(57)【要約】酸化的バランスの変化によってもたらされるリスクの診断的判定のための方法が記載され、この方法は、総コレステロールと、ヒドロペルオキシドと、抗酸化能との光度測定に基づいて、防御指数、酸化指数、および酸化的バランスの変化によってもたらされるリスク指数（または「ＯＢＲＩ」）を算出することを含む。この後者の指数は、心血管のリスクを高度に予測する、コレステロールレベルに関する酸化的バランスの状態を判定することにおいて、特に信頼性が高く確実であることが判明した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化的バランスの変化によってもたらされるリスクの診断的判定のための方法であって、前記方法は、
ａ）生物学的サンプルを提供するステップと、
ｂ）時間ｔに測定される総コレステロールＴＣτと、任意には基底コレステロールＴＣｂとを光度測定するステップと、
ｃ）ヒドロペルオキシドＲＯＯＨを光度測定するステップと、
ｄ）抗酸化能ＡＣを光度測定するステップと、
ｅ）式ＰＩ＝ＡＣ／ＴＣτに従って防御指数ＰＩを算出するステップと、
ｆ）式ＯＩ＝ＲＯＯＨ／ＴＣτに従って酸化指数ＯＩを算出するステップと、
ｇ）式［ａ］：ＯＢＲＩ＝ＯＩ×Ｋ１／ＰＩ×ΔＴＣに従って、酸化的バランスの変化によってもたらされるリスク指数（または「ＯＢＲＩ」）を算出するステップと
を含み、ここでＫ１はヒトにおいて９．１に等しくラットにおいて５．９５に等しい定数であり、ΔＴＣはＴＣτ／ＴＣｂの比率である、方法。
【請求項２】
ステップｂ）、ｃ）およびｄ）の測定は、波長を３８０ｎｍから７８０ｎｍ、好ましくは４７０ｎｍから５５０ｎｍ、より好ましくは５０５ｎｍの波長に設定した後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルは、唾液、血清、血漿、全血、尿、涙、または汗である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＣの測定のために、前記生物学的サンプルが、チオシアネートのアルコール溶液を含む試薬１、ならびに無機ジルコニウム塩および三価鉄塩を含む試薬２と混合されるＰＡＴテストが使用されるか、または前記生物学的サンプルが、チオシアネートのアルコール溶液を含む試薬１、および三価鉄塩を含む試薬２と混合されるＢＡＰテストが使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記無機ジルコニウム塩はフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、およびそれらの混合物からなる群より選択され、前記三価鉄塩はフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生物学的サンプルにおけるヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法であって、前記方法は、
ｉ）硫酸および式（Ｉ）の発色団薬剤またはその塩を含む水溶液Ａを提供するステップであって、
【化１】
2017511479.tif 000015
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立にＨ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、またはハロゲン化物である、ステップと、
ｉｉ）酢酸およびアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物を含む水溶液Ｂを提供するステップと、
ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩＩ）塩および硫酸を含む水溶液Ｃを提供するステップと、
ｉｖ）生物学的サンプルを提供するステップと、
ｖ）前記溶液Ａ、前記溶液Ｂ、前記溶液Ｃおよび前記生物学的サンプルを組み合わせて、得られた混合物の吸光度をｔ０およびｔ１において測定するステップであって、ここでｔ０は前記混合物を形成するために組み合わせてから４５秒から７０秒後であり、ｔ１は２分から３分後である、ステップと、
ｖｉ）ｔ０における吸光度をｔ１における吸光度から引くことによって、ランバート−ベールの法則に従って、Ｈ２Ｏ２等価物の濃度の点から問題の前記サンプルのヒドロペルオキシドの酸化力の値を得るステップと
を含む、ヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法。
【請求項７】
前記水溶液Ａにおいて、前記発色団は０．０１９ｍｏｌ／ｌから０．５７ｍｏｌ／ｌの濃度であり、硫酸は０．１７ｍｏｌ／ｌから０．９３ｍｏｌ／ｌの濃度であり、前記水溶液Ｂにおいて、酢酸は０．１７ｍｏｌ／ｌから０．３５ｍｏｌ／ｌの濃度であり、前記アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物は０．１０ｍｏｌ／ｌから０．３５ｍｏｌ／ｌの濃度であり、前記水溶液Ｃにおいて、Ｆｅ（ＩＩＩ）は０．０００４ｍｏｌ／ｌから１．０ｍｏｌ／ｌの濃度であり、硫酸は０．００１ｍｏｌ／ｌから０．８３ｍｏｌ／ｌの濃度である、請求項６に記載のヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法。
【請求項８】
前記水溶液Ａは水と、０．０３〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミンまたはその塩と、０．７０〜０．７３ｍｏｌ／ｌの濃度の硫酸とを含み、前記水溶液Ｂは水と、０．２５〜０．２７ｍｏｌ／ｌの濃度の酢酸と、０．１５〜０．２０ｍｏｌ／ｌの濃度の水酸化ナトリウムとを含み、前記溶液Ｃは水と、０．５０〜０．５５ｍｏｌ／ｌの濃度のＦｅ（ＩＩＩ）塩と、０．０８〜０．１０ｍｏｌ／ｌの濃度の硫酸とを含む、請求項６または７に記載のヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法。
【請求項９】
ステップｃ）におけるヒドロペルオキシドＲＯＯＨの測定のために、請求項６〜８のいずれか一項に記載のヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法が使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５または請求項９のいずれか一項に記載の方法を実施するための統合分析システムであって、光度計と、サーモスタット遠心機と、ディスプレイと、プリンタと、前記方法のステップｂ）〜ｄ）の光度測定値を取得でき、かつステップｅ）〜ｇ）の指数を算出できる電子処理ユニットとを含む、統合分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化的バランスの変化によってもたらされるリスクの診断的判定のための方法に関し、この方法は、総コレステロールと、ヒドロペルオキシドと、抗酸化能との光度測定に基づいて、防御指数、酸化指数、および酸化的バランスの変化によってもたらされるリスク指数（ｒｉｓｋ  ｉｎｄｅｘ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂａｌａｎｃｅ）（または「ＯＢＲＩ」）を算出することを含む。この後者の指数は、心血管のリスクを高度に予測する、コレステロールレベルに関する酸化的バランスの状態を判定することにおいて、特に信頼性が高く確実であることが判明した。
【背景技術】
【０００２】
酸化的ストレス（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ：ＯＳ）条件の評価は、心血管疾患の患者の場合における特定の予後の重要性を想定するものである。血液（血清または血漿）中で酸化された過剰な量の生物学的分子が、適切な抗酸化能によって補償されないときにＯＳが生じ、もしそれが長期にわたれば、特に心血管疾患の患者の平均余命の低減を定めることになる（非特許文献１）。
【０００３】
ヒトおよび動物の体内におけるヒドロペルオキシド（ＲＯＯＨ）［ここでＲは、たとえば脂質、グリセロリン脂質、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、高分子までの単純な水素以外の化学的性質を有する分子を表す］の測定は、ＯＳの最も信頼性高いマーカーであると考えられている［非特許文献２］。
【０００４】
ＲＯＯＨは、酸化プロセスの初期段階にあるほとんどすべての生物学的高分子の表現であり、それらはＦｅ２＋（ユビキタス金属）と接触するときに、以下の公知の「フェントン反応」によってＯＳを伝播し得るすべての分子に共通する条件を表す。
