(57)【要約】炭水化物プロセシング酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、突然変異により触媒的に不活性化された。追加の突然変異により、高親和性かつ特異性のＮ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、又は両方を含む、レクチン様の性質を有する触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質を得た。2017513488.tif 000066
2017513488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質であって、対応する野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質と比べて複数のアミノ酸突然変異を有し、前記複数の突然変異が、
（ａ）前記ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の触媒活性を低下又は消失させる少なくとも１つの第１の突然変異；及び
（ｂ）結合親和性又は結合特異性に影響を与える少なくとも１つの第２の突然変異
を含む、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２】
前記第２の突然変異が、
（ｉ）Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性を高め；かつ／又は
（ｉｉ）Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を増加させる
突然変異を含む、請求項２に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３】
前記Ｏ結合型グリカンがＯ結合型ＧｌｃＮＡｃを含む、請求項２に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項４】
前記Ｏ結合型グリカンがＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、請求項２に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項５】
前記対応する野生型タンパク質が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ（配列番号３）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号４）、及びフラボバクテリウム・ミリコラ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号５）からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項６】
前記対応する野生型タンパク質が、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）を含む、請求項５に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項７】
前記第１の突然変異が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）におけるアミノ酸位置６０、１１８、２０６、若しくは２４８、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列における対応する位置に突然変異を含む、前記の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項８】
前記第２の突然変異が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）におけるアミノ酸位置５７、６０、６２、１１８、１１９、１２０、１２３、１２５、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１９２、２０６、若しくは２４８、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列における対応する位置に突然変異を含む、前記の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項９】
配列番号１のＤ５７位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１０】
配列番号１のＤ６０位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１１】
配列番号１のＹ６２位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にグリシン、トリプトファン、セリン、若しくはトレオニンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１２】
配列番号１のＥ１１８位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、グルタミン、トレオニン、若しくはシステインでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１３】
配列番号１のＴ１１９位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、若しくはバリンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１４】
配列番号１のＷ１２０位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にチロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１５】
配列番号１のＫ１２３位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１６】
配列番号１のＲ１２５位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にチロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１７】
配列番号１のＫ１５３位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１８】
配列番号１のＳ１５４位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にトレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１９】
配列番号１のＳ１５５位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２０】
配列番号１のＩ１５６位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、若しくはヒスチジンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２１】
配列番号１のＤ１５７位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２２】
配列番号１のＧ１９２位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にイソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２３】
配列番号１のＥ２０６位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にセリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、若しくはアルギニンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２４】
配列番号１のＲ２４８位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にトリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、若しくはリジンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２５】
Ｄ５７位、Ｄ６０位、Ｉ１５６位、Ｇ１９２位、及びＥ２０６位に突然変異を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２６】
Ｙ６２位、Ｅ１１８位、Ｓ１５５位、Ｒ２４８Ｗ位、又はこれらの任意の組合せの位置に突然変異をさらに含む、請求項２５に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２７】
（ａ）Ｄ５７Ｒ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｇ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｄ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｃ、及びＥ２０６Ｓ
（ｂ）Ｄ５７Ｃ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｗ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｑ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｔ、及びＥ２０６Ｒ
（ｃ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｄ）Ｄ５７Ｗ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｍ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｗ、及びＲ２４８Ｓ
（ｅ）Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｆ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ａ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｇ）Ｄ５７Ｌ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｈ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｅ１１８Ｑ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｉ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｊ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｋ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｋ１５３Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｌ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｍ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｎ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｏ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｐ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
（ｑ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｄ１５７Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｒ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｓ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
（ｔ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＥ２０６Ｓ
から選択される複数の突然変異を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２８】
クローンＤ６０Ａ、Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、Ｒ９１１３、又はＲ９１１Ｃ６０Ａによって発現される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２９】
Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ、又はＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ及びＯ結合型ＧａｌＮＡｃの両方に対する結合特異性及び親和性を増加させる第２の突然変異を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３０】
Ｎ結合型グリカン、Ｎ結合型複合糖質、Ｎ結合型糖ペプチド、Ｎ結合型糖タンパク質、又は遊離Ｎ−グリカンに結合する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３１】
Ｏ結合型グリカン、Ｏ結合型複合糖質、Ｏ結合型糖ペプチド、Ｏ結合型糖タンパク質、又は遊離Ｏ−グリカンに結合する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３２】
第２の成分に共有結合する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む第１の成分を含むコンジュゲート。
【請求項３３】
前記第２の成分がタンパク様成分である、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記第２の成分が非タンパク様成分である、請求項３２記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記第２の成分が治療薬又は診断薬である、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含むアフィニティーマトリックス。
【請求項３８】
固形支持体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子からなる群から選択される、請求項３７に記載のアフィニティーマトリックス。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、又はアフィニティーマトリックスと、使用説明書とを含むキット。
【請求項４０】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質又はコンジュゲート、又は請求項３６に記載の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
発現ベクターである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
請求項４１又は４２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４４】
細菌細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞又は酵母細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を作製するための方法であって、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質又はコンジュゲート、又は請求項３６に記載の融合タンパク質を、単離ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は宿主細胞から発現させるステップを含む、方法。
【請求項４７】
Ｎ結合型グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記Ｎ結合型グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項４８】
前記検出されたＮ結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｎ結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｏ結合型グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＯ結合型グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
Ｏ結合型グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項５１】
前記検出されたＯ結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｏ結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｏ結合型グリカンが、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
遊離Ｎ−グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｎ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記遊離Ｎ−グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項５５】
遊離Ｏ−グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｏ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記遊離Ｏ−グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項５６】
前記遊離Ｏ−グリカンが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃを含む、請求項５５項に記載の方法。
【請求項５７】
Ｎ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンを得るステップ
を含む、方法。
【請求項５８】
Ｏ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを得るステップ
を含む、方法。
【請求項５９】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含む診断組成物又は治療組成物。
【請求項６０】
前記ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、前記コンジュゲート、又は前記融合タンパク質が検出可能に標識される、請求項５９に記載の診断組成物又は治療組成物。
【請求項６１】
前記検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、りん光標識、比色標識、酵素標識、免疫標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識、又は電磁標識を含む、請求項６０に記載の診断組成物又は治療組成物。
【請求項６２】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の、治療薬としての使用。
【請求項６３】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の、診断薬としての使用。
【請求項６４】
標的薬物送達のための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
【請求項６５】
生物学的又は実験室サンプル中のＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンの存在又は量の検出のための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
【請求項６６】
生物学的又は実験室サンプル中のＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンの存在又は量の検出のための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
【請求項６７】
前記Ｏ結合型グリカンが、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記遊離Ｏ−グリカンが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃを含む、請求項６６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる２０１４年４月１８日出願の米国仮特許出願第６１／９８１，３３５号明細書の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
背景
グリコシル化及び炭水化物認識は、真核生物学の欠くことのできない必須の特徴である。生物中に存在する多数のグリカン（グライコーム）は、細胞局在及び一時的状態を含む多くの特徴に依存する動的特徴であり、かつ疾患状態、例えば、癌で不安定になる、又は病原体による接着に利用され得る。グリコシル化の変化は、疾患バイオマーカーとして機能し得るだけではなく、組換え治療用生物製剤の薬理学的特性に影響を与え得る。グリカンの不均質性は、ロット間の一貫性、免疫原性、薬物動態、活性、及びクリアランスに影響を与え得る。タンパク質及び核酸の場合とは異なり、グリカンの配列決定及び構造の特徴付けは、骨の折れる多段階プロセスであり、典型的には、サンプルの濃縮、酵素消化、及び質量分光分析、リアルタイム監視ができないプロセスを必要とする。３分の２を超える治療用生物製剤が、グリコシル化されており、バッチの許容には、グリコシル化パターンが設定範囲内である必要がある。
【０００３】
診断及び治療用途におけるグリカンのバイオマーカーとしての利用は、高度に特異的な検出試薬の製造における困難さによって妨げられ（Ｋｕｚｍａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１，３１（２０１３）（非特許文献1））、これは、グリカン構造が広範な多様性を有することから想定外ではない（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ５，１０８７−１１０４（２００９））（非特許文献2））。グリカンは、レクチン、抗体、及び酵素を含むタンパク質のいくつかのクラスによって認識される。レクチンは、典型的には、低い親和性（ｍＭ〜μＭ）及び広範な又はコンテクスト依存性グリカン認識を示すが（Ｄｅｂｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１７，４１−５５  （１９８１）（非特許文献3）；Ｌｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ；１９８６）（非特許文献4）；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ＆Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）２９１，２３５７−２３６４（２００１）（非特許文献5））、これらの問題にもかかわらず、レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、グリカン及び複合糖質の分離及び濃縮において最も広く適用されている技術である。抗炭水化物抗体は、レクチンと比較して改善された親和性を示し、かつ特定のグリカンに対して高度に特異的であり得るが、炭水化物が一般に免疫原性が低いことから、製造が困難であり得る。グリカンプロセシング酵素は、多くの場合、基質構造に関して非常に選択的であり、グリカン処理における不可欠の役割を反映している。部位特異的突然変異誘発法が、不活性な突然変異体の作製に利用され、基質特異性の特徴付けを容易である（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ８，２３３８−２３４６  （１９９９）（非特許文献6））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｕｚｍａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１，３１（２０１３）
【非特許文献２】Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ５，１０８７−１１０４（２００９）
【非特許文献３】Ｄｅｂｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１７，４１−５５  （１９８１）
【非特許文献４】Ｌｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ；１９８６）
【非特許文献５】Ｂｅｒｔｏｚｚｉ＆Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）２９１，２３５７−２３６４（２００１）
【非特許文献６】Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ８，２３３８−２３４６  （１９９９）
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、グリカン特異的な分析、診断、及び治療のツール及び試薬、これらの使用方法、並びにグリカン特異的な分析、診断、及び治療のツール及び試薬の調製プロセスに関する。Ｎ−グリカンプロセシング酵素、ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ（また、一般的にはペプチド：Ｎグリカナーゼ又はＰＮＧａｓｅ  Ｆとして知られている）は、突然変異によって触媒的に不活性化される。さらなる突然変異により、特定のグリカンに対する高い親和性かつ特異性を含むレクチン様の性質を有する触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質が得られる。一実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、Ｎ結合型グリカンに対する親和性及び特異性を示し；別の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、Ｏ結合型グリカン、例えば、Ｏ結合型Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ）又はＯ結合型Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ）に対する親和性及び特異性を示し；さらに別の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、Ｎ結合型グリカン及びＯ結合型グリカンの両方に対する親和性及び特異性を示す。触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質に共有結合したグリカンに結合する；任意選択的に、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、遊離グリカンにも結合する。
【０００６】
一態様では、本発明は、対応する野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質と比較して複数のアミノ酸突然変異を有する、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を提供する。適切な対応する野生型タンパク質の例としては、限定されるものではないが、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ（配列番号３）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号４）、及びフラボバクテリウム・ミリコラ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号５）が挙げられる。複数の突然変異は、（ａ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の触媒活性を低下又は消失させる少なくとも１つの第１の突然変異；及び（ｂ）結合親和性又は結合特異性に影響を与える少なくとも１つの第２の突然変異を含む。第２の突然変異は、（ｉ）Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性を高める突然変異；又は（ｉｉ）Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を増加させる突然変異の一方又は両方を含み得る。第２の突然変異は、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ、又はＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ及びＯ結合型ＧａｌＮＡｃの両方に対する結合特異性及び親和性を増加させることができる。一実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、Ｎ結合型グリカン、Ｎ結合型複合糖質、Ｎ結合型糖ペプチド、Ｎ結合型糖タンパク質、又は遊離Ｎ−グリカンに結合する。これに加えて又は別法では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、Ｏ結合型グリカン、Ｏ結合型複合糖質、Ｏ結合型糖ペプチド、Ｏ結合型糖タンパク質、又は遊離Ｏ−グリカンに結合する。
【０００７】
第１の（不活性化させる）突然変異は、例えば、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）におけるアミノ酸の６０位、１１８位、２０６位、若しくは２４８位の突然変異、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置の突然変異を含み得る。
【０００８】
（結合親和性及び／又は結合特異性に影響を与える）第２の突然変異は、例えば、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）におけるアミノ酸の５７位、６０位、６２位、１１８位、１１９位、１２０位、１２３位、１２５位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１９２位、２０６位、若しくは２４８位の突然変異、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置の突然変異を含み得る。一部の突然変異は、触媒活性を低下又は消失させ得ると共に、結合特異性及び／又は結合親和性に影響を与え得るという点で、第１及び第２の突然変異の両方として機能し得る。
【０００９】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＤ５７位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、ロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、又はトリプトファンが挙げられる。
【００１０】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＤ６０位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、アラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、又はトリプトファンが挙げられる。
【００１１】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＹ６２位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、グリシン、トリプトファン、セリン、又はトレオニンが挙げられる。
【００１２】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＥ１１８位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、アラニン、グルタミン、トレオニン、又はシステインが挙げられる。
【００１３】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＴ１１９位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、又はバリンが挙げられる。
【００１４】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＷ１２０位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、又はセリンが挙げられる。
【００１５】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＫ１２３位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、又はトリプトファンが挙げられる。
【００１６】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＲ１２５位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、チロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、又はトリプトファンが挙げられる。
【００１７】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＫ１５３位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、又はチロシンが挙げられる。
【００１８】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＳ１５４位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、トレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、又はチロシンが挙げられる。
【００１９】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＳ１５５位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、又はチロシンが挙げられる。
【００２０】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＩ１５６位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、又はヒスチジンが挙げられる。
【００２１】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＤ１５７位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、又はチロシンが挙げられる。
【００２２】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＧ１９２位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、イソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、又はセリンが挙げられる。
【００２３】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＥ２０６位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、セリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、又はアルギニンが挙げられる。
【００２４】
別法又はこれに加えて、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、配列番号１のＲ２４８位又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアミノ酸置換を含み得；この位置における適切な置換の例としては、トリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、又はリジンが挙げられる。
【００２５】
一実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、Ｄ５７位、Ｄ６０位、Ｉ１５６位、Ｇ１９２位、及びＥ２０６位に突然変異を有する。任意選択的に、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質はまた、Ｙ６２位、Ｅ１１８位、Ｓ１５５位、Ｒ２４８Ｗ位、又はこれらの任意の組合せ位置に突然変異を含む。
【００２６】
本発明の例示的な触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、限定されるものではないが、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）に対して複数の突然変異を有する以下のＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異を含む：
（ａ）Ｄ５７Ｒ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｇ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｄ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｃ、及びＥ２０６Ｓ
（ｂ）Ｄ５７Ｃ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｗ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｑ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｔ、及びＥ２０６Ｒ
（ｃ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｄ）Ｄ５７Ｗ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｍ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｗ、及びＲ２４８Ｓ
（ｅ）Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｆ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ａ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｇ）Ｄ５７Ｌ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｈ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｅ１１８Ｑ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｉ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｊ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｋ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｋ１５３Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｌ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｍ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｎ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｏ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｐ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
（ｑ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｄ１５７Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｒ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｓ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
（ｔ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＥ２０６Ｓ。
【００２７】
一部の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、クローンＤ６０Ａ、Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、Ｒ９１１３、又はＲ９１１Ｃ６０Ａによって発現される。
【００２８】
別の態様では、本発明は、第１の成分として、第２の成分に共有結合する触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含むコンジュゲートを提供する。第２の成分は、タンパク様成分又は非タンパク様成分である。第２の成分は、治療用物質、例えば、薬物、又は診断用物質、例えば、検出可能な標識、又は分析試薬であり得る。
【００２９】
別の態様では、本発明は、本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。融合タンパク質は、好都合に宿主細胞から発現され得る。
【００３０】
別の態様では、本発明は、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含むアフィニティーマトリックスを提供する。アフィニティーマトリックスの例としては、限定されるものではないが、固体支持体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子が挙げられる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、又はアフィニティーマトリックス及び使用説明書を含むキットを提供する。任意選択的に、このキットは、緩衝液、塩、標識若しくは検出試薬、又は他の診断若しくは分析試薬を含み得る。
【００３２】
別の態様では、本発明は、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、そのタンパク様コンジュゲート、又は本明細書で記載される融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。また、このポリヌクレオチドを含む又は取り込んだベクターも提供される。このベクターは、発現ベクター又はクローニングベクターであり得る。本発明は、前記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞（例えば、酵母）、又は動物細胞、例えば、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞であり得る。適切な宿主細胞の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞又は酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を作製する方法を提供する。触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質又はそのタンパク様コンジュゲート、又は本明細書に記載の融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで単離ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は宿主細胞から発現させることができる。
【００３４】
別の態様では、本発明は、Ｎ結合型グリカンを検出する方法を提供する。この方法は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で、生物学的又は実験室サンプルを触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及びＮ結合型グリカンを検出するステップを含み得る。任意選択的に、この方法は、検出されたＮ結合型グリカンを、例えば、このグリカンの構成糖を特定すること、このグリカンの糖組成を決定すること、このグリカン内での結合位置を決定すること、又はこのグリカンの立体化学を決定することによって特徴付けることをさらに含む。
【００３５】
別の態様では、本発明は、Ｏ結合型グリカンを検出する方法を提供する。この方法は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＯ結合型グリカンへの結合を可能にする条件下で、生物学的又は実験室サンプルを触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及びＯ結合型グリカンを検出するステップを含み得る。任意選択的に、この方法は、検出されたＯ結合型グリカンを、例えば、このグリカンの構成糖を特定すること、このグリカンの糖組成を決定すること、このグリカン内での結合位置を決定すること、又はこのグリカンの立体化学を決定することによって特徴付けることをさらに含む。このＯ結合型グリカンは、例えば、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃであり得る。
【００３６】
別の態様では、本発明は、遊離Ｎ−グリカンを検出する方法を提供する。この方法は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｎ−グリカンへの結合を可能にする条件下で、生物学的又は実験室サンプルを触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び遊離Ｎ−グリカンを検出するステップを含み得る。
【００３７】
別の態様では、本発明は、遊離Ｏ−グリカンを検出する方法を提供する。この方法は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｏ−グリカンへの結合を可能にする条件下で、生物学的又は実験室サンプルを触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び遊離Ｏ−グリカンを検出するステップを含み得る。この遊離Ｏ−グリカンは、例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃであり得る。
【００３８】
別の態様では、本発明は、Ｎ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンを濃縮、単離、又は精製する方法を提供する。この方法は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で、生物学的又は実験室サンプルを触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンを得るステップを含み得る。
【００３９】
別の態様では、本発明は、Ｏ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを濃縮、単離、又は精製する方法を提供する。この方法は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で、生物学的又は実験室サンプルを触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを得るステップを含み得る。
【００４０】
別の態様では、本発明は、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は本明細書に記載の融合タンパク質を含む診断又は治療用組成物を提供する。ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、任意選択的に、検出可能に標識される。適切な検出可能な標識の例としては、限定されるものではないが、放射性標識、蛍光標識、りん光標識、比色標識、酵素標識、免疫標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識、及び電磁標識が挙げられる。
【００４１】
別の態様では、本発明は、治療薬、診断薬、又は分析試薬として、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用を提供する。また、標的薬物送達用の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用も提供される。また、生物学的又は実験室サンプル中のＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンの存在又は量の検出のための触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用も提供される。また、生物学的又は実験室サンプル中のＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンの存在又は量の検出のための触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用も提供される。Ｏ結合型グリカンは、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃであり得；同様に、遊離Ｏ−グリカンは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ｎ−グリカンの複雑さの代表的な例を示している。修飾の前に新生ポリペプチドにまとまって付着した１４糖Ｎ−グリカン構造が中心に示されている。高度に保存された５糖Ｎ−グリカンコア構造が破線のボックスで示されている。
【図２】グリカンの化学的多様性を示している。グリカンの表現を均一にするための共同努力として開発された記号命名法におけるグリカンの異なるクラス。方向性は、上部の非還元末端から底部の還元末端への方向であり、矢印は、非還元末端における延長を示している。単糖間の結合は、単糖のアノマー配置（α、アルファ及びβ、ベータ）及び酸素原子が結合する還元末端単糖の酸素原子を含む。「／」は、いずれか一方の場合に使用される（β３／４はβ３又はβ４を意味する）。複合Ｎ結合型グリカンの場合、Ｇａｌに付着した共通末端モチーフは破線のボックスで示されている。省略形ＨＳ、ＣＳ、及びＤＳはそれぞれ、ヘペリン又はヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びデルマタン硫酸に一致する。Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄの許可による再版：Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｒａｍａｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ：グリカンの構造と機能の関係についての統合システムアプローチ。２，８１７−８２４、著作権、２００５。
【図３】ＰＮＧａｓｅ  Ｆ脱グリコシル化反応を示している。ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、アスパラギン側鎖と近接ＧｌｃＮＡｃとの間のＮ−グリコシド結合（アミド結合）を切断することによってポリペプチド主鎖からのＮ結合型グリカンの放出を触媒する。遊離アンモニアの放出に加えて、ポリペプチドタンパク質主鎖のアスパラギンがアスパラギン酸に変換される。
【図４ａ】図４は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列を示している。図４ａは、指定アミノ酸配列（配列番号１）を有するフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（エリザベスキンギア・メニンゴセプチカム（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）としても知られる）のＣＤＣ３５５２単離物からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ遺伝子（配列番号２）のコード領域のｃＤＮＡ配列。アミノ酸数が左側に示され、ヌクレオチド数が右側に示されている（Ｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２４：９０−９８で発表された）。
【図４ｂ】３１４のアミノ酸配列（配列番号１）が示され、注釈が付けられている。２つのドメインには、ｄ１ｐｎｆａ１及びｄ１ｐｎｆａ２の名称が付されている。残基４３１は、還元ＧｌｃＮＡｃに一致し、残基４３２は、キトビオースリガンドの第２のＧｌｃＮＡｃに一致する。３つのジスルフィド結合が、５１〜５６、２０４〜２０８、及び２３１〜２５２に位置する。ＰＤＢ  ＩＤ  １ＰＮＦのＲＣＳＢ  ＰＤＢ（ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）からの画像（Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０，２９４９３−２９４９７）。
【図４ｃ】Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（エリザベスキンギア・メニンゴセプチカム（Ｅ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）としても知られる）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩのアミノ酸配列（配列番号３）。
【図４ｄ】バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸配列（配列番号４）。
【図４ｅ】Ｆ．ミリコラ（Ｆ．ｍｉｒｉｃｏｌａ）（エリザベスキンギア・ミリコラ（Ｅ．ｍｉｒｉｃｏｌａ）としても知られる）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸配列（配列番号５）。
【図４ｆ】ｐＯＰＨ６コード配列（配列番号７）並びにＮ末端分泌タグ及びＣ末端ヘキサ−Ｈｉｓタグを含む発現ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号６）。矢印は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の開始を示し、アスタリスクは、停止コドンを示している。
【図４ｇ−１】ｐＯＰＨ６コード配列（配列番号６のアミノ酸４〜３１７）、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１；ＰＤＢ識別名１ＰＮＦ）、Ｆ．ミリコラ（Ｆ．ｍｉｒｉｃｏｌａ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号５）、Ｂ．フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号４；ＰＤＢ識別名３ＫＳ７）、及びＦ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ（配列番号３；ＰＤＢ識別名４Ｒ４Ｘ）。
【図４ｇ−２】図４ｇ−１の続きである。
