(57)【要約】  【課題】 本発明は、間葉系幹細胞から誘導した万能(多能性)幹細胞株pluripotent  stem cell line)を製造する方法、及びそれにより得られた誘導万能幹細胞株(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)に関する。   【解決手段】具体的に、本発明の誘導万能幹細胞株の製造方法は、(a)ヒトのへその緒(臍帯)から間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)を得る段階と; (b)前記間葉系幹細胞を、カジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地でコロニーを形成させる段階と; (c)前記コロニーを継代培養して、誘導万能幹細胞株を得る段階と;  を含む。本発明による誘導万能幹細胞株は、本発明者等により最初に構築されたものであり、本発明の万能幹細胞株は、多様な細胞に分化することができ、細胞移植治療を通じて多様な疾病または疾患を治療することができる。【選択図】図４
2017522909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞から誘導万能幹細胞株(induced pluripotency stem cell line)を製造する方法であって、
(a)ヒトのへその緒から間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)を得る段階と;
(b)前記間葉系幹細胞を、カジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地でコロニーを形成させる段階と;
(c)前記コロニーを継代培養して、誘導万能幹細胞株を得る段階と;
を含む誘導万能幹細胞株の製造方法。
【請求項２】
前記逆分化用培地は、カジメ抽出物(Ecklonia cava)とエネルギーウォーターとを含むことを特徴とする、請求項1に記載の誘導万能幹細胞株の製造方法。
【請求項３】
前記カジメ抽出物は、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、MEM(Minimal Essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、DMEM-F12、α-MEM(α-Minimal Essential Medium)、G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、MacCoy's 5A培地、AmnioMax、AminoMaxII complete Medium及びChang's Medium MesemCult-XF Mediumから構成された群より選択される培地に含まれることを特徴とする、請求項1または２に記載の誘導万能幹細胞株の製造方法。
【請求項４】
前記カジメ抽出物は、培地組成物を基準としたとき、1〜400μg/ml含まれていることを特徴とする、請求項1または２に記載の誘導万能幹細胞株の製造方法。
【請求項５】
前記逆分化用培地は、エネルギーウォーターを0.01〜10v/v%さらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の誘導万能幹細胞株の製造方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞を、カジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地で培養して逆分化した、誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)。
【請求項７】
前記逆分化用培地は、カジメ抽出物(Ecklonia cava)を、培地組成物を基準としたとき、1〜400μg/ml含むことを特徴とする、請求項６に記載の誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)。
【請求項８】
前記誘導万能幹細胞株は、Oct-4、SOX-2またはSSEA-4(stage-specific embryonic antigen)に対する染色反応で陽性反応を示すことを特徴とする、請求項6に記載の誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)。
【請求項９】
前記万能幹細胞株は、胚擬似体で、外胚葉細胞と内胚葉細胞と中胚葉細胞とに自然分化することができる能力を持つことを特徴とする、請求項6に記載の誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)。
【請求項１０】
請求項6に記載の誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)を含む、細胞治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞から誘導した万能(多能性)幹細胞株を製造する方法及び得られた万能幹細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞株は、連続継代性の細胞系、つまり樹立細胞株を意味するもので、培養細胞が無限増殖性を獲得して連続継代性細胞系になることを意味している。
