(57)【要約】  本開示は、幹細胞を関連する肝細胞系譜への分化のための方法及びキット、並びに、細胞応答、表現型のスクリーニング、および症状の処置における、関連する肝細胞系譜の使用方法を提供する。一実施形態において、幹細胞は、初めに胚体内胚葉の細胞へと分化され、それが、１つ以上のレチノイン酸活性化剤及び／又はトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）の１つ以上の阻害剤によって、後側前腸（ＰＦＧ）系譜細胞に分化される。さらなる実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化因子、及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータ、及び／又はサイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤によって、後側前腸系譜細胞を肝芽前駆細胞へ分化する方法を提供し、さらなる実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化因子及び／又は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤及び／又は１つ以上のＮｏｔｃｈ阻害剤によって、肝芽前駆細胞を肝前駆細胞へ分化する方法を提供する。別の実施形態は、１つ以上のＮｏｔｃｈ阻害剤及び／又はグルココルチコイドシグナル伝達の活性化因子及び／又はインスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化因子及び／又は１つ以上のアスコルビン酸シグナル活性化剤及び／又は追加因子によって、肝前駆細胞を肝細胞様細胞又は静脈周囲肝細胞様細胞への分化を開示する。ＬＢを自己再生状態に維持し、肝細胞様細胞を静脈周囲又は門脈周囲状態に維持するための方法及びキット、並びに、ＬＢ及び中／後腸（ＭＨＧ）細胞の表面マーカーもまた開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の細胞を後側前腸系譜に分化させる方法であって、前記幹細胞を、１つ以上のレチノイン酸活性化剤；及び／又はＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞を、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記後側前腸系譜の細胞が、未分化細胞と比較して、後側前腸系譜マーカーの遺伝子発現の上昇及び背側前腸マーカーの発現の減少を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法の持続時間が、約１〜８４時間である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
後側前腸系譜の細胞を肝芽前駆細胞に分化させる方法であって、前記後側前腸系譜の細胞を、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータ；及び／又はサイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含む、方法。
【請求項７】
前記後側前腸系譜の細胞を、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記肝芽前駆細胞が、未分化細胞と比較して、肝芽前駆細胞マーカーの遺伝子発現の上昇及び膵前駆細胞マーカーの発現の減少を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記肝芽前駆細胞が、未分化細胞と比較して、ＡＦＰ、ＴＢＸ３、ＨＮＦ４Ａ、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６、ＣＥＢＰＡα又はそれらの組み合わせを含むマーカーの遺伝子発現の上昇を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータが、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル伝達の活性化剤を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤を、約１〜７２時間の期間、前記後側前腸系譜の細胞と接触させ、その後、前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤を、約２４〜４８時間の期間、前記後側前腸系譜の細胞と接触させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法の持続時間が、約１〜１２０時間である、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記後側前腸系譜の細胞が、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法から得られるものである、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化させる方法であって、前記肝芽前駆細胞を、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；及び／又はＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることを含む、方法。
【請求項１５】
前記細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、及び／又はインスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触時間が、約４８時間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触時間は、少なくとも１〜１０８時間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記肝芽前駆細胞を、アスコルビン酸シグナル伝達の活性化剤；グルココルチコイドシグナル伝達の活性化剤；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の活性化剤；インスリンシグナル伝達の活性化剤；オンコスタチンＭシグナル伝達の活性化剤；アミノ酸混合物、及び／又はＬ−グルタチオンシグナル伝達の活性化剤からなる群から選択される１つ以上分化因子と接触させることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１４から得られた細胞を、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤；ＰＫＧシグナル伝達の阻害剤；グルココルチコイドシグナル伝達の活性化剤；リン脂質前駆体；オンコスタチンＭシグナル伝達の活性化剤；アミノ酸混合物、及びＬ−グルタチオンシグナル伝達の活性化剤からなる群から選択される１つ以上の分化因子と接触させることさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記肝前駆細胞が、未分化細胞と比較して、肝臓マーカーの遺伝子発現の上昇及び胆のうマーカーの発現の減少を含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記肝前駆細胞が、未分化細胞と比較して、アルブミン、ｃ−ＭＥＴ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＥＢＰＡ又はそれらの組み合わせを含むマーカーの遺伝子発現の上昇を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記肝前駆細胞が、未分化細胞と比較して、胆のうマーカーＳＯＸ９の遺伝子発現の低下を含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記肝芽前駆細胞が、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法から得られるものである、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
肝前駆細胞を、静脈周囲肝細胞様細胞に分化させる方法であり、前記肝前駆細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤、及び／又はＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含む、方法。
【請求項２５】
前記肝前駆細胞を、レチノイン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記肝前駆細胞を、プロゲステロンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記肝前駆細胞を、ビタミンＤシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記肝前駆細胞を、ＰＫＧシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記静脈周囲肝細胞様細胞が、未分化細胞と比較して、静脈周囲肝細胞マーカーの遺伝子発現の上昇、及び、肝細胞様細胞マーカーの発現の減少を含む、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記静脈周囲肝細胞マーカーが、ＧＳ、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＡＴ、ＡＸＩＮ２又はそれらの組み合わせを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法の持続時間が、約１〜１６８時間である、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記肝前駆細胞が、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法から得られるものである、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
肝前駆細胞を肝細胞様細胞へ分化する方法であって、前記肝前駆細胞を、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤、及び／又はＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることを含む、方法。
【請求項３４】
前記肝前駆細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータと接触させることをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記肝前駆細胞を、ＰＫＧシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記肝細胞様細胞が、未分化細胞と比較して、肝細胞様細胞マーカーの遺伝子発現の上昇、及び、静脈周囲マーカーの発現の減少を含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記肝細胞様細胞マーカーが、ＦＡＨ、ＰＡＨ、ＨＧＤ、ＨＰＤ、ＰＡＨ、ＴＡＴ、アルブミン、ＡＡＴ、ＡＲＧ１、ＣＰＳ１又はそれらの組合せを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法の持続時間が、約１〜１６８時間である、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記肝前駆細胞が、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法から得られるものである、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
肝芽前駆細胞を自己再生状態に維持する方法であって、前記肝芽前駆細胞を、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含む、方法。
【請求項４１】
前記肝芽前駆細胞を、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記肝芽前駆細胞を、１つ以上の上皮増殖因子と接触させることをさらに含む、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記肝芽前駆細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上のモジュレータと接触させることをさらに含む、請求項４１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記肝芽前駆細胞が、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法から得られるものである、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
肝細胞又は肝細胞様細胞を静脈周囲の状態に維持する方法であって、前記細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含む、方法。
【請求項４６】
前記肝細胞又は肝細胞様細胞を、ＴＧＦｂの１つ以上の阻害剤；及び／又はエストロゲンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法から得られるものである、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記肝細胞又は肝細胞様細胞が、ヒト肝臓から得られるものである、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
肝細胞を、門脈周囲状態に維持する方法であって、前記細胞を、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含む、方法。
【請求項５０】
前記肝細胞が、ヒト肝臓から得られるものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の細胞を後側前腸系譜に分化させるためのキットであって、以下の因子：１つ以上のレチノイン酸活性化剤；及び／又はＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、の１つ以上を含む、キット。
【請求項５２】
後側前腸系譜の細胞を肝芽前駆細胞に分化させるためのキットであって、以下の因子：ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータ；及び／又はサイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、の１つ以上を含む、キット。
【請求項５３】
肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化させるためのキットであって、以下の因子：ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；及び／又はＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、の１つ以上を含む、キット。
【請求項５４】
肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化させるためのキットであって、以下の因子：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；アスコルビン酸シグナル伝達の活性化剤；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はインスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、の１つ以上を含む、キット。
【請求項５５】
肝前駆細胞を静脈周囲肝細胞様細胞に分化させるためのキットであって、以下の因子：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、の１つ以上を含む、キット。
【請求項５６】
肝前駆細胞を肝細胞又は肝細胞様細胞に分化させるためのキットであって、以下の因子：サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、の１つ以上を含む、キット。
【請求項５７】
肝芽前駆細胞を自己再生状態に維持するためのキットであって、以下の因子：ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、の１つ以上を含む、キット。
【請求項５８】
以下の因子：ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；１つ以上の上皮増殖因子；ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；及び／又はＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、の１つ以上をさらに含む、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
肝細胞又は肝細胞様細胞を静脈周囲状態に維持するためのキットであって、以下の因子：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、の１つ以上を含む、キット。
【請求項６０】
以下の因子：ＴＧＦｂの１つ以上の阻害剤；及び／又はエストロゲンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、の１つ以上をさらに含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
肝細胞又は肝細胞様細胞を門脈周囲状態に維持するためのキットであって、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含む、キット。
【請求項６２】
ＥＧＦＲ又はＣＤ９９から選択される、ＬＢ細胞を単離又は選択するための表面マーカー。
【請求項６３】
ＣＤ３２５（Ｎ−カドヘリン）を含む、ＭＨＧ細胞を単離又は選択するための表面マーカー。
【請求項６４】
細胞応答をスクリーニングする方法であって、前記方法が：ａ）請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法で作製された細胞集団を、薬剤と接触させること；ｂ）前記薬剤によって誘導された細胞応答について、前記細胞集団を評価すること、を含む、方法。
【請求項６５】
前記スクリーニングがインビトロスクリーニングであり、前記接触させることがインビトロで実施される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記スクリーニングがインビボスクリーニングであり、前記接触させることが、前記細胞集団を含む宿主動物に前記薬剤を投与することによって実施される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
表現型をスクリーニングする方法であって、前記方法が：ａ）請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法で作製された細胞集団を宿主動物に投与することであって、ここで、前記細胞集団の前記細胞が、少なくとも１つの遺伝子座において遺伝子改変を有する；ｂ）前記投与された細胞集団によって誘導された検出可能な表現型について、前記宿主動物を評価すること、を含む方法。
【請求項６８】
前記少なくとも１つの遺伝子座における遺伝子改変が、少なくとも１つの遺伝子の破壊又は欠失をもたらす、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞集団が肝細胞を含み、前記検出可能な表現型が生存の増強を含む、請求項６７〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
症状に対して被験体を治療する方法であって、前記方法が：ａ）症状に対して被験体を治療するために、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法により作製された、治療有効量の細胞を、前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項７１】
前記細胞が、少なくとも１つの生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）又は生着促進（ｐｒｏ−ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）因子と同時投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞が、少なくとも１つの遺伝子座に遺伝子改変を含む、請求項７０〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月８日に出願されたシンガポール出願第１０２０１４０６４３６Ｕ号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は、全ての目的のために、その全体において参照されることによって、本明細書中に援用される。
発明の分野
【０００２】