【図５】ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｎ，Ｎ'−ジアセチルキトビオースと水分子との間の分子内水素結合接触部を示す概略図を示している。タンパク質残基は、長方形のボックス内に１文字のアミノ酸コードと配列番号で示され、水分子は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに委託されたファイルの番号に一致する番号で示されている。還元末端ＧｌｃＮＡｃ残基は左側にある。Å単位の水素結合はイタリック体で示されている。Ｗａｔ３４９（３４９）は２度出現し、一度はＯ３に接触し、１つはＡｒｇ−６１にあることに留意されたい。この研究は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｋｕｈｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｎ４−（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ）ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  Ａｍｉｄａｓｅ  Ｆ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９５；２７０：２９４９３−２９４９７で最初に発表された。著作権  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ。
【図６】ＰＮＧａｓｅ  Ｆ：キトビオース複合体の活性部位水素結合ネットワークを示している。α−キトビオースリガンド（輪郭）とのＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合溝の水素結合ネットワークが、実験Ｘ線データ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＰＮＦ）に基づいて示されている。タンパク質とリガンドとの間の結合溝の水分子は赤い球として示されている：Ｗａｔ７５、Ｗａｔ１４６、Ｗａｔ３４６、Ｗａｔ３４８、Ｗａｔ３４９。水素結合に関与する結合溝のアミノ酸：Ｄ６０、Ｒ６１、Ｙ８５、Ｅ１１８、Ｗ１２０、Ｓ１５５、Ｇ１９０、Ｗ１９１、Ｅ２０６、Ｒ２４８。
【図７】Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）設計戦略の概略図を示している。コンピューターによる方法、知識ベースのライブラリー設計、選択、並びに流れに沿った特徴付け及び評価を利用する統合的な戦略が示されている。薄い灰色のボックスは、選択された候補が所望の閾値を満たしているか否かのチェックポイントを示し、選択プロセスを、修正された選択条件で繰り返すことができる。選択された候補が、特異性及び親和性の特徴付け要件を満たしたら、この候補をアフィニティーマトリックスに固定して、Ｎ−糖ペプチド及びＮ−糖タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーベースの濃縮を評価する。
【図８】ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−キトビオース複合体のＣα位置にあるＲＭＳＤを示している。Ｗｏｏｄｓらによって作成されたＭＤシミュレーションデータ。
【図９】ＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合ポケットを示している。ａ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合部位における二糖キトビオースリガンドの４．５Å範囲内の残基。ｂ）結合に重要な残基を有する溶媒が到達可能な表面が標識されている。ＰＤＢ  ＩＤ  １ＰＮＦ。ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａパッケージで作成された分子グラフィックス。
【図１０】非増幅ＧｅｎＳｃｒｉｐｔライブラリー１の配列（配列番号８）及び制限地図を示している。発現ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの配列は、下線が引かれ、ＮｈｅＩ（太字）及びＢａｍＨＩ（イタリック体）制限部位が隣接している。合計８つの突然変異を、このライブラリー構築物にエンジニアリングした：Ｄ５７、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２、Ｅ１１８、Ｓ１５５、Ｉ１５６、Ｇ１９２、及びＥ２０６。単一点Ａ１７９Ｃヌクレオチド突然変異（矢印で示されている）が、Ｄ６０Ａアミノ酸突然変異を示すように導入された。この突然変異は、親和性相互作用を高めることが示され、また酵素の触媒活性を不活性化する又は著しく低減する。７つの部位飽和突然変異誘発部位を、ＮＮＫコドン（強調表示）縮重を用いてこのライブラリーにエンジニアリングし、Ｎは、等モルのＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧヌクレオチド混合物を表し、Ｋは、等モルのＧ又はＴヌクレオチド混合物を表す。Ｍ１３フォワードプライマー配列（配列番号９）及びＭ１３リバースプライマー配列（配列番号１０）が（小文字で）示されている。
【図１１】非増幅ＧｅｎｅＡｒｔライブラリー２の配列（配列番号１１）及び制限地図を示している。発現ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの配列は、下線が引かれ、ＮｈｅＩ（太字）及びＢａｍＨＩ（イタリック体）制限部位が隣接している。合計６つの部位飽和突然変異誘発部位を、このライブラリー構築物にエンジニアリングした：Ｄ５７、Ｄ６０（−Ｄ）、Ｉ１５６、Ｇ１９２、Ｅ２０６、及びＲ２４８。６つの部位飽和突然変異誘発部位の内の５つが、ヌクレオチド混合物で合成され、この混合物は、全てのアミノ酸が等モル分布となる。部位、Ｄ６０（矢印で示されている）では、アスパラギン酸を除く全てのアミノ酸となる改変ヌクレオチド混合物を利用した。Ｍ１３フォワードプライマー配列（配列番号１２）及びＭ１３リバースプライマー配列（配列番号１３）が（小文字で）示されている。
【図１２】ＰＮＧａｓｅ  Ｆ改変ｐＰＮＬ６酵母ディスプレイライブラリープラスミド地図を示している。
【図１３】酵母細胞表面ディスプレイを示している。酵母細胞表面のＡｇａ１ｐによって提示されたＡｇａ２ｐ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ融合タンパク質の表現。選択されたＰＮＧａｓｅ  Ｆクローン（複数可）は、Ｎ−グリカン標的と相互作用する。Ｎ−グリカン標的は、ビオチン標識され、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合された。元のｐＰＮＬ６構築物は、Ａｇａ２ｐタンパク質と融合タンパク質、この場合はＰＮＧａｓｅ  Ｆとの間にＨＡタグを含む。Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグが含められ、このタグを、各回の選択の前に酵母細胞表面の完全長Ａｇａ２ｐ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ融合タンパク質の発現を確認するためにフローサイトメトリーによって抗ｃ−ｍｙｃ蛍光抗体で検出する。通常は、約５０，０００コピーのＡｇａ−２ｐタンパク質が、酵母細胞表面に提示される。
【図１４】リボヌクレアーゼＢ糖型を示している。ＲＮａｓｅ  Ｂは、Ｎ３４に単一Ｎ−グリコシル化部位を有し、このグリコシル化部位は、Ｍａｎ５−９ＧｌｃＮＡｃ２の９つの糖型からなり得る。これらの糖型のモルパーセンテージは、９つの各グリカン構造の下に列記されている。
【図１５】酵母細胞の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を示している。磁気ビーズに結合したＮ−グリカン標的に対する酵母ディスプレイＰＮＧａｓｅ  Ｆライブラリー選択。ステップ１〜２：ＰＮＧａｓｅ  Ｆライブラリーを、最初の回の選択の開始時にビオチン−ストレプトアビジン磁気ビーズに対する陰性選択して（ｄＲＮａｓｅ  Ｂは含まない）、全てのビオチン−ストレプトアビジン磁気ビーズ結合クローンを除去する。ステップ３：ビオチン標識変性ＲＮａｓｅ  Ｂを、陽性選択を開始する前にストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（２．８μｍの直径）と共にプレインキュベートする。ステップ４：非結合酵母クローンを洗い流す。ステップ５：結合酵母クローンは保持される。ステップ６：次の回の選択のために結合クローンを増幅する。ステップ７：各回のＦＡＣＳ（不図示）の後、クローンを配列決定して濃縮及び収束を監視する。収束クローン（ｃｏｎｖｅｒｅｇｅｄ  ｃｌｏｎｅ）（複数可）を、流れに沿った特徴付けのためにＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補（複数可）として選択する。
【図１６】ＧｅｎｅＡｒｔライブラリー２を用いた酵母ディスプレイＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの選択及び濃縮を示している。（ａ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの繰り返される複数回の酵母ディスプレイ選択、増幅、及びパーセント濃縮を示している。各ライブラリーの入力サンプル、陰性選択サンプル、洗浄サンプル、及び出力サンプルのアリコートを毎回漸増して、選択及び濃縮の進行を監視する。データは、その回の入力クローンの開始数に対する選択後にビーズ結合サンプルから回収したクローン数を表す出力／入力比として表示されている。ＭＡＣＳベースの選択を１Ｍ、２Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、７Ｍ、及び８Ｍの回で行った。２回のＭＡＣＳごとに、ＦＡＣＳベースの選択を３Ｆ、６Ｆ、及び９Ｆの回で行った。理想的には、選択の各回は、変性ＲＮａｓｅ  Ｂ（ｄＲＮａｓｅ  Ｂ）又は変性アシアロフェチュイン（ｄアシアロフェチュイン）の標的Ｎ−グリカン構造に結合する機能的に適切なクローンを濃縮し、数回の選択後に収束する。濃縮及び収束は、ＦＡＣＳによるパニングの３回ごとに約５０のランダムに選択されたクローンのＤＮＡ配列決定で監視する。全てのクローン配列に対するクローンＲ９１１の濃縮は、選択の３回ごとにパーセンテージとして示される。（ｂ）濃縮クローン配列のアミノ酸のアイスロゴ。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列が底部に示されている。６つのランダム化位置の好ましいアミノ酸は、グラフィック表示で示されている。このデータは、３Ｆ、６Ｆ、及び９Ｆの選択の回から得られた約１５０のクローン配列に基づいている。各位置の最上部の残基も、選択されたクローンＲ９１１の配列である。
【図１７】酵母コロニーＰＣＲ及び配列決定プライマーを示している。
【図１８】酵母コロニーＰＣＲプラグラムを示している。
【図１９】酵母ディスプレイによって選択されたＰＮＧａｓｅ  ＦクローンのＰＣＲ増幅プライマーを示している。５'の太字の配列は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６配列に一致し、３'末端は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＰＮＬ６酵母ディスプレイプラスミドのＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列に一致している。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６フォワードプライマーの３'末端の小文字「ｃ」は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６プラスミドの「Ｇ」である。完全長ＰＣＲ産物は、消化産物のＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６空ベクターに結合するために使用されるＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限部位に隣接している。
【図２０】ＰＮＧａｓｅＦ−ｐＯＰＨ６  ｏｍｐＡ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−Ｈｉｓ６配列用のＰＣＲ増幅プライマーを示している。
【図２１】ｐＯＰＨ６  ＩＩ及びＰＮＧａｓｅ  ＦクローニングのＤＮＡゲルを示している。レーン１＝１ｋｂのＤＮＡステップラダー。レーン２＝ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）  ２９２１ｂｐ。レーン３＝ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）  ＸｂａＩ及びＸｈｏＩ二重消化２８５８ｂｐ。レーン４＝不正確な配列での挿入／連結の失敗。レーン５〜９＝正確なＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６  ＩＩ配列で連結されたＰＮＧａｓｅＦ−ｐＯＰＨ６  ＩＩベクター３９２３ｂｐ（スーパーコイル状及び非コイル状の移動バンドの両方を確認できる）。
【図２２】ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６  ＩＩベクター地図を示している。大腸菌発現（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクター、ｐＯＰＨ６  ＩＩは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）ベクターをベースとしたものであり、発現のためのｐＯＰＨ６からのＯｍｐＡ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−Ｈｉｓ６ｘ配列を有する。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６  ＩＩ発現プラスミドが、Ｄ６０Ａ単一点突然変異体、並びに酵母ディスプレイライブラリーから選択される４つのＰＮＧａｓｅ  Ｆクローン：Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、及びＲ９１１３に使用される。
【図２３】Ｄ６０Ａの勾配溶出プロフィールを示している。第１の鋭いピークは、５０ｍＭ  イミダゾール洗浄である（８．３％Ｂ）。第２のピークは、約１１０ｍＭ  イミダゾールで吸収が最大のＤ６０Ａの溶出に一致する（２０．５％Ｂ）。
【図２４】ＩＭＡＣ精製Ｄ６０ＡクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法を示している。ａ）Ｄ６０Ａ発現及びＩＭＡＣ精製サンプルのクマーシー染色変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ｂ）Ｄ６０Ａ発現及びＩＭＡＣ精製サンプルの複製ゲルのウェスタンブロット法。１：５０００の希釈のマウス抗Ｈｉｓ６  ＨＲＰ抗体を使用し、ＤＡＢ基質で発色させた。発現Ｄ６０Ａに一致する３６ｋＤａバンドは、レーン１〜３、５、及び８〜９の全てで確認できる。レーン１＝培養物。レーン２＝培養上清。レーン３＝可溶性ペリプラズム画分。レーン４＝陽性対照ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（３００ｎｇ）。レーン５＝不溶性細胞溶解物。レーン６＝通過負荷。レーン７＝タンパク質マーカー：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ（ブロット上で確認できる）、５０ｋＤａ、３７ｋＤａ（緑色）、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ（ブロット上で確認できる）、１５ｋＤａ、１０ｋＤａ（緑色）。レーン８＝５０ｍＭ  イミダゾール洗浄。レーン９＝イミダゾール勾配（２４μｇ）からのプールされた溶出ピーク画分。
【図２５】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムでのＤ６０Ａ  ＳＥＣクロマトグラムを示している。ＩＭＡＣ溶出画分を、ＳＥＣに通して高純度Ｄ６０Ａタンパク質を得た。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０Ａは共に１２ｍＬの保持容量で溶出した。
【図２６】ＳＥＣ精製Ｄ６０ＡクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法を示している。ａ）Ｄ６０Ａ  ＳＥＣ溶出ピーク画分のクマーシー染色変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ｂ）Ｄ６０Ａ  ＳＥＣ溶出ピーク画分の複製ゲルのウェスタンブロット法。１：５０００の希釈のマウス抗Ｈｉｓ６  ＨＲＰ抗体を使用し、ＤＡＢ基質で発色させた。発現Ｄ６０Ａに一致する３６ｋＤａバンドは、レーン２〜７の全てで確認できる。レーン１＝タンパク質マーカー（ウェスタンブロット法では確認できない）：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、３７ｋＤａ（緑色）、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ。レーン２〜７＝Ｄ６０Ａ溶出画分（それぞれ１μｇ）。レーン８＝陽性対照ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（５００ｎｇ）。Ｎ末端ＯｍｐＡ分泌タグを含まない、ＯｍｐＡ−Ｄ６０Ａ及びＤ６０Ａに一致する約３６ｋＤａの二重バンドを可視化するために、ゲルバンドを意図的に、通常よりも長く移動できるようにした。
【図２７】Ｒ９１１  ＩＭＡＣ溶出クロマトグラムを示している。Ｒ９１１の勾配溶出プロフィール。第１の鋭いピークは、５０ｍＭ  イミダゾール洗浄である（８．３％Ｂ）。浅くて広いピークは、Ｒ９１１の溶出に一致し、１４．５％Ｂ〜３１％Ｂである。
【図２８】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬカラムでのＲ９１１  ＳＥＣクロマトグラム。ＩＭＡＣ溶出画分をＳＥＣに通した。１４．０２ｍＬの保持容量で最大ピークを有する４つ目のピークが、この同じカラムのＤ６０Ａ溶出に一致している。
【図２９】ＩＭＡＣ及びＳＥＣ精製Ｒ９１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法を示している。ａ）Ｒ９１１  ＩＭＡＣ及びＳＥＣ溶出画分のクマーシー染色変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ｂ）Ｒ９１１  ＩＭＡＣ及びＳＥＣ溶出画分の複製ゲルのウェスタンブロット法。１：５０００の希釈のマウス抗Ｈｉｓ６  ＨＲＰ抗体を使用し、ＤＡＢ基質で発色させた。発現Ｒ９１１に一致する３６ｋＤａバンドは、レーン２〜９の全てで確認できる。レーン１＝タンパク質マーカー：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、３７ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ、１０ｋＤａ。レーン２＝培養物。レーン３＝不溶性細胞溶解物。レーン４＝可溶性ペリプラズム画分。レーン５＝５０ｍＭ  イミダゾール洗浄。レーン６＝プールされたＩＭＡＣ溶出画分番号４２〜６３。レーン７＝１０．３７ｍＬの保持容量での図２８の第２のＳＥＣ溶出ピークに一致するＳＥＣ画分の１５番。レーン８＝１２．４１ｍＬの保持容量での図２８の第３のＳＥＣ溶出ピークに一致するＳＥＣ画分番号２３。レーン９＝１４．０２ｍＬの保持容量での図２８の第４のＳＥＣ溶出ピークに一致するＳＥＣプール画分の２９〜３７番。レーン１０＝陽性対照Ｄ６０Ａ（１μｇ）。
【図３０】ＲＮａｓｅ  Ｂ  ｐＨスカウティングを示している。１０ｍＭ  酢酸ｐＨ５．５結合緩衝液により、ＲＮａｓｅリガンドのカルボキシメチルデキストランＣＭ−５センサー表面チップへの最も効率的な結合が得られた。
【図３１−１】図３１は、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｄ６０Ａ、Ｒ９１１、及びＲ９１１  Ｃ６０ＡのＳＰＲセンソグラムを示している。約３２００ＲＵの最大の応答（ＲＭＡＸ）を得るために変性ＲＮａｓｅ  Ｂを固定することによって高密度表面を用意した。ａ）ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ：２５０ｎＭ〜６４μＭ  段階希釈、ｂ）Ｄ６０Ａ：段階希釈７２ｎＭ〜２０μＭ。得られたデータをＳｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃによって分析した。
【図３１−２】図３１−１の続きである。ｃ）Ｒ９１１：７８ｎＭ〜５μＭ  段階希釈、及びｄ）Ｒ９１１  Ｃ６０Ａ：７８ｎＭ〜１０μＭ  段階希釈。得られたデータをＳｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃによって分析した。
【図３２】ＲＮａｓｅ  Ａ及びＲＮａｓｅ  Ｂを用いたＤ６０Ａアフィニティークロマトグラフィーを示している。
【図３３】ＲＮａｓｅ  ＡとＲＮａｓｅ  ＢとのＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーの比較を示している。
【図３４】脱グリコシル化ＲＮａｓｅ  ＢのＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーを示している。
【図３５】ＲＮａｓｅ  Ａ及びＲＮａｓｅ  Ｂのトリプシン消化のＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーを示している。
【図３６】競合溶出のために遊離キトビオースを用いたＲＮａｓｅ  ＢのＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーを示している。
【図３７】競合溶出のために遊離キトビオースを用いたＭＣＦ７細胞抽出物のＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーを示している。
【図３８】Ｄ６０Ａ及びＲ９１１クローンのグリカンアレイスクリーニングを示している。
【図３９】実験及び理論水素結合を示している。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ残基Ｄ６０、Ｒ６１、Ｅ１１８、Ｗ１２０、及びＷ１９１とキトビオースリガンド（輪郭）との間の７つの水素結合が破線で示されている。ａ）実験１ＰＮＦ  Ｘ線結晶学データで報告された水素結合。ｂ）１ＰＮＦのＭＤシミュレーションデータから計算した理論水素結合。
【図４０】１００ナノ秒の１ＰＮＦのＭＤシミュレーション中の相互作用エネルギーの安定性を示している。
【図４１】１００ナノ秒のＲ９１１  ＤｕｎのＭＤシミュレーション中の相互作用エネルギーの安定性を示している。相互作用エネルギーは、シミュレーションの５５ナノ秒後まで安定しない。５ナノ秒でのエネルギーデータは、計算ノードのハードウェアの故障によって起きたデータの喪失によって得ることができなかった。
【図４２】Ｃｈｉ１及びＣｈｉ２二面角のＤ５７Ｌ回転異性体のヒストグラムを示している。
【図４３】Ｃｈｉ１二面角のＤ６０Ｃ回転異性体のヒストグラムを示している。
【図４４】Ｃｈｉ１二面角のＥ２０６Ｓ回転異性体のヒストグラムを示している。
【図４５】Ｃｈｉ１及びＣｈｉ２二面角のＩ１５６Ｌ回転異性体のヒストグラムを示している。
【図４６】Ｃｈｉ１及びＣｈｉ２二面角のＧ１９２Ｉ回転異性体のヒストグラムを示している。
【図４７】Ｃｈｉ１及びＣｈｉ２二面角のＲ２４８Ｗ回転異性体のヒストグラムを示している。
【図４８】Ｒ９１１  Ｄｙｎ  ＭＤのシミュレーションの水素結合及び好ましい回転異性体を示している。Ｒ９１１残基Ｄ６０Ｃ、Ｒ６１、及びＷ１９１とキトビオース（輪郭）との間の５つの理論水素結合が破線によって示されている。Ｒ９１１突然変異（オレンジ色）の回転異性体は、７３ナノ秒のシミュレーション軌道から抽出された最も頻度の高い向きで示されている。
【図４９】糖トリペプチドリガンドを用いた１００ナノ秒の１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）のＭＤシミュレーション中の相互作用エネルギーの安定性を示している。５１〜７０ナノ秒の間の平均相互作用エネルギーは、約−５２．７ｋｃａｌ／モルであり、８０〜１００ナノ秒の間の平均相互作用エネルギーは、−４４．０ｋｃａｌ／モルである。
【図５０】糖トリペプチドと複合体を形成したｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの還元ＧｌｃＮＡｃの椅子型及びスキューボート環コンフォメーションを示している。結合ポケット内に糖トリペプチドを有するｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの表面疎水性の表現。ａ）ＭＤシミュレーションの最初の約７０ナノ秒の間に観察された還元ＧｌｃＮＡｃの４Ｃ１椅子型コンフォメーション（６０ナノ秒のスナップ写真）。挿入画像は、環原子のみを有する４Ｃ１コンフォメーションを示している。ｂ）シミュレーションの最後の２６ナノ秒の間のスキューボートコンフォメーション（８６ナノ秒のスナップ写真）。挿入画像は、環原子のみを有するスキューボートコンフォメーションを示している。
【図５１】６０ナノ秒の時点での１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）及び糖トリペプチドのＭＤシミュレーションの水素結合を示している。水素結合は破線で示されている。糖トリペプチドリガンドは、緑色で輪郭が示されている。触媒活性（Ｄ６０及びＥ２０６）、基質認識、及び相互作用の安定化に重要なアミノ酸残基が示されている。シミュレーションした水素結合Ｄ６０−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ３１６  ＮＡｃ及びＹ８５−ＯＨ−Ｎ３１６−Ｏδ（キトビオース結合アスパラギン酸）は中心に向かって描写されている。還元ＧｌｃＮＡｃは、４Ｃ１コンフォメーションである。
【図５２】８４ナノ秒の時点での１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）及び糖トリペプチドのＭＤシミュレーションの水素結合を示している。水素結合は破線で示されている。糖トリペプチドリガンドは、輪郭が示されている。触媒活性（Ｄ６０及びＥ２０６）、基質認識、及び相互作用の安定化に重要なアミノ酸残基が示されている。シミュレーションしたＷ２０７−Ｎε−Ｎ３１６−Ｏ（キトビオース結合アスパラギン酸）は左上部に向かって描写されている。還元ＧｌｃＮＡｃは、スキューボートコンフォメーションである。
【図５３】Ｏ−ＧｌｃＮＡｃペプチドリガンドを用いた５０ナノ秒の１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）のＭＤシミュレーション中の相互作用エネルギーの安定性を示している。２９ナノ秒〜３９ナノ秒の間の軌道の部分が、ＭＭ−ＧＢＳＡ分析のために選択された。
【図５４】Ｏ−ＧｌｃＮＡｃペプチドリガンドを用いた５０ナノ秒の１ＰＮＦＤ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）のＭＤシミュレーション中の相互作用エネルギーの安定性を示している。軌道の最後の部分（３９ナノ秒〜４９ナノ秒）が、ＭＭ−ＧＢＳＡ分析のために選択された。
【図５５】Ｏ−ＧｌｃＮＡｃペプチドリガンドを用いた５０ナノ秒のＲ９１１  Ｄｙｎ  のＭＤシミュレーション中の相互作用エネルギーの安定性を示している。軌道の最後の部分（３９ナノ秒〜４９ナノ秒）が、ＭＭ−ＧＢＳＡ分析のために選択された。
【図５６】４５ナノ秒の時点でのＲ９１１及びＧｌｃＮＡｃ−β−ＳｅｒのＭＤシミュレーションを示している。ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒリガンドは、輪郭が示されている。Ｎ−アセチル基が深い疎水性溝の中に延びた結合ポケットのリガンドを示すＲ９１１−ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒ複合体の表面疎水性の表現。理論水素結合は破線で示されている。Ｒ９１１突然変異残基が示されている。
【図５７】Ｒ９１１突然変異体のＬ５７Ｄ、Ｌ１５６Ｉ、及びＩ１９２ＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製を示している。
【図５８】Ｌ５７Ｄ精製プロフィールを示している。Ｌ５７Ｄは、ＩＭＡＣ分解からの２つの溶出ピークを有する。
【図５９】Ｒ９１１とは異なるＳＥＣ溶出パターンを示すＬ５７Ｄ突然変異体を示している。
【図６０】Ｏ−グリカナーゼ活性アッセイを示している。ｐＮＰ−Ｏ−グリカン基質（２５０μｇ／ｍＬ）を１０ピコモルの試験タンパク質と共に、２５μＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．５、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡで、３７℃で６０分間インキュベートした。２００μＬの０．２−Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液の添加によって反応を停止させた。４０５ｎｍでの吸光度を、酵素活性の指標として測定した。基質の省略形：ＧｌｃＮＡｃ：ｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ；キトビオース：ｐ−ニトロフェニルＮ、Ｎ'−ジアセチル−β−Ｄ−キトビオシド；α−ＧａｌＮＡｃ：ｐ−ニトロフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド；β−ＧａｌＮＡｃ：ｐ−ニトロフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。
【図６１】Ｎ−グリカナーゼ活性アッセイを示している。Ｎ−グリコシル化基質（１μｇの変性ＲＮａｓｅ  Ｂ）を１０ピコモルの試験タンパク質と共に、１５μＬの５０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．０、３７℃で６０分間インキュベートした。陰性対照及びＭ．Ｗ．マーカーとして、変性ＲＮａｓｅ  Ａを試験タンパク質と共に並列にインキュベートした。濃縮ＳＤＳ−Ｓａｍｐｌｅ緩衝液の添加及び１００℃で５分間の加熱によって反応を停止させた。最終産物を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
例示的な実施形態の詳細な説明
本発明は、酵素ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）に由来する触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質、及び本明細書に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の作製及び使用法方法を提供する。好ましいＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素及びコード配列は、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から得られるＰＮＧａｓｅ  Ｆである。本発明は、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆについて主に説明するが、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの他の供給源も利用できることを理解されたい。
【００４４】
ペプチド：Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）という名称は、糖ペプチド又は糖タンパク質中に存在するアスパラギンからＮ結合型グリカンを切断する化学反応を触媒する酵素のファミリーを含む。より具体的には、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素は、ポリペプチドのアスパラギン側鎖とＮ−グリカンの近接Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）との間のアミド結合の切断を触媒して、（置換）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニルアミン及びアスパラギン酸残基を含むペプチドを生成するＮ−グリカン放出酵素のクラスである。Ｎ結合型グリカンは、グルコサミン残基がさらにグリコシル化され得るＮ４−（アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギン残基であり得る。加水分解反応により、グリカン及び遊離アンモニアが放出され、アスパラギンがアスパラギン酸に変換されることなる（図３を参照）。本明細書で使用される「Ｎ−グリカン」及び「Ｏ−グリカン」という語は、一般に、加水分解反応で放出される遊離グリカンを指すが、文脈上、ペプチド又は他の基質に結合したグリカンも指すこともある。
【００４５】
「ＰＮＧａｓｅ  Ｆ」という名称は、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から単離された最初に知られたＰＮＧａｓｅ酵素に付与されたが；「ＰＮＧａｓｅ  Ｆ」という語は、上記のグリコシド活性を有する酵素のファミリーに関連するようになった。本発明は、突然変異の根拠としてＦ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて主に説明されるが、本発明は、このために他のＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の使用も包含する。
【００４６】
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆに対して複数の突然変異を含み、この突然変異の少なくとも１つは、酵素の触媒活性を低下又は消失させる。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの触媒活性は、好ましくは、活性部位における少なくとも１つの残基の部位特異的突然変異（「第１の」突然変異）によって低下又は消失される。
【００４７】
これに加えて、１つ以上の他のアミノ酸残基が、結合特異性又は結合親和性に影響を与えるように突然変異される（「第２の」突然変異）。一実施形態では、第２の突然変異は、活性を低下させる第１の突然変異のみを有する対応する突然変異体ＰＮＧａｓｅ  ＦのＮ結合型グリカンに対する結合親和性と比較して、Ｎ結合型グリカンに対する触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合親和性を高める。別の実施形態では、第２の突然変異は、１つ以上Ｏ結合型グリカン（非天然基質）に対する結合特異性及び親和性を増加させるようにＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合特異性を変更する。
【００４８】
触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質が結合する化合物は、酵素反応が実質的に抑制又は停止されるため、本明細書では「基質」ではなく「リガンド」と呼ばれることがある。
【００４９】
従って、一実施形態では、複数の突然変異の一部又は全ての結果として、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、対応する野生型酵素よりも、又は活性を低下若しくは消失させる１つ以上の突然変異のみを含む対応する不活性な突然変異体ＰＮＧａｓｅ  Ｆよりも高い親和性で天然基質Ｎ結合型グリカンに結合する。別の実施形態では、複数の突然変異の一部又は全ての結果として、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、Ｏ結合型グリカン、例えば、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃに結合する。Ｏ結合型グリカンは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの天然基質ではない。さらに別の実施形態では、複数の突然変異の一部又は全ての結果として、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、天然基質Ｎ結合型グリカン及びＯ結合型グリカンの両方、例えば、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃに結合する。Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃに結合する実施形態では、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃは、β−Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はα−Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃであり得、Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃは、β−Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ又はα−Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃであり得る。
【００５０】
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、Ｎ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、又は両方に結合する。このグリカンが共有結合する化合物は、例えば、生体分子、例えば、それぞれ糖ペプチド、糖タンパク質、若しくは糖脂質を生成するペプチド、タンパク質、若しくは脂質；天然若しくは非天然のポリマー若しくはポリマー足場；人工化合物、例えば、ペプトイド；有機リンカー分子；基質表面、例えば、樹脂又はビーズの表面；又は一般にあらゆる有機基質であり得る。糖ペプチド又は糖タンパク質では、Ｎ結合型グリカンは、典型的には、アスパラギン酸残基に付着し、Ｏ結合型グリカンは、典型的には、セリン又はトレオニン残基に付着する。
【００５１】
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質はまた、任意選択的に、加水分解型又は放出型のＮ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンに結合する。本発明は、Ｎ結合型又はＯ結合型であるグリカンの別の化合物、例えば、ペプチドアスパラギン又はペプチドセリン又はトレオニンへの結合について主に説明されるが、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の対応する遊離グリカンへの結合も、本発明によって包含されることを理解されたい。
【００５２】
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、グリコシル化化合物、又はＮ結合型グリカン又はＯ結合型グリカン（非天然基質）を含む表面に特異的に結合するが、野生型酵素と比較するとかなり遅い速度のこの化合物又は表面からのＮ結合型グリカンの切断を示す。好ましい一実施形態では、触媒的に不活性な酵素は、化合物又は表面からＮ結合型グリカンをそれほど切断しない。例えば、切断速度は、以下により詳細に説明されるように、対応する野生型酵素で観察される切断速度の５０％以下であり得る。特に好ましい一実施形態では、グリコシド結合の切断は、バックグラウンドレベルを超えては検出されない。
【００５３】
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、第１（不活性化させる）及び第２（結合特異性及び／又は結合親和性に影響を与える）の突然変異の両方を含み、本明細書では場合によっては、触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体又は触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体、又は短縮形の「ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体」と呼ばれ、これらの語は置き換え可能である。対応する野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、本明細書では場合によっては、基準化合物と呼ばれる。しかしながら、使用される専門用語にかかわらず、本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、触媒的に不活性なだけではなく；さらに、Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性を高め、かつ／又はＯ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を高める１つ以上の突然変異を含むことを理解されたい。言い換えれば、本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、例えば、以下に詳述されるようにＰＮＧａｓｅ  ＦのＤ６０位の少なくとも１つの第１の突然変異によって触媒的に不活性化され、（ｉ）追加の（第２の）突然変異を含まない対応する触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆと比較して、Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性を高くし、かつ／又は（ｉｉ）Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を高める、１つ以上の追加の第２の突然変異を含む。（ｉ）と同様にＮ結合型グリカンに対する高い結合親和性を示す触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、典型的には、触媒活性を低下又は消失させる第１の突然変異のみを有する対応するＰＮＧａｓｅ  ＦのＫＤよりも低いＫＤを有する。（ｉｉ）と同様のＯ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性の増加は、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆに対して新たに獲得した特徴である新規な特異性の導入を意味する。
【００５４】
結合親和性及び特異性の評価及び比較の方法、並びに触媒的に活性な型（基準化合物）の酵素（ここではＰＮＧａｓｅ  Ｆ）と触媒的に不活性な型（本発明の化合物）の酵素との間のようにこれらの２つの特徴の比較にかかわる特別な考慮が、本明細書、２０１０年６月１７日出願の「グリカン特異的分析ツール（Ｇｌｙｃａｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｏｏｌｓ）」という名称のＰＣＴ国際公開第２０１０／０６８８１７号パンフレット、及び２０１２年２月１６日に公開された米国特許出願公開第２０１２００４０４７４号明細書に記載されている。
【００５５】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆの系統名は、Ｎ結合型糖ペプチド−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−Ｌ−アスパラギンアミノヒドロラーゼＦであり；推奨名は、ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼＦである。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの代替名又はＰＮＧａｓｅ  Ｆの代替の実施形態は、Ｎ−オリゴ糖グリコペプチダーゼ、グリコペプチドＮ−グリコシダーゼ、グリコアミダーゼ、グリコペプチダーゼ、Ｎ−オリゴ糖グリコペプチダーゼ、及びＮ−グリカナーゼを含む（表２を参照されたい）。ＰＮＧａｓｅ  Ｆファミリーは、酵素の欧州委員会番号ＥＣ  ３．５．１．５２を有する。
【００５６】
基準化合物ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、突然変異により本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質を形成し、供給源によって限定されるものではない。触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を生成する突然変異の基礎又はプラットフォームとして機能するＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素（その核酸コード配列を含む）は、任意の好都合の生物から得ることができる。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素は、限定されるものではないが、細菌、植物、酵母、及び動物系に見られる。
【００５７】
好ましいＰＮＧａｓｅ  Ｆは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から得られる細菌ＰＮＧａｓｅ  Ｆである。フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）は、クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）及びエリザベスキンギア・メニンゴセプチカム（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）としても知られている。本発明は、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて主に説明される。従って、本明細書に記載のアミノ酸位置は、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸配列（３１４のアミノ酸；配列番号１；図４Ａ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０５４４９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６５９１０；Ｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２４：９０−９８）に基づいて指定される。図４Ａは、８つの部位で異なるＦ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の異なる菌株からの２つの相同なＦ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列を示し；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＩＤ  １ＰＮＦによって示される、Ｘ線結晶構造のために委託されたアミノ酸配列も参照されたい。アミノ酸配列番号１は、これらのアミノ酸配列、及び図４Ａに示されているように３９（Ａ／Ｔ）、１４９（Ｖ／Ｉ）、１６８（Ａ／Ｇ）、２１９（Ｓ／Ａ）、２４３  （Ｎ／Ｉ）、２４５（Ｔ／Ａ）、２６９（Ｉ／Ｔ）、及び／又は２８１（Ｎ／Ｓ）の１つ以上の位置で異なる他のＰＮＧａｓｅ  Ｆアミノ酸配列を含む。
【００５８】
しかしながら、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの他の供給源も利用できることを理解されたい。これに関連して、特に有用なＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素は、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）だけではなく、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ型（配列番号３）（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１５，２９０（１２）：７４５２−６２）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）から得たＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号４）、及びフラボバクテリウム・ミリコラ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号５）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２１１６３、エリザベスキンギア・ミリコラ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）及びクリセオバクテリウム・ミリコラ（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）としても知られる）も含む。代表的なアミノ酸配列及び核酸配列は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ、ＵｎｉＰｒｏｔ、及びＧｅｎＢａｎｋデータバンクで確認することができる。代表的なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔによる名称：Ｑ９ＸＢＭ８（Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ；配列番号１）、Ｐ２１１６３（Ｆ．ミリコラ（Ｆ．ｍｉｒｉｃｏｌａ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ；配列番号５）、Ａ０Ａ０９０ＫＩ５６−１（Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ型；配列番号３）、及びＱ５ＬＨ３１（Ｂ．フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ；配列番号４）を含む。ＰＮＧａｓｅ  ＦのいくつかのＸ線結晶構造は、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ用のＰＤＢ識別名１ＰＮＧ、１ＰＮＦ（キトビオースリガンドを有する）、１ＰＧＳ、及び３ＰＭＳ；フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ用のＰＤＢ識別名４Ｒ４Ｚ及び４Ｒ４Ｘ；及びバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ用のＰＤＢ識別名３ＫＳ７を含め、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から入手可能である。これらのＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素のアミノ酸配列は、ＰＤＢ委託でも報告されている。
【００５９】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆと配列が相同の他のタンパク質は、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を構成する基準化合物として使用することができ、細菌デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，１５７１−１５７７）及びプレシオシスチス・パシフィカ（Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｃｉｆｉｃａ）ＳＩＲ−１、並びに真核生物ダニオ・ゼブラ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）（ゼブラフィッシュ）、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）（大西洋サケ）、及びカタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ホヤ）（Ｆｉｌｉｔｃｈｅｖａ，ＰＮＧａｓｅｓ：Ａ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｒａｔｈｅｒ  Ｔｈａｎ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｖｏｌ．Ｐｈ．Ｄ．，Ｍａｓｓｅｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐａｌｍｅｒｓｔｏｎ  Ｎｏｒｔｈ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ，２０１０）から同定されたＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素を含む。
【００６０】
真核生物起源のＰＮＧａｓｅ  Ｆのさらなる例としては、限定されるものではないが、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔによる名称：Ｑ９６ＩＶ０）、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【００６１】
Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ以外のＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素が利用される場合は、第１（不活性化させる）及び第２（結合特異性及び／又は結合親和性に影響を与える）の突然変異は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する部位で生じさせる。対応する部位は、例えば、国際公開第２０１０／０６８８１７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２００４０４７４号明細書にさらに記載されているように、一次アミノ酸配列を整列させることによって、又はＸ線結晶構造の比較若しくは相同モデリングの使用によって決定することができる。一部の実施形態では、本発明による突然変異の基礎として利用されるＰＮＧａｓｅ酵素は、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸配列（配列番号１）に相同なアミノ酸配列を有する。相同なＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素は、Ｎ−グリカナーゼ活性を有し、基質結合に関与する１又は複数の領域内で、これらのアミノ酸配列は、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）の１又は複数の基質結合領域のアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性、４５％の同一性、５０％の同一性、５５％の同一性、６０％の同一性、６５％の同一性、７０％の同一性、７５％の同一性、８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、又は９８％の同一性を共有し得る。全アミノ酸配列に適用される全体の配列同一性は、かなり低くても良く；例えば、相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列は、１又は複数の結合領域の同一性のパーセンテージがたとえ高くても、１０％の同一性、１５％の同一性、２０％の同一性、２５％の同一性、又は３０％以上の同一性しか共有しなくても良い。例えば、４Ｒ４ＸＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ（ＥＣ  ２．７．７．７）は、３ＫＳ７とは約３７％の配列及び構造相同性を有し、１ＰＮＦ  ＰＮＧａｓｅ  Ｆとの配列及び構造相同性は約２６％であるが、結合部位は、著しい類似性を共有する。パーセント同一性は、２つのポリペプチドの残基を、これらの配列の全長に沿って同一のアミノ酸の数が最大となるように整列させることによって決定することができ；一方又は両方の配列のギャップが、同一のアミノ酸の数を最大にするためにアラインメントの作成で許容されるが、各配列におけるアミノ酸はなお、適切な順序に維持しなければならない。例えば、ポリペプチドは、Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４；２４７−２５０，１９９９）によって記載されている、ワールド・ワイド・ウェブ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを用いて比較することができる。最近になって、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａプログラムが、配列アライメント用に開発され（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：５３９，２０１１）、ワールド・ワイド・ウェブ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／で入手可能である。ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いる２つのアミノ酸配列の���較では、構造類似性は、パーセント「同一性」と呼ばれることもあるし、又はパーセント「類似性」と呼ばれることもある。「同一性」は、同一のアミノ酸の存在を意味し、「類似性」は、同一のアミノ酸の存在を意味するだけではなく、保存的な置換の存在をも意味する。
