(57)【要約】Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性のある腫瘍を同定するためのバイオマーカーを提供する。また、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のある腫瘍および/または患者を同定するための方法も提供する。Wnt経路インヒビターに反応すると予測されるがんを有する患者を処置するための方法が提供される。2017501137.tif 000190
2017501137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、患者における乳がんを処置する方法：
(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるかどうかを同定する工程であって、Wnt経路インヒビターが、
2017501137.tif 000154
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000155
を含む重鎖CDR2、
2017501137.tif 000156
を含む重鎖CDR3、
2017501137.tif 000157
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000158
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000159
を含む軽鎖CDR3を含む、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する抗体であり、
該同定が、
(i)患者の乳がんの試料を得る工程；
(ii)該試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、該サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；および
(iii)該バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に反応する可能性がある患者を同定する工程
を含む、工程；ならびに
(b)処置に反応する可能性がある患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程。
【請求項２】
Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト乳房腫瘍を同定する方法であって、Wnt経路インヒビターが、
2017501137.tif 000160
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000161
を含む重鎖CDR2、
2017501137.tif 000162
を含む重鎖CDR3、
2017501137.tif 000163
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000164
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000165
を含む軽鎖CDR3を含む、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する抗体であり、
方法が、
(a)乳房腫瘍の試料を得る工程；
(b)該試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、該サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；および
(c)該バイオマーカーの発現レベルに基づき、該腫瘍を、処置に反応性または非反応性である可能性があるとして同定する工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
ヒト乳房腫瘍を、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する方法であって、Wnt経路インヒビターが、
2017501137.tif 000166
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000167
を含む重鎖CDR2、
2017501137.tif 000168
を含む重鎖CDR3、
2017501137.tif 000169
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000170
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000171
を含む軽鎖CDR3を含む、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する抗体であり、
方法が、
(a)乳房腫瘍の試料を得る工程；
(b)該試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、該サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；および
(c)該バイオマーカーの発現に基づき、該腫瘍を、処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する工程
を含む、前記方法。
【請求項４】
Wnt経路インヒビターによる処置に対するヒト乳房腫瘍の反応性を判定する方法であって、Wnt経路インヒビターが、
2017501137.tif 000172
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000173
を含む重鎖CDR2、
2017501137.tif 000174
を含む重鎖CDR3、
2017501137.tif 000175
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000176
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000177
を含む軽鎖CDR3を含む、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する抗体であり、
方法が、
(a)乳房腫瘍の試料を得る工程；
(b)該試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、該サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；および
(c)該バイオマーカーの発現に基づき処置に対する該腫瘍の反応性を判定する工程
を含む、前記方法。
【請求項５】
Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性のある、乳がんを有する患者を同定する方法であって、Wnt経路インヒビターが、
2017501137.tif 000178
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000179
を含む重鎖CDR2、
2017501137.tif 000180
を含む重鎖CDR3、
2017501137.tif 000181
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000182
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000183
を含む軽鎖CDR3を含む、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する抗体であり、
方法が、
(a)患者の乳房腫瘍の試料を得る工程；
(b)該試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、該サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；および
(c)該バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に反応する可能性のある患者を同定する工程
を含む、前記方法。
【請求項６】
Wnt経路インヒビターによる処置のための乳がんを有する患者を選択する方法であって、Wnt経路インヒビターが、
2017501137.tif 000184
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000185
を含む重鎖CDR2、
2017501137.tif 000186
を含む重鎖CDR3、
2017501137.tif 000187
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000188
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000189
を含む軽鎖CDR3を含む、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する抗体であり、
方法が、
(a)患者の乳房腫瘍の試料を得る工程；
(b)該試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、該バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；および
(c)該バイオマーカーの発現レベルに基づき処置のための患者を選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項７】
各バイオマーカーの発現が、PCRに基づくアッセイ、qPCRアッセイ、マイクロアレイ、またはRNA配列決定により測定される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の発現レベルが、SEQ ID NO:62〜79からなる群より選択されるポリヌクレオチドを用いて測定される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の発現レベルが、
(a) SEQ ID NO:62のフォワードプライマー、SEQ ID NO:63のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:64を含むプローブ；
(b) SEQ ID NO:65のフォワードプライマー、SEQ ID NO:66のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:67を含むプローブ；
(c) SEQ ID NO:68のフォワードプライマー、SEQ ID NO:69のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:70を含むプローブ；
(d) SEQ ID NO:71のフォワードプライマー、SEQ ID NO:72のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:73を含むプローブ；
(e) SEQ ID NO:74のフォワードプライマー、SEQ ID NO:75のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:76を含むプローブ；ならびに
(f) SEQ ID NO:77のフォワードプライマー、SEQ ID NO:78のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:79を含むプローブ
を用いて測定される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
Wnt経路インヒビターが、SEQ ID NO:7を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8を含む軽鎖可変領域を含む抗体である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Wnt経路インヒビターが、PTA-9541としてATCCに寄託したプラスミドによりコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗原結合部位を含む抗体フラグメントである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Wnt経路インヒビターが、抗体OMP-18R5である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
乳房腫瘍または乳がんがHER2陰性乳房腫瘍である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
乳房腫瘍または乳がんが、三種陰性乳がん(TNBC)腫瘍である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Wnt経路インヒビターによる処置が、1つまたは複数の追加の治療剤との併用である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
追加の治療剤が化学療法剤である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
追加の治療剤がパクリタキセルである、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
追加の治療剤がnab結合型パクリタキセル(ABRAXANE)である、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
試料が組織試料または腫瘍生検材料である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
試料がホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
乳房腫瘍試料または乳がん試料中のFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を検出するためのキットであって、SEQ ID NO:62〜79からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、前記キット。
【請求項２３】
(a) SEQ ID NO:62のフォワードプライマー、SEQ ID NO:63のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:64を含むプローブ；
(b) SEQ ID NO:65のフォワードプライマー、SEQ ID NO:66のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:67を含むプローブ；
(c) SEQ ID NO:68のフォワードプライマー、SEQ ID NO:69のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:70を含むプローブ；
(d) SEQ ID NO:71のフォワードプライマー、SEQ ID NO:72のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:73を含むプローブ；
(e) SEQ ID NO:74のフォワードプライマー、SEQ ID NO:75のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:76を含むプローブ；ならびに
(f) SEQ ID NO:77のフォワードプライマー、SEQ ID NO:78のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:79を含むプローブ
を含む、請求項22に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2013年12月2日に出願された米国仮出願第61/910,663号、および2014年4月4日に出願された米国仮出願第61/975,339号の優先権の恩典を主張し、ここで、前記仮出願のそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、がん処置の分野に関する。より具体的には、本発明は、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のある腫瘍を同定するための方法を提供する。加えて、本発明は、Wnt経路インヒビター単独または他の治療剤との併用のいずれかによる処置に反応する可能性がある、がんを有する患者を同定、選択および／または処置するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんは先進諸国における主な死亡原因の一つであり、米国だけで毎年約160万人の人々ががんと診断され、550,000人を超える人々が死亡している。全体として、3人に1人を上回る人々がその生涯のうちに何らかの形態のがんを発生させると見積もられる。がんには200を超える異なるタイプがあり、そのうちの4つ、すなわち乳がん、肺がん、結腸直腸がん、および前立腺がんが、米国における全新規症例のほとんど半分を占める（Siegel et al., 2012, CA: A Cancer J. for Clin., 62:10-29（非特許文献1））。
【０００４】
シグナル伝達経路は、通常、細胞外のシグナルを核へと接続することで、細胞の成長、分化、生存、および死を直接的または間接的に制御する遺伝子の発現につながる。しかしながら、多種多様ながんにおいて、シグナル伝達経路は調節異常を起こしており、腫瘍のイニシエーションおよび/または進行と関連づけることができる。ヒト腫瘍形成と関係があるとされているシグナル伝達経路には、Wnt経路、Ras-Raf-MEK-ERK経路すなわちMAPK経路、PI3K-AKT経路、CDKN2A/CDK4経路、Bcl-2/TP53経路、およびNOTCH経路が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０００５】
Wntシグナル伝達経路は、胚パターン形成、後胚期の組織維持、および幹細胞生物学のいくつかの決定的調節因子の一つである。より具体的には、Wntシグナル伝達は、細胞極性の生成および幹細胞集団による自己再生を含む細胞運命指定に、重要な役割を果たす。Wnt経路の無秩序な活性化は数多くのヒトがんと関連し、そのようなヒトがんでは、その活性化が細胞の発生運命を変化させうると考えられる。Wnt経路の活性化は腫瘍細胞を未分化状態に維持し、かつ/または無制御な増殖につながる可能性があると考えられている。こうして、正常な発生および組織修復を制御するホメオスタシス機構を凌駕することによって、発がんが進行しうる（Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50（非特許文献2）;Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-31（非特許文献3）で概説されている）。
【０００６】
Wntシグナル伝達経路は、最初は、ショウジョウバエ（Drosophila）発生ミュータントwingless（wg）において、およびマウスがん原遺伝子int-1（現在はWnt1）から解明された（Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109（非特許文献4）;Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39:233-40（非特許文献5）;Cabrera et al., 1987, Cell, 50:659-63（非特許文献6）;Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50:649-57（非特許文献7））。Wnt遺伝子は分泌性の脂質修飾糖タンパク質をコードし、19種類の異なるWntタンパク質が哺乳動物において同定されている。これらの分泌性リガンドは、Frizzled（FZD）受容体ファミリーメンバーと低密度リポタンパク質（LDL）受容体関連タンパク質5または6（LRP5/6）とからなる受容体複合体を活性化する。FZD受容体はGタンパク質共役受容体（GPCR）スーパーファミリーのメンバーであり、7回膜貫通ドメインおよび大きな細胞外N末端リガンド結合ドメインを含有する。N末端リガンド結合ドメインは10個の保存されたシステインを含有し、システインリッチドメイン（CRD）または「Friドメイン」として公知である。ヒトFZD受容体には、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10の10種類がある。異なるFZD CRDは特定のWntタンパク質に対して異なる結合親和性を有する（Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277:41762-9（非特許文献8））。加えて、FZD受容体は古典的β-カテニン経路を活性化するものと、非古典的経路を活性化するものとに分類されうる（Miller et al., 1999, Oncogene, 18:7860-72（非特許文献9））。
【０００７】
がんにおけるWntシグナル伝達の役割は、マウスウイルスの近傍挿入によって形質転換された乳房腫瘍において、Wnt1（元々はint1）ががん遺伝子として同定されたことで、初めて明らかになった（Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109（非特許文献4））。これらの初期の観察以来、乳がんにおけるWntシグナル伝達の役割についてのさらなる証拠が蓄積され続けている。例えば、トランスジェニックマウスの乳腺におけるβ-カテニンの過剰発現は過形成および腺癌をもたらし（Imbert et al., 2001, J. Cell Biol., 153:555-68（非特許文献10）;Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9（非特許文献11））、一方、Wntシグナル伝達の喪失は正常な乳腺発生を妨害する（Tepera et al., 2003, J. Cell Sci., 116:1137-49（非特許文献12）;Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8:145-58（非特許文献13））。ヒト乳がんでは、β-カテニン蓄積が、50％を超える癌腫において、Wntシグナル伝達の活性化を示し、特定の変異は同定されていないものの、Frizzled受容体発現の上方制御が観察されている（Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9:119-31（非特許文献14）;Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol, 25:1337-42（非特許文献15））。
【０００８】
Wnt経路の活性化は、結腸直腸がん、肺がん、膵がん、およびメラノーマとも関連する。全結腸直腸がんの約5〜10％が遺伝性であり、その主要ながん型の一つは家族性大腸腺腫症（FAP）である。FAPは、常染色体優性疾患であり、罹患個体の約80％は、大腸腺腫症（APC）遺伝子に生殖細胞系変異を含有している。変異は、アキシンおよびβ-カテニンを含む他のWnt経路構成要素でも同定されている。個々の腺腫は第2の不活性化アレルを含有する上皮細胞のクローン増殖物であり、多数のFAP腺腫がんは、癌遺伝子および/または腫瘍抑制遺伝子の付加的変異により、不可避的に腺癌の発生をもたらす。さらにまた、APCにおける機能喪失型変異およびβ-カテニンにおける安定化型変異を含む、Wntシグナル伝達経路の活性化は、マウスモデルにおいて過形成発生と腫瘍成長を誘発し得る（Oshima et al, 1997, Cancer Res., 57:1644-9（非特許文献16）;Harada et al., 1999, EMBO J., 18:5931-42（非特許文献17））。
【０００９】
よって、Wnt経路は、がんの治療および処置の標的として認められている。創薬および医薬品開発が、特に癌分野において進歩するにつれて、「汎用型薬剤(one drug fits all)」アプローチは、「個別化医療」戦略に移ってきている。個別化医療戦略には、予後マーカー、薬力学的マーカー、および予測マーカーを含む、がんバイオマーカーに基づく治療レジメンが含まれうる。一般に、予測バイオマーカーは、腫瘍またはがんが特定の治療剤に対して反応性であるまたは感受性である可能性を評価し、その薬剤の使用から利益を得る可能性が最も高い患者の同定および/または選択を可能にしうる。
【００１０】
本発明は、がんの処置におけるWnt経路インヒビターの使用に関連する予測バイオマーカーの同定を提供する。また、がんを有する患者および/または腫瘍を、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性があるとして同定、選択、および/または分類するために予測バイオマーカーを用いる方法も提供する。処置に反応性であると予測される患者をWntインヒビターにより処置するための方法も提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Siegel et al., 2012, CA: A Cancer J. for Clin., 62:10-29
【非特許文献２】Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50
【非特許文献３】Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-31
【非特許文献４】Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109
【非特許文献５】Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39:233-40
【非特許文献６】Cabrera et al., 1987, Cell, 50:659-63
【非特許文献７】Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50:649-57
【非特許文献８】Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277:41762-9
【非特許文献９】Miller et al., 1999, Oncogene, 18:7860-72
【非特許文献１０】Imbert et al., 2001, J. Cell Biol., 153:555-68
【非特許文献１１】Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9
【非特許文献１２】Tepera et al., 2003, J. Cell Sci., 116:1137-49
【非特許文献１３】Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8:145-58
【非特許文献１４】Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9:119-31
【非特許文献１５】Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol, 25:1337-42
【非特許文献１６】Oshima et al, 1997, Cancer Res., 57:1644-9
【非特許文献１７】Harada et al., 1999, EMBO J., 18:5931-42
【発明の概要】
【００１２】
Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性のある患者を同定するためのバイオマーカーが提供される。加えて、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のある腫瘍および/または患者を同定するための方法も提供される。さらに、Wnt経路インヒビターに反応性であると予測されるかまたはそのような可能性があるとして同定されている患者におけるがんをWnt経路インヒビターにより処置する方法も提供される。
【００１３】
一局面において、本発明は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CRBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーの発現レベルに基づいて、腫瘍を、処置に反応性または非反応性である可能性があるとして同定する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト腫瘍を同定する方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト腫瘍を同定する方法は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CRBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、ここで、正の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性であると予測されることを示し、かつ負の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに非反応性であると予測されることを示す。本明細書で用いられる「標準化された」および「正規化された」は、互換的に用いられうる。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト腫瘍を同定する工程を含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき、腫瘍を、処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する工程を含む、ヒト腫瘍をWnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する方法を提供する。いくつかの態様では、ヒト腫瘍をWnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する方法は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、ここで、正の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性であると予測されることを示し、かつ負の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに非反応性であると予測されることを示す。いくつかの態様では、方法は、ヒト腫瘍を、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する工程を含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが遺伝子FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に対する腫瘍の反応性を判定する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置に対するヒト腫瘍の反応性(または感受性)を判定する方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる処置に対するヒト腫瘍の反応性または感受性を判定する方法は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが遺伝子FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、ここで、正の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性または感受性であると予測されることを示す。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に対するヒト腫瘍の反応性または感受性を判定する工程を含む。
【００１６】
別の局面において、本発明は、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に反応する可能性のある患者を同定する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある、がんを有する患者を同定する方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある、がんを有する患者を同定する方法は、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、ここで、正の判定値は、患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応すると予測されることを示す。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある、がんを有する患者を同定する工程を含む。
【００１７】
別の局面において、本発明は、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置のための患者を選択する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置のためのがんを有する患者を選択する方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる処置のためのがんを有する患者を選択する方法は、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程；および(d)患者の腫瘍試料が正の判定値を有するときに、処置のために患者を選択する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置のためのがんを有する患者を選択する工程を含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は、以下の工程を含む、患者におけるがんを処置する方法を提供する：(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程；(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(iii)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に反応する可能性がある患者を同定する工程を含む、工程；ならびに(b)処置に反応する可能性のある患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程。いくつかの態様では、患者におけるがんを処置する方法は、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程；(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(iii)サイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む、工程；ならびに(b)処置に反応すると予測される患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に患者が反応する可能性があるかどうかを同定する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、Wnt経路インヒビターをパクリタキセルと組み合わせて患者に投与する工程を含む。
【００１９】
別の局面において、本発明は、有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む、患者においてがんを処置する方法であって、患者が、患者の腫瘍試料中のバイオマーカーサインの発現レベルに基づきWntインヒビターによる処置に反応すると予測され、サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、患者においてがんを処置する方法は、有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程であって、患者が、患者腫瘍試料中のバイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現の加重和から計算された正の判定値に基づき処置に反応すると予測され、バイオマーカーのセットが、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程を含む。いくつかの態様では、患者は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に反応すると予測される。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと組み合わせてWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある腫瘍を有するかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程；(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(iii)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に反応する可能性がある患者を同定する工程を含む、工程；ならびに(b)有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための方法は、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある腫瘍を有するかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程；(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(iii)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む、工程；ならびに(b)腫瘍が正の判定値を有する患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性のある腫瘍を患者が有するかどうかを同定する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと組み合わせてWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む。
【００２１】
別の局面において、本発明は、有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための方法であって、患者が、患者腫瘍試料中のバイオマーカーサインの発現レベルに基づきWntインヒビターによる処置に反応する可能性があるとして同定され、サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための方法は、有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含み、ここで、患者は、患者腫瘍試料中のバイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現の加重和から計算された正の判定値に基づき処置に反応する可能性があるとして同定され、バイオマーカーのセットは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、患者は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるとして同定される。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと組み合わせてWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む。
【００２２】
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および/または態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、DKK1、EP300、およびCTBP1の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、DKK1、EP300、CTBP1、WNT6、WNT3、FZD2、APC、TLE2、DVL2、PITX2、WISP1、GSK3B、WNT9A、FZD7、およびLEF1の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数、および表2からの少なくとも1つの追加的バイオマーカーを含む。
【００２３】
