(57)【要約】  本発明は、一般に、Ｔ細胞バランス、例えば、Ｔｈ１７細胞分化、維持および／または機能をモジュレートし、制御し、またはそうでなければそれに影響を与える調節ネットワークを同定するための組成物および方法、ならびに種々の治療および／または診断指標においてＴ細胞バランスをモジュレートし、制御し、またはそうでなければそれに影響を与える調節ネットワークを利用するための組成物および方法に関する。本発明はまた、一般に、種々の治療および／または診断指標においてＴ細胞バランスをモジュレートし、制御し、またはそうでなければそれに影響を与える標的遺伝子および／または標的遺伝子産物の同定および利用に関する。
2017508457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞バランスが関与する免疫応答を診断し、予後診断および／または病期分類する方法であって、表１または表２の遺伝子から選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の第１の発現、活性および／または機能のレベルを検出すること、ならびに前記検出レベルをシグネチャー遺伝子または遺伝子産物の発現、活性および／または機能の対照レベルと比較することを含み、前記検出レベルおよび前記対照レベルの差が、対象における免疫応答の存在を示す、方法。
【請求項２】
対象における免疫応答をモニタリングする方法であって、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを、第１の時点において検出すること、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを、第２の時点において検出すること、ならびに発現、活性および／または機能の前記第１の検出レベルと、発現、活性および／または機能の前記第２の検出レベルとを比較することを含み、前記第１および第２の検出レベルの変化が、前記対象における前記免疫応答の変化を示す、方法。
【請求項３】
免疫応答のリスクがあり、またはそれに罹患している患者集団を同定する方法であって、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを、前記患者集団において検出すること、ならびに免疫応答のリスクがなく、またはそれに罹患していない患者集団における、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の前記レベルを比較することを含み、前記患者集団における表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の前記レベルの差が、免疫応答のリスクがあり、またはそれに罹患している前記患者集団を同定する、方法。
【請求項４】
異常な免疫応答のための治療または治療法を受ける対象をモニタリングして患者が前記治療または治療法に応答性であるか否かを決定する方法であって、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを前記治療または治療法の非存在下で検出すること、ならびに前記治療または治療法の存在下の、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の前記レベルを比較することを含み、前記治療または治療法の存在下の、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の前記レベルの差が、前記患者が前記治療または治療法に応答性であるか否かを示す、方法。
【請求項５】
前記免疫応答が、自己免疫応答または炎症応答である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記炎症応答が、自己免疫応答、感染性疾患および／または病原体関連障害に伴う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シグネチャー遺伝子が、Ｔｈ１７関連遺伝子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療または治療法が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１細胞、またはＴｒｅｇおよびＴｈ１細胞の組合せに向かう分化を誘導するための十分な量のＧＰＲ６５についてのアンタゴニストである、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記治療または治療法が、Ｔｈ１７細胞に向かうＴ細胞分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５の発現を向上または増加させるアゴニストである、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療または治療法が、ＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子について特異的である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療または治療法が、Ｔｈ１７細胞を病原性シグネチャーから非病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子のアンタゴニストである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療または治療法が、Ｔｈ１７細胞を非病原性シグネチャーから病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子の発現を向上または増加させるアゴニストである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞モジュレート剤が、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、分化Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の組合せ、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の組合せ、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の組合せ、またはナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の組合せである、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ細胞バランスをモジュレートする方法であって、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団を、Ｔ細胞モジュレート剤の非存在下の前記Ｔ細胞またはＴ細胞の集団の分化、維持および／または機能と比較してＴｈ１７細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および他のＴ細胞サブセット間のバランスを変更することにより、前記Ｔ細胞またはＴ細胞の集団の分化、維持および／または機能を改変するために十分な量の前記Ｔ細胞モジュレート剤と接触させることを含む、方法。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞モジュレート剤が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１細胞、またはＴｒｅｇおよびＴｈ１細胞の組合せに向かう分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５についてのアンタゴニストである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞モジュレート剤が、Ｔｈ１７細胞に向かうＴ細胞分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５の発現を向上または増加させるアゴニストである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞モジュレート剤が、ＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子について特異的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞モジュレート剤が、Ｔｈ１７細胞を病原性シグネチャーから非病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子のアンタゴニストである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞モジュレート剤が、Ｔｈ１７細胞を非病原性シグネチャーから病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子の発現を向上または増加させるアゴニストである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞モジュレート剤が、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、分化Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の組合せ、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の組合せ、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の組合せ、またはナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の組合せである、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞集団におけるＴｈ１７分化を向上させ、インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、ＳＴＡＴ３、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）およびＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（ＲＯＲＣ）から選択される１つ以上のＴｈ１７関連サイトカインもしくは１つ以上のＴｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を増加させ、ならびに／またはＦＯＸＰ３、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ４およびＴＢＸ２１から選択される１つ以上の非Ｔｈ１７関連サイトカインもしくは非Ｔｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を減少させる方法であって、Ｔ細胞を、ＣＤ５Ｌ、ＤＥＣ１、ＰＬＺＰ、ＴＣＦ４またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を向上させる薬剤と接触させることを含む、方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、ＣＤ５Ｌ、ＤＥＣ１、ＰＬＺＰ、またはＴＣＦ４の少なくとも１つの発現、活性および／または機能を向上させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤が、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアゴニスト、ペプチドアゴニスト、核酸アゴニスト、核酸リガンド、または小分子アゴニストである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が、抗体である、請求項２１または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
患者における異常な免疫応答の治療または創薬またはその治療物の配合もしくは調製のための、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１細胞、またはＴｒｅｇおよびＴｈ１細胞の組合せに向かう分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５についてのアンタゴニストの使用。
【請求項３０】
患者における異常な免疫応答の治療または創薬またはその治療物の配合もしくは調製のための、Ｔｈ１７細胞に向かうＴ細胞分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５の発現を向上または増加させるアゴニストの使用。
【請求項３１】
患者における異常な免疫応答の治療または創薬またはその治療物の配合もしくは調製のための、Ｔｈ１７細胞を病原性シグネチャーから非病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子のアンタゴニストの使用。
【請求項３２】
患者における異常な免疫応答の治療または創薬またはその治療物の配合もしくは調製のための、Ｔｈ１７細胞を非病原性シグネチャーから病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子の発現を向上または増加させるアゴニストの使用。
【請求項３３】
患者における異常な免疫応答を治療するためのＴ細胞モジュレート剤の使用。
【請求項３４】
表１または表２の遺伝子から選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物を発現する細胞の集団または組織中のＴ細胞バランスが関与する免疫応答が関与する疾患または病態の治療のための創薬の方法であって、
（ａ）前記疾患または病態の前記治療における効力についてスクリーニングすべき化合物または複数の化合物を提供するステップ；
（ｂ）前記化合物または複数の化合物を、前記細胞の集団または組織と接触させるステップ；
（ｃ）表１または表２の遺伝子から選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の第１の発現、活性および／または機能のレベルを検出するステップ；
（ｄ）前記検出レベルを、表１または表２の遺伝子から選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物または遺伝子産物の発現、活性および／または機能の対照レベルと比較するステップ；ならびに
（ｅ）前記検出レベルと前記対照レベルとの間の差異を評価して前記化合物または複数の化合物により誘発される前記免疫応答を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法または使用のいずれか１つを含む、治療方法または創薬方法または治療物を配合もしくは調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願および参照による組み込み
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１４年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／９４５，６４１号明細書からの優先権を主張する。国際公開第２０１２／０４８２６５号パンフレット；国際公開第２０１４／１４５６３１号パンフレット；国際公開第２０１４／１３４３５１号パンフレットが参照される。上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。出願引用文献、本明細書引用文献、本明細書に参照または引用される全ての文献、および参照により本明細書に組み込まれると示される全ての文献は、それぞれの個々の文献が、引用または参照される場合および箇所において具体的かつ個別に参照により組み込まれることが省略されずに示されるような程度で参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供
本発明は、以下の助成金のもと政府支援により行われた：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＰｉｏｎｅｅｒ  Ｇｒａｎｔ  ＤＰ１ＯＤ００３９５８−０１；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＰｉｏｎｅｅｒ  Ｇｒａｎｔ  ＤＰ１ＯＤ００３９５８−０３；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＣｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇｒａｎｔ  １Ｐ５０ＨＧ００６１９３−０１；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより授与されたＧｒａｎｔ  １Ｐ０１ＨＧ００５０６２−０１；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＧｒａｎｔ  ＤＰ１ＯＤ００３８９３、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＧｒａｎｔ  ＮＳ３０８４３、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＧｒａｎｔ  ＮＳ０４５９３７、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＧｒａｎｔ  ＡＩ  ７３７４８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＧｒａｎｔ  ＡＩ４５７５７、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＧｒａｎｔ  Ｐ０１ＡＩ０５６２９９およびＮａｔｉｏｎａｌ  ＭＳ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにより授与されたＧｒａｎｔ  ＲＧ２５７１。政府は一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、一般に、Ｔ細胞バランス、例えば、Ｔｈ１７細胞分化、維持および／または機能をモジュレートし、制御し、またはそうでなければそれに影響を与える調節ネットワークを同定するための組成物および方法、ならびに種々の治療および／または診断指標においてＴ細胞バランスをモジュレートし、制御し、またはそうでなければそれに影響を与える調節ネットワークを利用するための組成物および方法に関する。本発明はまた、一般に、種々の治療および／または診断指標においてＴ細胞バランスをモジュレートし、制御し、またはそうでなければそれに影響を与える標的遺伝子および／または標的遺伝子産物の同定および利用に関する。
【背景技術】
【０００４】
これらの重要性にかかわらず、Ｔ細胞のバランス、例として、ナイーブＴ細胞の分化を制御する分子回路は、大部分が不明のままである。哺乳動物細胞における調節ネットワークを再構築した近年の研究は、短期応答にフォーカスし、初代Ｔ細胞に容易に適用することができない摂動ベースアプローチに依存した。したがって、Ｔ細胞バランス、例として、Ｔｈ１７細胞分化、維持および機能をモジュレートし、制御し、またはそうでなければそれに影響を与える動的調節ネットワークのより良好な理解、ならびに種々の治療および診断方法においてこのネットワークを利用するための手段が必要とされている。本明細書における引用は、引用されるいかなるものも関連または先行技術であることを認めるものではなく、それが引用されるいかなるものの内容または日付に関するいかなる容認も構成するものでもない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，５５７，７４６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５４８，２５６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９８９，４３１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、多くの有用性を有する。本発明は、特定の治療、治療法、化合物、薬物または薬物もしくは化合物の組合せに応答し得、もしくは応答し得ない、または応答している患者または対象のための創薬および検出の方法およびそれからの組成物に関し、かつそれを含み；したがって、いずれの薬物または薬物の組合せが病態または疾患または感染または感染状態に関する特定の治療または治療法を提供し得るのかの解明、ならびに患者集団を選択する（例えば、応答し得、または応答し得ない、または応答している者を検出することによる）ための方法および組成物、または個別治療（創薬と、特定の治療、治療法、化合物、薬物、または薬物もしくは化合物の組合せに応答し得ない、または応答している患者または対象の検出との組合せ）を含む方法および組成物に関し、かつそれを含む（例えば、個体に関して、応答または応答しないこと、応答するもしくはしない潜在性を検出し、投与すべき特定の治療、治療法、化合物、薬物もしくは薬物もしくは化合物の組合せを調整し、または検出から示される治療、治療法、化合物、薬物もしくは薬物もしくは化合物の組合せを投与することによる）。
【０００７】
本発明は、Ｔ細胞バランス、例えば、Ｔｈ１７細胞分化、維持および機能をモジュレートするための組成物および方法、ならびに種々の治療法および診断方法におけるこのネットワークを活用する手段を提供する。本明細書において使用される用語「モジュレートする」は、１つ以上の遺伝子の発現の上方調節、もしくはそうでなければ増加、１つ以上の遺伝子の発現の下方調節、もしくはそうでなければ減少、１つ以上の遺伝子産物の発現、活性および／もしくは機能の阻害もしくはそうでなければ減少、ならびに／または１つ以上の遺伝子産物の発現、活性および／もしくは機能の向上もしくはそうでなければ増加を含む。
本発明において使用される用語「Ｔ細胞バランスをモジュレートする」は、種々のＴ細胞関連機能および／または機能のいずれかのモジュレーション、例として、非限定的な例として、Ｔ細胞分化を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；例えば、Ｔ細胞の寿命にわたりＴ細胞維持を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；Ｔ細胞機能を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）分化を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；例えば、Ｔｈ細胞の寿命にわたりＴｈ細胞維持を調節するネットワークに影響を与える制御もしくはそうでなければ影響；Ｔｈ細胞機能を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；Ｔｈ１７細胞分化を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；例えば、Ｔｈ１７細胞の寿命にわたりＴｈ１７細胞維持を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；Ｔｈ１７細胞機能を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）分化を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；例えば、Ｔｒｅｇ細胞の寿命にわたりＴｒｅｇ細胞維持を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；Ｔｒｅｇ細胞機能を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；他のＣＤ４＋Ｔ細胞分化を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；他のＣＤ４＋Ｔ細胞維持を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；他のＣＤ４＋Ｔ細胞機能を調節するネットワークの制御もしくはそうでなければ影響；Ｔ細胞の比の操作もしくはそうでなければ影響、例えば、Ｔｈ１７細胞と、他のＴ細胞タイプ、例えば、Ｔｒｅｇもしくは他のＣＤ４＋Ｔ細胞との比の操作もしくはそうでなければ影響など；異なるタイプのＴｈ１７細胞、例えば、病原性Ｔｈ１７細胞および非病原性Ｔｈ１７細胞などの比の操作もしくはそうでなければ影響；Ｔ細胞の少なくとも１つの機能もしくは生物学的活性の操作もしくはそうでなければ影響；Ｔｈ細胞の少なくとも１つの機能もしくは生物学的活性の操作もしくはそうでなければ影響；Ｔｒｅｇ細胞の少なくとも１つの機能もしくは生物学的活性の操作もしくはそうでなければ影響；Ｔｈ１７細胞の少なくとも１つの機能または生物学的活性の操作もしくはそうでなければ影響；および／または別のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも１つの機能もしくは生物学的活性の操作もしくはそうでなければ影響を含む。
【０００８】
本発明は、Ｔ細胞バランスをモジュレートするＴ細胞モジュレート剤を提供する。例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞タイプのレベルおよび／もしくはその間の、例えば、Ｔｈ１７と他のＴ細胞タイプ、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）との間のバランス、ならびに／またはＴｈ１７活性および炎症潜在性を調節し、それに影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす方法を提供する。本明細書において使用される用語、例えば、「Ｔｈ１７細胞」および／または「Ｔｈ１７表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）、およびインターロイキン１７Ａ／Ｆヘテロダイマー（ＩＬ１７−ＡＦ）からなる群から選択される１つ以上のサイトカインを発現する分化Ｔヘルパー細胞を指す。本明細書において使用される用語、例えば、「Ｔｈ１細胞」および／または「Ｔｈ１表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を発現する分化Ｔヘルパー細胞を指す。本明細書において使用される用語、例えば、「Ｔｈ２細胞」および／または「Ｔｈ２表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される１つ以上のサイトカインを発現する分化Ｔヘルパー細胞を指す。本明細書において使用される用語、例えば、「Ｔｒｅｇ細胞」および／または「Ｔｒｅｇ表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、Ｆｏｘｐ３を発現する分化Ｔ細胞を指す。
【０００９】
例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用してＴｈ１７表現型のレベルおよび／もしくはその間のバランス、ならびに／またはＴｈ１７活性および炎症潜在性を調節し、それに影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす方法を提供する。好適なＴ細胞モジュレート剤としては、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が挙げられる。
【００１０】
例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴモジュレート剤を使用してＴｈ１７細胞タイプのレベルおよび／またはその間、例えば、病原性および非病原性Ｔｈ１７細胞間のバランスの調節し、それに影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす方法を提供する。例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用して病原性および非病原性Ｔｈ１７活性のレベルおよび／またはその間のバランスを調節し、それに影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす方法を提供する。
【００１１】
例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞の集団の、例えば、規定の病原性区別の有無にかかわらずにＴｈ１７細胞に向かう分化、または規定の病原性区別の有無にかかわらずにＴｈ１７から離れる分化に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす方法を提供する。
【００１２】
例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞の集団の、例えば、非Ｔｈ１７Ｔ細胞サブセットに向かう分化、または非Ｔｈ１７細胞サブセットから離れる分化に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす方法を提供する。例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞可塑性を誘導し、例えば、Ｔｈ１７細胞を異なるサブタイプに、または新たな状態に変換する方法を提供する。
【００１３】
例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞可塑性を誘導し、例えば、Ｔｈ１７細胞を異なるサブタイプに、または新たな状態に変換する方法を提供する。
【００１４】
例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用して上記の任意の組合せを達成する方法を提供する。
【００１５】
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、および分化Ｔ細胞の混合物である。
【００１６】
Ｔ細胞モジュレート剤を使用し、Ｔｈ１７関連摂動に対して応答性の遺伝子として同定されている１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現をモジュレートする。これらの標的遺伝子は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、分化Ｔ細胞および／またはそれらの組合せを、Ｔ細胞モジュレート剤と接触させ、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現に対するその効果（存在する場合）をモニタリングして同定する。一部の実施形態において、１つ以上のシグネチャー遺伝子は、本明細書の表１または表２に列記されるものから選択する。
【００１７】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書の表３に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連サイトカインまたは受容体分子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書の表４に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連転写調節因子である。
【００１８】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書の表５に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連転写調節因子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書の表６に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連受容体分子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書の表７に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連キナーゼである。一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書の表８に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連シグナリング分子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書の表９に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連受容体分子である。
【００１９】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、Ｔｈ１７分化の誘導に関与する１つ以上の標的遺伝子、例えば、ＩＲＦ１、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＩＲＦ７、ＳＴＡＴ１、ＺＦＰ２８１、ＩＦＩ３５、ＲＥＬ、ＴＢＸ２１、ＦＬＩ１、ＢＡＴＦ、ＩＲＦ４など、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表５に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＡＥＳ、ＡＨＲ、ＡＲＩＤ５Ａ、ＢＡＴＦ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ４、ＣＨＤ７、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＢ１、Ｅ２Ｆ４、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＬＬ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＥＺＨ１、ＦＬＩ１、ＦＯＸＯ１、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡＤ２Ｂ、ＨＩＦ１Ａ、ＩＤ２、ＩＦＩ３５、ＩＫＺＦ４、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＵＮ、ＬＥＦ１、ＬＲＲＦＩＰ１、ＭＡＸ、ＮＣＯＡ３、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＬ３、ＮＦＫＢ１、ＮＭＩ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＭＬ、ＰＲＤＭ１、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＵＮＸ１、ＳＡＰ１８、ＳＡＴＢ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＰ１００、ＳＰ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＴＦＥＢ、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ２４、ａｎｄ／ｏｒ  ＺＦＰ１６１、またはそれらの任意の組合せである。
【００２０】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、Ｔｈ１７表現型の発生およびＴｈ１７Ｔ細胞の増幅に関与する１つ以上の標的遺伝子、例えば、ＩＲＦ８、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＺＰＦ２９８１、ＣＨＤ７、ＴＢＸ２１、ＦＬＩ１、ＳＡＴＢ１、ＲＵＮＸ１、ＢＡＴＦ、ＲＯＲＣ、ＳＰ４など、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表５に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＡＥＳ、ＡＨＲ、ＡＲＩＤ３Ａ、ＡＲＩＤ５Ａ、ＡＲＮＴＬ、ＡＳＸＬ１、ＢＡＴＦ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ４、ＣＤＣ５Ｌ、ＣＥＢＰＢ、ＣＨＤ７、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＭ、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＬＫ３、ＥＬＬ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＥＺＨ１、ＦＬＩ１、ＦＯＳＬ２、ＦＯＸＪ２、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＭＧＢ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＦＩ３５、ＩＫＺＦ４、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ６、ＫＬＦ９、ＬＥＦ１、ＬＲＲＦＩＰ１、ＭＡＦＦ、ＭＡＸ、ＭＡＺ、ＭＩＮＡ、ＭＴＡ３、ＭＹＣ、ＭＹＳＴ４、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ３、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＬ３、ＮＦＫＢ１、ＮＭＩ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＲＤＭ１、ＲＡＲＡ、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＡ、ＲＯＲＡ、ＲＵＮＸ１、ＳＡＰ１８、ＳＡＴＢ１、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＯＸ、ＳＰ１、ＳＰ４、ＳＳ１８、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ２１、ＴＦＥＢ、ＴＬＥ１、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＰＳ１、ＶＡＶ１、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、ＺＦＰ１６１、ＺＦＰ６２、ＺＮＦ２３８、ＺＮＦ２８１、ａｎｄ／ｏｒ  ＺＮＦ７０３、またはそれらの任意の組合せである。
【００２１】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、Ｔｈ１７細胞の安定化に関与し、および／またはＴｈ１７関連インターロイキン２３（ＩＬ−２３）シグナリングをモジュレートする１つ以上の標的遺伝子、例えば、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＪＵＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＣＨＤ７、ＳＡＴＢ１、ＲＵＮＸ１、ＢＡＴＦ、ＲＯＲＣ、ＳＰ４  ＩＲＦ４など、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表５に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＡＥＳ、ＡＨＲ、ＡＲＩＤ３Ａ、ＡＲＩＤ５Ａ、ＡＲＮＴＬ、ＡＳＸＬ１、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＢＡＴＦ、ＢＡＴＦ３、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、Ｃ２１ＯＲＦ６６、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ４、ＣＤＣ５Ｌ、ＣＤＹＬ、ＣＥＢＰＢ、ＣＨＤ７、ＣＨＭＰ１Ｂ、ＣＩＣ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＭ、ＣＳＤＡ、ＤＤＩＴ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＬＫ３、ＥＬＬ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＺＨ１、ＦＬＩ１、ＦＯＳＬ２、ＦＯＸＪ２、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡＤ２Ｂ、ＨＣＬＳ１、ＨＩＦ１Ａ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＦＩ３５、ＩＫＺＦ４、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＪＡＲＩＤ２、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ９、ＬＡＳＳ４、ＬＥＦ１、ＬＲＲＦＩＰ１、ＭＡＦＦ、ＭＡＸ、ＭＥＮ１、ＭＩＮＡ、ＭＴＡ３、ＭＸＩ１、ＭＹＣ、ＭＹＳＴ４、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ３、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＬ３、ＮＦＫＢ１、ＮＭＩ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＨＦ１３、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＲＤＭ１、ＲＡＲＡ、ＲＢＰＪ、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＮＦ１１、ＲＯＲＡ、ＲＯＲＣ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＳＡＰ１８、ＳＡＰ３０、ＳＡＴＢ１、ＳＥＲＴＡＤ１、ＳＩＲＴ２、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＯＸ、ＳＰ１、ＳＰ１００、ＳＰ４、ＳＳ１８、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ２１、ＴＦＥＢ、ＴＧＩＦ１、ＴＬＥ１、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＰＳ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｂ、ＶＡＶ１、ＶＡＸ２、ＸＢＰ１、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、ＺＦＰ１６１、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＮＦ２３８、ＺＮＦ２８１、ＺＮＦ７０３、ＺＮＲＦ１、ａｎｄ／ｏｒ  ＺＮＲＦ２、またはそれらの任意の組合せである。
【００２２】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表６に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＦＡＳ、ＣＣＲ５、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ２ＲＡ、ＭＹＤ８８、ＣＸＣＲ５、ＰＶＲ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、またはそれらの任意の組合せである。
【００２３】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表６に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＧＡ３、ＩＬ１Ｒ１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＡＣＶＲ２Ａ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１７ＲＡ、ＣＣＲ８、ＤＤＲ１、ＰＲＯＣＲ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ２、ＭＹＤ８８、ＰＴＰＲＪ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＣＸＣＲ３、ＩＬ１ＲＮ、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ２ＲＢ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＣＸＣＲ４、ＫＬＲＤ１、ＩＲＡＫ１ＢＰ１、ＰＶＲ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１８Ｒ１、ＴＲＡＦ３、またはそれらの任意の組合せである。
【００２４】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表６に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＧＡ３、ＩＬ１Ｒ１、ＦＡＳ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＡＣＶＲ２Ａ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１７ＲＡ、ＤＤＲ１、ＰＲＯＣＲ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ２、ＭＹＤ８８、ＢＭＰＲ１Ａ、ＰＴＰＲＪ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＣＸＣＲ３、ＩＬ１ＲＮ、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ２ＲＢ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＣＸＣＲ４、ＫＬＲＤ１、ＩＲＡＫ１ＢＰ１、ＰＶＲ、ＩＬ１５ＲＡ、ＴＬＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１８Ｒ１、ＴＲＡＦ３、ＩＦＮＧＲ１、ＰＬＡＵＲ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、またはそれらの任意の組合せである。
【００２５】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表７に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＤＵＳＰ２２、ＨＫ２、ＲＩＰＫ１、ＲＮＡＳＥＬ、ＴＥＣ、ＭＡＰ３Ｋ８、ＳＧＫ１、ＰＲＫＣＱ、ＤＵＳＰ１６、ＢＭＰ２Ｋ、ＰＩＭ２、またはそれらの任意の組合せである。
【００２６】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表７に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＰＳＴＰＩＰ１、ＰＴＰＮ１、ＡＣＰ５、ＴＸＫ、ＲＩＰＫ３、ＰＴＰＲＦ、ＮＥＫ４、ＰＰＭＥ１、ＰＨＡＣＴＲ２、ＨＫ２、ＧＭＦＧ、ＤＡＰＰ１、ＴＥＣ、ＧＭＦＢ、ＰＩＭ１、ＮＥＫ６、ＡＣＶＲ２Ａ、ＦＥＳ、ＣＤＫ６、ＺＡＫ、ＤＵＳＰ１４、ＳＧＫ１、ＪＡＫ３、ＵＬＫ２、ＰＴＰＲＪ、ＳＰＨＫ１、ＴＮＫ２、ＰＣＴＫ１、ＭＡＰ４Ｋ３、ＴＧＦＢＲ１、ＨＫ１、ＤＤＲ１、ＢＭＰ２Ｋ、ＤＵＳＰ１０、ＡＬＰＫ２、またはそれらの任意の組合せである。
【００２７】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表７に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＰＴＰＬＡ、ＰＳＴＰＩＰ１、ＴＫ１、ＰＴＥＮ、ＢＰＧＭ、ＤＣＫ、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＮ１８、ＭＫＮＫ２、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＲＥ、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＰＬＫ２、ＤＵＳＰ６、ＣＤＣ２５Ｂ、ＳＬＫ、ＭＡＰ３Ｋ５、ＢＭＰＲ１Ａ、ＡＣＰ５、ＴＸＫ、ＲＩＰＫ３、ＰＰＰ３ＣＡ、ＰＴＰＲＦ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＮＥＫ４、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＰＰＭＥ１、ＳＲＰＫ２、ＤＵＳＰ２、ＰＨＡＣＴＲ２、ＤＣＬＫ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＲＩＰＫ１、ＧＫ、ＲＮＡＳＥＬ、ＧＭＦＧ、ＳＴＫ４、ＨＩＮＴ３、ＤＡＰＰ１、ＴＥＣ、ＧＭＦＢ、ＰＴＰＮ６、ＲＩＰＫ２、ＰＩＭ１、ＮＥＫ６、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＵＲＫＢ、ＦＥＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＤＫ６、ＺＡＫ、ＶＲＫ２、ＭＡＰ３Ｋ８、ＤＵＳＰ１４、ＳＧＫ１、ＰＲＫＣＱ、ＪＡＫ３、ＵＬＫ２、ＨＩＰＫ２、ＰＴＰＲＪ、ＩＮＰＰ１、ＴＮＫ２、ＰＣＴＫ１、ＤＵＳＰ１、ＮＵＤＴ４、ＴＧＦＢＲ１、ＰＴＰ４Ａ１、ＨＫ１、ＤＵＳＰ１６、ＡＮＰ３２Ａ、ＤＤＲ１、ＩＴＫ、ＷＮＫ１、ＮＡＧＫ、ＳＴＫ３８、ＢＭＰ２Ｋ、ＢＵＢ１、ＡＡＫ１、ＳＩＫ１、ＤＵＳＰ１０、ＰＲＫＣＡ、ＰＩＭ２、ＳＴＫ１７Ｂ、ＴＫ２、ＳＴＫ３９、ＡＬＰＫ２、ＭＳＴ４、ＰＨＬＰＰ１、またはそれらの任意の組合せである。
【００２８】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表８に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＨＫ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＵＴ、ＤＵＳＰ１、ＮＡＤＫ、ＬＩＭＫ２、ＤＵＳＰ１１、ＴＡＯＫ３、ＰＲＰＳ１、ＰＰＰ２Ｒ４、ＭＫＮＫ２、ＳＧＫ１、ＢＰＧＭ、ＴＥＣ、ＭＡＰＫ６、ＰＴＰ４Ａ２、ＰＲＰＦ４Ｂ、ＡＣＰ１、ＣＣＲＮ４Ｌ、またはそれらの任意の組合せである。
【００２９】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表８に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＨＫ２、ＺＡＰ７０、ＮＥＫ６、ＤＵＳＰ１４、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＩＴＫ、ＤＵＴ、ＰＰＰ１Ｒ１１、ＤＵＳＰ１、ＰＭＶＫ、ＴＫ１、ＴＡＯＫ３、ＧＭＦＧ、ＰＲＰＳ１、ＳＧＫ１、ＴＸＫ、ＷＮＫ１、ＤＵＳＰ１９、ＴＥＣ、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＰＫＭ２、ＰＲＰＦ４Ｂ、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＢ、ＵＬＫ２、ＰＬＫ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＰＬＫ２、またはそれらの任意の組合せである。
【００３０】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表８に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＺＡＰ７０、ＰＦＫＰ、ＮＥＫ６、ＤＵＳＰ１４、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＩＮＰＰ５Ｂ、ＩＴＫ、ＰＦＫＬ、ＰＧＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＵＴ、ＰＰＰ１Ｒ１１、ＤＵＳＰ１、ＰＭＶＫ、ＰＴＰＮ２２、ＰＳＰＨ、ＴＫ１、ＰＧＡＭ１、ＬＩＭＫ２、ＣＬＫ１、ＤＵＳＰ１１、ＴＡＯＫ３、ＲＩＯＫ２、ＧＭＦＧ、ＵＣＫＬ１、ＰＲＰＳ１、ＰＰＰ２Ｒ４、ＭＫＮＫ２、ＤＧＫＡ、ＳＧＫ１、ＴＸＫ、ＷＮＫ１、ＤＵＳＰ１９、ＣＨＰ、ＢＰＧＭ、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＴＥＣ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ６、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＰＴＰ４Ａ２、ＰＫＭ２、ＰＲＰＦ４Ｂ、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＢ、ＡＣＰ１、ＵＬＫ２、ＣＣＲＮ４Ｌ、ＰＲＫＣＨ、ＰＬＫ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＰＬＫ２、またはそれらの任意の組合せである。
【００３１】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表９に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＣＤ２００、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ２４、ＣＣＮＤ２、ＡＤＡＭ１７、ＢＳＧ、ＩＴＧＡＬ、ＦＡＳ、ＧＰＲ６５、ＳＩＧＭＡＲ１、ＣＡＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＳＲＰＲＢ、ＴＲＰＶ２、ＩＬ２ＲＡ、ＫＤＥＬＲ２、ＴＮＦＲＳＦ９、またはそれらの任意の組合せである。
【００３２】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表９に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２００、ＣＤ２４、ＣＤ５Ｌ、ＣＤ９、ＩＬ２ＲＢ、ＣＤ５３、ＣＤ７４、ＣＡＳＴ、ＣＣＲ６、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＡＶ、ＦＡＳ、ＩＬ４Ｒ、ＰＲＯＣＲ、ＧＰＲ６５、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＯＲＡ、ＩＬ１ＲＮ、ＲＯＲＣ、ＣＹＳＬＴＲ１、ＰＮＲＣ２、ＬＯＣ３９０２４３、ＡＤＡＭ１０、ＴＮＦＳＦ９、ＣＤ９６、ＣＤ８２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２７、ＰＧＲＭＣ１、ＴＲＰＶ２、ＡＤＲＢＫ１、ＴＲＡＦ６、ＩＬ２ＲＡ、ＴＨＹ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＴＮＦＲＳＦ９、またはそれらの任意の組合せである。
【００３３】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表９に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４４、ＰＤＣＤ１、ＣＤ２００、ＣＤ２４７、ＣＤ２４、ＣＤ５Ｌ、ＣＣＮＤ２、ＣＤ９、ＩＬ２ＲＢ、ＣＤ５３、ＣＤ７４、ＡＤＡＭ１７、ＢＳＧ、ＣＡＳＴ、ＣＣＲ６、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ８１、ＣＤ６、ＣＤ４８、ＩＴＧＡＶ、ＴＦＲＣ、ＩＣＡＭ２、ＡＴＰ１Ｂ３、ＦＡＳ、ＩＬ４Ｒ、ＣＣＲ７、ＣＤ５２、ＰＲＯＣＲ、ＧＰＲ６５、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＦＣＲＬ１、ＲＯＲＡ、ＩＬ１ＲＮ、ＲＯＲＣ、Ｐ２ＲＸ４、ＳＳＲ２、ＰＴＰＮ２２、ＳＩＧＭＡＲ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＬＯＣ３９０２４３、ＡＤＡＭ１０、ＴＮＦＳＦ９、ＣＤ９６、ＣＡＰ１、ＣＤ８２、ＳＬＡＭＦ７、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２７、ＳＩＶＡ１、ＰＧＲＭＣ１、ＳＲＰＲＢ、ＴＲＰＶ２、ＮＲ１Ｈ２、ＡＤＲＢＫ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＴＲＡＦ６、ＩＬ２ＲＡ、ＴＨＹ１、ＫＤＥＬＲ２、ＩＬ１２ＲＢ２、ＴＮＦＲＳＦ９、ＳＣＡＲＢ１、ＩＦＮＧＲ１、またはそれらの任意の組合せである。
【００３４】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、Ｔｈ１７細胞分化のプロモーターである１つ以上の標的遺伝子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、ＧＰＲ６５である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、病原性Ｔｈ１７細胞分化のプロモーターでもあり、ＣＤ５Ｌ、ＤＥＣ１、ＰＬＺＰおよびＴＣＦ４からなる群から選択される。
【００３５】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、病原性Ｔｈ１７細胞分化のプロモーターである１つ以上の標的遺伝子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、ＣＤ５Ｌ、ＤＥＣ１、ＰＬＺＰおよびＴＣＦ４からなる群から選択される。
【００３６】
所望の遺伝子または標的遺伝子の組合せを選択し、選択された標的遺伝子がＴｈ１７分化および／またはＴｈ１７維持の間に過剰発現され、または過少発現されるか否かを決定した後に、所望の分化、維持および／または機能アウトカムに応じて好適なアンタゴニストまたはアゴニストを使用する。例えば、Ｔｈ１７分化の正の調節因子として同定される標的遺伝子について、それらの標的遺伝子と相互作用するアンタゴニストの使用は、分化をＴｈ１７表現型から離れてシフトさせる一方、それらの標的遺伝子と相互作用するアゴニストの使用は、分化をＴｈ１７表現型に向けてシフトさせる。Ｔｈ１７分化の負の調節因子として同定される標的遺伝子について、それらの標的遺伝子と相互作用するアンタゴニストの使用は、分化をＴｈ１７表現型に向けてシフトさせる一方、それらの標的遺伝子と相互作用するアゴニストの使用は、分化をＴｈ１７表現型から離れてシフトさせる。例えば、Ｔｈ１７維持の正の調節因子として同定される標的遺伝子について、それらの標的遺伝子と相互作用するアンタゴニストの使用は、Ｔｈ１７表現型を有する細胞の数を低減させる一方、それらの標的遺伝子と相互作用するアゴニストの使用は、Ｔｈ１７表現型を有する細胞の数を増加させる。Ｔｈ１７分化の負の調節因子として同定される標的遺伝子について、それらの標的遺伝子と相互作用するアンタゴニストの使用は、Ｔｈ１７表現型を有する細胞の数を増加させる一方、それらの標的遺伝子と相互作用するアゴニストの使用は、Ｔｈ１７表現型を有する細胞の数を低減させる。好適なＴ細胞モジュレート剤としては、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が挙げられる。
【００３７】
一部の実施形態において、Ｔｈ１７分化の正の調節因子は、ＭＩＮＡ、ＴＲＰＳ１、ＭＹＣ、ＮＫＦＢ１、ＮＯＴＣＨ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＲＢＰＪ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＢＡＴＦ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＴＶ６、ＦＡＳ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＧＡ３、およびそれらの組合せから選択される標的遺伝子である。一部の実施形態において、Ｔｈ１７分化の正の調節因子は、ＭＩＮＡ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＥＧＲ２、ＣＣＲ６、ＦＡＳおよびそれらの組合せから選択される標的遺伝子である。
【００３８】
一部の実施形態において、Ｔｈ１７分化の負の調節因子は、ＳＰ４、ＥＴＳ２、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＩＲＦ１およびそれらの組合せから選択される標的遺伝子である。一部の実施形態において、Ｔｈ１７分化の負の調節因子は、ＳＰ４、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３およびそれらの組合せから選択される標的遺伝子である。
【００３９】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、可溶性ＦａｓポリペプチドまたはＦＡＳに由来するポリペプチドである。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、Ｔｈ１７細胞中のＦＡＳの発現、活性、および／または機能を向上させ、またはそうでなければ増加させる薬剤である。本明細書に示されるとおり、Ｔ細胞集団中のＦＡＳの発現は、Ｔｈ１７細胞に向かう分化を誘導し、またはそうでなければそれに影響を与えた。一部の実施形態において、これらのＴ細胞モジュレート剤は、免疫応答、例えば、自己免疫応答または炎症応答の治療において有用である。一部の実施形態において、これらのＴ細胞モジュレート剤は、感染性疾患または他の病原体関連障害の治療において有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアゴニスト、ペプチドアゴニスト、核酸アゴニスト、核酸リガンド、または小分子アゴニストである。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、および分化Ｔ細胞の混合物である。
【００４０】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、ＦＡＳの発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である。Ｔ細胞集団中のＦＡＳ発現、活性および／または機能の阻害は、Ｔｈ１７細胞から離れる分化を抑制し、もしくはそうでなければそれに影響を与え、ならびに／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＴｈ１細胞に向かう分化を誘導し、もしくはそうでなければそれに影響を与えた。一部の実施形態において、これらのＴ細胞モジュレート剤は、免疫応答、例えば、自己免疫応答または炎症応答の治療において有用である。一部の実施形態において、これらのＴ細胞モジュレート剤は、自己免疫疾患、例えば、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、強直性脊椎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、および関節リウマチ、喘息、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶、例として、同種移植片拒絶、およびそれらの組合せの治療において有用である。さらに、Ｔｈ１７細胞の向上は、真菌感染および細胞外病原体の除去にも有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、追加のサイトカインを発現する部分分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、および分化Ｔ細胞の混合物である。
【００４１】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、ＣＣＲ５の発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である。Ｔ細胞集団中のＣＣＲ５発現、活性および／または機能の阻害は、Ｔｈ１７細胞から離れる分化を抑制し、もしくはそうでなければそれに影響を与え、ならびに／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＴｈ１細胞に向かう分化を誘導し、もしくはそうでなければそれに影響を与えた。一部の実施形態において、これらのＴ細胞モジュレート剤は、免疫応答、例えば、自己免疫応答または炎症応答の治療において有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、阻害剤または中和剤である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、および分化Ｔ細胞の混合物である。
【００４２】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、ＣＣＲ６の発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である。Ｔ細胞集団中のＣＣＲ６発現、活性および／または機能の阻害は、Ｔｈ１７細胞から離れる分化を抑制し、もしくはそうでなければそれに影響を与え、ならびに／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＴｈ１細胞に向かう分化を誘導し、もしくはそうでなければそれに影響を与えた。一部の実施形態において、これらのＴ細胞モジュレート剤は、免疫応答、例えば、自己免疫応答または炎症応答の治療において有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、および分化Ｔ細胞の混合物である。
【００４３】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、ＥＧＲ１の発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である。Ｔ細胞集団中のＥＧＲ１発現、活性および／または機能の阻害は、Ｔｈ１７細胞から離れる分化を抑制し、もしくはそうでなければそれに影響を与え、ならびに／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＴｈ１細胞に向かう分化を誘導し、もしくはそうでなければそれに影響を与えた。一部の実施形態において、これらのＴ細胞モジュレート剤は、免疫応答、例えば、自己免疫応答または炎症応答の治療において有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、および分化Ｔ細胞の混合物である。
【００４４】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、ＥＧＲ２の発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である。Ｔ細胞集団中のＥＧＲ２発現、活性および／または機能の阻害は、Ｔｈ１７細胞から離れる分化を抑制し、もしくはそうでなければそれに影響を与え、ならびに／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＴｈ１細胞に向かう分化を誘導し、もしくはそうでなければそれに影響を与えた。一部の実施形態において、これらのＴ細胞モジュレート剤は、免疫応答、例えば、自己免疫応答または炎症応答の治療において有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の混合物である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、および分化Ｔ細胞の混合物である。
【００４５】
例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用し、例えば、ナイーブＴ細胞もしくは細胞の集団に影響を与えて病原性もしくは非病原性Ｔｈ１７細胞もしくは細胞の集団に分化させることにより、病原性Ｔｈ１７細胞もしくは細胞の集団を非病原性Ｔｈ１７細胞もしくはＴ細胞の集団（例えば、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、分化Ｔ細胞およびそれらの組合せの集団）に切り替えることにより、または非病原性Ｔｈ１７細胞もしくはＴ細胞の集団（例えば、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、分化Ｔ細胞およびそれらの組合せの集団）を病原性Ｔｈ１７細胞または細胞の集団に切り替えることにより、Ｔｈ１７細胞または細胞の集団の表現型を調節し、それに影響を与え、またはそうでなければそれに影響を及ぼす方法を提供する。
【００４６】
一部の実施形態において、本発明は、標的遺伝子の細胞の集団または組織中のＴ細胞バランスが関与する免疫応答が関与する疾患または病態の治療のための創薬の方法であって、前記疾患または病態の治療における効力についてスクリーニングすべき化合物または複数の化合物を提供するステップ、前記化合物または複数の化合物を、前記細胞の集団または組織と接触させるステップ、標的遺伝子の第１の発現、活性および／または機能のレベルを検出するステップ、検出レベルを、標的遺伝子の対照レベルと比較するステップ、ならびに検出レベルと対照レベルとの間の差を評価して前記化合物または複数の化合物により誘発される免疫応答を決定するステップを含む方法を含む。例えば、方法は、とりわけ、感染組織、炎症組織、健常組織であり得る組織試料、またはそれらの組織試料の組合せを比較することを企図する。
【００４７】
本発明の一実施形態において、本発明のレダクターゼヌル動物を、有利に使用して組織または細胞特異的にＴ細胞バランスをモジュレートすることができる。このような動物は、生成物／薬物代謝、解毒、正常ホメオスタシスまたは疾患の原因におけるＴ細胞バランスの役割を研究すべき上記の用途に使用することができる。この実施形態は、代謝、例えば、炭素代謝の非存在下でそれらの組織または細胞において研究すべき他の効果、例えば、薬物トランスポーター媒介効果も可能とすることが想定される。したがって、本発明の動物を、本発明のさらなる態様において使用して上記細胞型のいずれかにおける機能および抗体をモジュレートして疾患モデルまたは生成物／創薬のためのモデルまたはＴ細胞バランスの機能を確認もしくは評価するためのモデルを生成することができる。
【００４８】
別の実施形態において、方法は、以下のイベント／パラメータのいずれか１つ以上の研究のためのインビトロアッセイとしての、本発明の動物組織および／またはそれに由来する細胞の集団の使用を企図する：（ｉ）生成物取り込みおよび流出におけるトランスポーターの役割；（ｉｉ）Ｔ細胞により産生される生成物代謝の同定；（ｉｉｉ）候補生成物がＴ細胞であるか否かの評価；または（ｉｖ）Ｔ細胞バランスに起因する薬物／薬物相互作用の評価。
【００４９】
本明細書において使用される用語「病原性」または「非病原性」は、一方のＴｈ１７細胞表現型が他方よりも望ましいことを意味するものとして解釈すべきではない。本明細書に記載のとおり、病原性Ｔｈ１７細胞の誘導の阻害またはＴｈ１７表現型の非病原性Ｔｈ１７表現型に向かうモジュレートが望ましい例が存在する。同様に、非病原性Ｔｈ１７細胞の誘導の阻害またはＴｈ１７表現型の病原性Ｔｈ１７表現型に向かうモジュレートが望ましい例が存在する。
【００５０】
本明細書において使用される用語、例えば、「病原性Ｔｈ１７細胞」および／または「病原性Ｔｈ１７表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、ＴＧＦ−β３の存在下で誘導された場合、ＴＧＦ−β３誘導Ｔｈ１７細胞中の発現のレベルと比較して上昇レベルの、Ｃｘｃｌ３、ＩＬ２２、ＩＬ３、Ｃｃｌ４、Ｇｚｍｂ、Ｌｒｍｐ、Ｃｃｌ５、Ｃａｓｐ１、Ｃｓｆ２、Ｃｃｌ３、Ｔｂｘ２１、Ｉｃｏｓ、ＩＬ１７ｒ、Ｓｔａｔ４、Ｌｇａｌｓ３およびＬａｇから選択される１つ以上の遺伝子を発現するＴｈ１７細胞を指す。本明細書において使用される用語、例えば、「非病原性Ｔｈ１７細胞」または「非病原性Ｔｈ１７表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、ＴＧＦ−β３の存在下で誘導された場合、ＴＧＦ−β３誘導Ｔｈ１７細胞中の発現のレベルと比較して減少レベルの、ＩＬ６ｓｔ、ＩＬ１ｒｎ、Ｉｋｚｆ３、Ｍａｆ、Ａｈｒ、ＩＬ９およびＩＬ１０から選択される１つ以上の遺伝子を発現するＴｈ１７細胞を指す。
【００５１】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、Ｔｈ１７細胞中のプロテインＣ受容体（ＰＲＯＣＲ、ＥＰＣＲまたはＣＤ２０１とも呼ばれる）の発現、活性および／または機能を向上させ、またはそうでなければ増加させる薬剤である。本明細書に示されるとおり、Ｔｈ１７細胞中のＰＲＯＣＲの発現は、例えば、Ｔｈ１７細胞を病原性シグネチャーから非病原性シグネチャーに切り替えることにより、Ｔｈ１７細胞の病原性を低減させた。したがって、ＰＲＯＣＲおよび／またはＰＲＯＣＲのそれらのアゴニストは、種々の適応症の治療において、特に異常免疫応答、例えば、自己免疫疾患および／または炎症障害の治療において有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアゴニスト、ペプチドアゴニスト、核酸アゴニスト、核酸リガンド、または小分子アゴニストである。
【００５２】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、プロテインＣ受容体（ＰＲＯＣＲ、ＥＰＣＲまたはＣＤ２０１とも呼ばれる）の発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である。Ｔｈ１７細胞中のＰＲＯＣＲ発現、活性および／または機能の阻害は、非病原性Ｔｈ１７細胞を病原性Ｔｈ１７細胞に切り替える。したがって、これらのＰＲＯＣＲアンタゴニストは、種々の適応症、例えば、感染性疾患および／または病原体関連障害の治療において有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、可溶性プロテインＣ受容体（ＰＲＯＣＲ、ＥＰＣＲまたはＣＤ２０１とも呼ばれる）ポリペプチドまたはＰＲＯＣＲに由来するポリペプチドである。
【００５３】
一部の実施形態において、本発明は、細胞集団におけるＴｈ１７分化、維持および／もしくは機能を阻害し、ならびに／またはＦＯＸＰ３、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ４およびＴＢＸ２１から選択される１つ以上の非Ｔｈ１７関連サイトカイン、１つ以上の非Ｔｈ１７関連受容体分子、または非Ｔｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を増加させる方法であって、Ｔ細胞を、ＭＩＮＡ、ＭＹＣ、ＮＫＦＢ１、ＮＯＴＣＨ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＲＢＰＪ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＢＡＴＦ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＴＶ６、ＦＡＳ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＧＡ３またはそれらの組合せの発現、活性および／機能を阻害する薬剤と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、薬剤は、ＭＩＮＡ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＥＧＲ２、ＣＣＲ６、ＦＡＳまたはそれらの組合せの少なくとも１つの発現、活性および／または機能を阻害する。一部の実施形態において、薬剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。一部の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態において、抗体は、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞であり、薬剤を、Ｔ細胞の表現型をモジュレートして所望の非Ｔｈ１７Ｔ細胞表現型、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表現型または別のＣＤ４＋Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞であり、薬剤を、部分分化Ｔ細胞の表現型をモジュレートして所望の非Ｔｈ１７Ｔ細胞表現型、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表現型または別のＣＤ４＋Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔｈ１７Ｔ細胞であり、薬剤を、Ｔｈ１７Ｔ細胞の表現型をモジュレートしてＴｈ１７Ｔ細胞表現型以外のＣＤ４＋Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔｈ１７Ｔ細胞であり、薬剤を、Ｔｈ１７Ｔ細胞の表現型をモジュレートし、例えば、病原性または非病原性Ｔｈ１７細胞表現型間のＴｈ１７Ｔ細胞表現型のシフトとし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。
【００５４】
一部の実施形態において、本発明は、細胞集団におけるＴｈ１７分化を阻害し、ならびに／またはＦＯＸＰ３、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ４およびＴＢＸ２１から選択される１つ以上の非Ｔｈ１７関連サイトカイン、１つ以上の非Ｔｈ１７関連受容体分子、または非Ｔｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を増加させる方法であって、Ｔ細胞を、ＳＰ４、ＥＴＳ２、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＩＲＦ１またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を向上させる薬剤と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、薬剤は、ＳＰ４、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３またはそれらの組合せの少なくとも１つの発現、活性および／または機能を向上させる。一部の実施形態において、薬剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアゴニスト、ペプチドアゴニスト、核酸アゴニスト、核酸リガンド、または小分子アゴニストである。一部の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞であり、薬剤を、Ｔ細胞の表現型をモジュレートして所望の非Ｔｈ１７Ｔ細胞表現型、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表現型または別のＣＤ４＋Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞であり、薬剤を、部分分化Ｔ細胞の表現型をモジュレートして所望の非Ｔｈ１７Ｔ細胞表現型、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表現型または別のＣＤ４＋Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔｈ１７Ｔ細胞であり、薬剤を、Ｔｈ１７Ｔ細胞の表現型をモジュレートしてＴｈ１７Ｔ細胞表現型以外のＣＤ４＋Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔｈ１７Ｔ細胞であり、薬剤を、Ｔｈ１７Ｔ細胞の表現型をモジュレートし、例えば、病原性または非病原性Ｔｈ１７細胞表現型間のＴｈ１７Ｔ細胞表現型のシフトとし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。
【００５５】
