(57)【要約】  本発明は、ラミニンα−４鎖に結合するヒトＭＣＡＭの能力を阻害する抗ＭＣＡＭ抗体を提供する。本発明はまた、神経炎症性疾患、自己免疫疾患、または癌の処置のための医薬組成物および医薬配合剤、そのような抗体を作製する方法、ならびに神経炎症性疾患、自己免疫疾患、または癌の処置のための薬剤を製造する際のそれらの使用を提供する。【選択図】図１
2017510567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）位置３２（カバットの番号付け）がＮ、Ｓ、またはＱであり得ること、位置３３（カバットの番号付け）がＧまたはＡであり得ること、および位置１（カバットの番号付け）がＥによって占有されていることを除く、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１の３つのカバットＣＤＲを含む成熟重鎖可変領域と；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３の３つのカバットＣＤＲを含む成熟軽鎖可変領域と、を含む抗体。
【請求項２】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９０％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９５％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９８％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９９％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９５％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９８％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９５％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９９％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９５％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９８％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９８％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９９％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９９％同一である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
ヒト化抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
アミノ酸残基１４１を含むエピトープでヒトＭＣＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）に結合する単離された抗ＭＣＡＭ抗体。
【請求項１６】
前記エピトープが、アミノ酸残基１４５を含む、請求項１５に記載の単離された抗ＭＣＡＭ抗体。
【請求項１７】
前記エピトープが、アミノ酸残基１４１を含むヒトＭＣＡＭの少なくとも５つの連続するアミノ酸残基を含む、請求項１５または１６に記載の単離された抗ＭＣＡＭ抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、モノクローナル抗体２１２０．４．１９、または実質的にモノクローナル抗体２１２０．４．１９からのＣＤＲを含む抗体ではない、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の単離された抗ＭＣＡＭ抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の単離された抗ＭＣＡＭ抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、キメラ、ヒト化、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）、またはヒト抗体である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の単離された抗ＭＣＡＭ抗体。  
【請求項２１】
抗原結合断片である、請求項１〜２０、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体。
【請求項２２】
請求項１〜２１、７４または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
（ａ）（ｉ）位置３２（カバットの番号付け）がＮ、Ｓ、またはＱであり得ること、および位置３３（カバットの番号付け）がＧまたはＡであり得ること、を除く、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１の３つのカバットＣＤＲを含む成熟重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３の３つのカバットＣＤＲを含む成熟軽鎖可変領域、
を含む抗体と；
（ｂ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で存在するヒスチジン緩衝剤と；
（ｃ）（ｉ）約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロース；および
（ｉｉ）約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するトレハロース、
から選択される１種または複数の糖およびポリオール（「糖／ポリオール」）と；
（ｄ）約０．００５〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０と、
を含み、
約５．５〜約７の範囲内のｐＨを特徴とする、医薬配合剤。
【請求項２４】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９０％同一であり、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９０％同一である、請求項２３に記載の医薬配合剤。
【請求項２５】
前記成熟重鎖可変領域の位置１（カバットの番号付け）が、Ｅによって占有されている、請求項２３または２４に記載の医薬配合剤。
【請求項２６】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項２７】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する、請求項２３〜２６のいずれかに記載の医薬配合剤。
【請求項２８】
（ａ）請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の単離された抗ＭＣＡＭ抗体と；
（ｂ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で存在するヒスチジン緩衝剤と；
（ｃ）（ｉ）約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロース；および
（ｉｉ）約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するトレハロース、
から選択される１種または複数の糖およびポリオール（「糖／ポリオール」）と；
（ｄ）約０．００５〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０と、
を含み、
約５．５〜約７の範囲内のｐＨを特徴とする、医薬配合剤。
【請求項２９】
前記単離された抗ＭＣＡＭ抗体が、アミノ酸残基１４１を含むエピトープでヒトＭＣＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）に結合する、請求項２８に記載の医薬配合剤。
【請求項３０】
前記抗体または前記単離された抗ＭＣＡＭ抗体が、約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２３〜２９、７６、または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項３１】
前記ヒスチジン緩衝剤が、約２０ｍＭの濃度で存在する、請求項２３〜３０、７６、または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項３２】
前記糖／ポリオールが、約２２０ｍＭの濃度で存在するスクロースである、請求項２３〜３１、７６、または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項３３】
前記ｐＨが、約６．０である、請求項３２に記載の医薬配合剤。
【請求項３４】
約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧を特徴とする、請求項３３に記載の医薬配合剤。
【請求項３５】
前記糖／ポリオールが、約２２０ｍＭの濃度で存在するトレハロースである、請求項２３〜３１、７６、または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項３６】
前記ｐＨが、約６．５である、請求項３５に記載の医薬配合剤。
【請求項３７】
約２８７ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧を特徴とする、請求項３６に記載の医薬配合剤。
【請求項３８】
前記抗体または前記単離された抗ＭＣＡＭ抗体の約５％未満が、前記配合剤中に凝集体として存在する、請求項２３〜３７、７６または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項３９】
増量剤をさらに含む、請求項２３〜３８、７６または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項４０】
滅菌されている、請求項２３〜３９、７６または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項４１】
凍結および解凍の際に安定している、請求項２３〜４０、７６または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項４２】
前記タンパク質の少なくとも６５％が、３８〜４２℃で少なくとも３０日間の貯蔵後、そして／または３８〜４２℃で少なくとも３ヶ月間の貯蔵後に、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて単一ピークとして現れる、請求項２３〜４１、７６または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項４３】
３８〜４２℃で少なくとも３０日間の貯蔵後、そして／または３８〜４２℃で少なくとも３ヶ月間の貯蔵後に、高速サイズ排除クロマトグラフィーにおいて５重量％以下の凝集タンパク質を有する、請求項２３〜４１、７６または７７のいずれか１項に記載の医薬配合剤。
【請求項４４】
（ａ）請求項１５〜２１、２３〜２７、７４または７５のいずれかに記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体と；
（ｂ）ヒスチジン緩衝剤と；
（ｃ）スクロースまたはトレハロースと；
（ｄ）ポリソルベート２０と、
を含む、凍結乾燥配合剤。
【請求項４５】
水を添加されて、約５．５〜約６．５のｐＨを有する配合剤に再溶解される、請求項４４に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項４６】
約１０ｍｇ〜約４０ｍｇの前記抗体または前記単離された抗ＭＣＡＭ抗体を含む、請求項４４または請求項４５に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項４７】
再溶解された場合に約２０ｍＭの量で存在するヒスチジン緩衝剤を含む、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項４８】
再溶解された場合に約２２０ｍＭの量で存在するスクロースを含む、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項４９】
再溶解された場合に約６．０のｐＨを有する、請求項４８に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項５０】
再溶解された場合に約２２０ｍＭの量で存在するトレハロースを含む、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項５１】
再溶解された場合に約６．５のｐＨを有する、請求項５０に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項５２】
前記ポリソルベート２０が、約０．０１〜約０．０５重量％の範囲内の量で存在する、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項５３】
（ａ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する前記抗体または前記単離された抗ＭＣＡＭ抗体と；
（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するヒスチジン緩衝剤と；
（ｃ）約２２０ｍＭの濃度で存在するスクロースと；
（ｄ）約０．０２％の濃度で存在するポリソルベート２０と；
（ｅ）約６．０のｐＨと、
を含む水性溶液に水を添加することにより再溶解され得る、請求項４４に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項５４】
（ａ）約２００ｍｇの前記抗体または前記単離された抗ＭＣＡＭ抗体と；
（ｂ）約１５．５ｍｇのヒスチジンと；
（ｃ）約３７６ｍｇのスクロースと；
（ｄ）約１ｍｇのポリソルベート２０と；
（ｅ）約６．０のｐＨと、
を含む、請求項５３に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項５５】
（ａ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する前記抗体または前記単離された抗ＭＣＡＭ抗体と；
