(57)【要約】  本発明は、外部プライマーセット、正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）と逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーの比率を異にする内部プライマーセット、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブを用いて、等温で非対称的に標的核酸を増幅し、これと同時にプローブの信号を増幅して、標的核酸を正確に検出する方法に関する。本発明によると、従来の方法であるプライマーの比率を同一にする等温プライマー及びプローブ増幅方法である対称ｉＴＰＡ方法などに比べて効率的にプローブの信号を増幅することができ、正確な病原菌の検出及び確認、規定された表現型をもたらす遺伝子変更の検出、遺伝疾患に対する感受性の診断、遺伝子発現の評価及び様々なゲノムプロジェクトに応用され、分子生物学的な研究及び病気の診断に有用である。【選択図】１【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含む標的ＤＮＡの等温増幅方法：（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基序列を有する外部プライマーセット、（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３´末端ＤＮＡ部分が相補的であり、５´末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が非常補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセット、及び（ｉｖ）前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセットの正方向プライマーと逆方向プライマーとの比率が、一方を過量に用いて非対称的に核酸が増幅されるセット、及び（ｖ）前記外部プライマーセットと混成プライマーセットによって生成される増幅産物と相補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブを含む反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素を添加した後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階を含む標的ＤＮＡの等温増幅方法及び前記増幅された信号プローブを用いることを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項２】
前記外部プライマーセットは、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、及び混成オリゴＲＮＡ／ＤＮＡで構成された群より選択される何れか一つのを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセットは、５´末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が標的ＤＮＡ序列と非常補的な塩基序列を有し、３´末端ＤＮＡ部分が標的ＤＮＡと相補的な塩基序列を有することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プローブは、前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプライマーセットのうち、過量に用いられるプライマーによって増幅された産物と相補的な塩基序列を有することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
前記正方向プライマーと逆方向プライマーの比率は、１：５から１：２０まで、あるいはその反対に構成される比率を有することを特徴とする、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プローブは、前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプライマーセットのうち、過量に用いられるプライマーによって増幅された産物と相補的な塩基序列を有することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ重合酵素は、耐熱性ＤＮＡ重合酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項８】
前記耐熱性ＤＮＡ重合酵素は、Ｂｓｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）  ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）  Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）  Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素、Ｂｃａ  ＤＮＡ重合酵素、及びパイ２９  ＤＮＡ重合酵素で構成された群より選択された何れか一つであることを特徴とする、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡ分解酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈであることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーは、３２〜６６塩基で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーは、ＤＮＡ部分の長さがそれぞれ１５〜３０塩基で構成され、ＲＮＡ部分は、長さが１〜６塩基で構成されることを特徴とする、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブは、１８〜３８塩基で構成されることを特徴とする、  請求項１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブは、ＤＮＡ部分の長さがそれぞれ８〜１６塩基で構成され、ＲＮＡ部分は、長さが１〜６塩基で構成されることを特徴とする、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブは、末端が標識物質で標識されていることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記標識物質は、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）と蛍光信号抑制物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）で構成された群より選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記等温増幅は、３０〜７５℃で行うことを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸と信号プローブの等温増幅方法及び増幅された信号プローブを用いた核酸の検出方法に関し、より詳しくは、外部プライマーセット、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセット及びＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブを用いて標的核酸と信号プローブを同時に増幅し、標的核酸を迅速に検出する方法に関する。より詳しくは、正方向のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーと逆方向のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーとの比率を異にして非対称的に核酸を増幅し、これと同時に非対称的に増幅されたＤＮＡのうち、プライマーが過量に用いられ、非対称的に過量に増幅されたＤＮＡと相補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブを用いて信号を増幅し、等温で核酸を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術は、少量の核酸を検出及び分析することにおいて非常に有用な技術である。標的核酸に対する核酸増幅技術の高い敏感性は感染性疾患及び遺伝性疾患の診断と分析のための遺伝子の分離技術及び法医学的な側面において、特定の核酸を検出する技術の発展を齎し、このような核酸の検出方法に基づいて非常に敏感な診断分析を行うことができる方法が開発されてきた（Ｂｅｌｋｕｍ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３：４９７、２００３）。核酸の検出は、ＤＮＡ本の相補性とｉｎ  ｖｉｔｒｏで単一本の核酸が二重本のハイブリッド分子を形成する能力に起因したものであって、上記の能力によって、試料から特定の核酸を検出することができる（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：２１、２００１）。
【０００３】
核酸の検出に用いられるプローブは、核酸試料に存在する標的序列と、混成化され得る特定序列と、で構成される。前記プローブは、化学物質、免疫−化学物質、蛍光または放射性同位元素によって判読される。大体、プローブは、標的核酸に対する相補的な序列を有する短い単片の核酸と、ＤＮＡハイブリダイゼーションを判読できる蛍光物質や、ビオチン及びジゴキシゲニンのような標識またはリポーター分子を含むように構成される。
【０００４】
しかし、上記のような核酸の検出方法によっては、特に、染色体ＤＮＡ上の短い序列を検出することができず、複製数が少なく、野生型遺伝子に対する変形された対立遺伝子の制限された複製数を解決することにおいて限界があった。核酸の検出方法の他の問題点として、標的序列、化学物質、またはプローブと他の分子や構造との物理的な相互作用を制限するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕの環境条件と関連がある。
【０００５】
標的核酸を検出するための方法は、３つのカテゴリーにグルーピングすることができ、標的核酸を増幅させる方法である目標核酸序列の増幅、プローブ分子の自体を増幅させるプローブ増幅、各プローブが示す信号を複合プローブまたは連結プローブ技術によって増加させる信号増幅がある。
【０００６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅技術は、少量の核酸を検出及び分析することにおいて強力な方法として用いられてきた。その中でもＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、最も幅広く用いられている核酸の増幅方法であって、相補的な序列の各らせん（ｓｔｒａｎｄ）を鋳型として使用して、プライマーによって核酸の合成が繰り返して進行されることで、相補的な序列の各らせんの複製本が合成されるのである。ＰＣＲ過程を行うためには、予めプログラムされた熱循環装備（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）が必要である。しかし、この方法は費用が高く所要され、特異性が比較的に低いと共に、結果を再現するためには遂行段階を極めて標準化しなければならないという問題がある。
【０００７】
また、その他の核酸の増幅方法であるＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、２つの隣接したオリゴヌクレオチドが標的核酸と混成化され、リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）によってライゲーションされる。これを通じて形成されたプローブ（ｐｒｏｂｅ）は相補的なヌクレオチドと共に温度サイクリング（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ）により増幅される。
【０００８】
