(57)【要約】  本発明は、ポリペプチドに関し、特に、補体系の活性または活性化を阻害することができるポリペプチドに関する。該ポリペプチドをコードする核酸および該ポリペプチドの使用にも関する。補体系は、生物から病原菌を排除する抗体および食細胞の能力を補助する、または“補う”。それは、自然免疫系の一部を構成する。補体活性化の下方制御は、動物モデル試験および生体外（ex vivo）試験において、いくつかの疾患の適応症の処置に有効であることが実証されている。本発明は、１つまたは複数の補体経路の不適切な活性化に関連する疾患または障害の処置のために使用できる新規なポリペプチドを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれか１つのアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）と少なくとも６０％の配列同一性を有する変異体アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｄ）少なくとも４０アミノ酸長、４２アミノ酸長、５０アミノ酸長、６０アミノ酸長、６５アミノ酸長、７０アミノ酸長または７５アミノ酸長である、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の活性フラグメント
を含むか、またはそれからなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）と少なくとも６０％の配列同一性を有する変異体アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｄ）少なくとも４０アミノ酸長、４２アミノ酸長、５０アミノ酸長、６０アミノ酸長、６５アミノ酸長、７０アミノ酸長または７５アミノ酸長である、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の活性フラグメント
からなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
（ｅ）配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９に記載の配列；または
（ｆ）（ｅ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する活性変異体アミノ酸配列
を含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９のアミノ酸配列と、その一端および／または両端に追加アミノ酸を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
Ｎ末端および／またはＣ末端にて１または複数のさらなるポリペプチドと融合した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の配列を含む融合タンパク質からなる、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
補体経路の活性を低下させる、または補体経路の活性化を阻害する、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
古典経路、第二経路および／またはレクチン経路の活性を低下させるか、またはその活性化を阻害する、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
第二経路の活性化を低下させるか、またはその活性化を阻害するよりも強力に、古典経路および／またはレクチン経路の活性を低下させるか、またはその活性化を阻害する、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
好適なアッセイにおいて、補体活性化を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％低下させる、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
１またはそれ以上の特定の組織において、補体系の全活性を１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上低下させるか、あるいは１またはそれ以上の特定の組織において、補体系の活性を１００％低下させ得る、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
Ｃ５に結合し、例えばＣ５転換酵素によるＣ５の活性化を阻害する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
例えば遺伝子治療用ベクターである、請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の１つまたは複数の単離されたポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１６】
（ｉ）請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド；（ｉｉ）請求項１２に記載のポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）請求項１３に記載のベクター；および、（ｉｖ）請求項１４に記載の宿主細胞、の１つまたはそれ以上を含む医薬組成物であって、要すれば、さらなる成分、例えば、１またはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含んでいてよい、医薬組成物。
【請求項１７】
１つまたは複数のさらなる活性成分をさらに含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
医薬としての使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド；請求項１２に記載のポリヌクレオチド；請求項１３に記載のベクター；または、請求項１４に記載の宿主細胞、を含む組成物；あるいは、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
補体経路の活性を低下させるか、または補体経路の活性化を阻害するのに使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド；請求項１２に記載のポリヌクレオチド；請求項１３に記載のベクター；または、請求項１４に記載の宿主細胞、を含む医薬組成物；あるいは、請求項１６または１７に記載の医薬組成物
【請求項２０】
補体経路の増大した活性に関連する疾患または障害の予防または治療に使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド；請求項１２に記載のポリヌクレオチド；請求項１３に記載のベクター；または、請求項１４に記載の宿主細胞、を含む医薬組成物；あるいは、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
補体が介在する疾患または病状の予防的または治療的処置において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド；請求項１２に記載のポリヌクレオチド；請求項１３に記載のベクター；または、請求項１４に記載の宿主細胞、を含む医薬組成物；あるいは、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
臓器移植における拒絶反応；全身性エリテマトーデス、重症筋無力症およびグッドパスチャー症候群などの自己免疫疾患において生じ得る、自己抗体および免疫複合体の沈着に起因する組織損傷；移植内皮への予め形成された宿主抗体の直接結合によって発症する超急性異種移植片拒絶における組織損傷；例えば脳卒中および心筋梗塞中ならびに大手術後に発生する虚血再灌流障害；抗リン脂質症候群および寒冷凝集疾患；関節炎；視神経脊髄炎；血栓性微小血管；シェーグレン症候群；乾癬；水疱性類天疱瘡および関連する皮膚疾患；心血管肺疾患；または、高密度のデポジット疾患の予防的または治療的処置において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド；請求項１２に記載のポリヌクレオチド；請求項１３に記載のベクター；または、請求項１４に記載の宿主細胞、を含む医薬組成物；あるいは、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
炎症性疾患、虚血、再灌流障害、自己免疫疾患、感染症、感染性疾患、移植拒絶、眼疾患、癌、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、心肺バイパスおよび血液透析の合併症、臓器移植における超急性拒絶、心筋梗塞、再灌流障害、外傷、成人呼吸窮迫症候群、熱傷、喘息、アナフィラキシーショック、腸炎、蕁麻疹、血管性浮腫、脈管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、腎疾患、敗血症、発作性夜間血色素尿症、乾癬、移植拒絶、癌、脳卒中、加齢黄斑変性症、非定型溶血性尿毒症症候群、クローン病およびアルツハイマー病、抗体が介在する補体活性化による神経障害（例えば、重症筋無力症、ギランバレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、視神経脊髄炎）および抗リン脂質症候群の予防的または治療的処置において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド；請求項１２に記載のポリヌクレオチド；請求項１３に記載のベクター；または、請求項１４に記載の宿主細胞、を含む医薬組成物；あるいは、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
