(57)【要約】  本発明は、マルチカラムクロマトグラフィーを使用して血漿から血漿タンパク質濃縮物を調製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿から治療用途のための精製された血漿タンパク質濃縮物を調製するための方法であって、血漿又は血漿画分がマルチカラムクロマトグラフィーに供される精製工程を含む、方法。
【請求項２】
血漿画分が、寒冷沈降した血漿上清、再懸濁した血漿寒冷沈降物、エタノール分画により得られた画分I〜V、カプリル酸及び/又はカプリレートでの沈殿後に得られた上清及び沈殿物、クロマトグラフィーによって保持されなかった溶出液又は画分、ろ液から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
治療用途のための精製された血漿タンパク質濃縮物が、免疫グロブリン、アルブミン、凝固因子、例えばフィブリノーゲン(第I因子)、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第XI因子、第XIII因子、フォン-ウィルブランド因子、プロトロンビン複合体又はPPSB(第II因子、第VII因子、第IX因子、第X因子)、活性化されたプロトロンビン複合体、生物学的な接着因子、及びプロテアーゼ阻害剤、例えばアルファ-1アンチトリプシン、C1-エステラーゼ阻害剤又は単独の若しくは混合物中のアンチトロンビン、アルファ/マクログロブリン、アンチキモトリプシン、アンチトリプシン、アポA、アポB、アポC、アポD、アポE、アポF、アポG、ベータXIIa、C反応性タンパク質、C7、C1r、C1s、C2、C3、C4、C4bP、C5、C6、C1q、C8、C9、カルボキシペプチダーゼN、セルロプラスミン、B因子、D因子、H因子、フィブロネクチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘパリン補因子II、ヒスチジンリッチGP、キニナーゼII、キニノーゲンHPM、リゾチーム、PAI2、PAII、PCI、プラスミン、プラスミン阻害剤、プラスミノゲン、プレアルブミン、プレカリクレイン、プロパージン、プロテアーゼネキシンINH、プロテインC、プロテインS、プロテインZ、血清アミロイドタンパク質(SAP)、TFPI、チオール-プロテイナーゼ、トロンボモジュリン、組織因子(TF)、TPA、トランスコバラミンII、トランスコルチン、トランスフェリン、ビトロネクチンから選択される血漿タンパク質を含有する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
治療用途のための精製された血漿タンパク質濃縮物が、免疫グロブリン濃縮物である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
治療用途のための精製された血漿タンパク質濃縮物が、アルブミン及び/又はフィブリノーゲン濃縮物である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
治療用途のための精製された血漿タンパク質濃縮物が、フィブリノーゲン及び/又はアルブミン並びに免疫グロブリン濃縮物である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
マルチカラムクロマトグラフィーが、マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
血漿又は寒冷沈降した血漿上清が、マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーからなるヒト免疫グロブリンの精製工程に直接供される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーのアフィニティーリガンドが、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4に対するアフィニティーを有するリガンドから選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーが、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、化学的リガンド、例えばペプチド、模倣ペプチド、ペプトイド、ナノフィチン、及びオリゴヌクレオチドリガンド、例えばアプタマーから選択されるアフィニティーリガンドを使用する、請求項7から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーが、工業用途に適合する浄化及び/又は激しい再使用の条件に耐性を有するアフィニティーリガンドから、特にペプチド、ペプトイド、ナノフィチン及びアプタマーから選択されるアフィニティーリガンドを使用する、請求項7から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
マルチカラムクロマトグラフィーが、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、例えばマルチカラム陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、又はマルチカラム疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はマルチカラムミックスモードクロマトグラフィー、又はマルチカラムサイズ排除クロマトグラフィーである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
マルチカラム陰イオン交換クロマトグラフィーが、DEAE又はTMAE又はQAE基でグラフト化された、架橋多糖ゲル又はビニル又はアクリルポリマーゲルで実行される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
血漿又はクロマトグラフィーによって保持されなかった画分等の高い塩分を有する媒体中で血漿タンパク質を捕捉するために、マルチカラム陰イオン交換及び/又はミックスモードクロマトグラフィーが、高度に耐塩性のマトリックスで行われる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
血漿又は寒冷沈降した血漿上清が、マルチカラム陰イオン交換クロマトグラフィーからなるヒト免疫グロブリンの精製工程に直接供され、任意選択で、前記ヒト免疫グロブリンを含有する画分が、それに続くカプリル酸での沈殿による精製工程に供され、免疫グロブリンを含有する上清が収集される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
血漿又は寒冷沈降した血漿上清が、マルチカラムアフィニティークロマトグラフィー又はマルチカラム陰イオン交換クロマトグラフィーであるアルブミン及び/又はフィブリノーゲンの精製工程に直接供され、任意選択で、アルブミン及び/又はフィブリノーゲンを含有する画分が、それに続くカプリル酸での沈殿による精製工程に供され、アルブミン及び/又はフィブリノーゲンを含有する画分が収集される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
マルチカラムクロマトグラフィーが、3から8つのカラム、優先的には3から5つのカラムを連続して含み、及び/又はマルチカラムクロマトグラフィーカラムが、ラジアルカラムである、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
以下の追加の工程:
-  脱脂及び/又は濾過工程;
-  カプリル酸での沈殿工程;
-  任意選択で溶媒-洗浄剤処置及び/又はナノ濾過を包含する、ウイルス不活化又は排除工程;
-  イオン交換クロマトグラフィー工程、特に陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー工程であって、陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、DEAE又はTMAE又はQAE基でグラフト化された、架橋多糖ゲル又はビニルポリマーゲルで優先的には実行される、工程;
-  特にアフィニティークロマトグラフィー、例えばマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる抗A及び抗B抗体の排除工程;
-  限外濾過による濃縮工程;
-  製剤化工程
の少なくとも1つを含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
治療用途のための精製された血漿タンパク質濃縮物への1種又は複数の医薬的に許容される安定剤の添加を含む製剤化工程、及び任意選択で、製剤化工程の終わりに得られた医薬調製物を凍結又は凍結乾燥する工程を更に含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
(a)溶媒/洗浄剤による血漿の第1の不活化工程;
(b)マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる工程(a)で得られた不活化血漿からの免疫グロブリンの精製工程;次いで
(c)任意選択で、工程(b)の結果得られた免疫グロブリン濃縮物からの、特にアフィニティークロマトグラフィーによる、抗A及び抗B抗体の排除工程;次いで
(d)任意選択で、工程(b)又は(c)の結果得られた免疫グロブリン濃縮物のナノ濾過による第2のウイルス排除工程;並びに
(e)工程(b)、(c)又は(d)の結果得られた免疫グロブリン濃縮物への、1種又は複数の医薬的に許容される安定剤の添加工程
を連続して含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
(a')マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる、寒冷沈降した血漿上清からの免疫グロブリンの精製工程;次いで
(b')溶媒/洗浄剤による工程(a')で得られた免疫グロブリン濃縮物の第1の不活化工程;次いで
(c')任意選択で、工程(b')の結果得られた免疫グロブリン濃縮物からの、特にアフィニティークロマトグラフィーによる、抗A及び抗B抗体の排除工程;次いで
(d')任意選択で、工程(b')又は(c')の結果得られた免疫グロブリン濃縮物のナノ濾過による第2のウイルス排除工程;並びに
(e')工程(b')、(c')又は(d')の結果得られた免疫グロブリン濃縮物への、1種又は複数の医薬的に許容される安定剤の添加工程
を連続して含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
(A)寒冷沈降した血漿上清の、エタノール及び/又はカプリル酸による分画工程;次いで
(B)任意選択で、工程(A)で得られた溶液の、溶媒/洗浄剤による第1のウイルス不活化又は排除工程;次いで
(C)工程(A)又は(B)で得られた溶液のマルチカラム陰イオン交換クロマトグラフィーによる免疫グロブリンの精製工程;次いで
(D)任意選択で、工程(C)の終わりに得られた免疫グロブリン濃縮物からの、特にアフィニティークロマトグラフィーによる抗A及び抗B抗体の排除工程;次いで
(E)任意選択で、工程(C)又は(D)の終わりに得られた免疫グロブリン濃縮物のナノ濾過による第2のウイルス排除工程;並びに
(F)工程(C)、(D)又は(E)の結果得られた免疫グロブリン濃縮物への、1種又は複数の医薬的に許容される安定剤の添加工程
を連続して含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
血漿又は寒冷沈降した血漿上清を、
-  終了時に免疫グロブリンを含有する画分が収集される、少なくとも1つのアフィニティーリガンドが免疫グロブリンと特異的に結合するマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー;並びに/或いは
-  その終わりにフィブリノーゲン及び/又はアルブミンを含有する画分が収集される、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー、
並びに任意選択で、アルブミン及び/又はフィブリノーゲンを含有する画分のカプリル酸での沈殿によるそれに続く精製工程、
並びに/或いは任意選択で、以下のそれに続く工程の少なくとも1つ:
-  ウイルス不活化又はウイルス排除工程、