（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するヒスチジン緩衝剤と；
（ｃ）約２２０ｍＭの濃度で存在するトレハロースと；
（ｄ）約０．０２％の濃度で存在するポリソルベート２０と；
（ｅ）約６．５のｐＨと、
を含む水性溶液に水を添加することにより再溶解され得る、請求項４４に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項５６】
（ａ）約２００ｍｇの前記抗体または前記単離された抗ＭＣＡＭ抗体と；
（ｂ）約１５．５ｍｇのヒスチジンと；
（ｃ）約４１６ｍｇのトレハロースと；
（ｄ）約１ｍｇのポリソルベート２０と；
（ｅ）約６．５のｐＨと、
を含む、請求項５５に記載の凍結乾燥配合剤。
【請求項５７】
体内の炎症部位へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする、哺乳動物対象における炎症性障害の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項５８】
中枢神経系（ＣＮＳ）へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする、哺乳動物対象におけるＣＮＳ炎症性障害の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項５９】
哺乳動物対象における多発性硬化症の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項６０】
哺乳動物対象における乾癬の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項６１】
哺乳動物対象におけるメラノーマなどの固形腫瘍の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項６２】
哺乳動物対象におけるサルコイドーシスの処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項６３】
哺乳動物対象における乾癬性関節炎の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項６４】
哺乳動物対象におけるパーキンソン病の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項６５】
哺乳動物対象におけるアレルギー性接触皮膚炎の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の使用。
【請求項６６】
請求項１〜２１、７４、または７５のいずれか１項に記載の抗体または単離された抗ＭＣＡＭ抗体の有効量を、必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、炎症部位へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性障害を処置する方法。
【請求項６７】
前記ＭＣＡＭ発現細胞が、ＴＨ１７細胞である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記哺乳動物対象が、ヒトである、請求項５７〜６７のいずれか１つに記載の方法または使用。
【請求項６９】
アミノ酸残基１４１をはじめとするヒトＭＣＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の５〜５０の連続するアミノ酸残基を含む、抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体に結合するためのエピトープを含む単離されたペプチド。
【請求項７０】
キャリアポリペプチドに結合されている、請求項６９に記載の単離されたペプチド。
【請求項７１】
アジュバントと混和されている、請求項６９または７０に記載の単離されたペプチド。
【請求項７２】
ラミニンα−４鎖へのヒトＭＣＡＭの結合を阻害する抗体を作製する方法であって、
（ａ）対象を、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載のペプチドで免疫化すること；
（ｂ）抗体を分泌するＢ細胞を前記対象から単離すること；および
（ｃ）前記抗体をスクリーニングして、ラミニンα−４鎖へのヒトＭＣＡＭの結合を阻害する抗体を同定すること、
を含む、方法。
【請求項７３】
（ｄ）前記Ｂ細胞を培養された不死化細胞と融合して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成させること；
（ｅ）前記ハイブリドーマ細胞を培養すること；および
（ｆ）培養物からモノクローナル抗体を単離すること、
をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ鎖配列を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８のアミノ鎖配列を有する軽鎖定常領域と、を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項７５】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ鎖配列を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８のアミノ鎖配列を有する軽鎖定常領域と、を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項７６】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ鎖配列を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８のアミノ鎖配列を有する軽鎖定常領域と、を含む請求項２３〜２７のいずれかに記載の医薬配合剤。
【請求項７７】
前記成熟重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ鎖配列を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８のアミノ鎖配列を有する軽鎖定常領域と、を含む請求項２３〜２７のいずれかに記載の医薬配合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月１２日出願の米国特許仮出願第６１／９５２，１１６号、２０１４年３月１３日出願の米国特許仮出願第６１／９５２，８３３号、２０１４年７月１１日出願の米国特許仮出願第６２／０２３，７２４号、および２０１４年１０月２４日出願の米国特許仮出願第６２／０６８，４１９号の優先権を主張するものであり、前述の出願のそれぞれが、全ての目的で全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表、表、またはコンピュータプログラム表の参照
「抗ＭＣＡＭ抗体および関連の使用方法」のために２０１５年３月４日に作成されたファイル４５８９１１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載された配列表は、１５４キロバイトである。このファイルに含まれる情報は、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＴＨ１７細胞（Ｔヘルパー１７細胞）と称されるＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットは、複数の自己免疫疾患、特にＴ細胞のＣＮＳ浸潤を含むそれらの神経炎症状態、例えば多発性硬化症および動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の病原に関連づけられてきた。ＴＨ１７細胞は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２をはじめとする複数の限定されたサイトカインを分泌することが報告されている。ＴＨ１７細胞は、組織の特異的動員および浸潤を受けることが報告されている。ＭＣＡＭは、ＴＨ１７細胞上で発現され、リガンドとしてのラミニンα−４に結合することが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求された発明の概要
本発明は、位置３２（カバットの番号付け）がＮ、Ｓ、またはＱであり得ること、位置３３（カバットの番号付け）がＧまたはＡであり得ること、および位置１（カバットの番号付け）がＥによって占有されていることを除く、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１の３つのカバットＣＤＲを含む成熟重鎖可変領域と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３の３つのカバットＣＤＲを含む成熟軽鎖可変領域と、を含む抗体を提供する。幾つかの抗体において、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９０％同一であり、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９０％同一である。幾つかのそのような抗体は、ヒト化された抗体である。そのような抗体の幾つかにおいて、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９８％または９９％同一である。そのような抗体の幾つかにおいて、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。幾つかのそのような抗体において、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９５％同一である。幾つかのそのような抗体において、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９５％同一であり、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する。幾つかのそのような抗体において、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する。幾つかのそのような抗体において、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する。幾つかのそのような抗体において、該重鎖定常領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１もしくは１７２のアミノ酸配列を有し、そして／または該軽鎖定常領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８のアミノ酸配列を有する。
【０００６】
本発明は、アミノ酸残基１４１を含むエピトープでヒトＭＣＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）に結合する抗ＭＣＡＭ抗体をさらに提供する。幾つかの抗体において、該エピトープは、アミノ酸残基１４５を含む。幾つかの抗体において、該エピトープは、アミノ酸残基１４１を含むヒトＭＣＡＭの少なくとも５つの連続するアミノ酸残基を含む。幾つかのそのような抗体において、該抗体は、
（ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に対応する成熟軽鎖可変領域を有するクローン１５；
（ｂ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対応する成熟軽鎖可変領域を有するクローン１７；
（ｃ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に対応する成熟軽鎖可変領域を有する１１７４．１．３；
（ｄ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に対応する成熟軽鎖可変領域を有する１４１４．１．２；
（ｅ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に対応する成熟軽鎖可変領域を有する１４１５．１．１；
（ｆ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０に対応する成熟軽鎖可変領域１７４９．１．３；
（ｇ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０に対応する成熟軽鎖可変領域２１２０．４．１９；
（ｈ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４に対応する成熟軽鎖可変領域２１０７．４．１０；ならびに
（ｉ）実質的にモノクローナル抗体１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９、および２１０７．４．１０からのＣＤＲを含む抗体、
からなる群から選択される抗体ではない。幾つかのそのような抗体において、該抗体は、モノクローナルである。幾つかのそのような抗体において、該抗体は、キメラ、ヒト化、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）、またはヒト抗体である。
【０００７】
幾つかのそのような抗体において、該抗体は、
（ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に対応する成熟軽鎖可変領域を有するクローン１５；
（ｂ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対応する成熟軽鎖可変領域を有するクローン１７；
（ｃ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に対応する成熟軽鎖可変領域を有する１１７４．１．３；
（ｄ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に対応する成熟軽鎖可変領域を有する１４１４．１．２；
（ｅ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に対応する成熟軽鎖可変領域を有する１４１５．１．１；
（ｆ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０に対応する成熟軽鎖可変領域１７４９．１．３；
（ｇ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、７１、または７２に対応する成熟軽鎖可変領域２１２０．４．１９；
