(57)【要約】個々の細胞または細胞集団の内容物の区分分析による個々の細胞または細胞集団を分析するための方法、組成物、及びシステム。個々の細胞または細胞集団は、細胞内容物にアクセスし、所定の細胞または細胞集団の内容を一意的に識別し、続いて、細胞の内容を分析して、それを個々の細胞または細胞集団に由来するものとして特徴付けるために、処理試薬と共に区分される。この分析と特徴付けには、配列決定によって細胞の核酸を分析して特徴付けることが含まれる。【選択図】図９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞から核酸を分析する方法であって、
（ａ）個々の細胞に由来する核酸を離散区分に提供することと、
（ｂ）前記離散区分内の前記核酸に由来する１つまたは複数の第１の核酸配列であって、共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを結合させている前記１つまたは複数の第１の核酸配列を生成することと、
（ｃ）前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第１の核酸配列に由来する１つもしくは複数の第２の核酸配列であって、共通のバーコード配列を含む前記１つもしくは複数の第２の核酸配列の特徴付けを行うことと、
（ｄ）（ｃ）で行われた前記特徴付けにおける前記共通の核酸バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、前記個々の細胞に由来する前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列を識別することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記離散区分が離散液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）において、前記オリゴヌクレオチドが、前記個々の細胞に由来する前記核酸と前記離散区分に共に区分される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）において、少なくとも１０，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）において、少なくとも１００，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）において、少なくとも５００，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）において、前記オリゴヌクレオチドがビーズに付着されて提供され、ビーズ上の各オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含み、前記ビーズが前記離散区分に前記個々の細胞と共に区分される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが前記ビーズに放出可能に付着している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ビーズが分解性ビーズを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｂ）の前または最中に、前記ビーズの分解を介して前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを放出することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｃ）の前に、前記離散区分から前記１つまたは複数の第１の核酸配列を放出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ｃ）が、前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列を配列決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列から、前記個々の細胞のゲノムの少なくとも一部の連続核酸配列をアセンブルすることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記個々の細胞が、前記個々の細胞の前記ゲノムの少なくとも一部の前記核酸配列に基づいて特徴付けされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸が、前記離散区分内の前記個々の細胞から放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（b）が、前記1つまたは複数の第1の核酸配列をもたらす条件下で前記核酸を逆転写させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記逆転写が前記離散区分で生じる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に提供され、かつポリＴ配列をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記逆転写が、前記ポリＴ配列を前記核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記ポリＴ配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、前記ポリＴ配列のハイブリダイゼーションを促進するアンカー配列をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが、ランダムプライミング配列をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ランダムプライミング配列がランダム六量体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記逆転写が、前記ランダムプライミング配列を前記核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記ランダムプライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記1つまたは複数の第１の核酸配列のうちの所与の１つが、前記核酸の所与の１つの少なくとも一部に対する配列相補性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記離散区分が、複数の細胞の中で、最大でも前記個々の細胞のみを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドが、固有の分子配列セグメントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記固有の分子配列セグメントの存在に少なくとも部分的に基づいて、前記核酸の所与の核酸に由来する前記１つもしくは複数の第１の核酸配列、または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列の個々の核酸配列を識別することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記固有の分子配列セグメントの存在に基づいて前記所与の核酸の量を決定することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の配列を生成するために、１つまたは複数の追加配列を前記１つまたは複数の第１の配列に追加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
スイッチオリゴヌクレオチドを用いて、第１の追加核酸配列を前記１つまたは複数の第１の核酸配列に追加することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記スイッチオリゴヌクレオチドが、前記１つまたは複数の第１の核酸配列の少なくとも一部にハイブリダイズさせ、前記第１の追加核酸配列を前記１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させるためにテンプレート指向様式で伸長する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の追加核酸配列に結合する前記より多くの第１の核酸配列のうちの１つを増幅させることをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅が前記離散区分で生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記増幅が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列を前記離散区分から放出した後に生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記増幅後に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記第１の追加配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列に１つまたは複数の第２の追加核酸配列を追加することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数の第２の追加配列の追加が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数の第１の核酸配列に前記１つまたは複数の第２の追加核酸配列を結合させることと、を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記除去が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列の剪断によって完了する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記結合が連結によって完了する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
（ｃ）の前に、１つまたは複数のＲＮＡ断片を生成するために、前記１つまたは複数の第１の核酸配列を転写させることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項４２】
前記転写が、離散区分からの前記1つまたは複数の第１の核酸配列の放出後に生じる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドが、Ｔ７プロモーター配列をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列に追加配列を結合させることと、をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記追加配列に結合する前記１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
（ｃ）の前に、１つまたは複数のＤＮＡ配列を生成するために、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記１つまたは複数のＤＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数のＤＮＡ配列に１つまたは複数の追加配列を結合させることと、をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸が、前記個々の細胞からのＲＮＡの逆転写から生成された相補的（ｃＤＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチドがプライミング配列をさらに含む、離散区分に提供される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記プライミング配列が、ランダムＮ量体を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
（ｂ）が、前記ライミング配列を前記ｃＤＮＡにハイブリダイズさせることと、前記プライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記離散区分が、前記オリゴヌクレオチドの相補配列を含むスイッチオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
（ｂ）が、前記スイッチオリゴヌクレオチドを前記核酸由来の核酸断片の少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、前記スイッチオリゴヌクレオチドをテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドを前記１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記１つまたは複数の第１の核酸配列が前記核酸由来の核酸断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
前記（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に結合させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
前記結合させることが連結させることを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
複数の区分が離散区分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
前記複数の区分が、１つの区分あたり平均１つ未満の細胞を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記複数の区分の２５％未満の区分が細胞を含まない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記複数の区分が、それぞれ少なくとも１つの区分された細胞を有する離散区分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記離散区分の２５％未満が複数の細胞を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも離散区分のサブセットがビーズを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記離散区分の少なくとも７５％が、少なくとも１つの細胞及び少なくとも１つのビーズを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記離散区分が、区分された核酸バーコード配列をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記離散区分が、少なくとも１，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記離散区分が、少なくとも１０，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記離散区分が、少なくとも１００，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記複数の区分が、少なくとも１，０００の区分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数の区分が少なくとも１０，０００の区分を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記複数の区分が、少なくとも１００，０００の区分を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
複数の異なる細胞タイプの集団における細胞を特徴付ける方法であって、
（ａ）前記集団内の個々の細胞からの核酸を離散区分へ提供することと、
（ｂ）共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記離散区分であって、複数の異なる区分が異なる共通の核酸バーコード配列を含む、前記離散区分内の個々の細胞からの前記核酸の１つまたは複数の断片に結合させることと、
（ｃ）前記複数の離散区分からの前記核酸の前記１つまたは複数の断片を特徴付けて、共通バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、前記１つまたは複数の断片を個々の細胞に帰属させることと、
（ｄ）前記複数の離散区分における前記１つまたは複数の断片の前記特徴付けに基づいて、前記集団内の複数の個々の細胞を特徴付けることと、を含む、前記方法。
【請求項７５】
前記核酸を断片化することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記離散区分が液滴である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸の前記１つまたは複数の断片を特徴付けることが、前記個々の細胞からのリボソームデオキシリボ核酸を配列決定することを含み、前記個々の細胞を特徴付けることが、細胞の属、種、株または変異体を識別することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記個々の細胞がマイクロバイオームサンプルに由来する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記個々の細胞がヒト組織サンプルに由来する、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
前記個々の細胞が哺乳類の循環細胞に由来する、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
前記個々の細胞が法医学的サンプルに由来する、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
前記核酸が、前記離散区分の前記個々の細胞から放出される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
個々の細胞または細胞集団を特徴付ける方法であって、
（ａ）複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプであって、各異なる細胞表面結合基タイプは異なる細胞表面特徴に結合することができ、かつ存在する場合は、１つまたは複数の細胞表面特徴結合基とその細胞表面特徴それぞれとの間の結合を可能にする条件下で、それに結合したレポーターオリゴヌクレオチドを含む、前記複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプを有する細胞をインキュベートすることと、  （ｂ）前記細胞を、バーコード配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む区分に区分することと、
（ｃ）前記バーコード配列を前記区分に存在するオリゴヌクレオチドレポーター基に結合させることと、
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドレポーター基及び結合したバーコードを配列決定することと、
（ｅ）配列決定されたレポーターオリゴヌクレオチドに基づいて前記細胞上に存在する細胞表面特徴を特徴付けることと、を含む方法。
【請求項８４】
複数の区分を含む組成物であって、前記複数の区分のそれぞれが、（ｉ）個々の細胞、及び（ｉｉ）共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む組成物。
【請求項８５】
前記複数の区分がエマルジョン中の液滴を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
前記複数の区分のそれぞれの中の前記オリゴヌクレオチドの集団が、前記複数の区分のそれぞれの中に配置されたビーズに結合される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８７】
前記個々の細胞には、それらのそれぞれの細胞表面特徴に関連する複数の異なる細胞表面特徴結合基が結合しており、各異なるタイプの細胞表面特徴結合基は、異なるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドレポーター基を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８８】
前記複数の異なる細胞表面特徴結合基が、複数の異なる細胞表面特徴に対して結合親和性を有する複数の異なる抗体または抗体断片を含む、請求項８７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月２６日出願の米国仮特許出願番号第６２／０１７，５５８号及び２０１４年１０月８日出願の米国仮特許出願番号第６２／０６１，５６７号の優先権を主張し、それらの出願のそれぞれは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【背景技術】
【０００２】
生物学及び生化学の材料及びシステムの分析及び特徴付けの顕著な進歩は、生命、健康、疾患及び治療のメカニズムの理解における前例のない進歩をもたらしている。これらの進歩の中で、生物系のゲノム構成を標的として特徴付ける技術は、遺伝子増幅技術の使用及び実施、ならびに核酸配列決定技術の進歩を含む、最も画期的な結果をいくつかもたらした。
【０００３】
核酸配列決定法は、診断、予後診断、バイオテクノロジー、及び法医学的生物学を含む幅広い生物医学的状況における情報を得るために使用することができる。配列決定としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング及び連鎖停止法を含む基本的な方法、またはショットガンシーケンシング及びブリッジＰＣＲを含むデノボシーケンシング法、またはポロニーシーケンシング、４５４パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ単一分子シーケンシング、ＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシングを含む次世代法等が挙げられる。
【０００４】
このような生物学的特徴付けの進歩にもかかわらず、多くの課題は未対処のままであり、現在提供されている解決策による対処は相対的に不十分である。本開示は、既存の技術の多くの欠点に対処するための新規な解決策及びアプローチを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、個々の細胞または細胞小集団を分析するための方法、組成物、及びシステムが提供され、これには、それらの個々の細胞または細胞集団から核酸を分析することと、核酸をそれらの個々の細胞または細胞集団に帰属させることと、が含まれる。
【０００６】
本開示の一態様は、細胞から核酸を分析する方法であって、離散区分に個々の細胞に由来する核酸を提供することと、離散区分内の核酸に由来する１つまたは複数の第１の核酸配列であって、共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを結合させている１つまたは複数の第１の核酸配列を生成することと、１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第１の核酸配列に由来する１つもしくは複数の第２の核酸配列であって、共通のバーコード配列を含む１つもしくは複数の第２の核酸配列の特徴付けを行うことと、その１つまたは複数の第２の核酸配列は；及び行われた特徴付けにおける共通の核酸バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、個々の細胞に由来する１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列を識別することと、を含む、方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、離散区分は離散液滴である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、個々の細胞に由来する核酸と共に離散区分に区分される。いくつかの実施形態では、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、または少なくとも５００，０００のオリゴヌクレオチドが、個々の細胞に由来する核酸と共に離散区分に区分される
