(57)【要約】  本発明は、ＡＤＡＭ１７と結合し得る新規な抗体ならびにまた前記抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。一態様から、本発明は、抗腫瘍活性を有する、ＡＤＡＭ１７と結合し得る新規な抗体または抗原結合性フラグメントに関する。本発明はまた、癌の治療のための薬物としての前記抗体の使用も含んでなる。最後に、本発明は、前記抗体を単独で、または他の抗癌化合物と組み合わせてまたは複合化して含んでなる組成物、および癌の治療におけるそれらの使用を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＡＭ１７エピトープと結合し、かつ、ＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを阻害するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記ＡＤＡＭ１７エピトープが配列番号３２の配列の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内に含まれるエピトープからなることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０でＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを阻害することを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質がＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦから選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７エピトープと結合することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ＡＤＡＭ１７エピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖；ならびに
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖
を含んでなることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列が配列番号７のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列が配列番号８のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号９、１１または１２のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号９、１１または１２のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項１１】
２０１２年１０月１８日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４６８６から得られたモノクローナル抗体１０２２Ｃ３からなることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
配列番号３２の配列の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内に含まれるＡＤＡＭ１７の単一のエピトープと結合し得ることを特徴とする、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０でＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを阻害することを特徴とする、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記ＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質がＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦから選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７エピトープと結合することを特徴とする、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１６】
腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する方法において使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞がＡＤＡＭ１７を発現する腫瘍細胞から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
２０１２年１０月１８日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたマウスハイブリドーマＩ−４６８６。
【請求項１９】
下記の核酸：
ａ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ；および
ｂ）配列番号１３〜２８および３６〜３８の配列からなる群から選択される配列のうち少なくとも１つを含んでなるＤＮＡ
から選択されることを特徴とする、単離された核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載のベクターにより形質転換された少なくとも１つの細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造のための方法であって、下記の工程：
ａ）請求項２１に記載の細胞の、培地および適当な培養条件での培養；および
ｂ）前記培養培地または前記培養細胞から出発して生産された前記抗体またはその抗原結合性フラグメントの回収
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体を含んでなる組成物。
【請求項２５】
組合せ製剤として細胞傷害性薬剤をさらに含んでなることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
複合製剤として細胞傷害性薬剤をさらに含んでなることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
組成物が薬学上許容可能なビヒクルをさらに含んでなる医薬組成物であることを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する方法において使用するための、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
癌の治療のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体もしくは請求項２３に記載の方法により得られた抗体、または請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３０】
前記癌がＡＤＡＭ１７を発現する癌から選択される癌であることを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記癌が卵巣癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、頭頸部癌および類表皮癌から選択される癌であることを特徴とする、請求項２９または３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＡＭ１７と結合し得る新規な抗体ならびに前記抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。一態様において、本発明は、抗腫瘍活性を有する、ＡＤＡＭ１７と結合し得る新規な抗体または抗原結合性フラグメントに関する。本発明はまた、癌の治療のための薬物としての前記抗体の使用も含んでなる。最後に、本発明は、前記抗体を単独で、または他の抗癌化合物と組み合わせてまたは複合化して含んでなる組成物、および癌の治療におけるそれらの使用を含んでなる。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭ１７（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１７(A disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17)）は、ヘビ毒様プロテアーゼ、ＴＮＦ−αコンベルターゼ、ＴＮＦ−α−変換酵素（ＴＡＣＥ）およびＣＤ  １５６ｂとも呼ばれる、いくつかの病理学的に重要な基質の細胞外切断（エクトドメインシェディング（ectodomain shedding））を担う膜結合メタロプロテアーゼである。最初に膜結合プロＴＮＦ−α遊離可溶性タンパク質の切断を担う酵素として同定され(Black R.A. et al, 1997 (Nature. 1997; 385(6618):729-33), Moss M.L. et al, 1997 (Nature. 1997; 385(6618):733-6))、以来、ＡＤＡＭ１７は多数の膜結合前駆体タンパク質のエクトドメインシェディングにおいて記載されている(Black R.A. et al, 1997 (Nature. 1997; 385(6618):729-33), Moss M.L. et al, 1997 (Nature. 1997; 385(6618):733-6))。ＡＤＡＭ１７によるエクトドメインシェディングは、細胞の膜から多数の可溶性サイトカインおよび増殖因子、例えば、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、エピレグリン、エピジェンおよびニューレグリンを遊離する(Arribas J. et al, (Curr Pharm Des. 2009; 15(20):2319-35))。ＡＤＡＭ１７はまた、ＩＬ−６Ｒａ、ＩＬ−１ＲＩＩ、Ｈｅｒ４、ｃ−Ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ、Ｍｅｒ、ＴＮＦ−α  ＲＩ  ＆  ＩＩを含む多くの受容体のシェディングを媒介し(Arribas, 2009)、そこでの生理学的結果は、受容体シェディングもしくは可溶性リガンド捕捉を介したシグナルサイレンシング、またはＩＬ−６Ｒａおよびｇｐ１３０に関して記載されているような受容体のトランス活性化(Chalaris A. et al, 2011 (Eur J Cell Biol. 2011; 90(6-7):484-94))であり得る。ＡＤＡＭ１７は、多数の接着分子のシェディングおよび細胞外微小環境の成分、例えば、Ｌ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ネクチン−４、ＣＤ４４およびコラーゲンＸＶＩＩを介して細胞外マトリックスのリモデリングおよび細胞−細胞接触に積極的に関与することができる。ＡＤＡＭ１７のよく理解されてない活性としては、細胞プリオンタンパク質およびアミロイド前駆体タンパク質のエクトドメインシェディングが含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
疑念を避けるため、明示されない限り、ＡＤＡＭ１７とは、配列番号２９の配列のヒトＡＤＡＭ１７に関する。
【０００４】
構造的には、ＡＤＡＭ１７は、プレプロタンパク質ドメイン（ａａ１〜２１４）、細胞外ドメイン（ａａ２１５〜６７１）、膜貫通ドメイン（ａａ６７２〜６９２）および細胞質ドメイン（ａａ６９３〜８２４）を含んでなる８２４アミノ酸のタンパク質からなる。
【０００５】
より詳しくは、細胞外ドメインは、配列番号３０の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ２１５〜４７４に相当する）のメタロプロテアーゼ（ＭＰ）ドメイン、配列番号３１の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ４７５〜５６３に相当する）のディスインテグリン（ＤＩ）ドメインおよび配列番号３２の配列（ＡＤＡＭ１７のａａ５６４〜６７１に相当する）の膜近位（ＭＰＤ）ドメインから構成される。
【０００６】
ＡＤＡＭ１７は、アンタゴニスト抗体の作製のための技術上困難な標的として記載されており、実際に、所望の特徴を生じるための特異的結合剤の選択および最適化を必要とする複雑な選択戦略が記載されている。これまでに記載されているこのような特異的アンタゴニストは１つだけであり、抗体Ｄ１（Ａ１２）は、ディスインテグリン−システインリッチドメインと触媒ドメインを同時に介してＡＤＡＭ１７と結合し得る。Ｄ１（Ａ１２）のアンタゴニスト活性は、そのアンタゴニスト活性を示すためにディスインテグリン−システインリッチドメインと触媒ドメインの両方との結合に依存する。
