(57)【要約】  本発明は、いくつかの血清型の種々のＨＰＶ抗原をコードする遺伝子を提供する。本発明の遺伝子は、改良された免疫学的品質及び四次構造を有するウイルス様粒子を生成する。本発明はまた、いくつかの血清型の種々のＨＰＶ抗原をコードする遺伝子の高コピー数を有する適切な宿主細胞、例えばＰ．パストリスを提供する。本発明はさらに、改良された免疫スケジュールでＨＰＶ抗原に対するワクチンを提供し、ここでワクチン投与レジメン及び抗原投与の量が減じられる。本発明はまた、酵母を用いての改良されたヒトパピローマウイルスワクチン組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から選択される単離遺伝子。
【請求項２】
ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を含むベクター。
【請求項３】
ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣ６、ｐＧＡＰＺ 及びｐＡＯ８１５ｚから選択される、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
ＭＴＣＣ ５９６９、ＭＴＣＣ ５９７０、ＭＴＣＣ ５９７１又はＭＴＣＣ ５９７２から選択されるＭＴＣＣ受託番号を有する、請求項２に記載のベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子により形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求項２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
酵母細胞、好ましくはＰ．パストリス（Ｐ．pastoris）である、請求項５及び６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
Ｐ．パストリス株Ｘ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１及び ＳＭＤ１１６８から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の遺伝子を用いることにより得られるウイルス様粒子。
【請求項１０】
５０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜４００ｎｍ、より好ましくは１００〜４００ｎｍの範囲の直径を有する、請求項９に記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
ＨＰＶ抗原に対して免疫応答を誘導できる、請求項１に記載のそれらからのキャプシドタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むヒトパピローマウイルスワクチン。
【請求項１２】
単一又は異なった血清型のＬ２、Ｅ６又はＥ７抗原をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１１に記載のヒトパピローマウイルスワクチン。
【請求項１３】
ＨＰＶ １６、ＨＰＶ ６、ＨＰＶ １８、ＨＰＶ １１、ＨＰＶ ３１、ＨＰＶ ３３、ＨＰＶ ４５、ＨＰＶ ５２、ＨＰＶ ５８、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１２に記載の血清型。
【請求項１４】
適切なアジュバント（単数又は複数）と共に、請求項１記載のＨＰＶ抗原の少なくとも１つのタンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項１５】
アルミニウムの塩、モノホスホリル脂質類似体、例えばグルコピラノシル脂質アジュバント、モナチド（ｍｏｎａｔｉｄｅ）、サイトカイン誘導物質、スクアレンベースのアジュバント、親油性アジュバント及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１４に記載のアジュバント。
【請求項１６】
請求項１１に記載されるヒトパピローマワクチンの調製方法であって、下記工程：
ａ．ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする遺伝子の合成、
ｂ．ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする遺伝子のための発現ベクターの構築、
ｃ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の形質転換された遺伝子の高コピー数を有するクローンの選択、
ｄ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の形質転換された遺伝子の発現分析、
ｅ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の遺伝子によりコードされるタンパク質の精製、
ｆ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質のＶＬＰのバルク溶液の調製、
ｇ．宿主細胞における前記タンパク質の特徴付け、
ｈ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質を含むワクチンの調製、
を包含する方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、酵母細胞、好ましくはＰ．パストリスである、請求項１６に記載されるヒトパピローマワクチンの調製方法。
【請求項１８】
単一又は異なった血清型のＨＰＶ Ｌ１である、請求項１〜１７の何れか１項に記載の主要キャプシドタンパク質。
【請求項１９】
ＨＰＶ １６ Ｌ１、ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１、ＨＰＶ １１ Ｌ１、ＨＰＶ ３１ Ｌ１、ＨＰＶ ３３ Ｌ１、ＨＰＶ ４５ Ｌ１、ＨＰＶ ５２ Ｌ１、ＨＰＶ ５８ Ｌ１、及びそれらの組み合わせ、好ましくはＨＰＶ １６ Ｌ１、ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１、ＨＰＶ １１ Ｌ１、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１８に記載のＨＰＶ Ｌ１タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にヒトにおけるヒトパピローマウイルス感染の予防のための、ヒトパピローマウイルス抗原をコードする遺伝子、及びワクチンの開発におけるその使用に関する。本発明はまた、酵母を用いての改良されたパピローマウイルスワクチン組成物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に、子宮頸癌は、女性では２番目に多い癌であり、毎年２７４，０００人が死亡している。子宮頸癌のインドにおける発生率は、年間約１３２，０００人であり、これはアジア太平洋地域におけるこの疾患の記録された発生数のほぼ５２％である。毎年７３，０００人近くの女性が子宮頸癌で死亡しており；それにより、世界的に記録されたすべての子宮頸癌死亡者のほぼ４分の１を占める疑わしい判別を保持している。２０２５年までに、途上国における発生率は世界的な割合の８０％近く占めると推定されている。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、約８ｋｂのサイズの上皮親和性の二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＰＶゲノムは、非構造タンパク質（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５，Ｅ６及びＥ７）及び構造タンパク質（Ｌ１及びＬ２）をコードする。１２０種以上のＨＰＶ型が報告されている。高リスクＨＰＶ型による持続感染は、子宮頸癌の誘発にとって最も重要な単一の要因である。高リスクＨＰＶ型の中で、ＨＰＶ１６及び１８は、世界中で子宮頸癌と最も頻繁に関連する遺伝子型である。インドの子宮頸癌における全体的ＨＰＶの有病率は、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５２、５６、５８、５９ 及び ＨＰＶ６８の順であることが判明した。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は共に、インドにおける子宮頸癌発症率の約８０％に寄与している。
【０００３】
現在、市場で世界的に使用されている次の２種の子宮頸癌ワクチンがある：Ｍｅｒｃｋ  ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．（Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標），Ｍｅｒｃｋ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）により製造される４価ＨＰＶ（ｇＨＰＶ）ワクチン、及びＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  ｐｌｃ．（ＣｅｒｖａｒｉｘＴＭ，ＧＳＫ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）により製造される二価ＨＰＶワクチン。ガーダシルは、２００６年６月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を受け、ＨＰＶ−ＨＰＶ６、１１、１６及び１８の４株を防ぐ。ＨＰＶには１００種類以上の株が存在するが、特定タイプが特に癌に関連している可能性があり；株１６及び１８は、米国における全ての子宮頸癌症例の７０％に関連している。株６及び１１は、性器疣贅の９０％に関連している。臨床試験では、以前に感染していなかった女性の中で、４種の株の持続感染症、前癌病変及び外性器病変を予防する高い有効性を示した。試験中の一部女性が５年間追跡され、そして持続感染症又は疾患に対して９５．８％のワクチン有効性、及び前癌性及び外的病変に対して１００％の有効性を示している。保護の期間を決定するために、さらなるフォローアップ研究が必要とされるが、１０−１４歳の青年期の若い女性は、１５−２４歳の女性よりもワクチンに対する免疫応答が強いことが示されており、このことは、早期のワクチン接種により、より長い抗体持続性をもたらすことを示唆している。最近の他の研究は、ワクチンはまた、膣及び外陰癌に対する保護も提供することを示している。Ａｌａｎ  Ｇｕｔｔｍａｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによれば、ＨＰＶワクチンは、「近年、女性のための最大のヘルスケアの進歩の１つと広く考えられている」。
【０００４】
ｑＨＰＶワクチンとは異なり、二価ＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ型１６及び１８の２つの抗原のみで構成される。そのＬ１タンパク質の合成のためには、遺伝子がバキュロウイルス発現ベクター中にクローニングされ、そして製造されたベクターが、昆虫細胞、すなわちイラクサギンウワ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）に感染させ、続いて、血清フリー培地において２日間インキュベートされ；次に、細胞が回収される。