【０００３】
さらに、幹細胞は、各組織から得られる分化する前段階の未分化細胞のことを総称する。未分化状態において一定期間の間、自分と同じ細胞を持続的に作り出すことができる性質と、適当な条件下では生物学的組織を構成する多様な細胞に分化することができる性質とを持っている。
【０００４】
幹細胞は、分化能と生成時期に応じて、大きく胚性幹細胞(embryonic stem cell)と成体幹細胞(adult stem cell)とに区分することができる。また、他の分類としては、幹細胞の分化能に応じるもので、万能(pluripotency；多能性)幹細胞と、多分化能(multipotency)幹細胞と、単分化能(unipotency)幹細胞とに分けられる。
【０００５】
成体幹細胞は、多分化能幹細胞または単分化能幹細胞に区分することができる。代表的な成体幹細胞としては、間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells; MSCs)と、造血幹細胞(hematopoietic stem cells; HSCs)とがある。間葉系幹細胞は、軟骨細胞(chondrocyte)、骨芽細胞(osteoblast)、脂肪細胞(adipocyte)、筋肉細胞(myocyte)、神経細胞(neuron)に分化し、造血幹細胞は、赤血球、白血球、血小板など、主として血液内の血球細胞に分化するものと知られている。
【０００６】
その反面、万能幹細胞は、生体を構成する3種類の胚葉(germ layer)のいずれにも分化することができ、人体の全ての細胞や臓器の組織に分化することができる多能性を持つ幹細胞のことを指し、一般的に胚性幹細胞がこれに該当する。ヒト胚性幹細胞は、ヒト生命体で生じる胚から作られるため、多くの倫理的な問題点を抱えているが、成体幹細胞に比べて細胞の増殖能及び分化能に優れていると知られている。成体幹細胞は、骨髓、血液、脳、肌などから得られるため、倫理的な問題が少ないものの、胚性幹細胞に比べて限定した分化能を持っている。
【０００７】
このような問題点を克服するための代案として、成体より由来した細胞を逆分化させて、胚性幹細胞に類似したカスタマイズ型万能幹細胞(株)を製造するための様々な方法が試みられてきた。その代表的な方法として、細胞融合法(fusion with ES cell)、体細胞核移植法(somatic cell nuclear transfer)、特定因子注入法(reprogramming by gene factor)などがある。細胞融合法は、誘導された細胞が2対の遺伝子をさらに有しているため、細胞の安全性の側面から問題点があり、体細胞核移植法は、卵子が大量に必要であり、効率も非常に低いという点から問題がある。そして、特定因子注入法は、特定の遺伝子を挿入して逆分化を誘導するために、発ガン遺伝子を含むウイルスを用いる方法であって、発ガンの危険が高く、低い効率及び方法的な側面からの難易度により、細胞治療剤の開発可能性の面から問題視(問題化)されている。
【０００８】
万能幹細胞株を成功的かつ多量に得るためには、分離した臍帯由来の単核細胞を培養する段階での培養組成物が非常に重要であることから、より多い量、高効率の誘導方法により万能幹細胞を製造するための研究が必要になった状態である。
【０００９】
一方、カジメを用いてアトピー疾患の治療または予防のための組成物(大韓民国公開特許公報  第2009-0043115号)や酸化染色用染毛剤組成物(大韓民国公開特許公報  第2012-0126148号)に使用した場合はあるが、間葉系幹細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell)を誘導万能幹細胞株(induced pluripotency stem cell line)に逆分化するための用途に使用されたことは全く無い状態である。
【００１０】
前記の「背景技術」として説明された事項は、本発明の背景についての理解を増進するためのものであるだけで、当該技術の分野における通常の知識を有する者にとって既知の従来技術に該当することを認めるものと受け入れてはいけない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】大韓民国公開特許公報  第2009-0043115号
【特許文献２】大韓民国公開特許公報  第2012-0126148号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者等は、安全性と生産効率の高い細胞治療剤の開発の実用化のための万能(多能性)幹細胞株を高効率で誘導する方法を見出そうと努力してきた。その結果、安全な天然抽出物であるカジメ抽出物を細胞培養培地に添加する場合、間葉系幹細胞を用いて安全にかつ高効率で誘導万能幹細胞株を製造することができることを確認することで、本発明を完成するに至った。