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および/または態様では、Wnt経路インヒビターは抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターは、少なくとも1つのFrizzled(FZD)タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターは、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される少なくとも1つのFZDタンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターは、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される少なくとも1つのFZDタンパク質に特異的に結合する抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターは、(a)
2017501137.tif 000003
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000004
を含む重鎖CDR2、および
2017501137.tif 000005
を含む重鎖CDR3、ならびに(b)
2017501137.tif 000006
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000007
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000008
を含む軽鎖CDR3を含む抗体である。
【００２４】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターは、SEQ ID NO:7を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8を含む軽鎖可変領域を含む抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターは、PTA-9541としてATCCに寄託したプラスミドによりコードされる重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターは、PTA-9541としてATCCに寄託したプラスミドによりコードされる重鎖および軽鎖を含む抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターは抗体OMP-18R5である。
【００２５】
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および/または態様では、Wnt経路インヒビターは可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターはFZD受容体タンパク質の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターはFZDタンパク質のFriドメインを含む。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターはFZD8のFriドメインを含む。一定の態様では、Wnt経路インヒビターは、FZD8のFriドメインおよびヒトFcドメインを含む。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターは可溶性受容体OMP-54F28である。
【００２６】
いくつかの態様では、腫瘍は、乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、神経膠腫、胃腸腫瘍、腎腫瘍(renal tumor)、卵巣腫瘍、肝腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜腫瘍、腎臓腫瘍(kidney tumor)、前立腺腫瘍、甲状腺腫瘍、神経芽細胞腫、膵腫瘍、多形性神経膠芽腫、子宮頸部腫瘍、胃腫瘍、膀胱腫瘍、ヘパトーマ、メラノーマ、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される。いくつかの態様では、腫瘍は乳房腫瘍である。
【００２７】
いくつかの態様では、がんは、乳がん、肺がん、結腸がん、神経膠腫、胃腸がん、腎がん（renal cancer）、卵巣がん、肝がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（kidney cancer）、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、多形性神経膠芽腫、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、ヘパトーマ、メラノーマ、および頭頚部がんからなる群より選択される。いくつかの態様では、がんは乳がんである。
【００２８】
いくつかの態様では、方法は、第2の治療剤を患者に投与する工程をさらに含む。いくつかの態様では、第2の治療剤は化学療法剤である。いくつかの態様では、第2の治療剤はパクリタキセルである。
【００２９】
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および/または態様では、試料には、腫瘍生検材料、コア生検組織試料、細針吸引液、毛包、または例えば血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、嚢胞液、もしくは尿などの体液の試料など、任意の臨床的に関連する組織試料が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、試料は腫瘍またはがんを有する患者から採取される。いくつかの態様では、試料は原発腫瘍である。いくつかの態様では、試料は転移がんである。いくつかの態様では、試料は組織試料である。いくつかの態様では、試料は腫瘍試料である。いくつかの態様では、試料は新鮮凍結(FF)組織試料である。いくつかの態様では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料である。いくつかの態様では、試料は全血、血漿、または血清である。いくつかの態様では、試料は細胞である。いくつかの態様では、試料は循環腫瘍細胞(CTC)である。
【００３０】
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および/または態様では、バイオマーカーの発現レベルは、これらに限定されるわけではないが、逆転写PCR(RT-PCR)、定量的RT-PCR(qPCR)、TaqMan(商標)、またはTaqMan(商標)低密度アレイ(TLDA)など、PCRに基づく方法を用いて決定される。いくつかの態様では、バイオマーカーの発現レベルは、マイクロアレイを用いて決定される。
【００３１】
前述した各局面の一定の態様、ならびに本明細書の他の項で記載する他の局面および/または態様では、各バイオマーカーの標準化された発現は、各バイオマーカーについて発現レベルを測定すること、および対応する加重値をそれに乗ずることにより決定され、ここで、各バイオマーカーの加重値はバイオマーカー発現により決定される。一定の態様では、判定値は、式：0.4560427*FBXW2 + 0.3378467*CCND2 - 0.4809354*RHOU + 0.409029*CTBP2 + 0.3291529*WIF1 + 0.2926374*DKK1 + 0.04662682に従って計算される。
【００３２】
いくつかの態様では、バイオマーカーの発現レベルは、PCRに基づくアッセイにより測定または決定される。いくつかの態様では、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の発現レベルが、SEQ ID NO:62〜79からなる群より選択されるポリヌクレオチドを用いて測定される。いくつかの態様では、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の発現レベルは、(a) SEQ ID NO:62のフォワードプライマー、SEQ ID NO:63のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:64を含むプローブ；(b) SEQ ID NO:65のフォワードプライマー、SEQ ID NO:66のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:67を含むプローブ；(c) SEQ ID NO:68のフォワードプライマー、SEQ ID NO:69のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:70を含むプローブ；(d) SEQ ID NO:71のフォワードプライマー、SEQ ID NO:72のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:73を含むプローブ；(e) SEQ ID NO:74のフォワードプライマー、SEQ ID NO:75のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:76を含むプローブ；ならびに(f) SEQ ID NO:77のフォワードプライマー、SEQ ID NO:78のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:79を含むプローブを用いて測定される。
【００３３】
いくつかの態様では、バイオマーカーの発現レベルは、多重分析物プロファイル検査、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ウェスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫測定法、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイにより測定または決定される。アッセイが抗体を用いるいくつかの態様では、抗体は検出可能に標識される。いくつかの態様では、標識は、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素標識、放射標識、アビジン/ビオチン標識、コロイド金粒子、着色粒子、および磁性粒子からなる群より選択される。
【００３４】
本発明はまた、本発明の少なくとも1つのバイオマーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも1つの試薬を含有する容器を含むキットも提供する。一定の態様では、試薬は、本発明のバイオマーカーに結合する抗体または核酸プローブである。
【００３５】
いくつかの態様では、キットは、SEQ ID NO:62〜79からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、キットは、(a) SEQ ID NO:62のフォワードプライマー、SEQ ID NO:63のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:64を含むプローブ；(b) SEQ ID NO:65のフォワードプライマー、SEQ ID NO:66のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:67を含むプローブ；(c) SEQ ID NO:68のフォワードプライマー、SEQ ID NO:69のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:70を含むプローブ；(d) SEQ ID NO:71のフォワードプライマー、SEQ ID NO:72のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:73を含むプローブ；(e) SEQ ID NO:74のフォワードプライマー、SEQ ID NO:75のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:76を含むプローブ；ならびに(f) SEQ ID NO:77のフォワードプライマー、SEQ ID NO:78のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:79を含むプローブを含む。
【００３６】
本発明の局面または態様が、マーカッシュ群または他の選択肢の群の形で記載されている場合、本発明は、列挙された群全体をまとめて包含するだけではなく、その群の各メンバーも個別に包含し、主群の考えうる部分群も全て包含し、群のメンバーの1つまたは複数を欠く主群も包含する。本発明は、請求項に係る発明における群メンバーのいずれかの1つまたは複数の明示的な排除も、想定している。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】反応性または非反応性乳房腫瘍の分類。乳房腫瘍OMP-B34細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図１Ｂ】反応性または非反応性乳房腫瘍の分類。乳房腫瘍OMP-B39細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図１Ｃ】反応性または非反応性乳房腫瘍の分類。乳房腫瘍OMP-B44細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図１Ｄ】反応性または非反応性乳房腫瘍の分類。乳房腫瘍OMP-B59細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図１Ｅ】反応性または非反応性乳房腫瘍の分類。乳房腫瘍OMP-B60細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図１Ｆ】反応性または非反応性乳房腫瘍の分類。乳房腫瘍UM-T01細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図１Ｇ】反応性または非反応性乳房腫瘍の分類。乳房腫瘍UM-T03細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図１Ｈ】反応性または非反応性乳房腫瘍の分類。乳房腫瘍UM-PE13細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図２】上位20位の遺伝子の性能曲線。
【図３】6種類の選択遺伝子のPCAプロット。
【図４】6遺伝子バイオマーカーサインと腫瘍体積の比率との相関。
【図５】分類確率分析に基づく腫瘍反応性の予測。T＝6遺伝子サインの確立のための訓練セットで用いた腫瘍。
【図６Ａ】予測バイオマーカーのインビボでの検証。乳房腫瘍OMP-B29細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図６Ｂ】予測バイオマーカーのインビボでの検証。乳房腫瘍OMP-B71細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図６Ｃ】予測バイオマーカーのインビボでの検証。乳房腫瘍OMP-B84細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図６Ｄ】予測バイオマーカーのインビボでの検証。乳房腫瘍OMP-B90細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図６Ｅ】予測バイオマーカーのインビボでの検証。乳房腫瘍UM-T02細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図６Ｆ】予測バイオマーカーのインビボでの検証。乳房腫瘍UM-T06細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注射した。マウスを、OMP-18R5抗体(-■-)、タキソール(-▲-)、OMP-18R5およびタキソールの併用(-▼-)、または対照抗体(-●-)で処置した。データを処置後の日数に対する腫瘍体積(mm3)として示す。
【図７】3種類の公的データベースを用いる6遺伝子バイオマーカーサインの集団保有率推定。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
I. 定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および表現を以下に定義する。
【００３９】
本明細書において使用する「バイオマーカー」という用語には、核酸およびタンパク質、ならびにその変異体およびフラグメントが含まれうるが、それらに限定されるわけではない。バイオマーカーには、バイオマーカーをコードする核酸配列の全体もしくは一部、またはそのような配列の相補体を含むDNAが含まれうる。本発明で有用なバイオマーカー核酸には、関心対象の任意の核酸配列の全体もしくは一部の配列を含むDNAおよびRNAの両方が含まれると見なされる。バイオマーカータンパク質は、任意のバイオマーカータンパク質またはポリペプチドの全体または一部のアミノ酸配列を含むと見なされる。
【００４０】
本明細書において使用する「抗体」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、または前述の組み合わせなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原結合部位によって認識し、それらに特異的に結合する、免疫グロブリン分子を指す。本明細書において使用する場合、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント（例えばFab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント）、一本鎖Fv（scFv）抗体、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質、およびその抗体が所望の生物学的活性を呈する限り、抗原結合部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの独自性に基づく5つの主要な免疫グロブリンクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）のいずれであってもよい。クラスが異なる免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造と三次元配置を有する。抗体はそのままでもよいし、限定するわけではないが、毒素や放射性同位体を含む他の分子にコンジュゲートされていてもよい。
【００４１】
「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体の一部分を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント、線状抗体（linear antibody）、一本鎖抗体、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本明細書において使用する「抗体フラグメント」は、少なくとも1つの抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。
【００４２】
抗体の「可変領域」という用語は、単独の、または組み合わされた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖または軽鎖の可変領域は一般に、「超可変領域」としても知られる3つの相補性決定領域（CDR）によって接続された4つのフレームワーク領域（FR）からなる。各鎖中のCDRはフレームワーク領域によって近接した状態にまとめられており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するための技法は少なくとも2つある：（1）異種間の配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al., 1991「Sequences of Proteins of Immunological Interest」5th Edition, National Institutes of Health、メリーランド州ベセスダ）および（2）抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948）。加えて、当技術分野では、これら2つのアプローチの組み合わせを使って、CDRが決定される場合もある。
【００４３】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、単一の抗原決定基またはエピトープの著しく特異的な認識および結合に関わる均一な抗体集団を指す。これは、典型的にはさまざまな異なる抗原決定基に対する異なる抗体の混合物を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体と完全長モノクローナル抗体の両者、ならびに抗体フラグメント（例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv）、一本鎖（scFv）抗体、抗体の一部分を含む融合タンパク質、および抗原結合部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらにまた、「モノクローナル抗体」は、限定するわけではないが、ハイブリドーマ生産、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物を含む、いくつもある技法によって作られた抗体を指す。
【００４４】
本明細書において使用する「ヒト化抗体」という用語は、最小限の非ヒト配列を含有する特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはそのフラグメントである抗体を指す。ヒト化抗体を作製するために用いられる方法は当技術分野において周知である。
【００４５】
本明細書において使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって生産される抗体、またはヒトによって生産される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体は、当技術分野において公知の技法のどれを使って作ってもよい。
【００４６】
本明細書において使用する「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の可変領域が、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する1つの哺乳動物種（例えばマウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、別の種（通常はヒト）に由来する抗体からの配列に対応する。
【００４７】
本明細書において使用する「親和性成熟抗体」という用語は、その抗体の1つまたは複数のCDR中に、改変を持たない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす1つまたは複数の改変を有する抗体を指す。この定義には、CDR残基の改変と一緒になされた非CDR残基中の改変も含まれる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルの親和性、さらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野において公知の手法により生産される。例えば、技法には、VHドメインおよびVLドメインシャフリング、CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダム変異導入法、ならびに部位指定変異導入法による親和性成熟が含まれてもよい。
【００４８】
「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は本明細書では互換的に使用され、特定の抗体によって認識され特異的に結合される能力を有する抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続するアミノ酸からも、タンパク質の三次フォールディングによって並置される不連続なアミノ酸からも形成されうる。連続するアミノ酸から形成されるエピトープ（線状エピトープともいう）は、典型的には、タンパク質変性時に保たれるのに対し、三次フォールディングによって形成されるエピトープ（コンフォメーショナルエピトープともいう）は、典型的には、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間的コンフォメーションにある少なくとも3個のアミノ酸、より通常は少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を含む。
【００４９】
「選択的に結合する」または「特異的に結合する」という用語は、結合作用物質または抗体が、エピトープ、タンパク質、または標的分子に、無関係なタンパク質または関連するタンパク質を含む代替物質よりも、より高い頻度で、より迅速に、より長い持続時間にわたって、より強い親和性で、または前記の何らかの組合せで、反応し、または会合することを意味する。一定の態様では、「特異的に結合する」は、例えば抗体がタンパク質に、約0.1 mM以下、より通常は約1 μM未満のKDで結合することを意味する。一定の態様において、「特異的に結合する」は、抗体が、ある時は少なくとも約0.1 μM以下のKDで、またある時は少なくとも約0.01 μM以下のKDで、そしてまたある時は少なくとも約1 nM以下のKDで標的に結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間の配列同一性ゆえに、特異的結合は、2つ以上の種のタンパク質（例えばヒトFZDとマウスFZD）を認識する抗体を包含することができる。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列の一定領域内の相同性ゆえに、特異的結合は、2種以上のタンパク質(例えばヒトFZD1とヒトFZD7)を認識する抗体（または他のポリペプチドもしくは結合作用物質）を包含することができる。一定の態様では、第1の標的に特異的に結合する抗体または結合作用物質は、第2の標的に特異的に結合する場合も、特異的には結合しない場合もありうると理解される。したがって「特異的結合」は、排他的結合、すなわち単一標的への結合を（包含することはできるものの）必ずしもを必要とはしない。したがって、結合作用物質は、一定の態様では、2つ以上の標的に特異的に結合しうる。一定の態様では、複数の標的が、作用物質または抗体上の同じ結合部位によって結合されうる。例えば、抗体は、ある例では、それぞれが2種以上のタンパク質上の同じエピトープに特異的に結合する2つの同一抗原結合部位を含みうる。一定の代替的な態様では、抗体は二重特異性または多重特異性であって、特異性が異なる少なくとも2つの抗原結合部位を含みうる。非限定的な例として、二重特異性作用物質は、あるタンパク質(例えばヒトFZD)上の標的を認識する1つの結合部位を含み、さらに第2のタンパク質(例えばヒトWNTタンパク質)上の異なる標的を認識する第2の異なる結合部位を含みうる。一般的には、結合への言及は特異的結合を意味するが、必ずしもそうとは限らない。
【００５０】
「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは線状でも分岐していてもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸で中断されていてもよい。これらの用語は、天然に修飾された、または介入によって、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションなどによって、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。この定義には、例えば1つまたは複数のアミノ酸類似体（例えば非天然アミノ酸など）ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも包含される。本発明のポリペプチドは抗体に基づきうるので、一定の態様では、ポリペプチドは一本鎖として存在するか、または会合した鎖（例えば二量体）として存在しうると理解される。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを包含する。ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは修飾塩基、および/またはそれらの類似体、またはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼによって組み込まれうる任意の基質であることができる。
【００５２】
「高ストリンジェンシーの条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、15 mM塩化ナトリウム/1.5 mMクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを50℃で利用する；(2)ハイブリダイゼーション時に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、50％(v/v)ホルムアミドを、pH6.5の0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％ポリビニルピロリドン/50 mMリン酸ナトリウムバッファーと一緒に5×SSC(0.75M NaCl、75 mMクエン酸ナトリウム)中で42℃にて利用する；または(3)ハイブリダイゼーション時に、50％ホルムアミドを、5×SSC、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、超音波処理サケ精子DNA(50 μg/ml)、0.1％SDS、および10％デキストラン硫酸中で42℃にて利用し、0.2×SSCおよび50％ホルムアミド中で42℃にて洗浄し、続いて55℃にてEDTAを含有する0.1×SSCからなる洗浄を行う条件により特定されうる。
【００５３】
2つ以上の核酸またはポリペプチドに関して「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、比較して、どの保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部とみなさずに一致度が最大になるように（必要であればギャップを導入して）整列させた時に、同じであるか、または指定したパーセンテージの同じヌクレオチド残基もしくはアミノ酸残基を有する、2つ以上の配列または部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較用のソフトウェアまたはアルゴリズムによって、または目視検査によって測定することができる。当技術分野では、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができるさまざまなアルゴリズムおよびソフトウェアがよく知られている。これらには、BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package、およびそのバリエーションなどがあるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、本発明の2つの核酸またはポリペプチドが実質的に同一である。すなわち、それらは、比較して、配列比較アルゴリズムを使った測定で、または目視検査による測定で、一致度が最大になるように整列させた時に、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、またいくつかの態様では、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％のヌクレオチド残基同一性またはアミノ酸残基同一性を有する。いくつかの態様では、同一性が、当該配列のうち、少なくとも約10残基長、少なくとも約20残基長、少なくとも約40〜60残基長、少なくとも約60〜80残基長、またはそれらの間の任意の整数値である領域にわたって存在する。いくつかの態様では、同一性が、60〜80残基より長い領域、例えば少なくとも約80〜100残基の領域にわたって存在し、いくつかの態様では、比較されている配列、例えばヌクレオチド配列のコード領域の全長にわたって、配列が実質的に同一である。
【００５４】
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基を、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えるものである。当技術分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されており、これには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ-分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。例えば、フェニルアラニンによるチロシンの置換は保存的置換である。好ましくは、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の、当該ポリペプチドまたは抗体が結合する抗原への結合を、抑止しない。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野では周知である。
【００５５】
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、宿主細胞に、1つまたは複数の関心対象の遺伝子または配列を送達し、通常は、それを発現させる能力を有する、コンストラクトを意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性凝集剤と会合したDNAまたはRNA発現ベクター、およびリポソームに封入されたDNAまたはRNA発現ベクターなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００５６】
本明細書において使用する「可溶性受容体」という用語は、細胞から可溶型で分泌されうる、受容体の第1膜貫通ドメインの前にある受容体タンパク質の細胞外ドメイン(またはそのフラグメント)を指す。一般に、これは受容体タンパク質のN末端部分である。
【００５７】
本明細書において使用する「FZD可溶性受容体」または「可溶性FZD受容体」という用語は、可溶型で細胞から分泌されうる、受容体の第1膜貫通ドメインの前にあるFZD受容体タンパク質のN末端細胞外フラグメントを指す。この用語には、N末端細胞外ドメイン（ECD）全体を含むFZD可溶性受容体も、それより小さいフラグメントも包含される。したがって、FZD Friドメインを含むFZD可溶性受容体も、この用語に含まれる。
【００５８】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物とは、自然には見いだされない形態にあるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、それらがもはや自然に見いだされる形態にはない程度にまで精製されたものが含まれる。いくつかの態様では、単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
【００５９】
本明細書において使用する「実質的に純粋」という用語は、少なくとも50％純粋（すなわち不純物を含まない）、少なくとも90％純粋、少なくとも95％純粋、少なくとも98％純粋、または少なくとも99％純粋である材料を指す。
【００６０】
本明細書において使用する「がん」および「がん性」という用語は、細胞の集団が無秩序な細胞成長を特徴とするような哺乳動物における生理的状態を指すか、そのような生理的状態を記述している。がんの例には、癌腫、芽細胞腫、肉腫、ならびにリンパ腫および白血病などの血液がんなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００６１】
本明細書において使用する「腫瘍」および「新生物」という用語は、良性（非がん性）であれ、前がん病巣を含む悪性（がん性）であれ、過剰な細胞成長または細胞増殖がもたらす任意の組織塊を指す。
【００６２】
本明細書において使用する「転移」という用語は、がんが元の部位から身体の別の領域に伝播または移行して、類似するがん性病巣を新しい場所に発生させる過程を指す。「転移」細胞または「転移性」細胞は、近隣細胞との付着接触を失って疾患の原発部位から（例えば血流またはリンパによって）移動することで、二次部位に侵入するものである。
【００６３】
「がん幹細胞」および「CSC」および「腫瘍幹細胞」および「腫瘍始原細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用され、（1）高い増殖能を有し、（2）非対称細胞分裂を起こして増殖能または発生能が低減しているおよび/または制限されている1タイプまたは複数タイプの分化型細胞子孫を生成させる能力を有し、（3）自己再生または自己維持のために対称細胞分裂を起こす能力を有する、がんまたは腫瘍からの細胞を指す。これらの性質は、免疫不全宿主（例えばマウス）への累代移植時に、腫瘍を形成しえない腫瘍細胞の大部分と比べて、腫瘍またはがんを形成または確立する能力を、がん幹細胞に付与する。がん幹細胞は、自己再生と分化とを無秩序に起こすことで、変異が発生するにつれて経時的に変化しうる異常細胞タイプを伴う腫瘍を形成する。
【００６４】
「がん細胞」および「腫瘍細胞」という用語は、がんまたは腫瘍または前がん病巣に由来する細胞の全集団を指し、がん細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成性細胞と、腫瘍形成性幹細胞（がん幹細胞）の両方を包含する。本明細書において使用する「がん細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、それらの腫瘍細胞をがん幹細胞とは区別するために、再生し分化する能力を欠く細胞をもっぱら指す場合には、「非腫瘍形成性」という用語で修飾される。
【００６５】
本明細書において使用する「腫瘍形成性」という用語は、自己再生（新たな腫瘍形成性がん幹細胞を生じさせる）性質と、増殖によって他の全ての腫瘍細胞を生成する（分化した、したがって非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じさせる）性質とを含む、がん幹細胞の機能的特色を指す。
【００６６】
本明細書において使用する「腫瘍形成性」という用語は、免疫不全宿主（例えばマウス）への累代移植時に触知可能な腫瘍を形成するという、腫瘍からのランダムな細胞試料が持つ能力を指す。この定義は、免疫不全宿主（例えばマウス）への累代移植時に触知可能な腫瘍を形成する濃縮および/または単離されたがん幹細胞の集団も包含する。
【００６７】
「患者」という用語は、ある特定処置の受容者となる任意の動物（例えば哺乳動物）を指し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類動物などを含むが、それらに限定されるわけではない。典型的には、「患者」および「対象」という用語は、ヒト患者に関して、本明細書では互換的に使用される。
【００６８】
「薬学的に許容される」という用語は、ヒトを含む動物における使用について、連邦政府または州政府の規制当局によって承認された（または承認されうる）製品もしくは化合物、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に掲載されている製品もしくは化合物を指す。
【００６９】
「薬学的に許容される賦形剤、担体またはアジュバント」または「許容される医薬担体」という用語は、少なくとも1つの本開示の作用物質（例えば抗体）と一緒に対象に投与することができ、作用物質の活性を破壊しない、賦形剤、担体またはアジュバントを指す。賦形剤、担体、またはアジュバントは、治療効果を送達するのに十分な用量で作用物質を投与した時に、非毒性であるべきである。
【００７０】
「有効量」または「治療有効量」または「治療効果」という用語は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」のに有効な結合作用物質、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機小分子、または他の薬物の量を指す。がんの場合、薬物（例えば抗体）の治療有効量は、治療効果を有し、したがって、がん細胞の数を低減し、腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、または腫瘍形成能を減少させ、がん幹細胞の数または頻度を低減し、腫瘍サイズを低減し、がん細胞集団を低減し、周辺臓器へのがん細胞の浸潤、例えば軟組織または骨へのがんの伝播を阻害および/または停止し、腫瘍細胞またはがん細胞の転移を阻害および/または停止し、腫瘍細胞またはがん細胞の成長を阻害および/または停止し、がんに関連する症状の1つまたは複数をある程度除去し、罹病率および死亡率を低減し、生活の質を改善することができるか、またはそれらの効果の組み合わせをもたらすことができる。作用物質、例えば抗体が、成長を防止し、かつ/または既存のがん細胞を殺す限りにおいて、それを、細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性と呼ぶことができる。