ＬＣＲは、プライマーを用いた核酸の伸張（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）より高い識別力（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ  ｐｏｗｅｒ）を有しているため、遺伝子の点突然変異（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）においてはＰＣＲより高い対立遺伝子特異性（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示す。ＬＣＲは、今まで開発された核酸増幅技術のうち、最も高い特異性を有し、全ての識別メカニズムが最適化されているため、最も容易に行うことができる方法ではあるが、反応速度が最も遅く、多数の変形プローブを必要とする問題がある。
【０００９】
ＬＣＲのようにライゲーションを用いる方法は、ＬＣＲまたはＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の過程で隋伴されるＤＮＡ接合によって一番目に原型化されるパッドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅ）を用いてＲＣＡ方法にて増幅させることで、標的増幅ＰＣＲを遂行せずにも遺伝子型を分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）することができる（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９：ｅ１１６、２００１）。
【００１０】
ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、エンドヌクレアーゼを通じて、らせんを置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）させることで、サンプル内の標的核酸の序列及びその相補的ならせんを増幅させる方法である。この方法は核酸重合酵素（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、少なくとも一つの置換られたｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含むｄＮＴＰｓ及び標的単片（ｔａｒｇｅｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）の３´末端に対して相補的なプライマーを少なくとも一つ以上含む混合物を用いる。各プライマーは５´末端に制限エンドヌクレアーゼ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）が認知可能な序列を有している（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：１６９１、１９９２）。
【００１１】
ＳＤＡ方法と類似した方法として、ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーまたはＲＮＡプライマーを用いてプライマーを伸張させた後、鋳型ＤＮＡと混成化を成しているＲＮＡプライマーを切断するＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を用いてプライマーと鋳型ＤＮＡを切断した後、鎖置換によって新しいプライマーを伸張させる方法、５´−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３´プライマーを用いるＳＰＩＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法（米国特許登録第６，２５１，６３９号）、５´−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３´プライマーを用いるＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）方法（米国特許出願第２００５／０１２３９５０号）、ＲＮＡプライマーを用いるＲｉｂｏｐｒｉｍｅｒ方法（米国特許出願第２００４／０１８０３６１号）、外部プライマーと内部ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーを用いる方法（米国特許登録第５，８２４，５１７号）等がある。
【００１２】
ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法は、一定の温度、一定のイオンの強さ（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）及び一定のｐＨで一つのプローモーター・プライマーのみを用いて標的核酸を増幅する方法である（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１１７３、１９８９）。ＴＭＡ方法は、実質的に標的核酸で構成された混合物と、標的核酸の３´末端部位またはそれと隣接した部位と混成化させるための標的序列の３´末端部位と相補的なオリゴヌクレオチドであるプローモーター・プライマー（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）を結合させることを特徴とする。前記プローモーター・プライマーは、コンプレキシング序列（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の５´末端部位に位置したＲＮＡ重合酵素に対するプロモーター部位の序列も含む。前記プローモーター・プライマー及び標的序列は、プローモーター・プライマー／標的序列ハイブリッドを形成することでＤＮＡが伸張されるようになる。
【００１３】
前記ＴＭＡ方法のＤＮＡ伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）過程において、標的序列の３´末端は、コンプレキシング序列と標的序列との間でプローモーター・プライマーが混成化された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）に近接した位置から伸張するものと推測される。プローモーター序列は、一番目のＤＮＡ伸張生成物を生成して二重らせんプローモーター序列を形成する前記伸張過程に対する鋳型として作用するようになる。プローモーター・プライマーの３´末端は二番目のＤＮＡ伸張過程に対するプライマーとしても用いられることができる。前記伸張過程では、鋳型として標的序列を用いることで二重らせん核酸複合体が形成される。前記複合体は、ＲＮＡ標的序列が用いられた場合にはＤＮＡ／ＲＮＡ複合体になり、ＤＮＡ標的序列が用いられた場合にはＤＮＡ／ＤＮＡ複合体になる。その後、標的序列の多様なＲＮＡ複製本を生産するために、プローモーター・プライマーのプローモーターを認知するＲＮＡ重合酵素が前記一番目のＤＮＡ伸張生成物を用いてＲＮＡを合成する。
【００１４】
ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法には、単一らせんＲＮＡの合成、単一らせんＤＮＡの合成及び二重らせんＤＮＡの合成が含まれる（Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３５０：９１、１９９１）。前記単一らせんＲＮＡは、一番目のプライマーに対する一番目の鋳型になり、前記単一らせんＤＮＡは、二番目のプライマーに対する二番目の鋳型になり、前記二重らせんＤＮＡは、前記一番目の鋳型に対する複製本を合成することにおいて三番目の鋳型になる。
【００１５】
ＰＣＲなどの熱循環過程を用いる増幅方法は、各サイクルの「標的」温度に到逹するために熱循環ブロックを必要とし、熱ブロックが標的温度に到逹するまで遅延時間が必要になるので、増幅反応が完了するまで長期間を必要とする問題がある。
【００１６】
ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、及びＴＭＡなどの等温標的核酸の増幅方法は、一定の温度で核酸増幅が行われるため、別途の熱循環装置が不要であり、操作が容易であるという利点がある。しかし、今まで開示された等温標的核酸の増幅方法は、幾つかの問題を有している。ＳＤＡ方法による核酸増幅は、規定された制限酵素のための部位が存在しなければならないので、応用性が制限され、ＮＡＳＢＡ及びＴＭＡのような転写・基礎増幅方法は、プライマーによる重合酵素プローモーター序列と増幅生成物の結合が必要であり、この過程は非特異的増幅を発生させる傾向がある。このような問題があるため、これらの転写・基礎増幅方法によるＤＮＡ標的の増幅メカニズムはよく打ち立てられていない。
【００１７】
また、現在用いられている増幅方法は、その他の問題として、先行増幅反応の増幅生成物によって試験サンプルが汚染する可能性があり、これによってサンプルの非標的特異的増幅を発生させる問題がある。これを防止するために、増幅反応の最後に、または標的核酸の増幅の開始前に、試験サンプルを脱汚染する多様な手段と物理的手段を採用する試験溶液の汚染検出方法が開発されているが、これらの大半は核酸増幅操作を複雑にさせる。
【００１８】
核酸の検出のための更に他の方法として、目的核酸やプローブを増幅させるのではなく、信号を増幅させる方法がある。これらの方法のうち、標的核酸をキャプチャーするために、４つのセットのプローブを用いるｂＤＮＡ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ）増幅法がある（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．、１０１：１５９、２００２）。信号増幅を用いたハイブリッドキャプチャー方法は、標的核酸を直接的に検出して標的核酸を増幅する方法と比較できるほどの敏感性を有しており、信号検出のために抗体や化学発光物質を用いる（ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０：３５６４、２００２；Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４：４９９８、１９９６）。
【００１９】
また、信号プローブを増幅する方法として、ＣＰＴ（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）増幅方法がある（Ｄｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、９：１４２、１９９０）。前記方法は、標的核酸と相補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブを用い、標的核酸と前記プローブが混成化される場合、混成信号プローブのＲＮＡ部分がＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって切断され、切断された混成信号プローブは標的核酸と分離され、また他のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブが標的核酸と混成化され、また切断されたプローブが生成されて、結果的に、循環的に信号プローブを増幅する方法である。ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡの両末端に蛍光物質と蛍光抑制物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を標識して切断された信号プローブを検出する蛍光共鳴エネルギー転移現象（ＦＲＥＴ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を用いたプローブ検出方法（米国特許出願第２００５／０２１４８０９号）などがある。しかし、前記ＣＰＴ方法は、増幅効率が１０２〜１０４であって比較的に低いため、独立的に診断に用いることは難しく、ＰＣＲ方法などの従来の核酸増幅によって一次的に標的核酸の特定部位の量を増加させた後、別途に信号プローブを増幅するようになり、使用が複雑であり、費用が高く所要される問題がある。
【００２０】