【０００５】
現在入手でき、且つ評価されているＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ型１６及び１８による感染の予防を目的とする。ＨＰＶワクチンは、組み換え技法により生成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）から調製され、そして６ヶ月間に３回の０．５ｍＬの筋肉内注射として与えられる。最近の結果は、ＨＰＶワクチンは、ほとんどで全てのワクチン接種された女性において高レベルの血清抗体誘発性の高い免疫原性があり、そして完全にワクチン接種された女性において、ＨＰＶ−１６／１８感染、及び、関連する前癌性子宮頸部病変に対して高度の防御を付与していることを示す。３３ヵ国の２７，０００人の女性において評価された四価（ＨＰＶ ６／１１／１６／１８）ワクチンは、持続感染の９９％以上の予防に有効であることが証明された。
【０００６】
本発明にかかるワクチンは、初期ＨＰＶワクチンの開発に使用されるような組換え技法を用いて生成される。組換え技法を用いて所望するタンパク質生成物を得るために関与する主要工程は、発現ベクター中への所望する遺伝子のクローニング、宿主細胞への遺伝子の発現（それは、発現系をも呼ばれる）、挿入された遺伝子から得られるタンパク質生成物の精製、及び特徴付けである。上記各工程で一般的に使用される方法及び成分は、従来技術において十分に入手可能である。それらのすべての言及された工程は、本明細書において一般的に使用される成分、例えば発現ベクター、宿主細胞、ヌクレオチド配列、等にいくらかの制限及び依存性を有する。当業者は、組み換え技法において各成分のお互いの適合性を分析しなければならない。
【０００７】
本発明は、発現系として酵母を用いて、４種の異なったＨＰＶ型、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ １８、ＨＰＶ ６及びＨＰＶ １１の後期ＨＰＶタンパク質のＨＰＶタンパク質をコードする新規コドン最適化遺伝子を有するヒトパピローマウイルスワクチン組成物を提供する。株ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の組み合わせがすべての循環するＨＰＶ株のわずか７０％を防御することができることは良く知られている。従って、追加の抗原をワクチンに加えることが推奨される。世界各地の疫学的相違が存在するために、世界の関連地域において、より広範な防御を提供する多くの血清型を包含することが望ましい（インドでは、ＨＰＶ３３及びＨＰＶ４５）。Ｌ１抗原と共に、Ｌ２抗原は防御範囲を広げることが記載されている。本発明により開発されたヒトパピローマワクチンのインビボセロコンバージョン応答は、既存の参照製品よりもより卓越していることが判明している。
【０００８】
本発明の現分野においては、野生型ＨＰＶ １６ Ｌ１遺伝子を含む同じプラスミドにより形質転換されたＰ．パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＫＭ７１株）はＬ１タンパク質を発現せず、このことは、Ｐ．パストリスにおけるＨＰＶ １６ Ｌ１発現のためにコドン最適化の必要性を示唆している。
【０００９】
［Ｂａｚａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．２００９；１５４（１０）；ｐ１−１６］。この文献は、ＨＰＶ１６  Ｌ１遺伝子のコドン最適化を記載しており、そしてそれを、非組込ベクターにクローニングし、そしてさらに、コンピテントピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を形質転換するために使用した。Ｂａｚａｎらは、ＶＬＰがより規則的で且つ一定（４５〜５０ｎｍ）であったことを開示している。大規模生成のためには、形質転換された酵母は、連続した有糸分裂の後、それらのベクターを失う可能性があるために、エピソームベクター（非組込ベクター）は有益ではないことが知られている。なぜならば、それらはゲノム中に組み込まれず、従って、選択圧力が存在しない場合は損なわれる可能性があるからである。選択された発現系において発現を得るためには、コドン最適化遺伝子が必要とされる。この技法は、適切な発現系を用いた任意の抗原については、当技術分野では周知である。例えば、Ｎ．Ｈａｎｕｍａｎｔｈａ  Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（２０１１）７３２６−７３３４は、ピキア・パストリスにおける、ヒトパピローマウイルス型１６及び１８のコドン最適化された主要キャプシドタンパク質（Ｌ１）の発現を記載している。また、Ｈａｎｕｍａｎｔｈａ  Ｒａｏらは、「ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の精製されたＶＬＰが平均約５３ｎｍの可変粒子サイズを示した」ことを開示している。ここで、ＨＰＶ遺伝子は、クローン化され、そしてＰ．パストリス株ＧＳ１１５において発現されている。
【００１０】
これらの文献は、それらのＶＬＰの免疫原特性の即時性に関する情報を提供していない。ＶＬＰの高められた免疫原性は、より多くの反復抗原提示を可能にするＶＬＰのサイズを増大させることにより達成され得る。最終的には、それは、ＨＰＶ抗原に対するより良好な免疫応答を提供する。
【００１１】
従って、本発明は、改良された免疫学的品質及び最終的には、ＨＰＶ抗原に対する実質的に高い免疫原性応答を有する自己集合ＶＬＰを提供する、異なった血清型に対するＨＰＶ Ｌ１遺伝子のコドン最適化を提供する。同様に、ＨＰＶ Ｌ２遺伝子のコドン最適化、すなわちＨＰＶの初期抗原（Ｅ６及びＥ７）を生成し、ＨＰＶ抗原に対するワクチンを開発することができる。
【００１２】
特定宿主において前記遺伝子の発現のために最適化された遺伝子の選択は、当該技術分野においては既知技術ではあるが、依然として、最適化において多くの可能なバリエーションが存在する。従って、コドン最適化のための方法は普遍的ではない。従って、すべての遺伝子は特有のコドン最適化法を有する。本出願人は、本発明の先行技術の一部である特許出願を、本明細書に以下でいくつか言及している。
【００１３】
１０６６／ＭＵＭＮＰ／２０１０は、ヒトパピロースウイルスの主要キャプシドタンパク質Ｌ１をコードするコドン最適化遺伝子を開示している。酵母細胞において、ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質Ｌ１をコードするコドン最適化遺伝子の発現により生成される、免疫原性を有する高分子、その使用及び組成物が提供される。本出願に記載される方法により得られるＶＬＰは、約５０〜８０ｎｍの範囲のサイズを有する。
【００１４】
インド特許第２０３３３３号は、ヒトパピローマウイルス１６、ヒトパピローマウイルス１８、ヒトパピローマウイルス３１及びヒトパピローマウイルス４５遺伝子型由来のＬ１タンパク質又は機能的Ｌ１タンパク質誘導体を含むウイルス様粒子を含むワクチン組成物を開示し、ここで前記ワクチンにより生成される抗体免疫応答は、ヒトパピローマウイルス、単独で製剤化されるウイルス様粒子それぞれへのレベルに類似するレベルである。当該特許は、ＨＰＶ １６／１８タンパク質が、目的のＨＰＶ ３６又は１８Ｌ１遺伝子をコードする組換えバキュロウイルス（ＭＯＩ：０．３）により感染されたイラクサギンウワバ(Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）)細胞（密度約３５００００個の細胞／ｍＬ）において発現されたことを開示する。ここで、好ましいアジュバントが３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせた水酸化アルミニウムであることが開示されている。昆虫細胞の使用は、宿主細胞ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質のような不純物の危険性を包含する。
【００１５】
インド特許第２４５１８９号は、ＨＰＶ１６及び１８並びにＨＰＶ型３１、４５及び５２から成るリストから選択される少なくとも１つの他のＨＰＶ癌型由来のＶＬＰ又はカプソーマを含む免疫原性組成物であって、ここで少なくとも１つの他の癌型のＶＰＬ又はカプソーマの用量が、ＨＰＶ１６又は１８の用量に比べて少なくされる、組成物を開示する。ここで、発明者は、製剤に２種のアジュバント、すなわち水酸化アルミニウム及び３Ｄ  ＭＰＬを使用している。それらのアジュバントは、抗原の免疫原性の誘発を助ける。
【００１６】
上記先行特許出願は、多くの研究が、発現系として酵母を用いてＨＰＶ抗原に対するワクチンの開発に行われて来たことを示す。Ｐ．パストリスは、大腸菌に続く、異種発現で２番目に多く使用される系である。所望する抗原を発現するための宿主としてのＰ．パストリスの選択は、所望する抗原及びＨＰＶに対するワクチンの開発の１つの良好な次の候補体の高発現を得るためには、未だに十分ではない。それは、上記参考文献［Ｂａｚａｎら］から良く理解されている。従って、目的の挿入された遺伝子の発現を得るためには、宿主細胞に応じた所望の抗原のコドン最適化の必要がある。
【００１７】
従って、低資源国でＨＰＶ予防接種を広く実施するには、解決すべきいくつかの課題と不確実性がある。この課題は次のものを包含する：現在入手できるワクチンの高い費用、実行可能性、許容性、ワクチン送達の物流（６ヶ月に３回の投与の必要性から、幼い若い女の子に到達するための、改良された戦略及びワクチンプラットフォーム）、子宮頸部新生物の予防における長期免疫原性及び有効性、ワクチン抗原により標的化されないＨＰＶ感染に対する交差防御、及び子宮頸部新生物に対する免疫原性の誘導及び維持及び長期防御する理論的に実行可能な投与レジメンの必要性。これらの課題は、公衆衛生サービスにおいてＨＰＶワクチンを導入するための、世界的な受け入れ及び推進するための適切な支持にとって重要である。
【００１８】
本発明者らは、ＨＰＶワクチンの発現収率、免疫原性、用量レジメ及び費用に関する問題の大部分を解決しようと試みて来た。本発明においては、マウスにおいて、わずか１回の免疫により、低用量のＨＰＶ Ｌ１抗原で、より高い免疫原性を実現するワクチン調製物が示されている。本発明は、究極的には、ＨＰＶ抗原に対して、驚くほど高い免疫応答を提供するであろうＨＰＶの種々の血清型のＬ１タンパク質をコードする新規遺伝子を提供する。従って、それらの候補体は、ＨＰＶワクチンに関連する主要問題を解決するであろう、ＨＰＶに対するワクチンの開発に使用され得る。本発明はまた、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ １８、ＨＰＶ ６、ＨＰＶ １１由来並びに、ＨＰＶ ３１、ＨＰＶ ５２、ＨＰＶ ５８及びＨＰＶ ４５遺伝子型から選択される少なくとも１つの別の遺伝子型由来のＬ１タンパク質を含むウイルス様粒子と、及びわずか１つのアジュバントとを含む免疫原性組成物も提供する。さらに、本発明は、発現系として昆虫細胞を使用しない。そのため、それは、安全性の懸念（アレルギー）の可能性がある昆虫由来の宿主細胞不純物、例えば宿主細胞ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質の危険性を低める。ＨＰＶの他の血清型、例えばＨＰＶ ３５、ＨＰＶ ３９、ＨＰＶ ５６、ＨＰＶ ５９及びＨＰＶ ６８のための免疫原性組成物は、本発明に記載される方法に従って調製され得る。さらに、本発明は、ＨＰＶ抗原に対して実質的により高い免疫応答を提供するであろう、より大きなサイズ及び改良された免疫学的品質を有するＶＬＰを提供する。
