(57)【要約】本開示の主題は、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相と、非カオトロピックであって、エタノールを含まない緩衝液とを用いて、核酸を血漿から精製するための方法およびキットを提供する。【選択図】図１
2017534289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を精製するための、カオトロープおよび揮発性物質を含まない方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に添加する工程と；
（ｂ）高濃度のコスモトロピック分子を含む結合緩衝液の存在下で、前記試料中の核酸を前記官能基化固相に結合させる工程と；
（ｃ）前記結合緩衝液を除去する工程と；
（ｄ）必要に応じて、前記官能基化固相に結合した前記核酸を洗浄緩衝液で洗浄する工程と；
（ｅ）前記核酸を、前記官能基化固相から溶出緩衝液で溶出させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの核酸が、ウイルス核酸、細菌核酸、および寄生虫核酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの核酸が、ＲＮＡおよびＤＮＡからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記血漿がヒト由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記官能基化固相が磁気特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記官能基化固相がシリカビーズおよび／またはピラーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記官能基化固相が、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ３、−ＯＨ、およびイミダゾールからなる群より選択される少なくとも１つの官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コスモトロピック分子が、硫酸アンモニウム、ＣＯ３−２、ＨＰＯ４−２、グルコース、トレハロース、多価アルコール、およびプロリンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合緩衝液が、約０．３Ｍ〜約２．０Ｍの硫酸アンモニウムを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）が、約５分〜約１０分間、室温で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合緩衝液および／または前記洗浄緩衝液がプロテイナーゼＫをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料中の前記少なくとも１つの核酸の濃度が、約０．０５〜約１，０００ｐｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料中の前記少なくとも１つの核酸の濃度が、約０．５〜約１０ｐｇ／ｍＬである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記洗浄緩衝液が低イオン強度緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記洗浄緩衝液が非イオン性洗剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｄ）が、約１分〜約１０分間、室温で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出緩衝液のｐＨが約８以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出緩衝液が低イオン強度緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｅ）が約８０℃で、約５分〜約１０分間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの核酸の工程（ｅ）後の回収率が約６０％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法がポイント・オブ・ケア検査に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
シリカまたはポリマー骨格を含む少なくとも１つの官能基化固相と、シリカまたはポリマー骨格を含む前記少なくとも１つの官能基化固相を使用して核酸を精製するための指示書一式とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年１１月７日に出願された特許文献１の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血液検体中の核酸（ＮＡ；ＲＮＡおよびＤＮＡ）の検出は、様々な急性および慢性の病状（例えば、病原体感染など）を検出するためのアッセイの重要な要素である。ＮＡのレベルを評価するためには、まずＮＡをヒト体液から精製し、下流のＮＡ増幅手順を阻害するタンパク質および分子を除去しなければならない。ヒト標本からのＮＡの効率的な精製は、次世代のウイルス性ＮＡシリコンマイクロチップベースの診断アッセイの設計において不可欠な要素である。現在の至適基準のＮＡ精製プロトコルは、Ｂｏｏｍら（非特許文献１）により記述されたものであり、これは大部分の市販のＮＡ精製キットの基礎となっており、カオトロピック塩の存在下でＮＡを二酸化ケイ素に結合させ、７０％エタノールを用いて二酸化ケイ素上にＮＡを沈殿させ、わずかにアルカリ性の緩衝液または水中にそれを再懸濁することを伴う。
