(57)【要約】本開示は、軟骨修復組成物、及び組成物中のプロテオグリカン含量の修正方法に関する。具体的には、方法は、移植のために使用可能な軟骨細胞から形成される、無血清かつコラーゲンフリーの新生軟骨に関する。アグリカン及び硫酸化グリコサミノグリカンなどのプロテオグリカンが使用され、温度変化を使用してその含量が修正される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理的温度の新生軟骨のプロテオグリカン含量と比較して前記新生軟骨の前記プロテオグリカン含量を減少させるのに十分な期間、生理的温度未満の温度で維持された前記新生軟骨を含有する、軟骨置換組成物であって、約３０℃以下の温度の前記新生軟骨が生理的温度に戻された場合に前記プロテオグリカン含量を増加させることが可能である、軟骨置換組成物。
【請求項２】
単離された軟骨細胞から生体外で作製された軟骨組織を含有する軟骨置換組成物あって、前記軟骨組織は生理的温度の前記軟骨組織の前記プロテオグリカン含量と比較して前記軟骨組織の前記プロテオグリカン含量を減少させるのに十分な期間、生理的温度未満の温度で維持され、約３０℃以下の温度の前記軟骨組織が生理的温度に戻された場合に前記プロテオグリカン含量を増加させることが可能である、軟骨置換組成物。
【請求項３】
前記生理的温度未満の温度が約３０℃以下である、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項４】
前記プロテオグリカン含量がアグリカン含量を含む、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項５】
前記プロテオグリカン含量が硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）含量を含む、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項６】
約３０℃以下に維持される前の生理的温度での前記新生軟骨の初期プリテオグリカン含量が、少なくとも約４００μｇ／ｃｍ２または少なくとも約５００μｇ／ｃｍ２の初期Ｓ−ＧＡＧ含量を含む、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項７】
前記初期プリテオグリカン含量が、約８００μｇ／ｃｍ２〜約２５００μｇ／ｃｍ２のＳ−ＧＡＧ含量を含む、請求項６に記載の軟骨置換組成物。
【請求項８】
前記組成物が、Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＸ型のコラーゲンを実質的に含まない、請求項６に記載の軟骨置換組成物。
【請求項９】
前記組成物の前記初期プロテオグリカン含量が、高分子量アグリカンに富んだ軟骨であることを示す、請求項６に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１０】
前記高分子量アグリカンが、前記軟骨の前記初期プロテオグリカン含量の少なくとも約８０％を占める、請求項９に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１１】
前記高分子量アグリカンが、前記軟骨の前記初期プロテオグリカン含量の少なくとも約９０％を占める、請求項９に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１２】
前記生理的温度が約３７℃である、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１３】
前記組成物が前記生理的温度で維持される際、前記組成物は更に正常酸素圧条件または低酸素条件で維持される、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１４】
約３０℃以下で維持した際の前記組成物の前記減少したプロテオグリカン含量と比較して前記組成物の前記プロテオグリカン含量を増加させるのに十分な期間、前記生理的温度に戻される、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１５】
前記組成物がヒトまたは動物のドナーから得た関節軟骨細胞を含む、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１６】
前記組成物が若年のドナーから得た関節軟骨細胞を含む、請求項９に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１７】
前記組成物が死体から得た関節軟骨細胞を含む、請求項８に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１８】
前記組成物が移植組織を含む、請求項９に記載の軟骨置換組成物。
【請求項１９】
