(57)【要約】  本発明は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを調節することで血管新生を調節する方法及び物質を提供する。本発明はまた、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを調節する物質が有益となる個体を同定する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを調節する有効量の物質を投与することを含む、血管新生の調節を必要とする個体において血管新生を調節する方法。
【請求項２】
前記物質が核酸、有機低分子、抗体、アプタマー、変異ＷＡＲＳ２又はこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質が、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害することで血管新生を阻害する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記物質が、ＷＡＲＳ２核酸に結合する核酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機低分子がインドールマイシン又はその誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、ＷＡＲＳ２を特異的にターゲットとする低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）及び／又はモルホリノオリゴマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記物質がＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを強化することで血管新生を強化する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記物質がＷＡＲＳ２の発現を指示するベクターである、請求項１、２又は７に記載の方法。
【請求項９】
ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質を投与することを含む、血管新生の阻害を必要とする個体において血管新生を阻害する方法。
【請求項１０】
前記物質が、核酸、有機低分子、抗体、アプタマー、変異ＷＡＲＳ２又はこれらの組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記物質が、ＷＡＲＳ２核酸に結合する核酸である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記有機低分子がインドールマイシン又はその誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が、ＷＡＲＳ２を特異的にターゲットとする低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）及び／又はモルホリノオリゴマーである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記個体が、網膜症、黄斑変性症、がん、肥満又はこれらの組み合わせを抱えている、請求項１〜６又は９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記網膜症が糖尿病性網膜症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記黄斑変性症が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＭＤが滲出型ＡＭＤ又は萎縮型ＡＭＤである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質を投与することを含む、網膜症の治療を必要とする個体において網膜症を治療する方法。
【請求項１９】
前記網膜症が糖尿病性網膜症である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質を投与することを含む、黄斑変性症の治療を必要とする個体において黄斑変性症を治療する方法。
【請求項２１】
前記黄斑変性症が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＭＤが滲出型ＡＭＤ又は萎縮型ＡＭＤである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記物質が核酸、有機低分子、抗体、アプタマー、変異ＷＡＲＳ２又はこれらの組み合わせである、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記物質が、ＷＡＲＳ２核酸に結合する核酸である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が、ＷＡＲＳ２を特異的にターゲットとする低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）及び／又はモルホリノオリゴマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記有機低分子がインドールマイシン又はその誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質を投与することを含む、がん細胞の増殖の阻害を必要とする個体においてがん細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２８】
前記物質が核酸、有機低分子、抗体、アプタマー、変異ＷＡＲＳ２又はこれらの組み合わせである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記物質が、ＷＡＲＳ２核酸に結合する核酸である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記有機低分子がインドールマイシン又はその誘導体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸が、ＷＡＲＳ２を特異的にターゲットとする低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）及び／又はモルホリノオリゴマーである、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記がん細胞が肺がん細胞である、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを強化する有効量の物質を投与することを含む、血管新生の強化を必要とする個体において血管新生を強化する方法。
【請求項３４】
前記物質が核酸、有機低分子、抗体、アプタマー、変異ＷＡＲＳ２又はこれらの組み合わせである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記物質がＷＡＲＳ２の発現を指示するベクターである、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＷＡＲＳ２の活性がＷＡＲＳ、ＥＰＲＳ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬ１４ａ又はこれらの組み合わせとの相互作用を含む、先行の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍の血管新生能の同定を必要とする個体において腫瘍の血管新生能を同定する方法であって、
コントロールと比較した、前記個体から得た１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルを測定することを含み、
前記１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して高いことは、前記個体における低い血管新生能の腫瘍を示し、
前記１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して低いことは、前記個体における高い血管新生能の腫瘍を示す、方法。
【請求項３８】
前記コントロールが、腫瘍を有していない１以上の個体から得た１つ以上のＥＶにおけるＷＡＲＳのレベルである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記個体から前記１つ以上のＥＶを含むサンプルを得ることを更に含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルが前記個体の生体液、前記個体の生体組織又はこれらの組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体液が血液又は血漿である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記個体から１つ以上のＥＶ又はその内容物を得ることを更に含む、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍の同定された血管新生能に基づいて前記個体を治療することを更に含む、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して前記１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物において低いならば、前記個体を、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質で治療する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ以上のＥＶがエキソソームである、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
心血管障害を抱える個体において血管新生能を同定する方法であって、
コントロールと比較した、前記個体から得た１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルを測定することを含み、
前記１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して高いことは前記個体における血管新生能が低いことを示し、
前記１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して低いことは、前記個体における血管新生能が高いことを示す、方法。
【請求項４７】
前記コントロールが、心血管異常を抱えていない１以上の個体から得た１つ以上のＥＶにおけるＷＡＲＳのレベルである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記個体から前記１つ以上のＥＶを含むサンプルを得ることを更に含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記サンプルが前記個体の生体液、前記個体の生体組織又はこれらの組み合わせである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記生体液が血液又は血漿である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記個体から１つ以上のＥＶ又はその内容物を得ることを更に含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記心血管障害の同定された血管新生能に基づいて前記個体を治療することを更に含む、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して前記１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物において高いならば、前記個体を、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを強化する有効量の物質で治療する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ以上のＥＶがエキソソームである、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
抗血管新生治療が、該治療を必要とする個体に有益となるか否かを判断する方法であって、
（ａ）個体の染色体１の全て又は一部のゲノム解析を行うこと、ここで、前記一部がＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣ［Ｃ／Ｇ］ＣＣＣＴＧＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＴＧＡＴＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を含む、及び、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６で少なくとも１つのアレルを検出すること、
を含み、
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６で少なくとも１つのアレルがＧであるならば、抗血管新生治療が前記個体にとって有益となる、方法。
【請求項５６】
前記個体が前記アレルでＧについてホモ接合である（Ｇ：Ｇ）、前記アレルでＧについてヘテロ接合である（Ｇ：Ｃ）又は前記アレルでＣについてホモ接合である（Ｃ：Ｃ）、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
染色体１の前記部分が、染色体１のポジション１１９，５０３，５９３〜１１９，５０４，０９３を含む、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記個体からのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６での前記少なくとも１つのアレルの検出結果をコントロールと比較する、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記コントロールが、抗血管新生治療に応答する、抗血管新生治療に応答しない又はこれらの組み合わせである１以上の個体から得られる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記個体が腫瘍を有する、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記個体からサンプルを得ることを更に含む、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記サンプルが前記個体の生体液、前記個体の生体組織又はこれらの組み合わせから得られる、請求項６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記生体液が血液又は血漿である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６がＧである少なくとも１つのアレルを有する前記個体を抗血管新生治療で治療することを更に含む、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗血管新生治療が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Ｔｉｅ−１受容体（Ｔｉｅ−１Ｒ）、Ｔｉｅ−２受容体（Ｔｉｅ−２Ｒ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＶＥ−カドヘリン又はこれらの組み合わせの阻害を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記個体がヒトである、先行の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
ＷＡＲＳの発現、活性又はこれらの組み合わせを調節する物質を同定する方法であって、
（ａ）評価対象である物質と接触させた細胞、組織及び／又は生物から得た１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）からＷＡＲＳの発現及び／又は活性を測定すること、及び、
（ｂ）（ａ）における前記ＷＡＲＳの発現、活性又はこれらの組み合わせをコントロールと比較すること
を含み、
前記ＷＡＲＳの発現、活性又はこれらの組み合わせが、コントロールと比較して、前記物質の存在下で変化するならば、前記物質はＷＡＲＳの発現、活性又はこれらの組み合わせを調節する、方法。
【請求項６８】
前記コントロールが、前記物質の不在下のＥＶのＷＡＲＳの発現、活性又はこれらの組み合わせである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＥＶのＷＡＲＳの発現、活性又はこれらの組み合わせが、前記コントロールと比較して、前記物質の存在下で低下する、請求項６７又は６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＥＶのＷＡＲＳの発現、活性又はこれらの組み合わせが、前記コントロールと比較して、前記物質の存在下で増加する、請求項６７又は６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞、組織及び／又は生物を前記評価対象である物質と接触させることを更に含む、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
評価対象である物質と接触させた前記細胞、組織及び／又は生物から前記１つ以上のＥＶを得ることを更に含む、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記１つ以上のＥＶがエキソソームである、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞の増殖は各種疾患の病態生理学の中核を成す。例えば、内皮細胞の無制御な増殖の結果としての血管新生は、例えばがん、糖尿病性眼疾患、黄斑変性症及び関節炎において重要な役割を果たす。
【０００２】
病態を見抜き、例えば血管新生に寄与する内皮細胞の増殖を含めた細胞の無制御な増殖に関連がある状態又は疾患を治療する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書で説明するように、ミトコンドリアトリプトファンｔＲＮＡシンセターゼ（ＷＡＲＳ２）が細胞増殖、特には内皮細胞の増殖の調節に一役買っていることが確認されており、これは血管新生に関連がある様々な障害においてはＷＡＲＳ２の調節が有益であることを含意している。本発明は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを、以下に限定するものではないが、本明細書で説明するように、核酸、有機低分子、抗体、アプタマー、変異ＷＡＲＳ２又はこれらの組み合わせを含めた様々な物質（agent）を使用して制御することで血管新生を調節する方法を提供する。
【０００４】
別の態様において、本発明は、内皮細胞以外の細胞、例えばがん性細胞の増殖を調節する方法を提供する。従って、本明細書においては、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを様々な物質を使用して制御することで例えばがん性細胞の増殖を調節する方法について説明する。
【０００５】
また、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせの調節が有益となる可能性がある、例えば腫瘍又は心血管疾患を抱えた個体を同定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
（０００６）−（００３１）
【図１Ａ−Ｃ】３つの独立したタイムポイントでのラットゲノムの冠血流量の遺伝子マッピングから冠血流量を制御するラット染色体２ｑ３４上の１つの座位が同定されることを示す。１Ａ：Ｆ２クロスにおける遺伝子マッピング；Ｙ軸、有意な関連の信頼度（１＝１００％、赤線＝有意性閾値）、Ｘ軸、ラットゲノムにおける位置。１Ｂ：マッピング系統及び追加系統を使用した領域のハプロタイプ絞り込み（ＢＮ＝ブラウンノルウェー、ＳＨＲ＝自然発症高血圧ラット、ＬＥＷ＝ルイスラット、ＷＫＹ＝ウィスター京都ラット）。１Ｃ：座位での遺伝子発現の遺伝的制御。２つの遺伝子が強い遺伝子制御下にあることが判明した（Ｐｅｘ１１ｂ及びＷａｒｓ２）。
【図２Ａ−Ｅ】様々なラット系統における冠血流量を示す。（２Ａ）Ｌｅｗ、ＳＨＲ及びＷＫＹ系統における低流量、（２Ｂ）ＳＨＲ．ＢＮ２コンジェニックにおける低流量のレスキュー。（２Ｃ）ＳＨＲ．ＢＮ２コンジェニックにおける異なる毛細血管密度。（２Ｄ）より低流量のＳＨＲアレルが占める冠血流量（ＣＦ）座位での遺伝子型の遺伝子型特異的な作用。（２Ｅ）ＢＮラット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）（高血流量）における野生型アレルと比較したＳＨＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、Ｌｅｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）及びＷＫＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（低血流量）におけるロイシン残基５３のフェニルアラニン（Ｆ）への変異。マウス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ヒト（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ニワトリ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ショウジョウバエ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ゼブラフィッシュ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）及び戻って酵母（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）からのこの残基の保存を示す。
【図３】ミトコンドリアおける野生型（ＷＴ）及びＬ５３Ｆ  ＷＡＲＳ２の局在及び変異酵素の酵素活性障害を示す。ＷＡＲＳ２の細胞局在の共焦点画像分析。ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）にＷＴ又はＬ５３Ｆ  ＷＡＲＳ２−ＧＦＰをトランスフェクトし、２４時間後、細胞を固定し、透過処理し、抗ｃｏｘ４で標識した（中央の２つのパネル）。ｃｏｘ４で標識したＷＡＲＳ２の共局在を最も右の２つのパネルに示す。バーサイズ＝５μｍ。
【図４】ＷＡＲＳへのＷＡＲＳ２の結合を示し、これはヒトＷＡＲＳ２タンパク質におけるＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）変異により減じられる作用であり、すなわちＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）のＷＡＲＳへの結合は弱くなる。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のトランスフェクションをベクターなし（ＭＯＣＫ）、ｆｌａｇタグ野生型ＷＡＲＳ２（ＷＴ）又はｆｌａｇタグＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）変異体（ＭＵＴ）で行い、免疫沈降させたｆｌａｇタンパク質をＷＡＲＳとの相互作用について分析した。
【図５】ＨＵＶＥＣ細胞培地においてＷＡＲＳ２がＷＡＲＳ分泌を調節することを示す。ｓｉＲＮＡを使用したＷＡＲＳ２遺伝子サイレンシング（上）により、ＩＦＮガンマ刺激に応答したＷＡＲＳ分泌が増加する。対照的に、アデノウイルスベクターを使用したＷＡＲＳ２過剰発現（下）はＷＡＲＳ分泌を阻害する。
【図６Ａ−Ｂ】図６ＡはＷＡＲＳ２サイレンシング（ｓｉＷＡＲＳ２）がスプライシングのＷＡＲＳ転写発現に影響しないことを示す。図６Ｂはベースライン及び続くＩＦＮ−ガンマ刺激後の内皮細胞におけるＷＡＲＳ細胞内局在を示す。
【図７】ＷＡＲＳ２がＧＡＩＴ複合体の成分に結合することを示し、これはＬ５３Ｆ変異体ではみられない作用である。ＨＵＶＥＣ細胞にＦｌａｇタグＷＡＲＳ２又はＦｌａｇタグＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）をトランスフェクトし、ｆｌａｇ精製画分をＧＡＩＴ複合タンパク質との相互作用についてブロットした。
【図８】ＷＡＲＳ２の過剰発現が、阻害物質ＭＧ１３２の添加により可逆である、重要なＧＡＩＴ成分ＲＰＬ１３ａのプロテオソーム分解を引き起こすことを示す。変異ＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）はＬ１３ａの発現に影響しない。
【図９】ＷＡＲＳがＨＵＶＥＣからエキソソームにおいて媒質に分泌されることを示し、これはブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）により阻害されない作用である。ＡｎｎｅｘＡ２＝アネキシンＡである。
【図１０】Ｗａｒｓ２開始コドン（ＡＴＧ  ＭＯ）に対するモルホリノを使用したゼブラフィッシュＷａｒｓ２遺伝子のサイレンシングの用量依存的効果を示す。この効果はヒトＷＡＲＳ２タンパク質の過剰発現により元に戻った。
【図１１】Ｗａｒｓ２開始コドンに対するモルホリノを使用したゼブラフィッシュＷａｒｓ２遺伝子のサイレンシングの血流量（左上）、生存率（右上）及び心臓機能（左下）への用量依存的効果を示す。ＣＯ＝心拍出；ｄｐｆ＝受精後経過日数；バー、平均；エラーバー、ＳＥＭ。
【図１２】Ｗａｒｓ２を阻害したＦｌｋ−ＧＦＰフィッシュにおける異常な血管形成及び用量依存的効果の定量化（左下）を示す。
【図１３】ラットＷＡＲＳ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、マウスＷＡＲＳ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及びヒトＷＡＲＳ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のアミノ酸配列のアラインメント。強調した配列「ＰＴＧＩＰＨＬＧＮＹＬＧＡ」は、変異ＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）において変異したリジン残基Ｌの位置を示す。
【図１４】ヒトＷＡＲＳ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のｃＤＮＡ配列を示す。強調した配列はｓｉＲＮＡがターゲットとする領域である。
【図１５】３つの異なるＷＡＲＳ２  ｓｉＲＮＡの存在下でのＨＥＫ２９３細胞におけるＷＡＲＳ２  ｍＲＮＡの発現のノックダウンを示す棒グラフである。
【図１６】ＷＡＲＳ２発現を制御するＷＡＲＳ２  ＳＮＰはヒト血漿におけるＷＡＲＳレベルも制御することを示すグラフである。**、Ｐ＜０．０１。
【図１７】ＷＡＲＳがエキソソームにおいて分泌されること、またＷＡＲＳ２の発現はＷＡＲＳを細胞において捕捉することでこれらのエキソソームの分泌を阻害することを示す共焦点イメージングである。コントロールウイルス（Ａｄ．コントロール、左のパネル）又はＷＡＲＳ２を発現しているウイルス（Ａｄ．ＷＡＲＳ２、右のパネル）を感染させたＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）で刺激し、次に染色した。コントロール細胞において、細胞の原形質膜からのＷＡＲＳを含有する膜結合エキソソーム／マイクロベシクルの発芽が見られる（矢印）。対照的に、ＷＡＲＳ２感染細胞においては大量のＷＡＲＳが原形質膜で蓄積したが（＊）、エキソソームでは蓄積しなかった。
【図１８Ａ−Ｂ】Ｚｎフィンガーヌクレアーゼを使用したブラウンノルウェー（ＢＮ）ラットにおけるＷａｒｓ２の効果的なターゲティングを示す。図１８Ａは、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼを使用して作り出した野生型ＢＮ（Ｗａｒｓ２+/+）及びヘテロ接合型遺伝子ターゲットＢＮ（Ｗａｒｓ２-/+）ラットにおける８ｂｐ欠失のジェノタイピングを示す。レーン１、ホモ接合野生型Ｗａｒｓ２+/+、レーン２〜６、ヘテロ接合型Ｗａｒｓ２-/+、レーン７、マーカー（５０ｂｐ、１００ｂｐ及び１５０ｂｐ）。図１８Ｂは、ＢＮ及びＦ１（Ｗａｒｓ２-/+）及びＦ１（Ｗａｒｓ２-/L53F、複合低形質）ラットにおけるＷａｒｓ２の遺伝子発現を示す。*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．０１；***、Ｐ＜０．００１。
【図１９Ａ−Ｃ】ラットでのインビボデータであり、ヌクレアーゼ技術を用いたラットＷａｒｓ２のターゲティングによる血管密度へのＺｎフィンガーヌクレアーゼ媒介作用を示す。図１９Ａは、Ｗａｒｓ２が低い場合に毛細血管密度は低いことを示す。図１９Ｂは、Ｗａｒｓ２が低い場合、心臓における毛細血管面積は狭いことを示す。図１９Ｃは、毛細血管密度に左右される冠血流量は、低Ｗａｒｓ２の心臓においては低いことを示す。バー、平均；エラーバー、ＳＥＭ。**、Ｐ＜０．０１；***、Ｐ＜０．００１。
【図２０Ａ−Ｂ】他のＷＡＲＳ２活性阻害モードを示す。図２０Ａは、インドールマイシンがヒトミトコンドリアＷＡＲＳ２を阻害するがヒト細胞質ＷＡＲＳ活性を阻害しないことを示す。図２０Ｂは、Ｗａｒｓ２変異ラット（Ｌ５３Ｆ変異を有する）における活性の低下を示す。**、Ｐ＜０．０１；***、Ｐ＜０．００１。
【図２１】コレステロール修飾ｓｉＲＮＡを使用した目におけるＷａｒｓ２のインビボノックダウンを示す。「ＮＴ」は非ターゲティングｓｉＲＮＡを示す。データは、３匹のラットで得られた結果の平均である。**、Ｐ＜０．０１。
【図２２Ａ−Ｆ】血管新生のインビトロモデルにおけるＷＡＲＳ２の作用を示す。図２２Ａ〜Ｃは、低下したＥＣ管腔形成で実証されるようにＷＡＲＳ２機能喪失を示す。図２２Ｄ〜Ｆは、ＧＦＰと比較した場合の、アデノウイルス（Ａｄ）媒介ＷＡＲＳ２過剰発現を用いたＷＡＲＳ２機能獲得を示す。ＥＣ管腔総数（図２２Ａ及び２２Ｄ）、ＥＣ管腔全長（図２２Ｂ及び２２Ｅ）及び総分岐点数（図２２Ｃ及び２２Ｆ）。バー、平均；エラーバー、ＳＤ。***、Ｐ＜０．００１。
【図２３Ａ−Ｂ】ＷＡＲＳ２阻害のＥＣ形態及び細胞数への影響を示す。図２３Ａは、ｓｉＮＴ又はｓｉＷＡＲＳ２をトランスフェクトし、アクチン（左）、ミトコンドリア（中央）について染色した超高解像度の顕微鏡画像、核染色した重ね合わせ画像（右）を示す（スケールバー＝２５μｍ）。ｓｉＷＡＲＳ２の存在下、アクチンストレス線維は実質的に全て消失し、細胞の縁はフリル様の外見を呈し（左及び右のパネル）、ミトコンドリアは塊状になる（中央及び右のパネル）。図２３Ｂは、ｓｉＮＴ又はｓｉＷＡＲＳ２で７２時間にわたるトランスフェクションを行った培地のＥＣ数を示す。バー、平均；エラーバー、ＳＤ。*、Ｐ＜０．０１、***、Ｐ＜０．００１。
【図２４Ａ−Ｂ】ＷＡＲＳ２阻害の細胞周期への影響を示す。図２４Ａは、内皮細胞（ＥＣ）におけるＷＡＲＳ２のｓｉＲＮＡ媒介阻害が２つ以上の不完全に分離した核を持つ複数の細胞をもたらすことを示す。核（矢印の頭）（バー＝５０μｍ）。図２４Ｂは、非ターゲティングｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ）又はＷＡＲＳ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＷＡＲＳ２）で処理した増殖中のＥＣにおける細胞周期のＦＡＣＳ分析である。結果は、ｓｉＷＡＲＳ２でのＳ期におけるＥＣの有意な減少及びＧ２／Ｍ期における増加を示す（１９．６２％から３０．８１％への４Ｎ増加としてみられる）。実験は繰り返され（ｎ＝３）、同様の結果が得られた。
【図２５】Ｗａｒｓ２の阻害が乳がん血管新生モデルにおいて血管の成長を防止することを示す。矢印は、正常なＷａｒｓ２を発現している動物由来の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）マトリゲルプラグ内への血管成長領域を示す。対照的に、Ｗａｒｓ２（Ｌ５３Ｆ）変異を抱えた動物由来のプラグ内への成長は事実上みられない。
【図２６】Ａ５４９肺がん細胞株の細胞増殖はＷＡＲＳ２の発現低下により抑えることができることを示す。データは３つの実験の平均である。標準偏差バーを示す。「***」はＰ＜０．００５で有意であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（００３２）
本発明の実施形態例について説明する。
【０００８】
（００３３）
本明細書で説明するように、実験ラットクロス（ブラウンノルウェーｘ自然発症高血圧ラットＦ２個体群）において、冠血流量の遺伝的決定因子をマッピングし、心臓における血流量を遺伝的に制御するラット染色体２上の座位を同定した。毛細血管密度が低下したコンジェニックラットにおいてその影響を確認した。ハプロタイプマッピング及びｅＱＴＬ分析によりその座位での候補遺伝子としてトリプトファンｔＲＮＡシンセターゼ２（Ｗａｒｓ２、ミトコンドリア局在）が優先され、Ｗａｒｓ２のシーケンシングにより高度に保存されたＡＴＰ結合ドメインにおけるＬ５３Ｆ変異を同定した（図１３を参照のこと）。
【０００９】
（００３４）
アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼはヘテロ二量複合体を形成することができ、ＷＡＲＳ２はＷＡＲＳに結合することが観察されており、ＷＡＲＳは、切断、分泌されると、ＶＥＧＦＡシグナル伝達及び血管新生を阻害する。ＷＡＲＳ２のＷＡＲＳへの結合はＬ５３Ｆ変異形態においてはおおむね無効となった。ＩＦＮ−γ刺激内皮細胞において、ＷＡＲＳ２過剰発現は抗血管新生ＷＡＲＳフラグメントの分泌を制限したが、ＷＡＲＳ２ノックダウンはその放出を増加させた。ＷＡＲＳは非標準的な分泌を示し、本発明で実証されたように、ＷＡＲＳはエキソソームで分泌された。ＷＡＲＳは殆どがサイトゾルに局在し、ＷＡＲＳの増加がミトコンドリア区画で見られ、ＷＡＲＳ細胞内保持及び切断の減少がＷＡＲＳ２過剰発現下で観察された。ゼブラフィッシュモデルにおいて、Ｗａｒｓ２のモルホリノ媒介阻害は血管管腔形成化の低下、動脈構造体の妨害及び心臓機能障害を引き起こした。更に、本明細書で説明するように、ＷＡＲＳ２活性又は発現の阻害は、内皮細胞の増殖の低下を引き起こす。
【００１０】
（００３５）
すなわち、本明細書で示すデータから、ＷＡＲＳ２が血管新生を調節するための新規な遺伝子として同定される。実際、ＷＡＲＳ２酵素活性部位及びＷＡＲＳへの結合が血管形成に影響する。本明細書で示すように、ＷＡＲＳ２の生物学的なターゲティングは、ＷＡＲＳの細胞外小胞（例えば、エキソソーム）の分泌、また内皮細胞の増殖を調節し、この作用を用いることで個体（例えば、ヒト）の疾患、例えばがん、とりわけＷＡＲＳ２が関与している乳がん、眼疾患及び代謝異常、例えば肥満（このような疾患にはＷＡＲＳ２変異が関与している）における異常な血管新生を阻害することができる。本明細書で示すデータは、ＷＡＲＳ２の変異がＷＡＲＳの機能、内皮細胞増殖、従って血管新生に非常に大きく影響し得ることを実証している。
【００１１】
（００３６）
別の態様において、本明細書で示すデータから、ＷＡＲＳ２の阻害ががん細胞数の有意な減少ももたらすことがわかり、これは本質的に、例えばガン性細胞の増殖調節を含め、内皮細胞を超えて細胞増殖の調節において広い役割を担っていることを示している。
【００１２】
（００３７）
本明細書において、用語「ＷＡＲＳ２」は、ミトコンドリアアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを指す。アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼはｔＲＮＡのその同族のアミノ酸へのアミノアシル化を触媒する。具体的には、「ＷＡＲＳ２」はミトコンドリアトリプトファンｔＲＮＡシンセターゼである。トリプトファン−ｔＲＮＡシンセターゼには、ＷＡＲＳと称される細胞質形態とＷＡＲＳ２と称されるミトコンドリア形態の２つの形態がある。
【００１３】
（００３８）
本明細書において、例えばＷＡＲＳ２のヒト形態は全て大文字で示し、ＤＮＡ／ＲＮＡ形態はイタリック体
【化１】
2017514888.tif 000002
で記載され、タンパク質形態はイタリック体にしない（ＷＡＲＳ２）。概して、非ヒト形態（例えば、マウス又はラット）では１文字目以外を小文字でＷａｒｓ２と記載し、ＤＮＡ／ＲＮＡ形態はイタリック体
【化２】
2017514888.tif 000003
で記載され、タンパク質形態はイタリック体にしない（Ｗａｒｓ２）。
（なお、本件外国語特許出願の翻訳文では、上述のイタリック体表示を、下線付の表示、すなわち「ＷＡＲＳ２」又は「Ｗａｒｓ２」として記載する。）
【００１４】
（００３９）
従って、一態様において、本発明は、それを必要とする個体において血管新生を調節する方法を対象とし、この方法は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを調節する有効量の物質を投与することを含む。
【００１５】
（００４０）
本明細書において、「血管新生」とは、血管を形成する内皮細胞の増殖のことである。
【００１６】
（００４１）
本明細書において、血管新生の「調節」とは血管新生を変化させることである。例えば、血管新生の調節方法は、血管新生の阻害、強化又は維持を含む。従って、別の態様において、本発明は、それを必要とする個体において血管新生を阻害する方法を対象とし、この方法は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質を投与することを含む。
【００１７】
（００４２）
幾つかの態様において、血管新生の阻害方法は、１種以上の状態又は疾患により引き起こされる又はその結果として起きる血管新生の阻害に用いることができる。例えば、この方法を用いて網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）又は黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、例えば滲出型ＡＭＤ又は萎縮型ＡＭＤ）を患っている個体において血管新生を阻害することができる。あるいは、血管新生の阻害方法は、がん（例えば、腫瘍の成長を支えている血管の成長を阻害すること）（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８６：３４６−３５２（２０１２）；Ａｂｅｒｇ，ＵＷＮ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６ｅ：２５７２０（２０１１）；Ｄａｍａｓｃｅｎｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２３  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ３−９（２０１１）；Ｈｕａｎａ  Ｃ−Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８ｅ：７６４２１（２０１３））又は代謝異常、例えば肥満（Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４２：９４９−９６０（２０１０）；Ｒｏｓｅｎ  ＥＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５６：２０−４４（２０１４）；Ｋｏｚａ，ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５：３４４８６−３４４９２（２０００））の血管新生の阻害に用いることができる。
【００１８】
（００４３）