【０００８】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドをビーズに付着させて提供し、ビーズ上の各オリゴヌクレオチドは同じバーコード配列を含み、ビーズは離散区分に個々の細胞と共区分される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはビーズに放出可能に付着している。いくつかの実施形態では、ビーズは分解性ビーズを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の第１の核酸配列の生成の前または最中に、ビーズの分解をすることによってビーズからオリゴヌクレオチドを放出することを含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は離散区分から１つまたは複数の第１の核酸配列を放出することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、特徴付けを行うことには、１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列を配列決定することを含む。本方法はまた、１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列の配列から個々の細胞のゲノムの少なくとも一部の連続核酸配列をアセンブルすることも含み得る。さらに、本方法は、個々の細胞のゲノムの少なくとも一部の核酸配列に基づいて個々の細胞を特徴付けることも含み得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、核酸は離散区分内の個々の細胞から放出される。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列を生成させることは、1つまたは複数の第1の核酸配列をもたらす条件下で核酸を逆転写させることを含む。いくつかの実施形態では、逆転写は離散区分で生じる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、離散区分に提供され、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態では、逆転写は、ポリＴ配列を核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、ポリＴ配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ポリＴ配列のハイブリダイゼーションを促進するアンカー配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ランダム六量体であり得る、ランダムプライミング配列を含む。いくつかの実施形態では、逆転写は、ランダムプライミング配列を核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、ランダムプライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の第１の核酸配列のうちの所与の１つは、核酸の所与の１つの少なくとも一部に対して相補的な配列を有する。いくつかの実施形態では、離散区分は、複数の細胞の中で最大でも個々の細胞のみを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、固有の分子配列セグメントを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、固有の分子配列セグメントの存在に少なくとも部分的に基づいて、核酸の所与の核酸に由来する１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列の個々の核酸配列を識別することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、固有の分子配列セグメントの存在に基づいて所与の核酸の量を決定することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本方法は、特徴付けを行う前に、１つまたは複数の第２の配列を生成するために、１つまたは複数の追加配列を１つまたは複数の第１の配列に追加することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、スイッチオリゴヌクレオチドを用いて、第１の追加核酸配列を１つまたは複数の第１の核酸配列に追加することを含む。いくつかの実施形態では、スイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の第１の核酸配列の少なくとも一部にハイブリダイズし、第１の追加核酸配列を１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させるためにテンプレート指向様式で伸長する。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の追加核酸配列に結合するより多くの第１の核酸配列の１つを増幅させることを含む。いくつかの実施形態では、増幅は離散区分で生じる。いくつかの実施形態では、増幅は、第１の追加核酸配列に結合する１つまたは複数の第１の核酸配列を離散区分から放出した後に生じる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本方法は、増幅後に、１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、第１の追加配列に結合する１つまたは複数の第１の核酸配列に１つまたは複数の第２の追加核酸配列を追加することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第２の追加配列を追加することは、第１の追加核酸配列に結合する１つまたは複数の第１の核酸配列のそれぞれの一部を除去することと、１つまたは複数の第１の核酸配列に１つまたは複数の第２の追加核酸配列を結合することと、を含む。いくつかの実施形態では、除去は、第１の追加核酸配列に結合する（例えば、連結する）１つまたは複数の第１の核酸配列の剪断によって完了する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数のＲＮＡ断片を生成するために、１つまたは複数の第１の核酸配列を転写させることを含む。いくつかの実施形態では、転写は、離散区分からの1つまたは複数の第１の核酸配列の放出後に生じる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはＴ７プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数のＲＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、１つまたは複数のＲＮＡ配列への追加配列を結合させることと、を含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、追加配列に結合する１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることを含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることを含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数のＤＮＡ配列を生成するために、１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることを含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、１つまたは複数のＤＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、１つまたは複数のＤＮＡ配列に１つまたは複数の追加配列を結合させることと、を含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、核酸は、個々の細胞からのＲＮＡの逆転写から生成された相補的（ｃＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはプライミング配列を含み、離散区分に提供される。いくつかの実施形態では、プライミング配列はランダムＮ量体を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列を生成することは、プライミング配列をｃＤＮＡにハイブリダイズさせることと、プライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、離散区分は、オリゴヌクレオチドの相補配列を含むスイッチオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列を生成することは、スイッチオリゴヌクレオチドを核酸由来の核酸断片の少なくとも一部にハイブリダイズさせることと、スイッチオリゴヌクレオチドをテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列を生成することは、オリゴヌクレオチドを１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させることを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列は、核酸由来の核酸断片である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列を生成することは、オリゴヌクレオチドを核酸に結合させる（例えば、連結させる）ことを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、複数の区分は離散区分を含む。いくつかの実施形態では、複数の区分は、１つの区分あたり平均１つ未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の区分の２５％未満の区分は細胞を含まない。いくつかの実施形態では、複数の区分は、それぞれ少なくとも１つの区分化された細胞を有する離散区分を含む。いくつかの実施形態では、離散区分の２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満は複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも離散区分のサブセットはビーズを含む。いくつかの実施形態では、離散区分の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、少なくとも１つの細胞及び少なくとも１つのビーズを含む。いくつかの実施形態では、離散区分は、区分化された核酸バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、離散区分は、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも１００，０００の異なる区分化された核酸バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、複数の区分は、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも１００，０００の区分を含む。
【００１８】
別の態様では、本開示は、複数の異なる細胞タイプの集団における細胞を特徴付ける方法であって、集団内の個々の細胞からの核酸を離散区分へ提供することと、共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを、離散区分であって、複数の異なる区分が異なる共通の核酸バーコード配列を含む、離散区分内の核酸の１つまたは複数の断片に結合させることと、複数の離散区分の核酸の１つまたは複数の断片を特徴付けることと、共通バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、１つまたは複数の断片を個々の細胞に帰属させることと、複数の離散区分における１つまたは複数の断片の特徴付けに基づいて、集団内の複数の個々の細胞を特徴付けることと、を含む方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本方法は、核酸を断片化することを含む。いくつかの実施形態では、離散区分は液滴である。いくつかの実施形態では、核酸の１つまたは複数の断片を特徴付けることは、個々の細胞からのリボソームデオキシリボ核酸を配列決定することを含み、個々の細胞を特徴付けることは、細胞の属、種、株または変異体を識別することを含む。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、マイクロバイオームサンプルに由来する。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、ヒト組織サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、哺乳類の循環細胞に由来する。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、法医学的サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、核酸は、離散区分の個々の細胞から放出される。
【００２０】
本開示のさらなる態様は、個々の細胞または細胞集団を特徴付ける方法であって、複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプであって、各異なる細胞表面結合基タイプは異なる細胞表面特徴に結合することができ、かつ存在する場合は、１つまたは複数の細胞表面特徴結合基とその細胞表面特徴のそれぞれとの間の結合を可能にする条件下で、それに結合したレポーターオリゴヌクレオチドを含む、複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプを有する細胞をインキュベートすることと、細胞を、バーコード配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む区分に区分化することと、バーコード配列を区分に存在するオリゴヌクレオチドレポーター基に結合させることと、オリゴヌクレオチドレポーター基及び結合したバーコードを配列決定することと、配列決定されたレポーターオリゴヌクレオチドに基づいて細胞上に存在する細胞表面特徴を特徴付けることと、を含む方法を提供する。
【００２１】
本開示のさらなる態様は、複数の区分を含む組成物であって、複数の区分のそれぞれは、個々の細胞、及び共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、複数の区分は、エマルジョン中の液滴を含む。いくつかの実施形態では、複数の区分のそれぞれの中のオリゴヌクレオチドの集団は、複数の区分のそれぞれの中に配置されたビーズに結合する。いくつかの実施形態では、個々の細胞には、それらの細胞表面特徴それぞれに関連する複数の異なる細胞表面特徴結合基が結合しており、各異なるタイプの細胞表面特徴結合基は、異なるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドレポーター基を含む。いくつかの実施形態では、複数の異なる細胞表面特徴結合基は、複数の異なる細胞表面特徴に対する結合親和性を有する複数の異なる抗体または抗体断片を含む。
【００２２】
本開示のさらなる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示される以下に記載の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態を可能とし、そのいくつかの詳細は、全て開示から逸脱することなく様々な明白な点において変更可能である。従って、図面及び説明は、本質的に例示的なものであり、限定的なものではないと見なされるべきである。
【００２３】
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組込まれているかのように示されているのと同じ程度で、参照により本明細書に組込まれる。参照により組込まれる刊行物及び特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲で、本明細書は、そのような任意の矛盾する材料に代わるかつ／または優先することを意図している。
【００２４】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び以下の添付の図面（本明細書の「Ｆｉｇｕｒｅ（図面）」及び「ＦＩＧ．」）を参照することによって、本発明の特徴及び利点がより良く理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】個々の細胞または小グループの細胞を区分化するためのマイクロ流体チャンネル構造を概略的に示す。
【図２】細胞及び追加の試薬を含むビーズまたはマイクロカプセルを共に区分化するためのマイクロ流体チャンネル構造を概略的に示す。
【図３】細胞の核酸の増幅及びバーコード化のための例示的プロセスを概略的に示す。
【図４】配列データを個々の細胞または細胞群に帰属させて、それらを特徴付けるのに使用する際の、細胞の核酸のバーコード化の使用の概略図を提示する。
【図５】標識された細胞結合性リガンドに関与する細胞を示す概略図を提示する。
【図６】本明細書に記載の方法を用いてＲＮＡ分析を実施するための例示的なワークフローの概略図を提示する。
【図７】本明細書に記載の方法を用いたリボ核酸（ＲＮＡ）の分析で使用するための、例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。
【図８】個々のバーコードを有するビーズと共に区分化された個々の細胞の画像を提供する。
【図９Ａ】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。
【図９Ｂ】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。
【図９Ｃ】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。
【図９Ｄ】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。
【図９Ｅ】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。
【図１０】ＲＮＡの例示的な分析における使用及びインビトロ転写のための配列の使用のための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。
【図１１】ＲＮＡ分析及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。
【図１２Ａ】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。
【図１２Ｂ】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。
【図１３Ａ】区分におけるテンプレートスイッチの逆転写及びＰＣＲからの例示的な収率の図を提示する。
【図１３Ｂ】区分におけるテンプレートスイッチの逆転写及びＰＣＲからの例示的な収率の図を提示する。
【図１３Ｃ】区分におけるテンプレートスイッチの逆転写及びＰＣＲからの例示的な収率の図を提示する。
【図１４Ａ】様々な細胞数を有する区分における逆転写及びｃＤＮＡ増幅からの例示的な収率の図を提示する。
【図１４Ｂ】様々な細胞数を有する区分における逆転写及びｃＤＮＡ増幅からの例示的な収率の図を提示する。
【図１５】様々な入力細胞濃度でのｃＤＮＡ合成及びリアルタイム定量的ＰＣＲからの例示的な収率、及び一定の細胞入力濃度での収率に及ぼすプライマー濃度の変動の影響の図を提示する。
【図１６】インビトロ転写からの例示的な収率の図を提示する。
【図１７】本明細書で提供される方法を実施するようにプログラムされるかまたさもなければそのように構成された例示的なコンピュータ制御システムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の様々な実施形態が本明細書に示されて説明されているが、当業者には、そのような実施形態は単なる例示的なものとして提供されることが明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、及び置換を想到し得る。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が使用され得ることが理解されるべきである。
【００２７】
値が範囲として記載されている場合、そのような開示は、特定の数値または特定のサブ範囲が明示されているかにかかわらず、そのような範囲内の全ての想定されるサブ範囲、及びそのような範囲内の特定の数値の開示を含むことが理解されるであろう。
【００２８】
Ｉ．単一細胞分析
先進的な核酸配列決定技術は、個々の生物及び比較的純粋な生物学的サンプルの実質的な配列情報を提供することを含む、生物学的材料を配列決定することにおける驚異的な結果をもたらしている。しかし、これらのシステムは、サンプルの全体的な構成のごく一部を表し得る、かつ個々の配列情報がさらに有益なものとなり得る生物学的サンプル中の細胞のサブ集団を識別して特徴付けることにおいて有効であるとは証明されていない。
【００２９】
ほとんどの核酸配列技術は、配列決定する核酸を、組織または他のサンプル由来の細胞の集合から抽出する。細胞集団の平均を表す遺伝物質を抽出するために、細胞を一斉に処理することができ、その後、これを所与の配列決定技術のために構成された配列決定可能なＤＮＡライブラリーへと処理することができる。理解されるように、ＤＮＡまたは核酸の観点から議論されることが多いが、細胞由来の核酸は、例えば、様々なＲＮＡ−ｓｅｑ方法の任意のものを用いて、配列決定のためのｃＤＮＡを生成するように処理され得る、例えば、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡなどを含むＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。この処理後、細胞特異的マーカーが存在しない場合、サンプル中の細胞のサブセットまたは全ての細胞によって寄与されたものとして遺伝子物質を帰属させることは、そのようなアンサンブルアプローチにおいて事実上不可能である。
【００３０】
また、このようなアンサンブルサンプル調製法では、特徴を細胞の集団の特定のサブセットに帰属させることができないことに加えて、最初から、細胞のサンプル中の多数の構成成分を識別かつ特徴付ける傾向があり、少数成分、例えば、１つの細胞、少数の細胞、またはサンプル中の全細胞のわずかな割合の細胞によって寄与される遺伝物質を選別することができるようには設計されていない。同様に、例えばｍＲＮＡの発現レベルを分析する場合、アンサンブルアプローチは、発現レベルの点で不均一である細胞集団からの潜在的に著しく不正確なデータを提示する傾向があるであろう。いくつかの場合では、発現が、分析された集団におけるごく少数の細胞において高く、かつ集団の細胞の大部分には存在しない場合、アンサンブル法は全集団に対して低レベルの発現を示すであろう。
【００３１】
この元の多数のバイアスは、これらのサンプルからシーケンンシングライブラリーを構築する際に使用される処理操作によって、さらに拡大され、さらに圧倒的なものとなる。特に、ほとんどの次世代配列決定技術は、シーケンシングライブラリーに十分なＤＮＡを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応などの、核酸断片の幾何学的増幅に依存している。しかし、そのような幾何学的増幅は、サンプル中の多数の成分の増幅に偏っており、そのような少数及び大多数の成分の開始比を保存していない場合がある。例として、サンプルが特定の細胞タイプ、例えば宿主組織細胞由来の９５％のＤＮＡ、及び別の細胞タイプ、例えば癌細胞由来の５％のＤＮＡをサンプル中に含む場合、ＰＣＲに基づく増幅は、比較指数関数的増幅（より高い濃度の反復倍加はより小さい画分のものを即座に上回る）及び増幅試薬及びリソースの隔離の関数（プライマー及び他の増幅試薬を優先的に利用する場合、より大きな画分が増幅される）の両方として、少数のＤＮＡの代わりに多数のＤＮＡを優先的に増幅させることができる。
【００３２】
これらの問題のいくつかは、増幅を必要としない単一分子システムなどの様々な配列決定システムを利用することによって対処することができるが、単一分子システム及び他の次世代配列決定システムのアンサンブル配列決定方法も十分に大きな入力ＤＮＡ要件の要求を有することができる。特に、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＳＭＲＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステムのような単一分子配列決定システムは、５００ナノグラム（ｎｇ）〜１０マイクログラム（μｇ）超のサンプル入力ＤＮＡ要件を有することができ、これは個々の細胞または細胞のさらに小さなサブ集団から得ることができるものよりもはるかに大きい。同様に、他のＮＧＳシステムは、約５０ｎｇ〜約１μｇのサンプル中のサンプルＤＮＡの出発量に合わせて最適化することができる。
【００３３】
ＩＩ．細胞の区画化及び特徴付け
しかし、本明細書で開示されるのは、小さな細胞の集団から、かつ、いくつかの場合には、特に細胞の集団がより大きい状況において、個々の細胞からの核酸を特徴付けるための方法及びシステムである。この方法及びシステムは、個々の細胞または細胞の小集合から抽出可能な非常に少量の入力核酸を処理して配列決定することができるというさらなる利点とともに、他の次世代システムのスループットが高い非増幅単一分子法の帰属の利点を提供する。
【００３４】
特に、本明細書に記載の方法は、例えば、個々の細胞または細胞の小グループ由来の核酸を含む、個々の細胞または細胞の小さな集団の解析を区画化し、次いで、その分析を、核酸が由来する個々の細胞または細胞の小グループに帰属させることを可能にする。これは、細胞集団が、５０／５０混合の細胞タイプ、９０／１０混合の細胞タイプ、もしくは実質的に任意の比率の細胞タイプ、及び完全な不均一混合の異なる様々な細胞タイプ、またはこれらの間の任意の混合物を表すかどうかにかかわらず、達成することができる。異なる細胞タイプは、個体の異なる組織タイプに由来する、異なる個体に由来する、異なる属、種、株、変異体、または上記の任意のもしくは全ての任意の組み合わせに由来する細胞または生物有機体を含み得る。例えば、異なる細胞タイプは、環境の、法医学の、微生物もしくは他のサンプルまたは細胞タイプの様々な他の混合物の任意のものに由来する個体、複数の異なる細菌種、株及び／または変異体由来の正常及び腫瘍組織を含み得る。
【００３５】