【００７１】
「処置する」または「処置」または「処置すること」または「軽減する」または「軽減すること」という用語は、1）診断された病的状態または障害を治し、減退させ、その症状を減らし、かつ/またはその進行を停止させる治療的手段と、2）標的とする病的状態または障害の発生を防止し、または遅らせる予防的または防止的手段との両方を指す。したがって、処置を必要とする者には、既に障害と診断された者、障害を患いやすい者、および障害を防止すべき者が含まれる。いくつかの態様では、患者が以下に挙げる効果の1つまたは複数を示すのであれば、その対象は本発明の方法によってうまく「処置され」ている:がん細胞の数の低減および/またはがん細胞の完全な欠如;腫瘍サイズの低減;腫瘍成長の阻害;軟組織および骨へのがん細胞の伝播を含む周辺臓器へのがん細胞浸潤の阻害および/または欠如;腫瘍細胞またはがん細胞の転移の阻害および/または欠如;がん成長の阻害および/または欠如;その具体的ながんに関連する1つまたは複数の症状の除去;罹病率および死亡率の低減;生活の質の改善;腫瘍形成性の低減;がん幹細胞の数または頻度の低減;またはそのような効果の何らかの組み合わせ。
【００７２】
本開示および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、複数形を包含する。
【００７３】
本明細書において「を含む（comprising）」という言葉を使って態様が説明されている場合は常に、「からなる（consisting of）」および/または「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語で説明される、それ以外の点では類似する態様も提供されると理解される。また、本明細書において「から本質的になる」という言葉を使って態様が説明されている場合は常に、「からなる」という用語で説明される、それ以外の点では類似する態様も提供されると理解される。
【００７４】
本明細書において「Aおよび/またはB」などの表現で使用される「および/または」という用語は、AとBの両方、AまたはB、A（のみ）、およびB（のみ）を包含するものとする。同様に、「A、B、および/またはC」などの表現で使用される「および/または」という用語も、以下の態様のそれぞれを包含するものとする:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A（のみ）;B（のみ）;およびC（のみ）。
【００７５】
II. 予測バイオマーカーの使用方法
本明細書において、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性(「感受性」)または非反応性(「抵抗性」)である可能性のある、がんを有する患者および/または腫瘍を同定、分類、および/または選択するための方法が提供される。加えて、Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性のある、処置に反応することが予測される、および/または処置に反応すると同定されている、がんを有する患者を処置するための方法が提供される。
【００７６】
本明細書において、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CRBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき、腫瘍を、処置に反応性または非反応性である可能性があるとして同定する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト腫瘍を同定する方法が提供される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト腫瘍を同定する方法は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CRBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、ここで、正の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性であると予測されることを示し、かつ負の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに非反応性であると予測されることを示す。
【００７７】
本明細書において、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき、腫瘍を、処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する工程を含む、ヒト腫瘍を、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する方法が提供される。いくつかの態様では、ヒト腫瘍を、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類する方法は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、ここで、正の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性であると予測されることを示し、かつ負の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに非反応性であると予測されることを示す。
【００７８】
本明細書において、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが遺伝子FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に対する腫瘍の反応性を判定する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置に対するヒト腫瘍の反応性(または感受性)を判定する方法が提供される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる処置に対するヒト腫瘍の反応性または感受性を判定する方法は、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが遺伝子FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、ここで、正の判定値は、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性であると予測されることを示す。
【００７９】
本明細書において、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に反応する可能性のある患者を同定する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるがんを有する患者を同定する方法が提供される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある、がんを有する患者を同定する方法は、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、ここで、正の判定値は、患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応すると予測されることを示す。いくつかの態様では、方法は、患者の腫瘍試料が正の判定値を有するときに処置のために患者を選択する工程をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、治療的有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程をさらに含む。
【００８０】
本明細書において、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；(c)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置のための患者を選択する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置のためのがんを有する患者を選択する方法が提供される。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる処置のためのがんを有する患者を選択する方法は、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程；および(d)患者の腫瘍試料が正の判定値を有するときに、処置のために患者を選択する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、治療的有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程をさらに含む。
【００８１】
本明細書において、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程；(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(iii)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に反応する可能性がある患者を同定する工程を含む、工程；ならびに(b)処置に反応する可能性のある患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含む、患者におけるがんを処置する方法が提供される。いくつかの態様では、患者におけるがんを処置する方法は、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程；(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(iii)サイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む、工程；ならびに(b)処置に反応すると予測される患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含む。
【００８２】
別の局面において、本発明は、有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む、患者においてがんを処置する方法であって、患者が、患者の腫瘍試料中のバイオマーカーサインの発現レベルに基づき、Wntインヒビターによる処置に反応性を有すると予測され、サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、患者においてがんを処置する方法は、有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含み、ここで、患者は、患者の腫瘍試料中のバイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現の加重和から計算された正の判定値に基づき、処置に反応すると予測され、バイオマーカーのセットは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む。
【００８３】
本明細書において、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある腫瘍を有するかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程；(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(iii)バイオマーカーの発現レベルに基づき処置に反応する可能性がある患者を同定する工程を含む、工程；ならびに(b)有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための方法は、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある腫瘍を有するかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程；(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(iii)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む、工程；ならびに(b)腫瘍が正の判定値を有する患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含む。
【００８４】
別の局面において、本発明は、有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための方法であって、患者が、患者腫瘍試料中のバイオマーカーサインの発現レベルに基づき、Wntインヒビターによる処置に反応する可能性があるとして同定され、サインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための方法は、有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含み、ここで、患者は、患者腫瘍試料中のバイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現の加重和から計算された正の判定値に基づき、処置に反応する可能性があるとして同定され、バイオマーカーのセットは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、患者は、パクリタキセルと併用したWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるとして同定される。いくつかの態様では、方法は、パクリタキセルと組み合わせてWnt経路インヒビターを患者に投与する工程を含む。
【００８５】
本明細書において、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CRBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、正の判定値が、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性であると予測されることを示し、かつ負の判定値が、腫瘍がWnt経路インヒビターに非反応性であると予測されることを示す、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト腫瘍を同定するための使用が提供される。
【００８６】
本明細書において、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき、判定値を計算する工程を含み、正の判定値が、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性であると予測されることを示し、かつ負の判定値が、腫瘍がWnt経路インヒビターに非反応性であると予測されることを示す、ヒト腫瘍を、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または非反応性である可能性があるとして分類するための使用が提供される。
【００８７】
本明細書において、(a)ヒト腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが遺伝子FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき、判定値を計算する工程を含み、正の判定値が、腫瘍がWnt経路インヒビターに反応性であると予測されることを示す、Wnt経路インヒビターによる処置に対するヒト腫瘍の感受性を判定するための使用が提供される。
【００８８】
本明細書において、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程を含み、正の判定値が、患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応すると予測されることを示す、Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある、がんを有する患者を同定するための使用が提供される。いくつかの態様では、使用は、患者の腫瘍試料が正の判定値を有するときに処置のために患者を選択する工程をさらに含む。いくつかの態様では、使用は、治療的有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程をさらに含む。
【００８９】
本明細書において、(a)患者の腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程；および(d)患者の腫瘍試料が正の判定値を有するときに処置のために患者を選択する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる処置のためのがんを有する患者を選択するための使用が提供される。いくつかの態様では、使用は、治療的有効量のWnt経路インヒビターを患者に投与する工程をさらに含む。
【００９０】
本明細書において、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があるかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程、(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程、および(iii)サイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む、工程；ならびに(b)処置に反応すると予測される患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含む、患者におけるがんの処置における使用のためのWnt経路インヒビターが提供される。
【００９１】
本明細書において、(a)患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性がある腫瘍を有するかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者のがんの試料を得る工程、(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程、および(iii)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む、工程；ならびに(b)腫瘍が正の判定値を有する患者に有効量のWnt経路インヒビターを投与する工程を含む、Wnt経路インヒビターによる有効な処置の可能性を増大させるための使用が提供される。
【００９２】
本明細書において、Wnt経路インヒビターによる処置に反応する可能性があると同定された患者におけるがんの処置における使用のためのWnt経路インヒビターであって、患者の同定が、(i)患者から得られたがん試料におけるバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインが、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(ii)サイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む、Wnt経路インヒビターが提供される。
【００９３】
本明細書において、患者におけるがんの処置において使用するためのWnt経路インヒビターであって、患者が、患者のがん試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの標準化された発現に基づき、正の判定値が計算される患者であり、バイオマーカーサインが、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む、Wnt経路インヒビターが提供される。
【００９４】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1のうち2つ以上を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1のうち3つ以上を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1のうち4つ以上を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1のうち5つ以上を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1からなる。
【００９５】
いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の少なくとも1つに加えて、1つまたは複数の追加のバイオマーカーを含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の少なくとも1つに加えて、表2に挙げる遺伝子から選択される1つまたは複数の追加のバイオマーカーを含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の少なくとも1つに加えて、バイオマーカーEP300、CTBP1、WNT6、WNT9A、SNT3、FZD2、FZD7、APC、TLE2、DVL2、PITX2、WISP1、GSK3B、およびLEF1の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、DKK1、EP300、およびCTBP1の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、バイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、DKK1、EP300、CTBP1、WNT6、WNT3、FZD2、APC、TLE2、DVL2、PITX2、WISP1、GSK3B、WNT9A、FZD7、およびLEF1の1つまたは複数を含む。
【００９６】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはRHOUを含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCTBP2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはWIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはDKK1を含む。
【００９７】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2およびCCND2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2およびRHOUを含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2およびCTBP2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2およびWIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2およびDKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2およびRHOUを含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2およびCTBP2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2およびWIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2およびDKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはRHOUおよびCTBP2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはRHOUおよびWIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはRHOUおよびDKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCTBP2およびWIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCTBP2およびDKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはWIF1およびDKK1を含む。
【００９８】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、および RHOUを含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、および CTBP2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、RHOU、および CTBP2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、RHOU、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、RHOU、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CTBP2、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CTBP2、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、RHOU、および CTBP2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、RHOU、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、RHOU、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、CTBP2、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、CTBP2、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはRHOU、CTBP2、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはRHOU、CTBP2、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはRHOU、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCTBP2、WIF1、および DKK1を含む。
【００９９】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、RHOU、および CTBP2を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、RHOU、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、RHOU、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、RHOU、CTBP2、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、RHOU、CTBP2、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CTBP2、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、RHOU、CTBP2、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、RHOU、CTBP2、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、CTBP2、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはRHOU、CTBP2、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、任意のこれらのサインは、1つまたは複数の追加のバイオマーカーを含んでもよい。
【０１００】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、および WIF1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、CTBP2、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、CCND2、RHOU、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはFBXW2、RHOU、CTBP2、WIF1、および DKK1を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインはCCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および DKK1を含む。
【０１０１】
いくつかの態様では、試料には、腫瘍生検材料、コア生検組織試料、細針吸引液、毛包、または例えば血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、嚢胞液、もしくは尿などの体液の試料など、任意の臨床的に関連する組織試料が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、試料は腫瘍またはがんを有する患者から採取される。いくつかの態様では、試料は原発腫瘍である。いくつかの態様では、試料は転移がんである。試料は、ヒト、または例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、反芻動物、ブタ、もしくはヒツジなどの非ヒト哺乳動物から採取されうる。いくつかの態様では、試料は、複数の時点で、例えば処置前、処置時、および/または処置後に対象から採取される。いくつかの態様では、試料は、対象の異なる部位から採取され、例えば、原発腫瘍からの試料および遠位部位の転移がんからの試料である。
【０１０２】
いくつかの態様では、試料はパラフィン包埋固定組織試料である。いくつかの態様では、試料はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料である。いくつかの態様では、試料は新鮮な組織(例えば、腫瘍)試料である。いくつかの態様では、試料は凍結組織試料である。いくつかの態様では、試料は新鮮凍結(FF)組織(例えば、腫瘍)試料である。いくつかの態様では、試料は体液から単離された細胞である。いくつかの態様では、試料は循環腫瘍細胞(CTC)を含む。いくつかの態様では、試料は保管組織試料である。いくつかの態様では、試料は、公知の診断歴、処置歴、および/または予後歴を伴う保管組織試料である。いくつかの態様では、試料は組織の塊である。いくつかの態様では、試料は分散細胞である。いくつかの態様では、試料サイズは約1個の細胞から約1×106個またはそれより多くの細胞である。いくつかの態様では、試料サイズは約10個の細胞から約1×105個の細胞である。いくつかの態様では、試料サイズは約10個の細胞から約10,000個の細胞である。いくつかの態様では、試料サイズは約10個の細胞から約1,000個の細胞である。いくつかの態様では、試料サイズは約10個の細胞から約100個の細胞である。いくつかの態様では、試料サイズは約1個の細胞から約10個の細胞である。いくつかの態様では、試料サイズは1個の細胞である。
【０１０３】
いくつかの態様では、試料はDNAまたはRNAへと処理される。いくつかの態様では、RNAは試料から単離される。いくつかの態様では、mRNAは試料から単離される。いくつかの態様では、RNAは、細胞溶解およびその中に含まれるタンパク質の変性を含む手法により細胞から単離される。いくつかの態様では、DNaseが添加され、DNAが除去される。いくつかの態様では、RNaseインヒビターが溶解バッファーに添加される。いくつかの態様では、タンパク質の変性/消化工程がプロトコールに加えられる。全RNAおよびmRNAを調製するための方法は当技術分野において周知であり、RNA単離キットが市販されている(例えば、RNeasy mini kit, Qiagen, USA)。いくつかの態様では、RNAはPCRに基づく技法により増幅される。
【０１０４】
バイオマーカー発現レベルの決定は、ポリヌクレオチド発現の分析、ポリヌクレオチドの配列決定、および/またはタンパク質発現の分析に基づく方法を含むが、これに限定されない、任意の適切な方法により行われうる。例えば、バイオマーカー発現レベルの決定は、関心対象の遺伝子から発現したmRNAの発現を検出すること、および/または遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を検出することにより行われうる。
【０１０５】
ポリヌクレオチドの分析のために通常用いられる方法には、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、およびインサイチューハイブリダイゼーション、RNAseプロテクションアッセイ、および例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、リアルタイムPCRとして公知の定量的PCR(qPCR)、TaqMan(商標)、TaqMan(商標)低密度アレイ(TLDA)、アンカーPCR、競合的PCR、cDNA末端の迅速増幅(RECE法)などのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく方法、およびマイクロアレイ解析が含まれる。RT-PCRは、異なる試料におけるmRNAレベルを比較し、遺伝子発現プロファイルを調べるために用いることができる定量的方法である。RT-PCRのバリエーションは、リアルタイム定量的PCRであり、二重標識した蛍光発生プローブ(例えば、TaqMan(商標)プローブ)によりPCR産物蓄積を測定する。ディファレンシャルディスプレイ、増幅断片長多型、BeadArray(商標)技術、高カバー率発現プロファイリング(HiCEP)およびデジタルPCRを含むが、これらに限定されるわけではない、当業者に公知の他のPCRに基づく技法が数多く存在する。配列決定に基づく遺伝子発現分析のための代表的な方法には、遺伝子発現連鎖解析法(SAGE)、超並列的特徴配列決定法(Massively Parallel Signature Sequencing) (MPSS)、およびmRNA配列決定を含むNexGen配列決定解析が含まれる。
【０１０６】
一定の態様では、バイオマーカー発現はqPCRアッセイを用いて決定される。例えば、全RNAは新鮮凍結（FF）試料から抽出されるか、または全RNAはマクロ解剖した(macro-dissected)ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料から抽出される。全RNAの量および質は、標準的な分光光度法および/または任意の他の適切な方法(例えば、Agilent Bioanalyzer)により評価される。RNA抽出に続いて、RNA試料は、標準的な方法および/または市販のcDNA合成キット(例えば、Roche Transcriptor First Strand cDNA合成キット)を用いて逆転写される。結果として生じるcDNAは、例えば、ABIプレ増幅キットを用いて、予め増幅される。バイオマーカー(例えば、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および/またはDKK1)の発現は、例えば、Roche Lightcycler 480システム(Roche Diagnostics)によりABI TaqMan Gene Expression Mastermixを用いて評価される。qPCR反応は三つ組で行われる。各アッセイについて、試料のサブセットは逆転写なしに実行され(RT陰性対照)、同様に、対照試料は鋳型なしに実行される。ユニバーサルヒトレファレンスRNA試料は、各プレート上に含まれ、陽性対照として機能する。適当なレファレンス遺伝子は、レファレンス遺伝子の標準パネルから特定される。候補レファレンス遺伝子は、同時制御のリスクを排除するために、異なる細胞機能により選択される。最適なレファレンス遺伝子は、特定のソフトウェアおよびアルゴリズム(例えば、Genexソフトウェア; GeNormアルゴリズムおよびNormfinderアルゴリズム)を用いて評価および選択される。各バイオマーカーの発現レベルは、選択された最適レファレンス遺伝子を用いて正規化される。いくつかの態様では、各バイオマーカーについてのこれらの正規化された(標準化された)発現値は、試料の判定値を計算するために用いられる。いくつかの態様では、各バイオマーカーについてのこれらの正規化された(標準化された)値は発現レベルを計算するために用いられる。
【０１０７】
いくつかの態様では、バイオマーカー発現は、各バイオマーカー(例えば、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および/またはDKK1)に特異的なプライマーおよび/またはプローブを含む、PCRに基づくアッセイを用いて決定される。本明細書において使用する「プローブ」という用語は、特に意図した標的生体分子に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、公知の技法を用いて当業者により合成されうるか、または生物学的調製物に由来しうる。プローブには、RNA、DNA、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、および有機分子が含まれうるが、これらに限定されるわけではない。「プライマー」または「プローブ」という用語は、特定のSEQ ID NOの配列を有するオリゴヌクレオチドまたは特定のSEQ ID NOに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを包含する。いくつかの態様では、プローブは修飾される。いくつかの態様では、プローブはクエンチャーで修飾される。いくつかの態様では、プローブは標識される。標識には、比色標識(colorimetric label)、蛍光標識、化学発光標識、または生物発光標識が含まれうるが、これらに限定されるわけではない。
【０１０８】
いくつかの態様では、各バイオマーカーのバイオマーカー発現は、特異的プライマーセットおよびプローブを用いて決定される。いくつかの態様では、特異的プライマーセットはフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる。いくつかの態様では、CCND2発現は、
2017501137.tif 000009
の配列を含むポリヌクレオチド、
2017501137.tif 000010
の配列を含むポリヌクレオチド、および
2017501137.tif 000011
の配列を含むポリヌクレオチド、またはそれら相補体を用いて決定される。いくつかの態様では、CCND2発現は、配列
2017501137.tif 000012
のフォワードプライマーおよび配列
2017501137.tif 000013
のリバースプライマーを用いて決定される。いくつかの態様では、CCND2発現は、配列
2017501137.tif 000014
のプローブを用いて決定される。
【０１０９】
いくつかの態様では、CTBP2発現は、単離された、
2017501137.tif 000015
の配列を含むポリヌクレオチド、
2017501137.tif 000016
の配列を含むポリヌクレオチド、および
2017501137.tif 000017
の配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの相補体を用いて決定される。いくつかの態様では、CTBP2発現は、配列
2017501137.tif 000018
のフォワードプライマーおよび
2017501137.tif 000019
の配列のリバースプライマーを用いて決定される。いくつかの態様では、CTBP2発現は、配列
2017501137.tif 000020
のプローブを用いて決定される。
【０１１０】
いくつかの態様では、DKK1発現は、単離された、
2017501137.tif 000021
の配列を含むポリヌクレオチド、
2017501137.tif 000022
の配列を含むポリヌクレオチド、および
2017501137.tif 000023
の配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの相補体を用いて決定される。いくつかの態様では、DKK1発現は、配列
2017501137.tif 000024
のフォワードプライマーおよび