他の態様において、本発明は、それを必要とする個体において網膜症を治療する方法を対象とし、この方法は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質を投与することを含む。特定の態様において、網膜症は糖尿病性網膜症である。
【００１９】
（００４４）
更に別の態様において、本発明は、それを必要とする個体において黄斑変性症（例えば、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ）を治療する方法を対象とし、この方法は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質の投与を含む。
【００２０】
（００４５）
他の態様において、本発明は、それを必要とする個体において血管新生を強化する方法を対象とし、この方法は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを強化する有効量の物質を投与することを含む。
【００２１】
（００４６）
幾つかの態様において、血管新生を強化する方法は、移植（例えば、臓器移植）又は創傷治癒の最中又は後である、あるいは各種心血管疾患に罹患している個体における血管新生の強化に用いることができる。
【００２２】
（００４７）
本明細書において、「心血管疾患」には、以下に限定するものではないが、狭心症、心筋梗塞、心不全、アテローム性動脈硬化症及び血管肉腫が含まれる。
【００２３】
（００４８）
別の態様において、本明細書で説明するように、ＷＡＲＳ２の調節は、内皮細胞以外の細胞（例えば、がん性細胞）の増加（成長）を調節することができる。特に、ＷＡＲＳ２の発現又はＷＡＲＳ２の活性の阻害はがん性細胞の数を減少させることができる。従って、本発明は、それを必要とする個体においてがん細胞の増殖を調節する方法を対象とし、この方法はＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを調節する有効量の物質を投与することを含む。本明細書において、「がん細胞の増殖」とは、本質的にがん細胞の増加のことである。
【００２４】
（００４９）
本明細書において、がん細胞の増殖の「調節」とは、がん細胞の増加能を変化させることである。例えば、がん細胞の増殖を調節する方法は、がん細胞の増加を阻害、強化又は維持することを含む。
【００２５】
（００５０）
特定の態様において、本発明は、それを必要とする個体においてがん細胞の増殖を阻害する方法を対象とし、この方法は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質を投与することを含む。
【００２６】
（００５１）
本明細書で説明するように、本発明の方法で使用する物質は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを調節（例えば、阻害、強化）する。ＷＡＲＳ２の活性には、ＷＡＲＳ２と１種以上のパートナーとの相互作用（例えば、結合）が含まれる。例えば、本明細書で示すように、ＷＡＲＳ２はＷＡＲＳ及びＧＡＩＴ（Ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）複合体のタンパク質と相互作用する。ＷＡＲＳ２と相互作用するＧＡＩＴ複合体のタンパク質の具体例には、グルタミル−プロリルｔＲＮＡシンセターゼ（ＥＰＲＳ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びリボソームタンパク質Ｌ  １３ａ（ＲＰＬ１３ａ）が含まれる。従って、幾つかの態様において、本発明の方法で使用する物質は、ＷＡＲＳ２及びＷＡＲＳ、ＥＰＲＳ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬ１３ａ又はこれらの組み合わせとの相互作用を調節する。
【００２７】
（００５２）
多種多様な物質のいずれをも本発明で提供する方法において使用することができる。例えば、この物質は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、有機低分子、抗体、アプタマー、変異ＷＡＲＳ２又はこれらの組み合わせになり得る。そのような物質を、例えば本明細書で例示する方法に従って速やかに試験して、この物質がＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせへの望ましい作用（例えば、阻害又は活性化／強化）を有するか否かを評価し得る。
【００２８】
（００５３）
特定の態様において、この物質は、ＷＡＲＳ２の全て若しくは一部をコードする核酸に結合する、ＷＡＲＳ２の発現を制御する、ＷＡＲＳ２と相互作用する（例えば、結合する）ポリペプチドの全て若しくは一部をコードする及び／又はＷＡＲＳ２と相互作用するポリペプチドの発現を制御する核酸である。ＷＡＲＳ２と相互作用するポリペプチドの発現又はＷＡＲＳ２それ自体の発現を制御するそのような核酸の例には、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アプタマー及び／又はモルホリノオリゴマーが含まれる。他の態様において、この物質は、ＷＡＲＳ２の発現を指示するベクター及び／又はＷＡＲＳ２と相互作用する（例えば、結合する）ポリペプチドである。一態様において、この物質は、ＷＡＲＳ２の過剰発現を指示するベクターである。本発明での使用に適した抑制核酸及びそのような核酸の設計方法の追加例は、当業者ならばすぐに利用可能である。例えば、米国特許出願公開第２０１５／００１７０９１号明細書を参照のこと。特定の態様において、この物質は、本明細書で例示するように、ＷＡＲＳ２の発現を低下させる又は阻害するｓｉＲＮＡである。一態様において、ＷＡＲＳ２を対象としたｓｉＲＮＡ対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０及び５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２及び５３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４及び５５である。別の態様において、Ｗａｒｓ２を対象としたｓｉＲＮＡ対はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８及び４９である。
【００２９】
（００５４）
さらなる態様において、この物質は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせに直接又は間接的に影響する有機低分子である。ＷＡＲＳ２の発現及び／又はＷＡＲＳ２の活性を調節できる有機低分子は標準的な方法を用いて用意し得て、本明細書で例示したアッセイで説明した通りである。ＷＡＲＳ２発現及び／又はＷＡＲＳ２活性がコントロールと比較してこの物質の存在下で変化するならば、この物質はＷＡＲＳ２発現及び／又はＷＡＲＳ２活性を調節する。一態様において、この物質はインドールマイシン又はその効果的な誘導体である。
【００３０】
（００５５）
他の態様において、この物質は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせに直接又は間接的に影響する抗体である。適切なターゲットを対象とした抗体及びその活性なフラグメントの同定、単離及び産生方法は、当該分野で確立され且つ周知である。文脈に反さない限り、「抗体」という語は最も広い意味で使用され、具体的には、ＷＡＲＳ２を認識し結合する限り、抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）及び抗体フラグメントをその範囲に含む。抗体分子は通常単一特異的であるが、異種特異的又は多特異性として描かれる場合もある。抗体分子は、特異的結合部位で抗原上の特異的抗原決定基又はエピトープに結合する。「抗体フラグメント」には完全長抗体の一部、概してその抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖフラグメント、二重特異性抗体、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体分子並びに抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が含まれる。従って、一態様において、この物質は、ＷＡＲＳ２に結合し且つその活性を例えばＷＡＲＳへのその結合を調節することで調節する抗体である。他の態様において、抗体はＷＡＲＳ２の発現を調節するタンパク質をターゲットとし結合することでＷＡＲＳ２を間接的に調節し得る。抗体がＷＡＲＳ２の発現又はＷＡＲＳ２の活性に及ぼす影響をスクリーニングする方法は標準的な方法を用いて成し遂げ得て、本明細書で例示したアッセイで説明した通りである。
【００３１】
（００５６）
ポリクローナル抗体を用意する方法は当業者ならばすぐに利用可能である。例えば、Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．），ｐ．１−５（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．４．１（１９９２）を参照のこと。モノクローナル抗体を用意する方法も同様に当業者ならば利用可能である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．５．１−２．６．７及びＨａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐ．７２６（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂ．（１９８８））を参照のこと。これらの文献は参照により本明細書に援用される。モノクローナル抗体は、各種の確立された技法によりハイブリドーマ培養物から単離及び精製することができる。このような単離技法には、タンパク質Ａセファロースを使用したアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．７．１−２．７．１２，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．９．１−２．９．３；Ｂａｒｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐ．７９−１０４（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）を参照のこと。モノクローナル抗体のインビトロ及びインビボでの処理方法も当業者は利用可能である。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法で作製し得る。あるいは、例えば米国特許第４８１６５６７号明細書に記載されるような遺伝子組み換え法により作製し得る。また、本発明で使用するためのモノクローナル抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリから単離し得る。加えて、遺伝子組み換え手段によりモノクローナル抗体をヒト化してヒト特異的且つ認識可能配列を含む抗体を作り出すことは周知である。例えば、概説に関しては、Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２１９２−２２０１（１９９７）及びＶａｓｗａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１０５−１１５（１９９８）を参照のこと。
【００３２】
（００５７）
別の態様において、この物質は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせに直接又は間接的に影響するアプタマーである。「アプタマー」とは、目的の特定の分子に高い親和性及び特異性でもって結合可能な核酸分子のことである。アプタマーは典型的には、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）として知られる公知のインビボ又はインビトロの選択技法を用いることで特定のリガンドに結合するように開発される。アプタマーの作製方法は、例えばＥｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８（１９９０）；Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５（１９９０）；米国特許第５５８２９８１号明細書、ＰＣＴ公報ＷＯ００／２００４０；米国特許第５２７０１６３号明細書；Ｌｏｒｓｃｈ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：９７３（１９９４）；Ｍａｎｎｉｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：９７２６（１９９７）；Ｂｌｉｎｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：３６０６−３６１０（１９９９）；Ｈｕｉｚｅｎｇａ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：６５６−６６５（１９９５）；ＰＣＴ公報ＷＯ９９／５４５０６；ＷＯ９９／２７１３３；ＷＯ９７／４２３１７及び米国特許第５７５６２９１号明細書に記載されている。アプタマーは、本発明において適宜、ＷＡＲＳ２の発現を活性化若しくは阻害するために又は直接ＷＡＲＳ２に結合させてその活性を調節するために使用し得る。アプタマーをスクリーニング及び設計する方法は確立されており、当業者はすぐに利用可能である。
【００３３】
（００５８）
更に別の態様において、この物質は、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせに影響する変異ＷＡＲＳ２である。例えば、本明細書で説明するように、Ｌ５３Ｆ置換を有するＷＡＲＳ２変異体は、ＷＡＲＳに結合する野生型ＷＡＲＳ２を調節する。従って、ＷＡＲＳ２活性を阻害したいならば（例えば、内皮細胞の増殖を阻害することで血管新生を阻害する又はがん性細胞の増殖を阻害するために）、Ｌ５３Ｆ変異型のＷＡＲＳ２を担持しているベクターをインビボで、公知の遺伝子導入方法でターゲティングし得る（例えば、米国特許第８７４１２７９号明細書及びＲａｍａｍｏｏｒｔｈ  Ｍ  ａｎｄ  Ｎａｒｖｅｋａｒ  Ａ．Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ−ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１−６．ｄｏｉ：１０．７８６０／ＪＣＤＲ／２０１５／１０４４３．５３９４．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｊａｎ  １を参照のこと）。別の態様において、ＷＡＲＳ２の発現は、公知のターゲット遺伝子破壊法を用いて、インビボで腫瘍において全て中断させ得る。
【００３４】
（００５９）
特定の作用機序に限定することを望むものではないが、本明細書で提示したデータは、ＷＡＲＳ２が、１つ以上の機序を通じて内皮細胞の増殖（及び従って血管新生）のモジュレータとして作用することを示唆している。例えば、ＷＡＲＳ２の阻害は内皮細胞の遊走及び分裂に必要なストレスファイバーの劇的な喪失につながる。ストレスファイバーを欠くと内皮細胞の増殖及び血管の形成（血管新生）が阻害及び／又は妨げられ得る。核の分離は不完全となり、Ｇ２／Ｍ期における細胞の蓄積がみられる。分裂できないことは最終的には細胞死につながる。同様に、ＷＡＲＳ２は、不完全な細胞分裂の結果として、他の細胞タイプ、例えばがん性細胞の増殖のモジュレータとして作用し得る。
【００３５】
（００６０）
加えて、ＷＡＲＳ２は、ミトコンドリアにおけるエネルギー生産に悪影響を及ぼすことで機能し得る。ＷＡＲＳ２を阻害すると酸素の消費が顕著に減少する。細胞の遊走及び分裂に必要なエネルギーの損失も同様に、細胞が分裂できず、分裂がＧ２／Ｍ期で停止し、最終的に細胞死につながる。両方のケースにおいて、結果は、内皮細胞の分裂及び増殖による血管形成の失敗を背景とした血管新生の阻害である。本明細書で示すデータは、阻害されたＷＡＲＳ２の存在下、内皮細胞管腔の形成は著しく減少することを実証している。がん性細胞の場合は、結果は細胞死及びがん性細胞の増殖低下である。
【００３６】
（００６１）
ここでもまた、特定の作用機序に限定することを望むものではないが、本明細書で示す他のデータは、ＷＡＲＳ２が、エキソソームからのＷＡＲＳと相互作用しその分泌を阻害することで血管新生のモジュレータとして作用することを示唆している。本明細書に記載の実験において、ＷＡＲＳ２機能獲得はＷＡＲＳ分泌を減少させた。ＷＡＲ分泌における減少は、血管新生に下流効果があると予測される。
【００３７】
（００６２）
従って、他の態様において、本発明は、それを必要とする個体において腫瘍の血管新生能を同定する方法を対象とする。本明細書において、腫瘍の「血管新生能」とは、腫瘍に侵入して例えば栄養分及び酸素を供給し並びに／又は老廃物を腫瘍から除去する血管が増殖することで身体が腫瘍の成長を刺激する能力のことである。特定の態様において、腫瘍の血管新生能とは、腫瘍が組織に浸潤する（浸潤能）及び／又は転移する（転移能）（例えば、腫瘍部位に近い又は遠い組織）能力のことである。
【００３８】
（００６３）
一態様において、本発明の方法は、コントロールと比較した、個体から得た１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）、例えば１つ以上のエキソソーム及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルを測定することを含む。１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して高いことは、腫瘍に侵入する（例えば、栄養分及び酸素を供給し並びに／又は老廃物を腫瘍から除去する）血管が増殖しにくいこと、すなわち個体における低い血管新生能の腫瘍を示す。１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して低いことは、腫瘍に侵入する（例えば、栄養分及び酸素を供給し並びに／又は老廃物を腫瘍から除去する）血管が増殖し易いこと、すなわち個体における高い血管新生能の腫瘍を示す。本発明の方法は、１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物を個体から得ることを更に含み得る。
【００３９】
（００６４）
特定の態様において、それを必要とする個体において腫瘍の血管新生能を同定する方法は、１つ以上のＥＶ（例えば、エキソソーム）及び／又はその内容物を個体から得て、コントロールと比較したその１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルを測定することを含む。１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して高いことは、腫瘍に侵入する血管が増殖しにくいこと、すなわち個体における低い血管新生能の腫瘍を示す。１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して低いことは、腫瘍に侵入する血管が増殖し易いこと、すなわち個体における高い血管新生能の腫瘍を示す。
【００４０】
（００６５）
本明細書において、細胞外小胞（ＥＶ）は、（１つ以上の）細胞から放出（例えば、分泌）される小胞である。特定の態様において、ＥＶはエキソソームであり、殆どの細胞タイプで分泌される（例えば、インビボ、インビトロ）エンドサイトーシス由来の約３０〜１００ｎｍの膜小胞である。更に別の態様において、ＥＶはエクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）であり、殆どの細胞タイプで分泌される（例えば、インビボ、インビトロ）エンドサイトーシス由来の約１００〜１０００ｎｍの膜小胞である。ＥＶはインビボで体液（例えば、血液、尿、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳）及び組織でもみられる。ＥＶ及び１つ以上のＥＶの内容物を得て分析する方法は当業者に公知である。例えば２０１３年９月３日にオンラインで発行されたＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍを参照のこと（この文献は全て本明細書に援用される）。特定の態様において、１つ以上のＥＶを単離、精製、実質的に精製及び／又は部分的に精製する。
