(57)【要約】【解決手段】提供されるのは、個体において全身性紅斑性狼瘡を診断又は観察する方法、系、及びキットである。特定の態様において、個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している自己抗体が定量化される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程を含む方法。
【請求項２】
Ｔリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルは、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプル中のＴリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球、及びＣＤ８＋細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも１つのＴリンパ球型によって表される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している全身性紅斑性狼瘡の診断用バイオマーカーのレベルを更に定量化する工程を更に含んでおり、診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄ、Ｃ３ｄ、補体経路のＣ４構成要素、及び補体経路のＣ３構成要素からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
（ａ）個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程と、
（ｂ）（ａ）におけるレベルを、コントロールＴリンパ球の表面に付着又は接触している自己抗体のレベルと比較する工程とを含んでおり、
（ａ）におけるサンプル由来の自己抗体のレベルの増加が、個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する方法。
【請求項７】
Ｔリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルは、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のＴリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球、及びＣＤ８＋細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも１つのＴリンパ球型によって表される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している全身性紅斑性狼瘡の診断用バイオマーカーのレベルを更に定量化する工程を更に含んでおり、診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄ、Ｃ３ｄ、補体経路のＣ４構成要素、及び補体経路のＣ３構成要素からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
（ａ）個体から白血球を含む血液サンプルを得る工程と、
（ｂ）血液サンプルから末梢血単核細胞集団を単離する工程と、
（ｃ）末梢血単核細胞集団を、末梢血単核細胞集団内のＴリンパ球の細胞表面に結合した自己抗体に特異的に結合する検出可能試薬を用いてインキュベートすることで、Ｔリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体を形成する工程と、
（ｄ）Ｔリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルを測定する工程と、
を含む方法。
【請求項１５】
Ｔリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体は、フローサイトメトリーによって測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
個体から得たＴ細胞−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルを、コントロール血液サンプルから得た類似のＴリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルと比較する工程を更に含んでおり、コントロール血液サンプルと比較した個体の血液サンプル由来のＴリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルの増加が、個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
検出可能試薬は、フローサイトメトリーによって検出可能な蛍光標識抗ヒトＩｇ抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
蛍光標識抗ヒトＩｇ抗体は、蛍光標識抗ヒトＩｇＧ抗体及び蛍光標識抗ヒトＩｇＭ抗体からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
キットであって、
（ａ）Ｔリンパ球に結合する自己抗体を特異的に認識する蛍光標識抗体であって、抗ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗ＩｇＭモノクローナル抗体である抗体と、
（ｂ）随意選択的に、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球とを識別する系統特異的Ｔリンパ球表面マーカーと反応性のフルオロ結合モノクローナル抗体と、
（ｃ）随意選択的に、１又は複数の生化学試薬と、
（ｄ）随意選択的に、全身性紅斑性狼瘡の診断におけるキットと（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の構成要素の使用についての説明書と、
を含むキット。
【請求項２０】
フルオロ結合モノクローナル抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ５、及びＣＤ２５からなる群から選択される特定のＴリンパ球表面マーカーに反応性を有する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察するためのシステムであって、
プロセッサと、
プログラム命令を含む非一時的なコンピュータ読出可能記憶媒体と、
を備えており、
プログラム命令は、実行されると、
（ａ）個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程と、
（ｂ）（ａ）におけるレベルを、コントロールＴリンパ球の表面に付着又は接触している自己抗体のレベルと比較する工程であって、（ａ）におけるサンプル由来の自己抗体のレベルの増加が個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する、工程と、
行うようにプロセッサに命令するように構成されている、システム。
【請求項２２】
Ｔリンパ球の表面に付着又は接触している、個体の自己抗体のレベルを、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
サンプル中のＴリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ＋Ｔｈ２リンパ球、及びＣＤ８＋細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも１つのＴリンパ球型によって表される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２６】
Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２７】
命令は更に、実行されると、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している全身性紅斑性狼瘡の診断用バイオマーカーのレベルを更に定量化するようにプロセッサに指示するように構成された命令を含んでおり、診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄ、Ｃ３ｄ、補体経路のＣ４構成要素、及び補体経路のＣ３構成要素からなる群から選択される、請求項２１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜連邦政府による資金提供を受けた研究の記載＞
本発明は、（ｉ）国立衛生研究所により付与された契約第ＲＯ１  ＡＩ０７７５９１号及び（ｉｉ）米国国防総省により付与された研究認可第Ｗ８１ＸＷＨ−０６−２−００３８号の下の政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１４年８月８日出願の米国仮特許出願第６２／０３５０７３号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ」の利益を主張し、この出願の開示は、引用を以てその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）（全身性自己免疫疾患の原型）は、過剰な自己抗体産生、補体系の活性化、リンパ球機能不全やリンパ球減少などの様々な免疫異常によって特徴付けられる。補体系が活性化すると、Ｃ３及びＣ４のタンパク質分解切断が起こって、最終的にＣ３ｄフラグメント及びＣ４ｄフラグメントが生じる。これらは、高反応性のチオエステル部分を含んでおり、病原体、細胞、又は免疫複合体の表面に共有結合することができる。本発明者らは最近、Ｃ４ｄが有意なレベルで、ＳＬＥ患者の赤血球、網状赤血球、血小板及びリンパ球の表面に特異的に存在することを報告した。最近の多施設研究により、細胞結合補体活性化産物（cell-bound complement activation products）（ＣＢ−ＣＡＰ）が、狼瘡の診断用バイオマーカーとして有効であると認められ、更なる報告は、狼瘡疾患の活性及び階層化（stratification）のバイオマーカーとしての大きな可能性を実証した。
【０００４】
狼瘡バイオマーカーとしての役割に加えて、ＣＢ−ＣＡＰは、赤血球やＴリンパ球などの循環細胞に機能異常を与えることが分かっており、狼瘡の病因における関与が示唆される。ＣＢ−ＣＡＰを生じさせる細胞事象及び分子事象の解明は、ＣＢ−ＣＡＰ生成のダウンストリーム効果を防止、破壊、又は中和することによって、可能性がある治療薬ターゲットの同定に至り得る。ＣＢ−ＣＡＰと狼瘡の病因との最も興味深い潜在的な関係の１つは、ＳＬＥ患者が循環抗リンパ球抗体を宿すという、以前からあるが十分に理解されていない観察報告である。
【０００５】