【００１３】
それで、本発明の目的は、間葉系幹細胞にカジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地(以下、STC-F002と称する)を処理して、誘導万能幹細胞株(induced pluripotent stem cell line)の製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、間葉系幹細胞をカジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地で培養して、逆分化した誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記誘導万能幹細胞株を含む細胞治療用組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明のその他の目的及び利点は、以下に示す発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一実施の態様によれば、(a)ヒトのへその緒(臍帯)から間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)を得る段階と; (b)前記間葉系幹細胞をカジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地でコロニーを形成させる段階と; (c)前記コロニーを継代培養して誘導万能幹細胞株を得る段階と;を含む間葉系幹細胞から誘導万能幹細胞株(induced pluripotency stem cell line)を製造する方法を提供する。
【００１８】
本発明者等は、胚を破壊するといった倫理的問題を伴うことなく、安全性と生産効率の高い細胞治療剤の開発の実用化のための万能幹細胞株を高効率で誘導する方法を見出そうと努力してきた。その結果、安全な天然抽出物であるカジメ抽出物を細胞培養培地に添加する場合、驚くべきことに高い効率で万能幹細胞株を製造することができることを確認した。
【００１９】
本発明の逆分化用培地組成物に含まれる有効成分であるカジメ(甘苔、Ecklonia cava)は、主として大韓民国南海岸(ナムヘアン)、済州島(チェジュド)海岸一帯及び鬱陵島(ウルルンド)海岸一帯に棲息する褐藻植物コンブ目コンブ科のの多年生海藻類であって、主としてアワビとサザエ等の餌になり、アルギン酸やヨード(ヨウ素)・カリウムを作る主要原料でもあるし、食用として用いられることもある。
【００２０】
本発明に含まれるカジメ抽出物は、水、(a)炭素数1〜4の無水または含水低級アルコール(メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール及びノルマルブタノールなど)、(b)前記低級アルコールと水との混合溶媒、(c)アセトン、(d)エチルアセテート、(e)クロロホルム、(f)1,3-ブチレングリコール、(g)ヘキサン、(h)ジエチルエーテルなどの有機溶媒を用いて抽出することができ、望ましくは、メタノールまたはエタノールと水との混合溶媒を用いて抽出することができる。混合溶媒を用いて抽出する場合、メタノールまたはエタノールの含量は、50〜80v/v%が望ましい。
【００２１】
現在、前記カジメ抽出物を化粧料などの肌組成物に適用するための事例が増加している(大韓民国公開特許公報  第2013-0017159号、 大韓民国公開特許公報   第2012-0040488号、 大韓民国公開特許公報   第2010-0097293号などを参照すること)が、万能幹細胞誘導用培地として開発された事例は全く無い。
【００２２】
本願において使用されている用語のうち“胚性幹細胞”とは、受精後、発生初期における胚盤胞(blastocyst)の内部細胞塊(inner cell mass)から分離して培養した細胞であって、万能性(pluripotency；多能性)を持つ細胞のことを指す。本願において使用されている用語のうち“万能幹細胞(多能性幹細胞)”とは、生体を構成する3種類の胚葉(germ layer)、つまり内胚葉(endoderm)、中胚葉(mesoderm)、外胚葉(ectoderm)のいずれにも分化することができる万能性を持つ幹細胞のことを指す。
【００２３】
本願において使用されている用語のうち“分化(differentiation)”とは、細胞が分裂増殖して成長する間において、相互に構造や機能が特殊化する現象、つまり生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられた働きを遂行するために、その形態や機能が変化していくことを言う。
【００２４】
本願において使用されている用語のうち“細胞治療剤”とは、ヒトから分離、培養及び特殊な操作を通じて製造された細胞及び組織で、治療、診断及び予防の目的に使用される医薬品であって、細胞或いは組織の機能を修復(回復)させるために、同種または異種の細胞を体外で増殖、選別するか、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を通じて、治療、診断及び予防の目的に使用される医薬品のことを指す。この細胞治療剤は、細胞の分化程度に応じて、大きく体細胞治療剤と幹細胞治療剤とに分類され、本発明は、特に幹細胞治療剤に関するものである。
