(57)【要約】本発明は、RSPOアンタゴニストおよびLGRアンタゴニスト、ならびに線維性疾患を治療または予防するためにRSPOアンタゴニストおよびLGRアンタゴニストを使用する方法に関する。本発明は、治療的有効量のRPSOアンタゴニストおよび/またはLGRアンタゴニスト、例えば、抗RSPO抗体、抗LGR抗体、または可溶性LGR受容体を対象に投与する工程を含む、対象における線維性疾患を治療するための方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載のLGR結合物質のいずれかを含む治療的有効量のLGR結合物質を対象に投与する工程を含む、対象における線維性疾患を治療または予防する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量のヒトR-スポンジン(RSPO)アンタゴニストまたはLGRアンタゴニストを対象に投与する工程を含む、対象における線維性疾患を治療または予防する方法。
【請求項２】
RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストが抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、ヒトRSPO3、ヒトRSPO2、ヒトRSPO1、またはヒトRSPO4からなる群より選択される少なくとも1種類のRSPOタンパク質に特異的に結合する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がRSPO3に特異的に結合し、かつ
(a)
DYSIH(SEQ ID NO:37)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000131
を含む重鎖CDR2、および
TYFANNFD(SEQ ID NO:39)
を含む重鎖CDR3、ならびに
2017528523.tif 000132
を含む軽鎖CDR1、
AASNLES(SEQ ID NO:42)
を含む軽鎖CDR2、および
2017528523.tif 000133
を含む軽鎖CDR3；
(b)
SEQ ID NO:46と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:47と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；または
(c)
SEQ ID NO:46の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:47の軽鎖可変領域
を含む、請求項2または請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がRSPO2に特異的に結合し、かつ
(a)
SSYAMS(SEQ ID NO:21)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000134
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000135
を含む重鎖CDR3、ならびに
2017528523.tif 000136
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:25)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTP(SEQ ID NO:26)
を含む軽鎖CDR3；
(b)
SEQ ID NO:27と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:28もしくはSEQ ID NO:66と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；または
(c)SEQ ID NO:27の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:28もしくはSEQ ID NO:66の軽鎖可変領域
を含む、請求項2または請求項3記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がRSPO1に特異的に結合し、かつ
(a)
TGYTMH(SEQ ID NO:5)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000137
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000138
を含む重鎖CDR3、ならびに
2017528523.tif 000139
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:9)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)
を含む軽鎖CDR3；
(b)
SEQ ID NO:11と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:12と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、もしくはSEQ ID NO:56と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:57と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域；または
(c)
SEQ ID NO:11の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:12の軽鎖可変領域、もしくはSEQ ID NO:56の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:57の軽鎖可変領域
を含む、請求項2または請求項3記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質に特異的に結合する、請求項2記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、LGR4、LGR5、およびLGR6からなる群より選択される少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質に特異的に結合する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、または抗原結合部位を含む抗体断片である、請求項2〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストが、ヒトLGRタンパク質の細胞外ドメインを含む可溶性受容体であり、該細胞外ドメインがヒトRSPOタンパク質に結合することができる、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ヒトLGRタンパク質がLGR5である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ヒトLGRタンパク質の細胞外ドメインがヒトLGR5のアミノ酸22〜564(SEQ ID NO:74)を含む、請求項10または請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶性受容体が非LGRポリペプチドを含む、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
非LGRポリペプチドがヒトFc領域を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
非LGRポリペプチドがSEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、またはSEQ ID NO:80を含む、請求項13または請求項14記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも1種類のさらなる治療剤の投与を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
さらなる治療剤が第2の抗体または抗炎症剤である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
線維性疾患が、肺線維症、腎線維症、肝線維症、皮膚線維症、心臓線維症、および癒着からなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
皮膚線維症が、強皮症、全身性硬化症、強皮症様疾患、皮膚硬化のない強皮症(sine scleroderma)、ケロイド形成、または肥厚性瘢痕である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
腎線維症が慢性腎疾患である、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2014年9月16日に出願された米国特許仮出願第62/051,026号の優先権恩典を主張する。米国特許仮出願第62/051,026号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、概して、RSPO、特に、ヒトRSPO1、RSPO2、およびRSPO3に結合する抗体および他の作用物質を含むが、これに限定されないRSPOアンタゴニストおよびLGRアンタゴニスト、ならびに線維性疾患を治療するためにRSPOアンタゴニストおよび/またはLGRアンタゴニストを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
線維症は、先進国世界における死亡のほぼ45％に直接的または間接的に寄与すると見積もられている。線維性疾患は、生理学的組織構造を破壊する細胞外マトリックス成分が過剰に蓄積し、これにより患部臓器が機能不全になることを特徴とする。ある場合では、線維症は慢性的な組織過敏または慢性炎症の結果だと考えられている。ある場合では、線維症は体内での自己免疫反応の結果であると考えられている。強皮症、肺線維症、および肝臓の硬変などの線維性疾患では、徐々に進行する実質組織から細胞外マトリックス成分への置き換わりが観察される。しかしながら、線維カスケードを維持する細胞性因子および分子性因子はまだ十分に理解されていない。
【０００４】
Wntシグナル伝達が、いくつかのヒト線維性疾患に結び付けられている。いくつかのタイプの線維性疾患における活性化されたWntシグナル伝達は、β-カテニンの蓄積、Wnt1およびWnt10BなどのWnt経路リガンドのアップレギュレーション、ならびにDkk1などの負のWnt経路制御因子のダウンレギュレーションによって特定され得る(Akhmetshina et al., 2012, Nature Communications, 3:735（非特許文献1）; Guo et al., 2012, Physiol. Res., 61:337-346（非特許文献2）)。Wntシグナル伝達経路は、胚パターン形成、後胚期の組織維持、および幹細胞生物学のいくつかの重大な制御因子の1つである。正常な発生および/または組織修復を制御するホメオスタシス機構に襲いかかることで病態形成が進行すし得る多くのヒト疾患と、無秩序なWnt経路活性化が結び付けられている。
【０００５】
WntリガンドとR-スポンジン(RSPO)タンパク質は協力して古典的Wnt経路を活性化することが示されている。RSPOタンパク質は、Wntシグナル伝達に似たβ-カテニンシグナル伝達を活性化することが分かっている。しかしながら、RSPOタンパク質とWntシグナル伝達との関係は今なお調べられている。RSPOタンパク質はWntリガンドに対して正の調節活性を有すると報告されている(Nam et al., 2006, JBC 281:13247-57（非特許文献3）)。この研究からまた、RSPOタンパク質はFrizzled8およびLRP6受容体リガンドとして機能し、β-カテニンシグナル伝達を誘導する可能性があることも報告された(Nam et al., 2006, JBC 281:13247-57（非特許文献3）)。最近の研究から、RSPOタンパク質とLGR(leucine-rich repeat containing, G protein-coupler receptor)タンパク質、例えば、LGR5は相互作用することが突き止められており(米国特許出願公開第2009/0074782号（特許文献1）および同第2009/0191205号（特許文献2）)、これらのデータから、β-カテニンシグナル伝達が活性化するための代替経路が示された。
【０００６】
R-スポンジン(RSPO)タンパク質ファミリーは脊椎動物間で保存されており、4種類のメンバー、RSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4を含む。これらのタンパク質は、上衣板特異的スポンジン、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、クリスチン(Cristin)1-4、およびフトリン(Futrin)1-4を含む様々な名前で呼ばれてきた。RSPOは、全体的に見て約40〜60％の配列相同性とドメイン構成を共有する小さな分泌タンパク質である。RSPOタンパク質は全て、N末端に2個のフューリン様システインリッチドメインと、その後に続くトロンボスポンジンドメインと塩基性の荷電したC末端テールを含有する(Kim et al., 2006, Cell Cycle, 5:23-26（非特許文献4）)。
【０００７】
研究から、RSPOタンパク質は脊椎動物発生中に(Kamata et al., 2004, Biochim. Biophys Acta, 1676:51-62（非特許文献5）)、およびゼノパス属(Xenopus)筋形成において(Kazanskaya et al., 2004, Dev. Cell, 7:525-534（非特許文献6）)役割を有することが分かっている。RSPO1はまた胃腸上皮細胞に対する強力なマイトジェンとして機能することも分かっている(Kim et al., 2005, Science, 309:1256-1259（非特許文献7）)。RSPO3はゼノパス属およびマウスでは内皮細胞およびその細胞前駆体の中で、またはそのすぐ近くで顕著に発現している。さらに、RSPO3は胚形成において血管新生因子として働く可能性があることが示唆されている(Kazanskaya et al., 2008, Development, 135:3655-3664（非特許文献8）)。
【０００８】
線維性疾患と診断された患者に対する薬物療法選択肢は非常に限られている。線維症、および線維症に関与するシグナル伝達経路を標的とする新たな剤が必要とされている。従って、線維症に関与するシグナル伝達経路を破壊する生体分子、例えば、RSPO結合物質は、新たな治療剤の可能性のある供給源である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第2009/0074782号
【特許文献２】米国特許出願公開第2009/0191205号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Akhmetshina et al., 2012, Nature Communications, 3:735
【非特許文献２】Guo et al., 2012, Physiol. Res., 61:337-346
【非特許文献３】Nam et al., 2006, JBC 281:13247-57
【非特許文献４】Kim et al., 2006, Cell Cycle, 5:23-26
【非特許文献５】Kamata et al., 2004, Biochim. Biophys Acta, 1676:51-62
【非特許文献６】Kazanskaya et al., 2004, Dev. Cell, 7:525-534
【非特許文献７】Kim et al., 2005, Science, 309:1256-1259
【非特許文献８】Kazanskaya et al., 2008, Development, 135:3655-3664
【発明の概要】
【００１１】
発明の簡単な概要
本発明は、治療的有効量のRPSOアンタゴニストおよび/またはLGRアンタゴニスト、例えば、抗RSPO抗体、抗LGR抗体、または可溶性LGR受容体を対象に投与する工程を含む、対象において線維性疾患を治療するための方法を提供する。
【００１２】
一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストには、少なくとも1種類のRSPOタンパク質またはLGRタンパク質に結合する抗体および他のポリペプチド、少なくとも1種類のRSPOタンパク質またはLGRタンパク質に結合する低分子、ならびに可溶性LGRタンパク質が含まれるが、これに限定されない。RSPOタンパク質(例えば、ヒトタンパク質)はRSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4の1つでもよい。LGRタンパク質はLGR4、LGR5、またはLGR6でもよい。
【００１３】
一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストはRSPO結合物質である。一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストはLGR結合物質である。一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストは抗体である。一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストは抗RSPO抗体である。一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストは抗LGR抗体である。一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストは可溶性受容体である。一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストはLGR-Fc可溶性受容体である。一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストはLGR5-Fc可溶性受容体である。
【００１４】
一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストは、少なくとも1種類のRSPOタンパク質またはその一部に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、前記抗体は、RSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4からなる群より選択される少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質に特異的に結合する。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載のRSPO結合物質のいずれかを含む、治療的有効量のRSPO結合物質を対象に投与する工程を含む、対象における線維性疾患を治療または予防する方法を提供する。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPOタンパク質に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO2に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO3に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO4に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトRSPO1に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトRSPO2に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトRSPO3に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトRSPO1に特異的に結合する抗体と、治療的有効量の、ヒトRSPO2に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトRSPO1に特異的に結合する抗体と、治療的有効量の、ヒトRSPO3に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトRSPO2に特異的に結合する抗体と、治療的有効量の、ヒトRSPO3に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。
【００１６】
一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPOタンパク質に特異的に結合する可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1に特異的に結合する可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO2に特異的に結合する可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO3に特異的に結合する可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、LGR4、LGR5、もしくはLGR6の細胞外ドメインまたはその断片を含む可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、LGR5の細胞外ドメインまたはその断片を含む可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、LGR5のアミノ酸22〜564を含む可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、LGR5のアミノ酸22〜264の断片を含む可溶性受容体である。一部の態様において、可溶性受容体は非LGRポリペプチドを含む。一部の態様において、非LGRポリペプチドはLGRタンパク質の細胞外ドメインに直接連結される。一部の態様において、非LGRポリペプチドはリンカーによってLGRタンパク質の細胞外ドメインに連結される。一部の態様において、非LGRポリペプチドはヒトFc領域である。一部の態様において、非LGRポリペプチドは、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、およびSEQ ID NO:80からなる群より選択されるヒトFc領域である。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に記載のLGR結合物質のいずれかを含む、治療的有効量のLGR結合物質を対象に投与する工程を含む、対象における線維性疾患を治療または予防する方法も提供する。一部の態様において、LGR結合物質は、ヒトLGRタンパク質に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、LGR結合物質は、ヒトLGR4に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、LGR結合物質は、ヒトLGR5に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、LGR結合物質は、ヒトLGR6に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトLGR4に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトLGR5に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象における線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の、ヒトLGR6に特異的に結合する抗体を対象に投与する工程を含む。
【００１８】
前記方法の一部の態様において、線維性疾患は、肺線維症、腎線維症、肝線維症、皮膚線維症、心臓線維症、および癒着形成からなる群より選択される。一部の態様において、線維性疾患は皮膚線維症である。一部の態様において、皮膚線維症には、強皮症、全身性硬化症、強皮症様疾患、皮膚硬化のない強皮症(sine scleroderma)、ケロイド形成、および肥厚性瘢痕が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、線維性疾患は腎線維症である。一部の態様において、腎線維症には慢性腎疾患が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、線維性疾患は肺線維症である。一部の態様において、肺線維症には、特発性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、縦隔線維症、および胸膜線維症が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、肺線維症は原発性肺線維症である。一部の態様において、肺線維症は続発性肺線維症である。一部の態様において、線維性疾患は肝線維症である。一部の態様において、肝線維症には肝臓の硬変が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、線維性疾患は心臓線維症である。一部の態様において、心臓線維症には、心筋線維症、心臓弁線維症、心内膜心筋線維症、およびアテローム性動脈硬化症が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、線維性疾患は肺線維症でない。一部の態様において、線維性疾患は肝線維症でない。一部の態様において、心臓線維症はアテローム性動脈硬化症でない。
【００１９】
一部の態様において、前記方法は、少なくとも1種類のさらなる治療剤の投与を含む。一部の態様において、さらなる治療剤は第2の抗体である。一部の態様において、さらなる治療剤は抗炎症剤である。
【００２０】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質(例えば、抗体)が、抗体89M5のCDR(本明細書の表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む、方法を提供する。
【００２１】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、
(a)
TGYTMH(SEQ ID NO:5)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000002
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000003
を含む重鎖CDR3;ならびに
(b)
2017528523.tif 000004
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:9)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)
を含む軽鎖CDR3を含む、方法を提供する。
【００２２】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:56と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:57と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:11を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:12を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:56を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:57を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２３】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、SEQ ID NO:13もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:13もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:14を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:16を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:14を含む重鎖およびSEQ ID NO:16を含む軽鎖を含む。一部の態様において、抗RSPO1抗体はh89M5-H8L5である。
【００２４】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、SEQ ID NO:58もしくはSEQ ID NO:59と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:60もしくはSEQ ID NO:61と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:58もしくはSEQ ID NO:59と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:60もしくはSEQ ID NO:61と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:59を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:61を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:59を含む重鎖およびSEQ ID NO:61を含む軽鎖を含む。一部の態様において、抗RSPO1抗体はh89M5-H2L2である。
【００２５】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質(例えば、抗体)が、抗体130M23のCDR(本明細書の表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む、方法を提供する。
【００２６】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、
(a)
SSYAMS(SEQ ID NO:21)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000005
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000006
を含む重鎖CDR3;ならびに
(b)
2017528523.tif 000007
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:25)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTP(SEQ ID NO:26)
を含む軽鎖CDR3を含む、方法を提供する。
【００２７】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、SEQ ID NO:27と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:66と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:28を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:66を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:32と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:32と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:30を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:32を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:30を含む重鎖およびSEQ ID NO:32を含む軽鎖を含む。一部の態様において、抗RSPO2抗体はh130M23-H1L6である。
【００２９】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:67もしくはSEQ ID NO:68と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:67もしくはSEQ ID NO:68と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:30を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:68を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:30を含む重鎖およびSEQ ID NO:68を含む軽鎖を含む。一部の態様において、抗RSPO2抗体はh130M23-H1L2である。
【００３０】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO3結合物質(例えば、抗体)が、抗体131R011のCDR(本明細書の表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む、方法を提供する。
【００３１】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO3結合物質が、
(a)
DYSIH(SEQ ID NO:37)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000008
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000009
を含む重鎖CDR3;ならびに
(b)
2017528523.tif 000010
を含む軽鎖CDR1、
2017528523.tif 000011
を含む軽鎖CDR2、および
2017528523.tif 000012
を含む軽鎖CDR3を含む、方法を提供する。
【００３２】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO3結合物質が、SEQ ID NO:46と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:47と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:46を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:47を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３３】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO3結合物質が、SEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:49と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:50もしくはSEQ ID NO:51と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:49と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO:50もしくはSEQ ID NO:51と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:49を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:51を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:49を含む重鎖およびSEQ ID NO:51を含む軽鎖を含む。一部の態様において、抗RSPO3抗体は131R010である。