【００６２】
野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ並びに本明細書に記載される第１及び／又は第２の突然変異を有するＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異を含む、本発明に有用なＰＮＧａｓｅ  Ｆは、当分野で周知の原核生物及び真核生物発現系、例えば、細菌、原生生物、真菌（例えば、酵母、例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はピチア属菌種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．））、昆虫、及び哺乳動物系を含む、本明細書でより詳細に説明される組換え発現系で好都合に発現され、かつこの系から任意選択的に単離される。
【００６３】
不活性化させる突然変異
野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆにおける少なくとも１つのアミノ酸は、突然変異体ＰＮＧａｓｅ  Ｆを触媒的に不活性にするために突然変異される。触媒活性を低下又は消失させる１つ以上の突然変異は、本明細書では「第１の」（不活性化させる）突然変異と呼ばれる。一実施形態では、酵素活性は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸残基６０、又は別の生物から得たＰＮＧａｓｅ  Ｆの対応する位置を突然変異させることによって低下又は消失される。Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸位置を本明細書で言及するときは必ず、このアミノ酸位置が、他の生物から得られるＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の対応する位置を包含することをここで理解されたい。Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆでは、６０位の野生型残基はアスパラギン酸（Ｄ）である。この残基は、突然変異が触媒活性を低下又は消失させるのであれば、その他のアミノ酸に突然変異させることができる。６０位で利用できるアミノ酸の例としては、限定されるものではないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリン、及び触媒活性を低下又は消失させるその他のアミノ酸、例えば、セレノシステインが挙げられる。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの６０位の好ましい突然変異としては、アラニン、アスパラギン、システイン、バリン、セリン、又はグリシンが挙げられる。一実施形態では、６０位の突然変異は、アラニン、システイン、又はアスパラギン、即ち、Ｄ６０Ａ、Ｄ６０Ｃ、又はＤ６０Ｎである。別の実施形態では、６０位の突然変異は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、又はアスパラギン（Ｎ）以外の、触媒活性を低下又は消失させる任意のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｄ６０を欠失させることができる。
【００６４】
別の実施形態では、酵素活性は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸残基２０６、又は別の生物から得たＰＮＧａｓｅ  Ｆの対応する位置の突然変異によって低下又は消失される。Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆでは、２０６位の野生型残基は、グルタミン酸（Ｅ）である。この残基は、突然変異が触媒活性を低下又は消失させるのであれば、その他のアミノ酸に突然変異させることができる。２０６位で利用できるアミノ酸の例としては、限定されるものではないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリン、及び触媒活性を低下又は消失させるその他のアミノ酸、例えば、セレノシステインが挙げられる。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの２０６位の好ましい突然変異は、アラニン、セリン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、及びシステインが挙げられる（図１６）。一実施形態では、２０６位の突然変異は、アラニン、セリン、アルギニン、又はトリプトファン、即ち、Ｅ２０６Ａ、Ｅ２０６Ｓ、Ｅ２０６Ｒ、又はＥ２０６Ｗである。別の実施形態では、２０６位の突然変異は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、又はトリプトファン（Ｗ）以外の、触媒活性を低下又は消失させる任意のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｅ２０６を欠失させることができる。
【００６５】
別の実施形態では、酵素活性は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸残基２４８、又は別の生物から得たＰＮＧａｓｅ  Ｆの対応する位置の突然変異によって低下又は消失される。Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆでは、２４８位の野生型残基は、アルギニン（Ｒ）である。この残基は、突然変異が触媒活性を低下又は消失させるのであれば、その他のアミノ酸に突然変異させることができる。２４８位で利用できるアミノ酸の例としては、限定されるものではないが、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリン、及び触媒活性を低下又は消失させるその他のアミノ酸、例えば、セレノシステインが挙げられる。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの２４８位の好ましい突然変異としては、トリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、及びリジンが挙げられる。一実施形態では、２４８位の突然変異は、トリプトファン又はセリン、即ち、Ｒ２４８Ｗ又はＲ２４８Ｓである。別の実施形態では、２４８位の突然変異は、セリン（Ｓ）又はトリプトファン（Ｗ）以外の、触媒活性を低下又は消失させる任意のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｒ２４８を欠失させることができる。
【００６６】
別の実施形態では、酵素活性は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆのアミノ酸残基１１８、又は別の生物から得たＰＮＧａｓｅ  Ｆの対応する位置の突然変異によって低下又は消失される。この突然変異は、他の不活性化させる突然変異がするようには触媒切断機構を直接的に妨げないが、天然基質、Ｎ結合型グリカンの結合を低減又は防止することによって活性に負の影響を与える。Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆでは、１１８位の野生型残基は、グルタミン（Ｅ）である。この残基は、突然変異がＮ結合型グリカンの結合を低下又は排除して、触媒活性に負の影響を与えるのであれば、その他のアミノ酸に突然変異させることができる。１１８位で利用できるアミノ酸の例としては、限定されるものではないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリン、及び触媒活性を低下又は消失させるその他のアミノ酸、例えば、セレノシステインが挙げられる。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの１１８位の好ましい突然変異としては、アラニン又はグルタミンが挙げられる。一実施形態では、１１８位の突然変異は、アラニン又はグルタミン、即ち、Ｅ１１８Ａ又はＥ１１８Ｑである。別の実施形態では、１１８位の突然変異は、アラニン（Ａ）又はグルタミン（Ｑ）以外の、触媒活性を低下又は消失させる任意のアミノ酸である。別の実施形態では、Ｅ１１８を欠失させることができる。
【００６７】
Ｄ６０、Ｅ１１８、Ｅ２０６、又はＲ２４８の１つ以上における突然変異の任意の組合せを使用して、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを触媒的に不活性化させることができる。さらに、本発明は、触媒活性を低下又は消失させるこれらの４つの部位のいずれかの突然変異に限定されるものではなく；触媒活性を低下又は消失させるあらゆる突然変異を使用することができる。
【００６８】
１１８位の突然変異が酵素の不活性化を引き起こすだけではなく、基質の結合、従って特異性に影響を与えることによって、Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を高めることにさらに留意されたい。従って、１１８位における突然変異は、第１（不活性化させる）の突然変異及び第２（結合特異性及び／又は結合親和性に影響を与える）の突然変異の両方として機能し得る。より一般的には、６０位、２０６位、２４８位、又は活性に負の影響を与えるその他の位置における突然変異は、Ｎ結合型グリカンに対する親和性を高める効果、及び／又はＯ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を高める効果をさらに有し得る。従って、あらゆる第１（不活性化させる）の突然変異は、任意選択的に、第２（結合特異性及び／又は結合親和性に影響を与える）の突然変異としても機能し得る。
【００６９】
Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性を高めるため、及び／又はＯ結合型グリカンを含めるためのリガンド特異性を変更するための突然変異
野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆにおける少なくとも１つのアミノ酸が、（ｉ）第１の活性を阻害する突然変異のみを有する対応する突然変異体ＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合親和性と比較して、Ｎ結合型グリカンに対する触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合親和性を高めるため、又は（ｉｉ）１つ以上の（非天然の基質である）Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を高めるためにＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合特異性を変更するため、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方のために突然変異される。結合特異性又は親和性を高める又は変更する１つ以上の突然変異は、本明細書では「第２の」突然変異と呼ばれる。
【００７０】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体の一部の実施形態は、Ｎ結合型グリカン（天然基質／グリカン）及びＯ結合型グリカン（新たに獲得した）の両方に対する著しい結合親和性を示す。一例として、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体Ｒ９１１（表１）が挙げられる。これらのＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を使用して、様々な化合物、例えば、Ｎ結合型及び／又はＯ結合型グリカン、並びに遊離Ｎ−グリカン及びＯ−グリカンを含む糖タンパク質及び糖ペプチドを濃縮する、選択する、又は検出することができる。
【００７１】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体の他の実施形態は、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、又は不活性化させる突然変異（複数可）のみを有するが、Ｏ結合型グリカンに対する著しい結合親和性を示さないＰＮＧａｓｅ  Ｆと比較して、Ｎ結合型グリカンに対する高い結合親和性を示す。一例として、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体Ｒ９１１  Ｌ５７Ｄ（表１）が挙げられる。これらのＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を使用して、多種多様な化合物、例えば、Ｎ結合型グリカン及び遊離Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質及び糖ペプチドを濃縮する、選択する、又は検出することができる。
【００７２】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体の他の実施形態は、Ｏ結合型グリカンに対する、著しい新たに獲得した結合特異性及び親和性を示すが、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ又は不活性化させる突然変異（複数可）のみを有するＰＮＧａｓｅ  Ｆと比較して、Ｎ結合型グリカンに対する低い親和性も示す。これらのＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を使用して、Ｏ結合型グリカン及び遊離Ｏ−グリカンを濃縮する、選択する、又は検出することができる。
【００７３】
Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を示す触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体の一部の実施形態は、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃに優先的に結合し；Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を示す触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体の他の実施形態は、Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃに優先的に結合する。
【００７４】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体の一部の実施形態がＯ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を示すという発見はかなりの驚きであった。当初は、非常に多数のＮ結合型複合糖質を認識する能力を有する触媒的に不活性な炭水化物結合を設計する目的で、Ｎ−グリカンプロセシング酵素、ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）が、以下に記載されるＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）に変換するために選択され；一般的な実験及び計算方法が、２０１０年６月１７日に公開された「グリカン特異的分析ツール（Ｇｌｙｃａｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｏｏｌｓ）」という名称のＰＣＴ国際公開第２０１０／０６８８１７号パンフレットに、そして２０１２年２月１６日に公開された米国特許出願公開第２０１２００４０４７４号明細書にも記載されている。コンピューターガイドライブラリー設計を使用し、次に定方向進化を行って、多数のＰＮＧａｓｅ  Ｆの有望な候補クローンを作製した。クローンＲ９１１（表１）によってコードされる突然変異体タンパク質が、Ｎ結合型グリカン（野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ又は不活性化されたＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体、Ｄ６０Ａよりも高い結合親和性を有する）だけではなく、Ｏ結合型グリカンにも結合することが予期せず見出された。Ｏ結合型グリカンを含む化合物は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの基質として機能するかは不明である。さらに、以下の実施例６に示されているように、ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、Ｏ−グリコシル化基質に対して酵素的に活性ではなく、観察される全てのＯ結合型グリカン親和性が、突然変異の結果として獲得された特性であるという強力な証拠を提供する。この予期していなかった特性を十分に利用するために、さらなる触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を見出すことを目的として（実施例６を参照）、クローンＲ９１１をさらなる突然変異の基礎として選択した。このさらなる触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体の一部は、Ｎ結合型グリカンに対するより高い結合親和性を示し、他は、Ｏ結合型グリカン、例えば、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ及びＯ結合型ＧａｌＮＡｃに対するより高い結合親和性を示す。
【００７５】
例示的なＰＮＧａｓｅ  Ｆの突然変異体
Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性の増加、又はＯ結合型グリカンに対する結合親和性を高めるためのリガンド特異性の変更は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの５７位、６０位、６２位、１１８位、１１９位、１２０位、１２３位、１２５位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１９２位、２０６位、及び２４８位、又は別の生物から得たＰＮＧａｓｅ  Ｆの対応する位置におけるいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、又は１３全部のアミノ酸残基の突然変異によって達成することができる。好ましい触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、これらの位置の少なくとも３つ、これらの位置の少なくとも４つ、これらの位置の少なくとも５つ、又はこれらの位置の少なくとも６つに突然変異を含み得る。好ましくは、残基６０、１１８、又は２０６の少なくとも１つが突然変異される。
【００７６】
列記された位置の一部の残基、例えば、５７位、６２位、１１９位、１２３位、１２５位、１５５位、１５６位、１９２位、及び２４８位の残基（表４を参照）は、本明細書では「テピッド（ｔｅｐｉｄ）」残基と呼ばれ、実施例２、ＰＣＴ国際公開第２０１０／０６８８１７号パンフレット、及び２０１２年２月１６日に公開された米国特許出願公開第２０１２００４０４７４号明細書に記載されているコンピューター支援法を用いて同定された。簡単に述べると、結合に関与する重要な相互作用が、計算により特定され、特異性に直接関与する残基（ホット残基（ｈｏｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ））と、結合にほとんど関与せず、従ってその突然変異が親和性の増加をもたらし得る残基（テピッド残基）とに分けられた。第１の群（「ホット」残基）は、酵素の特異性の決定に必須と見なされる残基を含む。第２の群（「テピッド」残基）は、基質に近接しているが、特異性の決定に必須とはみなされない残基を含む。基質に近いが、強い相互作用を形成しない残基は、基質結合活性を高め、かつ／又は結合特異性を変更し得る突然変異の候補として本明細書では見なされる。高特異性で高親和性のＰＮＧａｓｅ  Ｆ試薬、即ち、本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のエンジニアリングを目的として、分析の結果が、テピッド残基の飽和突然変異誘発によって、実施例１に記載される突然変異誘発ライブラリーの設計に利用される。
【００７７】
列記された位置の一部の残基は、Ｉ１５６を中心とする、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの「ループ」領域に存在する。Ｉ１５６の近傍の空間充填又は他の破壊的な突然変異を生じさせて、Ｎ結合型グリカンから離れて小さいＯ結合型グリカンに向かう傾斜結合にする（実施例４を参照されたい）。これに加えて又は別法では、アミノ酸１５３〜１５７に近接した配列、例えば、１５４位の両側への１つ、２つ、又は３つのアミノ酸の挿入は、Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性の増加が期待される。
【００７８】
適切な突然変異としては、限定されるものではないが：
Ｄ５７：ロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、トリプトファン
Ｄ６０：アラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、トリプトファン
Ｙ６２：グリシン、トリプトファン、セリン、トレオニン
Ｅ１１８：アラニン、グルタミン、トレオニン、システイン
Ｔ１１９：アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン
Ｗ１２０：チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、セリン
Ｋ１２３：アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン
Ｒ１２５：チロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン
Ｋ１５３：ヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、チロシン
Ｓ１５４：トレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、チロシン
Ｓ１５５：アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、チロシン
Ｉ１５６：ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、ヒスチジン
Ｄ１５７：アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、チロシン
Ｇ１９２：イソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、セリン
Ｅ２０６：セリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、アルギニン
Ｒ２４８：トリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、リジン
が挙げられる。
【００７９】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆに誘発できる個々の突然変異の例が、表１に示されている（表示「Ｘ」は、その位置の野生型アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す）。表１は、Ｄ６０、Ｅ１１８、Ｅ２０６、及び／又はＲ２４８における第１の不活性化させる突然変異、並びに１つ以上の第２の突然変異の両方を有する例示的な突然変異体を示している。例示的な突然変異体はＲ９１１であり、Ｒ９１１は、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆに対して６つの突然変異（Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、Ｒ２４８Ｗ）を有する。表１は、Ｒ９１１に基づいた復帰突然変異体も示し、この復帰突然変異体は、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆに対して４つ又は５つの突然変異しか含まない。野生型残基を示すセルは陰影が付けられている。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
表１に従ったアミノ酸置換を有する２０の例示的なＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体が以下に列記される。これらのＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体は、以下に列記される以外のアミノ酸位置に配列番号１のように野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列を有する。
突然変異体１：Ｄ５７Ｒ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｇ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｄ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｃ、及びＥ２０６Ｓ
突然変異体２：Ｄ５７Ｃ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｗ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｑ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｔ、及びＥ２０６Ｒ
突然変異体３：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体４：Ｄ５７Ｗ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｍ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｗ、及びＲ２４８Ｓ
突然変異体５：Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体６：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ａ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体７：Ｄ５７Ｌ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体８：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｅ１１８Ｑ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体９：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１０：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１１：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｋ１５３Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１２：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１３：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１４：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１５：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１６：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１７：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｄ１５７Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１８：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体１９：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
突然変異体２０：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＥ２０６Ｓ。
【００８２】
また、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで切断され得る、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆの切断型、並びにＮ結合型グリカン及び／又はＯ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性が維持されるのであれば、他の誘導体化、修飾、挿入、又は欠失を有する型も本発明に包含される。切断は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれか、又は両末端からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９以上のアミノ酸の切断を含み得る。
【００８３】
本明細書で使用される「触媒的に不活性な」酵素又は化合物は、触媒活性が低下した、好ましくはその触媒活性の少なくとも５０％、好ましくはその触媒活性の少なくとも６０％又は７０％が消失した酵素又は化合物であり、かつ触媒的に活性な酵素のアミノ酸組成とは異なるアミノ酸組成を有する。触媒的に不活性な酵素は、その活性の少なくとも７０％、その活性の少なくとも７５％、その活性の少なくとも８０％、その活性の少なくとも８５％、その活性の少なくとも９０％、又はその活性の少なくとも９５％が消失した酵素であり得る。例えば、切断率は、対応する野生型酵素で観察される切断率の５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％であり得る。活性が「消失された」酵素又は化合物は、その触媒活性の少なくとも９０％又は少なくとも９５％が消失した酵素又は化合物であり、かつ触媒的に活性な酵素のアミノ酸組成とは異なるアミノ酸組成を有する。「野生型（ＷＴ）酵素」という語は、生物中で自然に発生する遺伝子の配列を有し、かつヒトの介入によって変更されていない遺伝子によってコードされる酵素を指す。もちろん、野生型酵素の天然に存在する多型もこの定義に含まれることを理解されたい。タンパク質の天然の開始コドン又は停止コドンを通常は変更しないタンパク質の精製又は単離に使用される修飾、例えば、標識又は他の修飾は、本発明においてＷＴ酵素の定義の範囲内であることをさらに理解されたい。本明細書で使用される「リガンド」及び「基質」は、互換的に使用され、ＷＴ又は突然変異体酵素が結合できる分子を指す。
【００８４】
基質に対して高い結合親和性及び高い特異性を有するが、もはや基質に対して著しい酵素活性を有していない、本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質はＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）である。Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、Ｇｌｙｃｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  （Ｇ＆Ｄ）の登録商標である。「Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）」は、レクチン様の性質を有するタンパク質であり、かつ最先端の計算方法と実験方法の組み合わせを用いて炭水化物プロセシング酵素からエンジニアリングされる。Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、サンプルの濃縮及びグリコシル化部位マッピングを助けるために糖鎖生物学に直接利用することができる。Ｇ＆Ｄのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｌｙｃｏｓｅｎｓｏｒｓ．ｃｏｍ）を参照されたい。Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）及びその性質、並びに触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質の設計、合成、及びアッセイのための材料及び方法は、国際公開第２０１０／０６８８１７号パンフレット及び２０１２年２月１６日公開の米国特許出願公開第２０１２００４０４７４号明細書、並びに米国仮特許出願第６１／９００，７４６号明細書（Ｏ結合型Ｎ−アセチルグルコサミンに対して特異的な触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質「Ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｏ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ」）に記載され、それは、本発明においてこのような目的に有用であり得る。国際公開第２０１０／０６８８１７号パンフレット、２０１２年２月１６日に公開された米国特許出願公開第２０１２００４０４７４号明細書、及び米国仮特許出願第６１／９００，７４６号明細書は、それぞれ参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる。ＰＣＴ国際公開第２０１０／０６８８１７号パンフレット及び米国仮特許出願第６１／９００，７４６号明細書は、本明細書で使用される「結合親和性」及び「特異性」という語の意味についてのさらに詳細な情報も提供する。
【００８５】
コンジュゲート
本発明はまた、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体のコンジュゲートを含む。コンジュゲートは、第１の成分として、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を含み、この突然変異体は、少なくとも１つの第２の成分に共有結合し、この第２の成分は、タンパク様成分又は非タンパク様成分であり得る。一部の実施形態では、タンパク様成分を含むコンジュゲートは、周知の組換えＤＮＡ法を用いて融合タンパク質として合成することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体に化学的又は酵素的にコンジュゲートするタンパク様成分又は非タンパク様成分を含む。
【００８６】
本発明のコンジュゲートの一例は、本明細書では薬物とも呼ばれる治療薬にコンジュゲートした触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を含む。このコンジュゲートは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体が抗体の代わりに使用されるという点を除いて、周知の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に類似している。触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体にコンジュゲートされ得る薬物としては、限定されるものではないが、細胞毒、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤が挙げられる。
【００８７】
抗癌剤、抗炎症薬、炎症誘発剤、及び免疫調節剤は、癌及び前癌状態、並びに炎症及び免疫状態が、多くの場合、タンパク質グリコシル化パターンの変化に関連するため、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質へのコンジュゲーションに特に適している。例えば、治療又は診断放射性薬品は、癌糖マーカーを標的とすることができる「Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）−薬物」コンジュゲートを得るために触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体に結合させる又はこの変異体を組み込むことができる。一実施形態では、治療又は診断薬は、例えば、肺又は消化管における粘膜内層又は膜を標的とすることができる。
【００８８】
同様に、抗ウイルス薬及び抗細菌薬もまた、標的ウイルス又は細菌グリコシル化生体分子が優れた治療可能性を有するため、「Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）−薬物」コンジュゲートに組み込むのに特に適している。
【００８９】
本発明のコンジュゲートの別の例としては、診断薬又は検出薬にコンジュゲートした触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体が挙げられる。診断薬又は検出薬は、限定されるものではないが、放射性標識、蛍光標識、りん光標識、比色標識、酵素標識、免疫標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識、又は電磁標識を含む検出可能な標識を含み得る。触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体は、このＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体が、例えば、イムノアッセイによって直接的に検出できるため、診断薬又は検出薬として機能するようにコンジュゲートする必要がないことを理解されたい。
【００９０】
本発明のコンジュゲートの別の例としては、精製を容易にするためにマーカー配列、例えば、ペプチド、例えば、ヘキサ−ヒスチジン又は赤血球凝集素にコンジュゲートされた触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体が挙げられる。本発明には、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、ウシ血清アルブミン、ウシ膵臓トリプシン阻害剤、又は蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に共有結合された触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体を含むＰＮＧａｓｅ  Ｆ融合タンパク質が含まれる。
【００９１】
使用方法
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のレクチン様の性質のために、このＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の非常に多数の潜在的な用途は、当業者であればすぐに分かるであろう。一般に、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートは、抗グリカン抗体が現在使用されている目的と同じあらゆる目的に使用することができる。従って、本発明の化合物は、有利なことに、診断方法、分析方法、及び治療方法を含む様々な医療方法及び実験方法において、抗グリカン抗体の代用とすることができる。同様に、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートは、レクチンが現在使用されている目的と同じ目的に使用することができる。従って、本発明の化合物は、有利なことに、様々な診断方法及び分析実験方法において、レクチンの代用とすることができる。
【００９２】
診断方法及び分析方法
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートを使用して、生物学的サンプル又は合成サンプルにおいて、Ｎ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、又は両方を検出することができる。例えば、生物学的サンプル、例えば、組織又は体液をＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートに接触させて、生物学的サンプルのグリコシル化及び／又は糖化のレベル又は型を検出し、かつ／又は特徴付けることができる。このグリカンの特徴付けは、このグリカンの構成糖を特定すること、このグリカンの糖組成を決定すること、このグリカン内の連結位置を決定すること、又はこのグリカンの立体化学を決定することを含み得る。別の例として、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートは、グリコシル化のレベル又は型を監視するために、例えば、治療用抗生物質の合成において、治療用生物製剤の合成における品質管理に使用することができる。２０１２年９月７日に公開されたＰＣＴ国際公開第２０１２／１１８９２８号パンフレットを参照されたい。触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートは、親和性試薬として、又はアフィニティーマトリックスの一部として利用することができ；例えば、固体支持体、例えば、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子に取り付けて、生物学的サンプル又は合成サンプル中、又はこれらのサンプルからＯ結合型及び／又はＮ結合型化合物を検出又は濃縮するための方法で使用することができる。取り付けられたＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体は、合成グリコシル化化合物の単離及び／又は精製にも使用することができる。
【００９３】
診断は、対象から得られた生物学的サンプルに対して行うことができるが、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともできる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用例では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートが対象に投与され、対象内でのこのＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体の結合が検出される。好ましくは、コンジュゲートは、対象に投与され、このコンジュゲートは、生物医学的イメージングを容易にするために検出可能な標識を含む。適切なコンジュゲートの例としては、放射性標識、常磁性標識、又は反磁性標識にコンジュゲートされた触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体が挙げられる。
【００９４】
Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性及び／又はＯ結合型グリカンに対する新たに獲得された特異性が高められた触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を使用して、異常なグリコシル化を探すために生物学的サンプルを調べることができる。生物学的サンプルの例としては、限定されるものではないが、あらゆる生体液、組織、又は器官が挙げられる。生体液の例としては、限定されるものではないが、血液、尿、血清、唾液、脳脊髄液、及び精液が挙げられる。他の実施形態では、触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を、生体液及び組織中の標的分析物の存在又は量の検出に使用することができる。標的の例としては、外部から摂取される種、例えば、植物多糖、炭水化物系薬物、及び病原体が挙げられ、標的の表面は、多くの場合、異なる複合グリカンでコーティングされる。触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体は、薬物の発見及び新規なグリカン系化合物の生物学的活性の評価にも適用される。
【００９５】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、異常なグリコシル化が現れる疾患の診断及び／又は治療に使用することができる。触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を使用して、糖タンパク質、糖脂質、及び／又は様々な炭水化物エピトープを含む特定の腫瘍抗原を検出するために使用することができる。多数のこれらの腫瘍抗原は、腫瘍性疾患状態では上方制御されることが分かっている。腫瘍性疾患の発症及び進行を示すことができ、かつ触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質を検出することができる腫瘍抗原の例としては、限定されるものではないが、大腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、及び乳癌、並びに発育中の胎児に関連した糖タンパク質である癌胎児抗原（ＣＥＡ）；膵臓癌患者に見られる糖脂質中に存在する炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）又はシアル化ルイスＡ抗原；及び乳癌に関連した炭水化物抗原１５−３（ＣＡ１５−３）が挙げられる。
【００９６】
抗原の存在は、必ずしも癌細胞への転換を示すものではないが；細胞でのその局在化は、ＣＥＡの場合は、癌細胞への転換を示唆する。このため、選択制及び親和性の高い分析ツールが必要である。診断試験は現在、多くの場合、糖タンパク質のペプチド部分又は糖脂質の糖部分に対して産生される抗体に依存するが、正確なエピトープは、最近になってようやく特定されたばかりである。グリカンが特徴付けられる例では、複数の糖型が存在する場合が多い（例えば、ＣＥＡ）。糖型間を区別することができる試薬がないため、現在は、グリコシル化における僅かな相違が、疾患状態、癌型、又は組織局在化に相関する程度を決定することが不可能である。現在、これらの問題は、糖型の混合物として検査される単離糖タンパク質のＭＳ分析によって主に対処することができる。典型的には、行われる糖型集中（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ）のレベルだけが、レクチン（コンカナバリンＡ、（Ｃｏｎ  Ａ））アフィニティークロマトグラフィーを用いるグリカンを含む高マンノースでの濃縮である。より効率的な実験室分析及びルーチンの臨床診断技術は、糖型特異的試薬が存在しないため大幅に制限されたままである。
【００９７】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、生物学的サンプル中の任意の糖タンパク質について、存在する各糖型の相対存在量の定量に有用性を有し得る。本明細書で使用される「糖型」という語は、特定のグリカンが付着したタンパク質を指す。糖タンパク質は、複数の糖型を有し得る。より具体的には、糖型は、付着したグリカンの数又は型のみが異なるタンパク質のアイソフォームであり；アミノ酸配列は、様々な糖型で同じである。糖タンパク質は、多くの場合、付着した糖又はオリゴ糖が異なる多数の異なる糖型を含む。有利なことに、触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を使用して、特定の糖型を含む生物学的サンプルを濃縮することができる。触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を同様に使用して、グリカンが付着するタンパク質表面の特定のグリコシル化部位を特定することができる。触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を使用して、無傷の糖ペプチドを任意の糖タンパク質のタンパク分解消化により分離することもできる。サンプルの目的の分析物を濃縮することは、糖ペプチド画分のさらなる特徴付けに非常に役立つ。特に、濃縮は、ペプチド配列及びグリカン構造の識別を容易にし、これにより、グリコシル化部位の無傷のタンパク質内での識別、及び各グリコシル化部位に存在する特定のグリカンの特徴付けを可能にすることができる。
【００９８】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を、生体液、組織、器官、又は生細胞中のタンパク質の特定のグリカン修飾の監視に使用することができる。認識が、タンパク質の同一性に依存するものとは考えられず、触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体は、所与のＮ結合型グリカン及び／又はＯ結合型グリカンを含むあらゆるタンパク質を認識することができ、従って所与のグリカン修飾の検出に非常に有用であると考えられる。
【００９９】
さらに他の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの染色細胞又は組織に使用することができる。
【０１００】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を利用して、混合物中のＮ結合型及び／又はＯ結合型グリコシル化を監視することができ、このグリコシル化は、製薬産業又は研究の分野で使用される組換え糖タンパク質の製造中に起こり得る。
【０１０１】
前述の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、染料又は色素で標識して、目的の細胞、組織、糖タンパク質、糖ペプチド、オリゴ糖、又は多糖を含む生物学的サンプルに適用することができる。
【０１０２】
本発明の別の態様は、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の分析の適用例に使用する方法を提供する。本発明の触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体は、Ｎ結合型又はＯ結合型グリカン特異的分析ツールとして使用することができる。グリカン特異的分析ツールは、環境分野、発酵分野、食品分野、及び医療分野を含む様々な分野で検出方法として使用できる可能性があり、かつヒト又は動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出に使用することができる。例えば、本発明の触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を、親和性試薬又は組織染色の媒体として使用することができる。別の例として、触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を、生物学的サンプルのＮ結合型グリカン及び／又はＯ結合型グリカンの濃縮に使用することができる。さらに別の例として、触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を使用して、糖タンパク質上の特定のグリコシル化部位を決定することができる。
【０１０３】
特定の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを含む親和性分離の試薬として使用することができる。アフィニティークロマトグラフィーは、高度に特異的な生物学的相互作用、例えば、結合しているタンパク質とグリカンとの間の相互作用に基づいた、生化学的混合物を分離する方法である。本発明は、どの特定の設計又はクロマトグラフィーシステムに限定されるものではない。一般に、触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体は、固体支持体に共有結合で付着するか又は他の結合で固定され、かつ固定相を構成する。特定の実施形態では、触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体で誘導体化される固定相を、カラムクロマトグラフィーに使用することができる。これらの実施形態では、固体固定相の粒子が、管（充填カラム）の全内容積を満たすために使用される。別法では、固相粒子は、管（開放管カラム）の中間部分にある生物学的サンプル（即ち、移動相）のための開放された管内壁、即ち非制限経路上で、又はこの非制限経路に沿って濃縮される。他の実施形態では、誘導体化固定相を、バッチクロマトグラフィーに使用することができる。これらの実施形態では、固定相を導管に導入して、生物学的サンプルと混合することができる。前述の例は、概ねアフィニティークロマトグラフィーに着目しているが、これらの原理は、他の親和性精製プロトコルに容易に利用されることを理解されたい。
【０１０４】
治療方法
特定の実施形態では、本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を、治療薬として使用しても良いし、又は活性治療薬の送達のために修飾しても良い。本発明の触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体は、定義されたグリカン特異性を有しているため、治療薬の送達は、生体分子、例えば、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによって認識されるグリカン構造を有する糖タンパク質又は糖脂質を提示する細胞、組織、又は器官のみを標的とすることができる。
【０１０５】
従って、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を、多数の適用例の治療、例えば、標的薬物送達で使用する可能性がある。Ｎ結合型グリカン及びＯ結合型グリカンのレベル及び位置の変化は、癌を含む多数の疾患に関連することが示された。本発明の触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体は、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆと比較して、これらのグリカンの一方又は両方に対して高い親和性を有する。従って、本発明は、癌研究の分野で直接的な適用を有することが期待され、特定の型の癌の検出用の製品の開発につながる可能性がある。本発明はまた、糖鎖生物学に使用される試薬としての実用性も期待され、本発明を使用してＮ結合型グリカン及び／又はＯ結合型グリカン、例えば、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含むサンプルを濃縮し、これらの重要な炭水化物の検出及び分析を可能にする。触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を、治療薬の標的送達用の媒体として使用することができる。
【０１０６】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートを、感染、疾患、又は障害を治療又は予防するために対象に投与することができる。感染は、例えば、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、又は真菌感染であり得る。疾患又は障害は、外因性の病原体から生じることもあるし、又は自家性又は自己免疫性の場合もある。
【０１０７】
一実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体は、治療効果又は予防効果を達成するために対象の体内に存在するＮ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、又は両方に結合するように対象に投与される。Ｎ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンは、対象によって産生される内因性生体分子であることもあるし、又は病原体によって産生される外因性生体分子であることもある。一実施形態では、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体は、内因性生体分子、例えば、対象の癌、前癌状態、又は免疫異常に関連した生体分子に結合する。別の実施形態では、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体は、病原体の宿主細胞への結合を防止し；別の実施形態では、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体は、病原体の宿主細胞への取り込みを防止する。