ＳＬＥ患者における抗リンパ球抗体（ＡＬＡ）、特にＴ細胞特異的ＡＬＡは、１９７０年代に発見された。それ以来、ＡＬＡの特性を明らかにする多くの取組みがなされてきた。しかしながら、疾患の病因へのその関与は、不確かなままである。ＳＬＥにおいて主要な２つの型の抗Ｔ細胞抗体が既に説明されている。最初に、Ｔ細胞に４℃で最適に結合する低温反応性ＩｇＭ抗体が、ＳＬＥ患者において一般的なものとして報告された。しかしながら、当該抗体のインビボでの重要性は不明である。なぜなら、インビトロアッセイとインビボの病原性分子及び細胞機構との間に熱的差異があるためである。次に、狼瘡における中温反応性ＩｇＧ抗Ｔ細胞抗体が報告された。当該抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５やＩＬ−２Ｒなどの種々のＴ細胞表面分子に対する特異性が不均一であることが分かっている。
【０００６】
狼瘡の病因について、これらのＩｇＭ抗Ｔ細胞抗体とＩｇＧ抗Ｔ細胞抗体の２つの異なる関与が示唆されており、双方とも細胞ターゲットの破壊を伴うものである。ＩｇＭは、古典的補体経路の活性化に５００倍有効であり、Ｔ細胞の溶解攻撃作用の可能性を示唆している。しかしながら、低温反応性ＩｇＭ分子の結合が低温でしか起こらないのであれば、このことで、インビボでのこの可能性は除外されるであろう。また、ＩｇＭ抗Ｔ細胞抗体の存在は、ＳＬＥにおいて、リンパ球の減少と相関することは示されなかった。ＩｇＧは、あまり強力でない補体活性化剤である。しかしながら、その中温反応性は、そのようなインビボ機構を少なくとも実行可能とする。抗Ｔ細胞ＩｇＧについて、可能性がある他の役割として、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）と、Ｔ細胞シグナル伝達及び遺伝子発現の調節とが含まれることが示唆されている。
【０００７】
幾つかの報告は、狼瘡におけるＴリンパ球機能不全は、固有の欠陥（intrinsic defect）に起因しているというよりもむしろ、循環ＩｇＭ抗Ｔ細胞自己抗体及びＩｇＧ抗Ｔ細胞自己抗体がトリガーとなるかもしれないことを示唆している。しかし、２つの可能性は互いに相容れなくはない。纏めると、先行する報告によれば、抗Ｔ細胞抗体は、一部のＳＬＥ患者において存在し、そして疾患の病因におけるその潜在的関与の解明には、アイソタイプ、結合及び細胞障害作用の温度振幅（thermal amplitude）、並びに抗原特異性が考慮されるべきであることが示唆されている。
【発明の概要】
【０００８】
ある態様において、非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患（nonsystemic lupus erythematosus inflammatory disease）又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法及びシステムが提供される。当該方法及びシステムは、個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化することを含む。
【０００９】
ある態様では、キットが提供され、当該キットは、（ａ）Ｔリンパ球に結合する自己抗体を特異的に認識する蛍光標識抗体であって、抗ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗ＩｇＭモノクローナル抗体である抗体と、（ｂ）随意選択的に、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球とを識別する系統特異的Ｔリンパ球表面マーカーと反応性を有するフルオロ結合モノクローナル抗体と、（ｃ）随意選択的に、１又は複数の生化学試薬と、（ｄ）随意選択的に、全身性紅斑性狼瘡の診断におけるキットと、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の構成要素との使用についての説明書とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａ〜図１Ｆは、Ｃ４ｄが、ＳＬＥ患者においてＣＤ８Ｔ細胞に対してＣＤ４Ｔ細胞に特異的に結合し得ることを示す。ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８を有するＴ細胞に結合したＣ４ｄのレベルを、来院日に得た単一の血液サンプルを用いて、同時に測定した。６人の代表的なＳＬＥ患者のフローサイトメトリーのヒストグラムが示されており、同じ患者における所定の時間でのＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞上の類似の（パネルＡ及びパネルＢ）、又は異なる（パネルＣ〜パネルＦ）レベルでＣ４ｄが存在することを示している。クローズドヒストグラムは、Ｉｇアイソタイプコントロール染色を表す。オープンヒストグラムは、Ｃ４ｄ特異的染色を表す。
【００１１】
【図２Ａ】図２Ａは、Ｃ４ｄ及びＩｇが、ＳＬＥ患者においてＴ細胞の表面に同時に存在するが、他の疾患患者又は健康なコントロールにおいて存在しないことを示している。３２６人のＳＬＥ患者から調製した末梢血ＣＤ３Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって、表面結合Ｉｇ（Ｔ−Ｉｇ）及び表面結合Ｃ４ｄ（Ｔ−Ｃ４ｄ）について測定した。ＳＬＥ患者の４つの異なる群、Ｃ４ｄ−／Ｉｇ−（青色の菱形符号）、Ｃ４ｄ＋／Ｉｇ＋（赤色の正方形符号）、Ｃ４ｄ＋／Ｉｇ−（緑色の三角形符号）、及びＣ４ｄ−／Ｉｇ＋（水色の円形符号）が示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｃ４ｄ及びＩｇが、ＳＬＥ患者においてＴ細胞の表面上に同時に存在するが、他の疾患患者又は健康なコントロールにおいて存在しないことを示している。ＳＬＥ患者（ｎ＝３２６）、他の疾患（ｎ＝１８５）患者、及び健康なコントロール（ｎ＝４８）から得たＣＤ３Ｔ細胞のＴ−Ｉｇレベルを、フローサイトメトリーによって測定した。赤色の水平線は、Ｔ−Ｉｇ陽性について、実験に基づいて決定したカットオフを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｃ４ｄ及びＩｇが、ＳＬＥ患者においてＴ細胞の表面上に同時に存在するが、他の疾患患者又は健康なコントロールにおいて存在しないことを示している。Ｔ細胞に結合したＣ４ｄ及びＩｇのレベルを、来院日に得た単一の血液サンプルを用いたフローサイトメトリーによって測定した。１０人のＳＬＥ患者の代表的な結果が示されている。
【００１２】
【図３Ａ】図３Ａは、Ｔ−Ｃ４ｄ及びＴ−Ｉｇのレベルが経時的に変動するが、ＳＬＥ患者における特定のＴ細胞サブセットのレベルと概ね相関することを示している。（Ａ）Ｔ細胞に結合したＣ４ｄのレベル（明るい色のカラム）及びＩｇのレベル（暗い色のカラム）を、異なる来院時に得た単一の血液サンプルを用いたフローサイトメトリーによって測定した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｔ−Ｃ４ｄ及びＴ−Ｉｇのレベルが経時的に変動するが、ＳＬＥ患者における特定のＴ細胞サブセットのレベルと概ね相関することを示している。（Ｂ）ＳＬＥ患者のＣＤ４（明るい色のカラム）Ｔ細胞及びＣＤ８（暗い色のカラム）Ｔ細胞の表面に存在するＣ４ｄ及びＩｇを、多色フローサイトメトリー分析を用いて測定した。
【００１３】
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、血漿及び免疫グロブリンが、ドナーのＴＣ４ｄのシグネチャを正常なＴ細胞に移すことを示している。健康なコントロールから調製したＰＢＭＣは、処理されず（パネルＡ；ベースライン表現型）、２人のＴ−Ｃ４ｄ＋ＳＬＥ患者の血漿（パネルＢ１及びＣ１）又は精製したＩｇ（パネルＢ２及びパネルＣ２）でインキュベートされた。ネガティブコントロールとして、細胞は、健康なコントロールの血漿（パネルＤ１）と、又は精製したＩｇ（パネルＤ２）とでインキュベートされた。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｄは、血漿及び免疫グロブリンが、ドナーのＴＣ４ｄのシグネチャを正常なＴ細胞に移すことを示している。健康なコントロールから調製したＰＢＭＣは、処理されず（パネルＡ；ベースライン表現型）、２人のＴ−Ｃ４ｄ＋ＳＬＥ患者の血漿（パネルＢ１及びＣ１）又は精製したＩｇ（パネルＢ２及びパネルＣ２）でインキュベートされた。ネガティブコントロールとして、細胞は、健康なコントロールの血漿（パネルＤ１）と、又は精製したＩｇ（パネルＤ２）とでインキュベートされた。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｄは、血漿及び免疫グロブリンが、ドナーのＴＣ４ｄのシグネチャを正常なＴ細胞に移すことを示している。健康なコントロールから調製したＰＢＭＣは、処理されず（パネルＡ；ベースライン表現型）、２人のＴ−Ｃ４ｄ＋ＳＬＥ患者の血漿（パネルＢ１及びＣ１）又は精製したＩｇ（パネルＢ２及びパネルＣ２）でインキュベートされた。ネガティブコントロールとして、細胞は、健康なコントロールの血漿（パネルＤ１）と、又は精製したＩｇ（パネルＤ２）とでインキュベートされた。
【００１４】
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、ＳＬＥ患者由来の抗Ｔ細胞自己抗体が、ドナーのＴ−Ｃ４ｄのシグネチャを、正常なＴ細胞で生じさせることができることを示している。（Ａ）ＩｇＧ及びＩｇＭを、ＳＬＥ患者（ＳＬＥ１０２０８６、ＳＬＥ１０１６０６、及びＳＬＥ１０２７６３（Ｔ−Ｃ４ｄレベルが高い））、ＳＬＥ患者（ＳＬＥ１０２７７１（Ｔ−Ｃ４ｄレベルが低い））、及び健康なコントロール（ＨＣ２００９及びＨＣ２０３４）の血漿から精製した。精製したＩｇを、インビトロ移行に用いた。（Ｂ）患者ＳＬＥ１０２０８６、ＳＬＥ１０１９１９、及びＳＬＥ１２８３０５の血漿について、ＩｇＧ及びＩｇＭを欠乏させ、又は、健康なコントロールから調製した多数の白血球を用いて前もって吸収して、リンパ球反応性Ｉｇを欠乏させた。その後、Ｉｇ欠乏血漿、又は白血球プレ吸収済み血漿を、インビトロ表現型の移行実験に用いた。
【００１５】
【図６Ａ】図６Ａは、ＳＬＥと健康なコントロールとの識別におけるＲＯＣ比較を示す。図６Ａは、測定した全てのバイオマーカーとのＲＯＣ比較を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＬＥと健康なコントロールとの識別におけるＲＯＣ比較を示す。図６Ｂは、ＳＬＥと健康なコントロールとの識別における、ＣＢ−ＣＡＰバイオマーカー（ＴＣ４ｄ、ＥＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、及びＢＣ４ｄ）のサブセットとのＲＯＣ比較を示す。
【００１６】
