(57)【要約】  本発明は、組み換え微生物ならびにステビオールグリコシドおよびステビオールグリコシド前駆体を生産するための方法に関する。
2017528134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｃ）ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
の１以上を含む、組み換え宿主であって、
ここで、遺伝子の少なくとも１つが、組み換え遺伝子であり；および
ここで、組み換え宿主が、ステビオールグリコシド前駆体を生産することが可能である、
前記宿主。
【請求項２】
（ａ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレン合成酵素（ＫＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｆ）ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
を含む、組み換え宿主であって、
ここで、遺伝子の少なくとも１つが、組み換え遺伝子であり；および
ここで、組み換え宿主が、ステビオールを生産することが可能である、
前記宿主。
【請求項３】
（ａ）ＫＯポリペプチドが、配列番号７２または配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性；配列番号５４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性；配列番号７０、配列番号７１または配列番号７９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性；配列番号７７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性；または、配列番号７８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性、を有するＫＯポリペプチドを含み；
（ｂ）ＣＰＲポリペプチドが、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７６または配列番号８７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性；配列番号７３に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性；配列番号２２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性；配列番号２８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性；または、配列番号９８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性、を有するＣＰＲポリペプチドを含み；および／または
（ｃ）ＫＡＨポリペプチドが、配列番号８２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性；配列番号９１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性；または、配列番号６８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性、を有するＫＡＨポリペプチドを含む、
請求項１または２に記載の組み換え宿主。
【請求項４】
（ａ）配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するＫＯポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号８２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｃ）配列番号９８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子；
の１以上を含む、組み換え宿主であって、
ここで、遺伝子の少なくとも１つが、組み換え遺伝子であり；および
ここで、組み換え宿主が、ステビオールグリコシド前駆体を生産することが可能である、
前記宿主。
【請求項５】
（ａ）配列番号７０に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するＫＯポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号８２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｃ）配列番号９８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子；
の１以上を含む、組み換え宿主であって、
ここで、遺伝子の少なくとも１つが、組み換え遺伝子であり；および
ここで、組み換え宿主が、ステビオールグリコシド前駆体を生産することが可能である、
前記宿主。
【請求項６】
配列番号５４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するＫＯポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項４または５に記載の組み換え宿主。
【請求項７】
配列番号６８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組み換え宿主。
【請求項８】
配列番号７９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するＫＯポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載の組み換え宿主。
【請求項９】
（ａ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｃ）ｅｎｔ−カウレン合成酵素（ＫＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
の１以上をさらに含む、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載の組み換え宿主であって、
ここで、遺伝子の少なくとも１つが、組み換え遺伝子であり；および
ここで、組み換え宿主が、ステビオールグリコシド前駆体を生産することが可能である、
前記宿主。
【請求項１０】
（ａ）ＧＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号４９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）ＣＤＰＳポリペプチドが、配列番号３７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；および／または
（ｃ）ＫＳポリペプチドが、配列番号６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するポリペプチドを含む、
請求項９に記載の宿主。
【請求項１１】
宿主が、小胞体膜ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え宿主。
【請求項１２】
小胞体膜ポリペプチドが、配列番号１１４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する皮質ＥＲタンパク質２（ＩＣＥ２）ポリペプチドの遺伝形質を含む、請求項１１に記載の組み換え宿主。
【請求項１３】
ＫＯポリペプチドが、融合コンストラクトである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え宿主。
【請求項１４】
融合コンストラクトが、配列番号１１８または配列番号１２０に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１３に記載の組み換え宿主。
【請求項１５】
融合コンストラクトが、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０または配列番号１１２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１３または請求項１４に記載の組み換え宿主。
【請求項１６】
（ａ）ＵＧＴ８５Ｃポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ＵＧＴ７６Ｇポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｅ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする遺伝子；
の１以上をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え宿主であって、
ここで、遺伝子の少なくとも１つが、組み換え遺伝子であり；および
ここで、宿主が、ステビオールグリコシドを生産することが可能である、
前記宿主。
【請求項１７】
（ａ）ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドが、配列番号３０に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドが、配列番号８３に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドが、配列番号２９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｄ）ＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチドが、配列番号８４に示されたアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドまたは配列番号８８に示されたアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチドを含み；および／または
（ｅ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドが、配列番号８６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含む、
請求項１６に記載の組み換え宿主。
【請求項１８】
植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞または細菌細胞を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組み換え宿主。
【請求項１９】
細菌細胞が、エスケリキア細菌細胞、ラクトバシラス細菌細胞、ラクトコッカス細菌細胞、コルネバクテリウム細菌細胞、アセトバクター細菌細胞、アシネトバクター細菌細胞またはシュードモナス細菌細胞を含む、請求項１８に記載の組み換え宿主。
【請求項２０】
真菌細胞が、酵母細胞を含む、請求項１８に記載の組み換え宿主。
【請求項２１】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウイア・リポリティカ、カンジタ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピ、シバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイヴェロミセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、カンジタ・ボイジニ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロラスまたはカンジタ・アルビカンスの種からの細胞である、請求項２０に記載の組み換え宿主。
【請求項２２】
酵母細胞が、サッカロミセス属である、請求項２１に記載の組み換え宿主。
【請求項２３】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ種からの細胞である、請求項２２に記載の組み換え宿主。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に開示された遺伝子のいずれかが発現される条件下で、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組み換え宿主を培地において成長させること；
ここで、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体が、当該宿主によって合成される；および／または
（ｂ）任意に、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体を定量すること；および／または
（ｃ）任意に、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体を単離すること
を含む、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体を生産する方法。
【請求項２５】
ステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、ジグリコシル化ステビオール、トリグリコシル化ステビオール、テトラグリコシル化ステビオール、ペンタグリコシル化ステビオール、ヘキサグリコシル化ステビオール、ヘプタグリコシル化ステビオール、またはその異性体を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体が、当該条件下で培養されたとき、検出可能な濃度まで蓄積する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組み換え宿主または請求項２４もしくは請求項２５に記載の方法によって生産されたステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体。
【請求項２７】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の宿主または請求項２４もしくは請求項２５に記載の方法によって生産されたステビオールグリコシド組成物であって、組成物が、ステビア植物に由来する検出不可能な濃度の混入物を有する、前記組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の宿主または請求項２４もしくは請求項２５に記載の方法によって生産されたステビオールグリコシド組成物であって、組成物が、野生型ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に対して、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭが濃縮されたステビオールグリコシド組成物を有する、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
本発明の分野
この開示は、組み換え宿主におけるステビオールグリコシドおよびステビオールグリコシド前駆体の組み換え生産に関する。特に、この開示は、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、またはその異性体を含むステビオールグリコシドの組み換え宿主における生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の記載
甘味料は、食品、飲料、または製菓産業において最も一般的に使用される成分としてよく知られている。甘味料は、生産の間に最終的な食品中に取り込まれ得るか、または、適切に希釈されたとき、卓上用の甘味料またはパン焼きにおける砂糖の家庭用の代替品として独立して使用され得る。甘味料は、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、および蜂蜜などの天然甘味料ならびにアスパルテーム、サッカリン、およびスクラロースなどの人工甘味料を含む。ステビア抽出物は、多年生灌木ステビア・レバウディアナから単離され、抽出され得る天然甘味料である。ステビアは、ステビア抽出物の商業的生産のために、南アメリカおよびアジアにおいて一般的に成育される。様々な程度まで精製されたステビア抽出物は、食品およびブレンドにおける高い強度の甘味料として、または卓上用の甘味料として単独で商業的に使用される。
ジテルペンステビオールおよび様々なステビオールグリコシドを含むいくつかのステビオールグリコシドの化学構造は、図１に示される。ステビア植物の抽出物は、一般に甘いフレーバーに寄与するステビオールグリコシドを含むが、各ステビオールグリコシドの量はしばしば変化し、とりわけ種々の生産バッチ間で変化する。
ステビア植物からのステビオールグリコシドの回収および精製は、労働集約的であり、非効率的であることが証明されたことから、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭなどの所望のステビオールグリコシドの高い収量を蓄積し得る組み換え生産システムについて需要が残っている。商業的使用のための組み換え宿主におけるステビオールグリコシドの改善された生産についてもまた需要が残っている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の概要
本発明が先行技術を超える所定の利点および進歩を提供することは、上記背景に対するものである。
【０００４】
ここで開示されるこの発明は特定の利点または機能性に限定されないが、本発明は：
（ａ）ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｃ）ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、少なくとも１つの遺伝子は組み換え遺伝子であり；
ここで、組み換え宿主はステビオールグリコシド前駆体を生産することが可能である、
の１以上を含む組み換え宿主を提供する。
【０００５】
本発明は：
（ａ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ｅｎｔ−カウレン合成酵素（ＫＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子
（ｄ）ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｆ）ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、少なくとも１つ遺伝子は組み換え遺伝子であり；
ここで、組み換え宿主はステビオールを生産することが可能である、
を含む組み換え宿主もまた提供する。
【０００６】
ここで開示される組み換え宿主の一側面において、
（ａ）ＫＯポリペプチドは、配列番号７２または配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性；配列番号５４に示されたアミノ酸配列に対して６５％の同一性；配列番号７０、配列番号７１、または配列番号７９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性；配列番号７７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性；または配列番号７８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するＫＯポリペプチドを含み；
（ｂ）ＣＰＲポリペプチドは、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７６、または配列番号８７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性；配列番号７３に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性；配列番号２２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性；配列番号２８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性；または配列番号９８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＰＲポリペプチドを含み；および／または
（ｃ）ＫＡＨポリペプチドは、配列番号８２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性；配列番号９１に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性；または配列番号６８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するＫＡＨポリペプチドを含む。
【０００７】
本発明は：
（ａ）配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するＫＯポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号８２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｃ）配列番号９８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、少なくとも１つ遺伝子は組み換え遺伝子であり；
ここで、組み換え宿主はステビオールグリコシド前駆体を生産することが可能である、
の１以上を含む組み換え宿主をさらに提供する。
【０００８】
本発明は：
（ａ）配列番号７０に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するＫＯポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号８２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｃ）配列番号９８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、少なくとも１つの遺伝子は組み換え遺伝子であり；
ここで、組み換え宿主はステビオールグリコシド前駆体を生産することが可能である、
の１以上を含む組み換え宿主をさらに提供する。
【０００９】
ここで開示される組み換え宿主の一側面において、宿主は、配列番号５４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するＫＯポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００１０】
ここで開示される組み換え宿主の別の側面において、組み換え宿主は、配列番号６８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００１１】
ここで開示される組み換え宿主の別の側面において、組み換え宿主は、配列番号７９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するＫＯポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００１２】
ここで開示される組み換え宿主の一側面において、宿主は：
（ａ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｃ）ｅｎｔ−カウレン合成酵素（ＫＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、少なくとも１つの遺伝子は組み換え遺伝子であり；
ここで、組み換え宿主はステビオールグリコシド前駆体を生産することが可能である、
の１以上をさらに含む。
【００１３】
ここで開示される組み換え宿主のいくつかの側面において、
（ａ）ＧＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号４９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）ＣＤＰＳポリペプチドは、配列番号３７に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含み；および／または
（ｃ）ＫＳポリペプチドは、配列番号：６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１４】
ここで開示される組み換え宿主の一側面において、組み換え宿主は、小胞体膜ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００１５】
ここで開示される組み換え宿主の別の側面において、小胞体膜ポリペプチドは、配列番号１１４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する皮質ＥＲタンパク質２（ＩＣＥ２）ポリペプチドの遺伝形質(inheritance)を含む。
【００１６】
ここで開示される組み換え宿主の一側面において、ＫＯポリペプチドは融合コンストラクトである。
【００１７】
別の側面において、融合コンストラクトは、配列番号１１８または配列番号１２０に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１８】
別の側面において、融合コンストラクトは、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、または配列番号１１２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。
【００１９】
ここで開示される組み換え宿主の一側面において、宿主は：
（ａ）ＵＧＴ８５Ｃポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ＵＧＴ７６Ｇポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｅ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、少なくとも１つ遺伝子は組み換え遺伝子であり；
ここで、宿主はステビオールグリコシドを生産することが可能である、
の１以上をさらに含む。
【００２０】
ここで開示される組み換え宿主のいくつかの側面において、
（ａ）ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、配列番号３０に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号８３に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、配列番号２９に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｄ）ＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチドは、配列番号８４に示されたアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドまたは配列番号８８に示されたアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチドを含み；および／または
（ｅ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、配列番号８６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２１】