一態様では、本明細書に記載の方法及びシステムは、細胞を含有するサンプル材料由来の個々の細胞の核酸内容物の区画化、堆積化または区分化を、分散した区画または区分（本明細書では互換的に区分と呼ばれる）に提供し、ここで個々の区分は、その内容物と他の区分の内容物との分離を維持する。個々の細胞の特性を特定の区画に後で帰属させるために、固有の識別子、例えばバーコードを、区画化されたまたは区分化された細胞を保持する区分に、事前に、続けて、または同時に送達させることができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、いくつかの態様では、区分は、コンテナまたは容器（ウェル、マイクロウェル、チューブ、例えば、ＢｉｏＴｒｏｖｅナノアレイなどのナノアレイ基材の貫通ポート、または他のコンテナ）を指す。しかし、多くのいくつかの態様では、区画または区分は、流体流内で流動可能な区分を含む。これらの区分は、例えば、内部流体の中心またはコアを取り囲む外部バリアを有するマイクロカプセルまたはマイクロベシクルから構成されてもよく、またはそれらは、そのマトリックス内に材料を搭載かつ／または保持することができる多孔性マトリックスであってもよい。しかし、いくつかの態様では、これらの区分は、非水性連続相、例えば油相中に水性流体の液滴を含む。様々な異なる容器が、例えば、２０１３年８月１３日出願の米国特許出願第１３／９６６，１５０号に記載されており、その全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。同様に、非水性または油連続相中で安定な液滴を生成するためのエマルジョンシステムが、例えば、米国特許公開番号第２０１０／０１０５１１２号に詳細に記載されており、その全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。
【００３７】
エマルジョン中の液滴の場合、個々の細胞を離散区分に割り当てることは、一般に、水性流体の細胞の流れを、非水性流体の流れに導入し、それにより２つの流れの合流部で液滴を生成することによって達成され得る。特定の濃度レベルの細胞の水性細胞含有流を提供することによって、細胞数の観点から、得られる区分の占有レベルを制御することができる。単一細胞区分が望ましいいくつかの場合では、占有されている区分が主に単独で占有されることを確実にするために、区分が１区分あたり平均１個未満の細胞を含むように、流体の相対流速を制御することが望ましい場合がある。同様に、より高い割合の区分が占有されるように、例えば、占有されていない区分の割合がごく小さなものとなるように、流速を制御することが望まれる場合がある。いくつかの態様では、流れ及びチャンネルアーキテクチャーは、所望の数の単一占有区分が、確実に特定のレベルの占有されていない区分よりも少なくなり、かつ特定のレベルの複数の占有された区分より少なくなるように制御される。
【００３８】
多くの場合、システム及び方法は、占有された区分（１つまたは複数のマイクロカプセルを含む区分）の実質的に大部分が、占有された区分あたり１つ未満の細胞を含むことを保証するために使用される。いくつかの場合、区分化プロセスは、占有区分の２５％未満が１つ超の細胞を含むように制御され、多くの場合、占有区分の２０％未満が１つ超の細胞を有するが、いくつかの場合では、占有区分の１０％未満またはさらに５％未満が区分あたり１つ超の細胞を含む。
【００３９】
追加として、または代替として、多くの場合、過剰な数の空の区分の生成を避けることが望ましい。これは、十分な数の細胞を区分化領域に提供することによって達成され得るが、ポアソン分布によると、複数の細胞を含む区分の数が増加することが予想される。従って、本明細書に記載の態様に従って、多くの場合、生成された区分の５０％以下が非占有となるように、すなわち、１つ未満の細胞を含み、生成された区分の２５％以下、生成された区分の１０％以下が非占有となるように、区分化領域に向かう１つまたは複数の細胞、または他の流体の流れが制御される。さらに、いくつかの態様では、これらのフローは、単一の占有区分の非ポアソン分布を提示するが、より低いレベルの非占有区分を提供するように制御される。言い換えると、いくつかの態様では、上述した任意の単一占有率を依然として提供しながら、上述の範囲の非占有の区分を得ることができる。例えば、多くの場合、本明細書に記載のシステム及び方法の使用は、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満〜、多くの場合、５％未満〜の複数の占有率を有しながら、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、及びいくつかの場合、５％未満〜の非占有区分を有する区分を結果的に生成する。
【００４０】
理解されるように、上記占有率は、バーコードオリゴヌクレオチドを担持する細胞及びビーズの両方を含む区分にも適用可能である。特に、いくつかの態様では、占有された区分全体の実質的な割合は、ビーズ及び細胞の両方を含むことになる。特に、少なくとも５０％の区分が少なくとも１つの細胞及び少なくとも１つのビーズによって占有されるか、または少なくとも７５％の区分が同様に占有されるか、または少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の区分が同様に占有されると定めることが望ましい場合がある。さらに、区分内に単一の細胞及び単一のビーズを提供することが所望される場合、少なくとも５０％の区分が同様に占有され、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、またはさらに少なくとも９０％の区分が同様に占有され得る。
【００４１】
実質的に単一占有区分を提供することに関して説明されているが、特定の場合、例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の細胞及び／またはビーズを単一の区分内に含む、複数の占有区分を提供することが望ましい。従って、上述のように、流体及び区分化流体を含む細胞及び／またはビーズの流動特性を制御して、そのような複数の占有区分を提供することができる。特に、フローパラメーターは、区分の５０％超、７５％超、及びいくつかの場合８０％超、９０％超、９５％超またはそれ以上の所望の占有率を提供するように制御され得る。
【００４２】
さらに、多くの場合、単一の区分内の複数のビーズは、それに関連する様々な試薬を含むことができる。そのような場合、様々なビーズ源、すなわち、様々な関連試薬を含むものから、共通チャンネルまたは液滴生成接合部に、その共通チャンネルまたは液滴生成接合部への様々なチャンネル注入口を介して様々なビーズを導入することが有利であり得る。そのような場合、チャンネルまたは接合部への様々なビーズの流れ及び頻度は、各源からのマイクロカプセルの所望の比率を提供しながら、そのようなビーズが所望の数の細胞を有する区分に確実に対形成されるか組み合わされるように制御することができる。
【００４３】
本明細書に記載の区分は、多くの場合、例えば、１０μＬ未満、５μＬ未満、１μＬ未満、９００ピコリットル（ｐＬ）未満、８００ｐＬ未満、７００ｐＬ未満、６００ｐＬ未満、５００ｐＬ未満、４００ｐＬ未満、３００ｐＬ未満、２００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、５０ｐＬ未満、２０ｐＬ未満、１０ｐＬ未満、１ｐＬ未満、５００ナノリットル（ｎＬ）未満、またはさらには１００ｎＬ、５０ｎＬ未満、もしくはさらに低い極めて小さな体積を有することを特徴とする。
【００４４】
例えば、液滴ベースの区分の場合、液滴は、１０００ｐＬ未満、９００ｐＬ未満、８００ｐＬ未満、７００ｐＬ未満、６００ｐＬ未満、５００ｐＬ未満、４００ｐＬ未満、３００ｐＬ未満、２００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、５０ｐＬ未満、２０ｐＬ未満、１０ｐＬ未満、またはさらには１ｐＬ未満の、全体積を有することができる。ビーズと共に区分化される場合、例えば共区分化された細胞を含む、区分内のサンプル流体体積は、上述の体積の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、またはさらには上述の体積の１０％未満となる場合がある。
【００４５】
本明細書の他の箇所に記載されているように、種を区分化によって、区分の集団が生成され得る。そのような場合、区分の集団を生成するように、任意の適切な数の区分を生成することができる。例えば、本明細書に記載の方法では、少なくとも約１，０００個の区分、少なくとも約５，０００個の区分、少なくとも約１０，０００個の区分、少なくとも約５０，０００個の区分、少なくとも約１００，０００個の区分、少なくとも約５００，０００個の区分、少なくとも約１，０００，０００個の区分、少なくとも約５，０００，０００個の区分、少なくとも約１０，０００，０００個の区分、少なくとも約５０，０００，０００個の区分、少なくとも約１００，０００，０００個の区分、少なくとも約５００，０００，０００個の区分、または少なくとも約１，０００，０００，０００個の区分を含む区分の集団を生成することができる。さらに、区分の集団は、非占有区分（例えば、空の区分）及び占有区分の両方を含み得る。
【００４６】
特定の場合、マイクロ流体チャンネルネットワークは、本明細書に記載の区分を生成するのに特に適している。そのようなマイクロ流体デバイスの例には、２０１４年４月４日出願の米国特許出願第６１／９７７，８０４号にて詳細に記載されているものが含まれ、その全開示は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組込まれる。細胞の水性混合物を非水性流体に押出させる多孔質膜を含む、代替の機構も、個々の細胞の区分化に用いることができる。そのようなシステムは一般に、例えば、Ｎａｎｏｍｉ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【００４７】
個々の細胞を区分化するための単純化されたマイクロ流体チャンネル構造の例を図１に示す。本明細書の他の箇所に記載されているように、いくつかの場合では、占有されている区分の大部分は、占有された区分あたり１つ以下の細胞を含み、いくつかの場合、生成された区分の一部は占有されていない。しかし、いくつかの場合、占有されている区分の中には、１超の細胞を含むものもある。いくつかの場合、区分化プロセスは、占有区分の２５％未満が１超の細胞を含むように、多くの場合では、占有区分の２０％未満が１超の細胞を有するように、さらに、いくつかの場合では、占有区分の１０％未満またはさらに５％未満が区分あたり１超の細胞を含むように制御され得る。図示されるように、チャンネル構造は、チャンネル接合部１１０で連通するチャネンルセグメント１０２、１０４、１０６、及び１０８を含むことができる。動作中、浮遊細胞１１４を含む第１の水性流体１１２は、チャンネルセグメント１０２に沿って接合部１１０に輸送され、一方、水性流体１１２と混和しない第２の流体１１６は、チャンネルセグメント１０４及び１０６から接合部１１０に送達され、チャンネルセグメント１０８に流入する個々の細胞１１４を含む水性流体の分離液滴１１８を生成する。
【００４８】
いくつかの態様では、第２の流体１１６は、例えば、得られた液滴の合体を阻害しながら、その液滴を安定化させるためのフルオロ界面活性剤を含む、フッ素化油のような油を含む。特に有用な区分化流体及びフルオロ界面活性剤の例は、例えば、米国特許公開第２０１０／０１０５１１２号に記載されており、その全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。
【００４９】
他の態様では、液滴ベースを区分化することに加えて、またはそれに代えて、細胞は、１つまたは複数の個々の細胞または細胞の小グループを搭載している外殻または層または多孔質マトリックスを含み、かつ他の試薬を含み得るマイクロカプセル内に封入されてもよい。細胞のカプセル化は、様々なプロセスによって実施することができる。一般に、そのようなプロセスによって、分析される細胞を含む水性流体と、ポリマー前駆体に特定の刺激を加えたときにゲルまたは他の固体または半固体マトリックスに形成することができるポリマー前駆物質とを組み合わせる。そのような刺激としては、例えば、熱刺激（加熱または冷却のいずれか）、光刺激（例えば、光硬化によるもの）、化学的刺激（例えば、架橋によるもの、前駆体の重合開始（例えば、開始剤添加によるもの）、などが挙げられる。
【００５０】
細胞を含むマイクロカプセルの調製は、様々な方法によって行うことができる。例えば、個々の細胞または小グループの細胞を含むマイクロカプセルを形成するために、エアナイフ液滴またはエアロゾル発生器を使用して、前駆体流体の液滴をゲル化溶液中に分散させることができる。同様に、例えばＮａｎｏｍｉ，Ｉｎｃ．から入手可能なものなどの膜に基づくカプセル化システムが、本明細書に記載のマイクロカプセルを生成するために使用され得る。いくつかの態様では、図１に示すようなマイクロ流体システムを、本明細書に記載のように、細胞をカプセル化するのに容易に使用することができる。特に、かつ図１を参照すると、細胞及びポリマー前駆体材料を含む水性流体は、チャンネル接合部１１０に流入し、ここで非水性流体１１６の流れを介して、個々の細胞１１４を含む液滴１１８に区分化される。カプセル化方法の場合、非水性流体１１６は、ポリマー前駆体を重合させかつ／または架橋させて混入した細胞を含むマイクロカプセルを形成させる開始剤も含むこともできる。特に有用なポリマー前駆体／開始剤の対の例には、例えば、２０１４年２月７日出願の米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号に記載されたものが含まれ、これらの全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。
【００５１】
例えば、ポリマー前駆体材料が線状ポリマー材料、例えば線状ポリアクリルアミド、ＰＥＧ、または他の線状ポリマー材料を含む場合、活性化剤は架橋剤、または形成された液滴内の架橋剤を活性化する化学物質を含むことができる。同様に、重合性モノマーを含むポリマー前駆体の場合、活性化剤は重合開始剤を含んでもよい。例えば、ポリマー前駆体がアクリルアミドモノマーとＮ，Ｎ’−ビス−（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣ）コモノマーとの混合物を含む特定の場合には、テトラエチルメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）などの薬剤を、チャンネルセグメント１０４及び１０６内の第２の流体流内に供給することができ、これによって、アクリルアミド及びＢＡＣの架橋ポリマーネットワークまたはヒドロゲルへの共重合化が開始する。
【００５２】
液滴の形成時に第２の流体流１１６と第１の流体流１１２とが接合部１１０で接触すると、ＴＥＭＥＤは、第２の流体１１６から線状ポリアクリルアミドを含む水性の第１の流体１１２に拡散し、これによって、液滴内のポリアクリルアミドの架橋が活性化することになり、その結果、例えばヒドロゲル、マイクロカプセル１１８などのゲルが、細胞１１４を混入する固体または半固体のビーズまたは粒子として形成される。ポリアクリルアミドのカプセル化に関して説明されているが、他の「活性化可能な」カプセル化組成物もまた、本明細書に記載の方法及び組成物との関連で使用することができる。例えば、アルギネート液滴の形成及びそれに続く二価の金属イオン、例えばＣａ２＋への暴露を、記載されたプロセスを用いたカプセル化プロセスとして使用することができる。同様に、アガロース液滴も、例えば、冷却時など、温度ベースのゲル化によってカプセルに変換され得る。理解されるように、いくつかの場合、カプセル化された細胞は、例えば、時間の経過により、または、特定の刺激を適用することにより、細胞またはその内容物を、マイクロカプセルから、例えば、液滴などの追加の区分に放出させるのに十分にマイクロカプセルを分解することで、マイクロカプセルから選択的に放出可能であり得る。例えば、上記のポリアクリルアミドポリマーの場合、マイクロカプセルの分解は、ポリマーマトリックスを架橋するジスルフィド結合を切断するために、ＤＴＴなどの適切な還元剤の導入によって実現することができる（例えば、２０１４年２月７日出願の米国仮特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号参照、これらの全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる）。
【００５３】
理解されるように、カプセル化された細胞または細胞集団は、保存可能であり、液滴に基づいて区分化された細胞よりも運搬が容易であるという特定の潜在的な利点を提供する。さらに、いくつかの場合、異なる刺激の存在下または不在下のいずれかで、そのような細胞の経時的変化を特徴付けるために、分析される細胞を選択された時間の間インキュベートすることが望ましい場合がある。そのような場合、個々の細胞のカプセル化することによって、エマルジョン液滴中の単純な区分化よりも長いインキュベーションが可能となる場合があるが、いくつかの場合、液滴区分化細胞を、異なる時間の間、例えば、少なくとも１０秒、少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、または少なくとも１０時間以上インキュベートすることもできる。以上で示唆したように、細胞のカプセル化により、他の試薬が共に区分化される細胞の区分化が構成され得る。代替として、カプセル化された細胞を、上記他の区分、例えば液滴に容易に堆積させることができる。
【００５４】
特定の態様によれば、細胞は、区分内の細胞の内容物を放出させるために、溶解試薬とともに区分化されてもよい。そのような場合、溶解剤は、例えば、チャンネル接合部１１０の追加のチャンネルまたはチャンネル上流を介して、区分化結合部／液滴への細胞を導入するのと同時にまたはその直前に、細胞懸濁液と接触させることができる。溶解剤の例には、異なる細胞タイプ、例えば、グラム陽性または陰性細菌、植物、酵母、哺乳類などの溶解に使用される溶解酵素など、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、リゾスタフィン、ラビアーゼ、キタラーゼ、リチカーゼ、及び例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能な様々な他の溶解酵素、ならびに他の市販の溶解酵素などの生物活性試薬が含まれる。他の溶解剤は、追加的にまたは代替的に細胞と共に区分化されて、細胞の内容物を区分に放出させることができる。例えば、いくつかの場合、界面活性剤に基づく溶解溶液を、細胞を溶解するのに用いることができるが、これらは、界面活性剤が安定なエマルジョンを妨害し得るエマルジョンベースのシステムではあまり望ましくない場合がある。いくつかの場合、溶解溶液は、非イオン性界面活性剤、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ２０などを含み得る。いくつかの場合、溶解溶液は、イオン性界面活性剤、例えば、サルコシル及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを含み得る。同様に、他の方法を用いる溶解方法が使用されてもよく、エレクトロポレーション、熱的、音響的、または機械的細胞崩壊なども、例えば、細胞のカプセル化封入体の任意の孔径が細胞崩壊後の所望のサイズの核酸断片を保持するのに十分小さい場合に、液滴区分化に加えてまたはその代わりになり得る、細胞のカプセル化などの非エマルジョンベースの区分化などの特定の場合に使用されてもよい。
【００５５】
上記の細胞と共に区分化された溶解剤に加えて、例えば、プロテイナーゼＫなどのＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ不活性化剤または阻害剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、及びその後の核酸の処理における異なる細胞溶解成分の除去またはさもなければその負の活性または影響の低減に使用される他の試薬を含む、他の試薬も細胞と共に区分化され得る。さらに、カプセル化された細胞の場合、細胞を適切な刺激に暴露して、共に区分化したマイクロカプセルから細胞またはその内容物を放出させることができる。例えば、いくつかの場合、マイクロカプセルを分解させるために、かつ細胞またはその内容物をより大きな区分へ放出させるために、カプセル化された細胞とともに化学的刺激を共区分化することができる。いくつかの場合、この刺激は、本明細書の他の箇所に記載されている、それぞれのビーズまたは区分からオリゴヌクレオチドを放出するための刺激と同じであってもよい。代替の態様では、これは、オリゴヌクレオチドが同じ区分へ放出されるのとは異なる時間にカプセル化された細胞が区分に放出されることを可能にするために、異なる重複しない刺激であってもよい。
【００５６】
細胞のＤＮＡを断片化するためのエンドヌクレアーゼ、細胞の核酸断片を増幅させてその増幅された断片にバーコードオリゴヌクレオチドを結合させるのに使用されるＤＮＡポリメラーゼ酵素及びｄＮＴＰなどの追加の試薬も、細胞と共に区分化され得る。追加の試薬は、末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素、プライマー及びオリゴヌクレオチド、ならびにテンプレートスイッチに使用することができるスイッチオリゴヌクレオチド（本明細書では「スイッチオリゴ」とも呼ばれる）を含む逆転写酵素も含み得る。いくつかの場合、ｃＤＮＡの長さを増大させるためにテンプレートスイッチを使用することができる。テンプレートスイッチの一例では、ｃＤＮＡは、テンプレート、例えば、細胞のｍＲＮＡの逆転写から生成することができ、この場合、末端トランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素は、付加的なヌクレオチド、例えばポリＣを、テンプレートによってコード化されていないｃＤＮＡ、例えばｃＤＮＡの末端に添加することができる。スイッチオリゴは、追加のヌクレオチド、例えばポリＧに対して相補的な配列を備え得る。ｃＤＮＡ上の追加のヌクレオチド（例えば、ポリＣ）は、スイッチオリゴ上の追加のヌクレオチド（例えば、ポリＧ）に対して相補的な配列にハイブリダイズすることができ、これにより、スイッチオリゴを、逆転写により、ｃＤＮＡをさらに伸長させるために、テンプレートとして使用することができる。スイッチオリゴは、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む修飾された核酸、または任意の組み合わせを含み得る。
【００５７】
いくつかの場合、スイッチオリゴの長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０ヌクレオチド以上であってよい。
【００５８】
いくつかの場合、スイッチオリゴの長さは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、または２５０ヌクレオチド以上であってよい。
【００５９】
いくつかの場合、スイッチオリゴの長さは、最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９または２５０ヌクレオチドであってよい。
【００６０】
細胞の内容物がそれぞれの区分に放出されると、その区分内に含まれる核酸は、区分内でさらに処理され得る。本明細書に記載の方法及びシステムによると、個々の細胞の核酸の内容物には、一般に、それらの核酸が、特徴付けられる際、同じ１つの細胞または複数の細胞に由来するものとして帰属されるように、固有の識別子が付与されている。個々の細胞または細胞群に特徴を帰属させる能力は、個々の細胞または細胞群に特異的に固有の識別子を割り当てることによって提供されるが、これは、本明細書に記載の方法及びシステムの別の有利な態様となる。特に、細胞の構成要素（及び結果として、その特徴）に固有の識別子でタグ付けするかまたは標識化するために、例えば、バーコードの形態の固有の識別子が、個々の細胞または細胞の集団に割り当てられまたはそれと関連付けられる。次いで、これらの固有の識別子は、細胞の構成要素及び特徴を個々の細胞または細胞群に帰属させるのに使用される。いくつかの態様では、これは、個々の細胞または細胞群を固有の識別子と共に区分化することによって行われる。いくつかの態様では、固有の識別子は、個々の細胞の核酸の内容物に付着するか、さもなければそれと関連付けられるか、または細胞の他の構成要素、特にこれらの核酸の断片に結合することができる核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの形態で提供される。オリゴヌクレオチドは、所与の区分内のオリゴヌクレオチドの間では、その中に含まれる核酸バーコード配列は同じであるが、異なる区分の間では、オリゴヌクレオチドは異なるバーコード配列を有することができ、かつそれを有するか、または少なくとも所与の分析において全ての区分にわたる多数の異なるバーコード配列を表すことができるように、区分化される。いくつかの態様では、所与の区分には１つの核酸バーコード配列のみを関連付けることができるが、いくつかの場合、複数の異なるバーコード配列が存在してもよい。
【００６１】
核酸コード配列は、オリゴヌクレオチドの配列内に６〜約２０以上のヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、バーコード配列の長さは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。いくつかの場合、バーコード配列の長さは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。いくつかの場合、バーコード配列の長さは、最大６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以下であり得る。これらのヌクレオチドは、完全に隣接していてもよく、すなわち隣接するヌクレオチドの単一の区間内にあってもよいか、または１つまたは複数のヌクレオチドによって分離された複数の別個のサブ配列に分離されてもよい。いくつかの場合、分離されたバーコードサブ配列は、約４〜約１６ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの場合、バーコードサブ配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。いくつかの場合、バーコードサブ配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。いくつかの場合、バーコードサブ配列は、最大４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドまたはそれ以下であり得る。
【００６２】