2017501137.tif 000025
の配列のリバースプライマーを用いて決定される。いくつかの態様では、DKK1発現は、配列
2017501137.tif 000026
のプローブを用いて決定される。
【０１１１】
いくつかの態様では、FBXW2発現は、
2017501137.tif 000027
の配列を含むポリヌクレオチド、
2017501137.tif 000028
の配列を含むポリヌクレオチド、および
2017501137.tif 000029
の配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの相補体を用いて決定される。いくつかの態様では、FBXW2発現は、配列
2017501137.tif 000030
のフォワードプライマーおよび配列
2017501137.tif 000031
のリバースプライマーを用いて決定される。いくつかの態様では、FBXW2発現は、配列
2017501137.tif 000032
のプローブを用いて決定される。
【０１１２】
いくつかの態様では、RHOU1発現は、
2017501137.tif 000033
の配列を含むポリヌクレオチド、
2017501137.tif 000034
の配列を含むポリヌクレオチド、および
2017501137.tif 000035
の配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの相補体を用いて決定される。いくつかの態様では、RHOU1発現は、配列
2017501137.tif 000036
のフォワードプライマーおよび配列
2017501137.tif 000037
のリバースプライマーを用いて決定される。いくつかの態様では、RHOU1発現は、配列
2017501137.tif 000038
のプローブを用いて決定される。
【０１１３】
いくつかの態様では、WIF1発現は、
2017501137.tif 000039
の配列を含むポリヌクレオチド、
2017501137.tif 000040
の配列を含むポリヌクレオチド、および
2017501137.tif 000041
の配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの相補体を用いて決定される。いくつかの態様では、WIF1発現は、配列
2017501137.tif 000042
のフォワードプライマーおよび配列
2017501137.tif 000043
のリバースプライマーを用いて決定される。いくつかの態様では、WIF1発現は、配列
2017501137.tif 000044
のプローブを用いて決定される。
【０１１４】
本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの態様では、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の発現レベルは、SEQ ID NO:62〜79からなる群より選択されるポリヌクレオチドを用いて測定される。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの態様では、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の発現レベルは、(a) SEQ ID NO:62のフォワードプライマー、SEQ ID NO:63のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:64を含むプローブ；(b) SEQ ID NO:65のフォワードプライマー、SEQ ID NO:66のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:67を含むプローブ；(c) SEQ ID NO:68のフォワードプライマー、SEQ ID NO:69のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:70を含むプローブ；(d) SEQ ID NO:71のフォワードプライマー、SEQ ID NO:72のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:73を含むプローブ；(e) SEQ ID NO:74のフォワードプライマー、SEQ ID NO:75のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:76を含むプローブ；ならびに(f) SEQ ID NO:77のフォワードプライマー、SEQ ID NO:78のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:79を含むプローブを用いて測定される。
【０１１５】
いくつかの態様では、各バイオマーカー(例えば、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および/または DKK1)の発現レベルは別個のアッセイ(例えば、6回のアッセイ)で決定される。いくつかの態様では、各アッセイのためのレファレンス遺伝子および正規化方法は6回のアッセイ全てで同じである。いくつかの態様では、複数のバイオマーカー(例えば、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および/または DKK1)の発現レベルは1回のマルチプレックスアッセイで検出される。
【０１１６】
あるいは、バイオマーカー発現レベルは、mRNAから作製された相補的DNA(cDNA)または相補的RNA(cRNA)を増幅し、マイクロアレイを用いてそれを分析することにより決定されうる。マイクロアレイ技術は、数千の遺伝子の発現の同時解析を可能にする。いくつかの異なるアレイ配置およびそれらを作製するための方法は当業者に公知である。加えて、マイクロアレイは市販されている(例えば、Affymetrix GeneChips)、または特注することができる。現在広く使用されているマイクロアレイには、cDNAアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイが含まれる。一般に、関心対象のポリヌクレオチド(例えば、プローブまたはプローブセット)は、マイクロチップ基板上に配置または整列される。いくつかの態様では、少なくとも10、25、50、100、500、1000、5000、10,000、20,000、または25,000種類もしくはそれより多くの遺伝子に対するプローブがアレイ基板上に固定される。基板は、多孔性または非多孔性の支持体、例えば、ガラス、プラスチックまたはゲル表面でありうる。プローブには、DNA、RNA、DNAおよびRNAのコポリマー配列、DNAおよび/もしくはRNA類似体、またはそれらの組み合わせが含まれうる。いくつかの態様では、マイクロアレイには、各個々の遺伝子の結合部位の規則的配列を有する支持体が含まれる。マイクロアレイは、アドレス指定可能アレイまたは位置アドレス指定可能アレイであってもよく、例えば、アレイの各プローブは、各プローブのアイデンティティーがそのアレイの位置から決定することができるように、固体支持体上の既知の所定の位置に配置される。
【０１１７】
マイクロアレイ上の各プローブは、10〜50,000ヌクレオチド長でありうる。いくつかの態様では、マイクロアレイのプローブは、約1,000ヌクレオチド長未満、約750ヌクレオチド長未満、約500ヌクレオチド長未満、約250ヌクレオチド長未満、約100ヌクレオチド長未満、または約50ヌクレオチド長未満の長さを有するヌクレオチド配列からなることができる。一般に、アレイには、陽性対照プローブおよび陰性対照プローブが含まれる。
【０１１８】
一定の態様では、バイオマーカー発現はマイクロアレイを用いて決定される。例えば、全RNAが新鮮凍結(FF)組織試料から抽出されるか、または全RNAがマクロ解剖したホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料から抽出される。全RNAの量および質は、標準的な分光光度法および/または任意の他の適切な技法(例えば、Agilent Bioanalyzer)により評価される。RNA抽出に続いて、RNA試料は、標準的な方法および/または市販の増幅システム(例えば、NuGEN Ovation RNA Amplification System V2)を用いて増幅される。増幅されたcDNAは、標準的な手法に従って断片化され、標識され、そしてマイクロアレイにハイブリダイズされる(例えば、NuGEN Encore Biotin ModuleおよびAffymetrix GeneChipアレイを用いて)。アレイは、マイクロアレイの使用説明書に従って、洗浄され、染色され、そしてスキャンされる。マイクロアレイデータは前処理され、プローブ-レベル強度測定値は、Robust Multichipアルゴリズム(RMA)を用いて、バックグラウンド補正され、正規化され、発現測定値として集計される。プローブレベルデータは、各バイオマーカー(例えば、FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および/または DKK1)の発現レベルを得るために集計される。品質パラメータ閾値とデータ縮小技術(例えば、主成分分析)との組み合わせをデータセットに適用し、プロファイル品質を確立し、特定範囲外である可能性のある試料を同定する。各バイオマーカーについてのこれらの正規化された(または標準化された)発現値は、試料の判定値を計算するために用いられる。
【０１１９】
いくつかの態様では、バイオマーカー発現は、関心対象の1つまたは複数の遺伝子のタンパク質発現を試験することにより分析される。タンパク質発現の分析に通常用いられる方法には、免疫組織化学(IHC)に基づく方法、抗体に基づく方法、および質量分析に基づく方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。抗体、一般にはモノクローナル抗体は、遺伝子産物(例えば、タンパク質)の発現を検出するために用いられうる。いくつかの態様では、抗体は、抗体自体の直接標識により検出することができる。他の態様では、未標識の一次抗体が、標識された二次抗体と組み合わせて用いられる。組織免疫化学の方法および/またはキットは、当技術分野において周知であり、市販されている。
【０１２０】
いくつかの態様では、バイオマーカー発現は、多重分析物プロファイル検査、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫測定法、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイを含むが、これらに限定されるわけではない、当業者に公知のアッセイにより決定される。いくつかの態様では、抗体がアッセイで用いられ、この抗体は検出可能に標識される。抗体標識には、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、酵素標識、放射標識、アビジン/ビオチン、コロイド金粒子、着色粒子、および磁性粒子を含みうるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２１】
バイオマーカー発現を分析するのに適した他の方法には、プロテオミクスに基づく方法が含まれる。プロテオミクスには、特に、試料中のタンパク質発現の全般的な変化の試験が含まれる。いくつかの態様では、プロテオミクスによる方法は、以下の工程：(1)2-D電気泳動(2-D PAGE)による試料中の個々のタンパク質の分離、(2)ゲルから回収された個々のタンパク質の同定(例えば、質量分析またはN末端配列決定による)、および(3)バイオインフォマティクスを用いるデータの分析を含む。いくつかの態様では、プロテオミクスによる方法は、組織マイクロアレイ(TMA)を用いることを含む。組織アレイは、当業者に公知の種々の技術によって構築されうる。一定の態様では、手動の組織アレイヤーが、組織試料から調製されたパラフィンブロックから「コア」を取り出すために用いられる。次いで、コアは、グリッド上の指定の位置にある別のパラフィンブロック内に挿入される。1つのレシピエントブロックに約400もの試料からのコアを挿入することができる。その結果生じる組織アレイは、分析のために薄切片に処理されうる。いくつかの態様では、プロテオミクスによる方法は抗体マイクロアレイを含む。いくつかの態様では、プロテオミクスによる方法は、SELDI法、MALDI法、エレクトロスプレー法、および表面プラズモン共鳴法を含むが、これらに限定されるわけではない、質量分析を用いることを含む。いくつかの態様では、プロテオミクスによる方法は、アレイ形式でのビーズ上の抗体を含むがこれに限定されるわけではない、ビーズに基づく技術を含む。いくつかの態様では、プロテオミクスによる方法は、逆相タンパク質マイクロアレイ(RPPM)を含む。いくつかの態様では、プロテオミクスによる方法は、Global Proteome Survey(GPS)法を含むがこれに限定されるわけではない、マルチプレックスタンパク質プロファイリングを含む。
【０１２２】
いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、2つの試料間の差次的遺伝子発現により同定される。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、2つの試料間の差次的遺伝子発現により同定され、正常な細胞と比較してがん細胞で差次的に発現している遺伝子を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、非腫瘍形成性がん細胞と比較して腫瘍形成性がん幹細胞で差次的に発現している遺伝子を含む。いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、特定の処置に非反応性である腫瘍由来の細胞と比較して、同じ処置に反応性である腫瘍由来の細胞において差次的に発現している遺伝子を含む。
【０１２３】
いくつかの態様では、発現プロファイルはマイクロアレイ分析を用いて決定される。マイクロアレイデータは、2つの試料間で同様に発現した遺伝子および差次的に発現した遺伝子を含む遺伝子プロファイルを同定する。いくつかの態様では、発現プロファイルは、発現変化倍率に基づき、バイオマーカーサインへと絞り込まれる、選別される、および/または細分化される。いくつかの態様では、ある特定の発現変化倍率を上回る全ての遺伝子がバイオマーカーサインに含まれる。発現変化倍率は、上昇、低下、または上昇および低下の両方でありうる。いくつかの態様では、2倍以上の発現変化を有する全ての遺伝子がバイオマーカーサインに含まれる。いくつかの態様では、2.5倍以上の発現変化を有する全ての遺伝子がバイオマーカーサインに含まれる。いくつかの態様では、3倍以上の発現変化を有する全ての遺伝子がバイオマーカーサインに含まれる。いくつかの態様では、3.5倍以上の発現変化を有する全ての遺伝子がバイオマーカーサインに含まれる。いくつかの態様では、4倍以上の発現変化を有する全ての遺伝子がバイオマーカーサインに含まれる。
【０１２４】
いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイルは、統計解析に基づき、バイオマーカーサインへと絞り込まれる、選別される、および/または細分化される。統計的方法には、クラスター分析、サポートベクターマシン(SVM)分析、サポートベクターマシン-再帰的特徴消去(recursive feature elimination) (SVM-RFE)分析、Plattスケーリング、ニューラルネットワーク、および他のアルゴリズムが含まれうるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイルは、t-検定分析を用いて分析される。いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイスは、対応サンプルの実証的ベイズ解析を用いて分析される。いくつかの態様では、統計解析の組み合わせが用いられる。いくつかの態様では、SVMモデルが、訓練データに基づき判定値を得るために用いられる。いくつかの態様では、判定値は、バイオマーカーのセットの標準化された発現の加重和により計算される。いくつかの態様では、正の判定値は、レスポンダーであると予測される腫瘍を示し、負の判定値は、ノンレスポンダーであると予測される腫瘍を示す。いくつかの態様では、レスポンダーおよびノンレスポンダーについての分類確率は、Plattスケーリング(Platt, 1999, Advances in Large Margin Classifiers, pp. 61-74, MIT Press)を用いて得られる。Plattスケーリングは、例えばSVMモデルにより、得られた判定値に、最大尤度を用いてロジスティック分布を適合させることを含みうる。いくつかの態様では、0.5より高い確率に関連する腫瘍はレスポンダーであると予想され、0.5より低い確率の腫瘍はノンレスポンダーであると予想される。
【０１２５】
本明細書に記載のいずれかの方法または使用のいくつかの態様では、(レスポンダー状態またはノンレスポンダー状態に関する)腫瘍の分類確率は判定値に基づいて得られる。いくつかの態様では、確率は、判定値にロジスティック回帰を適合させることにより得られる。いくつかの態様では、0.5より高い確率に関連する腫瘍はレスポンダーであると予測され、0.5より低い確率を有する腫瘍はノンレスポンダーであると予測される。
【０１２６】
いくつかの態様では、バイオマーカーサインは、一連の分析工程により得られる。例えば、訓練試料集合からの発現データはマイクロアレイ分析から得られる。データを再処理し、特定の遺伝子による発現マトリックスを入手する。変動がゼロに近い遺伝子は、所定のレベルを下回る発現値の遺伝子であることから、取り除かれる。残った遺伝子をSVM-RFE分析を用いて順位付けする。一個抜き交差検証(LOOCV)法を用いて、最良予測遺伝子を同定および選択し、さらに正の予測値(PPV)、負の予測値(NPV)、感受性および特異性も測定する。
【０１２７】
いくつかの態様では、試料間P値が0.01以下で、発現の上昇を有する全ての遺伝子、発現の低下を有する全ての遺伝子、またはその両方が、バイオマーカーサイン中に含まれる。いくつかの態様では、試料間P値が0.005以下で、発現の上昇を有する全ての遺伝子、発現の低下を有する全ての遺伝子、またはその両方が、バイオマーカーサイン中に含まれる。いくつかの態様では、試料間P値が0.001以下で、発現の上昇を有する全ての遺伝子、発現の低下を有する全ての遺伝子、またはその両方が、バイオマーカーサイン中に含まれる。いくつかの態様では、FDR(偽発見率)が0.25以下で、発現の上昇を有する全ての遺伝子、発現の低下を有する全ての遺伝子、またはその両方が、バイオマーカーサイン中に含まれる。いくつかの態様では、FDRが0.1以下、0.01以下、または0.001以下で、発現の上昇を有する全ての遺伝子、発現の低下を有する全ての遺伝子、またはその両方が、バイオマーカーサイン中に含まれる。
【０１２８】
いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイルおよび/またはバイオマーカーサインは、統計モデルに基づき、絞り込み、選別および/または細分化される。いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイルおよび/またはバイオマーカーサインは、生存時間分析モデルに基づき、絞り込み、選別および/または細分化される。これらのモデルには、カプラン・マイヤー生存時間モデル、コックス比例モデル、コックス比例ハザードモデル、χ2分析、一変量ロジスティック回帰モデル、多変量競合リスクモデル、線形判別分析モデル、パラメトリック回帰モデルおよび相関分析モデルが含まれうるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２９】
いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイルおよび/またはバイオマーカーサインは、関連する臨床結果を有する遺伝子発現アレイデータセットを用いて、絞り込み、選別、細分化および/または試験される。公的に入手可能なデータセットを含むデータベースは、例えば、Gene Expression Omnibus(GEO)およびArrayExpressなど、複数存在する。
【０１３０】
いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイルおよび/またはバイオマーカーサインは、生物機能パラメータおよび/または遺伝子セットを用いて絞り込まれる。例えば、いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイルおよび/またはバイオマーカーサインは、Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)(Subramanian et al., 2005, PNAS, 102: 15545-15550)を用いて絞り込まれる。いくつかの態様では、遺伝子発現プロファイルは、それらの臨床結果を予測する能力に基づいて絞り込まれる。
【０１３１】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターは、本明細書に記載の抗FZD抗体である。本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターは、少なくとも1つのFrizzled(FZD)タンパク質またはその一部に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様では、抗FZD抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される少なくとも1つのFZDタンパク質に特異的に結合する。他の態様では、抗FZD抗体は、(a)GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:1)を含む重鎖CDR1、VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)を含む重鎖CDR2、およびNFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)を含む重鎖CDR3、ならびに(b)SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:4)を含む軽鎖CDR1、DKSNRPSG(SEQ ID NO:5)を含む軽鎖CDR2、およびQSYANTLSL(SEQ ID NO:6)を含む軽鎖CDR3を含む。いくつかの態様では、抗FZD抗体は、SEQ ID NO:7のアミノ酸を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗FZD抗体は、SEQ ID NO:8のアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗FZD抗体は、SEQ ID NO:7のアミノ酸を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8のアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗FZD抗体は抗体OMP-18R5である。いくつかの態様では、抗FZD抗体は、ATCC寄託番号PTA-9541を有するプラスミドによりコードされる。他の態様では、抗FZD抗体は、寄託番号PTA-9541を有するATCCに寄託したプラスミドによりコードされる抗体と、少なくとも1つのヒトFZDタンパク質への特異的結合について競合する。
【０１３２】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、腫瘍は、乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、神経膠腫、胃腸腫瘍、腎腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、甲状腺腫瘍、神経芽細胞腫、膵腫瘍、多形性神経膠芽腫、子宮頸部腫瘍、胃腫瘍、膀胱腫瘍、ヘパトーマ、メラノーマ、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される。いくつかの態様では、腫瘍は乳房腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍はHER-2陰性乳房腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍は三種陰性乳がん(TNBC)腫瘍である。
【０１３３】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、がんは、乳がん、肺がん、結腸がん、神経膠腫、胃腸がん、腎がん、卵巣がん、肝がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、多形性神経膠芽腫、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、ヘパトーマ、メラノーマ、および頭頚部がんからなる群より選択される。いくつかの態様では、がんは乳がんである。いくつかの態様では、がんはHER2陰性乳がんである。いくつかの態様では、がんは三種陰性乳がん(TNBC)である。
【０１３４】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、方法は、特に、患者がWnt経路インヒビターによる処置に反応性であると同定された後に、本明細書に記載のWnt経路インヒビター(例えば、抗FZD抗体)により患者を処置する工程を含む。いくつかの態様では、処置は、少なくとも1種の追加の治療剤をWnt経路インヒビターと組み合わせて投与する工程を含む。追加の治療剤は、Wnt経路インヒビターの投与の前に、それと同時に、および/またはそれに続いて投与することができる。いくつかの態様では、少なくとも1種の追加の治療剤は、1種、2種、3種、またはそれより多くの追加の治療剤を含む。
【０１３５】
有用な治療剤のクラスには、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製インヒビター、アルキル化剤(例えば、シスプラチン、モノ(白金)錯体、ビス(白金)錯体、3核白金錯体およびカルボプラチンなどの白金錯体)、アントラサイクリン類、抗生物質、葉酸代謝拮抗物質、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール(platinol)、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド類、タキサン類、トポイソメラーゼインヒビター、またはビンカアルカロイド等が含まれる。一定の態様では、第2の治療剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼインヒビター、または血管新生インヒビターである。
【０１３６】
Wnt経路インヒビターと組み合わせて投与しうる治療剤として化学療法剤が挙げられる。したがっていくつかの態様において、本方法または本処置は、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤のカクテルと組み合わされた本発明のWnt経路インヒビターの投与を伴う。Wnt経路インヒビター（例えば抗FZD抗体）による処置は、化学療法の施行に先だって、化学療法の施行と同時に、または化学療法の施行後に行うことができる。併用投与には、単一の医薬製剤での共投与、もしくは別個の製剤を使った共投与、またはいずれかの順序での、ただし一般的には全ての活性作用物質がそれぞれの生物学的活性を同時に発揮することができる期間内での、逐次的投与を含めることができる。そのような化学療法剤に関する調製および投与スケジュールは、製造者の説明書に従って、または熟練した医師の経験に基づいて使用することができる。そのような化学療法に関する調製および投与スケジュールは、「The Chemotherapy Source Book」4th Edition, 2008, M.C. Perry編、Lippincott, Williams & Wilkins（ペンシルベニア州フィラデルフィア）にも記載されている。
【０１３７】
本発明において有用な化学療法剤には、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN）;アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン;アジリジン類、例えばベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、およびウレドパ（uredopa）; アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン類およびメチラメラミン類（methylamelamines）;ナイトロジェンマスタード類、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロルエタミン、メクロメタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン; 抗生物質、例えばアクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えばメトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）;葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート;プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU;アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎薬（antiadrenal）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充薬、例えばフォリン酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート;デフォファミン（defofamine）;デメコルチン;ジアジコン;エルフォルミチン（elformithine）;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK;ラゾキサン;シゾフラン（sizofuran）;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマ��;ガシトシン（gacytosine）;アラビノシド（Ara-C）;タキソイド類、例えばパクリタキセル（TAXORE）およびドセタキセル（TAXOTERE）;クロラムブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド（VP-16）;イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;イバンドロネート;CPT11;トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）;レチノイン酸;エスペラミシン類;カペシタビン（XELODA）；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。化学療法剤には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗エストロゲンなどの抗ホルモン剤も含まれ、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)-イミダゾール類、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン（FARESTON）;ならびに抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン;ならびに上記の任意の薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれる。一定の態様では、追加の治療剤はパクリタキセル(タキソール)である。
【０１３８】
一定の態様では、化学療法剤がトポイソメラーゼインヒビターである。トポイソメラーゼインヒビターは、トポイソメラーゼ酵素（例えばトポイソメラーゼIまたはII）の作用を妨害する化学療法剤である。トポイソメラーゼインヒビターとしては、ドキソルビシンHCl、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCl、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド（VM-26）、およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１３９】
一定の態様では、化学療法剤が代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、正常な生化学反応に必要な代謝産物と似ているが、細胞分裂などの1つまたは複数の正常細胞機能を妨害しうるほどには異なる構造を持つ化学物質である。代謝拮抗物質としては、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサートナトリウム、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、テガフル、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４０】
一定の態様では、化学療法剤が、チューブリンに結合する作用物質を含むが、これに限定されるわけではない、有糸分裂阻害剤である。いくつかの態様では、前記剤はタキサンである。一定の態様では、前記剤はパクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体である。一定の態様では、前記剤は、パクリタキセル（TAXOL）、ドセタキセル（TAXOTERE）、アルブミン結合型パクリタキセル（nab-パクリタキセル；ABRAXANE）、DHA-パクリタキセル、またはPG-パクリタキセルである。一定の代替態様では、有糸分裂阻害剤が、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、またはビンデシンなどのビンカアルカロイド、またはそれらの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。いくつかの態様では、有糸分裂阻害剤が、キネシンEg5のインヒビターであるか、またはAurora AやPlk1などの分裂期キナーゼのインヒビターである。Wnt経路インヒビターと組み合わせて投与される化学療法剤が有糸分裂阻害剤である一定の態様では、処置されるがんまたは腫瘍が乳がんまたは乳房腫瘍である。一定の態様では、追加の治療剤は、パクリタキセル(タキソール)またはアルブミン結合型パクリタキセルである。
【０１４１】
いくつかの態様では、追加の治療剤が、小分子などの作用物質を含む。例えば、処置は、本発明のWnt経路インヒビターと、EGFR、ErbB2、HER2、および/またはVEGFを含むが、これらに限定されるわけではない、さらなる腫瘍関連抗原に対してインヒビターとして作用する小分子との併用投与を伴いうる。一定の態様では、追加の治療剤が、がん幹細胞経路を阻害する小分子である。いくつかの態様では、追加の治療剤がNotch経路のインヒビターである。いくつかの態様では、追加の治療剤がWnt経路のインヒビターである。いくつかの態様では、追加の治療剤がBMP経路のインヒビターである。
【０１４２】
本発明の一定の態様は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および FZD8からなる群より選択される少なくとも1種のヒトfrizzled(FZD)に特異的に結合する抗体による処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト乳房腫瘍を同定する方法であって、(a)ヒト乳房腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および DKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、乳房腫瘍が抗体による処置に反応性であると予測されることを示し、負の判定値が、腫瘍が抗体による処置に非反応性であると予測されることを示す、工程を含む、方法を含む。いくつかの態様は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および FZD8からなる群より選択される少なくとも1種のヒトfrizzled(FZD)に特異的に結合する抗体による処置に反応性である可能性のある乳がんを有する患者を同定する方法であって、(a)乳がんの試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および DKK1の1つまたは複数を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づいて判定値を計算する工程であって、正の判定値が、乳がんが抗体による処置に反応性であると予測されることを示す、工程を含む、方法を含む。いくつかの態様は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および FZD8からなる群より選択される少なくとも1種のヒトfrizzled(FZD)に特異的に結合する抗体による処置のための乳がんを有する患者を選択する方法であって、(a)乳がんの試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、および DKK1の1つまたは複数を含む、工程；(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、乳がんが抗体による処置に反応性であると予測されることを示す、工程；および患者の腫瘍試料が正の判定値を有するときに処置のために患者を選択する工程を含む、方法を含む。
【０１４３】
本発明のいくつかの態様は、(a)患者がFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される少なくとも1種のヒトfrizzled(FZD)に特異的に結合する抗体による処置に反応する可能性があるかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者の乳がんの試料を得る工程、(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の1つまたは複数を含む工程、および(iii)サイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む工程；ならびに(b)処置に反応すると予測される患者に有効量の抗体を投与する工程を含む、患者における乳がんを処置する方法を含む。
【０１４４】
本発明のある特定の態様は、パクリタキセルと併用した抗FZD抗体OMP-18R5による処置に反応性または非反応性である可能性のあるヒト乳房腫瘍を同定する方法であって、(a)ヒト乳房腫瘍の試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、乳房腫瘍が処置に反応性であると予測されることを示し、負の判定値が、腫瘍が処置に非反応性であると予測されることを示す、工程を含む方法を含む。いくつかの態様は、パクリタキセルと併用した抗FZD抗体OMP-18R5による処置に反応性である可能性のある乳がんを有する患者を同定する方法であって、(a)乳がんの試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；および(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、乳がんが処置に反応性であると予測されることを示す、工程を含む方法を含む。いくつかの態様は、パクリタキセルと併用した抗FZD抗体OMP-18R5による処置のための乳がんを有する患者を選択する方法であって、(a)乳がんの試料を得る工程；(b)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程；(c)バイオマーカーサイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、乳がんが処置に反応性であると予測されることを示す、工程；および患者の腫瘍試料が正の判定値を有するときに処置のために患者を選択する、工程を含む方法を含む。
【０１４５】
本発明のいくつかの態様は、(a)患者が、パクリタキセルと併用した抗FZD抗体OMP-18R5による処置に反応する可能性があるかどうかを同定する工程であって、該同定が、(i)患者の乳がんの試料を得る工程、(ii)試料中のバイオマーカーサインの各バイオマーカーの発現レベルを測定する工程であって、バイオマーカーサインがバイオマーカーFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含む、工程、および(iii)サイン中のバイオマーカーの標準化された発現に基づき判定値を計算する工程であって、正の判定値が、患者が処置に反応すると予測されることを示す、工程を含む工程；ならびに(b)処置に反応すると予測される患者に有効量の抗体およびパクリタキセルを投与する工程を含む、患者における乳がんを処置する方法を含む。