【００１９】
市販のＨＰＶワクチンは、酵母（サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ））又はバキュロウイルス発現系の何れかにおいて発現されるＨＰＶタンパク質によるＶＬＰ形成に基づき、そしてそれらの免疫原性は、それらの四次構造形成と直接相関する［Ｈｅｎｒｙｋ  Ｍａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．９５，Ｎｏ．１０，ｐ２１９５−２２０６］。この文献は、サッカロミセス・セレビシアエにおけるＨＰＶ型６、１１及び１６ Ｌ１ ＶＬＰタンパク質の発現が、不規則な形状であり、予測（６０ｎｍ）よりも小さいサイズ（３０〜５０ｎｍ）が広く分布したＶＬＰを生成したことを開示している。
【００２０】
本発明においては、発明者らは、異なった血清型のＨＰＶ、好ましくはＨＰＶ １６ Ｌ１、ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１及びＨＰＶ １１ Ｌ１において高い免疫原性を導く、より良好な四次構造を形成することによって、改善したＶＬＰを形成するための分解／再構築条件を最適化した。
【００２１】
これを達成するために、遺伝子は、酵母において発現するために、異なったＨＰＶ血清型（ＨＰＶ血清型、好ましくはＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１及びＨＰＶ １１ Ｌ１）のために最適化されたコドンである。遺伝子の特定領域が、ＶＬＰにおける翻訳後コンホメーション依存四次構造変化を達成するために、修飾された（本出願の以下の詳細な記載に記載されるように）。
【００２２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、特にことわらない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び変形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、記載される整数又は工程、又は整数若しくは工程の群を包含し、何れか他の整数又は工程、又は整数若しくは工程の群を排除するものではないことが理解されるであろう。
【００２３】
本明細書において、任意の先行する刊行物（又はそれに由来する情報）、又は公知の任意の事項への参照は、その先行する刊行物（又はそれに由来する情報）又は既知の事項が、本明細書が関係する分野における共通の一般的知識の一部を形成する知識又は承認又は示唆の任意の形態ではなく、そしてそれらの形として取られるべきではない。
発明の目的
【００２４】
第１の側面によれば、本発明は、宿主細胞に従ってコドン最適化されている、種々の血清型のＨＰＶの異なったタンパク質をコードする単離遺伝子を提供する。
【００２５】
前記側面の１つによれば、ＨＰＶの異なったタンパク質は、主要キャプシドタンパク質Ｌ１、マイナーキャプシドタンパク質Ｌ２、及び初期抗原Ｅ６及びＥ７を含む。
【００２６】
別の側面によれば、本発明は、種々の血清型、好ましくはＨＰＶ １６、ＨＰＶ １８、ＨＰＶ ６、ＨＰＶ １１、及び同様のもののＬ１タンパク質をコードする単離遺伝子を提供する。
【００２７】
第２の側面によれば、本発明は、宿主細胞中に組み込まれる異なったＨＰＶ抗原をコードするコドン最適化された遺伝子の結果として得られる改良された免疫学的品質を有するウイルス様粒子を提供する。
【００２８】
第３の側面によれば、本発明は、ＨＰＶの異なったタンパク質をコードする前記遺伝子により形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２９】
別の側面によれば、本発明は、種々の血清型のＨＰＶの異なったタンパク質をコードする遺伝子の高コピー数を有する宿主細胞を提供する。
【００３０】
さらなる側面によれば、本発明は、種々の血清型のＨＰＶの異なったタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
【００３１】
第４の側面によれば、本発明は、宿主細胞中に組み込まれる異なったＨＰＶ抗原をコードするコドン最適化された遺伝子の結果として得られる改良された四次構造を有するウイルス粒子を提供する。
【００３２】
第５の側面によれば、本発明は、有意に高い免疫原性を有するヒトパピローマウイルスに対するワクチンを提供する。
【００３３】
第６の側面によれば、本発明は、ワクチン投与レジメンが１回に減じられた改良された免疫スケジュールを有するＨＰＶ抗原に対するワクチンを提供する。
【００３４】
別の側面によれば、本発明は、実質的に低められた量の抗原を有する、ＨＰＶ抗原に対するワクチンを提供する。
【００３５】
さらなる側面によれば、本発明は、発現系として酵母を用いる、ＨＰＶ抗原に対するワクチンを提供する。
【００３６】
好ましい側面によれば、本発明は、発現系としてＰ．パストリスを用いる、ＨＰＶ抗原に対するワクチンを提供する。
【発明の概要】
【００３７】
本発明は、いくつかの血清型の種々のＨＰＶ抗原をコードするコード最適化された遺伝子を提供する。そのような遺伝子はさらに、改良された免疫学的品質及び四次構造を有するウイルス様粒子を生成する。そのようなＶＬＰは、ＨＰＶ抗原に対する実質的に高い免疫応答を生成する。
【００３８】
さらに、本発明は、いくつかの血清型の種々のＨＰＶ抗原をコードする遺伝子の高コピー数を有する適切な宿主細胞、好ましくはＰ．パストリスを提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、ワクチン投与レジメン及び抗原用量の量が減じられている、改良された免疫スケジュールを有する、ＨＰＶ抗原に対するワクチンを提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、適切なアジュバント（単数又は複数）と共に、ＨＰＶ抗原のタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ＨＰＶ １６ Ｌ１遺伝子を含む発現ベクター地図ｐＤＩＣＺαを示す。
【図２】図２は、種々の生成段階でのＨＰＶ １６Ｌ１のインプロセス分析を示す。
【図３】図３は、ウエスタンブロット法によるＨＰＶ１６Ｌ１の同一性分析を示す。
【図４】図４は、動的光散乱法（ＶＬＰの平均直径：２３８．９ｎｍ）によるＨＰＶ１６Ｌ１  ＶＬＰのサイズ分布分析を示す。
【図５】図５は、ネガティブ染色法を用いて、電子顕微鏡による最終ＶＬＰ形態を示す。
【図６】図６は、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原についての単回免疫による４週間後の抗体応答を示す。
【図７】図７は、ＨＰＶ １８ Ｌ１抗原についての単回免疫による４週間後の抗体応答を示す。
【図８】図８は、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原についての単回免疫による４週間後の抗体応答を示す。
【図９】図９は、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原についての単回免疫による４週間後の抗体応答を示す。
【図１０】図１０は、本発明のＨＰＶワクチン及び比較される対照ワクチンによる霊長類免疫後に得られる、ＥＬＩＳＡにより測定されるＨＰＶ １６ Ｌ１抗原に対する抗体力価を示す。
【図１１】図１１は、本発明のＨＰＶワクチン及び比較される対照ワクチンによる霊長類免疫後に得られる、ＥＬＩＳＡにより測定されるＨＰＶ １８ Ｌ１抗原に対する抗体力価を示す。
【図１２】図１２は、動的光散乱法（ＶＬＰの平均直径：３８８．４ｎｍ）によるＨＰＶ １８ Ｌ１ ＶＬＰのサイズ分布分析を示す。
【図１３】図１３は、動的光散乱法（ＶＬＰの平均直径：３６５ｎｍ）によるＨＰＶ ６ Ｌ１ ＶＬＰのサイズ分布分析を示す。
【図１４】図１４は、動的光散乱法（ＶＬＰの平均直径：３０７．９ｎｍ）によるＨＰＶ １１ Ｌ１ ＶＬＰのサイズ分布分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
実施形態の１つによれば、本発明は、種々の血清型のＨＰＶの異なったタンパク質をコードする、宿主細胞に従ってコドン最適化された単離遺伝子を提供する。
【００４３】
別の実施形態によれば、ＨＰＶの異なったタンパク質は、主要キャプシドタンパク質Ｌ１、マイナーキャプシドタンパク質Ｌ２、及び初期抗原Ｅ６及びＥ７を含む。
【００４４】
好ましい実施形態によれば、本発明は、種々の血清型、例えばＨＰＶ １６ Ｌ１、ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１ 及びＨＰＶ １１ Ｌ１のＬ１タンパク質をコードする単離遺伝子を提供する。
【００４５】
さらなる実施形態によれば、本発明は、宿主細胞中に組み込まれる異なったＨＰＶ抗原をコードするコドン最適化された遺伝子の結果として得られる改良された免疫学的品質を有するウイルス様粒子を提供する。そのようなＶＬＰは、異なった血清型によるＨＰＶ感染に対する防御のための増強された免疫応答を送達する。改良された免疫学的品質を有するＶＬＰは、ワクチンの調製へのアジュバント（単数又は複数）の使用を減少させるのに役立つ。
【００４６】
実施形態の１つによれば、本発明は、ＨＰＶの異なったタンパク質をコードする前記遺伝子により形質転換された宿主細胞を提供する。本発明によれば、宿主細胞は、最適なベクターにより形質転換された遺伝子が発現するであろう発現系と称することができる。
【００４７】
別の実施形態によれば、本発明は、種々の血清型のＨＰＶの異なったタンパク質をコードする遺伝子の高コピー数を有する宿主細胞を提供する。それは、異なった血清型のＨＰＶ抗原の高い発現を導く。
【００４８】
好ましい実施形態によれば、本発明の宿主細胞は、酵母細胞、好ましくはＰ．パストリスである。
【００４９】
より好ましい実施形態によれば、Ｐ．パストリス株Ｘ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＳＭＤ１１６８又は他のものが、発現系として使用され得る。
【００５０】
実施形態の１つによれば、本発明は、種々の血清型のＨＰＶの異なったタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。好ましい実施形態によれば、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣ６、ｐＧＡＰＺ、ｐＡＯ８１５又は他の類似するベクターは、本発明においてベクターとして使用され得る。それらのベクターは市販されている。好ましい実施形態によれば、本発明は、ＨＰＶの異なったタンパク質をコードする遺伝子により形質転換されたベクターを提供し、それらは受託番号ＭＴＣＣ ５９６９、ＭＴＣＣ ５９７０、ＭＴＣＣ ５９７１ 及びＭＴＣＣ ５９７２を有するベクターから選択され得る。それらのベクターは、ブダペスト条約下で本発明の出願により寄託された。前記寄託されたベクターは、本発明に従って開発された遺伝子を有する。ＭＴＣＣ ５９６９、ＭＴＣＣ ５９７０、ＭＴＣＣ ５９７１ 及びＭＴＣＣ ５９７２は、それぞれｐＰＩＣｚＨＰＶ ６Ｌ１、ｐＰＩＣｚＨＰＶ １１Ｌ１、 ｐＰＩＣｚＨＰＶ １６Ｌ１ 及び ｐＰＩＣｚＨＰＶ １８Ｌ１を意味する。
