(57)【要約】本発明は、２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＩＢＡ）などの酪酸に対する増加した耐性を有する細菌を提供する。具体的には、本発明は、少なくとも２．５ｇ／Ｌの酪酸に耐える細菌を提供する。この細菌は、例えば、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、ペプトストレプトコッカス属、アセトバクテリウム属、ユーバクテリウム属、またはブチリバクテリウム属に由来し得る。【選択図】  図１Ａ、図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２．５ｇ／Ｌの酪酸に耐える細菌。
【請求項２】
前記細菌が、少なくとも５ｇ／Ｌの酪酸に耐える、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項３】
前記細菌が、少なくとも６．７ｇ／Ｌの酪酸に耐える、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項４】
前記細菌が、少なくとも１０ｇ／Ｌの酪酸に耐える、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項５】
前記細菌が、少なくとも２．５ｇ／Ｌの酪酸に耐えることができない親細菌に由来する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項６】
前記酪酸が、２−ヒドロキシイソ酪酸（２‐ＨＩＢＡ）である、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項７】
前記細菌が、配列番号２、６、１０、１４、１７、２１、２４、２５、２９、３２、３６、４０、４４、４７、５１、５５、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８１、８５、８９、９３、９７、及び１０１からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項８】
前記細菌が、配列番号８、１２、２３、２７、３４、４９、６０、６４、６８、７２、７６、８３、９５、９９、及び１０３からなる群から選択される１つ以上のアミノ配列を含む、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項９】
前記細菌が、エタノール、酢酸塩、及び２，３−ブタンジオールからなる群から選択される１つ以上の生成物を生成する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１０】
前記細菌が、カルボキシド栄養性細菌である、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１１】
前記細菌が、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、ペプトストレプトコッカス属、アセトバクテリウム属、ユーバクテリウム属、またはブチリバクテリウム属から選択される細菌に由来する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１２】
前記細菌が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセティカム、クロストルジウム・フォルミコアセティカム、クロストリジウム・マグナム、ブチリバクテリウム・メチオトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクラム・バッチ、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモスム、ムーレラ・サーモアセチカ、スポロミューサ・オバート、スポロミューサ・シルバセティカ、スポロミューサ・スフェロイデス、オキソバクター・フェニギイ、またはサーモアナエルバクター・キウヴィに由来する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１３】
前記細菌が、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイに由来する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１４】
前記細菌が、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、クロストリジウム・オートエタノゲナムに由来する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項１５】
生成物を生成する方法であって、請求項１に記載の前記細菌を基質の存在下で培養することを含み、それにより前記細菌が生成物を生成する、前記方法。
【請求項１６】
前記生成物が、エタノール、酢酸塩、及び２，３−ブタンジオールからなる群から選択される、請求項１５に記載の前記方法。
【請求項１７】
前記基質が、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含む、請求項１５に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／９３２，６９９号の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本願は、本明細書と同時に提出され、以下、２０１５年１月２８日に作成された「ＬＴ１００ＷＯ１．ｔｘｔ」と名付けられた２４７，５４６バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして識別される、ヌクレオチド／アミノ酸配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
酪酸は、多様な産業において使用される。例えば、酪酸は、石油系燃料と比較して、より大きな持続可能性、温室効果ガス排出の低減、及び供給保証を提供する、バイオ燃料の生成において使用され得る。更に、酪酸は、医薬産業において、具体的にはプロドラッグ製剤において、及び酢酸酪酸セルロースプラスチックなどの生成物の製造ための化学産業において使用され得る。
【０００４】
２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢまたは２−ＨＩＢＡ）は、特に有用な酪酸である。現在、２−ＨＩＢＡは、最も一般的には３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）の異性化を通して生成され、医薬中間体、ならびにランタニド重金属及びアクチニド重金属のための錯体形成剤として使用される。しかしながら、２−ＨＩＢＡ及びその誘導体は、イソブチレン炭素骨格を有するモノマーからのポリマー合成において幅広い潜在的用途を有する。
【０００５】
近年、２−ＨＩＢＡ及び他の酪酸へのいくつかの生合成経路が探究されている。しかしながら、多くの微生物の増殖は、非常に低い濃度の酪酸によってすら影響を受け、これは、経済的に実行可能な量での酪酸の生成を妨害する。したがって、酪酸、具体的には２−ＨＩＢＡに対する増加した耐性を有する新しい微生物に対する強い必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、酪酸に対する高い耐性を有する細菌、及びその細菌を使用して、生成物を生成する方法を提供する。
【０００７】
本発明の細菌は、一般に、少なくとも２．５ｇ／Ｌの酪酸に耐えるが、少なくとも５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌなどのより高いレベルの酪酸に耐え得る。
【０００８】
一般に、本細菌は、酪酸に対するより低い耐性を有する親細菌に由来する。一実施形態において、本発明の細菌は、少なくとも２．５ｇ／Ｌの酪酸に耐えることができない親細菌に由来する。
【０００９】
好ましい一実施形態において、酪酸は、２−ヒドロキシイソ酪酸（２‐ＨＩＢＡ）である。
【００１０】
