(57)【要約】  本発明は、Ｋ−Ｒａｓ遺伝子発現をサイレンシングする際に使用される新規な組成物を提供する。より詳細には、本発明は、Ｋ−Ｒａｓ発現の阻害剤としての新規な非対称干渉ＲＮＡ分子、ならびに哺乳動物における癌または関連障害の処置における医薬組成物およびその使用を提供する。【選択図】図５（Ａ）
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象において癌を処置する方法であって、（ｉ）１８〜２３ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある、第一の鎖と、（ｉｉ）１２〜１７ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記第一の鎖と実質的に相補性があり、前記第一の鎖と共に二重鎖領域を形成する第二の鎖と、を含む二本鎖ＲＮＡ分子を、必要とする対象に投与することを含み、前記第一の鎖が１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子が、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能である、方法。
【請求項２】
選択された患者集団において癌を処置する方法であって、
（ａ）癌と診断された患者候補から得られた生物学的試料中の突然変異Ｋ−Ｒａｓ遺伝子増幅のレベルを測定するステップと；
（ｂ）前記患者候補の突然変異Ｋ−Ｒａｓ遺伝子増幅レベルがベンチマークレベルを超えていることを確認するステップと；
（ｃ）（ｉ）１８〜２３ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある、第一の鎖と、（ｉｉ）１２〜１７ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記第一の鎖と実質的に相補性があり、前記第一の鎖と共に二重鎖領域を形成する第二の鎖と、を含む二本鎖ＲＮＡ分子を、前記患者候補に投与するステップと、
を含み、前記第一の鎖が１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子が、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能である、方法。
【請求項３】
選択された患者集団において癌を処置する方法であって、
（ａ）癌と診断された患者候補から得られた生物学的試料中の突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質の発現レベルを測定するステップと；
（ｂ）前記患者候補の突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質発現レベルがベンチマークレベルを超えていることを確認するステップと；
（ｃ）（ｉ）１８〜２３ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある、第一の鎖と、（ｉｉ）１２〜１７ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記第一の鎖と実質的に相補性があり、前記第一の鎖と共に二重鎖領域を形成する第二の鎖と、を含む二本鎖ＲＮＡ分子を、前記患者候補に投与するステップと、
を含み、前記第一の鎖が１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子が、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能である、方法。
【請求項４】
前記癌が胃癌であるか、または前記対象が胃癌に罹患している、もしくは胃癌の素因がある、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の鎖の前記ヌクレオチド配列が、前記標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と少なくとも７０％の相補性がある配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の鎖が、１９〜２３ヌクレオチドの長さを有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の鎖が、２１ヌクレオチドの長さを有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第二の鎖が、１４〜１６ヌクレオチドの長さを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第二の鎖が、１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一の鎖が、２〜４ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一の鎖が、３ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、糖−、バックボーン−、および／または塩基−修飾リボヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バックボーン修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合内に修飾を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択されるアンチセンス鎖配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択されるセンス鎖配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一の鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択されるアンチセンス鎖配列を含み、前記第二の鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択されるセンス鎖配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、ヒトである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）１８〜２３ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある、第一の鎖と、（ｉｉ）１２〜１７ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記第一の鎖と実質的に相補性があり、前記第一の鎖と共に二重鎖領域を形成する第二の鎖と、を含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記第一の鎖が１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子が、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能である、前記二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記第一の鎖の前記ヌクレオチド配列が、前記標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と少なくとも７０％の相補性がある配列を含む、請求項１９に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記第一の鎖が、１９〜２３ヌクレオチドの長さを有する、請求項１９または２０に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記第一の鎖が、２１ヌクレオチドの長さを有する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２３】
前記第二の鎖が、１４〜１６ヌクレオチドの長さを有する、請求項２２に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２４】
前記第二の鎖が、１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項２３に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２５】
前記第一の鎖が、２〜４ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する、請求項２４に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２６】
前記第一の鎖が、３ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する、請求項２５に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２７】
前記二本鎖ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含む、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、糖−、バックボーン−、および／または塩基−修飾リボヌクレオチドである、請求項２７に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２９】
前記バックボーン修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合内に修飾を有する、請求項２８に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項３０】
前記第一の鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択されるアンチセンス鎖配列を含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項３１】
前記第二の鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択されるセンス鎖配列を含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項３２】
前記第一の鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択されるアンチセンス鎖配列を含み、前記第二の鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択されるセンス鎖配列を含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項３３】
必要とする対象において癌を処置する方法であって、前記対象においてＫ−Ｒａｓ遺伝子発現またはＫ−Ｒａｓ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項３４】
必要とする対象において癌幹細胞（ＣＳＣ）の生存および／または増殖を阻害する方法であって、前記対象においてＫ−Ｒａｓ遺伝子発現またはＫ−Ｒａｓ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項３５】
Ｋ−Ｒａｓ遺伝子発現またはＫ−Ｒａｓ活性を阻害することが、（ｉ）１８〜２３ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある、第一の鎖と、（ｉｉ）１２〜１７ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、前記第一の鎖と実質的に相補性があり、前記第一の鎖と共に二重鎖領域を形成する第二の鎖と、を含む二本鎖ＲＮＡ分子を、必要とする対象に投与することを含み、前記第一の鎖が１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子が、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、Ｋ−Ｒａｓ遺伝子発現をサイレンシングする際に使用される組成物に関する。より詳細には、本発明は、Ｋ−Ｒａｓ発現の阻害剤としての新規な非対称干渉ＲＮＡ分子、および哺乳動物における癌または関連障害の処置における医薬組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