【図７Ａ】図７Ａは、ＳＬＥと他の疾患との識別におけるＲＯＣ比較を示す。図７Ａは、測定した全てのバイオマーカーとのＲＯＣ比較を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＳＬＥと他の疾患との識別におけるＲＯＣ比較を示す。図７Ｂは、ＳＬＥと他の疾患との識別における、ＣＢ−ＣＡＰバイオマーカー（ＴＣ４ｄ、ＥＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、及びＢＣ４ｄ）のサブセットとのＲＯＣ比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の特許出願の開示が、引用を以て本明細書に組み込まれる：（１）特許協力条約国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／７３９８３号（２０１３年１２月１０日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ」）；及び（２）特許協力条約国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／０１５０３２号（２０１４年２月６日出願、表題「Ｃｅｌｌ−Ｂｏｕｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅ−Ｌｕｐｕｓ」）。
【００１８】
本明細書で用いられているように、「炎症性疾患又は炎症病態」は、個体において炎症の増悪を引き起こす任意の免疫疾患又は免疫状態を指す。炎症性疾患又は炎症病態はまた、個体において炎症の増悪を引き起こす任意の感染症又は感染状態にも言及している。一部の実施形態において、炎症性疾患又は炎症病態は、「慢性炎症性疾患又は慢性炎症病態」である。慢性炎症性疾患又は慢性炎症病態は、何週か、何カ月か、又はそれ以上の期間の後にも解消しない炎症病態である。慢性炎症病態が、急性炎症病態に続く場合もあるし、一部の疾患又は状態について、急性炎症性疾患又は急性炎症病態の不在下で出現する場合もある。炎症性疾患又は炎症病態として、以下が挙げられる：ＳＬＥ、慢性関節リウマチ、脈管炎（その特定の形態がヴェゲナー肉芽腫である）、硬皮症、特発性炎症性筋炎、シェーグレン症候群、血清病、移植拒絶反応、鎌状血球貧血、痛風、妊娠の合併症、例えば子癇前症、多発性硬化症、心血管疾患、感染症、例えばＣ型肝炎ウィルス感染、未分化結合組織病又はオーバーラップ結合組織病、レイノー病、骨関節炎、乾癬性関節炎、原発性抗リン脂質症候群、皮膚狼瘡など。これらの疾患又は状態はそれぞれ、慢性炎症性疾患又は慢性炎症病態として記載される場合もある。
【００１９】
本明細書中で用いられる「全身性紅斑性狼瘡」、「ＳＬＥ」、又は「狼瘡」は、多臓器障害をもたらす原型自己免疫疾患である。この抗自己応答は、種々の核及び細胞質の細胞構成要素に対して向けられる自己抗体によって特徴付けられる。これらの自己抗体はそれぞれの抗原に結合して免疫複合体を形成し、これが循環して最終的に組織中に付着する。この免疫複合体の付着、及び結果として起こる補体系の活性化が、慢性的な炎症及び組織損傷を引き起こす。
【００２０】
本明細書中で用いられる「非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態」、「非ＳＬＥ炎症性疾患又は非ＳＬＥ炎症病態」、又は「非狼瘡炎症性疾患又は非狼瘡炎症病態」は、全身性紅斑性狼瘡、ＳＬＥ、又は狼瘡でない任意の炎症性疾患或いは炎症病態であり、慢性関節リウマチ、脈管炎（その特定の形態がヴェゲナー肉芽腫である）、硬皮症、特発性炎症性筋炎、シェーグレン症候群、血清病、移植拒絶反応、鎌状血球貧血、痛風、妊娠の合併症、例えば子癇前症、多発性硬化症、心血管疾患、感染症、例えばＣ型肝炎ウィルス感染、未分化結合組織病又はオーバーラップ結合組織病、レイノー病、骨関節炎、乾癬性関節炎、原発性抗リン脂質症候群、皮膚狼瘡などが挙げられるが、これらに必ずしも限定されない。
【００２１】
本明細書で用いられているように、「白血球」は、赤血球でも網状赤血球でもない循環血球、例えば、Ｔリンパ球及びＢリンパ球、ＮＫ細胞、好酸球、好塩基球、顆粒白血球、好中球、単球、マクロファージ、巨大核細胞、形質細胞、循環内皮細胞、及び幹細胞に言及している。
【００２２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、丸型の核を有する任意の血球に対応できる。そのような細胞は、免疫応答に関与することが知られている。ＰＢＭＣとして、例えば、リンパ球、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球及びＮＫ細胞、単球、並びにマクロファージが挙げられる。
【００２３】
本発明を実施するのに利用されることが好ましいＰＢＭＣは、Ｔリンパ球に対応する。用語「Ｔリンパ球」は、本明細書中で、分化の任意のステージにあるＴリンパ球を指し、未感作ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球、及び成熟ＣＤ４＋又はＣＤ８＋リンパ球、例えばＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球（細胞表面にてＣＤ４を発現するヘルパーＴ細胞）、及びＣＤ８＋細胞障害性細胞（細胞表面にてＣＤ８を発現する細胞障害性Ｔリンパ球）が挙げられる。この目的で、そのような任意の細胞亜集団が、細胞ベースのそのようなマーカーを特異的に認識する抗体を用いることによって検出されてよい。そしてより具体的には、限定として意図されないが例として、用語「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を特異的に認識する抗体」は、ＰＢＭＣ集団上に存在するそのようなマーカーを特異的に認識する任意の抗体を指し、検出されるべきＰＢＭＣ集団がＴ細胞集団であるならば抗ＣＤ３抗体、又は検出されるべきＰＢＭＣ集団が細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）集団であるならば抗ＣＤ８抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書で用いられているように、「コントロール白血球」、「コントロールＰＢＭＣ」、又は「コントロールＴリンパ球」は夫々、本明細書中で定義される、炎症性疾患を患ってもいなければ炎症病態にもなく、ＳＬＥを患っていない、又はより低いレベルの炎症性疾患若しくは炎症病態（ＳＬＥを含む）しか示さない個体から単離された白血球、ＰＢＭＣ、又はＴリンパ球に言及している。これらにより、ＳＬＥを患う個人との比較によって、そのような「コントロール」Ｔリンパ球の何れかと比較された場合に、Ｔリンパ球に対する自己抗体の結合又は関係の、統計学的に意味がある増大が示される。炎症性疾患又は炎症病態が患者において診断又は観察されている場合、コントロール白血球、コントロールＰＢＭＣ、又はコントロールＴリンパ球はまた、より早い時期、例えばより早い週、月又は年に、同じ患者から単離された各細胞型に言及し得る。
【００２５】
本明細書で用いられているように、「補体経路の構成要素」は、タンパク質Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、及びそれらのフラグメント、例えば、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ｂ２ａ、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｃ、Ｃ４ｄ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｉ、Ｃ３ｄｇを含んでいる。また、Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１ｉｎｈ、ＭＡＳＰ１、ＭＡＳＰ２、ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＤ５９、Ｃ３ａＲ、Ｃ５ａＲ、Ｃ１ｑＲ、ＣＲ２、ＣＲ３、及びＣＲ４、並びに、本明細書で詳細には記載されない他の補体経路構成要素、受容体、及びリガンドも含まれる。
【００２６】
ある実施形態において種々のプロセス及びシステムを含む又は実施するハードウェアが用いられてよい。ハードウェアは、プロセッサ、例えば、プログラム命令を実行するように作動するＣＰＵを含んでよい。プログラム命令は、非一時的なコンピュータ読出し可能媒体、例えばリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、コンパクトディスク、デジタルディスク、フラッシュメモリ、メモリカード、ＵＳＢドライブ、光ディスク記憶媒体、分散コンピュータストレージプラットフォーム、例えばクラウドベースのアーキテクチャ、及び／又は他の記録媒体上に記憶されてよい。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、用語「プロセッサ」は、シングルプロセッサに言及し、又は、種々のプロセス工程を一緒に実施するマルチプルプロセッサに言及する。同様に、「記憶デバイス」又は「データベース」は、シングルデバイス又はシングルデータベースの言及し、或いは、プログラム命令及び／又はデータが全体にわたって分散されているマルチプルデバイス又はマルチプルデータベースに言及する。
【００２８】
＜略語＞
ＡＬＡ−抗リンパ球自己抗体（anti-lymphocyte autoantibodies）
【００２９】
ＡＤＣＣ−抗体依存性細胞障害作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity）
【００３０】
ＣＢ−ＣＡＰ−細胞結合補体活性化産物（cell-bound complement activation products）
【００３１】
Ｃ４ｄ−補体Ｃ４活性化産物Ｃ４ｄ（complement C4 activation product C4d）
【００３２】
Ｉｇ−免疫グロブリン（immunoglobulin）
【００３３】
ＳＬＥ−全身性紅斑性狼瘡（systemic lupus erythematosus）
【００３４】
Ｔ−Ｃ４ｄ−Ｔ細胞結合Ｃ４ｄ（T cell-bound C4d）
【００３５】