-  イオン交換クロマトグラフィー工程、
-  特にアフィニティークロマトグラフィーによる抗A及び抗B抗体の排除工程、
-  限外濾過による濃縮工程、
-  製剤化工程
に供する工程を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
-10℃から-40℃の間の温度で血漿を沈殿させること、次いで0℃から+1℃の間の温度で穏やかに解凍すること、それに続いて寒冷沈降物と上清とを分離するために解凍した血漿を遠心分離することによって、寒冷沈降した血漿上清が、前もって得られた、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
血漿又は寒冷沈降した血漿上清が、第1の血漿タンパク質を捕捉するために第1のマルチカラムクロマトグラフィーに直接供され、次いで第1のマルチカラムクロマトグラフィーからの非保持画分が、第2の血漿タンパク質を捕捉するために第2のマルチカラムクロマトグラフィーに供される、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
第2のマルチカラムクロマトグラフィーからの非保持画分が、第3の血漿タンパク質を精製するために、第3のクロマトグラフィー、優先的にはマルチカラムクロマトグラフィーに、又は沈殿工程に供される、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
マルチカラムアフィニティー又はイオン交換クロマトグラフィーからの保持画分が、目的の血漿タンパク質、優先的にはフィブリノーゲン及び/又はアルブミンであり、次いで任意選択で前記目的の血漿タンパク質が溶出される、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
マルチカラムアフィニティー又はイオン交換クロマトグラフィーからの保持画分が、不純物を含有し、非保持画分が、目的のタンパク質、優先的にはアルブミン及び/又はフィブリノーゲンを含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
血漿を分画するための方法であって、血漿又は寒冷沈降した血漿上清又は血漿画分を、
-  終了時に免疫グロブリンを含有する画分が収集される、少なくとも1つのアフィニティーリガンドが免疫グロブリンに特異的に結合するリガンドであるマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー;並びに
-  終了時にアルブミン及び/又はフィブリノーゲンを含有する画分が収集される、任意選択で高度に耐塩性の、マルチカラムイオン交換及び/又はミックスモードクロマトグラフィー;並びに任意選択で
-  フィブリノーゲン及び/又はアルブミンを含有する、先行するマルチカラムクロマトグラフィーによって保持されなかった前記画分の、沈殿及び/又はクロマトグラフィーによる精製工程
に直接供する工程を含む、方法。
【請求項３０】
血漿を分画するための方法であって、血漿又は寒冷沈降した血漿上清又は血漿画分を、
-  終了時に免疫グロブリンを含有する画分が収集される、少なくとも1つのアフィニティーリガンドが免疫グロブリンに特異的に結合するリガンドであるマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー;及び/又は
-  終了時にフィブリノーゲンを含有する画分が収集される、少なくとも1つのアフィニティーリガンドがフィブリノーゲンに特異的に結合するリガンドであるマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー;及び/又は
-  終了時にアルブミンを含有する画分が収集される、少なくとも1つのアフィニティーリガンドがアルブミンに特異的に結合するリガンドであるマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー
に直接供する工程を含む、方法。
【請求項３１】
免疫グロブリンと結合するマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーが、アルブミン及び/又はフィブリノーゲンと結合する1つ又は複数のマルチカラムクロマトグラフィーの上流で行われる、請求項26から29のいずれか一項に記載の分画の方法。
【請求項３２】
血漿における免疫グロブリンの分布プロファイルと類似するか又は同一な免疫グロブリンの分布プロファイルを有する免疫グロブリン濃縮物。
【請求項３３】
50から70%のIgG1、25から35%のIgG2、2から8%のIgG3及び1から8%のIgG4を有する免疫グロブリンG濃縮物である、請求項32に記載の免疫グロブリン濃縮物。
【請求項３４】
血漿の抗原レパートリーと類似するか又は同一な抗原レパートリーを有する免疫グロブリン濃縮物。
【請求項３５】
前記濃縮物の抗原レパートリーが、従来技術の濃縮物の抗原レパートリーと類似するか及び/又はそれより優れていることを特徴とする、請求項34に記載の免疫グロブリン濃縮物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿又は血漿画分から治療用途のためのヒト血漿タンパク質を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のところ、1種又は複数の血漿タンパク質が高濃度化された血漿画分で、多数の病状が処置されている。したがって、凝固因子欠乏に関連する出血を予防又は処置するための補充療法では、凝固因子が一般的に使用される。フィブリノーゲンは、先天性又は重度の無フィブリノーゲン血症に関連する合併症、及び低フィブリノーゲン血症に関連する出血症候群又は出血の危険を処置するためにほとんどの場合処方される。アルブミンは、循環血液の体積を回復及び維持することが意図されている(確認された血液量減少症)。同様に、現在のところ、一般的に95%より多くのIgを含む、免疫グロブリン、特に免疫グロブリンG(IgG)が高濃度化された血漿画分で、多数の病状が処置されている。
【０００３】
例えば、抗体産生が欠如している原発性免疫不全、特定の続発性免疫不全、例えば白血病、骨髄腫又は回帰感染等を治療するために、免疫グロブリンGが高濃度化された血漿画分、又はIgG濃縮物が使用されている。またIgの投与も、若年性及び成人特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、ギランバレー症候群、脱髄性多発ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、川崎病、多発性硬化症、ステロイド抵抗性の皮膚筋炎、急性筋無力症、散弾状網脈絡膜炎、胎児-母体間のABO型不適合による新生児黄疸(ABO型不適合による新生児の溶血性疾患)等の処置において有益な作用を有する場合がある。
【０００４】
欧州及びアメリカ合衆国では、特定のケースで処方される可能性がある複数の治療の指示及び極めて高い用量(1kg及び1日当たり最大2gの免疫グロブリン)が、不足するに至るほど供給にとって極端な負担となってきた。
【０００５】
また血漿から血漿タンパク質を精製するための多数の方法も開発されてきた。治療用途のための血漿タンパク質を抽出することを可能にする工業プロセスは、「血漿分画」と呼ばれる。現在使用されている分画技術は、一般的に、第VIII因子、フォン-ウィルブランド因子、フィブリノーゲン及びフィブロネクチンが高濃度化された寒冷沈降物を単離するために血漿を低温で解凍することを本質とする寒冷沈降反応工程から開始される。次いで上清画分[寒冷上清(cryosupernatant)]のタンパク質は、エタノールの存在下での逐次的な沈殿によって分離され得る(Cohnら、1946、J. Am. Chem. Soc. 68、459)。
【０００６】
エタノール分画を同様に使用する元のCohnの方法の数種の改変法も説明されている。したがって、Tanaka K.ら、2000による文献(Braz J Med Bio Res 2000、33(1): 27〜30)は、Cohnの方法に従ってエタノール分画後に得られた「I+II+II」及び「II+III」画分から、3つのタイプのゲル、すなわち2つのイオン交換ゲル(Q-セファロースFF及びCm-セファロースFF)及びゲル濾過工程(セファクリルS-300 HR)でのクロマトグラフ分離により、免疫グロブリンGを精製するための方法を説明している。
【０００７】
エタノール沈殿の代替経路がSteinbuchら(Rev. Franc. Et. Clin, and Biol. 1969、XIV、1054)により説明されており、これは、オクタン酸(又はカプリル酸/カプリレート)での沈殿を使用している。この代替経路は、血漿からほとんどのタンパク質を沈殿させることから、上清中の免疫グロブリンは失われない。これらの免疫グロブリンの精製は、陰イオン交換樹脂であるDEAE-セルロースへの吸着(「バッチ」で)により行われ、上清中に免疫グロブリンを残す。次いで上清は、限外濾過により濃縮される。
【０００８】
しかしながら、これらのエタノール又はカプリル酸沈殿は、ある程度のタンパク質変性及びタンパク質凝集体(特に免疫グロブリンポリマー)の形成を引き起こす可能性があり、これらは、アナフィラキシー反応の原因となり得る。したがって、凝集体を沈殿させるために、例えばプロピオラクトン、又は還元剤及びアルキル化剤、又はpH4、又はPEGを用いたそれに続く処理工程に進む必要がある。これらの追加の工程は、血漿タンパク質の収量を減少させる傾向がある。
【０００９】
したがって、ほとんどの製造方法が、分画された血漿1リットル当たり3.5から5.5gのIgGのIgG収量を要求している(「A modified caprylic acid method for manufacturing immunoglobulin G from human plasma with high yield and efficient virus clearance」  -  Vox Sang. 2006年2月;90(2):97〜104及び「A new methodology for polyvalent intravenous immunoglobulin solution production with a two-stage process of viral inactivation」  -  Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences、46巻、4号、2010年10月/12月)。
【００１０】
更に、エタノール分画の使用は比較的高価である。実際に、血漿1リットルの分画は、2lのエタノールの使用を必要とする。したがって、数千リットルの血漿を処理するためには、生産拠点の現場に極めて大量のエタノールを貯蔵し、加えてエタノール分画専用のシステムを冷却する必要がある。更に、工業施設は、大量の溶媒を貯蔵する、処置する、排除する、及び場合によっては再利用するのに好適でなければならず、これは、技術的に相当な制約及びコストがかかることを象徴している。
【００１１】
血漿タンパク質の純度は、使用中におけるそれらの最大の効能及び安全性を保証するための重要な問題である。したがって、エタノール又はカプリル酸による分画は、所望の純度を達成するために他の精製工程で補う必要があるが、これらの操作は、生成物が更に失われるために、収量を犠牲にして行われる。これらの追加の工程に関して、クロマトグラフィー技術は高い収量と共に高度な精製を特徴とすることから、それらの使用がますます増加している。したがって、目的のタンパク質を完全に維持しながら収量と純度を改善するために、これらのクロマトグラフィー技術をできる限り初期の血漿に近いところで行うことが有利である。これは、第XI因子、第IX因子、第VIII因子、フォン-ウィルブランド因子、プロテインC、アンチトロンビンIII等の比較的少量の血漿タンパク質を捕捉するためにすでに適用されている。ただし多価免疫グロブリン、アルブミン及びフィブリノーゲン等の豊富なタンパク質の場合、これらの分子を捕捉するのに必要なクロマトグラフィーゲルの体積が大きくなりすぎ、採算の合わない工業ツール(器具サイズ及びゲルのコスト)をもたらすことになる。一部では、大量のタンパク質を処理するためのクロマトグラフィーサイクルの蓄積が説明されているが(「Description and assessment of an industrial chromatography unit for preparing human plasma albumin」  -  Biotechnology of Blood Proteins 1993、227巻、176〜181頁)、これらの実践は最適ではなく、開発は不十分なままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2007/144476
