(57)【要約】  本開示は、丹参及びタンシノンの抗痙攣剤に係り、丹参抽出物の癲癇及び痙攣を特徴とする中枢神経系障害の抗痙攣薬としての用法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系障害の治療において抗痙攣剤として使用されることを特徴とする丹参のアセトン抽出物。
【請求項２】
アセトン抽出物がタンシノン類から構成されることを特徴とする請求項１に記載の丹参のアセトン抽出物。
【請求項３】
前記タンシノン類がジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、タンシノンＩＩＡ、及びミルチロンから構成されることを特徴とする請求項２に記載の丹参のアセトン抽出物。
【請求項４】
前記中枢神経系障害が発作として特徴づけられることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の丹参のアセトン抽出物。
【請求項５】
中枢神経系障害がてんかんであることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の丹参のアセトン抽出物。
【請求項６】
中枢神経系障害の治療において抗痙攣剤として使用されることを特徴とするタンシノン混合物。
【請求項７】
タンシノン混合物が、ジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、タンシノンＩＩＡ、及びミルチロンのうち少なくとも２つから構成されることを特徴とする請求項６に記載のタンシノン混合物。
【請求項８】
前記混合物が、タンシノンＩＩＡと、ジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、又はミルチロンの中から選ばれる少なくとも１つと、から構成されることを特徴とする請求項７に記載のタンシノン混合物。
【請求項９】
前記中枢神経系障害が発作として特徴づけられることを特徴とする請求項６乃至８の何れか１項に記載のタンシノン混合物。
【請求項１０】
前記中枢神経系障害がてんかんであることを特徴とする請求項６乃至９のうちの何れか１項に記載のタンシノン混合物。
【請求項１１】
中枢神経系障害の治療において抗痙攣剤として使用されることを特徴とするタンシノンＩＩＡ。
【請求項１２】
前記中枢神経系障害が発作として特徴づけられることを特徴とする請求項１１に記載のタンシノンＩＩＡ。
【請求項１３】
前記中枢神経系障害がてんかんであることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のタンシノンＩＩＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、丹参の抽出物及び化合物の抗痙攣活性、ならびに発作を特徴とする痙攣及び神経系障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんの患者数は世界で約６千万人にのぼり、そのうち３０％は、薬剤治療抵抗性発作を伴っている。費用対効果の高い投与計画をどれほど経済性がある形で維持できるかは、投与する薬剤の長期的有効性と、治療抵抗性発作や副作用（例えば傾眠からスティーブンス・ジョンソン症候群まで）を患者が発現する可能性に依存する（例えば非特許文献１を参照）。この問題を解決するため、副作用が最低限であるかまったく存在しない、新規な作用機序を有する新たな抗てんかん薬（ＡＥＤ）を発見する試みが継続的に実施されている。
【０００３】
有望な薬物リードを発見しようという探求において、伝統的な、植物薬で使用されている植物資源、微生物資源、及び海洋資源を探求することへの関心が復活している。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、先進国及び発展途上国の人口のうち７０％から８０％が植物薬による治療を受けたことがあるか、医療上の選択肢として頼りにしており、この事実が生物資源調査や植物薬関連の医薬品開発に取り組む推進力となっている（例えば非特許文献１２を参照）。
【０００４】
ただ、植物薬には懐疑的な見方が蔓延している一方で、市販されている医薬品の実に２５％が植物由来であり、様々な文化において実践されてきた伝統療法、又は民間療法についての調査を通じて発見されたものである（非特許文献１、２参照）。医薬品の発見におけるこうしたアプローチに合理性を与えているのは、自然資源から分離又は抽出された低分子は、組み合わせ技術により化学合成された化合物よりも構造が多様であるという事実である（非特許文献２を参照）。
【０００５】
各植物抽出物又は海洋資源抽出物は、コイ科の硬骨魚であるゼブラフィッシュ（学名：Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）などにおける適切な中〜高スループットのインビボモデルによるスクリーニングが可能な、ヒット化合物の有望なライブラリーとみなすことができる（非特許文献３、４参照）。
【０００６】
有望なヒット化合物とリード化合物を抗てんかん薬の開発のために発見するためのスクリーニングにおいて、植物資源から分離された低分子化合物の抗てんかん薬的活性を特定するためのプラットフォームとしてゼブラフィッシュ幼生を使用することについて、本発明者らは以前に説明を試みた（非特許文献３、４参照）。バラバラン（Ｂａｒａｂａｎ）らが実施した研究では、受精後７日のゼブラフィッシュ幼生は、ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）などの痙攣誘発化学物への暴露後に発作様の行動（渦状の遊泳や姿勢の崩壊など）を示している（非特許文献３、４参照）。
【０００７】
ペンチレンテトラゾールに対するゼブラフィッシュのこの生理的反応は、げっ歯類モデルの生理的反応に匹敵するものであり、既存の抗痙攣薬の投与に対する結果も類似していると判明している（非特許文献６、７、８参照）この類似性に加え、繁殖の容易さ、試料導入の容易さ、スコア付け／追跡に自動化スキームが利用可能であることなどのその他の要素により、ゼブラフィッシュは、伝統中国医学（ＴＣＭ）の医薬大全などの様々な民族薬局方に由来する抽出物（そして最終的には分離化合物）を事前スクリーニングするための信頼性のあるモデル動物に位置づけられる。
【０００８】
伝統中国医学は、２５００年以上前に確立された代替医療の流派であり、独自の基準体系と診断理論を有している。診断は主に症候群に基づいて行われる。症候群は、患者の身体的・精神的性質や社会環境といった二次的側面から影響を受ける根本的な病理過程を示す、具体的な兆候であるとみなされた（非特許文献９参照）。例えば、伝統中国医学では苦痛を「内風症候群」又は「風撃」と呼ぶ。これらは、西洋医学における二つの実際に異なる病気又は障害、すなわち脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）とてんかん発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）を示しているが、伝統中国医学の言語体系にはこれらに個別に相当する言葉が存在しない（非特許文献９参照）。
【０００９】
そのため、当該技術分野において丹参を活用するためには、てんかんの様々な側面の治療のために使用されうる化合物及び／又は化合物のクラスを特定し、それらの特徴を明らかにする必要性が依然として存在する。伝統中国医学において上記の病態の治療に使用される植物４０種の無作為標本に対し、当研究グループが予備的スクリーニングを実施したところ、１種類の植物、すなわち丹参が合格した。
【００１０】
丹参（学名：Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ  Ｂｕｎｇｅ）は、伝統中国医学の医薬大全に登場する植物であり、脳血管障害や心血管障害の治療にしばしば使用される（非特許文献９参照）。丹参は伝統中国医学により脳卒中患者に対して広く処方されていると共に、てんかん発作の抑制を目的とした伝統中国医薬である定涎丸にも含まれている（非特許文献９、１１参照）。丹参に含まれると特定されている活性化合物の大半は、タンシノン類と呼ばれる特定のジテルペノイド化合物クラスに属するか、サルビアノリン酸誘導体である。
【００１１】