インビトロでの、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物の使用。
【請求項２５】
補体系の活性化を試験するための診断アッセイにおける、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用。
【請求項２６】
補体経路の異常に増大した活性と関連する対象における疾患または障害の処置法であって、有効量の、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド；請求項１２に記載のポリヌクレオチド；請求項１３に記載のベクター；または、請求項１４に記載の宿主細胞、を含む医薬組成物；あるいは、請求項１６または１７に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
好適な細胞内でポリペプチドを発現させることを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを提供する方法。
【請求項２８】
ショウジョウバエＳ２細胞内でポリペプチドを発現させることを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドを提供する方法。
【請求項２９】
本明細書ならびに図面および実施例に記載の、ポリペプチド、組成物、医薬組成物または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドに関し、特に補体系の活性または活性化を阻害できるポリペプチドに関する。本発明はまた、該ポリペプチドをコードする核酸および該ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、生体から病原菌を排除する抗体および食細胞の能力を補助する、または“補う”。それは、自然免疫系の一部を構成する。補体系は、血中および細胞膜上に見いだされる３０以上のタンパク質からなり、溶液中のものは、一般的に、肝臓で合成され、通常は、不活性な前駆体（プロタンパク質）として循環している。幾つかの誘引物質の１つによって刺激を受けると、該系内のプロテアーゼが特定のタンパク質を切断して、さらなる切断の増幅カスケードが開始される。この活性化カスケードの最終結果は、応答の大幅な増幅であり、殺細胞膜侵襲複合体(cell-killing membrane attack complex)が活性化され、白血球細胞が動員され、炎症性メディエーターが放出される。補体タンパク質は、血清グロブリン画分の約５％を占め、オプソニンとして機能することができる。
【０００３】
補体系は、主に３つの異なる生化学的経路：古典経路、第二経路およびレクチン経路によって活性化され得る。非特異的プロテアーゼ依存的経路もまた、補体活性化においてより限定された役割を果たし得る。
【０００４】
古典経路は、一般的に、補体系タンパク質Ｃ１ｑが抗原−抗体複合体、ペントラキシン、またはアポトーシス細胞に結合することよって活性化される。古典経路の活性化は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症およびグッドパスチャー症候群などの自己免疫疾患で生じる可能性のある、自己抗体および免疫複合体の沈着に起因する組織損傷に関与している。古典経路の活性化は、移植片内皮への予め形成されている宿主抗体の直接結合によって誘発される超急性異種移植片拒絶における組織損傷の原因である。不適切な補体活性化はまた、例えば、脳卒中および心筋梗塞において、および大手術後に発生する虚血再灌流障害の重要なメディエーターでもある。
【０００５】
レクチン経路は、一般的には、マンノース結合レクチンが結合する微生物糖類により、または病原体に反応するフィコリンにより、活性化される。
【０００６】
第二経路は、一般的に、中性または陽性電荷特性を有し、そして補体阻害物質を発現しないか、または含まない、病原体の表面により活性化される。
【０００７】
補体系の活性化は、病原体に対する最初の防御機構として、および獲得免疫の増強因子（ファシリテーター）として、免疫における多くの保護機能を有している。一方、補体活性化は、多くの病的状態における組織損傷の主な原因である。
【０００８】
補体活性化の下方制御は、動物モデル試験および生体外（ex vivo）試験において、全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、心肺バイパスおよび血液透析、臓器移植における超急性拒絶、心筋梗塞、再灌流障害、および成人呼吸窮迫症候群を含む、いくつかの疾患の適応症の処置に有効であることが実証されている。加えて、熱傷、重度の喘息、アナフィラキシーショック、腸炎、蕁麻疹、血管性浮腫、脈管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、腎疾患、敗血症、発作性夜間血色素尿症、乾癬、移植拒絶、癌、脳卒中、加齢黄斑変性症、非定型溶血性尿毒症症候群、クローン病およびアルツハイマー病を含む、他の炎症状態および自己免疫／免疫複合体疾患もまた、補体活性化と密接に関連している。
【０００９】
販売承認を得るための最初の補体特異的薬物は、補体成分Ｃ５に対する抗体であるエクリズマブであった。しかし、補体活性化が関連する疾患が広範囲に亘るため、補体の活性または活性化を低下させるまたは阻害することができる治療剤の必要性が高まっている。また、いくつかの経路のみ、例えば、３つの経路（古典経路、レクチン経路または第二経路）全てではなく、そのうち１つまたは２つのみの活性を阻害するまたは低下させることができる治療剤を発見することも有益であり得る。活性化経路の特定の時点で活性を低下させるまたは阻害することができる治療剤を提供することもまた有利である。例えば、補体活性化経路内のより早い時点を阻害する阻害剤は、より狭く作用し得るので、特定の疾患をより良く標的とすることができる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、１つまたは複数の補体経路の不適切な活性化に関連する疾患または障害の処置のために使用することができる新規ポリペプチドを提供することである。
【００１１】
第一の面において、本発明は、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかのアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）と少なくとも６０％の配列同一性を有する変異体アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｄ）少なくとも４０アミノ酸長、４２アミノ酸長、５０アミノ酸長、６０アミノ酸長、６５アミノ酸長、７０アミノ酸長または７５アミノ酸長である、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の活性フラグメント
を含むか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１２】
該単離されたポリペプチドは、
（ｅ）配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９に記載の配列；または
（ｆ）（ｅ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する活性変異体アミノ酸配列
を含んでいてよいか、またはそれから構成されていてよい。
【００１３】
配列番号９、１０および１１のポリペプチドは全て、配列番号１の配列を含み、配列番号９および１０は、シグナル配列を含む。配列番号１０および１１は、６個のヒスチジンタグ配列を含む。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９に示すアミノ酸配列と、その５’もしくは３’末端に６個のヒスチジンタグ、または５’もしくは３’末端に別の精製タグとを含むかまたはそれからなる、ポリペプチドであり得る。
【００１５】
ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９のアミノ酸配列と、その一端および／または両端に追加のアミノ酸を含んでいてよい。例えば、精製タグまたは別の配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端に付加されてよい。ポリペプチドは、１または複数のさらなるポリペプチドと融合した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の配列を含む融合タンパク質を含み得るか、またはそれからなり得る。さらなるポリペプチドは、例えば、タンパク質の１つまたは複数の活性または不活性ドメイン、１つまたは複数の活性または不活性な完全長タンパク質、および／または１つまたは複数の活性または不活性なタンパク質フラグメントであり得る。
【００１６】
ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の配列を有するポリペプチドの活性フラグメントを含み得る。活性フラグメントは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２に記載の配列の、少なくとも少なくとも４０、少なくとも４２、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０または少なくとも７５の連続アミノ酸を含むか、またはそれからなり得る。活性フラグメントは、４２個のアミノ酸を有し得て、そして／または配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９に記載の配列を有する。