【０１０８】
別の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体のコンジュゲートが対象に投与され、このコンジュゲートは、上で例示された治療薬を含む。この治療薬は、抗生物質、例えば、微生物病原体を標的とする薬剤であり得る。治療薬は、自己疾患又は自己免疫疾患を標的とする薬剤、例えば、抗癌剤、例えば、細胞毒、又は免疫活性剤であり得る。部位特異的送達に使用できる治療薬の例としては、限定されるものではないが、様々な化学療法薬、抗生物質、及び抗ウイルス薬、毒素、ラジオアイソトープ、サイトカインなどが挙げられる。
【０１０９】
治療的使用のための触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートを、適切な動物モデル系、例えば、ラット、マウス、サル、又はウサギで毒性について試験することができる。ウイルス感染を治療又は予防する際のＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートの有用性を、ウイルスの複製を抑制する、ウイルス伝播を抑制する、又はウイルス感染に関連した症状を治療若しくは予防する能力を調べることによって評価することができる。同様に、細菌感染を治療又は予防する際のＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートの有用性を、細菌の複製を抑制する、又は細菌感染に関連した症状を治療若しくは予防する能力を調べることによって評価することができる。癌治療における有用性は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体又はそのコンジュゲートの、癌細胞の増殖又は転位を抑制する能力、血管形成を抑制する能力、又は細胞死を引き起こす能力を評価することによって判断することができる。
【０１１０】
作製方法
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、遺伝子エンジニアリング技術を用いて宿主細胞で発現させることができる。「細胞」という語は、あらゆる型の生物細胞を包含する。宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞であるが：単細胞真核生物、例えば、原生生物又は酵母も、宿主細胞として有用である。好ましい宿主細胞は、微生物細胞、好ましくは、単細胞微生物の細胞、例えば、細菌細胞又は酵母細胞である。細菌及び／又は微生物細胞の上記の選択にもかかわらず、ＰＮＧａｓｅ突然変異体を、動物、植物、昆虫、酵母、原生生物、細菌、又は古細菌の細胞に限定されずに発現させることができることを理解されたい。本発明の触媒的に不活性なＰＮＧａｓｅ  Ｆ誘導体を発現するようにエンジニアリングすることができる微生物細胞の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に加えて、広範な細菌及び酵母が挙げられ、このような細菌及び酵母には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム・カンジダ属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられる。好ましい微生物細胞としては、限定されるものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、及びエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）挙げられる。
【０１１１】
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を発現するように遺伝子エンジニアリングされた細胞は、「宿主」細胞、「組換え」細胞、「遺伝子エンジニアリングされた」細胞、又は単純に「エンジニアリングされた」細胞と呼ばれることもある。これらの語及び同様の語は、互換的に使用される。遺伝子エンジニアリングされた細胞は、天然では一緒に見られない遺伝物質を１つにする標準的な分子クローニング技術によって作製された１つ以上の人工のヌクレオチド配列を含む。組換えＤＮＡ分子の構築に使用されるＤＮＡ配列は、任意の種を起源とし得る。例えば、植物ＤＮＡを細菌ＤＮＡにつないでも良いし、又はヒトＤＮＡを真菌ＤＮＡにつないでも良い。別法では、天然ではどこにも存在しないＤＮＡ配列を、ＤＮＡの化学合成によって、又はＤＮＡの定方向突然変異によって作製し、組換え分子に組み入れることができる。組換えＤＮＡの発現から得られるタンパク質は、多くの場合、組換えタンパク質と呼ばれる。組換えの例は、以下により詳細に説明され、かつ（細胞の別の種から得られた）外来ポリヌクレオチドを細胞に挿入すること、合成ポリヌクレオチドを細胞に挿入すること、又はポリヌクレオチドを細胞内で転位又は再配置することを含み得る。どの形態の組換えも、遺伝子エンジニアリングと見なすことができ、従ってどの組み換え細胞も、遺伝子エンジニアリングされた細胞と見なすことができる。
【０１１２】
当業者には理解されるように、タンパク質、例えば、本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の発現は、多数の分子生物学技術によって達成することができる。例えば、発現は、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコピーを宿主細胞に導入することによって達成することができる。所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して内因性又は異種であり得る。好ましくは、このポリヌクレオチドは、ベクターを用いて細胞に導入されるが；裸ＤＮＡを使用することもできる。このポリヌクレオチドは、環状又は線状、一本鎖又は二本鎖であり得、かつＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの任意の変更形態又は組み合わせであり得る。ベクターは、遺伝物質を細胞に導入する媒体として使用できるあらゆる分子とすることができる。ベクターの例としては、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が挙げられる。ヌクレオチド配列を微生物に導入するために使用される分子生物学技術の例としては、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、及び形質転換が挙げられる。これらの方法は、当分野で周知である。ベクターの標的細胞への挿入は、通常は、細菌細胞では形質転換と呼ばれ、真核細胞ではトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入は、多くの場合、形質導入と呼ばれる。本発明における形質転換、トランスフェクション、及び形質導入という語は、本明細書では互換的に使用される。ベクターを使用して細胞に導入されたポリヌクレオチドは、多くの場合、導入遺伝子と呼ばれる。
【０１１３】
好ましくは、ベクターは、発現ベクターである。「発現ベクター」又は「発現構築物」は、特定のポリヌクレオチドを標的細胞に導入するために使用されるあらゆるベクターであり、発現ベクターが細胞内に導入されると、このポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、細胞転写及び翻訳機構によって産生される。典型的には、発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された調節配列を含む。調節配列は、当業者には一般的な知識であり、例えば、複製起点、プロモーター配列、及び／又はエンハンサー配列を含み得る。所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、染色体外に存在しても良いし、又は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれても良い。
【０１１４】
染色体外ＤＮＡは、細胞小器官、例えば、（殆どの真核細胞では）ミトコンドリア、並びに（植物では）葉緑体及び色素体に含まれ得る。より典型的には、染色体外ＤＮＡは、宿主細胞に導入されたベクター内に維持される。多くの場合、タンパク質の発現を最大化するために高いコピー数のベクターを選択することが有利であろう。任意選択的に、ベクターは、選択マーカーをさらに含み得る。特定の選択マーカーを使用して、ベクターが標的細胞内に存在するかを確認することができる。他の選択マーカーを使用して、ベクター及び／又は導入遺伝子が宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたかをさらに確認することができる。選択マーカーの使用は、当分野では一般的であり、技術者であれば、選択マーカーの様々な使用を理解し、認識するであろう。任意選択的に、ベクターは、レポーター遺伝子をさらに含み得る。レポーター遺伝子は、ベクターが標的細胞内で発現していることを確認するために使用することができ、かつベクターからの発現を監視するためにも使用することができる。レポーター遺伝子の使用は、当分野では一般的であり、技術者であれば、レポーター遺伝子の様々な使用を理解し、認識するであろう。
【０１１５】
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、本明細書に記載のあらゆる遺伝子エンジニアリングされた細胞から単離し、任意選択的に精製することができる。この触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質は、例えば、好気性又は嫌気性発酵プロセス中に、細胞又は培養培地から直接単離することができる。単離及び／又は精製は、既知の方法を用いて達成することができる。
【０１１６】
また、前記請求項のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体、コンジュゲート、融合タンパク質、又はアフィニティーマトリックス、及び使用説明書を含むキットも本発明によって提供される。
【０１１７】
本発明の以上の説明は、本発明の全ての開示される実施形態又は全ての実施を説明するものではない。以下の実施例は、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本出願におけるいくつかの箇所では、ガイダンスが、実施例のリストによって示され、この実施例は、様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合も、記載されるリストは、代表的な群として役割を果たすだけであり、限定的なリストと解釈するべきではない。
【０１１８】
「及び／又は」という語は、列記された要素の１つ若しくは全て、又は列記された要素の２つ以上の組み合わせを意味する。
【０１１９】
「好ましい」及び「好ましくは」という語は、特定の状況下で、特定の利益を提供し得る本発明の実施形態について述べる。しかしながら、同じ又は他の状況下で、他の実施形態も好ましいであろう。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記述は、他の実施形態が有用ではないことを示唆するものではなく、他の実施形態を本発明の範囲から排除するものではない。
【０１２０】
「含む」という語及びその変形は、これらの語が本説明及び特許請求の範囲で使用される場合は限定の意味を有するものではない。
【０１２１】
特段の記載がない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、互換的に使用され、かつ１つ又は２つ以上を意味する。
【０１２２】
また、本明細書では、終点による数値範囲の記述は、その範囲内に含まれる全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５．３、３．８０、４、５などを含む）。
【０１２３】
個別のステップを含む本明細書に開示されるいずれの方法でも、ステップは、任意の実施可能な順序で行うことができる。そして、適宜、２つ以上のステップの任意の組合せを同時に行うことができる。
【０１２４】
特段の記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分及び分子量などの量を表す全ての数字は、「約」という語によってどんな場合にも変更されるものであることを理解されたい。従って、反対の記載がなければ、本明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、本発明によって獲得することが望まれる所望の性質によって異なり得る近似値である。少なくとも、均等論を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、記載の有効桁数を考慮して、そして通常の丸めの手法を適用することによって解釈されるべきである。
【０１２５】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるが、特定の実施例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、全ての数値は、それぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生じる範囲を本質的に含む。
【０１２６】
全ての見出しは、読者に分かりやすくするためのものであり、特段の記載がない限り、見出しに続く文章の意味を限定するために使用されるものではない。
【０１２７】
本発明は、以下の実施例によって例示される。特定の実施例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載の本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるものであることを理解されたい。
【実施例】
【０１２８】
実施例１
コンピューターガイド定方向進化によってエンジニアリングされた炭水化物認識バイオセンサー
この実施例では、全てのＮ結合型グリカンに共通のコア糖ペプチド成分を検出するための新規な試薬が開発された。コンピューターガイドバイオコンビナトリアル設計及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向進化の組み合わせによって、Ｎ−グリカンプロセシング酵素、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆが、野生型酵素の基質に対する親和性が高い触媒的に不活性なタンパク質に変換された。レクチン様炭水化物認識生体分子の炭水化物プロセシング酵素（ＬＥＣＴＥＮＺ）からのエンジニアリングが、分子動力学シミュレーションを用いて最適な炭水化物−酵素相互作用を決定するためにコンピューター内で開始された。コンピューター内での構造／機能分析を、ＬＥＣＴＥＮＺ候補のｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向進化、選択、及び下流特徴付け（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）のための集中的なバイオコンビナトリアルライブラリーを作製することによって検証した。表面プラズモン共鳴を利用して結合反応速度を決定した。さらに、Ｎ−グリカン保持糖タンパク質、リボヌクレアーゼＢ、及びＮ−糖ペプチドの濃縮をアフィニティークロマトグラフィーによって実証した。ＭＣＦ７細胞抽出物からのＮ−糖タンパク質の濃縮を実証した。
【０１２９】
炭水化物認識は、通常の生物学的プロセスの不可欠な部分である。炭水化物認識は、宿主−病原体相互作用、生物学的発達に重要であり、疾患状態バイオマーカー検出にとって益々重要になっている。炭水化物認識の重要性及び宿主グリコシル化の多様性により、グリカンは、検出、診断、及び治療への応用のための明確な標的である。グリカンは、重要な疾患バイオマーカーとして機能するだけではなく、治療用生物製剤の薬理学的特性にも影響を与える。例えば、グリカンの不均質性は、ロット間の一貫性、免疫原性、薬物動態、活性、及び組換え糖タンパク質の生物学的クリアランスに影響を与え得る。３分の２を超える治療用生物製剤がグリコシル化組換えタンパク質であるとすると、バイオプロセス監視中のグリコシル化分析の新たなツールが必要である。
【０１３０】
全てのＮ結合型グリカンに共通のコアキトビオース成分を検出するための新規な試薬の開発が本明細書で報告される。コンピューターガイドバイオコンビナトリアルライブラリー設計及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向進化の組み合わせによって、Ｎ−グリカンプロセシング酵素、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆが、野生型酵素の基質に対する親和性が高い触媒的に不活性なタンパク質にエンジニアリングされた。炭水化物プロセシング酵素（Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標））からのレクチン様炭水化物認識生体分子のエンジニアリングが、分子動力学シミュレーションを用いて最適な炭水化物−酵素相互作用を決定するためにコンピューター内で開始された。コンピューター内での構造／機能分析が、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補の酵母表示選択によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向進化のための集中的なバイオコンビナトリアルライブラリーの設計を導いた。選択されたクローンＲ９１１は、非親和性強化対照クローン（Ｄ６０Ａ）に対して１０倍の親和性強化（ＫＤ＝０．２６μＭ）を有することが観察された。加えて、Ｎ−グリカン保持糖タンパク質、リボヌクレアーゼＢ、及びＮ−糖ペプチドの濃縮をＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーによって実証した。さらに、ヒト乳癌細胞株、ＭＣＦ７の細胞抽出物からの糖タンパク質の濃縮の成功により、複合混合物からの糖タンパク質の濃縮用の捕捉試薬としてのＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）の有用性を実証した。Ｒ９１１の分子モデリングが、親和性及び特異性に重要な突然変異についての洞察を提供し、従って実験的観察が合理化される。
【０１３１】
Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬の調製の成功は、糖ペプチド及び糖タンパク質サンプルの濃縮の課題に対するユニークな解決策を示すだけではなく、グリカン及び複合糖質の生物学的関連性のためのグリカン標的試薬のエンジニアリングの新規な戦略も実証する。
【０１３２】
重要性
炭水化物認識は、生物学的プロセスの重要な部分である。炭水化物認識は、宿主−病原体相互作用、生物学的発達に不可欠であり、疾患状態バイオマーカー検出にとって益々重要になっている８２。多くの腫瘍抗原は、糖タンパク質又は糖脂質であり、疾患状態で上方制御される様々な炭水化物エピトープが同定された８３。現在承認されている炭水化物腫瘍マーカーとして８４、以下が挙げられる：癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、大腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、及び乳癌、並びに発育中の胎児に関連した、５０〜８０％の炭水化物を含む糖タンパク質８５；膵臓癌患者に見られる糖脂質中に存在する炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）又はシアル化ルイスＡ抗原；及び炭水化物抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、乳癌に最も広く使用される血清マーカーであり、ムチンタンパク質１（ＭＵＣ１）に由来の糖タンパク質断片である８６。炭水化物認識の重要性及び宿主グリコシル化の多様性により、グリカンは、検出、診断、及び治療への応用のための明確な標的である８７〜９２。
【０１３３】
細胞表面上の多数のグリカンの位置により、これらのグリカンは、細胞間相互作用に重要であり、かつ正常な代謝プロセスの制御に関与する。グリカンの構造及び存在量は、細胞内プロセスの状態によって変動し得る動的性質であり、生物学的プロセスが正常状態と疾患状態との間で変動するため不均質となる。さらに、ＤＮＡ及びタンパク質合成とは異なり、グリカン合成は、多数の酵素によって動的に管理される非鋳型駆動酵素プロセスである。グリカン合成における複雑さが、生物学的プロセスにおけるグリカンの複雑な役割の要因であり得るが；グリコシル化機構及び活性における変動が、グリコシル化タンパク質の存在量にかかわらず、グリコシル化タンパク質に対して系統的な影響をもたらし得る。
【０１３４】
グリカンはまた、組換え治療用生物製剤の薬理学的特性に影響を与える。グリカンの不均質性は、ロット間の一貫性、免疫原性、薬物動態、活性、及びクリアランスに影響を与え得る９３。タンパク質及び核酸の場合とは異なり、グリカンの配列決定及び構造の特徴付けは、骨の折れる多段階プロセスであり、典型的には、サンプルの濃縮、酵素消化、及び質量分光分析、リアルタイム監視ができないプロセスを必要とする。３分の２を超える治療用生物製剤がグリコシル化組換えタンパク質であるとすると、バイオプロセス監視中のグリコシル化分析の新たなツールも必要である９４。
【０１３５】
グリカンの重要性にもかかわらず、グリカン及び複合糖質の発見及びルーチンの実験室分析は、入手可能な単離及び分析技術によって限定され８２、これは、グリカン構造の広範な多様性を考えると想定外ではない９５。従って、生物学的サンプルを調べて癌の異常なグリコシル化状態を確認するために使用することができる炭水化物特異性が明確なグリカンバイオセンサー、及びグリコシル化治療用生物製剤の製造が緊急に必要である８１。
【０１３６】
グリカンの生合成及び多様性
グリカンの新生タンパク質への共有結合は、非鋳型駆動プロセスであり、かつ約１，０００の遺伝子産物を必要とし、従って、オリゴ糖の生合成には、細胞資源の莫大な投資が必要であり、グリコシル化に必要な細胞機構の欠陥は致命的であり得る９１、９６〜９９。哺乳動物タンパク質のグリコシル化の主な型は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化である。
【０１３７】
Ｎ−グリカン構造の生合成は、小胞体膜で起こり、酵素の新生タンパク質へのひとまとまりの共翻訳的な付着の前に、ヒトでは２０を超える酵素が必要である１００〜１０４。合成は、ドリキルピロリン酸（ｄｏｌｉｃｈｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）担体で開始され、個々の単糖は、１４糖Ｎ−グリカン構造が完了するまで連続的に付着する１０２〜１０４。それぞれの異なるグリコシド結合は、特有の酵素を必要とする。タンパク質複合体、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ａｓｎ残基の側鎖へのＮ−グリコシド結合による新生ペプチド鎖のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  ｓｅｑｕｏｎｅ（ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）への１４糖Ｎ−グリカン構造のひとまとまりの付着に関与する１０１、１０３。小胞体シャペロンは、高マンノース含有未成熟糖タンパク質のゴルジへの移送の前の、Ｎ−グリカン構造との直接的な相互作用による新生ポリペプチドの適切な折り畳みを制御する。
【０１３８】
糖タンパク質として付着したＮ−グリカン構造のさらなる修飾及び末端合成に別の酵素が関与する、ハイブリッド及び複合グリコシル化タンパク質ゴルジ複合体の生合成は、シスゴルジ、メディアルゴルジ、及びトランスゴルジプロセスを経る。様々な糖型のグリコシル化タンパク質がこのように産生される。グリカン構造の非鋳型駆動酵素生合成は、広範なグリカン多様性をもたらす。
【０１３９】
（１４糖構造由来の）コア５糖Ｎ−グリカン構造が、保存され、かつ高等真核生物で次第に末端が修飾されるようになり、これにより非常に多様なＮ−グリコシル化が生じている（図１）。酵母は、高マンノース型のＮ−グリコシル化を示す１０５。植物は、高マンノース型のＮ−グリコシル化及びより複雑な型のＮ−グリコシル化の両方を示す１０６。動物は、末端修飾の最大の多様性によって反映される最も複雑なＮ−グリカン構造に進化させた９９。
【０１４０】
Ｏ結合型グリコシル化は、セリン及びトレオニン残基のヒドロキシル基へのコア糖（複数可）の共有結合によって定義される１０７、１０８。Ｏ−グリカンの２つの主なクラスは、ムチン及びプロテオグリカンからなる。切り取られて末端が修飾された大きいコアＮ−グリカン構造からなるＮ−グリコシル化とは異なり、ムチン型Ｏ−グリカンは、広範なＯ−グリカン多様性をもたらす小さい８コア構造からなる。これらのコア構造は、Ｎ−グリカンに見られる末端修飾に類似し、かつゴルジ複合体内のタンパク質のみに酵素的に付着している。
【０１４１】
ムチンは、コアＯ−グリカン構造の付着部位として機能するＳｅｒ／Ｔｈｒ反復配列を有する長いポリペプチドからなる。ジスルフィド結合オリゴマーの形成により、１ＭＤａよりも大きいムチンが形成され得る。ムチンとは異なり、プロテオグリカンは、ポリペプチド主鎖に付着した長い反復オリゴ糖鎖（１００の単糖残基を超える）からなる。オリゴマーは、多くの場合、反復アミノ由来二糖ヘキソースからなり、この二糖ヘキソースは、主にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として知られている。反復二糖単位に従って分類されるＧＡＧの３つの型は：（１）デルマタン硫酸／コンドロイチン硫酸、（２）ヘパリン硫酸／ヘパリン、及び（３）ケラチン硫酸である。プロテオグリカンは、細胞外マトリックス及び結合組織の主成分である。ムチン及びプロテオグリカンに加えて、Ｏ−グリカンの他の型として、α−結合Ｏ−フコース、β−結合Ｏ−キシロース、α−結合Ｏ−マンノース、β−結合Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ、α若しくはβ−結合Ｏ−ガラクトース、α若しくはβ−結合Ｏ−ＧａｌＮＡｃ、及びα若しくはβ−結合Ｏ−グルコースグリカンが挙げられる１０８。
【０１４２】
Ｎ及びＯ−グリカンの酵素生合成の非鋳型駆動プロセスは、グリコシル化による翻訳後修飾によってタンパク質の構造及び機能に広範な多様性を付与する。Ｏ及びＮ結合型グリカンの化学的及び構造的多様性の例が、図２に示される９６。グリカン合成における多様性により、各タンパク質の変異糖型の形態にさらなる複雑さを付与する。タンパク質が、複数のグリコシル化部位を高頻度に有し、かつ各部位が様々な糖型を有し得ることを考えると、グリカン生合成の複雑さ及び糖タンパク質及びその糖型の下流の役割を解明することは、大きな課題である。
【０１４３】
グリカン認識
グリカンは、レクチン、抗体、及び酵素を含むタンパク質のいくつかのクラスによって認識される。レクチン、グリカン結合タンパク質（その多くが、機能のために金属イオンを必要とする）は、多価相互作用が親和性を高めるため、ミリモルからマイクロモルの親和性及び高い結合活性効果を高頻度で有する８０、１０９。一部のレクチンは、異なる構造間で区別することができるが、殆どのレクチンは、類似の炭水化物構造に対して非常に広範な特異性を示す１１０〜１１２。従来、レクチンは、植物起源又は真菌起源から同定されているが、動物で同定される数も増加している。レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、最も広く適用されるグリカン、糖ペプチド、又は糖タンパク質単離技術である。しかしながら、全グリコプロテオーム（ｗｈｏｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ）の研究では、このアプローチの制限は、グリカンの検出を、レクチンカラム（複数可）の選択に基づいて糖タンパク質のサブセットに偏らせることである８０。
【０１４４】
グリカンは、分岐することができ、かつ連結構造間の相違を示すことができるため、グリカンの認識が、グリカンの組成及び３Ｄ構造の両方によって強く影響されることに留意することが重要である１１３。加えて、単糖の構造類似性を考慮すると、生物学的に無関係のグリカンでは、同じレクチン又は抗体と濃度依存性に交差反応するのが一般的である。従って、十分なグリカン又はタンパク質が存在すると、弱いがなお特異的な相互作用を検出することができ、間違って解釈される可能性がある８２、１１４、１１５。例えば、コムギ胚芽凝集素及びセイヨウイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ）凝集素（ＵＤＡ）は、これらの単糖が、共通３Ｄ結合モチーフを提示するように配向され得るという事実から、同じ結合部位の末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の両方を認識することが分かっている１１６、１１７。加えて、ＵＤＡは、真菌細胞の表面に関連したキトトリオース（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、及びＮ結合型グリカンに共通のマンノース（Ｍａｎ）含有三糖Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃの両方を認識する１１８、１１９。このような交差反応性は、分離できないため、グリカン組成を特徴付けるための試薬の調製又は適用に重大な課題を提示する。従って、サンプルの濃縮又は単離に使用される試薬の選択は、グリコミック分析（ｇｌｙｃｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）の結果をレクチン又は抗体の結合特性に基づいて複合糖質のサブセットに偏らせ得る８０。
【０１４５】
抗体は、レクチンよりも高い親和性及び特異性でグリカン構造を認識するが：抗体は、炭水化物が一般に弱い免疫原であることを考えると、作製が困難である。従って、抗炭水化物抗体の限られた選択肢しか利用可能でなく、抗炭水化物抗体の多くは、類似のグリカン構造に対して交差反応性を示す８２、１１４。
【０１４６】
レクチン又は抗体とは対照的に、グリカンプロセシング酵素は、多くの場合、基質構造に関して極めて選択的であり、グリカンプロセシングにおけるその必須の役割を反映している。グリコシルヒドロラーゼは、一般に、グリコシド結合を含む単糖残基の両方を認識し、多くの場合、この結合の位置及び構造に特異的である。例えば、様々な供給源からの酵素Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）及びキチナーゼは、グリコヒドロラーゼのファミリー１８の全てのメンバーであり、かつ類似の三次構造を有する。これらの類似性にもかかわらず、Ｅｎｄｏ  Ｈは、Ｎ−グリカンコア配列はＭａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ配列に存在する場合は、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合に対してのみ活性であり；キチン中の同じ結合を加水分解しない１２０。この特異性は、レクチンＵＤＡに見られる特異性とは対照的である。加えて、多くの炭水化物プロセシング酵素は、非触媒炭水化物結合分子を有し、この分子は、酵素−基質相互作用の特異性を高める働きをする１２１。部位特異的突然変異は、多くの場合、不活性突然変異体を作製するために利用され、基質特異性の特徴付けを容易にする１２０。
【０１４７】
従って、基質を検出するために試薬として炭水化物プロセシング酵素の不活性な突然変異体を利用する興味深い機会が存在する。このようなレクチン様酵素由来（Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標））試薬は、原則として、野生型酵素の固有の特異性を維持するという利点を有するであろう。実際、酵素の単一点突然変異が、アフィニティーカラムに使用して特定のグリカン（ポリシアル酸）又はペプチド（アンヒドロトリプシン）を捕捉できる試薬をもたらし得る例が存在する１２２、１２３。しかしながら、酵素は、代謝回転のために進化されてきたため、単純な不活性点突然変異体は、一般に、実用的な試薬として十分に高い親和性は有していない。
【０１４８】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ
ペプチド：Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ）酵素（表２）は、ポリペプチドのアスパラギン側鎖とＮ−グリカンの近接Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グリコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）との間のアミド結合の切断を触媒するＮ−グリカン放出酵素のクラスである。加水分解反応により、グリカン及び遊離アンモニアが放出され、アスパラギンがアスパラギン酸に変換される（図３）。
【０１４９】
【表２】
2017513488.tif 000004
【０１５０】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆの発見
Ｎ−グリカンプロセシング酵素、ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）は、１９８４年にＰｌｕｍｍｅｒらによってグラム陰性土壌細菌フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（以前は、クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）及びエリザベスキンギア・メニンゴセプチカム（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）として知られていた）から同定された１２４。ＰＮＧａｓｅ酵素は、植物、動物、及び真菌の全ての様々な種から同定されたが；ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、その最初の発見から３０年経過しても確認された唯一の細菌ＰＮＧａｓｅ酵素であるため、これらの他のＰＮＧａｓｅ酵素とは対照的である。近年、Ｎ−グリカナーゼ活性が変更された新規なＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩが、同じ生物、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から同定された。
【０１５１】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆの初期の研究により、この酵素が全てのＮ−グリカンの放出を触媒し得ることが示された１２４。しかしながら、これは、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  ＦとＥｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ（Ｅｎｄｏ  Ｆ）との混合物を含む酵素製剤によるものであった１２５。Ｅｎｄｏ  Ｆは、キトビオース部分のグリコシド結合を切断する一方、ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、グリコシルアミニル（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｍｉｎｙｌ）接合部でアミド結合を切断する１２６。これらの結果により、ＰＮＧａｓｅ  Ｆが実際にペプチド：Ｎ−グリコシダーゼであり、エンドグリコシダーゼではないことが確認され、ＰＮＧａｓｅ  Ｆが再分類されることになった。チャイニーズハムスター卵巣細胞からのフェチュイン糖ペプチド及びエリスロポエチンを用いた追加の実験により、酵素の活性が、洗剤で前処理された変性糖タンパク質で大幅に改善されることが示され、脱グリコシル化には著しく少ない酵素で済む１２５。しかしながら、緩衝液の組成を含む最適な反応条件は、ある洗剤及び金属イオンの存在下でのＰＮＧａｓｅ  Ｆ活性の低下を実証した最近の研究まで確立されなかった。これらの研究はまた、ｐＨ８．０での最適な酵素活性を確認し、塩化ナトリウムを含まないトリス緩衝液を使用するために緩衝液組成が最適化された１２６、１２７。
【０１５２】
１９８９年の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＰＮＧａｓｅ  Ｆのクローニング及び異種発現により、継続的な研究のための高純度の調製物が得られ、この調製物が、全Ｎ−糖タンパク質の脱グリコシル化のために急速に普及することになった１２８。しかしながら、Ｔｒｅｔｔｅｒらは、１９９１年に、ＰＮＧａｓｅ  Ａとは対照的に、アスパラギン（ａｓｐａｒａｉｎｅ）結合ＧｌｃＮＡｃのコアα１，３フコシル化が、ＰＮＧａｓｅ  Ｆに対する糖ペプチド又は糖タンパク質の耐性を付与したことを実証した１２９。１９９４年の初めに、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの２つの３次元Ｘ線結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤｓ  １ＰＮＧ＆１ＰＧＳ）が（リガンドなしで）得られ、活性部位を特定することへの関心が高まり、α１，３フコシル化が耐性を付与する理由が、アスパラギン結合ＧｌｃＮＡｃのＣ３位が結合溝の疎水性溝に埋もれることによる可能性が高いという仮説を立てた１３０〜１３２。この仮説は、Ｘ線結晶学的データが共結晶化ＰＮＧａｓｅ  Ｆ：キトビオース複合体で得られたときに確認された。
【０１５３】
ＰＮＧａｓｅ  ＦのＸ線結晶構造
キトビオースリガンド、Ｎ，Ｎ'−ジアセチルキトビオース、（ＰＢＤ  ＩＤ  １ＰＮＦ）と共結晶化されたＰＮＧａｓｅ  Ｆの第１の構造が、１９９５年にＫｕｈｎらによって２．０Åの解像度で公表された１３３。結晶化ＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の注釈付き配列が図４に示されている。非複合体化構造（ＰＤＢ  ＩＤｓ  １ＰＮＧ＆１ＰＧＳ）に一致して、複合体化ＰＮＧａｓｅ  Ｆのコンフォメーション：キトビオース構造に著しい変化が見られず、このコンフォメーションがキトビオースリガンドの結合による影響を受けていないことを示している。折り畳まれたタンパク質は、２つのドメインからなり、これらのドメインはそれぞれ、残基１〜１３７及び１４３〜３１４から構成される。両方のドメインは、境界面が広範な水素結合接触部を有するβシートの全長に延びるように、互いに近接して位置する８本鎖逆平行βサンドイッチを有する。非複合体化構造の３つの溝に基づいて、３つの結合部位が可能であると仮定した１３２。分子の一面にあるボウル上の第１の溝が、Ｌ−アスパラギナーゼの活性部位に類似した残基を含んでいた１３２。多数の酸性残基及びトレオニン残基を含む反対面にある浅いＳ字状の溝が、第２の可能な結合部位として仮定された１３２。分子の一端における２つのドメイン間の境界の深い溝が、第３の結合部位として仮定された。いくつかの酸性残基及びセリンを含むこの溝は、５つのトリプトファン残基を有するというユニークな特性を有していた１３２。
【０１５４】
１ＰＮＦ構造モデルは、２つのドメインの境界面の深い溝をキトビオースリガンドの結合溝であると裏付ける。結合溝におけるα−キトビオースリガンドの向きは、深い疎水性ポケットに延びた還元ＧｌｃＮＡｃＮ−アセチル基を示す（データは不図示）。５つの水分子が、タンパク質とキトビオース境界面との間に位置している。第２のＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル基が、結合溝の溶媒到達側に面している。還元ＧｌｃＮＡｃのＣ３位は、結合溝に面しており、グリカンが１，３フコシル化されている場合は、このグリカンがこの溝に適合する空間が存在しないであろうことを裏付ける。Ｃ３位とは異なり、Ｃ６位は、溝の溶媒に暴露される側に向かって外側を向き、この位置のα１，６フコシル化が、結合溝へのアクセスを立体的に妨げないことを示唆している。
【０１５５】
タンパク質とリガンドとの間の水素結合相互作用の広範なネットワークも証拠であり、その多くが、タンパク質とリガンドとの間の境界に位置する５つの水分子（Ｗａｔ７５、Ｗａｔ１４６、Ｗａｔ３４６、Ｗａｔ３４８、Ｗａｔ３４９）によって促進される。これらの水分子の内の３つ（Ｗａｔ７５、Ｗａｔ１４６、Ｗａｔ３４６）は、非複合体化構造のほぼ同じ位置にも存在する１３０、１３２。合計１０残基（Ｄ６０、Ｒ６１、Ｙ８５、Ｅ１１８、Ｗ１２０、Ｓ１５５、Ｇ１９０、Ｗ１９１、Ｅ２０６、Ｒ２４８）が、水分子とリガンドの水素結合のネットワークに関与する。Ｋｕｈｎらによって最初に公表された分子間水素結合接触部を示す概略図が、図５に再現されている１３３。この概略的な水素結合接触部のネットワークの３次元表現が図６に示されている。
【０１５６】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆの活性部位の残基
ＰＮＧａｓｅ  Ｆの活性部位の残基の点突然変異試験により、Ｄ６０が最初の触媒残基として確認され、Ｅ２０６が、反応中間状態の安定性に関与する可能性が高いことが確認された１３３。キトビオースリガンドの位置に基づくと、Ｄ６０及びＥ２０６は、酵素が切断し得るアミン結合の両側に亘るであろう。しかしながら、糖ペプチドと複合体を形成したＰＮＧａｓｅ  Ｆの構造は委託されておらず、従って機構は未だ確認されていない。Ｅ１１８の突然変異試験は、第２のＧｌｃＮＡｃのＯ６と相互作用するリガンドの反対側の末端にあり、Ｅ１１８が、Ｄ６０及びＥ２０６によって媒介される可能性が高い触媒活性に必要な基質認識に重要であることを示している。Ｄ６０Ａ、Ｅ２０６、及びＲ２４８によって促進される反応機構のモデルが提案され、Ｄ６０が最初の触媒残基である１３２、１３４。このモデルでは、Ｒ２４８は、Ｎ−グリコシド結合のカルボニル酸素と水素結合を形成すると仮定され、従って水酸化イオンによってＡｓｎ−カルボニル炭素が求核攻撃を受けやすくなる。この求核攻撃は、Ｗａｔ３４６（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＰＧＳではＷａｔ４２２）によって促進される可能性があり、このＷａｔ３４６は、複合体化構造及び非複合体化構造の両方に存在し、かつＤ６０、Ｅ２０６、及びＲ２４８に近接して位置する。水酸化イオンは、Ｗａｔ３４６からＤ６０へのプロトンの移動によって形成され得る。Ａｓｎ−カルボニル炭素は、水酸化イオンから求核攻撃を受ける可能性があり、遷移中間状態を形成する。Ｄ６０は、そのプロトンをアミン結合の窒素に供与し、アミド結合の切断が完了する。この提案されるモデルでは、Ｄ６０のｐＫａを、反応の最適ｐＨである４．５から８．０に引き上げる必要があろう。このような活性部位の局所環境の変化は、Ｅ２０６及びＤ６０を取り囲む近傍の芳香族残基（Ｙ８５、Ｗ２５１、Ｗ２０７、及びＷ１９１）によって引き起こされる疎水性環境によって実現可能であろう。
【０１５７】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆの重要性
３０年前のＰＮＧａｓｅ  Ｆの発見以来、特徴付けの前にＮ結合型グリカンを放出するための標準的なツールになった。ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、キトビオースコア及びＮ−グリカンペプチドとタンパク質のコンジュゲートに共通のアスパラギン結合ペプチドモチーフの両方を認識するため、Ｎ−グリカン保持糖タンパク質に対して広範な特異性を有する。基質特異性試験により、触媒活性に必要な最小グリカンモチーフがキトビオースコアであることが確認された１３５。加えて、認識される最小ペプチドモチーフは、全てのＮ結合型グリカンに共通のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒグリコシル化モチーフである１３５。興味深いことに、最適な酵素活性は、キトビオース結合ペンタペプチド、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒで観察され、酵素が、グリカン結合アスパラギンの上流及び下流の両方の残基を認識することを示唆している１３５。
【０１５８】
全てのＮ−グリカン保持糖タンパク質に共通のＮ−糖ペプチドコアに対するＰＮＧａｓｅ  Ｆの広範な特異性を考えると、この酵素は、Ｎ−糖ペプチド認識試薬をエンジニアリングするための理想的な候補であろう。現在、Ｎ−糖ペプチドを認識して濃縮できる単一検出試薬は存在しない。このような試薬は、糖質科学界にとってかなり興味深いものであり得、これをエンジニアリングすることがこの実施例の焦点である。
【０１５９】
概要
理論的アプローチ及び実験的アプローチの両方における近年の進展は、糖鎖生物学の分野を進展させる特有の機会を提供する。具体的には、高スループット定方向進化戦略を用いる計算化学及び構造生物学ツールを利用することにより、所望の機能を有するクローンの同定に集中した新規なタンパク質ライブラリーの合理的なコンピューター内での設計を実現可能にする８〜１５。計算によるドッキング及び分子動力学は、非常に複雑かつ柔軟な性質のタンパク質−グリカン相互作用を調べるための不可欠なツールとなってきている９、７０。さらに、結合相互作用を駆動する熱力学的寄与を評価するための結合自由エネルギーの決定は、その他の方法では決定することができない、アミノ酸によって破壊されるタンパク質−リガンド相互作用の洞察を提供する強力な計算技術である８、１０、１２。これらの計算ツールは、生体分子の相互作用の理解を深める役割を果たし、かつ新規な機能を有する生体分子の進展をガイドする。コンピューター内での結合の構造分析、分子動力学（ＭＤ）、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向進化を用いる結合自由エネルギーの分解戦略は、両方の分野を進展させるだけではなく、糖鎖生物学の分野に関連した新規な生体分子の進展も促進する知識ベースのタンパク質エンジニアリングを可能にする３、３１、４０。
【０１６０】
コンピューター内及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質エンジニアリング法の進展並びに新規なグリカン検出試薬の要望を考慮して、この実施例は、グリカンプロセシング酵素（ｅｎｚｙｍｅのｅｎｚ）からエンジニアリングされた新規なレクチン（ｌｅｃｔｉｎのｌｅｃｔ）様グリカン認識生体分子を説明し、この生体分子はＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）と呼ばれる（Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、Ｇｌｙｃｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ．の連邦政府による登録商標である）。グリカンプロセシング酵素は、そのグリカン基質に対して優れた特異性を有するため、親和性が高い触媒的に不活性な変異体を作製するための理想的な出発点として役立つ。具体的には、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）Ｎ−グリカンプロセシング酵素、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを、全てのＮ結合型グリカンに共通のコア糖ペプチド成分を検出するための触媒的に不活性な親和性の高い変異体にエンジニアリングした。
【０１６１】
Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）設計戦略の概略図が図７に示されている。野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素は既に、２．０Åの解像度、活性部位でＮ，Ｎ'−ジアセチルキトビオース二糖と共結晶化されている（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＰＮＦ）１３３。この構造モデルを使用して、分子動力学シミュレーション及び結合自由エネルギー分解分析を行ってキトビオースリガンドの近接必須テピッドアミノ酸残基を特定する。重要な残基は、飽和突然変異誘発のために選択されるのではないが、リガンド結合相互作用エネルギーが弱いテピッド残基は、定方向進化による飽和突然変異誘発のために選択される。定方向進化を酵母ディスプレイ系を用いて行って、標的Ｎ−グリカン保持糖タンパク質、リボヌクレアーゼＢ（ＲＮアーゼＢ）に対して親和性を有する突然変異ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンを選択する。選択されたＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）、Ｒ９１１は、速度論的分析用の表面プラズモン共鳴、特性決定用のグリカンアレイスクリーニングよって特徴付けられ、そしてＮ−糖ペプチド及びＮ−糖タンパク質サンプルの濃縮用のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーに利用される。
【０１６２】
炭水化物プロセシング酵素（Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標））からのレクチン様試薬の調製の成功は、Ｎ−糖ペプチド及びＮ−糖タンパク質サンプルの濃縮の課題に対するユニークな解決策を提供するだけではなく、グリカン及び複合糖質の生物学的関連性についてのグリカン標的試薬のエンジニアリングの新規な戦略も実証する。
【０１６３】
参考文献
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2017513488.tif 000006
2017513488.tif 000007
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【０１６４】
実施例２
バイオコンビナトリアルライブラリーのコンピューターガイド設計
コンピューターガイドライブラリー設計
野生型Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）Ｎ−グリカンプロセシング酵素、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆは既に、２．０Åの解像度で、活性部位でキトビオース二糖と共結晶化されている（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＰＮＦ）１。この１ＰＮＦ  Ｘ線結晶構造モデルを用いて、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−Ｎ、Ｎ'−ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）複合体の５ナノ秒の完全溶媒和ＭＤシミュレーションを、ＡＭＢＥＲ−ＧＬＹＣＡＭタンパク質−炭水化物力場を利用する圧力及び室温で、水中で行った２〜４。実験的構造に対する、Ｃα原子の位置における二乗平均差（ＲＭＳＤ）を、シミュレーション時間の関数として決定し、比較的低い１．５Åの平均（ＲＭＳＤ）（図８）は、このシミュレーションにより実験的構造が再現されたことを示した。加えて、複合体は、二糖リガンドとタンパク質との間の実験的に観察された水素結合相互作用を維持した（表３）。複合体のシミュレーションが安定であり、かつ実験的構造データに一致しているようであることを考慮して、相互作用エネルギーを計算した。加熱及び平衡前の期間（１ナノ秒）からのデータは、次の分析には含めなかった。ＡＭＢＥＲで実施されるＭＭ−ＧＢＳＡプロトコルを用いて、結合エネルギーに対する残基当たりの分子力学的（ＭＭ）寄与を、２〜５ナノ秒の間、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの３１４の各アミノ酸に対して計算した；一般化Ｂｏｒｎ（ＧＢ）連続溶媒モデルを利用して、脱溶媒和エネルギーを推定した５。加えて、ＭＤデータを、コンピューターアラニンスキャニングに利用した。図９は、リガンドの４．５Åの範囲の残基を示している。
【０１６５】
【表３】
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【０１６６】
全分子力学的（ファンデルワールス、ΔＥＶＤＷ、及び静電気、ΔＥＥＬＥの合計）相互作用エネルギー（ΔＥＭＭ）又は結合自由エネルギーのいずれかに対して少なくとも０．５ｋｃａｌ／モル寄与したその他の残基に加えて、リガンドの近接（４．５Åの範囲）残基の推定相互作用エネルギーが表４に列記される。残基当たりの結合自由エネルギー（ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ）を、分子力学的相互作用エネルギー（ΔＥＭＭ）と残基の脱溶媒和エネルギー（ΔＧＧＢ＋ＳＡ）の和として計算した。残基当たりのエネルギー分析により、結合部位の近接残基（図９）を、残基当たりの結合自由エネルギーに基づいて重要残基とテピッド残基に分類することができた。
【０１６７】
重要な残基は、基質とやや不利な相互作用をすることが示された３つの残基（Ｄ６０、Ｅ２０６、及びＥ１１８）を除いて、相互作用を著しく安定させた。これらの３つの残基はそれぞれ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの触媒機能に関連し、基質の不安定化におけるその役割を説明し得る１。点突然変異体の研究に基づいて、Ｄ６０は、最初の触媒残基として同定され、Ｅ２０６及びＥ１１８は、高エネルギー反応中間体の安定化を助けると提唱される１。複合体における水素結合及び芳香族スタッキングの実験的観察に一致して、エネルギー分解分析により、Ｒ６１、Ｗ１２０、Ｗ５８、Ｗ１９１、及びＷ２５１がリガンド結合に重要であることが確認された１。
【０１６８】
【表４】
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【０１６９】
リガンドに近接した等しく重要な９つの追加の残基が、結合にそれほどエネルギー寄与しないことが確認された。これらの９つの寄与度の低い残基又はテピッド残基は、定方向進化に部位飽和突然変異誘発ライブラリーを利用することによって親和性の向上に最高の機会を提供する。加えて、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆに対して、Ｄ６０又はＥ２０６のアラニン（Ｄ６０Ａ、Ｅ２０６Ａ）での計算上の置換が、これらの突然変異体が有利な相互作用エネルギーを有するべきであることを示している（表５）。特に、Ｄ６０Ａ相互作用エネルギーは、野生型（ｗｔ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆに対して著しく改善された基質親和性を示し、従ってＤ６０Ａ突然変異体が、発現及びさらなる実験的分析のために選択された。
【０１７０】
【表５】
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【０１７１】
酵母ディスプレイライブラリーの構築
２つの酵母表面ディスプレイ・バイオコンビナトリアル・ライブラリーが設計され、これらのライブラリーは、表４に示されている最適化のためのいくつかの計算上の予測残基を含む。ライブラリー１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が、ＮＮＫコドン縮重を用いて合成され、このライブラリー１は、全てのクローンに固定Ｄ６０Ａ突然変異体を含めた。ＮＮＫコドン縮重は、ランダム停止コドンの導入の可能性を低下させると共に、ＮＮＮコドン縮重に対するコドンバイアスも最小限にする６。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔライブラリー１の配列及び突然変異部位が図１０に示されている。ライブラリー２（ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が、全てのアミノ酸を等モル分布させるカセット突然変異誘発を用いて合成され、このライブラリー２は、１９のアミノ酸（即ち、Ｄを除く）を用いてランダム化Ｄ６０位を含めた。ＧｅｎｅＡｒｔライブラリー２の配列及び突然変異の部位は、図１１に示されている。
【０１７２】