このうち前者は、乾燥混紛の脂溶性抽出を主な手段として分離されるもので、この薬草の特徴である赤色の元でもある（丹参とはすなわち「赤い根」という意味である）。これらの化合物グループは双方とも、異なる薬理活性を有している。例えば、タンシノンＩはホスホリパーゼＡ２によりアラキドン酸の代謝を阻害する（非特許文献２７、２８参照）のに対して、サルビアノリン酸は血小板凝集と血栓形成を阻害する（非特許文献２７、２８参照）。
【００１２】
丹参の主要な生物活性成分であるタンシノンＩＩＡは、心虚血及び脳虚血の分野において過去１０年間にわたって中心的に研究されてきた。タンシノンＩＩＡの生物活性成分は、様々なものが報告されており、抗アテローム性動脈硬化（非特許文献２７、３０参照）、心臓保護（非特許文献９、３０参照）、及び神経保護（非特許文献３１、３２参照）がその例である。
【００１３】
丹参の心臓保護特性及び抗アテローム性動脈硬化特性については、広範な前臨床試験及び臨床試験がこれまでに実施されており、その結果として、タンシノンＩＩＡ、及び同成分の誘導体の中でも水溶性が比較的高いタンシノンＩＩＡスルホン酸ナトリウムが、中国では狭心症及び脳卒中に対する処方薬として使用されている（非特許文献３０、３２参照）。
【００１４】
心虚血に対する丹参抽出物の神経保護作用及びアルツハイマー病モデルがこれまでに解明されてきたが、丹参が有するとされる抗痙攣作用についてのデータは不十分である。そのため、丹参が低分子化合物のライブラリーである可能性が依然として存在しており、抗てんかん作用の確認のためにゼブラフィッシュ幼生を用いてスクリーニングされる意義がある。本明細書において、てんかんの発作と症状を抑制するための抗痙攣薬として使用するための丹参化合物について説明する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】世界保健機関  ２０１２年  癲癇に関する情報  第９９９号  （  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，（２０１２），Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ，Ｎｏ．  ９９９．Ｉｎ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ９９９／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
【非特許文献２】シー  エッチ  サスリスーラゴダキス（Ｓａｓｌｉｓ−Ｌａｇｏｕｄａｋｉｓ  ＣＨ），ブイ  サボライネン（Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ  Ｖ），イー  エム  ウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＥＭ），エフ  ホレスト（Ｆｏｒｅｓｔ  Ｆ），エス  ジェイ  ワグスタッフ（Ｗａｇｓｔａｆｆ  Ｓ）等、（２０１２年），Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｇ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９巻：ＰＰ．１５８３５−１５８４０．
【非特許文献３】エイ  ディー  クロフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＡＤ），  シー  ブイ  エスグレア（Ｅｓｇｕｅｒｒａ  ＣＶ），ピー  エイ  ドゥ  ビッテ（ｄｅ  Ｗｉｔｔｅ  ＰＡ），（２００８年），Ｆｉｓｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇｓ  ｆｒｏｍ  ｎａｔｕｒｅ：ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｓ  ａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．，７４巻：ＰＰ６２４−６３２．
【非特許文献４】エイ  エム  オルレアナ−パーカー（Ｏｒｅｌｌａｎａ−Ｐａｕｃａｒ  ＡＭ），エイ  エス  セルイス（Ｓｅｒｒｕｙｓ  ＡＳ），ティー  アフリカノヴァ（Ａｆｒｉｋａｎｏｖａ  Ｔ），ジェー  マエス（Ｍａｅｓ  Ｊ），ダブリュー  デ  ボルグリーベ（Ｄｅ  Ｂｏｒｇｇｒａｅｖｅ  Ｗ）等、（２０１２年），  Ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｓａｂｏｌｅｎｅ  ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｏｆ  Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ｍｏｄｅｌｓ，  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｂｅｈａｖ  ２４巻：  ｐｐ１４−２２．
【非特許文献５】Ｓ．Ｃ．バラバン（ＢａｒａｂａｎＳＣ），（２００７年），Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｍｏｄｅｌｓ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ，  ｆｌｉｅｓ，  ｗｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｆｉｓｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ，２０巻：ＰＰ１６４−１６８．
【非特許文献６】Ｓ  Ｃ  バラバン（Ｂａｒａｂａｎ  ＳＣ），Ｍ  Ｒ  テイラー  （Ｔａｙｌｏｒ  ＭＲ），Ｐ  Ａ  カストロ（Ｃａｓｔｒｏ  ＰＡ），Ｈ  バイエル  （Ｂａｉｅｒ  Ｈ），（２００５年），Ｐｅｎｔｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｚｏｌｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｅｈａｖｉｏｒ，  ｎｅｕｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃ−ｆｏｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３１巻：  ＰＰ７５９−７６８．
【非特許文献７】Ｔ  アフリカノバ  （Ａｆｒｉｋａｎｏｖａ  Ｔ），エイ  エス  セルイス（Ｓｅｒｒｕｙｓ  ＡＳ），オー  イー  ブエナフェ（Ｂｕｅｎａｆｅ  ＯＥ），アール  クリンカース（Ｃｌｉｎｃｋｅｒｓ  Ｒ），アイ  スモルダース（Ｓｍｏｌｄｅｒｓ  Ｉ）等，（２０１３年），Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｐｅｎｔｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｚｏｌ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ：  ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  ｖｅｒｓｕｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８巻：  ｅ５４１６６．
【非特許文献８】エス  ベルガマンス（Ｂｅｒｇｈｍａｎｓ  Ｓ），ジェー  ナント  （Ｈｕｎｔ  Ｊ），エイ  ローチ  （Ｒｏａｃｈ  Ａ），ピー  ゴールドスミス（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  Ｐ），（２００７），Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｏｆｆｅｒ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｒｅｅｎ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａ  ｗｉｄｅ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔｓ．  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓ．，  ７５巻：  ＰＰ１８−２８．）