低分子または小分子（ｓｈｏｒｔ）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用によるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を介した遺伝子サイレンシングが、治療ツールとして出現した。しかし、ＲＮＡｉを基にした薬物の開発は、際立った送達問題の他にも、ｓｉＲＮＡの限定的な有効性、インターフェロン様応答およびセンス鎖を介したオフターゲット遺伝子サイレンシングなどのｓｉＲＮＡの非特異的作用、ならびにｓｉＲＮＡ合成に関連した禁止事項または高いコストという難題に直面している。ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの有効性は、哺乳動物細胞の遺伝子の大部分で約５０％以下に限定される。これらの分子の製造は、高価（アンチセンスデオキシヌクレオチドの製造よりもかなり高価）で非効率的であり、化学修飾を必要とする。最後に、合成ｓｉＲＮＡの細胞外投与がインターフェロン様応答を惹起し得るという観察は、ＲＮＡｉを基にした研究およびＲＮＡｉを基にした治療開発において重大な障壁となっている。
【０００３】
タンパク質Ｋ−Ｒａｓは、正常な条件下では細胞成長および細胞分裂を調節する分子スイッチである。このタンパク質における突然変異が、連続した細胞成長を通して腫瘍の形成を誘導する。ヒト癌の約３０％は、ＧＴＰａｓｅ活性の低下およびＧＡＰ作用への非感受性により、ＧＴＰに構成的に結合された突然変異ＲＮＡｉタンパク質を有する。Ｒａｓは、突然変異するというよりむしろ他のシグナル伝達要素の不適切な活性を通して機能的に活性化される多くの癌における重要な因子でもある。突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質は、全ての腫瘍細胞において大きな割合で見出される。Ｋ−Ｒａｓタンパク質は、目的の中心部分を占める。多くのヒト癌において発癌的に突然変異したＫ−Ｒａｓの同定により、この構成的活性化タンパク質を合理的および選択的処置として標的とすることに多くの努力が払われた。数十年に及ぶ活性剤研究にもかかわらず、依然として、Ｋ−Ｒａｓの治療阻害剤の開発には大きな難題が残されている。
【０００４】
高度に腫瘍原性かつ転移性である高悪性度癌細胞が、様々な腫瘍タイプの癌患者から単離されており、癌幹細胞（ＣＳＣ）と称され、高い幹細胞性を有することが見出された。これらの幹細胞性の高い癌細胞は、基本的に癌転移および再発を担うと推定されている。多数の幹細胞性遺伝子、例えばβ−カテニン、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４は、癌細胞の幹細胞性に関連づけられて来た。しかし、癌細胞幹細胞性におけるＫ−Ｒａｓなどの発癌遺伝子の役割は、明らかになっていない。
【０００５】
したがって、癌と診断された対象においてＫ−Ｒａｓ遺伝子発現またはＫ−Ｒａｓ活性を選択的にサイレンシングし、より良好な有効性および効力、急速な作用発現、より良好な持続性、ならびにより少ない有害副作用を有する新規な組成物および方法を開発することが、求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
癌細胞の幹細胞性を維持する上でのＫ−Ｒａｓの役割を解明するために、本発明者らは、高い効力および精密性によって標的遺伝子をサイレンシングすることが可能な非対称サイレンシングＲＮＡ技術（ａｉＲＮＡ）を用いた。その上、ａｉＲＮＡ技術は、ＣＳＣに即座に適用することができる。本発明者らは、ＣＳＣがＫ−Ｒａｓの活性化突然変異またはＲａｓ経路の下流調節因子の活性化に高度に関与しているだけでなく、Ｋ−Ｒａｓ変異体が増幅されたＣＳＣがＫ−Ｒａｓサイレンシングに対して高感度になるという驚くべきことを発見した。さらに本発明者らは、Ｋ−Ｒａｓ突然変異体のＤＮＡコピー数がＫ−Ｒａｓサイレンシングへの癌幹細胞の感受性を直接予測させ、それにより、増幅されたＫ−Ｒａｓ突然変異体が悪性度および癌細胞幹細胞性の維持に必要であり、それは、発癌遺伝子と癌細胞幹細胞性との関連性を理解するための、そして癌幹細胞阻害剤を開発するための重要な意味を有し得ることが示唆される、という驚くべきことを発見した。
【０００７】
本発明は、本明細書で非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）と称される、哺乳動物細胞における強力な遺伝子サイレンシングを誘導し得る低分子二本鎖ＲＮＡの一分類を用いる組成物および方法を提供する。ａｉＲＮＡは、例えば内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０２９６８８号に記載されている。この分類のＲＮＡｉ導入物質は、２つのＲＮＡ鎖の長さの非対称により同定される。この構造設計は、遺伝子サイレンシングを実行する上で機能的に強力なだけでなく、現在の最先端技術のｓｉＲＮＡを上回る複数の利点も提供する。利点の１つとして、ａｉＲＮＡは、他のｓｉＲＮＡよりも長さがかなり短いＲＮＡ二本鎖構造を有することができ、これにより合成コストが削減され、長さに依存する非特異的インターフェロン様応答の惹起が排除／低減されるはずである。加えて、ａｉＲＮＡ構造の非対称性が、このセンス鎖によるオフターゲット効果を排除する、そして／または他の方法で低減する。さらにａｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシングを誘導する上で、ｓｉＲＮＡよりも有効性があり、強力で、発現が急速であり、持続性がある。ａｉＲＮＡは、生物学の研究、バイオテクノロジーおよび医薬品業界でのＲ＆Ｄ研究、ならびにＲＮＡｉを基にした治療など、他のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが適用される、または適用されると企図される全ての分野で使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
二本鎖ＲＮＡ分子は、１８〜２３ヌクレオチドの長さを有する第一の鎖、および１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する第二の鎖を含み、該第二の鎖は、該第一の鎖と実質的に相補性があり、該第一の鎖と共に二重鎖領域を形成し、該第一の鎖は、１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子は、真核細胞内での選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能である。幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある配列を含む。さらなる実施形態において、該第一の鎖は、標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列に少なくとも７０％相補性がある配列を含む。別の実施形態において、該真核細胞は、哺乳動物細胞または鳥類細胞である。
【０００９】
幾つかの実施形態において、該標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列は、ヒトＫ−Ｒａｓ標的配列である。幾つかの実施形態において、該標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として以下に示されたＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００４９８５に示された配列の少なくとも一部から選択されるヒトＫ−Ｒａｓ標的配列である。
【表１】
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2017511302.tif 000004
2017511302.tif 000005
【００１０】
幾つかの実施形態において、該標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列は、以下の表１に示される標的配列である。
【表２】
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【００１１】
幾つかの実施形態において、本明細書において非対称干渉ＲＮＡ分子またはａｉＲＮＡ分子とも称されるＲＮＡ二本鎖分子は、以下の表２に示されるものから選択されるセンス鎖配列、アンチセンス鎖配列、またはセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列との組み合わせを含む。
【表３】
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【００１２】
幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択されるセンス鎖配列を含む。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択されるセンス鎖配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択される配列と少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える同一性があるセンス鎖配列を含む。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択される配列と少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える同一性があるアンチセンス鎖配列を含む。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択される配列と少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える同一性があるセンス鎖配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択される配列と少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える同一性があるアンチセンス鎖を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、５’−オーバーハングの配列の少なくとも１つのヌクレオチドは、Ａ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。
【００１５】
幾つかの実施形態において、該二重鎖領域のＧＣ量は、２０％〜７０％である。
【００１６】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、１９〜２２ヌクレオチドの長さを有する。
【００１７】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、２１ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該第二の鎖は、１４〜１６ヌクレオチドの長さを有する。
【００１８】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、２１ヌクレオチドの長さを有し、該第二の鎖は、１５ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該第一の鎖は、２〜４ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する。さらなる実施形態において、該第一の鎖は、３ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する。
【００１９】
幾つかの実施形態において、該二本鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含む。さらなる実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、糖−、バックボーン−、および／または塩基−修飾リボヌクレオチドである。さらなる実施形態において、該バックボーン修飾ヌクレオチドは、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合内に修飾を有する。幾つかの実施形態において、該ホスホジエステル結合は、少なくとも１つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含むように修飾されている。別の実施形態において、該ヌクレオチド類似体は、ホスホチオアート基を含むバックボーン修飾リボヌクレオチドである。
【００２０】