Ｆｅ２＋＋ＲＯＯＨ  →  Ｆｅ３＋＋ＲＯＨ＋・ＯＨ
【０００５】
この反応は、ヒト体内における最も強力なオキシダントであるヒドロキシラジカル（・ＯＨ）の形成をもたらし、これは１０−９秒のオーダの反応半減期を伴って提供される。
【０００６】
ＲＯＯＨは比較的安定であるため、細胞内および細胞外の両方の血液ならびに間質性の状況において自由に循環し、それらの酸化潜在力を形成点から運び去るという特徴を有する。まさにこの特徴のために、ＲＯＯＨは、（たとえばそれぞれスーパーオキシドおよびヒドロキシラジカルであるＯ２・または・ＯＨなど）局所的／即時的作用を有するその他のより迅速に反応する種（例、それぞれ酸素または窒素の反応種であるＲＯＳまたはＲＮＳ）よりもかなり有害な、ＯＳの危険な拡散物質となっている。
【０００７】
アテローム性動脈硬化症の決定における脂質および酸化リポタンパク質の役割の仮説が確立されており、この状況において酸化リポタンパク質（特にＬＤＬ）は主要な原因であると考えられる。すべてのリポタンパク質はコレステロールおよびそのエステルを含有する。
【０００８】
残りの脂質に関して、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：Ｃｈ）は酵素的プロセスおよび非酵素的プロセスの両方に由来する酸化現象を受け、それは内在性の由来でもあり得るし、食品の貯蔵および調理プロセスの間に生じた酸化コレステロールの摂取によるものでもあり得る。
【０００９】
一般的に、コレステロールの酸化プロセスはオキシステロール（ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ：ＯｘＣｈ）の形成をもたらし、そのうち少なくとも４つは内在性の由来である。これらのうちの３つ、すなわちそれぞれ７α−ヒドロキシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロールは、胆汁酸塩の形成のためにチトクロムＰ４５０において起こる酸化プロセスに由来するものであるのに対し、４番目の４β−ヒドロキシコレステロールはこれらの内在性の塩の合成に関連していない。
【００１０】
Ｃｈと７β−ヒドロキシコレステロールとの間の中間体は７β−ヒドロペルオキシコレステロールと表され、これはフェントン反応を行い得る古典的なヒドロペルオキシドであるため、ＯＳを伝播できる。
【００１１】
ＯｘＣｈの一部は、Ｃｈが過剰である細胞を排除する手段を表すように、Ｃｈよりも３桁高い速度を伴ってより容易に膜を横切ることを可能にする極性／移動性のために生理的かつ機能的とみなされ得る。しかし、それらが過剰であることも有害であり、たとえば反応性細胞自己破壊（アポトーシス）またはマクロファージの側の攻撃系を迅速に引き起こすことにより、最終的にはその細胞自体の除去をもたらす。
【００１２】
最後に、食品のコレステロールは平均約１００ミリグラム／日のオーダで摂取されるが、それは食品の不適切な（および／または延長された）貯蔵によって、ならびに食品の調理後に、すでに酸化された形であり得ることに留意すべきである。すべての脂質の場合と同様に、この形のコレステロールは部分的に吸収されて、腸の細胞（腸細胞）の内側に形成するキロミクロンに取り込まれ、酸化脂質の中で一意に、すべてのリポタンパク質に移され得る（その他の酸化脂質はキロミクロンおよびレムナントに限られる）。したがって、ＯｘＣｈは可変密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＨＤＬ）の形成に用いられ、それらはすでに部分的に酸化されていて、伝播（循環）によるさらなる酸化プロセスを引き起こし得る。なお、酸化の点からは、任意のコレステロール構造が酸化され得るか、そのままか、またはエステル化された形かに関する区別なく、総ＶＬＤＬコレステロール、ＩＤＬ（レムナント）、ＬＤＬまたはＨＤＬを考慮することが重要である。
【００１３】
構造および代謝の両方の意味でのコレステロールの非常な重要性から、それは広範な防御系を備えている。
【００１４】
第１の防御線は、それが（異なる長さの炭素鎖の）脂肪酸とエステル化することである。このプロセスは、リポタンパク質の内側にコレステロールが堆積することを可能にする。正常な条件下で、Ｃｈはそのまま、ならびに肝臓および腸のＡＣＡＴ  Ａ：コレステリルアシルトランスフェラーゼ（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  Ａｃｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））によるエステル化された形の両方で収集され、次いで高密度リポタンパク質（ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＨＤＬ）に運ばれる。その後これらはトランスポータータンパク質（すなわちコレステリルエステルタンパク質トランスポーター（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  Ｅｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）またはＣＥＰＴ）を通じて、コレステロールを他のもっと低密度のリポタンパク質（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）（主にＶＬＤＬおよびＬＤＬ）に移して、それをトリグリセリドと交換する。（同じＨＤＬによって）エステル化コレステロール残基とともに肝臓に向けて運ばれるトリグリセリドの移行は、そのままおよびＣｈＯｘの両方としてこのやり方で行われる。
【００１５】
第２の防御線は、ＨＤＬ自体に存在する抗酸化酵素系であるパラオキソナーゼ（ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅｓ：ＰＯＮ）によって表される。これらの酵素系は、循環する抗酸化物質ネットワーク（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｎｅｔｗｏｒｋ：ＡＯ）によって補助され、この抗酸化物質ネットワークは、食品によって摂取されるアルブミンから尿酸、およびビタミン（ｖｉｔａｍｉｎｉｃ）（例、Ｖｉｔ  ＥおよびＶｉｔ  Ｃ）または非ビタミン（例、ポリフェノール）抗酸化物質にわたるさまざまな系列の誘導体を含む。
【００１６】
第３の防御線は、細胞区画の抗酸化物質系によって表され、主に遊離グルタチオン（ＧＳＨ）および古典的な細胞内抗酸化物質（例、ビタミンＢ群、コエンザイムＱ１０、リポ酸）、ならびにたとえばカタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタレダクターゼなどの酵素的抗酸化物質によって表される。
【００１７】
ＲＯＯＨは比較的安定であるため、それらは構造的および代謝的コレステロールの両方に対する酸化の脅威を表す。しかし、酸化的プロセスは、酸化可能な実体に対する酸化的実体の比率として見る必要がある。このプロセスは化学量論的規則に従っており、それに対しては酸化および防御の関係に含まれる両方の分子構成要素の濃度を評価する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｖａｓｓａｌｌｅ  Ｃ．ら著、「Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．２０１２；１９（８）：７１２−７
【非特許文献２】Ｃｏｒｎｅｌｌｉ  Ｕ．ら著、「Ｔｈｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｏｒａｌ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｔｏ  Ｄｉｅｔ  Ｐｏｏｒ  ｏｆ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１１，１，６４−７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
よって本発明の目的は、酸化的バランスの変化によってもたらされるリスクを信頼性高く、再現性良く、繰り返し、かつ経済的に評価することを可能にする方法を識別することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記に示された目的は、請求項１に記載されるとおりの、このリスクの判定のための方法によって達成された。
【００２１】
以下に提供される詳細な説明、および非限定的な実施例によって提供される実施形態例から、本発明の特徴および利点がより明確になるだろう。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