（ｈ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９に対応する成熟重鎖可変領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２または８４に対応する成熟軽鎖可変領域２１０７．４．１０；および
（ｉ）実質的にモノクローナル抗体１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９、および２１０７．４．１０からのＣＤＲを含む抗体、
からなる群から選択される抗体ではない。幾つかのそのような抗体において、該抗体は、モノクローナルである。幾つかのそのような抗体において、該抗体は、キメラ、ヒト化、ベニヤ化、またはヒト抗体である。
【０００８】
本発明は、上述の抗体のいずれかを含む医薬組成物をさらに提供する。
【０００９】
本発明は、（ａ）約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する本明細書に記載された任意の抗体と；（ｂ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で存在するヒスチジン緩衝剤などの緩衝剤と；（ｃ）約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロースまたはトレハロースなどの糖および／またはポリオールと；（ｄ）約０．００５〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０などの界面活性剤と、を含み、約５．５〜約７の範囲内のｐＨを特徴とする医薬配合剤をさらに提供する。
【００１０】
例示的な医薬配合剤は、（ａ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する本明細書に記載された任意の抗体と；（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するヒスチジン緩衝剤と；（ｃ）約２２０ｍＭの濃度で存在するスクロースと；（ｄ）約０．０２％の濃度で存在するポリソルベート２０と、（ｅ）約６．０のｐＨと、を含む。
【００１１】
別の例示的な医薬配合剤は、（ａ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する本明細書に記載された任意の抗体と；（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するヒスチジン緩衝剤と；（ｃ）約２２０ｍＭの濃度で存在するトレハロースと；（ｄ）約０．０２％の濃度で存在するポリソルベート２０と、（ｅ）約６．５のｐＨと、を含む。
【００１２】
本発明により提供された幾つかの配合剤は、増量剤をさらに含み、滅菌されており，そして／または凍結および解凍の際に安定している。幾つかの配合剤において、抗体の少なくとも６５％が、３８〜４２℃で少なくとも３０日間の貯蔵後、そして／または３８〜４２℃で少なくとも３ヶ月間の貯蔵後に、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて単一ピークとして現れる。幾つかの配合剤において、３８〜４２℃で少なくとも３０日間の貯蔵後、そして／または３８〜４２℃で少なくとも３ヶ月間の貯蔵後に、高速サイズ排除クロマトグラフィーにおいて５重量％以下の凝集タンパク質。
【００１３】
本発明により提供された抗体配合剤は、凍結乾燥配合剤の形態であり得る。例えば、代表的な凍結乾燥配合剤は、（ａ）本明細書に記載された任意の抗体と；（ｂ）ヒスチジン緩衝剤と；（ｃ）スクロースまたはトレハロースと；（ｄ）ポリソルベート２０と、を含み得る。凍結乾燥配合剤は、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇの抗体と、約０．００５〜約０．０５重量％の範囲内の濃度のポリソルベート２０と、を含み得る。再溶解の後、該凍結乾燥配合剤は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭのスクロースまたはトレハロースを含み得る。再溶解の後、該凍結乾燥配合剤は、約６〜約７のｐＨ、例えばｐＨ６．０または６．５を有する水性溶液を生成する。
【００１４】
再溶解の後、例示的凍結乾燥配合剤は、（ａ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する本明細書に記載された任意の抗体と；（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するヒスチジン緩衝剤と；（ｃ）約２２０ｍＭの濃度で存在するスクロースと；（ｄ）約０．２ｇ／Ｌの濃度で存在するポリソルベート２０と；（ｅ）約６．０のｐＨと、を含み得る。そのような凍結乾燥配合剤は、約２００ｍｇの抗体と、約１５．５ｍｇのヒスチジンと、約３７６ｍｇのスクロースと、約１ｍｇのポリソルベート２０と、を含み得る。
【００１５】
再溶解の後、別の例示的凍結乾燥配合剤は、（ａ）約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する本明細書に記載された任意の抗体と；（ｂ）約２０ｍＭの濃度で存在するヒスチジン緩衝剤などの緩衝剤と；（ｃ）約２２０ｍＭの濃度で存在するトレハロース二水和物と；（ｄ）約０．２ｇ／Ｌの濃度で存在するポリソルベート２０と；（ｅ）約６．５のｐＨと、を含み得る。そのような凍結乾燥配合剤は、約２００ｍｇの抗体と、約１５．５ｍｇのヒスチジンと、約４１６ｍｇのトレハロース二水和物と、約１ｍｇのポリソルベート２０と、を含み得る。
【００１６】
本発明は、体内の炎症部位へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性障害の処置のための薬剤の製造における上述の抗体のいずれかの使用をさらに提供する。そのような炎症性障害は、中枢神経系（ＣＮＳ）へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とするＣＮＳ炎症性障害であり得る。
【００１７】
本発明は、多発性硬化症、パーキンソン病、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サリコイドーシス、炎症性腸疾患、クローン病、または癌（例えば、固形または血液腫瘍）、例えばメラノーマの処置のための薬剤の製造における上述の抗体のいずれかの使用をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、炎症部位へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性障害を処置する方法であって、必要とする哺乳動物対象に、上述の抗体のいずれかの有効量を投与することを含む、方法をさらに提供する。幾つかの方法において、該疾患は、多発性硬化症、パーキンソン病、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サリコイドーシス、炎症性腸疾患、クローン病、または癌（例えば、固形または血液腫瘍）、例えばメラノーマである。幾つかの方法において、該ＭＣＡＭ発現細胞は、ＴＨ１７細胞である。幾つかの方法において、該哺乳動物対象は、ヒトである。該方法の幾つかにおいて、該抗体は、ラミニンα−４鎖を含むタンパク質へのＭＣＡＭの結合を阻害する。該方法の幾つかにおいて、該哺乳動物対象は、ヒトである。該方法の幾つかにおいて、該ＭＣＡＭ発現細胞は、ＴＨ１７細胞である。
【００１９】
本発明は、抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体に結合するためのエピトープを含む単離されたペプチドであって、アミノ酸残基１４１を含むヒトＭＣＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の５〜５０の連続アミノ酸残基を含む、単離されたペプチドをさらに提供する。これらのペプチドの幾つかにおいて、該ペプチドは、キャリアポリペプチドに結合されている。これらのペプチドの幾つかにおいて、該ペプチドは、アジュバントと混和されている。
【００２０】
本発明は、ラミニンα−４鎖へのヒトＭＣＡＭの結合を阻害する抗体を作製する方法であって、
（ａ）対象を先に記載されたペプチドで免疫化すること；
（ｂ）抗体を分泌するＢ細胞を該対象から単離すること；
（ｃ）該抗体をスクリーニングして、ラミニンα−４鎖へのヒトＭＣＡＭの結合を阻害する抗体を同定すること、
を含む、方法をさらに提供する。該方法の幾つかにおいて、該方法は、
（ｄ）該Ｂ細胞を培養された不死化細胞と融合して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成させること；
（ｅ）該ハイブリドーマ細胞を培養すること；および
（ｆ）培養物からモノクローナル抗体を単離すること、
をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】重要なクローンの同定を示す。平均表面発現値の関数としてプロットされた平均２１２０．４．１９結合値（灰色の菱形）。３０％未満のモノクローナル抗体反応性および５０％を超えるマウス血清結合の閾値を適用して、抗体結合が陰性であるが表面発現が陽性であるクローン（黒色の菱形）を同定した。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａは、リボン図により表されたヒトＭＣＡＭの相同性モデルである。図２Ｂは、ヒトＭＣＡＭの位置１４１（Ｉ１４１）および位置１４５（Ｐ１４５）の該当する残基を示すヒトＢＣＡＭ、ヒトＭＣＡＭ、およびマウスＭＣＡＭ配列の部分的アライメントを表す。図２Ｃは、ヒトＭＣＡＭのＩ１４１およびＰ１４５残基の位置および露出を表すリボン図を表す。
【図３Ａ】以下のものの可変重鎖の配列のアライメントを示す：ラット２１２０．４．１９抗ＭＣＡＭ抗体（２１２０．４．１９．６＿ＶＨ＿ｔｏｐｏ＿ｐｒｏ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）；２１２０  ＶＨ１ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）；２１２０  ＶＨ２ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）；２１２０  ＶＨ３ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；２１２０  ＶＨ４ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；２１２０  ＶＨ５ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）; およびフレームワークドナーとして用いられる重鎖ヒト可変ＡＦ０６２１３３  ＩＧＨＶ２−２６＊０１配列（ＡＦ０６２１３３＿ＶＨ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）。カバット番号付けを用い、ラット２１２０．４．１９．６抗体から可変重鎖可変ＡＦ０６２１３３  ＩＧＨＶ２−２６＊０１フレームワークに移植された超可変領域（ＨＶＲ）を枠で囲っている。（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１内の枠で囲まれたＮ／Ｄ残基の突然変異、例えばＮ３２Ｓ（ＶＨ３）；Ｎ３２Ｑ（ＶＨ４）；またはＧ３３Ａ（ＶＨ５）と組み合わせたＳ３０Ｔ、Ｉ３７Ｖ、Ｌ４８ＩおよびＫ７１Ｒ突然変異は、Ｎ脱アミド化突然変異体を提供する。ヒト化抗体配列内の太字のアミノ酸残基は、ラット抗体配列内の対応する残基と異なる。ＣＤＲの接触またはＣＤＲ構造に影響を及ぼし得るカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）およびインターフェース（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）アミノ酸残基の位置を、アスタリスクで示している。突然変異がＮ−脱アミノ化部位またはＮ−グリコシル化部位の存在により集中された残基が、括弧の付いた枠内に示されている
【図３Ｂ】以下のものの可変軽鎖の配列のアライメントを示す：ラット２１２０．４．１９．６抗ＭＣＡＭ抗体（２１２０．４．１９．６＿ＶＬ＿ｔｏｐｏ＿ｐｒｏ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；２１２０  ＶＬ１ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＬ１  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；２１２０  ＶＬ２ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＬ２  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；２１２０  ＶＬ３ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＬ３  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）;およびフレームワークドナーとして用いられた軽鎖ヒト可変Ｘ８４３４３  ＩＧＫＶ２−２６＊０１配列（Ｘ８４３４３＿ＶＬ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）。カバット番号付けを用い、ラット２１２０．４．１９．６抗体から可変軽鎖可変Ｘ８４３４３  ＩＧＫＶ２−２６＊０１フレームワークに移植された超可変領域（ＨＶＲ）を枠で囲っている。ヒト化抗体配列内の太字のアミノ酸残基は、ラット抗体配列内の対応する残基と異なる。ＣＤＲの接触またはＣＤＲ構造に影響を及ぼし得るカノニカルおよびインターフェースアミノ酸残基の位置を、アスタリスクで示している。