幾つかの実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、異常な塩基または修飾塩基である。別の実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、イノシン、またはトリチル化塩基を含む。
【００２１】
さらなる実施形態において、該ヌクレオチド類似体は、２’−ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮ（ここで各Ｒは、独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ，Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）から選択される基により置換されている、糖修飾リボヌクレオチドである。
【００２２】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、該少なくとも１つのデオキシヌクレオチドは、３’−オーバーハング、５’−オーバーハング、および二重鎖領域からなる群から選択される１つまたは複数の領域にある。別の実施形態において、該第二の鎖は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む。
【００２３】
本発明は、細胞または生物体内でＫ−Ｒａｓ発現をモジュレートする方法、例えばＫ−Ｒａｓ発現をサイレンシングする方法、または他の方法でＫ−Ｒａｓ発現を低減する方法であって、前記細胞または生物体を、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングが起こり得る条件下で、本開示の非対称二本鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップと、Ｋ−Ｒａｓまたは該二重鎖ＲＮＡに実質的に対応する配列部分を有する核酸に対して二本鎖ＲＮＡ分子により実行される選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを媒介するステップと、を含む、方法も提供する。さらなる実施形態において、前記接触させるステップは、前記二本鎖ＲＮＡ分子を、選択的Ｋ−Ｒａｓサイレンシングが起こり得る培養物または生物体内の標的細胞に導入するステップを含む。さらなる実施形態において、該導入するステップは、トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、感染、注入、経口投与、吸入、外用および局所投与からなる群から選択される。別の実施形態において、該導入するステップは、医薬的担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質キャリア、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、および類脂質からなる群から選択される医薬的に許容し得る賦形剤、担体、または希釈剤を用いることを含む。
【００２４】
幾つかの実施形態において、該モジュレートする方法は、細胞または生物体における遺伝子の機能または実用性を決定するために用いられる。
【００２５】
幾つかの実施形態において、該モジュレートする方法は、疾患または望ましくない状態を処置または予防するために用いられる。幾つかの実施形態において、該疾患または望ましくない状態は、癌、例えば胃癌である。
【００２６】
本開示は、胃癌の処置、予防、進行の遅延、または他の方法で胃癌の症状を軽減することにおいてＫ−Ｒａｓを標的とする組成物および方法を提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、本開示の二本鎖ＲＮＡ分子の治療有効量を、必要とする対象に投与することを含む。幾つかの実施形態において、該対象は、ヒトである。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌に罹患している。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌と診断されている。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌の素因がある。
【００２７】
本開示はまた、癌幹細胞の生存および／または増殖を阻害するためにＫ−Ｒａｓを標的とする組成物および方法を提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、本開示の二本鎖ＲＮＡ分子の治療有効量を、必要とする対象に投与することを含む。幾つかの実施形態において、該対象は、ヒトである。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌に罹患している。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌と診断されている。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌の素因がある。
【００２８】
本開示はまた、胃癌の処置、予防、進行の遅延、または他の方法で胃癌の症状を軽減する際にＣＳＣの生存および／または増殖を阻害することにおいてＫ−Ｒａｓを標的とする組成物および方法を提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、本開示の二本鎖ＲＮＡ分子の治療有効量を、必要とする対象に投与することを含む。幾つかの実施形態において、該対象は、ヒトである。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌に罹患している。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌と診断されている。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌の素因がある。
【００２９】
本開示はまた、選択された患者集団において癌を処置する方法であって、（ａ）癌と診断された患者候補から得られた生物学的試料中の突然変異Ｋ−Ｒａｓ遺伝子増幅のレベルを測定するステップと；（ｂ）該患者候補の突然変異Ｋ−Ｒａｓ遺伝子増幅レベルがベンチマークレベルを超えていることを確認するステップと；（ｃ）１８〜２３ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある、第一の鎖と、１２〜１７ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、該第一の鎖と実質的に相補性があり、第一の鎖と共に二重鎖領域を形成する第二の鎖と、を含む二本鎖ＲＮＡ分子を、該患者候補に投与するステップと、を含み、該第一の鎖が１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子が、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能である、方法を提供する。
【００３０】
幾つかの実施形態において、該ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、１人の作業者、または複数の作業者により実施され得る。
【００３１】
幾つかの実施形態において、患者候補の突然変異Ｋ−Ｒａｓ遺伝子増幅レベルが、本発明により請求された処置方法に好適に応答しない対照患者に比較して、少なくとも、例えば２倍大きい場合に、それはベンチマークレベルを超えると見なされる。同様に熟練した医師は、ＤＮＡコピー数の最適なベンチマークレベルが、本開示で提示されたデータに基づき、例えば非応答患者の約３倍または４倍であると決定することができる。
【００３２】
本開示はまた、選択された患者集団において癌を処置する方法であって、（ａ）癌と診断された患者候補から得られた生物学的試料中の突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質の発現レベルを測定するステップと；（ｂ）該患者候補の突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質発現レベルがベンチマークレベルを超えていることを確認するステップと；（ｃ）１８〜２３ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある、第一の鎖と、１２〜１７ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、該第一の鎖と実質的に相補性があり、第一の鎖と共に二重鎖領域を形成する第二の鎖と、を含む二本鎖ＲＮＡ分子を、該患者候補に投与するステップと、を含み、該第一の鎖が１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子が、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能である、方法を提供する。
【００３３】
幾つかの実施形態において、該ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、１人の作業者、または複数の作業者により実施され得る。
【００３４】
幾つかの実施形態において、患者候補の突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質発現レベルが、本発明により請求された処置方法に好適に応答しない対照患者に比較して、少なくとも、例えば２倍大きい場合に、それはベンチマークレベルを超えると見なされる。同様に熟練した医師は、突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質発現の最適なベンチマークレベルが、本開示で提示されたデータに基づき、例えば非応答患者の約３倍または４倍であると決定することができる。
【００３５】
本発明は、さらにキットを提供する。該キットは、１８〜２３ヌクレオチドの長さの第一のＲＮＡ鎖、および１２〜１７ヌクレオチドの長さの第二のＲＮＡ鎖を含み、該第二の鎖は、該第一の鎖と実質的に相補性があり、該第一の鎖と共に二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができ、該二本鎖ＲＮＡ分子は、１〜９ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび０〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有し、前記二本鎖ＲＮＡ分子は、Ｋ−Ｒａｓ特異性遺伝子サイレンシングを実行することができる。
【００３６】
本発明はまた、二本鎖分子を調製する方法を提供する。該方法は、第一の鎖および第二の鎖を合成するステップと、該二本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で該合成された鎖を組み合わせて、配列特異性遺伝子サイレンシングの実行を可能にするステップと、を含む。幾つかの実施形態において、該方法は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を、合成ステップの間、合成ステップの後、および組み合わせるステップの前に、または組み合わせるステップの後に、二本鎖ＲＮＡ分子に導入するステップをさらに含む。別の実施形態において、該ＲＮＡ鎖は、化学的に合成されるか、または生物学的に合成される。
【００３７】
本発明は、発現ベクターを提供する。該ベクターは、少なくとも１つの発現制御配列に動作可能に連結された二本鎖ＲＮＡ分子をコードする１つの核酸または複数の核酸を含む。幾つかの実施形態において、該ベクターは、第一の発現制御配列に動作可能に連結された第一の鎖をコードする第一の核酸と、第二の発現制御配列に動作可能に連結された第二の鎖をコードする第二の核酸と、を含む。別の実施形態において、該ベクターは、ウイルス、真核生物、または細菌の発現ベクターである。
【００３８】
本発明はまた、細胞を提供する。幾つかの実施形態において、該細胞は、ベクターを含む。別の実施形態において、該細胞は、二本鎖ＲＮＡ分子を含む。さらなる実施形態において、該細胞は、哺乳動物、鳥類、または細菌の細胞である。
【００３９】
該モジュレートする方法は、インビトロまたはインビボで薬物ターゲットを研究するために用いることもできる。本発明は、二本鎖ＲＮＡ分子を含む試薬を提供する。
【００４０】
本発明はまた、本開示の二本鎖ＲＮＡ分子を調製する方法であって、該第一の鎖および第二の鎖を合成するステップと、該二本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で該合成された鎖を組み合わせて、Ｋ−Ｒａｓ配列特異性遺伝子サイレンシングの実行を可能にするステップと、を含む、方法を提供する。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ鎖は、化学的に合成されるか、または生物学的に合成される。別の実施形態において、第一の鎖と第二の鎖は、別個に、または同時に合成される。
