(57)【要約】本発明は、操作された免疫細胞、それらを調製するための方法、および特に免疫療法用の医薬としてのそれらの使用に関する。本発明の操作された免疫細胞は、GCN2をコードする遺伝子およびPRDM1をコードする遺伝子から選択される少なくとも1種類の遺伝子が不活性化または抑制されていることを特徴とする。このように改変された免疫細胞は、例えば腫瘍細胞に起因するアルギニンおよび/またはトリプトファン枯渇微小環境に抵抗性を有し、本発明の免疫細胞を免疫療法に特に適したものにする。本発明は、様々なタイプの悪性腫瘍を処置するための免疫細胞を用いた標準的で手頃な価格の養子免疫療法戦略への道を開く。【特許請求の範囲】
【請求項１】
GCN2をコードする遺伝子および/またはPRDM1をコードする遺伝子を、DNA切断によって該遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼの使用によって不活性化することによって、免疫細胞を改変する工程
を含む、操作された免疫細胞を調製するための方法。
【請求項２】
前記免疫細胞が、GCN2をコードする遺伝子を不活性化することによって改変されている、請求項1記載の方法。
【請求項３】
GCN2が、SEQ ID NO: 1に示したヒトGCN2、またはSEQ ID NO：1の全長にわたってSEQ ID NO：1に示したヒトGCN2と少なくとも約80％の配列同一性を有するその機能的変種である、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
前記免疫細胞が、PRDM1をコードする遺伝子を不活性化することによって改変されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
PRDM1が、SEQ ID NO: 2に示したヒトPRDM1、またはSEQ ID NO：2の全長にわたってSEQ ID NO：2に示したヒトPRDM1と少なくとも約80％の配列同一性を有するその機能的変種である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記レアカットエンドヌクレアーゼが、前記免疫細胞に導入されている外因性核酸分子によってコードされる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記レアカットエンドヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 3またはSEQ ID NO: 4に示した配列に結合する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記レアカットエンドヌクレアーゼが、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼである、請求項6または7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記レアカットエンドヌクレアーゼがTALE-ヌクレアーゼである、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記レアカットエンドヌクレアーゼがRNAガイドエンドヌクレアーゼである、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記RNAガイドエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化する工程
をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
T細胞受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子が、該少なくとも1種類の遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼの使用により不活性化される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記レアカットエンドヌクレアーゼが、前記免疫細胞に導入された外因性核酸分子によってコードされる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記レアカットエンドヌクレアーゼが、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼである、請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
前記TCRの成分がTCRαである、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
悪性細胞の表面に発現している少なくとも1種類の抗原に対して向けられたキメラ抗原受容体（CAR）を 前記免疫細胞において発現させる工程
をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記CARが、前記免疫細胞に導入した外因性核酸分子によってコードされる、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記CARが、CD19、CD33、CD123、CS1、BCMA、CD38、5T4、ROR1、およびEGFRvIIIから選択される抗原に対して向けられる、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫細胞がT細胞である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
（a）患者またはドナー由来の免疫細胞を提供する工程；
（b）請求項1〜20のいずれか一項にしたがって該免疫細胞をエクスビボで調製する工程；
（c）結果として生じる操作された免疫細胞を増殖させる工程
を含む、免疫療法で用いられる免疫細胞を操作するための方法。
【請求項２２】
癌と診断された患者内に前記免疫細胞を注入する工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
請求項1〜20のいずれか一項記載の方法または請求項21もしくは22のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、操作された免疫細胞。
【請求項２４】
GCN2をコードする遺伝子および/またはPRDM1をコードする遺伝子が、レアカットエンドヌクレアーゼによる切断によって不活性化されていることを特徴とする、操作された免疫細胞。
【請求項２５】
GCN2をコードする遺伝子が不活性化されている、請求項24記載の操作された免疫細胞。
【請求項２６】
GCN2が、SEQ ID NO: 1に示したヒトGCN2、またはSEQ ID NO：1の全長にわたってSEQ ID NO：1に示したヒトGCN2と少なくとも約80％の配列同一性を有するその機能的変種である、請求項25記載の操作された免疫細胞。
【請求項２７】
PRDM1をコードする遺伝子が不活性化されている、請求項23〜26のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項２８】
PRDM1が、SEQ ID NO: 2に示したヒトPRDM1、またはSEQ ID NO: 2の全長にわたってSEQ ID NO: 2に示したヒトPRDM1と少なくとも約80％の配列同一性を有するその機能的変種である、請求項27記載の操作された免疫細胞。
【請求項２９】
GCN2をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する、請求項23〜28のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３０】
前記レアカットエンドヌクレアーゼが、SEQ ID NO: 3またはSEQ ID NO: 4に示した配列に結合する、請求項29記載の操作された免疫細胞。
【請求項３１】
PRDM1をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する、請求項23〜30のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３２】
前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む、請求項23〜31のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３３】
前記核酸が、前記免疫細胞による前記レアカットエンドヌクレアーゼの発現を可能にするベクターである、請求項32記載の操作された免疫細胞。
【請求項３４】
前記核酸がトランスフェクトされたmRNAである、請求項33記載の操作された免疫細胞。
【請求項３５】
前記レアカットエンドヌクレアーゼが、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAもしくはDNAガイドエンドヌクレアーゼである、請求項23〜34のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３６】
前記レアカットエンドヌクレアーゼがTALE-ヌクレアーゼである、請求項23〜35のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３７】
前記レアカットエンドヌクレアーゼがRNAガイドエンドヌクレアーゼである、請求項23〜36のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３８】
前記RNAガイドエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項37記載の操作された免疫細胞。
【請求項３９】
TCR受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子が不活性化されていることをさらに特徴とする、請求項23〜38のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項４０】
悪性細胞の表面に発現している少なくとも1種類の抗原に対して向けられたキメラ抗原受容体（CAR）を発現する、請求項23〜39のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項４１】
前記CARをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む、請求項40記載の操作された免疫細胞。
【請求項４２】
前記CARが、CD19、CD33、CD123、CS1、BCMA、CD38、5T4、ROR1、およびEGFRvIIIから選択される抗原に対して向けられる、請求項41記載の操作された免疫細胞。
【請求項４３】
T細胞であるか、またはT細胞に由来する、請求項23〜42のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項４４】
医薬として使用するための、請求項23〜43のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項４５】
癌の処置において使用するための、請求項23〜44のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項４６】
アルギナーゼを産生する腫瘍の処置において使用するための、請求項23〜45のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、操作された免疫細胞、例えばT細胞、それらを調製するための方法、および特に免疫療法用の医薬としてのそれらの使用に関する。本発明の操作された免疫細胞は、GCN2（general control nonderepressible 2；真核細胞翻訳開始因子2αキナーゼ4、EIFF2AK4としても公知である）をコードする遺伝子、およびPRDM1（PR domain containing 1, with ZNF domain；Bリンパ球誘導性成熟タンパク質1、BLIMP-1としても公知である）をコードする遺伝子から選択された少なくとも1種類の遺伝子が不活性化されているまたは抑制されていることを特徴とする。そのように改変された免疫細胞は、例えば、腫瘍細胞に起因する、アルギニンおよび/またはトリプトファン枯渇微小環境に対して抵抗性を有し、本発明の免疫細胞を免疫療法に特に適したものにする。本発明は、様々なタイプの悪性腫瘍を処置するための免疫細胞を用いた標準的で手頃な価格の養子免疫療法戦略への道を開く。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞性適応免疫は、T細胞としても公知のTリンパ球により媒介され、非自己または腫瘍性抗原を認識すると、標的細胞を破壊するか、または免疫系の他の細胞による免疫応答を組織化することができる。
【０００３】
養子免疫療法は、エクスビボで作製された自己由来の抗原特異的T細胞を導入することを伴い、ウイルス感染症および癌を処置する有望な戦略である。養子免疫療法に用いられるT細胞は、抗原特異的T細胞を増殖させることによって、または遺伝子工学によりT細胞を方向付け直すことによって作製することができる（Park, Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の導入は、移植に伴うウイルス感染および稀なウイルス関連悪性腫瘍の処置で用いられる確立した手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および導入は、黒色腫を処置することに成功したことが示されている。
【０００４】
T細胞における新たな特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）を遺伝子導入することによって首尾良く作製されている（Jena, Dotti et al. 2010）。CARは、1つの融合分子の形をとる、1つまたは複数のシグナル伝達ドメインに結合した標的化部分からなる合成受容体である。通常、CARの結合部分は、可動性リンカーによってつながっているモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む単鎖抗体（scFv）抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインをベースとする結合部分も首尾良く用いられている。第1世代CAR用のシグナル伝達ドメインはCD3ζまたはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第1世代CARはT細胞の細胞傷害性を首尾良く方向付け直すことが示されているが、インビボで長期増殖および抗腫瘍活性をもたらさなかった。CAR改変T細胞の生存率を向上させ、増殖を増やすために、CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナル伝達ドメインが単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）加えられている。CARを用いると、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現している抗原にT細胞を首尾良く方向付け直すことができた（Jena, Dotti et al. 2010）。
【０００５】
よって、腫瘍細胞に向けてT細胞の細胞傷害性を方向付け直すことが可能な一方で、これらの腫瘍細胞は依然として、回避機構により免疫応答を弱める可能性がある。そのような回避機構の1つは、アルギナーゼおよびインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO1）の産生によってその局所的微小環境からアルギニンおよびトリプトファンなどのある特定のアミノ酸を除去することである。
【０００６】
多くの報告が、アルギナーゼ活性と、悪性腫瘍細胞がポリアミンを産生してその急速な増殖を持続する必要性とを関連づけている。しかしながら、アルギナーゼは、T細胞増殖および活性化を阻害する傾向がある。
【０００７】
Rodriguez et al.（2004）は、L-アルギニン（L-Arg）が、T細胞機能の調節を含む複数の生物システムにおいて中心的役割を果たすことを見出した。アルギナーゼIを産生する骨髄系由来サプレッサー細胞によるL-Arg枯渇は、T細胞アネルギーを含む癌を有する患者において見られる。彼らは、L-Arg非存在下で培養したT細胞が細胞周期のG0-G1期で停止される限り、L-Arg飢餓がT細胞周期進行を制御できたことを示した。これは、T細胞がサイクリンD3およびサイクリン依存性キナーゼ4（cdk4）を上方制御できないことに関連した。サイクリンD3のサイレンシングは、L-Arg飢餓に起因する細胞周期停止を再現した。彼らはまた、GCN2キナーゼによるシグナル伝達がアミノ酸飢餓時に誘発されることも見出した。
【０００８】
最近の研究によって、アルギナーゼが、白血病芽球から発現および放出され、急性骨髄性白血病（AML）を有する患者の血漿中に高い濃度で存在し、T細胞増殖の抑制をもたらすことを実証された（Mussai, F. et al. 2013）。研究は、AML芽球の免疫抑制活性が、アルギナーゼの低分子阻害剤および誘導型一酸化窒素合成酵素により調節できることを示し、診断時に観察される汎血球減少症の一因となる免疫抑制性の微小環境をAMLが作り出すという仮説を強く支持した。高アルギナーゼ活性はまた、固形腫瘍、具体的には、胃がん、結腸がん、乳がん、および肺がん、より具体的には、小細胞肺癌を有する患者でも記載されている（Suer et al., 1999）。アルギナーゼ＋H2O---->尿素＋オルニチンにより触媒される反応が、腫瘍の環境における尿素およびオルニチン濃度を上昇させ、リンパ球に負の影響を与える可能性があるとも考えられる。別の面では、Rodriguez et al. （2004）による研究により、インビボでのアルギナーゼの阻害によって、マウスで腫瘍成長の低下が見出された。
【０００９】
代謝酵素IDO1は、いくつかの実験モデルにおいて寛容と炎症との間の平衡に寄与する。マクロファージおよび樹状細胞などのAPCにおけるIDO1の発現は、哺乳類の妊娠、炎症状態、自己免疫および腫瘍抵抗時に観察されるように、T細胞応答を抑制できる。IDO1は、腫瘍流入領域リンパ節（Munn, D.H. et al., 2004）ならびに小児急性骨髄性白血病（AML） （Rutella, S. et al., 2013）および慢性リンパ球性白血病を有する患者（Lindstrom V., et al. 2013）において形質細胞様樹状細胞により過剰発現されていることが見出された。IDO1は、必須アミノ酸トリプトファンを異化し、よって、局所的微小環境における濃度を低下させ、生物学的に活性な下流代謝物を生じさせる。酵母とマウス両方の研究によって、GCN2もまたトリプトファン欠乏に対する応答において役割を果たすことが明らかになった。PRDM1（BLIMP-1とも呼ばれる）はタンパク質であり、その発現レベルは、IDO1のものと同様であり、トリプトファン欠乏の状況で上方制御される。
【００１０】
