(57)【要約】本発明は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの製造方法に関する。本製造方法は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物から、加えられたマグネシウム塩の存在下において、抽出又は精製することを特徴とする。また、本発明は、本発明の製造方法により製造された、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物に関する。ここで、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量は、９５重量％を超える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの製造方法であって、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物から、加えられたマグネシウム塩の存在下において、抽出又は精製する、製造方法。
【請求項２】
ａ）Salvia miltiorrhizaの植物原料を第１のアルコール水溶液で抽出することにより、Salvia miltiorrhizaの液状抽出物を得ること、場合により、Salvia miltiorrhizaの液状抽出物を濃縮して、濃縮されたSalvia miltiorrhizaの液状抽出物を与えることと、
ｂ）Salvia miltiorrhizaの液状抽出物又は濃縮されたSalvia miltiorrhizaの抽出液を、マクロ多孔質吸収樹脂でのクロマトグラフィーにより分離し、ここで、第２のアルコール水溶液を溶出に使用し、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有する溶出液を収集することとを含み、
ここで、前記マグネシウム塩を、下記：ａ）の第１のアルコール水溶液、ｂ）のSalvia miltiorrhizaの液状抽出物又は濃縮されたSalvia miltiorrhizaの液状抽出物、及びｂ）の第２のアルコール水溶液の内の少なくとも１つに加える、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ｃ）Salvia miltiorrhizaの抽出物を、マクロ多孔質吸収樹脂でのクロマトグラフィーにより分離し、ここで、第３のアルコール水溶液を溶出に使用し、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有する溶出液を収集することを含み、
ここで、前記マグネシウム塩を、Salvia miltiorrhizaの抽出物及び／又は第３のアルコール水溶液に加える、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
前記マグネシウム塩が、下記化合物：ＭｇＳＯ４、Ｍｇ（Ａｃ）２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＢｒ２、ＭｇＣＯ３、及びＭｇ（ＨＣＯ３）２の内の１つ以上である、請求項１〜３のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項５】
加えられるマグネシウム塩の量が、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物１００ｇ当たりに、５〜２００mgである、請求項１〜４のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項６】
さらに、ｂ）又はｃ）において収集された溶出液を濃縮して、濃縮溶出液を与え、濃縮溶出液のｐＨ値を３〜７に調整し、ついで、有機溶媒で抽出して、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含むラフィネートを得ることを含む、請求項２又は３記載の製造方法。
【請求項７】
有機溶媒が、Ｃ３〜Ｃ６アルコール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルＣ１〜Ｃ３カルボキシラート、及びジ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）エーテルから選択される、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
有機溶媒が、下記溶媒：ｎ−ブチルアルコール、メチルアセタート、エチルアセタート、プロピルアセタート、ブチルアセタート、メチルｔ−ブチルエーテル、及びジエチルエーテルから選択される１つ以上である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
さらに、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含むラフィネートを濃縮し、続けて、アルコール沈殿し、ろ過し、乾燥させて、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム固形物を得ることを含む、請求項６〜８のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項１０】
アルコール沈殿に使用される溶媒が、エタノール又はエタノール水溶液である、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
第１のアルコール水溶液及び第２のアルコール水溶液が、同じか又は異なり、濃度が０〜８０％である、Ｃ１〜Ｃ４アルコールの水溶液から独立して選択される、請求項２記載の製造方法。
【請求項１２】
第３のアルコール水溶液が、濃度が０〜８０％である、Ｃ１〜Ｃ４アルコールの水溶液から選択される、請求項３記載の製造方法。
【請求項１３】
マクロ多孔質樹脂が、下記樹脂：ＨＰ２０、ＨＰＤ−８０、ＨＰＤ−１００、ＨＰＤ−１００Ｂ、ＨＰＤ−２００Ａ、ＨＰＤ−３００、ＨＰＤ−４５０、ＨＰＤ−７２２、ＨＰＤ−８２６、ＡＤＳ−５、ＡＤＳ−８、ＡＤＳ−２１、Ｄ１０１、ＡＢ−８、及び１３００−Ｉの内の１つ以上を含む、請求項２〜１２のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項１４】
リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物からリトスペルミン酸Ｂマグネシウムに混入した不純物を除去するための方法であって、
リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物の水溶液を、酸性又は中性ｐＨ条件下、好ましくはｐＨ３〜７で、有機溶媒により抽出する、方法。
【請求項１５】
リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物を、好ましくは、Salvia miltiorrhizaの植物原料から抽出することにより取得し、ここで、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量が、５０％以上、好ましくは、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上であり、かつ、９９％、９８％、９７％、９６％、又は９５％未満である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
混入した不純物が、ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）又はその塩、リトスペルミン酸又はその塩、及びロスマリン酸又はその塩を含む、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
有機溶媒が、Ｃ３〜Ｃ６アルコール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルＣ１〜Ｃ３カルボキシラート、及びジ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）エーテルから選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
有機溶媒が、下記溶媒：ｎ−ブチルアルコール、メチルアセタート、エチルアセタート、プロピルアセタート、ブチルアセタート、メチルｔ−ブチルエーテル、及びジエチルエーテルから選択される１つ以上である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
薬学的に活性な成分と、薬学的許容し得る担体又は賦形剤とを含み、ここで、薬学的に活性な成分が、Salvia miltiorrhizaの植物原料からの抽出により得られたリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物であり、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量が、９５重量％超であり、ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩の含有量が、０．５％未満であり、リトスペルミン酸及びその塩の含有量が、２．０％未満であり、ロスマリン酸及びその塩の含有量が、２．０％未満である、医薬組成物。
【請求項２０】
リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物が、含有量０．０１％超のダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩、含有量０．１％超のリトスペルミン酸及びその塩、並びに含有量０．１％超のロスマリン酸及びその塩を有する、請求項１９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを製造するための方法及びそれにより製造された高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムに関する。
【背景技術】
【０００２】
サルビアノリン酸塩は、Salvia miltiorrhizaの水溶性活性成分であり、その優れた生体活性、例えば、抗酸化、抗血小板凝集、及び抗アテローム性動脈硬化のために、臨床的に広く使用されてきた。これらのサルビアノリン酸塩の中でも、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム（又は、サルビアノリン酸Ｂマグネシウム、ＭＬＢ）が、主な化学成分である。
【化１】
2017510592.tif 000002
【０００３】
しかしながら、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを工業的に製造するための精製／分離方法は、報告されていない。例えば、中国特許第１９１１２７２号（特許文献１）には、Salvia miltiorrhizaからの高純度デプシド塩を含有する粉末状の注射調製物及びその製造方法が報告された。それにも関わらず、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量は、ほんの５０〜９５％であり、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量が多いほど、収率は低くなった。すなわち、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを得るための工業的製造コストは、非常に高いであろう。
【０００４】
加えて、実質的に純粋なリトスペルミン酸Ｂマグネシウム（９５％超の高純度）を活性成分として使用する医薬は、従来技術において報告されていない。
【０００５】
したがって、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを高収率で製造するための簡易で安定した方法の開発が必要とされている。特に、収率を改善する一方で、高純度（９５％超）のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを製造することが非常に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許第１９１１２７２号