【００５１】
さらなる実施形態によれば、本発明は、宿主細胞中に組み込まれる、異なったＨＰＶ抗原をコードするコドン最適化された遺伝子の結果として得られる改良された四次構造を有するウイルス様粒子を提供する。そのようなＶＬＰは、５０〜８０ｎｍの平均直径のＶＬＰと共に、約８０〜１００ｎｍの高直径のものである。好ましい実施形態によれば、本発明のＶＬＰは、５０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜４００ｎｍ、より好ましくは１００〜４００ｎｍのものである。
【００５２】
好ましい実施形態によれば、本発明は、ＨＰＶの種々の抗原に対する本発明の免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。それらのワクチンは、従来の経路及び用量で投与され得る。
【００５３】
実施形態の１つによれば、本発明は、以下の工程を含む、ヒトパピローマワクチンを調製するための方法を提供する：
ａ．ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする遺伝子の合成、
ｂ．ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターの構築、
ｃ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の形質転換された遺伝子の高コピー数を有するクローンの選択、
ｄ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の形質転換された遺伝子の発現分析、
ｅ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の遺伝子によりコードされるタンパク質の精製、
ｆ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質のＶＬＰのバルク溶液の調製、
ｇ．宿主細胞における前記タンパク質の特徴付け、
ｈ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質を含むワクチンの調製。
【００５４】
ここで、本発明の主要キャプシドタンパク質は、種々の血清型のＬ１タンパク質、例えばＨＰＶ １６ Ｌ１、ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１ 及びＨＰＶ １１ Ｌ１である。本発明の宿主細胞は、酵母細胞、好ましくはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、より好ましくはピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００５５】
さらなる実施形態によれば、本発明の精製工程は、カラムクロマトグラフィー、滅菌濾過、ダイアフィルトレーション、又はそれらの適切な組み合わせである。
【００５６】
実施形態の１つによれば、本発明は、ＨＰＶの異なった血清型において高い免疫原性を導く良好な四次構造を形成することにより、改良されたＶＬＰを形成する最適化された分解／再構築条件を提供する。研磨（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）クロマトグラフィー工程を経たＶＬＰは、良好な四次構造を有する改良されたＶＬＰを得るために、適切な予備製剤化緩衝液に提供される。本発明の好ましい予備製剤化緩衝液は、リン酸緩衝液である。
【００５７】
予備製剤化緩衝液は、異なったアジュバント及びそれらの組み合わせによるさらなる製剤開発のためにそれらの構造を維持するためにＶＬＰに安定性を提供するために使用される緩衝液として定義され得る。
【００５８】
そのような予備製剤化緩衝液はさらに、適切な還元剤（ＤＴＴ、β−メルカプトエタノール、ｔｗｅｅｎ８０又は他の同様のもの）、塩（ＮａＣｌ又はＫＣｌ）、アミノ酸及び酸性又は塩基性緩衝液を含んでもよい。
【００５９】
さらなる実施形態によれば、本発明は、有意に高い免疫原性を有する、ヒトパピローマウイルスに対するワクチンを提供する。本発明のワクチンは、異なったＨＰＶ血清型に対する防御免疫応答を誘発する。
【００６０】
実施形態の１つによれば、本発明は、ワクチン投与レジメンが減じられる、改良された免疫スケジュールによるＨＰＶ抗原に対するワクチンを提供する。
【００６１】
別の実施形態によれば、本発明は、実質的に低められた量の抗原を有する、ＨＰＶ抗原に対するワクチンを提供する。それは、開発途上国の商業レベルでの使用を可能にするワクチンの製造コストの削減を助ける。
【００６２】
実施形態の１つによれば、本発明は、適切なアジュバントと共にＨＰＶ抗原のタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。
【００６３】
アルミニウムの塩、モノホスホリル脂質（ＭＰＬ）類似体、例えばＧＬＡ（グルコピラノシル脂質アジュバント）、モノティド、サイトカイン誘発物質、スクアレンベースのアジュバント、親油性アジュバント、及び他の同様のものが使用され得る。
【００６４】
さらなる実施形態によれば、本発明は、医薬的に許容できる担体又は賦形剤と共に、免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。
【実施例】
【００６５】
次の非制限的例は、ＨＰＶ １６、ＨＰ １８、ＨＰＶ ６及びＨＰＶ １１を表す種々の血清型のＨＰＶのＬ１タンパク質をコードする遺伝子のコドン最適化を記載する。異なった抗原を有する他の免疫原性組成物が調製され得、そしてそのような免疫原性組成物が当業者の範囲内にあり、そして本発明の範囲内に含まれることは理解されるであろう。
【００６６】
実施例１：ＨＰＶ １６Ｌ１のためのコドン最適化された遺伝子の合成
【００６７】
Genebankから入手できるＨＰＶ １６Ｌ１抗原についてのヌクレオチド配列を収集した。Genebankから収集された各ヌクレオチド配列から得られたアミノ酸配列の整列を行った。この後、ＨＰＶ １６Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列の最も代表的であるコンセンサス配列を選択した。選択されたコンセンサスアミノ酸配列からヌクレオチド配列を決定し、そして宿主細胞によるコドン最適化のためにさらに使用した。この配列は、配列番号１として定義される。
【００６８】
配列番号１；ＨＰＶ １６Ｌ１抗原のヌクレオチド配列
(Gene bank No. gb|GQ423063.1|)
1    ATGTCTTTGT GGTTGCCATC TGAAGCTACT GTTTACTTGC CACCAGTTCC AGTTTCTAAG
61   GTTGTTTCTA CTGATGAATA CGTTGCTAGA ACTAACATTT ACTACCATGC TGGTACTTCT
121  AGATTGTTGG CTGTTGGTCA CCCATACTTT CCAATTAAGA AGCCAAACAA CAACAAGATT
181  TTGGTTCCAA AGGTTTCTGG TTTGCAATAC AGAGTTTTTA GAATCCATTT GCCAGATCCA
241  AACAAGTTTG GTTTTCCAGA TACTTCTTTT TACAACCCAG ATACTCAAAG ATTGGTTTGG
301  GCTTGTGTTG GTGTTGAAGT TGGTAGAGGT CAACCATTGG GTGTTGGTAT TTCTGGTCAC
361  CCATTGTTGA ACAAGTTGGA TGATACTGAA AACGCTTCTG CTTACGCTGC TAACGCTGGT
421  GTTGATAACA GAGAATGTAT TTCTATGGAT TACAAGCAAA CTCAATTGTG TTTGATTGGT
481  TGTAAGCCAC CAATTGGTGA ACATTGGGGT AAGGGTTCTC CATGTACTAA CGTTGCTGTT
541  AACCCAGGTG ATTGTCCACC ATTGGAATTG ATTAACACTG TTATTCAAGA TGGTGATATG
601  GTTGATACTG GTTTTGGTGC TATGGATTTT ACTACTTTGC AAGCTAACAA GTCTGAAGTT
661  CCATTGGATA TTTGTACTTC TATTTGTAAG TACCCAGATT ACATTAAGAT GGTTTCTGAA
721  CCATACGGTG ATTCTTTGTT TTTTTACTTG AGAAGAGAAC AAATGTTTGT TAGACACTTG
781  TTTAACAGAG CTGGTGCTGT TGGTGAAAAC GTTCCAGATG ATTTGTACAT TAAGGGTTCT
841  GGTTCTACTG CTAACTTGGC TTCTTCTAAC TACTTTCCAA CTCCATCTGG TTCTATGGTT
901  ACTTCTGATG CTCAAATTTT TAACAAGCCA TACTGGTTGC AAAGAGCCCA AGGTCATAAC
961  AACGGTATTT GTTGGGGTAA CCAATTGTTT GTTACTGTTG TTGATACTAC TAGATCTACT
1021 AACATGTCTT TGTGTGCTGC TATTTCTACT TCTGAAACTA CTTACAAGAA CACTAACTTT
1081 AAGGAATACT TGAGACACGG TGAAGAATAC GATTTGCAAT TTATTTTTCA ATTGTGTAAG
1141 ATTACTTTGA CTGCTGATGT TATGACTTAC ATTCATTCTA TGAACTCTAC TATTTTGGAA
1201 GATTGGAACT TTGGTTTGCA ACCACCACCA GGTGGTACTT TGGAAGATAC TTACAGATTT
1261 GTTACTTCTC AAGCTATTGC TTGTCAAAAG CACACTCCAC CAGCTCCAAA GGAAGATCCA
1321 TTGAAGAAGT ACACTTTTTG GGAAGTTAAC TTGAAGGAAA AGTTTTCTGC TGATTTGGAT
1381 CAATTTCCAT TGGGTAGAAA GTTTTTGTTG CAAGCTGGTT TGAAGGCTAA GCCAAAGTTT
1441 ACTTTGGGTA AGAGAAAGGC TACTCCAACT ACTTCTTCTA CTTCTACTAC TGCTAAGAGA
1501 AAGAAGAGAA AGTTGTAATA G
【００６９】
ここで、本発明においては、Ｐ．パストリスを、宿主細胞として使用する。他の酵母生物、好ましくはピキア属中の種々の種が、コドン最適化工程のための宿主細胞として使用され得る。配列番号１として定義されるＨＰＶ １６Ｌ１タンパク質のヌクレオチド配列をさらに、下記のようにして修飾した。