【００４１】
幾つかの実施形態において、該方法は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を、合成ステップの間、合成ステップの後、および組み合わせるステップの前に、または組み合わせるステップの後に、二本鎖ＲＮＡ分子に導入するステップをさらに含む。
【００４２】
本発明は、医薬組成物をさらに提供する。該医薬組成物は、活性剤としての少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子と、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質キャリア、ポリマー、ナノ粒子、コレステロール、脂質、および類脂質からなる群から選択される１つまたは複数の担体と、を含む。
【００４３】
本発明の別の特色および利点は、異なる実施例をはじめとする、本明細書で提供されたさらなる記載から明らかである。提供された実施例は、本発明を実践する上で有用な異なる成分および方法論を示す。該実施例は、請求された発明を限定しない。本開示に基づけば、当業者は、本発明を実践する上で有用な他の成分および方法論を同定および使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１（Ａ）】ａｉＲＮＡ  ＩＤ  ＮＯ：２１（「ａｉＫ−Ｒａｓ＃１」）を用いてＫ−ＲａｓターゲットＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２を標的とし、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１のＩＣ５０を決定した、インビトロ試験を示している図である。
【図１（Ｂ）】ａｉＲＮＡ  ＩＤ  ＮＯ：１４２（「ａｉＫ−Ｒａｓ＃２」）を用いてＫ−ＲａｓターゲットＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２を標的とし、ａｉＫ−Ｒａｓ＃２のＩＣ５０を決定した、インビトロ試験を示している図である。
【図２（Ａ）】ノーザンブロット分析によるＲＩＳＣにロードされたｓｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡの検出を示している図である。
【図２（Ｂ）】ＴＬＲ３／ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ結合の検出を示している図である。
【図２（Ｃ）】ＴＬＲ３／ＲＮＡ複合体が抗ＨＡ抗体で免疫沈降されたことを示している図である。
【図３（Ａ）】ａｉＫ−Ｒａｓ＃１またはａｉＫ−Ｒａｓ＃２でトランスフェクトされたＡＧＳおよびＤＬＤ１におけるコロニー形成アッセイを示している図である。
【図３（Ｂ）】ＡＧＳおよびＤＬＤ１からの溶解物のウェスタンブロット分析を示している図である。
【図３（Ｃ）】大細胞パネルにおけるコロニー形成アッセイの結果を示している図である。
【図４】Ｋ−ＲａｓおよびＥＧＦＲ−ＲＡＳ経路分子のウェスタンブロット分析を示している図である。
【図５（Ａ）】ａｉＫ−Ｒａｓの感受性が、Ｋ−Ｒａｓ突然変異体の大細胞パネルにおけるＫ−Ｒａｓ増幅と相関したことを示している図である。
【図５（Ｂ）】ａｉＫ−Ｒａｓの感受性が、Ｋ−Ｒａｓ突然変異体の大細胞パネルにおけるＫ−Ｒａｓ増幅と相関したことを示している図である。
【図６（Ａ）】ＣＳＣ培養における幹細胞性遺伝子発現を示している図である。
【図６（Ｂ）】様々な細胞株におけるスフェア形成アッセイの結果を示している図である。
【図６（Ｃ）】ａｉＫ−Ｒａｓ＃１およびａｉＫ−Ｒａｓ＃２を有するＡＧＳおよびＤＬＤ１細胞内のＣＤ４４高密度集団の欠失を示している図である。
【図７（Ａ）】ａｉＫ−Ｒａｓをトランスフェクトされた癌細胞におけるＣＳＣ関連遺伝子のヒートマップを示している図である。
【図７（Ｂ）】ウェスタンブロットによるダウンレギュレートされたＮｏｔｃｈシグナル伝達の確認を示している図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な記載
本発明は、真核細胞における選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能な非対称二本鎖ＲＮＡ分子に関する。幾つかの実施形態において、該二本鎖ＲＮＡ分子は、第一の鎖および第二の鎖を含む。該第一の鎖は、該第二の鎖よりも長い。該第二の鎖は、該第一の鎖と実質的に相補性があり、該第一の鎖と共に二重鎖領域を形成している。
【００４６】
該タンパク質Ｋ−Ｒａｓは、正常な条件下で細胞成長および細胞分裂を調節する分子スイッチである。このタンパク質における突然変異が、連続した細胞成長を通して腫瘍の形成を誘導する。ヒト癌の約３０％は、ＧＴＰａｓｅ活性の低下およびＧＡＰ作用への非感受性により、ＧＴＰに構成的に結合された突然変異ＲＮＡｉタンパク質を有する。Ｒａｓは、突然変異するというよりむしろ他のシグナル伝達要素の不適切な活性を通して機能的に活性化される多くの癌における重要な因子でもある。突然変異Ｋ−Ｒａｓタンパク質は、全ての腫瘍細胞で大きな割合で見出される。Ｋ−Ｒａｓタンパク質は、目的の中心部分を占める。多くのヒト癌において発癌的に突然変異したＫ−Ｒａｓの同定により、この構成的活性タンパク質を合理的および選択的処置として標的とすることに多くの努力が払われた。数十年に及ぶ活性剤研究にもかかわらず、依然として、Ｋ−Ｒａｓの治療阻害剤の開発には多くの難題が残されている。
【００４７】
本明細書で提供される組成物および方法は、癌の発達および維持におけるＫ−Ｒａｓの機能を解明することにおいて有用である。該組成物および方法は、標的遺伝子を高い効力でサイレンシングして長期持続的ノックダウンをもたらし、オフターゲット効果を低減する、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）を使用しており、複数のタイプのヒト癌細胞株における細胞生存に関するＫ−Ｒａｓの依存性が検討された。驚くべきことに、本発明者らは、Ｋ−Ｒａｓが、他のタイプの癌に比較して胃癌の維持により重要な役割を担うことを見出した。Ｋ−ＲａｓのａｉＲＮＡ誘導サイレンシングは、他の癌タイプに比較して胃癌細胞の細胞増殖および胃癌細胞によるコロニー形成能を阻害することが見出された。エビデンスを積み上げることで、癌幹細胞（ＣＳＣ）が予後、転移、および再発に大きく関連することが明らかとなった。ＣＳＣに及ぼすＫ−Ｒａｓの影響を検討するために、本発明者らは、インビトロＣＳＣ培養系へのＫ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシング効果をテストした。その結果、Ｋ−Ｒａｓの阻害が、他の癌タイプに比較して、胃のＣＳＣ由来のコロニーを減少させ、「幹細胞性」に関与する複数の遺伝子の遺伝子発現パターンを改変した。これらの試験の結果から、胃癌および胃のＣＳＣがＫ−Ｒａｓの発癌遺伝子による影響を受け、Ｋｒａｓ  ａｉＲＮＡが胃癌処置のための有望な治療候補であることが示唆される。したがって本開示は、胃癌の処置、予防、進行の遅延、または他の方法で胃癌の症状を軽減することにおいてＫ−Ｒａｓを標的とする組成物および方法を提供する。本開示はまた、癌ＣＳＣの生存および／または増殖を阻害するためにＫ−Ｒａｓを標的とする組成物および方法、ならびに胃癌の処置、予防、進行の遅延、または他の方法で胃癌の症状を軽減する際にＣＳＣの生存および／または増殖を阻害することにおいてＫ−Ｒａｓを標的とする組成物および方法を提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、本開示の二本鎖ＲＮＡ分子の治療有効量を、必要とする対象に投与することを含む。幾つかの実施形態において、該対象は、ヒトである。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌に罹患している。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌と診断されている。幾つかの実施形態において、該対象は、胃癌の素因がある。
【００４８】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物および方法で用いられる二本鎖ＲＮＡ分子は、１〜８ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび１〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハング、１〜１０ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび平滑末端、または１〜１０ヌクレオチドの５’−オーバーハングおよび平滑末端を有する。別の実施形態において、該二本鎖ＲＮＡ分子は、１〜８ヌクレオチドの２つの５’−オーバーハングまたは１〜１０ヌクレオチドの２つの３’−オーバーハングを有する。さらなる実施形態において、該第一の鎖は、１〜８ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび１〜８ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有する。さらなる実施形態において、該二本鎖ＲＮＡ分子は、単離された二本鎖ＲＮＡ分子である。
【００４９】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、１〜１０ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび１〜１０ヌクレオチドの５’−オーバーハングまたは５’−平滑末端を有する。別の実施形態において、該第一の鎖は、１〜１０ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび１〜１０ヌクレオチドの５’−オーバーハングを有する。別の実施形態において、該第一の鎖は、１〜１０ヌクレオチドの３’−オーバーハングおよび５’−平滑末端を有する。
【００５０】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、５〜１００ヌクレオチド、１２〜３０ヌクレオチド、１５〜２８ヌクレオチド、１８〜２７ヌクレオチド、１９〜２３ヌクレオチド、２０〜２２ヌクレオチド、または２１ヌクレオチドの長さを有する。
【００５１】
別の実施形態において、該第二の鎖は、３〜３０ヌクレオチド、１２〜２６ヌクレオチド、１３〜２０ヌクレオチド、１４〜２３ヌクレオチド、１４または１５ヌクレオチドの長さを有する。
【００５２】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、５〜１００ヌクレオチドの長さを有し、該第二の鎖は、３〜３０ヌクレオチドの長さを有するか；または該第一の鎖は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、該第二の鎖は、３〜２９ヌクレオチドの長さを有するか；または該第一の鎖は、１２〜３０ヌクレオチドの長さを有し、該第二の鎖は、１０〜２６ヌクレオチドの長さを有するか；または該第一の鎖は、１５〜２８ヌクレオチドの長さを有し、該第二の鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有するか；または該第一の鎖は、１９〜２７ヌクレオチドの長さを有し、該第二の鎖は、１４〜２３ヌクレオチドの長さを有するか；または該第一の鎖は、２０〜２２ヌクレオチドの長さを有し、該第二の鎖は、１４〜１５ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該第一の鎖は、２１ヌクレオチドの長さを有し、該第二の鎖は、１３〜２０ヌクレオチド、１４〜１９ヌクレオチド、１４〜１７ヌクレオチド、１４または１５ヌクレオチドの長さを有する。
【００５３】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、第二の鎖よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長い。
【００５４】
