(57)【要約】本発明は、植物化学物質に標準化されたバンジロウ葉抽出物を得る方法を提供する。得られる抽出物は水に対する溶解性が高く、食品および飲料製品に使用できる標準化された植物化学物質、たとえばグアイジャベリン、特にサポニンおよびポリフェノールを含む。本方法は、高度に精製された形態の植物化学物質を得るために特定の濾過方法を含む。得られた抽出物は、生物活性誘導分画に供して様々な化合物を単離し、植物化学物質の濃縮画分を得、続いて濃縮された生物活性画分から単一の植物化学物質の精製および単離を行う。植物化学物質は、抗糖尿病活性も示すグアイジャベリンと特定される。バンジロウ葉抽出物は食料および飲料産業に有用であり、チョコレート、カプセル、および水溶液を用いたサプリメントドリンクなど様々な配合物に使用される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性バンジロウ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）葉抽出物を調製するための方法であって、前記方法は、
ａ．乾燥させ、洗浄されたバンジロウ葉を、０．２ｍｍメッシュを用いて均一な大きさの粗粉末に粉砕するステップ（２０１）；
ｂ．前記粗粉末を、７０℃以下の温度で３時間、ヒドロアルコールにて抽出するステップ（２０２）；
ｃ．液状抽出物を約１００メッシュサイズの目の細かい濾布で濾過するステップ（２０３）；
ｄ．前記ヒドロアルコールを完全に除去するために前記濾過した透明な抽出物を蒸発させ、濃縮した前記抽出物を３０％の１つまたは複数の総溶解固形分で調整するステップ（２０４）；
ｅ．前記濃縮した濾過抽出物を、４℃で１２〜１８時間低温沈殿に供して濃縮物として沈降させるステップ（２０５）；
ｆ．前記沈降した物質を分離するために高流量濾過床を用いて前記濃縮物を濾過するステップ（２０６）；
ｇ．薄茶色から褐色の粉末を得るために濾液抽出物を噴霧乾燥させるステップ（２０７）；
ｈ．前記乾燥させた粉末の抽出物を粉砕し、均一な大きさの流動性粉末を得るために篩い分けするステップ（２０８）；および
ｉ．前記抽出物について植物化学物質の存在を分析するステップ（２０９）
を含む方法。
【請求項２】
使用される前記ヒドロアルコールは７０：３０の割合のメタノールと水の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出物について植物化学物質を分析するステップはポリフェノール、サポニンおよびグアイジャベリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バンジロウ葉抽出物は、チョコレート、カプセルおよび水溶液を用いたサプリメントを含む１つまたは複数の形態の栄養補助食品、飲料製品、医薬品および栄養補給食品として有用である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
イザヨイバラ（Ｒｏｓａ  ｒｏｘｂｕｒｇｉｉ）（スイートチェストナットローズ（Ｓｗｅｅｔ  ｃｈｅｓｔｎｕｔ  ｒｏｓｅ））、黄杞（Ｅｎｇｅｌｈｅｒｄｔｉａ  ｃｈｉｎａｎｓｉｓ）（コウキ（Ｋｏｈｋｉ））およびハス（Ｎｅｌｕｍｂｅ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）を含む１つまたは複数のハーブ抽出物を含むバンジロウ葉抽出物は、肝臓保護活性、鎮咳活性および抗糖尿病活性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）を含むバンジロウ葉抽出物は抗糖尿病活性を示し、天然のアペタイザーおよびリフレッシャーとして作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
バンジロウ葉抽出物は、ハーブ煎じ液を含む水溶液を用いたハーブ飲料として有用であり、酸化防止剤および心保護薬として作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
バンジロウ葉抽出物から植物化学物質を単離する方法であって、前記方法は、
ａ．クロロホルム可溶性画分および水性抽出物を得るために、標準化された葉抽出物を脱イオン水に曝し、クロロホルムを用いて液分配に供するステップ（３０１）；
ｂ．酢酸エチル可溶性層および水性抽出物層を得るために、クロロホルム洗浄した水性抽出物を酢酸エチルで液分配するステップ（３０２）；
