(57)【要約】  本明細書では、ＩＬ−１７を含む免疫療法組成物を開示する。本明細書ではまた、免疫応答の増加を必要とする対象の免疫応答を増加させる方法も開示する。本方法には、対象に免疫療法組成物を投与することを含んでも良い。免疫応答の増加により、インフルエンザウイルスから防御することができる。本明細書では、インフルエンザウイルス感染の診断方法も更に開示する。
2017511810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象のインフルエンザウイルス治療方法であって、ＩＬ−１７を含む免疫療法組成物を対象に投与することを含み、その結果、前記対象が複数のインフルエンザウイルス亜型に対する耐性を得る、前記方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−１７が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫療法組成物の投与が、電子穿孔または注入を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ａ型インフルエンザウイルスが、亜型Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、またはＨ１Ｎ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ａ型インフルエンザウイルスが、亜型Ｈ５Ｎ１である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ａ型インフルエンザウイルスが、亜型Ｈ７Ｎ９である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記対象の免疫応答が少なくとも約４倍増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対象の前記免疫応答が少なくとも約２倍増加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象の前記免疫応答の増加により、インフルエンザウイルスの少なくとも約７０％の生存率を達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象の前記免疫応答の増加により、インフルエンザウイルスの少なくとも約１００％の生存率を達成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫療法組成物が、ＩＬ−１７ペプチドをコードする核酸を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫療法組成物が、アミロライド、インフルエンザ抗原、及びインターロイキンからなる群から選択される１種以上の他の抗原を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
診断を必要とする対象のインフルエンザウイルス感染診断方法であって、
（ａ）前記対象から得たサンプルを提供することと、
（ｂ）前記サンプルのＩＬ−１７レベルを測定することと、
（ｃ）前記測定されたＩＬ−１７レベルをＩＬ−１７の閾値レベルと比較することと、
（ｄ）前記測定されたＩＬ−１７レベルレベルが前記ＩＬ−１７の閾値レベルより高い場合に、前記対象のインフルエンザウイルス感染を確定することと、を含む前記方法。
【請求項１５】
ＩＬ−１７が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、または血漿サンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記インフルエンザウイルスに感染した前記対象に、ＩＬ−１７を含む免疫療法組成物を投与することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＬ−１７が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
軽度のインフルエンザウイルス感染と重度のインフルエンザウイルス感染とを区別することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記インフルエンザウイルスが、亜型Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、またはＨ７Ｎ９である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１７を含む免疫療法組成物。
【請求項２２】
ＩＬ−１７が、配列番号１０または配列番号１１によってコードされる、請求項２１に記載の免疫療法組成物。
【請求項２３】
ＩＬ−１７が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項２１に記載の免疫療法組成物。
【請求項２４】
請求項２１に記載の免疫療法組成物であって、ＩＬ−１７が核酸によってコードされ、該免疫療法組成物がＩＬ−１７ペプチドを更に含む、前記免疫療法組成物。
【請求項２５】
アミロライド、インフルエンザ抗原、及びインターロイキンからなる群から選択される１つ以上の他の抗原を更に含む、請求項２１に記載の免疫療法組成物。
【請求項２６】
前記インフルエンザ抗原が、Ｈ１ＨＡ、Ｈ２ＨＡ、Ｈ３ＨＡ、Ｈ５ＨＡ、ＢＨＡ抗原、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載の免疫療法組成物。
【請求項２７】
前記インターロイキンが、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、ＩＬ−２１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載の免疫療法組成物。
【請求項２８】
薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項２１に記載の免疫療法組成物。
【請求項２９】
ＩＬ−１７が、ＩＬ−１７ペプチドのモノマーである、請求項２１に記載の免疫療法組成物。
【請求項３０】
ＩＬ−１７が、ＩＬ−１７ペプチドの二量体である、請求項２１に記載の免疫療法組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法組成物、インフルエンザの治療及び／または予防方法、ならびにインフルエンザウイルス感染の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、個体の免疫応答を活性化して、特定の疾患（例えば、インフルエンザ）に対する防御及び／または治療を提供するために使用する。毎年、インフルエンザウイルスに接触する及び／またはそれによる感染死に至る個体が多数である。特に、幼児、高齢者、免疫系が低下した個体、及び医療従事者はインフルエンザウイルス感染を受けやすく、入院を要する場合も多く、それに伴い経済面及び社会的な負担が生じている。３つのインフルエンザ株は、特に、ここ１０年間、重要な関心事となっている。Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型は、１９１９年の汎発流行性疾患（全世界で５，０００万〜１億人が死亡したスペインのトリインフルエンザ）、及び２０１０年の発生以来、１７，０００人以上の死者を出したブタＨ１Ｎ１の汎発流行をもたらした、一般的なヒトインフルエンザウイルスである。Ａ型トリインフルエンザウイルスＨ７Ｎ９亜型は、２０１３年に中国で発生し、新しい感染症としては異例の高率となる、死者２０人及び感染者１００人を出した、新たなＡ型インフルエンザ亜型である。Ａ型トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型は、２００６年の発生後、アジアを発端に全世界へと伝播した。これは、動物間流行病（ヒト以外の流行病）及び汎発性動物間流行病（影響が多種の動物、特に広域にわたる）であり、何千万羽の鳥類が死亡し、感染拡大を食い止めるため、何億羽の殺処分が進められた。Ｈ５Ｎ１の発生件数は、２００６年６月の発生件数６５件及び２００７年６月の５５件と比較して、２００８年６月の世界的な報告では、５か国（中国、エジプト、インドネシア、パキスタン、及びベトナム）で１１件であった。２０１３年７月、ＷＨＯは、合計６３０人のヒトへの感染例を確認し、２００３年以降３７５人が死亡したと発表した。
【０００３】
このようにインフルエンザウイルスは非常に変異性が高く、したがって製薬業者は、この変異性及び新興インフルエンザウイルス株に対処するため、毎年インフルエンザウイルスを対象とする新たなワクチン（すなわち、インフルエンザワクチン）を開発する必要がある。換言すれば、インフルエンザワクチンは、特定のある年に集団間で最も流布するインフルエンザ株（複数可）の予測に基づいて生産される。現在、これらのインフルエンザワクチンは、多くの場合、鶏卵内でインフルエンザウイルスを増殖させることによって生産される。したがって、受精したニワトリ及び卵子の供給、ならびに鶏卵内でインフルエンザウイルスがどの程度、良好に増殖するかによって生産が制限される。このように、汎発流行を受けてインフルエンザワクチン生産を加速し、またそのインフルエンザワクチンを特定のインフルエンザ株（複数可）を標的とする特定のワクチンに迅速に切り替えることは困難である。
【０００４】
したがって、当該技術分野において、多くの異なるＡ型インフルエンザ亜型に適用することができ、それによって感染拡大防止及び経年の生存率向上をもたらす、安全かつ有効な免疫療法組成物の開発が依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＩＬ−１７を含む免疫療法組成物に関する。ＩＬ−１７は、配列番号１０または配列番号１１によってコードされ得る。ＩＬ−１７は、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。ＩＬ−１７は核酸によってコードされても良く、免疫療法組成物はＩＬ−１７ペプチドを更に含んでも良い。
【０００６】
免疫療法組成物は、アミロライド、インフルエンザ抗原、及びインターロイキンからなる群から選択される１種以上の他の抗原を更に含んでも良い。インフルエンザ抗原は、Ｈ１ＨＡ、Ｈ２ＨＡ、Ｈ３ＨＡ、Ｈ５ＨＡ、ＢＨＡ抗原、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。インターロイキンは、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、ＩＬ−２１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
【０００７】
免疫療法組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含んでも良い。ＩＬ−１７は、ＩＬ−１７ペプチドのモノマーであり得る。ＩＬ−１７は、ＩＬ−１７ペプチドの二量体であり得る。
【０００８】
本発明は、治療を必要とする対象のインフルエンザウイルス治療方法に関し、該方法は、ＩＬ−１７を含む免疫療法組成物を対象に投与することを含み、その結果、対象が複数のインフルエンザウイルス亜型に対する耐性を得るものである。ＩＬ−１７は、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。免疫療法組成物は、ＩＬ−１７ペプチドをコードする核酸を更に含んでも良い。免疫療法組成物は、アミロライド、インフルエンザ抗原、及びインターロイキンからなる群から選択される更に１種以上の他の抗原を更に含んでも良い。
【０００９】
免疫療法組成物の投与には、電気穿孔または注射を含み得る。対象の免疫応答は、少なくとも約４倍増加し得る。対象の免疫応答は、少なくとも約２倍増加し得る。インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスであり得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、亜型Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、またはＨ１Ｎ１であり得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、亜型Ｈ５Ｎ１であり得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、亜型Ｈ７Ｎ９であり得る。対象の免疫応答増加により、インフルエンザウイルスから少なくとも約７０％の生存率を達成し得る。対象の免疫応答増加により、インフルエンザウイルスから少なくとも約１００％の生存率を達成し得る。
【００１０】
本発明は更に、診断を必要とする対象におけるインフルエンザウイルス感染の診断方法に関する。本方法は、対象から得たサンプルの提供、及びそのサンプル中のＩＬ−１７レベルの測定を含み得る。本方法はまた、測定されたＩＬ−１７レベルをＩＬ−１７の閾値レベルと比較すること、及び測定されたＩＬ−１７レベルがＩＬ−１７の閾値レベルより高い場合に、対象へのインフルエンザウイルス感染を確定することも含み得る。ＩＬ−１７は、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。
【００１１】
サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、または血漿サンプルであって良い。本方法は、インフルエンザウイルスに感染した対象に、ＩＬ−１７を含む免疫療法組成物を投与することを更に含み得る。ＩＬ−１７は、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。本方法は更に、軽度のインフルエンザウイルス感染と重度のインフルエンザウイルス感染とを区別することを含み得る。インフルエンザウイルスは、亜型Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、またはＨ７Ｎ９であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】マウス群に対してＩＬ−１７Ａ血清レベルをプロットしているグラフを示す。
【図１Ｂ】感染後日数（ｄｐｉ）に対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図１Ｃ】マウス群に対して肺組織でのウイルス負荷をプロットしているグラフを示す。
【図２Ａ】マウス群に対してＩＬ−１７Ａ血清レベルをプロットしているグラフを示す。
【図２Ｂ】感染後日数（ｄｐｉ）に対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図２Ｃ】マウス群に対して肺組織でのウイルス負荷をプロットしているグラフを示す。
【図３Ａ】感染後日数（ｄｐｉ）に対して、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に感染したマウスの体重減少率をプロットしているグラフを示す。
【図３Ｂ】ｄｐｉに対して、０．１μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置され、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に感染させたマウスの体重減少率をプロットしているグラフを示す。
【図３Ｃ】ｄｐｉに対して、０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置され、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に感染させたマウスの体重減少率をプロットしているグラフを示す。
【図４Ａ】ナイーブマウス（パネル上段）、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露されたマウス（パネル中段）、及びＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露される前に０．５μｇの組み換え型ＩＬ−１７Ａ（ｒＩＬ−１７Ａ）を用いて事前処置されたマウス（パネル下段）からの肺組織切片のＣＤ８+Ｔ細胞に特異的な抗体を用いたヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色及び免疫組織化学染色を示す。
【図４Ｂ】ナイーブマウス（パネル上段）、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露されたマウス（パネル中段）、及びＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露される前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウス（パネル下段）からの肺組織切片のＣＤ８+Ｔ細胞に特異的な抗体を用いたヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色及び免疫組織化学染色を示し、矢印は、それぞれの組織切片の肺組織に浸潤したＣＤ８+Ｔ細胞を示す。
【図５Ａ】ヒト対象に対してＩＬ−１７Ａ血清レベルをプロットしているグラフを示す。
【図５Ｂ】ヒト対象に対してＩＬ−１７Ａ血清レベルをプロットしているグラフを示す。
【図５Ｃ】ヒト対象に対してＩＬ−１７Ａ血清レベルをプロットしているグラフを示す。
【図５Ｄ】ヒト対象に対してＩＬ−１７Ａ血清レベルをプロットしているグラフを示す。
【図６Ａ】マウス群に対してサイトカインレベルをプロットしているグラフを示す。
【図６Ｂ】感染後日数（ｄｐｉ）に対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図６Ｃ】ｄｐｉに対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図７Ａ】マウス群に対してサイトカインレベルをプロットしているグラフを示す。
【図７Ｂ】マウス群に対してサイトカインレベルをプロットしているグラフを示す。
【図７Ｃ】感染後日数（ｄｐｉ）に対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図８Ａ】細胞の種類に対して、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生細胞の比率をプロットしているグラフを示す。
【図８Ｂ】感染後日数（ｄｐｉ）に対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図８Ｃ】ｄｐｉに対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図９Ａ】レシピエントマウスへのＣＤ８+Ｔ細胞の養子移入の実験体系を示す図解を示す。
【図９Ｂ】感染後日数（ｄｐｉ）に対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図９Ｃ】ｄｐｉに対して生存率をプロットしているグラフを示す。
【図１０Ａ】マウス群に対して、特異的な細胞溶解率をプロットしているグラフを示す。
【図１０Ｂ】ＣＤ８+Ｔ細胞集団に対して、特異的な細胞溶解率をプロットしているグラフを示す。
【図１１Ａ】ｍＲＮＡヌクレオチド配列を示す。
【図１１Ｂ】ヌクレオチドのコード配列を示す。
【図１１Ｃ】ハツカネズミ（マウス）ＩＬ−１７Ａのアミノ酸配列を示す。
【図１２Ａ】ｍＲＮＡヌクレオチド配列を示す。
【図１２Ｂ】ヌクレオチドのコード配列を示す。
【図１２Ｃ】ホモサピエンス（ヒト）ＩＬ−１７Ａのアミノ酸配列を示す。
【図１３Ａ】下線が引かれた配列がＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡ  ＴＣＣ）及びコザック配列（ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含み、二重下線が引かれた配列が終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡ、ならびにＸｈｏＩ部位（ＣＴＣ  ＧＡＧ）を含む、最適化されたマウスＩＬ−１７Ａヌクレオチド配列を示す。
【図１３Ｂ】最適化されたマウスＩＬ−１７Ａをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ及び１３Ｂ（すなわち、配列番号７及び８）の最適化されたヌクレオチド配列によってコードされた、マウスＩＬ−１７Ａのアミノ酸配列を示す。
【図１４Ａ】下線が引かれた配列がＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡ  ＴＣＣ）及びコザック配列（ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含み、二重下線が引かれた配列が終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡ、ならびにＸｈｏＩ部位（ＣＴＣ  ＧＡＧ）を含む、最適化されたヒトＩＬ−１７Ａヌクレオチド配列を示す。
【図１４Ｂ】最適化されたヒトＩＬ−１７Ａをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ及び１４Ｂ（すなわち、配列番号１０及び１１）の最適化されたヌクレオチド配列によってコードされた、ヒトＩＬ−１７Ａのアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）を含む免疫療法組成物に関する。免疫療法組成物を使用すると、任意の数のインフルエンザウイルス、例えば、病原性Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、及びＨ７Ｎ９に対する防御及び治療が可能である。このような防御及び治療は、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、及びＨ７Ｎ９などのＡ型インフルエンザウイルスに感染した対象の生存を有意に増加させることができる。生存が有意に増加する理由は、免疫療法組成物がＣＤ８+Ｔ細胞によって産生される抗ウイルスサイトカインのインターフェロン−γのレベルを上昇させるためである。また、これらＣＤ８+Ｔ細胞は細胞溶解活性も有しており、これにより、Ａ型インフルエンザウイルスが潜伏している細胞を破壊する。それにより、体内の他の細胞を溶解して急激に感染するＡ型インフルエンザウイルス粒子の更なる産生を防止する。したがって、本発明では、治療及び防御を必要とする対象に免疫療法組成物を投与することにより、インフルエンザウイルス感染を治療及び／または防御する方法も提供する。
【００１４】
血清中のＩＬ−１７レベルは、インフルエンザウイルスへの感染に伴って増加する。したがって、本発明はまた、診断を必要とする対象のＩＬ−１７血清レベルに基づいた、インフルエンザウイルス感染の診断方法に関する。
【００１５】
１．定義
別段に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者に共通に理解されるものと同じ意味を有している。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先される。好ましい方法及び材料を後述するが、本明細書の記載と同様または同等の方法及び材料を本発明の実施または試験に用いることができる。本明細書で述べる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で開示される材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、本明細書の範囲を限定するものではない。
【００１６】
本発明で使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｃａｎ」、「ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）」、及びこれらの変形は、非限定的な移行句、用語、または単語であり、付加的な行為または構造の可能性を排除するものではない。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象物を包含する。本開示は、明示的な記載の有無に関わらず、本明細書に提示された実施形態及び要素を含む、それらからなる、かつ本質的にそれらからなる他の実施形態も企図する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」は、抗原の免疫原性を高めるために、本明細書に記載の免疫療法組成物に添加される任意の分子を意味する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「コード配列」、「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を意味する。コード配列は更に、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞内での発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に、機能的に連結された開始シグナル及び終結シグナルを含み得る。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「相補体」または「相補的」とは、ある核酸が、核酸分子のヌクレオチド間またはヌクレオチド類似体間にワトソン・クリック塩基対（例えばＡ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を形成し得ることを意味する。