共に区分化されたオリゴヌクレオチドは、共に区分化された細胞由来の核酸の処理において有用な他の機能配列を含むことができる。これらの配列は、例えば、区分内の個々の細胞由来のゲノムＤＮＡを増幅させるための標的化またはランダム／ユニバーサル増幅プライマー配列を含みながら、例えば、配列の存在を識別するためのもしくはバーコード化された核酸をプルダウンするための、関連するバーコード配列、配列決定プライマーもしくはプライマー認識部位、ハイブリダイゼーションもしくはプローブ配列、または多数の他の潜在的機能配列のいずれかを結合させる。さらに、オリゴヌクレオチドならびに関連するバーコード及び他の機能配列を、サンプル材料と共に区分化することは、例えば、２０１４年２月７日出願の米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の第６１／９９１，０１８号、ならびに２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号、及び２０１４年２月７日出願の米国特許出願第１４／１７５，９３５号に記載されており、それらの全開示は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組込まれる。認識されるように、例えば、複数の液滴の合体を含む、オリゴヌクレオチドを共に区分化するための他の機構も使用することができ、この場合、１つの液滴は、オリゴヌクレオチド、または、例えば、マイクロ流体システム内の液滴などの、区分へのオリゴヌクレオチドのマイクロディスペンシングを含む。
【００６３】
簡潔には、一例では、ビーズに放出可能に付着した多数の上記オリゴヌクレオチドをそれぞれ含むビーズ、微粒子、またはマイクロカプセルが提供され、この場合、特定のビーズに付着したオリゴヌクレオチドの全てが同じ核酸バーコード配列を含むことになるが、多数の多様なバーコード配列は、使用されるビーズ集団にわたって表される。特に有用な例では、例えば、ポリアクリルアミドポリマーマトリックスを含むヒドロゲルビーズは、多数のオリゴヌクレオチド分子を担持することができるので、固体支持体及びオリゴヌクレオチドを区分へ送達するためのビヒクルとして使用され、かつ本明細書の他の箇所に記載されているように、特定の刺激に暴露されたときにそれらのオリゴヌクレオチドを放出するように構成され得る。いくつかの場合、ビーズの集団は、少なくとも１，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも５，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも１０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも少なくとも５０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも１００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも１，０００，０００の異なるバーコード配列、少なくとも５，０００，０００の異なるバーコード配列、または少なくとも１０，０００，０００の異なるバーコード配列を含む多様なバーコード配列ライブラリーを提供することになる。さらに、各ビーズは、多数のオリゴヌクレオチド分子が付着された状態で提供され得る。特に、個々のビーズ上のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド分子の数は、少なくとも１，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１０，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５０，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１０，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５０，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、及びある場合には少なくとも１０億個のオリゴヌクレオチド分子であってよい。
【００６４】
さらに、ビーズの集団が区分化される場合、得られる区分の集団は、少なくとも１，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも５，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも１０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも少なくとも５０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも１００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも１，０００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも５，０００，０００個の異なるバーコード配列、または少なくとも１０，０００，０００個の異なるバーコード配列を含む、多様なバーコードライブラリーも含むことができる。さらに、集団の各区分は、少なくとも１，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１０，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５０，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１０，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５０，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、及びいくつかの場合には少なくとも１０億個のオリゴヌクレオチド分子を含むことができる。
【００６５】
いくつかの場合、区分内の単一または複数のビーズのいずれかに付着している所与の区分内に、複数の異なるバーコードを組込むことが望ましい場合がある。例えば、いくつかの場合、例えば、所与の区分にバーコードのより強いアドレスまたは帰属を与えることによって、所与の区分からの出力を二重にまたは独立して確認するものとして、混合されているが既知であるバーコード配列セットは、後続の処理において識別がより大きく保証される場合がある。
【００６６】
オリゴヌクレオチドは、ビーズに特定の刺激を加えると、ビーズから放出可能である。いくつかの場合、刺激は、例えば、オリゴヌクレオチドを放出する光不安定な結合の切断を介した光刺激であってもよい。他の場合には、熱刺激を使用することができ、この場合、ビーズ環境の温度の上昇によって、オリゴヌクレオチドの結合がビーズから切断されるか、またはオリゴヌクレオチドがビーズから放出される。さらに他の場合には、オリゴヌクレオチドのビーズへの結合を切断するか、またはさもなければビーズからオリゴヌクレオチドを放出させる化学的刺激が使用される。このタイプのシステムの例は、２０１３年８月１３日出願の米国特許出願第１３／９６６，１５０号、及び２０１４年２月７日出願の米国仮特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号に記載されており、その全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。ある場合には、そのような組成物は、上記の細胞のカプセル化のためのポリアクリルアミドマトリックスを含み、ＤＴＴなどの還元剤へ暴露することにより、付着したオリゴヌクレオチドを放出するために分解され得る。
【００６７】
本明細書に記載の方法及びシステムに従って、付着したオリゴヌクレオチドを含むビーズは、単一のビーズ及び単一の細胞が個々の区分内に含まれるように、個々の細胞と共に区分化される。上記のように、単一細胞／単一ビーズの占有が最も望ましい状態であるが、複数の占有区分（細胞、ビーズのいずれかまたはその両方を単位とする）または非占有区分（細胞、ビーズのいずれかまたはその両方を単位とする）が存在することが多いことを理解されたい。図２には、バーコードオリゴヌクレオチドを含む細胞及びビーズを共に区分化するためのマイクロ流体チャンネル構造の例が、概略的に示されている。本明細書の他の箇所に記載されているように、いくつかの態様では、全占有区分の実質的な割合は、ビーズ及び細胞の両方を含み、いくつかの場合、生成される区分の一部は非占有となる。いくつかの場合、区分の一部は、１：１で区分化されていないビーズ及び細胞を有してもよい。いくつかの場合、例えば、単一の区分内に２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の細胞及び／またはビーズを含む、複数の占有区分を提供することが望ましい場合がある。図示のように、チャンネルセグメント２０２、２０４、２０６、２０８、２１０は、チャンネル接合部２１２で流体連通するように設けられている。個々の細胞２１４を含む水流は、チャンネルセグメント２０２を通ってチャンネル接合部２１２に向かって流れる。上述のように、これらの細胞は、区分化プロセスの前に、水性流体中に懸濁されていてもよいか、または予めカプセル化されてもよい。
【００６８】
同時に、バーコード担持ビーズ２１６を含む水流が、チャンネルセグメント２０４を通ってチャンネル接合部２１２に向かって流れる。非水性の区分化流体２１６は、側部チャンネル２０６及び２０８のそれぞれからチャンネル接合部２１２に導入され、混合流は流出チャンネル２１０に流入する。チャンネル接合部２１２内で、チャンネルセグメント２０２及び２０４からの２つの混合水流が合流し、共に区分化された細胞２１４及びビーズ２１６を含む液滴２１８に区分化される。上述のように、チャンネル接合部２１２で合流する各流体の流れ特性を制御すること、及びチャンネル接合部の形状を制御することによって、生成された区分２１８内でビーズ、細胞、またはその両方の所望の占有レベルを達成するために、合流及び区分化を最適化することができる。
【００６９】
いくつかの場合、細胞の溶解が区分化時またはその後にのみ開始するように、溶解剤、例えば、細胞溶解酵素を、例えば、チャンネルセグメント２０４を流れるビーズ流を用いて区分内に導入することができる。細胞のＤＮＡを断片化するためのエンドヌクレアーゼ、細胞の核酸断片を増幅させて増幅された断片にバーコードオリゴヌクレオチドを結合させるのに使用されるＤＮＡポリメラーゼ酵素及びｄＮＴＰなどの追加の試薬も、この構成において区分に添加えることができる。上記のように、多くの場合、ＤＴＴのような化学的刺激を、それぞれのビーズからバーコードを区分に放出するのに使用することができる。そのような場合、例えば、区分２１８内で、２つの流れが合流した後にのみバーコードが放出されるように、チャンネルセグメント２０２内に細胞含有流とともに化学刺激を提供することが特に望ましい場合がある。しかし、細胞がカプセル化されている場合、例えば、ビーズからオリゴヌクレオチドを放出し、かつそのマイクロカプセルから細胞を放出する共通の化学的刺激の導入は一般に、チャンネル接合部２１２の上流にあるか、またはそれに接続する別個の追加の側部チャンネル（図示せず）からもたらされてもよい。
【００７０】
理解されるように、例えば、保護試薬、同様のプロテイナーゼＫ類、キレート剤、核酸伸長剤、複製剤、ポリメラーゼなどの転写もしくは増幅試薬、逆転写酵素、トランスポゾンに基づく方法（例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ）に用いることができるトランスポザーゼ、ヌクレオシド三リン酸もしくはＮＴＰ類似体、プライマー配列及びそのような反応で使用される二価金属イオンなどの追加の補因子、リガーゼ酵素及び連結配列などの連結反応試薬、染料、標識、または他の標識試薬を含む多くの他の試薬を、細胞、ビーズ、溶解剤、及び化学的刺激とともに共区分化することができる。
【００７１】
チャンネルネットワークは、例えば、本明細書で説明されるように、適切な流体構成要素に流体結合され得る。例えば、入口チャンネルセグメント、例えば、チャンネルセグメント２０２、２０４、２０６、及び２０８は、チャンネル接合部２１２に供給すべき材料の適切な源に流体結合される。例えば、チャネンルセグメント２０２は、分析される細胞２１４の水性懸濁液の源に流体的に結合されることになり、チャンネルセグメント２０４は、ビーズ２１６の水性懸濁液源に流体結合されることになる。次いで、チャンネルセグメント２０６及び２０８は、非水性流体の１つまたは複数の源に流体結合される。これらの源は、マイクロ流体デバイスの本体構造内に画定された、またはそれに接続された単純な容器から、デバイス外の供給源、マニホールドなどから流体を送達する流体導管にわたる様々な異なる流体構成要素のいずれかを含んでもよい。同様に、出口チャンネルセグメント２１０は、区分化された細胞のための受容容器または導管に流体結合され得る。さらに、これは、マイクロ流体デバイスの本体に画定された容器であってもよく、または、区分化された細胞を後続のプロセス操作、器具、または構成要素に送達するための流体導管であってもよい。
【００７２】
図８は、油中水エマルジョン中の水性液滴中にビーズを含有するバーコードオリゴヌクレオチドと共に区分化された個々のＪｕｒｋａｔ細胞の画像を示す。図示されるように、個々の細胞は、容易に個々のビーズと共に区分化され得る。認識されるように、個々の細胞投入の最適化は、本明細書の他の箇所に記載されているように、区分あたりの望ましい細胞投入を達成するために、マイクロ流体システム内で細胞集団の希釈を実現することを含む多くの方法によって行うことができる。
【００７３】
操作では、個々の細胞の核酸内容物は、一旦溶解されると、例えば、断片化、増幅及びバーコード化、ならびに他の機能配列の添加を含む区分内でさらなる処理を行うのに利用可能なものとなる。上記のように、断片化は、核酸をより小さな断片に断片化するために、エンドヌクレアーゼなどの剪断酵素を共に区分化することによって達成され得る。これらのエンドヌクレアーゼには、タイプＩＩ及びタイプＩＩの制限エンドヌクレアーゼならびにニッキングエンドヌクレアーゼなどの他の核酸切断酵素などを含む、制限エンドヌクレアーゼが含まれ得る。いくつかの場合、断片化が所望されず、完全長の核酸が区分内に保持されていてもよく、またはカプセル化された細胞または細胞の内容物の場合には、区分化の前に、例えば、本明細書に記載の酵素的方法によって、または、例えば、機械的方法、例えば、機械的、音響的、もしくは他の剪断などによって、断片化を実施することができる。
【００７４】
細胞が、一旦共に区分化され、溶解されてそれらの核酸を放出すると、ビーズ上に配置されたオリゴヌクレオチドは、それらの核酸の断片をバーコード化して増幅させるのに使用され得る。サンプル核酸の断片を増幅かつバーコード化することにおいてこれらのバーコードオリゴヌクレオチドを使用する特に明確なプロセスは、前に参照により組込まれた、２０１４年２月７日出願の米国仮特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号に詳細に記載されている。簡潔には、一態様では、細胞と共に区分化されたビーズ上に存在するオリゴヌクレオチドは、そのビーズから細胞の核酸を有する区分に放出される。オリゴヌクレオチドは、バーコード配列と共に、その５’末端にプライマー配列を含むことができる。このプライマー配列は、細胞の核酸上の多数の異なる領域をランダムにプライミングすることを意図するランダムオリゴヌクレオチド配列であってもよいか、または細胞のゲノムの特定の標的領域のプライム上流を標的とする特異的プライマー配列であってもよい。
【００７５】
オリゴヌクレオチドのプライマー部分は、一旦放出されると、細胞の核酸の相補的な領域にアニールすることができる。また、細胞及びビーズと共に区分化された伸長反応試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、補因子（例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）は、細胞の核酸をテンプレートとして用いてプライマー配列を伸長させて、プライマーがアニールする細胞の鎖の相補的断片を生成し、その相補的断片は、オリゴヌクレオチド及びその関連するバーコード配列を含む。複数のプライマーをアニーリングして細胞の核酸の異なる部分にそれを伸長させることにより、核酸の重複した相補的な断片の大きなプールをもたらされ、それぞれの断片は、それが作製された区分を示す独自のバーコード配列を含む。いくつかの場合、これらの相補的断片は、それ自体が、区分に存在するオリゴヌクレオチドによってプライミングされたテンプレートとして使用されて、さらにバーコード配列を含む相補体の相補体を生成し得る。いくつかの場合、この複製プロセスは、第１の相補体が複製されたときに、ヘアピン構造または部分的ヘアピン構造の形成を可能にするために、その末端またはその付近に２つの相補的配列を生成するように構成され、分子がさらなる反復コピーを作製するためのベースとなる能力を減少させる。本明細書に記載される場合、細胞の核酸は、細胞内の任意の所望の核酸を含むことができ、その核酸には、例えば、細胞のＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡなどが含まれる。例えば、いくつかの場合、本明細書に記載の方法及びシステムは、発現ｍＲＮＡの特徴付け（例えば、そのようなｍＲＮＡの存在及び定量化を含む）に使用することができ、かつ、例えばそのようなｍＲＮＡの存在及び定量化を含めて、使用され、ＲＮＡ配列決定プロセスを特徴付けプロセスとして含むことができる。代替的にまたは追加的に、細胞と友に区分化された試薬は、ＤＮＡ配列決定が使用される配列決定プロセスを容易にするために、ＲＮＡをｃＤＮＡへ変換するための試薬、例えば逆転写酵素及び試薬を含み得る。特徴付けられる核酸がＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含むいくつかの場合において、この一例の概略図が図３に示されている。
【００７６】
図示されるように、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチオチドは、例えば、エマルジョン中の液滴３０２中に、サンプル核酸３０４と共に区分化される。本明細書の他の箇所に記載されているように、オリゴヌクレオチド３０８は、サンプル核酸３０４と共に区分化されたビーズ３０６に提供されてもよく、そのオリゴヌクレオチドは、パネルＡに示されるように、ビーズ３０６から放出可能である。オリゴヌクレオチド３０８は、１つまたは複数の機能配列、例えば配列３１０、３１４、及び３１６に加えて、バーコード配列３１２を含む。例えば、オリゴヌクレオチド３０８は、バーコード配列３１２、及び所与の配列決定システム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ（登録商標）またはＭｉｓｅｑ（登録商標）システムのフローセルにおいて結合のために使用されるＰ５配列に対する結合または固定化配列として機能し得る配列３１０を含むものとして示されている。図示のように、オリゴヌクレオチドは、サンプル核酸３０４の一部のプライミング複製のためのランダムまたは標的Ｎ量体を含み得るプライマー配列３１６も含む。オリゴヌクレオチド３０８には、シーケンシングシステムにおける合成反応によるポリメラーゼ媒介性のテンプレート指向性配列決定をプライミングするのに使用される「ｒｅａｄ１」すなわちＲ１プライミング領域などの配列決定プライミング領域を提供し得る配列３１４も含まれる。理解されるように、機能配列は、様々な異なる配列決定システム、例えば、４５４  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰｒｏｔｏｎまたはＰＧＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｘ１０など、及びその要求に適合するように選択され得る。多くの場合、バーコード配列３１２、固定化配列３１０、及びＲ１配列３１４は、所与のビーズに付着したオリゴヌクレオチドの全てに共通のものであり得る。プライマー配列３１６は、ランダムなＮ量体プライマーに対して変化し得るか、または特定の標的化された応用のための所定のビーズ上のオリゴヌクレオチドに共通なものであり得る。
【００７７】
理解されるように、いくつかの場合、機能配列は、ＲＮＡ−ｓｅｑの応用に有用なプライマー配列を含み得る。例えば、いつかの場合、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＲＮＡ−ｓｅｑの逆転写をプライミングするためのポリＴプライマーを含み得る。さらに他の場合には、例えば、個々のビーズに含まれる、所与の区分内のオリゴヌクレオチド、例えば、個々のビーズに含まれるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定プライマー及びＲＮＡ配列決定プライマーの両方、例えば、ビーズに結合したオリゴヌクレオチド内に含まれるポリＴのプライマー配列などの共通バーコード配列に加えて、複数のタイプのプライマー配列を含み得る。そのような場合、単一の区分化された細胞では、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列決定プロセスの両方が行われる。
【００７８】
プライマー配列３１６の存在に基づいて、オリゴヌクレオチドは、パネルＢに示されるサンプル核酸をプライミングすることができ、これによって、ポリメラーゼ酵素ならびにビーズ３０６及びサンプル核酸３０４と共に区分化された他の伸長試薬を用いて、オリゴヌクレオチド３０８及び３０８ａを伸長させることが可能となる。パネルＣに示されるように、オリゴヌクレオチドを伸長させた後、オリゴヌクレオチドは、ランダムＮ量体プライマーで、サンプル核酸３０４の複数の異なる領域にアニールするオリゴヌクレオチドを伸長させた後、複数の重複する相補体または核酸断片（例えば断片３１８及び３２０など）が作製される。これらの構築物は、サンプル核酸の部分に対して相補的な配列部分、例えば配列３２２及び３２４を含むが、本明細書では概して、バーコード配列が結合したサンプル核酸３０４の断片を含むものと称される。
【００７９】
次いで、パネルＤに示されるように、バーコード化された核酸断片では、例えば、配列分析による特徴付けを行うことができるか、または、それらを、本プロセスにおいてさらに増幅させることができる。例えば、ビーズ３０６から放出された、例えば、オリゴヌクレオチド３０８ｂなどの追加のオリゴヌクレオチドも、断片３１８及び３２０をプライミングすることができる。これは、断片３１８で示されている。特に、オリゴヌクレオチド３０８ｂ中のランダムＮ量体プライマー３１６ｂ（これは、多くの場合、所与の区分内の他のランダムＮ量体、例えば、プライマー配列３１６と異なり得る）の存在に基づいて、さらにオリゴヌクレオチドは、断片３１８とアニールして伸長されて、サンプル核酸配列の一部の複製を含む配列３２８を含む断片３１８の少なくとも一部に対する相補体３２６を作製する。オリゴヌクレオチド３０８ｂの伸長は、それが断片３１８のオリゴヌクレオチド部分３０８を介して複製するまで継続する。本明細書の他の箇所に記載され、かつパネルＤに示されるように、オリゴヌクレオチドは、例えば、断片３１８内に含まれるオリゴヌクレオチド３０８の配列３１６及び３１４を介した複製の後、所望の点でポリメラーゼによる複製の停止を促すように構成することができる。これは、本明細書に記載されるように、例えば、使用されるポリメラーゼ酵素によって処理され得ない異なるヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の組込みを含む、異なる方法によって達成され得る。例えば、これには、非ウラシル耐性ポリメラーゼがその領域の複製を停止するのを防ぐために、配列領域３１２内でのヌクレオチドを含むウラシルの含有を含まれ得る。その結果、バーコード配列３１２、結合配列３１０、Ｒ１プライマー領域３１４、及びランダムＮ量体配列３１６ｂを含む、一端に完全長オリゴヌクレオチド３０８ｂを含む断片３２６が作製される。配列の他方の末端には、第１のオリゴヌクレオチド３０８のランダムＮ量体に対する相補体３１６’、及び配列３１４’として示される、Ｒ１配列の全部または一部に対する相補体が含まれ得る。次いで、Ｒ１配列３１４及びその相補鎖３１４’は、部分的ヘアピン構造３２８を形成するために一緒にハイブリダイズすることができる。理解されるように、ランダムＮ量体は異なるオリゴヌクレオチド間で異なるため、これらの配列及びそれらの相補体はヘアピン形成に関与するとは考えられない。例えば、ランダムＮ量体３１６の相補体である配列３１６’は、ランダムＮ量体配列３１６ｂに相補的であるとは考えられない。これは、他の応用、例えば、Ｎ量体が所与の区分内のオリゴヌクレオチド間で共通する、標的化プライマーには当てはまらない。
【００８０】
これらの部分的なヘアピン構造を形成することにより、サンプル配列の第１レベルの複製物をさらなる複製からの除去すること、例えば、コピーの反復コピーを防止することを可能にする。部分ヘアピン構造は、作製された断片、例えば、断片３２６のその後の処理のための有用な構造を提供する。
【００８１】
一般に、細胞の核酸の増幅は、区分内のバーコード化された重複断片が、細胞のゲノムの特定の部分または全部の少なくとも１倍の適用範囲、対象のゲノムまたはその関連部分の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、またはそれ以上の適用範囲を構成するまで実行される。一旦バーコード化断片が生成されると、それらでは適切な配列決定システム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ（登録商標）、Ｍｉｓｅｑ（登録商標）またはＸ１０システムで直接配列決定されるか、または、例えば、逆読み取りのための第２の配列決定プライマー、サンプルインデックス配列などの他の機能配列のさらなる増幅、結合などのさらなる処理が行われてもよい。
【００８２】