本発明は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、胚体内胚葉の細胞を複数の細胞系譜に分化させるための方法に関する。本発明はさらに、本明細書に記載の方法を実施する際に使用するためのキット及び培地に関する。
【背景技術】
【０００３】
末期の肝不全は、出血、脳疾患及び最終的には死を含む重篤な臨床症状をもたらす。特に、肝臓は主に肝細胞を含み、これは生体にとって不可欠な多様な機能を実施する。これらの機能には、血流中の有害な毒性副生成物、例えばチロシン代謝産物及びアンモニアの排除及びアルブミン及び凝固因子を含む血清タンパク質の分泌が含まれる。
【０００４】
肝臓の発生及び形態形成は複雑なプロセスである。初期胚発生中、多能性胚盤葉細胞は〜Ｅ６．５で前原始線条を形成し、その後、〜Ｅ７．５で内胚葉胚層として知られているシートを生じる。Ｅ８．５において、内胚葉は、胚の前後軸に沿って伸長し、腸管を形成し、最終的に呼吸器及び消化管全体に沿って器官を生じる。腸管形成中、空間的に異なる側方及び中間の内胚葉前駆細胞は、マウス胚における運命マッピング研究によって示されるように、正中線に収束して後側前腸（ＰＦＧ）及びその後の肝芽（ＬＢ）を形成する。
【０００５】
肝臓の早期発生について実施された研究はあるが、肝臓の特定化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、肝細胞の形成及び肝臓機能の成熟を含むプロセスの理解は限定されたままである。例えば、肝臓幹細胞及びそれらの成熟子孫の形成を誘導する機構は依然として不明である。
【０００６】
さらに、肝細胞にインビボで生着、増殖、分化能を付与する因子は十分に検討されておらず、成人様肝細胞を得ることの困難さは依然として広く経験されている。
【０００７】
多能性幹細胞はいくつかの肝機能を有する肝細胞を産生することができるが、これらの肝細胞が成熟様の状態に進行するために明らかに支持されていない障壁が残っている。さらに、これらの多能性幹細胞から成体肝臓に移植され、頑強に再増殖することができる「本物の」移植可能な肝細胞様細胞を生成することは困難なままである。
【０００８】
これらの課題に鑑みて、胚葉の誘導及びパターン化及び種々の細胞系譜への分化の複数の段階にあるシグナル伝達論理を理解することが重要である。特に、肝臓の特定化を制御するシグナル伝達因子を理解し、ヒト多能性幹細胞に基づく分化を用いて肝臓形成のためのシグナル伝達パラダイムを体系立てる（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）ことが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、幹細胞誘導の基礎となるシグナル伝達論理及び最小限の外来系譜を有する肝細胞を産生するために幹細胞を一方向に駆動するための分化を解明することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
一態様によれば、胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の細胞を後側前腸（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｇｕｔ）（ＰＦＧ）系譜に分化させる方法であって、前記幹細胞を、１つ以上のレチノイン酸活性化剤；及びＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させること、を含む方法が提供される。
【００１１】
別の態様によれば、後側前腸系譜の細胞を肝芽（ＬＢ）前駆細胞に分化させる方法であって、前記後側前腸系譜の細胞を、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータ；及びサイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させること、含む方法が提供される。
【００１２】
別の態様によれば、肝芽前駆細胞（ｌｉｖｅｒ  ｂｕｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を肝前駆細胞（ｈｅｐａｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）に分化させる方法であって、前記肝芽前駆細胞を、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることを含む、方法が提供される。
【００１３】
別の態様によれば、肝前駆細胞を静脈周囲肝細胞（ｐｅｒｉｖｅｏｕｓ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）に分化させる方法であって、前記肝前駆細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤、及びＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と、接触させることを含む方法が提供される。
【００１４】
別の態様によれば、肝臓前駆細胞を、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、と接触させることを含む、肝前駆細胞を肝細胞様細胞に分化させる方法が提供される。
【００１５】
別の態様によれば、肝芽前駆細胞を、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、及びＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含む、肝芽前駆細胞を自己再生状態に維持する方法が提供される。
【００１６】
別の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と、接触させることを含む、肝細胞又は肝細胞様細胞を静脈周囲の状態（ｐｅｒｉｖｅｎｏｕｓ  ｓｔａｔｅ）に維持する方法が提供される。
【００１７】
別の態様によれば、前記細胞を、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含む、肝細胞を門脈周囲の状態（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ  ｓｔａｔｅ）に維持する方法が提供される。
【００１８】
別の態様によれば、１つ以上のレチノイン酸活性化剤、及びＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤を含む、胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の細胞を、後側前腸系譜に分化するためのキットが提供される。
【００１９】
別の態様によれば、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータ；及び／又はサイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含む、後側前腸系譜の細胞を肝芽前駆細胞に分化させるためのキットが提供される。
【００２０】
別の態様によれば、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；及び／又はＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤を含む、肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化するためのキットが提供される。
【００２１】
別の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；アスコルビン酸シグナル伝達の活性化剤；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はインスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含む、肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化させるためのキットが提供される。
【００２２】
別の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含む、肝前駆細胞を静脈周囲肝細胞様細胞に分化させるためのキットを提供する。
【００２３】
別の態様によれば、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、を含む、肝前駆細胞を肝細胞又は肝細胞様細胞に分化させるためキットが提供される。
【００２４】
別の態様によれば、肝芽前駆細胞を自己再生状態に維持するためのキットが提供されるものであり、以下の因子の１つ以上を含む：ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤。
【００２５】
別の態様によれば、肝細胞又は肝細胞様細胞を静脈周囲の状態に維持するためのキットが提供されるものであり、以下の因子の１つ以上を含む：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤。
【００２６】
別の態様によれば、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含む、肝細胞又は肝細胞様細胞を静脈周囲の状態に維持するためのキットが提供される。
【００２７】
別の態様によれば、ＥＧＦＲ又はＣＤ９９から選択されるＬＢ細胞を単離又は選択するための表面マーカーが提供される。
【００２８】
別の態様によれば、ＣＤ３２５（Ｎ−カドヘリン）を含むＭＨＧ細胞を単離又は選択するための表面マーカーが提供される。
【００２９】
別の態様によれば、細胞応答をスクリーニングする方法が提供され、前記方法は：ａ）本明細書に記載の方法に従って作製された細胞集団を薬剤（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）と接触させること；ｂ）前記薬剤によって誘導された細胞応答について、前記細胞集団を評価すること、を含む。
【００３０】
別の態様によれば、表現型をスクリーニングする方法が提供され、前記方法は：ａ）本明細書に記載の方法に従って作製された細胞集団を宿主動物に投与することであって、ここで、前記細胞の集団の前記細胞が、少なくとも１つの遺伝子座に遺伝子改変を含み；ｂ）前記投与された細胞集団によって誘導された検出可能な表現型について宿主動物を評価すること、を含む。
【００３１】
別の態様によれば、症状に対して被験体を治療する方法であって、前記方法は：ａ）前記症状に対して、前記被験体を治療するために、本明細書に記載の方法に従って作製された治療有効量の細胞を被験体に投与すること、を含む。
【００３２】
別の態様によれば、被験体の症状を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の方法に従って作製された治療有効量の細胞の使用が提供される。
本発明の詳細な説明
定義
【００３３】
本明細書で使用される以下の用語及び用語は、以下に示された意味を有するものとする：
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「幹細胞」という用語には、限定されないが、単一細胞レベルにおいて、自己再生し、かつ、分化して子孫細胞を産生する能力によって定義される未分化細胞であり、自己再生前駆細胞（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、非再生前駆細胞（ｎｏｎ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、及び最終分化細胞を含む。例えば、「幹細胞」は、（１）全能性幹細胞；（２）多能性幹細胞；（３）多分化能性幹細胞；（４）オリゴ能性幹細胞（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）；及び（５）単能性幹細胞を含んでもよい。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）は、異なる条件下で、３つ全ての生殖細胞層、すなわち内胚葉（例えば、腸組織）、中胚葉（血液、筋肉、及び血管を含む）、及び外胚葉（例えば、皮膚及び神経）で特徴付けられる細胞系へと分化する、発生能力を有する細胞をいう。３つの胚葉すべてに分化する細胞の発生能力は、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを用いて決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して作製された細胞又は細胞集団の多能性の好ましい試験は、三胚葉層それぞれの細胞へ分化する発生能力を有することの証明であるが、多能性は、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても、証明され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「誘導性多能性幹細胞」又はｉＰＳＣという用語は、幹細胞が、誘導された又は変化した、すなわち、３つ全ての胚葉又は真皮層：中胚葉、内胚葉及び外胚葉の組織に分化能力のある細胞へリプログラミングされた、分化成体細胞から産生された幹細胞を意味する。産生されたｉＰＳＣは、天然で見出される細胞を指すものではない。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚性胚盤胞の内部細胞塊の、天然に生じる多能性幹細胞を指す。このような細胞は、体細胞核移植由来の胚盤胞の内部細胞塊からも同様に得ることができる。胚性幹細胞は多能性であり、発生中に３つの主要胚葉：外胚葉、内胚葉及び中胚葉のすべての誘導体を生じる。言い換えれば、特定の細胞型に対して十分かつ必要な刺激が与えられた場合、成人の２００種類以上の細胞型のそれぞれへと発生することができる。それらは胚外膜又は胎盤には寄与せず、すなわち全能性ではない。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「分化」とは、非特殊化されていない（「コミットされていない」）又は低特殊化細胞（ｌｅｓｓ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）が、例えば、神経細胞又は筋肉細胞などの特殊化した細胞のような特徴を獲得するプロセスである。分化した又は分化誘導した細胞は、細胞の系譜内で、より特殊化した（「コミットされた」）位置を帯びた細胞である。分化の過程に適用される場合、「コミットされた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」という用語は、正常な状況下で、特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続ける点まで分化経路を進み、通常の状況下では、異なる細胞型に分化したり、分化が低い細胞型に戻ったりすることはできない細胞を指す。脱分化とは、細胞が細胞の系譜内で特殊化が低い（又はコミットされた）位置に戻るプロセスをいう。本明細書中で使用される場合、細胞の系譜は、細胞の遺伝、すなわち、それが由来する細胞及びそれが生じ得る細胞を定義する。細胞の系譜は、細胞を発生及び分化の遺伝的スキーム内に置く。系譜特異的マーカーは、目的の系譜の細胞の表現型に特異的に関連する特性を指し、目的の系譜へのコミットされていない細胞の分化を評価するために使用することができる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「未分化細胞」は、「自己再生」の特性を有し、発生能（すなわち、全能性、多能性、多分化能など）に関する特定の暗示された意味を持たずに、複数の細胞型に分化する発生能を有する未分化状態の細胞を指す。本明細書で使用するように、「自己再生」又は「自己再生状態」という用語は、細胞が娘細胞型を形成する潜在能力及び能力を保持するように、細胞を終始一貫して複製し続ける安定な細胞状態を指す。幹細胞の文脈において「能力」という用語は、１つの細胞がその娘細胞型に分化する能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）又は潜在能力（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を指す。例えば、後側前腸は、それが膵臓内胚葉及びＬＢ細胞のような娘細胞型を生じさせる場合、有能である。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」、「維持する（ｍａｉｎｔａｉｎ）」などは、細胞の増殖の有無にかかわらず、時間にわたって、前駆細胞の側面又は性質（遺伝子発現を含むがこれに限定されない）を保存することを指す。本明細書で使用される場合、用語「維持」、「維持する」などはまた、前駆体の次の発生段階への進行が失速、減速又は減少することを示す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「肝臓（ｌｉｖｅｒ）」、「肝（ｈｅｐａｔｉｃ）」などは、当業者によって認識されるその従来の意味を指し、それによって、肝臓は、門脈周囲又は静脈周囲の領域のいずれかにある、２つの領域の１つの肝細胞をそれぞれ含む、肝小葉のより小さな単位を含む。門脈周囲肝細胞（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）は、肝小葉の門脈付近に位置する肝細胞であり、それによって、門脈周囲肝細胞によって発現される関連遺伝子は、限定されないが、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ）、アルギニン１（ＡＲＧ１）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ１）を含む。対照的に、静脈周囲肝細胞（ｐｅｒｉｖｅｎｏｕｓ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）は、肝小葉の中心静脈の近くに位置する肝細胞であり、それによって、周囲の肝細胞によって発現される関連遺伝子は、限定されないが、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）及びグルタミン酸トランスポーター（ＧＬＴ１）を含んでもよく、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）、Ｔ−ｂｏｘ３（ＴＢＸ３）及びチトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ（ＣＹＰ３Ａ４）の発現を含んでもよい。さらに、静脈周囲肝細胞は、Ｗｎｔ調節に応答し、かつ非損傷条件下で自己複製する成人ヒト肝幹細胞などの異種サブタイプを含んでもよい。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）」、「肝細胞様細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ）」、「肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）」などの用語は、肝臓遺伝子及びタンパク質の発現などの肝臓様の性質を示すヒトＰＳＣから分化した細胞、及び／又は、肝臓の遺伝子／タンパク質発現及び肝機能を有するヒト肝臓由来の又は単離された肝細胞である。肝臓で発現される多くの遺伝子には、キャリアタンパク質アルブミン（ＡＬＢ）、血液凝固因子フィブリノーゲンα鎖（ＦＢＡ）、フィブリノーゲンβ鎖（ＦＢＢ）、フィブリノーゲンγ鎖（ＦＢＧ）、トロンビンゲン、アルファ１抗トリプシン（ＡＡＴ）、トリプシン代謝遺伝子［フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ（ＦＡＨ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、ホモゲンチセート１，２−ジオキシゲナーゼ（ＨＧＤ）、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＤ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、マレイルアセトアセテートイソメラーゼ（ＭＡＩ）］、及び尿素代謝遺伝子（ＡＲＧ１）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイルホスフェートシンターゼ１（ＣＰＳ１）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を含むが、これらに限定されない。用語「肝細胞又は肝細胞様細胞」は、これらに限定されないが、幹細胞、前駆細胞、分化した静脈周囲肝細胞及び門脈周囲肝細胞を含む、異なる肝細胞サブタイプを含む。さらに、「肝細胞様細胞」という用語は、これに限定されないが、自己複製能、増殖能及び分化能を含む、肝臓又は肝臓幹細胞又は前駆体の性質を有する可能性のある細胞を意味する。肝細胞様細胞は、成熟していても機能していなくてもよいが、肝臓に移植することができる。さらに、「成熟肝細胞」という用語は、ＡＡＴ、ＡＬＢ、ＦＡＨ、ＴＡＴ、ＡＲＧ１、ＯＴＣ、ＣＹＰ３Ａ４、ＧＳ、ＧＬＴ１、ＰＡＨ、ＨＰＤ、ＨＧＤ、ＯＴＣ、ＦＢＢ、ＦＢＡ、ＦＢＧなどの高レベルの機能性肝臓遺伝子を発現する肝細胞を指す。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「成熟した（ｍａｔｕｒｅ）」、「成熟（ｍａｔｕｒｉｔｙ）」などは、分化及び発生の過程における細胞の最終発生段階を記載する。