【００２５】
本発明の間葉系幹細胞は、哺乳動物来由の胚性幹細胞または成体幹細胞から分離した細胞であって、望ましくは臍帯来由の間葉系幹細胞であり、より望ましくは人体臍帯由来の間葉系幹細胞である。前記幹細胞は、人体において胎盤と胎児とを結ぶ臍帯から採取して得ることができる。臍帯からの間葉系幹細胞の採取は、多様な方法を用いて行うことができ、例えば、人体から臍帯を採取してDPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline；リン酸緩衝生理食塩水)で血液が出ないまで洗浄し、洗浄した臍帯を手術用メスの刃で切り刻み、37℃でインキュベートして単核細胞が含有された溶液を得ることができる。
【００２６】
本願において使用されている用語のうち“培地”とは、糖、アミノ酸、各種の栄養物質、血清、成長因子、無機質などの細胞の成長及び増殖などに必須的な要素を含む生体外(in vitro)で幹細胞などの細胞の培養または分化のための混合物のことを言う。
【００２７】
当業界においては多様な培地が市販されており、人為的に製造して使用することもできる。市販中の培地としては、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、MEM(Minimal Essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、DMEM F-12、α-MEM(α-Minimal Essential Medium)、G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium)、IMPM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、AmnioMax, AminoMaxII complete Medium(Gibco、Newyork、USA)、Chang's Medium MesemCult-XF Medium(STEMCELL Technologies、Vancouver、Canada)などがあり、人為的に製造することができる培地と共に、本発明の培地組成物に含まれる基本培地として使用することができる。
【００２８】
前記基本培地には、通常添加される血清成分(例えば、FBS(Fetal Bovine Serum))及び抗生剤(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン)などを添加することができる。前記基本培地に添加される血清成分または抗生剤成分の濃度は、本発明の効果を達成することのできる範囲内において変わることができ、望ましくは、10%のFBS、100unit/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシンなどを添加することができる。
【００２９】
また、本発明の培地は、栄養混合物(Nutrient Mixture)をさらに含むことができる。前記栄養混合物は、細胞培養に一般的に使用される各種のアミノ酸、ビタミン、無機塩などを含む混合物であって、前記アミノ酸、ビタミン、無機塩などを混合して製造するか、商業的に製造された栄養混合物を使用することができる。商業的に製造された栄養混合物としては、M199、MCDB110、MCDB202、MCDB302などを例示することができるが、これらに制限されるものではない。
【００３０】
さらに、本発明の培地は、万能幹細胞の誘導と安定化のために、エネルギーウォーターをさらに含むことができる。前記エネルギーウォーターは、0.01〜10v/v%で追加するのが望ましく、より望ましくは、0.05〜0.5v/v%で追加する。
【００３１】
本発明の培地組成物は、万能幹細胞誘導に特異的な培地であって、前記基本培地にカジメ抽出物を添加することで達成することができ、望ましくは、全体培地組成物を基準としたとき、1〜1,000μg/mlの濃度で、より望ましくは、1〜400μg/mlの濃度でカジメ抽出物を含むことができる。
【００３２】
本発明における“誘導万能幹細胞株”とは、多能性の間葉系幹細胞から胚性幹細胞のような万能性を誘導した幹細胞のことであって、持続的に継代培養することのできる細胞株を意味している。本発明の目的上、前記誘導万能幹細胞株は、望ましくは、EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)を意味している。
【００３３】
そのことから、本発明の他の実施の態様によれば、間葉系幹細胞をカジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地で培養して、逆分化した誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)を提供する。
【００３４】
