(57)【要約】  患者特有の変異の様々な発癌性関連指数を決定する方法が提供される。提供された方法は、様々な患者特有の変異の測定およびグレード分類、ならびに様々な関連の発癌性指数の定性的および定量的決定を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の患者特有の変異の発癌性指数を作成する方法であって、
ａ）患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）前記アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）前記発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、前記アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）前記変異を含む前記遺伝子を発現する前記アッセイ細胞中の前記発現されたＦＴＲの細胞下局在および／またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと；
ｅ）ｉ）前記異なる結果を処理して、発現構築物の前記第一のセットおよび発現構築物の前記第二のセットの存在下で前記テストされたＦＴＲのトランスロケーションの度合いを測定して、前記患者特有の変異の活性化レベルを測定すること；
ｉｉ）前記発現構築物の前記第二のセットの存在下での前記ＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの前記第一のセットの存在下での前記ＦＴＲのトランスロケーションの度合いを正規化して、前記患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること；ならびに
ｉｉｉ）前記患者特有の変異の前記正規化された活性化レベルと臨床転帰（参照）との写像を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の前記異なる結果を定量し、それにより前記１つまたは複数の患者特有の変異の前記発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
解析が、マシンラーニングを利用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
解析が、相関単変量解析、多変量解析、サポートベクターマシン、一般化線形モデルまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスロケーションの度合いが、核／細胞質比に基づいて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記指数が、悪性腫瘍に至らせる前記候補となる患者特有の変異の能力を示す数値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記指数が、前記患者の無増悪生存、前記患者の全生存、薬物応答の確率、無増悪期間（ＴＴＰ）、腫瘍応答率、再発率、無病生存（ＤＦＳ）、またはそれらの組み合わせを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記患者特有の変異の前記トランスロケーションの度合いがさらに、前記患者特有の変異が関与する細胞シグナル伝達経路の影響に正規化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞下局在が、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＴＲの標的遺伝子部分が、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＦＴＲのレポータ遺伝子部分が、蛍光マーカをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異の少なくとも１つが、発癌性変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記構築物および／またはベクターを乾燥させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｃ）が、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
テスト薬物を前記細胞に添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記テスト薬物への応答による、悪性腫瘍の成長に至らせる前記患者特有の変異の能力の低下を示す治癒指数を計算することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
発癌性グレード分類指数を作成するシステムであって、
ａ）テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子産物の細胞下トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように；
ｂ）前記ＦＴＲの前記細胞下トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、１つまたは複数の患者特有の変異の活性化レベルを測定するように；
ｃ）発現構築物の前記第二のセットの存在下での前記ＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の前記第一のセットの存在下での前記ＦＴＲの局在の細胞下トランスロケーションを正規化して、前記患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように；そして
ｄ）前記患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関を解析し、それにより前記発癌性指数を決定するように、
構成された回路を含み、
前記異なる結果が、
ｉ）１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること；
ｉｉ）前記アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること；ならびに
ｉｉｉ）前記発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、前記アッセイ細胞を各場所に添加すること、
によって得られる、システム。
【請求項２１】
解析が、マシンラーニングを含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
解析が、相関単変量解析、多変量解析、サポートベクターマシン解析、一般化線形モデル解析またはそれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
前記指数が、悪性腫瘍に至らせる前記候補となる患者特有の変異の能力を示す数値を有する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２４】
前記指数が、前記患者の無増悪生存、前記患者の全生存、薬物応答の確率、無増悪期間（ＴＴＰ）、腫瘍応答率、再発率、無病生存（ＤＦＳ）、またはそれらの組み合わせを示す、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２５】
前記患者特有の変異の前記トランスロケーションの度合いがさらに、前記患者特有の変異が関与する細胞シグナル伝達経路の影響に正規化される、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２６】
前記細胞下局在が、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２７】
前記ＦＴＲの標的遺伝子部分が、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２８】
前記ＦＴＲのレポータ遺伝子部分が、蛍光マーカをコードする、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２９】
前記遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３０】
前記変異の少なくとも１つが、発癌性変異である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３１】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３２】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３３】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３４】
トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記構築物および／またはベクターを乾燥させることをさらに含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３５】
ステップｉｉｉ）が、ステップｉ）および／またはステップｉｉ）に先行する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項３６】
テスト薬物を前記細胞に添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記処理回路がさらに、前記テスト薬物への応答による、悪性腫瘍の成長に至らせる前記患者特有の変異の能力の低下を示す治癒指数を決定するように構成される、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を示す治癒指数を作成する方法であって、
ａ）１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）前記アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）前記発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、前記アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）薬物の存在下および非存在下で、前記１つまたは複数の変異を含む遺伝子を発現する前記アッセイ細胞中の前記発現されたＦＴＲの細胞下局在および／またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと；
ｅ）ｉ）前記異なる結果を処理して、発現構築物の前記第一のセットおよび発現構築物の前記第二のセットの存在下で前記テストされたＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いを決定して、前記薬物の存在下または非存在下での前記患者特有の変異の活性化レベルを測定すること；
ｉｉ）前記薬物の存在下または非存在下で、発現構築物の前記第二のセットの存在下での前記ＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの前記第一のセットの存在下での前記ＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いを正規化して、前記患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること；ならびに
ｉｉｉ）前記薬物の存在下または非存在下での前記患者特有の変異の前記正規化された活性化レベルと、臨床転帰（参照）との相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の前記異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異についての前記薬物の治癒指数を決定するステップと；
を含む、方法。
【請求項３９】
該薬物が、抗癌薬である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
様々な濃度の薬物（複数可）を添加することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞下局在が、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
解析が、マシンラーニングを利用することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記変異の少なくとも１つが、発癌性変異である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記構築物および／またはベクターを乾燥させることをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
ステップｃ）が、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行する、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
患者特有の変異（複数可）の様々な発癌性関連指数を決定する方法およびシステムを提供する。該システムおよび方法は、様々な患者特有の変異の測定およびグレード分類、ならびに様々な関連の発癌性指数の定性的および定量的決定を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌（悪性腫瘍または悪性新生物）は、他の身体部分に侵入または拡大する能力を有する異常な細胞増殖を含む疾患群である。癌は、極めて多様であり、様々な根底的分子メカニズムがそれに関与する。したがって様々な癌と診断された患者の予後は、根底にある分子メカニズムの正確な診断に加え、発癌性変異ならびにオートクリンおよびパラクリンの影響の同定に応じて、大きく異なり得る。
【０００３】
さらに、癌の複雑さおよび異質性から、正確な予後および最適な治療を決定するために、患者特有の腫瘍シグナル伝達経路を定性的および定量的手法で反映し、該特有の変異を正確にグレード分類することが可能な、より感度が高く洞察力のある診断アプローチが求められる。例えば本出願の発明者らの一部への国際公開ＷＯ２０１４／１１１９３６号は、患者特有のドライバー変異を同定する方法およびシステムに向けられる。現在、腫瘍内に蓄積した変異の大きなプール、同定されたドライバー変異の限定されたレパトア、および様々な変異の相互作用、そして特にその活性に関する非常に限定された洞察のために、正確な予後または最適な標的治療選択を提供するための全ゲノムシーケンシング（次世代シーケンシングなど）の適切さが限定される。
【０００４】
したがって、患者特有の変異の定性的および定量的グレード分類を提供し、患者特有の変異の個人に合わせた指示を提供し得る様々な関連指数の測定を可能にし、患者特有の予後および／または最適な処置指示をさらに提供し得る方法およびシステムが、当該技術分野で依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
本発明は、患者の変異および患者の特有の状態（予後）に関する洞察を得ることができ、最適な処置の決定をさらに補助することができる、患者特有の変異（複数可）の様々な発癌性指数を決定および／または計算および／または作成する方法およびシステムを提供する。該患者特有の変異は、テスト細胞において、ドライバー変異の機能に関連するシグナル伝達経路の活性の変化を同定することによって認識される。幾つかの実施形態によれば、シグナル伝達経路の活性の変化は、患者の変異の機能に関連するレポータ遺伝子の細胞下局在の変化を同定することによって測定される。幾つかの実施形態において、特異的な患者由来マーカ（ＰＤＭ）遺伝子が、生体試料から得られ、またはそれに由来し（直接的または間接的に）、対応する蛍光トランスロケーション（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）レポータ（ＦＴＲ）遺伝子の細胞下トランスロケーションに及ぼす影響を生存可能なテスト細胞でテストして、テストされたＰＤＭが変異しているか否かを決定する。幾つかの実施形態において、該特異的な患者由来マーカを得て、蛍光レポータに融合し、患者由来レポータ（ＰＤＲ）を生成して、そこでＰＤＲの細胞下トランスロケーションを生存可能なテスト細胞でテストして、テストされたＰＤＭが変異しているか否かを決定する。幾つかの実施形態において、ドライバー変異の同定は、様々な薬物および／または薬物の組み合わせへの、同定された特有の変異の薬物応答を測定することができ、さらに同定された変異のグレード分類（それらの腫瘍形成作用に関する）を提供するように、そして様々な患者特有の発癌性指数を決定するように構成される。
【０００６】
本明細書に開示された方法およびシステムは、様々な同定された患者の変異の定性的および定量的グレード分類、ならびに同定された変異および全体的病状の腫瘍形成能に関する様々な指数、および患者の予後の決定を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
幾つかの実施形態において、本発明は、癌に関与する患者特有のドライバー変異を同定する方法およびシステムを提供し、様々な関連の指数およびそれを決定する方法をさらに提供する。幾つかの実施形態において、該ドライバー変異は、発癌性ドライバー変異である。幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、例えば非限定的に無増悪生存、全生存、薬物応答の確率、発癌性グレード分類指数、治癒指数などの様々な癌関連指数の形成を可能にする。幾つかの実施形態において、該指数は、薬物または薬物の組み合わせの治癒指数など、薬物関連指数を定量的に決定するプラットフォームを提供するため、処置にさらに関係し得る。
【０００８】
幾つかの実施形態によれば、パラクリン／オートクリン活性化経路に関して得られたデータと共に、変異に関して測定された定量的データを有する同定された変異を利用して、患者の腫瘍および変異した遺伝子内で影響を受けたシグナル伝達経路、ならびにその発癌活性を示す「腫瘍発癌性マップ」を作成することができる。
【０００９】
幾つかの実施形態によれば、患者特有のドライバー変異の発癌性のグレード分類を決定する方法であって、レポータマーカ遺伝子の細胞下局在／トランスロケーションの変化を同定することを含み、該細胞下局在の変化が、場合によりテスト薬物または薬物の組み合わせの存在下または非存在下でドライバー変異によって影響を受ける、方法が提供される。幾つかの実施形態によれば、患者由来マーカ（ＰＤＭ）は、患者の生体試料から得られ／それに由来し（例えばシーケンシングデータに基づき、直接的または間接的に）、レポータキメラ遺伝子（レポータ遺伝子部分および標的遺伝子部分のキメラ生成物を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ））の存在下で生存可能なテスト細胞中で発現されるように操作（設計）される。テスト細胞におけるＦＴＲの細胞下局在を、その後に測定する。テストＰＤＭの存在下でのＦＴＲの細胞下局在が、正常な条件下（即ち、対応するＷＴ  ＰＤＭの存在下）、および／または他の公知参照との比較で、ＦＴＲの細胞下局在と異なる場合、テストされたＰＤＭが変異されていることが示される。さらに、同定された変異をテスト薬物またはテスト薬物の組み合わせの存在下でテストして、テストされたＰＤＭの特異的薬物応答を同定することができ、さらに様々な治癒関連指数を決定するのに用いることができる。したがって本明細書に開示された方法を用いて、患者特有のＰＤＭを、ドライバー変異であるとして同定／特徴づけすることができ、薬物の存在下でさらにアッセイし、その局在および発癌活性に影響を及ぼす薬物の能力を測定して、最終的に様々な関連指数を作成することができる。代わりまたは追加として、幾つかの実施形態において、ＦＴＲを使用せずにＰＤＲ（即ち、レポータ遺伝子に連結／付着／融合されたＰＤＭ）を作製することおよび細胞下局在を追跡することによって、ＰＤＭを直接テストすることができる。そのようなドライバー変異を測定することによって、患者の腫瘍内で動作する活性化されたシグナル伝達経路を同定することができる。さらにこれにより、特定の患者の腫瘍を根絶して耐性メカニズムを回避するのに必要となる標的治療的処置を精密かつ特異的に選択することができる。
【００１０】
幾つかの実施形態によれば、有利には、患者特有の変異を同定するため、そして同じテスト細胞内の、同じ遺伝子および／もしくは異なる遺伝子における異なる変異もしくは変異の組み合わせ、ならびに／または異なるＰＤＭの組み合わせのグレード分類、そしてそれらの比較を可能にする様々な発癌性関連指数を決定するための、向上および改善された定量的診断プラットフォームが提供される。幾つかの実施形態において、開示された方法は、生存する（生存可能な）細胞においてＦＴＲへの影響をモニタリングすることによってドライマー変異を同定し、それに基づいて様々な関連指数を効果的に決定／作成／計算／生成することが可能な、細胞に基づくアッセイを含む。有利には本明細書に開示された方法は、異なる標的治療薬の耐性および感受性を高度の有意性でさらに同定することができ、様々な患者の変異の薬物応答を定量的に同定および／または比較することができ、さらに同じ標的に対して複数の薬物がある場合の薬物選択を提供することができる。さらに以下に例示される通り、本明細書に開示された方法によって決定された指数は、臨床において観察された転帰とも一致し、インビトロアッセイとインビボ条件との相関を与える。したがってこれらの結果は、様々な変異の様々な発癌性関連指数を同定し、そして定量的プラットフォームを提供し、異なる変異をグレード分類および比較する、開示された方法およびシステムの能力を示している。
【００１１】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法およびシステムは、生存可能なテスト細胞において、結果である様々な関連指数に基づいて、様々なシグナル伝達タンパク質（例えば、膜局在および／または細胞内の受容体およびシグナル伝達タンパク質など）の活性化をモニタリングすることによって、患者特有の腫瘍活性化シグナル伝達経路のプロファイルの同定を可能にする定量的プラットフォームを提供する。幾つかの実施形態において、ドライバー変異の同定は、蛍光レポータタンパク質（ＦＴＲ）を含む細胞内トランスロケーションイベントおよびタンパク質間相互作用（即ち、形質膜、細胞質、エンドソーム、核などへのトランスロケーション／それらの間の様々な細胞下局在）を検出することによって実施され得る。幾つかの実施形態によれば、本明細書に開示された方法およびシステムは、同じ患者の同じ生体試料における複数の変異イベント（まだ同定されていない変異、およびそのような変異の発癌活性の測定を含む）を単に同定することに加え、そのような変異の定量的評価およびグレード分類も提供して、最終的に該患者の正確な予後および／または特定の患者の個人に合わせた処置レジメンの決定を可能にするため有利である。したがって本明細書に開示された方法およびシステムはまた、癌をもたらす、または癌に関与する細胞内イベントおよび患者特有の変異の同定を可能にすることに加え、そのような事象の指数決定およびグレード分類と、患者に特別に適した効果的薬物処置を定量的に同定／指示することも可能にする。
【００１２】
幾つかの実施形態によれば、患者特有の変異および関与するシグナル伝達経路の同定の際に、同定された経路／変異を阻害すること／それらに影響を及ぼすこと／それらを調整することが知られている（または知られていない）標的治療薬／治療剤をテスト細胞に添加し、該発癌活性を再度テストして、腫瘍および患者への最良の効果を示す薬物／薬剤、「治癒指数」の計算の基礎になり得る測定を同定することができる。幾つかの実施形態において、特定の患者の処置のために、該様々な薬物／薬剤の処置およびそれらの各治癒指数を腫瘍発癌マップに重ね合わせて、ヘルスケア提供者に、患者特有の根底的分子腫瘍メカニズム、処置選択、および各予測された効能を提供することができる。
【００１３】
幾つかの実施形態によれば、患者特有の変異および関与するシグナル伝達経路の同定によって、発癌性グレード分類指数（発癌性指数）を決定／計算／作成することができ、同定された変異を発癌活性に基づいてグレード分類することができる。該同定された変異のグレード分類は、本明細書に開示された方法の定量的性質に起因し得る。該同定された変異のインビトロ作用（本明細書に開示された方法により同定され、特にレポータ遺伝子のトランスロケーションイベントによって決定される）は、同じ遺伝子の異なる変異の間、そして／または異なる遺伝子における異なる変異の間の発癌活性を示し、インビボでのこれらの変異の発癌活性に相関する、発癌性グレード分類を提供するように定量され得る。言い換えれば、本明細書に開示された定量法は、同じまたは異なる遺伝子における異なる変異の間の定量的比較を可能にし、インビボでのこれらの変異の作用に相関させ、予後および好ましい処置ラインに関して重要な示唆を有する。
【００１４】
幾つかの実施形態によれば、患者特有の変異および関与するシグナル伝達経路の同定（即ち、「腫瘍発癌性マップ」の作成）によって、同定された経路／変異を阻害すること／それに影響を及ぼすことが知られる標的治療薬／治療剤を、テスト細胞と共にインキュベートすることができ、阻害／減少された発癌活性を再度テストして、腫瘍および患者の発癌性指数（以下に詳述する）における最大減少をもたらす薬物／薬剤を同定することができる。幾つかの実施形態において、該薬物／薬剤によって誘導された発癌活性の阻害は、本明細書では「治癒指数」と称される。幾つかの実施形態において、様々な薬物／薬剤処置およびその各治癒指数を腫瘍発癌性マップに重ね合わせて、ヘルスケア提供者に、患者特有の根底的分子腫瘍メカニズム、処置選択、および各予測された効能を提供することができる。
【００１５】
幾つかの実施形態によれば、発癌性指数（グレード分類指数）を決定する方法およびシステムが提供される。幾つかの実施形態において、発癌性指数は、所与の患者腫瘍試料の中の悪性腫瘍の成長に至らせる所与の発癌性変異／異常の能力を示す。幾つかの実施形態において、該発癌性指数は、患者の悪性腫瘍の成長に至らせる所与の発癌性変異／異常の能力を示す。幾つかの実施形態において、該発癌性指数は、所与の患者における悪性腫瘍の成長に至らせる所与の発癌性変異／異常の能力に基づいて、患者の予後を示す。幾つかの実施形態において、該方法およびシステムは、例えば核／細胞質（ＮＣＲ）比に基づいて、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲの活性化または阻害の度合いを計算／コンピュータ計算／測定することを含む。幾つかの実施形態において、その後、所与のＰＤＭのためのテストＦＴＲ全ての合計を複雑な手法で計算して、悪性腫瘍の成長に及ぼすテストＰＤＭの影響を推測することができる。幾つかの例示的実施形態によれば、該発癌指数は、数値を有し、該値が高い程、テストされたＰＤＭの発癌性指数が高い。幾つかの実施形態において、発癌性指数の値およびその単位は、該指数の作成において用いられたデータおよび／またはさらなるパラメータに基づいて決定される。幾つかの実施形態において、定量するステップは、測定に数値を割り付けることを含む。
【００１６】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における１種もしくは複数の患者特有の変異、または腫瘍細胞中の１種もしくは複数の異常なシグナル伝達タンパク質の発癌性グレード分類指数を提供／作成する方法であって、
ａ）該生体試料から複数のｍＲＮＡを得るステップと；
ｂ）該複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）該生体試料からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、該対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレー（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ａｒｒａｙ）を形成させるステップと；