非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲ方法は、二重らせんＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅにおいて単一ＤＮＡのみが選択的に増幅するＰＣＲの派生技術であって、塩基序列ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのための単一本ＤＮＡ鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）の合成に有用に用いられた（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９４３６、１９８８、米国特許登録第５，０６６，５８４号）。また、非対称ＰＣＲ方法は、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅを用いて対称ＰＣＲ方法に比べてアデノウイルスを検出することにおいて一層効果的であることを示している（Ｐｏｄｄａｒ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １４：２５、２０００）。また、非対称ＰＣＲ方法は、ｆａｃｔｏｒ  Ｖ遺伝子の単一塩基変異（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）のための蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）形態のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎプローブのｔｅｍｐｌａｔｅの合成に用いられた（Ｓｚｉｌｖａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８：７２７、２００５）。正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーと逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを同量に用いる一般的な対称（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲ方法は、ある程度の増幅産物が合成された後には、増幅産物間の結合が増幅産物とプライマーの結合より確率的に非常に高い。その理由は、プライマーの塩基序列の長さが増幅産物の塩基序列の長さより著しく短いためである。よって、増幅産物とプライマーの結合より増幅産物間の結合の機会が多くなり、結果的に増幅効率が低下し、窮極的には増幅が中断されるプレート（ｐｌａｔｅａｕ）段階に至るようになる（Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎ．２２：１１３０、２００２）。非対称ＰＣＲ方法は、正方向と逆方向プライマーの濃度を異にして、正方向プライマーによって合成された増幅産物と、逆方向プライマーによって合成された増幅産物との量が異なるように誘導して、増幅産物間の結合の問題点を解決する方法を提供する（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７６５２、１９８８）。正方向あるいは逆方向のうち、少量のプライマーが全部消尽されれば、過量のプライマーが線形増幅を誘導してＰＣＲの増幅効率を高める効果がある。しかし、非対称ＰＣＲが対称ＰＣＲに比べて増幅効率が高いとはいえ、その差はあまり大きくない（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１８：３、１９９３）。その理由は、ＰＣＲの場合、温度を高めるｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎの過程で増幅産物間の結合あるいは増幅産物とプライマー間の結合が再度発生するためであると解釈可能である。温度を高めてｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎの過程が省略された等温増幅の場合、非対称方法がＰＣＲに比べて一層効果的である。特に、正方向あるいは逆方向プライマーによって合成された増幅産物と結合するプローブを用いる方法の場合、非対称増幅方法は非常に効果的である。すなわち、正方向と逆方向プライマーを同量に用いる対称増幅の場合、正方向と逆方向プライマーによって合成された増幅産物間の結合と、プローブと相補的な増幅産物とプロ��ブ間の競争結合が発生する。一般的に、増幅産物の塩基序列の長さがプローブの塩基序列の長さより長いため、増幅産物とプローブとの結合による信号発生の確率より、増幅産物間の結合によって信号発生が発生しない確率が一層高い。反応初期にはプローブの濃度が増幅産物の濃度より高く、増幅産物とプローブ間の結合が優勢であるが、増幅反応が進行するにつれて増幅産物の濃度が高くなり、増幅産物間の結合が増幅産物とプローブ間の結合より優勢であり、プローブの結合による信号発生が減少し、終局には信号発生が中断される。よって、正方向あるいは逆方向プライマーによって合成された増幅産物のうち、プローブと結合する増幅産物を合成するプライマーを過量に用いれば、増幅産物間の結合よりプローブと相補的な塩基序列を有する増幅産物とプローブ間の結合を誘導して、結果的にプローブの結合による信号発生の確率を高めるため、窮極的により効率的な増幅方法になる。
【００２１】
ＰＣＲを含む核酸の増幅方法の最大の問題の一つは、非特異的増幅である。非特異的増幅は、偽陽性の結果をもたらし、診断の正確度を低下させる非常に深刻な問題点に分類される。よって、大半のプライマーはバイオ情報学を用いたコンピューターシミュレーションなどの先端技術を用いてデザインする。しかし、コンピューターシミュレーションが実際の実験結果と常に一致するわけではないので、生物情報学技術によるデザインされたプライマーでも非特異的増幅が完全に排除されない。増幅過程で過量を用いるプライマー間の結合による増幅であるｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ現象は、核酸増幅の正確度を阻害する結果をもたらす。特に、ＰＣＲプライマーに比べて相対的に長さが長いプライマーを用いる等温増幅においてその問題点は非常に大きい。このような問題点があるため、等温増幅方法の場合、多様な種類のプライマーを用いる多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）増幅がＰＣＲに比べて難しいのが事実である。しかし、非対称増幅方法を用いる場合、このような問題点は解決可能になる。すなわち、正方向あるいは逆方向プライマーのうち、何れか一つを対称増幅方法に比べて著しく低い濃度を用いることで、プライマー間の結合機会を著しく低めるため、ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ現象を減らすことができる。
【００２２】
本願の発明人の先行特許（韓国特許登録第１０−０９５７０５７号）は、同量の正方向と逆方向のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーを用いて、核酸と信号プローブを同時に等温増幅させることで標的核酸を検出する対称等温増幅方法であって、敏感度が反応当たり１００細胞数以上であるので、診断に用いるのに限界があり、非特異的反応による偽陽性の結果をもたらすという問題がある。また、本先行特許技術は、増幅のために標的ＤＮＡとプライマーセットを含む反応混合物を変性させた後、酵素反応混合液を添加しなければならないという不便な方法であるという問題がある。
【００２３】
ここで、本願の発明者は、上記のような問題を克服し、標的核酸の検出敏感度を改善して正確に増幅させる方法及び標的核酸の増幅と同時に、前記増幅産物を検出する方法を開発しようと努力した結果、標的核酸と相補的な塩基序列を有する外部プライマーセットと標的核酸と部分的に相補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセットの正方向プライマーと逆方向プライマーの比率を異にする非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）方法を利用すれば、等温で信号プローブの増幅を対称方法に比べて一層効率的に増幅し、プライマー間の結合による非特異的増幅も低めることができるということを確認し、本発明を完成するようになった。また、本発明者は、等温で目的核酸の増幅過程で別途の変性過程なしにも増幅が可能だという更に他の等温増幅方法であるＬＡＭＰ方法の先例（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５０２３、２００３）に着目して本発明に適用し、別途の変性過程なしに簡便かつ効率的に増幅できるということを確認した上で発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
結局、本発明の目的は、標的核酸と信号プローブを等温で迅速かつ正確に増幅する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、等温で標的核酸及びプローブ信号の増幅を同時に行うことを特徴とする標的核酸の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記の目的を達成するために、本発明は、（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基序列を有する外部プライマーセット、（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３´末端ＤＮＡ部分が相補的であり、５´末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が非常補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセット、及び（ｉｖ）前記外部プライマーセットと混成プライマーセットによって生成される増幅産物と相補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブを含む反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素を含む酵素反応混合液を添加した後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階を含む標的ＤＮＡの等温増幅方法及び前記増幅された信号プローブを用いることを特徴とする、標的ＤＮＡの検出方法を提供する。前記反応混合物に用いられるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセットの正方向プライマーと逆方向プライマーとの比率は、一方を過量に用いて非対称的に単一本の核酸が増幅されることを含む。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、標的核酸を等温で迅速かつ正確に増幅する方法及び等温で標的核酸の増幅及び信号プローブの増幅を同時に行う核酸の検出方法を提供する効果を有する。本発明によれば、従来の方法であるＰＣＲ方法などに比べて簡便であり、汚染の危険性がなく、迅速かつ正確に標的核酸を増幅することができ、信号プローブを同時に増幅することができるため、病源菌の検出及び確認、規定された表現型をもたらす遺伝子変更の検出、遺伝疾患や疾患に対する感受性の診断、遺伝子発現の評価及び多様なゲノムプロジェクトに応用されるので、分子生物学的な研究及び疾病の診断に有用である。また、非対称等温増幅方法であって、従来の対称等温増幅方法に比べて敏感度と特異度が改善されており、より正確な診断が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係る標的ＤＮＡの等温増幅方法を図式的に示す図である。
【図２】本発明に係る標的ＤＮＡと信号プローブの等温増幅方法を図式的に示す図である。
【図３】本発明に係る対称等温増幅方法と非対称等温増幅方法との差異を図式的に示す図である。
【図４】結核菌をターゲットにして、本発明に係る対称等温増幅方法と非対称等温増幅方法によって生成された蛍光信号（Ｄｅｌｔａ  Ｒｎ）をリアルタイム蛍光検出装備で測定した結果を示す図である。
【図５】クラミジア菌をターゲットにして、本発明に係る対称等温増幅方法と非対称等温増幅方法によって生成された蛍光信号（Ｄｅｌｔａ  Ｒｎ）をリアルタイム蛍光検出装備で測定した結果を示す図である。
【図６】淋菌をターゲットにして、本発明に係る対称等温増幅方法と非対称等温増幅方法によって生成された蛍光信号（Ｄｅｌｔａ  Ｒｎ）をリアルタイム蛍光検出装備で測定した結果を示す図である。
【図７】リステリア菌をターゲットにして、本発明に係る対称等温増幅方法と非対称等温増幅方法によって生成された蛍光信号（Ｄｅｌｔａ  Ｒｎ）をリアルタイム蛍光検出装備で測定した結果を示す図である。