【００２０】
本明細書で互換的に使用される場合、「電気穿孔」、「電気透過」、または「界面動電増強」（「ＥＰ」）とは、生体膜に微細通路（孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味する。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、及び水などの生体分子が、細胞膜の片側から反対側に通過することを可能にする。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「断片」または「免疫原性断片」は、哺乳動物の免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部分を意味する。断片は、以下に示すタンパク質断片をコードする種々のヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。断片は、以下に示す１種以上の核酸配列の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態においては、断片は、以下に示す少なくとも１つの核酸配列の、少なくとも２０個以上のヌクレオチド、少なくとも３０個以上のヌクレオチド、少なくとも４０個以上ヌクレオチド、少なくとも５０個以上のヌクレオチド、少なくとも６０個以上のヌクレオチド、少なくとも７０個以上のヌクレオチド、少なくとも８０個以上のヌクレオチド、少なくとも９０個以上のヌクレオチド、少なくとも１００個以上のヌクレオチド、少なくとも１５０個以上のヌクレオチド、少なくとも２００個以上のヌクレオチド、少なくとも２５０個以上のヌクレオチド、少なくとも３００個以上のヌクレオチド、少なくとも３５０個以上のヌクレオチド、少なくとも４００個以上のヌクレオチド、少なくとも４５０個以上のヌクレオチド、少なくとも５００個以上のヌクレオチド、少なくとも５５０個以上のヌクレオチド、少なくとも６００個以上のヌクレオチド、少なくとも６５０個以上のヌクレオチド、少なくとも７００個以上のヌクレオチド、少なくとも７５０個以上のヌクレオチド、少なくとも８００個以上のヌクレオチド、少なくとも８５０個以上のヌクレオチド、少なくとも９００個以上のヌクレオチド、少なくとも９５０個以上のヌクレオチド、または少なくとも１０００個以上のヌクレオチドを含み得る。
【００２２】
本明細書で使用される場合、断片または免疫原性断片は、哺乳動物の免疫応答を誘発することができるポリペプチド配列またはその一部分も意味する。断片は、以下に示す種々のアミノ酸配列の少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。断片は、以下に示す１種以上のタンパク質の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態においては、断片は、以下に示す少なくとも１つのタンパク質の、少なくとも２０個以上のアミノ酸、少なくとも３０個以上のアミノ酸、少なくとも４０個以上のアミノ酸、少なくとも５０個以上のアミノ酸、少なくとも６０個以上のアミノ酸、少なくとも７０個以上のアミノ酸、少なくとも８０個以上のアミノ酸、少なくとも９０個以上のアミノ酸、少なくとも１００個以上のアミノ酸、少なくとも１１０個以上のアミノ酸、少なくとも１２０個以上のアミノ酸、少なくとも１３０個以上のアミノ酸、少なくとも１４０個以上のアミノ酸、少なくとも１５０個以上のアミノ酸、少なくとも１６０個以上のアミノ酸、少なくとも１７０個以上のアミノ酸、少なくとも１８０個以上のアミノ酸、少なくとも１９０個以上のアミノ酸、少なくとも２００個以上のアミノ酸、少なくとも２１０個以上のアミノ酸、少なくとも２２０個以上のアミノ酸、少なくとも２３０個以上のアミノ酸、または少なくとも２４０個以上のアミノ酸を含み得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「遺伝子構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子の投与先である個体の細胞内での発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に、機能的に連結される開始及び終結シグナルが含まれる。本明細書で使用される場合、用語「発現可能な形態」は、個体の細胞内に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節要素を含有する遺伝子構築物を指す。
【００２４】
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用される場合、「同一の」または「同一性」は、該配列が指定領域にわたって指定の割合の同一残基を有することを意味する。この割合を計算するには、２つの配列を最適に整列させ、指定領域にわたって２つの配列を比較し、両配列に同一残基が発生する位置の数を確定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を指定領域内の総位置数で除算し、その結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセント値を得る。２つの配列の長さが異なるか、または整列により１つ以上の付着末端が生じ、かつ指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡとを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は同等と見なすことができる。同一性は、手作業で行っても、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用して行っても良い。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原の誘導に応答した、哺乳動物などの宿主の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答若しくは体液性応答、またはその両方の形態であり得る。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の変異体の多くは、所与の核酸と同一目的で使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２７】
核酸は、一本鎖または二本鎖でも良いか、または二本鎖と一本鎖両方の配列の一部分も含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであっても良く、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法によって得ることができる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「機能的に連結された」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子での当該プロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同一であり得る。当該技術分野で既知のように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化を適応することができる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の結合配列を意味することができ、天然、合成、または天然及び合成の変性若しくはその組み合わせであっても良い。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、細胞中での核酸の発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味する。プロモーターは、発現を更に増強するため、かつ／または空間的発現及び／若しくはその一時的発現を改変するため、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサー要素または抑制要素を含むこともでき、これら要素は、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、若しくは臓器に関して、または発現が生じる発生段階に関して、または例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘導剤などの外部刺激に応答して、恒常的に若しくは差次的に遺伝子成分の発現を調節することができる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００３１】
「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載のＩＬ−１７タンパク質（及び／または１つ以上の他の抗原）のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列を指す。一般に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌しやすくすることが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質（しばしば成熟タンパク質と呼ばれる）の残余から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に連結される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「対象」は、本明細書に記載する免疫療法組成物を用いた治療を希望するまたは必要とする哺乳動物を意味し得る。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはネズミであり得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「実質的に同一」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個以上のアミノ酸の領域にわたって、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とが少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。「実質的に同一」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個以上のヌクレオチドにわたって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とが少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることも意味する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「試験サンプル」または「サンプル」は、一般に、対象とする検体を含有するかどうかを検査される生体物質、及び／または該検体の含有が疑われる生体物質を指す。生体物質は、任意の生体源に由来するものであっても良い。生体物質の例として、大便、全血、血清、血漿、赤血球、血小板、間質液、唾液、眼房水、脳脊髄液、汗、尿、腹水液、粘液、鼻汁、痰、滑液、腹膜液、膣液、月経分泌物、羊水、精液または汚物、培養液、細胞培養物、化学反応混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。試験サンプルは、生物源から直接取得したまま使用しても、サンプルの性質を変更するための前処理後に使用しても良い。例えば、このような前処理は、血液、希釈粘液などから血漿を調製することを含み得る。前処理の方法は、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加、溶解なども含み得る。このような前処理方法を試験サンプルに対して用いる場合、このような前処理方法とは、対象となる検体が未処理の試験サンプル（例えば、すなわち、このような前処理方法を一切施していない試験サンプル）中の濃度と比例した濃度で試験サンプル中に残存するようなものである。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」は、疾患の予防、抑制、抑圧、または完全な除去により動物を疾患から防御することを意味し得る。疾患の予防には、その疾患の発症前に本発明の免疫療法組成物を動物に投与することを伴う。疾患の抑制には、疾患の誘発後だが、その疾患の臨床的出現の前に、本発明の免疫療法組成物を動物に投与することを伴う。疾患の抑圧には、疾患の臨床的出現後に本発明の免疫療法組成物を動物に投与することを伴う。
【００３６】
本明細書で核酸に関して使用される「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部分若しくは断片、（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列若しくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）基準核酸若しくはその相補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、若しくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味する。
【００３７】
更に変異体は、アミノ酸の挿入、欠失、または同類置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドであると定義され得る。「生物活性」の代表例として、特異抗体により結合される能力または免疫応答を促進する能力が挙げられる。変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の同類置換、すなわち、あるアミノ酸を特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、及び分布）の類似した別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することにより部分的に特定することができる。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指標は、その疎水性及び電荷の考察に基づく。ハイドロパシー指標が類似するアミノ酸同士は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において既知である。一態様では、ハイドロパシー指標が±２であるアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、置換によってタンパク質の生物機能が保持されるかを判定することもできる。ペプチドとの関係においてアミノ酸の親水性を検討することにより、抗原性及び免疫原性と良好に相関すると報告されている有用な尺度である、そのペプチドの局所親水性の最大平均値を算出することが可能となる。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性などの生物活性を保持したペプチドを得ることができる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値のいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。この見解と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及びその他の特性により明らかとなるアミノ酸の相対的類似性、特にアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解される。
【００３８】
変異体は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一な核酸配列であっても良い。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であっても良い。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって、実質的に同一なアミノ酸配列であっても良い。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であっても良い。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、複製起点を包含する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであっても良く、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。
【００４０】
本明細書中の数値範囲の記述に関して、その間に入る各数は同程度の精度を有することが明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲の場合、６及び９に加えて７及び８という数が企図され、６．０〜７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０という数が明示的に企図される。
【００４１】
２．免疫療法組成物
本明細書では、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、その断片、その異性体、またはこれらの組み合わせを含む免疫療法組成物を提供する。免疫療法組成物を使用すると、任意の数のインフルエンザウイルスに対する防御、それによる多数の異なるインフルエンザ性病状の治療が可能になる。このような防御及び治療により、以下に詳細に説明するように、免疫療法組成物を投与されない対象と比較して、インフルエンザウイルスに感染した対象の生存率（及び死亡阻止率）を有意に増加させることができる。
【００４２】
免疫療法組成物は、免疫療法組成物を投与されない対象の免疫応答と比較して、免疫療法組成物を投与された対象の免疫応答を有意に増加させることができ、それによりインフルエンザウイルス感染の防御及び治療が可能になる。免疫療法組成物は、ＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を増加させることができる。増加するＣＤ８+Ｔ細胞応答には、細胞溶解性ＣＤ８+Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の増加が含まれ得る。増加するＣＴＬ応答には、免疫療法組成物を投与された対象での、標的細胞の抗原特異的な細胞溶解量の増加が含まれ得る。増加するＣＤ８+Ｔ細胞応答には、免疫療法組成物を投与された対象での、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８+Ｔ細胞の集団または頻度の増加が含まれ得る。ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞は、感染細胞の細胞溶解能を有し、それにより、新たなＡ型インフルエンザウイルス粒子が細胞機構により集合して、感染細胞の溶解時に急激に他の細胞に感染することを阻止することができる。
【００４３】
免疫療法組成物は、免疫療法組成物を投与された対象の免疫応答を、免疫療法組成物を投与されていない対象の免疫応答と比較して、約０．５倍〜約１５倍、約０．５倍〜約１０倍、または約０．５倍〜約８倍増加させることができる。免疫療法組成物は、免疫療法組成物を投与された対象の免疫応答を、免疫療法組成物を投与されていない対象の免疫応答と比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、または少なくとも約１５．０倍増加させることができる。
【００４４】
免疫療法組成物は、免疫療法組成物を投与された対象の免疫応答を、免疫療法組成物を投与されていない対象の免疫応答と比較して、約５０％〜約１５００％、約５０％〜約１０００％、または約５０％〜約８００％増加させることもできる。免疫療法組成物は、免疫療法組成物を投与された対象の免疫応答を、免疫療法組成物を投与されていない対象の免疫応答と比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１０００％、少なくとも約１０５０％、少なくとも約１１００％、少なくとも約１１５０％、少なくとも約１２００％、少なくとも約１２５０％、少なくとも約１３００％、少なくとも約１３５０％、少なくとも約１４５０％、または少なくとも約１５００％増加させることができる。
【００４５】
免疫療法組成物は、ＤＮＡ免疫療法組成物、ペプチド免疫療法組成物、またはＤＮＡとペプチドを組み合わせた免疫療法組成物であって良い。ＤＮＡ免疫療法組成物は、ＩＬ−１７をコードする核酸配列を含み得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはこれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ペプチド結合によってＩＬ−１７に連結される、リンカー配列、リーダー配列、またはタグ配列をコードする付加的な配列も含み得る。ペプチド免疫療法組成物は、ＩＬ−１７ペプチド、ＩＬ−１７タンパク質、その変異体、その断片、またはこれらの組み合わせを含み得る。ＤＮＡとペプチドを組み合わせた免疫療法組成物は、上記のＩＬ−１７をコードする核酸配列、及びＩＬ−１７ペプチドまたはタンパク質を含んで良く、ＩＬ−１７ペプチドまたはタンパク質とコードされるＩＬ−１７とは、同一のアミノ酸配列を有する。
【００４６】
免疫療法組成物は、１つ以上の他の抗原を更に含んでも良く、これには、例えば小分子（例えば、アミロライド）、インフルエンザウイルスのポリヌクレオチド、インフルエンザウイルスのペプチド、ＩＬ−１７以外のサイトカインをコードする核酸、及びＩＬ−１７ペプチド以外のサイトカインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。上記１つ以上の他の抗原については、以下で説明する。１つ以上の他の抗原を、上記のＤＮＡ免疫療法組成物、ペプチド免疫療法組成物、またはＤＮＡとペプチドを組合せた免疫療法組成物に含むことができる。
【００４７】
本発明の免疫療法組成物は、有効な免疫療法組成物に必要とされる特徴、例えば、免疫療法組成物自体が疾患または死を引き起こさないような安全性を有する、ウイルスまたは細菌などの生存病原菌への暴露により生じる疾患に対して防御性を有する、細胞の感染を予防する中和抗体を誘導する、細胞内病原体に対して防御性Ｔ細胞を誘導する、ならびに投与しやすさ、低副作用、生物学的安定性、及び用量当たりの低コストを実現するなどの特徴が挙げられる。
【００４８】
免疫療法組成物は更に、筋肉または皮膚などの異なる組織に投与されたときにも免疫応答を誘導することができる。免疫療法組成物は更に、電気穿孔法若しくは注射による投与、または皮下投与されたときにも免疫応答を誘導することができる。
【００４９】
ａ．ＩＬ−１７
上記のように、免疫療法組成物は、ＩＬ−１７、そのモノマー、その二量体、そのホモ二量体、そのヘテロ二量体、その断片、その変異体、またはこれらの組み合わせを含み得る。ＩＬ−１７は、ＩＬ−１７Ａ（別名ＣＴＬＡ−８）、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ（別名ＩＬ−２５）、及びＩＬ−１７Ｆであっても良い。ＩＬ−１７サイトカインは、複数の細胞型、例えばＴヘルパー型１７（Ｔｈ１７）細胞、活性Ｔ細胞、及び上皮細胞から単離され、それらに由来し得る。ＩＬ−１７サイトカインは、システインノット折り畳み構造を含む、高度に保存されたＣ末端を有し、またＩＬ−１７Ｂを除いてジスルフィド結合した二量体として分泌される。ＩＬ−１７Ｂは、非共有結合二量体として分泌される。ホモ二量体に加え、ヘテロ二量体もＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆとの間に形成され得る。
【００５０】
免疫療法組成物は、約０．００１μｇ〜約５μｇ、約０．００５のμｇ〜約４μｇ、約０．０１μｇ〜約３μｇ、約０．０５μｇ〜約２μｇ、または約０．１μｇ〜約１μｇのＩＬ−１７を含み得る。免疫療法組成物は、少なくとも約０．００１μｇ、少なくとも約０．００２μｇ、少なくとも約０．００３μｇ、少なくとも約０．００４μｇ、少なくとも約０．００５μｇ、少なくとも約０．００６μｇ、少なくとも約０．００７μｇ、少なくとも約０．００８μｇ、少なくとも約０．００９μｇ、少なくとも約０．０１μｇ、少なくとも約０．０２μｇ、少なくとも約０．０３μｇ、少なくとも約０．０４μｇ、少なくとも約０．０５μｇ、少なくとも約０．０６μｇ、少なくとも約０．０７μｇ、少なくとも約０．０８μｇ、少なくとも約０．０９μｇ、少なくとも約０．１μｇ、少なくとも約０．２μｇ、少なくとも約０．３μｇ、少なくとも約０．４μｇ、少なくとも約０．５μｇ、少なくとも約０．６μｇ、少なくとも約０．７μｇ、少なくとも約０．８μｇ、少なくとも約０．９μｇ、少なくとも約１．０μｇ、少なくとも約１．５μｇ、少なくとも約２．０μｇ、少なくとも約２．５μｇ、少なくとも約３．０μｇ、少なくとも約３．５μｇ、少なくとも約４．０μｇ、少なくとも約４．５μｇ、または少なくとも約５．０μｇのＩＬ−１７を含み得る。