ｆ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｇ）該ＤＮＡ構築物およびベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｈ）該生体試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップであって、該生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと；
ｉ）該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
を含む、方法が提供される。
【００１７】
幾つかの実施形態において、定量するステップは、発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を測定することを含む。幾つかの実施形態において、定量するステップは、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲのトランスロケーションの度合いおよび／またはそのＮＣＲを計算／コンピュータ計算／測定することを含む。幾つかの実施形態において、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲのトランスロケーションの度合いはさらに、参照値に較正／正規化／相関／写像される。幾つかの実施形態において、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲのトランスロケーションの度合いはさらに、例えば細胞周期または細胞分裂などのテストされたＦＴＲ／ＰＤＲが関与する細胞シグナル伝達経路の影響に較正／正規化される。幾つかの実施形態において、該方法は、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲの活性化または阻害の度合いを計算／コンピュータ計算／測定することを含む。幾つかの実施形態において、その後、所与のＰＤＭのためのテストＰＤＭ全ての合計を複雑な手法で計算して、悪性腫瘍の成長に及ぼすテストＰＤＭの影響を推測することができる。幾つかの例示的実施形態によれば、該発癌指数は、数値を有し、該値が高い程、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲの発癌性指数が高い。幾つかの実施形態において、定量するステップは、測定に数値を割り付けることを含む。幾つかの実施形態において、ステップｇ）は、ステップｅ）および／またはステップｆ）に先行し、その場合、アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターの添加前に各場所に添加される。
【００１８】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの属性は、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される。幾つかの実施形態において、該局在は、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞下局在を含む。
【００１９】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする。さらなる実施形態において、該ＦＴＲのレポータ遺伝子部分は、蛍光マーカ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、および／またはＨｃＲｅｄ１などをコードする。
【００２０】
幾つかの実施形態において、該生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される。幾つかの実施形態において、該方法によって同定された候補となる異常なシグナル伝達タンパク質は、患者特有の変異である。幾つかの実施形態において、該変異は、ドライバー変異である。
【００２１】
幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。他の実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、誘導型プロモータである。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、構成型プロモータである。
【００２２】
幾つかの実施形態において、該方法は、該トランスフェクトされた細胞において該発現構築物および／または発現ベクターの発現を誘導して、該アレーにおける各場所のために、該生体試料（例えば腫瘍）からのｃＤＮＡの第一のセットとＦＴＲとの遺伝子産物を得ることをさらに含む。
【００２３】
さらなる実施形態において、該増幅されたｃＤＮＡの発現構築物は、ＩＲＥＳおよび第二のレポータ遺伝子をさらに含む。
【００２４】
幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの発現ベクターは、環状発現ベクターである。さらなる実施形態において、該発現ベクターは、構成型または誘導型プロモータを含む。
【００２５】
幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む。幾つかの実施形態において、該方法は、テスト薬物をテスト細胞に添加することをさらに含む。幾つかの実施形態において、ステップｇ）、ｈ）および／またはｉ）は、薬物の存在下で繰り返すことができる。幾つかの実施形態において、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施形態において、該薬物は、テスト薬物である。幾つかの実施形態において、該方法は、１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、薬物の組み合わせを添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を定量的に測定することを含む。幾つかの実施形態において、テスト化合物の存在下で得られた結果は、テスト薬物によるテストされた遺伝子（複数可）の発癌活性の減少、および／または変異の薬物応答を示す治癒指数を決定するために用いることができる。
【００２６】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の発癌性指数を作成／決定／生成／コンピュータ計算する方法であって、ａ）該１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；ｂ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；ｃ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；ｄ）該１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの細胞下局在および／またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと；ｅ）ｉ）該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたＦＴＲのトランスロケーションの度合いを測定して、患者特有の変異の活性化レベルを測定すること；ｉｉ）該発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること；ならびにｉｉｉ）患者特有の変異の正規化された活性化レベルと臨床転帰（参照）との写像を解析すること、によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと；を含む、方法が提供される。幾つかの実施形態において、ステップｃ）は、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行し得る。
【００２７】
幾つかの実施形態によれば、解析は、マシンラーニングまたは任意の他のコンピュータ技術を利用することを含み得る。幾つかの実施形態において、解析は、非限定的に相関単変量解析マシン、多変量解析マシン、サポートベクターマシン、一般化線形モデルマシンまたはそれらの組み合わせなどの方法を含み得る。
【００２８】
幾つかの実施形態において、該トランスロケーションの度合いは、核／細胞質比（ＮＣＲ）に基づいて決定される。
【００２９】
幾つかの実施形態において、該指数は、悪性腫瘍に至らせる候補となる患者特有の変異の能力を示す数値を有する。
【００３０】
幾つかの実施形態において、該指数は、患者の無増悪生存、患者の全生存、薬物応答の確率、無増悪期間（ＴＴＰ）、腫瘍応答率、再発率、無病生存（ＤＦＳ）を示すことができる。
【００３１】
幾つかの実施形態において、該患者特有の変異のトランスロケーションの度合いはさらに、患者特有の変異が関与する細胞シグナル伝達経路の影響に正規化され得る。
【００３２】
幾つかの実施形態において、該細胞下局在は、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択され得る。
【００３３】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードし得る。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲのレポータ遺伝子部分は、蛍光マーカをコードし得る。
【００３４】
幾つかの実施形態において、該患者遺伝子は、該患者の生体試料に由来し得る。幾つかの実施形態において、該変異の少なくとも１つは、発癌性変異である。幾つかの実施形態において、該変異は、ドライバー変異である。幾つかの実施形態において、該遺伝子（またはその一部）は、その配列に基づいて人工的に合成され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、誘導型または構成型プロモータであり得る。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、遺伝子の一部を保有する。幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該構築物および／またはベクターを乾燥させることをさらに含み得る。
【００３６】
幾つかの実施形態において、該方法は、テスト薬物を該細胞に添加するステップをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、該方法は、テスト薬物への応答による、悪性腫瘍の成長に至らせる患者特有の変異の能力の低下を示す治癒指数を計算することをさらに含み得る。
【００３７】
幾つかのつかの実施形態によれば、発癌性グレード分類指数を作成するシステムであって、ａ）テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子産物の細胞下トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように；ｂ）ＦＴＲの細胞下トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように；ｃ）発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の第一のセットの存在下でのＦＴＲの局在の細胞下トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように；そしてｄ）患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、構成された回路を含み、該異なる結果が、ｉ）該１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること；ｉｉ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること；ならびにｉｉｉ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、によって得られる、システムが提供される。
【００３８】
幾つかの実施形態において、解析は、マシンラーニングを含み得る。幾つかの実施形態において、解析は、相関単変量解析、多変量解析マシン、サポートベクターマシン解析、一般化線形モデル解析またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００３９】
幾つかの実施形態において、ステップｉｉｉ）は、ステップｉ）および／またはステップｉｉ）に先行し得る。
【００４０】
幾つかの実施形態において、該異なる結果は、ｉ）該発現構築物および発現ベクターを該アッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加すること；ｉｉ）該アッセイ細胞に、該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを添加すること；およびｉｉｉ）該アドレス可能なアレーの特定の場所の該アッセイ細胞に、患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットを添加し、そして特定の場所の該アッセイ細胞に、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットを添加し、該発現構築物の第一のセットおよび該発現構築物の第二のセットが、共通の場所に添加されないこと、によって得ることができる。幾つかの実施形態において、ステップ（ｉｉ）および／またはステップ（ｉｉｉ）は、ステップｉ）に先行し得る。
【００４１】
幾つかの実施形態において、該処理回路はさらに、テスト薬物への応答による、悪性腫瘍の成長に至らせる患者特有の変異の能力の低下を示す治癒指数を計算するように構成され得る。
【００４２】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を示す治癒指数を作成する方法であって、ａ）該１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；ｂ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；ｃ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；ｄ）薬物の存在下および／または非存在下で、該変異を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの細胞下局在および／またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと；ｅ）ｉ）該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いを決定して、薬物の存在下または非存在下で患者特有の変異の活性化レベルを測定すること；ｉｉ）薬物の存在下または非存在下で、該発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること；およびｉｉｉ）薬物の存在下または非存在下での患者特有の変異の正規化された活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関を解析すること、によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより該患者特有の変異についての薬物の治癒指数を決定するステップと、を含む、方法が提供される。
【００４３】
幾つかの実施形態において、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施形態において、該方法は、１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含み得る。幾つかの実施形態において、該方法は、薬物の組み合わせを添加することを含み得る。幾つかの実施形態において、該方法は、様々な濃度の薬物（複数可）を添加することを含み得る。幾つかの実施形態において、ステップｃ）は、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行し得る。
【００４４】
幾つかの実施形態によれば、該発現構築物は、以下のステップの１つまたは複数を含む工程によって得ることができる：ｉ）該患者の生体試料から得られた複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップ；ｉｉ）発癌性変異を保有することが疑われる遺伝子をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップ；およびｉｉｉ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させるステップ。
【００４５】
幾つかの実施形態において、１つまたは複数の変異を保有することが疑われる該患者の遺伝子または遺伝子部分は、当該技術分野で公知の方法によって合成することができ、プロモータに動作可能に連結させて、該発現構築物を得ることができる。幾つかの実施形態において、該患者の遺伝子（またはその一部）および／または該対応する野生型遺伝子は、それらの配列に基づいて人工で合成することができ、さらに処理して対応するＰＤＭを作製することができる。
【００４６】
幾つかの実施形態によれば、さらに、癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を同定し、そして該患者特有のドライバー変異の様々な発癌性関連指数を決定／計算／コンピュータ計算するキットが提供される。さらなる実施形態において、患者の腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を同定するキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】幾つかの実施形態による、患者のドライバー変異の同定およびその薬物応答の検出のための方法のステップの略ブロック図である。
【図２Ａ】野生型（ＢＲＡＦ  ＷＴ）または変異体形態（ＢＲＡＦ変異体Ｇ４６４ＶまたはＶ６００ＥまたはＩ５５４Ｔ）のＢＲＡＦをコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの３０時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲ（ＥＲＫ２）の強度比が測定された（Ｎ：Ｃ比）。測定された細胞数（ｎ）が、各条件で示されている。
【図２Ｂ】ＰＤＭ（ＢＲＡＦ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図３Ａ】野生型形態（ＥＧＦＲ  ＷＴ）、単一変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ｓ）または三重変異体形態（ＥＧＦＲ三重変異体、Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＡＫＴ１−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの３０時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲ（ＥＲＫ２）の強度比が測定された（Ｎ：Ｃ比）。測定された細胞数（ｎ）が、各条件で示されている。
【図３Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（ＡＫＴ１）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図４Ａ】野生型（ＥＧＦＲ  ＷＴ）、単一変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ｓ）または三重変異体形態（ＥＧＦＲ三重変異体、Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＪＮＫ１Ａ１−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの３０時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲ（ＪＮＫ１Ａ１）の強度比が測定された（Ｎ：Ｃ比）。測定された細胞数（ｎ）が、各条件で示されている。
【図４Ｂ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（ＪＮＫ１Ａ１）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図５Ａ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（ＪＮＫ２、ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図５Ｂ】変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  ７４６Ｄｅｌ、Ｇ７１９Ａ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８６１Ｑ（ＥＧＦＲｔｒｉｐｌｅＭ））のＥＧＦＲをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＪＮＫ２−ＧＦＰ、ＥＲＫ２−ＧＦＰ、ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図６Ａ】ＰＤＭ（ＥＲＢＢ２）および対応するＦＴＲ（ＪＮＫ２、ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｐ３８）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図６Ｂ】変異体形態（ＥＲＢＢ２  Ｖ８４２Ｉ、ＥＲＢＢ２  Ｖ７７７Ｌ、ＥＲＢＢ２  Ｓ３１０Ｆ、ＥＲＢＢ２  Ｌ７５５Ｓ、ＥＲＢＢ２  Ｄ７６９Ｙ、ＥＲＢＢ２  Ａ１１７０Ｐ）のＥＲＢＢ２をコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ、ＪＮＫ２−ＧＦＰ、ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ、Ｐ３８−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図７Ａ】ＰＤＭ（ｃＫＩＴ）および対応するＦＴＲ（ＪＮＫ２、ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｐ３８、ＲＥＬ−Ａ）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図７Ｂ】変異体形態（ｃＫＩＴ  Ｋ６４２Ｅ、ｃＫＩＴ  Ｗ５５７−Ｋ５５８  Ｄｅｌ）のｃＫＩＴをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ、ＪＮＫ２−ＧＦＰ、ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ、Ｐ３８−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図８Ａ】ＰＤＭ（ＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＪＮＫ２、ＥＲＫ２、ＦＯＸＯ３ａ、ＲＥＬ−Ａ）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図８Ｂ】変異体形態（ＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｖ、ＫＲＡＳ  Ａ１４６Ｔ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ）のＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ、ＪＮＫ２−ＧＦＰ、ＦＯＸＯ３ａ−ＧＦＰ、ＲＥＬ−Ａ−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図９Ａ】ＰＤＭ（ＰＩＫ３ＣＡ）および対応するＦＴＲ（ＫＯＧ１、Ｐ３８  ＳＴＡＴ３、ＲＥＬ−Ａ）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図９Ｂ】変異体形態（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｙ１０２１Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｖ３４４Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｒ３８Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｑ５４６Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｎ３４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５７９Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｃ４２０Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｒ８８Ｑ／Ｄ３５０Ｇ）のＰＩＫ３ＣＡをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＫＯＧ１−ＧＦＰ、Ｐ３８−ＧＦＰ、ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ、ＲＥＬ−Ａ−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１０Ａ】ＰＤＭ（ＢＲＡＦ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２、ＪＮＫ２、ＲＥＬ−Ａ）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図１０Ｂ】変異体形態（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ｖ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ａ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６６Ｖ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６６Ｅ）のＢＲＡＦをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ、ＪＮＫ２−ＧＦＰ、ＲＥＬ−Ａ−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１１Ａ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図１１Ｂ】ＷＴ形態のＥＧＦＲおよびＷＴまたは変異体形態（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ）のＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１１Ｃ】ＷＴまたは変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）のＥＧＦＲおよびＷＴのＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１１Ｄ】ＷＴまたは変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）のＥＧＦＲおよびＷＴまたは変異体形態（ＫＲＡＳ  Ｇ１２、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ）のＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１２Ａ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＲＥＬ−Ａ）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図１２Ｂ】ＷＴ形態のＥＧＦＲおよびＷＴまたは変異体形態（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ）のＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＲＥＬ−Ａ−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１２Ｃ】ＷＴまたは変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）のＥＧＦＲおよびＷＴのＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＲＥＬ−Ａ−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１２Ｄ】ＷＴまたは変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）のＥＧＦＲおよびＷＴまたは変異体形態（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ）のＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＲＥＬ−Ａ−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１３Ａ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図１３Ｂ】ＷＴ形態のＥＧＦＲおよびＷＴまたは変異体形態（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ）のＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＪＮＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１３Ｃ】ＷＴまたは変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）のＥＧＦＲおよびＷＴのＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＪＮＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１３Ｄ】ＷＴまたは変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）のＥＧＦＲおよびＷＴまたは変異体形態（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ）のＫＲＡＳをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＪＮＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１４Ａ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲおよびＢＲＡＦ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けたシグナル伝達経路の略図である。