これに関して、細胞の文脈における「より成熟した」という用語は、「より成熟していない」細胞よりも進歩した少なくとも１つの発生段階である細胞を指す。さらに、成人の細胞（単数又は複数）は、最高レベルの成熟度を有することが理解されよう。「成熟細胞に分化する」という句は、系譜特定化中に分化した細胞において、より高い成熟度を達成することを示し、「成熟」遺伝子の発現は、機能的な細胞の機能及び表現型にとって重要な遺伝子の発現を指す。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「前駆細胞」は、より良い発生能を有する細胞、すなわち、それが分化によって生じ得る細胞と比較して、より原始的（例えば、発生経路又は進行に沿ってより早期段階にある）細胞表現型を指す。しばしば、前駆細胞は有意な又は非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、発生経路及び細胞が発生し分化する環境に依存して、より低い発生能を有する複数の異なる細胞、すなわち、分化細胞型、又は単一の分化細胞型を生じさせることができる。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「マーカー」は、目的の細胞において差動的に発現される核酸分子又はポリペプチド分子を指す。この文脈において、差次的発現とは、陽性マーカーのレベルの上昇、及び陰性マーカーのレベルの低下を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、目的の細胞が、当該分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて他の細胞から同定及び区別され得るように、他の細胞と比較して、目的の細胞において十分に高い又は低いことである。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「モジュレータ」は、定義されたシグナル伝達経路又はその標的の生物学的活性を増強又は阻害する任意の分子又は化合物をいう。阻害剤又は活性化剤は、限定されないが、シグナル伝達経路又は標的天然リガンドの一部である受容体、転写因子、シグナル伝達メディエータ／トランスデューサなどを標的とするペプチド、抗体、又は小分子を含んでもよく、これによりシグナル伝達経路の生物学的活性を調節する。これに関して、本明細書中で使用される場合、「阻害剤」又は「活性化剤」は、限定されるものではないが、シグナル伝達リガンド、受容体、トランスデューサ、シグナル伝達メディエータ及び転写因子を含む、定義されたシグナル伝達の１つ以上の成分の阻害又は活性化をいう。特に、「阻害剤」又は「活性化剤」は、シグナル伝達経路のリガンドタンパク質又はリガンドタンパク質以外のシグナル伝達経路の任意の成分（例えば、受容体、トランスデューサ、シグナル伝達メディエータ）のアンタゴニスト又はアゴニストを指してもよい。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「培養培地」、「分化培地」などの句は、幹細胞及び任意の細胞系譜の成長を支援するために使用される液体物質を指す。いくつかの実施形態にかかる、本発明によって使用される培養培地は、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えばサイトカイン、増殖因子及びホルモンなどのような物質の組み合わせを含んでもよい液体ベースの媒体、例えば水であり得る。
【００４８】
本明細書において、「フィーダー細胞」という用語は、幹細胞をフィーダー細胞上で共培養する場合、又は多能性幹細胞をフィーダー細胞によって作製された馴化培地の存在下で、マトリックス（例えば、細胞外マトリックス、合成マトリックス）上で培養する場合、幹細胞を増殖状態に維持するフィーダー細胞（例えば、線維芽細胞）を指す。フィーダー細胞の支持は、培養中のフィーダー細胞の構造（フィーダー細胞を組織培養プレート中で培養することによって形成される三次元マトリックス）、フィーダー細胞の機能（例えば、フィーダー細胞による増殖因子、栄養素及びホルモンの分泌、フィーダー細胞の増殖速度、老化前のフィーダー細胞の増殖能力）及び／又は幹細胞のフィーダー細胞層（単数又は複数）への付着に依存する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを一般に指すために使用される。その効果は、疾患又はその症状（単数又は複数）を完全又は部分的に予防するという点で予防的であり得、並びに／又は、疾患及び／若しくは疾患に起因する副作用の部分的又は完全な安定化の点で治療的であり得る。「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、以下を含む：（ａ）該疾患又は症状（単数又は複数）に罹りやすいが、まだそれを有すると診断されていない被験体において該疾患及び／又は症状（単数又は複数）が起こるのを予防すること；（ｂ）疾患及び／又は症状（単数又は複数）を阻害すること、すなわち、疾患及び／又は関連する症状の発症を停止させること；又は（ｃ）疾患及び関連する症状（単数又は複数）を緩和すること、すなわち、疾患及び／又は症状（単数又は複数）の退行を引き起こすこと。治療を必要とするものは、すでに罹患したもの（例えば、中胚葉性細胞型機能障害又は欠損を有するもの、例えば肝機能障害又は欠損を有するもの）、並びに予防が望まれるもの（例えば、肝細胞型機能障害又は欠損に対する感受性が増加したもの；中胚葉細胞型機能障害又は欠損を有することが疑われるもの；肝細胞型に対する１つ以上の危険因子を有するもの、など）が含まれ得る。
【００５０】
本明細書で使用される、「肝細胞様細胞」という用語は、門脈周囲肝細胞を含むが、これに限定されない。「肝細胞様細胞」は、静脈周囲肝細胞を含み得る。
【００５１】
本明細書で使用される「基礎培地」又は「基礎培地」などの用語は、炭素源、水、様々な塩、及びアミノ酸及び窒素の供給源を含む培地を指す。
【００５２】
本開示を通じて、特定の実施形態は、範囲の形式で開示され得る。範囲の形式の記述は、単に便宜上かつ簡潔さのためのものであり、開示された範囲（ｒｅｎｇｅ）の領域（ｓｃｏｐｅ）に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の説明は、その範囲内の、全ての可能なサブ範囲並びに個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など具体的に開示されるサブ範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば１、２、３、４、５及び６を有するものとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
図面の簡単な説明
【００５３】
本発明は、非限定的な実施例及び添付の図面と併せて考慮するとき、詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒト多能性幹細胞／ヒトＥＳＣを、前原始線条（ＡＰＳ）、胚体内胚葉（ＤＥ）、後側前腸（ＰＦＧ）、肝芽（ＬＢ）前駆細胞、肝前駆細胞（ＨＰ）、及び肝細胞様細胞（ＨＣ）に分化させるために用いることができるヒト多能性幹細胞及びシグナル伝達モジュレータからの肝臓分化のためのシグナル伝達戦略のタイムラインを示す。中／後腸（ＭＨＧ）、膵臓（ＰＡＮ）、胆のう（Ｂｉｌｉａｒｙ）（ＢＩＬ）及び静脈周囲肝細胞様細胞（ＰＶ）などの他の相互に排他的又は代替的な細胞運命は、特定のシグナル伝達モジュレータを用いて阻害又は抑制された。
【図１Ｂ】図１Ｂは、分化中の細胞の形態を示す。略語：ｉｎｈ−阻害剤、ｈｉ−高、ｌｏ−低、ｍｉｄ−中用量、ＴＧＦｂhi−高用量アクチビン／ノーダル、ＦＧＦ−ＦＧＦ活性化剤、ＷＮＴmid−Ｗｎｔ活性化剤の中程度用量、ＰＩ３Ｋinh−ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＢＭＰｉｎｈ−Ｂｍｐシグナル伝達阻害剤、ＲＡ−全トランスレチノイン酸、ＦＧＦｌｏ−低用量のＦＧＦ、ｃＡＭＰ−サイクリックＡＭＰ活性化剤、ＭＡＰＫｉｎｈ−ＭＡＰＫ阻害剤、ＴＧＦｂｉｎｈ−ＴＧＦｂ阻害剤、ＮＯＴＣＨｉｎｈ−Ｎｏｔｃｈシグナル伝達又はγ−セクレターゼ阻害剤、ＯＳＭ−オンコスタチンＭ、ＩＮＳ−インスリン、ＡＡ２Ｐ−Ｌ−アスコルビン酸２リン酸。
【図２Ａ】図２Ａは、分化の２日後のＳｏｘ１７−ｍＣｈｅｒｒｙ発現ＤＥの高いパーセンテージを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＬＢ細胞を生成するために後側前腸の発生能力を試験するために使用される戦略を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＡＦＰ、ＣＥＢＰＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１Ｂ、ＰＲＯＸ１、ＴＢＸ３及びＨＮＦ４Ａなどの肝芽マーカー遺伝子発現に基づくＬＢ細胞への後期下流分化における、前腸の特定化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の間の３日目における、全トランスレチノイン酸；ＩＩ．ｃＡＭＰ；ＩＩＩ．ＴＧＦβ；ＩＶ．ＦＧＦ及びＶ．Ｗｎｔを調節する効果を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、レチノイン酸及びＷｎｔシグナル伝達によるＡＰパターン化の概略図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＰＦＧ細胞を、Ｉ．ＲＡモジュレータ、ＩＩ．ｃＡＭＰ／ＰＫＡモジュレータ、ＩＩＩ．ＴＧＦβモジュレータ及びＩＶ．ＦＧＦモジュレータ、及び、Ｖ．ＢＭＰモジュレータにて処理する効果の遺伝子発現分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｈＥＳＣ由来ＬＢ細胞におけるＨＮＦ４Ａ、ＴＢＸ３、ＡＦＰ、ＣＥＢＰＡのタンパク質発現を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＬＢ、膵臓及び腸の初期前駆細胞などの各臓器ドメインにおける遺伝子発現境界の画定を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＬＢ特定化（４〜６日目）中のアクチビン処理が、１３日目にＡＬＢの発現を後に増強することを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、インビトロでの肝臓成熟を制御するシグナルの効果を示す。ＬＢ細胞を、遺伝子発現上、シグナルを調節するＩ．サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡ；ＩＩ．Ｎｏｔｃｈ；ＩＩＩ．インシュリン；ＩＶ．アスコルビン酸；Ｖ．ＦＧＦ／ＭＡＰＫ及びＶＩ．ＴＧＦβで処理し、肝前駆細胞（分化後１２日）及び肝細胞様細胞（分化後１６日）の形成を誘導した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、肝臓分化の７〜１８日の間に基礎培地にＫＯＳＲを含めると、ｈＥＳＣに比べてｈＰＳＣ由来の肝細胞様細胞（ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色によって検出される）に脂質小球が形成されることを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、それぞれＢＭＰ４（Ｂ）及びＢＭＰ阻害剤ＢＭ３１８９の添加によるＡＬＢ発現の増加及び減少を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ｈＰＳＣ由来胚体内胚葉（ＤＥ）、ｈＰＳＣ由来肝芽細胞（ＬＢ）及びｈＰＳＣ由来中／後腸（ＭＨＧ）細胞上で行われた表面マーカースクリーニングの概略図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｈＰＳＣ由来ＬＢ細胞上のＣＤ９９発現のユニークな発現のフローサイトメトリーヒストグラムを示すが、ＤＥ又はｈＰＳＣでは発現しない。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＥＧＦＲがユニークにｈＰＳＣ由来のＬＢを標識するが、ｈＰＳＣ由来のＭＨＧを標識しないことを示す。逆に、ＣＤ３２５は、ｈＰＳＣ由来のＭＨＧを標識するが、ＬＢは標識しない。
【図６Ａ】図６Ａは、無細胞ＦＲＧ−／−コントロール、成体ヒト肝細胞又はｈＥＳＣ由来肝細胞（Ｄ１８  ｈＰＳＣ由来肝臓）を移植したＦＲＧ−／−マウス肝臓から得た肝臓切片上のヒトアルブミンの発現を示す。Ｉ．マウス肝臓の生着及び個体群を示す。ＩＩ．門脈及び中心静脈のような血管近傍のｈＰＳＣ由来肝細胞の空間的局在を示す。ＩＩＩ．未移植（無細胞コントロール）又は成人ヒト肝細胞若しくはｈＰＳＣ由来肝臓のいずれかで移植されたマウス由来のＦＲＧ−／−マウス血清中に検出されたヒトアルブミンのグラフを示す。ＩＶ．非移植（無細胞コントロール）ＦＲＧ−／−マウスと比較した、移植された肝臓細胞からの血清中のビリルビンレベルの低下を表すグラフを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｈＰＳＣ由来肝臓（分化後１８日）を移植したマウスにおける生存の増強を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、インビボでの既知の肝臓発生タイミング及び遺伝子発現の変化の概要を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、胚体内胚葉から肝細胞を誘導するために使用され得るシグナルの要約を示す。ＣＨＩＲ及びＦＧＦは、ＬＢ前駆細胞の増殖及び自己再生を促進することが示されていることに留意されたい。
【図７Ｃ】図７Ｃは、肝臓特定化（ＡＬＢ＋細胞）若しくは胆のう細胞（ＳＯＸ９＋  ＨＮＦ６＋  ＨＮＦ１Ｂ＋）を促進するシグナル又は増殖を促進するシグナルを示す。矢頭のある線は陽性効果を表し、矢頭のない線は抑制効果を表す。略語：ｉｎｈ−阻害剤、ｈｉ−高、ｌｏ−低、ｍｉｄ−中用量、ＴＧＦｂhi−高用量アクチビン／ノーダル、ＦＧＦ−ＦＧＦ活性化剤、ＷＮＴmid−Ｗｎｔ活性化剤の中程度用量、ＰＩ３Ｋinh−ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＢＭＰｉｎｈ−Ｂｍｐシグナル伝達阻害剤、ＲＡ−全トランスレチノイン酸、ＦＧＦｌｏ−低用量のＦＧＦ、ｃＡＭＰ−サイクリックＡＭＰ活性化剤、ＭＡＰＫｉｎｈ−ＭＡＰＫ阻害剤、ＴＧＦｂｉｎｈ−ＴＧＦｂ阻害剤、ＮＯＴＣＨｉｎｈ−Ｎｏｔｃｈシグナル伝達又はγ−セクレターゼ阻害剤、ＯＳＭ−オンコスタチンＭ、ＩＮＳ−インスリン、ＡＡ２Ｐ−Ｌ−アスコルビン酸２リン酸、ＳＨＨ−ソニックヘッジホッグ活性化剤、ＥＧＦ−上皮増殖因子。
【図８】図８は、後のＬＢ分化に対して前腸の能力を調節する、Ｉ．Ｗｎｔ及びＩＩ．ＴＧＦｂ調節のシグナルを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、４〜６日間に、前腸から早期膵臓内胚葉の特定化を調節するシグナルを示す。Ｉ−ＴＧＦｂ／アクチビンＡ、ＩＩ−ＢＭＰ−Ｂｍｐシグナル伝達調節、及びＩＩＩ  ＦＧＦ−ＦＧＦシグナル伝達調節。略語：ＳＢ５０５−ＴＧＦｂ阻害剤、ＳＢ５０５１２４、ＡＣＴ１０−アクチビン（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＡＣＴ２０−アクチビン（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄ−Ｂｍｐシグナル伝達ＤＭ３１８９、Ｂ３，Ｂ１０，Ｂ２５−それぞれ３ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌの用量でのＢＭＰ４、Ｆ１０，Ｆ２０−それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ及び２５ｎｇ／ｍｌの用量でのＦＧＦ２、ＰＤ−ＰＤ０３２５９０１、ＡＣＤＲＳ−アクチビン、Ｃ５９、ＤＭ３１８９、ＲＡ、ＳＡＮＴ１の組み合わせ、ＡＣＰＲＳ−アクチビン、Ｃ５９、ＰＤ０３２５９０１、ＲＡ、ＳＡＮＴ１の組み合わせ、ＢＲ−ＢＭＰ４とＲＡの組み合わせ。
【図９Ｂ】図９Ｂは、免疫染色によるｈＰＳＣ由来膵内胚葉中のＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２のタンパク質発現を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃ  Ｉ．は、ＬＢ遺伝子発現に対するＴＧＦｂ調節の効果を示す。略語：ＳＢ５０５−ＴＧＦｂ阻害剤ＳＢ５０５１２４、Ｂ−Ｂｍｐ４、Ａ１０，Ａ２０，Ａ４０−それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ／ｍｌの用量でのアクチビンＡ；ＩＩ．は、Ｗｎｔシグナル伝達活性化が特定の肝芽遺伝子の発現を増加させることを示す。略語：ＤＫＫ１−Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１、ＸＡＶ−ＸＡＶ９３９、Ａ８３−Ａ８３−０１、Ｗ１５０−用量１５０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ３Ａ、ＣＨＩＲ３−用量３μＭのＣＨＩＲ９９２０１。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＬＢ誘導中の４〜６日目のＣＨＩＲ９９２０１の早期処理後の肝細胞様細胞の形態の相違を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅは、早期Ｗｎｔ阻害が、後に肝細胞様細胞における肝臓発現を促進することを示す。略語：ＸＡＶ−ＸＡＶ９３９、ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９２０１、ＣＨＩＲ１，２，３−ＣＨＩＲ９９２０１（それぞれ１μＭ、２μＭ、３μＭ）。
【図１０Ａ】図１０Ａは、肝臓遺伝子発現における「ＢＣＤＥＦＶ」と呼ばれるシグナル伝達カクテルから個々のシグナル伝達調節モジュレータを差し引く効果を示す。ＢはＢＭＰ４を、ＶはＶＥＧＦを、ＥはＥＧＦを、ＦはＦＧＦ２を、ＣはＣＨＩＲを、Ｄは肝前駆細胞の特定化（例えばＡＦＰ、ＡＬＢ、ＴＢＸ３）及び胆のうの特定化（ＳＯＸ９）に関連する遺伝子発現マーカー上のＤＡＰＴをそれぞれ表す、Ｂ、Ｖ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｄと略記されたシグナル伝達因子の異なる組み合わせの効果を示す。「ＢＣＤＥＦＶ」からのＣＨＩＲ又はＦＧＦ２の除去は、ＡＬＢ発現の有意な増加を示す。これは、ＣＨＩＲ及びＦＧＦ２がＡＬＢ発現を阻害することを示す。略語：Ｄ１０−分化の１０日目。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、インビトロでの肝臓成熟を制御するシグナルを示す。例えば、棒グラフは、デキサメタゾンがＡＬＢ発現を増加させることを示す。略語：ＡＡ−アミノ酸、３ｘ−ＩＭＤＭ／Ｆ１２中のアミノ酸の量よりも３倍高い濃度、１０ｘ−ＩＭＤＭ／Ｆ１２中のアミノ酸の量よりも１０倍高い濃度、ＩＮＳ−インシュリン、Ｂａｓｅ−ベース培地、ＣＣ−塩化コリン、ＤＥＸ−デキサメタゾン、ＤＤ−ＤＡＰＴ及びデキサメタゾン、ＰＤ１７３−ＰＤ１７３０７４、６日目の収穫−ｈＰＳＣ由来のＬＢコントロール。
【図１１Ａ】図１１は、Ａ．ｈＥＳＣ、Ｂ．ｈＥＳＣｓ由来胚体内胚葉、又はＣ．ｈＥＳＣ由来ＬＢで発現する細胞表面マーカーのリストを示す。黒く塗りつぶされたブロックは高い発現率（〜１００％）を示し、明瞭なブロックは低い発現率（〜０）を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、Ａ．ｈＥＳＣ、Ｂ．ｈＥＳＣｓ由来胚体内胚葉、又はＣ．ｈＥＳＣ由来ＬＢで発現する細胞表面マーカーのリストを示す。黒く塗りつぶされたブロックは高い発現率（〜１００％）を示し、明瞭なブロックは低い発現率（〜０）を示す。
【図１１Ｃ】図１１は、Ａ．ｈＥＳＣ、Ｂ．ｈＥＳＣｓ由来胚体内胚葉、又はＣ．ｈＥＳＣ由来ＬＢで発現する細胞表面マーカーのリストを示す。黒く塗りつぶされたブロックは高い発現率（〜１００％）を示し、明瞭なブロックは低い発現率（〜０）を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ＬＢ上ではＣＤ９９発現するが、ｈＥＳＣ／ｈＩＰＳＣ又はｈＥＳＣ／ｈＩＰＳＣ由来ＤＥでは発現がないことを示す。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ｈＥＳＣ、ｈＥＳＣ由来のＤＥ細胞又はｈＥＳＣ由来のＬＢ細胞上の細胞型特異的表面マーカー発現を要約したベン図を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、肝小葉におけるその局在に依存する、帯状の異種性肝細胞の概略図を示す。門脈周囲肝細胞は門脈の近くに位置し、一方で静脈周囲肝細胞は中心静脈の近くに位置する。これらの２つの肝細胞サブタイプは、異なる遺伝子を発現する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ヒト肝臓におけるＦＡＨの発現を示す。ＦＡＨ発現は、両方の肝細胞集団に存在するようである。
【図１３Ａ】図１３は、門脈周囲対静脈周囲遺伝子発現に対するＡ．ＰＫＡアゴニスト、Ｂ．シス−ＲＡ及びＣ．Ｗｎｔ阻害の効果を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、門脈周囲対静脈周囲遺伝子発現に対するＡ．ＰＫＡアゴニスト、Ｂ．シス−ＲＡ及びＣ．Ｗｎｔ阻害の効果を示す。