いくつかの側面において、ここで開示される組み換え宿主は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞を含む。
【００２２】
一側面において、細菌細胞は、エスケリキア(Escherichia)細菌細胞、例えば、大腸菌(Escherichia coli)細胞；ラクトバシラス(Lactobacillus)細菌細胞；ラクトコッカス(Lactococcus)細菌細胞；コルネバクテリウム(Cornebacterium)細菌細胞；アセトバクター(Acetobacter)細菌細胞；アシネトバクター(Acinetobacter)細菌細胞；またはシュードモナス(Pseudomonas)細菌細胞を含む。
【００２３】
一側面において、真菌細胞は酵母細胞を含む。
【００２４】
一側面において、酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、カンジタ・グラブラタ(Candida glabrata)、アシュビア・ゴシピ(Ashbya gossypii)、シバリンドネラ・ジャディニ(Cyberlindnera jadinii)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、クルイヴェロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、カンジタ・ボイジニ(Candida boidinii)、アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、キサントフィロミセス・デンドロラス(Xanthophyllomyces dendrorhous)、またはカンジタ・アルビカンス(Candida albicans)の種からの細胞である。
【００２５】
一側面において、酵母細胞はサッカロミセス属(Saccharomycete)である。
【００２６】
一側面において、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ種からの細胞である。
【００２７】
本発明は：
（ａ）ここで開示される組み換え宿主を、ここで開示される任意の遺伝子が発現される条件下で培地において成長させること；
ここで、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、当該宿主によって合成される；および／または
（ｂ）任意にステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体を定量すること；および／または
（ｃ）任意にステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体を単離すること
を含む、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体を生産する方法をさらに提供する。
【００２８】
いくつかの側面において、ステビオールグリコシドは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、ジグリコシル化ステビオール、トリグリコシル化ステビオール、テトラグリコシル化ステビオール、ペンタグリコシル化ステビオール、ヘキサグリコシル化ステビオール、ヘプタグリコシル化ステビオール、またはその異性体を含む。
【００２９】
いくつかの側面において、組み換え宿主またはここで開示される方法によって生産されたステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、当該条件下で培養されたとき検出可能な濃度まで蓄積する。
【００３０】
いくつかの側面において、組み換え宿主またはここで開示される方法によって生産されたステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、検出不可能な濃度のステビア植物に由来する混入物を有する。
【００３１】
いくつかの側面において、組み換え宿主またはここで開示される方法によって生産されたステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、野生型ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に対して、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭについて濃縮されたステビオールグリコシド組成物を有する。
【００３２】
本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、付随する請求項と一緒になされた以下の詳細な記載からより完全に理解されるであろう。請求項の範囲は、その詳述によって定義され、本記載に示された特徴および利点の特定の議論によって定義されないことに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
図面の簡潔な記載
本発明の実施態様の以下の詳細な記載は、以下の図面と併せて読まれたときに最も理解され得、ここで同様の構造は同様の参照数字で示され、ここで：
【００３４】
【図１】図１は、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）、ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）、ｅｎｔ−カウレン合成酵素（ＫＳ）、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、およびｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドを使用して、酵母においてゲラニルゲラニル二リン酸からステビオールを生産するための、操作された生合成経路の模式図を示す。
【００３５】
【図２】図２は、好適なウリジン５’−ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素によって触媒される代表的なステビオールグリコシドグリコシル化反応およびいくつかのステビオールグリコシド化合物の化学構造を示す。
【００３６】
【図３】図３は、配列番号５９に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＳ．レバウディアナＫＯ１（ＳｒＫＯ１）、コドン最適化された配列番号５５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ、または配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯを個々に発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるレバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）の生産を示す。ＲｅｂＢの生産は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析によって個々の培養のμＭ／ＯＤ６００として測定された。例３を参照。
【００３７】
【図４】図４は、配列番号５９に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＳｒＫＯ１、コドン最適化された配列番号５５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ、または配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯを個々に発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株における、培養試料のＬＣ−ＭＳ分析によって測定されたｅｎｔ−カウレン酸の生産を示す。Ｅｎｔ−カウレン酸レベルは、ｅｎｔ−カウレン酸に対応するＬＣ−ＭＳピークの曲線下面積（ＡＵＣ）として計算された。例３を参照。
【００３８】
【図５】図５は、Ｓ．レバウディアナＫＡＨｅ１（ＳｒＫＡＨｅ１；配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株またはＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）および配列番号５５〜６０のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯを共発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株における、全（細胞外＋細胞内）ステビオールグリコシドの生産を、ＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現しないコントロール株または配列番号５５〜６０のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯを発現するコントロール株と比較して示す。全ステビオールグリコシドの生産は、標準曲線との比較によって定量された。ｙ軸（μＭ）上にプロットされた値は、３つの生物学的レプリケートの平均である。例４を参照。
【００３９】
【図６】図６は、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を過剰発現し、配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯまたは配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯのいずれかをさらに発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、およびレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）の生産を示す。ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭの生産はμＭで測定された。例４を参照。
【００４０】
【図７】図７は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株またはＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）およびＫＯ（配列番号５５〜６０のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を共発現するステビオールグリコシドを生産する株におけるグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸の生産を示す。値はグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸に対応するＬＣ−ＭＳピークのＡＵＣとして、および３つの生物学的レプリケートの平均として計算された。例４を参照。
【００４１】
【図８】図８は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）またはＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株およびＫＯ（配列番号５５〜６０に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を共発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるグリコシル化ｅｎｔ−カウレノールの生産を示す。ｙ軸上にプロットされた値は、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノールに対応するＬＣ−ＭＳピークのＡＵＣとして計算された。例４を参照。
【００４２】
【図９】図９は、ＣＰＲ１（コドン最適化された配列番号６１に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）またはＣＰＲ７（配列番号２３に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）の生産を示す。ｙ軸上にプロットされた値はμＭで測定された。例５を参照。
【００４３】
【図１０】図１０は、ＳｒＫＡＨｅ１（コドン最適化された配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を過剰発現し、配列番号６２に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＣＰＲ４４９７をさらに発現する、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）の生産を示す。ｙ軸上にプロットされた値は、ＲｅｂＭのμＭ濃度を示す。例５を参照。
【００４４】
【図１１】図１１Ａは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）標準のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図１１Ｂは、配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨ（配列番号８２に示されたアミノ酸配列）を発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株による１３−ＳＭＧの生産を示す。例７を参照。
【００４５】
【図１２】図１２は、ＫＯおよびＣＰＲを共発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）およびレバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）の生産を示す。ＫＯは、ＳｒＫＯ１（コドン最適化された配列番号５９に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）、コドン最適化された配列番号６３に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ、またはコドン最適化された配列番号６４に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯから選択された。チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドは、コドン最適化された配列番号６６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＣＰＲまたはコドン最適化された配列番号６７に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＣＰＲから選択された。値は、ｙ軸上に示されたものは、示されたステビオールグリコシドのμＭ濃度。例６を参照。
【００４６】
【図１３】図１３は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）、配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨ、またはコドン最適化された配列番号８１に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨを発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）およびルブソシドの生産を示す。ｙ軸において示された値は、８つの生物学的レプリケートにわたって平均され、プレートリーダーを使用して測定されたＯＤ６００に対して規格化された１３−ＳＭＧおよびルブソシドのμＭ濃度である。エラーバーは、±それぞれの標準偏差である。例７を参照。
【００４７】
【図１４】図１４は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を単独で発現するか、またはＣＰＲ１（配列番号６１に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）またはＣＰＲ１２（配列番号９７に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）と組み合わせて発現するＳ．セレビシエ株から調製されたミクロソームタンパク質とのインキュベーションの際のチトクロムｃに対するチトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド活性を示す。結果は、２つの生物学的レプリケートの平均としてＵ／ｍｇで示される。例９を参照。
【００４８】
【図１５】図１５Ａは、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を単独で発現するか、またはＣＰＲ１（配列番号６１に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）またはＣＰＲ１２（配列番号９７に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）と組み合わせて発現する、ｅｎｔ−カウレン酸のＳ．セレビシエ株から調製されたミクロソームタンパク質との３０分間のインキュベーションの際のステビオールの蓄積を示す。結果は、３つの生物学的レプリケートの平均としてＡＵＣで示される。コントロール反応は、上記載のミクロソームタンパク質を含んだが、これらはステビオールの蓄積の測定前に３０分間インキュベートされなかった。図１５Ｂは、ｅｎｔ−カウレン酸の、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）を単独で発現するか、またはＣＰＲ１（配列番号６１に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）またはＣＰＲ１２（配列番号９７に示されたヌクレオチド配列によってコードされる）と組み合わせて発現するＳ．セレビシエ株から調製されたミクロソームタンパク質との３０分間のインキュベーション後のｅｎｔ−カウレン酸のレベルを示す。結果は、３つの生物学的レプリケートの平均としてμＭで示される。コントロール反応は、上記のミクロソームタンパク質を含んだが、ｅｎｔ−カウレン酸レベルの測定前に３０分間インキュベートされなかった。例９を参照。
【００４９】
【図１６】図１６は、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ、またはＳｒＫＯ１または配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯのいずれかとＣＹＰ１０２Ａ１（ここでは「ＢＭＲドメイン」を指す）のＮＡＤＰＨ依存性Ｐ４５０オキシドレダクターゼドメインとの間に融合コンストラクトを発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株によって蓄積されたステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、１，２−ビオシド、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、ｅｎｔ−カウレン酸、およびｅｎｔ−カウレンのレベルを示す。図１６Ａは、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）、ＳｒＫＯ１およびＢＭＲの融合コンストラクト（配列番号９９、配列番号１００）、ＳｒＫＯ１およびＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａの融合コンストラクト（配列番号１０１、配列番号１０２）、トランケートされたＳｒＫＯ１およびＢＭＲの融合コンストラクト（配列番号１０３、配列番号１０４）、トランケートされたＳｒＫＯ１およびＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａの融合コンストラクト（配列番号１０５、配列番号１０６）、またはコントロールプラスミドを発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株についてＬＣ−ＭＳによって測定された１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、およびＲｅｂＢのレベルを示す。図１６Ｂは、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）、ＳｒＫＯ１およびＢＭＲの融合コンストラクト（配列番号９９、配列番号１００）、ＳｒＫＯ１およびＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａの融合コンストラクト（配列番号１０１、配列番号１０２）、トランケートされたＳｒＫＯ１およびＢＭＲの融合コンストラクト（配列番号１０３、配列番号１０４）、トランケートされたＳｒＫＯ１およびＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａの融合コンストラクト（配列番号１０５、配列番号１０６）、またはコントロールプラスミドを発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株についてＬＣ−ＵＶによって測定されたｅｎｔ−カウレン酸およびｅｎｔ−カウレンのレベルを示す。図１６Ｃは、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯおよびＢＭＲの融合コンストラクト（配列番号１０７、配列番号１０８）、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯおよびＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａの融合コンストラクト（配列番号１０９、配列番号１１０）、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたトランケートされたＫＯおよびＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａの融合コンストラクト（配列番号１１１、配列番号１１２）、またはプラスミドコントロールを発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株についてＬＣ−ＭＳによって測定された１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、およびＲｅｂＢのレベルを示す。図１６Ｄは、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯおよびＢＭＲの融合コンストラクト（配列番号１０７、配列番号１０８）、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯおよびＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａの融合コンストラクト（配列番号１０９、配列番号１１０）、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたトランケートされたＫＯおよびＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａの融合コンストラクト（配列番号１１１、配列番号１１２）、またはプラスミドコントロールを発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株によって蓄積されたｅｎｔ−カウレン酸またはｅｎｔ−カウレンのレベルを示す。例１０を参照。
【００５０】
本発明の詳細な記載
本発明を詳細に記載する前に、多数の用語が定義されるであろう。ここで使用されるとおり、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に規定しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」への参照は１以上の核酸を意味する。
【００５１】
「好ましくは」、「一般的に」および「典型的に」のような用語は、請求項に記載の発明の範囲を限定するために、または請求項に記載の発明の構造または機能に対して所定の特徴が重大、必須、またはさらに重要であることを意味するためにここでは用いられないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施態様において用いられ得るか、または用いられ得ない、代替的または追加の特徴を強調することを意図するにすぎない。
【００５２】
本発明を記載し、定義する目的のために、用語「実質的に」は、任意の定量的な比較、値、測定、または他の表現に寄与し得る不確実性の固有の程度を表わすためにここで用いられることに留意されたい。用語「実質的に」もまた、問題の主題の基本的な機能における変化をもたらすことなく、定量的な表示が記載される参照から変わり得る程度を表わすためにここで用いられる。
【００５３】
この発明によれば、当業者によく知られている方法が、遺伝子発現コンストラクトおよび組み換え細胞を構築するために使用され得る。これらの方法は、in vitroの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、in vivoの組み換え技術、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む。例えば、Green & Sambrook, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, ４th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA)に記載された技術を参照。
【００５４】
ここで使用されるとおり、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その誘導体、またはその組み合わせを含む核酸を指すように互換的に使用され得る。
【００５５】
ここで使用されるとおり、用語「微生物」、「微生物宿主」、「微生物宿主細胞」、「組み換え宿主」、および「組み換え宿主細胞」は、互換的に使用され得る。ここで使用されるとおり、用語「組み換え宿主」は、ゲノムが少なくとも１つのＤＮＡ配列によって増大した宿主を指すように意図される。かかるＤＮＡ配列は、天然に存在しない遺伝子、通常ＲＮＡに転写されないか、またはタンパク質に翻訳（「発現され」）ないＤＮＡ配列、および宿主に導入することが望まれる他の遺伝子またはＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。典型的には、ここで記載される組み換え宿主のゲノムは、１以上の組み換え遺伝子の安定的な導入を通じて増大されることが理解されるであろう。一般に、導入されたＤＮＡは、ＤＮＡの受け手である宿主において元から存在していないが、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離すること、およびその後そのＤＮＡの１以上の追加のコピーを同じ宿主に導入すること、例えば、遺伝子の産物の生産を増強するか、または遺伝子の発現パターンを変更することは、この開示の範囲内である。いくつかの例において、導入されたＤＮＡは、例えば相同組み換えまたは部位特異的な変異誘発によって、内因性遺伝子またはＤＮＡ配列を改変するか、または置き換えさえもするであろう。好適な組み換え宿主は、微生物を含む。
【００５６】