本発明の誘導万能幹細胞株EPN-1は、大韓民国ソウル大学校医科大学の韓国細胞株研究財団に、2014年 5月 30日付にて、寄託番号KCLRF-BP-00318として寄託された。
【００３５】
望ましくは、Oct-4、SOX-2、またはSSEA-4(stage-specific embryonic antigen)に対する染色反応で陽性反応を示すことを特徴とする誘導万能幹細胞株EPN-1を提供する。本発明の一実施例においては、誘導万能幹細胞株としての特性を実験して、これが万能幹細胞株であることを立証した(図3及び図4)。
【００３６】
本発明の一実施例によれば、本発明のカジメ抽出物が含まれた培地組成物を用いた場合、DMEM F-12の培地のみを用いた場合とは異なり、8〜10日目の日になって万能幹細胞コロニーが形成されたことを確認した(図2)。
【００３７】
本発明の誘導万能幹細胞株は、胚性幹細胞と同一の分化能を持ち、細胞の模様においても胚性幹細胞とほぼ同一である。本発明の一実施例によれば、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子(Nanog、Oct4、Sox-2、c-Myc)及びタンパク質(SSEA4)が発現するかどうかを調べたところ、本発明によって誘導された万能幹細胞において、胚性幹細胞と同様に前記遺伝子及びタンパク質が発現することを確認した(図4及び図5)。
【００３８】
さらに、本発明の誘導万能幹細胞株は、外胚葉細胞である神経細胞と、内胚葉細胞である肝細胞と、中胚葉細胞である軟骨細胞及び骨芽細胞とに分化されたし、その分化有無をそれぞれの特異染色反応(神経細胞(Nestin)、肝細胞(α-fetrotein)、軟骨細胞(Alcian blue)、骨芽細胞(Von kossa))を通じて確認したところ、万能幹細胞のように外胚葉と内胚葉と中胚葉とに分化したことが確認され、胚性幹細胞と同一の分化能を持っている(図6〜図8)。
【００３９】
そのことから、本発明の誘導万能幹細胞株は、効果的な細胞治療剤として使用することができる。
【００４０】
本発明の組成物は、任意の投与経路によって、具体的には腹腔または胸腔投与、皮下投与、静脈または動脈血管内投与、筋肉内投与、注射による局所投与などの方法によって投与可能である。
【００４１】
本発明において、前記組成物は、通常の方法に基づいて注射剤、懸濁剤、乳化剤などの形態で投与することができ、必要に応じてフロイント完全補助剤などの補助剤に懸濁されるか、またはBCGのような補助剤活性を有する物質と共に投与することも可能である。
【００４２】
本発明の細胞治療用組成物は、関節炎、神経系疾患、内分泌系疾患、肝疾患などに適用可能であり、今後、ヒトに対する臨床試験結果によっては、ヒトに対する同種細胞治療剤としての可能性もある。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、以下の通りである:
【００４４】
(i)本発明は、カジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地を用いて、間葉系幹細胞から誘導万能(多能性)幹細胞株を製造する方法を提供する。
【００４５】
(ii)本発明は、カジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地で培養して、逆分化した誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)を提供し、これは本発明者等により最初に構築されたものである。
【００４６】
(iii) さらに本発明は、誘導万能幹細胞株EPN-1(寄託番号:  KCLRF-BP-00318)を含む細胞治療用組成物を提供する。
【００４７】
(iv)本発明による培地組成物を利用すると、間葉系幹細胞を用いて誘導万能幹細胞株を効率的に製造することができ、製造された万能幹細胞株は、多様な細胞への分化が可能であるので、細胞治療剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】間葉系幹細胞から、カジメ抽出物(Ecklonia cava)を含む逆分化用培地(STC-F002)を注入して、培養時に胚性幹細胞とほぼ同一の万能幹細胞が誘導されることを示す図である。
【図２】本発明の方法(実施例3)によってカジメ抽出物の濃度に応じて誘導された万能幹細胞コロニーの形成を示すものである。
【図３】本発明の方法によって誘導された細胞(実験例1)を、万能幹細胞の特異的タンパク質であるSSEA-4の発現を用いて、万能幹細胞であることを確認したものである。
【図４】本発明の方法によって誘導された細胞(実験例2)を、万能幹細胞の特異的タンパク質発現を用いて、万能幹細胞であることを確認したものである。
【図５】本発明の方法によって誘導された万能幹細胞の遺伝子発現(実験例3)を示すものである。
【図６】本発明の方法によって誘導された万能幹細胞の外胚葉細胞に分化を誘導して、万能幹細胞であることを確認したものである。
【図７】本発明の方法によって誘導された万能幹細胞の内胚葉細胞に分化を誘導して、万能幹細胞であることを確認したものである。