前記組成物が約２０〜３０℃の温度に維持され、密封容器の中に入れられる、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項２０】
前記容器が、ホイルパウチ、密封ＰＥＴＧトレー、及びガラス瓶からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記貯蔵期間が、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３０日、少なくとも約５０日、または少なくとも約６０日である、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項２２】
前記組成物が無血清の培地中で維持される、請求項１または２に記載の軟骨置換組成物。
【請求項２３】
ａ）あらかじめ生理的温度に維持されており、初期プロテオグリカン含量を有している、軟骨組成物を入手すること；
ｂ）前記軟骨組成物を無血清培地中で容器の中に密封すること；
ｃ）前記軟骨組成物の前記プロテオグリカン含量を前記初期プロテオグリカン含量よりも少ない貯蔵プロテオグリカン含量まで減少させるのに十分な貯蔵期間、前記密閉容器中の前記軟骨組成物を生理的温度未満の貯蔵温度で維持すること；
ｄ）その後、前記軟骨組成物を前記容器及び前記貯蔵温度から出し、無血清培地及び生理的温度を含む回復条件に前記軟骨組成物を戻すこと；
ｅ）前記軟骨組成物の前記プロテオグリカン含量が回復プロテオグリカン含量まで増加するのに十分な期間、前記軟骨組成物を前記回復条件で維持すること；
を含む、軟骨組織の修復のための、軟骨組成物のプロテオグリカン含量の修正方法。
【請求項２４】
前記生理的温度未満の温度が約３０℃以下である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記初期、貯蔵、及び回復のプロテオグリカン含量が、それぞれアグリカン含量を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記初期、貯蔵、及び回復のプロテオグリカン含量が、それぞれ硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）含量を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
約３０℃以下に維持される前の生理的温度での前記新生軟骨の前記初期プリテオグリカン含量が、少なくとも約４００μｇ／ｃｍ２または少なくとも約５００μｇ／ｃｍ２の初期Ｓ−ＧＡＧ含量を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記初期プリテオグリカン含量が、約８００μｇ／ｃｍ２〜約２５００μｇ／ｃｍ２のＳ−ＧＡＧ含量を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＸ型のコラーゲンを実質的に含まない、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物の前記初期プロテオグリカン含量が、高分子量アグリカンに富んだ軟骨であることを示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記高分子量アグリカンが、前記軟骨の前記初期プロテオグリカン含量の少なくとも約８０％を占める、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記高分子量アグリカンが、前記軟骨の前記初期プロテオグリカン含量の少なくとも約９０％を占める、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記生理的温度が約３７℃である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ａ）の前の前記組成物が正常酸素圧条件または低酸素条件で維持され、工程（ｄ）及び（ｅ）における回復条件時には、前記組成物は更に正常酸素圧条件または低酸素条件で維持される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物がヒトまたは動物のドナーから得た関節軟骨細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が若年のドナーから得た関節軟骨細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が死体から得た関節軟骨細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が移植組織を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｃ）において、前記組成物が約２０〜３０℃の温度に維持される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記密閉容器が、ホイルパウチ、密封ＰＥＴＧトレー、及びガラス瓶からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｃ）における前記貯蔵期間が、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３０日、少なくとも約５０日、または少なくとも約６０日である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記軟骨組成物の前記プロテオグリカン含量が回復プロテオグリカン含量まで増加するのに十分な期間前記軟骨組成物を前記回復条件で維持することが、被験体の軟骨欠損部に前記軟骨組成物を移植することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２３〜４２のいずれか１項に記載の方法によって作製される軟骨組成物。
【請求項４４】
生体外で作製され、軟骨組成物のプロテオグリカン含量を初期プロテオグリカン含量よりも少ない貯蔵プロテオグリカン含量まで減少させるのに十分な貯蔵期間、生体外で生理的温度未満の貯蔵温度にさらされ、その後、生理的温度に戻される軟骨組成物を含む、軟骨組成物であって、前記生理的温度に戻されると前記軟骨組成物が生存軟骨置換材料となる、軟骨組成物。
【請求項４５】
ａ）軟骨組成物を無血清培地中で容器の中に密封することと、前記軟骨組成物のプロテオグリカン含量を初期プロテオグリカン含量よりも少ない貯蔵プロテオグリカン含量まで減少させるのに十分な貯蔵期間、前記密閉容器中の前記軟骨組成物を生理的温度未満の貯蔵温度で維持することとを含む方法によって作製される軟骨組成物を得ること；
ｂ）その後、前記軟骨組成物を前記容器及び前記貯蔵温度から出すこと；
ｃ）被験体の軟骨欠損部に前記軟骨組成物を移植することであって、前記移植が前記軟骨組成物を生理的温度へ戻すこと；
ｄ）前記軟骨組成物の前記プロテオグリカン含量が前記組成物の回復プロテオグリカン含量まで増加するのに十分な期間、前記軟骨組成物を前記欠損部中で維持すること；
を含む、被験体の軟骨組織の修復方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本開示は、軟骨修復組成物、及び組成物のプロテオグリカン含量の修正方法に関する。
【発明の概要】
【０００２】
１つの態様では、本開示は、生理的温度の新生軟骨のプロテオグリカン含量と比較して新生軟骨のプロテオグリカン含量を減少させるのに十分な期間、生理的温度未満の温度で維持された新生軟骨を含有する、軟骨置換組成物であって、約３０℃以下の温度の新生軟骨が生理的温度に戻された場合にプロテオグリカン含量を増加させることが可能である、軟骨置換組成物を提供する。言い換えると、プロテオグリカン含量は、新生軟骨が生理的温度に戻された場合に、増加することが可能である。
【０００３】
別の態様では、本開示は、単離された軟骨細胞から生体外で作製した軟骨組織を含有する軟骨置換組成物あって、軟骨組織は生理的温度の軟骨組織のプロテオグリカン含量と比較して軟骨組織のプロテオグリカン含量を減少させるのに十分な期間、生理的温度未満の温度で維持され、約３０℃以下の温度の軟骨組織が生理的温度に戻された場合にプロテオグリカン含量を増加させることが可能である、軟骨置換組成物を提供する。言い換えると、軟骨組織のプロテオグリカン含量は、軟骨組織が生理的温度に戻された場合に増加することが可能である。
【０００４】
本明細書に記載の任意の軟骨置換組成物は、次のいずれかの１つ、任意の組み合わせ、または全てによって特徴付けることができる：
・生理的温度未満の温度は約３０℃以下である。
・プロテオグリカン含量にはアグリカン含量が含まれる。
・プロテオグリカン含量には硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）含量が含まれる。
・約３０℃以下に維持される前の生理的温度での新生軟骨の初期プリテオグリカン含量には、少なくとも約４００または少なくとも約５００μｇ／ｃｍ２の初期Ｓ−ＧＡＧ含量が含まれる。
・初期プリテオグリカン含量には、約８００μｇ／ｃｍ２〜２５００μｇ／ｃｍ２のＳ−ＧＡＧ含量が含まれる。
・組成物はＩ型、ＩＩＩ型、及びＸ型のコラーゲンを実質的に含まない。
・組成物の初期プロテオグリカン含量は、高分子量アグリカンに富んだ軟骨であることを示している。
・高分子量アグリカンは、軟骨の初期プロテオグリカン含量の少なくとも約８０％を占める。
・高分子量アグリカンは、軟骨の初期プロテオグリカン含量の少なくとも約９０％を占める。
・生理的温度は約３７℃である。
・組成物が生理的温度で維持される際、組成物は更に正常酸素圧条件または低酸素条件で維持される。
・約３０℃以下で維持した際の組成物の減少したプロテオグリカン含量と比較して組成物のプロテオグリカン含量を増加させるのに十分な期間、組成物を生理的温度に戻した。
・組成物はヒトまたは動物のドナーから得た関節軟骨細胞を含む。