【００５１】
免疫療法組成物のＩＬ−１７サイトカインシグナルは、ＩＬ−１７受容体ファミリーのメンバー及びこれら受容体の活性化によって、炎症誘発性サイトカイン、例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−６、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の産生を誘導する細胞間経路を生じさせる。したがって、ＩＬ−１７サイトカインの過剰発現は、自己免疫及び炎症性疾患、例えば喘息、慢性関節リウマチ、乾癬、移植拒絶反応、炎症性腸疾患、及び多発性硬化症の発生要因となり得る。
【００５２】
ＩＦＮ−γは、抗ウイルス性、免疫調節性、及び抗腫瘍特性を有しており、複数の遺伝子の転写を変化させ、種々の生理的応答及び細胞応答を生じさせ得る。ＩＦＮ−γによる効果としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を促進すること、正常細胞のクラスＩ  ＭＨＣ分子の発現を増加させること、マクロファージの抗原提示及びリソソーム活性を増加させること、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を誘導すること、ならびにＴｈ１分化を促進して、細胞毒性ＣＤ８+Ｔ細胞に関わる細胞性免疫を誘発しながら、体液性（抗体）反応のＴｈ２分化を抑制することがある。
【００５３】
細胞毒性ＣＤ８+Ｔ細胞（細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））は、ウイルス及び他の病原体に感染した細胞の死滅を誘導するＴ細胞の亜集団である。ＣＴＬは活性化すると、クローン性増殖を受け、抗原に特異的なエフェクター細胞を産生する。エフェクターＣＴＬは、エキソサイトーシス（すなわち、脱顆粒）の誘導プロセスを経て、感染細胞または標的細胞を殺傷する分子、例えば、パーフォリン、グラニュライシン、及びグランザイムを放出する。必要がない場合、エフェクターＣＴＬの多数は消滅するが、一部のエフェクター細胞は記憶細胞として保持され、その結果、再度抗原に遭遇すると、記憶細胞がエフェクター細胞へと分化して、急速に免疫応答が増大する。
【００５４】
上述のように、免疫療法組成物は、免疫療法組成物を投与されていない対象の免疫応答と比較して、免疫療法組成物を投与された対象の免疫応答を増加させることができる。この免疫応答の増加には、ＣＤ８+Ｔ細胞応答の増加が含まれ得る。ＣＤ８+Ｔ細胞応答の増加には、細胞溶解性ＣＤ８+Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の増加が含まれ得る。ＣＴＬ応答の増加には、免疫療法組成物を投与された対象での、標的細胞の抗原特異的な細胞溶解量の増加が含まれ得る。ＣＤ８+Ｔ細胞応答の増加には、免疫療法組成物を投与された対象での、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８+Ｔ細胞の集団または頻度の増加が含まれ得る。ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞は、細胞溶解活性を有し得る。
【００５５】
それにより、免疫療法組成物を投与された対象のＩＦＮ−γレベルを、免疫療法組成物を投与されていない対象のＩＦＮ−γレベルと比較して、約０．５倍〜約１５倍、約０．５倍〜約１０倍、または約０．５倍〜約８倍増加させることができる。免疫療法組成物を投与された対象のＩＦＮ−γレベルを、免疫療法組成物を投与されていない対象のＩＦＮ−γレベルと比較して、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、または少なくとも約１５．０倍増加させることができる。
【００５６】
また、免疫療法組成物を投与された対象のＩＦＮ−γレベルを、免疫療法組成物を投与されていない対象のＩＦＮ−γレベルと比較して、約５０％〜約１５００％、約５０％〜約１０００％、または約５０％〜約８００％増加させることもできる。また、免疫療法組成物を投与された対象のＩＦＮ−γレベルを、免疫療法組成物を投与されていない対象のＩＦＮ−γレベルと比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１０００％、少なくとも約１０５０％、少なくとも約１１００％、少なくとも約１１５０％、少なくとも約１２００％、少なくとも約１２５０％、少なくとも約１３００％、少なくとも約１３５０％、少なくとも約１４５０％、または少なくとも約１５００％増加させることができる。
【００５７】
（１）ＩＬ−１７Ａ
ＩＬ−１７は、ＩＬ−１７Ａ、その断片、その変異体、またはこれらの組み合わせであり得る。ＩＬ−１７Ａは、モノマー、ホモ二量体、またはＩＬ−１７Ｆとのヘテロ二量体であり得る。
【００５８】
ＩＬ−１７Ａは、任意の数の生物からのＩＬ−１７Ａタンパク質、例えば、マウス（ハツカネズミ）ＩＬ−１７Ａタンパク質、及びヒト（ホモサピエンス）ＩＬ−１７Ａタンパク質であり得る。マウスＩＬ−１７Ａタンパク質は、図１１Ｃ（すなわち、配列番号３）に示すアミノ酸配列、その断片、その変異体、またはこれらの組み合わせを有し得る。ヒトＩＬ−１７Ａタンパク質は、図１２Ｃ（すなわち、配列番号６）に示すアミノ酸配列、その断片、その変異体、またはこれらの組み合わせを有し得る。ＩＬ−１７Ａタンパク質は更に、１つ以上の追加アミノ酸配列要素、例えば免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列（例えば、配列番号１４）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、またはＩｇＥリーダー配列とＨＡタグの両方を含んでいても良い。
【００５９】
ＩＬ−１７Ａをコードする核酸は、例えば、マウス（ハツカネズミ）（図１１Ａ及び１１Ｂそれぞれの配列番号１及び２）、及びヒト（ホモサピエンス）（図１２Ａ及び１２Ｂそれぞれの配列番号４及び５）など、任意の数の生物からのものであり得る。ＩＬ−１７Ａをコードする核酸は、コドンの使用及び対応するＲＮＡ転写物に関して最適化することができる。ＩＬ−１７Ａをコードする核酸は、発現に最適化したコドン及びＲＮＡであって良い。ＩＬ−１７Ａをコードする核酸は、翻訳の開始効率を高めるコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。ＩＬ−１７Ａをコードする核酸は、翻訳の終止効率を高める複数の終止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＡＡ）を含むことができる。ＩＬ−１７Ａをコードする核酸は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列もコードし得る。ＩｇＥリーダー配列は、５′末端で核酸のＩＬ−１７Ａに連結され得る。ＩＬ−１７Ａをコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列（例えば、配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
【００６０】
最適化されたマウスＩＬ−１７Ａは、配列番号９（図１３Ａ及び１３Ｃ）をコードする、配列番号７の核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、最適化されたマウスＩＬ−１７Ａは、配列番号７に示す核酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態では、最適化されたマウスＩＬ−１７Ａは、配列番号９に示すアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
【００６１】
最適化されたマウスＩＬ−１７Ａは、配列番号９（図１３Ｂ及び１３Ｃ）をコードする、配列番号８の核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、最適化されたマウスＩＬ−１７Ａは、配列番号８に示す核酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。
【００６２】
マウスＩＬ−１７Ａは、配列番号９に示すアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【００６３】
最適化されたヒトＩＬ−１７Ａは、配列番号１２（図１４Ａ及び１４Ｃ）をコードする、配列番号１０の核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、最適化されたヒトＩＬ−１７Ａは、配列番号１０に示す核酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態では、最適化されたヒトＩＬ−１７Ａは、配列番号１２に示すアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
【００６４】
最適化されたヒトＩＬ−１７Ａは、配列番号１２（図１４Ｂ及び１４Ｃ）をコードする、配列番号１１の核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、最適化されたヒトＩＬ−１７Ａは、配列番号１１に示す核酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。
【００６５】
ヒトＩＬ−１７Ａは、配列番号１２に示すアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【００６６】
配列番号９及び配列番号１２の免疫原性断片を設けても良い。免疫原性断片は、配列番号９及び／または配列番号１２の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列のような免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列を含まない。
【００６７】
配列番号９及び１２の免疫原性断片と同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の免疫原性断片を設けても良い。このような断片は、配列番号９及び／または配列番号１２と９５％以上の同一性を有するタンパク質を少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％含み得る。本明細書でいくつかの実施形態は、ＩＬ−１７Ａタンパク質配列の免疫原性断片と９６％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。本明細書でいくつかの実施形態は、ＩＬ−１７Ａタンパク質配列の免疫原性断片と９７％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。本明細書でいくつかの実施形態は、ＩＬ−１７Ａタンパク質配列の免疫原性断片と９８％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。本明細書でいくつかの実施形態は、ＩＬ−１７Ａタンパク質配列の免疫原性断片と９９％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列のような免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片はリーダー配列を含まない。
【００６８】
いくつかの実施形態は、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１１の免疫原性断片に関する。免疫原性断片は、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、及び／または配列番号１１の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列のような免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片はリーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００６９】
配列番号７、配列番号８、配列番号１０、及び配列番号１１の免疫原性断片と同一性を有するヌクレオチド配列を持つ核酸の免疫原性断片を設けても良い。このような断片は、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、及び／または配列番号１１と９５％以上の同一性を有する核酸を少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％含み得る。本明細書でいくつかの実施形態は、ＩＬ−１７Ａ核酸配列の免疫原性断片と９６％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。本明細書でいくつかの実施形態は、ＩＬ−１７Ａ核酸配列の免疫原性断片と９７％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。本明細書でいくつかの実施形態は、ＩＬ−１７Ａ核酸配列の免疫原性断片と９８％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。本明細書でいくつかの実施形態は、ＩＬ−１７Ａ核酸配列の免疫原性断片と９９％以上の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列のような免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片はリーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００７０】
ｂ．他の抗原
免疫療法組成物は、ＩＬ−１７と組み合わされた１つ以上の他の抗原を更に含むことができる。抗原は、小分子、例えば、後述のようなアミロライド若しくはその他インフルエンザ核酸、タンパク質、またはこれらの組み合わせであり得る。抗原は、サイトカイン、例えば、後述するＩＬ−１７以外のインターロイキンであり得る。
【００７１】
抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはこれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはこれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ペプチド結合によって抗原に連結される、リンカー配列またはタグ配列をコードする付加的な配列も含み得る。核酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００７２】
抗原は、不特定多数の生物、例えばウイルスからのタンパク質、核酸、またはその断片、またはその変異体、またはこれらの組み合わせに含有され得て、抗原はインフルエンザと結合し得る。
【００７３】
（１）アミロライド
免疫療法組成物は更にアミロライドを含んでも良い。アミロライドは、以下の構造を有し得る。
【化１】
2017511810.tif 000003
【００７４】
アミロライドは、細胞中へのＤＮＡ取り込みを促進することができる。したがって、アミロライドは、免疫療法組成物中に、細胞へのＤＮＡ取り込みを促進することができる量で存在し得る。細胞によるＤＮＡ取り込みの好適な実効増加率は、アミロライドを全く含まない同様の免疫療法組成物と比較して、５％超、２５％超、または５０％超である。
【００７５】
アミロライドは、細胞へのＤＮＡ取り込みを促進するのに有用である、いくつかの機能性誘導体を有する。ピリミジン環（３位置）またはトリアミンのいずれかのアミノ部分を修飾することによって、機能性誘導体を形成することができる。アミロライドの機能性誘導体は、ベンザミルでも、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）でも良い。
【００７６】
（２）インフルエンザ抗原
免疫療法組成物は、インフルエンザ抗原、またはその断片、またはその変異体を更に含んでも良い。インフルエンザ抗原は、哺乳動物において１つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができるものである。抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、それらの変異体、それらの断片、またはこれらの組み合わせを含み得る。インフルエンザ抗原は、何らかのＡ型インフルエンザ亜型、例えばＨ７Ｎ９、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１亜型によって分離された、完全長または断片のペプチドを含む。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、Ａ型インフルエンザ血清型Ｈ１の複数の株に由来するコンセンサス配列、Ａ型インフルエンザ血清型Ｈ２の複数の株に由来するコンセンサス配列、Ａ型インフルエンザ血清型Ｈ１の複数の株の異なる集合に由来する２種類のコンセンサス配列の一部を含有するハイブリッド配列、またはＢ型インフルエンザの複数の株に由来するコンセンサス配列であり得る。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、Ｂ型インフルエンザ由来であっても良い。
【００７７】
インフルエンザ抗原は、免疫応答を誘導し得る特定のインフルエンザ免疫原に対して有効であり得る少なくとも１つの抗原性エピトープも含有し得る。抗原は、完全インフルエンザウイルス中に存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを設けても良い。抗原は、１つの血清型である複数のＡ型インフルエンザウイルス株、例えば血清型Ｈ１、血清型Ｈ２、血清型Ｈ１Ｎ１、血清型Ｈ７Ｎ９、及び／または血清型Ｈ７Ｎ１である複数のＡ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であっても良い。抗原は、２種類のコンセンサスヘマグルチニン抗原配列またはその一部の組み合わせに由来し得るハイブリッド型コンセンサスヘマグルチニン抗原配列であっても良い。２種類のコンセンサスヘマグルチニン抗原配列の各々は、１つの血清型である複数のＡ型インフルエンザウイルス株、例えば血清型Ｈ１である複数のＡ型インフルエンザウイルス株などの異なる集合に由来していても良い。抗原は、複数のＢ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であっても良い。
【００７８】
いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、Ｈ１ＨＡ、Ｈ２ＨＡ、Ｈ３ＨＡ、Ｈ５ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であり得る。あるいは、インフルエンザ抗原は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列またはコンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むコンセンサスヘマグルチニン抗原であり得る。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、それぞれが互いに異なる集合の配列に由来する２種類のコンセンサスＨ１配列の一部を含む合成ハイブリッド型コンセンサスＨ１配列であっても良い。合成ハイブリッド型コンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の例は、Ｕ２アミノ酸配列を含むタンパク質である。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質などの、Ｂ型インフルエンザ株からのヘマグルチニン配列に由来するコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であっても良い。
【００７９】
コンセンサスヘマグルチニン抗原は、１つ以上の付加的アミノ酸配列要素を更に含んでも良い。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、Ｎ末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列を更に含んでも良い。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出することができる固有の免疫原性エピトープである免疫原性タグを更に含んでも良い。このような免疫原性タグの例は、コンセンサスヘマグルチニンのＣ末端に連結され得る９アミノ酸のインフルエンザＨＡタグである。いくつかの実施形態では、コンセンサスヘマグルチニン抗原は、Ｎ末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列、及びＣ末端にＨＡタグを更に含み得る。
【００８０】
コンセンサスヘマグルチニン抗原は、インフルエンザアミノ酸のコンセンサス配列またはその断片、及びその変異体からなるコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であっても良い。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、非インフルエンザタンパク質配列及びインフルエンザタンパク質配列、またはそれらの断片及びそれらの変異体を含むコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であっても良い。
【００８１】
コンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＨ１アミノ酸配列からなり得るもの、あるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ、またはＩｇＥリーダー配列とＨＡタグの両方などの付加的要素を更に含むものが挙げられる。
【００８２】
コンセンサスＨ２タンパク質の例としては、コンセンサスＨ２アミノ酸配列からなり得るもの、あるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ、またはＩｇＥリーダー配列とＨＡタグの両方を更に含むものが挙げられる。
【００８３】
ハイブリッド型コンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＵ２アミノ酸配列からなり得るもの、あるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ、またはＩｇＥリーダー配列とＨＡタグの両方を更に含むものが挙げられる。
【００８４】
ハイブリッド型コンセンサスＢ型インフルエンザヘマグルチニンタンパク質の例としては、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列からなり得るものが挙げられ、あるいはこれに、ＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ、またはＩｇＥリーダー配列とＨＡタグの両方を含んでも良い。
【００８５】
コンセンサスヘマグルチニンタンパク質は、コンセンサスヘマグルチニン核酸、その変異体、またはその断片にコードされ得る。異なる株及び変異体からの複数の異なるヘマグルチニン配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサスヘマグルチニンタンパク質とは異なり、コンセンサスヘマグルチニン核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサスヘマグルチニンタンパク質配列が由来する複数の異なるヘマグルチニン配列中の特定のアミノ酸配列をコードするのに使用されるものとは異なり得る。コンセンサス核酸配列は、最適化されたコドン及び／または最適化されたＲＮＡであっても良い。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、５’非翻訳領域中にコザック配列を含んでも良い。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでも良い。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は、ヘマグルチニンコード配列の５’にある。Ｎ末端リーダーは分泌を促進することができる。Ｎ末端リーダーは、ＩｇＥリーダーまたはＩｇＧリーダーであり得る。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含み得る。免疫原性タグはタンパク質のＣ末端にあり得、それをコードする配列はＨＡコード配列の３’にある。免疫原性タグが与える固有のエピトープには、容易に入手可能な抗体があるため、このような抗体を試験中に用いてタンパク質の発現を検出及び確定することができる。免疫原性タグはタンパク質のＣ末端にあるＨＡタグであり得る。
【００８６】
（３）インターロイキン