【図８】本発明の方法によって誘導された万能幹細胞の中胚葉細胞に分化を誘導して、万能幹細胞であることを確認したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明であるだろう。
【００５０】
実施例
実施例1: 逆分化用培地(以下で‘STC-F002’と称する)の製造
実験に使用された生薬試料は、済州島で購入して専門家の正確な鑑定を受けた後、実験に使用した。乾燥した生薬試料100gを水1lに入れ、水は16時間の間、超音波抽出器を適用して抽出し、濾過紙を使用して濾過した。濾液を回転減圧蒸発器で濃縮させ、直ちに凍結乾燥した。済州カジメ抽出物を1〜1000μg/mlの濃度で、そしてエネルギーウォーターを0.1v/v%添加して、逆分化用培地であるSTC-F002培地を製造した。
【００５１】
実施例2: 人体臍帯からの間葉系幹細胞の分離及び培養
実施例2-1: 人体臍帯採取
臍帯組織は、出産直後に直ぐ収集される。試料が実験室に移される前に、先ずきれいに濯いだ後、直ちに移送用培地(50IU/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogenから購買する。))が添加されたF-12培地が入っている500mlの滅菌ガラス瓶に移される。実験室においては、滅菌の状態下においてclass100のフローフードで幹細胞の抽出が行われる。試料は、先ず、滅菌ステンレススチールの容器に移される。PBSは、数回洗浄した後、臍帯組織試料は、その後2cmの長さに切り出されて、直径10cmの細胞培養皿に移され、ここで追加的な洗浄及び70%のエタノールで抗感染処理し、抗生剤混合物(50IU/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogenから購買する。))が添加されたPBSにより前記溶液がきれいになるまで数回洗浄する。
【００５２】
実施例2-2: 人体臍帯からの幹細胞の分離及び培養
臍帯の血管及びその他の内部要素からワルトンゼリー(臍帯の基質)を分離するために、臍帯組織の切開が先ず行われる。血管を除去した後、分離したワルトンゼリーは、細胞の抽出のために、小片(0.5cmx0.5cm)の大きさに切り出される。外植(explant)は、上皮幹細胞または間葉系幹細胞の抽出に適合した細胞培養条件が揃っている別々の組織培養皿に、臍帯ワルトンゼリー片を入れて行われる。
【００５３】
間葉系細胞の分離/培養のために、前記外植した組織は、10%のウシ胎児血清(FBS、Hyclone)が添加された5mlのDMEM(Dulbecco's modified eagle medium)  F-12(Gibco)、10%のFBS、100unit/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシンに浸漬されて、二酸化炭素細胞培養器で37℃に維持された。培地は、3日毎または4日毎に入れ替えされた。細胞の成長(outgrowth)は、光学顕微鏡でモニタリングされた。伸張する細胞は、追加的な拡張及び冷凍保管(DMEM/10%のFBSを用いる。)のために、トリプシン処理(0.125%のトリプシン/0.05%のEDTA)をした。
【００５４】
前記培地は、3日毎または 4日毎に入れ替えされた。外植した組織からの細胞の伸張(outgrowth)は、光学顕微鏡でモニタリングされた。
【００５５】
間葉系幹細胞の抽出のために、細胞のペレットは、培地DMEMF-12(Gibco)、10%のFBS、100unit/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシンに再度懸濁及びカウントされ、10cmの組織培養皿に1x106の細胞/皿の密度で接種された。前記培地は、3日毎または4日毎に交換された。細胞の成長(growth)及びクローンの形成は、光学顕微鏡でモニタリングされた。約90%の細胞数(confluence)で、細胞は前記にて説明したようにサブカルチャー(sub-culture；二次培養)された。
【００５６】
実施例3: 逆分化用培地中のカジメ抽出物の濃度に応じるヒト来由間葉系幹細胞からの万能幹細胞の製造
STC-F002濃度に応じて、ヒト臍帯来由の幹細胞から万能幹細胞を誘導するための実験であって、対照群は、MSCの専用培地でDMEM F-12(Gibco)、10%のFBS、100unit/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシンを基本培地として使用しており、実験群は、継代培養を2回目したヒト臍帯来由の間葉系幹細胞を使用して、培地に済州カジメ抽出物を1μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1、000μg/mlの濃度で、そしてエネルギーウォーターを0.1v/v%添加した(図2)。ヒト臍帯来由の間葉系幹細胞を分離して、洗浄された単核球細胞を、6-ウェルプレート(dish)に1x104個の細胞を接種し、37℃と5%のCO2を維持して培養した。培養の結果、カジメ抽出物を1〜400μg/ml含む培地においてコロニーが形成されることを確認することができた。
