(57)【要約】本明細書では、乳腺腫瘍を伴う対象についての診断または予後を決定する方法が開示される。一実施形態では、方法は、試料中のＥＰＳ８様１（ＥＰＳ８Ｌ１）の量（ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量など）を決定するステップと、試料中のＥＰＳ８Ｌ１の量を、対照と比較するステップとを含む。試料中のＥＰＳ８Ｌ１の量が、対照と比較して増大すれば、対象は、予後不良である（生存の可能性の減少など）と決定される。一部の実施形態では、方法は、ＥｒｂＢ２ターゲティング療法を対象に施すステップなど、処置を、予後不良であると決定された対象に施すステップをさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳腺腫瘍を伴う対象の予後を決定する方法であって、
該対象に由来する試料中のＥＰＳ８様１（ＥＰＳ８Ｌ１）核酸またはタンパク質の量を決定するステップと；
該ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量を、対照と比較するステップと；
該ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量が、該対照と比較して増大していれば、該対象は予後不良であると決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量を決定するステップが、ＥＰＳ８Ｌ１核酸の量を決定するステップを含み、該ＥＰＳ８Ｌ１核酸の量が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡの量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＰＳ８Ｌ１核酸の量を決定するステップが、マイクロアレイ解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム逆転写ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、および比較ゲノムハイブリダイゼーションのうちの１または複数を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＰＳ８Ｌ１核酸の量を決定するステップが、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数を決定することを含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量を決定するステップが、ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の量を決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の量を決定するステップが、イムノアッセイを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイが、ウェスタンブロット法、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、または電気化学イムノアッセイである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記予後不良が、全生存の短縮、無再発生存の短縮、または無転移生存の短縮を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記全生存の短縮が、１０年間を超える生存の短縮を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記全生存の短縮が、５年間を超える生存の短縮を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記全生存の短縮が、３年間を超える生存の短縮を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対照が、ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の閾値レベルである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料中のＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の量を決定するステップと；
前記ＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の量を、対照と比較するステップであって、ＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の量の、前記対照と比較した増大が、前記対象は予後不良であることを示す、ステップと
をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、前記対象に由来する乳腺腫瘍試料である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象に由来する前記腫瘍試料が、組織生検または細針吸引物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織生検が、組織切片を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に由来する前記腫瘍試料が、新鮮な腫瘍試料、凍結した腫瘍試料、または固定された腫瘍試料を含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料を前記対象から得るステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療剤が、ＥｒｂＢ２特異的薬剤を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＥｒｂＢ２特異的薬剤が、トラスツズマブまたはラパチニブを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
乳腺腫瘍を伴う対象の予後を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
（ｉ）該対象に由来する試料中のＥＰＳ８様１（ＥＰＳ８Ｌ１）核酸またはタンパク質の量を決定し；
該ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量を、対照と比較するステップと；
（ｉｉ）該対象に由来する該試料中のＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の量を決定し；
該ＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の量を、対照と比較するステップと；
（ｉｉｉ）該ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量が、該対照と比較して増大しており、該ＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の量が、該対照と比較して増大していれば、該対象は予後不良であると決定するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
前記ＥＰＳ８Ｌ１核酸もしくはタンパク質および／または前記ＥｒｂＢ２核酸もしくはタンパク質の量を決定するステップが、ＥＰＳ８Ｌ１および／またはＥｒｂＢ２核酸の量を決定することを含み、該ＥＰＳ８Ｌ１および／またはＥｒｂＢ２核酸の量が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡの量を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＥＰＳ８Ｌ１および／またはＥｒｂＢ２核酸の量を決定するステップが、マイクロアレイ解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム逆転写ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、および比較ゲノムハイブリダイゼーションのうちの１または複数を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＥＰＳ８Ｌ１核酸の量を決定するステップが、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数を決定するステップを含み、かつ／または前記ＥｒｂＢ２核酸の量を決定するステップが、ＥｒｂＢ２の遺伝子コピー数を決定するステップを含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＥＰＳ８Ｌ１核酸もしくはタンパク質および／または前記ＥｒｂＢ２核酸もしくはタンパク質の量を決定するステップが、ＥＰＳ８Ｌ１および／またはＥｒｂＢ２タンパク質の量を決定するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＥＰＳ８Ｌ１および／またはＥｒｂＢ２タンパク質の量を決定するステップが、イムノアッセイを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記イムノアッセイが、ウェスタンブロット法、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、または電気化学イムノアッセイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記予後不良が、全生存の短縮、無再発生存の短縮、または無転移生存の短縮を含む、請求項２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、前記対象に由来する乳腺腫瘍試料である、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療剤が、ＥｒｂＢ２特異的薬剤を含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／８９４，５４８号の最先の出願日の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ＥｒｂＢ２陽性乳がんについての遺伝子マーカーと、ＥｒｂＢ２陽性乳がんの診断および／または予後を決定するための方法とに関する。
【０００３】
政府援助の承認
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第Ｕ５４ＣＡ１１２９７０号の下の政府援助によりなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