一部の実施形態において、本発明は、細胞集団におけるＴｈ１７分化を向上させ、インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、ＳＴＡＴ３、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）およびＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（ＲＯＲＣ）から選択される１つ以上のＴｈ１７関連サイトカイン、１つ以上のＴｈ１７関連受容体分子、もしくは１つ以上のＴｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を増加させ、ならびに／またはＦＯＸＰ３、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ４およびＴＢＸ２１から選択される１つ以上の非Ｔｈ１７関連サイトカイン、１つ以上のＴｈ１７関連受容体分子、もしくは非Ｔｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を減少させる方法であって、Ｔ細胞を、ＳＰ４、ＥＴＳ２、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＩＲＦ１またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を阻害する薬剤と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、薬剤は、ＳＰ４、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３またはそれらの組合せの少なくとも１つの発現、活性および／または機能を阻害する。一部の実施形態において、薬剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。一部の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態において、抗体は、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞であり、薬剤を、Ｔ細胞の表現型をモジュレートして所望のＴｈ１７Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞であり、薬剤を、部分分化Ｔ細胞の表現型をモジュレートして所望のＴｈ１７Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔｈ１７Ｔ細胞以外のＣＤ４＋Ｔ細胞であり、薬剤を、非Ｔｈ１７Ｔ細胞の表現型をモジュレートしてＴｈ１７Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔｈ１７Ｔ細胞であり、薬剤を、Ｔｈ１７Ｔ細胞の表現型をモジュレートし、例えば、病原性または非病原性Ｔｈ１７細胞表現型間のＴｈ１７Ｔ細胞表現型のシフトとし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明は、細胞集団におけるＴｈ１７分化を向上させ、インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、ＳＴＡＴ３、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）およびＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（ＲＯＲＣ）から選択される１つ以上のＴｈ１７関連サイトカイン、１つ以上のＴｈ１７関連受容体分子、および／またはＴｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を増加させ、ならびに／またはＦＯＸＰ３、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ４およびＴＢＸ２１から選択される１つ以上の非Ｔｈ１７関連サイトカイン、１つ以上のＴｈ１７関連受容体分子、または１つ以上の非Ｔｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を減少させる方法であって、Ｔ細胞を、ＭＩＮＡ、ＭＹＣ、ＮＫＦＢ１、ＮＯＴＣＨ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＲＢＰＪ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＢＡＴＦ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＴＶ６、ＦＡＳ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＧＡ３またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を向上させる薬剤と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、薬剤は、ＭＩＮＡ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＥＧＲ２、ＣＣＲ６、ＦＡＳまたはそれらの組合せの少なくとも１つの発現、活性および／または機能を向上させる。一部の実施形態において、薬剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアゴニスト、ペプチドアゴニスト、核酸アゴニスト、核酸リガンド、または小分子アゴニストである。一部の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態において、抗体は、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。一部の実施形態において、薬剤を、Ｆｏｘｐ３、ＩＦＮ−γ、ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ４および／またはＴＢＸ２１の発現、活性および／または機能を阻害するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞であり、薬剤を、Ｔ細胞の表現型をモジュレートして所望のＴｈ１７Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、部分分化Ｔ細胞であり、薬剤を、部分分化Ｔ細胞の表現型をモジュレートして所望のＴｈ１７Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞はＴｈ１７Ｔ細胞以外のＣＤ４＋Ｔ細胞であり、薬剤を、非Ｔｈ１７Ｔ細胞の表現型をモジュレートしてＴｈ１７Ｔ細胞表現型とし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔｈ１７Ｔ細胞であり、薬剤を、Ｔｈ１７Ｔ細胞の表現型をモジュレートし、例えば、病原性または非病原性Ｔｈ１７細胞表現型間のＴｈ１７Ｔ細胞表現型のシフトとし、および／またはそれを産生するために十分な量で投与する。
【００５７】
一部の実施形態において、本発明は、Ｔｈ１７分化に関連する遺伝子または遺伝子エレメントを同定する方法であって、ａ）Ｔ細胞を、Ｔｈ１７分化の阻害剤またはＴｈ１７分化を向上させる薬剤と接触させること；およびｂ）ステップ（ａ）により発現がモジュレートされた遺伝子または遺伝子エレメントを同定することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ｃ）Ｔｈ１７分化の阻害剤またはＴｈ１７分化を向上させる薬剤と接触させたＴ細胞中でステップｂ）において同定された遺伝子または遺伝子エレメントの発現を摂動させること；およびｄ）ステップｃ）により発現がモジュレートされた遺伝子を同定することも含む。一部の実施形態において、Ｔｈ１７分化の阻害剤は、ＭＩＮＡ、ＭＹＣ、ＮＫＦＢ１、ＮＯＴＣＨ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＲＢＰＪ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＢＡＴＦ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＴＶ６、ＦＡＳ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＧＡ３またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である。一部の実施形態において、薬剤は、ＭＩＮＡ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＥＧＲ２、ＣＣＲ６、ＦＡＳまたはそれらの組合せの少なくとも１つの発現、活性および／または機能を阻害する。一部の実施形態において、Ｔｈ１７分化の阻害剤は、ＳＰ４、ＥＴＳ２、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＩＲＦ１またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を向上させる薬剤である。一部の実施形態において、薬剤は、ＳＰ４、ＩＫＺＦ４またはＴＳＣ２２Ｄ３の少なくとも１つの発現、活性および／または機能を向上させる。一部の実施形態において、Ｔｈ１７分化を向上させる薬剤は、ＳＰ４、ＥＴＳ２、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＩＲＦ１またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を阻害する薬剤である。一部の実施形態において、Ｔｈ１７分化を向上させる薬剤は、ＭＩＮＡ、ＭＹＣ、ＮＫＦＢ１、ＮＯＴＣＨ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＲＢＰＪ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＢＡＴＦ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＴＶ６、ＦＡＳ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＧＡ３またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を向上させる薬剤である。一部の実施形態において、薬剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、核酸リガンド、または小分子アンタゴニストである。
【００５８】
一部の実施形態において、本発明は、Ｔｈ１７分化の誘導をモジュレートする方法であって、Ｔ細胞を、ＩＲＦ１、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＩＲＦ７、ＳＴＡＴ１、ＺＦＰ２８１、ＩＦＩ３５、ＲＥＬ、ＴＢＸ２１、ＦＬＩ１、ＢＡＴＦ、ＩＲＦ４から選択される１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表５に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＡＥＳ、ＡＨＲ、ＡＲＩＤ５Ａ、ＢＡＴＦ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ４、ＣＨＤ７、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＢ１、Ｅ２Ｆ４、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＬＬ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＥＺＨ１、ＦＬＩ１、ＦＯＸＯ１、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡＤ２Ｂ、ＨＩＦ１Ａ、ＩＤ２、ＩＦＩ３５、ＩＫＺＦ４、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＵＮ、ＬＥＦ１、ＬＲＲＦＩＰ１、ＭＡＸ、ＮＣＯＡ３、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＬ３、ＮＦＫＢ１、ＮＭＩ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＭＬ、ＰＲＤＭ１、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＵＮＸ１、ＳＡＰ１８、ＳＡＴＢ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＰ１００、ＳＰ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＴＦＥＢ、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ２４、ａｎｄ／ｏｒ  ＺＦＰ１６１、またはそれらの任意の組合せの発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤と接触させることを含む方法を提供する。
【００５９】
一部の実施形態において、本発明は、Ｔｈ１７表現型の発生およびＴｈ１７Ｔ細胞の増幅をモジュレートする方法であって、Ｔ細胞を、ＩＲＦ８、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＺＰＦ２９８１、ＣＨＤ７、ＴＢＸ２１、ＦＬＩ１、ＳＡＴＢ１、ＲＵＮＸ１、ＢＡＴＦ、ＲＯＲＣ、ＳＰ４から選択される１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表５に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＡＥＳ、ＡＨＲ、ＡＲＩＤ３Ａ、ＡＲＩＤ５Ａ、ＡＲＮＴＬ、ＡＳＸＬ１、ＢＡＴＦ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ４、ＣＤＣ５Ｌ、ＣＥＢＰＢ、ＣＨＤ７、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＭ、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＬＫ３、ＥＬＬ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＥＺＨ１、ＦＬＩ１、ＦＯＳＬ２、ＦＯＸＪ２、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＭＧＢ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＦＩ３５、ＩＫＺＦ４、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ６、ＫＬＦ９、ＬＥＦ１、ＬＲＲＦＩＰ１、ＭＡＦＦ、ＭＡＸ、ＭＡＺ、ＭＩＮＡ、ＭＴＡ３、ＭＹＣ、ＭＹＳＴ４、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ３、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＬ３、ＮＦＫＢ１、ＮＭＩ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＲＤＭ１、ＲＡＲＡ、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＡ、ＲＯＲＡ、ＲＵＮＸ１、ＳＡＰ１８、ＳＡＴＢ１、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＯＸ、ＳＰ１、ＳＰ４、ＳＳ１８、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ２１、ＴＦＥＢ、ＴＬＥ１、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＰＳ１、ＶＡＶ１、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、ＺＦＰ１６１、ＺＦＰ６２、ＺＮＦ２３８、ＺＮＦ２８１、ａｎｄ／ｏｒ  ＺＮＦ７０３、またはそれらの任意の組合せの発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤と接触させることを含む方法を提供する。
【００６０】
一部の実施形態において、本発明は、Ｔｈ１７細胞の安定化をモジュレートし、および／またはＴｈ１７関連インターロイキン２３（ＩＬ−２３）シグナリングをモジュレートする方法であって、Ｔ細胞を、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＪＵＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＣＨＤ７、ＳＡＴＢ１、ＲＵＮＸ１、ＢＡＴＦ、ＲＯＲＣ、ＳＰ４  ＩＲＦ４から選択される１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表５に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＡＥＳ、ＡＨＲ、ＡＲＩＤ３Ａ、ＡＲＩＤ５Ａ、ＡＲＮＴＬ、ＡＳＸＬ１、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＢＡＴＦ、ＢＡＴＦ３、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、Ｃ２１ＯＲＦ６６、ＣＢＦＢ、ＣＢＸ４、ＣＤＣ５Ｌ、ＣＤＹＬ、ＣＥＢＰＢ、ＣＨＤ７、ＣＨＭＰ１Ｂ、ＣＩＣ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＭ、ＣＳＤＡ、ＤＤＩＴ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＬＫ３、ＥＬＬ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＺＨ１、ＦＬＩ１、ＦＯＳＬ２、ＦＯＸＪ２、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡＤ２Ｂ、ＨＣＬＳ１、ＨＩＦ１Ａ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＦＩ３５、ＩＫＺＦ４、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＪＡＲＩＤ２、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ９、ＬＡＳＳ４、ＬＥＦ１、ＬＲＲＦＩＰ１、ＭＡＦＦ、ＭＡＸ、ＭＥＮ１、ＭＩＮＡ、ＭＴＡ３、ＭＸＩ１、ＭＹＣ、ＭＹＳＴ４、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ３、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＬ３、ＮＦＫＢ１、ＮＭＩ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＨＦ１３、ＰＨＦ２１Ａ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＲＤＭ１、ＲＡＲＡ、ＲＢＰＪ、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＮＦ１１、ＲＯＲＡ、ＲＯＲＣ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＳＡＰ１８、ＳＡＰ３０、ＳＡＴＢ１、ＳＥＲＴＡＤ１、ＳＩＲＴ２、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＯＸ、ＳＰ１、ＳＰ１００、ＳＰ４、ＳＳ１８、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ２１、ＴＦＥＢ、ＴＧＩＦ１、ＴＬＥ１、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＰＳ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｂ、ＶＡＶ１、ＶＡＸ２、ＸＢＰ１、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、ＺＦＰ１６１、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＮＦ２３８、ＺＮＦ２８１、ＺＮＦ７０３、ＺＮＲＦ１、ａｎｄ／ｏｒ  ＺＮＲＦ２、またはそれらの任意の組合せの発現、活性および／または機能をモジュレートする薬剤と接触させることを含む方法を提供する。
【００６１】
一部の実施形態において、本発明は、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表６に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＦＡＳ、ＣＣＲ５、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ２ＲＡ、ＭＹＤ８８、ＣＸＣＲ５、ＰＶＲ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００６２】
一部の実施形態において、本発明は、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表６に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＧＡ３、ＩＬ１Ｒ１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＡＣＶＲ２Ａ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１７ＲＡ、ＣＣＲ８、ＤＤＲ１、ＰＲＯＣＲ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ２、ＭＹＤ８８、ＰＴＰＲＪ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＣＸＣＲ３、ＩＬ１ＲＮ、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ２ＲＢ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＣＸＣＲ４、ＫＬＲＤ１、ＩＲＡＫ１ＢＰ１、ＰＶＲ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１８Ｒ１、ＴＲＡＦ３、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明は、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表６に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＧＡ３、ＩＬ１Ｒ１、ＦＡＳ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＡＣＶＲ２Ａ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１７ＲＡ、ＤＤＲ１、ＰＲＯＣＲ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ２、ＭＹＤ８８、ＢＭＰＲ１Ａ、ＰＴＰＲＪ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＣＸＣＲ３、ＩＬ１ＲＮ、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ２ＲＢ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＣＸＣＲ４、ＫＬＲＤ１、ＩＲＡＫ１ＢＰ１、ＰＶＲ、ＩＬ１５ＲＡ、ＴＬＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１８Ｒ１、ＴＲＡＦ３、ＩＦＮＧＲ１、ＰＬＡＵＲ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００６４】
一部の実施形態において、本発明は、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表７に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＤＵＳＰ２２、ＨＫ２、ＲＩＰＫ１、ＲＮＡＳＥＬ、ＴＥＣ、ＭＡＰ３Ｋ８、ＳＧＫ１、ＰＲＫＣＱ、ＤＵＳＰ１６、ＢＭＰ２Ｋ、ＰＩＭ２、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明は、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表７に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＰＳＴＰＩＰ１、ＰＴＰＮ１、ＡＣＰ５、ＴＸＫ、ＲＩＰＫ３、ＰＴＰＲＦ、ＮＥＫ４、ＰＰＭＥ１、ＰＨＡＣＴＲ２、ＨＫ２、ＧＭＦＧ、ＤＡＰＰ１、ＴＥＣ、ＧＭＦＢ、ＰＩＭ１、ＮＥＫ６、ＡＣＶＲ２Ａ、ＦＥＳ、ＣＤＫ６、ＺＡＫ、ＤＵＳＰ１４、ＳＧＫ１、ＪＡＫ３、ＵＬＫ２、ＰＴＰＲＪ、ＳＰＨＫ１、ＴＮＫ２、ＰＣＴＫ１、ＭＡＰ４Ｋ３、ＴＧＦＢＲ１、ＨＫ１、ＤＤＲ１、ＢＭＰ２Ｋ、ＤＵＳＰ１０、ＡＬＰＫ２、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００６６】
一部の実施形態において、本発明は、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表７に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＰＴＰＬＡ、ＰＳＴＰＩＰ１、ＴＫ１、ＰＴＥＮ、ＢＰＧＭ、ＤＣＫ、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＮ１８、ＭＫＮＫ２、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＲＥ、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＰＬＫ２、ＤＵＳＰ６、ＣＤＣ２５Ｂ、ＳＬＫ、ＭＡＰ３Ｋ５、ＢＭＰＲ１Ａ、ＡＣＰ５、ＴＸＫ、ＲＩＰＫ３、ＰＰＰ３ＣＡ、ＰＴＰＲＦ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＮＥＫ４、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＰＰＭＥ１、ＳＲＰＫ２、ＤＵＳＰ２、ＰＨＡＣＴＲ２、ＤＣＬＫ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＲＩＰＫ１、ＧＫ、ＲＮＡＳＥＬ、ＧＭＦＧ、ＳＴＫ４、ＨＩＮＴ３、ＤＡＰＰ１、ＴＥＣ、ＧＭＦＢ、ＰＴＰＮ６、ＲＩＰＫ２、ＰＩＭ１、ＮＥＫ６、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＵＲＫＢ、ＦＥＳ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＣＤＫ６、ＺＡＫ、ＶＲＫ２、ＭＡＰ３Ｋ８、ＤＵＳＰ１４、ＳＧＫ１、ＰＲＫＣＱ、ＪＡＫ３、ＵＬＫ２、ＨＩＰＫ２、ＰＴＰＲＪ、ＩＮＰＰ１、ＴＮＫ２、ＰＣＴＫ１、ＤＵＳＰ１、ＮＵＤＴ４、ＴＧＦＢＲ１、ＰＴＰ４Ａ１、ＨＫ１、ＤＵＳＰ１６、ＡＮＰ３２Ａ、ＤＤＲ１、ＩＴＫ、ＷＮＫ１、ＮＡＧＫ、ＳＴＫ３８、ＢＭＰ２Ｋ、ＢＵＢ１、ＡＡＫ１、ＳＩＫ１、ＤＵＳＰ１０、ＰＲＫＣＡ、ＰＩＭ２、ＳＴＫ１７Ｂ、ＴＫ２、ＳＴＫ３９、ＡＬＰＫ２、ＭＳＴ４、ＰＨＬＰＰ１、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００６７】
一部の実施形態において、本発明は、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表８に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＨＫ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＵＴ、ＤＵＳＰ１、ＮＡＤＫ、ＬＩＭＫ２、ＤＵＳＰ１１、ＴＡＯＫ３、ＰＲＰＳ１、ＰＰＰ２Ｒ４、ＭＫＮＫ２、ＳＧＫ１、ＢＰＧＭ、ＴＥＣ、ＭＡＰＫ６、ＰＴＰ４Ａ２、ＰＲＰＦ４Ｂ、ＡＣＰ１、ＣＣＲＮ４Ｌ、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００６８】
一部の実施形態において、本発明は、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表８に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＨＫ２、ＺＡＰ７０、ＮＥＫ６、ＤＵＳＰ１４、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＩＴＫ、ＤＵＴ、ＰＰＰ１Ｒ１１、ＤＵＳＰ１、ＰＭＶＫ、ＴＫ１、ＴＡＯＫ３、ＧＭＦＧ、ＰＲＰＳ１、ＳＧＫ１、ＴＸＫ、ＷＮＫ１、ＤＵＳＰ１９、ＴＥＣ、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＰＫＭ２、ＰＲＰＦ４Ｂ、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＢ、ＵＬＫ２、ＰＬＫ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＰＬＫ２、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００６９】
一部の実施形態において、本発明は、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表８に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＺＡＰ７０、ＰＦＫＰ、ＮＥＫ６、ＤＵＳＰ１４、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＩＮＰＰ５Ｂ、ＩＴＫ、ＰＦＫＬ、ＰＧＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＵＴ、ＰＰＰ１Ｒ１１、ＤＵＳＰ１、ＰＭＶＫ、ＰＴＰＮ２２、ＰＳＰＨ、ＴＫ１、ＰＧＡＭ１、ＬＩＭＫ２、ＣＬＫ１、ＤＵＳＰ１１、ＴＡＯＫ３、ＲＩＯＫ２、ＧＭＦＧ、ＵＣＫＬ１、ＰＲＰＳ１、ＰＰＰ２Ｒ４、ＭＫＮＫ２、ＤＧＫＡ、ＳＧＫ１、ＴＸＫ、ＷＮＫ１、ＤＵＳＰ１９、ＣＨＰ、ＢＰＧＭ、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＴＥＣ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰＫ６、ＲＰＳ６ＫＡ１、ＰＴＰ４Ａ２、ＰＫＭ２、ＰＲＰＦ４Ｂ、ＡＤＲＢＫ１、ＣＫＢ、ＡＣＰ１、ＵＬＫ２、ＣＣＲＮ４Ｌ、ＰＲＫＣＨ、ＰＬＫ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＰＬＫ２、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００７０】
一部の実施形態において、本発明は、初期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表９に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＣＤ２００、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ２４、ＣＣＮＤ２、ＡＤＡＭ１７、ＢＳＧ、ＩＴＧＡＬ、ＦＡＳ、ＧＰＲ６５、ＳＩＧＭＡＲ１、ＣＡＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＳＲＰＲＢ、ＴＲＰＶ２、ＩＬ２ＲＡ、ＫＤＥＬＲ２、ＴＮＦＲＳＦ９、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００７１】
一部の実施形態において、本発明は、中期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表９に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２００、ＣＤ２４、ＣＤ５Ｌ、ＣＤ９、ＩＬ２ＲＢ、ＣＤ５３、ＣＤ７４、ＣＡＳＴ、ＣＣＲ６、ＩＬ２ＲＧ、ＩＴＧＡＶ、ＦＡＳ、ＩＬ４Ｒ、ＰＲＯＣＲ、ＧＰＲ６５、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＯＲＡ、ＩＬ１ＲＮ、ＲＯＲＣ、ＣＹＳＬＴＲ１、ＰＮＲＣ２、ＬＯＣ３９０２４３、ＡＤＡＭ１０、ＴＮＦＳＦ９、ＣＤ９６、ＣＤ８２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２７、ＰＧＲＭＣ１、ＴＲＰＶ２、ＡＤＲＢＫ１、ＴＲＡＦ６、ＩＬ２ＲＡ、ＴＨＹ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＴＮＦＲＳＦ９、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００７２】
一部の実施形態において、本発明は、後期のＴｈ１７分化、維持および／または機能に関連するものとして表９に列記される標的遺伝子の１つ以上、例えば、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４４、ＰＤＣＤ１、ＣＤ２００、ＣＤ２４７、ＣＤ２４、ＣＤ５Ｌ、ＣＣＮＤ２、ＣＤ９、ＩＬ２ＲＢ、ＣＤ５３、ＣＤ７４、ＡＤＡＭ１７、ＢＳＧ、ＣＡＳＴ、ＣＣＲ６、ＩＬ２ＲＧ、ＣＤ８１、ＣＤ６、ＣＤ４８、ＩＴＧＡＶ、ＴＦＲＣ、ＩＣＡＭ２、ＡＴＰ１Ｂ３、ＦＡＳ、ＩＬ４Ｒ、ＣＣＲ７、ＣＤ５２、ＰＲＯＣＲ、ＧＰＲ６５、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＦＣＲＬ１、ＲＯＲＡ、ＩＬ１ＲＮ、ＲＯＲＣ、Ｐ２ＲＸ４、ＳＳＲ２、ＰＴＰＮ２２、ＳＩＧＭＡＲ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＬＯＣ３９０２４３、ＡＤＡＭ１０、ＴＮＦＳＦ９、ＣＤ９６、ＣＡＰ１、ＣＤ８２、ＳＬＡＭＦ７、ＰＬＡＵＲ、ＣＤ２７、ＳＩＶＡ１、ＰＧＲＭＣ１、ＳＲＰＲＢ、ＴＲＰＶ２、ＮＲ１Ｈ２、ＡＤＲＢＫ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＴＲＡＦ６、ＩＬ２ＲＡ、ＴＨＹ１、ＫＤＥＬＲ２、ＩＬ１２ＲＢ２、ＴＮＦＲＳＦ９、ＳＣＡＲＢ１、ＩＦＮＧＲ１、またはそれらの任意の組合せをモジュレートする方法を提供する。
【００７３】
一部の実施形態において、本発明は、対象に、治療有効量のプロテインＣ受容体（ＰＲＯＣＲ）の阻害剤を投与することにより、腫瘍増殖の阻害が必要とされる対象における腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＲＯＣＲの阻害剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤である。一部の実施形態において、ＰＲＯＣＲの阻害剤は、リポ多糖；シスプラチン；フィブリノゲン；１，１０−フェナントロリン；５−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン；シスタチオニン；ヒルジン；リン脂質；ドロトレコギンアルファ；ＶＥＧＦ；ホスファチジルエタノールアミン；セリン；ガンマ−カルボキシグルタミン酸；カルシウム；ワルファリン；エンドトキシン；クルクミン；脂質；および一酸化窒素からなる群から選択される１つ以上の薬剤である。
【００７４】
一部の実施形態において、本発明は、対象における免疫応答を診断する方法であって、表１または表２に列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを検出すること、ならびに検出レベルを、シグネチャー遺伝子または遺伝子産物発現、活性および／または機能の対照レベルと比較することを含み、検出レベルと対照レベルとの間の差が、対象における免疫応答の存在を示す方法を提供する。一部の実施形態において、免疫応答は、自己免疫である。一部の実施形態において、免疫応答は、炎症応答、例として、自己免疫応答に伴う炎症応答および／または感染性疾患もしくは他の病原体関連障害に伴う炎症応答である。
【００７５】
一部の実施形態において、本発明は、対象における免疫応答をモニタリングする方法であって、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物、例えば、表１または表２に列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子の発現、活性および／または機能のレベルを、第１の時点において検出すること、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物、例えば、表１または表２に列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子の発現、活性および／または機能のレベルを、第２の時点において検出すること、ならびに発現、活性および／または機能の第１の検出レベルと、発現、活性および／または機能の第２の検出レベルとを比較することを含み、第１および第２の検出レベルとの間の変化が、対象における免疫応答の変化を示す方法を提供する。一部の実施形態において、免疫応答は、自己免疫応答である。一部の実施形態において、免疫応答は、炎症応答である。
【００７６】
一部の実施形態において、本発明は、対象における免疫応答をモニタリングする方法であって、Ｔ細胞の集団を対象から第１の時点において単離すること、Ｔ細胞集団内のＴ細胞サブタイプの第１の比を第１の時点において決定すること、Ｔ細胞の集団を対象から第２の時点において単離すること、Ｔ細胞集団内のＴ細胞サブタイプの第２の比を第２の時点において決定すること、ならびにＴ細胞サブタイプの第１および第２の比を比較することを含み、第１および第２の検出比の変化が、対象における免疫応答の変化を示す方法を提供する。一部の実施形態において、免疫応答は、自己免疫応答である。一部の実施形態において、免疫応答は、炎症応答である。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明は、免疫チェックポイントの遮断を利用することにより、治療免疫性を活性化させる方法を提供する。生産的免疫応答の進行は、多数の免疫学的チェックポイントの通過を要求する。免疫応答は、刺激および阻害シグナルの平衡により調節される。免疫グロブリンスーパーファミリーは、免疫応答のこの協調における中心的な重要性を占め、ＣＤ２８／細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）：Ｂ７．１／Ｂ７．２受容体／リガンドグルーピングは、それらの免疫調節因子の原型的な例を表す（例えば、Ｋｏｒｍａｎ  ＡＪ，Ｐｅｇｇｓ  ＫＳ，Ａｌｌｉｓｏｎ  ＪＰ，“Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．”Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；９０：２９７−３３９参照）。部分的には、これらのチェックポイントの役割は、不所望で有害な自己指向活性の可能性を避けることである。これは自己免疫の予防に役立つ必須の機能である一方、悪性自己細胞が由来する細胞と同一の表面分子の配列を主に示す悪性自己細胞の標的化を目的とする良好な免疫療法の障壁として作用し得る。免疫チェックポイントタンパク質の発現は、疾患または障害において調節不全になり得、重要な免疫抵抗機序であり得る。特に阻害チェックポイントの遮断により末梢忍容性のこれらの機序を克服することを目的とする治療法は、単剤療法としてまたは他の治療法との相乗作用における治療活性を生成する潜在性を提供する。
【００７８】
したがって、本発明は、特に免疫療法のためにＴ細胞をエンジニアリングする方法であって、Ｔ細胞バランスをモジュレートして免疫チェックポイントに関与する少なくとも１つの遺伝子または遺伝子産物を不活性化させ、またはそうでなければ阻害することを含む方法に関する。
【００７９】
本明細書に提供される組成物および方法のいずれかにおいて使用される好適なＴ細胞モジュレート剤としては、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が挙げられる。非限定的な例として、好適なＴ細胞モジュレート剤または１つ以上のＴ細胞モジュレート剤との組合せで使用される薬剤を、本明細書の表１０に示す。
【００８０】
当業者は、Ｔ細胞モジュレート剤が種々の使用を有することを認識する。例えば、Ｔ細胞モジュレート剤は、本明細書に記載の治療剤として使用される。Ｔ細胞モジュレート剤は、スクリーニングアッセイ、診断キットにおける試薬として、もしくは診断ツールとして使用することができ、またはそれらのＴ細胞モジュレート剤は、治療試薬を生成するための競合アッセイにおいて使用することができる。
【００８１】
一実施形態において、本発明は、Ｔ細胞バランスが関与する免疫応答を診断し、予後診断し、および／または病期分類する方法であって、表１または表２の遺伝子から選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の第１の発現、活性および／または機能のレベルを検出すること、ならびに検出レベルをシグネチャー遺伝子または遺伝子産物の発現、活性および／または機能の対照レベルと比較することを含み得、検出レベルおよび対照レベルの差が、対象における免疫応答の存在を示す、方法に関する。
【００８２】
別の実施形態において、本発明は、対象における免疫応答をモニタリングする方法であって、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを、第１の時点において検出すること、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを、第２の時点において検出すること、ならびに発現、活性および／または機能の第１の検出レベルと、発現、活性および／または機能の第２の検出レベルとを比較することを含み、第１および第２の検出レベルの変化が、対象における免疫応答の変化を示す、方法に関する。
【００８３】
さらに別の実施形態において、本発明は、免疫応答のリスクがあり、またはそれに罹患している患者集団を同定する方法であって、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを、患者集団において検出すること、ならびに免疫応答のリスクがなく、または罹患していない患者集団における、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを比較することを含み得、患者集団における表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルの差が、免疫応答のリスクがあり、またはそれに罹患している患者集団を同定する、方法に関する。
【００８４】
さらに別の実施形態において、本発明は、異常な免疫応答のための治療または治療法を受ける対象をモニタリングして患者が治療または治療法に応答性であるか否かを決定する方法であって、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを治療または治療法の非存在下で検出すること、ならびに治療または治療法の存在下の、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを比較することを含み得、治療または治療法の存在下の、表１または表２の１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルの差が、患者が治療または治療法に応答性であるか否かを示す、方法に関する。
【００８５】
本発明はまた、Ｔ細胞バランスをモジュレートする方法であって、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団を、Ｔ細胞モジュレート剤の非存在下のＴ細胞またはＴ細胞の集団の分化、維持および／または機能と比較してＴｈ１７細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および他のＴ細胞サブセット間のバランスを変更することにより、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団の分化、維持および／または機能を改変するために十分な量のＴ細胞モジュレート剤と接触させることを含み得る、方法を含み得る。
【００８６】
免疫応答は、自己免疫応答または炎症応答であり得る。炎症応答は、自己免疫応答、感染性疾患および／または病原体関連障害に伴い得る。
【００８７】
シグネチャー遺伝子は、Ｔｈ１７関連遺伝子であり得る。
【００８８】
治療または治療法は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１細胞、またはＴｒｅｇおよびＴｈ１細胞の組合せに向かう分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５についてのアンタゴニストであり得る。治療または治療法は、Ｔｈ１７細胞に向かうＴ細胞分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５の発現を向上または増加させるアゴニストであり得る。治療または治療法は、ＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子について特異的であり得る。治療または治療法は、Ｔｈ１７細胞を病原性シグネチャーから非病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子のアンタゴニストであり得る。治療または治療法は、Ｔｈ１７細胞を非病原性シグネチャーから病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子の発現を向上または増加させるアゴニストであり得る。
【００８９】
Ｔ細胞モジュレート剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤であり得る。
【００９０】
Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、分化Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞および部分分化Ｔ細胞の組合せ、ナイーブＴ細胞および分化Ｔ細胞の組合せ、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の組合せ、またはナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞および分化Ｔ細胞の組合せであり得る。
【００９１】
本発明はまた、細胞集団におけるＴｈ１７分化を向上させ、インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、ＳＴＡＴ３、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）およびＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（ＲＯＲＣ）から選択される１つ以上のＴｈ１７関連サイトカインもしくは１つ以上のＴｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を増加させ、ならびに／またはＦＯＸＰ３、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ４およびＴＢＸ２１から選択される１つ以上の非Ｔｈ１７関連サイトカインもしくは非Ｔｈ１７関連転写調節因子の発現、活性および／もしくは機能を減少させる方法であって、Ｔ細胞を、ＣＤ５Ｌ、ＤＥＣ１、ＰＬＺＰ、ＴＣＦ４またはそれらの組合せの発現、活性および／または機能を向上させる薬剤と接触させる方法を含む。薬剤は、ＣＤ５Ｌ、ＤＥＣ１、ＰＬＺＰ、またはＴＣＦ４の少なくとも１つの発現、活性および／または機能を向上させ得る。この薬剤は、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチドアゴニスト、ペプチドアゴニスト、核酸アゴニスト、核酸リガンド、または小分子アゴニストであり得る。抗体は、モノクローナル抗体またはキメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体であり得る。
【００９２】
本発明はまた、患者における異常な免疫応答を治療するための、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１細胞、またはＴｒｅｇおよびＴｈ１細胞の組合せに向かう分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５についてのアンタゴニストの使用、Ｔｈ１７細胞に向かうＴ細胞分化を誘導するために十分な量のＧＰＲ６５の発現を向上または増加させるアゴニストの使用、Ｔｈ１７細胞を病原性シグネチャーから非病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子のアンタゴニストの使用、Ｔｈ１７細胞を非病原性シグネチャーから病原性シグネチャーに切り替えるために十分な量のＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される標的遺伝子の発現を向上または増加させるアゴニストの使用ならびにＴ細胞モジュレート剤の使用を含む。
【００９３】
したがって、本出願人らが権利を留保し、本明細書により任意のこれまでに公知の産物、プロセス、または方法の放棄を開示するようなこれまでに公知のいかなる産物、その産物の作製プロセス、またはその産物の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことが、本発明の目的である。さらに、本発明は、本出願人らが権利を留保し、本明細書により任意のそのような主題の放棄を開示するような、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）（米国特許法第１１２条第１段落）または欧州特許庁（ＥＰＯ）（ＥＰＣ第８３条）の明細書の記載および実施可能要件を満たさないいかなる産物、その産物の作製プロセス、またはその産物の使用方法も本発明の範囲内に包含しないものと意図されることが留意される。
【００９４】
本開示ならびに特に特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法におけるそれに属する意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法におけるそれらに属する意味を有し、例えば、それらは明示されていない要素を許容するが、先行技術に見出され、または本発明の基本もしくは新規特徴に影響を与える要素を排除することに留意されたい。本明細書に記載のものに拘束されると解釈すべきでない。
【００９５】
これらのおよび他の実施形態は、開示され、または以下の詳細な説明から明らかであり、それにより包含される。
【００９６】
本発明の新規特徴は、付属の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される説明としての実施形態を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、Ｔｈ１７分化のゲノムワイド時間的発現プロファイルを示す一連のグラフおよび説明である。図１Ａは、アプローチの概要を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂ−１および１Ｂ−２は、Ｔｈ１７分化の間の遺伝子発現プロファイルを示す。Ｔｈ１７極性化条件（ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６；左パネル、行ごとに正規化されたＺ）または対照活性化Ｔｈ０細胞に対するＴｈ１７極性化条件（右パネル、ｌｏｇ２（比））における１８個の時点（列）における遺伝子（行）についての示差的発現レベルを示す。遺伝子を２０個のクラスタ（Ｃ１〜Ｃ２０、着色バー、右）に分ける。右：代表的なクラスタにおける遺伝子についてのそれぞれの時点（Ｘ軸）における平均発現（Ｙ軸）および標準偏差（エラーバー）。クラスタサイズ（「ｎ」）、エンリッチされる機能アノテーション（「Ｆ」）、および代表的な遺伝子（「Ｍ」）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、３つの主要な転写期を示す。時点のそれぞれのペア間の相関マトリックス（赤色（相関スケールの右側））：高；青色（相関スケールの左側）：低）を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、キーサイトカインおよび受容体分子の転写プロファイルを示す。対照活性化Ｔｈ０細胞に対するＴｈ１７極性化条件（ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６；左パネル、行につき正規化されたＺ）における１８個の時点（行）のそれぞれにおけるそれぞれの遺伝子（列）についての示差的発現レベル（ｌｏｇ２（比））を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、キーサイトカインおよび受容体分子の転写プロファイルを示す。対照活性化Ｔｈ０細胞に対するＴｈ１７極性化条件（ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６；左パネル、行につき正規化されたＺ）における１８個の時点（行）のそれぞれにおけるそれぞれの遺伝子（列）についての示差的発現レベル（ｌｏｇ２（比））を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｇは、Ｔｈ１７分化の動的調節ネットワークのモデルを示す一連のグラフおよび説明である。図２Ａは、計算分析の概要を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、時間的ネットワーク「スナップショット」の模式図を示す。３つの連続する図式ネットワーク（上段およびマトリックス列）を、エッジ（上段）およびマトリックス行（Ａ→Ｂ−上段行；Ａ→Ｃ−中段行；Ａ→Ｄ−下段行）として示される調節因子（Ａ）から標的（Ｂ、ＣおよびＤ）への考えられる３つの相互作用とともに示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、１８個のネットワーク「スナップショット」を示す。左：それぞれの行は、少なくとも１つのネットワーク中で生じるＴＦ−標的相互作用に対応し；列は、それぞれの時点におけるネットワークに対応する。紫色エントリー：相互作用は、そのネットワーク中で活性である。ネットワークを、活性相互作用の類似度によりクラスタリングし（系統樹、上段）、３つの時間的に連続するクラスタ（初期、中期、後期、下段）を形成する。右：選択調節因子についてのエッジを示すヒートマップ。
【図２Ｄ】図２Ｄは、動的調節因子活性を示す。それぞれの調節因子（行）について、１８個のネットワーク（列、左）のそれぞれにおける、および単純化（矢印）により得られた３つの基準ネットワーク（中央）のそれぞれにおける標的遺伝子の数（標的のその最大数により正規化）を示す。右：摂動について選択された調節因子（桃色）、公知のＴｈ１７調節因子（灰色）、および３つの基準ネットワークにわたる標的遺伝子の最大数（緑色、０〜２５０個の標的の範囲）。
【図２Ｅ】図２Ｅは、それぞれのネットワークの中心が、活性ＴＦをそれ自体でＴＦをコードする標的遺伝子に接続するその「転写回路」であることを示す。示される転写因子回路（３つの基準ネットワークのそれぞれにおいて）は、転写調節因子を、それ自体で転写調節因子をコードする標的に関連付ける推定ネットワークのそれぞれの一部である。黄色ノードは、それぞれの時間セグメントの間に過剰発現（Ｔｈ０と比較）される転写因子遺伝子を示す。エッジの色は、調節相互作用を支持するデータタイプを反映する（凡例）。
【図２Ｆ】図２Ｆは、それぞれのネットワークの中心が、活性ＴＦをそれ自体でＴＦをコードする標的遺伝子に接続するその「転写回路」であることを示す。示される転写因子回路（３つの基準ネットワークのそれぞれにおいて）は、転写調節因子を、それ自体で転写調節因子をコードする標的に関連付ける推定ネットワークのそれぞれの一部である。黄色ノードは、それぞれの時間セグメントの間に過剰発現（Ｔｈ０と比較）される転写因子遺伝子を示す。エッジの色は、調節相互作用を支持するデータタイプを反映する（凡例）。
【図２Ｇ】図２Ｇは、それぞれのネットワークの中心が、活性ＴＦをそれ自体でＴＦをコードする標的遺伝子に接続するその「転写回路」であることを示す。示される転写因子回路（３つの基準ネットワークのそれぞれにおいて）は、転写調節因子を、それ自体で転写調節因子をコードする標的に関連付ける推定ネットワークのそれぞれの一部である。黄色ノードは、それぞれの時間セグメントの間に過剰発現（Ｔｈ０と比較）される転写因子遺伝子を示す。エッジの色は、調節相互作用を支持するデータタイプを反映する（凡例）。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、ケイ素ナノワイヤを使用するＴｈ１７分化におけるノックダウンスクリーンを示す一連のグラフおよび説明である。図３Ａは、バイアスなしの摂動候補のランキングを示す。摂動についてのランキングに基づき左から右に順序付けされた遺伝子を示す（列、上位ランキングが最も左）。２つの上段マトリックス：「ネットワーク情報」（最上段）および「遺伝子発現情報」によるランキングについての基準。紫色エントリー：遺伝子は、特性を有する（特性強度に比例する強度；上位５つの特性は二元性である）。棒チャート：ランキングスコア。「摂動」行：暗灰色：ノックダウンにより良好に摂動された遺伝子とそれに続く高品質ｍＲＮＡ定量；淡灰色：ノックダウン作製を試みたが、十分なノックダウンを達成も維持もできず、または十分なレプリケートを得なかった遺伝子；黒色：ノックアウトにより摂動され、またはノックアウトデータが既に利用可能であった遺伝子。公知の行：橙色エントリー：遺伝子は、Ｔｈ１７機能に既に関連した（この情報は遺伝子をランキングするために使用しなかった；図１０Ａ、１０Ｂ）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、垂直ケイ素ナノワイヤ上で培養された初代Ｔ細胞の走査型電子顕微鏡写真を示す（疑似着色した紫色）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ケイ素ナノワイヤによる送達が、ナイーブＴ細胞の分化を活性化も誘導もせず、抗ＣＤ３／ＣＤ２８による慣用のＴＣＲ刺激に対するそれらの応答に影響しないことを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ナノワイヤ上で送達されたｓｉＲＮＡによる効率的なノックダウンを示す。極性化サイトカインの導入の４８時間後におけるノックダウン後に残留するｍＲＮＡの％（ｑＰＣＲによる、Ｙ軸：非標的化ｓｉＲＮＡ対照に対する平均±標準誤差、ｎ＝１２、左の黒色バー）を示す。図３Ｄにおいて、示される候補調節因子は、表５に列記されるものである。図３Ａにおいて、候補調節因子をｘ軸上に列記し、それらは左から右に以下の順である、ＲＯＲＣ、ＳＡＴＢ１、ＴＲＰＳ１、ＳＭＯＸ、ＲＯＲＡ、ＡＲＩＤ５Ａ、ＥＴＶ６、ＡＲＮＴＬ、ＥＴＳ１、ＵＢＥ２Ｂ、ＢＡＴＦ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ５Ａ、ＮＲ３Ｃ１、ＳＴＡＴ６、ＴＲＩＭ２４、ＨＩＦ１Ａ、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＥＴＳ２、ＪＵＮ、ＲＵＮＸ１、ＦＬＩ１、ＲＥＬ、ＳＰ４、ＥＧＲ２、ＮＦＫＢ１、ＺＦＰ２８１、ＳＴＡＴ４、ＲＥＬＡ、ＴＢＸ２１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＩＲＦ７、ＳＴＡＴ２、ＩＲＦ３、ＸＢＰ１、ＦＯＸＯ１、ＰＲＤＭ１、ＡＴＦ４、ＩＲＦ１、ＧＡＴＡ３、ＥＧＲ１、ＭＹＣ、ＣＲＥＢ１、ＩＲＦ９、ＩＲＦ２、ＦＯＸＪ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＲＰ５３、ＳＵＺ１２、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＣＥＢＰＢ、ＩＤ２、ＣＲＥＭ、ＭＹＳＴ４、ＭＸＩ１、ＲＢＰＪ、ＣＨＤ７、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＶＡＸ２、ＫＬＦ１０、ＳＫＩ、ＥＬＫ３、ＺＥＢ１、ＰＭＬ、ＳＥＲＴＡＤ１、ＮＯＴＣＨ１、ＬＲＲＦＩＰ１、ＡＨＲ、１８１０００７Ｍ１４ＲＩＫ、ＳＡＰ３０、ＩＤ１、ＺＦＰ２３８、ＶＡＶ１、ＭＩＮＡ、ＢＡＴＦ３、ＣＤＹＬ、ＩＫＺＦ４、ＮＣＯＡ１、ＢＣＬ３、ＪＵＮＢ、ＳＳ１８、ＰＨＦ１３、ＭＴＡ３、ＡＳＸＬ１、ＬＡＳＳ４、ＳＫＩＬ、ＤＤＩＴ３、ＦＯＳＬ２、ＲＵＮＸ２、ＴＬＥ１、ＡＴＦ３、ＥＬＬ２、ＡＥＳ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＪＡＲＩＤ２、ＫＬＦ９、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＬＦ６、Ｅ２Ｆ８、ＢＣＬ６、ＺＮＲＦ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＫＬＦ７、ＨＭＧＢ２、ＦＵＳ、ＳＩＲＴ２、ＭＡＦＦ、ＣＨＭＰ１Ｂ、ＧＡＴＡＤ２Ｂ、ＳＭＡＤ７、ＺＦＰ７０３、ＺＮＲＦ１、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＴＳＣ２２Ｄ４、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＮＦ１１、ＡＲＩＤ３Ａ、ＭＥＮ１、ＲＡＲＡ、ＣＢＸ４、ＺＦＰ６２、ＣＩＣ、ＨＣＬＳ１、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＴＧＩＦ１。
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、Ｔｈ１７ネットワーク中の結合および相互拮抗モジュールを示す一連のグラフおよび説明である。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図４Ａは、２７５個の遺伝子シグネチャーに対する摂動された遺伝子の影響を示す。４８時間（ならびに６０時間におけるＩＬ−２１ｒおよびＩＬ−１７ｒａＫＯ）における３９個の因子（列）のノックダウンまたはノックアウト（ＫＯ）後の２７５個のシグネチャー遺伝子（行）の発現の変化を示す。青色（変化倍率（ｌｏｇ２）スケールの左側）：調節因子の摂動後の標的の発現の減少（非標的化対照と比較）；赤色（変化倍率（ｌｏｇ２）スケールの右側）：発現の増加；灰色：有意でない；全色（すなわち、非灰色）エントリーは、有意である（実施例１の方法の部参照）。「摂動」（左）：調節因子としても摂動されるシグネチャー遺伝子（黒色エントリー）。キーシグネチャー遺伝子を右に示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、２つの結合および対立モジュールを示す。Ｔｈ１７シグネチャー遺伝子の「正の調節因子」（青色ノード、ｘ軸の左側）、「負の調節因子」（赤色ノード、ｘ軸の右側）、Ｔｈ１７シグネチャー遺伝子（灰色ノード、下段）および他のＣＤ４＋Ｔ細胞のシグネチャー遺伝子（灰色ノード、上段）を関連付ける摂動ネットワークを示す。ノードＡ〜Ｂの青色エッジは、ＡのノックダウンがＢを下方調節することを示し；赤色エッジは、ＡのノックダウンがＢを上方調節することを示す。淡灰色ハロー：Ｔ１７分化にこれまで関連しなかった調節因子。
【図４Ｃ】図４Ｃは、いかにノックダウン効果がネットワークモデル中のエッジを検証するかを示す。ベン図：図２ａの元のモデル中の因子についての標的のセット（桃色円）と、ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験におけるその因子のノックダウンに対して応答する遺伝子のセット（黄色円）との比較。下段の棒チャート：４つの因子についてのこの重複の有意性（Ｘ軸）についての−ｌｏｇ１０（Ｐ値）（Ｙ軸、超幾何検定）を示す。類似の結果が、ノンパラメトリック順位和検定（マン・ホイットニーＵ検定、実施例１の方法の部参照）について得られた。赤色点線：Ｐ＝０．０１。
【図４Ｄ】図４Ｄは、いかに全般的ノックダウン効果がクラスタにわたり一致するかを示す。ベン図：ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験における因子のノックダウンに対して応答する遺伝子のセット（黄色円）と、図１ｂの２０個のクラスタ（紫色円）のそれぞれとの比較。「正のＴｈ１７」調節因子のノックダウンは、誘導クラスタ中の遺伝子を抑制し、抑制クラスタ中の遺伝子を誘導することが予測された（「負のＴｈ１７」調節因子についてはその逆）。ヒートマップ：それぞれの調節因子ノックダウン（行）およびそれぞれのクラスタ（列）について、上記検定による有意な重複（非灰色エントリー）を示す。赤色（エンリッチメント倍率スケールの右側）：ノックダウン時の上方調節についてのエンリッチメント倍率；青色（エンリッチメント倍率スケールの左側）：ノックダウン時の下方調節についてのエンリッチメント倍率。上段行中の橙色エントリーは、誘導クラスタを示す。
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄは、Ｍｉｎａ、Ｆａｓ、Ｐｏｕ２ａｆ１、およびＴｓｃ２２ｄ３が、Ｔｈ１７分化プログラムに影響するキー新規調節因子であることを示す一連のグラフおよび説明である。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図５Ａ〜５Ｄ、左：異なるピボット調節因子（四角形ノード）：（図５Ａ）Ｍｉｎａ、（図５Ｂ）Ｆａｓ、（図５Ｃ）Ｐｏｕ２ａｆ１、および（図５Ｄ）Ｔｓｃ２２ｄ３に集中した調節ネットワークモデルを示す。それぞれのネットワークにおいて、摂動（赤色および青色点線エッジ）、ＴＦ結合（黒色実線エッジ）、またはその両方（赤色および青色実線エッジ）に基づきピボットノードに接続された標的および調節因子（円形ノード）を示す。ピボットノードの摂動により影響された遺伝子を着色する（青色：標的はピボットノードのノックダウンにより下方調節される；赤色：標的は上方調節される）。（図５Ａ〜５Ｃ、中央および右）Ｔｈ１７極性化サイトカイン（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）を用いてまたは用いずに抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８によりインビトロで活性化されたそれぞれのＫＯマウスからのインビトロ分化細胞の７２時間における培養上清に対するＥＬＩＳＡおよびサイトメトリックビーズアッセイ（ＣＢＡ）による細胞内染色およびサイトカインアッセイ。（図５Ｄ、中央）Ｔｓｃ２２ｄ３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ。Ｔｓｃ２２ｄ３と多数のＴｈ１７基準因子との間の結合遺伝子（暗灰色）または結合領域（淡灰色）の重複の比率（Ｘ軸）を示す。全ての結果は、統計的に有意である（Ｐ＜１０−６；実施例１の方法の部参照）。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄは、Ｍｉｎａ、Ｆａｓ、Ｐｏｕ２ａｆ１、およびＴｓｃ２２ｄ３が、Ｔｈ１７分化プログラムに影響するキー新規調節因子であることを示す一連のグラフおよび説明である。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図５Ａ〜５Ｄ、左：異なるピボット調節因子（四角形ノード）：（図５Ａ）Ｍｉｎａ、（図５Ｂ）Ｆａｓ、（図５Ｃ）Ｐｏｕ２ａｆ１、および（図５Ｄ）Ｔｓｃ２２ｄ３に集中した調節ネットワークモデルを示す。それぞれのネットワークにおいて、摂動（赤色および青色点線エッジ）、ＴＦ結合（黒色実線エッジ）、またはその両方（赤色および青色実線エッジ）に基づきピボットノードに接続された標的および調節因子（円形ノード）を示す。ピボットノードの摂動により影響された遺伝子を着色する（青色：標的はピボットノードのノックダウンにより下方調節される；赤色：標的は上方調節される）。（図５Ａ〜５Ｃ、中央および右）Ｔｈ１７極性化サイトカイン（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）を用いてまたは用いずに抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８によりインビトロで活性化されたそれぞれのＫＯマウスからのインビトロ分化細胞の７２時間における培養上清に対するＥＬＩＳＡおよびサイトメトリックビーズアッセイ（ＣＢＡ）による細胞内染色およびサイトカインアッセイ。（図５Ｄ、中央）Ｔｓｃ２２ｄ３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ。Ｔｓｃ２２ｄ３と多数のＴｈ１７基準因子との間の結合遺伝子（暗灰色）または結合領域（淡灰色）の重複の比率（Ｘ軸）を示す。全ての結果は、統計的に有意である（Ｐ＜１０−６；実施例１の方法の部参照）。
【図５Ｃ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄは、Ｍｉｎａ、Ｆａｓ、Ｐｏｕ２ａｆ１、およびＴｓｃ２２ｄ３が、Ｔｈ１７分化プログラムに影響するキー新規調節因子であることを示す一連のグラフおよび説明である。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図５Ａ〜５Ｄ、左：異なるピボット調節因子（四角形ノード）：（図５Ａ）Ｍｉｎａ、（図５Ｂ）Ｆａｓ、（図５Ｃ）Ｐｏｕ２ａｆ１、および（図５Ｄ）Ｔｓｃ２２ｄ３に集中した調節ネットワークモデルを示す。それぞれのネットワークにおいて、摂動（赤色および青色点線エッジ）、ＴＦ結合（黒色実線エッジ）、またはその両方（赤色および青色実線エッジ）に基づきピボットノードに接続された標的および調節因子（円形ノード）を示す。ピボットノードの摂動により影響された遺伝子を着色する（青色：標的はピボットノードのノックダウンにより下方調節される；赤色：標的は上方調節される）。（図５Ａ〜５Ｃ、中央および右）Ｔｈ１７極性化サイトカイン（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）を用いてまたは用いずに抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８によりインビトロで活性化されたそれぞれのＫＯマウスからのインビトロ分化細胞の７２時間における培養上清に対するＥＬＩＳＡおよびサイトメトリックビーズアッセイ（ＣＢＡ）による細胞内染色およびサイトカインアッセイ。（図５Ｄ、中央）Ｔｓｃ２２ｄ３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ。Ｔｓｃ２２ｄ３と多数のＴｈ１７基準因子との間の結合遺伝子（暗灰色）または結合領域（淡灰色）の重複の比率（Ｘ軸）を示す。全ての結果は、統計的に有意である（Ｐ＜１０−６；実施例１の方法の部参照）。
【図５Ｄ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄは、Ｍｉｎａ、Ｆａｓ、Ｐｏｕ２ａｆ１、およびＴｓｃ２２ｄ３が、Ｔｈ１７分化プログラムに影響するキー新規調節因子であることを示す一連のグラフおよび説明である。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図５Ａ〜５Ｄ、左：異なるピボット調節因子（四角形ノード）：（図５Ａ）Ｍｉｎａ、（図５Ｂ）Ｆａｓ、（図５Ｃ）Ｐｏｕ２ａｆ１、および（図５Ｄ）Ｔｓｃ２２ｄ３に集中した調節ネットワークモデルを示す。それぞれのネットワークにおいて、摂動（赤色および青色点線エッジ）、ＴＦ結合（黒色実線エッジ）、またはその両方（赤色および青色実線エッジ）に基づきピボットノードに接続された標的および調節因子（円形ノード）を示す。ピボットノードの摂動により影響された遺伝子を着色する（青色：標的はピボットノードのノックダウンにより下方調節される；赤色：標的は上方調節される）。（図５Ａ〜５Ｃ、中央および右）Ｔｈ１７極性化サイトカイン（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）を用いてまたは用いずに抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８によりインビトロで活性化されたそれぞれのＫＯマウスからのインビトロ分化細胞の７２時間における培養上清に対するＥＬＩＳＡおよびサイトメトリックビーズアッセイ（ＣＢＡ）による細胞内染色およびサイトカインアッセイ。（図５Ｄ、中央）Ｔｓｃ２２ｄ３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ。Ｔｓｃ２２ｄ３と多数のＴｈ１７基準因子との間の結合遺伝子（暗灰色）または結合領域（淡灰色）の重複の比率（Ｘ軸）を示す。全ての結果は、統計的に有意である（Ｐ＜１０−６；実施例１の方法の部参照）。
【図６Ａ】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、３日間のＴＧＦ−β１およびＩＬ−６によるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の処理が、Ｔｈ１７細胞の分化を誘導することを示す一連のグラフおよび説明である。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図６Ａは、時間経過実験の概要を示す。ナイーブＴ細胞をＷＴマウスから単離し、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β１により処理した。次いで、マイクロアレイを使用して全般的ｍＲＮＡレベルを１８個の異なる時点において計測した（０．５時間〜７２時間、実施例１の方法の部参照）。対照として、同一の１８個の時点において回収されたＴｈ０条件下の同一のＷＴナイーブＴ細胞を使用した。最後の４つの時点（４８時間〜７２時間）について、細胞をＩＬ−６、ＴＧＦ−β１、およびＩＬ−２３により処理し、プロファイリングもした。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β１極性化条件によるＴｈ１７細胞の生成を示す。ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６により分化させたナイーブＴ細胞のＦＡＣＳ分析（右）は、ＩＬ−１７産生Ｔｈ１７Ｔ細胞についてのエンリッチメントを示し；これらの細胞は、Ｔｈ０対照においては観察されない。
【図６Ｃ】図６Ｃは、得られたマイクロアレイプロファイルと、ナイーブＴ細胞および分化Ｔｈ１７細胞からの公開データ（Ｗｅｉ  ｅｔ．ａｌ，２００９；Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｏｐ，Ｍ．＆Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．１０  Ｒ２５（２００９））との比較を示す。１８個のプロファイル（時点により順序付け、Ｘ軸）のそれぞれと、ナイーブＴ細胞プロファイル（青色）または分化Ｔｈ１７プロファイル（緑色）のいずれかとの間のピアソン相関係数（Ｙ軸）を示す。発現プロファイルは、ナイーブ様状態（ｔ＝０．５時間において、ｒ２＞０．８、ｐ＜１０−１０）からＴｈ１７分化状態（ｔ＝７２時間において、ｒ２＞０．６５、ｐ＜１０−１０）に徐々に移行する。
【図６Ｄ】図６Ｄは、キーサイトカインの発現を示す。キーＴｈ１７遺伝子ＲＯＲｃ（左）およびＩＬ−１７ａ（中央）（両方誘導）、ならびにサイトカインＩＦＮ−γ（時間経過において不変）について、Ｔｈ１７極性化（青色）およびＴｈ０対照（赤色）条件において１８個の時点（Ｘ軸）のそれぞれにおいて計測されたｍＲＮＡレベル（Ｙ軸）を示す。
【図７】Ｔｈ１７時間経過データにおいて示差的に発現された遺伝子のクラスタを示す一連のグラフである。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図１ｂの２０個のクラスタのそれぞれについて、Ｔｈ１７極性化（青色）およびＴｈ０（赤色）条件下のそれぞれの時点（Ｘ軸）における平均発現レベル（Ｙ軸、±標準偏差、エラーバー）を示す。クラスタサイズ（「ｎ」）、エンリッチされる機能アノテーション（「Ｆ」）、および代表的なメンバー遺伝子（「Ｍ」）を、上段に示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、ＩＬ−２３の転写効果を示す一連のグラフである。図８Ａは、キー遺伝子の転写プロファイルを示す。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。Ｔｈ１７極性化条件（青色）、Ｔｈ０対照（赤色）、およびＴｈ１７極性化条件へのＩＬ−２３の添加（分化の４８時間後に開始）後（緑色）におけるそれぞれの時点（Ｘ軸）における３つのキー遺伝子（ＩＬ−２２、ＲＯＲｃ、ＩＬ−４）の発現レベル（Ｙ軸）を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＩＬ−２３依存性転写クラスタを示す。Ｔｈ１７極性化サイトカインおよびＩＬ２３の両方により処理されたＷＴ細胞（赤色）と比較してＩＬ−２３ｒ−／−時間経過データ（青色）において示差的に発現された遺伝子のクラスタを示す。それぞれのクラスタについて、ノックアウト（青色）および野生型（赤色）細胞におけるそれぞれの時点（Ｘ軸）における平均発現レベル（Ｙ軸、±標準偏差、エラーバー）を示す。クラスタサイズ（「ｎ」）、エンリッチされる機能アノテーション（「Ｆ」）、および代表的なメンバー遺伝子（「Ｍ」）を、上段に示す。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、Ｔｈ１７分化の間のＲＯＲ−γｔの予測および検証されたタンパク質レベルを示す一連のグラフである。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図９Ａは、マイクロアレイにより計測された、Ｔｈ１７極性化条件下の元の時間経過に沿ったＲＯＲγｔのｍＲＮＡレベルを示す（青色）。ｍＲＮＡレベルについてのシグモイドフィット（緑色）を、それぞれの時点におけるＲＯＲγｔタンパク質のレベルを予測するモデル（Ｓｃｈｗａｎｈａｕｓｓｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３３７−３４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１００９８（２０１１）に基づく）についてのインプットとして使用する（赤色）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、刺激の４、１２、２４、および４８時間後においてＴｈ１７極性化条件（青色）およびＴｈ０条件（赤色）においてＦＡＣＳ分析により決定された計測ＲＯＲ−γｔタンパク質レベル（ｘ軸）の分布を示す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ノックダウンについての候補をランキングするための予測特性を示す一連のグラフである。異なる（図１０Ａ）ネットワークベース特性および（図１０Ｂ）発現ベース特性（図３Ａにおいて使用）についての公知のＴｈ１７因子のキュレートされたリストにおけるエンリッチメント倍率（Ｙ軸、全てのケースにおいて、ｐ＜１０−３、超幾何検定）を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、Ｔ細胞に対するナノワイヤ活性化、１０時間におけるノックダウン、ならびにＮＷベースノックダウンおよび得られた表現型の一致性を示す一連のグラフである。図１１Ａは、いかにナノワイヤがＴ細胞を活性化させず、生理学的刺激を干渉しないかを示す。極性化サイトカインを用いず（「サイトカインなし」）またはＴｈ１７極性化サイトカインの存在下で（「ＴＧＦ−β１＋ＩＬ６」）ペトリ皿中で（左）またはケイ素ナノワイヤ上で（右）増殖させたＴ細胞中の、ｑＰＣＲ（Ｙ軸、平均および平均の標準誤差）により活性化の４８時間後に計測されたキー遺伝子についてのｍＲＮＡのレベル（平均±標準誤差、ｎ＝３）を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ナノワイヤ上で送達されたｓｉＲＮＡによる効率的なノックダウンを示す。極性化サイトカインの導入の１０時間後におけるノックダウン後に残留するｍＲＮＡの％（ｑＰＣＲによる、Ｙ軸：平均±非標的化ｓｉＲＮＡ対照に対する標準誤差、ｎ＝１２、左の黒色バー）を示す。表示される遺伝子は、転写プロファイリングに選択された３９個の遺伝子の上位セットである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃ。ＮＷベースノックダウンおよび得られた表現型の一致性。刺激の４８時間後における９つの遺伝子のＮＷベースノックダウン（少なくとも２つの異なる培養物から）の３つの異なる実験についての平均標的転写低減および表現型変化（ＩＬ−１７ｆおよびＩＬ−１７ａ発現により計測）を示す。右青色バー：ノックダウンレベル（ｓｉＲＮＡ対照に対する残留％）；暗灰色および淡緑色バー：ぞれぞれ、ｓｉＲＮＡ対照に対するＩＬ−１７ｆおよびＩＬ−１７ａのｍＲＮＡ。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ９６×９６遺伝子発現チップを使用するそれぞれのナノワイヤ送達ノックダウンについてのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ発現プロファイルの交差検証を示す一連のグラフである。図１２Ａは、同一摂動下で同一遺伝子についてＦｌｕｉｄｉｇｍ（Ｙ軸）およびＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ（Ｘ軸）により計測された発現レベルの比較を示す。発現値を、実施例１に記載のとおり対照遺伝子に対して正規化した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、いかにＦｌｕｉｄｉｇｍデータの分析が標的化因子の正および負のＴｈ１７調節因子の２つのモジュールへの分類を概括するかを示す。少なくとも１つの因子ノックダウン（列）に対して有意に応答した８５個の遺伝子シグネチャー（行）のうちの８２個の遺伝子の転写の変化を示す。
