年４月２４日を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，５３１，３１７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
本開示は、結果として細胞形態学スクリーニング、ならびに、核酸、病原体、タンパク質、および他の疾患のマーカー等の分子成分のスクリーニングの両方に適した試料混合物を生成する、部分的溶解プロセスにより試料を処理する方法を記載する。一部の例では、核酸をシーケンシングし、疾患の遺伝子マーカーと比較することができる。好ましい実施形態では、方法は、試料中の細胞をビーズビーティング、即ち試料を多数のビーズと一緒に振盪することによって機械的に剪断するステップを含む。ビーズの急速な運動によって細胞が細切される。方法は、溶解の程度を制御するステップであって、それにより細胞形態学について観察されるべき試料中に十分な数の全細胞を保持するステップを含む。部分的溶解プロセスの後、試料中の細胞構造は、単独でまたはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）イメージングシステムと組み合わせたＴｈｉｎ  Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｐａｐ試験等の自動化システムと併用して、使用者によって観察され、試料はハイリスクＨＰＶタイプ等の遺伝子マーカーについてもスクリーニングされる。驚くべきことに、混合物中のビーズの存在は、細胞学的測定、たとえばＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）プロセッサーまたはイメージングシステムの機能に干渉せず、スライドの細胞提示または目視解析にも干渉しない。
【００１０】
方法は、一般に、細胞学と分子診断の組合せに適用できる。特に、方法は、子宮頸部スクリーニングに有用であり、細胞学と遺伝子スクリーニングの組合せによって子宮頸部の健康状態に関するより完全な像が提示される。たとえば、部分的に溶解した試料の第１の部分をスライドに載せて、異型細胞および細胞学的異常に関して観察することができる。部分的に溶解した試料の第２の部分は子宮頸部がんのリスクに相関することが公知の遺伝子マーカー、たとえばＨＰＶの存在についてスクリーニングすることができる。
【００１１】
部分的溶解方法は、機械的に剪断すること、界面活性剤により溶解すること、浸透圧により溶解すること、または当技術分野で公知の他の方法を含み得、選択した手法は、試料中の実質的に全ての細胞が溶解することを避けるように適合される。最新技術の細胞学的手法は、試料の構造的一体性を維持するために細心の注意を教示しているが、本開示は、同一の試料、即ち部分的に溶解した試料が細胞学および分子診断の両方に適する方法を述べている。この方法は、子宮頸部スクリーニング等の両方の種類のスクリーニングアッセイを必要とするプロトコールのための診断プロセスをストリームライン化する。二重の収集の必要がないので、プロセスが効率化される。収集ポイントが１つのみであるので、高感度の検査設定における相互汚染の頻度が低減される。また、他の分子診断プロトコールとは対照的に、本開示は診断プロセスにおいて分子試料が破壊されない方法を提供する。方法により、同じ細胞試料からの細胞形態学および遺伝子マーカーの同時のアッセイも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、部分的溶解方法を使用して試料をスクリーニングするためのワークフローを示す。
【００１３】
【図２】図２は、部分的溶解方法を使用して試料をスクリーニングするためのワークフローを示す。
【００１４】
【図３】図３は、部分的溶解方法の前後から細胞計数および可視化を比較するための実験デザインのフローチャートを示す。
【００１５】
【図４】図４は、機械的剪断法との使用に適した種々の針を示す。
【００１６】
【図５】図５は、部分的溶解ビーズビーティングプロトコールを改良するための試験を記載した試料表を示す。
【００１７】
【図６】図６は、種々の持続時間のビーズビーティングの後の細胞濃度の表を示す。
【００１８】
【図７】図７は、ビーズビーティング法の種々の試験の吸光度の結果を示す。
【００１９】
【図８】図８は、種々の混合時間でガーネットビーズに曝露した細胞の４０倍の視野を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（詳細な説明）
本開示は、結果として細胞形態学スクリーニングおよび分子診断の両方に適した試料混合物を生成する、部分的溶解のプロセスにより試料を処理する方法を記載する。最新技術の細胞学的手法は、試料の構造的一体性を維持するために細心の注意を教示するが、本開示は、同一の試料が細胞学と分子診断の両方に適するように部分的に溶解する方法を述べている。この方法は、子宮頸部スクリーニング等の完全な検査のために細胞学と遺伝子スクリーニングの両方を必要とするプロトコールのための診断プロセスをストリームライン化する。溶解の前に試料を分割することを教示する他の方法（たとえばＩｆｔｎｅｒら、「Ｓｔｕｄｙ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ＩＩ  ＩＮＮＯ−ＬｉＰＡ  ｖ２  ＨＰＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４７巻（７号）：２１０６〜２１１３頁、２００９年７月を参照）とは異なり、開示した方法によれば、ただ１つの試料の使用が必要なだけで細胞学的解析と分子診断の両方について満足のいく結果が得られる。
【００２１】
本発明は、部分的に溶解した試料の第１の部分をスライドに載せて、異型細胞および細胞学的異常に関して観察することができ、部分的に溶解した試料の第２の部分を分子成分、たとえば子宮頸部がん等の疾患のリスクに相関することが公知の遺伝子マーカーについてスクリーニングすることができるので、たとえば子宮頸部スクリーニングのための有用な方法を提供する。分子成分は、無細胞ＤＮＡ、分解したタンパク質、ウイルス、菌類、または他の化学的マーカー等の生物学的試料中に見出され得る任意の非細胞成分であってよい。分子成分は細胞の一部、または染色体、タンパク質もしくは酵素等の細胞亜構造を含んでもよい。好ましい実施形態では、分子成分はＤＮＡまたはｍＲＮＡもしくはｒＲＮＡ等のＲＮＡ等の核酸である。
【００２２】
図１は、部分的溶解方法を使用して試料をスクリーニングするためのワークフロー１００を示す。第１のステップ１１０は、試料を得ることを含む。試料は、細胞試料または細胞を含む体液試料を含む任意の生物学的試料であってよい。試料は子宮頸部試料、口腔試料、鼻腔試料、血液試料、羊水試料、または他の生物学的材料であってよい。試料はブラシ、スパチュラ、スワブ、シリンジ、または当技術分野で公知の他の装置を用いて収集することができる。ステップ１２０において、試料をＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液等の生物学的試料保存剤と接触させ、保存された生物学的試料を生成する。生物学的試料保存剤はメタノール、エタノールもしくはイソプロパノール等のアルコール、ＴｒｉｓもしくはＰＢＳ等の緩衝液、ホルムアルデヒドを含む溶液、またはＴｗｅｅｎ−２０もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等の界面活性剤を含んでよい。生物学的試料保存剤は、保存された生物学的試料中の細胞を固定し、または別の方法で細胞ベースの解析のためにこれらを調製するのに役立ち得る。
【００２３】
ステップ１３０において、保存された生物学的試料を部分的溶解プロセスに供する。部分的溶解により、少なくとも１０％の無傷細胞を含む混合物が得られる。一部の実施形態では、混合物は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の無傷細胞を含む。部分的溶解には機械的に剪断すること、界面活性剤により溶解すること、浸透圧により溶解すること、化学的に変性すること、遠心分離すること、超音波処理すること、凍結融解すること、または当技術分野で公知の他の溶解手法が含まれてよい。機械的に剪断することは、シリンジにより剪断すること、ビーズビーティングすること、当技術分野で公知の他の手法またはそれらの任意の組合せが含まれる。いずれの溶解手法を選択した場合でも、保存された生物学的試料中の細胞の実質的に全てを溶解しないように適合される。本発明の方法は、溶解の程度を所定のレベルに制御し、それにより細胞形態学に関して観察しようとする混合物中に十分な数の全細胞を保持するステップを含む。