よって本発明の目的は、酸化的バランスの変化によってもたらされるリスクの診断的判定のための方法であり、前記方法は、
ａ）生物学的サンプルを提供するステップと、
ｂ）時間ｔに測定される総コレステロールＴＣτと、任意には基底コレステロールＴＣｂとを光度測定するステップと、
ｃ）ヒドロペルオキシドＲＯＯＨを光度測定するステップと、
ｄ）抗酸化能（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ）ＡＣを光度測定するステップと、
ｅ）式ＰＩ＝ＡＣ／ＴＣτに従って防御指数（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）ＰＩを算出するステップと、
ｆ）式ＯＩ＝ＲＯＯＨ／ＴＣτに従って酸化指数（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）ＯＩを算出するステップと、
ｇ）式［ａ］：ＯＢＲＩ＝ＯＩ×Ｋ１／ＰＩ×ΔＴＣに従って、酸化的バランスの変化によってもたらされるリスク指数（または「ＯＢＲＩ」）を算出するステップと
を含み、ここでＫ１はヒトにおいて９．１に等しくラットにおいて５．９５に等しい定数であり、ΔＴＣはＴＣτ／ＴＣｂの比率である。
【００２３】
したがって本発明は、酸化的バランスの変化によってもたらされるリスクの評価のためのすべての関連パラメータ、すなわちＴＣ、ＲＯＯＨ、ＡＣ、ＯＩ、ＰＩおよびＯＢＲＩの測定を可能にする診断方法に関する。
【００２４】
「生物学的サンプル」とは、動物由来の任意の流体、たとえば唾液、血清、血漿、全血、尿、涙、汗などを意味する。好ましくは、前記生物学的流体は唾液、血清、血漿、または尿である。
【００２５】
本発明の方法を実施するために、３８０ｎｍから７８０ｎｍ、好ましくは４７０ｎｍから５５０ｎｍの範囲のλを読取るために好適な光度計（ｐｈｏｔｏｍｅｒ）が用いられ得る。
【００２６】
１つの特に好ましい実施形態において、λは５０５ｎｍである。
【００２７】
好ましくは、光度計は好ましくは３７℃の温度で温度調節することによって走行および維持され、生物学的サンプルの迅速な加熱（＜１ｍｉｎ）のために好適なサーモスタットを備えていればより良好である。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法を実施するための統合分析システムに関し、この統合分析システムは光度計と、サーモスタット遠心機と、ディスプレイと、プリンタと、本発明の方法のステップｂ）〜ｄ）の光度測定値を取得でき、かつステップｅ）〜ｇ）の指数を算出できる電子処理ユニットとを含む。
【００２９】
よって前記統合システムは、光度計および遠心機の両方の機能を実行できる単一の機器をオペレータが有することを可能にする、光度計およびサーモスタット遠心機を含む。加えてこのシステムは、光度計および遠心機の温度に加えて、動作メッセージを（さまざまな言語で）提供する自己指示ディスプレイを有する。これが可能なのは、この計測装置を管理し、かつ光度測定値ｂ）〜ｄ）を取得して本発明の方法のステップｅ）〜ｇ）の指数を算出できる電子処理ユニットのおかげである。最後に、このシステムはさらに、行われた測定および指数の算出の結果のカスタマイズ可能なヘッダを有するレシートを発行できるプリンタを統合する。
【００３０】
遠心機は、最大５ｍｌの内容量を有する、立方試験管［１ｃｍ×１ｃｍ］を好ましくは２から４含むために好適である。遠心機は光度計とともに温度調節されており、好ましくは６０００ｒｅｖ／ｍｉｎ±５％にて動作する。
【００３１】
総コレステロール（ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＴＣ）の測定
総コレステロールすなわちＴＣの測定は、光度的に行われる。
【００３２】
こうした目的のために、比色的酵素判定のための商業的に入手可能な計測装置が用いられ得る。
【００３３】
単一の分析ユニットに光度計と乾燥サーモスタットコンパートメントとを組み合わせており、その両方がデータを受信、処理および送出できるコンピュータシステムによって管理される「オープン」システム計測装置が特に好適である。好ましくは、光度計は少なくとも６つのフィルタ（３４０、４０５、５０５、５４６、５７８および６３０ｎｍ）に対して配置されており、すなわちそれは３２０ｎｍから６８０ｎｍのスペクトル範囲をカバーできる。このサーモスタットシステムは、好ましくは２０℃から４５℃の間の全間隔をカバーする（好ましくは０．１℃の感度および２５℃から３７℃における約７ｍｉｎの安定化時間を有するとき）。
【００３４】
ヒドロペルオキシド（ＲＯＯＨ）の測定
ヒドロペルオキシドすなわちＲＯＯＨの測定も光度的に行われ、この場合にもたとえば欧州特許第０７８３６９２号に従う「ｄ−ＲＯＭｓ」と呼ばれるテスト、または同時係属の国際特許出願である国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０５９１１１号に記載される方法などの、公知の計測装置および方法が使用され得る。
【００３５】
しかし、出願人は「ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ」と簡単に呼ばれる別のテストを開発し、本発明の方法におけるヒドロペルオキシドの測定のために、好ましくはこのテストが用いられる。
【００３６】
したがって別の局面において、本発明は、生物学的サンプルにおけるヒドロペルオキシドの酸化力の判定のための方法に関し、前記方法は、
ｉ）硫酸および式（Ｉ）の発色団薬剤またはその塩を含む水溶液Ａを提供するステップであって、
【００３７】
【化１】
2017511479.tif 000002
【００３８】
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立にＨ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、またはハロゲン化物である、ステップと、
ｉｉ）酢酸およびアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物を含む水溶液Ｂを提供するステップと、
ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩＩ）塩および硫酸を含む水溶液Ｃを提供するステップと、
ｉｖ）生物学的サンプルを提供するステップと、
ｖ）溶液Ａ、溶液Ｂ、溶液Ｃおよび生物学的サンプルを組み合わせて、得られた混合物の吸光度をｔ０およびｔ１において測定するステップであって、ここでｔ０は前記混合物を形成するために組み合わせてから４５秒から７０秒後であり、ｔ１は２分から３分後である、ステップと、
ｖｉ）ｔ０における吸光度をｔ１における吸光度から引くことによって、ランバート−ベールの法則に従って、Ｈ２Ｏ２等価物の濃度の点から問題のサンプルのヒドロペルオキシドの酸化力の値を得るステップとを含む。
【００３９】
上記の方法は、驚くべきことに上に報告されるとおりの試薬の好適な組み合わせによって、有利にはフェントン反応を加速および安定化できる。この組み合わせは、ヒドロペルオキシドのより速くより正確な測定を可能にする。Ｆｅ（ＩＩＩ）との反応において、これらのヒドロペルオキシドはラジカルを生成し、このラジカルは次いで発色団をラジカル化する。この形の発色団はラジカルの濃度に比例する色を呈し、この色は５０５ｎｍにて光度検出できるために、特定の手動ステップの除去を可能にする。
【００４０】
ｄＲＯＭｓテストによって同じ結果を得るために少なくとも５分間を要するのに対し、ｔ１の読み取りを混合物の調製のわずか２分後に行うことができるために、使用される試薬は驚くべきことに、有利には最大６０％の時間低減によって、テスト実行時間を低減させることができた。
【００４１】
さらに、本発明の方法の結果として、生物学的サンプルの活性力の算出において、より延長された線形性の間隔が達成され、すなわちそれは５０〜６００Ｕ．Ｃａｒｒであり、ここで１Ｕ．Ｃａｒｒは０．０８ｍｇ／ｄＬのＨ２Ｏ２に相当する。
【００４２】
加えて、本発明は有利には、試薬の品質管理のための対照「標準」サンプルとして、生物学的対照サンプル溶液を用いることを可能にする。
【００４３】
ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴテストにおいて、分析される生物学的サンプルは、好ましくは分析すべき流体に依存する３０秒から９０秒の可変時間にわたって、予備的に遠心分離される。
【００４４】