【図１３】刺激の１０時間〜４８時間後のＴｈ１７「機能」ネットワークの再配線を示すグラフである。１０時間および４８時間においてプロファイリングされたそれぞれの調節因子について、２つの時点において同一の活性化／抑制論理で現れる（持続性）；１つの時点においてのみ現れる（一過性）；または両方のネットワーク中に異なる活性化／抑制論理で現れる（反転性）「エッジ」（すなわち、遺伝子Ａは、遺伝子Ｂの摂動により影響される）の割合を算出した。持続的エッジにおいて、摂動効果（変化倍率）は、時点の少なくとも１つにおいて有意であり（実施例１の方法の部参照）、他の時点において一致しなければならない（活性化／抑制に関して）（１．２５倍のより許容性のカットオフを使用）。
【図１４】「有色」ネットワークモチーフを示す説明である。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。「有色」ネットワークモチーフ分析を使用し、同一のトポロジーならびに同一のノードおよびエッジ色を有する反復サブネットワークを見出した。４つの有意にエンリッチされたモチーフを示す（ｐ＜０．０５）。赤色ノード：正の調節因子；青色；負の調節因子；Ａ〜Ｂの赤色エッジ：ＡのノックダウンがＢを下方調節する；青色エッジ：ＡのノックダウンがＢを上方調節する。モチーフは、ＦＡＮＭＯＤソフトウェア（Ｗｅｒｎｉｃｋｅ，Ｓ．＆Ｒａｓｃｈｅ，Ｆ．ＦＡＮＭＯＤ：ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｏｔｉｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２，１１５２−１１５３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｌ０３８（２００６））を使用して見出した。
【図１５Ａ】図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、ナノワイヤ送達ノックダウンのＲＮＡ−ｓｅｑ分析を示す一連のグラフである。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。図１５Ａは、ノックダウンプロファイルの相関マトリックスを示す。ノックダウンにより摂動された調節因子のＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイル（ＮＴ  ｓｉＲＮＡ対照に対する変化倍率）間のスピアマン順位相関係数を示す。試料のいずれにおいても有意に示差的に発現されなかった遺伝子をプロファイルから除外した。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、異なるＣＤ４＋Ｔ細胞系統の公知のマーカー遺伝子に対するノックダウン効果を示す。１２個の調節因子（列）のそれぞれのノックダウン後の異なるＴ細胞系統（右に表記）の基準遺伝子（行）についての発現レベルを示す。赤色／青色：非標的化対照と比較したノックダウンにおける遺伝子発現の増加／減少（実施例１の方法の部参照）。少なくとも１つのノックダウン条件において有意に示差的に発現される遺伝子のみを示す。実験を階層的にクラスタリングし、正のＴｈ１７調節因子（左）および負のＴｈ１７調節因子（右）についての区別されるクラスタを形成する。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｘｐ３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７，７８６−８００，ｄｏｉ：Ｓ１０７４−７６１３（０７）００４９２−Ｘ［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００７．０９．０１０（２００７）により定義されるＴ制御性細胞シグネチャーの２つのサブクラスタに対するノックダウン効果を示す。それぞれのクラスタ（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌにおいてクラスタ１および５としてアノテートされる）は、慣用のＴ細胞と比較してＴｒｅｇ細胞中で過剰発現される遺伝子を含む。しかしながら、クラスタ１中の遺伝子は、Ｆｏｘｐ３により相関性であり、Ｆｏｘｐ３形質導入に対して応答性である。逆に、クラスタ１中の遺伝子は、Ｔｒｅｇ細胞中でＴＣＲおよびＩＬ−２に対してより直接応答性であり、Ｆｏｘｐ３に対して低応答性である。正のＴｈ１７調節因子のノックダウンは、「Ｆｏｘｐ３」クラスタ１中の遺伝子の発現を強力に誘導する。ノックダウンプロファイルを階層的にクラスタリングし、正のＴｈ１７調節因子（左）および負のＴｈ１７調節因子（右）についての区別されるクラスタを形成する。赤色／青色：非標的化対照と比較したノックダウンにおける遺伝子発現の増加／減少（実施例１の方法の部参照）。少なくとも１つのノックダウン条件において有意に示差的に発現される遺伝子のみを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、および１６Ｄは、フローサイトメトリーおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する、インビトロ分化の７２時間におけるノックアウト細胞中のサイトカイン産生の定量を示す一連のグラフである。示される全てのフローサイトメトリー図は、Ｏｃｔ１を除き、少なくとも３つの繰り返しを代表し、全てのＥＬＩＳＡデータは、少なくとも３つのレプリケートを有する。Ｏｃｔ１については、制限量の細胞のみが再構築マウスから利用可能であり、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡのためにＯｃｔ１欠損マウスの２つの繰り返しのみを考慮した。（図１６Ａ、左）Ｔｈ０対照下で活性化されたＭｉｎａ−／−Ｔ細胞は、図５Ａに示されるグラフについての対照である。（図１６Ａ、右）Ｍｉｎａ−／−Ｔ細胞が対照と比較して多くのＴＮＦを産生することを示すサイトメトリックビーズアッセイにより計測されたＭｉｎａ−／−およびＷＴ細胞によるＴＮＦ分泌。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、フローサイトメトリーにより計測されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７ａについてのＰｏｕ２ａｆ１−／−およびＷＴ細胞の細胞内サイトカイン染色を示す。
【図１６Ｃ】（図１６Ｃ、左）Ｆｏｘｐ３およびＩｌ−１７発現についてのＦａｓ−／−およびＷＴ細胞のフローサイトメトリー分析。（図１６Ｃ、右）サイトカインビーズアッセイＥＬＩＳＡにより計測されたＦａｓ−／−およびＷＴ細胞によるＩＬ−２およびＴｎｆ分泌。
【図１６Ｄ】（図１６Ｄ、左）Ｏｃｔ１欠損マウスについてのＴｈ０条件におけるＩＦＮ−γ陽性細胞の増加を示す、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７ａについてのＯｃｔ１−／−およびＷＴ細胞に対するフローサイトメトリー。（図１６Ｄ、右）サイトカインＥＬＩＳＡおよびサイトメトリックビーズアッセイにより計測されたＯｃｔ１−／−およびＷＴ細胞によるＩｌ−１７ａ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ産生。ＥＬＩＳＡ図における統計的有意性を、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１により示す。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｚｅｂ１、Ｓｍａｒｃａ４、およびＳｐ４がＴｈ１７分化プログラムに影響するキー新規調節因子であることを示す一連の説明である。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。異なるピボット調節因子（四角形ノード）：（図１７Ａ）Ｚｅｂ１およびＳｍａｒｃａ４、ならびに（図１７Ｂ）Ｓｐ４に集中した調節ネットワークモデルを示す。それぞれのネットワークにおいて、摂動（赤色および青色点線エッジ）、ＴＦ結合（黒色実線エッジ）、またはその両方（赤色および青色実線エッジ）に基づきピボットノードに接続された標的および調節因子（円形ノード）を示す。ピボットノードの摂動により影響された遺伝子を着色する（赤色：標的はピボットノードのノックダウンにより上方調節される；青色：標的は下方調節される）。
【図１８】Ｃｉｏｆａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｅｌｌ，２０１２）からのＣｈＩＰ−ｓｅｑおよびＲＮＡ−ｓｅｑデータとの重複を示すグラフである。エンリッチメント倍率を、ＣｈＩＰ−ｓｅｑおよびＲＮＡ−ｓｅｑを使用してＣｉｏｆａｎｉ  ｅｔ  ａｌにより試験され、３つのネットワークモデル（初期、中期（「中期」として示す）、および後期）における調節因子として予測される４つのＴＦについて示す。結果を、Ｃｉｏｆａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．のＣｈＩＰ−ｓｅｑベースネットワーク（青色）と、およびそれらの組合せＣｈＩＰ−ｓｅｑ／ＲＮＡ−ｓｅｑネットワーク（著者らにより記載の１．５のスコアカットオフを考慮；赤色）と比較する。全てのケースにおいて、重複（ＣｈＩＰ−ｓｅｑのみとの、または組合せＣｈＩＰ−ｓｅｑ／ＲＮＡ−ｓｅｑネットワークとの）のｐ値は、１０−１０（フィッシャーの正確検定を使用）未満であるが、エンリッチメント倍率は、因子により結合され、そのノックアウトにより影響される遺伝子において特に高く、それは最も機能的なエッジである。
【図１９Ａ】図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、および１９Ｄは、ＰＲＯＣＲが、ＴＧＦ−β１とＩＬ−６により誘導されたＴｈ１７細胞中で特異的に誘導されることを示す一連のグラフである。図１９Ａは、いかにＰＲＯＣＲ発現レベルを１８個の異なる時点におけるＴｈ０およびＴｈ１７条件下のマイクロアレイ分析により評価したかを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、いかにＰＲＯＣＲ  ｍＲＮＡの動的発現を、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６により分化させたＴｈ１７細胞における定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により計測したかを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、いかにＰＲＯＣＲ  ｍＲＮＡ発現を、それぞれのサイトカインによる刺激の７２時間後の異なるＴ細胞サブセットにおける定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により計測したかを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、いかにＰＲＯＣＲタンパク質発現を、それぞれのサイトカインによる刺激の７２時間後の異なるＴ細胞サブセットにおけるフローサイトメトリーにより試験したかを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、および２０Ｄは、ＰＲＯＣＲ刺激および発現が、Ｔｈ１７細胞からのサイトカイン産生に不可欠でないことを示す一連のグラフである。図２０Ａは、いかにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＰＲＯＣＲリガンドである活性化プロテインＣ（ａＰＣ、３００ｎＭ）の存在下の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激によりＴｈ１７細胞に分化させたかを示す。３日目、細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンにより４時間刺激し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７について細胞内染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、活性化プロテインＣ（ａＰＣおよび対照、それぞれ）を用いてまたは用いずに分化させたＴｈ１７細胞（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）からのＩＬ−１７産生を、３および５日目にＥＬＩＳＡにより評価したことを示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、いかにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１７条件（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）下で極性化し、ＧＦＰ対照レトロウイルス（対照ＲＶ）またはＰＲＯＣＲ発現レトロウイルス（ＰＲＯＣＲ  ＲＶ）のいずれかにより形質導入したかを示す。ＧＦＰ＋細胞中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の細胞内発現を、フローサイトメトリーにより評価した。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、いかにＥＰＣＲδ／δマウスおよび対照マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６によるＴｈ１７条件下で極性化されたかを示す。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の細胞内発現を、フローサイトメトリーにより評価した。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、ＰＲＯＣＲ発現が、Ｔｈ１７細胞上の共刺激分子の発現のわずかな変化を誘導するにすぎないことを示す一連のグラフである。図２１Ａは、いかにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１７条件（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）下で極性化し、ＧＦＰ対照レトロウイルス（対照ＧＦＰ）またはＰＲＯＣＲ発現レトロウイルス（ＰＲＯＣＲ  ＲＶ）のいずれかにより形質導入し、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰｄｐおよびＴｉｍ−３の発現をフローサイトメトリーにより分析したかを示す。図２１Ｂは、いかにナイーブ野生型（ＷＴ）またはＥＰＣＲδ／δＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激によりＴｈ１７細胞に分化したかを示す。ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰｄｐおよびＴｉｍ−３の発現を、フローサイトメトリーにより評価した。
【図２２Ａ】図２２Ａ、２２Ｂ、および２２Ｃは、ＰＲＯＣＲが非病原性Ｔｈ１７細胞中で発現されることを示す一連のグラフである。図２２Ａは、ＴＧＦ−β３＋ＩＬ−６（病原性）またはＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６（非病原性）により分化させたＴｈ１７細胞についての遺伝子およびそれらの２つのサブセットにおけるそれらの発現レベルの比較を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂおよび２２Ｃは、いかにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６、ＴＧＦ−β３およびＩＬ−６またはＩＬ−１βおよびＩＬ−６により分化させ、ＰＲＯＣＲ発現を（図２２Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により評価し（図２２Ｃ）、タンパク質発現をフローサイトメトリーにより測定したかを示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｂおよび２２Ｃは、いかにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６、ＴＧＦ−β３およびＩＬ−６またはＩＬ−１βおよびＩＬ−６により分化させ、ＰＲＯＣＲ発現を（図２２Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により評価し（図２２Ｃ）、タンパク質発現をフローサイトメトリーにより測定したかを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ、２３Ｂ、および２３Ｃは、ＰＲＯＣＲ刺激または発現が、Ｔｈ１７細胞中の一部の病原性シグネチャー遺伝子を損なうことを示す一連のグラフである。図２３Ａは、インビトロで３日間、活性化プロテインＣ（ａＰＣ）の存在下でＴＧＦβ１およびＩＬ−６により分化させたＴｈ１７細胞中のいくつかの病原性シグネチャー遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、３日間、ＧＦＰ対照レトロウイルス（対照ＲＶ）またはＰＲＯＣＲ発現レトロウイルス（ＰＲＯＣＲ  ＲＶ）のいずれかにより形質導入され、Ｔｈ１７条件下で極性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞中のいくつかの病原性シグネチャー遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、インビトロで３日間、ＴＧＦβ１およびＩＬ−６により分化させたＥＰＣＲδ／δマウスおよび対照マウスからのＴｈ１７細胞中のいくつかの病原性シグネチャー遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２４Ａ】図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、および２４Ｄは、Ｒｏｒγｔが、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６により極性化されるＴｈ１７条件下でＰＲＯＣＲ発現を誘導することを示す一連のグラフである。図２４Ａは、ＲｏｒγｔのＣｈＩＰ−Ｓｅｑを示す。ＰＲＯＣＲゲノム領域を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、いかにＴｈ１７細胞中のＰｒｏｃｒプロモーターへのＲｏｒγｔの結合を、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）により評価したかを示す。ＣｈＩＰは、Ｔｈ１７細胞からの消化クロマチンおよび抗Ｒｏｒγｔ抗体を使用して実施した。ＤＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、いかにＲｏｒγｔ−／−マウスおよび対照マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６によるＴｈ１７条件下ならびにＴｈ０条件下（サイトカインなし）で極性化させ、ＰＲＯＣＲ発現を３日目にフローサイトメトリーにより分析したかを示す。
【図２４Ｄ】図２４Ｄは、いかにＴｈ１７条件下で極性化させたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、３日間、ＧＦＰ対照レトロウイルス（対照ＲＶ）またはＲｏｒγｔ発現レトロウイルス（ＲｏｒγｔＲＶ）のいずれかにより形質導入したかを示す。ＰＲＯＣＲ  ｍＲＮＡ発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により計測し、ＰＲＯＣＲタンパク質発現をフローサイトメトリーにより評価した。
【図２５Ａ】図２５Ａ、２５Ｂ、および２５Ｃは、ＩＲＦ４およびＳＴＡＴ３が、Ｐｒｏｃｒプロモーターに結合し、ＰＲＯＣＲ発現を誘導することを示す一連のグラフである。図２５Ａは、いかにＰｒｏｃｒプロモーターへのＩＲＦ４またはＳＴＡＴ３の結合を、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）−ＰＣＲにより評価したかを示す。ＣｈＩＰは、Ｔｈ１７細胞から消化クロマチンおよび抗ＩＲＦ４または抗ＳＴＡＴ３抗体を使用して実施した。ＤＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、いかにＣｄ４ＣｒｅＳＴＡＴ３ｆｌ／ｆｌマウス（ＳＴＡＴ３ＫＯ）および対照マウス（ＷＴ）からのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＴＧＦ−β１とＩＬ−６によるＴｈ１７条件下で、およびサイトカインなしのＴｈ０条件下で極性化させたかを示す。３日目、ＰＲＯＣＲ発現を定量的ＰＣＲにより測定した。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、いかにＣｄ４ＣｒｅＩＲＦ４ｆｌ／ｆｌマウスおよび対照マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６によるＴｈ１７条件下で、ならびにサイトカインなしのＴｈ０条件下で極性化させたかを示す。３日目、ＰＲＯＣＲ発現をフローサイトメトリーにより測定した。
【図２６Ａ】図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、および２６Ｄは、ＰＲＯＣＲ欠損がＥＡＥ重症度を悪化させることを示す一連のグラフおよび説明である。図２６Ａは、ＭＯＧ３５−５５による免疫化の２１日後にＥＡＥマウスから単離されたＩＬ−１７およびＰＲＯＣＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、いかにＥＡＥが、対照レトロウイルス（対照＿ＧＦＰ）またはＰＲＯＣＲ発現レトロウイルス（ＰＲＯＣＲ＿ＲＶ）により形質導入されたＭＯＧ３５−５５特異的２Ｄ２細胞の養子移植により誘導され、Ｔｈ１７細胞に分化されたかを示す。それぞれの群についての平均臨床スコアおよびまとめを示す。結果は、２つの実験の一方の代表物である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、いかにＲａｇ１−／−マウスを、ＰＲＯＣＲ欠損（ＥＰＣＲδ／δ→Ｒａｇ１−／−）またはＷＴ  Ｔ細胞（ＷＴ→Ｒａｇ１−／−）のいずれかにより再構築し、ＥＡＥを誘導するためにＭＯＧ３５−５５により免疫化したかを示す。それぞれの群の平均臨床スコアを示す。結果は、２つの実験の一方の代表物である。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ＰＲＯＣＲ調節の模式的表示を示す。Ｒｏｒγｔ、ＩＲＦ４、およびＳＴＡＴ３は、ＰＲＯＣＲ発現を誘導する。活性化プロテインＣによるＰＲＯＣＲライゲーションは、病原性シグネチャー遺伝子ＩＬ−３、ＣＸＣＬ３、ＣＣＬ４およびＰｄｐの下方調節を誘導し、ＥＡＥの病原性を低減させた。
【図２７Ａ】図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃは、ＦＡＳがＴｈ１７分化を促進することを示す一連のグラフである。野生型（ＷＴ）またはＦＡＳ欠損（ＬＰＲ）マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２３の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激によりＴｈ１７細胞に分化させた。４日目、細胞を（図２７Ａ）ＰＭＡおよびイオノマイシンにより４時間刺激し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７について細胞内染色し、フローサイトメトリーにより分析し、（図２７Ｂ）ＩＬ−１７産生をＥＬＩＳＡにより評価した。
【図２７Ｂ】図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃは、ＦＡＳがＴｈ１７分化を促進することを示す一連のグラフである。野生型（ＷＴ）またはＦＡＳ欠損（ＬＰＲ）マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−２３の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激によりＴｈ１７細胞に分化させた。４日目、細胞を（図２７Ａ）ＰＭＡおよびイオノマイシンにより４時間刺激し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７について細胞内染色し、フローサイトメトリーにより分析し、（図２７Ｂ）ＩＬ−１７産生をＥＬＩＳＡにより評価した。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、いかにＲＮＡを抽出し、ＩＬ１７ａおよびＩｌ２３ｒのｍＲＮＡの発現を定量的ＰＣＲにより測定したかを示す。
【図２８Ａ】図２８Ａ、２８Ｂ、および２８Ｃは、ＦＡＳがＴｈ１分化を阻害することを示す一連のグラフである。野生型（ＷＴ）またはＦＡＳ欠損（ＬＰＲ）マウスからナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激によりＴｈ１細胞に分化させた。４日目、細胞を（図２８Ａ）ＰＭＡおよびイオノマイシンにより４時間刺激し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７について細胞内染色し、フローサイトメトリーにより分析し、（図２８Ｂ）ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡにより評価した。
【図２８Ｂ】図２８Ａ、２８Ｂ、および２８Ｃは、ＦＡＳがＴｈ１分化を阻害することを示す一連のグラフである。野生型（ＷＴ）またはＦＡＳ欠損（ＬＰＲ）マウスからナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激によりＴｈ１細胞に分化させた。４日目、細胞を（図２８Ａ）ＰＭＡおよびイオノマイシンにより４時間刺激し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７について細胞内染色し、フローサイトメトリーにより分析し、（図２８Ｂ）ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡにより評価した。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、いかにＲＮＡを抽出し、ＩｆｎｇのｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲにより測定したかを示す。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、ＦＡＳがＴｒｅｇ分化を阻害することを示す一連のグラフである。野生型（ＷＴ）またはＦＡＳ欠損（ＬＰＲ）マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＴＧＦ−βの存在下で抗ＣＤ３／抗−ＣＤ２８刺激によりＴｒｅｇに分化させた。４日目、細胞を（図２９Ａ）ＰＭＡおよびイオノマイシンにより４時間刺激し、ＩＬ−１７およびＦｏｘｐ３について細胞内染色し、フローサイトメトリーにより分析し、（図２９Ｂ）ＩＬ−１０産生をＥＬＩＳＡにより評価した。
【図３０Ａ】図３０Ａおよび３０Ｂは、ＦＡＳ欠損マウスがＥＡＥに対して抵抗性であることを示す一連のグラフである。野生型（ＷＴ）またはＦＡＳ欠損（ＬＰＲ）マウスを、１００μｇのＭＯＧ３５−５５によりＣＦＡ中、皮下注射で免疫化し、百日咳毒素を静脈内注射で与えてＥＡＥを誘導した。図３０Ａは、示されるそれぞれの群の平均臨床スコア±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、１４日目にいかにＣＮＳ浸潤リンパ球を単離し、ＰＭＡおよびイオノマイシンにより４時間再刺激し、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、およびＦｏｘｐ３について細胞内染色したかを示す。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【図３１】図３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃおよび３１Ｄは、ＰＲＯＣＲがＴｈ１７細胞上で発現されることを示す一連のグラフおよび説明である。図３１Ａは、ＰＲＯＣＲ、そのリガンドの活性化プロテインＣおよびシグナリングアダプターのＰＡＲ１の模式的表示を示す。図３１Ｂは、いかにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、示されるＴヘルパー細胞系統についての極性化条件下で分化させたかを示す。ＰＲＯＣＲの発現を３日目に定量的ＰＣＲにより測定した。図３１Ｃは、いかにマウスをＥＡＥのために免疫化し、細胞を疾患のピークにおいて単離し、サイトカイン産生（ＩＬ−１７）およびＰＲＯＣＲ発現をフローサイトメトリーにより分析したかを示す。図３１Ｄは、いかにナイーブおよびメモリー細胞をＷＴおよびＰＲＯＣＲｄ／ｄマウスから単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８により刺激したかを示す。ナイーブ細胞を示されるＴｈ１７極性化条件下で培養し；メモリー細胞をＩＬ−２３の存在下または非存在下で培養した。３日後、上清中のＩＬ−１７ＡレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。
【図３２Ａ】図３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃおよび３２Ｄは、いかにＰＲＯＣＲおよびＰＤ−１発現がＴｈ１７病原性に影響するかを示す一連のグラフである。図３２Ａは、病原性および非病原性Ｔｈ１７細胞のシグネチャー遺伝子を示す。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、非病原性（ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６）または病原性（ＴＧＦβ３＋ＩＬ−６またはＩＬ−β１＋ＩＬ−６）Ｔｈ１７細胞に分化させ、ＰＲＯＣＲ発現を定量的ＰＣＲにより測定した。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、いかにナイーブＷＴまたはＰＲＯＣＲｄ／ｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ａＰＣの存在下または非存在下でＴｈ１７極性化条件（ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６）下で刺激したかを示す。３つの病原性シグネチャー遺伝子の定量的発現を、３日目に測定した。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、いかにナイーブ２Ｄ２Ｔ細胞を、ＰＲＯＣＲまたは対照（ＧＦＰ）をコードするレトロウイルスにより形質導入し、インビトロでＴｈ１７細胞に分化させ、ナイーブレシピエント中に移植したかを示す。マウスをＥＡＥについてモニタリングした。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、いかにナイーブ２Ｄ２Ｔ細胞を、インビトロでＴＧＦβ１＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３によりＴｈ１７細胞に分化させ、ＷＴまたはＰＤ−Ｌ１−／−レシピエント中に移植したかを示す。マウスをＥＡＥについてモニタリングした。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、ＰＲＯＣＲ発現が疲弊Ｔ細胞中でエンリッチされることを示す一連のグラフである。図３３Ａは、いかにＣ５７ＢＬ／６またはＢａｌｂＣマウスにそれぞれＢ１６黒色腫またはＣＴ２６結腸癌細胞を移植したかを示す。腫瘍浸潤リンパ球を、腫瘍移植の３週間後に単離し、ＰＤ−１およびＴｉｍ３の発現に基づきソートし、リアルタイムＰＣＲを使用してＰＲＯＣＲ発現を分析した。エフェクターメモリー（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）ＣＤ８Ｔ細胞を、ナイーブマウスからソートした。図３３Ｂ）は、いかに抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞上のＰＲＯＣＲ、ＰＤ−１およびＴｉｍ３発現を、示される異なる時点において急性（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）および慢性（Ｃｌｏｎｅ  １３）ＬＣＭＶ感染からのＦＡＣＳにより計測したかを示す。
【図３４Ａ】図３４Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃは、Ｔｈ１７細胞上のＣＤ５Ｌの発現を実証する一連のグラフである。
【図３４Ｂ】図３４Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃは、Ｔｈ１７細胞上のＣＤ５Ｌの発現を実証する一連のグラフである。
【図３４Ｃ】図３４Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃは、Ｔｈ１７細胞上のＣＤ５Ｌの発現を実証する一連のグラフである。
【図３５Ａ】図３５Ａ、３５Ｂおよび３５Ｃは、いかにＣＤ５Ｌ欠損がＴｈ１７分化を変更しないことを示す一連の説明およびグラフである。
【図３５Ｂ】図３５Ａ、３５Ｂおよび３５Ｃは、いかにＣＤ５Ｌ欠損がＴｈ１７分化を変更しないことを示す一連の説明およびグラフである。
【図３５Ｃ】図３５Ａ、３５Ｂおよび３５Ｃは、いかにＣＤ５Ｌ欠損がＴｈ１７分化を変更しないことを示す一連の説明およびグラフである。
【図３６Ａ】図３６Ａおよび３６Ｂは、いかにＣＤ５Ｌ欠損が生存または安定性に影響を与えることによりＴｈ１７メモリーを変更するかを示す一連の説明およびグラフである。
【図３６Ｂ】図３６Ａおよび３６Ｂは、いかにＣＤ５Ｌ欠損が生存または安定性に影響を与えることによりＴｈ１７メモリーを変更するかを示す一連の説明およびグラフである。
【図３７Ａ】図３７Ａおよび３７Ｂは、いかにＣＤ５Ｌ欠損がより重度および持続的なＥＡＥをより高いＴｈ１７応答でもたらすかを示す一連のグラフである。
【図３７Ｂ】図３７Ａおよび３７Ｂは、いかにＣＤ５Ｌ欠損がより重度および持続的なＥＡＥをより高いＴｈ１７応答でもたらすかを示す一連のグラフである。
【図３８Ａ】図３８Ａ、３８Ｂおよび３８Ｃは、いかにＣＤ５Ｌの損失が、非病原性Ｔｈ１７細胞を病原性エフェクターＴｈ１７細胞に変換するかを示す一連の説明およびグラフである。
【図３８Ｂ】図３８Ａ、３８Ｂおよび３８Ｃは、いかにＣＤ５Ｌの損失が、非病原性Ｔｈ１７細胞を病原性エフェクターＴｈ１７細胞に変換するかを示す一連の説明およびグラフである。
【図３８Ｃ】図３８Ａ、３８Ｂおよび３８Ｃは、いかにＣＤ５Ｌの損失が、非病原性Ｔｈ１７細胞を病原性エフェクターＴｈ１７細胞に変換するかを示す一連の説明およびグラフである。
【図３９Ａ】図３９Ａおよび３９Ｂは、いかにＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）が病原性表現型を発生させるかを示す一連のグラフである。
【図３９Ｂ】図３９Ａおよび３９Ｂは、いかにＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）が病原性表現型を発生させるかを示す一連のグラフである。
【図４０】図４０Ａおよび４０Ｂは、種々のＴ細胞条件（Ｔｈ０、Ｔ１６、Ｔ３６、Ｂ６２３およびＴ）に曝露させたＧＰＲ６５ノックアウト細胞中でＩＬ１７Ａ発現が低減したことを示す一連のグラフである。
【図４１】図４１Ａ、４１Ｂ、４１Ｃ、および４１Ｄは、種々のＴ細胞条件（Ｔｈ０、Ｔ１６、Ｔ３６、Ｂ６２３およびＴ）に曝露させたＤＥＣ１ノックアウト細胞中のＩＬ１７Ａ発現が非病原性条件（Ｔ１６）において未変化であったが、病原性条件（Ｔ３６、Ｂ６２３）において低減したことを示す一連のグラフである。
【図４２】図４２Ａおよび４２Ｂは、種々のＴ細胞条件（Ｔｈ０、Ｔ１６、Ｔ３６、Ｂ６２３およびＴ）に曝露させたＰＬＺＰノックアウト細胞中のＩＬ１７Ａ発現が非病原性条件（Ｔ１６）において未変化であったが、病原性条件（Ｔ３６、Ｂ６２３）において低減したことを示す一連のグラフである。
【図４３】種々のＴ細胞条件（Ｔｈ０、Ｔ１６、Ｔ３６、Ｂ６２３およびＴ）に曝露させたＴＣＦ４ノックアウト細胞中のＩＬ１７Ａ発現が、病原性条件Ｂ６２３において低減したことを示すグラフである。
【図４４】ＰＲＯＣＲ突然変異マウスのＢ１６腫瘍接種を示すグラフである。７週齢野生型またはＰＲＯＣＲ突然変異（ＥＰＣＲデルタ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種した。
【図４５】図４５Ａ〜４５Ｈは、単一細胞ＲＮＡｓｅｑが、Ｔｈ１７細胞病原性と関連し、非病原性Ｔｈ１７細胞によってのみ発現される新規調節因子としてＣｄ５ｌを同定することを示す。単一細胞は、ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６（Ａ、Ｂ）、ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３（Ｃ）、ＴＧＦβ３＋ＩＬ−６（Ｄ）により分化させたインビトロＴｈ１７細胞およびＥＡＥ（スコア＝３）のピークにおけるマウスのＣＮＳからのインビボＴｈ１７細胞からソートした（Ｄ）。ＩＬ−１７Ａ．ＧＦＰ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をＤにおいて全てのパネルにおいてソートした。（Ａ）非病原性Ｔｈ１７細胞中のＣＤ５Ｌ発現と、病原性シグネチャーとの相関（Ｌｅｅ，Ａｗａｓｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）。（Ｂ）ＰＣ１の方向が病原性と相関するＣＤ５Ｌ発現の主成分分析。（Ｃ、Ｄ）示される条件からの単一細胞中のＣＤ５Ｌ発現のヒストグラム。インビトロＣＤ５Ｌ発現を、ｑＰＣＲ（Ｅ、Ｆ）およびフローサイトメトリー（Ｇ）により検証する。図４５Ｅ、Ｆ、Ｇは、インビトロＣＤ５Ｌ発現の検証を示す。ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４−ＣＤ２５−）を、示される種々の分化サイトカインの存在下でプレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によりソートし、活性化させた。ＣＤ５Ｌ発現をｑＰＣＲにより４８時間（Ｅ）および７２時間（Ｆ）において計測し、フローサイトメトリーにより４８時間において細胞内で計測した（Ｇ）；（Ｆ）４８時間において、細胞をプレートからリフトし、洗浄し、ＩＬ−２３またはＰＢＳを有する新たな培地中で再プレーティングし、さらに２４時間培養した。図４５Ｈは、インビボＣＤ５Ｌ発現の検証を示す。ＩＬ−１７Ａ．ＧＦＰレポーターマウスを、ＭＯＧ／ＣＦＡ（皮下注射、１日目）により百日咳毒素（静脈内、１日目および３日目）と免疫化した。マウスを疾患のピーク（スコア＝３）において安楽死させ、ＣＤ４＋ＧＦＰ＋およびＣＤ４＋ＧＦＰ−細胞をそれぞれＣＮＳおよび脾臓からソートした。Ｃｄ５ｌおよびＩｌ１７ａ発現をｑＰＣＲにより計測した。示される図面は、２つの独立マウス実験からのテクニカルレプリケートの代表的なデータである。Ｉ．ＩＬ−１７＋（ＧＦＰ＋）およびＩＬ−１７−（ＧＦＰ−）ＣＤ４＋細胞をナイーブマウスの腸管からソートし、ＲＮＡ転写物の数をｎａｎｏｓｔｒｉｎｇにより計測し、４つのハウスキーピング遺伝子に基づき正規化した。図面は、２つの独立実験のまとめである。
【図４６】図４６Ａ〜図４６Ｈは、ＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞エフェクター機能を調節することを示す。（Ａ）ＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−マウスを、百日咳毒素注射（ｉｖ）と４０μｇのＭＯＧ／ＣＦＡにより１日目および３日目に免疫化した。ＥＡＥを既に公開されているとおりスコアリングした（Ｊａｇｅｒ，Ｄａｒｄａｌｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。上段パネルは、３つの独立マウス実験からプールされた結果であり；下段パネルは、ＰＭＡ／イオノマイシンによる再刺激の４時間後に免疫化後１５日目にＣＮＳから単離されたＣＤ４Ｔ細胞からのサイトカイン産生を示す代表的なＦＡＣＳプロットである。まとめのデータを図５０Ｂに示す。図４６Ｂ、Ｃ、Ｄは、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４−ＣＤ２５−）をソートし、ＴＧＦβ１およびＩＬ−６の存在下でプレート結合抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体により４８時間活性化させたことを示す。細胞をブレフェルジンＡの存在下でＰＭＡ／イオノマイシンにより４時間再刺激し、ＦＡＣＳを使用してサイトカイン産生を計測した（Ｂ）；上清をＩＬ−１７およびＩＬ−１０のＥＬＩＳＡ分析に使用した（Ｃ）；ＲＮＡを細胞から直接精製し、ｑＰＣＲに供した（Ｄ）。図４６Ｅ、Ｆは、細胞を、ソートし、Ｂのとおり４８時間培養し、細胞をリフトし、洗浄し、新たな培地中でサイトカインなしでさらに７２時間再懸濁させ、再刺激したことを示す。サイトカイン産生をＦＡＣＳにより計測し（Ｅ）、ｍＲＮＡをｑＰＣＲにより定量した（Ｆ）。図４６Ｇ、Ｈは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋）（Ｇ）またはエフェクターメモリーＴｈ１７細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋ＲｏｒγｔＧＦＰ＋）（Ｈ）をエクスビボで直接ソートし、プレート結合抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体により４８時間活性化させたことを示す。細胞を回収し、ブレフェルジンＡの存在下でＰＭＡ／イオノマイシンと４時間培養し、ＦＡＣＳに供した。データは少なくとも３つの独立マウス実験の代表物である。
【図４７】図４７Ａ〜４７Ｆは、ＣＤ５Ｌが、Ｔｈ１７細胞の病原性を調節する主要なスイッチであることを示す。ナイーブＷＴまたはＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２Ｔ細胞をソートし、放射線照射ＡＰＣの存在下でＴＧＦβ１＋ＩＬ−６により分化させた（Ｊａｇｅｒ，Ｄａｒｄａｌｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。細胞をレストし、プレート結合抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体により４８時間再活性化させ、ＷＴ宿主中に静脈内注射した。（Ａ）分化後およびインビボ移植前の２Ｄ２Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの代表的なＦＡＣＳプロットを示す。（Ｂ）レシピエントマウスの体重およびＥＡＥスコア；（Ｃ）視神経（上段の２つのパネル）およびＣＮＳ（下段パネル）の代表的な組織構造。パネルは、ルクソールファストブルー−ヘマトキシリンおよびエオシン染色である。脱髄を、ＣＮＳの下段パネルにおいてミエリンの正常の青色染色の損失により示す。（Ｄ）移植後２７日目においてＣＮＳから単離されたＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２リンパ球の代表的なサイトカインプロファイル。細胞をＶａ３．２＋ＣＤ４＋に対してゲートした。全てのデータは、３つの独立マウス実験の代表物である。（Ｅ）ナイーブ２Ｄ２ＷＴまたはＣＤ５Ｌ−／−Ｔ細胞をソートし、１００，０００個の細胞をＣＤ４５．１ＷＴ宿主中に移植した。次いで、レシピエントを翌日にＭＯＧ／ＣＦＡにより免疫化した。Ｔ細胞を免疫化後１０日目に流入領域ＬＮから単離し、図４６に記載のとおりＰＭＡ／イオノマイシンにより再刺激した。代表的なＦＡＣＳプロットをＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞に対してゲートし、２つの独立実験のものであり、それぞれ４匹のマウスを用いた。（Ｆ）ナイーブＴ細胞を図４６Ｅに記載のとおりＴＧＦβ１＋ＩＬ−６により分化させ、ＲＮＡ精製およびｑＰＣＲに供した。データは少なくとも３つの独立マウス実験のまとめである。
【図４８】図４８Ａ〜４８Ｊは、ＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞リピドームバランスを飽和から不飽和脂質にシフトし、Ｒｏｒγｔリガンド利用可能性および機能をモジュレートすることを示す。図４８Ａ、Ｂは、Ｔｈ１７細胞のリピドーム分析を示す。（Ａ）ＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−ナイーブＴ細胞を図４６Ｂに記載のとおり、示されるサイトカインの存在下で分化させた。細胞および上清を９６時間において回収し、ＭＳ／ＬＣに供した。３つの独立マウス実験を実施した。示されるデータは、ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６条件下でＷＴとＣＤ５Ｌ−／−との間に少なくとも１．５倍の差を有する同定されたそれぞれの代謝物の発現の中央値である。（Ｂ）代表的な代謝物、例として、コレステロールエステルおよびＰＵＦＡ含有ＴＡＧ種の発現。図４８Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ〜Ｊは、以下を示す：（Ｃ）Ｔ細胞を示される種々のサイトカイン条件下で分化させ、４８時間および９６時間において回収した独立マウス実験のメタボローム分析。まとめのメタボローム分析を図５２Ａに示す。（Ｄ、Ｅ）示される種々の条件下で、Ａに記載のとおり分化させたＴｈ１７細胞からのＲｏｒγｔ  ＣｈＩＰ。Ｆ〜Ｋ。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを、対照ベクターまたはＲｏｒγｔベクターにより安定的に形質移入されたＥＬ４細胞中で実施した。（Ｆ、Ｇ）ＣＤ５ＬレトロウイルスベクターをＦおよびＧにおいて０、２５、５０および１００ｎｇ／ウェルにおいて同時形質移入した。（Ｈ〜Ｊ）１０μＭのアラキドン酸（ＰＵＦＡ）または２０μＭのパルミチン酸（ＳＦＡ）のいずれかを使用し（単一用量を示した場合）、タイトレーション実験において２０μＭ、４μＭおよび０．８μＭのＰＵＦＡ／ＳＦＡならびに５μＭ、０．５μＭおよび０．０５μＭの７，２７−ジヒドロキシコレステロールを使用した。全てのＣｈＩＰおよびルシフェラーゼアッセイは、少なくとも３つの独立実験の代表物である。
【図４９】ＣＤ５Ｌ発現は、単一細胞にわたる炎症促進／調節モジュールダイコトミーに従う。ＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６条件下で４８時間分化させた細胞を用いるＰＣＡプロット（最初の２つのＰＣ）を示し、それぞれの細胞をＣＤ５Ｌの発現ランキングスコアにより着色し（赤色：高い、青色：低い）、最初のＰＣを炎症促進／調節モジュールダイコトミーによりマークする。
【図５０】図５０Ａ〜５０Ｅ  ＰＵＦＡおよびＳＦＡは、Ｔｈ１７細胞機能を調節し、Ｔｈ１７細胞のＣＤ５Ｌ依存性調節に寄与し得る。（Ａ）ナイーブＴ細胞をＷＴまたはＩＬ−２３ＲＧＦＰレポーターマウスのいずれかからソートし、プレート結合抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により活性化させ、ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６により４８時間分化させた。４８時間において、細胞を新たな培地中で１０ｕＭのアラキドン酸（ＰＵＦＡ）または２０ｕＭのパルミチン酸（ＳＦＡ）のいずれかの存在下でＩＬ−２３とさらに４８時間培養し、ＰＭＡ／イオノマイシン再刺激およびＦＡＣＳのために回収した。ＦＦＡの濃度をタイトレーション実験において予め測定した（データ示さず）。（Ｂ）ＷＴおよびＲｏｒｃ−／−マウスからの細胞をＡに記載のとおりソートし、分化させ、ＦＦＡにより処理した。細胞をＲＮＡ精製およびｑＰＣＲのために回収した。（Ｃ）ナイーブＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−Ｔ細胞をＡに記載のとおり分化させた。次いで細胞をリフトし、洗浄し、サイトカインの添加なしで、対照または５ｕＭのアラキドン酸（ＰＵＦＡ）の存在下で新たな培地中で再プレーティングした。Ｔ細胞のサイトカインプロファイルをＰＭＡ／イオノマイシン再刺激後に計測した。データは少なくとも３つの独立分化実験の代表物である。ＤＥ。ナイーブＴ細胞をＡに記載のとおりソートし、ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６により分化させた。４８時間において、次いで細胞をリフトし、洗浄し、サイトカインの添加なしで、ＣＤ５Ｌ−／−Ｔ細胞については対照または５ｕＭのアラキドン酸（ＰＵＦＡ）；ＷＴ  Ｔ細胞については対照または２５ｕＭのパルミチン酸（ＳＦＡ）の存在下で新たな培地中で再プレーティングした。さらに４８時間後、細胞をｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析（Ｄ）またはｑＰＣＲ（Ｅ）のために回収した。
【図５１】図５１Ａ〜５１Ｃ  ＰＵＦＡおよびＣＤ５Ｌ作用のためのモデル。分化の間（Ａ）、豊富なＲｏｒγｔリガンドが合成され、ＰＵＦＡ／ＳＦＡの特異的影響を限定する；しかしながら、Ｔｈ１７細胞を分化させると（Ｂ、Ｃ）、グルコース代謝の減少に起因してリガンド合成が実質的に低減し、それによりＰＵＦＡがより顕著な効果を有することになる。この効果の程度は、ＣＤ５Ｌが存在するか（Ｂ）非存在か（Ｃ）に依存し、より弱いまたはより強い病原性細胞をそれぞれもたらす。
【図５２】図５２Ａ〜５２Ｄは、ＥＡＥを有するＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−マウスの特徴決定を示す。マウスを図４６Ａに記載のとおり免疫化した。（Ａ）免疫化１５日後、ＣＮＳからのリンパ球を単離し、直接染色し、ＦｏｘＰ３の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）Ａに記載のとおりのＣＮＳからの細胞をブレフェルジンＡを用いてＰＭＡ／イオノマイシンにより４時間再刺激し、フローサイトメトリーによりサイトカイン産生についてプロファイリングした。（Ｃ）免疫化１０日後、細胞をマウスの鼠径ＬＮから単離した。３Ｈチミジン取り込みアッセイを使用してＭＯＧ３５−５５ペプチドに応答するＴ細胞増殖を測定した；（Ｄ）Ｃからの上清を回収し、ＩＬ−１７の量をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図５３】図５３Ａ〜５３Ｄは、ＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞の病原性をアンタゴナイズすることを示す。受動的ＥＡＥを図４６に記載のとおり誘導する。手短に述べると、ナイーブ２Ｄ２細胞をＷＴマウスからソートし、ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３により分化させた。２４時間において、ＣＤ５Ｌ−ＧＦＰ過剰発現または対照ＧＦＰ構築物のいずれかを含有するレトロウイルス上清を使用して活性化細胞に感染させた。ＣＤ５Ｌの発現を感染３日後において分析した。両方の群において細胞の５０％がＧＦＰを発現した。（Ａ）移植前のサイトカインプロファイルの代表的なフローサイトメトリー分析；（Ｂ）移植後の体重損失曲線；（Ｃ）ＥＡＥスコア；（Ｄ）移植３０日後におけるＣＮＳからのＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの代表的なフローサイトメトリーデータ。
【図５４】図５４Ａ〜５４Ｄ  ＣＤ５Ｌは、Ｔｈ１７細胞中の脂質代謝を調節し、Ｒｏｒγｔ機能をモジュレートする。（Ａ）Ｒｏｒγｔ  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ（Ｘｉａｏ，Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）から同定されたＩｌ１７、Ｉｌ２３ｒおよびＩｌ１０領域中のＲｏｒγｔ結合部位。上段行は、アイソタイプ対照（赤色）であり、下段ロールは、抗Ｒｏｒγｔ抗体からのＲｏｒγｔ  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果を示す（実験手順）。（Ｂ）図４８Ｅに記載のとおりのＩｌ２３ｒのゲノム領域中のＲｏｒγｔのＣｈＩＰ−ＰＣＲ。（Ｃ、Ｄ）Ｒｏｒγｔ転写活性を、図４８Ｇに記載のとおりＣｄ５ｌを発現するレトロウイルスベクターの存在下でＩｌ２３ｒ（Ｃ）およびＩｌ１０（Ｄ）に関して計測した。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
本発明は、一般に、Ｔ細胞バランス、Ｔ細胞分化、Ｔ細胞維持および／またはＴ細胞機能を制御する調節ネットワークを同定するための組成物および方法、ならびに種々の治療および／または診断指標においてＴ細胞バランス、Ｔ細胞分化、Ｔ細胞維持および／またはＴ細胞機能を制御する調節ネットワークを利用するための組成物および方法に関する。
【００９９】
本発明は、Ｔ細胞バランスをモジュレートするための組成物および方法を提供する。本発明は、Ｔ細胞バランスをモジュレートするＴ細胞モジュレート剤を提供する。例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞タイプのレベルおよび／またはその間の、例えば、Ｔｈ１７と他のＴ細胞タイプ、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）との間のバランスを調節し、それに影響を与え、そうでなければ影響を及ぼす方法を提供する。例えば、一部の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞モジュレート剤およびそれらのＴ細胞モジュレート剤を使用してＴｈ１７活性のレベルおよび／またはそれと炎症潜在性との間のバランスを調節し、それに影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす方法を提供する。本明細書において使用される用語、例えば、「Ｔｈ１７細胞」および／または「Ｔｈ１７表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）、およびインターロイキン１７Ａ／Ｆヘテロダイマー（ＩＬ１７−ＡＦ）からなる群から選択される１つ以上のサイトカインを発現する分化Ｔヘルパー細胞を指す。本明細書において使用される用語、例えば、「Ｔｈ１細胞」および／または「Ｔｈ１表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を発現する分化Ｔヘルパー細胞を指す。本明細書において使用される用語、例えば、「Ｔｈ２細胞」および／または「Ｔｈ２表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される１つ以上のサイトカインを発現する分化Ｔヘルパー細胞を指す。本明細書において使用される用語、例えば、「Ｔｒｅｇ細胞」および／または「Ｔｒｅｇ表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、Ｆｏｘｐ３を発現する分化Ｔ細胞を指す。
【０１００】
これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞タイプ間、例えば、Ｔｈ１７と他のＴ細胞タイプ、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）との間のレベルおよび／またはバランスを調節し、それに影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。
【０１０１】
本発明は、Ｔ細胞分化、例えば、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）分化をモジュレートするための方法および組成物を提供する。本発明は、Ｔ細胞維持、例えば、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）維持をモジュレートするための方法および組成物を提供する。本発明は、Ｔ細胞機能、例えば、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）機能をモジュレートするための方法および組成物を提供する。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴｈ１７細胞タイプ間、例えば、病原性および非病原性Ｔｈ１７細胞間のレベルおよび／またはバランスを調節し、それに影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞の集団の、例えば、規定の病原性区別の有無にかかわらずにＴｈ１７細胞表現型に向かう分化、または規定の病原性区別の有無にかかわらずにＴｈ７細胞表現型から離れる分化に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞の集団の、例えば、規定の病原性区別の有無にかかわらずにＴｈ１７細胞表現型に向かう維持、または規定の病原性区別の有無にかかわらずにＴｈ７細胞表現型から離れる維持に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴｈ１７細胞の集団の、例えば、病原性Ｔｈ１７細胞表現型に向かう分化、もしくは病原性Ｔｈ１７細胞表現型から離れる分化、または非病原性Ｔｈ１７細胞表現型に向かう分化、もしくは非病原性Ｔｈ１７細胞表現型から離れる分化に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴｈ１７細胞の集団の、例えば、病原性Ｔｈ１７細胞表現型に向かう維持、もしくは病原性Ｔｈ１７細胞表現型から離れる維持、または非病原性Ｔｈ１７細胞表現型に向かう維持、もしくは非病原性Ｔｈ１７細胞表現型から離れる維持に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞の集団の、例えば、非Ｔｈ１７Ｔ細胞サブセットに向かう分化、または非Ｔｈ１７細胞サブセットから離れる分化に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞の集団の、例えば、非Ｔｈ１７Ｔ細胞サブセットに向かう維持、または非Ｔｈ１７細胞サブセットから離れる維持に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。
【０１０２】
本明細書において使用される用語、例えば、「病原性Ｔｈ１７細胞」および／または「病原性Ｔｈ１７表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、ＴＧＦ−β３の存在下で誘導された場合、ＴＧＦ−β３誘導Ｔｈ１７細胞中での発現のレベルと比較して上昇レベルの、Ｃｘｃｌ３、ＩＬ２２、ＩＬ３、Ｃｃｌ４、Ｇｚｍｂ、Ｌｒｍｐ、Ｃｃｌ５、Ｃａｓｐ１、Ｃｓｆ２、Ｃｃｌ３、Ｔｂｘ２１、Ｉｃｏｓ、ＩＬ１７ｒ、Ｓｔａｔ４、Ｌｇａｌｓ３およびＬａｇから選択される１つ以上の遺伝子を発現するＴｈ１７細胞を指す。本明細書において使用される用語、例えば、「非病原性Ｔｈ１７細胞」および／または「非病原性Ｔｈ１７表現型」ならびにそれらの全ての文法的変形は、ＴＧＦ−β３の存在下で誘導された場合、ＴＧＦ−β３誘導Ｔｈ１７細胞中での発現のレベルと比較して減少レベルの、ＩＬ６ｓｔ、ＩＬ１ｒｎ、Ｉｋｚｆ３、Ｍａｆ、Ａｈｒ、ＩＬ９およびＩＬ１０から選択される１つ以上の遺伝子を発現するＴｈ１７細胞を指す。
【０１０３】
これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴ細胞またはＴ細胞集団の機能および／または生物学的活性に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してヘルパーＴ細胞またはヘルパーＴ細胞集団の機能および／または生物学的活性に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用してＴｈ１７細胞またはＴｈ１７細胞集団の機能および／または生物学的活性に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用して非Ｔｈ１７Ｔ細胞または非Ｔｈ１７Ｔ細胞集団、例えば、Ｔｒｅｇ細胞もしくはＴｒｅｇ細胞集団、または別のＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞集団などの機能および／または生物学的活性に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。これらの組成物および方法は、Ｔ細胞モジュレート剤を使用し、例えば、Ｔｈ１７細胞を異なるサブタイプ、または新たな状態に変換することによりＴ細胞またはＴ細胞集団の可塑性に影響を与え、またはそうでなければ影響を及ぼす。
【０１０４】
本明細書に提供される方法は、高い時間分解能、新規計算アルゴリズム、および初代Ｔ細胞の摂動を実施するための革新的なナノワイヤベースツールにおける転写プロファイリングを組み合わせ、Ｔｈ１７分化を制御する動的調節ネットワークのモデルを体系的に導き、実験的に検証する。例えば、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１参照。このネットワークは、結合作用がＴｈ１７と他のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットとの間のレベルおよび／またはバランスの維持に不可欠であり得る新規調節因子を有する２つの自己強化的であるが相互に拮抗的なモジュールからなる。全体として、７１個の調節因子と１，２６６個の遺伝子と間の９，１５９個の相互作用が、少なくとも１つのネットワーク中でアクティブであり；７１個のうち４６個が新規である。本明細書に提供される実施例は、３９個の調節因子を同定および検証し、それらを包括的な時間的ネットワーク内に埋め込み、その組織化原理を明らかにし、Ｔｈ１７分化を制御するための新規薬物標的を強調する。
【０１０５】
「負のＴｈ１７」モジュールは、調節因子、例えば、ＳＰ４、ＥＴＳ２、ＩＫＺＦ４、ＴＳＣ２２Ｄ３および／またはＩＲＦ１を含む。規定のサブタイプのＴｈ１７細胞の負の調節因子として作用する転写因子Ｔｓｃ２２ｄ３が、ゲノム上でキーＴｈ１７調節因子と共局在化することが見出された。「正のＴｈ１７」モジュールは、調節因子、例えば、ＭＩＮＡ、ＰＭＬ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＲＯＣＲ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＺＥＢ１、ＥＧＲ２、ＣＣＲ６、および／またはＦＡＳを含む。クロマチン調節因子Ｍｉｎａの摂動は、Ｆｏｘｐ３発現を上方調節することが見出され、共活性化因子Ｐｏｕ２ａｆ１の摂動は、刺激されたナイーブ細胞中のＩＦＮ−γ産生を上方調節させることが見出され、ＴＮＦ受容体Ｆａｓの摂動は、刺激されたナイーブ細胞中のＩＬ−２産生を上方調節することが見出された。３つ全ての因子は、Ｔｈ１７細胞中のＩＬ−１７産生も制御する。免疫系の効率的な協調は、区別される炎症促進性および制御性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞集団の慎重な平衡を要求する。これらのうち、炎症促進性ＩＬ−１７産生Ｔｈ１７細胞は、細胞外病原体に対する防御における重要な役割を担い、いくつかの自己免疫疾患、例として、乾癬、強直性脊椎炎、多発性硬化症および炎症性腸疾患の誘導にも関与している（例えば、Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．，Ｏｕｋｋａ，Ｍ．＆Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．Ｔ（Ｈ）−１７  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｌｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，３４５−３５０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ０４０７−３４５（２００７）参照）。ナイーブＴ細胞からのＴｈ１７分化は、インビトロでサイトカインＴＧＦ−β１およびＩＬ−６により誘発することができる。ＴＧＦ−β１は単独で、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を誘導する一方（例えば、Ｚｈｏｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ＴＧＦ−ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｏｘｐ３  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔ（Ｈ）１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  ＲＯＲｇａｍｍａｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，２３６−２４０，ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０６８７８［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６８７８（２００８）参照）、ＩＬ−６の存在はｉＴｒｅｇを阻害し、Ｔｈ１７分化を誘導する（Ｂｅｔｔｅｌｌｉｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７）。
【０１０６】
ＴＧＦ−β１は、Ｆｏｘｐ３＋誘導Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）の誘導に要求される一方、ＩＬ−６の存在は、ｉＴｒｅｇの生成を阻害し、Ｔｈ１７分化プログラムを開始させる。このことは、病原性Ｔｈ１７細胞とＴｒｅｇ細胞との間の相互関係が存在し（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７）、これは、相互に拮抗的なマスター転写因子（ＴＦ）ＲＯＲ−γｔ（Ｔｈ１７細胞中）とＦｏｘｐ３（Ｔｒｅｇ細胞中）（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００８）との間のバランスに依存し得るという仮定を導く。他のサイトカイン組合せ、特に、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−２１またはＩＬ−１β、ＴＧＦ−β３＋ＩＬ−６、ＩＬ−６、およびＩＬ−２３も、ＲＯＲ−γｔおよびＴｈ１７細胞への分化を誘導することが示されている（Ｇｈｏｒｅｓｃｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔ（Ｈ）１７  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６７，９６７−９７１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９４４７（２０１０））。最後に、多数のサイトカイン組合せは、Ｔｈ１７細胞を誘導し得るが、ＩＬ−２３への曝露は、Ｔｈ１７表現型の安定化およびＴｈ１７細胞における病原性エフェクター機能の誘導の両方に重要である。
【０１０７】
Ｔｈ１７細胞を制御する調節ネットワークについては、ほとんど不明のままである（Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  １１，５９９−６１１（２００９）；Ｚｈｏｕ，Ｌ．＆Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１，１４６−１５２（２００９））。発生的に、ＴＧＦ−βはＴｈ１７およびｉＴｒｅｇ分化の両方に要求されるため、いかにそれらの間のバランスが達成されるかも、いかにＩＬ−６がＴｈ１７分化に向けて偏るかも理解されていない（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７）。機能的に、いかにＴｈ１７細胞の炎症促進状態が免疫抑制サイトカインＩＬ−１０により抑制されるかが不明確である（Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２００９；Ｚｈｏｕ＆Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９）。最後に、Ｔｈ１７の発生をドライブするキー調節因子および相互作用の多くが、不明のままである（Ｋｏｒｎ，Ｔ．，Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．，Ｏｕｋｋａ，Ｍ．＆Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．ＩＬ−１７  ａｎｄ  Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７，４８５−５１７，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｉｍｍｕｎｏｌ．０２１９０８．１３２７１０１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｉｍｍｕｎｏｌ．０２１９０８．１３２７１０［ｐｉｉ］（２００９））。
【０１０８】
近年の研究は、哺乳動物調節回路を解析するための摂動による結合体系的プロファイリングの能力を実証している（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｎｓｅｌｙ  ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  １４４，２９６−３０９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０１．００４（２０１１）；Ｌｉｔｖａｋ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ／ＥＢＰｄｅｌｔａ  ｉｎ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ＴＬＲ４−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，４３７−４４３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．１７２１（２００９）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４１，５５３−５６２（２００９）；Ａｍｉｔ，Ｉ．，Ｒｅｇｅｖ，Ａ．＆Ｈａｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１，８７３−８８０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ３１０９（２０１１）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  ｖｉｒａｌ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１）；Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））。これらの研究のほとんどが、１つの「固定」ネットワークを想定する計算回路再構築アルゴリズムに依存している。しかしながら、Ｔｈ１７分化は、数日間に及び、その間に調節ネットワークの要素および配線は変化する可能性が高い。さらに、ナイーブＴ細胞およびＴｈ１７細胞は、インビトロで、それらの表現型も機能も変化させずに慣習的方法により効率的に形質移入することができず、したがって、遺伝子発現を阻害するための摂動方針の効率が制限される。
【０１０９】
これらの制限は、本明細書に提示される試験において、転写プロファイリング、新規計算法、およびナノワイヤベースｓｉＲＮＡ送達（Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｎａｎｏｗｉｒｅｓ  ａｓ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，１８７０−１８７５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０９３５０１０７（２０１０）（図１ａ）を組み合わせてＴｈ１７分化の転写ネットワークを構築および検証することにより対処される。分化の間のｍＲＮＡ発現レベルのゲノムワイドプロファイルを使用し、系を制御する２５個の公知の調節因子を自動的に同定し、４６個の新規調節をノミネートするＴｈ１７分化を制御する動的調節回路のモデルを構築した。ケイ素ナノワイヤを使用してｓｉＲＮＡをナイーブＴ細胞中に送達し（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０）、次いで分化の間の２つの時点における代表的な遺伝子シグネチャーに対する２９個の候補転写調節因子および１０個の候補受容体の転写効果を摂動させ、計測した。このデータを組み合わせることにより、ネットワークの包括的検証モデルを構築した。特に、回路は、Ｔｈ１７発生を抑制または促進する１２個の新規検証調節因子を含む。再構築モデルを２つの結合し、拮抗的な高密度に内部接続されたモジュールに組織化し、一方はＴｈ１７プログラムを促進し、他方は抑制する。モデルは、機能がノックアウトマウスにおける全般的遺伝子発現、ＤＮＡ結合プロファイル、またはＴｈ１７分化に対する効果をさらに特徴とした１２個の新規調節因子を強調する。本明細書に提供される試験は、Ｔｈ１７Ｔ細胞サブセットの発生を理解するためのバイアスなしの体系的および機能的アプローチを実証する。
【０１１０】
本明細書に提供される方法は、高い時間分解転写時間経過、調節ネットワークを再構築する新規方法、およびＴ細胞を摂動させるための革新的なナノ技術を組み合わせ、Ｔｈ１７分化についてのネットワークモデルを構築および検証する。このモデルは、３つの連続する、高密度に内部接続されたネットワークからなり、７１個の調節因子（４６個の新規物）を含み、３つの相における実質的な再配線を示唆する。７１個の調節因子は、炎症性腸疾患（Ｊｏｓｔｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｈａｖｅ  ｓｈａｐｅｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９１，１１９−１２４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１５８２（２０１２））に遺伝的に関連する遺伝子と有意に重複する（７１個のうち１１個、ｐ＜１０−９）。このモデルを基礎とすることにより、１２７個の推定調節因子（８０個の新規物）を体系的にランキングし、上位ランキングのものを実験的に試験した。
【０１１１】
Ｔｈ１７調節因子は、２つの緊密に結合し、自己強化的であるが相互に拮抗的なモジュールに組織化されることが見出され、その協調作用は、いかにＴｈ１７、Ｔｒｅｇ、および他のエフェクターＴ細胞サブセット間のバランスが維持されるか、ならびにいかにＴｈ１７細胞の進行性指向性分化が達成されるかを説明し得る。２つのモジュール内には、１２個の因子（図４および５）が存在し、これらをさらに特性決定し、因子の４つを強調した（他のものは、図１７Ａ、１７Ｂに存在する）。この検証モデルは、Ｔｈ１７プログラムに正または負に影響を及ぼす少なくとも１２個の新規調節因子を強調する（図４および５）。注目すべきことに、これらのおよび公知の調節因子は、２つの緊密に結合している自己強化的であるが相互に拮抗的なモジュールに組織化され、その協調作用は、いかにＴｈ１７、Ｔｒｅｇ、および他のエフェクターＴ細胞間のバランスが維持されるか、ならびにいかにＴｈ１７細胞の進行性指向性分化が達成される一方、他のＴ細胞サブセットの分化を抑制するかを説明し得る。１２個の調節因子のうち４つ、Ｍｉｎａ、Ｆａｓ、Ｐｏｕ２ａｆ１、およびＴｓｃ２２ｄ３の機能を、対応するノックアウトマウスからのＴ細胞のＴｈ１７分化を分析することにより、またはＣｈＩＰ−Ｓｅｑ結合プロファイルによりさらに検証および特性決定した。
【０１１２】
Ｔ細胞モジュレート剤を使用し、Ｔｈ１７関連摂動に対して応答性の遺伝子として同定されている１つ以上の標的遺伝子または１つ以上の標的遺伝子の１つ以上の産物の発現をモジュレートする。これらの標的遺伝子は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ナイーブＴ細胞、部分分化Ｔ細胞、分化Ｔ細胞および／またはそれらの組合せを、Ｔ細胞モジュレート剤と接触させ、１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現に対する効果（存在する場合）をモニタリングすることにより同定する。一部の実施形態において、１つ以上のシグネチャー遺伝子は、以下に示される表１または表２に列記されるものから選択する。
【０１１３】
【表１】
2017508457.tif 000003
【０１１４】
【表２】
2017508457.tif 000004
【０１１５】
【表３】
2017508457.tif 000005
【０１１６】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、表３に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連サイトカインまたは受容体分子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、表４に示されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連転写調節因子である。
【０１１７】
【表４】
2017508457.tif 000006
【０１１８】
【表５】
2017508457.tif 000007
【０１１９】