乳がんは、全世界の女性において最も一般的ながんであり、全世界の女性におけるがんによる死亡の最も一般的な原因である。しかし、乳がんは、異質性の疾患であり、標準的治療に応答して大きく変動する。乳がん間の分子的変動の同定により、患者のための予後および処置の改善がなされている。例えば、多くの乳腺腫瘍内のＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）の増幅および／または過剰発現を同定する結果として、ＥｒｂＢ２陽性腫瘍を伴う患者の、ＥｒｂＢ２ターゲティング療法（トラスツズマブおよび／またはラパチニブなど）による処置がもたらされている。多くの症例では、これらの療法は、有効であるが、一部のＥｒｂＢ２陽性腫瘍は、処置に応答しないか、またはＥｒｂＢ２ターゲティング療法に対して抵抗性となる。したがって、患者のための診断、予後、および／または処置選択肢の改善を提供するための、さらなる分子的特徴付けと、乳腺腫瘍の層別化とが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、乳腺腫瘍を伴う対象についての診断または予後を決定する方法が開示される。一部の例では、診断を決定することは、腫瘍が良性であるか、悪性であるかを決定することを含む。他の例では、予後を決定することは、乳腺腫瘍を伴う対象のアウトカム（例えば、生存の可能性）を予測することを含む。一実施形態では、方法は、対象に由来する試料（乳腺腫瘍試料など）中の、ＥＰＳ８様１（ＥＰＳ８Ｌ１）核酸および／またはタンパク質の量を決定するステップと、試料中のＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質の量を、対照と比較するステップとを含む。試料中のＥＰＳ８Ｌ１の量が、対照と比較して増大すれば、対象は、予後不良である（生存の可能性の減少など）と決定される。
【０００６】
一部の実施形態では、開示される方法は、対象に由来する試料中のＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の量を決定するステップをさらに含む。一部の例では、ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の増大に加えて、試料中のＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の増大（ＥｒｂＢ２のｍＲＮＡ、タンパク質、遺伝子コピー数、および／または遺伝子増幅の増大など）を伴う対象は、特に、アウトカムが不良である。
【０００７】
さらなる実施形態では、方法は、ＥｒｂＢ２ターゲティング療法を対象に投与するステップなど、処置を、予後不良であると決定された対象に投与するステップをさらに含む。
【０００８】
本開示の前出の特色および他の特色は、添付の図面を参照しながら進められる、以下の詳細な記載から、より明らかとなろう。
【０００９】
以下の図のうちの少なくとも一部は、カラーで提出される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＥｒｂＢ２陽性乳がん細胞株と接触させたところ、成長阻害性およびアポトーシス性応答を引き起こしたｓｉＲＮＡの同定を示すヒートマップである。
【００１１】
【図１Ｂ】図１Ｂは、６つの選択された細胞株内のＥＰＳ８Ｌ１の発現を他の遺伝子と比べて示すプロットである。４つの遺伝子（ＳＴＡＲＤ３、ＥＲＢＢ２、ＤＯＣＫ９、およびＲＡＢ２０）が表示される。
【００１２】
【図２Ａ】図２Ａは、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓによる、表示される充実性腫瘍内のＥＰＳ８Ｌ１のゲノム異常の頻度を示す棒グラフである。全ての浸潤性乳癌のうちの少なくとも４％は、ＥＰＳ８Ｌ１の変化を有する。
【００１３】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒト乳がん細胞株のパネルにわたり、ＥＰＳ８Ｌ１のｍＲＮＡ発現パターン（中央値を中心とするｌｏｇ２）を示す棒グラフである。細胞株は、ｂａｓａｌ  Ａ（赤、左）、ｂａｓａｌ  Ｂ（グレー、中央）、およびｌｕｍｉｎａｌ（青、右）亜群に群分けされる。
【００１４】
【図２Ｃ】図２Ｃは、表示される分子亜型に従ったＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡ発現の層別化についての箱ひげ図である。
【００１５】
【図３Ａ】図３Ａは、２つの異なるＥＰＳ８Ｌ１  ｓｉＲＮＡ（中央右および右端パネル）、ならびに陰性（左端）および陽性（中央左）対照についての経時的成長アッセイを示す４つのプロットのセットである。
【００１６】
【図３Ｂ】図３Ｂは、表示されるｓｉＲＮＡまたは対照の存在下における、ＥＰＳ８Ｌ１発現についてのウェスタンブロット画像である。
【００１７】
【図３Ｃ】図３Ｃは、表示される細胞株内のＥＰＳ８Ｌ１およびＥｒｂＢ２を示すウェスタンブロット画像である。
【００１８】
【図４Ａ】図４Ａは、全ての乳がん腫瘍のＥＰＳ８Ｌ１発現に基づく全生存（ＯＳ）時間についてのカプラン−マイヤープロットである。
【００１９】
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２）に富む腫瘍のＥＰＳ８Ｌ１発現に基づく全生存（ＯＳ）時間についてのカプラン−マイヤープロットである。
【００２０】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＥＲ陽性腫瘍のＥＰＳ８Ｌ１発現に基づく全生存（ＯＳ）時間についてのカプラン−マイヤープロットである。
【００２１】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＥＲ陰性のＨｅｒ２に富む腫瘍のＥＰＳ８Ｌ１発現に基づく全生存（ＯＳ）時間についてのカプラン−マイヤープロットである。
【００２２】
【図５Ａ】図５Ａは、ＤＮＡの獲得と増幅とを個別とした、ＥＰＳ８Ｌ１およびＥｒｂＢ２のコピー数に基づく累積生存時間についてのカプラン−マイヤープロットである。
【００２３】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＤＮＡの獲得と増幅とを組み合わせた、ＥＰＳ８Ｌ１およびＥｒｂＢ２のコピー数に基づく累積生存時間についてのカプラン−マイヤープロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
配列表
本明細書で、または添付の配列表内で列挙される任意の核酸およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において規定されている、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸のための標準的な文字による略記法を使用して示される。少なくとも一部の例では、各核酸配列のうちの１つの鎖だけを示すが、相補鎖は、表示される鎖に対する任意の言及により組み入れられると理解される。
【００２５】
配列番号１は、例示的なＥＰＳ８Ｌ１  ＲＮＡｉの核酸配列である。
【００２６】
本明細書では、ＥＰＳ８Ｌ１が、ＥｒｂＢ２陽性乳がんの特に侵襲性の進行形態を検出するための有用なマーカーであることが開示される。本開示は、ＥｒｂＢ２陽性乳がんについての診断および予後のために、乳がんのこの亜型をさらなるサブクラスへと層別化することにより、精度が改善された方法を提供する。ＥｒｂＢ２陽性乳がんについての臨床的層別化の現行の状況では、腫瘍の分子亜型を決定する標準的手順は一般に、病理学的グレード付けと、分子マーカーの限定されたセットとに基づいており、ＥｒｂＢ２のタンパク質発現レベルは、単独で、またはＥｒｂＢ２ゲノム遺伝子座のＤＮＡコピー数の獲得の検出と組み合わせて解析されている。このような実験で得られるデータを、乳がんの分子的特徴付けについての現行の仮定と併せて使用して、腫瘍細胞集団についての理論的臨床挙動を推定する。しかし、これらの手法は、例えば、細胞のうちの相当な割合が分化による変化を経る可能性があり、このため、単一マーカー標識化により看過される場合、がん性細胞の分子的異質性など、腫瘍内複雑性を過小評価するであろう。これに対し、ＥＰＳ８Ｌ１は、乳房組織内のＥｒｂＢファミリー受容体を介するシグナル伝達への細胞の経路依存性を特徴づけるので、細胞のある特定の生理学的状態を直接反映する。ＥＰＳ８Ｌ１の機能的役割は、いまだ十分に理解されていないが、ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の発現と、細胞の増殖とが密接に連関していることは明らかである。
【００２７】
開示される方法は、ＥＰＳ８Ｌ１を同定するステップと、対象（乳がんを伴う対象など）に由来する試料中のＥＰＳ８Ｌ１の発現または遺伝子コピー数を決定するステップと、これを対照（健常または非罹患個体に由来する試料中のＥＰＳ８Ｌ１の発現またはコピー数など）と比較するステップとを含む。ＥＰＳ８Ｌ１の発現または遺伝子コピー数の差異は、対象が、初期にはＥｒｂＢ２陽性とだけ分類される、侵襲性の進行性乳がんで死亡する危険性が増大していることを示す。したがって、一部の例では、開示される方法はまた、対象に由来する試料が、ＥｒｂＢ２陽性である（例えば、ＥｒｂＢ２の発現量またはコピー数が対照と比較して増大している）かどうかを同定するステップも含む。
【００２８】
Ｉ．用語
そうでないことが注記されない限りにおいて、技術用語は、従来の用法に従い使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin  Lewin、Genes  VII、Oxford  University  Press刊、２０００年（ISBN  019879276X）；Kendrewら（編）、The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology、Blackwell  Publishers刊、１９９４年（ISBN  0632021829）；Robert  A.  Meyers（編）、Molecular  Biology  and  Biotechnology:a  Comprehensive  Desk  Reference、Wiley,  John  &  Sons,  Inc.刊、１９９５年（ISBN  0471186341）；およびGeorge  P.  Redei、Encyclopedic  Dictionary  of  Genetics,  Genomics,  and  Proteomics、第２版、２００３年（ISBN:0-471-26821-6）において見出すことができる。
【００２９】
そうでないことが説明されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。単数形の用語である「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、複数の言及を含む。同様に、「または」という語は、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、「および」を含むことを意図する。本開示の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を使用しうるが、下記では、適切な方法および材料が記載される。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書で言及されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号と関連する全ての配列は、２０１３年１０月７日現在存在している通りに、適用される規則および／または法律により容認可能な程度において、それらの全体が参照により組み込まれる。利益相反の場合は、用語の説明を含む本明細書が管理する。加えて、材料、方法、および例は、単なる例示的なものであって、限定的であることを意図するものではない。
【００３０】
本開示の多様な実施形態についての再検討を容易とするために、具体的な用語についての以下の説明を提供する。