【図１４Ｂ】ＷＴ形態のＥＧＦＲおよびＷＴまたは変異体形態（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ）のＢＲＡＦをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１４Ｃ】ＷＴまたは変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）のＥＧＦＲおよびＷＴのＢＲＡＦをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１４Ｄ】ＷＴまたは変異体形態（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）のＥＧＦＲおよびＷＴまたは変異体形態（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ）のＢＲＡＦをコードする遺伝子が、異なるレポータタンパク質（ＦＴＲ）と共にテスト細胞内で発現されて、細胞質および核中のＦＴＲ（ＥＲＫ２−ＧＦＰ）の量が、細胞の蛍光顕微鏡像（トランスロケーションの２４時間後に固定）に基づいて定量された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。核（Ｎ）と細胞質（Ｃ）との、ＦＴＲの強度比の差が測定された（デルタＮ：Ｃ比）。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
幾つかの実施形態によれば、ドライバー変異の機能に関連するシグナル伝達経路の活性の変化を同定および定量することによって、患者特有のドライバー変異の様々な発癌性関連指数を決定する方法およびシステムが提供される。幾つかの実施形態において、シグナル伝達経路活性の変化は、レポータ遺伝子の細胞下局在の変化を同定および定量することによって決定され、該レポータ遺伝子の細胞下局在の変化および前記変化の度合いは、ドライバー変異によって影響を受ける。幾つかの実施形態において、患者由来マーカ（ＰＤＭ）が、患者の生体試料から得ることができ、レポータキメラ遺伝子（ＦＴＲ）の存在下、テスト細胞内で発現されるように操作（設計）される。幾つかの実施形態において、患者由来マーカ（ＰＤＭ）は、同定された配列に基づき対応する患者の遺伝子（複数可）を人工で作製し（合成し）、テスト細胞内で発現されるようにそれらをさらに操作することによって、得ることができる。幾つかの実施形態において、追加または代わりとして、該患者特有のマーカは、蛍光レポータに融合されて、患者由来レポータ（ＰＤＲ）を作製する。その後、テスト細胞内でのＦＴＲ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の細胞下局在を測定する。テストＰＤＭ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の存在下でのＦＴＲの細胞下局在が、正常条件下で（即ち、対応するＷＴ  ＰＤＭの存在下で）、または他の所定の参照と比較して、ＦＴＲ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の細胞下局在と異なる場合、テストＰＤＭ（またはＰＤＲ）が変異していることを示している。さらに該方法は有利には、同定されたＰＤＭ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の応答の定量、および同定された変異（複数可）の重症度を示す発癌性グレード分類指数などの様々な発癌性関連指数の決定を可能にする。したがって、本明細書に開示された方法を用いれば、患者特有のＰＤＭを、ドライバー変異であると同定／特徴づけすることができ、さらにそれらの相対的重要性（例えば、発癌活性に関して）を測定および定量することができる。その上、そのようなドライバー変異を測定することによって、患者の腫瘍内で動作する活性化されたシグナル伝達経路およびそれらの薬物応答を、同定、定量およびグレード分類して、特定の患者の様々な経路の相対的重要性を測定することができる。これによって、予後を精密かつ特異的に提供し、さらに最適で個人に合わせた標的治療処置を選択することができる。
【００４９】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法およびシステムは、同定された変異の影響と、異常なシグナル伝達タンパク質およびシグナル伝達経路と、の定量分析および比較を可能にする。幾つかの実施形態によれば、本明細書に開示された方法およびシステムは、まだ同定されていない変異に加え、同じ患者の同じ生体試料中の複数の変異イベントを同定することを可能にし、さらにそのような変異の発癌活性の定量的測定、ならびにそのグレード分類および指数決定と、同定された変異に及ぼす様々な薬物の治癒的影響のグレード分類を可能にするため、有利である。例えば、現在利用される処置方法では、ｃＫｉｔ変異を保有する消化管間質腫瘍の患者は、グリーベックで処置される。しかし、一般的耐性メカニズムが、ｃＫｉｔそのものまたはその下流経路での二次変異によって起こると、そのような処置が無効になる。同様に、ＥＧＦＲ発癌性変異を有する肺癌患者は、標的治療処置が適格とされるが、利用可能なそのような薬物が複数存在する。したがって本明細書に開示された方法およびシステムは、検出、同定、定量を可能にし、同定された変異のグレード分類／指数決定を可能にし、最終的に、正確な予後を提供して、場合によりさらに、特定の患者への個人に合わせた最適な薬物処置を決定する。
【００５０】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法およびシステムは、患者の腫瘍と競合させて、活性化されたシグナル伝達経路およびグレード分類された発癌遺伝子活性を同定し、さらに様々な薬物への腫瘍感受性／耐性を測定する。幾つかの実施形態において、これは、トランスフェクトされたテスト細胞を１種または複数のテスト薬物と共にインキュベートすることによって実施される。幾つかの実施形態において、これは、トランスフェクトされたテスト細胞を患者の体液（血漿、胸水または間質液など）と共にインキュベートすることによって実施され得る。
【００５１】
本明細書で参照される用語「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列は、互換的に用いられ得る。該用語は、分離した断片の形態の、あるいはそれらのより大きな構築物、直鎖上もしくは分枝状、一本鎖、二本鎖、三本鎖、またはハイブリッドの構成要素としての、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、およびそれらの修飾形態のポリマーに向けられる。該用語はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを包含する。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を包含し得る。該ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、例えば相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはそれらのハイブリッド、またはＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであり得るが、これらに限定されない。したがって本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方を指すことになる。該用語は、天然由来塩基、糖およびヌクレオチド間の共有結合で構成されたオリゴヌクレオチド、ならびに各天然由来部分と類似した機能の非天然由来部分を有するオリゴヌクレオチドをさらに包含する。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「構築物」は、コード配列（即ち、最終生成物をードする配列）、制御配列、非コード配列、または任意のそれらの組み合わせを含み得る核酸配列を１つまたは複数含み得る、人工的に構成された、または単離された核酸分子を指す。構築物という用語は、例えばベクターを包含するが、それに限定されると理解するべきでない。
【００５３】
用語「発現ベクター」は、標的細胞内に異種核酸断片（ＤＮＡなど）を組み込んで発現する能力を有するベクターを指す。言い換えれば、発現ベクターは、転写され得る核酸配列／断片を含む。多くのウイルス、原核生物および真核生物の発現ベクターが公知であり、そして／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００５４】
本明細書で用いられる「上流」および「下流」は、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列などにおける相対的位置を指す。周知の通り、ヌクレオチド配列は、いわゆるヌクレオチドバックボーンの糖（デオキシリボースまたはリボース）環上の炭素に関して、５’末端および３’末端を有する。したがってヌクレオチド配列上の位置に対して、下流という用語は、該配列の３’末端に近い方の領域に関する。上流という用語は、鎖の５’末端に近い方の領域に関する。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「プロモータエレメント」、「プロモータ」または「プロモータ配列」は、一般にコード配列の５’末端に位置し（即ち、コード配列に先行し、コード配列の上流に位置し）、コード配列の発現を活性化するスイッチとして機能するヌクレオチド配列を指す。コード配列が、活性化されると、転写されると言われる。転写は一般に、コード配列からのＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡなど）の合成を含む。それゆえプロモータは、転写制御エレメントとして働き、ｍＲＮＡへのコード配列の転写の開始部位も提供する。プロモータは、全体としてネイティブ供給源に由来する場合があり、または天然に見出される異なるプロモータに由来する異なるエレメントで構成される場合があり、または合成ヌクレオチドセグメントを含む場合がある。異なるプロモータが、異なる組織もしくは細胞型、または異なる発達段階、または異なる環境条件への応答、または様々な発現レベルで、遺伝子の発現を管理し得ることは、当業者に理解されよう。遺伝子をほとんど常にほとんどの細胞型で発現させるプロモータは一般に、「構成型プロモータ」と称される。特異的組織内での遺伝子発現を誘導するプロモータは、「組織特異性プロモータ」と呼ばれる。
【００５６】
本明細書で用いられる用語「導入すること」および「トランスフェクション」は、互換的に用いることができ、例えば核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクターなどの分子を、標的細胞（複数可）に、より具体的には細胞の細胞質、細胞の核、ミトコンドリアの内部空間、小胞体（ＥＲ）などの標的細胞（複数可）の膜封入空間の内部に、転移または導入することを指す。該分子は、当業者に知られる任意の手段によって、例えば内容が参照により本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）に教示される通り、標的細胞（複数可）に導入され得る。分子を細胞内に「導入する」手段としては、例えば熱ショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、電気穿孔、リポフェクション、トランスフェクション試薬（複数可）、ウイルスを介した転移など、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、該導入された核酸は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡの形態であり得る修飾核酸であり得る。幾つかの実施形態において、該核酸は、細胞にトランスフェクトされる前に脱水される。幾つかの実施形態において、該核酸は、例えば発現ベクターなどのベクターに取り込まれる。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「発現」は、標的細胞における所望の最終生成物分子の産生を指す。該最終生成物分子としては、例えばＲＮＡ分子、ペプチドもしくはタンパク質など、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００５８】
本明細書で参照される用語「患者」は、疾患を有することが疑われる、または疾患と診断された対象に向けられる。幾つかの実施形態において、患者という用語は、癌を有する対象、または癌と診断された対象に向けられる。幾つかの実施形態において、患者は、腫瘍生検を得るのに適格である。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「生体試料」は、任意の適切な身体由来試料を包含するように向けられる。該試料は、全血、末梢血単球、白血球、骨髄などの液体試料を包含し得る。該試料は、様々な細胞および組織を包含し得る。該試料は、生検を包含し得る。該試料は、固定および／または包埋された組織切片を包含し得る。該試料は、新鮮な状態で抽出または凍結され得る。別の実施形態において、該試料は、血液試料である。別の実施形態において、該試料は、骨髄試料である。別の実施形態において、対象からの血液細胞を含む試料を単離および維持する方法は、平均的技能の当業者に知られている。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体断片およびそれらの誘導体を含む試料は、体液；細胞調製物の可溶性画分、または細胞を増殖させた培地；染色体、オルガネラ、または細胞から単離もしくは抽出された膜；溶液中の、または基板に結合させたゲノムＤＮＡ，ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリヌクレオチド、またはペプチド；細胞；組織；組織プリント；フィンガプリント、皮膚または毛髪；それらの断片および誘導体を含み得る。
【００６０】
本明細書で参照される用語「患者由来マーカ」（「ＰＤＭ」）および「対象のＰＤＭ」は、対象の生体試料から単離され、得られ、またはそれに由来し（直接的または間接的に）、機能的アッセイにおいてその活性が測定される、遺伝子または遺伝子産物（またはその一部）に向けられる。幾つかの実施形態において、該ＰＤＭ核酸配列（生体試料から直接得られた（例えば、ｃＤＮＡの作製によって）または人工で合成された（即ち、間接的に得られた））に、５’および／もしくは３’制御エレメント、ならびに／またはさらなるレポータ遺伝子が付加される。幾つかの実施例において、本明細書で用いられるＰＤＭは、必ずしもこの順序ではないが、制御エレメント（プロモータ）−ＰＤＭ配列−制御エレメント（ＩＲＥＳ）−レポータ遺伝子を含むキメラ核酸配列分子を含む。したがって、そのような核酸分子が、標的細胞内に導入され、発現されると、ＰＤＭ遺伝子産物（タンパク質）およびレポータ遺伝子産物（タンパク質）が、細胞内で発現される。追加または代わりとして、ＩＲＥＳ配列は、省略することができ、ＰＤＭ遺伝子産物およびレポータ遺伝子産物を含むキメラタンパク質が、細胞内で発現される。こうして形成されたキメラタンパク質が、本明細書では「患者由来レポータ」（「ＰＤＲ」）または「対象ＰＤＲ」と称される。幾つかの実施形態において、用語「対照ＰＤＭ」、「野生型ＰＤＭ」、「対応するＰＤＭ」および「対応する野生型ＰＤＭ」は、対照として用いられる、ＰＤＭ遺伝子に対応する（即ち、非変異で完全に活性の）野生型遺伝子に向けられる。幾つかの実施形態において、該野生型ＰＤＭは、患者の生体試料に由来しない。該対照ＰＤＭは、対象ＰＤＭと野生型（ｗｔ）ＰＤＭとで活性を比較するために用いられる。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「蛍光トランスロケーションレポータ」（「ＦＴＲ」）は、キメラレポータ遺伝子および対応する遺伝子産物に向けられる。標的（マーカ）遺伝子の少なくとも１つの属性が、テストＰＤＭによって影響を受け得る（直接的または間接的に）、所定の標的（マーカ）遺伝子部分（例えば細胞シグナル伝達タンパク質、キナーゼ、酵素など）に連結されたレポータ遺伝子部分（蛍光マーカ（タンパク質）など）を含むキメラＦＴＲ。
【００６２】
本明細書で参照される用語「テスト細胞」、「標的細胞」および「アッセイ細胞」は、互換的に用いられ得る。該用語は、本明細書に記載された通り、ＰＤＭおよび／またはＰＤＲおよび／またはＦＴＲおよび／または対照遺伝子のいずれかなど、ポリ核酸分子でトランスフェクトされたアッセイ細胞に向けられる。幾つかの実施形態において、該テスト細胞は、真核細胞である。幾つかの実施形態において、該テスト細胞は、初代細胞または細胞株であり得る。別の実施形態において、アッセイ細胞は、非癌性細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、細胞株に由来する。別の実施形態において、アッセイ細胞は、少なくとも１種の癌分泌増殖因子に応答する。別の実施形態において、アッセイ細胞は、トランスフェクションを受けることができる。別の実施形態において、アッセイ細胞は、一過性トランスフェクションを受けることができる。別の実施形態において、アッセイ細胞は、１つまたは複数の内在性遺伝子の発現が任意の分子方法によって減少または排除された細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、ＨｅＬａ細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、ＰＣ１２細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、Ｕ２ＯＳ細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９などのＮＣＩ６０細胞株である。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、患者由来の細胞である。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、癌患者由来の細胞である。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「細胞下局在」、「細胞下領域」および「細胞下区画」は、細胞の他の領域から様々な手段（例えば視覚的手段など）によって識別され得る細胞の任意の定義された部分を指す。幾つかの実施例において、細胞下領域は、細胞内の制限された領域であり得る。幾つかの実施例において、細胞下領域は、オルガネラを包含し得る。細胞下局在の非限定的例としては、例えば核、核小体、細胞質、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、クロロプラスト、膜、樹状突起棘、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格などが挙げられるが、これらに限定されない。各可能性は、別の実施形態である。幾つかの実施例において、用語「細胞下トランスロケーション」は、様々な条件下でレポータ遺伝子（ＦＴＲまたはＰＤＲなど）の細胞下局在の検出された変化を指す。例えばトランスロケーションは、核へ／核から、細胞質から／細胞質へのものであり得る。
【００６４】
本明細書で参照される用語「薬物」、「テスト化合物」および「テスト薬物」は、互換的に用いられ得る。薬物という用語は、疾病を処置する上で効果を有する任意の化合物、物質、分子、薬剤および／または試薬に向けられる。幾つかの実施例において、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施例において、薬物という用語は、１種よりも多くの薬物を包含し得る。幾つかの実施例において、薬物という用語は、薬物の組み合わせを包含する。幾つかの実施例において、該薬物は、細胞内タンパク質の発現および／活性の阻害剤である。
【００６５】
本明細書で参照される用語「薬物応答」および「薬物への感受性」は、互換的に用いられ得る。該用語は、テスト薬物によって誘発された応答または効果を指す。該用語は、発癌性変異などの変異の影響を抑制する薬物（複数可）の能力を指す。
【００６６】
幾つかの実施例において、用語「疾患を処置すること」または「疾病を処置すること」は、疾患に関連する症状を改善すること、重症度を低減すること、疾患を治癒すること、または疾患の発生を予防すること、に効果的な１種もしくは複数の化合物を投与することに向けられる。
【００６７】
用語「検出」、「診断」は、疾患、症状、障害、病理学的状態または正常な状態の検出の方法；疾患、症状、障害、病理学的状態を分類する方法；疾患、症状、障害、病理学的状態の重症度を測定する方法；疾患、症状、障害、病理学的状態の進行をモニタリングする方法；転帰および／またはその回復の見込みを予測する方法を指す。用語「診断」は、病理学的状態の存在または性質を同定することを意味する。
【００６８】
用語「基板」は、核酸分子、構築物、ベクターおよび／またはアッセイ細胞が配置された固体担体に向けられる。該基板は、非限定的にチップ、スライド、ウェル、コンテナ、管、バイアルなどの適切な基板の任意のタイプを包含し得る。幾つかの実施例において、該基板は、チップである。幾つかの実施例において、該基板は、顕微鏡スライドである。幾つかの実施例において、該基板は、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、３８４ウェルプレートなどのマルチウェルプレートである。幾つかの実施例において、各場所（またはアレーのポイント）を指定して同定可能にするマトリックスアレー（場所）を含むように、該基板が構築される。幾つかの実施例において、該核酸分子は、基板上で脱水される。幾つかの実施例において、該核酸分子は、トランスフェクション試薬の存在下または非存在下、基板上で脱水される。
【００６９】
用語「ドライバー変異」および「発癌性変異」は、互換的に用いられ得る。該用語は、疾患に直接的または間接的に関係する、変異した遺伝子または遺伝子産物に向けられる。幾つかの実施例において、該用語は、癌などの疾患に関係する、そして／または疾患に関与する、そして／または疾患をもたらし得る、そして／または疾患を誘発し得る、変異した遺伝子または遺伝子産物に向けられる。
【００７０】
用語「アドレス可能なアレー」は、空間的に離れた場所を含み、その場所の位置が同定可能かつ識別可能である、マトリックスに向けられる。幾つかの例示的実施例において、アドレス可能なアレーは、各ウェル（場所）が空間的に同定可能であるマルチウェルプレートを包含し得る。別の例示的実施形態において、アドレス可能なアレーは、指定されたアレーに位置する／配置された分離可能な場所を有する任意の基板を包含し得る。
【００７１】
該用語「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、対応するタンパク質またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列または分子を指す。幾つかの実施例において、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、対応するタンパク質またはその一部をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
用語「発癌性関連指数」は、同定された変異（複数可）（１つもしくは複数、またはそれらの組み合わせ）を発癌活性または能力に関して計算またはグレード分類することによって作成され得る任意のタイプの指数を含むように向けられる。幾つかの実施形態において、該発癌性関連指数は、数値である。幾つかの実施形態において、該発癌性関連指数は、インビボでの変異（複数可）の活性を反映する。幾つかの実施形態において、該発癌性関連指数は、同じ遺伝子の異なる変異間、および／または異なる遺伝子の異なる変異間で比較するために用いられ得る。
【００７３】
ここに、幾つかの実施形態による、患者の生体試料における患者特有のドライバー変異を同定し、そしてその薬物応答を同定する方法において例示的ステップのブロック図を概略的に示した図１を参照する。図１に示された通り、ステップ１００で、患者の生体試料が得られる。該生体試料は、血液、血清、生検、針生検、気管支肺胞洗浄液、胸水、腫瘍組織、尿、唾液および腫瘍組織から選択され得るが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、該生体試料は、新鮮であり得る（新鮮であり得る、または新鮮な状態で凍結され得る）、即ち、固定されていない試料であり得る（ステップ１０２）。幾つかの実施形態において、該生体試料は、生体試料の固体のために当該技術分野で公知の方法によって、固定され得る（ステップ１０４）。
【００７４】