幾つかの実施形態において、該二本鎖ＲＮＡ分子は、１〜１０の非ミスマッチまたはミスマッチヌクレオチドをさらに含む。さらなる実施形態において、該非ミスマッチまたはミスマッチヌクレオチドは、３’陥凹末端、またはその付近にある。別の実施形態において、該非ミスマッチまたはミスマッチヌクレオチドは、５’陥凹末端、またはその付近にある。別の実施形態において、該非ミスマッチまたはミスマッチヌクレオチド配列は、二重鎖領域にある。別の実施形態において、該非ミスマッチまたはミスマッチヌクレオチド配列は、１〜５ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該非ミスマッチまたはミスマッチヌクレオチドは、ループ構造を形成している。
【００５５】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖または第二の鎖は、少なくとも１つのニックを含むか、または２つのヌクレオチド断片により形成される。  
【００５６】
幾つかの実施形態において、該遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡ干渉、翻訳のモジュレーション、およびＤＮＡエピジェネティックモジュレーションのうちの１つ、２つまたは全てを通して実現される。
【００５７】
幾つかの実施形態において、サイレンシングされる該標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列は、表１に示された標的配列である。
【００５８】
幾つかの実施形態において、本明細書で非対称干渉ＲＮＡ分子またはａｉＲＮＡ分子とも称される該ＲＮＡ二本鎖分子は、表２に示されるものから選択されるセンス鎖配列、アンチセンス鎖配列、またはセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列との組み合わせを含む。
【００５９】
幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択されるセンス鎖配列を含む。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択されるセンス鎖配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。
【００６０】
幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択される配列と少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える同一性があるセンス鎖配列を含む。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択される配列と少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える同一性があるアンチセンス鎖配列を含む。幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ二本鎖分子（ａｉＲＮＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０〜６３７からなる群から選択される配列と少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える同一性があるセンス鎖配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３８〜９５５からなる群から選択される配列と少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える同一性があるアンチセンス鎖を含む。
【００６１】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他に明確な断りがなければ、複数の対象を含む。例えば用語「細胞」は、それらの混合物をはじめとする複数の細胞を包含する。
【００６２】
本明細書で用いられる「二重鎖ＲＮＡ」、「二本鎖ＲＮＡ」または「ＲＮＡ二本鎖」は、２つの鎖からなり少なくとも１つの二本鎖領域を有するＲＮＡを指し、二重鎖領域内、または２つの隣接する二本鎖領域の間、のいずれかに少なくとも１つのギャップ、ニック、バルジ、および／またはバブルを有するＲＮＡ分子を包含する。１つの鎖が、２つの二重鎖領域の間にマッチしていないヌクレオチドのギャップまたは単鎖領域を有する場合、該鎖は、複数の断片を有すると見なされる。本明細書で用いられる二重鎖ＲＮＡは、いずれかの末端または両方の末端に末端オーバーハングを有し得る。幾つかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡの２つの鎖は、特定の科学的リンカーを通して連結され得る。
【００６３】
本明細書で用いられる「アンチセンス鎖」は、標的メッセジャーＲＮＡに対して実質的な配列相補性を有するＲＮＡ鎖を指す。
【００６４】
本明細書で用いられる用語「単離された」または「精製された」は、通常、ネイティブ状態で随伴する成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均質性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を利用して測定される。
【００６５】
本明細書で用いられる「モジュレートすること」およびその文法的同義語は、増加または減少することのいずれか（例えば、サイレンシング）、言い換えればアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることのいずれかを指す。本明細書で用いられる「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子発現の低減を指し、例えば標的遺伝子の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の遺伝子発現減少を指すことができる。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「対象」は、特定の処置のレシピエントになるはずの、非限定的にヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などをはじめとする任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。幾つかの状況の下で、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関連して本明細書で互換的に用いられる。
【００６７】
本明細書で用いられる「処置すること」または「処置」または「処置する」または「緩和すること」または「緩和する」などの用語は、（１）診断された病的状態もしくは障害を治癒する、緩徐にする、症状を低減する、そして／または進行を停止させる治療方法、および（２）標的となる病的状態もしくは障害の発生を予防する、または緩徐にする防御的または予防的方法、の両方を指す。したがって処置を必要とする対象としては、既に障害を有する対象；障害を有することが立証された対象；および障害を予防されるべき対象が挙げられる。患者が以下の１つまたは複数を示せば、該対象は、本発明の方法にしたがって成功裏に処置される：癌細胞の数の減少または完全な非存在；腫瘍サイズの減少；軟組織および骨への癌の拡大など周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害または非存在；腫瘍転移の阻害または消滅；腫瘍成長の阻害または非存在；特定の癌に関連した１つまたは複数の症状の軽快；疾病率および死亡率の減少；ならびに生活の質の改善。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「阻害すること」、「阻害する」およびそれらの文法的同義語は、生物活性の文脈で用いられる場合、生物活性のダウンレギュレーションによりタンパク質の生成または分子のリン酸化などの標的機能を低減または排除し得ることを指す。生物体（細胞を含む）の文脈で用いられる場合、該用語は、生物体の生物活性のダウンレギュレーションによりタンパク質の生成または分子のリン酸化などの標的機能を低減または排除し得ることを指す。特定の実施形態において、阻害は、例えば標的活性の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の減少を指すことができる。障害または疾患の文脈で用いられる場合、該用語は、発症の予防、症状の緩和、疾患、状態または障害の排除の成功を指す。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「実質的に相補性がある」は、２つの核酸の間の塩基対合した二重鎖領域の相補性を指し、末端オーバーハングまたは２つの二重鎖領域間のギャップ領域などの任意の単鎖領域のものを指すわけではない。該相補性は、完全である必要はなく、例えば２つの核酸の間に、任意の数の塩基対ミスマッチが存在してもよい。しかし、ミスマッチの数があまりに多く、ハイブリダイゼーションが最小にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でも起こり得ない場合には、該配列は、実質的に相補性の配列ではない。２つの配列が、本明細書において「実質的に相補性」と言われる場合、それらの配列が選択された反応条件下でハイブリダイズするのに互いに十分に相補性があることを意味する。特異性を実現するのに十分となる、核酸相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとの関連性は、当該技術分野で周知である。ハイブリダイゼーション条件が、例えば対合した配列と非対合の配列との識別を可能にするのに十分である限りは、２つの実質的に相補性の鎖は、例えば完全に相補性であることも、または１つ〜多数のミスマッチを含むこともできる。したがって、実質的に相補性がある配列は、二重鎖領域内で、例えば１００％、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％もしくはそれ未満、または任意の数の塩基対相補性を有する配列を指すことができる。
【００７０】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉと略す）は、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により誘導された単鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）の標的破壊のための細胞工程である。ｓｓＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの遺伝子転写産物である。ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシングの一形態であり、その場合、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡに相補性の配列を有する遺伝子の発現に特異的に干渉し得る。ｄｓＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ鎖は、リボヌクレアーゼによる切断のために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの相補性遺伝子転写産物を標的とする。
【００７１】
ＲＮＡｉプロセスでは、長いｄｓＲＮＡが、リボヌクレアーゼタンパク質であるダイサーにより、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短い形態に処理される。ｓｉＲＮＡは、ガイド（またはアンチセンス）鎖およびパッセンジャー（またはセンス）鎖に分離される。ガイド鎖は、リボヌクレアーゼ含有多重タンパク質複合体であるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。その後、該複合体は、破壊するために相補的な遺伝子転写産物を特異的に標的とする。
【００７２】
ＲＮＡｉは、多くの真核生物に共通する細胞工程であることが示された。ＲＩＳＣおよびＤｉｃｅｒは、真核生物ドメイン全体で保存されている。ＲＮＡｉは、ウイルスおよび他の外来遺伝子材料への免疫応答において役割を担うと考えられている。