ｃ．乾燥させた粉末形態の酢酸エチル層を得るために、前記酢酸エチル層を回転蒸発器で蒸発させるステップ（３０３）；
ｄ．粒度７０〜２００ミクロンのシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、前記粉末形態の酢酸エチル層を亜分画するステップ（３０４）；および
ｅ．８５：１５の割合のクロロホルムおよびメタノールを用いたグラジエント溶出により、分離された植物化学物質を溶出するステップ（３０５）
を含む方法。
【請求項９】
前記植物化学物質の溶出は、各画分ごとに１００：１〜８５：１５の範囲の比率のクロロホルムおよびメチルアルコールを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより達成され、その結果、ケンフェロール−３−Ｏ−グリコシドおよびグアイジャベリンを含む１つまたは複数の画分が得られる、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
以下の明細書は、本発明および本発明を実施する方法を詳細に記載する。
【０００２】
本発明は、植物化学物質を含むグアバ（バンジロウ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ））葉抽出物の調製の方法に関し、さらに詳しくは食料および飲料分野に有用である、植物化学物質に標準化されたバンジロウ葉抽出物を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、不適切な食習慣により高血圧、糖尿病、脳梗塞および心疾患などの生活習慣に関連する疾患の発生が増加している。これらの疾患の流行は高齢世代だけでなく、若年世代にも見られており、重大な健康問題を提起している。多くの場合、こうした生活習慣関連疾患は、肥満と密接に関連していると指摘されている。したがって、生活習慣関連疾患の予防には、食事および身体運動の改善による肥満の処置および予防が重要である。
【０００４】
肥満を克服するため、多くのダイエット組成物が開示されている。しかしながら、これらの組成物は、適切にモニターしないと別の健康被害を誘発する化学化合物を含む。そこで、これらの疾患を、天然の植物化学物質を含むハーブ植物または様々な植物抽出物を用いて処置することが好ましい。植物化学物質は天然の供給源に由来しており、様々な疾患の処置用にますます検討されつつある。グアバ葉はそれらの１つである。
【０００５】
グアバとして一般に知られるバンジロウは、フトモモ科に属し、台湾および沖縄、インド等のような熱帯地域で育つ。バンジロウ葉抽出物は、多量のポリフェノール物質、タンニン物質、サポニン、エラグ酸グリコシド、フラボノイド等を含む。ある研究からは、抽出物がα−アミラーゼ阻害活性、および脂質ペルオキシドの形成を阻害する作用を示すことが明らかになった。その薬用成分により、バンジロウ葉サプリメントは現在、カプセル、栄養補助食品およびバンジロウ葉茶の形態で入手可能である。これは、薬および薬剤の使用に起因する副作用を回避するので、非常に有利である。
【０００６】
バンジロウ葉抽出物の単離、さらに治療目的での抽出物の使用のための、当該技術分野で入手可能な様々な方法がある。
【０００７】
「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ  ｌ．，  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」という名称の特許文献１には、胃腸機能に関連する神経系の機能障害が関係する多様な胃腸疾患の処置に有用な、グアバ植物由来、特にその葉由来の標準化された抽出物を含む植物薬物を抽出するプロセスが開示されている。本発明の臨床的に評価された植物薬物の抗菌特性、胃腸運動抑制特性、鎮痙特性、抗炎症特性、酸化防止特性および分泌抑制特性のほか、その無毒性により、胃腸機能の障害の処置のためにクリニックでのその使用が可能になる。上記のプロセスは、噴霧乾燥微粉末などの濾過法およびクロマトグラフ分離法を使用しない。上記のプロセスはまた、抽出された植物化合物ごとに、分離された画分の生物活性を調査するためのバイオアッセイ誘導分画（ｂｉｏ  ａｓｓａｙ  ｇｕｉｄｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）を行わない。