ここで使用されるとおり、用語「組み換え遺伝子」は、同一もしくは同様な遺伝子またはＤＮＡ配列がすでにかかる宿主において存在し得るか否かに拘らず、受け手の宿主中へ導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。この文脈における「導入された」または「増大された」は、人為的に導入または増大されたことを意味することが当該技術分野において知られる。したがって、組み換え遺伝子は、別の種からのＤＮＡ配列であり得るか、または同一の種を起源とするかもしくは同一の種において存在するが、組み換え方法によって宿主中へ取り込まれて組み換え宿主を形成するＤＮＡ配列であり得る。宿主中へ導入された組み換え遺伝子は、形質転換された宿主において通常存在するＤＮＡ配列と同一であり得、１以上の追加のコピーのＤＮＡを提供するために導入され、それによって、そのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能にすることが理解されるであろう。いくつかの側面において、当該組み換え遺伝子は、ｃＤＮＡによってコードされる。他の実施態様において、組み換え遺伝子は、合成であり、および／またはＳ．セレビシエにおける発現のためにコドン最適化されている。
【００５７】
ここで使用されるとおり、用語「操作された生合成経路」は、ここで記載される組み換え宿主において生じる生合成経路を指す。いくつかの側面において、生合成経路の１以上の工程は、未改変の宿主において天然に生じない。いくつかの実施態様において、遺伝子の異種バージョンは、遺伝子の内因性バージョンを含む宿主中へ導入される。
【００５８】
ここで使用されるとおり、用語「内因性」遺伝子は、特定の生物、組織、または細胞内を起源とし、特定の生物、組織、または細胞内で生産されるか、または合成される遺伝子を指す。いくつかの実施態様において、内因性遺伝子は、酵母の遺伝子である。いくつかの実施態様において、遺伝子は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．セレビシエ株Ｓ２８８Ｃを含むが、これに限定されない）に対して内因性である。いくつかの実施態様において、内因性の酵母の遺伝子は、過剰発現される。ここで使用されるとおり、用語「過剰発現」は、野生型の生物における遺伝子発現のレベルよりも高いレベルの生物における遺伝子の発現を指すために使用される。例えば、Prelich, 2012, Genetics 190:841-54を参照。いくつかの実施態様において、内因性の酵母の遺伝子は、欠失される。例えば、Giaever & Nislow, 2014, Genetics 197(2):451-65を参照。ここで使用されるとおり、用語「欠失」、「欠失された」、「ノックアウト」および「ノックアウトされた」は、もはや生物（Ｓ．セレビシエを含むが、これに限定されない）において発現されないように操作された内因性遺伝子を指すために互換的に使用され得る。
【００５９】
ここで使用されるとおり、用語「異種配列」および「異種コーディング配列」は、組み換え宿主以外の種に由来する配列を記載するために使用される。いくつかの実施態様において、組み換え宿主はＳ．セレビシエ細胞であり、異種配列はＳ．セレビシエ以外の生物に由来する。異種コーディング配列は、例えば、異種配列を発現する組み換え宿主とは異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫、または真菌に由来し得る。いくつかの実施態様において、コーディング配列は、宿主に由来する配列である。
【００６０】
「選択可能なマーカー」は、宿主細胞の栄養要求性を補完する任意の数の遺伝子の１つであり得るか、抗生物質耐性を提供し得るか、または変色をもたらし得る。遺伝子代替ベクターの線状化されたＤＮＡフラグメントは、次いで、当該技術分野においてよく知られている方法（下記を参照）を使用して細胞中へ導入される。ゲノム中への線状フラグメントの統合および遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定され得、例えば、ＰＣＲまたはサザンブロット分析によって実証され得る。選択におけるその使用に続いて、選択可能なマーカーは、例えば、Cre-LoxPシステム（例えばGossen et al., 2002, Ann. Rev. Genetics 36:153-173およびU.S. 2006/0014264を参照）によって、宿主細胞のゲノムから除去され得る。代替的には、遺伝子代替ベクターは、遺伝子の一部を含んで破壊されるように構築され得、ここで、当該部分が任意の内因性遺伝子プロモーター配列を欠き、何もコードしないか、または遺伝子のコーディング配列の不活性のフラグメントをコードする。
【００６１】
ここで使用されるとおり、用語「変異体」および「突然変異体」は、特定のタンパク質の野生型の配列と比較して、１以上のアミノ酸で改変されたタンパク質の配列を記載するために使用される。
【００６２】
ここで使用されるとおり、用語「不活性のフラグメント」は、遺伝子の全長コーディング配列から生産されたタンパク質の、例えば、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントである。遺伝子のかかる一部は、既知のプロモーター配列が遺伝子配列に作動可能に連結されないが、終止コドンおよび転写停止配列が遺伝子配列の部分に作動可能に連結されるようにベクターにおいて挿入される。このベクターは、その後、遺伝子配列の部分において線状化され、細胞中へ形質転換され得る。単一の相同組み換えを経て、この線状化されたベクターは、次いでその不活性化によって遺伝子の内因性の対応するものにおいて統合される。
【００６３】
ここで使用されるとおり、用語「ステビオールグリコシド」は、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）（CAS # 58543-16-1）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）（CAS # 58543-17-2）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）（CAS # 63550-99-2）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）（CAS # 63279-13-0）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）（CAS # 63279-14-1）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）（CAS # 438045-89-7）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）（CAS # 1220616-44-3）、ルブソシド（CAS # 63849-39-4）、ズルコシドＡ（CAS # 64432-06-0）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）（MassBank Record: FU000332）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、１，２−ステビオシド（CAS # 57817-89-7）、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、１，２−ビオシド（MassBank Record: FU000299）、１，３−ビオシド、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、トリグルコシル化ステビオールグリコシド、テトラグリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタグルコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサグルコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタグルコシル化ステビオールグリコシド、およびその異性体を指す。図２を参照；Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, prepared by Harriet Wallin, Food Agric. Org.もまた参照。
【００６４】
ここで使用されるとおり、用語「ステビオールグリコシド前駆体」および「ステビオールグリコシド前駆体化合物」は、ステビオールグリコシド生合成経路における中間体化合物を指すために使用される。ステビオールグリコシド前駆体は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ｅｎｔ−コパリル−二リン酸、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール（kaurenal）、ｅｎｔ−カウレン酸、およびステビオールを含むが、これらに限定されない。図１を参照。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールグリコシド化合物それ自体である。例えば、１９−ＳＭＧ、ルブソシド、ステビオシド、およびＲｅｂＥは、ＲｅｂＭのステビオールグリコシド前駆体である。図２を参照。ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体は、in vivo（すなわち、組み換え宿主において）、in vitro（すなわち、酵素的に）、または全細胞生物変換によって生産され得る。ここで使用されるとおり、用語「生産する」および「蓄積する」は、in vivo、in vitro、または全細胞生物変換によるステビオールグリコシドおよびステビオールグリコシド前駆体の合成を記載するために互換的に使用され得る。
【００６５】
ここで使用されるとおり、用語「ジグリコシル化ステビオール」は、グルコースまたはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）などの２つの糖部分を含むステビオール分子を指すために使用され得る。ジグリコシル化ステビオール分子の非限定的な例は、ステビオール−１，３−ビオシド、ステビオール−１，２−ビオシド、ルブソシド、２つのグルコース部分を含むステビオール分子、１つのグルコース部分および１つのＧｌｃＮＡｃ部分を含むステビオール分子、およびその異性体を含む。
【００６６】
ここで使用されるとおり、用語「トリグリコシル化ステビオール」は、グルコースまたはＧｌｃＮＡｃなどの３つの糖部分を含むステビオール分子を指すために使用され得る。トリグリコシル化ステビオール分子の非限定的な例は、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＧ、ステビオシド、２つのグルコース部分および１つのＧｌｃＮＡｃ部分を含むステビオール分子、およびその異性体を含む。
【００６７】
ここで使用されるとおり、用語「テトラグリコシル化ステビオール」は、グルコースまたはＧｌｃＮＡｃなどの４つの糖部分を含むステビオール分子を指すために使用され得る。テトラグリコシル化ステビオール分子の非限定的な例は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＱ、４つのグルコース部分を含むステビオール分子、３つのグルコース部分および１つのＧｌｃＮＡｃ部分を含むステビオール分子、およびその異性体を含む。
【００６８】
ここで使用されるとおり、用語「ペンタグリコシル化ステビオール」は、グルコースまたはＧｌｃＮＡｃなどの５つの糖部分を含むステビオール分子を指すために使用され得る。ペンタグリコシル化ステビオール分子の非限定的な例は、ＲｅｂＤ、５つのグルコース部分を含むステビオール分子、４つのグルコース部分および１つのＧｌｃＮＡｃ部分を含むステビオール分子、およびその異性体を含む。
【００６９】
ここで使用されるとおり、用語「ヘキサグリコシル化ステビオール」は、グルコースまたはＧｌｃＮＡｃなどの６つの糖部分を含むステビオール分子を指すために使用され得る。ヘキサグリコシル化ステビオール分子の非限定的な例は、ＲｅｂＭ、６つのグルコース部分を含むステビオール分子、５つのグルコース部分および１つのＧｌｃＮＡｃ部分を含むステビオール分子、およびその異性体を含む。
【００７０】
ここで使用されるとおり、用語「ヘプタグリコシル化ステビオール」は、グルコースまたはＧｌｃＮＡｃなどの７つの糖部分を含むステビオール分子を指すために使用され得る。ヘプタグリコシル化ステビオール分子の非限定的な例は、７つのグルコース部分を含むステビオール分子およびその異性体を含む。
【００７１】
ここで使用されるとおり、用語「グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸」は、グルコースまたはＧｌｃＮＡｃなどの糖部分を含むｅｎｔ−カウレン酸分子を指すために使用され得る。グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸分子の非限定的な例は、２つのグルコース部分および１つのＧｌｃＮＡｃ部分を含むｅｎｔ−カウレン酸分子、３つのグルコース部分を含むｅｎｔ−カウレン酸分子、１つのグルコース部分および１つのＧｌｃＮＡｃ部分を含むｅｎｔ−カウレン酸分子、２つのグルコース部分を含むｅｎｔ−カウレン酸分子、およびその異性体を含む。
【００７２】
ここで使用されるとおり、用語「グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール」は、グルコースまたはＧｌｃＮＡｃなどの糖部分を含むｅｎｔ−カウレノール分子を指すために使用され得る。グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール分子の非限定的な例は、３つのグルコース部分を含むｅｎｔ−カウレノール分子、１つのグルコース部分および１つのＧｌｃＮＡｃ部分を含むｅｎｔ−カウレノール分子、２つのグルコース部分を含むｅｎｔ−カウレノール分子、およびその異性体を含む。
【００７３】
組み換えステビオールグリコシドを生産するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）株は、WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227、およびWO 2014/122328に記載される。全細胞生物変換、およびin vitroによって組み換え宿主においてステビオールグリコシドを生産する方法もまた、WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227、およびWO 2014/122328に記載される。
【００７４】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体は、組み換え宿主におけるステビオールグリコシド生合成経路の発現に関与する１以上の酵素を通じてin vivoで生産される。例えば、ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＤＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＯポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子、およびＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子の１以上を発現するステビオールを生産する組み換え宿主は、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体をin vivoで生産し得る。例えば、図１および２を参照。当業者は、これら遺伝子の１以上が、宿主に対して内因性であり得ることを理解するであろう（ただし、これら遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施態様において、すべて）は、組み換え宿主中へ導入された組み換え遺伝子である）。
【００７５】
別の例において、ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＤＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＯポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子、およびＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組み換え宿主は、ステビオールをin vivoで生産し得る。例えば、図１を参照。当業者は、１以上のこれら遺伝子が、宿主に対して内因性であり得ることを理解するであろう（ただし、これらの遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施態様において、すべて）は組み換え宿主中へ導入された組み換え遺伝子である）。
【００７６】
別の例において、ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＤＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＯポリペプチドをコードする遺伝子、ＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子、ＣＰＲポリペプチドをコードする遺伝子、および１以上のＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現するステビオールを生産する組み換え宿主は、ステビオールグリコシドをin vivoで生産し得る。例えば、図１および２を参照。当業者は、１以上のこれら遺伝子が宿主に対して内因性であり得ることを理解するであろう（ただし、これら遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施態様において、すべて）は、組み換え宿主中へ導入された組み換え遺伝子である）。
【００７７】
ＫＳポリペプチドの非限定的な例は、配列番号１〜４および配列番号６に示される。ＫＯポリペプチドの非限定的な例は、配列番号７〜１０、５４、７０〜７２、７５、および７７〜７９に示される。ＫＡＨポリペプチドの非限定的な例は、配列番号１３〜１７、６８、８２、および９１に示される。ＣＰＲポリペプチドの非限定的な例は、配列番号２０〜２２、２８、６９、７３、７４、７６、８７、および９８に示される。ＣＤＰＳポリペプチドの非限定的な例は、配列番号３３〜３９に示される。ＣＤＰＳ−ＫＳポリペプチドの非限定的な例は、配列番号４０〜４２に示される。ＧＧＰＰＳポリペプチドの非限定的な例は、配列番号４３〜５０に示される。
【００７８】
いくつかの実施態様において、組み換え宿主は、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする核酸（配列番号３２）、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸（配列番号８３）、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸（配列番号２９）、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする核酸、および／またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする核酸（配列番号８６）を含む。いくつかの側面において、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号８４）またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号８８）であり得る。当業者は、これらの遺伝子の発現が特定のステビオールグリコシドを生産するために必要であり得るが、１以上のこれらの遺伝子が宿主に対して内因性であり得ることを理解するであろう（ただし、これらの遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施態様において、すべて）は組み換え宿主中へ導入された組み換え遺伝子である）。特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする外因性の核酸を含む。別の特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする外因性の核酸を含む。さらに別の特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外因性の核酸を含む。さらに別の特定の実施態様において、ステビオールを生産する組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２（とりわけ９１Ｄ２ｅ、９１Ｄ２ｍ、９１Ｄ２ｅ−ｂ、およびその機能的ホモログを含む）、およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外因性の核酸を含む。
【００７９】
所定の実施態様において、ステビオールグリコシドは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、および／またはＲｅｂＭである。ＲｅｂＡは、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、およびＵＧＴ９１Ｄ２を発現するステビオールを生産する組み換え微生物において合成され得る。ＲｅｂＢは、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＵＧＴ９１Ｄ２を発現するステビオールを生産する組み換え微生物において合成され得る。ＲｅｂＤは、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、およびＵＧＴ９１Ｄ２および／またはＥＵＧＴ１１を発現するステビオールを生産する組み換え微生物において合成され得る。ＲｅｂＭは、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、およびＵＧＴ９１Ｄ２および／またはＥＵＧＴ１１を発現するステビオールを生産する組み換え微生物において合成され得る（図２を参照）。
【００８０】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールグリコシド前駆体のステビオールグリコシド経路にin vitroで関与する１以上の酵素との接触を通じて生産される。例えば、ステビオールをＵＧＴポリペプチドと接触させることは、ステビオールグリコシドのin vitroでの生産をもたらし得る。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシド前駆体は、上流のステビオールグリコシド前駆体の、ステビオールグリコシド経路にin vitroで関与する１以上の酵素との接触を通じて生産される。例えば、ｅｎｔ−カウレン酸をＫＡＨ酵素と接触させることは、ステビオールのin vitroでの生産をもたらし得る。
【００８１】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、全細胞生物変換によって生産される。全細胞生物変換を生じさせるために、ステビオールグリコシド経路に関与する１以上の酵素を発現する宿主細胞は、細胞においてステビオールグリコシド前駆体を取り込み、改変する；in vivoでの改変後、ステビオールグリコシドは、細胞において残存し、および／または培地中へ分泌される。例えば、ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主細胞は、細胞においてステビオールを取り込み、ステビオールをグリコシル化し得る；in vivoでのグリコシル化後、ステビオールグリコシドは、培地中へ分泌され得る。いくつかの実施態様において、細胞は、改変される基質を取り込むか、または改変された産物を分泌するように透過処理される。
【００８２】
いくつかの実施態様において、ステビオール、１以上のステビオールグリコシド前駆体、および／または１以上のステビオールグリコシドは、２以上の宿主の共培養によって生産される。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシド経路に関与する１以上の酵素を発現する１以上の各宿主は、ステビオール、１以上のステビオールグリコシド前駆体、および／または１以上のステビオールグリコシドを生産する。例えば、ＧＧＰＰＳ、ＣＤＰＳ、ＫＯ、ＫＳ、ＫＡＨ、および／またはＣＰＲを含む宿主および１以上のＵＧＴを含む宿主は、１以上のステビオールグリコシドを生産する。
【００８３】
いくつかの実施態様において、in vivo、in vitro、または全細胞生物変換によって生産されたステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物は、とりわけステビア植物からのステビア抽出物よりも少ない混入物を含む。混入物は、異臭に寄与する植物に由来する化合物を含む。潜在的な混入物は、色素、脂質、タンパク質、フェノール類、糖類、スパスレノールおよび他のセスキテルペン類、ラブダンジテルペン類、モノテルペン類、デカン酸、８，１１，１４−エイコサトリエン酸、２−メチルオクタデカン、ペンタコサン、オクタコサン、テトラコサン、オクタデカノール、スチグマステロール、β−シトステロール、α−アミリン、β−アミリン、ルペオール、β−アミリンアセタート、五員環トリテルペン類、センタウレジン(centauredin)、ケルセチン(quercitin)、エピ−アルファ−カジノール(epi-alpha-cadinol)、カリオフィレン類(carophyllenes)および誘導体、ベータ−ピネン、ベータ−シトステロール、およびジベレリンを含む。
【００８４】
ここで使用されるとおり、用語「検出可能な量」、「検出可能な濃度」、「測定可能な量」および「測定可能な濃度」は、ＡＵＣ、μＭ／ＯＤ６００、ｍｇ／Ｌ、μＭ、またはｍＭで測定されたステビオールグリコシドのレベルを指す。ステビオールグリコシド生産（すなわち、すべての、上清の、および／または細胞内のステビオールグリコシドレベル）は、一般に当業者に利用可能な技術（例えば、これらに限定されないが、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、紫外−可視分光法／分光光度法（ＵＶ−Ｖｉｓ）、質量分析（ＭＳ）、および核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ））によって検出され得、および／または分析され得る。
【００８５】
ここで使用されるとおり、用語「検出不可能な濃度」は、低すぎるために、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＵＶ−Ｖｉｓ、ＭＳ、またはＮＭＲなどの技術によって測定および／または分析され得ない化合物のレベルを指す。いくつかの実施態様において、「検出不可能な濃度」の化合物は、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物において存在しない。
【００８６】