図１に示された通り、新鮮な生体試料から（ステップ１０２）、様々な成分が、それぞれ当該技術分野で周知の適切な方法によって抽出され得る。例えばステップ１０６に示された通り、間質液（ＩＦ）（細胞外液）は、抽出されて、後の使用に向けて貯蔵され得る。加えてｍＲＮＡは、新鮮な生体試料から抽出され得る（ステップ１０８）。その後、抽出／単離されたｍＲＮＡは、当該技術分野で周知の方法によって（ポリｄＴプライマーを用いるなど）、ｃＤＮＡライブラリの作製に用いられる（ステップ１１０）。特異的ＰＤＭのｃＤＮＡが、ｃＤＮＡライブラリから増幅されて、所定のＰＤＭの所望の遺伝子領域（ポリヌクレオチド）に対応する適切なプライマー対を用いることによって作製される。選択されるＰＤＭは、様々な疾患状態（例えば、発癌遺伝子）における対応するＷＴ  ＰＤＭまたは変異ＰＤＭの既知の機能／活性／役割に基づいて選択され得る。次にステップ１１２で、制御プロモータエレメントをＰＤＭ  ｃＤＮＡの５’末端に付加すること、および場合によりレポータ遺伝子、蛍光標識などの３’ＩＲＥＳおよび標識を付加することによって、アッセイＰＤＭが作製される。幾つかの実施形態において、該プロモータエレメントは、構成型プロモータまたは誘導型プロモータであり得る。幾つかの実施形態において、該ＰＤＭ  ｃＤＮＡは、ＦＴＲをコードする部分を含む追加的な発現カセットをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、ｃＤＮＡライブラリの作製ステップを行わずに該特異的ＰＤＭを人工的に合成／作製することによって（それらの同定された配列に基づき）、該特異的ＰＤＭが作製される。
【００７５】
図１にさらに示される通り、ステップ１１４で、ゲノムＤＮＡが、固定された生体試料（ホルマリン固定された試料など（ステップ１０４））から抽出され得る。ステップ１１６では、抽出されたＤＮＡが、特異的な所定のエクソン（癌の症例では変異していることが知られる）の増幅と、その結果である増幅された特異的エクソンが欠如した対応する全長遺伝子を含む発現構築物へのライゲーション／融合と、を受けて、テストされるＰＤＭを作製することができる。
【００７６】
次にステップ１１８において、ステップ１１２および／またはステップ１１６で作製された（ｃＤＮＡの作製を介して、または人工的に合成することによって）各ＰＤＭの核酸分子は、指定された場所（位置）にある担体基板（スライド、ウェル（例えばマイクロプレートウェル）、チップなど）の上に配置／スポットされ得る。ＰＤＭは、ＰＤＭに対応するように選択されたキメラレポータ（ＦＴＲ）をコードする核酸分子との混合物中に入れられる（即ち、選択されたＦＴＲは、ＰＤＭによって機能的に（直接的または間接的に）影響され得る）。ＰＤＭおよびＦＴＲをコードする核酸分子の混合物は、適切なトランスフェクション試薬をさらに含んで、テスト細胞への該分子のトランスフェクションを可能にし得る。場合によりＰＤＭ＋ＦＴＲ混合物は、基板上で脱水される。別の選択において、ＰＤＭおよびＦＴＲは、単一核酸分子上に配置されるように構築されて、細胞における両タンパク質の独立した発現を可能にする。並行して、ＷＴ  ＰＤＭおよび対応するＦＴＲを含む対照アッセイが、調製される。さらにステップ１１８において、十分量の選択されたテスト細胞が、適切な増殖培地と共に基板に添加される。核酸分子の添加前または添加後に、該細胞が添加され得る。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（９６ウェルプレートウェル）あたり約１〜１００００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（２４ウェルプレートウェル）あたり約１〜５００００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（１２ウェルプレートウェル）あたり約１〜１０００００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（９６ウェルプレートウェル）あたり約１〜１０００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（３８４ウェルプレートウェル）あたり約１〜１０００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ、ＰＣ１２、ＮＣＩ６０、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９などから選択されるが、これらに限定されない。その後、該細胞は、指定された時間（約６〜６０時間の範囲内など）、インキュベートされてＦＴＲの、そして場合によりＰＤＭの発現を可能にする。場合により幾つかの実施形態において、ステップ１１８で、該細胞が一定時間（０．５〜４８時間など）、固体基板に添加され（適切な増殖培地と共に）、その後、ＰＤＭおよび／またはＦＴＲをコードする核酸分子が、該細胞への該分子のトランスフェクションを可能にする条件下で該細胞に添加される。
【００７７】
次にステップ１２０で、所定の時間（４〜６０時間など）の後、細胞増殖培地を、新しい培地と交換し得る。幾つかの実施形態において、該交換培地は、低血清培地である。次にさらなるインキュベーション時間（４〜１６時間の範囲内など）の後、誘導型プロモータによって制御されたＰＤＭの発現の導入が開始される。導入型プロモータの導入は、例えばテトラサイクリン導入型プロモータを用いた場合にはテトラサイクリンの添加によって、またはエクジソン誘導型プロモータを用いた場合にはエクジソンの添加によって、または当該技術分野で公知の任意の他の方法によって、開始され得る。
【００７８】
場合によりステップ１２２で、固定された試料から作製されたＰＤＭの場合（ステップ１１６）、所定の時間（４〜６０時間など）の後、細胞増殖培地を、新鮮な培地と交換し得る。幾つかの実施形態において、該交換培地は、低血清培地である。次にさらなるインキュベーション時間（４〜２４時間の範囲内など）の後、ＰＤＭが、構成型プロモータの制御下で発現される。
【００７９】
次にステップ１２４で、テスト細胞におけるＰＤＭの発現を可能にするさらなる時間（例えば、約４〜４８時間の範囲内など）の後、ＦＴＲの細胞下局在が測定される。ＦＴＲの細胞下局在の測定は、蛍光顕微鏡を用いた画像化、生化学的方法を用いた細胞下区画の分画などの様々な手段によって実施され得る。幾つかの例示的実施形態において、該細胞は固定されて、蛍光ＦＴＲ局在が、蛍光画像化によって測定される。様々な実験条件下でのＦＴＲの細胞下局在の分析および比較が、テストされたＰＤＭが欠失しているか（即ち、変異しているか）否かについての決定を可能にする。例えばＦＴＲの細胞下局在は、ＦＴＲをテストされたＰＤＭと共発現させて、細胞内で測定される（テストアッセイ）。加えて、同じＦＴＲの細胞下局在は、ＦＴＲをＷＴ  ＰＤＭと共発現させて、細胞内で測定される（対照アッセイ）。テストアッセイと対照アッセイとのＦＴＲの細胞下局在の差が、テストされたＰＤＭの機能的活性について示す。したがって例えばステップ１２６で、ＦＴＲが、テストアッセイにおいて、対照アッセイと同じ細胞下局在であると同定されれば、テストされたＰＤＭは、変異していない。例えばステップ１２８で、ＦＴＲが、テストアッセイにおいて、対照アッセイと異なる細胞下局在であると同定されれば、テストＰＤＭは変異しており、このＰＤＭがドライバー変異であることが示される。次にステップ１３０で、結果（即ち、ＦＴＲの細胞下局在の変化、例えば核／細胞質（Ｎ：Ｃ）比）が定量されて、そのまま用いられ得る、またはさらに操作されて用いられ得る発癌性グレード分類指数を決定／計算／作成し（例えば、処理回路による）、以下にさらに詳述される通り、異なる変異、異なる遺伝子などの間で比較し、そしてさらなる患者特有の関連情報（予後など）を提供する。
【００８０】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における１つまたは複数の患者特有のドライバー変異の発癌性関連指数を決定する方法であって、
ａ）該生体試料から複数のｍＲＮＡを得るステップと；
ｂ）該複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）該試料からの増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｆ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｇ）該ＤＮＡ構築物およびベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｈ）該試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップであって、癌患者の該生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと；
ｉ）該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性関連指数を決定するステップと、
の１つまたは複数を含む（任意の選択された順序で）、方法が提供される。
【００８１】
幾つかの実施形態において、定量するステップは、発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を測定することを含む。幾つかの実施形態において、定量するステップは、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲのトランスロケーションの度合いを計算／コンピュータ計算／測定することを含む。幾つかの実施形態において、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲのトランスロケーションの度合いはさらに、悪性腫瘍の成長に及ぼすテストＰＤＭの影響を推測するために較正／正規化される。幾つかの例示的実施形態によれば、該発癌指数は、数値を有し、該値が高い程、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲの発癌性指数が高い。幾つかの実施形態において、定量するステップは、測定に数値を割り付けることを含む。
【００８２】
幾つかの実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、１つの発現構築物上（即ち、１つの分子上）に配置される。そのような実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、同一の、類似のまたは異なるプロモータを有し得る（即ち、ＰＤＭおよびＦＴＲの発現は、同一のまたは異なるプロモータによって制御され得る）。そのような実施形態において、先のステップｄ）およびｆ）は、１つのステップ（代わりのステップｄ）：増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させてｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させてテスト患者由来のマーカ（テストＰＤＭ）を生成し、前記発現構築物が、特異的レポータ遺伝子（ＦＴＲ）をさらに含むステップ、にまとめられる。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲは、プロモータ（ＰＤＭのプロモータと同一であり得るか、または異なり得る）に連結されている。さらなる実施形態において、該ＦＴＲは、レポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む。
【００８３】
幾つかの実施形態において、ステップｇ）は、ステップｅ）および／またはステップｆ）に先行し、その場合、アッセイ細胞は、発現カセットの添加前に各場所に添加される。
【００８４】
幾つかの実施形態において、該方法は、ステップｅ）において、実験対照として用いられ得る、前記遺伝子における１つまたは複数の既知ドライバー変異を含むＰＤＭ（本明細書では「人工ＰＤＭ」）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットを含む。発現構築物の第三のセットは、アドレス可能なアレーに添加される。
【００８５】
幾つかの実施形態において、該発癌性関連指数は、発癌性グレード分類指数、治癒指数、総発癌性指数、総治癒指数、転移指数、血管新生指数、ゲノム不安定性指数、微小管動的不安定性指数、細胞周期進行指数、アポトーシス指数、分化指数など、またはそれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【００８６】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における１つまたは複数の患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定する方法であって、
ａ）該生体試料から複数のｍＲＮＡを得るステップと；
ｂ）該複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）該生体試料からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｆ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｇ）該ＤＮＡ構築物およびベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｈ）該生体試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと；
ｉ）該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の１つまたは複数を含む（任意の選択された順序で）、方法が提供される。
【００８７】
幾つかの実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、１つの発現構築物上（即ち、１つの分子上）に配置される。そのような実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、同一の、類似のまたは異なるプロモータを有し得る（即ち、ＰＤＭおよびＦＴＲの発現は、同一のまたは異なるプロモータによって制御され得る）。そのような実施形態において、先のステップｄ）およびｆ）は、１つのステップ（代わりのステップｄ）：増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させて該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させてテスト患者由来のマーカ（テストＰＤＭ）を生成するステップであって、前記発現構築物が、特異的レポータ遺伝子（ＦＴＲ）をさらに含むステップ、にまとめられる。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲは、プロモータ（ＰＤＭのプロモータと同一であり得る、または異なり得る）に連結されている。さらなる実施形態において、該ＦＴＲは、レポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む。
【００８８】
幾つかの実施形態において、ステップｇ）は、ステップｅ）および／またはｆ）に先行し、その場合、アッセイ細胞は、発現カセットの添加前に各場所に添加される。
【００８９】
幾つかの実施形態において、該方法は、ステップｅ）において、実験対照として用いられ得る、前記遺伝子における１つまたは複数の既知ドライバー変異を含むＰＤＭ（人工ＰＤＭ）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットを含む。発現構築物の第三のセットは、アドレス可能なアレーに添加される。
【００９０】
さらなる実施形態において、該方法は、薬物の存在下でステップｇ）〜ｉ）のうちの任意の１つを薬物の存在下で繰り返して、該薬物の存在下および／または非存在下で、該試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性および／または対応する野生型発現ｃＤＮＡを比較することを含むステップｊ）をさらに含み、癌患者の生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用い、そして薬物の非存在下または存在下で、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の異なる結果が、該候補となる患者特有のドライバー変異の薬物応答を示す。
【００９１】
幾つかの実施形態において、定量するステップは、発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を測定することを含む。幾つかの実施形態において、定量するステップは、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲのトランスロケーションの度合いを計算／コンピュータ計算／決定することを含む。幾つかの実施形態において、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲのトランスロケーションの度合いはさらに、悪性腫瘍の成長に及ぼすテストＰＤＭの影響を推測するために較正／正規化される。幾つかの実施形態によれば、該発癌指数は、数値を有し、該値が高い程、テストされたＦＴＲ／ＰＤＲの発癌性指数が高い。幾つかの実施形態において、定量するステップは、測定に数値を割り付けることを含む。
【００９２】
幾つかの実施形態において、該生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織、および体液から選択される。
【００９３】
幾つかの実施形態によれば、２つ以上のＰＤＭの組み合わせが、アッセイ細胞において所与のＦＴＲを用いてテストされて、ＰＤＭの累積効果を測定／決定／同定することができる。
【００９４】
幾つかの実施形態によれば、該方法は、アッセイ細胞に、１つよりも多くのＰＤＭの異なる発癌構築物を導入することを含み得る。幾つかの実施形態において、該異なる発現構築物は、同時に、または連続で導入され得る。幾つかの実施形態において、該方法は、該細胞に、１つよりも多くのＰＤＭをコードする（例えば、２つの異なるＰＤＭ、３つの異なるＰＤＭなどをコードする）発現カセットを導入することを含み得る
【００９５】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における１つまたは複数の患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定する方法であって、
ａ）該生体試料から複数のｍＲＮＡを得るステップと；
ｂ）該複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと；
ｆ）該アッセイ細胞に、該生体試料からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、を添加するステップであって、そこで、アッセイ細胞への発現構築物のトランスフェクションが可能な条件下で、該発現構築物のそれぞれが異なったアドレス可能な場所のアッセイ細胞に添加されるステップと、
ｇ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを、アッセイ細胞に添加するステップと；
ｈ）該試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと；
ｉ）該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の１つまたは複数を含む、方法が提供される。
【００９６】
幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、指定されたＦＴＲで安定にトランスフェクトされ、対応するＦＴＲを発現するそのようなアッセイ細胞が、本明細書に開示された方法に用いられ得る。
【００９７】
幾つかの実施形態において、該方法は、ステップｆ）において、前記遺伝子における１つまたは複数の既知ドライバー変異を含むＰＤＭ（対応する人工ＰＤＭ）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットを、トランスフェクションが可能な条件下で、異なるアドレス可能な場所のアッセイ細胞に添加することを含む。
【００９８】
幾つかの実施形態において、該方法は、該試料からのｃＤＮＡを発現する細胞におけるＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較することをさらに含み、該生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有の発癌性変異として同定するために、生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、の異なる結果を用いる。
【００９９】
幾つかの実施形態において、該方法は、アッセイ細胞に薬物を添加して、該薬物の存在下と非存在下とで、該試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性および／または対応する野生型発現ｃＤＮＡを比較するステップをさらに含み、薬物の非存在下または存在下で、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の異なる結果が、該候補となる患者特有の発癌性変異の薬物応答を示す。
【０１００】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における異常なシグナル伝達タンパク質、および／または患者特有のドライバー変異の発癌性関連指数を決定する方法であって、
ａ）腫瘍の生検からなど、癌患者の該生体試料から複数のｍＲＮＡの試料を得るステップと；
ｂ）当該技術分野で公知の方法によって、該複数の腫瘍ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの個々のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｄ）増幅されたｃＤＮＡをプロモータおよびレポータ遺伝子に動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させて、キメラテスト患者由来レポータ（テストＰＤＲ）を生成させるステップと；
ｅ）該腫瘍からの増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセット（テストＰＤＲ）と、並行して、該ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセット（ｗｔ  ＰＤＲ）と、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｆ）場合により、担体固体基板上で該ｃＤＮＡ構築物を乾燥させるステップと；
ｇ）該ＤＮＡ構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｈ）トランスフェクトされた細胞において該構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのｃＤＮＡの第一のセットの遺伝子産物を得るステップと；
ｉ）該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該細胞におけるキメラレポータ遺伝子の少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと；
ｊ）該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の１つまたは複数を含む（任意の適切な順序で）、方法が提供される。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、該方法は、該細胞を該テスト薬物と共にインキュベートするステップをさらに含む。幾つかの実施形態において、該薬物は、抗癌薬／抗癌剤である。幾つかの実施形態において、１種よりも多くの薬物が、細胞に添加される。幾つかの実施形態において、薬物の組み合わせ（カクテル）が、細胞に添加され得る。幾つかの実施形態において、１種よりも多くの薬物が、細胞に添加される場合、該薬物は、任意の時間間隔および任意のインキュベーション時間で、同時または連続して添加され得る。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、１つの発現構築物上（即ち、１つの分子上）に配置される。そのような実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、同一の、類似のまたは異なるプロモータを有し得る（即ち、ＰＤＭおよびＦＴＲの発現は、同一のまたは異なるプロモータによって制御され得る）。幾つかの実施形態において、ステップｇ）は、ステップｅ）および／またはｆ）に先行することができ、その場合、該アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターの添加前に、各場所に添加される。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、発癌性指数の減少を示す治癒指数を決定するために、テスト化合物の存在下で得られた結果を用いることができる。
【０１０４】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料からの腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な細胞外および／または細胞内因子の発癌性関連指数を決定する方法であって、
ａ）アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと；
ｂ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを該アッセイ細胞に添加するステップと；
ｃ）該アレーの特定の場所で、該アッセイ細胞に患者の生体試料を添加するステップと；
ｄ）該患者の生体試料が添加された細胞において発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、該生体試料が添加されていない対応する細胞と比較するステップであって、腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子を同定するために、該患者の生体試料が添加された細胞と、該生体試料が添加されていない対応する細胞と、の異なる結果が用いられるステップと；
ｅ）腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子の異なる結果を定量し、それにより腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な前記因子の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の１つまたは複数を含む（任意の適切な順序で）、方法が提供される。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、該生体試料は、患者の腫瘍の微小環境、細胞外液、腫瘍から分泌された液体、血漿、気管支肺胞洗浄液など、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、該腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子は、オークリン因子、パラクリン因子、またはその両方から選択される。幾つかの実施形態において、該因子は、細胞該因子、細胞内因子、またはその両方である。幾つかの実施形態において、該因子は、非限定的にタンパク質（例えば、増殖因子）、核酸などの任意のタイプの分子から選択され得る。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、ＦＴＲを安定して発現する。幾つかの実施形態において、ステップｂ）は、ステップａ）に先行することができ、その場合、該細胞は、アドレス可能なアレーに添加されるＦＴＲの発現ベクターに添加される。
【０１０８】