【００４１】
（００６６）
腫瘍の血管新生能を同定する方法は、１つ以上のＥＶを含むサンプル（生体サンプル）を得ることを更に含み得る。このサンプルは、生体液、生体組織又はこれらの組み合わせから得られる。本発明の方法で使用するための生体サンプルの例には、生体液（例えば、血液、血清、尿、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳）及び生体組織（例えば、臓器組織、腫瘍組織）等が含まれる。
【００４２】
（００６７）
腫瘍の血管新生能を同定する方法は、腫瘍の血管新生能に基づいて個体を治療することを更に含み得る。例えば、この方法は、高い血管新生能の腫瘍を有する個体を、抗血管新生治療及び／又は抗血管新生治療以外の治療で治療することを更に含み得る。あるいは、この方法は、低い血管新生能の腫瘍を有する個体を、抗血管新生治療以外の治療（例えば、血管新生を阻害しない化学療法薬）で治療すること、あるいは個体を抗血管新生治療及び抗血管新生治療以外の治療で治療することを更に含み得る。特定の態様においては、１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して低下したならば、個体を、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質で治療する。当業者には明白であるように、腫瘍の血管新生能を同定する方法では多種多様なコントロールを使用できる。一態様において、コントロールは、腫瘍を有していない１人（匹）以上の個体から得られた１つ以上のＥＶ（例えば、腫瘍を有していない個体、例えば１人（匹）以上の健康な個体からのＥＶを含む１つ以上のサンプル）におけるＷＡＲＳのレベルである。
【００４３】
（００６８）
本発明の別の態様において、心血管障害を抱える個体において血管新生能を同定する方法を提供する。本明細書において、ある心血管状態の「血管新生能」とは、身体が、心臓に冠血流を送る血管を増殖させることで心血管応答を調節（すなわち、増加又は減少）する能力のことである。
【００４４】
（００６９）
一態様において、本発明の方法は、コントロールと比較した、心血管障害を抱える個体から得た１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）、例えば１つ以上のエキソソーム及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルを測定することを含む。１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して高いことは、個体における血管新生能が低い又は低下したこと、従って例えば狭心症又は心不全につながり得る、心臓への冠血流量の少なさを示す。１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物におけるＷＡＲＳのレベルがコントロールと比較して低いことは、個体における血管新生能が高い又は上昇したこと、これが例えばアテローム性動脈硬化症の増加につながり得ることを示す。特定の態様において、高い又は上昇した血管新生能は、脂肪細胞の成長の結果としての肥満に関連している。この方法は、１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物を個体から得ることも更に含み得る。
【００４５】
（００７０）
特定の態様において、心血管障害を抱える個体において血管新生能を同定する方法は、１つ以上のＥＶ（例えば、エキソソーム）及び／又はその内容物を個体から得て、その１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物における、コントロールと比較したＷＡＲＳのレベルを測定することを含む。コントロールは、心血管異常（cardiovascular condition）を抱えていない１人（匹）以上の個体から得られた１つ以上のＥＶにおけるＷＡＲＳのレベルになり得る。
【００４６】
（００７１）
心血管障害を抱える個体において血管新生能を同定する方法は、１つ以上のＥＶを含むサンプル（生体サンプル）を得ることを更に含み得る。このサンプルは、生体液、生体組織又はこれらの組み合わせから得られる。本発明の方法で使用するための生体サンプルの例には、生体液（例えば、血液、血清、尿、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳）及び生体組織（例えば、臓器組織、腫瘍組織）等が含まれる。
【００４７】
（００７２）
心血管障害を抱える個体において血管新生能を同定する方法は、心血管障害を抱える個体の同定した血管新生能に基づいて個体を治療することを更に含み得る。例えば、この方法は、コントロールと比較して低い又は低下した血管新生能の心血管状態を抱える個体を適切な治療薬で治療することで狭心症又は心不全を軽減又は予防することを更に含み得る。別の例において、この方法は、コントロールと比較して高い又は上昇した血管新生能の心血管状態を抱える個体を適切な治療薬で治療することでアテローム性動脈硬化症の影響を軽減又は予防することを更に含み得る。特定の態様においては、ＷＡＲＳのレベルが１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物においてコントロールと比較して高いならば、例えば狭心症又は心不全を治療するために、個体を、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを強化する有効量の物質で治療する。他の態様においては、ＷＡＲＳのレベルが１つ以上のＥＶ及び／又はその内容物においてコントロールと比較して低いならば、例えばアテローム性動脈硬化症の影響を制御するために、個体を、ＷＡＲＳ２の発現、ＷＡＲＳ２の活性又はこれらの組み合わせを阻害する有効量の物質で治療する。
【００４８】
（００７３）
他の態様において、本発明は、抗血管新生治療がそれを必要とする個体に有益となるか否かを判断する方法を対象とする。この方法は、個体の染色体１の全て又は一部のゲノム解析を行い、この一部はＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣ［Ｃ／Ｇ］ＣＣＣＴＧＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＴＧＡＴＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６で少なくとも１つのアレルを検出することを含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６で少なくとも１つのアレルがＧであるならば、抗血管新生治療は個体にとって有益となる。幾つかの態様において、個体におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６の１つのアレルはＧであり、もう一方のアレルはＣである（ポジション２６のアレルがＧ：Ｃの場合、個体はヘテロ接合である）。他の態様において、個体におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６の両方のアレルはＧである（ポジション２６のアレルがＧ：Ｇの場合、個体はホモ接合である）。更に別の態様において、個体におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６の両方のアレルはＣである（ポジション２６のアレルがＣ：Ｃの場合、個体はホモ接合である）。特定の態様において、個体は腫瘍を有する。
【００４９】
（００７４）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８を含む染色体１のこの部分は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍが作成したヒトに関するＨｕｍａｎ  Ｆｅｂ．２００９（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）アセンブリに基づいた染色体１のポジション１１９５０３５９３〜１１９５０４０９３を含む。
【００５０】
（００７５）
多種多様なゲノム解析法を、抗血管新生治療が個体に有益となるか否かを判断する方法に用いることができる。そのような方法の例には、シーケンシング解析（次世代シーケンシング）、電気泳動（ゲル、キャピラリ、温度勾配ゲル電気泳動）、ポリメラーゼ連鎖反応（高解像度融解分析）、質量分析、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、電気化学的分析（フェロセニルナフタレンジイミドを使用）、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（変性ＨＰＬＣ）、酵素分析（制限断片長多型解析（ＲＦＬＰ）、フラップエンドヌクレアーゼ、プライマー伸長法、５’−ヌクレアーゼ、オリゴヌクレオチドライゲーション）、ハイブリダイゼーション解析（動的アレル特異的ハイブリダイゼーション、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ａｓｏ）解析、分子ビーコン、マイクロアレイ（ＳＮＰマイクロアレイ）、ミスマッチ結合タンパク質又はこれらの組み合わせが含まれる。
【００５１】
（００７６）
抗血管新生治療がそれを必要とする個体に有益となるか否かを判断する方法は、個体からのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６での少なくとも１つのアレルの検出結果をコントロールと比較することを更に含み得る。いずれの適切なコントロールも使用でき、抗血管新生治療に応答する、抗血管新生治療に応答しない又はこれらの組み合わせである１人（匹）以上の個体に存在するアレルが含まれる。
【００５２】
（００７７）
抗血管新生治療が個体に有益となるか否かを判断する方法は、個体からサンプル（生体サンプル）を得ることを更に含み得る。このサンプルは、生体液、生体組織又はこれらの組み合わせから得られる。本発明の方法で使用するための生体サンプルの例には、生体液（例えば、血液、血清、尿、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳）及び生体組織（例えば、臓器組織、腫瘍組織）等が含まれる。
【００５３】
（００７８）
抗血管新生治療が個体に有益となるか否かを判断する方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のポジション２６にＧである少なくとも１つのアレルを有する個体を抗血管新生治療で治療することを更に含み得る。多種多様な抗血管新生治療が当業者には公知であり、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Ｔｉｅ−１受容体（Ｔｉｅ−１Ｒ）、Ｔｉｅ−２受容体（Ｔｉｅ−２Ｒ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）又はこれらの組み合わせの阻害が含まれる。
【００５４】
（００７９）
本明細書において、「個体」とは動物のことであり、特定の態様においては哺乳動物である。哺乳動物の例には、霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類等が含まれる。具体例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスが含まれる。
【００５５】
（００８０）
「それを必要とする個体」とは、研究者、獣医、医師又は他の臨床家が治療又は予防が必要であると判断した個体のことである。一実施形態において、それを必要とする個体は哺乳動物、例えばヒトである。
【００５６】
（００８１）
本発明の方法にしたがった投与の必要性又は要望は、周知のリスク因子を用いることで決定される。（１種以上の）特定の物質（例えば、組成物）の有効量は、最終的な分析において、担当医が決定するが、治療対象である正確な状態及び／又は疾患、患者（患畜）が患っている状態及び／又は疾患の重症度、選択した投与経路、付随して患者（患畜）が必要とする他の薬剤及び治療並びに医師の判断による他の因子等の因子に左右される。
【００５７】
（００８２）        
ＷＡＲＳ２を調節する有効量の物質を、それを必要とする個体に投与する。本明細書において、「有効量」又は「治療有効量」は、治療中の状態及び／又は疾患の全体又は一部における症状の緩和を含めた所望の生物学的又は医学的応答を組織、系、被験体又はヒトにおいて引き出すある量の活性組成物を意味する。
【００５８】
（００８３）
組成物は、単回投与（例えば、１日あたり）又は複数回投与で投与することができる。加えて、組成物は、１日以上にわたって投与することができる（例えば、連続した又は連続していない数日間）。
【００５９】
（００８４）
ＷＡＲＳ２の発現及び／又はＷＡＲＳ２の活性を調節する核酸は、インビトロ及びインビボの両方で、細胞との直接接触（例えば、「ネイキッド」ｓｉＲＮＡ）を含めた当業者に公知の様々な方法で又はターゲティング若しくは細胞への送達を促進する１種以上の物質と組み合わせて細胞に送達することができる。そのような物質及び方法には、リポプレックス、リポソーム、イオン導入法、ヒドロゲル、シクロデキストリン、ナノカプセル、ミクロスフィア、ナノスフィア及びタンパク質性ベクターが含まれる（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９９）１０：１０６８−１０７４及びＷＯ００／５３７２２パンフレット）。核酸／ビヒクルの組み合わせを、直接注入又は輸液ポンプの使用によりインビボで局所送達し得る。核酸はインビボで、静脈内、皮下、筋肉内若しくは皮内注射又は吸入を含めた様々な手段により送達することができる。
【００６０】
（００８５）
ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、長期血中滞留型リポソーム又はステルスリポソーム）を含む組成物の使用も周知である。これらの処方は、凝集及び融合を防止することでリポソーム又はリポプレックス溶液の安定性を上昇させる方法となる。これらの処方には、オプソニン作用及び単核食作用系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）による排除に抵抗することでカプセル化した薬剤をより長い時間にわたって血中で循環させ、組織を薬剤により強く曝露することができるというインビボの別の利点もある。そのようなリポソームは、腫瘍中で選択的に蓄積することも判明している（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期血中滞留型リポソームは、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態及び薬力学を強化する。また、長期血中滞留型リポソームは、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ分解から保護する。
【００６１】
（００８６）
ＷＡＲＳ２の発現及び／又はＷＡＲＳ２の活性を調節する核酸物質は、医薬組成物として処方し得る。医薬組成物は、単独で又は他の物質と組み合わせて、薬物又は診断薬として使用し得る。例えば、本発明の１種以上のｓｉＲＮＡは、送達用ビヒクル（例えば、リポソーム）及び賦形剤、例えば担体、希釈剤と組み合わせることができる。核酸の脂質媒介送達方法は周知である（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００１７０９１号明細書を参照のこと）。他の物質、例えば保存料及び安定剤も添加することができる。核酸分子の送達方法は当該分野で公知であり、また例えばＡｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５；Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２；米国特許第６３９５７１３号明細書及びＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５パンフレットに記載されている。核酸は、他の治療用化合物と組み合わせて、別々に又は同時に、例えば組み合わせ単位用量として投与することもできる。一実施形態において、本発明は、生理学的／医薬的に許容可能な賦形剤、例えば安定剤、保存料、希釈剤、バッファ等中に本発明による１種以上の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む医薬組成物を含む。
【００６２】
（００８７）
ＷＡＲＳ２の発現及び／又はＷＡＲＳ２の活性を調節する物質を含む医薬組成物は、医薬組成物を調製するための生理学的に許容可能な担体又は賦形剤と共に処方することができる。担体及び組成物は無菌になり得る。処方は、投与様式に合ったものでなくてはならない。
【００６３】
（００８８）
適切な医薬的に許容可能な担体には、以下に限定するものではないが、水、塩類溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロース又はデンプン、ブドウ糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン（ｖｉｓｃｏｕｓ  ｐａｒａｆｆｉｎ）、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、またこれらの組み合わせが含まれる。医薬製剤は、要望に応じて、活性化合物と有害な形で反応しない助剤、例えば滑沢剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変化させるための塩類、バッファ、着色料、香味及び／又は着香物質等と混合することができる。
【００６４】
（００８９）
要望に応じて、組成物は、少量の湿潤剤、乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。組成物は溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤又は粉末になり得る。組成物は、伝統的なバインダ及び担体、例えばトリグリセリドを使用して坐薬として処方することができる。経口製剤は標準的な担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。
【００６５】
（００９０）
ＷＡＲＳ２の発現及び／又はＷＡＲＳ２の活性を調節する物質は、他の化合物（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦの阻害剤、例えばＷＡＲＳ、ＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Ｔｉｅ−１受容体（Ｔｉｅ−１Ｒ）、Ｔｉｅ−２受容体（Ｔｉｅ−２Ｒ）、ＹＡＲＳ１（ミニＹａｒｓ１）（Ｅｗａｌｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，４１（４５）：１３３４４−１３３４９（２００２））、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）又はこれらの組み合わせ）との併用療法の一部として投与することもできる。
【００６６】
（００９１）
本発明の物質は、ヒトへの投与向けに構成した医薬組成物としてルーチンな手順に従って処方することができる。例えば、静脈内投与用の組成物は典型的には滅菌等張水性バッファ中の溶液である。必要ならば、組成物は可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤も含み得る。概して、成分は、別々に又は単位剤形内で混合して、例えば密封容器（例えば、活性化合物の量がわかるアンプル又はサシェ）内の凍結乾燥粉末又は水不使用濃縮物として供給される。組成物を輸注する場合、医薬品グレードの滅菌水、生理食塩水又はブドウ糖／水が入った輸液ボトルで分注することができる。組成物を注射により投与する場合は、投与に先立って成分を混合できるように注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを用意することができる。