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的の１つは、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを製造するための方法を提供することであり、この方法により、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率を改善することができる。特に、高純度（例えば、９５％超）のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、従来技術の方法と比較して、高収率で得ることができる。具体的には、本発明は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを製造するための方法であって、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物から、加えられたマグネシウム塩の存在下において、抽出又は精製する、方法を提供する。
【０００８】
本発明の別の目的は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムに混入した不純物を除去するための方法であって、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの水溶液を、酸性又は中性ｐＨ条件下で、有機溶媒により抽出する、方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、薬学的に活性な成分と、薬学的許容し得る担体又は賦形剤とを含み、ここで、薬学的に活性な成分が、９５重量％超の含有量を有するリトスペルミン酸Ｂマグネシウムであり、有効成分が、０．５％未満のダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩、２．０％未満のリトスペルミン酸又はその塩、ならびに２．０％未満のロスマリン酸又はその塩を含有する、医薬組成物を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、リトスペルミン酸Ｂ対照の高速液体クトマトグラム（ＨＰＬＣ）である。
【図２】図２は、本発明の実施例１において調製されたリトスペルミン酸Ｂマグネシウム固形物のＨＰＬＣクトマトグラムである。
【図３】図３は、６つのカチオン標準溶液対照のイオンクロマトグラフィーである。
【図４】図４は、本発明の実施例６において調製されたリトスペルミン酸Ｂマグネシウムのイオンクロマトグラフィーである。
【図５】図５は、リトスペルミン酸Ｂ及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの心筋芽細胞Ｈ９Ｃ２に対する毒作用を示す（トリプリケートウェル、ｎ＝３）。
【図６】図６は、リトスペルミン酸Ｂ及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの内皮細胞ＨＭＥＣ−１に対する毒作用を示す（トリプリケートウェル、ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Salvia miltiorrhizaのサルビアノリン酸塩又はSalvia miltiorrhizaの植物原料からリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを抽出するための複数の方法が従来技術に存在する。ここで、本発明者らは、これらの抽出又は精製プロセスにマグネシウム塩を加えることにより、最終生成物であるリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率を顕著に改善することできることを見出した。したがって、本発明は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを製造するための方法であって、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物から、加えられたマグネシウム塩の存在下において、抽出又は精製する、新規な方法を提供する。
【００１２】
一実施態様において、本発明のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを製造するための方法は、
ａ）Salvia miltiorrhizaの植物原料を第１のアルコール水溶液で抽出することにより、Salvia miltiorrhizaの液状抽出物を得ること、場合により、Salvia miltiorrhizaのアルコール水溶液抽出物を濃縮して、濃縮されたSalvia miltiorrhizaの液状抽出物を与えることと、
ｂ）Salvia miltiorrhizaの液状抽出物又は濃縮されたSalvia miltiorrhizaの抽出液を、マクロ多孔質吸収樹脂でのクロマトグラフィーにより分離し、ここで、第２のアルコール水溶液を溶出に使用し、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有する溶出液を収集することとを含み、
ここで、前記マグネシウム塩を、下記：ａ）の第１のアルコール水溶液、ｂ）のSalvia miltiorrhizaの液状抽出物又は濃縮されたSalvia miltiorrhizaの液状抽出物、及びｂ）の第２のアルコール水溶液の内の少なくとも１つに加える。
【００１３】
別の実施態様では、本発明のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを製造するための方法は、
ｃ）Salvia miltiorrhizaの抽出物を、マクロ多孔質吸収樹脂でのクロマトグラフィーにより分離し、ここで、第３のアルコール水溶液を溶出に使用し、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有する溶出液を収集することを含み、
ここで、前記マグネシウム塩を、前記Salvia miltiorrhizaの抽出物及び／又は第３のアルコール水溶液に加える。
【００１４】
本発明で使用されるマグネシウム塩は、本発明に有害な影響を及ぼさないであろう、任意の種類のマグネシウム塩であることができる。具体的な実施態様では、マグネシウム塩は、下記化合物：硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、酢酸マグネシウム（Ｍｇ（Ａｃ）２）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、臭化マグネシウム（ＭｇＢｒ２）、炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ３）、及び重炭酸マグネシウム（Ｍｇ（ＨＣＯ３）２）の内の１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
加えられるマグネシウム塩の量は、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物１００ｇ当たりに、０．１〜５００mgであることができる。具体的な実施態様では、加えられるマグネシウム塩の量は、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物１００ｇ当たりに、１〜３００mg、好ましくは、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物１００ｇ当たりに、５〜２００mg、より好ましくは、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物１００ｇ当たりに、１０〜１５０mg、及び最も好ましくは、Salvia miltiorrhizaの植物原料又はSalvia miltiorrhizaの抽出物１００ｇ当たりに、５０〜１００mgである。
【００１６】
本発明の方法によれば、第１のアルコール水溶液、第２のアルコール水溶液、及び第３のアルコール水溶液は、同じか又は異なってもよく、それぞれ、０〜８０％、５〜６０％、１０〜５０％、又は２０〜４０％の種々の濃度の、Ｃ１〜Ｃ４アルコール水溶液から独立して選択される。具体的な一実施態様では、第１のアルコール水溶液、第２のアルコール水溶液、及び第３のアルコール水溶液は全て、エタノール水溶液である。
【００１７】
本発明におけるクロマトグラフィー分離に使用されるマクロ多孔質樹脂は、下記樹脂：ＨＰ２０、ＨＰＤ−８０、ＨＰＤ−１００、ＨＰＤ−１００Ｂ、ＨＰＤ−２００Ａ、ＨＰＤ−３００、ＨＰＤ−４５０、ＨＰＤ−７２２、ＨＰＤ−８２６、ＡＤＳ−５、ＡＤＳ−８、ＡＤＳ−２１、Ｄ１０１、ＡＢ−８、１３００−Ｉの内の１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【００１８】
ある実施態様において、本発明の方法は、さらに、上記工程ｂ）又はｃ）において収集されたリトスペルミン酸Ｂマグネシウム溶出液を濃縮して、濃縮溶出液を与え、濃縮溶出液のｐＨ値を３〜７に調整し、ついで、これを有機溶媒で抽出して、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有するラフィネートを与えることを含んでもよい。濃縮溶出液のｐＨ値を調整するのに使用される材料は、特に制限されず、１つ以上の無機酸又は有機酸、例えば、１つ以上の塩酸、硫酸、リン酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸、及び酢酸であることができる。抽出に使用される有機溶媒は、Ｃ３〜Ｃ６アルコール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルＣ１〜Ｃ３カルボキシラート、及びジ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）エーテルから選択することができる。抽出に使用される好ましい有機溶媒は、下記溶媒：ｎ−ブチルアルコール、メチルアセタート、エチルアセタート、プロピルアセタート、ブチルアセタート、メチルｔ−ブチルエーテル、及びジエチルエーテルの内の１つ以上から選択される。
【００１９】
任意の有益な実施態様では、本発明の方法は、さらに、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有するラフィネートを濃縮し、続けて、アルコール沈殿し、ろ過し、乾燥させて、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有する固形物を与えることを含む。アルコール沈殿に使用される溶媒は、エタノール又はエタノール水溶液、好ましくは、８５〜９５％濃度を有するエタノール水溶液であることができる。乾燥は、下記方法：スプレー乾燥、真空乾燥、及び凍結乾燥の内の１つ以上により行うことができる。
【００２０】
加えて、本発明者らは、驚くべきことに、抽出及び精製プロセスの間にリトスペルミン酸Ｂマグネシウムに通常混入する一部の水溶性フェノール酸不純物が、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物の水溶液の簡易な有機溶媒抽出により除去することができることを見出した。
【００２１】