特定の変異が、酪酸耐性株において特定されている。これらの変異は、酪酸耐性の観察される増加に関与し得る。一実施形態において、本発明の細菌は、配列番号２、６、１０、１４、１７、２１、２４、２５、２９、３２、３６、４０、４４、４７、５１、５５、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８１、８５、８９、９３、９７、及び１０１からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。一実施形態において、本発明の細菌は、配列番号８、１２、２３、２７、３４、４９、６０、６４、６８、７２、７６、８３、９５、９９、及び１０３からなる群から選択される１つ以上のアミノ配列を含む。
【００１１】
本発明の細菌は、エタノール、酢酸塩、及び２，３−ブタンジオールのうちの１つ以上を含む様々な生成物を生成し得る。
【００１２】
一実施形態において、本発明の細菌は、カルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）細菌である。一実施形態において、本発明の細菌は、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、ペプトストレプトコッカス属、アセトバクテリウム属、ユーバクテリウム属、またはブチリバクテリウム属から選択される細菌に由来する。一実施形態において、本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセティカム、クロストルジウム（Ｃｌｏｓｔｒｄｉｕｍ）・フォルミコアセティカム、クロストリジウム・マグナム、ブチリバクテリウム・メチオトロフィカム（ｍｅｔｈｙｏｔｒｐｈｏｉｃｕｍ）、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクラム・バッチ、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモスム、ムーレラ・サーモアセチカ、スポロミューサ・オバート（ｏｖａｔｅ）、スポロミューサ・シルバセティカ、スポロミューサ・スフェロイデス、オキソバクター・フェニギイ、またはサーモアナエルバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｂａｃｔｅｒ）・キウヴィに由来する。好ましい一実施形態において、本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイに由来し、例えば、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムに由来する。
【００１３】
本発明は更に、本発明の細菌を基質の存在下で培養することを含む、生成物を生成する方法を提供する。生成物は、例えば、エタノール、酢酸塩、及び２，３−ブタンジオールのうちの１つ以上であり得る。好ましい一実施形態において、基質は、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】血清瓶中、異なる濃度の２−ＨＩＢＡで刺激されたＣ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１の増殖速度を示すグラフの組である。図１Ａ及び図１Ｂは、２組の増殖実験（ｎ＝３）の増殖曲線のそれぞれの差を示す。図１Ｃ及び図１Ｄは、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ対応する指数関数的適合線を示す。
【図１Ｂ】血清瓶中、異なる濃度の２−ＨＩＢＡで刺激されたＣ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１の増殖速度を示すグラフの組である。図１Ａ及び図１Ｂは、２組の増殖実験（ｎ＝３）の増殖曲線のそれぞれの差を示す。図１Ｃ及び図１Ｄは、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ対応する指数関数的適合線を示す。
【図１Ｃ】血清瓶中、異なる濃度の２−ＨＩＢＡで刺激されたＣ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１の増殖速度を示すグラフの組である。図１Ａ及び図１Ｂは、２組の増殖実験（ｎ＝３）の増殖曲線のそれぞれの差を示す。図１Ｃ及び図１Ｄは、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ対応する指数関数的適合線を示す。
【図１Ｄ】血清瓶中、異なる濃度の２−ＨＩＢＡで刺激されたＣ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１の増殖速度を示すグラフの組である。図１Ａ及び図１Ｂは、２組の増殖実験（ｎ＝３）の増殖曲線のそれぞれの差を示す。図１Ｃ及び図１Ｄは、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ対応する指数関数的適合線を示す。
【図２】血清瓶中、２−ＨＩＢＡで刺激されたＣ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１のＩＣ５０を描写するグラフである。
【図３Ａ】連続発酵条件下での、Ｃ．オートエタノゲナムに対する２−ＨＩＢＡの毒性を示すグラフの組である。図３Ａ及び図３Ｂは、２つの並行連続発酵における、増加した２−ＨＩＢＡ添加及び培養物回収中の代謝物プロファイルを示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２の毎時の測定による、２つの並行発酵のガスプロファイルを示す。
【図３Ｂ】連続発酵条件下での、Ｃ．オートエタノゲナムに対する２−ＨＩＢＡの毒性を示すグラフの組である。図３Ａ及び図３Ｂは、２つの並行連続発酵における、増加した２−ＨＩＢＡ添加及び培養物回収中の代謝物プロファイルを示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２の毎時の測定による、２つの並行発酵のガスプロファイルを示す。
【図３Ｃ】連続発酵条件下での、Ｃ．オートエタノゲナムに対する２−ＨＩＢＡの毒性を示すグラフの組である。図３Ａ及び図３Ｂは、２つの並行連続発酵における、増加した２−ＨＩＢＡ添加及び培養物回収中の代謝物プロファイルを示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２の毎時の測定による、２つの並行発酵のガスプロファイルを示す。
【図３Ｄ】連続発酵条件下での、Ｃ．オートエタノゲナムに対する２−ＨＩＢＡの毒性を示すグラフの組である。図３Ａ及び図３Ｂは、２つの並行連続発酵における、増加した２−ＨＩＢＡ添加及び培養物回収中の代謝物プロファイルを示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２の毎時の測定による、２つの並行発酵のガスプロファイルを示す。
【図４】Ｃ．オートエタノゲナムの耐性株の選択の連続発酵における、増加した２−ＨＩＢＡ添加中の代謝物プロファイル（酢酸塩、エタノール、及び２，３−ブタンジオールの生成）を描写するグラフである。Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１培養物が耐えた濃縮された２−ＨＩＢＡは、１．１ｇ／Ｌから６．７ｇ／Ｌ（６００％の耐性増加）へと再現性よく上昇した。
【図５】Ｃ．オートエタノゲナムの耐性株の選択のための連続発酵における、増加した２−ＨＩＢＡ添加中のガス（ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２）の取り込みを描写するグラフである。
【図６】２．２ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡ刺激あり及びなしでの、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１及び２−ＨＩＢＡ耐性株とともにの増殖プロファイルを示すグラフである。
【図７】２．２ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡ刺激あり及びなしでの、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１及び２−ＨＩＢＡ耐性株の増殖速度計算を示すグラフである。