【００１７】
活性フラグメントは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９に記載の配列と、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【００１８】
ポリペプチドは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９と、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のフラグメントまたは変異体であってよい。
【００１９】
好ましくは、本発明の活性フラグメントは、補体系に関して、それが由来するポリペプチドの阻害活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の活性を示す。すなわち、例えば、該フラグメントは、補体活性化に関して、それが由来するポリペプチドの阻害活性の少なくとも５０％を有する。本発明の活性フラグメントは、特定の組織において補体系に関して、それが由来するポリペプチドの活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％またはそれ以上を示し得る。特定の組織に特異的であるか、または特定の組織に標的化される場合、より低い活性を有する活性フラグメント、例えば、特定の組織における補体活性化に関して、それが由来するポリペプチドと比較して、約２０％、３０％、４０％または５０％の阻害活性である活性フラグメントであってもよい。
【００２０】
本発明のポリペプチドがシグナルおよび／またはタグ配列を含む場合、これらの１つまたはそれ以上は、該ポリペプチドの活性形態を遊離させるために除去され得る。
【００２１】
本発明はまた、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する変異体アミノ酸配列を提供する。本発明の配列番号１、９、１０および１１のポリペプチドは、ダニのリピケファルス−アッペンジクラトス（Rhipicephalus appendiculatus）から最初に単離され、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有する、他のダニ種由来の相同体を含むその変異体を提供する。相同体には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の配列のパラログおよびオーソログが含まれてよく、例えば、クリイロコイタマダニ（Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）、リピセファラス・ブルサ（Ｒ．ｂｕｒｓａ）、アンブリオマ・アメリカナム（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、アンブリオマ・カジェネンス（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ．ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ）、アンブリオマ・ヘブラエウム（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ．ｈｅｂｒａｅｕｍ）、オウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ）、ブーフィラス・アニュラタス（Ｂ．ａｎｎｕｌａｔｕｓ）、ブーフィラス・デコロラタス（Ｂ．ｄｅｃｏｌｏｒａｔｕｓ）、デルマセントール・レティキュラタス（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ）、デルマセントール・アンデルソニ（Ｄ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、デルマセントール・マルギナタス（Ｄ．ｍａｒｇｉｎａｔｕｓ）、デルマセントール・バリアビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ヘマフィサリス・イネルミス、ヘマフィサリス・レアチ（Ｈａ．ｌｅａｃｈｉｉ）、ヘマフィサリス・パンクタータ（Ｈａ．ｐｕｎｃｔａｔａ）、ヒアロンマ・アナトリクム・アナトリクム（Hyalomma anatolicum anatolicum）、Ｈｙ．ドロメダリー、Ｈｙ．マルギナツム・マルギナツム、マダニ（Ｉｘｏｄｅｓ  ｒｉｃｉｎｕｓ）、シュルツェマダニ（Ｉ．ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ）、シカダニ（Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）、イクソデス・ヘキサゴナス（Ixodes hexagonus）、ナガヒメダニ（Ａｒｇａｓ  ｐｅｒｓｉｃｕｓ）、アルガス・リフレクサス（Ａｒｇａｓ．ｒｅｆｌｅｘｕｓ）、オルニソドロス・エラティカス（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｅｒｒａｔｉｃｕｓ）、オルニソドロス・モウバタ・モウバタ（Ｏ．ｍｏｕｂａｔａ  ｍｏｕｂａｔａ）、オルニソドロス・モウバタ・ポルシナス（Ｏ．ｍ．ｐｏｒｃｉｎｕｓ）、およびオルニソドロス・サヴィギニュイ（Ｏ．ｓａｖｉｇｎｙｉ）を含む、他のダニ種由来のポリペプチドが含まれ得る。
【００２２】
アミノ酸同一性は、任意の好適なアルゴリズムを用いて計算することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、その初期設定で使用される）（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えばAltschul S. F. (1993) J MoI Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J MoI Biol 215:403-10に記載のように、相同性を計算するか、例えば、配列をラインアップするのに（同等のまたは対応する配列を同定するのに（一般的には、それらの初期設定で））使用することができる。
【００２３】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列において同じ長さのワードと共に整列された場合、ある程度の正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはこれを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することでより高スコアリング配列対合（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschulら、前出)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。このワードヒット(複数)は、累積アライメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に終了する：累積アライメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘだけ低下したとき；１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントが蓄積したために、累積スコアがゼロまたはゼロ未満になったとき；あるいは、いずれかの配列が末端に到達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワードの長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89: 10915-10919参照）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【００２４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を行う；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２種のポリヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間で偶然に一致が生じるであろう確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、ある配列が別の配列と類似していると考えられるのは、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合である。
【００２５】
変異体配列は、一般的に、少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上の変異により異なる（それは、アミノ酸の置換、欠失または挿入であり得る）。例えば、１から５０、２から４０、３から３０または５から２０個のアミノ酸置換、欠失または挿入を行うことができる。置換は、好ましくは保存的置換であり、例えば以下の表に従う。２列目の同じブロック中のアミノ酸および好ましくは３列目の同じ行のアミノ酸は、相互に置換され得る。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