したがって、本発明の別の態様は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物に混入した不純物を除去するための方法であって、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物の水溶液を、酸性又は中性ｐＨ条件下、好ましくはｐＨ３〜７で、有機溶媒により抽出する、方法を提供する。リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物は、好ましくは、Salvia miltiorrhizaの植物原料を抽出することにより得られ、ここで、主成分であるリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量が、５０％以上、好ましくは、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上であり、かつ、９９％、９８％、９７％、９６％、又は９５％未満である。本発明は、これらの終値により構成される任意の数値範囲に関する。本明細書におけるリトスペルミン酸Ｂマグネシウムに混入した不純物は、ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）又はその塩、リトスペルミン酸又はその塩、及びロスマリン酸又はその塩、例えば、ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）ナトリウム、ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）カリウム、ロスマリン酸ナトリウム、ロスマリン酸カリウム、リトスペルミン酸二カリウム、リトスペルミン酸マグネシウムなどを含む。これらの物質は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムのホモログであり、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムと非常に類似する物理的及び化学的性質を有する。有機溶媒による抽出により、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを著しくロスすることなく、これらの不純物を実質的に除去することができたことは、全く予期されなかったことである。これらの不純物は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムと特性が類似するためである。抽出に有用な有機溶媒は、好ましくは、Ｃ３〜Ｃ６アルコール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルＣ１〜Ｃ３カルボキシラート、及びジ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）エーテルから選択される。より好ましくは、抽出に有用な有機溶媒は、下記溶媒：ｎ−ブチルアルコール、メチルアセタート、エチルアセタート、プロピルアセタート、ブチルアセタート、メチルｔ−ブチルエーテル、及びジエチルエーテルの内の１つ以上から選択される。
【００２２】
本発明の別の目的は、本発明の方法により製造された高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを提供することできる。ここで、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物は、９５重量％超、好ましくは９６重量％超、より好ましくは９７重量％超、及び最も好ましくは９８重量％超のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含む。ある実施態様において、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物は、５重量％以下、好ましくは４重量％以下、より好ましくは３重量％以下、及び最も好ましくは２重量％以下の不純物を含む。前記不純物は、ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）、リトスペルミン酸、及びロスマリン酸の内の１つ以上を含む。
【００２３】
本発明の別の態様は、薬学的に活性な成分と、薬学的許容し得る担体又は賦形剤とを含み、ここで、薬学的に活性な成分が、Salvia miltiorrhizaの植物原料からの抽出により得られた、９５重量％超の含有量を有するリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物であり、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物が、０．５％未満、好ましくは０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、又は０．０５％未満の含有量を有するダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩；２．０％未満、好ましくは１．５％未満、１．０％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、又は０．１％未満の含有量を有するリトスペルミン酸及びその塩；ならびに、２．０％未満、好ましくは１．５％未満、１．０％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、又は０．１％未満の含有量を有するロスマリン酸及びその塩を含む、医薬組成物を提供する。好ましくは、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物は、０．０１％超の含有量を有するダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩、０．１％超の含有量を有するリトスペルミン酸及びその塩、ならびに、０．１％超の含有量を有するロスマリン酸及びその塩を含有する。好ましくは、本医薬組成物中のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物は、含有量０．５％未満、好ましくは０．３％未満、及びより好ましくは０．１％未満のリトスペルミン酸Ｂ二カリウムを有する。本医薬組成物中のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物は、含有量０．０１％超、０．０５％超、又は０．１％超のリトスペルミン酸Ｂ二カリウムを有する。好ましくは、本発明の医薬組成物中のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物は、含有量１％未満、好ましくは０．５％未満、好ましくは０．３％未満、及びより好ましくは０．１％未満の遊離リトスペルミン酸Ｂを有する。本医薬組成物中のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物は、含有量０．０１％超、０．０５％超、又は０．１％超の遊離リトスペルミン酸Ｂを有する。上限値及び下限値により説明される上記各成分について、本発明は、上限値のいずれか１つと下限値のいずれか１つにより構成される数値範囲に関する。最も好ましくは、本発明の医薬組成物中のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、本発明で記載された方法により製造される。
【００２４】
リトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、心血管疾患、例えば、冠動脈心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血発作などの処置に有用である。
【００２５】
本発明の高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム中では、リトスペルミン酸マグネシウム、ロスマリン酸ナトリウムなどの不純物が除去されている。ここで、これらの不純物は、弱い生体活性を示し、従来技術において除去するのが困難であった。またさらに、本発明者らは、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムが良好な安定性を示し、遊離リトスペルミン酸Ｂと比較して、ほとんど心毒性を表わさないことを見出した。さらに、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、遊離酸（リトスペルミン酸Ｂ）、他の塩（リトスペルミン酸Ｂ二カリウム）、及び低純度の混合物（Salvia miltiorrhizaのデプシド塩）より、ラット尾出血モデルにおいて、より良好な活性を示す。このため、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを活性成分として含有する本発明の医薬組成物では、リトスペルミン酸マグネシウム、ロスマリン酸ナトリウムなど、並びに／又は、遊離リトスペルミン酸Ｂ及びその他の塩などの類似不純物が実質的に除去されており、生体活性に関して優位性を示す。
【００２６】
本発明の方法により製造された高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、種々の医薬組成物として製造することができる。本医薬組成物の剤形は、液剤、注射剤、錠剤、糖衣錠、フィルムコート錠、腸溶コート錠、カプセル剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、経口液剤、口腔剤、顆粒剤、舐剤、丸剤、粉末剤、ペースト剤、舌下調製物、懸濁剤、坐剤、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、噴霧剤、滴剤、パッチ剤、及び液滴丸剤を含むが、これらに限定されない。本発明の方法により製造された高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムで製剤化された医薬組成物は、微少循環の改善、抗アテローム性動脈硬化、抗フリーラジカル酸化傷害、及び類似する症状に適用することができる。
【００２７】
本発明のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを製造するための方法は、同方法が簡易であり、低コストに実施することができ、工業的規模に容易に実現することができ、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムをより高い純度及び収率で与えることができるため、利点を示す。特に、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの抽出及び精製中にマグネシウム塩を加えることが、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム（９５％超）を得るために、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの顕著に改善された収率（約３％）をもたらすことができることが、本発明で初めて発見されている。本発明のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率は、従来技術、特に、中国特許公開公報第１０２０５８５９９号に記載された方法より２０％近く上回って向上する。収率の向上により、製造効率が更に改善される。改善された収率に加えて、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物が、他の方法では、複雑な分離によってしか得ることができないところ、本発明は、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物を、簡易な抽出プロセスにより、高純度（例えば、９５％超）でもたらすことができる。したがって、本発明の方法は、大規模な工業生産に非常に有意義であり、本発明の方法により製造されたリトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、医薬調製物に非常に適している。
【実施例】
【００２８】
下記実施例は、本発明を例示的に証明するのに使用されるが、本発明の範囲を制限すると全く理解されるべきでないない。
【００２９】
Ｉ．リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの調製
実施例１