複数の異なる区分からの断片の全てを、本明細書に記載のように高スループットシーケンサー上での配列決定のためにプールすることができるが、この場合、プールされた断片は、異なる細胞または小さな細胞集団の核酸に由来する多数の断片を含むが、所与の細胞の核酸由来の断片は同じバーコード配列を共有することになる。特に、各断片はその起源の区分、ひいてはその単一細胞または細胞の小集団に応じてコード化されるため、その断片の配列は、そのバーコードの存在に基づいてその細胞またはそれらの細胞に帰属させることができるが、このことは、複数の区分からの様々な配列断片を、異なる細胞の個々のゲノムのアセンブリーに適用するのにも役立つ。これは、図４に概略的に示されている。一例に示されるように、第１の細胞４００由来の第１の核酸４０４及び第２の細胞４０２由来の第２の核酸４０６はそれぞれ、上述のようにそれらの独自のバーコードオリゴヌクレオチドのセットで区分化される。核酸は、細胞由来の染色体、全ゲノム、または他の大きな核酸を含み得る。
【００８３】
各区分内で、各細胞の核酸４０４及び４０６は、第１の断片（複数可）の第２の断片の重複セット、例えば第２の断片セット４０８及び４１０を別々に提供するように処理される。また、この処理によって、第２の断片にバーコード配列が提供されるが、特定の第１の断片由来の第２の断片それぞれのバーコード配列は同じである。図示のように、第２断片セット４０８のバーコード配列は「１」で示され、断片セット４１０のバーコード配列は「２」で示される。バーコードの多様なライブラリーを、多数の異なる断片セットを差別的にバーコード化するのに使用することができる。しかし、異なる第１の断片由来の全ての第２の断片セットが異なるバーコード配列でバーコード化される必要はない。実際、多くの場合、複数の異なる第１の断片を、同じバーコード配列を含むように同時に処理することができる。多様なバーコードライブラリーが、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。
【００８４】
例えば、断片セット４０８及び４１０由来のバーコード化断片を、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．のＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ部門から入手可能な合成技術による配列を使用する配列決定のためにプールすることができる。配列は、一旦配列されると、配列読み取りデータ４１２は、例えば、集約された読み取りデータ４１４及び４１６に示されるように、含有されるバーコードに少なくとも部分的に基づいて、またいくつかの場合には、断片自身の配列に部分的に基づいて、それぞれの断片セットに帰属させることができる。次いで、各断片セットの帰属させた配列読み取りデータは、アセンブルされて、各細胞の核酸のアセンブルされた配列、例えば、配列４１８及び４２０を提供し、これは、個々の細胞、例えば、細胞４００及び４０２に帰属させることができる。
【００８５】
細胞内に存在する遺伝物質を分析することに関して記載されているが、本明細書に記載の方法及びシステムは、個々の細胞へ試薬の割り当て、かつその試薬に反応するするそれらの細胞の帰属分析または特徴付けを提供することによって、個々の細胞または細胞集団の他の態様を特徴付ける能力を含む、より広範な適用性を有する。これらの方法及びシステムは、例えば、研究、診断、病原体識別、及び他の多くの目的のために、細胞を特徴付けることができることにおいて特に価値がある。例として、例えば、分化のクラスターまたはＣＤタンパク質のような細胞表面タンパク質などの、広範囲の異なる細胞表面特徴は、癌のような疾患の特徴付けにおいて有意な診断関連性を有する。
【００８６】
１つの特に有用な応用では、本明細書に記載の方法及びシステムは、例えば、タンパク質、受容体などの細胞表面特徴といった細胞特徴を特徴付けるのに使用され得る。特に、本明細書に記載の方法は、上記のように区分化された場合に、例えばＤＮＡ配列決定技術を用いて、個々の細胞または細胞集団内のそのような細胞特徴の存在を確認するために、また、いくつかの場合には、それらの相対的な存在量または量を確認するために、バーコード化されて分析され得るこれらの細胞特徴にレポーター分子を結合させるのに使用され得る。
【００８７】
特定の例では、潜在的な細胞結合リガンド、例えば、抗体、抗体断片、細胞表面受容体結合分子などのライブラリーは、例えば、異なるレポーターオリゴヌクレオチド配列が特定のリガンドと結合し、従って特定の細胞表面特徴に結合することができる場合、第１のセットの核酸レポーター分子と結合させて提供され得る。いくつかの態様では、ライブラリーの異なるメンバーは、異なるオリゴヌクレオチド配列標識の存在によって特徴付けされてもよく、例えば、第１のタイプの細胞表面タンパク質または受容体に対する抗体は、第１の既知のレポーターオリゴヌクレオチド配列と関連付けられており、第２のレセプタータンパク質に対する抗体は、それと関連付けられている異なる既知のレポーターオリゴヌクレオチド配列を有することになる。細胞は、共に区分化される前に、例えば、受容体、タンパク質などの異なる細胞表面特徴の広範なパネルに対する抗体を表すことができ、かつそれらの関連するレポーターオリゴヌクレオチドを含むリガンドのライブラリーとインキュベートされることになる。結合していないリガンドは細胞から洗浄され、次いで細胞は上記のバーコードオリゴヌクレオチドと共に区分化される。結果として、区分には、細胞または細胞（複数）、ならびに結合したリガンド及びそれらの既知の関連レポーターオリゴヌクレオチドが含まれることになる。
【００８８】
区分内で細胞を溶解させる必要なしに、細胞の核酸ではレポーターオリゴヌクレオチドに対して上記のバーコード化操作を行い、バーコード化されたレポーターオリゴヌクレオチドを生成させることができるが、この場合、レポーターオリゴヌクレオチドの存在によって特定の細胞表面特徴の存在を示すことができ、また、バーコード配列によって、その細胞または細胞の集団と共に区分化されたバーコード配列に基づいて、ある範囲の異なる細胞表面特徴を所与の個々の細胞または細胞集団に帰属させることが可能となる。その結果、より広範な細胞集団内で細胞表面特徴の細胞ごとのプロファイルを生成することができる。本明細書に記載の方法及びシステムのこの態様は、以下でより詳細に説明される。
【００８９】
この例は図５で概略的に示される。図示のように、細胞５０２及び５０４によって表される細胞の集団は、細胞表面結合試薬、例えば抗体、細胞表面結合タンパク質、リガンドなどのライブラリーとインキュベートされるが、この場合、異なるタイプの結合基はそれぞれ、リガンド及び関連レポーター分子５０６、５０８、５１０、及び５１２（レポーター分子は別に影付き丸で示されている）として示されている、それに付随する関連付けられた核酸レポーター分子を含む。細胞がライブラリーによって結合された表面特徴を発現する場合、リガンド及びそれらに付随するレポーター分子は、細胞表面と結合または連結することができる。次いで、個々の細胞は、それらの結合したリガンド／レポーター分子、及び本明細書の他の箇所に記載された個々のバーコードオリゴヌクレオチドビーズ、例えば、ビーズ５２２及び５２４のそれぞれと、別個の区分、例えば液滴５１４及び５１６に区分化される。本明細書中に記載の他の例と同様に、バーコード化オリゴヌクレオチドはビーズから放出され、所与の区分では共通であるが異なる区分間では大幅に変化するバーコードで各区分内に存在するレポーター分子をバーコード配列に結合させるのに使用される。例えば、図５に示されるように、区分５１４の細胞５０２に結合するレポーター分子はバーコード配列５１８でバーコード化され、区分５１６の細胞５０４に結合するレポーター分子はバーコード５２０でバーコード化される。その結果、レポーター分子によって反映されるように細胞の表面リガンドを反映するが、共通のバーコード配列により個々の細胞に実質的に起因させることができるオリゴヌクレオチドのライブラリーが提供され、これによって、細胞の表面特性の単一細胞レベルプロファイリングが可能となる。理解されるように、このプロセスは、細胞表面受容体に限定されず、多様な特定の細胞構造、化学、または他の特性の存在を識別するのに使用され得る。
【００９０】
ＩＩＩ．単一細胞分析の応用
特定の個々のエル（ｅｌｌｓ）の分析、異なる細胞タイプの集団内の異なる細胞タイプの分析、環境、ヒトの健康、疫学法医学に関する、細胞の大集団の分析及び特徴付けを含む、本明細書に記載の単一細胞処理及び分析方法及びシステムの多様な応用が存在する。
【００９１】
本明細書に記載される単一細胞分析プロセスの特に有用な応用は、癌細胞の配列決定及び特徴付けでの応用である。特に、上記で示唆されたアンサンブル配列決定プロセスを含む従来の分析技術は、特に正常組織細胞の海に存在する癌細胞のゲノム構成の小さな変異を選別するのに高度には熟達していない。さらに、腫瘍細胞の間でさえも、様々な変異が存在し、配列決定に対するアンサンブルアプローチによってマスクされ得る（例えば、Ｐａｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５４２５７参照（２０１４年６月１２日にオンラインで公開）。癌細胞は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、細胞系に由来してもよく、また循環腫瘍細胞として得られてもよく、また、癌細胞に上記の区分化プロセスを行ってもよい。分析時、個々の細胞配列を単一の細胞または小さな細胞群に由来するものとして識別して、それらを正常組織細胞配列に対して区別することができる。さらに、その全開示が全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組込まれる、２０１４年６月２６日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６２／０１７，８０８号に記載されているように、各細胞から段階的配列情報を得ることもでき、それによって癌細胞内のハプロタイプ変異のより明確な特徴付けを可能にする。単一細胞分析アプローチは、その全開示が全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組込まれる、２０１４年６月２６日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６２／０１７，５８０号に記載されているように、少量の入力核酸を伴うシステム及び方法に特に有用である。
【００９２】
癌細胞分析と同様に、胎児の細胞の分析による胎児の健康または異常の分析及び診断は、従来の技術を用いた困難な作業である。特に、胎児の細胞試料を採取する羊水穿刺などの比較的侵襲的な処置がない場合、母体循環からのそれらの細胞の採取を用いることができる。理解されるように、そのような循環胎児細胞は、その循環の全体的な細胞集団の非常に小さな部分を構成する。その結果、母親の細胞とは対照的に、得られたデータのうち胎児の細胞に由来する可能性が高いものを特徴付けるために、複雑な分析が行われる。しかし、本明細書に記載の単一細胞の特徴付け、方法、及びシステムを用いることによって、個々の細胞に遺伝的構成を帰属させ、それらの細胞を、それぞれの遺伝的構成に基づいて母親のものまたは胎児のものとして分類することができる。さらに、胎児細胞の遺伝子配列は、例えば、ダウン症候群、エドワーズ症候群、及びパタウ症候群のような異数性を含む多くの遺伝的疾患のいずれかを識別するのに使用され得る。
【００９３】
より多様な細胞集団から個々の細胞を特徴付ける能力は、環境試験及び法医学分析の両方において有意な価値があり、サンプルは、サンプルが試験されている細胞、例えば、環境及び食品安全性試験などのための環境インジケータ生物、毒性生物など、性的暴行、及び他の暴力犯罪などの法医学分析における犠牲者及び／または加害者細胞に対して、それらの性質により、サンプルを「汚染する」細胞及び他の物質の多様な集団から構成され得る。
【００９４】
上記の単一細胞配列決定及び特徴付けプロセスのさらなる有用な応用は、神経科学の研究及び診断の分野のものである。特に、神経細胞は、各ニューロンをその近傍の細胞とは異なるものとする、ゲノムの周りを動くことができる長い散在性反復配列（ＬＩＮＥ）または「ジャンプする」遺伝子を含むことができる。研究により、ヒトの脳内のＬＩＮＥの数は、８０〜３００個の固有の挿入を有する他の組織、例えば心臓及び肝臓組織の数を超えることが示されている（例えば、Ｃｏｕｆａｌ，Ｎ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６０，１１２７−１１３１（２００９）参照）。これらの相違は、神経疾患に対する個人の感受性に関連すると考えられており（例えば、Ｍｕｏｔｒｉ，Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６８，４４３−４４６（２０１０）参照）、または課題に応答する多様性を脳に与える。したがって、本明細書に記載の方法は、個々の神経細胞の配列決定及び特徴付けにおいて使用され得る。
【００９５】
本明細書に記載の単一細胞分析方法は、ＲＮＡ転写物の識別及びその定量の識別の両方の点で、上記のような遺伝子発現の分析にも有用である。特に、本明細書に記載の単一細胞レベル分析法を使用して、個々の細胞、細胞集団、または細胞集団のサブセットに存在するＲＮＡ転写物を単離して分析することができる。特に、いくつかの場合、バーコードオリゴヌクレオチドは、プライミングし、複製し、結果として個々の細胞からバーコード化されたＲＮＡ断片を得るように構成することができる。例えば、いくつかの場合、バーコードオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ特異的プライミング配列、例えば、逆転写反応または他の標的プライミング配列においてｍＲＮＡのプライミング及び複製を可能にするポリＴプライマーセグメントを含み得る。代替的にまたは追加的に、バーコードオリゴヌクレオチドのランダムＮ量体プライマーセグメントを用いてランダムＲＮＡプライミングを実施してもよい。
【００９６】
図６は、本明細書に記載の方法を用いた個々の細胞におけるＲＮＡ発現分析のための一例示的方法の概略図を提供する。図示のように、操作６０２において、細胞を含むサンプルが、生存細胞によって選別され、その後の区分化のために定量化されて希釈される。操作６０４において、個々の細胞は、本明細書に記載のバーコードオリゴヌクレオチドを有するゲルビーズと共に別々に区分化される。細胞を溶解し、操作６０６で、バーコード化されたオリゴヌクレオチドを区分に放出すると、それらは、例えば、ｍＲＮＡのポリＡ尾部に相補的なポリＴプライマー配列によって、操作６０８でｍＲＮＡと相互作用してハイブリダイズする。ポリＴバーコードオリゴヌクレオチドをプライミング配列として使用して、操作６１０で逆転写反応を行い、バーコード配列を含むｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物を合成する。次いで、バーコード化されたｃＤＮＡ転写物は、ｃＤＮＡ配列及びその関連するバーコード配列（複数可）の決定のための生物学的配列決定システムに置かれる前に、操作６１２では、例えばＰＣＲプロセスを使用してさらなる増幅されて、操作６１４では精製される。いくつかの場合、図示のように、操作６０２〜６０８は、試薬がそれらの元の液滴または区分に残っている間に発生し得、一方操作６１２〜６１６は、バルクで（例えば、区分の外側で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、操作６１２〜６１６を完了させるためにエマルジョンを破壊し、液滴の内容物をプールすることができる。いくつかの場合では、バーコードオリゴヌクレオチドは、エマルジョンが破壊された後にエキソヌクレアーゼで分解され得る。エキソヌクレアーゼ活性は、プライマー消化後にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって阻害され得る。いくつかの場合、操作６１０は、逆転写混合物、例えば逆転写酵素、と関連する試薬とが共に区分化されることに基づいて、区分内で行うことができるか、またはバルク内で行うことができる。
【００９７】
本明細書の他の箇所に記載されているように、バーコードオリゴヌクレオチドの構造は、オリゴヌクレオチドバーコード配列に加えて多くの配列要素を含むことができる。上記のＲＮＡ分析に使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドの一例を図７に示す。図示のように、全体のオリゴヌクレオチド７０２は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能な結合７０６によってビーズ７０４に結合されている。オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のシーケンサー特異的フロー細胞付着配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのＰ５配列、及び配列決定用プライマー配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのＲ１プライマーを含み得る機能配列７０８などの、後続の処理で使用される機能配列を含んでもよい。バーコード配列７１０は、サンプルＲＮＡをバーコード化するのに使用するために構造に含まれる。ポリＴ配列７１２などのｍＲＮＡ特異的プライミング配列もオリゴヌクレオチド構造に含まれる。ポリＴ配列がｍＲＮＡの配列末端に確実にハイブリダイズするように、アンカー配列セグメント７１４を含むことができる。このアンカー配列は、ヌクレオチドのランダム短配列、例えば、ポリＴセグメントがｍＲＮＡのポリＡ尾部の配列端部においてハイブリダイズする可能性を確実に高めることになる１量体、２量体、３量体、またはそれ以上の配列を含むことができる。追加配列セグメント７１６をオリゴヌクレオチド配列内に提供することができる。いくつかの場合、この追加配列は、例えば、単一のビーズに結合する個々のオリゴヌクレオチドにわたって変化するランダム配列（例えば、ランダムＮ量体配列など）として、固有の分子配列セグメントを提供するが、一方、バーコード配列７１０は、個々のビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドの間で一定であることができる。この固有の配列は、元の発現されたＲＮＡの数の定量を可能にするために、捕捉された開始ｍＲＮＡ分子の固有の識別子を提供するのに役立つ。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表面に繋がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万〜数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができ、ここで、上記のように、バーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができるが、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。この固有の分子配列セグメントは、オリゴヌクレオチドの配列内に５〜約８個またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、固有の分子配列セグメントは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチドまたはそれ以上であってよい。いくつかの場合、固有の分子配列セグメントは、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチドまたはそれ以上であってよい。いくつかの場合、固有の分子配列セグメントは、長さが高々２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチドまたはそれ以下であってよい。
【００９８】
操作において、図６及び７を参照して、細胞はバーコード担持ビーズと共に区分化されて溶解されるが、その間、バーコード化オリゴヌクレオチドをビーズから放出される。次いで、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴ部分は、ｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズされ。次いで、ポリＴセグメントは、ｍＲＮＡの逆転写をプライミングして、ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物を生成するが、これには、バーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント７０８〜７１６のそれぞれを含まれる。さらに、オリゴヌクレオチド７０２は、アンカー配列７１４を含むため、ｍＲＮＡのポリＡ尾部の配列末端にハイブリダイズし、そこで逆転写をプライミングする可能性がより高くなる。任意の所与の区分内で、個々のｍＲＮＡ分子の全てのｃＤＮＡ転写物は、共通のバーコード配列セグメント７１０を含むことになる。しかし、固有のランダムＮ量体配列を含むことによって、所与の区分内の異なるｍＲＮＡ分子から作製された転写物は、この固有の配列において変化することになる。これにより、所与の区分の内容物の任意の後続の増幅の後でさえも識別可能な定量化機能が提供され、例えば、共通のバーコードに関連する固有のセグメントの数は、単一の区分、したがって単一の細胞から生じるｍＲＮＡの量を示すことができる。上記のように、ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物の配列を識別し、かつバーコードセグメント及び固有の配列セグメントを配列決定するために、転写物は増幅され、洗浄され、かつ配列決定される。
【００９９】
本明細書の他の箇所で述べたように、ポリＴプライマー配列が記載されているが、他の標的またはランダムプライミング配列も、逆転写反応のプライミングに使用することができる。同様に、溶解した細胞の内容物と共にバーコード化されたオリゴヌクレオチドを区分に放出するものと記載されているが、いくつかの例では、他の細胞内容物からＲＮＡを容易に分離するために、ゲルビーズ結合オリゴヌクレオチドを使用してゲルビーズの固相上のｍＲＮＡをハイブリダイズして捕捉することができることを理解されたい。
【０１００】
メッセンジャーＲＮＡ（細胞から得られたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ）分析を含むＲＮＡ分析に使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドのさらなる例を図９Ａに示す。図示のように、オリゴヌクレオチド９０２全体は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能なリンカー９０６によってビーズ９０４に結合され得る。オリゴヌクレオチドは、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのＰ５配列を含み得る機能配列９０８、及び配列決定プライマー配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのＲ１プライマー結合部位を含み得る機能配列９１０などの、後続の処理で使用される機能配列を含んでもよい。バーコード配列９１２は、サンプルＲＮＡをバーコード化するのに使用するために構造内に含まれる。ポリＴ配列９１４などのＲＮＡ特異的（例えば、ｍＲＮＡ特異的）プライミング配列もオリゴヌクレオチド構造に含まれる。ｍＲＮＡの配列末端でポリＴ配列を確実にハイブリダイズさせるために、アンカー配列セグメント（図示せず）を含むことができる。追加配列セグメント９１６をオリゴヌクレオチド配列内に提供することができる。この追加配列は、例えば、単一のビーズに結合する個々のオリゴヌクレオチドにわたって変化するランダムＮ量体配列として固有の分子配列セグメントを提供することができるが、一方でバーコード配列９１２は、個々のビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドの間で一定であることができる。本明細書の他の箇所に記載されているように、この固有の配列は、元の発現されたＲＮＡの数の定量、例えば、ｍＲＮＡ計数を可能にするために、捕捉された開始ｍＲＮＡ分子の固有の識別子を提供するのに役立つことができる。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドがビーズの表面に繋がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万〜数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができ、この場合、上記のように、バーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができるが、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。
【０１０１】