免疫療法組成物は、１種のインターロイキン、またはＩＬ−１７以外の他のインターロイキン及び／またはサイトカインの組み合わせを更に含んでも良い。インターロイキンは、ＩＬ−２３、その変異体、その断片、またはこれらの組み合わせであり得る。インターロイキンはまた、ＩＬ−３３、その変異体、その断片、またはこれらの組み合わせであり得る。インターロイキンは、ＩＬ−２１、その変異体、その断片、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００８７】
ｃ．ベクター
免疫療法組成物は、ＩＬ−１７をコードする核酸を含む１つ以上のベクターを含むことができ、１つ以上の抗原を更に含んでも良い。１つ以上のベクターは、ＩＬ−１７を発現させることができ、１つ以上の抗原を更に含んでも良い。ベクターは複製起点を含有する核酸配列を有し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターでも、宿主ゲノムに組み込まれるベクターでもあり得る。
【００８８】
１つ以上のベクターは発現構築物であり得、これは、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するのに用いられるプラスミドである。発現ベクターが細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質が、細胞の転写及び翻訳機構であるリボソーム複合体によって産生される。プラスミドは、エンハンサー及びプロモーター領域として作用する調節配列を含有するように、かつ、発現ベクター上に運搬された遺伝子の効率的な転写をもたらすように頻繁に操作される。本発明のベクターは、多量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、及びそれによるタンパク質を発現する。
【００８９】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローン化遺伝子との間の距離の調節、ならびに転写終結配列及びＰＴＩＳ（ポータブルな翻訳開始配列）の挿入などの発現シグナルを有しても良い。
【００９０】
（１）発現ベクター
ベクターは、環状プラスミドでも、線状核酸でもあり得る。環状プラスミド及び線状核酸は、適切な対象細胞内にて特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる。ベクターは、抗原をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを有することができ、これは終止シグナルに機能的に連結されても良い。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含み得る。対象のヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであっても良く、これは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞が何らかの特定の外部刺激に晒された場合にのみ転写を開始する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあって良い。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織若しくは器官、または発生段階に特異的でもあり得る。
【００９１】
（２）環状及び線状ベクター
ベクターは、一体化によって標的細胞を細胞性ゲノムに形質転換するか、または染色体外に存在し得る環状プラスミドであって良い（例えば、複製起点をもつ自律複製プラスミド）。
【００９２】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、若しくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現することができ、かつ、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することができるようにする任意の他の発現ベクターであり得る。
【００９３】
また、本明細書で提供されるのは、線状核酸または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）であり、これは、電気穿孔によって対象に効率よく送達され、かつ、１つ以上の所望のタンパク質、ペプチド、及び／または抗原を発現することができる。ＬＥＣは、任意のリン酸主鎖を持たない任意の線状ＤＮＡであっても良い。ＤＮＡはＩＬ−１７をコードし、１つ以上の抗原を更に含んでも良い。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでも良い。ＩＬ−１７の発現はプロモーターにより制御され、プロモーターは１つ以上の抗原の発現を更に制御することができる。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子及び／またはリン酸主鎖を含まなくても良い。ＬＥＣは所望のＩＬ−１７遺伝子発現と無関係な他の核酸配列を含まなくても良く、ＬＥＣは更に、１つ以上の抗原と無関係な他の核酸配列を含まなくても良い。
【００９４】
ＬＥＣは、線状化が可能な任意のプラスミド由来であっても良い。プラスミドは、抗原を発現可能であっても良い。プラスミドは、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）またはｐＭ２（ニューカレドニア／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、若しくはｐｒｏｖａｘ、またはＩＬ−１７をコードするＤＮＡを発現することができる任意の他の発現ベクターであっても良く、１つ以上の抗原を更に含んでも良く、細胞に、配列をＩＬ−１７、及び免疫系によって認識される１つ以上の抗原に翻訳させることができるものであって良い。
【００９５】
ＬＥＣはｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣはｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰ及びｐｃｒＭＲは、それぞれｐＮＰ（プエルトリコ／３４）及びｐＭ２（ニューカレドニア／９９）由来であり得る。
【００９６】
（３）プロモーター、イントロン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナル
ベクターはプロモーターを有しても良い。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離核酸の発現を調節することができる任意のプロモーターであっても良い。このようなプロモーターは、本明細書に記載のＩＬ−１７配列を転写し、本明細書に記載の１つ以上の抗原配列を更に転写する場合もあるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ経由の転写に必要とされるシス作用配列要素である。異種核酸の発現を導くために使用されるプロモーターは、個々の用途に応じて選択される。プロモーターは、ベクターの転写開始部位から、その自然状況での転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離に配置されていて良い。しかし、この距離の変更は、プロモーター機能を失うことなく適応することができる。
【００９７】
プロモーターは、抗原をコードする核酸配列、ならびに転写物、リボソーム結合部位、及び翻訳末端の効率的なポリアデニル化に必要なシグナルと機能的に連結されて良い。プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内で効率的な発現を示す別のプロモーターであっても良い。
【００９８】
ベクターは、機能性スプライス供与体部位及びスプライス受容体部位を持つエンハンサー及びイントロンを含んでも良い。ベクターは、効率的な終結をもたらすため、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ても、異なる遺伝子から得ても良い。
【００９９】
ｄ．免疫療法組成物の賦形剤及び他の成分
免疫療法組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含んでも良い。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、界面活性剤を含み得るトランスフェクション促進剤であって良く、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
【０１００】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えばポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）、または脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであり、該ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で免疫療法組成物中に存在して良い。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレン及びスクアレンなどの小胞を含んでも良く、ヒアルロン酸を用いて、遺伝子構築物と一体化させて投与しても良い。ＤＮＡプラスミド免疫療法組成物は、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３２４６４０参照）などの当該技術分野で既知の他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含んでも良い。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えばポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）、または脂質である。免疫療法組成物中のトランスフェクション促進剤の濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満、０．７５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．５００ｍｇ／ｍＬ未満、０．２５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．１００ｍｇ／ｍＬ未満、０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍＬ未満である。
【０１０１】
薬学的に許容される賦形剤はアジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミド中で発現される他の遺伝子であっても良く、あるいは免疫療法組成物中で上記プラスミドと組み合わされたタンパク質として送達されても良い。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、βインターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６からなる群から選択されても良く、これにはシグナル配列を欠失し、場合によりＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５も含む。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１０２】
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子として、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、ＩＬ−２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びそれらの機能性断片をコードするものが挙げられる。
【０１０３】
免疫療法組成物は、参照により本明細書中に完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に出願された米国特許第０２１，５７９号に記載された、免疫療法組成物の遺伝子促進剤を更に含んでも良い。
【０１０４】
免疫療法組成物は、使用される投与形態に応じて製剤化することができる。免疫療法組成物の注射可能な医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリー及び微粒子フリーであり得る。等張性の配合剤または溶液を用いることができる。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが挙げられる。免疫療法組成物は、血管収縮剤を含むことができる。等張溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含むことができる。免疫療法組成物は、ゼラチン及びアルブミンを含む安定剤を更に含んでも良い。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなどの安定剤により、製剤を室温または周囲温度下で長時間安定させることができる。
【０１０５】
３．診断方法
本発明はまた、診断を必要とする対象へのインフルエンザウイルス感染の診断方法に関する。本方法は、対象から得たサンプルを提供することを含み得る。サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、または血清サンプルであって良い。本方法はまた、サンプル中のＩＬ−１７レベルを測定することと、測定されたＩＬ−１７レベルを、正常で健康な対象と関連したＩＬ−１７の閾値レベルと比較することと、を含み得る。正常で健康な対象を、約５０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ−１７のレベルに関連付けることができる。５０ｐｇ／ｍＬは、正常で健康な対象とインフルエンザウイルスに感染した対象とを区別するための閾値レベルとなり得る。すなわち、正常で健康な対象は、約５０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ−１７レベルに関連付けることができ、インフルエンザウイルスに感染した対象は、約５０ｐｇ／ｍＬ超のＩＬ−１７レベルに関連付けることができる。
【０１０６】
本方法は更に、測定されたＩＬ−１７レベルが、正常で健康な対象と関連するＩＬ−１７の閾値レベルより高い場合に、対象がインフルエンザウイルスに感染していると判定することを含んでも良い。正常で健康な対象は、約５０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ−１７レベルに関連付けることができる。測定されたＩＬ−１７レベルが約５０ｐｇ／ｍＬ超である場合、対象はインフルエンザウイルスに感染している。測定されたＩＬ−１７レベルが約５０ｐｇ／ｍＬ未満である場合、対象はインフルエンザウイルスに感染していない。インフルエンザウイルスに感染した対象を、免疫療法組成物の投与により治療することができる。約５０ｐｇ／ｍＬ超であるＩＬ−１７レベルに関連付けられた対象を、免疫療法組成物の投与により治療することができる。
【０１０７】
本方法は、軽度のインフルエンザウイルス感染と重度のインフルエンザウイルス感染とを区別することを更に含んでも良い。軽度のインフルエンザウイルス感染を有する対象は、約５０ｐｇ／ｍＬ超または約５００ｐｇ／ｍＬ超のＩＬ−１７レベルに関連付けることができる。軽度のインフルエンザウイルス感染を有する対象は、約５００ｐｇ／ｍＬ超であるＩＬ−１７レベルに関連付けることができる。重度のインフルエンザウイルス感染を有する対象は、約５０ｐｇ／ｍＬ超であるが、約５００ｐｇ／ｍＬ未満であるＩＬ−１７レベルに関連付けることができる。すなわち、重度のインフルエンザウイルス感染を有する対象は、約５０ｐｇ／ｍＬ〜５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１７レベルに関連付けることができる。
【０１０８】
軽度のインフルエンザウイルス感染を有する対象から得たサンプルは、重度のインフルエンザウイルス感染を有する対象から得たサンプルと比較して、高いＩＬ−１７レベルを有し得る。軽度のインフルエンザウイルス感染を有する対象から得たサンプルは、重度のインフルエンザウイルス感染を有する対象から得たサンプルと比較して、少なくとも約０．２倍、少なくとも約０．３倍、少なくとも約０．４倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約０．６倍、少なくとも約０．７倍、少なくとも約０．８倍、少なくとも約０．９倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．１倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約２．６倍、少なくとも約２．７倍、少なくとも約２．８倍、少なくとも約２．９倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．１倍、少なくとも約３．２倍、少なくとも約３．３倍、少なくとも約３．４倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約３．６倍、少なくとも約３．７倍、少なくとも約３．８倍、少なくとも約３．９倍、または少なくとも約４．０倍高いＩＬ−１７レベルを有し得る。軽度のインフルエンザウイルス感染を有する対象から得たサンプルは、重度のインフルエンザウイルス感染を有する対象から得たサンプルと比較して、少なくとも約２．０倍高いＩＬ−１７レベルを有し得る。
【０１０９】
４．治療及び／または予防方法
本発明はまた、対象に免疫療法組成物を投与することにより、対象のインフルエンザに対する免疫応答を高める方法に関する。免疫応答の増加を利用して、対象の疾患、例えばインフルエンザウイルス感染などに対して治療、予防、及び／または防御することができる。免疫応答の増加により、インフルエンザウイルス感染時に、約６０％〜約１００％、約６５％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９０％、約６０％〜約８５％、約６０％〜約８０％、約６０％〜約７５％、または約６０％〜約７０％の生存率を実現し得る。免疫応答の増加により、インフルエンザ感染時に、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の生存率を実現し得る。
【０１１０】
免疫応答の増加により、インフルエンザウイルス感染による死亡を、約６０％〜約１００％、約６５％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９０％、約６０％〜約８５％、約６０％〜約８０％、約６０％〜約７５％、または約６０％〜約７０％阻止し得る。免疫応答の増加により、インフルエンザウイルス感染による死亡を、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％阻止し得る。
【０１１１】
免疫療法組成物の用量は、１μｇ〜１０ｍｇ有効成分／ｋｇ体重／時間であっても良く、２０μｇ〜１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／時間であっても良い。免疫療法組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与することができる。効果的な治療のための免疫療法組成物の投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
【０１１２】
ａ．インフルエンザウイルス
免疫療法組成物を投与された対象は、上記のような免疫療法組成物を投与していない対象と比較して、免疫応答が増加し得る。免疫応答の増加を利用して、インフルエンザウイルスに対して治療、予防、及び／または防御することができる。インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型インフルエンザウイルスであり得る。インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスであり得る。
【０１１３】
（１）Ａ型インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスであり得る。Ａ型インフルエンザウイルスは、２つの表面タンパク質、すなわち、ヘマグルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）の同定に基づいて亜型に分類される。ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼには、それぞれ１７及び１０の異なる亜型が存在する。したがって、Ａ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼのそれぞれの亜型により同定される。Ａ型インフルエンザウイルスは、不特定多数の亜型であり得、これには例えば、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、及びＨ７Ｎ９があるが、これらに限定されない。
【０１１４】
ｂ．投与
免疫療法組成物は、薬学技術分野の当業者に周知の標準的な技術に従って配合することができる。このような組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、及び症状、ならびに投与経路などの要因を考慮して、医学分野の当業者に周知の用量及び技術にて投与することができる。対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ネズミ、またはマウスなどの哺乳類であり得る。
【０１１５】
免疫療法組成物は、予防的または治療的に投与することができる。予防的投与において、免疫療法組成物は、免疫応答を誘導するのに十分な量で投与することができる。治療用途の場合、免疫療法組成物は、治療的作用を誘発するのに十分な量で、投与を必要とする対象に投与される。これを達成するために十分な量を「治療的有効量」と定義する。この用途のための有効量は、例えば、投与される免疫療法組成物の用法の特定の組成物、投与方式、疾患の段階及び重症度、患者の全身健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存することになる。
【０１１６】
免疫療法組成物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８  （１９９７））、Ｆｅｌｇｎｅｒら（米国特許第５，５８０，８５９号、１９９６年１２月３日公開）、Ｆｅｌｇｎｅｒ（米国特許第５，７０３，０５５号、１９９７年１２月３０日公開）、及びＣａｒｓｏｎら（米国特許第５，６７９，６４７号、１９９７年１０月２１日公開）の記載のような当該技術分野で周知の方法によって投与することができる。免疫療法組成物のＤＮＡは、粒子またはビーズと複合体を形成して、これを例えば、免疫療法組成物銃を用いて個体に投与することができる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択が、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを承知している。
【０１１７】
免疫療法組成物は、種々の経路によって送達できる。典型的な送達経路には、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達が含まれる。他の経路として、経口投与、経鼻投与、及び膣内経路が挙げられる。特にＤＮＡ免疫療法組成物に関して、免疫療法組成物を、個体の組織の間質空間に送達することができる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｌｇｎｅｒらの米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，７０３，０５５号）。免疫療法組成物は、筋肉に投与しても良く、あるいは、皮内若しくは皮下注射を通して、またはイオン導入法などによる経皮投与を通して投与しても良い。免疫療法組成物の表皮投与も用いることができる。表皮投与は、刺激源に対する免疫応答を活性化するために、表皮の最も外側の層を機械的または化学的に刺激することを含むことができる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｓｏｎらの米国特許第５，６７９，６４７号）。
【０１１８】
また、免疫療法組成物は、鼻腔内経路を通して投与するように処方することもできる。担体が固体である鼻腔投与に適した製剤には、例えば約１０ミクロン〜約５００ミクロン範囲の粒径を有する目の粗い粉末を含み得るが、これは鼻から吸う方法で、すなわち鼻付近で保持した粉末容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される。製剤は、点鼻スプレー、点鼻薬、またはネブライザーによるエアロゾル投与であっても良い。製剤は、水溶液または油性溶液の免疫療法組成物を含み得る。
【０１１９】