【００３４】
一部の態様において、RSPO結合物質はモノクローナル抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は組換え抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質はキメラ抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質はヒト化抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質はヒト抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質はIgG1抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質はIgG2抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は二重特異性抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は一価抗体である。
【００３５】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、方法は、ヒトRSPO1と本発明の抗RSPO1抗体との特異的結合において競合するRSPO1結合物質を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、ヒトRSPO1と、SEQ ID NO:11を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:12を含む軽鎖可変領域を含む抗体との特異的結合において競合する。一部の態様において、RSPO1結合物質は、ヒトRSPO1と、SEQ ID NO:56を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:57を含む軽鎖可変領域を含む抗体との特異的結合において競合する。一部の態様において、RSPO1結合物質が競合する抗体は、抗体89M5のCDRを含む抗体である。一部の態様において、RSPO1結合物質は、インビトロ競合的結合アッセイにおいてRSPO1と本発明の抗RSPO1抗体との特異的結合において競合する。
【００３６】
ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、RSPO1上にある、本発明の抗RSPO1抗体(例えば、89M5、h89M5-H8L5、またはh89M5-H2L2)と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する抗体である。一部の態様において、RSPO1結合物質は、本発明の抗RSPO1抗体(例えば、89M5、h89M5-H8L5、またはh89M5-H2L2)が結合するRSPO1上にあるエピトープと重複する、RSPO1上にあるエピトープに結合する抗体である。
【００３７】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、方法は、ヒトRSPO2と本発明の抗RSPO2抗体との特異的結合において競合するRSPO2結合物質を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、ヒトRSPO2と、SEQ ID NO:27を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:28を含む軽鎖可変領域を含む抗体との特異的結合において競合する。一部の態様において、RSPO2結合物質は、ヒトRSPO2と、SEQ ID NO:27を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:66を含む軽鎖可変領域を含む抗体との特異的結合において競合する。一部の態様において、RSPO2結合物質が競合する抗体は、抗体130M23のCDRを含む抗体である。一部の態様において、RSPO2結合物質は、インビトロ競合的結合アッセイにおいてRSPO2と本発明の抗RSPO2抗体との特異的結合において競合する。
【００３８】
ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、RSPO2上にある、本発明の抗RSPO2抗体(例えば、130M23、h130M23-H1L6、またはh130M23-H1L2)と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する抗体である。一部の態様において、RSPO2結合物質は、本発明の抗RSPO2抗体(例えば、130M23、h130M23-H1L6、h130M23-H1L2)が結合するRSPO2上にあるエピトープと重複する、RSPO2上にあるエピトープに結合する抗体である。
【００３９】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、方法は、ヒトRSPO3と本発明の抗RSPO3抗体との特異的結合において競合するRSPO3結合物質を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、ヒトRSPO3と、SEQ ID NO:46を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:47を含む軽鎖可変領域を含む抗体との特異的結合において競合する。一部の態様において、RSPO3結合物質が競合する抗体は、抗体131R010のCDRを含む抗体である。一部の態様において、RSPO3結合物質は、インビトロ競合的結合アッセイにおいてRSPO3と本発明の抗RSPO3抗体との特異的結合において競合する。
【００４０】
ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、RSPO3上にある、本発明の抗RSPO3抗体(例えば、131R010)と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する抗体である。一部の態様において、RSPO3結合物質は、本発明の抗RSPO3抗体(例えば、131R010)が結合するRSPO3上にあるエピトープと重複する、RSPO3上にあるエピトープに結合する抗体である。
【００４１】
本明細書に記載の任意の方法のある特定の態様において、RSPO結合物質または抗体は単離される。一部の態様において、RSPO結合物質または抗体は実質的に純粋である。
【００４２】
一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストは、少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質またはその一部に特異的に結合する抗体である。一部の態様において、前記抗体は、LGR4、LGR5、およびLGR6からなる群より選択される少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質に特異的に結合する。一部の態様において、前記抗体はヒトLGR5に特異的に結合する。ある特定の態様において、前記抗体は、(a)ATCC寄託番号PTA-9342を有する88M1ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列;ならびに(b)ATCC寄託番号PTA-9342を有する88M1ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む。一部の態様において、前記抗体は、ATCC寄託番号PTA-9342を有する88M1ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００４３】
一部の態様において、RSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストは、ヒトLGRタンパク質(例えば、LGR5)の細胞外ドメインまたはその断片を含む可溶性受容体であり、該細胞外ドメインはヒトRSPOタンパク質に結合することができる。一部の態様において、ヒトLGRタンパク質の細胞外ドメインは、ヒトLGR5のアミノ酸22〜564(SEQ ID NO:74)を含む。一部の態様において、可溶性受容体は非LGRポリペプチドを含む。一部の態様において、非LGRポリペプチドはヒトLGRタンパク質の細胞外ドメインに直接連結されるか、またはリンカーによってヒトLGRタンパク質の細胞外ドメインに接続される。一部の態様において、非LGRポリペプチドはヒトFc領域を含む(例えば、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、もしくはSEQ ID NO:80、またはSEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、もしくはSEQ ID NO:80と少なくとも80％、85％、90％、95％、もしくは99％同一のアミノ酸配列を含む)。
【００４４】
別の局面において、本発明は、細胞におけるWntシグナル伝達を阻害する方法であって、細胞を、本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質をそれぞれ含む、有効量のRSPO結合物質またはLGR結合物質と接触させる工程を含む、方法を提供する。一部の態様において、前記細胞は高レベルの少なくとも1種類のRSPOタンパク質を発現する。一部の態様において、前記細胞は高レベルのRSPO1を発現する。一部の態様において、前記細胞は高レベルのRSPO2を発現する。一部の態様において、前記細胞は高レベルのRSPO3を発現する。一部の態様において、前記細胞は高レベルの少なくとも1種類のRSPOタンパク質を発現する。一部の態様において、前記細胞は高レベルのRSPO1を発現する。一部の態様において、前記細胞は高レベルのRSPO2を発現する。一部の態様において、前記細胞は高レベルのRSPO3を発現する。ある特定の態様において、RSPO結合物質は線維組織の形成を阻害する。ある特定の態様において、LGR結合物質は線維組織の形成を阻害する。
【００４５】
本明細書に記載の任意の方法のある特定の態様において、前記方法は、細胞における少なくとも1種類のRSPOタンパク質の発現レベルを確かめる工程をさらに含む。一部の態様において、前記細胞は線維組織に由来する。
【００４６】
本明細書に記載の任意の方法のある特定の態様において、前記方法は、RSPO結合物質および少なくとも1種類のさらなる治療剤を対象に投与する工程を含む。本明細書に記載の任意の方法のある特定の態様において、前記方法は、LGR結合物質および少なくとも1種類のさらなる治療剤を対象に投与する工程を含む。
【００４７】
本明細書に記載のRSPO結合物質(例えば、抗体もしくは可溶性受容体)またはLGR結合物質を含む組成物が提供される。本明細書に記載のRSPO結合物質(例えば、抗体もしくは可溶性受容体)またはLGR結合物質、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。RSPO結合物質またはLGR結合物質を含む、有効量の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、対象(例えば、ヒト)における線維性疾患を治療する方法も提供される。線維性疾患を治療するためのRSPO結合物質および/またはLGR結合物質の使用も提供される。
【００４８】
本発明の局面または態様がマーカッシュグループまたは代替物の他のグループで説明された場合、本発明は、列挙されたグループ全体を全体として含むだけでなく、個々にグループの各メンバーも含み、かつメイングループの可能性のある全てのサブグループも含み、グループのメンバーのうちの1つまたは複数が存在しないメイングループも含む。本発明はまた、本発明においてグループのメンバーのいずれか1つまたは複数の明確な除外も想定する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルにおけるRSPO発現。
【図２】ブレオマイシン誘導性皮膚線維症モデルにおけるRSPO発現。
【図３】RSPO抗体によるブレオマイシン誘導性皮膚病変部の阻害。
【図４】ブレオマイシン誘導性皮膚病変部に由来する組織における遺伝子発現。12日目から組織試料を採取した。
【図５】ブレオマイシン誘導性皮膚病変部に由来するインターフェロンγの遺伝子発現。単一用量のブレオマイシンおよび単一用量の抗RSPO抗体を投与して24時間後に組織試料を採取した。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明は、線維性疾患を治療するための、および創傷治癒に起因する瘢痕を減らすための新規の方法を提供する。本発明は、治療的有効量のヒトRSPOアンタゴニストまたはLGRアンタゴニストを対象に投与する工程を含む、対象における線維性疾患を治療または予防する方法を提供する。前記方法は、RSPO結合物質および/またはLGR結合物質、特に、抗RSPO1抗体、抗RSPO2抗体、抗RSPO3抗体、抗LGR5抗体、またはLGR5-Fc可溶性受容体を、その必要のある対象に投与する工程を含む。RSPO結合物質およびLGR結合物質には、RSPOタンパク質相互作用およびLGRタンパク質相互作用の阻害剤が含まれるが、これに限定されない。
【００５１】
I.定義
本発明の理解を容易にするために、多数の用語および句を以下で定義する。
【００５２】
本明細書で使用する「線維性疾患」という用語は結合組織病を含むが、これに限定されない。当業者は、普通、線維症が臓器または組織における過剰な線維結合組織の形成または発生であると考える。一部の態様において、線維症は修復性または反応性のプロセスとして生じる。一部の態様において、線維症は損傷または傷害に応答して生じる。「線維症」という用語は、臓器または組織の正常要素である線維組織の形成とは対照的に、修復性または反応性のプロセスである臓器または組織における過剰な線維結合組織の形成または発生であると理解しなければならない。
【００５３】
本明細書で使用する「アンタゴニスト」および「アンタゴニストの」という用語は、標的の生物学的活性および/またはシグナル伝達経路を部分的または完全にブロックする、阻害する、低減する、または中和する任意の分子を指す。「アンタゴニスト」という用語は、タンパク質(例えば、RSPOタンパク質またはLGRタンパク質)の活性を部分的または完全にブロックする、阻害する、低減する、または中和する任意の分子を含むために本明細書において用いられる。適切なアンタゴニスト分子には、具体的には、アンタゴニスト抗体または抗体断片が含まれるが、これに限定されない。
【００５４】
本明細書で使用する「調整」および「調整する」という用語は、生物学的活性の変更または変化を指す。調整には活性の刺激または阻害が含まれるが、これに限定されない。調整は活性の増加もしくは減少でもよく、結合特性の変更でもよく、関心対象のタンパク質、経路、または他の生物学的地点(biological point)の活性に関連する生物学的特性、機能的特性、または免疫学的特性の他の任意の変更でもよい。
【００５５】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上記の組み合わせなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原結合部位によって認識し、かつ特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書で使用する、この用語は、抗体が望ましい生物学的活性を示す限り、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片)、単鎖Fv(scFv)抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位(すなわち、抗原結合部位)を含む他の任意の改変された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要なクラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそのサブクラス(アイソタイプ)(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは異なる周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。抗体は裸でもよく、毒素および放射性同位体を含むが、これに限定されない他の分子に結合体化されてもよい。
【００５６】
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部を指し、かつ無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖抗体、単鎖抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用する「抗体断片」は抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。
【００５７】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独で、または組み合わせて指す。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域は、「超可変領域」とも知られる3つの相補性決定領域(CDR)でつながれた4つのフレームワーク領域(FR)からなる。各鎖内のCDRはフレームワーク領域によって近くにまとめられ、他の鎖からのCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRの決定には少なくとも2種類の技法:(1)異種間配列可変性に基づくアプローチ(すなわち、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD));および(2)抗原-抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチ(Al-Lazikani et al (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948))がある。さらに、CDRを決定するために、これらの2つのアプローチの組み合わせが当技術分野において用いられることがある。
【００５８】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、1つの抗原決定基、すなわちエピトープの極めて特異的な認識および結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的に、様々な異なる抗原決定基に対して作られた異なる抗体の混合物を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷であり、かつ完全長であるモノクローナル抗体、ならびに抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、単鎖(scFv)抗体、二重特異性抗体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位(抗原結合部位)を含む他の任意の改変された免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ作製、ファージ選択、組換え体発現、およびトランスジェニック動物を含むが、これに限定されない任意の数の技法によって作製された、このような抗体を指す。
【００５９】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」という用語は、最小の非ヒト配列を含む、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはその断片である抗体の形を指す。典型的には、ヒト化抗体は、CDRのアミノ酸残基が、望ましい特異性、親和性、および/または結合能力を有する非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター)のCDR由来のアミノ酸残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域アミノ酸残基は、非ヒト種由来の抗体中の対応するアミノ酸残基で置き換えられる。ヒト化抗体を、フレームワーク領域中および/または置き換えられた非ヒトアミノ酸残基内のさらなるアミノ酸残基の置換によってさらに改変して、抗体の特異性、親和性、構造、および/または結合能力を改良および最適化することができる。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応する少なくとも1つの、および典型的には2つまたは3つのCDRのうちの実質的に全てを含むのに対して、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部を含むことができる。
【００６０】
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、またはヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体は、当技術分野で公知の任意の技術を用いて作製することができる。
【００６１】
本明細書で使用する「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、望ましい特異性、親和性、および/または結合能力を有する1つの哺乳動物種(例えば、マウス、ラット、ウサギなど)由来の抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、別の種(通常、ヒト)に由来する抗体中の配列に対応する。
【００６２】
本明細書で使用する「親和性成熟抗体」という句は、その1つまたは複数のCDRに1つまたは複数の変化があり、その結果として、これらの変化を有さない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性が改善している抗体を指す。この定義はまた、CDRアミノ酸残基の変化と共に加えられる非CDRアミノ酸残基の変化も含む。好ましい親和性成熟抗体は、一般的に、標的抗原に対してナノモル親和性を有するか、またはピコモル親和性でさえ有する。親和性成熟抗体は、重鎖および軽鎖の可変ドメインシャッフリング、CDRおよび/もしくはフレームワークアミノ酸残基のランダム変異誘発、またはCDRおよび/もしくはフレームワークアミノ酸残基の部位特異的変異誘発を含むが、これに限定されない当技術分野において公知の手順によって生成される。
【００６３】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は本明細書において同義に用いられ、かつ特定の抗体が認識し、特異的に結合することができる抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続したアミノ酸、およびタンパク質の三次フォールディング(tertiary folding)によって近接して並べられた非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されたエピトープ(線状(linear)エピトープとも呼ばれる)は、タンパク質が変性した場合に典型的には保持されるのに対して、三次フォールディングによって形成されたエピトープ(コンホメーションエピトープとも呼ばれる)は、タンパク質が変性すると典型的には失われる。エピトープは独特の空間配置中に典型的には少なくとも3アミノ酸、より通常は少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。
【００６４】
「選択的に結合する」または「特異的に結合する」という用語は、結合物質または抗体が、非関連タンパク質または関連タンパク質を含む別の物質より高頻度で、迅速に、長い期間で、大きな親和性で、または前記を組み合わせてエピトープ、タンパク質、または標的分子と反応または会合することを意味する。ある特定の態様において、「特異的に結合する」とは、例えば、約0.1mM以下、より通常は約1μM未満のKDで抗体がタンパク質に結合することを意味する。ある特定の態様において、「特異的に結合する」とは、時として少なくとも約0.1μM以下、それ以外の時には少なくとも約0.01μM以下、それ以外の時には少なくとも約1nM以下のKDで標的に結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間には配列同一性があるので、特異的結合は、複数の種にあるタンパク質(例えば、ヒトRSPO3およびマウスRSPO3)を認識する抗体を含んでもよい。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列のある特定の領域内には相同性があるので、特異的結合は、複数種類のタンパク質(例えば、ヒトRSPO3およびヒトRSPO1)を認識する抗体(または他のポリペプチドもしくは結合物質)を含んでもよい。ある特定の態様では、第1の標的に特異的に結合する抗体または結合部分は第2の標的に特異的に結合してもよく、特異的に結合しなくてもよいことが理解される。従って、「特異的結合」は、必ずしも、排他的な結合、すなわち、1種類の標的との結合を必要とするわけではない(だが、1種類の標的との結合を含んでもよい)。従って、抗体は、ある特定の態様では、複数種類の標的に特異的に結合してもよい。ある特定の態様では、複数種類の標的は抗体の同じ抗原結合部位に結合してもよい。例えば、抗体は、ある特定の場合では、2つ同一の抗原結合部位を含んでもよく、これらの抗原結合部位はそれぞれ、2種類またはそれ以上のタンパク質(例えば、RSPO3およびRSPO1)にある同じエピトープに特異的に結合する。ある特定の他の態様では、抗体は多重特異性でもよく、特異性の異なる少なくとも2種類の抗原結合部位を含んでもよい。非限定的な例として、二重特異性抗体は、あるタンパク質(例えば、ヒトRSPO3)のエピトープを認識する、ある抗原結合部位を含んでもよく、さらに、第2のタンパク質の異なるエピトープを認識する第2の異なる抗原結合部位を含んでもよい。必ずしもそうとは限らないが、一般的に、結合についての言及は特異的結合を意味する。
【００６５】
「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書において同義に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖または分枝鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語はまた、天然に、あるいは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合体化などの他の任意の操作もしくは修飾によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体(例えば、非天然アミノ酸を含む)ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義に含まれる。本発明のポリペプチドは、ある特定の態様では抗体をベースとすることがあるので、単鎖または会合した鎖として生じてもよいことが理解される。
【００６６】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は本明細書において同義に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および/またはその類似体、あるいはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質でもよい。
【００６７】
「高ストリンジェンシー条件」は、(1)洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば、50℃で、15mM NaCl/1.5mMクエン酸ナトリウム/0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを使用する条件;(2)ハイブリダイゼーションの間に、5xSSC(0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム)に溶解した変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、50％(v/v)ホルムアミド＋0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％Ficoll/0.1％ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5を42℃で使用する条件;または(3)ハイブリダイゼーションの間に、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液、超音波処理済みサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS、および10％硫酸デキストランに溶解した50％ホルムアミドを42℃で使用し、42℃で0.2×SSCおよび50％ホルムアミドで洗浄し、その後に、EDTAを含む0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を55℃で行う条件によって特定されてもよい。
【００６８】
2以上の核酸またはポリペプチドの文脈において、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を全く考慮することなく、最大一致(maximum correspondence)を得るように比較およびアラインメントされた時に(必要であれば、ギャップを導入する)、同じであるか、または特定のパーセントの同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する、2以上の配列または部分配列を指す。パーセント同一性は配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて測定されてもよく、目視検査によって測定されてもよい。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当技術分野において周知である。これらのアルゴリズムおよびソフトウェアには、BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package、およびそのバリエーションが含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、本発明の2つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一であり、このことは、これらが最大限一致するように比較およびアラインメントされた時に、配列比較アルゴリズムまたは目視検査を用いて測定された場合に、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、一部の態様では、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％のヌクレオチド同一性またはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。一部の態様において、同一性は、長さが少なくとも約10、好ましくは約20、より好ましくは約40〜60残基、少なくとも約60〜80残基、またはその間の任意の整数値の配列の領域にわたって存在する。一部の態様において、同一性は、60〜80残基より長い領域、例えば、少なくとも約80〜100残基にわたって存在し、一部の態様では、配列は、比較されている配列、例えば、ヌクレオチド配列のコード領域の完全長にわたって実質的に同一である。
【００６９】
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられる置換である。塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝(beta-branched)側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが当技術分野において定義されている。例えば、チロシンをフェニルアラニンで置換するのが保存的置換である。好ましくは、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体と、抗原、すなわち、そのポリペプチドまたは抗体が結合する1種類または複数種類のRSPOタンパク質との結合を阻止しない。抗原結合を無くさない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を特定する方法は当技術分野において周知である。
【００７０】
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、宿主細胞において関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を送達することができる、通常、発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクター、ならびにリポソームにカプセル化されたDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクターが含まれるが、これに限定されない。
【００７１】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然では見られない形をしたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、天然で見られる形ではない程度まで精製されたものが含まれる。一部の態様において、単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。
【００７２】
本明細書で使用する「実質的に純粋な」という用語は、純度(すなわち、汚染物質を含まない)が少なくとも50％の、純度が少なくとも90％の、純度が少なくとも95％の、純度が少なくとも98％の、または純度が少なくとも99％の材料を指す。
【００７３】
「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントとなる、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含むが、これに限定されない任意の動物(例えば、哺乳動物)を指す。典型的には、本明細書ではヒト対象について「対象」および「患者」という用語が同義に用いられる。
【００７４】
「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって認可されている(または認可可能である)か、米国薬局方、またはヒトを含む動物において使用するための一般に認められている他の薬局方に列挙されている製品または化合物を指す。
【００７５】
「薬学的に許容される賦形剤、担体、もしくはアジュバント」または「許容される薬学的な担体」という用語は、本開示の少なくとも1種類の結合物質(例えば、抗体)と共に対象に投与することができ、結合物質の活性を破壊しない、賦形剤、担体、またはアジュバントを指す。賦形剤、担体、またはアジュバントは、治療効果を送達するのに十分な用量で結合物質が投与された時に無毒でなければならない。普通、当業者および米国食品医薬品局（FDA）は、薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバントが任意の製剤の不活性成分と考える。
【００７６】
「有効量」または「治療的有効量」または「治療効果」という用語は、対象または哺乳動物の疾患または障害を「治療する」のに有効な結合物質、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機低分子、または他の薬物の量を指す。線維性疾患の場合には、治療的有効量の作用物質(例えば、抗体)は治療効果を有し、従って、線維性疾患の発症を予防してもよく、線維性疾患の発症を遅らせてもよく、線維性疾患の進行を遅らせてもよく、疾患における線維形成の量を減らしてもよく、臓器における線維材料の病理学的沈着を減らしてもよく、臓器における結合組織または細胞外マトリックスの病理学的沈着を減らしてもよく、線維性疾患に関連する症状の1つまたは複数をある程度まで軽減してもよく、罹患率および死亡率を減らしてもよく、生活の質を改善してもよく、このような効果の組み合わせでもよい。
【００７７】