細胞ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分析の例示的な方法において及び図９Ａを参照すると、細胞は、バーコード担持ビーズ、スイッチオリゴ９２４、ならびに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの他の試薬と共に、区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。操作９５０において、細胞が溶解される間、バーコード化されたオリゴヌクレオチド９０２は、（例えば、還元剤の作用によって）ビーズから放出され、放出されたバーコード化オリゴヌクレオチドのポリＴセグメント９１４は、細胞から放出されたｍＲＮＡ９２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作９５２において、ポリＴセグメント９１４は、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長されて、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物９２２を生成し、またバーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、９１２、９１０、９１６、及び９１４のそれぞれも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）に追加の塩基を添加することができる。次いで、スイッチオリゴ９２４は、ｃＤＮＡ転写物に添加された追加の塩基とハイブリダイズして、テンプレートスイッチングを促進し得る。次いで、スイッチオリゴ９２４をテンプレートとして使用して、ｃＤＮＡ転写物９２２を伸長させることによって、スイッチオリゴ配列に相補的な配列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことができる。任意の所定の区分内で、個々のｍＲＮＡ分子の全てのｃＤＮＡ転写物は、共通のバーコード配列セグメント９１２を含むことになる。しかし、固有のランダムＮ量体配列９１６を含むことによって、所与の区分内の異なるｍＲＮＡ分子から作製された転写物は、この固有の配列で変化することになる。これによって、本明細書の他の箇所に記載されているように、所与の区分の内容物の後続の任意の増幅の後でさえも識別可能な定量的特徴が提供され、例えば、共通バーコードに関連する固有のセグメントの数は、単一の区分、従って単一の細胞から生じるｍＲＮＡの量を示すことができる。操作９５２後、操作９５４では、ｃＤＮＡ転写物９２２はプライマー９２６（例えば、ＰＣＲプライマー）で増幅される。次に、増幅された生成物は、操作９５６で、（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によって）精製される。操作９５８において、増幅された生成物は剪断され、さらなる機能配列に連結され、さらに（例えば、ＰＣＲを介して）増幅される。機能配列は、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列９３０、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのＰ７配列、及び、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのＲ２プライマーに対する配列決定プライマー結合部位を含み得る機能配列９２８、及びサンプルインデックス、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのｉ７サンプルインデックス配列を含み得る機能配列９３２を含み得る。いくつかの場合、操作９５０及び９５２は区分内で発生し得るが、例えば、区分９５４、９５６、及び９５８は、バルク溶液で（例えば、区分外のプールされた混合物において）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、操作９５４、９５６、及び９５８を完了させるために、エマルジョンを破壊して、液滴の内容物をプールすることができる。いくつかの場合、操作９５４は区分内で完了させることができる。いくつかの場合、バーコードオリゴヌクレオチドは、エマルジョンが破壊された後にエキソヌクレアーゼで分解することができる。エキソヌクレアーゼ活性は、プライマー分解後にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって阻害することができる。特定の配列決定システム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムに使用される特定の配列参照に関して記載されているが、これらの配列への参照は例示のみを目的とするものであり、本明細書に記載の方法は、例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｇｅｎｉａ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓなどから入手可能なシステムのようなシステムで使用される特異的プライミング、結合、インデックス、及び他の操作配列を組込む他の配列システムと共に使用されるように構成され得ることを理解されたい。
【０１０２】
図９Ａに示されるＲＮＡ（例えば、細胞ＲＮＡ）分析に使用するためのバーコードオリゴヌクレクロチドの代替例では、機能配列９０８はＰ７配列であってよく、機能配列９１０はＲ２プライマー結合部位であってよい。さらに、機能配列９３０はＰ５配列であってもよく、機能配列９２８はＲ１プライマー結合部位であってもよく、機能配列９３２はＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのｉ５サンプルインデックス配列であってもよい。そのようなバーコードオレオゴクレオチドによって生成された構築物の構成は、配列決定中にポリＴ配列の配列決定を最小限に抑える（または回避する）のに役立つ。
【０１０３】
図９Ｂには、細胞ｍＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析のための別の例示的な方法が示されている。この方法では、スイッチオリゴ９２４は、逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの試薬と一緒に、個々の細胞及びバーコード化されたビーズと共に区分（例えば、エマルジョン中の液滴）へ区分化される。スイッチオリゴ９２４は、追加のタグ９３４（例えば、ビオチン）で標識化され得る。操作９５１において、細胞が溶解され、その間、バーコード化されたオリゴヌクレオチド９０２（例えば、図９Ａに示される）が（例えば、還元剤の作用によって）ビーズから放出される。いくつかの場合、配列９０８はＰ７配列であり、配列９１０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列９０８はＰ５配列であり、配列９１０はＲ１プライマー結合部位である。次に、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴセグメント９１４は、細胞から放出されるｍＲＮＡ９２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次いで、操作９５３において、ポリＴセグメント９１４は、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長され、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物９２２を生成し、また、バーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、９１２、９１０、９１６及び９１４のそれぞれも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）にさらなる塩基を添加することができる。次いで、スイッチオリゴ９２４は、ｃＤＮＡ転写物とハイブリダイズし、テンプレートスイッチングを容易にし得る。次いで、スイッチオリゴ９２４をテンプレートとして使用して、ｃＤＮＡ転写物９２２を伸長させることによって、スイッチオリゴ配列に相補的な配列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことができる。次に、区分内の試薬及びオリゴヌクレオチドから、ｃＤＮＡ転写物９２２を単離するのに、単離操作９６０を使用することができる。追加のタグ９３４、例えば、ビオチンを、磁性ビーズ９３８に結合し得る相互作用タグ９３６、例えば、ストレプトアビジンと接触させることができる。操作９６０において、操作９５５での増幅（例えば、ＰＣＲによるもの）前のプルダウン操作（例えば、磁気分離、遠心分離によるもの）、その後の操作９５７での精製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によるもの）、及び操作９５９でのさらなる処理（剪断、配列９２８、９３２、及び９３０の連結、ならびにその後の増幅（例えば、ＰＣＲによるもの））により、ｃＤＮＡを単離することができる。配列９０８がＰ７配列であり、配列９１０がＲ２プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ５配列であり、配列９２８はＲ１プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ５サンプルインデックス配列である。配列９０８がＰ５配列であり、配列９１０がＲ１プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ７配列であり、配列９２８はＲ２プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ７サンプルインデックス配列である。いくつかの場合、図示のように、操作９５１及び９５３は区分で発生し得るが、操作９６０、９５５、９５７、及び９５９は、バルク溶液（例えば、パーティシンの外部のプールされた混合物）で発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物は操作９６０を完了させるためにプールされ得る。次いで、処理のために転写物をプールした後、操作９６０に続いて、操作９５５、９５７、及び９５９を実行することができる。
【０１０４】
図９Ｃには、細胞ｍＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析のための別の例示的な方法が示されている。この方法では、スイッチオリゴ９２４は、逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの試薬と一緒に、個々の細胞及びバーコード化されたビーズと共に区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に共区分化される。操作９６１において、細胞が溶解され、その間バーコード化されたオリゴヌクレオチド９０２（例えば、図９Ａに示される）が（例えば、還元剤の作用によって）ビーズから放出される。いくつかの場合、配列９０８はＰ７配列であり、配列９１０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列９０８はＰ５配列であり、配列９１０はＲ１プライマー結合部位である。次に、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴセグメント９１４は、細胞から放出されるｍＲＮＡ９２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作９６３において、ポリＴセグメント９１４は、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いる逆転写反応で伸長され、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物９２２を生成し、また、バーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、９１２、９１０、９１６及び９１４のそれぞれも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）にさらなる塩基を添加することができる。次いで、スイッチオリゴ９２４は、ｃＤＮＡ転写物とハイブリダイズし、テンプレートスイッチングを容易にし得る。次いで、スイッチオリゴ９２４をテンプレートとして使用して、ｃＤＮＡ転写物９２２を伸長させることにより、スイッチオリゴ配列に相補的な配列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことができる。操作９６１及び操作９６３に続いて、操作９６２でｍＲＮＡ９２０及びｃＤＮＡ転写物９２２が変性される。動作９６４において、第２鎖は、追加のタグ９４２、例えば、ビオチンを有するプライマー９４０から伸長され、ｃＤＮＡ転写物９２２にハイブリダイズする。また、操作９６４において、ビオチン標識された第２鎖は、磁気ビーズ９３８に付着し得る相互作用タグ９３６、例えばストレプトアビジンと接触させることができる。操作９６５での増幅（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるもの）前のプルダウン操作（例えば、磁気分離、遠心分離によるもの）、その後の操作９６７での精製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によるもの）、及び操作９６９でのさらなる処理（剪断、配列９２８、９３２、及び９３０の連結、ならびにその後の増幅（例えば、ＰＣＲによるもの））によりｃＤＮＡを単離することができる。配列９０８がＰ７配列であり、かつ配列９１０がＲ２プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ５配列であり、配列９２８はＲ１プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ５サンプルインデックス配列である。配列９０８がＰ５配列であり、かつ配列９１０がＲ１プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ７配列であり、配列９２８はＲ２プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ７サンプルインデックス配列である。いくつかの場合、操作９６１及び９６３は区分で発生し得るが、操作９６２、９６４、９６５、９６７、及び９６９は、バルク（例えば、パーティシンの外部）で発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物は操作９６２、９６４、９６５、９６７、及び９６９を完了させるためにプールされ得る。
【０１０５】
図９Ｄには、細胞ｍＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析のための別の例示的な方法が示されている。この方法では、スイッチオリゴ９２４は、逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの試薬と一緒に、個々の細胞及びバーコード化されたビーズと共に区分化される。操作９７１において、細胞が溶解され、その間バーコード化されたオリゴヌクレオチド９０２（例えば、図９Ａに示される）が（例えば、還元剤の作用によって）ビーズから放出される。いくつかの場合、配列９０８はＰ７配列であり、配列９１０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列９０８はＰ５配列であり、配列９１０はＲ１プライマー結合部位である。次に、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴセグメント９１４は、細胞から放出されるｍＲＮＡ９２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作９７３において、ポリＴセグメント９１４は、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長され、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物９２２を生成し、また、バーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、９１２、９１０、９１６及び９１４のそれぞれも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）にさらなる塩基を添加することができる。次いで、スイッチオリゴ９２４は、ｃＤＮＡ転写物とハイブリダイズし、テンプレートスイッチングを容易にし得る。次いで、スイッチオリゴ９２４をテンプレートとして使用して、ｃＤＮＡ転写物９２２を伸長させることによって、スイッチオリゴ配列に相補的な配列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことができる。操作９６６で、ｍＲＮＡ９２０、ｃＤＮＡ転写物９２２、及びスイッチオリゴ９２４を変性させることができ、かつｃＤＮＡ転写物９２２を追加のタグ９４６、例えばビオチンで標識された捕捉オリゴヌクレオチド９４４とハイブリダイズさせることができる。この操作では、ｃＤＮＡ転写体にハイブリダイズしたビオチン標識された捕捉オリゴヌクレオチド９４４を、磁気ビーズ９３８に付着し得る、相互作用タグ９３６、例えば、ストレプトアビジンと接触させることができる。プルダウン操作（例えば、磁気分離、遠心分離によるもの）を使用して他の種（例えば、過剰のバーコード化オリゴヌクレオチド）から分離させた後、ｃＤＮＡ転写物を、（例えば、ＰＣＲによって）、操作９７５のプライマー９２６、それに続く操作９７７での精製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によるもの）及び操作９７９でのさらなる処理（剪断、配列９２８、９３２、及び９３０の連結、ならびにその後の増幅（例えば、ＰＣＲによるもの））によりで増幅させることができる。配列９０８がＰ７配列であり、かつ配列９１０がＲ２プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ５配列であり、配列９２８はＲ１プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ５サンプルインデックス配列である。配列９０８がＰ５配列であり、かつ配列９１０がＲ１プライマー結合部位である他の場合、配列９３０はＰ７配列であり、配列９２８はＲ２プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ７サンプルインデックス配列である。いくつかの場合、操作９７１及び９７３は区分で発生し得るが、操作９６６、９７５、９７７（精製）、及び９７９は、バルク（例えば、区分の外部）で発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物は操作９６６、９７５、９７７、及び９７９を完了させるためにプールされ得る。
【０１０６】
図９Ｅには、細胞ＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析のための別の例示的な方法が示されている。この方法では、個々の細胞は、バーコード担持ビーズ、スイッチオリゴ９９０、ならびに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの試薬と共に区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。操作９８１において、細胞が溶解され、その間、バーコード化されたオリゴヌクレオチド９０２（例えば、図９Ａに示される９０２）が（例えば、還元剤の作用によって）ビーズから放出される。いくつかの場合、配列９０８はＰ７配列であり、配列９１０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列９０８はＰ５配列であり、配列９１０はＲ１プライマー結合部位である。次に、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴセグメントは、細胞から放出されるｍＲＮＡ９２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作９８３において、ポリＴセグメントは、次いで、逆転写反応で伸長されて、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物９２２を生成し、またバーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、９１２、９１０、９１６、及び９１４のそれぞれも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）にさらなる塩基を添加することができる。次いで、スイッチオリゴ９９０は、ｃＤＮＡ転写物とハイブリダイズし、テンプレートスイッチングを容易にし得る。スイッチオリゴ配列に相補的であり、かつＴ７プロモーター配列を含む配列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことができる。操作９６８では、第２鎖を合成し、操作９７０では、Ｔ７プロモーター配列を、Ｔ７ポリメラーゼによって使用して、インビトロ転写においてＲＮＡ転写物を生成することができる。操作９８５では、ＲＮＡ転写産物を（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）により）精製し、逆転写してＤＮＡ転写物を形成し、第２鎖をＤＮＡ転写物の各々に合わせて合成することができる。いくつかの場合、精製前に、ＲＮＡ転写物をＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮＡａｓｅ  Ｉ）と接触させて、残留ＤＮＡを分解することができる。操作９８７において、ＤＮＡ転写物は断片化され、配列９２８、９３２、及び９３０などの追加の機能配列に連結され、いくつかの場合、（例えば、ＰＣＲにより）さらに増幅される。配列９０８がＰ７配列であり、かつ配列９１０がＲ２プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ５配列であり、配列９２８はＲ１プライマー結合部位であり、かつ配列９３２はｉ５サンプルインデックス配列である。配列９０８がＰ５配列であり、かつ配列９１０がＲ１プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ７配列であり、配列９２８はＲ２プライマー結合部位であり、かつ配列９３２はｉ７サンプルインデックス配列である。いくつかの場合、ＤＮＡ転写物の一部を除去する前に、ＤＮＡ転写物をＲＮａｓｅと接触させて残留ＲＮＡを分解することができる。いくつかの場合、操作９８１及び９８３は区分内で発生し得るが、操作９６８、９７０、９８５、及び９８７はバルクで（例えば区分外で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物は、操作９６８、９７０、９８５、及び９８７を完���するためにプールされ得る。
【０１０７】
メッセンジャーＲＮＡ（細胞から得たｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ）分析を含む、ＲＮＡ分析に使用するバーコードオリゴヌクレオチドの別の例を図１０に示す。図示のように、全体的なオリゴヌクレオチド１００２は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能なリンケージ１００６によってビーズ１００４に結合される。オリゴヌクレオチドは、後続の処理において使用される機能配列、例えば、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列、例えばＰ７配列を含み得る機能配列１００８、及び配列決定プライマー配列、例えば、Ｒ２プライマー結合部位を含み得る機能配列１０１０を含み得る。バーコード配列１０１２は、サンプルＲＮＡをバーコード化するのに使用するための構造内に含まれる。ポリＴ配列１０１４などのＲＮＡ特異的（例えば、ｍＲＮＡ特異的）プライミング配列は、オリゴヌクレオチド構造に含まれ得る。ポリＴ配列がｍＲＮＡの配列末端で確実にハイブリダイズするように、アンカー配列セグメント（図示せず）が含まれ得る。追加配列セグメント１０１６が、オリゴヌクレオチド配列内に提供されてもよい。この追加配列は、本明細書の他の箇所に記載されているように、固有の分子配列セグメントを提供することができる。さらなる機能配列１０２０、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、インビトロ転写のために含まれ得る。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表面に繋がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万〜数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができるが、この場合、上記のように、バーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができるが、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。
【０１０８】
細胞ＲＮＡ分析の例示的な方法において、図１０を参照すると、細胞は、バーコード担持ビーズ、ならびに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの試薬と共に、区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。操作１０５０において、細胞が溶解されるが、その間バーコード化されたオリゴヌクレオチド１００２が（例えば、還元剤の作用により）ビーズから放出され、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴセグメント１０１４がｍＲＮＡ１０２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作１０５２において、ポリＴセグメントは、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長させてｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物１０２２を生成し、またバーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント１０２０、１００８、１０１２、１０１０、１０１６、及び、１０１４のそれぞれも含む。任意の所与の区分内で、個々のｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ転写物の全ては、共通のバーコード配列セグメント１０１２を含むことになる。しかし、固有のランダムＮ量体配列を含むことにより、所与の区分内の異なるｍＲＮＡ分子から作製された転写物は、この固有の配列で変化することになる。これは、本明細書の他の箇所に記載されているように、所与の区分の内容物のその後の任意の増幅の後でさえも識別可能な定量的特徴を提供し、例えば、共通バーコードに関連する固有のセグメントの数は、単一の区分、従って単一の細胞から生じるｍＲＮＡの量を示すことができる。操作１０５４において、第２鎖が合成され、操作１０５６において、Ｔ７ポリメラーゼによってＴ７プロモーター配列が使用されて、インビトロ転写においてＲＮＡ転写物を生成することができる。操作１０５８において、転写物は断片化され（例えば、剪断され）、さらなる機能配列に連結されて、逆転写される。機能配列は、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列１０３０、例えばＰ５配列、及び配列決定プライマー、例えば、Ｒ１プライマー結合配列を含み得る機能配列１０２８、及びサンプルインデックス、例えば、ｉ５サンプルインデックス配列を含み得る機能配列１０３２を含み得る。操作１０６０では、ＲＮＡ転写物はＤＮＡに逆転写され、そのＤＮＡは（例えば、ＰＣＲにより）増幅され、配列決定されて、ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物の配列を識別し、かつバーコードセグメント及び固有の配列セグメントを配列決定することができる。いくつかの場合、操作１０５０及び１０５２は区分内で発生し得るが、操作１０５４、１０５６、１０５８、及び１０６０はバルクで（例えば、区分外で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物は、操作１０５４、１０５６、１０５８、及び１０６０を完了するためにプールされ得る。