【００７０】
修飾を、配列番号１で与えられるＨＰＶ １６Ｌ１のヌクレオチド配列の６１〜３００、３６１〜８４０及び／又は９６１〜１５２０間の位置で行った。それらの修飾は、ヌクレオチド配列のコドン最適化の後に得られるアミノ酸配列が、ＨＰＶ １６Ｌ１タンパク質の一次構造と１００％相同であろうような態様で行われた。続いて、このコドン最適化された配列は、サイズ及び免疫原性に関してＶＬＰの良好な四次構造を提供する。本発明者らは、前記位置での前記ヌクレオチド配列における反復的修飾の後、本明細書において、配列番号２として定義されるＨＰＶ １６Ｌ１抗原のための１つの新規なコドン最適化された配列を見出した。
【００７１】
配列番号２：ＨＰＶ １６Ｌ１抗原のヌクレオチド配列
【００７２】
1    ATGTCTTTGTGGTTGCCATCTGAAGCTACTGTTTACTTGCCACCA
46   GTTCCAGTTTCTAAAGTTGTTTCCACTGACGAATACGTTGCTAGA
91   ACTAACATCTACTACCACGCTGGTACTTCTAGATTGTTGGCTGTT
136  GGTCATCCATACTTCCCAATTAAGAAGCCAAACAACAACAAGATT
181  TTGGTTCCAAAGGTTTCCGGATTGCAATACAGAGTTTTCAGAATC
226  CATTTGCCAGATCCAAACAAGTTTGGTTTCCCAGATACTTCTTTC
271  TACAACCCAGACACTCAAAGACTTGTTTGGGCTTGTGTTGGTGTT
316  GAAGTTGGTAGAGGTCAACCATTGGGTGTTGGTATTTCTGGTCAC
361  CCATTGTTGAACAAGTTGGACGATACTGAAAACGCTTCTGCTTAC
406  GCTGCTAACGCTGGTGTTGATAACAGAGAATGTATTTCTATGGAC
451  TACAAGCAAACTCAATTGTGTTTGATTGGTTGTAAGCCACCAATT
496  GGTGAACATTGGGGAAAGGGTTCTCCATGTACTAATGTTGCTGTT
541  AACCCTGGTGATTGTCCACCATTGGAATTGATTAACACTGTTATT
586  CAAGACGGTGATATGGTTGATACTGGTTTCGGTGCTATGGATTTC
631  ACTACTTTGCAAGCTAACAAGTCTGAAGTTCCATTGGACATTTGT
676  ACTTCCATCTGTAAGTACCCAGACTACATTAAGATGGTTTCTGAA
721  CCATACGGTGATTCTTTGTTCTTCTACTTGAGAAGAGAACAAATG
766  TTTGTTAGACACTTGTTCAACAGAGCTGGTGCTGTTGGTGAAAAC
811  GTTCCAGATGACTTGTACATTAAGGGTTCTGGTTCTACTGCTAAC
856  TTGGCTTCTTCTAACTACTTTCCAACTCCATCTGGTTCTATGGTT
901  ACTTCTGACGCTCAAATTTTCAACAAGCCATACTGGTTGCAAAGA
946  GCACAAGGTCATAACAACGGTATTTGTTGGGGTAACCAATTGTTC
991  GTTACTGTTGTTGACACTACTAGATCCACTAACATGTCCTTGTGT
1036 GCTGCTATTTCTACTTCTGAAACTACTTACAAGAACACTAACTTC
1081 AAAGAGTACTTGAGACACGGAGAAGAATACGACTTGCAATTCATT
1126 TTCCAATTGTGTAAGATTACTTTGACTGCTGACGTTATGACTTAC
1171 ATTCACTCTATGAACTCTACTATTTTGGAAGATTGGAACTTCGGA
1216 TTGCAACCACCACCAGGTGGTACTTTGGAAGATACTTACAGATTC
1261 GTTACTTCTCAAGCTATTGCTTGTCAAAAGCATACTCCACCTGCT
1306 CCAAAAGAAGATCCATTGAAGAAGTACACTTTCTGGGAAGTTAAC
1351 TTGAAAGAAAAGTTCTCTGCTGATTTGGATCAATTCCCATTGGGT
1396 AGAAAGTTTTTGTTGCAAGCTGGATTGAAGGCTAAACCAAAGTTC
1441 ACTTTGGGAAAGAGAAAGGCTACTCCAACTACTTCTTCTACTTCT
1486 ACTACTGCTAAGAGAAAGAAGAGAAAATTGTAA 1518
【００７３】
同じ態様で、ＨＰＶ １８Ｌ１、ＨＰＶ ６Ｌ１ 及びＨＰＶ １１Ｌ１のためのコドン最適化された配列を生成した。ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１ 及びＨＰＶ １１ Ｌ１のコドン最適化された配列が、それぞれ配列番号３、４及び５として与えられている。  配列番号３：ＨＰＶ １８Ｌ１抗原のヌクレオチド配列
【００７４】
1    ATGGCTCTTTGGAGACCATCCGACAACACTGTTTACTTGCCACCA
46   CCATCCGTTGCTAGAGTTGTTAACACTGACGACTACGTTACTAGA
91   ACTTCCATCTTCTACCACGCTGGTTCTTCCAGATTGTTGACTGTT
136  GGTAACCCATACTTCAGAGTTCCAGCTGGAGGTGGTAACAAGCAA
181  GACATCCCAAAGGTTTCCGCTTACCAGTACAGAGTTTTCAGAGTT
226  CAGTTGCCAGACCCAAACAAGTTTGGATTGCCAGACAATTCCATC
271  TACAACCCAGAGACTCAGAGACTTGTTTGGGCTTGTGCTGGTGTT
316  GAAATCGGTAGAGGACAGCCATTGGGTGTTGGTTTGTCTGGTCAC
361  CCATTCTACAACAAGTTGGACGACACTGAATCTTCTCACGCTGCT
406  ACTTCTAACGTTTCCGAGGATGTTAGAGACAACGTTTCCGTTGAC
451  TACAAGCAGACTCAGTTGTGTATCTTGGGTTGTGCTCCAGCTATT
496  GGTGAACATTGGGCTAAGGGTACTGCTTGTAAGTCCAGACCATTG
541  TCTCAGGGAGATTGTCCACCATTGGAGTTGAAGAACACTGTTTTG
586  GAGGACGGTGATATGGTTGATACTGGTTACGGTGCTATGGACTTC
631  TCTACTTTGCAGGACACTAAGTGTGAAGTTCCATTGGACATCTGT
676  CAGTCCATCTGTAAGTACCCAGACTACTTGCAAATGTCCGCTGAT
721  CCATACGGTGACTCTATGTTCTTCTGTTTGAGAAGAGAGCAGTTG
766  TTCGCTAGACACTTCTGGAACAGAGCTGGTACTATGGGTGACACT
811  GTTCCACAATCCTTGTACATCAAGGGTACTGGAATGAGAGCTTCT
856  CCTGGTTCTTGTGTTTACTCTCCATCTCCATCCGGTTCCATTGTT
901  ACTTCCGACTCCCAGTTGTTCAACAAGCCATACTGGTTGCATAAG
946  GCTCAAGGTCACAACAACGGTATTTGTTGGCACAACCAGTTGTTC
991  GTTACTGTTGTTGACACTACTAGATCCACTAACTTGACTATCTGT
1036 GCTTCCACTCAATCTCCAGTTCCAGGACAATACGACGCTACTAAG
1081 TTCAAGCAGTACTCCAGACACGTTGAAGAGTACGACTTGCAGTTC
1126 ATCTTCCAGTTGTGTACTATCACTTTGACTGCTGATGTTATGTCC
1171 TACATCCACTCTATGAACTCCTCCATTTTGGAGGATTGGAACTTC
1216 GGTGTTCCACCACCACCAACTACTTCATTGGTTGACACTTACAGA
1261 TTCGTTCAGTCCGTTGCTATCACTTGTCAAAAGGACGCTGCTCCA
1306 GCTGAAAACAAGGACCCATACGACAAGTTGAAGTTCTGGAACGTT
1351 GACTTGAAAGAGAAGTTCTCCTTGGACTTGGACCAATACCCATTG
1396 GGTAGAAAGTTTTTGGTTCAGGCTGGATTGAGAAGAAAGCCAACT
1441 ATCGGTCCAAGAAAGAGATCAGCTCCATCCGCTACTACTTCATCC
1486 AAGCCAGCTAAGAGAGTTAGAGTTAGAGCTAGAAAGTAG 1524
配列番号４：ＨＰＶ ６Ｌ１抗原のヌクレオチド配列
【００７５】
1    ATGTGGAGACCATCCGACTCCACTGTTTATGTTCCACCACCAAAC
46   CCAGTTTCCAAGGTTGTTGCTACTGACGCTTACGTTACTAGAACT
91   AATATCTTCTACCACGCTTCCTCATCCAGATTGTTGGCTGTTGGT
136  CACCCATACTTCTCCATCAAGAGAGCTAACAAGACTGTTGTTCCA
181  AAGGTTTCCGGTTACCAGTACAGAGTTTTTAAGGTTGTTTTGCCA
226  GACCCAAACAAGTTCGCTTTGCCAGACTCTTCCTTGTTCGACCCA
271  ACTACTCAGAGATTGGTTTGGGCTTGTACTGGTTTGGAGGTTGGT
316  AGAGGTCAGCCATTGGGTGTTGGTGTTTCTGGTCACCCATTCTTG
361  AACAAGTACGACGACGTTGAGAACTCTGGTTCTGGTGGTAACCCA
406  GGTCAGGACAACAGAGTTAACGTTGGTATGGACTACAAGCAGACT
451  CAGTTGTGTATGGTTGGTTGTGCTCCACCATTGGGTGAACATTGG
496  GGTAAGGGTAAGCAGTGTACAAACACTCCAGTTCAGGCTGGTGAC
541  TGTCCACCTTTGGAGTTGATCACTTCCGTTATTCAGGACGGTGAC
586  ATGGTTGACACTGGTTTTGGTGCTATGAACTTCGCTGACTTGCAG
631  ACTAACAAGTCCGACGTTCCAATCGACATCTGTGGTACTACTTGT
676  AAGTACCCAGACTACTTGCAGATGGCTGCTGATCCATACGGTGAC
721  AGATTGTTCTTCTTCTTGAGAAAAGAACAGATGTTCGCTAGACAC
766  TTCTTCAACAGAGCTGGTGAAGTTGGTGAGCCAGTTCCAGACACT
811  TTGATCATTAAGGGTTCCGGTAACAGAACTTCCGTTGGTTCCTCC