【００７３】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、生物学において様々な役割を担う短い二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の分類である。最も注目すべきこととして、それは、ｓｉＲＮＡが特異的遺伝子の発現と干渉するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与する。加えてｓｉＲＮＡは、抗ウイルスメカニズムまたはゲノムのクロマチン構造の形成などの工程においても役割を担う。幾つかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、５’−リン酸および３’−ヒドロキシル末端を有する２〜３ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する短い（１９〜２１ヌクレオチド）二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を有する。
【００７４】
ダイサーは、ＲＮａｓｅＩＩＩリボヌクレアーゼファミリーの一種である。ダイサーは、長い二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、プレマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる約２０〜２５ヌクレオチド長で通常は３’末端に２つの塩基オーバーハングを有する短い二重鎖ＲＮＡ断片に切断する。ダイサーは、ＲＮＡ干渉経路の第一のステップを触媒し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成を開始し、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノートは、ｓｉＲＮＡガイド鎖の配列と相補性があるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解を可能にするエンドヌクレアーゼである。
【００７５】
本明細書で用いられる効果的なｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｉが標的遺伝子の転写産物を分解するのを惹起するのに効果的なｓｉＲＮＡである。標的遺伝子に相補性があるｓｉＲＮＡのそれぞれが、ＲＮＡｉを惹起して遺伝子の転写産物を分解するのに効果的というわけではない。実際に、時間のかかるスクリーニングは通常、効果的なｓｉＲＮＡ配列を同定することが必要となる。幾つかの実施形態において、該効果的なｓｉＲＮＡ配列は、９０％を超える、８０％を超える、７０％を超える、６０％を超える、５０％を超える、４０％を超える、または３０％を超える標的遺伝子発現の減少を可能にする。
【００７６】
本発明は、最初、全体として参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０２９６８８号および第ＷＯ２００９／０２９６９０号に詳細に記載された通り、ｓｉＲＮＡ様の結果をもたらすために、そしてｍｉＲＮＡ経路の活性をモジュレートするためにも用いられ得る非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）と呼ばれる構造スカフォールドを利用する。
【００７７】
ａｉＲＮＡの構造設計は、遺伝子調節を実行する上で機能的に強力なだけでなく、現在の最先端技術のＲＮＡｉ調節因子（主にアンチセンス、ｓｉＲＮＡ）を上回る複数の利点も提供する。利点の１つとして、ａｉＲＮＡは、現在のｓｉＲＮＡ構築物よりも長さがかなり短いＲＮＡ二本鎖構造を有することができ、これにより合成コストが削減され、宿主細胞からの長さに依存する非特異的インターフェロン様応答の惹起が排除または低減される。ａｉＲＮＡ内のパッセンジャー鎖の長さが短いため、ＲＩＳＣ内のパッセンジャー鎖による意図しない取込みもまた排除または低減され、その一方でｍｉＲＮＡを介した遺伝子サイレンシングで観察されたオフターゲット効果が低減されるはずである。ａｉＲＮＡは、生物学の研究、バイオテクノロジーおよび医薬品業界でのＲ＆Ｄ研究、ならびにｍｉＲＮＡを基にした診断および治療など、現在のｍｉＲＮＡに基づく技術が適用される、または適用されると企図される全ての分野で使用され得る。
【００７８】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある配列を含む。別の実施形態において、該第二の鎖は、標的Ｋ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補性がある配列を含む。
【００７９】
本発明は、Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを実行することが可能な非対称二重鎖ＲＮＡ分子に関連する。幾つかの実施形態において、本発明のＲＮＡ分子は、第一の鎖および第二の鎖を含み、該第二の鎖は、第一の鎖と実質的に相補性があるか、または部分的に相補性があり、該第一の鎖と該第二の鎖は、少なくとも１つの二重鎖領域を形成し、該第一の鎖は該第二の鎖よりも長い（長さの非対称）。本発明のＲＮＡ分子は、少なくとも１つの二重鎖領域と、独立して５’−オーバーハング、３’−オーバーハング、および平滑末端からなる群から選択される２つの末端と、を有する。
【００８０】
任意の末端オーバーハングおよび２つの二重鎖領域の間のギャップを含む、本発明のＲＮＡ分子の任意の単鎖領域は、化学修飾または二次構造のいずれかにより分解に対して安定にされ得る。該ＲＮＡ鎖は、マッチされていないか、または不完全にマッチされたヌクレオチドを有し得る。各鎖は、１つまたは複数のニック（核酸バックボーン内の切断）、ギャップ（１つまたは複数のヌクレオチド欠損を有する鎖断片）、および修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を有し得る。ＲＮＡ分子内のあらゆるヌクレオチドを化学修飾し得るだけでなく、各鎖を、機能性を高めるために１つまたは複数の部分、例えば１つまたは複数のペプチド、抗体、抗体断片、アプタマー、ポリマーなどの部分とコンジュゲートさせることができる。
【００８１】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖は、該第二の鎖よりも少なくとも１ヌクレオチド長い。さらなる実施形態において、該第一の鎖は、該第二の鎖よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長い。別の実施形態において、該第一の鎖は、該第二の鎖よりも少なくとも２０〜１００ヌクレオチド長い。さらなる実施形態において、該第一の鎖は、該第二の鎖よりも少なくとも２〜１２ヌクレオチド長い。さらなる実施形態において、該第一の鎖は、該第二の鎖よりも少なくとも３〜１０ヌクレオチド長い。
【００８２】
幾つかの実施形態において、該第一の鎖または長い鎖は、５〜１００ヌクレオチド、または好ましくは１０〜３０もしくは１２〜３０ヌクレオチド、またはより好ましくは１５〜２８ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態において、該第一の鎖は、２１ヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、該第二の鎖または短い鎖は、３〜３０ヌクレオチド、または好ましくは３〜２９ヌクレオチドもしくは１０〜２６ヌクレオチド、またはより好ましくは１２〜２６ヌクレオチドの長さを有する。幾つかの実施形態において、該第二の鎖は、１５ヌクレオチドの長さを有する。
【００８３】
幾つかの実施形態において、該二重鎖領域は、３〜９８塩基対（ｂｐ）の長さを有する。さらなる実施形態において、該二重鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。さらなる実施形態において、該二重鎖領域は、１０〜１９ｂｐの長さを有する。該二重鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐであり得る。
【００８４】
幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ分子の二重鎖領域は、任意のミスマッチまたはバルジを含まず、該２つの鎖が、該二重鎖領域内で互いに完全に相補性がある。別の実施形態において、該ＲＮＡ分子の二重鎖領域は、ミスマッチおよび／またはバルジを含む。
【００８５】
幾つかの実施形態において、該末端オーバーハングは、１〜１０ヌクレオチドである。さらなる実施形態において、該末端オーバーハングは、１〜８ヌクレオチドである。別の実施形態において、該末端オーバーハングは、３ヌクレオチドである。
【００８６】
本発明はまた、細胞または生物体においてＫ−Ｒａｓ遺伝子発現をモジュレートする方法（サイレンシング方法）を提供する。該方法は、前記細胞または生物体を、選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングが起こり得る条件下で二重鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップと、該二重鎖ＲＮＡに実質的に対応する配列部分を有する標的Ｋ−Ｒａｓ核酸に対して前記二本鎖ＲＮＡ分子により実行される選択的Ｋ−Ｒａｓ遺伝子サイレンシングを媒介するステップと、を含む。
【００８７】
幾つかの実施形態において、前記接触させるステップは、前記二本鎖ＲＮＡ分子を、選択的Ｋ−Ｒａｓサイレンシングが起こり得る培養物または生物体内の標的細胞に導入するステップを含む。さらなる実施形態において、該導入するステップは、トランスフェクション、リポフェクション、感染、電気穿孔、または他の送達技術を含む。
【００８８】
幾つかの実施形態において、該サイレンシング方法は、細胞または生物体における遺伝子の機能または実用性を決定するために用いられる。
【００８９】
該サイレンシング方法は、細胞または生物体内の遺伝子の発現をモジュレートするために用いられ得る。幾つかの実施形態において、該遺伝子は、疾患、例えばヒト疾患もしくは動物疾患、病的状態、または望ましくない状態と関連がある。幾つかの実施形態において、該疾患または望ましくない状態は、胃癌である。
【００９０】
本発明のＲＮＡ分子は、胃癌をはじめとする様々な疾患または望ましくない状態の処置および／または予防に用いられ得る。幾つかの実施形態において、本発明は、癌治療として、または癌を予防するため、または癌の進行を遅延させるために用いられ得る。本発明のＲＮＡ分子を用いて、細胞増殖または他の癌表現型に関与するＫ−Ｒａｓをサイレンシングまたはノックダウンすることができる。
【００９１】
本発明は、疾患または望ましくない状態を処置する方法を提供する。該方法は、非対称二本鎖ＲＮＡ分子を用いて、疾患または望ましくない状態に関連する遺伝子の遺伝子サイレンシングを実行することを含む。
【００９２】
本発明は、医薬組成物をさらに提供した。該医薬は、少なくとも１つの非対称二本鎖ＲＮＡ分子を含む（活性剤として）。幾つかの実施形態において、該医薬は、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質キャリア、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、および類脂質からなる群から選択される１つまたは複数の担体を含む。幾つかの実施形態において、該組成物は、診断用途のものである。幾つかの実施形態において、該組成物は、治療用途のものである。
【００９３】
本発明の医薬組成物および配合剤は、ＲＮＡ原材料以外は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡのために開発された医薬組成物および配合剤と同一または類似のものであり得る（例えば、ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７，  ”Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｓｉＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ６，  ４４３４５３；  Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，  ２００７，  ”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．”  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８，  １７３−１８４参照）。該医薬組成物および配合剤中のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡは、本開示の二本鎖ＲＮＡ分子により置換され得る。該医薬組成物および配合剤はまた、本開示の二本鎖ＲＮＡ分子を収容するようにさらに修飾され得る。
【００９４】