【０００３】
Ｂｏｏｍプロトコルは、次世代のシリコンマイクロチップベースのアッセイへのその適用において、少なくとも２つの点で制限されている。第１に、チオシアン酸グアニジニウムなどのカオトロピック塩は毒性があり、特別な取り扱いと処分を必要とする。この制限により、非熟練者は、実験室外の環境でこのプロトコルを使用することができない。第２に、７０％エタノール沈殿工程の使用は、次世代のＮＡシリコンマイクロチップベースの診断アッセイでこのプロトコルを使用する場合、複数の課題を提示する。例えば、エタノール沈殿工程は、ＮＡ増幅アッセイの強力な阻害物となる可能性があり、マイクロ流体チャネルを遮断する気泡の形成をもたらし、蒸発が不可能である。次世代ＮＡ診断アッセイにおいてＢｏｏｍベースのプロトコルを禁止するには、カオトロピック塩および揮発性有機化学物質を含まないＮＡ精製プロセスの開発が必要である。
【０００４】
Ｂｏｏｍベースのプロトコルの制限を克服しようとするいくつかの代替方法が記載されている。例えば、Ｈｏｕｒｆａｒら（非特許文献２）は、シリカ被覆磁気ビーズ固相を用いた、ウイルス性ＮＡのヒト血漿からの精製と、ｐＨ４でのコスモトロピック塩（硫酸アンモニウム）中での結合、ｐＨ６．８での洗浄工程、およびｐＨ８．５の緩衝液による８０℃での溶出からなるプロトコルとを記載している。ＲＮＡを分解することによりＮＡ増幅アッセイを妨害するＲＮａｓｅは、プロトコルの結合および洗浄工程においてプロテイナーゼＫを使用することにより阻害される。この方法で使用されるシリカ被覆磁気ビーズ固相は、マイクロチップベースのアッセイと適合しない。
【０００５】
Ｍｅｒｃｋの特許文献２は、磁気シリカビーズを用いた溶液からのＮＡの精製と、追加の塩なしのｐＨ４の緩衝液中での結合、ｐＨ６．５の緩衝液での洗浄、およびｐＨ９での溶出からなるプロトコルとを開示する。このプロトコルは、ＲＮａｓｅが阻害または除去されないため、血漿からのＮＡの精製には適さない。
【０００６】
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの特許文献３は、−ＣＯＯＨ基で官能基化された磁気ポリスチレンビーズと「クラウディング」試薬とを固相逆固定化として知られるプロセスにおいて使用し、生体液からＮＡを精製することについて記載している。この手順では、高濃度のＮａＣｌ（０．５〜５Ｍ）およびポリエチレングリコール（７〜１３％）の存在下で、ＮＡをカラムに結合させる。混入物質を高塩緩衝液を用いてカラムから洗い流し、低イオン強度緩衝液または水で溶出する。
【０００７】
ＮＡを血漿から精製するための現在の方法は、シリカベースの固相ならびに毒性および／または揮発性緩衝系の使用を伴い、これは、種々のリソース設定でのポイント・オブ・ケア診断試験におけるこれらの方法の使用を不可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国仮出願第６２／０７６，７９５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３５５，７９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７０５，６２８３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｏｏｍ  Ｒ，Ｓｏｌ  ＣＪ，Ｓａｌｉｍａｎｓ  ＭＭ，Ｊａｎｓｅｎ  ＣＬ，Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−ｖａｎ  Ｄｉｌｌｅｎ  ＰＭ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｏｏｒｄａａ  Ｊ．Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９０，２８（３）：４９５−５０３．
【非特許文献２】Ｈｏｕｒｆａｒ  ＭＫ，Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ  Ｕ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，５１：１２１７−１２２２．
【発明の概要】
【００１０】
いくつかの態様では、本開示の主題は、核酸を精製するための、カオトロープおよび揮発性物質を含まない方法であって、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に添加する工程と；（ｂ）高濃度のコスモトロピック分子を含む結合緩衝液の存在下で、試料中の核酸を官能基化固相に結合させる工程と；（ｃ）結合緩衝液を除去する工程と；（ｄ）必要に応じて、官能基化固相に結合した核酸を洗浄緩衝液で洗浄する工程と；（ｅ）核酸を、官能基化固相から溶出緩衝液で溶出させる工程とを含む方法を提供する。
【００１１】
いくつかの態様では、本開示の主題は、核酸を精製するための、カオトロープおよび揮発性物質を含まない方法であって、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を供給する工程と；（ｂ）少なくとも１つの核酸を、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に添加する工程と；（ｃ）高濃度のコスモトロピック分子を含む結合緩衝液の存在下で、少なくとも１つの核酸をシリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に結合させる工程と；（ｄ）高濃度のコスモトロピック分子を含む結合緩衝液を除去する工程と；（ｅ）シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に結合した少なくとも１つの核酸を、低イオン強度洗浄緩衝液で洗浄する工程と；（ｆ）少なくとも１つの核酸を、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相から低イオン強度溶出緩衝液で溶出させる工程とを含む方法を提供する。