【０００８】
「Ｇｕａｖａ  ｅｘｔｒａｃｔ」という名称の特許文献２には、グアバ果実の抽出物の調製、単離および使用が開示されている。この抽出物は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに関連する、それにより引き起こされる、またはそれが介在する疾患または状態の処置に使用される。グアバ抽出物は、ペルタトシドおよびグアイジャベリン（ｇｕａｉｊａｖｅｒｉｎ）、イソケルセチンを含むケルセチン関連フラボノール配糖体を含む。グアバ抽出物は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を阻害するのに効果的であった。
【０００９】
このように当該技術分野の問題に目を向けると、有益な薬理学的特性を有するグアイジャベリン（ｇｕｉｊａｖａｒｉｎ）、サポニンおよびポリフェノールなど様々な植物化学物質に標準化された水溶性バンジロウ葉抽出物を調製する方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２１７２号
【特許文献２】国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３５０２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、従来技術の問題を解決し、グアイジャベリン、特にサポニンおよびポリフェノールなどの標準化された植物化学物質を含むバンジロウから葉抽出物を抽出する方法を提供する。本発明は、植物化学物質が濃縮された画分を得、続いて濃縮された生物活性画分から単一の植物化学物質を精製および単離するために、抽出物の生物活性誘導分画（ｂｉｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｇｕｉｄｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）を開示する。抽出物は、任意の食品および飲料製品に組み込むことができる。この抽出方法は、噴霧乾燥などの濾過法を利用するものであり、噴霧乾燥抽出物を得、これを粉砕し、篩い分けして均一な粒度の粉末を得る。噴霧乾燥粉末についてはポリフェノール、サポニンおよびグアイジャベリンの含量を分析する。様々な植物化学物質を含む抽出物は、様々な産業にとって有用である。
【００１２】
こうして得られたバンジロウ葉抽出物は、質およびその生物学的機能性が非常に安定している。バンジロウ葉抽出物は、大量の生物活性ポリフェノール、フラボノイド、アントシアニンおよびタンニンを有する。バンジロウ葉抽出物は、水溶液基剤または水に溶解後、高い安定性を示した。得られた抽出物は高い溶解性を示し、沈殿が少なかったため、カプセル、チョコレート、水溶液飲料、錠剤等の様々な形態の食料および栄養素サプリメントとして、さらにバンジロウを含む他の飲料および茶浸出液を生産するための原料製品または中間製品としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態または複数の実施形態によるグアイジャベリン、ケルセチンおよびイソケルセチンの化学構造を示す。
【図２】バンジロウ葉抽出物の抽出方法を図示する。
【図３】バンジロウ葉抽出物から植物化学物質を単離する方法を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特許請求の範囲に記載されている発明の主題をより明確かつ簡潔に記載して示すために、以下の書面による記載に使用される特定の用語について以下の定義を与える。
【００１５】
「抽出物」という用語は、文脈により、本明細書に記載の単離方法によって葉などの植物源から得られるグアバ抽出物組成物を意味する。
【００１６】
「植物化学物質」という用語は、グアイジャベリン、サポニン等の植物に天然に存在する化学化合物を意味する。
【００１７】
本発明は、グアイジャベリン（ｇｕａｊａｖａｒｉｎ）、ケルセチンおよびイソケルセチンなどの特定の植物化学物質に標準化され、高度に改良された水溶性バンジロウ葉抽出物を提供することにより従来技術の問題を解決する。これらの植物化学物質の化学構造はそれぞれ図１ａ、１ｂおよび１ｃに示す。本抽出プロセスにより、高含量の植物化学物質を有する抽出物が得られる。
【００１８】