１kg Salvia miltiorrhizaの植物原料（Shanghai Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.から購入：ロット番号：131001）を取得し、粉砕した。粉砕したSalvia miltiorrhizaの植物原料を、５０％ エタノール水溶液 ７Ｌ、５Ｌ、及び３Ｌで、還流条件下において３回（それぞれ２時間）連続的に抽出した。抽出液を組み合わせ、アルコールが完全に除去されるまで、減圧下で濃縮した。得られた濃縮液をろ過して、ろ液 ６Ｌ（相対密度１．０２）を与えた。ついで、このろ液を、３kg マクロ多孔質樹脂Ｄ１０１（Tianjin Haiguang Chemical Engineering Co. Ltd.）による吸収クロマトグラフィーに供した。溶出を、６カラム容量の０％及び６％ 水性エタノール−ＭｇＣｌ２を連続して（溶出液である６％ エタノール／塩化マグネシウム水溶液は、合計５００mg 塩化マグネシウムを含む）、ついで、２カラム容量の２０％ エタノール−水溶出液、続けて、完了まで、５０％ エタノール−水溶出液で行った。リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含む溶出液を収集し、アルコールが完全に除去されるまで、減圧下で濃縮した。ついで、濃縮されたリトスペルミン酸Ｂマグネシウム液のｐＨを、弱酸性に調整した。この濃縮液を、エチルアセタートで、連続的に向流抽出した。水溶液画分を収集し、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの濃度が約１００mg/mLになるまで濃縮し、続けて、９５％ エタノールでアルコール沈殿し、ろ過した。ろ液を濃縮し、減圧下で乾燥させて、３０．８ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウム固形物を与えた。リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量は、９６．７０％であり、収率は、植物原料に基づいて２．９８％であった。主な不純物は、０．７６％ リトスペルミン酸及びその塩、０．６２％ ロスマリン酸及びその塩、ならびに０．１２％ ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩であった。
【００３０】
実施例２
１kg Salvia miltiorrhizaの植物原料（Shanghai Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.から購入：ロット番号：131001）を取得し、粉砕した。粉砕したSalvia miltiorrhizaの植物原料を、７０％ エタノール水溶液 ６Ｌ、５Ｌ、及び３Ｌで、還流条件下において３回（それぞれ２時間）連続的に抽出した。抽出液を組み合わせ、アルコールが完全に除去されるまで、減圧下で濃縮した。濃縮液に、２００mg 塩化マグネシウムを、撹拌条件下において加え、ついで、この液体をろ過し、マクロ多孔質樹脂ＨＰＤ−１００（Bon Chemical Engineering Co. Ltd.）によるクロマトグラフィーに供した。溶出を、６カラム容量の０％及び６％ エタノール水溶液を連続して、ついで、２カラム容量の２０％ エタノール−水溶液、続けて、完了まで、４５％ エタノール−水溶液で行った。リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含む溶出液を収集し、アルコールが完全に除去されるまで、減圧下で濃縮した。得られた濃縮されたリトスペルミン酸Ｂマグネシウム液のｐＨを、弱酸性に調整した。この濃縮液を、１倍量のエチルアセタートで３回抽出した。水溶液画分を収集し、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの濃度が約５０mg/mLになるまで濃縮し、続けて、９０％ エタノールでアルコール沈殿し、ろ過した。ろ液を濃縮し、減圧下で乾燥させて、３０．６ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウム固形物を与えた。リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量は、９６．３０％であり、収率は、植物原料に基づいて２．９５％であった。主な不純物は、０．８０％ リトスペルミン酸及びその塩、０．７１％ ロスマリン酸及びその塩、ならびに０．１３％ ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩であった。
【００３１】
ＩＩ．リトスペルミン酸Ｂマグネシウム及び主な不純物の検出及び分析
１．リトスペルミン酸Ｂマグネシウムのクロマトグラフ分析及び検出
機器：Agilent 1260高速液体クロマトグラフィー、Empower2クロマトグラフィーワークステーション、全波長ダイオードアレイ検出器；Sartorius cp225D hundred thousandth電子天秤。
【００３２】
クロマトグラフカラム：YMC C18クロマトグラフカラム（２５０×４．６mm、５μm）；試薬：メタノールは、クロマトグラフィー純度とした。水は、Milliporeで調製した超純水とした。他の試薬は全て、分析純度とした。
【００３３】
含有量測定のために、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム対照を、National Institutes For Food And Drug Controlから購入した（ロット番号：111562-201212）。
【００３４】
クロマトグラフ条件及びシステム安定性試験：オクタデシルシラン結合シリカゲルを、フィルタとして使用した。流速：１．０mL・分−１；カラム温度：３０℃；検出波長：２８８nm。リトスペルミン酸Ｂについて算出された理論上のプレート番号は、５０００以上であった。メタノール及び０．０５％ ギ酸水溶液を移動相として使用して、定組成溶出（メタノール比４５％）を３０分間行った。
【００３５】
リトスペルミン酸Ｂ対照溶液の調製
リトスペルミン酸Ｂ対照を、正確に秤量し、メスフラスコに移し、水で溶解させ、２５℃の大気温度で十分に振とうし、目盛り線まで希釈した。
【００３６】
サンプル溶液の調製
サンプルを、正確に秤量し、水で溶解させ、２５℃の大気温度で十分に振とうし、目盛り線まで希釈した。
【００３７】
測定方法
対照溶液を、正確に取り、液体クロマトグラフィーに注入した。クロマトグラムを生成し、記録した。サンプルを、正確に取り、液体クロマトグラフィーに注入した。ピーク面積比を算出した。
【００３８】
リトスペルミン酸Ｂ対照のＨＰＬＣクロマトグラムを、図１に示す。
【００３９】
本発明の実施例１において調製したリトスペルミン酸Ｂマグネシウム固形物のＨＰＬＣクロマトグラムを、図２に示す。
【００４０】
２．リトスペルミン酸Ｂ中の金属カチオンの検出
機器：DIONEX ICS900イオンクロマトグラフ、Thermo DS5導電率検出器；Inhibitor Thermo CSRS 300  ４mm；ワークステーションChromeleon 7；SPE-C18小型カラム；Sartorius cp225D hundred thousandth電子天秤。
【００４１】
クロマトグラフィーカラム：Dionex IonPac CS12A；ガードカラム：Dionex IonPac CG12A；２０mM メチルスルホン酸水溶液で溶出。
【００４２】
６つのカチオンＩＩ標準を、含有量測定及び分析のために、DIONEX Companyから購入した。
【００４３】
クロマトグラフィー条件及び測定方法：流速：１．０mL・分−１；注入量：１０μL；リトスペルミン酸Ｂマグネシウムのサンプルを、脱イオン水で１０００ppm母液に配合した。この母液を、実験直前に１００ppmに希釈した。塩酸の添加後（最終濃度２０mM）、サンプルを、１秒あたりに１滴の速度で、SPE-C18吸収カラムを通過させ、ついで、ミクロ多孔質フィルタメンブランを通過させ、直接注入した。
【００４４】
６つのカチオンＩＩ検量線
６つのカチオンＩＩ標準を、正確に秤量し、メスフラスコに移し、水で溶解させ、２５℃で十分振とうし、目盛り線まで希釈した。
【００４５】
測定方法
６つのカチオンＩＩ標準溶液を、正確に取り、イオンクロマトグラフに注入した。クロマトグラムを記録した。サンプルを、正確に取り、イオンクロマトグラフに注入した。ピーク面積比を算出した。
【００４６】
６つのカチオンＩＩ標準溶液対照のクロマトグラムを、図３に示した。
【００４７】
本発明の実施例６において調製したリトスペルミン酸Ｂマグネシウムのイオンクロマトグラムを、図４に示した。
【００４８】
実験結果から、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムが本発明により得られたことが示された。
【００４９】
３．リトスペルミン酸Ｂマグネシウム及び主な不純物の構造確認
不純物を、本発明の実施例１のリトスペルミン酸Ｂマグネシウム生成物から、ゲルカラムクロマトグラフィー及びＣ１８カラムにより分離し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、及び熱イオンクロマトグラフィーにより構造確認した。結果は、以下の通りであった。
【００５０】
３．１  ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）のナトリウム塩
【化２】
2017510592.tif 000003
1H NMR (D2O, 400MHz) δ: 6.79 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.59 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H), 5.18 (dd, J = 8.4, 4.0 Hz, 1H), 3.42 (dd, J = 14.3, 4.0 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 14.3, 8.4 Hz, 1H); 13C NMR (D2O, 100MHz) δ: 174.1, 145.3, 144.1, 130.1, 121.7, 117.4, 116.3, 78.6, 39.4; ESI-MS (m/z) 221.2 [M+Na]+; IC: Na+
【００５１】
３．２  リトスペルミン酸のマグネシウム塩
【化３】
2017510592.tif 000004
1H NMR (D2O, 400MHz) δ: 7.56 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 1.5Hz, 1H), 6.94 (d, J = 1.0Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.5Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 8.5Hz, 1H), 6.86(d, J = 8.5Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.5Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 8.5, 1.0Hz, 1H), 6.20 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.81 (d, J = 6.0Hz, 1H), 4.98 (dd, J = 9.5, 3.5Hz, 1H), 4.23 (d, J = 5.5Hz, 1H), 3.13 (dd, J = 14.1, 3.5Hz), 3.05 (dd, J = 14.1, 9.5Hz, 1H); 13C NMR (D2O, 100MHz) δ: 182.3, 180.1, 171.4, 149.7, 147.3, 147.0, 146.8, 145.6, 145.3, 145.1, 136.3, 133.4, 131.6, 126.5, 124.6, 124,2, 121.3, 120.4, 119.8, 119.2, 119.1, 118.7, 116.2, 91.9, 79.7, 62.3, 40.0; ESI-MS (m/z) 561.1 [M+Na]+; IC: Mg2+.