よって、アルギナーゼおよび/またはIDO1の産生は、アミノ酸欠乏を介して、腫瘍回避の重要な構成要素であり、革新的な免疫療法戦略、特にT細胞を伴う戦略によりにより対処する必要があるように思われる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明によれば、上記必要性は、T細胞などの免疫細胞においてGCN2および/またはPRDM1タンパク質形成を抑制または破壊し、それらをアルギニンおよび/またはトリプトファン枯渇に対して抵抗性にすることにより対処される。本明細書に示す実験を通じて、GCN2およびPRDM1タンパク質は、アルギニンおよび/またはトリプトファン飢餓のセンサーとして機能しており、これをスイッチオフにすることによって、免疫細胞の活性を著しく弱めることなく免疫細胞、特にT細胞のアネルギーを回避できることが見出される。結果として生じる免疫細胞は、アルギナーゼ産生細胞の局所的微小環境において増殖できる状態を残しており、よって、腫瘍に対して改善された免疫応答を速やかに与える。
【００１２】
一局面によれば、本発明は、操作された免疫細胞、特に、操作されたT細胞を調製するための方法を提供し、本方法は、
GCN2（ヒトGCN2またはその機能的変種など）をコードする遺伝子および/またはPRDM1（ヒトPRDM1またはその機能的変種など）をコードする遺伝子を不活性化または抑制することにより、T細胞などの免疫細胞を改変する工程
を含む。
【００１３】
ある特定の態様によれば、免疫細胞は、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子；NCBI参照配列: NG_034053.1）を不活性化することにより改変される。GCN2遺伝子の不活性化は、例えば、ゲノム改変によって、より具体的には、DNA切断、好ましくは二本鎖切断によって該遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを免疫細胞において発現させることによって成し遂げられてもよい。このようなレアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー（zinc-finger）ヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼでもよい。
【００１４】
特定の態様によれば、免疫細胞は、ヒト免疫細胞であり、SEQ ID NO: 1（NCBI参照配列: NP_001013725.2）に示したヒトGCN2、またはSEQ ID NO：1の全長にわたってSEQ ID NO：1に示したヒトGCN2と少なくとも約80％、例えば、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、もしくは少なくとも約99％の配列同一性を有するその機能的変種をコードする遺伝子を不活性化することによって改変される。
【００１５】
ある特定の態様によれば、免疫細胞は、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子；NCBI参照配列: NG_034053.1）を抑制することによって改変される。
【００１６】
ある特定の他の態様によれば、免疫細胞は、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子；NCBI参照配列: NG_029115.1）を不活性化することにより改変される。PRDM1遺伝子の不活性化は、例えば、ゲノム改変によって、より具体的には、DNA切断、好ましくは二本鎖切断によって該遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを免疫細胞において発現させることによって成し遂げられてもよい。このようなレアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼでもよい。
【００１７】
別の態様によれば、前記レアカットエンドヌクレアーゼは、DNAガイドエンドヌクレアーゼである。一例として、このようなエンドヌクレアーゼは、アルゴノート（Argonaute）タンパク質（Ago）でもよい。最近、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（HB27株）などの細菌由来のAgoタンパク質が、細菌において外因性DNAの取り込みおよび増殖のバリアとして働くと記載されている（Swarts D.C, et al. Nature 507: 258-261）。インビボでTt Agoは、大部分がプラスミド由来でありかつ5'末端デオキシシチジンに強い偏向を有する、13から25塩基対の5'リン酸ガイドDNAを取り込む。これらの低分子干渉DNAは、高温（75℃）で相補的DNA鎖を切断するようTtAgoを導く。WO2014189628A（Caribou biosciences）は、アルゴノートおよび設計された核酸-標的化核酸を含むこのような複合体を開示する。
【００１８】
特定の態様によれば、免疫細胞は、ヒト免疫細胞であり、SEQ ID NO: 2（NCBI参照配列: NP_001189.2）に示したヒトPRDM1、またはSEQ ID NO：2の全長にわたってSEQ ID NO：2に示したヒトPRDM1と少なくとも約80％、例えば、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、もしくは少なくとも約99％の配列同一性を有するその機能的変種をコードする遺伝子を不活性化することによって改変される。
【００１９】
ある特定の他の態様によれば、免疫細胞は、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子；NCBI参照配列: NG_029115.1）を抑制することによって改変される。
【００２０】
ある特定の他の態様によれば、免疫細胞は、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）およびPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）の両方を不活性化することにより改変される。GCN2遺伝子およびPRDM1遺伝子の不活性化は、例えば、ゲノム改変によって、より具体的には、DNA切断、好ましくは二本鎖切断によって該遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを免疫細胞において発現させることによって成し遂げられてもよい。このようなレアカットエンドヌクレアーゼは別個に、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼでもよい。
【００２１】
特定の態様によれば、免疫細胞は、特に、自己認識に関与する1種類または複数種の遺伝子、例えば、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする遺伝子を不活性化することによって、非アロ反応性になるようにさらに操作されてもよい。これは、ゲノム改変によって、さらに具体的には、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子、例えば、TCRαまたはTCRβをコードする遺伝子をDNA切断、好ましくは、二本鎖切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを免疫細胞、特にT細胞において発現させることによって成し遂げることができる。このようなレアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼでもよい。好ましくは、レアカットエンドヌクレアーゼは、TCRαをコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができる。
【００２２】
最適な態様によれば、免疫細胞は、悪性細胞の表面に発現している少なくとも1種類の抗原に対して向けられたキメラ抗原受容体（CAR）を発現するようにさらに操作されてもよい。具体的には、前記CARは、固形腫瘍細胞の表面に通常発現している抗原、5T4、ROR1およびEGFRvIIIなどに対して向けられる。前記CARはまた、液性腫瘍の表面に通常発現している抗原、CD123またはCD19に対して向けられてもよい。
【００２３】
従って、本発明は、さらなる局面において、GCN2をコードする遺伝子および/またはPRDM1をコードする遺伝子が不活性化されているかまたは抑制されていることを特徴とする、操作された免疫細胞、具体的には、単離された操作された免疫細胞を提供する。
【００２４】
ある特定の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）が不活性化されている、操作された免疫細胞、特に、単離された操作された免疫細胞が提供される。
【００２５】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）が抑制されている、操作された免疫細胞、特に、単離された操作された免疫細胞が提供される。
【００２６】
ある特定の他の態様によれば、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）が不活性化されている、操作された免疫細胞、特に、単離された操作された免疫細胞が提供される。
【００２７】
ある特定の他の態様によれば、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）が抑制されている、操作された免疫細胞、特に、単離された操作された免疫細胞が提供される。
【００２８】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）およびPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）の両方が不活性化されている、操作された免疫細胞、特に、単離された操作された免疫細胞が提供される。
【００２９】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）およびPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）の両方が抑制されている、操作された免疫細胞、特に、単離された操作された免疫細胞が提供される。
【００３０】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）が不活性化され、かつPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）が抑制されている、操作された免疫細胞、特に、単離された操作された免疫細胞が提供される。
【００３１】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）が抑制され、かつPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）が不活性化されている、操作された免疫細胞、特に、単離された操作された免疫細胞が提供される。
【００３２】
ある特定の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子を細胞中でDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する免疫細胞が提供される。さらに具体的には、このような免疫細胞は、前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼでもよい。
【００３３】
特定の態様によれば、前記レアカットエンドヌクレアーゼはSEQ ID NO: 3に示した配列に結合する。他の特定の態様によれば、前記レアカットエンドヌクレアーゼはSEQ ID NO: 4に示した配列に結合する。
【００３４】
ある特定の他の態様によれば、PRDM1をコードする遺伝子を細胞中でDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する免疫細胞が提供される。さらに具体的には、このような免疫細胞は、前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼでもよい。
【００３５】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子を細胞中でDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼ、およびPRDM1をコードする遺伝子を細胞中でDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する免疫細胞が提供される。さらに具体的には、このような免疫細胞は、前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードする1種または複数種のヌクレオチド配列を含む1種または複数種の外因性核酸分子を含み、前記レアカットエンドヌクレアーゼは別個に、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼでもよい。
【００３６】
特定の態様によれば、免疫細胞は、TCR受容体の成分をコードする、少なくとも1種類の不活性化された遺伝子をさらに有してもよい。さらに具体的には、このような免疫細胞は、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする前記少なくとも1種類の遺伝子をDNA切断、好ましくは二本鎖切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現してもよい。従って、前記免疫細胞は、T細胞受容体（TCR）の1成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含んでもよい。TCRの破壊は、同種異系処置戦略において使用することができる非アロ反応性免疫細胞をもたらす。
【００３７】
最適な態様によれば、免疫細胞は、悪性細胞の表面に発現している少なくとも1種類の抗原に対して向けられたキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように操作されてもよい。具体的には、免疫細胞は、前記CARをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む。特定の態様によれば、前記CARは、CD19、CD33、CD123、CS1、BCMA、CD38、5T4、ROR1およびEGFRvIIIから選択される抗原に対して向けられる。CARによる標的抗原の結合には、悪性細胞に対して向けられた免疫細胞による免疫応答を誘発し、その結果として、細胞間の間隙において様々なサイトカインおよび分解酵素の脱顆粒を起こす効果がある。
【００３８】
本発明の結果として、操作された免疫細胞は、癌などの医学的状態の処置または予防において使用するための治療用製品として、理想的には「既製の（off the shelf）」製品として使用することができる。
【００３９】
従って、本発明は、医薬として使用するための、本発明の操作された免疫細胞、またはそれらを含む組成物、例えば、薬学的組成物をさらに提供する。ある特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、癌の処置において使用するためのものであり、さらに具体的には、固形腫瘍または液性腫瘍の処置において使用するためのものである。特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、肺がん、小細胞肺がん、乳がん、子宮がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、膵臓がん、および皮膚がんからなる群より選択される癌の処置において使用するためのものである。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、肉腫の処置において使用するためのものである。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、癌腫の処置において使用するためのものである。より特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、腎癌、肺癌、または結腸癌の処置において使用するためのものである。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、および慢性骨髄単球性白血病（CMML）の処置において使用するためのものである。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫の処置において使用するためのものである。ある特定の態様によれば、操作された免疫細胞は、処置すべき患者、例えば、ヒト患者に由来する。ある特定の他の態様によれば、操作された免疫細胞は少なくとも1人のドナーに由来する。
【００４０】
本発明の一局面について本明細書において示された詳しい内容は本発明の他の局面のいずれにも適用されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】GCN2コード遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼ、および/またはPRDM1コード遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する、本発明による操作された免疫細胞の模式図。
【図２】5％ヒトAB血清および20 ng/mlヒトIL2を追加したXvivo15培地（96ウェルプレートの1ウェル当たり100 μl）中で増加濃度（0.5〜1500 ng/ml）の組換えアルギナーゼIに37℃にて72時間曝露した後の、TRACに特異的なTALEヌクレアーゼをコードするmRNAでトランスフェクトされたヒトT細胞（KO TRAC）、またはトランスフェクトされていないヒトT細胞（WT;野生型）の生細胞濃度のフローサイトメトリーによる測定。データによって、トランスフェクトされていないT細胞とTRAC特異的TALEヌクレアーゼで処理したT細胞の両方とも、インビトロでアルギニン欠乏に感受性であることが確認される。
【図３】GCN2特異的TALEヌクレアーゼをコードするmRNAでトランスフェクトしたヒトT細胞から単離したゲノムDNAに対するT7エンドヌクレアーゼアッセイの結果。トランスフェクトされていないT細胞から入手した試料と比較して低い分子バンドの存在は、用いられた両TLENの切断活性を意味する。
【図４】増加濃度のアルギニンを添加したRPMI1640培地中で37℃にて72時間インキュベートした後の、 GCN2特異的TALEヌクレアーゼをコードするmRNAでトランスフェクトしたヒトT細胞（KO1およびKO2）またはトランスフェクトされていないヒトT細胞（WT、野生型）の生細胞濃度のフローサイトメトリーによる測定。データは、GCN2特異的TALEヌクレアーゼで処理した細胞は、より低濃度のアルギニンにてより優れた生存を示し、よって、アルギナーゼが分泌されている腫瘍微小環境中で免疫抑制に対して抵抗性をもたらすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本明細書において特に定義のない限り、使用される技術用語および科学用語は全て、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００４３】