ここで使用されるとおり、用語「または」および「および／または」は、組み合わせにおける複数の成分または互いに排他的な複数の成分を記載するために用いられる。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は、「ｘ」単独。「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、およびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指し得る。いくつかの実施態様において、「および／または」は、組み換え細胞が含む外因性の核酸を指すために使用され、ここで、組み換え細胞は、ある群から選択された１以上の外因性の核酸を含む。いくつかの実施態様において、「および／または」は、ステビオールグリコシドおよび／またはステビオールグリコシド前駆体の生産を指すために使用される。いくつかの実施態様において、「および／または」は、ステビオールグリコシドの生産を指すために使用され、ここで、１以上のステビオールグリコシドが生産される。いくつかの実施態様において、「および／または」は、ステビオールグリコシドの生産を指すために使用され、ここで、１以上のステビオールグリコシドは、１以上の以下の工程を通じて生産される：組み換え微生物を培養すること、組み換え微生物において１以上のステビオールグリコシドを合成すること、および／または１以上のステビオールグリコシドを単離すること。
【００８７】
いくつかの実施態様において、ＫＯポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、または配列番号６０、配列番号６３、配列番号６４、または配列番号６５に示される。いくつかの側面において、ＫＯポリペプチドをコードする核酸は、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９または配列番号６０に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性、配列番号５６または配列番号５８に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性、配列番号６３に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性、または配列番号６４もしくは配列番号６５に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。いくつかの実施態様において、ＫＯ酵素のアミノ酸配列は、配列番号５４、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、または配列番号７９に示される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＫＯポリペプチドをコードする１以上の核酸の１以上のコピーを含む。
【００８８】
いくつかの実施態様において、ＲｅｂＢを生産するＳ．セレビシエ株における配列番号５５または配列番号５６に示されたＫＯ遺伝子の発現は、ＲｅｂＢを生産するＳ．セレビシエ株におけるＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）の発現と比較してＲｅｂＢのより高い生産をもたらす。例３を参照。
【００８９】
いくつかの実施態様において、機能的ＫＯを有するＲｅｂＢを生産することが可能である、Ｓ．セレビシエ株における配列番号５５、配列番号５６、または配列番号５７に示されたＫＯ遺伝子の発現は、ｅｎｔ−カウレン酸の生産をもたらす。例３を参照。
【００９０】
ここで使用されるとおり、用語「ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ」および「ステビオール合成酵素」は、互換的に使用され得、「ＫＡＨ」と略され得る。いくつかの実施態様において、ＫＡＨ酵素をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１８、配列番号８０、配列番号８１、配列番号９０、または配列番号９６に示される。いくつかの側面において、ＫＡＨポリペプチドをコードする核酸は、配列番号８０に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の同一性；または配列番号１８、配列番号８１、配列番号９０、または配列番号９６に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。いくつかの実施態様において、ＫＡＨ酵素のアミノ酸配列は、配列番号６８、配列番号８２、または配列番号９１に示される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＫＡＨ酵素をコードする１以上の核酸の１以上のコピーを含む。
【００９１】
いくつかの実施態様において、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）の１以上のコピーは、Ｓ．セレビシエ株において発現される。例えば、いくつかの実施態様において、２コピーのＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）は、Ｓ．セレビシエ株において発現される。
【００９２】
いくつかの実施態様において、ＫＡＨ酵素をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列番号８０に示される。配列番号８０の核酸は、配列番号８２に示されたアミノ酸配列を有するＫＡＨをコードする。Ｓ．セレビシエにおける発現のためにコドン最適化された配列番号８０のバージョンは、配列番号８１に示される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＫＡＨ酵素をコードする１以上の核酸の１以上のコピーを含む。例７を参照。
【００９３】
いくつかの実施態様において、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）および配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨまたはコドン最適化された配列番号８１に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨのいずれかは、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において共発現される。いくつかの実施態様において、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）および配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨまたはコドン最適化された配列番号８１に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨのいずれかのステビオールグリコシドを生産する株における共発現は、コントロールのステビオールグリコシドを生産する株またはＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するステビオールグリコシドを生産する株と比較して、ステビオールグリコシドのより高い生産をもたらす。例７および表６を参照。いくつかの側面において、過剰発現するＳｒＫＡＨｅ１は、８５．５μＭの１３−ＳＭＧの生産をもたらし、ＳｒＫＡＨｅ１および配列番号８０に示されたヌクレオチドによってコードされたＫＡＨの発現は、１５３．８μＭの１３−ＳＭＧの生産をもたらし、ＳｒＫＡＨｅ１および配列番号８１に示されたヌクレオチドによってコードされたＫＡＨの発現は、１３０．５μＭの１３−ＳＭＧの生産をもたらす。
【００９４】
いくつかの実施態様において、ＫＯ遺伝子は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）をさらに過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において発現される。いくつかの実施態様において、ＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株における配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、または配列番号６０、配列番号６５のＫＯ遺伝子の発現は、コントロールのステビオールグリコシドを生産する株またはＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産する株と比較して、ステビオールグリコシドのより高い発現をもたらす。例４を参照。
【００９５】
いくつかの実施態様において、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株における配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、または配列番号６０のＫＯ遺伝子の発現は、コントロールＳ．セレビシエ株と比較して、より高いレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸をもたらす。例４を参照。
【００９６】
いくつかの実施態様において、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株における配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、または配列番号６０のＫＯ遺伝子の発現は、コントロールのＳ．セレビシエ株またはＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株に対してグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール中間体化合物の改善された代謝変換をもたらす。例４を参照。
【００９７】
いくつかの実施態様において、ＫＡＨは、セイヨウミザクラ、ウメ、またはモモＫＡＨなどのサクラ属のＫＡＨである。いくつかの実施態様において、ＫＡＨはＣＹＰ７２Ａ２１９またはＣＹＰ７１Ａ２１９様ファミリーのＫＡＨである。いくつかの実施態様において、ＫＡＨ酵素をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列番号９０または配列番号９６に示される。配列番号９０および配列番号９６の核酸は、配列番号９１に示されたアミノ酸配列を有するセイヨウミザクラからのＫＡＨをコードする。いくつかの実施態様において、ＫＡＨポリペプチドは、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、または配列番号９５に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。いくつかの実施態様において、ＫＡＨポリペプチドは、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、または配列番号９５に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＫＡＨポリペプチドである。いくつかの実施態様において、組み換え宿主における配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、または配列番号９５に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、１３−ＳＭＧおよび／またはルブソシドなどのステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体の生産をもたらす。例８を参照。
【００９８】
いくつかの実施態様において、ＣＰＲ酵素をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列番号２３、配列番号５１、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号９７に示される。いくつかの側面において、ＣＰＲポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２３、配列番号６１、または配列番号６２に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するか、または配列番号２４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号５１、または配列番号９７に示されたヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。いくつかの実施態様において、ＣＰＲ酵素のアミノ酸配列は、配列番号２２、配列番号２８、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７４、または配列番号７６、配列番号８７、または配列番号９８に示される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＣＰＲ酵素をコードする１以上の核酸の１以上のコピーを含む。
【００９９】
非限定的な例において、ＳｒＫＡＨｅ１は、ＮＣＰ１遺伝子（ＹＨＲ０４２Ｗ）によってコードされたＳ．セレビシエＣＰＲによって活性化される。ＳｒＫＡＨｅ１によってコードされたＫＡＨの増強された活性化は、遺伝子ＡＴＲ２（配列番号５１）によってコードされたアラビドプシス・タリアナＣＰＲまたは遺伝子ＣＰＲ７（配列番号２３）またはＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）によってコードされたＳ．レバウディアナＣＰＲが組み換え細胞において共発現されるときに観察される。Ａ．タリアナポリペプチドＡＴＲ１およびＡＴＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示される。Ｓ．レバウディアナのポリペプチドＣＰＲ７およびＣＰＲ８は、配列番号２７および配列番号２８にそれぞれ示される。
【０１００】
いくつかの実施態様において、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）およびＡ．タリアナＡＴＲ２（配列番号５１）を共発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ７の発現は、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）およびＡ．タリアナＡＴＲ２（配列番号５１）を発現するコントロールのステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株と比較してより高いレベルのＲｅｂＭをもたらす。いくつかの実施態様において、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株における配列番号６２に示されたＣＰＲの発現は、配列番号６２に示された核酸を発現しないか、またはＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株と比較してより高いレベルのＲｅｂＭをもたらす。例５を参照。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、ＲｅｂＢを生産する株におけるＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）および配列番号６６または配列番号７７のＣＰＲ遺伝子の共発現は、配列番号６３または配列番号６４のＫＯ遺伝子および配列番号６６または配列番号７７のＣＰＲ遺伝子の共発現よりも１３−ＳＭＧおよびＲｅｂＢのより高い生産をもたらす。例６を参照。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、ＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）は、チトクロムｃを活性化する。いくつかの実施態様において、ＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）の存在下でチトクロムｃを活性化する。いくつかの実施態様において、ＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）は、ｅｎｔ−カウレン酸のステビオールへの変換を制御する。いくつかの実施態様において、ＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）と組み合わせて、ｅｎｔ−カウレン酸をステビオールへ変換する。いくつかの実施態様において、ステビオール生産は、ＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）をＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）と組み合わせて発現するＳ．セレビシエ株から調製されるミクロソームタンパク質とのｅｎｔ−カウレン酸のインキュベーションに際し検出される。いくつかの実施態様において、組み換え宿主におけるＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）の発現は、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体の生産をもたらす。例９を参照。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドを生産する株は、ＫＯおよびＣＹＰ１０２Ａ１のＮＡＤＰＨ依存性Ｐ４５０オキシドレダクターゼドメインを含む融合コンストラクト（ここで「ＢＭＲ」を指す）を発現する。ＢＭＲポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１１７に示される；ＢＭＲアミノ酸配列は、配列番号１１８に示される。いくつかの実施態様において、ＢＭＲは、ＢＭＲ  Ｗ１０４６Ａ突然変異体（配列番号１１９、配列番号１２０）を含むが、これに限定されない、突然変異体ＢＭＲである。ＢＭＲ突然変異体は、ＮＡＤＨに特異的であり得る。いくつかの実施態様において、ＫＯ−ＢＭＲ融合コンストラクトは、リンカー（配列番号１２１、配列番号１２２）を含む。いくつかの実施態様において、融合コンストラクトのＫＯは、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）または配列番号６５に示されたヌクレオチド配列（配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対応する）によってコードされたＫＯである。いくつかの実施態様において、融合コンストラクトのＫＯは、トランケートされたＫＯである。例示的なＫＯ−ＢＭＲ融合コンストラクトは、配列番号９９〜１１２に示される。例１０を参照。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドを生産する株におけるＳｒＫＯ１−ＢＭＲ融合コンストラクト（配列番号９９〜１０６）の発現は、ステビオールグリコシドを生産する株におけるＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）の発現と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸、１３−ＳＭＧ、およびＲｅｂＢレベルの増加をもたらす。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドを生産する株における融合コンストラクト（配列番号１０７、配列番号１０８）の発現は、ステビオールグリコシドを生産する株における配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯの発現と比較して、ｅｎｔ−カウレンのｅｎｔ−カウレン酸へのより大きな変換およびｅｎｔ−カウレン酸の１３−ＳＭＧへのより大きな変換をもたらす。いくつかの実施態様において、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯおよびＷ１０４６Ａ突然変異体ＢＭＲ（配列番号１０９、配列番号１１０）を含む融合コンストラクトの発現は、増加したｅｎｔ−カウレン酸レベルをもたらす。図１６（ＢおよびＤ）ならびに例１０を参照。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドを生産する株は、皮質ＥＲタンパク質２（ＩＣＥ２；配列番号１１３、配列番号１１４）の遺伝形質を含む。ＩＣＥ２は、ＹＩＬ０９０Ｗともいう。いくつかの側面において、ＩＣＥ２は、過剰発現される。ＩＣＥ２は、ＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）および／またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）を含む株において発現され得る。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドを生産する株は、２コピーのＩＣＥ２を含む。いくつかの実施態様において、ＩＣＥ２の発現は、ｅｎｔ−カウレン代謝（ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、およびｅｎｔ−カウレノールグリコシドの減少された蓄積をもたらす）を増加させ、コントロール株と比較してステビオールグリコシドの増加された蓄積をもたらす。表１０および例１１を参照。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、発酵によって培養されたステビオールグリコシドを生産する株における配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯの発現は、コントロールのステビオールグリコシドを生産する株と比較して、ｅｎｔ−カウレン化合物のより低い蓄積をもたらす。いくつかの側面において、より高いレベルのｅｎｔ−カウレン酸およびステビオールグリコシドがコントロール株と比較してもたらされる。いくつかの実施態様において、発酵によって培養されたステビオールグリコシドを生産する株における配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨ、配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ、および配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯの発現は、コントロール株と比較してｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、ｅｎｔ−カウレノールグリコシド、ｅｎｔ−カウレン酸、およびｅｎｔ−カウレン酸グリコシドの減少された蓄積ならびに増加されたステビオールグリコシドの生産をもたらす。いくつかの実施態様において、発酵によって培養されたＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）、配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨ、および配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯの発現は、コントロール株と比較して、減少されたｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、ｅｎｔ−カウレノールグリコシド、ｅｎｔ−カウレン酸、およびｅｎｔ−カウレン酸グリコシドの蓄積およびより高いレベルのステビオールグリコシドをもたらす。表１２および例１２を参照。
【０１０７】
機能的ホモログ
上記のポリペプチドの機能的ホモログは、組み換え宿主においてステビオールグリコシドを生産することにおける使用にもまた好適である。機能的ホモログは、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有し、１以上の参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能（単数または複数）を実施するポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドであり得、配列類似性は、収束的または発散的な進化的事象が原因であり得る。よって、機能的ホモログは、時として文献においてホモログ、またはオルソログ、またはパラログと指される。野生型コーディング配列の突然変異体によってコードされたポリペプチドなどの天然に生じる機能的ホモログの変異体は、それら自体機能的ホモログであり得る。機能的ホモログもまたポリペプチドのコーディング配列の部位特異的な変異誘発を介するか、または種々の天然に生じるポリペプチドのコーディング配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によって作製され得る。ここで記載される機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は、知られたものであり、とりわけ、定向進化技術、部位特異的な変異誘発技術およびランダム変異誘発技術を含み、ポリペプチドの特定の活性を増加させること、基質特異性を変更すること、発現レベルを変更すること、細胞内位置を変更すること、または所望の様式においてポリペプチド−ポリペプチド相互作用を改変することに有用であり得る。かかる改変されたポリペプチドは、機能的ホモログであるものと考えられる。用語「機能的ホモログ」は、時として機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
【０１０８】
機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アラインメントの分析によって同定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチドの配列のデータベースにおけるクエリ(query)を実行することは、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログを同定し得る。配列分析は、参照配列としてＫＯ、ＫＡＨ、またはＣＰＲアミノ酸配列を使用する非重複データベースのＢＬＡＳＴ、相互ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析に関与し得る。アミノ酸配列は、いくつかの例において、ヌクレオチド配列から推測される。４０％より大きな配列同一性を有するデータベースにおけるこれらのポリペプチドは、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドとしての適合性のさらなる評価のための候補である。アミノ酸配列の類似性は、別の１つの疎水性残基の置換または別の１つの極性残基の置換などの保存的アミノ酸置換を可能にする。所望される場合、かかる候補の手検測は、候補の数を狭めてさらに評価するために実施され得る。手検測は、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドにおいて存在するドメイン（例えば、保存された機能的ドメイン）を有すると思われるこれら候補を選択することによって実行され得る。いくつかの実施態様において、核酸およびポリペプチドは、ＢＬＡＳＴ分析を使用するよりはむしろ発現レベルに基づくトランスクリプトームデータから同定される。
【０１０９】
保存された領域は、領域を繰り返し配列であるステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの一次アミノ酸配列内に位置付けることによって同定され得、いくつかの二次構造（例えば、ヘリックスおよびベータシート）を形成し、正または負に荷電したドメインを確立し、またはタンパク質のモチーフまたはドメインを表わす。例えば、様々なタンパク質のモチーフおよびドメインについてコンセンサス配列を記載するワールドワイドウェブ上のＰｆａｍウェブサイト（sanger.ac.uk/Software/Pfam/ and pfam.janelia.org/）を参照。Ｐｆａｍデータベースに含まれた情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999) に記載される。保存された領域もまた密接に関係する種からの同一または関係するポリペプチドの配列をアラインメントすることによって決定され得る。密接に関係する種は、好ましくは同一ファミリーからのものである。いくつかの実施態様において、２つの種々の種からの配列のアラインメントは、かかるホモログを同定することに適当である。