本発明のポリペプチドはまた、遺伝子的にまたは化学的に別のペプチドに融合された本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質として提供されてもよい。他のペプチドの目的は、タンパク質の検出、発現、分離または精製を補助する目的を含む、任意の目的であってもよい。あるいは、該タンパク質は、タンパク質の循環半減期を増大させるためにＦｃペプチドなどのペプチドに融合されてもよい。他の融合パートナーの例としては、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、またはルシフェラーゼが含まれる。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、例えば、翻訳後修飾のように化学的に修飾されてもよい。例えば、それらは、グリコシル化、ペグ化、リン酸化されてよいか、または修飾アミノ酸残基を含む。それらは、精製を補助するためのヒスチジン残基の付加により、または細胞膜への挿入を促進するためのシグナル配列の付加により、修飾されてもよい。かかる修飾ポリペプチドは、本明細書で用いる用語“ポリペプチド”の範囲内に包含される。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であってよい。ポリペプチドは、該ポリペプチドの意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合されてもよく、また該ポリペプチドは、その場合でもなお実質的に単離されたとみなされ得ることが理解される。本発明における使用のためのポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であってよい。この場合、一般に、調製物中のポリペプチドの５０重量％以上、例えば６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、９０重量％以上、９５重量％以上または９９重量％以上が本発明のポリペプチドである、ポリペプチド調製物が含まれる。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、合成により、または組換えにより産生され得る。例えば、組換えポリペプチドは、培養中の哺乳動物細胞、真菌細胞、細菌細胞または昆虫細胞を、好適な調節配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクションし、該細胞を培養し、該細胞により産生された本発明のポリペプチドを抽出および精製することにより、産生され得る。本発明における使用のためのポリペプチドのアミノ酸配列は、非天然アミノ酸を含むように修飾され得るか、または化合物の安定性を増加させるために修飾され得る。ポリペプチドが合成手段によって産生されたとき、そのようなアミノ酸は、製造中に導入されてもよい。ポリペプチドは、合成または組換え産生のいずれかの後に修飾されてもよい。
【００３１】
本発明のポリペプチドはまた、Ｄ−アミノ酸を用いて産生され得る。多数の側鎖修飾が当技術分野で公知であり、ポリペプチドの活性を保持しながら、本発明のポリペプチドの側鎖を修飾し得る。
【００３２】
好ましくは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、補体系の活性または活性化を阻害または低下させる能力を有する。“阻害する”とは、ポリペプチドが、補体活性化の第二経路、古典経路またはレクチン経路の１つまたはそれ以上の活性化または活性を阻害または低下させることができることを意味する。好ましくは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、補体系のレクチン経路および／または古典経路を阻害し得る。好ましくは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、補体活性化の第二経路にほとんど効果を有しないか、または有意な効果を有しない。補体経路の効果を低下させるポリペプチドまたは組成物の能力は、任意の標準的な溶血アッセイまたは当該分野で公知の他の好適なアッセイ、例えば実施例に記載のもの、およびGiclasら（1994）に記載されているものなど、またはSeelen et al. Journal of Immunological Methods Volume 296, Issues 1-2, January 2005, Pages 187-198に記載のアッセイ（Ｗｉｅｓｌａｂ(登録商標)アッセイとしても公知）などの、ヒト血清における機能的な古典経路、ＭＢＬおよび／または第二経路の定性的な決定のための酵素免疫アッセイなどによって決定することができる。
【００３３】
好ましくは、本発明のポリペプチドまたは組成物の存在は、本発明のポリペプチドまたは組成物の不存在下での同じアッセイと比較して、好適なアッセイにおいて赤血球の溶解を減少させるか、または好適なアッセイにおいて補体活性化を少なくとも２０％低下させることが証明されている。本発明の、補体阻害剤分子であるポリペプチドまたは組成物は、より好ましくは、好適なアッセイにおいて、補体活性化を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％低下させ得る。
【００３４】
補体活性化のための好適なアッセイは、例えば、Seelenら（Journal of Immunologucal Methods Volume 296, Issues 1-2, January 2005, Pages 187−198）に記載の通り、ヒト血清における機能的な古典経路、ＭＢＬおよび／または第二経路の定性的な決定のための酵素免疫アッセイであり得る。ポリペプチドの活性は、任意の補体阻害アッセイを用いて試験することができる。ポリペプチドは、補体阻害アッセイを用いて試験するとき、補体経路の阻害活性を有し得る。
【００３５】
ポリペプチドは、補体系の総活性を１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上低下させ得るか、またはポリペプチドは、補体の活性を１００％低下させ得る。
【００３６】
ポリペプチドは、１以上の特定の組織における補体系の総活性を１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上低下させ得るか、またはポリペプチドは、１以上の特定の組織における補体系の活性を１００％低下させ得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドまたは組成物は、Ｃ５に結合し、Ｃ５の活性を阻害または低下させることにより、補体経路に作用することができる。例えば、ポリペプチドは、Ｃ５に結合し、そしてＣ５転換酵素、例えばＣ４ｂ２ａ３ｂおよび／またはＣ３ｂＢｂＣ３ｂおよび／またはＣ３ｂＢｂＣ３ｂＰによるＣ５の活性化を阻害または低下させ得る。
【００３８】
本発明のポリペプチドまたは組成物は、補体経路に作用し、ＭＢＬ、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３、Ｃ１複合体（Ｃ１ｑｒ２ｓ２）、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ａまたはＣ３ｂＢｂまたはＣ３ｂＢｂＰ）、Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ３ｂまたはＣ３ｂＢｂＣ３ｂまたはＣ３ｂＢｂＣ３ｂＰ））、プロパージン、Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８またはＣ９の１つまたはそれ以上の活性を阻害または低下させることができる。
【００３９】
本発明のポリペプチドまたは組成物は、補体経路に作用し、ＭＢＬ、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３、Ｃ１複合体（Ｃ１ｑｒ２ｓ２）、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ａまたはＣ３ｂＢｂまたはＣ３ｂＢｂＰ）、Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ３ｂまたはＣ３ｂＢｂＣ３ｂまたはＣ３ｂＢｂＣ３ｂＰ）またはプロパージンの１つまたはそれ以上の活性を阻害または低下させることができる。
【００４０】
本発明のポリペプチドまたは組成物は、補体経路に作用し、ＭＢＬ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ４ｂ２、Ｃ２、Ｃ２ｂおよびＣ４ｂ２ａの１つまたはそれ以上、より好ましくは、Ｃ２、Ｃ４ｂ２またはＣ４ｂ２ａの１つまたはそれ以上の活性を阻害または低下させることができる。
【００４１】
本発明のポリペプチドまたは組成物は、補体経路に作用し、１つまたはそれ以上の補体成分の活性を阻害または低下することができるが、プロパージン、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８またはＣ９の１つまたはそれ以上の活性を低下させることができない。
【００４２】