本明細書に記載のものと類似のまたは同等の全ての方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができ、適切な方法および材料を本明細書において説明する。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、特に定めのない限り、限定することが意図されない。
【００４４】
本発明の実施では、特に定めのない限り、当業者の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来法を用いる。このような技法は文献において十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology （Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA）； Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Third Edition, （Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press）； Oligonucleotide Synthesis （M. J. Gait ed., 1984）； Mullis et al. 米国特許第4,683,195号； Nucleic Acid Hybridization （B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984）； Transcription And Translation （B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984）； Culture Of Animal Cells （R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987）； Immobilized Cells And Enzymes （IRL Press, 1986）； B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning （1984）； the series, Methods In ENZYMOLOGY （J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York）、特に、Vol.154および155 （Wu et al. eds.）ならびにVol.185, 「Gene Expression Technology」（D. Goeddel, ed.）； Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells （J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）； Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology （Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987）； Handbook Of Experimental Immunology, Volume I-IV （D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986）、ならびにManipulating the Mouse Embryo, （Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986）を参照されたい。
【００４５】
操作されたT細胞を調製するための方法
一般的な局面において、本発明は、操作された免疫細胞、例えばT細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞を調製するための方法に関する。
【００４６】
したがって、本発明は、操作された免疫細胞を調製するための方法を提供し、本方法は、
GCN2（ヒトGCN2またはその機能的変種など）をコードする遺伝子および/またはPRDM1（ヒトPRDM1またはその機能的変種など）をコードする遺伝子を不活性化または抑制することにより、T細胞などの免疫細胞を改変する工程
を含む。
【００４７】
ある特定の態様によれば、免疫細胞は、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子; NCBI参照配列: NG_034053.1）を不活性化することによって改変される。GCN2遺伝子の不活性化は、例えば、ゲノム改変によって、より具体的には、DNA切断によって該遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼの免疫細胞における発現によって成し遂げられてもよい。
【００４８】
特定の態様によれば、免疫細胞は、ヒト免疫細胞であり、SEQ ID NO: 1（NCBI参照配列: NP_001013725.2）に示したヒトGCN2、またはSEQ ID NO：1の全長にわたってSEQ ID NO：1に示したヒトGCN2と少なくとも約80％、例えば、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、もしくは少なくとも約99％の配列同一性を有するその機能的変種をコードする遺伝子を不活性化することによって改変される。
【００４９】
ある特定の他の態様によれば、免疫細胞は、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子；NCBI参照配列: NG_029115.1）を不活性化することにより改変される。PRDM1遺伝子の不活性化は、例えば、ゲノム改変によって、より具体的には、DNA切断によって該遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼの免疫細胞における発現によって成し遂げられてもよい。
【００５０】
特定の態様によれば、免疫細胞は、ヒト免疫細胞であり、SEQ ID NO: 2（NCBI参照配列: NP_001189.2）に示したヒトPRDM1、またはSEQ ID NO：2の全長にわたってSEQ ID NO：2に示したヒトPRDM1と少なくとも約80％、例えば、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、もしくは少なくとも約99％の配列同一性を有するその機能的変種をコードする遺伝子を不活性化することによって改変される。
【００５１】
ある特定の他の態様によれば、免疫細胞は、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）およびPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）の両方を不活性化することにより改変される。これらの遺伝子の不活性化は、例えば、ゲノム改変によって、より具体的には、GCN2をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼ、およびPRDM1をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを免疫細胞において発現させることによって成し遂げられてもよい。
【００５２】
遺伝子を「不活性化する」または遺伝子「の不活性化」とは、関心対象の遺伝子（例えば、GCN2をコードする遺伝子またはPRDM1をコードする遺伝子）が機能的なタンパク質の形で発現されないことが意図される。特定の態様において、前記方法の遺伝子組換えは、レアカットエンドヌクレアーゼが、ある標的化遺伝子の切断を触媒し、それによって、この標的化遺伝子を不活性化するような、操作しようとする準備された細胞における前記レアカットエンドヌクレアーゼの発現に頼る。前記エンドヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖切断は、一般的に、相同組換え末端結合または非相同末端結合（NHEJ）の別々の機構によって修復される。しかしながら、NHEJは、切断部位のDNA配列を変えることが多い不完全な修復プロセスである。機構は、直接的な再連結（Critchlow and Jackson 1998）によって、または、いわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003）を介して2つのDNA末端の残存物を再結合することを伴う。非相同末端結合（NHEJ）を介した修復は小さな挿入または欠失をもたらすことが多く、特異的遺伝子ノックアウトを作り出すことに使用することができる。前記組換えは少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加でもよい。切断によって誘導される変異誘発事象、すなわち、NHEJ事象に続く変異誘発事象が起こった細胞は、当技術分野において周知の方法によって特定および/または選択することができる。
【００５３】
GCN2をコードする遺伝子を不活性化するために本発明に従って用いられるレアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Cas9）でもよい。
【００５４】
特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはTALE-ヌクレアーゼである。
【００５５】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名前でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼである。
【００５６】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZNF）である。
【００５７】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはRNAガイドエンドヌクレアーゼである。好ましい態様によれば、RNAガイドエンドヌクレアーゼはCas9/クリスパー複合体である。
【００５８】
免疫細胞において発現させるために、GCN2をコードする遺伝子を不活性化するために本発明にしたがって用いられるレアカットエンドヌクレアーゼは、該レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を介して細胞に導入されてもよい。したがって、本発明の方法は、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を免疫細胞に導入する工程を含んでもよい。結果として、GCN2をコードする遺伝子をDNA切断によって細胞において選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する、操作されたT細胞が得られる。
【００５９】
特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはSEQ ID NO: 3に示した 配列を標的とする（例えば、それに結合する）。他の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはSEQ ID NO: 4に示した配列を標的とする（例えば、それに結合する）。
【００６０】
PRDM1遺伝子を不活性化するために本発明にしたがって用いられるレアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Cas9）でもよい。
【００６１】
特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはTALE-ヌクレアーゼである。
【００６２】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼの名前でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼである。
【００６３】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZNF）である。
【００６４】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはRNAガイドエンドヌクレアーゼである。好ましい態様によれば、RNAガイドエンドヌクレアーゼはCas9/CRISPR複合体である。
【００６５】
T細胞において発現させるために、PRDM1をコードする遺伝子を不活性化するために本発明にしたがって用いられるレアカットエンドヌクレアーゼは、該レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を介して細胞に導入されてもよい。したがって、本発明の方法は、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒトPRDM1遺伝子）をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子をT細胞に導入する工程を含んでもよい。結果として、PRDM1をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する、操作されたT細胞が得られる。
【００６６】
ある特定の態様によれば、免疫細胞は、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子; NCBI参照配列: NG_034053.1）を抑制することによって改変される。
【００６７】
ある特定の他の態様によれば、免疫細胞は、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒト PRDM1遺伝子; NCBI参照配列: NG_029115.1）を抑制することによって改変される。
【００６８】
遺伝子を「抑制する」または遺伝子「の抑制」とは、改変した細胞における関心対象の遺伝子（例えば、GCN2またはPRDM1をコードする遺伝子）の発現が同じタイプの未改変の細胞における該遺伝子の発現と比較して低下することが意図される。具体的には、遺伝子を「抑制する」または遺伝子「の抑制」は、改変した細胞における関心対象の遺伝子（例えば、GCN2またはPRDM1をコードする遺伝子）の発現が、同じタイプの未改変の細胞における該遺伝子の発現と比較して少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、もしくは少なくとも約99％、または約100％低下することを意味する。
【００６９】
関心対象の遺伝子の抑制は、当技術分野において公知の任意の適した手段により成し遂げることができる。例えば、関心対象の遺伝子の発現は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、または干渉RNA（RNAi）分子、例えば、マイクロRNA（miRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）または低分子ヘアピン型RNA（shRNA）の使用など、遺伝子サイレンシング技術により低下してもよい。
【００７０】
特に操作されたT細胞の場合、本発明の操作された免疫細胞は、その細胞表面に機能的なT細胞受容体（TCR）を発現しないことも本発明により意図される。T細胞受容体は、抗原提示に応答したT細胞活性化に関与する細胞表面受容体である。TCRは、一般的に、集合してヘテロ二量体を形成する2本のα鎖およびβ鎖から作られ、CD3伝達サブユニットと結合して、細胞表面に存在するT細胞受容体複合体を形成する。TCRのα鎖およびβ鎖はそれぞれ、免疫グロブリンに似たN末端可変（V）領域および定常（C）領域、疎水性膜貫通ドメイン、ならびに短い細胞質領域からなる。免疫グロブリン分子と同様に、α鎖およびβ鎖の可変領域は、T細胞集団内に抗原特異性の大きな多様性を生み出すV（D）J組換えによって生じる。しかしながら、インタクトな抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、T細胞は、MHC分子と結合した処理ペプチド断片によって活性化される。これによって、MHC拘束と知られる、T細胞による抗原認識にさらなる要素が導入される。T細胞受容体を介してドナーとレシピエントとのMHC不一致が認識されると、T細胞が増殖し、場合によっては移植片対宿主病（GVHD）が発症する。正常なTCR表面発現は、複合体の7つ全ての成分の協調した合成および集合に依存することが示されている（Ashwell and Klusnor 1990）。TCRαまたはTCRβを不活性化するとT細胞表面からTCRが無くなり、それによって、アロ抗原の認識が阻止され、従って、GVHDが阻止される。従って、TCR成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子が不活性化されると、操作された免疫細胞はアロ反応性が低くなる。遺伝子を「不活性化する」または遺伝子「の不活性化」とは、関心対象の遺伝子（例えば、TCR成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子）が機能的なタンパク質の形で発現されないことが意図される。
【００７１】
従って、本発明の方法は、特定の態様によれば、T細胞受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化する工程をさらに含む。さらに具体的には、不活性化は、T細胞受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子をDNA切断、好ましくは、二本鎖切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを用いることによって（例えば、T細胞などの免疫細胞に導入することによって）成し遂げられる。特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、TCRαをコードする遺伝子またはTCRβをコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができる。好ましい態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、TCRαをコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができる。特に、ドナーから得られた同種異系免疫細胞の場合、TCRの成分、特に、TCRαをコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化すると、同種異系宿主に注入された時に、非アロ反応性の操作された免疫細胞が得られる。このため、操作された免疫細胞は、特に、移植片対宿主病のリスクが低いので同種移植に特に適している。
【００７２】
T細胞受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化するために本発明に従って用いられるレアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Cas9）でもよい。
【００７３】
特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはTALE-ヌクレアーゼである。