合成縮重オリゴヌクレオチドを、既定のアミノ酸サブセットが既定の位置に含められるように構築した（図１０及び図１１）。これらのオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ産物を得て、完全長断片をゲル精製した。両方のライブラリーの完全長産物を、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を用いてｐＰＮＬ６ベクターにクローニングした。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙが、ヒト抗体ｓｃＦｖ断片（ｐＰＮＬ６）の酵母細胞表面ディスプレイ非免疫ライブラリーのアリコートを提供した７。このライブラリーを、図１２に示されているようにｓｃＦｖ断片をＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＰＮＬ６）で置換するために改変した（Ｄｒ．Ｌｏｒｅｔｔａ  Ｙａｎｇ）。ＥＢＹ１００酵母細胞を、表面ディスプレイのためにＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＰＮＬ６ライブラリーで形質転換した（図１３）８。クローンの漸増及びランダム配列決定を行って、ライブラリーの質、形質転換の効率、及びカバーされるパーセント配列スペースを評価した。両方のライブラリーの配列カバレージの推定値の要約が表６に示されている。ライブラリー１を、部位飽和突然変異誘発の７つの部位を用いて設計した。ユニークなクローンの数の理論上の多様性は１．２８×１０９である。しかしながら、配列同一性及び形質転換体の総数に基づいて、推定合成多様性は、僅か２．４０×１０６クローンである。これは、ライブラリー１の構築及び形質転換の両方での非効率性を示す約０．１８％の配列カバレージを表す。ライブラリー２は、部位飽和突然変異誘発の６つの部位を用いて設計し、６．０８×１０７のユニークなクローンの理論上の多様性となる。ライブラリー２の推定合成多様性は、１．３６×１０７のユニークなクローンであると決定された。ライブラリー２は、約２２．３％の配列カバレージを有し、クローンの数に基づくと、ライブラリー１よりも５．７倍広い合成多様性となる。
【０１７３】
【表６】
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【０１７４】
酵母表面ディスプレイによるＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの定方向進化
構築した酵母ディスプレイＰＮＧａｓｅ  Ｆライブラリーを、標的Ｎ−グリカンに対する親和性が高いクローンの選択に利用した。酵母ライブラリーを、約２４時間、３０℃の振盪インキュベーターで、選択増殖培地で一晩増殖させた。酵母細胞表面上のＡｇａ２ｐ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ融合タンパク質の発現及びディスプレイが、Ｇａｌ１−１０プロモーターの下であり（図１２及び図１３）、従って酵母ライブラリーを、２０℃の振盪インキュベーターで、ガラクトース含有培地で一晩誘導した。誘導効率を、一次抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたフローサイトメトリーによって、完全に発現されたＡｇａ−２ｐ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ融合タンパク質のＣ末端ｃ−ｍｙｃタグを検出して決定した（データは不図示）。少なくとも６０％の誘導クローンを含む誘導酵母ディスプレイライブラリーを、Ｎ−グリカン標的に対する親和性の高いクローンの選択に使用した。
【０１７５】
２つのＮ−グリカン標的を、Ｎ−グリカン構造に対するｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の広範な特異性を維持するクローンを濃縮する選択戦略に利用した。一次Ｎ−グリカン標的は、ウシ膵リボヌクレアーゼＢ（ＲＮａｓｅ  Ｂ）であり、ウシ膵リボヌクレアーゼは、アスパラギン３４（Ｎ３４）に単一Ｎ−グリコシル化部位を含み、かつ９つの高マンノース糖型を有する（図１４）９〜１１。報告されたＲＮａｓｅ  Ｂの平均分子量は、グリコシル化種のそれぞれの相対存在量から得られた１５，０９５Ｄａである１２。ＲＮａｓｅ  Ｂ及びその非グリコシル化型ＲＮａｓｅ  Ａ（１３，６８０Ｄａの報告された平均分子量）は、十分に特徴付けられた酵素であり、かつ炭水化物分析技術を検証するための標準として頻繁に使用される１１〜１６。興味深いことに、ＲＮａｓｅ  ＡのＮＭＲスペクトルとＲＮａｓｅ  ＢのＮＭＲスペクトルとの比較に基づくと、ＲＮａｓｅ  ＢのＮ−グリコシル化は、その構造に対して認識できる影響を有していない１７。しかしながら、ＲＮａｓｅ  Ｂは、ＲＮａｓｅ  Ａよりも優れた安定性を示し、これは、グリコシル化が、タンパク質のコアに埋没した基の優先的な水和によって促進される変性傾向を緩和するという観察に一致している１４、１５。二次Ｎ−グリカン標的は、フェチュインをノイラミニダーゼで酵素的に脱シアル化することによって形成されるアシアロフェチュインであり、０．５％未満のＮ−アセチルノイラミン酸を含む。ウシ胎仔血清から単離されたフェチュインは、３つのＮ−グリコシル化部位及び５つのＯ−グリコシル化部位を有する４８．４ｋＤａの糖タンパク質であり、かつＲＮａｓｅ  Ｂに見られる高マンノース構造と比較して、相対的に複雑なＮ−グリカン構造を有する１８。フェチュインのパーセント重量組成比は、ポリペプチドが７４％、ヘキソースが８．３％、ヘキソサミンが５．５％、及びシアル酸が８．７％である。両方のＮ−グリカン標的糖タンパク質を変性させて、Ｎ−グリカンが酵母表面ディスプレイＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンに十分に到達可能にした。さらに、変性糖タンパク質を、ＦＡＣＳ用の蛍光標識ストレプトアビジンでの選択及び検出のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｅｒ、ストレプトアビジンで被覆された２．８μｍの磁気ビーズに提示するために、この変性糖タンパク質をビオチン標識した。
【０１７６】
この選択戦略は、ストレプトアビジンで被覆された２．８μｍの磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｅｒ）を用いる２回の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（図１５）及びこれに続く、標的Ｎ−グリカンとして変性ＲＮａｓｅ  Ｂ及びアシアロフェチュインを用いる３回の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含んでいた１９、２０。目的のＮ−グリカン標的に対する陽性選択の前に、ライブラリーを、第１回の選択の開始時に非被覆磁気ビーズに対して陰性選択して、ライブラリーから全てのビーズ結合クローンを除去した。
【０１７７】
２回のＭＡＣＳと１回のＦＡＣＳの選択のセットを繰り返し、合計で９回行った（図１６ａ）。標的Ｎ−グリカン含有ＲＮａｓｅ  Ｂのみを、ライブラリー１での９回全ての選択に使用した。しかしながら、Ｎ−グリカン含有ＲＮａｓｅ  Ｂ及びアシアロフェチュイン糖タンパク質の両方を、並列の選択の回でライブラリー２の標的として同時に使用した。ＲＮａｓｅ  Ｂでの３回目の選択により増幅されたライブラリー出力の一部を、４回目〜６回目の間にアシアロフェチュインに対して同時に選択した。標的ＲＮａｓｅ  Ｂ及びアシアロフェチュイン選択の両方からの出力を、６回目の後にプールした。前述のように、この組み合わせ出力プールの一部を、並列の７回目〜９回目の間に標的ＲＮａｓｅ  Ｂ及びアシアロフェチュインの両方に対して再び同時に選択した。９回目の選択の最後に、ＲＮａｓｅ  Ｂ及びアシアロフェチュイン選択出力プールの両方をもう一度組み合わせた。
【０１７８】
９回の反復選択及び増幅（約５０クローンを各３回目の終了時に配列決定した）の間に、クローンの濃縮を観察した。高レベルで濃縮されたクローン、指定Ｒ９１１は、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆに対して次の突然変異を有していた：Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ。６つの計算により選択された突然変異誘発部位における優勢なアミノ酸のグラフィック表示を、図１６ｂで確認することができる。
【０１７９】
【表７】
2017513488.tif 000020
【０１８０】
ライブラリー１及びライブラリー２の両方から選択された上２つの濃縮クローンの配列同一性が表７に要約されている。複数の部位におけるトリプトファンの選択は、芳香族側鎖が単糖の疎水面と相互作用することが知られているため重要である２１。ライブラリー２のＤ６０位は、１９のアミノ酸（Ｄを除く）に対する部位飽和突然変異誘発を受けやすく、両方のＲ９クローンで同じＤ６０Ａ突然変異を示した。これは、この位置のシステインが結合相互作用に非常に有利であることを示唆し得る。しかしながら、４つ全ての濃縮クローンにおけるシステインの存在は、１つのシステインの追加により、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの５１〜５６、２０４〜２０８、及び２３１〜２５２にある３つの既存のジスルフィド結合を破壊する可能性があるため、懸念材料でもあり得る。他の興味深い観察は、ライブラリー１からの両方のＲ６クローンでＥ１１８Ａ及びＩ１５６Ｔの突然変異が優先されることを含む。同様に、ライブラリー２からの両方のＲ９クローンは、Ｄ６０Ｃ及びＧ１９２Ｉの突然変異が優先されることを示している。Ｇ１９２Ｉ突然変異は、比較的小さいグリカン残基が大きい疎水性イソロイシン側鎖で置換されているため重要である。結合ポケットの疎水性の増加は、タンパク質−炭水化物相互作用を促進し得るが：大きい側鎖の存在はまた、結合ポケットへのアクセスを部分的にブロックし得る。選択されたＲ６及びＲ９クローンのＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）親和性試薬としての実用性を調べてその特性を特徴付けるために、選択されたＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現及び精製のための細菌発現ベクターにクローニングした。
【０１８１】
方法
分子動力学及び残基当たりの結合自由エネルギー分解
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−Ｎ，Ｎ'−ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）複合体の５ナノ秒の完全溶媒和ＭＤシミュレーションを、ＡＭＢＥＲ−ＧＬＹＣＡＭタンパク質−炭水化物力場を利用する圧力及び室温で、水中で行った。ＡＭＢＥＲで実施される一般化Ｂｏｒｎ（ＧＢ）連続溶媒モデルを利用して、結合エネルギーに対する残基当たりの寄与を、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの３１３の各アミノ酸について計算した５。典型的なＭＭ−ＧＢ／ＰＢ計算では、ＭＤ軌道から抽出された各構造「スナップ写真」のタンパク質（ΔＧＰＲＯＴＥＩＮ）、リガンド（ΔＧＬＩＧＡＮＤ）、及び複合体（ΔＧＣＯＭＰＬＥＸ）について自由エネルギーを計算する。５ナノ秒の軌道から、最初の１ナノ秒を捨て、分子力学的（ＭＭ）結合エネルギー分析のために残りの４ナノ秒から２０００のスナップ写真を（２ピコ秒の間隔で）選択した。次いで、結合自由エネルギー（ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ）を減算によって求めた。式１に示されているように、全軌道の平均化により、最終的な平均相互作用エネルギー（＜ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ＞）が得られ、この平均化はＭＤスナップ写真に対してである。
式１
＜ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ＞＝＜ΔＧＣＯＭＰＬＥＸ＞―＜ΔＧＰＲＯＴＥＩＮ＞−＜ΔＧＬＩＧＡＮＤ＞
【０１８２】
成分の自由エネルギーは、エネルギーを３つの範疇、即ち、分子力学（ΔＥＭＭ、静電気及びファンデルワールス）、エントロピー（ΔＳＭＭ）、及び溶媒和（ΔＧＳＯＬＶＡＴＩＯＮ）に分類することによって計算する（式２）。
式２
＜ΔＧ＞＝＜ΔＥＭＭ＞―Ｔ＜ΔＳＭＭ＞＋＜ΔＧＳＯＬＶＡＴＩＯＮ＞
【０１８３】
コンピューターアラニンスキャニング及び静電気スキャニング
Ｋｏｌｌｍａｎ  ｇｒｏｕｐで提案され、ＡＭＢＥＲで実施される単一軌道突然変異プロトコルに従って、野生型複合体のスナップ写真のセットを、式１及び２のエネルギー項のそれぞれの突然変異体の計算に利用した９。突然変異体の側鎖を切断し、Ｃγを水素原子で置換し、そしてＣβ−Ｈ結合の長さ及び方向を野生型Ｃβ−Ｃγの残基の長さ及び方向に合わせる。単一軌道突然変異プロトコルの基本的な近似は、突然変異体及び野生型が、非結合状態から結合状態への類似のコンフォメーション変化を受けること、及び局所側鎖の再編成が、アラニン突然変異自体に対する小さい摂動であることである９。野生型及び突然変異体種の別の軌道を移動することができるが、これは、（内部エネルギー成分が取り消されないため）かなりのノイズを導入し、かつ計算負荷が高い。別個のシミュレーションは、大きい残基又は荷電残基への突然変異の場合には妥当であろう。
【０１８４】
特定の位置におけるイオン化残基の影響を調べるために、アラニンスキャニングを変更して、理論上の正味の正電荷（Ａｌａ＋）又は負電荷（Ａｌａ−）を有するアラニンを利用した。アラニンの全ての原子が、標準部分電荷を有し、残基の全電荷を、Ｃβ原子の電荷に調整することによって＋１又は−１に合わせた。
【０１８５】
酵母ディスプレイＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンライブラリーの合成
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔライブラリーを、ＮＮＫコドン縮重を用いて合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。このライブラリーは、表３のライブラリー１の下に示されている突然変異誘発部位を含む。ＧｅｎｅＡｒｔライブラリーを、ヌクレオチド混合物を用いて合成し（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、全てのアミノ酸の等モル分布が得られ、このライブラリーは、表３のライブラリー２の下に示されている１９のアミノ酸（即ち、Ｄを除く）を用いるランダム化Ｄ６０位を含む。合成ライブラリーを、ｐＰＮＬ６ベクターにクローニングした（図１２）。
【０１８６】
酵母ディスプレイライブラリーによるＥＢＹ１００の形質転換
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＰＮＬ６ベクターのクローンライブラリーにより、推奨プロコルに従って表面ディスプレイ（図１３及び表６）のためにＥＢＹ１００酵母細胞を形質転換した８。
【０１８７】
酵母ディスプレイライブラリーの誘導
酵母ライブラリーを、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｒｉｃｈｌａｎｄ，ＷＡ）によって提供される酵母ディスプレイｓｃＦｖ抗体ライブラリーのユーザーマニュアル（Ｒｅｖ：ＭＦ０３１１１２）（ｓｙｓｂｉｏ．ｏｒｇ／ｄａｔａｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｔｍ）の推奨プロトコルに従って導入した。ＥＢＹ１００形質転換酵母ライブラリーを、ガラクトース含有培地に導入して、表面ディスプレイされたＡｇａ２ｐ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンを発現させる（図１３）。酵母細胞の少なくとも６０％がＣ末端ｃ−ｍｙｃタグを確実に発現するように、誘導効率をフローサイトメトリーによって決定する（データは不図示）。
【０１８８】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンライブラリーの酵母表面ディスプレイによる定方向進化
Ｎ−グリカン保持糖タンパク質、ＲＮａｓｅ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ  Ｒ７８８４）、及びアシアロフェチュイン（Ｓｉｇｍａ  Ａ４７８１）を選択標的として使用した９、１８。両方の糖タンパク質を変性させて、Ｎ−グリカン及び糖ペプチド領域が酵母表面ディスプレイＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンに最大限暴露されるようにした。
【０１８９】
選択戦略は、２回の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ；図１５）及びこれに続く、標的Ｎ−グリカンとして変性ＲＮａｓｅ  Ｂと変性アシアロフェチュインの混合物を用いる３回の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む１９、２０。２回のＭＡＣＳと１回のＦＡＣＳの選択のセットを、図１６ａに示されているように繰り返し、合計９回行った。
【０１９０】
配列決定のための酵母コロニーのＰＣＲ
各３回目の選択からの約５０コロニーを取り出して、２０μＬの分子生物学グレードの水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＨ３０５３８．０２）中、０．１％ＳＤＳで混合し、９５℃で５分間加熱し、そして氷温で保管した。２μＬの溶解酵母細胞混合物を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のための鋳型ＤＮＡを提供した。ＰＣＲマスターミックスを、製造者の推奨プロトコルに従って、１反応当たり５０μＬの最終量で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０９６６−０３４）及びｄＮＴＰミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １８４２７−０１３）を用いて調製した。フォワードプライマー及びリバースプライマー（図１７）を、０．２μＭの最終濃度でＰＣＲマスターミックスで混合した。ＰＣＲを、図１８に示されているようにプログラムされた熱サイクルで、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＥＰ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて行った。ＰＣＲ産物（１１６３塩基対長）を、０．７％アガロースゲルを用いて検証し、Ｍｕｌｔｉｉｍａｇｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃａｂｉｎｅｔ  （Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いて画像化し、そしてフォワード配列決定プライマー（図１７）を用いて配列決定するためにＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎに提出した。
【０１９１】
参考文献
2017513488.tif 000021
2017513488.tif 000022
2017513488.tif 000023
【０１９２】
実施例３
Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補の実験的特徴付け
コンピューターガイド酵母ディスプレイライブラリー選択から選択された４つのＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補（Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、及びＲ９１１３）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系で発現させて、固定金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製し、続くサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって純タンパク質を得た。精製タンパク質を使用して、そのＮ−糖ペプチド親和性試薬としての実用性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、グリカンアレイスクリーニング、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて調べた。
【０１９３】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの細菌発現ベクターへのクローニング
ｐＯＰＨ６細菌発現ベクターを用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆの高い収率及び可溶性の発現が、Ｌｏｏらによって報告された１。ｐＯＰＨ６ベクターは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆをペリプラズムに誘導するためにＮ末端ＯｍｐＡペリプラズム分泌タグを含む。この構築物はまた、発現ＰＮＧａｓｅ  ＦのＩＭＡＣ精製のためのＣ末端ヒスチジンタグも含む。このベクターを用いて、部位特異的突然変異誘発によってＤ６０Ａ点突然変異体を作製した（Ｄｒ．Ｌｏｒｅｔｔａ  Ｙａｎｇ）。
【０１９４】
加えて、酵母ディスプレイ選択ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローン（Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、及びＲ９１１３）も、オリゴヌクレオチドプライマー（図１９）を用いてｐＯＰＨ６ベクターにクローニングした。これらのプライマーは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＰＮＬ６ベクターのＰＮＧａｓｅ  Ｆクローン配列をＰＣＲ増幅して、隣接ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を完全長ＰＣＲ産物に導入するように設計した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で二重消化して、既に二重消化されたｐＯＰＨ６空ベクターに結合した。ＤＮＡ配列決定により、Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、及びＲ９１１３のｐＯＰＨ６ベクターへのクローニングの成功を確認した。しかしながら、発現タンパク質は、マウス抗Ｈｉｓ６ｘ  ＨＲＰ結合抗体を用いたウェスタンブロット法では検出できなかった。従って、新たな発現ベクター、ｐＯＰＨ６  ＩＩベクターを設計した。
【０１９５】
ｐＯＰＨ６  ＩＩ細菌発現ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）ベクターをベースとした。カスタムオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＯＰＨ６ベクター（図２０）のｏｍｐＡ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−Ｈｉｓ６ｘ配列をＰＣＲ増幅するように設計した。目的の全配列が確実に含まれるように、ＯｍｐＡ配列の上流にＸｂａＩ制限部位を含むＴ７フォワードプライマーを使用した。加えて、リバースプライマーは、ＸｈｏＩ制限部位を停止コドンのすぐ下流に導入するように設計した。これらの制限部位を使用してＰＣＲ産物を二重消化して、遺伝子をＸｂａ  Ｉ及びＸｈｏＩ二重消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）ベクター（図２１）にクローニングした。ＯｍｐＡ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−Ｈｉｓ６発現配列クローンを含む結合プラスミドをＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６  ＩＩとして同定し、ベクター地図が図２２に示されている。５つのｐＯＰＨ６  ＩＩプラスミドを構築し、それぞれは、目的の５つのＰＮＧａｓｅ  Ｆクローン：Ｄ６０Ａ、Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、及びＲ９１１３の内の１つを含んでいた。元のｐＯＰＨ６ベクターとは異なり、発現及び精製が、ｐＯＰＨ６  ＩＩベクターを用いて無事達成された。
【０１９６】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの発現及び精製
元のｐＯＰＨ６ベクターを用いた酵母ディスプレイ選択ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの発現に、既に公表されたプロトコルを用いて成功した１、２。しかしながら、発現及び精製は、Ｆｉｌｉｔｃｈｅｖａらによって開発されたプロトコルを用いてＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６  ＩＩベクターで無事成功した２。このプロトコルは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの発現及び精製を最適化するために採用した。
【０１９７】
５つ全てのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６  ＩＩ（Ｄ６０Ａ、Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、及びＲ９１１３）プラスミドで、発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。目的のタンパク質の発現は、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性Ｔ７プロモーターの制御下にある。要約すると、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む５０ｍＬの開始ＬＢ培地を、ＬＢ−カルベニシリン寒天プレートから選択された単一形質転換コロニーで接種し、３７℃の振盪インキュベーターで一晩増殖させた。培養物を、３７℃に予熱された１Ｌのカルベニシリンを含むＬＢで増殖させた。温度を、ＯＤ６００が０．４〜０．５の間で２２℃に低下させ、培養物をＩＰＴＧで誘導し、約２２時間のインキュベーションを続けた。培養物を、細胞ペレットを収集することによって回収し、これをフレンチプレスによって機械的細胞溶解物にした。この細胞溶解物を遠心分離機にかけて、不溶性細胞デブリを、ペリプラズム画分を含む上清から分離した。このペリプラズム画分をＩＭＡＣカラムにかけて、ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンをイミダゾール勾配で溶出させた。溶出ピークの画分をプールし、１０ｋＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮器を用いて濃縮し、そして純度を高めるためにサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの溶出ピーク画分をプールし、濃縮し、そしてＵＶ２８０吸光度（Ａ２８０）によってタンパク質収量を決定した。
【０１９８】
発現ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０ＡクローンのＩＭＡＣ及びＳＥＣクロマトグラム溶出プロフィールは類似していた。図２３は、Ｄ６０ＡのＩＭＡＣ溶出クロマトグラムを示している。発現及びＩＭＡＣ精製サンプルを、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法によって分析し、ゲル及びブロット画像が図２４に示されている。同様に図２５及び図２６は、対応するＤ６０ＡのＳＥＣ溶出クロマトグラムを示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット画像が図２６に示されている。可溶性ペリプラズム画分サンプル（図２４ａのレーン３）と不溶性細胞溶解物（図２４ａのレーン５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル比較により、Ｄ６０Ａの移動に一致するかなり大きい３６ｋＤａタンパク質バンドが不溶性細胞溶解物中に存在することが示されている。しかしながら、このタンパク質バンドの僅か部分しか、ウェスタンブロット法では検出されなかった（図２４ｂのレーン５）。これらのデータを総合すると、ウェスタンブロット法により、発現Ｄ６０Ａタンパク質の殆どが、可溶性ペリプラズム画分中であり（図２４のレーン３）、最小限の量が不溶性細胞溶解物中であり（図２４ｂのレーン５）、不溶性細胞溶解物のクマーシー染色ゲルで観察されたかなり大きい３６ｋＤａのバンドがＤ６０Ａではなかった（図２４ａのレーン５）ことが示される。サンプルを通過する負荷の分析により、Ｄ６０Ａタンパク質がウェスタンブロット法で検出されなかったため（図２４のレーン６）、ｈｉｓ標識Ｄ６０Ａタンパク質が特にＩＭＡＣカラムに保持されたことが示唆される。かなりの量の非特異的タンパク質が、サンプルを通過する同じ負荷のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認された（図２４のレーン６）。図２４のレーン８に示されているように、５０ｍＭ  イミダゾール洗浄ステップより、Ｄ６０Ａタンパク質の僅かな減少で非特異的タンパク質の殆どが除去された。従って、ＩＭＡＣ溶出Ｄ６０Ａプールサンプルは、たとえゲル及び二重ブロットが２４μｇの総タンパク質で過剰負荷されたとしても、非特異的タンパク質での汚染が最小限であることが図２４のレーン９に示されている。Ｄ６０ＡのＳＥＣ精製は、非特異的タンパク質溶出ピーク（図２５）もタンパク質バンドも、個々の溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析（図２６）によって検出されなかったため、純度をより一層改善する。野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０Ａクローンは共に、それぞれ１Ｌの発現培養物から約３．０ｍｇの高純度タンパク質の収量で、発現及び精製に成功した。精製ＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０Ａの同一性をＭＡＬＤＩによって確認した。加えて、Ｄ６０Ａの配列同一性も、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって確認した。
【０１９９】
Ｒ９１１のＩＭＡＣ及びＳＥＣクロマトグラム溶出プロフィールは、図２７及び図２８に示されているように、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０Ａの溶出プロフィールとは大幅に異なっていた。しかしながら、Ｒ９１１発現及び精製サンプルの変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０Ａの結果と同様の結果を示し、Ｒ９１１の溶出プロフィールにおける差異が、変性ゲルの比較では区別できない天然ＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０Ａに対する天然Ｒ９１１の構造の変化によるものであり得ることを示唆している。Ｒ９１１のＩＭＡＣ溶出プロフィールにおける著しい差異は、２０．５％Ｂでの比較的鋭いＤ６０Ａ  ＩＭＡＣ溶出ピーク（図２３）と比較して１４．５％Ｂ〜３１％Ｂの勾配の幅広いピーク（図２７）の溶出であった。同様に、Ｒ９１１  ＳＥＣ溶出プロフィールは、４つの異なる溶出ピークを示し（図２８）、この内の後半の３つの溶出ピークは、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析による比較的純度の高いＲ９１１溶出サンプルに一致する（図２９のレーン７、８、及び９）。これらのデータ、及びサイズ排除クロマトグラフィーがサイズ及び形状に基づいてタンパク質を分けることから、変性ゲル分析では区別できないＲ９１１構造異性体（折り畳まれたＲ９１１と誤って折り畳まれたＲ９１１との混合物の可能性が高い）が存在した可能性が高い。さらに、１４．０２ｍＬの保持容量で最大のピークである、これらの３つのＲ９１１溶出ピークの内の第３の溶出ピークのみが、同じＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬカラムのＤ６０Ａ溶出（同様に約１４ｍＬで最大のピーク）に一致していた。これは、１４．０２ｍＬの保持容量での第３のＲ９１１溶出ピークが、正しく折り畳まれたＲ９１１異性体であったことを示唆している。２ＬのＬＢ培養物からの全Ｒ９１１タンパク質収量は、約２．０ｍｇであり、ＳＥＣ溶出ピーク１からの約１．３１ｍｇ（６５％）、ＳＥＣ溶出ピーク２からの約０．３ｍｇ（１５％）、及びＳＥＣ溶出ピーク３からの約０．４ｍｇ（２０％）に一致する。正しく折り畳まれた全Ｒ９１１が僅か２０％の場合は、有効収量が僅か約０．４ｍｇであった。円偏光二色性又はＮＭＲ実験が、これらの仮定の３つの折り畳まれたＲ９１１異性体と誤って折り畳まれたＲ９１１異性体との間の一般的な構造上の差異の確認に役立ち得る。
【０２００】
Ｒ６１７、Ｒ１１３、及びＲ９１１３クローンを発現させて精製するためにいくつかの試みを行ったが；ＩＭＡＣ溶出プロフィールは常に、Ｒ９１１に対してより浅い溶出プロフィールであるが同様のボード（ｂｏａｒｄ）を有し、ウェスタンブロット法による検出にはタンパク質の量が不十分であった。野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、適切な折り畳みに必要な３つのジスルフィド結合を有し、４つ全ての酵母ディスプレイ選択クローンが、突然変異誘発の１つの部位にシステイン残基を誘導したため（表６）、さらなるシステインの追加が、誤って折り畳まれた疑いのあるＲ９１１並びに研究のためのｈｉｓ標識Ｒ６１７、Ｒ６１１３、及びＲ９１１３の精製ができないことに寄与したとしても驚きではない。従って、点突然変異体Ｒ６１７  Ｃ５７Ｄ、Ｒ６１１３  Ｃ１９２Ｇ、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａ、及びＲ９１１３  Ｃ６０Ａを構築し、これらの点突然変異体では、Ｒ６１７及びＲ６１１３システイン残基が野生型に戻り、Ｄ６０が触媒活性に必要であることから、Ｒ９１１及びＲ９１１３システイン残基が、野生型アスパラギン酸の代わりにアラニンに突然変異した。表８は、目的のＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの物理的及び化学的性質を列記している。
【０２０１】
【表８】
2017513488.tif 000024
【０２０２】
システイン点突然変異体の発現の成功は、ＩＭＡＣ精製Ｒ６１７  Ｃ５７Ｄ、Ｒ６１１３  Ｃ１９２Ｇ、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａ、及びＲ９１１３  Ｃ６０Ａのウェスタンブロット分析によって確認された（データは不図示）。しかしながら、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａしか実験要件に十分な量を産生することができなかったため、Ｒ９１１及びＲ９１１  Ｃ６０Ａのみをさらに調べた。システイン点突然変異体により、追加のシステインの存在が、Ｒ９１１の変更された溶出プロフィール及び提案された構造的異性体に対して部分的にしか関与していないことが確認された。興味深いことに、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａの溶出プロフィール（データは不図示）は、Ｒ９１１の溶出プロフィールに一致し（図２７、図２８、図２９）、他の５つの突然変異残基が、Ｒ９１１の変更されたＩＭＡＣ及びＳＥＣ溶出プロフィールに寄与するはずであることを示唆している。
【０２０３】
活性及び動態の研究
ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素を高親和性Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬に変換するために、触媒活性を無くし、同時に親和性を高める必要がある。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ  Ｄ６０Ａ単一点突然変異体は、３つの理由から特に興味深かった：（１）残基Ｄ６０は、この突然変異が酵素を触媒的に不活性することを実証したＤ６０Ｎ点突然変異体の研究に基づくと触媒活性を必要とする４、（２）コンピューターアラニンスキャニングデータ（表５）が、基質親和性に有利な相互作用エネルギーを予測した、及び（３）Ｄ６０Ａ単一点突然変異体が、定方向進化によって親和性が向上しなかったことから、Ｄ６０Ａを、親和性が向上したＲ９１１クローンとの比較のための触媒的に不活性な親和性が向上しない対照として使用することが適切であった。
【０２０４】
【表９】
2017513488.tif 000025
【０２０５】
クローンＤ６０Ａ及びＲ９１１の酵素活性の両方を調べた。グリコシル化基質、ＲＮａｓｅ  Ｂ、及び非グリコシル化型、ＲＮａｓｅ  Ａの性質が表９に示されている。ゲルシフトアッセイを用いて、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素に対する変性ＲＮａｓｅ  ＢにおけるクローンのＮ−脱グリコシル化触媒活性を決定した（表１０）。Ｄ６０Ａ単一点突然変異体は、著しく低下した触媒活性（ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆに対して約１３％）を有し、Ｒ９１１クローンは、一晩の反応ではサンプル中で検出可能な触媒活性を示さなかった。ＲＮａｓｅ  Ｂの脱グリコシル化は、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ５８００  ＴＯＦ−ＴＯＦを用いるマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＭＳ）によってさらに確認された。脱グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂ産物の質量は、ＲＮａｓｅ  Ａと一致することが確認され、相違は、Ｎ−グリカン切断反応中にＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱アミノ反応によりＮ３４がＤ３４になることである６。
【０２０６】
【表１０】
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【０２０７】
生体分子相互作用の速度実験を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＢｉａｃｏｒｅ  ３０００装置で行った。ＳＰＲは、平面偏光入射光が、電子の振動を刺激するときに生じる現象、又は金属（導電性）／誘電体界面に平行な電磁波（プラズモン）の伝播である。プラズモン波は、金属と約３００ｎｍに亘って広がる液体（又は空気）媒体との界面を伝播し、分子の表面への吸着による界面での変化により、全反射の条件下での反射入射光の角度のずれを引き起こす波動伝播が起こる。全反射は、プラズモンが励起される金表面にガラスプリズムを直接配置することによって達成される。質量の移動に対するＳＰＲの高い感度により、ＳＰＲが、生体分子の相互作用の測定に利用されている８。カルボキシ修飾デキストラン金表面を使用することにより、目的の標的リガンドを、アミン結合を用いてデキストラン誘導体化（ｄｅｘｔｒａｎ−ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅｄ）金表面に共有結合により固定することができる。
【０２０８】
ＳＰＲによるレクチン−炭水化物相互作用の評価は、速度論的分析のための十分に確立された技術である９、１０。ＣＭ−５カルボキシメチルデキストランセンサーチップは、目的のリガンドのアミン結合に利用される。しかしながら、このアプローチは、リガンドの向きがランダムとなり、リガンドの向きが目的の分析物との相互作用に特に重要である場合、又はリガンドの向きの影響が特定の利益である場合は適切ではないであろう。リガンドの向きは、Ｎｉ−ＮＴＡ誘導体化デキストラン表面を用いてヒスチジン標識タンパク質を捕捉することによって達成することができる１１。このアプローチは、捕捉分子が共有結合しないため捕捉分子が表面に吸着するという重大な難点を有する。近年、吸着に勝るヒスチジン標識タンパク質の共有結合固定化が実証された１２。マイクロ流体を使用して、目的の分析物を、生体分子（固定されたリガンドと分析物）間の相互作用が起こり得る、固定されたリガンドを含むフローセルを通過させる。同時に、センサー表面の反対側において、反射光の角度の変化の程度が質量の変化に比例する。
【０２０９】
変性ＲＮａｓｅ  Ｂ、及びＲＮａｓｅ  Ｂと同じペプチド配列を有するがＮ−グリコシル化を有していない変性ＲＮａｓｅ  Ａは、アミン結合化学を用いてＣＭ−５チップに共有結合させた。ＲＮａｓｅリガンドを、ＣＭ−５センサーチップのカルボキシメチルデキストラン表面に固定する前に、ｐＨスカウティング実験により、効率的な結合に最適なｐＨ５．５が示された（図３０）。約３０００ＲＵの理論ＲＭＡＸを得るために十分なリガンド結合で高密度表面を用意した。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆに対するＲ９１１のＤ６０Ｃ突然変異の影響を評価するために、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａ突然変異体も評価した。生体分子相互作用モデルを用いる定常状態結合反応速度を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置を用いて決定した。
【０２１０】
ＲＮａｓｅ  Ｂと酵母ＰＮＧａｓｅ酵素との間及びＲＮａｓｅ  Ｂと突然変異体酵素との間の結合反応速度を測定するためのＳＰＲの使用を実証した１３。同様の戦略を用いて、変性ＲＮａｓｅ  ＢをＣＭ−５センサーチップに固定し、段階希釈濃度のｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｄ６０Ａ、Ｒ９１１、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａを、結合反応速度を測定しながらセンサー表面を通過させた。反応速度の要約が表１１に示され、センソグラムが図３１に示されている。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆは、６．４μＭのＫＤ及び０．１×１０−１／秒の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。Ｄ６０Ａ対照クローン（ＫＤ＝２．７μＭ）に対して、選択されたＲ９１１クローンは、１０倍増加した親和性（ＫＤ＝０．２６μＭ）を有する。さらに、選択されたＲ９１１クローンは、Ｄ６０Ａ対照クローン（ｋｏｆｆ＝４．３×１０−１／秒）に対して、８４分の１の解離速度（ｋｏｆｆ＝５．１×１０−３／秒）を有する。Ｒ９１１  Ｃ６０Ａ変異体クローンは、Ｄ６０Ａ対照クローンに対して、僅か１．３倍増加した親和性（ＫＤ＝２．０μＭ）及び３５分の１の解離速度（ｋｏｆｆ＝１．２×１０−２／秒）を示した。変性リボヌクレアーゼＡ（ｄＲＮａｓｅ  Ａ）はＲＮａｓｅ  Ｂの非グリコシル化型であるため、この変性リボヌクレアーゼＡも陰性対照リガンドとして利用したが；当然、ＲＮａｓｅ  Ａが、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによって認識されるＮ−グリカン部分を有していないことから、特定の反応速度測定は行うことができなかった。具体的には、約１８００ＲＵの理論上最大の反応（ＲＭＡＸ）を得るために、ｄＲＮａｓｅ  Ａが固定された高密度表面を用意したが；ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｄ６０Ａ、Ｒ９１１、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａで測定された反応はＲＭＡＸを超えており、相互作用が非特異的であったことを示唆している。
【０２１１】
【表１１】
2017513488.tif 000027
【０２１２】
活性アッセイ及び反応速度データは、選択されたＲ９１１クローンが、触媒的に不活性であり、かつ親和性が向上していないＰＮＧａｓｅ  Ｆ  Ｄ６０Ａ対照クローンに対して著しく向上した親和性を有することを示している。加えて、産物を放出する速い代謝回転を一般に有する酵素とは異なり、遅い解離速度が、標的グリカンを濃縮する有用な親和性試薬にとって極めて重要であるため、Ｒ９１１の解離速度の向上は、大きな影響を与える。Ｒ９１１  Ｃ６０Ａクローンの速度論的分析は、６０位のシステイン残基の重要性についてのさらなる洞察を提供する。親和性及び解離速度の両方は、Ｃ６０Ａ突然変異によって悪影響を受ける。これは、情報の２つの極めて重要な点を示す：（１）Ｒ９１１のＤ６０Ｃ突然変異は、高い親和性にとって重要である、及び（２）その改善された親和性もまた、Ｒ９１１の遅い解離速度に直接影響を与える。これらの結果に基づいて、Ｒ９１１は、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補の速度論的基準を満たす。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆに対するＲ９１１突然変異のエネルギー寄与のコンピューターモデリングベースの分析が実施例４で説明される。
【０２１３】
Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー
レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、グリカン及び複合糖質の単離及び濃縮に最も広く利用されている技術である１４。抗体及びレクチンのような現在の炭水化物検出試薬の固有の制限にもかかわらず、多数の親和性ベースのグリカン及び複合糖質の濃縮方式が開発され、この適用例の強い必要性を示している。一般的な濃縮技術は、遠心分離機、スピン又は低圧ＬＣカラム、及び高圧／高流量レクチンクロマトグラフィーを可能にするＨＰＬＣ互換性マトリックスに詰め込まれたアガロース／セファロースに結合したレクチン、並びにピペット先端部に埋め込まれたレクチン修飾金ナノ粒子を含む１４、１５。近年、連続レクチンアフィニティークロマトグラフィーが、血清及び癌細胞溶解物のような複合サンプルから目的の糖タンパク質を濃縮するために利用されている１６、１７。しかしながら、このため、サンプルの濃縮又は単離に使用される試薬の選択は、糖鎖生物学的分析の結果を、レクチン又は抗体の結合特性に基づいて複合糖質のサブセットに偏らせ得る１８。
【０２１４】
アフィニティークロマトグラフィー形式での複合糖質の濃縮へのＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補の適用を調べた。ＨｉＴｒａｐ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｅ  （ＮＨＳ）活性化ＨＰカラムを用いて、精製ＰＮＧａｓｅ  Ｆ  Ｄ６０Ａ及びＲ９１１クローンをカラムのマトリックスに共有結合させて、Ｎ−糖ペプチド及びＮ−糖タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーベースの濃縮を評価した。クローンのＮＨＳ活性化カラムへの結合効率は、全てのＮＨＳ活性化カラム結合反応に対して一貫して８０％〜８７％の範囲である。結合緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で構成され、溶出緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で構成され、クロマトグラフィーにかけるときは常に０．４ｍＬ／分の一定流量とした。
【０２１５】
ＲＮａｓｅ  ＢとＲＮａｓｅ  Ａの濃縮の比較
対照Ｄ６０Ａのアフィニティークロマトグラフィーの結果は、Ｎ−グリコシル化ＲＮａｓｅ  ＢがＲＮａｓｅ  Ａに対して濃縮されないことを示している（図３２）。１．２５ｍＬの保持容量での通過ピークは、最初のロード（０〜５ｍＬの保持容量）の際にＲＮａｓｅ  Ｂ及びＲＮａｓｅ  Ａの両方がカラムを通過し、Ｄ６０Ａとの相互作用によって保持されなかったことを示している。溶出緩衝液（５〜１０ｍＬの保持容量）を通したときにＲＮａｓｅ  Ｂでは溶出ピークが観察されなかった。小さい溶出ピークが、７．２２ｍＬの保持容量で、ＲＮａｓｅ  Ａで見られる。これは、ＲＮａｓｅ  Ａサンプルが９０％の純度であるためこのサンプル中の不純物によるものであり得、そして混入物としていくらかのＲＮａｓｅ  Ｂを含む可能性がある。加えて、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆは、キトビオースコア、及びペプチド主鎖のペプチドグリコシル化配列ｓｅｑｕｏｎｅ（Ａｓｎ−Ｘ（−Ｐｒｏ）−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の両方を認識することが知られ、従って、ＲＮａｓｅ  ＡのＡｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒグリコシル化ｓｅｑｕｏｎｅが、Ｄ６０Ａ単一点突然変異体によってなんとか認識される可能性がある。しかしながら、ＲＮａｓｅ  Ａから観察される小さい溶出ピークの相対量は最小限である。
【０２１６】
Ｄ６０Ａとは異なり、Ｒ９１１のアフィニティークロマトグラフィーのロード及び溶出プロフィールは、ＲＮａｓｅ  Ａと比較したＮ−グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂの濃縮を示している（図３３）。特異的なＲ９１１：ＲＮａｓｅ  Ｂグリカン相互作用を確認するために、ＲＮａｓｅ  ＢをＰＮＧａｓｅ  Ｆで脱グリコシル化した。脱グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂを、Ｒ９１１アフィニティーカラムに通した（図３４）。クロマトグラムは、脱グリコシル化ＲＮａｓｅ  ＢがＲ９１１によって保持されずにカラムを通過したことを示している。総合すると、これらの結果は、Ｒ９１１とＲＮａｓｅ  Ｂグリカンとの間の特異的な相互作用を裏付ける。
【０２１７】
ＲＮａｓｅ  Ａ及びＲＮａｓｅ  Ｂトリプシン消化のアフィニティークロマトグラフィー
Ｒ９１１を用いてＮ−糖ペプチドからのペプチドの分離を調べるために、ＲＮａｓｅ  Ａ及びＲＮａｓｅ  Ｂをトリプシンで消化した。トリプシン消化物をＲ９１１カラムにロードした。ＲＮａｓｅ  Ａトリプシン消化ペプチドをカラムに通すと、ＲＮａｓｅ  Ｂトリプシン消化サンプルの一部がカラムに保持され、これを溶出緩衝液で溶出させた（図３５）。通過及び溶出サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析して、一部のＮ−糖ペプチドが濃縮されたことを確認した。
【０２１８】
ＲＮａｓｅ  Ｂの遊離キトビオースでの競合溶出
Ｒ９１１結合ＲＮａｓｅ  Ｂのキトビオースでの競合溶出を行って、Ｎ−グリカン構造のキトビオースコアのＲ９１１との特異的な相互作用をさらに確認した。まず、ＲＮａｓｅ  ＢをＲ９１１アフィニティーマトリックスにロードし、次いで、標準溶出緩衝液の代わりの結合緩衝液中、遊離キトビオースで競合的に溶出させた（図３６）。溶出サンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、ＲＮａｓｅ  Ｂがキトビオースで競合的に溶出されたことを確認した。
【０２１９】
キトビオースでの競合溶出を用いたＭＣＦ７全細胞抽出物からのＮ−糖タンパク質の濃縮
Ｒ９１１のＮ−糖タンパク質親和性濃縮試薬としての適用を、ＭＣＦ７全細胞抽出物を用いて実証した。細胞抽出物（１００μｇ）を、Ｒ９１１アフィニティーカラムにロードし、次いで、標準溶出緩衝液の代わりの結合緩衝液中、遊離キトビオースで競合的に溶出させた（図３７）。１．１９ｍＬの保持容量で観察されたピークに一致する細胞抽出タンパク質の大部分をカラムに通し、約６．６μｇのタンパク質がカラムに保持され、これを、６．６３ｍＬの保持容量でのピークに一致する遊離キトビオースで競合的に溶出させた。
【０２２０】
ストックＭＣＦ７細胞抽出物サンプル及び競合的に溶出されたサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、タンパク質をＵｎｉＰｒｏｔ及びＵｎｉＰｅｐデータベースで同定した１９、２０。Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー（ＬＡＣ）の結果を、Ｊａｃ、ＣｏｎＡ、及びＷＧＡレクチンを用いて同様にＭＣＦ７細胞抽出物で行われた、報告されたマルチレクチンアフィニティークロマトグラフィー（ＭＬＡＣ）実験と比較し、表１２に要約されている１７。ＭＣＦ７細胞抽出物でのＭＬＡＣにより、溶出された８８のタンパク質の内の８４％が糖タンパク質であるという結果になる。Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーにより、溶出された７３のタンパク質の内の７１．２％が糖タンパク質であるという結果になる。Ｒ９１１  ＬＡＣで溶出された糖タンパク質は、ＭＬＡＣで溶出された糖タンパク質と大部分が異なっている。さらに、ＭＬＡＣによって同定された１１の糖タンパク質は、ＭＣＦ７細胞抽出物中には存在したが、Ｒ９１１  ＬＡＣによって濃縮されなかった。これらの相違は、濃縮のために利用された捕捉試薬の異なる特異性を考えると驚くべきことではない。
【０２２１】
Ｒ９１１  ＬＡＣによる糖タンパク質濃縮の要約が表１３に示されている。ＭＣＦ７細胞抽出物ストックサンプルに対して、Ｒ９１１  ＬＡＣ溶出糖タンパク質サンプルは、３．４倍の糖タンパク質の濃縮を示している。さらに、溶出された糖タンパク質は、４２．５％の（３１）Ｎ−糖タンパク質及び２８．８％の（２１）Ｏ−糖タンパク質からなり、２．０倍のＮ−糖タンパク質の濃縮及び５．２倍のＯ−糖タンパク質の濃縮を表している。
【０２２２】
【表１２】
2017513488.tif 000028
【０２２３】
Ｒ９１１  ＬＡＣによるＯ−糖タンパク質の濃縮は、Ｒ９１１がＮ−グリカンプロセシング酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆに由来するため予想外であり、Ｎ−糖ペプチド及びキトビオースコアに対する酵素の基質特異性は十分に確立されている４、２１〜２４。Ｏ−糖タンパク質の濃縮の洞察が、溶出されたＯ−糖タンパク質の７６％（１６）がＯ−ＧｌｃＮアシル化されているという観察から得られ、Ｒ９１１の認識される共通の構造モチーフが、Ｎ−糖タンパク質及びＯ−ＧｌｃＮアシル化糖タンパク質の両方のＧｌｃＮＡｃを還元する可能性が高いことを示唆している２５、２６。従って、Ｎ−糖タンパク質及びＯ−ＧｌｃＮアシル化糖タンパク質の両方の濃縮は、Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）によって達成することができ、この濃縮物が、Ｎ−糖タンパク質及びＯ−ＧｌｃＮアシル化糖タンパク質の両方に共通のコアモチーフを認識することができるユニークな捕捉試薬となる。濃縮Ｎ−糖タンパク質及びＯ−糖タンパク質はそれぞれ、表１４及び表１５に列記されている。
【０２２４】
【表１３】
2017513488.tif 000029
【０２２５】
【表１４】
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【０２２６】
【表１５】
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【０２２７】
グリカンアレイスクリーニング
Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ）によって開発されたグリカンアレイは、６１０のユニークな哺乳動物グリカンからなり（バージョン５．１）、かつグリカン結合タンパク質の特異性の決定における非常に貴重なツールであることが証明された２７、２８。天然及び合成グリカンのライブラリーは、スペーサーを含むアミノリンカーで修飾される。グリカンは、アミノ修飾スペーサーリンカーによってＮＨＳ活性化ガラス表面に共有結合する。各グリカンは、アレイに６つの複製でプリントされる。表面に固定されたグリカンは殆どが、ペプチドグリコシル化ｓｅｑｕｏｎｅ（Ａｓｎ−Ｘ（−Ｐｒｏ）−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含まない；ただし、２つのリンカーＳｐ２２（ペプチドＮＳＴ）及びＳｐ２４（ペプチドＫＶＡＮＫＴ）を除く。ペプチドｓｅｑｕｏｎｅの欠如は、グリカン相互作用の正常な生物学的背景から逸脱している。末端グリカン構造を認識する多くの炭水化物認識タンパク質では、これは、大きな問題ではない（例えば：末端シアル酸を認識するレクチン）。しかしながら、これは、様々なトランスフェラーゼの場合のように、グリカンが提示される又はグリカンが移送されるタンパク質の関連でグリカン構造を認識する炭水化物プロセシング酵素では大きな問題である。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素が、ｓｅｑｕｏｎｅ及びアスパラギン結合キトビオースコアからなる糖ペプチドを認識することが知られていることから、固定されたグリカンにおけるペプチドｓｅｑｕｏｎｅの欠如は制限である。