ポリペプチドは、ＭＢＬ、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３、Ｃ１複合体（Ｃ１ｑｒ２ｓ２）、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ａまたはＣ３ｂＢｂまたはＣ３ｂＢｂＰ）、Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ３ｂまたはＣ３ｂＢｂＣ３ｂまたはＣ３ｂＢｂＣ３ｂＰ））、プロパージン、Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９から選択される１つまたはそれ以上の因子と結合するか相互作用することができ、その活性を低下させ得る。補体経路の下流因子の活性もまた、上流因子の低下した活性のために低下し得る。
【００４３】
ポリペプチドは、ＭＢＬ、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３、Ｃ１複合体（Ｃ１ｑｒ２ｓ２）、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ａまたはＣ３ｂＢｂまたはＣ３ｂＢｂＰ）、Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ａ３ｂまたはＣ３ｂＢｂＣ３ｂまたはＣ３ｂＢｂＣ３ｂＰ）またはプロパージンから選択される１つまたはそれ以上の因子と結合するか相互作用することができ、その活性を低下させ得る。補体経路の下流因子の活性もまた、上流因子の低下した活性のために低下し得る。
【００４４】
ポリペプチドは、ＭＢＬ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ４ｂ２、Ｃ２、Ｃ２ｂおよびＣ４ｂ２ａから選択される1つ以上の因子、より好ましくはＣ２、Ｃ４ｂ２またはＣ４ｂ２ａの１つまたはそれ以上と結合するか、またはそれと相互作用して、その活性を低下させることができる。補体経路における下流因子の活性もまた、上流因子の低下した活性のために低下し得る。
【００４５】
本発明のポリペプチドまたは組成物は、レクチン経路、第二経路および／または古典経路に関与する１種以上のタンパク質に作用し得る。好ましくは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、レクチン経路、第二経路および古典経路において１種以上のタンパク質の活性に作用する。本発明のポリペプチドまたは組成物は、第二経路に作用するよりも強力にレクチン経路および古典経路に作用し得る。ポリペプチドは、第二経路の活性を低下させるよりも強力に、古典経路およびレクチン経路の活性を低下させ得る。このことは、ポリペプチドの適当な投薬レベルが、細菌および他の感染症を処置／予防するのに十分なレベルで、完全に古典経路およびレクチン経路の活性を排除するが、第二経路の活性の一部を残すことができるため、有利である。本発明のポリペプチドまたは組成物は、第二経路に関与するたんぱく質に作用し得ない。
【００４６】
さらなる面により、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよい。
【００４７】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば発現ベクターを提供し得る。そのような発現ベクターは、分子生物学の分野で常套的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡならびに適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、および他の要素、例えば、タンパク質を発現させるために必要で、正しい方向に配置された、ポリアデニル化シグナルなどの使用を含んでいてよい。コーディング配列もまた、使用される宿主生物に適した好ましいコドン使用をもたらすように選択することができる。他の好適なベクターは、当業者には明らかである。
【００４８】
好ましくは、本発明においてベクター中に使用するためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコーディング配列の発現をもたらすことができる調節配列に作動可能に連結されており、すなわち、ベクターは、発現ベクターである。用語“作動可能に連結された”とは、記載される成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並列関係を意味する。コーディング配列に“作動可能に連結された”調節配列、例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるように配置されている。
【００４９】
ベクターは、例えば、複製の起点、所望によりポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および所望によりプロモーターの調節因子を備えた、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、一般的に、インビボでの使用に適する。ベクターは、遺伝子治療用ベクター、例えばアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰ−Ｒベクターであってよい。
【００５０】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞と適合性であるように選択され得る。例えば、β−アクチンプロモーターなどの哺乳動物プロモーターを使用可能である。組織特異的プロモーターが特に好ましい。ウイルスプロモーター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス由来の末端反復配列領域（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型（ＩＥ）プロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ ＩＥプロモーターなど）、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）もまた使用可能である。ウイルスプロモーターは、当技術分野で容易に入手可能である。
【００５１】
ベクターは、真核生物のゲノム配列、好ましくは哺乳動物のゲノム配列に相同な配列を含むポリヌクレオチドをもたらす、ポリヌクレオチドに隣接する配列をさらに含んでいてよい。これは、本発明の該ポリヌクレオチドを真核細胞のゲノム内へ相同組換えによって導入することを可能にする。特に、ウイルスの配列が隣接している発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに好適なウイルスベクターを調製するために用いることができる。好適なウイルスベクターの他の例には、ヘルペス単純ウイルスベクターならびにレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびＨＰＶウイルスを含むレトロウイルスが含まれる。これらのウイルスを用いる遺伝子導入技術は、当業者に公知である。レトロウイルスベクターは、例えば、宿主ゲノムにポリヌクレオチドをもたらすポリヌクレオチドを安定に組み込むために使用され得る。これに対して、複製欠損型アデノウイルスベクターは、エピソームのままであり、従って、一過性発現を可能にする。
【００５２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクター含む宿主細胞をさらに提供し得る。宿主細胞は、処置される対象の細胞であってよい。
【００５３】
さらなる面において、本発明は、本発明の１つまたはそれ以上の単離されたポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、インビトロでの使用のためのものであり得る。本発明の組成物は、ヒトにおいて、例えば、インビボでの使用のためのものであり得る。本発明の組成物は、動物、例えば、哺乳動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、齧歯動物、魚類、爬虫類または鳥類での使用のためのものであり得る。本発明の組成物は、医薬組成物であり得る。
【００５４】
別のさらなる面において、本発明は、（ｉ）本発明の単離されたポリペプチド；（ｉｉ）本発明のポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）本発明のベクター；および、（ｉｖ）本発明の宿主細胞のうち１つまたはそれ以上を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、さらなる成分、例えば、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含んでいてよい。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、本発明の１つ以上の単離されたポリペプチドに加えて、１つまたは複数のさらなる活性成分を含んでいてよい。医薬組成物は、免疫系を調節する１個または複数のさらなる活性成分を含んでいてよい。
【００５６】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、経口、口腔、肛門、肺、静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、腹腔内、関節内、局所、吸入、眼内を介するような経腸経路または非経腸経路、あるいは他の適当な投与経路で投与されることが意図され得る。