【特許文献２】WO2009/122281
【特許文献３】FR2970003
【特許文献４】EP0703922
【特許文献５】WO99/64462
【特許文献６】WO2002/092632
【特許文献７】WO2013/007740
【特許文献８】WO2007/077365
【特許文献９】FR0308403
【特許文献１０】FR0304388
【特許文献１１】FR0859117
【特許文献１２】FR1054721
【特許文献１３】FR1055825
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Cohnら、1946、J. Am. Chem. Soc. 68、459
【非特許文献２】Tanaka K.ら、2000(Braz J Med Bio Res 2000、33(1): 27〜30)
【非特許文献３】Steinbuchら(Rev. Franc. Et. Clin, and Biol. 1969、XIV、1054)
【非特許文献４】「A modified caprylic acid method for manufacturing immunoglobulin G from human plasma with high yield and efficient virus clearance」  -  Vox Sang. 2006年2月;90(2):97〜104
【非特許文献５】「A new methodology for polyvalent intravenous immunoglobulin solution production with a two-stage process of viral inactivation」  -  Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences、46巻、4号、2010年10月/12月
【非特許文献６】「Description and assessment of an industrial chromatography unit for preparing human plasma albumin」  -  Biotechnology of Blood Proteins 1993、227巻、176〜181頁
【非特許文献７】John Curlingら、「A comparative study of Cohn and chromatographic fractionation using a novel affinity "Cascade Process"」PPB congress 2005年5月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
それゆえに、最終生成物が高純度を有し、有害な可能性がある不純物を含まないことを確実にしつつも、治療用途のための血漿タンパク質、特に免疫グロブリン、アルブミン及び/又はフィブリノーゲンの生産収量を増加させることが、なお大いに求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一般的に、本発明は、高い収量で、特に当業者公知の方法の収量より高い収量で精製されたヒト血漿タンパク質の画分を調製するための方法に関する。この目的を達成するために、本出願人は、マルチカラムクロマトグラフィー、特にマルチカラムアフィニティー若しくはイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィーによる少なくとも1つの精製工程を含む、血漿から精製されたヒト血漿タンパク質濃縮物を調製するための方法を開発した。より正確には、本発明に係る方法は、典型的に使用されるクロマトグラフィーカラムを、連続して設置されるか又は独立に制御される数個のより小さいカラムに分割することによって、クロマトグラフィー工程を行うことを提唱している。このようなマルチカラムクロマトグラフィーを実行する工程は、クロマトグラフィーゲル中に存在する官能基を可能な限り最大限使用し、同時に血漿タンパク質調製バッチ1つにつき使用されるクロマトグラフィーゲルの体積を大いに低下させることを可能にする。
【００１６】
また本発明は、当業者公知の方法と比較してより高い収量でヒト免疫グロブリン(Ig)濃縮物を調製するための方法にも関する。この目的を達成するために、本出願人は、エタノール及び/又はカプリル酸を使用する初期の分画工程を、マルチカラムクロマトグラフィーを使用する、特にマルチカラムアフィニティー若しくはイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィーを使用する捕捉工程で置き換えた、精製されたIgを調製するための方法を開発した。クロマトグラフィーの前に、沈殿によりタンパク質不純物を排除する工程は、行われない。血漿又は血漿寒冷上清は、前記マルチカラムクロマトグラフィーに直接供される。マルチカラムクロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである場合、本発明に係る方法は、有利には、前記クロマトグラフィーの後にカプリル酸及び/又はエタノールによる分画工程を含んでいてもよい。
【００１７】
したがって本発明は、血漿から治療用途のための精製された血漿タンパク質濃縮物を調製するための方法であって、血漿又は血漿画分がマルチカラムクロマトグラフィーに供される精製工程を含む、方法に関する。
【００１８】
特に、本発明は、血漿から治療用途のためのヒト免疫グロブリン濃縮物を調製するための方法であって、血漿又は寒冷沈降した血漿上清(cryoprecipitated plasma supernatant)がマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーに供される免疫グロブリン精製工程を含む、方法に関する。
【００１９】
別の例示的な実施形態において、免疫グロブリン精製工程は、血漿又は寒冷沈降した血漿上清をマルチカラム陰イオン交換クロマトグラフィーに供することによって行われる。次いで、その終わりに免疫グロブリンを含有する上清が収集される、それに続くカプリル酸による沈殿工程を想定することが可能である。
【００２０】
本発明はまた、血漿から治療用途のためのヒトアルブミン及び/又はフィブリノーゲン濃縮物を調製するための方法であって、血漿又は寒冷沈降した血漿上清が、マルチカラムクロマトグラフィー、特にマルチカラムアフィニティー若しくはイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィーに供されるアルブミン及び/又はフィブリノーゲン精製工程を含む、方法にも関する。
【００２１】
本発明の特定の実施形態によれば、マルチカラムアフィニティー又はイオン交換クロマトグラフィーは、目的のタンパク質(フィブリノーゲン及び/又はアルブミン)を捕捉し、次いで溶出させることができる。本発明の別の特定の実施形態によれば、マルチカラムアフィニティー又はイオン交換クロマトグラフィーは、非保持画分中に目的のタンパク質(アルブミン及び/又はフィブリノーゲン)を収集するために、不純物を捕捉する。本発明によれば、このような方法はまた、アルブミン及び/又はフィブリノーゲンを含有する画分が沈殿による精製工程に供され、その終わりに不純物が溶液中に残る、それに続く追加の工程を含んでいてもよい。
【００２２】
一般的に、本発明によれば、血漿から、又は寒冷上清から、又はエタノール若しくはカプリル酸画分から、任意選択でウイルス的に安全に、又は中間精製工程、特に濾過、別のクロマトグラフィー、若しくはマルチカラムクロマトグラフィー等の結果得られたあらゆる生成物から直接的にマルチカラムクロマトグラフィーによって治療用途のための血漿タンパク質の精製工程を行うことが可能である。
【００２３】
本発明の特定の実施形態において、寒冷沈降した血漿上清又は血漿が、血漿タンパク質を捕捉するために第1のマルチカラムクロマトグラフィーに直接供され、次いでこのクロマトグラフィーの非保持画分が、第2の血漿タンパク質を捕捉するために第2のマルチカラムクロマトグラフィーに供される。
【００２４】
その後、第2のマルチカラムクロマトグラフィーの非保持画分は、第3の血漿タンパク質を精製するために、クロマトグラフィー、特にマルチカラムクロマトグラフィー、又は沈殿工程に供されてもよい。
【００２５】
特定の例示的な実施形態において、本発明に係る方法は、マルチカラムアフィニティー又はイオン交換クロマトグラフィーによる寒冷沈降した血漿上清の精製工程、任意選択で、それに続いて例えば前記画分のエタノール沈殿によるアルブミン及び/又はフィブリノーゲンを含む画分中に存在する不純物の排除工程を含む、血漿から治療用途のためのアルブミン及び/又はフィブリノーゲン濃縮物を調製するための方法を本質とする。別の例示的な実施形態において、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィーによる精製工程は、免疫グロブリン除去血漿画分で行われる。有利には、アルブミン及び/又はフィブリノーゲン濃縮物を調製するための方法は、免疫グロブリン濃縮物を調製するための方法の後に、任意選択で、前記方法の終わりに収集された血漿画分を使用するマルチカラムクロマトグラフィーによって行われる。
【００２６】
したがって、本発明はまた、血漿を分画するための方法であって、血漿又は寒冷沈降した血漿上清を、
-  その終わりに免疫グロブリンを含有する画分が収集される、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー;次いで
-  その終わりにアルブミンを含有する画分が収集される、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー;次いで
-  その終わりにフィブリノーゲンを含有する画分が収集される、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー
に連続して直接供することを本質とする工程を含む、方法にも関する。
【００２７】
必要に応じて、3つの工程の配列は、1種のタンパク質を他の2種よりもうまく抽出するために任意選択で改変してもよい。
【００２８】
したがって、本発明はまた、血漿を分画するための方法であって、血漿又は寒冷沈降した血漿上清を、
-  その終わりに免疫グロブリンを含有する画分が収集される、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー;次いで
-  その終わりにフィブリノーゲンを含有する画分が収集される、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー;次いで
-  その終わりにアルブミンを含有する画分が収集される、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー
に連続して直接供することを本質とする工程を含む、方法にも関する。
【００２９】
したがって血漿画分は、その終わりに免疫グロブリン、アルブミン、次いでフィブリノーゲンが連続して除去される3つのマルチカラムクロマトグラフィー又は別の配列に連続して供される。
【００３０】
特定の例示的な実施形態において、本発明に係る方法は、血漿から治療用途のための免疫グロブリン濃縮物を調製するための方法であって、
(a)血漿の物理化学的な処置、例えば溶媒/洗浄剤又は洗浄剤単独又は溶媒単独、これらに限定されず関連する物質の可能な組合せでの処置による、第1のウイルス不活化又は排除工程;
(b)工程(a)の結果得られた不活化血漿のマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる寒冷沈降した血漿上清の精製工程;
(c)任意選択で、工程(b)の結果得られた免疫グロブリン濃縮物からの、特にマルチカラム抗A及び抗Bアフィニティークロマトグラフィーによる抗血球凝集素抗体の排除工程;
(d)任意選択で、工程(b)又は(c)の結果得られた免疫グロブリン濃縮物のナノ濾過による第2のウイルス不活化又は排除工程;並びに
(e)工程(b)、(c)又は(d)の結果得られた免疫グロブリン濃縮物への、1種又は複数の医薬的に許容される安定剤の添加工程