【００１２】
他の態様では、本開示の主題は、シリカまたはポリマー骨格を含む少なくとも１つの官能基化固相と、少なくとも１つの官能基化固相を使用して核酸を精製するための指示書一式とを含むキットを提供する。
【００１３】
上述した本開示の主題の特定の態様は、全体的または部分的に本開示の主題により取り組まれ、他の態様は、以下に最も良く記載される添付の実施例および図に関連して説明が進むにつれて明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
上記のように本開示の主題を概括的な言葉で説明してきたため、ここで添付の図を参照するが、必ずしも一定の縮尺で描かれてはいない。
【図１】初期濃度が１および１０ｐｇ／ｍＬであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡで本開示の方法を使用した後の、ＨＣＶ  ＲＮＡの回収率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示の主題は、添付の図を参照して以下により詳細に記載されるが、本発明の実施形態の全てではなく、一部が示される。同様の番号は、全体を通して同様の要素を指す。本開示の主題は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されるものと解釈されるべきではない；むしろ、これらの実施形態は、本開示が適切な法的要件を満たすように提供される。実際に、前述の説明および関連する図に示された教示の利益を有する、本明細書に記載の本開示の主題の多くの修正および他の実施形態を、本開示の主題に関連する分野の当業者は思い浮かぶであろう。したがって、本開示の主題は、開示した特定の実施形態に限定されるものではないこと、修正および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。
【００１６】
本開示の主題は、シリカまたはポリマー骨格を含む非官能基化および官能基化固相と非カオトロピック塩との新規な組み合わせ、および核酸を精製するためのエタノールを含まない緩衝液プロトコルを提供する。これらの方法は、多くの異なる固相で、非カオトロピック塩を含む複数の異なる緩衝液プロトコルを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、高濃度のコスモトロピック分子を含む緩衝液を利用し、混入物質を低イオン強度緩衝液で除去し、低イオン強度緩衝液で溶出する。本開示の主題は、毒性カオトロピック塩および揮発性有機化学物質の使用の必要性を克服する。本開示の主題は、現在の診断アッセイおよび次世代のシリコンマイクロチップベースの診断アッセイでの使用に適している。さらに、本開示の主題は、ポイント・オブ・ケア診断マイクロ流体または磁気システムでの使用に適用可能であり、それにより、全てのリソース設定にわたるポイント・オブ・ケア診断の世界的な使用を可能にする。特定の実施形態では、本開示の主題は、核酸を血漿から精製する方法を提供する。
【００１７】
（Ｉ．核酸を血漿から精製する方法）
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の主題は、核酸を精製するための、カオトロープおよび揮発性物質を含まない方法であって、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に添加する工程と；（ｂ）高濃度のコスモトロピック分子を含む結合緩衝液の存在下で、試料中の核酸を官能基化固相に結合させる工程と；（ｃ）結合緩衝液を除去する工程と；（ｄ）必要に応じて、官能基化固相に結合した核酸を洗浄緩衝液で洗浄する工程と；（ｅ）核酸を、官能基化固相から溶出緩衝液で溶出させる工程とを含む方法を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示の主題は、核酸を精製するための、カオトロープおよび揮発性物質を含まない方法であって、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を供給する工程と；（ｂ）少なくとも１つの核酸を、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に添加する工程と；（ｃ）高濃度のコスモトロピック分子を含む結合緩衝液の存在下で、少なくとも１つの核酸をシリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に結合させる工程と；（ｄ）結合緩衝液を除去する工程と；（ｅ）シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に結合した少なくとも１つの核酸を、低イオン強度洗浄緩衝液で洗浄する工程と；（ｆ）少なくとも１つの核酸を、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相から低イオン強度溶出緩衝液で溶出させる工程とを含む方法を提供する。
【００１９】
本明細書で使用される「ポリマー骨格」は、多数の繰り返しサブユニットからなる巨大分子または高分子中に連続鎖を一緒になって形成する一連の共有結合した原子を指す。本明細書で使用される「シリカ骨格」は、一連の共有結合したケイ素原子を指す。
【００２０】