【０１１０】
典型的に、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存された領域を同定することに有用である。関係するポリペプチドの保存された領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの実施態様において、保存された領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
【０１１１】
例えば、組み換え宿主においてステビオールを生産するために好適なポリペプチドは、ＫＯ、ＫＡＨ、およびＣＰＲの機能的ホモログを含む。
【０１１２】
例えば、ＫＯ、ＫＡＨ、またはＣＰＲの基質特異性を改変するための方法は、当業者に知られており、部位特異的／合理的な変異誘発アプローチ、ランダム定向進化アプローチ、およびランダム変異誘発／飽和技術が酵素の活性部位近傍で実行される組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、Osmani et al., 2009, Phytochemistry 70: 325-347を参照。
【０１１３】
候補配列は、典型的には参照配列の長さの８０％〜２００％、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％である長さを有する。機能的ホモログポリペプチドは、典型的には参照配列の長さの９５％〜１０５％、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０％、または任意の範囲である長さを有する。参照核酸またはポリペプチドに対して任意の候補核酸またはポリペプチドの同一性（％）は、以下のとおり決定され得る。参照配列（例えば、ここで記載される核酸配列またはアミノ酸配列）は、コンピュータープログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８３、デフォルトパラメータ）を使用して１以上の候補配列にアラインメントされ、これは、それらの全長にわたって実施される核酸またはポリペプチド配列のアラインメント（グローバルアラインメント）を可能にする。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(13):3497-500。
【０１１４】
ＣｌｕｓｔａｌＷは、参照と１以上の候補配列との間のベストマッチを計算し、それらをアラインメントし、これにより、同一性、類似性および相違が決定され得る。１以上の残基の間隙は、参照配列、候補配列、または両方中へ挿入され得、配列アラインメントを最大化する。核酸配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のデフォルトパラメータが使用される：文字の大きさ：２；ウィンドウの大きさ：４；点数化方法：パーセンテージ；上対角線(top diagonal)の数：４；および間隙ペナルティ：５。核酸配列の複数のアラインメントのために、以下のパラメータが使用される：間隙オープンペナルティ：１０．０；間隙エクステンションペナルティ：５．０；および重み変化(transition)：有。タンパク質配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のパラメータが使用される：文字の大きさ：１；ウィンドウの大きさ：５；点数化方法：パーセンテージ；上対角線の数：５；間隙ペナルティ：３。タンパク質配列の複数のアラインメントのために、以下のパラメータが使用される：重みマトリクス：blosum；間隙オープンペナルティ：１０．０；間隙エクステンションペナルティ：０．０５；親水性間隙：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；残基特異的な間隙ペナルティ：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷのアウトプットは、配列間の関係性を反映する配列アラインメントである。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ワールドワイドウェブ上のベイラー医科大学の検索起動サイト（searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）およびワールドワイドウェブ上の欧州バイオインフォマティクス研究所サイト（ebi.ac.uk/clustalw）で行われ得る。
【０１１５】
参照配列に対する候補核酸またはアミノ酸配列の同一性（％）を決定するために、配列はＣｌｕｓｔａｌＷを使用してアラインメントされ、アラインメントにおける同一マッチの数は参照配列の長さによって除され、結果は１００で乗される。同一性の値（％）は、最も近い１０分の１に丸めるられ得ることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は、７８．１に丸めるられるが、一方７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２に丸めるられる。
【０１１６】
機能的なＫＯ、ＫＡＨ、またはＣＰＲタンパク質は、酵素によって実施された酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含み得ることが理解されるであろう。いくつかの実施態様において、ＫＯ、ＫＡＨ、またはＣＰＲタンパク質は融合タンパク質である。用語「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「融合酵素」、「融合コンストラクト」、「キメラタンパク質」、「キメラポリペプチド」、「キメラコンストラクト」、および「キメラ酵素」は、種々のタンパク質をコードする２以上の遺伝子を一緒にすることを通じて操作されたタンパク質を指すようにここで互換的に使用され得る。いくつかの実施態様において、ＫＯ、ＫＡＨ、またはＣＰＲポリペプチドをコードする核酸配列は、続く操作（例えば、精製または検出）、分泌、またはコードされたポリペプチドの局在化を促進するように設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列において、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかに位置するように挿入され得る。コードされたタグの非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ）、およびＦｌａｇ（商標）タグ（Kodak, New Haven, CT）を含む。タグの他の例は、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグを含む。
【０１１７】
いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、ドメインスワッピングによって変更されたタンパク質である。ここで使用されるとおり、用語「ドメインスワッピング」は、第一タンパク質のドメインを第二タンパク質のドメインで置き換えるプロセスを記載するために使用される。いくつかの実施態様において、第一タンパク質のドメインおよび第二タンパク質のドメインは、機能的に同一であるか、または機能的に同様である。いくつかの実施態様において、第二タンパク質のドメインの構造および／または配列は、第一タンパク質のドメインの構造および／または配列とは異なる。いくつかの実施態様において、ＫＯポリペプチドはドメインスワッピングによって変更される。例１０を参照。
【０１１８】
ステビオールおよびステビオールグリコシド生合成核酸
ここで記載されるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するために好適な１以上の制御領域に対してセンスの向きで作動可能に連結されたそのポリペプチドのコーディング配列を含む。多くの微生物は、多シストロン性ｍＲＮＡからの複数の遺伝子産物を発現することが可能であるため、複数のポリペプチドは、所望された場合、それらの微生物の単一の制御領域の制御下で発現され得る。コーディング配列および制御領域は、制御領域が配列の転写または翻訳を調節するために有効であるように制御領域およびコーディング配列が位置付けられるとき、作動可能に連結されるものと考えられる。典型的には、コーディング配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位は、単シストロン性遺伝子のための制御領域の下流の１つのヌクレオチドと約５つのヌクレオチドとの間に位置付けられる。
【０１１９】
多くの場合において、ここで記載されるポリペプチドについてのコーディング配列は、組み換え宿主以外の種において同定され、すなわち、異種核酸である。したがって、組み換え宿主が微生物である場合、コーディング配列は、他の原核または真核微生物、植物または動物からのものであり得る。しかしながら、いくつかの場合において、コーディング配列は、宿主に由来し、その生物中へ導入されている配列である。天然配列は、外因性核酸に連結された非天然配列（例えば、組み換え核酸コンストラクトにおいて天然配列に隣接する非天然の制御配列など）の存在によって天然に生じる配列としばしば区別され得る。さらに、安定的に形質転換された外因性核酸は、典型的には天然配列が見出される位置以外の位置で統合される。「制御領域」は、転写または翻訳産物の転写または翻訳開始および速度、ならびに安定性および／または可動性(mobility)に影響するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。制御領域は、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５´および３´非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、停止配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。制御領域は、典型的には、少なくともコア（基礎的）プロモーターを含む。制御領域もまた、エンハンサー配列、上流要素または上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つのコントロール要素を含み得る。制御領域は、制御領域およびコーディング配列を位置付けることによってコーディング配列に作動可能に連結され、これにより、制御領域は配列の転写または翻訳の調節に有効である。例えば、コーディング配列およびプロモーター配列を作動可能に連結するために、コーディング配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの下流の１のヌクレオチドと約５０のヌクレオチドとの間に位置付けられる。しかしながら、制御領域は、翻訳開始部位の上流の約５，０００ヌクレオチド、または転写開始部位の上流の約２，０００ヌクレオチドものところで位置付けられ得る。
【０１２０】
含まれる制御領域の選択は、いくつかの因子（効率性、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および所定の培養段階の間の優先的な発現を含むが、これらに限定されない）に依存する。制御領域をコーディング配列に対して適切に選択し、位置付けることによってコーディング配列の発現を調節することは、当業者に日常的な事項である。１よりも多い制御領域（例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、および誘導性要素）が存在し得ることは理解されるであろう。
【０１２１】
１以上の遺伝子は、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシド生産の個別の側面に有用である「モジュール」における組み換え核酸コンストラクトにおいて組み合わされ得る。モジュール、特に多シストロン性モジュールにおいて複数の遺伝子を組み合わせることは、様々な種におけるモジュールの使用を促進する。例えば、ステビオール生合成遺伝子クラスター、またはＵＧＴ遺伝子クラスターは、多シストロン性モジュールにおいて組み合わされ得、これにより、好適な制御領域の挿入後、モジュールは幅広い種へ導入され得る。別の例として、ＵＧＴ遺伝子クラスターは、各ＵＧＴコーディング配列が別個の制御領域に作動可能に連結されてＵＧＴモジュールを形成するように組み合わされ得る。かかるモジュールは、単シストロン性発現が必要であるか、または所望されるそれらの種において使用され得る。ステビオールまたはステビオールグリコシドの生産に有用な遺伝子に追加して、組み換えコンストラクトは、典型的には、複製開始点、および適切な種におけるコンストラクトの維持のための１以上の選択可能なマーカーもまた含有する。
【０１２２】
遺伝子コードの縮重のため、多数の核酸が特定ポリペプチドをコードし得、すなわち、多くのアミノ酸について、アミノ酸のコドンとして働く１よりも多いヌクレオチドの三つ組が存在することが理解されるであろう。したがって、所与のポリペプチドについてコーディング配列におけるコドンは、その宿主（例えば、微生物）の適切なコドンバイアス表を使用して、特定宿主における最適な発現が得られるように改変され得る。単離された核酸として、これら改変された配列は、精製された分子として存在し得、組み換え核酸コンストラクトのモジュールを構築することにおける使用のためのベクターまたはウイルス中へ取り込まれ得る。
いくつかの場合において、代謝中間体をステビオールまたはステビオールグリコシド生合成に転向させるために内因性ポリペプチドの１以上の機能を阻害することが望ましい。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシド生産をさらに増加させるために、例えば、スクアレンエポキシダーゼを下方調節することによって、酵母株におけるステロールの合成を下方制御することが望ましいものであり得る。別の例として、所定の内因性遺伝子産物（例えば、ここで議論される二次代謝産物またはホスファターゼからグルコース部分を除去するグリコヒドロラーゼ）の分解性の機能を阻害することが望ましいものであり得る。かかる場合において、ポリペプチドまたは遺伝子産物を過剰発現する核酸は、株中へ形質転換される組み換えコンストラクトにおいて含まれ得る。代替的に、変異誘発は、機能を増加または増強させるために望ましい遺伝子において突然変異体を生成するように使用され得る。
【０１２３】
宿主微生物
組み換え宿主は、ステビオールグリコシドを生産するためのポリペプチドを発現するために使用され得、哺乳動物、昆虫、植物、および藻類細胞を含む。多数の原核生物および真核生物もまた、ここで記載される組み換え微生物（例えば、グラム陰性細菌、酵母、および真菌など）を構築することにおける使用のために好適なものであり得る。ステビオールグリコシド生産株としての使用のために選択された種および株は、どの生産遺伝子が株に対して内因性であるか、およびどの遺伝子が存在しないかを決定するために第一に分析される。内因性の対応するものが株において存在しない遺伝子は、失われた機能（単数または複数）を供給するために次いで株中へ形質転換される、１以上の組み換えコンストラクトにおいて有利に組み立てられる。
【０１２４】
典型的には、組み換え微生物は、定義された温度（単数または複数）で所望の期間、発酵槽において成長させられる。構築され、本発明によって提供される遺伝子操作された微生物は、とりわけ、ケモスタット、バッチ、フェドバッチ培養、半連続的発酵（ドローアンドフィル、連続灌流発酵、および連続灌流細胞培養など）を含む従来の発酵プロセスを使用して培養され得る。方法において使用される特定の微生物に依存して、イソペンテニル生合成遺伝子ならびにテルペン合成酵素およびシクラーゼ遺伝子などの他の組み換え遺伝子もまた存在し得、発現され得る。基質および中間体（例えば、イソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ＧＧＰＰ、ｅｎｔ−カウレンおよびｅｎｔ−カウレン酸など）のレベルは、公開された方法による分析のための培地から試料を抽出することによって決定され得る。
【０１２５】
本方法における使用の炭素源は、ステビオールグリコシドの成長および／または生産を促進する組み換え宿主細胞によって代謝され得る任意の分子を含む。好適な炭素源の例は、スクロース（例えば、糖蜜において見出されるもの）、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオースまたは他のグルコース含有ポリマーを含むが、これらに限定されない。酵母を宿主として用いる実施態様において、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、およびグルコースなどの炭素源は、好適である。炭素源は、培養の期間終始、宿主生物に提供され得るか、または代替的に、別のエネルギー源（例えば、タンパク質など）の存在下、ある期間、生物は成長させられ、次いでフェドバッチ段階の間、炭素のみの源が提供され得る。
【０１２６】
組み換え微生物が、所望の期間、培養において成長させられた後、ステビオールおよび／または１以上のステビオールグリコシドは、次いで当該技術分野において既知の様々な技術を使用して培養から回収され得る。いくつかの実施態様において、透過処理剤は、供給物が宿主中へ入ることおよび産物が外に出ることを助けるために添加され得る。例えば、培養された微生物の粗製ライセートは、上清を得るために遠心分離され得る。得られた上清は、次いでクロマトグラフィーカラム（例えばＣ−１８カラムなど）に適用され、水で洗浄されて親水性化合物が除去され、その後、関心の化合物（単数または複数）がメタノールなどの溶媒によって溶出され得る。化合物（単数または複数）は、次いで予備ＨＰＬＣによってさらに精製され得る。WO 2009/140394もまた参照。
【０１２７】
ここで議論される様々な遺伝子およびモジュールが、単一の宿主よりはむしろ２以上の組み換え宿主において存在し得ることが理解されるであろう。複数の組み換え宿主が使用されるとき、それらは混合された培養において成長させられ、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシドを蓄積し得る。
【０１２８】
代替的には、２以上の宿主は、各々、別個の培地において成長させられ得、第一培地の産物（例えば、ステビオールなど）は、第二培地中へ導入されて、後続の中間体または最終産物（例えば、ＲｅｂＡなど）へ変換され得る。第二、または最終的な宿主によって生産された産物は、次いで回収される。いくつかの実施態様において、組み換え宿主が、培地以外の栄養源を使用し、発酵槽以外のシステムを用いることによって成長させられることもまた理解されるであろう。
【０１２９】
例示的な原核種および真核種は、より詳細に以下に記載される。しかしながら、他の種が好適であり得ることが理解されるであろう。例えば、好適な種は、アガリクス(Agaricus)、アスペルギルス(Aspergillus)、バシラス(Bacillus)、カンジタ(Candida)、コルネバクテリウム、エレモテシウム(Eremothecium)、エスケリキア、フザリウム(Fusarium)／ジベレラ(Gibberella)、クルイヴェロミセス(Kluyveromyces)、ラエティポルス(Laetiporus)、レンチナス(Lentinus)、ファフィア(Phaffia)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、ピキア(Pichia)、フィスコミトレラ(Physcomitrella)、ロドトルラ(Rhodoturula)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、スファセロマ(Sphaceloma)、キサントフィロミセス(Xanthophyllomyces)またはヤロウイア(Yarrowia)などの属にあるものであり得る。かかる属からの例示的な種は、レンチナス・チグリヌス(Lentinus tigrinus)、ラエティポルス・スルフレウス(Laetiporus sulphureus)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、ピキア・パストリス、シバリンドネラ・ジャディニ、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)、ロドトルラ・グルチニス(Rhodoturula glutinis)、ロドトルラ・ムシラギノーサ(Rhodoturula mucilaginosa)、ファフィア・ロドジマ(Phaffia rhodozyma)、キサントフィロミセス・デンドロラス、フザリウム・フジクロイ(Fusarium fujikuroi)／ジベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)、カンジタ・ウチルス(Candida utilis)、カンジタ・グラブラタ、カンジタ・アルビカンス、およびヤロウイア・リポリティカを含む。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、微生物は、エスケリキア細菌細胞（例えば、大腸菌細胞など）；ラクトバシラス細菌細胞；ラクトコッカス細菌細胞；コルネバクテリウム細菌細胞；アセトバクター細菌細胞；アシネトバクター細菌細胞；またはシュードモナス細菌細胞などの原核生物であり得る。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、微生物は、ジベレラ・フジクロイ、クルイヴェロミセス・ラクティス、シゾサッカロミセス・ポンベ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、ヤロウイア・リポリティカ、アシュビア・ゴシピ、またはＳ．セレビシエなどの子嚢菌であり得る。
【０１３２】
いくつかの実施態様において、微生物は、ブラケスレア・トリスポラ(Blakeslea trispora)、ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)、ヘマトコッカス・プルビアリス(Haematococcus pluvialis)、クロレラ(Chlorella)種、ワカメ、ヒジキ、マコンブ、セネデスムス・アルメリエンシス種などの藻類細胞であり得る。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、微生物は、ブラケスレア・トリスポラ、ドナリエラ・サリナ、ヘマトコッカス・プルビアリス、クロレラ種、ワカメ、ヒジキ、マコンブ、セネデスムス・アルメリエンシスなどのシアノバクテリア細胞であり得る。
【０１３４】
サッカロミセス種
サッカロミセスは、合成生物学において広く使用される土台(chassis)の生物であり、組み換え微生物プラットフォームとして使用され得る。例えば、突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよびＳ．セレビシエについて利用可能な他の情報のライブラリーが存在し、様々なモジュールの合理的な設計が産物収量を増強させることを可能にする。組み換え微生物を作製することについての方法は既知である。
【０１３５】
アスペルギルス種
Ａ．オリゼー(A. oryzae)、Ａ．ニガーおよびＡ．スソーヤ(A. sojae)などのアスペルギルス種は、食品生産において広く使用される微生物であり、組み換え微生物プラットフォームとしても使用され得る。ヌクレオチド配列は、Ａ．ニデュランス(A. nidulans)、Ａ．フミガーツス(A. fumigatus)、Ａ．オリゼー、Ａ．クラバタス(A. clavatus)、Ａ．フラバス(A. flavus)、Ａ．ニガーおよびＡ．テレウス(A. terreus)のゲノムについて利用可能であり、合理的な設計および内因性経路の改変によってフラックスを増強させ、産物収量を増加させることを可能にする。アスペルギルス、ならびにトランスクリプトームの検討およびプロテオミクスの検討について代謝モデルが開発された。Ａ．ニガーは、クエン酸およびグルコン酸などの多数の食品成分の工業生産のために培養され、したがって、Ａ．ニガーなどの種は、ステビオールグリコシドを生産するために一般に好適である。
【０１３６】
大腸菌
大腸菌（合成生物学における別の広く使用されるプラットフォーム生物）は、組み換え微生物プラットフォームとしても使用され得る。サッカロミセスと同様に、突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび大腸菌について利用可能な他の情報のライブラリーが存在し、様々なモジュールの合理的な設計が産物収量を増強することを可能にする。サッカロミセスについての上記のものと同様な方法が、組み換え大腸菌微生物を作製するために使用され得る。
【０１３７】
アガリクス、ジベレラ、およびファネロカエテ種
アガリクス、ジベレラ、およびファネロカエテ(Phanerochaete)の種は、それらは培養において大量のイソプレノイド生産することが知られていることから、有用であり得る。したがって、大量のステビオールグリコシドを生産するためのテルペン前駆体は、内因性遺伝子によって既に生産される。したがって、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドについての組み換え遺伝子を含むモジュールは、メバロン酸またはＭＥＰ経路遺伝子を導入する必要なく、かかる属からの種中へ導入され得る。
【０１３８】
アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)（ブラストボトリス・アデニニボランス(Blastobotrys adeninivorans)）
アークスラ・アデニニボランスは、異常な生化学的特性を有する二形性酵母（出芽酵母（パン類製造業者の酵母など）のように４２℃の温度まで成長し、この閾値を超えると糸状の形態で成長する）である。それは、広範囲の基質において成長し得、硝酸塩を同化し得る。それは、天然プラスチックを生産し得る株の生成または環境試料におけるエストロゲンのバイオセンサーの開発にうまく適用されている。
【０１３９】
ヤロウイア・リポリティカ
ヤロウイア・リポリティカは、二形性酵母（アークスラ・アデニニボランスを参照）であり、半子嚢菌類ファミリーに属する。ヤロウイア・リポリティカの全ゲノムは、知られている。ヤロウイア種は好気性菌であり、非病原性であるものと考えられる。ヤロウイアは疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）を使用することにおいて効率的であり、糖で成長し得る。それは、産業応用に高いポテンシャルを有し、油性微生物である。ヤロウイア・リポリティカは、その乾燥細胞重量のおよそ４０％まで脂質含有量を蓄積し得、脂質蓄積および再移動のためのモデル生物である。例えば、Nicaud, 2012, Yeast 29(10):409-18; Beopoulos et al., 2009, Biochimie 91(6):692-6; Bankar et al., 2009, Appl Microbiol Biotechnol. 84(5):847-65を参照。
【０１４０】
ロドトルラ(Rhodotorula)種