開示された二本鎖ＲＮＡ分子の「医薬的に許容し得る塩」または「塩」は、イオン結合を含む開示された二本鎖ＲＮＡ分子の生成物であり、典型的には開示された二本鎖ＲＮＡ分子を対象への投与に適した酸または塩基のいずれかと反応させることにより生成される。医薬的に許容し得る塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩をはじめとする酸付加塩；Ｎａ、Ｋ、Ｌｉなどのアルカリ金属陽イオン、ＭｇもしくはＣａなどのアルカリ土類金属塩、または有機アミン塩を挙げることができるが、それらに限定されない。
【００９５】
「医薬組成物」は、対象への投与に適した形態の、開示された二本鎖ＲＮＡ分子を含有する配合剤である。一実施形態において、該医薬組成物は、バルクまたは単位投与剤型である。単位投与剤型は、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器のシングルポンプまたはバイアルをはじめとする様々な形態のいずれかである。組成物の単位用量中の有効成分（例えば、開示された二本鎖ＲＮＡ分子またはその塩の配合剤）の量は有効量であり、関係する特定の処置に応じて変動する。当業者は、患者の年齢および状態に応じて、投与量に日常的変動を加えることが時には必要であることを認識するであろう。投与量はまた、投与経路に依存するであろう。経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内などをはじめとする様々な経路が企図される。本発明の二本鎖ＲＮＡ分子の外用または経皮投与のための投与剤型としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が挙げられる。一実施形態において、該活性二本鎖ＲＮＡ分子は、滅菌条件下で、薬学的に許容し得る担体と、そして必要とされる任意の防腐剤、緩衝液、または噴射剤と混合される。
【００９６】
本発明は、該医薬組成物の有効量を必要とする対象に投与することを含む処置方法を提供する。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ｉｖ、ｓｃ、外用、ｐｏ、およびｉｐからなる群から選択される経路を介して投与される。別の実施形態において、該有効量は、１ｎｇ〜１ｇ／日、１００ｎｇ〜１ｇ／日、または１μｇ〜１ｍｇ／日である。
【００９７】
本発明はまた、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子を、少なくとも１種の医薬的に許容し得る賦形剤または担体と共に含む医薬配合剤を提供する。本明細書で用いられる「医薬的に許容し得る賦形剤」または「医薬的に許容し得る担体」は、医薬投与に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含するものとする。適切な担体は、参照により本明細書に組み込まれる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｔｗｅｎｔｉｅｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，”  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ．，に記載されている。そのような担体または希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、それらに限定されない。リポソームおよび不揮発油などの非水性ビヒクルもまた、用いることができる。医薬的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性二本鎖ＲＮＡ分子と不適合である場合を除き、該組成物中でのそれらの使用が企図される。補助的な活性二本鎖ＲＮＡ分子を、該組成物に組み入れることもできる。
【００９８】
本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子（有効成分として）の治療有効量（例えば、腫瘍成長の阻害、腫瘍細胞の死滅、細胞増殖障害の処置または予防などを通して所望の治療効果を実現するのに十分な有効レベル）を、従来の手順により（即ち、本発明の医薬組成物を生成することにより）標準的医薬担体または希釈剤と組み合わせることにより調製された適切な投与剤型で投与される。これらの手順は、所望の調製を達成するのに適した原材料を混合、造粒、圧縮、または溶解することを含み得る。別の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子の治療有効量は、標準の医薬担体または希釈剤を含まない適切な投与剤型で投与される。
【００９９】
医薬的に許容し得る担体としては、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸などの固体担体が挙げられる。例示的な液体の担体としては、シロップ、ピーナッツオイル、オリーブオイル、および水などが挙げられる。同様に担体または希釈剤としては、当該技術分野で公知の時間遅延材料、例えば単独での、またはワックス、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセリロース、メタクリル酸メチルなどを伴う、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを挙げることができる。他の充填剤、賦形剤、香味剤および当該技術分野で公知の他の添加剤を、本発明による医薬組成物に含めることもできる。
【０１００】
本発明の活性二本鎖ＲＮＡ分子を含有する医薬組成物は、一般に知られる手法、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖剤作製（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程により製造され得る。医薬組成物は、医薬的に用いられ得る調製剤への活性二本鎖ＲＮＡ分子の処理を容易にする賦形剤および／または補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容し得る担体を用いて従来の処方で配合され得る。もちろん、適切な配合剤は、選択された投与経路に依存する。
【０１０１】
本発明の二本鎖ＲＮＡ分子または医薬組成物は、現在、化学療法的処置に用いられている周知の方法の多くで、対象に投与され得る。例えば癌の処置の場合、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、腫瘍に直接注射されても、血流もしくは体腔に注射されても、経口摂取されても、またはパッチにより皮膚を通して適用されてもよい。乾癬病の処置の場合、全身投与（例えば、経口投与）または罹患した皮膚領域への外用投与が、好ましい投与経路である。選択される用量は、効果的処置をなすのに十分でなければならないが、許容し得ない副作用を引き起こすほど高くてはならない。疾患状態（例えば、胃癌）の状況および患者の健康が、処置期間中、および処置後の合理的期間に、綿密にモニタリングされなければならない。
【０１０２】
実施例
本発明の異なる特色をさらに示すために、実施例を以下に示す。実施例は、本発明を実践するための有用な方法論も示している。これらの実施例は、請求される本発明を限定するものではない。
【０１０３】
実施例１：ａｉＫ−Ｒａのインビトロでの効力
図１（Ａ）は、ａｉＲＮＡ  ＩＤ  ＮＯ：２１（「ａｉＫ−Ｒａｓ＃１」）を用いてＫ−ＲａｓターゲットＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２を標的とし、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１のＩＣ５０を決定した、インビトロ試験を示している。ＤＬＤ１細胞（ＡＴＣＣ）に、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収して，ＲＮＡを単離した。ａｉＫ−Ｒａｓ＃１のＩＣ５０を、ｑＰＣＲにより決定した。残留するｍＲＮＡを、ＧＡＰＤＨ発現レベルに標準化した。３．１ｐＭというＩＣ５０から、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１が高い効力でＫ−Ｒａｓ遺伝子発現をサイレンシングすることが示される。
【０１０４】
図１（Ｂ）は、ａｉＲＮＡ  ＩＤ  ＮＯ：１４２（「ａｉＫ−Ｒａｓ＃２」）を用いてＫ−ＲａｓターゲットＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２を標的とし、ａｉＫ−Ｒａｓ＃２のＩＣ５０を決定した、インビトロ試験を示している。ＤＬＤ１細胞に、ａｉＫ−Ｒａｓ＃２をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収して，ＲＮＡを単離した。ａｉＫ−Ｒａｓ＃２のＩＣ５０を、ｑＰＣＲにより決定した。残留するｍＲＮＡを、ＧＡＰＤＨ発現レベルに標準化した。３．５ｐＭというＩＣ５０から、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１が高い効力でＫ−Ｒａｓ遺伝子発現をサイレンシングすることが示される。
【０１０５】
実施例２：ａｉＫ−Ｒａｓのオフターゲット効果の減少
図２（Ａ）は、ノーザンブロット分析によるＲＩＳＣへのｓｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡローディングの検出を示している。低分子ＲＮＡ  ＲＩＳＣローディングを分析するために、ＨＥＫ２９３  Ｆｌａｇ−Ａｇｏ２安定細胞にａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ二本鎖をトランスフェクトした。細胞を示された時点で溶解して、Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｆ１８０４）で免疫沈降させた。免疫沈降物を洗浄し、ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５５９６−０１８）抽出により複合体から単離して、１５％ＴＢＥ−尿素ＰＡＧＥまたは１５％ＴＢＥ非変性ＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動の後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎａｄ−ＸＬナイロン膜に移し替えた。その後、ｒ−Ｐ３２標識された検出物のセンス鎖またはアンチセンス鎖プローブを膜上のＲＮＡにハイブリダイズした。Ｆｌａｇ−Ａｇｏ２を発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ＃２９３−ｎｕｌｌ）にｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡをトランスフェクトし、その後、免疫沈降アッセイを実施した。Ｆｌａｇ−Ａｇｏ２細胞を安定発現するＦｌａｇ−Ａｇｏ２  ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｌａｇ−Ａｇｏ２ネオマイシンプラスミドＤＮＡベクターの一過性トランスフェクションにより作製した。選択的ネオマイシン含有培地の後、モノクローナル集団をウェスタンブロットにより選択した。非変性ゲルを用いて、ｄｓＲＮＡを検出した。
【０１０６】
図２（Ｂ）は、ａｉＲＮＡのオフターゲット効果の減少を示している。ＨｅＬａ細胞に、アンチセンス鎖またはセンス鎖に基づくａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ標的配列およびａｉＫ−Ｒａｓ＃２またはｓｉＫ−Ｒａｓ＃２（５ｎＭ）を融合されたルシフェラーゼレポーター遺伝子をトランスフェクトした。図２（Ｃ）は、ＴＬＲ３／ＲＮＡ複合体が抗ＨＡ抗体（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ＃ａｂ−ｈａｔａｇ）で免疫沈降されたことを示している。ＲＮＡをペレットから抽出して、ノーザンブロット分析を実施し、ａｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡとＴＬＲ３受容体との相互作用を測定した。
【０１０７】
図２（Ａ）〜（Ｃ）は、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１およびａｉＫ−Ｒａｓ＃２の非対称構造がセンス鎖を介したオフターゲット効果およびＬＴＲ３結合を減少させたことを示している。
【０１０８】
実施例：３Ｋ−Ｒａｓ突然変異細胞におけるａｉＫ−Ｒａｓ感受性