【００３１】
がん：分化を喪失した退形成、成長速度の増大、周囲組織への浸潤を経て、転移が可能な悪性新生物である。例えば、乳がんとは、乳房組織内で生じるか、または乳房組織から生じる悪性新生物（乳管癌など）である。乳がんはしばしば、ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ（ＥＲ陽性および／またはＰＲ陽性、ＥｒｂＢ２陰性、ならびに低Ｋｉ６７）、ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ（ＥＲ陽性および／もしくはＰＲ陽性およびＥｒｂＢ２陽性、または高Ｋｉ６７を伴うＥｒｂＢ２陰性）、ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅまたはトリプルネガティブ（ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、ＥｒｂＢ２陰性、サイトケラチン５／６陽性、および／またはＨＥＲ１陽性）、またはＥｒｂＢ２陽性（ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、ＥｒｂＢ２陽性）として分類される。しかし、乳がんは、個体間および腫瘍内の細胞レベルの両方において異質性の可能性があり、当業者は、乳がんが、分類スキーム内に常に当てはまるとは限らない場合があることを理解するであろう。
【００３２】
残存がんとは、任意の形態の処置を、がんを低減または根絶するように、対象に施した後で、対象において残るがんである。転移がんとは、転移がんが由来するがんの元の部位以外の、体内の１または複数の部位におけるがんである。局所的再発とは、元のがんと同じ部位、例えば、元のがんと同じ組織における、またはこの近傍におけるがんの再発である。
【００３３】
対照：被験試料との比較のために使用される試料または標準物質である。一部の実施形態では、対照とは、健常者から得られた試料、またはがんを伴うと診断された患者から得られた非腫瘍組織試料である。他の実施形態では、対照は、時間的対照または標準的な基準値もしくは値の範囲（予後またはアウトカムが既知のがん患者群など、かつて調べられた対照試料、または非腫瘍組織内のＥＰＳ８Ｌ１レベルなど、ベースラインもしくは正常値を表す試料群など）である。他の例では、対照は、閾値である。
【００３４】
ＥＰＳ８Ｌ１：上皮成長因子受容体キナーゼ基質８様タンパク質１、ＥＰＳ８関連タンパク質１としてもまた公知の、ＥＰＳ８様１である。ＥＰＳ８Ｌ１は、上皮成長因子受容体の基質（上皮成長因子受容体経路基質８）と関連する。ＥＰＳ８Ｌ１の機能は、未知である。
【００３５】
ＥＰＳ８Ｌ１の核酸およびアミノ酸配列は、公開されている。例えば、ＥＰＳ８Ｌ１のゲノムＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１９．９（ヌクレオチド５５５８７２２１〜５５５９９２９１）において開示されており、２０１３年１０月７日現在ＧｅｎＢａｎｋで提供されている通りに、参照により組み込まれる。加えて、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１３３１８０、ＮＭ＿０１７７２９、ＮＭ＿１３９２０４、ＸＭ＿００５２５９０２０、ＸＭ＿００５２５９０２１、およびＸＭ＿００５２５９０２２は、例示的なヒトＥＰＳ８Ｌ１核酸配列を開示し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿５７３４４１、ＮＰ＿０６０１９９、ＮＰ＿６３１９４３、ＸＰ＿００５２５９０７７、ＸＰ＿００５２５９０７８、ＸＰ＿０５０５９０７９は、例示的なヒトＥＰＳ８Ｌ１タンパク質配列を開示し、それらの全てが、２０１３年１０月７日現在ＧｅｎＢａｎｋで提供されている通りに、参照により組み込まれる。当業者は、さらなるＥＰＳ８Ｌ１配列およびこれらの変異体を同定することができる。
【００３６】
ＥｒｂＢ２：ｖ−ｅｒｂ−ｂ２トリ赤芽球性白血病ウイルス性がん遺伝子相同体２、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、またはＨｅｒ２としても公知である。ＥｒｂＢ２は、チロシンキナーゼの上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである。ＥｒｂＢ２は、乳がんおよび卵巣がん含む複数のがん内で増幅され、かつ／または過剰発現する。ＥｒｂＢ２は、リガンド結合性ドメインを有さず、それ自体では、リガンドに結合できない。しかし、ＥｒｂＢ２は、ＥＧＦ受容体ファミリーの他のメンバーと共にヘテロ二量体化し、リガンド結合性および細胞内シグナル伝達経路のキナーゼ介在型活性化を安定化させる。
【００３７】
ＥｒｂＢ２の核酸およびタンパク質配列は、公開されている。例えば、ＥｒｂＢ２のゲノムＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１７．１０（ヌクレオチド３７８４４１６７〜３７８８４９１５）において開示されており、２０１３年１０月７日現在ＧｅｎＢａｎｋで提供されている通りに、参照により組み込まれる。加えて、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００５２５７１３９、ＮＭ＿００１００５８６２、ＮＭ＿００４４４８、およびＸＭ＿００５２５７１４０は、例示的なヒトＥｒｂＢ２核酸配列を開示し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００５２５７１９６、ＮＰ＿００１００５８６２、ＮＰ＿００４４３９、およびＸＰ＿００５２５７１９７は、それらの全てが、２０１３年１０月７日現在ＧｅｎＢａｎｋに存在する通りに、参照により本明細書に組み込まれる、例示的なヒトＥｒｂＢ２アミノ酸配列を開示する。当業者は、さらなるＥｒｂＢ２配列およびこれらの変異体を同定することができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーション：ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡとの間の２つの鎖の相補性領域の間で塩基対を形成し、これにより、二重鎖分子を形成することである。特定の程度の厳密性をもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法の性質、ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化するであろう。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（Ｎａ＋濃度など）により、ハイブリダイゼーションの厳密性が決定される。特定の程度の厳密性を達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算については、Sambrookら（１９８９年）、Molecular  Cloning、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Plainview、NY（９および１１章）において論じられている。
【００３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける決定：例えば、試料中の１または複数の標的を同定する抗体、核酸、および／または標識などの試薬との反応による検査室内での試料（組織試料など）の変換を必要とする検査室における技法を使用することにより、値または量を決定することである。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける決定により、標的が、試料中で、対照と比べて増大するか、減少するかを示すことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける決定は、抽象的な情報の操作を超えたことを要求する。
【００４０】
標識（または検出可能な標識）：例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、または顕微鏡法による検出が可能な薬剤である。例えば、標識は、核酸分子またはタンパク質（プローブまたは抗体など）に結合させることができ、これにより、標的核酸分子またはタンパク質の検出を可能とする。標識の例は、放射性同位元素、酵素基質、共同因子、リガンド、化学発光剤、フルオロフォア、ハプテン、酵素、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。他の例では、標識は、合成（非自然発生の）標識である。標識付けのための方法、および多様な目的に適する標識の選択における指針は、例えば、Sambrookら（Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor、New  York、１９８９年）およびAusubelら（Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９９８年）において論じられている。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー：プローブは、検出用標識またはレポーター分子に結合した単離核酸を含む。プライマーとは、短鎖核酸、好ましくは、約１５ヌクレオチドまたはこれを超える長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドである。プライマーを、核酸ハイブリダイゼーションにより相補性の標的ＤＮＡ鎖にアニールさせて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長させることができる。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または当技術分野で公知の他の核酸増幅法による核酸配列の増幅のために使用することができる。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性は、その長さと共に増大することを理解するであろう。したがって、例えば、２０の連続するヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーは、１５ヌクレオチドだけの対応するプローブまたはプライマーより高度な特異性で、標的にアニールするであろう。したがって、より大きな特異性を得るために、約２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはこれを超える連続するヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーを選択することができる。
【００４２】
予後：がん（例えば、乳がん）などの疾患の経過についての予測である。予測は、対象が侵襲性の再発性疾患を発症する可能性、１または複数の転移を発症する可能性、特定の長さの時間にわたり生存する可能性（例えば、対象が、１、２、３、５、１０年間またはこれを超えて生存する可能性を決定する）、特定の治療に応答する可能性、またはこれらの組合せを決定することを含みうる。予測はまた、腫瘍が、悪性腫瘍であるか、良性腫瘍であるかを決定することも含みうる。
【００４３】