【図１３Ｃ】図１３は、門脈周囲対静脈周囲遺伝子発現に対するＡ．ＰＫＡアゴニスト、Ｂ．シス−ＲＡ及びＣ．Ｗｎｔ阻害の効果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、インビトロでの肝細胞代謝退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）の特徴付け、それにより、成人ヒト肝細胞をインビトロで増殖され、それらが退行を逆転できるかどうかを決定するためにシグナルモジュレータが添加されることの模式図を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、インビトロ培養中の肝細胞の肝遺伝子発現（ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ３Ａ４、ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＡＲＧ１、ＰＣＫ１、ＨＮＦ４Ａ、ＣＥＢＰＡ）の有意な減少を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、インビトロでの肝臓成熟の退行を減少させるシグナルの要約を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、シトクロム酵素（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１）並びに先端及び基底トランスポータ（ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＳＬＣＯ１Ａ２）の遺伝子発現分析に関する、調節するｉ．Ｎｏｔｃｈ；ｉｉ．ＴＧＦβ；ｉｉｉ．Ｗｎｔ／ＧＳＫ３Ｂ；ｉｖ．エストロゲン及びｖ．ｃＡＭＰの効果を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＣＹＰ１，２，３ファミリー、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＡＡＴ、ＰＸ、ＰＸＲ、ＡＡＴ、ＰＥＰＣＫ１、ＳＤＨ、ＡＬＢ、ＦＢＰ１、ＦＢＡ、ＦＢＢ、ＦＢＧ、Ｇ６ＰＣなどの肝臓遺伝子発現に対し、８−ブロモＣＡＭＰ、ｓｐ−ＣＡＭＰ、ｒｐ−ＣＡＭＰを用いたサイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の調節効果を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、どの成分が肝臓遺伝子発現に影響するかを決定するために、シグナル伝達因子のカクテルから個々の成分を除去することによる、減算スクリーニングを示す。ＣＨＩＲ９９２０１（ＣＨＩＲ）を除去すると、ＡＲＧ１、ＳＥＲＤＨ、ＣＰＳ１のような門脈周囲遺伝子発現が増加し、ＧＬＴ及びＧＳが減少する一方、８−ブロモＣＡＭＰの除去はシトクロム遺伝子の発現の増加をもたらす。
【図１６Ａ】図１６Ａは、０、２、３、５、７日の時間経過（ｄ０、ｄ２、ｄ３、ｄ５、ｄ７と略記）にわたって培養された成人ヒト初代肝細胞の肝臓遺伝子に対する、市販培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、肝細胞を増殖させるＣＭ４０００ベース培地又はＸｅｎｏＴｅｃｈ  Ｋ２３００のいずれか）及び本明細書に開示される培地（ＴＧＦＢシグナル伝達阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤、ＰＫＡ阻害剤及びｗｎｔ活性化剤を含む）の比較を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂの下部パネルは、解凍後５時間及び市販培地（Ｋ２３００）又は本明細書に開示されたｍＨｅｐ培地を用いたインビトロ培養の７日後の、免疫染色によるＣＹＰ３Ａ４のタンパク質発現を示す。
【図１７Ａ】図１７は、遺伝子発現分析を用いて、Ｚｈａｏら、２０１２又はＳｉ−Ｔａｙｅｂら、２０１０又は本明細書に開示された方法に記載の組成物を用いて、６日間の分化後のＤＥ細胞に対する前腸及び肝臓誘導培地の効果を示す。Ｚｈａｏら、２０１２又はＳｉ−Ｔａｙｅｂら、２０１０の方法は、典型的にはより長い期間を必要とし、従って、本明細書中に開示される方法を６日間にわたって用いて誘導される細胞において、ＬＢ遺伝子の発現はより高い。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、１３日〜１６日の間の、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ添加が、肝細胞様細胞におけるＡＬＢの発現を増加させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
実施形態の説明
本発明が記載される前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、そのように変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲にのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００５６】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本開示の精神及び範囲内に改変及び変形が包含されることが理解されるため、本発明の実施又は試験に使用することができる。本開示及び実施形態は、前腸及び肝芽の特定化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、肝臓対胆のう運命への系譜分離、及び最終的に肝臓成熟を含む、肝臓発生の異なる段階を調節する様々なシグナル伝達経路の同定に関する。特に、本開示及び発明は、肝芽前駆細胞への内胚葉の前後及び背側（ｄｏｒｓｏ）のパターニングを制御する発生シグナルを調査し、続いて肝芽前駆細胞をより分化した肝臓運命に至らせる因子を同定するために、胚体内胚葉（ＤＥ）集団を利用し、移植可能な肝臓前駆細胞を作製することを究極の目的とする。
【００５７】
このように、本開示は、その特異化及び機能達成を含む、肝臓発生を支配するシグナル伝達機構のさらなる理解に基づく。有利なことに、本開示は、肝臓分化の異なる段階のためのシグナル制御の知識を提供し、幹細胞からの移植可能な肝前駆細胞の生成を最大にし、従って治療用途に潜在的に有用であり得る肝細胞の生成を可能にする。
【００５８】
このように、本開示及び実施形態は、多能性幹細胞を生着可能な肝細胞に分化させるための方法及び細胞培養培地を提供する。特に、本開示は、胚体内胚葉（ＤＥ）由来の細胞を、表１に概説される一連の中間分化工程を介して肝細胞様細胞に分化させる方法を提供する。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
本開示の文脈において、胚体内胚葉の細胞は、これに限定されないが、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む多能性幹細胞に由来してもよく、それは、ヒト胚発生源に由来してもしていなくてもよい。そのようなものとして、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）であり得る。
【００６１】
例えば、本発明における使用に適した多能性幹細胞としては、限定されないが、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、ヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ、スウェーデン）、Ｈｅｓ３（ＮＩＨコード：ＥＳ０３）、ＭｅＬ１（ＮＩＨコード：０１３９）、又は、少なくとも多能性細胞に特徴的な以下のマーカーの少なくとも１つを発現する幹細胞：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−Ｉ、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａｌ−６０、Ｔｒａｌ−８１、を含んでもよい。
【００６２】
同様に、多能性幹細胞は、非胚発生源に由来する誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよく、制限なく増殖可能であり、３つの胚葉層のそれぞれに分化することができる。例えば、ｉＰＳ細胞系は、ＢＪＣ１及びＢＪＣ３を含むことができるが、これに限定されない。ｉＰＳ細胞はＥＳＣと本質的に同じ培養物中で挙動することが理解される。
【００６３】
これに関して、技術分野の文脈において周知であるように、多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉又は外胚葉の複数の胚葉から種々の細胞系譜の機能細胞に分化し得るだけでなく、移植後に複数の胚葉の組織となり、胚盤胞への注射後には、すべてではないにしても、ほとんどの組織に実質的に寄与する。
【００６４】
従って、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉のパターン形成を誘導するための周知の培養方法を用いてｈＰＳＣから誘導され得る。特に、ＤＥ細胞を得るためのそのような方法は、ＤＥ細胞だけでなく他の混入する系譜を含む細胞の不均質な混合物を生じ得る。例えば、胚体内胚葉細胞は、ＴＧＦｂ活性化剤、Ｗｎｔ活性化剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、及びＦＧＦ活性化剤を用いて１日目にｈＰＳＣを培養することで得ることができ、その後２日目にＴＧＦｂ活性化剤、ＢＭＰ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤でその細胞を培養してもよい。本明細書中に記載される方法において、表１の分化工程は、意図された細胞系譜への細胞の増殖及び／又は分化を支持することができる適切な培地中で細胞を培養することを含む。特に、細胞の培養は、インビトロで１つ以上の分化因子と細胞の接触を含んでもよい。「接触させる」という用語は、分化因子への細胞のインビボ曝露を含むことを意図するものではなく、任意の適切な方法で実施されてもよい。例えば、細胞は、１つ以上の分化因子を含む付着培養で、又は懸濁培養で処理されてもよい。１つ以上の分化因子と接触させた細胞を、細胞を安定化させ、又は細胞をさらに分化させるために、他の細胞分化環境でさらに処理してもよいことが理解される。
【００６５】
特定の遺伝子及び／又はタンパク質マーカーの発現を測定することにより、１つ以上の細胞系譜への細胞の分化の進行を同定し、それらの進行をモニターすることができる。培養細胞又は単離された細胞における遺伝子及び／又はタンパク質マーカーの発現を測定及び評価するための方法は、標準的であり、当該分野で公知のものである。例えば、そのような方法は、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡアッセイ、酵素活性アッセイ及び免疫アッセイ、例えば、切片材料の免疫組織化学分析、免疫染色及び蛍光イメージング、ウェスタンブロッティング、インタクトな細胞で利用可能なマーカーに対してはフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、を含む。特に、系譜特異的細胞の単離は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）による細胞の選別によって行うことができる。本開示及び細胞系譜の文脈において、表２は、分化状態と細胞の系譜を同定するために使用され得る遺伝子及び／又はタンパク質マーカーを概説する。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
分化因子
種々の増殖因子及び他の化学的シグナルは、１つ以上の特定の所望の細胞系譜の子孫細胞培養への、幹細胞の分化を調節し得る。本発明において使用され得る分化因子には、レチノイン酸、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達、サイクリックＡＭＰ／プロテインキナーゼＡ（サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡ）シグナル伝達、増殖因子シグナル伝達、Ｗｎｔシグナル伝達、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達又はＦＧＦ／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＦＧＦ／ＭＡＰＫ）シグナル伝達、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、プロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）シグナル伝達、オンコスタチンＭ／Ｇｐ１３０シグナル伝達、ＨＧＦシグナル伝達、ステロイドホルモンシグナル伝達、アスコルビン酸シグナル伝達、ビタミンＤシグナル伝達、Ｌ−グルタチオンシグナル伝達、インスリンシグナル伝達又はグルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性を調節する化合物又は分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、分化因子には、アミノ酸混合物又はリン脂質前駆体が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００６８】
一実施形態では、レチノイン酸（ＲＡ）のモジュレータは、レチノイン酸前駆体、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＴＴＮＢＰ（アロチノイド酸−４−［（１Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペン−１−イル］−安息香酸）、ＡＭ５８０又はビタミンＡなどの活性化剤を含んでもよいが、これらに限定されない。全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の活性化剤には、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ，−ノナテトラエン酸を含んでもよいがこれに限定されず；ＡＴＲＡの代替の実施形態は、９−シスレチノイン酸及び１３−シスレチノイン酸（９−シスレチノイン酸のＩＵＰＡＣ名は、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）ノナ−２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ，８Ｅ−テトラエン酸であり、及び１３−シスレチノイン酸は、（２Ｚ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン酸である）。
【００６９】
一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のモジュレータは、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＢＭＰ２などの活性化剤を含むが、これに限定されない。
【００７０】
一実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達のモジュレータは、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０又はＦＧＦシグナル伝達経路の他のファミリーメンバーなどの活性化剤を含むが、これに限定されない。
【００７１】
一実施形態では、ＦＧＦ／ＭＡＰＫシグナル伝達のモジュレータは、限定されないが、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド）、ＰＤ１７３０７４（Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素）、ＰＤ−１６１５７０（Ｎ−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素）、ＦＩＩＮ１塩酸塩（Ｎ−（３−（（３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−７−（４−（ジエチルアミノ）ブチルアミノ）−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メチル）フェニル）アクリルアミド）、ＦＲ−１８０２０４（５−（２−フェニル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−３−イルアミン）、ＧＳＫ１１２０２１２、ＶＸ７４５及びＳＵ５４０２（２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸）などの活性化剤を含んでもよい。
【００７２】
一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達のモジュレータは、限定されないが、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＩＤＥ１（１−［２−［（２−カルボキシフェニル）メチレン］ヒドラジド］ヘプタン酸）、ＩＤＥ２（ヘプタン二酸−１−（２−シクロペンチリデンヒドラジド）又はノーダル（Ｎｏｄａｌ）などの活性化剤であってもよく、又は限定されないが、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＳＢ−５０５１２４（２−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−６−メチル−ピリジン）、Ｌｅｆｔｙ１及びＬｅｆｔｙ２などの阻害剤を含んでもよい。
【００７３】
一実施形態では、ＰＫＡ及びｃＡＭＰシグナル伝達のモジュレータは、８−ブロモＣＡＭＰ、フォルスコリン及びｓｐ−ＣＡＭＰなどの活性化剤を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のモジュレータは、ＲＯ４９２９０９７（プロパンジアミド、Ｎ１−［（７Ｓ）−６，７−ジヒドロ−６−オキソ−５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル］−２，２−ジメチル−Ｎ３−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）−）及びＤＡＰＴ（Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル）などのγセクレターゼ阻害剤を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００７５】
一実施形態では、ＰＫＧシグナル伝達のモジュレータは、１４００Ｗジヒドロクロリド（Ｎ−［［３−（アミノメチル）フェニル］メチル］−エタンイミドアミドジヒドロクロリド）及びＫＴ５８２３（（９Ｓ，１０Ｒ，１２Ｒ）−２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−２，９−ジメチル−１−オキソ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１０−カルボン酸、メチルエステル）などの阻害剤を含んでもよいが、これに限定されない。一実施形態では、ＰＫＧシグナル伝達のモジュレータは、サイクリックＧＭＰ及びＳＮＡＰなどの活性化剤を含み得るが、これに限定されない。
【００７６】
一実施形態では、オンコスタチンＭ／Ｇｐ１３０シグナル伝達のモジュレータは、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、又はオンコスタチンＭ若しくはＧｐ１３０シグナル伝達経路の他のファミリーメンバーを含むが、これに限定されない。
【００７７】
一実施形態では、ステロイドホルモンシグナル伝達の１つ以上のモジュレータは、プロゲステロン又はグルココルチコイドを含んでもよいが、これに限定されない。一実施形態では、グルココルチコイドのモジュレータは、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、コルチゾール、デキサメタゾン−ｔ−ブチルアセテート、ヒドロコルチゾン及びＧＳＫ９０２７（Ｎ−［４−［１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンゼンスルホンアミド）などのアゴニストを含んでもよいが、これに限定されない。
【００７８】