免疫療法組成物は、懸濁剤、シロップ、またはエリキシル剤などの液体調製物であっても良い。また、免疫療法組成物は、非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注射投与）用の調製物、例えば、滅菌懸濁液またはエマルションであり得る。
【０１２０】
免疫療法組成物は、リポソーム、ミクロスフェア、または他のポリマーマトリクス（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｌｇｎｅｒらの米国特許第５，７０３，０５５号、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉ〜ＩＩＩ巻（第２版，１９９３））に組み込むことができる。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり、製造及び投与が比較的容易な、非毒性の生理学的に許容される代謝可能な担体であり得る。
【０１２１】
免疫療法組成物は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６６４，５４５号に記載の方法などによる電気穿孔法によって投与することができる。電気穿孔法は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３０２，８７４号、同第５，６７６，６４６号、同第６，２４１，７０１号、同第６，２３３，４８２号、同第６，２１６，０３４号、同第６，２０８，８９３号、同第６，１９２，２７０号、同第６，１８１，９６４号、同第６，１５０，１４８号、同第６，１２０，４９３号、同第６，０９６，０２０号、同第６，０６８，６５０号、及び同第５，７０２，３５９号記載の方法及び／または装置によって行われても良い。電気穿孔法は、低侵襲性装置によって行っても良い。
【０１２２】
低侵襲性電気穿孔装置（「ＭＩＤ」）は、上述の免疫療法組成物及び関連流体を体組織に注入する装置であり得る。装置は、中空針、ＤＮＡカセット、及び流体送達手段を含んでも良く、装置は、体組織への針の挿入中にＤＮＡを同時に（例えば、自動的に）体組織に注入するように、使用する流体送達手段が作動するように適合されている。これは、針が挿入されている間にＤＮＡ及び関連流体を徐々に注入する機能により、体組織を通る流体のより均一な分布が得られるという利点を有する。また、注入されるＤＮＡがより広い面積にわたって分布するため、注入中に体感される痛みを低減させることができる。
【０１２３】
ＭＩＤは、針を使用せずに免疫療法組成物を組織に注入することができる。ＭＩＤは、免疫療法組成物が組織表面を貫通し、下層の組織及び／または筋肉に入るような力で、免疫療法組成物を細流またはジェットとして注入することができる。細流またはジェットの力は、マイクロオリフィスを通じて、二酸化炭素などの圧縮ガスを瞬時に膨張させることで生じさせることができる。低侵襲性電気穿孔装置及びその使用方法の例については、それぞれの内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００８０２３４６５５号、米国特許第６，５２０，９５０号、米国特許第７，１７１，２６４号、米国特許第６，２０８，８９３号、米国特許第６，００９，３４７号、米国特許第６，１２０，４９３号、米国特許第７，２４５，９６３号、米国特許第７，３２８，０６４号、及び米国特許第６，７６３，２６４号に記載されている。
【０１２４】
ＭＩＤは、無痛で組織を貫通する高速ジェット液体を生成する注射器を備えることができる。このような無針注射器は市販されている。本明細書で利用することができる無針注射器の例として、それぞれの内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，８０５，７８３号、同第４，４４７，２２３号、同第５，５０５，６９７号、及び同第４，３４２，３１０号に記載のものが挙げられる。
【０１２５】
直接的または間接的な電気輸送に適した形態の所望の免疫療法組成物を、無針注射器を用いて、治療される組織に導入（例えば、注入）することができる。これは、通常、組織表面に注射器を接触させ、免疫療法組成物を組織に貫入させるのに十分な力を有する、薬剤のジェット送達を作動させて行う。例えば、治療される組織が粘膜、皮膚、または筋肉の場合、角質層を経て皮層へと、または下層の組織及び筋肉それぞれへと薬剤を貫入させるのに十分な力で、粘膜または皮膚表面に向けて薬剤を発射する。
【０１２６】
無針注射器は、全種類の組織、特に、皮膚及び粘膜に免疫療法組成物を送達するのによく適している。いくつかの実施形態では、無針注射器は、免疫療法組成物を含有する液体を表面及び対象の皮膚または粘膜へと進入させるのに使用され得る。本発明の方法を用いて治療することができる様々な種類の組織の代表的な例として、膵臓、喉頭、鼻咽頭、下咽頭、中咽頭、唇、喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、睾丸、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはその任意の組み合わせが挙げられる。
【０１２７】
ＭＩＤは、組織を電気穿孔する針状電極を有し得る。例えば、長方形または正方形パターンに配列された複数の電極アレイ内で、複数対の電極間にパルスを発生させることにより、一対の電極間にパルスを発生させるよりも優れた結果を得る。例えば、米国特許第５，７０２，３５９号、表題「Ｎｅｅｄｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｓ」に開示されているものは、治療的処置中に複数対の針にパルスを発生させることができる針アレイである。記載内容が参照により本明細書に完全に組み込まれる該出願において、針は円形配列で設置されているが、対向する対の針状電極間にパルスを発生させることが可能な接続器及び切り替え装置を有する。一対の針状電極を用いて、組み換え発現ベクターを細胞に送達することができる。このような装置及びシステムは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されている。あるいは、通常の注射針に似た単一針によるＤＮＡの注入及び電気穿孔が可能な単一針装置を用いて、現在使用されている装置によって送達する電圧よりも低い電圧のパルスを印加することで、患者が受ける電気刺激を低減することができる。
【０１２８】
ＭＩＤは、１つ以上の電極アレイを備えても良い。アレイは、同一直径または異なる直径の２つ以上の針を備えても良い。針は等間隔または不等間隔に配置されていても良い。針は、０．００５インチ〜０．０３インチ、０．０１インチ〜０．０２５インチ、または０．０１５インチ〜０．０２０インチであり得る。針は直径０．０１７５インチであり得る。針は０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上の間隔で配置されていても良い。
【０１２９】
ＭＩＤは、１つのパルス発生器と、１工程で免疫療法組成物を送達して電気穿孔パルスを与える２針以上の免疫療法組成物用注射器とから構成されていても良い。パルス発生器は、パーソナルコンピュータで操作されるフラッシュカード経由でパルス及び注入パラメータを柔軟にプログラミングすることができるだけでなく、電気穿孔及び患者のデータを包括的に記録及び保存することができる。パルス発生器は、様々な電圧パルスを短時間で送達することができる。例えば、パルス発生器は、持続時間１００ｍｓに１５ボルトのパルスを３回送達することができる。このようなＭＩＤの一例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３２８，０６４号に記載されている、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製Ｅｌｇｅｎ  １０００システムである。
【０１３０】
ＭＩＤは、モジュール式の電極システムであるＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ  ＰＡ）装置及びシステムであっても良く、これは生体または植物の選択された組織の細胞へＤＮＡなどの高分子を容易に導入することができるようにする。モジュール式の電極システムは、複数の針状電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針状電極への導電性リンクを提供する電気コネクタ、及び電源を備えることができる。操作者は、支持構造に搭載された複数の針状電極を把持して、生体または植物の選択された組織の中へしっかりと挿入することができる。次いで皮下注射針を介して、選択された組織の中に高分子を送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器が作動され、複数の針状電極に定電流の電気パルスが印加される。印加された定電流の電気パルスは、複数の電極間での細胞への高分子の導入を促進する。細胞の過熱による細胞死は、定電流パルスにより組織内の電力損失を制限することで最小限に抑えられる。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ装置及びシステムは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されている。
【０１３１】
ＭＩＤは、Ｅｌｇｅｎ  １０００システム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であり得る。Ｅｌｇｅｎ  １０００システムは、中空針と流体送達手段とを設ける装置を備えても良く、該装置は、前記体組織への針の挿入中に本明細書に記載の免疫療法組成物である流体を同時に（例えば、自動的に）体組織に注入するように、使用する流体送達手段を作動させるように適合されている。この利点は、針が挿入されている間に流体を徐々に注入できる機能により、体組織を通る流体のより均一な分布が得られる点である。また、注入される流体量がより広い面積にわたって分布するため、注入中に体感される痛みが低減されることも考えられる。
【０１３２】
加えて、流体の自動注入は、注入される流体の実際の投与量の自動的な監視及び記録を容易にする。このデータは、必要な場合、文書化を目的として制御ユニットにより保存することができる。
【０１３３】
注入速度は直線的であっても、非直線的であっても良く、また注入は、治療される対象の皮膚を通って針が挿入された後、かつ針が更に体組織に挿入される間に実行され得ることが理解されるであろう。
【０１３４】
本発明の装置による流体注入に好適な組織としては、腫瘍組織、皮膚、または肝組織が挙げられるが、筋肉組織であっても良い。
【０１３５】
装置は、体組織への針の挿入を誘導する針挿入手段を更に含む。流体の注入速度は、針の挿入速度により制御される。これは、針の挿入と流体の注入の両方を制御することができるため、挿入速度を注入速度と所望する通りに整合させることができるという利点を有する。また、この利点により、使用者は装置を操作しやすくなる。所望する場合、針を体組織に自動的に挿入する手段を設けることもできる。
【０１３６】
使用者は、流体の注入をいつ開始するかを選択することができる。ただし、注入は針の先端が筋肉組織に到達したときに開始されるのが理想であり、装置は流体の注入を開始するのに十分な深さまで針が挿入された時点を感知する手段を含んでいて良い。これは、針が所望の深さ（通常は筋肉組織が始まる深さになる）に到達したときに流体の注入が自動的に開始されるように作動できることを意味する。例えば、事前設定した針の挿入深さ、例えば、針が皮膚層を通過するのに十分であると思われる値（４ｍｍ）になるように、筋肉組織の始まる深さを選択することもできる。
【０１３７】
感知手段は超音波プローブを備えても良い。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知する手段を備えてもよい。この場合、手段自体は、体組織内の針の深さを記録しなくても良いが、代わりに針が様々な種類の体組織から筋肉へと移動するにつれて、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知するように適合される。これらの代替案はいずれも、注入の開始が可能であることを感知する比較的正確かつ操作が簡単な手段を提供する。所望する場合、更に針の挿入深さを記録することができ、その記録を流体の注入制御に使用すると、記録される針の挿入深さが記録されるときに、注入される流体量を判定することができる。
【０１３８】
装置は、針を支持する基部と、基部をその中に受容するハウジングとを更に含み、該基部はハウジングに対して可動であり、それにより基部がハウジングに対して第１の後方位置にあるときには、針がハウジング内へと後退し、基部がハウジング内の第２の前方位置にあるときには、針がハウジングから突出する。これは、ハウジングを患者の皮膚の上に合わせることができ、かつ基部に対してハウジングを移動させることにより、針を患者の皮膚に挿入することができるので、使用者にとって有利である。
【０１３９】
上述のように、針が皮膚に挿入されるときに、針の長さにわたって流体が均一に分布するように、流体注入速度の制御が達成されることが望ましい。流体送達手段は、制御された速度で流体を注入するように適合されているピストン駆動手段を含んでも良い。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモーターにより作動することができる。しかし、ピストン駆動手段は、基部がハウジングに対して軸方向に移動されることにより作動され得る。流体送達のために、別の手段を設けても良いことが理解されるであろう。よって、注射器及びピストンシステムの代わりに、例えば、圧搾により、制御された速度または非制御の速度で流体を送達可能な密閉容器を設けることもできる。
【０１４０】
上記の装置は、任意のタイプの注入にも使用できる。しかし、電気穿孔分野において特に有用であると考えられることから、この装置は、針に電圧を印加する手段を更に含んでも良い。この手段により、針を注入のためだけではなく、電気穿孔中の電極としても使用することが可能になる。これは、注入される流体と同じ領域に電界が印加されることを意味するという点で特に有利である。電気穿孔には、従来、前に注入された流体に電極を正確に合わせることが非常に困難であるという問題があり、そのため使用者は、注入された物質と電界との間の重なりを確保しようとして、広い領域にわたって必要以上に大量の流体を注入し、より広い面積にわたって電界を印加する傾向にあった。本発明を使用すれば、電界と流体との良好な適合を達成しつつ、流体の注入量と電界の印加サイズの両方を低減することができる。
【０１４１】
５．治療キット
本明細書では、上記のような治療及び／または予防方法を用いて対象を治療するのに使用することができる治療キットを提供する。治療キットは免疫療法組成物を含み得る。治療キットは、上記の治療及び／または予防方法に従って使用することができる。治療キットは、バイアルまたは瓶などの１つ以上の容器も備えることができ、各容器には別々の試薬が収容される。
【０１４２】
本開示による治療キットは、本発明の治療及び／若しくは予防の実施、ならびに／または治療キットの使用方法に関する取扱説明書を含むことが好ましい。本開示の治療キットに含まれる取扱説明書は、パッケージ材に貼付するか、または添付文書として含むことができる。通常、取扱説明書は書面または印刷物であるが、このようなものに限定されない。取扱説明書を収容し、最終使用者に指示内容を伝達できるものであれば、いかなる媒体も本開示によるものと見なされる。このような媒体として、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、及びチップ）、光学式媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「取扱説明書」は、指示内容が記載されたインターネット群のアドレスを含み得る。
【０１４３】
６．診断キット
本明細書では、上記のような診断方法の実施を必要とする対象のインフルエンザウイルス感染を診断するために使用することができる診断キットを提供する。診断キットは、上記の診断方法に従って使用することができる。診断キットは、バイアルまたは瓶などの１つ以上の容器も備えるこができ、各容器には別々の試薬が収容される。診断キットは、緩衝剤（複数を含む）、希釈剤（複数を含む）、標準剤（複数を含む）、及び／またはサンプル処理、洗浄、若しくは本明細書に記載の診断方法の他の任意の工程の実施に有用な他の任意の材料など、使用者の観点から望ましい場合がある他の材料（複数を含む）を更に含むことができる。
【０１４４】
本開示による診断キットは、本発明の診断実施に関する、及び／または診断キットの使用方法に関する取扱説明書を含むことが好ましい。本開示の診断キットに含まれる取扱説明書は、パッケージ材に貼付するか、または添付文書として含むことができる。通常、取扱説明書は書面または印刷物であるが、このようなものに限定されない。取扱説明書を収容し、最終使用者に指示内容を伝達できるものであれば、媒体もこの開示によるものと見なされる。このような媒体として、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、及びチップ）、光学式媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）等が挙げられるが、これらに限定されない。上記のように、用語「取扱説明書」は、指示内容が記載されたインターネット群のアドレスを含み得る。
【０１４５】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される複数の態様を有する。
【実施例】
【０１４６】
７．実施例
実施例１
Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１感染に対するＩＬ−１７Ａ媒介耐性
ＩＬ−１７Ａが生体内でＡ型インフルエンザ感染に対する耐性を媒介できるかどうかを判定するために、後述のようなＣ５７ＢＬ／６マウス及びＩＬ−１７ＡノックアウトマウスのＡ型インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス感染を検査した。
【０１４７】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ウイルスの鼻粘膜投与により、５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１（Ａ／ニワトリ／河南／１／２００４）に暴露した。対照として、第２群の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の代わりにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を鼻粘膜経由で投与した。感染後６日（ｄｐｉ）で、暴露マウスと対照マウスの血清中のＩＬ−１７Ａタンパク質レベルを、ＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）を用いて測定した。
【０１４８】
図１Ａに示すように、暴露マウスでは、対照（暴露されていない）マウスと比較して、ＩＬ−１７Ａタンパク質レベルが有意に増加した。図１Ａのデータは、３回の独立した実験を表し、エラーバーは平均±標準誤差（ＳＥＭ）、**はｐ＜０．０１（独立スチューデントｔ検定）を示す。Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露したマウスは、対照マウスと比較して、ＩＬ−１７Ａレベルが約５倍高かった。したがって、このデータから、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への感染に対応して、血清中のＩＬ−１７Ａレベルが増加することが示された。
【０１４９】
ＩＬ−１７ＡがＡ型インフルエンザウイルス感染に対する防御を媒介したかどうかを判定するために、２つの群（群当たりｎ＝６）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスそれぞれを、ウイルス感染の７日前と２日前に、０．１μｇ及び０．５μｇの組み換えＩＬ−１７Ａ（ｒＩＬ−１７Ａ）で事前に腹腔内（ｉ．ｐ）処置した。ｒＩＬ−１７ＡはマウスＩＬ−１７Ａホモ二量体である。第３群（ｎ＝６）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６のマウスは対照としての役割を果たし、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。ＩＬ−１７Ａノックアウトマウスであった第４群（ｎ＝６）のマウスにも、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。ＩＬ−１７ＡノックアウトはＣ５７ＢＬ／６の遺伝的背景に属する。０日目に、４つの群のマウスを、５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に鼻腔感染させ、ウイルス暴露以降の１６日間にわたって毎日マウスの死亡率を観測した。
【０１５０】
図１Ｂに示すように、ＩＬ−１７Ａノックアウトマウスは、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスよりも、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露の影響を受けやすかった。図１Ｂのデータは、３回の独立した実験を表す。具体的には、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスは感染後１３日で死亡したのに対して、ＩＬ−１７Ａノックアウトマウスは感染後１０日で死亡した。対照的に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の暴露から用量依存的様式で防御された（図１Ｂ）。０．１μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、適度に防御され、１６日目に、約７０％のマウスがＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の暴露から生存した。０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスは正常であり、１６日目（すなわち、調査最終日）に、１００％のマウスがＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の暴露から生存した。
【０１５１】
ウイルス負荷が、ＩＬ−１７Ａによって付与される防御と一致するかどうかを判定するために、２つの群（群当たりｎ＝６）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスそれぞれを、ウイルス感染の７日前と２日前に、０．１μｇ及び０．５μｇの組み換えＩＬ−１７Ａ（ｒＩＬ−１７Ａ）で事前に腹腔内（ｉ．ｐ）処置した。第３群（ｎ＝６）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６のマウスは対照としての役割を果たし、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。ＩＬ−１７Ａノックアウトマウスであった第４群（ｎ＝６）のマウスにも、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、４つ群のマウスを、５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に鼻腔感染させた。感染後６日でマウスを犠牲死させ、各マウスから肺組織を回収した。肺組織をホモジナイズして、それぞれの肺組織のウイルス負荷を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）分析により測定した。リアルタイムＰＣＲ分析により、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子を検出した。
【０１５２】
図１Ｃに示すように、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置によりもたされる防御は、ウイルス負荷と相関した。図１Ｃのデータは、３回の独立した実験を表し、エラーバーは平均の±ＳＥＭ、＊＊はｐ＜０．０５（独立スチューデントｔ検定）、及び＊＊はｐ＜０．０１（独立スチューデントｔ検定）を示す。ｒＩＬ−１７Ａを投与した両群のＣ５７ＢＬ／６マウスは、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置しなかったＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して、ウイルス負荷のレベルが低下した。ウイルス負荷は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与したｒＩＬ−１７Ａの用量とも対応した。すなわち、０．５μｇ用量のｒＩＬ−１７Ａでは、０．１μｇ用量のｒＩＬ−１７Ａの場合よりもウイルス負荷が低くなった。加えて、上記のようにＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露の影響を受けやすかったＩＬ−１７Ａノックアウトマウスは、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置した、またはしなかった野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスよりもウイルス負荷が高かった。