【００５２】
３．３  ロスマリン酸
【化４】
2017510592.tif 000005
1H NMR ((CD3)2CO, 400MHz) δ: 7.55 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 2.0 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.59 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 6.23 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.17 (br.d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.07 (br.d, J = 14.3 Hz, 1H), 2.93 (dd, J = 14.3, 8.0 Hz, 1H); 13C NMR ((CD3)2CO, 100MHz) δ: 171.1, 166.3, 148.5, 145.6, 145.4, 144.7, 143.3, 128.6, 126.7, 121.6, 120.7, 117.1, 115.3, 115.0, 114.6, 114.2, 72.6, 37.5; ESI-MS (m/z) 361.2 [M+H]+.
【００５３】
３．４  リトスペルミン酸Ｂマグネシウム
【化５】
2017510592.tif 000006
1H NMR (CD3OD, 500MHz) δ: 7.52 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.65 (dd, J = 8.2, 2.0 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 8.2, 1.9 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 6.20 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.20 - 5.15 (m, 2H), 4.35 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.06 (dd, J = 14.3, 4.3 Hz, 1H), 3.03 - 2.96 (m, 2H), 2.83 (dd, J = 14.3, 9.6 Hz, 1H); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δ: 171.8, 170.7, 170.4, 166.2, 147.2, 144.9, 144.7, 144.2, 144.1, 143.4, 143.2, 141.7 131.8, 127.4, 127.1, 124.5, 122.8, 120.4, 120.2, 119.9, 116.5, 116.5, 115.7, 115.4, 114.7, 114.6, 114.5, 114.5, 111.5, 86.4, 73.7, 72.8, 56.1, 36.0, 35.6; ESI-MS (m/z) 741.2 [M+Na]+；IC: Mg2+.
【００５４】
ＩＩＩ．リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの抽出又は精製プロセスにおける調査
１．リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率におけるマグネシウム塩の効果
抽出及び分離プロセスの間に加えられたマグネシウム塩のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率における効果を調査するために、下記検証実験を行った。
【００５５】
比較例１（任意のマグネシウム塩を加えない）
１００ｇ Salvia miltiorrhizaの植物原料（Shanghai Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.から購入：ロット番号：131001）を取得し、１回の抽出単位として、５０ｇに分けた。各単位についての抽出工程は、下記の通りとした。
（１）５０ｇ Salvia miltiorrhizaの植物原料を、７０％ エタノール ３００mLで、還流下において２時間抽出し、ろ過した。ろ液 １８０mLを収集した。残留物に、７０％ エタノール ２５０mLを更に加え、還流下で２時間抽出し、ろ過した。ろ液 ２３５mLを収集した。残留物に、７０％ エタノール ２５０mLを更に加え、還流下で２時間抽出し、ろ過した。ろ液 ２２５mLを収集した。これらのろ液を組み合わせた（６４０mL）。エタノールを回収し、８２ｇ 液状抽出物を、相対密度１．０９１（６０℃）で得た。この抽出物を、相対密度１．０２に水で希釈し、ろ過して、ろ液 ３０５mLを得た。得られたろ液を、１５０ｇ １３００−Ｉ（Yangzhou Pharmaceutical Co., Ltd.）マクロ多孔質樹脂吸収カラムに、ゆっくり充填した。吸収完了後、水 ３００mLを使用して、糖、タンパク質、及び無機塩を洗浄した。さらに、６％ エタノール ３００mLを使用して、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを除く他のサルビアノリン酸塩を除去した。最後に、２０％ エタノール １５０mLを、溶出に使用した。各溶出液 １０mLを、１つの画分として収集した。溶出液容量 １２０mLを、ＨＰＬＣ検出により確認した後に得た。この溶出液を、減圧下において、−０．０７〜−０．１MPaの真空度及び８０℃以下の温度で濃縮して、５．７ｇ 抽出物を、相対密度１．１５（５０℃）で得た。
【００５６】
（２）残りの５０ｇ Salvia miltiorrhizaの植物原料を、７０％ エタノール ３００mLで、還流下において２時間抽出し、ろ過した。ろ液 １９０mLを収集した。残留物に、７０％ エタノール ２５０mLを更に加え、還流下で２時間抽出し、ろ過した。ろ液 ２２５mLを収集した。残留物に、７０％ エタノール ２５０mLを更に加え、還流下で２時間抽出し、ろ過した。ろ液 ２２０mLを収集した。これらのろ液を組み合わせた（６３５mL）。エタノールを回収し、９５ｇ 抽出物ペーストを、相対密度１．０９０（６０℃）で得た。この抽出物を、相対密度１．０２に水で希釈し、ろ過して、ろ液 ３０５mLを得た。得られたろ液を、１５０ｇ １３００−Ｉ（Yangzhou Pharmaceutical Co., Ltd.）マクロ多孔質樹脂吸収カラムに、ゆっくり充填した。吸収完了後、水 ３００mLを使用して、糖、タンパク質、及び無機塩を洗浄した。さらに、６％ エタノール ３００mLを使用して、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを除く他のサルビアノリン酸塩を除去した。最後に、２０％ エタノール １５０mLを、溶出に使用した。各溶出液 １０mLを、１つの画分として収集した。溶出液容量 １１０mLを、ＨＰＬＣ検出により確認した後に得た。この溶出液を、減圧下において、−０．０７〜−０．１MPaの真空度及び８０℃以下の温度で濃縮して、５．５ｇ 抽出物を、相対密度１．１５（５０℃）で得た。
【００５７】
１１．２ｇ 液状抽出物を、上記単位（１）及び（２）からの抽出物を組み合わせることにより得た。９５％ エタノール ３００mLを加えた後、混合物を、アルコール沈殿のために、２時間静置し、ついで、ろ過して、透明な液体 ２９０mLを与えた。ろ液を、６０℃以下の温度で−０．０７〜−０．１MPaの真空度におけるエタノール回収に供し、ついで、０．０８Mpaの真空度及び６０℃以下の温度で乾燥させて、３．２７ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量８５．１０％及び収率２．７８％（植物含量に基づく）で与えた。
【００５８】
比較例２（塩化カリウムを添加）
処理工程を、塩化カリウム（１６mg、０．２１mmol）を抽出プロセス中に加えたことを除いて、比較例１の処理工程と同様とした。３．１７ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量８４．２３％及び収率２．６７％（植物含量に基づく）で得た。
【００５９】
実施例３
処理工程を、塩化マグネシウム（２０mg、０．２１mmol）を抽出プロセス中に加えたことを除いて、比較例１の処理工程と同様とした。３．８６ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量８６．３６％及び収率３．３３％（植物含量に基づく）で得た。
【００６０】
実施例４
処理工程を、塩化マグネシウム（２０mg、０．２１mmol）を濃縮抽出液に加えたことを除いて、比較例１の処理工程と同様とした。４．０７ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量８４．２１％及び収率３．４２％（植物含量に基づく）で得た。
【００６１】
実施例５
処理工程を、塩化マグネシウム（２０mg、０．２１mmol）をカラム分離中の水溶出相に加えたことを除いて、比較例１の処理工程と同様とした。３．９５ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量８５．３１％及び収率３．３７％（植物含量に基づく）で得た。
【００６２】
表１に、比較例１〜２及び実施例３〜５で得られたリトスペルミン酸Ｂマグネシウムについての、純度、固形物量、収率、及び収率の相対向上率を示す。ここで、収率の相対向上率を、比較例１の収率に基づいて算出した。