【００６７】
（００９２）
化合物は治療有効量で投与される。特定の障害又は状態の治療において治療上有効な化合物量はその障害又は状態の性質に左右され、また標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、インビトロ又はインビボアッセイを任意で用いることで最適な用量範囲を特定し易くし得る。製剤で用いる精確な用量も投与経路、また血管新生疾患、血管疾患、心疾患又は循環器疾患の症状の深刻度に左右され、医師の判断及び各患者の環境に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれた用量反応曲線から外挿し得る。
【００６８】
（００９３）
別の態様において、本発明は、ＷＡＲＳの発現及び／又はＷＡＲＳの活性を調節する物質を同定する方法を対象とする。この方法は、評価対象である物質と接触させた細胞、組織及び／又は生物から得た１つ以上のＥＶ（例えば、エキソソーム）からＷＡＲＳの発現及び／又はＷＡＲＳの活性を測定し、ＷＡＲＳの発現及び／又はＷＡＲＳの活性をコントロールと比較することを含み、ＷＡＲＳの発現及び／又はＷＡＲＳの活性が、コントロールと比較して、その物質の存在下で変化するならば、その物質はＷＡＲＳの発現及び／又は活性を調節する。この方法は、細胞、組織及び／又は生物を評価対象である物質と接触させることを更に含み得る。この方法はまた、評価対象である物質と接触させた細胞、組織及び／又は生物から１つ以上のＥＶを得ることを更に含み得る。
【００６９】
（００９４）
特定の態様において、本発明は、ＷＡＲＳの発現及び／又は活性を調節する物質を同定する方法を対象とし、（１つ以上の）細胞、組織及び／又は生物（エキソソーム等の１つ以上のＥＶを含む）を評価対象である物質と接触させ、この物質との接触後の細胞、組織及び／又は生物から１つ以上のＥＶを得て、この物質との接触後の生物、組織及び／又は生物から得た１つ以上のＥＶにおけるＷＡＲＳの発現及び／又は活性を測定し、ＷＡＲＳの発現及び／又は活性をコントロールと比較することを含む。ＷＡＲＳの発現及び／又は活性が、コントロールと比較して、その物質の存在下で変化するならば、この物質はＷＡＲＳの発現及び／又は活性を調節する。
【００７０】
（００９５）
ＥＶのＷＡＲＳ発現の測定は、ＥＶ内で発現する又はＥＶから分泌されるＷＡＲＳの量を測定することを含む。ＥＶのＷＡＲＳ活性の測定は、ＷＡＲＳがＥＶから分泌されたか否か及びＷＡＲＳがＷＡＲＳ２と相互作用（例えば、結合、会合）する又はどの程度まで相互作用するかを測定することを含む。
【００７１】
（００９６）
幾つかの態様において、ＥＶのＷＡＲＳ発現及び／又は活性は、コントロールと比較して、物質との接触後に低下する。他の態様において、ＥＶのＷＡＲＳ発現及び／又は活性は、コントロールと比較して、物質との接触後に上昇する。
【００７２】
（００９７）
当業者には明白であるが、本発明の方法においては多種多様なコントロールを使用することができる。適切なコントロールの例は、物質と接触していない細胞、組織及び／又は生物から得た１つ以上のＥＶにおけるＷＡＲＳ発現及び／又は活性である。
【００７３】
（００９８）
幾つかの態様において、評価対象である物質と接触させた細胞、組織及び／又は生物は同じ個体由来になり得る。他の態様において、細胞、組織及び／又は生物は同じ種の別の個体由来になり得る。更に別の態様において、細胞、組織及び／又は生物は異なる種由来になり得る。
〔例証〕
【００７４】
（００９９）
【実施例１】
【００７５】
（００１００）−（００１０４）
冠血流量及び毛細血管密度に関する新規な遺伝子としてのＷＡＲＳ２の同定
方法
ラットの親系統
４つの親系統について調査した。自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）を高血圧系統として含め、ブラウンノルウェー（ＢＮ）、ウィスター京都（ＷＫＹ）及びルイスを正常血圧性コントロール系統として含めた。１２〜１４週齢の雄のラットの表現型を２匹／日の割合で決定した。全てのラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（マーゲート、英国）から購入した。
【００７６】
（００１０５）（００１０６）
ＢＮ−ＳＨＲ  Ｆ２個体群
ラットを、一雄一雌の交配システムで繁殖させた。ＢＮの雌をＳＨＲの雄と交配させることでＢＮ  Ｘ  ＳＨＲ（ＢＸＨ）Ｆ１ラットを作り出し、逆交雑を行うことでＳＨＲ  ｘ  ＢＮ（ＨＸＢ）ラットを得た。Ｆ１  ＢＸＨラットを交雑させてＦ２  ＢＸＨラットを作り出し、Ｆ１  ＨＸＢラットを交雑させてＦ２  ＨＸＢラットを作り出した。ラットをロンドンにあるインペリアルカレッジの施設：Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓでケージ１つあたり最大５匹で飼育した。ラットは標準的な固形飼料及び滅菌水を好きな時に摂取できた。繁殖時を除いて、ラットは性別で分けた。自動ライト切り換えにより、ラットを１２時間の概日周期で飼育した。群体を定期的に、別のケージで飼育している歩哨を用いて特定の病原体について試験した。全ての手順は、１９８６年の英国動物（化学的処置）法に準拠して行った。
【００７７】
（００１０７）（００１０８）
血圧（ＢＰ）
血圧は、生体外での表現型決定のための心臓切除前に各ラットにおける頸動脈カニューレ挿入により測定した。超小型の２ｍｍ圧力カテーテル（ＭＰＶＳ−Ｕｌｔｒａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＤＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。測定前に圧力カテーテルの較正を外部マノメータに対して行った。次に、吸入４％イソフルランを使用してラットに麻酔をかけた。頸動脈領域を露出させ、動脈切開術を行い、カテーテルを取り付けた。次に、ＬａｂｃｈａｒｔＰｒｏソフトウェア（ＡＤＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で連続的にデータを収集し、オフラインで分析した。頸動脈へのカテーテル挿入後、吸入イソフルランの濃度を４％から１．５％に徐々に低下させるとＢＰが生理的レベルに達する。ＢＰデータの記録後、圧力カテーテルを血管から抜き、血管をＣＦ測定前に結紮した。
【００７８】
（００１０９）（００１１０）
冠血流量（ＣＦ）
ＣＦをランゲンドルフ装置を使用して測定した。切除後、心臓を速やかに氷冷したクレブスバッファに入れ、生体外潅流装置に移した。大動脈をカニューレにブルドッグクランプでクランプし、３／０絹糸で固定した。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ及びＨｅａｒｓｅの提案通りに調製した改変クレブス−ヘンゼライトバッファ溶液を使用して心臓の潅流を行った。この溶液をジャケット付きタンクにおいて３７℃で維持し、カルボジェン溶液（９５％酸素、５％ＣＯ2）で連続的にガス供給することでｐＨ７．３５〜７．４５を維持した。心臓切除から３分以内に潅流を確立した。左心房（ＬＡ）を除去し、液体充填ラテックスバルーンを左心室（ＬＶ）腔に設置した。ＬＶ収縮力（ＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘ）及びＬＶ弛緩（ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）をＬＶ圧力から導き出した。同軸バイポーラ電極を右心房に取り付け、ペーシングを３６０拍動／分で開始させた。電極を右心房及び左心室に取り付けて連続的な心電図を記録した。装置全体を、３７℃に保ったコンテナ内で維持した。潅流液を心臓に一定量、９０ｍｍＨｇ潅流圧でポンピングした。ＣＦを、心腔に近いアセンブリに設置したインライン超音波流量計で測定し、気泡トラップが心臓での空気塞栓症を防止した。血行動態データをＬａｂｃｈａｒｔＰｒｏソフトウェア（ＡＤＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で連続的に収集し、実験後、オフラインで分析した。取り出した心臓標本をベースラインで１５分間にわたって観察した。最大充血状態を評価するための過渡的な１分間にわたる全虚血及び再灌流が続いた。続いて、近位ＬＡＤの３５分間にわたる結紮により心筋梗塞を誘発させ、続いて１時間にわたって再灌流させた。代謝産物のレベルを測定するために、心臓からの溶出液をベースライン中及び再潅流の最初の１０分間に回収した。
【００７９】
（００１１１）（００１１２）
遺伝子発現データ
Ｆ２ラットの一部に関し、Ｆ２ラットからの非虚血ＬＶをＣＦ測定後に取り出し、遺伝子発現解析用に−８０℃で保存した。全部で１１８個のＲＮＡサンプルをＭａｘｗｅｌｌ  １６  ｓｙｓｔｅｍ  ＲＮＡ精製キット（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ、サウザンプトン、英国）を使用して１２のバッチで処理した。各サンプルにおいて、各２５μｇの組織について２００μＬのライセートを加え、固形サンプルが見えなくなるまでサンプルをホモジナイズした。次に、２００μＬのサンプル／ライセートを４００μＬのＲＮＡ希釈バッファで希釈し、ボルテックスすることで完全に溶解させた。５０μＬの透徹剤をサンプル／ライセートに加えてＤＮＡの結合を７０℃で行った。次に、透徹剤／サンプル混合物を冷却し、２分間にわたって１２０００ｒｐｍで遠心分離した。下相をＭａｘｗｅｌｌロボットに入れると、最終的なリボヌクレアーゼ非含有水中の４０μＬのＲＮＡサンプルが得られた。次に、ＲＮＡの純度をＮａｎｏＤｒｏｐを使用して評価した。ＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザプラットフォームを使用して評価し、ＲＮＡインテグリティナンバーが＜８のサンプルは廃棄した。
【００８０】
（００１１３）
発現は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｒａｔ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  １．０  ＳＴを使用して測定した。次に、同一ＧＣ内容のバックグラウンドプローブの平均を減じることで、生プローブ強度をバックグラウンド補正した。次に、ＶＳＮ規格化ステップ（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）をデータに適用し、各転写物のプローブセット発現をＭｅｄｉａｎ−ｐｏｌｉｓｈ法によりまとめた。
【００８１】
（００１１４）（００１１５）
遺伝子型データ
Ｆ２個体群からのＤＮＡを、Ｍａｘｗｅｌｌ  １６システムでのロボットＤＮＡ抽出を用いて尾部組織のサンプルから抽出した。ＤＮＡの量及び質を、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕａｎｔ−ｉｔアッセイを用いて評価した。高スループットのジェノタイピングを、カスタムジェノタイピングビーズチップ上でＩｌｌｕｍｉｎａのＧｏｌｇｅｎＧａｔｅアッセイを用いて行った。１６５４３のＢＮ−ＳＨＲ  ＳＮＰをＳＴＡＲコンソーシアム（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｄ．ｍｃｗ．ｅｄｕ／）から得て、各ＳＮＰについて周囲の１６０ｂｐの配列をＳＨＲゲノム配列に基づいて回復した（Ａｔａｎｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２０：７９１−８０３（２０１０）。ＳＮＰ及びその周囲の配列を生物情報学的評価のためにＩｌｌｕｍｉｎａに提出し、クオリティスコアがつけられた。次に、ゲノム上に均一に分布している、クオリティスコアが０．９５以上の７６８のＳＮＰを選択してビーズチップを構築した。ハイブリダイゼーション及びイメージング後、遺伝子型をＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア及びＧｅｎＣａｌｌアルゴリズムを使用してコールした。親及びＦ１サンプルをＦ２サンプルにジェノタイピング品質のコントロールとして加えた（親−親−子エラー／Ｐ−Ｐ−Ｃ）。サンプル複製物もＢｅａｄＣｈｉｐに搭載することで再現性誤差を見積もった。クラスタ分離が不良、低い平均規格化強度（Ｒ＜０．２）又は低ＭＡＦ（ＭＡＦ＜０．１）のＳＮＰは除外した。ハーディ・ワインベルグ平衡からの有意な逸脱を示すＳＮＰ（Ｐ＜１０−３）も除外した。遺伝子型の選別後、Ｐ−Ｐ−Ｃ精度は約９７％であり、複製エラー率は約０．０１％であると評価された。総コール率は９３％であった。欠けている遺伝子型は、デフォルト設定のｆａｓｔＰｈａｓｅ及び２つのファウンダーハプロタイプを使用してインピュートした。
【００８２】
（００１１６）（００１１７）
冠血流量マッピング
冠血流量ＱＴＬを、ＨＥＳＳのｍａｔｌａｂ実装を用いてマッピングした。全部で６種類の冠血流量表現型（平均及び最大、３つのタイムポイント）をモデルに従属変数として含めた。高ＬＤ（ｒ２＞ＸＸ）におけるマーカーは分析前に除去し、ＳＮＰ遺伝子型をモデルにおけるリグレッサーとして使用した。デフォルトパラメータをＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｓｅａｒｃｈ（ＨＥＳＳ）に使用した。ＳＮＰによる表現型の遺伝子調節を同定するためには０．８の周辺事後確率が必要であった。対応するハプロタイプを、ＨＥＳＳで選択したマーカーを取り巻く２つのマーカーの間の範囲をとることで得た。
【００８３】
（００１１８）（００１１９）
ｅＱＴＬマッピング
ｅＱＴＬを、ＥＳＳ＋＋プログラムを使用してマッピングした。Ｆ２においてマイクロアレイで測定した３つのｍＲＮＡ発現レベルを従属変数としてモデルに含め、遺伝子型をリグレッサーとして使用した。
【００８４】
（００１２０）（００１２１）
結果
本研究では、冠血流量及び毛細血管密度に関する新規な遺伝子としてＷＡＲＳ２を同定した。冠血流量の遺伝的制御は知られていない。本明細書では、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ−Ｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７８：１１４−１１８（２０１１）；Ｐｅｔｒｅｔｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，４０：５４６−５５２（２００８）に記載のものと同様のアプローチを用いた、ラットにおける大規模なＦ２交雑実験におけるこの研究について説明する。
【００８５】
（００１２２）
冠血流量を、１７２匹のブラウンノルウェー自然発症高血圧ラット（ＢＮ−ＳＨＲ）Ｆ２個体群において、ランゲンドルフ装置を使用して３つのタイムポイントで測定した。広く受け入れられている冠血流量決定因子のラット個体群における作用について調査した。左心室の弛緩圧（（ｄｐ／ｄｔ）分）が冠血流量に及ぼす強い影響（ｒ＝−０．３４、ｐ＝４．６ｘ１０-6）が見られ、収縮期又は拡張期血圧の影響は観察されず（それぞれｐ＝０．１９及びｐ＝０．３６）、これはラット個体群における冠血流量を制御する血圧非依存性の機序を示唆している。
【００８６】
（００１２３）
最大及び平均冠血流量を、ＨＥＳＳを使用して３つの異なるタイムポイントでマッピングした（Ｂｏｔｔｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８９：１４４９−１４５９（２０１１）。ＨＥＳＳは、これらの表現型間の相関構造を利用することで複数の表現型を共同でモデル化する。
【００８７】
（００１２４）
虚血及び梗塞後に基底レベルで測定された冠血流量はラットの染色体２ｑ３４上の１つの座位と強力且つ一貫した関係にあることが観察された（図１に示す）。ハプロタイプの限界の上限は２つの隣接マーカーの位置から導きだされ、これは因果関係がある遺伝子変異体が１８９．３と１９４．５Ｍｂとの間に位置し得ることを示す。
【００８８】
（００１２５）
ＢＮ及びＳＨＲからの左心室組織におけるＲＮＡ配列解析により、この領域において４２の発現遺伝子が同定され、これらのうちの３つは有意なｅＱＴＬを有した（図１）。２つの遺伝子Ｗａｒｓ２及びカテプシン−Ｓは非同義変異を有すると判明した。カテプシン−Ｓは部分保存タンパク質部位に変異を有し、また心臓での発現は少ない。他方で、Ｗａｒｓ２は心臓で高く発現し、核にコードされ、ミトコンドリアに局在するミトコンドリアアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ａＡＲＳ）である。トリプトファンをその同族ｔＲＮＡに移行させる。
【００８９】
（００１２６）
多数のａＡＲＳ（チロシンＡＲＳ（ＹＡＲＳ）、セリンＡＲＳ（ＳＡＲＳ）、細胞質トリプトファンＡＲＳ（ＷＡＲＳ））は進化の間に脈管形成における非標準な役割を獲得し、ＷＡＲＳの切断産物はＶＥＧＦシグナル伝達を阻害すると判明している。従って、ＷＡＲＳ２は、ラットにおいて２ｑ３４座位で冠血流量を制御する候補遺伝子として優先された。
【００９０】
（００１２７）
心臓においては概ね、小さい毛細血管の抵抗が血流を制御する。遺伝子型で条件付けされ、交雑させたＦ２交雑ラットにおけるその座位での毛細血管密度を調べ、座位の有意な影響（Ｐ＝１．３ｘ１０-13）が見られた（図２を参照のこと）。
【実施例２】
【００９１】
（００１２８）−（００１３１）
ＷＡＲＳ２及びＷＡＲＳとのその相互作用のキャラクタリゼーション
材料及び方法
抗Ｌ１３ａ及びアネキシンＡはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇから調達した。Ａｌｅｘａ−４８８／５６８ヤギ抗マウス／ウサギＩｇＧはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから調達した。抗ＶＥＧＦ及びＧＡＰＤＨはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから調達し、その他の抗体は全てＡｂｃａｍから調達した。ポリクローナル抗ＷＡＲＳ２ウサギ抗血清は、ウサギのＫＭＳ  ＫＳＤ  ＰＤＫ  ＬＡＴ  ＶＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）又はＣＩＬ  ＴＳＭ  ＫＫＶ  ＫＳＬ  ＲＤＰ  Ｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）ペプチドでの免疫化後に得られた。これらは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（英国）による対応するペプチドを使用して産生及びクロマトグラフィ精製された。Ｌ５３Ｆ変異ＷＡＲＳ２  ｃＤＮＡをＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＩＩ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示に従って使用し、Ｃ末端がｍｙｃ−ＤＤＫ又はＧＦＰ（ＯｒｉＧｅｎｅ）であるヒトＷＡＲＳ２ｃＤＮＡを含有するプラスミド構築物をテンプレートとして使用して作製した。Ｌ５３Ｆは、ヌクレオチドシーケンシングにより検証した。アデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ、Ａｄ−ＷＡＲＳ２）はＳｉｇｎａＧｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ヒトＷＡＲＳ  ｃＤＮＡを、ヒトＨＵＶＥＣ細胞から抽出したＲＮＡから合成し、コード領域を、ＥｃｏＲＩ及びＫｏｓａｃ配列を順方向プライマー並びにｆｌａｇ配列及びＸｂａＩを逆方向プライマー中に有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。配列を検証した後、ＷＡＲＳをｐＬＶＸ−ＥＦ１ａ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃ）にクローニングした。