【図８】サルモネラ菌をターゲットにして、本発明に係る対称等温増幅方法と非対称等温増幅方法によって生成された蛍光信号（Ｄｅｌｔａ  Ｒｎ）をリアルタイム蛍光検出装備で測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、一観点から、（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基序列を有する外部プライマーセット、（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３´末端ＤＮＡ部分が相補的であり、５´末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が非常補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセット、及び（ｉｖ）前記外部プライマーセットと混成プライマーセットによって生成される増幅産物と相補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブを含む反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素を含む酵素反応混合液を添加した後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階を含む標的ＤＮＡの等温増幅方法及び前記増幅された信号プローブを用いることを特徴とする、標的ＤＮＡの検出方法を提供する。前記反応混合物に用いられるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセットの正方向プライマーと逆方向プライマーとの比率は、一方を過量に用いて非対称的に単一本の核酸が増幅されることを含む。
【００２９】
図１に示すように、本発明に係る標的ＤＮＡの等温増幅は、下記の過程にて行われ得る。
【００３０】
まず、増幅を行う鋳型になる標的ＤＮＡ、外部プライマーセット、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセット及びＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プローブの混合物に、ＤＮＡ重合酵素とＲＮＡ分解酵素が含まれた酵素反応溶液を混合させた後、増幅させる。この際、反応液内で標的ＤＮＡに前記外部プライマーセットと前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセットがアニーリングされる。前記外部プライマーセットは、混成プライマーセットより標的ＤＮＡの両末端側に近い序列と相補的な序列を含んでいることが好ましく、混成プライマーセットは、外部プライマーより標的ＤＮＡの中心に近い序列を含んでいることが好ましく、この場合、混成プライマーは外部プライマーよりＤＮＡ鎖の伸張方向の先方にアニーリングされる。アニーリングされた外部プライマーと混成プライマーは鎖置換能力があるＤＮＡ重合酵素によって伸張され、外部プライマーが標的ＤＮＡに従って伸張されることによって、伸張方向の先方に位置している混成プライマーから伸張されたＤＮＡ鎖が標的ＤＮＡから離れることで鎖置換が発生され、最終的に、混成プライマーから伸張された単一らせんＤＮＡ増幅産物と外部プライマーから伸張された二重らせんＤＮＡ増幅産物が得られる。
【００３１】
前記増幅産物である単一らせんＤＮＡを鋳型にして外部プライマーと混成プライマーがアニーリングされる。アニーリングされた外部プライマーと混成プライマーは、鎖置換能力があるＤＮＡ重合酵素によって伸張され、外部プライマーが単一らせんＤＮＡに従って伸張されることによって、伸張方向の先方に位置している混成プライマーから伸張されたＤＮＡ鎖が単一らせんＤＮＡから離れることで鎖置換が発生され、最終的に、混成プライマーから伸張された新しい単一らせんＤＮＡ増幅産物と外部プライマーから伸張された二重らせんＤＮＡ増幅産物が得られる。前記増幅された単一らせんＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーがアニーリングされ、伸張されてＲＮＡを含む二重らせんＤＮＡ増幅産物が得られる。二重らせんＤＮＡのＲＮＡ部分はＲＮａｓｅ  Ｈによって分解され、伸張、鎖置換によって単一らせんＤＮＡが生成される。前記単一らせんＤＮＡを鋳型にして、プライマーのアニーリング、伸張、鎖置換、ＲＮＡ切断の過程が繰り返されることで標的ＤＮＡが増幅される（図１）。
【００３２】
図２に示すように、本発明の一実施例による信号プローブの増幅は、前記核酸等温増幅と同時に行われる。前記標的ＤＮＡの等温増幅を通じて増幅されたＤＮＡがＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブとアニーリングされてＲＮＡ／ＤＮＡ混成二重らせんが形成されれば、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性によってＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブのＲＮＡ部分が切断され、切断された信号プローブは標的ＤＮＡから分離して離れ、新しいＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブが結合され、ＲＮａｓｅ  Ｈによって切断、分離されるサイクルが繰り返されることで、信号プローブが増幅されるようになる（図２）。
【００３３】
図３に示すように、本発明の一実施例による混成プライマーセットのうち、正方向の混成プライマーと逆方向の混成プライマーとの比率を異にして、過量のプライマーが一方向の増幅産物を生成し、過量に増幅された一方向のＤＮＡと相補的な塩基序列を有する信号プローブと結合する機会を高め、結果的に非対称等温増幅方法が対称等温増幅方法に比べて信号プローブの増幅機会を高める。特に、プライマーによって増幅された増幅産物の長さがプローブの長さより長いため、対称的な増幅方法の場合、増幅産物間の結合が増幅産物とプローブ間の結合より確率的に高く、プローブ増幅の効率性が低下するのに対し、非対称方法は過量に増幅された増幅産物とプローブ間の結合を効果的に誘導することができ、プローブの増幅効率を高めるので、結果的に標的ＤＮＡの検出敏感度が大きく改善される。
【００３４】
図４から図６の結果から分かるように、従来の対称等温増幅方法に比べて、非対称等温増幅方法は敏感度が改善されることが分かる。
【００３５】
図７から図８の結果から分かるように、従来の対称等温増幅方法に比べて、非対称等温増幅方法は特異度が改善されることが分かる。
【００３６】
本発明で用いられる外部プライマーセットは、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ及び混成オリゴＲＮＡ／ＤＮＡで構成された群より選択される何れか一つを用いることができ、標的核酸序列に相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）であり、１５〜３０塩基を有することが好ましい。また、前記外部プライマーと相補的な標的ＤＮＡ序列は、混成プライマーと相補的な標的ＤＮＡ序列と隣接した序列（１〜６０ｂｐの差）であることが好ましく、外部プライマーと相補的な標的ＤＮＡ序列は、混成プライマーと相補的なＤＮＡ序列より標的ＤＮＡ序列の３´末端側に近い序列であることが好ましい。
【００３７】
本発明で用いられるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセットは、５´末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が標的ＤＮＡ序列と非常補的な塩基序列を有し、３´末端ＤＮＡ部分が標的ＤＮＡと相補的な塩基序列を有することを特徴とする。前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーは、３２〜６６塩基で構成されることが好ましく、この際、ＤＮＡ部分の長さがそれぞれ１５〜３０塩基で構成され、ＲＮＡ部分は長さが１〜６塩基で構成されることが好ましい。
【００３８】
本発明において、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーと相補的な標的ＤＮＡの序列は、外部プライマーと相補的な標的ＤＮＡの序列より３´末端の方に位置した序列を含んでいることが好ましく、混成プライマーと相補的な標的ＤＮＡ序列は、外部プライマーと相補的な標的ＤＮＡ序列と隣接した序列（１〜６０ｂｐの差）であることが好ましい。
【００３９】
本発明で用いられるＤＮＡ重合酵素は、ＤＮＡ鋳型に従って核酸プライマーを確張できる酵素であって、置換された本が結合されるポリヌクレオチドから核酸本を切替することができなければならない。本発明で用いられ得るＤＮＡ重合酵素は、耐熱性ＤＮＡ重合酵素であることが好ましく、耐熱性ＤＮＡ重合酵素として、Ｂｓｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）  ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）  Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）  Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素、Ｂｃａ  ＤＮＡ重合酵素、パイ２９  ＤＮＡ重合酵素などが挙げられる。
【００４０】
本発明で用いられるＲＮＡ分解酵素は、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成体のＲＮＡ本を切断するのに特異的であり、単一本のＲＮＡは分解しないことが好ましく、より好ましくはＲＮａｓｅ  Ｈを用いることが好ましい。
【００４１】
本発明で用いられるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブは、前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセットのうち、正方向あるいは逆方向プライマーのうち、過量に用いられたプライマーによって増幅される核酸増幅産物と相補的な塩基序列を有するオリゴヌクレオチドであることが好ましく、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブの５´末端と３´末端はオリゴＤＮＡで構成され、中間部分はオリゴＲＮＡで構成されることが好ましい。
【００４２】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブは、１８〜３８塩基で構成されることが好ましく、５´末端及び３末端のＤＮＡ部分はそれぞれ８〜１６塩基で構成されることが好ましく、中間に位置したＲＮＡ部分は１〜６塩基で構成されることが好ましい。
【００４３】
また、前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブは、末端が標識物質で標識されていることを特徴とすることができ、前記標識物質には蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）と蛍光信号抑制物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）などを用いることができる。
【００４４】
本発明で用いられる混成プライマーセットのうち、正方向プライマーと逆方向プライマーとの濃度の比率は１：５から１：２０、あるいは５：１から２０：１に用いられ、より好ましくは、１：１０あるいは１０：１に用いられることができる。過量に用いられた混成プライマーは、混成プローブとの相補的な塩基序列を有している。
【００４５】
本発明において、前記等温増幅は、本発明のプライマーと鋳型ＤＮＡがアニーリングされることができ、用いられる酵素の活性を実質的に抑制しない温度で行われることが好ましい。本発明において、増幅反応が行われる温度は、好ましくは３０〜７５℃が好ましく、より好ましくは、３７〜７０℃が好ましく、５０〜６５℃であることが最も好ましい。
【００４６】