【０１４６】
III. Wnt経路インヒビター
本発明は、Wnt経路インヒビターによる処置に反応性または感受性である可能性のある、がんを有する患者および/または腫瘍を同定するための方法を提供する。本明細書において使用する「Wnt経路インヒビター」には、Frizzled(FZD)結合作用物質およびWnt結合作用物質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。FZD結合作用物質には、FZDタンパク質に特異的に結合する抗体が含まれうる。Wnt結合作用物質には、Wntタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびにWntタンパク質に結合する可溶性FZD受容体が含まれうる。
【０１４７】
一定の態様において、Wnt経路インヒビターは、1種または複数種のヒトFZDタンパク質に結合する作用物質である。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10種のFZDタンパク質に、特異的に結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種のFZDタンパク質に結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8を含む1種または複数種のFZDタンパク質に結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質がFZD7に結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質がFZD5および/またはFZD8に結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する。FZD結合作用物質の非限定的な例は米国特許第7,982,013号に見いだすことができる。
【０１４８】
一定の態様では、FZD結合作用物質がFZDアンタゴニストである。一定の態様では、FZD結合作用物質がWnt経路アンタゴニストである。一定の態様では、FZD結合作用物質がWntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、古典的Wntシグナル伝達を阻害する。
【０１４９】
いくつかの態様では、FZD結合作用物質が抗体である。いくつかの態様では、FZD結合作用物質がポリペプチドである。一定の態様では、FZD結合作用物質が抗体または抗原結合部位を含むポリペプチドである。一定の態様において、本明細書に記載するFZD結合抗体またはFZD結合ポリペプチドの抗原結合部位は、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のヒトFZDタンパク質に結合する能力を有する（または結合する）。一定の態様において、FZD結合抗体またはFZD結合ポリペプチドの抗原結合部位は、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9およびFZD10からなる群より選択される1、2、3、4、または5種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合する能力を有する。いくつかの態様において、FZD結合作用物質が2種以上のFZDタンパク質に結合する抗体である場合、それは「汎FZD抗体」と呼ぶことができる。
【０１５０】
一定の態様において、FZD結合作用物質（例えば抗体）は、それが結合する1種または複数種のヒトFZDタンパク質の細胞外ドメイン（ECD）に、特異的に結合する。一定の態様において、FZD結合作用物質は、それが結合するヒトFZDタンパク質のFriドメイン（システインリッチドメイン（CRD）としても知られている）内に、特異的に結合する。各ヒトFZDタンパク質のFriドメインの配列は当技術分野において公知であり、それらをSEQ ID NO:13（FZD1）、SEQ ID NO:14（FZD2）、SEQ ID NO:15（FZD3）、SEQ ID NO:16（FZD4）、SEQ ID NO:17（FZD5）、SEQ ID NO:18（FZD6）、SEQ ID NO:19（FZD7）、SEQ ID NO:20（FZD）、SEQ ID NO:21（FZD9）、およびSEQ ID NO:22（FZD10）として記載する。
【０１５１】
一定の態様では、FZD結合作用物質が、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のFZDタンパク質に結合する。いくつかの態様において、FZD結合作用物質は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される1、2、3、4、または5種のFZDタンパク質に、特異的に結合する。いくつかの態様において、FZD結合作用物質は、少なくともFZD5およびFZD8に特異的に結合する。
【０１５２】
いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質に、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下、または約0.1nM以下の解離定数（KD）で結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、少なくとも1種のFZDタンパク質に、約10nM以下のKDで結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、少なくとも1種のFZDタンパク質に、約1nM以下のKDで結合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、少なくとも1種のFZDタンパク質に、約0.1nM以下のKDで結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）のそれぞれに、約40nM以下のKDで結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種または複数種のそれぞれに、約10nM以下のKDで結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のそれぞれに、約10nMのKDで結合する。いくつかの態様では、FZDタンパク質に対する結合作用物質（例えば抗体）のKDが、Biacoreチップ上に固定化されたFZD細胞外ドメインまたはFZD-Friドメインの少なくとも一部分を含むFZD-Fc融合タンパク質を使って決定されるKDである。
【０１５３】
一定の態様では、FZD結合作用物質が、1種または複数種の（例えば2種以上、3種以上、または4種以上の）ヒトFZDタンパク質に、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、または約1nM以下のEC50で結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、2種以上のFZDタンパク質に、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のEC50で結合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、以下のFZDタンパク質のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）に関して、約20nM以下のEC50を有する:FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8。一定の態様では、FZD結合作用物質が、以下のFZDタンパク質のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）に関して、約10nM以下のEC50を有する:FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8。一定の態様では、FZD結合作用物質が、FZD5および/またはFZD8の結合に関して、約40nM以下または20nM以下のEC50を有する。
【０１５４】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、抗体であるFZD結合作用物質である。いくつかの態様では、抗体が組換え抗体である。いくつかの態様では、抗体がモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、抗体がキメラ抗体である。いくつかの態様では、抗体がヒト化抗体である。いくつかの態様では、抗体がヒト抗体である。一定の態様では、抗体がIgG1抗体である。一定の態様では、抗体がIgG2抗体である。一定の態様では、抗体が、抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、抗体が一価、単一特異性、または二価である。いくつかの態様では、抗体が二重特異性抗体または多重特異性抗体である。いくつかの態様では、抗体が細胞傷害性部分にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、抗体が単離されている。いくつかの態様では、抗体が実質的に純粋である。
【０１５５】
本発明のFZD結合作用物質（例えば抗体）は、当技術分野において公知である任意の方法により、特異的結合に関してアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、Biacore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの技法を使った競合アッセイ系および非競合アッセイ系などがあるが、それらに限定されるわけではない。そのようなアッセイは当技術分野ではルーチンであり、周知である（例えばAusubel et al.編（1994〜現在）「Current Protocols in Molecular Biology」John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク州ニューヨークを参照されたい）。
【０１５６】
一定の態様において、本発明は、
2017501137.tif 000045
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000046
を含む重鎖CDR2、
2017501137.tif 000047
を含む重鎖CDR3を含むFZD結合作用物質（例えば抗体）である、Wnt経路インヒビターを提供する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質がさらに、
2017501137.tif 000048
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000049
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000050
を含む軽鎖CDR3を含む。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、
2017501137.tif 000051
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000052
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000053
を含む軽鎖CDR3を含む。一定の態様では、FZD結合作用物質が、（a）
2017501137.tif 000054
を含む重鎖CDR1、
2017501137.tif 000055
を含む重鎖CDR2、および
2017501137.tif 000056
を含む重鎖CDR3、ならびに（b）
2017501137.tif 000057
を含む軽鎖CDR1、
2017501137.tif 000058
を含む軽鎖CDR2、および
2017501137.tif 000059
を含む軽鎖CDR3を含む。
【０１５７】
一定の態様において、本発明は、以下の要素を含むFZD結合作用物質（例えば抗体）を提供する:（a）
2017501137.tif 000060
を含む重鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体;（b）
2017501137.tif 000061
を含む重鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体;（c）
2017501137.tif 000062
を含む重鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体;（d）
2017501137.tif 000063
を含む軽鎖CDR1、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体;（e）
2017501137.tif 000064
を含む軽鎖CDR2、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体;および（f）
2017501137.tif 000065
を含む軽鎖CDR3、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を含むその変異体。一定の態様では、アミノ酸置換が保存的置換である。
【０１５８】
一定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:7に対して少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および/またはSEQ ID NO:8に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、FZD結合作用物質（例えば抗体）を提供する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:7に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。一定の態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:8に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:7に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および/またはSEQ ID NO:8に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:7を含む重鎖可変領域および/またはSEQ ID NO:8を含む軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:7を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8を含む軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:7から本質的になる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8から本質的になる軽鎖可変領域を含む。
【０１５９】
一定の態様において、本発明は、以下の要素を含むFZD結合作用物質（例えば抗体）を提供する:（a）SEQ ID NO:9（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）またはSEQ ID NO:11に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO:10（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）またはSEQ ID NO:12に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、以下の要素を含む:（a）SEQ ID NO:9（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）またはSEQ ID NO:11に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖;および/または（b）SEQ ID NO:10（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）またはSEQ ID NO:12に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:9（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）またはSEQ ID NO:11を含む重鎖、および/またはSEQ ID NO:10（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）またはSEQ ID NO:12を含む軽鎖を含む。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:11を含む重鎖およびSEQ ID NO:12を含む軽鎖を含む。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:9のアミノ酸20〜463から本質的になる重鎖およびSEQ ID NO:10のアミノ酸20〜232から本質的になる軽鎖を含む。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:11から本質的になる重鎖およびSEQ ID NO:12から本質的になる軽鎖を含む。
【０１６０】
一定の態様において、本発明は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7および/またはFZD8のうちの少なくとも1つに特異的に結合するFZD結合作用物質（例えば抗体）であるWnt経路インヒビターであって、前記FZD結合作用物質（例えば抗体）が抗体OMP-18R5のCDRのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含むものを提供する。抗体OMP-18R5（18R5およびバンチクツマブとしても知られている）は、他のFZD結合作用物質と共に、以前に米国特許第7,982,013号に記載されている。OMP-18R5 IgG2抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNAは、2008年9月29日にブダペスト条約の規定の下にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-9541が割り当てられた。いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、OMP-18R5のCDRのうちの1つまたは複数、OMP-18R5のCDRのうちの2つ以上、OMP-18R5のCDRのうちの3つ以上、OMP-18R5のCDRのうちの4つ以上、OMP-18R5のCDRのうちの5つ以上、またはOMP-18R5のCDRの6つ全てを含む。
【０１６１】
本発明は、Wnt経路インヒビターであるポリペプチドを提供する。本ポリペプチドには、ヒトFZDタンパク質に特異的に結合する抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、ポリペプチドが、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種のFZDタンパク質に結合する。いくつかの態様では、ポリペプチドが、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8に結合する。いくつかの態様では、ポリペプチドが、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に結合する。
【０１６２】
一定の態様では、ポリペプチドが、抗体OMP-18R5のCDRのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む。いくつかの態様では、ポリペプチドが、1つのCDRにつき4つまで（すなわち、0、1つ、2つ、3つ、または4つ）のアミノ酸置換を持つCDRを含む。一定の態様では、重鎖CDRが重鎖可変領域内に含まれる。一定の態様では、軽鎖CDRが軽鎖可変領域内に含まれる。
【０１６３】
いくつかの態様において、本発明は、1種または複数種のヒトFZDタンパク質に特異的に結合するポリペプチドであって、ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO:8に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものを提供する。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:8に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO:8に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:7を含むアミノ酸配列、および/またはSEQ ID NO:8を含むアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
いくつかの態様では、FZD結合作用物質が、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを含む。
【０１６５】
一定の態様では、FZD結合作用物質が、OMP-18R5抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。一定の態様では、FZD結合作用物質が、OMP-18R5抗体の重鎖および軽鎖（リーダー配列ありまたはリーダー配列なし）を含む。
【０１６６】
一定の態様では、FZD結合作用物質が、抗体OMP-18R5を含むか、抗体OMP-18R5から本質的になるか、または抗体OMP-18R5からなる。
【０１６７】
一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合に関して、SEQ ID NO:7を含む重鎖可変領域とSEQ ID NO:8を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合に関して、SEQ ID NO:9（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）を含む重鎖とSEQ ID NO:10（シグナル配列ありまたはシグナル配列なし）を含む軽鎖とを含む抗体と競合する。一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合に関して、SEQ ID NO:11を含む重鎖とSEQ ID NO:12を含む軽鎖とを含む抗体と競合する。一定の態様では、FZD結合作用物質が、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合に関して、抗体OMP-18R5と競合する。いくつかの態様では、FZD結合作用物質またはFZD結合抗体が、インビトロ競合結合アッセイにおいて、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への特異的結合に関して競合する。
【０１６８】
一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、本発明の抗体と同じ、または本質的に同じ、1種または複数種のヒトFZDタンパク質上のエピトープに結合する。別の態様において、FZD結合作用物質は、本発明の抗体が結合するFZDタンパク質上のエピトープとオーバーラップする、1種または複数種のヒトFZDタンパク質上のエピトープに結合する抗体である。一定の態様では、FZD結合作用物質（例えば抗体）が、抗体OMP-18R5と同じ、または本質的に同じ、1種または複数種のFZDタンパク質上のエピトープに結合する。別の態様において、FZD結合作用物質は、抗体OMP-18R5が結合するFZDタンパク質上のエピトープとオーバーラップする、1種または複数種のヒトFZDタンパク質上のエピトープに結合する抗体である。
【０１６９】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合する作用物質である。一定の態様では、作用物質が1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10種、またはそれ以上のWntタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される1種または複数種の（または2種以上、3種以上、4種以上、5種以上などの）Wntタンパク質に結合する。一定の態様では、1種または複数種の（または2種以上、3種以上、4種以上、5種以上などの）Wntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される。
【０１７０】
一定の態様では、Wnt結合作用物質がWntアンタゴニストである。一定の態様では、Wnt結合作用物質がWnt経路アンタゴニストである。一定の態様では、Wnt結合作用物質がWntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が古典的Wntシグナル伝達を阻害する。
【０１７１】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が抗体である。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質がポリペプチドである。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、抗体または抗原結合部位を含むポリペプチドである。一定の態様では、本明細書において記載するWnt結合抗体またはWnt結合ポリペプチドの抗原結合部位が、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のヒトWntタンパク質に結合する能力を有する（または結合する）。一定の態様では、Wnt結合抗体またはWnt結合ポリペプチドの抗原結合部位が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される1、2、3、4、または5種のヒトWntタンパク質に特異的に結合する能力を有する。Wnt結合作用物質の非限定的な例は国際公開公報第2011/088127号に見いだすことができる。
【０１７２】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1種または複数種のヒトWntタンパク質のC末端システインリッチドメインに結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、以下からなる群より選択される、1種または複数種のWntタンパク質内のドメインに結合する:SEQ ID NO:46（Wnt1）、SEQ ID NO:47（Wnt2）、SEQ ID NO:48（Wnt2b）、SEQ ID NO:49（Wnt3）、SEQ ID NO:50（Wnt3a）、SEQ ID NO:51（Wnt7a）、SEQ ID NO:52（Wnt7b）、SEQ ID NO:53（Wnt8a）、SEQ ID NO:54（Wnt8b）、SEQ ID NO:55（Wnt10a）、およびSEQ ID NO:56（Wnt10b）。
【０１７３】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1種または複数種の（例えば2種以上、3種以上、または4種以上の）Wntタンパク質に、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のKDで結合する。例えば、一定の態様では、2種以上のWntタンパク質に結合する本明細書に記載のWnt結合作用物質が、それらWntタンパク質に、約100nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のKDで結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）のWntタンパク質のそれぞれに、約40nM以下のKDで結合し、ここで、Wntタンパク質は、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される。いくつかの態様では、Wntタンパク質に対する結合作用物質（例えば抗体）のKDが、Biacoreチップ上に固定化されたWnt C末端システインリッチドメインの少なくとも一部分を含むWnt融合タンパク質を使って決定されるKDである。
【０１７４】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1種または複数種の（例えば2種以上、3種以上、または4種以上の）ヒトWntタンパク質に、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、または約1nM以下のEC50で結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、2種以上のWntに、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のEC50で結合する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、Wntタンパク質Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、および/またはWnt16のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）に関して、約20nM以下のEC50を有する。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、以下のWntタンパク質のうちの1種または複数種（例えば1、2、3、4、または5種）に関して、約10nM以下のEC50を有する:Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、および/またはWnt10b。
【０１７５】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、抗体であるWnt結合作用物質である。いくつかの態様では、抗体が組換え抗体である。いくつかの態様では、抗体がモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、抗体がキメラ抗体である。いくつかの態様では、抗体がヒト化抗体である。いくつかの態様では、抗体がヒト抗体である。一定の態様では、抗体がIgG1抗体である。一定の態様では、抗体がIgG2抗体である。一定の態様では、抗体が、抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、抗体が一価、単一特異性、または二価である。いくつかの態様では、抗体が二重特異性抗体または多重特異性抗体である。いくつかの態様では、抗体が細胞傷害性部分にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、抗体が単離されている。いくつかの態様では、抗体が実質的に純粋である。
【０１７６】
本発明のWnt結合作用物質（例えば抗体）は、FZD結合作用物質について本明細書に記載するように、当技術分野において公知である任意の方法により、特異的結合に関してアッセイすることができる。
【０１７７】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が可溶性受容体である。一定の態様では、Wnt結合作用物質が、FZD受容体タンパク質の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、FZDタンパク質のFriドメインを含む。いくつかの態様では、FZD Friドメインを含む可溶性受容体が、FZD ECD全体を含む可溶性受容体と比較して、改変された生物学的活性（例えば増加したタンパク質半減期）を示すことができる。タンパク質半減期は、ポリエチレングリコール（PEG）またはポリエチレンオキシド（PEO）を使った共有結合修飾によって、さらに改変する（すなわち、増加させる）ことができる。一定の態様では、FZDタンパク質がヒトFZDタンパク質である。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10である。可溶性FZD受容体の非限定的な例は、米国特許第7,723,477号および同第7,947,277号ならびに米国特許出願公開第2013/0034551号に見いだすことができる。
【０１７８】
ヒトFZD1〜10タンパク質のそれぞれの予測FriドメインをSEQ ID NO:13〜22として記載する。ヒトFZD1〜10タンパク質のそれぞれの予測最小FriドメインをSEQ ID NO:23〜32として記載する。さまざまなFriドメインに対応する正確なアミノ酸については、当業者間でその理解に相違が存在しうる。したがって、上記および本明細書において概説するドメインのN末端および/またはC末端には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、さらには10アミノ酸の伸長または短縮が考えられる。
【０１７９】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、ヒトFZDタンパク質のFriドメイン、または1種もしくは複数種のヒトWntタンパク質に結合するFriドメインのフラグメントもしくは変異体を含む。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10である。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質がFZD4である。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質がFZD5である。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質がFZD8である。一定の態様では、ヒトFZDタンパク質がFZD10である。一定の態様では、FZDタンパク質がFZD4であり、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:16を含む。一定の態様では、FZDタンパク質がFZD5であり、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:17を含む。一定の態様では、FZDタンパク質がFZD7であり、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:19を含む。一定の態様では、FZDタンパク質がFZD8であり、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:20を含む。一定の態様では、FZDタンパク質がFZD10であり、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:22を含む。一定の態様では、FZDタンパク質がFZD8であり、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:33を含む。
【０１８０】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、FZD1の最小Friドメイン（SEQ ID NO:23）、FZD2の最小Friドメイン（SEQ ID NO:24）、FZD3の最小Friドメイン（SEQ ID NO:25）、FZD4の最小Friドメイン（SEQ ID NO:26）、FZD5の最小Friドメイン（SEQ ID NO:27）、FZD6の最小Friドメイン（SEQ ID NO:28）、FZD7の最小Friドメイン（SEQ ID NO:29）、FZD8の最小Friドメイン（SEQ ID NO:30）、FZD9の最小Friドメイン（SEQ ID NO:31）、またはFZD10の最小Friドメイン（SEQ ID NO:32）を含むFriドメインを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、FZD8（SEQ ID NO:30）の最小Friドメインを含むFriドメインを含む。
【０１８１】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、FZD1のFriドメイン、FZD2のFriドメイン、FZD3のFriドメイン、FZD4のFriドメイン、FZD5のFriドメイン、FZD6のFriドメイン、FZD7のFriドメイン、FZD8のFriドメイン、FZD9のFriドメイン、またはFZD10のFriドメインから本質的になるFriドメインを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、FZD8のFriドメインから本質的になるFriドメインを含む。
【０１８２】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、以下の配列からなる群より選択される配列を含む:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、およびSEQ ID NO:33。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20から本質的になるFriドメインを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33から本質的になるFriドメインを含む。
【０１８３】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、1つまたは複数（例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など）の保存的置換を含み、Wntタンパク質に結合する能力を有する、前述のFZD Friドメイン配列のいずれか一つの変異体を含む。
【０１８４】
一定の態様では、Wnt結合作用物質、例えばヒトFZD受容体のFriドメインを含む作用物質が、さらに非FZDポリペプチドを含む。いくつかの態様では、FZD可溶性受容体が、他の非FZD機能および構造ポリペプチド、例えば限定するわけではないが、ヒトFc領域、タンパク質タグ（例えばmyc、FLAG、GST）、他の内在性タンパク質またはタンパク質フラグメント、またはFZD ECDもしくはFriドメインと第2のポリペプチドとの間の任意のリンカー領域を含む他の任意の有用タンパク質配列などに連結された、FZD EGDまたはFriドメインを含みうる。一定の態様では、非FZDポリペプチドがヒトFc領域を含む。Fc領域は、免疫グロブリンのクラス、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEのどれからでも得ることができる。いくつかの態様では、Fc領域がヒトIgG1 Fc領域である。いくつかの態様では、Fc領域がヒトIgG2 Fc領域である。いくつかの態様では、Fc領域が野生型Fc領域である。いくつかの態様では、Fc領域が変異型Fc領域である。いくつかの態様では、Fc領域のN末端部分が（例えばヒンジドメインにおいて）1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸分、切り詰められる。いくつかの態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨害するために、ヒンジドメイン中のアミノ酸を変化させる。いくつかの態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨害または阻止するために、システインがセリンに置き換えられる。いくつかの態様では、Fc領域のC末端部分が、1、2、3アミノ酸分またはそれ以上、切り詰められる。いくつかの態様では、Fc領域のC末端部分が1アミノ酸分、切り詰められる。一定の態様では、非FZDポリペプチドが、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む。一定の態様では、非FZDポリペプチドが、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38から本質的になる。一定の態様では、非FZDポリペプチドが、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:37から本質的になる。