「キュベット１」と呼ばれる１つのキュベット（立方測定のもの、１ｃｍ×１ｃｍおよび５ｍＬの体積容量）、１つのエッペンドルフ（登録商標）、および１つのガラス薬瓶に、それぞれ水溶液Ａ、水溶液Ｂおよび水溶液Ｃを予め入れる。水溶液Ｂを含むエッペンドルフ（登録商標）に、水溶液Ｃおよび生物学的サンプルを加える。それを撹拌し、エッペンドルフ（登録商標）の内容物を、水溶液Ａを含むキュベット１に注ぎ入れる。
【００４５】
撹拌後、キュベット１はｔ０におけるベースライン光度測定を受け、特定の時間の後にｔ１における最終光度測定を受ける。
【００４６】
光度測定値はＣａｒｒ．Ｕ．によって表され、ここで１Ｃａｒｒ．Ｕ．は０．０８ｍｇ／ｄＬのＨ２Ｏ２に相当する。
【００４７】
好ましい実施形態に従うと、発色団は濃縮された形で提供され、ここで「濃縮された」とは、発色団を溶解した水溶液を乾燥するまで蒸発させることを意味する。これは有利にはより大きな安定性を可能にし、かつ他方で公知のテストによって提供される手動ステップの大幅な低減を可能にする。
【００４８】
好ましくは、前記発色団薬剤はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミンまたはその塩である。
【００４９】
好適な発色団塩は硫酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、塩化物、リン酸塩、硝酸塩、およびそれらの混合物である。
【００５０】
好適なＦｅ（ＩＩＩ）塩は塩化物、塩素酸塩、硫酸アンモニウム、硫酸塩、硫化物、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、およびそれらの混合物である。好ましくは、前記Ｆｅ（ＩＩＩ）塩は塩化物である。
【００５１】
好ましくは、前記アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物はカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、またはそれらの混合物である。
【００５２】
前記水溶液における溶媒は水、好ましくは脱ミネラル水または脱イオン水である。
【００５３】
好ましくは、前記発色団は水溶液Ａ中で０．０１９ｍｏｌ／ｌから０．５７ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．０３０ｍｏｌ／ｌから０．４５ｍｏｌ／ｌの濃度である。好ましくは、前記発色団はステップｖ）において得られる混合物中で０．００７２ｍｏｌ／ｌから０．２２ｍｏｌ／ｌの濃度である。
【００５４】
好ましくは、硫酸は水溶液Ａ中で０．１７ｍｏｌ／ｌから０．９３ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．２０ｍｏｌ／ｌから０．８０ｍｏｌ／ｌの濃度である。
【００５５】
好ましくは、酢酸は水溶液Ｂ中で０．１７ｍｏｌ／ｌから０．３５ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．２０ｍｏｌ／ｌから０．３０ｍｏｌ／ｌの濃度である。好ましくは、酢酸はステップｖ）において得られる混合物中で０．１６ｍｏｌ／ｌから０．３３ｍｏｌ／ｌの濃度である。
【００５６】
好ましくは、アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物は水溶液Ｂ中で０．１０ｍｏｌ／ｌから０．３５ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．１５ｍｏｌ／ｌから０．３０ｍｏｌ／ｌの濃度である。好ましくは、酢酸はステップｖ）において得られる混合物中で０．１３ｍｏｌ／ｌから０．３３ｍｏｌ／ｌの濃度である。
【００５７】
好ましくは、Ｆｅ（ＩＩＩ）は水溶液Ｃ中で０．０００４０ｍｏｌ／ｌから１．０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．００１ｍｏｌ／ｌから０．８ｍｏｌ／ｌの濃度である。好ましくは、Ｆｅ（ＩＩＩ）はステップｖ）において得られる混合物中で０．０００３３ｍｏｌ／ｌから０．６ｍｏｌ／ｌの濃度である。
【００５８】
好ましくは、硫酸は水溶液Ｃ中で０．００１ｍｏｌ／ｌから０．８３ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．００５ｍｏｌ／ｌから０．６０ｍｏｌ／ｌの濃度である。
【００５９】
好ましくは、硫酸はステップｖ）において得られる混合物中で０．０２０ｍｏｌ／ｌから０．７８ｍｏｌ／ｌの濃度である。
【００６０】
好ましい実施形態の１つに従うと、水溶液Ａにおいて、前記発色団は０．０１９ｍｏｌ／ｌから０．５７ｍｏｌ／ｌの濃度であり、硫酸は０．１７ｍｏｌ／ｌから０．９３ｍｏｌ／ｌの濃度であり、水溶液Ｂにおいて、酢酸は０．１７ｍｏｌ／ｌから０．３５ｍｏｌ／ｌの濃度であり、アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物は０．１０ｍｏｌ／ｌから０．３５ｍｏｌ／ｌの濃度であり、水溶液Ｃにおいて、Ｆｅ（ＩＩＩ）は０．０００４ｍｏｌ／ｌから１．０ｍｏｌ／ｌの濃度であり、硫酸は０．００１ｍｏｌ／ｌから０．８３ｍｏｌ／ｌの濃度である。
【００６１】
１つの特に好ましい実施形態に従うと、水溶液Ａは水と、０．０３〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミンまたはその塩と、０．７０〜０．７３ｍｏｌ／ｌの濃度の硫酸とを含み、水溶液Ｂは水と、０．２５〜０．２７ｍｏｌ／ｌの濃度の酢酸と、０．１５〜０．２０ｍｏｌ／ｌの濃度の水酸化ナトリウムとを含み、水溶液Ｃは水と、０．５０〜０．５５ｍｏｌ／ｌの濃度のＦｅ（ＩＩＩ）塩と、０．０８〜０．１０ｍｏｌ／ｌの濃度の硫酸とを含む。
【００６２】
同様に好ましい実施形態において、水溶液Ａは水と、０．１〜３ｍｇの量のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミンまたはその塩と、０．１〜１．４μｌの量の硫酸とを含み、水溶液Ｂは水と、０．０１〜０．０２ｍｌの量の酢酸と、５〜８ｍｇの量の水酸化ナトリウムとを含み、水溶液Ｃは水と、１〜８μｇの量のＦｅ（ＩＩＩ）塩と、０．０１〜０．２μｌの量の硫酸とを含む。
【００６３】
特に好ましい実施形態において、３つの水溶液の組成は、表Ａに報告されるものである。
【００６４】
【表１】
2017511479.tif 000003
【００６５】
この特に好ましい実施形態において、１０μｌの量の溶液Ｃを含むエッペンドルフ（登録商標）を表Ａの溶液Ｂを含むエッペンドルフ（登録商標）に加え、１０秒間撹拌した後に１０μＬの量の生物学的サンプルを加え、１０秒間撹拌した後にエッペンドルフ（登録商標）の内容物を、溶液Ａを含むキュベット１に注ぎ入れる。１５０秒後、キュベット１は光度測定を受ける。測定値はＣａｒｒ．Ｕによって提供され、ここで１Ｃａｒｒ．Ｕは０．０８ｍｇ／ｄＬのＨ２Ｏ２に相当する。
【００６６】
別の局面において、本発明は上記の方法を実施するためのキットに関し、このキットは、
ａ）式（Ｉ）の発色団薬剤またはその塩を含む少なくとも１つの容器であって、
【００６７】
【化２】
2017511479.tif 000004
【００６８】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立にＨ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、またはハロゲン化物である、容器と、
ｂ）酢酸緩衝液を含む少なくとも１つの容器と、
ｃ）Ｆｅ（ＩＩＩ）塩を含む少なくとも１つの容器と、
ｄ）ハイパーペルオキシドの酸化力の判定を行うための指示を含むリーフレットとを含む。
【００６９】
好ましくは、前記発色団はキットの容器ａ）内に濃縮された形で存在する。
【００７０】
ヒドロペルオキシドの測定に対して好ましく有利であると識別されるすべての局面は、その実施のためのキットに対しても同様に好ましく有利であると考えられることが理解されるべきである。
【００７１】
抗酸化能（ＡＣ）の測定