を連続して含む、方法からなる。
【００３１】
別の特定の例示的な実施形態において、本発明に係る方法は、血漿から治療用途のための免疫グロブリン濃縮物を調製するための方法であって、
(a')マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる寒冷沈降した血漿上清の精製工程;
(b')工程(a')で得られた免疫グロブリン濃縮物の、洗浄剤/溶媒による第1のウイルス不活化又は排除工程;
(c')任意選択で、工程(b')の結果得られた免疫グロブリン濃縮物からの、特にマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる抗A及び抗B抗体の排除工程;
(d')任意選択で、工程(b')又は(c')の結果得られた免疫グロブリン濃縮物のナノ濾過による第2のウイルス不活化又は排除工程;並びに
(e')工程(b')、(c')又は(d')の結果得られた免疫グロブリン濃縮物への、1種又は複数の医薬的に許容される安定剤の添加工程
を連続して含む、方法を本質とする。
【００３２】
別の特定の例示的な実施形態において、本発明に係る方法は、血漿から治療用途のための免疫グロブリン濃縮物を調製するための方法であって、
(A)寒冷沈降した血漿上清のエタノール及び/又はカプリル酸による分画工程;
(B)任意選択で、工程(A)で得られた溶液の、溶媒/洗浄剤による第1のウイルス不活化又は排除工程;
(C)工程(A)又は(B)で得られた溶液のマルチカラム陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程;
(D)任意選択で、工程(C)の終わりに得られた免疫グロブリン濃縮物からの、特にマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる抗A及び抗B抗体の排除工程;
(E)任意選択で、工程(C)又は(D)の終わりに得られた免疫グロブリン濃縮物のナノ濾過による第2のウイルス不活化又は排除工程;並びに
(F)工程(C)、(D)又は(E)の結果得られた免疫グロブリン濃縮物への、1種又は複数の医薬的に許容される安定剤の添加工程
を連続して含む、方法を本質とする。
【００３３】
本発明はまた、血漿を分画するための方法であって、血漿又は寒冷沈降した血漿上清を、
-  その終わりに免疫グロブリンを含有する画分が収集される、少なくとも1つのアフィニティーリガンドが免疫グロブリンに特異的に結合するリガンドであるマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー;並びに/或いは
-  その終わりにフィブリノーゲン及び/又はアルブミンを含有する画分が収集される、ミックスモードクロマトグラフィーと称され、任意選択で高度に耐塩性の、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー
に直接供することを本質とする工程を含む、方法にも関する。
【００３４】
本発明はまた、血漿を分画するための方法であって、血漿又は寒冷沈降した血漿上清を、
-  その終わりに免疫グロブリンを含有する画分が収集される、少なくとも1つのアフィニティーリガンドが免疫グロブリンに特異的に結合するリガンドであるマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー;及び/或いは
-  その終わりにフィブリノーゲンを含有する画分が収集される、少なくとも1つのアフィニティーリガンドがフィブリノーゲンに特異的に結合するリガンドであるマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー;及び/或いは
-  その終わりにアルブミンを含有する画分が収集される、ミックスモードクロマトグラフィーと称され、任意選択で高度に耐塩性の、マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用若しくは化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)を介したマルチカラムクロマトグラフィー
に直接供することを本質とする工程を含む、方法にも関する。
【００３５】
有利には、最初に、免疫グロブリンを標的とするマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーが行われ、この第1の分画工程の結果得られた画分に、フィブリノーゲン及び/又はアルブミンを標的とする1つ又は複数のマルチカラムアフィニティー及びイオン交換クロマトグラフィーが行われて、免疫グロブリンG型が除去される。有利には、アルブミンを捕捉するためのマルチカラムクロマトグラフィーは、第3の位置で行われてもよい。
【００３６】
本発明はまた、血漿における免疫グロブリンの分布プロファイルと類似するか又は同一な免疫グロブリンの分布プロファイルを有する免疫グロブリンG型濃縮物にも関する。
【００３７】
優先的には、本発明に係る免疫グロブリン濃縮物は、50から70%の間のIgG1、25から35%の間のIgG2、2から8%の間のIgG3及び1から8%の間のIgG4を有するIgG免疫グロブリン濃縮物である。
【００３８】
本発明は更に、血漿の抗原レパートリーと類似するか又は同一な抗原レパートリーを有する免疫グロブリン濃縮物に関する。優先的には、本発明に係る免疫グロブリン濃縮物は、従来技術の濃縮物の抗原レパートリーと類似するか及び/又はそれより優れている抗原レパートリーを有する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図1A〜図1Dは、本発明に係る方法で実行されるマルチカラムクロマトグラフィーの原理を図式的に表した図である。
【図２】本発明に係る方法の実行の例に従って、一連のマルチカラムクロマトグラフィーを用いた豊富な血漿タンパク質の連続的な精製のための工程の配列を図式的に表した図である。
【図３】実施例2、3及び4で行われたマルチカラムクロマトグラフィーの終わりに得られた画分の非還元条件下でのSDS-PAGEゲル及びクーマシーブルー染色の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義
「血漿タンパク質」は、本発明によれば、血漿中に含有されるあらゆるタンパク質、より詳細には工業目的又は治療目的のあらゆるタンパク質を意味する。血漿タンパク質は、アルブミン、アルファ/マクログロブリン、アンチキモトリプシン、アンチトロンビン、アンチトリプシン、アポA、アポB、アポC、アポD、アポE、アポF、アポG、ベータXIIa、C1-阻害剤、C反応性タンパク質、C7、C1r、C1s、C2、C3、C4、C4bP、C5、C6、C1q、C8、C9、カルボキシペプチダーゼN、セルロプラスミン、B因子、D因子、H因子、第I因子、第IX因子、第V因子、第VII因子、第VIIa因子、第VIII因子、第X因子、第XI因子、第XII因子、第XIII因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘパリン補因子II、ヒスチジンリッチGP、IgA、IgD、IgE、IgG、ITI、IgM、キニナーゼII、キニノーゲンHPM、リゾチーム、PAI2、PAII、PCI、プラスミン、プラスミン阻害剤、プラスミノゲン、プレアルブミン、プレカリクレイン、プロパージン、プロテアーゼネキシンINH、プロテインC、プロテインS、プロテインZ、プロトロンビン、血清アミロイドタンパク質(SAP)、TFPI、チオール-プロテイナーゼ、トロンボモジュリン、組織因子(TF)、TPA、トランスコバラミンII、トランスコルチン、トランスフェリン、ビトロネクチン、及びフォン-ウィルブランド因子を包含する。
【００４１】
特に、血漿タンパク質は、凝固タンパク質、すなわち、血餅の形成を引き起こす連鎖反応カスケードに関与する血漿タンパク質を包含する。凝固タンパク質は、第I因子(フィブリノーゲン)、第II因子(プロトロンビン)、第V因子(プロアクセレリン)、第VII因子(プロコンベルチン)、第VIII因子(抗血友病因子A)、第IX因子(抗血友病因子B)、第X因子(スチュアート因子)、第XI因子(ローゼンタール因子又はPTA)、第XII因子(ハーゲマン因子)、第XIII因子(フィブリン安定化因子又はFSF)、PK(プレカリクレイン)、HMWK(高分子量キニノーゲン)、第III因子(トロンボプラスチン又は組織因子)、ヘパリン補因子II(HCII)、プロテインC(PC)、トロンボモジュリン(TM)、プロテインS(PS)、フォン-ウィルブランド因子(WF)及び組織因子経路阻害剤(TFPI)、又は組織因子を包含する。
【００４２】
特定の実施形態において、血漿タンパク質は、酵素活性を有する凝固タンパク質からなる。酵素活性を有する凝固タンパク質は、第II因子(プロトロンビン)、第VII因子(プロコンベルチン)、第IX因子(抗血友病因子B)、第X因子(スチュアート因子)、第XI因子(ローゼンタール因子又はPTA)、第XII因子(ハーゲマン因子)、第XIII因子(フィブリン安定化因子又はFSF)及びPK(プレカリクレイン)の活性型を包含する。
【００４３】
本発明の状況において、用語「ヒト免疫グロブリン」又は「ヒトIg」は、免疫グロブリンA(IgA)、免疫グロブリンE(IgE)、免疫グロブリンM(IgM)又は免疫グロブリンG(IgG)であり得る多価免疫グロブリンを指す。本発明に係るヒト免疫グロブリンは、有利にはIgGであり、サブクラス(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4)は問わない。これらは、免疫グロブリン全体であってもよいし、又は多価免疫グロブリンの製造プロセス中に得られたあらゆる中間体画分であってもよい。
【００４４】
「血漿画分」は、1つ又は複数の精製工程に供された血漿のあらゆる部分又は下位の部分を意味する。したがって血漿画分は、寒冷沈降した血漿上清、血漿寒冷沈降物(再懸濁済み)、エタノール分画により得られたI〜V画分(Cohn又はKistler及びNitschmannの方法に従って)、カプリル酸及び/又はカプリレートでの沈殿後に得られた上清及び沈殿物、マルチカラムクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーの溶出液及びクロマトグラフィーカラムの非吸着画分、並びにろ液を包含する。
【００４５】
本発明によれば、「寒冷沈降した血漿上清」又は「寒冷上清」は、凍結した血漿を解凍した後(寒冷沈降反応)に得られた液相に相当する。特に、寒冷上清は、-10℃から-40℃の間の温度で血漿を凍結すること、次いで0℃から+6℃の間、優先的には0℃から+1℃の間の温度で穏やかに解凍すること、それに続いて寒冷沈降物と寒冷上清とを分離するために解凍した血漿を遠心分離することにより得ることができる。寒冷沈降物では、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォン-ウィルブランド因子及び第VIII因子が濃縮され、それに対して寒冷上清は、補体因子、ビタミンK依存性因子、例えばプロテインC、プロテインS、プロテインZ、第II因子、第VII因子、第IX因子及び第X因子、フィブリノーゲン並びに免疫グロブリン並びにアルブミンを含有する。
【００４６】
「精製工程」は、所与の画分中で、目的の生成物、特に血漿タンパク質の高濃度化を可能にする方法のあらゆる工程を意味する。
【００４７】
本発明に係る調製方法は、主として、血漿又はあらゆる血漿画分から治療用途のための血漿タンパク質を精製するためのマルチカラムクロマトグラフィー工程の使用に基づく。このようなマルチカラムクロマトグラフィー工程の実行は、免疫グロブリン濃縮物の調製に特に適している。実際に、本発明によれば、ヒト血漿又はヒト血漿寒冷上清をマルチカラムクロマトグラフィーに直接供することが可能である。当然ながら、マルチカラムクロマトグラフィーによる精製の上流で、濾過及び/又はエタノール/カプリル酸による分画の工程を想定することも可能である。
【００４８】