「治療する」もしくは「治療」もしくは「治療するために」または「軽減する」もしくは「軽減するために」という用語は、1)診断された病理学的状態もしくは障害の症状を治癒する、診断された病理学的状態もしくは障害の症状を遅らせる、診断された病理学的状態もしくは障害の症状を和らげる、および/または診断された病理学的状態もしくは障害の進行を止める治療的処置と、2)標的とされた病理学的状態または障害の発症を予防する、および/または遅らせる予防的処置または防止的処置の両方を指す。従って、治療を必要とする者には、既に障害がある者;障害になりやすい者;および障害を予防しようとする者が含まれる。一部の態様において、患者が、以下:線維性疾患の発症が予防されたこと、線維性疾患の発症が遅れたこと、線維性疾患の進行が遅れたこと、疾患における線維形成の量が減ったこと、臓器における線維材料の病理学的沈着が減ったこと、臓器における結合組織または細胞外マトリックスの病理学的沈着が減ったこと、線維性疾患に関連する1つまたは複数の症状がある程度まで軽減したこと、罹患率および死亡率が減ったこと、生活の質が改善したこと、またはこのような効果の何らかの組み合わせの1つまたは複数を示すのであれば、対象は、本発明の方法に従って首尾良く「治療されている」。
【００７８】
本開示および特許請求の範囲で使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈によってはっきりと規定されていない限り複数形を含む。
【００７９】
本明細書において「を含む」という言葉で態様が説明された場合はいつでも、「からなる」および/または「から本質的になる」という用語で説明された他の類似する態様も提供されることが理解される。本明細書において「から本質的になる」という言葉で態様が説明された場合はいつでも、「からなる」で説明された他の類似する態様も提供されることも理解される。
【００８０】
本明細書において「Aおよび/またはB」という句で用いられるような「および/または」という用語は、AおよびB、AまたはB、A(のみ)、ならびにB(のみ)を含むことが意図される。同様に、「A、B、および/またはC」という句で用いられるような「および/または」という用語は、以下の態様のそれぞれ:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(のみ);B(のみ);ならびにC(のみ)を包含することが意図される。
【００８１】
II.使用方法および薬学的組成物
本発明は、線維性疾患を予防および/または治療するための方法を提供する。一部の態様において、方法は、本明細書に記載のRSPO結合物質および/またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)を使用する工程を含む。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4のアンタゴニストである。ある特定の態様において、LGR結合物質は、ヒトLGR4、LGR5、および/またはLGR6のアンタゴニストである。前記方法はインビトロ方法でもよくエクスビボ方法でもよくインビボ方法でもよい。本発明はまた、線維性疾患を治療するための医薬を製造するための本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)の使用も提供する。
【００８２】
本発明は、本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)を用いて線維性疾患を治療または予防するための方法を提供する。ある特定の態様において、線維性疾患を治療する方法は、インビトロで細胞または組織をRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)と接触させる工程を含む。例えば、関心対象の臓器に由来する細胞株または初代細胞のいずれかである線維芽細胞が関心対象の作用物質(例えば、RSPO結合物質またはLGR結合物質)と接触される。α-平滑筋アクチン、トランスフォーミング成長因子ベスト(best)1、および/またはフィブロネクチンのアップレギュレーション;細胞外マトリックス沈着;ならびにコラーゲン/ヒドロキシプロリン内容物を含むが、これに限定されない筋線維芽細胞/間葉系の分化を評価することによって、関心対象の作用物質による効果を観察することができる。
【００８３】
ある特定の態様において、線維性疾患を治療する方法は、インビボで細胞または組織をRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)と接触させる工程を含む。ある特定の態様において、細胞または組織をRSPO結合物質またはLGR結合物質と接触させる工程は動物モデルにおいて企てられる。例えば、RSPO結合物質は、線維性疾患を有するマウスに投与されてもよい。一部の態様において、RSPO結合物質はトランスジェニックマウスに投与されてもよい。一部の態様において、RSPO結合物質は動物に投与される。一部の態様において、線維症の発症を予防するために、動物に線維症誘導剤が投与されるのと同時に、または線維症誘導剤が投与された直後にRSPO結合物質は投与される(「予防モデル」)。一部の態様において、線維症が誘導された後にRSPO結合物質は治療剤として投与される(「治療モデル」)。一部の態様において、RSPO結合物質は抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は抗RSPO1抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は抗RSPO2抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は抗RSPO3抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質は可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質はLGR5可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合はLGR5-Fc融合タンパク質である。
【００８４】
動物において線維症を誘導するためのモデルは当業者に公知である。例えば、肺線維症は、ブレオマイシンを腹腔内注射することによってマウスに誘導することができる。肺線維症はまた、ブレオマイシン、フルオレセインイソチオシアネート、または微粒子状物質、例えば、シリカおよびアスベストの気管内注入によって誘導することもできる。肝線維症は、四塩化炭素を腹腔内注射することによってマウスに誘導することができる。皮膚線維症は、ブレオマイシンを局所注射することによってマウスに誘導することができる。
【００８５】
ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量のRSPO結合物質を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO抗体を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量のLGR可溶性受容体を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量のLGR結合物質を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗LGR抗体を対象に投与する工程を含む。
【００８６】
ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO1抗体を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO1抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO1抗体は、
TGYTMH(SEQ ID NO:5)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000013
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000014
を含む重鎖CDR3;ならびに
2017528523.tif 000015
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:9)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)
を含む軽鎖CDR3を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO1抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO1抗体は、SEQ ID NO:11と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:12と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO1抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO1抗体は、SEQ ID NO:56と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:57と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO1抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO1抗体は、SEQ ID NO:11の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:12の軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO1抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO1抗体は、SEQ ID NO:56の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:57の軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、抗RSPO1抗体は抗体89M5のヒト化バージョンである。一部の態様において、抗RSPO1抗体は抗体h89M5-H8L5である。一部の態様において、抗RSPO1抗体は抗体h89M5-H2L2である。
【００８７】
ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO2抗体を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO2抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO2抗体は、
SSYAMS(SEQ ID NO:21)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000016
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000017
を含む重鎖CDR3;ならびに
2017528523.tif 000018
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:25)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTP(SEQ ID NO:26)
を含む軽鎖CDR3を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO2抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO2抗体は、SEQ ID NO:27と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:66と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO2抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO2抗体は、SEQ ID NO:27の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:66の軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、抗RSPO2抗体は抗体130M23のヒト化バージョンである。一部の態様において、抗RSPO2抗体は抗体h130M23-H1L6である。一部の態様において、抗RSPO2抗体は抗体h130M23-H1L2である。
【００８８】
ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO3抗体を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO3抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO3抗体は、
DYSIH(SEQ ID NO:37)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000019
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000020
を含む重鎖CDR3、ならびに
2017528523.tif 000021
を含む軽鎖CDR1、
2017528523.tif 000022
を含む軽鎖CDR2、および
2017528523.tif 000023
を含む軽鎖CDR3を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO3抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO3抗体は、SEQ ID NO:46と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:47と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗RSPO3抗体を対象に投与する工程を含み、抗RSPO3抗体は、SEQ ID NO:46の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:47の軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、抗RSPO3抗体は抗体131R010である。
【００８９】
ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗LGR抗体を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗LGR5抗体を対象に投与する工程を含み、抗LGR5抗体は、ATCC寄託番号PTA-9342を有する88M1ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列、ならびにATCC寄託番号PTA-9342を有する88M1ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量の抗LGR5抗体を対象に投与する工程を含み、抗LGR5抗体は、ATCC寄託番号PTA-9342を有する88M1ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００９０】
ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量のLGR可溶性受容体を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量のLGR5可溶性受容体を対象に投与する工程を含み、LGR5可溶性受容体はLGR5の細胞外ドメインまたはその断片を含む。一部の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量のLGR5可溶性受容体を対象に投与する工程を含み、LGR5可溶性受容体はヒトLGR5のアミノ酸22〜564を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量のLGR5可溶性受容体を対象に投与する工程を含み、LGR5可溶性受容体はSEQ ID NO:74を含む。ある特定の態様において、線維性疾患を治療または予防する方法は、治療的有効量のLGR5可溶性受容体を対象に投与する工程を含み、LGR5可溶性受容体はSEQ ID NO:75を含む。
【００９１】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1に結合し、線維性疾患の発症を予防する。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1に結合し、線維性疾患の発症を遅くする。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1に結合し、線維性疾患の進行を遅くする。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1に結合し、疾患における線維形成の量を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1に結合し、臓器にある線維材料の病理学的沈着を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1に結合し、臓器にある結合組織および/または細胞外マトリックスの病理学的沈着を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質は抗RSPO1抗体である。一部の態様において、抗RSPO1抗体は抗体89M5のヒト化バージョンである。一部の態様において、抗RSPO1抗体はh89M5-H8L5である。一部の態様において、抗RSPO1抗体はh89M5-H2L2である。
【００９２】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO2に結合し、線維性疾患の発症を予防する。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO2に結合し、線維性疾患の発症を遅くする。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO2に結合し、線維性疾患の進行を遅くする。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO2に結合し、疾患における線維形成の量を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO2に結合し、臓器にある線維材料の病理学的沈着を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO2に結合し、臓器にある結合組織および/または細胞外マトリックスの病理学的沈着を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質は抗RSPO2抗体である。一部の態様において、抗RSPO2抗体は抗体130M23のヒト化バージョンである。一部の態様において、抗RSPO2抗体はh130M23-H1L6である。一部の態様において、抗RSPO2抗体はh130M23-H1L2である。
【００９３】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO3に結合し、線維性疾患の発症を予防する。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO3に結合し、線維性疾患の発症を遅くする。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO3に結合し、線維性疾患の進行を遅くする。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO3に結合し、疾患における線維形成の量を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO3に結合し、臓器にある線維材料の病理学的沈着を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO3に結合し、臓器にある結合組織および/または細胞外マトリックスの病理学的沈着を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質は抗RSPO3抗体である。一部の態様において、抗RSPO3抗体は131R010である。
【００９４】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4に結合し、線維性疾患の発症を予防する。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4に結合し、線維性疾患の発症を遅くする。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4に結合し、線維性疾患の進行を遅くする。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4に結合し、疾患における線維形成の量を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4に結合し、臓器にある線維材料の病理学的沈着を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4に結合し、臓器にある結合組織および/または細胞外マトリックスの病理学的沈着を減らす。一部の態様において、RSPO結合物質はLGR可溶性受容体である。一部の態様において、LGR可溶性受容体はLGR5可溶性受容体である。一部の態様において、LGR5可溶性受容体はFc領域を含む。一部の態様において、LGR可溶性受容体は、SEQ ID NO:72を含むLGR5-Fc融合タンパク質である。
【００９５】
前記方法の一部の態様において、線維性疾患は、肺線維症、腎線維症、肝線維症、皮膚線維症、心臓線維症、および癒着形成からなる群より選択される。一部の態様において、線維性疾患は皮膚線維症である。一部の態様において、皮膚線維症には、強皮症、全身性硬化症、強皮症様疾患、皮膚硬化のない強皮症、ケロイド形成、および肥厚性瘢痕が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、線維性疾患は腎線維症である。一部の態様において、腎線維症には慢性腎疾患が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、線維性疾患は肺線維症である。一部の態様において、肺線維症には、特発性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、縦隔線維症、および胸膜線維症が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、肺線維症は原発性肺線維症である。一部の態様において、肺線維症は続発性肺線維症である。一部の態様において、線維性疾患は肝線維症である。一部の態様において、肝線維症には肝臓の硬変が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、線維性疾患は心臓線維症である。一部の態様において、心臓線維症には、心筋線維症、心臓弁線維症、心内膜心筋線維症、およびアテローム性動脈硬化症が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、線維性疾患は肺線維症でない。一部の態様において、線維性疾患は肝線維症でない。一部の態様において、心臓線維症はアテローム性動脈硬化症でない。
【００９６】
ある特定の態様において、方法は、組織における少なくとも1種類のRSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルを確かめる工程をさらに含む。一部の態様において、組織におけるRSPOの発現レベルを確かめる工程は、RSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルを確かめる工程を含む。一部の態様において、組織試料(例えば、線維組織)におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルは、参照試料におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルと比較される。一部の態様において、組織試料におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルは、正常組織におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルと比較される。一部の態様において、組織試料におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルは、RSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の予め決められた発現レベルと比較される。一部の態様において、組織試料におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルは、正常組織におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の予め決められた発現レベルと比較される。一部の態様において、組織のRSPO1発現レベルが高い。一部の態様において、組織のRSPO2発現レベルが高い。一部の態様において、組織のRSPO3発現レベルが高い。一般的に、組織試料におけるRSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルは、同じ組織タイプの正常組織におけるRSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルと比較される。しかしながら、一部の態様において、RSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルは、組織タイプのグループ内でのRSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の平均発現レベルと比較される。一部の態様において、組織試料におけるRSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルは、同じ組織タイプまたは異なる組織タイプの組織の他の試料にあるRSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルと比較される。
【００９７】
一部の態様において、RSPO発現レベルを確かめる工程は治療前に行われる。一部の態様において、参照試料(例えば、正常組織)における同じRSPOの発現レベルまたは予め決められたレベルと比較して組織試料のRSPO発現レベルが高ければ、対象には、本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)が投与される。例えば、一部の態様において、正常組織または対照組織におけるRSPO3発現レベルと比較して組織試料のRSPO3(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルが高ければ、対象にはRSPO3結合物質(例えば、抗RSPO3抗体)が投与される。
【００９８】
さらに、本発明は、正常組織における、もしくは参照試料における同じRSPO(すなわち、タンパク質もしくは核酸)の発現、またはRSPOタンパク質の予め決められたレベルと比較してRSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルが高い組織試料(例えば、線維組織)を対象が有するかどうか確かめる工程を含む、RSPO結合物質またはLGR結合物質を用いた治療のためにヒト対象を特定する方法を提供する。
【００９９】
一部の態様において、RSPO1結合物質を用いた治療のためにヒト対象を特定する方法は、参照試料またはRSPO1の予め決められたレベルと比較してRSPO1発現レベルが高い線維組織を対象が有するかどうか確かめる工程を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質を用いた治療のためにヒト対象を特定する方法は、対象から線維組織の試料を入手する工程、および参照試料またはRSPO1の予め決められたレベルと比較して線維組織のRSPO1発現レベルが高いかどうか確かめる工程を含む。一部の態様において、線維組織のRSPO1発現レベルが高ければ、対象は、RSPO1に特異的に結合する抗体を用いた治療のために選択される。一部の態様において、治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載の抗RSPO1抗体が投与される。一部の態様において、線維組織のRSPO1発現レベルが高ければ、対象は、RSPO1に特異的に結合するLGR可溶性受容体を用いた治療のために選択される。一部の態様において、治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載のLGR可溶性受容体が投与される。
【０１００】
一部の態様において、RSPO2結合物質を用いた治療のためにヒト対象を特定する方法は、参照試料またはRSPO2の予め決められたレベルと比較してRSPO2発現レベルが高い線維組織を対象が有するかどうか確かめる工程を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質を用いた治療のためにヒト対象を特定する方法は、対象から線維組織の試料を入手する工程、および参照試料またはRSPO2の予め決められたレベルと比較して線維組織のRSPO2発現レベルが高いかどうか確かめる工程を含む。一部の態様において、線維組織のRSPO2発現レベルが高ければ、対象は、RSPO2に特異的に結合する抗体を用いた治療のために選択される。一部の態様において、治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載の抗RSPO2抗体が投与される。一部の態様において、線維組織のRSPO2発現レベルが高ければ、対象は、RSPO2に特異的に結合するLGR可溶性受容体を用いた治療のために選択される。一部の態様において、治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載のLGR可溶性受容体が投与される。
【０１０１】
一部の態様において、RSPO3結合物質を用いた治療のためにヒト対象を特定する方法は、参照試料またはRSPO3の予め決められたレベルと比較してRSPO3発現レベルが高い線維組織を対象が有するかどうか確かめる工程を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質を用いた治療のためにヒト対象を特定する方法は、対象から線維組織の試料を入手する工程、および参照試料またはRSPO3の予め決められたレベルと比較して線維組織のRSPO3発現レベルが高いかどうか確かめる工程を含む。一部の態様において、線維組織のRSPO3発現レベルが高ければ、対象は、RSPO3に特異的に結合する抗体を用いた治療のために選択される。一部の態様において、治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載の抗RSPO3抗体が投与される。一部の態様において、線維組織のRSPO3発現レベルが高ければ、対象は、RSPO3に特異的に結合するLGR可溶性受容体を用いた治療のために選択される。一部の態様において、治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載のLGR可溶性受容体が投与される。
【０１０２】
一部の態様において、線維組織の複数種類のRSPO(すなわち、タンパク質または核酸)の発現レベルが高ければ、対象には、発現レベルが最も高いRSPOに結合するRSPO結合物質が投与される。一部の態様において、線維組織におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルが確かめられ、正常組織におけるRSPO1レベルと比較して線維組織のRSPO1発現レベルが高ければ、対象は、RSPO1に特異的に結合する抗体を用いた治療のために選択される。治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載の抗RSPO1抗体が投与される。一部の態様において、RSPO1結合物質は抗体89M5のヒト化バージョンである。一部の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H8L5である。一部の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H2L3である。一部の態様において、線維組織におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルが確かめられ、正常組織におけるRSPO2レベルと比較して線維組織のRSPO2発現レベルが高ければ、対象は、RSPO2に特異的に結合する抗体を用いた治療のために選択される。治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載の抗RSPO2抗体が投与される。一部の態様において、RSPO2結合物質は抗体130M23のヒト化バージョンである。一部の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L6である。一部の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L2である。一部の態様において、線維組織におけるRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の発現レベルが確かめられ、正常組織におけるRSPO3レベルと比較して線維組織のRSPO3発現レベルが高ければ、対象は、RSPO3に特異的に結合する抗体を用いた治療のために選択される。治療のために選択されたら、対象には、本明細書に記載の抗RSPO3抗体が投与される。一部の態様において、RSPO3結合物質は抗体131R011である。
【０１０３】
本発明はまた、(a)少なくとも部分的に、RSPO1レベルが高い組織試料を有する対象に基づいて治療のために対象を選択する工程、および(b)本明細書に記載の治療的有効量のRSPO1結合物質を対象に投与する工程を含む、ヒト対象における線維性疾患を治療する方法も提供する。一部の態様において、RSPO1結合物質は抗体89M5のヒト化バージョンである。一部の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H8L5である。一部の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H2L2である。一部の態様において、RSPO1結合物質はLGR可溶性受容体である。
【０１０４】
本発明はまた、(a)少なくとも部分的に、RSPO2レベルが高い組織試料を有する対象に基づいて治療のために対象を選択する工程、および(b)本明細書に記載の治療的有効量のRSPO2結合物質を対象に投与する工程を含む、ヒト対象における線維性疾患を治療する方法も提供する。一部の態様において、RSPO2結合物質は抗体130M23のヒト化バージョンである。一部の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L6である。一部の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L2である。一部の態様において、RSPO2結合物質はLGR可溶性受容体である。
【０１０５】
本発明はまた、(a)少なくとも部分的に、RSPO3レベルが高い組織試料を有する対象に基づいて治療のために対象を選択する工程、および(b)本明細書に記載の治療的有効量のRSPO3結合物質を対象に投与する工程を含む、ヒト対象における線維性疾患を治療する方法も提供する。一部の態様において、RSPO3結合物質は抗体131R010である。一部の態様において、RSPO3結合物質はLGR可溶性受容体である。
【０１０６】