抗酸化能ＡＣの測定は光度的に行われ、この場合にもたとえばＢＡＰ（生物学的抗酸化力（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ））テストと呼ばれるテストなどの公知の計測装置および方法が用いられてもよく、このテストは生物学的サンプル、好ましくは血清血漿の抗酸化力を、生物学的サンプルが三価鉄イオンを二価鉄イオンに還元する能力の観点から、特定の色素源の色の変化を光度検出して評価するものである。ＢＡＰテストにおいて、生物学的サンプルは、チオシアネートのアルコール溶液を含む試薬１、および三価鉄塩を含む試薬２と混合される。したがってＢＡＰテストにおいて、分析されるサンプルは、チオシアネート溶液に三価鉄イオンの供給源、好ましくはＦｅＣｌ３を加えることによって得られる着色溶液に溶解される。短いインキュベーション（５分間）の後に溶液は変色し、色錯体の形成の原因である最初に存在する三価鉄イオンを、考慮される時間間隔においてテストサンプルの構成要素がより多く還元できた方が、変色がより顕著になる。この変色の程度を光度的に評価することによって、還元された三価鉄イオンの量、および最終的には還元能力、すなわち標準物質として公知である参照サンプルと比較したテストサンプルの抗酸化力を定めることができる。
【００７２】
代替的には、国際特許出願の国際公開第２０１１／１０４２６７号に記載される、簡便のために「ＰＡＴ」テストと略される方法に従って、抗酸化能の測定が行われる。
【００７３】
このＰＡＴテストに従うと、「キュベット２」と呼ばれるキュベット（立方測定のもの、１ｃｍ×１ｃｍおよび５ｍＬの体積容量）が使用される。
【００７４】
キュベット２には試薬１および試薬２が予め入れられる。
【００７５】
試薬１はチオシアネートのアルコール溶液を含むのに対し、試薬２は無機ジルコニウム塩および三価鉄塩を含む。
【００７６】
好ましくは、前記アルコール溶液は水−アルコール混合物である。
【００７７】
好ましくは、前記無機ジルコニウム塩はフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される。より好ましくは、この無機ジルコニウム塩はフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、およびそれらの混合物からなる群より選択される。好ましい実施形態において、前記無機ジルコニウム塩はＺｒＣｌ４である。
【００７８】
好ましくは、前記三価鉄塩はフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される。好ましい実施形態において、前記三価鉄塩は硝酸塩である。
【００７９】
キュベット２はベースライン光度測定を受け、所与の時間（ｔ）の後に最終光度測定を受ける。
【００８０】
好ましくは、前記時間（ｔ）はベースライン光度測定の４０〜１２０秒後であり、より好ましくはベースライン光度測定の５０〜１００秒後である。
【００８１】
光度測定値はＵ  Ｃｏｒによって表される（ここで１Ｕ  Ｃｏｒは１．４μｍｏｌ／ＬのＶｉｔ  Ｃに相当する）。
【００８２】
特に好ましい実施形態において、試薬１および２の組成は、表Ｂに報告されるものである。
【００８３】
【表２】
2017511479.tif 000005
【００８４】
４０μＬの表Ｂの試薬２をキュベット２に加え、１０秒間撹拌した後に、ベースライン読取りのために光度計に入れる。その直後に、ＰＡＴの抗酸化能に対する第１の光度読取りを行う。
【００８５】
１０μＬの生物学的サンプルを直ちにキュベット２に加え、１０秒間撹拌し、キュベット２を光度計に再挿入する。
【００８６】
第１の読取りの６０秒後に、この機器はサンプルの第２の読取りを行い、それはＵ  Ｃｏｒによって表される（ここで１Ｕ  Ｃｏｒは１．４μｍｏｌ／ＬのＶｉｔ  Ｃに相当する）。
【００８７】
好ましい実施形態において、ＲＯＯＨおよびＰＡＴによる抗酸化能ＡＣのそれぞれの値は、本発明のシステムの光度計の底部に組み込まれた感熱プリンタによって提供され得る。
【００８８】
酸化的バランスの変化によってもたらされるリスク（ＯＢＲＩ、酸化的バランスリスク指数）の算出
ヒトにおける判定は次のとおりに行われ、式［ａ］から出発する。
ＯＢＲＩ＝ＯＩ×Ｋ１／ＰＩ×ΔＴＣ  ［ａ］
【００８９】
Ｋ１は、ＴＣ、ＲＯＯＨおよび抗酸化能のそれぞれのレベルがＴＣｂ＝２００ｍｇ／ｄＬ；ｄ−ＲＯＯＨ＝２７５Ｃａｒｒ．Ｕ．；ＡＣ＝２５００Ｕ  Ｃｏｒに対応する平均正常レベルによって表されるときの、ＯＢＲＩ＝１（すなわちリスク１）の値を得るために必要な因数である。
【００９０】
他方、ＴＣτは、判定の時間におけるコレステロール値である。
【００９１】
平均正常レベルに対して報告される値に対して、ＯＢＲＩの算出が＝１になるのは、Ｋ１＝９．１の場合のみである。
【００９２】
実際に、再び平均正常レベルの条件において、ＯＩおよびＰＩの対応値は次のとおりである。
ＯＩ＝１．３７５［すなわち２７５／２００］；ＰＩ＝１２．５［すなわち２５００／２００］
【００９３】
したがってＯＢＲＩは、１．３７５×９．１／１２．５、または＝１（単位リスク）となる。
【００９４】
時間ｔに一致するコレステロールレベル、すなわちＴＣτ（すなわち、判定の時間における問題とする対象のコレステロール値）の条件におけるＯＢＲＩの算出に対しては、［ａ］式におけるＫ１の値およびＴＣｂの値を置換して、ＯＢＲＩの値は次の式によって定められる。
ＯＢＲＩ＝ＯＩ×９．１／ＰＩ×（ＴＣτ／２００）
これを簡略化すると、次のとおりになる。
ＯＢＲＩ＝ＯＩ／ＰＩ×０．０４５５×ＴＣτ  ［ｂ］
したがって［ｂ］は、ヒトにおけるＲＯＯＨ、ＡＣおよびＴＣτの現在のレベルに関して適用すべき簡略化された式である。
【００９５】
他方で、ラットにおいてＫ１＝５．９５である。
【００９６】
ヒトとラットとのこの差異は、ラットにおける正常コレステロール値が未知であるという事実によるものである。これらは実際には系統、使用される食餌、動物の年齢に依存する。したがって、ベースラインコレステロール値（すなわち第１のサンプルが取られた時間におけるＴＣｂ）と、考慮されるべき時間における値（すなわちＴＣτ）とが参照として用いられる。この方法のステップｂ）において、ＴＣｂ測定が任意のものとして示されている理由はこれである。すなわち、ヒトにおいてはＴＣｂ値＝２００ｍｇ／ｄＬが想定されるのに対し、ラットではＴＣｂを測定する必要がある。
【００９７】
１４６匹の動物に対して行われた実施例１において報告される度数分布の分析から、（単位リスク値として）ＯＢＲＩ＝１の中央値を得るべきであれば、Ｋ１＝５．９５の因数を使用する必要があることを明らかにすることが可能であった。
【００９８】
以下に続く実施例において詳細に示されるとおり、ＯＢＲＩ指数の低減とＣＩＭＴ改善との間に興味深い相関が現れており、ここでＣＩＭＴは頸動脈内中膜複合体厚（Ｃａｒｏｔｉｄ  Ｉｎｔｉｍａ−Ｍｅｄｉａ  Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を表し、すなわち心血管リスクマーカーとして使用される頸動脈の動脈セグメントの測定値である。
【００９９】
たとえばアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患は、長年にわたって静かに進行することがあり、その後致死的であることが明らかになり得る心血管系に影響する臨床的事象、たとえば心臓発作および脳卒中などを決定付け得る。これらの疾患の発生を予測できる初期の血管の変化を識別できることによって致死的事象を低減できることは、専用の診断法の開発において必須であり、当然この診断法は高い信頼性を提供するとともに高い実行速度を提供する必要がある。
【０１００】
この意味で、本発明の方法はこれらの要求を満たし得ることが見出された。特にＯＢＲＩは、コレステロールレベルに関する酸化的バランスの実際の改善の判定において非常に信頼性の高い指数であることが判明した。たとえば、実施例４に示されるとおり、この指数が有意に改善した（＞０．８）対象においてのみ、アテローム動脈硬化性血管疾患の退行が観察される。
【０１０１】
本発明の方法の目的に対して、上に報告されたとおりの方法自体の個々のステップにおける方策の好ましい局面のすべての可能な組み合わせが同様に好ましく、したがって記載されていることが理解されるべきである。
【０１０２】
本発明の実施形態例を、非限定的な実施例によって以下に提供する。
【実施例】
【０１０３】
実施例１．
標準的食餌で維持したラットにおけるＯＩ、ＰＩおよびＯＢＲＩ指数の評価
ウィスター−チャールス・リバー（Ｗｉｓｔａｒ−Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）系の体重１８０ｇから２４０ｇのオスのラット１４６匹を分析した。動物達を個別のケージに割り当て、標準的食餌（＃４８ランドイン−カウセレット（Ｒａｎｄｏｉｎ−Ｃａｕｓｅｒｅｔ））を与えた。
【０１０４】
制御された条件（２５℃および周囲湿度６０％、食物および水適宜）において７日間にわたり収容した後、朝（第８日）に、ヘパリン処理した注射器によって動物の尾の静脈から０．２５ｍＬ以下の量の血液サンプルを取った。血漿の単離のためにサンプルを遠心分離し、この血漿を分析のときまで−８０℃にて維持した。動物をサンプル摂取のために絶食させなかった。