【００２４】
好ましい実施形態では、方法は、保存された生物学的試料中の細胞をビーズビーティングすること、即ち保存された生物学的試料をＭＯ−ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が販売しているビーズ等の多数のビーズと一緒に振盪することによって機械的に剪断するステップを含む。液体培地中で細胞とビーズとを一緒に振盪することによって細胞が溶解することは公知である。ビーズは、ガラス、セラミック、金属、ガーネットまたは当技術分野で公知の他の材料から作られてよい。ビーズの直径は０．１ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．５ｍｍ、０．７ｍｍ、１．４ｍｍ、２．３８ｍｍ、２．８ｍｍと等しいかもしくはこれより小さくてもよいし、またはこれより大きくてもよい。振盪は手動で振盪すること、オービタルシェーカーを使用すること、ボルテックスミキサーを使用すること、または当技術分野で公知の他の任意の手法を含んでよい。振盪の持続時間は１秒、２秒、５秒、１０秒、１５秒、２０秒、３０秒、４５秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分未満、またはこれより長くてよい。
【００２５】
別の実施形態では、方法は、シリンジを剪断することによって保存された生物学的試料中の細胞を部分的に溶解するステップを含む。溶液中の細胞は、図４に示すＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｒｏｂｂｉｎｓｖｉｌｌｅ、ＮＪ）製の再使用可能なステンレススチール針等のシリンジ針を通ってポンプ輸送される。針の長さは１０ｍｍ未満、２０ｍｍ未満、３０ｍｍ未満、５０ｍｍ未満、８０ｍｍ未満、１００ｍｍ未満、２００ｍｍ未満またはこれより長くてよい。針の孔径は１５２μｍ、２０３μｍ、２５４μｍ、４０６μｍ、６１０μｍ、６８６μｍまたはこれより大きくてよい。溶液中の細胞は手動で、または外部電源によって駆動されるポンプモーターを使用して針を通ってポンプ輸送され得る。シリンジは単一の一方向ストロークまたは多数回の前後のストロークによってポンプ輸送され得る。
【００２６】
部分的溶解プロセスの後、ステップ１４０において、混合物の一部を細胞ベースの解析に使用し、ステップ１５０において、混合物の別の一部を分子成分についてアッセイする。細胞ベースの解析（ステップ１４０）は、臨床医が細胞をスライドに載せて、顕微鏡下で細胞を観察することによって行なわれ得る。頸部がんについてスクリーニングする場合には、細胞を扁平上皮細胞の異常または腺細胞の異常についてスクリーニングする。その代わりに、異常を検出するために混合物をＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）イメージングシステムと組み合わせたＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）Ｐａｐ試験等の自動化イメージングマシンにかけてもよい。細胞を部分的に溶解するためにビーズビーティングを使用する実施形態では、イメージングの前にビーズを除去する必要はない。驚くべきことに、混合物中のビーズの存在はＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）プロセッサーまたはイメージャーの機能に干渉せず、スライドの目視解析にも干渉しない。ある特定の持続時間のビーズビーティングおよびシリンジによる剪断から調製したスライドは、細胞の破片または分解を殆どまたは全く示さず、細胞ベースの解析に適している。
【００２７】
ＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）システムを使用するため、使用者は細胞とＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液を含有するバイアルをＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）スライドおよびＴｒａｎｓＣｙｔ（登録商標）フィルターとともにＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）プロセッサーに入れる。イメージャーは回転によって混合物を均質化し、フィルターは穏やかな吸引の助けを借りて細胞を収集する。次いでフィルターはスライドと接触して細胞の薄層をスライドに移す。次いでスライドを固定剤と接触させ、その後、スライドを染色し、封入処理することができる。
【００２８】
細胞ベースの解析については、ＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）イメージャーはスライド上の全ての細胞および細胞のクラスターをスキャンしてＤＮＡ含量を測定する。このイメージャーはスライド上の最も大きく最も暗い核を識別し、細胞検査技師による検討のためにこれらを強調し、その解析に焦点を合わせることを補助する。イメージャーおよび細胞検査技師によるこの「二重検討」スクリーニングプロセスは、手動検討単独の場合と比べて疾患の検出を増大させることが証明されており、偽陰性を３９％減少させる（Ｈｏｗ  Ｄｕａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｉｎｐｒｅｐ．ｃｏｍ／ｈｃｐ／ｉｍａｇｉｎｇ＿ｓｙｓｔｅｍ／ｄｕａｌ＿ｒｅｖｉｅｗ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ｈｔｍｌ参照）。ある特定の持続時間のビーズビーティングおよびシリンジによる剪断から調製したスライドは、細胞の破片または分解を殆どまたは全く示さず、細胞構造の観察に適している。
【００２９】
分子成分をアッセイすること（ステップ１５０）は、混合物の全てまたは一部を遠心分離することを含んでよい。遠心分離することは１０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、６００ｇ、１０００ｇ、２０００ｇまたはそれより大きい半径方向力で実施することができる。遠心分離の持続時間は１０秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分またはそれ超でよい。ステップ１５０はスクリーニングしようとする上清のアリコートを取り出すことをさらに含んでよい。ステップ１５０は、核酸を検出すること、核酸を定量すること、核酸を識別すること、シーケンシングすること等をさらに含んでよい。
【００３０】
遺伝子スクリーニングはＨｏｌｏｇｉｃ製のＣｅｒｖｉｓｔａ（登録商標）ＨＰＶまたはＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶ等の市販のシステムによって実施することができる。Ｃｅｒｖｉｓｔａ（登録商標）ＨＰＶは、シグナル増幅および蛍光検出を使用してハイリスクのＨＰＶ株に関連する個々の塩基対の変化を検出する。Ｃｅｒｖｉｓｔａ（登録商標）ＨＰＶは、一次反応および二次反応からなる所有のＩｎｖａｄｅｒ（商標）ケミストリーを使用している。一次反応では、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）プローブはウイルスＤＮＡの標的エリアと結合し、重なり構造を生成する。次いでこの構造のフラップが所有の有するＣｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素によって切断される。このプロセスによって複数のフラップが作成され、これらが二次反応において蛍光標識された共通のヘアピン構造に結合する。二次反応では、一次反応で生成された切断されたフラップがプローブとして機能し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）カセットとしても公知のヘアピン構造の相補的配列と結合する。二次反応は切断されたフラップとＦＲＥＴカセットとの組合せを利用して蛍光ベースのシグナル増幅を生じる。次いで蛍光シグナルが蛍光光度計によって測定され、ハイリスクＨＰＶ株の存在（または非存在）が確認される。並行する反応で同時に、Ｃｅｒｖｉｓｔａ（登録商標）ＨＰＶ  ＨＲ試験のユニークな内部対照が、検査用試料の中に適切なＤＮＡが存在する場合には赤色の蛍光シグナルを生成する。緑色の蛍光シグナルはハイリスクＨＰＶタイプの存在を示す。Ｈｏｌｏｇｉｃ製のＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶシステムはｍＲＮＡを標的として１４種のハイリスクＨＰＶタイプを識別する。ＡＰＴＩＭＡシステムはｍＲＮＡ標的捕捉、標的増幅、および増幅生成物の検出を含む。類似のＡＰＴＩＭＡ試験も、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を識別してクラミジアまたは淋菌性泌尿生殖器感染症の診断を補助するために使用することができる。ＡＰＴＩＭＡアッセイに関する追加情報は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，３６５号、第６，１５０，５１７号、第７，０９４，５４１号および第７，１７２，８６３号に記載されている。