細胞または組織におけるRSPO発現レベルを確かめるための方法は当業者に公知である。核酸発現の場合、これらの方法には、PCRに基づくアッセイ、マイクロアレイ分析、およびヌクレオチド配列決定(例えば、NextGen配列決定)が含まれるが、これに限定されない。タンパク質発現の場合、これらの方法には、ウエスタンブロット分析、タンパク質アレイ、ELISA、免疫組織化学(IHC)アッセイ、およびFACSが含まれるが、これに限定されない。
【０１０７】
線維組織のRSPO発現レベルが高いかどうか確かめるための方法では様々な試料を使用することができる。一部の態様において、試料は、線維性疾患を有する対象から採取される。一部の態様において、試料は新鮮な試料である。一部の態様において、試料は凍結した試料である。一部の態様において、試料は、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した試料である。一部の態様において、試料は細胞溶解産物まで処理される。一部の態様において、試料はDNAまたはRNAまで処理される。
【０１０８】
さらに、本発明は、本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質を含む組成物を提供する。ある特定の態様において、前記組成物は、薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物である。一部の態様において、薬学的組成物は、対象(例えば、ヒト患者)における線維性疾患の治療または予防において用いられる。
【０１０９】
精製された本発明の抗体または作用物質と薬学的に許容されるビヒクル(例えば、担体または賦形剤)を組み合わせることによって、保管および使用のための製剤が調製される。当業者は、普通、薬学的に許容される担体、賦形剤、および/または安定剤が製剤または薬学的組成物の不活性成分だと考える。
【０１１０】
適切な薬学的に許容されるビヒクルには、無毒の緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸;塩、例えば、塩化ナトリウム;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤、例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾール;低分子量ポリペプチド(例えば、約10未満のアミノ酸残基);タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;炭水化物、例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体、例えば、Zn-タンパク質錯体;および非イオン界面活性剤、例えば、TWEENまたはポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これに限定されない。(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.)。
【０１１１】
本発明の薬学的組成物は、局所治療または全身治療のための多様な手法で投与することができる。投与は、表皮パッチもしくは経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤、および散剤による局部投与;ネブライザーによる投与を含む、散剤もしくはエアゾール剤の吸入もしくはガス注入による肺投与、気管内投与、および鼻腔内投与;経口投与;または静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、もしくは筋肉内投与(例えば、注射もしくは注入)を含む非経口投与;あるいは頭蓋内投与(例えば、くも膜下腔内投与もしくは脳室内投与)でもよい。本明細書に記載の方法の一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は局所投与される。一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は皮下投与される。一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は筋肉内投与される。一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は局部投与される。一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は静脈内投与される。一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は吸入により投与される。
【０１１２】
治療製剤は単位剤形でもよい。このような製剤には、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解した溶液もしくは懸濁液、または坐剤が含まれる。錠剤などの固形組成物では、主要な有効成分が薬学的担体と混合されている。従来の錠剤化成分には、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはゴム、および希釈剤(例えば、水)が含まれる。これらを用いて、本発明の化合物またはその無毒な薬学的に許容される塩の均質な混合物を含む固体の予備処方組成物を形成することができる。次いで、固体の予備処方組成物は上述のタイプの単位剤形にさらに分けられる。長期作用という利点を与える剤形を得るために、製剤または組成物の錠剤、丸剤などがコーティングされてもよく、他の方法で調合されてもよい。例えば、錠剤または丸剤は内部組成物が外部成分によって覆われてもよい。さらに、崩壊に抵抗するよう働いて、内部成分がそのまま胃を通過するのを可能にするか、またはその放出を遅らせることができる腸溶層によって、2つの成分は分離されてもよい。このような腸溶層またはコーティングには様々な材料を使用することができる。このような材料には、多くのポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との混合物が含まれる。
【０１１３】
本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)はまたマイクロカプセルの中に封入することもできる。このようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技法または界面重合法によって調製され、それぞれ、例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.)に記載のように、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルを、コロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)の中に、またはマクロエマルジョンの中に入れる。
【０１１４】
ある特定の態様では、薬学的製剤には、リポソームと複合体化した本発明のRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)が含まれる。リポソームを生成する方法は当業者に公知である。例えば、リポソームの中には、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって作製できるものもある。規定された孔径のフィルターに通してリポソームを押し出すことにより、望ましい直径を有するリポソームが得ることができる。
【０１１５】
ある特定の態様では、本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質を含む徐放性調製物を生成することができる。徐放性調製物の適切な例には、RSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形された物品(例えば、フィルムまたはマイクロカプセル)の形をしている。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)、ポリ乳酸、L-グルタミン酸と7エチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、ならびにポリD-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０１１６】
ある特定の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)を投与する工程に加えて、前記方法または治療は、少なくとも1種類のさらなる治療剤を投与する工程をさらに含む。さらなる治療剤は、RSPO結合物質またはLGR結合物質の投与の前に、それと同時に、および/またはその後に投与することができる。さらなる治療剤を含む薬学的組成物も提供される。一部の態様において、少なくとも1種類のさらなる治療剤は1種類、2種類、3種類の、またはそれより多いさらなる治療剤を含む。
【０１１７】
2種類以上の治療剤を用いた併用療法では、異なる作用機構によって働く剤を使用することが多いが、このことは必要とされない。異なる作用機構をもつ剤を用いた併用療法を用いると相加効果または相乗効果が得られることがある。併用療法を用いると、各剤の用量が、単独療法において用いられる各剤の用量より少なくなり、それによって、剤の毒性副作用が減少する、および/または剤の治療指数が増加することがある。
【０１１８】
一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質と少なくとも1種類のさらなる治療剤を組み合わせると相加的または相乗的な結果が得られる。一部の態様において、併用療法はRSPO結合物質またはLGR結合物質の治療指数を増加させる。一部の態様において、併用療法は、さらなる剤の治療指数を増加させる。一部の態様において、併用療法は、RSPO結合物質またはLGR結合物質の毒性および/または副作用を減少させる。一部の態様において、併用療法は、さらなる剤の毒性および/または副作用を減少させる。
【０１１９】
一部の態様において、さらなる治療剤は抗炎症剤である。一部の態様において、抗炎症剤はステロイド、グルココルチコステロイド、またはコルチコステロイドである。ステロイドには、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、およびプレドニゾンが含まれ得るが、これに限定されない。
【０１２０】
一部の態様において、抗炎症剤は非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)である。NSAIDには、ナプロキセンナトリウム、セレコキシブ、スリンダク、オキサプロジン、サルサラート、ジフルニサル、ピロキシカム、インドメタシン、エトドラク、メロキシカム、ナプロキセン、ナブメトン、ケトロラックトロメタミン、ナプロキセン/エキソメプラゾール(exomeprazole)、ジクロフェナク、およびアスピリンが含まれ得るが、これに限定されない。
【０１２１】
一部の態様において、抗炎症剤は低分子である。一部の態様において、抗炎症剤は、イマチニブ(GLEEVEC)などのチロシンキナーゼ阻害剤である。
【０１２２】
一部の態様において、抗炎症剤は、炎症性サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、および/またはケモカインの阻害剤である。一部の態様において、抗炎症剤は、炎症性サイトカインの活性を阻害する抗体である。一部の態様において、抗炎症剤は、IL-1、IL-18、IL-33、IL36、IL-37、IL-6、IL-11、IL-31、IL-17、IL-25、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロンα、インターフェロンγ、および/またはインターフェロンβに結合する、および/またはこれを阻害する抗体である。
【０１２３】
一部の態様において、さらなる治療剤はWnt経路阻害剤である。一部の態様において、Wnt経路阻害剤は、frizzled(FZD)タンパク質に結合する結合物質である「FZD結合物質」である。FZD結合物質の非限定的な例は米国特許第7,982,01号において見られる。FZD結合物質には抗FZD抗体が含まれ得るが、これに限定されない。一部の態様において、方法は、RSPO結合物質を抗FZD抗体と組み合わせて投与する工程を含む。一部の態様において、方法は、RSPO結合物質を抗FZD抗体18R5と組み合わせて投与する工程を含む。一部の態様において、Wnt経路阻害剤は、Wntタンパク質に結合する結合物質である「Wnt結合物質」である。Wnt結合物質の非限定的な例は、米国特許第7,723,477号および同第7,947,277号;ならびに国際公開WO2011/088127およびWO2011/088123において見られる。Wnt結合物質には抗Wnt抗体およびFZD-Fc可溶性受容体が含まれ得るが、これに限定されない。一部の態様において、方法は、RSPO結合物質またはLGR結合物質をFZD-Fc可溶性受容体と組み合わせて投与する工程を含む。一部の態様において、方法は、RSPO結合物質またはLGR結合物質をFZD8-Fc可溶性受容体と組み合わせて投与する工程を含む。一部の態様において、方法は、RSPO結合物質またはLGR結合物質を抗FZD抗体と組み合わせて投与する工程を含む。
【０１２４】
一部の態様において、本明細書に記載の方法は、複数のさらなる治療剤と組み合わせて、治療的有効量のRSPO結合物質またはLGR結合物質を投与する工程を含む。
【０１２５】
併用投与は、単一の薬学的製剤の形での、または別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよく、どちらの順番でもよいが、一般的に、活性作用物質の全てがその生物活性を同時に発揮できるような、ある期間内で行われる連続投与を含んでもよい。
【０１２６】
RSPO結合物質またはLGR結合物質と少なくとも1種類のさらなる治療剤の組み合わせは任意の順序で投与されてもよく、同時に投与されてもよいことが理解される。一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は、第2の治療剤を用いて以前に治療されたことがある患者に投与される。ある特定の他の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質と第2の治療剤は実質的に同時に、または同時に投与される。例えば、対象は、第2の治療剤(例えば、化学療法)による治療コースを受けながらRSPO結合物質(例えば、抗体)が与えられてもよい。ある特定の態様では、RSPO結合物質またはLGR結合物質は、第2の治療剤で治療して1年以内に投与される。ある特定の他の態様では、RSPO結合物質またはLGR結合物質は、第2の治療剤で治療して10ヶ月以内、8ヶ月以内、6ヶ月以内、4ヶ月以内、または2ヶ月以内に投与される。ある特定の他の態様では、RSPO結合物質またはLGR結合物質は、第2の抗癌剤で治療して4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間以内に投与される。一部の態様では、RSPO結合物質またはLGR結合物質は、第2の治療剤で治療して5日以内、4日以内、3日以内、2日以内、または1日以内に投与される。さらに、2種類の(またはそれより多い)作用物質または治療が数時間または数分のうちに(すなわち、実質的に同時に)対象に投与されてもよいことが理解される。
【０１２７】
疾患を治療する場合、本発明のRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)の適切な投与量は、治療しようとする疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、疾患の応答性、RSPO結合物質またはLGR結合物質が治療目的または予防目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴などによって決まる。これらは全て、治療を行っている医師の自由裁量に委ねられている。RSPO結合物質またはLGR結合物質は一度に投与されてもよく、数日〜数ヶ月間続く一連の治療にわたって投与されてもよく、治癒するまで、または疾患状態が低下するまで投与されてもよい。最適な投与計画は患者の体内の薬物蓄積測定値から計算することができ、個々の抗体または作用物質の相対効力に応じて変化する。投与を行っている医師は、最適投与量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。ある特定の態様において、投与量は、0.01μg〜100mg/kg体重、0.1μg〜100mg/kg体重、1μg〜100mg/kg体重、1mg〜100mg/kg体重、1mg〜80mg/kg体重10mg〜100mg/kg体重、10mg〜75mg/kg体重、または10mg〜50mg/kg体重である。ある特定の態様において、RSPO結合物質の投与量は約0.1mg〜約20mg/kg体重である。ある特定の態様において、投与量は毎日、毎週、毎月、または毎年1回以上与えることができる。ある特定の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は1週間毎に1回、2週間毎に1回、または3週間毎に1回、与えられる。
【０１２８】
当業者に公知なように、どの治療剤の投与でも副作用および/または毒性が起こる可能性がある。場合によっては、副作用および/または毒性は、治療に有効な用量の特定の剤を投与するのを止めるほど重篤である。場合によっては、薬物療法は中断しなければならず、他の剤が試みられる場合がある。しかしながら、同じ薬効分類(therapeutic class)にある多くの剤が同様の副作用および/または毒性を示すことが多い。このことは、患者は療法を停止しなければならないか、または可能なら、治療剤に関連する不快な副作用に苦しまなければならないことを意味する。
【０１２９】
従って、本発明は、1種類または複数種類の作用物質を投与するために間欠投与戦略を使用する工程を含む、対象における線維性疾患を治療する方法を提供する。間欠投与戦略を使用する工程によって、RSPO結合物質、LGR結合物質、第2の作用物質などの投与に関連する副作用および/または毒性が低減する可能性がある。
【０１３０】
III.RSPOアンタゴニストおよびLGRアンタゴニスト
本発明は、ヒトRSPOタンパク質またはヒトLGRタンパク質に特異的に結合する作用物質を含む方法を提供する。これらの作用物質は、それぞれ、本明細書において「RSPO結合物質」および「LGR結合物質」と呼ばれる。RSPO結合物質およびLGR結合物質の非限定的な例は、米国特許出願公開第2006/0275870号、同第2009/0074782号、同第2009/0191205号、同第2009/0220495号、同第2010/0071078号、同第2012/0039912号、同第2012/0263730号、同第2013/0095116号、同第2013/0336885号、同第2013/0337533号、同第2014/0017253号、同第2014/0302054号、同第2015/0147333、および国際公開番号WO2010/016766、WO2014/012007、WO2014/192974において見られる。一部の態様において、RSPO結合物質は抗体である。一部の態様において、RSPO結合物質はポリペプチドである。ある特定の態様において、RSPO結合物質はRSPO1に結合する(「RSPO1結合物質」)。ある特定の態様において、RSPO結合物質はRSPO2に結合する(「RSPO2結合物質」)。ある特定の態様において、RSPO結合物質はRSPO3に結合する(「RSPO3結合物質」)。ある特定の態様において、RSPO結合物質は1種類または複数種類のヒトRSPOタンパク質に特異的に結合する。ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、およびRSPO4の完全長アミノ酸(aa)配列は当技術分野において公知であり、本明細書において、SEQ ID NO:1(RSPO1)、SEQ ID NO:2(RSPO2)、SEQ ID NO:3(RSPO3)、およびSEQ ID NO:4(RSPO4)と示される。一部の態様において、RSPO結合物質は可溶性受容体である。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトLGRタンパク質の細胞外ドメインまたはその断片を含む可溶性受容体である。一部の態様において、ヒトLGRタンパク質はLGR4、LGR5、またはLGR6である。ヒトLGR4、LGR5、およびLGR6の完全長アミノ酸(aa)配列は当技術分野において公知であり、本明細書において、SEQ ID NO:71(LGR4)、SEQ ID NO:72(LGR5)、およびSEQ ID NO:73(LGR6)と示される。
【０１３１】
一部の態様において、LGR結合物質は抗体である。一部の態様において、LGR結合物質はポリペプチドである。ある特定の態様において、LGR結合物質はLGR4に結合する(「LGR4結合物質」)。ある特定の態様において、LGR結合物質はLGR5に結合する(「LGR5結合物質」)。ある特定の態様において、LGR結合物質はLGR6に結合する(「LGR6結合物質」)。ある特定の態様において、LGR結合物質は1種類または複数種類のヒトLGRタンパク質に特異的に結合する。
【０１３２】
ある特定の態様において、本明細書に記載のRSPO結合物質(例えば、抗体または二重特異性抗体)の抗原結合部位は、1種類、2種類、3種類、または4種類のRSPOに結合することができる(または結合する)。ある特定の態様において、本明細書に記載のRSPO結合物質(例えば、抗体または二重特異性抗体)の抗原結合部位は、第1のRSPOタンパク質(例えば、RSPO1)ならびに他の1種類、2種類、または3種類のRSPO(例えば、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4)に結合することができる(または結合する)。一部の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体)はヒトRSPOとマウスRSPOの両方に特異的に結合する。
【０１３３】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1(SEQ ID NO:1)のアミノ酸21〜263の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1(SEQ ID NO:1)のアミノ酸31〜263の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1(SEQ ID NO:1)のアミノ酸34〜135の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1(SEQ ID NO:1)のアミノ酸34〜85の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1(SEQ ID NO:1)のアミノ酸91〜135の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1(SEQ ID NO:1)のアミノ酸147〜207の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、RSPO1のフューリン様システインリッチドメインに結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPO1のフューリン様システインリッチドメインの内部にある少なくとも1つのアミノ酸に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO1のトロンボスポンジンドメインに結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPO1のトロンボスポンジンドメインの内部にある少なくとも1つのアミノ酸に結合する。
【０１３４】
ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO2(SEQ ID NO:2)のアミノ酸22〜243の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO2(SEQ ID NO:2)のアミノ酸22〜205の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO2(SEQ ID NO:2)のアミノ酸35〜134の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO2(SEQ ID NO:2)のアミノ酸34〜84の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO2(SEQ ID NO:2)のアミノ酸90〜134の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、RSPO2のフューリン様システインリッチドメインに結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPO2のフューリン様システインリッチドメインの内部にある少なくとも1つのアミノ酸に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO2のトロンボスポンジンドメインに結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPO2のトロンボスポンジンドメインの内部にある少なくとも1つのアミノ酸に結合する。
【０１３５】
ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO3(SEQ ID NO:3)のアミノ酸22〜272の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO3(SEQ ID NO:3)のアミノ酸22〜207の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO3(SEQ ID NO:3)のアミノ酸35〜135の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO3(SEQ ID NO:3)のアミノ酸35〜86の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO3(SEQ ID NO:3)のアミノ酸92〜135の内部に特異的に結合する抗体である。ある特定の態様において、RSPO結合物質はRSPO3のフューリン様システインリッチドメインに結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPO3のフューリン様システインリッチドメインの内部ある少なくとも1つのアミノ酸に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPO3のトロンボスポンジンドメインに結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPO3のトロンボスポンジンドメインの内部ある少なくとも1つのアミノ酸に結合する。
【０１３６】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の解離定数(KD)で少なくとも1種類のRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の解離定数(KD)で少なくとも1種類のRSPOタンパク質に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約20nM以下のKDで少なくとも1種類のRSPOタンパク質に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約10nM以下のKDで少なくとも1種類のRSPOタンパク質に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約1nM以下のKDで少なくとも1種類のRSPOタンパク質に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約0.5nM以下のKDで少なくとも1種類のRSPOタンパク質に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約0.1nM以下のKDで少なくとも1種類のRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、本明細書に記載のRSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は少なくとも2種類のRSPOタンパク質に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、約10nM以下のKDでヒトRSPOとマウスRSPOの両方に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、約1nM以下のKDでヒトRSPOとマウスRSPOの両方に結合する。一部の態様において、RSPO結合物質は、約0.1nM以下のKDでヒトRSPOとマウスRSPOの両方に結合する。一部の態様において、RSPOタンパク質に対する結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)の解離定数は、Biacoreチップ上に固定された、RSPOタンパク質の少なくとも一部を含むRSPO融合タンパク質を用いて求められた解離定数である。一部の態様において、RSPOタンパク質に対する結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)の解離定数は、Biacoreチップ上にある抗ヒトIgG抗体が捕獲した結合物質と、RSPOタンパク質を用いて求められた解離定数である。
【０１３７】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の50％効果濃度(EC50)で少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質に結合する。ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の50％効果濃度(EC50)で少なくとも1種類のヒトRSPOに結合する。
【０１３８】
ある特定の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の解離定数(KD)で少なくとも1種類のLGRタンパク質に結合する。ある特定の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の解離定数(KD)で少なくとも1種類のLGRタンパク質に結合する。一部の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約20nM以下のKDで少なくとも1種類のLGRタンパク質に結合する。一部の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約10nM以下のKDで少なくとも1種類のLGRタンパク質に結合する。一部の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約1nM以下のKDで少なくとも1種類のLGRタンパク質に結合する。一部の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約0.5nM以下のKDで少なくとも1種類のLGRタンパク質に結合する。一部の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約0.1nM以下のKDで少なくとも1種類のLGRタンパク質に結合する。ある特定の態様において、本明細書に記載のLGR結合物質(例えば、抗体)は少なくとも2種類のLGRタンパク質に結合する。一部の態様において、LGRタンパク質に対する結合物質(例えば、抗体)の解離定数は、Biacoreチップ上に固定された、LGRタンパク質の少なくとも一部を含むLGR融合タンパク質を用いて求められた解離定数である。一部の態様において、LGRタンパク質に対する結合物質(例えば、抗体)の解離定数は、Biacoreチップ上にある抗ヒトIgG抗体が捕獲した結合物質と、LGRタンパク質を用いて求められた解離定数である。
【０１３９】
ある特定の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の50％効果濃度(EC50)で少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質に結合する。ある特定の態様において、LGR結合物質(例えば、抗体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の50％効果濃度(EC50)で少なくとも1種類のヒトLGRに結合する。
【０１４０】
ある特定の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は抗体である。一部の態様において、前記抗体は組換え抗体である。一部の態様において、前記抗体はモノクローナル抗体である。一部の態様において、前記抗体はキメラ抗体である。一部の態様において、前記抗体はヒト化抗体である。一部の態様において、前記抗体はヒト抗体である。一部の態様において、前記抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgM抗体である。ある特定の態様において、前記抗体はIgG1抗体である。ある特定の態様において、前記抗体はIgG2抗体である。一部の態様において、前記抗体はIgG4抗体である。ある特定の態様において、前記抗体は、抗原結合部位を含む抗体断片である。一部の態様において、前記抗体は二重特異性抗体または多重特異性抗体である。一部の態様において、前記抗体は一価抗体である。一部の態様において、前記抗体は単一特異性抗体である。一部の態様において、前記抗体は二価抗体である。一部の態様において、前記抗体は細胞傷害性部分に結合体化される。一部の態様において、前記抗体は単離される。一部の態様において、前記抗体は実質的に純粋である。
【０１４１】
本発明のRSPO結合物質(例えば、抗体)は、当技術分野において公知の任意の方法によって特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、Biacore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの技法を用いた競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が含まれるが、これに限定されない。このようなアッセイは日常的なものであり、当技術分野において周知である(例えば、Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照されたい。)。
【０１４２】
例えば、作用物質とヒトRSPOタンパク質との特異的結合はELISAを用いて確かめられる場合がある。ELISAアッセイは、抗原を調製する工程、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする工程、検出可能な化合物、例えば、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)に結合体化されたRSPO結合物質をウェルに添加する工程、ある期間にわたってインキュベートする工程、および抗原に結合した作用物質の存在を検出する工程を含む。一部の態様において、RSPO結合物質は、検出可能な化合物に結合体化されず、その代わりに、RSPO結合物質を認識し、検出可能な化合物に結合体化された第2の抗体(例えば、抗Fc抗体)がウェルに添加される。一部の態様において、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、RSPO結合物質がウェルにコーティングされてもよく、コーティングされたウェルに抗原が添加された後に、検出可能な化合物に結合体化された第2の抗体が添加されてもよい。当業者であれば、検出されるシグナルを増やすように改変することができるパラメータならびに当技術分野において公知のELISAの他のバリエーションについて精通しているであろう。
【０１４３】