【０１８５】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、FZD受容体の少なくとも最小FriドメインとFc領域とを含む融合タンパク質である。本明細書にいう「融合タンパク質」は、少なくとも2種の遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。いくつかの態様では、第1ポリペプチドのC末端が、免疫グロブリンFc領域のN末端に連結される。いくつかの態様では、第1ポリペプチド（例えばFZD Friドメイン）が、Fc領域に直接（すなわち介在リンカーなしで）連結される。いくつかの態様では、第1ポリペプチドがリンカーを介してFc領域に連結される。
【０１８６】
本明細書において使用する「リンカー」という用語は、第1ポリペプチド（例えばFZD構成要素）と第2ポリペプチド（例えばFc領域）との間に挿入されるリンカーを指す。いくつかの態様では、リンカーがペプチドリンカーである。リンカーはポリペプチドの発現、分泌または生物活性に有害な影響を及ぼしてはならない。リンカーは抗原性であってはならず、免疫応答を誘発してはならない。適切なリンカーは当業者には公知であり、グリシン残基とセリン残基との組み合わせを含むことが多く、立体障害の少ないアミノ酸を含むことが多い。有用なリンカーに組み込むことができる他のアミノ酸には、スレオニン残基およびアラニン残基がある。リンカーの長さは、例えば1〜50アミノ酸長、1〜22アミノ酸長、1〜10アミノ酸長、1〜5アミノ酸長、または1〜3アミノ酸長の範囲をとることができる。リンカーとしては、SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n（式中nは1〜7である）、GRA、ポリ(Gly)、ポリ(Ala)、
2017501137.tif 000066
を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。本明細書にいうリンカーは、第1ポリペプチド（例えばFZD Friドメイン）のC末端からのアミノ酸残基も第2ポリペプチド（例えばFc領域）のN末端からのアミノ酸残基も含まない介在ペプチド配列である。
【０１８７】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、FZD Friドメインと、Fc領域と、FZD FriドメインをFc領域につなぐリンカーとを含む。いくつかの態様では、FZD Friドメインが、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:30、またはSEQ ID NO:33を含む。いくつかの態様では、リンカーが
2017501137.tif 000067
を含む。
【０１８８】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、またはSEQ ID NO:33を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含み、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドに直接連結されている。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:37を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20から本質的になる第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:37から本質的になる第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:30を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:30を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:37を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:35を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33から本質的になる第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:35から本質的になる第2ポリペプチドとを含む。
【０１８９】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、またはSEQ ID NO:33を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含み、第1ポリペプチドはリンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:37を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20から本質的になる第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:37から本質的になる第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:30を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33を含む第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:35を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33から本質的になる第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:35から本質的になる第2ポリペプチドとを含む。
【０１９０】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、またはSEQ ID NO:33に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含み、第1ポリペプチドは第2ポリペプチドに直接連結されている。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:30に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。
【０１９１】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、またはSEQ ID NO:33に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含み、第1ポリペプチドは、リンカーによって第2ポリペプチドに接続されている。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:20に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:30に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:33に対して少なくとも95％同一である第1ポリペプチドと、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、またはSEQ ID NO:38を含む第2ポリペプチドとを含む。
【０１９２】
FZDタンパク質は、タンパク質の輸送を指示するシグナル配列を含有する。シグナル配列（シグナルペプチドまたはリーダー配列ともいう）は、新生ポリペプチドのN末端に位置する。それらはポリペプチドを小胞体に向かわせ、タンパク質はそれぞれの行き先に、例えば細胞小器官の内部空間、内膜、細胞外膜、または分泌により細胞外部へと、分別される。大半のシグナル配列は、タンパク質が小胞体に輸送された後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切除される。ポリペプチドからのシグナル配列の切除は、通常、アミノ酸配列中の特異的部位で起こり、シグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。特異的切断部位は通常は1つであるが、2つ以上の切断部位がシグナルペプチダーゼによって認識され、かつ/または使用されて、ポリペプチドのN末端が不均一になる場合がある。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位が使用されることにより、発現されるポリペプチドのN末端アミノ酸が異なることになりうる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載するポリペプチドは、異なるN末端を持つポリペプチドの混合物を含みうる。いくつかの態様では、N末端が長さで1、2、3、4、5、6、7、8、9、10アミノ酸、またはそれ以上異なる。いくつかの態様では、N末端が長さで1、2、3、4、または5アミノ酸異なる。いくつかの態様では、ポリペプチドが実質的に均一、すなわちポリペプチドが同じN末端を有する。いくつかの態様では、ポリペプチドのシグナル配列が、1つまたは複数（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個など）のアミノ酸置換および/またはアミノ酸欠失を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのシグナル配列が、1つの切断部位を優勢にすることで1種類のN末端を持つ実質的に均一なポリペプチドをもたらすことを可能にするアミノ酸置換および/またはアミノ酸欠失を含む。
【０１９３】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、およびSEQ ID NO:45からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
一定の態様では、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:39の配列を含む。一定の態様では、作用物質が、1つまたは複数（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個など）の保存的置換を含むSEQ ID NO:39の配列を含む。一定の態様では、作用物質が、SEQ ID NO:39と少なくとも約90％、約95％、または約98％の配列同一性を有する配列を含む。一定の態様では、SEQ ID NO:39の変異体が、1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合する能力を維持している。
【０１９５】
一定の態様では、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:40の配列を含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:40である。一定の代替態様では、作用物質が、1つまたは複数（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個など）の保存的置換を含むSEQ ID NO:40の配列を含む。一定の態様では、作用物質が、SEQ ID NO:40と少なくとも約90％、約95％または約98％の配列同一性を有する配列を含む。一定の態様では、SEQ ID NO:40の変異体が、1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合する能力を維持している。
【０１９６】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:41の配列を含む。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質がSEQ ID NO:41である。一定の代替態様では、作用物質が、1つまたは複数（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個など）の保存的置換を含むSEQ ID NO:41の配列を含む。一定の態様では、作用物質が、SEQ ID NO:41と少なくとも約90％、約95％、または約98％の配列同一性を有する配列を含む。一定の態様では、SEQ ID NO:41の変異体が、1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合する能力を維持している。
【０１９７】
いくつかの態様では、Wnt結合作用物質がOMP-54F28である。
【０１９８】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、およびSEQ ID NO:45からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一定の態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、およびSEQ ID NO:41からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、およびSEQ ID NO:41からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる。一定の態様では、ポリペプチドがSEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドがSEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドがSEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドがSEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドがSEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む。一定の態様では、ポリペプチドがSEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む。
【０１９９】
いくつかの態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、およびSEQ ID NO:41からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドである。いくつかの態様では、ポリペプチドが、SEQ ID NO:41を含む実質的に精製されたポリペプチドである。一定の態様では、実質的に精製されたポリペプチドが、少なくとも90％の、ASAというN末端配列を有するポリペプチドからなる。いくつかの態様では、新生ポリペプチドが、1種類のN末端配列を持つ実質的に均一なポリペプチド産物をもたらすシグナル配列を含む。
【０２００】
一定の態様では、Wnt結合作用物質が、免疫グロブリンのFc領域を含む。本発明の結合作用物質のいくつかが、ネイティブの、すなわち改変されていない定常領域を含む、ほぼ同じ免疫原性の融合タンパク質と比較した場合に、所望の生化学的特徴、例えば増加したがん細胞局在、増加した腫瘍浸透、低減した血清中半減期、または増加した血清中半減期を与えることができるように、Fc領域の少なくとも一部分が欠失しているか、または他の形で改変されている融合タンパク質を含むことは、当業者には理解されるであろう。Fc領域の修飾は、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含みうる。本明細書に開示する修飾融合タンパク質は、2つある重鎖定常ドメイン（CH2またはCH3）のうちの1つまたは複数の改変もしくは変更、またはヒンジ領域の改変もしくは変更を含みうる。別の態様では、CH2ドメイン全体を除去することもできる（ΔCH2コンストラクト）。いくつかの態様では、省かれた定常領域ドメインが、欠如している定常領域ドメインによって通例付与されている分子の可動性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば10aa残基）で置き換えられる。
【０２０１】
いくつかの態様において、修飾融合タンパク質は、CH3ドメインをヒンジ領域に直接連結するように工学的に操作されている。別の態様では、ヒンジ領域と修飾CH2および/またはCH3ドメインとの間にペプチドスペーサーが挿入されている。例えば、CH2ドメインが欠失していて、残ったCH3ドメイン（修飾または無修飾）が5〜20アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に接合されているコンストラクトを、発現させることができる。そのようなスペーサーは、定常ドメインの調節要素が自由かつアクセス可能な状態を保っていることまたはヒンジ領域が可動性を保っていることを保証するために、付加することができる。しかし、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性であって、コンストラクトに対する望まれない免疫応答を誘発することになりうる点に注意すべきである。したがって一定の態様では、コンストラクトに付加されるスペーサーはいずれも、融合タンパク質の望ましい生物学的品質が維持されるように、比較的非免疫原性であるだろう。
【０２０２】
いくつかの態様では、修飾融合タンパク質が、定常ドメインの部分的でしかない欠失を有するか、小数の、あるいは一つだけのアミノ酸の置換を有しうる。例えば、CH2ドメインの選択された区域における単一アミノ酸の変異は、Fc結合を実質的に低減させ、よってがん細胞局在および/または腫瘍浸透を増加させるのに十分でありうる。同様に、1つまたは複数の定常領域ドメインのうち、特異的エフェクター機能（例えば補体C1q結合）を制御する部分を、単純に欠失させることが望ましい場合もありうる。そのような定常領域の部分的欠失は、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわずに残したまま、結合作用物質の選ばれた特徴（例えば血清中半減期）を改良しうる。そのうえ、上記で言及したように、本開示の融合タンパク質の定常領域は、結果として得られるコンストラクトのプロファイルを強化する1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって修飾してもよい。この点で、修飾融合タンパク質の立体配置および免疫原性プロファイルを実質的に維持したまま、保存された結合部位が与える活性（例えばFc結合）を妨害することが可能になりうる。一定の態様では、修飾融合タンパク質が、エフェクター機能の減少または増加などといった望ましい特徴を強化するために、またはより多くの細胞毒もしくは糖質取り付け部位を設けるために、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含む。
【０２０３】
定常領域が数種類のエフェクター機能を媒介することは、当技術分野において公知である。例えば（抗原に結合した）IgG抗体またはIgM抗体のFc領域への補体のC1構成要素の結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は炎症応答も刺激し、自己免疫過敏症にも関与しうる。加えて、免疫グロブリンのFc領域は、Fc受容体（FcR）を発現する細胞に結合することができる。IgG（ガンマ受容体）、IgE（イプシロン受容体）、IgA（アルファ受容体）およびIgM（ミュー受容体）など、異なる抗体クラスに特異的なFc受容体がいくつかある。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食と破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解、炎症性メディエーターの放出、胎盤移行、および免疫グロブリン生産の制御などといった、いくつかの重要で多様な生物学的応答を誘発する。
【０２０４】
いくつかの態様では、修飾融合タンパク質が改変されたエフェクター機能を与え、それが、結果として、投与された作用物質の生物学的プロファイルに影響を及ぼす。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または（点変異もしくは他の手段による）不活化は、循環修飾作用物質のFc受容体結合を低減し、それによってがん細胞局在および/または腫瘍浸透を増加させうる。別の態様では、定常領域修飾が作用物質の血清中半減期を増加または低減させる。いくつかの態様では、ジスルフィド連結またはオリゴ糖部分が排除されるように、定常領域が修飾される。
【０２０５】
一定の態様では、修飾融合タンパク質が、通常はFc領域に関連する1つまたは複数のエフェクター機能を持たない。いくつかの態様では、作用物質が、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）活性、および/または補体依存性細胞傷害（CDC）活性を持たない。一定の態様では、作用物質が、Fc受容体および/または補体因子に結合しない。一定の態様では、作用物質はエフェクター機能を持たない。
【０２０６】
いくつかの態様において、本明細書に記載するWnt結合作用物質（例えば可溶性受容体）は、免疫原性が低減するように修飾されている。一般に、完全に正常なヒトタンパク質に対する免疫応答は、それらのタンパク質を治療薬として使用する場合には稀である。しかし、多くの融合タンパク質は自然界に見いだされる配列と同じポリペプチド配列を含むものの、いくつかの治療用融合タンパク質は、哺乳動物において免疫原性であることが示されている。いくつかの研究では、リンカーを含む融合タンパク質は、リンカーを含有しない融合タンパク質より免疫原性が高いことが見いだされている。したがって、いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、免疫原性を予測するために、計算的手法によって解析される。いくつかの態様では、ポリペプチドが、T細胞エピトープおよび/またはB細胞エピトープの存在について解析される。T細胞エピトープまたはB細胞エピトープが同定され、かつ/または予測されたら、そのエピトープを妨害または破壊するために、それらの領域に修飾（例えばアミノ酸置換）を加えることができる。T細胞エピトープおよび/またはB細胞エピトープを予測するために使用することができるアルゴリズムおよびソフトウェアは、当技術分野では種々知られている。例えば、ソフトウェアプログラムSYFPEITHI、HLA Bind、PEPVAC、RANKPEP、DiscoTope、ElliPro、およびAntibody Epitope Predictionは、いずれも公的に利用することができる。
【０２０７】
いくつかの態様では、本明細書に記載するWnt結合作用物質（例えば可溶性受容体）またはWnt結合ポリペプチドのいずれかを生産する細胞が提供される。いくつかの態様では、本明細書に記載するWnt結合作用物質（例えば可溶性受容体）またはWnt結合ポリペプチドのいずれかを含む組成物が提供される。いくつかの態様では、組成物が、少なくとも80％、90％、95％、97％、98％、または99％のポリペプチドがASAというN末端配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、100％のポリペプチドがASAというN末端配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、少なくとも80％のポリペプチドがASAというN末端配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、少なくとも90％のポリペプチドがASAというN末端配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が、少なくとも95％のポリペプチドがASAというN末端配列を有するポリペプチドを含む。
【０２０８】
本明細書に記載するポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであることができる。本発明の一部のアミノ酸配列を、タンパク質の構造または機能に著しい影響を及ぼさずに変化させうることは、当技術分野では認識されるであろう。そのような配列の相違が考えられる場合は、タンパク質上には活性を決定する重要な区域があるだろうということに留意すべきである。したがって本発明はさらに、FZDタンパク質の実質的な活性を示す、またはFZDタンパク質の領域、例えば本明細書において論述するタンパク質部分を含む、ポリペプチドのバリエーションを包含する。そのようなミュータントは、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換（type substitution）を含む。
【０２０９】
もちろん、当業者が行うであろうアミノ酸置換の数は、上述したものを含む多くの因子に依存する。一定の態様では、任意の所与の可溶性受容体ポリペプチドについて、置換の数は、50、40、30、25、20、15、10、5または3個以下であるだろう。
【０２１０】
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、対応する完全長ポリペプチドをペプチド合成によって生産するために使用することができる。それゆえに、フラグメントは、完全長ポリペプチドを生産するための中間体として使用することができる。ポリペプチドのこれらのフラグメントまたは部分を「タンパク質フラグメント」または「ポリペプチドフラグメント」ということもできる。
【０２１１】
本発明の「タンパク質フラグメント」は、1種もしくは複数種のヒトWntタンパク質または1種もしくは複数種のヒトFZDタンパク質に結合する能力を有するタンパク質の一部分または全部である。いくつかの態様では、フラグメントが、1種または複数種のヒトWntタンパク質に対して高い親和性を有する。いくつかの態様では、フラグメントが、1種または複数種のヒトFZDタンパク質に対して高い親和性を有する。本明細書に記載するWnt結合作用物質のいくつかのフラグメントは、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部（例えばFc領域）に連結されたFZDタンパク質の細胞外部分の少なくとも一部を含むタンパク質フラグメントである。タンパク質フラグメントの結合親和性は約10-11〜10-12Mの範囲内にありうる。ただし、フラグメントのサイズが変わると、親和性はかなり変動して、10-7〜10-13Mの範囲に及びうる。いくつかの態様では、フラグメントが約100〜約200アミノ酸長であり、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部に連結された結合ドメインを含む。
【０２１２】
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は任意の公知の方法によって調製することができる。いくつかの態様では、関心対象の抗原（例えば精製されたペプチドフラグメント、完全長組換えタンパク質、または融合タンパク質）を皮下または腹腔内に複数回注射することで動物（例えばウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ロバ）を免疫することにより、ポリクローナル抗体を生じさせる。抗原は、任意で、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または血清アルブミンなどの担体にコンジュゲートすることができる。抗原（担体タンパク質ありまたは担体タンパク質なし）を滅菌食塩水に希釈し、通常はアジュバント（例えば完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント）と混和することで、安定なエマルションを形成させる。十分な期間の後、免疫された動物の血液および/または腹水からポリクローナル抗体が回収される。ポリクローナル抗体は当技術分野における標準的方法によって、例えば限定するわけではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析などによって、血清または腹水から精製することができる。
【０２１３】
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知のハイブリドーマ法を使って調製することができる（例えばKohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497を参照されたい）。ハイブリドーマ法を使用するいくつかの態様では、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を上述のように免疫することで、免疫抗原に特異的に結合するであろう抗体の生産をリンパ球に生じさせる。いくつかの態様では、リンパ球をインビトロで免疫することができる。いくつかの態様において、免疫抗原はヒトタンパク質またはその一部分であることができる。いくつかの態様において、免疫抗原はマウスタンパク質またはその一部分であることができる。
【０２１４】
免疫後に、リンパ球を単離し、適切な骨髄腫細胞株と例えばポリエチレングリコールを使って融合させることで、ハイブリドーマ細胞を形成させ、次にそれを、未融合のリンパ球および骨髄腫細胞から選び出すことができる。選んだ抗原を特異的に指向するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、例えば限定するわけではないが、免疫沈降、免疫ブロッティング、およびインビトロ結合アッセイ（例えばフローサイトメトリー、FACS、ELISA、およびラジオイムノアッセイ）を含むさまざまな方法によって同定することができる。ハイブリドーマは、インビトロ培養において標準的方法を使って増殖させるか（J.W. Goding, 1996「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」3rd Edition, Academic Press、 カリフォルニア州サンディエゴ）またはインビボで動物における腹水腫瘍として増殖させることができる。モノクローナル抗体は、例えば限定するわけではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を含む当技術分野における標準的方法に従って、培養培地または腹水から精製することができる。
【０２１５】
一定の態様では、当業者に公知の組換えDNA技法を使って、モノクローナル抗体を作ることができる。抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使ったRT-PCRなどによって、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、それらの配列を従来の技法を使って決定する。次に、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、本来であれば免疫グロブリンタンパク質を生産しない大腸菌（E. coli）、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトした時にモノクローナル抗体を生産する適切な発現ベクターにクローニングする。別の態様では、組換えモノクローナル抗体、またはそのフラグメントを、ファージディスプレイライブラリーから単離することができる。
【０２１６】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、代替抗体を生成させるために、組換えDNA技術を使って、いくつかの異なる方法で、さらに修飾することができる。いくつかの態様では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインで、例えばヒト抗体の同領域を置換することで、キメラ抗体を生成させるか、または非免疫グロブリンポリペプチドを置換することで、融合抗体を生成させることができる。いくつかの態様では、定常領域を切り詰めるか除去することで、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを生成させる。モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化するために、可変領域の部位指定変異導入または高密度変異導入を使用することができる。
【０２１７】
いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがヒト化抗体である。典型的には、ヒト化抗体は、CDRのアミノ酸残基が、当業者に公知の方法を使って、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）の免疫グロブリンのCDRのアミノ酸残基で置き換えられているヒト免疫グロブリンである。いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域アミノ酸残基を、所望の特異性、親和性、および/または結合能を有する非ヒト種の抗体からの対応するアミノ酸残基で置き換える。いくつかの態様では、抗体の特異性、親和性、および/または能力を精密化し最適化するために、Fvフレームワーク領域中および/または置き換えられた非ヒトアミノ酸残基内のさらなるアミノ酸残基の置換によって、ヒト化抗体をさらに修飾することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRの全てまたは実質的に全てを含有する少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメイン領域の実質的に全てを含むであろうが、その一方で、フレームワーク領域の全て、または実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域または定常ドメイン（Fc）の少なくとも一部分（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）も含むことができる。一定の態様では、そのようなヒト化抗体が治療に使用される。なぜなら、それらはヒト対象に投与された場合の抗原性およびHAMA（ヒト抗マウス抗体）応答を低減しうるからである。ヒト化抗体の生成に用いられる方法は当技術分野において周知である。
【０２１８】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターがヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知のさまざまな技法を使って、直接的に調製することができる。いくつかの態様では、標的抗原に対する抗体を生産する、インビトロで免疫した、または免疫個体から単離した、不死化ヒトBリンパ球を、生成させることができる。いくつかの態様では、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから、ヒト抗体を選択することができる。あるいは、免疫されていないドナーの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから、ファージディスプレイ技術を使って、ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで生産することもできる。抗体ファージライブラリーの生成と使用のための技法は、当技術分野において周知である。限定するわけではないが鎖シャフリング（Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783）や部位指定変異導入などといった親和性成熟戦略は、当技術分野では公知であり、高親和性ヒト抗体の生成に使用することができる。
【０２１９】
いくつかの態様では、ヒト免疫グロブリン座を持つトランスジェニックマウスにおいて、ヒト抗体を作ることができる。これらのマウスは、免疫すると、内在性免疫グロブリン生産の非存在下で、ヒト抗体の全レパートリーを生産する能力を有する。このアプローチは、米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;および同第5,661,016号に記載されている。
【０２２０】
本発明は、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質または少なくとも1種のWntタンパク質を特異的に認識する二重特異性抗体も包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを特異的に認識し、それらに結合する能力を有する。異なるエピトープは同じ分子内にあってもよいし（例えばヒトFZD5上の2つの異なるエピトープ）、異なる分子上にあってもよい（例えばFZD5上の1つのエピトープと第2のタンパク質上の異なるエピトープ）。いくつかの態様では、二重特異性抗体がモノクローナルヒト抗体またはモノクローナルヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体は、第1抗原標的を発現する細胞に細胞性防御機構を集中させるために、第1抗原標的（例えばFZDタンパク質）と、第2抗原標的、例えば白血球上のエフェクター分子（例えばCD2、CD3、CD28、CD80、またはCD86）またはFc受容体（例えばCD64、CD32、またはCD16）とを特異的に認識し、それらに結合することができる。いくつかの態様では、抗体を使って、細胞傷害性作用物質を、特定の標的抗原を発現する細胞に向かわせることができる。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性作用物質または放射性核種キレーター、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、またはTETAなどに結合するアームとを有する。
【０２２１】
二重特異性抗体は、インタクトな抗体または抗体フラグメントであることができる。3つ以上の結合価を有する抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60）。したがって、一定の態様では、抗体が多重特異性である。二重特異性抗体および多重特異性抗体を作るための技法は、当業者には公知である。
【０２２２】
一定の態様において、本明細書に記載する抗体（または他のポリペプチド）は、単一特異性であることができる。例えば、一定の態様では、抗体が含有する1つまたは複数の抗原結合部位のそれぞれが、異なるタンパク質上の相同エピトープを結合する能力を有する（または結合する）。一定の態様において、本明細書に記載する単一特異性抗体の抗原結合部位は,例えばFZD5およびFZD7に結合する能力を有する（または結合する）（すなわち、同じエピトープがFZD5タンパク質にもFZD7タンパク質にも見いだされる）。
【０２２３】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、インタクトな抗体とは異なる機能または能力を有しうる。例えば抗体フラグメントは増加した腫瘍浸透性を有しうる。抗体フラグメントを生産するための技法は、例えば限定するわけではないがインタクトな抗体のタンパク質分解消化を含めて、種々知られている。いくつかの態様において、抗体フラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって生産されるF(ab')2フラグメントが含まれる。いくつかの態様において、抗体フラグメントには、F(ab')2フラグメントのジスルフィド橋を還元することによって生成するFabフラグメントが含まれる。別の態様において、抗体フラグメントには、抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって生成するFabフラグメントが含まれる。一定の態様では、抗体フラグメントが組換え生産される。いくつかの態様において、抗体フラグメントには、Fvフラグメントまたは一本鎖Fv（scFv）フラグメントが含まれる。Fab、Fv、およびscFv抗体フラグメントは、大腸菌または他の宿主細胞中で発現させ、そこから分泌させることができ、それにより、これらのフラグメントを大量に生産することが可能になる。いくつかの態様では、抗体フラグメントが、本明細書において論じる抗体ファージライブラリーから単離される。例えば、FZDタンパク質もしくはWntタンパク質またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にするために、Fab発現ライブラリーを構築するための方法を使用することができる。いくつかの態様では、抗体フラグメントが線状抗体フラグメントである。一定の態様では、抗体フラグメントが単一特異性または二重特異性である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターがscFvである。1種もしくは複数種のヒトFZDタンパク質または1種もしくは複数種のヒトWntタンパク質に特異的な一本鎖抗体の生産には、さまざまな技法を使用することができる。
【０２２４】
さらに、抗体をその血清中半減期を増加させるために修飾することが、抗体フラグメントの場合は特に、好ましい場合がある。これは、例えば、抗体フラグメント中の適当な領域への変異導入によって抗体フラグメントにサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことによって、または前記エピトープをペプチドタグに組み込んでから、それを抗体フラグメントの一端または中央に（例えばDNA合成またはペプチド合成で）融合することによって、達成することができる。いくつかの態様において、抗体は、その血清中半減期が減少するように、修飾される。