【０１０９】
図１０に示すＲＮＡ（例えば、細胞ＲＮＡ）分析に使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドの代替例では、機能的配列１００８はＰ５配列であってもよく、機能的配列１０１０はＲ１プライマー結合部位あってもよい。さらに、機能配列１０３０はＰ７配列であってもよく、機能配列１０２８はＲ２プライマー結合部位であってもよく、機能配列１０３２はｉ７サンプルインデックス配列であってもよい。
【０１１０】
メッセンジャーＲＮＡ（細胞から得たｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ）分析を含む、ＲＮＡ分析に使用するバーコードオリゴヌクレオチドのさらなる例を図１１に示す。図示のように、全体的なオリゴヌクレオチド１１０２は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能なリンケージ１１０６によってビーズ１１０４に結合される。オリゴヌクレオチドは、後続の処理において使用される機能配列、例えば、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列、例えばＰ５配列を含み得る機能配列１１０８、及び配列決定プライマー配列、例えば、Ｒ１プライマー結合部位を含み得る機能配列１１１０を含み得る。いくつかの場合、配列１１０８はＰ７配列であり、配列１１１０はＲ２プライマー結合部位である。バーコード配列１１１２は、サンプルＲＮＡをバーコード化するのに使用するための構造内に含まれる。追加配列セグメント１１１６は、オリゴヌクレオチド配列内に提供されてもよい。いくつかの場合、この追加配列は、本明細書の他の箇所に記載されているように、固有の分子配列セグメントを提供することができる。さらなる配列１１１４、例えばポリＧが、テンプレートスイッチングを促すために含まれてもよい。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表面に繋がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万〜数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができ、この場合上記のように、バーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができるが、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。
【０１１１】
細胞ＲＮＡ分析の例示的な方法において、図１１を参照すると、細胞は、バーコード担持ビーズ、ポリＴ配列、ならびに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの他の試薬と共に、区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。操作１１５０において、細胞が溶解され、その間、バーコード化されたオリゴヌクレオチドが（例えば、還元剤の作用により）ビーズから放出され、ポリＴ配列が細胞から放出されたｍＲＮＡ１１２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作１１５２において、ポリＴ配列は、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長されて、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物１１２２を生成する。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）にさらなる塩基を添加することができる。次いで、ｃＤＮＡ転写体に添加された追加の塩基、例えばポリＣは、バーコード化されたオリゴヌクレオチドの１１１４とハイブリダイズすることができる。これによって、テンプレートスイッチングを容易にすることができ、バーコードオリゴヌクレオチドに相補的な配列をｃＤＮＡ転写物に組込むことができる。転写物は、さらに処理され（例えば、増幅され、部分除去され、追加配列が追加されるなど）、本明細書の他の箇所に記載されているように、例えば、配列決定によって特徴付けされ得る。そのような方法によって生成された構築物の構成は、配列決定中のポリＴ配列の配列決定を最小限にする（または回避する）のに役立つ。
【０１１２】
細胞ＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析で使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドのさらなる例を図１２Ａに示す。図示のように、オリゴヌクレオチド１２０２全体は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能なリンケージ１２０６によってビーズ１２０４に結合されている。オリオゴヌクレオチドは、その後の処理で使用される機能配列、例えば、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列、例えば、Ｐ５配列を含み得る機能配列１２０８、及び配列決定プライマー配列、例えば、Ｒ１プライマー結合部位を含み得る機能配列１２１０を含み得る。いくつかの場合、配列１２０８はＰ７配列であり、配列１２１０はＲ２プライマー結合部位である。バーコード配列１２１２は、サンプルＲＮＡをバーコード化するのに使用するための構造内に含まれる。追加配列セグメント１２１６は、オリゴヌクレオチド配列内に提供されてもよい。いくつかの場合、この追加配列は、本明細書の他の箇所に記載されているように、固有の分子配列セグメントを提供することができる。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表面に繋がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万〜数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができ、この場合、上記のように、バーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができるが、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。このバーコードを用いた例示的細胞ＲＮＡ分析法では、細胞は、バーコード担持ビーズならびにＲＮＡリガーゼ及び還元剤などの他の試薬と共に区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。細胞が溶解され、その間バーコード化されたオリゴヌクレオチドが（例えば、還元剤の作用によって）ビーズから放出される。次いで、バーコード化オリゴヌクレオチドは、区分中にある間に、ＲＮＡリガーゼによってｍＲＮＡ転写物の５’末端に連結され得る。後続の操作には、精製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によるもの）及びさらなる処理（剪断、機能配列の連結、及び続く増幅（例えばＰＣＲによるもの））を含んでもよく、これらの操作は、バルクで（例えば、区分外で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物はさらなる操作のためにプールされ得る。
【０１１３】
細胞ＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析に使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドのさらなる例を図１２Ｂに示す。図示のように、オリゴヌクレオチド１２２２全体は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能なリンケージ１２２６によってビーズ１２２４に結合されている。オリオゴヌクレオチドは、後続の処理において使用される機能配列、例えば、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列、例えばＰ５配列を含み得る機能配列１２２８、及び配列決定プライマー配列、例えば、Ｒ１プライマー結合部位を含み得る機能配列１２３０などを含み得る。いくつかの場合、配列１２２８はＰ７配列であり、配列１２３０はＲ２プライマー結合部位である。バーコード配列１２３２は、サンプルＲＮＡをバーコード化するのに使用するために構造内に含まれる。プライミング配列１２３４（例えば、ランダムプライミング配列）もオリゴヌクレオチド構造、例えば、ランダム六量体に含まれ得る。さらなる配列セグメント１２３６は、オリゴヌクレオチド配列内に提供され得る。いくつかの場合、この追加配列は、本明細書の他の箇所に記載されているように、固有の分子配列セグメントを提供する。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表面に繋がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万〜数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができ、この場合、上記のように、バーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができるが、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。図１２Ｂのバーコードオリゴヌクレオチドを用いた例示的な細胞  ｍＲＮＡ分析法では、細胞は、バーコード担持ビーズ、ならびに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどのさらなる試薬と共に、区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。細胞が溶解され、その間、バーコード化されたオリゴヌクレオチドが（例えば、還元剤の作用により）ビーズから放出される。いくつかの場合、配列１２２８はＰ７配列であり、配列１２３０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列１２２８はＰ５配列であり、配列１２３０はＲ１プライマー結合部位である。ランダム六量体のプライミング配列１２３４は、細胞のｍＲＮＡをランダムにハイブリダイズすることができる。ランダム六量体配列は、細胞からのｍＲＮＡをテンプレートとして用いて逆転写反応で伸長させて、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物を生成することができ、またバーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント１２２８、１２３２、１２３０、１２３６、及び１２３４のそれぞれも含む。その後の操作には、精製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によるもの）、さらなる処理（剪断、機能配列の連結、及び続く増幅（例えばＰＣＲによるもの））を含み、これらの操作は、バルクで（例えば、区分外で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊されて、液滴の内容物はさらなる操作のためにプールされる。バーコード担持ビーズと共に区分化され得る追加の試薬には、細胞由来のゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを分解するためにリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びヌクレアーゼをブロックするオ���ゴヌクレオチドが含まれ得る。代替として、さらなる処理操作中にｒＲＮＡ除去剤を適用してもよい。そのような方法によって生成された構築物の構成は、配列決定中のポリＴ配列の配列決定を最小限にする（または回避する）のに役立つ。
【０１１４】
本明細書に記載の単一細胞分析法は、トランスクリプトーム全体の分析にも有用であり得る。図１２Ｂのバーコードを再び参照すると、プライミング配列１２３４は、ランダムＮ量体であり得る。いくつかの場合、配列１２２８はＰ７配列であり、配列１２３０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列１２２８はＰ５配列であり、配列１２３０はＲ１プライマー結合部位である。このバーコードを用いた全トランスクリプトーム解析の例示的方法では、個々の細胞は、バーコード担持ビーズ、ポリＴ配列、ならびに逆転写酵素、ポリメラーゼ、還元剤、及びｄＮＴＰなどの他の試薬と共に、区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に共区分化される。この方法の操作では、細胞が溶解され、その間、バーコード化されたオリゴヌクレオチドが（例えば、還元剤の作用により）ビーズから放出され、ポリＴ配列は細胞ｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズする。テンプレートとしてｍＲＮＡを用いた逆転写反応では、細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物を生成することができる。次いでＲＮＡをＲＮａｓｅで分解することができる。次いで、バーコード化されたオリゴヌクレオチドのプライミング配列１２３４は、ｃＤＮＡ転写物にランダムにハイブリダイズすることができる。オリオゴヌクレオチドは、図３に示したものと同様のビーズ及び細胞と共に区分化されたポリメラーゼ酵素及び他の伸長試薬を用いて伸長させて、図３（パネルＦ）に示した例示的な増幅生成物と同様の増幅生成物（例えば、バーコード化された断片）を生成することができる。バーコード化された核酸断片では、いくつかの場合、例えば、配列分析により、特徴付けされるさらなる処理（例えば、本明細書の他の箇所に記載された増幅、さらなる配列の添加、洗浄処理など）を行ってもよい。この操作では、シーケンシングシグナルは完全長ＲＮＡに由来し得る。
【０１１５】
様々なバーコードデザインの操作が個別に検討されているが、個々のビーズは、同時に使用することができる様々なデザインのバーコードオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０１１６】
より大きな集団からの個々の細胞または細胞サブ集団を特徴付けることに加えて、本明細書に記載のプロセス及びシステムは、細胞または他の生物集団の全体的なプロファイルを提供する方法として個々の細胞を特徴付けるのにも使用され得る。様々な用途では、例えば、マイクロバイオーム分析及び特徴付け、環境試験、食品安全性試験、例えば、汚染の追跡における疫学的分析などを含む、細胞集団内の異なる細胞または生物型の存在及び定量の評価が必要とされる。特に、上記の分析プロセスは、集団内の多数の個々の細胞を個別に特徴付する、配列決定する、かつ／または識別するのに使用され得る。次いで、この特徴付けを使用して、元の集団の全体的なプロファイルをアセンブルし、それによって重要な予後及び診断情報を提供することができる。
【０１１７】
例えば、腸、頬、表皮マイクロバイオームなどを含むヒトのマイクロバイオームのシフトは、異なる病態または健康状態の診断及び予後の両方として識別されている。本明細書に記載の単一細胞分析方法及びシステムを使用して、全体の集団における個々の細胞をさらに特徴付けし、配列決定し、かつ識別して、診断集団関連因子を示し得るその集団内のシフトを識別することができる。例として、バクテリアの分類学的分類のための非常に正確な方法として、細菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列決定が用いられてきた。上記の標的化された増幅及び配列決定プロセスを使用して、細胞の集団内の個々の細胞の識別を提供することができる。ある集団内の異なる細胞の数をさらに定量化して、現在の状態または経時的な状態の変化を識別することができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ．ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈ．１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１２，８（１２）：ｅ１００２８０８、及びＲａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｍｅｄ．，Ｊｕｎｅ  ２０１１，５７（３）：１６２−１７０（それぞれが、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる）を参照されたい。同様に、感染または潜在的な感染の識別及び診断も、本明細書に記載の単一細胞分析の利益を享受して、例えば、上記の環境、及び任意の他の診断上関連する環境、例えば、脳脊髄液、血液、糞便または腸サンプルなどを含む、他の細胞または他の生物学的物質、細胞及び／または核酸の大きな混合物中に存在する微生物種を識別するものであってよい。
【０１１８】
前述の分析は、所与のサンプルの細胞集団にわたる異なる耐性マーカー／変異の分布及びプロファイリングの分析による、異なる細胞、例えば、癌細胞、細菌病原体などの潜在的薬物耐性の特徴付けにも特に有用であり得る。さらに、これらのマーカー／変異の経時的変化を特徴付けることによって、そのような薬物耐性の問題によって特徴付けされる様々な疾患の進行、改変、予防、及び治療についての貴重な洞察を得ることができる。
【０１１９】
細胞の観点で記載されているが、例えば、細胞、ウイルス、細胞小器官、細胞内封入体、小胞、小胞体などを含む様々な個々の生物学的生物または生物の構成要素のいずれかは、本記載に包含されることが理解される。さらに、細胞を参照する場合、そのような参照には、単細胞に由来するかまたは多細胞生物に由来するかにかかわらず、原核細胞、真核細胞、細菌、真菌、植物、哺乳類、または他の動物細胞タイプ、マイコプラズマ、正常組織細胞、腫瘍細胞、もしくは任意の他の細胞タイプを含むがこれらに限定されない、任意のタイプの細胞が含まれることが理解される。
【０１２０】
同様に、微生物、ウイルス、またはそのようなサンプル中に存在する他の生物学的汚染物質をプロファイリングするための異なる環境のサンプルの分析は、疾患の疫学に関する重要な情報を提供し、疾患の発生、流行及びパンデミックの予測に役立つ可能性がある。
【０１２１】
上記のように、本明細書に記載の方法、システム、及び組成物は、個々の細胞または細胞集団の他の態様の分析及び特徴付けにも使用することができる。一例示的プロセスでは、それらの細胞表面タンパク質に関して分析されて特徴付けされる細胞を含むサンプルが提供される。また、細胞が特徴付けされる細胞表面タンパク質または抗原(または他の細胞の特徴)(本明細書では細胞表面特徴結合基とも呼ばれる)に対する結合親和性を有する抗体、抗体断片、または他の分子のライブラリーも提供される。考察を容易にするために、これらの親和性基を本明細書では結合基と呼ぶ。結合基は、結合基が結合する細胞表面の特徴を示すレポーター分子を含むことができる。特に、１つのタイプの細胞表面特徴に特異的な結合基タイプは第１のレポーター分子を含むことになり、異なる細胞表面特徴に特異的な結合基タイプはそれと関連する異なるレポーター分子を有することになる。いくつかの態様では、これらのレポーター分子は、オリゴヌクレオチド配列を含むことになる。オリゴヌクレオチドベースのレポーター分子は、配列に関する有意な多様性をもたらしながら、ほとんどの生体分子、例えば、抗体などに容易に結合することができ、かつ例えば、配列決定技術またはアレイ技術を用いて容易に検出することができるという利点を提供する。例示的プロセスでは、結合基は、それらに結合したオリゴヌクレオチドを含む。したがって、第１の結合基タイプ、例えば、第１のタイプの細胞表面特徴に対する抗体は、それと結合する、第１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを有することになる。異なる結合基タイプ、例えば、他の異なる細胞表面特徴に対する結合親和性を有する抗体は、それと結合する、異なるヌクレオチド配列、例えば、部分的にまたは完全に異なるヌクレオチド配列を含むレポーターオリオゴヌクレオチドを有することになる。いくつかの場合、各タイプの細胞表面特徴結合基、例えば、抗体または抗体断片に関して、レポーターオリオゴヌクレオチド配列は公知のものであり、公知の細胞表面特徴結合基と結合していると容易に識別することができるものである。これらのオリゴヌクレオチドは、結合基に直接結合していても、ビーズ、分子格子、例えば、直鎖状、球状、架橋型、または他のポリマー、または複数のレポーターオリゴヌクレオチドを単一の結合基と付着させる結合基に付着しているかもしくはさもなければそれと結合している他のフレームワークに付着していてもよい。
【０１２２】
単一の結合基に結合した複数のレポーター分子の場合、そのようなレポーター分子は同じ配列を含むことができるか、または特定の結合基はレポーターオリゴヌクレオチド配列の公知のセットを含むことになる。例えば、異なる結合基間では異なる細胞表面特徴に特異的であるため、レポーター分子は異なるものであってよく、かつ特定の結合基に帰属可能なものであってよい。
【０１２３】
レポーター基の結合基への結合は、様々な直接的または間接的な、共有結合性または非共有結合性の結合または付着のいずれかによって達成され得る。例えば、抗体ベースの結合基に結合したオリゴヌクレオチドレポーター基の場合、そのようなオリゴヌクレオチドは、化学的コンジュゲーション技術（例えば、Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからから入手可能なＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）抗体標識化キット）、ならびに例えば、アビジンまたはストレプトアビジンリンカーによるビオチン化抗体及びオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドに結合した、１つまたは複数のビオチン化リンカーを含むビーズ）を使用した他の非共有結合機構を使用して抗体または抗体断片の一部に共有結合させてもよい。抗体及びオリゴヌクレオチドビオチニル化技術が利用可能である（例えば、Ｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｌｕｏｒｉｄｅ−Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｆｏｒ  ５’−ｅｎｄ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｊａｎ  １５，２００３；３１（２）：７０８−７１５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＤＮＡ  ３’  Ｅｎｄ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（これらの全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる）を参照されたい）。同様に、タンパク質及びペプチドのビオチン化技術が開発されており、容易に利用可能である（例えば、米国特許第６，２６５，５５２号（この全開示は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組込まれる）を参照されたい）。
【０１２４】
所望のレポーター分子または所与の分析の多様性、使用される配列検出スキームなどに応じて任意の範囲の異なる長さを有するレポーターオリゴヌクレオチドが提供され得る。いくつかの場合、これらのレポーター配列は、長さが約５ヌクレオチド超、長さが約１０ヌクレオチド超、長さが約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、またはさらに２００ヌクレオチド超であってよい。いくつかの場合、これらのレポーターヌクレオチドは、長さが約２５０ヌクレオチド未満、約２００、１８０、１５０、１２０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、またはさらに３０ヌクレオチド未満であってもよい。多くの場合、レポーターオリゴヌクレオチドは、既にサイズ決定されており、かつさもなければ配列決定システムで分析されるように構成されたバーコード化生成物を提供するように選択することができる。例えば、これらの配列は、理想的には、特定の配列決定システムに対して所望の長さの配列決定可能な生成物を生成する長さで提供され得る。同様に、これらのレポーターオリゴヌクレオチドは、レポーター配列に加えて、シーケンサー結合配列、シーケンシングプライマー配列、増幅プライマー配列、またはこれらのいずれかに対する相補体などのさらなる配列要素を含み得る。
【０１２５】