本明細書で使用される「カオトロープ」または「カオトロピック剤」は、水構造を破壊し、非極性溶媒粒子の溶解度を増大させ、溶質凝集物を不安定化させる薬剤である。「カオトロープを含まない」方法は、カオトロピック剤を使用しない方法である。本明細書で使用される「コスモトロピック」分子は、イオン性または非イオン性であり、水分子を有利に相互作用させ、タンパク質などの高分子における分子内相互作用を安定化させる。イオン性コスモトロープは、ＣＯ３２−、ＳＯ４２−、ＨＰＯ４２−、マグネシウム（２＋）、リチウム（１＋）、亜鉛（２＋）、およびアルミニウム（＋３）のように小さい傾向がある。本明細書で使用される「揮発性物質を含まない」方法は、アルコール、より具体的にはエタノールなどの揮発性分子を使用しない方法である。
【００２１】
本明細書で使用する用語「試料」は、少なくとも１つの核酸を含む分子の任意の混合物を指し、あらゆる種類の組織、培養細胞、体液、全血、血清、血漿、尿、糞便、微生物、ウイルス、寄生虫、植物、および酵素反応後の核酸を含む混合物などが挙げられる。組織の例には、昆虫および軟体動物などの無脊椎動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類などの脊椎動物、ならびにヒト、ラット、イヌ、ネコ、およびマウスなどの哺乳動物由来の組織が含まれる。培養細胞は、細菌、藍藻、放線菌、およびマイコプラズマなどの原核生物由来、ならびに植物、動物、真菌、および原生動物などの真核生物由来であり得る。血液試料は、生物から直接採取された血液、または何らかの方法で濾過され、赤血球および／または血清もしくは血漿などのいくつかの要素を除去した血液を含む。いくつかの実施形態では、試料は血漿である。他の実施形態では、血漿はヒト由来である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、約０．５ｐｇ／ｍＬ〜約１０ｐｇ／ｍＬの生体関連の血液ウイルスＲＮＡ濃度を検出し、これは、例えば、１×１０５〜１×１０６コピーのＨＣＶ  ＲＮＡ／ｍＬに相当する。他の実施形態では、試料中の少なくとも１つの核酸の濃度は、約０．０５ｐｇ／ｍＬ〜約１０００ｐｇ／ｍＬである。さらに他の実施形態では、試料中の少なくとも１つの核酸の濃度は、約０．５ｐｇ／ｍＬ〜約１０ｐｇ／ｍＬである。本明細書で使用する「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、または、ホスホロチオエートおよびチオエステルなどの、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかである、それらの任意のリン酸エステル類似体を指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の一次および二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態に限定されない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、および染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際に、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与えるという通常の慣習に従い、配列は、本明細書中で説明され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＲＮＡ分子の非限定的な例には、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｄｓＲＮＡが含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡからなる群より選択される。他の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ウイルス、細菌、および寄生虫の核酸からなる群より選択される。ウイルス核酸の非限定的な例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡ、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡが含まれる。寄生虫核酸の非限定的な例は、マラリアＤＮＡである。特定の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ウイルス核酸、細菌核酸、および寄生虫核酸からなる群より選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡからなる群より選択される。さらに他の実施形態では、核酸はＲＮＡであり、ＲＮＡはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡである。
【００２３】
本明細書で使用される用語「精製された」、「単離された」、および「抽出された」は、互換的に使用される。「精製された核酸」は、タンパク質、脂質、および炭水化物を含むがこれらに限定されない他の化合物から分離された核酸を説明するために本明細書で使用される。ポリヌクレオチドは、試料の少なくとも約５０％、好ましくは６０〜７５％が単一のポリヌクレオチド配列および立体配座（線状対共有結合）を示す場合に、実質的に純粋である。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、典型的には、核酸試料の約５０％、好ましくは６０〜９０％重量／重量、より一般的には約９５％、好ましくは約９９％超の純度を含む。ポリヌクレオチドの純度または均質性は、試料のアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続くゲル染色の際の単一のポリヌクレオチドバンドの視覚化などの、当技術分野で周知の多数の手段により示される。