【００５７】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、種々の剤形で投与されることが意図されてもよい。これは、経口投与（例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水溶液または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒として）、非経腸投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、眼内投与、鼻腔内投与、経皮投与、局所投与または点滴技術によって投与されてよい。
【００５８】
一般的に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に使用するために剤形化され、これは、薬学分野で常套の方法を用いて行うことができる。医薬担体または希釈剤は、例えば、等張溶液であってよい。例えば、固体経口形態は、活性化合物と共に、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン；滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤；例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；脱凝集剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはデンプングリコール酸ナトリウム；発泡性混合物；染料；甘味剤；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩など；ならびに、医薬製剤において使用される、一般的な非毒性物質および薬理学的に不活性な物質を含んでいてよい。そのような医薬製剤は、既知の方法で、例えば混合、造粒、打錠、糖衣、またはフィルムコーティング処理によって製造することができる。経口投与用の液体分散液は、シロップ剤、エマルジョンおよび懸濁剤であってもよい。シロップ剤は、担体として、例えば、サッカロースまたはグリセリンおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールと共にサッカロースを含有してもよい。
【００５９】
懸濁液およびエマルジョンは、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有してもよい。筋肉内注射用の懸濁液または溶液は、活性化合物と共に、薬学的に許容される担体、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、および所望により、好適な量のリドカイン塩酸塩を含有してもよい。
【００６０】
静脈内投与または点滴用の溶液は、担体として、例えば、滅菌水を含んでいてよく、または好ましくはそれらは、滅菌、水性、等張食塩水の形態であってもよい。
【００６１】
坐薬について、伝統的な結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得る。そのような坐薬は、０．５％から１０％、好ましくは１％から２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成され得る。
【００６２】
経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態をとり、活性成分の１０％から９５％、好ましくは２５％から７０％を含有する。医薬組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥物質は、投与前に、例えば懸濁液に再構成され得る。再構成は、好ましくは、緩衝液中で行われる。
【００６３】
患者への経口投与用のカプセル、錠剤および丸剤は、例えば、オイドラギット“Ｓ”、オイドラギット“Ｌ”、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶性コーティングを備えていてもよい。
【００６４】
無針注射による送達、例えば経皮送達に適する医薬組成物もまた、使用することができる。本発明の組成物は、局所適用に通常使用される全ての投与量形態で提供することができ、特に水性、水性−アルコール性または油性の溶液の形態、ローションまたは血清型の分散液の形態、無水または親油性ゲルの形態、水相に油相を分散させる（Ｏ／Ｗ）またはその逆（Ｗ／Ｏ）によって得られるミルクタイプの液体または半固体の粘性エマルジョン形態、あるいはクリームまたはゲルタイプの希薄な半固体の粘性の懸濁液またはエマルジョンの形態、あるいは、マイクロエマルジョン形態、マイクロカプセル形態、微小粒子形態、またはイオン性および／または非イオン性の小胞分散液形態で提供できる。これらの組成物類は、標準的な方法により調製される。それらはまた、水性、アルコール性または水性−アルコール性溶液の形態、クリーム形態、ゲル形態、エマルジョン形態または泡状形態、あるいは加圧下にて噴射剤を含有するエアロゾル組成物の形態で、頭皮に使用することもできる。
【００６５】
本発明の組成物の異なる成分の量は、当技術分野において従来から使用されているものである。
【００６６】
好ましくは、治療的有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物が投与されるか、または投与が意図される。用量は、種々のパラメーター、特に使用されるポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物；処置される患者の年齢、体重および状態；投与経路；および、必要なレジメンに応じて、決定され得る。そして、医師は、任意の特定の患者のための必要な投与経路および投与量を決定することができる。一般的な１日用量は、体重１ｋｇ当たり、約０．００１から５０ｍｇ、好ましくは約０．０ｌｍｇから１０ｍｇであり、ポリペプチドの活性、処置される患者の年齢、体重および状態、疾患の種類および重篤度、ならびに投与の頻度および経路によって変わる。好ましくは、１日用量レベルは、０．５ｍｇから２ｇまでである。より低用量を、局所投与のために使用することができる。
【００６７】
さらなる面により、本発明は、医薬としての使用のための、本発明のポリペプチドを含む組成物；本発明のポリヌクレオチド；本発明のベクター；または、本発明の宿主細胞を提供する。
【００６８】
さらなる面により、本発明は、補体が介在する疾患または病状の処置における使用のための、本発明のポリペプチドを含む組成物；本発明のポリヌクレオチド；本発明のベクター；または本発明の宿主細胞を提供する。
【００６９】
処置とは、治療的または予防的処置であり得る。
【００７０】
別の面により、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の本発明のポリペプチド；本発明のポリヌクレオチド；本発明のベクター；または本発明の宿主細胞を投与することを含む、補体が介在する疾患または病状の処置法を提供する。
【００７１】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物により処置可能または予防可能な、補体が介在する疾患または障害は、対象における補体系の活性化、または増加した活性化に起因する、または結果として補体系の活性化または増加した活性化をもたらす、任意の疾患または障害であり得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物または医薬組成物は、補体系の異常な活性化、または補体系の異常な活性化に関連する任意の疾患もしくは障害のリスクがある個体において正常レベルが維持されるように、補体系の活性化を予防するのに有用であり得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物または医薬組成物は、第二経路に顕著な効果を有さず、古典経路および／またはレクチン経路の活性化を予防するのに特に有用であり得る。これは、細菌感染および他の感染症を軽減または予防するのに十分ないくつかの第二経路の活性を残したまま、臓器移植における急性拒絶反応；全身性エリテマトーデス、重症筋無力症およびグッドパスチャー症候群などの自己免疫疾患において生じ得る、自己抗体および免疫複合体の沈着に起因する組織損傷；移植内皮への予め形成された宿主抗体の直接結合によって発症する超急性異種移植片拒絶における組織損傷；例えば脳卒中および心筋梗塞中ならびに大手術後に発生する虚血再灌流障害；抗リン脂質症候群および寒冷凝集疾患；関節炎；視神経脊髄炎；血栓性微小血管；シェーグレン症候群；乾癬；水疱性類天疱瘡および関連する皮膚疾患；心血管肺疾患；および、高密度のデポジット疾患の予防に有用あり得る。
【００７２】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物または医薬組成物は、異常に活性な補体系を有する対象において、補体系の活性を低下するのに有用であり得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物または医薬組成物は、古典経路、第二経路および／またはレクチン経路の活性を低下させるのに有用であり得る。これは、臓器移植における急性拒絶反応；全身性エリテマトーデス、重症筋無力症およびグッドパスチャー症候群などの自己免疫疾患において生じ得る、自己抗体および免疫複合体の沈着に起因する組織損傷；移植内皮への予め形成された宿主抗体の直接結合によって発症する超急性異種移植片拒絶における組織損傷；例えば脳卒中および心筋梗塞中ならびに大手術後に発生する虚血再灌流障害；抗リン脂質症候群および寒冷凝集疾患；関節炎；視神経脊髄炎；血栓性微小血管；シェーグレン症候群；乾癬；水疱性類天疱瘡および関連する皮膚疾患；心血管肺疾患；および、高密度のデポジット疾患の処置に有用であり得る。