【図８】２−ＨＩＢＡ耐性株の代謝プロファイルを示すグラフである。具体的には、２−ＨＩＢＡ耐性株は、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１よりも少ない２，３−ブタンジオールを生成するようである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、少なくとも２．５ｇ／Ｌの酪酸に耐える細菌を提供する。特定の実施形態において、本細菌は、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも３．５ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも４．５ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも５．５ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも６．５ｇ／Ｌ、少なくとも６．７ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも７．５ｇ／Ｌ、少なくとも８ｇ／Ｌ、少なくとも８．５ｇ／Ｌ、少なくとも９ｇ／Ｌ、少なくとも９．５ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌに耐える。
【００１６】
酪酸（ブタン酸）は、任意の好適な酪酸もしくはその塩（ブチレート）、エステル（ブタノエート）、異性体、または誘導体であり得る。一般に、酪酸は、比較的低濃度（例えば、１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、または２ｇ／Ｌ）で、野生型または非適応の微生物に対して毒性である。一実施形態において、酪酸は、ヒドロキシル官能基及びカルボン酸官能基の両方を有する４炭素有機分子であるヒドロキシ酪酸である。別の実施形態において、酪酸は、２−ヒドロキシ酪酸（α−ヒドロキシ酪酸）、３−ヒドロキシ酪酸（β−ヒドロキシ酪酸）、または４−ヒドロキシ酪酸（γ−ヒドロキシ酪酸）である。特に好ましい一実施形態において、酪酸は、２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡまたは２−ＨＩＢ）である。
【００１７】
「耐える」、「耐性」、「に対する耐性」、「の耐性」という用語、及び類似する用語は、特定の量のある物質、具体的には毒素の存在下で増殖または生存する、言及される微生物の能力または資質を指す。本明細書において、これらの用語は、一般に、特定の量の酪酸（２−ＨＩＢＡなど）の存在下で増殖または生存する、言及される微生物の能力または資質を説明するために使用される。「増加した耐性」または「減少した耐性」とは、言及される微生物が、野生型、親、または非適応の微生物と比較して、それぞれより高いまたはより低い、特定のある物質の存在下で増殖または生存する能力または資質を有することを指す。一般に、特定の量のある物質に「耐える」微生物は、その量の物質の存在下で、微生物の最大増殖速度の少なくとも半分の増殖速度を有する。耐性はまた、酪酸の存在下での、微生物または微生物集団の生存、微生物または微生物集団の増殖速度、及び／または微生物または微生物集団による１つ以上の生成物の生成速度の観点から測定され得る。最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）は、特定の生物学的または生化学的機能の阻害における、物質の有効性の尺度である。
【００１８】
本発明の細菌は、本発明の細菌が由来する、野生型、親、または非適応の細菌に対して毒性であり得る（すなわち、それらが耐え得ない）酪酸の濃度に耐える。一実施形態において、本発明の細菌は、少なくとも２．５ｇ／Ｌの酪酸または少なくとも５ｇ／Ｌの酪酸に耐えることができない親細菌に由来する。関連する一実施形態において、本発明の細菌は、少なくとも２．５ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡまたは少なくとも５ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡに耐えることができない親細菌に由来する。
【００１９】
本発明の細菌は、２−ＨＩＢＡなどの酪酸に対する耐性の観察される増加に関与する遺伝子変異を含み得る。例えば、本発明の細菌は、実施例５に記載される遺伝子、遺伝子要素、またはタンパク質中に１つ以上の変異を含み得る。一実施形態において、本発明の細菌は、配列番号２、６、１０、１４、１７、２１、２４、２５、２９、３２、３６、４０、４４、４７、５１、５５、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８１、８５、８９、９３、９７、及び１０１からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。一実施形態において、本発明の細菌は、配列番号８、１２、２３、２７、３４、４９、６０、６４、６８、７２、７６、８３、９５、９９、及び１０３からなる群から選択される１つ以上のアミノ配列を含む。
【００２０】
「変異した」とは、本発明の細菌が由来する野生型または親微生物と比較して、本発明の細菌において修飾されている核酸またはタンパク質を指す。一実施形態において、変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施形態では、突然変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよい。
【００２１】
「遺伝子修飾」という用語は、幅広く微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。遺伝子修飾の方法は、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモーター挿入または欠失、改変遺伝子発現または不活性化、酵素工学、指向性進化、知識型設計、ランダム突然変異導入法、遺伝子シャフリング、及びコドン最適化を含む。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１、Ｐｌｅｉｓｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：６１１−６１７，２０１１、Ｐａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０に記載される。
【００２２】
用語「変異体」は、核酸及びタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸及びタンパク質の配列などの、参照核酸及びタンパク質の配列から変化する、核酸及びタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を果たす変異体核酸またはタンパク質を使用して実施されてもよい。例えば、変異体タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ反応を触媒してもよい。変異体遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異体プロモーターは、参照プロモーターと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
【００２３】
そのような核酸またはタンパク質は、本明細書において「機能的に同等の変異体」と称されてもよい。一例として、機能的に同等の核酸変異体は、対立遺伝子変異型、遺伝子のフラグメント、突然変異遺伝子、多型などを含んでもよい。他の微生物からの相同遺伝子もまた、機能的に同等の変異体の例である。機能的に同等の変異体はまた、配列が特定の生物に対するコドン最適化の結果として変化する核酸を含む。核酸の機能的に同等の変異体は、好ましくは、参照核酸と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超える核酸配列同一性（相同性パーセント）を有する。タンパク質の機能的に同等の変異体は、好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超えるアミノ酸同一性（相同性パーセント）を有する。変異体核酸またはタンパク質の機能同等性は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して評価され得る。
【００２４】
「微生物」は、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本発明の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の引用は、「細菌」を網羅するものと解釈されるべきである。
【００２５】