特定の目的のために、より高い解像度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または当該技術分野でよく知られている他の手段を使用することにより提供することができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、純度は、少量の核酸の検出が望ましい方法における核酸の回収率ほど重要ではないかもしれない。本明細書で使用される用語「回収率」は、固体支持体からの核酸の溶出後に溶出緩衝液中に見られる、試料中に見られる初期量と比較した核酸の量を意味する。本開示の方法は、少なくとも約５０％、好ましくは約６０％を超える回収率を可能にする。いくつかの実施形態では、回収率は約７０％より大きい。いくつかの実施形態では、回収率は約８０％より大きい。いくつかの実施形態では、回収率は約８５％より大きい。いくつかの実施形態では、回収率は約９０％より大きい。他の実施形態では、本開示の方法を実施した後の少なくとも１つの核酸の回収率は、約６０％以上である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、核酸の精製に使用するためのシリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相を提供する。本明細書で使用される用語「固相」は、剛性および可撓性の固体を含む。固体基材の非限定的な例には、ゲル、繊維、微小球、球体、立方体、他の形状の粒子、チャネル、マイクロチャネル、毛細管、容器の壁、膜およびフィルター、ビーズ、ピラー、樹脂、スラリー、膜もしくはディスク、または本開示の方法に適した任意の一般的な固体支持材料が含まれる。固相を使用する利点は、それが望ましくない分子を除去する広範な洗浄を可能にすることである。固相を使用することの別の利点は、それが核酸を引き付ける磁気特性を有し得ることである。固相を使用するさらに別の利点は、それが部分または分子で官能基化され、「官能基化固相」を形成することができることである。特定の実施形態では、これらの官能基化された部分を使用して、核酸分子に結合することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相は、磁気特性を有する。他の実施形態では、官能基化固相はシリカを含む。シリカの非限定的な例には、ＳｉＯ２、アモルファスシリコン酸化物、ガラス、多孔質シリカ、微細加工されたシリコン、アルキルシリカ、アルミニウムシリケート、シラン処理された材料、および酸化されシラン処理された材料が含まれる。さらに他の実施形態では、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相は、シリカビーズおよび／またはピラーを含む。さらなる実施形態では、官能基化固相は、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ３、−ＯＨ、およびイミダゾールからなる群より選択される少なくとも１つの官能基を含む。一実施形態では、官能基化固相は、−ＣＯＯＨ基で官能基化された磁気ビーズを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、核酸を含む試料を供給する工程、核酸をシリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に添加する工程、および結合緩衝液の存在下で、核酸をシリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に結合させる工程を含む。本開示の緩衝液系は、カオトロピック塩および揮発性化学物質を使用せず、代わりに高濃度のコスモトロピック分子を使用して核酸結合を促進する。本明細書で使用される用語「結合」は、核酸および固相などの２つ以上の化合物が、非共有結合関係で互いに会合することを指す。他の実施形態では、コスモトロピック分子は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ＣＯ３−２、ＨＰＯ４−２、グルコース、トレハロース、多価アルコール、およびプロリンからなる群より選択される。さらに他の実施形態では、結合緩衝液の存在下でのシリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相への核酸の結合は、約５〜約１０分間室温で起こる。本明細書で使用される用語「室温」は、２０〜２４℃（６８〜７５°Ｆ）の範囲などの、人々が一般的に慣れ親しんだ典型的または好ましい室内（環境制御された）温度を指す。
【００２８】
本明細書で使用する「高濃度のコスモトロピック分子」は、結合緩衝液中のコスモトロピック分子の濃度が約０．３Ｍ以上であることを意味する。例えば、濃度は、０．４Ｍ  ０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、または１．９Ｍ以上であり得る。いくつかの実施形態では、結合緩衝液は、約０．３Ｍ〜約２．０Ｍのコスモトロピック分子を含む。他の実施形態では、結合緩衝液は、約０．３Ｍ〜約２．０Ｍの硫酸アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、結合緩衝液は、例えば、硫酸アンモニウムと塩化ナトリウムとの組み合わせなどの、複数種類のコスモトロピック分子の混合物を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、結合緩衝液の存在下で核酸を官能基化固相へ結合させた後、結合緩衝液を除去する。試料を遠心分離する、または陽性空気圧および／または真空を試料に適用するなど、試料から緩衝液を除去する方法は、当該技術分野でよく知られているため、本明細書では詳細には説明されない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、結合緩衝液を除去した後、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相に結合した核酸を、低イオン強度洗浄緩衝液で少なくとも１回洗浄する。他の実施形態では、低イオン強度洗浄緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＭＥＳなどを含む。さらに他の実施形態では、低イオン強度洗浄緩衝液は、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｂｒｉｊ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、イリノイ州）、Ｉｇｅｐａｌなどの非イオン性洗剤を含む。