【０２２５】
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合で接合された2つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば免疫細胞を望まれない細胞にターゲティングするために提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体を、合成タンパク質化学における公知の方法、例えば架橋剤を必要とするものを使って、インビトロで調製することもできると考えられる。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使って、またはチオエーテル結合を形成させることによって、構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートや、メチル-4-メルカプトブチルイミデートがある。
【０２２６】
本発明の目的上、修飾抗体が、抗体と標的（すなわちヒトFZDタンパク質またはヒトWntタンパク質）との会合をもたらす任意のタイプの可変領域を含みうることは、理解されるはずである。これに関連して、可変領域は、体液性応答の開始と所望の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリンの生成とを誘発することができる任意のタイプの哺乳動物を含みうる、またはその哺乳動物に由来しうる。したがって、修飾抗体の可変領域は、例えばヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、マカクなど）由来またはウサギ由来であることができる。いくつかの態様では、修飾免疫グロブリンの可変領域と定常領域がどちらもヒトの領域である。別の態様では、その分子の結合特性を改良し、または免疫原性を低減するために、適合する抗体（通常は非ヒト供給源に由来するもの）の可変領域を工学的に操作または特異的に加工することができる。この点で、本発明において有用な可変領域は、ヒト化されたもの、またはインポートされたアミノ酸配列を含めることにより、他の形で改変されたものでありうる。
【０２２７】
一定の態様では、重鎖および軽鎖の可変ドメインがどちらも、1つまたは複数のCDRの少なくとも部分的な置き換えによって、そして必要であれば、部分的なフレームワーク領域の置き換えならびに配列修飾および/または配列改変によって、改変される。CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス、さらには同じサブクラスの抗体に由来しうるが、CDRは、好ましくは、異なる種からの抗体に由来するであろうと考えられる。一つの可変ドメインの抗原結合能をもう一つの可変ドメインに移すために、CDRの全てをドナー可変領域からのCDRの全てで置き換える必要はないであろう。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移す必要しかないであろう。
【０２２８】
可変領域の改変とは別に、本発明の修飾抗体が、ネイティブの、すなわち改変されていない定常領域を含む、ほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に、所望の生化学的特徴、例えば増加した腫瘍局在および/または増加した血清中半減期が得られるように、定常領域ドメインの1つまたは複数の少なくとも断片が欠失しているかまたは他の形で改変されている抗体（例えば完全長抗体またはその免疫反応性フラグメント）を含むであろうことは、当業者には理解されるだろう。いくつかの態様では、修飾抗体の定常領域はヒト定常領域を含むであろう。本発明と適合する定常領域の修飾は、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。本明細書において開示する修飾抗体は、3つの重鎖定常ドメイン（CH1、CH2またはCH3）の1つまたは複数への、かつ/または軽鎖定常ドメイン（CL）への改変または修飾を含みうる。いくつかの態様では、1つまたは複数のドメインを、修飾抗体の定常領域から部分的にまたは完全に欠失させる。いくつかの態様では、修飾抗体が、CH2ドメイン全体が除去されたドメイン欠失コンストラクトまたはドメイン欠失変異体（ΔCH2コンストラクト）を含むであろう。いくつかの態様では、省かれた定常領域ドメインが、欠如している定常領域ドメインによって通例付与されている分子の可動性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば10アミノ酸残基）で置き換えられる。
【０２２９】
いくつかの態様において、修飾抗体は、CH3ドメインを抗体のヒンジ領域に直接融合するように、工学的に操作される。別の態様では、ヒンジ領域と修飾CH2ドメインおよび/またはCH3ドメインの間にペプチドスペーサーが挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失していて、残ったCH3ドメイン（修飾または無修飾）が5〜20アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に接合されているコンストラクトを、発現させることができる。そのようなスペーサーは、定常ドメインの調節要素が自由かつアクセス可能な状態を保っていることまたはヒンジ領域が可動性を保っていることを保証するために、付加することができる。しかし、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性であって、コンストラクトに対する望まれない免疫応答を誘発することになりうる点に注意すべきである。したがって一定の態様では、コンストラクトに付加されるスペーサーはいずれも、修飾抗体の望ましい生物学的品質が維持されるように、比較的非免疫原性であるだろう。
【０２３０】
いくつかの態様では、修飾抗体が、定常ドメインの部分的でしかない欠失を有するか、小数の、あるいは一つだけのアミノ酸の置換を有しうる。例えば、CH2ドメインの選択された区域における単一アミノ酸の変異は、Fc結合を実質的に低減させ、よってがん細胞局在および/または腫瘍浸透を増加させるのに十分でありうる。同様に、1つまたは複数の定常領域ドメインのうち、特異的エフェクター機能（例えば補体C1q結合）を制御する部分を、単純に欠失させることが望ましい場合もありうる。そのような定常領域の部分的欠失は、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわずに残したまま、抗体の選ばれた特徴（血清中半減期）を改良しうる。そのうえ、上記で言及したように、本開示の抗体の定常領域は、結果として得られるコンストラクトのプロファイルを強化する1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって修飾してもよい。この点で、修飾抗体の立体配置および免疫原性プロファイルを実質的に維持したまま、保存された結合部位が与える活性（例えばFc結合）を妨害することが可能になりうる。一定の態様では、修飾抗体が、エフェクター機能の減少または増加などといった望ましい特徴を強化するために、またはより多くの細胞毒もしくは糖質取り付け部位を設けるために、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含む。
【０２３１】
定常領域が数種類のエフェクター機能を媒介することは、当技術分野において公知である。例えば（抗原に結合した）IgG抗体またはIgM抗体のFc領域への補体のC1構成要素の結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は炎症応答も刺激し、自己免疫過敏症にも関与しうる。加えて、抗体のFc領域は、Fc受容体（FcR）を発現する細胞に結合することができる。IgG（ガンマ受容体）、IgE（イプシロン受容体）、IgA（アルファ受容体）およびIgM（ミュー受容体）など、異なる抗体クラスに特異的なFc受容体がいくつかある。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食と破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解、炎症性メディエーターの放出、胎盤移行、および免疫グロブリン生産の制御などといった、いくつかの重要で多様な生物学的応答を誘発する。
【０２３２】
一定の態様において、Wnt経路インヒビターは、改変されたエフェクター機能を与える抗体である。これらの改変されたエフェクター機能は、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を及ぼしうる。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または（点変異もしくは他の手段による）不活化は、循環修飾抗体（例えば抗FZD抗体）のFc受容体結合を低減し、それによってがん細胞局在および/または腫瘍浸透を増加させうる。別の態様では、定常領域修飾が抗体の血清中半減期を増加または低減させる。いくつかの態様では、ジスルフィド連結またはオリゴ糖部分が排除されるように、定常領域が修飾される。本発明による定常領域の修飾は、当業者によく理解されている周知の生化学的技法または分子工学的手法を使って、容易に行うことができる。
【０２３３】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが1つまたは複数のエフェクター機能を持たない抗体である。例えば、いくつかの態様では、抗体がADCC活性、および/またはCDC活性を持たない。一定の態様では、抗体がFc受容体および/または補体因子に結合しない。一定の態様では、抗体がエフェクター機能を持たない。
【０２３４】
本発明はさらに、本明細書において説明するキメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体、またはそれらの抗体フラグメントに実質的に相同な変異体および等価物を包含する。これらは、例えば保存的置換変異、すなわち1つまたは複数のアミノ酸の類似するアミノ酸による置換を含有することができる。例えば、保存的置換とは、同じ一般クラス内で、あるアミノ酸を別のアミノ酸で置換すること、例えばある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること、またはある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸で置換することなどを指す。保存的アミノ酸置換が意図するものは、当技術分野において周知であり、本明細書でも説明する。
【０２３５】
一定の態様では、本明細書に記載する抗体が単離されている。一定の態様では、本明細書に記載する抗体が実質的に純粋である。
【０２３６】
本発明のいくつかの態様では、Wnt経路インヒビターがポリペプチドである。ポリペプチドは、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質または少なくとも1種のWntタンパク質に結合する、抗体またはそのフラグメントを含む、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであることができる。本発明のいくつかのアミノ酸配列を、タンパク質の構造または機能に著しい影響を及ぼさずに変化させうることは、当技術分野では認識されるであろう。したがって本発明はさらに、ヒトFZDタンパク質またはWntタンパク質に対する抗体またはそのフラグメントの実質的活性を示すか、同抗体またはそのフラグメントの領域を含む、ポリペプチドのバリエーションを包含する。いくつかの態様では、FZD結合ポリペプチドまたはWnt結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリエーションが、欠失、挿入、逆位、反復、および/または他のタイプの置換を含む。
【０２３７】
ポリペプチド、その類似体および変異体はさらに、通常はポリペプチドの一部ではない追加の化学部分を含有するように修飾することができる。誘導体化された部分は、ポリペプチドの溶解度、生物学的半減期および/または吸収を改善することができる。これらの部分は、ポリペプチドおよび変異体の望ましくない任意の副作用を低減または排除することもできる。化学部分に関する総説は「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press（ロンドン）に見いだすことができる。
【０２３８】
本明細書に記載する方法で用いることができる単離されたポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって生産することができる。そのような方法は、直接タンパク質合成法から、ポリペプチド配列をコードするDNA配列を構築してその配列を適切な宿主中で発現させる方法まで、さまざまである。いくつかの態様では、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNAを単離または合成することにより、組換え技術を使ってDNA配列を構築する。任意で、部位特異的変異導入法によって配列に変異を導入することで、その機能的類似体を得ることもできる。
【０２３９】
いくつかの態様では、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列を、オリゴヌクレオチド合成装置を使って、化学合成によって構築することができる。オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、関心対象の組換えポリペプチドの生産を行う予定の宿主細胞において好まれるコドンを選択することによって設計される。標準的方法を適用することで、単離された関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使って、逆翻訳遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成してから、それらをライゲートすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的アセンブリのために、5'または3'オーバーハングを含有する。
【０２４０】
（合成、部位指定変異導入法、または他の方法による）アセンブリが終わったら、関心対象の特定ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、発現ベクターに挿入して、所望の宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に作動的に連結することができる。適正なアセンブリは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および/または適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確かめることができる。当技術分野においては周知であるように、宿主においてトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るには、選んだ発現宿主において機能的な転写および翻訳発現制御配列に遺伝子が作動的に連結されていなければならない。
【０２４１】
一定の態様では、組換え発現ベクターを使って、ヒトFZDタンパク質またはWntタンパク質に対する結合作用物質（例えば抗体または可溶性受容体）またはそのフラグメントをコードするDNAを増幅し、発現させる。例えば組換え発現ベクターは、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適切な転写および/または翻訳調節要素に作動的に連結された、FZD結合作用物質、Wnt結合作用物質、抗FZD抗体もしくはそのフラグメント、抗Wnt抗体もしくはそのフラグメント、またはFZD-Fc可溶性受容体のポリペプチド鎖をコードする、合成DNAフラグメントまたはcDNA由来のDNAフラグメントを有する、複製可能なDNAコンストラクトであることができる。転写単位は、一般に、（1）遺伝子発現において調節的役割を有する1つまたは複数の遺伝要素、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、（2）mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される、構造配列またはコード配列、および（3）適当な転写および翻訳開始および終結配列のアセンブリを含む。調節要素には、転写を制御するためのオペレーター配列を含めることができる。通常は複製起点によって付与される宿主中で複製する能力と、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子を、さらに組み込むことができる。DNA領域は、それらが互いに機能的な関係にある場合に、「作動的に連結」されている。例えば、シグナルペプチド（分泌性リーダー）のDNAは、それがあるポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現するのであれば、そのポリペプチドのDNAに作動的に連結されており、プロモーターは、それがあるコード配列の転写を制御するのであれば、そのコード配列に作動的に連結されており、あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするような位置にあるのであれば、コード配列に作動的に連結されている。いくつかの態様では、酵母発現系における使用を意図した構造要素が、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される別の態様では、それはN末端メチオニン残基を含みうる。この残基は、任意で、発現された組換えタンパク質から引き続いて切り離すことで、最終産物を与えることもできる。
【０２４２】
発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。多種多様な発現宿主/ベクターの組み合わせを使用することができる。真核宿主用の有用な発現ベクターとしては、例えばSV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主用の有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えばpCR1、pBR322、pMB9およびそれらの誘導体を含む大腸菌由来のプラスミド、およびそれより宿主域が広いプラスミド、例えばM13ファージおよび他の線維状一本鎖DNAファージが挙げられる。
【０２４３】
FZD結合作用物質またはWnt結合作用物質（または抗原として使用するためのタンパク質）を発現させるための適切な宿主細胞としては、適当なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母細胞、昆虫細胞、または高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス（Bacillus）が挙げられる。高等真核細胞としては、後述する哺乳動物由来の樹立細胞株が挙げられる。無細胞翻訳系も使用しうる。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、当技術分野で周知である。抗体生産を含むタンパク質生産に関する追加情報は、例えば米国特許出願公開第2008/0187954号、米国特許第6,413,746号および同第6,660,501号、ならびに国際公開公報第2004/009823号に見いだすことができる。
【０２４４】
組換えポリペプチドの発現には、さまざまな哺乳類培養系が使用される。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、そのようなタンパク質が一般に正しくフォールディングされ、適切に修飾され、生物学的に機能的であることから、好ましいであろう。適切な哺乳動物宿主細胞株の例として、COS-7（サル腎臓由来）細胞株、L-929（マウス線維芽細胞由来）細胞株、C127（マウス乳房腫瘍由来）細胞株、3T3（マウス線維芽細胞由来）細胞株、CHO（チャイニーズハムスター卵巣由来）細胞株、HeLa（ヒト子宮頸がん由来）細胞株、BHK（ハムスター腎臓線維芽細胞由来）細胞株、HEK-293（ヒト胎児腎臓由来）細胞株およびそれらの変異体が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、非転写要素、例えば複製起点、発現させようとする遺伝子に連結された適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5'または3'隣接非転写配列、ならびに5'または3'非翻訳配列、例えば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、ならびに転写終結配列を含むことができる。
【０２４５】
昆虫細胞培養系（例えばバキュロウイルス）における組換えタンパク質の発現も、正しくフォールディングされた生物学的に機能的なタンパク質を生産するためのロバストな方法になる。昆虫細胞において異種タンパク質を生産するためのバキュロウイルス系は、当業者に周知である（例えばLuckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47を参照されたい）。
【０２４６】
したがって本発明は、本明細書に記載するFZD結合作用物質またはWnt結合作用物質を含む細胞を提供する。いくつかの態様では、細胞が、本明細書に記載する結合作用物質（例えば抗体または可溶性受容体）を生産する。一定の態様では、細胞が抗体を生産する。一定の態様では、細胞が抗体OMP-18R5を生産する。いくつかの態様では、細胞が可溶性受容体を生産する。いくつかの態様では、細胞がFZD-Fc可溶性受容体を生産する。いくつかの態様では、細胞がFZD8-Fc可溶性受容体を生産する。いくつかの態様では、細胞がFZD8-Fc可溶性受容体54F28を生産する。
【０２４７】
形質転換宿主によって生産されるタンパク質は、任意の適切な方法に従って精製することができる。標準的方法としては、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（differential solubility）、または他の標準的なタンパク質精製技法による方法が挙げられる。適当なアフィニティーカラムを通すことによる安易な精製を可能にするために、ヘキサ-ヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に取り付けることができる。単離されたタンパク質は、タンパク質分解、質量分析（MS）、核磁気共鳴（NMR）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、およびx線結晶解析などの技法を使って、物理的に特徴づけることもできる。
【０２４８】
いくつかの態様では、培養培地中に組換えタンパク質を分泌する発現系からの上清を、まず、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットなどを使って濃縮することができる。濃縮工程に続いて、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することができる。いくつかの態様では、アニオン交換樹脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックスまたは基材を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製によく使用される他のタイプであることができる。いくつかの態様では、カチオン交換工程を使用することができる。適切なカチオン交換体として、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリックスが挙げられる。いくつかの態様では、例えば限定するわけではないがセラミックヒドロキシアパタイト（CHT）などのヒドロキシアパタイト媒体を使用することができる。一定の態様では、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルなどといった疎水性RP-HPLC媒体を使用する1つまたは複数の逆相HPLC工程を使って、結合作用物質をさらに精製することができる。均一な組換えタンパク質を得るために、前述の精製工程の一部または全部をさまざまな組合せで使用することもできる。
【０２４９】
いくつかの態様では、細菌培養において生産された組換えタンパク質を、例えば細胞ペレットからの初回抽出後に、1つまたは複数の濃縮工程、塩析工程、水性イオン交換クロマトグラフィー工程、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程などを行うことによって単離することができる。最終精製工程にはHPLCを使用することができる。組換えタンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用などといった任意の従来法で破砕することができる。
【０２５０】
抗体および他のタンパク質を精製するための当技術分野において公知の方法として、例えば米国特許公報第2008/0312425号、同第2008/0177048号、および同第2009/0187005号に記載されているものも挙げられる。
【０２５１】
一定の態様では、Wnt結合作用物質またはFZD結合作用物質が、抗体ではないポリペプチドである。タンパク質標的に高い親和性で結合する非抗体ポリペプチドを同定し生産するためのさまざまな方法が当技術分野では公知である。例えばSkerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304;Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27;Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol, 17:653-658;Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76;およびSkerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83を参照されたい。一定の態様では、FZD結合ポリペプチドまたはWnt結合ポリペプチドを生産し、かつ/または同定するために、ファージディスプレイ技術を使用することができる。一定の態様では、ポリペプチドが、プロテインA、プロテインG、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、およびチオレドキシンからなる群より選択されるタイプのタンパク質スキャフォールドを含む。
【０２５２】
一定の態様では、結合作用物質を、いくつかのコンジュゲート（すなわちイムノコンジュゲートまたはラジオコンジュゲート）形態または非コンジュゲート形態のいずれか一つで使用することができる。一定の態様では、補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞傷害を含む対象の自然防御機構を利用して悪性細胞またはがん細胞を排除するために、抗体を非コンジュゲート形態で使用することができる。
【０２５３】
いくつかの態様では、結合作用物質が、細胞傷害性作用物質にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、細胞傷害性作用物質が化学療法剤、例えば限定するわけではないが、メトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤である。いくつかの態様では、細胞傷害性作用物質が、細菌、真菌、植物、または動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント、例えば限定するわけではないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（Momordica charantia）インヒビター、クルシン、クロチン、サボウソウ（Sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセン類である。いくつかの態様では、細胞傷害性作用物質が、ラジオコンジュゲートまたはラジオコンジュゲート抗体を生産するための放射性同位体である。ラジオコンジュゲート抗体の生産にはさまざまな放射性核種、例えば限定するわけではないが、90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Reおよび212Biなどを利用することができる。いくつかの態様では、抗体と、1つまたは複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテン（trichothene）、およびCC1065、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートを生産することができる。一定の態様では、抗体と細胞傷害性作用物質とのコンジュゲートが、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジポイミデートHCL）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えばビス(p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）を使って作られる。
【０２５４】
一定の態様では、Wnt経路インヒビター（例えば抗体または可溶性受容体）が、少なくとも1種のWntタンパク質（すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10種のWntタンパク質）のアンタゴニストである。一定の態様において、Wnt経路インヒビターは、それが結合するWntタンパク質の活性を阻害する。一定の態様において、Wnt経路インヒビターは、それが結合するヒトWntタンパク質の活性を、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。
【０２５５】
一定の態様では、Wnt経路インヒビター（例えば抗体または可溶性受容体）が、適当な受容体への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、1種または複数種のヒトFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntタンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様では、少なくとも1種のWntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される。いくつかの態様では、1種または複数種のヒトFZDタンパク質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、および/またはFZD8への1種または複数種のWntタンパク質の結合を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD8への1種または複数種のWntタンパク質の結合を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターによるFZDタンパク質への特定Wntの結合の阻害が、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。一定の態様では、FZDタンパク質へのWntの結合を阻害する作用物質が、Wnt経路シグナル伝達も阻害する。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが、FZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、ヒトWnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが、可溶性受容体54F28である。
【０２５６】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビター（例えば抗体または可溶性受容体）が、少なくとも1種のヒトWntタンパク質のアンタゴニストであり、Wnt活性を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターがWnt活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のWntタンパク質の活性を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される少なくとも1種のヒトWntタンパク質の活性を阻害する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される少なくとも1種のWntタンパク質に結合する。一定の態様では、少なくとも1種のWntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、ヒトWnt活性を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体54F28である。
【０２５７】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトFZDタンパク質のアンタゴニストであり、FZD活性を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD活性を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のFZDタンパク質の活性を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される少なくとも1種のヒトFZDタンパク質の活性を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、および/またはFZD8の活性を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD8の活性を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが抗FZD抗体OMP-18R5である。
【０２５８】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトWntタンパク質のアンタゴニストであり、Wntシグナル伝達を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターがWntシグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、1、2、3、4、5種、またはそれ以上のWntタンパク質によるシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される少なくとも1種のWntタンパク質のシグナル伝達を阻害する。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、Wntシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体54F28である。
【０２５９】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、β-カテニンシグナル伝達のアンタゴニストである。一定の態様では、Wnt経路インヒビターがβ-カテニンシグナル伝達を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％阻害する。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、β-カテニンシグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。
【０２６０】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、受容体への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を阻害する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトWntタンパク質の、1種または複数種のその受容体への結合を阻害する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を阻害する。いくつかの態様では、Wnt結合作用物質が、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、および/またはFZD10への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を阻害する。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntの結合の阻害が、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターがさらに、Wnt経路シグナル伝達および/またはβ-カテニンシグナル伝達を阻害する。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体54F28である。
【０２６１】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、受容体への少なくとも1種のWntの結合を遮断する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のヒトWntタンパク質の、1種または複数種のその受容体への結合を遮断する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntの結合を遮断する。いくつかの態様では、Wnt経路インヒビターが、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、および/またはFZD10への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を遮断する。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntの結合の遮断が、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のWntタンパク質の結合を遮断するWnt経路インヒビターがさらに、Wnt経路シグナル伝達および/またはβ-カテニンシグナル伝達を阻害する。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、抗体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、抗FZD抗体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、抗体OMP-18R5である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、FZD-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、FZD8-Fc可溶性受容体である。一定の態様では、少なくとも1種のFZDタンパク質への少なくとも1種のヒトWntの結合を遮断するWnt経路インヒビターが、可溶性受容体54F28である。
【０２６２】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、Wnt経路シグナル伝達を阻害する。Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターは、一定の態様では、Wntシグナル伝達経路中の1種または複数種の受容体によるシグナル伝達を阻害しうるが、必ずしも全ての受容体によるシグナル伝達を阻害しうるわけではないと理解される。一定の代替態様では、全てのヒト受容体によるWnt経路シグナル伝達が阻害されうる。一定の態様では、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種の受容体によるWnt経路シグナル伝達が、阻害される。一定の態様では、Wnt経路インヒビターによるWnt経路シグナル伝達の阻害が、Wnt経路シグナル伝達のレベルの少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％の低減である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、Wnt経路シグナル伝達を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体54F28である。