このようなマルチカラムクロマトグラフィーの使用は、一般的に、治療用途のための血漿タンパク質にかかる工業規模のコストを低減することを可能にする。特に、マルチカラムクロマトグラフィーは、前記カラムが全体として飽和した時点でクロマトグラフ支持体を使用することを可能にするものであり、これは、慣例的な実践では目的の分子の10%の漏出が検出されたらすぐにキャパシティーが限界になる従来のクロマトグラフィーより少量のゲルしか必要としない。同様に、溶出、洗浄及び浄化相はより小さいカラムで行われるため、溶液及び緩衝液の必要性が従来のクロマトグラフィーと比較して大きく低減される。クロマトグラフィーのカスケードによる血漿分子分画の原理はすでに説明されているが(John Curlingら、「A comparative study of Cohn and chromatographic fractionation using a novel affinity "Cascade Process"」PPB congress 2005年5月)、付随する低いキャパシティー及び生産性のために限定的な工業的な関心しか示されていない。とりわけ驚くべき且つ有利な方式で、本発明に係るマルチカラムクロマトグラフィーの使用は、より大きい捕捉キャパシティー及び/又はより高い生産性を、単位時間及びゲル体積当たりの抽出された生成物の単位質量で示すことを可能にすることで、カスケードクロマトグラフィーの原理をより一層魅力的なものにしている。
【００４９】
図1に、マルチカラムクロマトグラフィーの原理を図式的に示す。このようなマルチカラムクロマトグラフィーは、クロマトグラフィーで従来使用されるカラム(クロマトグラフィー支持体)を、それより小さいサイズを有し、一方の出口が他方の入口に繋がるように互いに連結されている数個のカラム(同じクロマトグラフィー支持体の)に分けることを可能にする。
【００５０】
一般的に、マルチカラムクロマトグラフィーは、異なる性質を有する数個のクロマトグラフィーカラムの並置(直列又は並列で)を除外する。
【００５１】
まとめると、精製しようとする画分は、カラム1に注入され(図1A)、その出口はカラム2に直列に繋がっている。したがって、カラム1から解離した目的の血漿タンパク質の漏出分は、収集された「非吸着」画分に流出する代わりに、残留した目的の血漿タンパク質がその上に吸着が可能であると予想されるカラム2(ガードカラム)で収集される。カラム1の後に連続して設置されるガードカラム2、3、4等の数は、収集しようとする目的のタンパク質の漏出分の比率によって決まる(本明細書で説明する例では、3つのガードカラム2〜4が示される)。カラム1のローディングとそれに次ぐ洗浄が完了したら(図1A及び図1B)、個々に溶出(図1C)、再生(図1D)及び任意選択で平衡(示さず)工程を受けるために、カラム1を他のカラム2〜4から分離することができる。カラム1が再度平衡化されたら、カラム1を、最後のガードカラム等として再度連続して設置することができる。
【００５２】
並行して、カラム2が部分的にローディングされ、次いで第1の位置に移動し、順に血漿画分のローディングを受け、その漏出分がそれに続くガードカラム3及び4等に再度収集される。
【００５３】
したがってマルチカラムクロマトグラフィーは、漏出分がガードカラムに収集されるため、ブレイクスルーすることによって、材料を失うことなくゲルの飽和を最適化することを可能にする。
【００５４】
本発明によれば、数々のマルチカラムクロマトグラフィー技術を使用することができる。特に疑似移動床式(Stimulated Moving Bed)(SMB)技術が公知であり、これからシーケンシャルマルチカラムクロマトグラフィー(SMCC)技術が派生し、これは、本発明に係る方法の実行に特に好適である。マルチカラムクロマトグラフィーの実施形態の例は、特許出願WO2007/144476及びWO2009/122281で説明されている。
【００５５】
本発明によれば、マルチカラムクロマトグラフィーは、アフィニティー、イオン交換(陰イオン又は陽イオン)、疎水性相互作用、ミックスモード又はサイズ排除クロマトグラフィーであり得る。優先的には、マルチカラムクロマトグラフィーは、マルチカラムアフィニティー、ミックスモード又は陰イオン交換クロマトグラフィーである。
【００５６】
本発明の特定の例示的な実施形態において、マルチカラムクロマトグラフィーは、ラジアルクロマトグラフィー、すなわちラジアルカラムを使用するものである。本発明によれば、大きいほうの外径(入口側)の表面積と小さいほうの内径(出口側)の表面積との比率が少なくとも2であるラジアルカラムを使用することが可能である。これらのカラムは、ローディング流速の増加を可能にすることから、処理しようとする血漿が大量である場合、及び/又は目的の血漿タンパク質、例えば免疫グロブリンを、その分子の完全性を維持するために迅速に精製しなければならない場合に、本方法を特に有利にする。同様に、これは、精製工程の期間を短くすることから、単位時間当たりのバッチ数を増やすことを可能にする。
【００５７】
必要に応じて、より詳細には処理しようとする血漿の体積に応じて、数ミリリットル(例えば実験スケールでの実行用)、例えば5〜20mlから、数百又は数千リットル(工業スケール)、例えば200〜2000lまでのクロマトグラフィーカラムを使用することができる。カラムの各範囲につき、固定相を形成するゲルベッドの高さを適合させることも可能であり、例えば6cm、12cm又は18cmである。当業者は、処理しようとする体積及び/又は所望の流速に応じて、どのようにカラムの数、それらの寸法及びゲルの高さを適合するか認識している。
【００５８】
特定の例において、特に寒冷上清から直接的に免疫グロブリン濃縮物を調製するために、マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーが有利に使用される。
【００５９】
ほとんどのアフィニティーゲル(アフィニティークロマトグラフィーの固定相を形成する)、特に工業的に使用されるものは、最大の免疫グロブリン(Ig)ローディングキャパシティーがイオン交換ゲルの4分の1から5分の1である(80〜100g/lに対して20〜30g/l)ことが公知である。したがって、大量の血漿を処理するには、必要となるアフィニティーゲルの量が、プロセスを経済的に実行不可能にしていることが一般的に認められている。
【００６０】
しかしながら、本出願人は、クロマトグラフィーカラムを数個のより小さいカラムに、特に3から8個のカラム、優先的には3から5個のカラムに分割することによって、この不利益を相殺できることを発見した。複数のクロマトグラフィーカラムの使用は、1つ又は複数の主要カラム、目的のタンパク質のローディング中に主要カラムを通り抜ける目的の血漿タンパク質を捕捉すると予想されるガードカラムを連続して配置することを可能にする。次いでこの(これらの)主要カラム中に存在するアフィニティーリガンドを、クロマトグラフィーゲルの最大キャパシティーに到達するように飽和させる。次いでこの(これらの)カラムをシステムから外して、別々に溶出させることにより、目的のタンパク質の収集が可能になる。次いでガードカラムが順に主要カラムになる。3から50、好ましくは5から30、より好ましくは7から15の連続したサイクルは、アフィニティーリガンドの使用を最大化して、目的の分子を捕捉して溶出させるのに必要な全体のゲル体積を低減することを可能にする。
【００６１】
有利には、アフィニティーリガンドは、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体若しくは化学的リガンド、例えばペプチド、模倣ペプチド、ペプトイド、ナノフィチン(nanofitin)、又はオリゴヌクレオチドリガンド、例えばアプタマーから選択される。
【００６２】
例えば、架橋アガロースマトリックスを含むゲルは、高い流速での作動を可能にし、目的のタンパク質と結合することができるアフィニティーリガンドと組み合わせて使用することができる。特定の実施形態において、アフィニティーリガンドは、ヒトIgのFcフラグメント又は免疫グロブリン内のあらゆる保存された配列と結合することを可能にする。
【００６３】
別の特定の実施形態において、使用されるアフィニティーリガンドは、IgのFcフラグメントを認識する組換えタンパク質であり、マトリックス、例えばGE Healthcare社製のIgSelectゲルにカップリングされている。
【００６４】
有利には、リガンドは、免疫グロブリン(例えば免疫グロブリンG)のクラスを特異的に認識するか、及び/又は1つ若しくは複数の免疫グロブリンのサブクラス(例えば、IgG1及び/又はIgG2及び/又はIgG3及び/又はIgG4)を特異的に認識するように選択され得る。別の特定の実施形態において、使用されるアフィニティーリガンドは、IgGに対するアフィニティーを有し、有利にはIgAに対するアフィニティーを有さないプロテインGである。更に別の特定の実施形態において、使用されるアフィニティーリガンドは、IgG1、IgG2及びIgG4には特異的に結合するがIgG3を捕捉することができないプロテインAである。
【００６５】
特定の例示的な実施形態において、マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーのアフィニティーリガンドは、免疫グロブリンGに対するアフィニティーを有し、有利には、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4に対するアフィニティーを有するリガンドから選択される。より詳細には、本発明の方法に従って得られたIgG濃縮物は、有利には、血漿の分布プロファイルと類似するIgGサブクラスの分布プロファイルを有する。特に、本発明に係るIgG濃縮物は、有利には、50から70%の間のIgG1、25から35%の間のIgG2、2から8%の間のIgG3及び1から8%の間のIgG4、又はより好ましくは60から70%の間のIgG1、30から35%の間のIgG2、3から6%の間のIgG3及び2から5%の間のIgG4を含む。特定の実施形態において、本発明の方法に従って得られた濃縮物は、血漿と比較して、IgG3及び/又はIgG4サブクラスがわずかに減少している場合があるが、それにもかかわらずその生成物は、治療効能の点で血漿のIgGサブクラスレパートリーと類似するIgGサブクラスレパートリーを有する生成物に匹敵するもののままである。
【００６６】
別の特定の例示的な実施形態において、マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーのアフィニティーリガンドは、フィブリノーゲン又はアルブミンに対するアフィニティーを有する。より詳細には、本発明はまた、血漿から直接的にヒトフィブリノーゲン及び/又はアルブミン濃縮物を調製するための方法であって、前記血漿又は寒冷沈降した血漿上清がマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーに供され、ここでアフィニティーリガンドは、フィブリノーゲン及び/又はアルブミンに対するアフィニティーを有する、方法にも関する。使用されるリガンドは、特にあらゆる市販のリガンドであってもよく、例えばCaptureSelect HSA(Life Technologies社)アフィニティーリガンド又はCaptureSelect Fibrinogen(Life Technologies社)アフィニティーマトリックスリガンドであってもよい。
【００６７】
有利には、本発明の方法のために選択されるアフィニティーリガンドは、工業用途に適合する浄化及び/又は激しい再使用の条件に耐性を有する。特定の実施形態において、アフィニティーリガンドはしたがって、有利には、ペプチド及び/若しくはペプトイド(ファージディスプレイ等のコンビナトリアル生物学の結果得られる)、ナノフィチン(極限環境細菌から抽出される)、並びに/又はアプタマーから選択される。
【００６８】
特定の例において、アフィニティーリガンドは、アプタマーであり、特に核酸アプタマーである。用語「アプタマー」は、本明細書で使用される場合、一本鎖核酸分子、DNA又はRNAを指し、特に、目的のタンパク質に特異的に結合することができる一本鎖核酸分子、例えば、ヒトIgのFcフラグメント又は免疫グロブリンの保存された配列に結合することによって免疫グロブリンに特異的に結合することができる一本鎖核酸分子を指す。有利には、アプタマーは、免疫グロブリン(例えば、免疫グロブリンG)のクラスを特異的に認識するか、及び/又は1つ若しくは複数の免疫グロブリンのサブクラス(例えば、IgG1及び/又はIgG2及び/又はIgG3及び/又はIgG4)を特異的に認識するように選択され得る。アプタマーは、一般的に、5から120個の間のヌクレオチドを含み、インビトロでいわゆるSELEX[指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)]方法によって選択され得る。「核酸アプタマー」は、本発明によれば、一本鎖核酸、特にヒトIgGのFcフラグメントに特異的に結合する一本鎖核酸を意味する。