【００９２】
（００１３２）（００１３３）
細胞培養、トランスフェクション及びアデノウイルス形質導入
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、１０％胎児仔ウシ血清及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで保存した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び培地（ＥＢＭ−及びＥＢＭ−２シングルＱｕａｔｓ）はＬｏｎｚａから購入し、パッセージ７に先立って使用した。プラスミドのトラスフェクションのために（ＨＥＫ２９３）、細胞を１日前に７０％のコンフルエンスで播種し、リポフェクタミン２００（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎｅ）トランスフェクション試薬を製造業者の指示に従って使用した。ＨＵＶＥＣトランスフェクションに関し、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｊｅｔＰＥＩ−ＨＵＶＥＣトランスフェクション試薬（ＰＯＬＹＰＬＵＳ−ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ  Ｉｎｃ、ニューヨーク）を、製造業者の指示に従って使用した。遺伝子導入のために、ＨＵＶＥＣを８０％コンフルエンスまで６ウェルプレート又はＴ７５フラスコで成長させた。細胞の形質導入を、ＨＵＶＥＣ成長培地において、総体積１ｍｌ（６ウェルプレート）又は１０ｍｌ（Ｔ７５フラスコ）中２００プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染多重度（ＭＯＩ）で行った。感染から２４時間後、細胞を、１％ＦＢＳを含有する培地中で１時間にわたってインキュベートし、次に５００Ｕ／ｍｌのヒト組み換えＩＦＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を更に２４時間にわたって補充してから分析のために処理した。
【００９３】
（００１３４）（００１３５）
酵素アッセイ用のＧＳＴ融合タンパク質
ＷＡＲＳ２及びＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）ｃＤＮＡを市販のベクターにクローニングし（表を参照のこと）、標準的な手順でＩＰＴＧ誘導及びＧＳＨビーズ系精製により発現させた。精製したタンパク質を、標準的なマラカイトグリーンアッセイ（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて定量化した。
【００９４】
（００１３６）（００１３７）
培養細胞からのＲＮＡ抽出
トータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造業者の指示に従って抽出した。簡単に説明すると、細胞を３５０μｌのＲＬＴバッファに溶解させ、Ｓｈｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライし、１分間にわたって１４０００ｒｐｍでスピンした。ライセートを等体積の７０％エタノールと混合し、ＲＮｅａｓｙカラムにアプライし、次に遠心分離に供し、供給ＲＷ１及びＲＰＥバッファで洗浄した。最後にトータルＲＮＡを３０μｌのＲＮａｓｅ非含有水中で溶出させ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２６０ｎｍでの吸光度を測定することで定量化した。必要になる時までＲＮＡを−８０℃で保存した。
【００９５】
（００１３８）（００１３９）
定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）分析及びＷＡＲＳスプライシングＰＣＲ
トータルＲＮＡ（１μｇ）を、ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓプロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡ（１μｌ）をＱＰＣＲに、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓ４４３８、Ｓｉｇｍａ）を使用した２０μｌの反応系で供し、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。１回のｓｉＲＮＡ処理あたり３つの独立した６ウェル培養物を少なくとも３回の独立した実験のそれぞれにおいて使用し、各サンプルを二重にして行った。全てのデータを２−ΔΔＣＴ法で分析した。
【００９６】
（００１４０）
【表１】
2017514888.tif 000004
【００９７】
（００１４１）
ＷＡＲＳスプライシング変異体を検出するために、ＷＡＲＳ用の１μｌのｃＤＮＡ及び２８Ｓ用の１／２０希釈ｃＤＮＡを５０μｌのＰＣＲ反応系で使用し、２４サイクルを採用した（ＱＰＣＲの融解曲線に従って決定）。
【００９８】
（００１４２）（００１４３）
タンパク質抽出及びウェスタンブロット法
細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）及びホスファターゼ阻害剤（Ｈａｌｔ  Ｐｈｏｓｐｈａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＰＭＳＦ（０．５ｍＭ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を含有する細胞溶解バッファ（９８０３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で溶解させた。次に、細胞ライセートを短時間、超音波処理し、１０分間にわたって１４０００ｇ（４℃）で遠心分離した。上清を保持し、タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン標準品を使用したビシンコニン酸アッセイで測定した。タンパク質サンプル（２０μｇ）を１０％又は１３％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、図のレジェンドに示すような抗体でプローブした。免疫反応バンドを西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体でＰｅｒｏｘｉｄｅ及びＬｕｍｉＧｌｏ試薬（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して可視化した。
【００９９】
（００１４４）（００１４５）
ｓｉＲＮＡ媒介ＷＡＲＳ２ノックダウン
ＨＵＶＥＣ細胞を６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞にＤｈａｒｍａＦＥＣＴ−１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＷＡＲＳ２ターゲティングＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌを製造業者の指示に従ってトランスフェクトした。所与のトランスフェクションのために、２４μｌのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１及び４７６μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１本の試験管内で混合し、５μｌの上記のＷＡＲＳ２ターゲティング又はスクランブルコントロールｓｉＲＮＡ（２０μＭ）を４９０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭと第２の試験管内で混合した。５分間にわたる室温でのインキュベーション後、上記の溶液を混合し、室温で更に２０分間にわたって静置してから細胞に加えた。最終的なｓｉＲＮＡ濃度は２５ｎＭであった。ノックダウン有効性をＱＰＣＲによりトランスフェクションから２日後に評価し、少なくとも８５％であると判明した。ノックダウン有効性はウェスタンブロット法では確認できなかったが、これはＷＡＲＳ２に対するどの抗体も内在性ＷＡＲＳを検出できないからであり、ただし発明者が作製した２つの抗ＷＡＲＳ２抗体は、ＷＡＲＳ２−ｆｌａｇを発現している細胞からのライセートにおけるＷＡＲＳ２を検出することができる。
【０１００】
（００１４６）（００１４７）
免疫蛍光法
細胞を滅菌したカバーガラス上に約８０％のコンフルエンスで播種した。免疫蛍光分析のために、細胞を３％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドにおいて１５分間にわたって室温で固定し、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において４分間にわたって透過処理し、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中でブロックした。細胞を一次抗体と１時間にわたりインキュベートし（希釈１／４０〜１００）、次にＡｌｅｘａ  ４８８／５６８コンジュゲートヤギ抗マウス／ウサギＩｇＧ（高交差吸収、希釈１／１００）と１時間にわたってインキュベートした。共に周囲温度で行った。カバーガラスをスライドにＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ退色防止封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用してマウントした。細胞を、６０ｘオイル対物レンズを使用したＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡で観察し、画像をＬｅｉｃａ共焦点ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＵＫ）Ｌｔｄ、ミルトンケインズ、英国）で分析した。
【０１０１】
（００１４８）（００１４９）
Ｌ５３Ｆ及び野生型のＷＡＲＳ２及びＷＡＲＳレンチウイルスの準備
ｆｌａｇ又はＧＦＰ又はＷＡＲＳ−ｆｌａｇでタグ付けしたＷＡＲＳ２（ＷＴ及びＬ５３Ｆ）用のｃＤＮＡをｐＬＶＸ−ＥＦ１  ａｌｐｈａ−ＩＲＥＳ−ｚｓ  Ｇｒｅｅｎ（カタログ番号６３１９８２、Ｃｌｏｎｔｅｃ）又はｐＬＶＸ−ＥＦ１  ａｌｐｈａ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（カタログ番号６３１９８７、Ｃｌｏｎｔｅｃ）又はｐＬＶＸ−ＥＦ１  ａｌｐｈａ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクター（カタログ番号６３２１８３、Ｃｌｏｎｔｅｃ）にＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位を用いてサブクローニングした。特定のウイルスを、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステム（６３１２４７）を使用して、製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃ）のプロトコルに従ってＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞で作製した。
【０１０２】
（００１５０）
Ｗａｒｓ  ｃＤＮＡを作製するためのプライマー
Ｆ：ｇｇｇａａｔｔｃｇｃｃｇｃｃｇｃｇａｔｃｇｃＣＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）（ＥｃｏＲＩ、Ｋｏｓａｃ）
Ｒ：ＧｃｔｃｔａｇａｔｔａｃｔｔａｔｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃｔｔｇｔａａｔｃＣＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）（ＸｂａＩ、ｆｌａｇ）
【０１０３】
（００１５１）
Ｗａｒｓ２−ＦＬＡＧを作製するためのプライマー
順方向：ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）
逆方向：ＧｃｔｃａｇａＧＣＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＴＡＴＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）（ＸｂａＩ）
【０１０４】
（００１５２）
Ｗａｒｓ２−ＧＦＰを作製するためのプライマー
順方向：ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）
逆方向：５’−ＧＣｔｃｔａｇａＧＣＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＴＴＴＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３０）（ＸｂａＩ）
【０１０５】
（００１５３）（００１５４）
ミトコンドリア分画及びエキソソーム分泌
サイトゾル及びミトコンドリアを分離するために、ミトコンドリア分画キット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を取扱説明書に従って使用した。ミトコンドリア及びサイトゾル画分の純度を、ミトコンドリアタンパク質複合体Ｉ（Ｍｉｔｏｓｃｉｅｎｃｅ）又は可溶性サイトゾルタンパク質チューブリン（Ｓｉｇｍａ）に対する抗体を使用して検証した。エキソソームのコレクションをＨＵＶＥＣライセートからキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４４７８３５９）を使用して製造業者の指示に従って作製した。
【０１０６】
（００１５５）（００１５６）
免疫沈降及び質量分析
免疫沈降のために、細胞ライセートを、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤（Ｈａｌｔ  Ｐｈｏｓｐｈａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＰＭＳＦ（０．５ｍＭ）を含有する溶解バッファ（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）において調製した。製造業者のプロトコルに従って、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）をＷａｒｓ２  ｆｌａｇタグ付けタンパク質の精製に使用した。溶出前に、タンパク質／ビーズを、ＰＢＳ中の０．５％ＮＰ４０、次に３回、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムで洗浄し、結合したタンパク質を５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の２００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（３ｘｆｌａｇペプチド、Ｓｉｇｍａ）で溶出させた。質量分析を、トータルソリューションダイジェスト法の全定性＋定量分析により行った。
【０１０７】
（００１５７）−（００１５９）
結果
ＷＡＲＳ２及びＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）はＨＥＫ細胞においてミトコンドリアに局在する
ＷＡＲＳ２は核コード化ミトコンドリア局在ａＡＲＳである。ヒトＷＡＲＳ２及びラットと同じアミノ酸変化を有する変異ヒトＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）の局在を調べた。変異及び野生型の両方がミトコンドリアに局在した（本明細書においては図３に示す）。
【０１０８】
（００１６０）（００１６１）
ＷＡＲＳ２はＷＡＲＳに結合するが変異ＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）は結合しない
ａＡＲＳはより高次のオリゴマー化をそれ自身と又は互いに行い得て、その機能に影響する。ＷＡＲＳ２が公知の抗血管新生機能を有するその細胞質カウンターパートＷＡＲＳに結合するか否かを試験した。ＷＡＲＳ２はＷＡＲＳとＨＵＶＥＣ細胞において結合すると判明した。作用は、（図４からわかるように）Ｌ５３Ｆ変異により低下した。
【０１０９】
（００１６２）（００１６３）
ＷＡＲＳ２発現はＷＡＲＳ分泌に影響する。タンパク質レベルで媒介される作用
ＷＡＲＳフラグメントは、ＶＥ−カドヘリンへの結合による抗血管新生活性を有する。ＷＡＲＳ分泌の制御は明らかになっていない。ＷＡＲＳ２過剰発現はＷＡＲＳ分泌を阻害し、ＷＡＲＳ２遺伝子のサイレンシングはＷＡＲＳ分泌を増加させた。この作用はタンパク質レベルで媒介され、スプライシング又は転写作用との関連は見られなかった。
【０１１０】
（００１６４）
ＨＵＶＥＣ細胞を培養し、アデノウイルスコード化ＷＡＲＳ２を感染させた又はＷＡＲＳ２に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。コントロールウイルス及びｓｉＲＮＡを全ての実験において使用した。コントロールと比較して、ＷＡＲＳ２機能獲得はＷＡＲＳ分泌を減少させた。コントロールと比較して、ＷＡＲＳ２機能喪失はＷＡＲＳ分泌を増加させた（図５を参照のこと）。すなわち、これらのデータは、ＷＡＲＳ２が、血管新生に対して下流効果を有するＷＡＲＳ分泌を調節することを示す。ＷＡＲＳ転写がＩＦＮ−ガンマ刺激により増加すること、またＷＡＲＳの選択的スプライシングがあることは公知であるが、これらの事象へのＷＡＲＳ２の作用は本発明においては示されなかった（図６Ａを参照のこと）。従って、ＷＡＲＳ２のＷＡＲＳへの作用はタンパク質レベルである。
【０１１１】
（００１６５）（００１６６）
ＷＡＲＳ及びＷＡＲＳ２相互作用の細胞局在
ＷＡＲＳは根本的には細胞質タンパク質であるが、ＷＡＲＳの成分はミトコンドリア局在しており、このサブプールはＨＵＶＥＣにおけるインターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマ刺激に続いて増加する。
【０１１２】
（００１６７）
ＷＡＲＳとＷＡＲＳ２との相互作用を本発明において実証した。細胞内分画実験において、ＷＡＲＳはミトコンドリアで検出され、このサブプールはＩＦＮ−ガンマ刺激で増加した。従って、タンパク質−タンパク質相互作用はミトコンドリア画分で起きると予期され、またこのミトコンドリア画分は細胞からのＷＡＲＳの分泌において役割を果たすと考えられる（図６Ｂを参照のこと）。
【０１１３】
（００１６８）（００１６９）
ＷＡＲＳ２はＧＡＩＴ複合体の成分と相互作用する
ＷＡＲＳ２のタンパク質−タンパク質相互作用をより深く理解するために、質量分析（ＭＳ）を行った。本発明の実験において、ＭＳデータは、ＷＡＲＳ２とＥＰＲＳ（ａＡＲＳ）、ＧＡＰＤＨ及びＲＰＬ１４ａとの相互作用を示した。これらのタンパク質は、ＮＳＡＰ１と共に、ＶＥＧＦ及び炎症遺伝子のタンパク質発現をターゲット遺伝子の３’ＵＴＲへの結合を介して制御するのに重要であるＧＡＩＴ複合体を規定する。
【０１１４】
（００１７０）
ＭＳデータだけでは結論がでないが、これは多くの相互作用がこのタイプの実験で確認され下流での検証が必要だからである。相互作用を検証するために、ｃｏ−ＩＰ実験をＷＡＲＳ２及びＷＡＲＳ２（Ｌ５３Ｆ）変異体で行った。ＷＡＲＳ２（ただしＬ５３Ｆ変異体ではない）とＥＰＲＳ、ＧＡＰＤＨ及びＲＰＬ１４ａとの相互作用を記録した（図７に示す通りである）。
【０１１５】
（００１７１）
更に、本明細書に示すように、ＷＡＲＳ２の過剰発現はＲＰＬ１４ａの劇的な喪失をプロテアソームへのターゲティングにより引き起こした。これはプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２により元に戻すことができる作用である（図８を参照のこと）
【０１１６】
（００１７２）