補体活性化産物Ｃ４ｄを有するＴ細胞は、ＳＬＥの診断用バイオマーカーとしてかなり感度が良く、且つ特異的であることが分かっている。Ｃ４ｄを有するＴ細胞はまた、機能的に異常であり、狼瘡の病因における細胞結合補体活性化産物（ＣＢ−ＣＡＰ）についての関与を示唆している。しかしながら、Ｃ４ｄを有するＴ細胞（Ｔ−Ｃ４ｄ）の生成を担う機構は、今まで特定されていない。本発明者らは、横断研究及び前向き研究を行なって、ＳＬＥにおける、Ｔ−Ｃ４ｄシグネチャの生成に果たす抗Ｔ細胞自己抗体の潜在的な役割を調査した。ＳＬＥ患者、他の炎症性疾患患者、及び健康なコントロール由来のＴ細胞が、フローサイトメトリーによって、Ｃ４ｄ及び／又は免疫グロブリン（Ｉｇ）の表面付着について測定された。患者からフレッシュに単離されたリンパ球が、細胞表面上の免疫グロブリン（即ち、ＡＬＡ）の存在について、フローサイトメトリーによって、患者の血清又は血漿中で先にインキュベーションされることなく、直接分析された。インビトロ表現型移行実験が実行されて、Ｔ−Ｃ４ｄシグネチャをインビトロで生じさせる能力について、ＳＬＥ患者由来のＩｇが測定された。結果から、ＳＬＥの個々の患者は、当該患者のＴ細胞及びＴ細胞サブセット上のＣ４ｄ及び／又はＩｇの存在を反映する特異的シグネチャを有することが実証されている。また、シグネチャドナーから精製されたＩｇへの曝露によって、正常なＴ細胞に、ＳＬＥ患者特異的シグネチャがインビトロで移行され得る。補体活性化は、Ｃ５ｂ−９（膜攻撃複合体）又は細胞溶解の発生を介して進行せず、Ｔ−Ｃ４ｄは、リンパ球減少と相関しない。いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、これらの結果から、患者特異的Ｔ−Ｃ４ｄシグネチャは、半溶解（sublytic）補体活性化をトリガーする抗Ｔ細胞自己抗体によって生じることが示唆される。このことは重要であるが、以前は、狼瘡の病因において、自己抗体と補体活性化との複雑な相互作用における関連が認識されていなかった。Ｔ−ＩｇがＴ−Ｃ４ｄの付着を引き起こす、Ｔ−ＩｇとＴ−Ｃ４ｄとの因果関係が、狼瘡患者において、狼瘡診断にとってだけでなく、疾患活性の観察にとっても重要であり得ると考えられる。
【００３６】
抗Ｔリンパ球抗体及びＣＢ−ＣＡＰの細胞への付着における２つの重要な特徴に基づいて、併用アッセイは、ＳＬＥ患者において疾患活性を観察するのに特に有用であり得ると考えられている。第一に、本発明者らは、抗Ｔ細胞抗体が、細胞表面へのＣＢ−ＣＡＰの付着を引き起こすことを実証したので、細胞表面上にＣＢ−ＣＡＰが同時に存在しない抗Ｔ細胞抗体の検出を用いることで、ＣＢ−ＣＡＰがその後付着して、疾患活性の増大に寄与することとなると予測できる。対照的に、抗Ｔ細胞抗体の不在下でのＣＢ−ＣＡＰの存在は、抗Ｔ細胞抗体が事前に付着していたことを示すことができて、そしてそれに応じて疾患活性に関して洞察を与えることができる。抗Ｔ細胞抗体及びＣＢ−ＣＡＰ双方の同時存在又は同時不在は、現在の疾患活性を反映すること、又は将来の活性を予測することができると考えられる。第二に、本発明者らは以前に、ＣＢ−ＣＡＰは、一旦付着すると、細胞の表面に共有結合して、おそらく、細胞の寿命の間、常時結合したままであることを実証した。対照的に、抗Ｔ細胞抗体は、共有結合しないので、結合後の任意の時期でも細胞から放出され得る。いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、ＣＢ−ＣＡＰによる細胞の常時タギングに対する抗Ｔ細胞抗体のそのような「ヒットエンドラン」特性は、細胞のターゲティングがいつ起こったかについての洞察を与えることができ、かつ患者の疾患活性を観察且つ予測するのに有用であり得ると考えられる。
【００３７】
本発明の一実施形態は、異なる炎症性疾患又は炎症病態（即ち、非全身性紅斑性狼瘡（「ＳＬＥ」）炎症性疾患又は非ＳＬＥ炎症病態）由来の合併症を有しているかもしれない個体とは異なる個体におけるＳＬＥの特異的な診断法及び／又は観察法を開示する。その方法論は、個体の自己抗体のレベルを定量化する工程を含んでおり、自己抗体は、個体の血液サンプルから得られたＴリンパ球の表面に付着しており、接触しており、又は安定に結合しているある種の形態にある。サンプルは、Ｔリンパ球の集団などの白血球を含む。この目的で、そして分析のために個体から得られた血液サンプルに関して、本発明の別の実施形態は、Ｔリンパ球の表面上付着した、又は表面と接触している、個体の自己抗体のレベルが、個体の血液サンプルから得られた末梢血単核細胞の集団から測定される方法論を開示する。
【００３８】
本明細書を考察すると、任意の代表的なＴリンパ球型が、開示されるこの方法論の範囲によって包含されることが理解されるであろう。即ち、Ｔリンパ球は、個体の血液サンプルから得られたものであり、これらは、代表的なＴリンパ球であってよく、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球、ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球、及び他のＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ４＋Ｔｈ９ヘルパー細胞、ＣＤ４＋Ｔｈ１７ヘルパー細胞、ＣＤ４＋Ｔ濾胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞、及びＣＤ４＋調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない）からなる群から選択されてよい。
【００３９】
これらの実施形態は、非ＳＬＥ炎症性疾患又は非ＳＬＥ炎症病態ではなくＳＬＥの特定の限定詞（determiner）として、個体内に存在する抗Ｔ細胞自己抗体を単一集中検出と定量化することに関する一方で、本発明の更なる実施形態は、定量化の集中と、個体内に存在する抗Ｔ細胞自己抗体の定量化に加えて、血液サンプル（例えばＰＢＭＣ）から得られるＴリンパ球の表面に付着又は接触しているＳＬＥ診断用バイオマーカーのレベルを検出及び定量化する。この二次診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄ、Ｃ３ｄ、補体経路のＣ４構成要素、及び補体経路のＣ３構成要素からなる群から選択される。実施形態において、好ましい二次診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄである。
【００４０】
別の実施形態は、異なる炎症性疾患又は炎症病態由来の合併症（即ち、非ＳＬＥ炎症性疾患又は非ＳＬＥ炎症病態）を患っている虞がある個体とは異なる個体において、ＳＬＥを確定的に診断か及び／又は観察する方法を開示している。ある工程は、個体の自己抗体のレベルを定量化することを含んでおり、当該自己抗体は、白血球の集団を含んでいる個体の血液サンプルから得られたＴリンパ球の表面に付着している、Ｔリンパ球の表面と接触している、又は、Ｔリンパ球の表面と安定結合している何らかの形態にあり（個体から単離されたＰＢＭＣの調製が挙げられるが、これに限定されない）、付加的な工程と組み合わされる。付加的な工程には、（本明細書にて定義されているように、例えば、コントロール血液サンプルから得られた末梢血単核細胞の集団から調製されたＴリンパ球の集団を含む）類似する「コントロール」サンプルを得る工程と、試験される個体のレベルを、Ｔリンパ球のコントロール集団の表面に付着又は接触している自己抗体のレベルと比較する工程とが含まれる。試験される個体におけるサンプル由来の自己抗体のレベルの増加は、その個体内のＳＬＥを特定する。ここでも、この特定の実施形態は、代表的なＴリンパ球型として、個体の血液サンプルから得られ得る任意のＴリンパ球を意図しており、当該Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球、ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球、及び他のＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ４＋Ｔｈ９ヘルパー細胞、ＣＤ４＋Ｔｈ１７ヘルパー細胞、ＣＤ４＋Ｔ濾胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞、及びＣＤ４＋調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が挙げられるがこれらに限定されない）からなる群から選択されることが理解されるであろう。
【００４１】
加えて、本明細書に記載されているように、Ｔリンパ球の集団を含む試験（即ち、個体の）サンプル、及びコントロールＴリンパ球の集団を含む「コントロール」サンプルの両方の測定は、先に開示したように、Ｔリンパ球の表面に付着又は接触することが知られており、ＳＬＥと関連している付加的な診断用バイオマーカー又は診断用バイオマーカーセットのレベルを定量化するような付加的な測定を更に含んでよいと考えられる。そのような診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄ、Ｃ３ｄ、補体経路のＣ４構成要素、及び補体経路のＣ３構成要素からなる群から選択される。実施形態において、好ましいバイオマーカーは、Ｃ４ｄである。
【００４２】
本明細書で開示される別の実施形態は、非ＳＬＥ炎症性疾患又は非ＳＬＥ炎症病態とは異なる個体においてＳＬＥを確定的に診断又は観察する方法を包含している。当該方法は、白血球を含む血液サンプルを個体から得る工程と、血液サンプルから末梢血単核細胞集団を単離する工程と、末梢血単核細胞集団内のＴリンパ球の細胞表面に結合した自己抗体に特異的に結合する検出可能試薬で末梢血単核細胞集団をインキュベートする工程と、Ｔリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体を形成する工程と、Ｔリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルを測定する工程とを含んでいる。この方法論は、例えば、フローサイトメトリーに関する技術において説明されている任意の既知の方法論を用いたＴリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体の測定、認識、又は定量化に十分適している。コントロールサンプルに対する、試験個体由来のそのような任意の複合体のレベルの比較に関して先に開示されているように、この実施形態はまた、個体から得られたＴ細胞−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルを、コントロール血液サンプルから得られた類似のＴリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルと比較することを意図している。試験サンプルとコントロールサンプル間でのこのような測定比較は、特定の個体内のＳＬＥを診断する又は継続的に観察するのに更に有益であろう。
【００４３】
本明細書でさらに開示されるように、検出可能試薬は、フローサイトメトリーによって検出可能な蛍光標識抗ヒトＩｇ抗体であってよく、特に、本明細書を通して開示されているように、蛍光標識抗ヒトＩｇＧ抗体及び蛍光標識抗ヒトＩｇＭ抗体からなる群から選択される蛍光標識抗ヒトＩｇ抗体であり得るが、それらに限定されない。
【００４４】