相対向上率＝（収率−比較例１の収率）／収率×１００％
【００６３】
【表１】
2017510592.tif 000007
【００６４】
比較例１〜２と実施例３〜５との間の結果の比較から、本発明の抽出及び分離プロセス中のマグネシウム塩の添加により、マグネシウム塩を加えなかった、又は、カリウム塩を加えた場合のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率（２．７８％及び２．６７％）より、明らかに高いリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率（３．３３％、３．４２％、及び３．３７％）がもたらされたことが示された。
【００６５】
２．リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの純度における抽出の効果
比較例３
１００ｇ Salvia miltiorrhizaの植物原料（Shanghai Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.から購入：ロット番号：131001）を粉砕し、煎じ、４倍容量、２倍容量、及び２倍容量の水で３回連続して、各２時間抽出した。抽出液を組み合わせ、室温に冷却し、遠心分離によりろ過した。ろ液を、３倍容量の１３００−Ｉマクロ多孔質樹脂（Yangzhou Pharmaceutical Co., Ltd.）を充填した吸収カラムを、ゆっくり通過させた。吸収完了後、６倍容量の水を使用して、糖、タンパク質、及び無機塩を洗浄した。さらに、６倍容量の２０％ エタノールを使用して、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを除く他のサルビアノリン酸塩を除去した。最後に、３倍容量の５０％ エタノールを使用して、Salvia miltiorrhizaのサルビアノリン酸塩を溶出した。ＴＬＣ検出に基づいて、５０％までのエタノールによる溶出液に、大量のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムが含まれていた。これを収集し、減圧下において、植物原料重量の１／１０量まで濃縮した。その後、無水エタノールを、植物原料重量の９／１０量に、撹拌条件下において、ゆっくり加えた。２時間の静置後、沈殿物を、遠心分離により廃棄した。ろ液を、植物原料重量の１／２０量に濃縮し、ついで、無水エタノールを、植物原料重量の１９／２０量で加え、２時間静置し、遠心分離によりろ過した。ろ液を、減圧下において、乾燥するまで濃縮した。粉砕後、２．５７ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９１．１６％及び収率２．３７％（植物原料に基づく）で得た。主な不純物は、０．７８％ リトスペルミン酸及びその塩、６．５７％ ロスマリン酸及びその塩、ならびに０．１０％ ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩であった。
【００６６】
比較例４
１００ｇ Salvia miltiorrhizaの植物原料（Shanghai Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.から購入：ロット番号：131001）を粉砕し、煎じ、９０〜１００℃において、水 ６００、３００、及び２５０mLで３回連続して、各２時間抽出した。抽出液を組み合わせ、遠心分離によりろ過した。ろ液を、減圧下において濃縮した。濃縮液（２５０mL）を、１３００−Ｉマクロ多孔質樹脂（Yangzhou Pharmaceutical Co., Ltd.） ３００mLを充填した吸収カラムを、ゆっくり通過させた。その後、水 ８００mLを使用して、不純物を除去するために、吸収カラムを洗浄した。さらに、５０％ エタノール ６００mLを使用して、Salvia miltiorrhizaのサルビアノリン酸塩を溶出した。５０％ エタノールの溶出による溶出物を収集し、減圧下において、１０mLに濃縮し、無水エタノール ９０mLを、撹拌しながらゆっくり加えた。２時間の静置後、ついで、遠心分離し、沈殿物を廃棄した。上清を濃縮し、乾燥させ、粉砕して、８０．５６％ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含むサルビアノリン酸塩を与えた。主な不純物は、５．２１％ リトスペルミン酸及びその塩、８．６４％ ロスマリン酸及びその塩、ならびに０．６２％ ダンシェンス（ｄａｎｓｈｅｎｓｕ）及びその塩であった。
【００６７】
Salvia miltiorrhizaの得られたサルビアノリン酸塩を、水で溶解させ、ＨＰ２０マクロ多孔質樹脂カラムで分離した。溶出を、６カラム容量の０％及び６％ エタノール水溶液で連続して、２カラム容量の２０％ エタノール水溶液、ついで、完了まで、５０％ エタノール水溶液で行った。ＨＰＬＣ検出により、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含む５０％ エタノール溶出液を収集し、減圧下において、アルコールが完全に除去されるまで濃縮した。濃縮液のｐＨを、５に調整し、エチルアセタートによる逆抽出に３回供した。リトスペルミン酸Ｂマグネシウム画分を収集し、減圧下において、乾燥するまで濃縮した。２．１６ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９８．６７％及び収率２．１３％（植物原料に基づく）で得た。主な不純物は、０．５２％ リトスペルミン酸及びその塩ならびに０．３２％ ロスマリン酸及びその塩であった。
【００６８】
比較例５
１００ｇ Salvia miltiorrhizaの植物原料（Shanghai Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.から購入：ロット番号：131001）を、６倍容量の６０％ エタノールで、還流下において２時間抽出した。この抽出を、合計３回行った。抽出液を組み合わせ、アルコールが完全に除去されるまで、減圧下において濃縮した。濃縮液を、ろ過後に、ＨＰ２０マクロ多孔質樹脂カラムで分離した。溶出を、６カラム容量の０％及び６％ エタノール水溶液で連続して、続けて、２カラム容量の２０％ エタノール水溶液、ついで、完了まで、５０％ エタノール水溶液で行った。ＨＰＬＣ検出により、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含む５０％ エタノール溶出液を収集し、減圧下において、アルコール臭が検出されなくなるまで濃縮した。濃縮液のｐＨを、５に調整し、エチルアセタートによる逆抽出に３回供した。リトスペルミン酸Ｂマグネシウム画分を収集し、乾燥するまで、減圧下において濃縮した。２．４１ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９６．２１％及び収率２．３２％（植物原料に基づく）で得た。主な不純物は、１．０８％ リトスペルミン酸及びその塩ならびに０．９６％ ロスマリン酸及びその塩であった。
【００６９】
実施例６
１００ｇ Salvia miltiorrhizaの植物原料（Shanghai Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.から購入：ロット番号：131001）を、６倍容量の６０％ エタノールで、還流下において２時間抽出した。この抽出を、合計３回行った。抽出液を組み合わせ、アルコール臭が検出されなくなるまで、減圧下において濃縮した。濃縮液に、塩化マグネシウム（１６mg、０．２１mmol）を加え、３０分間撹拌し、ついで、ろ過後に、ＨＰ２０マクロ多孔質樹脂カラムで分離した。溶出を、６カラム容量の０％及び６％ エタノール水溶液で連続して、続けて、２カラム容量の２０％ エタノール水溶液、ついで、完了するまで、５０％ エタノール水溶液で行った。ＨＰＬＣ検出により、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有する５０％ エタノール溶出液を収集し、減圧下において、アルコール臭が検出されなくなるまで濃縮した。濃縮液のｐＨを、５に調整し、エチルアセタートによる逆抽出に３回供した。リトスペルミン酸Ｂマグネシウム画分を収集し、乾燥するまで、減圧下において濃縮した。２．９７ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９６．９２％及び収率２．８８％（植物原料に基づく）で得た。主な不純物は、０．９２％ リトスペルミン酸及びその塩ならびに０．８１％ ロスマリン酸及びその塩であった。
【００７０】
表２に、比較例３〜５及び実施例６で得られたリトスペルミン酸Ｂマグネシウムについての、純度、固形物量、収率、及び収率の相対向上率を示す。ここで、収率の相対向上率を、比較例３の収率に基づいて算出した。
相対向上率＝（収率−比較例３の収率）／収率×１００％
【００７１】
【表２】
2017510592.tif 000008
【００７２】
比較例３〜５と実施例６との結果を比較することにより、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量（９５％超を達成）を、逆抽出により、顕著に改善することができたことが見出された。加えて、比較例４〜５と実施例６との結果を比較することにより、高純度のリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率を、加えられたマグネシウム塩により、顕著に改善するこができたことが更に見出された。一方、実施例６の結果から、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの含有量は、粗原料として純度約８０％のSalvia miltiorrhizaのデプシド塩を使用した場合、９８％に達することができたことが示された。