・組成物は若年のドナーから得た関節軟骨細胞を含む。
・組成物は死体から得た関節軟骨細胞を含む。
・組成物は移植組織を含む。
・組成物は約２０〜３０℃の温度に維持される。
・生理的温度未満の温度で維持される際の組成物は、密封容器の中に入れられる。すなわち、空気への曝露は減らされるか排除される。
・密閉容器は、ホイルパウチ、密封ＰＥＴＧトレー、及びガラス瓶からなる群から選択される。
・貯蔵期間は少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３０日、少なくとも約５０日、少なくとも約６０日、少なくとも約９０日、少なくとも約１２０日、少なくとも約１５０日、または少なくとも約３６０日である。
・組成物は、生理的温度未満の温度での維持の前、及び／または最中、及びまたは後に、無血清の培地中で維持される。
・組成物は、密閉容器の中で、無血清の培地中で維持される。
【０００５】
別の態様では、本開示は、
ａ）あらかじめ生理的温度に維持されており、初期プロテオグリカン含量を有している、軟骨組成物を入手すること；
ｂ）軟骨組成物を無血清培地中で容器の中に密封すること；
ｃ）軟骨組成物のプロテオグリカン含量を初期プロテオグリカン含量よりも少ない貯蔵プロテオグリカン含量まで減少させるのに十分な貯蔵期間、密閉容器中の軟骨組成物を生理的温度未満の貯蔵温度で維持すること；
ｄ）その後、軟骨組成物を容器及び貯蔵温度から出し、無血清培地及び生理的温度を含む回復条件に軟骨組成物を戻すこと；
ｅ）軟骨組成物のプロテオグリカン含量が回復プロテオグリカン含量まで増加するのに十分な期間、軟骨組成物を回復条件で維持すること；
を含む、軟骨組織の修復のための、軟骨組成物のプロテオグリカン含量の修正方法を提供する。
被験体の軟骨欠損部
【０００６】
別の態様では、本開示は、
ａ）軟骨組成物を無血清培地中で容器の中に密封することと、軟骨組成物のプロテオグリカン含量を初期プロテオグリカン含量よりも少ない貯蔵プロテオグリカン含量まで減少させるのに十分な貯蔵期間、密閉容器中の軟骨組成物を生理的温度未満の貯蔵温度で維持することとを含む方法によって作製される軟骨組成物を得ること；
ｂ）その後、軟骨組成物を容器及び貯蔵温度から出すこと；
ｃ）被験体の軟骨欠損部に軟骨組成物を移植することであって、移植が軟骨組成物を生理的温度へ戻すこと；
ｄ）軟骨組成物のプロテオグリカン含量が組成物の回復プロテオグリカン含量まで増加するのに十分な期間、軟骨組成物を欠損部中で維持すること；
を含む、被験体の軟骨組織の修復方法を提供する。
【０００７】
いずれの方法においても、生理的温度未満の温度は約３０℃以下とすることができる。初期、貯蔵、及び回復のプロテオグリカン含量には、それぞれアグリカン含量が含まれる。初期、貯蔵、及び回復のプロテオグリカン含量には、それぞれ硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）含量が含まれる。約３０℃以下で維持する前の生理的温度での新生軟骨の初期プロテオグリカン含量には、少なくとも約４００または少なくとも約５００μｇ／ｃｍ２の初期Ｓ−ＧＡＧ含量が含まれていてもよい。初期プロテオグリカン含量には、約８００μｇ／ｃｍ２〜約２５００μｇ／ｃｍ２のＳ−ＧＡＧ含量が含まれていてもよい。組成物はＩ型、ＩＩＩ型、及びＸ型のコラーゲンを実質的に含んでいなくてもよい。組成物の初期プロテオグリカン含量は、高分子量アグリカンに富んだ軟骨であることを示し得る。高分子量アグリカンは、軟骨の初期プロテオグリカン含量の少なくとも約８０％を占めていてもよい。高分子量アグリカンは、軟骨の初期プロテオグリカン含量の少なくとも約９０％を占めていてもよい。生理的温度は約３７℃であってもよい。工程（ａ）の前の組成物は、あらかじめ正常酸素圧条件または低酸素条件で維持されていてもよく、また工程（ｄ）及び（ｅ）における回復条件の際には、組成物は更に正常酸素圧条件または低酸素条件で維持されてもよい。組成物は、ヒトまたは動物のドナー、若年のドナー、死亡した個体（動物またはヒト、すなわち死体）から得た関節軟骨細胞を含んでいてもよい。組成物は移植組織を含んでいてもよい。工程（ｃ）において、組成物は約２０〜３０℃の温度に維持されてもよい。密閉容器は、ホイルパウチ、密封ＰＥＴＧトレー、及びガラス瓶からなる群から選択されてもよい。工程（ｃ）における貯蔵期間は少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３０日、少なくとも約５０日、または少なくとも約６０日、少なくとも約９０日、少なくとも約１２０日、少なくとも約１５０日、または少なくとも約３６０日であってもよい。
【０００８】
軟骨組成物のプロテオグリカン含量が回復プロテオグリカン含量まで増加するのに十分な期間、軟骨組成物を回復条件で維持することは、…に軟骨組成物を移植することを含んでいてもよい。
【０００９】