一部の実施形態において、標的遺伝子は、表５に示されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連転写調節因子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、表６に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連受容体分子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、表７に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連キナーゼである。一部の実施形態において、標的遺伝子は、表８に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連シグナリング分子である。一部の実施形態において、標的遺伝子は、表９に列記されるものから選択される１つ以上のＴｈ１７関連受容体分子である。
【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
【表７】
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【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
【表１０】
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【０１２５】
【表１１】
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【０１２６】
【表１２】
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【０１２７】
【表１３】
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【０１２８】
【表１４】
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【０１２９】
【表１５】
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【０１３０】
【表１６】
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【０１３１】
【表１７】
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【０１３２】
【表１８】
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【０１３３】
【表１９】
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【０１３４】
【表２０】
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【０１３５】
【表２１】
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【０１３６】
【表２２】
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【０１３７】
新規「正のＴｈ１７」因子には、亜鉛フィンガーＥ−ボックス結合ホメオボックス１のＺｅｂ１があり、これは初期誘導され、Ｔｈ１７時間経過において持続され（図１７ａ）、多くの公知のキーＴｈ１７因子の発現に類似する。Ｚｅｂ１ノックダウンは、Ｔｈ１７シグネチャーサイトカイン（例として、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２１）およびＴＦ（例として、Ｒｂｐｊ、Ｍａｆｆ、およびＭｉｎａ）ならびに後期誘導サイトカインおよび受容体分子遺伝子の発現を減少させる（ｐ＜１０−４、クラスタＣ１９）。これは、Ｔｈ１７細胞中でＲＯＲ−γｔ、ＢａｔｆおよびＳｔａｔ３により結合され、Ｓｔａｔ３ノックアウトマウスからの細胞中で下方調節される（図１７ａ）。興味深いことに、Ｚｅｂ１は、クロマチン因子Ｓｍａｒｃａ４／Ｂｒｇ１と相互作用して上皮細胞中でＥ−カドヘリンプロモーターを抑制し、上皮間葉移行を誘導することが公知である（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｉｌｌｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＺＥＢ１  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎ  ＥＭＴ  ｂｙ  ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＷＩ／ＳＮＦ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＲＧ１．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２９，３４９０−３５００，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１０．１０２（２０１０））。Ｓｍａｒｃａ４は、３つ全てのネットワークモデルにおける調節因子であり（図２ｄ、ｅ）、「正のモジュール」のメンバーである（図４ｂ）。これは、Ｔｈ１７時間経過において示差的に発現されないが、Ｂａｔｆ、Ｉｒｆ４およびＳｔａｔ３（Ｔｈ１７の正の調節因子）によってだけでなくＧａｔａ３およびＳｔａｔ５（他の系統の正の調節因子、図１７ａ）によっても結合される。Ｓｍａｒｃａ４を含有するクロマチンリモデリング複合体は、ヌクレオソームを置き換え、ＩＦＮ−γプロモーターにおいてクロマチンをリモデリングし、Ｔｈ１細胞中のその発現を促進することが公知である（Ｚｈａｎｇ，Ｆ．＆Ｂｏｏｔｈｂｙ，Ｍ．Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｒｇ１  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｒｅ  Ｓｔａｔ４  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３，１４９３−１５０５，ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００６００６６（２００６））。ＩＬ−１７ａプロモーターの近くに潜在的なＳｍａｒｃａ４結合ＤＮＡ配列も存在する（Ｍａｔｙｓ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．ＴＲＡＮＳＦＡＣ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｆｒｏｍ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｔｏ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，３７４−３７８（２００３））。まとめると、このことは、おそらくＺｅｂ１との相互作用におけるＳｍａｒｃａ４によるクロマチンリモデリングが、Ｔｈ１７細胞を正に調節し、ＩＬ−１７発現に不可欠であるモデルを示唆する。
【０１３８】
逆に、新規「負のＴｈ１７」因子には、モデルにおいてＲＯＲ−γｔの調節因子として、ならびにＲＯＲ−γｔ、Ｂａｔｆ、Ｉｒｆ４、Ｓｔａｔ３およびＳｍａｒｃａ４の標的として予測される初期誘導遺伝子Ｓｐ４がある（図１７ｂ）。Ｓｐ４ノックダウンは、４８時間におけるＲＯＲ−γｔ発現の増加、ならびにＴｈ１７シグネチャー遺伝子、例として、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１およびＩｒｆ４の発現の増加および他のＣＤ４＋細胞のシグネチャー遺伝子、例として、Ｇａｔａ３、Ｆｏｘｐ３およびＳｔａｔ４の発現の減少により反映される全体的なより強く、「より清浄な」Ｔｈ１７分化をもたらす。
【０１３９】
これらの新規および公知の調節因子は、協調作用してモジュール内およびモジュール間相互作用を編成し、Ｔｈ１７細胞の進行性分化を促進する一方、このサブセットの指向性分化を阻害し、Ｔ細胞の他のＴ細胞サブセットへの分化を促進するモジュールを制限する。例えば、Ｓｍａｒｃａ４およびＺｅｂ１のノックダウンは、Ｍｉｎａの減少をもたらす一方（Ｔｈ１７「正の調節因子」間の全ての正の相互作用に起因）、Ｓｍａｒｃａ４またはＭｉｎａのノックダウンは、負の交差モジュール相互作用に起因するＴｓｃ２２ｄ３  ３１発現の増加をもたらす。ＲＮＡｓｅｑを使用して示されるとおり、これらの効果は、ネットワーク中の調節因子の発現を超えて拡大し、Ｔｈ１７転写プログラムに全体的に影響する：例えば、Ｍｉｎａのノックダウンは、中期から後期のＴｈ１７分化ネットワークの進行に対する実質的な効果を有する。なぜなら、この影響される下方調節遺伝子一部が、それぞれの時間的クラスタ（ｐ＜１０−５、例えば、クラスタＣ９、Ｃ１９）に有意に重複するためである。負の調節因子Ｔｓｃ２２ｄ３およびＳｐ４については、逆の傾向が観察される。例えば、転写調節因子Ｓｐ４は、Ａｈｒ、Ｂａｔｆ、ＲＯＲ−γｔなどを含むサイトカインシグナリング（Ｃ１９；ｐ＜１０−７）および造血（Ｃ２０；ｐ＜１０−３）クラスタを阻害することにより、分化Ｔｈ１７細胞が後期の分化に入るのを抑制する。これらの知見は、Ｔｈ１７分化を支配する複合分子回路の作用の理解における大規模機能摂動試験の能力を強調する。
【０１４０】
近年の研究において、Ｃｉｏｆａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｉｏｆａｎｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１２．０９．０１６（２０１２））は、公知のキー因子についてのＣｈＩＰＳｅｑデータならびに野生型およびノックアウトマウスにおける転写プロファイルに基づきＴｈ１７調節因子を体系的にランキングした。このネットワークは公知のコアＴｈ１７ＴＦに集中した一方、そこに提示される相補アプローチは、生理学的に有意義な状況において多くの遺伝子を摂動させた。このコアＴｈ１７ネットワークは、コンピュータにより推定されたモデルと有意に重複することが保証される（図１８）。
【０１４１】
正および負のモジュール（図４および５）の配線は、Ｔｈ１７プログラムの機能論理の一部を明らかにしないが、直接および間接的相互作用の両方を含む可能性が高い。機能モデルは、ＤＮＡ結合プロファイル（Ｇｌａｓｍａｃｈｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｒｅｃｔｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＰ−１−ＩＲＦ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２８３０９（２０１２））またはタンパク質−タンパク質相互作用（Ｗｕ，Ｃ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．＆Ｔｈａｌｈａｍｅｒ，Ｔ．ＳＧＫ１  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＩＬ−２３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ））との基礎をなす物理的相互作用を解析するための優れた出発点を提供する。同定された調節因子は、Ｔｈ１７／Ｔｒｅｇバランスを調節するため、および病原性Ｔｈ１７を非病原性のものに切り替えるための強力な新たな標的である。
【０１４２】
シグネチャー遺伝子の選択のための自動化手順
本発明はまた、種々の治療および／または診断指標において有用な遺伝子シグネチャーを決定する方法を提供する。これらの方法の目的は、目的プロセスに関して情報を与える遺伝子の小さいシグネチャーを選択することである。基本概念は、異なるタイプの情報は、ゲノム全体（＞２０ｋの遺伝子）の「スペース」の、関連遺伝子のサブセットへの異なる分類を伴い得ることである。この方針は、シグネチャーサイズに対する制約を考慮し、これらの分類の最良のカバレッジを有するように設計される。例えば、この方針の一部の実施形態において、２つのタイプの情報：（ｉ）時間的発現プロファイル；および（ｉｉ）機能的アノテーションが存在する。第１の情報源は、遺伝子を、共発現される遺伝子のセットに分類する。情報源は、遺伝子を、共機能的遺伝子のセットに分類する。次いで、遺伝子の小さいセットを、それぞれのセットからの所望の数の代表物、例えば、それぞれの共発現セットからの少なくとも１０個の代表物およびそれぞれの共機能的セットからの少なくとも１０個の代表物が存在するように選択する。複数の情報源を用いる作業（ひいては、複数の分類を「被覆」する目的）の問題は、コンピュータ科学の理論において集合被覆として公知である。この問題は最適性に対して解決することができない一方（そのＮＰ困難性に起因）、それは、小倍数内で近似させることができる。一部の実施形態において、それぞれのセットからの代表物の所望数は、１つ以上、少なくとも２つ、５つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上である。
【０１４３】
このアプローチの重要な特性は、シグネチャーのサイズ（次いで、それがこの制約下であり得る最良のカバレッジを見出す）；またはカバレッジの所望のサイズ（次いで、カバレッジ要求を満たし得る最小のシグネチャーサイズを選択する）を与えることができることである。
【０１４４】
この手順の例示的な実施形態は２７５個の遺伝子シグネチャー（表１）の選択であり、これは分化プログラムの可能な限り多くの局面を反映させるためのいくつかの基準を組み合わせた。以下の要件を定義した：（１）シグネチャーは、Ｔｈ１７マイクロアレイシグネチャーに属するＴＦ（他のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較、例えば、Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｖｏｌ．３０  １５５−１６７（２００９））など、本明細書に記載の方法の部参照）；ネットワーク中の調節因子として含まれ、少なくともわずかに示差的に発現されるＴＦ；または強力に示差的に発現されるＴＦの全てを含まなければならず；（２）これは、類似の発現プロファイルを有する遺伝子のそれぞれのクラスタからの少なくとも１０個の代表物を含まなければならず；（３）これは、異なるネットワーク中のそれぞれのＴＦの予測標的からの少なくとも５つの代表物を含有しなければならず；（４）これは、それぞれのエンリッチされた遺伝子オントロジー（ＧＯ）カテゴリー（示差的に発現される遺伝子にわたり計算）からの最小数の代表物を含まなければならず；（５）これは、分化プロセスに関連する約１００個の遺伝子、例として、示差的に発現されるサイトカイン、受容体分子および他の細胞表面分子の、手作業によりアセンブルされたリストを含まなければならない。これらの異なる基準は実質的な重複を生成し得るため、集合被覆アルゴリズムを使用して５つの条件の全てを満たす遺伝子の最小のサブセットを見出した。マイクロアレイデータにおいて発現が変化（時間で、または処理間で）を示さなかった１８個の遺伝子を、このリストに付加した。
【０１４５】
シグネチャー遺伝子の使用
本発明は、種々の診断および／または治療指標において使用されるＴ細胞関連遺伝子シグネチャーを提供する。例えば、本発明は、種々の診断および／または治療指標において有用なＴｈ１７関連シグネチャーを提供する。本発明に関する「シグネチャー」は、限定されるものではないが、核酸と、その多型、突然変異物、変異体、改変物、サブユニット、断片、および他の分析物または試料由来計測物を包含する。
【０１４６】
例示的なシグネチャーを表１および２に示し、本明細書において、とりわけ、「Ｔｈ１７関連遺伝子」、「Ｔｈ１７関連核酸」、「シグネチャー遺伝子」、または「シグネチャー核酸」と集合的に称する。
【０１４７】
これらのシグネチャーは、表１または表２に列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の第１レベルを検出し、検出レベルをシグネチャー遺伝子または遺伝子産物発現、活性および／または機能の対照レベルと比較することにより、対象における免疫応答を診断し、予後診断し、および／または病期分類し、検出レベルおよび対照レベルの差が、対象における免疫応答の存在を示す方法において有用である。
【０１４８】
これらのシグネチャーは、表１または表２に列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを第１の時点において検出し、表１または表２に列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能のレベルを第２の時点において検出し、発現、活性および／または機能の第１の検出レベルと、発現、活性および／または機能の第２の検出レベルとを比較することにより、対象における免疫応答をモニタリングし、第１および第２の検出レベルの変化が、対象における免疫応答の変化を示す方法において有用である。
【０１４９】
これらのシグネチャーは、表１または表２に列記されるものから選択される１つ以上のシグネチャー遺伝子または１つ以上のシグネチャー遺伝子の１つ以上の産物の発現、活性および／または機能の検出レベルに基づき、免疫応答のリスクがあり、またはそれに罹患している患者集団を同定する方法において有用である。これらのシグネチャーは、治療または治療法の有効性を決定するための、異常免疫応答のための治療および治療法を受ける対象のモニタリングにも有用である。これらのシグネチャーは、患者が治療または治療法に対して応答性であるか否かを決定するための、異常免疫応答のための治療および治療法を受ける対象のモニタリングにおいても有用である。これらのシグネチャーは、異常免疫応答の症状の治療、その進行の遅延、またはそうでなければその改善において有効である治療法および治療の選択または改変にも有用である。本明細書に提供されるシグネチャーは、治療の選択を容易にする精度での、規定状態の疾患における患者の群の選択に有用である。
【０１５０】
本発明は、１つ以上のシグネチャー核酸に結合する検出試薬を有するキットも含む。本発明により、１つ以上のシグネチャー核酸に結合し得る検出試薬、例えば、オリゴヌクレオチドのアレイも提供される。好適な検出試薬としては、キットの形態で一緒に包装されるシグネチャー核酸の一部に相補的な相同核酸配列、例えば、オリゴヌクレオチド配列を有することにより、１つ以上のシグネチャー核酸を特異的に同定する核酸が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、シグネチャー遺伝子の断片であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、２００、１５０、１００、５０、２５、１０以下のヌクレオチド長であり得る。キットは、別個の容器中に、またはそれらをマトリックスに結合させるための試薬とともに別個に包装され）、対照配合物（陽性および／または陰性）、および／または検出標識、例えば、とりわけ、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、シアニン色素、Ａｌｅｘａ色素、ルシフェラーゼ、放射性標識を含有し得る。アッセイを実施するための説明書（例えば、印刷物、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を、キット中に含めることができる。アッセイは、例えば、ノザンハイブリダイゼーションまたはＤＮＡチップまたはサンドイッチＥＬＩＳＡまたは当技術分野において公知の任意の他の方法の形態であり得る。あるいは、キットは、１つ以上の核酸配列を含む核酸基板アレイを含有する。
【０１５１】
Ｔ細胞モジュレート剤の使用
本明細書に提供される組成物および方法のいずれかにおいて使用される好適なＴ細胞モジュレート剤としては、抗体、可溶性ポリペプチド、ポリペプチド剤、ペプチド剤、核酸剤、核酸リガンド、または小分子剤が挙げられる。非限定的な例として、好適なＴ細胞モジュレート剤または１つ以上のＴ細胞モジュレート剤との組合せで使用される薬剤を、以下の表１０に示す。
【０１５２】
【表２３】
2017508457.tif 000025
【０１５３】
【表２４】
2017508457.tif 000026
【０１５４】
【表２５】
2017508457.tif 000027
【０１５５】
【表２６】
2017508457.tif 000028
【０１５６】
【表２７】
2017508457.tif 000029
【０１５７】
【表２８】
2017508457.tif 000030
【０１５８】
【表２９】
2017508457.tif 000031
【０１５９】
本発明による治療実体の投与を、改善された移動、送達、忍容性などを提供するために配合物中に取り込まれる好適な担体、賦形剤、および他の薬剤とともの施すことが認識される。複数の適切な配合物を、全ての製薬化学者に公知の処方集に見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈ  ｅｄ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））、特に、その中のＢｌａｕｇ、ＳｅｙｍｏｕｒによるＣｈａｐｔｅｒ  ８７。これらの配合物としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー剤、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオンまたはアニオン）含有ベシクル（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト剤、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル剤、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。上記混合物のいずれも、本発明による治療および治療法において適切であり得るが、配合物中の活性成分が配合物により不活性化されず、配合物が投与経路について生理学的に適合性および忍容性であることを条件とする。Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００）、Ｗａｎｇ  Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）および製薬化学者に周知の配合物、賦形剤および担体に関連する追加の情報についてのそれらの引用も参照。
【０１６０】
Ｔ細胞モジュレート剤を含む本発明の治療配合物は、免疫関連障害または異常免疫応答に伴う症状を治療または緩和するために使用される。本発明はまた、免疫関連障害または異常免疫応答に伴う症状を治療または緩和する方法を提供する。治療レジメンは、免疫関連障害または異常免疫応答に罹患している（またはそれらを発症するリスクがある）対象、例えば、ヒト患者を、標準的方法を使用して同定することにより実施される。例えば、Ｔ細胞モジュレート剤は、自己免疫疾患および／または炎症障害の治療における有用な治療ツールである。ある実施形態において、Ｔｈ１７Ｔ細胞分化をモジュレートする、例えば、阻害し、中和し、または干渉するＴ細胞モジュレート剤の使用が、自己免疫疾患および／または炎症障害の治療に企図される。ある実施形態において、Ｔｈ１７Ｔ細胞分化をモジュレートする、例えば、向上させ、または促進するＴ細胞モジュレート剤の使用は、例えば、ある病原体および他の感染性疾患に対するＴｈ１７応答の増強に企図される。Ｔ細胞モジュレート剤は、例えば、移植片拒絶を予防し、遅延させ、もしくはそうでなければ軽減させ、および／または移植片の生存を延長させるための種々の移植指標における有用な治療ツールでもある。なぜなら、移植片拒絶の一部の症例においてもＴｈ１７細胞が重要な役割を担い得ることも示されているためである（例えば、Ａｂａｄｊａ  Ｆ，Ｓａｒｒａｊ  Ｂ，Ａｎｓａｒｉ  ＭＪ．，“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １７  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１２  Ｆｅｂ；１７（１）：８−１４．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＭＯＴ．０ｂ０１３ｅ３２８３４ｅｆ４ｅ４参照）。Ｔ細胞モジュレート剤は、癌および／または抗腫瘍免疫における有用な治療ツールでもある。なぜなら、Ｔｈ１７／Ｔｒｅｇバランスはそれらの適用症にも関与しているためである。例えば、一部の研究は、ＩＬ−２３およびＴｈ１７細胞が一部の癌、例えば、非限定的な例として、結腸直腸癌における役割を担うことを示唆している（例えば、Ｙｅ  Ｊ，Ｌｉｖｅｒｇｏｏｄ  ＲＳ，Ｐｅｎｇ  Ｇ．“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１３  Ｊａｎ；１８２（１）：１０−２０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｐａｔｈ．２０１２．０８．０４１．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｎｏｖ  １４参照）。Ｔ細胞モジュレート剤は、異常Ｔｈ１７細胞産生を呈する遺伝子欠損を有する患者、例えば、Ｔｈ１７細胞を天然に産生しない患者においても有用である。
【０１６１】
Ｔ細胞モジュレート剤は、自己免疫障害、炎症疾患などに対するワクチンにおいて、および／またはワクチンアジュバントとしても有用である。これらのタイプの障害の治療のためのアジュバントの組合せは、標的化される自己抗原、すなわち、自己免疫に関与する自己抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質；炎症自己抗原、例えば、アミロイドペプチドタンパク質、または移植抗原、例えば、アロ抗原からの広範な抗原との組合せにおける使用に好適である。抗原は、タンパク質に由来するペプチドまたはポリペプチド、ならびに以下のもの：糖、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、移植抗原、アレルゲン、または他の巨大分子要素のいずれかの断片を含み得る。一部の例において、２つ以上の抗原を抗原組成物中に含める。
【０１６２】
自己免疫疾患としては、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、自己免疫要素によるウイルス疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアック疱疹状皮膚炎；慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症脱髄多発性神経障害（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）としても公知）、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１６３】
一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、対象における炎症要素を有する自己免疫疾患、例えば、異常免疫応答の症状の治療、その進行の遅延、またはそうでなければその改善において有用である。一部の実施形態において、Ｔ細胞モジュレート剤は、異常Ｔｈ１７応答、例えば、異常ＩＬ−１７産生に伴うことが公知の自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ブドウ膜炎、ループス、強直性脊椎炎、および関節リウマチなどの治療に有用である。
【０１６４】
炎症障害としては、例えば、慢性および急性炎症障害が挙げられる。炎症障害の例としては、アルツハイマー病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、骨関節炎、敗血症、卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症ならびに人工呼吸器誘発性肺損傷が挙げられる。
【０１６５】
これらの免疫関連障害に伴う症状としては、例えば、炎症、発熱、全身倦怠感、発熱、疼痛（炎症部位に局在することが多い）、頻脈、関節疼痛または疼き（関節痛）、呼吸促迫または他の異常呼吸パターン、悪寒、錯乱、見当識障害、興奮、眩暈、咳嗽、呼吸困難、肺感染、心不全、呼吸器不全、浮腫、体重増加、粘液膿性の再発、悪液質、喘鳴、頭痛、および腹部症状、例えば、腹痛、下痢または便秘などが挙げられる。
【０１６６】
治療の有効性は、特定の免疫関連障害を診断または治療する任意の公知の方法に関連して決定する。免疫関連障害の１つ以上の症状の緩和は、Ｔ細胞モジュレート剤が臨床的利益を付与することを示す。
【０１６７】
免疫関連障害または異常免疫応答に罹患している患者へのＴ細胞モジュレート剤の投与は、種々の実験室または臨床的目的のいずれかが達成される場合、良好とみなされる。例えば、患者へのＴ細胞モジュレート剤の投与は、免疫関連障害または異常免疫応答に伴う症状の１つ以上が緩和、低減、阻害され、またはさらなる、すなわち、悪化状態に進行しない場合、良好とみなされる。患者へのＴ細胞モジュレート剤の投与は、免疫関連障害または異常免疫応答が寛解に入り、またはさらなる、すなわち、悪化状態に進行しない場合、良好とみなされる。
【０１６８】
Ｔ細胞モジュレート剤の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされる量に関連する。投与すべき要求量は、さらに、Ｔ細胞モジュレート剤のその特異的標的の特異性に依存し、投与されるＴ細胞モジュレート剤が、それが投与される他の対象から自由体積で枯渇される速度にも依存する。
【０１６９】
Ｔ細胞モジュレート剤は、医薬組成物の形態で、種々の疾患および障害の治療のために投与することができる。このような組成物の調製に関与する原理および考慮、ならびに要素の選択における指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９ｔｈ  ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに提供される。
【０１７０】
ポリペプチドベースのＴ細胞モジュレート剤を使用する場合、標的に特異的に結合し、治療機能を保持する最小断片が好ましい。このような断片は、化学合成し、および／または組換えＤＮＡ技術により産生することができる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）参照）。配合物は、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものも含有し得る。あるいは、またはさらに、組成物は、その機能を向上させる薬剤、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤などを含み得る。このような分子は、好適には、意図される目的に有効な量の組合せで存在する。
【０１７１】
本発明は、本明細書に考察される方法または使用のいずれか１つを含む治療方法または創薬方法または治療物を配合もしくは調製する方法を包含する。
【０１７２】
本発明はまた、ＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される１つ以上の遺伝子中の突然変異の１つ以上の阻害に関与し得る分子、有利には、小分子または生物製剤の同定に関する。本発明は、小分子または生物製剤のライブラリーをスクリーニングして体細胞突然変異の発現の抑制もしくは阻害に関与する化合物を同定し、または突然変異を有する細胞がＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌの１つ以上においてより正常に挙動するように細胞の表現型を変更することを企図する。
【０１７３】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、ＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌの１つ以上における体細胞突然変異の発現の抑制または阻害に関与する小分子または生物製剤を同定するために企図される。この方法のフレキシビリティにより、生物学の多数の異なる領域が同等に多様な化学的嗜好と関わり合うことが可能となった（例えば、Ｉｎｇｌｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，４３８−４４１（２００７）参照）。２００，０００超のユニーク小分子を含有する化学ライブラリー、および天然産物ライブラリーの多様なセットをスクリーニングすることができる。これとしては、例えば、構造的多様性、複数の治療域の集合的カバレッジ、およびヒトにおける公知の安全性およびバイオアベイラビリティーについて選択される特許切れの化合物のＰｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリー（１，１２０個の化学物質）が挙げられ、ほとんどＦＤＡ承認薬物の１，０４０個の化合物−ライブラリーからなるＮＩＮＤＳ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２（例えば、米国特許第８，５５７，７４６号明細書参照）も企図される。
【０１７４】
ＮＩＨのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｐｒｏｂｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＭＬＰＣＮ）は、数千個の小分子（基礎生物学を証明し、疾患の理解を発展させるためのツールとして使用することができる化合物）へのアクセスを提供する。小分子は、研究者が生物学的経路の複雑性を理解するのに役立ち、または新規治療剤のための出発点であり得る。Ｔｈｅ  Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＩＰＤｅＣ）は、ＭＬＰＣＮの一部であり、ラージスケールスクリーニングおよび医化学のための３３０，０００超の化合物の増大するライブラリーへのアクセスを提供する。これらの化合物のいずれかを、ＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌの１つ以上における体細胞突然変異の発現の抑制または阻害に関与する化合物のスクリーニングに利用することができる。
【０１７５】
本明細書において使用される語句「治療有効量」は、非毒性であるが所望の治療効果を提供するために十分な量の薬物、薬剤、または化合物を指す。
【０１７６】
本明細書において使用される「患者」は、医学的治療を受ける任意のヒトまたはそれを受け得る者を指す。
【０１７７】
「多型性部位」は、別のポリヌクレオチドと１つ以上の単一ヌクレオチド変化だけ異なるポリヌクレオチドを指す。
【０１７８】
「体細胞突然変異」は、親から遺伝されず、子孫にも伝わらない遺伝子構造の変化を指す。
【０１７９】
本発明による治療法または治療は、単独で、または別の治療法と同時に実施することができ、または自宅、医師の診療室、診療所、外来、または病院において提供することができる。治療は、一般に、医師が治療法の効果を厳密に観察し、必要とされる任意の調整を行うことができるように病院において開始する。治療法の継続期間は、患者の年齢および病態、心血管疾患の病期、ならびにいかに患者が治療に応答するかに依存する。さらに、心血管疾患を発症するより高いリスクを有する者（例えば、遺伝的な傾向がある者）は、疾患の症状を阻害し、または遅延させるための予防的治療を受け得る。
【０１８０】
本発明の医薬品は、当業者に公知の手法において、例えば、慣用の溶解、凍結乾燥、混合、造粒または糖衣プロセスにより調製される。配合物を作製するための当技術分野において周知の方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出される。
【０１８１】
本発明の医薬品の投与は、心血管疾患の発症の治療または阻害（例えば、遅延による）に有効な化合物濃度をもたらす任意の好適な手段により得る。化合物は、好適な担体物質、例えば、投与される化合物の治療特性を保存する薬学的に許容可能な賦形剤と混合される。１つの例示的な薬学的に許容可能な賦形剤は、生理食塩水である。好適な担体物質は、一般に、医薬品の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。医薬品は、経口、直腸管、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、鼻腔、局所または経皮、膣、または眼内投与に好適な剤形で提供することができる。したがって、医薬品は、例えば、錠剤、カプセル剤、ピル剤、散剤、顆粒剤、懸濁液、エマルジョン、液剤、ゲル剤、例として、ヒドロゲル、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、プラスター剤、ドレンチ（ｄｒｅｎｃｈ）、送達デバイス、坐剤、浣腸管剤、注射剤、インプラント、噴霧剤、またはエアゾール剤の形態であり得る。
【０１８２】
本発明の方法により患者の遺伝子型を決定するため、その患者からゲノムＤＮＡの試料を得ることが必要であり得る。ゲノムＤＮＡのその試料は、その患者から採取された組織または細胞の試料から得ることができる。
【０１８３】
組織試料は、限定されるものではないが、毛髪（毛根を含む）、皮膚、頬ぬぐい液、血液または唾液を含み得る。組織試料は、試料を試料が採取された個々の患者に関連付ける識別番号または他の指標によりマークすることができる。試料のアイデンティティーは、有利には、本発明の方法全体を通して一定のままであり、それにより分析の抽出の間の試料の統一性および連続性を保証する。あるいは、指標は、データ、および任意の他の関連データを、データを得た患者に逆に関連付けることを確保する標準の方法で変えることができる。要求される試料の量／サイズは当業者に公知である。
【０１８４】
一般に、組織試料は、患者に対応するコードを担持するナンバリング系を使用して標識される容器中で配置することができる。したがって、特定の患者の遺伝子型は容易に追跡可能である。
【０１８５】
本発明の一実施形態において、サンプリングデバイスおよび／または容器を医師に提供することができる。サンプリングデバイスは、有利には、個々の患者から一定の再現可能な試料を採取する一方、いかなる組織のクロスコンタミネーションも同時に回避する。したがって、個々の患者に由来する試料組織のサイズおよび容量は、一致する。
【０１８６】
本発明によれば、ＤＮＡの試料は、目的の患者の組織試料から得られる。どの細胞または組織の資源を使用するとしても、十分な量の細胞を得て十分な量のＤＮＡを分析に提供しなければならない。この量は公知であり、または当業者により容易に決定可能である。
【０１８７】
ＤＮＡは、当業者に公知の技術により組織／細胞から単離される（例えば、米国特許第６，５４８，２５６号明細書および同第５，９８９，４３１号明細書、Ｈｉｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｉｎｒｕｉ  Ｉｄｅｎｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９８９；３４（３）：２１７−２３およびＪｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｊａｎ．２５．１９９１；１９（２）：４０８参照；これらの開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる）。例えば、高分子量ＤＮＡは、プロテイナーゼＫ抽出およびエタノール沈殿を使用して細胞または組織から精製することができる。ＤＮＡは、当技術分野において公知の任意の他の好適な方法を使用して患者標本から抽出することができる。
【０１８８】
本発明の目的は、患者からのＤＮＡを分析することにより所与の目的患者の遺伝子型を決定して心血管疾患の発症と関連する本発明の規定の体細胞突然変異を担持する患者を同定することである。特に、キットは、特定の突然変異、例えば、限定されるものではないが、ＤＥＣ１、ＰＺＬＰ、ＴＣＦ４およびＣＤ５Ｌからなる群から選択される１つ以上の遺伝子を同定するためのプライマーまたは他のＤＮＡマーカーを有し得る。
【０１８９】
患者の遺伝子型を決定し、所与のＤＮＡ試料が特定の体細胞突然変異を含有するか否かを同定または分析する当技術分野において公知の多くの方法が存在する。遺伝子型を決定する任意の方法は、本発明において遺伝子型を決定するために使用することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、アンプライマーシーケンシング、ＤＮＡシーケンシング、蛍光分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（または「ＦＲＥＴ」）ベースハイブリダイゼーション分析、ハイスループットスクリーニング、質量分光法、核酸ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＦＬＰ分析およびサイズクロマトグラフィー（例えば、キャピラリーまたはゲルクロマトグラフィー）が挙げられ、これらは全て当業者に周知である。
【０１９０】
本発明の方法、例えば、ホールエキソームシーケンシングおよび標的化アンプリコンシーケンシングは、患者中の体細胞突然変異検出のための診断キットにおける商業用途を有する。本発明による試験キットは、例えば、本発明によるホールエキソームシーケンシングおよび標的化アンプリコンシーケンシングに必要な材料のいずれかを含み得る。特定の有利な実施形態において、本発明のための診断は、本明細書に開示の遺伝子のいずれかを試験することを含み得る。キットは、本発明の配列を検出または計測するための追加の手段、例えば、試薬、ならびにさらに理想的には陽性および陰性対照をさらに含む。
【０１９１】
本発明は、固体またはフレキシブル担体、例えば、紙、ナイロンまたは他のタイプの膜、フィルター、チップ、スライドガラス、マイクロチップ、マイクロビーズ、または任意の他のそのようなマトリックス上で固定化される本発明によるプローブをさらに包含し、その全ては本発明の範囲内である。この形態のプローブは、目下のところ、「ＤＮＡチップ」と称される。これらのＤＮＡチップは、本発明の体細胞突然変異を分析するために使用することができる。本発明は、本明細書に記載の配列の１つ以上をベースとする核酸分子のアレイまたはマイクロアレイをさらに包含する。本明細書において使用される「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体またはフレキシブル担体、例えば、紙、ナイロンまたは他のタイプの膜、フィルター、チップ、スライドガラス、または任意の他の好適な固体担体上の合成された区別されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアレイを指す。一実施形態において、マイクロアレイは、開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，４４６，６０３号明細書；同第５，５４５，５３１号明細書；同第５，８０７，５２２号明細書；同第５，８３７，８３２号明細書；同第５，８７４，２１９号明細書；同第６，１１４，１２２号明細書；同第６，２３８，９１０号明細書；同第６，３６５，４１８号明細書；同第６，４１０，２２９号明細書；同第６，４２０，１１４号明細書；同第６，４３２，６９６号明細書；同第６，４７５，８０８号明細書および同第６，４８９，１５９号明細書ならびにＰＣＴ出願公開の国際公開第０１／４５８４３Ａ２号パンフレットに記載の方法および装置により調製され、使用される。
【実施例】
【０１９２】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を説明する目的にために挙げられ、本発明を決して限定することを意味しない。本発明は、本明細書に記載の方法とともに、好ましい実施形態の現在の代表物であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨に包含されるその変更形態および他の使用が当業者によって行われる。
【０１９３】
これに関して、本発明において使用され、または本発明に関する細胞中の突然変異およびさらには突然変異マウスは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣａｓ９発現真核細胞またはＣａｓ−９発現真核動物、例えば、マウスによるものであり得ることが挙げられる。Ｃａｓ９発現真核細胞または真核動物、例えば、マウスは、それに送達または投与されるガイドＲＮＡを有し得、それによりＲＮＡが遺伝子座を標的化し、本発明において、または本発明に関して使用される所望の突然変異を誘導する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、その成分、およびそのような成分の送達に関する一般的情報、例として、方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ならびにその作製および使用方法（量および配合に関するものを含む）、ならびにＣａｓ９発現真核細胞、Ｃａｓ９発現真核動物、例えば、マウス（全て本発明において、または本発明に関して有用）に関して、以下が参照される：米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書，同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９０６，６１６号明細書；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２８７９３８Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３４Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２５６０４６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４８７０２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２７００Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６９９Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６６４Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２３４９７２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２２７７８７Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８９８９６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９１９Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６８４３Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７９７７０Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）および米国特許出願公開第２０１４−０１７９００６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許／特許出願：欧州特許第２７７１４６８号明細書（欧州特許第１３８１８５７０．７号明細書）、欧州特許第２７６４１０３号明細書（欧州特許第１３８２４２３２．６号明細書）、および欧州特許第２７８４１６２号明細書（欧州特許第１４１７０３８３．５号明細書）；およびＰＣＴ特許出願公開の国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７４３号明細書）、国際公開２０１４／０９３６９４号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７９０号明細書）、国際公開２０１４／０９３５９５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６１１号明細書）、国際公開２０１４／０９３７１８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８２５号明細書）、国際公開２０１４／０９３７０９号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８１２号明細書）、国際公開２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号明細書）、国際公開２０１４／０９３６３５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６９１号明細書）、国際公開２０１４／０９３６５５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４７３６号明細書）、国際公開２０１４／０９３７１２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８１９号明細書）、国際公開２０１４／０９３７０１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４８００号明細書）、国際公開２０１４／０１８４２３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０５１４１８号明細書）、国際公開２０１４／２０４７２３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１７９０号明細書）、国際公開２０１４／２０４７２４号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８００号明細書）、国際公開２０１４／２０４７２５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０３号明細書）、国際公開２０１４／２０４７２６号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０４号明細書）、国際公開２０１４／２０４７２７号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０６号明細書）、国際公開２０１４／２０４７２８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０８号明細書）、国際公開２０１４／２０４７２９号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０４１８０９号明細書）、および：
＞Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
＞ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ  Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ  Ｄ．，Ｃｏｘ  Ｄ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＬＡ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
＞Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗａｎｇ  Ｈ．，Ｙａｎｇ  Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ  ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ  ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ  ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍａｙ  ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
＞Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ  ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＡＥ，Ｈｓｕ  ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  Ｍ，Ｃｏｎｇ  Ｌ，Ｐｌａｔｔ  ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３  Ａｕｇ  ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  ２３；
＞Ｄｏｕｂｌｅ  Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ  Ａｕｇ  ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５．（２０１３）；
＞ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
＞Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８．（２０１３）；
＞Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｃ  １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；
＞Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃａｓ９  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ  Ｆｅｂ  ２７．（２０１４）．１５６（５）：９３５−４９；
＞Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃａｓ９  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ  Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ．，Ｋｒｉｚ  ＡＪ．，Ｃｈｉｕ  ＡＣ．，Ｈｓｕ  ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ  ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ  ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ．，Ｃｈｅｎ  Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，Ｓｈａｒｐ  ＰＡ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）Ａｐｒ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９、
＞ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５９（２）：４４０−４５５（２０１４）ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４、
＞Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １５７，１２６２−１２７８（Ｊｕｎｅ  ５，２０１４）（Ｈｓｕ  ２０１４）、
＞Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４  Ｊａｎｕａｒｙ  ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１、
＞Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｇＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ３  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０２６、および
＞Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １９  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５。これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９４】
本発明は、異なる細胞からのＲＮＡを個々にタグ付けし、単一ライブラリーの作出を可能とする一方、それぞれのリードの細胞アイデンティティーを保持するハイスループット単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑおよび／または標的化核酸プロファイリング（例えば、シーケンシング、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応など）を含む。これに関して、開示が参照により組み込まれる２０１４年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／０４８，２２７号明細書の技術を、本発明においてまたは本発明に関して使用することができる。ハイスループットにおいて個々の細胞から核酸を単離し、溶解させ、バーコード化し、調製するための分子バーコード化およびエマルジョンベースマイクロ流体工学の組合せが使用される。マイクロ流体装置（例えば、ポリジメチルシロキサン製）、ナノリットル未満逆エマルジョン液滴。これらの液滴は、核酸をバーコード化捕捉ビーズと同時封入するために使用される。例えば、それぞれのビーズは、それぞれのドロップおよびその内容物が区別可能になるようにユニークにバーコード化される。核酸は、当技術分野において公知の任意の資源、例えば、単一細胞、細胞のペア、細胞溶解物、または溶液に由来するものなどに由来し得る。細胞は、それが液滴中に封入されるため溶解される。単一細胞およびバーコード化ビーズをそれらの液滴中にポアソン統計でロードするため、１００，０００〜１０００万個のそのようなビーズが、約１０，０００〜１００，０００個の細胞をバーコード化するために必要とされる。これに関して、以下を含み得る単一細胞シーケンシングライブラリーが存在し得る：１つのユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズを、７５〜１２５μｍの直径を有するエマルジョン液滴中の単一細胞と合流させること；細胞を溶解させてそのＲＮＡをＲＮＡ捕捉マイクロビーズ上へのハイブリダイゼーションによる捕捉に利用可能とすること；エマルジョン液滴の内側または外側のいずれかで逆転写を実施して細胞のｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズに共有結合している第１のｃＤＮＡ鎖に変換すること；全ての細胞からｃＤＮＡ付着マイクロビーズをプールすること；ならびに単一コンポジットＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製およびシーケンシングすること。したがって、ユニークバーコードおよびマイクロ流体装置に好適な直径を有するユニークにバーコード化されたＲＮＡ捕捉マイクロビーズを調製する方法が存在し得ることを提供することが本発明の実施に関し、または実施において想定され、それは、１）プールアンドスプリット法でビーズの表面上で逆ホスホラミダイト合成を実施し、その結果、合成のそれぞれのサイクルにおいてビーズを、４つのカノニカルヌクレオチド（Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＡ）の１つまたは２つ以上の塩基長のユニークオリゴヌクレオチドとの４つの反応中にスプリットすること；２）このプロセスを複数回にわたり、少なくとも６回、最適には、１２回超繰り返し、その結果、後に、プール中のそれぞれのビーズの表面上に１６００万個超のユニークバーコードが存在することを含み得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２０６４４７参照）���同様に、本発明において、または本発明に関して、マイクロ流体系を介して単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器が存在し得、それは、以下を含み得る：フィルター、および担体流体チャネルを含み得、前記担体流体チャネルは、レジスターをさらに含み得る油−界面活性剤インレット；フィルターおよび担体流体チャネルを含み得、前記担体流体チャネルは、レジスターをさらに含み得る分析物用インレット；フィルターおよび担体流体チャネルを含み得、前記担体流体チャネルは、レジスターをさらに含み得るｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬用インレット；前記担体流体チャネルは、調整可能または所定の流速においてその中を流動する担体流体を有し；それぞれの前記担体流体チャネルは、ジャンクションにおいて合流し；前記ジャンクションは、ドロップ用アウトレットを含有する混合器に接続されている。同様に、本発明の実施に関して、または本発明の実施において、単一細胞シーケンシングライブラリーを作出する方法であって、１つのユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズを、１２５μｍの直径を有するエマルジョン液滴中で単一細胞と合流させ、それにより細胞を溶解させ、ＲＮＡ捕捉マイクロビーズ上でＲＮＡを捕捉すること；液滴の破壊後およびマイクロビーズの回収後；またはエマルジョン液滴内側のいずれかで逆転写を実施して細胞のＲＮＡを、ＲＮＡ捕捉マイクロビーズに共有結合している第１のｃＤＮＡ鎖に変換すること；全ての細胞からｃＤＮＡ付着マイクロビーズをプールすること；ならびに単一コンポジットＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製およびシーケンシングすることを含み得；エマルジョン液滴は、５０〜２１０μｍであり得る方法が存在し得る。さらなる実施形態において、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズの直径は、１０μｍ〜９５μｍである方法。したがって、本発明の実施は、ユニークバーコードおよびマイクロ流体装置に好適な直径を有するユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズを調製することを包括し、１）プールアンドスプリット法でビーズの表面上で逆ホスホラミダイト合成を実施し、その結果、合成のそれぞれのサイクルにおいてビーズを、４つのカノニカルヌクレオチド（Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＡ）の１つとの４つの反応中にスプリットすること；２）このプロセスを複数回にわたり、少なくとも６回、最適には、１２回超繰り返し、その結果、後に、プール中のそれぞれのビーズの表面上に１６００万個超のユニークバーコードが存在することを含み得る。共有結合は、ポリエチレングリコールであり得る。ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズの直径は、１０μｍ〜９５μｍであり得る。したがって、本発明の実施に関して、または本発明の実施において、ユニークバーコードおよびマイクロ流体装置に好適な直径を有するユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズを調製する方法であって、１）プールアンドスプリット法でビーズの表面上で逆ホスホラミダイト合成を実施し、その結果、合成のそれぞれのサイクルにおいてビーズを、４つのカノニカルヌクレオチド（Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＡ）の１つとの４つの反応中にスプリットすること；２）このプロセスを複数回にわたり���少なくとも６回、最適には、１２回超繰り返し、その結果、後に、プール中のそれぞれのビーズの表面上に１６００万個超のユニークバーコードが存在することを含み得る方法が存在し得ることも想定される。ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズの直径は、１０μｍ〜９５μｍであり得る。さらに、本発明の実施に関して、マイクロ流体系を介してコンポジット単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器が存在し得、それは、以下を含み得る：フィルターおよび２つの担体流体チャネルを含み得、前記担体流体チャネルは、レジスターをさらに含み得る油−界面活性剤インレット；フィルターおよび２つの担体流体チャネルを含み得、前記担体流体チャネルは、レジスターをさらに含み得る分析物用インレット；担体流体チャネルを含み得るｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬用インレット；前記担体流体チャネルは、調整可能または所定の流速においてその中を流動する担体流体を有し；それぞれの前記担体流体チャネルは、ジャンクションにおいて合流し；前記ジャンクションは、液滴ピンチオフ用構造物とそれに続くドロップ用アウトレットに接続されている混合器に接続されている。分析物は、化学試薬、遺伝子摂動細胞、タンパク質、薬物、抗体、酵素、核酸、オルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたは核、細胞またはそれらの任意の組合せを含み得る。機器の一実施形態において、分析物は細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、脳細胞である。機器の一実施形態において、溶解試薬は、アニオン性界面活性剤、例えば、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、またはカオトロピック塩、例えば、チオシアン酸グアニジニウムを含み得る。フィルターは、正方ＰＤＭＳポストを含み得；例えば、フィルターはそのようなポストの細胞チャネル上に存在し、辺は１２５〜１３５μｍの範囲であり、ポスト間は７０〜１００ｎｍ離隔している。油−界面活性剤インレット上のフィルターは、２つのサイズの正方ポストを含み得；一方は、７５〜１００μｍの範囲の辺を有し、それらの間は２５〜３０μｍ離隔しており、他方は、４０〜５０μｍの範囲の辺を有し、１０〜１５μｍ離隔している。機器は、レジスター、例えば、７０００〜９０００μｍの長さ、５０〜７５μｍの幅および１００〜１５０ｍｍの深さを有するサーペンタインであるレジスターを含み得る。機器は、油−界面活性剤インレットについて８０００〜１２，０００μｍの長さ、分析物（細胞）インレットについては５０００〜７０００、およびマイクロビーズおよび溶解薬剤用インレットについては９００〜１２００μｍを有するチャネルを有し得、ならびに／または全てのチャネルは、１２５〜２５０ｍｍの幅、および１００〜１５０ｍｍの深さを有する。細胞チャネルの幅は１２５〜２５０μｍであり得、深さは１００〜１５０μｍであり得る。機器は、７０００〜９０００μｍの長さおよび１１０〜１４０μｍの幅を有し、１５０μｍごとに３５〜４５ｏのジグザグを有する混合器を含み得る。混合器の幅は約１２５μｍであり得る。油−界面活性剤は、ＰＥＧブロックポリマー、例えば、ＢＩＯＲＡＤ（商標）ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｉｌであり得る。担体流体は水−グリセロール混合物であり得る。本発明の実施においてまたは本発明に関して、混合物は、以下の要素の組合せにより装飾されている複数のマイクロビーズを含み得る：ビーズ特異的オリゴヌクレオチドバーコード；個々のビーズ上のオリゴヌクレオチド間で変動し、したがってそれらの個々のオリゴヌクレオチド分子を区別し、または識別支援するために使用することができる追加のオリゴヌクレオチドバーコード配列；下流分子−生物学的反応のための基質を作出する追加のオリゴヌクレオチド配列、例えば、オリゴ−ｄＴ（成熟ｍＲＮＡの逆転写用）、特異的配列（トランスクリプトームの特異的部分の捕捉、またはＤＮＡポリメラーゼおよび類似の酵素のためのプライミング用）、またはランダム配列（トランスクリプトームまたはゲノム全体にわたるプライミング用）。任意の個々のマイクロビーズの表面上の個々のオリゴヌクレオチド分子は、それらの要素の３つ全てを含有し得、第３の要素は、オリゴ−ｄＴおよびプライマー配列の両方を含み得る。混合物は、複数のマイクロビーズを含み得、前記マイクロビーズは、以下の要素を含み得る：少なくとも１つのビーズ特異的オリゴヌクレオチドバーコード；個々のビーズ上のオリゴヌクレオチド間で変動し、それによりビーズ特異的オリゴヌクレオチド分子の識別を支援する少なくとも１つの追加の識別オリゴヌクレオチドバーコード配列；場合により、下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチド配列。混合物は、下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含み得る。さらなる実施形態において、下流分子生物学的反応は、成熟ｍＲＮＡの逆転写のため；トランスクリプトームの特異的部分を捕捉するため、ＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくは類似の酵素をプライミングするため；またはトランスクリプトームもしくはゲノム全体を通してプライミングするためである。混合物は、オリゴ−ｄＴ配列を含み得る追加のオリゴヌクレオチド配列を含み得る。混合物は、プライマー配列を含み得る追加のオリゴヌクレオチド配列をさらに含み得る。混合物は、オリゴ−ｄＴ配列およびプライマー配列を含み得る追加のオリゴヌクレオチド配列をさらに含み得る。用いることができる標識物質の例としては、当業者に公知の標識物質、例えば、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、および放射性物質が挙げられる。
具体例としては、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチン、およびルテニウムが挙げられる。標識物質としてビオチンが用いられる場合、好ましくは、ビオチン標識抗体の添加後、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）に結合しているストレプトアビジンがさらに添加される。有利には、標識は、蛍光標識である。蛍光標識の例としては、限定されるものではないが、Ａｔｔｏ色素、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−��ルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；およびナフタロシアニンが挙げられる。蛍光標識は、蛍光タンパク質、例えば、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または任意の光変換タンパク質であり得る。比色標識、生物発光標識および／または化学発光標識は、標識をさらに達成させ得る。標識としては、摂動分析によるハイブリダイゼーション複合体中の分子間のエネルギー移動、クエンチング、またはドナーおよびアクセプター分子間の電子輸送をさらに挙げることができ、その後者は二本鎖マッチハイブリダイゼーション複合体により容易にすることができる。蛍光標識は、ペリレンまたはテリレンであり得る。代替例において、蛍光標識は、蛍光バーコードであり得る。有利には、標識は、光感受性であり得、標識は、光活性化され、および／または光が１つ以上のリンカーを開裂させて分子積み荷を放出させる。光活性化分子積み荷は、主要集光性複合体（ＬＨＣＩＩ）であり得る。別の実施形態において、蛍光標識は、フリーラジカル形成を誘導し得る。有利には、薬剤は、動的な方法でユニークに標識することができる（例えば、２０１２年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／７０３，８８４号明細書参照）。ユニーク標識は、少なくとも部分的に、天然核酸であり得、２つ以上の検出可能オリゴヌクレオチドタグの互いへの逐次付着により生成することができ、それぞれのユニーク標識は、別個の薬剤と会合させることができる。検出可能オリゴヌクレオチドタグは、そのヌクレオチド配列のシーケンシングにより、および／またはそれを付着させることができる非核酸検出可能部分の検出により検出することができるオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドタグは、それらのヌクレオチド配列により、またはオリゴヌクレオチドに付着している非核酸検出可能部分、例えば、限定されるものではないが、フルオロフォアにより、またはそれらのヌクレオチド配列および非核酸検出可能部分の組合せにより検出可能であり得る。検出可能オリゴヌクレオチドタグは、１つ以上の非オリゴヌクレオチド検出可能部分を含み得る。検出可能部分の例としては、限定されるものではないが、フルオロフォア、微粒子、例として、量子ドット（Ｅｍｐｏｄｏｃｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１２６−１３０，１９９９）、金ナノ粒子（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：６０２５−６０２９，２０００）、マイクロビーズ（Ｌａｃｏｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１７）：９４６１−９４６６，２０００）、ビオチン、ＤＮＰ（ジニトロフェニル）、フコース、ジゴキシゲニン、ハプテン、および当業者に公知の他の検出可能部分を挙げることができる。一部の実施形態において、検出可能部分は、量子ドットであり得る。このような部分を検出する方法は本明細書に記載され、および／または当技術分野において公知である。したがって、検出可能オリゴヌクレオチドタグは、限定されるものではないが、ユニークヌクレオチド配列を含み得るオリゴヌクレオチド、検出可能部分を含み得るオリゴヌクレオチド、ならびにユニークヌクレオチド配列および検出可能部分の両方を含み得るオリゴヌクレオチドであり得る。ユニーク標識は、２つ以上の検出可能オリゴヌクレオチドタグの互いへの逐次付着により産生することができる。検出可能タグは、複数の検出可能タグ中に存在し得、またはその中で提供することができる。同一または異なる複数のタグを使用することができる。なぜなら、それぞれの検出可能タグの資源がユニーク標識の一部であり得るためである。換言すると、複数のタグは、下位セットに下位分類することができ、単一の下位セットをそれぞれのタグのための資源として使用することができる。１つ以上の他の種をタグと会合させることができる。特に、溶解細胞により放出される核酸を１つ以上のタグにライゲートすることができる。これらとしては、例えば、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ転写物、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡなどを挙げることができる。このような核酸は、タグそれ自体のシーケンシングに加え、シーケンシングすることができ、それはタグ、または対応する液滴もしくは細胞が曝露される条件と関連し得る細胞の核酸プロファイルについての情報を生じ得る。
【０１９５】