幾つかの実施形態によれば、１つもしくは複数の患者特有の変異の発癌性指数を作成および／または決定および／または生成および／またはコンピュータ計算する方法であって、
ａ）患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）変異を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの細胞下局在および／またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと；
ｅ）ｉ）該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたＦＴＲのトランスロケーションの度合いを決定して、患者特有の変異の活性化レベルを測定すること；
ｉｉ）該発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること；ならびに
ｉｉｉ）患者特有の変異の正規化された活性化レベルと臨床転帰（参照）との写像／相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと；
を含む、方法が提供される。
【０１０９】
幾つかの実施形態によれば、解析は、マシンラーニング利用することを含み得る。幾つかの実施形態において、解析は、非限定的に相関単変量解析マシン、多変量解析マシン、サポートベクターマシン、一般化線形モデルマシンまたはそれらの組み合わせなどの方法を含み得る。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、該トランスロケーションの度合いは、核／細胞質比（ＮＣＲ）に基づいて決定される。幾つかの実施形態において、臨床転帰の参照／臨床転帰は、非限定的に臨床試験、検査演習の臨床結果、ヘルスケア提供者による処置の臨床結果、技術分野の参考資料など、またはそれらの組み合わせなどの参照を含み得る。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、該指数は、悪性腫瘍に至らせる候補となる患者特有の変異の能力を示す数値を有する。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、該指数は、患者の無増悪生存、患者の全生存、薬物応答の確率、無増悪期間（ＴＴＰ）、腫瘍応答率、再発率、無病生存（ＤＦＳ）を示すことができる。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、該患者特有の変異のトランスロケーションの度合いはさらに、患者特有の変異が関与する細胞シグナル伝達経路の影響に正規化され得る。
【０１１４】
幾つかの実施形態において、該患者の遺伝子は、患者の生体試料に由来し得る（直接的または間接的）。幾つかの実施形態において、該変異の少なくとも１つは、発癌性変異である。幾つかの実施形態において、該変異は、ドライバー変異である。幾つかの実施形態において、該患者特有の遺伝子（複数可）は、該遺伝子の配列に基づき、人工的に作製することができる（例えば、オリゴヌクレオチドの合成による）。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、誘導型または構成型プロモータである。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、遺伝子の一部を保有する。幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該構築物および／またはベクターを乾燥させるステップをさらに含み得る。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、ステップｃ）は、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行することができ、その場合、アッセイ細胞は、発現カセットの添加の前に各場所に添加される。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、該方法は、実験対照として用いられ得る、前記遺伝子における１つまたは複数の既知変異を含むＰＤＭ（人工ＰＤＭ）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットをさらに含み得る。発現構築物の第三のセットは、アドレス可能なアレーに添加される。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、該方法は、テスト薬物を該細胞に添加するステップをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、該方法は、テスト薬物への応答による、悪性腫瘍の成長に至らせる患者特有の変異の能力の低下を示す治癒指数を計算することをさらに含み得る。
【０１１９】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の発癌性指数を作成および／または決定および／または生成および／またはコンピュータ計算する方法であって、
ａ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと；
ｂ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを該アッセイ細胞に添加するステップと；
ｃ）該アドレス可能なアレーの特定の場所の該アッセイ細胞に、患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットを添加し、そして特定の場所の該アッセイ細胞に、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットを添加するステップであって、該発現構築物の第一のセットおよび該発現構築物の第二のセットが、共通の場所に添加されないステップと；
ｄ）該変異（複数可）を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの細胞下局在および／またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと；
ｅ）ｉ）該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたＦＴＲのトランスロケーションの度合いを決定して、患者特有の変異の活性化レベルを測定すること；
ｉｉ）該発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること；ならびに
ｉｉｉ）患者特有の変異の正規化された活性化レベルと臨床転帰（参照）との写像／相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと；
を含む、方法が提供される。
【０１２０】
幾つかの実施形態によれば、発癌性グレード分類指数を作成するシステムであって、
ａ）テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子産物の細胞下トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように；
ｂ）ＦＴＲの細胞下トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように；
ｃ）発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲの局在の細胞下トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように；そして
ｄ）患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関／写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、
ｉ）患者特有の変異（複数可）を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること；
ｉｉ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること；ならびに
ｉｉｉ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、
によって得られる、システムが提供される。
【０１２１】
幾つかの実施形態において、解析は、マシンラーニングまたは任意の他のコンピュータ方法を包含し得る。幾つかの実施形態において、解析は、相関単変量解析、相関多変量解析、サポートベクターマシン、一般化線形モデル解析またはそれらの組み合わせを包含し得る。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、ステップｉｉｉ）は、ステップｉ）および／またはｉｉ）に先行し、その場合、該アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターの添加の前に各場所に添加される。
【０１２３】
幾つかの実施形態において、該システムは、実験対照として用いられ得る、前記遺伝子における１つまたは複数の既知ドライバー変異を含むＰＤＭ（人工ＰＤＭ）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットをさらに含み得る。発現構築物の第三のセットは、アドレス可能なアレーに添加される。
【０１２４】
幾つかの実施形態において、該処理回路はさらに、テスト薬物への応答による、悪性腫瘍の成長に至らせる患者特有の変異の能力の低下を示す治癒指数を計算するように構成され得る。
【０１２５】
幾つかの実施形態によれば、発癌性グレード分類指数を作成するシステムであって、
ａ）テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子産物の細胞下トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように；
ｂ）ＦＴＲの細胞下トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように；
ｃ）発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲの局在の細胞下トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように；そして
ｄ）患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、
ｉ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、
ｉｉ）患者特有の変異（複数可）を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること；ならびに
ｉｉｉ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること、
によって得られる、システムが提供される。
【０１２６】
幾つかの実施形態によれば、発癌性グレード分類指数を作成するシステムであって、
ａ）テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子産物の細胞下トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように；
ｂ）ＦＴＲの細胞下トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように；
ｃ）発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲの局在の細胞下トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように；そして
ｄ）患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関／写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、以下のステップ：
ｉ）腫瘍の生検からなど、癌患者の該生体試料から複数のｍＲＮＡの試料を得るステップと；
ｉｉ）当該技術分野で公知の方法によって、該複数の腫瘍ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｉｉｉ）様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの個々のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｉｖ）増幅されたｃＤＮＡをプロモータおよびレポータ遺伝子に動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させて、キメラテスト患者由来レポータ（テストＰＤＲ）を生成させるステップと；
ｖ）該腫瘍からの増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセット（テストＰＤＲ）と、並行して、該ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセット（ｗｔ  ＰＤＲ）と、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｖｉ）場合により、担体固体基板上で該ｃＤＮＡ構築物を乾燥させるステップと；
ｖｉｉ）該ＤＮＡ構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｖｉｉｉ）トランスフェクトされた細胞において該構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのｃＤＮＡの第一のセットの遺伝子産物を得るステップと；
ｉｘ）該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該細胞におけるキメラレポータ遺伝子の少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと；
ｘ）該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の１つまたは複数を含む工程によって得られる、システムが提供される。
【０１２７】
１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を示す治癒指数を作成する方法であって、
ａ）患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）薬物の存在下と非存在下とで、該変異を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの細胞下局在および／またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと；
ｅ）ｉ）該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いを決定して、患者特有の変異の活性化レベルを測定すること；
ｉｉ）該薬物の存在下または非存在下で、該発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること；ならびに
ｉｉｉ）薬物の存在下または非存在下での患者特有の変異の正規化された活性化レベルと、臨床転帰（参照）との相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより患者特有の変異に関する薬物の治癒指数を決定するステップと；
を含む、方法が提供される。
【０１２８】
幾つかの実施形態において、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施形態において、該方法は、１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含み得る。幾つかの実施形態において、該方法は、薬物の組み合わせを添加することを含み得る。幾つかの実施形態において、該方法は、様々な濃度の薬物（複数可）を添加することを含み得る。
【０１２９】
幾つかの実施形態において、ステップｃ）は、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行することができる。
【０１３０】
幾つかの実施形態によれば、１つもしくは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を示す治癒指数を作成する方法であって、
ａ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｂ）患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｃ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｄ）薬物の存在下および非存在下で、変異（複数可）を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの細胞下局在および／またはトランスロケーションを、対応する野生型発現遺伝子と比較して、異なる結果を同定するステップと；
ｅ）ｉ）該異なる結果を処理して、発現構築物の第一のセットおよび発現構築物の第二のセットの存在下で該テストされたＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いを決定して、薬物の存在下または非存在下での患者特有の変異の活性化レベルを測定すること；
ｉｉ）薬物の存在下または非存在下で、該発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いに基づき、発現ベクターの第一のセットの存在下でのＦＴＲの細胞下トランスロケーションの度合いを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定すること；ならびに
ｉｉｉ）薬物の存在下または非存在下での患者特有の変異の正規化された活性化レベルと、臨床転帰（参照）との相関を解析すること、
によって候補となる患者特有の変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有の変異についての薬物の治癒指数を決定するステップと；
を含む、方法が提供される。
【０１３１】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を示す治癒指数を作成するシステムであって、
ａ）薬物または薬物の組み合わせの存在下および非存在下で、テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子産物の細胞下トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように；
ｂ）ＦＴＲの細胞下トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように；
ｃ）薬物または薬物の組み合わせの存在下または非存在下で、発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の第一のセットの存在下でのＦＴＲの局在の細胞下トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように；そして
ｄ）患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関／写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、
ｉ）患者特有の変異（複数可）を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること；
ｉｉ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること；ならびに
ｉｉｉ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、
によって得られる、システムが提供される。
【０１３２】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置（薬物応答）への感受性を示す治癒指数を作成するシステムであって、
ａ）薬物または薬物の組み合わせの存在下および非存在下で、テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子産物の細胞下トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように；
ｂ）ＦＴＲの細胞下トランスロケーションまたは局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように；
ｃ）薬物または薬物の組み合わせの存在下または非存在下で、発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の第一のセットの存在下でのＦＴＲの局在の細胞下トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように；そして
ｄ）患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関／写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、
ｉ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加すること、
ｉｉ）患者特有の変異（複数可）を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させること；ならびに
ｉｉｉ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加すること；
によって得られる、システムが提供される。
【０１３３】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を示す治癒指数を作成するシステムであって、
ａ）薬物または薬物の組み合わせの存在下および非存在下で、テスト細胞において、発現構築物の第一のセットの存在下および発現構築物の第二のセットの存在下で、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子産物の細胞下トランスロケーションの度合いを示す異なる結果を得るように；
ｂ）該細胞下トランスロケーションまたはその局在の度合いに基づき、患者特有の変異の活性化レベルを測定するように；
ｃ）薬物または薬物の組み合わせの存在下または非存在下で、発現構築物の第二のセットの存在下でのＦＴＲのトランスロケーションの度合いに基づき、発現構築物の第一のセットの存在下でのＦＴＲの局在の細胞下トランスロケーションを正規化して、患者特有の変異の正規化された活性化レベルを測定するように；そして
ｄ）患者特有の変異の活性化レベルと臨床転帰（参照）との相関／写像を解析し、それにより該発癌性指数を決定するように、
構成された処理回路を含み、
該異なる結果が、以下のステップ：
ｉ）腫瘍の生検からなど、癌患者の該生体試料から複数のｍＲＮＡの試料を得るステップと；
ｉｉ）当該技術分野で公知の方法によって、該複数の腫瘍ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｉｉｉ）様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの個々のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｉｖ）増幅されたｃＤＮＡをプロモータおよびレポータ遺伝子に動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させて、キメラテスト患者由来レポータ（テストＰＤＲ）を生成させるステップと；
ｖ）該腫瘍からの増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセット（テストＰＤＲ）と、並行して、該ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセット（ｗｔ  ＰＤＲ）と、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｖｉ）場合により、担体固体基板上で該ｃＤＮＡ構築物を乾燥させるステップと；
ｖｉｉ）該ＤＮＡ構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｖｉｉｉ）トランスフェクトされた細胞において該構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのｃＤＮＡの第一のセットの遺伝子産物を得るステップと；
ｉｘ）該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該細胞におけるキメラレポータ遺伝子の少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップであって、癌患者の生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いるステップと；
ｘ）該候補となる患者特有のドライバー変異の異なる結果を定量し、それにより前記患者特有のドライバー変異の発癌性グレード分類指数を決定するステップと、
の１つまたは複数を含む（任意の順序で）工程によって得られる、システムが提供される。
【０１３４】
幾つかの実施形態によれば、本明細書に開示された方法およびシステムで用いられる発現構築物は、以下のステップの１つまたは複数を含む工程によって得ることができる：
ｉ）患者の生体試料から得られた複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップ；
ｉｉ）発癌性変異を保有することが疑われる遺伝子をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップ；および
ｉｉｉ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させるステップ。
【０１３５】
幾つかの実施形態において、１つまたは複数の変異を保有することが疑われる該患者の遺伝子または遺伝子部分は、当該技術分野で公知の方法によって合成することができ、プロモータに動作可能に連結させて、該発現構築物を得ることができる。幾つかの実施形態において、該患者の遺伝子（またはその一部）および／または該対応する野生型（ＷＴ）遺伝子は、本明細書で詳述される通り、それらの配列に基づいて人工で合成することができ、さらに処理して対応するＰＤＭを作製することができる。
【０１３６】
幾つかの実施形態によれば、パラクリン／オートクリン活性化経路に関して得られたデータと共に変異に関するデータを有する同定された変異を用いて、患者の腫瘍内の影響を受けたシグナル伝達経路、ならびに変異された遺伝子およびそれらの発癌活性を示す「腫瘍発癌性マップ」を作成することができる。幾つかの実施形態において、該腫瘍発癌性マップは、テストされた遺伝子の個々の発癌性指数の要約で構成される。幾つかの実施形態において、該変異は、発癌性変異である。幾つかの実施形態において、該変異は、ドライバー変異である。
【０１３７】
幾つかの実施形態において、患者特有の変異および関与するシグナル伝達経路の同定（即ち、腫瘍発癌性マップの作成）の後、第二のテストを実施することができ、その第二のテストアッセイは、同定された経路／変異を阻害すること／それに影響を及ぼすことが知られている標的治療薬／治療剤／組成物など、処置の存在下で実施される。こうして、患者の腫瘍の発癌性指数に影響を有する薬物／薬剤／組成物を、決定することができる。幾つかの実施形態において、テストされた薬物／薬剤／組成物によって誘導された発癌活性の変化は、本明細書では「治癒指数」と称される。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、様々な薬物／薬剤処置およびそれらの各治癒指数は、「腫瘍発癌性マップ」と重ね合わせることができ、ヘルスケア提供者に、患者特有の根底的分子腫瘍メカニズムおよび処置選択、ならびに特定の患者を処置するための処置選択およびそのそれぞれの予測される有効性を提供することができる。
