(57)【要約】活性化プロゲステロン受容体を有する腫瘍を特定するための系および方法を提供する。抗プロゲスチンによる成長阻害に影響を受けやすい腫瘍を有すると疑われる患者は、抗プロゲスチンで処置することが可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍化またはがん性であることが疑われる組織サンプルを患者から得るステップと；
前記組織サンプルのプロゲステロン受容体と会合するゲノムＤＮＡを検出するステップと；
組織サンプルにある、１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的の第１転写レベルを検出するステップであって、前記ＤＮＡ標的は、Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択される、ステップと；
陰性対照組織サンプルにある、１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的の第２転写レベルを検出するステップであって、前記ＤＮＡ標的は、Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択される、ステップと；
前記第１転写レベルおよび前記第２転写レベルを比較するステップと；
前記１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的の転写レベルが、前記陰性対照サンプルでのレベルより少なくとも約４倍多い場合に、抗プロゲスチンを患者に投与するステップを含む、抗プロゲスチンを用いた患者の治療方法。
【請求項２】
前記組織サンプルは、乳房、脳、髄膜腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮肉腫、子宮筋腫、および肺の組織からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗プロゲスチンは、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニル、ウリプリスタル、ＺＭ１７２４０６、ＺＭ１５０２７１、ＺＭ１７２４０５、およびアグレプリストンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗プロゲスチンは、一日あたり約１０ｍｇ〜約２００ｍｇの量で前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗腫瘍化合物を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗腫瘍化合物は、エベロリムス、トラスツズマブ、ＴＭ１−Ｄ、抗ＨＥＲ２薬、ベバシズマブ、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビン、シクロホスファミド、抗エストロゲン、選択的エストロゲン受容体調節因子、アロマターゼ阻害剤、および抗アンドロゲンからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
補因子結合モチーフの有無を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記補因子結合モチーフはＦＯＸＡ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノムＤＮＡは免疫沈降により検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫沈降は、モノクローナル抗体ｈＰＲａ６およびｈＰＲａ７を用いて実行される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ゲノムＤＮＡに会合する前記プロゲステロン受容体は、抗ＰＲ一次抗体を用いた免疫沈降により検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択される核酸を含む、実質的に単離された核酸。
【請求項１３】
前記核酸はＤＮＡである、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記核酸はＲＮＡである、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１５】
Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択される核酸に対し相補的な核酸を含む、実質的に単離された核酸。
【請求項１６】
前記核酸はＤＮＡである、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記核酸はＲＮＡである、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１２に記載の核酸と、ゲノムＤＮＡ標的の有無を検出するためのモノクローナル抗体とを含んだキット。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体はｈＰＲａ６およびｈＰＲａ７である、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１４年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９５１，６５０号の優先権を主張する。上記参照出願は、全体を再度述べるように参照により本明細書に組み込まれる。特許および特許出願を含むがこれらに限定されるわけではない本明細書に引用される参考文献は全て、参照によりその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
乳房および子宮内膜などの標的組織におけるプロゲステロンシグナル伝達の分子メカニズムを理解するために、数十年にわたり多大な努力がなされてきた。プロゲステロンはその核内受容体（ＰＲ）を介して転写を調節し、該ＰＲはクロマチンの特定の標的部位に会合する。ＰＲが結合するコンセンサスデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列（プロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ））は、逆方向反復配列中の６つの核酸塩基対：RGNACAnnnTGTNCYからなる［１、２、３］。ＤＮＡ結合ＰＲは転写共役因子および会合補因子をリクルートし、これは局所クロマチン構造を修正し、転写活性化を促し、結果としてＰＲ標的遺伝子の活性化または抑制をもたらす［４、５、６、７］。タンパク質間相互作用によりＰＲ調節複合体と会合する共調節因子および補因子に加え、ＰＲはクロマチンリモデリング因子をリクルートし、これは局所ＤＮＡ構造を修正し、ＰＲ相互作用および転写活性化を高める［８］。プロゲスチン調節部位におけるクロマチンリモデリングに関与することが知られている因子には、ＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体［８、９］、および、ＭＭＴＶの結合および活性化のためにＰＲと協同する転写因子ＮＦ１［１０、１１］が含まれる。エストロゲン受容体（ＥＲ）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）を含む他の核内受容体については、凝縮クロマチンと相互作用するＦＯＸＡ１などのパイオニア因子が、転写標的の核内受容体活性化に必要である［１２、１３、１４、１５、１６、１７］。ＰＲＥにおけるＤＮＡとの直接的な相互作用に加え、ＰＲは、ＡＰ−１、ＳＰ１、およびＳｔａｔ３など他の転写因子へのテザリングにより標的遺伝子と会合することが報告されている［１８、１９、２０、２１、２２］。
【０００３】
ＰＲの転写活性を支配する決定要因はin vitroで記載されてきたが、in vivoでのプロゲステロンの多形役割の分子基盤はよく理解されていない。プロゲステロンは、正常な生殖組織機能［２３］と子宮支持体の分化に必要であり、そして、子宮内膜の増殖を抑える［２４］。一方、乳房では、プロゲステロンは、増殖増加、管の側方分岐、および小葉腺胞の発達と関連する［２５］。これらの２つの組織におけるプロゲステロン特有の効果との整合性を維持しつつ、乳房および子宮内膜ではプロゲステロンに対する特有の転写応答がある［２３、２６、２７、２８、２９、３０］。
【０００４】
ホルモン補充療法で外因性プロゲスチンにさらされることは、乳がんリスクの増加と関連がある［３１、３２、３３、３４、３５］。興味深いことにプロゲスチンは、乳がん細胞にある、正常な乳房とは異なるトランスクリプトームを調節するため［３６］、乳がんリスクに対するプロゲスチンの影響が、前がん乳房組織および／またはがん乳房組織におけるプロゲスチン作用の特異性の変化に影響され得るというのは理にかなっている。ＰＲの細胞特異性の変化がプロゲスチンの乳がんリスクに対する有害な影響の基礎となる場合、プロゲスチン作用の細胞特異性の決定要因は解明する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、種々の組織型における活性化プロゲステロン受容体を特定する系および方法を提供する。別の態様では、腫瘍組織の活性化プロゲステロン受容体を、プロゲステロン受容体のゲノム（ＤＮＡ）結合部位への結合を検出することにより特定する。これらの例示的な系および方法を用いて、抗プロゲスチン（例えば、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニル、ウリプリスタル、ＺＭ１７２４０６、ＺＭ１５０２７１、ＺＭ１７２４０５、およびアグレプリストン）による増殖阻害およびがん細胞アポトーシスの影響を受けやすい悪性腫瘍を有する疑いのある患者を特定し、処置することが可能である。一態様では、抗プロゲスチンによる増殖阻害の影響を受けやすい悪性腫瘍（がん）を有する疑いのある患者を、抗プロゲスチンで処置することが可能である。別の態様では、抗プロゲスチンでの処置の影響を受けやすいがんには、乳がん、脳がん、髄膜腫、前立腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、子宮筋腫、および肺がんが含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらなる態様では、抗プロゲスチンを、１日に約１０ｍｇ〜２００ｍｇの量で患者に投与することが可能である。任意で、抗腫瘍化合物（例えば、エベロリムス、トラスツズマブ、ＴＭ１−Ｄ、抗ＨＥＲ２薬、ベバシズマブ、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビン、シクロホスファミド、抗エストロゲン、選択的エストロゲン受容体調節因子、アロマターゼ阻害剤、及び抗アンドロゲン）も、抗プロゲスチンでの処置と同時または前後で患者に投与してよい。
【０００６】
本明細書に記載の態様は、抗プロゲスチンを用いた処置に影響を受けやすいがんおよび腫瘍を特定するための方法および系を提供する。一態様では、本明細書に記載するように、特定のゲノムＤＮＡ領域に結合した活性化プロゲステロン受容体つまりＰＲを特定および数量化し、抗プロゲスチンを用いた処置に影響を受けやすい悪性腫瘍を特定することが可能である。
【０００７】
別の態様では、テストサンプルの特定ゲノムＤＮＡ領域が、例えば、アッセイ内の比較陰性対照参照サンプルの同一特定領域の検出に比べ少なくとも約４倍多いレベルで数量化されることは、活性化ＰＲの存在を示す。このような数量化に関する例示的な比較陰性対照サンプル（一態様では、本明細書ではまとめて「対照ＤＮＡ配列」と呼ぶ）には、（１）本明細書に記載する、例えばＣｈＩＰ−ｓｅｑアッセイで予め清澄化した（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅｄ）サンプルに由来する単離インプットゲノムＤＮＡ、および、（２）非特定免疫グロブリンの存在下または一次抗体の非存在下で実行した、さもなければ、テストサンプルの特定ＰＲクロマチン免疫沈降と同じ方法で処置した、例えば、ＣｈＩＰ−ＰＣＲアッセイにおけるテストサンプルの、クロマチン免疫沈降が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０００８】
さらに別の態様では、本明細書で使用するのに適した抗プロゲスチンにはオナプリストンが含まれるが、これに限定されるわけではない。
【０００９】
オナプリストン（例えば、(8S,11R,13R,14S,17S)-11-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17-ヒドロキシ-17-(3-ヒドロキシプロピル)-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン）は、以下の化学構造を有する。
【００１０】
【化１】
2017510557.tif 000003
【００１１】
他の抗プロゲスチンには、プロゲステロン3-(6,6-エチレン-17B-ヒドロキシ-3-オキソ-17A-プレグナ-4-エン-17A-YL)プロピオン酸G-ラクトン、3-(6,6-エチレン-17.ベータ.-ヒドロキシ-3-オキソ-17.アルファ.-プレグナ-4-エン-17.アルファ.-y- l)プロピオン酸.ガンマ.-ラクトン、および以下が含まれる。
【００１２】
ミフェプリストン
(10S,11S,14S,15S,17R)-17-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-14-ヒドロキシ-15-メチル-14-(プロパ-1-イン-1-イル)テトラシクロ[8.7.0.0^{2,7}.0^{11,15}]ヘプタデカ-1,6-ジエン-5-オン
【００１３】
【化２】
2017510557.tif 000004
【００１４】
リロプリストン
(11-ベータ,17-ベータ,17(z))-ロペニル);エストラ-4,9-ジエン-3-オン,11-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-17-ヒドロキシ-17-(3-ヒドロキシ-1-p;11β-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17β-ヒドロキシ-17-[(Z)-3-ヒドロキシ-1-プロぺニル]エストラ-4,9-ジエン-3-オン
【００１５】
【化３】
2017510557.tif 000005
【００１６】
ＯＲＧ２０５８
(8R,9S,10R,13S,14S,16R,17S)-16-エチル-17-(2-ヒドロキシアセチル)-13-メチル-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
【００１７】
【化４】
2017510557.tif 000006
【００１８】
ロナプリサン
(8S,11R,13S,14S,17S)-11-(4-アセチルフェニル)-17-ヒドロキシ-13-メチル-17-(1,1,2,2,2-ペンタフルオロエチル)-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
【００１９】
【化５】
2017510557.tif 000007
【００２０】
アソプリスニル