別の例では、作用物質とヒトRSPOタンパク質との特異的結合はFACSを用いて確かめられる場合がある。FACSスクリーニングアッセイは、抗原を融合タンパク質(例えば、RSPO-CD4TM)として発現するcDNA構築物を作製し、トランスフェクションによって構築物を細胞に導入し、細胞表面に抗原を発現させ、RSPO結合物質を、トランスフェクトされた細胞と混合し、ある期間にわたってインキュベートする工程を含んでもよい。RSPO結合物質が結合した細胞は、検出可能な化合物と結合体化した二次抗体(例えば、PE結合抗Fc抗体)とフローサイトメーターを用いて特定することができる。当業者であれば、検出されるシグナルを最適化するように改変することができるパラメータならびにスクリーニング(例えば、遮断抗体のスクリーニング)を強化し得るFACSの他のバリエーションについて精通しているであろう。
【０１４４】
競合的結合アッセイによって、作用物質と抗原との結合親和性および作用物質-抗原相互作用のオフレートを求めることができる。競合的結合アッセイの一例は、漸増量の非標識抗原の存在下で、標識された(例えば、3Hまたは125Iで標識された)抗原またはその断片もしくは変種を関心対象の結合物質とインキュベーションした後に、標識抗原に結合した作用物質を検出する工程を含むラジオイムノアッセイである。抗原に対する作用物質の親和性および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから求めることができる。一部の態様において、抗原に結合する作用物質の結合オンレートおよびオフレートを求めるために、Biacore動態解析が用いられる。一部の態様において、Biacore動態解析は、抗原がチップ表面に固定化されているチップからの抗体の結合および解離を解析する工程を含む。一部の態様において、Biacore動態解析は、結合物質がチップ表面に固定化されているチップからの抗原の結合および解離を解析する工程を含む。
【０１４５】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質(例えば、抗体)が、抗体89M5のCDR(表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む、方法を提供する。
【０１４６】
【表１】
2017528523.tif 000024
【０１４７】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、
TGYTMH(SEQ ID NO:5)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000025
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000026
を含む重鎖CDR3を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO1結合物質は、
2017528523.tif 000027
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:9)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)
を含む軽鎖CDR3をさらに含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、
2017528523.tif 000028
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:9)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)
を含む軽鎖CDR3を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、
(a)
TGYTMH(SEQ ID NO:5)を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000029
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000030
を含む重鎖CDR3;ならびに
(b)
2017528523.tif 000031
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:9)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)
を含む軽鎖CDR3
を含む。
【０１４８】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体または二重特異性抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、
(a)
TGYTMH(SEQ ID NO:5)を含む重鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2017528523.tif 000032
を含む重鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(c)
2017528523.tif 000033
を含む重鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(d)
2017528523.tif 000034
を含む軽鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(e)
WASTRHT(SEQ ID NO:9)を含む軽鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;および
(f)
QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)を含む軽鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の態様において、置換は生殖系列ヒト化プロセスの一環としてなされる。
【０１４９】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、SEQ ID NO:11と少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:12と少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:11と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:12と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:11と少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および/またはSEQ ID NO:12と少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:11を含む重鎖可変領域、および/またはSEQ ID NO:12を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:11を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:12を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:11からなる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:12からなる軽鎖可変領域を含む。
【０１５０】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、SEQ ID NO:56と少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:57と少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:56と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:57と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:56と少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:57と少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:56を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:57を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:56を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:57を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:56からなる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:57からなる軽鎖可変領域を含む。
【０１５１】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、(a)SEQ ID NO:13もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO1結合物質は、(a)SEQ ID NO:13もしくはSEQ ID NO:14と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:14を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:16を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:14を含む重鎖およびSEQ ID NO:16を含む軽鎖を含む。
【０１５２】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1に特異的に結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO1結合物質が、(a)SEQ ID NO:58もしくはSEQ ID NO:59と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:60もしくはSEQ ID NO:61と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO1結合物質は、(a)SEQ ID NO:58もしくはSEQ ID NO:59と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:60もしくはSEQ ID NO:61と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:59を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:61を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、SEQ ID NO:59を含む重鎖およびSEQ ID NO:61を含む軽鎖を含む。
【０１５３】
ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、抗体h89M5-H8L5の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、抗体h89M5-H8L5の重鎖および軽鎖(リーダー配列を有する、またはリーダー配列を有さない)を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H8L5である。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、キメラ型の抗体の中に抗体h89M5-H8L5の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、抗RSPO1抗体はh89M5-H8L5である。
【０１５４】
ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、抗体h89M5-H2L2の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、抗体h89M5-H2L2の重鎖および軽鎖(リーダー配列を有する、またはリーダー配列を有さない)を含む。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H2L2である。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は、キメラ型の抗体の中に抗体h89M5-H2L2の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、抗RSPO1抗体はh89M5-H2L2である。
【０１５５】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、RSPO1結合物質は、抗体89M5の重鎖CDRおよび/または軽鎖CDRを含む。89M5抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ブダペスト条約の規定に基づいて、2011年6月30日に、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-11970が付与された。
【０１５６】
抗体h89M5-H8L5の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドは、ブダペスト条約の規定に基づいて、2014年8月15日に、ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-121494およびPTA-121495が付与された。一部の態様において、RSPO1結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-121494が付与されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-121495が付与されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-121494が付与されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域、およびATCCに寄託され、PTA-121495が付与されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-121494が付与されたプラスミドによってコードされる重鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-121495が付与されたプラスミドによってコードされる軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO1結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-121494が付与されたプラスミドによってコードされる重鎖、およびATCCに寄託され、PTA-121495が付与されたプラスミドによってコードされる軽鎖を含む。
【０１５７】
ある特定の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H8L5を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は抗体89M5の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H8L5の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１５８】
ある特定の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H2L2を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は抗体89M5の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO1結合物質は抗体h89M5-H2L2の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１５９】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質(例えば、抗体)は、抗体130M23のCDR(表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む、方法を提供する。
【０１６０】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、
SSYAMS(SEQ ID NO:21)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000035
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000036
を含む重鎖CDR3を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO2結合物質は、
2017528523.tif 000037
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:25)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTP(SEQ ID NO:26)
を含む軽鎖CDR3をさらに含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、
2017528523.tif 000038
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:25)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTP(SEQ ID NO:26)
を含む軽鎖CDR3を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、
(a)
SSYAMS(SEQ ID NO:21)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000039
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000040
を含む重鎖CDR3;ならびに
(b)
2017528523.tif 000041
を含む軽鎖CDR1、
WASTRHT(SEQ ID NO:25)
を含む軽鎖CDR2、および
QQHYSTP(SEQ ID NO:26)
を含む軽鎖CDR3を含む。
【０１６１】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体または二重特異性抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、
(a)
SSYAMS(SEQ ID NO:21)
を含む重鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2017528523.tif 000042
を含む重鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(c)
2017528523.tif 000043
を含む重鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(d)
2017528523.tif 000044
を含む軽鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(e)
WASTRHT(SEQ ID NO:25)
を含む軽鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;および
(f)
QQHYSTP(SEQ ID NO:26)
を含む軽鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の態様において、置換は生殖系列ヒト化プロセスの一環としてなされる。
【０１６２】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、SEQ ID NO:27と少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:28もしくはSEQ ID NO:66と少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:28と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:66と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27と少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:28もしくはSEQ ID NO:66と少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:28もしくはSEQ ID NO:66を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:28を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:66を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27からなる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:28からなる軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:27からなる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:66からなる軽鎖可変領域を含む。
【０１６３】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、(a)SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:32と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO2結合物質は、(a)SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:32と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:30を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:32を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:30を含む重鎖およびSEQ ID NO:32を含む軽鎖を含む。
【０１６４】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO2に特異的に結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO2結合物質が、(a)SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:67もしくはSEQ ID NO:68と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO2結合物質は、(a)SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:67もしくはSEQ ID NO:68と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:30を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:68を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO2結合物質は、SEQ ID NO:30を含む重鎖およびSEQ ID NO:68を含む軽鎖を含む。
【０１６５】
ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、抗体h130M23-H1L6の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、抗体h130M23-H1L6の重鎖および軽鎖(リーダー配列を有する、またはリーダー配列を有さない)を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L6である。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、キメラ型の抗体の中に抗体h130M23-H1L6の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、抗RSPO2抗体はh130M23-H1L6である。
【０１６６】
ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、抗体h130M23-H1L2の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、抗体h130M23-H1L2の重鎖および軽鎖(リーダー配列を有する、またはリーダー配列を有さない)を含む。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L2である。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は、キメラ型の抗体の中に抗体h130M23-H1L2の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、抗RSPO2抗体はh130M23-H1L2である。
【０１６７】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、RSPO2結合物質は、抗体130M23の重鎖CDRおよび/または軽鎖CDRを含む。130M23抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ブダペスト条約の規定に基づいて、2011年8月10日に、ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-12021が付与された。
【０１６８】
ある特定の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L6を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は抗体130M23の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L6の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１６９】
ある特定の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L2を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は抗体130M23の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO2結合物質は抗体h130M23-H1L2の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１７０】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO3結合物質(例えば、抗体)は、抗体131R011のCDR(本明細書の表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む、方法を提供する。
【０１７１】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法であって、RSPO3結合物質が、
DYSIH(SEQ ID NO:37)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000045
を含む重鎖CDR2、および
2017528523.tif 000046
を含む重鎖CDR3
を含む、方法を提供する。一部の態様において、RSPO3結合物質は、
2017528523.tif 000047
を含む軽鎖CDR1、
2017528523.tif 000048
を含む軽鎖CDR2、および
2017528523.tif 000049
を含む軽鎖CDR3
をさらに含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、
2017528523.tif 000050
を含む軽鎖CDR1、
2017528523.tif 000051
を含む軽鎖CDR2、および
2017528523.tif 000052
を含む軽鎖CDR3を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、
(a)
DYSIH(SEQ ID NO:37)
を含む重鎖CDR1、
2017528523.tif 000053
を含む重鎖CDR2、および
TYFANNFD(SEQ ID NO:39)
を含む重鎖CDR3;ならびに
(b)
2017528523.tif 000054
を含む軽鎖CDR1、
AASNLES (SEQ ID NO:42)
を含む軽鎖CDR2、および
2017528523.tif 000055
を含む軽鎖CDR3を含む。
【０１７２】
ある特定の態様において、本発明は、ヒトRSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体または二重特異性抗体)を含む方法であって、RSPO3結合物質が、
(a)
DYSIH(SEQ ID NO:37)
を含む重鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2017528523.tif 000056
を含む重鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(c)
2017528523.tif 000057
を含む重鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(d)
2017528523.tif 000058
を含む軽鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(e)
2017528523.tif 000059
を含む軽鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;および
(f)
2017528523.tif 000060
を含む軽鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種を含む、方法を提供する。ある特定の態様において、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の態様において、置換は生殖系列ヒト化プロセスの一環としてなされる。
【０１７３】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を提供し、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:46と少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:47と少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:46と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:47と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:46と少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:47と少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:46を含む重鎖可変領域、および/またはSEQ ID NO:47を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:46を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:47を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:46からなる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:47からなる軽鎖可変領域を含む。
【０１７４】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO3に特異的に結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を提供し、RSPO3結合物質は、(a)SEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:49と少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:50もしくはSEQ ID NO:51と少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、(a)SEQ ID NO:48もしくはSEQ ID NO:49と少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または(b)SEQ ID NO:50もしくはSEQ ID NO:51と少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:49を含む重鎖および/またはSEQ ID NO:51を含む軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、SEQ ID NO:49を含む重鎖およびSEQ ID NO:51を含む軽鎖を含む。
【０１７５】
ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、抗体131R010の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、抗体131R010の重鎖および軽鎖(リーダー配列を有する、またはリーダー配列を有さない)を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は抗体131R010である。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、キメラ型の抗体の中に抗体131R010の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は、抗体131R010の重鎖CDRおよび/または軽鎖CDRを含む。一部の態様において、抗RSPO3抗体は131R010である。
【０１７６】
抗体131R010の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドは、ブダペスト条約の規定に基づいて、2013年6月18日に、American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-120420およびPTA-120421が付与された。一部の態様において、RSPO3結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-120420が付与されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-120421が付与されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-120420が付与されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域およびATCCに寄託され、PTA-120421が付与されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-120420が付与されたプラスミドによってコードされる重鎖を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-120421が付与されたプラスミドによってコードされる軽鎖を含む。一部の態様において、RSPO3結合物質は、ATCCに寄託され、PTA-120420が付与されたプラスミドによってコードされる重鎖およびATCCに寄託され、PTA-120421が付与されたプラスミドによってコードされる軽鎖を含む。