【００７３】
３．リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率及び純度におけるマグネシウム塩の添加量の効果
実施例７
１００ｇ Salvia miltiorrhizaの植物原料（Shanghai Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.から購入：ロット番号：131001）を、６倍容量の６０％ エタノールで、還流下において２時間抽出した。この抽出を、合計３回行った。抽出液を組み合わせ、アルコール臭が検出されなくなるまで、減圧下において濃縮した。濃縮液に、５mg 塩化マグネシウムを加え、３０分間撹拌し、ついで、ろ過後に、ＨＰ２０マクロ多孔質樹脂（Mitsubishi Chemical, Japan）カラムで分離し、６カラム容量の水、２０％ エタノール、及び４０％ エタノールで連続的に溶出した。ＨＰＬＣ検出により、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含有する４０％ 溶出液を収集し、減圧下において、アルコール臭が検出されなくなるまで濃縮した。濃縮液のｐＨを、５に調整し、エチルアセタートによる逆抽出に３回供した。リトスペルミン酸Ｂマグネシウム画分を収集し、乾燥するまで、減圧下において濃縮した。２．６２ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９６．６３％及び収率２．５２％（植物原料に基づく）で得た。
【００７４】
実施例８
処置工程を、１０mg 塩化マグネシウムを濃縮抽出液に加えたことを除いて、実施例７の処理工程と同様にした。２．９１ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９５．３５％及び収率２．７７％（植物原料に基づく）で得た。
【００７５】
実施例９
処置工程を、２０mg 塩化マグネシウムを濃縮抽出液に加えたことを除いて、実施例７の処理工程と同様にした。３．０５ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９６．８１％及び収率２．９５％（植物原料に基づく）で得た。
【００７６】
実施例１０
処置工程を、５０mg 塩化マグネシウムを濃縮抽出液に加えたことを除いて、実施例７の処理工程と同様にした。３．２５ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９４．１１％及び収率３．０６％（植物原料に基づく）で得た。
【００７７】
実施例１１
処置工程を、１００mg 塩化マグネシウムを濃縮抽出液に加えたことを除いて、実施例７の処理工程と同様にした。３．５２ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９２．５６％及び収率３．２６％（植物原料に基づく）で得た。
【００７８】
実施例１２
処置工程を、２００mg 塩化マグネシウムを濃縮抽出液に加えたことを除いて、実施例７の処理工程と同様にした。３．４８ｇ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、含有量９３．１７％及び収率３．２４％（植物原料に基づく）で得た。
【００７９】
表３に、実施例７〜１２それぞれで得られたリトスペルミン酸Ｂマグネシウムについての、純度、固形物量、及び収率を示す。
【００８０】
【表３】
2017510592.tif 000009
【００８１】
表３に示されたように、Salvia miltiorrhiza１００ｇ当たりに、５〜１００mgの範囲で塩化マグネシウムを加えた場合、加えたマグネシウム塩量が多いほど、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率が高くなった。一方、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの収率は、塩化マグネシウム量を２００mgに増加させた場合には、顕著には向上しなかった。
【００８２】
４．リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの安定性についての調査
リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの化学安定性を、ピーク面積（ＨＰＬＣ）の変動を検出することにより調査した。具体的な実験方法：リトスペルミン酸Ｂ（研究室で製造；ロット番号：20131017）及び本発明の実施例１において調製したリトスペルミン酸Ｂマグネシウムをそれぞれ、１mg/mL 水溶液に２５℃で配合した。ついで、この水溶液を、１０倍に希釈した。リトスペルミン酸Ｂのピーク面積の変動を、２８８nmにおいて、０、２、４、６、８、１２、及び２４時間の期間でそれぞれ、ＨＰＬＣにより検出した。１０マイクロリットルを、各時点で注入した。結果を、表４に示す。
【００８３】
【表４】
2017510592.tif 000010
【００８４】
実験結果から、ピーク面積が、各成分について、２４時間以内に著しく変動しないことが示された。これにより、本発明の実施例１において調製したリトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、良好な化学安定性を有することが証明された。
【００８５】
ＩＶ．リトスペルミン酸Ｂマグネシウムの薬理学的活性の調査
実験実施例１．リトスペルミン酸Ｂ及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウムについての細胞傷害性及び抗酸化活性の調査
【００８６】
１．１  細胞傷害性実験の調査材料及び方法
１．１．１．細胞傷害性実験についての材料
サンプル及び対照
使用前に生理食塩水で配合した、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム（本出願の実施例６において調製）、リトスペルミン酸Ｂ（研究室で製造；ロット番号20131017）；溶媒対照としての生理食塩水を、Jiangsu Yabang Pharmaceutical Co., Ltd.から得た。他の試薬は全て、市販の分析純度の製品とした。
【００８７】
細胞株及び試薬
心筋芽細胞（Ｈ９Ｃ２）；微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）；乳酸デヒドロゲナーゼ細胞傷害性検出キット、Beyotime Biotechnology Institute。
【００８８】
主な機器：多機能ＥＬＩＳＡリーダ（Spectra MAX M2e)、Molecular Devices, USAの製品；顕微鏡（Optiphot-2）Nikon, Japan；ＣＯ２インキュベータ、Thermo, USA；バイオセーフティーキャビネット、Boxun, Shanghai。
【００８９】
１．１．２  細胞傷害性実験の方法
用量設定
リトスペルミン酸Ｂ及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウムの用量を、１０、５０、１００、２００、４００、８００、１２００、１６００μMに設定し、培養時間を、本実験では２４時間に設定した。
【００９０】
実験方法
Ｈ９Ｃ２細胞及びＨＭＥＣ−１細胞をそれぞれ、１０％ ＦＢＳ含有の低糖類ＤＭＥＭ培地及びＭＣＤＢ−１３１培地中において、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。細胞を、９６ウェル培養プレートに播種した。このプレートに、種々の濃度のリトスペルミン酸Ｂ溶液及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウム溶液を、翌日（約８０％融合）加えた。合計２４時間の培養後、検出を、乳酸デヒドロゲナーゼ細胞傷害性検出キットの説明書に従って行った。
【００９１】
観察インジケータ及び観察時間
観察インジケータを、細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼレベルとする。細胞生存率を、細胞内ＬＤＨ含量比、すなわち（処理したサンプルウェルの吸光度−サンプル対照ウェルの吸光度）／（最大酵素活性を有する細胞の吸光度−サンプル対照ウェルの吸光度）×１００により表した。
【００９２】
統計学的方法
データを、平均±標準偏差（平均±ＳＤ）で表した。２群のデータ比較を、スチューデントｔ検定法により、統計学的に分析した。ｐ＜０．０５は、統計学的差異を示す。
【００９３】
１．１．３  細胞傷害性実験の結果
種々の濃度のリトスペルミン酸Ｂ及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウムを、細胞と共に２４時間培養した。細胞内ＬＤＨ含有量検出の結果から、心筋芽細胞Ｈ９Ｃ２について、４００、８００、１２００、１６００μM リトスペルミン酸Ｂ及び８００、１２００、１６００μM リトスペルミン酸Ｂマグネシウムにより、細胞内ＬＤＨ含有量が、正常な対照ウェルと比較して有意に減少し（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）；内皮細胞ＨＭＥＣ−１について、１２００及び１６００μM リトスペルミン酸Ｂ及び１２００及び１６００μM リトスペルミン酸Ｂマグネシウムにより、細胞内ＬＤＨ含有量が、正常な対照ウェルと比較して有意に減少した（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）ことが示された。表５、図５、及び図６を参照のこと。