(8S,11R,13S,14S,17S)-11-[4-[(E)-ヒドロキシイミノメチル]フェニル]-17-メトキシ-17-(メトキシメチル)-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
【００２１】
【化６】
2017510557.tif 000008
【００２２】
ウリプリスタル
(8S,11R,13S,14S, 17R)-17-アセチル-11-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17-ヒドロキシ-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
【００２３】
【化７】
2017510557.tif 000009
【００２４】
ＰＦ−２４１３８７３
4-[3-シクロプロピル-1-(メシルメチル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-イル]オキシ,-2,6-ジメチルベンゾニトリル
【００２５】
【化８】
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【００２６】
アグレプリストン
(8S,11R,13S,14S,17R)-11-(4-ジメチルアミノフェニル)-17-ヒドロキシ-13-メチル-17-[(Z)-プロパ-1-エニル]-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
【００２７】
【化９】
2017510557.tif 000011
【００２８】
追加の抗プロゲスチンには以下のものが含まれる。
【００２９】
ＺＭ１７２４０６−(R)-N-(3-クロロ-4-シアノフェニル-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミド：
【００３０】
【化１０】
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【００３１】
ＺＭ１７２４０５−(S)-N-(3-クロロ-4-シアノフェニル)-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミド：
【００３２】
【化１１】
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【００３３】
ＺＭ１５０２７１−N-(3-クロロ-4-シアノフェニル)-3,3,3,-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミド：
【００３４】
【化１２】
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【００３５】
卵巣ホルモンプロゲステロンの転写効果は多面的であり、核プロゲステロン受容体（ＰＲ）、つまりリガンド活性化転写因子のＤＮＡへの結合は、標的組織の範囲で様々な結果をもたらす。ＰＲトランスクリプトームの細胞特異性に寄与するＰＲのゲノム相互作用の特有パターンを特定するため、乳がん細胞と不死化正常乳房細胞のＰＲについて、ゲノム結合部位を比較した。プロゲスチン調節遺伝子の６０％を１つまたは複数のＰＲ結合領域と会合させ、ＰＲ結合を両細胞株での転写結果と互いに関連付けた。
【００３６】
２つの細胞株のＰＲシストローム間の重複は予想外に低く、転写標的での重複も同様に低かった。保存されたＰＲ結合エレメント（ＤＮＡ領域）を乳がんおよび正常乳房の両細胞株に由来するＰＲＤＮＡ結合領域で特定したが、ＦＯＸＡ１部位が乳がん細胞結合領域に過大に示され、ＮＦ１およびＡＰ−１のモチーフが不死化正常株で特異的に濃縮されるという、既知の補因子結合モチーフ濃縮の、特有のパターンが見られた。下流分析が、補因子の可用性の差がこれらの特有のＰＲシストローム（例えば、ゲノムＤＮＡにおける特定のプロゲステロン受容体結合部位）を生み得ることを示唆した。これは、補因子レベルがＤＮＡ結合領域に対するＰＲ特異性を調整し得ることを示す。ＰＲ結合の細胞特異性は、主要な結合補因子の協調効果により決定し得る。この情報を用いて、抗プロゲスチン（例えば、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニル、ウリプリスタル、ＺＭ１７２４０６、ＺＭ１５０２７１、ＺＭ１７２４０５、およびアグレプリストン）により増殖阻害の影響を受けやすい腫瘍を有する疑いのある患者を特定し処置することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１Ａは、Ｔ−４７ＤのＰＲ結合領域について、最も近い遺伝子転写開始点（ＴＳＳ）からの距離の分布を示す図である。図１Ｂは、ＡＢ３２のＰＲ結合領域について、最も近い遺伝子転写開始点（ＴＳＳ）からの距離の分布を示す図である。 図１Ｃは、Ｔ−４７Ｄの１染色体当たりの遺伝子数に対する結合領域の線回帰分析を示す図である。図１Ｄは、ＡＢ３２の１染色体当たりの遺伝子数に対する結合領域の線回帰分析を示す図である。図１Ｅは、ＰＲ結合の上方制御遺伝子までの距離の中央値を示す図である。図１Ｆは、ＡＢ３２細胞の上方制御遺伝子および下方制御遺伝子に関する結合領域の分布を示す図である。
【図２】図２Ａは、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８で処置した２時間、６時間、および２４時間後に測定したＴ−４７Ｄ細胞とＡＢ３２細胞の、遺伝子発現プロファイルを示す図である。図２Ｂは、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８で処置した２時間、６時間、および２４時間後に測定したＴ−４７Ｄ細胞とＡＢ３２細胞の、遺伝子発現プロファイルを示す図である。図２Ｃは、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８で処置した２時間、６時間、および２４時間後に測定したＴ−４７Ｄ細胞とＡＢ３２細胞の、遺伝子発現プロファイルを示す図である。図２Ｄは、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８で処置した２時間、６時間、および２４時間後に測定したＴ−４７Ｄ細胞とＡＢ３２細胞の、遺伝子発現プロファイルを示す図である。図２Ｅは、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８で処置した２時間、６時間、および２４時間後に測定したＴ−４７Ｄ細胞とＡＢ３２細胞の、遺伝子発現プロファイルを示す図である。図２Ｆは、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８で処置した２時間、６時間、および２４時間後に測定したＴ−４７Ｄ細胞とＡＢ３２細胞の、遺伝子発現プロファイルを示す図である。
【図３】図３Ａは、Ｔ−４７Ｄ細胞とＡＢ３２細胞の間で共通するＰＲ結合領域を示す図である。図３Ｂは、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８（ＯＲＧ）または媒介物で２時間、６時間、および２４時間処置したＴ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞において、全ゲノムマイクロアレイにより測定した転写産物の発現を示す図である。図３Ｃは、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞において、２時間、６時間、または２４時間でプロゲスチンにより調節された転写産物間の共通部分を示す図である。図３Ｄは、各々の処置時間でのＴ−４７ＤおよびＡＢ３２におけるプロゲスチン調節転写産物の数を示す図である。
【図４】図４Ａは、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞の結合領域で特定される全長ＰＲＥとコアＰＲＥを示す図である。図４Ｂは、ＭＥＭＥ−ＣｈＩＰおよびＨｏｍｅｒを用いた、保存された配列モチーフの統計的濃縮に関して分析したＰＲ結合領域配列を示す図である。図４Ｃは、ＭＥＭＥ−ＣｈＩＰおよびＨｏｍｅｒを用いた、保存された配列モチーフの統計的濃縮に関して分析したＰＲ結合領域配列を示す図である。図４Ｄは、強、中、または弱／無で分けたＰＲＥ分類を示す図である。図４Ｅは、強、中、または弱／無で分けたＰＲＥ分類を示す図である。
【図５】図５Ａは、ＦＯＸＡ１の存在下および非存在下における、ＡＢ３２細胞のプロゲスチンに応答する転写プロファイルの教師なし（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）クラスター分析を示す図である。図５Ｂは、Ｔ−４７Ｄ細胞の内因性発現と比較した、ウイルス形質導入前後のＡＢ３２細胞および親ＭＣＦ−１０Ａ細胞のＦＯＸＡ１タンパク質発現を示す図である。図５Ｃは、ＦＯＸＡ１の存在下および非存在下での、ＡＢ３２細胞のプロゲスチン調節転写産物の数を示す図である。図５Ｄは、ＰＲ、ＥＲ、およびＦＯＸＡ１の結合部位におけるＦＯＸＡ１結合強度の比較を示す図である。図５Ｅは、ＦＯＸＡ１発現と同時にプロゲスチン調節を消失した、獲得した、または、保持した遺伝子について、ＡＢ３２細胞におけるＰＲ結合領域の調節遺伝子に対する比率を示す図である。図５Ｆは、ＡＢ３２のＰＲ結合領域から、ＦＯＸＡ１発現と同時にプロゲスチン調節を消失した、獲得した、または、保持した遺伝子までの距離を示す図である。
【図６】Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞の染色体に対するプロゲステロン受容体（ＰＲ）結合の分布を示す図である。
【図７】ＰＲ結合とプロゲスチン調節時の関係を示す図である。
【図８】ＰＲ結合領域の場所を示す図である。
【図９】Ｔ−４７Ｄ細胞における転写調節パターンを示す図である。
【図１０】ＡＢ３２細胞における転写調節パターンを示す図である。
【図１１】Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞におけるＰＲ結合領域を示す図である。
【図１２】ＣｈＩＰ−ｓｅｑで特定される、検証細胞型特異的ＰＲ結合領域を示す図である。
【図１３】ＯＲＧ２０５８で処置したＴ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞のＰＲ結合領域と、プロゲステロン（Ｐ４）処置後Ｔ−４７Ｄ細胞における結合の、重複を示す図である。
【図１４】追加乳房細胞株における遺伝子発現のプロゲスチン調節を示す図である。
【図１５】Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞における調節会合結合部位の、ＰＲＥおよび補因子のモチーフ濃縮を示す図である。
【図１６】Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞のＰＲ結合領域におけるＰＲＥ位置の分布を示す図である。
【図１７】ＰＲＥ強度はＰＲ結合を予測しないことを示す例示的実験の図である。
【図１８】細胞株におけるＦＯＸＡ１転写産物の発現を示す図である。
【図１９】予想ＦＯＸＡ１モチーフがある場合、または、ない場合の、ＰＲ結合領域でのＦＯＸＡ１結合を示す図である。
【図２０】Ｔ−４７Ｄ細胞、ＡＢ３２細胞、およびＡＢ４９細胞におけるＰＲ発現を示す図である。
【図２１】ＨＣＣ１４２８乳がん細胞のＴ−４７Ｄにおける活性化ＰＲのＣｈＩＰバリデーションを示す図である。
【図２２】Ｔ−４７Ｄ乳がん細胞およびＨＣＣ１４２８乳がん細胞におけるＣｈＩＰ検証実験の集計を示す図である。
【図２３】Ｔ−４７Ｄ乳がん細胞およびＨＣＣ１４２８乳がん細胞におけるＰＲ活性化の特徴を裏付ける、ＰＲ結合標的の例示的リストを示す図である。
【図２４】Ｔ−４７Ｄ乳がん細胞およびＨＣＣ１４２８乳がん細胞における、ＯＲＧ２０５８にリガンドされたプロゲステロン受容体による結合に対する、オナプリストンの効果を示す図である。
【００３８】
一態様において、ＰＲが結合する応答エレメントのＤＮＡ配列、転写補因子の可用性、および標的細胞のクロマチン構造は、ＰＲトランスクリプトームの特異性に対し複合効果がある。別の態様では、正常乳房細胞および乳がん細胞におけるプロゲステロン受容体（ＰＲ）応答エレメント、転写補因子、およびクロマチン構造の寄与は、ハイスループットシーケンシングと組み合わせたゲノムワイドＰＲクロマチン免疫沈降を用いて、例示的乳がん細胞株（Ｔ−４７Ｄ）ならびにＰＲ−ＡおよびＰＲ−Ｂ両方のアイソフォームを安定的に発現する不死化正常乳細胞（ＡＢ３２、ＭＣＦ−１０Ａのクローンを発現する安定ＰＲ）のゲノムＤＮＡにおけるＰＲ相互作用を比較することで明らかにすることが可能である。さらに別の態様では、例示的ＰＲシストロームを特定し、特徴を調べる。これらのＰＲシストロームを用いることで、例えば、本明細書に記載の抗プロゲスチンでの処置に影響を受けやすい悪性腫瘍（例えば、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がんおよび子宮肉腫）を有する患者を特定することが可能である。抗プロゲスチンでの処置に影響を受けやすい患者を特定し処置することは、該患者におけるがんの発生、増殖、成長、および転移に影響を与え得る。
【００３９】
種々の正常組織および腫瘍化組織にあるプロゲステロン受容体の活性および状態は、予測することが可能である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／６４４，８７２号明細書を参照のこと。この情報を用いて、抗プロゲスチン（例えば、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニル、ウリプリスタル、ＺＭ１７２４０６、ＺＭ１５０２７１、ＺＭ１７２４０５、およびアグレプリストン）による成長阻害の影響を受けやすい腫瘍を有する疑いのある患者を特定し、処置することが可能である。本明細書の一態様において、プロゲステロン受容体を、患者から採取した腫瘍化またはがん性の疑いのある組織サンプルのゲノムＤＮＡ標的に結合し、組織サンプルおよび陰性対照サンプルの１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的のレベルまたは存在量を検出することでプロゲステロン受容体の活性および状態を明らかにし；１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的のレベルまたは存在量が、陰性対照サンプルにおけるレベルの少なくとも約４倍多いか、または、陰性対照サンプルにおけるレベルより統計的に著しく多い場合に、患者に抗プロゲスチンを投与する、方法および系を記載する。
【００４０】
一態様において、「シストローム」という用語は、ゲノム内のＤＮＡ領域の集合を意味し、これは特異的なシス作用転写調節因子（例えば、ＰＲ）に結合される。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的」という用語は、プロゲステロン受容体が結合することができるゲノムＤＮＡ領域を意味し、ゲノムＤＮＡの対照領域と比較し、プロゲステロン受容体シストロームの転写の増加に関連する。
【００４２】
「投与する」という用語は、１つまたは複数の薬物を提供すること、１つまたは複数の薬物を処方すること、または、１つまたは複数の薬物を処方集に載せることを意味する。「提供すること」という用語は、任意の適切な投与経路（例えば、経口、注射、静脈内、筋肉内、および経皮など）を通じて薬物を直接的に患者に投薬すること、または、そうするように患者に指示を与えることを意味する。