一実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達のモジュレータは、限定されないが、ＣＨＩＲ９９２０１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル）、Ａ１０７０７２２（１−（７−メトキシキノリン−４−イル）−３−［６−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］尿素）、Ｗｎｔ３ａ、アセトキシム、ＢＩＯアセトキシム、ＢＩＯ（６−ブロモ−３−［（３Ｅ）−１，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシイミノ）−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１，３−ジヒドロ−（３Ｚ）−２Ｈ−インドール−２−オン）、Ｒ−スポンジンファミリーのメンバー、又はＷｎｔシグナル伝達ファミリーのメンバーなどの活性化剤である。一実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達のモジュレータは、限定されないが、Ｃ５９（２−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）フェニル）−Ｎ−（４−（ピリジン−３−イル）フェニル）アセトアミド）、ＩＷＰ２（Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド、Ｄｋｋ１、ＸＡＶ９３９（３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン）、ＩＷＲ１（４−（１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド）ＦＨ−５３５＝（２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−メチル−４−ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミドなどの阻害剤を含んでもよい。
【００７９】
一実施形態では、ビタミンＤシグナル伝達の１つ以上のモジュレータは、コレカルシフェロール又はビタミンＤ３などの活性化剤を含み得るが、これに限定されない。
【００８０】
一実施形態では、アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤としては、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸（ＡＡ２Ｐ）又はＬ−アスコルビン酸又は２−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）アスコルビン酸などの活性化剤を含み得るが、これに限定されない。
【００８１】
一実施形態では、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤には、インスリン又はインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）などの活性化剤を含み得るが、これに限定されない。
【００８２】
一実施形態では、リン脂質前駆体には、エタノールアミン、塩化コリン、イノシトール、セリン又はグリセロールが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８３】
一実施形態では、増殖因子シグナル伝達のモジュレータは、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝細胞腫由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経増殖因子（ＮＧＦ）及び他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ウシ胎児ソマトトロピン（ＦＢＳ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６又はＩＬ−７のシグナル伝達経路のいずれか１つのファミリーメンバータンパク質を含み得るが、これに限定されない。
【００８４】
本明細書に開示される分化因子は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、又は約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌ、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、又は約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、又は約１５ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの量で使用され得る。
【００８５】
本明細書中に開示される分化因子は、約０．１ｎＭ〜１Ｍ、又は約０．１ｎＭ〜約２００ｍＭ、又は約０．５ｎＭ〜約１５０ｍＭ、又は約０．５ｎＭ〜約１００ｍＭ、又は約１ｎＭ〜約１００ｍＭの範囲の量で使用され得る。
胚体内胚葉（ＤＥ）の分化細胞
【００８６】
本発明は、胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の細胞を後側前腸系譜（ＰＦＧ）に分化させる方法を提供する。
【００８７】
従って、一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の幹細胞を後側前腸系譜に分化させる方法を提供し、前記幹細胞を、１つ以上のレチノイン酸活性化剤；及び／又はＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることを含む。
【００８８】
一実施形態では、１つ以上のレチノイン酸活性化剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、１つ以上のレチノイン酸活性化剤は、約２μＭの量の全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）及び／又は約５００ｎＭの量のＴＴＮＰＢを含み得る。
【００８９】
一実施形態において、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１μＭの量のＡ８３−０１及び／又は約１０μＭの量のＳＢ４３１５４２及び／又は約１〜２μＭの量のＳＢ５０５１２４を含み得る。
【００９０】
一実施形態では、本方法は、前記細胞をＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含んでもよい。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ４及び／又は約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ２及び／又は約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ７を含み得る。
【００９１】
一実施形態では、方法は、前記幹細胞をＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含んでもよい。一実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態において、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１０ｎｇ／ｍｌの量のＦＧＦ２を含み得る。
【００９２】
一実施形態では、後側前腸系譜の細胞は、未分化細胞と比較して、後側前腸系譜マーカーの遺伝子発現の上昇及び背側前腸マーカーの発現の減少を含むことができる。一実施形態では、背側前腸マーカーはＭｎｘ１を含む。
【００９３】
一実施形態では、胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の細胞の、後側前腸系譜の細胞への分化は、約１２〜８４時間、１２〜７２時間、１８〜７２時間、１８〜６６時間時間、１８〜６０時間又は２４〜６０時間で完了され得る。
【００９４】
一実施形態では、方法の持続時間は、約１〜８４時間であってもよい。
後側前腸系譜の分化細胞
【００９５】
本発明は、後側前腸系譜の細胞を肝芽前駆細胞に分化させる方法を提供し、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータ；及び／又はサイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と、後側前腸系譜の前記細胞とを接触させることを含んでもよい。
【００９６】
一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態において、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１０ｎｇ／ｍｌの量のアクチビンＡ及び／又は約１０ｎｇ／ｍｌの量のＮｏｄａｌを含み得る。
【００９７】
一実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータは、約１ｎＭ〜１Ｍの量であり得る。一実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータは、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤及びＷｎｔシグナル伝達の活性化剤を含むことができる。一実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤が細胞と接触した後、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤を細胞と接触させてもよい。一実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤は、約１〜７２時間の期間、後側前腸系譜の細胞と接触されてもよく、その後、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤は、後側前腸系譜の細胞と約２４〜４８時間の期間、接触されてもよい。一実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤は、約１μＭの量のＣ５９及び／又は約１μＭの量のＸＡＶであり得る。一実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤は、約１μＭの量のＣＨＩＲであり得る。
【００９８】
一実施形態では、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎＭ〜１Ｍの量であり得る。一実施形態では、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｍＭの量の８−ブロモＣＡＭＰ及び／又は約１０μＭの量のフォルスコリンを含み得る。
【００９９】
一実施形態では、方法は、後側前腸系譜の前記細胞をＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含むことができる。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７又はそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ４及び／又は約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ２及び／又は約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ７を含み得る。
【０１００】
一実施形態において、肝芽前駆細胞は、未分化細胞と比較して、肝芽前駆細胞マーカーの上昇した遺伝子発現及び膵前駆細胞マーカーの発現の減少を含み得る。
【０１０１】
一実施形態では、肝芽前駆細胞は、未分化細胞と比較して、ＡＦＰ、ＴＢＸ３、ＨＮＦ４Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ１Ａ又はそれらの組み合わせを含むマーカーの上昇した遺伝子発現を含むことができる。一実施形態では、肝臓芽前駆細胞マーカーはＰｄｘ１を含み得る。
【０１０２】
一実施形態において、後側前腸系譜の細胞の肝芽前駆細胞への分化は、約１２〜８４時間、１２〜７２時間、１８〜７２時間、１８〜６６時間、１８〜６０時間又は２４〜６０時間で完了し得る。
【０１０３】
一実施形態では、方法の持続時間は、約１〜１２０時間であってもよい。
【０１０４】
一実施形態では、後側前腸系譜の細胞は、本明細書に記載されるように、胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の細胞を後側前腸系譜（ＰＦＧ）に分化させる方法から得ることができる。
自己再生状態における肝芽前駆細胞の維持
【０１０５】
本発明は、肝芽前駆細胞を、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と、接触させることを含む、肝芽前駆細胞を自己再生状態に維持する方法を提供する。
【０１０６】
一実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＦＧＦシグナル伝達経路の他のファミリーメンバー、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１０７】
一実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９２０１、Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−スポンジンファミリーのメンバー、Ｗｎｔシグナルファミリーのメンバー、アセトキシム、ＢＩＯ又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１０８】
一実施形態では、肝芽前駆細胞をＦＧＦ及びＣＨＩＲ９９２０１と接触させてもよい。一実施形態では、肝芽前駆細胞を約１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ及び／又は約１ｎＭ〜１００ｍＭのＣＨＩＲ９９２０１と接触させる。一実施形態において、肝芽前駆細胞は、約２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ及び／又は約２μＭのＣＨＩＲ９９２０１と接触させてもよい。
【０１０９】
一実施形態では、方法は、前記肝芽前駆細胞をＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含んでもよい。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１１０】
一実施形態では、方法は、前記肝芽前駆細胞を１つ以上の上皮増殖因子と接触させることをさらに含んでもよい。
【０１１１】
一実施形態では、方法は、前記肝芽前駆細胞をＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることをさらに含んでもよい。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈの１つ以上の阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１１２】
一実施形態では、方法は、肝芽前駆細胞をＢＭＰ４、ＥＧＦ、及びＤＡＰＴと接触させることをさらに含んでもよい。一実施形態において、肝芽前駆細胞は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び／又は約１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び／又は約１ｎＭ〜１００ｍＭのＤＡＰＴと接触させてもよい。一実施形態において、肝芽前駆細胞は、約１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、及び／又は約１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び／又は約１０μＭのＤＡＰＴと接触させてもよい。
【０１１３】
一実施形態では、肝芽前駆細胞は、分化細胞と比較して、ＡＦＰ、ＴＢＸ３、ＨＮＦ４ａ、ＣＥＢＰα又はそれらの組み合わせを含むマーカーの上昇した遺伝子発現を含んでもよい。
【０１１４】
一実施形態において、肝芽前駆細胞は、本明細書に記載されるように、後側前腸系譜の細胞を肝芽前駆細胞に分化させる方法から得られてもよい。
分化する肝芽前駆細胞
【０１１５】
本発明は、肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化させる方法を提供し、この方法は、前記肝芽前駆細胞を、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；及び／又はＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることを含んでもよい。
【０１１６】
一実施形態では、方法は、細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及び／又はインスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤又はそれらの組み合わせと、接触させることをさらに含んでもよい。
【０１１７】
一実施形態では、方法は、前記肝芽前駆細胞を、アスコルビン酸シグナル伝達の活性化剤；グルココルチコイドシグナル伝達の活性化剤；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の活性化剤；インスリンシグナル伝達の活性化剤；オンコスタチンＭシグナル伝達の活性化剤；アミノ酸混合物、及び／又はＬ−グルタチオンシグナル伝達の活性化剤からなる群から選択され得る１つ以上の分化因子と接触させることをさらに含んでもよい。
【０１１８】
一実施形態では、方法は、細胞を、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤；ＰＫＧシグナル伝達の阻害剤；グルココルチコイドシグナル伝達の活性化剤；リン脂質前駆体；オンコスタチンＭシグナル伝達の活性化剤；アミノ酸混合物、及び／又はＬ−グルタチオンシグナル伝達の活性化物質又はそれらの組み合わせからなる群から選択され得る１つ以上の分化因子と接触させることをさらに含んでもよい。
【０１１９】
一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１μＭの量のＡ８３−０１及び／又は約１０μＭの量のＳＢ４３１５４２及び／又は約１〜２μＭの量のＳＢ５０５１２４を含み得る。
【０１２０】
一実施形態において、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約２５０ｎＭの量のＧＳＫ１１２０２１２及び／又は約１００ｎＭの量のＰＤ１７３０７４及び／又は約２５０ｎＭの量のＶＸ７４５を含み得る。
【０１２１】
一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約２μＭの量のＲＯ４９２９０９７及び／又は約１０μＭの量のＤＡＰＴを含み得る。
【０１２２】
一実施形態では、アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約２００μｇ／ｍｌの量のＡＡ２Ｐ、及び／又は約２００μｇ／ｍｌの量のＬ−アスコルビン酸、又は約２００μｇ／ｍｌの２−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル）アスコルビン酸を含んでもよい。
【０１２３】
一実施形態では、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎＭ〜１Ｍの量であり得る。一実施形態では、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｍＭの量の８−ブロモＣＡＭＰ及び／又は約１０μＭの量のフォルスコリンを含み得る。
【０１２４】
一実施形態では、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１０μｇ／ｍｌの量のインスリンを含み得る。
【０１２５】
一実施形態では、グルココルチコイドシグナル伝達の活性化剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１０μＭの量のＤＥＸ及び／又は約１０μＭの量のＧＳＫ９０９７を含み得る。
【０１２６】
一実施形態では、オンコスタチンＭシグナル伝達の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、オンコスタチンＭシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、ＯＳＭ、約１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ又はＧｐ１３０シグナル伝達経路の他のファミリーメンバー、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１２７】
一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７又はそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ４及び／又は約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ２及び／又は約３０ｎｇ／ｍｌの量のＢＭＰ７を含み得る。
【０１２８】
一実施形態において、リン脂質前駆体は、０．００１％〜５％又は１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、リン脂質前駆体は、０．０２％の量のエタノールアミン及び／又は約５０μｇ／ｍｌの量の塩化コリンを含み得る。当技術分野で理解されるように、％量は１００ｍｌ当たりの量を指す。例えば、１％は、１ｍｌ／１００ｍｌを意味し、０．０２％は２０μｌ／１００ｍｌを意味する。
【０１２９】
一実施形態において、ＰＫＧシグナル伝達の阻害剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、ＰＫＧシグナル伝達の阻害剤は、約２μＭの量の１４００Ｗジヒドロクロリド及び／又は約２μＭのＫＴ５８２３及び／又は約１μＭの（Ｓ）−メチルイソチオ尿素硫酸塩を含み得る。