別の実施形態は、個体におけるＳＬＥを特定診断する又は観察するためのキットを提供する。そのキットは、Ｔリンパ球に結合する自己抗体を特異的に認識する蛍光標識抗体（抗ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗ＩｇＭモノクローナル抗体が挙げられるが、決してこれらに限定されない）を含んでよく、随意選択的に、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球とを識別する系統特異的Ｔリンパ球表面マーカーと反応性のフルオロ結合モノクローナル抗体を含んでおり、随意選択的に１又は複数の生化学試薬を含んでおり、そして、随意選択的に、ＳＬＥの診断又は観察におけるキット及びキット構成要素の使用説明書を含んでいる。そのような任意のキットはまた、本明細書に開示されているように、（Ｔリンパ球に結合することが見出された個体の自己抗体以外の）１又は付加的なバイオマーカーの同定に適していてよい。当該バイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ５、及びＣＤ２５からなる群から選択された特定のＴリンパ球表面マーカーに反応性を有するフルオロ結合モノクローナル抗体（flouro-conjugated monoclonal antibodies）のキットの包含物であってよいが、これらに限定されない。
【００４５】
先に記載された診断及び疾患活性観察の方法と併用して、非ＳＬＥ炎症性疾患又は非ＳＬＥ炎症病態とは異なる個体における、少なくともＴ細胞−自己抗体−検出可能試薬の複合体の測定を用いて、場合によっては、補体経路構成要素（Ｃ４ｄ及び／又はＣ３ｄが挙げられるが、これらに限定されない）の付加的な測定を更に用いて、ＳＬＥを明確に診断又は観察するのに用いられる判定は、手動で実行されてよい。しかしながら、多くの場合、自動化されたシステム及び／又は装置を用いて実行されるのが便利であり、そこでは、血液サンプル（又は、例えば、単離されたＰＢＭＣ画分）は、必要な判定をするように自動的に分析され、ベース又は基準値との比較は、その目的に適したコンピュータソフトウェアを用いて、自動的に実行される。
【００４６】
故に、本発明の一実施形態は、非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察するためのコンピュータシステムを含んでいる。当該システムは、プロセッサと、プログラム命令を格納した非一時的なコンピュータ読出可能記憶媒体とを含んでいる。当該プログラム命令は、実行されるとプロセッサに命令して、個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化して、その後、個体のレベルを、コントロールＴリンパ球の表面に付着又は接触している自己抗体のレベルと比較するように構成されている。個体からのサンプルの自己抗体のレベルが高いと、個体のＳＬＥが同定される。この目的で、本発明の方法に用いられるそのような任意のコンピュータソフトウェア、又はコンピュータ読出可能媒体は、血液サンプルから得られた末梢血単核細胞の集団から測定された、Ｔリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルに対応するデータを受信するためのコードを含むコンピュータ読出可能媒体を含んでよい。当該Ｔリンパ球は、サンプル中の少なくとも１つのＴリンパ球型によって表され、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球、ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球、及び他のＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ４＋Ｔｈ９ヘルパー細胞、ＣＤ４＋Ｔｈ１７ヘルパー細胞、ＣＤ４＋Ｔ濾胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞、及びＣＤ４＋調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない）からなる群から選択される代表的なＴリンパ球が挙げられる。加えて、本発明の方法に用いられるそのような任意のコンピュータソフトウェア、又はコンピュータ読出可能媒体は、Ｔリンパ球の表面に付着又は接触することが知られており、ＳＬＥと関連する付加的なバイオマーカーのレベルに対応するデータを受信するためのコードを含むコンピュータ読出可能媒体を含んでよい。診断用バイオマーカーは、Ｃ４ｄ、Ｃ３ｄ、補体経路のＣ４構成要素、及び補体経路のＣ３構成要素からなる群から選択され、好ましい一つは、Ｃ４ｄである。別の態様では、本発明の方法に用いられるそのようなコンピュータソフトウェア、又はコンピュータ読出可能媒体に関し、任意の付加的なキット構成要素の個々の使用レベルに対応するデータを受信するためのコードを含むコンピュータ読出可能媒体が挙げられる。当該キット構成要素は、例えば、当該本明細書で記載されているように、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ５、及びＣＤ２５からなる群から選択される特定のＴリンパ球表面マーカーに反応するフルオロ結合モノクローナル抗体である。
【００４７】
本発明者らは以前に、補体活性化産物、特にＣ４ｄが、ＳＬＥ患者において循環細胞に高いレベルで特異的に結合することによって、狼瘡診断についてかなり感度が良く、且つ特異的であるＣＢ−ＣＡＰのシグネチャが生じることを実証している。狼瘡患者の大半は、Ｃ４ｄ及び／又はＣ３ｄを有する赤血球、リンパ球、血小板、及び他の循環細胞を、個々の患者に固有の細胞特異的パターンで有する。これらのＣＢ−ＣＡＰのシグネチャの生成を担う機構は、今まで特定されていない。本発明者らは、抗細胞特異的自己抗体がＣＢ−ＣＡＰ付着の原因かもしれないと仮定して、抗Ｔ細胞自己抗体の役割の可能性に特に焦点を合わせた。本明細書では、半溶解補体活性化を介したＴＣＤ３−Ｃ４ｄ、ＴＣＤ４−Ｃ４ｄ、及びＴＣＤ８−Ｃ４ｄのシグネチャの生成における抗Ｔ細胞自己抗体の役割を裏付けており、これが、狼瘡における以前に認識されていなかった病原性機構であることを示唆する証拠が提供される。
【００４８】
第一に、８０％を超える狼瘡患者が、高度に患者特異的であるＣＢ−ＣＡＰのシグネチャを有することが既に実証されている。これらのシグネチャの原因である機構は、過去に確定されていない。自己抗体が、細胞表面でのＣ４ｄ付着における特定のパターンの生成について自然と疑われるであろう。しかしながら、細胞表面での補体の抗体媒介活性化により、溶血性貧血において、そして、リツキシマブ等の剤を用いたモノクローナル抗体媒介Ｂ細胞欠乏療法において観察されるような細胞の破壊が生じると一般的に考えられる。本発明者らは、抗Ｔ細胞自己抗体が、狼瘡患者において循環Ｔ細胞に存在すること、そしてＴ−Ｉｇ／Ｔ−Ｃ４ｄパターンが、個々の患者間で経時的に合致することを本明細書で実証している。さらに、Ｔ細胞にＩｇ及びＣ４ｄを有する狼瘡患者から精製されたＩｇＭ及びＩｇＧは、Ｔ−Ｃ４ｄのシグネチャを健康なＴ細胞に移行することができる。纏めると、これらの観察は、Ｔ細胞の表面における古典的補体経路の活性化が、ＳＬＥ患者において一般的に起こることを裏付けている。Ｔ−Ｃ４ｄシグネチャとリンパ球減少の相関の欠如と、これらＴ細胞における膜攻撃複合体の不足とは、古典的経路の活性化が、Ｃ５転換酵素の顕著な生成を介して進行しないことを実証する。
【００４９】
第二に、ＳＬＥ患者の抗Ｔ細胞自己抗体は、４０年以上前に最初に発見されたが、疾患の病因における明らかな役割は明確にされていなかった。ある課題は、低温反応性ＩｇＭがどのようにインビボ温熱状態にて病原性であり得るかについて調整することであった。いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、本明細書に記載される研究から、低濃度のＩｇＭ自己抗体が、Ｔ細胞にインビボで結合することが可能であり、細胞溶解を引き起こすことのないＣ４ｄの付着の原因となることが示唆される。
【００５０】
第三に、本研究の結果は、現在までのＣＢ−ＣＡＰの全報告に記載される奇妙な観察を説明することができる。異常なレベルのＣ４ｄを有する特定の細胞型は、所定の患者において、フローサイトメトリーヒストグラムによって反映されるように、ほぼ常に一様に陽性である。例えば、患者のＣＢ−ＣＡＰシグネチャがＴＣＤ３−Ｃ４ｄを含むならば、その患者における全ＣＤ３細胞はＣ４ｄ陽性となるであろうし、各細胞上のＣ４ｄのレベルは類似するであろう。これは、Ｆｃの受容体又は補体活性化産物を有する細胞のサブセットにしか結合し得ない細胞上の循環免疫複合体の付着によって生じるパターンと対照的である。いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、狼瘡患者において循環抗Ｔ細胞自己抗体は、全循環Ｔリンパ球を認識することによって、各細胞にＣ４ｄ付着を生じさせる能力を有すると考えられる。このモデルが、Ｔ細胞上で、そしておそらく他の細胞で観察されるＣＢ−ＣＡＰの均質パターンを説明する。
【００５１】
第四に、いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、本明細書に記載される観察によってさらに、ＣＢ−ＣＡＰシグネチャは、無害なバイスタンダー細胞での全身性補体活性化及び付着によるのではなく、細胞特異的なターゲティング機構を介して生じるという仮説を裏付ける。
【００５２】
いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、Ｔ−Ｉｇシングル陽性患者は、疾患が起こっている間におけるターゲットＴ細胞への可逆的Ｉｇ結合によって説明され得る。当該結合は、Ｔ細胞上でのＣ４ｄの付着を触媒する。Ｃ４ｄは、一旦生じてＴ細胞表面に共有結合すると、開始自己抗体がＴ細胞から離れた場合ですら、安定したままであり得る。幾つかのＩｇＧサブクラス（例えば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４）の抗Ｔ細胞自己抗体は、補体系の活性化をトリガーして、Ｃ４ｄなしでＩｇを結合する表現型を生じさせるのに非効率的であるかもしれない。付加的なＡＬＡ独立機構の存在によって、ＣＡＰが生じてＴ細胞に付着することも考えられる。しかしながら、ＳＬＥ患者における特徴的な自己抗体過剰産生を考慮すると、ＡＬＡ媒介機構は、細胞特異的、そして患者特異的なＴ−Ｃ４ｄ表現型の培養において支配的な役割を演じるらしいと考えられる。
【００５３】
本発明者らは、ＳＬＥ患者において、Ｔ細胞やＴ細胞サブセットでのＣ４ｄの付着が、抗Ｔ細胞自己抗体によってトリガーされる半溶解補体活性化によって生じることを明らかにした。いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、この以前に認識されていない経路は、自己抗体が古典的補体経路を半溶解能で活性化する病原性悪循環であり得る。Ｃ４ｄの付着は、ターゲットにされた細胞の機能障害に寄与し、この細胞は循環流中に残留し、そして更なる免疫調節不全、自己抗体産生、補体活性化、及び組織損害を引き起こす。
【００５４】
以下の実施例が、本発明をさらに説明するのに役に立つ。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］
＜材料及び方法＞
［研究参加者］
ＳＬＥ患者：確定的ＳＬＥについて米国リウマチ学会の分類基準を満たす３２６人の患者を最初に集め、追跡した。
【００５６】