【００４３】
「プロゲスチン」という用語は、プロゲステロンの作用の一部またはすべてを再現する天然または合成のプロゲステロン物質を意味し、また、プロゲステロン受容体調節因子（ＰＲＭ）または選択性プロゲステロン受容体調節因子（ＳＰＲＭ）ともいう。
【００４４】
「抗プロゲスチン」という用語は、プロゲステロン剤の形成、輸送、または作用を阻害する、または、プロゲステロン剤を不活性化する物質を意味し、これには、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニル、ウリプリスタル、ＺＭ１７２４０６、ＺＭ１５０２７１、ＺＭ１７２４０５、およびアグレプリストンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。ＰＲＭおよびＳＰＲＭはいくらかの抗プロゲスチン特性を持ち得、使用状況に応じて抗プロゲスチンまたはプロゲスチンと考えることができる。
【００４５】
「結合する」または「結合して」という用語は、相互作用または化学結合（例えば、水素、疎水性、イオン性、および共有）を介した、分子または化合物の１つまたは複数の部分の会合を意味する。「架橋する」または「架橋して」という用語は、「結合する」または「結合して」と言う用語の一形態であり得る。
【００４６】
本明細書では、患者が抗プロゲスチンでの処置に影響を受けやすいかどうか判断するための方法および系を提供する。一態様において、患者を抗プロゲスチンで処置する方法は、腫瘍化またはがん性の疑いのある組織サンプルを患者から得るステップと、プロゲステロン受容体を前記組織サンプルのゲノムＤＮＡに結合するステップと、前記組織サンプルのプロゲステロン受容体と会合するゲノムＤＮＡを検出するステップと、前記組織サンプルおよび陰性対照サンプルのＤＮＡ標的と会合する１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体の転写または存在量を検出するステップと、１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的のレベルが、陰性対照サンプルにおけるレベルの少なくとも約４倍多いか、または、陰性対照サンプルにおけるレベルより統計的に著しく多い場合に、患者に抗プロゲスチンを投与するステップを含む。
【００４７】
組織サンプルまたは生検材料は、患者から、例えば、外科医、内科医、看護師、または医療技術者により、腫瘍を有する疑いのある、または、がんもしくは他の異常な細胞成長の兆候を示す患者から、得ることが可能である。
【００４８】
組織サンプルは、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した１％ホルムアルデヒドにサンプルをさらし、機械的に粉砕および架橋することにより、分析用に処置または調製することが可能である。サンプルは溶解バッファに再懸濁させることが可能であり、ゲノムＤＮＡは音波処理により断片化することが可能である。
【００４９】
プロゲステロン受容体（ＰＲ）結合ゲノムＤＮＡは、二次抗体磁気ビーズ結合体と複合化した抗ＰＲ一次抗体と共に培養することにより、免疫沈降させることが可能である。一態様では、少なくとも、複製決定物と、サンプルを含む対応陰性対照培養を用いて、一次抗体を用いずに、アッセイを行うことが可能である。磁気ビーズ複合体はバッファで洗浄し、非特異的シグナルを低減することが可能である。
【００５０】
ゲノムＤＮＡは、例えば磁気ビーズを、溶出バッファ（１％ＳＤＳ、０．１ＭＮａＨＣＯ３）を用いて室温で１５分間、２倍に培養し、分離ゲノムＤＮＡを含む溶出液を収集することにより、ビーズから溶出することが可能である。架橋は、例えば、塩が多量に含まれる中で少なくとも４時間６５℃に加熱することにより元に戻すことが可能である。ゲノムＤＮＡ断片は、ＰＣＲ精製試薬、例えば、Ｑｉａｇｅｎ社から提供されるＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製することが可能である。
【００５１】
活性化ＰＲ会合ＤＮＡ標的は、該活性化ＰＲ会合ＤＮＡ標的に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる量的リアルタイムＰＣＲにより、検出することが可能である。一態様では、サンプルを３倍に増幅する。別の態様では、少なくとも４つの活性化ＰＲ会合ＤＮＡ標的を選択する。
【００５２】
テストサンプル中の活性化ＰＲ会合ＤＮＡ標的の存在量は、特異的一次抗体無しで培養した陰性対照／参照サンプルと比較して求めることが可能である。一態様では、倍数差＝２＾−（平均Ｃｔテスト−平均Ｃｔ参照）である。倍数差の統計的有意差は、例えば、独立反復測定についてスチューデントのｔ検定を行うことにより求めることが可能である。一態様において、約４倍以上の倍数差および０．０５未満のｐ値は、活性化ＰＲの存在を示す。
【００５３】
別の態様では、活性化ＰＲが検出された場合、抗プロゲスチンを患者に投与することが可能である。
【００５４】
さらに別の態様では、組織サンプルを、乳房、脳、髄膜腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮肉腫、子宮筋腫、および肺の組織からなる群から選択する。
【００５５】
一態様では、抗プロゲスチンは、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニル、ウリプリスタル、ＺＭ１７２４０６、ＺＭ１５０２７１、ＺＭ１７２４０５、およびアグレプリストンからなる群から選択する。
【００５６】
別の態様では、抗プロゲスチンを一日に約１０ｍｇ〜約２００ｍｇの量で患者に投与する。
【００５７】
さらに別の態様では、抗プロゲスチンに加え、抗腫瘍化合物（例えば、エベロリムス、トラスツズマブ、ＴＭ１−Ｄ、抗ＨＥＲ２薬、ベバシズマブ、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビン、シクロホスファミド、抗エストロゲン、選択的エストロゲン受容体調節因子、アロマターゼ阻害剤、および抗アンドロゲン）を患者に投与または共投与することが可能である。
【００５８】
一態様では、活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的は、ＡＣＳＬ１およびＰＡＣＳＩＮ１の近くにＰＲ結合領域を含む。
【００５９】
別の態様では、免疫沈降を、モノクローナル抗ＰＲ抗体、例えば、ｈＰＲａ６およびｈＰＲａ７を用いて実行することが可能である。
【００６０】
他の態様は、組織サンプルのプロゲステロン受容体の活性化状態を判断する系を提供する。該系は、例えば、抗ＰＲ一次抗体、および、１つまたは複数の、活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的を対象とするオリゴヌクレオチドプライマー対を含むことが可能である。
【００６１】
別の態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＣＳＬ１およびＰＡＣＳＩＮ１の近くの結合領域を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー群から選択することが可能である。
【００６２】
他の態様は、腫瘍化またはがん性の疑いのある組織サンプルを患者の腫瘍から取得し、プロゲステロン受容体を前記組織サンプルのゲノムＤＮＡに結合（例えば、架橋）し、前記組織サンプルのプロゲステロン受容体と会合するゲノムＤＮＡを検出し、前記組織サンプルにある１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的のレベルを検出し、そして、１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的のレベルが、陰性対照サンプルにおけるレベルの少なくとも約４倍多いか、または、陰性対照サンプルにおけるレベルより統計的に著しく多い場合に、患者に抗プロゲスチンを投与することにより、抗プロゲスチンによる成長阻害に影響を受けやすい腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。
【００６３】
さらなる態様は、腫瘍化またはがん性の疑いのある組織サンプルを患者から取得し；前記組織サンプルにおいて、プロゲステロン受容体と会合するゲノムＤＮＡを検出し；Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６（下記表）からなる群から選択した、１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的の存在量を検出し；そして、前記組織サンプルの陰性対照アッセイにおいて、同様のＤＮＡ領域を検出することにより、抗プロゲスチンで患者を処置する方法を提供する。Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択した１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的の転写レベルが、陰性対照サンプルの同様のＤＮＡ領域のレベルより少なくとも約４倍多いか、または、陰性対照より統計的に著しく多い場合に、患者に抗プロゲスチンを投与することが可能である。
【００６４】
【表１】
2017510557.tif 000015
【００６５】
さらなる態様は、抗プロゲスチンで患者を処置する方法であって、腫瘍化またはがん性の疑いのある組織サンプルを前記患者から取得するステップと、前記組織サンプルにおいてプロゲステロン受容体と会合するゲノムＤＮＡを検出ステップと、組織サンプルにおいて１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的の第１転写レベルを検出するステップであって、前記ＤＮＡ標的は、Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択される、ステップと、陰性対照組織サンプルにおいて１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的の第２転写レベルを検出するステップであって、前記ＤＮＡ標的は、Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択される、ステップと、前記第１転写レベルと前記第２転写レベルを比較するステップと、１つまたは複数の活性化プロゲステロン受容体会合ＤＮＡ標的の転写レベルが、陰性対照サンプルにおけるレベルの少なくとも約４倍多い場合に、抗プロゲスチンを前記患者に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６６】
一態様において、組織サンプルは、乳房、脳、髄膜腫、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮肉腫、子宮筋腫、および肺の組織からなる群から選択する。
【００６７】
別の態様では、抗プロゲスチンは、オナプリストン、ロナプリサン、ミフェプリストン、ＰＦ−０２４１３８７３、テラプリストン、リロプリストン、ＯＲＧ２０５８、アポプリスニル、ウリプリスタル、ＺＭ１７２４０６、ＺＭ１５０２７１、ＺＭ１７２４０５、およびアグレプリストンからなる群から選択する。
【００６８】
さらに別の態様では、抗プロゲスチンは、一日に約１０ｍｇ〜約２００ｍｇの量で患者に投与する。
【００６９】
さらなる態様は、抗腫瘍化合物（例えば、エベロリムス、トラスツズマブ、ＴＭ１−Ｄ、抗ＨＥＲ２薬、ベバシズマブ、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、アントラサイクリン、アントラセンジオン、カルボプラチン、シスプラチン、５−ＦＵ、ゲムシタビン、シクロホスファミド、抗エストロゲン、選択的エストロゲン受容体調節因子、アロマターゼ阻害剤、及び抗アンドロゲン）を投与することを提供する。
【００７０】
一態様では、補因子結合モチーフの存在を検出する（例えば、ＦＯＸＡ１）。別の態様では、ゲノムＤＮＡを免疫沈降により検出する。免疫沈降は、モノクローナル抗体（例えば、ｈＰＲａ６およびｈＰＲａ７）を用いて実行することが可能である。さらに別の態様では、ゲノムＤＮＡと会合するプロゲステロン受容体を、抗ＰＲ一次抗体を用いた免疫沈降により検出する。
【００７１】
さらなる態様は、Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択した核酸を含む、実質的に単離した核酸を提供する。核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡとすることが可能である。核酸は、Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択した核酸に相補的とすることが可能である。
【００７２】
さらなる態様は、Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択した核酸の転写レベルを検出するキットを提供する。一態様において、該キットは、Ｔ４７Ｄ２８２２、Ｔ４７Ｄ２９９、Ｔ４７Ｄ３５１４、Ｔ４７Ｄ４４１４、Ｔ４７Ｄ４８１８、Ｔ４７Ｄ５０４５、およびＴ４７Ｄ５５１６からなる群から選択した核酸と、ゲノムＤＮＡ標的の存在を検出するモノクローナル抗体（例えば、ｈＰＲａ６およびｈＰＲａ７）とを含む。
【００７３】
本明細書に記載のいくつかの例示的態様を記載する前に、本発明は、以下の記載に述べる構成またはプロセスステップの詳細に限定されるものではないことを理解すべきである。本明細書に記載の態様は、種々のやり方で実践または実行することが可能である。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
ゲノムワイドＰＲ相互作用プロファイルの生成
一態様において、ＰＲゲノム相互作用を、Ｔ−４７Ｄ乳がん細胞と、ＡＢ３２細胞株：ＭＣＦ−１０Ａ不死化正常乳房細胞株のクローンを発現する安定ＰＲとにマッピングした。細胞をプロゲスチンＯＲＧ２０５８で処置し（１０ｎＭ、４５分）、続いてＰＲ−クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）とＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを行った。配列をヒトゲノムとアライメントし、アライメントにおいて濃縮されたゲノム領域をＢｏｗｔｉｅ［３７］およびＥＲＡＮＧＥ［３８］のソフトウェアツール（偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）０．２７％）を用いて特定した。
【００７５】
Ｔ−４７Ｄ細胞ではＰＲ結合の６３１２個のピークを特定し、ＡＢ３２細胞では８１１７個の結合領域を検出した（表１）。ＰＲ結合領域は最も近い遺伝子の１００ｋｂ内に最も多く（Ｔ−４７Ｄで８８％、ＡＢ３２で７３％）、５０ｋｂ内では、Ｔ−４７で結合領域中５７％、ＡＢ３２で５４％だった。しかしながら、遺伝子ＴＳＳの１０ｋｂ内では結合領域はほとんどなかった（Ｔ−４７Ｄで２１％、ＡＢ３２で２０％）（表１）。Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞の各ＰＲ結合領域について、最も近い遺伝子転写開始点からの距離の分布を、図１Ａおよび１Ｂにそれぞれ示す。