【０２２８】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ  Ｄ６０Ａ及びＲ９１１クローンを、グリカンアレイスクリーニングのためにＣＦＧ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇｌｙｃａｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｒｅ  （旧名Ｃｏｒｅ  Ｈ）に提出した。精製タンパク質を、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８で標識し、そして色素：タンパク質標識比を、Ｄ６０Ａでは２．１：１、Ｒ９１１では８．２：１に決定した。標識タンパク質を、０．１％  ＢＳＡを含む、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４からなる緩衝液中、２００μｇ／ｍＬの最終濃度で、アレイでインキュベートした。インキュベーション後、０．１％  ＢＳＡを含まない同じ緩衝液でアレイを洗浄した。乾燥させたアレイを、マイクロアレイスキャナーでスキャニングし、個々のグリカンの特徴／スポットのシグナル強度を定量化した。
【０２２９】
図３８は、Ｄ６０Ａ及びＲ９１１クローンのグリカンアレイスキャニングの結果の対照比較を示している。要約すると、報告されたｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の特異性に一致する、（α１，６コアフコシル化を含む、及びα１，６コアフコシル化を含まない）表面固定Ｎ−グリカンとの結合相互作用を示す、高いシグナル強度が、標識Ｄ６０Ａで観察された。さらに、α１，３コアフコシル化グリカンとのＤ６０Ａの相互作用のシグナル強度の不足も観察された。これは、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆが、アスパラギン結合Ｎ−アセチルグルコサミンにα１，３結合フコースを有するグリカンを放出できないが、α１，６コアフコシル化Ｎ−グリカンが放出され得ることに一致している。
【０２３０】
標識Ｒ９１１クローンの場合は、著しく低いがバックグラウンドよりも高い、類似の表面固定Ｎ−グリカン構造のシグナル強度が、標識Ｒ９１１で観察された。Ｒ９１１のデータセットの低いＳＮ比は、Ｒ９１１クローンの特異性が選択された突然変異によって変更された可能性によるものであり得る。しかしながら、これは、ＳＰＲアフィニティーデータ及びＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーの両方の結果に一致していない。従って、低いＳＮ比及び一見して低下したＤ６０Ａに対する特異性のより可能性の高い原因は、８．２：１の高い色素：Ｒ９１１タンパク質標識の比である。高い色素−標識比は、色素分子が結合ポケット内の利用可能なアミン基と相互作用する高い可能性により結合部位を破壊し得る。理想的な標識比は、Ｄ６０Ａの場合と同様に２：１である。よりロバストなグリカンアレイを用いる特異性の結果を得るために、Ｒ９１１グリカンアレイスクリーニングを、低い色素とタンパク質標識の比で繰り返す必要がある。残念ながら、低い発現収量の結果としての精製Ｒ９１１の利用可能性の限定、及び複数の技術を用いたＲ９１１の特徴付けの必要性により、すぐには実験を繰り返し行うことができない。
【０２３１】
方法
ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの発現
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ｐＯＰＨ６  ＩＩ（Ｄ６０Ａ、Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、及びＲ９１１３）プラスミドで、発現のためにＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２３０１３２）から入手した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。各クローンに対して、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレート（１００μｇ／ｍｌ  カルベニシリン）から採取した単一コロニーを、シェーカー（２５０〜３００ＲＰＭ）で、１００μｇ／ｍｌ  カルベニシリンを含む５０ｍＬのＬＢ培地で、３７℃で一晩培養した。翌日、培養物を、１００μｇ／ｍｌ  カルベニシリンを含む３７℃に予熱された１ＬのＬＢ培地で増殖させた。ＯＤ６００が０．４〜０．５の間に、温度が３７℃から２２℃に低下し、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、培養物を一晩誘導した（約２０時間）。４℃のＡｖａｎｔｉ  ＪＡ１０ローターを用いて４５００×ｇ（３０分間）で細胞ペレットを回収した。Ｒ９１１の培養では、１ＬのＬＢ培地から約８ｇの細胞ペレットが得られた。この細胞ペレットを、２０ｍＬの氷冷ＩＭＡＣ結合緩衝液（０．１Ｍ  ＥＰＰＳ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  イミダゾール、ｐＨ８．５０）で再懸濁した。ＲｏｃｈｅのＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害合タブレット（０５８９２７９１００１）を１ｍＬの結合緩衝液又は分子グレードの水に溶解し、混合して再懸濁細胞ペレットにした。フレンチプレスを用いて６，０００ｐｓｉで細胞を３回、機械的に溶解した。細胞溶解物を、４℃のＡｖａｎｔｉ  ＪＡ１０ローターで、３０，０００×ｇ（４５分間）で遠心分離して、ペリプラズム画分を含む上清から不溶性細胞デブリを分離した。上清を収集して、０．８μｍのフィルターで上清を５ｍＬずつろ過した。
【０２３２】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの固定金属アフィニティークロマトグラフィー
濾過したペリプラズム画分をＩＭＡＣカラムにロードして、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＵＰＣ  １０を用いてＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンをイミダゾール勾配で溶出させた。ＩＭＡＣ結合緩衝液（Ａ）は、０．１Ｍ  ＥＰＰＳ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  イミダゾール、ｐＨ８．５０から構成され、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（Ｂ）は、０．１Ｍ  ＥＰＰＳ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  イミダゾール、ｐＨ８．５０から構成された。製造者の推奨プロコルに従って、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（１７−５２４７−０１）を洗浄し、Ｎｉ２＋で帯電させ、そして平衡化した。プログラムされた方法（Ｕｎｉｃｏｒｎ  ５．１）を、全ての精製で使用した。要約すると、ニッケル荷電ＨｉｓＴｒａｐカラムを、５ＣＶの結合緩衝液、３．５ｍＬ／分の流量で平衡化した。ペリプラズム画分（約２０ｍｌ）を、Ｐ−９６０サンプルポンプを用いて２ｍＬ／分の流量でカラムにロードした。ロードされたカラムを、２ｍＬ／分の流量で、９ＣＶの結合緩衝液（１００％Ａ）で洗浄した。非特異的に結合したタンパク質を、２ｍＬ／分の流量で、８．３％Ｂ（５０ｍＭ  イミダゾールに等しい）の１０ＣＶの段階溶出で溶出させた。２ｍＬ／分の流量で、１８ＣＶを超える４３％Ｂ勾配溶出を使用して、Ｎｉ結合ヒスチジン標識ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンを溶出させ、溶出タンパク質の２．５ｍＬ画分を収集した。カラムを、２ｍＬ／分の流量で、１００％Ｂの８ＣＶの段階溶出で洗浄し、続いて、３．５ｍＬ／分の流量で、５ＣＶを超える１００％Ａで再平衡化した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０（１０ｋＤａカットオフ）濃縮器を用いて、溶出タンパク質含有画分をプールし、ＳＥＣによるさらなる精製のために約２５０μＬの最終容量まで濃縮した。
【０２３３】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンのサイズ排除クロマトグラフィー
約２５０μＬの濃縮ＩＭＡＣサンプルを、ＳｕｐｅｒＤｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ又はＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬカラムを用いてＳＥＣ精製のために５００μＬ注入ループにロードした。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムは、ＳｕｐｅｒＤｅｘ  ７５カラムに対してＲ９１１の精製を向上させた。従来通り、自動化法（Ｕｎｉｃｏｒｎ  ５．１）を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＵＰＣ  １０での精製のために使用した。カラムを、０．４ｍＬ／分の流量で、１．５ＣＶの泳動緩衝液（５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．００）で平衡化した。０．５ｍＬのループを２．５ｍＬの泳動緩衝液でフラッシュしてサンプルをカラムに注入し、次いで流量を０．２ｍＬ／分に下げた。画分収集（０．５ｍＬ）を６．７５ｍＬの保持容量で開始した。溶出ピークに一致する画分をプールし、１０ｋＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎ  ２０濃縮器を用いて濃縮し、ＵＶ２８０吸光度（Ａ２８０）によってタンパク質収量を決定した。０．５ＬのＬＢ培地からのＤ６０Ａ対照クローンのＳＥＣ精製後の典型的な収量は約３．０ｍｇであった。比較として、２ＬのＬＢ培地からのＲ９１１及びＲ９１１  Ｃ６０Ａクローンの典型的な収量は約０．３ｍｇであった。
【０２３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマーシー染色
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ４−２０％  ＴＧＸゲル（４５６−１０９３及び４５６−１０９４）及び推奨緩衝液を、タンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。全てのサンプルを、製造者の推奨するＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液レシピを用いて、β−メルカプトエタノールを含む６倍のストック濃度で変性し、ゲルに移す前に９５℃で５分間インキュベートした。ゲルを２００Ｖ（最大１５０ｍＡ）で３５分間泳動させた。推奨される高速マイクロ波染色及び脱染手順によって、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ'ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（ＬＣ６０６０）を用いてゲルをクマーシー染色した。
【０２３５】
ウェスタンブロット法
以下の緩衝液、試薬、及び溶液を、修正された製造者のプロトコルを用いてウェスタンブロット法に使用した：
１．１０倍の転写緩衝液（１Ｌ）：２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（３０．２８ｇ／Ｌ）、１．９２Ｍ  グリシン（１４４．１ｇ／Ｌ）、０．０５％  ＳＤＳ（５ｇ／Ｌ）、ＨＣｌによってｐＨ８．３に調整
２．１０倍のＴＢＳ（１Ｌ）：１．４Ｍ  ＮａＣｌ（８１．８２ｇ／Ｌ）、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ系（３０．２８ｇ／Ｌ）、ＨＣｌによってｐＨ７．４に調整
３．１０倍のＢＬＯＴＴＯ（１００ｍＬ）：Ｂｉｏ−Ｒａｄの１０％  脱脂粉乳（１０ｇ）（１７０−６４０４ＸＴＵ）、９０％  ＮＡＮＯｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒ（９０ｍＬ）
４．１倍のブロッキング緩衝液（５００ｍＬ）：０．５ｍＬ（５００μＬ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、５０ｍＬの１０倍のＢＬＯＴＴＯ、５０ｍＬの１０倍のＴＢＳ、４００ｍＬのＮＡＮＯｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒ
５．５％  ブロッキング緩衝液（２つの膜に１００ｍＬ）：５％  脱脂粉乳（４ｇ）、９６ｍＬの１倍のブロッキング緩衝液
６．１倍のＴＢＳ（１００ｍＬ）：１０ｍＬの１０倍のＴＢＳ、９０ｍＬのＮＡＮＯｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒ
７．メタノールを含む１倍の転写緩衝液（１Ｌ）  ｐＨ８．３：１００ｍＬの１０倍の転写緩衝液、１５０ｍＬのメタノール、７５０ｍＬのＮＡＮＯｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒ
８．ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＰＶＤＦ  Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ膜（ＲＰＮ３０３Ｆ）
９．Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合マウス抗ヒスチジン抗体（ＨＩＳＰ１２−ＨＲＰ）
１０．Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ基質溶液（３４０６５）。
【０２３６】
ＴＧＸゲル及びＰＶＤＦ膜を用いるタンパク質の転写を、氷上に維持した転写装置で、１００Ｖ（最大３５０ｍＡ）で３０分間行った。磁気撹拌バーを使用して、転写プロセス中に転写緩衝液を循環させた。転写後、膜を２０ｍＬのＮＡＮＯｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒで３回洗浄し、振盪台で、２０ｍＬの５％  ブロッキング緩衝液で４５分間ブロックし、続いて１０ｍＬの１倍のブロッキング緩衝液中、抗ヒスチジンＨＲＰ結合抗体（１：５０００）と共にシェーカーで、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、膜を２０ｍＬの１倍のブロッキング緩衝液でそれぞれ５分間洗浄し、続いてシェーカーで、２０ｍＬの１倍のＴＢＳで同様にそれぞれ５分間、３回洗浄した。発色のためのＤＡＢ基質の添加の前に、膜を２０ｍＬのＮＡＮＯｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒですすいだ。ゲルにロードされて膜に転写されるタンパク質の量によって、膜を１〜１０分間発色させた。この膜を、標準卓上型スキャナーを用いるスキャニングの前に、２０ｍＬのＮＡＮＯｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒで最後に１回すすぎ、次いで乾燥させた。
【０２３７】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの脱グリコシル化活性
ゲルシフトアッセイを用いて、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素に対するＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの脱グリコシル化活性を決定した。それぞれ５０ｎｇのｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｄ６０Ａ、及びＲ９１１を、５０μＬの反応容量で、５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０中、５０μｇの変性ＲＮａｓｅ  Ｂと共に３７℃で一晩インキュベートした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、脱グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂ産物のＲＮａｓｅ  Ｂに対する移動の変化を観察した。スキャンしたゲル画像をＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析して、ＲＮａｓｅ  Ｂ基質に対する脱グリコシル化産物を定量化した（附表４）７。脱グリコシル化産物を、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。
【０２３８】
タンパク質の変性
Ｓｉｇｍａから購入した５ｍｇの０．１１３μモル  アシアロフェチュイン（４４，１８９ｇ／モル）（Ａ４７８１−５０ＭＧ）を、６Ｍ  グアニジンＨＣｌ（９５．５３ｇ／ｍｏｌ）（１ｍＬ中、５７３ｍｇ）を含む１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解し、２８ｍｇの１８２μモル  ＤＴＴ（１５４．２５ｇ／ｍｏｌ）の添加によって５５℃で１時間還元し、続いて１２８ｍｇの６９２μモル  ヨードアセトアミド（１８４．９６ｇ／ｍｏｌ）を添加して室温で３０分間維持した。０．５ｍＬの混合物をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｄ−Ｓａｌｔ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓで脱塩し、１．７５ｍＬの移動相体積（ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ）の後に０．５ｍＬの画分を収集した。
【０２３９】
ＭＡＬＤＩ質量分析
質量分析を、ＡＢＩ  ５８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ高解像度質量分析計を用いて行った。１ｍｌの容量の３０％  アセトニトリル（ＡＣＮ）及び０．３％  ＴＦＡ中に約１０ｍｇのシナピン酸を再懸濁することによってシナピン酸マトリックスを用意した。マトリックスとタンパク質サンプルを３０：１の比率で混合して、合計４ピコモルのタンパク質にした。サンプルをＭＡＬＤＩプレートにスポットし（１μＬ）、このプレートをＡＢＩ５８００にロードする前に空気乾燥させた。
【０２４０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  Ｄ６０Ａ配列の同定
８μＬの４０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３を１０μＬのＤ６０Ａサンプル（１０μｇ）に添加して１８μＬの総容量にしてタンパク質サンプルを用意した。このサンプルを、２μＬの１Ｍ  ＤＴＴを用いて５６℃１時間還元し、暗所で４５分間、２０μＬの５５ｍＭ  ヨードアセトアミドでカルボキシアミドメチル化した。トリプシン（２０μｇ）を８０μＬの４０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３に溶解し、１０μＬ（２．５μｇ）をサンプルに添加してタンパク質を３７℃で一晩消化した。消化後、ペプチドを、５μＬの１％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化した。Ｃ１８スピンカラムで脱塩を行い、そしてサンプルを真空遠心分離機で乾燥させた。ペプチドを、１９μＬの移動相Ａ（水中、０．１％  ギ酸）及び１μＬの移動相Ｂ（水中、８０％  アセトニトリル及び０．１％  ギ酸）で再懸濁した。サンプルを、各回１０００ｐｓｉで１０分間、高圧窒素ボンベによってＣ１８逆相樹脂が自己充填されたナノスプレーテーパー型キャピラリーカラム／エミッターにロードした。各回は、１分当たり約２００ｎＬの流量での、１６０分間の増加する移動相Ｂの勾配から構成された。最初のタンパク質の同定では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、ナノエレクトロスプレーイオン源を備えたＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ−ＸＬで行った。機器による方法を用いて全ＭＳスペクトルを収集し、３０秒間隔の動的排除セットを用いる衝突誘起解離（３８％正規化衝突エネルギー）で８つの最も強いピークのＭＳ／ＭＳスペクトルを作製した。得られたデータを、Ｓｅｑｕｅｓｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを用いて、Ｄ６０Ａ配列を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）データベース、及び標的のみのデータベースを検索した。Ｓｅｑｕｅｓｔパラメーターを変更して、メチオニンの酸化及びシステインのアルキル化を可能にする修飾について調べた。ペプチドの質量の許容量を１０００ｐｐｍに設定し、断片イオンの許容量を１ダルトンに設定した。結果を、１％の擬陽性率（ＦＤＲ）でフィルタリングした。
【０２４１】
表面プラズモン共鳴
リガンド、変性ＲＮａｓｅ  Ｂ、天然ＲＮａｓｅ  Ｂ、及びＲＮａｓｅ  Ｂと同じペプチド配列を有するがＮ−グリコシル化を有していない変性ＲＮａｓｅ  Ａを、アミン結合化学を用いてＣＭ−５チップに共有結合させた。最適な結合条件を、Ｂｉａｃｏｒｅの推奨プロトコルに従って酢酸緩衝液のｐＨスカウティングによって決定した（図３１）。３０００ＲＵの計算ＲＭＡＸを得るために十分なリガンド結合で高密度表面領域を用意した。リガンド固定のために、１０ｍＭ  酢酸緩衝液、ｐＨ５．５から構成される結合緩衝液を使用した。分析物として使用するＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンは、１０μＭ〜７２．５ｎＭの範囲の段階希釈濃度のＤ６０Ａ、Ｒ９１１、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａとした。泳動緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４から構成されていた。生体分子相互作用モデルを用いる定常状態の結合反応速度を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃを用いて決定した（表１０及び図３２）。
【０２４２】
グリカンアレイスクリーニング
Ｄ６０Ａ及びＲ９１１クローンを、グリカンアレイスクリーニングのためにＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ'Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇｌｙｃａｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｒｅ  （旧名Ｃｏｒｅ  Ｈ）に提出した２９。精製Ｄ６０Ａを、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８で標識し、そして色素：タンパク質標識比を２．１：１に決定した。精製Ｒ９１１も同様に標識し、そして色素：タンパク質標識比を８．２：１に決定した。クローンを、０．１％  ＢＳＡを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４からなる緩衝液中、２００μｇ／ｍＬの最終濃度で、アレイでインキュベートした。インキュベーションの１時間後に、アレイを、０．１％  ＢＳＡを含まない同じ緩衝液で４回洗浄した。スライドを、窒素気流で乾燥させ、そして標準グリカンアレイデータ収集及び分析プロトコルを用いて処理した。最後の洗浄後にスライドを乾燥させたら、スライドをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＳｃａｎＡｒｒａｙスキャナーに配置し、そして検出に使用した波長ごとにデータを取得する（ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８）。使用したＰＭＴ設定は７０％であり、使用したレーザー出力は９０％である。保存後、画像をＩｍａｇｅｎｅソフトウェアで開き、グリッドを使用して、ビオチン対照スポットを用いてスライドのスポットに整合させる。整合したら、各スポットに結合した量を定量化する。マイクロソフト社のエクセルでデータを分析し、この分析では、６つの複製の内の最も高いスポットと最も低いスポットが除去され、残りの４つのスポットの平均が、適切な統計資料と共に図及び表に示される。
【０２４３】
Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）クロマトグラフィー
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造された１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（１７−０７１６−０１）を用いて、精製ＰＮＧａｓｅ  Ｆ  Ｄ６０Ａ及びＲ９１１クローンをカラムマトリックスに共有結合させて、アフィニティークロマトグラフィーを用いるＮ−糖ペプチド及びＮ−糖タンパク質の濃縮を評価した。製造者の推奨プロトコルを用いて、ＰＮＧａｓｅ  ＦクローンのＮＨＳ活性化カラムへの結合効率は、全てのＮＨＳ活性化カラム結合反応で一貫して８０％〜８７％の範囲であった。標準結合緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４から構成され、標準溶出緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４から構成されていた。競合溶出実験では、溶出緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２３５．６μＭ（１００μｇ／ｍＬ）  キトビオース、ｐＨ７．４から構成されていた。キトビオースは、Ｓｉｇｍａから入手した（Ｄ１５２３−１０）。再生緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４から構成されていた。ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ＵＰＣ  １０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、１００μＬサンプル注入ループ、１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化カラム、ＵＶ２８０検出で構成された全てのクロマトグラフィー実験に使用した。全てのクロマトグラフィーの実験では、０．４ｍＬ／分の一定の流量とした。カラムを、１０ｍＬ又は１０カラム容量（ＣＶ）の結合緩衝液で平衡化し、続いて１００μＬのサンプルを注入した。５ＣＶを超える結合緩衝液を用いてサンプルをカラムに通して、非結合サンプルを洗浄した。結合サンプルを５ＣＶを超える溶出緩衝液で溶出させた。結合及び溶出の際に、０．５ｍＬの画分を収集した。５ＣＶの再生緩衝液でカラムを再生し、５ＣＶの結合緩衝液で再平衡化した。
【０２４４】
ＭＣＦ７細胞抽出物の調製
ヒト乳癌ＭＣＦ７細胞を、１０％ウシ胎仔血清が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を継代し、トリプシンフリー細胞遊離を用いて回収した。約２．３×１０７の細胞を回収し、５分間の１０００×ｇでの遠心分離によって４℃の１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。細胞ペレットを、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む１．５ｍＬのフィルター滅菌された細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ｖ／ｖ  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）で再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートした１７。この細胞を、処理間に１５秒間の停止（３０％の振幅）がある、１５秒の間隔で合計２分間超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓ−４０００）した。溶解した細胞を、４℃のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４３０Ｒで１７，０００×ｇで１時間遠心分離した。ＭＣＦ７細胞抽出物を含む上清を、５０μＬのアリコートにして−８０℃で保管した。ＭＣＦ７細胞抽出物のタンパク質濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（２３２７７）を用いて１０．６７ｍｇ／ｍＬと決定した。アリコートにしたＭＣＦ７細胞抽出物ストックを氷上で解凍し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈した。１００μＬサンプルループを用いて、１００μｇの１ｍｇ／ｍＬ  ＭＣＦ７細胞抽出物を、糖タンパク質濃縮用のＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティーカラムに注入した。
【０２４５】
Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー溶出サンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるタンパク質の同定
Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティーカラムから溶出されたＭＣＦ７細胞抽出物及びタンパク質を、標準の溶液中消化プロトコルを用いて還元し、アルキル化し、そして配列グレードトリプシン（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｇｒａｄｅ  ｔｒｙｐｓｉｎ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した３０。サンプルを１％  トリフルオロ酢酸で酸性化し、そしてＣ１８スピンカラム（Ｓｉｌｉｃａ  Ｃ１８，Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を用いて脱塩を行った。ペプチドを乾燥させ、そして３９μＬの緩衝液Ａ（０．１％  ギ酸）及び１μＬの緩衝液Ｂ（８０％  アセトニトリル及び０．１％  ギ酸）で再懸濁した。サンプルを、オートサンプラーチューブにロードしてＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｄｉｏｎｅｘ）に入れる前に、０．２μｍフィルター（Ｎａｎｏｓｅｐ，Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ）によって回転濾過した。
【０２４６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、ナノスプレーイオン化源を利用するＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｒｉｂｒｉｄ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。各サンプルについて、１０μＬを注入し、１分当たり約２００ｎＬの流量での増加する緩衝液Ｂの１８０分間の勾配によって分離した。機器による方法を用いて、３秒ごとに全質量スペクトルを収集し、最も強いイオンを連続的に捕捉して、３８％衝突誘起解離（ＣＩＤ）で断片化し、そして得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを記録した。動的排除を利用して、１０秒の枠内の第２の選択の後の６０秒の選択プロセスから前駆イオンを排除した。
【０２４７】
全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＳＥＡＱＵＥＳＴアルゴリズム（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  １．４，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用してＵｎｉＰｒｏｔヒトデータベースを検索した。ＳＥＡＱＵＥＳＴパラメーターを、最大２つの内部切断ミス（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を有するトリプシンペプチドを許容するように設定した。質量許容差は、前駆イオンを２０ｐｐｍ、そして断片イオンを０．５Ｄａに設定した。動的な質量の増加は、メチオニンの酸化及びシステイン残基のアルキル化が原因と認められる。またスペクトルを、ヒトデータベースの反転によって作成されたランダムデータベースを検索して、同定の擬陽性率（ＦＤＲ）を決定した。ＰｒｏｔｅｏＩＱは、全てのＳＥＡＱＵＥＳＴ検索結果のファイル及びデータベースを利用して、ペプチドの一致をフィルタリングして正確なタンパク質の同定を達成した３１。２０％  ＦＤＲを通過したペプチドは、タンパク質同定と見なされ、２％  ＦＤＲを通過したタンパク質のみが報告された。
【０２４８】
ＵｎｉＰｅｐ及びＵｎｉＰｒｏｔデータベースを用いるＭＣＦ７細胞抽出物糖タンパク質の同定
ＵｎｉＰｒｏｔは、ストックＭＣＦ７サンプルのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析から作成されたタンパク質同定リストを検証し、Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー溶出ＭＣＦ７サンプルをＵｎｉＰｅｐデータベースで処理して、実験的に確認されたＮ−糖ペプチドを有するタンパク質を同定した２０。加えて、Ｎ結合型糖化部位（Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｉｔｅ）を有する潜在的な糖タンパク質も、Ｎ−グリコシル化ｓｅｑｕｏｎｅ（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の存在に基づいてＵｎｉＰｅｐによって同定した。Ｎ−及Ｏ−糖タンパク質の最終リストには、ＵｎｉＰｅｐ、ＵｎｉＰｒｏｔ、及び文献報告によって糖タンパク質として確認されたタンパク質のみを含めた１９、２０、２５、２６、３２。加えて、Ｎ−グリコシル化部位を有すると推定されたタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ細胞内局在化の記述が、グリコシル化タンパク質で予想される細胞内局在化（ゴルジ、分泌、小胞エキソソーム、細胞外空間、及びヒストン）に一致する場合にのみ最終リストに含めた。
【０２４９】
参考文献
2017513488.tif 000033
2017513488.tif 000034
2017513488.tif 000035
【０２５０】
実施例４
ＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの分子動力学シミュレーション
ＰＮＧａｓｅ  ＦクローンＤ６０Ａ、Ｒ９１１、及びＲ９１１  Ｃ６０ＡのｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素に対するコンフォメーション分析をＭＤシミュレーションによって研究して、この研究から残基当たりの相互作用エネルギーを計算した。２．０Åの解像度での、活性部位にＮ，Ｎ'−ジアセチルキトビオース二糖を有するｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素のＸ線結晶学ベースの構造モデルは、既に報告されている（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＰＮＦ）１。１ＰＮＦモデルを使用して、Ｄ６０Ａ、Ｒ９１１、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａクローンの突然変異モデルを構築した。加えて、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合ポケットの共結晶化Ｎ，Ｎ'−ジアセチルキトビオース二糖リガンドは、修飾Ｎ−グリカン構造をＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの構造モデルの結合ポケットに配置するガイドとして機能する。
【０２５１】
Ｄ６０Ａ、Ｒ９１１、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａの構造モデル
結合モデルのための回転異性体の選択
ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆモデル、１ＰＮＦを鋳型として使用して、ＰＮＧａｓｅクローンＤ６０Ａ、Ｒ９１１、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａのモデルを構築した。２つの回転異性体ライブラリーを使用して、Ｒ９１１突然変異の側鎖回転異性体を選択した。Ｘ線結晶学ベースの主鎖依存性Ｄｕｎｂｒａｃｋライブラリーを使用して回転異性体を選択し、モデルＲ９１１  Ｄｕｎ及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｕｎを構築した２。加えて、ＭＤベースの主鎖依存性Ｄｙｎａｍｅｏｍｉｃｓライブラリーを使用して、モデルＲ９１１  Ｄｙｎ及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｙｎも構築した３。立体衝突の最も少ない、可能性が最も高い回転異性体を選択した。Ｒ９１１  Ｄｕｎ及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｕｎモデルの構築のために評価されて選択されたＤｕｎｂｒａｃｋ回転異性体が表１６に列記されている。同様に、Ｒ９１１  Ｄｙｎ及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  ＤｙｎのＤｙｎａｍｅｏｍｉｃｓ回転異性体が表１７に列記されている。Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ突然変異の回転異性体が、隣接残基との関連で示されている。Ｅ２０６Ｓの回転異性体は、衝突が予測されなかったとしては示されていない。ＭＤシミュレーション及び遊離エネルギー分解を計算して、どの回転異性体が実験相互作用エネルギーを最良に近似したかを評価した。最良に近似した回転異性体モデルは、全ての後のコンピューターでの研究に有用である。
【０２５２】
【表１６】
2017513488.tif 000036
【０２５３】
【表１７】
2017513488.tif 000037
【０２５４】
回転異性体の評価のためのＭＤシミュレーション
ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｄ６０Ａ、及び４つ全ての回転異性体モデルのＭＤシミュレーション（１００ナノ秒）を、Ｎ，Ｎ'−ジアセチルキトビオース二糖（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−αＯＨ）で行った。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ実験的構造（１ＰＮＦ）に対する、Ｃα原子の位置における二乗平均平方根差（ＲＭＳＤ）を、シミュレーション時間の関数として決定した。１００ナノ秒のシミュレーションの間の６つのモデルのそれぞれの平均ＲＭＳＤは、低く安定し、１．２Å〜１．３Åの範囲であり、構造的平衡性を示している。回転異性体の分析に使用される６つの構造モデル及び各ＭＤシミュレーションの平均ＲＭＳＤ値のリストが表１８に列記されている。
【０２５５】
【表１８】
2017513488.tif 000038
【０２５６】
シミュレーションの安定性を確認することに加えて、１ＰＮＦ  Ｘ線データにおける実験的に観察された水素結合長の再現性を確認した。１ＰＮＦ（ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ）のＭＤシミュレーションにおけるタンパク質とＮ，Ｎ'−ジアセチルキトビオース二糖（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−αＯＨ）リガンドとの間の理論上の水素結合長を、表１９の実験により決定された水素結合長と比較し、これが図３９に示されている。１ＰＮＦモデルのＭＤシミュレーションは、実験水素結合長を正確に再現した。他のモデルは、１ＰＮＦに由来し、全てのモデルに亘って一貫したＲＭＳＤ値が構造的安定性を示したため、モデルの残りは、Ｒ９１１及びＲ９１１  Ｃ６０Ａクローンの実験水素結合長のデータが存在しなかったため構造的に有効であると思われた。
【０２５７】
【表１９】
2017513488.tif 000039
【０２５８】
回転異性体モデルのエネルギー収束及びＭＭ−ＧＢＳＡ
複合体のＭＤシミュレーションが安定して、実験構造データに一致していることを確認してから、相互作用エネルギーを、１００ナノ秒のＭＤ軌道期間に亘って１ナノ秒の間隔で計算した。図４０は、１００ナノ秒のＭＤシミュレーション中の１ＰＮＦのＭＤシミュレーションのエネルギー収束を示す、軌道時間に亘る安定した相互作用エネルギーを示している。これに対して、図４１は、Ｒ９１１  ＤｕｎのＭＤシミュレーションの最初の５４ナノ秒間のエネルギー収束の欠如を示している。Ｒ９１１  ＤｕｎのＭＤシミュレーションとは異なり、Ｒ９１１  ＤｙｎのＭＤシミュレーションは、１００ナノ秒のシミュレーションの間中、安定した相互作用エネルギーを有していた。５４ナノ秒での１０ｋｃａｌ／モルの相互作用エネルギー遷移の前後のＲ９１１  Ｄｕｎのコンフォメーション分析は、シミュレーションの後半のコンフォメーションが、Ｒ９１１  Ｄｙｎのシミュレーションに類似していることを示唆した。これは、Ｒ６１の第２のＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル基との水素結合を不安定化させるＲ９１１  Ｄ５７Ｌ突然変異の向きで特に観察される。Ｒ９１１  Ｄｙｎａｍｅｏｍｉｃｓモデルは、エネルギーの最小化及び平衡化の間、このコンフォメーションをとり、１００ナノ秒の工程中、このコンフォメーションで安定したままである。しかしながら、Ｒ９１１  Ｄｕｎｂｒａｃｋモデルは、シミュレーションの広範の変更されたＲ６１の向きのみをとる。これは、Ｄｕｎｂｒａｃｋモデルが、Ｒ９１１  ｄｙｎａｍｅｏｍｉｃｓモデルに対して変更されたＲ６１の向きを長時間とることを示唆すると考えられる。従って、分子力学一般化Ｂｏｒｎ表面積（ＭＭ−ＧＢＳＡ）分析のためのＲ９１１  ＤｕｎのＭＤシミュレーションの後半の選択は、Ｒ９１１  Ｄｕｎｂｒａｃｋ及びＲ９１１  Ｄｙｎａｍｅｏｍｉｃｓ軌道の両方の軌道に一致したＲ６１の変更されたコンフォメーションによってある程度合理的に説明される。これはまた、エネルギー収束に到達させるサンプリング要件に適合した、この試験で利用される長いシミュレーションの重要性も実証する。キトビオース（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−αＯＨ）リガンドを用いる他のＭＤシミュレーションのエネルギー収束分析は、全てのシミュレーションが、最初の６０ナノ秒後に構造が集束したことを示唆した。従って、軌道の収束部分（最後の４０ナノ秒）からのＭＤ工程データを、ＭＭ−ＧＢＳＡエネルギー分析した。
【０２５９】
結合エネルギーを、ＭＭ−ＧＢＳＡ法を利用して、直接的な静電相互作用、極性及び非極性脱溶媒和、並びにファンデルワールス接触からの寄与に分解した４。このＭＭ−ＧＢＳＡ法により、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ（１ＰＮＦ）に対して−３５．１ｋｃａｌ／モルの全相互作用エネルギーが生じた。この値は、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの−７．１ｋｃａｌ／モルの実験結合自由エネルギー（表１０）を過大評価し、これは、リガンド結合に関連したエントロピーペナルティーを省略するＭＭ−ＧＢＳＡ計算の典型的な特徴である４。コンフォメーション柔軟性の変化から生じるエントロピー効果を推定することができるが、収束を達成するために非常に長いＭＤシミュレーションを必要とし得る５。しかしながら、タンパク質の側鎖の柔軟性の低下から生じるエントロピー効果は、リガンドと強く相互作用する残基で最大であり、テピッド残基及びコールド残基（ｃｏｌｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）で最小であると予想され得る。これらの理由から、エントロピー寄与は計算されなかった。さらに、保存水分子（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｗａｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｕｅ）が、これらのＭＭ−ＧＢＳＡエネルギー推定に含まれず、保存水の欠如は、Ｅ２０６Ｓ、Ｄ６０Ｃ、及びＲ２４８Ｗの不正確な推定エネルギーを生じさせる可能性があり、これらの部位は、野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆ複合体実験Ｘ線データにおいて保存水分子と相互作用することが知られている１。加えて、分解された残基当たりの寄与の推定で行われる近似により、計算結合エネルギーは、比較的大きい誤差を有し得、従って定量的評価を許容することができない。従って、ＭＭ−ＧＢＳＡデータの定量分析が適切である６。
【０２６０】
１ＰＮＦは、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の構造を表すため、非親和性最適化実験対照として使用したＤ６０Ａ単一点突然変異体を、Ｒ９１１及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｕｎｂｒａｃｋ及びＤｙｎａｍｅｏｍｉｃｓ回転異性体モデルに対する比較用の対照構造モデルとして同様に使用した。キトビオース（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−αＯＨ）リガンドを用いるこれら６つのＭＤシミュレーションからの突然変異残基の残基当たりの推定ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ（ｋｃａｌ／モル）エネルギーが表２０に示されている。
【０２６１】
【表２０】
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【０２６２】
１ＰＮＦ（−２．７ｋｃａｌ／モル）とＤ６０Ａ（−２．８ｋｃａｌ／モル）の合計ΔＧＢＩＮＤＩＮＧは、類似しており、Ｄ６０Ａ突然変異が、前の分析（表４）に一致して、僅かにエネルギー的に有利であることを示唆している。１ＰＮＦのＤ６０Ａモデルに対する実験ΔΔＧＢＩＮＤ−ＥＸＰは、Ｄ６０Ａ突然変異が、エネルギー的に−０．５ｋｃａｌ／モル有利であることを示している。Ｄｕｎｂｒａｃｋ回転異性体モデル、Ｒ９１１  Ｄｕｎ、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  ＤｕｎのＤ６０Ａに対する比較は、推定ΔΔＧＢＩＮＤＩＮＧ相互作用エネルギーが１ＰＮＦと著しくは異なっていないことを示している。Ｄｕｎｂｒａｃｋモデルの結果は、実験データに一致している。しかしながら、Ｄｙｎａｍｅｏｍｉｃｓ回転異性体モデル、Ｒ９１１  Ｄｙｎ、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  ＤｙｎのＤ６０Ａに対する比較は、相互作用エネルギー動向が実験データに一致していることを裏付ける。具体的には、Ｒ９１１に対するＲ９１１  Ｃ６０Ａの突然変異は、比較的不利な相互作用エネルギーを有するが、１ＰＮＦ程悪くない。このデータもまた、１ＰＮＦ及びＤ６０Ａに対する親和性の向上のためのＲ９１１のＤ６０Ｃ突然変異の重要性を裏付ける。実験相互作用エネルギーの再現性に基づいて、突然変異残基の回転異性体のコンフォメーションをＭＤシミュレーションから決定した。さらに、Ｄｙｎａｍｅｏｍｉｃ回転異性体モデル、Ｒ９１１  Ｄｙｎ、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｙｎを、追加のグリカン及び糖ペプチドグリカンを用いるＭＤシミュレーションのために選択した。
【０２６３】
Ｒ９１１  ＤｙｎのＭＤシミュレーションからの回転異性体のコンフォメーション
Ｒ９１１  ＤｙｎのＭＤシミュレーションからの突然変異残基の回転異性体の二面角を、軌道のエネルギー的に収束した部分（最後の４０ナノ秒）から導出した。二面角頻度ヒストグラムをプロットして、６つ全ての突然変異残基の好ましい二面角を同定した（図４２〜図４７）。好ましい回転異性体のコンフォメーションが特定され、表２１に列記されている。４つの回転異性体は、複数の好ましいコンフォメーション（Ｄ５７Ｌ  Ｃｈｉ２、Ｅ２０６Ｓ  Ｃｈｉ１、Ｇ１９２Ｉ  Ｃｈｉ１、及びＧ１９２Ｉ  Ｃｈｉ２）を有していた。従って、回転異性体の最も好ましい組み合わせが、収束軌道の最後の４０ナノ秒から抽出されたフレームにおける発生頻度に基づいて特定された（表２２）。回転異性体の組み合わせの最も高頻度のセットが、リガンド相互作用の最も好ましい向きを表すと考えられた。Ｒ９１１  ＤｙｎのＭＤシミュレーションからの回転異性体のコンフォメーションの最も好ましいセットを示す軌道からのスナップ写真が図４８に示されている。
【０２６４】
【表２１】
2017513488.tif 000041
【０２６５】
【表２２】
2017513488.tif 000042
【０２６６】
Ｎ−グリカン及びＮ−糖ペプチドリガンドを用いたＰＮＧａｓｅ  ＦクローンのＭＤシミュレーション及び結合自由エネルギー分解（ＭＭ−ＧＢＳＡ）
既に評価したＲ９１１及びＲ９１１  Ｃ６０ＡのＤｙｎａｍｅｏｍｉｃｓ構造モデル及び１ＰＮＦ及びＤ６０Ａモデルを用いて、１００ナノ秒のＭＤシミュレーションを修飾リガンドで行った。オリゴ糖部分のアスパラギンのＮδへの付着がβ−配置中に存在すると考えて、１つのセットの４つのシミュレーションを、β−キトビオースリガンド（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−βＯＨ）を用いて行った。たとえ溶液中で、還元末端のＯ１ヒドロキシル基のα−及びβ−アノマー配置の両方の混合物を含む平衡状態が存在しても、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の１ＰＮＦ構造は、α―キトビオースリガンドと共結晶化した１。第２のセットの４つのシミュレーションを、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆによって認識される、アスパラギン結合糖ペプチドモチーフ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−β−Ａｓｎ−Ｘ［−Ｐ］−Ｔｈｒを用いて行った。ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いた基質要求性試験により、これが最適な触媒活性に必要な必須モチーフであることが裏付けられた７。ＲＮａｓｅ  Ｂを、実験的研究のＮ−グリカン含有タンパク質標的として使用したため、ＲＮａｓｅ  Ｂペプチド配列を、必須糖ペプチドリガンド（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−β−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ）に使用した。加えて、１ＰＮＦ及びＤ６０Ａモデルの残基Ｅ２０６は、カルボキシル基のプロトン化状態を反映するように修飾された（ＧＬＨ２０６）。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの最適な触媒活性は、約ｐＨ８．０〜８．５と報告され、従ってグルタミン酸のプロトン化（ｐＫａが約４．１）は、通常は起きないであろう。しかしながら、隣接疎水性トリプトファン残基２０７及び２５１の点突然変異の研究は、疎水性環境が触媒活性に重要であり、そしてこの疎水性環境がＥ２０６のｐＫａを約８．５に上昇させる可能性があることを示している８、９。
【０２６７】
β−キトビオースリガンドと複合体を形成したＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの分析
全てのモデルの安定したシミュレーション軌道が、ＲＭＳＤ分析によって確認され、続いてエネルギー収束分析によって安定した相互作用エネルギーが確認された。従来の回転異性体モデルの研究と同様に、軌道の収束部分からのデータを、ＭＭ−ＧＢＳＡエネルギー分析した。表２３は、ＭＤシミュレーションに使用されるβ−キトビオースリガンドと複合体を形成したＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンのモデル、計算した平均ＲＭＳＤ、及び推定相対結合エネルギーの要約である。
【０２６８】
全てのクローンの推定総理論結合自由エネルギー（合計ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ）は、既に説明したエントロピーペナルティーの排除により実験結合自由エネルギー（ΔΔＧＢＩＮＤ−ＥＸＰ）を過大評価する４、５。β−キトビオースリガンドシミュレーション用の６つの突然変異残基の相対ΔΔＧＢＩＮＤＩＮＧ相互作用エネルギーが、実験で観察された相互作用エネルギー動向を再現した。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素は、Ｄ６０Ａに対してそれほど有利ではない総相互作用エネルギー（０．１ｋｃａｌ／モル）を有し、Ｒ９１１（−１．８ｋｃａｌ／モル）及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ（−０．５ｋｃａｌ／モル）の両方は、Ｄ６０Ａに対して有利な相互作用エネルギーを有し、Ｒ９１１がＲ９１１  Ｃ６０Ａよりも有利である。
【０２６９】
【表２３】
2017513488.tif 000043
【０２７０】
ＭＭ−ＧＢＳＡエネルギー分析及び残基当たりの寄与を計算して、β−キトビオースリガンド軌道（最後の４０ナノ秒）の収束部分が、Ｄ６０Ａに対するΔΔＧＢＩＮＤＩＮＧに使用されたかを決定した。分解エネルギー寄与は、ファンデルワールス成分（ΔＥＶＤＷ）と静電気成分（ΔＥＥＬＥ）との和から構成される総分子力学的相互作用エネルギー（ΔＥＭＭ）からなる。総結合自由エネルギー（ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ）は、極性及び非極性脱溶媒和（ΔＧＧＢ＋ＳＡ）とΔＥＭＭの一般化Ｂｏｒｎ近似から構成される。β−キトビオースと複合体を形成した４つ全てのモデル（１ＰＮＦ、Ｄ６０Ａ、Ｒ９１１  Ｄｙｎ、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｙｎ）の（ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆにおける突然変異した６つの残基の）相互作用エネルギーが表２４〜表２７に要約されている。
【０２７１】
【表２４】
2017513488.tif 000044
【０２７２】
【表２５】
2017513488.tif 000045
【０２７３】
【表２６】
2017513488.tif 000046
【０２７４】
【表２７】
2017513488.tif 000047
【０２７５】
分解エネルギーの分析は、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０ＡクローンのＧ１９２及びＥ２０６の両方が、ライブラリー設計のためのテピッド残基及びホット残基を特定するために使用される５ナノ秒のＭＤシミュレーションのエネルギー分解の結果に一致する、不利なΔＧＢＩＮＤＩＮＧ相互作用エネルギーを有することを示している（表３）。酵母ディスプレイ選択突然変異Ｇ１９２Ｉ及びＥ２０６Ｓは、Ｒ９１１及びＲ９１１  Ｃ６０Ａの推定相互作用エネルギーに有利に寄与する。加えて、Ｄ５７Ｌ、Ｉ１５６Ｌ、及びＲ２４８Ｗ突然変異もまた、やや有利な相互作用エネルギーを有すると推定される。