【００３１】
方法を子宮頸部スクリーニングまたは他の遺伝子スクリーニングのために使用する実施形態では、ステップ１５０は、識別された核酸を公知のマーカーのデータベースと比較して、対象が公知のマーカーを有するかどうかを決定することを追加的に含む。公知のマーカーのデータベースは、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２またはＨＰＶ−６８を含む頸部がんに関する女性のリスクを識別するために使用されるマーカーを含んでよい（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ  （ＨＰＶ），Ｃａｎｃｅｒ，ＨＰＶ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，ａｎｄ  ＨＰＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  Ａｓｋｅｄ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ（２０１３年１０月２２日））。以下に述べるものを含む他の核酸バイオマーカーを使用してもよい。以下に述べる核酸の増幅、検出およびシーケンシングの方法を、図１に示す方法の実施形態において使用してもよい。
【００３２】
図２は、部分的溶解方法を使用して試料をスクリーニングするためのワークフロー２００を示す。第１のステップ１１０は、試料を収集することを含む。試料は、細胞試料または細胞を含む体液試料を含む任意の生物学的試料であってよい。試料は子宮頸部試料、口腔試料、鼻腔試料、血液試料、羊水試料、または他の生物学的材料であってよい。試料はブラシ、スパチュラ、スワブ、シリンジ、または当技術分野で公知の他の装置を用いて収集することができる。ステップ１２０において、試料をＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液等の生物学的試料保存剤と接触させ、保存された生物学的試料を生成する。生物学的試料保存剤はメタノール、エタノールもしくはイソプロパノール等のアルコール、ＴｒｉｓもしくはＰＢＳ等の緩衝液、またはＴｗｅｅｎ−２０もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等の界面活性剤を含んでよい。生物学的試料保存剤は、保存された生物学的試料中の細胞を固定し、または別の方法で細胞ベースの解析のためにこれらを調製するのに役立ち得る。
【００３３】
ステップ１３０において、保存された生物学的試料を部分的に溶解するプロセスに供する。部分的に溶解することにより、少なくとも１０％の無傷細胞を含む混合物が得られる。一部の実施形態では、混合物は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の無傷細胞を含む。部分的に溶解することには機械的に剪断すること、界面活性剤により溶解すること、浸透圧により溶解すること、化学的に変性すること、遠心分離すること、超音波処理すること、凍結融解すること、または当技術分野で公知の他の溶解手法が含まれてよい。機械的剪断にはシリンジによる剪断、ビーズビーティング、当技術分野で公知の他の手法またはそれらの任意の組合せが含まれる。いずれの溶解手法を選択した場合でも、保存された生物学的試料中の細胞の実質的に全てを溶解しないように適合される。本開示の方法は、溶解の程度を制御し、それにより細胞形態学に関して観察しようとする混合物中に十分な数の全細胞を保持するステップを含む。
【００３４】
好ましい実施形態では、方法は、保存された生物学的試料中の細胞をビーズビーティングすること、即ち保存された生物学的試料をＭＯ−ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が販売しているビーズ等の多数のビーズと一緒に振盪することによって機械的に剪断するステップを含む。液体培地中で細胞とビーズを一緒に振盪することによって細胞が溶解することは公知である。ビーズはガラス、セラミック、金属、ガーネットまたは当技術分野で公知の他の材料から作られてよい。ビーズの直径は０．１ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．５ｍｍ、０．７ｍｍ、１．４ｍｍ、２．３８ｍｍ、２．８ｍｍと等しいもしくはこれより小さいか、またはこれより大きくてよい。振盪は手動で振盪すること、オービタルシェーカーを使用すること、ボルテックスミキサーを使用すること、または当技術分野で公知の他の任意の手法を含んでよい。振盪の持続時間は１秒、２秒、５秒、１０秒、１５秒、２０秒、３０秒、４５秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分未満、またはこれより長くてよい。
【００３５】
別の実施形態では、方法は、シリンジによる剪断によって保存された生物学的試料中の細胞を部分的に溶解するステップを含む。溶液中の細胞は、図４に示すＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｒｏｂｂｉｎｓｖｉｌｌｅ、ＮＪ）製の再使用可能なステンレススチール針等のシリンジ針を通ってポンプ輸送される。針の長さは１０ｍｍ未満、２０ｍｍ未満、３０ｍｍ未満、５０ｍｍ未満、８０ｍｍ未満、１００ｍｍ未満、２００ｍｍ未満またはこれより長くてよい。針の孔径は１５２μｍ、２０３μｍ、２５４μｍ、４０６μｍ、６１０μｍ、６８６μｍまたはこれより大きくてよい。溶液中の細胞は手動で、または外部電源によって駆動されるポンプモーターを使用して針を通ってポンプ輸送され得る。シリンジは単一の一方向ストロークまたは多数回の前後のストロークによってポンプ輸送され得る。
【００３６】
部分的溶解プロセスの後、ステップ１４０において、混合物を細胞ベースの解析に使用する。細胞ベースの解析（ステップ１４０）は臨床医が細胞をスライドに載せて、顕微鏡下で細胞を観察することによって行なわれ得る。頸部がんについてスクリーニングする場合には、細胞を扁平上皮細胞の異常または腺細胞の異常についてスクリーニングする。その代わりに、異常を検出するために混合物をＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）イメージングシステム等の自動化イメージングマシンにかけてもよい。細胞を部分的に溶解するためにビーズビーティングを使用する実施形態では、イメージングの前にビーズを除去する必要はない。驚くべきことに、混合物中のビーズの存在はＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）プロセッサーまたはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）イメージャーの機能に干渉せず、スライドの目視解析にも干渉しない。ＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）システムの詳細は上に概説される。ある特定の持続時間のビーズビーティングおよびシリンジによる剪断から調製したスライドは、細胞の破片または分解を殆どまたは全く示さず、細胞ベースの解析に適している。
【００３７】
ステップ１５０において細胞を細胞成分についてアッセイする。細胞成分をアッセイすること１５０は混合物を遠心分離することを含んでよい。遠心分離することは１０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、６００ｇ、１０００ｇ、２０００ｇまたはそれより大きい半径方向力で実施することができる。遠心分離の持続時間は１０秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分またはそれ超でよい。ステップ１５０はスクリーニングしようとする上清のアリコートを取り出すことをさらに含んでよい。ステップ１５０は、核酸を検出すること、核酸を定量すること、核酸を識別すること、シーケンシングすること等をさらに含んでよい。遺伝子スクリーニングは、その詳細を上で詳述したＨｏｌｏｇｉｃ製のＣｅｒｖｉｓｔａ（登録商標）ＨＰＶまたはＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶ等の市販のデバイスによって実施することができる。