他の疾患患者：種々の非ＳＬＥ自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、硬皮症、特発性炎症性筋疾患、原発性抗リン脂質症候群、及び未分化結合組織病の患者を合計１８５人、ＳＬＥ患者集団と同じ期間中に集めた。
【００５７】
健康なコントロール：合計４８人の健常者を、地方広告を介して集めた。健康な状態を確かめるために、参加者は既存の医学的状態に関して短い質問事項に答えた。
【００５８】
［血漿及び血清の調製、免疫グロブリンの単離、並びに免疫グロブリンの欠乏］
各参加者の来院時に、抗凝固剤としてＥＤＴＡを含むＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に、４．５ｍｌの血液サンプルを収集した。ＥＤＴＡで凝固を阻止した血液サンプルを、採血後２４時間以内に処理した。１０分間の遠心分離によって８００×ｇで血漿を分画し、４℃（即時の短期使用用）又は−８０℃（将来の長期使用用）で保存した。抗凝固剤のない血清分離チューブに収集した健康なコントロールの血液から、正常なヒト血清を調製し、分注し、使用するまで−８０℃で保存した。Ｐｉｅｒｃｅ  ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）（Ａ／Ｇ）ＩｇＧ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、メーカーの説明書に従って、血漿中に存在する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を単離した。ＩｇＧの収集後、タンパク質Ａ／Ｇアフィニティカラムからのフロースルーを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎａｂ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ  Ｓｐｉｎ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メーカーの説明書に従ってさらに分画して、ＩｇＭを富化した。各アフィニティカラムから溶出したＩｇＧ画分及びＩｇＭ画分を脱塩し、バッファをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に変え、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）遠心フィルタ（分子量カットオフ３０ｋＤ；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、遠心分離によって濃縮した。Ｉｇを欠乏させるために、血漿サンプルを、タンパク質Ａ／Ｇカラム及びタンパク質Ｌカラムに２回連続して通した。最終フロースルーを収集し、ＰＢＳに対して透析し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）装置を用いて元の体積に濃縮し直した。リンパ球反応性Ｉｇを欠乏させるために、血漿サンプル（５０μｌ）を、末梢血リンパ球（１０７個の細胞；健康なコントロール個体から単離した）と４℃で３０分間インキュベートしてから、遠心分離による細胞の除去によって回収した。
【００５９】
［末梢血単核細胞の単離］
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＥＤＴＡで凝固を阻止した血液サンプルから、採血後２４時間以内に勾配遠心分離によって単離した。簡潔に、血液サンプルを遠心分離して、血漿及び細胞を分離した。細胞画分を、３つの分量のＰＢＳで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の上に重ね、室温で２０分間、４００×ｇで遠心分離した。血漿とＦｉｃｏｌｌ溶液間の界面に配置された単核細胞を、フレッシュなチューブ中に慎重に移して、ＰＢＳで充分に洗浄して、混入する血小板を除去し、そしてＰＢＳ中に再懸濁させた。
【００６０】
［Ｔ細胞結合Ｃ４ｄ（Ｔ−Ｃ４ｄ）及びＴ細胞結合免疫グロブリン（Ｔ−Ｉｇ）測定のためのフローサイトメトリーアッセイ］
ＥＤＴＡで凝固を阻止した血液から調製したＰＢＭＣを、ＣＢ−ＣＡＰ検出のために等分量のアリコートに分割した。最近開発された多色フローサイトメトリーアッセイを一部変更して用いて、Ｔ細胞に結合したＣ４ｄ及びＩｇのレベルを測定した。リンパ球、単球、及び残留する顆粒球を、特徴的な表面分子の発現と、前方（サイズ）／側方（粒度）スキャッタリングにおけるそれらに固有の特徴とに基づいて識別した。系統特異的細胞表面マーカー（Ｔ細胞についてのＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）との反応性を有するフィコエリトリン（ＰＥ）−、ＰＥ−Ｃｙ５−、又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−結合マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、Ｚｅｎｏｎ抗体ラベリングキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｉｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素で標識されている、マウスモノクローナル抗ヒトＣ４ｄ  ｍＡｂ（マウスＩｇＧ１；Ｃ４のＣ４ｄ含有フラグメントとの反応性を有する；Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗ヒトＩｇＧ（マウスＩｇＧ１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、或いは、抗ヒトＩｇＭ（マウスＩｇＧ１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と併せて使用した。或いはまた、ＰＥ結合抗ヒトＩｇカッパ鎖、又はＰＥ結合抗ヒトＩｇラムダ鎖（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、抗Ｃ４ｄ及び抗細胞表面マーカー抗体と併用して、Ｔ細胞結合Ｉｇの軽鎖サブタイプを同定した。染色後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメータ及びＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、細胞を分析した。検出される抗体染色の特異性を確実にするために、適切なアイソタイプのマウスＩｇＧで染色した各患者由来の白血球アリコートを、全ての実験にルーチン的に含めた。ＬＢ−ＣＡＰ測定の日々の信頼性を確実にするために、ＣａｌｉＢｒｉｔｅ  ３ビーズと、ＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とを用いて、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータを毎日較正した。細胞結合Ｃ４ｄ及び細胞結合Ｉｇのレベルを、特有の平均（median）蛍光強度（ＳＭＦＩ）として表した。これは、アイソタイプコントロールの平均蛍光強度を引いたＣ４ｄ（又はＩｇ）−特有の平均蛍光強度として算出された。
【００６１】
［インビトロ表現型移行実験］
健康なコントロール、又はＴ−Ｃ４ｄレベルが低いＳＬＥ患者から個別に単離したＰＢＭＣ（５０μｌのＰＢＳ中１０６個の細胞）を、先に記載したフローサイトメトリー分析に基づいて高Ｔ−Ｃ４ｄ／Ｔ−Ｉｇ表現型を有すると同定した個々のＳＬＥ患者から調製した血漿の５０μｌを用いて、インキュベートした。一部の実験においては、ＳＬＥ血漿を、様々な量の精製ＩｇＧ又はＩｇＭ（１００〜１０００μｇ）で、Ｉｇ欠乏血漿で、又はリンパ球を吸収済みの血漿で置換した。４℃にて３０分間インキュベーションした後、ＰＢＭＣ懸濁液をＰＢＳで２回洗浄して、ＧＶＢ２＋バッファ（１％ゼラチン、５ｍＭベロナールＮａ、１４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）の５０μｌ中に再懸濁させ、（補体の源として）正常なヒト血清の５０μｌを用いてインキュベートした。一部のケースにおいては、熱不活化した正常なヒト血清又はＣ１ｑ欠乏ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ）を、ネガティブコントロール血清として用いた。３７℃にて４０分間インキュベーションした後、細胞懸濁液をＰＢＳで２回洗浄し、先に記載した多色フローサイトメトリーアッセイにかけた。
【００６２】
［実施例２］
［ＴＣＤ３−Ｃ４ｄ、ＴＣＤ４−Ｃ４ｄ、及びＴＣＤ８−Ｃ４ｄの患者特異的シグネチャが、ＳＬＥにおいて生じる］
横断研究を行なって、Ｔ細胞上のＣ４ｄのレベルがＣＤ４サブセットとＣＤ８サブセットで類似する、又は異なる患者を同定した。一部の患者において、ＣＤ３＋Ｔ（ＴＣＤ３）細胞のＣ４ｄ染色ヒストグラムは、細胞の単一集団を反映し、ＣＤ４＋Ｔ（ＴＣＤ４）細胞及びＣＤ８＋Ｔ（ＴＣＤ８）細胞のＣ４ｄ染色ヒストグラムは区別できず、２細胞サブセットのそれぞれへのＣ４ｄ結合レベルが等しいことを反映している（図１、パネルＡ及びパネルＢ）。しかしながら、二相性ＴＣＤ３−Ｃ４ｄヒストグラムが、ＳＬＥ患者の多くで観察された（図１、パネルＣ〜パネルＦ）。ＴＣＤ４−Ｃ４ｄ及びＴＣＤ８−Ｃ４ｄアッセイは、これらの二相性ヒストグラムが、個々の患者内のこれらの２つの細胞サブセットにおけるＣ４ｄレベルの差異に起因することを実証した。一部の患者において、ＴＣＤ８細胞と比較してかなり高いレベルのＣ４ｄが、ＴＣＤ４細胞で検出された（図１、パネルＣ及びパネルＤ）。逆に、他の患者におけるＴＣＤ４細胞と比較して有意に高いレベルのＣ４ｄが、ＴＣＤ８細胞に存在し得た（図１、パネルＥ及びパネルＦ）。概して、所定の患者のＴＣＤ４−Ｃ４ｄ／ＴＣＤ８−Ｃ４ｄ特異的な選択的結合プロファイル又はシグネチャは、経時的に安定したままであるように見えたが、細胞に存在するＣ４ｄの実際のレベルは、経時的に変動し得た（表１）。このパターンに対する例外が存在した。結合パターンの「変換」が、疾患の経過中に、一部の患者において起こった（例えば、患者ＳＬＥ５６５２５及びＳＬＥ１０２３５７、表１）。以前に報告されたように、補体Ｃ５ｂ−９（膜攻撃複合体）は、Ｔ細胞で検出されなかった。いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、Ｔ細胞サブセットがＣ４ｄ付着によって選択的にターゲットとなって、患者特異的Ｔ−Ｃ４ｄシグネチャが同定できるというこの結果は、特定の機構がこれらの表現型の生成の原因であり得ることを示唆した。Ｔ−Ｃ４ｄシグネチャは、リンパ球減少と関連しなかった（図示せず）。
【表１】
2017528734.tif 000003
【００６３】
［実施例３］
［免疫グロブリン及びＣ４ｄは、ＳＬＥにおいてＴ細胞に同時に存在する］