【００７４】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名前でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼである。
【００７５】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZNF）である。
【００７６】
別の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはRNAガイドエンドヌクレアーゼである。好ましい態様によれば、RNAガイドエンドヌクレアーゼはCas9/クリスパー複合体である。
【００７７】
T細胞などの免疫細胞において発現させるために、T細胞受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化するために本発明にしたがって用いられるレアカットエンドヌクレアーゼは、前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を介して細胞に導入されてもよい。したがって、本発明の方法は、T細胞受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子をDNA切断、好ましくは二本鎖切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を前記免疫細胞に導入する工程を含んでもよい。
【００７８】
結果として、T細胞受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子をDNA切断により選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをさらに発現する、操作された免疫細胞、例えばT細胞が得られる。その結果、TCRαなどのT細胞受容体の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子が不活性化されていることを特徴とする、操作された免疫細胞、例えばT細胞が得られる。
【００７９】
本発明は、操作された免疫細胞、例えばT細胞が、悪性細胞の表面に発現している少なくとも1種類の抗原に対して向けられたキメラ抗原受容体（CAR）をさらに発現することも企図する。したがって、ある特定の態様によれば、本発明の方法は、悪性細胞の表面に発現している少なくとも1種類の抗原に対して向けられたキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を前記免疫細胞に導入する工程をさらに含む。特定の態様によれば、前記CARは、CD19、CD33、CD123、CS1、BCMA、CD38、5T4、ROR1およびEGFRvIIIから選択される抗原に対して向けられる。
【００８０】
本発明にしたがって改変される免疫細胞は、任意の適切な免疫細胞でよい。例えば、免疫細胞は、T細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞でよい。ある特定の態様によれば、免疫細胞は、免疫細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性T細胞またはヘルパーTリンパ球などのT細胞である。特定の態様によれば、T細胞は細胞傷害性Tリンパ球である。特定の態様によれば、T細胞は、CD4+Tリンパ球である。特定の態様によれば、T細胞はCD8+Tリンパ球である。ある特定の他の態様によれば、免疫細胞はナチュラルキラー細胞である。
【００８１】
免疫細胞は血液から抽出されてもよい。あるいは、免疫細胞は、例えば、インビトロ分化によって、幹細胞から派生してもよい。幹細胞は、成人幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞でありうる。幹細胞は、ヒトまたは非ヒト幹細胞であってもよい。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。
【００８２】
ある特定の態様によれば、免疫細胞は、例えば、インビトロ分化によって、幹細胞から派生する。特定の態様によれば、幹細胞は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である。特定の他の態様によれば、幹細胞は、造血幹細胞などの複能性幹細胞である。ある特定の他の態様によれば、免疫細胞は、例えば、インビトロ分化によって、リンパ球系共通前駆（CLP）細胞から派生する。
【００８３】
ある特定の態様によれば、免疫細胞は哺乳動物の免疫細胞である。特定の態様によれば、免疫細胞は霊長類の免疫細胞である。さらに具体的な態様によれば、免疫細胞はヒト免疫細胞、例えばヒトT細胞である。
【００８４】
本発明の免疫細胞の増殖および遺伝子改変の前に、様々な非限定的な方法によって対象、例えば患者から細胞の供給源を得ることができる。T細胞などの免疫細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、複数の非限定的な供給源から得ることができる。ある特定の態様によれば、入手可能でありかつ当業者に公知の多数の免疫細胞株を用いてもよい。他のある特定の態様によれば、免疫細胞は健常ドナーから得ることができる。他のある特定の態様によれば、免疫細胞は、悪性腫瘍と診断された患者から得ることができる。他のある特定の態様において、前記細胞は、異なる表現型特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。
【００８５】
レアカットエンドヌクレアーゼ
本発明のある特定の態様によれば、関心対象の遺伝子、例えば、GCN2をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼが用いられる。
【００８６】
「レアカットエンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子の内部にある、核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型酵素または変種酵素を指す。特に、前記ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、より好ましくは、高度に特異的であり、長さが10〜45塩基対（bp）、通常、長さが10〜35塩基対、さらに通常、12〜20塩基対の核酸標的部位を認識するレアカットエンドヌクレアーゼでもよい。本発明によるエンドヌクレアーゼは特定のポリヌクレオチド配列を認識し、前記エンドヌクレアーゼの分子構造に応じて、これらの標的配列の内部で、またはこれらの標的配列に隣接する配列の内部で核酸を切断する。この特定のポリヌクレオチド配列は「標的配列」とさらに呼ばれる。レアカットエンドヌクレアーゼは、特定のポリヌクレオチド配列を認識し、ここで一本鎖切断または二本鎖切断を生成することができる。
【００８７】
特定の態様において、本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼは、RNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9/クリスパー複合体である。RNAガイドエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼがRNA分子と結合する次世代ゲノム操作ツールを構成する。この系では、RNA分子ヌクレオチド配列によって標的特異性が決定され、エンドヌクレアーゼが活性化される（Gasiunas, Barrangou et al. 2012； Jinek, Chylinski et al. 2012； Cong, Ran et al. 2013； Mali, Yang et al. 2013）。Cas9はCsn1とも呼ばれ、crRNAの生合成および侵入DNAの破壊の両方に関与する大きなタンパク質である。Cas9は、S.サーモフィラス（S.thermophiles）、リステリア・イノクア（Listeria innocua）（Gasiunas, Barrangou et al. 2012； Jinek, Chylinski et al. 2012）、およびS.ピヨゲネス（S.Pyogenes）（Deltcheva, Chylinski et al. 2011）などの様々な細菌種において述べられている。この大きなCas9タンパク質（>1200アミノ酸）は、タンパク質の中央にある2つの推定ヌクレアーゼドメイン、すなわち、HNH（McrA様）ヌクレアーゼドメインと、分割されたRuvC様ヌクレアーゼドメイン（RNアーゼHフォールド（RNase H fold））を含有する。Cas9変種は、天然で自然界に存在せず、タンパク質工学またはランダム変異誘発によって得られるCas9エンドヌクレアーゼでもよい。本発明によるCas9変種は、例えば、変異、すなわち、S.ピオゲネスCas9エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（COG3513）からの欠失、またはS.ピオゲネスCas9エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列における、少なくとも1つの残基の挿入もしくは置換によって得ることができる。
【００８８】
他の特定の態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名前でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼでもよい。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当業者に周知である（Stoddard, B.L., 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的であり、長さが12〜45塩基対（bp）、通常、長さが14〜40bpのDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに対応してもよい。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼはI-CreI変種でもよい。「変種」エンドヌクレアーゼ、すなわち、天然で自然界に存在せず、遺伝子工学またはランダム変異誘発によって得られるエンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼによって認識されるDNA配列とは異なるDNA配列に結合することができる（国際出願WO2006/097854を参照されたい）。
【００８９】
他の特定の態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、通常、IIS型制限酵素であるFokIの切断ドメインと、3つ以上のC2H2ジンクフィンガーモチーフを含有するDNA認識ドメインとの融合である「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ZFN）でもよい。2つのZFNそれぞれが正確な方向および間隔でDNAの特定の位置でヘテロ二量体化するとDNAの二本鎖切断（DSB）が起こる。このようなキメラエンドヌクレアーゼの使用は、Urnov et al.（2010）により概説されるように当技術分野において広範囲にわたって報告されている。標準的なZFNは切断ドメインと各ジンクフィンガードメインのC末端とを融合する。2つの切断ドメインが二量体化して、DNAを切断できるようになるために、2つのZFNがそれぞれDNAの反対鎖に結合する。これらのC末端は、ある一定の距離をあけて離れている。ジンクフィンガードメインと切断ドメインとの間にある、最も一般的に用いられるリンカー配列は、それぞれの結合部位の5'末端が5〜7bp隔てられていることを必要とする。新たなジンクフィンガーアレイを作製する最も簡単な方法は、特異性が分かっている小さなジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュール集合プロセスは、それぞれが3塩基対DNA配列を認識することができる3つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、9塩基対標的部位を認識することができる3フィンガーアレイを作製することを伴う。望ましい配列を標的とすることができるジンクフィンガーアレイを作製するために、非常に多くの選択方法が用いられてきた。初期の選択の取り組みでは、部分的にランダム化されたジンクフィンガーアレイの大きなプールから、ある特定のDNA標的に結合したタンパク質を選択するためにファージディスプレイが利用された。つい最近の取り組みでは、酵母1ハイブリッド系、細菌1ハイブリッド系および2ハイブリッド系、ならびに哺乳動物細胞が利用された。
【００９０】
他の特定の態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、典型的には転写アクチベーター様エフェクタータンパク質（TALE）に由来するDNA結合ドメインまたはモジュラー塩基対塩基結合ドメイン（MBBBD）に由来するDNA結合ドメインと、エンドヌクレアーゼ活性を有する触媒ドメインとの融合に起因する、「TALE-ヌクレアーゼ」（例えばWO2011159369を参照）または「MBBBD-ヌクレアーゼ」（例えばWO2014018601を参照）である。このような触媒ドメインは、通常、例えば、I-TevI、ColE7、NucA、およびFok-Iなどの酵素に由来する。TALE-ヌクレアーゼは、選択された触媒ドメインに応じて単量体または二量体の形で形成することができる（WO2012138927）。このような操作されたTALE-ヌクレアーゼは、商品名TALEN（商標）（Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France）で市販されている。一般的に、DNA結合ドメインは、配列特異性が、非限定的な例としてザントモナス属（Xanthomonas）またはラルストニア属（Ralstonia）の細菌タンパク質AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1cに由来する一連の33〜35アミノ酸の反復によって動かされる転写アクチベーター様エフェクター（TALE）に由来する。これらの反復は、本質的に、塩基対との相互作用を特定する2つのアミノ酸位置だけ異なる（Boch, Scholze et al. 2009； Moscou and Bogdanove 2009）。DNA標的内にあるそれぞれの塩基対には1個の反復が接触し、この特異性は反復の2つの変種アミノ酸（いわゆる反復可変ジペプチド（repeat variable dipeptide）、RVD）に起因する。TALE結合ドメインは、標的化配列の1番目のチミン塩基（T0）の要求を担うN末端移行ドメイン（translocation domain）、および核移行シグナル（NLS）を含有するC末端ドメインをさらに含んでもよい。TALE核酸結合ドメインは、通常、複数のTALE反復配列を含む操作されたコアTALEスキャフォールドに対応し、それぞれの反復は、TALE認識部位のそれぞれのヌクレオチド塩基に特異的なRVDを含む。本発明において、前記コアスキャフォールドのそれぞれのTALE反復配列は、30〜42個のアミノ酸、より好ましくは33個または34個のアミノ酸で作られ、位置12および13に配置された2つの重要なアミノ酸（いわゆる反復可変ジペプチド、RVD）が前記TALE結合部位配列の1つのヌクレオチドの認識を媒介する。特に、33アミノ酸長または34アミノ酸長より長いTALE反復配列では、12および13以外の位置に等価な2つの重要なアミノ酸が配置されてもよい。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するRVDは、Cを認識する場合はHD、Tを認識する場合はNG、Aを認識する場合はNI、GまたはAを認識する場合はNNである。別の態様において、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性を調整するために、特に、この特異性を増強するために、重要なアミノ酸12および13は他のアミノ酸残基に変異されてもよい。TALE核酸結合ドメインは、通常、8〜30個のTALE反復配列を含む。より好ましくは、本発明の前記コアスキャフォールドは8〜20個のTALE反復配列を含み、より好ましくは15個のTALE反復配列を含む。本発明の前記コアスキャフォールドはまた、前記TALE反復配列セットのC末端に配置された20個のアミノ酸で作られた、さらなる1個の切断型TALE反復配列、すなわち、さらなるC末端半TALE反復配列も含んでもよい。他のモジュラー塩基対塩基特異的核酸結合ドメイン（MBBBD）がWO2014018601に記載されている。前記MBBBDは、例えば��内部共生体菌類であるブルクホルデリア・リゾキシニカ（Burkholderia Rhizoxinica）の最近、配列決定されたゲノムに由来する新たに特定されたタンパク質、すなわち、EAV36_BURRH、E5AW43_BURRH、E5AW45_BURRH、およびE5AW46_BURRHタンパク質から操作されてもよい。これらの核酸結合ポリペプチドは、塩基特異的な約31〜33個のアミノ酸のモジュールを含む。これらのモジュールはザントモナス属TALE共通反復と40％未満の配列同一性を示し、より大きなポリペプチド配列可変性を示す。特定の核酸配列に対して結合特性を有する新たなタンパク質またはスキャフォールドを操作するために、ブルクホルデリア属（Burkholderia）およびザントモナス属に由来する上記タンパク質に由来する異なるドメイン（モジュール、N末端およびC末端）が有用であり、キメラTALE-MBBBDタンパク質を形成するために組み合わされてもよい。
【００９１】
TALE-ヌクレアーゼに限って言えば、関心対象の遺伝子内の適切な標的配列は、入手可能なソフトウェアツールによって特定され得る。例えば、ソフトウェアツール「Target Finder」は、Doyle et al. （2012）により開発されたTAL Effector Nucleotide Targeter（TALENT）2.0ソフトウェアパッケージの一部としても提供される、TALEヌクレアーゼの標的配列の特定を可能にするウェブベースのツール（例えば、https://tale-nt.cac.cornell.edu/からアクセス可能である）である。特注のTALE-ヌクレアーゼは、Cellectis Bioresearch, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, Franceに注文してもよい。
【００９２】
レアカットエンドヌクレアーゼによる不活性化のためのヒトGCN2遺伝子内の例示的な非限定的標的配列を、SEQ ID NO: 3およびSEQ ID NO: 4に示す。
【００９３】
特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、SEQ ID NO: 3に示した配列を標的とする（例えば、それに結合する）。他の特定の態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、SEQ ID NO: 4に示した配列を標的とする（例えば、それに結合する）。