【図４Ａ】以下のものの成熟重鎖可変領域の配列のアライメントを示す：ラット２１２０．４．１９抗ＭＣＡＭ抗体（２１２０．４．１９．６＿ＶＨ＿ｔｏｐｏ＿ｐｒｏ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）；２１２０  ＶＨ１．Ｑ１Ｅヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ１．Ｑ１Ｅ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）；２１２０  ＶＨ２．Ｑ１Ｅヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ２．Ｑ１Ｅ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）；２１２０  ＶＨ３．Ｑ１Ｅヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ３．Ｑ１Ｅ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）；２１２０  ＶＨ４．Ｑ１Ｅヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ４．Ｑ１Ｅ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）；２１２０  ＶＨ５．Ｑ１Ｅヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＨ５．Ｑ１Ｅ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）；およびフレームワークドナーとして用いられた重鎖ヒト可変ＡＦ０６２１３３  ＩＧＨＶ２−２６＊０１配列（ＡＦ０６２１３３＿ＶＨ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）。カバット番号付けを用い、ラット２１２０．４．１９．６抗体から可変重鎖可変ＡＦ０６２１３３  ＩＧＨＶ２−２６＊０１フレームワークに移植された超可変領域（ＨＶＲ）を枠で囲っている。位置Ｑ１Ｅの置換を、枠により大まかに表している。
【図４Ｂ】以下のものの可変軽鎖の配列のアライメントを示す：ラット２１２０．４．１９．６抗ＭＣＡＭ抗体（２１２０．４．１９．６＿ＶＬ＿ｔｏｐｏ＿ｐｒｏ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；２１２０  ＶＬ１ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＬ１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；２１２０  ＶＬ２ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＬ２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；２１２０  ＶＬ３ ヒト化抗ＭＣＡＭ抗体（ｈ２１２０ＶＬ３；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）;およびフレームワークドナーとして用いられた軽鎖ヒト可変Ｘ８４３４３  ＩＧＫＶ２−２６＊０１配列（Ｘ８４３４３＿ＶＬ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）。カバット番号付けを用い、ラット２１２０．４．１９．６抗体から可変軽鎖可変８４３４３  ＩＧＫＶ２−２６＊０１フレームワークに移植された超可変領域（ＨＶＲ）を枠で囲っている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列の簡単な説明
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、抗体クローン１７の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、抗体クローン１７の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、抗体クローン１７のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００２５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、抗体クローン１７のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、抗体クローン１７のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００２７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、抗体クローン１７の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、抗体クローン１７の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、抗体クローン１７のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、抗体クローン１７のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、抗体クローン１７のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、ヒトＭＣＡＭアクセッション番号ＣＡＡ４８３３２のアミノ酸配列である。
【００３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、抗体クローン１５の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は、抗体クローン１５の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は、抗体クローン１５のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は、抗体クローン１５のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６は、抗体クローン１５のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７は、抗体クローン１５の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８は、抗体クローン１５の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９は、抗体クローン１５のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０は、抗体クローン１５のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１は、抗体クローン１５のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２は、ヒトＭＣＡＭドメイン１（残基１９〜１２９）のアミノ酸配列である。
【００４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３は、ヒトＭＣＡＭドメイン２（残基１３９〜２４２）のアミノ酸配列である。
【００４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４は、ヒトＭＣＡＭドメイン３（残基２４４〜３２１）のアミノ酸配列である。
【００４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５は、ヒトＭＣＡＭドメイン４（残基３５５〜４２４）のアミノ酸配列である。
【００４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６は、ヒトＭＣＡＭドメイン５（残基４３０〜５１０）のアミノ酸配列である。
【００４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７は、ヒトラミニン４１１のα４鎖アイソフォームのアミノ酸配列である（アクセッション番号ＮＰ００１０９８６７６）。
【００４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８は、ヒトラミニン４１１のα４鎖アイソフォームのアミノ酸配列である（アクセッション番号ＣＡＡ４８３２２）。
【００５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９は、抗体１１７４．１．３の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０は、抗体１１７４．１．３の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４は、抗体１１７４．１．３の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５は、抗体１１７４．１．３の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９は、抗体１４１４．１．２の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０は、抗体１４１４．１．２の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４は、抗体１４１４．１．２の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５は、抗体１４１４．１．２の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９は、抗体１４１５．１．１の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０は、抗体１４１５．１．１の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４は、抗体１４１５．１．１の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５は、抗体１４１５．１．１の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９は、抗体１７４９．１．３の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０は、抗体１７４９．１．３の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００８５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４は、抗体１７４９．１．３の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５は、抗体１７４９．１．３の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００８７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００８９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９は、抗体２１２０．４．１９の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９内に示された抗体２１２０．４．１９の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１は、抗体２１２０．４．１９の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００９３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２は、抗体２１２０．４．１９の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００９４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００９７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６は、抗体２１２０．４．１９の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００９８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７は、抗体２１２０．４．１９の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００９９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１００】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【０１０１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【０１０２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１は、抗体２１０７．４．１０の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０１０３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１内に示された抗体２１０７．４．１０の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１０４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３は、抗体２１０７．４．１０の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０１０５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３内に示された抗体２１０７．４．１０の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１０６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【０１０７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【０１０８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【０１０９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８は、抗体２１０７．４．１０の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０１１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９は、抗体２１０７．４．１０の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【０１１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【０１１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３は、抗体１７４９．１．３の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４は、ヒト化抗体１７４９バージョン１の成熟重鎖可変領域（ＶＨ１）のアミノ酸配列である。