【０１７７】
ある特定の態様において、RSPO3結合物質は抗体131R010を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ある特定の態様において、RSPO3結合物質は抗体131R010の変種を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０１７８】
本発明は、少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質に特異的に結合する抗体または少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質に特異的に結合する抗体を含むが、これに限定されないポリペプチドを含む方法を提供する。一部の態様において、ポリペプチドはヒトRSPO1に結合する。一部の態様において、ポリペプチドはヒトRSPO2に結合する。一部の態様において、ポリペプチドはヒトRSPO3に結合する。一部の態様において、ポリペプチドはヒトLGR4に結合する。一部の態様において、ポリペプチドはヒトLGR5に結合する。一部の態様において、ポリペプチドはヒトLGR6に結合する。本発明はまた、少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質に特異的に結合する可溶性受容体を含むポリペプチドを含む方法も提供する。
【０１７９】
ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、抗体89M5のCDR(本明細書の表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、抗体130M23のCDR(本明細書の表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、抗体131R010のCDR(本明細書の表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは、1つのCDRにつき4個まで(すなわち、0個、1個、2個、3個、または4個)のアミノ酸置換を有するCDRを含む。ある特定の態様において、重鎖CDRは重鎖可変領域内に含まれる。ある特定の態様において、軽鎖CDRは軽鎖可変領域内に含まれる。
【０１８０】
一部の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するポリペプチドを含む方法であって、前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:11および/またはSEQ ID NO:12と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:13と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:15と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:14と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:16と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:11と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:12と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:13と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:15と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:14と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:16と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:11のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む。
【０１８１】
一部の態様において、本発明は、ヒトRSPO1に特異的に結合するポリペプチドを含む方法であって、前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:56および/またはSEQ ID NO:57と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:58と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:60と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:59と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:61と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、またはSEQ ID NO:61と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:56と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:57と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:58と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:60と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:59と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:61と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:56のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:57のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:58のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:60のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:59のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:61のアミノ酸配列を含む。
【０１８２】
一部の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するポリペプチドを含む方法であって、前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:27および/またはSEQ ID NO:28と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、ヒトRSPO2に特異的に結合するポリペプチドを含む方法であって、前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:27および/またはSEQ ID NO:66と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:29と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:67と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:30と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:32もしくはSEQ ID NO:68と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、または SEQ ID NO:68と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:27と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:28もしくはSEQ ID NO:66と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:29と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:67と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:30と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:32もしくはSEQ ID NO:68と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:66のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:67のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:30のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:30のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:68のアミノ酸配列を含む。
【０１８３】
一部の態様において、本発明は、ヒトRSPO3に特異的に結合するポリペプチドを含む方法であって、前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:46および/またはSEQ DI NO:47と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法を提供する。一部の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:48と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:50と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:49と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:51と少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、またはSEQ ID NO:51と少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:46と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:47と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:48と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:50と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:49と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:51と少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:46のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:47のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:48のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:50のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:49のアミノ酸配列および/またはSEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む。
【０１８４】
抗体を含む多くのタンパク質は、タンパク質を様々な場所に輸送するシグナル配列を含有する。シグナル配列(シグナルペプチドまたはリーダー配列とも呼ばれる)は新生ポリペプチドのN末端に位置する。シグナル配列はポリペプチドを小胞体に標的化し、タンパク質は目的地に、例えば、細胞小器官の内部空間、内膜、細胞の外膜に仕分けされるか、または分泌を介して細胞外部に仕分けされる。タンパク質が小胞体に輸送された後に、ほとんどのシグナル配列はシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。ポリペプチドからのシグナル配列の切断は、通常、アミノ酸配列中の特異的部位において起こり、シグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。通常、一カ所の特異的切断部位があるが、複数の切断部位がシグナルペプチダーゼによって認識および/または使用されて、ポリペプチドの均質でないN末端が生じる場合がある。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位を用いると、異なるN末端アミノ酸を有する発現ポリペプチドを生じることができる。従って、一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドは、異なるN末端を有するポリペプチドの混合物を含んでもよい。一部の態様において、N末端の長さは1個、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸分だけ異なる。一部の態様において、ポリペプチドは実質的に均質である、すなわち、前記ポリペプチドは同じN末端を有する。一部の態様において、前記ポリペプチドのシグナル配列は、「天然」または「親」シグナル配列と比較して1つまたは複数の(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などの)アミノ酸置換および/または欠失を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドのシグナル配列は、一カ所の切断部位が優勢になり、それによって、あるN末端を有する実質的に均質なポリペプチドが生じるのを可能にするアミノ酸置換および/または欠失を含む。一部の態様において、前記ポリペプチドのシグナル配列はポリペプチドの発現レベルに影響を及ぼす、例えば、発現を増加または減少させる。
【０１８５】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1と、抗体89M5のCDRを含む抗体との特異的結合において競合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。ある特定の態様において、本発明は、RSPO2と、抗体130M23のCDRを含む抗体との特異的結合において競合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。ある特定の態様において、本発明は、RSPO3と、抗体131R010のCDRを含む抗体との特異的結合において競合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。
【０１８６】
ある特定の態様において、本発明は、RSPO1上にある、抗体89M5のCDRを含む抗体と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。ある特定の態様において、本発明は、RSPO2上にある、抗体89M5のCDRを含む抗体と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。ある特定の態様において、本発明は、RSPO3上にある、抗体131R010のCDRを含む抗体と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。
【０１８７】
ある特定の態様において、本発明は、抗体89M5のCDRを含む抗体が結合するRSPO1上にあるエピトープと重複する、RSPO1上にあるエピトープに結合するRSPO1結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。ある特定の態様において、本発明は、抗体130M23のCDRを含む抗体が結合するRSPO2上にあるエピトープと重複する、RSPO2上にあるエピトープに結合するRSPO2結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。ある特定の態様において、本発明は、抗体131R010のCDRを含む抗体が結合するRSPO3上にあるエピトープと重複する、RSPO3上にあるエピトープに結合するRSPO3結合物質(例えば、抗体)を含む方法を提供する。
【０１８８】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、本明細書に記載のRSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質に結合し、RSPO活性を調整する。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPOアンタゴニストであり、RSPO活性を減少させる。一部の態様において、RSPO結合物質はRSPOアンタゴニストであり、β-カテニン活性を減少させる。
【０１８９】
ある特定の態様において、本明細書に記載のRSPO1結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)はヒトRSPO1に結合し、RSPO1活性を調整する。一部の態様において、RSPO1結合物質はRSPO1アンタゴニストであり、RSPO1活性を減少させる。一部の態様において、RSPO1結合物質はRSPO1アンタゴニストであり、β-カテニン活性を減少させる。ある特定の態様において、本明細書に記載のRSPO2結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)はヒトRSPO2に結合し、RSPO2活性を調整する。一部の態様において、RSPO2結合物質はRSPO2アンタゴニストであり、RSPO2活性を減少させる。一部の態様において、RSPO2結合物質はRSPO2アンタゴニストであり、β-カテニン活性を減少させる。ある特定の態様において、本明細書に記載のRSPO3結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)はヒトRSPO3に結合し、RSPO3活性を調整する。一部の態様において、RSPO3結合物質はRSPO3アンタゴニストであり、RSPO3活性を減少させる。一部の態様において、RSPO3結合物質はRSPO3アンタゴニストであり、β-カテニン活性を減少させる。
【０１９０】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質のアンタゴニストである。一部の態様において、RSPO結合物質は少なくとも1種類のRSPOのアンタゴニストであり、RSPO活性を阻害する。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、RSPO活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。一部の態様において、RSPO結合物質は、1種類、2種類、3種類、または4種類のRSPOタンパク質の活性を阻害する。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4の活性を阻害する。
【０１９１】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質のアンタゴニストである。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、RSPOシグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。一部の態様において、RSPO結合物質は、1種類、2種類、3種類、または4種類のRSPOタンパク質によるシグナル伝達を阻害する。一部の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPO1、RSPO2、RSPO3、および/またはRSPO4のシグナル伝達を阻害する。
【０１９２】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)はβ-カテニンシグナル伝達のアンタゴニストである。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、β-カテニンシグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。
【０１９３】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、少なくとも1種類のRSPOタンパク質と受容体との結合を阻害する。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPOタンパク質と、その受容体の1つまたは複数との結合を阻害する。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPOタンパク質と少なくとも1種類のLGRタンパク質との結合を阻害する。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPOタンパク質とLGR4、LGR5、および/またはLGR6との結合を阻害する。ある特定の態様において、RSPO結合物質と少なくとも1種類のLGRタンパク質との結合は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％阻害される。ある特定の態様において、少なくとも1種類のRSPOと少なくとも1種類のLGRタンパク質との結合を阻害するRSPO結合物質は、さらに、β-カテニンシグナル伝達を阻害する。
【０１９４】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)は、少なくとも1種類のRSPOと受容体との結合をブロックする。ある特定の態様において、RSPO結合物質は、ヒトRSPOタンパク質と、その受容体の1つまたは複数との結合をブロックする。一部の態様において、RSPO結合物質は、RSPOと少なくとも1種類のLGRタンパク質との結合をブロックする。一部の態様において、RSPO結合物質は、少なくとも1種類のRSPOタンパク質とLGR4、LGR5、および/またはLGR6との結合をブロックする。ある特定の態様において、RSPO結合物質と少なくとも1種類のLGRタンパク質との結合は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％ブロックされる。ある特定の態様において、少なくとも1種類のRSPOタンパク質と少なくとも1種類のLGRタンパク質との結合をブロックするRSPO結合物質は、さらに、β-カテニンシグナル伝達を阻害する。
【０１９５】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)はβ-カテニンシグナル伝達を阻害する。β-カテニンシグナル伝達を阻害するRSPO結合物質は、ある特定の態様では、β-カテニンシグナル伝達経路にある1種類または複数種類の受容体によるシグナル伝達を阻害することができるが、必ずしも、全種類の受容体によるシグナル伝達を阻害するわけではないことが理解される。ある特定の他の態様では、全種類のヒト受容体によるβ-カテニンシグナル伝達が阻害されてもよい。ある特定の態様において、LGR4、LGR5、およびLGR6からなる群より選択される1種類または複数種類の受容体によるβ-カテニンシグナル伝達が阻害される。ある特定の態様において、RSPO結合物質によってβ-カテニンシグナル伝達が阻害されるとは、β-カテニンシグナル伝達レベルが少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％低下することである。
【０１９６】
ある特定の態様において、RSPO結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)はβ-カテニン活性化を阻害する。β-カテニン活性化を阻害するRSPO結合物質は、ある特定の態様では、1種類または複数種類の受容体によるβ-カテニン活性化を阻害することができるが、必ずしも、全種類の受容体によるβ-カテニン活性化を阻害するわけではないことが理解される。ある特定の他の態様では、全種類のヒト受容体によるβ-カテニン活性化が阻害されてもよい。ある特定の態様において、LGR4、LGR5、およびLGR6からなる群より選択される1種類または複数種類の受容体によるβ-カテニン活性化が阻害される。ある特定の態様において、RSPO結合物質によってβ-カテニン活性化が阻害されるとは、β-カテニン活性化レベルが少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％低下することである。
【０１９７】
RSPO結合物質またはLGR結合物質(または候補結合物質)がβ-カテニンシグナル伝達を阻害するかどうか確かめるためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイは当技術分野において公知である。例えば、インビトロでβ-カテニンシグナル伝達レベルを測定するために、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に複数コピーのTCF結合ドメインを含有するTCF/Lucレポーターベクターを用いた、細胞をベースとするルシフェラーゼレポーターアッセイが用いられることがある(Gazit et al., 1999, Oncogene, 18; 5959-66; TOPflash, Millipore, Billerica MA)。RSPO結合物質が存在する条件における、RSPOタンパク質またはRSPO培養上清有りまたは無しでの1種類または複数種類のWnt(例えば、トランスフェクト細胞によって発現されたWntまたはWnt培養上清によって供給されたWnt)の存在下でのβ-カテニンシグナル伝達レベルを、RSPO結合物質が存在しない条件でのシグナル伝達レベルと比較する。TCF/Lucレポーターアッセイに加えて、β-カテニンシグナル伝達に対するRSPO結合物質もしくはLGR結合物質(または候補物質)の作用は、β-カテニンにより調節される遺伝子、例えば、c-myc(He et al., 1998, Science, 281:1509-12)、サイクリンD1(Tetsu et al., 1999, Nature, 398:422-6)、および/またはフィブロネクチン(Gradl et al., 1999, Mol. Cell Biol., 19:5576-87)の発現レベルに対する前記作用物質の作用を測定することによってインビトロまたはインビボで測定することができる。ある特定の態様では、β-カテニンシグナル伝達に対するRSPO結合物質またはLGR結合物質の作用はまた、Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6、および/またはβ-カテニンのリン酸化状態に対する前記作用物質の作用を測定することによって評価することもできる。
【０１９８】
ある特定の態様において、本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質は、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間のマウス、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期を有する。ある特定の態様では、RSPO結合物質またはLGR結合は、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間のマウス、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期を有するIgG(例えば、IgG1またはIgG2)抗体である。ポリペプチドおよび抗体などの作用物質の半減期を延ばす(または短くする)方法は当技術分野において公知である。例えば、IgG抗体の循環半減期を延ばす公知の方法には、pH6.0での抗体と新生児型Fc受容体(FcRn)とのpH依存性結合を高める、Fc領域への変異の導入が含まれる。Fc領域を欠く抗体断片の循環半減期を延ばす公知の方法にはペグ化のような技法が含まれる。
【０１９９】
一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は任意の公知の方法によって調製することができる。一部の態様において、ポリクローナル抗体は、複数回の皮下注射または腹腔内注射を用いて、関心対象の抗原(精製されたペプチド断片、完全長組換えタンパク質、または融合タンパク質)で動物(例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ロバ)を免疫することによって産生される。抗原は、任意で、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)または血清アルブミンなどの担体と結合体化することができる。抗原(担体タンパク質をもつ、または担体タンパク質をもたない)は滅菌食塩水で希釈され、通常、安定したエマルジョンを形成するためにアジュバント(例えば、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント)と組み合わせられる。十分な時間がたった後に、ポリクローナル抗体は、免疫された動物、通常、血液または腹水から回収される。ポリクローナル抗体は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を含むが、これに限定されない当技術分野における標準的な方法に従って血清または腹水から精製することができる。
【０２００】
一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知のハイブリドーマ法を用いて調製することができる。一部の態様では、ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を上述のように免疫して、免疫に用いた抗原に特異的に結合する抗体の産生をリンパ球から誘発させる。一部の態様では、リンパ球はインビトロで免疫することができる。一部の態様では、免疫に用いる抗原はヒトタンパク質またはその一部でもよい。一部の態様では、免疫に用いる抗原はマウスタンパク質またはその一部でもよい。
【０２０１】
免疫に続いてリンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを用いて適切なミエローマ細胞株と融合させる。ハイブリドーマ細胞を、当技術分野において公知の特殊な培地を用いて選択する。融合しなかったリンパ球とミエローマ細胞は選択プロセスを生き延びない。選択された抗原に対して特異的に作られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫沈降、イムノブロッティング、ならびにインビトロ結合アッセイ(例えば、フローサイトメトリー、FACS、ELISA、およびラジオイムノアッセイ)を含むが、これに限定されない様々な方法によって特定されることがある。ハイブリドーマはインビトロ培養で標準的な方法を用いて増殖されてもよく、インビボで動物の中で腹水腫瘍として増殖されてもよい。モノクローナル抗体は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を含むが、これに限定されない当技術分野において標準的な方法に従って培養培地または腹水から精製することができる。
【０２０２】
ある特定の態様において、モノクローナル抗体は、当業者に公知のように組換えDNA法を用いて作製する場合ができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるRT-PCRによって単離し、それらの配列を、標準的な技法を用いて決定する。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクター中へクローニングし、それを、トランスフェクションされていなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはミエローマ細胞にトランスフェクションによって導入すると、宿主細胞はモノクローナル抗体を産生する。
【０２０３】
ある特定の他の態様において、組換えモノクローナル抗体またはその断片は、望ましい種の可変ドメインまたはCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することができる。
【０２０４】
さらに、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、組換えDNA技術を用いることによって、代わりの抗体を生じるように改変することができる。一部の態様では、キメラ抗体を作製するためには、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、例えば、ヒト抗体の領域で、または融合抗体を作製するためには非免疫グロブリンポリペプチドで置換することができる。一部の態様では、モノクローナル抗体の望ましい抗体断片を作製するために、定常領域は切断または除去される。可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。
【０２０５】
本明細書に記載の方法の一部の態様において、ヒトRSPOタンパク質またはLGRタンパク質に対するモノクローナル抗体はヒト化抗体である。典型的には、ヒト化抗体は、当業者に公知の方法を用いて、CDR由来の残基が、望ましい特異性、親和性、および/または結合能力を有する非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど)のCDR由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである。一部の態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基は、非ヒト種由来の抗体中の対応する残基と置き換えられる。一部の態様において、ヒト化抗体は、Fvフレームワーク領域中および/または置き換えられた非ヒト残基内のさらなる残基の置換によってさらに改変されて、抗体の特異性、親和性、および/または能力を改良および最適化することができる。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応する全てまたは実質的に全てのCDRを含む可変ドメイン領域を含むのに対して、全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。一部の態様において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部を含むことができる。ある特定の態様において、このようなヒト化抗体は、ヒト対象に投与された時に抗原性およびHAMA(ヒト抗マウス抗体)応答を低減する可能性があるので治療に用いられる。