【００９４】
キメラ抗原受容体（CAR）
養子免疫療法は、エクスビボで作製された自己由来の抗原特異的T細胞を導入することを伴い、癌またはウイルス感染症を処置する有望な戦略である。養子免疫療法に用いられるT細胞は、抗原特異的T細胞を増殖させることによって、または遺伝子工学によってT細胞を方向付け直すことによって作製することができる（Park, Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の導入は、移植に関連するウイルス感染症と稀なウイルス関連悪性疾患を処置するのに用いられる十分に確立した手順である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および導入は黒色腫を処置することに成功したことが示されている。
【００９５】
T細胞における新たな特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）を遺伝子導入することによって首尾良く作製されている（Jena, Dotti et al. 2010）。CARは、1つの融合分子の形をとる、1つまたは複数のシグナル伝達ドメインに結合した標的化部分からなる合成受容体である。通常、CARの結合部分は、可動性リンカーによってつながっているモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む単鎖抗体（scFv）抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインをベースとする結合部分も首尾良く用いられている。第1世代CAR用のシグナル伝達ドメインはCD3ζまたはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第1世代CARはT細胞の細胞傷害性を首尾良く方向付け直すことが示されているが、インビボで長期増殖および抗腫瘍活性をもたらさなかった。CAR改変T細胞の生存率を向上させ、増殖を増やすために、CD28、OX-40（CD134）、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナル伝達ドメインが単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）加えられている。CARを用いると、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現している抗原にT細胞を首尾良く方向付け直すことができた（Jena, Dotti et al. 2010）。
【００９６】
ある特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、CD19、CD33、CD123、CS1、BCMA、CD38、5T4、ROR1、およびEGFRvIIIから選択される抗原に対して向けられる。特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、CD33に対して向けられる。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、CS1に対して向けられる。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、BCMAに対して向けられる。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、CD38に対して向けられる。
【００９７】
ある特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、5T4、ROR1、およびEGFRvIIIなど、固形腫瘍細胞の表面に通常発現している抗原に対して向けられる。特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、5T4に対して向けられる。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、ROR1に対して向けられる。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、EGFRvIIIに対して向けられる。
【００９８】
ある特定の他の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、CD123など、液性腫瘍の表面に通常発現している抗原に対して向けられる。特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、CD123に対して向けられる。
【００９９】
B急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）の大多数が一様にCD19を発現するのに対して、骨髄系細胞、赤血球細胞、およびT細胞、ならびに骨髄幹細胞と同様、非造血細胞では発現は存在しないので、CD19は免疫療法の魅力的な標的である。B細胞悪性疾患上にあるCD19を標的とする臨床試験が有望な抗腫瘍応答を伴って進行中である。CD19特異的マウスモノクローナル抗体FMC63のscFv領域に由来する特異性をもつキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞が、WO2013/126712に記載される。
【０１００】
従って、特定の態様によれば、操作された免疫細胞によって発現されるキメラ抗原受容体はBリンパ球抗原CD19に対して向けられたものである。
【０１０１】
ある特定の態様によれば、キメラ抗原受容体は単鎖キメラ抗原受容体である。本発明による操作された免疫細胞において発現される単鎖キメラ抗原受容体の一例は、少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む単一のポリペプチドである。前記細胞外リガンド結合ドメインは、特異的抗CD19モノクローナル抗体4G7に由来するscFVを含む。このCARは、例えば、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入を用いて免疫細胞に形質導入されると、リンパ腫または白血病に関与する悪性B細胞の表面に存在するCD19抗原の認識に寄与する。
【０１０２】
特定の態様によれば、キメラ抗原受容体は、SEQ ID NO：5に示したアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはSEQ ID NO：5の全長にわたってSEQ ID NO：5に示したアミノ酸配列と少なくとも70％、例えば、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、その変種である。好ましくは、前記変種はCD19に結合することができる
【０１０３】
特に好ましいキメラ抗原受容体は、SEQ ID NO：6に示したアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはSEQ ID NO：6の全長にわたってSEQ ID NO：6に示したアミノ酸配列と少なくとも80％、例えば、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、その変種である。このような変種は、少なくとも1個、少なくとも2個、または少なくとも3個のアミノ酸残基が置換されている点でSEQ ID NO：6に示したポリペプチドを異なってもよい。好ましくは、前記変種はCD19に結合することができる。
【０１０４】
ある特定の他の態様によれば、キメラ抗原受容体は、悪性細胞または感染細胞の表面に発現している別の抗原、例えば、分化クラスター分子、例えば、CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、およびCD138、腫瘍関連表面抗原、例えば、ErbB2（HER2/neu）、癌胎児抗原（CEA）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、上皮増殖因子受容体（EGFR）、EGFR変種III（EGFRvIII）、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアロガングリオシドGD2、管上皮ムチン、gp36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ（prostase）、プロスターゼ特異的抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、プロステイン（prostein）、PSMA、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インシュリン増殖因子（IGF1）-I、IGF-II、IGFI受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメイン（extra domain）A（EDA）およびエクストラドメインB（EDB）、ならびにテネイシン-CのA1ドメイン（TnC A1）および線維芽細胞関連タンパク質（fap）；細胞系列特異的抗原または組織特異的抗原、例えば、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、GM-CSF、サイトカイン受容体、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、BCMA（CD269、TNFRSF17）、多発性骨髄腫抗原もしくはリンパ芽球性白血病抗原、例えば、TNFRSF17（UNIPROT Q02223）、SLAMF7（UNIPROT Q9NQ25）、GPRC5D（UNIPROT Q9NZD1）、FKBP11（UNIPROT Q9NYL4）、KAMP3、ITGA8（UNIPROT P53708）、およびFCRL5（UNIPROT Q68SN8）より選択される抗原、ウイルス特異的表面抗原、例えば、HIV特異的抗原（例えば、HIV gp120）； EBV特異的抗原、CMV特異的抗原、HPV特異的抗原、ラッサ（Lasse）ウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、ならびにこれらの表面抗原の任意の誘導体または変種に対して向けられてもよい。
【０１０５】
ある特定の他の態様において、キメラ抗原受容体は多鎖キメラ抗原受容体である。T細胞に導入される先行技術のキメラ抗原受容体は、シグナル伝達ドメインの連続付加を必要とする単鎖ポリペプチドから形成された。しかしながら、シグナル伝達ドメインがその自然の膜近傍位置から動くと、その機能が妨げられる可能性がある。この欠点を克服するために、出願人は、最近、全ての関係するシグナル伝達ドメインの正常な膜近傍位置を可能にするために、FcεRIに由来する多鎖CARを設計した。WO2013/176916に記載のように、この新たな構造では、FcεRIα鎖の高親和性IgE結合ドメインは、T細胞特異性を細胞標的に方向付け直すためにscFvなどの細胞外リガンド結合ドメインと交換され、共刺激シグナルを正常な膜近傍位置に配置するためにFcεRIβ鎖のN末端テールおよび/またはC末端テールが用いられる。
【０１０６】
従って、本発明による操作された免疫細胞が発現するCARは、特に、本発明の操作された免疫細胞の作製および増殖に合わせられた多鎖キメラ抗原受容体でもよい。このような多鎖CARは、以下の成分：
（a）FcεRIα鎖の膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメインを含む1つのポリペプチド、
（b）FcεRIβ鎖のN末端細胞質テールおよびC末端細胞質テールの一部ならびに膜貫通ドメインを含む1つのポリペプチド、ならびに/または
（c）それぞれが、FcεRIγ鎖の細胞質内テールの一部および膜貫通ドメイン含み、異なるポリペプチドが自発的に一緒になって多量体化して二量体CAR、三量体CAR、または四量体CARを形成する、少なくとも2つのポリペプチド
の少なくとも2つを含む。
【０１０７】
このような構造によれば、リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインは別個のポリペプチドに載って運ばれる。異なるポリペプチドは近接して膜内に固定されるので互いに相互作用することが可能になる。このような構造では、シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインは膜近傍位置にあってもよい（すなわち、細胞膜に隣接し、細胞膜の内側にあってもよい）。これは、共刺激ドメインの機能の改善を可能にすると考えられる。このマルチサブユニット構造はまた、さらに大きな融通性と、T細胞活性化をさらに厳密に制御するCARを設計する可能性ももたらす。例えば、多重特異性CAR構造を得るために、異なる特異性を有するいくつかの細胞外抗原認識ドメインを含めることが可能である。多鎖CARの中に入る異なるサブユニット間の相対比を制御することも可能である。このタイプの構造は、WO2014039523において、より詳細に記載されている。
【０１０８】
1つの多鎖CARの一部として異なる鎖を集合することは、例えば、シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインと融合した、IgEの高親和性受容体（FcεRI）（Metzger, Alcaraz et al. 1986）の異なるα鎖、β鎖、およびγ鎖を用いることによって可能になる。γ鎖は、膜貫通領域と、1個の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ITAM）（Cambier 1995）を含有する細胞質テールを含む。
【０１０９】
多鎖CARは、標的中の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を増大するように、いくつかの細胞外リガンド結合ドメインを含んでもよい。一態様において、細胞外リガンド結合ドメインは同じ膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれてもよく、任意で、リンカーで分けられてもよい。別の態様において、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多鎖CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれてもよい。
【０１１０】
本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合した後に、免疫細胞および免疫応答の活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を担う。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、多鎖CARが発現している免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカイン分泌を含むヘルパー活性でもよい。
【０１１１】
本願において、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を誘導するタンパク質部分を指す。
【０１１２】
単鎖CARまたは多鎖CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して働く、Fc受容体またはT細胞受容体および補助受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変種、および同じ機能をもつ任意の合成配列でもよい。シグナル伝達ドメインは、抗原依存的一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列、および二次シグナルまたは共刺激シグナルを供給するように抗原非依存的に働く細胞質シグナル伝達配列である2つの別々のクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフであるITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでもよい。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として役立つ、様々な受容体の細胞質内テールにおいて発見された詳細に明らかにされたシグナル伝達モチーフである。本発明において用いられるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するITAMが含まれ得る。特定の態様によれば、多鎖CARのシグナル伝達ドメインはCD3ζシグナル伝達ドメインを含んでもよく、FcεRIβ鎖またはγ鎖の細胞質内ドメインを含んでもよい。
【０１１３】
特定の態様によれば、本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【０１１４】
リガンド結合ドメインは、文献において言及された単鎖CARに関して、以前に使用および言及された任意の抗原受容体、特に、モノクローナル抗体に由来するscFvでよい。
【０１１５】
送達方法
本発明者らは、本発明に従って用いられる核酸分子を細胞内に、または前記細胞の細胞下区画に送達するために当技術分野において公知の、あらゆる手段を考えた。これらの手段には、非限定的な例として、ウイルス形質導入、エレクトロポレーションが含まれ、リポソーム送達手段、ポリマー担体、化学的担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、エマルジョン、天然のエンドサイトーシスまたはファゴサイトース（phagocytose）経路も含まれる。
【０１１６】
本発明によれば、本明細書において詳述された核酸分子は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって免疫細胞に導入することができる。核酸分子を免疫細胞内に導入する適切な非限定的な方法には、核酸分子が細胞ゲノムに組み込まれる安定形質転換法、核酸分子が細胞ゲノムに組み込まれない一過的形質転換法、およびウイルスを介した方法が含まれる。前記核酸分子は、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって前記細胞に導入されてもよい。一過的形質転換法には、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはパーティクルボンバードメントが含まれる。ある特定の態様において、核酸分子は、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドである。適宜、前記ベクターは、免疫細胞による、本明細書において詳述された、それぞれのポリペプチドまたはタンパク質の発現を可能にする発現ベクターである。
【０１１７】