【非特許文献９】エヌ  ジェー  サッチャー（Ｓｕｃｈｅｒ  ＮＪ，（２００６年），Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈｅｒｂａｌ  ｓｔｒｏｋｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｂｅｈａｖ．，８巻：ＰＰ３５０−３６２．
【非特許文献１０】エル  ゾー（Ｚｈｏｕ  Ｌ），ゼット  ゾー（Ｚｕｏ  Ｚ），エム  エス  チョー（Ｃｈｏｗ  ＭＳ），（２００５年），Ｄａｎｓｈｅｎ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５巻：ＰＰ１３４５−１３５９．
【非特許文献１１】エックス  スン（Ｓｕｎ  ）Ｘ，エル  エヌ  チャン（Ｃｈａｎ  ＬＮ），エヌ  ジェー  サッチャー（Ｓｕｃｈｅｒ  ＮＪ），（２００５年），Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｓ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｄａｎｓｈｅｎ．  Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２巻：  ＰＰ１７３−１７７．
【非特許文献１２】エス  バクセンデール（Ｂａｘｅｎｄａｌｅ  Ｓ），シー  ジェー  ホルズワース（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ  ＣＪ），ピー  エル  メザ  サントスコイ  （Ｍｅｚａ  Ｓａｎｔｏｓｃｏｙ  ＰＬ），エム  アール  ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＭＲ），ジェー  フォックス（Ｆｏｘ  Ｊ）等，（２０１２年），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ．  Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ，５巻：ＰＰ７７３−７８４．
【非特許文献１３】シー  ティッセ（Ｔｈｉｓｓｅ  Ｃ），ビー  ティッセ（Ｔｈｉｓｓｅ  Ｂ），（２００８年），Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｓ，  Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，３巻：ＰＰ５９−６９．
【非特許文献１４】エックス  ワン（Ｗａｎｇ  Ｘ），エス  エル  モリス−ナチケ（Ｍｏｒｒｉｓ  −Ｎａｔｓｃｈｋｅ  ＳＬ），ケー  エッチ  リー（Ｌｅｅ  ＫＨ），（２００７年），Ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｔａｎｓｈｅｎ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，２７巻：ＰＰ１３３−１４８．
【非特許文献１５】ジェー  ディー  アダムス（Ａｄａｍｓ  ＪＤ），アール  ワン（Ｗａｎｇ  Ｒ），ジェー  ヤン（Ｙａｎｇ  Ｊ），イー  ジェー  リエン  （Ｌｉｅｎ  ＥＪ），（２００６年），Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅｓ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｃｈｉｎ．  Ｍｅｄ．，１巻：Ｐ３．
【非特許文献１６】エス  ワイ  キム（Ｋｉｍ  ＳＹ），ティー  シー  ムーン（Ｍｏｏｎ  ＴＣ），エッチ  ダブリュー  チャン（Ｃｈａｎｇ  ＨＷ），ケー  エッチ  ソン（Ｓｏｎ  ＫＨ），  エス  エス  カン（Ｋａｎｇ  ＳＳ）等，（２００２年），Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  Ｉ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ  ｂｕｎｇｅ  ｏｎ  ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓ．，１６巻：ＰＰ６１６−６２０．
【非特許文献１７】エム  ケー  タン（Ｔａｎｇ  ＭＫ），ディー  シー  レン（Ｒｅｎ  ＤＣ），ジェーＺｈａｎｇティー（ザン  ＪＴ），ジー  エッチ  ドゥ（Ｄｕ  ＧＨ），（２００２年），Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｒａｄｉｘ  Ｓａｌｖｉａｅ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａｅ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，９巻：ＰＰ４０５−４０９．
【非特許文献１８】エス  ズー（Ｘｕ  Ｓ），ピー  リウ（Ｌｉｕ  Ｐ），（２０１３），Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ｌｌ−Ａ：  ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｏｌｄ  ｒｅｍｅｄｉｅｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ．，２３巻：ＰＰ１４９−１５３．
【非特許文献１９】エル  リウ（Ｌｉｕ  Ｌ），エックス  ザーン（Ｚｈａｎｇ  Ｘ），エル  ワン（Ｗａｎｇ  Ｌ），アール  ヤング）（Ｙａｎｇ  Ｒ），エル  クイ（Ｃｕｉ  Ｌ）等，（２０１０年），Ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ＩＩＡ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＯＲＣ１  ａｎｄ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＯＲＣ１，  ｐＣＲＥＢ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，８２巻：ＰＰ２２８−２３３．
【非特許文献２０】エックス  エッチ  チアン（Ｔｉａｎ  ＸＨ），ジェー  エッチ  ウー（Ｗｕ  ＪＨ），（２０１３），Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：  ａ  ｐａｔｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗ（Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６−Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０１２）．  Ｅｘｐｅｒｔ，Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．２３巻：ｐｐ１９−２９．
【非特許文献２１】シー  エム  リー（Ｌｅｅ  ＣＭ），エッチ  エヌ  ウォン（Ｗｏｎｇ  ＨＮ），ケー  ワイ  チュイ（Ｃｈｕｉ  ＫＹ），ティー  エフ  チョアン（Ｃｈｏａｎｇ  ＴＦ），ピー  エム  ホン（Ｈｏｎ  ＰＭ）等，（１９９１年），Ｍｉｌｔｉｒｏｎｅ，  ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｈｅｒｂ  Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１２７巻：ＰＰ２３７−２４１．
【非特許文献２２】エッチ  エム  チャン（Ｃｈａｎｇ  ＨＭ），ケー  ワイ  チュイ（Ｃｈｕｉ  ＫＹ），エフ  ダブリュー  タン（Ｔａｎ  ＦＷ），ワイ  ヤング（Ｙａｎｇ  Ｙ），ゼット  ピー  ゾーン（Ｚｈｏｎｇ  ＺＰ）等，（１９９１年），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｍｉｌｔｉｒｏｎｅ，  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ  Ｂｕｎｇｅ  （Ｄａｎｓｈｅｎ），  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３４巻：ＰＰ１６７５−１６９２．