【０２０６】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技法を用いて直接、調製することができる。一部の態様において、ヒト抗体は、インビトロで免疫された不死化ヒトBリンパ球から作製されてもよく、免疫された個体から単離されたリンパ球から作製されてもよい。どちらの場合でも、標的抗原に対して作られた抗体を産生する細胞を作製および単離することができる。一部の態様において、ヒト抗体を発現するファージライブラリーからヒト抗体を選択することができる。または、ファージディスプレイ技術を用いて、インビトロで、未免疫ドナーに由来する免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片を生成することができる。抗体ファージライブラリーを作製および使用するための技法は周知であり、ファージライブラリーは市販されている。抗体が特定されたら、高親和性ヒト抗体を作製するために、鎖シャッフリング(chain shuffling)、ドメインシャッフリング(domain shuffling)、および部位特異的変異誘発を含むが、これに限定されない当技術分野において公知の親和性成熟戦略が用いられる場合がある。
【０２０７】
一部の態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作製することができる。免疫されると、これらのマウスは、内因性の免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の全レパートリーを産生することができる。
【０２０８】
本発明はまた、少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質および/または少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質を特異的に認識する二重特異性抗体も包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原またはエピトープを特異的に認識および結合することができる。異なるエピトープは同じ分子の中にあってもよく(例えば、2つのエピトープはヒトRSPO1上にある)、異なる分子上にあってもよい(例えば、1つのエピトープはRSPO1上にあり、1つのエピトープはLGR5上にある)。一部の態様において、二重特異性抗体の効力は個々の抗体と比較して、または複数種類の抗体の組み合わせと比較して高い。一部の態様において、二重特異性抗体の毒性は個々の抗体と比較して、または複数種類の抗体の組み合わせと比較して低い。どの結合物質(例えば、抗体)も特有の薬物動態(PK)(例えば、循環半減期)を有し得ることは当業者に公知である。一部の態様において、二重特異性抗体には、2種類の活性結合物質のPKを同時発生させる能力がある。この場合、2種類の個々の結合物質のPKプロファイルは異なる。一部の態様において、二重特異性抗体には、2種類の結合物質(例えば、抗体)の働きを共通の領域(例えば、特異的組織)に集める能力がある。一部の態様において、二重特異性抗体には、2種類の結合物質(例えば、抗体)の働きを共通の標的(例えば、特異的組織)に集める能力がある。一部の態様において、二重特異性抗体には、2種類の結合物質(例えば、抗体)の働きを複数の生物学的経路または生物学的機能に標的化する能力がある。
【０２０９】
一部の態様において、二重特異性抗体はモノクローナル抗体である。一部の態様において、二重特異性抗体はヒト化抗体である。一部の態様において、二重特異性抗体はヒト抗体である。一部の態様において、二重特異性抗体はIgG1抗体である。一部の態様において、二重特異性抗体はIgG2抗体である。一部の態様において、二重特異性抗体は毒性および/または副作用が弱い。一部の態様において、二重特異性抗体は、2種類の個々の抗体の混合物または単一の作用物質である抗体と比較して毒性および/または副作用が弱い。一部の態様において、二重特異性抗体は治療指数が高い。一部の態様において、二重特異性抗体は、2種類の個々の抗体の混合物または単一の作用物質である抗体と比較して治療指数が高い。
【０２１０】
一部の態様において、細胞防御機構を、第1の抗原標的を発現および/または産生する細胞に焦点を合わせるために、前記抗体は第1の抗原標的(例えば、RSPO2)ならびに第2の抗原標的、例えば、白血球表面にあるエフェクター分子(例えば、CD2、CD3、CD28、CTLA-4、CD80、もしくはCD86)またはFc受容体(例えば、CD64、CD32、もしくはCD16)を特異的に認識および結合することができる。一部の態様において、前記抗体は、細胞傷害剤を、特定の標的抗原を発現する細胞に向けるのに使用することができる。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害剤または放射性核種キレート剤、例えば、EOTUBE、DPTA、DOTA、もしくはTETAに結合するアームを有する。
【０２１１】
二重特異性抗体を作製するための技法は当業者に公知である。一部の態様において、二重特異性抗体は、2本の重鎖間にある境界面の一部であるアミノ酸が改変された重鎖定常領域を含む。一部の態様において、二重特異性抗体は「ノブ-イントゥ-ホール(knob-into-hole)」戦略を用いて作製することができる。場合によっては、「ノブ」および「ホール」という専門用語は「突起」および「空洞」という用語と置き換えられる。一部の態様において、二重特異性抗体は、重鎖間でジスルフィド結合を形成することができない変種ヒンジ領域を含んでもよい。一部の態様において、改変は、静電相互作用を変えるアミノ酸変化を含んでもよい。一部の態様において、改変は、疎水性相互作用/親水性相互作用を変えるアミノ酸変化を含んでもよい。
【０２１２】
二重特異性抗体は無傷の抗体でもよく、抗原結合部位を含む抗体断片でもよい。結合価が2を超える抗体も意図される。従って、ある特定の態様において、RSPOタンパク質に対する抗体は多重特異性である。
【０２１３】
ある特定の態様において、本明細書に記載の抗体(または他のポリペプチド)は単一特異性でもよい。ある特定の態様において、抗体が含有する1つまたは複数の抗原結合部位はそれぞれ、RSPOタンパク質上にある相同エピトープまたはLGRタンパク質上にある相同エピトープに結合することができる(または結合する)。ある特定の態様において、本明細書に記載の単一特異性抗体の抗原結合部位は、例えば、RSPO2およびRSPO3に結合することができる(または結合する)(すなわち、同じエピトープがRSPO2タンパク質とRSPO3タンパク質の両方に見られる)。
【０２１４】
本明細書に記載の方法のある特定の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は抗体断片である。抗体断片は、無傷の抗体とは異なる機能または能力を有する場合がある。例えば、抗体断片は高い組織浸透力を有することがある。無傷の抗体のタンパク質分解消化を含むが、これに限定されない、抗体断片を生成するための様々な技法が公知である。一部の態様において、抗体断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF(ab')2断片が含まれる。一部の態様において、抗体断片には、F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片が含まれる。他の態様において、抗体断片には、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製されるFab断片が含まれる。ある特定の態様において、抗体断片は組換えによって生成される。一部の態様において、抗体断片には、Fvまたは単鎖Fv(scFv)断片が含まれる。Fab、Fv、およびscFv抗体断片は大腸菌または他の宿主細胞の中で発現させ、大腸菌または他の宿主細胞から分泌させることができ、これにより、これらの断片を多量に産生することが可能になる。一部の態様において、抗体断片は、本明細書に記載の抗体ファージライブラリーから単離される。例えば、RSPOタンパク質またはその誘導体、断片、類似体、もしくはホモログに対して望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片を迅速かつ効果的に特定するためにFab発現ライブラリーを構築するための方法を使用することができる。一部の態様において、抗体断片は直鎖抗体断片である。ある特定の態様において、抗体断片は単一特異性または二重特異性である。ある特定の態様において、RSPO結合物質はscFvである。1種類もしくは複数種類のヒトRSPOタンパク質または1種類もしくは複数種類のヒトLGRタンパク質に特異的な単鎖抗体を生成するために様々な技法を使用することができる。
【０２１５】
さらに、特に抗体断片の場合、抗体の血清半減期を変える(例えば、延ばす、または短くする)ように抗体を改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、サルベージ(salvage)受容体結合エピトープを前記抗体断片に組み込むことによって、前記抗体断片にある適切な領域を変異させることによって、またはペプチドタグにエピトープを組み込み、次いで、これを、(例えば、DNA合成もしくはペプチド合成によって)どちらかの端に、もしくは中央で前記抗体断片と融合させることによって達成することができる。
【０２１６】
ヘテロ結合抗体も本発明の範囲内にある。ヘテロ結合抗体は、共有結合した2種類の抗体で構成される。例えば、免疫細胞を不必要な細胞に標的化するために、このような抗体が提案されている。ヘテロ結合抗体は、架橋剤が関与する方法を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製できることも考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエテール結合を形成することによって免疫毒素を構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミダートが含まれる。
【０２１７】
本発明の目的では、改変された抗体は、前記抗体と標的(すなわち、ヒトRSPO)を会合させる任意のタイプの可変領域を含んでもよいことが理解されるはずである。これに関して、可変領域は、体液性応答を開始し、望ましい抗原に対する免疫グロブリンを発生するように誘導することができる任意のタイプの哺乳動物を含んでもよく、体液性応答を開始し、望ましい抗原に対する免疫グロブリンを発生するように誘導することができる任意のタイプの哺乳動物に由来してもよい。従って、改変された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル、マカクなど)、またはウサギに由来する可変領域でもよい。一部の態様において、改変された免疫グロブリンの可変領域と定常領域は両方ともヒトである。他の態様において、適合性抗体(通常、非ヒト供給源に由来する)の可変領域は、分子の結合特性を改善するように、または免疫原性を弱めるように操作されてもよく、特別に合わせられてもよい。これに関して、本発明において有用な可変領域はヒト化されもよく、移入アミノ酸配列を含めることによって他の方法で変えられてもよい。
【０２１８】
ある特定の態様において、重鎖および軽鎖の両方にある可変ドメインは、1つまたは複数のCDRの少なくとも部分的な交換によって変えられ、必要に応じて、部分的なフレームワーク領域交換ならびに配列の改変および/または変化によって変えられる。CDRは、フレームワーク領域が得られた抗体と同じクラス、さらにはサブクラスの抗体に由来してもよいが、異なるクラスの抗体から、多くの場合、異なる種に由来する抗体からCDRが得られる場合があることが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移すために、全CDRを、ドナー可変領域に由来する全CDRと交換することが必要でない場合がある。逆に、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すことだけ必要な場合がある。
【０２１９】
可変領域への変化にもかかわらず、当業者は、天然の定常領域または変化していない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した時に、本発明の改変された抗体が、高い組織局在化または長い血清半減期などの望ましい生化学的特性を得るように定常領域ドメインの1つまたは複数の少なくとも一部分が欠失されている、または他の方法で変えられている抗体(例えば、完全長抗体またはその免疫反応性断片)を含むことを理解する。一部の態様において、改変された抗体の定常領域はヒト定常領域を含む。本発明と適合する定常領域への改変は、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。本明細書において開示された改変された抗体は、3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2、もしくはCH3)の1つもしくは複数、および/または軽鎖定常ドメイン(CL)への変化または改変を含んでもよい。一部の態様において、1つまたは複数のドメインは、改変された抗体の定常領域から部分的にまたは完全に欠失されている。一部の態様において、改変された抗体は、CH2ドメイン全体が取り除かれているドメイン欠失構築物または変種(ΔCH2構築物)を含む。一部の態様において、取り除かれる定常領域ドメインは、典型的には、存在しない定常領域によって付与される分子柔軟性の一部をもたらす短いアミノ酸スペーサー(例えば、10個の残基)と交換される。
【０２２０】
一部の態様において、改変された抗体は、CH3ドメインを前記抗体のヒンジ領域に直接、融合させるように操作される。他の態様では、ヒンジ領域と、改変されたCH2ドメインおよび/またはCH3ドメインとの間にペプチドスペーサーが挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失されており、5〜20アミノ酸スペーサーを用いて、残っているCH3ドメイン(改変または非改変)がヒンジ領域とつなげられている構築物が発現されてもよい。このようなスペーサーを付加することにより、定常ドメインの調節エレメントを遊離状態でアクセス可能に保つこと、またはヒンジ領域の可撓性を保つことができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは場合によっては免疫原性を有することが判明しており、構築物に対する望ましくない免疫応答を誘発する場合があることに留意しなければならない。従って、ある特定の態様では、改変された抗体の望ましい生物学的特性が維持されるように、構築物に付加されるどのスペーサーも比較的、免疫原性がない。
【０２２１】
一部の態様において、改変された抗体には、定常ドメインの部分的欠失、または数個のアミノ酸の置換、それどころか1個のアミノ酸の置換しかなくてもよい。例えば、Fc結合を大幅に低減させ、それによって、細胞局在化および/または組織浸透力を高めるには、CH2ドメインの選択された領域にある1個のアミノ酸を変異させることで十分な場合がある。同様に、調整しようとする特定のエフェクター機能(例えば、補体C1q結合)を制御する1つまたは複数の定常領域ドメインの一部を単に欠失させることが望ましい場合がある。このような定常領域の部分的欠失は、この定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能をそのままにしながら、抗体の選択された特性(血清半減期)を改善する可能性がある。さらに、上記で言及したように、開示された抗体の定常領域は、結果として生じる構築物のプロファイルを向上させる、1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって改変されてもよい。この点で、改変された抗体の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位(例えば、Fc結合)によって提供される活性を混乱させることが可能な場合がある。ある特定の態様において、改変された抗体は、エフェクター機能の減少もしくは増加などの望ましい特性を強化するような、または細胞毒素もしくは炭水化物接着部位をもっと増やすような、定常領域への1個または複数個のアミノ酸の付加を含む。
【０２２２】
定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することは当技術分野において公知である。例えば、補体のC1成分と、(抗原に結合した)IgG抗体またはIgM抗体のFc領域が結合すると補体系が活性化される。補体活性化は細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体活性化はまた炎症応答も刺激し、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、抗体のFc領域は、Fc受容体(FcR)を発現する細胞に結合することができる。IgG(γ受容体)、IgE(ε受容体)、IgA(α受容体)、およびIgM(μ受容体)を含む異なるクラスの抗体に特異的な多くのFc受容体がある。抗体と、細胞表面上のFc受容体が結合すると、貪食および抗体コーティング粒子の破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解(抗体依存性細胞傷害またはADCCと呼ばれる)、炎症メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む多くの重要かつ多様な生物学的応答が誘発される。
【０２２３】
ある特定の態様において、改変された抗体はエフェクター機能の変化をもたらし、次に、これにより、投与された抗体の生物学的プロファイルが影響を受ける。例えば、一部の態様では、(点変異または他の手段によって)定常領域ドメインが欠失または不活性化すると、改変された循環抗体のFc受容体結合が低下し、それによって、細胞局在化および/または組織浸透力が増大する可能性がある。他の態様において、定常領域の改変は前記抗体の血清半減期を延ばす。他の態様において、定常領域の改変は前記抗体の血清半減期を短くする。一部の態様において、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を無くすように定常領域は改変される。本発明による定常領域の改変は、周知の生化学的または分子的な操作法を用いて容易に行われる場合がある。
【０２２４】
ある特定の態様において、抗体であるRSPO結合物質またはLGR結合物質には1つまたは複数のエフェクター機能がない。例えば、一部の態様において、前記抗体にはADCC活性がない、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)活性がない。ある特定の態様において、前記抗体はFc受容体および/または補体因子に結合しない。ある特定の態様において、前記抗体にはエフェクター機能がない。
【０２２５】
本発明は、本明細書において示されたキメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体、またはその抗体断片と実質的に相同な変種および均等物をさらに含む。これらは、例えば、保存的置換変異、すなわち、類似するアミノ酸による1つまたは複数のアミノ酸の置換を含有してもよい。
【０２２６】
ある特定の態様において、本明細書に記載の抗体は単離される。ある特定の態様において、本明細書に記載の抗体は実質的に純粋である。
【０２２７】
本発明の一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質はポリペプチドである。前記ポリペプチドは、少なくとも1種類のRSPOタンパク質および/または少なくとも1種類のLGRタンパク質に結合する、抗体またはその断片を含む組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドでもよい。本発明のアミノ酸配列の中には、タンパク質の構造または機能に重大な影響を及ぼすことなく変えることができるものもあることが当技術分野において認められる。従って、本発明は、かなりの活性を示すか、またはヒトRSPOタンパク質もしくはヒトLGRタンパク質に対する抗体の領域もしくはその断片を含むポリペプチドのバリエーションをさらに含む。一部の態様において、RSPO結合ポリペプチドまたはLGR結合ポリペプチドのアミノ酸配列のバリエーションには、欠失、挿入、逆位、反復、および他のタイプの置換が含まれる。
【０２２８】
ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドは単離される。ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドは実質的に純粋である。
【０２２９】
前記ポリペプチド、その類似体、および変種は、通常、ポリペプチドの一部にはない、さらなる化学部分を含有するように、さらに改変することができる。誘導体化部分はポリペプチドの溶解度、生物学的半減期、および/または吸収を改善するか、または他の方法で調整することができる。これらの部分はまた、ポリペプチドおよび変種の望ましくない副作用を低減するか、または無くすこともできる。化学部分の概要は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, Londonにおいて見ることができる。
【０２３０】
本明細書に記載のポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって生成することができる。このような方法は、直接的なタンパク質合成法から、ポリペプチド配列をコードするDNA配列の構築、および適切な宿主におけるこれらの配列の発現に及ぶ。一部の態様において、DNA配列は、組換え技術を用いて、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離または合成することによって構築される。任意で、この配列は、その機能類似体を得るために部位特異的変異誘発によって変異誘発することができる。
【０２３１】
一部の態様において、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によって構築される場合がある。オリゴヌクレオチドは、望ましいポリペプチドのアミノ酸配列と、関心対象の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好ましいコドンを選択することに基づいて設計することができる。標準的な方法を適用して、関心対象の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳(back-translate)した遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、望ましいポリペプチドの一部をコードする、いくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的に組み立てるための5'オーバーハングまたは3'オーバーハングを含有する。
【０２３２】
関心対象の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を(合成、部位特異的変異誘発、または別の方法によって)組み立てたら、発現ベクターに挿入し、望ましい宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に機能的に連結することができる。適切に組み立てられたことは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および/または適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確かめることができる。当技術分野において周知のように、宿主におけるトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るためには、遺伝子を、選択された発現宿主において機能する転写発現制御配列および翻訳発現制御配列に機能的に連結しなければならない。
【０２３３】
ある特定の態様では、ヒトRSPOタンパク質またはヒトLGRタンパク質に対する抗体またはその断片をコードするDNAを増幅および発現するために組換え発現ベクターが用いられる。例えば、組換え発現ベクターは、RSPO結合物質、例えば、抗RSPO抗体またはその断片のポリペプチド鎖をコードする合成DNA断片またはcDNA由来DNA断片が、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、または昆虫遺伝子に由来する適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに機能的に連結されている複製可能なDNA構築物でもよい。転写単位は、一般的に、(1)遺伝子発現を調節する役割を有する遺伝因子またはエレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、(2)mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに(3)適切な転写および翻訳の開始配列および終結配列の集合を含む。調節エレメントは、転写を制御するオペレーター配列を含むことがある。通常、複製起点によって付与される、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込むことができる。DNA領域は、これらの機能が互いに関連しているときに「機能的に連結」されている。例えば、シグナルペプチド(分泌リーダー)のDNAは、ポリペプチド分泌に関与する前駆体としてポリペプチドが発現されるのであれば、ポリペプチドDNAに機能的に連結されている。プロモーターは、コード配列の転写を制御すれば、コード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位は、コード配列が翻訳されるように配置されていれば、コード配列に機能的に連結されている。一部の態様において、酵母発現系における使用を目的とした構造エレメントには、宿主細胞により翻訳されるタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。他の態様において、組換えタンパク質がリーダー配列も輸送配列もなく発現される状況では、N末端メチオニン残基を含むことがある。この残基は、任意で、最終産物を得るために発現組換えタンパク質から後で切断することができる。
【０２３４】
発現制御配列および発現ベクターの選択は宿主の選択によって決まる。多種多様な発現宿主/ベクターの組み合わせを使用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド、例えば、pCR1、pBR322、pMB9、およびその誘導体を含む大腸菌に由来するプラスミド、さらに広い宿主域のプラスミド、例えば、M13、ならびに他の繊維状一本鎖DNAファージが含まれる。
【０２３５】
本発明のRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、ポリペプチドまたは抗体)は1つまたは複数のベクターから発現させることができる。例えば、一部の態様において、ある1つの重鎖ポリペプチドは、あるベクターによって発現され、第2の重鎖ポリペプチドは第2のベクターによって発現され、軽鎖ポリペプチドは第3のベクターによって発現される。一部の態様において、第1の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、ある1つのベクターによって発現され、第2の重鎖ポリペプチドは第2のベクターによって発現される。一部の態様において、2種類の重鎖ポリペプチドは、ある1つのベクターによって発現され、軽鎖ポリペプチドは第2のベクターによって発現される。一部の態様において、3種類のポリペプチドは、ある1つのベクターによって発現される。従って、一部の態様において、第1の重鎖ポリペプチド、第2の重鎖ポリペプチド、および軽鎖ポリペプチドは、単一のベクターによって発現される。
【０２３６】
RSPO結合物質もしくはLGR結合物質(または抗原として使用するRSPOタンパク質もしくはLGRタンパク質)を発現させるのに適した宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母細胞、昆虫細胞、または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または桿菌が含まれる。高等真核細胞には、下記に記載の哺乳動物に由来する樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も用いられることがある。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳動物細胞宿主と使用するのに適した適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは当業者に公知である。
【０２３７】
組換えポリペプチドを発現させるために様々な哺乳動物培養系が用いられることがある。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、このようなタンパク質がおおむね正しく折り畳まれ、適切に修飾され、かつ生物学的に機能するので望ましい場合がある。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、COS-7(サル腎臓由来)、L-929(マウス線維芽細胞由来)、C127(マウス乳癌由来)、3T3(マウス線維芽細胞由来)、CHO(チャイニーズハムスター卵巣由来)、HeLa(ヒト子宮頚癌由来)、BHK(ハムスター腎臓線維芽細胞由来)、HEK-293(ヒト胚腎臓由来)細胞株、およびその変種が含まれるが、これに限定されない。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結される適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5'または3'隣接非転写配列、ならびに5'または3'非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含むことができる。
【０２３８】
昆虫細胞培養系(例えば、バキュロウイルス)における組換えタンパク質の発現もまた、正しく折り畳まれ、かつ生物学的に機能するタンパク質を産生するための頑強な方法を提供する。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は当業者に周知である。
【０２３９】
形質転換宿主により産生されたタンパク質は任意の適切な方法に従って精製することができる。標準的な方法には、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびサイジング(sizing)カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技法が含まれる。適切なアフィニティカラム上での通過による容易な精製を可能にするために、アフィニティタグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼをタンパク質に取り付けることができる。免疫グロブリンを精製するために用いられるアフィニティクロマトグラフィーには、プロテインA、プロテインG、およびプロテインLクロマトグラフィーが含まれ得る。単離されたタンパク質は、タンパク質分解、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、質量分析法(MS)、核磁気共鳴(NMR)、等電点電気泳動(IEF)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、およびX線結晶学のような技法を用いて物理的に特徴付けることができる。単離されたタンパク質の純度は、SDS-PAGE、SEC、キャピラリーゲル電気泳動、IEF、およびキャピラリー等電点電気泳動(cIEF)を含むが、これに限定されない当業者に公知の技法を用いて求めることができる。
【０２４０】
一部の態様において、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて、組換えタンパク質を培養培地に分泌する発現系からの上清を濃縮することができる。濃縮工程後に、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することができる。一部の態様において、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックスまたは支持体を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般的に用いられる他のタイプでもよい。一部の態様において、陽イオン交換工程を使用することができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリックスが含まれる。一部の態様において、セラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含むが、これに限定されないヒドロキシアパタイト培地を使用することができる。ある特定の態様において、組換えタンパク質(例えば、RSPO結合物質)をさらに精製するために、疎水性RP-HPLC媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた1つまたは複数の逆相HPLC工程を使用することができる。均質な組換えタンパク質を得るために、前述の精製工程の一部または全てを様々な組み合わせで使用することができる。
【０２４１】
一部の態様において、二重特異性抗体などのヘテロ二量体タンパク質は、本明細書に記載の任意の方法に従って精製される。一部の態様において、抗RSPOまたは抗LGR二重特異性抗体は少なくとも1つのクロマトグラフィー工程を用いて単離および/または精製される。一部の態様において、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程はアフィニティクロマトグラフィーを含む。一部の態様において、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程は陰イオン交換クロマトグラフィーをさらに含む。一部の態様において、単離および/または精製された抗体産物は少なくとも90％のヘテロ二量体抗体を含む。一部の態様において、単離および/または精製された抗体産物は少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％のヘテロ二量体抗体を含む。一部の態様において、単離および/または精製された抗体産物は約100％のヘテロ二量体抗体を含む。
【０２４２】
一部の態様において、細菌培養において産生された組換えタンパク質は、例えば、最初に、細胞ペレットから抽出し、その後に、1回または複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことによって単離することができる。最終精製工程にはHPLCを使用することができる。組換えタンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の便利な方法によって破壊することができる。
【０２４３】
ある特定の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は、多数の結合型(すなわち、免疫結合体もしくは放射性結合体(radioconjugate))または非結合型のいずれか1つにおいて使用することができる。ある特定の態様において、前記抗体は、補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞毒性を含む対象の自然防御機構を利用して過剰増殖細胞を排除するために非結合型で使用することができる。
【０２４４】