【０１５３】
要約すると、上記のデータから、ＩＬ−１７Ａノックアウトマウスがウイルス感染による影響をより受けやすかったのに対して、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置された野生型マウスは、ウイルス負荷が低下し、生存率が用量依存的様式で増加したため、ＩＬ−１７Ａは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１による感染の防御（及び耐性の媒介）をもたらしたことが明らかになった。加えて、これらのデータは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に対する感染時に、ＩＬ−１７Ａレベルが増加したため、ＩＬ−１７Ａレベルがインフルエンザウイルス感染を反映することを示した。
【０１５４】
実施例２
Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９感染に対するＩＬ−１７Ａ媒介耐性
上記のように、ＩＬ−１７Ａレベルは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への感染に対応して増加した。ＩＬ−１７Ａは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１感染に対する防御も付与した。ＩＬ−１７Ａが生体内で他のＡ型インフルエンザウイルスに対する耐性を媒介するかどうかを判定するために、後述のようなＣ５７ＢＬ／６マウスのＡ型インフルエンザＨ７Ｎ９ウイルス感染を検査した。
【０１５５】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ウイルスの鼻粘膜投与により、１０  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９（Ａ／上海／４６６４Ｔ／２０１３）に暴露した。対照として、第２群の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９の代わりにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を鼻粘膜経由で投与した。感染後７日（ｄｐｉ）で、暴露マウスと対照マウスの血清中のＩＬ−１７Ａタンパク質レベルを、ＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）を用いて測定した。
【０１５６】
図２Ａに示すように、暴露マウスでは、対照（暴露されていない）マウスと比較して、ＩＬ−１７Ａタンパク質レベルが有意に増加した。図２Ａのデータは、３回の独立した実験を表し、エラーバーは平均±標準誤差（ＳＥＭ）、***はｐ＜０．００１（独立スチューデントｔ検定）を示す。Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露したマウスは、対照マウスと比較して、ＩＬ−１７Ａレベルが約５倍高かった。このデータから、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９への感染に対応して、血清中のＩＬ−１７Ａレベルが増加することが示された。したがって、血清中のＩＬ−１７Ａレベルは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９感染（実施例２）か、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１感染（実施例１）のいずれかに対応して増加した。
【０１５７】
ＩＬ−１７ＡがＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９感染に対する防御を媒介したかどうかを判定するために、２つの群の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスそれぞれを、ウイルス感染の７日前と２日前に、０．１μｇ（ｎ＝９）及び０．５μｇ（ｎ＝７）の組み換えＩＬ−１７Ａ（ｒＩＬ−１７Ａ）で事前に腹腔内（ｉ．ｐ）処置した。第３群（ｎ＝７）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６のマウスは対照としての役割を果たし、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、３つのマウス群を、１０  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に鼻腔感染させ、ウイルス暴露以降の１６日間にわたって毎日マウスの死亡率を観測した。加えて、マウスの体重を、ウイルス暴露以降の１６日間、毎日観測した。
【０１５８】
図２Ｂに示すように、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置せずに、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露された全てのＣ５７ＢＬ／６マウスは、感染後８日という早期に死亡した。図２Ｂのデータは、３回の独立した実験を表す。対照的に、０．１μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの約２２．２％は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９の暴露から生存し、感染後１６日時点で生存していた。０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの約７１．４％は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９の暴露から生存し、感染後１６日時点で生存していた。加えて、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、ウイルス感染後当初は体重の減少を示したが、両群の（すなわち、０．１μｇ及び０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａにより事前処置された）生存マウスは、感染後１６日までに体重減の全てまたは大半を回復した（図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ）。上記のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１で観察されたように、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置は、用量依存的様式でＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に対する防御をもたらした。すなわち、ｒＩＬ−１７Ａの用量が多い方が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９感染に対するより高い防御（及び耐性）が得られた。
【０１５９】
Ｈ７Ｎ９のウイルス負荷が、ＩＬ−１７Ａによって付与される防御と一致するかどうかを判定するために、２つの群（群当たりｎ＝５）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスそれぞれを、ウイルス感染の７日前と２日前に、０．１μｇ及び０．５μｇの組換えＩＬ−１７Ａ（ｒＩＬ−１７Ａ）で事前に腹腔内（ｉ．ｐ）処置した。第３群（ｎ＝５）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６のマウスは対照としての役割を果たし、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、３つ群のマウスを、１０  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に鼻腔感染させた。感染後７日でマウスを犠牲死させ、各マウスから肺組織を回収した。肺組織をホモジナイズして、それぞれの肺組織のウイルス負荷を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）分析により測定した。リアルタイムＰＣＲ分析により、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子を検出した。
【０１６０】
図２Ｃに示すように、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置によりもたらされる防御は、ウイルス負荷と相関した。図２Ｃのデータは、３回の独立した実験を表し、エラーバーは平均±ＳＥＭ、**はｐ＜０．０１（独立スチューデントｔ検定）を示す。ｒＩＬ−１７Ａを投与した両群のＣ５７ＢＬ／６マウスは、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置しなかったＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して、ウイルス負荷のレベルが有意に低下した。Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１で観察されたように、用量依存的様式でｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスの肺組織では、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９のより低いレベルが検出された。したがって、ＩＬ−１７Ａを用いた事前処置は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９の両方に対して防御（及び耐性の媒介）をもたらし、両方のウイルスのウイルス負荷を低下させた。
【０１６１】
要約すると、上記のデータから、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置したマウスは、ウイルス負荷が低下し、生存率が用量依存的様式で増加したため、ＩＬ−１７Ａは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９による感染の防御（及び耐性の媒介）をもたらしたことが明らかになった。加えて、これらのデータは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９への感染時に、ＩＬ−１７Ａレベルが増加したため、ＩＬ−１７Ａレベルがウイルス感染を反映することを示した。したがって、実施例１及び２のデータは、ＩＬ−１７Ａが複数のＡ型インフルエンザウイルス、すなわち、Ｈ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９への感染に対して、防御（及び耐性の媒介）をもたらし、ＩＬ−１７ＡレベルがいずれのＡ型インフルエンザウイルスへの感染も反映することを示した。
【０１６２】
実施例３
ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスの肺炎症反応
Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９への感染時、リンパ球は相当数の肺組織を浸潤させ、これが炎症、組織損傷、及び死亡の一因となる。ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置して、または処置せずに、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１またはＨ７Ｎ９に暴露させたマウスの肺組織内のＣＤ８+Ｔ細胞浸潤を、組織化学及び免疫組織化学的検査を用いて検査した。
【０１６３】
具体的には、１つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群のＣ５７ＢＬ／６マウスには、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、第１及び第２群両方のＣ５７ＢＬ／６マウスに、５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１を鼻腔感染させた。第３群のＣ５７ＢＬ／６マウスはナイーブの対照としての役割を果たし、よって、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置を施さず、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１を投与しなかった。感染後６日目に３つ全ての群のマウスを犠牲死させ、マウスから肺組織切片を得た。組織切片をヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で着色した。ＣＤ８+Ｔ細胞に特異的な抗体を用いて、組織切片に免疫組織化学的検査も実施した。
【０１６４】
図４Ａの上部パネルは、ナイーブマウスからの代表的な肺組織切片のＨ＆Ｅ（上段左パネル）及びＣＤ８+Ｔ細胞（上段右パネル）の染色を示す。ナイーブマウスは、正常または健康な肺組織の外観を示す対照としての役割を果たした。Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露されたマウスからの肺組織は、肺胞壁の肥厚及びＣＤ８＋Ｔ細胞の広範囲な分布を示した（図４Ａの中段左右のパネルは、それぞれ、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露されたマウスからの代表的な肺組織切片のＨ＆Ｅ及びＣＤ８+Ｔ細胞染色を示す）。Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露されたマウスからの肺組織は、これらマウスでの重篤な気管支肺炎も示した。
【０１６５】
対照的に、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露する前に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスからの肺組織は、軽度の損傷及び浸潤性ＣＤ８+Ｔ細胞の空間的に不連続な分布を示した（図４Ａの下段左右のパネルは、それぞれ、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露する前に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスからの代表的な肺組織切片のＨ＆Ｅ及びＣＤ８+Ｔ細胞染色を示す）。すなわち、事前処置して暴露したマウスからの肺組織切片では、暴露マウスと比較して、ＣＤ８+Ｔ細胞浸潤の発生が少なく、その結果、事前処置して暴露したマウスの肺組織は、暴露マウスの肺組織と比較して、組織損傷及び炎症をほとんど示さなかった。同時に、これらのデータは、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露に応答した肺組織のＣＤ８+Ｔ細胞浸潤を低下させ、それにより、同じ肺組織の損傷及び炎症が減少することを示した。
【０１６６】
更に、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露されたマウスで、肺組織へのＣＤ８+Ｔ細胞浸潤を検査した。具体的には、１つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群のＣ５７ＢＬ／６マウスには、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、第１及び第２群両方のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１０  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９を鼻腔感染させた。第３群のＣ５７ＢＬ／６マウスはナイーブの対照としての役割を果たし、よって、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置を施さず、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９を投与しなかった。感染後６日目に全３つの群全てのマウスを犠牲死させ、マウスから肺組織切片を得た。組織切片をＨ＆Ｅで着色した。ＣＤ８+Ｔ細胞に特異的な抗体を用いて、組織切片に免疫組織化学的検査も実施した。
【０１６７】
図４Ｂの上部パネルは、ナイーブマウスからの代表的な肺組織切片のＨ＆Ｅ（上段左パネル）及びＣＤ８+Ｔ細胞（上段右パネル）の染色を示す。上記のように、ナイーブマウスは、正常または健康な肺組織の外観を示す対照としての役割を果たした。Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露されたマウスからの肺組織は、肺胞壁の肥厚及びＣＤ８+Ｔ細胞の広範囲な分布を示した（図４Ｂの中段左右のパネルは、それぞれ、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露されたマウスからの代表的な肺組織切片のＨ＆Ｅ及びＣＤ８+Ｔ細胞染色を示す）。Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露されたマウスからの肺組織は、これらマウスでの重篤な気管支肺炎も示した。
【０１６８】
対照的に、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露する前に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスからの肺組織は、軽度の損傷及び浸潤性ＣＤ８+Ｔ細胞の空間的に不連続な分布を示した（図４Ｂの下段左右のパネルは、それぞれ、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露する前に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスからの代表的な肺組織切片のＨ＆Ｅ及びＣＤ８+Ｔ細胞染色を示す）。すなわち、事前処置して暴露したマウスからの肺組織切片では、暴露マウスと比較して、ＣＤ８+Ｔ細胞浸潤の発生が少なく、その結果、事前処置して暴露したマウスの肺組織は、暴露マウスの肺組織と比較して、組織損傷及び炎症をほとんど示さなかった。同時に、これらのデータは、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９への暴露に応答した肺組織のＣＤ８+Ｔ細胞浸潤を低下させ、それにより、同じ肺組織の損傷及び炎症が減少することを示した。
【０１６９】
要約すると、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１またはＨ７Ｎ９に暴露されたマウスは、ＣＤ８+Ｔ細胞による肺組織の著しい浸潤、肺組織の損傷、肺組織の炎症、及び重度の気管支肺炎を示した。ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１またはＨ７Ｎ９に暴露されたマウスを防御した。これは、処置されたマウスでは、ウイルス暴露の前にｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置しなかったマウスと比較して肺組織のＣＤ８+Ｔ細胞浸潤が減少し、その結果、防御されたマウスは肺組織の損傷及び炎症が減少したためである。したがって、ＩＬ−１７Ａは、肺組織のＣＤ８+Ｔ細胞浸潤を低減することにより、Ｈ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９ウイルス感染に対する防御（及び耐性の媒介）をもたらした。さもなければ、肺組織のＣＤ８+Ｔ細胞浸潤は、肺組織の損傷及び炎症の一因となっていたであろう。
【０１７０】
実施例４
Ａ型インフルエンザウイルスに感染したヒト対象のＩＬ−１７Ａレベル
上記の実施例１〜３から、ＩＬ−１７ＡがＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９への感染からマウスを防御することが実証された。加えて、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９に感染したマウスでは、ＩＬ−１７Ａレベルが上昇していた。Ａ型インフルエンザウイルスに感染したヒト対象で、ＩＬ−１７Ａレベルが変化するかどうかを判定するために、健康なヒト対象、及びＡ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、またはＨ７Ｎ９に感染したヒト対象から得た血清中のＩＬ−１７Ａレベルを測定した。
【０１７１】
血清サンプルは、５０人の健康なヒト対象、及びＡ型インフルエンザウイルスに急性感染した９９人のヒト対象から収集して分析した。具体的には、収集した血清中のＩＬ−１７Ａレベルを、ＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）を用いて測定した。１６人のヒト対象を、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２（すなわち、季節性インフルエンザ）に感染していた。６５人のヒト対象はＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（すなわち、汎発流行性インフルエンザ）に感染しており、うち１６人が重度の感染、及び４９人が軽度の感染であることを同定した。１８人のヒト対象はＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に感染しており、うち１０人が重度の感染、及び８人が軽度の感染であることを同定した。
【０１７２】
健康な対象と比較して、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１またはＨ７Ｎ９のいずれかに感染した対象から収集した血清中のＩＬ−１７Ａレベルは、有意に上昇していた（図５Ａのｐ＜０．０００１、図中の各記号は個々の対象を表し、データは平均±ＳＥＭであり、水平線は対照群それぞれの平均を表した）。健康な対象からの血清のＩＬ−１７Ａレベルが、５０ｐｇ／ｍＬ未満であったのに対して、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、またはＨ３Ｎ２に感染した対象からの血清のＩＬ−１７Ａレベルは、５０ｐｇ／ｍＬ超であった。具体的には、Ｈ１Ｎ１感染対象及びＨ７Ｎ９感染対象は、健康な対象と比較して、それぞれ平均１６倍及び１２倍高いＩＬ−１７Ａレベルを有した。Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２に感染した対象から収集した血清でも、健康な対象と比較して、ＩＬ−１７Ａレベルが有意に増加した（図５Ａのｐ＜０．０５）。Ｈ３Ｎ２感染対象は、健康な対象と比較して、平均２倍高いＩＬ−１７Ａレベルを血清中に有した。
【０１７３】
感染対象の血清で観察されたＩＬ−１７Ａレベルの上昇は、ウイルス感染の重度と対応した。感染が軽度である対象（すなわち、臨床的に軽度の対象）は、インフルエンザ様症状だけを示し、胸部Ｘ線及び／または肺のコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンは正常であった。感染が重度である対象（すなわち、臨床的に重度の対象）は、（１）３日超の発熱、（２）痰、血液、及び／若しくは胸の痛みを時々伴う急性咳、（３）呼吸困難及びチアノーゼ、（４）倦怠感、反応低下、睡魔、及び／若しくは痙攣、（５）嘔吐及び／若しくは下痢（時々、それに伴う脱水）、（６）胸部Ｘ線及び／若しくは肺ＣＴスキャンで所見される複数の肺葉硬化及び重度の肺炎、（７）呼吸不全若しくはショック症状及び／若しくは多臓器不全、ならびに／または（８）集中治療室への収容を伴った。
【０１７４】
Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１またはＨ７Ｎ９に感染した対象のうち、臨床的に「軽度」の対象は、臨床的に「重度の」対象と比較して、高いＩＬ−１７Ａレベルを示した（図５Ｂ及び５Ｃ。図中の各記号は個々の対象を表し、データは平均±ＳＥＭであり、水平線は対照群それぞれの平均を表した）。軽度の対象は、重度感染を有する対象と比較して、約２倍高いＩＬ−１７Ａレベルを血清中に有した。具体的には、軽度の対象からの血清のＩＬ−１７Ａレベルは、５００ｐｇ／ｍＬ超であったのに対して、重度の対象からの血清のＩＬ−１７Ａレベルは、５０ｐｇ／ｍＬを超えたが、５００ｐｇ／ｍＬ未満であった。
【０１７５】
Ｈ５Ｎ１ウイルス感染に関して、酵素結合免疫吸着アッセイを使用して、感染確認後３日目、５日目、及び１０日目に、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に感染した２人の対象から収集した血清中のＩＬ−１７Ａレベルを検出した。１人目の感染対象は中国広州（ＧＫ対象）、２人目の感染対象は中国香港出身（ＨＫ対象）であった。対照として、３人の健康な対象、及びインフルエンザ以外のウイルスを感染した１人の対象（すなわち、非インフルエンザ対象）からも血清サンプルを収集した。