【００３１】
したがって、いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、低イオン強度緩衝液である。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、非イオン性洗剤を含む。さらに他の実施形態では、高いｐＨの洗浄緩衝液を用いて混入物質を除去する。さらなる実施形態では、洗浄は約１〜約１０分間室温で行われる。洗浄方法は、当該技術分野でよく知られており、任意の適切な洗浄スキームが使用され得る。さらなる実施形態では、結合緩衝液および／または洗浄緩衝液は、特に試料が血漿を含む場合、試料中のタンパク質を除去するためのプロテイナーゼＫをさらに含む。
【００３２】
洗浄工程後、核酸は、シリカまたはポリマー骨格を含む官能基化固相から、低イオン強度溶出緩衝液で溶出される。低イオン強度溶出緩衝液の非限定的な例には、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＧＬｙ、１０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ、および１０ｍＭ  Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパンが含まれる。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは約８以上である。他の実施形態では、溶出緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓを約８〜約９のｐＨで含む。さらに他の実施形態では、溶出は約８０℃で約５〜約１０分間行われる。さらなる実施形態では、精製された核酸を、増幅アッセイにおいて混入物質からの干渉なしに使用することができる。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、いくつかの実施形態において、用語「低イオン強度緩衝液」は、約１０ｍＭ以下のイオン強度を有する緩衝液を指す。他の実施形態では、低イオン強度緩衝液は、約５ｍＭ〜約１０ｍＭのイオン強度を有する。さらに他の実施形態では、低イオン強度緩衝液は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭのイオン強度を有する。低イオン強度緩衝液は当該技術分野でよく知られており、したがって、本開示の主題で洗浄用または溶出用に使用することができる他の低イオン強度緩衝液は、本明細書では詳細には説明されない。
【００３４】
本開示の主題は、ポイント・オブ・ケア検査に特に適用可能である。本開示の方法は、使いやすく、持ち運びができ、毒性または揮発性緩衝系を使用しない。したがって、いくつかの実施形態では、本方法はポイント・オブ・ケア検査に使用される。
【００３５】
（ＩＩ．核酸を精製するためのキット）
本開示の主題はまた、本開示の方法を実施するためのキットも提供する。いくつかの実施形態では、本開示の主題は、シリカまたはポリマー骨格を含む少なくとも１つの官能基化固相と、シリカまたはポリマー骨格を含む少なくとも１つの官能基化固相を使用して核酸を精製するための指示書一式とを含むキットを提供する。本開示のキットの任意の要素には、適切な緩衝液、試薬、包装材料などが含まれる。緩衝液または試薬の例には、滅菌水、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液が含まれる。キットの試薬は、例えば凍結乾燥された形態で、または安定化された液体として、それらが安定となる容器中にあってもよい。キットは、本開示の方法を単純化するために、予め測定された量の試薬を供給し得る。
【００３６】
（ＩＩＩ．定義）
特定の用語を本明細書では使用しているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用され、限定することを目的としていない。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本記載の主題が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３７】
長年にわたる特許法の慣習に従い、用語「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば、「被験体（ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及は、文脈が明らかに反対（例えば、複数の被験体）などではない限り、複数の被験体を含む。
【００３８】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ，  およびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、文脈上別段の解釈が必要でない限り、非排他的な意味で使用される。同様に、用語「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」およびその文法上の異形は、リスト内の項目の列挙が、リストされた項目に置換または追加可能な他の同様の項目を除外しないように、非限定的であることが意図されている。