【非特許文献２３】イー  ジェー  カラブレセ（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ  ＥＪ），（２００８年），Ｈｏｒｍｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６６巻：ＰＰ５９４−６１７．
【非特許文献２４】イー  ジェー  カラブレセ（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ  ＥＪ），（２００８），Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３８巻：ＰＰ５４３−５５６．
【非特許文献２５】エッチ  ハオ（Ｈａｏ  Ｈ），ジー  ワン（Ｗａｎｇ  Ｇ），エヌ  クイ（Ｃｕｉ  Ｎ），ジェー  リ（Ｌｉ  Ｊ），エル  ジー（Ｘｉｅ  Ｌ）等，（２００６年），Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ＩＩＡ  ｓｏｌｉｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ．Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ，７２巻：ＰＰ１３１１−１３１７．
【非特許文献２６】エス  ズー（Ｘｕ  Ｓ），ピー  ジェー  リトゥレ（Ｌｉｔｔｌｅ  ＰＪ），ティー  ラン（Ｌａｎ  Ｔ），ワイ  フアング（Ｈｕａｎｇ  Ｙ），ケー  レ（Ｌｅ  Ｋ）等、（２０１１年）、Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ｌｌＡ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｆｅｄ  ａ  ｈｉｇｈ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｄｉｅｔ．  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，５１５巻：ＰＰ７２−７９．
【非特許文献２７】ジェー  ディー  アダムス（Ａｄａｍｓ  ＪＤ），アール  ワ  （Ｗａｎｇ  Ｒ），ジェー  ヤング）（Ｙａｎｇ  Ｊ），イー  ジェー  リエン（Ｌｉｅｎ  ＥＪ），（２００６年）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅｓ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｃｈｉｎ，Ｍｅｄ．，１巻：Ｐ３．
【非特許文献２８】エス  ワイ  キム（Ｋｉｍ  ＳＹ），ティー  シー  ムーン（Ｍｏｏｎ  ＴＣ），エッチ  ダブリュー  チャン（Ｃｈａｎｇ  ＨＷ），ケー  エッチ  ソン（Ｓｏｎ  ＫＨ），  エス  エス  カン  （Ｋａｎｇ  ＳＳ）等、（２００２年）、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  Ｉ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ  ｂｕｎｇｅ  ｏｎ  ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ。、１６卷：ＰＰ６１６−６２０．
【非特許文献２９】エム  ケー  タン（Ｔａｎｇ  ＭＫ），ディー  シー  レン（Ｒｅｎ  ＤＣ），  ジェー  ティー  ザーン（Ｚｈａｎｇ  ＪＴ），ジー  エッチ  ドゥ（Ｄｕ  ＧＨ）、（２００２年）、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｒａｄｉｘ  Ｓａｌｖｉａｅ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａｅ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，９巻：  ＰＰ４０５−４０９．
【非特許文献３０】エス  ズー（Ｘｕ  Ｓ），ピー  リウ（Ｌｉｕ  Ｐ），（２０１３年），Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ｌｌ−Ａ：ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｏｌｄ  ｒｅｍｅｄｉｅｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．，２３巻：ＰＰ１４９−１５３．
【非特許文献３１】エル  リウ（Ｌｉｕ  Ｌ），エックス  ザング（Ｚｈａｎｇ  Ｘ），エル  ワン（Ｗａｎｇ  Ｌ），アール  ヤング（Ｙａｎｇ  Ｒ），エル  クイ（Ｃｕｉ  Ｌ）等，（２０１０年），Ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ＩＩＡ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＯＲＣ１  ａｎｄ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＯＲＣ１，  ｐＣＲＥＢ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，Ｂｕｌｌ  ８２巻：ＰＰ２２８−２３３．
【非特許文献３２】エッチ  エックス  ティアン（Ｔｉａｎ  ＸＨ），ジェー  エッチ  ウー（Ｗｕ  ＪＨ），（２０１３），Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：  ａ  ｐａｔｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗ  （Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６−Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１２）．Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．，２３巻：ＰＰ１９−２９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本開示の１つの側面は、中枢神経系障害の治療において抗痙攣剤として使用するための、丹参のアセトン抽出物に関する。いくつかの実施態様では、アセトン抽出物はタンシノン類から構成される。例えば、アセトン抽出物はジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、タンシノンＩＩＡ、及びミルチロンから構成されていてよい。例示的な抽出物は、タンシノンＩから構成されていてよい。特定の実施態様において、中枢神経系障害は発作を特徴とする。いくつかの実施態様では、中枢神経系障害はてんかんである。
【００１７】
本開示の別の側面は、中枢神経系障害の治療において抗痙攣剤として使用するための、タンシノン類混合物に関する。いくつかの実施形態では、混合物はジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、タンシノンＩＩＡ、及びミルチロンのうち少なくとも２つから構成される。特定の実施形態では、混合物はタンシノンＩＩＡと、ジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、及びミルチロンのうち少なくとも１つから構成される。
【００１８】
例示的な混合物はタンシノンIを含んでいてもよく、例えばタンシノンＩＩＡとタンシノンＩの組み合わせで構成されていてよい。このタンシノン類混合物は、発作を特徴とする中枢神経系障害に対する抗痙攣剤として使用されていてよい。例えば、中枢神経系障害はてんかんであってよい。
【００１９】