Ｔ−Ｃ４ｄのシグネチャの原因である機構は、一部の患者においては、ＴＣＤ８細胞に対してＴＣＤ４細胞でのＣ４ｄの特異的付着の原因であるはずであり、最も可能性が高い説明は、ＴＣＤ８細胞に対してＴＣＤ４細胞に特異的な自己抗体を介するというものであろう。これは、ＳＬＥ患者におけるＴ細胞の表面でのＣ４ｄ（Ｔ−Ｃ４ｄ）及び免疫グロブリン（Ｔ−Ｉｇ）の存在を調査し、かつ相関させるフローサイトメトリー分析によって、調査された。その結果は、ＳＬＥ患者群の有意な画分（約３０％）由来のＴ細胞が、実際に、来院時にＣ４ｄ及びＩｇの双方で同時にデコレートされていることを実証した（図２Ａ）。各患者のＴ−Ｃ４ｄ／Ｔ−Ｉｇ表現型及びレベルの相当な変化に注目した。全員ではないが一部の患者におけるＴ−Ｃ４ｄレベルとＴ−Ｉｇレベルとの良好な相関に注目した。各ヒストグラム内の挿入図は、対応する相関分析を示している。青色のカラム：Ｔ−Ｃ４ｄ；紫色のカラム：Ｔ−Ｉｇ。残りのＳＬＥ患者は、Ｃ４ｄ若しくはＩｇの何れかについてシングルポジティブであり、又はダブルネガティブであった。比較すると、他の疾患の患者及び健康なコントロールのＴ細胞は、表面結合Ｉｇ及びＣ４ｄの双方について、ネガティブであった（図２Ｂ；Ｔ−Ｉｇについてのみデータを示す）。他の自己免疫疾患患者１８５人のうち、２人の患者（両者ともシューグレン症候群）のみが、Ｔ細胞の表面に存在するＩｇのレベルが有意に高かった。２人の患者のうち１人はまた、Ｔ−Ｃ４ｄレベルも有意に高かった。
【００６４】
任意の時点で、Ｃ４ｄ及びＩｇの双方（図２Ｃ、パネルａ）、Ｃ４ｄのみ（図２Ｃ、パネルｃ）、又はＩｇのみ（図２Ｃ、パネルｅ）を有するＴ細胞を、異なるＳＬＥ患者において検出することができた。異なる患者におけるＴ細胞上での、そして同じ患者におけるＴ細胞サブセット上でのＣ４ｄ及びＩｇの共存、又は個別の存在に注目した。一部のケースにおいて、様々なレベルのＩｇ及びＣ４ｄを有するＴ細胞の異なる亜集団を、同じ患者内で同時に検出することができた（図２Ｃ、パネルｂ及びパネルｄ）。この後者の発見は、これらの亜集団が、動的Ｉｇ／Ｃ４ｄ結合プロセスにおいて、あるステージから次のステージに移行中の細胞を表すかもしれないことを示唆した。
【００６５】
選択したＳＬＥ患者の群を追跡して、Ｔ細胞上のＣ４ｄ及びＩｇの存在を周期的に、９から３３ヵ月にわたって経時的に調査した。図３Ａに示すように、個々の患者の間で、Ｔ−Ｃ４ｄ及びＴ−Ｉｇの双方のレベル、並びにＣ４ｄ及び／又はＩｇを有するＴ細胞の頻度及び比率は、経時的にかなり変化した。一部の患者において、Ｔ−Ｃ４ｄレベルとＴ−Ｉｇレベルは、全ての来院を通して強く相関した（例えば、患者＃ＳＬＥ  １０２７６３、Ｒ２＝０．７０６３；患者＃ＳＬＥ  １０１５９２、Ｒ２＝０．９５５１）。しかしながら、一部の患者において、Ｔ−Ｃ４ｄレベルとＩｇレベルとの一般的相関は、来院のサブセットに制限された（例えば、患者＃ＳＥＬ  １０２３２６の来院１、３、及び５回目）。これらの結果はさらに、個々の患者間で変動し得る動的Ｉｇ／Ｃ４ｄ結合プロセスを示唆する。
【００６６】
さらに、Ｔ細胞の特定のサブセットにおける表面結合Ｉｇの存在が、その特定のＴ細胞亜集団でのＣ４ｄのレベルの増大と相関することに注目した。例えば、ＴＣＤ４細胞での選抜された高いＴ−Ｃ４ｄレベルは、所定の患者におけるＴＣＤ４細胞でのＴ−Ｉｇレベルの選抜された増大と対応し（図３Ｂ、パネルａ及びパネルｂ）、その逆も同様である（図３Ｂ、パネルｃ及びパネルｄ）。一部の患者においてＴＣＤ８細胞よりも高いレベルのＩｇがＴＣＤ４細胞で検出された場合（パネルａ）、ＴＣＤ８細胞よりも高いレベルのＣ４ｄがＴＣＤ４細胞で検出された（パネルｂ）点に注目されたい。高いＣ４ｄレベル（パネルｃ）とＩｇレベル（パネルｄ）間の類似した相関が、ＴＣＤ８細胞について観察された。これらの観察は、ＳＬＥ患者におけるＴ細胞でのＩｇの結合とＣ４ｄの付着との間の因果リンクを示唆しており、最もありそうなのは、古典的補体経路の活性化を介したものである。
【００６７】
［実施例４］
［Ｔ−Ｃ４ｄ表現型は、ＳＬＥ患者由来の血漿によって移される］
Ｉｇ及びＣ４ｄが、一部のＳＬＥ患者の循環Ｔ細胞の表面で同時に検出されたので、特定の抗Ｔ自己抗体の結合が、補体系を活性化して、当該細胞の表面に付着するＣ４ｄを生じさせるというモデルを仮定した。それ故に、ＳＬＥ患者の血漿が、Ｔ−Ｃ４ｄ表現型に結合してこれを正常なＴ細胞にインビトロで「移す」ことができるか否かを調査した。ＳＬＥ患者の研究群、他の疾患患者、及び健康なコントロールに由来する様々な血漿サンプルを、健康な個体から、又はごく僅かなレベルのＴ−Ｃ４ｄしか有していないＳＬＥ患者から単離したＴ細胞に対して試験した。処理した細胞集団内のＴ細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。図４に典型的に示すように、Ｔ−Ｃ４ｄネガティブである正常なＴ細胞（パネルＡ）は、Ｔ−Ｃ４ｄ及びＴ−Ｉｇレベルが高いことが知られているドナーＳＬＥ患者から調製した血漿で処理した後の表面で、有意なレベルのＣ４ｄを獲得した（パネルＢ１及びＣ１）。健康なレシピエント細胞上で生じたＴ−Ｃ４ｄのパターンは、注目すべきことに、各実験において、狼瘡ドナー細胞に存在するものと類似していた。比較すると、健康なコントロールの血漿は、正常なＴ細胞でＣ４ｄ付着を生じさせることができなかった（パネルＤ１）。高いレベルのＣ４ｄが、健康なコントロールの血漿及びＩｇではなく、Ｔ−Ｃ４ｄ＋ＳＬＥの血漿及びＩｇによる処理後の細胞表面に付着した点に留意のこと。それらの結果は、低いＴ−Ｉｇ／Ｔ−Ｃ４ｄ表現型を示したＳＬＥ患者の血漿でも、健康なコントロールの血漿でもなく、Ｔ−Ｉｇ／Ｔ−Ｃ４ｄ表現型の高まりを示したＳＬＥ患者ドナーの血漿のみが、Ｔ−Ｃ４ｄ表現型を正常なＴ細胞に移すことができることを一貫して示した。
狼瘡患者由来の血漿によるＴＣ４ｄ表現型の移行は、Ｃ５ｂ−９の生成にも、細胞数の有意な減少にも至らない（データは示さず）。
【００６８】
［実施例５］
［Ｔ−Ｃ４ｄ表現型は、ＳＬＥ患者の免疫グロブリンによって移される］
ＳＬＥ患者の血漿から精製したＩｇを用いて、表現型移行実験を実行した。その結果は、Ｔ−Ｃ４ｄレベルが高いＳＬＥ患者の血漿から精製したＩｇが、正常なＴ細胞にインビトロでＴ−Ｃ４ｄ表現型を移すことができることを実証した（図４、パネルＢ２及びパネルＣ２；図４Ａ参照）。健康なコントロールから（図４、パネルＤ２）、又はＴ−Ｃ４ｄレベルがごく僅かなＳＬＥ患者から（図示せず）精製したＩｇは、Ｔ−Ｃ４ｄシグネチャを移すことができなかった。ＩｇＧと比較して、等濃度のＩｇＭが、Ｔ−Ｃ４ｄシグネチャをより効果的に生じさせたことから、古典的補体経路活性化の機械的役割が裏付けられた（図５Ａ）。ＩｇＭは、ＩｇＧと比較して、古典的補体経路のかなり強力な活性化剤であることから、結合後に細胞表面でＴ−Ｃ４ｄをかなり効果的に生じさせる。ドナーＳＬＥ血漿からのＩｇの減少により、補体活性化とＴ細胞へのＣ４ｄ結合をインビトロで誘導する能力は完全に無効となった（図５Ｂ）。さらに、ＳＬＥ血漿のこの能力は、潜在的なリンパ球反応性液性因子を、リンパ球との血漿のプレインキュベーションによって除去すると、有意に減少した（図５Ｂ）。ヒト血小板又は線維芽細胞による吸収は、効果が無かった（図示せず）。これらの結果は、ＳＬＥ患者中のＴ−Ｃ４ｄシグネチャが、抗Ｔ細胞自己抗体及び抗Ｔ細胞サブセット自己抗体によって生じるという仮説を裏付けている。
【００６９】
［実施例６］
［ＳＬＥと、他の疾患（ＯＤ）と、健康なコントロール（ＨＣ）間での比較］
以下に記載する患者データを用いて、更なる分析を実行した（表２）。連続したデータを、ＳＬＥ、ＯＤ、及びＨＣで階層化して、平均±標準偏差（ＳＤ）、並びにメジアン及び四分位範囲（ＩＱＲ）として報告した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、３群間の全体的差異を検定した。相互比較に関する情報を与えるために、事後検定を用いた。ＣＢ−ＣＡＰバイオマーカーの敏感度及び特異度を夫々、ＯＤ患者及びＨＣ患者を用いることによって、ＳＬＥ患者において判定した。マーカー、そしてまたサブセットのそれぞれに応じて、受信者動作曲線（ＲＯＣ）を用いた。
【表２】
2017528734.tif 000004
【表３】
2017528734.tif 000005
【００７０】
表４は、Ｔ−Ｉｇ陽性及び個々のＣＢ−ＣＡＰバイオマーカー陽性（陽性は先に、ＨＣの最大値と定義したので、ＨＣに対する特異度は１００％であった）に基づいた、ＳＬＥに対する敏感度及び他の疾患（ＯＤ）又は健康なコントロール（ＨＣ）に対する特異度を示す。
【表４】
2017528734.tif 000006
【００７１】
感度を高めるが、最も高い特異度を維持するバイオマーカー又はその組合せを見出すために、Ｔ−Ｉｇ陰性対象における感度／特異度を、個々のＣＢ−ＣＡＰバイオマーカーで最初に判定した。ＴＣ４ｄが最も良く、ＳＬＥに対する全体の感度が３３．２％（表４）から５５．１％（表５）に高められることが見出された。
【表５】
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【００７２】
続いて、Ｔ−Ｉｇ及びＴＣ４ｄの双方が陰性である個体間で、２番目に良いバイオマーカーを同定した。表６に示すように、Ｔ−Ｉｇ及びＴＣ４ｄを組み合わせることで、全体の敏感度が３３．２％から５５．１％に高まる一方で、他の疾患及び健康なコントロールに対して夫々９０．８％及び１００％という、ほぼ完全な特異度が維持されたことが分かった。Ｂ−Ｃ４ｄをＴＣ４ｄに加えることで、ＳＬＥに対する敏感度が６１．１％にさらに高まった。しかしながら、ＯＤに対する全体的な特異度は８６．４％に低下した。
【表６】
2017528734.tif 000008
＋は、列の上から下へと順に加えることを示す。例えば、＋ＴＣ４ｄは、Ｔ−Ｉｇ及びＴＣ４ｄの組合せを意味する。
【００７３】
データを、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いてプロットした。それらは、その識別閾値の変化に伴ったバイナリ分類システムの性能を示すグラフィカルプロットである。当該分析は、診断ツールとしての、ＣＢ−ＣＡＰアッセイと併用したＴ−Ｉｇの付加価値を実証する。
【００７４】
図６Ａは、ＳＬＥと健康なコントロールとの識別における、全てのバイオマーカーとのＲＯＣ比較を示す。ＳＬＥと健康なコントロールとを比較するＲＯＣ分析は、ＢＣ４ｄ（ＡＵＣ＝０．８５３）及びＴＣ４ｄ（ＡＵＣ＝０．８４０）が最も良い予測因子であり、これにＲＣ４ｄ（ＡＵＣ＝０．８０）及びＥＣ４ｄ（ＡＵＣ＝０．８０）が続くことが明らかになった。これは、表６において先に示す結果と一致した。
【００７５】
図６Ｂは、ＳＬＥと健康なコントロールとの識別における、ＣＢ−ＣＡＰバイオマーカーのサブセット（ＴＣ４ｄ、ＥＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、及びＢＣ４ｄ）とのＲＯＣ比較を示す。
【００７６】
図７Ａは、ＳＬＥと他の疾患との識別におけるＲＯＣ比較を示す。
【００７７】