【００７６】
ＰＲ結合領域を全染色体について検出し、多少のばらつきは見られたが、１染色体当たりの結合部位の数は、染色体の大きさおよびその特定の染色体の遺伝子数を反映していた。Ｔ−４７Ｄ細胞（図１Ｃ）およびＡＢ３２細胞（図１Ｄ）における１染色体当たりの遺伝子数に対する結合領域の線形回帰分析が、ＡＢ３２細胞では遺伝子数に対しより強い相関関係があることを明らかにした（Ｔ−４７ＤでＲ２＝０．５８であるのに対し、ＡＢ３２ではＲ２＝０．７６）。全体として２つの細胞株間の１染色体当たりの結合領域数の間には相関関係があった（捕捉図１、Ｒ２＝０．６６）が、いくつかの例外もあった。染色体２および染色体８の結合領域は、ＡＢ３２と比較しＴ−４７Ｄデータセットでは下方描写される一方、染色体１１の領域は上方描写された。Ｔ−４７Ｄ細胞の核型［３９］は、ＡＢ３２細胞と比較し重要な再構成および複製を示し、これは、Ｔ−４７Ｄ細胞が染色体１１を２コピーではなく４コピー含むことにより観察される結合の差を部分的に説明し得る。しかしながら、染色体２はＴ−４７Ｄ細胞で正常であるものの、この染色体の領域への結合はＡＢ３２細胞で検出される頻度の半分であった。ＡＢ３２においてＰＲにより結合される染色体２の調節遺伝子についての機能アノテーションにより、代謝関連遺伝子の濃縮が明らかになり（補足表１）、これは、がん細胞株においてプロゲスチンに対する代謝応答が変わる、または、弱まることを示唆した。
【００７７】
（実施例２）
ＰＲゲノム相互作用と転写応答の間の関係
別の態様では、ＣｈＩＰ−ｓｅｑと並行して行った遺伝子発現プロファイリングにより、ＰＲ結合領域は調節遺伝子の周りに集中していることが明らかになった。１遺伝子当たりのＰＲ結合領域濃度は、例えば、全体のＰＲ結合領域濃度（Ｔ−４７Ｄ細胞の全遺伝子では１遺伝子あたり０．７３、ＡＢ３２細胞では０．７４；表１）より、調節遺伝子で高かった（１調節遺伝子あたりの結合領域濃度：Ｔ−４７Ｄ細胞では２．２３、ＡＢ３２細胞では２．１９；表１）。加えて、ＰＲ結合のピークは、全遺伝子の５０ｋｂ内のＰＲ結合領域比率（Ｔ−４７Ｄ細胞では、遺伝子転写開始点の５０ｋｂ内にＰＲ結合領域の５７％、ＡＢ３２細胞では５４％；表１）と比較し、調節遺伝子のＴＳＳの５０ｋｂ内にあることが多かった（Ｔ−４７Ｄ細胞では調節遺伝子の７４％、ＡＢ３２細胞では調節遺伝子の６９％）。
【００７８】
Ｔ−４７Ｄ細胞のＰＲ結合領域は、平均して、下方制御遺伝子近くの領域よりも上方制御遺伝子のＴＳＳに近かった。Ｔ−４７Ｄ細胞において、ＰＲ結合から上方制御遺伝子までの距離の中央値は４４ｋｂである一方、下方制御遺伝子までの距離の中央値は７５ｋｂだった（図１Ｅ）。これは、この細胞株の上方制御遺伝子および下方制御遺伝子までの結合領域距離の累積度数分布における、統計的に重要な全体差に反映された（図１Ｅ、ｐ＝０．００１、コルモゴロフ・スミルノフ２標本検定）。対照的に、ＡＢ３２細胞では、上方制御遺伝子および下方制御遺伝子についての結合領域分布に重要な差は見られなかった（図１Ｆ、ｐ＝０．３０５）。
【００７９】
ＰＲ結合領域が上方制御遺伝子により近いことに加え、上方制御遺伝子の近くにはより多くのＰＲ結合領域があり、例えば、Ｔ−４７Ｄ細胞において、１上方制御遺伝子当たり平均結合領域は平均２．３結合領域であるのに対し、１下方制御遺伝子当たりは平均１．５であり、そして、ＡＢ３２細胞の１上方制御遺伝子および１下方制御遺伝子当たりでは、それぞれ平均２．４領域および平均１．９領域であった（表１）。さらに、ＰＲ結合領域に会合する比率は、上方制御遺伝子（Ｔ−４７Ｄの上方制御遺伝子で５０９／７８６−６５％、ＡＢ３２の上方制御遺伝子で４３９／５４６−８０％）の方が、下方制御遺伝子（Ｔ−４７Ｄの下方制御遺伝子で５０／９８−５１％、ＡＢ３２で下方制御遺伝子の３２５／６２１−５２％、表１）より高かった
【００８０】
（実施例３）
ＰＲ結合は転写調節に関連する
別の態様では、両細胞株の調節遺伝子の大部分（Ｔ−４７Ｄで５５９／９５０（５９％）、ＡＢ３２で７４９／１２４９（６０％）、図２ＡおよびＢ、表１）は、１００ｋｂ内に１つまたは複数のＰＲ結合領域を有した。ＯＲＧ２０５８処置後は、より早い時点でＰＲ結合と転写調節の間により強い関連が見られた。これはＰＲにより直接的に調節される遺伝子は、非直接的標的である遺伝子より、転写レベルで早く検出されやすいことを示す（補足図２）。両細胞株において、より早い時間でプロモータ近位ＰＲ結合領域（５’ＵＴＲおよび１０ｋｂ上流まで）がより高く描写されていることから分かるように（図２ＣおよびＤ）、この関係はＴ−４７Ｄ細胞で最も強く、ＡＢ３２細胞では、調節遺伝子のＴＳＳに比較的近い結合領域にのみ当てはまった。
【００８１】
別の態様では、遺伝子内領域および遺伝子間領域についてのＰＲ結合領域の全体分布は、両細胞株で類似していた（補足図３）：最も高いＰＲ結合領域比率は、上流および調節遺伝子の５’ＵＴＲで観察され、調節遺伝子と結合する領域のうち４３〜４５％を占めた。
【００８２】
Ｔ−４７Ｄ細胞のＰＲ結合領域に関連するプロゲスチン調節転写産物の自己組織化マップ（ＳＯＭ）クラスタリング（図２）、および、対応する結合領域の分析が、ＰＲ結合領域は、下方制御遺伝子またはより遅い時点で調節された遺伝子のＴＳＳよりも、迅速に上方制御された遺伝子のＴＳＳに著しく近いことを示した（クラスカル−ウォリス一元配置分散分析、ｐ値＜０．００１、図２Ｆ−クラスター０〜５を６〜８と比較）。全プロゲスチン調節転写産物の自己組織化マップクラスタリングにより、ＰＲ結合に関連する遺伝子のサブセットで見られるものと全体的に類似した調節パターンが明らかになった（図９）。しかしながら、より大きいデータセットにおいて、２６個の転写産物のクラスターが、ＯＲＧ２０５８により全時点で減少するが、２４時間後には基礎レベルに向かって戻り始めることを示すことが検出された。このクラスターの１２個の転写産物は、ＰＲ結合に関連する転写産物のセットにも存在したが、１４個は完全プロゲスチン調節トランスクリプトームにのみにあり、早く調節されるが２４時間でほぼ回復する転写産物を示し、これは、直接的ＰＲ結合に影響を受ける転写サイレンシングは、非直接的調節よりも維持されることを示唆した。
【００８３】
ＡＢ３２細胞では、ＯＲＧ２０５８により増加するより減少する転写産物がより多く（図１０）、調節クラスター間で観察される結合領域からＴＳＳまでの平均距離に著しい違いはなかった（クラスカル−ウォリスｐ値＝０．２０９、図示なし）。
【００８４】
（実施例４）
細胞株間にあるＰＲ結合の特有パターンは、異なる転写応答を反映する
Ｔ−４７ＤにおいてＰＲにより結合される６３１２個の領域、および、ＡＢ３２の８１１７個の領域のうち、１８２４個の結合領域だけ（全組み合わせのうち１４％）が両細胞株に共通で、Ｔ−４７Ｄの結合領域のうち２９％、ＡＢ３２の結合領域のうち２２％を占めた（図３）。両細胞株に共通する結合領域は、調節遺伝子と会合している可能性は低かった：ＡＢ３２およびＴ−４７Ｄの両方に見られる１８２４個の結合領域のうち、ＡＢ３２では４３１個（２４％）がプロゲスチン調節と関連し、Ｔ−４７Ｄでは３４５個（１９％）が関連し、これは、表１に示す全結合領域の調節遺伝子との会合と類似していた。１５７個（９％）の結合領域が、両細胞株において調節遺伝子と会合していた（データ表示なし）。一方の細胞株だけで検出される、または、両細胞株に共通して検出される結合ピークの例を図１１に示す。定方向ＣｈＩＰにより、ＡＢ３２、Ｔ−４７Ｄ、または両細胞株の調節遺伝子に対するＰＲ結合の異なるパターンを確かめた（図１２）。さらに、Ｔ−４７Ｄ細胞の別のＰＲシストロームと、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ細胞の、ＰＲ結合間の重複を直接的に調べることにより［４０］、ＡＢ３２ＰＲデータセットとよりも２つのＴ−４７Ｄデータセットの間で、結合領域により多くの重複があることが明らかになった（図１３）。
【００８５】
２つの細胞株間の結合部位の重複の欠如は、プロゲスチン処置の２、６、２４時間後の、転写プロファイルにおける同様の重複の少なさに反映された（図３Ｃ〜Ｅ）。２つの細胞株のプロゲスチン標的における重複の小ささは、試験した全ての時点において類似していた（図３Ｅ）。この重複の欠如は２つの追加細胞株であるＺＲ−７５−１乳がん細胞、および、追加ＰＲ発現細胞株ＭＣＦ−１０ＡクローンであるＡＢ９においても確かめられ、これは、互いに（図１４）、または、Ｔ−４７Ｄ細胞もしくはＡＢ３２細胞と直接的に比較した場合、プロゲスチン応答で同様に重複が低いことを明らかにした。
【００８６】
（実施例５）
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞のＰＲ結合領域で特定される保存ＰＲＥ
調節遺伝子と会合するＰＲ結合領域のデノボモチーフ濃縮分析により、事前に予測したプロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ）と一致する保存ＰＲ結合モチーフ（図４Ａ）の、非常に著しい濃縮を特定した。ＭＥＭＥ−ＣｈＩＰ（ソフトウェア分析プログラム）ツールおよびＨｏｍｅｒモチーフ分析（ソフトウェア分析プログラム）ツールにより、３つの非特異的対により分離され、ＰＲ結合エレメントについての古典的な生化学研究と一致し［２、３］、最近簡潔に説明されたエレメント［４０］と類似する、６塩基対逆方向反復配列ＲＧＮＡＣＡからなるコンセンサスＰＲ結合モチーフを特定した。加えて、Ｈｏｍｅｒでのデノボ分析は、逆方向反復配列の中心コアを表す、非常に濃縮された短めのエレメントを特定した（図４Ａ）。これは、ＰＲＥの、このより高度に保存された部分がＰＲ結合にとって最も重要であることを示唆した。Ｔ−４７Ｄ細胞では、調節遺伝子と会合する７８２／１２３９（６３％）のＰＲ結合領域が１つまたは複数の全長またはコアのＰＲＥモチーフを含み（図１５Ａ）、結合領域の３３％において、これは少なくとも１つの高度に保存された全長ＰＲＥを含んだ。ＡＢ３２細胞では、調節関連ＰＲ結合領域の６２％がＰＲＥを含んだ（図１５Ｂ）。ＰＲ結合の実質的な比率は、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞の両方で、結合領域の中心周りに正常なＰＲＥ分布があることから、これらのモチーフとの直接的なゲノム相互作用に影響されやすかった（図１６および１標本コルモゴロフ-スミルノフ検定）。ＰＲＥの数はピークの高さと互いに関係があるわけではないが（ピアソン回帰Ｒ２＝０．００４８）、両細胞株の多くの結合領域は２個以上のＰＲＥを含み、これは、ＰＲＥ数が結合強度と互いに関連しないことを示唆した。
【００８７】
２つの細胞株でデノボモチーフマッピングにより定義された全長ＰＲＥに対し、位置特異的確率行列を用い、全ＰＲ結合領域のＰＲＥ強度を分類した。調節関連ＰＲ結合領域と調節非関連ＰＲ結合領域の、強力なＰＲＥを含む比率が同じ（データ表示なし）だったことから、ＰＲＥ強度は転写結果を予測しなかった。調節関連ＰＲ結合領域をＰＲＥのｐ値に基づいてグループ分けした（図４ＢおよびＣ、強（＋＋＋）−ｐ＜１×１０−５、中（＋＋）−ｐ＝１×１０−５〜１×１０−３、弱／無（＋）−ｐ＞１×１０−３）。この基準によると、Ｔ−４７Ｄ細胞の調節関連結合領域の７７％およびＡＢ３２の７６％が１つまたは複数の中または強のＰＲＥを含んだ（ｐ＜０．００１）。ＰＲ結合領域の大部分は強ＰＲＥを含まず、これは、ＰＲ結合部位選択における広範な自由度を示唆し、また、ＰＲ結合強度はＤＮＡ核酸配列によってのみ決定されるのではなく、二次ＤＮＡ構造および他のＤＮＡ結合ＰＲ補因子によっても影響を受ける可能性があることを含意した。ＰＲ結合ピークの高さは、転写結果と互いに正の関係を持ち、これは、それが結合強度の尺度となることを示唆した。Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞の両方で、上方制御遺伝子の５０ｋｂ内にある結合領域の平均ピーク高さは、任意の調節遺伝子から離れているものより著しく高かった（図４ＤおよびＥ。独立ｔ検定、Ｔ−４７Ｄ ｐ＝２．８９×１０−８、ＡＢ３２ ｐ＝３．８×１０−６）。ＰＲＥ強度をピーク高さと直接的に比較した際、相関関係は見られず、ＰＲＥの質のみがＰＲ結合強度を決定するわけではないことを示した（図１７）。この発見は、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞のピーク高さによる上位ＰＲ結合領域についての、定方向ＣｈＩＰ検証により支持された。これらの領域についての分析により、Ｔ−４７Ｄ細胞では２領域のみが強ＰＲＥを含み、ＡＢ３２細胞では３領域のみが強ＰＲＥを含むことを明らかになった。上位１０個のほとんどの領域は中強度ＰＲＥを含み、ＰＲ結合は各細胞株において、１つを除くすべての結合領域で確かめられた（表Ｓ２）。
【００８８】
（実施例６）
Ｔ−４７ＤおよびＡＢ３２における結合領域は、特有のモチーフ濃縮を有する
他の濃縮モチーフの有無について、各結合ピークから４００ｂｐまで配列を分析した。Ｔ−４７Ｄ細胞の結合領域は、パイオニア因子ＦＯＸＡ１に関するモチーフが著しく濃縮されていた（図４Ｆ）一方で、ＡＢ３２細胞由来のＰＲ結合領域ではこの因子に関し著しい濃縮はなかった。ＦＯＸＡ１結合モチーフを、Ｔ−４７Ｄ細胞の調節関連ＰＲ結合領域の５４８／１２３９（４４％）で特定した（図１５Ａ）。ＡＢ３２細胞の結合領域では、ＡＰ−１複合体およびＤＮＡ結合ＰＲ補因子ＮＦ１に関し、結合部位の強い濃縮があった。ＡＢ３２細胞の調節関連ＰＲ結合領域のうち、ＡＰ−１結合モチーフは４５４／１６３９（２８％）で存在し、ＮＦ１部位は３８０／１６３９（２３％）で特定された（図１５Ｂ）。これらの細胞のうち、両因子について結合モチーフを含んだのは比較的少なかった（７４／１６３９、４．５％）。ＯＲＧ２０５８により上方または下方に制御された遺伝子近くの結合領域において、いずれの転写因子モチーフも普及に差はなかった（ｔ検定、ｐ＞０．０５）。さらに、上方調節関連結合領域および下方調節に関連するものについての別のモチーフ分析では、異なる転写因子モチーフの濃縮は明らかにならなかった（図示なし）。
【００８９】
（実施例７）
パイオニア因子ＦＯＸＡ１はＰＲ転写応答を変える