免疫細胞に導入される核酸分子はDNAでもよくRNAでもよい。ある特定の態様において、免疫細胞に導入される核酸分子はDNAである。ある特定の他の態様において、免疫細胞に導入される核酸分子は、RNA、特に、本明細書において詳述されたポリペプチドまたはタンパク質をコードするmRNAであり、このmRNAは、例えば、エレクトロポレーションによって、免疫細胞に直接導入される。適切なエレクトロポレーション技法は、例えば、国際公開WO2013/176915（特に「エレクトロポレーション」ブリッジングという表題のセクション、29〜30頁）に記載されている。mRNAでもよい特定の核酸分子は、GCN2をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子である。mRNAでもよい別の特定の核酸分子は、PRDM1をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子である。mRNAでもよい、さらに他の特定の核酸分子は、T細胞受容体の1成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子である。
【０１１８】
一過的に発現させて、外来DNAの染色体組込みを回避するために、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子は、mRNAの形で、例えば、エレクトロポレーションによってトランスフェクトされ得る。この点において、パルス電場を用いることで、材料を細胞に送達するために生細胞を一過的に透過処理するのを可能にするcytoPulse技術を使用してもよい（米国特許第6,010,613号およびWO2004/083379）。
【０１１９】
非アロ反応性免疫細胞
T細胞受容体は、抗原提示に応答したT細胞活性化に関与する細胞表面受容体である。TCRは、一般的に、集合してヘテロ二量体を形成する2本のα鎖およびβ鎖から作られ、CD3伝達サブユニットと結合して、細胞表面に存在するT細胞受容体複合体を形成する。TCRのα鎖およびβ鎖はそれぞれ、免疫グロブリンに似たN末端可変（V）領域および定常（C）領域、疎水性膜貫通ドメイン、ならびに短い細胞質領域からなる。免疫グロブリン分子と同様に、α鎖およびβ鎖の可変領域は、T細胞集団内に抗原特異性の大きな多様性を生み出すV（D）J組換えによって生じる。しかしながら、インタクトな抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、T細胞は、MHC分子と結合した処理ペプチド断片によって活性化される。これによって、MHC拘束と知られる、T細胞による抗原認識にさらなる要素が導入される。T細胞受容体を介してドナーとレシピエントとのMHC不一致が認識されると、T細胞が増殖し、場合によってはGVHDが発症する。正常なTCR表面発現は、複合体の7つ全ての成分の協調した合成および集合に依存することが示されている（Ashwell and Klusnor 1990）。TCRαまたはTCRβを不活性化するとT細胞表面からTCRが無くなり、それによって、アロ抗原の認識が阻止され、従って、GVHDが阻止される。
【０１２０】
従って、さらに本発明によれば、免疫細胞、特にT細胞の生着は、TCR成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子を不活性化することによって改善され得る。TCRαまたはTCRβをコードする遺伝子を不活性化することによって、TCRは細胞内で機能しなくなる。
【０１２１】
Cas9/クリスパー系の使用に関して、本出願人は、TCRをコードする3つのエキソンの中に適切な標的配列を確かめており、そのため、切断効率を保持しながら、生細胞において毒性を大幅に低減することが可能になった。好ましい標的配列を表1に示した（TCR陰性細胞の比が低い場合は+、比が中間の場合は++、比が高い場合は+++）。
【０１２２】
（表１）T細胞においてCas9を用いるガイドRNAの適切な標的配列
2017513472.tif 000002
【０１２３】
MHC抗原はまた、移植反応において主な役割を果たすタンパク質でもある。拒絶反応は、T細胞が、移植された組織の表面にある組織適合抗原と反応することによって媒介され、これらの抗原の大きなグループは主要組織適合抗原（MHC）である。これらのタンパク質は全ての高等脊椎動物の表面に発現しており、ヒト細胞ではHLA抗原（ヒト白血球抗原）と呼ばれる。TCRと同様に、MHCタンパク質はT細胞刺激において重要な役割を果たしている。抗原提示細胞（多くの場合、樹状細胞）は、細胞表面にあるMHCに載せて、外来タンパク質の分解産物であるペプチドを呈する。共刺激シグナルの存在下でT細胞は活性化され、同様に同じペプチド/MHC複合体を呈する標的細胞に作用する。例えば、刺激されたTヘルパー細胞が、抗原をMHCと共に呈するマクロファージを標的とするか、または細胞傷害性T細胞（CTL）が、外来ウイルスペプチドを呈するウイルス感染細胞に作用する。
【０１２４】
従って、アロ反応性の低いT細胞を提供するために、本発明の方法は、少なくとも一つのHLA遺伝子を不活性化するかまたは変異させる工程をさらに含んでもよい。
【０１２５】
ヒトのクラスI HLA遺伝子クラスターは3つのメジャー遺伝子座B、C、およびAと、いくつかのマイナー遺伝子座を含む。クラスII HLAクラスターも3つのメジャー遺伝子座DP、DQ、およびDRを含み、クラスI遺伝子クラスターおよびクラスII遺伝子クラスターは両方とも、集団内にクラスI遺伝子およびクラスII遺伝子両方のいくつかの異なるアレルがある点で多型である。同様にHLA機能において役割を果たす、いくつかのアクセサリータンパク質もある。Tap1およびTap2サブユニットは、ペプチド抗原をクラスI HLA複合体に装填するのに必要不可欠なTAP輸送体複合体の一部である。LMP2およびLMP7プロテオソームサブユニットは、HLAに載せて呈するために抗原からペプチドへのタンパク質分解において役割を果たしている。LMP7の低減は、おそらく、安定化の欠如により、細胞表面にあるMHCクラスIの量を低減することが示されている（Fehling et al. （1999） Science 265:1234-1237）。TAPおよびLMPの他に、その産物がTAP複合体とHLAクラスI鎖との架橋を形成し、ペプチドの装填を増強するタパシン遺伝子がある。タパシンが低減すると、MHCクラスI集合が損なわれ、MHCクラスIの細胞表面発現が低減し、免疫応答が損なわれた細胞が生じる（Grandea et al. （2000） Immunity 13:213-222およびGarbi et al. （2000） Nat. Immunol. 1:234-238）。上記の遺伝子はいずれも、開示されたように、例えば、WO2012/012667に開示されたように本発明の一部として不活性化することができる。
【０１２６】
免疫細胞の活性化および増殖
本発明による方法は、免疫細胞を活性化および/または増殖するさらなる工程を含んでもよい。これは、免疫細胞を遺伝子組換えする前または遺伝子組換えした後に、例えば、米国特許第6,352,694号;同第6,534,055号;同第6,905,680号;同第6,692,964号;同第5,858,358号;同第6,887,466号;同第6,905,681号;同第7,144,575号;同第7,067,318号;同第7,172,869号;同第7,232,566号;同第7,175,843号;同第5,883,223号;同第6,905,874号;同第6,797,514号;同第6,867,041号;および米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を用いて行うことができる。これらの方法に従って、CD3 TCR複合体に関連するシグナルを刺激する作用物質および免疫細胞表面にある共刺激分子を刺激するリガンドが接着された表面と接触させることによって、本発明の免疫細胞を増殖することができる。
【０１２７】
特に、T細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片または抗CD2抗体との接触によってインビトロで刺激されてもよく、プロテインキナーゼCアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）とカルシウムイオノフォアとの接触によってインビトロで刺激されてもよい。T細胞表面にあるアクセサリー分子を同時刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞増殖を刺激するのに適した条件下で、T細胞集団と抗CD3抗体および抗CD28抗体を接触させることができる。CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗CD3抗体および抗CD28抗体。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあってもよく、または表面に結合していてもよい。当業者が容易に認識し得るように、粒子と細胞の割合は、標的細胞に対する粒子のサイズに依存し得る。本発明のさらなる態様において、細胞、例えばT細胞は、薬剤コーティングビーズと組み合わされ、ビーズおよび細胞は後で分離され、次いで、細胞は培養される。別の態様では、培養前に薬剤コーティングビーズおよび細胞は分離されず、一緒に培養される。抗CD3および抗CD28が取り付けられている常磁性ビーズ（3x28ビーズ）がT細胞と接触するのを可能にすることで、細胞表面タンパク質が連結される場合がある。一態様において、細胞（例えば、4〜10個のT細胞）およびビーズ（例えば、1：1比のDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ）が、緩衝液中、好ましくは、PBS（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）の中で組み合わされる。これもまた、任意の細胞濃度を使用できることを当業者は容易に理解することができる。混合物は数時間（約3時間）〜約14日間、培養されてもよく、その間の任意の整数値の時間にわたって培養されてもよい。別の態様では、混合物は21日間、培養されてもよい。T細胞培養に適した条件には、血清（例えば、胎仔ウシ血清または胎児ヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インシュリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞増殖のための他の任意の添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞増殖のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、および還元剤、例えば、N-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールが含まれるが、これに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清の、あるいは適量の血清（もしくは血漿）、または規定された一組のホルモン、ならびに/またはT細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインが加えられた、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養物にだけ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気+5％CO2）の下で維持される。異なる刺激時間に曝露されたT細胞は異なる特徴を示す場合がある。
【０１２８】
別の特定の態様において、これらの免疫細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖させることができる。これらの細胞はまた、インビボ、例えば前記細胞を対象に投与した後に対象の血液中で増殖させることができる。
【０１２９】
操作された免疫細胞
本発明の結果として、改善された特徴を有する操作された免疫細胞を得ることができる。特に、本発明は、GCN2をコードする遺伝子および/またはPRDM1をコードする遺伝子が不活性化または抑制されていることを特徴とする、操作された、好ましくは単離された免疫細胞を提供する。
【０１３０】
ある特定の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）が不活性化されている、操作された免疫細胞が提供される。
【０１３１】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）が抑制されている、操作された免疫細胞が提供される。
【０１３２】
ある特定の他の態様によれば、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒト PRDM1遺伝子）が不活性化されている、操作された免疫細胞が提供される。
【０１３３】
ある特定の他の態様によれば、PRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒト PRDM1遺伝子）が抑制されている、操作された免疫細胞が提供される。
【０１３４】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）およびPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒト PRDM1遺伝子）の両方が不活性化されている、操作された免疫細胞が提供される。
【０１３５】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）およびPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒト PRDM1遺伝子）の両方が抑制されている、操作された免疫細胞が提供される。
【０１３６】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）が不活性化され、かつPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒト PRDM1遺伝子）が抑制されている、操作された免疫細胞が提供される。
【０１３７】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子（例えば、ヒトGCN2遺伝子）が抑制され、かつPRDM1をコードする遺伝子（例えば、ヒト PRDM1遺伝子）が不活性化されている、操作された免疫細胞が提供される。
【０１３８】
ある特定の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子をDNA切断、好ましくは二本鎖切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する、操作された免疫細胞が得られる。特定の態様によれば、前記免疫細胞は、前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む。さらに特定の態様によれば、前記レアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼである。したがって、具体的な態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはTALE-ヌクレアーゼである。別の具体的な態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。別の具体的な態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。さらに別の具体的な態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、RNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9である。
【０１３９】
ある特定の態様によれば、PRDM1をコードする遺伝子をDNA切断、好ましくは二本鎖切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する、操作された免疫細胞が得られる。特定の態様によれば、前記免疫細胞は、前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む。さらに特定の態様によれば、前記レアカットエンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、またはRNAガイドエンドヌクレアーゼである。したがって、具体的な態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはTALE-ヌクレアーゼである。別の具体的な態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。別の具体的な態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。さらに別の具体的な態様によれば、レアカットエンドヌクレアーゼは、RNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9である。
【０１４０】
ある特定の他の態様によれば、GCN2をコードする遺伝子をDNA切断、好ましくは二本鎖切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼ、およびPRDM1をコードする遺伝子をDNA切断、好ましくは二本鎖切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼを発現する、操作された免疫細胞が得られる。特定の態様によれば、前記免疫細胞は、前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードする1種または複数種のヌクレオチド配列を含む1種または複数種の外因性核酸分子を含む。
【０１４１】
ある特定の態様によれば、操作された免疫細胞は、DNA切断、好ましくは二本鎖切断によってT細胞受容体の成分、例えばTCRαをコードする少なくとも1種類の遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをさらに発現する。特定の態様によれば、前記免疫細胞は、前記レアカットエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む。
【０１４２】
ある特定の態様によれば、操作された免疫細胞は、悪性細胞の表面に発現している少なくとも1種類の抗原に対して向けられたキメラ抗原受容体（CAR）をさらに発現する。特定の態様によれば、前記免疫細胞は、前記CARをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む。
【０１４３】
特に、GCN2をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼ、PRDM1をコードする遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼ、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種類の遺伝子をDNA切断によって選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼ、およびキメラ抗原受容体について本明細書において示された詳しい内容が本発明のこの局面にも適用されることが理解される。
【０１４４】