本発明に係る核酸の等温増幅方法は、追加の外部プライマーを用いるので、単一ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーを用いる従来の方法（米国特許登録第６，２５１，６３９号）に比べて、その特異性が高いと共に、外部プライマーによって置換された内部プライマーが新しい鋳型として作用し、幾何級数的に増幅されることで、増幅の効率を画期的に改善するのが可能である。また、従来の方法が単一ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーを用いて標的塩基序列増幅の際、一定の部位を増幅するために増幅を遮断する別途の遮断機（ｂｌｏｃｋｅｒ）または鋳型スィッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を用いるのに対し、本発明は、正方向プライマーと逆方向プライマーとの対を用いて別途の遮断機または鋳型スィッチオリゴヌクレオチドを使わずに、願望の部位のみをきれいに増幅することができる利点がある。
【００４７】
また、増幅されたＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブが結合して分離されるサイクルを繰り返して信号プローブを増幅させることができるため、核酸増幅と信号プローブ増幅が同時に単一段階（ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ）で行われ、核酸増幅と信号プローブ増幅を同時に行うことができ、従来の技術であるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーを用いて核酸のみを増幅する技術（米国特許登録第５，８２４，５１７号）あるいはＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブのみを増幅する技術（米国特許出願第２００５／０２１４８０９号）に比べて核酸と信号プローブを同時に増幅する利点がある。
【００４８】
本発明に係る核酸の等温増幅方法は、従来の棟梁の正方向プライマーと逆方向プライマーを用いる対称的な等温核酸及び信号プローブ増幅方法に比べて、正方向プライマーと逆方向プライマーとの比率を異にする非対称的に過量に増幅されたＤＮＡを提供し、これと相補的な塩基序列を有する信号プローブがアニーリングされる機会を高め、効果的に信号プローブを増幅し、結果的に核酸の検出の敏感度と特異度が改善される。
【００４９】
さらに、本発明は、用いられるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーのうち、５´末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が鋳型と非常補的な塩基序列を有しており、単一ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーを用いる従来の方法で、ＲＮＡ分解酵素の反応活性がＤＮＡ重合酵素のプライマー拡張活性より高い場合に発生する問題点を考慮する必要がないという利点がある。
【００５０】
また、本発明に係るＤＮＡの等温増幅方法は、最初のプライマー拡張との鎖置換反応の後、新たに合成された増幅産物が新しい鋳型として用いられる場合、鋳型と非常補的なＲＮＡ部位がプライマーと相補的な鋳型として作用し、プライマーとの結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）温度を上昇させることで、増幅効率を増加させると共に、プライマーダイマー（ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ）の形成を防止し、増幅産物の純度を高めることができる。
【００５１】
本発明の核酸の等温増幅方法は、試料のＤＮＡ抽出から完全な増幅まで約１時間が所要され、試料ＤＮＡの抽出が行われていれば約４０分が所要されるので、非常に速かに増幅反応を行うことができる利点がある。
【００５２】
本発明は、他の観点から、（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基序列を有する外部プライマーセット、（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３´末端ＤＮＡ部分が相補的であり、５´末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が非常補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマーセット、及び（ｉｖ）前記外部プライマーセットと混成プライマーセットによって生成される増幅産物と相補的な塩基序列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブを含む反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素を含む酵素反応混合液を添加した後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階を含む標的ＤＮＡの等温増幅方法及び前記増幅された信号プローブを用いることを特徴とする、標的ＤＮＡの検出方法を提供する。前記反応混合物に用いられる混成プライマーセットのうち、正方向プライマーと逆方向プライマーとの比率は、一方を過量に用いて非対称的に単一本の核酸が増幅されることを含む。
【００５３】
本発明の方法により増幅された信号プローブは、蛍光検出器を用いて別途の後処理過程なしに反応チューブから直接的に蛍光信号を検出することができる。この際、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プローブは末端がそれぞれ蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）と蛍光信号抑制物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が標識されており、プローブが切断する前には蛍光エネルギーが蛍光信号抑制物質に転移され、蛍光信号の放出が抑制され、プローブが切断した後には、蛍光信号の転移が発生しないＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）形態の信号プローブである。
【００５４】
本発明に係る核酸の等温増幅方法及び核酸の検出方法は、一定の温度で反応を行うワンステップ（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）核酸及び信号プローブ等温増幅であり、特別な熱変換装置を必要としないため、迅速かつ簡便に標的核酸を増幅することができ、増幅過程で２対のプライマーセットとプローブを用いることで、従来の方法に比べて、標的核酸のみを正確に増幅できると共に、信号プローブまで増幅できる利点があり、増幅過程で正方向の混成プライマーと逆方向の混成プライマーとの比率を異にする非対称核酸及び信号プローブ方法であって、従来の方法に比べて、増幅されたＤＮＡ鋳型と信号プローブのアニーリング機会を高め、結果的に、敏感度と特異度が改善される利点がある。また、本発明に係る核酸の等温増幅方法及び核酸の検出方法は、等温の一つのチューブ（ｏｎｅ−ｔｕｂｅ）内で行われるので、核酸のリアルタイムの検出のための大量処理が可能であるという利点がある。このような利点は、増幅技術の広範囲な使用を制限していた汚染による付加反応が発生する危険を最小化することができる。
【００５５】
以下、実施例を通じて、本発明についてより詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を持った者にとって自明である。
【００５６】
実施例１：結核ＤＮＡの等温増幅
標的ＤＮＡとして、商業的に販売している結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを定量希釈して、等温増幅反応の鋳型として用いた。（Ｖｉｒｃｅｌｌ、Ｓｐａｉｎ）
【００５７】
外部プライマー（序列番号１及び序列番号２）は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＳ６１１０塩基序列に相補的な序列を含むように設計しており、序列番号１（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号２（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである。
【００５８】
序列番号１：５´−ＣＧＡＴＣＧＡＧＣＡＡＧＣＣＡ−３´
【００５９】
序列番号２：５´−ＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＡ−３´
【００６０】
ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマー（序列番号３及び序列番号４）は５´末端オリゴＤＮＡ−ＲＮＡ部分はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＳ６１１０塩基序列に非常補的な序列を有し、３´末端オリゴＤＮＡ部分はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＳ６１１０塩基序列に相補的な序列を有するように設計しており、序列番号３（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号４（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【００６１】
序列番号３：５´−ＣＧＡＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＧＴＡＣＴＣＧＡＣＣＴＧＡ−３´
【００６２】
序列番号４：５´−ＣＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＡＧＧＴＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴ−３´
【００６３】
信号プローブ増幅を行うためのＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブ（序列番号５）は、前記プライマーセットによって増幅されたＤＮＡに相補的な塩基序列を有し、５´末端がＦＡＭ  ｄｙｅに、３´末端がＤＡＢＣＹＬ  ｑｕｅｎｃｈｅｒに標識されており、序列番号５（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【００６４】
序列番号５：５´−ＦＡＭ−ＡＴＣＣＧＴＡＵＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴＴＣＡ−ＤＡＢＣＹＬ−３´
【００６５】
前記外部プライマーセットと混成プライマーセットを用いて標的核酸を増幅するために、まず、前記外部プライマーセット、混成プライマーセットを含む反応混合物と酵素混合物を用意した。前記反応混合物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファーに１０ｍＭ（ＮＨ４）３ＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．６ｍＭｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、１．６ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ  ＢＳＡ、０．６ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ、１００ｍＭ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、０．１１μＭの外部プライマーセット（ＩＤＴ）、１．１μＭの混成プライマーセット（ＩＤＴ）（非対称等温増幅の場合、２．２μＭの正方向の混成プライマー（ｓｅｎｓｅ）及び０．２２μＭの逆方向の混成プライマー（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ））を添加して製造した。前記酵素混合物は、１  ｕｎｉｔ  Ｂｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、６  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、６  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＮＥＢ）、５０ｎＭの混成信号プローブ（ＩＤＴ）を添加して製造した。
【００６６】