【０００７】
本発明は、有効な抗腫瘍活性を有するＡＤＡＭ１７を標的とする適切な抗体の欠如を改善することを意図する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、ＡＤＡＭ１７と結合し得る抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【０００９】
特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、従来技術に記載されている抗体とは対照的にシングルドメインを介してＡＤＡＭ１７と結合し得る。言い換えれば、本発明による抗体は、単一のエピトープと結合し得るが、従来技術の抗体は、ディスインテグリン−システインリッチドメインと触媒ドメインという２つの異なる独立したドメインから構成されるコンフォメーショナルエピトープに結合する。
【００１０】
この特性は、抗体の結合が患者の性質、処置される病態の性質、患者の健康状態などによるＡＤＡＭ１７の特定のコンフォメーションに依存しないので、特に着目される。
【００１１】
一実施形態では、ＡＤＡＭ１７エピトープと結合し、かつＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディング（shedding）を阻害するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが記載され、ここで、前記ＡＤＡＭ１７エピトープは、配列番号３２の配列の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内に含まれる単一のエピトープからなる。
【００１２】
一実施形態では、ＡＤＡＭ１７エピトープと結合し、かつＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを阻害するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが記載され、ここで、前記ＡＤＡＭ１７エピトープは、配列番号３２の配列の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内に含まれるエピトープからなる。
【００１３】
ＡＤＡＭ１７のＭＰＤに結合する抗体は、限定されるものではないが、免疫およびハイブリドーマ作製、モノクローナルＢ細胞選択、ファージディスプレー、リボゾームディスプレー、酵母ディスプレー、標的化遺伝子合成と組み合わせた発現免疫応答シーケンシングを含む、当業者に周知のいくつかの技術のうちのいずれかによって得ることができる。各方法は、標的抗原としてＡＤＡＭ１７タンパク質または選択されたサブドメインを用いて行うことができる。当業者ならば、ＡＤＡＭ１７細胞外ドメイン、またはより詳しくは、ＭＰＤと結合する抗体の集団からＭＰＤ結合抗体を選択することができるであろう。続いての選択および特性決定は、ＭＰＤ結合に関する選択工程も意味し、それにより、ＡＤＡＭ１７細胞外ドメインに対する総ての結合剤が、ＭＰＤまたはＭＰＤの選択されたサブドメインに対する結合に関して選択的にスクリーニングされる。あるいは、総ての選択工程はＭＰＤまたはＭＰＤの選択されたサブドメインに対して行うことができ、天然のＡＤＡＭ１７細胞外ドメインに対する結合が、続いての選択および特性決定工程として使用される。
【００１４】
特定の実施形態によれば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１：ＦＲＥＴペプチド切断アッセイ。
【図２】図２：Ａ４３１−ＴＧＦａ−Ｎｌｕｃ細胞のＴＧＦａ−Ｎｌｕｃ遊離に及ぼすｍＡｂ  １０２２Ｃ３の影響。
【図３】図３：Ａ４３１−ＡＲＥＧ−Ｎｌｕｃ細胞のＡＲＥＧ−Ｎｌｕｃ遊離に及ぼすｍＡｂ  １０２２Ｃ３の影響。
【図４】図４：Ａ４３１−ＴＮＦａ−Ｎｌｕｃ細胞のＴＮＦａ−Ｎｌｕｃ遊離に及ぼすｍＡｂ  １０２２Ｃ３の影響。
【図５】図５：Ａ４３１−ＨＢ−ＥＧＦ−Ｎｌｕｃ細胞のＨＢ−ＥＧＦ−Ｎｌｕｃ遊離に及ぼすｍＡｂ  １０２２Ｃ３の影響。
【図６】図６：１０２２Ｃ３変異体に関するＦＲＥＴペプチド切断アッセイ。
【図７】図７：腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ１２９９に対するグリコシル化されたおよび酵素的に脱グリコシル化されたｍ１０２２Ｃ３の結合。
【図８】図８：ＭＣＦ７細胞におけるｍＡｂ  １０２２Ｃ３のＡＲＥＧシェディング阻害。
【図９】図９：ＭＣＦ７細胞におけるＡＲＥＧシェディングに及ぼすｍＡｂ  １０２２Ｃ３の用量の影響。
【図１０】図１０：確立されたＡ４３１異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図１１】図１１：フラグメントＡ４３１異種移植モデルにおける１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図１２】図１２：Ａ４３１異種移植モデルにおけるｍ１０２２Ｃ３（マウス型）とｃ１０２２Ｃ３（キメラ型）の比較。
【図１３】図１３：確立されたＣａＯＶ−３異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図１４】図１４：確立されたＯＶＩＳＥ異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図１５】図１５：確立されたＢｘＰＣ３異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図１６】図１６：確立されたＢＩＣＲ−２２異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図１７】図１７：確立されたＪＩＭＴ−１異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図１８】図１８：確立されたＮＣＩ−Ｈ２９２異種移植における１０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
「モノクローナル抗体」は、均質に近い抗体集団から生じる抗体を意味すると理解される。より詳しくは、集団の個々の抗体は、最小の割合で見られ得る少数の起こり得る自然突然変異以外は同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は、単細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核生物宿主細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核生物宿主細胞など）の成長から生じる抗体からなり、一般に、１つおよび１つだけのクラスおよびサブクラスの重鎖と１タイプだけの軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は特異性が高く、かつ、単一の抗原向けられる。
【００１７】
「結合(binding)」または「結合する(binds)」などは、抗体またはその抗原結合性フラグメントが生理学的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することが意図される。２つの分子が結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、および表面プラズモン共鳴などが含まれる。疑念を避けるため、それは、前記抗体または抗原結合性フラグメントが別の抗体と低レベルで結合または干渉できないことを意味するものではない。好ましい実施形態としては、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントは、非特異的分子（ＢＳＡ、カゼインなど）に対する結合に関するその親和性の少なくとも２倍の親和性でその抗原に結合する。しかしながら、別の実施形態として、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントは、前記抗原にのみ結合する。
【００１８】
膜近位ドメイン（ＭＰＤ）、既述のように、ヒトＡＤＡＭ１７（配列番号２９の配列）のアミノ酸ドメイン５６４〜６７１からなる。ここで、マウスＡＤＡＭ１７の対応するＭＰＤもまたアミノ酸５６４〜６７１から構成されることも指摘できる。
【００１９】
特定の態様によれば、本明細書に記載の抗体は、メタロプロテアーゼ（ＭＰ）ドメインと結合せず、前記ＭＰドメインは配列番号２９の配列のアミノ酸２１５〜４７４から構成される。
【００２０】
特定の態様によれば、本明細書に記載の抗体はディスインテグリン（ＤＩ）ドメインと結合せず、前記ＤＩドメインは、配列番号２９の配列のアミノ酸４７５〜５６３から構成される。
【００２１】
シェディング活性を担うことが知られているＡＤＡＭ１７の触媒ドメインに干渉せずに、ＡＤＡＭ１７基質のシェディングを低減または阻害し得るアンタゴニスト、より詳しくは、抗体は記載されたことも示唆されたこともないので、この態様は驚くべきものである。言い換えれば、本明細書に記載の抗体は、病態の特定の状況において少なくとも１つの基質に関するＡＤＡＭ１７の酵素活性を選択的に低減または阻害することができ、前記病態は癌である。本明細書に記載の抗体の利点は、それが触媒ドメインとは結合しないが、その基質の全部または一部に対するＡＤＡＭ１７の酵素活性を低減または阻害できる可能性があることから、ＡＤＡＭ１７の全触媒活性を阻害しないと思われるという事実によるものであり得る。
【００２２】
一実施形態では、本出願に記載の抗体は、ＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害する。
【００２３】
本発明に関して、「ＩＣ５０」という表現は、達成可能な最大の半分の阻害を達成するのに必要な、用量応答評価における抗体の濃度を意味する。ＩＣ５０のこのような評価は、細胞からの基質シェディング評価または組換えタンパク質を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペプチド切断アッセイによって行うことができる。
【００２４】
好ましい態様において、本発明による抗体は、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００２５】
好ましい態様において、本発明による抗体は、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング増殖因子α）のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００２６】
好ましい態様において、本発明による抗体は、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００２７】
好ましい態様において、本発明による抗体は、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子）のシェディングを、より好ましくは、少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【００２８】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦから選択されるＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを阻害することを特徴とする。
【００２９】
一実施形態において、本発明の抗体は、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦから選択されるＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは、１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【００３０】
一実施形態において、本発明の抗体は、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよびＨＢ−ＥＧＦのシェディングを少なくとも５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することを特徴とする。
【００３１】
別の態様によれば、本抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７エピトープと結合することを特徴とする。
【００３２】
別の実施形態では、本抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下、より好ましくは約２ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７エピトープと結合することを特徴とする。