さらに、本発明の範囲には、本発明による操作された免疫細胞から得られた細胞株も包含される。
【０１４５】
本発明の結果として、操作された免疫細胞は、癌などの医学的状態の処置または予防において使用するための治療用製品として、理想的には「既製の」製品として使用することができる。
【０１４６】
治療用途
本発明にしたがって入手できる免疫細胞は、医薬、特に、必要とする患者（例えば、ヒト患者）において癌を処置するための医薬として用いることが意図される。したがって、本発明は、医薬として使用するための、操作された免疫細胞を提供する。特に、本発明は、癌の処置において使用するための、操作された免疫細胞を提供する。また、少なくとも1つの本発明の操作された免疫細胞を含む組成物、特に、薬学的組成物も提供される。ある特定の態様において、組成物は、本発明の操作された免疫細胞の集団を含んでもよい。
【０１４７】
処置は、寛解させる処置でもよく、根治的処置でもよく、予防的処置でもよい。処置は自家免疫療法の一環でもよく、同種異系免疫療法処置の一環でもよい。自家とは、患者の処置に用いられる細胞、細胞株、または細胞集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合ドナーに由来することを意味する。同種異系とは、患者の処置に用いられる細胞または細胞集団が前記患者に由来しないが、ドナーに由来することを意味する。
【０１４８】
本発明は、典型的にはドナーから得られた免疫細胞、例えばT細胞の非アロ反応性細胞への形質転換が可能な限り、同種異系免疫療法に特に適している。これは標準的なプロトコール下で行われ、必要に応じて何回でも再現されうる。結果として得られた改変された免疫細胞はプールされてもよく、1人または数人の患者に投与されてもよく、「既製の」治療製品として利用することができる。
【０１４９】
処置は、主として、癌と診断された患者を処置することを目的とする。本発明により処置される特定の癌は、固形腫瘍を有する癌だが、液性腫瘍に関係してもよい。成人腫瘍/癌および小児科腫瘍/癌も含まれる。
【０１５０】
ある特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、癌の処置において使用するためのものであり、さらに具体的には、固形腫瘍または液性腫瘍の処置において使用するためのものである。特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、固形腫瘍の処置において使用するためのものである。他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、液性腫瘍の処置において使用するためのものである。
【０１５１】
特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、肺がん 、小細胞肺がん、乳がん、子宮がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、膵臓がん、および皮膚がんからなる群より選択される癌の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、肺がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、小細胞肺がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、乳がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、子宮がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、前立腺がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、腎臓がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、結腸がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、肝臓がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、膵臓がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、皮膚がんの処置において使用するためのものである。
【０１５２】
他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、肉腫の処置において使用するためのものである。
【０１５３】
他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、癌腫の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、腎癌 、肺癌、または結腸癌の処置において使用するためのものである。
【０１５４】
他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、および慢性骨髄単球性白血病（CMML）の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、急性リンパ性白血病（ALL）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、急性骨髄性白血病（AML）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、慢性リンパ性白血病（CLL）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、慢性骨髄性白血病（CML）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、慢性骨髄単球性白血病（CMML）の処置において使用するためのものである。
【０１５５】
他の特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、リンパ腫、例えば、B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、原発性CNSリンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、ホジキンリンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、非ホジキンリンパ腫の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫（DLBCL）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、濾胞性リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、辺縁帯リンパ腫（MZL）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（MALT）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、小細胞リンパ球性リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、マントル細胞リンパ腫（MCL）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、バーキットリンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、縦隔（胸腺）原発B細胞性大細胞型リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、ワルデンストレームマクログロブリン血症の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、節性辺縁帯B細胞リンパ腫（NMZL）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、脾性辺縁帯リンパ腫（SMZL）の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、血管内大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、原発性滲出性リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、リンパ腫様肉芽腫症の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、T細胞/組織球豊富型大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、CNS（中枢系）の原発性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、原発性皮膚びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、高齢者のEBV陽性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、炎症に不随するびまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、ALK陽性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、形質芽球性リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によれば、操作された免疫細胞または組成物は、HHV8関連多中心性キャッスルマン病で生じる大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。
【０１５６】
ある特定の態様によれば、操作された免疫細胞は、処置すべき患者、例えば、ヒト患者に由来する。ある特定の他の態様によれば、操作された免疫細胞は、少なくとも1人のドナーに由来する。
【０１５７】
前記処置は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群より選択される1つまたは複数の療法と組み合わせて行うことができる。
【０１５８】
ある特定の態様によれば、本発明の免疫細胞は患者に投与されると活発にインビボで免疫細胞増殖することができ、長期間にわたって、好ましくは、1週間、より好ましくは、2週間、さらにより好ましくは、少なくとも1ヶ月にわたって体液中に残り続けることができる。本発明による免疫細胞は、これらの期間にわたって残り続けると予想されるが、患者の体内での寿命は、1年、好ましくは、6ヶ月、より好ましくは、2ヶ月、さらにより好ましくは、1ヶ月を超えないことが意図される。
【０１５９】
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植（implantation）、または移植（transplantation）を含む任意の従来のやり方で行われてもよい。本明細書に記載の組成物は、患者に対して、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に投与されてもよい。一態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
【０１６０】
細胞または細胞集団の投与は、体重1kgにつき104〜109個の細胞を、好ましくは、体重1kgにつき105〜106個の細胞を、この範囲内にある全ての整数値の細胞数を含めて投与することからなってもよい。前記の細胞または細胞集団は1回の投与または複数回の投与で投与されてもよい。別の態様において、前記有効量の細胞は単回投与として投与される。別の態様において、前記有効量の細胞は、ある期間にわたって複数回投与として投与される。投与のタイミングは、管理を行っている医師によって判断され、患者の臨床状態に左右される。前記の細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々のニーズは異なるが、特定の疾患または状態に対する特定の細胞タイプの有効量の最適範囲の決定は当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的利益または予防的利益をもたらす量を意味する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、併用処置がもしあれば、その種類、処置の頻度、ならびに望ましい効果がどういったものかに左右される。
【０１６１】
別の態様において、前記有効量の細胞または細胞を含む組成物が非経口投与される。前記投与は静脈内投与でもよい。前記投与は腫瘍内に注射することによって直接行われてもよい。
【０１６２】
ある特定の態様において、細胞は、薬剤、例えば、抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン-2、シタラビン（ARA-Cとも知られる）、またはMS患者の場合はナタリジマブ（nataliziimab）処置もしくは乾癬患者の場合はエファリズチマブ（efaliztimab）処置もしくはPML患者の場合は他の処置を含むが、これに限定されない任意の数の関係のある治療モダリティーと一緒に（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者に投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸、およびFK506、抗体、または他の免疫除去剤（immunoablative agent）、例えば、CAMPATH、抗CD3抗体、または他の抗体療法、サイトキシン（cytoxin）、フルダリビン（fludaribine）、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコプリノール酸（mycoplienolic acid）、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに放射線照射と併用されてもよい。これらの薬物はカルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66：807-815, 11； Henderson et al., Immun. 73：316-321, 1991； Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5：763-773, 93）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学療法剤、例えば、フルダラビン、外部ビーム放射線療法（XRT）、シクロホスファミド、または抗体、例えば、OKT3もしくはCAMPATHのいずれかを用いたT細胞除去療法（ablative therapy）と共に（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者に投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、B細胞切除療法、例えば、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンの後に投与される。例えば、一態様において、対象は、高用量化学療法を用いた標準的な処置を受けた後に、末梢血幹細胞移植を受けてもよい。ある特定の態様において、移植後に、対象には、増殖された本発明の遺伝子操作された免疫細胞が注入される。さらなる態様では、増殖された細胞が外科手術前または外科手術後に投与される。
【０１６３】
処置を必要とする患者において処置するための方法も、本発明のこの局面に包含され、本方法は、（a）少なくとも1つの本発明の操作された免疫細胞、好ましくは、前記免疫細胞の集団を準備する工程；および（b）前記免疫細胞または集団を前記患者に投与する工程を含む。
【０１６４】
少なくとも1つの本発明の操作された免疫細胞、好ましくは、前記免疫細胞の集団を用いた医薬を調製するための方法も本発明のこの局面に包含される。従って、本発明は、医薬の製造における、少なくとも1つの本発明の操作された免疫細胞、好ましくは、前記免疫細胞の集団の使用を提供する。好ましくは、このような医薬は、上記で特定した疾患の処置において使用するためのものである。
【０１６５】
他の定義
ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は一文字表記に従って本明細書において指定される。例えば、QはGlnまたはグルタミン残基を意味し、RはArgまたはアルギニン残基を意味し、DはAspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
【０１６６】
アミノ酸の置換とは、あるアミノ酸残基と別のアミノ酸残基との交換を意味する。例えば、ペプチド配列中のアルギニン残基とグルタミン残基との交換はアミノ酸置換である。
【０１６７】
ヌクレオチドは以下の通りに指定される。ヌクレオシドの塩基を指定するのに一文字表記が用いられる。すなわち、aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドの場合、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。
【０１６８】
本明細書で使用する「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生じた断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じた断片を指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド（例えば、DNAおよびRNA）もしくは天然ヌクレオチドの類似体（例えば、天然ヌクレオチドのエナンチオマー型）の単量体で構成されてもよく、両方の組み合わせで構成されてもよい。改変ヌクレオチドは糖部分および/またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分の変化を有することがある。糖の改変には、例えば、1つまたは複数のヒドロキシル基と、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基との交換が含まれる。または、糖はエーテルまたはエステルとして官能化されてもよい。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的および電子的に似た構造と交換されてもよい。塩基部分の改変の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体がホスホジエステル結合またはこのような連結の類似体によって連結されてもよい。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０１６９】