本開示のさらに別の側面は、中枢神経系障害の治療において抗痙攣剤として使用するための、タンシノンＩＩＡに関する。いくつかの実施態様では、中枢神経系障害は発作を特徴とする。特定の実施態様では、中枢神経系障害はてんかんである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】異なる濃度の丹参抽出物を事前投与された、受精後７日のゼブラフィッシュ幼生のペンチレンテトラゾール誘導活性曲線を示す。結果は、溶媒のみの対照群に対して正規化した（１００％設定）。抽出物に対する暴露時間は１時間（Ａ）及び１８時間（Ｂ）である。時間当たりでＰ値を＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、＜０．００１（＊＊＊）で表した２要因の分散分析による分析を実施した。
【図２】丹参抽出物の逆相高速液体クロマトグラムを示しており、図２（Ａ）では分析カラム、図２（Ｂ）ではセミ分取カラムが使用されている。表１は、セミ分取高速液体クロマトグラフィーの収率の計算値を示している。
【図３】粗丹参抽出物から分離されたタンシノン（１）〜（４）の分子構造を示した。
【図４】ペンチレンテトラゾール正規化濃度反応曲線を示しており、（Ａ）は１５，１６−ジヒドロタンシノンＩ、（Ｂ）はクリプトタンシノン、（ｃ）はタンシノンＩＩＡ、（Ｄ）はミルチロンの結果である。結果は、ペンチレンテトラゾールのみの対照群に対して正規化した（１００％設定）。時間当たりでＰ値を＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、＜０．００１（＊＊＊）で表した２要因分散分析による分析を実施した。
【図５】ｃ−ｆｏｓ発現の調整能を視覚化するために、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）法を施した受精後７日のゼブラフィッシュ幼生を示している。（Ａ）は事前投与なし、溶媒のみ、細胞固定と染色前にペンチレンテトラゾール非暴露、（Ｂ）は事前投与なし、溶媒のみ、細胞固定と染色前に３０分間のペンチレンテトラゾール暴露、（ｃ）は８０μＭのタンシノンＩＩＡの事前投与後、細胞固定と染色前にペンチレンテトラゾール非暴露、（Ｄ）は８０μＭのタンシノンＩＩＡの事前投与後、ペンチレンテトラゾール暴露、細胞固定、染色を施した。図５Ｅは、ｃ−ｆｏｓ発現の調整能を視覚化するために溶媒と８０μＭのタンシノンＩＩＡ（Ｔａｎ  ＩＩＡ）にＷＩＳＨ法による染色を施した受精後７日のゼブラフィッシュ幼生の定量分析の結果を示しており、灰色のバーは追加的なペンチレンテトラゾール暴露を施した場合、白色のバーはこれを施さなかった場合の結果である。スチューデントのｔ検定を、＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、＜０．００１（＊＊＊）というＰ値の統計学的有意性を判定するために実施した。
【図６】ペンチレンテトラゾールを静脈内投与したタンシノンＩＩＡ投与マウスのレーダーグラフを示している（マウス  ｎ＝６／投与群）。各群の結果は、対照群に対して正規化した（１００％設定）。マウスは、以下の発作の進行度ごとに、ペンチレンテトラゾール用量に応じてスコア付けした：耳痙攣（ＥＴ）、尾痙攣（ＴＴ）、間代性筋痙攣（ＭＴ）、前肢クローヌス（ＦＣ）、転倒（Ｆ）、緊張性後肢伸張（ＨＬＥ）、死亡（Ｄ）。標準偏差はこのグラフには含まれていないが、各投与群の平均ペンチレンテトラゾール用量とともに図６Ｂに記載した。スチューデントのｔ検定を使用した統計的分析を実施したところ、対照群との比較においていずれの投与群でも有意な差は判定されなかった。
【図７】は、タンシノンＩＩＡを投与した雄のＮＭＲＩマウスにおける６Ｈｚの精神運動発作アッセイの棒グラフを示している。（マウス  ｎ＝６／投与群）。信頼水準９５％でのフィッシャーの正確確率検定による分析を行った。
【図８】１〜１０ｍｇ／ｋｇのタンシノンＩＩＡを投与された雄のＮＭＲＩマウスの梁歩行アッセイのスコアを示している（マウス  ｎ＝６／投与群）。投与群当たりでＰ値を＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、＜０．００１（＊＊＊）で表した１要因分散分析及びダネット検定による統計分析を実施した。
【図９】対照薬（溶媒のみ；ＶＨＣ）とタンシノンＩＩＡ（ｔａｎ  ＩＩＡ）の静脈内投与後に２０ｍＭのペンチレンテトラゾール暴露と９０分間の追跡を受けた受精後３日のゼブラフィッシュ幼生における、ペンチレンテトラゾール正規化濃度反応曲線を示している。結果は、ペンチレンテトラゾールのみの対照群に対して正規化した（１００％設定）。時間当たりでＰ値を＜０．０５（＊）、＜０．０１  （＊＊）、＜０．００１（＊＊＊）で表した２要因分散分析による分析を実施した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示は、発作を特徴とするてんかんなどの神経系障害の治療における抗痙攣薬として使用するための、タンシノン類を含む、丹参、丹参抽出物、及び丹参化合物に関する。それゆえ、抗痙攣薬は、発作、痙攣、及び／又はその他の身体運動もしくは身体機能上の不随意な変化の抑制に有効であることが求められる。抗痙攣薬はさらに、抗てんかん薬、ＡＥＤ、抗発作薬、及び／又は発作薬という名称であってよい。
【００２２】
（丹参とタンシノン化合物）
丹参は、ｒｅｄ  ｓａｇｅ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｓａｇｅ、ｔａｎ  ｓｈｅｎ、又はｄａｎ  ｓｈｅｎとも呼ばれるサルビア属の植物であり、伝統中国医療において幅広く使用されている。中国では、慢性腎不全、冠動脈性心疾患、脳血管障害などの幅広い疾患の治療のために、丹参の根が単独使用されるか、その他の植物の抽出物と併用されている。さらなる研究により、丹参については、その他の用途の中でも血液凝固、肝線維症、がん性細胞増殖、ＨＩＶ複製、及び遊離基細胞毒性の抑制に有用である可能性が示唆されている。
【００２３】
丹参製剤の組成は、調合法に依存するものであるため、各製剤の効果は調合法により決定づけられる。植物としての丹参のどの部分であっても、組成物の調合に使用してよい。例えば、丹参の根を組成物の調合に使用してよい。丹参の根の全体、あるいは根、主根、側根、根毛、根端、及び／又は根冠を含むが、これらに限定されない部分を使用して、組成物を調合してよい。丹参のうち根でない部分、すなわち葉、茎、芽、種、つぼみ、花、及び／又は果実も、組成物の調合に使用してよい。
【００２４】
本開示の１つの側面は、中枢神経系障害の治療において抗痙攣剤として使用するための、丹参のアセトン抽出物に関する。いくつかの実施態様では、アセトン抽出物は丹参の根から調合される。アセトン抽出物は、本明細書に説明されている方法により調合してよい。例えば、乾燥混紛の状態にある丹参の根を、超音波法によってアセトン内に分散させたうえで、得られた溶液を濾過・減量乾固してよい。残渣（ＤＳＨ）は、分光グレードのジメチルスルホキシドで溶解するか、１：１の割合のジメチルスルフォキシド：ポリエチレングリコール２００（ジメチルスルフォキシド：ＰＥＧ−２００）で溶解してよい。
【００２５】
いくつかの実施態様では、アセトン抽出物はタンシノン類から構成される。タンシノン類は、フェナントレン骨格を有する環状化合物であり、フェナントレンキノン類である。
代表的なタンシノン類の構造式を下記に示す：
【化１】
2017513807.tif 000002
【化２】
2017513807.tif 000003
【化３】
2017513807.tif 000004
【化４】
2017513807.tif 000005
【化５】
2017513807.tif 000006
【００２６】