【０１０５】
第１のベースライン決定の際に、尿採取のために各動物を個別の代謝ケージに２４ｈ収容した。これらの条件においては、尿への食品の混入を防ぐために動物を絶食させた。
【０１０６】
全体の実験はセッション当り２４〜２６匹の動物群で行い、合計６の連続的セッションを行い、これらのセッションは１年間にわたって行われたためにすべての季節を考慮に入れたものである。
【０１０７】
サンプルに対して、以下の制御を行った。酵素的比色法を用いた総コレステロール（ＴＣ）、Ｕ．Ｃａｒｒ．（ここで１Ｕ．Ｃａｒｒ．は０．０８ｍｇ／ｄＬ  Ｈ２Ｏ２に相当する）によるｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴテスト（表Ａの組成による）を用いたヒドロペルオキシド（ＲＯＯＨ）のレベル、ならびにそれぞれＵ  Ｃｏｒ（ここで１Ｕ  Ｃｏｒは１．４μｍｏｌ／Ｌ  Ｖｉｔ  Ｃに相当する）によるＰＡＴテスト（表Ｂの組成による）、およびμｍｏｌ／Ｌ  Ｖｉｔ  ＣによるＵＡＴテスト（ＵＡＴまたは尿中抗酸化物質テスト（Ｕｒｉｎａｒｙ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｔｅｓｔ））を通じた、血漿中の抗酸化能および尿中のＵＡＴのレベル。ＵＡＴの決定において、ＲＯＯＨ測定は行わなかった。
【０１０８】
尿中濃度と尿体積との積も算出して、身体が系統的酸化を制御するための抗酸化物質の使用の機能として抗酸化物質の排出の縮小を行っていたかどうかを評価した。
【０１０９】
これら後者のｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ、ＰＡＴ、ＵＡＴの記録に対して本発明の方法を使用したが、この方法はさらにＯＩ、ＰＩおよびＯＢＲＩ指数を提供する。
【０１１０】
式［ａ］を用いてＯＢＲＩの値を算出した。すなわち、ＯＢＲＩ＝ＯＩ×Ｋ１／ＰＩ×ΔＴＣであり、
ここでＫ１＝５．９５であり、ΔＴＣ＝ＴＣτ／ＴＣｂである。この値は中央値＝１を可能にし、これは記録された値に対して見積もられるべき、ベースライン時間における単位リスクを表す。ΔＴＣパラメータは、ＴＣτ（現在）対ＴＣｂ（ベースライン）の比率によって表した。したがって、ＴＣτ／ＴＣｂの比率のベースライン評価においてそれは＝１であったのに対し、その後の評価ではＴＣτ／ＴＣｂの点値であった（通常≠１であるが、必須ではない）。
【０１１１】
記録されたすべてのデータから、調査された９変数に対して得られた値の平均および標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ：ＳＤ）、中央値、分布パラメータを算出した。
【０１１２】
平均および中央値に関する結果を表１に集めており、五分位数（Ｑ１からＱ５）に基づく分布値を表２に報告している。
【０１１３】
【表３】
2017511479.tif 000006
【０１１４】
その後五分位数に分割することによって、５つの異なる測定値を構成することを可能にし、これによって正常レベルならびに正常より上および下のものの両方を追跡することができる。
【０１１５】
【表４】
2017511479.tif 000007
【０１１６】
変数間の相関（「ｒ」）も評価した。これらを表３に報告している。
【０１１７】
相関の有意性を判定するためにｐ＜０．０１レベルを用いた。サンプルのサイズは、０．２１６に対応する「ｒ」値を有意とみなし得るようにするものである。全体的に、観察したすべての相関は整合していることが判明し、さらに確実に興味深い指標を提供する。
【０１１８】
ＴＣに関して、ＴＣのレベルがｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴの値およびＰＡＴ値と同等に上昇するとき、ＯＩおよびＩＰ指数も明らかに低減する（ＴＣの値は分母にあるため）が、ＯＢＲＩ指数は変化せず、防御機能によるバランスの形成を証明する。
【０１１９】
ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴに関して、その値はＯＩおよびＯＢＲＩと直接相関するのに対し、ＰＡＴおよびＰＩ、ならびに当然ながらＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴとは逆相関することを注記する。
【０１２０】
ＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ指数とＯＢＲＩとの相関性が高い（ｒ＝０．９３４、ｐ＜０．０１）ことは、これらの指数の両方がリスクを判定するために十分な変数を表すことを示すと考えられる。しかし以下の実施例においては、ＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ指数がＯＢＲＩよりもはるかに識別力が低いことを示している。
【０１２１】
予想どおり、ＰＡＴはＩＰおよびＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴと直接相関し（それぞれｒ＝０．５２７および０．７２２、どちらもｐ＜０．０１）、ＯＩ（ｒ＝−０．５４３、ｐ＜０．０１）およびＯＢＲＩ（ｒ＝−０．７２９、ｐ＜０．０１）と逆相関する。これらは等式の構成要素に関係するため、これらの相関も予想される相関である。
【０１２２】
【表５】
2017511479.tif 000008
【０１２３】
ＯＩ指数はそれぞれ、ＯＢＲＩとの正の相関（ｒ＝０．８４８、ｐ＜０．０１）およびＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴとの負の相関（ｒ＝−０．７３０、ｐ＜０．０１）を有する。ＰＩにも同じことがいえる。
【０１２４】
以下に示し得るとおり、ＴＣτ／ＴＣｂの比率（すなわちΔＴＣ）によるＯＢＲＩの決定に含まれるコレステロールの変化は、ＯＢＲＩの目的のために非常に重要である。このため、予後の点からＯＢＲＩがどのようにＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴの比率と区別されるかを観察する。ＴＣの変化を考慮しなければ、ＯＢＲＩはＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴに５．９５を乗じたものに近くなる。
【０１２５】
他方で、ＴＣτレベルを考慮するとき、ＯＢＲＩ指数は因数≠５．９５によるＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴの比率とは実質的に異なるものとなる。
【０１２６】
このことは、コレステロールレベルを低減することが心血管リスクを低減するための重要な要素であると考えられるという臨床的エビデンスに一致するが、酸化的バランスも考慮する必要がある。
【０１２７】
実施例２．
ラットにおけるＯＢＲＩ値の安定性
本実験の目的は、正常条件下で維持されたラットにおける完全な酸化的バランス値の変化を評価することであった。
【０１２８】
実施例１で報告した１４６匹の動物群からの２１匹のラットを分析し、同じやり方でテストを繰り返しながら実施例１で報告したのと同じ条件下でこれらのラットを２週間追跡した。
【０１２９】
変数に対して、以下の指数を算出した。ＯＩ（酸化指数、すなわちｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ／ＴＣ）、ＰＩ（コレステロール酸化防御指数、すなわちＰＡＴ／ＴＣ）、ＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ指数（すなわちコレステロールレベルを考慮に入れない一般的な酸化的バランス）、ＯＢＲＩ、この場合のＯＢＲＩはＴＣτ値（すなわち２週間後のコレステロールレベル）およびベースライン値すなわちＴＣｂを考慮に入れている。結果を表４に報告している。
【０１３０】
【表６】
2017511479.tif 000009
【０１３１】
動物におけるＴＣが有意に低減していることを実験は示す。このデータは、生産者（チャールス・リバー）の飼育場で用いられる食餌と異なる食餌を受けた動物の代謝の安定化を予測させるものであり、おそらくは現在の食餌（＃４８ランドイン−カウセレット）がその血漿濃度を変えている。
【０１３２】
この低減の結果として、分母（ＯＩおよびＰＩはどちらも共通分母としてＴＣを有する）の低減がもたらされ、したがってどちらの指数も増加する傾向がある。しかし、両方の指数の増加は、安定なままのＯＢＲＩ指数を変更できない。
【０１３３】