試料（または生物学的試料）：対象から得られた、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、またはこれらの組合せを含有する生物学的検体である。例としてはは、末梢血、尿、唾液、組織生検、細針吸引物、手術検体、および剖検材料を含むがこれらに限定されない。一部の例では、試料は、新鮮な、凍結された、または固定された腫瘍試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料などの腫瘍試料を含む。
【００４４】
対象：ヒトおよび獣医科対象などの非ヒト哺乳動物を含む分類である、生きている多細胞脊椎生物である。
【００４５】
生存：診断または初回の処置（手術または初回の化学療法など）の日付と、再発、転移、または死亡など、特定のイベントとの間の時間間隔である。全生存とは、診断または初回の処置の日付と、死亡日または最終回の追跡の日付との間の時間間隔である。無再発生存とは、診断または初回の処置の日付と、再発（局所領域的再発など）の診断日または最終回の追跡の日付との間の時間間隔である。無転移生存とは、診断または初回の処置の日付と、転移の診断日または最終回の追跡の日付との間の時間間隔である。
【００４６】
腫瘍：新生組織形成の産物は、新生物（腫瘍）であり、新生物とは、過剰な細胞分裂から生じる組織の異常な成長である。周囲組織に浸潤したり転移したりしない腫瘍を、「良性」と称する。周囲組織に浸潤し、かつ／または転移しうる腫瘍を、「悪性」と称する。一部の例では、腫瘍は、乳腺腫瘍である。
【００４７】
ＩＩ．いくつかの実施形態についての概観
本明細書では、乳腺腫瘍を伴う対象についての診断または予後を決定する方法が開示される。一部の例では、診断を決定することは、腫瘍が良性であるか、悪性であるかを決定することを含む。他の例では、予後を決定することは、乳腺腫瘍を伴う対象のアウトカム（例えば、生存の可能性）を予測することを含む。一実施形態では、方法は、乳腺腫瘍を伴う対象に由来する試料（腫瘍試料、例えば、乳腺腫瘍試料など）中のＥＰＳ８Ｌ１の量（ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量など）を決定するステップと、試料中のＥＰＳ８Ｌ１の量を、対照と比較するステップとを含む。乳腺腫瘍試料中のＥＰＳ８Ｌ１の量が、対照と比較して増大していれば、対象は、予後不良である（生存の可能性の減少など）と決定される。他の例では、方法は、乳腺腫瘍試料中のＥＰＳ８Ｌ１の量が、対照と比較して増大していれば、対象は、乳がんを有すると決定するステップを含む。開示される方法はまた、ＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質を増大させる、任意の種類の腫瘍、例えば、卵巣腫瘍を伴う対象についての診断または予後を決定するのにも使用することができる。
【００４８】
一部の例では、方法は、乳腺腫瘍試料中のＥＰＳ８Ｌ１核酸の量を決定するステップを含む。ＥＰＳ８Ｌ１核酸は、ゲノムＤＮＡ（例えば、試料中のＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数または遺伝子増幅の存在を決定すること）を含む場合もあり、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ（例えば、試料中のＥＰＳ８Ｌ１の発現を決定すること）を含む場合もある。他の例では、方法は、乳腺腫瘍試料中のＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の量を決定するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、ＥｒｂＢ２、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびＫｉ６７を含むがこれらに限定されない、乳腺腫瘍試料中の１または複数のさらなる核酸またはタンパク質を検出するステップをさらに含む。特定の例では、方法は、試料中の、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子増幅の存在、および／またはＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の量を決定するステップと、ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量を、対照と比較するステップと、試料中の、ＥｒｂＢ２の遺伝子コピー数、ＥｒｂＢ２の遺伝子増幅の存在、および／またはＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の量を決定するステップと、ＥｒｂＢ２核酸またはタンパク質の量を、対照と比較するステップとを含む。ＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質の増大と、ＥｒｂＢ２核酸および／またはタンパク質の増大との組合せを伴う対象は、特に予後不良である。一部の例では、ＥＰＳ８Ｌ１のコピー数の獲得およびＥｒｂＢ２の増幅を伴う対象の平均生存時間は、４８カ月間未満（４２カ月間未満、３６カ月間未満、３０カ月間未満、２４カ月間未満、１８カ月間未満、１２カ月間未満、６カ月間未満、または３カ月間未満など）である。他の例では、ＥＰＳ８Ｌ１のコピー数の喪失およびＥｒｂＢ２のコピー数の獲得を伴う対象は、特に予後良好である（５年間を超えるか、７年間を超えるか、１０年間を超えるか、１２年間を超えるか、１５年間を超えるか、またはこれよりなお長い平均生存時間など）。試料中の核酸またはタンパク質の量を決定する方法は、当業者に公知であり、下記で、より詳細に論じられる。
【００４９】
一部の実施形態では、開示される方法は、乳腺腫瘍を伴う患者に由来する試料を活用する。他の実施形態では、方法は、ＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質を増大させているかまたは増大させていることが疑われる腫瘍を伴う患者（例えば、卵巣腫瘍を伴う患者）に由来する試料を活用する。一部の例では、試料は、腫瘍細胞、例えば、腫瘍試料（乳腺腫瘍試料など）を含む。試料はまた、例えば、腫瘍細胞と隣接するかまたは腫瘍細胞が混在する非腫瘍細胞も含みうる。特定の例では、試料は、対象に由来する組織、生検、または体液（乳腺腫瘍の生検または細針吸引物など）を含む。一部の例では、試料は、新鮮な、凍結された、または固定された腫瘍試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料などの腫瘍試料を含む。他の例では、試料は、循環腫瘍細胞（血液試料または血液試料の少なくとも１つの画分を含む試料など）を含む。さらなる例では、試料は、腫瘍細胞を含む試料から単離された核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはｃＤＮＡなど）またはタンパク質を含みうる。
【００５０】
予後不良とは、生存（全生存、無再発生存、または無転移生存など）の可能性（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）の減少、生存時間の短縮（例えば、１０年間未満、５年間未満、３年間未満、２年間未満、または１年間未満の予測平均生存）、悪性腫瘍の存在、疾患の重症度の増大、治療に対する応答の減少、腫瘍の再発の増大、転移の増大などであるがこれらに限定されない、任意の陰性の臨床アウトカムを指す場合がある。特定の例では、予後不良とは、生存の見込み（ｃｈａｎｃｅ）の減少（例えば、診断または初回の処置時から１０年間と等しいか、または１０年間未満、例えば、９年間未満、８年間未満、７年間未満、６年間未満、５年間未満、４年間未満、３年間未満、２４カ月間未満、１８カ月間未満、１２カ月間未満、６カ月間未満、もしくは３カ月間未満などの予測平均生存時間）である。
【００５１】
方法の一部の実施形態では、試料中の、ＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質の量の、対照と比べた変化は、予後不良を示す。一部の例では、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数ならびに／またはＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の量の、対照と比べた増大（統計学的に有意な増大など）は、予後不良を示す。例えば、ＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質の量の、対照または基準値（または値の範囲）と比べた増大は、生存の見込みの減少（例えば、全生存、無再発生存、または無転移生存の短縮）などの予後不良を示す。一部の例では、生存の見込みの減少は、診断または初回の処置時から５０カ月間と等しいか、または５０カ月間未満、例えば、４８カ月間未満、４２カ月間未満、３６カ月間未満、３０カ月間未満、２４カ月間未満、１８カ月間未満、１２カ月間未満、９カ月間未満、６カ月間未満、もしくは３カ月間未満などの予測平均生存時間を含む。他の例では、ＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質の量の、対照と比べた有意な変化がないことまたは減少は、予後良好（生存の見込みの増大、例えば、全生存、無再発生存、または無転移生存の延長など）を示す。具体例では、ＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質の量の、対照と比べた有意な変化がないことまたは減少は、生存の見込みの増大、例えば、診断または初回の処置時から少なくとも５年間、少なくとも６年間、少なくとも７年間、少なくとも８年間、少なくとも９年間、少なくとも１０年間、少なくとも１２年間またはこれを超えるなど、少なくとも５０カ月間の予測平均生存時間などの予後良好を示す。
【００５２】
さらなる実施形態では、ＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質の量の、対照と比べた増大（ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数の増大またはＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子増幅など）、ならびにＥｒｂＢ２核酸および／またはタンパク質の量の、対照と比べた増大（ＥｒｂＢ２の遺伝子コピー数の増大またはＥｒｂＢ２の遺伝子増幅など）は、生存の見込みの減少などの予後不良を示す。一部の例では、生存の見込みの減少は、診断または初回の処置時から５０カ月間と等しいか、または５０カ月間未満、例えば、４８カ月間未満、４２カ月間未満、３６カ月間未満、３０カ月間未満、２４カ月間未満、１８カ月間未満、１２カ月間未満、９カ月間未満、６カ月間未満、もしくは３カ月間未満などの生存時間を含む。他の例では、試料中のＥＰＳ８Ｌ１核酸および／またはタンパク質の量の、対照と比べた減少（ＥＰＳ８Ｌ１核酸の喪失など）、ならびに試料中のＥｒｂＢ２核酸および／またはタンパク質の、対照と比べた増大（ＥｒｂＢ２の獲得など）は、生存の見込みの増大などの予後良好を示す。一部の例では、生存の見込みの増大は、診断または初回の処置時から少なくとも５０カ月間と等しいか、または少なくとも５０カ月間を超える（少なくとも５年間、少なくとも６年間、少なくとも７年間、少なくとも８年間、少なくとも９年間、少なくとも１０年間、少なくとも１２年間、もしくはこれを超えるなど）生存時間を含む。
【００５３】