【０１１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５は、ヒト化抗体１７４９バージョン２の成熟重鎖可変領域（ＶＨ２）のアミノ酸配列である。
【０１１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６は、重鎖可変フレームワークドナーＵ９６２８２＿ＶＨのアミノ酸配列である。
【０１１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７は、抗体１７４９．１．３の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８は、ヒト化抗体１７４９バージョン１の成熟軽鎖可変領域（ＶＬ１）のアミノ酸配列である。
【０１２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９は、ヒト化抗体１７４９バージョン２の成熟軽鎖可変領域（ＶＬ２）のアミノ酸配列である。
【０１２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００は、軽鎖可変フレームワークドナーＸ０２９９０＿ＶＬのアミノ酸配列である。
【０１２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１は、抗体２１０７．４．１０．１８の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２は、ヒト化抗体２１０７バージョン１の成熟重鎖可変領域（ＶＨ１）のアミノ酸配列である。
【０１２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３は、ヒト化抗体２１０７バージョン２の成熟重鎖可変領域（ＶＨ２）のアミノ酸配列である。
【０１２５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４は、ヒト化抗体２１０７バージョン３の成熟重鎖可変領域（ＶＨ３）のアミノ酸配列である。
【０１２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５は、ヒト化抗体２１０７バージョン４Ａの成熟重鎖可変領域（ＶＨ４Ａ）のアミノ酸配列である。
【０１２７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６は、ヒト化抗体２１０７バージョン５Ａの成熟重鎖可変領域（ＶＨ５Ａ）のアミノ酸配列である。
【０１２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７は、ヒト化抗体２１０７バージョン６の成熟重鎖可変領域（ＶＨ６）のアミノ酸配列である。
【０１２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８は、重鎖可変フレームワークドナーＡＦ０６２１３３＿ＶＨのアミノ酸配列である。
【０１３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９は、抗体２１０７．４．１０．１８の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０は、ヒト化抗体２１０７バージョン１の成熟軽鎖可変領域（ＶＬ１）のアミノ酸配列である。
【０１３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１は、ヒト化抗体２１０７バージョン２の成熟軽鎖可変領域（ＶＬ２）のアミノ酸配列である。
【０１３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２は、ヒト化抗体２１０７バージョン３の成熟軽鎖可変領域（ＶＬ３）のアミノ酸配列である。
【０１３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３は、軽鎖可変フレームワークドナーＵ８６８０３のアミノ酸配列である。
【０１３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４は、抗体２１２０．４．１９．６の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５は、ヒト化抗体２１２０バージョン１の成熟重鎖可変領域（ＶＨ１）のアミノ酸配列である。
【０１３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６は、ヒト化抗体２１２０バージョン２の成熟重鎖可変領域（ＶＨ２）のアミノ酸配列である。
【０１３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７は、ヒト化抗体２１２０バージョン３の成熟重鎖可変領域（ＶＨ３）のアミノ酸配列である。
【０１３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８は、ヒト化抗体２１２０バージョン４の成熟重鎖可変領域（ＶＨ４）のアミノ酸配列である。
【０１４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９は、ヒト化抗体２１２０バージョン５の成熟重鎖可変領域（ＶＨ５）のアミノ酸配列である。
【０１４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０は、抗体２１２０．４．１９．６の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１は、ヒト化抗体２１２０バージョン１の成熟軽鎖可変領域（ＶＬ１）のアミノ酸配列である。
【０１４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２は、ヒト化抗体２１２０バージョン２の成熟軽鎖可変領域（ＶＬ２）のアミノ酸配列である。
【０１４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３は、ヒト化抗体２１２０バージョン３の成熟軽鎖可変領域（ＶＬ３）のアミノ酸配列である。
【０１４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４は、軽鎖可変フレームワークドナーＸ８４３４３＿ＶＬのアミノ酸配列である。
【０１４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８は、ヒト化重鎖／軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９は、ヒト化抗体２１２０バージョン３（ＶＨ３）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０は、ヒト化抗体２１２０バージョン４（ＶＨ４）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１は、ヒト化抗体２１２０バージョン５（ＶＨ５）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１は、ヒト化抗体２１０７バージョン１（ＶＨ１）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２は、ヒト化抗体２１０７バージョン４（ＶＨ４）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３は、ヒト化抗体２１２０バージョン１−５（ＶＨ１−ＶＨ５）のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【０１７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６は、位置１（カバット番号付け）がＥによって占有された抗体２１２０．４．１９．ＱＩＥの成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７は、位置１（カバット番号付け）がＥによって占有されたヒト化抗体２１２０バージョン１  ＱＩＥの成熟重鎖可変領域（ＶＨ１．Ｑ１Ｅ）のアミノ酸配列である。
【０１７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８は、位置１（カバット番号付け）がＥによって占有されたヒト化抗体２１２０バージョン２  ＱＩＥの成熟重鎖可変領域（ＶＨ２．Ｑ１Ｅ）のアミノ酸配列である。
【０１８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９は、位置１（カバット番号付け）がＥによって占有されたヒト化抗体２１２０バージョン３  ＱＩＥの成熟重鎖可変領域（ＶＨ３．Ｑ１Ｅ）のアミノ酸配列である。
【０１８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０は、位置１（カバット番号付け）がＥによって占有されたヒト化抗体２１２０バージョン４  ＱＩＥの成熟重鎖可変領域（ＶＨ４．Ｑ１Ｅ）のアミノ酸配列である。
【０１８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１は、位置１（カバット番号付け）がＥによって占有されたヒト化抗体２１２０バージョン５  ＱＩＥの成熟重鎖可変領域（ＶＨ５．Ｑ１Ｅ）のアミノ酸配列である。
【０１８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２は、成熟重鎖または成熟軽鎖可変領域に融合され得る例示的シグナルペプチドをコードする核酸配列である。
【０１８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２の核酸配列によりコードされた例示的シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【０１８５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４は、成熟重鎖または成熟軽鎖可変領域に融合され得る例示的シグナルペプチドをコードする核酸配列である。
【０１８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４の核酸配列によりコードされた例示的シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【０１８７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６は、成熟重鎖または成熟軽鎖可変領域に融合され得る例示的シグナルペプチドをコードする核酸配列である。
【０１８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６の核酸配列によりコードされた例示的シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【０１８９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８は、Ｎ末端にアルギニンを有するヒト化２１２０軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【０１９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９は、Ｎ末端にアルギニンを有さないヒト化２１２０軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【０１９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０は、ヒト化２１２０重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【０１９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１は、ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇｌｍ３アロタイプ定常領域のアミノ酸配列である。
【０１９３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２は、ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇｌｍ３アロタイプ定常領域のアミノ酸配列である。
【０１９４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３は、ヒト化抗体２１２０バージョン３の成熟軽鎖領域（ＶＬ３＋軽鎖定常領域）のアミノ酸配列である。
【０１９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４は、ヒト化抗体２１２０バージョン５の成熟重鎖領域（ＶＨ５＋ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇｌｍ３アロタイプ定常領域）のアミノ酸配列である。
【０１９６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５は、ヒト化抗体２１２０バージョン５の成熟重鎖領域（ＶＨ５＋ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇｌｍ３アロタイプ定常領域）のアミノ酸配列である。
【０１９７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６は、ヒト化抗体２１２０バージョン５  Ｑ１Ｅの成熟重鎖領域（ＶＨ５．Ｑ１Ｅ＋ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇｌｍ３アロタイプ定常領域）のアミノ酸配列である。