したがって、本発明は、油中水型エマルジョンとしてマイクロ流体装置により生成される単分散水性液滴の使用を通して細胞、オルガネラ、核酸、タンパク質などを含有し得る個々のエマルジョン液滴への試薬のハイスループットおよび高分解能送達を含み得、または実施することができる。液滴は、流動油相中で運搬され、界面活性剤により安定化される。一態様において、単一細胞または単一オルガネラまたは単一分子（タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ）は、水溶液／分散液から均一な液滴中に封入される。関連態様において、複数の細胞または複数の分子が単一細胞または単一分子に代用し得る。１ｐＬ〜１０ｎＬの範囲の容量の水性液滴は、個々の反応器として機能する。液滴中の１０４〜１０５個の単一細胞は、単一のランで処理および分析することができる。迅速なラージスケール化学スクリーニングまたは複合生物学的ライブラリー同定のためにマイクロ液滴を利用するため、規定の化合物または生物学的プローブ細胞または目的分子バーコードをそれぞれ含有する異なる種のマイクロ液滴を、好ましい条件、例えば、混合比、濃度、および組合せの順序において、生成および組み合わせなければならない。それぞれの種の液滴は、別個のインレットマイクロ流体チャネルからメインのマイクロ流体チャネル中のコンフルエンス点において導入される。好ましくは、液滴容量は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０１９５１２７号明細書および国際公開第２００７／０８９５４１号パンフレットに開示のとおり、ある種が他の種よりも大きく、担体流体中で異なる速度において、通常、他の種よりも緩慢に移動するような設計により選択される。チャネル幅および長さは、より早い種の液滴が最も緩慢な種を捕捉するように選択される。チャネルのサイズ制約は、より早く移動する液滴がより緩慢に移動する液滴を追い越し、合流帯域に流入する一連の液滴をもたらすのを防止する。多段階化学反応、生化学反応、またはアッセイ検出化学反応は、異なるタイプの種を反応に添加する前に固定反応時間を要求することが多い。多段階反応は、プロセスを複数回繰り返すことにより達成され、第２、第３またはそれより多いコンフルエンス点はそれぞれ別個の合流点を有する。高度に効率的で正確な反応および反応の分析は、インレットチャネルからの液滴の頻度が最適化された比にマッチし、種の容量がマッチして組合せ液滴中で最適化された反応条件を提供する場合に達成される。流体液滴は、液滴を含有する液体の流動を変更することにより本発明の流体系内でスクリーニングまたはソートすることができる。例えば、実施形態の１セットにおいて、流体液滴は、流体液滴を包囲する液体を第１のチャネル、第２のチャネルなどに方向付けることにより進行させ、またはソートすることができる。実施形態の別のセットにおいて、流体系内、例えば、異なるチャネル内またはチャネルの異なる部分内の圧力は、流体液滴の流動を方向付けるように制御することができる。例えば、液滴は、流動のさらなる方向付けのための複数のオプションを含むチャネルジャンクションに向けて方向付ける（例えば、任意選択の下流流動チャネルを定義するチャネル中のブランチ部、またはフォーク部に向けて方向付ける）ことができる。任意選択の下流流動チャネルの１つ以上の中の圧力は、液滴をチャネルの１つの中に選択的に方向付けるように制御することができ、それぞれの連続的な液滴の下流流動経路を独立して制御することができるように連続的な液滴のジャンクションへの到達に要求される時間の順序で圧力変化をもたらすことができる。１つの配置において、液体リザーバーの膨張および／または収縮を使用し、例えば、流動液滴を含有する液体の移動を方向付けることにより流動液滴をチャネル中に進行させ、またはソートすることができる。さらに、液体リザーバーの膨張および／または収縮は、例えば、本明細書に記載の他の流動制御装置および方法と組み合わせることができる。液体リザーバーの膨張および／または収縮を引き起こし得る装置の非限定的な例としては、ピストンが挙げられる。液滴を処理するためのマイクロ流体チャネルを使用するためのキー要素としては、（１）正確な容量の液滴を産生すること、（２）正確な頻度において液滴を産生することおよび（３）第１の試料液滴流の頻度が第２の試料液滴流の頻度にマッチするように第１の試料液滴流を第２の試料液滴流と一緒にすることが挙げられる。好ましくは、ライブラリー液滴の頻度が試料液滴の頻度にマッチするように試料液滴流を事前作製されたライブラリー液滴流と一緒にすること。規則的な頻度において均一な容量の液滴を産生する方法は、当技術分野において周知である。１つの方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１７２４７６号明細書および国際公開第２００４／００２６２７号パンフレットに開示される分散相流体および非混和性担体流体の流体力学的収束を使用して液滴を生成することである。事前作製された液滴のライブラリーであることがコンフルエンスにおいて導入される種の１つに望ましく、そのライブラリーは、複数の反応条件を含有し、例えば、ライブラリーは、細胞または酵素に対するそれらの効果のスクリーニングのために別個のライブラリー要素として封入される一連の濃度における複数の異なる化合物を含有し得、あるいはライブラリーは、遺伝子座のコレクションの標的化増幅のために異なるライブラリー要素として封入される複数の異なるプライマーペアから構成され得、あるいはライブラリーは、複数の結合アッセイを実施するために異なるライブラリー要素として封入される複数の異なる抗体種を含有し得る。基質上への反応条件のライブラリーの導入は、事前作製されたライブラリー液滴のコレクションを、推進流体によりバイアルからプッシュすることにより達成される。推進流体は、連続流体である。推進流体は、担体流体（例えば、フルオロカーボン油）と同一の物質を含み得る。例えば、１０ピコリットルの液滴からなるライブラリーをマイクロ流体サブストレート上のインレットチャネル中に、毎秒１０，０００ピコリットルの流速の推進流体により推進させる場合、公称上、液滴がコンフルエンス点に流入すると予測される頻度は、毎秒１０００個である。しかしながら、実際、液滴は、緩慢に流出するそれらの間の油と一緒になる。経時的には、担体流体はライブラリー液滴から流出し、液滴の数密度（数／ｍＬ）は増加する。したがって、推進流体のための注入の単一固定速度は、サブストレート中のマイクロ流体チャネル中への液滴の均一な導入速度を提供しない。さらに、平均ライブラリー液滴容量のライブラリーごとの変動は、コンフルエンス点における液滴導入の頻度のシフトをもたらす。したがって、試料変動および油流出から生じる液滴の均一性の欠如は、解決すべき別の問題を提供する。例えば、ライブラリー中で公称上の液滴容量が１０ピコリットルと予測されるが、ライブラリーごとに９〜１１ピコリットルで変動する場合、１０，０００ピコリットル／秒の注入速度は毎秒９００〜１，１００個の液滴の頻度範囲を名目上もたらす。要約すると、チップ上で作製された液滴についての分散相の組成の試料ごとの変動、ライブラリー液滴の数密度が経時的に増加する傾向および平均液滴容量のライブラリーごとの変動は、単に固定注入速度を使用することにより液滴の頻度がコンフルエンスにおいて容易にマッチし得る程度を厳しく限定する。さらに、これらの限定は、容量を再現可能に組み合わせることができる程度に対しても影響する。ポンプ流速正確性の典型的な変動およびチャネル寸法の変動との組合せにより、系は、ランツーランに基づき補償する手段なしで厳しく限定される。上記事実は、解決すべき問題を説明するだけでなく、マイクロ流体チャネル内のマイクロ液滴に対するマイクロ流体制御の即時調節の方法の必要性を実証する。界面活性剤および油の組合せは、液滴の生成、貯蔵、および操作を容易にして多様なライブラリーのそれぞれの液滴内のユニークな化学／生化学／生物学的環境を維持するために開発しなければならない。したがって、界面活性剤および油の組合せは、（１）ドロップ形成プロセスならびに後続の回収および貯蔵の間の制御不能な癒合に対して液滴を安定化し、（２）油相および／または液滴間へのいかなる液滴含有物の輸送も最小化し、（３）それぞれの液滴の含有物との化学および生物学的不活性を維持しなければならない（例えば、油−水界面における封入含有物の吸着も反応もなし、および液滴中の生物学的または化学成分に対する悪影響もなし）。液滴ライブラリー機能および安定性に対する要求に加え、油中界面活性剤溶液は、プラットフォームと関連する流体物理学および材料と結び付けなければならない。具体的には、油溶液は、マイクロ流体チップを構築するために使用される材料を膨潤も、溶解も、分解もさせてはならず、油の物理的特性（例えば、粘度、沸点など）はプラットフォームの流動および操作条件に適してなければならない。界面活性剤なしで油中で形成される液滴は安定でなく癒合を許容し、したがって、界面活性剤はエマルジョンライブラリーのための連続相として使用される油中で溶解させなければならない。界面活性剤分子は、両親媒性であり、分子の一部は油溶性であり、分子の一部は水溶性である。水−油界面が、例えば、本明細書に記載のインレットモジュール中のマイクロ流体チップのノズルにおいて形成される場合、油相中で溶解される界面活性剤分子は界面に吸着する。分子の親水性部分は、液滴内側に残留し、分子の親フルオロ部分は液滴の外部をデコレートする。界面に界面活性剤が集中する場合、液滴の表面張力は低減し、したがってエマルジョンの安定性が改善される。癒合に対する液滴の安定化の他、界面活性剤は、それぞれの液滴の含有物に対して不活性であるべきであり、界面活性剤は、油または他の液滴への封入成分の輸送を促進すべきでない。液滴ライブラリーは、単一のコレクションにおいて一緒にプールされる多数のライブラリー要素から構成することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１０００２２４１号明細書参照）。ライブラリーは、単一のライブラリー要素から１０１５個のライブラリー要素以上まで複雑性が変動し得る。それぞれのライブラリー要素は、固定濃度における１つ以上の所与の成分であり得る。要素は、限定されるものではないが、細胞、オルガネラ、ウイルス、細菌、酵母、ビーズ、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチドまたは小分子化合物であり得る。要素は、識別子、例えば、標識を含有し得る。用語「液滴ライブラリー」は、本明細書において、「エマルジョンライブラリー」とも称される。これらの用語は本明細書全体を通して交換可能に使用される。細胞ライブラリー要素としては、限定されるものではないが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、初代細胞、培養細胞系、癌細胞、幹細胞、組織から得られた細胞、または任意の他の細胞型を挙げることができる。細胞ライブラリー要素は、１つから何十万個の多数の細胞を個々の液滴中で封入することにより調製される。封入される細胞の数は、通常、ポアソン統計により、細胞の数密度および液滴の容量から与えられる。しかしながら、一部の場合、この数は、Ｅｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｄｒｏｐｓ．”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，８（８）：１２６２−１２６４，２００８に記載のとおりポアソン統計から逸れる。細胞の離散的性質は、単一出発媒体中に全て存在する複数の細胞バリアントを用いるライブラリーの大量調製を可能とし、次いでその媒体は多くとも１つの細胞を含有する個々の液滴カプセルに破壊される。次いで、これらの個々の液滴カプセルを合わせ、またはプールしてユニークライブラリー要素からなるライブラリーを形成する。封入後の細胞分裂、または一部の実施形態において細胞分裂に続く封入が、クローンライブラリー要素を産生する。ビーズベースライブラリー要素は、所与のタイプの１
つ以上のビーズを含有し得、他の試薬、例えば、抗体、酵素または他のタンパク質も含有し得る。全てのライブラリー要素が異なるタイプのビーズを含有するが、同一の包囲媒体を含有する場合、ライブラリー要素は、単一出発流体から全て調製することができ、または種々の出発流体を有し得る。バリアント、例えば、ゲノム改変された酵母または細菌細胞のコレクションから大量調製された細胞ライブラリーの場合、ライブラリー要素は、種々の出発流体から調製される。タンパク質に対するバリアントを産生するように遺伝子操作された複数の細胞または酵母または細菌を用いて出発する場合、液滴当たり正確に１つの細胞を有し、わずかな液滴が２つ以上の細胞を含有することが望ましいことが多い。一部の場合、ポアソン統計からの変動は、液滴当たり正確に１つの細胞を有するより多くの液滴が存在し、例外的にわずかな空の液滴または２つ以上の細胞を含有する液滴が存在するように液滴のロードの向上を提供するように達成することができる。液滴ライブラリーの例は、ビーズ、細胞、小分子、ＤＮＡ、プライマー、抗体の範囲の異なる含有物を有する液滴のコレクションである。より小さい液滴は、フェムトリットル（ｆＬ）容量ドロップのオーダーであり得、それは特に液滴分注器について企図される。容量は、約５〜約６００ｆＬの範囲であり得る。より大きい液滴は、サイズが約０．５ミクロン〜５００ミクロン直径の範囲であり、それは約１ピコリットル〜１ナノリットルに相当する。しかしながら、液滴は、５ミクロンほど小さく、５００ミクロンほど大きくてよい。好ましくは、液滴は、１００ミクロン未満、約１ミクロン〜約１００ミクロン直径である。最も好ましいサイズは、約２０〜４０ミクロン直径（１０〜１００ピコリットル）である。液滴ライブラリーの試験される好ましい特性としては、浸透圧バランス、均一サイズ、およびサイズ範囲が挙げられる。本発明のエマルジョンライブラリー内の液滴は、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性油内に含有され得る。一部の実施形態において、非混和性フルオロカーボン油内のフルオロ界面活性剤は、１つ以上の過フッ素化ポリエーテル（ＰＦＰＥ）ブロックおよび１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックからなるブロックコポリマーであり得る。他の実施形態において、フルオロ界面活性剤は、２つのＰＦＰＥブロックにアミド結合基により共有結合しているＰＥＧセンターブロックからなるトリブロックコポリマーである。フルオロ界面活性剤（ライブラリー中の液滴の均一サイズと類似）の存在は、液滴の安定性および統一性を維持するために重要であり、本明細書に記載の種々の生物学的および化学アッセイのためのライブラリー内の液滴の後続の使用にも不可欠である。本発明の液滴ライブラリー中で利用することができる流体（例えば、水性流体、非混和性油など）および他の界面活性剤は、本明細書により詳細に記載される。したがって、本発明は、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性油（例えば、フルオロカーボン油）内の複数の水性液滴を含み得るエマルジョンライブラリーであって、それぞれの液滴はサイズが均一であり、同一の水性流体を含み得、異なるライブラリー要素を含み得るエマルジョンライブラリーを含み得る。本発明はまた、エマルジョンライブラリーを形成する方法であって、異なるライブラリー要素を含み得る単一水性流体を提供すること、それぞれのライブラリー要素を、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の水性液滴中に封入すること（それぞれの液滴は、サイズが均一であり、同一の水性流体を含み得、異なるライブラリー要素を含み得る）、ならびに少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内で水性液滴をプールし、それによりエマルジョンライブラリーを形成することを含み得る方法を提供する。例えば、エマルジョンライブラリーの１つのタイプにおいて、全ての異なるタイプの要素（例えば、細胞またはビーズ）を、同一媒体中で含有される単一資源中でプールすることができる。初回プール後、細胞またはビーズを液滴中で封入し、異なるタイプのビーズまたは細胞を有するそれぞれの液滴が異なるライブラリー要素である液滴のライブラリーを生成する。初回溶液の希釈は、封入プロセスを可能とする。一部の実施形態において、形成される液滴は、単一細胞もしくはビーズを含有し、または何も含有せず、すなわち、空である。他の実施形態において、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数のコピーを含有する。封入されている細胞またはビーズは、一般に、同一タイプの細胞またはビーズに対するバリアントである。別の例において、エマルジョンライブラリーは、非混和性フルオロカーボン油内の複数の水性液滴を含み得、単一分子を封入することができ、その結果、産生される２０〜６０個の液滴（例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個の液滴、またはその間の任意の整数）当たり１つの液滴内で含有される単一分子が存在する。単一分子は、分子を含有する溶液を、単一分子の封入が可能となるような低濃度に希釈することにより封入することができる。１つの具体例において、ＬａｃＺプラスミドＤＮＡを２０ｆＭの濃度においてインキュベーションの２時間後に封入し、その結果、４０個の液滴中に約１つの遺伝子が存在し、１０μｍの液滴が毎秒１０ｋＨｚにおいて作製された。これらのライブラリーの形成は、限定希釈に依存する。
【０１９６】
本発明はまた、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得るフルオロカーボン油内の少なくとも第１の水性液滴および少なくとも第２の水性液滴を含み得るエマルジョンライブラリーであって、少なくとも第１および少なくとも第２の液滴は、サイズが均一であり、異なる水性流体および異なるライブラリー要素を含むエマルジョンライブラリーを提供する。本発明はまた、エマルジョンライブラリーを形成する方法であって、少なくとも第１の要素のライブラリーを含み得る少なくとも第１の水性流体を提供すること、少なくとも第２の要素のライブラリーを含み得る少なくとも第２の水性流体を提供すること、前記少なくとも第１のライブラリーのそれぞれの要素を、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の少なくとも第１の水性液滴中に封入すること、前記少なくとも第２のライブラリーのそれぞれの要素を、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の少なくとも第２の水性液滴中に封入すること（少なくとも第１および少なくとも第２の液滴は、サイズが均一であり、異なる水性流体および異なるライブラリー要素を含み得る）、ならびに少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の少なくとも第１の水性液滴および少なくとも第２の水性液滴をプールし、それによりエマルジョンライブラリーを形成することを含み得る方法を提供する。当業者は、本発明の方法および系が、好ましくは、本明細書に開示の細胞、突然変異などに関して実施されないが、本発明は、いかなる特定のタイプの試料にも限定される必要がなく、本発明の方法および系を任意のタイプの有機、無機、または生物学的分子（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２２７１４号明細書参照）と使用することができることを認識する。特定の実施形態において、試料としては、核酸標的分子を挙げることができる。核酸分子は、合成であり、または天然存在資源に由来し得る。一実施形態において、核酸分子は、種々の他の成分、例えば、タンパク質、脂質および非テンプレート核酸を含有する生物学的試料から単離することができる。核酸標的分子は、動物、植物、細菌、真菌、または任意の他の細胞生物から得られた任意の細胞材料から得ることができる。ある実施形態において、核酸標的分子は、単一細胞から得ることができる。本発明において使用される生物学的試料としては、ウイルス粒子または調製物を挙げることができる。核酸標的分子は、生物から直接、または生物から得られた生物学的試料から、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便および組織から得ることができる。任意の組織または体液標本を本発明において使用される核酸のための資源として使用することができる。核酸標的分子は、培養細胞、例えば、初代細胞培養物または細胞系から単離することもできる。標的核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体により感染されていてよい。試料は、生物学的標本から抽出された全ＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスまたはゲノムＤＮＡでもあり得る。一般に、核酸は、種々の技術、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃ��ｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）により記載されるものにより生物学的試料から抽出することができる。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、ステムおよびループ構造）であり得る。生物学的試料から得られた核酸は、典型的には、断片化して分析に好適な断片を産生することができる。標的核酸は、種々の機械的、化学的および／または酵素的方法を使用して所望の長さに断片化または剪断することができる。ＤＮＡは、音波処理、例えば、Ｃｏｖａｒｉｓ法、ＤＮアーゼへの短時間曝露を介して、または１つ以上の制限酵素の混合物、もしくはトランスポーゼースもしくはニック形成酵素を使用してランダムに剪断することができる。ＲＮＡは、ＲＮアーゼへの短時間曝露、加熱およびマグネシウム、または剪断により断片化することができる。ＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換することができる。断片化を用いる場合、断片化前または後にＲＮＡをｃＤＮＡに変換することができる。一実施形態において、生物学的試料からの核酸は、音波処理により断片化される。別の実施形態において、核酸は、ハイドロシェア装置により断片化される。一般に、個々の核酸標的分子は、約４０塩基〜約４０ｋｂであり得る。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、ステムおよびループ構造）であり得る。本明細書に記載の生物学的試料は、洗浄剤または界面活性剤の存在下でホモジナイズまたは分別することができる。緩衝液中の洗浄剤の濃度は、約０．０５％〜約１０．０％であり得る。洗浄剤の濃度は、最大で、洗浄剤が溶液中で可溶性のままである量であり得る。一実施形態において、洗浄剤の濃度は０．１％〜約２％である。洗浄剤、特に非変性性である軽度のものは、試料を溶解させるように作用し得る。洗浄剤は、イオン性または非イオン性であり得る。非イオン性洗浄剤の例としては、ｔｒｉｔｏｎ、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００  ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−−（ＯＣＨ２−−ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝９〜１０、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４  ｘ＝７〜８）、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（商標）ＣＡ６３０オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ベータＯＧ）、ｎ−ドデシル−ベータ、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ−ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ−ｎ−テトラデシルエーテル（Ｃ１４Ｅ０６）、オクチル−ベータ−チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド、ＯＴＧ）、Ｅｍｕｌｇｅｎ、およびポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）が挙げられる。イオン性洗浄剤（アニオン性またはカチ��ン性）の例としては、デオキシコレート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）が挙げられる。双性イオン試薬、例えば、Ｃｈａｐｓ、ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎ  ３−１４、および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートを、本発明の精製スキームにおいて使用することもできる。別の洗浄剤または界面活性剤を用いてまたは用いずに尿素を添加することができることも企図される。溶解またはホモジナイゼーション溶液は、他の薬剤、例えば、還元剤をさらに含有し得る。このような還元剤の例としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、または亜硫酸の塩が挙げられる。核酸のサイズ選択は、極めて短い断片または極めて長い断片を除去するように実施することができる。核酸断片は、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して所望数の断片を含み得る分画に分けることができる。それぞれの断片の断片サイズを限定する好適な方法は、当技術分野において公知である。本発明の種々の実施形態において、断片サイズは、約１０〜約１００Ｋｂ以上の長さの間に限定される。本発明におけるまたは本発明に関する試料としては、個々の標的タンパク質、タンパク質複合体、翻訳後修飾を有するタンパク質、およびタンパク質／核酸複合体を挙げることができる。タンパク質標的としては、ペプチドが挙げられ、酵素、ホルモン、構造成分、例えば、ウイルスカプシドタンパク質、および抗体も挙げられる。タンパク質標的は、合成であり、または天然存在資源に由来し得る。本発明のタンパク質標的は、種々の他の成分、例として、脂質、非テンプレート核酸、および核酸を含有する生物学的試料から単離することができる。タンパク質標的は、動物、細菌、真菌、細胞生物、および単一細胞から得ることができる。タンパク質標的は、生物から直接、または生物から得られた生物学的試料、例として、体液、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便および組織から得ることができる。タンパク質標的は、細胞および組織溶解物ならびに生化学的分画から得ることもできる。個々のタンパク質は、単離ポリペプチド鎖である。タンパク質複合体としては、２つまたはポリペプチド鎖が挙げられる。試料としては、翻訳後修飾、例として、限定されるものではないが、リン酸化、メチオニン酸化、脱アミノ化、グリコシル化、ユビキチン化、カルバミル化、ｓ−カルボキシルメチル化、アセチル化、およびメチル化を有するタンパク質を挙げることができる。タンパク質／核酸複合体としては、架橋または安定タンパク質−核酸複合体が挙げられる。個々のタンパク質、タンパク質複合体、翻訳後修飾を有するタンパク質、およびタンパク質／核酸複合体の抽出または単離は、当技術分野において公知の方法を使用して実施される。
【０１９７】
したがって、本発明は、試料液滴の形成を含み得る。液滴は、非混和性担体流体により包囲される水性液滴である。このような液滴を形成する方法は、例えば、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００８／００１４５８９号明細書、同第２００８／０００３１４２号明細書、および同第２０１０／０１３７１６３号明細書）、Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，７０８，９４９号明細書および米国特許出願公開第２０１０／０１７２８０３号明細書）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，０４１，４８１号明細書およびＲＥ４１，７８０号明細書として再発行）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号明細書に示されている。これらのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明は、ハイスループットマイクロ流体系内で液滴を操作するための系および方法に関し得る。マイクロ流体液滴は、分化細胞を封入する。細胞は溶解され、そのｍＲＮＡは、表面上のバーコード化オリゴｄＴプライマーを含有する捕捉ビーズ上にハイブリダイズされ、これらは全て液滴の内側にある。バーコードは、フレキシブル多原子リンカー、例えば、ＰＥＧを介して捕捉ビーズに共有結合している。好ましい実施形態において、液滴は、フルオロ界面活性剤（例えば、ペルフルオロオクタノール）の添加により破壊し、洗浄し、回収する。次いで、逆転写（ＲＴ）反応を実施してそれぞれの細胞のｍＲＮＡを、ユニークにバーコード化され、ｍＲＮＡ捕捉ビーズに共有結合している第１のｃＤＮＡ鎖に変換する。続いて、慣用のライブラリー調製プロトコルを使用して、テンプレート切り替え反応を介するユニバーサルプライマーを補正してＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製する。任意の所与の細胞からのｍＲＮＡの全てをユニークにバーコード化するため、単一ライブラリーをシーケンシングし、次いでコンピュータにより分解してどのｍＲＮＡがどの細胞に由来したのかを決定する。このように、単一シーケンシングランを通して、何万（以上）という区別可能なトランスクリプトームを同時に得ることができる。オリゴヌクレオチド配列は、ビーズ表面上で生成することができる。これらのサイクルの間、ビーズを合成カラムから除去し、プールし、４つの質量が等しい部分にアリコート化し；次いで、それらのビーズアリコートを別個の合成カラム中に配置し、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ、またはｄＡホスホラミダイトのいずれかと反応させる。他の例において、長さがより大きいジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを使用し、他の例において、オリゴ−ｄＴテールを遺伝子特異的オリゴヌクレオチドにより置き換えて特異的標的（単数または複数）、全てのまたは特異的ＲＮＡの捕捉のための任意の長さのランダム配列をプライミングする。このプロセスを、合計で４１２＝１６，７７７，２１６個のユニークにバーコード配列について１２回繰り返した。これらのサイクルの完了時、８サイクルの縮重オリゴヌクレオチド合成を全てのビーズに対して実施し、次いで３０サイクルのｄＴ添加を実施した。他の実施形態において、縮重合成を省略し、短縮し（８サイクル未満）、または延��し（８サイクル超）；他の実施形態において、３０サイクルのｄＴ添加を遺伝子特異的プライマー（単一標的または多くの標的）または縮重配列により置き換える。上記のマイクロ流体系は、本発明の試薬送達系マイクロ流体ライブラリープリンタまたは液滴ライブラリープリンティング系とみなす。溶解試薬およびバーコードを含有する液滴生成器から、油を含有するマイクロ流体アウトレットチャネルを通り、ジャンクションに向かって試料流体が流動するにつれて液滴が形成される。規定数の液滴に対応するロードされる試薬エマルジョンの規定容量を、担体流体の流動流中にオンデマンドで分注させる。試料流体は、典型的には、水性緩衝溶液、例えば、超純水（例えば、１８メガオーム抵抗率、例えば、カラムクロマトグラフィーにより得られたもの）、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または酢酸塩緩衝液を含み得る。核酸分子と生理学的に適合性である任意の液体または緩衝液を使用することができる。担体流体は、試料流体と非混和性であるものを含み得る。担体流体は、非極性溶媒、デカン（例えば、テトラデカンまたはヘキサデカン）、フルオロカーボン油、シリコーン油、不活性油、例えば、炭化水素または別の油（例えば、鉱油）であり得る。担体流体は、１つ以上の添加剤、例えば、表面張力を低減させる薬剤（界面活性剤）を含有し得る。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、フルオロ界面活性剤、および水に対して油中で可溶性である他の薬剤を挙げることができる。一部の用途において、実施は、第２の界面活性剤を試料流体に添加することにより改善される。界面活性剤は、例えば、液滴を交差チャネル中に押し出し、または注入するために必要とされる剪断力を低減させることにより液滴サイズ、流動および均一性の制御または最適化を支援し得る。これは、液滴容量および周期性、または液滴が交差チャネル中に割ける速度もしくは頻度に影響を与え得る。さらに、界面活性剤は、フッ素化油中で水性エマルジョンを癒合から安定化するように機能し得る。液滴は、液滴を安定化する界面活性剤により水性油界面における表面張力を低減させることにより包囲させることができる。担体流体に添加することができる好ましい界面活性剤としては、限定されるものではないが、ソルビタン系カルボン酸エステル（例えば、「Ｓｐａｎ」界面活性剤、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ）、例として、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ  ２０）、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ  ４０）、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ  ６０）およびソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ  ８０）、ならびに過フッ素化ポリエーテル（例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｋｒｙｔｏｘ  １５７  ＦＳＬ、ＦＳＭ、および／またはＦＳＨ）などの界面活性剤が挙げられる。使用することができる非イオン性界面活性剤の他の非限定的な例としては、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール（例えば、ノニル−、ｐ−ドデシル−、およびジノニルフェノール）、ポリオキシエチレン化直鎖アルコール、ポリオキシエチレン化ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化メルカプタン、長鎖カルボン酸エステル（例えば、天然脂肪��のグリセリルおよびポリグリセリルエステル、プロピレングリコール、ソルビトール、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステル、ポリオキシエチレングリコールエステルなど）およびアルカノールアミン（例えば、ジエタノールアミン−脂肪酸縮合物およびイソプロパノールアミン−脂肪酸縮合物）が挙げられる。一部の場合、マイクロ流体系を介して単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器は、容量推進流動を提供し、一定容量を経時的に注入する。流体チャネル中の圧力は、注入速度およびチャネル寸法の関数である。一実施形態において、装置は、油／界面活性剤インレット；分析物用インレット；フィルター、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬用インレット；インレットを接続する担体流体チャネル；レジスター；液滴ピンチオフ用構造物；混合器；およびドロップ用アウトレットを提供する。一実施形態において、本発明は、マイクロ流体系を介して単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器であって、フィルターおよび担体流体チャネルを含み得る油−界面活性剤インレット（前記担体流体チャネルは、レジスターをさらに含み得る）；フィルターおよび担体流体チャネル含み得る分析物用インレット（前記担体流体チャネルは、レジスターをさらに含み得る）；フィルターおよび担体流体チャネルを含み得るｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬用インレット（前記担体流体チャネルは、レジスターをさらに含み得る）を含み得、前記担体流体チャネルは、調整可能または所定の流速においてその中を流動する担体流体を有し；それぞれの前記担体流体チャネルは、ジャンクションにおいて合流し；前記ジャンクションは、ドロップ用アウトレットを含有する混合器に接続している装置を提供する。したがって、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑのためのマイクロ流体系マイクロ流体流動スキームを介して単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器が想定される。２つのチャネル（一方は細胞懸濁液を担持し、他方はユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉ビーズ、溶解緩衝液およびライブラリー調製試薬を担持する）は、ジャンクションにおいて合わさり、液滴当たり１つの細胞および１つのビーズの割合において不活性担体油中に直ちに同時封入される。それぞれのドロップにおいて、ビーズバーコードタグ付きオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡテンプレートとして使用して、それぞれのｍＲＮＡをユニーク細胞特異的識別子によりタグ付けする。本発明はまた、マウスおよびヒト細胞の混合物のＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーの使用を包含する。担体流体は、担体流体中の界面活性剤がチャネル壁部をコートするようにアウトレットチャネルを通して流動させることができる。フルオロ界面活性剤は、過フッ素化ポリエーテルＤｕＰｏｎｔ  Ｋｒｙｔｏｘ  １５７  ＦＳＬ、ＦＳＭ、またはＦＳＨを、揮発性フッ素化溶媒中で水性水酸化アンモニアと反応させることにより調製することができる。溶媒および残留水およびアンモニアは、ロータリーエバポレーターにより除去することができる。次いで、界面活性剤は、フッ素化油（例えば、Ｆｌｏｕｒｉｎｅｒｔ（３Ｍ））中で溶解させることができ（例えば、２．５重量％）、次いでそれ��担体流体として機能する。試薬液滴を産生するための試料流体リザーバーの作動は、オンデマンドキャパビリティーを介する動的試薬送達（例えば、コンビナトリアルバーコード化）の概念を基礎とする。オンデマンド特性は、送達液滴を本明細書に記載のとおり一次液滴に放出するための種々の技術キャパビリティーの１つにより提供することができる。本開示および本明細書引用文献および当技術分野における知識から、流速、チャネル長さ、およびチャネル形状を開発することは当業者の範囲内であり；ランダムまたは規定の試薬組合せを含有する液滴を確立し、オンデマンドで生成し、目的の試料／細胞／基質を含有する「反応チャンバ」液滴と合流させることができる。複数のユニークタグを追加の液滴中に取り込み、そのタグを、一次液滴に特異的であるように設計された固体担体に結合することにより、一次液滴が曝露される条件をコードおよび記録することができる。例えば、核酸タグを連続的にライゲートして条件およびその順序を反映する配列を作出することができる。あるいは、タグを独立して固体担体に付加し、付属させることができる。バイオインフォマティクスにより情報を記録するために使用することができる動的標識系の非限定的な例は、２０１２年９月２１日および２０１２年１１月２９日に出願された米国仮特許出願である名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ａｇｅｎｔｓ」に見出すことができる。このように、２つ以上の液滴を、種々の異なる条件に曝露することができ、液滴を条件に曝露するたびに、条件をコードする核酸を、一緒に、または液滴と会合しているユニーク固体担体にそれぞれライゲートされた液滴に添加し、その結果、異なる履歴を有する液滴を後に合わせる場合であっても、液滴のそれぞれの条件は、異なる核酸を通して利用可能のままである。複数の条件への曝露に対する応答を評価する方法の非限定的な例は、２０１２年９月２１日に出願された米国仮特許出願である名称「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｔａｇｇｉｎｇ」に見出すことができる。したがって、本発明においてまたは本発明に関して、種々の目的化合物（薬物、小分子、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、試薬など）の制御送達から独立して、またはそれに関連して分子バーコード（例えば
、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、フルオロフォアなど）の動的生成が存在し得ることが想定される。例えば、ユニーク分子バーコードをノズルの１つのアレイ中で作出することができる一方、個々の化合物または化合物の組合せを別のノズルアレイにより生成することができる。次いで、バーコード／目的化合物を細胞含有液滴と合流させることができる。コンピュータログファイルの形式の電子記録を、送達されるバーコードを送達される下流試薬と関連付けることを保持させる。この方法により、例えば、単一細胞薬物スクリーニング、調節経路の制御摂動などの用途のために細胞の大集団を効率的にスクリーニングすることが可能となる。開示される発明の装置および技術は、単一細胞（または単一分子）レベルにおいて、およびコスト効率的にデータ分解能を要求する研究を実施する労力を容易にする。本発明は、油中水型エマルジョンとしてマイクロ流体チップ中で１つずつ生成される単分散水性液滴の使用を通して細胞、核酸、タンパク質などを含有し得る個々のエマルジョン液滴への試薬のハイスループットおよび高分解能送達を想定する。寿命実験の間に個々の細胞および液滴処理／組合せを動的に追跡することができること、および開示プロセスを通して液滴を操作するさらなるキャパビリティーでエマルジョン液滴のライブラリーをオンデマンドで作出する能力を有することが有利である。本発明の実施において、液滴の動的追跡が存在し得、液滴配置の履歴および単一細胞ベース環境における用途を作出する。液滴生成および配置は、動的インデックス化方針を介して、および本発明の開示実施形態による制御方法で生成する。マイクロ液滴は、毎秒数千個の液滴の高度に効率的な速度において処理し、分析し、ソートすることができ、疾患の生物学的機序の細胞モデル、または生化学、もしくは薬理学的アッセイのいずれかにおいて数百万個の区別される化合物、生物学的プローブ、タンパク質または細胞の迅速なスクリーニングを可能とする強力なプラットフォームを提供する。複数の生物学的アッセイおよび生物学的合成が企図される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が企図される（例えば、米国特許出願公開第２０１２０２１９９４７号明細書参照）。本発明の方法は、任意のタイプの化学反応または任意のタイプの生物学的アッセイを実施するために試料流体を合流するために使用することができる。液滴における増幅反応を実施するための試料流体の合流が存在し得る。増幅は、核酸配列の追加のコピーの産生を指し、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応または当技術分野において周知の他の技術（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．［１９９５］）を使用して実施される。増幅反応は、核酸分子を増幅させる当技術分野において公知の任意の増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖立体構造多型、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１８９−１９３；Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：５−１６）、リガーゼ検出反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１８９−１９３）、鎖置換増幅および制限断片長多型、転写ベース増幅系、核酸配列ベース増幅、ローリングサイクル増幅、および超分岐ローリングサイクル増幅であり得る。ある実施形態において、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、クローニングも精製もなしでゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させる、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，６８３，２０２号明細書、参照により本明細書に組み込まれる）による方法を指す。標的配列を増幅させる方法は、過剰のオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列とそれに続く熱サイクリングの正確な配列を含有するＤＮＡ混合物にＤＮＡポリメラーゼの存在下で導入することを含む。プライマーは、二本鎖標的配列のそのそれぞれの鎖に相補的である。増幅を行うため、プライマーを標的分子内のその相補的配列にアニールさせる。アニール後、プライマーをポリメラーゼにより伸長させて相補鎖の新たなペアを形成する。変性、プライマーアニールおよびポリメラーゼ伸長のステップは、複数回にわたり（すなわち、変性、アニールおよび伸長が１つのサイクルを構成し；多数のサイクルが存在し得る）繰り返して高濃度の所望標的配列の増幅セグメントを得ることができる。所望標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに関してプライマーの相対的位置により決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。液滴中でＰＣＲを実施する方法は、例えば、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００８／００１４５８９号明細書、同第２００８／０００３１４２号明細書、および同第２０１０／０１３７１６３号明細書）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，０４１，４８１号明細書、ＲＥ４１，７８０号明細書として再発行）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号明細書に示されている。そのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。第１の試料流体は、核酸テンプレートを含有する。第１の試料流体の液滴は、上記のとおり形成する。それらの液滴は、核酸テンプレートを含む。ある実施形態において、液滴は、単一の核酸テンプレートのみを含み、したがって、デジタルＰＣＲを実施することができる。第２の試料流体は、ＰＣＲ反応のための試薬を含有する。このような試薬としては、一般に、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ型のデオキシヌクレオチド、塩化マグネシウム、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（全て水性緩衝液内で懸濁）が挙げられる。第２の流体は、詳細が以下に考察される増幅標的核酸の検出のための検出可能標識プローブも含む。２つの試料流体間の試薬のこのタイプの分別が唯一の可能性ではない。一部の例において、第１の試料流体は、ＰＣＲに必要な試薬の一部または全部を含む一方、第２の試料流体は、ＰＣＲに必要な試薬の残部を検出プローブと一緒に含有する。プライマーは、種々の方法、例として、限定されるものではないが、当技��分野において周知の方法（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９（１９７９））を使用する適切な配列のクローニングおよび直接化学的合成により調製することができる。プライマーは、市販源、例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｉｇｍａ、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手することもできる。プライマーは、同一の融解温度を有し得る。プライマーの長さは、５’末端または３’末端において伸長または短縮して所望の融解温度を有するプライマーを産生することができる。さらに、それぞれのプライマーペアのアニール位置は、プライマーペアの配列および長さが所望の融解温度を生じさせるように設計することができる。２５塩基対よりも小さいプライマーの融解温度を決定するための最も単純な式は、Ｗａｌｌａｃｅルール（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。コンピュータプログラム、例として、限定されるものではないが、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＨｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ製のＤＮＡｓｉｓを使用してプライマーを設計することもできる。それぞれのプライマーのＴＭ（融解またはアニール温度）は、ソフトウェアプログラム、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から入手可能なＯｌｉｇｏ  Ｄｅｓｉｇｎを使用して計算する。
【０１９８】
次いで、核酸を含有する液滴をＰＣＲ試薬と、上記の本発明の方法により第２の流体中で合併し、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ型のデオキシヌクレオチド、塩化マグネシウム、フォワードおよびリバースプライマー、検出可能標識プローブ、ならびに標的核酸を含む液滴を産生する。混合液滴を産生したら、液滴を熱サイクリングし、それぞれの液滴中の標的核酸の増幅をもたらす。液滴は、加熱および冷却ラインの間のサーペンタイン経路中のチャネルに通して流動させて液滴中の核酸を増幅させることができる。チャネルの幅および深さは、それぞれの温度において滞留時間を設定するように調整することができ、それは１秒未満および数分の間のいずれでも制御することができる。３つの温度帯域を増幅反応に使用することができる。３つの温度帯域は、二本鎖核酸の変性（高温帯域）、プライマーのアニール（低温帯域）、および二本鎖核酸を産生するための一本鎖核酸の増幅（中間温度帯域）をもたらすように制御する。これらの帯域内の温度は、ＰＣＲ反応を実施するための当技術分野において周知の範囲内に収まる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）参照。３つの温度帯域は、以下のとおり温度を有するように制御することができる：９５℃（ＴＨ）、５５℃（ＴＬ）、７２℃（ＴＭ）。調製された試料液滴は、制御速度においてチャネルを通り流動する。試料液滴は、熱サイクリング前に最初に初回変性帯域（ＴＨ）を通過する。初回予熱は、試料液滴内の核酸が熱サイクリング前に良好に変性したことを確保するための拡張帯域である。予熱帯域についての要求および要求される変性時間の長さは、反応において使用される化学物質に依存的である。試料は、約９５℃の高温帯域中を通過し、そこで変性と呼ばれるプロセスにおいて試料を最初に一本鎖ＤＮＡに分離する。次いで、試料は約５５℃の低温に流動し、そこでハイブリダイゼーションプロセスが生じ、その間にプライマーは試料の相補的配列にアニールする。最終的に、試料が約７２℃の第３の中間温度を通り流動するとき、ポリメラーゼプロセスが生じ、熱安定酵素を用いてプライマーをＤＮＡの一本鎖に沿って伸長させる。核酸は、液滴がチャネルを通り流動するとき、液滴がそれぞれの熱サイクルを通過するのと同一の熱サイクリングおよび化学反応を受ける。装置中のサイクルの総数は、加熱帯域の拡張により容易に変更される。試料は、それが完全な加熱装置のＮ回の増幅サイクルを通過するのと同一の熱サイクリングおよび化学反応を受ける。他の態様において、温度帯域は、ＰＣＲ反応のための２つの個々の温度帯域を達成するように制御される。ある実施形態において、２つの温度帯域は、以下の温度を有するように制御される：９５℃（ＴＨ）および６０℃（ＴＬ）。試料液滴は、場合により、熱サイクリングに流入する前に初回予熱帯域を通り流動する。予熱帯域は、活性化のための一部の化学物質に、およびさらに熱サイクリング反応が開始する前に液滴中の二本鎖核酸が完全に変性されることを確保するために重要であり得る。例示的な実施形態において、予熱滞留長さは、より高温における液滴の約１０分の予熱をもたらす。試料液滴は、約９５℃の高温帯域へと続き、そこで変性と呼ばれるプロセスにおいて試料を最初に一本鎖ＤＮＡに分離する。次いで、試料は装置を通り約６０℃の低温帯域に流動し、そこでハイブリダイゼーションプロセスが生じ、その間、プライマーは試料の相補的配列にアニールする。最終的に、ポリメラーゼプロセスが生じ、熱安定酵素を用いてプライマーをＤＮＡの一本鎖に沿って伸長させる。試料は、それが完全装置のそれぞれの熱サイクルを通過するのと同一の熱サイクリングおよび化学反応を受ける。装置中のサイクルの総数は、ブロック長および管の拡張により容易に変更される。増幅後、液滴を増幅産物の検出のための検出モジュールに流動させることができる。液滴は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、レポーターの存在または量の検出を使用して個々に分析および検出することができる。一般に、検出モジュールは、１つ以上の検出機器と連動している。検出機器は、光学もしくは電気的検出器またはそれらの組合せであり得る。好適な検出機器の例としては、特徴の代表的なシグナル、マーカー、またはレポーターを検出するため、ならびにソーティングモジュールにおける計測またはソート作用を測定および方向付けるために協働する光導波路、顕微鏡、ダイオード、光刺激装置（例えば、レーザ）、光電子倍増管、およびプロセッサ（例えば、コンピュータおよびソフトウェア）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。検出モジュールおよび液滴中の増幅産物を検出する方法のさらなる記載は、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００８／００１４５８９号明細書、同第２００８／０００３１４２号明細書、および２０１０／０１３７１６３号明細書）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号明細書に示されている。
【０１９９】
アッセイの例は、ＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、米国特許出願公開第２０１０００２２４１４号明細書参照）でもある。本発明は、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の複数の水性液滴を含み得る別のエマルジョンライブラリーであって、それぞれの液滴は、サイズが均一であり、少なくとも第１の抗体、および少なくとも第２の抗体に結合している単一要素を含み得、前記第１および第２の抗体は異なるエマルジョンライブラリーを提供する。一例において、それぞれのライブラリー要素は、異なるビーズを含み得、それぞれのビーズは多数の抗体に付着しており、ビーズは、溶液中の異なる抗体を含有する液滴内に封入されている。次いで、これらの抗体は、「ＥＬＩＳＡサンドイッチ」を形成させることができ、それをＥＬＩＳＡアッセイのために洗浄および調製することができる。さらに、これらの液滴の含有物は、それに含有される抗体に特異的であるように変更してアッセイの結果を最大化することができる。単一細胞アッセイも、本発明の一部として企図される（例えば、個々の細胞をアッセイするためのマイクロ流体工学の適用の概要についてＲｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ５，０２１５０１（２０１１）参照）。その細胞とその環境との相互作用を正確に制御することができ、または実験下の機能もしくは特性から単離することができる場合、単一細胞アッセイを個々の細胞の機能または特性を定量する実験として企図することができる。単一細胞アッセイの研究開発は、遺伝子変動が疾患を引き起こし、細胞の小さい下位集団が疾患起源を表すという概念を大きく前提とする。細胞から分泌される化合物、細胞内成分、細胞−細胞または細胞−薬物相互作用をアッセイする方法および個々の細胞をパターニングする方法も、本発明内に企図される。
【０２００】
これらのおよび他の技術を本発明においてまたは本発明の実施に関して用いることができる。
【０２０１】
実施例１：材料および方法
手短に述べると、遺伝子発現プロファイルを、１８個の時点（０．５時間〜７２日間）において、Ｔｈ１７条件（ＩＬ−６、ＴＧＦ−β１）または対照（Ｔｈ０）下で、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイＨＴ＿ＭＧ−４３０Ａを使用して計測した。４つの推論法にわたるコンセンサスを使用して示差的に発現された遺伝子を検出し、自動導出されたｋを用いるｋ平均法を使用して遺伝子をクラスタリングする。時間的調節相互作用を、調節因子の推定標的（例えば、ＣｈＩＰｓｅｑに基づく）と、標的遺伝子のクラスタ（４つのクラスタリングスキームを使用）との間の有意な（ｐ＜５＊１０−５およびエンリッチメント倍率＞１．５）重複を検索することにより推定した。ネットワークベースおよび発現ベース特性を使用して摂動についての候補を辞書的に順序付けした。ｓｉＲＮＡ送達にＳｉＮＷを使用して摂動を行った。これらの方法を以下により詳細に記載する。
【０２０２】
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｗｔ）、Ｍｔ−／−、Ｉｒｆ１−／−、Ｆａｓ−／−、Ｉｒｆ４ｆｌ／ｆｌ、およびＣｄ４Ｃｒｅマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。Ｓｔａｔ１−／−および１２９／Ｓｖ対照マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）から購入した。ＩＬ−１２ｒβ１−／−マウスは、Ｒｕｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒからＤｒ．Ｐａｈａｎ  Ｋａｌｉｐａｄａにより提供された。ＩＬ−１７Ｒａ−／−マウスは、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈからＤｒ．Ｊａｙ  Ｋｏｌｌｓにより提供された。Ｉｒｆ８ｆｌ／ｆｌマウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈからＤｒ．Ｋｅｉｋｏ  Ｏｚａｔｏにより提供された。Ｉｒｆ４ｆｌ／ｆｌおよびＩｒｆ８ｆｌ／ｆｌマウスの両方をＣｄ４Ｃｒｅマウスと交配してＣｄ４Ｃｒｅ×Ｉｒｆ４ｆｌ／ｆｌおよびＣｄ４Ｃｒｅ×Ｉｒｆ８ｆｌ／ｆｌマウスを生成した。全ての動物を、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡにおける慣用の無菌施設中で飼育および維持した（ＩＵＣＡＣプロトコル：０３１１−０３１−１４（ＶＫＫ）および０６０９−０５８０１５（ＡＲ））。全ての実験を、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｒｅａ  Ｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により概説される指針に従って実施した。さらに、Ｍｉｎａ−／−マウスからの脾臓は、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＨｏｓｐｉｔａｌからＤｒ．Ｍａｒｋ  Ｂｉｘにより提供された（ＩＡＣＵＣプロトコル：４５３）。Ｐｏｕ２ａｆ１−／−マウスを、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｒｏｅｄｅｒの実験室から入手した（Ｋｉｍ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＯＣＡ−Ｂ／ＯＢＦ−１／Ｂｏｂ−１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｓｏｔｙｐｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８３，５４２−５４７，ｄｏｉ：１０．１０３８／３８３５４２ａ０（１９９６））。野生型およびＯｃｔ−／−胎児肝臓を、Ｅ１２．５日目に得、亜致死的に放射線を浴びたＲａｇ１−／−マウス中に既に記載のとおり移植した（Ｗａｎｇ，Ｖ．Ｅ．，Ｔａｎｔｉｎ，Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．＆Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｃｔ−１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，２００５−２０１０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０３０７３０４１０１（２００４））（ＩＡＣＵＣプロトコル：１１−０９００３）。
【０２０３】
細胞ソーティングおよびペトリ皿中のインビトロＴ細胞分化：Ｃｄ４＋Ｔ細胞を、脾臓およびリンパ節から抗ＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して精製し、次いで１％のＦＣＳを有するＰＢＳ中で、抗Ｃｄ４−ＰｅｒＣＰ、抗Ｃｄ６２ｌ−ＡＰＣ、および抗Ｃｄ４４−ＰＥ抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＣＡ）により室温において２０分間染色した。
【０２０４】
ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを使用してナイーブＣｄ４＋Ｃｄ６２ｌｈｉｇｈＣｄ４４ｌｏｗＴ細胞をソートした。ソートされた細胞を、プレート結合抗Ｃｄ３（２μｇ／ｍｌ）および抗Ｃｄ２８（２μｇ／ｍｌ）によりサイトカインの存在下で活性化させた。Ｔｈ１７分化について：２ｎｇ／ｍＬのｒｈＴＧＦ−β１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、２５ｎｇ／ｍＬのｒｍＩｌ−６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、２０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩｌ−２３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、および２０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−β１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。細胞を、０．５〜７２時間培養し、ＲＮＡ、細胞内サイトカイン染色、およびフローサイトメトリーのために回収した。
【０２０５】
フローサイトメトリーおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣ）：ソートされたナイーブＴ細胞を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）、イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）およびモネンシンを含有するタンパク質輸送阻害剤（Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により４時間刺激してから抗体による染色により検出した。表面マーカーを１％のＦＣＳを有するＰＢＳ中で室温において２０分間染色し、次いで、続いて細胞をＣｙｔｏｐｅｒｍ／Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で固定し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により浸透化させ、記載のとおりＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で希釈されたＢｉｏｌｅｇｅｎｄコンジュゲート抗体、すなわち、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ６５０（商標）抗マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）およびアロフィコシアニン抗ＩＬ−１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０．１）により染色した（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＴＨ１７  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，２３５−２３８（２００６））（図５、図１６）。ＲＯＲγｔタンパク質発現の時間経過を計測するため、同様にｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のフィコエリスリンコンジュゲート抗レチノイド関連オーファン受容体ガンマを使用した（Ｂ２Ｄ）（図１６）。ノックアウトマウスからの細胞についてのＦＯＸＰ３染色を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＦＯＸＰ３染色キット（００−５５２３−００）により、その“Ｏｎｅｓｔｅｐ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ（ｎｕｃｌｅａｒ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ”に従って実施した。ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒまたはＬＳＲ  ＩＩ（両方ともＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかを使用してデータを収集し、次いでＦｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）（Ａｗａｓｔｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２７  ｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８，１３８０−１３８９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ１５４１（２００７）；Ａｗａｓｔｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ＩＬ−２３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｆｐ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｉｃｅ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＩＬ−１７−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２，５９０４−５９０８，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０９００７３２（２００９））を使用して分析した。
【０２０６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用するサイトカイン分泌の定量：ノックアウトマウスからのナイーブＴ細胞およびそれらの野生型対照を上記のとおり培養し、それらの上清を７２時間後に回収し、サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＩＬ−１７およびＩＬ−１０についての抗体）により、または示されるサイトカインについてのサイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により、製造業者の説明書に従って測定した（図５、図１６）。
【０２０７】
マイクロアレイデータ：ナイーブＴ細胞をＷＴマウスから単離し、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β１により処理した。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイＨＴ＿ＭＧ−４３０Ａを使用して得られたｍＲＮＡレベルを１８個の異なる時点において計測した（（０．５〜７２時間；図１ｂ））。さらに、最初にＩＬ−６、ＴＧＦ−β１により処理され、および４８時間後にＩＬ−２３を添加された細胞を、５つの時点（５０〜７２時間）においてプロファイリングした。対照として、Ｔｈ０条件下で刺激された時間および培養マッチＷＴナイーブＴ細胞を使用した。生物学的レプリケートを、１８個の時点の８つ（１時間、２時間、１０時間、２０時間、３０時間、４２時間、５２時間、６０時間）で計測し、再現性は高かった（ｒ２＞０．９８）。さらなる検証のため、分化時間経過を、Ｔｈ１７細胞およびナイーブＴ細胞の公開マイクロアレイデータ（Ｗｅｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖｏｌ．３０  １５５−１６７（２００９））と比較した（図６ｃ）。追加のデータセットにおいて、ナイーブＴ細胞をＷＴおよびＩｌ２３ｒ−／−マウスから単離し、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−２３により処理し、４つの異なる時点（４９時間、５４時間、６５時間、７２時間）においてプロファイリングした。ＲＭＡアルゴリズムとそれに続く分位数正規化（Ｒｅｉｃｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ  ２．０．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３８，５００−５０１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０５０６−５００（２００６））を使用して発現データを前処理した。
【０２０８】
示差的に発現された遺伝子の検出：示差的に発現された遺伝子（Ｔｈ０対照と比較）を、４つの方法を使用して見出した：（１）変化倍率。少なくとも２つの時点間の２倍変化（上方または下方）の要求。（２）多項式フィット。時間経過データにおける示差的発現を同定するために設計されたＥＤＧＥソフトウェア（Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊ．，Ｘｉａｏ，Ｗ．，Ｌｅｅｋ，Ｊ．，Ｔｏｍｐｋｉｎｓ，Ｒ．＆Ｄａｖｉｓ，Ｒ．ｉｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．ｖｏｌ．１０２  １２８３７（２００５）；Ｌｅｅｋ，Ｊ．Ｔ．，Ｍｏｎｓｅｎ，Ｅ．，Ｄａｂｎｅｙ，Ａ．Ｒ．＆Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊ．Ｄ．ＥＤＧＥ：ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２，５０７−５０８，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｋ００５（２００６））を使用し、ｑ値の閾値は≦０．０１であった。（３）シグモイドフィット。ＥＤＧＥと類似する一方、時間経過遺伝子発現データのモデリングにより適切なことが多いシグモイド関数により多項式を置き換えるアルゴリズム（Ｃｈｅｃｈｉｋ，Ｇ．＆Ｋｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １６，２７９−２９０，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｃｍｂ．２００８．１３ＴＴ１０．１０８９／ｃｍｂ．２００８．１３ＴＴ［ｐｉｉ］（２００９））を使用した。≦０．０１のｑ値の閾値。（４）ＡＮＯＶＡを使用した。遺伝子発現を、時間（２つ以上のレプリケートが存在する時点のみ使用）および処理（「ＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６」または「Ｔｈ０」）によりモデリングする。モデルは、それぞれの可変部を独立して、およびそれらの相互作用を考慮する。処理パラメータまたは相互作用パラメータにより割り当てられたｐ値が０．０１のＦＤＲ閾値をパスしたケースを報告した。
【０２０９】
全体として、方法間の実質的な重複（方法の任意のペア間の８２％の平均）が観察された。遺伝子の示差的発現スコアを、それを検出した試験の数と定義した。示差的に発現された遺伝子として、示差的発現スコア＞３のケースを報告した。
【０２１０】
Ｉｌ２３ｒ−／−時間経過（ＷＴのＴ細胞と比較）について、方法１．３（上記）を使用した。ここで、１．５の変化倍率カットオフを使用し、少なくとも２つの試験により検出された遺伝子を報告した。
【０２１１】
クラスタリング：示差的に発現された遺伝子をグルーピングするいくつかの手法を、それらの時間経過発現データに基づき考慮した：（１）それぞれの時点について、２つの群を定義した：Ｔｈ０細胞に対して（ａ）過剰発現された全ての遺伝子および（ｂ）過少発現された全ての遺伝子（以下参照）；（２）それぞれの時点について、２つの群を定義した：前の時点と比較して（ａ）誘導された全ての遺伝子および（ｂ）抑制された全ての遺伝子；（３）Ｔｈ１７極性化条件のみを使用するＫ平均クラスタリング。クラスタ内類似度（クラスタのセントロイドとの平均ピアソン相関）が全てのクラスタについて０．７５よりも高くなるように、最小ｋを使用した；および（４）Ｔｈ０およびＴｈ１７プロファイルの連結を使用するＫ平均クラスタリング。
【０２１２】
方法（１、２）について、遺伝子を含むか否かを決定するため、その元のｍＲＮＡ発現プロファイル（Ｔｈ０、Ｔｈ１７）、およびシグモイド関数（Ｃｈｅｃｈｉｋ，Ｇ．＆Ｋｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １６，２７９−２９０，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｃｍｂ．２００８．１３ＴＴ１０．１０８９／ｃｍｂ．２００８．１３ＴＴ［ｐｉｉ］（２００９））（したがって、一過性の揺らぎをフィルタリングする）としてのそれらの近似値を考慮した。変化倍率レベル（Ｔｈ０（方法１）または前の時点（方法２）と比較）は、以下の３つの値の最小値として定義されるカットオフをパスすることを要求された：（１）１．７；（２）全ての時点にわたる変化倍率のヒストグラムの平均＋ｓｔｄ；または（３）全ての時点にわたる最大変化倍率。図１ｂに表示されるクラスタは、方法４により得た。
【０２１３】
調節ネットワーク推定：Ｔｈ１７分化の潜在的調節因子を、それらの推定標的と、上記方法１〜４に従ってグループピングされた示差的に発現された遺伝子のセットとの間の重複を計算することにより同定した。いくつかの情報源からの調節因子−標的会合をアセンブルした：（１）２９８個の転写調節因子のインビボＤＮＡ結合プロファイル（典型的には、他の細胞中で計測）（Ｌｉｎｈａｒｔ，Ｃ．，Ｈａｌｐｅｒｉｎ，Ｙ．＆Ｓｈａｍｉｒ，Ｒ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｏｔｉｆ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｔｈｅ  Ａｍａｄｅｕｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ａｎｄ  ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｍｅｔａｚｏａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，１１８０−１１８９，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．０７６１１７．１０８（２００８）；Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ＩＴＦＰ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４，２４１６−２４１７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｎ４３９（２００８）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｎ  ｍａｊｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，５３２−５４４，ｄｏｉ：Ｓ１９３４−５９０９（１０）００４４０−６［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．０７．０１６（２０１０）；Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．２６  ２４３８−２４４４（２０１０）；Ｌｉｂｅｒｚｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）３．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，１７３９−１７４０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ２６０（２０１１）；Ｊｉａｎｇ，Ｃ．，Ｘｕａｎ，Ｚ．，Ｚｈａｏ，Ｆ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｍ．ＴＲＥＤ：ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅ，ｎｅｗ  ｅｎｔｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５，Ｄ１３７−１４０（２００７））；（２）１１個の調節タンパク質のノックアウトに対する転写応答（Ａｗａｓｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；Ｓｃｈｒａｍｌ，Ｂ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＡＰ−１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂａｔｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｔ（Ｈ）１７  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６０，４０５−４０９，ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０８１１４［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８１１４（２００９）；Ｓｈｉ，Ｌ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．ＨＩＦ１ａｌｐｈａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ  ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＨ１７  ａｎｄ  Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０８，１３６７−１３７６，ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１１０２７８（２０１１）；Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｃｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＩＬ−１７  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔ，ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  ＳＴＡＴ５．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２，２４７−２５４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．１９９５（２０１１）；Ｄｕｒａｎｔ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＳＴＡＴ３  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３２，６０５−６１５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１０．０５．００３（２０１０）；Ｊｕｘ，Ｂ．，Ｋａｄｏｗ，Ｓ．＆Ｅｓｓｅｒ，Ｃ．Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｒｅ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｎ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．：１９５０）１８２，６７０９−６７１７，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０７１３３４４（２００９）；Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，２５７−２６３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９０５０（２００９）；Ｘｉａｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ−ｄｒｉｖｅｎ  Ｓｍａｄ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＩＬ−６  ａｎｄ  ＩＬ−２３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１，２２７７−２２８４，ｄｏｉ：１８１／４／２２７７［ｐｉｉ］（２００８））；（３）Ｏｎｔｏｇｅｎｅｔアルゴリズム（Ｊｏｊｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、審査中；利用可能な調節モデル：を、マウスの自然および適応免疫系からの１５９個の細胞サブセットからの４８４個のマイクロアレイ試料を含むマウスＩｍｍＧｅｎコンソーシアムからのデータ（２０１０年１月公開（Ｈｅｎｇ，Ｔ．Ｓ．＆Ｐａｉｎｔｅｒ，Ｍ．Ｗ．Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ：ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９，１０９１−１０９４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ１００８−１０９１（２００８））に適用することにより得られた追加の潜在的相互作用；（４）プロモーター領域中のシス調節因子エンリッチメントの統計分析（Ｅｌｋｏｎ，Ｒ．，Ｌｉｎｈａｒｔ，Ｃ．，Ｓｈａｒａｎ，Ｒ．，Ｓｈａｍｉｒ，Ｒ．＆Ｓｈｉｌｏｈ，Ｙ．ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．１３  ７７３−７８０（２００３）；Ｏｄａｂａｓｉｏｇｌｕ，Ａ．，Ｃｅｌｉｋ，Ｍ．＆Ｐｉｌｅｇｇｉ，Ｌ．Ｔ．ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９７  ＩＥＥＥ／ＡＣＭ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ５８−６５（ＩＥＥＥ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，１９９７））；および（５）ＩＰＡソフトウェアのＴＦエンリッチメントモジュール。データベース中のそれぞれのＴＦについて、フィッシャーの正確検定を使用するその推定標的と上記定義の群のそれぞれとの間の重複の統計的有意性を計算した。ｐ＜５＊１０−５およびエンリッチメント倍率＞１．５のケースを含めた。
【０２１４】