【００３３】
「Ｋｄ」は、「Ｋｄ」または「ＫＤ」とも呼ばれ、特定の抗体−抗原複合体の解離定数を意味する。Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ  ここで、Ｋｏｆｆは、抗体−抗原複合体からの抗体解離の解離速度定数であり、Ｋｏｎは、抗体が抗原と会合する速度である(Chen Y. et al, 1999; J Mol Biol. 1999; 293(4):865-81))。
【００３４】
本明細書では、本発明は天然形態の抗体に関するものではなく、すなわち、それはその天然環境にはなく、天然源から精製により単離または取得できた、またはそうでなければ遺伝子組換え、もしくは化学合成により取得できた、本明細書に記載されるように、その後、非天然アミノ酸を含み得ると理解されなければならない。
【００３５】
本発明の一実施形態は、ＡＤＡＭ１７エピトープと結合し、かつ、６つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含んでなり得る抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、ここで、前記６つのＣＤＲのうち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つが、配列番号１〜６のアミノ酸配列または最適なアラインメントの後に配列番号１〜６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列を含んでなるＣＤＲから選択される。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、抗体または任意のその抗原結合性フラグメントは、配列番号１〜６の配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１〜６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の６つのＣＤＲを含んでなる。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭ１７エピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントに関し、前記抗体は、
それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖；および
それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖
を含んでなる。
【００３８】
本発明の一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号１の配列を含んでなり、Ｘ１と表される残基は極性アミノ酸から選択される。極性アミノ酸は好ましくは、アスパラギン（ＡｓｎもしくはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐもしくはＤ）、グルタミン（ＧｌｎもしくはＱ）、セリン（ＳｅｒもしくはＳ）、グルタミン酸（ＧｌｕもしくはＥ）、アルギニン（ＡｒｇもしくはＲ）、リシン（ＬｙｓもしくはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓもしくはＨ）、トリプトファン（ＴｒｐもしくはＷ）、チロシン（ＴｙｒもしくはＹ）またはトレオニン（ＴｈｒもしくはＴ）から選択される。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、残基Ｘ１は、小型極性アミノ酸から選択される。小型極性アミノ酸は好ましくは、アスパラギン（ＡｓｎもしくはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐもしくはＤ）、セリン（ＳｅｒもしくはＳ）またはトレオニン（ＴｈｒもしくはＴ）から選択される。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、残基Ｘ１は、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）である。
【００４１】
本出願の抗体対象は、ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列が配列番号７のアミノ酸配列であることを特徴とする。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、残基Ｘ１は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）である。
【００４３】
本出願の抗体対象は、ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列が配列番号８のアミノ酸配列であることを特徴とする。
【００４４】
抗体の「抗原結合性フラグメント」という表現は、前記抗体の標的（一般には抗原とも呼ばれる）、一般には同じエピトープに結合する能力を保持し、かつ、抗体のアミノ酸配列の少なくとも５つの連続するアミノ酸残基、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２００の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなるいずれのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も示すことが意図される。
【００４５】
好ましい実施形態では、前記抗原結合性フラグメントは、それが由来する抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる。さらに好ましい実施形態では、前記抗原結合性フラグメントは、それが由来する抗体の２つ、３つ、４つまたは５つのＣＤＲ、より好ましくは６つのＣＤＲを含んでなる。
【００４６】
「抗原結合性フラグメント」は、限定されるものではないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントまたはダイアボディ、またはＸＴＥＮ（延長組換えポリペプチド）もしくはＰＡＳモチーフなどの変性ペプチドとの融合タンパク質、またはその半減期がポリ（エチレン）グリコールなどのポリ（アルキレン）グリコールの付加（「ペグ化」）（ペグ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを表す）などの化学修飾により、もしくはリポソーム内への組み込みにより延長される任意のフラグメントからなる群から選択することができ、前記フラグメントは、本発明による抗体の特徴的なＣＤＲのうちの少なくとも１つを有する。好ましくは、前記「抗原結合性フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列で構成されるか、または前記部分配列を含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性および標的に対する十分な親和性、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。
【００４７】
用語「エピトープ」は、抗体により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的エピトープまたは機能的エピトープとして定義され得る。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンフォメーショナルエピトープでもあり得る。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面群である決定基を含み得、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴、および／または特異的電荷特徴を持ち得る。
【００４８】
疑念を避けるため、「単一のエピトープ」という表現は、必ずしも直鎖エピトープを意味しない。
【００４９】
疑念を避けるため、文脈がそうではないことを示さない限り、ＣＤＲという表現は、ＩＭＧＴにより定義される抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。
【００５０】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造において使用される。
【００５１】
３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。用語ＣＤＲ（単数または複数）は、本明細書では、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の親和性により結合を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかを、もしくは全体でさえ示すために使用される。
【００５２】
本発明による抗体またはその任意の抗原結合性フラグメントはまた、ｉ）それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％＞、好ましくは８５％＞、９０％）、９５％および９８％＞の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなると記載することもできる。
【００５３】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２配列間の「同一性パーセンテージ」または「同一性％」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基パーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]ローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）の手段によって行うことができる。
【００５４】
２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、ここで、比較する核酸配列またはアミノ酸配列は、その２配列間の最適なアラインメントの参照配列と比較して付加または欠失を持ち得る。同一性パーセンテージは、２配列間、好ましくは２つの全配列の間でアミノ酸、ヌクレオチドまたは残基が同一である位置の数を決定し、その同一の位置の数をアラインメントウインドウ内の位置の総数で割り、その商に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
【００５５】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２に関して；選択されるマトリックスは、このプログラムによって提案される例えば「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに使用し、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムによって直接計算される。
【００５６】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％＞、９５％および９８％＞の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、参照配列、特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含有するものが含まれる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の生物活性を変更しないいずれのアミノ酸も示すものとする。
【００５７】
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかに基づいて決定され得る。
【００５８】
限定されない例として、下記表１は、対応する改変抗体の生物活性に有意な改変をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も通常可能である。
【００５９】
【表１】
2017501723.tif 000002
【００６０】
本発明による抗体または任意のその抗原結合性フラグメントはまた、ｉ）それぞれ配列番号７、２および３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３、または最適なアラインメントの後に配列番号７、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖と、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％＞、好ましくは８５％、９０％）、９５％および９８％＞の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなると記載することもできる。