【０１９８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７は、ヒト化抗体２１２０バージョン５  Ｑ１Ｅの成熟重鎖領域（ＶＨ５．Ｑ１Ｅ＋ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇｌｍ３アロタイプ定常領域）のアミノ酸配列である。
【０１９９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８は、ヒト化抗体２１０７バージョン４Ｂの成熟重鎖可変領域（ＶＨ４Ｂ）のアミノ酸配列である。
【０２００】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９は、ヒト化抗体２１０７バージョン５Ｂの成熟重鎖可変領域（ＶＨ５Ｂ）のアミノ酸配列である。
【０２０１】
定義
モノクローナル抗体は、典型的には単離された形態で提供される。これは、抗体が典型的には、製造または精製から生じたタンパク質および他の巨大分子の少なくとも５０％ｗ／ｗの純度であることを意味するが、モノクローナル抗体が過剰な医薬的に許容し得る担体（複数可）または使用を容易にする他のビヒクルと混和される可能性を排除するものではない。モノクローナル抗体は、製造または精製から生じたタンパク質および他の巨大分子の少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％ｗ／ｗの純度の場合もある。
【０２０２】
標的抗原へのモノクローナル抗体の特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的結合は、検出可能な程度により大きな規模であり、少なくとも１つの無関係な標的に生じる非特異的結合と識別可能である。特異的結合は、特定の官能基または特定の空間的嵌合（例えば、錠前と鍵のタイプ）の間の結合形成の結果であり得るが、非特異的結合は通常、ファンデルワールス力の結果である。しかし特異的結合は、必ずしも、モノクローナル抗体が１つの標的および唯一の標的に結合することを意味するわけではない。
【０２０３】
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）鎖および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、最初は開裂可能なシグナルペプチドに結合されて発現される。シグナルペプチドを含まない可変領域は、成熟可変領域と称される場合がある。したがって例えば軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定する。
【０２０４】
軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖の中で、可変領域と定常領域が、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により接続され、重鎖もまた約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む（概して、全ての目的で全体として参照により本明細書に組み入れられるＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｐａｕｌ，  Ｗ．，  ｅｄ．，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９，  Ｃｈ．  ７を参照されたい）。
【０２０５】
各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成している。したがってインタクト抗体は、２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体以外では、該２つの結合部位は、同一である。鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域により接続された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により整合されて、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ−末端からＣ−末端まで、軽鎖および重鎖の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り付けは、カバットのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ，  １９８７  ａｎｄ  １９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３  （１９８９）の定義に従う。カバットは、広範囲で用いられ番号付け規則（カバット番号付け）も提供しており、それによれば異なる重鎖間または異なる軽鎖間の対応する残基が同じ数を割り付けられる（例えば、Ｈ８３は、カバット番号付けでは成熟重鎖可変領域内の位置８３を意味し、同様に位置Ｌ３６は、カバット番号付けでは成熟軽鎖可変領域内の位置３６を意味する）。カバット番号付けは、他に明白な断りがなければ、抗体の可変領域内の位置の参照全体で用いられる。
【０２０６】
用語「抗体」は、インタクト抗体およびその抗原結合断片を包含する。典型的には断片は、インタクト抗体と競合し、別の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、ダイアボディ、Ｄａｂ、ナノボディ、およびＦｖをはじめとする標的への特異的結合のために得られる。断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクト免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により生成され得る。
【０２０７】
用語「抗体」はまた、二重特異性抗体、および／またはキメラ抗体、および／またはヒト化抗体を包含する。二重特異性または二官能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ７９：３１５−３２１  （１９９０）；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−５３  （１９９２））。幾つかの二重特異性抗体において、２つの異なる重／軽鎖対は、ヒト化重／軽鎖対、および異なるエピトープに特異的な重／軽鎖対を包含し得る。
【０２０８】
幾つかの二重特異性抗体において、１つの重鎖軽鎖対は、以下にさらに開示される通りヒト化抗体であり、該重軽鎖対は、血液脳関門で発現される受容体、例えばインスリン受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体、に結合する抗体のものである（Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ８８：４７７１−４７７５，  １９９１；  Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３７３−３７７，  １９９３）。そのような二重特異性抗体は、受容体を介したトランスサイトーシスにより血液脳関門を通過し得る。二重特異性抗体の脳取込みは、血液脳関門受容体への親和性を低下させるように二重特異性抗体を操作することにより、さらに増進され得る。該受容体への親和性を低下させると、脳内でのより広い分布が得られる（例えば、Ａｔｗａｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｍｅｄ．  ３，  ８４ｒａ４３，  ２０１１；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｍｅｄ．  ３，  ８４ｒａ４４，  ２０１１参照）。
【０２０９】
例示的な二重特異性抗体は、（１）各軽鎖および重鎖が短いペプチド結合を介して縦列になった２つの可変ドメインを含む二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  （２０１０）内の、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  （ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）；（２）２つの一本鎖ダイアボディが融合して、標的抗原の各々に対して２つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体になったタンダブ（Ｔａｎｄａｂ）；（３）ｓｃＦｖがダイアボディと組み合わさって、多価分子となったフレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）；（４）Ｆａｂに適用されると、異なるＦａｂ断片に結合した２つの同一のＦａｂ断片から成る三価二重特異性結合タンパクを生成し得る、プロテインキナーゼＡにおける「二量体化およびドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドックアンドロック」分子；（５）例えば、ヒトＦｃ領域の両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子、でもあり得る。二重特異性抗体の調製に有用なプラットホームの例としては、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＦｃａｂおよびＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃ操作ＩｇＧｌ（Ｘｅｎｃｏｒ）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく；Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１０】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸、または１つ以上のタンパクの三次折り畳みによって並置された不連続のアミノ酸から形成され得る。連続のアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への暴露の際に保持されるが、三次折り畳みで形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒での処理で失われる。エピトープは、典型的には空間的コンフォメーション内に少なくとも３つ、より通常には少なくとも５または８〜１０の独特のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法としては、例えばＸ線結晶学および二次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ．  （１９９６）を参照されたい。
【０２１１】
「アンタゴニスト」抗体または他の結合剤は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するものである。そのような抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害し得る。
【０２１２】
ＭＣＡＭに関する用語「生物学的活性」および「生物学的に活性の」は、リガンド（ラミニンα４鎖、例えばラミニン４１１のα４鎖）に特異的に結合し、そして／またはＣＮＳへのＭＣＡＭ発現細胞、例えばＴＨ１７細胞の浸潤を容易にする能力を指す。
【０２１３】
「阻害する」は、薬剤が少なくとも１つの標的、例えばＭＣＡＭの生物学的活性を低下させることを意味する。そのような阻害剤は、少なくとも１つの標的の活性を、少なくとも約２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％阻害する。
【０２１４】
「対象」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトまたは他の哺乳動物対象を包含する。
【０２１５】
アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的で、アミノ酸を次のように群分けする:群Ｉ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ;群ＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群ＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；群ＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；群Ｖ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および群ＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換には、同じ分類のアミノ酸の間の置換が含まれる。非保存的置換は、これらの分類の１つの要素を、他の分類の要素と交換することから成る。
【０２１６】
配列同一性％は、カバット番号付け規則によって、最大に整合される抗体配列で決定される。アライメントの後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が参照抗体の同じ領域と比較される場合、対象抗体領域と参照抗体領域との配列同一性％は、対象抗体領域と参照抗体領域の両方において同じアミノ酸が占める位置の数を、その２つの領域の整合させた位置のギャップを除外した総数で割り、１００を乗じて百分率に変換したものである。
【０２１７】
１つまたは複数の列挙された要素を「含む」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を含む組成物は、該抗体を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。
【０２１８】
値の範囲の指定には、その範囲に入る、またはその範囲を定義する全ての整数、およびその範囲内の整数により定義される全ての部分範囲が含まれる。
【０２１９】
文脈から他に明記されない限り、用語「約」は、述べられた値の測定標準誤差（ＳＥＭ）内の値を包含する。
【０２２０】
統計学的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。
【０２２１】
詳細な説明
Ｉ．概論
ラミニン４１１のラミニンα４鎖へのＭＣＡＭ結合を阻害するという有用な特性を有する抗体は、ＷＯ／２０１２／１７００７１号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３号に開示される。とりわけ本出願は、（ａ）２１２０．４．１９抗体の新しいヒト化形態を提供し、（ｂ）この抗体が結合するエピトープをマッピングし、（ｃ）同じエピトープに結合する抗体を提供し、そして（ｄ）開示された抗体の新しい配合剤を提供する。