調節ネットワーク中のそれぞれのエッジに、そのそれぞれの調節因子および標的ノードの発現プロファイルに基づきタイムスタンプを割り当てた。標的ノードについて、遺伝子が示差的に発現され、または前の時点（上記グルーピング法１および２と同様）に対して有意に誘導もしくは抑制されたタイムスタンプを考慮した。調節因子ノードを、（ｉ）それがＴｈ０と比較して過少発現された場合；または（ｉｉ）発現が低く（時間における最大値の＜２０％）、遺伝子がＴｈ０と比較して過剰発現されなかった場合；または（ｉｉｉ）時間におけるこの時点まで、遺伝子が１００の最小発現値を超えて発現されなかった場合、所与の時点において「非存在」と定義した。追加の制約として、Ｓｃｈｗａｎｈａｕｅｓｓｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（Ｇｌｏｂａｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３３７−３４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１００９８（２０１１））からのモデルを使用し、時間的発現プロファイルの連続表示のためのシグモイドフィット（Ｃｈｅｃｈｉｋ＆Ｋｏｌｌｅｒ，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２００９）、およびタンパク質半減期の推定のためのＰｒｏｔＰａｒａｍソフトウェア（Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  ｓｅｒｖｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２，５３１−５５２（１９９９））を使用してタンパク質発現レベルを推定した。所与の時点において、予測タンパク質レベルは、時間経過の間に到達される最大値を１．７倍以上で下回り、Ｔｈ０レベルを１．７倍未満で下回らないことが要求された。時点規定グルーピング（上記グルーピング法１および２）に基づき推定されたエッジに割り当てられたタイミングを、その規定時点に限定した。例えば、エッジを１時間において誘導された遺伝子のセットのエンリッチメントに基づき推定した場合（グルーピング法＃２）、それに「１時間」のタイムスタンプを割り当てる。次いで、この同一エッジは、それが追加の試験により明らかにされた場合、追加のタイムスタンプのみを有し得る。
【０２１５】
Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇシグネチャー遺伝子の選択：２７５個の遺伝子シグネチャー（表１）の選択は、可能な限り多くの分化プログラムの局面を反映するためのいくつかの基準を組み合わせた。以下の要件を定義した：（１）シグネチャーは、Ｔｈ１７マイクロアレイシグネチャーに属するＴＦ（他のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｖｏｌ．３０  １５５−１６７（２００９））、本明細書に記載の方法の部参照）；ネットワーク中の調節因子として含まれ、示差的発現スコア＞１を有するＴＦ；または強力に示差的に発現されるＴＦ（示差的発現スコア＝４）の全てを含まなければならず；（２）これは、類似の発現プロファイルを有する遺伝子のそれぞれのクラスタからの少なくとも１０個の代表物を含まなければならず（上記クラスタリング法（４）を使用）；（３）これは、異なるネットワーク中のそれぞれのＴＦの予測標的からの少なくとも５つの代表物を含有しなければならず；（４）これは、それぞれのエンリッチされた遺伝子オントロジー（ＧＯ）カテゴリー（全ての示差的に発現される遺伝子にわたり計算）の最小数の代表物を含まなければならず；（５）これは、分化プロセスに関連する約１００個の遺伝子、例として、示差的に発現されるサイトカイン、受容体分子および他の細胞表面分子の手作業によりアセンブルされたリストを含まなければならない。これらの異なる基準は実質的な重複を生成し得るため、集合被覆アルゴリズムを使用して５つの条件の全てを満たす遺伝子の最小サブセットを見出した。このリストに、マイクロアレイデータにおいて発現が変化を示さなかった（時間で、または処理間で）１８個の遺伝子を付加した。
【０２１６】
８５個の遺伝子シグネチャー（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ  ｑＰＣＲアッセイに使用）は、２７５個の遺伝子シグネチャーのサブセットであり、記載の全てのキー調節因子およびサイトカインを含むように選択される。このリストに、１０個の対照遺伝子（２９０００６４Ａ１３ＲＩＫ、ＡＰＩ５、ＣＡＮＤ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｈ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＧＯＬＧＡ３、ＨＳＢＰ１、ＫＨＤＲＢＳ１、ＭＥＤ２４、ＭＫＬＮ１、ＰＣＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＵＦＵ、ＴＭＥＤ７、ＵＢＥ３Ａ、ＺＦＰ４１０）を付加した。
【０２１７】
摂動標的の選択：バイアスなしのアプローチを使用してＴｈ１７分化の候補調節因子（転写因子またはクロマチン修飾因子遺伝子）をランキングした。このランキングは、以下の特性に基づいた：（ａ）調節因子をコードする遺伝子がＴｈ１７マイクロアレイシグネチャーに属したか否か（他のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｖｏｌ．３０  １５５−１６７（２００９））、本明細書に記載の方法参照）；（ｂ）調節因子がキーＴｈ１７分子（ＩＬ−１７、ｌＬ−２１、ＩＬ２３ｒ、およびＲＯＲ−γｔ）を標的化することを予測されたか否か；（ｃ）調節因子が、ＩＰＡソフトウェアからの摂動および物理的結合データの両方に基づき検出されたか否か；（ｄ）調節因子が、少なくとも１０個の標的遺伝子のカットオフを使用してネットワーク中に含まれたか否か；（ｅ）調節因子をコードする遺伝子が、Ｔｈ１７時間経過において有意に誘導されたか否か。誘導が４時間後に起きたケースのみを考慮して非特異的ヒットを除外した；（ｆ）調節因子をコードする遺伝子が、前の試験におけるＴｈ１７関連摂動に応答して示差的に発現されたか否か。この基準について、摂動されたＴｈ１７細胞における転写効果のデータベースをアセンブルした、例として：Ｂａｔｆ（Ｓｃｈｒａｍｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００９）、ＲＯＲ−γｔ（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、未公開）、Ｈｉｆ１ａ（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２０１１））、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ５（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１１）；Ｄｕｒａｎｔ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖｏｌ．３２  ６０５−６１５（２０１０）、Ｔｂｘ２１（Ａｗａｓｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、未公開）、ＩＬ２３ｒ（本試験）、ならびにＡｈｒ（Ｊｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９））のノックアウト。ジゴキシン（Ｈｕｈ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｇｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  ＲＯＲｇａｍｍａｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７２，４８６−４９０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９９７８（２０１１））およびハロフジノン（Ｓｕｎｄｒｕｄ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３２４，１３３４−１３３８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７２６３８（２００９））に対するＴｈ１７応答からのデータ、ならびにＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、未公開）から推定されるＲＯＲ−γｔによる直接結合に関する情報も含めた。公開発現データセットの分析を、本明細書に記載の方法の部に記載する。それぞれの調節因子について、それが有意ヒット（上方／下方調節または結合）として現れた条件の数をカウントし；２〜３ヒット（１０個のビンのうち分位数３〜７）を有する調節因子について、次いで１のスコアを割���当て；３を超えるヒット（分位数８〜１０）を有する調節因子について、２のスコアを割り当てる（そうでなければ０のスコアを割り当てる）；ならびに（ｇ）Ｔｈ１７時間経過における遺伝子の示差的発現スコア。
【０２１８】
調節因子を、上記特性により順序：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、（ｅおよびｆの合計）、ｇに従って辞書的に順序付けた（すなわち、ａに従って最初のソート、次いでｂに従って同順位解消、など）。少なくとも１つの時点の間に過剰発現されない遺伝子を除外した。例外として、追加の外部検証（特性ｆ）を有する予測調節因子（特性ｄ）を保持した。このランキングを検証するため、教師あり検定を使用した：Ｔｈ１７分化に既に関連した７４個の調節因子を、手作業によりアノテートした。特性の全ては、それらの調節因子に高度に特異的である（ｐ＜１０−３）。さらに、教師あり学習法（Ｎａｉｖｅ  Ｂａｙｅｓ）を使用して、特性は、アノテートされた調節因子についての良好な予測能力を提供し（７１％の精度、５倍交差検証を使用）、得られたランキングは、教師なしの辞書的順序付けと高度に相関した（スピアマン相関＞０．８６）。
【０２１９】
この方針をタンパク質受容体のランキングに適合させた。この目的のため、特性ｃを除外し、残りの「タンパク質レベル」特性（ｂおよびｄ）を以下の定義により置き換えた：（ｂ）それぞれのリガンドが、Ｔｈ１７時間経過の間に誘導されるか否か；および（ｄ）受容体が、少なくとも５つの標的化転写調節因子のカットオフを使用してネットワーク中に標的として含まれたか否か。
【０２２０】
ケイ素ナノワイヤを使用する遺伝子ノックダウン：４×４ｍｍケイ素ナノワイヤ（ＮＷ）基体を調製し、既に記載のとおり９６ウェル組織培養プレート中で３μＬの５０μＭプールの４つのｓｉＧＥＮＯＭＥ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍｃｏｎ）によりコートした（Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｎａｎｏｗｉｒｅｓ  ａｓ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０７，１８７０−１８７５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０９３５０１０７（２０１０））。手短に述べると、１５０，０００個のナイーブＴ細胞を１０μＬの完全培地中でｓｉＲＮＡ付きＮＷ上で播種し、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に置いて４５分間沈降させてから完全に培地添加した。これらの試料を２４時間静置して標的転写物のノックダウンを可能とした。この後、ｓｉＲＮＡ形質移入Ｔ細胞を、αＣｄ３／Ｃｄ２８ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、製造業者の推奨に従ってＴｈ１７極性化条件（ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６、上記）下で活性化させた。活性化の１０または４８時間後、培養培地をそれぞれのウェルから除去し、試料を１００μＬのＰＢＳにより穏やかに洗浄してから２−メルカプトエタノール（１：１００容量基準）が補給された２０μＬの緩衝液ＴＣＬ（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解させた。ｍＲＮＡをＴｕｒｂｏｃａｐｔｕｒｅプレート（Ｑｉａｇｅｎ）中で回収した後、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ酵素（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに変換し、既に記載のとおりｑＲＴ−ＰＣＲを使用して８〜１２個の非標的化ｓｉＲＮＡ対照試料に対するノックダウンレベルおよび表現型変化の両方を検証した（Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＴＬＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ  ｖｉｒａｌ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｃｅｌｌ  １４７，８５３−８６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．１０．０２２（２０１１））。標的ｍＲＮＡの６０％の低減を、ノックダウン閾値として使用した。それぞれのノックダウン実験において、それぞれの個々のｓｉＲＮＡプールを四重でランさせ；それぞれのｓｉＲＮＡを少なくとも３つの別個の実験において試験した（図１１）。
【０２２１】
摂動アッセイにおけるｍＲＮＡ計測：Ｇｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｉｓｓ，Ｇ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｂｅ  ｐａｉｒｓ．ＳＩ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，３１７−３２５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１３８５（２００８））において完全に提示されるｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを使用し、上記のとおり選択された合計２９３個の遺伝子を検出するために構築されたカスタムＣｏｄｅＳｅｔを計測した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ  ＨＤシステムを使用して９６個の遺伝子の最小セットも計測した。最後にＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して摂動物の１２個を追跡および検証した。
【０２２２】
上記のとおり選択された合計２９３個の遺伝子を検出するために構築されたカスタムＣｏｄｅＳｅｔを、時間経過の間に発現が影響を受けないままの１８個の対照遺伝子を含め、使用した。それぞれのＮＷノックダウンに由来するインプットｍＲＮＡの希少性を考慮し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ−ＣｏｄｅＳｅｔ特異的な１４サイクルの特異的標的増幅（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＴＡ）プロトコルを製造業者の推奨に従って５μＬのＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μＬのプールされた混合プライマー（それぞれ５００ｎＭ、プライマー配列については表Ｓ６．１参照）を検証されるノックダウンからの５μＬのｃＤＮＡに添加することにより実施した。増幅後、５μＬの増幅ｃＤＮＡ産物を９５℃において２分間融解させ、氷上でスナップ冷却し、次いでＣｏｄｅＳｅｔと６５℃において１６時間ハイブリダイズさせた。最後に、ハイブリダイズされた試料をｎＣｏｕｎｔｅｒプレップステーション中にロードし、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して製造業者の説明書に従って産物カウントを定量した。増幅後に濃縮されすぎた試料を希釈し、再度ランさせた。全脾臓およびＴｈ１７極性化ｃＤＮＡの段階希釈物（１：１、１：４、１：１６、および１：６４、プレＳＴＡ）を使用して異なる量の出発インプット材料の効果を制御し、試料増幅のバイアスを確認した。
【０２２３】
Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒデータ分析：それぞれの試料について、カウント値を、マイクロアレイデータにおいて変化を示さない（時間で、または処理間で）対照遺伝子（１８個の遺伝子全部）のセットに割り当てられたカウントの合計により除した。それぞれの条件について、変化倍率比を計算し、非標的化（ＮＴ）ｓｉＲＮＡにより処理された少なくとも３つの異なる対照試料と比較した。次いで、全てのペアワイズ比較（すなわち、Ａ条件の繰り返しおよびＢ対照（ＮＴ）試料についてのＡ×Ｂペア）の結果を一緒にプールし：半数を超えるペアワイズ比較における同一方向（上方／下方調節）の実質的な変化倍率（閾値ｔを上回る）が要求された。閾値ｔをｍａｘ｛ｄ１、ｄ２｝として決定し、ｄ１は、マッチングＮＴ試料の全てのペア間の絶対対数変化倍率の平均＋ｓｔｄであり（すなわち、同一バッチおよび同一時点を形成し；ｄ１＝１．６６）、ｄ２は、１８個の対照遺伝子により示される絶対対数変化倍率の平均＋標準偏差の１．６４５倍である（１８×Ａ×Ｂ値の全てを考慮することによりそれぞれの比較について別個に決定し；正規性の仮定のもとｐ＝０．０５に対応する）。ＮＴおよびノックダウン試料の両方が正規化前に低いカウント（＜１００）を有した全てのペアワイズ比較を無視した。
【０２２４】
並べ替え検定を使用し、予測ネットワークモデル（図２）とＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒにおいて計測されたノックダウン効果（図４、図１０）との間の重複を評価した。２つの指標を、予測標的が利用可能であるそれぞれのＴＦについて計算した：（ｉ）特異度（それぞれのノックダウンにより影響される予測標的の割合（ｎＣｏｕｎｔｅｒにより計測される遺伝子のみを考慮））、および（ｉｉ）感度（モデルにおけるその予測標的でもある所与のＴＦノックダウンにより影響される遺伝子の割合）。循環性を回避するため、ノックアウト単独に基づき元のネットワークにおいて予測される標的遺伝子をこの分析から排除した。得られた値（平均でそれぞれ１３．５％および２４．８％）をＦスコア（特異度および感度の調和平均）に組み合せた。次いで、Ｆスコアの計算を５００個のランダム化データセットにおいて繰り返し、ノックダウン結果マトリックス中の標的遺伝子ラベルをシャッフルした。報告される実験的ｐ値は以下である：
Ｐ＝（１＋＃同等のより良好なＦスコアを有するランダム化データセット）／（１＋＃ランダム化データセット）
【０２２５】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ  ＨＤに基づくｍＲＮＡ計測：検証されたノックダウンからのｃＤＮＡを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ  ＨＤに基づく定量のために調製した。手短に述べると、５μＬのＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＬのプールされた混合プライマー（それぞれ５００ｎＭ、プライマーについての表Ｓ６．１参照）、および１．５μＬの水を、２．５μＬのノックダウン検証ｃＤＮＡに添加し、１４サイクルのＳＴＡを製造業者の推奨に従って実施した。ＳＴＡ後、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ消化（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を実施し、０．８μＬのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、０．４μＬのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒおよび２．８μＬの水をそれぞれの試料に添加し、次いで試料をボルテックスにかけ、遠心分離し、試料を３７℃に３０分間加熱することにより取り込まれないプライマーを除去した。１５分間の８０℃熱不活化後、増幅試料をＢｕｆｆｅｒ  ＴＥ中で１：５に希釈した。次いで、ＥｖａＧｒｅｅｎおよび９６×９６遺伝子発現チップ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ  ＨＤ）（Ｄａｌｅｒｂａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，１１２０−１１２７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２０３８（２０１１））を使用して増幅検証ノックダウンならびに全脾臓およびＴｈ１７段階希釈対照（１：１、１：４、１：１６、および１：６４、プレＳＴＡ）を分析した。
【０２２６】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍデータ分析：それぞれの試料について、Ｃｔ値を、４つのハウスキーピング遺伝子のセットに割り当てられたＣｔ値の幾何平均から引いた。それぞれの条件について、変化倍率比を計算し、非標的化（ＮＴ）ｓｉＲＮＡにより処理された少なくとも３つの異なる対照試料と比較した。次いで、全てのペアワイズ比較（すなわち、Ａ条件の繰り返しおよびＢ対照（ＮＴ）試料についてのＡ×Ｂペア）の結果を一緒にプールし：半数を超えるペアワイズ比較における同一方向（上方／下方調節）の正規化Ｃｔ値間の実質的な差（閾値ｔを上回る）が要求された。閾値ｔをｍａｘ｛ｌｏｇ２（１．５）、ｄ１（ｂ）、ｄ２｝として決定し、ｄ１（ｂ）は、発現分位数ｂ（１＜＝ｂ＜＝１０）の全ての遺伝子にわたるマッチングＮＴ試料（すなわち、同一バッチおよび同一時点から）の全てのペア間の差分の平均＋ｓｔｄである。ｄ２は、１０個の対照遺伝子（４つのハウスキーピング遺伝子とＮａｎｏｓｔｒｉｎｇシグネチャーからの６つの対照遺伝子）により示される差分の平均＋標準偏差の１．６４５倍であり；ｄ２は、全ての１０×Ａ×Ｂ値を考慮することによりそれぞれの比較について別個に決定し、正規性の仮定のもとｐ＝０．０５に対応する）。ＮＴおよびノックダウン試料の両方が正規化前に低いカウント（Ｃｔ＜２１（増幅を考慮し、このカットオフは、慣用の３５のＣｔカットオフに対応する））を有する全てのペアワイズ比較を無視した。
【０２２７】
ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用するｍＲＮＡ計測：ＮＥＢＮｅｘｔ  ｍＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用し、製造業者の推奨に従ってＮＷ媒介ノックダウンからの検証一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換した。次いで、０．９×ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して試料を清浄した。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してライブラリーを調製し、定量し、プールし、次いでＨｉＳｅｑ  ２５００（Ｉｌｌｕｍｎｉａ）により平均深度２０Ｍリードで配列決定した。
【０２２８】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ分析：ＵＣＳＣ公知遺伝子トランスクリプトーム（Ｆｕｊｉｔａ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅ：ｕｐｄａｔｅ  ２０１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９，Ｄ８７６−８８２，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ９６３（２０１１））に基づくＢｏｗｔｉｅインデックスを作出し、Ｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｏｐ，Ｍ．＆Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０，Ｒ２５，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２００９−１０−３−ｒ２５（２００９））を使用してペアエンドリードをこのインデックスに直接アラインした。次に、ＲＳＥＭ  ｖ１．１１（Ｌｉ，Ｂ．＆Ｄｅｗｅｙ，Ｃ．Ｎ．ＲＳＥＭ：ａｃｃｕｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２，３２３，ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１０５−１２−３２３（２０１１））を、これらのアラインメントに対してデフォルトパラメータで実行して発現レベルを推定した。ＲＳＥＭ遺伝子レベル発現推定値（タウ）に１，０００，０００を乗じてそれぞれの遺伝子についての百万単位の転写物（ＴＰＭ）推定値を得た。分位数正規化を使用して試料のそれぞれのバッチ内のＴＰＭ値をさらに正規化した。それぞれの条件について、変化倍率比を計算し、非標的化（ＮＴ）ｓｉＲＮＡにより処理された少なくとも２つの異なる対照試料と比較した。次いで、全てのペアワイズ比較（すなわち、Ａ条件の繰り返しおよびＢ対照（ＮＴ）試料についてのＡ×Ｂペア）の結果を一緒にプールし：半数を超えるペアワイズ比較における同一方向（上方／下方調節）のＴＰＭ値間の有意差が要求された。有意カットオフｔをｍａｘ｛ｌｏｇ２（１．５）、ｄ１（ｂ）｝として決定し、ｄ１（ｂ）は、発現分位数ｂ（１＜＝ｂ＜＝２０）の全ての遺伝子にわたるマッチングＮＴ試料（すなわち、同一バッチおよび同一時点から）の全てのペア間の対数倍率比の平均＋１．６４５＊ｓｔｄである。ＮＴおよびノックダウン試料の両方が低いカウント（ＴＰＭ＜１０）を有する全てのペアワイズ比較を無視した。低い発現値に起因する誤った倍率レベルを回避するため、それぞれのバッチにおける全てのＴＰＭ値の（１０個のうちの）第１の分位数の値に設定された小さい定数を発現値に付加した。
【０２２９】
超幾何検定を使用し、予測ネットワークモデル（図２）とＲＮＡ−ｓｅｑにおいて計測されたノックダウン効果（図４ｄ）との間の重複を評価した。バックグラウンドとして、マイクロアレイデータに現れた遺伝子の全て（したがって、２０個がネットワーク中に含まれる潜在性を有する）を使用した。追加の検定として、ウィルコクソン・マン・ホイットニー順位和検定を使用し、アノテートされたセットの遺伝子の絶対対数変化倍率を、遺伝子の全セットと比較した（前述と同一のバックグラウンドを使用）。順位和検定は、有意閾値の設定を要求せず；代わりに、それは全ての遺伝子の変化倍率値を考慮する。順位和検定により生成されたｐ値は、超幾何検定におけるものよりも低く（すなわち、より有意であり）、したがって、図４ｃにおいて、より厳密（超幾何的）なｐ値のみを報告した。
【０２３０】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用するＴｓｃ２２ｄ３ＤＮＡ結合のプロファイリング：Ｔｓｃ２２ｄ３についてのＣｈＩＰ−ｓｅｑを既に記載のとおり、Ａｂｃａｍ製の抗体を使用して実施した（Ｒａｍ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  Ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １４７，１６２８−１６３９（２０１１））。このデータの分析を、既に記載のとおり実施し（Ｒａｍ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  Ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １４７，１６２８−１６３９（２０１１））、本明細書に記載の方法の部に詳述した。
【０２３１】
Ｔｓｃ２２ｄ３ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータの分析：Ｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｏｐ，Ｍ．＆Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．１０  Ｒ２５（２００９））を使用してＣｈＩＰ−ｓｅｑリードをマウスゲノムのＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３７（ＵＣＳＣ  ｍｍ９）にアラインした。ＭＡＣＳ（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．９  Ｒ１３７（２００８））を使用してエンリッチ結合領域（ピーク）を検出し、ｐ値カットオフは１０−８であった。ピークが遺伝子の５’末端に近接する場合（転写開始部位から１０ｋｂ上流および１ｋｂ下流）、または遺伝子本体内に存在する場合、ピークを遺伝子に関連付けた。遺伝子座標についてのＲｅｆＳｅｑ転写物アノテーションを使用した。
【０２３２】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークとアノテートされたゲノム領域との重複を評価した。領域ＡがＢの頂点から５０ｂｐの距離内に存在する場合、ＡがピークＢと重複することが決定された（ＭＡＣＳにより決定）。使用領域は、以下を含んだ：（ｉ）Ｅｎｓｅｍｂｌｅデータベース（Ｆｌｉｃｅｋ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｓｅｍｂｌ  ２０１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９，Ｄ８００−８０６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ１０６４（２０１１））からの調節特性アノテーション；（ｉｉ）Ｏｒｅｇａｎｏアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＬ−１２ｂｅｔａ  ａｎｄ  ＩＬ−２３Ｒ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  ａ  ＵＫ  ｃｏｈｏｒｔ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２８，１３２５−１３２７，ｄｏｉ：５７０１１４０［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｓｊ．ｊｉｄ．５７０１１４０（２００８））により見出された２１個の調節特性；（ｉｉｉ）ｍｕｌｔｉｚ３０ｗａｙアルゴリズム（ここでは、ｍｕｌｔｉｚ３０ｗａｙスコア＞０．７を有する領域を考慮した）によりアノテートされた保存領域；（ｉｖ）ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒによりアノテートされた繰り返し領域；（ｖ）推定プロモーター領域（ＲｅｆＳｅｑ（Ｐｒｕｉｔｔ，Ｋ．Ｄ．，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔ．＆Ｍａｇｌｏｔｔ，Ｄ．Ｒ．ＮＣＢＩ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＲｅｆＳｅｑ）；ａ  ｃｕｒａｔｅｄ  ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５，Ｄ６１−６５，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｌ８４２（２００７））においてアノテートされた転写物の１０ｋｂ上流および１ｋｂ下流を考慮）；（ｖｉ）ＲｅｆＳｅｑにおける遺伝子本体アノテーション；（ｖｉｉ）３’近接領域（３’末端に対して１ｋｂ上流および５ｋｂ下流を考慮）；（ｖｉｉｉ）Ｔｈ１７細胞中のヒストンマークＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３がエンリッチされた領域（Ｗｅｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖｏｌ．３０  １５５−１６７（２００９））；（ｉｘ）Ｔｈ１７細胞中のＳｔａｔ３およびＳｔａｔ５の結合（Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｃｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＩＬ−１７  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔ，ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  ＳＴＡＴ５．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，２４７−２５４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．１９９５（２０１１））、Ｉｒｆ４およびＢａｔｆ（Ｇｌａｓｍａｃｈｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｒｅｃｔｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＰ−１−ＩＲＦ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２８３０９（２０１２））、ならびにＲＯＲγｔ（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ  未公開）、ならびにｉＴｒｅｇ中のＦｏｘｐ３（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、未公開）がエンリッチされた領域。
【０２３３】
ピーク「ｘ」のそれぞれのセットおよびゲノム領域「ｙ」のそれぞれのセットについて、二項ｐ値を使用してＭｃｌｅａｎ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２８  ｎｂｔ．１６３０−１６３９（２０１０）に記載のとおりゲノム中のそれらの重複を評価した。ヒットの数を、ｙと重複するｘピークの数と定義する。セット（ｉ）〜（ｖｉｉ）中のバックグラウンド確率を、ゲノムの全長により除された領域の全長（ｂｐ）に設定する。セット（ｖｉｉｉ）〜（ｉｘ）中のバックグラウンド確率を、アノテートされたゲノム領域の全長により除された領域の全長に設定し：これは、アノテートされた調節領域（セットｉ、およびｉｉにおいて定義）、遺伝子に近接するとしてアノテートされた領域（セットｖ〜ｖｉｉからの定義を使用）、Ｔｈ１７細胞中のヒストンマークを担持する領域（セットｖｉｉｉからの定義を使用）、またはＴｈ１７細胞中の転写調節因子により結合される領域（セットｉｘからの定義を使用）を含む。
【０２３４】
転写調節因子（セットｉｘ）については、追加の「遺伝子レベル」検定も含め：ここで、超幾何ｐ値を使用する結合遺伝子のセット間の重複を評価した。類似の検定を使用して結合遺伝子とＴｓｃ２２ｄ３ノックダウン中で示差的に発現される遺伝子との間の重複を評価した。
【０２３５】
分析は、第２のピークコーリングソフトウェア（Ｓｃｒｉｐｔｕｒｅ）（Ｇｕｔｔｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２８  ５０３−５１０（２０１０）；Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１２．０７．０３０（２０１２））により繰り返し、全ての上記検定において一致する結果を得た。具体的には、同時占有される結合部位および共通標的遺伝子の両方に関して、検定されたＴｈ１７因子との類似レベルの重複が見られた。
【０２３６】
モジュール間の単色相互作用の統計的有意性の推定：図４ｂの機能ネットワークは、２つの正および負のモジュールからなる。２つのインデックスを計算した：（１）モジュール内インデックス：同一モジュールのメンバー間の正のエッジの割合（すなわち、ノックダウン／ノックアウトにおける下方調節）；および（２）モジュール間インデックス：負である同一モジュールのメンバー間の負のエッジの割合。ネットワークを１，０００回シャッフルした一方、ノード出次数（すなわち、出ていくエッジの数）およびエッジサイン（正／負）を維持し、２つのインデックスを再計算した。報告されたｐ値は、ｔ検定を使用して計算した。
【０２３７】
Ｔｈ１７シグネチャーを導き、Ｔｈ１７関連摂動に対して応答性の遺伝子を同定するための文献マイクロアレイデータの使用：Ｔｈ１７シグネチャー遺伝子を定義するため、Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．３０  １５５−１６７（２００９）からの遺伝子発現データをダウンロードおよび分析し、ＲＭＡアルゴリズムを使用してデータを前処理し、次いで２３ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎスイートのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＦｉｌｅＣｒｅａｔｏｒモジュールにおけるデフォルトパラメータを使用して分位数正規化を行った（Ｒｅｉｃｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ  ２．０．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８，５００−５０１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０５０６−５００（２００６））。このデータは、Ｔｈ１７、Ｔｈ１、Ｔｈ２、ｉＴｒｅｇ、ｎＴｒｅｇ、およびナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からのレプリケートマイクロアレイ計測値を含む。それぞれの遺伝子について、それが全ての他の細胞サブセットと比較してＴｈ１７細胞中で過剰発現されるか否かを、片側ｔ検定を使用して評価した。＜０．０５のｐ値を有する全てのケースを保持した。追加のフィルタリングステップとして、Ｔｈ１７細胞中の遺伝子の発現レベルが、全ての他の細胞サブセット中のその発現よりも少なくとも１．２５倍高いことが要求された。低い発現値に起因する誤った倍率レベルを回避するため、小さい定数（ｃ＝５０）を発現値に付加した。
【０２３８】
公開Ｔｈ１７関連摂動に対して応答性の遺伝子を定義するため、種々の条件下のＴｈ１７細胞の転写プロファイルを提供するいくつかの情報源からの遺伝子発現データ（上記列記）をダウンロードおよび分析した。これらのデータセットを上記のとおり前処理した。所与の条件において示差的に発現された遺伝子（それらのそれぞれの対照と比較して）を見出すため、ケースおよび対照条件におけるそれぞれのプローブセットの発現レベル間の変化倍率を計算した。低い発現値に起因する誤った倍率レベルを回避するため、上記の小さい定数を発現値に付加した。考えられるケース−対照比較の全ての５０％超が１．５倍変化のカットオフを上回るケースのみを報告した。追加のフィルターとして、デュプリケートが利用可能である場合、Ｚスコアを上記のとおり計算し、対応するｐ値＜０．０５を有するケースのみを報告した。
【０２３９】
遺伝子：以下の表１１に説明する略語は、本明細書において本開示全体にわたり使用される遺伝子、例として、限定されるものではないが、本明細書の表１〜９に示されるものを識別するために使用される。
【０２４０】
【表３０】
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【０２４１】
【表３１】
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【０２４２】
【表３２】
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【０２４３】
【表３３】
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【０２４４】
【表３４】
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【０２４５】
【表３５】
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【０２４６】
【表３６】
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【０２４７】
【表３７】
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【０２４８】
【表３８】
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【０２４９】
【表３９】
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【０２５０】
【表４０】
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【０２５１】
【表４１】
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【０２５２】
【表４２】
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【０２５３】
【表４３】
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【０２５４】
【表４４】
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【０２５５】
【表４５】
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【０２５６】
Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ＳＴＡおよびｑＲＴ−ＰＣＲ／ＦｌｕｉｄｉｇｍのためのプライマーならびにｓｉＲＮＡ配列：表Ｓ６．１は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ／ｑＲＴ−ＰＣＲ実験およびＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現プロファイリングにおいて使用されるそれぞれのフォワードおよびリバースプライマーについての配列を表示する。表Ｓ６．２は、ノックダウン分析に使用されるＲＮＡｉについての配列を表示する。
【０２５７】
【表４６】
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【０２５８】
【表４７】
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【０２５９】
【表４８】
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【０２６０】
【表４９】
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【０２６１】
【表５０】
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【０２６２】
【表５１】
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【０２６３】
【表５２】
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【０２６４】
【表５３】
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【０２６５】
【表５４】
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【０２６６】
【表５５】
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【０２６７】
【表５６】
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【０２６８】
【表５７】
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【０２６９】
【表５８】
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【０２７０】
【表５９】
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【０２７１】
【表６０】
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【０２７２】
【表６１】
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【０２７３】
【表６２】
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【０２７４】
【表６３】
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【０２７５】
【表６４】
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【０２７６】
【表６５】
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【０２７７】
【表６６】
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【０２７８】
【表６７】
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【０２７９】
【表６８】
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【０２８０】
【表６９】
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【０２８１】
【表７０】
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【０２８２】
【表７１】
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【０２８３】
【表７２】
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【０２８４】
【表７３】
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【０２８５】
【表７４】
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【０２８６】
【表７５】
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【０２８７】
【表７６】
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【０２８８】
【表７７】
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【０２８９】
【表７８】
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【０２９０】
【表７９】
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【０２９１】
【表８０】
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【０２９２】
【表８１】
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【０２９３】
実施例２
Ｔｈ１７分化の転写時間経過
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化を、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−６を使用して誘導し、抗炎症サイトカインＴＧＦ−β１および炎症促進性サイトカインＩＬ−６の組合せにより誘導されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化の間に７２時間の時間経過に沿って１８個の時点においてマイクロアレイを使用して転写プロファイルを計測した（図１、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ、実施例１の方法の部参照）。対照として、ｍＲＮＡプロファイルを、分化サイトカインの添加なしで活性化された細胞（Ｔｈ０）について計測した。Ｔｈ１７分化の間に特異的に示差的に発現された１，２９１個の遺伝子を、Ｔｈ１７分化細胞と対照細胞とを比較することにより同定し（実施例１の方法の部参照）、区別される時間的プロファイルを示す２０個の共発現クラスタに分けた（ｋ平均クラスタリング、実施例１の方法の部参照、図１ｂおよび図７）。これらのクラスタを使用して応答を特性決定し、下記のとおり調節ネットワークモデルを再構築した（図２ａ）。
【０２９４】
転写および分化の３つの主要ウェーブ：細胞がナイーブ様状態（ｔ＝０．５時間）からＴｈ１７（ｔ＝７２時間；図１ｃおよび図６ｃ）に移行するにつれて３つの転写期が存在する：初期（４時間まで）、中期（４〜２０時間）、および後期（２０〜７２時間）。それぞれの期は、分化期（Ｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９）：（１）誘導、（２）表現型の発生および増幅、ならびに（３）安定化およびＩＬ−２３シグナリングにそれぞれ対応する。
【０２９５】
初期は、免疫応答経路（例えば、ＩＬ−６およびＴＧＦ−βシグナリング；図１ｄ）の一過性誘導（例えば、クラスタＣ５、図１ｂ）を特徴とする。第１の移行点（ｔ＝４時間）は、ＲＯＲ−γｔの発現レベルの有意な増加が特徴的であり、これはより初期の時点において検出不能である。第２の移行（ｔ＝２０時間）は、サイトカイン発現の有意な変化を伴い、Ｔｈ１７表現型を強化するＴｈ１７シグネチャーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１７）が誘導され、他のＴ細胞系統に属する他のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）の同時減少が誘導される。
【０２９６】
一部の初期誘導遺伝子は発現の持続を示し（例えば、クラスタＣ１０、図１ｂ）；これらは、本明細書において転写因子（ＴＦ）とも称される転写調節因子（ＴＲ）、例として、キーＴｈ１７因子Ｓｔａｔ３、Ｉｒｆ４およびＢａｔｆ、ならびにサイトカインおよび受容体分子ＩＬ−２１、Ｌｉｆ、およびＩｌ２ｒａについてエンリッチされる。
【０２９７】
中期（ｔ＝４時間）への移行は、ＲＯＲ−γｔ（マスターＴＦ；図６ｄ）および別の１２個のＴＦ（クラスタＣ２０、図１ｂ）、公知（例えば、Ａｈｒ）および新規（例えば、Ｔｒｐｓ１）の両方のＴｈ１７分化への誘導が特徴的である。４時間の時点において、Ｔｈ１７分化のマスターＴＦであるＲＯＲ−γｔの発現は有意に増加し（図６ｄ）、分化表現型の蓄積の開始を示し（「中期」）、残りの時間経過全体にわたり上昇したままである。別の１２個の因子は、類似のパターンを示す（クラスタ８  Ｃ２０、図１ｂ）。これらとしては、ＡｈｒおよびＲｂｐｊ、ならびにＴｈ１７分化における役割を有するとこれまでに記載されていない多数の因子（例えば、Ｅｔｖ６およびＴｒｐｓ１）が挙げられる。全体として、４〜２０時間で誘導される５８５個の遺伝子が示差的に発現され、初期応答遺伝子から実質的に区別される（図１ｂ；例えば、クラスタＣ２０、Ｃ１４、およびＣ１）。
【０２９８】
後期（ｔ＝２０時間）への移行の間、Ｔｈ１７シグネチャーサイトカインのｍＲＮＡが誘導される（例えば、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−９；クラスタＣ１９）一方、他のＴ細胞系統をシグナリングするサイトカインのｍＲＮＡは抑制される（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４）。ＩＬ−１０ファミリーからの調節サイトカインも誘導され（ＩＬ−１０、ＩＬ−２４）、おそらく、「病原性」または「非病原性」Ｔｈ１７細胞の出現に関連する自己限定機序としてである（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３，９９１−９９９；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．２４１６）。約４８時間、細胞は、後期における重要な役割を担うＩＬ２３ｒ（図８Ａ、８Ｂ）を誘導する（データ示さず）。
【０２９９】
活性化の２０〜４２時間後（すなわち、ＲＯＲ−γｔ発現の誘導の１６時間後に開始）、８２１個の遺伝子、例として、多くの主要なサイトカイン（例えば、クラスタＣ１９、図１ｂ）の発現の、Ｔｈ０と比較して実質的な変化が存在する。Ｔｈ１７関連炎症サイトカイン、例として、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２４、ＩＬ−９およびリンホトキシンアルファＬＴＡ（Ｅｌｙａｍａｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｔｃｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍａｄ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６，６２３−６３４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１２．０１．０２０（２０１２））の発現が、強力に誘導される（図１ｄ）一方、他のサイトカインおよびケモカインは抑制され、またはそれらの低い基底レベルのままである（クラスタＣ８およびＣ１５、図１ｂおよび図７）。これらとしては、他のＴ−ヘルパー細胞タイプを特性決定するサイトカイン、例えば、ＩＬ−２（Ｔｈ１７分化インヒビター）、ＩＬ−４（Ｔｈ２）、およびＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）、ならびに他のもの（Ｃｓｆ１、Ｔｎｆｓｆ９／４およびＣｃｌ３）が挙げられる。最後に、ＩＬ−１０からの調節サイトカインも誘導され（ＩＬ−１０、ＩＬ−２４）、おそらく、自己限定機序としてである。したがって、２０時間の時点が、提案される「病原性」対「非病原性」／調節Ｔｈ１７細胞の出現に重要であり得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２）。
【０３００】
残りの時間経過（＞４８時間）において示差的に発現された１，０５５個の遺伝子のほとんどの発現変化は緩やかであり、２０〜４２時間の期間の間に応答した遺伝子において生じ（図１、例えば、クラスタＣ１８、Ｃ１９、およびＣ２０）、典型的には、同一の軌道（上方または下方）で継続する。最も強力に後期に誘導された遺伝子には、ＲＯＲ−γｔとの相互作用を介してＴｈ１７発生を向上させることが既に示されているＴＦのＨｉｆ１ａ（Ｄａｎｇ，Ｅ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔ（Ｈ）１７／Ｔ（ｒｅｇ）ｂａｌａｎｃｅ  ｂｙ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １．Ｃｅｌｌ  １４６，７７２−７８４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０７．０３３（２０１１））。最も後期の時点（７２時間）において過剰発現された遺伝子は、アポトーシス機能についてエンリッチされ（ｐ＜１０−６）、初代培養物におけるＴｈ１７細胞の制限された生存と一致し、これとしては、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４（図８ａ）が挙げられ、このことは、ＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６処理下で細胞がより不安定な表現型を有し得ることを示唆する。
【０３０１】
ＩＬ−２３ｒのｍＲＮＡ発現の誘導のピークは４８時間において生じ、この時点において、細胞表面上にＩＬ−２３ｒタンパク質が確認され始めた（データ示さず）。ＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６およびＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３により刺激された細胞間の、またはＷＴおよびＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３により処理されたＩＬ−２３ｒ−／−細胞間の時間的転写プロファイルを比較した場合に観察されるとおり（図８）、後期応答は、部分的にはＩＬ−２３に依存する。例えば、ＩＬ−２３ｒ欠損Ｔｈ１７細胞において、ＩＬ−１７ｒａ、ＩＬ−１ｒ１、ＩＬ−２１ｒ、ＲＯＲ−γｔ、およびＨｉｆ１ａの発現は減少し、ＩＬ−４発現は増加する。ＩＬ−２３ｒ−／−細胞中で上方調節される遺伝子は、他のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットについてエンリッチされ、このことは、ＩＬ−２３シグナリングの非存在下で細胞が脱分化し始めることを示唆し、したがってＩＬ−２３が分化Ｔｈ１７細胞の表現型の安定化における役割を有し得るという仮定をさらに支持する。
【０３０２】
実施例３
動的調節相互作用の推定
任意の１つの理論に拘束されることを望むものではないが、クラスタ（図１ｂ）のそれぞれが、関連する時点において活性である調節因子を共有する遺伝子を包含することが仮定された。これらの調節因子を予測するため、公開されているゲノムプロファイルからの調節因子−標的会合の一般ネットワークをアセンブルした（Ｌｉｎｈａｒｔ，Ｃ．，Ｈａｌｐｅｒｉｎ，Ｙ．＆Ｓｈａｍｉｒ，Ｒ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｏｔｉｆ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｔｈｅ  Ａｍａｄｅｕｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ａｎｄ  ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｍｅｔａｚｏａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，１１８０−１１８９，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．０７６１１７．１０８（２００８）；Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ＩＴＦＰ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４，２４１６−２４１７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｎ４３９（２００８）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｎ  ｍａｊｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，５３２−５４４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．０７．０１６（２０１０）；Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．２６  ２４３８−２４４４（２０１０）；Ｌｉｂｅｒｚｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）３．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，１７３９−１７４０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ２６０（２０１１）；Ｊｉａｎｇ，Ｃ．，Ｘｕａｎ，Ｚ．，Ｚｈａｏ，Ｆ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｍ．ＴＲＥＤ：ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅ，ｎｅｗ  ｅｎｔｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５，Ｄ１３７−１４０（２００７）；Ｅｌｋｏｎ，Ｒ．，Ｌｉｎｈａｒｔ，Ｃ．，Ｓｈａｒａｎ，Ｒ．，Ｓｈａｍｉｒ，Ｒ．＆Ｓｈｉｌｏｈ，Ｙ．ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．１３  ７７３−７８０（２００３）；Ｈｅｎｇ，Ｔ．Ｓ．＆Ｐａｉｎｔｅｒ，Ｍ．Ｗ．Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ：ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１０９１−１０９４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ１００８−１０９１（２００８））（図２ａ、実施例１の方法の部参照）。
【０３０３】
公開ゲノムプロファイルからの調節因子−標的会合の一般ネットワークを、以下のとおりアセンブルした：２９８個の調節因子についてのインビボタンパク質−ＤＮＡ結合プロファイル（Ｌｉｎｈａｒｔ，Ｃ．，Ｈａｌｐｅｒｉｎ，Ｙ．＆Ｓｈａｍｉｒ，Ｒ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｏｔｉｆ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｔｈｅ  Ａｍａｄｅｕｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ａｎｄ  ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｍｅｔａｚｏａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，１１８０−１１８９，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．０７６１１７．１０８（２００８）；Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ＩＴＦＰ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４，２４１６−２４１７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｎ４３９（２００８）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｎ  ｍａｊｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，５３２−５４４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．０７．０１６（２０１０）；Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．２６  ２４３８−２４４４（２０１０）；Ｌｉｂｅｒｚｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）３．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，１７３９−１７４０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ２６０（２０１１）；Ｊｉａｎｇ，Ｃ．，Ｘｕａｎ，Ｚ．，Ｚｈａｏ，Ｆ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｍ．ＴＲＥＤ：ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅ，ｎｅｗ  ｅｎｔｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５，Ｄ１３７−１４０（２００７）、それぞれの遺伝子プロモーターにおいてスコアリングされた８２５個のＤＮＡシス調節エレメント（Ｅｌｋｏｎ，Ｒ．，Ｌｉｎｈａｒｔ，Ｃ．，Ｓｈａｒａｎ，Ｒ．，Ｓｈａｍｉｒ，Ｒ．＆Ｓｈｉｌｏｈ，Ｙ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，７７３−７８０，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．９４７２０３（２００３））、１１個の調節タンパク質のノックアウトに対する転写応答、および１５９個の免疫細胞タイプにわたる共発現パターンから推定された調節関係（Ｈｅｎｇ，Ｔ．Ｓ．＆Ｐａｉｎｔｅｒ，Ｍ．Ｗ．Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ：ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉ���ｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１０９１−１０９４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ１００８−１０９１（２００８））（実施例１の方法の部参照）。ほとんどのタンパク質−ＤＮＡ結合プロファイルはＴｈ１７細胞において計測されなかった一方、多数のキーＴＦ、例として、Ｉｒｆ４およびＢａｔｆ（Ｇｌａｓｍａｃｈｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｒｅｃｔｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＰ−１−ＩＲＦ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２８３０９（２０１２））、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ５（Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｃｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＩＬ−１７  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔ，ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  ＳＴＡＴ５．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，２４７−２５４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．１９９５（２０１１））、ならびにＲｏｒｃ（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、未公開）のＴｈ１７細胞におけるＤＮＡ−結合プロファイルが含まれた。
【０３０４】
次いで、調節因子の推定標的とその遺伝子のクラスタとの間にも有意な重複が存在した場合にのみ、調節因子を推定標的のそのセットからの遺伝子に接続した（実施例１の方法の部参照）。異なる調節因子が異なる時点において作用するため、調節因子とその標的との間の接続は、ある時間窓内でのみ活性であり得る。この窓を決定するため、それぞれのエッジを、いつ標的遺伝子が調節されるのか（その発現プロファイルに基づく）、および調節因子ノードが十分なレベルにおいて発現されるのか（そのｍＲＮＡレベルおよび推定タンパク質レベルに基づく（Ｓｃｈｗａｎｈａｅｕｓｓｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３３７−３４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１００９８（２０１１））；実施例１の方法の部参照）の両方を示すタイムスタンプにより標識した。標的遺伝子について、それがＴｈ０条件と比較して示差的に発現され、またはＴｈ１７時間経過における前の時点と比較して誘導もしくは抑制される時点を考慮した。調節因子ノードについて、調節因子が十分に発現され、Ｔｈ０条件に対して抑制されない時点のみを含めた。この目的のため、調節因子の予測タンパク質発現レベルを、近年提案されたモデル（Ｓｃｈｗａｎｈａｕｓｓｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３３７−３４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１００９８（２０１１））を使用してそのｍＲＮＡレベルから推定した（実施例１の方法の部参照）。このように、ネットワーク「スナップショット」を１８個の時点のそれぞれについて導いた（図２ｂ〜ｄ）。全体として、７１個の調節因子と１，２６６個の遺伝子と間の９，１５９個の相互作用が、少なくとも１つのネットワーク中で推定された。
【０３０５】
分化の間の実質的な調節再配線：活性因子および相互作用は、あるネットワークから次のネットワークへと変化する。相互作用の大半は、全てのネットワークに関与する調節因子（例えば、Ｂａｔｆ）についてさえ、一部の時間枠においてのみ活性である（図２ｃ）。活性相互作用の類似度に基づき、３つの分化期（図２ｄ）に対応する３つのネットワーククラスを同定した（図２ｃ）。それぞれの期における全てのネットワークを１つのモデルに単純化させ、３つの連続ネットワークモデルをもたらした（図９Ａ、９Ｂ）。調節因子のうち、３３個はネットワークの全てにおいて活性である（例えば、多くの公知のマスター調節因子、例えば、Ｂａｔｆ１、Ｉｒｆ４、およびＳｔａｔ３）一方、１８個は１つにおいてのみ活性である（例えば、初期ネットワーク中のＳｔａｔ１およびＩｒｆ１；後期ネットワーク中のＲＯＲ−γｔ）。実際、ＲＯＲ−γｔのｍＲＮＡレベルは約４時間において誘導される一方、ＲＯＲ−γｔタンパク質レベルは約２０時間において増加し、さらに経時的に上昇し、モデルと一致する（図９）。
【０３０６】
高密度に相互接続された転写回路：それぞれのネットワークの中心には、活性ＴＦを、それら自体でＴＦをコードする標的遺伝子に接続するその「転写回路」が存在する。例えば、初期応答ネットワーク中の転写回路は、調節因子として作用することが予測される４８個の因子を、その転写物が最初の４時間の間に上方または下方調節される７２個の因子に接続する（このモデルのサブセットを図２ｅに示す）。回路は、既に免疫シグナリングおよびＴｈ１７分化に関与した多くのＴＦを、正または負の調節因子のいずれか、例として、負（Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ５）および正（Ｓｔａｔ３）の両方であるＳｔａｔファミリーメンバー、先駆的因子Ｂａｔｆ、ＴＧＦ−βシグナリングにより標的化されるＴＦ（Ｓｍａｄ２、Ｒｕｎｘ１、およびＩｒｆ７）、ＴＣＲシグナリングにより標的化されるいくつかのＴＦ（Ｒｅｌ、Ｎｆｋｂ１、およびＪｕｎ）、ならびに調節因子および強力に誘導される標的遺伝子の両方として位置するいくつかのインターフェロン調節因子（Ｉｒｆ４およびＩｒｆ１）として自動的に強調する。さらに、Ｔｈ１７分化における役割を有することがこれまで記載されなかった３４個の調節因子を同定した（例えば、Ｓｐ４、Ｅｇｒ２、およびＳｍａｒｃａ４）。全体として、回路は、高密度に相互接続されており（Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１１）、４８個の調節因子の１６個は、それら自体、転写制御される（例えば、Ｓｔａｔ１、Ｉｒｆ１、Ｉｒｆ４、Ｂａｔｆ）。このことは、一部が自動調節であり得るフィードバック回路を示唆する（例えば、Ｉｒｆ４、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ１について）。
【０３０７】
初期ネットワークと同様に、主要なＴｈ１７調節因子、例えば、ＲＯＲ−γｔ、Ｉｒｆ４、Ｂａｔｆ、Ｓｔａｔ３、およびＨｉｆ１ａを含む中期および後期転写回路における６４個のＴＦ間の実質的な交差調節が存在する（図２ｅ）。
【０３０８】
体系的摂動についての新規調節因子のランキング：公知のＴｈ１７調節因子に加え、ネットワークは、予測調節因子（図２ｄ）、誘導される標的遺伝子、またはその両方（図２Ｅ）としての多くの新規因子を含む。これは、Ｔｈ１７細胞中で既に公知の（例えば、ＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１７ＲＡ）、および新規の（例えば、Ｆａｓ、Ｉｔｇａ３）誘導される標的としての受容体遺伝子も含有する。このことは、現行の知識と比較して実質的な追加の複雑性を示唆するが、体系的に試験して役割を評価し、それぞれの候補の機能を特性決定しなければならない。
【０３０９】
候補調節因子を、摂動についてランキングし（図２ａ、３ａ、実施例１の方法の部参照）、調節役割（図３ａ、「ネットワーク情報」）および標的としての役割（図３ａ、「遺伝子情報」）を反映する特性によりガイドした。
【０３１０】
この目的のため、スコアリングスキームを考案して候補調節因子を摂動についてランキングし（図２ａ、図３ａ、図１０、方法の部）、タンパク質活性（調節因子ノードとしての関与、図３ａ、「ネットワーク情報」）およびｍＲＮＡレベル（標的としての発現の変化、図３ａ、「遺伝子発現情報」；方法の部）によりガイドした。それぞれの基準のもと、摂動させる遺伝子を選択するためにいくつかの特性を考慮した（実施例１の方法の部参照）。「ネットワーク情報」において、遺伝子がネットワーク中で調節因子として作用するか否か（この予測役割についての実験的支持のタイプ）、およびそれがキーＴｈ１７遺伝子を標的化することを予測されるか否かを考慮した。「遺伝子発現情報」において、ＩＬ２３Ｒノックアウトのもと時間経過データ（誘導される遺伝子を優先）における、またはＴｈ１７細胞中の摂動の公開データ（例えば、Ｂａｔｆノックアウト（Ｓｃｈｒａｍｌ，Ｂ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．４６０  ４０５−４０９（２００９））；完全なリストについては方法の部参照）におけるコード遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化；および遺伝子がＴｈ１７細胞中で他のＣＤ４＋サブセットと比較して高度に発現されるか否かを、ゲノムワイド発現プロファイル（Ｗｅｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖｏｌ．３０  １５５−１６７（２００９））に基づき考慮した。
【０３１１】
遺伝子をコンピュータにより順序付けしてある特性（例えば、キーＴｈ１７遺伝子の予測調節因子）を他の特性（例えば、時間経過データにおける示差的発現）に対して強調した。類似のスキームを使用して受容体タンパク質をランキングした（実施例１の方法の部参照）。上位にランキングされた因子の質を支持するため、それらを手作業によりキュレートされたＴｈ１７調節因子についてエンリッチし（ｐ＜１０−３）（図１０）、教師あり法（実施例１の方法の部参照）により学習されたランキングと十分に相関した（スピアマンｒ＞０．８６）。６５個の遺伝子：５２個の調節因子および１３個の受容体を摂動のために選択した。これらは、上位４４個の調節因子および上位９つの受容体（数個の周知のＴｈ１７遺伝子および／またはノックアウトデータが既に存在したものを除く）のほとんど、ならびに追加の代表的なより低いランキング因子を含んだ。
【０３１２】
実施例４
初代Ｔ細胞のナノワイヤベース摂動
キー因子が欠失したノックアウトマウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の応答の試験が強力な方針である一方、それはマウス株の利用可能性または新たなマウスを生成する能力により制限される。未刺激初代マウスＴ細胞において、ウイルスまたは形質移入ベースｓｉＲＮＡ送達はほぼ不可能であった。なぜなら、その送達は分化または細胞生存率のいずれかを変更するためである（Ｄａｒｄａｌｈｏｎ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ＤＮＡ  ｆｌａｐ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ８，１９０−１９８（２００１）；ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６９，５７５４（２００２））。したがって、ケイ素ナノワイヤ（ＮＷ）をベースとする新たな送達技術（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０；Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｗｉｒｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．１２，６４９８−６５０４，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ３０４２９１７（２０１２））を使用し、ｓｉＲＮＡをナイーブＴ細胞中に、それらを活性化させずに効率的に（＞９５％）送達するようにそれを最適化した（図３ｂおよびｃ）（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ２０１２）。
【０３１３】
近年、ＮＷが哺乳動物細胞の膜に効率的に浸透し、広範な外部分子を最小の侵襲性の非活性化方法で送達し得ることが実証された（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０；Ｓｈａｌｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２）。特に、ｓｉＲＮＡをナイーブネズミＴ細胞中に効率的に（＞９５％）送達するようにＮＷ−Ｔ細胞界面（図３ｂ）を最適化した。この送達は、ナイーブＴ細胞の分化を活性化も誘導もせず、抗ＣＤ３／ＣＤ２８による慣用のＴＣＲ刺激に対するそれらの応答に影響しない（図３ｃ）（Ｓｈａｌｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２））。重要なことに、ＮＷ送達ｓｉＲＮＡは、実質的な標的転写物ノックダウンを、抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化前およびその最大４８時間後でさえ、急速な細胞増殖にかかわらず生じさせた（図３ｄ）。
【０３１４】
次いで、６０個の遺伝子をＮＷ媒介ｓｉＲＮＡ送達により摂動させることを試み、効率的なノックダウン（活性化の４８時間後に残留する転写物＜６０％）が３４個の遺伝子について達成された（図３ｄおよび図１１、表Ｓ６．２）。ノックアウトマウスを、７つの他の遺伝子について得、そのうちの２つ（Ｉｒｆ８およびＩｌ１７ｒａ）はノックダウンセットと同様であった。全部で、６５個の選択遺伝子の３９個（２９個の調節因子および１０個の受容体）が良好に摂動され、Ｔｈ１７分化にこれまで関連しなかった２１個の遺伝子が含まれた。
【０３１５】
ナノワイヤベーススクリーンは、Ｔｈ１７ネットワーク中の３９個の調節因子を検証する：遺伝子発現に対する摂動の効果を、２つの時点においてプロファイリングした。摂動の２８個を、ＲＯＲ−γｔの誘導の直後、分化開始の１０時間後においてプロファイリングし（図６）、Ｔｈ１７表現型がより多く樹立される４８時間において摂動の全てをプロファイリングした（図１ｂ）。摂動の２つ（Ｉｌ１７ｒａおよびＩｌ２１ｒノックアウト）を、６０時間においてもプロファイリングした。
【０３１６】
特に、２７５個のシグネチャー遺伝子の発現に対する活性化の４８時間後の摂動の効果を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを使用して計測した（Ｉｌ１７ｒａおよびＩｌ２１ｒノックアウトは、６０時間においても計測した）。
【０３１７】
シグネチャー遺伝子を、分化プロセスの可能な限り多くの局面をカバーするようにコンピュータにより選択した（実施例１の方法の部参照）：これらは、ほとんどの示差的に発現されたサイトカイン、ＴＦ、および細胞表面分子、ならびにそれぞれのクラスタ（図１ｂ）からの代表物、エンリッチされる機能、およびそれぞれのネットワーク中の予測標的を含む。検証のため、８５個の遺伝子のシグネチャーを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋシステムを使用してプロファイリングし、高度に再現性の結果を得た（図１２）。
【０３１８】