【００６９】
アプタマーは、多数の利点を有する。アプタマーは、それらのオリゴヌクレオチドの性質のために、低い免疫原性とストリンジェントな物理化学的条件(DMSOの存在、極めて酸性又は極めて塩基性のpH、有機溶媒又は高温の使用)に対する高い耐性を有しており、アフィニティーリガンドとして使用される状況において様々な浄化戦略が可能になる。したがって、従来のクロマトグラフィーと比較して複数のサイクル及びより多くのローディングでありつつも、クロマトグラフィーカラムを浄化し、それらの汚染を制限し、ウイルス又はプリオン汚染の危険を低減するために、浄化工程を行うことにより、アフィニティーゲルの寿命を増加させることが可能である。アプタマーは、それらの核酸型の構造のために、塩基性pHでの浄化に特に好適であり、100から200サイクルの再使用が可能になる。
【００７０】
本出願人の名前でなされた特許出願FR2970003は、固定した核酸アプタマーを有するアフィニティー支持体を製造するための方法を説明している。特に、この出願は、表面が活性化された固体支持体上にカルボン酸基をグラフト化することによって、少なくとも1つの反応性アミン官能基を含む核酸を固定するための方法を説明している。
【００７１】
特定の実施形態において、マルチカラムクロマトグラフィーは、有利には、連続したクロマトグラフィーカラムを使用する1つ又は複数の連続した精製工程に適用されてもよい。したがって、第1のマルチカラムクロマトグラフィーによって保持されなかった画分を使用して、最も好適な順番で他の目的の血漿タンパク質を精製することができる。特定の例示的な実施形態において、第1のマルチカラムクロマトグラフィーは、免疫グロブリンを精製するために、血漿又は寒冷沈降物で行われる。この第1の精製の結果得られた血漿画分は、アルブミンを精製するために、第2のマルチカラムクロマトグラフィーに供される。免疫グロブリン及びアルブミンが除去されたこの第2のマルチカラムクロマトグラフィーの結果得られた血漿画分は次いで、フィブリノーゲン等を精製するために、第3のマルチカラムクロマトグラフィーに供されてもよい。特に、凝固カスケードを活性化させずに免疫グロブリン、アルブミン及び/又はフィブリノーゲンが特定的に連続して精製されるように、血漿を連続フローで処置することが可能である。
【００７２】
別の特定の例示的な実施形態において、第1のマルチカラムクロマトグラフィーは、免疫グロブリンを精製するために、血漿又は寒冷沈降物で行われる。この第1の精製の結果得られた血漿画分は、フィブリノーゲンを精製するために、第2のマルチカラムクロマトグラフィーに供される。免疫グロブリン及びフィブリノーゲンが除去されたこの第2のマルチカラムクロマトグラフィーの結果得られた血漿画分は次いで、アルブミン等を精製するために、第3のマルチカラムクロマトグラフィーに供されてもよい。特に、凝固カスケードを活性化させずに免疫グロブリン、フィブリノーゲン及び/又はアルブミンが特定的に連続して精製されるように、血漿を連続フローで処置することが可能である。
【００７３】
本発明によれば、治療用途のためのヒト血漿タンパク質濃縮物を調製するための方法はまた、以下の工程:
(i)ウイルス不活化又はウイルス排除工程;
(ii)イオン交換クロマトグラフィー工程;
(iii)特にアフィニティークロマトグラフィーによる抗A及び抗B抗体の排除工程;
(iv)カプリル酸及び/又はカプリレートでの沈殿工程;
(v)限外濾過による濃縮工程;
(vi)製剤化工程
の少なくとも1つを含んでいてもよい。
【００７４】
有利には、本発明に係る調製方法は、治療用途のためのヒトタンパク質濃縮物を得ることを可能にし、工程(i)から(vi)の間に少なくとも1つのそれに続く工程を含んでいてもよい。
【００７５】
特定の例示的な実施形態において、本調製方法は、治療用途のためのヒト免疫グロブリン濃縮物を得ることを可能にし、任意選択で工程(i)から(vi)の間に1つ又は複数のそれに続く工程を含む。
【００７６】
別の特定の例示的な実施形態において、本調製方法は、治療用途のためのアルブミン濃縮物を得ることを可能にし、前記方法は、任意選択で工程(i)から(vi)の間に1つ又は複数のそれに続く工程を含む。
【００７７】
別の特定の例示的な実施形態において、本調製方法は、治療用途のためのフィブリノーゲン濃縮物を得ることを可能にし、前記方法は、任意選択で工程(i)から(vi)の間に1つ又は複数のそれに続く工程を含む。
【００７８】
例えば、血漿又は寒冷上清をマルチカラムクロマトグラフィー、特にマルチカラムアフィニティー又は陰イオン交換クロマトグラフィーに直接供することにより得られたヒト血漿タンパク質濃縮物及び/又は免疫グロブリン濃縮物は、有利には、少なくとも1種の感染因子の少なくとも1回の排除又は不活化工程を受けてもよい。
【００７９】
工程(i)で標的化される感染因子のうち、ウイルス及びプリオン等のUTA[非通常型伝播性因子(unconventional transmissible agent)]を挙げることができる。
【００８０】
ウイルス不活化は、化学物質、例えば溶媒及び/若しくは洗浄剤での処置、並びに/又は熱(低温殺菌及び/又は乾燥加熱)での処置、並びに/又は放射線照射(ガンマ及び/又はUV-C)による処置、並びに/又はpH処置(酸性pHでの処置)を含むことが多い。
【００８１】
好ましくは、本発明に係る工程(i)は、少なくとも1回の溶媒及び洗浄剤での処置を含む。溶媒及び洗浄剤での処置(一般的には溶媒/洗浄剤又はS/D処置と称される)は、特に、リン酸トリ-n-ブチル(TnBP)、並びに/又はTriton X-100、Tween(好ましくはTween 80)、コール酸ナトリウム及び2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール(オクトキシノール)から選択される洗浄剤での処置を含む。
【００８２】
感染因子、特にウイルス及びUTAを除去するために、ナノ濾過を使用してもよい。血漿タンパク質のケースにおいて、ナノ濾過は、一般的に、80nmより小さい孔径を有するフィルターを介した目的のタンパク質濃縮物の濾過を指す。例えば、以下のフィルター:BioEx、Planova(登録商標)75nm、Planova(登録商標)35nm、Planova(登録商標)20nm又はPlanova(登録商標)15nm[旭化成メディカル株式会社(Asahi corporation)]、Ultipor DV 50又はDV 20(Pall社)、Virosart CPV(Sartorius社)、Viresolve NFR又はNFP(Millipore社)が利用可能である。ナノ濾過は、有利には、単一のフィルターで行ってもよいし、又は連続して同一な孔径若しくは減少する孔径を有する数種のフィルターで行ってもよい。
【００８３】
また感染因子も深層濾過を用いて除去することができる。利用可能なフィルターは、例えば、再生セルロースで構成されるフィルターであり、その場合、濾過助剤(例えばセライト、パーライト又はキースラガー)が添加されてもよく、これらはCuno社(Zeta+VRシリーズのフィルター)、Pall-Seitz社(P-シリーズの深型フィルター)又はSartorius社(Virosart CPV、Sartoclear P深型フィルター)によって販売されている。
【００８４】
特定の実施形態において、精製しようとするタンパク質の完全性がマルチカラムクロマトグラフィー上流の処置によって利益を得るように、ウイルス不活化工程は、有利には、血漿又は寒冷沈降した血漿上清又は再懸濁した血漿寒冷沈降物に直接行われてもよい。
【００８５】
別の特定の実施形態において、粗製の血漿及び/又は寒冷沈降した血漿上清及び/又は再懸濁した血漿寒冷沈降物は、マルチカラムクロマトグラフィーの上流で、深層濾過に供されてもよいし、又は例えば6μm、1μm、更には0.45〜0.2μmのポリプロピレンフィルター若しくはそれと同等の媒体での一連の濾過に供されてもよい。このような予備的な工程は、有利には、マルチカラムクロマトグラフィーに使用されるカラムの早期の付着物を予防及び/又は低減することを可能にする。別の特定の実施形態において、使用される深型フィルターは、処理された血漿画分において脂質の低減を可能にする脱脂用深型フィルター(例えばCuno社又はPall-Seitz社)である。
【００８６】
有利には、ウイルス不活化又は排除工程(i)に続いて、イオン交換クロマトグラフィー工程(ii)が行われる。
【００８７】
特定の例において、イオン交換クロマトグラフィー工程(ii)は、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーである。このような陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、本出願人の名前でなされた特許出願EP0703922及びWO99/64462で説明されている。
【００８８】
特定の例において、陰イオン交換クロマトグラフィー工程(ii)は、本出願人の名前でなされた特許出願WO2002/092632及びWO2013/007740で説明されているように、DEAE又はTMAE又はQAE基でグラフト化された、架橋多糖ゲル又はビニル若しくはアクリルポリマーゲルで実行されてもよい。
【００８９】
別の特定の例において、マルチカラム陰イオン交換及び/又はミックスモードクロマトグラフィーが、高度に耐塩性のマトリックスで行われることにより、血漿又はクロマトグラフィーによって保持されなかった画分等の高い塩分を有する媒体中で血漿タンパク質を捕捉することが可能になる。有利には、高度に耐塩性のマルチカラム陰イオン交換及び/又はミックスモードクロマトグラフィーは、PALL BIOSEPRA社製のSTAr AXゲル、GE Healthcare社製のCapto MMCゲル又はMerck社製のESHMUNO HCXゲル、又は当業者公知のあらゆる等価なゲルで行われる。
【００９０】
特に、治療用途のための免疫グロブリン濃縮物の調製のために、陰イオン交換クロマトグラフィー工程(ii)は、
-  溶媒-洗浄剤処置[工程(i)]を受けた溶液をpH8から10に調整する工程;
-  それらを、免疫グロブリンの吸着及び流出液中の非吸着タンパク質の通過を可能にするpH8から10に前もって緩衝液中で平衡化したクロマトグラフィーカラムにローディングする工程;
-  全ての非吸着タンパク質及び溶媒/洗浄剤の混合物が除去されるまで、同じ緩衝液で洗浄する工程;
-  及び好適な緩衝液で免疫グロブリンを溶出させる工程
を含んでいてもよい。
【００９１】
この溶出は、免疫グロブリンを溶出させるために、4から7の間のpH、好ましくはpH6.2でリン酸緩衝液を用いて行われてもよい。
【００９２】
また本発明に係る方法は、抗A及び/又は抗B抗体の排除工程(iii)を含んでいてもよい。特定の例において、抗A及び/又は抗B抗体の排除工程(iii)は、工程(ii)の終わりに得られた溶液で行われる。この工程は、例えば、本出願人の名前でなされた特許出願WO2007/077365で説明されている方法に従って行われてもよい。したがって、治療用途のための免疫グロブリン濃縮物の調製のケースにおいて、工程(ii)で得られた溶液は、マトリックスが血液型A及び/若しくはBと抗原的に類似するオリゴ糖基でグラフト化されている支持体、又はマトリックスが血液型A及び/若しくはBと抗原的に類似するオリゴ糖基でグラフト化されている支持体の混合物に前記多価免疫グロブリン濃縮物を浸透させることによる、イムノアフィニティークロマトグラフィーでの抗A及び抗B抗体の排除工程に供されてもよい。特定の実施形態において、抗A及び/又は抗B抗体の排除工程(iii)は、マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによって行われる。
【００９３】
特定のケースにおいて、本発明に係る方法は、カプリル酸及び/又はカプリレートでの沈殿工程(iv)を含んでいてもよい。一般的に、わずかに酸性の媒体中でカプリル酸及び/又はカプリレートを添加することは、上清中に残っているIg以外の血漿タンパク質の沈殿を可能にする。本発明によれば、マルチカラムクロマトグラフィーによる精製工程の前又は後にこのカプリル酸沈殿工程(iv)を行うことが可能である。
【００９４】