ケルセチンは、柑橘類果実に見られるルチン、グアイジャベリンなどいくつかの植物化学物質のアグリコン形態である。ケルセチンは、炎症のいくつかの初期プロセスを直接阻害するため、著しい抗炎症活性が立証されている。たとえば、ケルセチンは、ヒスタミンおよび他のアレルギー／炎症性メディエーターの生成と放出との両方を阻害する。さらに、ケルセチンは、強力な酸化防止活性およびビタミンＣ節約作用を発揮する。
【００１９】
図２は、バンジロウ葉抽出物の抽出方法を図示する。方法（２００）は、乾燥させ、洗浄されたバンジロウ葉を、０．２ｍｍメッシュを用いて均一な大きさの粗粉末に粉砕するステップ（２０１）から始める。ステップ（２０２）では、下から上へ抽出溶媒を連続的に循環させたまま、粗粉末をヒドロアルコールで７０℃以下の温度にて３時間抽出する。使用されるヒドロアルコールは、メタノール（７０％）と水（３０％）との混合物であり、抽出は、円錐形のステンレス鋼抽出器で行う。ステップ（２０３）では、液状抽出物を約１００メッシュサイズの目の細かい濾布で濾過する。ステップ（２０４）では、濾過した透明な抽出物を濃縮または蒸発させて溶媒を完全に除去し、濃縮した抽出物を３０％の総溶解固形分で調整する。ステップ（２０５）では、濃縮した濾過抽出物を、４℃で１２〜１８時間、低温沈殿に供して、濃縮物を沈降させる。ステップ（２０６）では、沈降した物質を分離するために高流量濾過床を用いて、濃縮物を特定の濾過で濾過する。ステップ（２０７）では、濃縮した濾液抽出物を噴霧乾燥に供する。乾燥機の温度は、薄茶色から褐色の粉末を得るように確認を行い設定する。ステップ（２０８）では、乾燥させた粉末の抽出物を粉砕して、均一な大きさの流動性粉末を得るため篩い分けする。ステップ（２０９）では、抽出物について分析し、ポリフェノール、サポニンおよびグアイジャベリンなどの植物化学物質の含量を標準化する。
【００２０】
本抽出方法により、非常に強力なバンジロウ抽出物が得られる。利用される方法はまた、食料および飲料用に好適な優れた製品を作るのにも洗練された方法である。本方法はまた、高度に精製された抽出物を得るために特定の精製法を含む。
【００２１】
図３は、バンジロウ葉抽出物からの植物化学物質の単離を図示する。こうして得られたバンジロウ葉抽出物は、植物化学物質を単離するのに使用される。バンジロウ葉抽出物から植物化学物質を単離する方法（３００）は、標準化されたバンジロウ葉抽出物を脱イオン水に加え、さらにクロロホルムで液分配に供してクロロホルム可溶性画分および水性抽出物を得るステップ（３０１）から始める。ステップ（３０２）では、クロロホルム洗浄した水性抽出物をさらに酢酸エチルで分配して酢酸エチル可溶性層および水性抽出物層を得る。ステップ（３０３）では、乾燥させた粉末形態の酢酸エチル層を得るために、酢酸エチル層を回転蒸発器で濃縮する。ステップ（３０４）では、粉末形態を粒度７０〜２００ミクロンのシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて亜分画する。ステップ（３０５）では、分離された植物化学物質を、８５：１５の割合のクロロホルムおよびメタノールを用いたグラジエント溶出により溶出する。
【００２２】
酢酸エチル層は、各画分ごとに１００：１〜８５：１５の範囲のクロロホルムおよびメチルアルコールの様々な比率を用いたグラジエント溶出のシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供する。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの結果、６つの画分が分離された、すなわち９４％クロロホルムおよび６％メタノールにより分離されたＰＧＦ−１（バンジロウ画分−１）、９３％クロロホルムおよび７％メタノールにより分離されたＰＧＦ−２、９１％クロロホルムおよび９％メタノールにより分離されたＰＧＦ−３、８８〜８２％クロロホルムおよび１２〜１８％メタノールにより分離されたＰＧＦ−４、７９〜０％クロロホルムおよび２１〜１００％メタノールにより分離されたＰＧＦ−５、およびＰＧＦ−６は酢酸エチル分配層である。
【００２３】