【０１３０】
一実施形態では、Ｌ−グルタチオンシグナル伝達の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。別の実施形態において、Ｌ−グルタチオンシグナル伝達の活性化剤は、約１００μｇ／ｍｌの量のＬ−グルタチオンを含み得る。
【０１３１】
一実施形態では、アミノ酸混合物は、約１ｎｇ／ｍｌ以上の濃度であってもよく、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン及びＬ−チロシンを含んでもよい。一実施形態では、アミノ酸混合物は、約１８７．５ｍｇ／Ｌのグリシン、約１６９．５ｍｇ／ＬのＬ−アラニン、約１４７５ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン塩酸塩、約２００．０５ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン、約２１６．５ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、約６３２．６ｍｇ／ＬのＬ−システイン塩酸塩、約４４８．５ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約３１５ｍｇ／ＬのＬ−ヒスチジン塩酸塩、約５４５ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシン、約５９０．５ｍｇ／ＬのＬ−ロイシン、約９１２．５ｍｇ／ＬのＬ−リシン塩酸塩、約１７２．５ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、約３５５ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、約３７２．５ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、約２６２．５ｍｇ／ＬのＬ−セリン、約５３４．５ｍｇ／ＬのＬ−スレオニン、約９０．０２ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、約５２５．３５ｍｇ／ＬのＬ−バリン、約５５９．０５ｍｇ／ＬのＬ−チロシンを含み得る。
【０１３２】
一実施形態では、肝前駆細胞は、未分化細胞と比較して、肝臓マーカーの遺伝子発現の上昇及び胆のうマーカーの発現低下を含み得る。一実施形態では、肝前駆細胞は、未分化細胞と比較して、アルブミン、ｃ−ＭＥＴ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＥＢＰα又はそれらの組み合わせを含むマーカーの遺伝子発現の上昇を含み得る。一実施形態では、肝前駆細胞は、未分化細胞と比較して、マーカーＳＯＸ９の遺伝子発現の低下を含む。
【０１３３】
一実施形態では、肝芽前駆細胞の肝前駆細胞への分化は、約１２〜８４時間、１２〜７２時間、１８〜７２時間、１８〜６６時間、１８〜６０時間又は２４〜６０時間で完了し得る。
【０１３４】
一実施形態では、工程ａ）の持続時間は、約１〜１０８時間であり得る。別の実施形態において、工程ｂ）の持続時間は、少なくとも４８時間であり得る。一実施形態では、方法の持続時間は、少なくとも１５６時間であってもよい。
【０１３５】
一実施形態において、肝芽前駆細胞は、本明細書に記載されるように、後側前腸系譜の細胞を肝芽前駆細胞に分化させる方法より得られてもよい。
肝前駆細胞を静脈周囲肝細胞様細胞に分化させる
【０１３６】
本発明は、肝前駆細胞を静脈周囲肝細胞様細胞に分化させる方法を提供するものであり、前記肝前駆細胞を：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤及び／又はＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含んでもよい。
【０１３７】
一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約２μＭの量のＲＯ４９２９０９７及び／又は約１０μＭの量のＤＡＰＴを含んでもよい。
【０１３８】
一実施形態では、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１０μＭの量のＤＥＸ及び／又は約１０μＭのＧＳＫ９０９７を含み得る。
【０１３９】
一実施形態では、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１０μｇ／ｍｌの量のインスリンを含み得る。
【０１４０】
一実施形態では、アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約２００μｇ／ｍｌの量のＡＡ２Ｐ、及び／又は約２００μｇ／ｍｌの量のＬ−アスコルビン酸を含み得る。
【０１４１】
一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１００ｎｇ／ｍｌの量のアクチビン及び／又は約１００ｎｇ／ｍｌの量のＮｏｄａｌを含み得る。
【０１４２】
一実施形態では、方法は、肝前駆細胞に、レチノイン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤を接触させることを、さらに含んでもよい。一実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１μＭの量の９−シスＲＡを含み得る。
【０１４３】
一実施形態では、方法は、前記肝前駆細胞をプロゲステロンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含んでもよい。一実施形態では、プロゲステロンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、１ｎＭ〜１ｍＭの量であり得る。一実施形態において、プロゲステロンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１μＭの量のプロゲステロンを含み得る。
【０１４４】
一実施形態では、方法は、前記肝前駆細胞をビタミンＤシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含んでもよい。一実施形態では、ビタミンＤシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、ビタミンＤシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約５００ｎＭの量のコレカルシフェロール、及び／又は約５００ｎＭの量のビタミンＤ３を含み得る。
【０１４５】
一実施形態では、方法は、前記肝前駆細胞をＰＫＧシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含んでもよい。一実施形態において、ＰＫＧシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、ｃＧＭＰ又はＳ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を含み得る。
【０１４６】
一実施形態では、静脈周囲肝細胞様細胞は、未分化細胞と比較して、静脈周囲肝細胞マーカーの遺伝子発現の上昇及び門脈周囲マーカーの発現の減少を含み得る。一実施形態では、静脈周囲肝細胞マーカーは、ＧＳ、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＡＴ、ＡＸＩＮ２又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１４７】
一実施形態では、肝前駆細胞の静脈周囲肝細胞様細胞への分化は、約１２〜８４時間、１２〜７２時間、１８〜７２時間、１８〜６６時間、１８〜６０時間又は２４〜６０時間で完了され得る。一実施形態では、分化は、少なくとも１時間以内に完了できる。
【０１４８】
一実施形態では、方法の持続時間は、約１〜１６８時間であり得る。
【０１４９】
一実施形態では、肝前駆細胞は、本明細書に記載されるように、肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化させる方法から得ることができる。
静脈周囲状態の肝細胞又は肝細胞様細胞の維持
【０１５０】
本発明は、肝細胞又は肝細胞様細胞を静脈周囲の状態で維持する方法を提供し、該方法は、インビトロ細胞培養中に静脈周囲細胞マーカーの発現が高レベルに維持することができるように、前記細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを含み得る。
【０１５１】
一実施形態では、方法は、前記細胞を、ＴＧＦβの１つ以上の阻害剤；及び／又はエストラジオールなどのエストロゲンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることを、さらに含んでもよい。
【０１５２】
一実施形態では、細胞は、本明細書に記載されているように、肝前駆細胞を静脈周囲肝細胞に分化させる方法から得られてもよい。一実施形態では、細胞はヒト肝臓から得ることができる。
肝細胞前駆細胞を肝細胞様細胞に分化する
【０１５３】
本発明は、肝前駆細胞を肝細胞様細胞に分化させる方法を提供し、該方法は、前記肝前駆細胞を、ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤に接触させることを含み得る。
【０１５４】
一実施形態では、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎＭ〜１Ｍの量であり得る。一実施形態では、ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｍＭの量の８−ブロモＣＡＭ、及び／又は約１０μＭの量のフォルスコリン及び／又は１０μＭの量の１６，１６−ジメチル−プロスタグランジンＥ２（１６，１６−ｄｍＰＧＥ２）を含み得る。
【０１５５】
一実施形態では、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１０μＭの量のＤＥＸ及び／又は約１０μＭのＧＳＫ９０９７を含み得る。
【０１５６】
一実施形態において、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１０μｇ／ｍｌの量のインスリンを含み得る。
【０１５７】
一実施形態において、アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの量であり得る。一実施形態では、アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤は、約２００μｇ／ｍｌの量のＡＡ２Ｐ、及び／又は約２００μｇ／ｍｌの量のＬ−アスコルビン酸を含み得る。
【０１５８】
一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約２μＭの量のＲＯ４９２９０９７及び／又は約１０μＭの量のＤＡＰＴを含み得る。
【０１５９】
一実施形態では、方法は、前記肝前駆細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることをさらに含み得る。一実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１ｎＭ〜１Ｍの量であり得る。一実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１μＭの量のＣ５９、及び／又は約１μＭの量のＸＡＶを含み得る。
【０１６０】
一実施形態では、方法は、前記肝前駆細胞を、ＰＫＧシグナル伝達の１つ以上の阻害剤と接触させることをさらに含み得る。一実施形態では、ＰＫＧシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約１ｎＭ〜１００ｍＭの量であり得る。一実施形態では、ＰＫＧシグナル伝達の１つ以上の阻害剤は、約２μＭの量の１４００Ｗジヒドロクロリド、及び／又は約２μＭのＫＴ５８２３又は約１μＭの硫酸（Ｓ）−メチルイソチオ尿素を含み得る。
【０１６１】
一実施形態では、肝細胞様細胞は、門脈周囲肝細胞であり得る。
【０１６２】
一実施形態では、肝細胞様細胞は、未分化細胞と比較して、肝細胞様細胞マーカーの遺伝子発現の上昇及び静脈周囲マーカーの発現の減少を含み得る。一実施形態では、肝細胞様細胞マーカーは、ＣＰＳ１、ＴＡＴ、アルブミン、ＡＰＣ、ＡＲＧ１又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１６３】
一実施形態では、肝前駆細胞の肝細胞様細胞への分化は、約１２〜８４時間、１２〜７２時間、１８〜７２時間、１８〜６６時間、１８〜６０時間又は２４〜６０時間で完了され得る。一実施形態では、分化は少なくとも１時間以内に完了され得る。
【０１６４】
一実施形態では、方法の持続時間は、約１〜１６８時間であり得る。
【０１６５】
一実施形態では、肝前駆細胞は、本明細書に記載されるように、肝臓前駆細胞を肝前駆細胞に分化させる方法から得ることができる。
肝細胞の門脈周囲状態の維持
【０１６６】
本発明は、門脈周囲肝細胞を自己再生状態に維持する方法を提供し、該方法は、前記門脈周囲肝細胞にサイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の1つ以上の活性化剤を接触させることを含んでもよい。
【０１６７】
一実施形態では、門脈周囲肝細胞は、本明細書に記載されるように、肝前駆細胞を肝細胞様細胞に分化させる方法から得ることができる。一実施形態では、細胞はヒト肝臓から得られてもよい。
細胞培養培地及びキット
【０１６８】
本明細書に記載される方法及び細胞は、他の因子が補充された培養培地中、又は細胞系譜の増殖、維持又は分化のためにそれに適応するように別の処理された培養培地中の１つ以上の分化因子と接触され得る。幹細胞の多分化能を維持するために、例えば、本明細書中に開示されている幹細胞及び細胞系譜は、馴化培地、例えばｍＥＦ−ＣＭ、又は新鮮な無血清培地単独、ｍＴｅｓＲ、又は当該技術分野において公知の他のｈＰＳＣ維持培地、又はエッセンシャル８のようなゼノフリー培地中で、培養されてもよい。幹細胞を分化させるために、本明細書中に開示される幹細胞及び細胞系譜は、フィーダー層を含むフィーダーフリー培地又はフィーダー層を含む培地中で培養することができ、それにより、その培養培地は、ＣＤＭ２、ＣＤＭ  ＫＯＳＲ又はＩＭＤＭ／Ｆ１２であってもよい。ＣＤＭ２は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２栄養混合物（Ｆ１２）、トランスフェリン、インスリン、濃縮脂質、又はポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含むものとして化学的に定義されるものを含む。ＣＤＭ  ＫＯＳＲは、１０％ＫＯＳＲ、ＩＭＤＭ、Ｆ１２濃縮脂質、又はＰＶＡを含む。ＩＭＤＭ／Ｆ１２はＩＭＤＭとＦ１２を含む。ＫＯＳＲの特定の成分が脂質形成を促進するようなので、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地を７〜１８日の間に使用された。あるいは、分化のために、当技術分野で公知の細胞生存及び増殖のための基本成分を含み、分化を混乱させる添加された増殖因子／化学物質を含有しない最小限の基礎培地に由来する基礎培地を使用してもよい。このような因子は、本明細書に記載の細胞系譜の増殖、維持又は分化に使用するための培養培地に添加される、又は培養培地の調製に使用されるキットの形態で供給することができる。
【０１６９】
一実施形態では、細胞の培養は、単層培養、凝集培養、又は懸濁培養を含むがこれに限定されない形式であってもよい。当該技術分野において理解されるように、単層培養では、細胞はプラスチック支持体又はマトリックスのような支持体に付着してもよく、懸濁培養中では、細胞はいずれの表面にも付着しないものであってもよい。当該技術分野において理解されるように、凝集培養において、細胞は、細胞の「ボール」又は「凝集塊」又は「凝集体」として他の細胞と接触して増殖され得る。
【０１７０】
一実施形態では、培養培地は、フィーダー層から得られる馴化培地であってもよい。フィーダー層は線維芽細胞を含み、一実施形態では、胚性線維芽細胞を含むことが企図される。
【０１７１】
代替の培養系は、幹細胞の増殖を促進することができる増殖因子を補った無血清培地を使用する。例えば、幹細胞が無条件血清置換（ＳＲ）培地中で維持される無フィーダーの無血清培養系は、幹細胞の自己再生を引き起こすことができる様々な増殖因子を補充した。
【０１７２】
一実施形態では、培地は、フィーダー細胞、あるいは、フィーダー細胞又は培養物中に外的に添加されたフィーダー細胞の培養物から採取された外的に添加された馴化培地を含まないフィーダーフリー培地であってもよい。もちろん、培養されるべき細胞がフィーダー細胞を含む種培養物に由来する場合、偶発的な同時単離、及び、所望の細胞（例えば、未分化霊長類の幹細胞）を伴ったこれらのフィーダー細胞のいくらか少量の割合の別の培養への続く導入は、フィーダー細胞の意図的導入とみなされるべきではない。そのような場合、培養物は僅少数のフィーダー細胞を含む。「僅少（ｄｅ  ｍｉｎｉｍｕｓ）」とは、分化可能な細胞がフィーダー細胞上で培養されたであろう以前の培養条件からその瞬間の培養条件に持ち越されるフィーダー細胞の数を意味する。同様に、フィーダー細胞又は培養物に播種した幹細胞から発生するフィーダー様細胞は、意図的に培養物に導入されたとはみなされない。あるいは、化学的に定義され、ＰＶＡ、濃縮脂質、ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）、ＩＭＤＭ、Ｆ１２を含有し得るフィーダーを含まない培養培地を用いることができる。
【０１７３】
一実施形態では、本発明は、１つ以上のレチノイン酸活性化剤及びＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤を含み得る、胚体内胚葉（ＤＥ）系譜の細胞を後側前腸系譜に分化させるためのキットを提供する。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明は、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータ；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含み得る、後側前腸系譜の細胞を肝芽前駆細胞に分化させるためのキットを提供する。
【０１７５】
別の実施形態において、本発明は、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；Ｗｎｔシグナル伝達の１つ以上のモジュレータ；ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤及びＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含み得る、後側前腸系譜の細胞を肝芽前駆細胞に分化させるためのキットを提供する。
【０１７６】
別の実施形態において、本発明は、ＴＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤を含み得る、肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化させるためのキットを提供する。
【０１７７】
別の実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；アスコルビン酸シグナル伝達の活性化剤；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含み得る、肝芽前駆細胞を肝前駆細胞に分化させるためのキットを提供する。
【０１７８】
別の実施形態では、本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤；グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及びＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含み得る、肝前駆細胞を静脈周囲肝細胞様細胞に分化させるためのキットを提供する。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明は、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；グルココルチコイドシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；インスリンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；アスコルビン酸シグナル伝達の１つ以上の活性化剤；及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤を含み得る、肝臓前駆細胞を、肝細胞又は肝細胞様細胞に分化させるためのキットを提供する。
【０１８０】
別の実施形態では、本発明は、肝芽前駆細胞を自己再生状態に維持するためのキットを提供するものであって、以下の因子の１つ以上を含み得る：ＦＧＦシグナル伝達の１つ以上の活性化剤及びＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤。
【０１８１】