【００３９】
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、別段の指示がない限り、量、大きさ、寸法、比率、形状、処方、パラメータ、パーセンテージ、分量、特性などを表す全ての数、ならびに明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値は、用語「約」が値、量または範囲と共に明示的に現れていなくても、全ての場合において用語「約」により修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、厳密ではなく、および厳密である必要はないが、公差、換算係数、四捨五入、および測定誤差などを反映して、ならびに本開示の主題により得られることが求められている所望の特性に応じて、当業者に知られている他の因子を反映して、近似的および／または必要に応じてより大きくもしくはより小さくてもよい。例えば、用語「約」は、値に言及する場合、いくつかの実施形態では、指定された量から、±１００％、いくつかの実施形態では±５０％、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、およびいくつかの実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味することができ、そのような変動は、開示の方法を実行するのに、または開示の組成物を使用するのに適切であるものとする。
【００４０】
さらに、用語「約」は、１つ以上の数字または数値範囲に関連して使用される場合、範囲内の全ての数字を含むそのような数字の全てを指すと理解されるべきであり、記載の数値より上および下に境界を拡張することにより、その範囲を変更する。エンドポイントによる数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数、例えば、その分数を含む整数全体（例えば、１〜５の記載は、１、２、３、４、および５、ならびにそれらの分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１など）およびその範囲内の任意の範囲を含む。
【実施例】
【００４１】
以下に示す実施例は、当業者に、本開示の主題の代表的な実施態様を実施するための指針を提供するために含まれている。本開示および当業者の一般的なレベルに照らして、当業者であれば、以下の実施例は例示的なものに過ぎず、本開示の主題の範囲から逸脱することなく多くの変更、修正、および改変を採用することができることを理解することができる。以下の合成の説明および具体的な実施例は、説明のためにのみ意図されており、他の方法による本開示の化合物の製造方法を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４２】
（実施例１）
（方法）
結合緩衝液３８０μＬ（約０．３Ｍ〜約２．０Ｍの硫酸アンモニウムおよび０．５〜１％  ＮＰ−４０を含有する１００〜２００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４）を、１００μＬのＲＮＡ溶液に添加し、最終濃度１ｐｇ／ｍＬまたは１０ｐｇ／ｍＬのＲＮＡを得た。この溶液を、−ＣＯＯＨ基で官能基化された磁気ビーズと共に、室温で５〜１０分間インキュベートした。次いで結合緩衝液を除去し、固相を洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．５〜７、０〜１％  ＮＰ−４０）と共に、１〜１０分間室温でインキュベートした。洗浄緩衝液を除去し、５０〜１００μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８〜９）中、８０℃で５〜１０分間インキュベートすることにより、ＲＮＡを固相から溶出した。
【００４３】
（実施例２）
（結果）
図１は、ＨＣＶ  ＲＮＡの緩衝液からの精製効率（％回収率）を示す。１および１０ｐｇ／ｍＬのＲＮＡ濃度に対する平均％回収率（±標準偏差）は、それぞれ６０％（±２０）および６２％（±１５）であった。１ｐｇ  ＨＣＶ  ＲＮＡ／ｍＬ＝１×１０２ｃｐ  ＨＣＶ  ＲＮＡ／μＬおよび１０ｐｇ  ＨＣＶ  ＲＮＡ／ｍＬ＝１×１０３ｃｐ  ＨＣＶ  ＲＮＡ／μＬ。これらの回収率は、他の方法を用いて報告された回収率に類似しており、広範囲の生体液にわたるＮＡの検出を可能にする。
【００４４】
（参考文献）
本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示の主題が関連する技術分野における当業者のレベルを示す。全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれ個々の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示しているかのように、同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。多くの特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書で参照されているが、そのような参照は、任意のこれらの文献が当該技術分野における一般常識の一部をなすことを認めるものではないことが理解される。
【００４５】
前述の主題は、理解を明確にするために例示および実施例によりある程度詳細に記載されているが、特定の変更および修正を添付の特許請求の範囲内で実施できることは、当業者には理解されるであろう。
【図１】
2017534289.tif 000003
【国際調査報告】
2017534289.tif 000004
2017534289.tif 000005