【００６１】
本発明による抗体または任意のその抗原結合性フラグメントはまた、ｉ）それぞれ配列番号８、２および３のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号８、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％＞、好ましくは８５％、９０％）、９５％）および９８％＞の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなると記載することもできる。
【００６２】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性有する配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００６３】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１１のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００６４】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１２のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
【００６５】
一実施形態において、本抗体は、配列番号９、１１または１２のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする。
【００６６】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１０のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１０の配列となくとも８０％＞、好ましくは８５％、９０％＞、９５％および９８％＞の同一性を有する配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
【００６７】
一実施形態において、本抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインを含んでなることを特徴とする。
【００６８】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
ｉ）配列番号９、１１もしくは１２から選択されるアミノ酸配列を含んでなる配列、または最適なアラインメントの後に配列番号９、１１もしくは１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列の重鎖可変ドメインと、
ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１０の配列と少なくとも８０％＞、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列の軽鎖可変ドメインと
を含んでなる。
【００６９】
より詳しくは、本発明は、配列番号９、１１または１２のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる配列軽鎖可変ドメインとを含んでなることを特徴とする抗体に関する。
【００７０】
一実施形態において、本抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる。
【００７１】
一実施形態において、本抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる。
【００７２】
一実施形態において、本抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと、ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる。
【００７３】
一実施形態において、本抗体は、マウス抗体からなる。この場合、それはｍ１０２２Ｃ３と呼ばれる。
【００７４】
一実施形態において、本抗体は、キメラ抗体からなる。この場合、それはｃ１０２２Ｃ３と呼ばれる。
【００７５】
一実施形態において、本抗体は、ヒト化抗体からなる。この場合、それはｈｚ１０２２Ｃ３と呼ばれる。
【００７６】
一実施形態において、本抗体は、ヒト抗体からなる。この場合、それはｈ１０２２Ｃ３と呼ばれる。
【００７７】
１０２２Ｃ３という表現はまた、本抗体をその起源に関わらずに表すためにも使用でき、それがｍ／ｃ／ｈ／ｈｚ  １０２２Ｃ３を包含することを意味する。
【００７８】
より明確にするために、下記表２に本発明の抗体に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる。
【００７９】
【表２】
2017501723.tif 000003
【００８０】
別の態様において、本抗体またはその抗原結合性フラグメントは、キメラ抗体からなる。
【００８１】
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を、前記の所与のとは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
【００８２】
本抗体またはそのキメラフラグメントは、組換え遺伝学の技術を使用することにより作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターおよび本発明の非ヒト、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列、およびヒト抗体定常領域をコードする配列を含有する組換えＤＮＡをクローニングすることにより作製することができる。このような１つの組換え遺伝子によりコードされる本発明によるキメラ抗体は、例えばマウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域より決定され、そのアイソタイプはヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。キメラ抗体を作製するための方法についてはVerhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)を参照。
【００８３】
本発明の特定の態様は、
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖；
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖；ならびに
ｉｉｉ）マウスとは異種の抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなる前記  抗体
を含んでなるキメラ抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【００８４】
本発明の一実施形態において、マウスとは異なる前記種はヒト(human)（可能性としてヒト(man)とも呼ばれる）。
【００８５】
一例として、本発明によるキメラ抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖、および／または配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００８６】
一例として、本発明によるキメラ抗体は、配列番号３４のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖と、場合により、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００８７】
より好ましい実施形態では、本発明によるキメラ抗体は、配列番号３３または３４のアミノ酸配列を含んでなる配列重鎖と、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００８８】
別の態様において、本発明は、ヒト化抗体からなる抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【００８９】
「ヒト化抗体」は、ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子の他の部分は１つ（または複数の）非ヒト抗体に由来する抗体を意味する。加えて、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）の一部は結合親和性を保存するように改変することができる(Jones et al. , Nature, 321 :522-525, 1986; Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al, Nature, 332:323-327, 1988)。
【００９０】
本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術（例えば、文献Singer et al, J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992;およびBebbington et al, Bio/Technology, 10: 169-175, 1992に記載されているものなど）によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける予防的および／または治療的処置を含む方法におけるそれらの使用のために好ましい。例えば、ＰＤＬにより特許ＥＰ０４５１２６１、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７またはＵＳ５，５３０，１０１、ＵＳ６，１８０，３７０、ＵＳ５，５８５，０８９およびＵＳ５，６９３，７６１に記載されている「ＣＤＲグラフト」技術などの他のヒト化技術も当業者に公知である。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用され得る。
【００９１】
本発明の特定の態様は、
ｉ）それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖；
ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列、または最適なアラインメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖；ならびに
ｉｉｉ）ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなる前記抗体
を含んでなるヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【００９２】
一実施形態では、ｉ）それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖；ならびにｉｉｉ）ヒト抗体の由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなる前記抗体を含んでなるヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが記載される。
【００９３】
一実施形態では、ｉ）それぞれ配列番号７、２および３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖；ならびにｉｉｉ）ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなる前記抗体を含んでなるヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが記載される。
【００９４】
一実施形態では、ｉ）それぞれ配列番号８、２および３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖、ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖；ならびにｉｉｉ）ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域も含んでなる前記抗体を含んでなるヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが記載される。
【００９５】
好ましい様式では、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域は、それぞれλまたはκおよびγ−１、γ−２またはγ−４領域である。
【００９６】