図３（Ａ）は、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１またはａｉＫ−Ｒａｓ＃２でトランスフェクトされたＡＧＳおよびＤＬＤ１におけるコロニー形成アッセイを示している。細胞に１ｎＭ  ＧＦＰ  ａｉＲＮＡ（対照；ＧＧＴＴＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５６））または１ｎＭ  ａｉＫ−Ｒａｓ＃１もしくはａｉＫ−Ｒａｓ＃２を２４時間トランスフェクトした。その後、細胞をトリプシン処理して、５００〜２０００細胞／ウェルになるように６ウェルプレートに再度播種して、細胞のコロニー形成能を測定した。１１〜１４日後に、コロニーをギムザ染色液で染色してカウントした。ウェスタンブロット分析では、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄して溶解緩衝液［５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１×Ｈａｌｔプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｅｆｉｃ、カタログ＃８７７８６）］で溶解した。可溶性タンパク質（１０μｇ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離して、ＰＶＤＦ膜に移し替えた。一次抗体をこの試験で用いた。抗原−抗体複合体を化学発光の増強により視覚化した（ＢｉｏＲａｄ、カタログ＃１７０−５０６０）。
【０１０９】
図３（Ｂ）は、ＡＧＳおよびＤＬＤ１からの溶解物のウェスタンブロット分析、ならびにＫ−Ｒａｓ発現、切断されたカスパーゼ３、および切断されたＰＡＲＰに及ぼすａｉＫ−Ｒａｓ＃１およびａｉＫ−Ｒａｓ＃２のトランスフェクション効果を示している。
【０１１０】
図３（Ｃ）は、大細胞パネルにおけるコロニー形成アッセイの結果を示している。パネル内の全ての細胞株が、ＡＴＣＣにより得られた。Ｋ−Ｒａｓ突然変異体を宿した細胞が強調されている。
【０１１１】
実施例４：ａｉＫ−Ｒａｓ感受性とＫ−Ｒａｓ増幅の相関
図４は、Ｋ−ＲａｓおよびＥＧＦＲ−ＲＡＳ経路分子のウェスタンブロット分析を示している。溶解物（１０μｇ／レーン）をロードして、ＥＧＦＲ、ｃＲａｆ、ＭＥＫ、およびＥＲＫの全体およびリン酸化形態を検出した。Ｋ−Ｒａｓの活性化形態（Ｋ−Ｒａｓ  ＧＴＰ）を、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤを利用して細胞溶解物からアフィニティー精製して、Ｋ−Ｒａｓ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した。以下の抗体をウェスタンブロットに用いた：アクチン（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ａ５３１６）、Ｋ−ＲＡＳ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ３０およびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃８９５５）、切断されたＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃５６２５）、切断されたカスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃９６６４）、ホスホ−ＥＧＦ受容体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃３７７７）、ＥＧＦ受容体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃４２６７）、ホスホ−ｃ−Ｒａｆ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃９４２７）、ｃ−Ｒａｆ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃９４２２）、ホスホ−ＭＥＫ１／２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃９１５４）、ＭＥＫ１／２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃８７２７）、ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋｌ／２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃４３７０）、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃４６９５）、Ｊａｇｇｅｄ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃２６２０）、Ｎｏｔｃｈｌ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃３６０８）、ｃ−Ｍｙｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃５６０５）。ＲＢＤプルダウンを、Ｒａｓ活性化キット（Ａｂｅａｍ、カタログ＃ａｂ  １２８５０４）を用いて製造業者のプロトコルに従い実施した。Ｋ−Ｒａｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ＃ｓｃ３０）では、沈降物をブロットした。ロード対照として、アクチン（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ａ５３１６）をブロットした。図４は、ａｉＫ−Ｒａｓの感受性がＫ−Ｒａｓ増幅と相関し、Ｒａｓ経路分子の活性化状態と相関しないことを示している。
【０１１２】
図５（Ａ）は、ａｉＫ−Ｒａｓの感受性が、Ｋ−Ｒａｓ突然変異体の大細胞パネルにおいてＫ−Ｒａｓ増幅と相関したことを示している。パネルの細胞株は全て、ＡＴＣＣから得られた。Ｋ−Ｒａｓのコロニー数を、ｑＰＣＲにより分析した。統計差を、両側マン・ホイットニーのＵ検定により決定した。ｐ＜０．０５の差を、統計学的に有意と見なした。
【０１１３】
図５（Ｂ）は、ａｉＫ−Ｒａｓの感受性が、Ｋ−Ｒａｓ突然変異体の大細胞パネルにおいてＫ−Ｒａｓ増幅と相関したことを示している。Ｋ−Ｒａｓタンパク質発現レベルを、ウェスタンブロットにより測定した。ウェスタンブロットのバンドを、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（Ｂｉｏｒａｄ）により定量した。統計差を、両側マン・ホイットニーのＵ検定により決定した。ｐ＜０．０５の差を、統計学的に有意と見なした。
【０１１４】
図３（Ａ）〜（Ｃ）および５（Ａ）〜（Ｂ）は、ａｉＫ−Ｒａｓの感受性がＫ−Ｒａｓ突然変異細胞内で変動すること、およびそれがＫ−Ｒａｓコピー数と相関することを示している。
【０１１５】
実施例６：感受性細胞株のＣＳＣ様表現型に及ぼすａｉＫ−Ｒａｓの影響
図６（Ａ）は、ＣＳＣ培養における幹細胞性遺伝子発現を示している。ＡＧＳ細胞を、ＣＳＣ培地［Ｂ−２７サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１７５０４−０４４）、２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃２３６−ＥＧ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃２３３−ＦＢ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ栄養混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１１３２０−０３３）］で２週間培養した。ＣＳＣスフェアのＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、およびＳｏｘ２遺伝子発現を、ｑＰＣＲにより定量した。
【０１１６】
図６（Ｂ）は、様々な細胞株におけるスフェア形成アッセイの結果を示している。スフェア形成アッセイのために、アガロースをコートしたプレートを調製してオートクレーブにかけた０．５％寒天を分配し、直ちに吸引した。トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理してカウントし、その後、２０００細胞／１×ＣＳＣ培地１００μＬに希釈した。０．３３％アガロースを含む加温されたＣＳＣ培地１．９ｍＬ（Ｓｉｇｍａ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ、カタログ＃Ａ−４０１８）を、最終的なアガロース濃度０．３％になるようにＣＳＣ培地中の細胞に添加した。プレートを４℃で１０分間静置して冷却した。プレートを室温で１０分間静置して、ＣＳＣ培地１ｍＬを上層に添加した。プレートを３７℃／１５％ＣＯ２インキュベーターで１８〜２５日間インキュベートした。スフェアをカウントするために、ＣＳＣ培地を吸引して、ＰＢＳ中のクリスタルバイオレット（ＥＭＤ、カタログ＃１９２−１２）溶液を添加し、室温で１時間インキュベートしてスフェアを染色した。
【０１１７】
細胞をトリプシン処理して、寒天をコートした６ウェルプレート上のＣＳＣ培地／３％ソフト寒天に２０００細胞／ウェルで再度播種して、細胞のスフェア形成能を測定した。１８〜２５日後に、スフェアをクリスタルバイオレットで染色して、スフェアの数をカウントした。
【０１１８】
図６（Ｃ）は、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１およびａｉＫ−Ｒａｓ＃２を有するＡＧＳおよびＤＬＤ１細胞内のＣＤ４４高密度集団の欠失を示している。ＣＤ４４発現をフローサイトメトリーで検出し、そこでＡＧＳおよびＤＬＤ１細胞を氷上で染色緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ＃５５４６５７）中のＰＥコンジュゲート抗ＣＤ４４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ＃５５５４７９）で４５分間染色して、染色緩衝液で１回洗浄した。ＣＤ４４陽性集団をフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検出した。
【０１１９】
図６（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明によるａｉＫ−Ｒａｓが感受性細胞株においてＣＳＣ様表現型をモジュレートすることを示している。
【０１２０】
実施例７：ＣＳＣ関連遺伝子発現パターンに及ぼすＫ−Ｒａｓノックダウンの影響
図７（Ａ）は、ａｉＫ−Ｒａｓをトランスフェクトされた癌細胞におけるＣＳＣ関連遺伝子のヒートマップを示している。細胞に１ｎＭ対照ａｉＫ−ＲａｓまたはａｉＫ−Ｒａｓ＃１を４８時間トランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲを、ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイを有する８４のＣＳＣ関連遺伝子のための特異的な検証済みプライマーを用いて、総ＲＮＡについて実施した。遺伝子発現の倍率変化を、ａｉＫ−Ｒａｓ＃１と対照ａｉＲＮＡ試料との比率として計算した。図７（Ｂ）は、ウェスタンブロットによるダウンレギュレートされたＮｏｔｃｈシグナル伝達の確認を示している。以下の表３は、図７（Ａ）に示されたヒートマップに対応するａｉＫ−Ｒａｓ＃１により３倍を超えてダウンレギュレートされた遺伝子を要約している。
【表４】
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【０１２１】
本明細書に例示および開示された実施形態は、本発明を作製および使用するための本発明者らに知られる最良の方法を当業者に教示することのみを意図している。本明細書内のいずれも、本発明の範囲を限定するものと見なすべきではない。示された実施例は全て、代表的および非限定的である。本発明の上記実施例は、先の教示を参照して当業者に認識される通り、本発明を逸脱することなく改良または変更することが可能である。それゆえ、本発明が、特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、具体的に記載されたもの以外に実践され得ることが理解されるべきである。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図２（Ｃ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【国際調査報告】
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