分離された画分は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ：ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による定性解析に供する。ＴＬＣは、シリカゲルを固定（ｓｔａｔｉｏｎｅｒｙ）層として、４５：４５：１０の割合のトルエン、酢酸エチルおよび酢酸を移動相として用いて行う。分離された画分はさらにＨＰＬＣに供する。さらに、各植物化学物質は、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化質量分析法による分子量の決定のために定量解析に供する。最後に、植物化学物質について、核磁気共鳴（ＮＭＲ：Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、紫外（ＵＶ：Ｕｌｔｒａ−ｖｉｏｌｅｔ）および赤外分光（ＩＲ：Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）解析により化学的キャラクタリゼーションを行う。得られた植物化学物質の純度は９９％である。
【００２４】
植物化学物質の化学的キャラクタリゼーションの結果、ケンフェロール−３−Ｏ−グリコシド、ケルセチン−３−Ｏ−ａ−Ｌ−アラビノピラノシド（グアイジャベリン）が存在した。
【００２５】
上記プロセスにより得られたグアイジャベリンについて、生物活性、すなわち抗糖尿病活性（α−グルコシダーゼ阻害、α−アミラーゼ阻害およびリパーゼ阻害）をスクリーニングする。プレインキュベーション混合物は、８０ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０、ビヒクル緩衝液、陽性対照、様々な濃度の試験サンプルおよび５０μｌのα−グルコシダーゼを含んでいた。反応混合物を混合して３７℃で３０分間プレインキュベートする。基質としてスクロースを最終濃度２３．１２５ｍＭになるように加え、反応混合物を混合して、３７℃で５０分間インキュベートする。沸騰水浴で２分間維持することにより反応を停止し、次いで室温まで冷却する。５０μｌの反応混合物に２５０μｌのグルコース試薬を加え、混合し、２５℃で１０分間インキュベートする。５１０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定する。対照反応は試験サンプルを用いずに行う。
【００２６】
抽出物はα−グルコシダーゼの用量依存的阻害を示し、したがって抽出物の抗糖尿病活性が示される。
【００２７】
バンジロウ葉抽出物は、チョコレート、カプセル、および水溶液を用いたサプリメントドリンク等の様々な形態で食料および飲料分野の主な産業において有用である。抽出物はまた、医薬品、化粧品、栄養補給食品等にも有用である。
【００２８】
バンジロウ葉抽出物は、バンジロウ抽出物と、ポリフェノールおよびフラボノイドを含む他のハーブ抽出物とを含むチョコ化合物など、上記の発明から得られたグアバ抽出物を含む食品および飲料製品の生産に有用である。チョコ化合物は頭痛、体の痛み、悪心、灼熱感の緩和に有用であり、肝臓保護活性も示す。
【００２９】
バンジロウ葉抽出物はまた、イザヨイバラ（Ｒｏｓａ  ｒｏｘｂｕｒｇｉｉ）（スイートチェストナットローズ（Ｓｗｅｅｔ  ｃｈｅｓｔｎｕｔ  ｒｏｓｅ））、黄杞（Ｅｎｇｅｌｈｅｒｄｔｉａ  ｃｈｉｎａｎｓｉｓ）（コウキ（Ｋｏｈｋｉ））およびハス（Ｎｅｌｕｍｂｅ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）など他のハーブ抽出物と組み合わせてカプセルとして生産される。このカプセルは、肝臓保護活性、鎮咳活性および抗糖尿病活性を示す。
【００３０】
上記の配合物に加えて、バンジロウ葉抽出物は、天然茶としても使用される。天然茶は、桑葉およびチャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）葉と組み合わせてグアバ抽出物を含む。バンジロウ茶は糖尿病の予防に役立ち、糖尿病患者の血糖レベルも低下させ、肝臓保護活性を示す。バンジロウ茶は天然のアペタイザー（ａｐｐｅｔｉｚｅｒ）およびリフレッシャー（ｒｅｆｒｅｓｈｅｒ）としても作用する。
【００３１】
ハーブ煎じ液などバンジロウ葉抽出物の水溶液を用いたハーブ飲料は、酸化防止剤および心保護薬として作用する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2017508801.tif 000009
2017508801.tif 000010
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