いくつかの実施態様では、アセトン抽出物は、タンシノン類から構成される。いくつかの実施態様では、アセトン抽出物は、タンシノンＩＩＡ、クリプトタンシノン、ミルチロン、及びジヒドロタンシノンＩから構成される。アセトン抽出物は、タンシノンＩ（同義語：タンシノンＩ、タンシノンＡ、タンシキノンＩ）、タンシノンＩＩＡ（同義語：１，６，６−トリメチル−６，７，８，９−テトラヒドロフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン、Ｄａｎ  Ｓｈｅｎ  ｋｅｔｏｎｅ）、クリプトタンシノン（同義語：１，２，６，７，８，９−ヘキサヒドロ−１，６，６−トリメチル−（Ｒ）−フェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン、クリプトタンシノン、タンシノンＣ）、ミルチロン（同義語：５，６，７，８−テトラヒドロ−８，８−ジメチル−２−（１−メチルエチル）−３，４−フェナントレンジオン、５，６，７，８−テトラヒドロ−２−イソプロピル−８，８−ジメチル−３，４−フェナントレンジオン、ミルチロン、ＮＳＣ  ６３９６６２、ローズマリーキノン）、及びジヒドロタンシノンＩ（同義語：（−）−ジヒドロタンシノン１、１５，１６−ジヒドロタンシノンＩ、ジヒドロタンシノンＩ）のうちの少なくとも１つから構成されていてよい。アセトン抽出物は、構造Ｉ〜構造Ｖのうちの少なくとも１つを有する例示的なタンシノン類で構成されていてよい。
【００２７】
本開示のさらに別の側面は、中枢神経系障害の治療において使用するための、タンシノン類の混合物に関する。いくつかの実施形態では、混合物は、タンシノンＩＩＡ、ジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、及びミルチロンのうち少なくとも２つから構成される。いくつかの実施形態では、混合物はタンシノンＩＩＡと、ジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、及びミルチロンのうち少なくとも１つから構成される。いくつかの実施形態では、混合物はタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、ジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、及びミルチロンのうち少なくとも２つから構成される。いくつかの実施形態では、混合物はタンシノンＩＩＡと、タンシノンＩ、ジヒドロタンシノンＩ、クリプトタンシノン、及びミルチロンのうち少なくとも１つから構成される。
【００２８】
本開示のまた別の側面は、中枢神経系障害の治療において抗痙攣剤として使用するための、タンシノンＩＩＡに関する。
いくつかの実施態様では、中枢神経系障害はてんかんである。てんかんは、薬剤治療抵抗性てんかんの形態であるか、及び／又は、遺伝性てんかんの形態であってよい。
特定の実施態様では、中枢神経系障害は不随意運動を特徴とする。不随意運動は、てんかんに関連しているか、三叉神経痛や筋痙攣などの障害を原因とするものであってよい。
【００２９】
本開示のさらにまた別の側面は、てんかんの治療における使用のための、丹参のアセトン抽出物、少なくとも２種のタンシノン類の混合物、及び／又はタンシノンＩＩＡに関する。
いくつかの実施態様では、てんかんは痙攣を特徴としていてよい。特定の実施態様では、てんかんは痙攣を特徴としていなくともよい。
【００３０】
（てんかんと痙攣性障害）
てんかんという言葉は、発作、痙攣、及び／又はその他の身体運動もしくは身体機能上の不随意な変化を特徴としていることがある、様々な神経系障害を指している。推定で世界で約６，５００万人の人々がてんかんを患っているが、効果的な治療法の選択肢は限られている。
現在利用可能な抗てんかん薬（ＡＥＤ）のうちほぼすべてが、神経細胞の興奮性を抑制するために、ＧＡＢＡ受容体や、ナトリウム、グルタミン酸塩、またはカルシウムのチャンネルを標的としている。しかしながら、これらを標的とする従来の抗てんかん薬は、全てんかん患者のうちの２５〜３０％の患者の発作を抑制できておらず、患者によっては当初は抗てんかん薬に反応を示したものの、その後に薬剤耐性（薬剤治療抵抗性）発作を経験する者もいる。
【００３１】
てんかん発作は、脳内の異常、過剰、または過同期性のいずれのニューロン活動によっても引き起こされることがある。いくつかの実施態様では、抗痙攣剤による治療が必要なてんかん発作は、感染、脳卒中、外傷、熱、腫瘍、薬剤使用、血液脳関門損傷、及び／又は神経変性疾患が引き起こしている。
特定の実施態様では、感情状態、光や音に対する反応、睡眠、睡眠不足、ホルモン、代謝障害、及び／又は先天性血管が、てんかん発作の要因となる。本明細書に開示される抗痙攣剤が治療効果をもたらすてんかん発作は、単純部分発作や複雑部分発作などの部分発作と分類されるものであってもよいし、欠神発作、ミオクローヌス発作、間代発作、強直発作、強直間代発作、無緊張発作などの全身発作と分類されるものであっても、複合型の発作であってもよい。発作は、辺縁系のてんかん焦点、先行危険因子損傷、潜伏期、神経回路網の再編成へと至る海馬硬化症の存在などを特徴とする、側頭葉てんかんの症状を呈していてもよい。
【００３２】
丹参抽出物、タンシノン類混合物、タンシノンＩＩＡなど、本明細書で説明される抗痙攣剤は、治療抵抗性発作に対する治療効果を提供するものであってもよい。特に、部分てんかんの６Ｈｚ精神運動発作モデルが、辺縁系発作を含む治療抵抗性発作のモデルとして使用されている。
【００３３】
てんかん発作を患う患者は、０〜６カ月齢、６〜１２カ月齢、１２〜１８カ月齢、１８〜２４カ月齢の新生児であってよい。特定の実施態様では、てんかん発作を患う患者は、６５〜７０歳、７５〜８０歳、８５〜９０歳、９５〜１００歳、１００〜１０５歳、またはそれ以上の年齢である。患者はまた、２〜１２歳の子供、１３〜１９歳の青年、または２０〜６４歳の成人であってよい。
【００３４】
抗痙攣剤は、てんかん発作に関連する症状及び／又はてんかんの治療を含む、てんかん発作の治療に使用されてよい。さらに抗痙攣剤は、脳血管疾患や神経変性疾患などの中枢神経系障害を原因とするてんかん発作の治療に使用されてもよい。抗痙攣薬（すなわち「抗痙攣剤」）の目標の１つは、発作の引き金となるニューロンの急速・過剰な発火を抑制することである。
【００３５】
抗痙攣剤のもう一つの目標は、脳内における発作拡大を防止し、脳損傷を引き起こしうる興奮毒性作用が発生する可能性からの保護を提供することである。抗痙攣剤は、抗発作薬又は抗てんかん薬（ＡＥＤ）と呼ばれてもよい。てんかんの通常の特徴として、脳及び／又は神経系の一部が過剰興奮性を呈している。抗てんかん薬は、この過剰興奮部位を抑制する手助けをすることにより、てんかん発作を予防する働きをする。
【００３６】
てんかんは、薬剤治療抵抗性てんかんの形態であるか、及び／又は、遺伝性てんかんの形態であってよい。いくつかの実施態様では、てんかんは痙攣や発作を特徴としておらず、脳内の異常、過剰、又は過同期性のニューロン活動を反映している。
【実施例】
【００３７】
以上が開示の概略であり、以降はその概略を詳細に説明するための実施例である。これらの特定の実施例は、本開示の特定の側面と実施態様を説明するために記載されているに過ぎず、  本開示をいかなる点においても限定することを目的としていない。しかしながら、実施例にて説明される特定の一般的原則は、本開示のその他の側面、又は実施態様に広く適用可能である可能性がある。
【実施例１】
【００３８】
（ゼブラフィッシュペンチレンテトラゾールアッセイによる丹参のアセトン粗抽出物の活性）
ゼブラフィッシュ幼生を異なる濃度の丹参生薬アセトン抽出物に１時間（受精後７日幼生）及び１８時間（受精後６日幼生）にわたり暴露した後、ペンチレンテトラゾール投与を行い、活性を追跡した。丹参生薬抽出物は、５μｇ／ｍＬの最大許容濃度（ＭＴＣ）において暴露時間１時間後の幼生のペンチレンテトラゾール誘導活性を低下させたものの、暴露時間１８時間後には低下は見られなかった。最大許容濃度を超えると、幼生は暴露３時間後に徐脈、姿勢の崩壊、及び接触反応遅延を示し、１８時間後に死亡した。
【実施例２】
【００３９】
（丹参の粗アセトン抽出物中のタンシノン類の単離と同定、及びゼブラフィッシュによる評価）
丹参生薬アセトン抽出物を分析的高速液体クロマトグラフィーにかけたところ、１１個のピークの存在が確認された（図２）。相対存在量でなく活性により識別するために、これらのピークを最初に等量（１０μＬ）のジメチルスルフォキシドに溶解した後に０．３ｘ  Ｄａｎｉｅａｕ溶液中（１％最終ジメチルスルフォキシド濃度）で受精後７日目幼生に１８時間暴露した後、ペンチレンテトラゾールに暴露した。前暴露期間中に幼生が毒性の兆候を示したピークを、当初の未知濃度の半分ないし１０分の１の濃度へと希釈した。この方法により４個のピークが活性ピークであることが確認されたことを受け（データ省略）、これらを核磁気共鳴分析法による構造解明のためのセミプレパラティブ分取の対象とした。
【００４０】