【００３８】
方法を子宮頸部スクリーニングまたは他の遺伝子スクリーニングのために使用する実施形態では、ステップ１５０は、識別された核酸を公知のマーカーのデータベースと比較して、対象が公知のマーカーを有するかどうかを決定することを追加的に含む。公知のマーカーのデータベースは、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２またはＨＰＶ−６８を含む頸部がんに関する女性のリスクを識別するために使用されるマーカー等の、増大したがんのリスクと相関するマーカーを含んでよい（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ  （ＨＰＶ），Ｃａｎｃｅｒ，ＨＰＶ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，ａｎｄ  ＨＰＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  Ａｓｋｅｄ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ（２０１３年１０月２２日））。以下に述べるものを含む他の核酸バイオマーカーを使用してもよい。以下に述べる核酸の増幅、検出およびシーケンシングの方法を、図２に示す方法の実施形態において使用してもよい。
【００３９】
図３は、部分的溶解方法の前後において細胞計数および可視化を比較するための実験デザイン３００のフローチャートを示す。実験デザイン３００は液体培地３１０の中の口腔細胞の試料で開始する。液体培地はＰＢＳ、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液または上に述べた他の任意の培地であってよい。試料の一部を取り出し、計数または可視化する（３２０）。開示した方法とともに使用され得る細胞計数手法としては、分光光度法、血球計数法、フローサイトメトリー等が挙げられる。細胞を載せて顕微鏡下で観察することによって、またはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）システム等のイメージングシステムによって可視化することができる。試料の残りを部分的に溶解し（３３０）、部分的に溶解された混合物を生成する。混合物は溶解した細胞を含有する。溶解した細胞は細胞成分およびその断片を含む。混合物は細胞の分子成分も含有し、その中には核酸、タンパク質、オルガネラ、および他の細胞内構造物が含まれる。分子成分は生物学的試料中に存在する病原体の成分も含む。そのような病原体としては、細菌、ウイルス、酵母等が挙げられる。特に、病原体はクラミジア、淋病、トリコモナス症、およびカンジダ症を含む疾患に関連することがある。部分的溶解ステップ３３０は、上述の部分的溶解手法のいずれかを含んでもよい。部分的に溶解した混合物のアリコートを、一方で細胞計数および可視化３４０のため、他方で精製および分子解析３５０のために取り出す。細胞計数および可視化ステップ３２０の結果を細胞計数および可視化ステップ３４０の結果と比較し、部分的溶解ステップ３３０の効果を決定することができる。部分的溶解ステップ３３０は、ステップ３４０における細胞が適切な計数および可視化のためには分解されすぎている程度に、またはステップ３５０における分子解析を実施するには試料の溶解が不十分である程度に、適宜調節することが可能である。部分的溶解ステップ３３０がビーズビーティングすることを含む実施形態では、可能な調節としては、上述のようにビーズの数、ビーズのサイズ、ビーズの材料、混合もしくはボルテックスの持続時間の変更、または溶解手順に対する他の定量的もしくは定性的な変更が挙げられる。部分的溶解ステップ３３０がシリンジによる剪断を含む実施形態では、可能な調節としては、シリンジの長さもしくは直径の変更、またはシリンジを通して細胞を押し出すために加える圧力の変更が挙げられる。部分的溶解ステップ３３０が界面活性剤による溶解、浸透圧による溶解または化学的変性を含む実施形態では、可能な調節としては、試薬の濃度の変更、または試薬の置換が挙げられる。
【００４０】
図４は、シリンジによる剪断を含む機械的剪断法との使用に適したＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｒｏｂｂｉｎｓｖｉｌｌｅ、ＮＪ）製の種々の再使用可能なステンレススチール針を示す。針は長さおよび孔径が様々である。針の長さは１０ｍｍ未満、２０ｍｍ未満、３０ｍｍ未満、５０ｍｍ未満、８０ｍｍ未満、１００ｍｍ未満、２００ｍｍ未満またはこれより長くてよい。針の孔径は１５２μｍ、２０３μｍ、２５４μｍ、４０６μｍ、６１０μｍ、６８６μｍまたはこれより大きくてよい。シリンジによる剪断手法を実施するため、溶液中の細胞は手動で、または外部電源によって駆動されるポンプモーターを使用して針を通ってポンプ輸送され得る。シリンジは単一の一方向ストロークまたは多数回の前後のストロークによってポンプ輸送され得る。
【００４１】
図５は、部分的溶解ビーズビーティングプロトコールを改良するための試験を記載した試料表を示す。培養ＣａＳｋｉ細胞を使用して、濃度１００，０００細胞／ｍＬで細胞株ベースのＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）検体を作成した。それぞれ２０ｍＬの試料にガーネットビーズ（ＭＯ−ＢＩＯ  Ｐ／Ｎ  １３１２３−０５）を加え、試料を種々の混合時間でボルテクサーにかけた。ＣａＳｋｉ試料にビーズを加えない対照も調製した。この表は使用者がビーズビーティングプロトコールの最適な混合時間を決定することの助けとなる。部分的溶解方法を改良するため、プロトコールの他の条件に変更を加えた他の表を作ることもできる。たとえば、研究者はビーズの材料、ビーズのサイズ、ビーズの濃度またはビーズの体積を変更してもよい。シリンジによる剪断プロトコールを含む他の部分的溶解プロトコールのために類似の表を構築することもできる。シリンジによる剪断プロトコールを試験するための表として、変数には針の長さ、孔サイズ、ポンプの圧力および時間を含めてよい。
【００４２】
図６は、図５の実験方法による種々の持続時間のビーズビーティングの後の細胞濃度の表を示す。溶解の前後に各試料から１００μｌのアリコートを取り出し、細胞濃度を定量した。溶解前の細胞計数の平均は８４，０００細胞／ｍＬであった。溶解後の細胞計数を図６に示す。溶解時間が長くなると、細胞の破片のレベルが増大するので、細胞の計数が不可能になった。これは、一部の条件下では５分を超える混合は有用な結果をもたらさないことを示唆している。
【００４３】
図７は、図５の実験方法による種々の持続時間のビーズビーティングの後の吸光度の結果を示す。溶解後の細胞を６００ｇで５分間遠心分離し、上清０．１ｍＬを吸光度読取りのために取り出した。吸光度は混合時間とともに増大する。これは、一部の条件下では過剰な溶解は試料中の構造の可視性を低下させ得ることを示している。
【００４４】
核酸は当技術分野で公知の方法によって得られ得る。一般に核酸は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、２８０〜２８１頁（１９８２年）に記載されているもの等の種々の手法によって、部分的に溶解した試料から抽出することができる。
【００４５】