【００７３】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、１つまたは複数の補体経路の活性を低下させる、または補体経路のうちの１つまたは複数の活性を阻害するのに使用するためのものであり得る。
【００７４】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、１つまたは複数の補体経路の増加した活性に関係する疾患または障害の処置のためのものであり得る。
【００７５】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、１つまたは複数の補体経路の不適切な活性化に関連する疾患または障害の処置のためのものであり得る。
【００７６】
補体が介在する疾患または障害には、炎症性疾患、虚血、再灌流障害、自己免疫疾患、感染、感染性疾患、移植拒絶、眼疾患または癌が含まれ得る。
【００７７】
補体が介在する疾患または障害にはまた、全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、心肺バイパスおよび血液透析、臓器移植における超急性拒絶、心筋梗塞、再灌流障害、外傷、成人呼吸窮迫症候群、熱傷、喘息、アナフィラキシーショック、腸炎、蕁麻疹、血管性浮腫、脈管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、腎疾患、敗血症、発作性夜間血色素尿症、乾癬、移植拒絶、癌、脳卒中、加齢黄斑変性症、非定型溶血性尿毒症症候群、クローン病およびアルツハイマー病から選択される疾患または障害が含まれ得る。
【００７８】
本発明のポリペプチドおよび組成物は、急性拒絶、抗体が介在する補体活性化による神経障害（例えば、重症筋無力症、ギランバレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、視神経脊髄炎）および抗リン脂質症候群の処置または予防に特に有用であり得る。
【００７９】
本発明はさらに、対象において古典経路、第二経路（第二経路）および／またはレクチン経路の活性または活性化を低下させる方法であって、有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００８０】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、ポリペプチドの単位用量が、古典経路および／またはレクチン経路、好ましくは両方の経路の活性を、第二経路よりも約７倍低下させることができるため、有利であり得る。従って、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、第二経路に有意な影響なしに、古典経路およびレクチン経路の活性を低下させるために使用できる。この面は、二次感染の危険性が高い（例えば、移植または熱傷）病状である場合、または感染性生物によって発症する病状が、補体活性化の第二経路によって制御される場合に特に有用であり得る。好適な投与量にて、古典経路およびレクチン経路の活性は大幅に低下され得るが、第二経路の活性は、わずかしか低下しない。
【００８１】
本発明はさらに、対象における補体経路の異常な、および／または増加した活性に関連する疾患または障害の処置法であって、有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００８２】
本発明はさらに、インビトロでの本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物の使用を提供する。例えば、本発明のポリペプチドは、補体経路を調査するために使用できる。本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するために使用できる。本発明の単離された核酸は、インビトロ法においてポリヌクレオチドプローブとして使用することができる。
【００８３】
本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドは、補体系の活性化を試験するための診断アッセイにおいて使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドまたは単離された核酸は、古典経路またはレクチン経路の活性化と第二経路の活性化とを区別するための診断アッセイにおいて使用することができる。
【００８４】
本発明は、本発明のポリペプチドを提供する方法であって、好適な細胞中でポリペプチドを発現させることを含む方法を提供する。
【００８５】
細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり得る。細胞は、ショウジョウバエＳ２細胞であり得る。
【００８６】
ポリペプチドは、インビトロで化学的に合成することができる。
【００８７】
当業者は、いずれか１つの態様および／または面および／または特許請求の範囲の好適な特徴は、全ての他の態様および／または面および／または特許請求の範囲に適用できることを理解する。
【００８８】
一例としてのみ、添付の図面を参照して、本発明の詳細な説明を以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、補体系の古典経路、レクチン経路および第二経路の概要を示す。
【図２】図２は、ＲａＣＩのアミノ酸配列を示す。配列番号１は、本明細書中、ＲａＣＩとも言い、それは、シグナル配列または６−Ｈｉｓタグを有していない。配列番号２、３、４、５、６、７および８は、配列番号１（ＲａＣＩ）のホモログを示し、それらは全て、シグナル配列または６−Ｈｉｓタグを有していない。配列番号９は、Ｎ末端に下線を付したシグナル配列を有する配列番号１（ＲａＣＩ）を示す。配列番号１０は、下線を付したシグナル配列に続いて６−Ｈｉｓタグを有する配列番号１（ＲａＣＩ）を示す。配列番号１１は、６−Ｈｉｓタグを有し、シグナル配列を有しない、配列番号１（ＲａＣＩ）を示す。
【図３】図３は、配列番号１から８のＣＬＵＳＴＡＬ  ２．１マルチプル配列アラインメントを示す。
【図４】図４は、配列番号１から８のＣｌｕｓｔａｌ  ２．１により作成されたパーセント単位行列（Percentage Identity Matrix）を示す。
【図５】図５は、古典経路、レクチン経路および第二経路のそれぞれについての、配列番号１（標識したＲａＣＩ）および配列番号１１（標識したＨｉｓ−ＲａＣＩ）のペプチドを使用した補体阻害アッセイの結果を示す。Ｈｉｓ−Ｎｅｇポリペプチドは、陰性対照として使用する無関係のＨｉｓタグを付したタンパク質の上清である。１７μｇの精製したＣｏｖｅｒｓｉｎ（ＯｍＣＩ）を陽性対象として用い、これは、補体系の終末経路を阻害するため、全ての補体経路を阻害する。血清の活性のみを１００％に設定する。示される値は、２つの反復試験の平均である。
【図６】図６は、古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）および第二経路（ＡＰ）に対する６−Ｈｉｓ−ＲａＣＩの効果を示す。近似曲線のそれぞれの最大値および最小値を、それぞれ１００％および０％活性に設定した。値は、３つの反復試験の平均であり、エラーバーは標準誤差を示す。
【００９０】
【図７】図７は、ＲａＣＩおよびその複数種のホモログの補体阻害活性を示す。配列番号１−６に対応するタンパク質を試験した。タンパク質のいくつかは、例えば“Ｈｉｓ−Ｓｅｑ＿ＩＤ２”と示すように、Ｎ末端に６Ｈｉｓタグを付して試験し、タンパク質のいくつかは、例えば“ＳＥＱ＿ＩＤ２”のように、６Ｈｉｓタグを付さないで試験した。６Ｈｉｓタグは、顕著に活性に影響を与えないことが分かった。安定なＳ２細胞株の上清を、Ｇｉｃｌａｓ  ＰＣにより記載されたプロトコル（National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine、デンバー、コロラド州、製品名：免疫学の現在のプロトコル、ユニット番号：ユニット１３．１、ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ１３０１ｓ０９）に従い、感作されたヒツジ赤血球を用いて、溶血アッセイにおいて阻害活性を調べた。正常ヒト血清は、１／８０の最終希釈に使用した。
【図８】図８は、本発明の阻害剤によるＣ５のプルダウンアッセイの結果を示す。４つの阻害剤を、ＮＨＳ活性化磁気ビーズ（Pierce Thermo Scientific）に共有結合させた。これらは全て、ヒト血清由来のＣ５に結合し、これは、ポリクローン性抗Ｃ５抗体（ＣｏｍｐＴｅｃｈ、ＵＳＡ）を用いたウェスタンブロット分析によって確認した。（−）として示されるＣ５を欠く血清を陰性対照として用いた。これらの阻害剤は全て、Ｃ５に結合することにより作用し、これを本発明者らは、血清サンプルからヒトＣ５をプルダウンするためにビーズに共有結合された阻害剤を使用することができるという事実によって証明した。
【図９】図９は、Ｃ５−ＯｍＣＩ−ＲｍＣＩ−エクリズマブ複合体のサイズ排除溶出プロファイルおよびクマシーゲルを示す。Ｃ５は、Ｈｉｓタグを付したＯｍＣＩを用いてヒト血清から精製した。次いで、純粋なＯｍＣＩ−Ｃ５複合体を、３倍モル過剰量のエクリズマブ（Ａｂ）およびＲｍＣＩと混合した。ゲルの写真は、最初のピークの集めた画分を示している。第二のピークは、遊離抗体およびＲｍＣＩを含む。これらの阻害剤は、既知のダニタンパク質（ＯｍＣＩ／Ｃｏｖｅｒｓｉｎ）またはエクリズマブの両方と異なる方法でＣ５に結合し、これを本発明者らは、４つのタンパク質の四次複合体を形成することができるという事実によって証明した。