「親微生物」は、本発明の細菌を発生させるために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在する微生物（すなわち、野生型微生物）または以前に修飾されたことのある微生物（すなわち、変異体または組換え微生物）であり得る。本発明の細菌は、親微生物において発現または過剰発現されなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるように修飾され得る。同様に、本発明の細菌は、親微生物によって含有されなかった１つ以上の遺伝子を含有するように修飾され得る。一実施形態において、親生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイである。好ましい一実施形態において、親生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＺ１５６１である。
【００２６】
用語「〜由来の」は、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から修飾または適合されて、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成することを示す。そのような修飾または適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、突然変異、または置換を含む。一般に、本発明の細菌は、親微生物に由来する。一実施形態において、本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセティカム、クロストルジウム・フォルミコアセティカム、クロストリジウム・マグナム、ブチリバクテリウム・メチオトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクラム・バッチ、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモスム、ムーレラ・サーモアセチカ、スポロミューサ・オバート、スポロミューサ・シルバセティカ、スポロミューサ・スフェロイデス、オキソバクター・フェニギイ、またはサーモアナエルバクター・キウヴィに由来する。好ましい一実施形態において、本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイに由来する。例えば、本発明の細菌は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ１００６、ＤＳＭ１９６３０、またはＤＳＭ２３６９３の下で寄託される株の特定特性を有する、クロストリジウム・オートエタノゲナムに由来し得る。特に好ましい一実施形態において、本発明の細菌は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、クロストリジウム・オートエタノゲナムに由来する。
【００２７】
「カルボキシド栄養細菌（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈ）」は、高濃度の一酸化炭素（ＣＯ）に耐えることが可能である微生物である。本発明の細菌は、カルボキシド栄養性であり得る。一実施形態において、本発明の細菌は、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、ペプトストレプトコッカス属、アセトバクテリウム属、ユーバクテリウム属、またはブチリバクテリウム属から選択されるカルボキシド栄養性細菌に由来する。
【００２８】
本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイの種を含むカルボキシド栄養性クロストリジウム、及びクロストリジウム・オートエタノゲナムＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（国際公開第ＷＯ２００９／０６４２００号）、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、クロストリジウム・リュングダリイＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ  ５５３８３）（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、クロストリジウム・リュングダリイＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ  ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、クロストリジウム・リュングダリイＣ−０１（ＡＴＣＣ  ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、クロストリジウム・リュングダリイＯ−５２（ＡＴＣＣ  ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、クロストリジウム・ラグスダレイＰ１１Ｔ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２）（国際公開第ＷＯ２００８／０２８０５５号）の菌株を含むがこれらに限定されない関連分離株、「クロストリジウム・コスカッティ」（米国公開第２０１１／０２２９９４７号）などの関連分離株、またはクロストリジウム・リュングダリイＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）などの突然変異した菌株のクラスターに由来してもよい。
【００２９】
これらの菌株は、クロストリジウムｒＲＮＡクラスターＩ内のサブクラスターを形成し、それらの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、約３０％の同様の低いＧＣ含有量を有して９９％を超えて同一である。しかしながら、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合及びＤＮＡフィンガープリント実験は、これらの菌株が異なる種に属することを示した（国際公開第ＷＯ２００８／０２８０５５号）。このクラスターの菌株は、同様の遺伝子型及び表現型の両方を有する共通の特徴によって定義され、それらは全て、同じエネルギー節約及び発酵代謝のモードを共有する。更に、このクラスターの菌株は、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。このクラスターの全ての種は、同様の形態及びサイズを有し（対数増殖細胞は、０．５〜０．７×３〜５μｍである）、中温性であり（最適増殖温度は３０〜３７℃の間）、偏性嫌気性である（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３、及び国際公開第ＷＯ２００８／０２８０５５号）。更に、それらは全て、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適初期ｐＨは５．５〜６）、同様の増殖率を有するＣＯ含有ガス上の強力な独立栄養増殖、ならびに主な発酵最終生成物としてのエタノール及び酢酸、及びある特定の条件下で形成される少量の２，３‐ブタンジオール及び乳酸と同様の代謝プロファイルなど、同じ主要な系統発生的形質を共有する（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４、Ｋoｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３、及び国際公開第ＷＯ２００８／０２８０５５号）。インドール生成が、３つ全ての種で同様に観察された。
【００３０】
しかしながら、これらの種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の基質利用が異なった。更に、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に栄養要求性である種と、そうではない種があることがわかった。ガス取り込みに関与するウッド・ユングダール経路遺伝子の組織及び数は、酢酸及びアミノ酸配列の差に関わらず、全ての種で同じであることが分かっている（Ｋoｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの微生物の範囲内で示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。したがって、これらの形質は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイなどの１つの微生物に特有なのではなく、むしろカルボキシド栄養性、エタノール合成クロストリジウムに対して一般的な形質であり、性能の差がある可能性はあるが、機構がこれらの菌株にわたって同様に作用することが予想され得る。