【００５７】
実施例4: コロニーを継代培養して幹細胞株を構築する
実施例3で生成されたコロニーを、コラゲナーゼ1mg/mlを処理して、コロニー細胞を分離し、10%のFBSと100unit/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシンが含有されたDMEM/F12の培地において、1ｘ106の細胞数でT175flaskに接種して、CO２incubatorで培養し、2日〜3日毎に培地を入れ替え、confluency 80%程度になった時に継代培養を行う条件で、2回継代培養して幹細胞株を構築した。
【００５８】
実験例1: 誘導万能幹細胞株であるか否かの確認
実施例4の方法により培養された細胞株が、万能幹細胞株としての特徴を示しているか否かを、次のような方法で確認した。
【００５９】
具体的に、前記実施例4の方法により継代培養された幹細胞は、コロニーを持続的に形成することを確認したし、万能幹細胞の特異的なマーカーであるSSEA-4 抗体を使用し、免疫化学的染色法を適用して、共焦点顕微鏡(confocal microscope)で分析したところ、コロニー細胞だけでマーカーが染色されたので、コロニー中の細胞だけが万能幹細胞であることを確認した(図3)。また、これを6ヶ月の間継代培養しても、幹細胞が増殖し続けることから見て、細胞株(cell line)であることを確認した。
【００６０】
よって、本発明者等は、前記細胞株を“EPN-1 cell”と名付け、2014年5月 30日付にて、韓国細胞株研究財団(Korean Cell Line Research Foundation、大韓民国ソウル市鍾路区蓮建洞28番地  ソウル大学校医科大学ガン研究所)に、寄託番号KCLRF-BP-00318として寄託した。
【００６１】
実験例2: 万能幹細胞のタンパク質発現有無の分析
前記実施例3で製造された万能幹細胞に対して、胚性幹細胞の特異タンパク質であるOCT4、SOX2、SSEA4(stage-specific embryonic antigen4)の発現有無を、これに対する抗体を使用し、免疫化学的染色法を適用して、タンパク質の発現有無を分析した。染色過程は、先ず4%の パラホルムアルデヒド(Paraformaldehyde)を用いて細胞を固定した後、PBSで洗浄し、1%のBSA溶液でブロッキング(blocking)をした。
【００６２】
OCT4、SOX3、SSEA4に対する1次抗体を処理して、4℃で18時間の間反応させた後、PBSで洗浄し、1次抗体に対する蛍光(FITC)が付いた2次抗体を処理して、室温で1時間の間反応させた。その後、細胞のDNAを染色するために、hochest dyeを用いており、結果的に細胞の核を染色した。PBSで洗浄した後、蛍光顕微鏡(fluorescence microscope)を使用して発現有無を分析し、その結果を図3に示した。
【００６３】
タンパク質の染色は、FITCを使用して488nmの波長で写真を撮影しており、Hochestは、UV波長である350nm波長で写真を撮影して、FITC波長と重ならない。一番目の図面は、各々のタンパク質発現と核での遺伝子発現に対する染色結果を示しており、hochestは、hochest dyeを用いて細胞の核を染色したことを示しており、三番目の図面は、これらの2つの図面をマージして示している(図4)。
【００６４】
その結果、実験群においては、済州カジメ抽出物の濃度が1〜400μg/mlである時のみで、10日後にコロニーが形成されるのが観察された(図2)し、万能幹細胞の特異的マーカーであるOCT4、SOX2、SSEA4が、コロニーのみで染色されて、万能幹細胞であることを確認した(図4)。
【００６５】
実験例3: 万能幹細胞の遺伝子分析の比較
前記実施例3で製造された万能幹細胞を顕微鏡で観察しながら、200μlのパイペットを使用してコロニーのみを切り離した後、TRIzol試薬(Invitrogen社製造)を使用してRNAの全体を分離した。逆転写-重合酵素連鎖反応(RT-PCR)を用いてcDNAを合成した後、OCT4、Sox-2、Nanog、c-Myc及び対照遺伝子であるGAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)遺伝子に、特異的なプライマーを用いてPCRを進行した。
【００６６】
Nanog、OCT4、Sox-2は、胚性幹細胞で見られる特徴的遺伝子であり、c-Myc 遺伝子は、胚性幹細胞及び成体細胞の両方で陽性として見られる非特異的な遺伝子である。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析して、これらの遺伝子の発現を確認した結果を図5に示した。
【００６７】