ＦＯＸＡ１転写産物は、ＡＢ３２細胞およびＡＢ９細胞と比較し、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＺＲ−７５−１細胞で豊富に発現し（図１８）、これは、内因性ＦＯＸＡ１レベルがＰＲ転写応答の調節で役割を果たし得ることを示唆した。したがって、内因性ＦＯＸＡ１レベルを欠くＡＢ３２細胞を、レンチウイルス送達ＦＯＸＡ１に感染させた（図５）。これは、プロゲスチン調節トランスクリプトームにおいて、６時間後と２４時間後に大きな変化をもたらした（図５Ａ）。ＦＯＸＡ１形質導入は、制御ｐＣＤＨウイルスのみ形質導入された細胞では調節されなかった３０３個の転写産物に、プロゲスチン調節をもたらした（図５Ｃ）。これらの標的のほぼ半分（１４６／３０３、４８％）は、共にクラスター化した遺伝子の特有のカセットとして検出された（図５Ａ、赤い帯）。機能分析により、ＦＯＸＡ１発現後プロゲスチン調節を得た遺伝子は、血管の形態形成および細胞運動性の調節に関与することが明らかになった（表Ｓ３およびデータ表示なし）。これらのカテゴリーには、増殖因子β３、ＣＤ４４、および塩基性繊維芽細胞増殖因子を転換するような遺伝子が含まれた。驚くべきことに、ＦＯＸＡ１が存在しない場合に調節された転写産物の大部分（ＦＯＸＡ１なしで、６時間で、２４時間で、または両方で調節された１３３３個の転写産物、図５Ｃ）は、パイオニア因子の発現時に調節を失い、これは多数のクラスターで明らかだった（図５Ａ、青い帯）。機能分析により、ＦＯＸＡ１の発現が、アポトーシスの陰性調節に関わる遺伝子に与える主な影響が明らかになった：ＦＯＸＡ１がない場合、これらはプロゲスチンにより増加したが、ＦＯＸＡ１が発現するとプロゲスチン応答性を消失した（表Ｓ３およびデータ表示なし）。プロゲスチンにより減少するこのカテゴリーの遺伝子はＦＯＸＡ１の発現により変化せず、これは、ＦＯＸＡ１の正味の影響は、プロゲスチンに対する応答時にアポトーシスを促進することだということを示唆した。プロゲスチン調節に対するＦＯＸＡ１発現の減衰効果は、パイオニア因子がＰＲ作用において二重の役割を果たし得ることを示唆した。該役割は、アンドロゲン標的のサブセットに対しては活性化因子として、他に対しては補助抑制因子として作用する［４１］という、アンドロゲン受容体シグナル伝達におけるその役割に類似していた。１６８個の転写産物のプロゲスチン調節だけが、変化したＦＯＸＡ１レベルの影響を受けなかった（図５Ｃ）。これらの遺伝子の機能的分析により、プロゲスチンの影響を受けた増加は、細胞周期の進行に関与することが明らかになり、これは、プロゲスチンの増殖効果はＦＯＸＡ１を必要としない場合があることを示唆した。
【００９０】
ＦＯＸＡ１は、ＥＲで見られるものとは異なる影響をＰＲ転写に与えるようだったことから、Ｔ−４７Ｄ細胞におけるＰＲ結合領域周りのＦＯＸＡ１ＣｈＩＰ−ｓｅｑ相互作用［４２］の濃度を、ＦＯＸＡ１またはＥＲ結合領域で見られる濃度と比較した（図５Ｄ）。理論に縛られることなく、ＥＲ結合領域周りのＦＯＸＡ１の結合は非常に強く、エストロゲンシグナル伝達におけるこの因子の必要性を示した。対照的に、ＦＯＸＡ１の相互作用のピークはＰＲ結合領域の近くで見られたが、配列濃縮は著しく低く（図５Ｄ）、これは、ＦＯＸＡ１は一部の領域でＰＲ結合に関係し得るものの、それは結合事象のサブセットを表すことを示唆する。
【００９１】
この結論は、ＦＯＸＡ１結合が、ＦＯＸＡ１モチーフが予測されたＰＲ結合領域において、モチーフのない領域よりずっと強く、ＥＲ結合領域全体で観察された結合濃度に類似していたという発見に支持される（図１９）。ＰＲ結合部位数が、ＦＯＸＡ１発現に対するプロゲスチン調節を得た遺伝子の近くで異なるか否かをテストするため、ＦＯＸＡ１が発現した際にプロゲスチン調節を消失した、獲得した、または、維持した遺伝子の近くにあるＦＯＸＡ１陰性ＡＢ３２細胞の、ＰＲ結合ピークの数を比較した。調節を得た遺伝子近くのＰＲ結合領域は若干少なかったが（図５Ｅ）、差は著しくなかった。これは、ＦＯＸＡ１が標的遺伝子のＰＲ結合および転写調節に影響を与える機能はＰＲ結合部位濃度と関係がないこと；ＰＲは「獲得」遺伝子サブセットの近くで弱い会合を形成するが、ＦＯＸＡ１は、生産的になるための相互作用に必要でないことを示唆した。また、ＦＯＸＡ１が発現した際にプロゲスチン調節を消失した、獲得した、または、保存した遺伝子に会合するＰＲ結合領域の、ＮＦ１およびＡＰ−１について、モチーフの濃縮レベルを試験したが、群間で差は見られなかった（図示なし）。
【００９２】
ＦＯＸＡ１は、そのＤＮＡ湾曲活性を通じ、転写因子活性に影響を与える［４３、４４、４５］。転写に影響を与えるＦＯＸＡ１を必要とするＰＲ結合領域は、必要としない場合より標的遺伝子からさらに離れている場合があり、それらの領域近くのＦＯＸＡ１結合はＤＮＡ湾曲をまねき、これは標的遺伝子により近いＰＲ転写複合体をもたらすことについて熟考した。ＰＲ結合領域から、ＦＯＸＡ１により調節を獲得した遺伝子までの距離を試験することにより、これが事実であり、この遺伝子サブセットは、ＦＯＸＡ１がない場合に調節された遺伝子近くの結合領域より、調節遺伝子から著しく離れていることが明らかになった（図５Ｆ、ｐ＝０．００３、独立ｔ検定）。
【００９３】
要約すると、２つの異なる例示的な細胞株（例えばＴ−４７ＤおよびＡＢ３２）におけるＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイリングにより、特有のＰＲ結合パターンが予想外に明らかになった。これらの特有のシストロームは、プロゲスチンに対する転写応答における顕著な差に反映される。２つの細胞株のＰＲ結合は、類似したＤＮＡ相互作用モードを示す類似度の高いＰＲＥの影響を受けるが、補因子結合部位濃縮、特にＦＯＸＡ１における主な違いは、これらの補因子の発現レベルが、ＰＲの細胞特定結合およびリガンド応答に影響を与えることを示唆する。
【００９４】
この、ＰＲゲノム相互作用について一番詳しいゲノムワイド調査により、不死化正常細胞および悪性乳房細胞における非重複ＰＲ結合部位が特定され；ＰＲ相互作用は近位プロモータの遠位側で起きることが示され、これは、ＰＲ効果が、直接的シス作用転写因子についてこれまで予想されていたより長い距離にわたり影響を受けることを支持し；転写補因子は細胞特定ＰＲ活性に対する重要な要因であることが示された。
【００９５】
（実施例８）
ＰＲ結合領域はＴＳＳから離れている
ほとんどのＰＲ結合領域が調節遺伝子のＴＳＳから１０ｋｂ超離れて位置し、両細胞株の調節遺伝子の３５％未満が、ＴＳＳの１０ｋｂ内にＰＲ結合領域を有し、調節遺伝子の４％未満が、ＴＳＳの１ｋｂ内に結合領域を有する。両乳房細胞型において、結合は、遺伝子調節と互いに関連し、ほとんどのプロゲスチン調節遺伝子が５０ｋｂ内に１つまたは複数のＰＲ結合領域を有し、プロゲスチンにより増加した遺伝子は、減少した遺伝子よりもＰＲ結合部位と会合する可能性が高い。これらの発見は、比較実験系での他の核内受容体についての所見と一致する。Ｒｅｄｄｙらは、デキサメタゾンで処置したＡ５４９細胞において、ＣｈＩＰ−ｓｅｑにより、４３９２個のＧＲ結合部位（２％ＦＤＲ）を特定した［４６］。Ｗｅｌｂｏｒｅｎらは、ＭＣＦ−７細胞において、使用したｐｅａｋ−ｃａｌｌｉｎｇアルゴリズムに応じて、７７１３〜１０２０５個のエストロゲン依存性ＥＲ結合部位を特定した［４７］。ＥＲもＧＲも結合および遺伝子調節の間に相関関係を示し、本研究の発見と一致して、プロモータ近位結合の比率が比較的低いことが報告されている［１４、４６、４７］。下方調節とよりも強い、転写上方調節と結合の間の相関関係はまた、ＥＲ［１４］およびＧＲ［４６］についても記載されている。
【００９６】
一態様において、発見されたＰＲ結合部位の数は、プロゲスチン調節転写標的の数を超え、多くのＰＲ結合部位は活性転写と関連していなかった（例えば、ＰＲ結合領域の２０％が、各細胞株で転写調節と関連していた）。一態様において、これは、ＰＲ結合部位の遺伝子に対する会合の「近さ」を表すと考えられる。この発見は、他の核内受容体に関する結果と一致する［１４、１７、４６、４７］。多くの可能性のある説明が提案されている［４８］。一部の結合事象は、ゲノムワイド発現プロファイリングの検出閾値を下回るレベルで転写を調節し得る。さらに、結合部位のサブセットは、転写調節が高レベルでは起きないような、細胞のサブセットでのみ起きる弱めの会合または結合を表すこともある。ＰＲ結合ピークシグナル強度が、非調節関連結合領域に比べ、調節遺伝子の近くで著しく高かったことから、当社のデータはこの可能性を支持する。転写調節と関連しない結合事象は、コンテクストのサブセットでのみ利用可能な結合補因子の協力を必要とする細胞型特定部位にあり得ることも示唆されている［４８、４９、５０］。ＰＲＥは調節関連および非関連結合領域に同様に普及するという発見は、非特定相互作用は全結合の小コンポーネントを説明すると主張するが、結合領域の比率は非特定相互作用を表すことも想定しなければならない。
【００９７】
（実施例９）
ＰＲ結合領域におけるＰＲＥ
ＰＲ結合領域は、上記のプロゲステロン応答エレメントと一致する配列を有する結合エレメントについて、著しく濃縮されていた［２、３］。１５塩基対回帰性応答エレメントの特定塩基位置における相対的保存は可変であり、ＧＲ［４６、５０］およびＡＲ［５１］で見られる保存パターンと一致した。コアの高保存エレメントを表す短めのモチーフ（ＣＡ/ｔ ｎｎｎ ＴＧＴｎＣ、図４Ａ）も検出され、これは、ＰＲ結合エレメントにおけるこれらの位置が特別重要であることを示した。コンセンサス配列がいくつかの位置で顕著な変化を可能にすることに示されるように、ＰＲＥ配列には大きくばらつきがあり、多くの結合領域は、理想から相当逸脱した弱配列を含んでいた。さらに、ある割合のＰＲ結合領域はコンセンサスＰＲＥを全面的に失っており、直接的に結合するＰＲがあるのかという疑問を生んだ。これに対処するため、これらの領域のみにあるモチーフ濃縮を探し、より低い有意水準でＰＲＥ様モチーフを特定した（図示なし）。これは、コンセンサスＰＲＥを持たない多くの結合領域が、ＰＲＥと一致する配列を含むことを示唆する。同様の結果がＧＲについて報告されている［４６］。
【００９８】
ＰＲ結合領域で特定されたＰＲＥの存在および強度にはばらつきがあったが、これは、特定の領域が転写活性と関連するか否かについての決定要因ではなかった。ＰＲＥ強度がＰＲ結合ピーク強度とも転写結果とも互いに関連しなかったためである。これは、ＰＲＥ強度が、ＰＲが特定の結合領域と相互に関連し、遺伝子発現を調節するか否かについての唯一の決定要因ではなく、他の配列特徴およびＤＮＡ結合補因子の影響が重要な決定要因であり得ることを示唆する。これは、２つの試験細胞株において、ＰＲの潜在的細胞型特定結合補因子としてＦＯＸＡ１、ＡＰ−１、およびＮＦ１を特定することにより、支持される。
【００９９】
（実施例１０）
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞のＰＲシストロームは重複しない
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞のＰＲ結合領域には、比較的小さい重複があった。これは、プロゲスチンに対する転写応答も２つの細胞株間で重複しないという所見と一致した。さらに、両細胞株で共通の結合領域が、転写結果と関連しやすいということはなかった。２つの追加細胞株、ＺＲ−７５−１乳がん細胞、および独立ＰＲ陽性ＭＣＦ−１０Ａクローン（ＡＢ９）での発現プロファイリングは、プロゲスチンによる転写調節において同様に重複が少ないことを明らかにした。ＭＣＦ−７乳がん細胞およびＥＲ発現Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞におけるＥＲ結合パターンの比較が、結合部位およびトランスクリプトームにおいて同様に重複が少ないことを明らかにした［４９］。その研究では、異なったプロモータのメチル化が、この差の基礎をなすものとして提案された。しかしながら、ＡＢ３２細胞におけるＤＮＡメチル化の全体的な抑制は、存在する転写標的を高めるものの、プロゲスチン応答トランスクリプトームを著しく変えることはなかった（データ表示なし）。
【０１００】
当社の発見を支持して、Ｙｉｎと同僚が最近、アンタゴニストＲＵ４８６に曝されたＴ−４７Ｄ細胞および子宮筋腫細胞のＰＲゲノム相互作用において、同様に重複が少ないことを報告した［５２］。本明細書に記載の例示的Ｔ−４７ＤおよびＡＢ３２のＰＲシストロームと、公的に利用可能なデータセットとの比較により、ＡＢ３２細胞での結合（２８％）とより、２つのＴ−４７Ｄデータセット間の重複がより多いことを明らかにし（５１％が、Ｔ−４７ＤのＰＲ結合部位は当社の研究のＴ−４７Ｄでも見られると報告した）、これは、特有の結合パターンについての所見の妥当性を支持する。
【０１０１】
公開研究では、Ｔ−４７Ｄ細胞を、プロゲステロンで処置した。これは、薬物動態的にはＯＲＧ２０５８とプロファイルが類似しているが、合成類似物より迅速にＰＲから分離する。さらに、ゲノムＤＮＡでのＰＲの移動度はリガンド特異的であることが示され［５３］、プロゲステロンと比較しＯＲＧ２０５８と結合した場合は、ＰＲの移動度は異なり得る。次に、ＰＲ結合を異なる方法により検出した：本研究ではＣｈＩＰ−ｓｅｑを用いたが、公開データはＣｈＩＰ−ｃｈｉｐに由来する。ＣｈＩＰ−ｓｅｑは、無作為ゲノムワイドというやり方で結合を調べる。ＣｈＩＰ−ｃｈｉｐは用いるアレイに存在する配列に依存し、ハイブリダイゼーションバイアスにより影響を受け得る。類似の重複が、ＣｈＩＰ−ｓｅｑおよびＣｈＩＰ−ｃｈｉｐによりＭＣＦ−７細胞で検出されたＥＲ結合部位において観察された［４７］。最後に、公開データを生成するのに用いた分析方法は、当社研究で用いたものとは異なった。
【０１０２】
（実施例１１）
クロマチン構造の役割とパイオニア因子ＦＯＸＡ１
ＦＯＸＡ１などのパイオニア因子は、密集したヘテロクロマチンに結合することが可能で、ＤＮＡ構造を開いてＥＲ、ＧＲ、およびＡＲなどの核内受容体による結合および調節を可能にする［１２、１４、１５、１７、４１、５４］。ＦＯＸＡ１に対する要件のレベルおよびそれが受容体シグナル伝達で果たす役割は、受容体間で異なる。特定の遺伝子標的は細胞株間で異なり得るが、ＦＯＸＡ１の発現は、ＥＲによる転写活性化にとって重要である。最近の研究では、Ｈｕｒｔａｄｏと同僚が、３つの乳癌細胞株、ＭＣＦ−７，Ｔ−４７Ｄ、およびＺＲ−７５−１においてＥＲとＦＯＸＡ１の結合をマッピングし、サイレンシング因子ＣＴＦＣの位置が３つの細胞株間で異なることを示し、どのＥＲ標的がＦＯＸＡ１結合により転写増強されるのかを明らかにした。これらの細胞株において、ＦＯＸＡ１はＥＲ作用にとって重要であった［１５］。
【０１０３】
対照的に、ＦＯＸＡ１は、アンドロゲンシグナリングでは二重の役割を果たすようで、そこでそれは、一部のＡＲ標的のアンドロゲン反応性を促し、他の抑制因子として機能する。これは、ＬＮＣａＰ前立腺がん細胞における最近の研究により支持され、該研究では、ＦＯＸＡ１の減少がＡＲ結合パターンの著しいリモデリングと、アンドロゲン調節転写産物での顕著な増加を引き起こした［４１］。このコンテクストにおいて、ＦＯＸＡ１は結合部位選択の決定要因であり、標的部位に依存するＡＲ結合のファシリテーターとしても抑制因子としても作用する。
【０１０４】
ＦＯＸＡ１が、内因性ＦＯＸＡ１を欠くＡＢ３２細胞において、プロゲスチン応答とＦＯＸＡ１の過剰発現に絶対必要というわけではなく、この細胞においてプロゲスチン調節遺伝子の数の顕著な減少を引き起こしたことから、当社のデータは、ＦＯＸＡ１がＰＲシグナル伝達においてＡＲと類似した役割を果たし得ることを示す。ＦＯＸＡ１は豊富に発現するＴ−４７Ｄ細胞では、パイオニア因子に関する結合モチーフは、ＰＲ結合領域において統計的に濃縮されていた。ＦＯＸＡ１モチーフを含む領域を通じたＰＲシグナル伝達におけるＦＯＸＡ１の役割は、Ｔ−４７Ｄ細胞のこれらの部位におけるＦＯＸＡ１結合レベルは、予測ＦＯＸＡ１モチーフを含まないＰＲ結合領域での相互作用よりも大きいという発見により支持された。しかしながら、Ｔ−４７Ｄ細胞の全ＰＲ結合領域周りの平均ＦＯＸＡ１結合と、ＥＲ相互作用部位でのそれとの比較は、ＰＲ近くのＦＯＸＡ１結合の全体濃縮はＥＲより著しく低いことを明らかにし、これは、ＦＯＸＡ１が全ＰＲ相互作用にとって必要ではないことを示した。まとめると、当社のデータは、ＦＯＸＡ１がＴ−４７Ｄで認められる標的の多くのＰＲ転写活性化のエンハンサーとして機能し得る一方、ＡＢ３２細胞ではＦＯＸＡ１発現の欠如がＦＯＸＡ１により普通は抑止され得るＰＲ標的結合を、可能にすることを示唆する。