２０１２年１０月１８日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、２５  Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２５  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４６８６から得られたモノクローナル抗体１０２２Ｃ３、からなることを特徴とするモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが記載される。
【００９７】
別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌し得るマウスハイブリドーマ、特に、２０１２年１０月１８日にＩ−４６８６番としてｔｈｅ  Ｆｒｅｎｃｈ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＮＣＭ，パスツール研究所，パリ，フランス）に提出されたマウス起源のハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４系統の細胞の融合によって得られたものである。
【００９８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、配列番号３２の配列の膜近位ドメイン（ＭＰＤ）内に含まれるＡＤＡＭ１７の単一のエピトープに結合し得ることを特徴とする。
【００９９】
本抗体の別の好ましい特性は、それが５００ｐＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０でＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質のシェディングを阻害するということであり、前記ＡＤＡＭ１７の少なくとも１つの基質は、好ましくはＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＡＲＥＧおよび／またはＨＢ−ＥＧＦから選択される。
【０１００】
別の実施形態では、本抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に約１０ｎＭ以下、好ましくは約５ｎＭ以下、より好ましくは約２ｎＭ以下のＫｄでＡＤＡＭ１７エピトープと結合することを特徴とする。
【０１０１】
本発明の別の態様は、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に有効量の上記の抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与する工程を含んでなる。
【０１０２】
別の実施形態では、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する方法において使用するための抗体が記載され、前記腫瘍細胞は、ＡＤＡＭ１７を発現する腫瘍細胞から選択される。
【０１０３】
当業者ならば、サイトメトリー、免疫組織化学、抗体結合能（ＡＢＣ）などの既知の技術のいずれかによってＡＤＡＭ１７の発現レベルを容易に決定できるであろう。
【０１０４】
限定されない例として、発現レベルは、ＡＤＡＭ１７に対する標識抗体の抗体結合能（ＡＢＣ）をサイトメトリーにより測定することで決定することができる。
【０１０５】
一実施形態において、腫瘍細胞は、少なくとも５０００のＡＢＣを有するＡＤＡ１７を発現すると見なされる。
【０１０６】
別の実施形態では、腫瘍細胞は、少なくとも１００００のＡＢＣを有するＡＤＡ１７を発現すると見なされる。
【０１０７】
本出願の別の態様は、２０１２年１０月１８日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスマウスに寄託されたハイブリドーマＩ−４６８６に関する。
【０１０８】
本発明の別の態様は、下記の核酸：
ａ）上記の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸；
ｂ）配列番号１３〜２８の配列、または最適なアラインメントの後に配列番号１３〜２８および３６〜３８と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％＞、９５％および９８％の同一性パーセンテージを示す配列を含んでなる核酸
から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する。
【０１０９】
本発明は、下記の核酸：
ａ）上記の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ；および
ｂ）配列番号１３〜２８および３６〜３８からなる群から選択される配列のうちの１つを含んでなる、好ましくは、ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ１、Ｌ２、Ｌ３をコードする６つの核酸、または重鎖および／もしくは軽鎖、好ましくは、配列番号１３〜２８および３６〜３８からなる群から選択される抗ＡＤＡＭ１７抗体可変ドメインをコードする核酸を含んでなるＤＮＡ
から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する。
【０１１０】
下記表３に本発明の抗体に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる。
【０１１１】
【表３】
2017501723.tif 000004
【０１１２】
用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書において互換的に使用され、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有せず、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかであるフラグメントまたは核酸の領域を定義する、改変されたまたは改変されていないヌクレオチドの厳密な配列を意味する。
【０１１３】
ここで、本発明はそれらの天然の染色体環境にある、すなわち天然状態にあるヌクレオチド配列に関するものではないことも含めておくべきであろう。本発明の配列は単離および／または精製されたものであり、すなわち、それらは直接または例えばコピーにより間接的にサンプリングされたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。ここで、組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られた、または化学合成により得られた単離された核酸も述べておくべきであろう。
【０１１４】
最適なアラインメントの後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％）、９５％および９８％＞の同一性パーセンテージを示す「核配列」とは、参照核配列に対して、特に、欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換などの特定の改変、特に規則的なものを示す核配列を意味する。好ましくは、これらは参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列（これは遺伝コードの縮重に関するものである）、または好ましくは高ストリンジェント条件下で参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補配列である。
【０１１５】
また、上述の核酸を含んでなるベクターも記載される。
【０１１６】
本発明は特に、このようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを目的とする。
【０１１７】
本発明のベクターは、好ましくは、所与の宿主細胞内でヌクレオチド配列の転写／翻訳発現および／または分泌を可能とする要素を含み、その結果、コードされるタンパク質の発現／分泌をもたらす。従って、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含まなければならない。好ましい実施形態では、このようなベクターは、宿主細胞内で安定な様式で維持され得るべきであり、場合により翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを有してもよい。これらの種々要素は、使用する宿主細胞に応じて当業者により選択および最適化される。この目的で、ヌクレオチド配列は選択された宿主内で自己複製するベクターに挿入することもできるし、または選択された宿主の組み込みベクターとすることもできる。
【０１１８】
このようなベクターは、当業者により一般に使用される方法によって作製され、得られたクローンをリポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学法などの標準的な方法によって好適な宿主に導入することができる。
【０１１９】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらはクローンまたは本発明のヌクレオチド配列をクローニングするまたは発現させることを目的に、宿主細胞を形質転換するために使用される。
【０１２０】
本発明はまた、上記のベクターを含んでなる宿主細胞にも関する。
【０１２１】
宿主細胞は、原核生物系または真核生物系、例えば、細菌細胞、例えばまた、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞の中から選択することができる。昆虫細胞または植物細胞も使用可能である。
【０１２２】
本出願のもう１つの主題は、上記の抗体により形質転換された少なくとも１つの細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物からなる。
【０１２３】
従ってまた、本明細書による抗体またはその抗原結合性フラグメントの生産のための方法であって、下記の工程：
ａ）上記の細胞の、培地および適当な培養条件での培養；および
ｂ）前記培養培地または前記培養細胞から出発して生産された前記抗体またはその抗原結合性フラグメントの回収
を含んでなることを特徴とする方法も記載される。
【０１２４】
本発明による形質転換細胞は、本発明による組換えポリペプチドの作製のための方法に使用される。その方法がベクターおよび／または本発明によるベクターにより形質転換された細胞を使用することを特徴とする、組換え形態での本発明によるポリペプチドの作製のための方法もまた本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターにより形質転換された細胞は、前述のポリペプチドの発現および前記組換えペプチドの回収を可能とする条件下で培養される。
【０１２５】
既述のように、宿主細胞は、原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系で分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を同定することが可能である。従って、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌させる組換えタンパク質の生産に有利に使用することができる。実際に、対象とするこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部ではなく細胞培養の上清中に存在するという事実によって容易となる。
【０１２６】
本発明のポリペプチドはまた化学合成によって作製することもできる。１つのこのような作製方法もまた、本発明の対象である。当業者ならば、固相技術（特に、Steward et ah, 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 第2版参照）または部分的固相技術、フラグメントの縮合による、または溶液中での従来の合成によるなどの化学合成の方法を知っている。化学合成により得られ、対応する非天然アミノ酸を含有し得るポリペプチドも本発明に含まれる。
【０１２７】
本発明の方法により得られる可能性のある抗体またはその抗原結合性フラグメントも本発明に含まれる。
【０１２８】
本発明は、薬物として使用するための上記抗体またはその抗原結合性フラグメントに関する。
【０１２９】
本発明はまた、抗腫瘍化合物からなる別の治療上有効な化合物をさらに含んでなることを特徴とする組成物に関する。
【０１３０】
一実施形態において、本出願は、上記の抗体を含んでなる組成物に関する。
【０１３１】
一実施形態において、組成物は、組合せ製剤として、治療上有効な量の細胞傷害性薬剤をさらに含んでなることを特徴とする。
【０１３２】