【００３１】
「アセトゲン」は、嫌気呼吸の生成物として酢酸塩を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、かつアセチル−ＣｏＡならびに酢酸塩などのアセチル−ＣｏＡ由来生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。一実施形態において、本発明の細菌は、アセトゲンである。
【００３２】
本発明の細菌は、例えば、エタノール（国際公開第２００７／１１７１５７号）、酢酸塩（国際公開第２００７／１１７１５７号）、ブタノール（国際公開第２００８／１１５０８０号及び国際公開第２０１２／０５３９０５号）、ブチレート（国際公開第２００８／１１５０８０号）、２，３−ブタンジオール（国際公開第２００９／１５１３４２号）、乳酸塩（国際公開第２０１１／１１２１０３号）、ブテン（国際公開第２０１２／０２４５２２号）、ブタジエン（国際公開第２０１２／０２４５２２号）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（国際公開第２０１２／０２４５２２号及び国際公開第２０１３／１８５１２３号）、エチレン（国際公開第２０１２／０２６８３３号）、アセトン（国際公開第２０１２／１１５５２７号）、イソプロパノール（国際公開第２０１２／１１５５２７号）、脂質（国際公開第２０１３／０３６１４７号）、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）（国際公開第２０１３／１８０５８１号）、イソプレン（国際公開第２０１３／１８０５８４号）、脂肪酸（国際公開第２０１３／１９１５６７号）、２−ブタノール（国際公開第２０１３／１８５１２３号）、１，２−プロパンジオール（国際公開第２０１４／０３６９１５２号）、ならびに１‐プロパノール（国際公開第２０１４／０３６９１５２号）を生成し得る、または生成するように操作され得る。
【００３３】
本発明の細菌はまた、本発明の細菌が由来する、野生型、親、または非適応の細菌とは異なる代謝プロファイルを有し得る。具体的には、本発明の細菌は、異なる生成物または異なる量の生成物を生成し得る。一実施形態において、本発明の細菌は、本発明の細菌が由来する、野生型、親、または非適応の細菌と比較して、比較的少ない量の２，３−ブタンジオールを生成する。例えば、本発明の細菌は、約６ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌ未満の２，３−ブタンジオールを生成し得る。
【００３４】
用語「基質」は、本発明の細菌のための炭素及び／またはエネルギー源を指す。典型的には、基質は、一酸化炭素（ＣＯ）を含むガス状基質である。基質は、体積で約２０％〜１００％、２０％〜７０％、３０％〜６０％、または４０％〜５５％のＣＯなど、大きな割合のＣＯを含んでもよい。特定の実施形態では、基質は、体積で約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％のＣＯを含む。本発明の細菌は概して、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。
【００３５】
基質が水素（Ｈ２）を含有する必要はないが、Ｈ２の存在は、生成物形成に有害であるはずはなく、改善した全体的効率をもたらし得る。例えば、特定の実施形態では、基質は、２：１、１：１、または１：２のＨ２：ＣＯのおよその比率を含んでもよい。一実施形態では、基質は、体積で約３０％、２０％、１５％、または１０％未満のＨ２を含む。他の実施形態では、基質は、低濃度のＨ２、例えば、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＨ２を含む。さらなる実施形態では、基質は、Ｈ２を実質的に含有しない。基質はまた、二酸化炭素（ＣＯ２）、例えば、体積で約１％〜８０％または１％〜３０％のＣＯ２を含有してもよい。一実施形態では、基質は、体積で約２０％未満のＣＯ２を含む。さらなる実施形態では、基質は、体積で約１５％、１０％、または５％未満のＣＯ２を含む。別の実施形態では、基質は、ＣＯ２を実質的に含有しない。
【００３６】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替の形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０１：２１１−２２７，２００２）を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【００３７】
基質は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副生成物として得られる、または何らかの他の源からの排ガスであってもよい。ある特定の実施形態では、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製プロセス、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、及びコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、ＣＯ含有ガスは、任意の従来の方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。ＣＯは、合成ガス、すなわち、一酸化炭素及び水素を含むガスの一成分であってもよい。産業プロセスから生成されるＣＯは通常、燃焼処理されてＣＯ２を生成し、したがって、本発明は、ＣＯ２温室効果ガス排出を低減することにおいて特定の有用性を有する。基質の組成は、反応の効率及び／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、またはろ過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などの任意の望ましくない不純物を除去する、及び／または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【００３８】
本発明の細菌は、培養されてもよい。典型的には、培養は、血清瓶またはバイオリアクタ中で実施される。用語「バイオリアクタ」は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他の装置などの１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器及び第２の培養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「培養」及び「発酵」は、交換可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期及び生成物生合成期の両方を包含する。
【００３９】
培養物は概して、細菌の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、及び／または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号、米国特許第５，５９３，８８６号、及び国際公開第ＷＯ２００２／００８４３８号に記載される。
【００４０】
培養／発酵は、望ましくは、標的生成物の生成のために適切な条件下で実施されるべきである。考慮すべき反応条件は、圧力（またはＣＯの分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のＣＯが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。具体的には、ＣＯ含有基質の導入速度は、生成物がＣＯ制限条件下での培養によって消費され得るため、液相中のＣＯの濃度が制限的にならないことを確実にするように制御されてもよい。
【００４１】