特定の例では、対照の少なくとも１．２５倍（対照と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、またはこれを超えるなど）の試料中のＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量は、対象が予後不良であることを示す。他の例では、試料中の、遺伝子コピー数の増大または遺伝子増幅の存在は、対象が予後不良であることを示す。一部の例では、２を超える（約２、３、４、５、１０、２０を超えるか、またはこれを上回るなど）ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数、またはＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数の、第１９染色体コピー数に対する、約２を超える（約２、３、４、５、１０、２０を超えるか、またはこれを上回るなど）比は、対象についての予後不良を示す。
【００５４】
対照は、それに対して腫瘍試料中のＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量を比較するための任意の適切な対照でありうる。一部の実施形態では、対照試料は、非腫瘍組織である。一部の例では、非腫瘍組織は、腫瘍と隣接する非腫瘍組織など、同じ対象から得られる。他の例では、非腫瘍組織は、健常対照対象から得られる。他の実施形態では、対照は、基準値または値の範囲である。例えば、基準値は、健常対照対象群、またはがん患者群に由来する非腫瘍組織から得られた平均遺伝子コピー数および／または発現値から導出することができる。
【００５５】
さらなる例では、対照は、閾値である。ＥＰＳ８Ｌ１の閾値レベルは、ＥＰＳ８Ｌ１核酸の定量化レベル（ＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡまたはＥＰＳ８Ｌ１遺伝子のコピー数など）またはＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の定量化レベルである。閾値レベルを超える試料中のＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量により、乳腺腫瘍を伴う対象における、特定の疾患状態またはアウトカム（予後不良など）が予測される。閾値レベルの性質および数値（存在する場合）は、ＥＰＳ８Ｌ１核酸の量を決定するのに選択された方法に基づき変化するであろう。当業者は、現在当技術分野で公知であるか、またはこれから開示される核酸またはタンパク質の量を測定する任意の方法を使用して、生存の短縮を予測する試料中のＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の閾値レベルを決定することができる。
【００５６】
一部の例では、ＥＰＳ８Ｌ１の閾値レベルは、高度、中程度、または低度の生存（例えば、全生存）の確率など、複数の閾値レベルを含む。他の例では、閾値を下回る試料中のＥＰＳ８Ｌ１の量が、対象は予後良好である可能性が高いことを示す低閾値量と、それを上回るＥＰＳ８Ｌ１の量が、対象は予後不良であることを示す、別個の高閾値量とが存在しうる。２つの閾値の間のＥＰＳ８Ｌ１の量は、対象の予後に対して決定的ではないとみなされる。一部の例では、複数の閾値を、いわゆる「三分位数」、「四分位数」、または「五分位数」解析により選択する。これらの方法では、複数の群を併せて、単一の集団とみなし、等しい数の個体を有する、３つまたはこれを超える「ビン」に分ける。これらのビンのうちの２つの間の境界は、対象が、予後不良であるか、または予後不良となる特定のレベルの危険性を示す閾値レベルとみなすことができる。危険性は、被験対象が収まるビンに基づき割り当てることができる。
【００５７】
ＥＰＳ８Ｌ１を測定する特定の方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＩＳＨ、またはＩＨＣ）のための、対象が予後不良であることを示すＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の閾値を得るために、ＥＰＳ８Ｌ１の量は、乳腺腫瘍を伴う対象の第１のコホートであって、予後不良であることがわかっているコホートから得られた試料と、予後良好であることがわかっている第２のコホートから得られた試料とを使用して決定する。例示的な一実施形態では、第１のコホートは、生存が５０カ月間未満の対象を含み、第２のコホートは、生存が５０カ月間を超える対象を含む。しかし、当業者は、閾値を決定するのに適する、異なるコホートを選択することができる。ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質は、両方のコホートで決定し、対象が予後不良であることを意味するＥＰＳ８Ｌ１の量を、閾値と決定する。一部の例では、閾値は、予後不良を予測する最大の能力をもたらし、検査の選択性および感度の両方を最大化するＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の量である。発現の閾値レベルの予測力は、当技術分野で公知のいくつかの統計学的方法受信者動作曲線下面積（ＲＯＣ  ＡＵＣ）、オッズ比、またはハザード比など）のうちのいずれかにより評価することができる。
【００５８】
特定の実施形態では、開示される方法は、処置を、乳腺腫瘍を伴う対象に投与するステップをさらに含む。ＥＰＳ８Ｌ１の増大は、ＥｒｂＢ２陽性腫瘍において、それらの腫瘍が、ＥＲ陽性またはＥＲ陰性の場合であれ、そうでない場合であれ、特に予測的であることが見出されている（下記の実施例４を参照されたい）。したがって、一部の例では、本明細書で開示される方法を使用して予後不良であると同定される（例えば、ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質を増大させた乳腺腫瘍を有する）対象には、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）ターゲティング療法を投与する。ＥｒｂＢ２ターゲティング療法は、トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、またはこれらの組合せを含む。当業者は、現在公知であるか、または将来開発される療法を含む、さらなるＥｒｂＢ２ターゲティング療法を選択することができる。一部の例では、対象には、ＥｒｂＢ２ターゲティング療法と、抗エストロゲン療法との組合せを投与する。他の例では、本明細書で開示される方法を使用して予後良好であると同定される（例えば、ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質が正常であるか、またはこれを減少させた乳腺腫瘍を有する）対象は、標準的ケア（手術、放射線、および／またはネオアジュバント化学療法など）で処置する。
【００５９】
さらなる例では、対象にはまた、タモキシフェン、レトロゾール、トレミフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、またはこれらの組合せなど、１または複数の抗ホルモン療法も投与することができる。対象にはまた、タキサン（パクリタキセルまたはドセタキセルなど）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、またはミトキサントロンなど）、シクロホスファミド、カペシタビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、またはこれらの組合せなど、１または複数のアジュバント化学療法薬も投与することができる。なおさらなる例では、ＥＰＳ８Ｌ１核酸またはタンパク質の増大を伴う対象は、手術により、例えば、さらなる組織を摘出することにより、腫瘍境界部をより広くとることにより、かつ／またはさらなるリンパ節を摘出することにより処置することができる。対象はまた、放射線療法によっても処置することができる。
【００６０】
ＩＩＩ．核酸またはタンパク質を検出する方法
下記で記載される通り、試料中の核酸またはタンパク質（ＥＰＳ８Ｌ１またはＥｒｂＢ２など）の量は、当技術分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれか１つを使用して検出することができる。例示的な方法が提供されるが、本開示は、このような方法に限定されるわけではない。さらに、下記の方法については、ＥＰＳ８Ｌ１を具体的に参照しながら記載するが、当業者であれば、目的の他の核酸またはタンパク質（ＥｒｂＢ２を含むがこれに限定されない）を検出するのに、類似の方法を活用しうることを理解するであろう。
【００６１】
Ａ．ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出するための方法
遺伝子発現は、ＥＰＳ８Ｌ１など、タンパク質をコードするｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を検出することにより評価することができる。一部の例では、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を定量化する。ＲＮＡは、市販のキットを含む、当業者に周知の方法を使用して、対象に由来する試料（乳腺腫瘍を伴う対象に由来する腫瘍試料、対象に由来する隣接する非腫瘍組織試料、正常（健常）対象に由来する腫瘍非含有組織試料、またはこれらの組合せなど）から単離することができる。当技術分野では、ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法が周知であり、Ausubelら、Current  Protocols  of  Molecular  Biology、John  Wiley  and  Sons（１９９７年）を含む、分子生物学の標準的な教科書において開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、RuppおよびLocker、Biotechniques、６巻：５６〜６０頁（１９８８年）；ならびにDe  Andresら、Biotechniques、１８巻：４２〜４４頁（１９９５年）において開示されている。一例では、ＲＮＡの単離は、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）など、市販品の製造元による精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを使用して実施することができる。組織試料に由来する全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離することができる。腫瘍または他の生物学的試料から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離により単離することができる。
【００６２】
ＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡ（例えば、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子発現）を決定する方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法、ポリヌクレオチドのシークエンシングに基づく方法、およびプロテオミクスベースの方法を含む。一部の例では、試料中のｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロット法またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ParkerおよびBarnes、Methods  in  Molecular  Biology、１０６巻：２４７〜２８３頁、１９９９年）；ＲＮアーゼ保護アッセイ（Hod、Biotechniques、１３巻：８５２〜４頁、１９９２年）；または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Weisら、Trends  in  Genetics、８巻：２６３〜４頁、１９９２年）など、ＰＣＲベースの方法を使用して定量化する。代替的に、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む、特定の二重鎖を認識しうる抗体を利用することができる。シークエンシングベースの遺伝子発現解析のための代表的方法は、遺伝子発現の逐次解析（ＳＡＧＥ：ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、および大規模並列処理特徴配列決定（ＭＰＳＳ：ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による遺伝子発現解析を含む。
【００６３】
一部の例では、ＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡは、二重標識蛍光発生プローブ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ）を介して、ＰＣＲ産物の蓄積を測定する、ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列についての内部コンペティターを、正規化のために使用する、定量的競合ＰＣＲ、および試料中に含有される正規化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する、定量的比較ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）（Heidら、Genome  Research、６巻：９８６〜９９４頁、１９９６年を参照されたい）の両方に適合する。定量的ＰＣＲについてはまた、米国特許第５，５３８，８４８号においても記載されている。関連するプローブおよび定量的増幅手順については、米国特許第５，７１６，７８４号および米国特許第５，７２３，５９１号において記載されている。定量的ＰＣＲをマイクロ滴定プレート内で実行するための装置は、例えば、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から市販されている。
【００６４】
一部の例では、ＥＰＳ８Ｌ１発現は、マイクロアレイを使用して同定または確認する。ＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）は、マイクロアレイ技術を使用して、新鮮な
のまたはパラフィン包埋腫瘍組織中のいずれかで測定することができる。この方法では、アレイは、ＥＰＳ８Ｌ１についての１または複数のプローブを含む。次いで、アレイは、試料から単離された核酸（ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）とハイブリダイズさせる。マイクロアレイは、１または複数のハウスキーピング遺伝子についてのプローブなど、１または複数の対照プローブも含みうる。
【００６５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）とは、目的の遺伝子の発現を検出および比較するための別の方法である。ＩＳＨは、核酸ハイブリダイゼーションの技術を、単一細胞レベルに適用および外挿し、細胞化学、免疫細胞化学、および免疫組織化学の技術と組み合わせて、形状の維持を可能とし、細胞マーカーの識別の維持および同定を可能とし、組織および血液試料など、集団内の特定の細胞への配列の局在を可能とする。ＩＳＨとは、相補性核酸を使用して、１または複数の特異的な核酸配列を、組織の部分または切片内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、または、組織が十分に小さい場合は、組織全体（ホールマウントＩＳＨ）に局在するハイブリダイゼーションの種類である。ＲＮＡ  ＩＳＨを使用して、ＦＦＰＥ乳腺腫瘍試料などの乳腺腫瘍試料中の、または腫瘍マイクロアレイ内のＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡ発現を、定性的または半定量的に評価することができる。
【００６６】
検出法の一部の実施形態ではまた、１または複数の「ハウスキーピング」遺伝子または「内部対照」の発現も評価することができる。これらの用語は、それらの存在により、ＥＰＳ８Ｌ１  ｍＲＮＡ、ＥＰＳ８Ｌ１  ｃＤＮＡ、またはＥＰＳ８Ｌ１タンパク質レベルについての評価が可能となる、任意の構成的またはグローバル発現遺伝子（または、下記で論じられる通り、タンパク質）を含む。このような評価は、遺伝子転写の全構成的レベルと、ＲＮＡ（またはタンパク質）回収量の変動についての対照の決定を含む。
【００６７】
Ｂ．遺伝子コピー数を決定するための方法
開示される方法の一部の例では、遺伝子コピー数（ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数または遺伝子増幅など）を決定する。一部の例では、方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（蛍光、発色、または銀ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、またはポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイム定量的ＰＣＲなど）を含む。
【００６８】
特定の例では、遺伝子コピー数を、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、または銀ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）などのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）により決定する。ＩＳＨ法では、試料をＥＰＳ８Ｌ１のゲノムＤＮＡプローブと接触させ、プローブの、試料中の染色体または核とのハイブリダイゼーションを、直接的または間接的に検出する。例えば、ＦＩＳＨを使用して、ＤＮＡプローブ（ＥＰＳ８Ｌ１プローブなど）を、蛍光色素またはハプテンで標識する。プローブの、染色体または核とのハイブリダイゼーションは、直接的に（蛍光標識プローブの場合）または間接的に（ハプテン標識プローブを検出するための蛍光標識抗ハプテン抗体を使用して）視覚化する。ＣＩＳＨでは、プローブを、ハプテン（ジゴキシゲニン、ビオチン、またはフルオレセインなど）で標識し、適切な基質（ＤＡＢ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰなど）の存在下で、ハイブリダイズさせたプローブの部位において有色産物を産生する酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなど）にコンジュゲートさせた抗ハプテン抗体により、または酵素にコンジュゲートさせた二次抗体により検出する。同様に、ＳＩＳＨでは、ハプテン標識プローブは、抗体（抗ハプテン抗体または二次抗体のいずれか）にコンジュゲートさせた酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）が、ハイブリダイズさせたプローブの部位において、金属ナノ粒子（銀または金など）の沈着を触媒することを除き、抗ハプテン抗体により検出する。ＥＰＳ８Ｌ１のコピー数は、染色体または核上の蛍光スポット、有色スポット、または銀スポットの数をカウントすることにより決定することができる。遺伝子（または染色体）のコピー数は、病理学者などの当業者、または、自動式の方法の場合は、コンピュータにより推定されうる。
【００６９】
他の例では、ＥＰＳ８Ｌ１遺伝子および第１９染色体ＤＮＡ（第１９染色体のセントロメアＤＮＡなど）の両方を、例えば、ＩＳＨにより、対象に由来する試料中で検出する。ＥＰＳ８Ｌ１および第１９染色体コピー数は、染色体または核上の蛍光スポット、有色スポット、または銀スポットの数をカウントすることにより決定することができる。次いで、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数の、第１９染色体数に対する比を決定する。例えば、ＳｕｒｅＦＩＳＨ  Ｃｈｒ  １９  ＣＥＰ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）またはＳＥ  １／１５／１９  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ（Ｋｒｅａｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）など、第１９染色体のセントロメアプローブが市販されている。
【００７０】
他の例では、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用して、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数を決定する。例えば、Kallioniemiら、Science、２５８巻：８１８〜８２１頁、１９９２年；米国特許第５，６６５，５４９号および同第５，７２１，０９８号を参照されたい。一例では、腫瘍試料および対照組織（非乳腺腫瘍試料などの基準試料）に由来するＤＮＡを、異なる検出可能な標識で標識する。腫瘍ＤＮＡ試料と基準ＤＮＡ試料とを混合し、混合物を、正常な中期染色体とハイブリダイズさせる。染色体に沿った蛍光強度比を使用して、腫瘍試料内のＤＮＡ獲得または喪失の領域を評価する。
【００７１】
ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数はまた、アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）によっても決定することができる。例えば、PinkelおよびAlbertson、Nat.  Genet.、３７巻：Ｓ１１〜Ｓ１７頁、２００５年；Pinkelら、Nat.  Genet.、２０巻：２０７〜２１１頁、１９９８年；Pollackら、Nat.  Genet.、２３巻：４１〜４６頁、１９９９年を参照されたい。ａＣＧＨは、標準的ＣＧＨと類似するが、ａＣＧＨでは、ＤＮＡ混合物を、何十、何百、または何千もの規定されたＤＮＡプローブ（ＥＰＳ８Ｌ１遺伝子の部分と相同なプローブなど）を含有するスライドとハイブリダイズさせる。アレイ内の各プローブにおける蛍光強度比を使用して、腫瘍試料内のＤＮＡ獲得または喪失の領域を評価するが、これらは、蛍光強度の変化を呈示する特定のプローブに基づき、ＣＧＨより精細にマッピングされうる。
【００７２】