特定の例示的な実施形態において、マルチカラム陰イオン交換クロマトグラフィーによる目的の血漿タンパク質の精製工程に続いて、カプリル酸及び/又はカプリレートでの沈殿工程が行われる。このようなマルチカラムイオン交換クロマトグラフィー/カプリル酸沈殿の組合せは、Ig濃縮物(特にIgG濃縮物)並びに/又はアルブミン及び/若しくはフィブリノーゲン濃縮物を調製するのに特に有利であり得る。
【００９５】
特に、治療用途のための免疫グロブリン濃縮物を調製するための、カプリル酸での沈殿工程(iv)は、
-  任意選択で、3.0から6.0の間の値、優先的にはpH4に血漿画分のpHを調整する工程;
-  血漿画分にカプリル酸を添加する工程;
-  遠心分離又は濾過して、IgGが高濃度化された上清を収集する工程
を本質とする工程を含んでいてもよい。
【００９６】
本発明に係る方法は、有利には、1つ又は複数の限外濾過による濃縮工程(v)を含んでいてもよい。例えば、Ig濃縮物の調製中に、マルチカラムクロマトグラフィー工程の結果得られ、任意選択で工程(i)から(iv)の1つ及び/又は他の工程に前もって供されたIgが高濃度化された画分を、膜限外濾過に供することが可能である。
【００９７】
また、ヒト血漿タンパク質濃縮物に、1種又は複数の医薬的に許容される安定剤を添加する工程(vi)を想定することも可能である。本発明によれば、製剤化工程(vi)の前にナノ濾過を行うことによる、追加のウイルス防御工程(i)を想定することが可能である。
【００９８】
医薬的に許容される安定剤は、血漿タンパク質濃縮物に好適な配合物、特に出願FR0308403で説明されているような賦形剤、優先的には免疫グロブリン濃縮物に好適な配合物、特に本出願人の名前でなされた出願FR0304388、FR0859117、FR1054721及びFR1055825で説明されているような賦形剤を意味する。
【００９９】
任意選択で、製剤化工程(vi)に続いて、工程(vi)で得られた医薬調製物を凍結又は凍結乾燥する工程(vii)を行ってもよい。
【０１００】
有利には、本発明に係る方法は、特に低温貯蔵工程を回避することによって、免疫グロブリン濃縮物、並びに/又はフィブリノーゲン及び/若しくはアルブミン濃縮物の調製を可能にする。
【０１０１】
有利には、本発明に係る方法は、血漿1l当たり5gより優れた収量で、好ましくは血漿1l当たり6gより優れた収量で、免疫グロブリン濃縮物を得ることを可能にする。極めて有利な方式では、本発明に係る方法は、初期の血漿1l当たり7〜8gに近い免疫グロブリン収量が達成されるように最適化される。
【０１０２】
有利には、本発明に係る方法は、30g/lより優れた収量で、極めて有利には35g/lより優れた収量で、アルブミン濃縮物を得ることを可能にする。フィブリノーゲンに関して、その血漿レベルが約3g/lであるため、アフィニティーによる捕捉工程は、有利には、1工程でそれらの80%を捕捉することを可能にする。好ましくは、連続的なクロマトグラフィーは、90%より優れた収量を達成することを可能にする。
【０１０３】
有利な方式において、本発明に係る方法により得られた免疫グロブリン濃縮物は、血漿の抗原レパートリーと類似するか又は同一な抗原レパートリーを有する。特定の実施形態において、本発明に係る方法により得られた免疫グロブリン濃縮物は、従来技術の濃縮物の抗原レパートリーと類似するか及び/又はそれより優れている抗原レパートリーを有する。実際に、本発明に係る方法の間に免疫グロブリン損失を制限することにより、有利には、血漿の免疫グロブリン分布と類似する免疫グロブリン分布を保持し、広範な抗原パネルを維持することが可能になる。
【０１０４】
本発明に係る方法は、したがって、特異的な抗原性の標的に対して向けられた免疫グロブリンの画分を生産するのに特に有利である。
【０１０５】
同様に、本発明に係る方法は、特にすでに免疫グロブリンが除去された血漿画分からのアルブミン濃縮物の調製に特に有利である。本発明に係るマルチカラムクロマトグラフィー工程は、90%より高い捕捉収量を可能にする。従来のクロマトグラフィー工程中のゲルのキャパシティーは、一般的にゲル1l当たり25から30gの間であるにもかかわらず、本発明に係るマルチカラム陰イオン交換若しくは疎水性相互作用クロマトグラフィー又は化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)の使用は、ゲル1l当たり50gより高いキャパシティー、すなわち支持体の動的キャパシティーの全体としての飽和を達成することを可能にする。
【０１０６】
以下の実施例は本発明を例示するが、その範囲は制限しない。
【実施例１】
【０１０７】
寒冷上清へのマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる免疫グロブリン濃縮物の調製
材料及び方法
寒冷上清
8から10g/lの間のIgGを含む約5リットルのヒト血漿寒冷上清の2つのバッチ(バッチ13500-13L-06002及び13500-13L-06007)を700mlの画分のアリコートにし、次いで-80℃で凍結する。以下のTable 1(表1)に、使用されるバッチの特徴を示す。
【０１０８】
【表１】
2017508759.tif 000002
【０１０９】
試験中、必要な体積の寒冷上清を、生成物の内部温度が25℃を超えないように37℃の水浴中で20〜30分間解凍する。
【０１１０】
緩衝溶液
以下のTable 2(表2)に、アフィニティークロマトグラフィー方法の様々な工程の間に使用される緩衝溶液の組成を要約する。
【０１１１】
【表２】
2017508759.tif 000003
【０１１２】
以下のTable 3(表3)に、イオン交換クロマトグラフィー方法の様々な工程の間に使用される緩衝溶液の組成を要約する。
【０１１３】
【表３】
2017508759.tif 000004
【０１１４】
クロマトグラフィーゲル
アフィニティークロマトグラフィーには、GE Healthcare社製のIgSelect(登録商標)ゲルが使用される(バッチ番号10035817及び10017479)。使用されるアフィニティーリガンドは、ヒトIgGのFcフラグメントに特異的に結合するBAC社(BioAffinity社)製のリガンドである。このリガンドは、Igの吸着を容易にする長い炭素スペーサーを介してマトリックスベースとカップリングされた14kDの組換えタンパク質である。後者は、多点のアミド結合を介してスペーサーとカップリングされている。
【０１１５】
イオン交換クロマトグラフィーには、強い陰イオン交換ゲルであるFractogel(登録商標)EMD TMAEが使用される(バッチ番号09L03583)。このゲルは、その上にトリメチルアミノエチル(TMAE)基がグラフト化された架橋ポリメタクリレート樹脂からなる。
【０１１６】
カラム
マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーには、3から5個のProxcys社製のラジアルカラム、参照番号μ-RFC 5.0-6.0(バッチ1303B014  -  ゲル体積:10ml;ゲル高さ:12cm;入口の直径の出口の直径に対する比率:2:1)を、BioSc Lab自動システム(Novasep社)と組み合わせて使用した。
【０１１７】
TMAEクロマトグラフィーには、ゲル体積41ml、高さ20.4cm、及び表面積2.0cm2を有するXK16カラム(GE Healthcare社)を、AKTA Purifier 10自動システム(GE Healthcare社)と共に使用した。
【０１１８】
限外濾過
30kDaのカットオフ及び50cm2の表面積を有するMillipore社製のBiomax 30(PES)カセット(参照番号C1PA45544)が使用される。
【０１１９】
滅菌濾過
5cm2の表面積と0.45μm及び0.2μmの多孔率を有するSartorius社製のMinisartフィルター(参照番号16537及び16532)が使用される。
【０１２０】
試験
マルチカラムアフィニティークロマトグラフィー
ゲル吸着及び洗浄相中に、連続して逐次的に繋がっている4つのカラムに、ゲル1l当たり26gのIgGのローディング、5分の接触時間、7.3から7.8の間の結合pHで試験を行い、pH3の0.1Mグリシン溶液を用いて溶出を行った。
【０１２１】
各クロマトグラフィー後にゲルを再生した。
【０１２２】
再生は、2CVの2M塩化ナトリウム溶液を通過させることを本質とした。
【０１２３】
280nmでODを記録すること、及びIgG収量を計算することによって、クロマトグラフィーをモニターした(比濁アッセイ)。
【０１２４】
作業流速は、吸着中2分の接触時間に相当する2.3ml/分であった。
【０１２５】
以下のTable 4(表4)に要約したようにマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー工程を行った。
【０１２６】
【表４】
2017508759.tif 000005
【０１２７】
S/D処置及びTMAEクロマトグラフィー
エンベロープウイルスを不活化するために、S/D処置を約30分行う。次いで、TMAEゲルに注入する前に生成物のpH及び伝導率を調整する。
【０１２８】
次いでTMAEゲルの非吸着画分を収集する(画分を取り出す)。ベースラインに復帰しカラムを洗浄した後、次の相のためにゲルの溶出液を収集する。
【０１２９】
限外濾過
限外濾過工程は、TMAEカラムの溶出液を透析して80〜120g/lの中間濃度に濃縮することを可能にする。
【０１３０】
製剤化
製剤化緩衝液(マンニトール、グリシン、ポリソルベート80)を添加することによって生成物を製剤化した。生成物の最終濃度を50g/lに調整する。
【０１３１】
得られた生成物を、0.45及び0.22μmのフィルターの順番で滅菌濾過する。次いでこれをサンプリングし、液体状態で4.0〜7.0℃の温度で貯蔵する。
【０１３２】
結果
第1の精製工程としてエタノールでの分画を含む方法に従って得られた50g/lの免疫グロブリンIgG(参照生成物)と比較するために、最終生成物に対して分析を行った。
-  比濁法による総IgG及びサブクラスのアッセイ[Table 6(表6)]。
-  ELISA(酵素結合免疫吸着検査法)によるIgA、IgM及びIgEのアッセイ[Table 7(表7)]。
【０１３３】
【表５】
2017508759.tif 000006
【０１３４】
【表６】
2017508759.tif 000007
【０１３５】
寒冷上清から直接的にIgGを精製するためのこれらの条件は、品質において参照生成物と同等の生成物をもたらすことが特筆される。更に、上記のTable 6(表6)で示されているように、全てのIgGサブクラスの保存が、血漿のIgGサブクラスに近い分布で観察される。
【０１３６】
より興味深いことに、IgSelectゲルを使用したマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーは、90%より優れた工程収量を有し、寒冷上清1リットル当たり7.4gのIgGが収集される。アフィニティーゲルからの非吸着画分中で完全にIgGが除去されたことが特筆される。
【０１３７】
【表７】
2017508759.tif 000008
【０１３８】
結論として、工業スケールで、特に1日当たり数千リットルの血漿体積を処理するために、マルチカラムクロマトグラフィーによる血漿寒冷上清からの直接的なIgGの精製が可能であることは確実である。
【０１３９】
例えば、4500リットルのヒト血漿の工業バッチを処理するために、以下:50l及びゲル高さ12cmの4つのカラム、ゲル1リットル当たり27gのIgGに相当する寒冷上清のローディング、100から300cm/時間の間の直線的な吸着流速、並びにゲル洗浄及び溶出工程のための200から600cm/時間の間のより高い直線的な流速が使用される可能性がある。
【０１４０】
70リットルのゲルの3つのカラム又は40リットルのゲルの5つのカラムで構成される構造が可能であり、バッチ全体を処理するために行われるサイクル数は、使用される原材料の体積によって決定される。
【０１４１】
このような実行は、工業スケールであっても、規制上の要件を満たし、医薬的な使用に必要な全品質(純度、生物学的な安全性、IgGサブクラス分布等)を有する免疫グロブリン濃縮物を得ることを可能にする。特に、血漿の4種のIgGサブクラスの維持が観察される。溶媒/洗浄剤の混合物、IgA及びIgEを排除するために、次いでTMAEクロマトグラフィーが想定され得る。
【０１４２】
更に、NaClでの予備溶出と同時に、又は尿素/酢酸画分中の混合物として、80%ポリソルベートでゲルを洗浄する工程を提供することが可能である。
【実施例２】