【０１３９】
幾つかの実施形態によれば、患者特有の腫瘍の発癌性指数に影響を及ぼすことが可能な候補処置を同定する方法であって、患者特有のドライバー変異を同定すること（本明細書に開示された方法のいずれかによる）、および患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異に及ぼす候補薬物の影響をテストすること（本明細書に開示された方法のいずれかによる）、を含む、方法が提供される。幾つかの実施形態において、該候補処置は、薬物、薬剤、組成物、または任意のタイプの処置である。
【０１４０】
幾つかの実施形態によれば、所与の患者の腫瘍試料内の悪性腫瘍の成長に至らせる所与の同定された発癌性変異／異常（ＰＤＲ／ＰＤＭ）の能力を示す発癌性指数を決定する方法であって、悪性腫瘍の成長に及ぼすテストＰＤＭの影響を推測するために較正／正規化されたテストＦＴＲ／ＰＤＲのトランスロケーションの度合いを計算すること／コンピュータ計算すること／測定することを含む、方法が提供される。幾つかの実施形態によれば、該発癌性指数は、数値を有し、該値が高い程、テストされたＦＴＲ／ＰＤＭの発癌性指数が高い。幾つかの実施形態において、該発癌性指数は、１〜１００の範囲内である。幾つかの実施形態において、該発癌性指数は、１〜５０の範囲内である。幾つかの実施形態において、該発癌性指数は、１〜１０の範囲内である。幾つかの実施形態において、該発癌性指数は、０〜１０の範囲内である。幾つかの実施形態において、該発癌性指数は、０〜５の範囲内である。幾つかの実施形態において、該発癌性指数は、０〜１の範囲内である。
【０１４１】
幾つかの実施形態によれば、用語「発癌性指数」および「発癌性グレード分類指数」は、互換的に用いられ得る。それらの用語は、所与の患者の腫瘍試料内の悪性腫瘍の成長に至らせる所与の発癌性変異／異常の能力を示す値に向けられる。
【０１４２】
幾つかの実施形態によれば、発癌性変異を保有すると同定された各遺伝子は、腫瘍の同定された異なるドライバー変異の間での重症度比較を可能にする発癌性指数が割り付けられる。
【０１４３】
幾つかの実施形態によれば、用語「総発癌性指数」は、所与の患者の腫瘍試料内の悪性腫瘍の成長に至らせる全てのシグナル伝達経路における全ての同定された変異の総能力を示す値に向けられる。幾つかの実施形態において、該総発癌性指数は、同定された変異遺伝子の発癌性指数全てを合計することによって計算することができ、疾患の全体的重症度を示す。
【０１４４】
幾つかの実施形態によれば、用語「治癒指数」は、患者の腫瘍の１つまたは複数の抗癌処置（薬物処置など）によって生じた発癌性指数の変化を反映する値（数値など）に向けられる。
【０１４５】
幾つかの実施形態によれば、用語「総治癒指数」は、患者の腫瘍の完全なコンビナトリアル薬物処置によって生じた総発癌性指数の変化全体を合計した値（数値など）に向けられる。
【０１４６】
幾つかの実施形態において、該治癒指数は、特異的なテスト遺伝子、遺伝子セットまたは遺伝子の組み合わせの発癌性指数、およびテスト化合物（小分子、治療抗体など）でのテスト細胞の処置によるこの指数の変化（影響の性質に応じて減少／不変／増加のいずれか）に基づいて計算され得る。テスト化合物が、テスト細胞の発癌性指数の減少を誘導し得る場合（即ち、この遺伝子によって測定された発癌性シグナル伝達の減少がある場合）、これは、高い治癒指数をもたらす。
【０１４７】
幾つかの実施形態によれば、用語「転移指数」は、細胞解離に至らせて原発腫瘍部位から離れた位置において腫瘍または細胞の浸透／接着を形成する所与の変異／異常の能力を示す値（数値など）に向けられる。幾つかの実施形態において、用語「総転移指数」は、同定された変異遺伝子の転移指数全体を合計した値（数値など）に向けられ、疾患の全体的転移能を示す。
【０１４８】
幾つかの実施形態によれば、用語「血管新生指数」は、腫瘍内の血管形成／発達／分岐／透過に至らせて腫瘍量／腫瘍の成長を支える、所与の変異／異常の能力を示す値（数値など）に向けられる。幾つかの実施形態によれば、用語「総血管新生指数」は、同定された変異遺伝子の血管新生指数全体を合計した値（数値など）に向けられる。
【０１４９】
幾つかの実施形態によれば、用語「ゲノム不安定性指数」は、腫瘍内でＤＮＡ修復を阻害する、またはＤＮＡ変異およびそれらの確定を刺激する所与の変異／異常の能力、あるいは腫瘍の成長に至らせる、または元の腫瘍と類似の、もしくは異なるさらなる腫瘍を刺激する体細胞変異としての、所与の変異／異常の能力を示す数値（数値など）に向けられる。幾つかの実施形態において、用語「総ゲノム不安定性指数」は、同定された変異遺伝子のゲノム不安定性指数全体を合計した値（数値など）に向けられる。
【０１５０】
幾つかの実施形態によれば、用語「微小管動的不安定性指数」は、腫瘍の成長に至らせる微小管系または他の細胞骨格系の活性または安定性に関する所与の変異／異常の能力を示す値（数値など）に向けられる。幾つかの実施形態において、該変異／異常は、微小管タンパク質／微小管結合タンパク質におけるタンパク質コンフォメーション状態、力学的不安定性、または細胞分裂を刺激し得るもしくは有糸分裂抑制因子に耐性を有し得る他の細胞骨格タンパク質、または微小管系もしくは他の細胞骨格系を安定化し、これにより腫瘍成長に至らし得る他の微小管薬もしくは細胞骨格薬から選択され得る。幾つかの実施形態によれば、用語「総微小管動的不安定性指数」は、同定された変異遺伝子の微小管動的不安定性指数全体を合計した値（数値など）に向けられる。
【０１５１】
幾つかの実施形態によれば、用語「細胞周期進行指数」は、細胞周期の進行に影響を及ぼす所与の変異／異常の能力を示す値（数値など）に向けられる。
【０１５２】
幾つかの実施形態によれば、用語「アポトーシス指数」は、細胞のアポトーシスに影響を及ぼす所与の変異／異常の能力を示す値（数値など）に向けられる。
【０１５３】
幾つかの実施形態によれば、用語「分化指数」は、細胞分化の進行に影響を及ぼす所与の変異／異常の能力を示す値（数値など）に向けられる。
【０１５４】
幾つかの実施形態によれば、本明細書に開示された方法およびシステムに基づいて決定／計算／コンピュータ計算された、本明細書に開示された発癌性関連指数の１つまたは複数は、患者への最良の治療効果を提供し得る患者特有の処置を同定、決定および／または推奨するために用いられ得る。
【０１５５】
幾つかの実施形態によれば、様々な指数を作成するために用いられる方法およびシステムは、例えばマシンラーニング技術などの様々な計算技術を利用し得る。幾つかの実施形態において、マシンラーニング技術は、相関解析、サポートベクターマシン、一般化線形モデルなど、またはそれらの組み合わせなどの技術を含み得る。
【０１５６】
幾つかの実施形態によれば、指数を作成するための計算における第一のステップは、正規化ステップ（前処理）である。幾つかの実施形態において、該正規化ステップは、参照値を提供することを含む。幾つかの例示的実施形態において、患者特有の変異および変異したシグナル伝達経路の活性レベルの測定（本明細書に記載されたシステムおよび方法による）は、核／細胞質比（ＮＣＲ）の単位で表され得る。このため正規化ステップは、野生型（ＷＴ）試料／参照（例えば、ＷＴ−ＰＤＭ）の未処理ＮＣＲを測定することを含むことができ、それが参照値（例えば、０）に任意に設定され、テストＰＤＭの測定ＮＣＲ（「テストＮＣＲ」）のそれぞれが、このＷＴ参照に相対的な値を与えられる。追加または代わりとして、それぞれの測定されたテストＮＣＲは、関連する一定の参照に相対的であり得、その単位に正規化され得る（例えば、参照が常に１００になるように）。
【０１５７】
幾つかの実施形態において、該正規化ステップの後に、様々な生物学的アッセイアウトプット（即ち、本明細書に開示された方法およびシステムによる患者遺伝子のテストおよびその活性化レベルの測定）から得られた実際の結果を、臨床の参照／臨床転帰に写像／相関させる関数を学習して、臨床関連指数を提供する、適切なマシンラーニング法（または任意の他の適切なコンピューターシステム）を行うことができる。幾つかの実施形態において、臨床転帰の参照／臨床転帰は、非限定的に臨床試験、検査演習の臨床結果、ヘルスケア提供者による処置の臨床結果、技術分野の参考資料など、またはそれらの組み合わせなどの参照を含み得る。
【０１５８】
幾つかの実施形態によれば、得られた指数は、指数を作成するために提供されたインプット（データ）に依存し、このため指数の臨床的有意性は、インプットに左右される。幾つかの実施形態において、患者特有の遺伝子の活性化レベルを測定するのに、観察された無増悪生存と共に生物学的アッセイのアウトプットを用いた場合に、得られた発癌性指数が、無増悪生存指数である（即ち、作成された指数は患者特有の変異に基づき、患者の無増悪生存を示す／予測する）。幾つかの実施形態において、インプット（データ）が、測定された病院での薬物応答と共に、薬物の存在下および非存在下での患者特有の遺伝子の生物学的アッセイのアウトプットである場合には、得られた指数は、薬物応答の指標／予測変数である。幾つかの実施形態において、計算された指数は、定量的である。
【０１５９】
幾つかの実施形態によれば、指数は、さらなる臨床参照／臨床転帰のインプットを用いず、生物学的アッセイから得られたデータに基づいて作成され得る（即ち、様々な患者特有のＰＤＭの活性化レベルを測定する）。
【０１６０】
幾つかの実施形態によれば、本明細書に開示されたシステムは、指数を作成するのに必要なステップなど、またはそれらの組み合わせのいずれかを実施するために前記処理回路によって実行可能なコンピュータへの入力に適した機器に保存された、処理回路（処理ロジック、処理ユニット、プロセッサなどを含む）、非一次的メモリなどの任意の適切なハードウエア、ファームウエア、またはソフトウエアを含み得る。
【０１６１】
幾つかの実施形態によれば、患者は、癌に罹患した患者である。幾つかの実施形態において、癌としては、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫および混合型の腫瘍などの癌が挙げられる。腫瘍の特定の分類としては、リンパ増殖性疾患、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、骨癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部癌、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、皮膚癌、腎臓癌、さらにはこれらの全ての転移が挙げられる。処置を受けることが可能な特定のタイプの腫瘍としては、肝細胞癌、肝癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋皮肉腫、浸潤性乳管癌、乳頭腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌（高分化、中分化、低分化または未分化）、腎細胞癌、副腎腫、副腎様腺癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌（小細胞、非小細胞および大細胞肺癌など）、膀胱癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、神経芽腫、結腸癌、直腸癌、造血器悪性腫瘍（急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、脊髄リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫をはじめとする全てのタイプの白血病およびリンパ腫など）が挙げられる。
【０１６２】
特定の実施形態によれば、該癌は、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、骨髄腫、白血病、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌からなる群から選択される。
【０１６３】
幾つかの実施形態において、該患者は、癌について陽性と診断されている。幾つかの実施形態において、該患者は、標的治療処置レジメンを受けていて、処置結果が既知または未知である。幾つかの実施形態において、該患者は、入手可能な患者腫瘍分子プロファイリング（ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、ＰＣＲおよびシーケンシング）を有する。幾つかの実施形態において、該患者は、入手可能な患者履歴および転帰（患者の応答、耐性、再発率および生存率）を有する。
【０１６４】
幾つかの実施形態において、該生体試料は、血液、血清、生検、針生検、気管支肺胞洗浄液、胸水、尿、唾液および腫瘍から選択される。幾つかの実施形態において、該生体試料は、単離されたばかりであり得る。幾つかの実施形態において、該生体試料は、凍結されたものであり得る。幾つかの実施形態において、該生体試料は、固定されたものであり得る。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、アッセイ細胞中で発現される各タンパク質（テストされるＰＤＭ、ＦＴＲ、ＷＴ  ＰＤＭ、ＰＤＲなど）は、差次的に同定可能である。別の実施形態において、各タンパク質は、直接的または間接的に、異なるマーカもしくはレポータ、または異なる蛍光タンパク質によって同定され得る。別の実施形態において、各キメラタンパク質（ＦＴＲまたはＰＤＲなど）は、異なるレポータ部分を含む。別の実施形態において、異なるタンパク質は、蛍光タンパク質またはレポータを共有し得る。別の実施形態において、本発明の各キメラタンパク質は、異なるレポータ部分を含む。
【０１６６】
別の実施形態において、ＰＤＭは、癌の成長に関連する。別の実施形態において、ＰＤＭは、発癌遺伝子または腫瘍抑制因子である。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞骨格制御因子である。別の実施形態において、ＰＤＭは、腫瘍成長および転移において役割を有する。別の実施形態において、ＰＤＭは、小胞輸送タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、小胞テザリングタンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞接着タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、核移入タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、増殖因子受容体である。別の実施形態において、ＰＤＭは、サイトカイン受容体である。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞付着タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、腫瘍炎症に関与する。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞極性タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、シグナル伝達タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、アダプタータンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、プロテインキナーゼである。別の実施形態において、ＰＤＭは、交換因子である。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞骨格タンパク質である。幾つかの例示的実施形態において、ＰＤＭは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＧＦＢＲ２、ＦＢＸＷ７、ＭＹＣ、ＬＫＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＣＦ７Ｌ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＥＳＲ１、ＡＲ、ＰＲ、ＤＤＲ２、ＭＥＫ１またはそれらの任意の組み合わせを含む群またはそれらからなる群から選択される。
【０１６７】
別の実施形態において、ＰＤＭは、蛍光タンパク質など（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１など）のマーカ（標識）と共に発現され得る。幾つかの例示的実施形態において、該マーカは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）のマーカモチーフを含み、画像化の前に、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２またはＲｅＡｓＨ−ＥＤＴ２が、テストアッセイに添加されて、該Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓモチーフを含む組換えタンパク質への結合によって蛍光になり得る。幾つかの実施形態において、該Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓを含む該タンパク質は、ＰＤＭ、単独の蛍光タンパク質、または細胞下オルガネラ、例えば形質膜または核を標識するためにさらに用いられ得る細胞下マーカに融合された蛍光タンパク質であり得る。幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭと共に発現される該マーカ（標識）は、ＰＤＭのトランスフェクションまたは発現を検証するマーカとして用いられ、アッセイ細胞である。
【０１６８】
別の実施形態において、ＰＤＲは、蛍光タンパク質など（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１など）のマーカ（標識）に融合されたＰＤＭである。幾つかの例示的実施形態において、ＰＤＲは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）モチーフを含むマーカ（標識）に融合されたＰＤＭである。
【０１６９】
幾つかの例示的実施形態において、該ＦＴＲは、蛍光マーカ（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１などの蛍光タンパク質）またはＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓモチーフ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）などのレポータ部分と、非限定的に癌の成長に関連するタンパク質、発癌遺伝子産物、細胞骨格制御因子、小胞輸送タンパク質、小胞テザリングタンパク質、細胞接着タンパク質、核移入タンパク質、増殖因子受容体、細胞付着タンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、腫瘍炎症に関与するタンパク質、細胞極性タンパク質、増殖因子シグナル伝達タンパク質、アダプター、細胞骨格タンパク質などから選択される標的タンパク質部分と、を含む融合（キメラ）タンパク質である。各可能性は、別の実施形態である。
【０１７０】
幾つかの例示的実施形態において、該ＦＴＲは、蛍光タンパク質などのレポータ部分と、非限定的にＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ｍＴＯＲ、ＲｅｌＡ、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＥＲＦ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＣＴＮＮＢ１、ＪＮＫ１α、ＪＮＫ１β、ＪＮＫ２α、ＪＮＫ２β、ＥＲＫ５、Ｐ３８α、Ｐ３８β、ＡＭＰＫ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＰ５３、ＥＳＲ１、ＧＡＴＡ３、ＣＤＫ２、ＳＭＡＤ１、ＮＯＴＣＨ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＰＲＫＡＣＡ、ＮＬＫまたはそれらの任意の組み合わせを含むまたはそれらからなる群から選択される標的（マーカ）タンパク質部分と、を含む融合タンパク質である。各可能性は、別の実施形態である。
【０１７１】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＫＲａｓであり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＥＲＦ、ＪＮＫおよびＡＫＴ１から選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１７２】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＡＫＴ２またはＡＫＴ３であり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＡＫＴ１およびＲｅｌＡから選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１７３】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＦＧＦＲ１であり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＪＮＫ（ＪＮＫ１α１など）、ｐ３８ｂ、ＡＫＴ１およびＳＴＡＴ３から選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１７４】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＢＲａｆであり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２およびＥＲＦから選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１７５】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＥＧＦＲであり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＲｅｌＡ、ＡＫＴ１、ｐ３８ｂ、ＪＮＫ１ａ１から選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１７６】
別の実施形態において、本発明は、各アッセイ細胞がＰＤＭおよび／またはＦＴＲを発現するアッセイ細胞を含む。別の実施形態において、本発明は、各アッセイ細胞が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲおよび／またはＰＤＲを発現するアッセイ細胞を含む。別の実施形態において、本発明は、各アッセイ細胞が異なるＤＮＡ断片でトランスフェクトされ、核ＤＮＡ断片が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲをコードする、アッセイ細胞を含む。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、場所（位置）を指定された固体基板上に配置／播種／増殖される。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、各場所で同一である。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、各場所で同一でない。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、培地中で各場所に添加される。幾つかの実施形態において、該細胞は、ＤＮＡ構築物を既に脱水させた固体基板に添加される。幾つかの実施形態において、該細胞は最初、固体基板上に播種され、所定の時間の後、トランスフェクトされる。
【０１７７】
別の実施形態において、本発明は、各アッセイ細胞が異なるＤＮＡ断片でトランスフェクトされ、各ＤＮＡ断片が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲおよび／またはＰＤＲをコードする、アッセイ細胞を含む。
【０１７８】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの局在の同定は、タンパク質アッセイ、結合アッセイ、免疫アッセイ、顕微鏡画像化、または当業者に公知の任意の他の適切なアッセイを利用して実施される。幾つかの実施形態において、テストＰＤＭの活性化レベルは、ＦＴＲの核／細胞質比（ＮＣＲ）に基づいて測定され得る。
【０１７９】
幾つかの実施形態において、本発明は、アッセイ細胞における形態学的変化を検出するステップをさらに含む。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、任意の患者ＤＮＡのシーケンシングを必要としない。
【０１８０】
幾つかの実施形態によれば、該方法は、テスト薬物を細胞に添加すること、および様々な実験条件下でＦＴＲのトランスロケーションに及ぼす該薬物の影響を同定すること、をさらに含み得る。
【０１８１】
幾つかの実施形態によれば、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの例示的実施形態において、該薬物は、ブレンツキシマブ・ベドチン、カボザンチニブ、カルフィルゾミブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、デノスマブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イブルチニブ、イマチニブメシル酸塩、イピリムマブ、ラパチニブ、ニロチニブ塩酸塩水和物、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペルツズマブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、リツキサン、ソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムス、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、ジブ・アフリベルセプトから選択され得るが、これらに限定されない。
【０１８２】
幾つかの実施形態によれば、該薬物（複数可）は、任意の所望の量／濃度でテスト細胞に添加され得る。例えば該薬物は、１ｎＭ〜１ｍＭの濃度で添加され得る。
【０１８３】
幾つかの実施形態によれば、該薬物（複数可）は、添加されて、テスト細胞と共に任意の所望の時間、例えば１０分〜２４時間の範囲内でインキュベートされ得る。
【０１８４】
幾つかの実施形態によれば、患者の癌を診断するキットが提供される。幾つかの実施形態において、腫瘍細胞における異常な細胞シグナル伝達経路を同定するキットが提供される。幾つかの実施形態において、患者特有のドライバー変異を同定するキットが提供される。幾つかの実施形態において、患者特有のドライバー変異の薬物応答を測定／検出／同定するキットが提供される。幾つかの実施形態において、薬物治療に対する患者の変異遺伝子の応答／耐性を測定するキットが提供される。幾つかの実施形態によれば、患者特有の発癌性変異の様々な発癌性関連指数を作成／決定するキットが提供される。
【０１８５】
幾つかの実施形態において、本発明は、患者特有のドライバー変異を同定することによって、対象における癌または分子上の癌プロファイルを診断するキットを提供する。該キットは、幾つかの実施形態によれば、癌に関与する処置の成功を予測するため、またはパラクリンもしくはオートクリン因子を同定するために、用いられ得る。別の実施形態において、該キットは、レポータ遺伝子を検出する手段を少なくとも１つ含む。別の実施形態において、該キットは、マーカを検出する手段を含む。幾つかの実施形態において、該キットは、核酸分子および／もしくはテスト細胞を保持するための基板もしくはコンテナ、検出／トランスロケーションアッセイ（複数可）を実施するための指示、テスト細胞、トランスフェクション試薬、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。