別の例では、ＥＰＳ８Ｌ１のコピー数を、ＴＡＱＭＡＮアッセイを伴うようなリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により決定する。例えば、米国特許第６，１８０，３４９号を参照されたい。ＥＰＳ８Ｌ１のコピー数を、試料中に含有される正規化遺伝子であって、コピー数が既知である正規化遺伝子と比べて決定する（Heidら、Genome  Research、６巻：９８６〜９９４頁、１９９６年を参照されたい）。定量的ＰＣＲについてはまた、米国特許第５，５３８，８４８号においても記載されている。
【００７３】
当業者には、ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子コピー数を決定するのに使用されうるさらなる方法が公知である。これらの方法は、サザンブロット法、マルチプレックスライゲーション依存型プローブ増幅（ＭＬＰＡ；例えば、Schoutenら、Nucl.  Acids  Res.、３０巻：ｅ５７頁、２００２年を参照されたい）、および高密度ＳＮＰ遺伝子型決定アレイ（例えば、ＷＯ９８／０３０８８３を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【００７４】
Ｃ．タンパク質を検出するための方法
一部の例では、タンパク質（ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質など）の発現を解析する。適切な生物学的試料は、対象の腫瘍（乳腺腫瘍など）、対象の非腫瘍組織から得られたタンパク質、および／またはがんを有さない対象の１または複数の試料から得られたタンパク質を含有する試料を含む。
【００７５】
ＥＰＳ８Ｌ１に特異的な抗体を、HarlowおよびLane（Antibodies,  A  Laboratory  Manual、CSHL、New  York、１９８８年）で提示されているイムノアッセイ法など、当技術分野で周知である、いくつかのイムノアッセイ法のうちの１つによる、ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の検出および定量化のために使用することができる。当技術分野では、このような抗体を構築する方法が公知である。加えて、このような抗体は、市販されうる。
【００７６】
例示的な市販のＥＰＳ８Ｌ１抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、例えば、カタログ番号ａｂ５８６８７、ａｂ６４８３９、ａｂ１２９５４７、およびａｂ１６９７０１）製、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、例えば、カタログ番号ｓｃ−１３２６７３、ｓｃ−１３２６７２、およびｓｃ−１０１９５０）製、ならびにＡｂｎｏｖａ（Ｗａｌｎｕｔ、ＣＡ、例えば、カタログ番号Ｈ０００５４８６９−Ｂ０１、Ｈ０００５４８６９−Ｂ０１Ｐ、およびＨ０００５４８６９−Ａ０１）製の抗ＥＰＳ８Ｌ１抗体を含む。
【００７７】
任意の標準的なイムノアッセイフォーマット（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＲＩＡアッセイなど）を使用して、ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質レベルを測定することができる。免疫組織化学法も、ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の検出および定量化のために活用することができる。このような技法に関する一般的な指針は、BancroftおよびStevens（Theory  and  Practice  of  Histological  Techniques、Churchill  Livingstone、１９８２年）およびAusubelら（Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９９８年）において見出すことができる。
【００７８】
ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質を定量化することを目的として、タンパク質（乳腺腫瘍試料など）を含む、対象の生物学的試料を使用することができる。ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の量は、試料中で評価することができ、必要に応じて、腫瘍試料中の隣接する非腫瘍組織内で評価することもでき、がんを有さない対象に由来する組織内で評価することもできる。試料中のＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の量は、がんを有さない対象に由来する細胞内で見出されるタンパク質のレベル、または他の対照（標準値または基準値など）と比較することができる。量の有意な増大または減少は、当技術分野で公知の統計学的方法を使用して評価することができる。
【００７９】
さらなる例では、ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質は、電気化学イムノアッセイ法を使用して、試料中で検出することができる。例えば、Yuら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１２８巻：１１１９９〜１１２０５頁、２００６年；Maniら、ACS  Nano、３巻：５８５〜５９４頁、２００９年；Malhotraら、Anal.  Chem.、８２巻：３１１８〜３１２３頁、２０１０年を参照されたい。この方法では、抗体（抗ＥＰＳ８Ｌ１抗体など）を、伝導性表面に結合させた、末端カルボキシル化シングルウォールカーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、マルチウォールカーボンナノチューブ（ＭＷＣＮＴ）、または金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）にコンジュゲートさせる。ＳＷＮＴ、ＭＷＣＮＴ、またはＡｕＮＰを試料と接触させると、試料中のＥＰＳ８Ｌ１タンパク質は、一次抗体に結合する。レドックス酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）に直接的または間接的にコンジュゲートさせた二次抗体は、一次抗体またはＥＰＳ８Ｌ１タンパク質に結合する（例えば、「サンドイッチ」アッセイでは）。シグナルは、酵素基質（例えば、酵素がＨＲＰである場合は、過酸化水素）を、センサーを浸漬させ、触媒性還元によりもたらされる電流を測定する溶液に添加することにより発生させる。
【００８０】
ＳＥＬＤＩなど、定量的分光法を使用して、試料（腫瘍組織、非がん性組織、およびがんを有さない対象に由来する組織など）中のＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の発現を解析することができる。一例では、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を使用して、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（商標）（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用することにより、タンパク質発現を検出する。当技術分野では、このような方法が周知である（例えば、米国特許第５，７１９，０６０号；米国特許第６，８９７，０７２号；および米国特許第６，８８１，５８６号を参照されたい）。ＳＥＬＤＩとは、解析物を、解析物の捕捉または脱離を増強する表面上のエネルギー流へと提示する脱離のための固相法である。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例は、開示される方法を例示するものである。本開示に照らして、当業者は、過度な実験なしに、開示される方法についての、これらの実施例および他の実施例の変化形が可能であることを認識するであろう。
【００８２】
（実施例１）
ＥＲＢＢ２陽性乳がん細胞株にわたる、ＥＲＢＢ２サブセット特異性を伴う、成長阻害性およびアポトーシス誘導性ＲＮＡｉ標的の同定
乳がん細胞のＨｅｒ２陽性（ＥｒｂＢ２陽性）亜群の成長および生存に不可欠な遺伝子を同定するために、セルスポットマイクロアレイ（ＣＳＭＡ）ＲＮＡｉプラットフォーム（Rantalaら、BMC  Genomics、１２巻：１６２頁（２０１１年）；参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、一連のｓｉＲＮＡのスクリーニングを実施した。同じ乳がん亜型内の腫瘍であれば、それらの成長（増殖および／または生存）のための分子的機構を共有すると仮定して、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  ｎｅｔｗｏｒｋによる、乳がんについての概要（参照により本明細書に組み込まれる、The  Cancer  Genome  Atlas  Network、Nature、４９０巻：６１〜７０頁、２０１２年）に従い、乳がんの臨床的Ｈｅｒ２陽性亜群において最も高頻度で増幅される遺伝子を含む特注のｓｉＲＮＡライブラリーを開発した。
【００８３】
それらの公知のゲノム亜型に基づき、合計６つの細胞株を、スクリーニング実験のために選択した。これらの６つの細胞株は、ＨＣＣ１５６９、ＢＴ４７４、２１ＮＴ、ＪＩＭＴ１、ＨＣＣ２０２、およびＨＣＣ１９５４であった。利用可能な場合は、各遺伝子について、単一の機能的に検証されたｓｉＲＮＡを選択し、それについてあらかじめ検証されたｓｉＲＮＡが利用可能でない各遺伝子については、２つのｓｉＲＮＡを選択した。非ターゲティング配列を伴う陰性対照のｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＳｔａｒ（登録商標）Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を、トランスフェクション陰性対照として使用した。ＣＳＭＡ上のトランスフェクションの７２時間後、切断型ＰＡＲＰの抗体ベースの検出、およびＥｄＵ組込みについての蛍光検出アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞成長およびＲＮＡｉによる遺伝子サイレンシングの結果としてのアポトーシスの誘導を評価した。全ての被験細胞株にわたり、それらの下方調節により、２標準偏差を超える（ｚスコア＜−２）増殖の平均値低減、または２標準偏差を超える（ｚスコア＞２）ｃＰＡＲＰシグナルの増大が引き起こされる場合に、ＲＮＡｉによりターゲティングされた遺伝子を、Ｈｅｒ２陽性亜群特異的成長促進遺伝子とみなした（図１Ａ）。配列ＡＡＣＡＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＴＴＡＧＣＡ（配列番号１；Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｓ＿ＥＰＳ８Ｌ１＿１４）をターゲティングするｓｉＲＮＡである、ＥＰＳ８Ｌ１のＲＮＡｉは、６つのＨｅｒ２陽性乳がん細胞株全てにわたり、最強の成長阻害性ｓｉＲＮＡの中から同定した（図１Ｂ）。
【００８４】
（実施例２）
乳がんにおけるＥＰＳ８Ｌ１のゲノム異常および発現パターンについての解析
ＥＰＳ８Ｌ１のゲノム異常ならびに臨床がん試料および乳がん細胞株にわたる発現パターンについての解析を、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ；Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのcbioportal.org/public-portalで利用可能）から公表されているデータセット、および補遺データ（Neveら、Cancer  Cell、１０巻、５１５〜５２７頁（２００６年）；参照により本明細書に組み込まれる）のそれぞれに基づき実施した。