発現分析のためのシグネチャー遺伝子を、分化プロセスの可能な限り多くの局面をカバーするようにコンピュータにより選択した（実施例１の方法の部参照）。これらは、大多数の示差的に発現されたサイトカイン、ＴＦ、および細胞表面分子、ならびにそれぞれの発現クラスタ（図１ｂ）からの代表遺伝子、エンリッチされる生物学的機能、およびそれぞれのネットワーク中の調節因子の予測標的を含む。重要なことに、シグネチャーが、摂動される調節因子をコードする遺伝子のほとんどを含むため、それらの間の接続（図４ａ、「摂動」）、例として、フィードバックおよびフィードフォワードループを決定することができる。
【０３１９】
シグネチャー遺伝子に対する摂動の効果の統計的有意性を、非標的化ｓｉＲＮＡとの、および示差的に発現されなかった１８個の対照遺伝子との比較によりスコアリングした（実施例１の方法の部参照、図４ａ、全ての非灰色エントリーが有意である）。試験調節因子の２６個の摂動は、４８時間の時点における少なくとも２５個のシグネチャー遺伝子（任意の応答を有したシグネチャー遺伝子の１０％）の発現に対して有意な効果を有した。平均して、摂動は４０個の遺伝子に影響し、シグネチャー遺伝子の８０％が少なくとも１つの調節因子により影響された。元のネットワークモデル（図２）を支持し、調節因子のノックダウンにより影響される遺伝子と、その予測標的との間に有意な重複が存在する（ｐ≦０．０１、並べ替え検定；実施例１の方法の部参照）。
【０３２０】
ネットワークのダイナミクスを試験するため、１０時間（ＲＯＲ−γｔの誘導直後）における摂動の２８個の効果を、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋシステムを使用して計測した。機能相互作用の３０％が、１０時間および４８時間の両方において同一活性化／抑制論理内に存在する一方、残りは１つの時点においてのみ存在することが見出された（図１３）。このことは、元のモデルにおける再配線の程度と一致する（図２ｂ）。
【０３２１】
可能であれば、それぞれの調節因子の機能をＴｈ１７分化について正または負のいずれかとして分類した。具体的には、４８時間の時点において、調節因子の２２個の摂動が、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆ発現を有意に減衰させ（「正のＴｈ１７調節因子」、図４ｂ、青色）、別の５つの摂動が、ＩＬ−１７レベルを有意に増加させた（「負のＴｈ１７調節因子」、図４ｂ、赤色）。これらの強力に正または負の調節因子の１２個は、Ｔｈ１７細胞にこれまで関連しなかった（図４ｂ、青色または赤色ノード周囲の淡灰色ハロー）。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。次に、Ｔｈ１７表現型の発生におけるこれらの強力な正および負の調節因子の役割をフォーカスした。
【０３２２】
Ｔｈ１７ネットワーク中の２つの結合拮抗回路：それぞれの調節因子をＴｈ１７シグネチャー遺伝子（例えば、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、図４ｂ、灰色ノード、下段）に対するその効果により特性決定し、４８時間においてネットワークが２つの拮抗モジュールに組織化されることが見出された：摂動がＴｈ１７シグネチャー遺伝子（図４ｂ、灰色ノード、下段）の発現を減少させた２２個の「正のＴｈ１７因子」（図４ｂ、青色ノード：９つの新規物）のモジュール、および摂動がその発現を増加させた５つの「負のＴｈ１７因子」（図４ｂ、赤色ノード：３つの新規物）のモジュール。これらの図面の着色版は、Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４９６：４６１−４６８（２０１３）／ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１に見出すことができる。モジュールのそれぞれは、そのメンバー間の正の自己強化相互作用を介して緊密に内部接続されている一方（モジュール内エッジの７０％）、ほとんど（８８％）のモジュール間相互作用は、負である。この組織化は、統計的に有意であり（実験的ｐ値＜１０−３；実施例１の方法の部参照、図１４）、酵母中の遺伝子回路において既に観察されるものに結びつく（Ｓｅｇｒｅ，Ｄ．，Ｄｅｌｕｎａ，Ａ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．＆Ｋｉｓｈｏｎｙ，Ｒ．Ｍｏｄｕｌａｒ  ｅｐｉｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７，７７−８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ１４８９（２００５）；Ｐｅｌｅｇ，Ｔ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．，Ｒｕｐｐｉｎ，Ｅ．＆Ｓｈａｒａｎ，Ｒ．Ｎｅｔｗｏｒｋ−ｆｒｅｅ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ６，ｅ１０００６３５，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１０００６３５（２０１０））。１０時間において、同一の調節因子は、この明確なパターンを生じさせず（ｐ＞０．５）、このことは、その時点においてネットワークが依然として可鍛性であることを示唆する。
【０３２３】
２つの拮抗モジュールは、Ｔｈ１７と他のＴ細胞サブセットとの間のバランスの維持およびＴｈ１７細胞の炎症促進状態の自己限定における重要な役割を担い得る。実際、正のＴｈ１７因子の摂動は、他のＴ細胞サブセットのシグネチャー遺伝子（例えば、Ｇａｔａ３、図４ｂ、灰色ノード、上段）も誘導する一方、負のＴｈ１７因子の摂動はそれらを抑制する（例えば、Ｆｏｘｐ３、Ｇａｔａ３、Ｓｔａｔ４、およびＴｂｘ２１）。
【０３２４】
実施例５
新規因子の検証および特性決定
本明細書に提示される試験は、正または負の因子の１２個（Ｔｈ１７細胞に関連しなかった１２個の新規因子の１１個を含む；図４ｂ、淡灰色ハロー）の役割をフォーカスした。それぞれの因子の摂動後にＲＮＡ−Ｓｅｑを使用してその予測標的（図２）が摂動により影響されるか否かを試験した（図４ｃ、ベン図、上段）。両方のデータセット中に存在する因子の３つ（Ｅｇｒ２、Ｉｒｆ８、およびＳｐ４）についての高度に有意な重複（ｐ＜１０−５）が見出され、４番目（Ｓｍａｒｃａ４）についての境界有意重複が見出され、このことはネットワーク中のエッジの質を検証した。
【０３２５】
次に、「正のＴｈ１７」または「負のＴｈ１７」としての１２個の因子のそれぞれの指定を、その因子のノックダウンに対して応答する遺伝子のセット（ＲＮＡ−Ｓｅｑにおける）を、２０個のクラスタ（図１ｂ）のそれぞれと比較することにより評価した。元の定義と一致して、「正のＴｈ１７」調節因子のノックダウンは、そうでなければ誘導されるクラスタ中の遺伝子を下方調節し、そうでなければ抑制され、または誘導されないクラスタ中の遺伝子を上方調節した（「負のＴｈ１７」調節因子についてはこの逆；図４ｄおよび図１５ａ、ｂ）。正または負の調節因子のいずれかにより影響される遺伝子は、キーＣＤ４＋転写調節因子（例えば、Ｆｏｘｐ３（Ｍａｒｓｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｘｐ３  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４５，９３１−９３５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５４７８（２００７）；Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４５，９３６−９４０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５５６３（２００７））、Ｂａｔｆ、Ｉｒｆ４、およびＲＯＲ−γｔ（Ｇｌａｓｍａｃｈｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｒｅｃｔｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＰ−１−ＩＲＦ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２８３０９（２０１２）；Ｃｉｏｆａｎｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１２．０９．０１６（２０１２）），Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、未公開データ）により結合されるものとも有意に重複した。例えば、「正のＴｈ１７」調節因子Ｍｉｎａのノックダウン後に下方調節される遺伝子は、後期に誘導されるクラスタ（例えば、Ｃ１９、Ｃ２０）において高度にエンリッチされる（ｐ＜１０−６）。逆に、同一の後期に誘導されるクラスタ中の遺伝子は、「負のＴｈ１７」調節因子Ｓｐ４のノックダウン後にいっそうより上方調節されるようになる。
【０３２６】
Ｍｉｎａは、Ｔｈ１７プログラムを促進し、Ｆｏｘｐ３プログラムを阻害する：Ｊｕｍｏｎｊｉ  Ｃ（ＪｍｊＣ）ファミリーからのクロマチン調節因子であるＭｉｎａのノックダウンは、シグネチャーＴｈ１７サイトカインおよびＴＦ（例えば、ＲＯＲ−γｔ、Ｂａｔｆ、Ｉｒｆ４）ならびに後期誘導遺伝子（クラスタＣ９、Ｃ１９；ｐ＜１０−５）の発現を抑制する一方、Ｔｒｅｇ細胞のマスターＴＦであるＦｏｘｐ３の発現を増加させる。Ｍｉｎａは、Ｔｈ１７分化の間に強力に誘導され（クラスタＣ７）、ＩＬ２３ｒ−／−Ｔｈ１７細胞中で下方調節され、モデル（図５ａ）におけるＢａｔｆ（Ｇｌａｓｍａｃｈｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｒｅｃｔｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＰ−１−ＩＲＦ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２８３０９（２０１２））、ＲＯＲ−γｔ（Ｇｌａｓｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２）、およびＭｙｃの予測標的である。Ｍｉｎａは、ＴＦのＮＦＡＴと相互作用し、ＩＬ−４プロモーターを抑制することによりＴｈ２バイアスを抑制することが示された（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｎａ，ａｎ  Ｉｌ４  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ，ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  ２  ｂｉａｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，８７２−８７９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．１７４７（２００９））。しかしながら、細胞中で、ＭｉｎａノックダウンはＴｈ２遺伝子を誘導せず、このことは、Ｍｉｎａ、ＢａｔｆおよびＲＯＲ−γｔ間の正のフィードバックループを介する代替作用モードを示唆した（図５ａ、左）。このモデルと一致して、Ｍｉｎａ発現は、ＲＯＲ−γｔノックアウトマウスからのＴｈ１７細胞中で低減され、Ｍｉｎａプロモーターは、ＲＯＲ−γｔにより結合されることがＣｈＩＰ−Ｓｅｑにより見出された（データ示さず）。最後に、Ｍｉｎａノックダウンにより誘導された遺伝子は、Ｔｒｅｇ細胞中でＦｏｘｐ３により結合されるもの（Ｍａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７）（Ｐ＜１０−２５）と、およびＴｒｅｇ細胞中のＦｏｘｐ３活性に既に結びつけられたクラスタ（Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｘｐ３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７，７８６−８００，ｄｏｉ：Ｓ１０７４−７６１３（０７）００４９２−Ｘ［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００７．０９．０１０（２００７））と有意に重複する（図１５ｃ）。既に定義されたＴｒｅｇ細胞の転写シグネチャーと比較した場合（慣用のＴ細胞と比較（Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｘｐ３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ��ｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７，７８６−８００，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００７．０９．０１０（２００７）））、Ｍｉｎａノックダウンにおいて誘導される遺伝子は、ＦｏｘＰ３の機能活性に緊密に結びつけられたクラスタ中でエンリッチされる。逆に、Ｍｉｎａノックダウンにおいて下方調節される遺伝子は、Ｔｒｅｇ細胞中でＴＣＲおよびＩＬ−２に対してより直接的に応答性であり、Ｆｏｘｐ３に対して応答性でない（図１５ｃ）。
【０３２７】
Ｍｉｎａの役割をさらに分析するため、Ｍｉｎａ−／−マウスからのナイーブＴ細胞の分化後にＩＬ−１７ａおよびＦｏｘｐ３発現を計測した。Ｍｉｎａ−／−細胞は、細胞内染色により検出されるとおり、野生型（ＷＴ）細胞と比較してＩＬ−１７ａを減少させ、Ｆｏｘｐ３を増加させた（図５ａ）。対応する上清のサイトカイン分析は、ＩＬ−１７ａ産生の減少ならびにＩＦＮ−γ（図５ａ）およびＴＮＦ−α（図１６ａ）の増加を裏付けた。Ｔｈ１７分化条件下で、Ｍｉｎａの損失は、細胞内染色により検出されるとおり、ＩＬ−１７発現の減少およびＦｏｘＰ３の増加をもたらした（図５ａ）。これらの分化培養物からの上清のサイトカイン分析は、ＩＬ−１７産生の減少と、ＩＦＮγ（図５ａ）およびＴＮＦα（図１６ａ）の同等の増加を裏付けた。
【０３２８】
Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１７細胞間の相互関係は十分記載されており（Ｋｏｒｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−２１  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｔ（Ｈ）１７  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，４８４−４８７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５９７０（２００７））、このことは、ＲＯＲ−γｔ／Ｆｏｘｐ３のＴＦの直接結合により達成されることが想定された。しかしながら、分析は、このプロセスにおける媒介における調節因子Ｍｉｎａについての重要な役割を示唆する。このことは、ＲＯＲ−γｔおよびＢａｔｆにより誘導されるＭｉｎａが、ＲＯＲ−γｔの転写を促進する一方、Ｆｏｘｐ３の誘導を抑制し、こうして急速なＴｈ１７分化の優先により相互のＴｒｅｇｓ／Ｔｈ１７バランス（Ｋｏｒｎ、ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７））に影響するモデルを示唆する。
【０３２９】
Ｆａｓは、Ｔｈ１７プログラムを促進し、ＩＦＮ−γ発現を抑制する：ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー６であるＦａｓは、別の正のＴｈ１７調節因子である（図５ｂ）。Ｆａｓは、初期に誘導され、モデル中でＳｔａｔ３およびＢａｔｆの標的である。Ｆａｓノックダウンは、キーＴｈ１７遺伝子（例えば、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１７ｆ、Ｈｉｆ１ａ、Ｉｒｆ４、およびＲｂｐｊ）の、および誘導されるクラスタＣ１４の発現を抑制し、Ｔｈ１関連遺伝子、例として、ＩＦＮ−γ受容体１およびＫｌｒｄ１（Ｃｄ９４；ＲＮＡ−Ｓｅｑによる、図４、図５ｂ、および図１５）の発現を促進する。ＦａｓおよびＦａｓリガンド欠損マウスは、自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導に対して抵抗性であるが（Ｗａｌｄｎｅｒ，Ｈ．，Ｓｏｂｅｌ，Ｒ．Ａ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｅ．＆Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．Ｆａｓ−  ａｎｄ  ＦａｓＬ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９，３１００−３１０３（１９９７））、ＩＦＮ−γ応答もＴｈ１応答も欠損しない。この現象の基礎をなす機序は、研究されなかった。
【０３３０】
これを利用するため、Ｆａｓ−／−マウス（図５ｂ、図１６ｃ）からのＴ細胞を分化させた。ノックダウン分析と一致して、両方のＴｈ１７およびＴｈ０極性化条件下でＩＬ−１７ａの発現は強力に抑制され、ＩＦＮ−γ産生は強力に増加した（図５ｂ）。これらの結果は、Ｆａｓは、デス受容体である他、Ｔｈ１／Ｔｈ１７バランスの制御における重要な役割を担い得、Ｆａｓ−／−マウスは、Ｔｈ１７細胞の欠落に起因してＥＡＥに対して抵抗性であり得ることを示唆する。
【０３３１】
Ｐｏｕ２ａｆ１は、Ｔｈ１７プログラムを促進し、ＩＬ−２発現を抑制する：Ｐｏｕ２ａｆ１（ＯＢＦ１）のノックダウンは、Ｔｈ１７シグネチャー（図５ｃ）の、ならびに中期および後期誘導遺伝子（クラスタＣ１９およびＣ２０、ｐ＜１０−７）の発現を強力に減少させる一方、他のＣＤ４＋サブセットの調節因子（例えば、Ｆｏｘｐ３、Ｓｔａｔ４、Ｇａｔａ３）の、および非誘導クラスタ（クラスタＣ２およびＣ１６  ｐ＜１０−９）中の遺伝子の発現を増加させる。Ｔ細胞分化におけるＰｏｕ２ａｆ１の役割は、探索されていない（Ｔｅｉｔｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ＯＣＡ−Ｂ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，５４６−５５３（２００３））。この効果を調査するため、Ｐｏｕ２ａｆ１−／−マウスからのＴ細胞を分化させた（図５ｃ、図１６ｂ）。ＷＴ細胞と比較して、ＩＬ−１７ａ産生は、強力に抑制された。興味深いことに、ＩＬ−２産生は、非極性化（Ｔｈ０）条件下でＰｏｕ２ａｆ１−／−Ｔ細胞中で強力に増加した。したがって、Ｐｏｕ２ａｆ１は、Ｔｈ１７細胞の公知の内因性抑制因子であるＩＬ−２の産生を遮断することによりＴｈ１７分化を促進し得る（Ｌａｕｒｅｎｃｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ＳＴＡＴ５  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｓ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １７  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６，３７１−３８１，ｄｏｉ：Ｓ１０７４−７６１３（０７）００１７６−８［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００７．０２．００９（２００７））。Ｐｏｕ２ａｆ１は、ＴＦのＯＣＴ１またはＯＣＴ２の転写共活性化因子として作用する（Ｔｅｉｔｅｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３）。ＩＬ−１７ａ産生は、Ｏｃｔ１欠損細胞中でも強力に抑制され（図１６ｄ）、このことは、Ｐｏｕ２ａｆ１がこの共因子を介してその効果の一部を発揮し得ることを示唆した。
【０３３２】
ＴＳＣ２２ｄ３は、Ｔｈ１７分化および炎症促進機能を制限し得る：ＴＳＣ２２ドメインファミリータンパク質３（Ｔｓｃ２２ｄ３）のノックダウンは、Ｔｈ１７サイトカイン（ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２１）およびＴＦ（ＲＯＲ−γｔ、Ｒｂｐｊ、Ｂａｔｆ）の発現を増加させ、Ｆｏｘｐ３発現を低減させる。マクロファージの従来の研究は、Ｔｓｃ２２ｄ３発現がグルココルチコイドおよびＩＬ−１０により刺激され、それがそれらの抗炎症および免疫抑制効果における重要な役割を担うことを示している（Ｃｈｏｉ，Ｓ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｓｃ−２２  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｓｍａｄ４  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１，２３−２８（２００５））。Ｔｈ１７細胞中のＴｓｃ２２ｄ３ノックダウンは、ＩＬ−１０およびその産生を向上させる他のキー遺伝子の発現を増加させた（図５ｄ）。ＩＬ−１０産生は、Ｔｈ１７細胞を自己免疫において低病原性にすることが示されているが（Ｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｙ．＆Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．Ｔｈｅ  ｍａｎｙ  ｆａｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，７０２−７０６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｉ．２０１１．０８．００７（２０１１）；Ｃｈａｕｄｈｒｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３４，５６６−５７８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１１．０３．０１８（２０１１））、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７ａの共産生は、ある感染、例えば、粘膜部位における黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の除去についての指標応答であり得る（Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ＩＦＮ−γ  ｏｒ  ＩＬ−１０  ａｎｄ  ａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−１β．Ｎａｔｕｒｅ  ４８４，５１４−５１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０９５７（２０１２））。このことは、Ｔｓｃ２２ｄ３が、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０を共産生するＴｈ１７細胞サブタイプの誘導のための負のフィードバックループの一部であり、それらの炎症促進能を制限するモデルを示唆する。Ｔｓｃ２２ｄ３は、ステロイドのデキサメタゾンに応答して他の細胞中で誘導され（Ｊｉｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｉｎ  ｍｏｄｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２８，４９０−４９６，ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｔｐｒ．７４７（２０１２））、これはＴｈ１７分化およびＲ��Ｒ−γｔ発現を抑制する（Ｈｕ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｕｏ，Ｙ．Ｌ．，Ｌａｉ，Ｗ．Ｙ．＆Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｆ．［Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｏｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１７  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １７  ｉｎ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｍｉｃｅ］．Ｎａｎ  Ｆａｎｇ  Ｙｉ  Ｋｅ  Ｄａ  Ｘｕｅ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ  ２９，１１８５−１１８８（２００９））。したがって、Ｔｓｃ２２ｄ３は、ステロイドのこの効果を媒介し得る。
【０３３３】
Ｔｓｃ２２ｄ３の役割をさらに特性決定するため、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑを使用してＴｈ１７細胞中のそのＤＮＡ結合プロファイルを計測し、そのノックダウン後にＲＮＡ−Ｓｅｑを使用してその機能効果を計測した。Ｔｓｃ２２ｄ３の機能および物理的標的間に有意な重複が存在する（Ｐ＜０．０１、例えば、ＩＬ−２１、Ｉｒｆ４；実施例１の方法の部参照）。例えば、Ｔｓｃ２２ｄ３は、ＩＬ−２１およびＩｒｆ４に近接して結合し、これらはＴｓｃ２２ｄ３ノックダウンにおいて上方調節されるようにもなる。さらに、Ｔｓｃ２２ｄ３結合部位は、主要なＴｈ１７因子のもの、例として、Ｂａｔｆ、Ｓｔａｔ３、Ｉｒｆ４、およびＲＯＲ−γｔ（＞５のエンリッチメント倍率；図５ｄ、実施例１の方法の部参照）に有意に重複する。このことは、Ｔｓｃ２２ｄ３が、結合部位上で正のＴｈ１７調節因子と競合する転写抑制因子としてその負のＴｈ１７機能を発揮するモデルを示唆し、これは、ＣＤ４＋調節の従来の知見と類似する（Ｃｉｏｆａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１２；Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｃｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＩＬ−１７  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔ，ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  ＳＴＡＴ５．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，２４７−２５４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ．１９９５（２０１１））。
【０３３４】
実施例６
プロテインＣ受容体（ＰＲＯＣＲ）は、Ｔｈ１７細胞の病原性表現型を調節する
Ｔｈ１７細胞は近年、Ｔ細胞サブセットと同定され、炎症自己免疫応答のドライブおよびある細胞外病原体に対する保護応答の媒介に関与している。分子シグネチャーなどの因子に基づき、Ｔｈ１７細胞は、病原性または非病原性として分類される（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３（１０）：９９１−９９９およびオンライン方法参照）。
【０３３５】
本明細書において使用される用語「病原性」または「非病原性」は、一方のＴｈ１７細胞表現型が他方よりも望ましいことを意味するものとして解釈すべきでないことに留意すべきである。本明細書に記載のとおり、病原性Ｔｈ１７細胞の誘導の阻害またはＴｈ１７表現型の非病原性Ｔｈ１７表現型または別のＴ細胞表現型に向けるモジュレートが望ましい例が存在する。同様に、非病原性Ｔｈ１７細胞の誘導の阻害またはＴｈ１７表現型の病原性Ｔｈ１７表現型または別のＴ細胞表現型に向けるモジュレートが望ましい例が存在する。例えば、病原性Ｔｈ１７細胞は、免疫応答、例えば、自己免疫および／または炎症に関与することが考えられる。したがって、病原性Ｔｈ１７細胞分化の阻害またはそうでなければ非病原性Ｔｈ１７細胞もしくは別のＴ細胞表現型に向かうＴｈ１７Ｔ細胞のバランスの減少が、免疫関連障害、例えば、自己免疫疾患または炎症障害の症状を治療またはそうでなければ改善するための治療方針において望ましい。別の例において、感染に応じて、非病原性または病原性Ｔｈ１７細胞は、感染性疾患および他の病原体関連障害における保護免疫応答の構築において望ましいことが考えられる。したがって、非病原性Ｔｈ１７細胞分化の阻害またはそうでなければ病原性Ｔｈ１７細胞もしくは別のＴ細胞表現型に向かうＴｈ１７細胞のバランスの減少またはその逆が、免疫関連障害、例えば、感染性疾患の症状を治療またはそうでなければ改善するための治療方針において望ましい。
【０３３６】
Ｔｈ１７細胞は、以下の遺伝子またはそれらの遺伝子の産物の１つ以上が、ＴＧＦ−β１誘導Ｔｈ１７細胞と比較してＴＧＦ−β３誘導Ｔｈ１７細胞中で上方調節される区別される病原性シグネチャーを呈する場合、病原性とみなされる：Ｃｘｃｌ３、Ｉｌ２２、Ｉｌ３、Ｃｃｌ４、Ｇｚｍｂ、Ｌｒｍｐ、Ｃｃｌ５、Ｃａｓｐ１、Ｃｓｆ２、Ｃｃｌ３、Ｔｂｘ２１、Ｉｃｏｓ、Ｉｌ７ｒ、Ｓｔａｔ４、Ｌｇａｌｓ３またはＬａｇ３。Ｔｈ１７細胞は、以下の遺伝子またはそれらの遺伝子の産物の１つ以上が、ＴＧＦ−β１誘導Ｔｈ１７細胞と比較してＴＧＦ−β３誘導Ｔｈ１７細胞中で下方調節される区別される非病原性シグネチャーを呈する場合、非病原性とみなされる：Ｉｌ６ｓｔ、Ｉｌ１ｒｎ、ｌｋｚｆ３、Ｍａｆ、Ａｈｒ、Ｉｌ９またはＩｌ１０。
【０３３７】
発生するＴｈ１７細胞の時間的マイクロアレイ分析を実施し、Ｔｈ１７細胞中で示差的に発現され、Ｔｈ１７細胞の発生を調節する細胞表面分子を同定した。ＰＲＯＣＲが、Ｔｈ１７細胞中で示差的に発現される受容体として同定され、その発現がＴｈ１７特異的転写調節因子により調節されることを見出された。
【０３３８】
プロテインＣ受容体（ＰＲＯＣＲ；ＥＰＣＲまたはＣＤ２０１とも呼ばれる）は、主に内皮細胞、ＣＤ８＋樹状細胞上で発現され、他の造血および間質細胞上では低いレベルに発現されることも報告された。これは、活性化プロテインＣならびに第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子および第Ｘａ因子に結合し、多様な生物学的機能、例として、抗凝固、細胞保護、抗アポトーシス、および抗炎症活性を有することが示された。しかしながら、これらの試験前、Ｔ細胞中のＰＲＯＣＲの機能は探索されていなかった。
【０３３９】
Ｔｈ１７細胞中のＰＲＯＣＲおよびそのリガンド活性化プロテインＣの生物学的機能を分析し、それがＴｈ１７細胞の病原性シグネチャーの一部として同定された遺伝子の一部の発現を減少させることが見出された。さらに、Ｔｈ１７細胞中のＰＲＯＣＲ発現は、Ｔｈ１７細胞の病原性を低減させ、ヒト多発性硬化症についてのマウスモデルにおける疾患を改善した。
【０３４０】
これらの結果は、ＰＲＯＣＲがそのリガンドの結合を介してＴｈ１７細胞の病原性についての調節遺伝子として機能することを意味する。したがって、この経路の調節は、炎症および自己免疫疾患に対する治療アプローチに利用することができることが想定される。
【０３４１】
これらの試験は、ＰＲＯＣＲのＴｈ１７特異的発現および自己免疫Ｔｈ１７病原性の低減におけるその役割を記載する最初のものである。したがって、抗体または他のアゴニストを介するＰＲＯＣＲの活性化は、免疫応答、例えば、炎症自己免疫障害における治療方針として有用である。さらに、抗体または他の阻害剤を介するＰＲＯＣＲの遮断を利用してある感染作用物質および病原体に対する保護Ｔｈ１７応答を増強することができる。
【０３４２】
ＰＲＯＣＲは、Ｔｈ１７細胞中で発現される：膜受容体ＰＲＯＣＲ（プロテインＣ受容体；ＥＰＣＲまたはＣＤ２０１とも呼ばれる）は、上皮細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびナチュラルキラー細胞上に存在するが、その発現は、Ｔ細胞に対してこれまで報告されていなかった（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ，Ｚｌｏｋｏｖｉｃ  ＢＶ，Ｍｏｓｎｉｅｒ  ＬＯ．２０１２．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ９５：３３３−４５）。しかしながら、本明細書に記載のＴｈ１７細胞の詳細なトランスクリプトーム分析により、Ｔｈ１７細胞分化（Ｙｏｓｅｆ  Ｎ，Ｓｈａｌｅｋ  ＡＫ，Ｇａｕｂｌｏｍｍｅ  ＪＴ，Ｊｉｎ  Ｈ，Ｌｅｅ  Ｙ，Ａｗａｓｔｈｉ  Ａ，Ｗｕ  Ｃ，Ｋａｒｗａｃｚ  Ｋ，Ｘｉａｏ  Ｓ，Ｊｏｒｇｏｌｌｉ  Ｍ，Ｇｅｎｎｅｒｔ  Ｄ，Ｓａｔｉｊａ  Ｒ，Ｓｈａｋｙａ  Ａ，Ｌｕ  ＤＹ，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ  ＪＪ，Ｐｉｌｌａｉ  ＭＲ，Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ  ＰＪ，Ｃｏｌｅｍａｎ  ＭＬ，Ｂｉｘ  Ｍ，Ｔａｎｔｉｎ  Ｄ，Ｐａｒｋ  Ｈ，Ｋｕｃｈｒｏｏ  ＶＫ，Ｒｅｇｅｖ  Ａ．２０１３．Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９６：４６１−８）に重要なノードとしてＰＲＯＣＲが同定された。ＰＲＯＣＲは、ＣＤ１／ＭＨＣ分子と構造的相同性を共有し、活性化プロテインＣ（ａＰＣ）ならびに血液凝固第ＶＩＩ因子およびγδＴ細胞のＶγ４Ｖδ５ＴＣＲに結合する。ＰＲＯＣＲは、その短い細胞質テールに起因して、直接シグナリングしないが、Ｇタンパク質共役受容体ＰＡＲ１と会合することによりシグナリングする（図３０ａ；（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ９５：３３３−４５（２０１２）））。Ｔｈサブセット上のＰＲＯＣＲ発現を分析するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞を極性化条件下でインビトロで分化させ、ＰＲＯＣＲ発現を測定した。Ｔｈ１７細胞のネットワーク分析により示されるとおり、高レベルのＰＲＯＣＲをＴｈ１７条件下で分化させた細胞中で検出することができた（図３１ｂ）。免疫応答の間のＴｈ１７細胞上のＰＲＯＣＲの発現を試験するため、マウスをＭＯＧ／ＣＦＡにより免疫化してＥＡＥを誘導した。ＰＲＯＣＲは、脾臓およびリンパ節中のＴ細胞上では発現されなかった。対照的に、これは、ＣＮＳを浸潤するＴｈ１７細胞上で検出することができた（図３１ｃ）。これらのデータは、ＰＲＯＣＲがインビトロおよびインビボでＴｈ１７細胞上で発現され、この場合、それが主として標的臓器を浸潤するＴ細胞に制限されることを示す。Ｔｈ１７細胞中のＰＲＯＣＲの機能を調査するため、低ＰＲＯＣＲ突然変異体（ＰＲＯＣＲｄ／ｄ）からのＴ細胞を使用してＰＲＯＣＲの損失がＩＬ−１７産生にいかに影響するかを試験するように試験を設計した。ＰＲＯＣＲ欠損は、初期胚性致死を引き起こす一方（胚１０．５日目）（Ｇｕ  ＪＭ，Ｃｒａｗｌｅｙ  ＪＴ，Ｆｅｒｒｅｌｌ  Ｇ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｌｉ  Ｗ，Ｅｓｍｏｎ  ＮＬ，Ｅｓｍｏｎ  ＣＴ．２００２．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４３３３５−４３）、少量（野生型の＜１０％）のみのＰＲＯＣＲを保持するＰＲＯＣＲの低発現は、致死を完全に回避するために十分であり、マウスは定常状態条件下で正常に発生する（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  ＦＪ，Ｌｉａｎｇ  Ｚ，Ｖｏｌｋｉｒ  ＳＰ，Ｈａａｌｂｏｏｍ  Ｅ，Ｍａｒｔｉｎ  ＪＡ，Ｓａｎｄｏｖａｌ−Ｃｏｏｐｅｒ  ＭＪ，Ｒｏｓｅｎ  ＥＤ．２００２．Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｖｅｒｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐ，ｓｕｒｖｉｖｅ，ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ  ｎｏｒｍａｌｌｙ，ａｎｄ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８８：４６２−７２）。敗血症ショックについてのモデルにおいてチャレンジした場合、ＰＲＯＣＲｄ／ｄマウスは、ＷＴマウスと比較して低下した生存率を示す（Ｉｗａｋｉ  Ｔ，Ｃｒｕｚ  ＤＴ，Ｍａｒｔｉｎ  ＪＡ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  ＦＪ．２００５．Ａ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｂｌｏｏｄ  １０５：２３６４−７１）。Ｔｈ１７条件下で分化させたナイーブＣＤ４＋ＰＲＯＣＲｄ／ｄＴ細胞は、ＷＴナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して少ないＩＬ−１７を産生した（図３１ｄ）。ＩＬ２３とともに培養したエフェクターメモリーＰＲＯＣＲｄ／ｄＴ細胞は、ＷＴメモリーＴ細胞よりも多いＩＬ−１７を産生した。したがって、ＰＲＯＣＲは、ＰＤ−１と同様に、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞の生成を促進するが、Ｔｈ１７エフェクターＴ細胞の機能を阻害する。
【０３４３】
腫瘍モデルにおけるＰＲＯＣＲノックダウン分析：図４４は、ＰＲＯＣＲ突然変異マウスのＢ１６腫瘍接種を示すグラフである。７週齢の野生型またはＰＲＯＣＲ突然変異（ＥＰＣＲデルタ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種した。図４４に示されるとおり、ＰＲＯＣＲの阻害は、腫瘍増殖を示した。したがって、ＰＲＯＣＲの阻害は、腫瘍増殖の妨害のために、および癌の治療のための他の治療用途において有用である。
【０３４４】
ＰＤ−１およびＰＲＯＣＲは、Ｔｈ１７病原性に影響する：Ｔｈ１７細胞は、極めて異種性であり、Ｔｈ１７サブセットの病原性は、それらの分化の間のサイトカイン環境に応じて異なる（Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ  ＣＥ，Ｍｅｌｅ  Ｆ，Ａｓｃｈｅｎｂｒｅｎｎｅｒ  Ｄ，Ｊａｒｒｏｓｓａｙ  Ｄ，Ｒｏｎｃｈｉ  Ｆ，Ｇａｔｔｏｒｎｏ  Ｍ，Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ  Ｓ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ，Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ．２０１２．Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｏｒ  ＩＬ−１０  ａｎｄ  ａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−１ｂｅｔａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５１４−８；Ｌｅｅ  Ｙ，Ａｗａｓｔｈｉ  Ａ，Ｙｏｓｅｆ  Ｎ，Ｑｕｉｎｔａｎａ  ＦＪ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ａ，Ｘｉａｏ  Ｓ，Ｋｌｅｉｎｅｗｉｅｔｆｅｌｄ  Ｍ，Ｋｕｎｄｅｒ  Ｓ，Ｓｏｂｅｌ  ＲＡ，Ｒｅｇｅｖ  Ａ，Ｋｕｃｈｒｏｏ  Ｖ．２０１２．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；およびＧｈｏｒｅｓｃｈｉ  Ｋ，Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ａ，Ｙａｎｇ  ＸＰ，Ｔａｔｏ  ＣＭ，ＭｃＧｅａｃｈｙ  ＭＪ，Ｋｏｎｋｅｌ  ＪＥ，Ｒａｍｏｓ  ＨＬ，Ｗｅｉ  Ｌ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＴＳ，Ｂｏｕｌａｄｏｕｘ  Ｎ，Ｇｒａｉｎｇｅｒ  ＪＲ，Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｋａｎｎｏ  Ｙ，Ｗａｔｆｏｒｄ  ＷＴ，Ｓｕｎ  ＨＷ，Ｅｂｅｒｌ  Ｇ，Ｓｈｅｖａｃｈ  ＥＭ，Ｂｅｌｋａｉｄ  Ｙ，Ｃｕａ  ＤＪ，Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｏ’Ｓｈｅａ  ＪＪ．２０１０．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔ（Ｈ）１７  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：９６７−７１）。サイトカイン環境に加え、いくつかの共刺激経路がＴヘルパーサブセット、例として、Ｔｈ１７細胞の分化および機能の調節に関与している。ＣＴＬＡ−４−Ｂ７相互作用は、Ｔｈ１７分化を阻害する（Ｙｉｎｇ  Ｈ，Ｙａｎｇ  Ｌ，Ｑｉａｏ  Ｇ，Ｌｉ  Ｚ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｙｉｎ  Ｆ，Ｘｉｅ  Ｄ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ．２０１０．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ＣＴＬＡ−４−−Ｂ７  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５：１３７５−８）。さらに、本明細書に記載の研究により、ＩＣＯＳがＴｈ１７細胞の維持における重要な役割を担うことが明らかになった（Ｂａｕｑｕｅｔ  ＡＴ，Ｊｉｎ  Ｈ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ＡＭ，Ｍｉｔｓｄｏｅｒｆｆｅｒ  Ｍ，Ｈｏ  ＩＣ，Ｓｈａｒｐｅ  ＡＨ，Ｋｕｃｈｒｏｏ  ＶＫ．２００９．Ｔｈｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＩＣＯＳ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｍａｆ  ａｎｄ  ＩＬ−２１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＴＨ−１７  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１６７−７５）。
【０３４５】
本明細書における病原性対非病原性Ｔｈ１７細胞の詳細なゲノム分析に基づき、自己免疫疾患における病原性対非病原性エフェクターＴｈ１７細胞を定義する分子シグネチャーが決定された（Ｌｅｅ  Ｙ，Ａｗａｓｔｈｉ  Ａ，Ｙｏｓｅｆ  Ｎ，Ｑｕｉｎｔａｎａ  ＦＪ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ａ，Ｘｉａｏ  Ｓ，Ｋｌｅｉｎｅｗｉｅｔｆｅｌｄ  Ｍ，Ｋｕｎｄｅｒ  Ｓ，Ｓｏｂｅｌ  ＲＡ，Ｒｅｇｅｖ  Ａ，Ｋｕｃｈｒｏｏ  Ｖ．２０１２．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。興味深いことに、ＰＲＯＣＲは、非病原性Ｔｈ１７細胞のシグネチャーの一部であり、その発現は非病原性サブセット中で高度に増加する（図３２ａ）。さらに、ＰＲＯＣＲは、Ｔｈ１７病原性の調節における機能的役割を担うと考えられる。なぜなら、ＰＲＯＣＲのそのリガンドａＰＣによるエンゲージメントが、一部の非病原性シグネチャー遺伝子を誘導する一方、ＰＲＯＣＲｄ／ｄマウスからのＴｈ１７細胞がそれらの遺伝子の発現の減少を示すためである（図３２ｂ）。ＰＲＯＣＲが自己免疫のインビボモデルにおけるＴｈ１７細胞の病原性に影響し得るか否かを試験するため、ＥＡＥについての養子移植モデルを使用した。疾患を誘導するため、ＭＯＧ特異的２Ｄ２ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をＴｈ１７条件下で分化させ、次いでナイーブレシピエント中に移植した。図３２ｃに示されるとおり、Ｔｈ１７細胞上のＰＲＯＣＲの強制発現は、疾患を改善し、このことは、ＰＲＯＣＲが病原性Ｔｈ１７細胞の非病原性Ｔｈ１７細胞に向かう変換をドライブすることを裏付けた。さらに、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用がインビボでエフェクターＴｈ１７細胞の病原性を制限することが見出された。ＭＯＧ３５−５５特異的（２Ｄ２）Ｔｈ１７エフェクター細胞をＷＴとＰＤ−Ｌ１−／−マウス中に移植した場合、ＰＤ−Ｌ１−／−レシピエントは、ＥＡＥの兆候を急速に発症し（移植後５日ほどの初期）、ＥＡＥの重症度は顕著に増加し、ほとんどの実験はＰＤ−Ｌ１−／−レシピエントの疾病の急速な発症に起因して終了を余儀なくされた（図３２ｄ）。ＣＮＳ浸潤細胞の数は、ＰＤ−Ｌ１−／−レシピエントにおいて有意に増加し、ＷＴマウスと比較してＰＤ−Ｌ１−／−レシピエントにおける２Ｄ２＋ＩＬ−１７＋の割合が大きかった。したがって、ＰＤ−１およびＰＲＯＣＲは両方とも、エフェクターＴｈ１７細胞の病原性を制御すると考えられる。
【０３４６】
いくつかの共阻害分子が、抗原持続の間のＴ細胞機能不全に関与している。特に、ＰＤ−１およびＴｉｍ−３は、癌および慢性ウイルス感染、例えば、ヒトにおけるＨＩＶ、ＨＣＶおよびマウスにおけるＬＣＭＶに広い関与を有する。マウスおよびヒトにおける自己反応性Ｔ細胞応答は、阻害分子の発現の低減を特徴とする。自己免疫状況におけるＴ細胞機能不全を誘導する能力は、臨床的に有益であり得る。Ｃｏｐａｘｏｎｅ治療に対して応答するＭＳ患者は、有意に上昇したレベルのＰＲＯＣＲおよびＰＤ−Ｌ１の発現を示す。Ｔｉｍ−３発現の増加およびＴ細胞疲弊の促進はＴ細胞の脳炎誘発性を制限し、ＥＡＥ重症度を低減させる能力を提供することが既に実証されている（Ｒａｎｇａｃｈａｒｉ  Ｍ，Ｚｈｕ  Ｃ，Ｓａｋｕｉｓｈｉ  Ｋ，Ｘｉａｏ  Ｓ，Ｋａｒｍａｎ  Ｊ，Ｃｈｅｎ  Ａ，Ａｎｇｉｎ  Ｍ，Ｗａｋｅｈａｍ  Ａ，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ＥＡ，Ｓｏｂｅｌ  ＲＡ，Ｏｋａｄａ  Ｈ，ＭｃＫｉｎｎｏｎ  ＰＪ，Ｍａｋ  ＴＷ，Ａｄｄｏ  ＭＭ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＡＣ，Ｋｕｃｈｒｏｏ  ＶＫ．２０１２．Ｂａｔ３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔｉｍ−３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １８：１３９４−４００）。したがって、Ｔｈ１７細胞中で選択的にエンリッチされる新規阻害分子ＰＲＯＣＲが、Ｔ細胞疲弊における役割も担い得るか否かを決定するように、試験を設計した。ＰＲＯＣＲは、ＰＤ−１およびＴｉｍ−３の両方を発現する疲弊腫瘍浸潤リンパ球中で発現されることが見出された（図３３ａ）。この観察と一致して、ＰＲＯＣＲは、慢性ＬＣＭＶ感染の間に抗原特異的疲弊ＣＤ８Ｔ細胞中でほとんどエンリッチされることが見出された（図３３ｂ）。Ｔ細胞疲弊が慢性ウイルス感染および腫瘍免疫において有害である一方、疲弊の誘導は、自己免疫疾患を引き起こす潜在的に病原性のエフェクター細胞の制御における有益な役割を担い得る。ＰＤ−１およびＰＲＯＣＲの発現および／または機能の調節は、自己免疫の制御においてこのタスクを実行するための手段を提供し得る。
【０３４７】
実施例７
Ｔｈ細胞分化におけるＦａｓ
Ｆａｓは、ＦａｓＲ、ＣＤ９５、ＡＰＯ−１、ＴＮＦＲＳＦ６としても公知であり、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＦａｓＬの結合は、カスパーゼ−８を活性化させ、アポトーシスをもたらすＦＡＤＤ（デスドメイン）に結合するＦＡＳトリマーをもたらす。Ｆａｓは、アポトーシス非依存性効果、例えば、肝細胞中のＡｋｔ、ＳＴＡＴ３、およびＮＦ−κＢとの相互作用ならびに癌細胞中のＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫ経路との相互作用も呈する。
【０３４８】
Ｌｐｒマウスは、機能的ノックアウト（ＫＯ）を作出するＦａｓについてのドミナントネガティブ（トランスポゾンイントロン１）である。これらのマウスは、リンパ増殖性疾患（ｌｐｒ）；週齢依存性、ＬＮ、脾臓の＞２５倍のサイズ増加；Ｔｈｙ１＋Ｂ２２０＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＴＣＲａ／ｂ＋Ｔ細胞の拡張を呈する。これらのマウスは、それらを全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のモデルとする自然抗ｄｓＤＮＡ  Ａｂ、全身自己免疫を産生するが、それらのマウスは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対して抵抗性である。Ｇｌｄマウスは、ＦａｓＬについてのドミナントネガティブである。ＣＤ４Ｃｒｅ−／ＣＤ１９Ｃｒｅ−／ＣＤ４Ｃｒｅ−ＣＤ１９Ｃｒｅ−／ＬｃｋＣｒｅ−ＦａｓｆｌｏｘであるＦａｓ  ｆｌｏｘマウスはリンパ増殖を呈さず、Ｔｈｙ１＋Ｂ２２０＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＴＣＲａ／ｂ＋Ｔ細胞の拡張を呈さない。これらのマウスは、進行性リンパ球減少症、炎症肺線維症、および消耗症候群を呈する。ＭｘＣｒｅ＋ポリ（ＩＣ）−ＦａｓｆｌｏｘであるＦａｓ  ｆｌｏｘマウスは、ｌｐｒ表現型を呈する。ＭＯＧＣｒｅ−ＦａｓｆｌｏｘであるＦａｓ  ｆｌｏｘマウスは、ＥＡＥに対して抵抗性である。ＬｙｓＭＣｒｅ−ＦａｓｆｌｏｘであるＦａｓ  ｆｌｏｘマウスは、リンパ増殖および糸球体腎炎を呈する。
【０３４９】
Ｆａｓ（ＣＤ９５）はアポトーシスを媒介する受容体として同定されたが、本明細書のデータは、ＦａｓがＴｈ１７分化およびＥＡＥの発症に重要であることを明示する。本明細書のデータは、Ｆａｓ欠損マウスがＴｈ１７細胞分化を欠損し、Ｔｈ１およびＴｒｅｇ細胞に優先的に分化することを実証する。Ｆａｓ欠損マウスにおけるＴｒｅｇ細胞の拡張およびＴｈ１７細胞の阻害は、ＥＡＥにおける疾患抵抗性を担い得る。
【０３５０】
Ｆａｓ欠損細胞は、Ｔｈ１７細胞に分化するそれらの能力が損なわれ、それらは、Ｔｈ１７条件（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３）下でインビトロで培養した場合に有意により低いレベルのＩＬ−１７を産生する。さらに、これらは、Ｔｈ１７細胞に重要であるＩＬ−２３Ｒのレベルの低減を示す。なぜなら、ＩＬ−２３がＴｈ１７安定性および病原性に要求されるためである。対照的に、Ｆａｓは、ＩＦＮ−γ産生およびＴｈ１分化を阻害する。なぜなら、Ｆａｓ欠損マウスに由来する細胞は有意により高いレベルのＩＦＮ−γを分泌するためである。同様に、Ｆａｓ欠損細胞は、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにより容易に分化し、より高いレベルのＴｒｅｇエフェクターサイトカインＩＬ−１０を分泌する。したがって、Ｆａｓは、ＴｒｅｇおよびＩＦＮ−γ産生Ｔｈ１細胞への分化を抑制する一方、Ｔｈ１７分化を促進すると考えられる。したがって、炎症自己免疫障害、例えば、ＥＡＥにおいて、Ｆａｓは、Ｔヘルパー細胞のバランスを、保護ＴｒｅｇおよびＩＦＮ−γ産生Ｔｈ１細胞から離れて、病原性Ｔｈ１７細胞に向けてシフトすることにより疾患進行を促進すると考えられる。
【０３５１】
実施例８
Ｔｈ１７病原性状態のモジュレーションにおけるＣＤ５Ｌの標的化
ＣＤ５Ｌ（ＣＤ５抗原様；ＡＩＭ（マクロファージのアポトーシスインヒビター））が、Ｔｈ１７病原性状態の新規調節因子として同定された。ＣＤ５Ｌは、マクロファージスカベンジャー受容体システインリッチドメインスーパーファミリーに属する５４ｋＤタンパク質であり；他のファミリーメンバーとしては、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ３６、ＭＡＲＣＯなどが挙げられる。ＣＤ５Ｌは、マクロファージおよび脂肪細胞により発現され、ＣＤ３６を通して細胞中に取り込まれる（Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２０１０）。ＣＤ５Ｌは、ＲＸＲ／ＬＸＲ（Ｖａｌｌｅｄｏｒ  ＡＦ  ｅｔ  ａｌ．２００４）の活性化により誘導することができ、胸腺細胞およびマクロファージの脂質誘導アポトーシスを阻害する。ＣＤ５Ｌは、肥満関連自己抗体産生に関与し（Ａｒａｉ  Ｓ  ｅｔ．ａｌ．２０１３）、脂質代謝における役割を担う。ＣＤ５Ｌは、脂肪細胞中の脂肪分解を促進し、肥満の発症を潜在的に予防し（Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、脂肪酸シンターゼを阻害することによりデノボ脂質合成を阻害する（Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【０３５２】
図３４Ａ〜３４Ｃは、Ｔｈ１７細胞上のＣＤ５Ｌの発現を実証する一連のグラフである。図３５Ａ〜３５Ｃは、いかにＣＤ５Ｌ欠損がＴｈ１７分化を変更しないかを示す一連の説明およびグラフである。図３６Ａ〜３６Ｃは、いかにＣＤ５Ｌ欠損が生存または安定性に影響を与えることによりＴｈ１７メモリーを変更するかを示す一連の説明およびグラフである。
【０３５３】
図３７Ａ〜３７Ｂは、いかにＣＤ５Ｌ欠損がより重度および持続的なＥＡＥをより高いＴｈ１７応答でもたらすかを示す一連のグラフである。図３８Ａ〜３８Ｃは、いかにＣＤ５Ｌの損失が、非病原性Ｔｈ１７細胞を病原性エフェクターＴｈ１７細胞に変換するかを示す一連の説明およびグラフである。図３９Ａ〜３９Ｂは、いかにＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）が病原性表現型を発生させるかを示す一連のグラフである。
【０３５４】
実施例９
機能的Ｔｈ１７データの単一細胞分析
治療法および／または診断的使用のために活用することができる標的遺伝子の単一細胞分析は、集団レベルにおいて同定することができず、または他の点で集団レベルにおける好適な標的遺伝子として容易に明らかにならない遺伝子の同定を可能とする。
【０３５５】
単一細胞ＲＮＡシーケンシングは、異なるサブタイプのＴｈ１７細胞を特徴決定し、それらの不均一性および可塑性の根底をなす調節機序のより良好な理解を獲得するユニークな機会を提供する。特に、本明細書に記載の研究は、インビトロおよびインビボの両方でＴｈ１７細胞の下位集団を同定し、効果を現す潜在的な分岐機序をマッピングするように設計した。これらの結果は、重要な機序的洞察に自己免疫疾患の治療における治療関連性についての潜在性を提供する。
【０３５６】
単一細胞ｍＲＮＡ  ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑライブラリーの調製のためにマイクロ流体技術（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１）を使用して、分化Ｔｈ１７細胞（１回で９６個の細胞）をインビトロで病原性または非病原性極性化条件下で２つの時点（分化プロセスへの４８時間および９６時間）においてプロファイリングした。さらに、中枢神経系から単離されたＴｈ１７細胞およびリンパ節を、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ；多発性硬化症のマウスモデル）により免疫化されたマウスの疾患のピークにおいてプロファイリングした。次いで、得られるデータセット（全体で約１０００個の細胞）の処理および分析のためにコンピュータパイプラインを開発した。結果は、資源への有利な点ならびに単一細胞レベルにおいて観察される発現パターン、発現モダリティー、すなわち、いかに遺伝子が集団にわたり発現されるかのマップ、および変動性、すなわち、いかに遺伝子の発現レベルがタイトに調節されるかの機能的関係を提供する。
【０３５７】
例えば、シグネチャーサイトカインＩＬ−１７Ａが、インビトロで細胞のトランスクリプトームの変動性の最大レベルの１つを示すことが見出された。この変動性は、下位集団への細胞の管理されない分別と強く相関し、それは潜在的に病原性の細胞（高レベルのＩＬ−１７Ａおよび低レベルの免疫抑制サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０）と非病原性細胞（逆の発現プロファイル）との間のスペクトルに及ぶ。
【０３５８】
２つの極端な状態を特徴決定する規定の遺伝子は、魅力的な標的遺伝子を提供し、従来の集団レベルアプローチ（Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９６，４６１−４６８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１９８１（２０１３））により検出されなかった候補を含む。最も有望な標的遺伝子を同定するため、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ結果を複数の他の情報源（例えば、転写因子結合）と組み合わせる遺伝子優先順位決定スキームを開発した。次いで、それぞれのノックアウトマウスを使用して高ランキング標的をさらに分析した。
【０３５９】
以下は、単一細胞分析方法および種々のＴ細胞表現型を誘導するための条件を提供する。
・条件Ｔｈ０：細胞をＣＤ３／ＣＤ２８により活性化させるが、対照としてサイトカインを培地に添加しなかった。
・条件Ｔ１６：ＣＤ３／ＣＤ２８活性化＋ＴＧＦβ１＋ＩＬ６を培地に添加して非病原性Ｔｈ１７条件を産生する。
・条件Ｔ３６：ＣＤ３／ＣＤ２８活性化＋ＴＧＦβ３＋ＩＬ６を培地に添加して病原性Ｔｈ１７条件を産生する。
・条件Ｂ６２３：ＣＤ３／ＣＤ２８活性化＋ＩＬ１β＋ＩＬ６＋ＩＬ２３を培地に添加して病原性Ｔｈ１７条件を産生する。
・条件Ｔ：ＣＤ３／ＣＤ２８活性化＋ＴＧＦβ１を培地に添加してＴｒｅｇ条件を産生する。
【０３６０】
条件Ｔｈ０下では細胞の増幅が活性化されるが、細胞は規定のアウトカムに向かう影響を受けない。条件Ｔ１６、Ｔ３６およびＢ６２３下では、上記のとおり、活性化され、増幅する細胞は規定のＴｈ１７細胞アウトカムに向かう影響を受ける。ここでも、本明細書において使用される用語「病原性」または「非病原性」は、一方のＴｈ１７細胞表現型が他方のものよりも望ましいことを意味すると解釈すべきでない。これらを使用して異なる同定特徴を有する異なるＴｈ１７細胞表現型を暗示する。
【０３６１】
以下の方法を本明細書に記載の研究において使用した：マウス：Ｃ５７ＢＬ／６野生型、ＣＤ４−／−（２６６３）。マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ＩＬ−１７Ａ−ＧＦＰマウスは、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎから入手した。さらに、ＧＰＲ６５−／−マウスからの脾臓およびリンパ節はＹａｎｇ  Ｌｉにより提供された。ＺＢＴＢ３２−／−マウスは、Ｐｉｅｒ  Ｐａｏｌｏ  Ｐａｎｄｏｌｆｉの実験室から入手した。細胞ソーティングおよびインビトロＴ細胞分化：ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して脾臓およびリンパ節から精製し、次いで、１％のＦＣＳを有するＰＢＳ中で室温において抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ６２ｌ−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４４−ＰＥ抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）により２０分間染色した。ナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２ｌｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗ  Ｔ細胞は、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを使用してソートした。ソートされた細胞をプレート結合抗ＣＤ３（２μｇ  ｍｌ−１）および抗ＣＤ２８（２μｇ  ｍｌ−１）によりサイトカインの存在下で活性化させた。ＴＨ１７分化のため、以下の試薬を使用した：２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１および組換えヒトＴＧＦ−β３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、２５ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、２０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および２０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−１β（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。細胞を４８〜９６時間培養し、ＲＮＡ、細胞内サイトカイン染色、フローｆｉｓｈのために回収した。
【０３６２】
ＣｙＴＯＦおよびフローサイトメトリー：ＥＡＥの活性誘導および疾患分析：ＥＡＥの活性誘導のため、マウスをＣＦＡ中１００μｇのＭＯＧ（３５−５５）（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）（配列番号１３９５）の皮下注射により免疫化し、次いでマウスは２００ｎｇの百日咳毒素を腹腔内で０および２日目に受けた（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。マウスをモニタリングし、それにＥＡＥの古典的および非典型兆候の発現についてスコアを以下の基準により毎日割り当てた：０、疾患なし；１、尾部色調の減少および軽度のバランス欠陥；２、後肢脆弱、部分麻痺または自発的転倒を引き起こす重度のバランス欠陥；３、完全な後肢麻痺または歩行を妨げる極めて重度のバランス欠陥；４、前および後肢麻痺または体重の異なる位置への移動不能；５、瀕死状態（ｇｅｒ，Ａ．，Ｄａｒｄａｌｈｏｎ，Ｖ．，Ｓｏｂｅｌ，Ｒ．Ａ．，Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．＆Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．Ｋ．Ｔｈ１，Ｔｈ１７，ａｎｄ  Ｔｈ９  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８３，７１６９−７１７７，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０９０１９０６（２００９））。
【０３６３】
疾患のピークにおけるＥＡＥマウスからのＴ細胞の単離：疾患のピークにおいて、マウスＴ細胞を流入領域リンパ節およびＣＮＳから回収した。ＣＮＳからの単離のため、低温ＰＢＳをマウスの心臓の左心室に通してかん流させた。脳および脊髄をＰＢＳにより静水圧によりフラッシュアウトした。ＣＮＳ組織を鋭いカミソリの刃により細分化し、コラゲナーゼＤ（２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびＤＮアーゼＩ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）により３７℃において２０分間消化した。単核細胞を、セルストレーナー（７０μｍ）への組織の通過とそれに続くパーコール勾配（３７％および７０％）を通した遠心分離により単離した。単核細胞の除去後、リンパ球を洗浄し、染色し、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、７ＡＡＤおよびＩＬ１７ａ−ＧＦＰまたはＦＯＸＰ３−ＧＦＰについてソートした。
【０３６４】
ホールトランスクリプトーム増幅：細胞溶解およびＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ（ａｍｓｋｏｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，７７７−７８２（２０１２））ホールトランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）は、Ｃ１チップ上で、ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を以下の修正で使用するＣ１  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｕｔｏ  Ｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃ１  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して実施した。
【０３６５】
【表８２】
2017508457.tif 000084
【０３６６】
【表８３】
2017508457.tif 000085
【０３６７】
【表８４】
2017508457.tif 000086
【０３６８】
ライブラリー調製およびＲＮＡ−Ｓｅｑ：ＷＴＡ産物をＣ１チップから回収し、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ調製試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造業者の推奨に従ってマイナー修正して使用してｃＤＮＡライブラリーを調製した。具体的には、反応は、推奨容量の１／４においてランし、タグメンテーションステップを１０分間に延長し、ＰＣＲステップの間の伸長時間を３０秒から６０秒に増加させた。ＰＣＲステップ後、９６個全ての試料をライブラリー正規化なしでプールし、０．９×ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により２回清浄し、緩衝液ＴＥ中で溶出させた。プールされたライブラリーは、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  ＤＮＡ  Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量し、高感受性ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して試験した。最終的に、ＨｉＳｅｑ２０００またはＨｉＳｅｑ２５００シーケンサーのいずれかを使用して試料をディープシーケンシングした。
【０３６９】
集団対照のＲＮＡ−Ｓｅｑ：集団対照は、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の推奨に従って使用して全ＲＮＡを抽出することにより生成した。続いて、水中１μＬのＲＮＡを２μＬの溶解反応ミックスに添加し、サイクリング条件Ｉ（上記）を使用して熱サイクリングさせた。次に、４μＬの室温反応ミックスを添加し、サイクリング条件ＩＩ（上記）を使用して混合物を熱サイクリングさせた。最終的に、１μＬの全室温反応物を９μＬのＰＣＲミックスに添加し、サイクリング条件ＩＩＩ（上記）を使用してその混合物を熱サイクリングさせた。産物を定量し、０．１２５ｎｇ／μＬに希釈し、ライブラリーを上記のとおり調製し、清浄し、試験した。
【０３７０】
フローサイトメトリーおよび細胞内サイトカイン染色：ソートされたナイーブＴ細胞を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）、イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）およびモネンシンを含有するタンパク質輸送インヒビター（Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、抗体による染色による検出前に４時間刺激した。表面マーカーを１％のＦＣＳを有するＰＢＳ中で室温において２０分間染色し、次いで続いて細胞をＣｙｔｏｐｅｒｍ／Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で固定し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により浸透化し、記載のとおりＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で希釈されたＢｉｏｌｅｇｅｎｄコンジュゲート抗体、すなわち、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ６５０抗マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）およびアロフィコシアニン抗ＩＬ−１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０．１）により染色した１４。Ｆｏｘｐ３染色は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＦｏｘｐ３染色キット（００−５５２３−００）により、その「Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ（ｎｕｃｌｅａｒ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に従って実施した。データは、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒまたはＬＳＲ  ＩＩ（両方ともＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかを使用して収集し、次いでＦｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して分析した。
【０３７１】
ＥＬＩＳＡを使用するサイトカイン分泌の定量：ノックアウトマウスおよびその野生型対照からのナイーブＴ細胞を上記のとおり培養し、それらの上清を４８時間および９６時間後に回収し、サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＩＬ−１７およびＩＬ−１０についての抗体）により、または示されるサイトカインについてのサイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により製造業者の説明書に従って測定した。
【０３７２】
ＲＮＡ発現のＲＮＡ−フローＦｉｓｈ分析：ＲＮＡ−ｓｅｑ試料と同一の条件下で調製された細胞を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）ＶｉｅｗＲＮＡ  ＩＳＨ  Ｃｅｌｌ  Ａｓｓａｙキットにより製造業者のプロトコルに従って調製した。ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ  Ｘ  ＭｋＩＩによる６０倍の倍率におけるハイスループット画像取得は、単一細胞の明視野を含む高分解能画像の分析を可能とする。目的遺伝子を１型プローブにより標的化し、ハウスキーピング遺伝子を４型プローブにより標的化し、核をｄａｐｉにより染色した。単一細胞を細胞特性、例えば、区域、アスペクト比（明視野画像）および核染色に基づき選択した。陰性対照として、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤａｐＢ遺伝子（１型プローブ）を使用した。スポット計数をａｍｎｉｓ  ＩＤＥＡＳソフトウェアにより実施して発現分布を得た。
【０３７３】
タンパク質発現のＣｙＴＯＦ分析：インビトロ分化細胞を培養し、７２時間において回収し、次いで上記のフローサイトメトリープロトコルと同様に３時間刺激した。続いて、試料を既に記載のとおり調製した１５。レポーターマウスからのリンパ節およびＣＮＳから単離されたインビボ細胞を、それらの限定数に起因して、ＣＤ４−／−マウスから単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞のプール中に組み込んで適切な試料調製を可能とした。ＣＤ４−／−マウスからの細胞を染色し、ＣＤ３＋ＣＤ４−７ＡＡＤ−細胞についてソートしてＣｙＴＯＦ染色の間に少量のＣＤ４＋染色が得られることを確保し、ＬＮおよびＣＮＳからのＣＤ４＋細胞をインシリコで同定することができた。
【０３７４】
Ｔｈ１７分化の間の単一細胞のＲＮＡ−ｓｅｑプロファイリング：インビトロで分化させたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞のｍＲＮＡレベルを、２つのタイプの極性化条件下でプロファイリングした：Ｔｇｆβ１＋ＩＬ６およびＴｇｆβ３＋ＩＬ６。両方の処理がＩＬ１７産生をもたらす（Ｇｈｏｒｅｓｃｈｉ，Ｋ．，Ｌａｕｒｅｎｃｅ，Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｐ．，Ｈｉｒａｈａｒａ，Ｋ．＆Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．Ｊ．Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １７  ｃｅｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２，３９５−４０１（２０１１））一方、後者のみが養子移植時に自己免疫をもたらす（ｏｓｔｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｈａｖｅ  ｓｈａｐｅｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９１，１１９−１２４（２０１２））。マイクロ流体チップ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１）を単一細胞ｍＲＮＡ  ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑライブラリーの調製に使用した。それぞれの極性化条件を分化プロセスへの４８時間および９６時間においてサンプリングした。これらの単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーに加え、少なくとも１０，０００個の細胞のそれらの対応するバルク集団も、それぞれの条件についての少なくとも２つのレプリケートと、１５００万リードの平均深さにおいてシーケンシングした。
【０３７５】
ＲＮＡ−ｓｅｑリードを、Ｔｏｐ−Ｈａｔを使用してマウスゲノムのＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３７（ＵＣＳＣ  ｍｍ９）にアラインした。得られるアラインメントをＣｕｆｆｌｉｎｋｓにより処理して転写物の発現を評価した。ｍＲＮＡ定量のためのＲＳＥＭ（予測最大化によるＲＮＡ−Ｓｅｑ）ソフトウェアをベースとする代替的パイプラインも用いた。特に記載のない限り、この代替的パイプラインを用いて得られた結果は、本明細書に提示のものと類似した。
【０３７６】
ライブラリー品質メトリクス、例えば、ゲノムアラインメント速度、リボソームＲＮＡコンタミネーション、および３’または５’カバレッジバイアスをそれぞれのライブラリーについて計算した。これらのパラメータの低い値を有した細胞をフィルタリングし；残りの細胞（総プロファイリング細胞の約８０％）は、類似の品質メトリクスを有した。追加の前処理ステップとして、ライブラリー品質メトリクスと有意に（ｐ＜１ｅ−３）相関する主成分を差し引いた。最終的に、特に記載のない限り、試料の細胞の少なくとも２０％中で大量発現（百万当たりのエクソンのキロベース当たりの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）（ＦＰＫＭ）＞１０）されなかったそれぞれの試料からの遺伝子を廃棄し、インビトロ試料について平均約６ｋの遺伝子、インビボ試料について約３ｋの遺伝子を保持した。
【０３７７】
集団レプリケートの遺伝子発現レベルは互いにタイトに相関した（ピアソンｒ＞０．９７、対数スケール）が、個々の細胞間の発現の有意差が存在した（０．７２＜ｒ＜０．８２、平均：０．７８；図１ｂ）。この大きい細胞間変動にかかわらず、全ての単一細胞にわたる平均発現は集団データと十分に相関した（ｒ＞０．９２）。
【０３７８】
単一細胞プロファイルは、インビトロのＩＬ１７関連不均一性を明らかにする：Ｔｇｆβ１＋ＩＬ６により分化させた細胞にわたる個々の遺伝子からの発現の分布を考慮すると、広域の挙動が観察された。分析遺伝子の約４０％が、全ての細胞中で構成的に発現された。保証として、この遺伝子セットはハウスキーピング遺伝子（ｐ＜ｘ）について高度にエンリッチしている。しかしながら、ＴＨ１７シグネチャーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７ｆ、ＩＬ９およびＩＬ２１）および早期作用転写因子（例えば、Ｒｏｒｃ、Ｉｒｆ４、Ｂａｔｆ、Ｓｔａｔ３、Ｈｉｆ１ａ、およびＭｉｎａ）の構成的発現も見られた。残りの遺伝子は、バイモーダル発現パターンを示し、細胞の少なくとも２０％において高いｍＲＮＡレベル、および残りの細胞においてかなり低い（検出不能であることが多い）レベルであった。興味深いことに、バイモーダルな遺伝子としては、キーＴＨ１７シグネチャーサイトカイン、ケモカインおよびそれらの受容体（例えば、ＩＬ２３ｒ、ＩＬ１７ａ、Ｃｃｌ２０）が挙げられる。バイモダリティーは、集団レベルデータにおいて既に観察されたとおり、ＩＬ−１０ファミリーからの制御性サイトカイン（ＩＬ１０、ＩＬ２４、ＩＬ２７ｒａ）についても見られた。最終的に、小さい表示（通常、細胞の＜３０％）が、他のＴ細胞系統を特徴決定する転写因子およびサイトカイン（例えば、ＩＬ１２ｒｂ２、Ｓｔａｔ４［Ｔｈ１］、Ｃｃｒ４、およびＧａｔａ３［Ｔｈ２］、ならびに低レベルのＦｏｘｐ３［ｉＴｒｅｇ］）について見られた。ＩＬ１０モジュールからの遺伝子の発現は、自己限定性機序を表すことが考えられ、それは細胞のサブセット中で活性であり、Ｔｇｆβ１により分化させたＴＨ１７細胞の「非病原性」効果における役割を担い得る。他のＴ細胞サブセットからの発現は、非Ｔｈ１７細胞による試料のコンタミネーションを表し得、またはむしろ「ハイブリッド」二重陽性細胞より複雑な状況を反映し得る。
【０３７９】
ハイスループット高分解能フローＲＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−フローＦＩＳＨ）、無増幅イメージング技術を実施して単一細胞発現データの不均一性が、少量の細胞ＲＮＡの増幅に伴うライブラリー調製バイアスおよび技術ノイズではなく真の生物学的差異を反映することを確認した。広範な発現および変動レベルをカバーするために選択された９つの遺伝子について、ＲＮＡ−フローＦＩＳＨにより検出された不均一性は、シーケンシングデータを密接に反映した。例えば、ハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチン（Ａｃｔｂ）およびβ２−マイクログロブリン（Ｂ２ｍ））およびキーＴｈ１７転写因子（例えば、Ｒｏｒｃ、Ｉｒｆ４、Ｂａｔｆ）の発現は、単一細胞ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＲＮＡ−ＦＩＳＨ計測値の両方における対数正規分布にマッチした。対照的に、他のシグネチャー遺伝子（例えば、ＩＬ１７ａ、ＩＬ２）は、有意により高いレベルの不均一性を示し、ＲＮＡ−ＳＥＱ結果を繰り返した。
【０３８０】
細胞下位集団の同定：この挙動を定量するため、３つのパラメータ：（アルファ）−発現細胞の％；（シグマ）：発現細胞についての発現の標準偏差；および（ミュー）：発現細胞についての発現の平均レベルを使用する細胞にわたる所与の遺伝子の分布を記載する、Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈａｌｅｋ，ｅｔ  ａｌ．“Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３  Ｍａｙ  １９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２１７）によるモデルを適応させた。この適応されたモデルにおいて、それらのパラメータは、発現分布を２つの分布：発現細胞についての対数正規分布および非発現細胞についての指数関数の混合モデルとフィットすることにより推定される。興味深いことに、シグネチャーサイトカインＩＬ１７ａがインビトロの細胞のトランスクリプトームにおける変動性の最大レベルの１つを示すことが見出された。追加のサイトカイン、ケモカインおよびそれらの受容体、例として、Ｃｃｌ２０、ＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ９およびＩＬ２４が、高度に変動性の遺伝子として共通した。これらのキー遺伝子が強力な変動性を示す一方、それらのパターンが細胞の状態について情報をどの程度示すかが明確ではなかった。これを調査するため、種々のＣＤ４＋系統のシグネチャー遺伝子と、全て他の発現遺伝子の間の相関を計算した。このマップのクラスタ化は、調節サイトカイン（ＩＬ１０モジュール）と、炎症促進性分子（ＩＬ１７、Ｒｏｒｃ）との間の明確な区別を明らかにする。ＩＬ１０モジュールからの発現は、自己限定性機序を表すと考えられ、それは細胞のサブセットにおいて活性であり、Ｔｇｆβ１により分化させたＴＨ１７細胞の「非病原性」効果における役割を担う。