【０１８６】
本発明の診断組成物は、所望なら、製造品、例えば診断試薬および使用説明書を含み得るＦＤＡ認可キットなどのキットの中で提供され得る。該キットはまた、医薬品の製造、使用または販売を管理する政府機関によって処方された形態でコンテナに添付された注意書きに適合され得、該注意書きは、該組成物の形態、またはヒトもしくは獣医学的使用の機関による認可を反映している。
【０１８７】
別の実施形態において、本発明の方法およびキットは、癌患者の生存率を上昇させる。本発明のアッセイは、理想的にはキットの調製に適する。そのようなキットは、バイアル、管、プレート、スライドなどのコンテナ手段のそれぞれが細胞アッセイの分離エレメントを含みながら、該コンテナ手段を１つまたは複数備えて密封されて受け取るように区画化された運搬手段を含み得る。
【０１８８】
一実施形態において、それぞれが異なる本発明のタンパク質を含むアッセイ細胞のパネルを含む、対象の癌を診断するキットが提供され、該キットは、ＰＤＭ（患者の生体試料由来）および／またはＦＴＲおよび／またはＦＴＲをコードする核酸分子を有する基板を含み、該基板はさらに、アッセイ細胞と、癌を有することが疑われるヒト対象から単離された生体試料と、トランスロケーションイベントを反応、測定および／または検出するための印刷された使用説明書と、を保持することが可能である。
【０１８９】
幾つかの実施形態において、トランスフェクトされたアッセイ細胞は、効果的条件下で培養され、組換えタンパク質または標識されたタンパク質の発現を可能にする。一実施形態において、本発明の標識されたタンパク質またはマーカタンパク質（ＰＤＭ、ＦＴＲなど）は、組換えタンパク質またはキメラである。幾つかの実施形態において、効果的な培養条件としては、タンパク質の発現を可能にする効果的培地、バイオリアクタ、温度、ＣＯ２、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、効果的培地は、細胞を培養して本発明の組換えポリペプチドを生成する任意の培地を指す。幾つかの実施形態において、培地としては、典型的には同化可能な炭素、窒素およびリン酸供給源、ならびに適切な塩、無機質、金属および他の栄養素、例えばビタミンを有する水溶液が挙げられる。幾つかの実施形態において、本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクタ、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートで培養され得る。幾つかの実施形態において、培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素量で実施される。幾つかの実施形態において、培養条件は、当業者の技能の範囲内である。
【０１９０】
幾つかの実施形態において、本発明は、タンパク質トランスロケーションイベントをモニタリングおよび記録するための再分配技術を利用する。別の実施形態において、タンパク質の標的が、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質でラベル化され、安定して、または一過性にトランスフェクトされた細胞株が作製される。別の実施形態において、本発明のアッセイは、ハイスループット光学顕微鏡を基にした機器を利用して読み取られる。
【０１９１】
別の実施形態において、本発明のタンパク質トランスロケーションアッセイは、主として細胞培地の成分としての生体試料に由来するＰＤＭのリードシリーズ（ｌｅａｄ  ｓｅｒｉｅｓ）のプロファイリング、一次スクリーニングに用いられる、ハイコンテントのハイスループットアッセイである。別の実施形態において、本発明のタンパク質トランスロケーションアッセイは、スピニングディスク技術または任意の他の顕微鏡に基づく技術を利用した生存細胞の画像化を含む。
【０１９２】
幾つかの実施形態において、トポノミックローカライゼーション（ｔｏｐｏｎｏｍｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）技術を用いて、タンパク質トランスロケーションイベントを追跡および記録する。幾つかの実施形態において、本発明のタンパク質の免疫蛍光手段が利用される。幾つかの実施形態において、本発明のタンパク質は、蛍光マーカでラベル化される。幾つかの実施形態において、共焦点顕微鏡画像が、評価および処理される。別の実施形態において、標準的なデータセットは、生物学的条件につき各細胞の２〜４０の画像を含む。別の実施形態において、自動化画像解析が、実施される。別の実施形態において、自動化画像解析は、細胞内コンパートメントまたは構造の同定を含む。
【０１９３】
別の実施形態において、空間的関係が、異なる次元で取り込まれる。別の実施形態において、有界領域中のタンパク質−マーカ濃度の定量的評価が、実施される。別の実施形態において、本発明はさらに、画素間の距離の等方性分布の測定および評価に基づく、タンパク質の共局在試験を提供する。別の実施形態において、本発明は、２次元解析（領域）を提供する。別の実施形態において、本発明はさらに、０次元解析（ポイント）を提供する。別の実施形態において、本発明は、１次元モデリングを提供する。
【０１９４】
用語「含む」、「含むこと」「包含する」、「包含すること」、「有する」およびそれらの活用語は、「包含するがそれに限定されないこと」を意味する。用語「含む」および「含むこと」は、幾つかの実施形態において、それぞれ「からなる」および「からなること」に限定される。用語「からなること」は、「包含し、それらに限定されること」を意味する。用語「から本質的になる」は、組成物、方法または構造が追加の成分、ステップおよび／または部分を包含し得るが、該追加の成分、ステップおよび／または部分が、特許請求された組成物、方法または構造の基本的特性および新規特性を実質的に変化させない場合に限ることを意味する。
【０１９５】
本明細書で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他の事柄を明示しない限り、複数の対象物を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、その混合物をはじめとする複数の化合物を包含し得る。
【０１９６】
本明細書に表示された数値を参照しながら本明細書で用いられる用語「約」は、表示された値＋／−１０％と理解されるべきである。
【０１９７】
本明細書で用いられる用語「方法」は、非限定的に化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られた手法、手段、技術および手順、または化学、薬理学、生物学、生化学および医学技術の実施者によって既知の手法、手段、技術ならびに手順から即座に開発された手法、手段、技術および手順など、所与のタスクを達成する手法、手段、技術および手順を指す。
【０１９８】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、限定することを意図するものではない以下の実施例を検討する際に、当業者に明白となろう。加えて上記の、そして以下の特許請求の範囲の部分で請求される本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれによって、以下の実施例の実験的裏づけが見出される。
【０１９９】
以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態をより完全に説明するために提示されている。しかしそれらは、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０２００】
実施例
一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術を含む。そのような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）；  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ，  ”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に示された方法論；  ”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  ”Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”  ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９９４），  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  ”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）；  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  ”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）を参照されたい；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に詳細に記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；  ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，  Ｍ．  Ｊ．，  ｅｄ．  （１９８４）；  “Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）；  ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８４）；  ”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．，  ｅｄ．  （１９８６）；  ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；  ”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  （１９８４）  ａｎｄ  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．  １−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  ”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）；  Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）を参照されたい（それらの全てが、参照により本明細書に組み入れられる）。他の一般的参考資料は、この文書全体に提供されている。
【０２０１】
生体試料の採取
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍生検と凍結した新鮮な腫瘍部分または生検の両方を採取する。ＦＦＰＥ試料を用いて、癌の進行に関与することが知られている特異的ゲノムエクソン（ｃＫｉｔのエクソン１１など）を抽出する。新鮮な（新鮮な、または新鮮な状態で凍結された）生検を、ｍＲＮＡの抽出と間質液抽出の両方に使用する。
【０２０２】
このように、後向き試験と前向き試験の両方の試料を採取する。後向き試験は、処置の有効性が知られている症例からの凍結腫瘍切片に基づく。
【０２０３】
前向き試験は、手術／生検／気管支鏡検査の直後に採取された新鮮なまたはスナップ凍結された試料／生検組織／腫瘍切片に基づく。これは、関連する全てのテストタンパク質（発癌遺伝子または指示薬など）の増幅を可能にする。気管支鏡検査により得られる血漿試料（ヘパラン硫酸ゲルチューブを用いる）、血液試料、腹水、胸水および肺液などの他の体液は、それらが多くの腫瘍分泌物を蓄積するため非常に重要であり、同じく採取される。
【０２０４】
腫瘍切除（手術、生検、気管支鏡検査）の後に、腫瘍組織を氷上の滅菌バッグまたはチューブ内に入れる（ホルマリンで処理しない）。病理医は、腫瘍を、固定に必要なものと、さらなる分析のために氷上で新鮮なまま輸送される、腫瘍を最もよく表すものと、に分割する（生存可能な腫瘍切片のサイズおよび位置を考慮して）。病理医は、悪性細胞に富む組織切片または領域、および間質組織または他の非悪性組織の量が少ない組織切片または領域を同定し、それを切除する。組織の正味重量が１ｇを超える場合には、組織をさらに複数の小片に切断し、セルロースカラム上に置き、１００ｇで１０分間遠心分離する（組織グラムあたり１００±５０マイクロリットルのＩＦが予測される）。その後、組織を別の１５／５０ｍｌチューブに移し、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。間質液（ＩＦ）として知られる遠心分離された液体を、元のチューブ内で凍結させる。
針生検  −  組織を１５コニカルチューブに入れ、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支鏡検査による生検  −  組織を１５コニカルチューブに入れ、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支肺胞洗浄液  −  抽出液を２本の５０ｍｌファルコンチューブに分配し、遠心分離する（３０００ＲＰＭ、１５分）。液体を新しいチューブに移し、液体と細胞（元のチューブの）の両方を−８０℃で凍結させる。
胸水  −  胸水を遠心分離し（３０００ＲＰＭ、１５分）、液体を新しいチューブに移し、液体と細胞（元のチューブの）の両方を−８０℃で凍結させる。
凍結切片  −  可能であれば、腫瘍をミクロトームで凍結し、切り出す。
【０２０５】
ホルマリン固定された包埋腫瘍生検からのゲノムＤＮＡの抽出
エクソン１１のｃＫｉｔ変異、ＥＧＦＲエクソン１９、２０、ＨＥＲ２エクソン２０など、特定のエクソンにおいて既知の変異が存在する遺伝子を同定するために、ＦＦＰＥ組織から抽出されたＤＮＡを用いる。この目的のために、標準的なＤＮＡ抽出キットおよびプロトコルを用いる（例えば、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織、カタログ番号５６４０４）。
【０２０６】
エクソンの増幅および全長遺伝子への挿入
所望のエクソンを発現させるために、ゲノムＤＮＡの増幅を実施し、このエクソンを欠く全長遺伝子にこのエクソンを挿入する。この目的のために、即発現可能なベクターにおいてこのエクソンを欠く全長遺伝子を作製し、その後、このエクソンを従来の分子生物学の技術を用いて該構築物中に組み込む。
【０２０７】
新鮮な生検：冷凍生検からの必要量の組織の抽出
生検の画分を、ＲＮＡ精製および間質液抽出に使用する。生物材料の残りを、将来の参照分析または追加の分析（免疫組織化学検査（ＩＨＣ）、ＦＩＳＨなど）のために貯蔵する。
【０２０８】
間質液（ＩＦ）の抽出
腫瘍細胞によって分泌され、抗癌薬への耐性を付与し得る物質の存在を検出するために、テスト細胞に対するアゴニストとしての後の使用のために、以下に詳述される通り抽出された間質液（ＩＦ）を貯蔵する。
【０２０９】
組織試料をガラス繊維フィルター付きカラム内で、４℃および１５００ｇで７分間遠心分離することによって、ＩＦ抽出を実施する。その後、該液体をカラムの底部から新しいチューブに採取する。
【０２１０】
ｍＲＮＡの抽出
試料から抽出されたｍＲＮＡは、患者由来のマーカ（ＰＤＭ）、即ち、既知の発癌遺伝子であり、細胞に発癌遺伝子特性をもたらす変異を潜在的に保有する遺伝子（ドライバー変異を保有する可能性のある遺伝子）の増幅のために必要である。テストされる例示的遺伝子としては、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＧＦＢＲ２、ＦＢＸＷ７、ＭＹＣ、ＬＫＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＣＦ７Ｌ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＡＲ、ＰＲ、ＥＳＲ１、ＤＤＲ２、ＭＥＫ１、およびＭＥＫ２が挙げられる。
【０２１１】
ＲＮＡ抽出を、グアニジウム−塩化セシウム法、グアニジウム酸（Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  Ａｃｉｄ）−フェノール法およびカオトロピック塩の存在下で核酸に結合するガラス繊維フィルターを含む、当技術分野で公知の方法によって、そして／または市販のキット（製造業者の使用説明書によるＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット、カタログ番号７４１０６など）の使用によって実施する。
【０２１２】
ｃＤＮＡの作製
ＰＤＭの増幅を可能にするために、組織から抽出されたｍＲＮＡに基づいてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡを、テンプレートｍＲＮＡに基づき、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー、ランダムヘキサマープライマー、または特異的プライマーを用いて合成する。例示的なプロトコルとしては、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘプロトコル（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８０８０−０５１）の使用が挙げられる。
【０２１３】
テストＰＤＭの作製
テストＰＤＭの作製は、選択されたＰＤＭの増幅、およびアッセイ細胞での適正な発現を可能にするための追加的エレメントの付着、の２つのステップで実施される。
【０２１４】
直接的アプローチでは、増幅されるテストＰＤＭに関連するオリゴヌクレオチドを含む予備ＰＣＲ反応を実施して、ｃＤＮＡ試料中のこれらの選択された遺伝子の過剰提示を可能にする。間接的アプローチでは、特異的テストＰＤＭの配列に基づいてテストＰＤＭを人工的に合成し、この人工ＰＤＭを適切なプライマーを用いたＰＣＲ反応のテンプレートとして用いることができる。
【０２１５】
幾つかの実施例において、増幅される各遺伝子について別々のウェル／チューブにｃＤＮＡ試料を分取する。
【０２１６】
各ＰＤＭ用に設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を実施し、ｃＤＮＡライブラリから選択されたＰＤＭ遺伝子、または人工的に作製されたテンプレートＰＤＭに基づいて選択されたＰＤＭ遺伝子を増幅する。
【０２１７】
以下のテストＰＤＭのＰＣＲ増幅のために、以下のプライマーセットを用いる（表１）。
【表１】
2017522030.tif 000002
【０２１８】
ＰＤＭ遺伝子領域が増幅されたら、第２のＰＣＲ反応を実施して、各ＰＤＭ遺伝子配列の５’末端にプロモータ（ＣＭＶなどの構成型プロモータまたはテトラサイクリンプロモータなどの誘導型プロモータのいずれか）を付加し、３’末端にＩＲＥＳと、それに続いて蛍光レポータ遺伝子（指定された通りＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、または任意の他のレポータ遺伝子など）を付加する。
【０２１９】
幾つかの実施例において、プロモータおよびＩＲＥＳ＋蛍光レポータエレメントの付加を、分子生物学クローニングツールにより、ＰＣＲアプローチ、ライゲーション酵素または組換えアプローチ（それぞれ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼまたはＩｎＦｕｓｉｏｎ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）など）による所望のエレメントへのＰＣＲ産物の融合によって実施する。
【０２２０】
全長核酸分子が形成されたら（即ち、５’プロモータ−ＰＤＭ−３’ＩＲＥＳ＋レポータ（またはこれらのエレメントの任意の他の順序））、ＰＣＲ反応を用いた増幅を実施して、細胞へのトランスフェクションに十分な量の核酸分子を得る。
【０２２１】
場合により、核酸分子の増幅は、適切な発現ベクターへの全長核酸分子のライゲーションおよび細菌の形質転換によって実現する。このように形成されたプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットなどの標準的なプラスミド抽出キットを用いて抽出する。場合により、様々なＰＤＭの直鎖状ＰＣＲ断片を、テスト細胞へのトランスフェクションに使用する。
【０２２２】
ＦＴＲの作製
以下のプライマーセットを、以下のＦＴＲの標的部分のＰＣＲ増幅に使用した（表２）：
【表２】
2017522030.tif 000003
【０２２３】
発現構築物のトランスフェクション（ＦＴＲおよびＰＤＭ混合物）
予め設計されたマトリックスに従って、分析に用いられる各レポータ遺伝子（ＦＴＲ）を、先に記載された通り調製された対照の野生型ＰＤＭ遺伝子またテストＰＤＭ遺伝子のいずれかと混合し、適切なトランスフェクション試薬と混合する。
【０２２４】
１つの選択肢では、トランスフェクション混合物を適切な固体担体基板上に配置し、場合により脱水する。様々な設定において、基板としては、顕微鏡スライド、チップ、細胞培養プレート、マルチプレートのウェル、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなどの様々な固体基板が挙げられる。各混合物を、指定された追跡可能な場所／スポット（即ち、指定されたウェル、またはスライドもしくはチップ上の指定された位置）に配置する。基板上のトランスフェクション混合物に、一定数の細胞（基板の型に依存し、先に記載された通り、約１００〜１００，０００個の範囲内）を、通常の完全増殖培地中で、各スポット上に分注する。細胞は、テストＰＤＭおよびアッセイに基づいて、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＣＩ６０細胞、例えばＡ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９など、または任意の他の適切な細胞株から選択される。テスト細胞を固体基板上に配置し、細胞の型、増殖培地およびトランスフェクション条件に応じて１２〜４８時間インキュベートする。インキュベーション時間によって、細胞が基板に接着し、ＦＴＲおよびＰＤＭが導入および発現する。
【０２２５】
別の選択肢では、細胞を予め設計されたマトリックスに従って固体基板上に播種する（指定された、追跡可能な場所／スポット（即ち、指定されたウェル、またはスライドもしくはチップ上の指定された位置）に）。所定時間の後、細胞を適切なトランスフェクション条件下で、ＦＴＲおよび適切なＰＤＭ（ＷＴ  ＰＤＭまたはテストＰＤＭ）でトランスフェクトする。ＦＴＲおよび適切なＰＤＭは、２つの別の分子上に、または両方の遺伝子をコードする単一分子上に配置することができる。
【０２２６】
アッセイの実行：誘導型プロモータ
レポータＦＴＲの十分な発現後、増殖培地を低血清培地と交換して（培地中に存在する任意の増殖因子／リガンドを除去するため）、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
【０２２７】
シグナル伝達レベルが著しく低下したら（４〜１６時間以内）、ＰＤＭ発現の誘導を開始する。これは、テトラサイクリン誘導型プロモータを使用する場合にはテトラサイクリンの添加によって、そしてエクジソン誘導型プロモータを使用する場合にはエクジソンの添加によって実現される。
【０２２８】
幾つかの実施例において、間質液（ＩＦ）および／または抗癌薬を添加して、ＰＤＭの発現を誘導し、それによってＰＤＭに及ぼすＩＦまたは薬物の影響をテストする。
【０２２９】
アッセイの実行  −  構成型プロモータ
細胞におけるＦＴＲおよびＰＤＭの十分な発現後（両方とも構成型プロモータの制御下で）、増殖培地を低血清培地と交換して（培地中に存在する任意の増殖因子／リガンドを除去するため）、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
【０２３０】
幾つかの実施例において、間質液および／または抗癌薬を添加してＰＤＭの発現を誘導し、それによって、ＰＤＭに及ぼすＩＦまたは薬物の影響をテストする。
【０２３１】
画像の取得および解析
ＰＤＭの発現後（トランスフェクション後３０時間）に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回連続して洗浄することにより固定する。その後、スライドをカバースリップで覆い、対応する各ＦＴＲの局在を画像化する。
【０２３２】
対照の野生型細胞およびＰＤＭトランスフェクト細胞の両方における各ＦＴＲの画像解析を実施して、比較する。対照細胞対ＰＤＭトランスフェクト細胞におけるＦＴＲの局在化の差を定量し、それを用いて、テストＰＤＭの発癌性形態または野生型形態がテスト試料中に存在するか否かを決定する。定量は、ＩｍａｇｅＪなどの標準的な画像解析ソフトウエアを用いて実施する。
【０２３３】
アッセイ細胞としてＨｅＬａ細胞を用いる例示的アッセイ：
０日目：スライドを０．０１％のポリ−Ｌ−リシンで、室温（ＲＴ）にて５分間プレコーティングした後、滅菌水（ＤＤＷ）で洗浄する。水を吸引し、スライドを２時間乾燥させる。ＨｅＬａ細胞（１５０００細胞）を、各ウェルにつき２００μ１の完全培地（完全培地：ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ））中で播種する。
【０２３４】
１日目：トランスフェクション試薬（ＦｕｇｅｎｅＨＤ試薬（Ｐｒｏｍｅｇｅ、カタログ番号Ｅ２３１１）をＲＴに加温し、ボルテックス処理する。各ウェルについて、チューブ内にＰＤＭ発現構築物を５０／１００／２００ｎｇ；適切なＦＴＲ発現構築物を５０／１００ｎｇ；Ｏｐｔｉｍｅｍ緩衝液（総量１０μｌまで）およびＦｕｇｅｎｅＨＤ（各３μｇのＤＮＡに対して１μｌ）を含むトランスフェクション混合物を、チューブ内で調製する。トランスフェクション混合物を、室温で１５分間インキュベートする。細胞培地をウェルから吸引し、各ウェルに１００μｌのトランスフェクション培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、抗生物質不含）を補充する。トランスフェクション混合物１０μｌを各ウェルに添加する。その後、細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。６８時間後、培地を飢餓培地１（０．１％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）と交換し、細胞を３７℃の加湿インキュベータにて５％ＣＯ２でインキュベートする。薬物／化学的阻害剤の２４時間インキュベーションを要するアッセイでは、該薬物／阻害剤を必要な濃度で添加する。
【０２３５】
薬物とのインキュベーションを要するアッセイでは、必要となる薬物を補充された飢餓培地２で、培地を交換する。その後、細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。加えて、薬物のより短いインキュベーションが必要な場合、それを実施することができる。
【０２３６】
２日目：２６時間後（即ち、細胞固定の４時間前）に、培地を飢餓培地２（１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ）に交換する。その後、細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。
【０２３７】
シグナル伝達の誘導を要するアッセイでは、必要に応じて誘導物質を補充された飢餓培地２で、培地を交換する。その後、細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中、７℃でインキュベートする。加えて、薬物のより短いインキュベーションが必要な場合、それを実施することができる。
【０２３８】