図5によると、誘導過程を経ていない間葉系幹細胞(MSC)においては、万能幹細胞の特徴的な遺伝子であるOCT4の発現度が低い反面、本発明の方法によって誘導された万能幹細胞(EPN)においては、これらの特徴的な遺伝子が顕著に高く発現した。幹細胞遺伝子であるSOX2とNanogとは、同様に、間葉系幹細胞(MSC)よりも、誘導された万能幹細胞(EPN)において顕著に高く発現しており、非特異的な遺伝子であるc-Mycは、誘導過程を経ている細胞(EPN)が、誘導過程を経ていない細胞(MSC)よりも低く発現することが分かった。
【００６８】
実験例4: 外胚葉細胞(神経細胞)への分化
神経細胞への分化を誘導するために、本発明による逆分化用培地(STC-F002)を使用して、湿度95%、37℃、5%のCO2条件の培養器で培養して、間葉系幹細胞から万能幹細胞を誘導した後、神経細胞分化溶液DMEM  F-12、2%のB-27 supplement、2mM L-glutamin、30ng/mlのEGF、25ng/mlのbFGFで5日間培養した後、2%のFCS(Fatal Calf Serum)、25ng/mlのbFGF、25ng/mlのBDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)から構成された培地で7日間培養した。神経細胞への分化検証のために、Nestinタンパク質を免疫組織化学染色を通じて確認したところ、図6にて示したように、緑色蛍光に染色されて陽性反応を見せ、万能幹細胞と予想された細胞が外胚葉性の神経細胞に分化することができることを確認することができた。
【００６９】
実験例5: 内胚葉細胞(肝細胞)への分化
肝細胞への分化を誘導するために、本発明による逆分化用培地(STC-F002)を使用して、湿度95%、37℃、5%のCO2条件の培養器で培養して、間葉系幹細胞から万能幹細胞を誘導した後、肝細胞分化溶液DMEM F-12、20nMのdexamethason、5.5μg/mlのtransferring、7ng/mlのsodium selenite、100ng/mlのHGF、50ng/mlのFGF、10μg/mlのinsulinで3週間の間培養した。肝細胞への分化検証のために、α-fetrotein免疫組織化学染色を通じて確認したところ、図7にて示したように、緑色蛍光に染色されて陽性反応を見せ、万能幹細胞と予想された細胞が内胚葉細胞である肝細胞に分化することができることを確認することができた。
【００７０】
実験例6: 中胚葉細胞(軟骨細胞、骨芽細胞)への分化
軟骨細胞への分化を誘導するために、本発明による逆分化用培地(STC-F002)を使用して、湿度95%、37℃、5%のCO2条件の培養器で培養して、間葉系幹細胞から万能幹細胞を誘導した後、軟骨細胞分化溶液DMEM F-12、0.1uMのdexamethason、50μg/mlのAsA(Acetylsalicylic Acid)、100μg/mlのsodium pyruvate、40μg/mlのproline、10ng/mlのTGF-β1、5%のITS(Insulin-Transferrin-Selenium ; 6.25μg/mlのinsulin、6.25μg/mlのtransferring、6.25ng/mlのselenius scid)、1.25mg/mlのbovine serum albumin、5.35mg/mlのlioleic acidで 2週間の間培養した。軟骨細胞への分化検証のために、Alcian blue組織化学染色を通じて確認したところ、図8にて示したように、Alcian blue陽性反応を見せ、万能幹細胞と予想された細胞が中胚葉細胞である軟骨細胞に分化することができることを確認することができた。
【００７１】
一方、骨芽細胞への分化を誘導するために、本発明による逆分化用培地(STC-F002)を混合した培地を使用して、湿度95%、37℃、5%のCO2条件の培養器で培養して、間葉系幹細胞から万能幹細胞を誘導した後、骨芽細胞分化溶液DMEM F-12、2uMのdexamethasone、10mMのβ-glycerol phosphate、0.3mMのascorbic acid、1uMのBMP(bone morphogenic protein)で2週間の間培養した。骨芽細胞への分化検証のために、Von kossa組織化学染色を通じて確認したところ、図8にて示したように、Von kossaに陽性反応を見せ、万能幹細胞と予想された細胞が中胚葉細胞である骨芽細胞に分化することができることを確認することができた。
【００７２】
以上で本発明の特定の部分を詳細に記述してきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は、単に好適な具現例であるだけで、これらに本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。そのため、本発明の実質的な範囲は、添付する特許請求の範囲に記載の請求項及びそれらの等価物によって定義されると言える。
【受託番号】
【００７３】
寄託機関名: 韓国細胞株研究財団
受託番号: KCLRF-BP-00318
受託日付: 20140530
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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