【０１７６】
ＧＫ対象は入院し、その１０日後に重度の肺機能不全により死亡した。ＧＺ対象は、感染期間中、ＩＬ−１７Ａの血清レベルが低かった（図５Ｄ。図中、データは平均±ＳＥＭである）。対照的に、ＨＫ対象は、健康な対象、非インフルエンザ対象、及びＧＺ対象と比較して、ＩＬ−１７Ａレベルが高かった（図５Ｄ）。ＨＫ対象は、Ｈ５Ｎ１ウイルス感染から回復した。
【０１７７】
要約すると、これらデータから、Ａ型インフルエンザウイルス（すなわち、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、及びＨ５Ｎ１）に感染したヒト対象では、健康な対象と比較して、ＩＬ−１７Ａレベルが増加または上昇したことを示した。したがって、Ａ型インフルエンザウイルスに感染したヒト（実施例４）及びマウス（実施例１及び２）では、ＩＬ−１７Ａレベルが増加したことから、ＩＬ−１７Ａレベルの上昇は、Ａ型インフルエンザウイルスへの感染を示すものであった。ＩＬ−１７Ａレベルは、ヒト対象の感染重度とも対応した。すなわち、ＩＬ−１７Ａレベルは、重度のウイルス感染を有する対象と比較して、軽度のウイルス感染を有する対象の方が高かった。
【０１７８】
実施例５
ウイルス感染に対する防御にＩＬ−６及びＴＮＦ−αは必要ない
ＩＬ−１７Ａは、生来の免疫応答、例えば、インターロイキン６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の一部であるサイトカインを誘発することができる。ＩＬ−６及びＴＮＦ−αは炎症を媒介し得る。ＩＬ−１７Ａが、ＩＬ−６及び／またはＴＮＦ−αによってＡ型インフルエンザウイルス感染に対する耐性を媒介するかどうかを検査するために、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露されたマウスから収集した血清中のＩＬ−６及びＴＮＦ−αレベルを測定した。
【０１７９】
具体的には、２つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ウイルス感染の７日前と２日前を、それぞれ０．１μｇ及び０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。０日目に、２つの群のマウスを５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。第３群のＣ５７ＢＬ／６マウスは対照としての役割を果たし、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置も、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露も行わなかった（すなわち、ナイーブマウス）。感染後６日目に、血清をマウスから収集し、収集した血清中のＩＬ−６及びＴＮＦ−αレベルを測定した。
【０１８０】
ウイルスへの暴露前にｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスは、ナイーブマウスと比較して、血清中のＩＬ−６レベルが増加していた（図６Ａ、**ｐ＜０．０１）。ＩＬ−６レベルの増加は、事前処置で投与したｒＩＬ−１７Ａの用量に依存した。すなわち、ｒＩＬ−１７Ａの用量が多い方が、血清中のＩＬ−６レベルが高くなるという結果が生じた。しかしながら、ＴＮＦ−αレベルは、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置及びＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露によって変化しなかった。
【０１８１】
加えて、野生型（すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６）マウス、ＩＬ−６ノックアウトマウス、及びＴＮＦＲ１／２（すなわち、ＴＮＦ−α）ノックアウトマウスを、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のみに、またはｒＩＬ−１７Ａの事前処置と組み合わせて暴露させた。次に、感染後の死亡率を測定した。図６Ｂに示すように、野生型マウスが感染後約９日までに死亡したのに対して、ＩＬ−６ノックアウトマウスは感染後１２日までに死亡した。しかしながら、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置した野生型及びＩＬ−６ノックアウトマウスの１００％が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露から生存した。これらのデータは、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置後、ＩＬ−６レベルは用量依存的様式で増加した一方で、ウイルス暴露に対するＩＬ−１７Ａを媒介した防御にＩＬ−６を必要としなかったことを示した。
【０１８２】
図６Ｃに示すように、野生型及びＴＮＦＲ１／１ノックアウトマウスは、感染後９日及び感染後１２日までにそれぞれ死亡した。ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置した野生型及びＴＮＦＲ１／２ノックアウトマウスの１００％が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露から生存した。これらのデータは、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置に応じて、ＴＮＦ−αレベルが変化せず、ウイルス暴露に対するＩＬ−１７Ａを媒介した防御にＴＮＦ−αを必要としなかったことを示した。
【０１８３】
要約すると、ＩＬ−１７Ａは、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αに依存することなく、Ｈ５Ｎ１ウイルス感染に対する防御（及び耐性の媒介）をもたらした。
【０１８４】
実施例６
ウイルス感染に対する防御にＩＦＮ−γは必要だが、ＩＬ−４は必要ない
サイトカイン、例えば、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、Ａ型インフルエンザウイルスによる感染を制御することができる。ＩＬ−１７Ａが、ＩＬ−４及び／またはＩＦＮ−γによってＡ型インフルエンザウイルス感染に対する耐性を媒介するかどうかを検査するために、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１またはＨ７Ｎ９に暴露されたマウスから収集した血清中のＩＬ−４及びＩＦＮ−γレベルを測定した。
【０１８５】
具体的には、２つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に、それぞれ０．１μｇ及び０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第３群のＣ５７ＢＬ／６マウスには、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、３つの群のマウスを５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。第４群のＣ５７ＢＬ／６マウスは対照としての役割を果たし、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置も、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露も行わなかった（すなわち、ナイーブマウス）。感染後６日目に、血清をマウスから収集し、収集した血清中のＩＬ−４及びＩＦＮ−γレベルを測定した。
【０１８６】
図７Ａに示すように、４つ群のマウス間でＩＬ−４レベルの有意差は観察されなかった。図７Ａのデータは、３回の独立した実験を表す。Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露されたマウスでは、ナイーブマウスと比較して、ＩＦＮ−γレベルが増加した。しかし、ＩＦＮ−γレベルは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露されたマウスと比較して、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じて用量依存的様式で有意に増加した（図７Ａ、*ｐ＜０．０５（独立スチューデントｔ検定））。０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスは、０．１μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウス、Ｈ５Ｎ１に暴露されたマウス、及びナイーブマウスよりも血清中のＩＦＮ−γレベルが高かった（図７Ａ。それぞれＩＦＮ−γレベルが約１．６倍、約３．２５倍、及び約６．５倍高い）。これらのデータは、血清中のＩＦＮ−γレベルは、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じて、用量依存的様式で有意に増加するが、ＩＬ−４レベルは増加しないことを示した。
【０１８７】
更にＩＬ−４及びＩＦＮ−γレベルを検査するために、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に代わってＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９を用いて上記の実験を繰り返した。具体的には、２つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に、それぞれ０．１μｇ及び０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第３群のＣ５７ＢＬ／６マウスには、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、３つ群のマウスを１０  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露させた。Ｈ７Ｎ９ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。第４群のＣ５７ＢＬ／６マウスは対照としての役割を果たし、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置も、Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９への暴露も行わなかった（すなわち、ナイーブマウス）。感染後６日目に血清をマウスから収集し、収集した血清中のＩＬ−４及びＩＦＮ−γレベルを測定した。
【０１８８】
図７Ｂに示すように、４つ群のマウス間でＩＬ−４レベルの差は観察されなかった。図７Ｂのデータは、３回の独立した実験を表す。Ａ型インフルエンザウイルスＨ７Ｎ９に暴露されたマウスと、ウイルスへの暴露前に０．１μｇのｒＩＬ−１７を用いて事前処置したマウスとの間のＩＦＮ−γレベルは同等であった。しかしながら、０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置したマウスでは、事前処置を受けていないマウス、及び０．１μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスと比較して、ＩＦＮ−γレベルが有意に増加した（図７Ｂ、**ｐ＜０．０１（独立スチューデントｔ検定））。具体的には、０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスは、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置を受けていないマウスと比較して、ＩＦＮ−γレベルが約１．９倍高かった。これらのデータは、血清中のＩＦＮ−γレベルはｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じて、用量依存的様式で有意に増加するが、ＩＬ−４レベルは増加しないことを示した。
【０１８９】
更にＩＦＮ−γを検査するために、野生型（すなわち、Ｃ５６ＢＬ／６）及びＩＦＮ−γノックアウトマウスを、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のみに、またはｒＩＬ−１７Ａの事前処置と組み合わせて暴露させた。具体的には、１つ群の野生型マウス（ｎ＝６）及び１つ群のＩＦＮ−γノックアウトマウス（ｎ＝６）を、ウイルス感染の７日前と２日前に、０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群の野生型マウス（ｎ＝６）及び第２群のＩＦＮ−γノックアウトマウス（ｎ＝６）には、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、４つ群のマウスを５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。マウスの死亡率を、感染後１６日にわたって毎日観測した。
【０１９０】
図７Ｃに示すように、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露した野生型及びＩＦＮ−γノックアウトマウスは、感染後１４日及び感染後１０日までにそれぞれ死亡した。このデータは、ＩＦＮ−γノックアウトマウスが野生型マウスよりも、Ｈ５Ｎ１ウイルス感染を受けやすいことを示した。加えて、ｒＩＬ−１７Ａを用いたＩＦＮ−γノックアウトマウスの事前処置は、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を受けなかったＩＦＮ−γノックアウトマウスと比較して、死亡を遅延させた。ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＩＦＮ−γノックアウトマウスの約１５％が、感染後１６日までＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露から生存した。対照的に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置した野生型マウスの１００％が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露から生存した。これらのデータは、ＩＬ−１７ＡがＩＦＮ−γによってＡ型インフルエンザウイルス感染に対する耐性を媒介したことを示した。すなわち、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する有効な防御にＩＦＮ−γを必要とした。
【０１９１】
要約すると、ＩＬ−４レベルは、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じて変化しなかった。しかしながら、ＩＦＮ−γレベルはｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じて用量依存的様式で増加し、ＩＦＮ−γによってＩＬ−１７ＡはＡ型インフルエンザウイルス感染を防御した。
【０１９２】
実施例７
ＣＤ８+Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞によって産生されたＩＦＮ−γ
ＩＦＮ−γは、ウイルス感染中、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、及び／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により分泌され得る。ｒＩＬ−１７Ａの事前処置により誘導されるＩＦＮ−γレベルの増加を担う細胞集団（複数を含む）を判定するために、感染後６日目にＩＦＮ−γ陽性細胞を検出した。
【０１９３】
具体的には、野生型マウス（すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６）を、ウイルス感染の７日前と２日前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群のＣ５７ＢＬ／６マウスには、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、この２つ群のマウスに加え、１つの群のＩＬ−１７Ａノックアウトマウスを、５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。別の群のＣ５７ＢＬ／６マウスは対照としての役割を果たし、ｒＩＬ−１７Ａを用いた事前処置も、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露も行わなかった（すなわち、ナイーブマウス）。感染後６日目に４つ群のマウスから脾細胞を単離して、ホルマリン不活性化Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１により、生体外で１２時間（ｈ）活性化した。ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、またはＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌をフローサイトメトリーで測定し、それにより、ＩＦＮ−γの細胞内染色を検出した。
【０１９４】
図８Ａに示すように、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置した（及びウイルスに暴露した）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＣＤ４+Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌は、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を受けていない（だが、ウイルスには暴露された）マウスから単離されたＣＤ４+Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌と比較して減少した。したがって、ＣＤ４+Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌は、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じて減少した。図８Ａのデータは、３回の独立した実験を表す。対照的に、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置は、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置がない場合と比較して、ＣＤ８+Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を有意に増加させた（図８Ａ、**ｐ＜０．０１）。ｒＩＬ−１７Ａの事前処置は、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置がない場合と比較して、ＮＫ細胞からのＩＦＮ−γ分泌も有意に増加させた（図８Ａ、*ｐ＜０．０５）。したがって、これらのデータは、ＣＤ８+Ｔ細胞及びＮＫ細胞が、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じて観察されるＩＦＮ−γレベルの増加に有意に寄与することを示した。
【０１９５】
ＣＤ８+Ｔ細胞がｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じてＩＦＮ−γを分泌したことから、ＩＬ−１７ＡがＣＤ８+Ｔ細胞によってウイルス感染を防御したかどうかを判定するために、ＣＤ８+Ｔ細胞を欠くマウス（すなわち、ＣＤ８ノックアウトマウス）のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露に対する耐性能を検査した。具体的には、野生型（すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６）マウス及びＣＤ８ノックアウトマウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群のＣ５７ＢＬ／６マウス及び第２群のＣＤ８ノックアウトマウスには、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、４つの群のマウスを５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。マウスの死亡率を、感染後１６日にわたって毎日観測した。
【０１９６】
図８Ｂに示すように、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露した野生型及びＣＤ８ノックアウトマウスは、感染後１２日目及び感染後７日目にそれぞれ死亡した。このデータは、ＣＤ８ノックアウトマウスが野生型マウスよりも、Ｈ５Ｎ１ウイルス感染を受けやすいことを示した。加えて、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣＤ８ノックアウトマウスは、感染後８日までに死亡したため、ｒＩＬ−１７ＡによるＣＤ８ノックアウトマウスの事前処置が、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を受けなかったＣＤ８ノックアウトマウスと比較して、死亡を１日遅延させた（図８Ｂ）。上記で観察されたように、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置した野生型マウスの１００％が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露から生存した。これらのデータは、ＩＬ−１７ＡがＣＤ８+Ｔ細胞によってＡ型インフルエンザウイルス感染に対する耐性を媒介したことを示した。すなわち、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する有効な防御にＣＤ８+Ｔ細胞を必要とした。
【０１９７】
以上で実証したように、ＩＦＮ−γはｒＩＬ−１７Ａの事前処置に応じてＮＫ細胞によっても分泌された。したがって、ＩＬ−１７ＡがＮＫ細胞によってウイルス感染を防御したかどうかを判定するために、ＮＫ細胞欠損マウス（すなわち、抗ＮＫ１．１マウス）の、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露への耐性能を検査した。具体的には、４つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスを検査した。第１群のＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＮＫ細胞を欠損させず、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置も行わなかった。第２群のＣ５７ＢＬ／６マウスは、ウイルス感染の７日前と２日前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第３群のＣ５７ＢＬ／６マウスには、ウイルス感染の７日前、３日前、及び１日前に抗ＮＫ１．１中和モノクローナル抗体を腹腔内注入した。第４群のＣ５７ＢＬ／６マウスには、ウイルス感染の７日前、３日前、及び１日前に抗ＮＫ１．１中和モノクローナル抗体を腹腔内注入し、かつウイルス感染の７日前及び２日前に、０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置投与した。０日目に、４つの群のマウスを５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。マウスの死亡率を、感染後１６日にわたって毎日観測した。
【０１９８】
図８Ｃに示すように、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露した野生型及びＮＫ欠損（すなわち、抗ＮＫ１．１）マウスは、感染後１２日及び感染後９日までにそれぞれ死亡した。このデータは、ＮＫ欠損マウスが野生型マウスよりも、Ｈ５Ｎ１ウイルス感染を受けやすいことを示した。ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＮＫ欠損マウス（すなわち、抗ＮＫ１．１＋ｒＩＬ−１７Ａ）の約７０％が、感染後１６日まで、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露から生存した（図８Ｃ）。ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置された野生型マウスの１００％が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１への暴露から生存した。これらデータは、ＮＫ細胞が欠損しているが、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスは、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置された野生型マウスと比較して、生存率の減少が穏やかであったため（すなわち、ウイルス暴露に対する生存率が約７０％対１００％）、ＩＬ−１７Ａが媒介したウイルス感染防御の促進にＮＫ細胞が果たす役割は、（ＣＤ８+Ｔ細胞よりも）小さいことを示した。