ロドトルラは、単細胞の、着色された酵母である。油性の赤色酵母である、ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)は、粗製グリセロールから脂質およびカロテノイドを生産することが示された（Saenge et al., 2011, Process Biochemistry 46(1):210-8）。ロドトルラ・トルロイデス(Rhodotorula toruloides)株は、改善されたバイオマスおよび脂質の生産性のための効率的なフェドバッチ発酵システムであることが示された（Li et al., 2007, Enzyme and Microbial Technology 41:312-7）。
【０１４１】
ロドスポリジウム・トルロイデス
ロドスポリジウム・トルロイデスは、油性酵母であり、脂質生産経路の操作に有用である（例えば、Zhu et al., 2013, Nature Commun. 3:1112; Ageitos et al., 2011, Applied Microbiology and Biotechnology 90(4):1219-27などを参照）。
【０１４２】
カンジタ・ボイジニ
カンジタ・ボイジニは、（メタノールで成長し得る）メチロトローフの酵母である。ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)およびピキア・パストリスなどの他のメチロトローフの種のように、それは、異種タンパク質を生産するための優れたプラットフォームを提供する。数グラム範囲の分泌された外来タンパク質の収量が報告されている。計算方法であるＩＰＲＯは、カンジタ・ボイジニのキシロースレダクターゼの補因子の特異性を、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへ実験的に転換する変異を近年予測した。例えば、Mattanovich et al., 2012, Methods Mol Biol. 824:329-58; Khoury et al., 2009, Protein Sci. 18(10):2125-38などを参照。
【０１４３】
ハンセヌラ・ポリモルファ（ピキア・アングスタ）
ハンセヌラ・ポリモルファは、メチロトローフの酵母である（カンジタ・ボイジニを参照）。それは広範囲の他の基質でさらに成長し得る；それは熱耐性であり、硝酸塩を同化し得る（クルイヴェロミセス・ラクティスもまた参照）。それは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリンおよびＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンアルファ−２ａを生産すること、さらに技術的酵素の範囲にまでに適用されている。例えば、Xu et al., 2014, Virol Sin. 29(6):403-9などを参照。
【０１４４】
クルイヴェロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)
クルイヴェロミセス・ラクティスは、通常ケフィアの生産に適用される酵母である。それは、いくつかの糖で成長し得、最も重要なことに、乳および乳清において存在するラクトースで成長し得る。それは、チーズを生産するためのキモシン（通常仔牛の胃において存在する酵素）を生産するためにとりわけうまく適用されている。生産は、４０，０００Ｌ規模の発酵槽で行われる。例えば、van Ooyen et al., 2006, FEMS Yeast Res. 6(3):381-92などを参照。
【０１４５】
ピキア・パストリス
ピキア・パストリスはメチロトローフの酵母である（カンジタ・ボイジニおよびハンセヌラ・ポリモルファを参照）。それは、外来タンパク質を生産するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素は、キットとして利用可能であり、それは、タンパク質を生産するためにアカデミアで世界的に使用されている。複合体ヒトＮ−グリカン（酵母グリカンは、ヒトにおいて見出されたものに類似しているが、同一ではない）を生産し得る株に操作がなされてきた。例えば、Piirainen et al., 2014, N Biotechnol. 31(6):532-7を参照。
【０１４６】
フィスコミトレラ(Physcomitrella)種
フィスコミトレラのコケは、懸濁培養において成長させられるとき、酵母または他の真菌培養と同様な特性を有する。この属は、他の種類の細胞において生産することが困難であり得る植物の二次代謝産物を生産するために使用され得る。
【０１４７】
ステビオールグリコシド組成物
ステビオールグリコシドは、種々の食品システムにおいて必ずしも同等なパフォーマンスを有しない。したがって、合成を選択のステビオールグリコシド組成物へ向ける能力を有することが望まれる。ここで記載される組み換え宿主は、特定のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭ）について選択的に濃縮され、一貫性がある味覚プロファイルを有する組成物を生産し得る。ここで使用されるとおり、用語「濃縮された」は、ステビア植物からのステビオールグリコシド組成物（抽出物）と比較して、特定のステビオールグリコシドの増加された割合を有するステビオールグリコシド組成物を記載するために使用される。したがって、ここで記載される組み換え宿主は、所与の食品のための所望の甘味プロファイルを満たすように適合され、バッチ間で一貫性がある各ステビオールグリコシドの割合を有する組成物の生産を促進し得る。いくつかの実施態様において、ここで記載される宿主は、ステビア抽出物において見出される望まれない植物の副産物を生産しないか、またはその低減された量を生産する。したがって、ここで記載される組み換え宿主によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、ステビア植物に由来する組成物と区別可能である。
【０１４８】
蓄積された個々のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭなど）の量は、約１〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、約３〜約１０ｍｇ／Ｌ、約５〜約２０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約５０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２５〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ、または約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２，８００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌなどであり得る。いくつかの側面において、個々のステビオールグリコシドの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超え得る。蓄積されたステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭなど）の組み合わせの量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２００〜約１，５００、少なくとも約２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６，０００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌなどであり得る。いくつかの側面において、ステビオールグリコシドの組み合わせの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超え得る。一般に、より長い培養時間は、より大量の産物をもたらすであろう。したがって、組み換え微生物は、１日〜７日、１日〜５日、３日〜５日、約３日、約４日、または約５日の間培養され得る。
【０１４９】
ここで議論される様々な遺伝子およびモジュールが単一の微生物というよりはむしろ２以上の組み換え微生物において存在し得ることが理解されるであろう。複数の組み換え微生物が使用されるとき、それらは、混合された培養において成長されてステビオールおよび／またはステビオールグリコシドを生産し得る。例えば、第一の微生物は、ステビオールグリコシド前駆体を生産するための１以上の生合成遺伝子を含み得るが、第二の微生物は、ステビオールグリコシド生合成遺伝子を含む。第二または最終的な微生物によって生産された産物は、次いで回収される。いくつかの実施態様において、培地以外の栄養源を使用して、および発酵槽以外のシステムを用いることによって、組み換え微生物が成長されることもまた理解されるであろう。
【０１５０】
代替的に、２以上の微生物は、各々、別個の培地において成長され得、例えば、ステビオールなどの第一培地の産物は第二培地中へ導入され、続く中間体へ変換され得るか、またはＲｅｂＡなどの最終産物へ変換され得る。第二または最終的な微生物によって生産された産物は、次いで回収される。いくつかの実施態様において、組み換え微生物が培地以外の栄養源を使用して、および発酵槽以外のシステムを用いることによって成長されることもまた理解されるであろう。
【０１５１】
ここで開示される方法によって得られるステビオールグリコシドおよび組成物は、食品、食事補助サプリメントおよび甘味料組成物を作るために使用され得る。例えば、WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227、およびWO 2014/122328などを参照。
【０１５２】
例えば、実質的に純粋なステビオールまたはＲｅｂＭまたはＲｅｂＤなどのステビオールグリコシドは、アイスクリーム、炭酸飲料、果物ジュース、ヨーグルト、焼き製品、チューインガム、ハードおよびソフトキャンディ、ならびにソースなどの食品に含まれ得る。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、医薬産物、薬用産物、食事補助サプリメントおよび食事栄養補助サプリメントなどの非食品においてもまた含まれ得る。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、農産業およびペット産業の両方のための動物飼料産物にもまた含まれ得る。代替的には、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシドの混合物は、組み換え微生物を別々に培養し、特定のステビオールまたはステビオールグリコシドを各々生産し、各微生物から実質的に純粋な形態のステビオールまたはステビオールグリコシドを回収し、次いで化合物を組み合わせて、所望の割合の各化合物を含む混合物を得ることによって作られ得る。ここで記載される組み換え微生物は、現在のステビア産物と比較して、より正確かつ一貫性がある混合物が得られることを可能にする。
【０１５３】
別の代替において、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、例えば、サッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、またはアセスルファムカリウムなどの他の甘味料と一緒に食品中へ取り込まれ得る。他の甘味料に対するステビオールまたはステビオールグリコシドの重量比は、最終的な食品において満足のいく味を達成するために所望のとおりに変化され得る。例えば、U.S. 2007/0128311などを参照。いくつかの実施態様において、ステビオールまたはステビオールグリコシドは、フレーバー調節剤としてフレーバー（例えば、シトラスなど）とともに提供され得る。
【０１５４】
ここで記載される組み換え微生物によって生産された組成物は、食品中へ取り込まれ得る。例えば、組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、ステビオールグリコシドおよび食品の種類に依存して、乾燥重量ベースで約２０ｍｇのステビオールグリコシド／ｋｇ食品〜約１８００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品に及ぶ範囲の量において食品中へ取り込まれ得る。例えば、組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で５００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、デザート、冷たい製菓（例えば、アイスクリームなど）、乳製品（例えば、ヨーグルトなど）、または飲料（例えば、炭酸飲料など）中へ取り込まれ得る。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で３００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、焼き製品（例えば、ビスケットなど）中へ取り込まれ得る。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、ソース（例えば、チョコレートシロップなど）または野菜製品（例えば、ピクルスなど）中へ取り込まれ得る。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で１６０ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、パン中へ取り込まれ得る。組み換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で１６００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、ハードまたはソフトキャンディ中へ取り込まれ得る。組み換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量ベースで最大で１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、加工された果物製品（例えば、果物ジュース、果物フィリング、ジャム、およびゼリーなど）中へ取り込まれ得る。いくつかの実施態様において、ここで生産されたステビオールグリコシド組成物は、医薬組成物の成分である。例えば、Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, prepared by Harriet Wallin, Food Agric. Org.；EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS), “Scientific Opinion on the safety of steviol glycosides for the proposed uses as a food additive,” 2010, EFSA Journal 8(4):1537；U.S. Food and Drug Administration GRAS Notice 323；U.S Food and Drug Administration GRAS Notice Notice 329；WO 2011/037959；WO 2010/146463；WO 2011/046423；およびWO 2011/056834などを参照。
【０１５５】
例えば、かかるステビオールグリコシド組成物は、９０〜９９重量％のＲｅｂＡおよび検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有し得、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどで食品中へ取り込まれ得る。
【０１５６】
かかるステビオールグリコシド組成物は、３重量％超のＲｅｂＢを有するＲｅｂＢ濃縮された組成物であり得、食品におけるＲｅｂＢの量が、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどであるように食品中へ取り込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＢ濃縮された組成物は、検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有する。
【０１５７】
かかるステビオールグリコシド組成物は、３重量％超のＲｅｂＤを有するＲｅｂＤ濃縮された組成物であり得、食品におけるＲｅｂＤの量が、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどであるように食品中へ取り込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＤ濃縮された組成物は、検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有する。
【０１５８】
かかるステビオールグリコシド組成物は、３重量％超のＲｅｂＥを有するＲｅｂＥ濃縮された組成物であり得、食品におけるＲｅｂＥの量が、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどであるように食品中へ取り込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＥ濃縮された組成物は、検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有する。
【０１５９】
かかるステビオールグリコシド組成物は、３重量％超のＲｅｂＭを有するＲｅｂＭ濃縮された組成物であり得、食品におけるＲｅｂＭの量が、乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇなどであるように食品中へ取り込まれ得る。典型的には、ＲｅｂＭ濃縮された組成物は、検出不可能な量のステビア植物に由来する混入物を有する。
【０１６０】
いくつかの実施態様において、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、卓上用の甘味料または「カップ一杯分(cup-for-cup)」の製品中へ取り込まれる。かかる製品は、典型的には、１以上の増量剤、例えばマルトデキストリンなどの当業者に既知のマルトデキストリンによって適切な甘味レベルまで希釈される。ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＭについて濃縮されたステビオールグリコシド組成物は、例えば、卓上使用のために乾燥重量ベースで１０，０００〜３０，０００ｍｇのステビオールグリコシド／ｋｇ製品で小袋に包装され得る。いくつかの実施態様において、ステビオールグリコシドは、in vitro、in vivo、または全細胞生物変換で生産される。
【０１６１】
本発明は、以下の例おいてさらに記載されるであろうが、請求項に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０１６２】
例
以下の例は、本発明の特定の実施態様およびその様々な使用の説明である。それらは、説明目的のみのために記載され、本発明を限定するものとして受け取られるべきではない。
【０１６３】
例１．ＬＣ−ＭＳ分析手順
３つのＬＣ−ＭＳ手順がここで使用された。例２〜６に使用された第一の方法において、ＬＣ−ＭＳ分析は、加熱されたエレクトロスプレーイオン（ＨＥＳＩ）源を有するTSQ Quantum Access（ThermoFisher Scientific）三重四極質量分析器に連結されたWaters Acquity UPLC（登録商標）BEH shield RP18カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å孔径）を備えるUltimate 3000 UPLCシステム（Dionex）を使用して実行された。溶出は、溶離液Ｂ（０．１％のギ酸を含むＭｅＣＮ）および溶離液Ａ（０．１％のギ酸を含む水）の移動相を使用し、０．０から４．０分で２５％から４７％のＢへ勾配を増加させ、４．０から５．０分で４７％から１００％のＢへ増加させ、５．０から６．５分で１００％のＢを維持することによって実施された。流速は０．４ｍＬ／分であり、カラム温度は３５℃であった。ステビオールグリコシドは、ＳＩＭ（単一イオンモニタリング）を使用して、以下のｍ／ｚトレースにより検出された。
【表１Ａ】
2017528134.tif 000003
【０１６４】
例７、８、および１０に使用された第二の方法において、ＬＣ−ＭＳ分析は、Waters ACQUITY ESI（エレクトロスプレーイオン化）TQD三重四極質量分析器に連結されたWaters ACQUITY UPLC（Waters Corporation, Milford, MA）上で実行された。化合物の分離は、ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuardプレカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍＸ５ｍｍ）を備えるWaters ACQUITY UPLC（登録商標）BEH C18カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍの粒子、１３０Å孔径）上で、２つの移動相の勾配（Ａ（０．１％のギ酸を含む水）およびＢ（０．１％のギ酸を含むアセトニトリル）による、０．３から２．０分の間の２０％から５０％へのＢの増加、２．０１分での１００％までの増加、０．６分間の１００％の維持、０．６分間の再平衡）を使用することによって達成された。流速は０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は５５℃であった。ＭＳ取得は、ＳＩＭモード（単一イオンモニタリング）を使用する負イオンモードにあった。ステビオールグリコシド定量は、真正標準との比較によってなされた。
【表１Ｂ】
2017528134.tif 000004
【０１６５】
例９に使用された第三の方法において、ＬＣ−ＭＳ分析は、ＥＳＩを備え、負モードにおいて操作されるWaters単一四極質量分析器（ＳＱＤ）に連結されたWaters Acquity UPLC（登録商標）BEH C18 カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å）を使用するWaters ACQUITY UPLC（Waters Corporation, Milford, MA）上で実行された。化合物の分離は、２つの移動相の勾配（Ａ（０．１％のギ酸を含む水）およびＢ（０．１％のギ酸を含むアセトニトリル）による、０．３から２．５分の間の６０％から１００％へのＢの増加、０．１分間の１００％のＢの維持、および０．２分間の再平衡）によって達成された。流速は０．６ｍＬ／分、カラム温度は５５℃で設定された。ステビオールまたはｅｎｔ−カウレン酸はＳＩＭ（単一イオンモニタリング）を使用して測定され、真正標準と比較することによって定量された。
【表１Ｃ】
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【０１６６】
例２．ステビオールグリコシドを生産し、かつＲｅｂＢを生産する酵母株の構築
ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株は、WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227、およびWO 2014/122328に記載のとおり構築された。例えば、シネココッカス種ＧＧＰＰＳ（配列番号４９）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、トランケートされたトウモロコシＣＤＰＳ（配列番号３７）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ａ．タリアナＫＳ（配列番号６）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＫＯ（配列番号５９、配列番号７９）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ａ．タリアナＡＴＲ２（配列番号５１、配列番号８７）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、イネＥＵＧＴ１１（配列番号８６）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３０）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号２９）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号２）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、およびＳ．レバウディアナＵＧＴ９１Ｄ２変異体であるＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号８８）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む酵母株は、ステビオールグリコシドを蓄積した。
【０１６７】
ＵＧＴ９１Ｄ２（PCT/US2012/050021からの配列番号５）のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ変異体は、２１１位でのロイシンについてのメチオニンの置換および２８６位でのバリンについてのアラニンの置換を含む。追加の変異体は、PCT/US2012/050021の表１４および例１１に記載の変異体（Ｔ１４４Ｓ、Ｍ１５２Ｌ、Ｌ２１３Ｆ、Ｓ３６４Ｐ、およびＧ３８４Ｃ変異体は除く）を含み得る。Ｌ２１１ＭおよびＶ２８６Ａのアミノ酸改変を有するＳ．レバウディアナＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂをコードする、GeneArtによってコドン最適化された配列（アミノ酸配列について配列番号８８；コドン最適化されたヌクレオチド配列は配列番号８９に示される）は、天然酵母ＴＤＨ３プロモーターから発現され、天然酵母ＣＹＣ１ターミネーターが続く。
【０１６８】
細胞は、採取前に振とう（ディープウェルについて４００ｒｐｍ、１５ｍＬのFalcon成長チューブについて２００ｒｐｍ）によって合成完全（ＳＣ）培地において３０℃で５日間成長させた。培養試料（細胞除去なし）は、ＤＭＳＯの存在下で、ＬＣ−ＭＳによる全グリコシドレベルの検出のために加熱された。株は、２５００ｍｇ／Ｌを超えるＲｅｂＤの全量、２５００ｍｇ／Ｌを超えるＲｅｂＭの全量、７００ｍｇ／Ｌを超えるＲｅｂＡの全量を蓄積した。WO 2014/122227を参照。
【０１６９】
分離Ｓ．セレビシエ株は、ＲｅｂＢを蓄積するように構築された。この株は、シネココッカス種ＧＧＰＰＳ（配列番号４９）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、トランケートされたトウモロコシＣＤＰＳ（配列番号３７）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ａ．タリアナＫＳ（配列番号６）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＫＯ（配列番号５９、配列番号７９）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ａ．タリアナＡＴＲ２（配列番号５１、配列番号８７）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、イネＥＵＧＴ１１（配列番号８６）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３０）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号２）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、およびＳ．レバウディアナＵＧＴ９１Ｄ２変異体であるＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号８８）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含み、ステビオールグリコシドを蓄積した。