一実施形態では、肝芽前駆細胞を自己再生状態に維持するためのキットは、以下の因子の１つ以上をさらに含み得る：ＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の活性化剤、１つ以上の上皮増殖因子、ＴＧＦβシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤。
【０１８２】
一実施形態では、肝細胞又は肝細胞様細胞を、静脈周囲状態に維持するためのキットが提供され、以下の因子の１以上を含む：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の１つ以上の阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達の１つ以上の活性化剤。キットは、以下の因子の１つ以上をさらに含み得る：ＴＧＦｂの１つ以上の阻害剤；及び／又はエストロゲンシグナル伝達の１つ以上の活性化剤；サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の阻害剤。
【０１８３】
一実施形態では、サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達の１つ以上の活性化剤を含む、肝細胞又は肝細胞様細胞を門脈周囲状態に維持するためのキットが提供される。
【０１８４】
本明細書に例示的に記載される開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又は要素（複数）、制限又は制限（複数）がない場合に適切に実施することができる。従って、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、広範かつ制限なしに読まれるものとする。さらに、本明細書で使用される用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用には、示され説明された特徴又はその一部の任意の等価物を排除する意図はないが、クレームされた本発明の範囲内において種々の変更が可能であることが認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている本発明の修正及び変形が当業者によって採用されてもよく、そのような修正及び変形は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１８５】
本開示は、本明細書において広く一般的に記載されている。包括的な開示に含まれるより狭い種及び亜属のグループの各々も、本発明の一部を形成する。これは、切除された材料が本明細書に具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、属からの主題を除去する条件又は否定的制限を伴う本発明の包括的な記述を含む。
細胞表面マーカー
【０１８６】
一実施形態では、ＥＧＦＲ又はＣＤ９９から選択されるＬＢ細胞を単離又は選択するための表面マーカーが提供される。
【０１８７】
一実施形態では、ＣＤ３２５（Ｎ−カドヘリン）を含むＭＨＧ細胞を単離又は選択するための表面マーカーが提供される。
スクリーニング方法
【０１８８】
一実施形態では、細胞応答をスクリーニングする方法が提供され、該方法は、ａ）本明細書に記載の方法に従って作製された細胞集団を薬剤（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）と接触させること；及びｂ）薬剤によって誘導された細胞応答についての細胞集団を評価すること、を含む。
【０１８９】
一実施形態では、スクリーニングはインビトロスクリーニングであってもよく、接触工程は、インビトロで実施してもよい。スクリーニングはインビボで行うことができ、接触工程は、細胞集団を含む宿主動物に薬剤を投与することによって実施することができる。
【０１９０】
一実施形態では、表現型をスクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は：ａ）本明細書に記載の方法に従って作製された細胞集団を宿主動物に投与する工程であって、前記細胞集団の細胞が、少なくとも１つの遺伝子座に遺伝子改変を含む；及び、ｂ）投与された細胞集団によって誘導された検出可能な表現型について宿主動物を評価すること、を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの遺伝子座における遺伝子改変は、少なくとも１つの遺伝子の破壊又は欠失をもたらし得る。細胞集団は肝細胞を含むことができ、検出可能な表現型は生存促進を含むことができる。
【０１９２】
一実施形態では、症状について被験体を治療する方法が提供され、該方法は：ａ）症状について被験体を治療するために、本明細書に記載の方法に従って作製された治療有効量の細胞を被験体に投与すること、を含む。
【０１９３】
細胞は、少なくとも１つの生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）又は生着促進（ｐｒｏ−ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）因子と同時投与されてもよい。
【０１９４】
細胞は、少なくとも１つの遺伝子座に遺伝子改変を含み得る。
【０１９５】
一実施形態では、被験体の症状を治療するための医薬品の製造における、本明細書に記載の方法に従って作製された治療有効量の細胞の使用が提供される。
【０１９６】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な実施例の範囲内にある。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバー又はサブグループに関しても記載されることを認識するであろう。
実験セクション
材料及び方法
ＢＣＬ２過剰発現ｈＥＳＣ
【実施例】
【０１９７】
ｍＴｅＳＲ１−増殖Ｈ９  ｈＥＳＣに、ＥＦ１Ａ−ＢＣＬ２−Ｔ２Ａ−ＧＦＰレンチウイルス（Ｃ３０６）を形質導入した。成功裡に形質導入されたＧＦＰ＋ｈＥＳＣは、２ラウンドのＦＡＣＳ選別によって濃縮され、＞９０％純粋ポリクローナルＢＣＬ２−ＧＦＰ＋ｈＥＳＣ集団を得た。その後、Ｃ３０６  Ｈ９  ｈＥＳＣを肝臓分化に使用した。
組織培養
【０１９８】
ｍＴｅＳＲ１−増殖ｈＰＳＣを培養し、以下のように分化させた：
ａ）ｈＰＳＣ細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＲ００５）及びＧｅｌｔｒｅｘ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、カタログ番号Ａ１４１３３０２）を使用して、小さな塊として１：１２で播種した。
ｂ）前側原始線条（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅａｋ）（１日目）は、血清不含ＣＤＭ２基礎培地中、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、ＰＩ−１０３（５０ｎＭ）及びＦｇｆ２（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて２４時間使用して、特定化した。
ｃ）アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＤＭ３１８９（２５０ｎＭ）及びＰＩ−１０３（５０ｎＭ）を同じ基礎培地に２４時間添加して胚体内胚葉（ＤＥ）を誘導した（２日目）。
ｄ）次に、ＣＤＭ  ＫＯＳＲ基礎培地中で、Ａ８３−０１（１μＭ）、ＲＡ（２μＭ）、ＢＭＰ４（３０ｎｇ／ｍｌ）及びＦｇｆ２（１０ｎｇ／ｍｌ）をさらに２４時間使用して、ＤＥをＰＦＧにパターン化した。
ｅ）ＰＦＧは、ＣＤＭ  ＫＯＳＲ基礎培地中、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、８−ブロモ−ＣＡＭＰ（１ｍＭ）及びＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、３日目（４日目〜６日目）にＬＢ前駆体にさらに分化した。
ｆ）ＬＰ前駆体細胞は、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、オンコスタチンＭ（１０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＤＡＰＴ、Ｃ５９（１μＭ）又はＲＯ４９１９０９７（２μＭ）、フォルスコリン（１０μＭ）、ヒト組換えインスリン（１０μｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸−２リン酸（２００μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタチオン（１００μｇ／ｍｌ）及びアミノ酸濃縮物及びＩＭＤＭ／Ｆ１２培地中で次の６日間（７〜１２日目）処理し、肝前駆細胞を誘導した。
ｇ）肝前駆細胞を、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地中、デキサメタゾン（１０μＭ）、ＲＯ４９２９０９７（２μＭ）又はＤＡＰＴ（１０μＭ）、フォルスコリン（１０μＭ）、ヒト組換えインスリン（１０μｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸−２リン酸塩（２００μｇ／ｍｌ）で６日間（１３日目〜１８日目）処置し、肝細胞様細胞を生成させた。
ＦＲＧ-/-マウスへの脾臓内移植
【０１９９】
ＦＲＧ-/-Ｃ５７ＢＬ６マウスをＹｅｃｕｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入し、１６ｍｇ／ＬのＮＴＢＣ水で維持した。手術の１日前に、ＦＲＧ-/-マウスに、ｕＰＡを発現するアデノウイルスを１．２５×１０＾９ｐｆｕ／２５ｇで後方眼窩に（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｌｙ）注射した。約２４時間後、１５０万個のＢＣＬ２  ＯＥｈＰＳＣ由来肝細胞をマウスに脾臓内移植した。１ｍｌ  ０．９％生理食塩水、鎮痛剤（１．５ｍｇ／ｋｇブプロエピネフリン）及び抗生物質（１０ｍｇ／ｋｇエンロフロキサシン）を、手術直後及び３日後にマウスに皮下投与した。２週間ごとにマウスの質量を測定した。
【０２００】
薬物２−（２−ニトロ−４−フルオロメチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）の実験サイクル中、ＮＴＢＣオフ期間の７日後に３日間８ｍｇ／ＬのＮＴＢＣを供給した。ＮＴＢＣ除去期間は徐々に増加した。例えば、ＮＴＢＣは、２〜４ヶ月かけて徐々に８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間除去された。その後、ＮＴＢＣは完全に除去された。可能な限り傷害の程度を標準化するために、各ケージに同じ量のＮＴＢＣが提供された。各マウスが全用量のＮＴＢＣを受けたかどうかに関して注意を払った。
遺伝子発現プロファイリング
【０２０１】
Ｚｙｍｏ  ＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出した。ＲＴ−定量的ＰＣＲを用いて遺伝子発現を定量した。プライマー配列はＮＣＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｔｏｏｌで設計し、遺伝子発現解析に使用する前にプライマーの特異性と直線性を試験した。
免疫染色及び免疫組織化学
【表３】
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フローサイトメトリー
【０２０２】
凡例スクリーンは、製造業者の指示に従って行われた。フローサイトメトリー分析は、ＬＳＲＩＩ及びＦｌｏｗＪｏを用いて行った。
実験結果
Ｉ．後側前腸（ＰＦＧ）への胚体内胚葉（ＤＥ）分化
レチノイン酸、ＢＭＰ、ＴＧＦβ及びＦＧＦシグナル伝達は、肝膵臓ドメインを規定し、肝臓−膵臓能力を有する内胚葉を育成する。
【０２０３】
肝臓発生の間、胚体内胚葉細胞の集団は、前腸又は中／後腸のいずれかを形成するために、前方−後方軸に沿って最初にパターン化される。本発明において、肝芽（ＬＢ）細胞を生じるための前腸細胞の発生能力に対するシグナル伝達阻害の効果を調べた。能力は、幹細胞又は前駆細胞がその娘細胞型に分化する能力として定義される。例えば、後側前腸は、膵臓内胚葉及びＬＢ細胞などの娘細胞型を生じさせることができる場合、能力を有する。
【０２０４】
特に、インビボでは、前腸（ＦＧ）及び中腸／後腸（ＭＨＧ）は相互に排他的な様式で前側−後側（ＡＰ）にパターン化されることに留意することが重要である。例えば、ゼブラフィッシュ胚において、Ｗｎｔ阻害は、前腸マーカーＨｅｘの発現を促進し、中腸／後腸の特定化を抑制する一方、Ｗｎｔ活性化は逆に中腸／後腸細胞運命を促進し、前腸のマーカー発現を阻害することが示されている。しかしながら、本発明では、前腸の特定化の間、ＤＫＫ１、Ｃ５９及びＩＷＰ２（２４時間）によるＷｎｔ阻害は、ＭＨＧマーカーＣＤＸ２及びＥＶＸ１の発現を減少させるが、下流のＬＢ遺伝子発現（ＡＦＰ、ＣＥＢＰＡ、ＴＢＸ３、ＨＮＦ１Ｂ）の発現も著しく減少させることを示す（図８Ａ）。一方、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１及びＨＥＸ（初期の膵臓及び肝臓細胞で発現）発現は、Ｗｎｔ阻害で上方制御された（図８Ａ）。
【０２０５】
これに関して、ＴＧＦβ阻害と、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＲＡを用いた処理の併用は、肝細胞を生成する能力を有する後側前腸（ＰＦＧ）様細胞を生成することが見出された。
レチノイン酸（ＲＡ）
【０２０６】
レチノイン酸（ＲＡ）は、肝臓−膵臓の能力を内胚葉に付与することが見出された。
【０２０７】
アフリカツメガエルにおいて、原腸形成終了時のＲＡは、肝臓及び膵臓の両方の特定化に影響を与える。ゼブラフィッシュ胚では、ＲＡシグナル伝達はまた、内在的に腸内胚葉を前−後軸に沿ってパターン化することが知られている。例えば、ＲＡ欠損ゼブラフィッシュ胚もまた、Ｐｄｘ１の発現を欠き、結果的に膵臓発生を誘導することができない。
【０２０８】
２日目のｈＰＳＣ由来のＤＥをＲＡの用量を増加させて処置することにより、ＲＡの添加が、ＬＢ細胞におけるＡＦＰ、ＨＮＦ４Ａ、及びＣＥＢＰＡのその後の増加した発現によって示されるように、肝臓の能力を増強させることが見出された（図２）。
ＢＭＰシグナル伝達
【０２０９】
ＤＥ特定化後のＢＭＰ阻害（２４時間）は、細胞がＬＢ細胞に分化する能力を低下させ、その後のＡＦＰ、ＣＥＢＰＡ、ＴＢＸ３、ＴＴＲ、ＨＮＦ４Ａ、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１Ｂの肝臓遺伝子発現を減少させることが見出された。逆に、前腸の特定化中のＢＭＰ４処理は、ＬＢ細胞を生成する能力が軽度に増強することをもたらす（図２）。
ＴＧＦβシグナル伝達
【０２１０】
前腸の特定化段階中のＤＥ細胞に対するＴＧＦβ阻害処理は、後で肝臓遺伝子発現（ＡＦＰ、ＣＥＢＰＡ、ＴＢＸ３、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１、ＦＯＸＡ１、ＴＴＲ）を増加させ、その後のＬＢ分化を支持する（図２）。
ＦＧＦシグナル伝達
【０２１１】
この点に関して、前腸の特定化の間にＤＥ細胞にＦＧＦ２を供給することにより、その後のＣＥＢＰＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１の肝芽遺伝子発現の増加が観察された（図２）。
ＩＩ．肝芽（ＬＢ）への後側前腸（ＰＦＧ）分化
ＰＫＡ、ＢＭＰ、ＷＮＴ、ＦＧＦ及びＴＧＦβは促進するが、ＲＡは肝芽の特定化を阻害する
【０２１２】
レチノイン酸、ノーダル／アクチビン、Ｂｍｐ、ＰＫＡ、ＦＧＦ及びＷｎｔシグナル伝達を含むシグナル伝達経路が、ＬＢの特定化を直接的に調節することができるかどうかを決定するために調べた。
レチノイン酸
【０２１３】
ＲＡの早期処理は、後で肝臓細胞を産生する前腸能力を促進するが、逆にＲＡ処理は、ＬＢの特定化並びにＡＦＰ、ＣＥＢＰＡ、ＨＮＦ６及びＨＮＦ４Ａの及び発現を阻害することが本明細書において実証されている（図３）。従って、後のタイミングでのＲＡの添加は、肝臓の特定化に有害である。
ＢＭＰシグナル伝達
【０２１４】
ＢＭＰ４はＬＢを促進するが、膵臓の特定化を阻害し（図２）、肝臓の特定化がＢＭＰＲ-/-マウスにおいて無効にされたという結果と一致することが見出された。さらに、ＢＭＰ４は、３０〜４０ｎｇ／ｍｌのより高用量で、ＬＢ遺伝子（ＨＮＦ４Ａ、ＰＲＯＸ１、ＡＦＰ、ＴＢＸ３、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、及びＣＥＢＰＡ）の発現を最大限に誘導する。（図３）。
ＦＧＦシグナル伝達
【０２１５】
ＰＤ０３２５９０１によるＦＧＦ／ＭＡＰＫシグナル伝達の阻害は、ＬＢ遺伝子発現（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１、ＴＢＸ３、ＨＮＦ４Ａ）の減少を生じたが、ＦＧＦ２の添加は、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１、ＴＢＸ３、ＨＮＦ４Ａ、ＡＦＰ、ＣＥＢＰＡ、ＨＮＦ１ＢのＬＢ遺伝子発現に利益をもたらさなかった。この観察は、細胞によって内因的に産生されたか、又はＣＤＭベース培地成分ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）に外因的に存在する既存のＦＧＦリガンドの存在によって説明され得る（図３）。
ＴＧＦβシグナル伝達
マウス胚では、Ｅ１０．５でリン酸化Ｓｍａｄ２染色がＬＢ細胞で検出され、能動的なシグナル伝達が誘導されたことが示唆された。さらに、リアルタイムＰＣＲ分析により、４〜６日目のＴＧＦβ阻害は、異なるＬＢ遺伝子に別々に影響を及ぼすことが示されている。例えば、アクチビンの添加は、ＬＢ発現（すなわち、ＡＦＰ及びＣＥＢＰＡ）を減少させるが、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ及びＴＢＸ３レベルを増加させる（図３）。アクチビンの用量の増加が、ＬＢマーカー発現を低下させるようであるので（図９Ｂ）、アクチビンの効果は用量依存性であるように思われる。ＬＢ特定化におけるアクチビン処理が、後にＡＬＢ発現肝細胞を生成するための細胞の能力に利益をもたらすかどうかを決定するために、細胞を肝臓特異的培地で任意に処置した。
興味深いことに、Ａ８３−０１及びＳＢ５０５１２４によるＴＧＦβの阻害は、その後のＡＬＢの発現を減少させるが、１０ｎｇ／ｍｌでのアクチビンの添加は、その後の分化におけるＡＬＢ発現の後期発現を増加させる（図３Ｄ）。
【０２１６】
これらの結果は、ＬＢ特定化中のアクチビンの早期処理が、これらの細胞が後に高レベルのＡＬＢを発現する能力を促進することを示唆している。
サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達
【０２１７】
プロスタグランジンＥ２は、発生中にゼブラフィッシュの肝細胞への内胚葉の特定化を調節することが示され、ＰＫＡシグナル伝達の上流活性化剤でもある。これとは別に、肝芽の特定化において、ＰＫＡシグナル伝達の他の既知の役割は知られていない。
【０２１８】
ＰＫＡ活性化剤、例えば８−ブロモＣＡＭＰ及びフォルスコリンによる細胞の処理は、肝臓の特定化を促進することが示された。実際、両方の処置は、ＬＢの特定化中に、ＡＦＰ、ＣＥＢＰＡ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１Ｂ、ＰＲＯＸ１、ＴＢＸ３及びＨＮＦ４Ａを含むＬＢマーカーの発現を有意に増加させる（図３）。
Ｗｎｔシグナル伝達
【０２１９】
インビボでの内胚葉、前腸及び肝臓の特定化中、Ｗｎｔシグナル伝達の動的で変化する役割は、インビトロ分化の間において、この経路の一時的に制御された活性化を必要とする。
【０２２０】
この点に関して、初期の肝芽の特定化の間の、３〜６日目のＷｎｔシグナル伝達の早期阻害が、肝細胞様細胞において、より強い肝臓遺伝子発現をもたらしたことが見出された。それから程なく、ＬＢ特定化段階で、Ｗｎｔ３Ａ又はＣＨＩＲ９９２０１の添加は、増殖を促進し、より高いＬＢ遺伝子発現を誘導する。（図９Ｃ、図９Ｄ）。
【０２２１】
これらの結果は、ＰＫＡ、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ及びＲＡが初期の肝臓対膵臓の特定化において役割を果たすことを示した。系譜境界の正確な区分は、運命マーカーの限定された発現に反映される。例えば、肝臓、膵臓及びＭＨＧ前駆細胞は、肝芽前駆細胞、膵臓内胚葉及びＭＨＧマーカーを、それぞれ交差混入する系譜発現なしで排他的に発現する。具体的には、ｈＰＳＣ由来のＬＢ、ＭＨＧ及び初期膵臓内胚葉の遺伝子発現は、ＨＮＦ１Ａ、ＣＥＢＰＳ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６、ＨＥＸ、ＮＲ５Ａ１、ＴＢＸ３、ＰＤＸ１、ＯＤＤ１、ＭＮＸ１、ＥＶＸ１及びＣＤＸ２などの主要系譜指定子又は転写因子の遺伝子発現境界の区分を示す。
肝芽（ＬＢ）前駆細胞への効率的な分化
【０２２２】
ＤＥは、それをＲＡ、ＦＧＦ、ＢＭＰ４で処理し、同時にＴＧＦβシグナル伝達を１日阻害することにより、ＰＦＧに分化させた（「ＢＡＲＦ」）。続いて、アクチビン及びＢＭＰで３日間処理することにより、ＰＦＧからＬＢ前駆細胞を特定化した（ＡｃｔＢ）。この２工程方法は、「ＳＲ２」と呼ぶことができる。
【０２２３】