組合せが構成される成分は、その組合せの最大有効性が得られるように、同時、個別、または逐次に投与してよく、各投与については、迅速投与から連続潅流までその持続時間の変更が可能である。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「同時投与」とは、単一のユニークな剤形による組成物の２つの化合物の投与を意味する。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「個別投与」とは、異なる剤形での本発明による組成物の２つの化合物の同時投与を意味する。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、「逐次投与」とは、それぞれ異なる剤形で本発明による組成物の２つの化合物の連続的投与を意味する。
【０１３６】
「治療上有効な量」とは、本明細書で使用する場合、疾患の症状を予防、緩和、軽減もしくは改善する、または治療される患者の生存を延長するために有効な１つの化合物（または複数の化合物）の最小の濃度または量を意味する。治療上有効な量はまた、薬剤の毒性作用または有害作用に治療上有益な効果が上回るものである。より詳しくは、癌の治療に関して、治療上有効な量は、（１）腫瘍のサイズを縮小する（または好ましくは排除する）；（２）腫瘍転移を阻害する（すなわち、いくらか緩徐化する、好ましくは停止させる）；（３）腫瘍成長をいくらか阻害する（すなわち、いくらか緩徐化する、好ましくは停止させる）；および／または（４）癌に関連する１以上の症状をいくらか緩和する（または好ましくは、排除する）効果を有する量を意味する。
【０１３７】
一実施形態において、本組成物は、治療上有効な量の細胞傷害性薬剤を複合製剤としてさらに含んでなることを特徴とする。
【０１３８】
本発明の意味において、「複合体」とは一般に、１以上の細胞傷害性薬剤と物理的に連結されて、高度に標的化された化合物となった上記の抗体を少なくとも含んでなる組成物を意味する。
【０１３９】
一実施形態において、前記抗体は、リンカーによって細胞傷害性薬剤に化学的に連結される。「リンカー」、「リンカー単位」、または「連結」は、共有結合を含んでなる化学部分または結合タンパク質を少なくとも１つの細胞傷害性薬剤に共有結合する原子の鎖を意味する。リンカーは、「切断不能」でも「切断可能」でもよい。
【０１４０】
本発明の組成物はまた、種々の希釈剤、増量剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、および当技術分野で周知の他の材料も含み得る。
【０１４１】
別の実施形態では、本組成物は、薬学上許容可能なビヒクルをさらに含んでなる医薬組成物である。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、「薬学上許容可能なビヒクル」または「薬学上許容可能な担体」には、生理学的に適合する溶媒、バッファー、塩溶液、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化材および吸収遅延剤などのいずれかおよび総てが含まれる。担体のタイプは、意図される投与経路に基づいて選択することができる。種々の実施形態では、担体は、静脈投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与または経口投与に好適なものである。薬学上許容可能な担体としては、無菌水溶液または分散液および無菌注射溶液または分散液の即時調合製剤のための無菌粉末が含まれる。薬学上有効な物質のための媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。非経口投与可能な化合物を調製するための方法は周知であるか、または当業者に自明であり、例えば、引用することにより本明細書の一部とされるRemington's Pharmaceutical Science, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)、およびその第18版および第19版にさらに詳しく記載されている。
【０１４３】
「細胞傷害性薬剤」または「細胞傷害性」とは、対象に投与した際に、細胞増殖の進展、好ましくは、対象の身体における癌の発生を、細胞の機能を阻害もしくは抑制することにより、かつ／または細胞死を引き起こすことにより治療または予防する薬剤を意図する。
【０１４４】
多くの細胞傷害性薬剤が単離または合成されており、細胞増殖を阻害すること、または腫瘍細胞を、決定的でなくとも少なくとも有意に破壊もしくは減少させることを可能とする。
【０１４５】
より詳しくは、細胞傷害性薬剤は、好ましくは、限定されるものではないが、薬物、毒素、放射性同位元素などからなる。
【０１４６】
別の態様によれば、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する方法において使用するための組成物が記載される。
【０１４７】
本発明はまた、癌の予防または治療を意図する薬物の製造のための本組成物の使用を含んでなる。
【０１４８】
本発明はまた、癌の治療のための、上記の、もしくは上記の方法により得られた抗体または上記の組成物の使用に関し、前記癌はＡＤＡＭ１７を発現する癌から選択される癌である。
【０１４９】
好ましい実施形態では、前記癌は、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、頭頸部癌および類表皮癌から選択される癌である。
【０１５０】
治療適用に関して、本発明の組成物は、ヒトに、ボーラスとしてもしくは一定期間にわたる持続的注入による静脈内に、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口の、局所的、または吸入経路により投与され得るものを含む、上述のものなどの薬学上許容可能な投与形で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。本発明の前記組成物はまた、局部的ならびに全身性治療効果を発揮するように、腫瘍内、腫瘍近傍、病巣内、または病巣近傍経路により好適に投与される。
【０１５１】
本発明の他の特徴および利点は、例および図面とともに本明細書に示され、図面の判例を以下に示す。
【実施例】
【０１５２】
実施例１：抗体の作製
ヒトＡＤＡＭ１７に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１５〜２０μｇのヒトＡＤＡＭ１７組換えタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：９３０−ＡＤＢ、ｒｈＡＤＡＭ１７）で３回皮下免疫した。最初の免疫は完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。以降の免疫にはフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。
【０１５３】
融合の３日前に、２個体の免疫マウス（血清力価測定に基づいて選択）をフロイントの不完全アジュバントとともに１５〜２０μｇのｒｈＡＤＡＭ１７タンパク質で追加免疫した。近位リンパ節の細断によりリンパ球を調製した後、それらをＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と１：４比（リンパ球：骨髄腫）で融合させた（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）。融合プロトコールはKohler and Milstein (1975)により記載されているものであり、最後に、５０枚の９６ウェルプレートに播種した。次に、融合細胞に対して代謝ＨＡＴ選択を行った。融合およそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングでは、ハイブリドーマの上清を、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＡＤＡＭ１７に対して生成したｍＡｂの分泌に関して評価した。
【０１５４】
簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）をＰＢＳ中０．７μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＤＡＭ１７タンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：９３０  ＡＤＢ）５０μｌ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。次に、これらのプレートを０．５％ゼラチン（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）を含有するＰＢＳで、３７℃にて２時間遮断した。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出し、５０μｌのサンプル（ハイブリドーマ上清または精製抗体）をＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ウエストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中、１／５０００希釈液として３７℃で１時間加えた。ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加えた。室温で１０分のインキュベーション後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０１５５】
第２のスクリーニング工程として、選択されたハイブリドーマ上清をＡ１７２ヒト腫瘍細胞の表面で発現される細胞型のＡＤＡＭ１７と結合し得るｍＡｂに関してＦＡＣＳ分析により評価した。フローサイトメトリーによる選択のために、２×１０５細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルの、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に１／５００希釈したＡｌｅｘａ  ４８８結合ヤギ抗マウス抗体（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄の後、各試験管にヨウ化プロピジウムを終濃度４０μｇ／ｍｌで加えた後に細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。細胞単独およびＡｌｅｘａ  ４８８結合二次抗体とともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。各実験でアイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）を使用した。少なくとも５０００細胞を用いて、蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を評価した。
【０１５６】
できるだけ速やかに、選択されたハイブリドーマを限界希釈によってクローニングした。各コードにつき１枚の９６ウェルプレートを準備した。クローニング専用培養培地で８細胞／ｍｌに調整した１００μｌ容量の細胞懸濁液を各ウェルに添加した。７日目に、これらのウェルを顕微鏡で観察してクローニングおよびプレーティング効率を確認した後、これらのプレートに１００μｌのクローニング専用培養培地を再供給した。その後、９〜１０日目に、ハイブリドーマ上清を、それらのｒｈＡＤＡＭ１７タンパク質に対する反応性に関してスクリーニングした。次に、アイソタイピングキット（カタログ番号５３００．０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いてクローニングされたｍＡｂのアイソタイプを調べた。各ハイブリドーマから１つのクローンを選択し、ｒｈＡＤＡＭ１７およびヒト腫瘍細胞（Ａ  １７２）に対するそれらの結合特異性確認するために拡大培養した。
【０１５７】
実施例２：ＦＲＥＴペプチド切断アッセイ
黒色９６ウェルプレートで、４０μｌ／ウェルの組換えヒトＡＤＡＭ１７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：９３０  ＡＤＢ）（２５０ｎｇ／ｍｌ）を種々の濃度の１０μｌの抗ＡＤＡＭ１７  ｍＡｂ（ｍ１０２２Ｃ３）または無関連のｍＡｂ（９Ｇ４）とともに室温で１０分間インキュベートした。次に、各末端を５−ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡで標識したプロＴＮＦα  ＡＤＡＭ１７特異的切断部位に相当する基質ペプチド（５−ＦＡＭ−ＳＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲＫ−ＴＡＭＲＡ）１０μＭ溶液  ５０μｌを加えた。その後、種々の３７℃インキュベーション時間（ｔ＝０、２、６および２４時間）後にＢｅｒｔｈｏｌｄ  Ｍｉｔｈｒａｓプレートリーダー（励起フィルター４８５ｎｍ、発光フィルター５３０ｎｍ、エネルギーランプ：７０００リーディングタイム：０．２秒／ウェル）にて蛍光を連続的に測定した。非切断基質ペプチドでは５−ＦＡＭの蛍光はＴＡＭＲＡにより消光されるので、蛍光の増加はＡＤＡＭ１７活性を反映した。