別の態様では、本開示は開示された方法のいずれかによって作製される軟骨組成物を提供する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、生体外で作製され、軟骨組成物のプロテオグリカン含量を初期プロテオグリカン含量よりも少ない貯蔵プロテオグリカン含量まで減少させるのに十分な貯蔵期間、生体外で生理的温度未満の貯蔵温度にさらされ、その後、生理的温度に戻される軟骨組成物を含む、軟骨組成物であって、生理的温度に戻されると軟骨組成物が生存軟骨置換材料となる、軟骨組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】回復培養期間中の移植組織の経時的なプロテオグリカン（Ｓ−ｇａｇ）含量のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、一つには、単離された軟骨細胞から生体外で作製された軟骨組成物のプロテオグリカン含量を、組成物の温度を変化させることによって操ることができるという驚くべき発見に基づくものであり、軟骨組織修復のための、軟骨組成物のプロテオグリカン含量の修正方法を提供する。例えば、プロテオグリカン含量は、組成物の温度を生理的温度未満に下げることによって減らすことができ、その後、プロテオグリカン含量は、組成物の温度を生理的温度に戻すことによって回復させることができる。
【００１３】
本明細書において、用語「被験体」とは、ヒト及びヒトではない霊長類（例えばサル
または類人猿）、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット）などの哺乳類を含む（ただしこれらに限定されない）動物のことをいう。好ましくは、被験体はヒトである。
【００１４】
本明細書において別段の規定がない限り、本開示に関連して使用される科学的用語及び技術的用語は、当業者が普通に理解する意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は明確であるべきではあるが、何らかの潜在的な曖昧性が存在する場合には、あらゆる辞書的な定義または外的な定義よりも本明細書で与えられる定義が優先される。更に、文脈から必要とされない限り、本明細書及び請求項で使用される単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００１５】
別途記載がない限り、「または」の使用は、「及び／または」を意味する。更に、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、並びに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｄｌｕｄｅｄ」などの他の形態は限定的には使用されない。同様に、「要素」または「成分」などの用語は、別段の具体的な記載がない限り、１つの構成単位を含む要素及び成分と、１つより多い副次的単位を含む要素及び成分の、両方が包含される。
【００１６】
本明細書において、用語「軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ及びｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）」とは、生体内での正常な軟骨組織の成長を生じさせる、軟骨に特異的な細胞のことをいい、これらの細胞は軟骨の支持基質（主にコラーゲンとプロテオグリカンとからなる）を合成し、蓄積する。
【００１７】
用語「表現型」とは、細胞または組織の、任意のレベルでの、物理的に、形態的に、生物化学的に、または分子的に、観察可能な特徴のことをいう。
【００１８】
本明細書において、用語「ヒアルロン酸」は、用語「ヒアルロン酸塩」、「ヒアルロナン」、及び「ＨＡ」と置き換え可能であり、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖繰り返し単位からなる多糖のことをいう。市販のＨＡは通常はそのナトリウム塩の形態である。ＨＡは、鶏冠由来または細菌発酵由来のいずれかの精製したヒアルロン酸ナトリウムなど、天然のヒアルロン酸塩であってもよいし、合成ヒアルロン酸塩であってもよい。
【００１９】
本明細書において、用語「サイトカイン」は、用語「成長因子」と置き換え可能であり、それ自身の機能（自己分泌作用）を変えるか、隣接する細胞の機能（傍分泌作用）を変える目的で、ある細胞によって分泌される、幅広い範囲の比較的低分子量の薬理的に活性なタンパク質のことをいう。個々のサイトカインは複数の生物学的活性を有し得る。異なるサイトカインが重複する活性を有している場合もある。
【００２０】