856  ATCTACGTTAACACTCCATCCGGTTCCTTGGTTTCTTCTGAGGCT
901  CAGTTGTTCAACAAGCCATACTGGTTGCAGAAGGCTCAGGGTCAC
946  AACAACGGTATCTGTTGGGGTAACCAGTTGTTCGTTACTGTTGTT
991  GACACTACTAGATCCACTAATATGACTTTGTGTGCTTCCGTTACT
1036 ACTTCCTCCACTTACACTAACTCCGACTACAAAGAGTACATGAGA
1081 CACGTTGAAGAGTACGACTTGCAGTTCATCTTCCAGTTGTGTTCC
1126 ATCACTTTGTCCGCTGAGGTTATGGCTTACATCCACACTATGAAC
1171 CCATCCGTTTTGGAGGACTGGAACTTCGGTTTGTCTCCACCACCT
1216 AACGGTACTTTGGAGGACACTTACAGATACGTTCAGTCCCAGGCT
1261 ATCACTTGTCAGAAGCCAACTCCAGAGAAAGAGAAGCCAGACCCT
1306 TACAAGAACTTGTCCTTCTGGGAGGTTAACTTGAAAGAGAAGTTC
1351 TCCTCAGAGTTGGACCAGTACCCATTGGGTAGAAAGTTCTTGTTG
1396 CAGTCCGGTTACAGAGGTAGATCCTCCATCAGAACTGGTGTTAAG
1441 AGACCAGCTGTTTCCAAGGCTTCTGCTGCTCCAAAGAGAAAGAGA
1486 GCTAAGACTAAGAGATAG 1503
配列番号５：ＨＰＶ １１Ｌ１抗原のヌクレオチド配列
【００７６】
1    ATGTGGAGACCATCCGACTCCACTGTTTATGTTCCACCACCAAAC
46   CCAGTTTCCAAGGTTGTTGCTACTGACGCTTACGTTAAGAGAACT
91   AATATCTTCTACCACGCTTCCTCATCCAGATTGTTGGCTGTTGGT
136  CACCCTTACTACTCCATCAAGAAGGTTAACAAGACTGTTGTTCCA
181  AAGGTTTCCGGTTACCAGTACAGAGTTTTTAAGGTTGTTTTGCCA
226  GACCCAAACAAGTTCGCTTTGCCAGACTCTTCCTTGTTCGACCCA
271  ACTACTCAGAGATTGGTTTGGGCTTGTACTGGTTTGGAGGTTGGT
316  AGAGGTCAGCCATTGGGTGTTGGTGTTTCTGGTCACCCTTTGTTG
361  AACAAGTACGACGACGTTGAGAACTCCGGTGGTTATGGTGGTAAC
406  CCAGGTCAAGACAACAGAGTTAACGTTGGTATGGACTACAAGCAG
451  ACTCAGTTGTGTATGGTTGGTTGTGCTCCACCATTGGGTGAACAT
496  TGGGGTAAGGGTACTCAGTGTTCCAACACTTCCGTTCAGAACGGT
541  GACTGTCCACCTTTGGAGTTGATCACTTCCGTTATTCAGGACGGT
586  GACATGGTTGACACTGGTTTTGGTGCTATGAACTTCGCTGACTTG
631  CAGACTAACAAGTCCGACGTTCCATTGGACATCTGTGGTACTGTT
676  TGTAAATACCCAGACTACTTGCAGATGGCTGCTGATCCATACGGT
721  GACAGATTGTTCTTCTACTTGAGAAAAGAACAGATGTTCGCTAGA
766  CACTTCTTCAACAGAGCTGGTACTGTTGGTGAGCCAGTTCCAGAT
811  GACTTGTTGGTTAAGGGTGGTAACAACAGATCCTCCGTTGCTTCC
856  TCCATCTACGTTCATACTCCATCCGGTTCCTTGGTTTCTTCTGAG
901  GCTCAGTTGTTCAACAAGCCATACTGGTTGCAGAAGGCTCAGGGT
946  CACAACAACGGTATTTGTTGGGGTAACCACTTGTTCGTTACTGTT
991  GTTGACACTACTAGATCCACTAATATGACTTTGTGTGCTTCCGTT
1036 TCCAAGTCCGCTACTTACACTAACTCCGACTACAAAGAGTACATG
1081 AGACACGTTGAAGAGTTCGACTTGCAGTTCATCTTCCAGTTGTGT
1126 TCCATCACTTTGTCCGCTGAGGTTATGGCTTACATCCACACTATG
1171 AACCCATCCGTTTTGGAGGACTGGAACTTCGGTTTGTCTCCACCA
1216 CCTAACGGTACTTTGGAGGACACTTACAGATACGTTCAGTCCCAG
1261 GCTATCACTTGTCAGAAGCCAACTCCAGAGAAAGAGAAGCAGGAC
1306 CCATACAAGGACATGTCTTTCTGGGAGGTTAACTTGAAAGAGAAG
1351 TTCTCCTCAGAGTTGGACCAGTTCCCATTGGGTAGAAAGTTCTTG
1396 TTGCAGTCCGGTTACAGAGGTAGAACTTCCGCTAGAACTGGTATC
1441 AAAAGACCAGCTGTTTCCAAGCCATCCACTGCTCCAAAGAGAAAA
1486 AGAACTAAGACTAAGAAGTAG 1506  
【００７７】
実施例２：ＨＰＶ １６Ｌ１のための発現ベクターの構成
【００７８】
発現ベクターｐＰＩＣＺαを、ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子の発現のために使用した。ｐＰＩＣ６、ｐＧＡＰＺ、ｐＡＯ８１５又は他の同様のベクターが、ＨＰＶ１６Ｌ１の発現のために使用され得る。ｐＰＩＣＺαは、ピキア・ペストリスにおいて組換えタンパク質を発現し、そして分泌するために使用される３．６ｋｂのベクターである。それは次の特徴を有する：
◆ピキアにおいて目的の遺伝子のメタノール誘導性の高レベル発現を可能にするＡＯＸ１プロモーターを含む、９４２ｂｐのフラグメント。ＡＯＸ１遺伝子座へのプラスミド組み込みを標的とする。
◆ＡＯＸ１転写終結（ＴＴ）領域は、ｍＲＮＡ安定性を高めるために、ポリアデニル化を含む効率的な３’ｍＲＮＡプロセッシングを可能にするＡＯＸ１遺伝子（約２６０ｂｐ）からの天然の転写終結及びポリアデニル化シグナルを可能にする。
◆ゼオシン耐性遺伝子は、大腸菌及びピキアにおける形質転換体の選択を可能にする。
◆大腸菌においてゼオシン耐性遺伝子の恒常的発現を駆動するＥＭ７プロモーター。
◆ピキアにおいてゼオシン耐性遺伝子の発現を駆動する、サッカロミセス・セレビシアエ由来のＴＥＦ１プロモーター。
◆ｐＵＣ起点は、大腸菌におけるプラスミドの複製及び維持を可能にする。
【００７９】
ＨＰＶ １６ Ｌ１発現ベクターを、ベクターｐＰＩＣＺαのマルチクローニングサイト中に、ＨＰＶ１６Ｌ１をコードするＢｓｔＢＩ／ＮｏｔＩフラグメントを挿入することにより、構築した。得られる発現ベクターは、ｐＰＩＣＺ−ＨＰＶ１６Ｌ１と称する。その物理的地図は、図１に示される。構築に使用される方法は基本的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）の通りである。
【００８０】
同じ態様で、ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１及びＨＰＶ １１Ｌ１を含む発現ベクターを構築した。
【００８１】
実施例３：ＨＰＶ １６ Ｌ１の形質転換された遺伝子の高コピー数を有するクローンの選択
【００８２】
ａ）コンピテント細胞の調製
ピキア・パストリス株を、酵母抽出物ペプトンデキストロース培地（ＹＰＤ）において、３０℃で一晩、増殖した。２Ｌのフラスコ中の５００ｍＬの新鮮な培地を、０．１〜０．５ｍＬの前記一晩の培地を播種した。それを、ＯＤ６００＝１．３〜１．５まで、再び一晩、増殖した。細胞を、遠心分離し、そしてそのペレットを、氷冷却された滅菌水で、１〜２回、再懸濁した。細胞を遠心分離し、そしてペレットを、２０ｍＬの氷冷却の１Ｍのソルビトールに再懸濁した。細胞を遠心分離し、そしてペレットを、１ｍＬの氷冷却の１Ｍのソルビトールに再懸濁し、約１．５ｍＬの最終体積にした。氷上で細胞を維持し、そしてその日に使用する。
【００８３】
ｂ）形質転換
上記工程からの細胞８０μＬを、５〜１０μｇの線状化されたｐＰＩＣＺα  ＤＮＡと共に混合し（５〜１０μＬの滅菌水中）、そしてそれらを、氷冷却された０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移した。細胞を含むキュベットを、氷上で５分間インキュベートした。コンピテント酵母細胞のアリコートを、氷上で融解し、そして６００ｎｇの環状プラスミドＤＮＡを、各アリコートに添加した。その懸濁液を、予備冷却されたエレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、１．７ ｋＶ、２５μＦ、２００ Ｏｈｍにて、ＢＩＯＲＡＤ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＩＩで実施した。すぐに、１ｍＬの氷冷却された１Ｍのソルビトールを、キュベットに添加した。キュベットの内容物を、滅菌の１５ｍＬチューブに移した。チューブを、振盪しながら２時間、３０℃でインキュベートした。２００μＬチューブを、１５０μｇ／ｍＬの濃度のゼオシンを含む、各別々の標識されたＹＰＯプレート上に広げた。プレートを、コロニーが形成するまで、３日間３０℃でインキュベートした。１０〜２０個のコロニーを取り、そして適切な濃度のゼオシンを含む、新鮮なＹＰＤプレート上で精製する（単一コロニーのためのストリーク）。
【００８４】
クローンの一次選択を、ピキアゲノム中に組み込まれる遺伝子のコピー数に基づいて行った。これは、クローンの発現と相関する。スクリーニングを、対応する特定遺伝子（ＨＰＶ１６Ｌ１、ＨＰＶ１８Ｌ１、ＨＰＶ６Ｌ１又はＨＰＶ１１Ｌ１）に対して特異的である半定量的ＰＣＲを用いて行った。
【００８５】
定量的コロニーＰＣＲアッセイの異なったパラメーターを、異なるプライマーセットを用いて、最適化した。さらに、これらのプライマーについて、ピキアゲノムとのこれらとの交差反応性、及び特異的遺伝子の最低コピー数を選択するその感受性を試験した。
【００８６】
定量的コロニーＰＣＲの後、ＨＰＶ１６Ｌ１のクローンを、ＲＴ  ＰＣＲを用いて遺伝子コピー数について分析し、そして最高の遺伝子コピー数を有するクローンを選択した。実施例４：形質転換されたＨＰＶ １６Ｌ１遺伝子の発現分析
【００８７】
ＲＴ  ＰＣＲ結果から選択されたクローンを、ＢＧＹ培地に播種し、そしてそれらの発現を、培養物のメタノール誘導後に分析した。培養物を溶解し、そして形質転換体プールの得られる上清液を、ウエスタンブロットにより分析した。最終クローンを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより再び分析し、ＨＰＶタンパク質についての最良の生成クローンを選択した。クマーシーブリリアントブルー染色後のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルが、図２として示されている。ウエスタンブロットによるＨＰＶ血清型１６Ｌ１の同定が図３として示されている。