【０２６３】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、β-カテニンの活性化を阻害する。β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターは、一定の態様では、1種または複数種の受容体によるβ-カテニンの活性化を阻害しうるが、必ずしも全ての受容体によるβ-カテニンの活性化を阻害しうるわけではないと理解される。一定の代替態様では、全てのヒト受容体によるβ-カテニンの活性化が阻害されうる。一定の態様では、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種の受容体によるβ-カテニンの活性化が阻害される。一定の態様では、Wnt結合作用物質によるβ-カテニンの活性化の阻害が、β-カテニンの活性化のレベルの少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％の低減である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが抗体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが抗FZD抗体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが抗体OMP-18R5である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターがFZD-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターがFZD8-Fc可溶性受容体である。いくつかの態様では、β-カテニンの活性化を阻害するWnt経路インヒビターが可溶性受容体54F28である。
【０２６４】
Wnt経路インヒビターがβ-カテニンシグナル伝達を阻害するかどうかを決定するためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、β-カテニンシグナル伝達レベルをインビトロで測定するには、ホタルルシフェラーゼリポーター遺伝子の上流に複数コピーのTCF結合ドメインを含有するTCF/Lucリポーターベクターを利用する、細胞に基づくルシフェラーゼレポーターアッセイを使用することができる（Gazit et al., 1999, Oncogene, 18;5959-66;TOPflash, Millipore、マサチューセッツ州ビルリカ）。1種または複数種のWntタンパク質（例えばトランスフェクト細胞が発現するWntまたはWnt条件培地によって提供されるWnt）の存在下、結合作用物質の存在下での、β-カテニンシグナル伝達のレベルを、結合作用物質が存在しない状態でのシグナル伝達のレベルと比較する。TCF/Lucリポーターアッセイに加えて、β-カテニンシグナル伝達に対する結合作用物質（または候補作用物質）の効果は、β-カテニンの調節を受ける遺伝子、例えばc-myc（He et al., 1998, Science, 281:1509-12）、サイクリンD1（Tetsu et al., 1999, Nature, 398:422-6）、および/またはフィブロネクチン（Gradl et al., 1999, Mol. Cell Biol., 19:5576-87）の発現のレベルに対する作用物質の効果を測定することにより、インビトロまたはインビボで測定することができる。一定の態様において、β-カテニンシグナル伝達に対する結合作用物質の効果は、ディシェベルド-1、ディシェベルド-2、ディシェベルド-3、LRP5、LRP6、および/またはβ-カテニンのリン酸化状態に対する作用物質の効果を測定することによって評価することもできる。
【０２６５】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、以下の効果のうちの1つまたは複数を有する:腫瘍細胞の増殖を阻害する、腫瘍成長を阻害する、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度を低減する、腫瘍の腫瘍形成性を低減する、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度を低減することによって腫瘍の腫瘍形成性を低減する、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす、腫瘍中の細胞の分化を誘発する、腫瘍形成性細胞を非腫瘍形成性状態へと分化させる、腫瘍細胞における分化マーカーの発現を誘導する、腫瘍細胞の転移を防止する、または腫瘍細胞の生存を減少させる。
【０２６６】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、腫瘍成長を阻害する能力を有する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、インビボでの腫瘍成長を（例えば異種移植片マウスモデルにおいて、かつ/またはがんを有するヒトにおいて）阻害する能力を有する。いくつかの態様では、腫瘍が、結腸直腸腫瘍、結腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。一定の態様では、腫瘍がメラノーマである。一定の態様では、腫瘍が結腸直腸腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が膵腫瘍である。一定の態様では、腫瘍が乳房腫瘍である。一定の態様では、腫瘍がWnt依存性腫瘍である。
【０２６７】
一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、腫瘍の腫瘍形成性を低減する能力を有する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、動物モデル、例えばマウス異種移植モデルにおいて、がん幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成性を低減する能力を有する。一定の態様では、腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度が、少なくとも約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、約50分の1、約100分の1、または約1000分の1に低減する。一定の態様では、がん幹細胞の数または頻度の低減が、動物モデルを使った限界希釈アッセイによって決定される。限界希釈アッセイを使って腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度の低減を決定する工程に関するさらなる例と指針は、例えば国際公開公報第2008/042236号ならびに米国特許公報第2008/0064049号および同第2008/0178305号に見いだすことができる。
【０２６８】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、少なくとも1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間は、インビボで活性である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間は、インビボで活性なIgG（例えばIgG1またはIgG2）抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、少なくとも1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間は、インビボで活性な融合タンパク質である。
【０２６９】
一定の態様では、本明細書に記載するWnt経路インヒビターが、マウス、カニクイザル、またはヒトにおいて、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の循環半減期を有する。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、マウス、カニクイザル、またはヒトにおいて、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の循環半減期を有するIgG（例えばIgG1またはIgG2）抗体である。一定の態様では、Wnt経路インヒビターが、マウス、カニクイザル、またはヒトにおいて、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間の循環半減期を有する融合タンパク質である。ポリペプチドおよび抗体などの作用物質の半減期を増加（または減少）させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、IgG抗体の循環半減期を増加させる公知の方法として、新生児型Fc受容体（FcRn）への抗体のpH依存的結合をpH6.0で増加させるFc領域への変異の導入が挙げられる（例えば米国特許公報第2005/0276799号、同第2007/0148164号、および同第2007/0122403号を参照されたい）。Fc領域を欠く抗体フラグメントの循環半減期を増加させる公知の方法として、PEG化などの技法が挙げられる。
【０２７０】
IV. キット
本発明の方法を実施するためのキットがさらに提供される。「キット」は、本発明の少なくとも1つのバイオマーカー発現を特異的に検出するための少なくとも1つの試薬、例えば抗体、核酸プローブなどを含む任意の製品(例えば、パッケージまたは容器)を意図する。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして、販売促進、流通、および/または販売されうる。加えて、キットは、キットを説明しかつその使用のための指示書を含む添付文書も含みうる。
【０２７１】
いくつかの態様では、キットは、マイクロアレイ技術を用いて本発明の方法を実施するための試薬を含む。いくつかの態様では、キットは、qPCRアッセイを用いて本発明の方法を実施するための試薬を含む。陽性対照および/または陰性対照は、本発明により利用される試薬の活性および正しい使用を確認するためにキット中に含まれうる。対照には、関心対象のバイオマーカーの存在について陽性もしくは陰性のいずれかであることが公知の試料、または関心対象のバイオマーカーを含む他の試料が含まれうる。対照の設計および使用は、標準的であり、かつ十分に当業者の通常能力の範囲内である。
【０２７２】
いくつかの態様では、キットは、SEQ ID NO:62〜79からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、キットは、(a) SEQ ID NO:62のフォワードプライマー、SEQ ID NO:63のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:64を含むプローブ；(b) SEQ ID NO:65のフォワードプライマー、SEQ ID NO:66のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:67を含むプローブ；(c) SEQ ID NO:68のフォワードプライマー、SEQ ID NO:69のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:70を含むプローブ；(d) SEQ ID NO:71のフォワードプライマー、SEQ ID NO:72のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:73を含むプローブ；(e) SEQ ID NO:74のフォワードプライマー、SEQ ID NO:75のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:76を含むプローブ；ならびに(f) SEQ ID NO:77のフォワードプライマー、SEQ ID NO:78のリバースプライマー、およびSEQ ID NO:79を含むプローブを含む。
【０２７３】
本発明の方法の任意のまたは全ての工程が人により実施されるか、または代替的に、自動化された形で実施される可能性があることがさらに理解される。よって、試料調製、バイオマーカー発現の検出等の工程は自動化されうる。
【０２７４】
本開示の態様は、本開示のある特定の抗体の調製および本開示の抗体を用いるための方法を詳細に説明する以下の非限定的な実施例を参照することにより、さらに明示することができる。本開示の範囲から逸脱することなく、材料にも方法にも多くの変更を行なえることは、当業者には明白であるだろう。
【実施例】
【０２７５】
実施例1
OMP-18R5およびタキソールの併用による処置に反応性である腫瘍の同定
乳房腫瘍異種移植モデルOMP-B34、OMP-B39、OMP-B44、OMP-B59、OMP-B60、UM-T01、UM-T03、およびUM-PE13を、OncoMed PharmaceuticalsまたはUniversity of Michiganで最小限に継代した患者由来の腫瘍検体から確立した。2〜4×104個の細胞のOMP-B34、OMP-B39、OMP-B44、OMP-B59、OMP-B60、UM-T01、UM-T03、またはUM-PE13腫瘍を、6〜8週齢のNOD/SCIDマウスの皮下に注入した。腫瘍が100〜150 mm3の平均体積に到達するまで、腫瘍を成長させた。腫瘍を有するマウスを4群（各群n＝10）にランダムに分け、対照抗体1B711(15 mg/kg)、抗FZD抗体OMP-18R5(15 mg/kg)、タキソール(10 mg/kg)、またはタキソール(10 mg/kg)と組み合わせたOMP-18R5(15 mg/kg)により処置した。抗体および/またはタキソールによる処置を週毎に施した。指定の時点で電子ノギスにより、腫瘍成長をモニターし、腫瘍体積を測定した。データを平均±S.E.M.として表す。
【０２７６】
腫瘍が抗FZD抗体OMP-18R5に反応性であるかどうかを判定するために、単剤腫瘍体積データを対照と比較し、OMP-18R5およびタキソールによる併用処置を単剤としてのタキソールと比較した。本試験について、「レスポンダー」腫瘍は、単剤としてのタキソールによる腫瘍成長阻害と比較して、OMP-18R5およびタキソールにより有意に優れた腫瘍成長阻害を示す腫瘍として定義された。
【０２７７】
各異種移植モデルについての結果を図1A〜Hに示す。t-検定を各時点で実行した。多重比較は、2要因反復測定ANOVA、それに続くボンフェローニ補正を用いた。t-検定および2要因反復測定ANOVAをGraphPad Prism5(GraphPad Software Inc.)を用いて行った。腫瘍OMP-B59、OMP-B60、UM-T03、およびUM-PE13はレスポンダーであることが示され、腫瘍OMP-B34、OMP-B39、OMP-B44、およびUM-T01はノンレスポンダーであることが示された。結果を表1に要約する。
【０２７８】
【表１】
2017501137.tif 000068
【０２７９】
実施例2
予測バイオマーカーの同定
OMP-18R5およびタキソールの併用による処置に反応しなかった乳房腫瘍OMP-B34、OMP-B39、OMP-B44の未処置の乳房腫瘍(「ノンレスポンダー」)、ならびにUM-T01、ならびにOMP-18R5およびタキソールの併用による処置に反応した腫瘍OMP-B59、OMP-B60、UM-T03、およびUM-PE13の未処置の腫瘍(「レスポンダー」)に対して、マイクロアレイ分析を行った。RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (Qiagen、Valencia CA)を用いて製造者の説明書に従うDNAse処理により、RNAを各腫瘍から単離した。試料を−80℃で保存した。RNAをAgilent 2100 Bioanalyzerで可視化し、インタクトな28Sおよび18Sリボソームのピークの存在により完全性を確認した。全てのRNA試料は260/280の比が>1.8であった。各腫瘍から単離した全RNAをOvation RNA Amplification System V2(NuGEN、San Carlos、CA)を用いて増幅した。増幅させたアンチセンス一本鎖cDNAを、FL-Ovation cDNA Biotin Module V2(NuGEN)を用いて断片化し、ビオチン化した。アレイへのハイブリダイゼーション前に、cDNAおよび断片化したcDNAの質を分光光度計およびBioanalyzerにより評価した。製造者の技術マニュアルに概説されているように、処理したRNAをAffymetrix HG-U133 plus 2.0マイクロアレイ(Affymetrix、Santa Clara、CA)にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、スキャンし、分析した。GeneChip-RMA(Wu et al.、2004、J. Amer. Stat. Assn.、99:909-917)を用いて、マイクロアレイデータをプローブセットレベルデータへ処理した。マウスのマーカーとクロスハイブリダイズする可能性のあるプローブセットを除いた。遺伝子レベルに対するデータを要約し、最も強いシグナルを有するプローブを選択したことを確認するために、1つの遺伝子をマッピングする全てのプローブセットの中で最大発現を用いた。低発現(log2スケールで<5)またはゼロに近い変動(< 0.01)の遺伝子は除去した。平均からlog2スケール発現を引き、各遺伝子の標準偏差によって割ることにより、遺伝子をN(0、1)に標準化した。
【０２８０】
分析は、古典的経路、平面内細胞極性、Wnt/Ca+2、Wntシグナル伝達の負の調節、細胞運命、組織極性、細胞成長および増殖、細胞遊走、細胞周期、ならびに細胞ホメオスタシスを含む複数のシグナル伝達経路由来の遺伝子を用いて行われた(表2を参照)。
【０２８１】
【表２】
2017501137.tif 000069
2017501137.tif 000070
2017501137.tif 000071
【０２８２】
サポートベクターマシン-再帰的特徴消去(SVM-RFE)法(Guyon et al, 2002, Machine Learning, 46:389-422)を、レスポンダー腫瘍とノンレスポンダー腫瘍を区別できる遺伝子を同定するために用い、サポートベクターマシン(SVM)法(Cortes and Vapnik, 1995, Machine Learning, 20:273-297)を分類のために用いた。一個抜き交差検証(LOOCV)法を用いて、遺伝子の数を選択し、モデルの正の予測値(PPV)、負の予測値(NPV)、感受性および特異性も測定した。FBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1を含むバイオマーカーサインは、8種類の乳房腫瘍を用いてPPV＝NPV＝感受性＝特異性＝100％の最良性能を達成した(図2を参照)。図3に示すように、主成分分析(PCA)は、6遺伝子バイオマーカーサインが8種類の乳房腫瘍のほぼ完全な分別をもたらしたことを示した。加えて、6遺伝子バイオマーカーサインと実施例1に記載のインビボ実験からの腫瘍体積の比率(RTV)との間には強い相関関係が観察された(相関＝ 0.95、p値＝ 0.0003；交差検証した相関＝ 0.89、p値＝ 0.00027；図4)。
【０２８３】
訓練データに基づき、判定値をSVMモデルから決定した。6遺伝子バイオマーカーサインについて、判定値は、6遺伝子の標準化された発現の加重和により計算できる：0.4560427*FBXW2＋0.3378467*CCND2−0.4809354*RHOU＋0.409029*CTBP2＋0.3291529*WIF1＋02926374*DKK1＋0.04662682。正の判定値は、腫瘍がレスポンダーであると予測されることを示し、負の判定値は、腫瘍がノンレスポンダーであると予測されることを示した。加えて、判定値に対してロジスティック回帰を適合することにより、分類確率を得ることができる。0.5より高い確率に関連する腫瘍はレスポンダーであると予測され、0.5より低い確率を有する腫瘍はノンレスポンダーであると予測された。
【０２８４】
実施例3
予測バイオマーカーのインビボでの検証
6種類の追加の乳がん腫瘍をOncoMed Tumor Bankから選択し、実施例1に記載のようにマイクロアレイ分析を行った。6種類の乳がん腫瘍はOMP-B29、OMP-B71、OMP-B84、OMP-B90、UM-T02、およびUM-T06であった。本明細書に記載の通り、6遺伝子バイオマーカーサインにより分類確率分析を用いて、タキソールと併用した抗FZD抗体OMP-18R5による処置に対するこれらの腫瘍それぞれの反応を予測した(図5を参照)。並行して、6種類の腫瘍を、実施例1に記載のようにインビボ異種移植モデルにおいて評価した(図6A〜Fを参照)。実施例1に記載のように、インビボモデルにおける「レスポンダー」は、単剤としてのタキソールによる腫瘍成長阻害と比較して、OMP-18R5およびタキソールの併用により有意に優れた腫瘍成長阻害を示す腫瘍である。分類確率に基づく予測をインビボ異種移植モデルの結果と比較した。結果を表3に要約する。
【０２８５】
【表３】
2017501137.tif 000072
【０２８６】
表3に示すように、6種類の乳がん腫瘍のそれぞれの反応は、判定値および分類確率を用いる6遺伝子バイオマーカーサインにより正確に予測された。
【０２８７】
実施例4
6遺伝子バイオマーカーサインの保有率推定
バイオマーカーサインの保有率は、バイオマーカーサインに基づきレスポンダーであると予測された集団の割合として定義することができる。3種類の公的に入手可能な乳がんマイクロアレイデータセットに6遺伝子バイオマーカーサインを適用することにより、HER2陰性(HER2-)集団および三種陰性乳がん(TNBC)集団における6遺伝子バイオマーカーサインの保有率を推定した。Cremoux2001データセットは、145人のHer2-および81人のHER2+を含む226人の患者により、Affymetrix U133plus2マイクロアレイを基にして集計され、ここで、51人のTNBCはHER2-グループ内に含まれた。Wang2011データセットは、79人のHER2-および36人のHER2+を含む115人の患者により、Affymetrix U133plus2マイクロアレイを基にして集計され、ここで、28人のTNBCはHER2-グループ内に含まれた。Prat2010データセットは、215人のHER2-および118人のHER2+を含む333人の患者により、Agilent Human 1Aマイクロアレイを基にして集計され、ここで、57人のTNBCはHER2-グループ内に含まれた。公的データの前処理には、データをダウンロードすること、6遺伝子に対するプローブセットマッピングを抽出すること、およびプローブセットを6遺伝子にまとめることが含まれた。平均を引き、公的データ中の各遺伝子の標準偏差によって割ることにより、遺伝子レベル発現データをさらに標準化した。訓練データにより構築されたSVMモデルを用いて公的データを分類した。分類確率を得て、予測レスポンダー(確率>0.5)の割合を6遺伝子バイオマーカーサインに基づき計算した。
【０２８８】
図7に示すように、3種類のデータベース内での6遺伝子バイオマーカーサインの予測保有率は非常に類似していた(およそ60％)。この予測は、タキソールと併用した抗FZD抗体OMP-18R5による治療に反応性である乳がん患者の大集団が存在することを示唆する。
【０２８９】
実施例5
6遺伝子バイオマーカーサインについてのqPCRアッセイ
qPCRアッセイを展開し、試料中のFBXW2、CCND2、RHOU、CTBP2、WIF1、およびDKK1の発現レベルを決定した。プライマーおよびプローブを、公的に入手可能なmRNA配列を用いて設計した。プライマーおよびプローブを作製し、ヒト新鮮凍結(FF)組織試料およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト組織試料を用いる最適化試験および検証試験において用いた。特異的プライマーおよびプローブを表4に列記する(全ての配列は5'から3'の方向)。TOP1(トポイソメラーゼ1)、GUSB(βグルクロニダーゼ)、SDHA(コハク酸デヒドロゲナーゼ)、およびPUM1(プミリオホモログ1)を含む4種類のレファレンス遺伝子を正規化のために用いた。
【０２９０】
【表４】
2017501137.tif 000073
【０２９１】
18個の異種移植乳房腫瘍から得た全RNAに対してqPCRを行った。腫瘍検体を回収し、迅速に急速凍結し、RNA単離の前に−80℃で保存した。製造者のプロトコールに従ってRNeasy Fibrous Mini Kit(Qiagen, Valencia CA, PN#74704)を用いてTissueLyzer均質化およびDNase I処理により、全RNAを抽出した。RNAをBioanalyzer 2100(Agilent, Santa Clara, CA)で可視化し、RIN値>6.0を有するインタクトなRNAであることを検証した。全てのRNAはA260/A280の比率が>1.8であった。
【０２９２】
qPCRは2ステップ法で行われた。最初に、Applied Biosystems User Bulletin 2に記載されているように、ランダムヘキサマーを用いて全RNAからcDNAを合成した。次のqPCR反応において、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA. Cat # 4304437および4326708)を製造者のプロトコールに従って用いた。遺伝子発現の量を、三つ組の反応からCt(サイクル閾値)法を用いて決定した。サイクル閾値は一般に、シグナルが検出閾値と交差するのに必要とされるサイクルの数であると考えられる。Ctレベルは、試料中の標的核酸の量に反比例する。6遺伝子のCtは、4種類のレファレンス遺伝子のCtレベルを用いて正規化される。18個の異種移植試料について正規化した6遺伝子サインのCtを表5に示す。
【０２９３】
【表５】
2017501137.tif 000074
【０２９４】
判定値は、qPCRアッセイから生じたデータから正規化した6遺伝子の発現の加重和により計算することができる。これらの判定値は、マイクロアレイデータに基づく分析から生じた判定値とは異なっていたが、2つのモデルの予測能力は非常に類似している。
【０２９５】
本明細書に記載する実施例および態様は例示のために過ぎないこと、そしてそれらに照らしてさまざまな変更または改変が当業者には示唆され、それらは本願の本旨および範囲に包含されるべきものであることは、理解されるであろう。
【０２９６】
本明細書において言及する刊行物、特許、および特許出願は全て、個々の刊行物、特許、または特許出願について参照によりそのまま組み込まれることを個別に明記した場合と同じ程度に、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【０２９７】
以下は本願において開示される配列である。
OMP-18R5重鎖CDR1（SEQ ID NO:1）
2017501137.tif 000075
OMP-18R5重鎖CDR2（SEQ ID NO:2）
2017501137.tif 000076
OMP-18R5重鎖CDR3（SEQ ID NO:3）
2017501137.tif 000077
OMP-18R5軽鎖CDR1（SEQ ID NO:4）
2017501137.tif 000078
OMP-18R5軽鎖CDR2（SEQ ID NO:5）
2017501137.tif 000079
OMP-18R5軽鎖CDR3（SEQ ID NO:6）
2017501137.tif 000080
OMP-18R5重鎖可変領域アミノ酸配列（SEQ ID NO:7）
2017501137.tif 000081
OMP-18R5軽鎖可変領域アミノ酸配列（SEQ ID NO:8）
2017501137.tif 000082
OMP-18R5重鎖アミノ酸配列（下線部は予測シグナル配列）（SEQ ID NO:9）
2017501137.tif 000083
OMP-18R5軽鎖アミノ酸配列（下線部は予測シグナル配列）（SEQ ID NO:10）
2017501137.tif 000084
OMP-18R5重鎖アミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:11）
2017501137.tif 000085
OMP-18R5軽鎖アミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:12）
2017501137.tif 000086
ヒトFZD1 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:13）
2017501137.tif 000087
ヒトFZD2 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:14）
2017501137.tif 000088
ヒトFZD3 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:15）
2017501137.tif 000089
ヒトFZD4 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:16）
2017501137.tif 000090
ヒトFZD5 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:17）
2017501137.tif 000091
ヒトFZD6 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:18）
2017501137.tif 000092
ヒトFZD7 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:19）
2017501137.tif 000093
ヒトFZD8 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:20）
2017501137.tif 000094
ヒトFZD9 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:21）
2017501137.tif 000095
ヒトFZD10 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:22）
2017501137.tif 000096
ヒトFZD1アミノ酸116〜227（SEQ ID NO:23）
2017501137.tif 000097
ヒトFZD2アミノ酸39〜150（SEQ ID NO:24）
2017501137.tif 000098
ヒトFZD3アミノ酸28〜133（SEQ ID NO:25）
2017501137.tif 000099
ヒトFZD4アミノ酸48〜161（SEQ ID NO:26）
2017501137.tif 000100
ヒトFZD5アミノ酸33〜147（SEQ ID NO:27）
2017501137.tif 000101
ヒトFZD6アミノ酸24〜129（SEQ ID NO:28）
2017501137.tif 000102
ヒトFZD7アミノ酸49〜160（SEQ ID NO:28）
2017501137.tif 000103
ヒトFZD8アミノ酸35〜148（SEQ ID NO:30）
2017501137.tif 000104
ヒトFZD9アミノ酸39〜152（SEQ ID NO:31）
2017501137.tif 000105
ヒトFZD10アミノ酸34〜147（SEQ ID NO:32）
2017501137.tif 000106
ヒトFZD8 Friドメインアミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（変異体）（SEQ ID NO:33）
2017501137.tif 000107
ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:34）
2017501137.tif 000108
ヒトIgG1 Fc領域（変異体）（SEQ ID NO:35）
2017501137.tif 000109
ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:36）
2017501137.tif 000110
ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:37）
2017501137.tif 000111
ヒトIgG2 Fc領域（SEQ ID NO:38）
2017501137.tif 000112
FZD8-Fc変異体54F03アミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:39）
2017501137.tif 000113
FZD8-Fc変異体54F16、54F17、54F18、54F23、54F25、54F27、54F29、54F31、および54F34アミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:40）
2017501137.tif 000114
FZD8-Fc変異体54F19、54F20、54F24、54F26、54F28、54F30、54F32、54F34および54F35アミノ酸配列（予測シグナル配列なし）（SEQ ID NO:41）
2017501137.tif 000115
FZD8-Fc変異体54F03アミノ酸配列（シグナル配列あり）（SEQ ID NO:42）
2017501137.tif 000116
FZD8-Fc変異体54F16アミノ酸配列（シグナル配列あり）（SEQ ID NO:43）
2017501137.tif 000117
FZD8-Fc変異体54F26（シグナル配列あり）（SEQ ID NO:44）
2017501137.tif 000118
FZD8-Fc変異体54F28（シグナル配列あり）（SEQ ID NO:45）
2017501137.tif 000119
ヒトWnt1 C末端システインリッチドメイン（aa288〜370）（SEQ ID NO:46）
2017501137.tif 000120
ヒトWnt2 C末端システインリッチドメイン（aa267〜360）（SEQ ID NO:47）
2017501137.tif 000121
ヒトWnt2b C末端システインリッチドメイン（aa298〜391）（SEQ ID NO:48）
2017501137.tif 000122
ヒトWnt3 C末端システインリッチドメイン（aa273〜355)（SEQ ID NO:49）
2017501137.tif 000123
ヒトWnt3a C末端システインリッチドメイン（aa270〜352）（SEQ ID NO:50）
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ヒトWnt7a C末端システインリッチドメイン（aa267〜359）（SEQ ID NO:51）
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ヒトWnt7b C末端システインリッチドメイン（aa267〜349）（SEQ ID NO:52）
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ヒトWnt8a C末端システインリッチドメイン（aa248〜355）（SEQ ID NO:53）
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ヒトWnt8b C末端システインリッチドメイン（aa245〜351）（SEQ ID NO:54）
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ヒトWnt10a C末端システインリッチドメイン（aa335〜417）（SEQ ID NO:55）
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ヒトWnt10b C末端システインリッチドメイン（aa307〜389）（SEQ ID NO:56）
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リンカー（SEQ ID NO:57）
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リンカー（SEQ ID NO:58）
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リンカー（SEQ ID NO:59）
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リンカー（SEQ ID NO:60）
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リンカー（SEQ ID NO:61）
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CCND2フォワードプライマー (SEQ ID NO:62)
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CCND2リバースプライマー (SEQ ID NO:63)
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CCND2 プローブ (SEQ ID NO:64)
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CTBP2フォワードプライマー (SEQ ID NO:65)
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CTBP2リバースプライマー (SEQ ID NO:66)
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CTBP2 プローブ (SEQ ID NO:67)
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DKK1フォワードプライマー (SEQ ID NO:68)
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DKK1リバースプライマー (SEQ ID NO:69)
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DKK1 プローブ (SEQ ID NO:70)
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FBXW2フォワードプライマー (SEQ ID NO:71)
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FBXW2リバースプライマー (SEQ ID NO:72)
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FBXW2 プローブ (SEQ ID NO:73)
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RHOU1フォワードプライマー (SEQ ID NO:74)
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RHOU1リバースプライマー (SEQ ID NO:75)
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RHOU1 プローブ (SEQ ID NO:76)
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WIF1フォワードプライマー (SEQ ID NO:77)
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WIF1リバースプライマー (SEQ ID NO:78)
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WIF1 プローブ (SEQ ID NO:79)
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【図１Ａ】
2017501137.tif 000191
【図１Ｂ】
2017501137.tif 000192
【図１Ｃ】
2017501137.tif 000193
【図１Ｄ】
2017501137.tif 000194
【図１Ｅ】
2017501137.tif 000195
【図１Ｆ】
2017501137.tif 000196
【図１Ｇ】
2017501137.tif 000197
【図１Ｈ】
2017501137.tif 000198
【図２】
2017501137.tif 000199
【図３】
2017501137.tif 000200
【図４】
2017501137.tif 000201
【図５】
2017501137.tif 000202
【図６Ａ】
2017501137.tif 000203
【図６Ｂ】
2017501137.tif 000204
【図６Ｃ】
2017501137.tif 000205
【図６Ｄ】
2017501137.tif 000206
【図６Ｅ】
2017501137.tif 000207
【図６Ｆ】
2017501137.tif 000208
【図７】
2017501137.tif 000209
【配列表】
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【国際調査報告】
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