合わせて、この分化戦略は、Ｈ１（図３）、Ｈ７、ＨＥＳ２及びＨＥＳ３（図示せず）を含む多様なｈＥＳＣ株由来のＡＦＰ、ＣＥＢＰＡ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１Ｂ、ＰＲＯＸ１、ＴＢＸ３及びＨＮＦ４Ａ肝芽前駆細胞の高度に均質な分化がもたらされ、それは、免疫染色により確認した。
【０２２４】
方法「ＳＲ２」の有効性を、ＲＴｑＰＣＲを用いた既存の肝誘導条件と比較した。高純度のＤＥから出発して、ＤＥは、続いて、分化因子の（ｉ）ＳＲ２、（ｉｉ）ＢＭＰ４及びＦＧＦ２を次の４日間、又は（ｉｉｉ）２日間ＦＧＦ７及びＳＢを用い、別の２日間次のＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＢＭＰ４を用いて最初に前腸の特定化を誘導する「ＦＳＢ」、で処理した。  この点に関して、ｑＰＣＲは、方法ＳＲ２が、他の２つのアプローチ（“Ｚｈａｏ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３，１５７−１６１”及び“Ｓｉ  Ｔａｙｅｈ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１，２９７−３０５”」と比較して、ＣＥＢＰＡ、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６及びＰＲＯＸ１の最も高い発現を誘導することを明らかにした。逆に、ＭＨＧマーカーＣＤＸ２は、記載された方法（ｉｉ）から誘導された集団においてアップレギュレートされた（図１７）。
【０２２５】
要約すると、ＳＲ２分化アプローチは、以前のプロトコルよりもより多くのＬＢ前駆細胞集団を生成する；この時間枠にわたってＬＢ誘導に関与するシグナル伝達経路の以前に強調された重要性をさらに確認する。
ｈＰＳＣ、内胚葉、ＬＢ前駆細胞において特異的に発現される細胞型特異的細胞表面マーカーの同定
【０２２６】
ヒト前駆細胞は、インビボで多量かつ高純度でのアクセスが困難である。インビトロで作製された豊富かつ幾分均質なｈＰＳＣ、ＤＥ、ＬＢ及びＭＨＧ集団を利用して、高スループットの細胞表面マーカースクリーニングを行った（２４２個の表面マーカー及びアイソタイプコントロール）。これらの分析は、３つの発生段階のそれぞれに特異的な細胞表面マーカーを同定した。例えば、未分化ｈＰＳＣ濃縮（ＣＤ２１、ＣＤ３０、ＣＤ４４、ＣＤ５０、ＣＤ６６、ＣＤ１００、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２０５、ＣＤ２７１、ＣＤ３０９、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１）、ＤＥ濃縮（ＣＤ１１７、ＣＤ１１２及びＣＤ１８４）及びＬＢ濃縮（ＣＤ９９、ＣＭＲＦ４４及びＥＧＦＲ）マーカー（図５、図１１）。ＣＤ９９は、他の内胚葉下流の誘導体（図示せず）にある程度存在するが、ＣＤ９９はＬＢ集団において遍在的に発現されるが（＞９０％）、前のｈＰＳＣ及びＤＥ段階では見られなかった（図５、１１）。この傾向は、Ｈ１、Ｈ７、ＨＥＳ２、及びＨＥＳ３細胞株全体にわたって一貫しており、ＣＤ９９はｈＰＳＣからのＬＢ特定化の漸進的段階で細胞を追跡するのに役立つことを示唆している。（図５、図１１）。
【０２２７】
さらに、ＭＨＧ細胞の非存在下でＬＢ細胞を排他的に単離し濃縮するために、ＭＨＧ細胞ではなくＬＢ細胞上で唯一発現された細胞表面マーカーの同定が求められた。ＣＤ３２５は〜７５％のＭＨＧ細胞上に発現するが、ＬＢ細胞では発現せず、ＥＧＦＲは〜７０％のＬＢ細胞で発現するが、ＭＨＧ細胞上には存在しないことが見出された（図５、図１１）。
ＩＩＩ．肝前駆細胞への肝芽（ＬＢ）分化
ＦＧＦ／ＭＡＰＫ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、ＨＧＦ及びＷｎｔシグナル伝達は、肝前駆細胞対胆のう特定化を媒介する
【０２２８】
ＡＬＢは、Ｅ９．５の肝芽において検出されないが、その後、Ｅ１０．５肝臓において発現され、ＡＬＢ−肝芽細胞からの転移が起こったことを示唆する。従って、ｈＰＳＣ由来ＬＢ細胞からのＡＬＢ発現を促進するシグナル伝達条件を調べた。
【０２２９】
ＡＬＢ−から、より分化したＡＬＢ＋状態へのＬＢ前駆細胞の進行を調節するシグナルを同定するために、複数のシグナル伝達経路を、ＡＬＢ発現（ＦＧＦ、ＷＮＴ、Ｎｏｔｃｈ、ＨＧＦ、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ、ＴＧＦβ、及びＢＭＰを含む）に対するそれらの効果について体系的にスクリーニングした。
サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達
【０２３０】
９〜１２日目に肝芽前駆細胞を８−ブロモＣＡＭＰ及びフォルスコリンで処理すると、ＦＡＨ、ＰＡＨ、ＨＧＤ、ＨＰＤ、ＴＡＴ、ＣＰＳ１、ＣＹＰ３Ａ４などの機能的肝臓酵素の発現が増強され、肝前駆細胞マーカーＡＬＢの発現が促進される（図４Ａ）。
ＢＭＰシグナル伝達
【０２３１】
ＢＭＰ４のＬＢ細胞への添加は、肝前駆細胞におけるＡＬＢ発現を促進し、ＢＭＰシグナル伝達の阻害は逆に肝臓遺伝子の発現を強く抑制することが見出された（図４Ａ）。
ＴＧＦβシグナル伝達
【０２３２】
ＳＢ５０５１２４を用いた７〜１２日目、９〜１２日目又は７〜１０日目の間の肝細胞（ＬＢ段階を超えた）の長期間の処理は、肝細胞様細胞を生成する肝前駆細胞の能力を低下させ、ＡＬＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＰＳ１、ＦＡＨ、ＴＡＴ、ＰＡＨ、ＨＧＤ、ＨＰＤ及びＭＡＩなどの肝臓遺伝子の低発現をもたらす。一方、７〜８日目の短期のＳＢ５０５１２４処理は、ＴＡＴ、ＦＡＨ、ＰＡＨ、ＨＧＤ、ＨＰＤ、及びＭＡＩのより高い機能性肝臓遺伝子発現をもたらした（図４Ａ）。言い換えれば、短期のＴＧＦｂ阻害は、一般に、下流の肝細胞様細胞に分化する能力のある肝前駆細胞を誘導した。
Ｗｎｔシグナル伝達
【０２３３】
Ｗｎｔシグナル伝達は、肝臓の特定化の間に時間的に動的な役割を果たすが、まずそれは前腸で抑制され、その後、ＬＢの特定化中に活性化された。その後、ＡＰＣ不活性化／β−カテニン活性化による肝芽のカノニカルｗｎｔシグナル伝達の異所的活性化は、マウス肝臓の低形成、ＡＬＢ発現の遮断、及び肝細胞分化の失敗をもたらした。
【０２３４】
この点に関して、初期の前腸又はＬＢの特定化（第４〜６日）中の早期Ｗｎｔ阻害は下流の肝細胞の特定化を促進する一方、Ｗｎｔ活性化が肝芽の拡張及び特定化を促進するが（図９Ｄ）、ＬＢ前駆細胞の後のＷｎｔ活性化は、それらのＡＬＢ発現及び肝臓運命への進行を阻害する（図１０）ことが示されている。
【０２３５】
従って、７日目〜１０日目のＷｎｔアゴニストの除去は、ＡＬＢ発現を強く増強し、Ｗｎｔ経路がＡＬＢ発現を阻害することを示している（図１０）。
ＦＧＦシグナル伝達
【０２３６】
肝芽前駆細胞のＦＧＦ２処理（２０ｎｇ／ｍｌ）はＡＬＢ発現の減少をもたらし（図１０）、ＳＯＸ９発現をわずかに増加させるようでもあり（図１０）、肝臓対胆のう運命の選択の分離における役割を示唆している。
【０２３７】
この結果は、ＦＧＦが、ニワトリ肝芽細胞外植片の胆のう特定化を促進するという知見と一致する。逆に、ＦＧＦ阻害剤ＰＤ１７３０７４又はＭＡＰＫ阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２を用いたＬＢ細胞の２日間の短時間の処理は、肝臓遺伝子のその後のより高い発現をもたらした（図４ＡＶ）。これらの結果は、ＦＧＦシグナル伝達の阻害がＬＢ前駆細胞状態の退出を促したことを示唆した。
【０２３８】
このように、７〜１０日目のＦＧＦアゴニストの除去は、ＡＬＢ発現を強く増強し、ＦＧＦ経路がＡＬＢ発現を阻害することを示す。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達
【０２３９】
Ｊａｇｇｅｄ−１は、Ｅ１２．５で肝細胞近くの門脈内皮に発現するＮｏｔｃｈリガンドであり、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子であるＨｅｓ１はＥ１４．５で発現する。逆に、肝臓発生中のＮｏｔｃｈの活性化は、異所性の胆のうの特定化をもたらす。出生後の肝細胞でさえも、Ｎｏｔｃｈ活性化は胆のう運命への転換をもたらす。
【０２４０】
ＤＡＰＴ又はＲＯ４９２９０９７によるＮｏｔｃｈ阻害は、ＡＬＢを増強する一方で、ＳＯＸ９発現を減少させることが示された（図４Ａ）。
【０２４１】
従って、ＬＢ上のＮｏｔｃｈ阻害剤処理はまた、ＡＬＢ発現を増強し、ＳＯＸ９発現を低下させるようであり、再プログラミングされた肝細胞及び肝臓オルガノイドからの以前の結果を反映している。これは、Ｎｏｔｃｈ阻害がＬＢ前駆細胞の次の肝前駆細胞状態への進行を促進することを示唆している。
【０２４２】
従って、Ｎｏｔｃｈ（ＤＡＰＴ又はＲＯ４９２９０９７）経路の同時遮断は、６−ＴＢＸ３＋ＬＢ前駆細胞を後のＡＬＢ＋肝前駆細胞状態に駆動するために使用された。
ＨＧＦシグナル伝達
【０２４３】
マウス胚では、ｃＭｅｔ及びＨＧＦの転写産物がＥ１１によって検出される。成体マウスにおいて、ＨＧＦシグナル伝達は、肝臓の部分的切除時に肝細胞の再生において役割を果たす。Ｅ１４マウス肝細胞の初代培養物へのＨＧＦの添加もまた、それらの成熟を促進した。従って、ＬＢ様細胞へのＨＧＦの添加はＡＬＢの発現を促進することが発見された（図１７Ｂ）。
ＯＳＭ及びＤＥＸ添加はＡＬＢ発現及びＴＢＸ３下方制御を促進する
【０２４４】
Ｎｏｔｃｈ阻害剤の添加及びＨＧＦによる処理によって、ＬＢ段階からＡＬＢ＋段階への進行が促進されるが、ＯＳＭ及びＤＥＸもＡＬＢ発現を促進することが見出された（図１０）。
ＩＶ．肝臓成熟を促進する発達シグナルもまた、成人ヒト肝表現型の維持を促進する
【０２４５】
初代ヒト肝細胞は、インビトロ培養中に退行し、それらの生体異物酵素の発現を失うことが知られている。従って、遺伝子発現プロファイリングは、０，１，３，５及び７日間のコースにわたって市販の培地を用いたインビトロ培養中に、ヒト肝細胞に対しＲＮＡ−ｓｅｑによって実施した。多くの機能的に重要な肝臓遺伝子の急激な減少が観察された。ＱＰＣＲの検証により、タンパク質代謝酵素（ＡＲＧ１）、炭水化物代謝酵素（ＰＣＫ１）及び生体異物調節因子及びＰ４５０シトクロム酵素（ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ３Ａ４）が培養１日後に急激に下方制御されることが確認された（図１４）。
【０２４６】
肝機能の自発的な喪失はインビボで観察されていないので、肝臓におけるシグナル伝達環境からの解放が、肝遺伝子発現の調節不全及び肝臓成熟の喪失をもたらしたと仮定された。しかしながら、肝細胞の表現型成熟の喪失の間に、ＳＯＸ９及びＡＦＰの発現の有意な増加は検出されなかった。さらに、ＲＢＰＪ（Ｎｏｔｃｈメディエータ）、ＳＭＡＤ２（ＴＧＦｂメディエータ）、ＷＮＴ４（Ｗｎｔリガンド）、ＷＮＴ１１（Ｗｎｔリガンド）などのシグナル伝達経路の構成要素の遺伝子発現は調節不全であるようである。例えば、ＲＢＰＪ及びＳＭＡＤ２発現は増加するが、ＷＮＴ４及びＷＮＴ１１発現は下方制御される。
【０２４７】
肝細胞の特定及び／又は成熟を促進するシグナルはまた、インビトロ培養中の肝臓成熟のそのような喪失及び遺伝子発現を改善すると考えられた。従って、２日後の肝臓遺伝子への影響を決定するために、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦｂ、Ｗｎｔ、並びにエストロゲン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＰＫＡ／ｃＡＭＰ経路を含む他の主要なシグナル伝達経路を含めて、調節不全と思われるシグナル伝達経路を調べた。
【０２４８】
シトクロム酵素（例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７及びＣＹＰ７Ａ１）の発現は、標準培地で培養して２日後に下方制御されることが見出された。しかしながら、小分子シグナル伝達阻害剤（ＤＡＰＴ及びＲＯ４９２９０９７）によるＮｏｔｃｈ阻害は、肝細胞を５時間だけ解凍した後に匹敵するレベルまで、前述のシトクロム酵素の大部分の発現を上方制御した（図１４）。肝細胞におけるＮｏｔｃｈの活性化は、それらを胆のう運命へと変換する。
【０２４９】
同様に、Ａ８３−０１又はＳＢ−５０５１２４によるＴＧＦβの阻害は、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７及びＣＹＰ７Ａ１の発現を増加させた（図１１）。特に、シトクロム発現に対するＳＢ−５０５１２４の効果は、Ａ８３−０１よりも強く現れる。具体的には、ＴＧＦβは、門脈周囲よりも静脈周囲特定化を促進することが示され、それにより、アクチビンは用量依存的にＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７発現を促進し、より高い用量（例えば１００ｎｇ／ｍｌ）でより大きく増加することが示された。これは、ＴＧＦβが肝臓発生中の胆のう運命の特定化を促進することを考えると驚くべきことである。他方、アクチビン処理は、門脈周囲遺伝子の下方制御をもたらすようである（図１２）。ＴＧＦβの阻害はまた、ＡＢＣＣ２及びＡＢＣＣ３の発現を増強する（図１４）。
【０２５０】
成体マウスにおいて、Ｗｎｔシグナル伝達は、タンパク質代謝酵素の帯状発現を調節することが実証されている。本発明において、Ｗｎｔ３ａ／ＧＳＫ３ｂ処理は、静脈周囲の生体異物遺伝子発現（例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５及びＣＹＰ３Ａ７）を増加させることが発見された（図１４）。ＧＳＫ３阻害／Ｗｎｔ活性化は、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３及びＡＢＣＢ１１を含む先端及び基底トランスポータの発現を促進する。
【０２５１】
さらに、ｄ１３〜１８における小分子Ｃ５９又はＤｋｋ１によるＷｎｔ阻害は、ＡＬＢ、ＣＹＰ３Ａ７の発現を促進する（図１４）。逆に、ＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９２０１）の添加は、肝臓遺伝子の発現を大幅に減少させる（図１４）。
【０２５２】
肝細胞のｈＰＳＣからの分化の間、ＰＫＡ／ｃＡＭＰシグナル伝達は、ＡＬＢ、ＣＹＰ３Ａ４、及びチロシン代謝遺伝子の肝臓遺伝子発現を増加させる上で主要な役割を果たす。
【０２５３】
成人の初代肝細胞において、８−ブロモＣＡＭＰ及びｓｐＣＡＭＰのようなＰＫＡ／ｃＡＭＰアゴニストは、静脈周囲遺伝子発現（例えば、ＣＹＰ１、ＣＹＰ２及びＣＹＰ３ファミリーのメンバー）を減少させながら、門脈周囲遺伝子発現を促進する。逆に、ｃＡＭＰアンタゴニストＲｐＣＡＭＰは、ｐ４５０シトクロム発現を促進した（図１５）。これに関して、ＰＫＡアゴニズムは、ＣＰＳ１、ＡＲＧ１及びＧ６Ｐのような門脈周囲遺伝子の発現を増加させ、一方で、同時に、静脈周囲遺伝子発現を減少させることが示された。これは、ＰＫＡ／ｃＡＭＰの活性化が、静脈周囲運命よりも門脈周囲系譜の系譜分離を促進することを支持する。
【０２５４】
さらに、ビタミン誘導体、９−Ｃｉｓ−ＲＡは、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ１、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ１Ａ１の発現を増強する一方、逆にＡＲＧ１、ＯＴＣ、ＡＳＬ１及びＣＰＳ１などの門脈周囲遺伝子の発現を低下させることが示された（図１３）。
【０２５５】
ＰＫＧシグナル伝達はまた、門脈周囲及び静脈周囲遺伝子発現を調節することが示された。肝臓前駆細胞のＰＫＧアンタゴニスト、１４００Ｗジヒドロクロリド及びＫＴ５８２３での処理は、いずれも、ＦＡＨ、ＰＡＨ、ＨＧＤ、ＴＡＴ、ＣＰＳ１、ＡＲＧ１、ＦＢＡ、ＦＢＢ及びＦＢＧの発現を上方制御する。一方、ＰＫＧアゴニストＳ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）処理は、ＦＡＨ、ＣＹＰ３Ａ４の減少、及びＧＳ発現の増加をもたらす（図１０）。
肝前駆細胞又は肝細胞のインスリン及びアスコルビン酸処理は、ｈＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるチロシン代謝遺伝子の発現を増加させる
【０２５６】
肝臓の１つの重要な機能は、チロシン代謝物として知られるタンパク質代謝の毒性副生成物を分解することである。遺伝性チロシン血症１型及びチロシン血症２型を含む肝代謝障害は、フマリルアセトアセテート加水分解酵素（ＦＡＨ）及びチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）などの酵素の欠乏に起因する。チロシン代謝経路は、ＰＡＨ、ＨＧＤ、ＨＰＤ、ＴＡＴ、ＭＡＩ、及びＦＡＨを含む一連の酵素を含む。
【０２５７】
このように、ｈＰＳＣ由来肝細胞におけるこれらのチロシン代謝遺伝子の有意に高い発現を誘導し得るシグナル伝達因子を調べた。
【０２５８】
驚くべきことに、肝臓の特定化中の７日目〜１２日目まで間のヒト組換えインスリン処理は、ＰＡＨ、ＨＧＤ、ＨＰＤ、ＴＡＴ、ＭＡＩ、及びＦＡＨを含む機能的に重要な肝臓遺伝子の発現を有意に増加させることが見出された（図４）。ＡＬＢ、ＣＰＳ１及びＣＹＰ３Ａ４などの他の遺伝子も強く増強されている（図６）。その後の１３日目から１６日目までのインスリンの処理は、チロシン代謝遺伝子及びＣＹＰ３Ａ４のような生体異物代謝遺伝子を増強し続ける（図４）。
【０２５９】
アスコルビン酸のより安定な形態であるＬ−アスコルビン酸−２−リン酸（ＡＡ２Ｐ）による肝芽前駆細胞の、７日目〜１２日目及び１３日目〜１６日目の後期段階での処理も、肝臓成熟を有意に促進した。例えば、ＡＡ２Ｐ処理では、ＰＡＨ、ＨＧＤ、ＨＰＤ、ＴＡＴ、ＭＡＩ、ＦＡＨ、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＬＢ及びＣＰＳ１の発現の増強が観察される（図４）。
【０２６０】
さらに、７日目〜１２日目の間のアミノ酸の添加は、肝臓遺伝子発現を促進することが示され（図１０）（１３日目〜１６日目は促進しない）、これは、高められたアミノ酸レベルが肝臓成熟に有益であることを示唆している。
【０２６１】
肝臓の成熟及び複雑な代謝機能の達成には、より高いレベルのリン脂質が必要であり、それは、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア及びリソソームのような膜が豊富な細胞小器官の構成要素である。従って、リン脂質前駆体の供給が肝臓成熟を促進するかどうかが検討された。２つの主なタイプのリン脂質は、ホスファチジルコリン（全リン脂質の〜５０％）及びホスファチジルエタノールアミン（リン脂質の約２０〜３０％）である。より高レベルのリン脂質前駆体コリン塩化物の供給が、ＡＬＢ、ＦＡＨ、ＰＡＨ、ＴＡＴ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＡＴ、ＴＨＲ、ＦＢＡ、ＦＢＢ、ＦＢＧ及びＴＢＸ３の発現を増加させることが見出された（図１０）。
ｈＰＳＣ由来の肝前駆細胞による肝臓の再増殖
【０２６２】
真に生着し、増殖し、宿主肝臓を再増殖させ、肝機能を回復させるｈＰＳＣ由来肝前駆細胞の生成は、依然として困難な目標のままである。ＦＲＧ−／−遺伝的マウスモデルは、天然のＦＡＨ−／−肝臓細胞における損傷を誘導するために広く使用されており、従ってＦＡＨ＋肝臓細胞の選択の利点を提供する。ＦＡＨを発現するｈＥＳＣ由来の肝前駆細胞の確実性を試験するために、細胞をＦＲＧ−／−マウスに経腔的に移植し、ＮＴＢＣの休薬により慢性肝障害を誘導し、ｉ）再増殖の程度、ｉｉ）細胞の局在、ｉｉｉ）ヒト血清アルブミンの分泌、ｉｖ）ビリルビンレベルの程度、ｖ）生存率、及びｖｉ）ＡＬＢ及びＦＡＨの発現を測定した。
【０２６３】
抗アポトーシス遺伝子ＢＣＬ２を異所的に発現するＨ９及びＨ７  ｈＥＳＣ及び野生型Ｈ１  ｈＥＳＣは、移植のための肝前駆細胞を生成するためのｈＥＳＣの供給源として使用される。成人のヒト凍結保存肝細胞及び細胞を含まない培地は、それぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとしてマウスに脾臓内注射される。
【０２６４】
移植３ヶ月後、マウス肝臓において、ヒトＡＬＢ発現肝細胞が検出され、ｈＰＳＣ由来肝細胞のマウス肝臓への組込みが示された。これらのヒト細胞は、肝小葉全体に分散し、門脈及び中心静脈を含む脈管構造近くに局在しているようである（図６）。血管及び類同毛細血管の近傍の肝臓におけるこれらの細胞の分散は、アルブミンなどのタンパク質の分泌を促進し得る（図６）。
【０２６５】
特に、〜１０〜２００ｎｇ／ｍｌのヒトアルブミンが、マウス血清（ｎ＝７）において検出され、移植された肝臓による分泌（図６）及びこれらのマウスの血清中のビリルビンレベルの減少を示す（図６）。ｈＰＳＣ由来の肝細胞を移植したマウスの生存率は、非細胞注入コントロールと比較して改善されている（図６）。
【０２６６】
まとめると、これらの結果は、宿主器官への移植肝細胞の機能的統合及び肝臓損傷の改善を示す。
ｈＰＳＣ由来ＬＢ及び肝前駆細胞の特性
【０２６７】
ｈＰＳＣ由来のＬＢ細胞（６日目）及びｈＰＳＣ由来の中／後腸（ＭＨＧ）細胞に対して、リオプレート（ｌｙｏｐｌａｔｅ）スクリーニングを行う。ＣＤ３２５は〜７５％のＭＨＧ細胞上に発現するが、ＬＢ細胞では発現せず、ＥＧＦＲは〜７０％のＬＢ細胞上に発現するが、ＭＨＧ細胞上には存在しないことが示された（図５、図１１）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【国際調査報告】
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