予想されるデータとしての尿中排出の増加（ｐ＜０．０１）を特に注記すべきである。なぜなら、２週間の間に動物の体重は平均約８０ｇ増加しており、結果的に尿体積への影響を伴うためである。ＵＡＴ値は一定のままであってｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴの増加と一致しており、身体の成長（加齢を参照）は酸化的状態を増加させることによってそれに影響することを示す。この現象は、動物を２８ヵ月の期間にわたって追跡した実施例３においてより明白である。
【０１３４】
実施例３．
ラットにおける生存の予測子としてのＯＢＲＩ指数
この研究の目的は、標準的条件において維持された正常なラットの生存を判定することであった。
【０１３５】
実施例１で報告した１４６匹の動物群に属する２１匹のラットを分析した。
【０１３６】
これらは実施例２で報告したのと同じ動物であり、これらの動物を２４ヵ月の期間にわたって追跡して、同じ標準的条件（すなわち実施例１の条件）下で維持した。
【０１３７】
動物達を示された収容条件下で、食物および水を適宜与えて置き、自然死亡率をチェックするために２８ヵ月間にわたって追跡した。最初の７日間の収容後、およびその後の２４ヵ月間の収容後にも、すべての変数をチェックした。
【０１３８】
サンプルに対して、酵素的比色法を用いて総コレステロールレベルチェック（ＴＣ）を行い、Ｕ．Ｃａｒｒ．（ここで１Ｕ．ＣＡＲＲ．は０．０８ｍｇ／ｄＬ  Ｈ２Ｏ２に相当する）によるｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴテストを用いてヒドロペルオキシド（ＲＯＯＨ）のレベル、およびＣｏｒ  Ｕ（ここで１Ｕ  Ｃｏｒは１．４ｍｏｌ／Ｌ  Ｖｉｔ  Ｃに相当する）によるＰＡＴテストを通じた総抗酸化物質貯蔵のレベルのチェックを行った。
【０１３９】
濃度と尿体積との積に基づいて、収集した尿に排出された抗酸化物質の定性総量（ＵＡＴまたは尿中抗酸化物質テスト、濃度×体積）を算出した。
【０１４０】
２８ヵ月間の収容後に、動物の死亡率を記録した。
【０１４１】
２匹の動物は、（肺炎のため）それぞれ１匹が６ヵ月、１匹が９ヵ月の寿命にて、通常の平均余命よりも早期に死亡した。
【０１４２】
結果を表５に報告している。
【０１４３】
ＴＣ（ｐ＜０．０５）およびｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴテストの有意な増加を観察したのに対し、ＰＡＴは実質的に一定のままであった。ＯＩ指数も一定のままであったのに対し、ＰＩ指数およびＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴの比率は有意な低減（ｐ＜０．０５）を被った。
【０１４４】
この挙動は、ＲＯＯＨの増加がＰＡＴの同等の増加を補償しなかったことによって証明されるとおり、動物の年齢の増加に伴って酸化的バランスが失われる傾向があったことを示した。
【０１４５】
尿中排出は有意に（ｐ＜０．０１）増加したのに対し、抗酸化物質の排出（ＵＡＴ）は時間に対して一定のままであった。
【０１４６】
ＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴの比率の低減（−１９％、ｐ＜０．０５）およびＯＢＲＩの増加（＋５３％、ｐ＜０．０５）の両方において、酸化的不均衡を観察した。２項の変化の程度が有意に異なることは、ＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ指数よりもＯＢＲＩ指数の方が感受性が高いことを示す。
【０１４７】
【表７】
2017511479.tif 000010
【０１４８】
表６に報告するとおり、指数自体に関する動物の死亡率を考慮するとき、この感受性の差は明確に強調される。
【０１４９】
２８ヵ月では、合計１９匹の動物に対して１０匹の死を観察した。
【０１５０】
表６は、２８ヵ月において、ＯＢＲＩが増加した動物の１０／１４が死亡したのに対し、ＯＢＲＩが低減した５匹の動物はどれも死亡しなかったことを示す。
【０１５１】
フィッシャーに従う完全カイ二乗検定において、この差は有意である（ｐ＝０．０１０８）。
【０１５２】
主要な血漿変数を、個別に取ったもの、すなわちＴＣ、ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ、ＰＡＴと、指数として取ったもの、すなわちＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴ、ＯＩおよびＰＩとの両方を分析して、死亡率と相関させた。ＰＡＴ、ＩＰ、ＰＡＴ／ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴの増加は「有利」な値と考えられたのに対し、ＴＣ、ＯＩ、ｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴの増加は「不利」と考えられた。
【０１５３】
ｐ０．１３７２からｐ０．８７２４の間の正確確率値、すなわち有意でない値に対して見積もられた、分析したその他すべての変数に関しては、死亡率に有意差はない。
【０１５４】
このすべてから、ＯＢＲＩ指数は予測生存値を有するのに対し、その他すべての変数または指数はこの特徴を有さないことが明らかである。
【０１５５】
【表８】
2017511479.tif 000011
【０１５６】
実施例４．
アテローム性動脈硬化症のヒトにおける頸動脈の厚さの改善に関するＯＢＲＩ値
超音波によって実証した頸動脈のアテローム性動脈硬化症である２２名の対象を検討した。対象はすべて男性であり、年齢は５４歳から６４歳であった。
【０１５７】
承認基準は、スタチン療法を受けるべき、トリグリセリド＜３００ｍｇ／ｄＬを伴う高コレステロール血症［２３０ｍｇ／ｄＬ＜ＴＣ＜３００ｍｇ／ｄＬ］の存在に対して与えた。
【０１５８】
除外基準は、あらゆるその他の療法またはあらゆる慢性疾患からなるものであり、したがって対象はスタチンによる処置のみを受け得た。実験分析の期間中は、可能性のある感染性疾患に対する反復療法を許可した。その症状が実験制御から少なくとも１５日間起こっており、かつその疾患のいかなる続発症も起こっていない場合に、これを認めた。
【０１５９】
有職者および退職者の対象、ならびに喫煙者および非喫煙者の両方を無差別に承認した。
【０１６０】
全体の実験を、２０１３年の７月の初めから１０月の第２週までの期間に行った。２つの期間において実験制御を行った。すなわち、ベースラインまたは処置の開始前の１週間以内、およびスタチン（ロバスタチンまたはプラバスタチンに限定した）による処置の３ヵ月（±３日）後である。スタチンは常に、それぞれロバスタチン１０ｍｇおよびプラバスタチン２０ｍｇの固定用量で用い、常に排他的に夕食前の１９：３０から２０：３０の時間に投与した。この実験は「登録」タイプであった。しかし、超音波オペレータおよび生物統計学者はどちらも処置について知らなかった。プラバスタチンは商業的に入手可能なものの１つ（オリジナルまたはジェネリック）であったのに対し、ロバスタチンは排他的に商品Ａｎｔｉｌｉｐ（登録商標）に由来するものであった。この製品は、ベニコウジカビ（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）の抽出物に由来するロバスタチンと、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）からのポリグルコサミンおよび植物ステロールと（それぞれ５ｍｇ、１８２ｍｇおよび１５０ｍｇ）によって調剤された錠剤を含んだ。
【０１６１】
プラバスタチンの投与は単一の錠剤からなるものであったが、Ａｎｔｉｌｉｐ（登録商標）の投与はいずれの場合にも同時に２つの錠剤の投与であった。
【０１６２】
各制御に対して、ＰＲＥＩＵＳエラストソノグラファー日立（Ｅｌａｓｔｏｓｏｎｏｇｒａｐｈｅｒ  Ｈｉｔａｃｈｉ）エコグラフによって、両側頸動脈超音波を行った。横断画像および長手方向画像において、頸動脈を分析した。この調査は、通常の頸動脈の球状部の起点の１．５ｃｍ以内、球状部自体、頸動脈の外部および内部の評価を含んだ。画像に対して各動脈について５回の測定を行って、頸動脈内中膜複合体厚（ＣＩＭＴ）を測定した。動脈プラークは除外した（動脈の内側の１．５ｍｍ以上のあらゆる突起をプラークとみなした）。ＣＩＭＴ測定値はｍｍで表した。超音波検査の３日以内に実験室変数を評価し、それはこのタイプの患者に対する通常の分析ルーチンの一部であった。この評価は、コレステロールおよびトリグリセリドレベル（ＴＣ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＴＧ）；ＯＩ、ＰＩおよびＯＢＲＩ指数のそれぞれによってｄ−ＲＯＭｓ  ＦＡＳＴおよびＰＡＴによって表される酸化的バランスからなるものであった。