【０１７０】
例３．ＫＯ遺伝子を発現する酵母株におけるステビオールグリコシドの生産
増加されたレベルのｅｎｔ−カウレン酸がステビオールグリコシドの生産を改善するか決定するために、様々な種からのＫＯ遺伝子の活性が分析された。推定されたＫＯ遺伝子は、NCBI Basic Local Alignment Sequence Search Tool（BLAST）を使用して同定された。ＫＯポリペプチドをコードする遺伝子は、クローニングされ、ＫＯ遺伝子を欠損するように改変された例２に記載のＲｅｂＢを生産するＳ．セレビシエ株において発現された。したがって、ＲｅｂＢは機能的ＫＯの発現に際して蓄積されるにすぎなかった。
【０１７１】
配列番号５４（ヌクレオチド配列は配列番号５５に示される）および配列番号７５（ヌクレオチド配列は配列番号５６に示される）に示されたアミノ酸配列によって同定される２つのＫＯポリペプチドは、ＲｅｂＢを生産する株において、ＳｒＫＯ１（ヌクレオチド配列は配列番号５９に示され、アミノ酸配列は配列番号７９に示される）よりも高いレベルのＲｅｂＢを蓄積することが見出された。ＲｅｂＢレベル（μＭ／ＯＤ６００）は図３に示される。
【０１７２】
ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるＫＯポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号５５または配列番号５６）の発現もまたｅｎｔ−カウレン酸の蓄積をもたらした（図４）。コドン最適化されたＫＯポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号５７）および配列番号７０に示されたＫＯポリペプチドをコードする遺伝子の発現もまたｅｎｔ−カウレン酸の蓄積をもたらした。しかしながら、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）の発現は、測定可能なレベルのｅｎｔ−カウレン酸をもたらさなかった。したがって、配列番号５５〜５７に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯポリペプチドは、Ｓ．セレビシエにおいて、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、および／またはｅｎｔ−カウレナールを、配列番号５９に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＳｒＫＯ１ポリペプチドと比較してより効率的にｅｎｔ−カウレン酸に変換した。
【０１７３】
例４．ＫＯ遺伝子を発現し、さらにＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現する酵母株におけるステビオールグリコシドの生産
クローニングされたＫＯ遺伝子は、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において個々に発現された。ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）を発現する、例２に記載のＳ．セレビシエ株は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を過剰発現するように改変された。試験されたＫＯ遺伝子のコーディング配列、ならびにそれらの対応するアミノ酸配列は、表２に示される。配列番号５５、５７、５８、５９、および６０に示された配列は、Ｓ．セレビシエにおける発現のためにコドン最適化された。
【表２】
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【０１７４】
表２のＫＯ酵素をコードする任意の異種核酸を共発現し、さらにＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を過剰発現するＳ．セレビシエ株は、図５に示されるとおり、コントロールのＳ．セレビシエ株（表２のＫＯを発現しない）またはＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するだけのステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株よりも高いレベルのステビオールグリコシドを蓄積した。ここで配列番号６５として同定された、配列番号５６のコドン最適化されたバージョンを発現し、ＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現する、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株は、配列番号５６に示された核酸およびＳｒＫＡＨｅ１を共発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株よりも高いレベルのステビオールグリコシド（ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭ）を蓄積した（図６）。
【０１７５】
さらに、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、または配列番号６０に示された核酸を共発現し、さらにＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するＳ．セレビシエ株は、表２のＫＯを発現しないコントロールＳ．セレビシエ株よりも高いレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸を蓄積した（図７）。
【０１７６】
また、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、または配列番号６０に示された核酸を共発現し、さらにＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するＳ．セレビシエ株は、中間体化合物、ｅｎｔ−カウレノールの改善された代謝変換を実証し、次いで、表２のＫＯを発現しないコントロールのＳ．セレビシエ株または図８に示されるＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するだけのステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株に対して、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノールの低減された蓄積をもたらした。コントロールのＳ．セレビシエ株およびＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するだけのステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、または配列番号６０に示された核酸を発現し、さらにＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するＳ．セレビシエ株よりも、高いレベルのグリコシル化ｅｎｔ−カウレノールを各々蓄積した。
【０１７７】
例５．ＣＰＲ遺伝子を発現する酵母株におけるステビオールグリコシドの生産
クローニングされたＣＰＲ遺伝子は、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において個々に発現された。Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）およびＡ．タリアナＡＴＲ２（配列番号５１）を発現する、例２に記載のステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株は、表３のＣＰＲをコードする核酸を共発現するように改変された。試験されたＣＰＲ遺伝子のコーディング配列、ならびにそれらの対応するアミノ酸配列は表３に示される。
【表３】
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【０１７８】
図９に示されるとおり、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）およびＡ．タリアナＡＴＲ２（配列番号５１）を既に発現している、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株におけるＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）の発現またはＣＰＲ７（配列番号２３、配列番号６９）の発現は、ＣＰＲ１またはＣＰＲ７を発現しないコントロールのステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株によって蓄積されたものよりも高いレベルのＲｅｂＭをもたらした。また、配列番号６２に示された核酸を発現し、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を過剰発現するステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株は、ＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するにすぎないコントロールのステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株によって蓄積されたものよりも高いレベルのＲｅｂＭを蓄積した（図１０）。
【０１７９】
例６．ＫＯ遺伝子およびＣＰＲ遺伝子を共発現する酵母株におけるステビオールグリコシドの生産
ステビオールグリコシドの生産は、表４のＫＯ遺伝子および表５のＣＰＲを共発現するように改変された、例２に記載のＲｅｂＢを生産するＳ．セレビシエ株において試験された。
【表４】
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【表５】
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【０１８０】
図１２に示されるとおり、ＲｅｂＢを生産する株におけるＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）および表５のＣＰＲ遺伝子のいずれかの共発現は、配列番号６３または配列番号６４に示された核酸および表５のチトクロムＰ４５０遺伝子のいずれかの共発現よりも高い１３−ＳＭＧおよびＲｅｂＢの生産をもたらした。
【０１８１】
例７．ＫＡＨ遺伝子を発現する酵母株におけるステビオールグリコシドの生産
候補ＫＡＨ酵素は、１３−ＳＭＧを蓄積するように操作されたＳ．セレビシエ株においてクローニングされ、発現された。１３−ＳＭＧを生産するＳ．セレビシエ株は、シネココッカス種ＧＧＰＰＳ７ポリペプチド（配列番号４９）をコードする組み換え遺伝子、トランケートされたトウモロコシＣＤＰＳポリペプチド（配列番号３７）をコードする組み換え遺伝子、Ａ．タリアナＫＳポリペプチド（配列番号６）をコードする組み換え遺伝子、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）、ＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）、配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ（配列番号７５に示されたアミノ酸配列）、および別個の発現カセットにおいて染色体に統合されたＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３０）を含んだ（図１１Ｂ）。株は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を欠損し；したがって、１３−ＳＭＧは、Ｓ．セレビシエ株の機能的ＫＡＨによる形質転換に際し蓄積されたにすぎなかった（図１１Ｂ）。
【０１８２】
形質転換体はＳＣ−ＵＲＡ培地において４日間成長させ、ＤＭＳＯ  １：１によって８０℃で１０分間抽出された。抽出物は、ＬＣ−ＭＳによって分析された（例１の方法２）。配列番号８０に示された核酸によって形質転換されたＳ．セレビシエは、１３−ＳＭＧを蓄積した（図１１Ｂ）。したがって、配列番号８２に示された、配列番号８０によってコードされたタンパク質は、ＫＡＨである。
【０１８３】
配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨは、酵母（配列番号８１）における発現のためにコドン最適化され、上記の１３−ＳＭＧを生産するＳ．セレビシエ株において発現された。ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８）または配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨの発現と同様に、配列番号８１に示されたコドン最適化されたヌクレオチド配列の発現は、１３−ＳＭＧ＋ルブソシド（図１３）の生産をもたらした。
【０１８４】
配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨおよび配列番号８１に示されたコドン最適化されたヌクレオチド配列もまた、例２に記載のとおり、ＳｒＫＡＨｅ１を発現するステビオールグリコシドを生産する株において個々に発現された。１３−ＳＭＧの生産は、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８）の過剰発現、配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨの過剰発現、または配列番号８１に示されたコドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨの過剰発現に際して、配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨ、配列番号８１に示されたコドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨを発現しないか、またはＳｒＫＡＨｅ１を過剰発現するコントロール株と比較して増加された。表６を参照。配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨまたは配列番号８１に示されたコドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨのいずれかの発現は、コントロール株またはＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８）を過剰発現するＳ．セレビシエ株のいずれかよりも高いステビオールグリコシドの生産（１３−ＳＭＧ＋１，２−ビオシド＋ルブソシド＋ＲｅｂＢ＋ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）をもたらした。表６を参照。
【表６】
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【０１８５】
例８．ＣＹＰ７２Ａ２１９ファミリーのＫＡＨ遺伝子を発現する酵母株におけるステビオールグリコシドの生産
Ｓ．セレビシエにおける発現のためにコドン最適化された配列番号９１のポリペプチドをコードする配列番号９０の核酸は、１３−ＳＭＧを蓄積するように操作された例７に記載のＳ．セレビシエ株においてクローニングされ、発現された。１３−ＳＭＧを生産するＳ．セレビシエ株は、シネココッカス種ＧＧＰＰＳ７ポリペプチド（配列番号４９）をコードする組み換え遺伝子、トランケートされたトウモロコシＣＤＰＳポリペプチド（配列番号３７）をコードする組み換え遺伝子、Ａ．タリアナＫＳポリペプチド（配列番号６）をコードする組み換え遺伝子、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）、ＣＰＲ８（配列番号２４、配列番号２８）、配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ（配列番号７５に示されたアミノ酸配列）、および別個の発現カセットにおいて染色体に統合されたＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３０）を含んだ。
【０１８６】
形質転換体は、ＳＣ−ＵＲＡ培地において４日間成長させ、８０℃で１０分間、ＤＭＳＯ  １：１によって抽出された。抽出物は、ＬＣ−ＭＳによって分析された（例１の方法２）。配列番号９０に示された核酸によって形質転換されたＳ．セレビシエは、１３−ＳＭＧならびにルブソシドを蓄積した（表７）。したがって、配列番号９１に示された、配列番号９０の核酸配列によってコードされたタンパク質はＫＡＨである。
【表７】
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【０１８７】
例９．ＣＰＲ１およびＣＰＲ１２の活性の決定
ＣＰＲ１およびＣＰＲ１２の活性は、in vitroミクロソームアッセイを使用して測定された。ミクロソームは、Pompon et al., "Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments," Methods Enzymol. 272:51-64 (1996)によって教示された方法の改変されたバージョンによって調製された。Ｓ．セレビシエ細胞は、１０分間４℃で沈降させた。ペレットは、１０ｍＬのＴＥＫバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＣｌ）によって洗浄された。細胞は、１０分間４℃で再び沈降させ、ペレットは１〜３ｍＬのＴＥＳ２バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６００ｍＭソルビトール）において再懸濁された。ガラスビーズ（４２５〜６００ミクロン）が試料に添加され、細胞は、５分間４℃で振とうし、ボルテックスすることによって激しく破壊された。上清は採取され、ビーズはときどきＴＥＳ２バッファーによって洗浄された。洗浄物は上清と組み合わされ、試料は１５分間４℃で遠心分離され、破壊されていない細胞およびガラスビーズを除去した。試料は次いで１時間４℃で超遠心分離された。ペレットはＴＥＳバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６００ｍＭソルビトール、１％（ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ）によって２回洗浄され、ＴＥＧバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール）によって一度洗浄された。試料は、１〜３ｍＬのＴＥＧにおいて再懸濁され、ペレットは均質化された。
【０１８８】
野生型コントロールのミクロソームタンパク質は、異種ＫＡＨまたはＣＰＲを含まない野生型Ｓ．セレビシエ細胞から上記のとおり調製された。ミクロソームタンパク質もまた、染色体レベルで統合された遺伝子コンストラクトから、ｉ）ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）、ｉｉ）ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）およびＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）、またはｉｉｉ）ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）およびＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）を発現するＳ．セレビシエ細胞から調製された。ステビオールグリコシドを生産する株からのミクロソームタンパク質は、例２に記載の遺伝子を発現し、さらにＳ．レバウディアナからのコドン最適化されたＣＰＲ１（アミノ酸配列の配列番号７６に対応する配列番号６１）ならびに配列番号７５によってコードされたＫＯを含む、Ｓ．セレビシエ細胞から調製された。
【０１８９】
ＣＰＲ１およびＣＰＲ１２の活性は、ＣＰＲ１またはＣＰＲ１２の、ＮＡＤＰＨの存在下でチトクロムＣをin vitroで還元する能力を測定する、チトクロムＣレダクターゼアッセイキット（Sigma-Aldrich；CY0100-1KT）を使用してまず決定された。チトクロムＣの還元は、分光光度的に定量可能である５５０ｎｍでの吸光度の増加をもたらした。使用溶液は９ｍｇのチトクロムＣを２０ｍＬのアッセイバッファーに添加することによって調製され、溶液は２５℃で使用まで保存された。ＮＡＤＰＨはＨ２Ｏにおいて０．８５ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈された。最終的な反応体積は、１．１ｍＬ（９５０μＬの使用溶液（０．４３ｍｇチトクロムＣ）、２８μＬの酵素希釈バッファー、１００μＬ  ＮＡＤＰＨ溶液（０．０８５ｍｇ  ＮＡＤＰＨ）、２０μＬのチトクロムＣオキシダーゼインヒビター、２μＬのミクロソームタンパク質）であった。ブランク試料はミクロソームタンパク質を含まず、９５０μＬの使用溶液（０．４３ｍｇのチトクロムＣ）、３０μＬの酵素希釈バッファー、１００μＬ  ＮＡＤＰＨ溶液（０．０８５ｍｇ  ＮＡＤＰＨ）、および２０μＬのチトクロムＣオキシダーゼインヒビターによって調製された。分光光度計は、ＮＡＤＰＨを除く反応に添加されたすべての成分によってブランクとした。酵素反応は、ＮＡＤＰＨの添加によって開始され、試料はピペッティングによって完全に混合され、吸光度は、５５０ｎｍで７０秒間（１０秒間の読み取りの間隔）測定された。２つの独立した速度測定が各ミクロソーム調製物についてなされ、速度は特定の活性の計算について平均化された。反応が完了した後、結果は、標準ＢＣＡアッセイ（Thermo Scientific）を使用して測定されたタンパク質濃度に対して規格化された。
【０１９０】
ユニット／ｍＬは、以下の式を使用して計算された（ΔＡ５５０／分は吸光度読み取り期間の５５０ｎｍでの吸光度の変化を表わし、１．１は反応体積（ｍＬ）を表わし、２１．１は、還元されたチトクロムｃについての吸光係数を表わす：
ユニット／ｍＬ＝（ΔＡ５５０／分ｘ希釈因子ｘ１．１）／（２１．１ｘ酵素体積）
【０１９１】
各試料のユニット／ｍＬ値は、ＣＰＲ活性（ユニット／ｍｇ）を計算するために、そのそれぞれのミクロソームタンパク質濃度によって除される。図１４は、ｉ）ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）、ｉｉ）ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）およびＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）、ならびにｉｉｉ）ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）およびＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）ミクロソーム試料の活性測定を示す。
【０１９２】
野生型コントロールからのミクロソーム調製物は、最小のＣＰＲ活性のみを示し、天然ＮＣＰ１（ＹＨＲ０４２Ｗ）の低い活性を反映した。同様に、ＫＡＨｅ１を過剰発現する酵母株からのミクロソーム調製物は、ＣＰＲ活性の増加を実証しなかった。対照的に、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）およびＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）およびＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）を発現する株からのミクロソーム調製物は、ネガティブコントロールと比較して、それぞれ７および１４倍高い活性で高いＣＰＲ活性を実証した（図１４）。
【０１９３】
別個の実験において、上記で調製されたミクロソームにおけるステビオールの形成およびｅｎｔ−カウレン酸の消費は測定された。３３μＭ  ｅｎｔ−カウレン酸、１０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、および５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）における１０μＬのミクロソームタンパク質は、１００μＬの全反応体積において３０分間３０℃でインキュベートされた。コントロール反応は、すべての反応成分の添加の後にすぐ抽出され、氷上で混合され、インキュベーション前に等分された。ステビオールおよびｅｎｔ−カウレン酸のレベルは、例１に記載の第二のＬＣ−ＭＳ手順を使用して定量された。ステビオールの定量について、ＤＭＳＯ（１：１）によってミクロソーム反応は８０℃で１０分間抽出され、遠心分離後にＬＣ−ＭＳ分析に送られた。ｅｎｔ−カウレン酸の定量について、ミクロソーム反応物はアセトニトリル１：４（２０％ミクロソーム反応および８０％アセトニトリル）によって８０℃で１０分間抽出され、遠心分離後にＬＣ−ＭＳ分析に送られた。ｅｎｔ−カウレン酸測定について得られたＡＵＣ値は、標準曲線を使用して濃度へ変換された。
【０１９４】
図１５Ａに示されるとおり、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）およびＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）のいずれかを発現するＳ．セレビシエ株から調製されたミクロソームタンパク質は、３０分間のインキュベーション期間で、ｅｎｔ−カウレン酸をステビオールへ変換した。（３０分間のインキュベーション期間なしですぐに抽出された）ステビオールグリコシドを生産する株コントロールについての図１５Ａに示されたステビオールのレベルは、ミクロソーム調製前の株によって蓄積され、ミクロソームとともに共精製されたステビオールに対応する。図１５Ｂに示されるとおり、ｅｎｔ−カウレン酸のレベルは、インキュベーションに際して、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）を単独またはＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）と組み合わせて発現するＳ．セレビシエ株から調製されたミクロソームタンパク質とともに減少した。３０分間インキュベートされたステビオールグリコシドを生産する株ミクロソーム試料について、図１５Ｂに示される増加されたｅｎｔ−カウレン酸のレベルは、ミクロソーム調製前に株によって蓄積されたｅｎｔ−カウレン酸およびミクロソームとともに共精製されたｅｎｔ−カウレンから蓄積されたｅｎｔ−カウレン酸に対応する。図１５Ｂに示されるｅｎｔ−カウレン酸のレベルは、使用された希釈因子について修正された。
【０１９５】
例１０．ＫＯとＰ４５０レダクターゼドメインとの間に融合コンストラクトを含むＳ．セレビシエ株におけるステビオールグリコシドの生産