方法を子宮頸部スクリーニングまたは他の遺伝子スクリーニングのために使用する実施形態では、ステップ１５０は、識別された核酸を公知のマーカーのデータベースと比較して、対象が公知のマーカーを有するかどうかを決定することを追加的に含む。公知のマーカーのデータベースは、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２またはＨＰＶ−６８を含む頸部がんの発症に関する女性のリスクに関連するマーカー等の、がんの高いリスクに相関するマーカーを含んでよい（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ  （ＨＰＶ），Ｃａｎｃｅｒ，ＨＰＶ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，ａｎｄ  ＨＰＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  Ａｓｋｅｄ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ（２０１３年１０月２２日））。頸部がんの発症に関連するバイオマーカーは、Ｐａｔｅｌ（ＵＳ７，３００，７６５）、Ｐａｒｄｅｅら（ＵＳ７，１５３，７００）、Ｋｉｍ（ＵＳ６，９０５，８４４）、Ｒｏｂｅｒｔｓら（ＵＳ６，３１６，２０８）、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ（ＵＳ２００８／０１１３３４０）、Ｋｗｏｋら（ＵＳ２００８／００４４８２８）、Ｆｉｓｈｅｒら（ＵＳ２００５／０２６０５６６）、Ｓａｓｔｒｙら（ＵＳ２００５／００４８４６７）、Ｌａｉ（ＵＳ２００８／０３１１５７０）およびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｚｅｅら（ＵＳ２００９／００２３１３７）にも示されている。これらの論文、特許、および特許出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。頸部がんに関連する例示的なバイオマーカーとしては、ＳＣ６；ＳＩＸ１；ヒト頸部がん２プロトオンコジーン（ＨＣＣＲ−２）；ｐ２７；ウイルスオンコジーンＥ６；ウイルスオンコジーンＥ７；ｐ１６ＩＮＫ４Ａ；Ｍｃｍタンパク質（Ｍｃｍ５等）；Ｃｄｃタンパク質；トポイソメラーゼ２アルファ；ＰＣＮＡ；Ｋｉ−６７；サイクリンＥ；ｐ−５３；ＰＡＩ１；ＤＡＰ−キナーゼ；ＥＳＲ１；ＡＰＣ；ＴＩＭＰ−３；ＲＡＲ−β；ＣＡＬＣＡ；ＴＳＬＣ１；ＴＩＭＰ−２；ＤｃＲ１；ＣＵＤＲ；ＤｃＲ２；ＢＲＣＡ１；ｐ１５；ＭＳＨ２；Ｒａｓｓｆ１Ａ；ＭＬＨ１；ＭＧＭＴ；ＳＯＸ１；ＰＡＸ１；ＬＭＸ１Ａ；ＮＫＸ６−１；ＷＴ１；ＯＮＥＣＵＴ１；ＳＰＡＧ９；およびＲｂ（網膜芽細胞腫）タンパク質が挙げられる。
【００４６】
膣がんの発症に関連するバイオマーカーは、Ｇｉｏｒｄａｎｏ（ＵＳ５，８４０，５０６）、Ｋｒｕｋ（ＵＳ２００８／０００９００５）、Ｈｅｌｌｍａｎら（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ.１００巻（８号）：１３０３〜１３１４頁、２００９年）に示されている。これらの論文、特許、および特許出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。膣がんに関連する例示的なバイオマーカーとしては、ｐＲｂ２／ｐ１３０およびＢｃｌ−２が挙げられる。
【００４７】
本発明は、がんのスクリーニングに限定されない。これは種々の形質のバイオマーカーのスクリーニングにも使用できる。核酸バイオマーカーは核酸の変異に関連することが多く、これには付加、欠失、挿入、再配列、逆位、転位、トランスバージョン、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、一塩基変異多型（ＳＮＰ）、および大きな染色体配列の変化には達しない配列内の２個またはそれ超のヌクレオチドの置換が含まれる。ＳＮＰは、１個のヌクレオチドが配列内の別のヌクレオチドを置き換える際に起こるゲノムの一種の微妙な配列変化である。染色体数の変化には、付加、欠失、逆位、転座、コピー数の変動、および配列内の染色体の置換が含まれる。バイオマーカーにおけるこれらの核酸の変異も、がんの指標であり得る。
【００４８】
核酸バイオマーカーは、単一の多分析物スクリーニングアッセイにおける使用のための当技術分野で公知の任意の方法によってアッセイされ、または検出される。本発明の方法は、上述のがんの指標となる特徴のいずれか１つを探すための複数のバイオマーカーについての少なくとも１つの検出アッセイの実施を提供する。同一のシーケンシングプラットフォームまたは異なったシーケンシングプラットフォームを使用して、バイオマーカーまたは特徴の任意の組合せをアッセイすることができる。したがって、単一の多分析物スクリーニングアッセイについて種々の任意の特徴を探すために、複数のバイオマーカーについて１種超の検出手法を実施することができる。たとえば、特定のバイオマーカーの検出に特に適しているという理由で一方の検出手法を選択することもでき、特定の特徴の検出に特に適しているという理由で他方の検出手法を選択することもできる。
【００４９】
本発明における使用に適したプローブとしては、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ等の核酸、核酸アナログ、ロックされた核酸、修飾核酸から形成されたもの、ならびにペプチド核酸等の別の有機成分を有する核酸を含む混合クラスのキメラプローブが挙げられる。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよい。例示的なヌクレオチドアナログとしては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン、およびウリジンのリン酸エステルが挙げられる。非天然ヌクレオチドの他の例としては、キサンチンもしくはヒポキサンチン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、デオキシイノシン、または５−メチルシトシン等のメチル化シトシン、およびＮ４−メトキシデオキシシトシンが挙げられる。メチル化核酸、たとえば２’−Ｏ−ｍｅｔｈＲＮＡ等のポリヌクレオチド模倣体の塩基、ペプチド核酸、修飾ペプチド核酸、およびたとえばＤＮＡまたはＲＮＡ中に生じる１つまたは複数の塩基と塩基相補性を示すことによって実質的にヌクレオチドまたは塩基と同様に作用することができる任意の他の構造部分も含まれる。
【００５０】
プローブが標的の核酸および核酸リガンドとハイブリダイズすることができれば、ヌクレオチドプローブの長さは重要ではない。実際上、プローブは任意の長さでよい。たとえば、プローブは５ヌクレオチド程度と少くても、５０００ヌクレオチド程度と多くてもよい。例示的なプローブは５−マー、１０−マー、１５−マー、２０−マー、２５−マー、５０−マー、１００−マー、２００−マー、５００−マー、１０００−マー、３０００−マー、または５０００−マーである。最適なプローブ長さを決定する方法は当技術分野で公知である。たとえば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｈｕｂｅｒ、米国特許第５，８８８，７７８号を参照されたい。
【００５１】
検出のために使用されるプローブは、放射標識、蛍光標識、または酵素標識等の検出可能な標識を含んでよい。たとえば参照により本明細書に組み込まれるＬａｎｃａｓｔｅｒら、米国特許第５，８６９，７１７号を参照されたい。ある特定の実施形態では、プローブは蛍光標識される。蛍光標識されたヌクレオチドは、そのそれぞれの内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫａｍｂａｒａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、６巻：８１６〜８２１頁（１９８８年）、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１３巻：２３９９〜２４１２頁（１９８５年）、およびＳｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻；６７４〜６７９頁（１９８６年）に記載されたもの等の種々の手法によって生成することができる。蛍光染料は、化学的または酵素的手段で容易に切断されるリンカーアームによってデオキシリボースに連結され得る。そのそれぞれの内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１年）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．、１５巻：５３０５〜５３２１頁（１９８７年）；Ｓｈａｒｍａら、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．、１９巻：３０１９頁（１９９１年）；Ｇｉｕｓｔｉら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２巻：２２３〜２２７頁（１９９３年）；Ｆｕｎｇら（米国特許第４，７５７，１４１号）；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ（米国特許第４，７３９，０４４号）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３１巻、１５４３〜１５４６頁（１９９０年）；Ｓｐｒｏａｔら、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ.、１５巻：４８３７頁（１９８７年）；およびＮｅｌｓｏｎら、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ.、１７巻：７１８７〜７１９４頁（１９８９年）に示されるように、ヌクレオチドに標識を付着するための数多くのリンカーおよび方法がある。ヌクレオチドに付加し得る一般的な反応基を介した共有結合的に付着に対するフルオロフォアおよびクエンチャー分子の誘導体化については広範囲の指針が文献に存在する。Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ（上記）；Ｇｕｉｓｔｉら（上記）；Ａｇｒａｗａｌら（上記）；およびＳｐｒｏａｔら（上記）に記載されているように、フルオロフォア部分をヌクレオチドに付着させるための多くのリンク部分および方法も存在する。