０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブに前記反応混合物５μｌ、酵素混合物５μｌ、濃度を異にする鋳型ＤＮＡ１０μｌを常温で添加し、６１℃で１．５時間の等温増幅を行った。一方、陰性対照群として蒸溜水１０ｍｌを用いた。増幅反応は等温増幅蛍光検出装備（シンコ、大韓民国）を用いて反応温度を６１℃にセッティングし、１分ごとに蛍光信号を取得するようにセッティングした。
【００６７】
その結果、図４に示すように、非対称等温増幅方法が対称等温増幅方法に比べて検出能力が優れていることが分かった。
【００６８】
実施例２：クラミジアＤＮＡの等温増幅
標的ＤＮＡとして、クラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを用いた。クラミジア菌のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出するために、クラミジア菌株（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＲ−８８７）からＧ−ｓｐｉｎＴＭ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７１２１）を用いてｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出した後、増幅反応を実施した。Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ抽出は、菌懸濁液５００μｌを１３，０００ｒｐｍで１分間原審分離して上層液を取り除き、５００μｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で若干交ぜて原審分離して上層液を取り除いた後、ＲＮａｓｅ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋが添加されたＧ−ｂｕｆｆｅｒ溶液３００μｌを添加してｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔを懸濁させ、６５℃で１５分間停置した。次に、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ２５０μｌを入れてよく混合した後、ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにＤＮＡを結合させた。５００ｍｌのｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａを添加した後、１３０００ｒｐｍで１分間原審分離して取り除き、ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ５００ｍｌを添加して原審分離した。１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅにｃｏｌｕｍｎを移して５０μｌのｅｌｅｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを添加した後、１分間原審分離して１５．８ｎｇ／ｍｌのｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを得た。これを一定量希釈して等温増幅反応の鋳型として用いた。
【００６９】
外部プライマー（序列番号６及び序列番号７）はＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ塩基序列に相補的な序列を含むように設計しており、序列番号６（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号７（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである。
【００７０】
序列番号６：５´−ＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣＧＴＴＣＣＧ−３´
【００７１】
序列番号７：５´−ＣＡＧＴＴＡＴＡＧＧＴＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＣ−３´
【００７２】
ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマー（序列番号８及び序列番号９）は、５´末端オリゴＤＮＡ−ＲＮＡ部分はＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡに非常補的な序列を有し、３´末端オリゴＤＮＡ部分はＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ塩基序列に相補的な序列を有するように設計しており、序列番号８（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号９（逆方向  ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【００７３】
序列番号８：５´−ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＡＴＡ−３´  
【００７４】
序列番号９：５´−ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＡＴＡＣＴＣＡＧ−３´
【００７５】
信号プローブ増幅を行うためのＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブ（序列番号５）は前記プライマーセットによって増幅されたＤＮＡに相補的な塩基序列を有し、５´末端がＦＡＭ  ｄｙｅに、３´末端がＢＨＱ１  ｑｕｅｎｃｈｅｒに標識されており、序列番号１０（ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【００７６】
序列番号１０：５´−ＦＡＭ−ＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＵＧＡＵＡＵＴＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴ−ＢＨＱ１−３´
【００７７】
前記外部プライマーセットと混成プライマーセットを用いて標的核酸を増幅するために、まず、前記外部プライマーセット、混成プライマーセットを含む反応混合物と酵素混合物を用意した。前記反応混合物は、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファーに１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ  ＢＳＡ、０．１５ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ、２０ｍＭ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、０．２μＭの外部プライマーセット（ＩＤＴ）、１μＭの混成プライマーセット（ＩＤＴ）（非対称等温増幅の場合、０．４μＭの正方向の混成プライマー（ｓｅｎｓｅ）及び２μＭの逆方向の混成プライマー（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ））を添加して製造した。前記酵素混合物は、３  ｕｎｉｔｓ  Ｂｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、８  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、６  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＮＥＢ）、５０ｎＭの混成信号プローブ（ＩＤＴ）を添加して製造した。
【００７８】
０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブに前記反応混合物５μｌ、酵素混合物５μｌ、濃度を異にする鋳型ＤＮＡ１０μｌを常温で添加し、６１℃で１．５時間の等温増幅を行った。一方、陰性対照群として蒸溜水１０ｍｌを用いた。増幅反応は等温増幅蛍光検出装備（シンコ、大韓民国）を用いて反応温度を６１℃にセッティングし、１分ごとに蛍光信号を取得するようにセッティングした。
【００７９】
その結果、図５に示すように、非対称等温増幅方法が対称等温増幅方法に比べて検出能力が優れていることが分かった。
【００８０】
実施例３：淋菌ＤＮＡの等温増幅
標的ＤＮＡとして、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｓｅ）  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを用いた。淋菌のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出するために淋菌菌株（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４９２２６）からＧ−ｓｐｉｎＴＭ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７１２１）を用いてｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出した後、増幅反応を実施した。Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ抽出は、菌懸濁液５００μｌを１３，０００ｒｐｍで１分間原審分離して上層液を取り除き、５００μｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で若干交ぜて原審分離して上層液を取り除いた後、ＲＮａｓｅ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋが添加されたＧ−ｂｕｆｆｅｒ溶液３００μｌを添加してｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔを懸濁させ、６５℃で１５分間停置した。次に、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２５０μｌを入れてよく混合した後、ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにＤＮＡを結合させた。５００μｌのｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａを添加した後、１３０００ｒｐｍで１分間原審分離して取り除き、ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ５００μｌを添加して原審分離した。１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅにｃｏｌｕｍｎを移して５０μｌの  ｅｌｅｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを添加した後、１分間原審分離して４．７ｎｇ／ｍｌのｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを得た。これを一定量希釈して等温増幅反応の鋳型として用いた。
【００８１】
外部プライマー（序列番号１１及び序列番号１２）はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｓｅ  ｏｐａ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に相補的な序列を含むように設計しており、序列番号１１（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号１２（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである。
【００８２】
序列番号１１：５´−ＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＴＡＴＴＧＴＧ−３´
【００８３】
序列番号１２：５´−ＴＴＴＣＧＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴ−３´  
【００８４】
ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマー（序列番号１３及び序列番号１４）は５´末端オリゴＤＮＡ−ＲＮＡ部分はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｓｅ  ｏｐａ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に非常補的な序列を含むように設計しており、３´末端オリゴＤＮＡ部分はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｓｅ  ｏｐａ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に相補的な序列を含むように設計しており、序列番号１３（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号１４（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【００８５】
序列番号１３：５´−ＧＣＡＴＡＧＣＴＣＡＡＧＴＡＴＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡ−３´
【００８６】
序列番号１４：５´−ＣＴＡＴＣＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＣＧＡＣＣＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧ−３´  
【００８７】
信号プローブ増幅を行うためのＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブ（序列番号１５）は、前記プライマーセットによって増幅されたＤＮＡに相補的な塩基序列を有し、５´末端がＦＡＭ  ｄｙｅに、３´末端がＤＡＢＣＹＬ  ｑｕｅｎｃｈｅｒに標識されており、序列番号１５（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【００８８】
序列番号１５：５´−ＦＡＭ−ＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＡＴＴＡＴＡＴＣＧＧＤＡＢＣＹＬ−３´  
【００８９】
前記外部プライマーセットと混成プライマーセットを用いて標的核酸を増幅するために、まず、前記外部プライマーセット、混成プライマーセットを含む反応混合物と酵素混合物を用意した。前記反応混合物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファーに１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．６ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ  ＢＳＡ、０．４ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ、２０ｍＭ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、０．１μＭの外部プライマーセット（ＩＤＴ）、１μＭの混成プライマーセット（ＩＤＴ）（非対称等温増幅の場合、４．４μＭの正方向の混成プライマー（ｓｅｎｓｅ）及び０．４４μＭの逆方向の混成プライマー（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ））を添加して製造した。前記酵素混合物は、５  ｕｎｉｔｓ  Ｂｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、５  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、６  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＮＥＢ）、３０ｎＭ混成信号プローブ（ＩＤＴ）を添加して製造した。
【００９０】
０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブに前記反応混合物５μｌ、酵素混合物５μｌ、濃度を異にする鋳型ＤＮＡ１０μｌを常温で添加し、６１℃で１．５時間の等温増幅を行った。一方、陰性対照群として蒸溜水１０μｌを用いた。増幅反応は等温増幅蛍光検出装備（シンコ、大韓民国）を用いて反応温度を６１℃にセッティングし、１分ごとに蛍光信号を取得するようにセッティングした。
【００９１】
その結果、図６に示すように、非対称等温増幅方法が対称等温増幅方法に比べて検出能力が優れていることが分かった。
【００９２】
実施例４：リステリアＤＮＡの等温増幅
標的ＤＮＡとして、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ）  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを用いた。リステリア菌のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出するために、リステリア菌株（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３５１５２）からＧ−ｓｐｉｎＴＭ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７１２１）を用いてｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出した後、増幅反応を実施した。Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ抽出は、菌懸濁液５００μｌを１３，０００ｒｐｍで１分間原審分離して上層液を取り除き、５００μｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で若干交ぜて原審分離して上層液を取り除いた後、ＲＮａｓｅ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋが添加されたＧ−ｂｕｆｆｅｒ溶液３００μｌを添加してｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔを懸濁させ、６５℃で１５分間停置した。次に、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２５０ｍｌを入れてよく混合した後、ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにＤＮＡを結合させた。５００μｌのｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａを添加した後、１３０００ｒｐｍで１分間原審分離して取り除き、ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ５００μｌを添加して原審分離した。１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅにｃｏｌｕｍｎを移して５０μｌのｅｌｅｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを添加した後、１分間原審分離して８．４ｎｇ／ｍｌのｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを得た。これを一定量希釈して等温増幅反応の鋳型として用いた。
【００９３】
外部プライマー（序列番号１６及び序列番号１７）はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ  ａｃｔＡ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に相補的な序列を含むように設計しており、序列番号１６（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号１７（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである。
【００９４】
序列番号１６：５´−ＴＧＣＧＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴ−３´
【００９５】
序列番号１７：５´−ＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴ−３´
【００９６】
ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマー（序列番号１８及び序列番号１９）は５´末端オリゴＤＮＡ−ＲＮＡ部分はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ  ａｃｔＡ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に非常補的な序列を含むように設計しており、３´末端オリゴＤＮＡ部分はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ  ａｃｔＡ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に相補的な序列を含むように設計しており、序列番号１８（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号１９（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【００９７】
序列番号１８：５´−ＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＵＵＡＴＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＴＡＡＣＣＣＣＧＡＣ−３´
【００９８】
序列番号１９：５´−ＣＴＧＴＣＡＴＴＣＡＴＡＧＴＣＴＣＧＴＣＵＡＣＵＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＡ−３´
【００９９】
信号プローブ増幅を行うためのＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブ（序列番号２０）は前記プライマーセットによって増幅されたＤＮＡに相補的な塩基序列を有し、５´末端がＦＡＭ  ｄｙｅに、３´末端がｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １（ＢＨＱ１）に標識されており、序列番号２０（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【０１００】
序列番号２０：５´−ＦＡＭ−ＡＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＢＨＱ１−３´
【０１０１】
前記外部プライマーセットと混成プライマーセットを用いて標的核酸を増幅するために、まず、前記外部プライマーセット、混成プライマーセットを含む反応混合物と酵素混合物を用意した。前記反応混合物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファーに１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、６ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ  ＢＳＡ、０．８ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ、０．１μＭの外部プライマーセット（ＩＤＴ）、１μＭの混成プライマーセット（ＩＤＴ）（非対称等温増幅の場合、０．０１μＭの正方向の外部プライマー（ｓｅｎｓｅ）、０．１μＭの正方向の混成プライマー（ｓｅｎｓｅ）及び０．１μＭの逆方向の外部プライマー（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）、１μＭの逆方向の混成プライマー（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）を添加して製造した。前記酵素混合物は、３  ｕｎｉｔｓ  Ｂｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、６  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、６  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＮＥＢ）、１５ｎＭの混成信号プローブ（ＩＤＴ）を添加して製造した。