ＣＹＰ１０２Ａ１（Ｐ４５０ＢＭ３；配列番号１１５、配列番号１１６ともいう）は、バシラス・メガタリウムからの触媒的に自己充足的な可溶性の酵素である。例えば、Whitehouse et al., 2012, Chem Soc Rev. 41(3):1218-60などを参照。２つのドメインは、ＣＹＰ１０２Ａ１ポリペプチド鎖：Ｐ４５０ヘムドメイン（ＢＭＰ）およびＮＡＤＰＨ依存性Ｐ４５０オキシドレダクターゼドメイン（ＢＭＲ）において存在する。ＣＹＰ１０２Ａ１は、一酸化された(monooxygenated)産物を生産するために、ＮＡＤＰＨのほぼ１００％の還元する能力を用いる。例えば、Yuan et al., 2009, Biochemistry 48(38):9140-6などを参照。
【０１９６】
ＣＹＰ１０２Ａ１のＢＭＲドメイン（「ＢＭＲ」；配列番号１１７、配列番号１１８に示されたコドン最適化されたヌクレオチド配列）は、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）またはDodhia et al., 2006, J Biol Inorg Chem. 11(7):903-16に記載の、リンカー（配列番号１２１、配列番号１２２）を有する配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ（配列番号７５に示されたアミノ酸配列）に融合された。ＣＹＰ１０２Ａ１のＢＭＲドメインの野生型バージョン、ならびに、ＣＹＰ１０２Ａ１の補因子の特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへ転換することが見出されている、ＢＭＲドメインのＷ１０４６Ａ突然変異体（配列番号１１９、配列番号１２０）が使用された。Girvan et al., 2011, Arch Biochem Biophys. 507(1):75-85を参照。ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）および配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯもまたＣＹＰ１０２Ａ１のＢＭＲドメインとの融合前にトランケートされた；これらの切断は、ＫＯ遺伝子の膜アンカーの欠損をもたらし、ＫＯ−ＢＭＲ融合コンストラクトの細胞基質のバージョンをもたらすことが、バイオインフォマティクスによって予測された。分析されたＫＯ−ＢＭＲ融合コンストラクトは表８に示される。
【表８】
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【０１９７】
ＫＯ−ＢＭＲ融合コンストラクトは、任意の追加のＫＯ遺伝子を含まないように改変された例２に記載のＲｅｂＢを生産する株においてクローニングされ、形質転換された。したがって、１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、およびＲｅｂＢを含むステビオールグリコシドは、機能的ＫＯの発現に際して蓄積されたにすぎなかった。各形質転換プレートからの３つの掻き取り（１μＬループの細胞）は、２００μｌのnanopureのＨ２Ｏにおいて再懸濁された。７０μＬは次いで９６ディープウェルプレートにおける１ｍＬのＳＣ−ＵＲＡへ移され、３０℃、５日間４００ｒｐｍでインキュベートされた。生物学的な３通り(Biological triplicates)が、１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、およびＲｅｂＢレベルを測定するためにＬＣ−ＭＳ（例１の方法２）によって分析され、単一の試料はＬＣ−ＵＶによってｅｎｔ−カウレンおよびｅｎｔ−カウレン酸のレベルを測定するために分析された。
【０１９８】
ＬＣ−ＭＳについて、５０μＬの試料は、５０μＬの１００％ＤＭＳＯと混合され、８０℃まで１０分間加熱された。その後、試料は４０００ＲＣＦで１０分間スピンダウンされ、８５μＬの得られた上清はＬＣ−ＭＳプレートへ移された。ＬＣ−ＭＳの結果は、Wallac, 2104 EnVision（Perkin Elmer）プレートリーダーによって測定された個々の培養のＯＤ６００によって規格化された。
【０１９９】
ＬＣ−ＵＶは、可変波長検出器（ＶＷＤ）、サーモスタットカラムコンパートメント（ＴＣＣ）、オートサンプラー、オートサンプラー冷却ユニット、およびバイナリポンプを含むAgilent 1290機器によって、およびSB-C18 rapid resolution high definition (RRHD)2.1 mm x 300 mm、１．８μｍ分析カラム（シリーズにおける２つの１５０ｍｍカラム；６５℃のカラム温度）を使用して行われた。ステビオールグリコシドおよびステビオールグリコシド前駆体は、逆相Ｃ１８カラムによって分離され、その後２１０ｍｍでのＵＶ吸光度によって検出された。ステビオールグリコシドの定量は、ＲｅｂＡの標準に対して各分析のピーク面積を比較すること、および異なるモル吸光係数を有する種について補正因子を適用することによってなされた。ステビオールグリコシド前駆体（カウレン酸、カウレナール、カウレノール、ｅｎｔ−カウレン、およびゲラニルゲラニオールなど）の定量は、カウレン酸の標準に対して各分析のピーク面積を比較すること、および異なるモル吸光係数を有する種について補正因子を適用することによってなされた。ＬＣ−ＵＶについて、０．５ｍＬの培養は、スピンダウンされ、上清は除去され、ペレットの湿重量が計算された。ＬＣ−ＵＶの結果は、ペレット湿重量によって規格化された。
【０２００】
図１６Ｂおよび１６Ｄに示されるとおり、空のプラスミドによって形質転換されたＳ．セレビシエ株は、ｅｎｔ−カウレンを蓄積した。ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）を含むプラスミドによる形質転換または配列番号６５に示されたヌクレオチド配列を有するＫＯ遺伝子を含むプラスミドによる形質転換は、１３−ＳＭＧ、１，２−ビオシド、およびＲｅｂＢ（図１６Ａおよび１８６Ｃ）の蓄積をもたらした。
【０２０１】
全長ＳｒＫＯ１−ＢＭＲ融合コンストラクト（野生型またはＷ１０４６Ａ突然変異体ＢＭＲ；配列番号：９９〜１０２）の発現は、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）の発現と比較して、ｅｎｔ−カウレン酸、１３−ＳＭＧ、およびＲｅｂＢの増加をもたらした。図１６Ａおよび１６Ｂを参照。トランケートされたＳｒＫＯ１−ＢＭＲ融合コンストラクト（野生型またはＷ１０４６Ａ突然変異体ＢＭＲ；配列番号１０３〜１０６）の発現は、ＳｒＫＯ１（配列番号５９、配列番号７９）の発現と比較してｅｎｔ−カウレン酸の増加をもたらした（図１６Ｂ）。トランケートされたＳｒＫＯ１−ＢＭＲ融合コンストラクトもまたステビオールグリコシドの生産を増加させたが、グリコシル化活性は、トランケートされたＳｒＫＯ１−ＢＭＲ融合コンストラクトよりも全長ＳｒＫＯ１−ＢＭＲ融合コンストラクトでより高かった（図１６Ａ）。
【０２０２】
配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯおよび野生型ＢＭＲ（配列番号１０７、配列番号１０８）を含む融合コンストラクトの発現は、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯと比較して、ｅｎｔ−カウレン酸の１３−ＳＭＧへのより大きな変換をもたらした（図１６Ｃ）。配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯおよびＷ１０４６Ａ突然変異体ＢＭＲ（配列番号１０９、配列番号１１０）を含む融合コンストラクトの発現は、ｅｎｔ−カウレン酸レベルの減少、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯと同様なグリコシル化活性をもたらした（図１６Ｃ）。
【０２０３】
例１１．ＩＣＥ２を含むＳ．セレビシエ株におけるステビオールグリコシド経路の評価
ＩＣＥ２は、ＥＲ亜鉛恒常性（zinc homeostasis）およびチトクロムＰ４５０安定性および／または活性などのメカニズムに関与する小胞体（ＥＲ）膜タンパク質である。例えば、Estrada de Martin et al., 2005, J Cell Sci. 118(Pt 1):65-77 and Emmerstorfer et al., 2015, Biotechnol J. 10(4):623-35などを参照。ＩＣＥ２（配列番号１１３、配列番号１１４）はクローニングされ、シネココッカス種ＧＧＰＰＳポリペプチド（配列番号４９）をコードする組み換え遺伝子、トランケートされたトウモロコシＣＤＰＳポリペプチド（配列番号３７）をコードする組み換え遺伝子、Ａ．タリアナＫＳポリペプチド（配列番号６）をコードする組み換え遺伝子、組み換えＳ．レバウディアナＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５９、配列番号７９）、Ａ．タリアナＡＴＲ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５１、配列番号８７）、ＳｒＫＡＨｅ１（配列番号１８、配列番号６８）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号２４、配列番号２８）、配列番号８１に示されたヌクレオチド配列によってコードされた組み換えＫＡＨ遺伝子（配列番号８２に示されたアミノ酸配列に対応する）、配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされた組み換えＫＯ遺伝子（配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対応する）、配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされた組み換えＫＯ遺伝子（配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対応する）、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号８３）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナのＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド（配列番号３０）をコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナのＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号２９）をコードする組み換え遺伝子、ＥＵＧＴ１１（配列番号８６）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号８４）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、およびＣＰＲ１（配列番号６１、配列番号７６）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含むステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株において過剰発現された。過剰発現は、ＵＳＥＲクローニングシステムを使用する統合によって実行された。例えば、Nour-Eldin et al., 2010, Methods Mol Biol. 643:185-200などを参照。表９は、上記の株において発現された追加の組み換え遺伝子（ＩＣＥ２および／またはＣＰＲ１２）を示す。コントロール株は、ＩＣＥ２（配列番号１１３、配列番号１１４）またはＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含まなかった。
【表９】
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【０２０４】
フェドバッチ発酵は、２Ｌの発酵槽において好気的に３０℃で、グルコース、硫酸アンモニウム、微量金属、ビタミン、塩、およびバッファーを含む最小培地において、およそ１６時間の成長段階、その後のおよそ１１０時間のグルコースを含む定義された流加培地による栄養補給段階によって実施された。６．０に近いｐＨおよびグルコース限定条件は維持された。全培養試料（細胞除去なし）は、例１０のＬＣ−ＵＶ方法によって分析されてステビオールグリコシドおよびステビオール経路中間体のレベルを決定した。
【０２０５】
以下の値は、ステビオールグリコシドおよびステビオールグリコシド前駆体の測定されたレベルに基づき計算された。「全フラックス」は、測定されたＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ、１３−ＳＭＧ、ルブソシド、ステビオール−１，２−ビオシド、ジグリコシル化ステビオール、トリグリコシル化ステビオール、テトラグリコシル化ステビオール、ペンタグリコシル化ステビオール、ヘキサグリコシル化ステビオール、ヘプタグリコシル化ステビオール、コパルオール（copalol）、ｅｎｔ−カウレン酸、グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、ゲラニルゲラニオール、ｅｎｔ−カウレナール、およびｅｎｔ−カウレンレベルの合計として計算された（ｇ／ＬＲｅｂＤ等価）。「前（ｐｒｅ）ステビオールグリコシド／フラックス」は、（（「全フラックス」−（ゲラニルゲラニオール＋コパルオール＋ｅｎｔ−カウレン＋グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール＋ｅｎｔ−カウレノール＋ｅｎｔ−カウレナール＋ｅｎｔ−カウレン酸＋グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸）／「全フラックス」）として計算された。「ＫＡＨ工程／フラックス」は、（（ｅｎｔ−カウレン酸＋グリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸）／「全フラックス」）として計算された。「ＫＯ工程／フラックス」は、（（ｅｎｔ−カウレン＋グリコシル化ｅｎｔ−カウレノール＋ｅｎｔ−カウレノール＋ｅｎｔ−カウレナール）／「全フラックス」）として計算された。
【０２０６】
前ステビオールグリコシド／フラックス、ＫＯ工程／フラックス、およびＫＡＨ工程／フラックス値は、以下の表１０に示される。ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、グリコシル化ｅｎｔ−カウレノールの減少した量ならびにｅｎｔ−カウレン酸およびグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸の増加した量は、コントロールのステビオールグリコシドを生産する株と比較して、ＩＣＥ２を含む株に観察された。これらの効果は、ＣＰＲ１および／またはＣＰＲ１２の存在下でより強かった（表１０）。２コピーのＩＣＥ２（ＩＣＥ２株Ｂ）の過剰発現は、コントロール株であるＩＣＥ２株Ａ、またはＩＣＥ２株Ｃと比較して、減少したｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、およびｅｎｔ−カウレノールグリコシドのレベルおよび増加したステビオールグリコシドのレベルをもたらした（表１０）。ステビオールグリコシドレベルは、２コピーのＩＣＥ２を含むステビオールグリコシドを生産する株においてほとんど増加した。したがって、ＩＣＥ２は、チトクロムＰ４５０の機能を改善することが見出された。
【表１０】
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【０２０７】
例１２．ＣＰＲ１およびＣＰＲ１２を含むＳ．セレビシエ株の発酵によるステビオールグリコシドの生産
シネココッカス種ＧＧＰＰＳポリペプチド（配列番号４９）をコードする組み換え遺伝子、トランケートされたトウモロコシＣＤＰＳポリペプチド（配列番号３７）をコードする組み換え遺伝子、Ａ．タリアナＫＳポリペプチド（配列番号６）をコードする組み換え遺伝子、組み換えＳ．レバウディアナＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５９、配列番号７９）、Ａ．タリアナＡＴＲ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号５１、配列番号８７）、ＳｒＫＡＨｅ１をコードする組み換え遺伝子（配列番号１８、配列番号６８）ポリペプチド、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号２４、配列番号２８）、ＣＰＲ１をコードする組み換え遺伝子（配列番号６１、配列番号７６）ポリペプチド、ＳｒＫＡＨｅ１をコードする組み換え遺伝子（配列番号１８、配列番号６８）ポリペプチド、配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされた組み換えＫＯ遺伝子（配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対応する）、ＵＧＴ７６Ｇ１をコードする組み換え遺伝子（配列番号８３）ポリペプチド、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３０）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号２９）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号８８）をコードする組み換え遺伝子、およびＥＵＧＴ１１（配列番号８６）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、ならびに株中のゲノムに統合された表１１に示される組み換え遺伝子を含む、ステビオールグリコシドを生産するＳ．セレビシエ株は、発酵によって培養された。ステビオールグリコシドおよびステビオールグリコシド前駆体のレベルは、例１１に記載のとおりＬＣ−ＵＶによって測定された。前ＫＯ／フラックス、前ＫＡＨ／フラックス、前ステビオールグリコシド／フラックス値は、例１１に記載のとおり計算された。
【表１１】
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【０２０８】
前ステビオールグリコシド／フラックス、ＫＯ工程／フラックス、およびＫＡＨ工程／フラックス値は、以下の表１２に示される。配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯを含む株（株Ａ）において、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、およびｅｎｔ−カウレノールグリコシドのより低い蓄積がもたらされた。ｅｎｔ−カウレン酸およびステビオールグリコシドのより高いレベルもまた、コントロール株と比較して測定された。配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨ、配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯ（配列番号７５に示されたアミノ酸配列に対応する）、および配列番号６５に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯを含む株（株Ｂ）において、コントロール株と比較して、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、ｅｎｔ−カウレノールグリコシド、およびｅｎｔ−カウレン酸の蓄積が減少し、ステビオールグリコシドの蓄積が増加した。ＣＰＲ１２（配列番号９７、配列番号９８）、配列番号８０に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＡＨ、および配列番号５６に示されたヌクレオチド配列によってコードされたＫＯを含む株（株Ｃ）において、コントロールと比較して、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナール、ｅｎｔ−カウレノールグリコシド、およびｅｎｔ−カウレン酸の蓄積は減少し、ステビオールグリコシドの蓄積は増加した。表１２を参照。したがって、ＣＰＲ１２は、ＫＡＨおよび／またはＫＯ活性を改善するレダクターゼタンパク質であることが見出された。
【表１２】
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【０２０９】
本発明を詳細に記載し、その特定の実施態様を参照することによって、添付の請求項に定義される本発明の範囲を逸脱することなく、改変および変更が可能であるであることは明らかであろう。より具体的には、本発明のいくつかの側面がここで特に有利なものとして同定されるが、本発明が必ずしも本発明のこれら特定の側面に限定されないことが意図される。
【０２１０】
【表１３−１】
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【０２１１】
【表１３−２】
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【０２１２】
【表１３−３】
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【０２１３】
【表１３−４】
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【０２１４】
【表１３−５】
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【０２１５】
【表１３−６】
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【０２１６】
【表１３−７】
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【０２１７】
【表１３−８】
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【０２１８】
【表１３−９】
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【０２１９】
【表１３−１０】
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【０２２０】
【表１３−１１】
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【０２２１】
【表１３−１２】
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【０２２２】
【表１３−１３】
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【０２２３】
【表１３−１４】
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【０２２４】
【表１３−１５】
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【０２２５】
【表１３−１６】
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【０２２６】
【表１３−１７】
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【０２２７】
【表１３−１８】
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【０２２８】
【表１３−１９】
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【０２２９】
【表１３−２０】
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【０２３０】
【表１３−２１】
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【０２３１】
【表１３−２２】
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【０２３２】
【表１３−２３】
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【０２３３】
【表１３−２４】
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【０２３４】
【表１３−２５】
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【０２３５】
【表１３−２６】
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【０２３６】
【表１３−２７】
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【０２３７】
【表１３−２８】
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【０２３８】
【表１３−２９】
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【０２３９】
【表１３−３０】
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【０２４０】
【表１３−３１】
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【０２４１】
【表１３−３２】
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【０２４２】
【表１３−３３】
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【０２４３】
【表１３−３４】
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【０２４４】
【表１３−３５】
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【０２４５】
【表１３−３６】
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【０２４６】
【表１３−３７】
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【０２４７】
【表１３−３８】
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【０２４８】
【表１３−３９】
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【０２４９】
【表１３−４０】
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【０２５０】
【表１３−４１】
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【０２５１】
【表１３−４２】
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【０２５２】
【表１３−４３】
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【０２５３】
【表１３−４４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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