分離されたピークに対する一次元核磁気共鳴分析又は二次元核磁気共鳴分析による分析により、それらのピークがタンシノン類として構造的に関連していることが示された（表１）。活性ピークはそれぞれ、１５，１６−ジヒドロタンシノンＩ（１）、クリプトタンシノン（２）、タンシノンＩＩＡ（３）、ミルチロン（４）と特定された（図３）。
【００４１】
これらの活性タンシノン類について、濃度反応曲線を作成した。１、２、３、４の最大許容濃度値はそれぞれ、２．５、１７、＞８０（最大溶解性時）、及び７μＭであり、これらの濃度中、受精後７日幼生においてペンチレンテトラゾール誘導活性の最大の低下が見られた（図３Ａ〜Ｄ）。１５，１６−ジヒドロタンシノンＩ（１）が最高の活性濃度を示したが、その他のタンシノン類と比べると３０分間にわたってペンチレンテトラゾール誘導活性が一貫して低下したわけではなかった。有効濃度が最大許容濃度よりも低かったミルチロン（４）とは異なり（図４Ｄ）、クリプトタンシノン（２）は最大許容濃度時にのみペンチレンテトラゾール関連活性の有意な低下を示した（図４Ｂ）。タンシノンＩＩＡ（３）も、最大許容濃度である８０μＭにおいて、アッセイ時間全体にわたってペンチレンテトラゾール誘導活性の有意な低下を示した（図４Ｃ）。先行文献に記載されている通り、タンシノンＩＩＡは丹参の主要な生物活性成分としてこれまでに特定されており、心血管障害及び脳血管障害に対する処方薬として開発が進められてきたため、本発明者らは以降の実験対象としてこの化合物に焦点を絞ることを選択した。
【実施例３】
【００４２】
（ゼブラフィッシュ幼生へのタンシノンＩＩＡの静脈内微量投与）
幼生溶媒中のタンシノンＩＩＡの低溶解性を補うため、溶媒（１：１の割合のジメチルスルフォキシドと０．３ｘ  Ｄａｎｉｅａｕ溶液）又は１００ｍＭのタンシノンＩＩＡ溶液の何れかの静脈内（ｉ．ｖ．）投与を、受精後３日ゼブラフィッシュ幼生に行い、追加的な運動記録を作成した。静脈内投与されたタンシノンＩＩＡは、受精後３日幼生のペンチレンテトラゾール誘導運動を有意に低下させた（図９）。急速静脈投与量（１ｎＬ）、濃度（１００  ｍＭ）、受精後３日幼生平均体重（０．２５ｍｇ）を考慮し、幼生に対する予測計算用量は５９ｍ／ｋｇ（図９）とした。
【実施例４】
【００４３】
（ゼブラフィッシュ幼生におけるｃ−ｆｏｓ発現に対するタンシノンＩＩＡの効果）
これまでの研究により、脳波（ＥＥＧ）記録の代わりとなる痙攣誘発剤に対する神経反応の高スループット指標としての、ゼブラフィッシュ幼生の中枢神経系におけるｃ−ｆｏｓ癌遺伝子転写のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析の信頼性が示されてきた（非特許文献６、１２参照）。ペンチレンテトラゾールへの暴露前に１８時間にわたって試料に事前暴露された受精後６日／７日幼生に対するホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）法により、タンシノンＩＩＡの神経保護活性の確認を行った。ｃ−ｆｏｓの過剰発現の程度が発作の重篤性と脳内のニューロン損傷と関連付けられたため（非特許文献１２参照）、脳内の癌遺伝子ｃ−ｆｏｓ癌遺伝子の過剰発現を、偽投与、溶媒投与、試料投与のいずれかを受けた各幼生について、スコア付けした。ペンチレンテトラゾール投与前にタンシノンＩＩＡ（８０μＭ）に１８時間暴露された幼生では、溶媒に事前暴露された幼生と比較して、ｃ−ｆｏｓ発現の低下がみられ（図５）、のち脳の染色が有意に低減した。定量分析により、脳内のｃ−ｆｏｓ染色の３分の１が低減したことが確認された（図５ｅ）。
【実施例５】
【００４４】
（げっ歯類モデルにおけるタンシノンＩＩＡの評価）
本発明者らは、丹参生薬抽出物の潜在的活性を２種の標準的なげっ歯類発作モデル（時限的なペンチレンテトラゾール静脈内投与試験とマウスの６Ｈｚ角膜刺激）により検討した。１０、１、及び０．１ｍｇ／ｋｇの各用量のタンシノンＩＩＡをマウスに静脈内投与したところ、連続的ペンチレンテトラゾール静脈内投与の段階から、より複雑なパターンが示された（図６）。すなわち、発作閾値の低下がペンチレンテトラゾール投与の初期段階で観察されたものの、より後期になると上昇した（表２）。６Ｈｚ精神運動発作アッセイでは、１ｍｇ／ｋｇタンシノンＩＩＡのみが、マウス６匹中５匹の保護を達成した（図７）。
【００４５】
タンシノンＩＩＡのげっ歯類発作アッセイを補足するため、本発明者らは同化合物単独の特定の用量範囲が神経学的欠損に寄与している可能性を判定することを選択した。ＮＭＲＩマウスに対して同化合物を１０ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した後、梁歩行アッセイを実施した。両群の成績はいずれも、溶媒のみの投与を受けたマウスと同程度に良好であり、ジザゼパム（１ｍｇ／ｋｇ）を投与されたマウスの成績を上回っていた。後者の場合、踏み外し及び転等の数が増加していた（図８）。
【００４６】
（材料と方法）
植物材料及び試薬。丹参乾燥混紛は、国立清華大学の化学系（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）から入手した。タンシノンｉｉａ及びジヒドロタンシノンＩの標準は、ＩＭＡＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｌｔｄ．（中国天津市）から調達した。
【００４７】
（粗抽出物の製造）
丹参乾燥根紛５ｇを５０ｍＬのアセトンに超音波法（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ５５１０Ｅ−ＭＴ：米国、０６８１３ダンベリー）で分散させ、得られた溶液を濾過・濃縮・乾固した（６０ｍｇ）。得られた残留物（ＤＳＨ）を、分光分析用グレードのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ；ベルギー、Ｇｅｅｌ）で２０ｍｇの原液として溶解した。げっ歯類アッセイ用には、残留物を１：１の割合のジメチルスルフォキシド：ポリエチレングリコール２００（ジメチルスルフォキシド：ＰＥＧ−２００）で１００ｍｇの原液として溶解した。すべての原液は−２０℃にて保管した。
【００４８】
（高速液体クロマトグラフィー）
約２００μｇの生薬抽出物を、２０μＬの高速液体クロマトグラフィーグレードのアセトニトリル（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ；ベルギー、Ｇｅｅｌ）で溶解し、Ｌｕｎａ  Ｃ−１８（２）逆相シリカ分析カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ：アメリカ、カリフォルニア、トーランス）、四連溶媒ポンプ及びダイオードアレイ検出器を備えた日立ＥＺＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ  高速液体クロマトグラフィーシステムに注入した。抽出物中の成分を消散させるため、溶媒グラジエントシステム（０〜４０分、５０％アセトニトリル／水〜１００％アセトニトリル；４１〜６０分、１００％アセトニトリル〜５０％アセトニトリル／水）を０．８ｍＬ／ｍｉｎで使用した。セミミクロ分取作業のため、抽出物の１０ｍｇをＷａｔｅｒｓ  ２４８７二波長検知器（Ｗａｔｅｒｓ  米国：マサチューセッツ、マイアミ、ミルフォード）及びＳｕｎ  Ｆｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ−１８逆相セミ分取カラム（１０×２５０ｍｍ、５μｍ：Ｗａｔｅｒｓ  ＵＳＡ：アメリカ、マサチューセッツ、ミルフォード）を備えたＧｉｌｓｏｎ  ７１２  高速液体クロマトグラフィーシステムに投入した。このスキームにおいて、成分の分画を分離するために類似の溶媒グラジエントシステムを２．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で使用した。分離された分画に回転蒸発を施し乾燥窒素ガスでパージすることで、さらなる分析の対象とする残留物を得た。
【００４９】
（  核磁気共鳴分光分析（ＮＭＲ））