【０１０５】
Ｔ−４７Ｄ細胞とＦＯＸＡ１を形質導入したＡＢ３２細胞の、プロゲスチン調節間の重複は低かった。これは、ＦＯＸＡ１発現がＡＢ３２細胞を、そのプロゲスチン応答においてＴ−４７Ｄ細胞のようにすることがないことを示唆する。これは、ＦＯＸＡ１はＴ−４７Ｄ細胞において全ＰＲ結合事象に絶対必要というわけではないという当社の所見に一致する。それはまた、ＦＯＸＡ１はＰＲ結合に影響を与え得るが、他の細胞特異的な因子または特徴がＰＲ結合を決定するのに重要であり、これはＣｈＩＰにより特定することができない場合があることも示唆する。ＥＲもＡＲも、細胞型およびプロモータ特異的なやり方で、ヒストン修正因子に関連することが示されているが［５５、５６］、これは、大きい共調節複合体の一部としてエンハンサーにリクルートされ、モチーフ分析により特定することはできないだろう。ＧＲシストロームの性質はクロマチンへのアクセシビリティに大きく依存することが示されており［５７］、これはまた細胞型特異的である。同様の因子が、細胞型特異的なやり方でＰＲ結合に影響を与える可能性が高い。
【０１０６】
（実施例１２）
ＡＰ−１およびＮＦ−１
ＰＲなどの核内受容体は、ＡＰ−１へのテザリングにより、ホルモン応答エレメントとは無関係にＤＮＡと会合することが示されている［１８、１９、２０］。ＥＲの場合、この機構は、エストロゲンによる標的転写産物の転写抑制に影響を与えると報告された［１４］。これらの発見は、ＡＰ−１結合部位は、ＰＲＥのない結合領域ではよりありふれており、下方制御遺伝子と会合し得ることを示唆する。ＡＰ−１部位は、ＡＢ３２結合領域では、ＰＲＥを含む領域の２７％、および、ＰＲＥのない領域の２９％に存在していた。この比率は、ＡＰ−１部位濃縮が観察されないＴ−４７Ｄ細胞よりも全体的に高かった（Ｔ−４７Ｄでは、ＰＲＥを有する領域の１２％と、ＰＲＥのない領域の１０．７％がＡＰ−１部位を含んだ）。しかしながら、２つの結合領域サブセット間では差はなかった。また、ＡＰ１部位は、上方制御遺伝子より下方制御遺伝子でより普及しているという証拠もなかった（データ表示なし）。これらのデータは、ＡＰ−１は、ＡＢ３２細胞の結合部位サブセットでＰＲと協力し得るが、プロゲステロンシグナル伝達におけるその役割は、エストロゲンの場合より小さいことを示唆する。
【０１０７】
転写補因子ＮＦ１のＤＮＡへの結合はＰＲによる共会合を要し、ＮＦ１およびＰＲは遺伝子発現に対し相乗効果を有し［１１］、これは、これらの転写因子の共発現が転写結果を高める可能性を示す。乳腺では、ＮＦ１イソフォームの協調発現が乳の分泌および退縮に関与する［５８］。乳腺におけるＮＦ１の作用はコンテクスト特異的であり、乳房上皮細胞がラミニンリッチ細胞外マトリクスと接触して維持される場合に誘発される［５９］。乳腺におけるＮＦ１の発達特異的およびコンテクスト特異的な作用は、それのＰＲとの相互作用がＮＦ１とＰＲの両方のレベルにより調節され得ること、および、これらが、発がん現象を含む生理学的環境下で調整を受けやすい場合があることを示唆する。乳がん細胞ではないが、ＡＢ３２細胞のＰＲ結合領域におけるＮＦ１結合モチーフの濃縮は、この見解を支持し、ＮＦ１が細胞型限定ＰＲ補因子であることを示唆する。
【０１０８】
クロマチンリモデリング補因子の組み合わせが、乳房でのプロゲステロン応答に重要であり、この補因子の相対的発現および協調作用がＰＲシストロームを決定する。プロゲステロンの正常組織および悪性標的組織での効果は多様であり、本研究の結果は、プロゲステロン調節シストロームにおける主要補因子とＰＲ間の相互作用は、プロゲステロン作用のコンテクスト特異性に寄与し、乳がんでの異常プロゲスチン効果において中心的な役割を果たすことを示す。
【０１０９】
（実施例１３）
細胞培養
Ｔ−４７Ｄ乳がん細胞株およびＺＲ−７５−１乳がん細胞株をＥ.Ｇ. ａｎｄ Ｇ. Ｍａｓｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（マサチューセッツ州、ウースター）から取得した。ＭＣＦ−１０Ａ不死化正常乳房細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ腎臓細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ａｔｃｃ．ｏｒｇ、バージニア州、マナサス）から取得した。Ｔ−４７Ｄ細胞およびＺＲ−７５−１細胞を、１０％のウシ胎児血清と０．２５単位／ｍＬのインシュリンとを含むＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。ＨＥＫ２９３Ｔを、１０％のウシ胎児血清を捕捉したダルベッコ変法イーグル培地に維持した。ＰＲＡおよびＰＲＢの、ウイルスベクターからＭＣＦ−１０Ａ細胞株への共導入、ならびに、ピューロマイシンを用いたクローン選択により、ＡＢ３２細胞株およびＡＢ９細胞株を生成した。クローンは、ＰＲＡおよびＰＲＢの発現について、二重免疫蛍光分析およびウエスタンブロットを行うことにより特性を明らかにした。ＡＢ３２およびＡＢ９におけるＰＲ発現を、Ｔ−４７Ｄ細胞におけるＰＲレベルと比較したウエスタンブロットを図２０に示す。細胞を、コレラ毒素（０．１μｇ／ｍＬ）、インシュリン（０．２８ｉｕ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍＬ）、上皮成長因子（０．０２μｇ／μＬ）、および５％ウマ血清を捕捉した、ＤＭＥＭ：Ｈａｍｓ−Ｆ１２が１：１の培地に維持した。合成プロゲスチンＯＲＧ２０５８をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥヘルスケア、オーストラリア、ライダルメア）から取得した。ＴＳＡおよび５ＡｄＣをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（オーストラリア、キャッスルヒル）から取得した。
【０１１０】
（実施例１４）
クロマチン免疫沈降
細胞を１５ｃｍの組織培養皿で、８０％の密集度で培養し、その後４５分間１０ｎＭのＯＲＧ２０５８または媒介物で処置した。ホルムアルデヒドを最終濃度が１％になるまで培養基に加え、１０分間３７℃で培養することにより、クロマチンを実質的に架橋した。培地を即座に取り除き、細胞を冷たいリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、掻き取ることにより採取した。細胞を遠心分離により集め、沈殿物を１０分間４℃でＳＤＳ緩衝液（１％ ＳＤＳ；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）に溶解した。溶解物を、４℃で、Ｂｒａｎｓｏｎ４５０ソニケーターを用い、振幅４０％デューティ６０％で、１分間の粉砕を少なくとも１分間の停止で区切りながら７回行い、超音波分解した。溶解物を４℃で１５分間、１３０００ｘｇで遠心分離し、残骸を取り除いた。ゲノムＤＮＡを一定分量の溶解物から単離し、ゲル電気泳動により調べ、音波処理が平均サイズ２００〜４００ｂｐの断片化ＤＮＡをもたらしていることを確かめた。上清をＩＰ緩衝液（０．５％ＮＰ−４０；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８；１２０ｍＭ ＮａＣｌ；０．５ｍＭ ＰＭＳＦ；コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル、Ｒｏｃｈｅ、オーストラリア、ライド）で１：１０に希釈し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ヒツジ抗マウスＩｇＧ磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オーストラリア、マルグレーブ）で培養し、４℃で少なくとも２時間静かに回転し、非特異的な二次抗体ビーズへの結合を減らすことにより予め清澄化した。ＰＲに結合したゲノムＤＮＡ断片を、一晩４℃でｈＰＲａ６およびｈＰＲａ７という自社マウスモノクローナル抗ＰＲ抗体［６０］および新しいヒツジ抗マウスＩｇＧ磁気ビーズ（１．４ｍＬ希釈溶解物当たり４０μＬ）を用いて、回転することにより単離した。ビーズを、ＩＰ緩衝液、高塩濃度洗浄緩衝液（０．５％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）、リチウム洗浄緩衝液（２５０ｍＭ ＬｉＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）、およびＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で連続して洗浄した。単離ＤＮＡ断片を、２度、１５分間室温で溶出緩衝液（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３）を用いて溶出した。架橋を、０．２５Ｍ ＮａＣｌを加え、６５℃まで少なくとも６時間加熱することにより元に戻した。ＤＮＡ断片を、Ｑｉａｇｅｎ社のＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ、オーストラリア、ドンカスター）を用いて精製した。ＰＲクロマチン免疫沈降によりＯＲＧ２０５８処置細胞から単離したＤＮＡ断片を、Ｒａｍａｃｉｏｔｔｉ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（オーストラリア、ニューサウスウェールズ大学）にあるＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ−ＩＩｘシーケンサー、および、Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｋｓ（オーストラリア、ハインドマーシュ）で配列決定した。予め清澄化したＯＲＧ２０５８処置サンプルから単離したインプットＤＮＡをベースライン対照として配列決定した。一定分量のＤＮＡを、次世代シーケンシングにおいてインプットＤＮＡ対照サンプルとして供給するため、予め清澄��したＯＲＧ２０５８処置サンプルから単離した。
【０１１１】
（実施例１５）
分析
Ｂｏｗｔｉｅ０．１２．０．１を用いて、配列を、リピートをマスクしたヒトゲノムｈｇ１８（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３６）に対しアライメントを行った［３７］。２つまでのミスマッチを、アライメントを行った配列で許容した。重複するアライメントは１０の重複まで許容したが、最高位のアライメントのみを報告した。この手法はリードのうち４２％〜４８％のアライメントをもたらした。Ｔ−４７Ｄにおける結果は、３つの独立した生物学的反復実験と２つの反復インプット対照の組み合わせ結果を表す。ＡＢ３２の結果は、２つの独立ＣｈＩＰとインプット対照サンプルそれぞれに由来する。全配列は、ＣｈＩＰ１つとＴ−４７Ｄ細胞からの対応インプット対照サンプル１つを除き、３６ｂｐリード長だった。これらのサンプルは６４塩基対リード長で処理したが、データ処理中に３６塩基対に調整し、下流分析でのバイアスを避けた。ＰＲ結合の濃縮領域を、ＥＲＡＮＧＥオープンソースソフトウェアツールを用いて求めた［３８］。ＥＲＡＮＧＥ ｆｉｎｄａｌｌ．ｐｙ（分析ソフトウェアプログラム）の移行学習機能（-ｓｈｉｆｔ Ｌｅａｒｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いて、ピークのシフトが７０ｂｐであることを求めた。ピークの閾値を対照インプットＤＮＡ配列から求めたように、バックグラウンドの４倍と設定した。領域内の最小リード数（ＲＰＭ）を１０に設定した。マルチリードを１／重複度という値で重みづけした。ピークを偽発見率０．２７％で呼び出した。ＰＲ結合領域に、ＣｉｓＧｅｎｏｍｅ ｖ１．１［６１］およびＨｏｍｅｒ［６２］を用いて、近隣の遺伝子と比較したアノテーションを付けた。既知でデノボ濃縮された結合モチーフを、Ｈｏｍｅｒおよびモチーフ分析ツールであるＭＥＭＥ ｓｕｉｔｅバージョン４を用いて特定した［６３、６４］。ＭＥＭＥで発見した結合モチーフ濃縮の重要性を、Ｆｉｓｈｅｒの正確検定を用いて求めた。濃縮のＥ値は、テストした配列の数を掛けたｐ値を表す。モチーフ濃縮を、結合領域配列を対応ゲノムバックグラウンドと比較する累積超幾何分布分析を用いて、Ｈｏｍｅｒでスコア付けした［６２］。ＭＥＭＥのＦＩＭＯプログラムを用い、ＡＢ３２細胞株およびＴ−４７Ｄ細胞株においてＭＥＭＥにより発見された位置特異的確率行列を利用して、ＡＢ３２細胞およびＴ−４７細胞のＰＲ結合領域における全長ＰＲＥの発生を分類した。コンセンサスＰＲＥに対する類似性に関し、ｐ値＜０．０１の配列が報告され、ｐ値は０．０１〜１×１０−１０におよんだ。低めのｐ値はコンセンサスＰＲＥと比較しより大きい配列保存を示し、比較を目的として、ｐ値＜１×１０−５は強ＰＲＥを表すと考えた。Ｔ−４７Ｄ細胞におけるＰＲゲノム相互作用と、公開されたＥＲおよびＦＯＸＡ１のインタラクトームとの比較のために［４２］、配列タグライブラリをＨｏｍｅｒの３つのデータセット全てから生成し、結合ピークを各データセットについて、同一のパラメータを用いて特定した。平均ＦＯＸＡ１タグ密度をその後、Ｈｏｍｅｒのピークアノテーション機能を用いて、ＰＲ、ＥＲ、およびＦＯＸＡ１のピークにおいて求めた。ＣｈＩＰ−ｓｅｑおよび遺伝子発現プロファイリングにより生成した全生データは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ���ｍｎｉｂｕｓ （www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）に置いてあり、ＧＥＯ受入番号ＧＳＥ３１１３０を介してアクセス可能である。遺伝子発現データはＭＩＡＭＥガイドラインに従う。
【０１１２】
（実施例１６）
リアルタイムＰＣＲ
定方向ＣｈＩＰを、ＣｈＩＰ−ｓｅｑに関して記載したものと同一のプロトコルを用いて実行した。標的テンプレートを、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ６０００リアルタイムＰＣＲマシーンでＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｓｙｂｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、定量化した。定方向ＣｈＩＰを上記のように実行し、精製したｇＤＮＡ断片を、リアルタイムｑＰＣＲによる定量化の前に２〜５倍に希釈した。特異的標的検証に用いたプライマー配列は：ACSL1 - fwd 5'-TGC AAA GAG CAA GAC AGA AAA G-3'、rev - 5'-GCG GTC ATA GAG ACA CAA TTC C-3'、DHRS9 - fwd 5'-GGC TGT CTG AGT GAA TCT GTA GTG-3'、rev - 5'-AGT TAC ATT TGC CCT TGA TTC C-3'、FLRT3 - fwd 5'-GGA GAA ACA GAC TTT ACC TGA CC-3'、rev - 5'-TGT TGC AGT CAA GGA GAC AGA G-3'、NOTCH 2 - fwd 5'-GCC TGT TCC TAT TAA GTG TCC TG-3'、rev - 5'-GGC TGT AAA GTT ATT TGC TAG ATT G-3'、PACSIN1 - fwd 5'-AAC GTC CTC TTC CTG CTC TTG-3'、rev - 5'-GAG CTT TGA TGT AGA CGG AAT-3' G、PDK4- fwd 5'-CG AGC AGC AAT AAC TTT CC-3'、rev - 5'-ACG CAA GAA CAC AGT GAG TAG C-3だった。