【０１５８】
抗ＡＤＡＭ１７  ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３は、基質ペプチド切断の用量依存的阻害を示した（図１）。
【０１５９】
実施例３：腫瘍細胞株Ａ４３１からの組換え基質のＡＤＡＭ１７シェディング
それぞれナノルシフェラーゼ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と融合されたプロＴＧＦα、プロＨＢ−ＥＧＦ、プロアンフィレグリンまたは変異型プロＴＮＦαを原形質膜で発現する安定トランスフェクトＡ４３１細胞株を作製した。これらの細胞の原形質膜におけるＡＤＡＭ１７活性は、ナノルシフェラーゼ（登録商標）に融合された成熟基質の培養培地中への遊離をもたらした。培養培地サンプルにおけるナノルシフェラーゼ活性の時間依存的測定はＡＤＡＭ１７活性を反映した。Ａ４３１基質−Ｎｌｕｃ細胞を９６ウェル培養プレート中に３００００細胞／ウェルで播種した。２日後、培養培地を除去し、抗ＡＤＡＭ１７  ｍＡｂ（ｍ１０２２Ｃ３）または無関連ｍＡｂ（９Ｇ４）が種々の濃度で希釈された２００μｌの新鮮培養培地に置き換えた。培養（３７℃、ＣＯ２  ５％）２４時間後、総ての試験ウェルから５μｌの培養培地を採取し、ホワイトハーフエリア９６ウェルプレートのウェルに分注した。１５μｌの（ＰＢＳ希釈）Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（フリマジン）の添加後、各試験の総発光をＢｅｒｔｈｏｌｄ  Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０マルチモードマイクロプレートリーダーにて０．１秒間読み取った。
【０１６０】
抗ＡＤＡＭ１７  ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３は、ｉ）培養培地中のＴＧＦα−Ｎｌｕｃ遊離（図２）、ｉｉ）培養培地中のＡＲＥＧ−Ｎｌｕｃ遊離（図３）、ｉｉｉ）培養培地中のＴＮＦα−Ｎｌｕｃ遊離（図４）およびｉｖ）培養培地中のＨＢ−ＥＧＦ−Ｎｌｕｃ遊離（図５）の用量依存的低下を誘導した。ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３によりＴＧＦα、プロＨＢ−ＥＧＦ、プロアンフィレグリンまたは変異型プロＴＮＦαのシェディングの阻害に関して得られたＩＣ５０値を文献で公開されているものと比較した（表４）。ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３は、対照化合物比べて試験した総ての基質の細胞シェディングの有意に１０倍より大きい、好ましくは２０倍より大きい、好ましくは３０倍より大きい、好ましくは４０倍より大きい、好ましくは５０倍より大きい阻害を示した。
【０１６１】
【表４】
2017501723.tif 000005
【０１６２】
実施例４：ＡＤＡＭ１７に結合するｍＡｂ  １０２２Ｃ３
ｍＡｂ  １０２２Ｃ３のヒト、マウスおよびキメラＡＤＡＭ１７に対する結合プロファイルは、ウエスタンブロットおよび表面プラズモン共鳴により決定した。いくつかのＡＤＡＭ１７サブドメインおよびヒト／マウスキメラタンパク質をＨＥＫ２９３細胞からヒトＦｃ融合タンパク質として発現させた。Ａタンパク質により精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離とその後のｍ１０２２Ｃ３を用いたウエスタンブロット解析および表面プラズモン共鳴に従って結合に関して試験した。作製し、結合に関して試験したタンパク質を表４に詳細に示す。アミノ酸の位置は、ヒトＡＤＡＭ１７：受託番号Ｐ７８５３６およびマウスＡＤＡＭ１７：受託番号ＡＡＩ３８４２１を参照して引用する。発現したヒト起源のＡＤＡＭ１７ドメインを大文字で、マウス起源のドメインを小文字で記載する。ドメイン名は次のように略す：Ｐ、プロドメイン；Ｃ、触媒ドメイン；Ｄ、ディスインテグリンドメイン；ＭＰＤ、膜近位ドメイン。断片化されたドメインは、アミノ末端側（Ｎｔｅｒ）かカルボキシ末端側（Ｃｔｅｒ）か、タンパク質構造におけるそれらの位置により示す。
【０１６３】
ウエスタンブロット結合アッセイ：
等量の精製タンパク質を、非還元条件下、４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中１％の脱脂乳とともにこのメンブレンをインキュベートすることによりブロッキングを行った。次に、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔ中１μｇ／ｍｌ  ｍ１０２２Ｃ３抗体とともに、連続振盪下、室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔ中１：３０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧとともに、連続振盪下、室温で１時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質は、増強化学発光検出系キットにより製造者の説明書に従って可視化した。
【０１６４】
ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイ：
試験はＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置で行った。ｍＡｂ  １０２２Ｃ３をリガンドとして模試医、ＡＤＡＭ１７フラグメントおよびキメラ構築物をアナライトとして用いる。試験はアミンカップリングキット（ＢＲ−１０００−５０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＢＲ−１００８−２６、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をランニングバッファーとして用いて、ＣＭ５センサーチップ（ＢＲ−１０００−１２）の両フローセルのマトリックスに共有結合されたウサギ抗マウスポリクローナル抗体（マウス抗体捕捉キット、ＢＲ−１００８−３８、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に対して２５℃、１０μｌ／分で行った。このバッファーをリガンドおよびアナライトの希釈のために使用する。
【０１６５】
１５μｇ／ｍｌ濃度のｍＡｂ  １０２２Ｃ３の溶液を１分間、第２のフローセルに注入した（作業面）。各サイクルで、ＡＤＡＭ１７キメラ構築物（Ｃ末端位置にヒトＦｃドメインを有する）の１つを両フローセルに３分間２５０ｎＭの濃度で注入する：ｍ１０２２Ｃ３（ＦＣ１）を含まない参照および７００ＲＵ前後のｍ１０２２Ｃ３（ＦＣ２）を含む作業セル。記録されたシグナルは、ＦＣ２応答とＦＣ１応答の間の違いに相当する。
【０１６６】
陽性応答は９０ＲＵと１４０ＲＵの間である。陰性応答は総て１０ＲＵより小さい。各サイクルの終わりに、ｍ１０２２Ｃ３を１０ｍＭグリシンＨＣｌ  ｐＨ１．７バッファーの注入によって（マウス抗体捕捉キットから）３分間除去した。
【０１６７】
【表５】
2017501723.tif 000006
【０１６８】
実施例５：表面プラズモン共鳴試験を用いたモノクローナル抗体１０２２Ｃ３に対するＡＤＡＭ−１７の細胞外ドメインの結合の解離定数の定義
両フローセル上で、カルボキシメチルデキストランマトリックスに共有結合したウサギ抗マウス（ＲＡＭ）ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で活性化されたＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の第２のフローセルに抗体（リガンド）を結合させた。２倍希釈スキームにより得られた４００〜１２．５ｎＭの範囲の濃度の可溶性ＡＤＡＭ１７（アナライト）（５２ｋＤａの分子量を推定）を、流速３０μｌ／分で、解離相の測定のために１２０秒パルス（会合）および延長１８０秒の遅延で表面に注入した。ＲＡＭ表面を、ＮａＯＨ  ３０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭおよび１０ｍＭグリシン，ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファー溶液を用いて再生した。各濃度で得られた曲線を、参照ＦＣ１表面（マウス抗ＴＡＣＥ  ｍＡｂを含まないＲＡＭ）からシグナルを差し引き、次に、ランニングバッファー注入（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＨＢＳ−ＥＰバッファー）から得られたシグナルを差し引くことにより二重参照した。
【０１６９】
データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウエアを用い、１：１ラングミュアモデルを用いて処理した。フィットの適合性は、０傾向でなければならない屈折率（ＲＩ）およびκ２値により測定した。
結果を下記の表６にまとめる。
【０１７０】
【表６】
2017501723.tif 000007
【０１７１】
実施例６：脱グリコシル化ＣＤＲＨ１の結合評価およびＦＲＥＴ阻害
ｍＡｂ  １０２２Ｃ３はＣＤＲＨ１内に位置するＮ−グリコシル化部位を有し、これは分泌タンパク質において翻訳後修飾される。このグリコシル化部位の影響を決定するために、ｍ１０２２Ｃ３を酵素的に脱グリコシル化した（アスパラギン残基をアスパラギン酸に変換するプロセス）。
【０１７２】
ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３を、２つのグリコシダーゼを用いて連続的に脱グリコシル化した。１μｌのノイラミダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐ０７２０Ｓ、５００００Ｕ／ｍＬ）を２０μｇの１ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ溶液に加え、この混合物を穏やかに振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。次に、１μｌのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐ０７０４Ｓ、５０００００Ｕ／ｍＬ）を加え、その後、さらなるインキュベーション工程を３７℃で一晩行った。
【０１７３】
ｍ１０２２Ｃ３の酵素的脱グリコシル化は、親ｍＡｂの阻害レベルを保持するＦＲＥＴペプチド切断アッセイ（図６）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価されるｍ１０２２Ｃ３の阻害活性を低減しなかった。
【０１７４】
酵素的に脱グリコシル化された１０２２Ｃ３は、腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ１２９９との結合に関して評価し、親抗体の結合能を保持していたことが示された（図７）。
【０１７５】
実施例７：アンフィレグリンシェディングアッセイ
ＡＤＡＭ１７は、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）を含む一連のＥＧＦＲリガンドのシェディングに関与する。ｍ１０２２Ｃ３が、ＡＤＡＭ１７により誘導されるＡＲＥＧの切断を阻害し得るかどうかを決定するために、このリガンドをＭＣＦ−７エストロゲン依存性乳癌細胞の上清に添加した。簡単に述べれば、１６０００ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートの各ウェルの２００μｌの完全培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０  ｗ／ｏ  フェノールレッド＋１０％ＳＶＦ＋１％Ｌ−グルタミン）中に播種した。プレーティング後４８時間で、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、供試化合物を０．５％ＳＦＶ培地に加えた。これらの実験では、ＴＡＰＩ１を阻害の陽性対照（対照化合物）として導入し、供試抗体の形式に応じてｍＩｇＧ１またはｈＩｇＧ１のいずれかのアイソタイプ対照を陰性対照として含めた。ＰＭＡもＡＲＥＧシェディングの陽性対照として使用した。次に、細胞をさらに４８時間インキュベートした後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡ  ＤＵＯ  ＳＥＴ定量アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＡＲＥＧを添加した。同時に、細胞死がＡＲＥＧシェディングプロセスの原因ではなかったことを確認するために、細胞生存率を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光法を用いて評価した。