【０２７６】
【表２８】
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【０２７７】
β−キトビオースリガンドを用いた全てのクローンの理論ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ相互作用エネルギーの比較が表２８に示されている。Ｄ６０Ａに対するクローンの実験結合エネルギー（ΔΔＧＢＩＮＤ−ＥＸＰ）も含まれている。Ｄ６０、即ち触媒活性に必要な残基が特に重要である。Ｄ６０及びＤ６０Ａの両方は、かなり有利な相互作用をもたらし、Ｄ６０Ｃは、あまり有利ではない０．２ｋｃａｌ／モルの寄与を有すると推定される。この理論データは、Ｒ９１１及びＲ９１１  Ｃ６０Ａクローンの実験データに反し、Ｄ６０Ｃの突然変異が、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａに対する全Ｒ９１１結合エネルギーに対して−１．２ｋｃａｌ／モル大きい寄与（ΔΔＧＢＩＮＤ−ＥＸＰ）をすることを示している（表１０）。この矛盾は、実験データが、ＭＤシミュレーションでのようにβ−キトビオースではなく、変性ＲＮａｓｅ  ＢをＮ−グルカン含有標的リガンドとして使用して作成されたことによる可能性が高い。これは、Ｄ６０Ｎ、Ｄ６０Ｅ、及びＤ６０Ｃを用いる点突然変異体の研究の報告として重要であり、全てが、Ｄ６０が触媒活性に必要であることを示している１、８。これらの報告は、Ｄ６０Ａ点突然変異体で観察された触媒活性の著しい減少に一致している（表１０）。Ｄ６０の重要な役割は、結合キトビオースリガンドの還元ＧｌｃＮＡｃのアノマーヒドロキシルとＤ６０が直接相互作用することを示す１ＰＮＦ結晶構造データによっても立証されている１。糖ペプチドの場合には、アノマーヒドロキシルは、酵素で加水分解されるグリコシド結合で置き換えられるであろう。さらに、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素を用いた基質特異性要件の研究により、酵素が、アスパラギン結合炭水化物部分及びＮ−Ｘ―Ｔグリコシル化ｓｅｑｕｏｎｅからなるペプチド部分の両方を認識することが実証されている７。従って、β−キトビオースリガンドを用いたＭＤシミュレーションは、Ｎ−グリカンのグリコシド結合の部位にＤ６０が有する実験相互作用も、Ｎ−結合型グリカンに共通のペプチドｓｅｑｕｏｎｅとのｗｔＰＮＧａｓｅ酵素の相互作用も十分にシミュレーションすることができない。
【０２７８】
糖トリペプチドリガンドと複合体を形成したＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンの分析
一般的なＮ−結合糖トリペプチド（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−β−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ）と複合体を形成したクローンを用いたＭＤシミュレーションを行って、結合相互作用をより正確にモデル化し、かつ相互作用エネルギーを推定した。末端電荷（Ｎ末端ではＮＨ３＋及びＣ末端ではＣＯＯ−）を中和するために、糖トリペプチドリガンドのペプチド部分を、ＡＭＢＥＲ  Ｔｏｏｌｓ  １３の構成要素であるｘｌｅａｐで定義される、Ｎ末端ＡＣＥ［−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３］保護基及びＣ末端ＮＭＥ［−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３］保護基を用いてモデル化した１０。表２９は、ＭＤシミュレーションに使用される糖トリペプチドリガンドと複合体を形成したＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンのモデル、計算平均ＲＭＳＤ、及び推定相対結合エネルギーの要約である。
【０２７９】
【表２９】
2017513488.tif 000049
【０２８０】
Ｄ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）、Ｒ９１１  Ｄｙｎ、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｙｎ糖トリペプチド複合モデルは全て、シミュレーション全体で安定した相互作用エネルギーを有していた。しかしながら、１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）の軌道は、シミュレーション中に相互作用エネルギーの変動を示した（図４９）。
【０２８１】
ＩＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）糖トリペプチドの軌道の視覚化により、相互作用エネルギーの変動に一致する、７１〜７４ナノ秒の間のコンフォメーションの変化が示された。シミュレーションの最初の７０ナノ秒の間に、還元ＧｌｃＮＡｃは、Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒトリペプチド部分が比較的安定している正常な４Ｃ１椅子型コンフォメーション（図５０ａ及び図５１）を有していた。Ｌｅｕ及びＴｈｒ残基の動的運動は、比較的制限されないが安定であり、Ａｓｎ残基は、全シミュレーションの間、付着したキトビオースが結合ポケットに保持されるため、比較的制限される。還元ＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル基は、１ＰＮＦ  Ｘ線結晶学データに一致して、疎水性ポケットの中に及んでいた１。しかしながら、７１〜７４ナノ秒の間に、Ａｓｎ残基のペプチド主鎖が、キトビオース結合ポケットから斜め上方に延びた溝に亘って整合しているタンパク質面に向かって回転した（図５０ｂ）。Ｄ６０−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ３１６  ＮＡｃとＹ８５−ＯＨ−Ｎ３１６−Ｏδ（キトビオース結合アスパラギン）との間で観察されたシミュレーションされた水素結合が、このコンフォメーション変化の間に消失する（図５１）。従って、キトビオース結合アスパラギンのリガンド主鎖の酸素原子（Ｎ３１６−Ｏ）が、延びている溝にあるＷ２０７に近づく。この向きにより、シミュレーションされたＷ２０７−Ｎε−Ｎ３１６−Ｏ水素結合が形成される（図５２）。このコンフォメーションの変化は、アスパラギン側鎖のグリコシド結合を変形させて、より軸方向に向かって移動させ、これにより、既に観察された還元ＧｌｃＮＡｃの４Ｃ１椅子型コンフォメーションがスキューボートコンフォメーションに移行する（図５０ｂ及び図５２）。観察されたスキューボートコンフォメーションは、グリコシド機構のミカエリス複合体に類似している１１、１２。シミュレーションされたＷ２０７−Ｎε−Ｎ３１６−Ｏ水素結合及び還元ＧｌｃＮＡｃのスキューボートコンフォメーションは、残りのシミュレーションの間（２６ナノ秒）、維持される。
【０２８２】
還元ＧｌｃＮＡｃのスキューボートコンフォメーションの変化は、糖トリペプチドリガンドと複合体を形成した１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）でのみ観察され、他の１ＰＮＦリガンド複合体では観察されなかった。同様に、同様のコンフォメーション変化は、安定した相互作用エネルギーに一致した、糖トリペプチドリガンドを用いたＤ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）、Ｒ９１１  Ｄｙｎ、及びＲ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｙｎの軌道で観察された。観察されたスキューボートコンフォメーションは、糖トリペプチドとｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素との間のユニークな相互作用を示している。このため、最後の２０ナノ秒の１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）の軌道及び他の３つのシミュレーションを、ＭＭ−ＧＢＳＡ分析に使用した。
【０２８３】
糖トリペプチドと複合体を形成した４つ全てのモデル（１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）、Ｄ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）、Ｒ９１１  Ｄｙｎ、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａ  Ｄｙｎ）の（ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの突然変異した６つの残基の）相互作用エネルギーが表３０〜表３３に要約されている。
【０２８４】
【表３０】
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【０２８５】
【表３１】
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【０２８６】
【表３２】
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【０２８７】
【表３３】
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【０２８８】
糖トリペプチドリガンドを用いた全てのクローンの理論ΔＧＢＩＮＤＩＮＧ相互作用エネルギーの比較が表３４に示されている。１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）及びＤ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）の相互作用エネルギー分析の推定値は、Ｄ６０Ａ突然変異が、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆに対する有利な相互作用エネルギーを有することを示している。これは主に、Ｄ６０に対するＤ６０Ａのより有利な溶媒和エネルギー（ΔＧＧＢ＋ＳＡ）寄与による。これらのデータは、計算アラニンスキャニングの結果に一致している（表４）。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素に対して、Ｄ６０Ａ単一点突然変異体は、１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）に対して−１．６ｋｃａｌ／モル（ΔΔＧＢＩＮＤＩＮＧ）有利な（示された６つの残基の）総相互作用エネルギーをもたらす。これは、いくつかの他のデータによって立証される：（１）シミュレーション中のＤ６０Ａの１ＰＮＦに対する安定した相互作用エネルギー、（２）１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）のシミュレーションデータで観察されたような糖ペプチドコンフォメーション変化の欠如、及び（３）Ｄ６０Ａの実験結合エネルギーが、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素よりも−０．５ｋｃａｌ／モル有利である。
【０２８９】
【表３４】
2017513488.tif 000054
【０２９０】
Ｒ９１１  Ｄｙｎのデータは、Ｄ６０Ｃの突然変異が、Ｄ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）よりも−０．３ｋｃａｌ／モル有利であることを示している。しかしながら、Ｄ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）に対するΔΔＧＢＩＮＤＩＮＧは、Ｒ９１１が−１．４ｋｃａｌ／モル有利であることを示している。主な有利な寄与は、Ｇ１９２Ｉ及びＲ２４８Ｗからであり、結合ポケットの疎水性を高める。他方、Ｄ５７Ｌ及びＥ２０６Ｓは、有利な相互作用エネルギー寄与を殆どしないと推定される。この結果は、これらの２つの残基が野生型に戻るとより有利であり得ることを示唆するものであろう。Ｄ５７の場合は、この観察は、Ｄ５７がＲ６１との水素結合の安定化に関与し、第２のＧｌｃＮＡｃとの水素結合を認識する直接基質を形成する有利な向きにＲ６１を維持することを示唆するシミュレーションデータによって立証され得る（図５１及び図５２）。同様に、１ＰＮＦ  Ｘ線結晶モデルからのＥ２０６相互作用データは、Ｅ２０６が、結合ポケットの保存水分子（Ｗａｔ３４６及びＷａｔ３４８）との水素結合に関与し、かつ基質認識に直接は関与していないことを示している（図５及び図６）１。Ｗａｔ３４６及びＷａｔ３４８の両方は、還元ＧｌｃＮＡｃと直接的な水素結合を形成する。さらに、Ｒ９１１のＥ２０６Ｓの突然変異は、酸性残基から極性残基への変化であり、この変化は、タンパク質−炭水化物相互作用に有利である。しかしながら、これらのＭＤシミュレーションが、結合ポケットの保存水分子で行われなかったため、Ｅ２０６Ｓの推定理論相互作用エネルギーは、このシミュレーションで得られる推定値とは異なる可能性が高い。
【０２９１】
Ｒ９１１（−１．４ｋｃａｌ／モル）のΔΔＧＢＩＮＤＩＮＧ相対相互作用エネルギーの推定は、Ｄ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）モデルに対して、Ｒ９１１  Ｃ６０Ａ（−１．９ｋｃａｌ／モル）ほど有利ではなかった。これは、実験データ（ΔΔＧＢＩＮＤ−ＥＸＰ）と対照的である。しかしながら、これらの理論推定値は、計算誤差の範囲内であり、この差異が統計的に有意でないことを示唆している。分解計算が、エネルギー寄与を近似することを考えると、比較的誤差の大きいＭＭ−ＧＢＳＡ推定値を得ることは珍しいことではなく、従ってデータの定性的評価が適切となる。
【０２９２】
β−キトビオース及び糖トリペプチドリガンドのトリペプチド部分のエネルギー寄与も、ＭＭ−ＧＢＳＡ分析で決定した（表３４）。有利な相互作用の大部分は、タンパク質と、ペプチド（−４ｋｃａｌ／モル〜−６ｋｃａｌ／モル）に対する糖トリペプチドの炭水化物部分（−１４ｋｃａｌ／モル〜−１６ｋｃａｌ／モル）との間である。１ＰＮＦ  Ｘ線モデルからの実験データは、結合ポケットの残基とキトビオースリガンドとの間の水素結合のネットワークを示している（図５及び図６）１。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの基質特異性の研究は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの触媒活性が、糖トリペプチド基質（キトビオース−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）では８３％であり、糖ジペプチド基質（キトビオース−Ａｓｎ−Ａｌａ）では、活性が１．８％であることを示し、１００％の活性は、ペンタペプチド基質（キトビオース−Ｔｒｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）で得られる７。従って、基質特異性の研究は、ペプチド部分が重要であることが示している。これらのシミュレーションは、既に述べた実験データに基づいて糖トリペプチドリガンドを利用したため、より決定的な相互作用エネルギーの結果は、糖ペンタペプチドリガンドで得られるであろうと予想され得る。
【０２９３】
【表３５】
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【０２９４】
Ｒ９１１の突然変異、特性、及び相対結合相互作用エネルギーの要約が表３５に示されている。ＭＭ−ＧＢＳＡデータは、６つの突然変異残基の内の４つ（Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ）が、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ΔΔＧＢＩＮＤＩＮＧ）に対して有利な相互作用エネルギーを有し、Ｄ５７Ｌが僅かに寄与している。
【０２９５】
１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）のＭＤ軌道は、Ｄ５７が、シミュレーションの間中、Ｒ６１との水素結合に関与することを示し、この水素結合は、図５１及び図５２で可視化されている。この相互作用は、当初は報告されておらず１（図５）、１ＰＮＦ実験データの再分析により、Ｄ５７のＲ６１との水素結合が立証される。この水素結合は、キトビオースリガンドの第２の半分を所定の位置に維持する、第２のＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル基の溶媒露出面との水素結合に関与するため、Ｒ６１をキトビオースリガンドの下側の位置に保持するために重要である（図６）。Ｒ６１はまた、Ｗａｔ３４９と水素結合し、これにより、キトビオースリガンドのタンパク質界面側の大きい水素結合ネットワークの一部が促進される（図６）。これらのデータは、まだ報告されていない、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆにおいて基質を安定させるＤ５７の重要な役割を示している。従って、Ｒ９１１におけるこの残基のＤ５７Ｌへの突然変異は、基質認識に悪影響を及ぼし得る。これは、結合溝から外側に揺動して溶媒により露出される位置をとる第２のＧｌｃＮＡｃを示す、キトビオースリガンドを用いたＲ９１１のＭＤ軌道データによって立証される。Ｒ６１は、Ｄ５７Ｌの突然変異により、もはやＤ５７水素結合によって所定の位置に保持されておらず、結合溝に戻り、第２のＧｌｃＮＡｃのタンパク質面側との水素結合を促進する。これらの観察はまた、相互作用エネルギー（−０．１±０．１ｋｃａｌ／モル）に対してごく僅かに有利に寄与するＲ９１１  Ｄ５７Ｌの突然変異のＭＭ−ＧＢＳＡ相互作用エネルギーの推定によって立証される。従って、Ｄ５７Ｌが野生型に戻されると、基質の認識及び親和性の向上が当然予想され得る。
【０２９６】
Ｒ９１１  Ｅ２０６Ｓの場合は、野生型Ｅ２０６の実験データは、保存水分子との水素結合相互作用を示し、これは、理論エネルギーの推定では説明がつかなかった。これは、Ｅ２０６Ｓ突然変異で推定された中立相互作用エネルギー（０．０±０．１ｋｃａｌ／モル）に寄与した可能性がある。全体として、Ｒ９１１の理論小計ΔΔＧＢＩＮＤＩＮＧ相互作用エネルギー（−１．４±０．８ｋｃａｌ／モル）は、実験により決定された値（−１．９ｋｃａｌ／モル）を再現した。
【０２９７】
Ｓｅｒ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃリガンドを用いたＰＮＧａｓｅ  ＦクローンのＭＤシミュレーション及び結合自由エネルギー分解
Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーによる０−ＧｌｃＮアセチル化糖タンパク質の濃縮は、Ｒ９１１が、コアＮ−糖ペプチドに対して明確な基質特異性を有するＮ−グリカンプロセシング酵素ＰＮＧａｓｅ  Ｆに由来することを考えると予想外であった１、７、１３〜１５。１ＰＮＦ、Ｄ６０Ａ、及びＲ９１１の構造モデルを、結合ポケットにおける共通Ｏ−ＧｌｃＮＡｃモチーフ（ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒ）を用いて作成し、５０ナノ秒のＭＤシミュレーション及びＭＭ−ＧＢＳＡ分析に利用した（表３６）。末端電荷（Ｎ末端ではＮＨ３＋、Ｃ末端ではＣＯＯ−）を中和するために、ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒリガンドのセリン残基を、ＡＭＢＥＲ  Ｔｏｏｌｓ  １３の構成要素であるｘｌｅａｐで定義される、Ｎ末端ＡＣＥ［−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３］保護基及びＣ末端ＮＭＥ［−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３］保護基を用いてモデル化した１０。
【０２９８】
【表３６】
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【０２９９】
構造平衡を、この研究に使用した以前のモデルに一致した、５０ナノ秒のＭＤシミュレーション中に計算した低い平均ＲＭＳＤによって確認した。相互作用エネルギーを、各モデルについて５０ナノ秒のＭＤ軌道の期間に亘って１ナノ秒間隔で計算した（図５３〜図５５）。当然、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ糖ペプチドとの１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）複合体の相互作用エネルギーは、全５０ナノ秒の軌道中、不安定のままであった（図５３）。観察された不安定性は、Ｎ−糖ペプチドに対するｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの特異性を示す実験データの立証である可能性が高い。しかしながら、リガンドが、軌道中に結合部位に維持され、この維持が、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ実験構造で観察されるように同じ疎水性ポケットへのＮ−アセチル基の伸長によって助けられ、野生型キトビオース及びＯ−ＧｌｃＮＡｃリガンドの両方における共通Ｎ−アセチル基が認識に重要であることを示唆していることに留意することが重要である。加えて、不安定性の大部分は、残基Ｄ６０の近傍での、５０ナノ秒の軌道中に視覚的に観察される急速なコンフォメーションの変化に基づいて、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ糖ペプチドリガンドのＡＣＥ−Ｓｅｒ−ＮＭＥペプチド部分からくるようである。１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）モデルとは異なり、Ｄ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）モデルは、５０ナノ秒のＭＤ軌道の間中、安定した相互作用エネルギーを有し（図５４）、Ｄ６０残基が、この残基のＤ６０Ａへの突然変異が安定した相互作用エネルギーをもたらしたため、１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）のＭＤシミュレーション中に観察される相互作用エネルギーの不安定性（図５３）の原因であることを示唆している。
【０３００】
複合体のＲ９１１  Ｄｙｎモデルは、図５５に示されているように、１７ナノ秒〜３０ナノ秒、及び３９ナノ秒〜５０ナノ秒に最も顕著な様々な安定した相互作用エネルギーの領域を有していた。これらの２つの領域間の重要な相違は、Ｒ６１とＧｌｃＮＡｃ−Ｏ４との間の水素結合相互作用の欠如により変更された前の時点のリガンドのコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）である。Ｒ６１とＧｌｃＮＡｃ−Ｏ４との水素結合が、３９ナノ秒で形成され始めると、複合体は、ＭＤシミュレーションの最後の１１ナノ秒の間の有利な相互作用エネルギー及び軌道の視覚分析によって証明されるようにより安定したコンフォメーションをとる（図５６）。Ｒ９１１とＯ−ＧｌｃＮＡｃリガンドとの間の理論水素結合のリストが、表３７に示され、図５６ｂに描写されている。これらの観察により、Ｒ９１１  Ｄｙｎ及びＤ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）の軌道の３９ナノ秒〜４９ナノ秒の時点間の１０ナノ秒の軌道が、ＭＭ−ＧＢＳＡ分析のために選択された。１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）複合体の場合は、軌道の最も安定した領域がＭＭ−ＧＢＳＡ分析のために選択された（２９ナノ秒〜３９ナノ秒）。しかしながら、たとえ軌道のこの領域が比較的不安定であっても、ＭＭ−ＧＢＳＡデータは、最善ではないと見なされるべきである。長い１００ナノ秒のＭＤシミュレーションでは、よりエネルギー的に安定したコンフォメーションをとる１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ複合体にならなかった。同様に、コンフォメーションの著しい変化は、ＭＤシミュレーションが１００ナノ秒まで延長されたときには、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃと複合体を形成したＤ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）又はＲ９１１  Ｄｙｎモデルでは全く観察されなかった。
【０３０１】
【表３７】
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【０３０２】
ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒ複合体を用いたモデルの推定結合自由エネルギーが表３８に示されている。相互作用エネルギー及び軌道の視覚化で観察されるように、ＭＭ−ＧＢＳＡデータはまた、Ｄ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）複合体（−１．６±０．４ｋｃａｌ／モル）に対する１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）複合体（−０．５±１．６ｋｃａｌ／モル）のＤ６０の相対的に不利な相互作用エネルギーを示している。これは、１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）複合体のＤ６０残基について計算した大きい推定誤差によっても裏付けられる。Ｒ９１１  Ｄｙｎ複合体のＤ６０Ｃの突然変異の推定相互作用エネルギーは比較的有利である（−３．２±０．７）。Ｄ６０Ｃの突然変異とは異なり、Ｅ２０６Ｓの突然変異は、著しく不利であるが：これは、この部位で相互作用することが観察される保存水分子が、ＭＭ−ＧＢＳＡの残基当たりの推定に含まれていないため、不正確な過小評価が一因であり得る。それでも、Ｅ２０６のＤ６０Ａ（ＧＬＨ２０６）で推定される著しく有利な相互作用エネルギー（−１．６±０．７ｋｃａｌ／モル）により、Ｅ２０６Ｓが野生型に戻されると、ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒに特異的なリガンド認識も向上し得ると考えられる。
【０３０３】
【表３８】
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【０３０４】
Ｉ１５６部位は、最小限の有利な相互作用寄与をすると推定される。これは、ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒリガンドには存在しない、野生型キトビオースリガンドの第２のＧｌｃＮＡｃとの相互作用にこの部位がより重要であるため驚きではない。しかしながら、Ｉ１５６部位のタンパク質ループ領域は、キトビオースの第２のＧｌｃＮＡｃの結合部位へのアクセスを遮断することによってＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒリガンドに対する特異性を改善する伸長による修飾に重要であり得る。Ｄ５７Ｌの突然変異がまた、極僅かに有利な相互作用をもたらし、かつＲ９１１キトビオース複合体で既に観察されたようにＲ６１水素結合相互作用を不安定化させる。既に述べたように、実験及びデータのモデル化は、Ｒ６１が、キトビオースの第２のＧｌｃＮＡｃ残基のＮ−アセチル基との水素結合によって媒介される基質認識にとって重要であることを示している。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ糖ペプチド（ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒ）とのＲ９１１  Ｄｙｎ複合体では、Ｒ６１が、軌道の最後の部分に向かってＧｌｃＮＡｃ−Ｏ４と水素結合する。これらの観察は、Ｄ５７Ｌが野生型に戻されると、基質認識及び特異性を高める可能性があることを示唆している。
【０３０５】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ糖ペプチド（ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒ）を用いたデータのモデル化は、実験により観察されたＯ−ＧｌｃＮアセチル化糖タンパク質の濃縮の合理化を提供する。さらに、Ｏ−ＧｌｃＮアセチル化糖タンパク質に対する特異性は、Ｅ２０６Ｓを野生型に戻し、そしてＩ１５６Ｌのループ領域を伸長させて大きいキトビオースリガンドを結合ポケットから遮断することによって高めることができる。加えて、Ｒ９１１によるＯ−ＧｌｃＮＡｃの認識の方法は、セリン残基（−２．９±０．６ｋｃａｌ／モル）に対する還元ＧｌｃＮＡｃ（−１６．４±１．５ｋｃａｌ／モル）との非常に有利な相互作用によって行われるようであり、これは、表３４に記載され、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ複合体の実験データに示されている、野生型キトビオースリガンドの相互作用における還元ＧｌｃＮＡｃとの有利な相互作用の観察に一致している１。
【０３０６】
方法
１ＰＮＦからのＤ６０Ａ及びＲ９１１構造の構築
１ＰＮＦ  Ｘ線構造モデルをベースモデルとして使用し、このベースモデルから、他の全ての突然変異ＰＮＧａｓｅ  ＦモデルをＵＳＣＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ  ｖ１．８．１を用いて構築した１、１６。Ｄｕｎｂｒａｃｋ及びＤｙｎａｍｅｏｍｉｃｓ回転異性体のライブラリーを利用して、ＵＳＣＦ  Ｃｈｉｍｅｒａの回転異性体の選択及びねじれ角ツールを用いたモデル化及びモデルへの編集に好ましい回転異性体を選択した２、３。表１８に列記されている、α−キトビオースリガンド（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−αＯＨ）を用いたＰＮＧａｓｅ  Ｆの６つのモデルを構築した。表２３に列記されている、β−キトビオースリガンド（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−βＯＨ）を用いたＰＮＧａｓｅ  Ｆの４つのモデルを構築した。表２９に列記されている、糖トリペプチドリガンド（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−β−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ）を用いたＰＮＧａｓｅ  Ｆの４つのモデルを構築した。表３６に列記されている、ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｓｅｒリガンドを用いた３つのモデルを作製した。末端電荷（Ｎ末端ではＮＨ３＋、Ｃ末端ではＣＯＯ−）を中和するために、全ての糖ペプチドリガンドのペプチド部分を、ＡＭＢＥＲ  Ｔｏｏｌｓ  １３の構成要素であるｘｌｅａｐで定義される、Ｎ末端ＡＣＥ［−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３］保護基及びＣ末端ＮＭＥ［−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３］保護基を用いてモデル化した１０。
【０３０７】
ＭＤシミュレーション
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ−リガンド複合体の１００ナノ秒の十分に溶媒和されたＭＤシミュレーションを、ＡＭＢＥＲ−ＧＬＹＣＡＭタンパク質−炭水化物力場を利用する圧力（ＮＰＴ）及び室温で、水中で行った。系は、全てのモデル化回転異性体がエネルギー最小化コンフォメーションとなるように系制限マスク（ｓｙｓｔｅｍ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔ  ｍａｓｋ）（タンパク質Ｃα及びリガンド環原子）を用いる陰溶媒（５０００ステップ）で最小化した。ｔｌｅａｐを用いて、系を、ＴＩＰ３Ｐ水モデルで陽溶媒和した。次いで、陽溶媒和系を、系制限マスクを用いてエネルギーを最小化した（２０００ステップ、ＮＶＴ）。同様に系制限マスクを用いて３０ピコ秒の加熱ステップを行い（ＮＶＴ）、続いてリガンド制限のみ（リガンド環原子）を用いて１ナノ秒の平衡化（ＮＰＴ）を行った。１００ナノ秒の生産工程を行い（５０，０００，０００ステップ、ＮＰＴ）、データを０．００２ピコ秒ごとに保存し、これは、データのナノ秒ごとの５００フレームの保存に一致する。軌道分析を、ＡＭＢＥＲ  Ｔｏｏｌｓ１３で実施されるｔｌｅａｐ、ｐｔｒａｊ、及びｃｐｐｔｒａｊを用いて行った１０、１７。ＵＳＣＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ  １．８．１を用いてデータを視覚化した１６。
【０３０８】
結合自由エネルギーの分解
結合エネルギーへの残基当たりの寄与を、軌道のエネルギー収束部分に対して実施例２で既に説明された、ＡＭＢＥＲで実施される一般化Ｂｏｒｎ（ＧＢ）連続溶媒モデルを利用して、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの３１４の各アミノ酸に対して計算した１８。
【０３０９】
参考文献
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【０３１０】
実施例５
バイオコンビナトリアルライブラリーの構築及びスクリーニング
バイオコンビナトリアルライブラリーの効率的な構築及びスクリーニングのためには、ライブラリーを約１０９クローンに制限することが重要であり１、これは、７つのランダム化位置（２０７＝１×１０９クローン）に一致する。どの残基が変化するべきかが即座にわからない場合は、ライブラリーの設計は困難であり得る。ここで、計算シミュレーションからの入力が、適切なアミノ酸の特定に役立ち、これによりライブラリーの設計に集中できる。計算ガイダンス、特に潜在的なクローンの数の削減に関する利点が記載されている２。Ｂａｒａｋａｔ及びＬｏｖｅによる近年の再考察での観察されたように３、ｉｎ  ｖｉｖｏでのスクリーンと一体化された計算アルゴリズムは、タンパク質の設計の分野において卓越した迅速な成功もたらす。
【０３１１】
ここで、計算を中心とした酵母ディスプレイＧｅｎｅＡｒｔライブラリー（ライブラリー２）は、約１．３６×１０７のクローンの多様性を有し、約２２％の理論多様性の推定配列カバレージを表している（表６）。ＦＡＣＳの前のＭＡＣＳによる選択は、ライブラリーが、機能的に適切なクローンの実用的な選別のための厳格な選択圧力としてＦＡＣＳを用いる前に十分に濃縮されるようにする役割を果たす（図１５及び図１６ａ）。ライブラリーを、ＲＮａｓｅ  Ｂ及びアシアロフェチュインの代表的なＮ−グリカン標的の混合物に対して選択して、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の同族特異性を保持したクローンを濃縮した。
【０３１２】
Ｒ９１１タンパク質配列の検査は、タンパク質−グリカン相互作用で一般に見られる残基の濃縮を示した。炭水化物の疎水性面は、芳香族アミノ酸とのスタッキング相互作用に頻繁に関与し、これは、１．５ｋｃａｌ／モル寄与すると推定される４。次いで、選択が、ＭＭ−ＧＢＳＡ分析に基づいて−０．８±０．２ｋｃａｌ／モルの有利な寄与と推定される２４８位でのＴｒｐの導入をもたらすことに留意されたい。加えて、いくつかの他の突然変異は、ｗｔ配列（Ｄ５７Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｄ６０Ｃ、及びＥ２０６Ｓ）に対する全疎水性を高めた（表３５）。
【０３１３】
Ｒ２４８Ｗの突然変異は、炭水化物−芳香族相互作用の促進におけるその既知の重要性のためだけではなく、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの触媒機構（Ａｓｎ−カルボニル原子を求核攻撃されやすくする）及び触媒部位でのＷａｔ３４６との相互作用（図５及び図６）におけるＲ２４８の提唱された役割のために特に興味深い５、６。Ｒ２４８Ａの点突然変異は、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素に対して０．１％の触媒活性を有する５。Ｒ９１１の触媒活性の欠如（表１０）は、Ｒ２４８Ｗの突然変異が一因であり得る。従って、Ｒ２４８Ｗの突然変異は、親和性を高めるだけではなく、Ｒ９１１の触媒活性に寄与し得る。
【０３１４】
アスパラギンと還元ＧｌｃＮＡｃとの間のグリコシド結合に跨る野生型Ｅ２０６及びＤ６０は、Ｘ線結晶構造１ＰＮＦにおける保存水（Ｗａｔ３４６及びＷａｔ３４８）との水素結合相互作用（図５及び図６）に関与し、かつ触媒活性に寄与することが知られている６。従って、Ｒ９１１における触媒残基（Ｄ６０Ｃ及びＥ２０６Ｓ）の極性突然変異が、触媒不活性にも寄与する可能性が高いが、基質認識に重要な水素結合ネットワークを保護する可能性が高いことにも留意することが重要である。保存水分子を用いたＭＭ−ＧＢＳＡエネルギー相互作用分析は、Ｒ９１１におけるＥ２０６Ｓ及びＤ６０Ｃの役割のさらなる洞察を提供し得る。
【０３１５】
糖トリペプチドと複合体を形成したｗｔＰＮＧａｓｅ  ＦのＭＤ分析は、Ｄ５７が、水素結合相互作用によるＲ６１の安定化、従ってＲ６１と第２のＧｌｃＮＡｃとの間の基質認識の向上に重要であることを示した。このタイプの安定化相互作用は、１ＰＮＦ  Ｘ線結晶構造におけるＳ１５５残基とＥ１１８残基との間で報告されている（図５及び図６）６。Ｒ６１のように、Ｅ１１８は、結合溝の保存水分子及び第２のＧｌｃＮＡｃと直接相互作用する。Ｅ１１８の向きは、Ｓ１５５との水素結合相互作用によって安定化される。Ｒ９１１におけるＤ５７Ｌを野生型に戻すことにより、Ｒ６１による基質認識を改善し、かつ親和性を高めることができる。
【０３１６】
自由エネルギー分解分析は、他に同等の実験方法が存在しないため、残基当たりの相互作用エネルギーを調べる強力なツールを提供する。−４４．０ｋｃａｌ／モルの総相互作用エネルギーを、糖トリペプチドリガンドを用いた１ＰＮＦ（ＧＬＨ２０６）のＭＤシミュレーションのために計算した（表２９）。この値は、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの−７．１０３ｋｃａｌ／モルの実験結合自由エネルギーを過大評価し（表１１）、これは、リガンド結合に関連したエントロピーペナルティーを省略するＭＭ−ＧＢＳＡ計算の典型的な特徴である７。コンフォメーション柔軟性の変化から生じるエントロピー効果を推定することができるが、収束を達成するために非常に長いＭＤシミュレーションを必要とし得る８。しかしながら、タンパク質の側鎖の柔軟性の低下から生じるエントロピー効果は、リガンドと強く相互作用する残基で最も高く、テピッド残基及びコールド残基（ｃｏｌｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）で最も低いと予想され得る。これらの理由から、エントロピー寄与は計算しなかった。
【０３１７】
ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０Ａとは異なり、Ｒ９１１及びＲ９１１  Ｃ６０Ａクローンの発現及び精製は低い収量（約１５０μｇ／Ｌ）となった。これらのクローンのＩＭＡＣ及びＳＥＣ溶出プロフィールは、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びＤ６０Ａとは異なっていた。さらに、複数のＲ９１１  ＳＥＣ溶出ピークのウェスタンブロット分析により、Ｒ９１１クローンの構造異性体の存在が示唆され、その一部は、誤って折り畳まれたＲ９１１クローンであり得る。タンパク質突然変異許容、複数の突然変異がタンパク質安定性を低下させるリスクは、タンパク質ライブラリーの設計の共通の問題であり、これは、特に酵素の熱安定性及び活性を高めるために選択される場合は、適切な選択パラメーターの使用によって補償することができる９。しかしながら、親和性を高める上で、これらの課題は根強く存在し、突然変異の不安定化を最小限にする近年の試みが、安定効果のために配列スペースを事前にスクリーニングするタンパク質折り畳みアルゴリズムの開発につながった９。
【０３１８】
ＳＰＲ動的データは、Ｒ９１１が、Ｎ−グリカン保持糖タンパク質ＲＮａｓｅ  Ｂに対してマイクロモル以下の親和性（ＫＤ＝０．２６μＭ）を有し、非親和性最適化Ｄ６０Ａ対照に対して親和性が１０倍高いことを実証している。Ｒ９１１はまた、８４分の１の解離速度（ｋｏｆｆ＝５．１×１０−３／秒）を有する。Ｒ９１１  Ｃ６０Ａは、比較的低い親和性及び低い解離速度を示す場合は、Ｄ６０Ｃ  Ｒ９１１の突然変異が、結合相互作用に重要な寄与を果たすことを示唆し、これは、他の突然変異からの全体的な相乗効果によってさらに強められる。重要なことに、動的データは、設計戦略に示されている高い親和性と低い解離速度関連のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）選択閾値を満たす（図５）。
【０３１９】
Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）をアフィニティークロマトグラフィー（ＬＡＣ）にかけると、Ｎ−グリカン保持糖タンパク質ＲＮａｓｅ  Ｂ及びＲＮａｓｅ  Ｂ由来のＮ−糖ペプチドの濃縮が実証された。さらに、脱グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂの濃縮の不足及びキトビオースを用いた競合溶出により、Ｒ９１１がＮ−グリカン構造の共通キトビオース糖ペプチドコアを認識することが実証されている。これは、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素の観察された特異性及びＤ６０Ａグリカンアレイスクリーニングの結果に一致している。それでもなお、Ｒ９１１のグリカン特異性が、グリカンアレイスクリーニングによってさらに調べられる。
【０３２０】
競合溶出によるＭＣＦ７細胞抽出物からの天然糖タンパク質の濃縮のためにＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）をアフィニティークロマトグラフィー（ＬＡＣ）にかけることにより、Ｒ９１１によって認識される共通還元ＧｌｃＮＡｃを共有するＮ−糖タンパク質及びＯ−ＧｌｃＮアセチル化Ｏ−糖タンパク質の両方が３．４倍に濃縮された。これは、Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）が、Ｎ−グリカンの共通キトビオースコア、及び共通コアＯ−ＧｌｃＮアセチル化モチーフ含有Ｏ−糖タンパク質の両方を認識する唯一の既知の試薬であるため重要であり、単一親和性試薬を用いる糖タンパク質の２つの主なクラスの濃縮を可能にする。さらに、Ｊａｃ、ＣｏｎＡ、及びＷＧＡレクチンを用いるマルチレクチンアフィニティークロマトグラフィー（ＭＬＡＣ）と比較すると、Ｒ９１１  ＬＡＣでは、ＭＬＡＣでは濃縮されない糖タンパク質が濃縮された１０。糖タンパク質濃縮プロフィールの差異は、グリカンの検出として利用される捕捉試薬の異なる特異性がアフィニティークロマトグラフに利用されるレクチンのタイプによって変動することを考えると驚きではない１１。当然、一部の非糖タンパク質も、Ｒ９１１  ＬＡＣからの溶出サンプルで確認された。アフィニティークロマトグラフィーによるサンプル濃縮の別の弱点は、標的リガンドの直接親和性選択以外の非特異的タンパク質−タンパク質相互作用によって捕捉されるタンパク質から生じる擬陽性である１２。
【０３２１】
炭水化物プロセシング酵素の触媒的に不活性な高親和性捕捉試薬へのエンジニアリングのための自由エネルギー分解に基づいたバイオコンビナトリアルライブラリーの設計のこの種類の最初の適用により、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）設計戦略が全体として承認され、タンパク質エンジニアリングに関連した課題が顕著になる。これらの研究は、Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）を選択突然変異によってさらに強めて、２つの別のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬を調製することができることを示唆し、この２つの別のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬の一方は、Ｎ−糖ペプチド及びＮ−糖タンパク質に特異的であり、第２のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬は、Ｏ−ＧｌｃＮアセチル化糖タンパク質及び糖ペプチドに特異的である。重要な次のステップは、Ｄ５７Ｌ突然変異を野生型に戻すことであり得、これは、Ｎ−糖タンパク質に対する基質特性を高めるための最も効果的な方法である可能性が高いためである。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ特異的Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、Ｅ２０６Ｓ及びＤ５７Ｌの両方を野生型に戻して、Ｉ１５６Ｌのループ領域を伸長させて大きいキトビオースリガンドを結合ポケットから遮断することによってエンジニアリングすることができる。
【０３２２】
ここに示される研究はまた、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）の調製用の代替の配列スペースの調査のための第２世代のバイオコンビナトリアルライブラリーの開発の基礎となる。文献報告及び本明細書で報告されるデータに基づいて、表３９は、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆの結合溝で同定された重要な残基の提唱される役割を列記する。このリストは、別のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補の開発をガイドするためにＰＮＧａｓｅ  Ｆによる基質認識の理解の向上に役立つ。開発を進展させ得る別の重要な因子は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆと複合体を形成した糖トリペプチド又は糖ペンタペプチドの実験構造データの作成であろう。Ｄ６０Ａ単一点突然変異体との複合体をこの研究で開発し、この複合体は、著しく低い触媒活性を有し、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）エンジニアリングに使用するのに等しく有用な構造であろう。しかしながら、過去２０年間に亘るこのようなデータ取得における成果不足は、実験構造データの取得の困難さの表れである。
【０３２３】
【表３９】
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【０３２４】
Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）を、酵母表面ディスプレイＰＮＧａｓｅ  Ｆバイオコンビナトリアルライブラリーのコンピューターガイド設計を用いて選択した。Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、全てのＮ結合型グリカン及びコアＯ−ＧｌｃＮアセチル化糖タンパク質に共通のコア糖ペプチド成分を検出するための新規の汎特異的（ｐａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）試薬である。Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）設計戦略のこの適用は、グリカン特異性及び高い親和性を有する炭水化物プロセシング酵素から別のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬をエンジニアリングする機会を提供する。従って、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬は、既存の炭水化物認識レクチン及び抗体の使用を補完し、そしてアフィニティークロマトグラフィーのようなサンプル濃縮適用例に利用することができる。他の適用例、例えば、グリカン検出アレイ、ＦＡＣＳ及びＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙｓ、免疫組織化学、及びバイオプロセスモニタリングでのＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬の有用性をさらに調べる。
【０３２５】
参考文献
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2017513488.tif 000064
【０３２６】
実施例６
Ｏ−ＧｌｃＮアセチル化糖タンパク質及び糖ペプチドの濃縮のためのエンジニアリングされたＬＥＣＴＥＮＺバイオセンサー
エンジニアリングされたＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚの特徴付けは、Ｎ−グリコシル化及びＯ−ＧｌｃＮアセチル化糖タンパク質及び糖ペプチドの両方に対する特異性を示した。この二重特異性は、Ｎ−グリコシル化及びＯ−ＧｌｃＮアセチル化の両方に共通の還元ＧｌｃＮＡｃ構造モチーフの認識に基づいている（実施例４）。本明細書に提示される研究は、変異Ｒ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚの調査及び開発を継続する：１つは、Ｎ−糖ペプチド及びＮ−糖タンパク質に対するさらに高められた特異性を有し、第２のＬｅｃｔｅｎｚ変異体は、Ｏ−ＧｌｃＮアセチル化糖ペプチド及びＮ−糖タンパク質に特異的である（実施例５）。さらに、Ｏ−ＧａｌＮアセチル化に対して特異的な第３のＬｅｃｔｅｎｚ変異体も調べられる。Ｏ−ＧａｌＮＡｃ特異性の原理は、ＧａｌＮＡｃがＧｌｃＮＡｃのＣ４エピマー（ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びエンジニアリングされたＲ９１１  Ｌｅｃｔｅｎｚによって認識される重要な構造モチーフ）であるという観察に基づいている。
【０３２７】
Ｒ９１１の点突然変異誘発の研究
Ｒ９１１の８つの突然変異体を作製した（表４０）。これらの突然変異体の内の７つは、Ｒ９１１アミノ酸をｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列に戻す。グルタミン酸１１８をグルタミン（Ｅ１１８Ｑ）に変換する８番目の突然変異体を作製し、これは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びそのＤ６０Ａ突然変異体にも存在する。これらの突然変異のそれぞれは、特定のグリコシル化部位とのユニークな相互作用を調整することができる重要な課題に対応する。
【０３２８】
【表４０】
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【０３２９】
従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータに基づくと、Ｒ９１１は、Ｎ−グリカン及びＯ−ＧｌｃＮＡｃの両方と相互作用する。様々なグリカン及び糖ペプチドを用いたＲ９１１の分子動力学及び結合自由エネルギーの推定は、上に列記された復帰突然変異が、特定のグリコシル化を用いて相互作用に対するＲ９１１の親和性を調整し得ることを示唆している。例えば、Ｒ９１１の分子動力学データは、Ｄ５７Ｌの突然変異が、キトビオースコアの末端ＧｌｃＮＡｃ認識に重要な隣接Ｒ６１残基との水素結合相互作用を不安定化させることを予測する（図５１及び図５６ｂ）。従って、Ｌ５７Ｄの復帰突然変異は、Ｎ−グリカン認識及び親和性を向上させることが予想される。同様に、Ｌ１５６Ｉ／Ｓ２０６Ｅの復帰は、これらの導入突然変異の最小限又は不利な推定結合自由エネルギーにより、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ認識を向上させることができる（表３８）。Ｒ９１１、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、及びＤ６０Ａに存在するＥ１１８は、キトビオースコアの第２のＧｌｃＮＡｃとの相互作用を安定化させることが予想される。Ｅ１１８Ｑ突然変異は、この突然変異が基質の結合及び認識を不安定化させるため触媒活性を消失させると報告され、従って、Ｏ−ＧｌｃＮアセチル化糖タンパク質に対する特異性が変化するであろう（表３９）。Ｔ１１９は、水素結合相互作用によってＤ５７を不安定化させ、従って、この水素結合相互作用を破壊するこの部位の突然変異がＤ５７、及びＲ６１とのその水素結合相互作用を不安定化させ得、これによりＮ−グリカン構造に対する特異性が低下し、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ認識に対する特異性が高まる。Ｋ１２３は、Ｔ５５、Ｃ５６、及びＤ５７との主鎖相互作用を安定化させる。これらの相互作用の破壊は、Ｄ５７を不安定化させ得、従ってＲ６１は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃに対する特異性が同様に変化する。同様に、Ｒ１２５は、水素結合相互作用によってＲ６１を安定化させ、従って、この水素結合相互作用を破壊するこの部位の突然変異が、Ｒ６１の末端ＧｌｃＮＡｃとの相互作用を不安定化させ得、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃに対する特異性が同様に変化する。
【０３３０】
上に列記された７つ全てのＲ９１１の復帰突然変異で、タンパク質発現に成功した。Ｅ１１８Ｑ突然変異体を、すぐに得られる発現データを用いて作製した。ウェスタンブロット法により、ＳＥＣから精製されたＩ１９２Ｇと一緒の、固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）から精製された６ｘＨｉｓ標識Ｌ５７Ｄ及びＬ１５６Ｉの検出が実証される（図５７）。Ｌ５７Ｄは、Ｒ９１１からの定性的にユニークな精製プロフィールを有し：Ｌ５７Ｄは、ＩＭＡＣ溶液からの２つの溶出ピークを有し、Ｒ９１１は、３つの溶出ピークを示す（図５８のＵＶトレースを参照されたい）。加えて、各突然変異体は、ＵＶトレースのオーバーレイで示されているように、Ｒ９１１とは異なるＳＥＣ溶出パターンを示す（図５９）。溶出パターンにおけるこれらの差異は、これらの突然変異体が、Ｒ９１１とは異なる特性、例えば、タンパク質コンフォメーションを有することが示唆し得る。しかしながら、Ｌ５７Ｄは、精製されるタンパク質の量及び３６ｋＤａでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動においてＲ９１１と同様に挙動する（図５７を参照されたい）。グリカンアレイスクリーニングを用いるＬ５７Ｄ及びＲ９１１結合プロフィールの特異性の比較（図３８）を含め、これらの突然変異体のそれぞれのさらなる機能分析が進行中である。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ突然変異体のマトリックスリストが表１に例示されている。
【０３３１】
ｐＮＰ−β−ＧｌｃＮＡｃ、ｐＮＰ−キトビオース、ｐＮＰ−α−ＧａｌＮＡｃ、及びｐＮＰ−β−ＧａｌＮＡｃ基質に対するＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びｏｇＯＧＡ活性の調査
Ｒ９１１のＯ−グリカン親和性が野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆから「引き継がれる」可能性を明確に排除するために、本出願人は、サイズは同様であるが構造及び／又はコンフォメーションが異なる４つのＯ−グリカン基質に対して酵素活性アッセイを行った。これらは：Ｏ−グリカナーゼの基質として知られるｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（β−ＧｌｃＮＡｃ）、オセアニコーラ・グラヌローサス（Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）（ｏｇＯＧＡ）からのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ｐ−ニトロフェニルＮ，Ｎ'−ジアセチル−β−Ｄ−キトビオース（キトビオース）、ｐ−ニトロフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（α−ＧａｌＮＡｃ）、及びｐ−ニトロフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（β−ＧａｌＮＡｃ）である。
【０３３２】