【００５２】
プローブに付着する検出可能な標識は、直接的にまたは間接的に検出可能であり得る。ある特定の実施形態では、的確な標識は使用する検出方法の特定の種類に少なくとも部分的に基づいて選択され得る。例示的な検出方法としては、放射活性検出、光学吸光度検出、たとえばＵＶ−可視吸収度検出、光学発光検出、たとえば蛍光、燐光もしくは化学発光、ラマン散乱が挙げられる。好ましい標識としては、蛍光標識等の光学的に検出可能な標識が挙げられる。蛍光標識の例としては、これだけに限らないが、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体；アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；アレクサ；フルオレセイン；共役マルチ染料；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒａｎ１５１）；シアニン染料；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアネートフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロライド（ＤＮＳ、ダンシルクロライド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）；２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体；ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロライドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ａｔｔｏ染料、Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｔａブルー；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンが挙げられる。本発明では、他の光学的検出可能な標識を含む、蛍光標識以外の標識も意図されている。
【００５３】
ある特定の実施形態では、核酸はシーケンシングを使用して検出される。合成時解読（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は次世代の手順において使用される一般的な手法であり、本発明とよく協働する。しかし、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ゲルベースの手法など他のシーケンシング法も使用することができる。一般にシーケンシングには、プライマーを鋳型にハイブリダイズして鋳型／プライマーの二重鎖を形成するステップ、鋳型に依存する様式でポリメラーゼがヌクレオチドをプライマーに付加することを可能にする条件下において、検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下で二重鎖をポリメラーゼと接触させるステップが含まれる。次いで検出可能な標識からのシグナルを使用して取り込まれた塩基を識別し、ステップを逐次的に繰り返して鋳型中のヌクレオチドの線形順序を決定する。例示的な検出可能な標識としては、放射標識、蛍光標識、酵素標識等が挙げられる。特定の実施形態では、検出可能な標識は蛍光標識等の光学的に検出可能な標識であってよい。例示的な蛍光標識としては、シアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、アレクサ、または共役マルチ染料が挙げられる。配列を検出するための数多くの手法が公知であり、一部については以下に例示する。しかし、配列データを検出し、コンパイルする的確な手段は本明細書に記載する本発明の機能には影響しない。
【００５４】
好ましい実施形態では、核酸は単分子シーケンシングを使用して検出される。提供される本発明の方法において使用され得るシーケンシング技術の例はイルミナシーケンシングである。イルミナシーケンシングはフォールドバックＰＣＲおよびアンカープライマーを使用する固体表面上のＤＮＡの増幅に基づいている。ゲノムＤＮＡを断片化し、断片の５’末端および３’末端にアダプターを付加する。フローセルチャネルの表面に付着したＤＮＡ断片を伸長し、ブリッジ増幅する。断片は二本鎖になり、二本鎖分子は変性される。多サイクルの固相増幅およびそれに続く変性によって、フローセルの各チャネル内に同一鋳型の一本鎖ＤＮＡ分子の約１０００コピーのクラスターを数百万個作成することができる。逐次的なシーケンシングを実施するために、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびフルオロフォアで標識された４種の可逆的終端ヌクレオチドを使用する。ヌクレオチドの取り込みの後、レーザーを使用してフルオロフォアを励起し、画像を取り込み、第１の塩基の識別を記録する。取り込まれた各塩基から３’ターミネーターおよびフルオロフォアを除去し、取り込み、検出および識別のステップを繰り返す。
【００５５】
提供される本発明の方法における使用に適した単分子シーケンシング手法の別の例はイオントレントシーケンシングである（米国特許公開第２００９／００２６０８２号、第２００９／０１２７５８９号、第２０１０／００３５２５２号、第２０１０／０１３７１４３号、第２０１０／０１８８０７３号、第２０１０／０１９７５０７号、第２０１０／０２８２６１７号、第２０１０／０３００５５９号、第２０１０／０３００８９５号、第２０１０／０３０１３９８号、および第２０１０／０３０４９８２号）。これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。イオントレントシーケンシングでは、ＤＮＡを剪断して約３００〜８００塩基対の断片とする。断片は平滑末端である。次いで断片の末端にオリゴヌクレオチドアダプターをライゲーションする。アダプターは断片の増幅およびシーケンシングのためのプライマーとして役立つ。断片は表面に付着することができ、断片が個々に分解できるような分解能で付着される。１個または複数のヌクレオチドの付加によってプロトン（Ｈ＋）が放出され、そのシグナルはシーケンシング機器によって検出され、記録される。シグナルの強度は取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのシーケンシングプラットフォームＰｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（商標）（ＰＣＧ）とともに使用するための「Ｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ  ｖ．２．０」と題する文献等のユーザーガイドに、本発明の方法における使用に適したイオントレントプロトコールが詳細に記載されている。
【００５６】