【０１１３】
（実施例１７）
レンチウイルス形質導入
ＦＯＸＡ１のｃＤＮＡを、ＰｌａｓｍＩＤ Ｄａｎａ Ｆａｂｅｒ／Ｈａｒｖａｒｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｒｅ（マサチューセッツ州、ボストン）から取得した。オープンリーディングフレームを高忠実度ＰＣＲにより増幅し、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰのマルチプルクローニングサイトに転移した。挿入の整合性をシーケンシングにより確かめた。レンチウイルス粒子を、ｐＣＤＨ−ＦＯＸＡ１−ＧＦＰベクターとレンチウイルスのパッケージング構造体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共移入し、ウイルスを４８時間、培地に蓄積することにより生成した。ウイルス力価を、Ｆａｃｓ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いてＡＢ３２細胞の希釈系列で推定し、ＧＦＰ陽性を推定した。ＡＢ３２細胞を、７０％の感染率をもたらすと予測されるレベルで感染させ、２４時間３７℃で培養してＦＯＸＡ１を発現させ、その後、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８を用い、０時間、６時間、および２４時間、処置した。親ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰウイルスを感染させた対応対照サンプルを、各時点で含めた。
【０１１４】
（実施例１８）
遺伝子発現マイクロアレイ
全ＲＮＡを、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ精製コラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてビオチン標識した。増幅サンプル（７５０ｎｇ）を、推薦したＩｌｌｕｍｉｎａ試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って、ヒト全ゲノムＨＴ−１２遺伝子発現ビーズアレイにハイブリダイズした。生データを、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて分析した。バックグラウンド減算データおよび三次スプライン正規化後、異なる発現のｐ値を、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ｓｔｕｄｉｏ ｃｕｓｔｏｍ ｍｏｄｅｌを用いて求めた。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＳＰＳＳ統計ソフトウェアを用いてさらに分析した。階層的クラスタリングおよび自己組織化マップクラスタリングを、ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎを用いて実行した［６５］。
【０１１５】
（実施例１９）
タンパク質抽出物の調製およびイムノブロット
タンパク質イムノブロットにより分析する細胞をトリプシン処理により採取し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、遠心分離により集めて細胞沈殿物にした。全細胞抽出物を、１０ｍＭのＮａＭｏＯ４、１％アプロチニン、コンプリートプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ、オーストラリア、キャッスルヒル）、および０．５ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルを含むＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．１％β−メルカプトエタノール）で、細胞を溶解し、１５分間４℃で回転することにより調整した。単離可能な残骸を、１４０００ｘｇで、１５分間４℃で遠心分離することにより取り除いた。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｄｙｅ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、オーストラリア、リージェンツ・パーク）を用いて推定した。タンパク質を、変性７.５％ポリアクリアミド−ＳＤＳゲルを介した電気泳動により断片化し、上記のようにニトロセルロースメンブレンに移した［６６］。ＦＯＸＡ１発現Ｔ−４７Ｄの検出に関し、全細胞抽出物を１レーン当たり１００μｇ置き、形質導入した細胞抽出物を１レーンあたり１０μｇ置いた。ＦＯＸＡ１を、１：８００で希釈したヤギ抗ヒトＦＯＸＡ１ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ５０８９、Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オーストラリア、ワーテルロー）と、ウサギ抗ヤギホースラディッシュペルオキシダーゼ複合二次抗体（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、キングスグローブ）とを用いて検出した。ＰＲタンパク質発現の検出に関し、全細胞抽出物を指示されたように置いた。ＰＲを、ｈＰＲａ６およびｈＰＲａ７という自社マウスモノクローナル抗体（それぞれ１：１００）、ならびに、ヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ複合二次抗体（Ｄａｋｏ）を用いて検出した。タンパク質バンドを、ＥＣＬ試薬（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オーストラリア、ムラリー）を用いた化学発光反応、および、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｈｅａｌｔｈ、オーストラリア、リッチモンド）を用いたフィルムに対する露光または結像により、視覚化した。
【０１１６】
（実施例２０）
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞におけるＰＲ結合部位のゲノム分布
図１に示すように、ＣｈＩＰ−ｓｅｑにより特定されるプロゲスチン依存ＰＲ結合ＤＮＡ断片を、Ｂｏｗｔｉｅを用いてゲノムとアライメントを行い、結合のピークを、０．２７％ＦＤＲで、ＥＲＡＮＧＥを用いて特定した。（ＡおよびＢ）（Ａ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｂ）ＡＢ３２細胞におけるＲｅｆＳｅｑ遺伝子の転写開始点を基準にしたＰＲ結合領域の場所を、ＣｉｓＧｅｎｏｍｅを用いて求めた。（ＣおよびＤ）（Ｃ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｄ）ＡＢ３２細胞における染色体ごとのＰＲ結合領域分布を、遺伝子番号順に並べた。（ＥおよびＦ）（Ｅ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｆ）ＡＢ３２細胞におけるＴＳＳから所定距離内にあるＰＲ結合領域を有するプロゲスチン調節遺伝子のパーセンテージである。実線−上方制御遺伝子会合結合領域であり、破線−下方制御遺伝子会合結合領域である。上方制御遺伝子および下方制御遺伝子の、最も近いＴＳＳまでの距離の中央値を示す。
【０１１７】
（実施例２１）
プロゲスチン応答遺伝子に会合するＰＲ結合
図２に示すように、Ｔ−３７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞の遺伝子発現プロファイルを、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８で処置した２時間後、６時間後、おび２４時間後に求めた。未処置対照と比較し、２時間目、６時間目、および／または２４時間目で著しく異なって発現した転写産物は、プロゲスチン調節されたと考えられ、同一細胞株のＰＲ結合領域のリストと比較した。（ＡおよびＢ）（Ａ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｂ）ＡＢ３２細胞における、ＰＲ結合領域とプロゲスチン調節遺伝子の間の重複。（ＣおよびＤ）（Ｃ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｄ）ＡＢ３２細胞における、２時間目、６時間目、および２４時間目に調節された遺伝子の１０ｋｂ以内または５'−ＵＴＲにあるＰＲ結合領域。（Ｅ）グループ化したＴ−４７Ｄ細胞における、プロゲスチン調節パターンを有する遺伝子を、Ｇｅｎｅ Ｐａｔｔｅｒｎを用いてＳＯＭクラスター分析により特定した。調節パターンを、未処置対照を基準にした平均ｌｏｇ倍率変化としてプロットした。エラーバーは平均の標準誤差を表す。（Ｆ）（Ｅ）に示す各ＳＯＭクラスターと関連するＰＲ結合領域の、ＴＳＳまでの平均距離。
【０１１８】
（実施例２２）
Ｔ−４７ＤおよびＡＢ３２における異なるＰＲ結合および転写調節
図３Ａに関連し、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞間で共通するＰＲ結合領域を、Ｂｅｄ ＴｏｏｌｓのＩｎｔｅｒｓｅｃｔＢｅｄ機能を用いて特定した。Ｔ−４７Ｄ細胞またはＡＢ３２細胞に特異的な、または、両細胞株に共通する領域の数およびパーセンテージを示す。
【０１１９】
図３Ｂに関連し、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞を１０ｎＭのＯＲＧ２０５８（ＯＲＧ）または媒介物で、２時間、６時間、および２４時間処置した。転写産物発現を全ゲノムマイクロアレイにより測定した。Ｔ−４７Ｄ細胞またはＡＢ３２細胞において、１つまたは複数の時点で、ＯＲＧ２０５８処置済みサンプルにおいて、未処置対照に比べ異なって発現する遺伝子を、教師なし階層的クラスター分析により比較した。赤−媒体処置対照と比較し増加した発現であり、緑−媒介物処置対照と比較し減少した発現である。
【０１２０】
図３Ｃに関連し、２時間目、６時間目、または２４時間目のＴ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞における、プロゲスチンにより調節された転写産物間の重複を示す。Ｔ−４７ＤまたはＡＢ３２におけるプロゲスチンにより特異的に調節された転写産物、および、両細胞株に共通する調節の、数およびパーセンテージを示す。
【０１２１】
図３Ｄに関連し、個々の処置時間での、Ｔ−４７ＤおよびＡＢ３２のプロゲスチン調節転写産物の数を示す。特定の時点で、Ｔ−４７Ｄ細胞またはＡＢ３２細胞で特異的に調節された転写産物、または、両方で調節された転写産物の数を示す。
【０１２２】
（実施例２３）
ＰＲ結合領域におけるモチーフ濃縮
図４Ａに関連し、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞における結合領域で特定された、全長ＰＲＥおよびコアＰＲＥを示す。調節関連ＰＲ結合領域配列を、ＭＥＭＥ−ＣｈＩＰおよびＨｏｍｅｒを用いて、保存された配列モチーフの統計的濃縮について分析した。完全でコアなＰＲ結合エレメントを両細胞株に発見した。ＭＥＭＥ−ＣｈＩＰにより特定した全長ＰＲＥとＨｏｍｅｒで特定したコアエレメントを示す。
【０１２３】
図４ＢおよびＣに関連し、（Ｂ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｃ）ＡＢ３２細胞におけるｐ値によるＰＲＥ強度を示す。ＰＲＥを、強（＋＋＋、ｐ＜１×１０−５）、中（＋＋、ｐ＝１×１０−５〜１×１０−３）、または弱／無（＋、１×１０−３）に分類した。
【０１２４】
図４Ｄおよび４Ｅに関連し、（Ｄ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｅ）ＡＢ細胞の調節関連ＰＲ結合領域および非調節関連ＰＲ結合領域の、ＰＲピーク高さを示す。（Ｆ）Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞における上位転写因子結合モチーフ濃縮。
【０１２５】
（実施例２４）
ＦＯＸＡ１のＡＢ３２細胞への導入はプロゲスチン応答を変える
図５Ａに関連し、ＦＯＸＡ１の存在下および非存在下における、ＡＢ３２細胞のプロゲスチンに応答する転写プロファイルの、教師なしクラスター分析を示す。ＡＢ３２細胞を、ｐＣＤＨ−ＦＯＸＡ１構造体またはｅｍｐｔｙ ｐＣＤＨ対照を含むウイルス粒子で２４時間形質導入した。細胞を、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８（ＯＲＧ）または媒介物で６時間および２４時間処置した。遺伝子発現を全ゲノムマイクロアレイにより測定した。ＯＲＧ２０５８処置細胞で、任意の時点で対照と比較し異なって発現する遺伝子を、教師なし階層的クラスター分析により分析した。赤−増加ｌｏｇ ｆｏｌｄ発現であり、緑−減少ｌｏｇ ｆｏｌｄ発現である。
【０１２６】
図５Ｂに関連し、ウイルス形質導入前後の、ＡＢ３２細胞および親ＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＦＯＸＡ１タンパク質発現を、Ｔ−４７Ｄ細胞における内因性発現と比較して示す。
【０１２７】
図５Ｃに関連し、ＦＯＸＡ１の存在下および非存在下における、ＡＢ３２細胞でのプロゲスチン調節転写産物の数を示す。
【０１２８】
図５Ｄに関連し、ＰＲ、ＥＲ、およびＦＯＸＡ１結合部位におけるＦＯＸＡ１結合強度の比較を示す。
【０１２９】
図５Ｅに関連し、ＦＯＸＡ１発現と同時にプロゲスチン調節を消失した、獲得した、または、保持した遺伝子について、ＡＢ３２細胞におけるＰＲ結合領域の調節遺伝子に対する比率を示す。
【０１３０】
図５Ｆに関連し、ＡＢ３２のＰＲ結合領域から、ＦＯＸＡ１発現と同時にプロゲスチン調節を消失した、獲得した、または、保持した遺伝子までの距離を示す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【０１３１】
（実施例２６）
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞における、染色体に対するＰＲ結合領域の分布
図６に関連し、１染色体当たりのＰＲ結合領域の総数を、Ｔ−４７ＤデータセットおよびＡＢ３２データセット間の線形回帰により比較した。当てはめ線および９５％信用区間を示す。ラベルは染色体番号を示す。
【０１３２】
（実施例２７）
ＰＲ結合とプロゲスチン調節時の間の関係
図７に関連し、１つまたは複数のＰＲ結合領域と会合する、処置して２時間後、６時間後、または２４時間後のプロゲスチン調節遺伝子の比率を、（Ａ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｂ）ＡＢ３２細胞において求めた。