この結果は、β−ＧｌｃＮＡｃ（陽性対照）に対するｏｇＯＧＡの活性を裏付けるが、キトビオース、α−ＧａｌＮＡｃ、又はβ−ＧａｌＮＡｃ基質のいずれに対するｏｇＯＧＡの活性も裏付けない（図６０）。より重要なことに、この実験は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ及びその誘導体、Ｄ６０Ａ、及びＲ９１１の全ての残存Ｏ−グリカナーゼ活性を排除する。
【０３３３】
加えて、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの陽性Ｎ−グリカナーゼ活性が、標準的なゲルシフトアッセイによって再確認された（表１０）。図６１は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆが、記載されるアッセイ条件下で１μｇのＲＮａｓｅ  Ｂを完全に脱グリコシル化し、ＲＮａｓｅ  Ｂが、グリコシル化されていないＲＮａｓｅ  Ａのサイズに類似した位置に移動することになることを示している。対照的に、Ｒ９１１及びＤ６０Ａは、脱グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂ（ＲＮａｓｅ  Ａに等しい）を示すバンドが観察されなかったため、グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂに対して不活性である。陰性対照として、ｏｇＯＧＡが実験に含められた。
【０３３４】
結論として、活性アッセイは、Ｒ９１１のＯ−グリカン親和性が、ｗｔＰＮＧａｓｅ  ＦのＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）へのエンジニアリングの結果として獲得された新たな特性であることを明確に実証している。加えて、これらのデータは、ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆも、α−ＧａｌＮＡｃ又はβ−ＧａｌＮＡｃに対して触媒活性を有していないことも実証し、ＰＮＧａｓｅ  ＦのＧａｌＮＡｃ認識Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）へのエンジニアリングも獲得された新たな特性であり得ることを示唆している。
【０３３５】
全ての特許、特許出願、及び刊行物の完全な開示、並びに本明細書で言及される電子的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑに寄託されたヌクレオチド配列、並びに、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢに寄託されたアミノ酸配列、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑの注釈付きコード配列からの翻訳を含む）が、参照により本明細書に組み入れられる。本出願の開示と参照により本明細書に組み入れられるあらゆる文献の開示（複数可）との間にどんな矛盾が存在する場合も、本出願の開示が優先される。上記の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためだけに記載されている。これらの説明及び実施例から不必要な限定が生じるものではない。本発明は、図示され説明された詳細に限定されるものではなく、当業者に明らかな変更形態については、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ−１】
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【図４ｇ−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月17日(2017.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質であって、対応する野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質と比べて複数のアミノ酸突然変異を有し、前記複数の突然変異が、
（ａ）前記ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の触媒活性を低下又は消失させる少なくとも１つの第１の突然変異；及び
（ｂ）結合親和性又は結合特異性に影響を与える少なくとも１つの第２の突然変異
を含む、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２】
前記第２の突然変異が、
（ｉ）Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性を高め；かつ／又は
（ｉｉ）Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を増加させる
突然変異を含む、請求項１に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３】
前記Ｏ結合型グリカンがＯ結合型ＧｌｃＮＡｃを含む、請求項２に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項４】
前記Ｏ結合型グリカンがＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、請求項２に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項５】
前記対応する野生型タンパク質が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ（配列番号３）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号４）、及びフラボバクテリウム・ミリコラ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号５）からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項６】
前記対応する野生型タンパク質が、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）を含む、請求項５に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項７】
前記第１の突然変異が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）におけるアミノ酸位置６０、１１８、２０６、若しくは２４８、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列における対応する位置に突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項８】
前記第２の突然変異が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号１）におけるアミノ酸位置５７、６０、６２、１１８、１１９、１２０、１２３、１２５、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１９２、２０６、若しくは２４８、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列における対応する位置に突然変異を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項９】
配列番号１のＤ５７位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１０】
配列番号１のＤ６０位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１１】
配列番号１のＹ６２位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にグリシン、トリプトファン、セリン、若しくはトレオニンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１２】
配列番号１のＥ１１８位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、グルタミン、トレオニン、若しくはシステインでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１３】
配列番号１のＴ１１９位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、若しくはバリンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１４】
配列番号１のＷ１２０位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にチロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１５】
配列番号１のＫ１２３位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１６】
配列番号１のＲ１２５位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にチロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１７】
配列番号１のＫ１５３位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１８】
配列番号１のＳ１５４位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にトレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項１９】
配列番号１のＳ１５５位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２０】
配列番号１のＩ１５６位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、若しくはヒスチジンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２１】
配列番号１のＤ１５７位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２２】
配列番号１のＧ１９２位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にイソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２３】
配列番号１のＥ２０６位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にセリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、若しくはアルギニンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２４】
配列番号１のＲ２４８位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にトリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、若しくはリジンでのアミノ酸置換を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２５】
Ｄ５７位、Ｄ６０位、Ｉ１５６位、Ｇ１９２位、及びＥ２０６位に突然変異を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２６】
Ｙ６２位、Ｅ１１８位、Ｓ１５５位、Ｒ２４８位、又はこれらの任意の組合せの位置に突然変異をさらに含む、請求項２５に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２７】
（ａ）Ｄ５７Ｒ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｇ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｄ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｃ、及びＥ２０６Ｓ
（ｂ）Ｄ５７Ｃ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６２Ｗ、Ｅ１１８Ａ、Ｓ１５５Ｑ、Ｉ１５６Ｔ、Ｇ１９２Ｔ、及びＥ２０６Ｒ
（ｃ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｄ）Ｄ５７Ｗ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｍ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｗ、及びＲ２４８Ｓ
（ｅ）Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｆ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ａ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｇ）Ｄ５７Ｌ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｈ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｅ１１８Ｑ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｉ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｊ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｗ１２０Ｘ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｋ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｋ１５３Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｌ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｍ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｓ１５５Ｘ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｎ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｏ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｐ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
（ｑ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｄ１５７Ｘ、Ｇ１９２Ｉ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｒ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｅ２０６Ｓ、及びＲ２４８Ｗ
（ｓ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＲ２４８Ｗ
（ｔ）Ｄ５７Ｌ、Ｄ６０Ｃ、Ｉ１５６Ｌ、Ｇ１９２Ｉ、及びＥ２０６Ｓ
から選択される複数の突然変異を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２８】
クローンＤ６０Ａ、Ｒ６１７、Ｒ６１１３、Ｒ９１１、Ｒ９１１３、又はＲ９１１Ｃ６０Ａによって発現される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項２９】
Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ、又はＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ及びＯ結合型ＧａｌＮＡｃの両方に対する結合特異性及び親和性を増加させる第２の突然変異を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３０】
Ｎ結合型グリカン、Ｎ結合型複合糖質、Ｎ結合型糖ペプチド、Ｎ結合型糖タンパク質、又は遊離Ｎ−グリカンに結合する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３１】
Ｏ結合型グリカン、Ｏ結合型複合糖質、Ｏ結合型糖ペプチド、Ｏ結合型糖タンパク質、又は遊離Ｏ−グリカンに結合する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
【請求項３２】
第２の成分に共有結合する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む第１の成分を含むコンジュゲート。
【請求項３３】
前記第２の成分がタンパク様成分である、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記第２の成分が非タンパク様成分である、請求項３２記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記第２の成分が治療薬又は診断薬である、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含むアフィニティーマトリックス。
【請求項３８】
固形支持体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子からなる群から選択される、請求項３７に記載のアフィニティーマトリックス。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、又はアフィニティーマトリックスと、使用説明書とを含むキット。
【請求項４０】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質又はコンジュゲート、又は請求項３６に記載の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
発現ベクターである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
請求項４１又は４２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４４】
細菌細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞又は酵母細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を作製するための方法であって、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質又はコンジュゲート、又は請求項３６に記載の融合タンパク質を、単離ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は宿主細胞から発現させるステップを含む、方法。
【請求項４７】
Ｎ結合型グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記Ｎ結合型グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項４８】
前記検出されたＮ結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｎ結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｏ結合型グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＯ結合型グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
Ｏ結合型グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項５１】
前記検出されたＯ結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｏ結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｏ結合型グリカンが、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
遊離Ｎ−グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｎ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記遊離Ｎ−グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項５５】
遊離Ｏ−グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｏ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記遊離Ｏ−グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項５６】
前記遊離Ｏ−グリカンが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃを含む、請求項５５項に記載の方法。
【請求項５７】
Ｎ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンを得るステップ
を含む、方法。
【請求項５８】
Ｏ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＯ−グリカンへの結合を可能にする条件下で請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを得るステップ
を含む、方法。
【請求項５９】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含む診断組成物又は治療組成物。
【請求項６０】
前記ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、前記コンジュゲート、又は前記融合タンパク質が検出可能に標識される、請求項５９に記載の診断組成物又は治療組成物。
【請求項６１】
前記検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、りん光標識、比色標識、酵素標識、免疫標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識、又は電磁標識を含む、請求項６０に記載の診断組成物又は治療組成物。
【請求項６２】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の、治療薬としての使用。
【請求項６３】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の、診断薬としての使用。
【請求項６４】
標的薬物送達のための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
【請求項６５】
生物学的又は実験室サンプル中のＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンの存在又は量の検出のための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
【請求項６６】
生物学的又は実験室サンプル中のＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンの存在又は量の検出のための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
【請求項６７】
前記Ｏ結合型グリカンが、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記遊離Ｏ−グリカンが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃを含む、請求項６６に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
別の態様では、本発明は、Ｏ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを濃縮、単離、又は精製する方法を提供する。この方法は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＯ−グリカンへの結合を可能にする条件下で、生物学的又は実験室サンプルを触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを得るステップを含み得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
別の態様では、本発明は、治療薬、診断薬、又は分析試薬として、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用を提供する。また、標的薬物送達用の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用も提供される。また、生物学的又は実験室サンプル中のＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンの存在又は量の検出のための触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用も提供される。また、生物学的又は実験室サンプル中のＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンの存在又は量の検出のための触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用も提供される。Ｏ結合型グリカンは、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃであり得；同様に、遊離Ｏ−グリカンは、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃであり得る。
[本発明1001]
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質であって、対応する野生型ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質と比べて複数のアミノ酸突然変異を有し、前記複数の突然変異が、
（ａ）前記ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の触媒活性を低下又は消失させる少なくとも1つの第1の突然変異；及び
（ｂ）結合親和性又は結合特異性に影響を与える少なくとも1つの第2の突然変異
を含む、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1002]
前記第2の突然変異が、
（ｉ）Ｎ結合型グリカンに対する結合親和性を高め；かつ／又は
（ｉｉ）Ｏ結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を増加させる
突然変異を含む、本発明1002の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1003]
前記Ｏ結合型グリカンがＯ結合型ＧｌｃＮＡｃを含む、本発明1002の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1004]
前記Ｏ結合型グリカンがＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、本発明1002の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1005]
前記対応する野生型タンパク質が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号1）、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ−ＩＩ（配列番号3）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号4）、及びフラボバクテリウム・ミリコラ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）からのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号5）からなる群から選択されるタンパク質を含む、本発明1001〜1004のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1006]
前記対応する野生型タンパク質が、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号1）を含む、本発明1005の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1007]
前記第1の突然変異が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号1）におけるアミノ酸位置60、118、206、若しくは248、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列における対応する位置に突然変異を含む、前記の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1008]
前記第2の突然変異が、Ｆ．メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（配列番号1）におけるアミノ酸位置57、60、62、118、119、120、123、125、153、154、155、156、157、192、206、若しくは248、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列における対応する位置に突然変異を含む、前記の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1009]
配列番号1のＤ57位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1008のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1010]
配列番号1のＤ60位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1009のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1011]
配列番号1のＹ62位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にグリシン、トリプトファン、セリン、若しくはトレオニンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1010のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1012]
配列番号1のＥ118位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、グルタミン、トレオニン、若しくはシステインでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1011のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1013]
配列番号1のＴ119位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、若しくはバリンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1012のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1014]
配列番号1のＷ120位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にチロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1013のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1015]
配列番号1のＫ123位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1014のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1016]
配列番号1のＲ125位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にチロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1015のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1017]
配列番号1のＫ153位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1016のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1018]
配列番号1のＳ154位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にトレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1017のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1019]
配列番号1のＳ155位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1018のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1020]
配列番号1のＩ156位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、若しくはヒスチジンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1019のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1021]
配列番号1のＤ157位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にアスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1020のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1022]
配列番号1のＧ192位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にイソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1021のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1023]
配列番号1のＥ206位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にセリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、若しくはアルギニンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1022のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1024]
配列番号1のＲ248位、又は相同ＰＮＧａｓｅ  Ｆ配列の対応する位置にトリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、若しくはリジンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1023のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1025]
Ｄ57位、Ｄ60位、Ｉ156位、Ｇ192位、及びＥ206位に突然変異を含む、本発明1001〜1024のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1026]
Ｙ62位、Ｅ118位、Ｓ155位、Ｒ248Ｗ位、又はこれらの任意の組合せの位置に突然変異をさらに含む、本発明1025の触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1027]
（ａ）Ｄ57Ｒ、Ｄ60Ａ、Ｙ62Ｇ、Ｅ118Ａ、Ｓ155Ｄ、Ｉ156Ｔ、Ｇ192Ｃ、及びＥ206Ｓ
（ｂ）Ｄ57Ｃ、Ｄ60Ａ、Ｙ62Ｗ、Ｅ118Ａ、Ｓ155Ｑ、Ｉ156Ｔ、Ｇ192Ｔ、及びＥ206Ｒ
（ｃ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｄ）Ｄ57Ｗ、Ｄ60Ｃ、Ｉ156Ｍ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｗ、及びＲ248Ｓ
（ｅ）Ｄ60Ｃ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｆ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ａ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｇ）Ｄ57Ｌ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｈ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｅ118Ｑ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｉ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｗ120Ｘ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｊ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｗ120Ｘ、Ｓ155Ｘ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｋ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｋ153Ｘ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｌ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｓ154Ｘ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｍ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｓ155Ｘ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｎ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｉ156Ｘ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｏ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｐ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｇ192Ｉ、及びＲ248Ｗ
（ｑ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｉ156Ｌ、Ｄ157Ｘ、Ｇ192Ｉ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｒ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｉ156Ｌ、Ｅ206Ｓ、及びＲ248Ｗ
（ｓ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、及びＲ248Ｗ
（ｔ）Ｄ57Ｌ、Ｄ60Ｃ、Ｉ156Ｌ、Ｇ192Ｉ、及びＥ206Ｓ
から選択される複数の突然変異を含む、本発明1001〜1026のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1028]
クローンＤ60Ａ、Ｒ617、Ｒ6113、Ｒ911、Ｒ9113、又はＲ911Ｃ60Ａによって発現される、本発明1001〜1027のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1029]
Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃ、又はＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ及びＯ結合型ＧａｌＮＡｃの両方に対する結合特異性及び親和性を増加させる第2の突然変異を含む、本発明1001〜1028のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1030]
Ｎ結合型グリカン、Ｎ結合型複合糖質、Ｎ結合型糖ペプチド、Ｎ結合型糖タンパク質、又は遊離Ｎ−グリカンに結合する、本発明1001〜1029のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1031]
Ｏ結合型グリカン、Ｏ結合型複合糖質、Ｏ結合型糖ペプチド、Ｏ結合型糖タンパク質、又は遊離Ｏ−グリカンに結合する、本発明1001〜1030のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質。
[本発明1032]
第2の成分に共有結合する、本発明1001〜1031のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む第1の成分を含むコンジュゲート。
[本発明1033]
前記第2の成分がタンパク様成分である、本発明1032のコンジュゲート。
[本発明1034]
前記第2の成分が非タンパク様成分である、本発明1032のコンジュゲート。
[本発明1035]
前記第2の成分が治療薬又は診断薬である、本発明1032〜1034のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1036]
本発明1001〜1031のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を含む融合タンパク質。
[本発明1037]
本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含むアフィニティーマトリックス。
[本発明1038]
固形支持体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子からなる群から選択される、本発明1037のアフィニティーマトリックス。
[本発明1039]
本発明1001〜1038のいずれかの、触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、又はアフィニティーマトリックスと、使用説明書とを含むキット。
[本発明1040]
本発明1001〜1033のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質又はコンジュゲート、又は本発明1036の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
[本発明1041]
本発明1040のポリヌクレオチドを含むベクター。
[本発明1042]
発現ベクターである、本発明1041のベクター。
[本発明1043]
本発明1041又は1042のベクターを含む宿主細胞。
[本発明1044]
細菌細胞である、本発明1043の宿主細胞。
[本発明1045]
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞又は酵母細胞である、本発明1043の宿主細胞。
[本発明1046]
触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質を作製するための方法であって、本発明1001〜1033のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質又はコンジュゲート、又は本発明1036の融合タンパク質を、単離ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は宿主細胞から発現させるステップを含む、方法。
[本発明1047]
Ｎ結合型グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記Ｎ結合型グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
[本発明1048]
前記検出されたＮ結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記Ｎ結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
Ｏ結合型グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＯ結合型グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
Ｏ結合型グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
[本発明1051]
前記検出されたＯ結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記Ｏ結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記Ｏ結合型グリカンが、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、本発明1050〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
遊離Ｎ−グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｎ−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記遊離Ｎ−グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
[本発明1055]
遊離Ｏ−グリカンを検出するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質の遊離Ｏ−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ；及び
前記遊離Ｏ−グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
[本発明1056]
前記遊離Ｏ−グリカンが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃを含む、本発明1055項の方法。
[本発明1057]
Ｎ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンを得るステップ
を含む、方法。
[本発明1058]
Ｏ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって：
生物学的又は実験室サンプルを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質のＮ−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンを得るステップ
を含む、方法。
[本発明1059]
本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含む診断組成物又は治療組成物。
[本発明1060]
前記ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、前記コンジュゲート、又は前記融合タンパク質が検出可能に標識される、本発明1059の診断組成物又は治療組成物。
[本発明1061]
前記検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、りん光標識、比色標識、酵素標識、免疫標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識、又は電磁標識を含む、本発明1060の診断組成物又は治療組成物。
[本発明1062]
本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の、治療薬としての使用。
[本発明1063]
本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の、診断薬としての使用。
[本発明1064]
標的薬物送達のための、本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
[本発明1065]
生物学的又は実験室サンプル中のＮ結合型グリカン又は遊離Ｎ−グリカンの存在又は量の検出のための、本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
[本発明1066]
生物学的又は実験室サンプル中のＯ結合型グリカン又は遊離Ｏ−グリカンの存在又は量の検出のための、本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
[本発明1067]
前記Ｏ結合型グリカンが、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ又はＯ結合型ＧａｌＮＡｃを含む、本発明1066の使用。
[本発明1068]
前記遊離Ｏ−グリカンが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ又はＯ−ＧａｌＮＡｃを含む、本発明1066の使用。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆの重要性
３０年前のＰＮＧａｓｅ  Ｆの発見以来、特徴付けの前にＮ結合型グリカンを放出するための標準的なツールになった。ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、キトビオースコア及びＮ−グリカンペプチドとタンパク質のコンジュゲートに共通のアスパラギン結合ペプチドモチーフの両方を認識するため、Ｎ−グリカン保持糖タンパク質に対して広範な特異性を有する。基質特異性試験により、触媒活性に必要な最小グリカンモチーフがキトビオースコアであることが確認された１３５。加えて、認識される最小ペプチドモチーフは、全てのＮ結合型グリカンに共通のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒグリコシル化モチーフである１３５。興味深いことに、最適な酵素活性は、キトビオース結合ペンタペプチド、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号２１）で観察され、酵素が、グリカン結合アスパラギンの上流及び下流の両方の残基を認識することを示唆している１３５。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
酵母ディスプレイＰＮＧａｓｅ  Ｆクローンライブラリーの合成
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔライブラリーを、ＮＮＫコドン縮重を用いて合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。このライブラリーは、表４のライブラリー１の下に示されている突然変異誘発部位を含む。ＧｅｎｅＡｒｔライブラリーを、ヌクレオチド混合物を用いて合成し（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、全てのアミノ酸の等モル分布が得られ、このライブラリーは、表４のライブラリー２の下に示されている１９のアミノ酸（即ち、Ｄを除く）を用いるランダム化Ｄ６０位を含む。合成ライブラリーを、ｐＰＮＬ６ベクターにクローニングした（図１２）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
グリカンアレイスクリーニング
Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ）によって開発されたグリカンアレイは、６１０のユニークな哺乳動物グリカンからなり（バージョン５．１）、かつグリカン結合タンパク質の特異性の決定における非常に貴重なツールであることが証明された２７、２８。天然及び合成グリカンのライブラリーは、スペーサーを含むアミノリンカーで修飾される。グリカンは、アミノ修飾スペーサーリンカーによってＮＨＳ活性化ガラス表面に共有結合する。各グリカンは、アレイに６つの複製でプリントされる。表面に固定されたグリカンは殆どが、ペプチドグリコシル化ｓｅｑｕｏｎｅ（Ａｓｎ−Ｘ（−Ｐｒｏ）−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含まない；ただし、２つのリンカーＳｐ２２（ペプチドＮＳＴ）及びＳｐ２４（ペプチドＫＶＡＮＫＴ（配列番号２２））を除く。ペプチドｓｅｑｕｏｎｅの欠如は、グリカン相互作用の正常な生物学的背景から逸脱している。末端グリカン構造を認識する多くの炭水化物認識タンパク質では、これは、大きな問題ではない（例えば：末端シアル酸を認識するレクチン）。しかしながら、これは、様々なトランスフェラーゼの場合のように、グリカンが提示される又はグリカンが移送されるタンパク質の関連でグリカン構造を認識する炭水化物プロセシング酵素では大きな問題である。ｗｔＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素が、ｓｅｑｕｏｎｅ及びアスパラギン結合キトビオースコアからなる糖ペプチドを認識することが知られていることから、固定されたグリカンにおけるペプチドｓｅｑｕｏｎｅの欠如は制限である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９２】
β−キトビオース及び糖トリペプチドリガンドのトリペプチド部分のエネルギー寄与も、ＭＭ−ＧＢＳＡ分析で決定した（表３４）。有利な相互作用の大部分は、タンパク質と、ペプチド（−４ｋｃａｌ／モル〜−６ｋｃａｌ／モル）に対する糖トリペプチドの炭水化物部分（−１４ｋｃａｌ／モル〜−１６ｋｃａｌ／モル）との間である。１ＰＮＦ  Ｘ線モデルからの実験データは、結合ポケットの残基とキトビオースリガンドとの間の水素結合のネットワークを示している（図５及び図６）１。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの基質特異性の研究は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの触媒活性が、糖トリペプチド基質（キトビオース−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）では８３％であり、糖ジペプチド基質（キトビオース−Ａｓｎ−Ａｌａ）では、活性が１．８％であることを示し、１００％の活性は、ペンタペプチド基質（キトビオース−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号２３））で得られる７。従って、基質特異性の研究は、ペプチド部分が重要であることが示している。これらのシミュレーションは、既に述べた実験データに基づいて糖トリペプチドリガンドを利用したため、より決定的な相互作用エネルギーの結果は、糖ペンタペプチドリガンドで得られるであろうと予想され得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017513488000001.app
【国際調査報告】
2017513488.tif 000136
2017513488.tif 000137
2017513488.tif 000138