【０２２２】
用語「２１２０．４．１９」、「ｍ２１２０」、「マウス２１２０」抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４に対応する成熟可変重鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０に対応する成熟可変軽鎖を有するげっ歯類由来モノクローナル抗体クローンを指す。「ヒト化２１２０」または「ｈｕ２１２０」は、２１２０．４．１９クローンのヒト化変異体を指す。
【０２２３】
ＩＩ．標的分子
天然ヒト野生型ＭＣＡＭ（ＣＤ１４６およびＭＵＣ１８としても公知のメラノーマ細胞接着分子）は、以下のアミノ酸配列を有する６４６アミノ酸のタンパク質である：
MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEKRTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYCELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKEGDRVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEASGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRGVVIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEITLPPSRKTELVVEVKSDKLPEEMGLLQGSSGDKRAPGDQGEKYIDLRH （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）。
（アクセッション番号ＡＡＡ２０９２２．１（ＣＡＡ４８３３２）の下でのＧｅｎＢａｎｋデータベース）。ＭＣＡＭは、脈管組織内の細胞間接続部の細胞接着および内皮単層結合に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面糖タンパク質である。それは、メラノーマおよび前立腺癌をはじめとする固形腫瘍などの多くの癌の腫瘍進行も促進する。それは、ホモタイプ／同種親和性の手法で相互作用することが知られており、他のリガンドとも結合し得る。ヒトＭＣＡＭは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２〜２６として示される５つの免疫グロブリンドメインを含む（１：アミノ酸残基１９〜１２９；２：アミノ酸残基１３９〜２４２；３：アミノ酸残基２４４〜３２１；４：アミノ酸残基３３５〜４２４；および５：アミノ酸残基４３０〜５１０）。
【０２２４】
文脈に他に明記されていなければ、ＭＣＡＭまたはその断片は、先に示された天然ヒト野生型アミノ酸配列およびそのヒト対立遺伝子変異体を包含する。
【０２２５】
ラミニンα４は、ほとんどの細胞および臓器のタンパク質網の基礎である基底板（基底膜の）で発現されるラミニン分子内で見出されるポリペプチド鎖の１つを指す。ラミニンは、形質膜分子を通して細胞膜に結合し、細胞接着に寄与することが公知である。ラミニンα−４鎖は、典型的にはラミニンβ鎖およびラミニンγ鎖と複合体を形成する。ラミニンα−４鎖は、ラミニン４１１（ラミニン８またはα４β１γ１）；ラミニン４２１（ラミニン９またはα４β２γ１）、およびラミニン４２３（ラミニン１４またはα４β２γ３）をはじめとする数多くのラミニン分子中で見出される。ヒトラミニンα４鎖には２つの主なアイソフォーム：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ００１０９８６７６およびＮＰ００１０９８６７７（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８）がある。「ラミニン４１１」は、３つのポリペプチドサブユニットまたは鎖：α４鎖、β１鎖およびγ１鎖で構成された三量体ポリペプチド複合体を指す。
【０２２６】
ＭＣＡＭに対するアンタゴニストとしては、抗体、ＩｇＧ定常領域への受容体またはリガンドの融合タンパク質、他の生物学的結合分子、および小分子が挙げられる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、非ヒト抗体、例えばマウスもしくはラット、非ヒト霊長類抗体であり得、またはヒト抗体でもあり得る。抗体は、キメラ、ベニヤ化、ヒト化、霊長類化などであり得る。
【０２２７】
ＭＣＡＭアンタゴニストは、（ｉ）リガンド：ラミニンα４鎖、例えばラミニン４１１のα４鎖に特異的に結合する、および／または（ｉｉ）ＭＣＡＭ発現細胞、例えばＴＨ１７細胞が対象の組織に浸潤または遊走するのを容易にする、というＭＣＡＭの能力を完全に、または部分的に阻害するアンタゴニストを指す。ＭＣＡＭアンタゴニストとしては、ＭＣＡＭに、またはそのリガンドであるラミニンα４に結合する抗体または他のアンタゴニストが挙げられる。
【０２２８】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．抗体２１２０．４．１９、ならびにそのキメラ、ベニヤ化、およびヒト化形態
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体からのＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列に移植されている、遺伝子操作された抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第６，４０７，２１３号、Ａｄａｉｒの米国特許第５，８５９，２０５  ６，８８１，５５７号、Ｆｏｏｔｅの米国特許第６，８８１，５５７号参照)。アクセプター抗体配列は、例えば成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖細胞系列領域配列であり得る。ヒトアクセプター抗体配列は、場合により多くの公知ヒト抗体配列の中から選択されて、ヒトアクセプター配列可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの高度の配列同一性（例えば、６５〜８５％の同一性）を提供することができる。したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体からの一部または全てのＣＤＲと、存在するならば完全にまたは実質的にヒト抗体配列からの可変領域フレームワーク配列および定常領域と、を有する抗体である。同様にヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖からの少なくとも１つ、２つ、そして通常は３つ全てのＣＤＲと、存在するならば実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列からの重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域配列と、を有する。同様にヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖からの少なくとも１つ、２つ、そして通常は３つ全てのＣＤＲと、存在するならば実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列からの軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域と、を有する。ナノボディおよびｄＡｂ以外では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ＣＤＲＨ１が最大２つの置換を有することができ、ＣＨＤＲＨ２が、位置Ｈ６０〜６５に置換を有することができることを除き、対応する残基（カバットによる定義）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が、各ＣＤＲの間で同一である場合には、ヒト化抗体内のＣＤＲは、実質的に非ヒト抗体内の対応するＣＤＲからのものである。カバットにより定義された対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が、同一である場合には、抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、実質的にそれぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域のものである。
【０２２９】
ヒト化抗体は、多くの場合、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全て（好ましくはカバットにより定義された通り）を組み込んでいるが、それらは、マウス抗体からのＣＤＲの全てよりも少ないＣＤＲ（例えば、少なくとも３、４、または５つのＣＤＲ）で作製することもできる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：３０７６，  ２００２；  Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３２０：  ４１５−４２８，  ２００２；  Ｉｗａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：１０７９−１０９１，  １９９９；  Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １６４：１４３２−１４４１，  ２０００）。
【０２３０】
幾つかの抗体において、ＣＤＲの一部のみ、即ちＳＤＲと称される、結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットが、ヒト化抗体内での結合を保持するのに必要となる。抗原と接触しておらずＳＤＲ内に存在しないＣＤＲ残基は、過去の研究に基づき、コチア超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  ＢｉｏＩ．  １９６：  ９０１，  １９８７）の外側に位置するカバットＣＤＲの領域から、分子モデリングおよび／もしくは経験により、またはＧｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１：  ８６３，  ２００４に記載される通り、同定することができる（例えば、ＣＤＲ  Ｈ２の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、多くの場合必要とならない）。１つまたは複数のドナーＣＤＲ残基が存在しないか、またはドナーＣＤＲ全体が除外された位置にあるそのようなヒト化抗体では、その位置を占有するアミノ酸は、アクセプター抗体配列内の対応する位置（カバット番号付けによる）を占有しているアミノ酸であり得る。含まれるＣＤＲ内のドナーアミノ酸に代わるアクセプターのそのような置換の数は、競合する事柄のバランスを反映する。そのような置換は、ヒト化抗体内のマウスアミノ酸の数を減少させ、その結果、潜在的な免疫原性を低下させる点で、潜在的に有利である。しかし、置換は親和性の変化を引き起こすことができ、好ましくは親和性の有意な低下が回避される。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸もまた、経験的に選択することができる。
【０２３１】
ＭＣＡＭに対する２１２０．４．１９ラット抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３号に開示されており、本明細書ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜８０により規定される。２１２０．４．１９抗体のキメラ、ベニヤ化、およびヒト化形態もまた、該７７３号出願で開示された。開示されたヒト化形態は、本明細書ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５〜１１９、１２１〜１２３、１３９〜１４１、および１５３として規定される。これらのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯにより表されるヒト化重鎖およびヒト化軽鎖の任意の並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む開示された形態を、医薬組成物および配合剤などの本発明の幾つかの態様において用いることができる。
【０２３２】
本出願は、グルタミンが重鎖可変領域（即ち、Ｑ１Ｅ）の位置１（カバット番号付け）の所でグルタミン酸に置換されている、２１２０．４．１９抗体の追加のヒト化形態を提供する。重鎖可変領域内のＱ１Ｅ置換は、抗体の結合特性に及ぼす実質的な影響を生じると予測されないが、抗体の安定性を改善し得る保存的置換である。
【０２３３】
他に明白な断りかなければ、以下の説明は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３号に開示されたヒト化抗体および本明細書に開示されたＱ１Ｅ変異体を包含する。
【０２３４】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８のカバットＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＳＮＧＶＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９のカバットＣＤＲ２：ＡＩＳＳＧＧＴＴＹＹＮＳＡＦＫＳ；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０のカバットＣＤＲ３：ＲＹＧＹＧＷＹＦＤＦを含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。幾つかの抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３のカバットＣＤＲ１：ＫＡＳＱＮＩＹＮＳＬＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のカバットＣＤＲ２：ＮＡＮＳＬＱＴ；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５のカバットＣＤＲ３：ＱＱＦＹＳＧＹＴを含む軽鎖可変領域を含む。幾つかのそのような抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８のカバットＣＤＲ１内にＮ３２Ｓ置換またはＮ３２Ｑ置換を含み、幾つかは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８のカバットＣＤＲ１内にＧ３３Ａ置換を含む。これらの置換は、抗体親和性および能力の増強をはじめとする改善された特徴を提供することが見出された。