【００８８】
実施例５：ＨＰＶ １６Ｌタンパク質の精製
【００８９】
ＨＰＶ １６Ｌ１タンパク質の精製工程が以下に与えられる：
各ＨＰＶタンパク質の精製及び回収工程に包含される各ユニット操作工程が、１つの代表的バッチ材料を用いて実証されている。
【００９０】
ａ）洗浄された細胞ペレットの溶解
バッチを、生成段階の最後に回収した。各発酵槽から、約１２Ｌの培養液を回収した。細胞を主に遠心分離により分離し、使用済み培地からタンパク質を含む培養細胞を分離した。洗浄されたペレットを、溶解緩衝液に溶解した。細胞を、高圧ホモジナイザーを用いて溶解した。
【００９１】
ｂ）清澄化
細胞溶解の後、生成物を含む上清液を、遠心分離により細胞残骸から分離した。上清液をさらに、０．４５μｍのフィルターを用いて清澄化した。
【００９２】
ｃ）捕捉工程クロマトグラフィー
清澄化された溶解物を、適切な樹脂上にロードした。タンパク質の溶出を、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を高めることにより行った。
【００９３】
ｄ）研磨工程クロマトグラフィー
目的のタンパク質を含む、プールされた画分を、適切な樹脂上にロードした。タンパク質の溶出を、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を下げることにより行った。
【００９４】
ｅ）ダイアフィルトレーションにより緩衝液交換
プールされた画分を、リン酸緩衝液に対して、適切なＰＥＳ膜フィルターを通してダイアフィルトレートし、タンパク質溶液から過剰量の塩化ナトリウムを除去した。
【００９５】
ｆ）滅菌濾過
ダイアフィルトレーション工程の後、精製されたタンパク質溶液を、そのバルク溶液の調製のために提供した。
【００９６】
実施例６：ＨＰＶ １６Ｌ１のＶＬＰのバルク溶液の調製
【００９７】
上記精製工程後に得られる精製されたタンパク質を、分解／再構築条件に供し、改良された四次構造を有する最終の安定したＶＬＰを得た。発現されたＶＬＰの分解／再構築を、予備製剤化緩衝液において行った。この予備製剤化緩衝液を、発現されたＶＬＰの再構築のために、約５〜１０倍に希釈した。ＮａＣｌ又はＫＣｌなどの塩を、発現されたＶＬＰの分解で使用される予備製剤化緩衝液に、５００ｍＭ〜２Ｍの濃度で添加した。
【００９８】
分解緩衝液は、還元剤及びアミノ酸を含む。再構築緩衝液は、分解緩衝液の成分と共に、高濃度の塩を含む。
【００９９】
得られるＶＬＰのサイズを、動的光散乱法により分析した。この工程の後に得られるＨＰＶ １６Ｌ１の相同ＶＬＰは、９０ｎｍの平均直径を有した。それは、図４に示されている。この工程の後に、得られるＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１及びＨＰＶ １１ Ｌ１の相同ＶＬＰは、それぞれ、図１２、１３及び１４に示されている。
【０１００】
精製されたタンパク質溶液を、無菌条件下で０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過し、そしてバルク薬物物質として貯蔵した。
【０１０１】
実施例７：ピキア・パストリスにおけるＨＰＶ−１６Ｌ１キャプシドタンパク質の特徴付け
【０１０２】
前記タンパク質の部分的なＮ末端配列を、エドマン分解により確認し、そして一次構造（トリプシンマップ）を観察した。バッチ精製された抗原は、ＤＴＮＢアッセイにより評価される場合、構造に何れの遊離チオール（−ＳＨ）基も示さない。バッチ精製された抗原は、ナノ粒子追跡分析により決定される場合、何れの凝集体も含まないことが見出された。バッチ精製された抗原は、ＥＬＩＳＡによれば、宿主細胞タンパク質も及びＲＴ−ＰＣＲベースの方法によれば、ＤＮＡ混入もないことが見出された。調製物を、ＬＡＬ試験により評価される場合、エンドトキシンを有さないことが見出された。ＶＬＰの構造安定性を確かめるために、本発明者らは、電子顕微鏡検査を行い、平均直径９０ｎｍを有する粒子を見出した。ＨＰＶ １６Ｌ１  ＶＬＰの陰性染色が図５に示されている。
【０１０３】
この実施例に言及されるすべての技法は、当該技術分野において十分に利用可能である。
【０１０４】
バルク薬物物質は、非発熱性容器に−８０℃で保存された。
【０１０５】
実施例８：ＨＰＶ １６Ｌ１を含むワクチンの調製
【０１０６】
精製された抗原を、アルミニウムベースのアジュバント上に吸着し、そして無菌的にバイアルに充填した。０．８〜２０ｍｇ／０．５ｍＬのリン酸緩衝液生理食塩水を含むリン酸アルミニウムを、最終製剤化のために、１６０μｇのＨＰＶ １６Ｌ１タンパク質に添加した。アルミニウムベースのアジュバントを、無機塩アジュバント、例えばカルシウム、鉄及びジルコニウムの塩、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、アジュバントエマルション、例えば不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、モンタニド、ＭＦ ５９及びアジュバント６５、細菌由来アジュバント又はそれらの組み合わせにより置換することができる。同じ態様で、当業者は、他の血清型のＬ１タンパク質、例えば１８、１６、１１及びそれらの組み合わせを含むワクチンを調製することができる。
【０１０７】
実施例９：マウス免疫及び発現生成物の免疫原性の決定
【０１０８】
方法：
この研究は、アジュバントを用いる、アジュバント若しくは対照生成物を用いない試験サンプルの１つの代表的バッチについて、英国薬局方２０１２に基づいて実施された。表１に記載される実施デザインを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウス（生後６〜８週の雌のマウス）を用いてインビボでの有効性について分析した。
【０１０９】
【表１】
2017528137.tif 000002
【０１１０】
０．５ｍＬの希釈参照製品／試験ワクチンを、名マウスに皮下注射した（各希釈グループについて１０匹のマウス）。０．５ｍＬのワクチン希釈溶液を、同じ態様で１０匹のマウスに注射した。それらはＰＢＳ対照であり、そして２８日間、動物を維持する。２９日目、眼球静脈穿刺により各マウスから血液を採取し、そして室温で１時間、放置し、凝固させた。チューブを、４，０００ｒｐｍで４℃で１０分間、遠心分離し、そして血清を別々の標識された微量遠心チューブに集めた。
【０１１１】
すべての血清サンプルを、ＡＤＩ（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），ＵＳＡからの以下のＥＬＩＳＡキットを用いて、一度に試験した。
マウス抗ＨＰＶ１６Ｌ１ＥＬＩＳＡキット（＃５５０−３１６−ＰＭＧ）
マウス抗ＨＰＶ１８Ｌ１ＥＬＩＳＡキット（＃５５０−３１８−ＰＭＧ）
マウス抗ＨＰＶ６Ｌ１ＥＬＩＳＡキット（＃５５０−３０６−ＰＭＧ）
マウス抗ＨＰＶ１１Ｌ１ＥＬＩＳＡキット（＃５５０−３１１−ＰＭＧ）
【０１１２】
本発明のＶＬＰベースのワクチンと、アジュバントなし及び対照標準を有するＶＬＰ調製物とを比較した。ＥＬＩＳＡアッセイにより得られる結果は、図６、７、８及び９、及び表２に示されている。
【０１１３】
【表２】
2017528137.tif 000003
【０１１４】
実施例１０：ラットにおけるヒトパピローマウイルスワクチンに対して精製される抗体のエンドポイントの同定及び決定
【０１１５】
方法：
最初にＨＰＶ １６Ｌ１又はＨＰＶ １８Ｌ１タンパク質をマイクロタイタープレートのウェル上に固定した。プレートを、スキムミルク粉末によりさらにブロックし、非特異的相互作用を回避した。ＨＰＶ １６Ｌ１及びＨＰＶ １８Ｌ１に対する抗体を有するラット由来の血清サンプルをサンプル希釈緩衝液により希釈し、何れかのタンパク質（ＨＰＶ １６Ｌ１／ＨＰＶ １８Ｌ１）で各プレート上に被覆した各抗原との特異的結合を得た。標識された抗−ラットＨＲＰを、二次抗体として添加した。免疫学的反応は、抗−ラット抗体と、特異的抗体（ＨＰＶ １６Ｌ１／ＨＰＶ １８Ｌ１）との間での複合体の形成をもたらす。洗浄の各工程において、末結合反応物を除去した。次に、基質ＯＰＤを反応せしめた。マイクロタイタープレートリーダー上での発色反応から読み取られる基質の量は、血清サンプルに存在するそれぞれの抗体の濃度に正比例する。
【０１１６】
実験デザイン  
【０１１７】
グループ当たり１０匹の雄及び１０匹の雌ラットのグループを、ヒトパピローマウイルス（ｒＤＮＡ）ワクチン製剤により、０．２５ｍＬ／動物（低）、０．５ｍＬ／動物（中）、及び１．０ｍＬ／動物（高）の３種の用量レベルで、３ヶ月間にわたってＷｉｓｔａｒラットに、２週間に１回、筋肉内注射した。この研究は、単独のプラシーボを受けるビークル対照グループとして独立した対照グループを有した。さらに、回復グループは、副作用の可逆性、持続性又は遅延した発生を観察するために、処置後１か月間、同時ビークル対照と共に高い用量レベルで維持された。処置前、処置後及び回復後の期間での免疫原性について血清サンプルを収集し、その後、抗ＨＰＶを、処置後グループとともに、ビークル対照（１．０ｍＬのプラシーボ／ラット）、低用量（０．２５ｍＬワクチン／ラット）、中用量（０．５ｍＬワクチン／ラット）及び高用量（１．０ｍＬワクチン／ラット）について、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定した。
【０１１８】
【表３】
2017528137.tif 000004
【０１１９】
力価の決定  
ＨＰＶ １６Ｌ１又はＨＰＶ １８Ｌ１に対する異なったプレートを、抗原濃度が５０ｎｇ／ウェルになるようにコートし、そして２〜８℃で一晩のインキュベーションを維持した。次に、プレートを、５％ブロッキング溶液（ＰＢＳＴ中、スキムミルク）に維持し、そして３７℃で２時間、インキュベーションを維持した。各グループからのすべてのサンプルを別々にプールし、そしてＰＢＳＴ（リン酸緩衝液生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ  ２０）緩衝液により５０倍に希釈した。プレートを洗浄し、そして５０μＬの各サンプルを、予め決めたウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションを維持した。プレートをＰＢＳＴにより洗浄し、そして次に、５０μＬの抗−ラットＩｇＧ  ＨＲＰを、各ウェルに添加し、そして３７℃で６０分間インキュベートを維持した。次に、プレートをＰＢＳＴにより再び洗浄し、そして５０μＬの基質（リン酸クエン酸塩緩衝液及びＨ2Ｏ2に溶解されたＯＰＤ）を、各ウェルに添加し、暗室において室温で１５分間プレートを維持した。次に、２５μＬの停止溶液（１００ｍＬのＷＦＩ中、４．５ｍＬのＨ２ＳＯ４）を、各ウェルに添加し、プレートをＳｅｃｔｒａＭＡＸ  １９０マイクロタイタープレートリーダー上で４９０ｎｍで読み取った。
【０１２０】
結果
【０１２１】
【表４】
2017528137.tif 000005
【０１２２】
【表５】
2017528137.tif 000006
【０１２３】
【表６】
2017528137.tif 000007