【００９４】
【表５】
2017510592.tif 000011
【００９５】
結論
高用量のリトスペルミン酸Ｂ及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、心筋芽細胞及び内皮細胞の両方に毒作用を有したが、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、特に内皮細胞株において、リトスペルミン酸より低い毒性を示した。
【００９６】
１．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗脂質過酸化実験の調査材料及び方法
１．２．１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗脂質過酸化実験のための材料
サンプル及び対照
使用前に生理食塩水で配合した、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム（本願の実施例６において調製）、リトスペルミン酸Ｂ（研究室で製造；ロット番号：20131017）；溶媒対照としての生理食塩水を、Jiangsu Yabang Pharmaceutical Co., Ltd.から得た。他の試薬は全て、市販の分析純度の製品とした。Ｔｒｉｓ塩基、塩化カリウム、リン酸二カリウム、グリセロール等（Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.）；クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０、ウシ血清アルブミン（Shanghai Lanji Technology Development Co., Ltd.）。
【００９７】
実験動物
種及び系統：ＳＤラット；供給元：Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.、実験動物産生ライセンス：SCXK (Shanghai) 2012-0002；数及び性別：２匹、オス；動物体重：２００〜２５０ｇ。
【００９８】
１．２．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗脂質過酸化実験の方法
肝臓ミクロソームを調製するための手順
肝臓組織を採取し、細かく切り、バッファーＡで洗浄し、拭き、８ｇ分秤量した。組織１ｇ当たりに、バッファーＡ １０mLを加えることにより、合計で８０mLを加え、続けて、自動ホモジナイゼーションし、手動ホモジナイザーで更にホモジナイゼーションした。このホモジネートを、１０，０００ｇ及び４℃で、３０分間遠心分離した。上清を採取した。この上清を、１０５，０００ｇ及び４℃で、６０分間遠心分離した。得られた沈殿物を、ミクロソームとした。ついで、このミクロソームに、バッファーＢを加えて、ミクロソーム懸濁液を得た。この懸濁液を、２mLの小型チューブにアリコートし、更なる使用のために−７０℃の冷蔵庫で保存した。タンパク質含有量の測定：ブラッドフォード法（クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０法）を使用。
【００９９】
ラット肝臓ミクロソーム中での脂質酸化の測定
肝臓ミクロソーム １mLを、各チューブに加え、続けて、種々の濃度の試薬溶液を加えた。混合物を、十分振とうし、３７℃の水浴で９０分間培養した。チューブを取り出した後、１０％ トリクロロ酢酸（ＴＣＡ） １mL及び０．６７％ チオバルビツール酸（ＴＢＡ） １mLを、各チューブに加えた。このチューブを、沸騰した水浴に１５分間入れ、ついで、流水で冷却し、３０００rpmで１０分間遠心分離した。上清を、５３２nmでの比色測定に供した。含有量を、テトラエトキシプロパン標準で算出し、タンパク質 １mg当たりの含有量で表した。
【０１００】
計算式
ＭＤＡ含有量（nmol/mg  タンパク質）＝｛［（Ａサンプル−Ａブランク）÷（Ａ標準−Ａブランク）］×１０nmol/mL｝÷タンパク質含有量
阻害率％＝（ＭＤＡブランク−ＭＤＡサンプル）／ＭＤＡブランク×１００％
【０１０１】
１．２．２  実験結果
結果を、表６に示す。薬剤濃度 １００μMにおいて、リトスペルミン酸Ｂ及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、かなりの抗脂質過酸化効果を示した。この場合、阻害率は、８５％付くに達した。このことは、これらの化合物の抗酸化が、化学構造中のフェノール性ヒドロキシによるが、塩形態は、これに関して影響を及ぼさないことを示している。
【０１０２】
【表６】
2017510592.tif 000012
【０１０３】
実験実施例２．リトスペルミン酸Ｂ、リトスペルミン酸Ｂ二カリウム、Salvia miltiorrhizaのデプシド塩、及びリトスペルミン酸Ｂマグネシウムについての、ラットの切断された尾の出血における効果
【０１０４】
２．１  材料及び方法
２．１．１  実験材料
サンプル及び対照
使用前に生理食塩水で配合した、リトスペルミン酸Ｂ、リトスペルミン酸Ｂ二カリウム、Salvia miltiorrhizaのデプシド塩（８５％ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含む）、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム；溶媒対照としての生理食塩水を、Jiangsu Yabang Pharmaceutical Co., Ltd.から得た。他の試薬は全て、市販の分析純度の製品とした。
【０１０５】
実験動物
種及び系統：ＳＤラット；供給元：Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.、実験動物産生ライセンス：SCXK (Shanghai) 2012-0002；数及び性別：５０匹、オス；動物体重：１２０〜２００ｇ。
【０１０６】
主な機器：水浴、外科用メス、タイマー
【０１０７】
２．１．２  実験方法
用量設定
リトスペルミン酸種の試薬の用量を、本実験では、５０及び１００mg/kgに設定した。生理食塩水を、更なる溶媒対照として与えた。尾切断のタイミングを、投与後２分とした。
【０１０８】
サンプル及び対照の投与経路及び投与量：大腿静脈からの注入により投与、２mL/kg。
【０１０９】
実験方法
動物に、水のみを与えて、一晩絶食させた。５０mg/kg ペントバルビタールナトリウムを、実験前に麻酔するために、腹腔内に注入した。動物の麻酔後、マーカーを、マーカーペン及び定規で、ラットの尾の先端から４mmに付けた。薬剤を、動物の大腿静脈から注入した。２分後、尾を、動物の尾におけるマーカーを付けた位置において、外科用メスにより迅速に切断した。残った動物の尾を、３７℃の水浴中に準備した生理食塩水チューブに素早く入れ、計時を開始した。動物の尾の出血を観察した。３０秒以内に出血がそれ以上観察されなかった時点で、時間を、動物の凝固時間（単位：秒）として記録した。３０分で出血が観察されなかった場合、実験を停止し、１８００秒と記録した。
【０１１０】
観察インジケータ及び観察時間：インジケータを、出血時間とした。
【０１１１】
統計学的方法
実験データを、ｘ±ＳＤで表した。GraphPad Prism 51 の一元ＡＮＯＶＡを、有意差検定に適用した。
【０１１２】
２．２  実験結果
表７に示されたように、５０及び１００mg/kg リトスペルミン酸種の化合物をＳＤラットに対して静脈内注射により投与することにより、ラットの切断した尾の出血時間を、有意に伸ばすことができる。同じ用量のリトスペルミン酸Ｂ又はリトスペルミン酸ＢマグネシウムをＳＤラットに対して静脈内注射により投与することにより、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム投与群におけるラットの切断した尾の出血時間は、リトスペルミン酸Ｂ投与群よりかなり長かった。加えて、同じ用量において、リトスペルミン酸Ｂマグネシウム投与群におけるラットの切断した尾の出血時間は、リトスペルミン酸Ｂ二カリウム及びSalvia miltiorrhizaのデプシド塩（比較例４の段落１における記述に基づいて得られる、８０．５６％ リトスペルミン酸Ｂマグネシウムを含む）より有意に長かった。
【０１１３】
【表７】
2017510592.tif 000013
【０１１４】
上記薬理学的実験結果から、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、心筋芽細胞Ｈ９Ｃ２及び内皮細胞ＨＭＥＣ−１の細胞傷害性実験において、リトスペルミン酸Ｂより低い毒性を示したことが示されている。加えて、リトスペルミン酸Ｂマグネシウムは、ラットの尾の出血時間を伸ばすための実験において、遊離酸（リトスペルミン酸Ｂ）、他の塩（リトスペルミン酸Ｂ二カリウム）、及び低純度の混合物（Salvia miltiorrhizaのデプシド塩）に対して優れた活性を示した。
【図１】
2017510592.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2017510592.tif 000021
2017510592.tif 000022
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