トランスフェクション後３０時間目に、細胞を以下の工程により固定する（全てのステップを室温で行う）：細胞をＰＢＳで３回洗浄する。固定溶液（ＰＢＳ中５％グルコース／４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ））で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄する。場合により、細胞をＤＡＰＩ溶液で染色し、その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
【０２３９】
実施例１：ＥＲＫ１／２経路の細胞下トランスロケーションアッセイはＷＴと変異体ＢＲＡＦを識別することができ、定量的手法でＢＲＡＦドライバー変異を同定することができる
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）共にＷＴ  ＰＤＭ（ＢＲＡＦ−ＷＴ）または指示された変異ＰＤＭ（以下の変異の１つを保有する変異ＢＲＡＦ：既知のドライバー変異Ｇ４６４Ｖまたは（ｏｒｖ）Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦのキナーゼドメイン内に存在する機能的に未知の変異Ｉ５５４Ｔ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。総括すると、結果から、２種の機能が既知の変異（Ｇ４６４ＶおよびＶ６００Ｅ）が、ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路を活性化することが示される（図２Ａ）。結果はさらに、機能的に未知の変異（Ｉ５４４Ｔ）もまたテストシグナル伝達経路を活性化することを示しており、これが発癌性変異であることが示される。その上、ＥＲＫ２をＦＴＲとして用いた場合に、機能的に未知のＩ５４４Ｔ変異を保有する変異ＢＲＡＦによる活性化レベルが、Ｇ４６４Ｖ変異よりも活性があると過去に報告された既知のＶ６００Ｅ変異を保有するＢＲＡＦで観察されたものと同程度に高い。
【０２４０】
したがって本明細書に開示された方法を用いることによって、ＢＲＡＦ変異体（Ｉ５４４Ｔ）が、異常なシグナル伝達経路を誘導し得る機能的に活性の変異体であると同定され、ＦＴＲの細胞下トランスロケーションのグレード上昇は、ＢＲＡＦ発癌性変異の重度と相関する。
【０２４１】
実施例２：細胞下トランスロケーションアッセイはＷＴと変異体ＥＧＦＲとの識別およびＥＧＦＲ変異の重症度のグレード分類を可能にする
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲと共に、ＷＴ  ＰＤＭ（ＥＧＦＲ−ＷＴ）または示された変異ＰＤＭ（以下の変異の１つを保有する変異ＥＧＦＲ：既知のドライバー変異Ｇ７１９、Ｌ８６１Ｑ、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｄｅｌまたは３つの既知ドライバー変異Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０Ｍ（小分子ＥＧＦＲ阻害剤への耐性を付与することで知られる）およびＬ８６１Ｑを含む変異体）でトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図３Ａ、４Ａおよび５Ｂに示す。図３Ａでは、ＦＴＲはＡＫＴ１であり、Ｆ４Ａでは、ＦＴＲはＪＮＫ１である。図５Ｂは、ＷＴと比較してＮ：Ｃ比の差（デルタＮ：Ｃ比）として表した、３つの異なる経路に沿った４つの変異の比較を強調したものである。総括すると結果から、ＡＫＴ１をＦＴＲとして用いた場合（図３Ａ）、ＪＮＫ１をＦＴＲとして用いた場合（図４Ａ）、またはＪＮＫ２、ＥＲＫ２およびＳＴＡＴ３の場合（図５Ｂ）、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、ＦＴＲの細胞下トランスロケーションのグレードの上昇が、ＥＧＦＲ発癌性変異の重度に相関する。
【０２４２】
実施例３：細胞下トランスロケーションアッセイはＥＲＢＢ２変異の重症度のグレード分類を可能にする
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＪＮＫ２、ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３またはＰ３８と共に、ＷＴ  ＰＤＭまたは示された変異ＰＤＭ（ＥＲＢＢ２  Ｖ８４２Ｉ、Ｖ７７７Ｌ、Ｓ３１０Ｆ、Ｌ７５５Ｓ、Ｄ７６９Ｙ、Ａ１１７０Ｐ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定し（Ｎ：Ｃ比）、ＷＴと比較してＮ：Ｃ比の差（デルタＮ：Ｃ比）として表している。図６Ｂに表された結果は、４つの異なる経路に沿った６つの変異の比較を強調したものである。
【０２４３】
総括すると結果から、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、ＦＴＲの細胞下トランスロケーションのグレード上昇が、ＥＲＢＢ２発癌性変異の重度に相関する。
【０２４４】
実施例４：細胞下トランスロケーションアッセイはｃＫＩＴ変異の重症度のグレード分類を可能にする
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３、ＪＮＫ２、ＲＥＬ−ＡまたはＰ３８と共に、ＷＴ  ＰＤＭまたは示された変異ＰＤＭ（ｃＫＩＴ  Ｋ６４２Ｅ、Ｗ５５７−Ｋ５５８ｄｅｌ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定し（Ｎ：Ｃ比）、ＷＴと比較してＮ：Ｃ比の差（デルタＮ：Ｃ比）として表している。図７Ｂに表された結果は、５つの異なる経路に沿った２つの変異の比較を強調したものである。
【０２４５】
総括すると結果から、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、ＦＴＲの細胞下トランスロケーションのグレード上昇が、ｃＫＩＴ発癌性変異の重度に相関する。
【０２４６】
実施例５：細胞下トランスロケーションアッセイはＫＲＡＳ変異の重症度のグレード分類を可能にする
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＦＯＸＯ３ａ、ＪＮＫ２、ＥＲＫ２またはＲＥＬ−Ａと共に、ＷＴ  ＰＤＭまたは示された変異ＰＤＭ（ＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｈ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ａ１４６Ｖ、Ａ１４６Ｔ、Ｇ１３Ｄ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定し（Ｎ：Ｃ比）、ＷＴと比較してＮ：Ｃ比の差（デルタＮ：Ｃ比）として表した。図８Ｂに表された結果は、４つの異なる経路に沿った１０の変異の比較を強調したものである。総括すると結果から、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、ＦＴＲの細胞下トランスロケーションのグレード上昇が、ＫＲＡＳ発癌性変異の重度に相関する。
【０２４７】
実施例６：細胞下トランスロケーションアッセイはＰＩＫ３ＣＡ変異の重症度のグレード分類を可能にする
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＫＯＧ１、Ｐ３８、ＳＴＡＴ３またはＲＥＬ−Ａと共に、ＷＴ  ＰＤＭまたは示された変異ＰＤＭ（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｙ１０２１Ｃ、Ｖ３４４Ａ、Ｒ３８Ｈ、Ｑ５４６Ｌ、Ｎ３４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｅ５７９Ｋ、Ｅ５４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｃ４２０Ｒ、Ｒ８８Ｑ／Ｄ３５０Ｇ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定し（Ｎ：Ｃ比）、ＷＴと比較してＮ：Ｃ比の差（デルタＮ：Ｃ比）として表している。図９Ｂに表された結果は、４つの異なる経路に沿った１２の変異の比較を強調したものである。総括すると結果から、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、ＦＴＲの細胞下トランスロケーションのグレード上昇が、ＰＩＫ３ＣＡ発癌性変異の重度に相関する。
【０２４８】
実施例７：細胞下トランスロケーションアッセイはＢＲＡＦ変異の重症度のグレード分類を可能にする
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２、ＪＮＫ２またはＲＥＬ−Ａと共に、ＷＴ  ＰＤＭまたは示された変異ＰＤＭ（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６８Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６６Ｅ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定し（Ｎ：Ｃ比）、ＷＴと比較してＮ：Ｃ比の差（デルタＮ：Ｃ比）として表した。図１０Ｂに表された結果は、３つの異なる経路に沿った６つの変異の比較を強調したものである。総括すると結果から、活性化レベルが、異なる変異体によって変動することが示される。したがって本明細書に開示された方法を利用することにより、ＦＴＲの細胞下トランスロケーションのグレード上昇が、ＢＲＡＦ発癌性変異の重度に相関する。
【０２４９】
実施例８：細胞下トランスロケーションアッセイは異なる経路でのＥＧＦＲとＫＲＡＳとの間の優性変異の測定を可能にする
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ：ＥＲＫ２、ＪＮＫ２またはＲＥＬ−Ａと共に、ＷＴ  ＥＧＦＲ  ＰＤＭもしくはＫＲＡＳ  ＰＤＭまたは示された変異ＰＤＭ（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８６１Ｑ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比（Ｎ：Ｃ比）を測定した。図１１Ｂ、図１１Ｃおよび図１１Ｄに示された結果から、各変異が、ＥＲＫ１／２経路に別々に影響を及ぼし、ＥＧＦＲとＫＲＡＳの両変異を合わせると、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異がＫＲＡＳ変異に対して優性であるが（Ｇ１２Ｖはわずかに付加的作用を有する）、ＫＲＡＳ変異がＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異よりも優性であることが明らかである。第二の経路ＮＦｋＢを測定すると（図１２Ｂ、図１２Ｃおよび図１２Ｄ）、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異は優性であるが、Ｌ８６１Ｑから、この経路の場合に、ＫＲＡＳ変異がＥＧＦＲ変異の次であることが示唆される。最後にＪＮＫ経路を測定すると、図１３Ｂ、図１３Ｃおよび図１３Ｄに示された結果から、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異がＫＲＡＳ変異よりも優性であるがＫＲＡＳ変異体がＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ変異よりも優性であることが示される。まとめると、ＫＲＡＳに直接つながる経路は、ＥＧＦＲ変異体と比較して優性の差を示すが、ＥＧＦＲ特異的経路は、ＫＲＡＳ変異の精密さによる影響を受けないことが示される。この結果は、本明細書に開示された方法を用いると、テストした遺伝子の組み合わせによって、それらの活性と、優性、重要性、または他の変異との相互作用に関してさらなる洞察が得られることを実証している。
【０２５０】
実施例９：細胞下トランスロケーションアッセイは異なる経路でのＥＲＢＢ２とＢＲＡＦとの間の優性変異の測定を可能にする
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ：ＥＲＫ２と共に、ＷＴ  ＥＲＢＢ２  ＰＤＭもしくはＢＲＡＦ  ＰＤＭまたは示された変異ＰＤＭ（ＥＲＢＢ２  Ｌ７５５Ｓ、Ｖ７７７Ｌ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比（Ｎ：Ｃ比）を測定した。図１４Ｂおよび図１４Ｃに示された結果から、ＢＲＡＦ変異体がＥＲＫ１／２経路に影響を及ぼすが、ＥＲＢＢ２変異体が有意に活性でないことが示される。ＥＲＢＢ２とＢＲＡＦの両変異を合わせると、図１４Ｄに示された結果から、ＥＲＢＢ２  Ｖ７７７Ｌ／ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の組み合わせを除き、ＥＲＢＢ２の存在がＢＲＡＦ変異体の影響をある程度まで低減することが明らかである。それゆえＥＲＫ１／２経路は、ＥＲＢＢ２およびＢＲＡＦ変異の組み合わせによって異なる程度に影響を受ける。これらの結果は、本明細書に開示された方法を用いると、テストした遺伝子の組み合わせによって、それらの活性およびそれらの間の相互作用に関してさらなる洞察が得られることを実証している。
【０２５１】
実施例１０：発癌性指数の例示的計算（無増悪生存指数、全生存指数、薬物応答の確率）
以下の例示的発癌性指数を作成するために用いられる方法は、中でもマシンラーニング技術を用いている。計算の第一のステップは、正規化ステップ（前処理）である。正規化ステップに続いて、様々な生物学的アッセイのアウトプット（即ち、本明細書に開示された方法およびシステムによる患者の遺伝子のテストおよびその活性化レベルの測定）から得られた実際の結果を臨床関連指数に写像する関数を学習する適切なマシンラーニング法を行うことができる。
【０２５２】
以下の実施例では、様々な計算のアウトプットが、発癌性指数である。指数のタイプは、指数を作成するために提供されたインプット（データ）に依存する。例えば、患者特有の遺伝子の生物学的アッセイのアウトプットを、観察された無増悪生存と共に用いた場合に、得られた指数は、無増悪生存指数である（即ち、作成された指数は患者特有の変異に基づき、患者の無増悪生存を示す／予測する）。同様に、インプット（データ）が、測定された病院での薬物応答と共に、薬物の存在下および非存在下での患者特有の遺伝子の生物学的アッセイのアウトプットである場合には、得られた指数は、薬物応答の指標／予測変数である。
【０２５３】
正規化：先に詳述された通り、用いられた方法およびシステムは、患者特有の変異および変異されたシグナル伝達経路の活性化レベルの測定を可能にする。該活性化レベルは、本明細書に開示された方法によって測定および決定される核／細胞質比（ＮＣＲ）の単位で表され得る。この実施例において、野生型（ＷＴ）参照の未処理ＮＣＲは、参照値（例えば、０）に任意に設定され、テストされたＰＤＭの測定ＮＣＲ（「テストＮＣＲ」）のそれぞれは、このＷＴ参照に対する相対的な値が与えられる。例えば、特定の患者腫瘍切片では、参照ＷＴ遺伝子ＸのＮＣＲが１．４であることが見出され、テスト遺伝子ＸのＮＣＲが２．１であることが見出された場合、遺伝子Ｘの報告された値は、０．７である（即ち、２．１−１．４）。同様に、各測定されたテストＮＣＲは、関連の固定された参照に相対的であり得、その単位に正規化され得る（即ちその結果、参照は、常に１００になる）。例えば、例示的ＰＤＭ−ＦＴＲ対のＫＲＡＳ−ＥＲＫの場合、ＫＲＡＳ−ＷＴ−ＥＲＫの値が１．４であり、患者ＫＲＡＳ−ＥＲＫ値が１．７であれば、ＫＲＡＳ＿ＷＴ−ＥＲＫは、１００に正規化することができ、患者ＫＲＡＳ−ＥＲＫ対は、それに応じて値１２１を与えられる（１２１＝１．７／１．４＊１００）。
【０２５４】
したがって、生物学的アッセイの正規化されたアウトプットは、様々な適切なマシンラーニング技術のインプットとして用いられ得る。例示的技術を、以下に記載する。
【０２５５】
相関単変量／多変量解析：正規化されたデータを用いて、特定のシグナル伝達経路の活性化レベルと、例えば患者の応答との相関を解析することができる。標準の統計法を適用して、単変量解析での活性化と有益な患者応答との相関が統計学的に有意になるそれらの経路を同定する。これらの経路は、既存の臨床状態がある場合には、その転帰のマーカである。多変量解析は、遺伝子および／または経路のセットを同定するために適用され、その活性レベルは、組み合わせで用いられた場合には、該セットを構成する個々の遺伝子／経路よりも良好な転帰マーカ（患者の応答）である。さらに、癌の分子病理学の特定の態様に関連することが知られている、またはそれが疑われる遺伝子／経路の群を定義することが可能である。遺伝子／経路は、癌の分子生物学の特定の態様において既知の、もしくは疑われる役割に基づいて、または特定の群に既に割り付けられている別の遺伝子／経路との同時活性化に基づいて、特定の群に割り付けることができる。
【０２５６】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）：正規化ステップの後、活性化パターンを臨床的関連性の群および亜群に分類し得るＳＶＭに、データを提供する。ＳＶＭは、カーネルを利用して、活性化レベルをより高次元の空間に写像し、異なる群の活性化レベルを分離する超平面を同定し得る。カーネル（以下の式のＫ）の例としては、非限定的に線形、多項式、ガウス放射基底関数、双曲線タンジェント、または任意の他の非線形関数などのカーネルを挙げることができる。
【０２５７】
幾つかのトレーニングデータＤを設定すると、ｎ個のセットの場合の式は：
【数１】
2017522030.tif 000004
（式中、ｙは、ポイントｘが属する臨床転帰の応答変数（応答者対非応答者など）でありる。Ｘは、生物学的アッセイの正規化されたアウトプットのベクトル（本明細書に記載された通り）であり、特定の患者で観察された活性レベル全ての高次元の表記である）。ＳＶＭは、以下の最適化問題に変わる：
【数２】
2017522030.tif 000005
（式中、量は、複数の拘束、具体的には：
【数３】
2017522030.tif 000006
および
【数４】
2017522030.tif 000007
に供されたαに関して最大になる）
【０２５８】
最適化問題の最終結果は、αの：
【数５】
2017522030.tif 000008
によって定義される超平面である。
【０２５９】
この超平面は、患者の活性化の空間を２つの応答分類（応答患者と非応答患者）に分別する。ＳＶＭへの自然な適用は、二項式分類であるが、多クラスＳＶＭを用いて、分類のより高度の分割およびより多くの応答特性を加えることができる。例えば正規化されたデータを用いて、遺伝子／経路のセットの活性化レベルに基づいて患者の予後の群（即ち、無増悪生存：分類Ａ  １〜３ヶ月、分類Ｂ  ４〜６ヶ月、分類Ｃ  ７〜９ヶ月など）に分類することができる。ＳＶＭは、正規化された活性化データを、トレーニングセットＤにおける各患者の観察された分類と共にトレーニングされる。ＳＶＭを再トレーニングして、さらなるデータを含むように変えることができる。
【０２６０】
一般化線形モデル（ＧＬＭ）：正規化ステップ（先の通り）の後、データが臨床関連性を予測し得るＧＬＭに送られる。ＧＬＭは、カーネルを利用して、線形回帰、ロジスティック回帰およびポアソン回帰をはじめとする様々な他の統計モデルを統一して、活性化レベルを臨床関連性変数の結果に写像する。
【０２６１】
依存的変数（即ち、指数）の予測値は、以下の式の線形予測変数Ｘβに関するリンク関数ｇ（）として表される：
【数６】
2017522030.tif 000009
（式中、Ｘは、共変動全てのベクトルであり、βは、該共変動変数それぞれに「有意性」を割り付けるために、例から学習する必要がある未知のパラメータのベクトルである）。リンク関数は、例えば非限定的に正規、指数、ガンマ、逆ガウス、ポアソンなどの多くの形態をとることができる。リンク関数の選択は、観察されたデータと、得られた指数の考察によって決定される。
【０２６２】
幾つかの実施例において、未知の重みのベクトルβは、例えばニュートン・ラフソン法を用いるなど、多くの技術による最尤推定の最適化を利用して見出すことができる。
【０２６３】
ベクトルβが見出されたら、生物学的アッセイの新しい正規化アウトプットを式に加えることができ、得られた数字は臨床指数である。
【０２６４】
一実施例として、活性化レベルのベクトルは、生物学的アッセイによって決定される：ＫＲＡＳ−ＥＲＫ、ＫＲＡＳ−ＦＯＸＯ３、ＫＲＡＳ−ＲｅｌＡ、ＰＩ３Ｋ−ＦＯＸＯ３、ＰＩ３Ｋ−ＲｅｌＡ、ＥＧＦＲ−ＳＴＡＴ３、ＥＧＦＲ−ＥＲＫ、ＥＧＦＲ−ＦＯＸＯ３、ＥＧＦＲ−ＲｅｌＡ。観察のこのベクトルの正規化された転帰は、［１１０，１６０，１００，８０，８０，１６０，１００，１００，１００］になることができ、未知の重みのベクトルは、β＝［０．００１７，０．００３３，０．００５３，０．０００２，０．０００２，０．００３３，０．００６７，０．００６７  ０］として学習することができる。指数リンク関数を用いると、予測された指数２３．１８１０が作成される。
【０２６５】
学習されたβパラメータが、無増悪生存（例えば１週間での）の応答変数を用いて学習された場合、指数２３．１８は、テストされた患者で約２３日という推定の無増悪生存を示している。
【０２６６】
実施例１１：例示的発癌指数（メディアン無増悪生存予測変数）の作成
この例示的指数を作成するために、以下の計算およびアルゴリズムを用いる：
【数７】
2017522030.tif 000010
ＯＩ  −  発癌性指数（メディアン無増悪生存の予測変数）
Ａ  −  各ＰＤＭと各ＦＴＲの間の正規化された活性化マトリックス
Ｗ  −  各ＰＤＭとＦＴＲの間の重みマトリックス。マシンラーニングされている（得られた生物学的結果と入手できた臨床データのフィッティング）。
【０２６７】
これは、先に記載された一般化線形モデル（ＧＬＭ）の、例としての一具現化である。この実施例では、用いられたリンク関数は、恒等関数（簡便さのために）であり、測定された活性化レベルの正規化は、絶対値演算子を含む。
【０２６８】
この例では、以下のＰＤＭとＦＴＲのセットの活性化を測定した。
【０２６９】
テストされたＰＤＭは、ＥＧＦＲ  Ｌ８６１ＱおよびＬ８５８Ｒである。テストされたＦＴＲは、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｐ３８ｂである。
【０２７０】
得られた正規化された活性化レベルは、
Ａｉ，ｊ，＝
【表３】
2017522030.tif 000011
【０２７１】
この結果は、Ｌ８６１Ｑ変異を保有するＥＧＦＲ遺伝子がＦＴＲ：ＪＮＫ２、ＪＮＫ１、ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３、Ｐ３８ｂでそれぞれ０．０６、０．１１、０．１４、０．１６、０．０７の正規化された活性化を起こしたことを示している。この結果は、本明細書に開示された方法によって測定された各ＦＴＲで０．１３、０、０．２１、０．４、０．２５の正規化された活性化を起こしたことを示している。
【０２７２】
この活性化レベルを用いて、これらの特有の変異を有する患者で観察されたメディアン無増悪生存の応答変数と共に該システムをトレーニングした。パラメータＷの得られた学習されたベクトルは、
Ｗｉ，ｊ，＝
【表４】
2017522030.tif 000012
【０２７３】
こうして得られた指数（即ち、患者で予測されたメディアン無増悪生存の指数）は、以下のことを示している。
【０２７４】
ＥＧＦＲ遺伝子にＬ８６１Ｑ変異を有する患者で予測されるメディアン無増悪生存の推定値は、８．０３ヶ月である。この値は、当該技術分野で観察された８．１ヶ月という値と同等である（Ｃｈｉｕ，  Ｃｈａｏ−Ｈｕａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０  ７９３−７９９）。
【０２７５】
ＥＧＦＲ遺伝子にＬ８５８Ｒ変異を有する患者で予測されるメディアン無増悪生存の推定値は、１０．４ヶ月である。この値は、当該技術分野で観察された１０．８ヶ月と同等である（Ｒｏｓｅｌｌ，  Ｒａｆａｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），  Ｔｈｅ  ｌａｎｃｅｔ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １３．３  （２０１２）：  ２３９−２４６）。
【０２７６】
したがって、本明細書で示された結果は、本明細書に開示された方法およびシステムによって作成された発癌性指数が、感度がありかつ正確で、実際にテストされた変異および一般患者の状態の発癌性の度合い、ならびにその予後について信頼性のある評価を提供するために用いることができることを示している。
【０２７７】
具体的実施形態の前述の説明は、本発明の一般的性質を極めて完全に明示しているため、現在の知識を適用することによって、過度の実験を行わず、かつ一般的概念から逸脱せずに、他者がそのような具体的実施形態を即座に改良し、そして／または様々な適用例に適合させることができ、それゆえそのような適合および改良は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲に含まれると解釈されなければならず、そしてそのことを意図するものである。本発明を具体的実施形態と共に記載したが、多くの代替例、改良および変更が当業者に明白になることは明らかである。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲の主旨および範囲に含まれるそのような代替例、改良および変更の全てを包含するものとする。
【図１】
2017522030.tif 000013
【図２Ａ】
2017522030.tif 000014
【図２Ｂ】
2017522030.tif 000015
【図３Ａ】
2017522030.tif 000016
【図３Ｂ】
2017522030.tif 000017
【図４Ａ】
2017522030.tif 000018
【図４Ｂ】
2017522030.tif 000019
【図５Ａ】
2017522030.tif 000020
【図５Ｂ】
2017522030.tif 000021
【図６Ａ】
2017522030.tif 000022
【図６Ｂ】
2017522030.tif 000023
【図７Ａ】
2017522030.tif 000024
【図７Ｂ】
2017522030.tif 000025
【図８Ａ】
2017522030.tif 000026
【図８Ｂ】
2017522030.tif 000027
【図９Ａ】
2017522030.tif 000028
【図９Ｂ】
2017522030.tif 000029
【図１０Ａ】
2017522030.tif 000030
【図１０Ｂ】
2017522030.tif 000031
【図１１Ａ】
2017522030.tif 000032
【図１１Ｂ】
2017522030.tif 000033
【図１１Ｃ】
2017522030.tif 000034
【図１１Ｄ】
2017522030.tif 000035
【図１２Ａ】
2017522030.tif 000036
【図１２Ｂ】
2017522030.tif 000037
【図１２Ｃ】
2017522030.tif 000038
【図１２Ｄ】
2017522030.tif 000039
【図１３Ａ】
2017522030.tif 000040
【図１３Ｂ】
2017522030.tif 000041
【図１３Ｃ】
2017522030.tif 000042
【図１３Ｄ】
2017522030.tif 000043
【図１４Ａ】
2017522030.tif 000044
【図１４Ｂ】
2017522030.tif 000045
【図１４Ｃ】
2017522030.tif 000046
【図１４Ｄ】
2017522030.tif 000047
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月27日(2017.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017522030000001.app
【国際調査報告】
2017522030.tif 000048
2017522030.tif 000049
2017522030.tif 000050