【０１０２】
０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブに前記反応混合物５μｌ、酵素混合物５μｌ、濃度を異にする鋳型ＤＮＡ１０μｌを常温で添加し、６１℃で１．５時間の等温増幅を行った。一方、特異度を測定するための菌株は、黄色葡萄状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：Ｋｏｒｅａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ（ＫＣＴＣ）  １９２７）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、ＫＣＴＣ  １９２５）、膓炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、ＡＴＣＣ  １７８０２）、バシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、ＡＴＣＣ  ４９９５３）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、ＫＣＴＣ  ２５１７）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７；ＡＴＣＣ  ３５１５０）をリステリア菌ＤＮＡ抽出方法と同じ方法で抽出したＤＮＡ１０ｍｌを用いた。増幅反応は等温増幅蛍光検出装備（シンコ、大韓民国）を用いて反応温度を６１℃にセッティングし、１分ごとに蛍光信号を取得するようにセッティングした。
【０１０３】
その結果、図７に示すように、非対称等温増幅方法が対称等温増幅方法に比べて特異度が優れていることが分かった。
【０１０４】
実施例５：サルモネラＤＮＡの等温増幅
標的ＤＮＡとして、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを用いた。サルモネラ菌のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出するために、サルモネラ菌株（ＫＣＴＣ  １９２５）からＧ−ｓｐｉｎＴＭ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７１２１）を用いてｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出した後、増幅反応を行った。Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ抽出は、菌懸濁液５００μｌを１３，０００ｒｐｍで１分間原審分離して上層液を取り除き、５００μｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で若干交ぜて原審分離して上層液を取り除いた後、ＲＮａｓｅ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋが添加されたＧ−ｂｕｆｆｅｒ溶液３００μｌを添加してｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔを懸濁させ、６５℃で１５分間停置した。次に、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２５０μｌを入れてよく混合した後、ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにＤＮＡを結合させた。５００ｍｌのｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａを添加した後、１３０００ｒｐｍで１分間原審分離して取り除き、ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ５００μｌを添加して原審分離した。１．５ｍｌ  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅにｃｏｌｕｍｎを移し、５０μｌの  ｅｌｅｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを添加した後、１分間原審分離して６．７ｎｇ／ｍｌのｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを得た。これを一定量希釈して等温増幅反応の鋳型として用いた。
【０１０５】
外部プライマー（序列番号１６及び序列番号１７）はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｉｎｖＡ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に相補的な序列を含むように設計しており、序列番号２１（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号２２（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである。
【０１０６】
序列番号２１：５´−ＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＣ−３´
【０１０７】
序列番号２２：５´−ＣＴＧＡＧＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＡＧＡＡＣＧＡ−３´
【０１０８】
ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成プライマー（序列番号２３及び序列番号２４）は５´末端オリゴＤＮＡ−ＲＮＡ部分はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｉｎｖＡ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に非常補的な序列を含むように設計しており、３´末端オリゴＤＮＡ部分はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｉｎｖＡ遺伝子ＤＮＡ塩基序列に相補的な序列を含むように設計しており、序列番号２３（正方向、ｓｅｎｓｅ）及び序列番号２４（逆方向、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【０１０９】
序列番号２３：５´−ＡＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＡＣＣ−３´
【０１１０】
序列番号２４：５´−ＡＴＣＧＣＡＧＡＴＴＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＡＧＴＡ−３´
【０１１１】
信号プローブ増幅を行うためのＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ混成信号プローブ（序列番号２０）は前記プライマーセットによって増幅されたＤＮＡに相補的な塩基序列を有し、５´末端がＦＡＭ  ｄｙｅに、３´末端がｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １（ＢＨＱ１）に標識されており、序列番号２５（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）は次のようである（オリゴＲＮＡ部分は下線を引いて表示している）。
【０１１２】
序列番号２５：５´−ＦＡＭ−ＴＣＡＧＴＧＣＧＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＡＢＨＱ１−３´
【０１１３】
前記外部プライマーセットと混成プライマーセットを用いて標的核酸を増幅するために、まず、前記外部プライマーセット、混成プライマーセットを含む反応混合物と酵素混合物を用意した。前記反応混合物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）バッファーに１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、６ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μｇ  ＢＳＡ、０．７５ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ、０．０７５μＭの外部プライマーセット（ＩＤＴ）、１．１２５μＭの混成プライマーセット（ＩＤＴ）（非対称等温増幅の場合、０．０７５μＭの正方向の外部プライマー（ｓｅｎｓｅ）、２．２５μＭの正方向の混成プライマー（ｓｅｎｓｅ）及び０．０７５μＭの逆方向の外部プライマー（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）、０．２２５μＭの逆方向の混成プライマー（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）を添加して製造した。前記酵素混合物は、３  ｕｎｉｔｓ  Ｂｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）、６  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、６  ｕｎｉｔｓ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＮＥＢ）、２５ｎＭ混成信号プローブ（ＩＤＴ）を添加して製造した。
【０１１４】
０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブに前記反応混合物５μｌ、酵素混合物５μｌ、濃度を異にする鋳型ＤＮＡ１０μｌを常温で添加し、６１℃で１．５時間の等温増幅を行った。一方、特異度を測定するための菌株は、黄色葡萄状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：Ｋｏｒｅａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ（ＫＣＴＣ）  １９２７）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ：ＡＴＣＣ  ５１５２）、膓炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、ＡＴＣＣ  １７８０２）、バシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、ＡＴＣＣ  ４９９５３）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、ＫＣＴＣ  ２５１７）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７；ＡＴＣＣ  ３５１５０）をリステリア菌ＤＮＡ抽出方法と同じ方法で抽出したＤＮＡ１０ｍｌを用いた。増幅反応は等温増幅蛍光検出装備（シンコ、大韓民国）を用いて反応温度を６１℃にセッティングし、１分ごとに蛍光信号を取得するようにセッティングした。
【０１１５】
その結果、図８に示すように、非対称等温増幅方法が対称等温増幅方法に比べて特異度が優れていることが分かった。
【０１１６】
以上のように、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を持った者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されるわけではことは明白である。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項と、それらの等価物によって定義されるはずである。
【図１】
2017501737.tif 000002
【図２】
2017501737.tif 000003
【図３】
2017501737.tif 000004
【図４】
2017501737.tif 000005
【図５】
2017501737.tif 000006
【図６】
2017501737.tif 000007
【図７】
2017501737.tif 000008
【図８】
2017501737.tif 000009
【国際調査報告】
2017501737.tif 000010
2017501737.tif 000011
2017501737.tif 000012
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