上昇した圧力でバイオリアクタを動作させることは、気相から液相へのＣＯ物質移動の増加した速度を可能にする。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を実施することが好ましい。また、所与のＣＯ変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、及びその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。米国特許第５，５９３，８８６号における例によると、反応器体積は、反応器動作圧力の増加に線形比例して低減され得る。つまり、１０気圧の圧力で動作するバイオリアクタは、１気圧の圧力で動作するバイオリアクタの１０分の１の体積である必要しかない。加えて、国際公開第ＷＯ２００２／００８４３８号は、それぞれ１５０ｇ／Ｌ／日及び３６９ｇ／Ｌ／日のエタノール生産性をもたらす、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で実施されるガス−エタノール発酵を記載する。対照的に、大気圧で同様の培地及び入力ガス組成を使用して実施される発酵は、１日、１リットル当たり１０〜２０倍少ないエタノールを生成することがわかった。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例は、本発明を更に例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００４３】
この実施例は、クロストリジウムの株の一般的な増殖を実証する。
実施例１
【００４４】
クロストリジウム菌株を標準的な嫌気性技術（Ｈｕｎｇａｔｅ，Ｍｅｔｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３Ｂ：１１７−１３２，１９６９、Ｗｏｌｆｅ，Ａｄｖ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６：１０７−１４６，１９７１）を使用して、ｐＨ５．６でＰＥＴＣ培地中で３７℃において増殖させた。フルクトース（従属栄養増殖）またはヘッドスペース内の３０ｐｓｉのＣＯ含有製鉄ガス（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ現場（Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺ）から収集、組成：４４％  ＣＯ、３２％  Ｎ２、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２）（独立栄養増殖）を基質として使用した。固体培地に対しては、１．２％バクトアガー（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｔｏｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ  ０７４１７，ＵＳＡ）を添加した。
【表１】
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【００４５】
実施例２
この実施例は、血清瓶及び連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）中、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１に対する２−ＨＩＢＡの毒性を実証する。
【００４６】
血清瓶
【００４７】
０、０．５、１、１．５、２、３、または４ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡを含有する培地で、２組の血清瓶実験を実行した。両方の組の増殖実験からの光学密度（ＯＤ）データの平均をプロットした。目視で観察された指数関数的増殖相外のデータ点を取り除き、指数関数的傾向線を適合させることによって、各濃度の２−ＨＩＢＡの増殖速度（μ）を計算した（図１）。
【００４８】
図１は、異なる濃度の２−ＨＩＢＡで刺激されたＣ．オートエタノゲナムの増殖速度を示す。図１Ａ及び図１Ｂは、２組の増殖実験（ｎ＝３）の増殖曲線のそれぞれの差を示す。図１Ｃ及び図１Ｄは、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ対応する指数関数的適合線を示す。図１Ｃは更に、抽出された等式及びＲ２値の一例を示す。傾向線等式から増殖速度を抽出するために、以下の等式、ＯＤ＝ＯＤ０Ｘｅμｔ（傾向線等式中、ＯＤ＝ｙ、ｔ＝ｘである）を使用し、以下に列挙される計算された増殖速度を得た。
【表２】
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【００４９】
Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＵＳＡ）内にμ対ｌｏｇ１０［２−ＨＩＢＡ］として増殖速度（μ）をプロットして、Ｃ．オートエタノゲナムの増殖速度が５０％である２−ＨＩＢＡの濃度を決定した（図２）。血清瓶中、Ｃ．オートエタノゲナムについて、２．２ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡのＩＣ５０を計算した。図２に図示するように、最大１ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡの濃度は、増殖に対して影響をほとんどまたは全く有しないようであり、その後最大２ｇ／Ｌの濃度まで比較的小さな影響がある。しかしながら、曲線の急峻な降下が示すように、２ｇ／Ｌを超える２−ＨＩＢＡの増殖に対する影響は急なものである。
【００５０】
連続撹拌槽反応器
【００５１】
ＣＳＴＲに、Ｃ．オートエタノゲナムを接種し、安定した光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）及び希釈度（Ｄ約１．５）に至らしめた。ＣＳＴＲにおける全ての発酵について、酵母抽出物を含有しない既知組成培地を使用した。代謝物（ＨＰＬＣによって測定）及びガス組成物入／出（ＧＣによって測定）を含むパラメータを１時間毎に監視した。培養代謝に対する２−ＨＩＢＡの初期の影響は、ＣＯ及び／またはＨ２の利用速度の測定可能な低減を含み、それに代謝物生成速度の減少が続いた。
【００５２】
２つのＣＳＴＲを並行して実行し、流量及び組成において同一の接種菌及び培地を提供した。反応器を、１．５の希釈度で１．５ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡを含有する培地とともに、０．９日目に連続に切り替えた。ガス取り込みの低減が確認されるまで培地を供給し、その後、２−ＨＩＢＡを含有しない新鮮な培地の流入を使用して、培養物を回収した。次いで、このプロセスを、一方の反応器内の同一の培養物に対して反復した（他方は対照としての役割を果たした）。
【００５３】
この実験の結果を、図３に図示する。図３Ａ及び図３Ｂは、２つの並行連続発酵における、増加した２−ＨＩＢＡ添加及び培養物回収中の代謝物プロファイルを示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２の毎時の測定による、２つの並行発酵のガスプロファイルを示す。
【００５４】
２−ＨＩＢＡの導入後、Ｃ．オートエタノゲナムの代謝プロファイルは、２，３−ブタンジオール生成、キャッピングエタノール生成を優遇するようにシフトした。２−ＨＩＢＡからの増加する流入、及び低減されたＣＯ及びＨ２の取り込みによって引き起こされる全体の代謝レベルの降下の下、バイオマス生成は低減した。流入培地から２−ＨＩＢＡを取り除くことによって、ガス取り込み及び代謝生成は安定化する。これは、２−ＨＩＢＡに対する可逆反応を示す。連続ＣＳＴＲシステムにおける２−ＨＩＢＡの平均影響レベルを、１．１５ｇ／Ｌであると計算した。
【００５５】
血清瓶実験及びＣＳＴＲ実験は、直接比較可能ではないことに留意することが重要である。バッチ型血清瓶実験は、増殖速度及びＩＣ５０を計算するために設計された一方で、ＣＳＴＲ実験は、ガス取り込み及び代謝物生成の連続監視によって、代謝に対する２−ＨＩＢＡの初期の影響を検出するために設計された。
【００５６】
実施例３
この実験は、２−ＨＩＢＡ耐性株の選択を実証する。
【００５７】
連続発酵における選択、または寒天プレート上での選択により株を得、２−ＨＩＢＡに対する増加した耐性について試験した。連続発酵における選択は、プロセスの観点から最も関連性があり、容易に分裂している微生物は保持され、分裂していない微生物は押し流されるため、増殖関連形質をスクリーニングするために有用なツールであることを示している。この戦略は不均一な培養物をもたらし得るものの、それは、単一のコロニーが均一な培養物を保証し、コロニーサイズの差が増殖速度の指標である、寒天プレート上での選択アプローチと組み合わせられ得る。