操作中、所望される細胞表面特徴のいずれかを分析するために、細胞含有サンプルを、結合分子及びその関連するレポーターオリゴヌクレオチドと共にインキュベートする。インキュベーション後、細胞を洗浄して結合していない結合基を除去する。洗浄後、細胞は、上述のバーコード担持ビーズとともに、別個の区分、例えば、液滴に区分化されるが、この場合、それぞれの区分は、限られた数の細胞、例えば、くつかの場合、単一細胞を含む。ビーズからバーコードを解放すると、それらはレポーターオリゴヌクレオチドの増幅及びバーコード化をプライミングすることになる。上記のように、レポーター分子のバーコード化複製物は、プライマー配列、結合配列などの機能配列をさらに含み得る。
【０１２６】
次いで、バーコード化レポーターオリゴヌクレオチドで、配列分析を行い、どのレポーターオリゴヌクレオチドが区分内の細胞に結合しているかを識別する。さらに、関連するバーコード配列を配列決定することによっても、所与の細胞表面特徴が、そのレポーター配列が同じバーコード配列を含む、すなわち、同じ区分由来である他の異なる細胞表面特徴と同じ細胞に由来した可能性が高いことを識別することができる。
【０１２７】
次いで、バーコード配列の存在に基づく個々の区分から生じるレポーター分子に基づいて、細胞集団からの個々の細胞の細胞表面プロファイルを作製することができる。個々の細胞または細胞集団のプロファイルは、診断上関連性のある情報を提供し得る細胞表面特徴の変化を識別するために、他の細胞、例えば「正常な」細胞からのプロファイルと比較され得る。特に、これらのプロファイルは、癌及び他の障害などの細胞表面受容体の変化によって特徴付けされる様々な疾患の診断に特に有用であり得る。
【０１２８】
ＩＶ．装置とシステム
本明細書では、上記のように細胞を区分化するのに使用されるマイクロ流体装置も提供される。このようなマイクロ流体装置は、図１及び２に示されるような区分化プロセスを実行するためのチャンネルネットワークを含むことができる。特に有用なマイクロ流体装置の例は、２０１４年４月４日に出願された米国仮特許出願第６１／９７７，８０４号に記載されており、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。簡潔には、これらのマイクロ流体装置は、細胞を別個の細胞に区分化させるために、かつそのような細胞を、例えば、ビーズ上に配置されたオリゴヌクレオチドバーコードライブラリーメンバーと共に区分化させるために、本明細書に記載されているものなどのチャンネルネットワークを備えることができる。これらのチャンネルネットワークは、固体ボディ、例えば、チャンネルが画定されるガラス、半導体またはポリマーのボディ構造内に配置することができるが、この場合、それらのチャンネルは、その端部で、例えば、チャンネルネットワークの出力から、様々な入力流体を受容するために、かつ区分化された細胞を最終的に堆積させるために、端部で容器と連通する。例として、図２を参照すると、チャンネル２０２と流体連結する容器には、細胞２１４の水性懸濁液が提供されてもよく、チャンネル２０４に連結する容器には、オリゴヌクレオチドを担持するビーズ２１６の水性懸濁液が提供されてもよい。チャンネルセグメント２０６及び２０８には、非水性溶液、例えば油が供給されてもよく、この中に水性流体がチャンネル接合部２１２において液滴として区分化される。最終的に、排出容器を、チャンネル２１０に流体連結させて、そこに区分化された細胞及びビーズを送達することができ、かつそこからそれらを採取してもよい。理解されるように、容器として記載されているが、チャンネルセグメントは、他のシステムの配管、マニホールド、または流体構成要素を含む様々な異なる流体源または受容構成要素のいずれかに連結され得ることが理解されるであろう。
【０１２９】
チャンネルネットワークを介して、例えば、加えられた圧力差、遠心力、動電ポンピング、毛細管、または重力流などによって、これらの流体の流れを制御するシステムも提供される。
【０１３０】
Ｖ．キット
本明細書では、個々の細胞または細胞の小さな集団を分析するためのキットも提供される。キットには、水性緩衝液及び非水性区分化流体または油の両方を含む、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の全ての区分化流体、本明細書に記載のようにビーズと放出可能に結合している核酸バーコードライブラリー、マイクロ流体装置、細胞を破壊し、核酸を増幅させ、かつ細胞の核酸の断片またまたはその複製物にさらなる機能配列を提供するための試薬、ならびに本明細書に記載の方法で上述のいずれかのものを使用するための説明書が含まれ得る。
【０１３１】
ＶＩ．コンピュータ制御システム
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされているコンピュータ制御システムを提供する。図１７は、核酸配列決定方法、核酸配列データの解釈及び細胞核酸、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）などの分析、ならびに配列データから細胞を特徴付けることを含む、本開示の方法を実施するようにプログラムされているかまたはさもなければ構成されている、コンピュータシステム１７０１を示す。コンピュータシステム１７０１は、電子デバイスに対して遠隔に配置されたユーザーまたはコンピュータシステムの電子デバイスであってよい。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであってよい。
【０１３２】
コンピュータシステム１７０１は、単一コアもしくはマルチコアプロセッサー、または並列処理のための複数のプロセッサーであってよい中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサー」及び「コンピュータプロセッサー」とも記載される）１７０５を備える。コンピュータシステム１７０１は、メモリまたはメモリ場所１７１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１７１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース１７２０（例えば、ネットワークアダプター）、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、及び／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺装置１７２５を備える。メモリ１７１０、記憶装置１７１５、インターフェース１７２０、及び周辺装置１７２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ１７０５と通信する。記憶装置１７１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であってよい。コンピュータシステム１７０１は、通信インターフェース１７２０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１７３０に動作可能に連結することができる。ネットワーク１７３０は、インターネット、インターネット及び／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネット及び／もしくはエクストラネットであってよい。ネットワーク１７３０は、いくつかの場合、電気通信及び／またはデータネットワークである。ネットワーク１７３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを有効にすることができる１つまたは複数のコンピュータサーバーを備えることができる。ネットワーク１７３０は、コンピュータシステム１７０１を用いるいくつかの場合、コンピュータシステム１７０１に連結するデバイスがクライアントまたはサーバーとして動作することを可能にするピアツーピアネットワークを実装することができる。
【０１３３】
ＣＰＵ１７０５は、プログラムまたはソフトウェアで具現化され得る、機械可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ１７１０などのメモリ場所に記憶することができる。命令は、ＣＰＵ１７０５を対象として、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ１７０５をプログラムするか、さもなければそれを構成することができる。ＣＰＵ１７０５によって実行される動作例には、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックが含まれ得る。
【０１３４】
ＣＰＵ１７０５は、集積回路などの回路の一部であってよい。システム１７０１の１つまたは複数の他の構成要素を回路に含むことができる。いくつかの場合、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０１３５】
記憶装置１７１５は、ドライバー、ライブラリー、及び保存されたプログラムなどのファイルを格納することができる。記憶装置１７１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザー選択及びユーザープログラムを格納することができる。コンピュータシステム１７０１は、いくつかの場合、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム１７０１と通信するリモートサーバーに位置するような、コンピュータシステム１７０１の外部にある１つまたは複数の追加データ記憶装置を含むことができる。
【０１３６】
コンピュータシステム１７０１は、ネットワーク１７３０を介して１つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１７０１は、ユーザーのリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話機、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザーは、ネットワーク１７３０を介してコンピュータシステム１７０１にアクセスすることができる。
【０１３７】
本明細書に記載の方法は、例えばメモリ１７１０または電子記憶装置１７１５などのコンピュータシステム１７０１の電子記憶場所に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサー）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能コードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用中、コードは、プロセッサー１７０５によって実行することができる。いくつかの場合、コードは、記憶装置１７１５から取り出され、プロセッサー１７０５によって即座にアクセスされるようにメモリ１７１０に記憶することができる。いくつかの状況では、電子記憶装置１７１５を排除することができ、機械実行可能命令がメモリ１７１０に記憶される。
【０１３８】
コードを実行するように適合させたプロセッサーを有する機械と共に使用するようにコードをプレコンパイルして構成することができるか、または実行時にコンパイルすることができる。コードは、プレコンパイルまたはコンパイルされた方法でコードを実行させるように選択することができるプログラミング言語で提供され得る。
【０１３９】
コンピュータシステム１７０１などの本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングで具現化され得る。本技術の様々な態様は、典型的には、あるタイプの機械可読媒体に搭載またはそこで具現化された、機械（またはプロセッサー）実行可能コード及び／または関連データの形式の「製品」または「製造品」と考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に格納することができる。「記憶」タイプの媒体は、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのコンピュータ、プロセッサーなどの有形のメモリ、またはそれに関連するモジュールのいずれかまたは全てを含むことができ、これによって、随時、ソフトウェアプログラミングに持続性格納を提供することができる。ソフトウェアの全部または一部は、時々、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを介して通信され得る。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のものへと、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへとソフトウェアを読み込むことを可能にすることができる。したがって、ソフトウェア要素を担うことができる別のタイプの媒体には、有線及び光陸線ネットワークならびに様々なエアリンクを介して、ローカルデバイス間のインターフェースにわたって使用される光波、電波、及び電磁波が含まれる。有線または無線リンク、光リンクなどのそのような波を搬送する物理的要素も、ソフトウェアを担う媒体と考えることができる。本明細書で使用される場合、持続的な有形の「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行する命令をプロセッサーへ提供することに関与する任意の媒体を指す。
【０１４０】
したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体には、例えば、図面に示されたデータベースなどを実装するために使用されるものなど、任意のコンピュータ（複数可）などの記憶装置のいずれかなどの光学ディスクまたは磁気ディスクが含まれる。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどの動的メモリが含まれる。有形の伝送媒体には、同軸ケーブルと、コンピュータシステム内でバスを備えるワイヤを含む銅線及び光ファイバーと、が含まれる。搬送波伝送媒体は、電気もしくは電磁信号、または無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音響波もしくは光波の形態をとり得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、孔のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、フラッシュＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコード及び／もしくはデータを読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のために１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスをプロセッサーに搬送することに関与し得る。
【０１４１】
コンピュータシステム１７０１は、例えば、核酸配列決定、核酸配列決定データの分析、核酸配列決定サンプルの特徴付け、細胞特徴付けの結果などを提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）１７４０を備える電子ディスプレイ１７３５を備えるか、またはそれと通信することができる。ＵＩの例には、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザーインターフェースが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
本開示の方法及びシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムによって実装することができる。アルゴリズムは、中央処理装置１７０５による実行時にソフトウェアによって実施することができる。アルゴリズムは、例えば、核酸配列決定の開始、核酸配列決定データの処理、核酸配列決定結果の解釈、核酸サンプルの特徴付け、及び細胞の特徴付けなどを行うことができる。
【実施例】
【０１４３】
ＶＩＩ．実施例
実施例Ｉ  エマルジョンを用いた細胞ＲＮＡ分析
一例では、図９Ａに示す操作で、エマルジョン液滴中で、テンプレートスイッチングによる逆転写及びｃＤＮＡ増幅（ＰＣＲによるもの）を行う。逆転写及びｃＤＮＡ増幅（ＰＣＲによるもの）のために区分化された反応混合物は、１，０００の細胞もしくは１０，０００の細胞または１０ｎｇのＲＮＡ、バーコード化オリゴヌクレオチド／０．２％Ｔｘ−１００／５倍のＫａｐａ緩衝液を含むビーズ、２倍のＫａｐａ  ＨＳ  ＨｉＦｉ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ、４μＭのスイッチオリゴ、ならびにＳｍａｒｔｓｃｒｉｂｅを含む。細胞が存在する場合、混合物は、大部分または全ての液滴が単一細胞及び単一ビーズを含むように区分化される。操作９５０のように、細胞が溶解され、その間バーコード化オリゴヌクレオチドがビーズから放出され、バーコード化オリゴヌクレオチドのポリＴセグメントが、細胞から放出されたｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズする。ポリＴセグメントは、操作９５２のように逆転写反応で伸長され、ｃＤＮＡ転写物は操作９５４のように増幅される。熱サイクル条件は４２℃で１３０分間、９８℃で２分間、ならびに９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で６分間の３５サイクルである。熱サイクル後、エマルジョンは破壊され、操作９５６と同様に転写物はＤｙｎａｂｅａｄｓ及び０．６倍のＳＰＲＩで精製される。
【０１４４】
図１３Ａの１，０００の細胞、図１３Ｃの１０，０００細胞、図１３Ｂの１０ｎｇのＲＮＡに対する、エマルジョン中のテンプレートスイッチ逆転写及びＰＣＲからの収率が示されている（Ｓｍａｒｔｓｃｒｉｂｅ線）。１０ｎｇのＲＮＡのエマルジョン中で実施されたＲＴ及びＰＣＲからのｃＤＮＡ転写物は、操作９５８と同様に、剪断されて機能配列に連結され、０．８倍のＳＰＲＩで洗浄され、ＰＣＲによりさらに増幅される。増幅生成物は０．８倍のＳＰＲＩで洗浄される。この処理からの収率を図１３Ｂ（ＳＳＩＩ線）に示す。
【０１４５】
実施例ＩＩ  エマルジョンを用いた細胞ＲＮＡ分析
別の例では、図９Ａに示す操作で、エマルジョン液滴中で、テンプレートスイッチングによる逆転写及びｃＤＮＡ増幅（ＰＣＲによるもの）を行う。逆転写及びｃＤＮＡ増幅（ＰＣＲによるもの）のために区分化された反応混合物は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、バーコード化オリゴヌクレオチド／０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／５倍のＫａｐａ緩衝液を含むビーズ、２倍のＫａｐａ  ＨＳ  ＨｉＦｉ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ、４μＭのスイッチオリゴ、及びＳｍａｒｔｓｃｒｉｂｅを含む。混合物は、大部分または全ての液滴が単一細胞及び単一ビーズを含むように区分化される。操作９５０のように、細胞が溶解され、その間バーコード化されたオリゴヌクレオチドがビーズから放出され、バーコード化されたオリゴヌクレオチドのポリＴセグメントが、細胞から放出されたｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズする。ポリＴセグメントは、操作９５２のように逆転写反応で伸長され、ｃＤＮＡ転写物は操作９５４のように増幅される。熱サイクル条件は４２℃で１３０分間、９８℃で２分間、ならびに９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で６分間の３５サイクル、である。熱サイクル後、エマルジョンは破壊され、操作９５６と同様に転写物はＤｙｎａｂｅａｄｓ及び０．６倍のＳＰＲＩで洗浄される。様々な細胞数（６２５の細胞、１，２５０の細胞、２，５００の細胞、５，０００の細胞、１０，０００の細胞）との反応からの収率を図１４Ａに示す。これらの収率は、図１４Ｂに示されるＧＡＤＰＨ  ｑＰＣＲアッセイ結果で確認される。
【０１４６】
実施例ＩＩＩ  エマルジョンを用いたＲＮＡ分析
別の例では、図９Ｃに示されるのと同様の方法で、エマルジョン液滴中で逆転写を行い、バルクでｃＤＮＡ増幅を行う。逆転写反応のために区分化される反応混合物は、バーコード化されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、１０ｎｇのＪｕｒｋａｔ  ＲＮＡ（例えばＪｕｒｋａｔ  ｍＲＮＡ）、５倍のＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ緩衝液、及びＳｍａｒｔｓｃｒｉｂｅを含む。バーコード化オリゴヌクレオチドはビーズから放出され、バーコード化オリゴヌクレオチドのポリＴセグメントは、操作９６１のようにＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズする。ポリＴセグメントは、操作９６３のように逆転写反応において伸長される。逆転写の熱サイクル条件は、４２℃で２時間の１サイクル、及び７０℃で１０分間の１サイクルである。熱サイクル後、エマルジョンは破壊され、操作９６２のようにＲＮＡ及びｃＤＮＡ転写物は変性される。次いで、第２鎖は、操作９６４のようにビオチンタグを有するプライマーでプライマー伸長により合成する。このプライマー伸長の反応条件は、第１鎖としてのｃＤＮＡ転写物、及び０．５〜３．０μＭの濃度範囲のビオチン化伸長プライマーを含む。熱サイクル条件は、９８℃で３分間の１サイクル、ならびに９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で３０分間の１サイクルである。プライマーの伸長後、第２鎖をＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１及びＴ１でプルダウンし、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＸＴ緩衝液で洗浄する。第２鎖は、以下のサイクル条件、すなわち９８℃で３分間の１サイクル、ならびに９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で３０分間の１サイクルで、操作９６５のようにＰＣＲにより事前に増幅される。様々な濃度のビオチン化プライマー（０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ及び３．０μＭ）の収率を図１５に示す。
【０１４７】
実施例ＩＶ  エマルジョンを用いたＲＮＡ分析
別の例では、図１０に示すように、Ｔ７ポリメラーゼによるインビトロ転写がＲＮＡ転写物を生成するのに使用される。逆転写反応のために区分化される反応混合物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列も含むバーコード化されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、１０ｎｇのヒトＲＮＡ（例えば、ヒトｍＲＮＡ）、５倍のＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ緩衝液、及びＳｍａｒｔｓｃｒｉｂｅを含む。混合物は、液滴の大部分または全部が単一のビーズを含むように区分化される。バーコード化オリゴヌクレオチドはビーズから放出され、バーコード化オリゴヌクレオチドのポリＴセグメントは、操作１０５０のようにＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズする。ポリＴセグメントは、操作１０５２のように逆転写反応において伸長される。熱サイクル条件は、４２℃で２時間の１サイクル及び７０℃１０分間で１サイクルである。熱サイクル後、エマルジョンは破壊され、残りの操作はバルクで行われる。次いで、第２鎖が、操作１０５４のようにプライマー伸長によって合成される。このプライマー伸長の反応条件は、テンプレートとしてのｃＤＮＡ転写物及び伸長プライマーを含む。熱サイクル条件は、９８℃で３分間の１サイクル、ならびに９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃３０分間の１サイクルである。このプライマー伸長後、第２鎖を０．６倍のＳＰＲＩで精製する。次いで、操作１０５６のように、ＲＮＡ転写物を生成するためにインビトロ転写が行われる。インビトロ転写を一晩行い、転写物を０．６倍のＳＰＲＩで精製する。インビトロ転写からのＲＮＡ収率を図１６に示す。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施形態が本明細書に示されて説明されているが、当業者には、そのような実施形態は例示のためにのみ提供されていることが明らかであろう。本発明は、本明細書中に提供された特定の例によって限定されないことが意図されている。本発明を上述の明細書を参照して説明したが、本明細書の実施形態の説明及び例示は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。ここで、当業者は、本発明から逸脱することなく、多くの変形形態、変更形態、及び置換形態に想到するであろう。さらに、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数によって決定される、本明細書に記載の特定の描写、構成、または相対的な比率に限定されないことを理解されるであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において使用され得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、任意のそのような代替、改変、変形、または等価物も網羅するものと考えられる。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、かつこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物はそれによって網羅されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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