【０１６３】
対象の一般的特徴を表７に報告している。
【０１６４】
【表９】
2017511479.tif 000012
【０１６５】
ＣＩＭＴの任意の変化に対する酸化的条件の比率を分析するために、相関係数「ｒ」を分析した。得られた結果を表８に記録している。
【０１６６】
【表１０】
2017511479.tif 000013
【０１６７】
ＨＤＬおよびＯＩを除き、スタチンによる処置後に記録されたすべてのデータは、有利な意味で有意に変わったことが示された。
【０１６８】
スタチンの作用に対する古典的な参照変数の中で、処置後にＴＣ、ＬＤＬおよびＴＧはそれぞれ２１±７．０％、２８±１０．５％、１２±９．８％だけ低減したのに対し、ＯＢＲＩに対する低減はさらに有意であり、４３±１３．８％であったことを観察できる。各製品に対する症例数が限られていたため、使用した２つのスタチン間の相違を明らかにすることはできなかった。
【０１６９】
血液の変数およびそれらそれぞれの指数と、ＣＩＭＴの低減との間の相関係数を表９にまとめている。ＣＩＭＴの低減＞１０％の患者［１０症例］に対する変数／指数の平均±ＳＤ値を記録し、かつＣＩＭＴが変化しなかった患者［１２症例］についても報告している。
【０１７０】
【表１１】
2017511479.tif 000014
【０１７１】
興味深いのはＯＢＲＩ指数低減とＣＩＭＴ改善との相関（ｒ＝０．５４６、ｐ＜０．０５）であり、一方でその他すべての変数は相関していない。この数字の確認において、ＯＢＲＩ値が有意に低減した症例においてのみ研究変数の有意差が観察される。
【０１７２】
なお、これらの結果は、ＯＢＲＩがラットの寿命の長さと相関させるべき実験室指数の唯一のものであることを明らかにした実施例３で得られた結果を確証するものである。
【０１７３】
結論として、ＯＢＲＩ指数が有意に改善した対象においてのみ血管の動脈硬化性疾患の退行も観察できるほどに、ＯＢＲＩはコレステロールレベルに関する酸化的バランスの実際の改善の判定において非常に信頼性が高いことが判明した。
【０１７４】
１２週間の観察期間に限定すると、ＯＢＲＩ指数が少なくとも４５％改善しているときにＣＩＭＴの低減がほぼ排他的に観察されることが暗示される。
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月16日(2016.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化的バランスの変化によってもたらされるリスクの診断的判定のための方法であって、前記方法は、
ａ）生物学的サンプルを提供するステップと、
ｂ）時間ｔに測定される総コレステロールＴＣτと、任意には基底コレステロールＴＣｂとを光度測定するステップと、
ｃ）ヒドロペルオキシドＲＯＯＨを光度測定するステップと、
ｄ）抗酸化能ＡＣを光度測定するステップと、
ｅ）式ＰＩ＝ＡＣ／ＴＣτに従って防御指数ＰＩを算出するステップと、
ｆ）式ＯＩ＝ＲＯＯＨ／ＴＣτに従って酸化指数ＯＩを算出するステップと、
ｇ）式［ａ］：ＯＢＲＩ＝ＯＩ×Ｋ１／ＰＩ×ΔＴＣに従って、酸化的バランスの変化によってもたらされるリスク指数（または「ＯＢＲＩ」）を算出するステップと
を含み、ここでＫ１はヒトにおいて９．１に等しくラットにおいて５．９５に等しい定数であり、ΔＴＣはＴＣτ／ＴＣｂの比率である、方法。
【請求項２】
ステップｂ）、ｃ）およびｄ）の測定は、波長を３８０ｎｍから７８０ｎｍ、好ましくは４７０ｎｍから５５０ｎｍ、より好ましくは５０５ｎｍの波長に設定した後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルは、唾液、血清、血漿、全血、尿、涙、または汗である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＣの測定のために、前記生物学的サンプルが、チオシアネートのアルコール溶液を含む試薬１、ならびに無機ジルコニウム塩および三価鉄塩を含む試薬２と混合されるＰＡＴテストが使用されるか、または前記生物学的サンプルが、チオシアネートのアルコール溶液を含む試薬１、および三価鉄塩を含む試薬２と混合される生物学的抗酸化力（ＢＡＰ）テストが使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記無機ジルコニウム塩はフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、およびそれらの混合物からなる群より選択され、前記三価鉄塩はフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生物学的サンプルにおけるヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法であって、前記方法は、
ｉ）硫酸および式（Ｉ）の発色団薬剤またはその塩を含む水溶液Ａを提供するステップであって、
【化１】
2017511479.tif 000016
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立にＨ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、またはハロゲン化物である、ステップと、
ｉｉ）酢酸およびアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物を含む水溶液Ｂを提供するステップと、
ｉｉｉ）Ｆｅ（ＩＩＩ）塩および硫酸を含む水溶液Ｃを提供するステップと、
ｉｖ）生物学的サンプルを提供するステップと、
ｖ）前記溶液Ａ、前記溶液Ｂ、前記溶液Ｃおよび前記生物学的サンプルを組み合わせて、得られた混合物の吸光度をｔ０およびｔ１において測定するステップであって、ここでｔ０は前記混合物を形成するために組み合わせてから４５秒から７０秒後であり、ｔ１は２分から３分後である、ステップと、
ｖｉ）ｔ０における吸光度をｔ１における吸光度から引くことによって、ランバート−ベールの法則に従って、Ｈ２Ｏ２等価物の濃度の点から問題の前記サンプルのヒドロペルオキシドの酸化力の値を得るステップと
を含む、ヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法。
【請求項７】
前記水溶液Ａにおいて、前記発色団は０．０１９ｍｏｌ／ｌから０．５７ｍｏｌ／ｌの濃度であり、硫酸は０．１７ｍｏｌ／ｌから０．９３ｍｏｌ／ｌの濃度であり、前記水溶液Ｂにおいて、酢酸は０．１７ｍｏｌ／ｌから０．３５ｍｏｌ／ｌの濃度であり、前記アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物は０．１０ｍｏｌ／ｌから０．３５ｍｏｌ／ｌの濃度であり、前記水溶液Ｃにおいて、Ｆｅ（ＩＩＩ）は０．０００４ｍｏｌ／ｌから１．０ｍｏｌ／ｌの濃度であり、硫酸は０．００１ｍｏｌ／ｌから０．８３ｍｏｌ／ｌの濃度である、請求項６に記載のヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法。
【請求項８】
前記水溶液Ａは水と、０．０３〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミンまたはその塩と、０．７０〜０．７３ｍｏｌ／ｌの濃度の硫酸とを含み、前記水溶液Ｂは水と、０．２５〜０．２７ｍｏｌ／ｌの濃度の酢酸と、０．１５〜０．２０ｍｏｌ／ｌの濃度の水酸化ナトリウムとを含み、前記溶液Ｃは水と、０．５０〜０．５５ｍｏｌ／ｌの濃度のＦｅ（ＩＩＩ）塩と、０．０８〜０．１０ｍｏｌ／ｌの濃度の硫酸とを含む、請求項６または７に記載のヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法。
【請求項９】
ステップｃ）におけるヒドロペルオキシドＲＯＯＨの測定のために、請求項６〜８のいずれか一項に記載のヒドロペルオキシドＲＯＯＨの酸化力を判定するための方法が使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５または請求項９のいずれか一項に記載の方法を実施するための統合分析システムであって、光度計と、サーモスタット遠心機と、ディスプレイと、プリンタと、前記方法のステップｂ）〜ｄ）の光度測定値を取得でき、かつステップｅ）〜ｇ）の指数を算出できる電子処理ユニットとを含む、統合分析システム。
【国際調査報告】
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