【００５８】
連続発酵
【００５９】
連続発酵における２−ＨＩＢＡ耐性を改良するために、供給培地中の２−ＨＩＢＡ濃度を緩徐に増加させた。増加する２−ＨＩＢＡ濃度に対処することができない微生物は発酵システムから希釈し出された一方で、改善された耐性を有する微生物は保持された。培養物抵抗性が改善するにつれて、グリセロールストックを収集した。
【００６０】
ＣＳＴＲに、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１を接種した。反応器を、バッチモードで始動させ、約４０時間後、１．５の希釈度で連続モードに切り替えた。動作が安定した後、供給培地に２−ＨＩＢＡ（１．１ｇ／Ｌ）を添加し、これは１．５の希釈度で反応器に流し込まれた。その後、１日当たり約０．０５ｇ／Ｌで、２−ＨＩＢＡの濃度を緩徐に増加させた。
【００６１】
連続培養からの結果を、図４及び図５に図示し、図４は、増加する２−ＨＩＢＡ濃度での代謝物（酢酸塩、エタノール、及び２，３−ブタンジオール）データを示し、図５は、増加する２−ＨＩＢＡ濃度でのガス（ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２）取り込みデータを示す。連続発酵における選択中、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１培養物が耐える２−ＨＩＢＡ濃度は、８５日間にわたって２−ＨＩＢＡ濃度を緩徐に増加させることによって、１．１ｇ／Ｌから６．７ｇ／Ｌ（６００％の耐性増加）へと再現性よく上昇した。更なる実験は、２−ＨＩＢＡに対するこの増加した耐性は、表現型適応の結果であるだけでなく、株の遺伝子変化の結果であることを示す。
【００６２】
株の検証
【００６３】
連続発酵実験から選択された株は、非適応のＣ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１に対して、増加した増殖速度を示す。図６は、２．２ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡ刺激あり及びなしでの、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１及び２−ＨＩＢＡ耐性株とともにの増殖プロファイルを示す。計算された増殖速度は、図７に示すように、２．２ｇ／Ｌの２−ＨＩＢＡで刺激されたとき、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１に対して、２−ＨＩＢＡ耐性株の２５％増加した増殖速度を示した。
【００６４】
実施例４
この実施例は、酪酸（２−ＨＩＢＡ）耐性株の代謝プロファイル、具体的には、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１と比較した、２−ＨＩＢＡ耐性株による２，３−ブタンジオールの生成を説明する。
【００６５】
２−ＨＩＢＡ耐性株を、２ＬのＢｉｏＦｌｏ１１５システム（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）内で約１．５Ｌの作業堆積とともに培養した。ＣＳＴＲシステムは、制御された反応器環境の確保において重要な要素である、ガスから液体への物質移動及び混合を改良するための、２つの６枚刃Ｒｕｓｈｔｏｎインペラー及びバッフルを備えた。発酵器の温度を、３７℃に維持した。ｐＨ及び酸化還元電位（ＯＲＰ）電極（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をヘッドプレート通して挿入し、それらの読み取りを５分間隔で記録した。発酵器に接続された蠕動ポンプを使用して、培養物のｐＨを５．３に維持し、ｐＨが設定点未満に降下するとすぐに、５ＭのＮＨ４ＯＨの溶液を発酵器内への投与を引き起こした。発酵器に接続された全てのガス及び液体ラインは、ガス不透過管から作製して、管壁を通した酸素拡散を最小化した。個々のガス（Ｎ２、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２）に対して較正した質量流動制御器（ＭＦＣ）を使用して、正確な混合及び流動制御を可能とした。３％のＨ２と、４５％のＣＯと、１７％のＣＯ２と、３５％のＮ２とのガス混合物を、１Ｌの液体当たり、１分当たり最大流量１６７ｍＬのガスで培養物に供給した。発酵器の希釈度または細菌増殖速度を、１日−１に設定した。
【００６６】
連続条件下、２−ＨＩＢＡ耐性株は、約１６〜１８ｇ／Ｌのエタノール及び約１．３ｇ／Ｌの２，３−ブタンジオール（ＢＤＯ）を生成した。したがって、２−ＨＩＢＡ耐性株は、約１３．８：１〜約１２．３：１のエタノール：ＢＤＯ生成比を実証する。対照的に、類似の条件下、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１は、一般に、約３：１のエタノール：ＢＤＯ生成比で、約１８ｇ／Ｌのエタノール及び約６ｇ／ＬのＢＤＯを生成する。したがって、２−ＨＩＢＡ耐性株は、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１よりも少ないＢＤＯを生成し、したがって、高いエタノール：ＢＤＯ生成比によって特徴付けられるようである。
【００６７】
実施例５
この実施例は、酪酸（２−ＨＩＢＡ）耐性株において観察される核酸及びアミノ酸変異を説明する。
【００６８】
２つの酪酸耐性株における酪酸耐性の遺伝子基礎を調査した。第１の株を連続培養で発生させ、第２の株をプレート上での選択によって発生させた。１００倍超の被覆範囲を有するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉ−Ｓｅｑプラットフォームを使用して、両方の株を配列決定した。
【００６９】
両方の株において、いくつかのＳＮＰ（一塩基遺伝子多型）が見出された。連続培養株は１７個のＳＮＰ及び５個の挿入欠失（挿入または欠失）を有した一方で、プレーティングされた株は１０個のＳＮＰ及び４個の挿入欠失を有した。ＳＮＰのうちのいくつかは、両方の株に共通していた。いくつかのＳＮＰは、同義（ＳＹＮ）変異を有するタンパク質をもたらし、いくつかのＳＮＰは、非同義（ＮＯＮ）変異を有するタンパク質をもたらした。これらの変異を以下の表にまとめる。
【表３】
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2017504339.tif 000006
2017504339.tif 000007
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【００７０】
以下の表に記載するように、これらの要素のうちのそれぞれの完全な配列を提供する。
【表４】
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【００７１】
まとめると、酪酸耐性株は、前述の遺伝子、遺伝子要素、またはタンパク質のうちのいずれかの中に１つ以上の変異を含み得る。具体的には、酪酸耐性株は、配列番号２、６、１０、１４、１７、２１、２４、２５、２９、３２、３６、４０、４４、４７、５１、５５、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８１、８５、８９、９３、９７、及び１０１のうちの１つ以上の核酸配列、または配列番号８、１２、２３、２７、３４、４９、６０、６４、６８、７２、７６、８３、９５、９９、及び１０３のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
【００７２】
いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、これらの変異が酪酸耐性にどのように影響を与え得るのかを説明することを試みている。
【００７３】
ＧｒｏＥＳＬまたはＤｎａＫＪなどのシャペロンまたは熱ショックタンパク質は、特定のストレッサーに対する耐性を改善することが知られている。例えば、熱ショックタンパク質は、クロストリジウム・アセトブチリカムにおけるブタノールに対する耐性を改善すると説明される（Ｔｏｍａｓ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６９：４９５１−４９６５，２００３；Ｚｉｎｇａｒｏ，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ，１６：１９６−２０５，２０１３；Ｚｉｎｇａｒｏ，ＭＢｉｏ，３：ｅ００３０８−１２，２０１２）。ＤｎａＫＪの変異は、ストレッサーに対する改善された耐性、及び酪酸に対する改良された耐性につながり得る。