「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的DNA配列」、「核酸標的配列」、「標的配列」、または「プロセシング部位」とは、本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼによって標的化および処理することができるポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、細胞内にある特定のDNA場所、好ましくは、ゲノム場所だけでなく、遺伝物質の本体とは独立して存在することができる遺伝物質部分、例えば、非限定的な例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはミトコンドリアなどの細胞小器官の中にある遺伝物質部分も指す。RNAガイド標的配列の非限定的な例は、RNAガイドエンドヌクレアーゼを望ましい遺伝子座に向けるガイドRNAにハイブリダイズすることができるゲノム配列である。
【０１７０】
「送達ベクター」は、本発明において必要とされる薬剤/化学物質および分子（タンパク質または核酸）を細胞に触れ合わせる（すなわち、細胞と「接触させる」）か、または細胞内もしくは細胞下区画内に送達する（すなわち、「導入する」）のに本発明において使用することができる任意の送達ベクターであることが意図される。「送達ベクター」には、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、エマルジョン、または他の適切な導入ベクターが含まれるが、これに限定されない。これらの送達ベクターによって、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、または他のベクター、例えば、プラスミド、または透過性ペプチドの送達が可能になる。これらの後者の場合、送達ベクターは分子担体である。
【０１７１】
「ベクター」またはという用語は、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体、非染色体、半合成、もしくは合成の核酸からなってもよい直鎖もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これに限定されない。好ましいベクターは、連結している核酸の自律的な複製が可能なベクター（エピソームベクター）および/または連結している核酸の発現が可能なベクター（発現ベクター）である。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。
【０１７２】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス）ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin, J. M., Retroviridae： The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。
【０１７３】
「レンチウイルスベクター」とは、パッケージング能が比較的大きく、免疫原性が低く、高効率で広範囲の異なる細胞タイプに安定して形質導入を生じさせる能力があるために遺伝子送達に非常に有望な、HIVをベースとするレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、3つのプラスミド（パッケージング、エンベロープ、および導入）またはそれより多いプラスミドをプロデューサー細胞に一過的にトランスフェクトした後に作製される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と、細胞表面にある受容体との相互作用を介して標的細胞に入る。ウイルスRNAが入ったら、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写産物は、感染細胞のDNAにウイルスが組み込まれるための基質である二本鎖直鎖ウイルスDNAである。「組込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込むことができるベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの働きによって標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【０１７４】
送達ベクターはソノポレーション（sonoporation）もしくはエレクトロポレーションまたはこれらの技法の派生物などの任意の細胞透過処理法と関連づけられてもよく、組み合わされてもよい。
【０１７５】
「細胞」とは、インビトロ培養するための任意の真核生物の生細胞、これらの生物に由来する初代細胞および細胞株であることが意図される。
【０１７６】
「初代細胞」とは、ごくわずかな集団倍化を経ており、従って、連続して腫瘍を形成する細胞株または人工的に不死化された細胞株と比較して、細胞が得られた組織の主要な機能成分および特徴をよく表している、生組織（すなわち、生検材料）から直接採取され、インビトロで増殖するように樹立された細胞であることが意図される。
【０１７７】
非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞;HEK293細胞;Caco2細胞;U2-OS細胞;NIH3T3細胞;NSO細胞;SP2細胞;CHO-S細胞;DG44細胞;K-562細胞、U-937細胞;MRC5細胞;IMR90細胞;ジャーカット細胞;HepG2細胞;HeLa細胞;HT-1080細胞;HCT-116細胞;Hu-h7細胞;Huvec細胞;Molt4細胞からなる群より選択することができる。
【０１７８】
これらの細胞株は全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を産生する、発現する、定量する、検出する、研究するための細胞株モデルを提供するために本発明の方法によって改変することができる。これらのモデルはまた、研究および産生において、ならびに非限定的な例として化学物質、バイオ燃料、治療剤学、および農学などの様々な分野において関心対象の生物学的に活性な分子をスクリーニングするのに使用することもできる。
【０１７９】
「幹細胞」とは、自己複製能および分化した細胞を生じさせる能力を有する細胞を意味する。より明確には、幹細胞は、その母細胞と同じ娘細胞を生じさせることができ（自己複製）、かつ潜在力がより限定された子孫（分化細胞）を産生することができる細胞である。
【０１８０】
「NK細胞」とは、ナチュラルキラー細胞を意味する。NK細胞は、大形顆粒リンパ球として定義され、Bリンパ球およびTリンパ球を生じるリンパ球系共通前駆細胞から分化する第三の細胞を構成する。
【０１８１】
「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）配列またはポリペプチド配列への1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個までの、またはそれより多いヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入が意図される。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を及ぼすことができる。変異はまた、ゲノム配列の構造またはコードされるmRNAの構造/安定性に影響を及ぼすこともある。
【０１８２】
「変種」とは、反復変種、変種、DNA結合変種、TALE-ヌクレアーゼ変種、親分子のアミノ酸配列中にある少なくとも1つの残基の変異または交換によって得られたポリペプチド変種であることが意図される。
【０１８３】
「機能的変種」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体が意図される。このような変異体は、親タンパク質またはタンパク質ドメインと比較して同じ活性、またはさらなる特性、あるいはより高い活性または低い活性を有してもよい。
【０１８４】
「遺伝子」とは、特定のタンパク質またはタンパク質セグメントをコードする、染色体に沿って直線的に並べられたDNAセグメントからなる遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、典型的に、プロモーター、5'非翻訳領域、1つまたは複数のコード配列（エキソン）、任意で、イントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー、および/またはサイレンサーをさらに含んでもよい。
【０１８５】
本明細書で使用する「遺伝子座」という用語は、染色体上にあるDNA配列（例えば、遺伝子）の特定の物理的な場所である。「遺伝子座」という用語は、染色体上にあるレアカットエンドヌクレアーゼ標的配列の特定の物理的な場所を指すことがある。このような遺伝子座は、本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼによって認識および/または切断される標的配列を含んでもよい。本発明の関心対象の遺伝子座は、細胞の遺伝物質の本体（すなわち、染色体）に存在する核酸配列だけでなく、前記遺伝物質の本体とは独立して存在することができる遺伝物質部分、例えば、非限定的な例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはミトコンドリアなどの細胞小器官の中にある遺伝物質部分も適することが理解される。
【０１８６】
「切断」という用語は、ポリヌクレオチドの共有結合バックボーンの破壊を指す。ホスホジエステル結合の酵素的加水分解または化学的加水分解を含むが、これに限定されない様々な方法によって切断を開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断がいずれも可能であり、二本鎖切断は2つの別個の一本鎖切断事象の結果として発生してもよい。二本鎖DNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッド切断によって平滑末端または付着末端のいずれかが生じる可能性がある。
【０１８７】
「融合タンパク質」とは、元々は別々のタンパク質またはその一部をコードする2種類以上の遺伝子を結合することにある当技術分野において周知のプロセスの結果が意図される。前記「融合遺伝子」が翻訳されると、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する1本のポリペプチドが生じる。
【０１８８】
「同一性」とは、2つの核酸分子間または2つのポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較する目的でアラインメントされ得る各配列中の位置を比較することによって求めることができる。比較配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸を占める時には、これらの分子はその位置で同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、それぞれ、核酸配列またはアミノ酸配列が共有する位置にある同一のヌクレオチドもしくはアミノ酸またはマッチしたヌクレオチドもしくはアミノ酸の数の関数である。2つの配列間の同一性を計算するために、GCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin, Madison, Wis.）の一部として利用可能であり、例えば、デフォルト設定で使用することができるFASTAまたはBLASTを含めて、様々なアラインメントアルゴリズムおよび/またはプログラムが用いられる場合がある。例えば、本明細書に記載の特定のポリペプチドと少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有する、好ましくは、実質的に同じ機能を示すポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。
【０１８９】
「共刺激リガンド」は、T細胞上のコグネイト共刺激分子に特異的に結合し、それによって、一次シグナル、例えば、TCR/CD3複合体と、ペプチドが搭載されたMHC分子との結合によって供給される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むが、これに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを供給する、抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（inducible costimulatory igand）（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これに限定されない。共刺激リガンドはまた、特に、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドなどがあるが、これに限定されない、T細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体も包含する。
【０１９０】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって、増殖などがあるが、これに限定されない細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびTollリガンド受容体が含まれるが、これに限定されない。
【０１９１】
本明細書で使用する「共刺激シグナル」は、TCR/CD3連結などの一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および/または重要な分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを引き起こすシグナルを指す。
【０１９２】
本明細書で使用する「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドに結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、このドメインは細胞表面分子と相互作用することができる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するように選択されてもよい。従って、リガンドとして働き得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス感染症、細菌感染症、および寄生生物感染症、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連する細胞表面マーカーが含まれる。
【０１９３】
本明細書で使用する「対象」または「患者」という用語は、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全メンバーを含む。
【０１９４】
本発明の上記の記載は、当技術分野のどんな当業者でも本発明を作製および使用することができるように、本発明を作製および使用するやり方およびプロセスを提供する。この実施可能性（enablement）は、特に、最初の説明の一部を構成する、添付の特許請求の範囲の対象（subject matter）に向けて提供される。
【０１９５】
数値の限界または範囲が本明細書において述べられている場合、終点が含まれる。数値の限界または範囲の中にある全ての値および部分範囲も、明瞭に書かれているように明確に含まれる。
【０１９６】
本発明を大まかに説明したが、ある特定の実施例を参照することによって理解を深めることができる。実施例は例示のためだけに本明細書で示され、特に定めのない限り、限定することが意図されない。
【実施例】
【０１９７】
実施例1：アルギナーゼ活性に対するT細胞感受性
T細胞がその微小環境におけるアルギナーゼI活性によるアルギニン欠乏に感受性であったことを検証するために、5％ヒトAB血清および20 ng/mlヒトIL2を追加したXcico15培地（96ウェルプレートの1ウェル当たり100 μl）を増加濃度の組換えアルギナーゼI（0.5から1500 ng/μl）と共にインキュベートした。
【０１９８】
4℃にて3日後に、TRAC特異的TALEヌクレアーゼをコードするmRNAで以前にトランスフェクトした（PulseAgile）ヒトT細胞またはRNAでトランスフェクトしていないヒトT細胞を、アルギナーゼ処理した培地で再懸濁した。37℃にて72時間後に、細胞の生存をフローサイトメトリーにより測定した。結果を図2に図示する。
【０１９９】
図2に見られるように、アルギナーゼの濃度が増加し、その結果、培地中のアルギニンの濃度が低下することによって、生存T細胞の劇的な減少が引き起こされる。これらの結果は、TRAC特異的TALEヌクレアーゼで処理したT細胞（KO TRAC）と未処理のT細胞（WT）の両方が、そのインビトロ微小環境におけるアルギニン欠乏に感受性であることを示唆する。
【０２００】
実施例2：TALEヌクレアーゼの使用によるGCN2破壊
ヒトT細胞においてGCN2遺伝子を破壊するように2種類のTALEヌクレアーゼ（GCN2_1およびGCN2_2）を設計した。ヒトGCN2遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼをコードするmRNAを、Cellectis Bioresearch（8, rue de la Croix Jarry, 75013 Paris）に注文した。以下の表2は、各TALEヌクレアーゼによって切断される標的配列を示す。
【０２０１】
（表２）ヒトGCN2遺伝子を標的とするTALEヌクレアーゼ
2017513472.tif 000003
【０２０２】
ヒトT細胞を、前記TALEヌクレアーゼのいずれかをコードするmRNAでトランスフェクトした。対照細胞はRNAでトランスフェクトしなかった。トランスフェクトの3日後、ゲノムDNAを単離し、T7エンドヌクレアーゼアッセイに供し、TALEヌクレアーゼ活性を検出した。結果を図3に図示する。
【０２０３】
図3に見られるように、RNAトランスフェクションなしの試料と比較して低分子バンドの存在によって、両TALEヌクレアーゼの切断活性が明示された。
【０２０４】
GCN2破壊がアルギナーゼによるアルギニン欠乏に対する抵抗性を付与したかどうかを試験するために、TALEN処理したT細胞ならびに対照細胞を、アルギニンを増加濃度で添加しているアルギニンなしで調製したRPMI1640培地中でインキュベートした。37℃にて72 hのインキュベーション後に、細胞の生存をフローサイトメトリーにより測定した。
【０２０５】
図4に見られるように、GCN2 TALENで処理したT細胞は、より低濃度のアルギニンでより優れた生存を示した。これは、破壊されたGCN2遺伝子を有しているために機能型のGCN2タンパク質を発現しない免疫細胞、特にT細胞は、アルギナーゼが分泌されている腫瘍微小環境において免疫抑制に抵抗性をもたらすことを示唆する。
【０２０６】
説明において引用した参考文献のリスト
2017513472.tif 000004
2017513472.tif 000005
【図１】
2017513472.tif 000006
【図２】
2017513472.tif 000007
【図３】
2017513472.tif 000008
【図４】
2017513472.tif 000009
【配列表】
2017513472000001.app
【国際調査報告】
2017513472.tif 000010
2017513472.tif 000011
2017513472.tif 000012
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