提供される本発明の方法において使用することができるＤＮＡシーケンシング手法の別の例は４５４シーケンシング（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ、４３７巻、３７６〜３８０頁）である。４５４シーケンシングには２つのステップが含まれる。第１のステップにおいて、ＤＮＡを剪断して約３００〜８００塩基対の断片とする。断片は平滑末端である。次いで断片の末端にオリゴヌクレオチドアダプターをライゲーションする。アダプターは断片の増幅およびシーケンシングのためのプライマーとして役立つ。断片は、たとえば５’−ビオチンタグを含有するアダプターＢを使用してＤＮＡ捕捉ビーズ、たとえばストレプトアビジン被覆ビーズに付着することができる。ビーズに付着した断片は油水エマルジョンの液滴の中でＰＣＲによって増幅される。その結果、各ビーズ上にクローン増幅されたＤＮＡ断片の多数のコピーが得られる。第２のステップにおいて、ビーズを（ピコリッターサイズの）ウェルに捕捉する。各ＤＮＡ断片の上で並行してパイロシーケンシングを実施する。１個または複数のヌクレオチドの付加によって光シグナルが発生し、これがシーケンシング機器のＣＣＤカメラに記録される。シグナルの強度は取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。パイロシーケンシングはヌクレオチドの付加に際して放出されるピロホスフェート（ＰＰｉ）を使用している。ＰＰｉはアデノシン５’ホスホサルフェートの存在下にＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換される。ルシフェラーゼはＡＴＰを使用してルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、この反応によって光が発生し、これが検出され、解析される。
【００５７】
提供される本発明の方法において使用することができるＤＮＡシーケンシング手法の別の例はＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。ＳＯＬｉＤシーケンシングでは、ゲノムＤＮＡを剪断して断片とし、断片の５’末端および３’末端にアダプターを付着させて断片ライブラリーを生成する。あるいは、断片の５’末端および３’末端にアダプターをライゲーションし、断片を環状化し、環状化した断片を消化して内部アダプターを生成し、得られる断片の５’末端および３’末端にアダプターを付着させてメイトペアードライブラリーを生成することによって内部アダプターを導入することができる。次に、ビーズ、プライマー、鋳型、およびＰＣＲ成分を含有するマイクロリアクターの中でクローンビーズの集団を調製する。ＰＣＲに続いて鋳型を変性させ、ビーズを富化して伸長した鋳型を有するビーズを分離する。選択したビーズの上の鋳型を３’修飾に供し、それによりガラススライドへの結合を可能にする。部分的ランダムオリゴヌクレオチドを特定のフルオロフォアによって識別された中央の決定塩基（または塩基対）と逐次ハイブリダイゼーションおよびライゲーションすることによって、配列を決定することができる。色を記録した後、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドを切断して除去し、次いでプロセスを繰り返す。
【００５８】
提供される本発明の方法において使用することができるシーケンシング技術の別の例としては、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）技術が挙げられる。ＳＭＲＴでは、４種のＤＮＡ塩基のそれぞれが４種の異なった蛍光染料の１つに付着している。これらの染料はリン酸基で連結している。単一のＤＮＡポリメラーゼが鋳型の一本鎖ＤＮＡの単分子とともにゼロモード導波路（ＺＭＷ）の底に固定化されている。ＺＭＷは、ＺＭＷの内外に（マイクロ秒で）迅速に拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対するＤＮＡポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの取り込みを観察することを可能にする封じ込め構造である。成長するストランドにヌクレオチドを取り込むのに数ミリ秒かかる。この間に蛍光標識が励起されて蛍光シグナルが発生し、蛍光タグが切断される。対応する染料の蛍光を検出することにより、どの塩基が取り込まれたかが示される。プロセスを繰り返す。
【００５９】
提供される本発明の方法において使用することができるシーケンシング手法の別の例はナノポアシーケンシング（Ｓｏｎｉ  Ｇ  ＶおよびＭｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７年）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３巻：１９９６〜２００１頁）である。ナノポアは直径約１ナノメーターの小孔である。ナノポアを導電性流体中に浸漬し、その全体に電位を印加すると、ナノポアを通るイオンの導電によって僅かな電流が生じる。流れる電流の量はナノポアのサイズに影響されやすい。ＤＮＡ分子がナノポアを通過すると、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドが異なった程度にナノポアを閉塞する。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通過する際のナノポアを通過する電流の変化はＤＮＡ配列の読取りを表わす。
【００６０】
複雑なアッセイ、たとえば次世代シーケンシングのためのＤＮＡが不十分な場合に、試料中の核酸の量を増加させるために使用される一般的な手法は、試料中の核酸を検出するアッセイを実施する前に試料についてＰＣＲを実施することである。ＰＣＲは、クローニングまたは精製を伴わないゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増大させるためのＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）による方法を指す。標的の核酸配列および核酸リガンドを増幅させるプロセスには、核酸および核酸リガンドと結合するオリゴヌクレオチドプライマーの過剰量、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下に熱サイクリングの正確な配列を導入することが含まれる。プライマーは標的の核酸および核酸リガンドのそれぞれのストランドに相補的である。ＰＣＲプロセスによって試料中のＤＮＡが増幅され、サザンブロットまたはシーケンシング等の当技術分野で公知の標準的なアッセイによる検出のために十分な量のＤＮＡが産生される。ＰＣＲに関する他の変形としては、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖コンフォメーション多型、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、および制限断片長多型が挙げられる。
【００６１】
ＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の単一のコピーを、いくつかの異なった方法論（たとえば染色、標識されたプローブとのハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの取り込みおよびそれに続くアビジン−酵素コンジュゲート検出、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰ等の３２Ｐ−標識されたデオキシヌクレオチドトリホスフェートの増幅されたセグメントへの取り込み）によって検出可能なレベルに増幅することが可能である。本発明の一実施形態では、標的の核酸および核酸リガンドを、検出可能に標識されたプローブを使用して検出することができる。核酸プローブのデザインおよびオリゴヌクレオチドプローブの合成法は当技術分野で公知である。たとえば、これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（２００３年）またはＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８２年）を参照されたい。これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）またはＦ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）。オリゴヌクレオチドプローブを合成するための好適な方法は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：２８１〜２８５頁（１９８５年）にも記載されており、その内容は参照により組み込まれる。
【００６２】
ある実施形態では、核酸鋳型分子を基板（本明細書では表面とも称される）に付着させ、本明細書に記載したように単分子シーケンシングによる解析に供する。核酸鋳型分子を、鋳型／プライマーの二重鎖が個々に光学的に分解できるように表面に付着する。本発明における使用のための基板は二次元または三次元であってよく、平面状の表面（たとえばガラススライド）を含んでいても、成形されていてもよい。基板としては、ガラス（たとえば制御多孔質ガラス（ＣＰＧ））、石英、プラスチック（ポリスチレン（低架橋および高架橋ポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリ（メチルメタクリレート）等）、アクリルコポリマー、ポリアミド、ケイ素、金属（たとえばアルカンチオレート誘導体化金）、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲルマトリックス（たとえばシリカゲル）、ポリアクロレイン、または複合体を挙げることができる。