【０３８１】
これを調査するため、主成分分析を細胞の空間に対して実施した。ＰＣＡが、ＩＬ１７ａを発現しない細胞からＩＬ１７ａ発現細胞を適切に分離し得ることが見出された。さらに、第１のＰＣがＩＬ１７ａと正に相関し、ＩＬ１０と負に相関することが見出された。したがって、最初の２つのＰＣの空間中の細胞の表現は、潜在病原性細胞（高レベルのＩＬ−１７ａおよび低レベルの免疫抑制サイトカイン様ＩＬ−１０）と、非病原性細胞（逆の発現プロファイル）との間のスペクトルに及ぶ。ＰＣは、他の細胞特性との相関を計算することにより特徴決定した。
【０３８２】
ＧＰＲ６５は、Ｔｈ１７分化を促進し、ＩＬ２を抑制する：第１の実験セットは、自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、強直性脊椎炎、炎症性腸管疾患、およびクローン病と遺伝子的に関連するグリコスフィンゴ脂質受容体の標的遺伝子ＧＰＲ６５を同定した。ＧＰＲ６５は、本明細書においてＩＬ１７モジュールと称される炎症応答と関連する遺伝子のモジュールとの正の相関を示し、本明細書においてＩＬ１０と称される調節サイトカインプロファイルと関連する遺伝子のモジュールと負に相関する。ＩＬ１７モジュールとしては、ＢＡＴＦ、ＳＴＡＴ４、ＭＩＮＡ、ＩＬ１７Ｆ、ＣＴＬＡ４、ＺＢＴＢ３２（ＰＬＺＰ）、ＩＬ２、ＩＬ１７Ａ，およびＲＯＲＣなどの遺伝子が挙げられる。ＩＬ１０モジュールとしては、ＩＬ１０、ＩＲＦ４、ＩＬ９、ＩＬ２４、およびＳＭＡＤ３などの遺伝子が挙げられる。ＩＬ１７モジュールとの正の相関を有することが公知の遺伝子としては、ＢＡＴＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＲＯＲＣ、およびＭＩＮＡが挙げられる。ＩＬ１７モジュールとの負の相関を有することが公知の遺伝子としては、ＦＯＸＰ３、ＡＨＲ、ＴＲＰ５３、ＩＫＺＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ２３、およびＩＬ９が挙げられる。本開示全体を通して記載されるとおり、ＩＬ１７モジュールの新規調節因子としては、ＤＥＣ１、ＣＤ５Ｌ、およびＺＢＴＢ３２（ＰＬＺＰ）が挙げられる。
【０３８３】
ＧＰＲ６５の役割を追求するため、ＧＰＲ６５−／−マウスを得、種々のＴ細胞条件下（Ｔｈ０、Ｔ１６、Ｔ３６、Ｂ６２３、Ｔ）でナイーブＴ細胞を分化させた。図４０Ａおよび４０Ｂは、ＧＰＲ６５ノックアウト細胞中でＩＬ１７Ａ発現が低減することを実証し、例えば、図４０Ａにおいて、Ｔ１６条件について４２％だけ、Ｔ３６条件について４８％だけ、Ｂ６２３条件について７３％だけ、図４０Ｂにおいて、Ｔ１６条件において２０％だけ、Ｔ３６条件について１３％だけ低減する。さらに、Ｂ６２３条件は、通常、Ｔｈ１細胞に帰属し、重度の免疫応答の誘発と関連するサイトカインのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生の増加を示した。これらの結果は、ＧＰＲ６５がＴｈ１７分化の調節因子であることを実証する。したがって、ＧＰＲ６５のモジュレーションを使用してＴ細胞の集団をＴｈ１７表現型に向け、またはそれから遠ざけるように影響させることができる。
【０３８４】
第２の実験セットは、Ｂｈｌｈｅ４０としても公知の標的遺伝子ＤＥＣ１を同定した。ＤＥＣ１は、Ｔ細胞活性化時にＣＤ２８依存的に高度に誘導されることが公知の基本ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子である（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌｌｏｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．“ＣＤ２８−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＤＥＣ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｊｕｌ  ２９；２１０（８）：１６０３−１９．ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１２２３８７．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｊｕｌ  ２２）。ＤＥＣ１は、実験的自己免疫脳脊髄炎の発症に要求され、炎症促進サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、およびＩＬ−２の産生における重要な役割を担う（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２０１３）。本明細書に提示される研究前、ＤＥＣ１は、従来は一般にＴ細胞と、または特にＴｈ１７細胞と関連することが公知でなかった。
【０３８５】
ＤＥＣ１の役割を追求するため、ＤＥＣ１−／−マウスを得、種々のＴ細胞条件（Ｔｈ０、Ｔ１６、Ｔ３６、Ｂ６２３、Ｔ）下でナイーブＴ細胞を分化させた。図４１Ａに示されるとおり、ＩＬ−１７Ａ発現は、非病原性条件、すなわち、Ｔ１６において未変化であったが、発現は、病原性条件Ｔ３６およびＢ６２３において低減し、例えば、Ｔ３６条件について約５５％減少し、Ｂ６２３条件について約４３％減少した。図４１Ｂに示されるとおり、ＤＥＣ１ノックアウト細胞は、ＦＯＸＰ３陽性細胞の増加も実証した。図４１Ｃは、サイトカイン分泌アッセイ（ＣＢＡ）が、全てのＴｈ１７条件についてＩＬ１７Ａについての減少および全てのＴｈ１７条件についてＩＬ−１０産生の増加を実証することにより図４１Ａに見られるＩＣＣデータを大きく支持することを実証する。これらの結果は、ＤＥＣ１が病原性Ｔｈ１７分化のプロモーターであることを実証する。したがって、ＤＥＣ１のモジュレーションを使用してＴ細胞の集団をＴｈ１７病原性表現型に向け、またはそれから遠ざけるように影響させることができる。
【０３８６】
第３の実験セットは、Ｚｂｔｂ３２としても公知の標的遺伝子ＰＬＺＰを同定した。ＰＬＺＰは、ＧＡＴＡ−３のリプレッサーであることが公知の転写因子である。ＰＬＺＰは、Ｔ細胞活性化を負に調節すること（Ｉ−Ｃｈｅｎｇ  Ｈｏ，２００４）およびサイトカイン発現活性化を調節すること（ＳＣ  Ｍｉａｗ，２０００）が示されている。
【０３８７】
ＰＬＺＰの役割を追求するため、ＰＬＺＰ−／−マウスを得、ナイーブＴ細胞を種々のＴ細胞条件（Ｔｈ０、Ｔ１６、Ｔ３６、Ｂ６２３、Ｔ）下で分化させた。図４２Ａに示されるとおり、ＩＬ−１７Ａ産生は病原性Ｔｈ１７細胞条件Ｔ３６およびＢ６２３において減少した。これらの結果は、ＰＬＺＰが病原性Ｔｈ１７分化のプロモーターであることを実証する。したがって、ＰＬＺＰのモジュレーションを使用してＴ細胞の集団をＴｈ１７病原性表現型に向け、またはそれから遠ざけるように影響させることができる。
【０３８８】
第４の実験セットは、基本ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子の標的遺伝子ＴＣＦ４（転写因子４）を同定した。ＴＣＦ４は、超経路（ｓｕｐｅｒ−ｐａｔｈｗａｙ）、例として、ＭＡＰＫシグナリング経路および筋形成経路に関連することが公知である。
【０３８９】
ＴＣＦ４の役割を追求するため、ＴＣＦ４−／−マウスを得、種々のＴ細胞条件（Ｔｈ０、Ｔ１６、Ｔ３６、Ｂ６２３、Ｔ）下でナイーブＴ細胞を分化させた。図４３に示されるとおり、ＩＬ−１７Ａ産生は、病原性Ｔｈ１７細胞条件Ｂ６２３において減少した。これらの結果は、ＴＣＦ４を病原性Ｔｈ１７分化のプロモーターとして使用することができることを実証する。したがって、ＴＣＦ４のモジュレーションを使用してＴ細胞の集団をＴｈ１７病原性表現型に向け、またはそれから遠ざけるように影響させることができる。
【０３９０】
実施例１０
細胞内脂質代謝の調節因子ＣＤ５Ｌは、Ｔｈ１７細胞の病原性を抑制する
ＩＬ−１７産生Ｔｈ１７細胞は、組織炎症の部位において存在し、ヒトおよび関連ネズミモデルにおける多数の自己免疫疾患の病原性に関与する（Ｋｌｅｉｎｅｗｉｅｔｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｈａｆｌｅｒ  ２０１３，Ｌｅｅ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。しかしながら、ＩＬ−１７産生Ｔｈ１７細胞の全てが、自己免疫組織炎症および疾患（「病原性」）を誘導するわけではない。正常な腸管粘膜をライニングするＴｈ１７細胞は、腸管マイクロフローラの組織侵入を防止し、上皮障壁機能を促進することにより組織ホメホスタシスにおける重要な役割を担うと考えられる（Ｇｕｇｌａｎｉ  ａｎｄ  Ｋｈａｄｅｒ  ２０１０）。さらに、Ｔｈ１７細胞は、病原体、例えば、真菌（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ））および細胞外細菌（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））（Ｇａｆｆｅｎ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｒｏｍａｎｉ  ２０１１）に対する宿主防御における重要な役割を担う。したがって、Ｔｈ１７細胞は、その機能の大きい程度の多様性を示す：一方で、それらは組織炎症および自己免疫の強力な誘導因子であり、他方で、それらは組織ホメホスタシスおよび障壁機能を促進する。インビボでＴｈ１７細胞のこれらの逆の機能を制御する細胞外シグナルおよび細胞内機序は、部分的にのみ公知であり、集中的に研究されている。
【０３９１】
区別されるエフェクター機能を有する異なるタイプのＴｈ１７細胞は、サイトカインの異なる組合せによりインビトロで生成することができる。２つのサイトカインＩＬ−６およびＴＧＦβ１は、インビトロでナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化を誘導し得るが、それらの細胞は実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、中枢神経系の自己免疫疾患モデルの不十分な誘導因子であることが示されている（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｖｅｌｄｈｏｅｎ，Ｈｏｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。炎症促進サイトカインＩＬ−２３へのこれらの細胞の曝露により、それらを疾患誘導病原性細胞とすることができる（ＭｃＧｅａｃｈｙ，Ｂａｋ−Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ａｗａｓｔｈｉ，Ｒｉｏｌ−Ｂｌａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｊａｇｅｒ，Ｄａｒｄａｌｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９，ＭｃＧｅａｃｈｙ，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。実際、サイトカインの他の組合せ、例えば、ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３（Ｇｈｏｒｅｓｃｈｉ，Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）またはＴＧＦβ３＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３は、インビボ養子移植時に重度の組織炎症を有する強力なＥＡＥを誘発するＴｈ１７細胞の分化を誘導し得る。これらの区別されるインビトロ分化プロトコルにより生成されたＴｈ１７細胞の遺伝子発現プロファイルの比較は、病原性Ｔｈ１７細胞を、病原性Ｔｈ１７細胞中で発現される１６個の遺伝子（例えば、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ−２３Ｒ）の炎症促進モジュールおよび非病原性細胞中で発現される７つの遺伝子（例えば、ＩＬ−１０）の調節モジュールからなる非病原性Ｔｈ１７細胞から区別する遺伝子シグネチャーの同定をもたらした。ＩＬ−２３への非病原性Ｔｈ１７細胞の曝露は、調節モジュールの発現が縮小および炎症促進モジュールの発現の誘導によりそれらを病原性表現型に変換し、このことはＩＬ−２３がＴｈ１７細胞の機能的表現型を決定付けるマスターサイトカインであることを示唆する。
【０３９２】
ヒトにおいて、２つの異なるサブタイプのＴｈ１７細胞が異なるタイプの病原体について特異性を有するとも記載されている。ＩＦＮγとＩＬ−１７を同時産生するＴｈ１７細胞をカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に応答して生成した一方、ＩＬ−１０とＩＬ−１７を同時産生するＴｈ１７細胞は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染についての特異性を有する（Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，Ｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）。ＩＬ−１およびＩＬ−２３の両方は、抗原に応答してこれらの機能的に区別されるサブタイプのＴｈ１７細胞のそれぞれの誘導に寄与した。これらのヒトＴｈ１７細胞サブセットと、マウス中の病原性および非病原性Ｔｈ１７細胞との比較は、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）特異的Ｔｈ１７細胞が病原性Ｔｈ１７細胞を炎症促進モジュールの発現により反映し得る一方、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）特異的Ｔｈ１７細胞が自己免疫のマウスモデルにおいて記載されている非病原性Ｔｈ１７細胞とより類似することを示唆する。
【０３９３】
病原性および非病原性Ｔｈ１７細胞をドライブするキー分子スイッチの同定は、病原性Ｔｈ１７細胞の選択的阻害を可能とする一方、非病原性潜在組織保護Ｔｈ１７細胞をスペアする。今日まで、ＩＬ−２３が分化するＴｈ１７細胞の病原性表現型を誘発する細胞内機序は、十分に理解されていない。ゲノムアプローチは、そのような候補機序を見出すための魅力的で公平なアプローチを提供する（Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）が、病原性および非病原性細胞がインビボで同時に存在し、インビトロで同時分化する可能性が高く、よりわずかなシグナルを検出する能力を限定する。実際、病原性および非病原性由来細胞の集団を比較する従来のシグネチャーは、強力な候補調節因子ではなく、むしろエフェクター分子を見出した。単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑの進歩は、そのようなよりわずかであるが生理学的に重要な調節因子を同定する手段を開く。
【０３９４】
ここで、インビボ自己免疫病変およびインビトロ分化からのＴｈ１７細胞の単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルを使用してＴｈ１７病原性の新規調節因子ＣＤ５Ｌ（ＣＤ５様）を同定した。ＣＤ５Ｌは、非病原性Ｔｈ１７細胞中で主に発現され、ＩＬ−２３への曝露時に下方調節される。ＣＤ５Ｌ欠損は、Ｔｈ１７細胞リピドームを調節し、多価不飽和脂肪アシル（ＰＵＦＡ）と、飽和脂質との間のバランスを変更し、次いでＴｈ１７細胞分化のマスター転写因子のＲｏｒγｔの活性および結合に影響を与えることにより、非病原性Ｔｈ１７細胞を疾患誘導病原性Ｔｈ１７細胞に変換する。したがって、ＣＤ５Ｌは、目下、Ｔｈ１７細胞機能状態を区別する重要な調節因子として同定され、Ｔ細胞脂質代謝がＴｈ１７細胞の病原性を調節する経路の統合成分として同定される。
【０３９５】
結果：Ｔｈ１７細胞は、細胞外病原体に対する宿主防御および腸管組織ホメオスタシスの維持における重要な役割を担うが、複数の自己免疫疾患の病原性誘導にも関与する。「病原性」および「非病原性」Ｔｈ１７細胞状態などのバランス化に関与する機序は、ほとんど不明のままである。ここでは、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用してＣＤ５Ｌ（ＣＤ５様）を、非病原性Ｔｈ１７細胞中で選択的に発現されるが、病原性Ｔｈ１７細胞中では発現されない新規調節因子の１つとして同定した。ＣＤ５Ｌは、Ｔｈ１７分化に影響を与えない一方、それは主要な機能スイッチとして機能する。なぜなら、ＣＤ５Ｌの損失が「非病原性」Ｔｈ１７細胞を、インビボでマウスにおいて自己免疫疾患を促進する「病原性」Ｔｈ１７細胞に変換するためである。ＣＤ５Ｌは、ＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞が飽和脂質、例として、コレステロール代謝物の発現増加、および多価不飽和脂肪アシル（ＰＵＦＡ）の発現減少を示すように細胞内リピドームをモジュレートすることによりこの効果を媒介することが示される。次いで、これは、Ｔｈ１７細胞のマスター転写因子のＲｏｒγｔのリガンド利用可能性および機能、ならびにＴ細胞機能を変更する。この研究は、Ｔｈ１７細胞の機能状態の重要な調節因子としてＣＤ５Ｌを同定し、Ｔ細胞中の免疫保護および疾患のバランス化における脂質飽和および脂質代謝の重要性を強調した。
【０３９６】
単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑは、病原性の高ランキング候補調節因子としてＣＤ５Ｌを同定する：Ｔｈ１７細胞機能の候補調節因子を同定するため、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルを、インビボでＥＡＥの間にＣＮＳから単離され、またはインビトロで非病原性条件（ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６）および病原性（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３）条件下で分化させたＴｈ１７細胞から分析した。手短に述べると、３つの一連の証拠を使用して遺伝子を病原性との潜在的なそれらの関連性についてランク付けした：（１）２つの反相関モジュール：「炎症促進モジュール」（Ｉｌ１７ａの発現と正の相関）および「調節モジュール」（Ｉｌ１０の発現と正の相関）の存在を示したインビトロで（非病原性条件において）分化させた単一Ｔｈ１７細胞にわたる転写物の発現の共分散分析；（２）ＰＣ１上の細胞の局在が病原性遺伝子の発現に関連するように細胞が病原性スペクトルに及ぶことを示したいずれかの条件下で分化させた単一Ｔｈ１７細胞の主成分分析（ＰＣＡ）；および（３）細胞が第１のＰＣ（エフェクターからメモリーから疲弊状態）および第２のＰＣ（ナイーブ様から最終分化状態）に沿って広い機能スペクトルに及ぶことを示したインビボでＥＡＥの間にＣＮＳおよびリンパ節から単離された単一Ｔｈ１７のＰＣＡ。
【０３９７】
Ｃｄ５ｌ（Ｃｄ５様）は、２つのキー特性の驚くべき組合せを示す潜在的調節因子の単一細胞分析による高ランキング遺伝子の１つであった：（１）それは、インビトロで非病原性条件下で誘導されたＴｈ１７細胞中でのみ発現され（図４５Ｄ）；しかし（２）それらの非病原性細胞中で、それはＴｈ１７細胞中の炎症促進モジュール中の他の遺伝子との共分散のメンバーとして発現された。第１に、病原性条件（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３）下で誘導されたＴｈ１７細胞の大部分（約８０％）は、ＣＤ５ｌ発現を欠いた一方、非病原性（ＴＧＦ−ｂ１＋ＩＬ−６）条件下で分化させたＴｈ１７細胞は、主にＣｄ５ｌを発現した（図４５Ｃ）。さらに、非病原性条件（ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６）下で分化させ、ソートされたＩＬ−１７Ａ＋（ＧＦＰ＋、ＧＦＰは、ＩＬ−１７プロモーターの制御下にある）細胞のほとんどは、Ｃｄ５ｌを発現し（図４５Ｄ、上段左パネル）、ＩＬ１７モジュールとのその元の関連性と一致した（非ソート細胞；下段）。対照的に、２つの異なる病原性条件（ＩＬ−１□＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３またはＴＧＦβ３＋ＩＬ−６）下で分化させたＴｈ１７細胞は、Ｔ細胞の大多数においてＣｄ５ｌ発現を欠いた。同様に、活性ＥＡＥを受けるマウスの中枢神経系（ＣＮＳ）からソートされた脳炎誘発性Ｔｈ１７細胞（ＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ．ＧＦＰ＋）は、単一細胞レベルにおいていかなるＣｄ５ｌも発現しなかった（図４５Ｄ、下段右パネル）。第２に、ＣＤ５Ｌは、炎症促進モジュールの定義シグネチャーと高度に正に相関し、調節モジュールと負に相関する。特に、これは、発現が事前に定義された病原性遺伝子シグネチャーの発現とも最も強力に相関する炎症促進モジュール中の上位５つの遺伝子のうちに存在する（図４５Ａ、経験的ｐ値＜０．０５）。さらに、より高いレベルのＣｄ５ｌを発現する非病原性Ｔｈ１７細胞は、病原性シグネチャーと同様に、上記のＰＣ１についてより低いスコアも有する（図４５Ｂ、０．４４のピアソン相関；ｐ＜１０−７）。
【０３９８】
ＣＤ５Ｌは、スカベンジャー受容体システインリッチスーパーファミリーのメンバーである（Ｓａｒｒｉａｓ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。この発現は、マクロファージにおいて既に報告され（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｈｉｒｏｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、エンドサイトーシス後の脂肪細胞中で細胞質脂肪酸シンターゼに結合することが示されている。これは、病原体関連分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ（ＰＡＭＰ））についての受容体であり、自然免疫応答の調節における機能を有し得ることも報告されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。しかしながら、これはＴ細胞中で発現されると報告されておらず、したがって、Ｔ細胞機能におけるその役割は同定されていない。
【０３９９】
ＣＤ５Ｌ発現は、インビトロおよびインビボで非病原性Ｔｈ１７細胞と特異的に関連する：非病原性条件下で分化させたが、ＩＬ１７炎症モジュールと関連するＴｈ１７細胞中のＣＤ５Ｌの排他的発現が、非病原性および病原性状態間の転移の調節におけるユニークな役割を示し得ることが仮定された。炎症モジュールとの同時発現および病原性シグネチャーとの相関（図４５Ａ、Ｂ）自体が病原性の正の調節因子としての機能を示唆し得た一方、病原性条件下でインビトロで分化させ、またはＣＮＳ中の病変から単離されたＴｈ１７細胞からのＣＤ５Ｌの明らかな非存在（図４５Ｃ、Ｄ）は、より細かい役割を示唆する。特に、ＣＤ５Ｌは病原性の負の調節因子であり得ることが仮定され、このことは真に病原性の細胞からのその非存在を説明する。特に、細胞の状態変化の負の調節因子のｍＲＮＡは、それらが酵母（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００３；Ｐｅ’ｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００２）からヒト（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００７）までの真核生物中で負に調節するモジュールと同時調節されることが多い。
【０４００】
この仮説を試験するため、種々の分化条件下で培養されたナイーブＣＤ４Ｔ細胞のｑＰＣＲ（図４５Ｅ、Ｆ）およびタンパク質発現分析（図４５Ｇ）による、ＣＤ５Ｌがインビトロおよびインビボの両方で非病原性Ｔｈ１７細胞中でユニークに発現される初期の知見を、最初に検証および拡張した。ｍＲＮＡレベルにおいて、Ｔｈ０、Ｔｈ１またはＴｈ２ヘルパーＴ細胞（図４５Ｅ）においてはＣｄ５ｌ発現がほとんど見出されず、または見出されず、ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６により分化させたＴｈ１７細胞中で高い発現が見出されたが、ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３により分化させたＴｈ１７細胞中またはｉＴｒｅｇ中では発現がほとんど見出されず、または見出されなかった（図４５Ｅ）。重要なことに、フローサイトメトリーにより、ＣＤ５Ｌタンパク質発現について類似のパターンが観察される（図４５Ｇ）。
【０４０１】
次に、ＣＤ５Ｌ発現がインビボで弱病原性Ｔｈ１７細胞と関連するか否かを追求した。第１に、Ｃｄ５ｌ発現を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ３５−５５）による免疫化後にマウスから単離されたＴｈ１７細胞中で分析した。Ｔｈ１７細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＬ−１７．ＧＦＰ＋）を末梢（脾臓）からソートし、Ｃｄ５ｌがＩＬ−１７＋Ｔ細胞中でのみ発現され、ＩＬ−１７−Ｔ細胞中では発現されないことが見出された（図４５Ｈ、左パネル）。全く対照的に、Ｃｄ５ｌは、ＣＮＳからのＴｈ１７細胞中では発現されない一方、ｌ１７（図４５Ｈ、右パネル）の有意な発現が見られ、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータと一致する（図４５Ｄ）。次に、Ｃｄ５ｌ発現を、腸管粘膜をライニングし、炎症と関連しないナイーブマウスから単離されたＴｈ１７細胞に対して分析した。ＩＬ−１７Ａ．ＧＦＰ＋およびＩＬ−１７Ａ．ＧＦＰ−ＣＤ４Ｔ細胞を、Ｔｈ１７細胞が組織ホメオスタシスおよび粘膜障壁機能に寄与すると考えられるナイーブマウスの腸管間膜リンパ節（ｍＬＮ）および固有層（ＬＰ）から単離した。正常腸管粘膜のｍＬＮおよびＬＰから回収されたＩＬ−１７−Ｔ細胞でなく、ＩＬ−１７＋が、高レベルのＣｄ５ｌを発現した（図４５Ｉおよびデータ示さず）。したがって、ＣＤ５Ｌは、インビボで非病原性（病原性でない）Ｔｈ１７細胞中で発現される遺伝子である。
【０４０２】
最終的に、Ｔｈ１７細胞をより病原性にすることが公知のＩＬ−２３曝露が、Ｃｄ５ｌ発現を直接調節し得るか否かを試験した。ＣＤ５ＬがＩＬ２３依存性病原性の正の調節因子である場合、その発現がＩＬ２３により増加される一方、それが負の調節因子である場合、その発現が抑制されることが仮定された。ＩＬ−２３ＲがＴ細胞活性化の４８時間後に誘導されたとき、ナイーブＴ細胞をＴＧＦβ１＋ＩＬ−６により４８時間分化させ、次いで新たな培地中でＩＬ−２３を用いてまたは用いずに拡張させた。ＩＬ−２３の添加は、ＰＢＳ対照と比較してＣｄ５ｌ発現を有意に抑制し（図４５Ｆ）、炎症促進モジュールを獲得し、病原性Ｔｈ１７細胞になるそれらの細胞と、および病原性の負の調節因子としてのＣＤ５Ｌの仮定の割り当てと一致した。
【０４０３】
ＣＤ５Ｌは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７分化に影響を与えることなくＴｈ１７細胞エフェクター機能を抑制し／減衰させる：ＣＤ５Ｌがインビボで任意の機能的役割を担うか否かを分析するため、野生型（ＷＴ）およびＣｄ５ｌ欠損マウスをＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡにより免疫化してＥＡＥを誘導した。ＣＤ５Ｌ−／−マウスは、少なくとも２８日間持続する有意により重度の臨床ＥＡＥを示した一方、ＷＴマウスは、免疫化１２日後に回復し始めた（図４６Ａ）。次に、ＣＤ４Ｔ細胞の表現型をＥＡＥの過程の間に分析した。ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の類似の頻度が、ＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−マウスにおいて見出され、このことは疾患の重症度の増加がＣｄ５ｌ欠損マウス中のＴｒｅｇの数の減少に起因しないことを示唆した（図５０Ａ）。他方、ＣＤ５Ｌ−／−マウスのＣＮＳにおいて有意により高い割合のＩＬ−１７産生ＣＤ４Ｔ細胞およびより低い割合のＩＦＮγ＋ＣＤ４Ｔ細胞（図４６Ａおよび５１Ｂ）が観察された。さらに、インビトロＭＯＧ再活性化に応答して、ＣＤ５Ｌ−／−マウスの流入領域リンパ節（ｄＬＮ）からの細胞は、より高い増殖応答を示し、より多いＩＬ−１７を産生した（図５１Ｃ、Ｄ）。これは、Ｔｈ１７細胞の機能の定義におけるＣＤ５Ｌについての直接または間接的役割のいずれかと一致する。
【０４０４】
ＣＤ５Ｌの効果がＴｈ１７細胞の分化における直接的役割に起因するか否かを決定するため、ナイーブＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−ＣＤ４Ｔ細胞を非病原性Ｔｈ１７細胞条件下で分析し、ＣＤ５ＬがシグネチャーＴｈ１７遺伝子の発現を直接調節するか否かを分析した。ＣＤ５Ｌの損失は、細胞内サイトカイン染色により、またはＥＬＩＳＡによりＩＬ−１７発現により計測されたとおり、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７分化に影響を与えず（図４６Ｂ、Ｃ）、他のシグネチャーＴｈ１７遺伝子、例として、Ｉｌ１７ｆ、Ｉｌ２１、Ｉｌ２３ｒまたはＲｏｒｃ（図４６Ｄ）についても影響を与えなかった。しかしながら、非病原性Ｔｈ１７分化条件下で、ＷＴ  Ｔｈ１７細胞はＩＬ−１０を産生する一方、ＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞は、ＥＬＩＳＡ（図４６Ｃ）またはｑＰＣＲ分析（図４６Ｄ）により測定されたとおりＩＬ−１０の発現の減少を示した。これらの観察は、ＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞分化を直接調節しないこと、Ｔｈ１７細胞分化が単独ではＣＤ５Ｌ−／−マウスにおけるＥＡＥへの感受性の増加を説明し得ないが、ＣＤ５Ｌが実際に分化Ｔｈ１７細胞の内部状態に影響を与え得ることを示唆する。
【０４０５】
次に、ＣＤ５Ｌがエフェクター／メモリーＴｈ１７細胞の拡張または維持における任意の役割を有するか否かを決定した。この目的のため、非病原性条件下で分化させたナイーブＴｈ１７細胞を洗浄し、ＩＬ−２３を用いずに再プレーティングした。再刺激時、ＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞は、有意により高い割合のＩＬ−１７Ａ＋細胞およびＩＬ−２３Ｒ＋細胞（図４６Ｅ）を有し、このことはＣＤ５Ｌ欠損がより安定的に拡張するＴｈ１７細胞をもたらすことを示唆した。この結果と一致して、ＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞は、ｑＰＣＲにより測定されるとおり、より多いＩｌ１７ａおよびＩｌ２３ｒならびにより少ないＩｌ１０を発現した（図４６Ｆ）。したがって、ＣＤ５Ｌは、ナイーブＴ細胞の初期Ｔｈ１７細胞分化を調節しないが、その拡張および／またはエフェクター機能を経時的に制御しない。この結果と一致して、ＣＤ５Ｌ−／−マウスからエクスビボで直接単離されたエフェクターメモリー細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋）は、有意により高いＩＬ−１７およびより低いＩＬ−１０レベル（図４６Ｇ）を発現した。ＩＬ−１７を産生するこのより高い割合のエフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ５Ｌ−／−マウスのレパートリーを持続するＴｈ１７細胞のより大きい安定性およびより高い頻度を反映し得た。インビボで単離されたＴｈ１７細胞もより多いＩＬ−１７を細胞ベースで産生するか否かに対処するため、ＲＯＲγｔ＋（ＧＦＰ＋）エフェクター／メモリーＴ細胞を、ＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−マウスからソートし、エクスビボ活性化時にそれらのサイトカイン産生を分析した。ＣＤ５Ｌ−／−マウスからのＲＯＲγｔ．ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１７のかなりより高い産生およびＩＬ−１０のより低い産生を示し、このことはＲＯＲγｔ＋細胞がＣＤ５Ｌの非存在下でより良好なＩＬ−１７産生因子であることを示唆した（図４６Ｈ）。
【０４０６】
ＣＤ５Ｌは、Ｔｈ１７細胞の病原性を調節する主要なスイッチである：ＣＤ５Ｌの損失が非病原性Ｔｈ１７細胞を病原性の疾患誘導Ｔｈ１７細胞に変換し得るか否かを研究するため、ＣＤ５Ｌ−／−マウスを、ＭＯＧ３５−５５／ＩＡｂについて特異的なＴＣＲを発現する２Ｄ２トランスジェニックマウスに交雑した。ＣＤ５Ｌを欠損するナイーブ２Ｄ２トランスジェニックＴ細胞を、非病原性（ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６）Ｔｈ１７条件下で分化させ、次いでＷＴレシピエント中に移植した。移植前、ＩＬ−１７＋Ｔ細胞の類似の頻度がＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２ナイーブ細胞（図４７Ａ）から生成され、このことはＣＤ５ＬがナイーブＴ細胞のＴｈ１７分化に影響を与えない観察と一致した。
【０４０７】
次に、ＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２細胞のレシピエントにおける臨床および組織学的疾患進行を比較した。予測されるとおり、ＷＴ  ２Ｄ２Ｔｈ１７細胞の多くのレシピエント（６／１３）は、臨床または組織学的ＥＡＥのほんのわずかな兆候を示し、または示さなかった。際立ったことに、全ての（１２／１２）ＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２レシピエントは、視神経炎を伴う重度のＥＡＥを発症した。さらに、ＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２レシピエントは、有意な体重損失を示し、ＣＮＳ中でより多くの異所性リンパ濾胞様構造（高度に病原性のＩＬ−２３処理Ｔｈ１７細胞により誘導される疾患の特徴）を発症した（図４７Ｂ、Ｃ）（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。したがって、ＣＤ５ＬのＴ細胞内因性発現は、Ｔｈ１７細胞の病原性の抑制における肝要な役割を担う。養子移植後、ＥＡＥを受けるマウスのＣＮＳからＴ細胞を単離した。２Ｄ２ＣＤ５Ｌ−／−Ｔ細胞は、ＷＴ２Ｄ２Ｔ細胞と比較してＩＬ−１７産生Ｔ細胞のかなりより高い頻度およびＩＬ−１０のレベルの低減を保持した（図４７Ｄ）。養子移植時、ＷＴ２Ｄ２Ｔ細胞は、インビボでＩＦＮγの産生を獲得した一方、極めて小さい比率のＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２Ｔ細胞のみがＩＦＮγを産生し、このことはＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞の安定性も調節し得ることを示唆した。この観察と一致して、ナイーブＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２Ｔ細胞をＷＴ宿主中に移植し、マウスをＥＡＥ誘導なし（百日咳毒素を与えず）でＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡにより免疫化した場合、ＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２Ｔ細胞は、ＷＴと比較して高い頻度のＩＬ−１７Ａ＋Ｔ細胞を蓄積した。際立ったことに、ＷＴ  Ｔ細胞がＩＬ−１０を発現した一方、ＣＤ５Ｌ−／−２Ｄ２Ｔ細胞はＩＬ−１０を発現しなかった（図４７Ｅ）。
【０４０８】
ＩＬ−２３は、ＣＤ５Ｌの発現を抑制し得るため、およびＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞病原性を抑制するように機能するため、ＣＤ５Ｌ発現の持続がＴｈ１７細胞のＩＬ−２３ドライブ病原性をアンタゴナイズするはずであることが結論付けられた。この仮定を試験するため、Ｔｈ１７細胞中のＣＤ５Ｌの異所性発現のためのレトロウイルスベクターを生成した。ナイーブ２Ｄ２Ｔ細胞を病原性分化条件（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３）下で分化させ、ＣＤ５Ｌにより形質導入し、ＷＴレシピエント中に移植し、体重損失および臨床ＥＡＥの発症が続いた。移植前、ＣＤ５Ｌにより形質導入された２Ｄ２Ｔ細胞は、類似のＩＬ−１７発現および増加したＩＬ−１０発現を有した（図５１Ａ）。移植後、病原性条件下で分化させたＴｈ１７細胞中のＣＤ５Ｌの異所性発現は、ＷＴ対照と比較して、それらがマウスの体重損失の低減およびＥＡＥの誘導の有意な減少をもたらす点でそれらの病原性を低減させた（図５１Ｂ、Ｃ）。さらに、インビボで移植されたＣＤ５Ｌ過剰発現２Ｄ２Ｔ細胞は、ＩＬ−１７産生を損失し、移植細胞のほとんどがＩＦＮγを産生し始めた（図５１Ｄ）。したがって、ＣＤ５Ｌは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７分化を調節しないが、ＣＤ５Ｌの損失が非病原性Ｔｈ１７細胞を、インビボでＩＬ−１７を安定的に産生する病原性Ｔｈ１７細胞に変換する点でＴｈ１７細胞の機能状態に影響を与え、Ｔｈ１７細胞中のその持続過剰発現は、それらの細胞がＩＬ−１７の発現を損失し、インビボでＩＦＮγ産生Ｔｈ１表現型を獲得する点で病原性Ｔｈ１７細胞を弱病原性および弱安定表現型に変換する。これら２つのデータセットは、Ｔｈ１７細胞の機能的病原性状態の負の調節因子としてのＣＤ５Ｌの役割を明確に支持する。
【０４０９】
これらの機能的知見と一致して、ＣＤ５Ｌは、Ｔｈ１７細胞中で既に定義される病原性／非病原性遺伝子シグネチャーの発現も調節する。これを示すため、ナイーブＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−Ｔ細胞を非病原性ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６条件下で分化させ、それらを、いかなる外因性ＩＬ−２３も添加せずに新たな培地中で４８時間レストし、次いでｑＰＣＲによりｍＲＮＡ発現分析を行った。非病原性条件下で分化させたＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞は、病原性シグネチャーのいくつかのエフェクター分子、例として、Ｉｌ２３ｒ、Ｉｌ３、Ｃｃｌ４、Ｇｚｍｂ、Ｌｒｍｐ、Ｌａｇ３およびＳｇｋ１を有意に上方調節し、非病原性シグネチャーのいくつかの遺伝子、例として、Ｉｌ１０、Ｉｌ９およびＭａｆを下方調節した（図４７Ｆ）。しかしながら、いくつかの他のシグネチャー遺伝子は、ＣＤ５Ｌにより影響を受けず、このことはより細かい機序を示唆した。
【０４１０】
ＣＤ５Ｌは、Ｒｏｒγｔリガンド利用可能性および機能をモジュレートする飽和から不飽和脂質までのＴｈ１７細胞リピドームバランスをシフトする：ＣＤ５Ｌは、脂肪細胞の細胞質中で脂肪酸シンターゼに結合することにより、脂質代謝を調節することが公知であるため（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）、ＣＤ５Ｌが、Ｔ細胞中で脂質代謝物を特異的に調節することによりＴｈ１７細胞機能も調節し得ることが予測された。この仮定を試験するため、脂質代謝がＣＤ５Ｌにより調節され、ＣＤ５Ｌ−／−マウスからのＴｈ１７細胞中で観察される病原性の増加と関連するか否かを分析した。非病原性（ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６）および病原性（ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３）条件下で分化させたＷＴおよびＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞のリピドームをプロファイリングした。質量分析および液体クロマトグラフィーを使用して分化するＴｈ１７細胞の細胞内で、または上清中で約２００個の脂質代謝物を分解および同定することが可能であった。ＷＴとＣＤ５Ｌ−／−との間で示差的に発現されたそれらの代謝物のうち、非病原性条件下で分化させたＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞および病原性条件下で分化させたＷＴ  Ｔｈ１７細胞のリピドーム間の顕著な類似性（図４８Ａ）が観察された。他の代謝変化のうち、液体クロマトグラフィーおよび質量分析により計測されるとおり（図４８Ｂおよび５２Ａ）、ＣＤ５Ｌ欠損が飽和脂質（ＳＦＡ）、例として飽和脂肪アシルおよびコレステロールエステル（ＣＥ）を担持する代謝物の、ならびに顕微鏡観察により示されるとおり（図５２Ｂ）、遊離コレステロールのレベルを有意に増加させた。さらに、ＣＤ５Ｌの非存在は、多価不飽和脂肪アシル（ＰＵＦＡ）を担持する代謝物の有意な低減をもたらした（図４８Ｂ）。ＣＥの類似の増加およびＰＵＦＡの低減が、非病原性ＷＴ細胞と比較して２つの病原性条件（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３およびＴＧＦβ３＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３）のいずれかの下で分化させたＴｈ１７細胞のリピドーム中で観察される（図４８Ｃおよび図５１Ａ）。したがって、Ｔｈ１７細胞病原性は、飽和脂質の増加およびＰＵＦＡ代謝物の減少において反映されるとおりリピドーム飽和のバランスのシフトと関連する。
【０４１１】
コレステロール代謝物、例えば、オキシステロールは、Ｒｏｒγｔのアゴニストリガンドとして機能することが既に報告されている（Ｊｉｎ，Ｍａｒｔｙｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｓｏｒｏｏｓｈ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。従来のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ分析（Ｘｉａｏ，Ｙｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）は、ＲｏｒγｔがＩｌ２３ｒおよびＩｌ１７（図４８Ｄ）のプロモーターおよびイントロン領域中ならびにＩｌ１０中のＣＮＳ−９近くのいくつかの部位において結合することを示唆し、そこではＩｌ１０発現を調節する他の転写因子、例えば、ｃＭａｆも結合する。上記のとおり、ＣＤ５Ｌは、Ｒｏｒγｔ＋Ｔｈ１７細胞中でＩＬ−２３ＲおよびＩＬ−１７の発現を抑制し、ＩＬ−１０産生を促進する。なぜなら、ＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞がより高いコレステロール代謝物およびより低いＰＵＦＡを含有するためである（図４８Ａ、Ｂ）。これらのデータをまとめると、ＣＤ５Ｌは、ＳＦＡ−ＰＵＦＡバランスへの影響を通して、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０の発現をそれらの標的へのＲｏｒγｔの結合に影響を与えることにより調節することが仮定された。
【０４１２】
この仮定を試験するため、ＣＤ５Ｌが、ＣｈＩＰ−ＰＣＲおよびルシフェラーゼレポーターアッセイを使用することによりＲｏｒγｔ活性をモジュレートするか否かを最初に評価した。この仮定と一致して、ＲｏｒγｔのＣｈＩＰは、ＷＴと比較してＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞中でＩｌ１７およびＩｌ２３ｒ領域中のＲｏｒγｔの有意に高い結合およびＩｌ１０領域への有意に低減した結合を示した（図４８Ｄ、Ｅおよび５２Ｃ）。一貫して、ＣＤ５Ｌの異所性過剰発現は、Ｉｌ１７およびＩｌ２３ｒプロモータールシフェラーゼレポーターのＲｏｒγｔ依存性転写を抑制するために（図４８Ｆおよび５２Ｄ）、およびＲｏｒγｔ存在下でＩｌ１０レポーターの転写を向上させるために十分である（図４８Ｇ）。
【０４１３】
次に、ＳＦＡまたはＰＵＦＡの添加によるＷＴ  Ｔｈ１７細胞のリピドームバランスの変化が、ゲノム領域へのＲｏｒγｔ結合を調節し得るか否かを試験し（図４８ＤＥおよび５２Ｃ）、ＳＦＡの存在下で、Ｉｌ１７およびＩｌ２３ｒゲノム要素へのＲｏｒγｔ結合のエンリッチメントの有意な増加が存在する一方、ＰＵＦＡの存在下のＲｏｒγｔの結合の減少が存在したことを見出した（図４８Ｄおよび５２Ｃ）。ＰＵＦＡの添加は、Ｉｌ１０  ＣＮＳ−９領域へのＲｏｒγｔ結合のエンリッチメントも有意に増加させ（図４８Ｅ）、このことはＴｈ１７細胞の脂質含有物の操作が実際にＲｏｒγｔ  ＤＮＡ結合能をモジュレートし得ることを示唆する。
【０４１４】
最終的に、ＣＤ５Ｌが、Ｒｏｒγｔリガンドを限定することによりＲｏｒγｔ転写活性を調節する場合、Ｒｏｒγｔの外因性アゴニストの添加がＣＤ５Ｌ誘導抑制をレスキューすることが結論付けられた。実際、Ｒｏｒγｔの内因性リガンドとして既に示される７，２７ジヒドロオキシコレステロール（Ｓｏｒｏｏｓｈ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）の添加は、Ｉｌ１７レポーター転写のＣＤ５Ｌドライブ抑制をレスキューし、このことはリガンド利用可能性がＣＤ５ＬによるＲｏｒγｔ機能の調節に部分的に寄与することを示唆した（図４８Ｈ）。他方で、ＰＵＦＡの添加は、対照細胞中でＲｏｒγｔドライブＩｌ１７ａ転写を減少させたが、ＣＤ５Ｌを発現する細胞中では減少させず（図４８Ｉ）、このことはＰＵＦＡの機能がＲｏｒγｔリガンドに依存し得ることを示唆した。実際、Ｒｏｒγｔがアゴニストリガンドの存在下でＩｌ２３ｒエンハンサーを強力にトランス活性化させ得る一方、アゴニストリガンドへのＰＵＦＡの添加は、Ｒｏｒγｔ媒介Ｉｌ２３ｒトランス活性化をほぼ完全に阻害し、Ｉｌ１０トランス活性化を向上させた（図４８Ｊ、Ｋ）。この観察は、ＰＵＦＡがＲｏｒγｔリガンド結合をモジュレートし得、したがって、Ｉｌ２３ｒおよびＩｌ１０をトランス活性化させるＲｏｒγｔの能力に影響を与えることを示唆する。他方、ＳＦＡ自体の添加がＲｏｒγｔ依存性転写にほとんど影響しなかった一方、それにもかかわらず、それはオキシステロールの機能を改変した（図４８Ｊ、Ｋ）。したがって、ＣＤ５Ｌは、リピドームバランスをシフトし、Ｒｏｒγｔリガンド利用可能性および機能を限定することにより病原性／非病原性シグネチャーのメンバーのＩｌ２３ｒおよびＩｌ１０の発現を調節する。
【０４１５】
ＰＵＦＡおよびＳＦＡは、Ｔｈ１７細胞機能を調節し、Ｔｈ１７細胞のＣＤ５Ｌ依存性調節に寄与し得る：非病原性条件下で分化させたＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞は、脂質飽和の変更されたバランスを有するため、ならびにＰＵＦＡおよびＳＦＡは、Ｒｏｒγｔ結合および機能的活性をモジュレートし得るため、脂肪酸部分のＴｈ１７細胞機能との関連性およびＣＤ５ＬドライブＴｈ１７細胞病原性へのその寄与を分析した。Ｔｈ１７細胞の生成に対するＰＵＦＡおよびＳＦＡを添加する効果を最初に試験した。ＷＴ  Ｔｈ１７細胞をＴＧＦβ１＋ＩＬ−６により分化させ、新たな培地中でＰＵＦＡまたはＳＦＡのいずれかの存在下でＩＬ−２３を使用して拡張させた。ＰＵＦＡは、ＩＬ−１７＋およびＩＬ−２３Ｒ．ＧＦＰ＋ＣＤ４Ｔ細胞の割合を抑制し（図４９Ａ）、このことはＰＵＦＡが病原性条件下でＴｈ１７細胞機能を限定し得ることを示唆した。他方、ＳＦＡの添加は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２３Ｒ発現の両方の発現を増加させたが、この効果は、有意でなかった。なぜなら、病原性Ｔｈ１７細胞中の既に極めて高いレベルのＳＦＡが、外因性ＳＦＡの添加によりさらに変更され得なかったためと考えられる。この結果は、Ｉｌ１７およびＩｌ２３ｒ発現のｑＰＣＲ分析と一致し、さらに、ＰＵＦＡの効果は、Ｒｏｒγｔ−／−Ｔｈ１７細胞中で停止され（図４９Ｂ）、このことはＰＵＦＡの機能がＲｏｒγｔ発現を要求することを示唆する。非病原性条件下で分化させたＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞は、ＰＵＦＡ処理にも感受性であり、ＩＬ−１７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の低減をもたらす（図４９Ｃ）。
【０４１６】
次に、Ｔｈ１７細胞病原性への脂質飽和の寄与を研究した。脂質飽和のバランスが非病原性ＷＴ  Ｔｈ１７細胞および病原性ＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞を区別する場合、ＷＴへのＳＦＡ、およびＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞（ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６）へのＰＵＦＡの添加がＴｈ１７細胞病原性に関連する転写シグネチャーの逆の変化をもたらし得ることが予測された。したがって、（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒを使用して）ＴＧＦβ１＋ＩＬ−６により分化させたＳＦＡまたは対照処理ＷＴ  Ｔｈ１７細胞およびＰＵＦＡもしくは対照処理ＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞におけるＴｈ１７細胞分化および機能の３１６個の遺伝子シグネチャーの発現を分析した。ＰＵＦＡ処理ＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞はＷＴ非病原性Ｔｈ１７細胞と類似し、ＳＦＡ処理ＷＴ非病原性Ｔｈ１７細胞はＣＤ５Ｌ−／−Ｔｈ１７細胞とより類似することが見出された（図４９Ｄ）。ｑＰＣＲ分析は、ＰＵＦＡおよびＳＦＡが病原性シグネチャーにおけるキー遺伝子、例として、Ｉｌ１０、Ｉｌ２３ｒ、Ｃｃｌ５、Ｃｓｆ２およびＬａｇ３の発現を逆に調節することを確認した（図４９Ｄ）（特に、一部の場合、ＰＵＦＡおよびＳＦＡは、同一の効果を有する；例えば、Ｉｌ２２発現は、いずれかの脂肪酸による処理後により増加する）。まとめると、これらの観察は、脂質飽和のバランスが、Ｔｈ１７細胞トランスクリプトームを調節することによりＴｈ１７細胞のＣＤ５Ｌ依存性調節に寄与することを示唆する。
【０４１７】
考察：Ｔｈ１７細胞は、腸管ホメオスタシスの維持、病原体に対する宿主防御のマウントから自己免疫疾患の誘導に及ぶ多様な機能を示し得るＴヘルパー細胞系統である。いかにＴｈ１７細胞がそのような多様な逆の機能を媒介し得るかが、対処すべき重要な課題のままである。これは、特に重要である。なぜなら、抗ＩＬ−１７およびＴｈ１７ベース治療法が一部の自己免疫疾患において高度に有効であるが、Ｔｈ１７細胞が疾患プロセスに遺伝子的に関連している場合であっても（Ｃｈｏ  ２００８，Ｌｅｅｓ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、他の疾患において影響しなかったためである（Ｇｅｎｏｖｅｓｅ，Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｈｕｅｂｅｒ，Ｓａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｌｅｏｎａｒｄｉ，Ｍａｔｈｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｐａｐｐ，Ｌｅｏｎａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｂａｅｔｅｎ  ａｎｄ  Ｋｕｃｈｒｏｏ  ２０１３，Ｐａｔｅｌ，Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。単一細胞ゲノミクスを使用して、この問題に対処し、Ｔｈ１７細胞の新規機能的調節因子を同定した。
【０４１８】
ここで、ＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞の病原性に影響を与える新規調節因子の１つとして強調され、調査される。（１）ＣＤ５Ｌは非病原性Ｔｈ１７細胞中でのみ高度に発現されるが、それらの中で、炎症促進モジュールと共分散し、このパターンは病原性の負のモジュレーターであることと一致すること；（２）ＣＤ５ＬはＴｈ１７分化に影響を与えないが、Ｔｈ１７細胞の長期拡張および機能的表現型に影響を与えること；（３）ＣＤ５Ｌ欠損は、非病原性Ｔｈ１７細胞を病原性Ｔｈ１７細胞に変換すること；および（４）ＣＤ５Ｌは、Ｔｈ１７細胞中の脂質代謝を調節し、ＳＦＡとＰＵＦＡとの間のバランスを変更することが示される。
【０４１９】
一見逆説的であるが、ＣＤ５Ｌは、非病原性Ｔｈ１７細胞中でのみ発現されるが、炎症促進モジュールと共分散する。この初期観察により、ＣＤ５Ｌは非病原性から病原性への転移の負の調節因子であることが仮定される。なぜなら、そのような負の調節因子は、酵母からの生物において、調節ネットワーク中でそれらが抑制する標的と共分散することが公知であることが多いためである。機能的分析は、この仮定を証明し、ＣＤ５Ｌを実際に発現させて非病原性Ｔｈ１７細胞中で炎症促進モジュールを抑制することができることを示唆する。したがって、この特異的パターン（非病原性細胞中で排他的に発現するが、炎症促進モジュールと共分散する）を有する他の遺伝子は、炎症促進エフェクター機能をクエンチするリプレッサーでもあり得る。したがって、環境コンテクストまたはトリガーに応じて、非病原性Ｔｈ１７細胞は、単一遺伝子、例えば、ＣＤ５Ｌの発現を阻害することにより炎症促進または病原性Ｔｈ１７細胞に容易に変換され得る。これは、ＩＬ−２３ＲシグナリングがＣＤ５Ｌ発現を抑制し得ることおよびＣＤ５Ｌの持続的発現がＴｈ１７細胞の炎症促進機能を阻害することを明確に示すデータにより支持される。炎症促進モジュールの抑制に加え、ＣＤ５Ｌは、調節モジュールを機能も促進し得、それにより環境トリガーへの迅速な応答を可能とするスイッチとして作用し、その結果、Ｔｈ１７細胞が他の中間経路に依存しなくてもそれらの機能的表現型を変化させ得る。ＣＤ５Ｌの発現が非病原性Ｔｈ１７細胞の機能を安定化させ得、その結果、調節モジュールおよび炎症促進モジュールは、細胞集団中で同時存在することも明らかである。この観察は、非病原性Ｔｈ１７細胞中で同時発現される調節モジュールと炎症促進モジュールとの間の分子差異も強調し、このことはＩＬ−１７およびＩＬ−１０の両方を産生し得る非病原性Ｔｈ１７細胞が、生理学的プロセスにおけるユニークな役割を有することを示唆する。これは、腸管内微生物叢に応答して小腸中で発生し得るＴｈ１７細胞（Ｅｓｐｌｕｇｕｅｓ，Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、およびＩＬ−１０も同時産生し得、肺の粘膜表面上の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する保護免疫に重要であると想定されるＴｈ１７細胞（Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，Ｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）が、自己免疫も組織損傷も媒介しない近年の発見と一致する。
【０４２０】
病原性および非病原性Ｔｈ１７細胞の両方が、流入領域リンパ節中に存在するが、病原性Ｔｈ１７細胞は、組織炎症（ＣＮＳ）の部位において出現し、非病原性Ｔｈ１７細胞は、それらが粘膜障壁機能を促進し、さらに組織ホメオスタシスを維持する腸管または他の粘膜表面中で出現する。これは、ＣＤ５Ｌの発現において反映され、それは定常状態における腸管中のＴｈ１７細胞中で高度に発現されるが、自己免疫組織炎症のピークにおけるＣＮＳ中では発現されない。ＥＡＥの間にＣＮＳ中に存在するＩＬ−２３は、ＣＤ５Ｌを抑制し、非病原性Ｔｈ１７細胞を病原性Ｔｈ１７細胞に変換し得る。定常状態において、何が腸管中のＣＤ５Ｌ発現および非病原性を促進するのかは公知でない。ＴＧＦβは、腸中の多量のＴＧＦβおよびインビボＩＬ−１０産生ＣＤ４Ｔ細胞の分化（Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｋｏｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  ２０１１）およびインビトロＴｈ１７細胞の分化（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｖｅｌｄｈｏｅｎ，Ｈｏｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６）の両方におけるその役割を考慮すると、明らかな候補である。規定の市販の細菌（Ｉｖａｎｏｖ，Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｙａｎｇ，Ｔｏｒｃｈｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）および微生物叢からの代謝物（Ａｒｐａｉａ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）も、Ｔ細胞分化の調節に関与する。特に、ＣＤ５Ｌは、分泌タンパク質として報告され（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｈｉｒｏｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、ＰＡＭＰの認識における役割を担う（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。インビボで、腸管中の非病原性Ｔｈ１７細胞により発現されるＣＤ５Ｌが微生物叢と相互作用し得、腸管寛容性および非病原性Ｔｈ１７表現型を維持することが考えられる。したがって、Ｔｈ１７細胞の２つの機能的状態は、高度に可塑性であり得、環境に応じて、病原性または非病原性Ｔｈ１７細胞のいずれかが組織微小環境の変化のセンシングにより生成され得る。しかしながら、非病原性Ｔｈ１７細胞中のＣＤ５Ｌの発現は、Ｔｈ１７細胞の非病原性機能状態の維持に重要であり、ＩＬ−２３がＣＤ５Ｌを迅速に抑制し、それがそれらの細胞を病原性にするとが明らかである。この仮定は、炎症性腸管疾患の間の腸管中の局所的なＩＬ−２３の産生により非病原性Ｔｈ１７細胞が病原性Ｔｈ１７細胞に容易に変換され得ることも予測する。
【０４２１】
いかにＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞の病原性を調節するか？この研究において、ＣＤ５Ｌが、少なくとも部分的にＴｈ１７細胞中の細胞内脂質代謝を調節することによりＴｈ１７細胞機能を調節し得る証拠が提供される。ＣＤ５Ｌが、脂肪酸シンターゼへの直接結合を通して脂肪酸のデノボ合成を阻害することが示された（Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）が、これはＴ細胞においては実証されていない。Ｔｈ１７細胞中で、ＣＤ５Ｌが脂肪酸シンターゼの一般的なインヒビターでないが、ＰＵＦＡとＳＦＡのバランスを調節することが発見された。ＰＵＦＡは、Ｒｏｒγｔについてのリガンド依存性機能を限定し、その結果、ＣＤ５ＬまたはＰＵＦＡの存在下で、Ｉｌ１７ａおよびＩｌ２３ｒへのＲｏｒγｔ結合が向上する一方（両方の遺伝子のトランス活性化の低減とともに）、Ｉｌ１０遺伝子座における結合およびそれからの発現が向上することが示される。特に、Ｉｌ１０発現を調節するＲｏｒγｔの能力は、これまで報告されなかった。ＣＤ５ＬがＴｈ１７細胞分化全体に影響しないため、これは、Ｒｏｒγｔ機能に対するＣＤ５Ｌおよび脂質バランスの高度に細かい効果を示唆し、一部の遺伝子座へのその結合およびそれにおけるトランス活性化を向上させ、他方では低減させ、他の遺伝子座、例えば、一般のＴｈ１７細胞分化に必要とされるものにおけるその機能に影響を与えない可能性が高い。いかにこれが機序的に達成されるかが依然として調査されていない。例えば、Ｉｌ１０転写の調節は複雑であり、多様な転写因子およびエピジェネティック修飾に依存する。Ｔｈ１７細胞中で、Ｓｔａｔ３およびｃ−Ｍａｆは、Ｉｌ１０の発現を促進し得る（Ｓｔｕｍｈｏｆｅｒ，Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｘｕ，Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。Ｓｔａｔ３、Ｃ−ＭａｆおよびＲｏｒγｔは全て、同一のＩｌ１０エンハンサー要素に結合し得るため、利用可能なリガンドの質および量に応じて、Ｒｏｒγｔが他の転写因子と相互作用し、Ｉｌ１０転写を調節し得ることが考えられる。より一般には、これは、Ｒｏｒγｔリガンドのスペクトルが、少なくとも部分的に、細胞中のＣＤ５Ｌにより調節されるＰＵＦＡとＳＦＡ脂質のバランスに依存し、異なるリガンドがＲｏｒγｔに対して区別される特異性に影響する仮定を支持し、例えば、区別される機能的状態に関連する機能的状態のスペクトルを想定することができる。このような機序を完全に解明するためにさらなる研究が要求される。
【０４２２】
いくつかの代謝経路が、Ｔｈ１７細胞分化と関連する。ＨＩＦ１αは、Ｒｏｒγｔの直接トランス活性化を通してＴｈ１７細胞分化を促進し得（Ｄａｎｇ，Ｂａｒｂｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｓｈｉ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、アセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼは、解糖および脂質合成経路を通してＴｈ１７／Ｔｒｅｇバランスを調節し得る（Ｂｅｒｏｄ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ＨＩＦ１αおよびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼの両方は、肥満と関連し、Ｔｈ１７細胞分化および機能を調節する遺伝子中の突然変異を保有するマウスは、肥満表現型を獲得することが示されている（Ｗｉｎｅｒ，Ｐａｌｔｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ａｈｍｅｄ  ａｎｄ  Ｇａｆｆｅｎ  ２０１０，Ｊｈｕｎ，Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｗｕｒｍｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。したがって、Ｔｈ１７細胞発生と肥満との間の関連が明らかである。肥満の特徴は、飽和脂肪およびコレステロールの蓄積である。この研究において、細胞レベルにおいて、リピドーム飽和がＲｏｒγｔ機能を調節することによりＴｈ１７細胞機能を促進し得る証拠が提供される。
【０４２３】
Ｔｈ１７細胞の病原性の調節の他、ＣＤ５Ｌ欠損Ｔｈ１７細胞は、より安定的なＴｈ１７表現型をインビボで保持すると考えられる。非病原性条件下で分化させたＣＤ５Ｌ欠損ナイーブ２Ｄ２Ｔ細胞からのＴｈ１７細胞は、より多いＩＦＮγ＋発現を達成するＷＴ２Ｄ２細胞と対照的にＷＴ宿主中への移植時にほとんどのＩＬ−１７＋およびＩＦＮγ−を保持する。さらに、未分化ナイーブＣＤ５Ｌ−／−ＣＤ４＋２Ｄ２Ｔ細胞の移植が、ＷＴ２Ｄ２Ｔ細胞と比較して免疫化後にＩＬ−１７Ａ＋細胞のより高い頻度をもたらした。ＣＤ５Ｌは、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞分化を調節しないため、これは、Ｔｈ１７細胞表現型がＣＤ５Ｌの非存在下でより安定的であり得ることを示唆する。Ｔｈ１７細胞安定性は、部分的には、リガンド利用可能性に依存性であることが考えられる。したがって、Ｔｈ１７細胞による微小環境のセンシングは、ＣＤ５Ｌ発現を変化させ、Ｒｏｒγｔリガンド利用可能性を調節し得、次いでＴｈ１７表現型および機能に影響を与え得る。
【０４２４】
したがって、単一細胞ゲノミクスおよび計算分析を使用することにより、ＣＤ５Ｌが、Ｔｈ１７細胞の病原性の新規リプレッサーとして同定され、他の点で集団レベルゲノムプロファイルにより不明確であるＴｈ１７細胞機能に影響を与える分子スイッチを同定する単一細胞ゲノミクスの能力を強調した。ＣＤ５Ｌは、それ自体ではＴｈ１７分化に影響を与えないが、利用可能なＲｏｒγｔリガンドの質および量を潜在的に調節することによりＴｈ１７細胞の機能（病原性と非病原性表現型）に影響する分子スイッチであると考えられ、単一マスター調節因子が複数の機能的状態をおそらく担うことを可能とする。結果は、リピドームを免疫細胞の不可欠な機能を結び付け、感受性および特異的治療介入のための新たな道を開く。
【０４２５】
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【０４２６】
実施例１１
ＧＰＲ６５は、Ｔｈ１７分化を促進し、ＥＡＥに不可欠である
ＧＰＲ６５は、グリコスフィンゴ脂質受容体であり、炎症促進モジュールと同時発現され（図４ＢおよびＳ６Ｅ）、このことはそれが病原性の促進における役割を有し得ることを示唆する。ＧＰＲ６５は、Ｔｈ１様エフェクター／メモリー表現型を達成するＣＮＳから回収されたインビボＴｈ１７細胞中でも高度に発現される（図２Ｄ）。重要なことに、ＧＰＲ６５の遺伝子変動は、多発性硬化症（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、強直性脊椎炎（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、炎症性腸管疾患（Ｊｏｓｔｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、およびクローン病（Ｆｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）と関連する。
【０４２７】
ＧＰＲ６５の役割を、インビトロＴｈ１７分化およびインビボ自己免疫の発症において試験した。インビトロＧｐｒ６５−／−マウスから単離されたナイーブＴ細胞を、ＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６（非病原性条件）またはＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３（病原性条件）により９６時間分化させた。両方の場合において、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣ）により計測されるとおり野生型対照と比較してＧｐｒ６５−／−細胞におけるＩＬ−１７ａ陽性細胞の約４０％の低減が存在した（図５Ａ）。ＩＬ−２３により再活性化させたＧｐｒ６５−／−マウスからのメモリー細胞も、野生型と比較してＩＬ−１７ａ陽性細胞の約４５％低減を示した（図Ｓ６）。一貫して、上清の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ＩＬ−１７ａ（ｐ＜０．０１）およびＩＬ−１７ｆ（ｐ＜２．５×１０−５）（図５Ｂ）の分泌低減およびＩＬ−１０分泌の増加（ｐ＜０．０１、図Ｓ６Ｃ）を病原性（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋Ｌ−２３）分化条件下で示した。
【０４２８】
Ｔｈ１７機能に対するＧＰＲ６５の効果をさらに検証するため、ＲＮＡ−ｓｅｑプロファイルを、インビトロでＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６のもと９６時間分化させたＧｐｒ６５−／−Ｔｈ１７細胞のバルク集団から計測した。Ｔｈ１７細胞の病原性のドライバーとしてＧＰＲ６５についての役割を支持すると、Ｇｐｒ６５−／−細胞中で（野生型と比較して）上方調節される遺伝子が、ＴＧＦ−β１＋ＩＬ−６（正のＰＣ１、図４Ｃ）下でより多い制御性細胞を特徴決定する遺伝子について、および病原性シグネチャーにおいて下方調節される遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）（Ｐ＜１．４×１０−４、超幾何検定）について有意にエンリッチされる（Ｐ＜１８．５×１０−３１、超幾何検定）ことが見出された。
【０４２９】
インビボ組織炎症および自己免疫疾患に対するＧＰＲ６５の損失の効果を決定するため、Ｇｐｒ６５−／−マウスに由来するＣＤ４＋リンパ球および脾細胞を、ＲＡＧ−１−／−マウス中に移植し、次いでＭＯＧ３５−５５免疫化した。ＧＰＲ６５発現Ｔ細胞の非存在下で、マウスがＥＡＥから保護され（図５Ｄ）、野生型細胞により移植された対照と比較してかなり少ないＩＬ−１７ＡおよびＩＦＮ−γ陽性細胞がＬＮおよび脾臓から回収されることが見出された（図Ｓ６Ｂ）。さらに、ＭＯＧ３５−５５による免疫化マウスからの脾臓およびＬＮ細胞のインビトロ再刺激は、ＧＰＲ６５の損失が、野生型対照と比較してＭＯＧ特異的ＩＬ−１７ＡまたはＩＦＮ−γ陽性細胞の大幅な低減をもたらすことを示し（図５Ｃ）、このことはＧＰＲ６５がインビボで脳炎誘導Ｔ細胞の生成を調節することを示唆する。まとめると、データは、ＧＰＲ６５が病原性Ｔｈ１７表現型の正の調節因子であり、その損失がＥＡＥからの保護をもたらすことを強力に検証する。
【０４３０】
参照文献
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃ．，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｃａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃ．，Ｓａｗｃｅｒ，Ｓ．，Ｈｅｌｌｅｎｔｈａｌ，Ｇ．，Ｐｉｒｉｎｅｎ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｃ．Ｃ．，Ｐａｔｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．Ａ．，Ｍｏｕｔｓｉａｎａｓ，Ｌ．，Ｄｉｌｔｈｅｙ，Ａ．，Ｓｕ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７６，２１４−２１９．
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｓ，Ａ．，Ｈａｄｌｅｒ，Ｊ．，Ｐｏｉｎｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｋａｒａｄｅｒｉ，Ｔ．，Ｌｅｏ，Ｐ．，Ｃｒｅｍｉｎ，Ｋ．，Ｐｒｙｃｅ，Ｋ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｉｓｋ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｏｃｉ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４５，７３０−７３８．
Ｊｏｓｔｉｎｓ，Ｌ．，Ｒｉｐｋｅ，Ｓ．，Ｗｅｅｒｓｍａ，Ｒ．Ｋ．，Ｄｕｅｒｒ，Ｒ．Ｈ．，ＭｃＧｏｖｅｒｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｈｕｉ，Ｋ．Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｍｍ，Ｌ．Ｐ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｙ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｈａｖｅ  ｓｈａｐｅｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９１，１１９−１２４．
Ｆｒａｎｋｅ，Ａ．，ＭｃＧｏｖｅｒｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｒａｄｆｏｒｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．，Ａｈｍａｄ，Ｔ．，Ｌｅｅｓ，Ｃ．Ｗ．，Ｂａｌｓｃｈｕｎ，Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｏ  ７１  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｉ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２，１１１８−１１２５．
Ｌｅｅ，Ｙ．，Ａｗａｓｔｈｉ，Ａ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．，Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｆ．Ｊ．，Ｘｉａｏ，Ｓ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．，Ｗｕ，Ｃ．，Ｋｌｅｉｎｅｗｉｅｔｆｅｌｄ，Ｍ．，Ｋｕｎｄｅｒ，Ｓ．，Ｈａｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３，９９１−９９９．
【０４３１】
実施例１２
ＭＯＧ刺激Ｐｌｚｐ−／−細胞は、病原性Ｔｈ１７細胞の生成における欠陥を有する
転写因子ＰＬＺＰ（ＲＯＧ）は、ＧＡＴＡ３の公知のリプレッサー（Ｍｉａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）（Ｔｈ２マスター調節因子）であり、Ｔ−ヘルパー細胞中でサイトカイン発現を調節する（Ｍｉａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ｐｌｚｐは、炎症促進モジュールと同時発現されるため、それがＴｈ１７細胞における病原性を調節し得ることが仮定された（しかしながら、ＥＡＥ実験を着手することはできなかった。なぜなら、ＰＬＺＰ−／−マウスがＥＡＥ感受性バックグラウンドで利用可能でないためである）。
【０４３２】
インビトロ分化させたＰｌｚｐ−／−細胞は、野生型と同等のレベルにおいてＩＬ−１７Ａを産生した一方（図Ｓ８Ａ）、ＭＯＧドライブリコールアッセイは、Ｐｌｚｐ−／−細胞ＩＬ−１７Ａ産生における欠陥を有し、それは再刺激の間にＭＯＧ濃度が増加するにつれて現れることを明らかにした（図５Ｈ）。さらに、Ｐｌｚｐ−／−細胞は、インビボ分化Ｔｈ１７細胞を既に拡張するように作用するＩＬ−２３の存在下で再活性化させた場合、野生型細胞よりも少ないＩＬ−１７Ａも産生した（図Ｓ８Ｂ）。最終的に、Ｐｌｚｐ−／−Ｔ細胞は、より少ないＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ（図５Ｉ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ（図Ｓ８Ｃ）を分泌した。これらの観察は、ＰＬＺＰが広範な炎症サイトカインの発現を調節することを示唆する。Ｐｌｚｐ−／−細胞の分化への４８時間において、Ｉｒｆ１（ＦＣ＝５．１）、Ｉｌ−９（ＦＣ＝１．８）および調節モジュールの他の転写物がＷＴと比較して上方調節される一方（表Ｓ１０）、炎症促進モジュールからの転写物、例えば、Ｃｃｌ−２０（ＦＣ＝０．３８）、Ｔｎｆ（ＦＣ＝０．１０）およびＩｌ−１７ａ（ＦＣ＝０．４２）が抑制される。
【０４３３】
したがって、単一細胞ゲノミクスおよび共分散分析により、インビトロでＴｈ１７細胞の発生およびインビボで自己免疫に影響を与えるＴｈ１７細胞の病原性の多数の新規調節因子が同定された。
【０４３４】
参照文献
Ｍｉａｗ，Ｓ．Ｃ．，Ｃｈｏｉ，Ａ．，Ｙｕ，Ｅ．，Ｋｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｏ，Ｉ．Ｃ．（２０００）．ＲＯＧ，ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ＧＡＴＡ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２，３２３−３３３．
【０４３５】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、そのような実施形態は、例としてのみ提供されることは当業者に明らかである。多数の変更形態、変化形態、および置換形態は、目下、当業者によって本発明から逸脱せずに行われる。本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替物を、本発明の実施において用いることができることを理解すべきである。
【図１Ａ】
2017508457.tif 000087
【図１Ｂ】
2017508457.tif 000088
【図１Ｃ】
2017508457.tif 000089
【図１Ｄ】
2017508457.tif 000090
【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2017508457.tif 000095
【図２Ｅ】
2017508457.tif 000096
【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
2017508457.tif 000099
【図３Ｂ】
2017508457.tif 000100
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
2017508457.tif 000103
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2017508457.tif 000114
【図７】
2017508457.tif 000115
【図８Ａ】
2017508457.tif 000116
【図８Ｂ】
2017508457.tif 000117
【図９Ａ】
2017508457.tif 000118
【図９Ｂ】
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【図１０】
2017508457.tif 000120
【図１１Ａ】
2017508457.tif 000121
【図１１Ｂ】
2017508457.tif 000122
【図１１Ｃ】
2017508457.tif 000123
【図１２Ａ】
2017508457.tif 000124
【図１２Ｂ】
2017508457.tif 000125
【図１３】
2017508457.tif 000126
【図１４】
2017508457.tif 000127
【図１５Ａ】
2017508457.tif 000128
【図１５Ｂ】
2017508457.tif 000129
【図１５Ｃ】
2017508457.tif 000130
【図１６Ａ】
2017508457.tif 000131
【図１６Ｂ】
2017508457.tif 000132
【図１６Ｃ】
2017508457.tif 000133
【図１６Ｄ】
2017508457.tif 000134
【図１７】
2017508457.tif 000135
【図１８】
2017508457.tif 000136
【図１９Ａ】
2017508457.tif 000137
【図１９Ｂ】
2017508457.tif 000138
【図１９Ｃ】
2017508457.tif 000139
【図１９Ｄ】
2017508457.tif 000140
【図２０Ａ】
2017508457.tif 000141
【図２０Ｂ】
2017508457.tif 000142
【図２０Ｃ】
2017508457.tif 000143
【図２０Ｄ】
2017508457.tif 000144
【図２１】
2017508457.tif 000145
【図２２Ａ】
2017508457.tif 000146
【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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