【００７４】
細菌微小区画は、その全体がタンパク質からなる小器官である。それらは、酵素をそれらの基質及び共因子によってカプセル化し、共局在化し、画定された微小環境内の脆弱な酵素を保護することによって、ならびに、毒性または揮発性の中間体を隔離することによって、特定の代謝プロセスを促進する（Ｙｅａｔｅｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，２１：２２３−２３１，２０１１）。そのような微小区画タンパク質のうちの２つの異なるもののプロモーター領域（ゲノム上の２つの異なる座位上）の変化は、改良された酪酸耐性に寄与し得る微小区画形成の上方調節につながり得る。
【００７５】
セリン型Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａカルボキシペプチダーゼなどのＤＤ−トランスペプチダーゼは、ペプチドグリカン鎖を架橋して、クロストリジウム類などのグラム陽性細菌において強固な細胞壁を形成する。細胞壁の構造及び流動性は、クロストリジウム・アセトブチリカムにおけるブタノールなどのストレッサーに対する細菌の耐性に影響を与えることが知られている（Ｂａｅｒ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５３：２８５４−２８６１，１９８７）。における変異は、膜流動性に影響を与え、酪酸耐性を改良し得る。Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼにおける変異は、タンパク質配列を変化させなかったが、むしろコドン使用、及び潜在的には翻訳に影響を与えた。
【００７６】
シグマ７０は、指数関数的増殖中の主要シグマ因子である。ｒｐｏＤの配列の変化は、遺伝子発現に対して広範囲な影響を有し得、酪酸に対する改善された耐性に寄与し得る。ｒｐｏＤの変異は、タンパク質配列を変化させなかったが、むしろコドン使用、及び潜在的には翻訳に影響を与えた。更に、ＤｅｏＲ及びＰａｄＲファミリーにおける２つの広範囲調節因子は、ＳＮＰを含有し、これはアミノ酸変化をもたらした。ＤｅｏＲ転写調節因子は、トランスポーターを主に抑制因子として制御することが知られている一方で、ＰａｄＲ転写制御因子は、排出ポンプなどの解毒作用に関連する遺伝子の発現を制御することが知られており、これが改善された酪酸耐性の理由であり得る。
【００７７】
両方の株において、ＳＮＰはまた、酪酸に対して解毒作用を有し得るＡＢＣトランスポートシステムに関連することが見出された。更に、ＡＴＰ結合領域ＡＴＰアーゼドメインタンパク質の変異が観察されている。両方のＡＴＰ要求システムは、細胞のエネルギー代謝にとって重要であり得、これは、転じて耐性、及びエタノール及び２，３−ブタンジオールの生成などの代謝物生成速度にとって重要である。
【００７８】
ＡｂｒＢ型ファミリータンパク質は、アルキル化及び他の細胞損傷の調節に関与する複数回貫通膜タンパク質である（Ｄａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０８：１３２１−１３２３，２００５）。そのようなＡｂｒＢ型ファミリータンパク質の転写調節因子のプロモーター領域の変化は、酪酸耐性を改良し得る。
【００７９】
変異はまた、感知及び信号伝達要素において見出された。応答調節因子受容体のプロモーター領域の変異はまた、２，３−ブタンジオールなどのピルビン酸由来生成物に対して、エタノールなどの生成アセチル−ＣｏＡ由来生成物を優遇する改良された酪酸耐性または変化した代謝プロファイルにつながる広範囲な影響（例えば、転写因子に影響を与える）をもたらし得る。
【００８０】
電子輸送タンパク質は、エネルギー代謝において重要な役割を果たす（Ｋoｐｋｅ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１０７：１３０８７−１３０９２，２０１０）。電子輸送フラボタンパク質の５つのペアのうちの１つは、各サブユニットにおける非同義アミノ酸変化によって、変化されることが見出された。この変異は、電子流動を変化させ、おそらくはそれを改善し、微生物が高い酪酸濃度により良く対処することを可能にさせた可能性がある。それはまた、２，３−ブタンジオールなどのピルビン酸由来生成物に対して、エタノールなどの生成アセチル−ＣｏＡ由来生成物を優遇するように細菌代謝を変化させた可能性がある。
【００８１】
アミノ酸代謝に関与する２つの遺伝子、アスパルチル／グルタミル−ｔＲＮＡアミドトランスフェラーゼ及び３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、アミノ酸変化をもたらすＳＮＰを含有した。大腸菌及びサルモネラ菌において、２−ヒドロキシイソ酪酸などの酪酸は、ケトール酸レダクトイソメラー酵素ゼなどの分岐鎖アミノ酸生合成経路を阻害することが報告されている（Ａｒｆｉｎ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２４４：１１１８−１１２７，１９６９、Ｃｈｕｎｄｕｒｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２８：４８６−４９３，１９８９、Ｍｒａｃｈｋｏ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，２９４：４４６−４５３，１９９２）。したがって、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼにおける変化は、酪酸に対する改良された耐性、及び競合阻害またはフィードバック阻害に対する保護をもたらし得る。アミノ酸生成もまた、及び潜在的には２，３−ブタンジオールなどの類似の前駆体を使用する代謝物の生成もまた、この変化によって変化させられ得る（Ｋoｐｋｅ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７７：５４６７−５４７５，２０１１）。アスパルチル／グルタミル−ｔＲＮＡアミドトランスフェラーゼにおける変化は、アルギニン及びグルタミン酸アミノ酸の貯蔵に影響を与え得る。グルタミン酸またはアルギニンなどのアミノ酸は、酸抵抗性に関与することが知られており（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２：８９８−９０７，２００４）、酪酸耐性を改善する可能性がある。
【００８２】
更に、変異は、耐性または生成物形成に関与し得る推定機能を有する遺伝子中に見出された。一例において、機能未知ＤＵＦ９１７のタンパク質の遺伝子の末端での変異は、機能未知ＤＵＦ９１７のタンパク質について、第２の遺伝子との融合につながるフレームシフトをもたらしたため、潜在的に変化した機能性を有する融合タンパク質をもたらした。
【００８３】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の従来技術への言及は、その従来技術が任意の国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【００８４】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと」、「有すること」、「含むこと」、及び「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる実施例または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく理解することを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すものと解釈するべきではない。
【００８５】
本発明を実施するための本発明者らに既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物及び均等物を含む。更に、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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