ＳＬＥと他の疾患とを比較するＲＯＣ分析は、ＢＣ４ｄ（ＡＵＣ＝０．７５５）及びＴＣ４ｄ（ＡＵＣ＝０．７５０）が最も良い予測因子であることを明らかにした。Ｔ−Ｉｇのみ（０．７６）と比較して、全体的なＲＯＣは０．７６から０．８０に増大し、この差異は、ほぼ統計的有意性があった（ｐ＝０．０７）。
【００７８】
図７Ｂは、ＳＬＥと他の疾患との識別における、ＣＢ−ＣＡＰバイオマーカーのサブセット（ＴＣ４ｄ、ＥＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、及びＢＣ４ｄ）とのＲＯＣ比較を示す。
【００７９】
先に記載した特徴及び機能、並びに代替案を、他の多くの異なる系又は用途に組み合わせてよい。現在予見し難い、又は予期しない種々の変形、改良、変更、又は改善が、当業者によってなされるかもしれず、これらもまた夫々、開示した実施形態によって包含されることが意図される。
【００８０】
本発明の特徴又は態様が、代替案のマーカッシュ群又は他の群の観点から記載される場合、当業者であれば、本発明はまた、そのマーカッシュ群又は他の群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループを単位として記載されることを認識するであろう。
【００８１】
特に明記しない限り、本明細書中に記載する全数値範囲は、その中に包含される範囲及び具体的な整数の全ての組合せ及び部分的組合せを含む。そのような範囲はまた、記載される本発明の範囲内でもある。
【００８２】
本明細書中の全ての引用文献は、引用を以てその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2017528734.tif 000009
【図２Ａ】
2017528734.tif 000010
【図２Ｂ】
2017528734.tif 000011
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2017528734.tif 000017
【図５】
2017528734.tif 000018
【図６Ａ】
2017528734.tif 000019
【図６Ｂ】
2017528734.tif 000020
【図７Ａ】
2017528734.tif 000021
【図７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年12月4日(2015.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程と、
個体由来の血液サンプルにおいて、ＴＣ４ｄ、ＥＣＲ１、ＥＣ４ｄ、ＰＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、ＢＣ４ｄ、ＭＣ４ｄ、及びＧＣ４ｄからなる群から選択される１又は複数のバイオマーカーのレベルをアッセイする工程と、
を含む方法。
【請求項２】
Ｔリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルは、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプル中のＴリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球、及びＣＤ８＋細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも１つのＴリンパ球型によって表される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
（ａ）個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程と、
（ｂ）（ａ）におけるレベルを、コントロールＴリンパ球の表面に付着又は接触している自己抗体のレベルと比較する工程と、
（ｃ）個体由来の血液サンプルにおいて、ＴＣ４ｄ、ＥＣＲ１、ＥＣ４ｄ、ＰＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、ＢＣ４ｄ、ＭＣ４ｄ、及びＧＣ４ｄからなる群から選択される１又は複数のバイオマーカーのレベルをアッセイする工程と、
を含み、
（ａ）におけるサンプル由来の自己抗体のレベルの増加と、１又は複数のバイオマーカーのレベルの異常とが、個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する方法。
【請求項５】
Ｔリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルは、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サンプル中のＴリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球、及びＣＤ８＋細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも１つのＴリンパ球型によって表される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
（ａ）個体から白血球を含む血液サンプルを得る工程と、
（ｂ）血液サンプルから末梢血単核細胞集団を単離する工程と、
（ｃ）末梢血単核細胞集団を、末梢血単核細胞集団内のＴリンパ球の細胞表面に結合した自己抗体に特異的に結合する検出可能試薬を用いてインキュベートすることで、Ｔリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体を形成する工程と、
（ｄ）Ｔリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルを測定する工程と、
（ｅ）個体由来の血液サンプルにおいて、ＴＣ４ｄ、ＥＣＲ１、ＥＣ４ｄ、ＰＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、ＢＣ４ｄ、ＭＣ４ｄ、及びＧＣ４ｄからなる群から選択される１又は複数のバイオマーカーのレベルをアッセイする工程と、
を含む方法。
【請求項１１】
Ｔリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体は、フローサイトメトリーによって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
個体から得たＴ細胞−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルを、コントロール血液サンプルから得た類似のＴリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルと比較する工程を更に含んでおり、コントロール血液サンプルと比較した個体の血液サンプル由来のＴリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルの増加と、健康なコントロールのレベルと比較した１又は複数のバイオマーカーのレベルの異常とが、個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
検出可能試薬は、フローサイトメトリーによって検出可能な蛍光標識抗ヒトＩｇ抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光標識抗ヒトＩｇ抗体は、蛍光標識抗ヒトＩｇＧ抗体及び蛍光標識抗ヒトＩｇＭ抗体からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
キットであって、
（ａ）Ｔリンパ球に結合する自己抗体を特異的に認識する蛍光標識抗体であって、抗ＩｇＧモノクローナル抗体又は抗ＩｇＭモノクローナル抗体である抗体と、
（ｂ）随意選択的に、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球とを識別する系統特異的Ｔリンパ球表面マーカーと反応性のフルオロ結合モノクローナル抗体と、
（ｃ）ＴＣ４ｄ、ＥＣＲ１、ＥＣ４ｄ、ＰＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、ＢＣ４ｄ、ＭＣ４ｄ、およびＧＣ４ｄからなる群から選択される１又は複数のバイオマーカーの定量化に用いるのに適した１又は複数の生化学試薬と、
（ｄ）随意選択的に、全身性紅斑性狼瘡の診断におけるキットと（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の構成要素の使用についての説明書と、
を含むキット。
【請求項１６】
フルオロ結合モノクローナル抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ５、及びＣＤ２５からなる群から選択される特定のＴリンパ球表面マーカーに反応性を有する、請求項１９に記載のキット。
【請求項１７】
非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察するためのシステムであって、
プロセッサと、
プログラム命令を含む非一時的なコンピュータ読出可能記憶媒体と、
を備えており、
プログラム命令は、実行されると、
（ａ）個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のＴリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程と、
（ｂ）（ａ）におけるレベルを、コントロールＴリンパ球の表面に付着又は接触している自己抗体のレベルと比較する工程と、
（ｃ）個体由来の血液サンプルにおいて、ＴＣ４ｄ、ＥＣＲ１、ＥＣ４ｄ、ＰＣ４ｄ、ＲＣ４ｄ、ＢＣ４ｄ、ＭＣ４ｄ、及びＧＣ４ｄからなる群から選択される１又は複数のバイオマーカーのレベルをアッセイする工程と、
行うようにプロセッサに命令するように構成されており、
（ａ）におけるサンプル由来の自己抗体のレベルの増加と、１又は複数のバイオマーカーのレベルの異常とが、個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する、システム。
【請求項１８】
Ｔリンパ球の表面に付着又は接触している、個体の自己抗体のレベルを、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
サンプル中のＴリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球、ＣＤ＋Ｔｈ２リンパ球、及びＣＤ８＋細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも１つのＴリンパ球型によって表される、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔｈ２リンパ球である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球である、請求項１８に記載のシステム。
【国際調査報告】
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