【０１２４】
【表７】
2017528137.tif 000008
【０１２５】
【表８】
2017528137.tif 000009
【０１２６】
【表９】
2017528137.tif 000010
【０１２７】
【表１０】
2017528137.tif 000011
【０１２８】
【表１１】
2017528137.tif 000012
【０１２９】
要約
処置前サンプルの結果は、対照ラットにほとんど等しく、そして雄及び雌ラットにおいて非反応性である吸光度値を示す。同じグループの雄及び雌ラットを、ヒトパピローマウイルス（ｒＤＮＡ）ワクチンにより、３ヶ月間、低用量（０．２５ｍＬ／動物）、中用量（０．５ｍＬ／動物）及び高用量（１．０ｍＬ／動物）で処置した。３ヶ月の処理の最後において、結果は、ワクチンに対して高い反応性の高い吸光度値を示す。反応性は、ＥＬＩＳＡ力価を用いて測定され、雄グループにおいて、低用量ではＨＰＶ １６Ｌ１に対して３８８０．４１７及びＨＰＶ １８Ｌ１に対して５２２．３３８、中用量ではＨＰＶ １６Ｌ１に対して６３７７．３２７及びＨＰＶ １８Ｌ１に対して６３２．２３５、及び高用量ではＨＰＶ １６Ｌ１に対して２５８３２．４１７及びＨＰＶ １８Ｌ１に対して１１９８．７６２であった。反応性はＥＬＩＳＡ力価を用いて測定され、雌グループにおいて、低用量で、ＨＰＶ １６Ｌ１について１５５６７．３４３及びＨＰＶ １８Ｌ１について７７０．１８０、中用量で、ＨＰＶ １６Ｌ１について２４４４５．２４５及びＨＰＶ １８Ｌ１について４０５８．０３４、及び高用量で、ＨＰＶ １６Ｌ１について２６２８３．２４８及びＨＰＶ １８Ｌ１について４１００．０００であった。１ヶ月の回復期間の最後における血清サンプルは、雄ラットにおいて、ＨＰＶ １６Ｌ１について２５４１６．２６５及びＨＰＶ １８Ｌ１について１０４２．３７６、及び雌ラットにおいて、ＨＰＶ １６Ｌ１について３０４１０．０８５及びＨＰＶ １８Ｌ１について９５１．９４０のＥＬＩＳＡ力価としての反応性を示す。
【０１３０】
結論
エンドポイント研究結果は、Cadila Healthcare Ltd.により製造されたヒトパピローマウイルス（ｒＤＮＡ）ワクチンが、低、中及び高用量で抗体を生成することにより免疫原性であることが、ＨＰＶ １６Ｌ１対して３０４１０．０８５及びＨＰＶ １８Ｌ１対して４１００．０００のＥＬＩＳＡの最高力価まで測定できることを示す。
【０１３１】
実施例１１：霊長類（アカゲザル）の免疫及び力価の決定
【０１３２】
それぞれ２０μｇのＨＰＶ ６Ｌ１及びＨＰＶ １８Ｌ１及びそれぞれ４０μｇのＨＰＶ １１Ｌ１を含むＨＰＶワクチン製剤を、リン酸アルミニウムゲルにおいて調製した。その製剤化されたワクチンは、その使用まで、２〜８℃で保存した。ワクチンを、１人のヒト用量に相当する、アカゲザルにおける１匹の動物当たり１ｍＬとして、０日目で単一用量の筋肉内投与により免疫し、続いて２１日目、１８０日目、及びさらにまた、３４２日目に、参照ワクチングループ及び陰性対照グループと共に、追加免疫した。実験の開始前、すべての非ヒト霊長類を、臨床化学パラメーターの物理的、獣医学的検査及び分析に供した。
【０１３３】
霊長類を、種々の間隔で以下のワクチンを用いて、以下の免疫スケジュールに従ってワクチン接種した。
【０１３４】
【表１２】
2017528137.tif 000013
【０１３５】
血液サンプルを、ＥＬＩＳＡによる抗体力価の決定のために、２１、３３、４６、６３、１２６、１８６、１９３、３４２、３７２ 及び４３３日目の血清について収集した。血清サンプルを、所定の間隔でサルから実験デザインに従って収集した。血清サンプルを、ＥＬＩＳＡによる抗体測定のために−２０℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡを、ウェル当たり５０〜１００ｎｇとしてＥＬＩＳＡプレート上を、ＨＰＶ １６Ｌ１／ＨＰＶ １８Ｌ１の精製されたタンパク質により一晩、被覆した後、実施した。末結合タンパク質を、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ緩衝液により洗浄し、そして１％ＢＳＡを含むプロッキング緩衝液を、１時間プレートに添加し、非特異的部位をブロックした。血清サンプルを、ＰＢＳにより適切に希釈し、そしてウェルに添加した。未結合サンプルを、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ緩衝液により洗浄し、そしてＨＲＰＯにより標識された抗−サルＩｇＧを４５分間添加した。プレートを、洗浄緩衝液により再び洗浄し、そしてペルオキシダーゼ基質を添加した。それを暗室において２５分間インキュベートした。最終的に、２５μＬの停止溶液を、各試験ウェルに添加した。プレートを４０５ｎｍで１５分以内に読み取った。標準の曲線を、ＥＬＩＳＡカットオフＯ．Ｄ（ブランク及び負のサンプルからの平均Ｏ．Ｄ＋３Ｓ．Ｄ）の後のエンドポイント力価の考慮に基づいてのそれらの割り当てられたＥＬＩＳＡ力価に対する正の参照ワクチン血清のプールの異なった希釈溶液のＯ．Ｄ値を用いてプロットした。ＥＬＩＳＡにより測定される抗体力価が下記表１３及び１４、及び図１０及び１１に示されている。
【０１３６】
【表１３】
2017528137.tif 000014
【０１３７】
【表１４】
2017528137.tif 000015
【０１３８】
本発明に従って調製された試験ワクチンは、最初は、参照ワクチンと同等の応答を提供する。その後、試験ワクチンにより得られた免疫応答は、より長い期間にわたって持続するが、ところが参照ワクチンは、類似する免疫応答を達成するためには、追加の免疫量を必要とする。同様に、ＨＰＶ １６Ｌ１及びＨＰＶ １８Ｌ１における中和抗体応答を確認するために、本発明者らはまた、シュードウイルス中和アッセイによる同等の免疫応答を見出した。本発明者らのワクチンは、ワクチン接種後４３３日間にわたって参照の４用量よりも、合計３用量での参照ワクチンを用いてＨＰＬ  １６Ｌ１及びＨＰＶ １８Ｌ１についてＥＬＩＳＡにより測定された全抗体応答に関して同等であることを見出した。従って、サルにおけるＨＰＶ １６Ｌ１及びＨＰＶＯ１８Ｌ１に対する効力について、対照ワクチンよりも、本発明のワクチンは卓越性の強い証拠を提供している。
【図１】
2017528137.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年4月6日(2017.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルスの単一主要キャプシドタンパク質を含む、ウイルス様粒子であり、ここで、前記ウイルス様粒子が、１００〜４００ｎｍの範囲の直径を有する、ウイルス様粒子。
【請求項２】
請求項１に記載のヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から選択される単離遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣ６、ｐＧＡＰＺ及びｐＡＯ８１５から選択される、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
ＭＴＣＣ ５９６９、ＭＴＣＣ ５９７０、ＭＴＣＣ ５９７１又はＭＴＣＣ ５９７２から選択されるＭＴＣＣ受託番号を有する、請求項３に記載のベクター。
【請求項６】
請求項２に記載の遺伝子を含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項３又は４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
酵母細胞、好ましくはＰ．パストリス（Ｐ．pastoris）である、請求項６又は７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
Ｐ．パストリス株Ｘ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１及び ＳＭＤ１１６８から選択される、請求項６、７又は８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ＨＰＶ抗原に対して免疫応答を誘導できる、請求項１に記載のウイルス様粒子を含むヒトパピローマウイルスワクチン。
【請求項１１】
単一又は異なった血清型のＬ２、Ｅ６又はＥ７抗原の遺伝子によってコードされたウイルス様粒子をさらに含む、請求項１０に記載のヒトパピローマウイルスワクチン。
【請求項１２】
ＨＰＶ １６、ＨＰＶ ６、ＨＰＶ １８、ＨＰＶ １１、ＨＰＶ ３１、ＨＰＶ ３３、ＨＰＶ ４５、ＨＰＶ ５２、ＨＰＶ ５８、及びそれらの組み合わせから選択される、血清型である、請求項１１に記載のヒトパピローマウイルスワクチン。
【請求項１３】
適切なアジュバント（単数又は複数）と共に、請求項１記載のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記アジュバント（単数又は複数）が、アルミニウムの塩、モノホスホリル脂質類似体、例えばグルコピラノシル脂質アジュバント、モナチド（ｍｏｎａｔｉｄｅ）、サイトカイン誘導物質、スクアレンベースのアジュバント、親油性アジュバント及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項１０に記載されるヒトパピローマワクチンの調製方法であって、下記工程：
ａ．ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする遺伝子の合成、
ｂ．ヒトパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする遺伝子のための発現ベクターの構築、
ｃ．前記ベクターによるピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の形質転換、
ｄ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の形質転換された遺伝子の高コピー数を有するクローンの選択、
ｅ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の形質転換された遺伝子の発現分析、
ｆ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の遺伝子によりコードされるタンパク質の精製、
ｇ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質の請求項１に記載のサイズのＶＬＰのバルク溶液の調製、
ｇ．宿主細胞における前記タンパク質の特徴付け、
ｉ．前記ヒトパピローマウイルスのタンパク質を含むワクチンの調製、
を包含する方法。
【請求項１６】
単一主要キャプシドタンパク質が、ＨＰＶ Ｌ１である、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項１７】
前記ＨＰＶ Ｌ１が、ＨＰＶ １６ Ｌ１、ＨＰＶ １８ Ｌ１、ＨＰＶ ６ Ｌ１、及びＨＰＶ １１ Ｌ１から選択される、請求項１６に記載のウイルス様粒子。
【国際調査報告】
2017528137.tif 000030
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