通常、本明細書で記載されている細胞及び組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子及びタンパク質及び核酸の化学、並びに交配に関連して使用される専門用語及びこれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されている。本開示の方法及び技術は、特段の指示がない限り、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、並びに、本明細書全体の中で引用され及び論じられている様々な一般的かつより具体的な参照文献に記載の通りに、通常行われる。全ての化学反応、酵素反応、染色反応、または精製手段は、当該技術分野で一般的に確立されているか本明細書で記載されているような、メーカーの仕様書及び手順書に従って行われる。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、並びに創薬及び薬化学と関連して使用される専門用語、並びにこれらの実験室手順及び技術も、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されている。化学合成、化学分析、医薬品、処方、送達、並びに、診断及び治療（全ての被験体、ヒト及び動物の）のためには、標準的な技術が使用される。
【００２１】
Ａ．軟骨組成物及び方法
基本的な細胞の分離、培養、及び増殖の方法、特には軟骨細胞の分離、培養、及び増殖についての方法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されている。新生軟骨などの単離された軟骨細胞から生体外で作製される軟骨組成物、及びそのような組成物からなる移植組織の作製方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６４５，７６４；Ｎｏ．６，２３５，３１６；Ｎｏ．７，０８７，２２７；Ｎｏ．７，２７３，７５６；及びＮｏ．８，０１７，３９４の中で以前に述べられているとおりであり、これらそれぞれの開示全体は、参照により本明細書に包含される。本明細書において特段の指示がない限り、方法及び手順は、当該技術分野で周知の従来方法に従って、並びにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６４５，７６４；Ｎｏ．６，２３５，３１６；Ｎｏ．７，０８７，２２７；Ｎｏ．７，２７３，７５６；及びＮｏ．８，０１７，３９４の実施例について記載されているとおりに行われる。
【００２２】
本明細書に記載の方法及びシステムは、一つには、単離された軟骨細胞から生体外で作製された軟骨組成物のプロテオグリカン含量を、組成物の温度を変化させることによって操ることができるという驚くべき発見に基づくものである。例えば、プロテオグリカン含量は、組成物の温度を生理的温度未満に下げることによって減らすことができ、その後、特に驚くべきことには、プロテオグリカン含量は、組成物の温度を生理的温度に戻すことによって回復させることができる。好ましくは、組成物の温度を下げる際、組成物は密封された容器（すなわち、組成物の空気への曝露を減らすか排除する容器）の中で、組織培地中に、好ましくは無血清培地中に維持される。組成物の温度の生理的温度への回復は、生理的温度及び正常酸素圧条件もしくは低酸素条件を与える生体内培養条件に組成物を戻すことによって、並びに／または生きている被験体の生体内に組成物を移植することによって、例えば被験体中の軟骨欠損部に移植することによって、達成することができる。
【００２３】
本発明の方法にかかる軟骨組成物を作製するための軟骨細胞は、例えばヒトまたは動物のドナー由来の軟骨から単離することができる。典型的なドナーは、新生児、幼児、または思春期前のドナーなど未成熟または若年のドナーである。ドナーは、死亡した未成熟または若年のドナーなどの死亡した個体であってもよい。軟骨細胞は、鳥類または哺乳類の軟骨細胞であってもよく、好ましくはヒトの軟骨細胞であってもよい。軟骨細胞は、免疫による異種移植拒絶反応を抑えるように遺伝子操作された遺伝子組み換え動物由来であってもよい（Ｓａｎｄｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓａｎｄｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；及びＯｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。軟骨は、ヒアリン、弾性軟骨、または繊維軟骨を含む任意の組織から得ることができる。軟骨細胞は、逐次的な酵素消化法（Ａｄｋｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）によってなどの、当該技術分野で公知の方法によって単離することができる。
【００２４】