【０１３３】
（実施例２８）
ＰＲ結合領域の場所
図８に関連し、最も近い遺伝子に対する全ＰＲ結合領域の分布を、（Ａ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｂ）ＡＢ３２細胞において、ＣｉｓＧｅｎｏｍｅ ｖ１．１を用いて求めた。
【０１３４】
（実施例２９）
ＰＲ結合領域の場所
図９に関連し、最も近い遺伝子に対する全ＰＲ結合領域の分布を、（Ａ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｂ）ＡＢ３２細胞において、ＣｉｓＧｅｎｏｍｅ ｖ１．１を用いて求めた。
【０１３５】
（実施例３０）
ＡＢ３２細胞における転写調節パターン
図１０に関連し、プロゲスチン調節転写産物を、ＡＢ３２細胞において、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８で処置して２時間後、６時間後、および２４時間後に、遺伝子発現プロファイリングにより特定した。２４時間の経時変化における転写調節パターンを、Ｇｅｎｅ Ｐａｔｔｅｒｎを用いた自己組織化マップクラスタリングにより特定した。
【０１３６】
（実施例３１）
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞におけるＰＲ結合領域
図１１に関連し、Ｔ−４７Ｄ細胞またはＡＢ３２細胞に特異的な、または、両株に共通するＰＲ結合領域の例を、ＵＣＳＣゲノムブラウザに表示されたカスタムトラック（ｃｕｓｔｏｍ ｔｒａｃｋ）として示す。
【０１３７】
（実施例３２）
ＣｈＩＰ−ｓｅｑで特定した細胞型特異的ＰＲ結合領域の検証
図１２に関連し、（Ａ）Ｔ−４７Ｄ、（Ｂ）ＡＢ３２、または（Ｃ）両細胞株において特定されたＰＲ結合領域を、結合領域特異的プライマーおよび定量化リアルタイムＰＣＲを用いて、定方向ＰＲ−ＣｈＩＰにより検証した。Ｔ−４７Ｄでは調節され、ＡＢ３２では調節されなかった、ＡＣＳＬ１およびＰＡＣＳＩＮ１の近くで結合した領域は、Ｔ−４７Ｄ細胞では結合断片の顕著な濃縮を生成し、ＡＢ３２では生成しなかった。逆も真であり、ＰＲ標的領域はＡＢ３２では特定され、Ｔ−４７Ｄでは特定されなかった。ＦＬＲＴ３およびＤＨＲＳ９はＡＢ３２でのみ両方とも転写標的であり、ＡＢ３２ではＰＲにより強力に結合されたが、Ｔ−４７Ｄ細胞では弱い会合を示した。ＰＤＫ４およびＮｏｔｃｈ２は両細胞株で調節されるプロゲスチンであり、両方でＰＲにより結合されたが、会合はＴ−４７Ｄにおいてより強かった（Ｔ−４７Ｄ対ＡＢ３２で、ＰＤＫ−４結合濃縮が８５倍対４２倍、Ｎｏｔｃｈ２結合濃縮が３００倍対３７倍だった）。
【０１３８】
（実施例３３）
ＯＲＧ２０５８で処置したＴ−４７ＤおよびＡＢ３２のＰＲ結合領域と、プロゲステロン（Ｐ４）処置後Ｔ−４７Ｄにおける結合との重複（図１３）
当社のデータを、Ｔａｎｇら［１］で集計され、http://cistrome.dfci.harvard.edu/NR_Cistrome/で利用可能な、Ｔ−４７ＤにおけるプロゲステロンにリガンドされたＰＲ結合と比較する。
【０１３９】
（実施例３４）
追加乳房細胞株における遺伝子発現のプロゲスチン調節
図１４に関連し、ＺＲ−７５−１乳がん細胞およびＡＢ９ＰＲ陽性変換正常乳房細胞を、１０ｎＭのＯＲＧ２０５８媒介物で２時間、６時間、または２４時間処置し、その後採取し、全ＲＮＡを単離した。遺伝子発現レベルをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨＴ−１２マイクロアレイにより推定した。データを、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを用いて分析した。媒介物処置細胞と比較し、ＯＲＧ２０５８で著しく異なり（差分ｐ値＜０．０１）、１．５以上の倍率変化を有するレベルの転写産物を、プロゲスチン調節されたと考えた。（Ａ）ＺＲ−７５−１細胞、ＡＢ９細胞、または両方におけるプロゲスチン調節転写産物の数。（Ｂ）アレイ（ピアソン相関係数）および遺伝子発現倍率変化（中心化されない相関係数）についての教師なし平均リンケージ階層的クラスター分析を、Ｇｅｎｅ Ｐａｔｔｅｒｎを用いて、一方または両方の細胞株にあるプロゲスチン調節された転写産物のサブセットにおいて実行した。赤−媒介物と比較し、ＯＲＧ２０５８で増加する発現であり、緑−媒介物と比較し、ＯＲＧ２０５８で減少する発現である。
【０１４０】
（実施例３５）
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞の調節関連結合部位におけるＰＲＥおよび補因子モチーフ濃縮
図１５に関連し、１つまたは複数の上位濃縮転写補因子結合モチーフのある、またはない、ＰＲＥを含む調節関連ＰＲ結合領域の相対的比率を示す。（Ａ）Ｔ−４７Ｄのモチーフ分布および（Ｂ）ＡＢ３２のモチーフ分布を示す。
【０１４１】
（実施例３６）
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞のＰＲ結合領域におけるＰＲＥ位置の分布
図１６に関連し、ピークの中心を基準にしたＰＲ結合領域におけるＰＲＥモチーフの位置を、（Ａ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｂ）ＡＢ３２細胞における度数分布としてプロットする。
【０１４２】
（実施例３７）
ＰＲＥ強度はＰＲ結合を予測しない
図１７に関連し、ＰＲＥモチーフを、ＭＥＭＥのＦＩＭＯプログラムを用いてＰＲ結合領域に分類した［２］。ｐ値によって求められる、各結合領域における最も強いＰＲＥ候補の強度を、ＰＲ結合強度の指標として、ピーク高さに対しプロットした。推定当てはめ線とピアソン相関係数Ｒ２を推定した。データを（Ａ）Ｔ−４７Ｄ細胞および（Ｂ）ＡＢ３２細胞について示す。
【０１４３】
（実施例３８）
細胞株におけるＦＯＸＡ１転写産物発現
図１８に関連し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＴ−１２アレイで測定したＦＯＸＡ１転写産物発現を、乳がん（Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７５−１）と変換正常乳房（ＡＢ９、ＡＢ３２）細胞において比較した。ＦＯＸＡ１レベルは、ＡＢ３２細胞におけるレベルと比較して表す。
【０１４４】
（実施例３９）
予測ＦＯＸＡ１モチーフのある、またはない、ＰＲ結合領域でのＦＯＸＡ１結合
図１９に関連し、ＰＲ結合領域におけるＦＯＸＡ１モチーフの存在を、Ｈｏｍｅｒソフトウェアを用いて予測した。ＦＯＸＡ１に結合していると予測されるＰＲ結合領域およびＦＯＸＡ１結合モチーフを欠いた領域を、実際のＦＯＸＡ１結合濃縮について別々に分析した。ＦＯＸＡ１モチーフを含むＰＲ結合領域（青線）と、いずれの予測ＦＯＸＡ１モチーフも欠いたＰＲ結合領域（赤線）における、ＣｈＩＰ−ｓｅｑによるＴ−４７Ｄにおける平均ＦＯＸＡ１結合強度を示す。
【０１４５】
（実施例４０）
Ｔ−４７Ｄ細胞、ＡＢ３２細胞、およびＡＢ９細胞におけるＰＲ発現
図２０に関連し、搭載表示時の全細胞抽出物に由来するタンパク質を、変性７.５％ポリアクリアミド−ＳＤＳゲルを介した電気泳動により断片化し、ニトロセルロースメンブレンに移した。ＰＲタンパク質バンドを、本明細書に記載するように視覚化した。
【０１４６】
（実施例４１）
表Ｓ１：ＡＢ３２における、染色体による遺伝子機能アノテーション一覧
遺伝子オントロジー用語である濃縮を、染色体２、染色体８、および染色体１１において、ＡＢ３２細胞のＰＲ結合領域会合遺伝子のサブセットに関し求めた。
【０１４７】
【表２】
2017510557.tif 000016
【０１４８】
（実施例４２）
表Ｓ２：上位ＰＲ結合領域の検証
Ｔ−４７Ｄ細胞およびＡＢ３２細胞の選択部位に対するＰＲ結合を、定方向ＣｈＩＰ−ＰＣＲにより確かめた。１０個の結合領域を、Ｔ−４7Ｄでの検証用に選択し、ＡＢ３２細胞では９個を選択した。
【０１４９】
【表３】
2017510557.tif 000017
【０１５０】
（実施例４３）
表Ｓ３：ＦＯＸＡ１発現と同時に消失した、獲得した、または、保持したプロゲスチン調節遺伝子クラスターの機能アノテーション
機能アノテーションクラスタリングを、ＦＯＸＡ１発現後のＡＢ３２細胞において、プロゲスチン調節を消失した、獲得した、および、保存した遺伝子グループについて行った。
【０１５１】
【表４】
2017510557.tif 000018
【０１５２】
（実施例４４）
オナプリストンによるＰＲ結合の減衰（図２１〜２４）
ＰＲにより結合され、１０ｎＭの薬物濃度を用いて６時間でプロゲスチンＯＲＧ２０５８により調節された遺伝子に近いことが、Ｔ−４７Ｄ細胞でのＣｈＩＰ−ｓｅｑによりあらかじめ示された、多くのゲノム領域を選択した。
【０１５３】
Ｔ−４７Ｄ細胞および第２乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８において、ＯＲＧ２０５８、オナプリストン、その組合せ、または媒介物を用い、ＣｈＩＰ−ＰＣＲを実行した。用いた濃度は、１ｎＭのＯＲＧ２０５８と１００ｎＭのオナプリストンだった。これは、ＯＲＧ効果がこの濃度で最大であり、オナプリストンにより切断されることを明らかにした予備実験に基づいた。
【０１５４】
１０個の結合領域を両細胞株でテストし、ＯＲＧ２０５８にリガンドされたＰＲによる結合およびオナプリストンによる減衰を、１０個のうち９個で確認した。一態様において、オナプリストンのみが存在する場合に、一部の標的に対するＰＲ結合が確認される。これは主にＴ−４７Ｄ細胞においてであり、オナプリストンはＰＲによるＤＮＡ結合を阻止すると報告されていることを考えると、驚くべきでことである。
【０１５５】
（実施例４５）
発現プロファイリング（図２１〜２４）
発現プロファイリングは、３０９個の異なって発現するプローブを明らかにし、これは、一方または両方の細胞株において、２６７個の遺伝子が１ｎＭのＯＲＧ２０５８により調節されたことを表した。オナプリストンは、Ｔ−４７Ｄの５遺伝子およびＨＣＣ１４２８における６遺伝子以外の全てのプロゲスチン調節を切断した。プロゲスチン応答は概してＴ−４７Ｄ細胞においてより顕著であった。Ｔ−４７Ｄ細胞は、ＨＣＣ１４２８より著しく高いレベルでＰＲを発現する。
【０１５６】
全体的に、データにより、２つの関係のない細胞株において、プロゲスチンにより活性化されたＰＲが、定義された一連のＤＮＡ標的に対し再現可能に結合し、この結合はオナプリストンにより減衰することが確かめられた。
【０１５７】
上記記載は、特定の態様に言及するが、これらの態様は単に例示的であることを理解すべきである。本明細書に記載の多様な形式および方法に対して様々な修正および変形を行えることは当業者には自明であろう。したがって、本記載は、記載およびその同等物の範囲内に修正および変形を含むことを意図する。
【０１５８】
〔参考文献〕
本明細書に引用する参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
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【０１５９】
略語（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）
AP-1  アクチベータータンパク質（Activator protein）1
AR    アンドロゲン受容体（Androgen receptor）
Bowtie      配列アライメントソフトウェア（Sequence alignment software）(http://bowtie-bio.sourceforge.net)
CD44  細胞表面糖タンパク質（cell surface glycoprotein）CD44
ChIP  クロマチン免疫沈降（Chromatin immunoprecipitation）
Ct    定量化リアルタイムＰＣＲ反応におけるサイクル閾値（Cycle threshold）
CTCF  CCCTC-結合因子（binding factor）
ER    エストロゲン受容体（Estrogen receptor）
ERANGE findall.py ＣｈＩＰピーク特定ソフトウェアツール (http://woldlab.caltech.edu/rnaseq)
FDR   偽発見率（False discovery rate）
FOXA1 フォークヘッドボックス（Forkhead box）A1
GR    グルココルチコイド受容体（Glucocorticoid receptor）
Homer ＣｈＩＰピーク特定およびＤＮＡ結合モチーフ特定用配列分析ソフトウェア(http://biowhat.ucsd.edu/homer/)
MEME-ChIP   具体的にはＣｈＩＰ−ｓｅｑデータにおけるＤＮＡ結合モチーフ特定用配列分析オンラインツール(http://meme.nbcr.net/)
NF1   核内因子（Nuclear factor）1
ORG   オルガノン（Organon）2058
PRE   プロゲステロン応答エレメント（Progesterone response element）
SOM   自己組織化マップ（Self-organizing map）
SP1   特異性タンパク質（Specificity protein）1
Stat3 シグナル伝達兼転写活性化因子（Signal transducer and activator of transcription）
TSS   転写開始点（Transcription start site）
【図１】
2017510557.tif 000019
【図２】
2017510557.tif 000020
【図３】
2017510557.tif 000021
【図４】
2017510557.tif 000022
【図５】
2017510557.tif 000023
【図６】
2017510557.tif 000024
【図７】
2017510557.tif 000025
【図８】
2017510557.tif 000026
【図９】
2017510557.tif 000027
【図１０】
2017510557.tif 000028
【図１１】
2017510557.tif 000029
【図１２】
2017510557.tif 000030
【図１３】
2017510557.tif 000031
【図１４Ａ】
2017510557.tif 000032
【図１４Ｂ】
2017510557.tif 000033
【図１５Ａ】
2017510557.tif 000034
【図１５Ｂ】
2017510557.tif 000035
【図１６】
2017510557.tif 000036
【図１７】
2017510557.tif 000037
【図１８】
2017510557.tif 000038
【図１９】
2017510557.tif 000039
【図２０】
2017510557.tif 000040
【図２１】
2017510557.tif 000041
【図２２】
2017510557.tif 000042
【図２３】
2017510557.tif 000043
【図２４】
2017510557.tif 000044
【国際調査報告】
2017510557.tif 000045
2017510557.tif 000046
2017510557.tif 000047