【０１４３】
血漿へのマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによる免疫グロブリンの捕捉
材料及び方法
第1のマルチカラムクロマトグラフィーを介して免疫グロブリンを抽出するために、8から10g/lの間のIgGを含む約30lの血漿のプールの形成を可能にする大量のヒト血漿を、生成物の内部温度が25℃を超えないように37℃の水浴中で解凍した。
【０１４４】
【表８】
2017508759.tif 000009
【０１４５】
緩衝溶液
以下のTable 9(表9)に、アフィニティークロマトグラフィー方法の様々な工程で使用される緩衝溶液の組成を要約する。
【０１４６】
【表９】
2017508759.tif 000010
【０１４７】
クロマトグラフィーのためのゲル
アフィニティークロマトグラフィーのために、Life Technologies社製のCaptureSelect FcXLアフィニティーゲル(参照番号19432801L、バッチ番号200814-03)が使用される。使用されるアフィニティーリガンドは、4種のヒトIgGサブクラスのCH3ドメインに特異的に結合するBAC社(BioAffinity社)製のリガンドである。このリガンドは、14kDの組換えタンパク質である。
【０１４８】
カラム
マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーには、4個のProxcys社製のラジアルカラム(MD 122 MK III  -  ゲル体積:250ml/カラム、総アフィニティーゲル体積がゲル1.0lの場合;ゲル高さ:12cm;入口の直径/出口の直径の比率:2/1)を、BioSc Mパイロット自動システム(Novasep社)と組み合わせて使用した。
【０１４９】
試験
マルチカラムアフィニティークロマトグラフィー
自動システムによって逐次的に制御される4つのカラムで試験を行い、ここで血漿のローディングはゲル1l当たり21gのIgGに相当し、接触時間は7.1から7.8の間の非変性性の血漿吸着pHで3から4分であり、溶出はpH3.0で酢酸溶液を用いて行われた。各クロマトグラフィー後にゲルを再生した。
【０１５０】
280nmでODを記録し、溶出液のプールでIgG収量を計算することによってクロマトグラフィーをモニターした(比濁アッセイ)。以下のTable 10(表10)に要約したようにマルチカラムアフィニティークロマトグラフィー工程を行った。
【０１５１】
【表１０】
2017508759.tif 000011
【０１５２】
過剰に酸性のpHにおけるIgG凝集の危険を制限するために、得られたアフィニティーカラムの溶出液を、1M水酸化ナトリウム溶液を使用してpH4.8に調整した。
【０１５３】
マルチカラムFcXLアフィニティークロマトグラフィー溶出液の透析濾過による濃縮
溶出液を水中で透析濾過し、約70g/lの濃度を得るために30kDaのカットオフ閾値を有する膜で濃縮した。
【０１５４】
結果
限外濾過により濃縮したマルチカラムクロマトグラフィーの溶出液に分析を行った。
-  比濁分析による総IgG及びIgGサブクラスのアッセイ[Table 11(表11)]。
-  ELISA(酵素結合免疫吸着検査法)によるIgA、IgM及びIgEのアッセイ[Table 12(表12)]。
【０１５５】
【表１１】
2017508759.tif 000012
【０１５６】
【表１２】
2017508759.tif 000013
【０１５７】
これらの血漿から直接的にIgGを精製するための条件は、極めて優れた品質の生成物をもたらすことが特筆される。更に、上記のTable 11(表11)で示されたように、血漿における分布に近い分布での全てのIgGサブクラスの維持が観察される。
【０１５８】
より有利には、FeXLゲルを使用したマルチカラムアフィニティークロマトグラフィーは、90%より優れた工程収量を有し、すなわち処理された血漿1リットル当たり7.5gより多くのIgGが収集される。アフィニティーゲルからの非吸着画分における完全なIgGの除去は特筆すべきことである。加えて、ゲルからの非吸着画分中のアルブミン及びフィブリノーゲンが完全に収集される。
【０１５９】
【表１３】
2017508759.tif 000014
【０１６０】
結論として、工業スケールで、特に1日当たり数千リットルの血漿体積を処置するために、マルチカラムクロマトグラフィーによる血漿からの直接的なIgGの精製を全体として想定することができる。
【０１６１】
【表１４】
2017508759.tif 000015
【０１６２】
このような実行は、工業スケールであっても、血漿中に存在する免疫グロブリンを極めて効率的に捕捉することを可能にする。また、単一の工程で、治療用免疫グロブリンのプールの期待される品質を保持する極めて優れた純度の溶出液を得ることも可能になる。特に、血漿の4種のIgGサブクラスの維持とIgA、IgM及びIgEの優れた排除が観察される。残留した微量のIgA、IgM及びIgEを排除するために、次いでTMAEタイプのイオン交換クロマトグラフィー(Merck社)を想定することができる。
【実施例３】
【０１６３】
マルチカラムイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー又は化学的リガンドの組合せ(マルチモーダル)によるアルブミンの捕捉
材料及び方法
実施例2によるIgGを精製するための方法の終わりに収集されたIgG除去血漿が使用され、使用されるアフィニティーゲルにアルブミンは全く結合しない。
【０１６４】
血漿画分の特徴は、0.01Mクエン酸緩衝液中、16.15g/lのヒトアルブミン、pH=6.5、12mS/cmの伝導率である。
【０１６５】
以下のTable 15(表15)に、クロマトグラフィー方法の様々な工程で使用される緩衝溶液の組成を要約する。
【０１６６】
【表１５】
2017508759.tif 000016
【０１６７】
ミックスモードクロマトグラフィーゲル
アルブミンのクロマトグラフィーには、HEA Hypercelタイプの塩耐性ミックスモードゲルが使用される。
【０１６８】
カラム
それぞれ10mlの連続する5つのラジアルカラムを、BioSc Lab自動システム(Novasep社)と組み合わせて使用した。それぞれ164分の6サイクル、すなわち約17時間の連続作動が行われる。
【０１６９】
この例で適用されたマルチカラムクロマトグラフィー条件により、実質的に完全なアルブミンの捕捉を確認することができ、非吸着画分中に極めてわずかなアルブミンしか残らなかった。以下の表は、収集された各画分における収量及び精製された目的の画分において達成された最低限の純度を要約する。
【０１７０】
【表１６】
2017508759.tif 000017
【０１７１】
カラム出口において10%の漏出に達したらローディングを停止させる従来の試験と比較して、マルチカラムクロマトグラフィー試験中に少なくとも70%のキャパシティー増加が観察される。Table 17(表17)は、2つの条件に関して計算された増加を要約する。
【０１７２】
【表１７】
2017508759.tif 000018
【０１７３】
Table 17(表17)の結果は、吸着されなかったアルブミンは約3.4%だけであったことを示す。電気泳動によれば約80%の純度が観察される。
【０１７４】
pH=3.9で溶出した後、88%の収量が達成された。この試験は、HEA-HyperCel支持体でのマルチカラムクロマトグラフィー様式に従ったクロマトグラフィーによって血漿アルブミンの少なくとも96%が捕捉され、更にこのアルブミンの少なくとも88%が溶出で収集されたことを示し、これは、少なくとも80%の捕捉/溶出バランスに相当する。このゲルでのマルチカラムクロマトグラフィーは、ゲルのキャパシティーを、従来のクロマトグラフィーにおける30g/lから、52g/lに変化させること、すなわち必要な総ゲル体積を総計で70%低減することを可能にする。
【０１７５】
ヒト血漿は約40g/lのアルブミンで構成されているため、少なくとも33g/lがこの例に従って精製することができる。
【実施例４】
【０１７６】
マルチカラムアフィニティークロマトグラフィーによるフィブリノーゲンの捕捉
材料及び方法
血漿画分
実施例3に従ってアルブミンを精製するための方法(2つのマルチカラムクロマトグラフィーを14時間で通過)の終わりに収集されたIgG及びアルブミン除去血漿を、-80℃で凍結及び貯蔵し、次いでクロマトグラフィーによるフィブリノーゲン捕捉の日に解凍した後に使用する。
血漿画分の特徴:抗原性フィブリノーゲン:0.32g/l。
【０１７７】
緩衝溶液
以下のTable 18(表18)に、クロマトグラフィー方法の様々な工程で使用される緩衝溶液の組成を要約する。
【０１７８】
【表１８】
2017508759.tif 000019
【０１７９】
アフィニティークロマトグラフィーゲル
クロマトグラフィーには、CaptureSelectフィブリノーゲンアフィニティーゲル(Life Technologies社、参照番号191291050、バッチ171013-01)が使用され、以下のTable 19(表19)に、そのフィブリノーゲン捕捉の特徴を要約する。
【０１８０】
【表１９】
2017508759.tif 000020
【０１８１】
カラム
5mlの軸状カラム[参照番号Tricorn 5/100(GE Healthcare社)、カラム体積:1.6ml;カラム高さ:8cm]を使用した。
【０１８２】
アフィニティー精製
解凍した免疫グロブリン及びアルブミン除去血漿を、変性させることなく、平衡化したフィブリノーゲンCaptureSelectアフィニティーカラムに注入する。約10g/lのローディングを適用した。ELISA方法によって溶出液のフィブリノーゲン含量をアッセイした。
【０１８３】
結果
方法の完了時、フィブリノーゲン収量は70%である。得られた生成物は、1.3mg/mlの抗原性フィブリノーゲン濃度を有する。
【０１８４】
この試験から明らかに、クロマトグラフィー工程だけを連続して使用することにより(ウイルス不活化及び濾過工程とは別に)3種の豊富な血漿タンパク質を捕捉することが可能であることが実証される。
【０１８５】
この例において、2つの連続するマルチカラムクロマトグラフィー及び従来のクロマトグラフィーを相次いで行い、非吸着画分を連続して再度処理した。10時間より長期にわたるこの一連のクロマトグラフィー(図2)は、捕捉された分子、極めて具体的に言えば最後に精製された分子、本発明のケースではフィブリノーゲンの品質にとって有害ではない。後者のものは、免疫グロブリンの捕捉、それに続くアルブミンの捕捉及び、最終的に、それに続くフィブリノーゲンの捕捉の様々な連続したクロマトグラフィーの非還元条件下でのSDS-PAGE及びクーマシーブルー染色で示された通り、精製方法を通してその完全性を極めて良好に保持した(図3)。
【０１８６】
この図3では、初発の血漿並びにそれに次ぐ溶出液及び非保持画分は、血漿からの捕捉された分子の連続的な除去及び溶出液における捕捉された分子の高濃度化を示す。
【０１８７】
ウェル1は、分子量マーカーに対応し、ウェル2は、未精製の通常の血漿に対応する。
【０１８８】
ウェル3及びウェル4は、実施例2で得られた画分に対応する。
【０１８９】
ウェル5及びウェル6は、実施例3で得られた画分に対応する。
【０１９０】
ウェル7及びウェル8は、実施例4で得られた画分に対応する。
【０１９１】
340kDaの分子量を有するフィブリノーゲンは、マルチカラム免疫グロブリン捕捉クロマトグラフィーの非保持画分中で、次いでマルチカラムアルブミン捕捉クロマトグラフィーの非保持画分中でその分子の完全性を良好に保持する。フィブリノーゲン捕捉アフィニティークロマトグラフィーの非保持画分中でフィブリノーゲンが存在しないことが観察され、前記フィブリノーゲンは完全に捕捉され、このクロマトグラフィーの溶出液中で大部分が無傷の構造を有することがわかる。
【図２】
2017508759.tif 000021
【図１】
2017508759.tif 000022
【図３】
2017508759.tif 000023
【国際調査報告】
2017508759.tif 000024
2017508759.tif 000025
2017508759.tif 000026
2017508759.tif 000027
2017508759.tif 000028
2017508759.tif 000029
2017508759.tif 000030
2017508759.tif 000031