【０１９９】
要約すると、ＣＤ８+Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ分泌は、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置に応じて有意に増加したが、ＣＤ４+Ｔ細胞では増加しなかった。ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置によって付与される防御は、ＣＤ８+Ｔ細胞の不在下では有意に減少したが、ＮＫ細胞の不在下での減少は穏やかであった。厳密に言えば、ＣＤ８+Ｔ細胞の不在下では、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置は死亡を遅延させたが、回避はできなかった。総合すると、これらのデータは、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞が、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する、ＩＬ−１７Ａ媒介性の防御（及び耐性）に有意に寄与することを示した。
【０２００】
実施例８
ＣＤ８+Ｔ細胞の養子移入
上記のように、ＩＬ−１７Ａは、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞によって、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する防御（及び耐性の媒介）をもたらした。以下で詳細に説明するように、ＩＬ−１７Ａ媒介性の防御が、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞により促進されることを、養子移入を使用して更に確認する。ＣＤ８+Ｔ細胞の養子移入の体系を図９Ａに示す。
【０２０１】
具体的には、ｒＩＬ−１７Ａにより事前処置され、Ｈ５Ｎ１に感染したマウスからの野生型ＣＤ８+Ｔ細胞、または無処置のＨ５Ｎ１感染マウスからの野生型ＣＤ８+Ｔ細胞を、Ｈ５Ｎ１に感染した野生型マウスに養子移入した。簡潔には、第１群のＣ５７ＢＬ／６（すなわち、野生型）マウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群のＣ５７ＢＬ／６マウスは、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置しなかった。第３群のマウス、すなわちＣＤ８+Ｔ細胞欠損マウス（すなわち、ＣＤ８ノックアウトマウス）は対照として使用し、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置しなかった。０日目に、３つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスを５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。養子移入を受けるＣ５７ＢＬ／６マウス（すなわち、レシピエントマウス）も、０日目に５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。
【０２０２】
感染後６日目に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウス（すなわち、上記第１群のマウス）から、及びｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けなかったＣ５７ＢＬ／６マウス（すなわち、上記第２群のマウス）からＣＤ８+Ｔ細胞を単離した。次に、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に感染して６日経つＣ５７ＢＬ／６（すなわち、野生型）マウスに、第１群のマウスから単離した１ｘ１０7のＣＤ８+Ｔ細胞を養子移入し、このレシピエントマウス（すなわち、図９ＢのＷＴ  ＣＤ８  Ｔ細胞＋ｒＩＬ−１７Ａ）の死亡率を感染後１６日まで毎日観測した。加えて、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に感染して６日経つＣ５７ＢＬ／６（すなわち、野生型）マウスに、第２群のマウスから単離した１ｘ１０7のＣＤ８+Ｔ細胞を養子移入し、このレシピエントマウス（すなわち、図９ＢのＷＴ  ＣＤ８＋Ｔ細胞）の死亡率を感染後１６日まで毎日観測した。ＣＤ８ノックアウトマウス（すなわち、図９ＢのＣＤ８  ＫＯ）の死亡率も、感染後１６日まで毎日観測した。
【０２０３】
図９Ｂに示すように（ならびに実施例７及び図８Ｂで観察されたように）、ＣＤ８ノックアウトマウスは感染後７目に死亡し、ＣＤ８+Ｔ細胞欠損マウスの対照としての役割を果たした。図９Ｂのデータは、３回の独立した実験を表す。第２群のマウス（すなわち、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けていないが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露されたＣ５７ＢＬ／６マウス）からＣＤ８+Ｔ細胞を受けた、Ｃ５７ＢＬ／６感染マウスは、感染後１０目に死亡した（図９Ｂ、ＷＴ  ＣＤ８  Ｔ細胞）。対照的に、第１群のマウス（すなわち、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露される前に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウス）からＣＤ８+Ｔ細胞を受けた、Ｃ５７ＢＬ／６感染マウスの５０％は、感染後１６日に生存していた（図９Ｂ、ＷＴ  ＣＤ８  Ｔ細胞＋ｒＩＬ−１７Ａ）。これらのデータは、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスから単離したＣＤ８+Ｔ細胞が、レシピエントマウスにウイルス感染に対する防御（及び耐性の媒介）をもたらしたことを示した。これらのデータは、ｒＩＬ−１７Ａで処置されたＣＤ８+Ｔ細胞は、既にウイルスに感染しているマウスにおいても、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する防御をもたらし得ることも示した。
【０２０４】
加えて、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞がＡ型インフルエンザウイルス感染に対するＩＬ−１７Ａ媒介性の防御を促進することを更に確認するために、ウイルスに暴露する前にｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けた、または受けていないＩＦＮ−γノックアウトマウスからのＣＤ８+Ｔ細胞を、野生型のＨ５Ｎ１感染マウスに養子移入した。簡潔には、Ｃ５７ＢＬ／６（すなわち、野生型）マウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第１群のＩＦＮ−γノックアウトマウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群のＩＦＮ−γノックアウトマウスは、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置しなかった。２つの群のＩＦＮ−γノックアウトマウス及びｒＩＬ−１７Ａで事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスを、０日目に５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。養子移入を受けるＣ５７ＢＬ／６（すなわち、野生型）マウスも、０日目に５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。
【０２０５】
感染後６日目に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスからＣＤ８+Ｔ細胞を単離し、単離した１ｘ１０7の細胞を、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に感染して６日経つＣ５７ＢＬ／６マウスに養子移入した。このレシピエントマウス（すなわち、図９ＣのＷＴ  ＣＤ８  Ｔ細胞＋ｒＩＬ−１７Ａ）の死亡率を感染後１６日まで毎日観測した。
【０２０６】
また、感染後６日目に、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたＩＦＮ−γノックアウトマウス（すなわち、上記第１群のＩＦＮ−γノックアウトマウス）から、及びｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けなかったＩＦＮ−γノックアウトマウス（すなわち、上記第２群のＩＦＮ−γノックアウトマウス）からもＣＤ８+Ｔ細胞を単離した。次に、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に感染して６日経つＣ５７ＢＬ／６（すなわち、野生型）マウスに、第１群のＩＦＮ−γノックアウトマウスから単離した１ｘ１０7のＣＤ８+Ｔ細胞を養子移入した。このレシピエントマウスの死亡率を感染後１６日まで毎日観測した（すなわち、図９ＣのＩＦＮ−γ  ＫＯ  ＣＤ８  Ｔ細胞＋ｒＩＬ−１７Ａ）。加えて、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に感染して６日経つＣ５７ＢＬ／６（すなわち、野生型マウス）に、第２群のＩＦＮ−γノックアウトマウスから単離した１ｘ１０7のＣＤ８+Ｔ細胞を養子移入した。このレシピエントマウスでは、死亡率を感染後１６日まで毎日観測した（すなわち、図９ＣのＩＦＮ−γ  ＫＯ  ＣＤ８  Ｔ細胞）。
【０２０７】
図９Ｃに示すように（及び図９Ｂで観察されたように）、Ｃ５７ＢＬ／６感染マウス（ｒＩＬ−１７Ａにより事前処置された、Ｃ５７ＢＬ／６感染マウスからのＣＤ８+Ｔ細胞を受けたマウス）の５０％は、感染後１６日に生存していた（すなわち、図９ＣのＷＴ  ＣＤ８  Ｔ細胞＋ｒＩＬ−１７Ａ）。このデータは、上記で説明し、図９Ｂに示した観察と一致していることから、図９Ｃの養子移入実験において陽性対照の役割を果たした。図９Ｃのデータは、３回の独立した実験を表す。
【０２０８】
第２群のＩＦＮ−γノックアウトマウス（すなわち、ウイルス暴露前にｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けていないＩＦＮ−γノックアウトマウス）からＣＤ８+Ｔ細胞を受けたＣ５７ＢＬ／６感染マウスは、感染後１１日目に死亡した（図９Ｃ、ＩＦＮ−γ  ＫＯ  ＣＤ８  Ｔ細胞）。このデータは、ＩＦＮ−γを産生することができず、かつｒＩＬ−１７による事前処置を受けなかったマウスに由来するＣＤ８+Ｔ細胞は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１感染を防御することができなかったことを示した。第１群のＩＦＮ−γノックアウトマウス（すなわち、ウイルス暴露前にｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けたＩＦＮ−γノックアウトマウス）からのＣＤ８+Ｔ細胞を受けたＣ５７ＢＬ／６感染マウスは、感染後１２日目に死亡した（図９Ｃ、ＩＦＮ−γ  ＫＯ  ＣＤ８  Ｔ細胞＋ｒＩＬ−１７Ａ）。このデータは、ＩＦＮ−γを産生することができず、かつｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置されたマウスに由来するＣＤ８+Ｔ細胞は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１感染を防御することができなかったことを示した。
【０２０９】
要約すると、上記データは、ｒＩＬ−１７Ａにより事前処置されたマウスからＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞を受けた後は、Ｈ５Ｎ１感染マウスは回復し、生存したことを示した。ＩＦＮ−γを産生することができないＣＤ８+Ｔ細胞を受けたＨ５Ｎ１感染マウスは、（ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置の有無に関わらず）ウイルス感染から回復せず、生存しなかった。したがって、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞は、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対するＩＬ−１７Ａ媒介性の防御を促進したが、ＩＦＮ−γを産生することができないＣＤ８+Ｔ細胞は防御を促進しなかった。ＣＤ８+Ｔ細胞、及び該ＣＤ８+Ｔ細胞から産生されたＩＦＮ−γは、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対するＩＬ−１７Ａ媒介性の防御に有意に寄与した。
【０２１０】
実施例９
ＣＤ８+Ｔ細胞の溶解活性
細胞溶解性であるＣＤ８+Ｔ細胞は、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても知られている。ＣＴＬは、抗ウイルス活性を有し得る。そこで、インフルエンザウイルス感染に対するＩＬ−１７Ａ媒介性の防御を促進するＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞溶解活性を検査した。具体的には、後述するように、細胞溶解活性の生体内及び生体外アッセイを使用した。
【０２１１】
細胞溶解活性の生体内アッセイに関しては、同系脾細胞をＣ５７ＢＬ／６ナイーブマウス（すなわち、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を受けず、インフルエンザウイルスにも暴露されていないマウス）から調製した。同系脾細胞を２つの群に分けた。第１群の同系脾細胞に、不活性Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１を間欠投与し、１０μＭのカルボキシフルオレセイン・スクシンイミジル・エステル（ＣＦＳＥ、細胞を染色するための蛍光染料）にて標識した。第２群の同系脾細胞を０．５μＭのＣＦＳＥで標識した。両群から、等しい数の脾細胞を混合した。
【０２１２】
野生型（すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６）マウス及びＣＤ８+Ｔ細胞欠損マウス（すなわち、ＣＤ８ノックアウトマウス）を、ウイルス感染の７日前と２日前に、０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群のＣ５７ＢＬ／６マウス及び第２群のＣＤ８ノックアウトマウスは、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、４つのマウス群を５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。Ｈ５Ｎ１ウイルスは、マウスに鼻粘膜投与した。感染後６日目に、これら４つの群のマウスに上記の混合脾細胞を静脈注射した。８時間後、脾細胞をレシピエントマウスから単離して、生体内の抗原特異的な細胞溶解レベルを判定した。
【０２１３】
図１０Ａに示すように、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置された野生型マウスでは、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けなかった野生型マウスと比較して、抗原特異的な溶解が有意に増加した（すなわち、それぞれ図１０ＡのＷＴ＋ｒＩＬ−１７Ａ及びＷＴ）。図１０Ａのデータは、３回の独立した実験、平均±ＳＥＭ、***ｐ＜０．００１（独立スチューデントｔ検定）を表す。具体的には、ｒＩＬ−１７Ａにより事前処置された野生型マウスの抗原特異的な溶解は、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けなかった野生型マウスの抗原特異的な溶解よりも、約４倍高かった。このデータは、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置がＣＴＬ活性を有意に誘導したことを示した。
【０２１４】
加えて、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けているＣＤ８ノックアウトマウス及び該処置を受けていないＣＤ８ノックアウトマウスでは、抗原特異的な溶解活性のレベルが同程度であった（それぞれ、図１０ＡのＣＤ８  ＫＯ＋ｒＩＬ−１７Ａ及びＣＤ８  ＫＯ）。ＣＤ８ノックアウトマウスは、むしろ、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置の有無に関わらず、野生型マウスで観察された抗原特異的な溶解レベルよりも低い抗原特異的な溶解レベルを有していた。したがって、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けている、及び受けていないＣＤ８ノックアウトマウスの両方で、野生型マウスのＣＴＬ活性と比較して、ＣＴＬ活性が約２分の１に減少した。要約すると、これらのデータは、ＣＤ８+Ｔ細胞が細胞溶解活性に必要とされ、更にこの細胞溶解活性が、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置に応じて有意に増加したことを示した。
【０２１５】
ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞溶解活性を更に検査し、ＩＦＮ−γの産生が細胞溶解活性に必要であるかどうかを判定するために、生体外アッセイを使用して、ＣＤ８+Ｔ細胞の異なる集団の細胞溶解活性を評価した。具体的には、野生型マウス及びＩＦＮ−γノックアウトマウスを、ウイルス感染の７日前と２日前に、０．５μｇのｒＩＬ−１７Ａで事前に腹腔内処置した。第２群の野生型マウス及び第２群のＩＦＮ−γノックアウトマウスには、ｒＩＬ−１７Ａの事前処置を施さなかった。０日目に、４つ群のマウスを５  ＬＤ50のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に暴露させた。ウイルスは、マウスの鼻粘膜に投与した。感染後６日目に４つの群のマウスからＣＤ８+Ｔ細胞を単離して、これをエフェクターＴ細胞として使用した。
【０２１６】
同系脾細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ナイーブマウス（すなわち、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けず、インフルエンザウイルスにも暴露されていないマウス）から調製した。同系脾細胞を２つの群に分けた。第１群の同系脾細胞に、不活性Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１を間欠投与し、１０μＭのＣＦＳＥにて標識した。第２群の同系脾細胞は０．５μＭのＣＦＳＥで標識し、これは陰性対照としての役割を果たした。
【０２１７】
次に、第１群及び第２群の脾細胞を、４つの群のマウスそれぞれから単離したエフェクターＴ細胞と個別に混合した。３日後に、特異的な溶解性をフローサイトメトリーにより分析した。
【０２１８】
図１０Ｂに示すように、ｒＩＬ−１７Ａを用いて事前処置された野生型マウスから単離したＣＤ８+Ｔ細胞では、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けなかった野生型マウスから単離されたＣＤ８+Ｔ細胞と比較して、抗原特異的な溶解のレベルが高かった（それぞれ図１０ＢのＷＴ  ＣＤ８＋ｒＩＬ−１７Ａ及びＷＴ  ＣＤ８）。図１０Ｂのデータは、３回の独立した実験、平均±ＳＥＭ、及び**ｐ＜０．０１（独立スチューデントｔ検定）を表す。このデータは、以上で述べた生体内アッセイでも観察されたように、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置が、ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞溶解活性を増加させることを示した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。ＩＦＮ−γを産生することができないＣＤ８+Ｔ細胞は、ｒＩＬ−１７Ａにより事前処置された野生型マウスから単離されたＣＤ８+Ｔ細胞と比較して、抗原特異的な溶解活性レベルが有意に低下した（それぞれ、図１０ＢのＩＦＮ−γＫＯ  ＣＤ８及びＷＴ  ＣＤ８＋ｒＩＬ−１７Ａ）。加えて、ｒＩＬ−１７Ａにより事前処置されたＩＦＮ−γノックアウトマウスから得たＣＤ８+Ｔ細胞は、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けなかったＩＦＮ−γノックアウトマウスから単離されたＣＤ８+Ｔ細胞と同程度のレベルの抗原特異的な溶解活性を有していた（それぞれ、図１０ＢのＩＦＮ−γＫＯ  ＣＤ８＋ｒＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮ−γＫＯ  ＣＤ８）。ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置を受けた、及び受けなかったＩＦＮ−γノックアウトマウスから単離したＣＤ８+Ｔ細胞のＣＴＬ活性は、ｒＩＬ−１７Ａにより事前処置された野生型マウスから単離されたＣＤ８+Ｔ細胞のＣＴＬ活性と比較して、それぞれ約３分の１及び約２分の１に減少した。これらのデータは、ＩＦＮ−γノックアウトマウスでは、ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞溶解活性が、野生型マウスと比較して有意に阻害されたことを示した。これらのデータは、ＩＦＮ−γの産生がない場合、ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞溶解活性が、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置によって有意に誘導されないことも示した。
【０２１９】
要約すると、生体内及び生体外の抗原特異的な細胞溶解性アッセイから得たデータは、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置によって誘導されるＣＤ８+Ｔ細胞の細胞溶解活性がＩＦＮ−γ産生に依存することを実証した。
【０２２０】
したがって、これらのデータに加え、上記実施例で得たデータは、インフルエンザウイルスに感染したマウス及びヒトの両方で、ＩＬ−１７Ａ血清レベルが有意に増加し、インフルエンザウイルス感染の重度がヒトのＩＬ−１７Ａ血清レベルに対応し、ＩＬ−１７Ａノックアウトマウスがインフルエンザウイルス感染をより受けやすく、ｒＩＬ−１７Ａによる事前処置が、マウスの死亡を用量依存的様式で阻止することを実証した。インフルエンザウイルス感染に対するＩＬ−１７Ａ媒介性の防御（及び耐性）は、抗原特異的な細胞溶解活性を有した、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８+Ｔ細胞により促進された。このＩＦＮ−γ産生細胞溶解ＣＤ８+Ｔ細胞は、ＩＬ−１７Ａによる処置によって誘導された。要約すると、ＩＬ−１７Ａによる処置は、この種のＩＬ−１７Ａによる処置を受けている対象をインフルエンザウイルス感染から防御する抗ウイルス性免疫応答を有意に誘導した。
【０２２１】
上記の詳細な説明及び付随する実施例は、単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、本発明は添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によってのみ定義されるものと理解される。
【０２２２】
開示される実施形態に対する種々の変更及び改変は、当業者には明白であろう。そのような変更及び改変は、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用方法に関するものを限定することなく含み、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2017511810.tif 000007
【図２Ｂ】
2017511810.tif 000008
【図２Ｃ】
2017511810.tif 000009
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2017511810.tif 000013
【図４Ｂ】
2017511810.tif 000014
【図５Ａ】
2017511810.tif 000015
【図５Ｂ】
2017511810.tif 000016
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2017511810.tif 000020
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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