【図１０】図１０は、３つの阻害剤の配列アライメントを示し、これにより本発明者らは構造を得た。ジスルフィド結合のパターンを黄色の線で示し、アライメントの上部に番号を付した。最高解像度構造（ＤａＣＩ）における二次構造の程度（ＤＳＳＰにより定義される）は、下に青色で示した。これらの３つの阻害剤の完全な構造は、ファミリーに見られる配列多様性のレベル（機能のために必要とされるタンパク質の折り畳まれたコア内の５０％未満の配列同一性）を表す。
【００９１】
【図１１】図１１は、スティック表示されたジスルフィド結合を有するＤａＣＩ構造のｃａｒｔｏｏｎ表示（Ｎ末端からＣ末端へ青色から赤色に着色）を示す。９０度回転させた図も表示する。
【図１２】図１２は、構造ＤａＣＩ（青色から赤色へ着色）、ＲａＣＩ（黒色）およびＲｍＣＩ（灰色）を有する、３つの阻害剤のリボン表示の重なりを示す。ルートは、該構造の骨格原子間の二乗偏差が１Å２であることを意味する。本発明者らは、Ｃ５と複合体形成したこれらの３つの阻害剤のそれぞれの完全な構造を解析し、阻害剤がＣ５と干渉する方法を正確に定義した。これは、機能に必要な分子の一部が、最初と最後のＣＹＳ間にある４２残基のみであることに加えて、厳密には、この領域内の残基がＣ５に直接結合していることを明らかにする。
【図１３】図１３は、ＲｍＣＩの欠失変異体による補体阻害を示す。変異体および野生型ＲｍＣＩを大腸菌シャッフルＴ７細胞中で発現させ、細胞溶解物を、溶血アッセイにおいて阻害活性について試験した。空のベクターを陰性対照として用いた。値は、２つの反復試験の平均である。
【図１４】図１４は、Ｃ５に結合した阻害剤の構造に基づく配列アライメントを示す。緑色に着色された残基は、Ｃ５との複合体の形成に伴い埋もれる(内在する)。緑のイタリック体で示されているものは、Ｃ５中の残基と架橋形成する特定の塩である。
【図１５】図１５は、補体Ｃ５の異種間アライメントを示す。ヒトＣ５は、各ブロックの上の配列であり、青色で強調された残基は、ＤａＣＩ／ＲａＣＩ／ＲｍＣＩとの複合体形成に伴い埋もれる残基である。下の配列に注目すると、他の種で保存されている相互作用残基（contact residue）が示されている。本発明者らは、これらの阻害剤がヒトおよびモルモットの血清に対して完全に活性であり（アライメントの上と下の配列）、ブタの血清に対して部分的に活性であり（上から４番目の配列）、そしてラットおよびマウスに対して活性がない（下から３番目および４番目の配列）ことを明らかにした。
【００９２】
【図１６】図１６は、古典経路の溶血アッセイにおいて試験したＤａＣＩ／ＲａＣＩ／ＲｍＣＩ／ＨｍＣＩの異種間活性を示す。アッセイにおける最終血清濃度は、１／８０（ヒト）および１／６４０（モルモット）である。値は、３つの反復試験の平均であり、エラーバーは、標準誤差を示す。ただし、マウスアッセイにおいて、値は、２つの反復試験の平均である。値は、ＰＢＳ（１００％活性）および空のウェル（０％）に対して正規化した。
【図１７】図１７は、ＤａＣＩ（Ｎ末端の青色からＣ末端の赤色で着色）と補体Ｃ５（小麦）との複合体の図を示す。本発明者らは、これらの阻害剤が、Ｃ５転換酵素との相互作用を停止すること（以前のＣ５阻害剤の仮定される機序であった）により作用しないことを明らかにする競合アッセイを行い、そして本発明の構造は、活性化を抑制する立体構造にＣ５を固定する可能性が高いことを示唆している。治療の観点では、このことは、患者における阻害されたＣ５の存在が、活性化酵素への結合について競合することにより、存在する阻害されていないＣ５の活性化を防止するようにさらに作用することを意味する。
【図１８】図１８は、Ｃ５−リガンド複合体との競合アッセイを示す。純粋なＣ５（ＣｏｍｐＴｅｃｈ、ＵＳＡ）を２倍モル過剰量のリガンドと混合し、そして複合体をサイズ排除クロマトグラフィー工程により精製した。精製された複合体を、Ｗｉｅｓｌａｂベースの古典経路ＥＬＩＳＡにおいて希釈した血清と混合した。抗体は、エクリズマブ薬に基づくＦａｂフラグメントであり、陰性対照は標的補体ではないダニタンパク質である。値は、３つの反復試験の平均であり、エラーバーは、標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
材料および方法
ポリペプチドの配列および発現
配列番号１から１１の配列を、ショウジョウバエＳ２細胞（ExpreS2ion Biotechnologies, Denmark）においてｐＥｘｐｒｅｓ２−２ベクターから発現させた。配列番号９および配列番号１０は、シグナル配列に下線を付して示される。配列番号１から８、１１および１２は、シグナル配列なしで示される。シグナル配列はショウジョウバエＳ２細胞での発現中に切断されて、配列番号１−８、１１および１２で示されるペプチドが提供される。相同体である配列番号２から８のシグナル配列は、配列番号９で下線を付したシグナル配列と同じか、またはそれと類似であり得る。
【００９４】
配列番号９
（ＭＮＡＭＬＶＬＦＩＡＳＡＬＦＩＳＥＨＮＴＥＥＶＫＴＴＰＩＰＮＨＱＣＶＮＡＴＣＥＲＫＬＤＡＬＧＮＡＶＩＴＫＣＰＱＧＣＬＣＶＶＲＧＡＳＮＩＶＰＡＮＧＴＣＦＱＬＡＴＴＫＰＰＭＡＰＧＤＮＫＤＮＫＥＥＥＳＮ）、および
配列番号１０
（ＭＫＬＣＩＬＬＡＶＶＡＦＶＧＬＳＬＧＨＨＨＨＨＨＡＧＥＥＶＫＴＴＰＩＰＮＨＱＣＶＮＡＴＣＥＲＫＬＤＡＬＧＮＡＶＩＴＫＣＰＱＧＣＬＣＶＶＲＧＡＳＮＩＶＰＡＮＧＴＣＦＱＬＡＴＴＫＰＰＭＡＰＧＤＮＫＤＮＫＥＥＥＳＮ）
は、SignalP 4.1 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）により予測される、分泌のためのシグナルペプチド（下線）を含む。タンパク質を、業者のプロトコル（ＥｘｐｒｅＳ２ｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に従い、７２時間、一過的に発現させた。使用済みの培地を遠心分離によって除き、補体阻害アッセイを用いて、抗補体活性について試験した。
【００９５】
Ｈｉｓ６−ＲａＣＩの精製
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（Ｈｉｓ６−ＲａＣＩ）に融合したＲａＣＩを、ショウジョウバエＳ２細胞（ExpreS2ion Biotechnologies, Denmark）においてｐＥｘｐｒｅｓ２−２ベクターから発現させた。安定な細胞株の作製およびＨｉｓ６−ＲａＣＩの発現を、業者のプロトコル（ExpreS2ion Biotechnologies, Denmark）に従って行った。細胞培養物を遠心によって清澄化し、Ｈｉｓ６−ＲａＣＩを、完全なＨｉｓタグ精製カラム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて上清から精製し、次いでゲル濾過工程により精製した。
【実施例】
【００９６】
Ｈｉｓ−６−ＲａＣＩについての補体阻害アッセイ
Ｈｉｓ６−ＲａＣＩの段階希釈の補体阻害活性を、Complement System Screen WIESLAB（Euro Diagnostica, Sweden）を、以下の変更を加えて、業者のプロトコルに従って用いて決定した。正常ヒト血清を全ての条件で用いた。補体阻害を試験するために、２μｌの精製したＨｉｓ６−ＲａＣＩを１００μｌの希釈した血清に添加し、その後、インキュベーション工程を行った。３つの経路のそれぞれでのＨｉｓ６−ＲａＣＩの効果を、キットに付属の異なる緩衝液およびＥＬＩＳＡストリップで試験した。段階希釈を、各経路についてＨｉｓ６−ＲａＣＩのＩＣ５０値を計算するために用いた。
【００９７】
このアッセイの結果を図４に示す。Ｈｉｓ６−ＲａＣＩの古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）および第二経路（ＡＰ）に対する効果。各近似曲線の最大値および最小値を、それぞれ１００％および０％活性に設定した。値は３つの反復試験の平均であり、エラーバーは標準誤差を示す。
【００９８】
使用済み培地についての補体阻害アッセイ
使用済み培地についての補体阻害活性を、Complement System Screen WIESLAB（Euro Diagnostica, Sweden）を、以下の変更を加えて、業者のプロトコルに従って用いて決定した。正常ヒト血清を全ての条件で用いた。補体阻害を試験するために、５μｌの使用済み培地に１００μｌの希釈した血清を添加し、その後、インキュベーション工程を行った。３つの経路のそれぞれでの配列番号１の効果を、Ｗｉｅｓｌａｂのキットに付属の異なる緩衝液およびＥＬＩＳＡストリップで試験した。Ｗｉｅｓｌａｂのキットは、３つの経路のそれぞれを活性化するためにＥＬＩＳＡプレート上の３つの異なるコーティングを有するＥＬＩＳＡキットである。阻害剤を、ＥＬＩＳＡウェルに添加する前に、血清に添加した。アッセイは、Ｓｅｅｌｅｎらの Journal of Immunological Methods Volume 296, Issues 1-2, January 2005, Pages 187−198に記載の通りに行った。
【００９９】
結果
使用済み培地についての補体阻害アッセイの結果を図３に示し、配列番号１の、古典経路、レクチン経路および第二経路に対する効果が示される。Ｈｉｓ−Ｎｅｇは、陰性対照として用いる無関係のＨｉｓタグを付したタンパク質の上清である。１７μｇの精製したＣｏｖｅｒｓｉｎ（ＯｍＣＩ）を陽性対照として用い、それは、補体系の終末経路を阻害するため、全ての経路を阻害する。血清のみの活性を１００％に設定する。値は、２つの反復試験の平均である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017524345.tif 000029
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