【００６３】
好適な三次元基板としては、たとえば球、微粒子、ビーズ、膜、スライド、プレート、微細加工したチップ、チューブ（たとえば毛細管）、マイクロウェル、微小流体デバイス、チャネル、フィルター、または核酸を固着するのに適した任意の他の構造物が挙げられる。基板には鋳型核酸もしくはプライマーの集団を含む領域を有することができる平面アレーまたはマトリックスが含まれ得る。例としては、ヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレンスライド、誘導体化磁気スライド、ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン等が挙げられる。
【００６４】
基板は好ましくは光学処理および核酸の付着を最適化するために被覆される。本発明における使用のための基板は、バックグラウンドを低減するために処理してもよい。例示的な被覆としてはエポキシド、および（たとえばオリゴヌクレオチドまたはストレプトアビジン等の結合分子によって）誘導体化されたエポキシドが挙げられる。
【００６５】
核酸分子を基板の表面に固着するまたは固定化するために種々の方法を使用することができる。固定化は表面への直接または間接結合によって達成できる。結合は共有結合的連結によるものであってよい。Ｊｏｏｓら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７巻：９６〜１０１頁、１９９７年；Ｏｒｏｓｋａｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ.４２巻：１５４７〜１５５５頁、１９９６年；およびＫｈａｎｄｊｉａｎ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ.１１巻、１０７〜１１５頁、１９８６年を参照されたい。好ましい付着は、表面上に一体化されたエポキシドへの鋳型の末端ヌクレオチドまたはプライマーの５’末端の直接アミン結合である。結合は非共有結合的連結によるものでもよい。たとえば、ビオチン−ストレプトアビジン（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２４巻：１４４３頁、１９９１年）およびジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３巻：１１２２頁、１９９２年）は、核酸を表面および平行面に固着するための一般的なツールである。あるいは、付着は疎水鎖を脂質の単層または二層に固着することによって達成できる。核酸分子を基板に付着するための当技術分野で公知の他の方法も使用することができる。
【００６６】
一部の実施形態では、シーケンシングされる複数の核酸分子を固体支持体に結合させる。核酸を固体支持体に固定化するため、捕捉配列／ユニバーサルプライミングサイトを鋳型の３’末端および／または５’末端に付加することができる。固体支持体に共有結合的に付着させた相補的配列に捕捉配列をハイブリダイズすることによって、固体支持体に核酸を結合することができる。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも称される）は、固体支持体に付着した配列に相補的な核酸配列であり、ユニバーサルプライマーとして二重に役立ち得る。一部の実施形態では、捕捉配列はポリＮｎであり、ここでＮはＵ、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣであり、ｎはたとえば２０〜７０、４０〜６０、たとえば約５０である。たとえば捕捉配列はポリＴ４０〜５０またはその相補体であってよい。捕捉配列の代替として、カップリング対（たとえば米国特許公開第２００６／０２５２０７７号に記載された、たとえば抗体／抗原対、受容体／リガンド対、またはアビジン−ビオチン対）の一方のメンバーを、そのカップリング対のそれぞれの他方のメンバーで被覆された表面に捕捉されるべき各断片に連結することができる。
【００６７】
一部の実施形態では、バーコード配列を核酸に付着する。たとえば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｔｅｉｎｍａｎら（ＰＣＴ国内出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／６４００１）を参照されたい。
【実施例】
【００６８】
図８は種々の混合時間でガーネットビーズに曝露した細胞の４０倍の視野を示す。細胞はビーズビーティングプロトコールの実施形態の試験の産物であった。培養したＣａＳｋｉ細胞（ＨＰＶ−１６、およびＨＰＶ−１８に関連する配列を含有する細胞株）を使用して濃度１００，０００細胞／ｍＬで細胞株ベースのＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）検体を作成した。２０ｍＬの試料それぞれにガーネットビーズ（ＭＯ−ＢＩＯ  Ｐ／Ｎ  １３１２３−０５）を加え、試料を種々の混合時間でプラットフォームボルテクサーにかけた。
【００６９】
スライドを調製し、核染色、リンス溶液、オレンジＧ溶液、対比染色溶液、および青色化溶液を含むＴｈｉｎＰｒｅｐ染色セットを使用して細胞を染色した。次いでスライドを封入処理し、ＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）５０００プロセッサーで処理した。
【００７０】
驚くべきことに、ガーネットビーズの存在はマシンにおけるスライドの処理に干渉せず、処理したスライドの調査および解析も阻害しなかった。ビーズがある場合もない場合も、各々、試料からは類似の処理指標が得られ、ビーズがプロセッサーの機能に干渉しないことを意味していた。同様にビーズがある場合もない場合も試料は類似のスライド細胞充実度および細胞提示を有していた。
【００７１】
長時間の混合に供した試料では、フィルターの高度の閉塞および目標とするフィルターの流量の低減を達成するために必要なパルス吸引の回数の減少があった。これはプロセッサーが試料のフィルターへの送液を止める引き金となる。この効果の結果、スライドの細胞充実度が減少した。この効果は混合時間５分またはそれ超においてのみ見られた。
【００７２】
図８の画像は、査読者が写真撮影にスライドの細胞エリアを選択したため、スライド全体の細胞充実度ではなく、細胞提示のみを表わす。細胞提示は、ガーネットビーズの存在または混合時間の結果としての顕著な細胞形態への効果はないことを示している。全ての対照および試験パラメーターの間で核の鮮明さおよび染色品質は類似している。混合時間が長くなった結果としては、スライド上の細胞の破片が僅かに多くなったのみであった。
【００７３】
実験結果から、溶解時間が長くなると、細胞計数の低下、試料中の細胞破片の目視による証明、試料の濁度の増大、溶解物の吸光度の増大、およびＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）フィルターの閉塞の増大がもたらされることが分かった。しかし溶解はＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）スライド上での細胞の移送または細胞提示の品質には影響しないようであった。
【００７４】
（参照による組み込み）
本開示全体において特許、特許出願、特許公開、雑誌、単行本、書類、ウェブコンテンツ等の他の文書への参照および引用を行なった。そのような文書の全てはあらゆる目的のため参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７５】
（等価物）
本発明の種々の改変およびさらなる多くの本発明の実施形態は、本明細書に示し記載したものに加え、本明細書で引用した科学および特許文献への参照を含めて、本文書の内容全体から、当業者には明白となろう。本明細書の主題は、本発明の種々の実施形態およびその等価物における本発明の実施のために適合することができる重要な情報、例示および指針を含んでいる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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