これらのデータは、ＷＡＲＳ２が、ＶＥＧＦ活性の制御において第２レベルで、ここでは多数のサイトカイン及びケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ８、ＣＣＲ３）の翻訳に加えてＶＥＧＦの翻訳を制御するＧＡＩＴ複合体の活性を調節することで作用することを示している。
【０１１７】
（００１７３）（００１７４）
ＷＡＲＳはエキソソーム／マイクロベシクル経路を通して非標準的な分泌を経る
これまでの研究からＷＡＲＳが分泌されることは判明したが、分泌経路は、非標準的ではあるが、キャラクタリゼーションされていない。ＷＡＲＳ分泌にブレフェルジンＡ（ゴルジ媒介分泌を阻害する物質）が及ぼす作用をＨＵＶＥＣ細胞において調べた。上述したように、何の作用も観察されなかった。さらなる調査により、ＷＡＲＳ分泌がエキソソームで行われること、ＷＡＲＳ２により阻害される作用であることが判明した（図９）。これは、エキソソームにおけるＷＡＲＳの新規な分泌経路を規定する。
【実施例３】
【０１１８】
（００１７５）−（００１７８）
ゼブラフィッシュにおけるＷＡＲＳ２機能喪失は血管新生障害及び心機能障害を引き起こす
方法
ゼブラフィッシュにおけるモルホリノ実験及びゼブラフィッシュ血管形成のイメージングを標準的なアプローチを用いて行った。
【０１１９】
（００１７９）（００１８０）
結果
Ｗａｒｓ２の血管発生及び心臓へのインビボ作用を調べるために、Ｗａｒｓ２の第１コドンに対してモルホルホリノを使用してゼブラフィッシュにおいてＷａｒｓ２活性を阻害した。血管形成及び心臓機能における欠陥から、魚の形態及び生存率には際立った影響があり、図１０〜１２にまとめてある。
【実施例４】
【０１２０】
（００１８１）−（００１８４）
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞におけるｓｉＷＡＲＳ２ノックダウン
方法
ＨＥＫ細胞を１０ｃｍディッシュ上にトランスフェクション前日に播種した。約５０％の密度で、トランスフェクションをＲＮＡｉｍａｘ（製造業者のプロトコル）を使用して行った。ｓｉＲＮＡを、１２０ｎＭのｓｉＲＮＡと２０μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉｍａｘとの１ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ中の混合物を使用して調製した。細胞をインキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、次に５ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭでカバーし、リポフェクタミン／ｓｉＲＮＡ混合物を滴加した。細胞をインキュベートし（６時間）、次に培地を（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）に変更した。ＲＮＡをプロトコル通りに抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。ＲＮＡ定量化をＮａｎｏｄｒｏｐを使用して評価し、質をＯＤ比２６０ｎｍ／２８０ｎｍに基づいて求めた。逆転写を、１μｇのＲＮＡ（Ｂｉｏｒａｄ  ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｃＤＮＡ合成プロトコル）を使用して行い、ＱＰＣＲをＱｕａｎｔｉＦＡＳＴ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎプロトコルを用いて行った。
【０１２１】
（００１８５）
ヒトＷＡＲＳ２用のプライマー
Ｆ  ＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＧＡＡＴＡＡＣＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）
Ｒ  ＣＡＴＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）
【０１２２】
（００１８６）
ヒトＧＡＰＤＨ用のプライマー
Ｆ  ＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）
Ｒ  ＡＴＣＧＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）
【０１２３】
（００１８７）
サイクリング条件
９５Ｃ      ５分
９５Ｃ      １０秒  ］
６０Ｃ      ３０秒  ］  ４０ｘ
９５Ｃ      １５秒
６０Ｃ      １分
【０１２４】
（００１８８）
全てのサンプルを二重で分析し、平均及び標準偏差を求めた。増幅の特異性を、６０〜９５℃の融解曲線により求めた。ＧＡＰＤＨへの規格化を標準的なｄｄＣｔ法を用いて行った。
【０１２５】
（００１８９）
実験を５回繰り返し、結果を表２（及び図１５）に示す。
【０１２６】
（００１８９）
【表２】
2017514888.tif 000005
【０１２７】
（００１８９）
ＷＡＲＳ２  ｓｉＲＮＡ１：
センス：５’−ＧＣＡＵＵＣＡＡＣＣＵＡＣＡＧＧＡＡＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）
アンチセンス：５’−ＡＵＵＣＣＵＧＵＡＧＧＵＵＧＡＡＵＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）
【０１２８】
（００１８９）
ＷＡＲＳ２  ｓｉＲＮＡ２：
センス：５’−ＣＣＧＡＣＡＵＵＣＵＧＵＵＧＵＡＣＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）
アンチセンス：５’−ＵＵＧＵＡＣＡＡＣＡＧＡＡＵＧＵＣＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）
【０１２９】
（００１８９）
ＷＡＲＳ２  ｓｉＲＮＡ３：
センス：５’−ＧＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＵＵＵＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）
アンチセンス：５’−ＵＡＡＡＵＧＧＵＣＣＵＵＧＵＣＣＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）
【０１３０】
（００１８９）
これら３つのｓｉＲＮＡ配列対はそれぞれ下のＷＡＲＳ２配列の領域をターゲットにしている。幾つかの態様において、ｓｉＲＮＡ配列は余分なチミン（Ｔ）をｓｉＲＮＡ対のセンス及びアンチセンスの両方の鎖の３’端に含むことで細胞内でのヌクレアーゼ活性に対するｓｉＲＮＡ耐性を上昇させている。特定の態様において、ｓｉＲＮＡセンス及びアンチセンス鎖は２つのＴ（ＴＴ）を３’端に含む。
ｓｉＲＮＡ１ターゲット  ＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＴＡＣＡＧＧＡＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）
ｓｉＲＮＡ２ターゲット  ＣＣＧＡＣＡＴＴＣＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）
ｓｉＲＮＡ３ターゲット  ＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）
【０１３１】
（００１８９）
図１４は、上述したような、３つのｓｉＲＮＡがターゲットとした位置を示すＷＡＲＳ２のｃＤＮＡを示す。
【実施例５】
【０１３２】
（００１９０）−（００１９３）
より高いＷＡＲＳ２発現に関連したＷＡＲＳ２  ＳＮＰはヒト血漿においてＷＡＲＳレベルを制御する
ＷＡＲＳ  ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを用いてヒト血漿におけるＷＡＲＳを測定し、ＷＡＲＳ２のＳＮＰ遺伝子型と比較した（ｒｓ９８４２２２）。血漿におけるＷＡＲＳレベルを、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡを用いて測定した（ＡＢＩＮ３６６２２３、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ  ＧｍｂＨ，アーヘン、ドイツ）。血漿を健康な志願者から採取し、アリコートし、−７０℃で保存した。１００μｌの無希釈の血漿を測定ごとに使用した。検量線を使用した測定を二重に行い、検出限界は０．０７８ｎｇ／ｍｌであると判明した。ＯＤを４５０ｎｍ（５４０ｎｍで補正）でマイクロプレートリーダ（ｕＱｕａｎｔ、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）により読み取った。
【０１３３】
（００１９４）−（００１９７）
ＷＡＲＳ２  ＳＮＰアッセイ
ＳＮＰ  ＩＤ：ｒｓ９８４２２２をＷＡＲＳ２  ＳＮＰアッセイにおいて使用した。
アッセイ：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｃ＿＿＿８６９９０５１＿１０
使用したシステム：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｔｅｐｏｎｅ  ｐｌｕｓ  ｒｔＰＣＲ
【０１３４】
（００１９８）
【表３】
2017514888.tif 000006
【０１３５】
（００１９９）
蛍光配列
ＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣ［Ｃ／Ｇ］ＣＣＣＴＧＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＴＧＡＴＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）
【０１３６】
（００２００）（００２０１）
ＶＩＣ色素Ｃヌクレオチド、ＦＡＭ色素Ｇヌクレオチド
本研究ではＷＡＲＳ２  ＳＮＰ  ＲＳ９８４２２２を調査し、これはＣ／Ｇトランスバージョン置換の多型性を有する。健康な志願者のコホートにおけるこの多型性の比を調査するために、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの既成のアッセイを利用した（アッセイＩＤ：Ｃ＿＿＿８６９９０５１＿１０）。このアッセイではＶＩＣ／ＦＡＭ色素混合物を使用して存在しているＳＮＰを特定する。このアッセイをリアルタイムＰＣＲでＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｔｅｐｏｎｅ  Ｐｌｕｓを用いて行い、Ｓｔｅｐｏｎｅ  Ｐｌｕｓソフトウェアｖ２．１で分析し、ＳＮＰを特定するためのアレル識別プロットを作成した。
【０１３７】
（００２０２）（００２０３）
結果
データは、ＷＡＲＳ２発現を制御するＷＡＲＳ２  ＳＮＰはヒト血漿におけるＷＡＲＳレベルも制御することを示す。本発明で示すように、増加したＷＡＲＳ２発現はＷＡＲＳ分泌を減少させた。サンドイッチＥＬＩＳＡ法（上の方法セクションを参照のこと）を用いて、複数の組織（脂肪を含む）における高レベルのＷＡＲＳ２発現に関連したＷＡＲＳ２  ＳＮＰ  ｒｓ９８４２２２がヒト血漿における低循環レベルのＷＡＲＳに関連しているか否かを確認した。これはＳＮＰのヒト血漿におけるＷＡＲＳへの作用を明らかにした。Ｇ：Ｇアレルに関してホモ接合の個体（組織における高ＷＡＲＳ２）は、Ｇ：Ｃアレル（組織における中等度のＷＡＲＳ２発現）及びＣ：Ｃアレル（組織における低ＷＡＲＳ２発現）と比較してヒト血漿におけるＷＡＲＳレベルが低かった。図１６を参照のこと。
【実施例６】
【０１３８】
（００２０４）−（００２０８）
ＷＡＲＳ２発現はエキソソームにおけるＷＡＲＳ分泌を制御する
方法
細胞培養及び免疫細胞化学
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ）をＥＢＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）を使用して培養した。２継代後、細胞をＴｒｙｐＬＥＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）に消化させ、密度５０００細胞／ｃｍ2で８ウェルチャンバスライド（ｉｂｉｄｉ）に播種した。５０％のコンフルエンスで、ヒトＷＡＲＳ２又はＧＦＰを発現しているアデノウイルス（ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を感染多重度１００（４８時間）で加えた。低血清ＥＢＭ−２培地をアプライし、選択した細胞をインターフェロン−ガンマ（５００単位／ｍｌ、４８時間）で刺激した。細胞を４％ホルムアルデヒドで１５分間にわたって固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００で処理し（１０分間）、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡをブロッキング用にアプライした（３０分間）。一次抗体（ＷＡＲＳ、Ａｂｃａｍ、１：２００、１％ＢＳＡ中）をアプライし、細胞を４℃で一晩インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し（ｘ３）、二次抗体（Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒコンジュゲーテッド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ、１：１０００）とインキュベートした（３０分間）。ＰＢＳで洗浄後（３ｘ）、細胞を３０分間にわたってファロイジン（Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒコンジュゲーテッド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ、１〜２００）とインキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し（ｘ３）、ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ、１〜１０００、５分間）とインキュベートし、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ退色防止封入剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）でマウントした。同じ設定を用いてレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ  ７１０、Ｚｅｉｓｓ）で画像を得た。
【０１３９】
（００２０９）（００２１０）
結果
共焦点画像は、ＷＡＲＳのエキソソームにおける分泌を示している。更に、ＷＡＲＳ２の発現は、細胞でのＷＡＲＳの捕捉により、これらのエキソソームの分泌を阻害した（図１７を参照のこと）。ＨＵＶＥＣ細胞にコントロールウイルス（図１７、左パネルに示す）又はＷＡＲＳ２を発現しているウイルス（図１７、右パネルに示す）を感染させ、インターフェロンガンマで刺激し、次にＷＡＲＳ、アクチン及び核を染色した。コントロール細胞において、ＷＡＲＳを含有している膜結合エキソソーム／マイクロベシクルが細胞の原形質膜から発芽しているのが見られた（矢印）。対照的に、ＷＡＲＳ２感染細胞においては大量のＷＡＲＳが原形質膜（*）に蓄積したが、エキソソームでは蓄積しなかった。
【実施例７】
【０１４０】
（００２１１）−（００２１５）
ＷＡＲＳ２のＺｎフィンガーヌクレアーゼ破壊は血管密度の低下につながる
方法
ラットにおけるＷａｒｓ２の破壊
ＢＮラットＷａｒｓ２座位を、ＺＦＮターゲットサイト：ＡＣＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＴＧＣｇｇｃｔｃＣＣＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）（Ｓａｇｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＡ、米国）に対するＺｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）での第１エキソンの末端領域におけるターゲットにした。遺伝子破壊を、シーケンシング及びＺＦＮターゲットサイトでのエキソン１において同定された８ｂｐ欠失によりスクリーニングした。これはＷａｒｓ２タンパク質のアミノ酸２７後でのフレームシフト及びＷａｒｓ２のアミノ酸５３後のエキソン２における未成熟終止を引き起こした。
【０１４１】
（００２１６）（００２１７）
変異系統のジェノタイピング
ゲノムＤＮＡを、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡキット（ＯＭＥＧＡ  ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造業者のプロトコルに従って使用してトゥークリップサンプルから抽出した。精製に続いて、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ）及び１μＭの以下のプライマー：
（ｉ）５’−ＧＴＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）及び
（ｉｉ）５’−ＧＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）から成る各サンプルについてＰＣＲを行った。
ＰＣＲサイクリング条件：（ｉ）９５℃、５分；（ｉｉ）９５℃、３０秒；（ｉｉｉ）６５℃、３０秒；（ｉｖ）７２℃、３０秒；（ｖ）サイクル２〜４を３０回繰り返す；（ｖｉ）７２℃、５分；（ｖｉｉ）４℃保持。ＰＣＲ産物を５％アガロースゲルでの電気泳動にかけた。予期されたバンドサイズは（ｉ）野生型＝９２ｂｐ、（ｉｉ）ヘテロ接合欠失＝９２ｂｐ及び８４ｂｐ、（ｉｉ）ホモ接合欠失＝８４ｂｐであった。
【０１４２】
（００２１８）（００２１９）
結果
インビボでのこれらのラットの結果は、Ｗａｒｓ２レベルが毛細血管密度及び冠血流量に影響したことを示す。具体的には、Ｗａｒｓ２レベルが低い場合、毛細血管密度は低かった。加えて、Ｗａｒｓ２が低い場合、心臓における毛細血管面積も狭かった。同様に、Ｗａｒｓ２レベルが低い場合、毛細血管密度に左右される心臓における冠血流量は少なかった。図１９Ａ〜Ｃはこれらの結果を示すものである。図１８は、Ｗａｒｓ２がＺｎフィンガーヌクレアーゼを使用して効果的に破壊されたことを示す。
【実施例８】
【０１４３】
（００２２０）−（００２２４）
ＷＡＲＳ２活性阻害
方法
ＷＡＲＳ及びＷＡＲＳ２  ＡＭＰ−ｇｌｏ酵素アッセイ
ＷＡＲＳ及びＷＡＲＳ２酵素アッセイを、９６ウェルフォーマットアッセイを用いてＡＭＰ−ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で最適化した化学発光をベースとしたＡＴＰ欠乏アッセイを用いて行った。反応バッファは２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．２、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのジチオスレイトール、０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、０．２ｍＭのスペルミン、１０Ｕ／ｍＬのピロホスファターゼを含有し、用いた酵素濃度は２００ｎＭであった。基質濃度は以下の通りであった：Ｌ−トリプトファン１００μＭ、バルクＥ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）２００μｇ／ｍＬ及びＡＴＰ  １００μＭ。反応を３７℃で１時間にわたって行い、続いて試薬Ｉ（ＡＭＰ−ｇｌｏキット）を添加した。プレートを室温で更に１時間にわたってインキュベートした。その時間の終わりに、ＡＭＰ検出溶液を全てのサンプルに加え、１時間にわたって室温でインキュベートした。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００マイクロプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）で発光を測定することでデータを収集した。指示に応じて、インドールマイシンを１０マイクロモル濃度で加えた。