【０１７６】
図８は、３回の独立した実験の平均である。予想されたように、対照化合物ＴＡＰＩ１はＡＲＥＧシェディングの有意な阻害（６２％）を誘導したが、シェディングの陽性対照として導入されたＰＭＡは、この状況において、ＡＲＥＧの劇的なシェディングを誘導できることを示した。アイソタイプ対照も、ＴＡＰＩ  １の可溶化のためにビヒクルとして使用したＤＭＳＯも、ＡＲＥＧシェディングを妨げた。マウスアイソタイプ対照として導入された対照ｍＡｂ  ９Ｇ４はＡＲＥＧシェディングに影響を及ぼさなかった。ｍ１０２２Ｃ３は、対照化合物と同様の強さでＡＲＥＧシェディングを阻害した。次に、ｍ１０２２Ｃ３の用量範囲を検討した（図９）。ｍ１０２２Ｃ３は０．１５μｇ／ｍｌといった低い用量で活性があったことを示した。
【０１７７】
実施例８：ｍＡｂ  １０２２Ｃ３のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
総てのｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために、６〜８週齢の無胸腺マウスを使用した。これらの,マウスは上部に滅菌フィルターの付いたケージで飼い、無菌条件で維持し、仏国・欧州ガイドラインに従って取り扱った。
【０１７８】
ＡＤＡＭ１７発現レベルは、飽和濃度を決定するために、ＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）４℃で２０分間インキュベートした１×１０５細胞／１００μｌを漸増濃度のＭＡＢ９３０１（クローン１１１６３３、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色することにより測定した。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。細胞を再懸濁させ、４℃で２０分間、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、スコットランド、＃  Ａ１１０１７）とともにインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。次に、標識された細胞を１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた後、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ル・ポン＝ド＝クレ、フランス）で分析した。生存細胞のみを分析するためにヨウ化プロピジウムを加えた。並行して、ＱＩＦＩＫＩＴビーズをフローサイトメトリーおよびモノクローナル抗体結合による抗体結合および細胞当たりの抗原密度の決定に用いた。ＱＩＦＩＫＩＴは、１０μｍ径の、異なるが、十分に定義された量のマウスｍＡｂ分子でコーティングされた一連のビーズを含む。ビーズは、一次マウスｍＡｂで標識された種々の抗原密度を有する細胞を模倣する。定量された抗原は抗体結合能（ＡＢＣ）単位で表す。
【０１７９】
８．１  Ａ４３１異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝１７０００）を発現する類表皮癌細胞株Ａ４３１を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に１０×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後２０日）、マウスを、匹敵する腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、２０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１８０】
得られた結果を図１０にまとめた。それらは、ｍ１０２２Ｃ３  ｍＡｂにより媒介される劇的な腫瘍阻害（４９日目で９７％）を示し、４９日目に、総ての処置マウスで腫瘍退縮を示し、６個体のうち２個体で完全退縮が達成された。
【０１８１】
８．２  腫瘍断片で確立されたＡ４３１異種移植モデル
見られたｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３の抗腫瘍活性のロバスト性を決定するために、まず、上記のように細胞移植により腫瘍を形成した。次に、腫瘍体積がおよそ２００〜３００ｍｍ３に達した際に、腫瘍を無菌的に摘出し、壊死領域を注意深く避けながら１ｍｍ３の断片に細断し、その後、これらの断片を、無胸腺マウスの新たな系統での腫瘍増殖のために用いた。この増殖を、腫瘍の成長と特徴の両方を安定化させるために３回行った後、およそ１４５ｍｍ３に達する腫瘍担持マウス６個体ずつ２群（腫瘍細胞注入後１４日）を作成した。１群に負荷用量２０ｍｇ／ｋｇで腹膜内処置を行った後、毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。第２群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１８２】
得られた結果を図１１にまとめた。断片から確立された腫瘍は細胞移植から得られるものよりも速く増殖した。この所見は、これらの腫瘍のより悪性度の高い表現型と一致した。このより悪性度の高い状況では、ｍ１０２２Ｃ３は、３５日目に７３％に達する腫瘍阻害を有し、なお有意である。
【０１８３】
８．３  Ａ４３１異種移植モデルにおけるマウス１０２２Ｃ３（ｍ１０２２Ｃ３）とそのＩｇＧ１キメラ型（ｃ１０２２Ｃ３）の比較
ｍ１０２２Ｃ３とそのキメラ型を比較するために、Ａ４３１異種移植モデルを上記のように無胸腺マウスへの細胞移植によって確立した。図１２に示された結果は、これら２つの化合物はｍ１０２２Ｃ３およびｃ１０２２Ｃ３に対してそれぞれ８２％および７５％に達する腫瘍阻害に匹敵することを示した。
【０１８４】
８．４  ＣａＯＶ３異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝２００００）を発現する卵巣癌細胞株ＣａＯＶ−３を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１２０ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後１８日射）、マウスを、匹敵する腫瘍サイズを有する５個体ずつ２群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１８５】
得られた結果を図１３にまとめた。それらは、ｍ１０２２Ｃ３  ｍＡｂにより媒介される劇的な腫瘍阻害を示し、６９日目に、総ての処置マウスで腫瘍退縮、５個体のうち１個体で完全退縮が見られた。腫瘍阻害は８４日目に９４％に達した。
【０１８６】
８．５  ＯＶＩＳＥ異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝４９０００）を発現する卵巣癌細胞株ＯＶＩＳＥを、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後２８日）、マウスを、匹敵する腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１８７】
得られた結果を図１４にまとめた。それらは、ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３により媒介される劇的な腫瘍阻害を示し、総ての処置マウスで腫瘍退縮が見られ、腫瘍阻害は５３日目に５８％に達した。
【０１８８】
８．６  ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝１２６００）を発現する膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後２５日）、マウスを、匹敵する腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、２０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１８９】
得られた結果を図１５にまとめた。それらは、ｍＡｂ  ｍ１０２２Ｃ３により媒介される、４７日目に７６％に達する劇的な腫瘍阻害を示した。
【０１９０】
８．７  ＢＩＣＲ−２２異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝１６０００）を発現する舌扁平上皮癌細胞株ＢＩＣＲ−２２を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後１１日）、マウスを、匹敵する腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、５ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１９１】
得られた結果を図１６にまとめた。それらは、ｍ１０２２Ｃ３  ｍＡｂにより媒介される劇的な腫瘍阻害を示した（３３日目に８６％）。
【０１９２】
８．８  ＪＩＭＴ−１異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝３００００）を発現するＨＥＲ２標的療法に対して耐性があることが知られている乳癌細胞株ＪＩＭＴ−１を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後１４日）、マウスを、匹敵する腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、２０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１９３】
得られた結果を図１７にまとめた。それらは、ｍ１０２２Ｃ３  ｍＡｂにより媒介される腫瘍阻害を示した（３３日目に４１％）。
【０１９４】
８．９  ＮＣＩ−Ｈ２９２異種移植モデル：確立された腫瘍
ＡＤＡＭ１７（ＡＢＣ＝１２０００）を発現する粘表皮肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。０日目にマウスの皮下に７×１０６細胞を注入した。腫瘍がおよそ１５０ｍｍ３に達した際に（腫瘍細胞注入後９日）、マウスを、匹敵する腫瘍サイズを有する６個体ずつ２群に分け、２０ｍｇ／ｋｇの負荷用量で腹膜内処置した後、毎週、１０ｍｇ／ｋｇのｍ１０２２Ｃ３モノクローナル抗体の維持量で処置した。このモデルで行った従前の実験で、ビヒクル処置マウスとアイソタイプ対照処置マウスの間で腫瘍成長の違いは見られなかったことから、対照群にはビヒクルのみを施した。異種移植片成長率の観察のためにこれらのマウスに経過観察を行った。腫瘍体積は、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。
【０１９５】
得られた結果を図１８にまとめた。それらは、ｍ１０２２Ｃ３  ｍＡｂにより媒介される腫瘍阻害を示した（２６日目に５０％）。
【図１】
2017501723.tif 000008
【図２】
2017501723.tif 000009
【図３】
2017501723.tif 000010
【図４】
2017501723.tif 000011
【図５】
2017501723.tif 000012
【図６】
2017501723.tif 000013
【図７】
2017501723.tif 000014
【図１６】
2017501723.tif 000015
【図１７】
2017501723.tif 000016
【図１８】
2017501723.tif 000017
【図８】
2017501723.tif 000018
【図９】
2017501723.tif 000019
【図１０】
2017501723.tif 000020
【図１１】
2017501723.tif 000021
【図１２】
2017501723.tif 000022
【図１３】
2017501723.tif 000023
【図１４】
2017501723.tif 000024
【図１５】
2017501723.tif 000025
【配列表】
2017501723000001.app
【国際調査報告】
2017501723.tif 000026
2017501723.tif 000027
2017501723.tif 000028
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