残留物を、内径５ｍｍのガラス製ＮＭＲ管中の２．５ｍＬの重水素化ジメチルスルフォキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ：アメリカ、ミズーリ、セントルイス）に溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００ＭＨｚ  核磁気共鳴分析計に投入したうえで分析を行った。ＡＣＤＬａｂｓ  ＮＭＲ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １２（ＡＣＤＬａｂｓ：アメリカ、マサチューセッツ、ケンブリッジ）を使用し、プロトンシグナル及びカーボンシグナルを確認するためのデータと構造の分析を行った。
【００５０】
（ゼブラフィッシュ）
水温２８度℃、１４時間／１０時間の明暗周期の標準的な水産繁殖条件にて、ゼブラフィッシュ成魚（ＡＢ系統）を飼育した。自然産卵後の卵を収集・選別し、常時明所環境において、２８℃に設定したインキュベーター内の０．３ｘ  Ｄａｎｉｅａｕ溶液中で受精後７日まで飼育した。
【００５１】
（マウス）
１０週〜１２週齢の雄のＣ５７ＢＩ／６マウス及びＮＭＲＩマウスを１２時間／１２時間の明暗周期下で飼育し、標準的なげっ歯類用の餌を自由給餌で与えた。動物実験及び飼育のすべての側面は、国家規制及び欧州規制を順守して実施しており、ルーヴェン・カトリック大学の動物実験委員会の承認を受けた。
【００５２】
（自動化ゼブラフィッシュ幼生ペンチレンテトラゾールアッセイ）
受精後７日ゼブラフィッシュ幼生を９６ウェルプレートの各ウェルに１匹ずつ配置した。過剰な幼生溶媒は取り除き、１００μＬの対照溶液又は試料溶液で置換した。２８℃に設定したインキュベーター内の暗箱に調製済みプレートを１時間又は１８時間にわたって収容した後、ウェルごとに毒性兆候（脈拍数異常、姿勢の崩壊、浮種、壊死、驚愕反応／接触反応遅延など）を調査した。最大許容濃度（ＭＴＣ）は、暴露１８時間後の受精後６日／７日幼生で毒性兆候を引き起こさなかった最高試料濃度に設定した。４０ｍＭのペンチレンテトラゾールをウェルごとに１００μＬ追加し、プレートをゼブラフィッシュ追跡ボックスに収容し、３０分間の記録作成の前に５分間平衡させた。追跡データはＥｘｃｅｌ（登録商標）フォーマットでエクスポートし、統計解析前にＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．５  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で処理した。各追跡データを、各セット内のペンチレンテトラゾールのみの対照群の数値に対して正規化し（１００％設定）、それ以降の各複製セットを２要因ＡＮＯＶＡとボンフェローニ事後分析の前にプールした。
【００５３】
（受精後３日ゼブラフィッシュ幼生へのタンシノンＩＩＡ静脈内微量投与）
幼生溶媒中のタンシノンＩＩＡの溶解性が問題となる可能性を克服するため、静脈内微量投与を実施した。受精後３日ゼブラフィッシュ幼生にトリカインで麻酔を施した後、アガロースでできた溝入りの型枠にあおむけで固定した。１ナノリットルのタンシノンＩＩＡ（５０％ジメチルスルフォキシド中、１００ｍＭ）を、伸長ガラスキャピラリ針を使用して、キュヴィエ管（成長後の総主静脈（ＣＣＶ））を通じて血管中に投与した（非特許文献１８参照）。投与済みの幼生を、９６ウェルプレート内のトリカインを含まない幼生溶媒中で３０分間放置して回復を待った後、２０ｍＭのペンチレンテトラゾールに暴露し、同数の偽投与幼生と非投与幼生を対照群として自動化による運動アッセイを行った。
【００５４】
（脳内ｃ−ｆｏｓ発現の確認のための受精後７日ゼブラフィッシュ幼生に対するホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ法）
魚類モデルと哺乳動物モデルの双方においてｃ−ｆｏｓ発現の増加が発作発現の指標として裏付けられているため（非特許文献６、１２参照）、ゼブラフィッシュ脳内の発作抑制の程度を評価するためにこのアッセイを行った。少なくとも３０匹の受精後６日／７日幼生を１ｍＬの溶媒溶液及び試料溶液に１８時間にわたり暴露させた後、さらに１ｍＬの４０ｍＭ  ペンチレンテトラゾールに３０分間暴露させた。標準的手順に従い、処理後の幼生を４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、１０ｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫに暴露させた後で、ジゴキシゲニンで標識したｃ−ｆｏｓ  ＲＮＡプローブでハイブリダイゼーションを施した（非特許６、１２、１３参照）。
【００５５】
（マウスに対する時限的ペンチレンテトラゾール投与アッセイ）
２４匹のＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスを、各６匹から構成される対照群と投与群に分けた。マウスを拘束し、ポリエチレンチューブに取り付けられた１ｃｍの２９ゲージ針で側脈にカテーテル挿入し、サージカルテープで固定した。以下のいずれかの溶液（溶媒、１：１の割合のジメチルスルフォキシド：ＰＥＧ２００、濃度別の丹参生薬抽出物、及びタンシノンＩＩＡ）を１００μＬの用量で、自動化静脈内注入ポンプ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＬＡＤＯＩＮ−１０００  １１ＶＤＣ、０．７５Ａ）を使用して５０μＬ／ｍｉｎの速度で２分間かけてマウスに静脈内投与した後で、１０分間の培養を行った後に、１５０μＬ／ｍｉｎの速度での７．５ｍｇ／ｍＬ  ペンチレンテトラゾール（０．９％食塩水）の連続投与に移行した。マウスは、以下の発作の進行度ごとに、遅延時間に応じてスコア付けした：耳痙攣（ＥＴ）、尾痙攣（ＴＴ）、間代性筋痙攣（ＭＴ）、前肢クローヌス（ＦＣ）、転倒（Ｆ）、緊張性後肢伸張（ＨＬＥ）、死亡（Ｄ）。生き残ったすべてのマウスは、投与終了時に即座に安楽死させた。
【００５６】
（マウスにおける６Ｈｚ精神運動発作アッセイ）
約３０〜３５ｇのＮＭＲＩマウスを１ケージにつき６匹のグループに分けた。各マウスに、処理の３０分前に、以下の溶液のうちのいずれかを腹腔内投与した：溶媒（１：１の割合のジメチルスルフォキシド：ＰＥＧ２００）、濃度別の丹参生薬抽出物、タンシノンＩＩＡ。発作を、Ｕｇｏ−Ｂａｓｉｌ社製機器を使用した角膜刺激により誘発した。角膜電極の使用前に、０．５％キシロカインをマウスの両目に投与した。マウスは手作業で拘束し、刺激付加後直ちにプレキシグラス製ケージ内に解放した。その後、失神、前肢クローヌス、洞毛伸縮、挙尾などの特徴的な兆候を確認するため４５秒間にわたってマウスを観察した。想定時間内に発作が見られない場合、保護作用と定義した。
【００５７】
（梁歩行試験）
約３０〜３５ｇのＮＭＲＩマウスを１ケージにつき６匹のグループに分け、広い足場から８０ｃｍの木製の梁の上を歩いて渡る訓練を３回施した。各マウスには、実際の実験の３０分前に、以下の溶液のうちのいずれかを腹腔内投与した：溶媒、タンシノンＩＩＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、及び１ｍｇ／ｋｇ）、ジアゼパム（１ｍｇ／ｋｇ）。梁上の移動時間、踏み外し、及び落下をマウスごとに３回の試行で記録した。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
【表２】
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【００６０】
（参照による引用）
本明細書に記載されたすべての文献及び特許出願は、個々の文献又は特許が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記載された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。  齟齬が生じた場合には本明細書が、本明細書に定める定義を含め、優先する。
【００６１】
（均等物）
本発明の特定の実施態様について上述の説明は、一例に過ぎず、それに限定されるものではない。本明細書及び以下の請求項を読んだ当業者にとって、本発明には多くの変形例が存在するということは明白であろう。本発明の全範囲は、請求項及び均等物の全範囲を参照し、本明細書及び本発明の変形例を参照することをもって、決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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