【０１４４】
（００２２５）（００２２６）
結果
適切な化合物を使用してＷＡＲＳ２活性を阻害し得る。例えば、本研究は、インドールマイシンがヒトミトコンドリアＷＡＲＳ２を阻害するもののヒト細胞質ＷＡＲＳ活性は阻害しないことを示す。ＷＡＲＳ２活性のそのような阻害は他の阻害モードと組み合わせ得る。例えば、ＷＡＲＳ２変異ラットの変異（Ｌ５３Ｆ）は低血管成長及び低ＷＡＲＳ２酵素活性に関連する。従って、例えば遺伝子治療法を用いて、ＷＡＲＳ２変異型Ｌ５３Ｆを被験体に導入することで酵素活性を低下させ、欠陥成長を阻害し得る。そのようなターゲット遺伝子治療法を他のＷＡＲＳ２阻害剤、例えばインドールマイシン又は関連化合物と更に組み合わせることで血管成長を阻害し得る。図２０Ａ及び２０Ｂはこれらの結果を示したものである。
【実施例９】
【０１４５】
（００２２７）−（００２３０）
コレステロール修飾ｓｉＲＮＡを使用したラットの目におけるＷＡＲＳ２のインビボノックダウン
方法
非ターゲティング（ＮＴ）ｓｉＲＮＡ及びｓｉＷａｒｓ２の両方をＤｈａｒｍａｃｏｎから購入し、用意した滅菌ｓｉＲＮＡバッファで調合した。５０μｇのｓｉＷａｒｓ２を３匹のＦ３４４ラットのそれぞれの各目に総体積５μｌで硝子体内注入した。同じ用量のＮＴコントロールｓｉＲＮＡを、各ラットの反対側の目に注入した。網膜及び脈絡膜を４８時間後に回収し、トータルＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）で抽出した。次に、ｃＤＮＡを製造業者のプロトコル（ＢｉｏＲａｄ）に従って合成した。
【０１４６】
（００２３１）−（００２３５）
Ｗａｒｓ２発現を測定するためのリアルタイムＰＣＲ反応をＳＹＢＲｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）で行い、以下のプライマー：
Ｗａｒｓ２順方向：５’−ＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）；
Ｗａｒｓ２逆方向：５’  ＴＡＣＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）；
ＧＡＰＤＨ順方向：５’−ＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）；
ＧＡＰＤＨ逆方向：５’−ＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）
を使用してＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに規格化した。
【０１４７】
（００２３６）（００２３７）
結果
Ｗａｒｓ２を、コレステロール修飾ｓｉＲＮＡを使用してラットの目においてインビボで効果的にノックダウンした。非ターゲットｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＲＮＡをターゲットにしているＷａｒｓ２は、より高いＷａｒｓ２発現阻害を示した。図２１を参照のこと。
【０１４８】
（００２３８）
ＮＴ−ｓｉＲＮＡ：
センス：５’−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）
アンチセンス：５’−ＡＧＵＣＧＡＣＡＵＧＵＡＡＡＣＣＡＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）
【０１４９】
（００２３９）
Ｗａｒｓ２  ｓｉＲＮＡ：
センス：５’−ＧＣＵＣＣＡＡＵＣＡＧＡＡＧＵＧＡＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）
アンチセンス：５’−ＵＣＡＣＵＵＣＵＧＡＵＵＧＧＡＧＣＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）
【実施例１０】
【０１５０】
（００２４０）−（００２４４）
血管新生のインビトロモデル
方法
管腔形成アッセイ
４８時間のｓｉＲＮＡトランスフェクション又は４８時間のアデノウイルス形質導入若しくはｓｉＲＮＡ遺伝子ノックダウン後、ＨＵＶＥＣを収穫し、１ウェルあたり５０μｌのマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックス、グロースファクターリデュースト）を事前にコーティングした９６ウェルプレートに密度８０００細胞／ウェルで播種した。フルＥＧＭ−２培地で８時間にわたって培養した後、画像を各ウェル（中央の位置）について対物レンズ５Ｘ（ＤＭ３０００倒立顕微鏡、Ｌｅｉｃａ）で得た。画像をＷｉｍＴｕｂｅ（Ｗｉｍａｓｉｓ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）で分析した。
【０１５１】
（００２４５）（００２４６）
結果
ＷＡＲＳ２の調節は血管の形成（すなわち、血管新生）における増加及び／又は減少につながった。ＷＡＲＳ２機能の喪失は血管新生における極めて顕著な減少につながり、内皮細胞の管腔の形成、管腔の全長及び分岐点の数により測定される通りである。データを図２２Ａ〜Ｃに示す。対照的に、ＷＡＲＳ２機能の獲得（図２２Ｄ〜Ｆに示す）は血管新生のこれらの尺度における対応する増加につながった。
【実施例１１】
【０１５２】
（００２４７）−（００２５０）
ｓｉＷＡＲＳ２は内皮細胞増殖の低下を引き起こす
方法
８ウェルチャンバスライドで培養したＨＵＶＥＣを４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００で透過処理を施し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＰＢＳ中１〜２００、３０分間）とインキュベートした。細胞核をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＰＢＳ中１〜１０００、５分間）で染色し、細胞をＰｒｏＬｏｎｇ  ｇｏｌｄ退色防止封入剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）又はＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤマウント媒体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした。画像を、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ  ７１０、Ｚｅｉｓｓ）及び超解像構造化照明顕微鏡（ＥＬＹＲＡ  ＰＳ．１、Ｚｅｉｓｓ）を使用して得た。超解像度画像を、製造業者の指示に従ってＳＩＭモジュールをつけてＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）で後処理した。
【０１５３】
（００２５１）
細胞数：付着ＨＵＶＥＣをトリプシン処理により収穫し、自動細胞計数器（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で数を数えた。
【０１５４】
（００２５２）（００２５３）
結果
細胞形態への作用は、図２３Ａの高解像度顕微鏡写真からみてとれる。阻害されたＷＡＲＳ２の存在下、アクチン線維は全て消失し、ミトコンドリアは塊となった。これにより内皮細胞の遊走及び分裂能は低下した。核の分離は不完全に終わり、細胞はＧ２／Ｍ期で蓄積する（図２４Ａ及びＢを参照のこと）。これらの変化の下流効果は細胞死により増殖を減少させた。著しく阻害された増殖能は図２３Ｂのグラフからみてとれる。
【実施例１２】
【０１５５】
（００２５４）−（００２５８）
Ｗａｒｓ２阻害はインビボ乳がん血管新生モデルにおいて血管成長を防止する
方法
マトリゲルプラグ血管新生アッセイ
Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ膜マトリックス（ＬＤＥＶ非含有：５ｍｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＣＢ−４０２３４Ａ）を氷上又は４℃の冷蔵庫内で解凍した。マトリゲルを氷上に維持しながら、組み換えラットＶＥＧＦ  １６４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５６４−ＲＶ−０１０／ＣＦ）の再構成したストック（滅菌ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ）をマトリゲル中の最終濃度５００ｎｇ／ｍｌまで加えた。５００μｌの冷たいＶＥＧＦ／マトリゲルを冷却した１ｍｌシリンジに装填し、２３又は２７ゲージの針（キャップ付き）を取り付けた。注入時まで冷たく維持するためにシリンジを氷上で維持した。
【０１５６】
（００２５９）
ラットに、イソフルラン又はケタミンカクテルを使用して麻酔をかけた。一番下と下から２番目の乳首との間の乳腺脂肪織（ＭＦＰ）をつまみ、少し持ち上げ、５００μｌのマトリゲルをＭＦＰに注入した。マトリゲルは速やかに固化した。注入から５日後、ラットを安楽死させ、マトリゲルプラグを慎重に脂肪組織から切除した。組織をホイルに包み、速やかに液体窒素中で凍結させた。
【０１５７】
（００２６０）（００２６１）
結果
乳がん血管新生モデルにおいて、阻害Ｗａｒｓ２の存在下、血管成長はインビボで防止された。正常なＷａｒｓ２の３匹のラット及びＷａｒｓ２（Ｌ５３Ｆ）変異を抱える３匹のラット（本明細書で説明したようにＺｎフィンガーヌクレアーゼを使用して変異させた。図１８も参照のこと）について調査した。正常なＷａｒｓ２を有し発現したラットにおいて、ＶＥＧＦマトリゲルプラグへの血管成長を、調査した３匹のラットのそれぞれで可視化した。対照的に、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼを使用した変異によりＷａｒｓ２が阻害されている３匹のラットにおいては、事実上、ＶＥＧＦマトリゲルプラグへの血管成長はみられなかった。再成長を伴う又は伴わないマトリゲルプラグは図２５に見られる。従って、ＷＡＲＳ２阻害は、強化された及び／又は望ましくない血管成長を特徴とする障害（例えば、がん及び様々な眼疾患）にとって有益である。
【実施例１３】
【０１５８】
（００２６２）−（００２６５）
レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のラットモデルにおける病変サイズ及び漏出の減少についてのＷａｒｓ２  ｓｉＲＮＡの評価
方法
非ターゲティングｓｉＲＮＡ（ネガティブコントロール）、Ｗａｒｓ２  ｓｉＲＮＡ（試験物質）及び抗ＶＥＧＦ  Ａｂ（ポジティブコントロール）を６〜８週齢のブラウンノルウェー雌ラットの目に以下のデザインに沿って硝子体内投与した。
１日目：片目あたり３つの病変部を形成するための両目へのレーザー処置
３日目：ネガティブコントロール、ポジティブコントロール又は試験物質の両目への硝子体内注入
２２日目：インビボ蛍光眼底造影検査
２２日目：後の組織学的分析用の眼球摘出及び固定
表４に示すように、５匹のラットの３つのグループを用いた。
【０１５９】
（００２６５）
【表４】
2017514888.tif 000007
【０１６０】
（００２６６）
全てのラットを３匹のグループで、標準的な動物飼育条件下の換気ラックに置いた大型のケージで飼育した。
【０１６１】
（００２６７）（００２６８）
麻酔
２０単位のケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）及び１００単位のキシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）を用いてケタミン及びキシラジンをＵ−１００シリンジで混合した。麻酔混合物をＩＰ注入により１μｌ／ｇ（体重）で投与した。
【０１６２】
（００２６９）（００２７０）
ＣＮＶ病変部形成のためのレーザー照射
ラットの瞳孔を１％サイクロジル溶液で散大させ、光から保護した。目で見てわかるほど散大させてから、ラットをケタミン／キシラジンで鎮静させた。鎮静させたラットの眼底を観察し、Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＩＩ小動物用眼底カメラ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で記録した。Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＩＩカスタムレーザーアタッチメントを介して接続した熱レーザーを使用してレーザー処置を行った。波長５２０ｎｍを用いて全部で３つの病変部を各目に形成する。得られた眼底画像を記録し、評価することで、レーザーによりブルッフ膜に気泡が成功裡に形成されたことを確認した。
【０１６３】
（００２７１）（００２７２）
硝子体内投与
ラットにケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、瞳孔をサイクロゲル及び／又はトロピカミドの局所投与により散大させた。鎮静及び散大後、片目あたり総体積５μｌをＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ及び３３ゲージ針を使用して毛様体扁平部で硝子体に注入した。
【０１６４】
（００２７３）
ＮＴ−ｓｉＲＮＡ：
センス：５’−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）
アンチセンス：５’−ＡＧＵＣＧＡＣＡＵＧＵＡＡＡＣＣＡＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）
【０１６５】
（００２７４）
Ｗａｒｓ２  ｓｉＲＮＡ：
センス：５’−ＧＣＵＣＣＡＡＵＣＡＧＡＡＧＵＧＡＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）
アンチセンス：５’−ＵＣＡＣＵＵＣＵＧＡＵＵＧＧＡＧＣＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）
【０１６６】
（００２７５）（００２７６）
蛍光眼底造影検査
ラットにケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、次に１０％フルオレセインナトリウムを１μｌ／ｇ（体重）でＩＰ注入した。次に、眼底画像を、Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＩＩ及びターゲット波長４８８ｎｍ用のエキサイタ／バリアフィルタを使用して８ビットＴＩＦＦファイルとしてキャプチャした。標準的なカラー眼底写真も各目についてキャプチャした。
【０１６７】
（００２７７）（００２７８）
イメージング及び病変部の定量化
全てのＴＩＦＦ画像をコンピュータ画像解析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ、米国）により定量化した。次に、病変部を個別にフリーハンドでトレースすることで面積をピクセルで定量化し、カラー眼底画像を病変部の位置の参照に使用した。病変部中央の駆血領域は、面積の計算から除外した。出血又は２つの病変部が重なっているならば、これらの病変部を分析から除外した。
【０１６８】
（００２７９）（００２８０）
組織回収
ラットにケタミン／キシラジン（８０／１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけ、次にＥｕｔｈａｓｏｌ（ペントバルビタール）の２００ｍｇ／ｋｇでのＩＰ投与により安楽死させた。安楽死に続いて、眼球を摘出し、個別に４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定に続いて、全ての眼球を個々の２ｍＬスクリューキャップ付きポリプロピレン管で保存した。サンプルは室温で保存した。
【０１６９】
（００２８１）（００２８２）
データ及び統計解析
統計解析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン４．０）で有意性に関する独立ｔ検定を用いて行った。ｐ値＜０．０５での変化のみを統計的に有意であるとみなす。
【実施例１４】
【０１７０】
（００２８３）（００２８４）
実施例１３で行った実験の結果
ネガティブコントロールのラット（すなわち、非ターゲティングｓｉＲＮＡを注入したラット）においては、レーザー処置後、予測通り脈絡膜血管新生が進行する。しかしながら、治療的介入コントロール（抗ＶＥＧＦ抗体）及び試験物質（ＷＡＲＳ２  ｓｉＲＮＡ）の場合、新血管新生の程度において有意な減少が観察される。
【実施例１５】
【０１７１】
（００２８５）−（００２８８）
ヒトＡ５４９肺がん細胞数へのＷＡＲＳ２ノックダウンの影響
方法
トランスフェクション１日前に、Ａ５４９肺がん細胞株（ＡＴＣＣカタログ：ＣＣＬ−１８５）を９６ウェルプレートで１０4細胞／ウェルで培養した。次の日、細胞に非ターゲティングｓｉＲＮＡコントロール（ＳＮ００１−１０Ｄ、１０ｎｍｏｌ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄから入手）又はヒトＷＡＲＳ２  ｓｉＲＮＡ（５’−ＣＣＧＡＣＡＴＴＣＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡ−３’−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、そのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ手順に関するＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓプロトコルに記載のとおりに行った。
【０１７２】
（００２８９）
トランスフェクションから２、４及び５日後に細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分析した。
【０１７３】
（００２９０）（００２９１）
結果
本研究は、ＷＡＲＳ２をターゲットにしたｓｉＲＮＡを使用してＷＡＲＳ２発現を低下させることがヒトＡ５４９肺がんにおいて肺がん細胞の数を有意に減少させることを実証している。図２６に示すように、非ターゲティングｓｉＲＮＡに効果はなかったが、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションからわずか２日後には細胞数における有意な減少が観察され、トランスフェクションから５日後には数は７０％減少した。従って、がん細胞の増殖は、ＷＡＲＳ２の発現の低下により低下した又は阻害された。
【０１７４】
（００２９２）
本明細書で引用した全ての特許、公開公報及び参考文献の教示は、参照により全て援用される。
【０１７５】
（００２９３）
本発明をその実施形態例を参照しながら具体的に示し、説明してきたが、当業者ならば、添付の請求項に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく形態及び細部において様々な変更を加え得ることがわかる。
【図１Ａ】
2017514888.tif 000008
【図１Ｂ−Ｃ】
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【図２Ａ−Ｅ】
2017514888.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９Ａ−Ｃ】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｆ】
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【図２３Ａ】
2017514888.tif 000032
【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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