軟骨組成物を作製するための増殖培養物は、例えば新生児、幼児、または思春期前などの未成熟の軟骨細胞をドナーの関節軟骨から単離し、培養皿または培養容器中で解離細胞を培地に播種することによって、例えば作製することができる。培地は、好ましくは実質的に無血清または無血清の増殖培地である。「化学的に定義された」培地は無血清の培地であり、その化学的成分は既知である。培地は、好ましくは少なくとも１つの成長因子を含有する無血清培地である。典型的な実質的に無血清の増殖培地は、唯一のタンパク質源としてインスリン−トランスフェリン−セレン−複合体を含有する無血清培地である、ＨＬ−１（登録商標）である。ＨＬ−１（登録商標）は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄから入手可能である。他の好適な無血清増殖培地は当業者であれば簡単に分かるであろう。
【００２５】
任意の方法において、または任意の組成物の作製に関し、好適な培地には、例えば、アデノメジュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型運動刺激因子、ＢＭＰ−２やＢＭＰ−４やＢＭＰ−７などの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、コンドロモジュリン−Ｉ（ＣｈＭ−Ｉ）、コンドロモジュリン−ＩＩ（ＣｈＭ−ＩＩ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１８、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子−５（ＧＤＦ５）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、治癒促進因子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌細胞由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）及び他の神経栄養因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔシグナル経路、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ＰＤＧＦ−ｂｂ、プレイオトロフィン、並びにＳＤＦ−１、から選択することができる少なくとも１種の成長因子が任意選択的に含まれていてもよい。
【００２６】
任意の方法において、または任意の組成物の作製に関し、好適な培地は、可溶性ＩＩ型コラーゲン、グルコース、インスリン、トランスフェリン、セレン、アスコルビン酸、生物活性なナノ材料、及びデキサメタゾン（ＳＦ３Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種の培地添加剤を任意選択的に含有していてもよい。更に、好適な培地は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラチン硫酸塩、ヘパラン、ヘパラン硫酸塩、デキストラン、デキストラン硫酸塩、アルギン酸塩、細菌由来の多糖、合成多糖、硫酸化糖、及び非硫酸化糖からなる群から選択される少なくとも１種の多糖を含有していてもよい。多糖は、培地の溶液中で、少なくとも約０．００１％〜約１０％の濃度であってもよい。
【００２７】
本明細書に記載の方法にかかる軟骨組成物は、体外で連続的増殖及び培養を行うことによって生体外で作製することができ、これは、驚くべきことには、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６４５，７６４に記載されているように、アグリカンを含む高いプロテオグリカン含量で強化された、実質的に連続な不溶性のグリコサミノグリカンとコラーゲン強化ヒアリンの細胞外基質によって取り囲まれた、多層の細胞によって特徴付けられる。硫酸化グリコサミノグリカンＳ−ＧＡＧのレベルは、例えばＳ−ＧＡＧ分析によって決定することができ、これはプロテオグリカン含量の指標である。
【００２８】
したがって、本開示には本明細書に記載の軟骨組成物及び方法が包含される。
【実施例】
【００２９】
Ｂ．実施例
本開示を実証するために以降の実施例が含まれている。以降の実施例で開示されている技術は本開示の実施において十分に機能すると発明者らによって発見された技術を表していることが当業者に理解されるはずである。しかし、当業者であれば、本開示に基づいて、本開示に対して多くの変更を行うことが可能であり、そのようにしても、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなしに同様のあるいは類似した結果を得られることを認識するはずである。したがって、記述されている全ての事項は例示的と解釈すべきであり、限定的な意味で解釈すべきではない。
【００３０】
実施例１：新生軟骨移植組織のＳ−ＧＡＧの回復
この試験は、生理的温度未満の温度での貯蔵時に新生軟骨移植組織のプロテオグリカン含量が減少するものの、３７℃／１０％ＣＯ２に戻した際に、移植組織中の細胞が基質産生を再開することを示すデータを提供する。新生軟骨は、別途、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６４５，７６４；Ｎｏ．６，２３５，３１６；Ｎｏ．７，０８７，２２７；Ｎｏ．７，２７３，７５６；及びＮｏ．８，０１７，３９４の実施例について記載されている方法及び手順に従って作製される。