【００８５】
図２Ａは、ＴＣＧＡデータの充実性腫瘍にわたる、ＥＰＳ８Ｌ１異常の頻度を示す。図２Ｂは、５１の個別の乳がん細胞株にわたる、中央値を中心とするＥＰＳ８Ｌ１の発現であって、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ（登録商標）プラットフォームを使用して解析され、既に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる、Staafら、２０１０年、J.  Clin.  Oncol.、２８巻：１８１３〜１８２０頁）通りに処理された発現を示す。細胞株は、ｂａｓａｌ  Ａ（赤、左）、ｂａｓａｌ  Ｂ（グレー、中央）、およびｌｕｍｉｎａｌ（青、右）亜群（Neveら）に群分けする。図２Ｃは、Neveらによる注釈データに基づき、臨床亜型：トリプルネガティブ（ＴＮ）、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２）、およびホルモン受容体陽性（ＨＲ）に群分けされた、図２Ｂの５１の細胞株内のＥＰＳ８Ｌ１についての発現を表示する。ヒト乳がんのモデル細胞株内のＥＰＳ８Ｌ１発現のこの層別化により、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体アルファ）発現状態に従い区分されるのであれ、ＥｒｂＢ２の増幅および／または過剰発現状態に従い区分されるのであれ、ＥＰＳ８Ｌ１が、ｌｕｍｉｎａｌ由来の細胞内で最も高度に発現することが示される。
【００８６】
（実施例３）
ＥＰＳ８Ｌ１発現のサイレンシングの、細胞成長および生存率に対する効果
ｓｉＲＮＡによる、ＥＰＳ８Ｌ１の細胞成長および生存率に対する効果についての検証実験を、生細胞イメージングにより実施した。ＥＰＳ８Ｌ１  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｓ＿ＥＰＳ８Ｌ１＿２およびＨｓ＿ＥＰＳ８Ｌ１＿１４）を、ＪＩＭＴ１乳がん細胞と接触させ、成長を測定した。細胞は、透明底９６ウェルプレート（ウェル１つ当たりの細胞１０，０００個）および１２ウェルプレート（ウェル１つ当たりの細胞２×１０５個）上で培養し、ｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、１７ｎＭのｓｉＲＮＡ構築物（Ｑｉａｇｅｎ）を、１：６００（ｖ／ｖ）の比でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞についての時系列イメージングは、２０倍の対物レンズ（Ｅｓｓｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用する、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）ＨＤ生細胞イメージング顕微鏡により実施した。画像は、２時間ごとに２日間にわたり収集した。細胞成長の尺度としてのウェルコンフルエンスについての比較解析により、細胞に、ＥＰＳ８Ｌ１  ｓｉＲＮＡであるＨｓ＿ＥＰＳ８Ｌ１＿１４をトランスフェクトする結果として、非ターゲティング対照と比較して８０％を超える成長阻害がもたらされるのに対し、ｓｉＲＮＡであるＨｓ＿ＥＰＳ８Ｌ１＿２は、非ターゲティングｓｉＲＮＡによるトランスフェクション対照と比較して１５％の成長阻害がもたらされることが示された（図３Ａ）。
【００８７】
ＥＰＳ８Ｌ１  ｓｉＲＮＡが、ＥＰＳ８Ｌ１タンパク質の発現を阻害することを確認するウェスタンブロットを、図３Ｂおよび図３Ｃに示す。全細胞溶解物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画し、ニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ）に転写した。５％のスキムミルクを使用して、フィルターを、非特異的結合に対してブロッキングした。膜は、抗体（ＥＰＳ８Ｌ１；１：１０００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；カタログ番号Ａｂ５８６８７）により、４℃で一晩にわたりプローブした。同じフィルターを、チューブリンに対する非特異的抗体（１：５０００、Ａｂｃａｍ）でプロービングすることにより、等量ローディングを確認した。シグナルは、フィルターを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体およびヤギ抗ウサギ抗体（１：１０００；Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートすることにより明らかにした。図３Ｂは、ＥＰＳ８Ｌ１特異的ｓｉＲＮＡによるＥＰＳ８Ｌ１のサイレンシングを示す。図３Ｃは、表示されるヒト乳がん細胞株内の、ＥＰＳ８Ｌ１特異的ｓｉＲＮＡによるＥＰＳ８Ｌ１サイレンシングを示す。ベータアクチンを、ローディング対照として使用した。
【００８８】
（実施例４）
臨床乳がん試料亜群内の高ＥＰＳ８Ｌ発現により、全生存の不良が予測される
公表供給源からプールされた、１８８１例の試料による乳腺腫瘍セットについての、遺伝子発現データおよび注釈データを含むデータセットを使用して、ＥＰＳ８Ｌ１発現の臨床的関連性を評価した。１８８１例の試料による乳腺腫瘍セットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａアレイを使用して解析された１１の公表データセット（表１）を含む。
【表１】
2017501679.tif 000002
【００８９】
ＥＰＳ８Ｌ１の遺伝子発現レベルの、アウトカムとの関連付けは、評価項目としての全生存（ＯＳ）および１０年間の打切りを使用して実施した。１８８１例の試料によるセット内の試料は、ＥＰＳ８Ｌ１発現レベル（ｌｏｇ２による発現）に基づく３つの分位区間：ＥＰＳ８Ｌ１＿ｌｏｗ（中央値である０と比べた、−５．２０４〜−０．２９５の範囲の発現）；ＥＰＳ８Ｌ１＿ｍｅｄｉｕｍ（中央値である０と比べた、−０．２９５〜０．４７２の発現）；およびＥＰＳ８Ｌ１＿ｈｉｇｈ（中央値である０と比べた、０．４７２〜３．７０７の発現）に層別化した後、亜群内でカプラン−マイヤー生存解析（参照により本明細書に組み込まれる、Ringnerら、PLoS  One、６巻：ｅ１７９１１頁、２０１１年）を行った。ログランクＰ値は、−ｌｏｇ１０（Ｐ値）として示す。図４Ａ〜４Ｄは、ＥＰＳ８Ｌ１発現により、ＥＰＳ８Ｌ１＿ｈｉｇｈ発現を伴う全ての腫瘍内の全生存が予測され、それらの腫瘍が、ＥＲ陽性またはＥＲ陰性の場合であれ、そうでない場合であれ、ＨＥＲ２陽性腫瘍内の全生存が特に予測されることを示す（図４Ｂ〜４Ｄ）。
【００９０】
（実施例５）
ゲノムＤＮＡ内の高ＥＰＳ８Ｌ１コピー数により、乳がん患者における全生存の不良が予測される
１７８例の原発性乳がん症例に由来するＥＰＳ８Ｌ１についてのコピー数変化を、Ｈｕ−２４４Ａ  ＣＧＨマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から抽出した。腫瘍は、Ｏｓｌｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｕｌｌｅｖａｌ、Ｎｏｒｗａｙにおいて、１９９０年〜１９９４年にわたり、１２〜１６年間にわたる観察期間により、逐次的に回収された、２１２例の原発性乳がん症例のコホート（Langerod  Aら、２００９年、Breast  Cancer  Res.、９巻（３号）：Ｒ３０頁；参照により本明細書に組み込まれる）の一部である。試料は、標識前の増幅ステップを伴わずに、標準的プロトコール（Barrett  MTら、２００４年、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、１０１巻（５１号）：１７７６５〜１７７７０頁；参照により本明細書に組み込まれる）によりプロファイリングした。スキャンされたマイクロアレイ画像を読み取り、線形正規化を含む、ａＣＧＨ前処理のためのプロトコール（ＣＧＨｖ４＿９５＿Ｆｅｂ０７およびＣＧＨ−ｖ４  ９１  ２）を伴う、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（登録商標）ｖ９．５（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により解析した。データは、Ｋ  ｍｉｎ＝５およびγ＝２５の設定で、ＰＣＦ（Ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｆｉｔ）アルゴリズムを使用してセグメント化した。異常は、閾値：０．３；獲得＞０．３および喪失＜−０．３（第１９染色体の遺伝子シグナルと比較したｌｏｇ２スケール）によりスコア付けした。ＥＰＳ８Ｌ１のコピー数変化と生存との統計学的関連付けは、ＳＰＳＳ  １６．０（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）により実施した。ＦＩＳＨを使用してＥｒｂ  Ｂ２の増幅を規定するためのＡＳＣＯガイドライン（２．２を超えるＥｒｂＢ２遺伝子シグナルの、第１７染色体シグナルに対する比；Wolffら、Arch.  Pathol.  Lab.  Med.、１３１巻：１８〜４３頁、２００７年）を使用して、ＥｒｂＢ２およびＥＰＳ８Ｌ１が、コピー数の獲得＞０．９（ｌｏｇ２スケール）で増幅される腫瘍を規定した。
【００９１】
図５ＡおよびＢは、ＥＰＳ８Ｌ１のコピー数に基づく、全生存時間についてのカプラン−マイヤー解析を示す２つのプロットのセットである。図５Ａでは、ＤＮＡの獲得と増幅とを個別とするのに対し、図５Ｂでは、ＤＮＡの獲得と増幅とを組み合わせた。ＥＰＳ８Ｌ１の獲得を伴う対象の生存時間は、短縮され（図５ＡおよびＢ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）の増幅およびＥＰＳ８Ｌ１の喪失の両方を伴う対象の累積生存時間は、とりわけ不良であった（図５Ｂ）。興味深いことに、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）の獲得およびＥＰＳ８Ｌ１の喪失を伴う対象の生存は、特に良好であり（図５ＡおよびＢ）、良性腫瘍または進行の非常に遅い腫瘍を有する可能性さえあった。これらの結果は、ＥＰＳ８Ｌ１  ＤＮＡコピー数の変化の検出の、単一のマーカーとしての、またはＥｒｂＢ２コピー数状態の検出と組み合わせた、臨床予後のための適用可能性を示す。
【００９２】
本開示の原理が適用されうる多くの可能な実施形態を考慮して、例示される実施形態は、単なる例であって、本発明の範囲を限定するものとしては考えるべきではないことを認識されたい。そうではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神の中に収まる全てのものを、本発明として主張する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2017501679.tif 000009
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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