一部の態様において、RSPO結合物質またはLGR結合物質は細胞傷害剤に結合体化される。一部の態様において、細胞傷害剤は、メトトレキセート、アドリアマイシン(adriamicin)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロランブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤を含むが、これに限定されない化学療法剤である。一部の態様において、細胞傷害剤は、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来する酵素活性を有する毒素、またはジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ニガウリ(Momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(Sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、およびトリコテセン(tricothecene)を含むが、これに限定されない、その断片である。一部の態様において、細胞傷害剤は、放射性結合体または放射性結合抗体を生成するために放射性同位体である。放射性結合抗体を生成するために、90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re、および212Biを含むが、これに限定されない様々な放射性核種を利用することができる。抗体と、カリチアマイシン、マイタンシノイド、トリコテン(trichothene)、およびCC1065、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などの1種類または複数種類の低分子毒素との結合体も使用することができる。抗体と細胞傷害剤との結合体は、様々な二官能性タンパク質結合物質、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジジチオール(pyridyidithiol))プロピオナート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えば、グルタレルデヒド(glutareldehyde))、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート)、およびビス活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を用いて作られることがある。
【０２４５】
IV.ポリヌクレオチド
ある特定の態様において、本発明は、少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質または少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質に特異的に結合するポリペプチド(またはポリペプチドの断片)をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを包含する。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列しか含まないポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。例えば、一部の態様において、本発明は、ヒトRSPOタンパク質に対する抗体をコードするか、またはこのような抗体の断片(例えば、抗原結合部位を含む断片)をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の態様において、本発明は、ヒトLGRタンパク質に対する抗体をコードするか、またはこのような抗体の断片(例えば、抗原結合部位を含む断片)をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはRNAの形をとってもよく、DNAの形をとってもよい。DNAはcDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含み、二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖であればコード鎖でもよく非コード(アンチセンス)鎖でもよい。
【０２４６】
ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、およびSEQ ID NO:68からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:69、およびSEQ ID NO:70からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０２４７】
ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、およびSEQ ID NO:55からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドと少なくとも約80％同一、少なくとも約85％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一の、一部の態様では少なくとも約96％、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:69、およびSEQ ID NO:70にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:69、およびSEQ ID NO:70の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。ある特定の態様において、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシー条件下で行われる。
【０２４８】
ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは、同じ読み枠で、ポリヌクレオチド、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド(例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列)と融合した成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列をもつポリペプチドがプレタンパク質であり、成熟型ポリペプチドを形成するために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質+さらなる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードしてもよい。プロ配列をもつ成熟タンパク質がプロタンパク質であり、不活性型タンパク質である。プロ配列が切断されると、活性のある成熟タンパク質が残る。
【０２４９】
ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは、同じ読み枠で、マーカー配列、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列と融合した成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーと融合した成熟ポリペプチドを精製するための、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグでもよい。または、マーカー配列は、哺乳動物宿主(例えば、COS-7細胞)が用いられる場合、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する血球凝集素(HA)タグでもよい。一部の態様において、マーカー配列は、他のアフィニティタグと共に使用することができるFLAG-タグである。
【０２５０】
さらに、本発明は、例えば、断片、類似体、および/または誘導体をコードする上記で説明したポリヌクレオチドの変種に関する。
【０２５１】
ある特定の態様において、本発明は、本明細書に記載のRSPO結合物質(例えば、抗体)またはその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約80％同一、少なくとも約85％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、一部の態様では少なくとも約96％、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０２５２】
本明細書で使用する、参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという句は、前記ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチドごとに5個までの点変異を含むことができること以外は、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味することが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列にあるヌクレオチドを5％まで欠失させるか、または別のヌクレオチドで置換することができる。または、参照配列にある全ヌクレオチドの5％までの数のヌクレオチドを参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'末端位置もしくは3'末端位置または末端位置の間にあるどの場所でも起こってもよく、参照配列においてヌクレオチド間で個別に散在してもよく、参照配列内で1つまたは複数の連続したグループとなって散在してもよい。
【０２５３】
ポリヌクレオチド変種は、コード領域、非コード領域、またはその両方の変化を含有してもよい。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種は、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの性質および活性を変えない変化を含有する。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種は、(遺伝暗号の縮重により)ポリペプチドのアミノ酸配列を変えないサイレントな置換を含む。一部の態様において、ヌクレオチド変種は、転写物レベルで発現差をもたらす(例えば、発現を増加または減少させる)ヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチド変種は、様々な理由で、例えば、特定の宿主に合わせてコドン発現を最適化するように生成することができる(すなわち、ヒトmRNAのコドンを、細菌宿主、例えば、大腸菌に好ましいコドンに変えることができる)。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種は、配列の非コード領域またはコード領域にある少なくとも1つのサイレント変異を含む。
【０２５４】
一部の態様において、コードされるポリペプチドの発現(または発現レベル)を調整するために、または変えるためにポリヌクレオチド変種が生成される。一部の態様において、コードされるポリペプチドの発現を増やすために、ポリヌクレオチド変種が生成される。一部の態様において、コードされるポリペプチドの発現を減らすために、ポリヌクレオチド変種が生成される。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種のコードされるポリペプチドの発現は親ポリヌクレオチド配列と比較して増加している。一部の態様において、ポリヌクレオチド変種のコードされるポリペプチドの発現は親ポリヌクレオチド配列と比較して減少している。
【０２５５】
一部の態様において、ヘテロ多量体分子の産生を増やすために、(コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく)少なくとも1種類のポリヌクレオチド変種が生成される。一部の態様において、二重特異性抗体の産生を増やすために、(コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく)少なくとも1種類のポリヌクレオチド変種が生成される。
【０２５６】
ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは単離される。ある特定の態様において、前記ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
【０２５７】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む細胞も提供される。一部の態様において、発現ベクターはポリヌクレオチド分子を含む。一部の態様において、宿主細胞は、前記ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを含む。一部の態様において、宿主細胞はポリヌクレオチド分子を含む。
【０２５８】
V.RSPO結合物質を含むキット
本発明は、本明細書に記載のRSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)を備え、本明細書に記載の方法を実施するのに使用することができるキットを提供する。ある特定の態様において、キットは、1つまたは複数の容器の中に、少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質に対する少なくとも1種類の精製された抗体を含む。ある特定の態様において、キットは、1つまたは複数の容器の中に、少なくとも1種類のヒトLGRタンパク質に対する少なくとも1種類の精製された抗体を含む。ある特定の態様において、キットは、1つまたは複数の容器の中に、少なくとも1種類のヒトRSPOタンパク質に結合する少なくとも1種類の精製された可溶性受容体を含む。一部の態様において、キットは、全対照を含む、検出アッセイを実施するのに必要および/または十分な成分、アッセイを実施するための指示、ならびに分析するための、および結果を提示するための任意の必要なソフトウェアを全て備える。当業者は、本発明の開示されたRSPO結合物質および/またはLGR結合タンパク質を、当技術分野において周知の確立したキットの形式の1つに容易に組み入れることができることを容易に認識する。
【０２５９】
さらに、RSPO結合物質またはLGR結合物質(例えば、抗体または可溶性受容体)、ならびに少なくとも1種類のさらなる治療剤を備えるキットが提供される。ある特定の態様において、第2の(またはそれより多い)治療剤は抗炎症剤である。ある特定の態様において、第2の(またはそれより多い)治療剤はWnt経路阻害剤である。
【０２６０】
以下の非限定的な実施例を参照することによって、本開示の態様をさらに規定することができる。実施例では、本開示のある特定の抗体の調製および本開示の抗体を使用するための方法が詳細に説明される。本開示の範囲から逸脱することなく、材料および方法どちらにも多くの変更を加えることができることは当業者に明らかである。
【実施例】
【０２６１】
実施例1
肺線維症モデル
マウスモデルにおける肺線維症の誘導は、Baran et al., 2011, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 45:999-1006およびDakhlallah et al., 2013, Am J. Respir. Crit. Care Med., 187:397-405に記載されている。おおむね、このモデルに従った。簡単に述べると、6〜8週齢C57BL/6Nマウスに0.035U/gブレオマイシンまたはビヒクル(食塩水)を腹腔内注射した。1日目、4日目、9日目、12日目、15日目、18日目、22日目、25日目、29日目、および32日目に、0.9％NaClに溶解した濃度が7U/mlのブレオマイシン100μlをマウスに投与した。9日目、16日目、22日目、29日目、および33日目に、5匹の代表的なマウスを安楽死させた。肺からの組織断片を遺伝子発現分析のために収集した。残った肺組織にはホルマリンを灌流し、組織学的分析のために保管した。
【０２６２】
ブレオマイシンを注射したマウスに由来する肺組織の組織学的分析から、16日目に線維症の証拠が認められ、29日目に線維症が最大になることが観察された。ブレオマイシンを注射したマウスに由来する肺組織におけるRspo1、Rspo2、およびRspo3の遺伝子発現を定量RT-PCRによって評価した。ある特定の時点での、ブレオマイシンを注射したマウスに由来する肺組織における遺伝子発現は、食塩水を注射したマウスに由来する肺組織における遺伝子発現と比べたものである。分析のために、グルクロニダーゼβ(Gusb)を規準化に使用した。
【０２６３】
図1に示したように、ブレオマイシンを注射したマウスに由来する肺組織におけるRspo2発現が9日目および16日目にアップレギュレートした後に、22日目、26日目、および33日目にダウンレギュレートした。対照的に、Rspo1およびRspo3の遺伝子発現は9日目にダウンレギュレートし、33日目までダウンレギュレートし続けた。
【０２６４】
9日目および16日目に検出されたRspo2遺伝子発現の上昇は、肺組織の中に入る浸潤性炎症細胞の存在および肺線維症の発生と同時に起こった。このことから、RSPOタンパク質、特にRSPO2は線維プロセスに関与する可能性があると示唆される。
【０２６５】
実施例2
皮膚線維症モデル
ブレオマイシンを用いたマウスモデルにおける皮膚線維症の誘導は、Distler et al., 2007, Arthritis & Rheumatism, 56(1):311-322に記載されている。おおむね、このモデルに従った。簡単に述べると、6〜8週齢マウスの上背の規定された領域にブレオマイシンを皮下注射で注射した。注射部位領域は大きさが約1cm2であり、マウス背中の背側外側領域(脊髄から約2cm側方)に位置する。一匹のマウスにつき2箇所の注射部位があった。1日目、3日目、5日目、8日目、および10日目に、0.9％NaClに溶解した濃度が0.5mg/mlのブレオマイシン100μlを投与した。2日目、5日目、8日目、および12日目に、4匹の代表的なマウスを安楽死させた。注射部位からの組織断片を遺伝子発現分析のために収集し、組織学的分析のためにホルマリン固定した。
【０２６６】
ある特定の時点での、ブレオマイシンを注射したマウスに由来する皮膚組織における遺伝子発現は、ナイーブマウスに由来する皮膚組織における遺伝子発現と比べたものである。分析のために、グルクロニダーゼβを規準化に使用した。
【０２６７】
図2に示したように、最初に注射して24時間後(2日目)に、ブレオマイシン注射部位の皮膚組織におけるRspo3発現がアップレギュレートし、5日目にピークに達した。Rspo3は8日目および12日目になってもアップレギュレートしていたが、発現レベルは5日目から減少していた。Rspo1の発現レベルは、このモデルのブレオマイシン注射部位では影響を受けるようには見えなかったが、Rspo2はわずかにアップレギュレートするように見えた。
【０２６８】
最初にブレオマイシンを注射して24時間後と早くにRspo3遺伝子発現の上昇が観察されたことから、RSPOタンパク質は線維症の早期事象に関与する可能性があると示唆される。皮膚線維症モデルにおけるRspo3遺伝子発現の強力なアップレギュレーションは肺線維症モデルにおけるRspo2遺伝子発現の誘導と対照をなす。これらの結果から、異なるタイプの線維症の発生および進行においてRSPOタンパク質の組織特異的な役割がある可能性があると示唆される。
【０２６９】
実施例3
ブレオマイシンによる皮膚病変部の誘導に対する抗RSPO抗体の効果
前記の実施例2に記載のようにマウスに皮膚線維症を誘導した。6〜8週齢マウスの上背の2カ所の規定された領域にブレオマイシンを皮下注射で注射した。1日目、3日目、5日目、8日目、および10日目に、0.9％NaClに溶解した濃度が0.5mg/mlのブレオマイシン100μlを投与した。1日目および8日目に、対照抗体1B7.11、抗RSPO2抗体130M23、抗RSPO3抗体131R010、または抗RSPO2抗体130M23と抗RSPO3抗体131R010の組み合わせを25mg/kgの用量で投与した。対照抗体群では4匹のマウスを治療し、それぞれの抗RSPO抗体群では8匹のマウスを治療した。
【０２７０】
12日目に、どの対照抗体マウスの注射部位にも、8カ所の注射部位のうち8カ所で、100％の頻度で、触診可能な皮膚病変部が存在した。抗RSPO2抗体130M23で治療したマウスでは、16カ所の注射部位のうち13カ所で、81％の頻度で、触診可能な皮膚病変部があった。抗RSPO3抗体131R010で治療したマウスでは、16カ所の注射部位のうち6カ所で、38％の頻度で、触診可能な病変部があった。抗RSPO2抗体130M23と抗RSPO3抗体131R010の組み合わせで治療したマウスでは、16カ所の注射部位のうち2カ所にしか触診可能な病変部がなく、頻度は13％であった。これらの結果を図3に示した。
【０２７１】
12日目に、注射部位領域に由来する組織を収集し、組織を遺伝子発現分析および組織学的分析に使用した。いくつかの遺伝子の遺伝子発現を定量RT-PCRによって評価した。遺伝子には、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド1(Cxcl1)、エンドグリン(Eng)、インターフェロンγ(Ifng)、インターロイキン16(Il16)、腫瘍壊死因子(Tnf)、アキシン2(Axin2)、ロイシンリッチリピートを持つG共役型受容体5(Lgr5)、R-スポンジン1(Rspo1)、R-スポンジン3(Rspo3)、および平滑筋アクチン(Acta2)が含まれた。
【０２７２】
図4に示したように、抗RSPO2抗体130M23と抗RSPO3 131R010の組み合わせを用いた治療によって、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子、およびエンドグリンを含む炎症に関与する遺伝子の発現が低下した(12日目に評価した)。この治療によって、Wnt経路関連遺伝子Lgr5の遺伝子発現も低下し、さらに少ない程度でAxin2が低下した。単一の作用物質として抗RSPO2抗体130M23を用いた治療および抗RSPO3抗体131R010を用いた治療によって、12日目に、これらの遺伝子の発現は低下しなかった。興味深いことに、単一用量のブレオマイシンおよび単一用量の抗RSPO抗体を投与して24時間後に、単一の作用物質としておよびの組み合わせでの抗RSPO抗体によって、インターフェロンγの遺伝子発現は大幅に低下した(図5)。
【０２７３】
これらの結果から、抗RSPO3抗体を単独で用いた治療または抗RSPO3抗体を抗RSPO2抗体と組み合わせて用いた治療には、ブレオマイシンによって誘導される皮膚病変部の形成を強力に阻害する能力があることが分かる。抗RSPO2抗体130M23を抗RSPO3抗体131R010と組み合わせて投与することで、触診可能な皮膚病変部の発生率が低下し、Wntシグナル伝達および炎症に関連する遺伝子がダウンレギュレートしたことから、複数種類のRSPOタンパク質が線維症の発生および発症に関与する可能性があると示唆される。これらの結果は、抗RSPO抗体などの抗RSPOアンタゴニストが線維性疾患の治療に有効な可能性があるという仮説を支持する。
【０２７４】
本明細書に記載の実施例および態様は例示目的にすぎず、本明細書に記載の実施例および態様を考慮して様々な変更または変化が当業者に示唆され、本願の精神および範囲の中に含まれることが理解される。
【０２７５】
本明細書において引用された、刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含むアクセッション番号/データベース配列は全て、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号/データベース配列が参照により本明細書に組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２７６】
本願に開示される配列は、以下である。
シグナル配列があるヒトRSPO1アミノ酸配列(SEQ ID NO:1)
2017528523.tif 000061
シグナル配列があるヒトRSPO2アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)
2017528523.tif 000062
シグナル配列があるヒトRSPO3アミノ酸配列(SEQ ID NO:3)
2017528523.tif 000063
シグナル配列があるヒトRSPO4アミノ酸配列(SEQ ID NO:4)
2017528523.tif 000064
89M5重鎖CDR1(SEQ ID NO:5)
TGYTMH
89M5重鎖CDR2(SEQ ID NO:6)
2017528523.tif 000065
89M5重鎖CDR3(SEQ ID NO:7)
2017528523.tif 000066
89M5軽鎖CDR1(SEQ ID NO:8)
2017528523.tif 000067
89M5軽鎖CDR2(SEQ ID NO:9)
WASTRHT
89M5軽鎖CDR3(SEQ ID NO:10)
QQHYSTPW
h89M5-H8L5重鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:11)
2017528523.tif 000068
h89M5-H8L5軽鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:12)
2017528523.tif 000069
下線を引いた推定シグナル配列があるh89M5-H8L5重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:13)
2017528523.tif 000070
推定シグナル配列がないh89M5-H8L5重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:14)
2017528523.tif 000071
下線を引いた推定シグナル配列があるh89M5-H8L5軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:15)
2017528523.tif 000072
推定シグナル配列がないh89M5-H8L5軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:16)
2017528523.tif 000073
h89M5-H8L5重鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:17)
2017528523.tif 000074
h89M5-H8L5軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:18)
2017528523.tif 000075
h89M5-H8L5重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:19)
2017528523.tif 000076
h89M5-H8L5軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:20)
2017528523.tif 000077
130M23重鎖CDR1(SEQ ID NO:21)
SSYAMS
130M23重鎖CDR2(SEQ ID NO:22)
2017528523.tif 000078
130M23重鎖CDR3(SEQ ID NO:23)
2017528523.tif 000079
130M23軽鎖CDR1(SEQ ID NO:24)
2017528523.tif 000080
130M23軽鎖CDR2(SEQ ID NO:25)
WASTRHT
130M23軽鎖CDR3(SEQ ID NO:26)
QQHYSTP
h130M23-H1L6重鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:27)
2017528523.tif 000081
h130M23-H1L6軽鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:28)
2017528523.tif 000082
下線を引いた推定シグナル配列があるh130M23-H1L6重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:29)
2017528523.tif 000083
推定シグナル配列がないh130M23-H1L6重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:30)
2017528523.tif 000084
下線を引いた推定シグナル配列があるh130M23-H1L6軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:31)
2017528523.tif 000085
推定シグナル配列がないh130M23-H1L6軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:32)
2017528523.tif 000086
h130M23-H1L6重鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:33)
2017528523.tif 000087
h130M23-H1L6軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:34)
2017528523.tif 000088
h130M23-H1L6重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:35)
2017528523.tif 000089
h130M23-H1L6軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:36)
2017528523.tif 000090
131R010重鎖CDR1(SEQ ID NO:37)
DYSIH
131R010重鎖CDR2(SEQ ID NO:38)
2017528523.tif 000091
131R010重鎖CDR3(SEQ ID NO:39)
TYFANNFD
131R010別の重鎖CDR3(SEQ ID NO:40)
2017528523.tif 000092
131R010軽鎖CDR1(SEQ ID NO:41)
2017528523.tif 000093
131R010軽鎖CDR2(SEQ ID NO:42)
AASNLES
131R010別の軽鎖CDR2(SEQ ID NO:43)
AAS
131R010軽鎖CDR3(SEQ ID NO:44)
2017528523.tif 000094
131R010別の軽鎖CDR3(SEQ ID NO:45)
2017528523.tif 000095
131R010重鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:46)
2017528523.tif 000096
131R010軽鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:47)
2017528523.tif 000097
下線を引いた推定シグナル配列がある131R010重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:48)
2017528523.tif 000098
推定シグナル配列がない131R010重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:49)
2017528523.tif 000099
下線を引いた推定シグナル配列がある131R010軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:50)
2017528523.tif 000100
推定シグナル配列がない131R010軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:51)
2017528523.tif 000101
131R010重鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:52)
2017528523.tif 000102
131R010軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:53)
2017528523.tif 000103
131R010重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:54)
2017528523.tif 000104
131R010軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:55)
2017528523.tif 000105
h89M5-H2L2重鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:56)
2017528523.tif 000106
h89M5-H2L2軽鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:57)
2017528523.tif 000107
下線を引いた推定シグナル配列があるh89M5-H2L2重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:58)
2017528523.tif 000108
推定シグナル配列がないh89M5-H2L2重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:59)
2017528523.tif 000109
下線を引いた推定シグナル配列があるh89M5-H2L2軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:60)
2017528523.tif 000110
推定シグナル配列がないh89M5-H2L2軽鎖アミノ酸配列 (SEQ ID NO:61)
2017528523.tif 000111
h89M5-H2L2重鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:62)
2017528523.tif 000112
h89M5-H2L2軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:63)
2017528523.tif 000113
h89M5-H2L2重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:64)
2017528523.tif 000114
h89M5-H2L2軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:65)
2017528523.tif 000115
h130M23-H1L2軽鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:66)
2017528523.tif 000116
下線を引いた推定シグナル配列があるh130M23-H1L2軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:67)
2017528523.tif 000117
下線を引いた推定シグナル配列がないh130M23-H1L2軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:68)
2017528523.tif 000118
h130M23-H1L2軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:69)
2017528523.tif 000119
h130M23-H1L2軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:70)
2017528523.tif 000120
ヒトLGR4タンパク質配列(SEQ ID NO:71)
2017528523.tif 000121
ヒトLGR5タンパク質配列(SEQ ID NO:72)
2017528523.tif 000122
ヒトLGR6タンパク質配列(SEQ ID NO:73)
2017528523.tif 000123
LGR5 ECDアミノ酸22〜564(SEQ ID NO:74)
2017528523.tif 000124
LGR5-Fcタンパク質配列(SEQ ID NO:75)
2017528523.tif 000125
ヒトIgG1Fc領域(SEQ ID NO:76)
2017528523.tif 000126
ヒトIgG1Fc領域(SEQ ID NO:77)
2017528523.tif 000127
ヒトIgG1Fc領域(SEQ ID NO:78)
2017528523.tif 000128
ヒトIgG1Fc領域(SEQ ID NO:79)
2017528523.tif 000129
ヒトIgG2Fc領域(SEQ ID NO:80)
2017528523.tif 000130
【図１】
2017528523.tif 000140
【図２】
2017528523.tif 000141
【図３】
2017528523.tif 000142
【図４】
2017528523.tif 000143
【図５】
2017528523.tif 000144
【配列表】
2017528523000001.app
【国際調査報告】
2017528523.tif 000145
2017528523.tif 000146