【００３１】
このレポートでは、６．７×１０６細胞／移植組織片で、Ｅ１１−０８５から播種した単一ロットの大きい（６．１５ｃｍ２）新生軟骨からのデータがまとめられた：
１．ＤＩＲ−１３−１６７の下、１日目に解凍して播種した。
２．６３日目頃に６５ｍＬのＰＥＴＧトレーに入れた。
３．ＰＥＴＧトレーの中で、２２．５℃及び／または３０℃で貯蔵した。
４．トレーに入れて６０日目頃に、すなわち１２３日目頃に、トレーから取り出し、ＲＭ０７７培地中で３７℃／１０％ＣＯ２培養条件に戻した。
５．試験１８４日目（回復培養６１日目）頃に採取した。
【００３２】
１日目の貯蔵前の移植組織の初期Ｓ−ＧＡＧ含量は１３０１μｇ／ｃｍ２であり、これは少なくとも５００μｇ／ｃｍ２という現行の仕様を満たしている。回復培養での６１日後、全ての移植組織のＳ−ＧＡＧ含量は、貯蔵前のＳ−ＧＡＧ含量と一致するか上回っていた。
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【００３３】
６３日目の貯蔵の前の移植組織の初期ＤＮＡ含量は２６ｐｇ／ｃｍ２であり、これは少なくとも７μｇ／ｃｍ２という現行の仕様を満たしている。
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【００３４】
図１に示されているように、全ての移植組織のプロテオグリカン含量は、回復培養期間中に少なくとも５５％増加した。
【００３５】
取り扱いを容易にするためには、Ｓ−ＧＡＧは移植組織に必要な成分ではあるものの、貯蔵時のこの基質成分の減少は、代謝活性及び／または移植組織の生存能力の低下を意味しないようである。
【００３６】
実施例２：新生軟骨移植組織のＳ−ＧＡＧの回復
生理的温度未満の温度での貯蔵時に移植組織のプロテオグリカン含量が減少するものの、３７℃／１０％ＣＯ２に戻した際、移植組織中の細胞は基質産生を再開する。新生軟骨は、別途、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６４５，７６４；Ｎｏ．６，２３５，３１６；Ｎｏ．７，０８７，２２７；Ｎｏ．７，２７３，７５６；及びＮｏ．８，０１７，３９４の実施例について記載されている方法及び手順に従って作製される。４．９×１０６細胞／移植組織片で、Ｅ１３−００１から多数の小さい（２４ｍｍ）新生軟骨を播種し、次の通りに処理した：
１．１日目に新生軟骨を解凍して播種した。
２．６２日目に採取した。シリコーン製のガスケットを有するガラス瓶（１番目の容器）中の６５ｍＬの培地に入れ、ホイルパウチ（２番目の容器）の中に密閉した。
３．３０℃で５７日間貯蔵した。
４．容器から取り出し、３７℃／１０％ＣＯ２の培養条件に戻した。
５．６４日間培養を続け、試験のために試料を採取した。
【００３７】
貯蔵の後、移植組織は完全分化培地（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（アスコルビン酸塩及びグルタミンが添加されたＲＭ０７７培地）中、３７℃の加湿型ウォータージャケット式インキュベーター（１０％ＣＯ２）中で維持された。培地は３〜４日毎に取り換えられた（６ｍＬ／移植組織）。
【００３８】
貯蔵時にＳ−ＧＡＧが減少したのにもかかわらず、驚くべきことに、移植組織中の細胞は、培養条件に戻した際に生存能力及び基質の産出能力を有したままのようである。
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【００３９】
移植組織のプロテオグリカン含量は回復培養期間中にほぼ３倍になり、ＤＮＡは実質的に同じでままであった。
【００４０】
Ｓ−ＧＡＧは、ヒト軟骨の必須の構成成分であり、この存在は圧縮負荷を吸収する含水の粘性ゲルの供給に寄与する。しかし、貯蔵時のこの基質成分の減少は、移植組織の特性の低下を意味しないようである。回復培養を行うと、プロテオグリカンのレベルは貯蔵前のレベルさえも上回る。これは、細胞が生存可能なままであり、貯蔵期間後でさえもアグリカンを産出し続けることを意味する。
【００４１】
明細書中で述べられている全ての特許及び刊行物は、本開示に関連する技術分野の当業者の水準の指標である。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により包含されることが具体的にかつ個別に指示されているのと同程度に、参照により本明細書に包含される。
【図１】
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【国際調査報告】
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