【０２３５】
本発明は、該成熟重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、該成熟軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、抗ＭＣＡＭ抗体も提供する。幾つかのそのような抗体は、ドナー２１２０．４．１９抗体のＣＤＲ領域と完全にまたは実質的に同一である、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲを含む。同一でない場合、ＣＤＲは、好ましくは先の段落のような、本明細書で定義されたタイプおよび位置での置換を有する。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、コチア）により定義され得るが、好ましくはカバットにより定義された通りである。
【０２３６】
先に記載された抗体のいずれかは、ヒト化抗体であり得る。幾つかのヒト化抗体は、位置３２（カバット番号付け）がＮ、Ｓ、またはＱであり得、位置３３（カバット番号付け）がＧまたはＡであり得ることを除く、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１の３つのカバットＣＤＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６のＣＤＲと同一である）を含む成熟重鎖可変領域と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３の３つのカバットＣＤＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のＣＤＲと同一である）を含む成熟軽鎖可変領域と、を含み、好ましくは該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９０％同一であり、好ましくは該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９０％同一である。任意のそのような抗体は、カバット番号付けによる位置Ｈ１にＱまたはＥのいずれかを有することができる（即ち、Ｑ１Ｅ置換）。
【０２３７】
成熟重鎖可変領域内にＱ１Ｅ置換を有する本明細書で提供された抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６（即ち、２１２０．４．１９．Ｑ１Ｅ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域を含む抗体を包含する。幾つかのそのような抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と称されるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域を含む。該成熟重鎖および軽鎖可変領域は、任意の可能な並べ替えで組み合わせることができる。例示的組み合わせは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と称されるアミノ鎖配列を有する成熟軽鎖可変領域と、を含む抗体である。ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３号に記載されたようなＱ１Ｅ置換を有さないこれらの抗体の形態もまた、医薬組成物および配合剤などの本発明の幾つかの態様において用いることができる。
【０２３８】
本発明は、成熟重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６（即ち、２１２０．４．１９．Ｑ１Ｅ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、軽鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のいずれかに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、抗体をさらに提供する。そのような抗体は、好ましくはヒト化されている。任意のそのような抗体は、カバット番号付けによる位置Ｈ１にＱまたはＥのいずれかを有し得る（即ち、Ｑ１Ｅ置換）。
【０２３９】
開示されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの変異体は、典型的には少数（例えば、軽鎖もしくは重鎖成熟可変領域フレームワーク、またはその両方のいずれかにおいて典型的には１、２、３、５、または１０以下の）の置換、欠失または挿入により成熟重鎖および軽鎖可変領域配列と異なる。任意の変化は、好ましくは保存的置換である。
【０２４０】
Ｂ．定常領域の選択
キメラ、ベニヤ化またはヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に結合し得る。定常領域の選択は、一部として、抗体依存性の細胞を介した細胞傷害、抗体依存性細胞捕食、および／または補体依存性細胞傷害が望ましいかどうかに依存する。例えば、ヒト同位体ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、補体依存性細胞傷害を有し、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４はそれを有さない。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はまた、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも強い細胞媒介性エフェクター機能を誘導する。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。
【０２４１】
軽鎖および／または重鎖のアミノまたはカルボキシ末端の１つまたは複数のアミノ酸、例えば重鎖のＣ末端リジンが、分子の一部または全てにおいて欠損または誘導体化され得る。置換を定常領域で実施して、補体依存性細胞傷害もしくはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を低減もしくは増大すること (例えば、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏらの米国特許第５，８３４，５９７号;およびＬａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：４００５，２００６参照)、またはヒトにおける半減期を延長することができる(例えば、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４参照)。例示的な置換としては、抗体の半減期を増加させるための、位置２５０のＧｌｎおよび／または位置４２８（この段落において、定常領域にＥＵ番号付けを使用している)のＬｅｕが挙げられる。位置２３４、２３５、２３６および／または２３７のあらゆる位置での置換が、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低下させる(例えば、米国特許第６，６２４，８２１号参照)。ヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および２３７のアラニン置換を、エフェクター機能を低下させるために用いることができる。幾つかの抗体は、エフェクター機能を低下させるために、ヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および２３７にアラニン置換を有する。場合によりヒトＩｇＧ２の位置２３４、２３６および／または２３７はアラニンで置換され、位置２３５はグルタミンで置換される(例えば、米国特許第５，６２４，８２１号参照)。幾つかの抗体において、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる位置２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３２２、３２９、および３３１の１つまたは複数での突然変異が用いられる。幾つかの抗体において、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる位置３１８、３２０、および３２２の１つまたは複数での突然変異が用いられる。幾つかの抗体において、位置２３４および／もしくは２３５が、アラニンで置換されており、そして／または位置３２９が、グリシンで置換されている。位置２３４および２３５が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２などにおいてアラニンで置換されている。幾つかの抗体において、該アイソタイプは、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。例示的ヒト軽鎖κ定常領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８のアミノ酸配列を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８のＮ末端アルギニンを除外することができ、その場合、軽鎖κ定常領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９のアミノ酸配列を有する。例示的ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０のアミノ酸配列を有する（Ｃ末端リジンを有する、または有さない）。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体として、別の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖成熟可変ドメインと軽鎖成熟可変ドメインがスペーサーを介して結合された一本鎖抗体として、発現され得る。
【０２４２】
ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプ変異およびイソアロタイプ変異を示し、即ち定常領域は、異なる個体において１つまたは複数の多型位置で異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が１つまたは複数の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点で、アロタイプと異なる。したがって、例えば他の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１  Ｇ１ｍ３アロタイプであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１のアミノ酸配列を有する。別の重鎖定常領域は、Ｃ末端リジンを欠くことを除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１のアミノ酸配列を有する。別の重鎖定常領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２のアミノ酸配列を有する。さらに別の重鎖定常領域は、Ｃ末端リジンを欠くことを除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２のアミノ酸配列を有する。
【０２４３】
本発明は、先の定常領域のいずれかをコードする核酸を提供する。場合によりそのような核酸は、シグナルペプチドをさらにコードしており、定常領域に結合されたシグナルペプチドと共に発現され得る。
【０２４４】
Ｃ．組換え抗体の発現
抗体は、組換え発現によって産生することができる。抗体をコードする核酸は、所望の細胞型(例えば、ＣＨＯまたはＳｐ２／０)での発現のためにコドン最適化され得る。組換え核酸構築物は、典型的には自然に会合された、または異種プロモーター領域をはじめとする抗体鎖のコドン配列に操作可能に結合された発現制御配列を含む。発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能なベクターにおける真核生物プロモーター系であり得る。ベクターが適当な宿主に組み込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応抗体の回収および精製に適した条件下で保持される。抗体鎖をコードするベクターまたは複数のベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素などの選択可能な遺伝子も含み、抗体鎖をコードする核酸のコピー数を増幅させることができる。
【０２４５】
大腸菌は、抗体、特に抗体断片を発現するのに特に有用な原核宿主である。酵母などの微生物もまた、発現に有用である。サッカロマイセスは、発現制御配列、複製起点、終結配列などを所望通り有する適切なベクターを備えた酵母宿主の一例である。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素に由来するプロモーターが挙げられる。
【０２４６】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するために、使用され得る。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照されたい。インタクト異種タンパクを分泌することが可能な複数の適切な宿主細胞株が、当該技術分野において開発されており、それにはＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、Ｈｅｌａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳｐ２／０およびＮＳ０をはじめとする非抗体産生骨髄腫が挙げられる。非ヒト細胞を使用することが、有利になり得る。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））などの発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列などの必要な処理情報部位を含み得る。適切な発現制御配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
【０２４７】
抗体の重鎖および軽鎖をコードするベクター（複数可）を細胞培養物に導入したら、細胞プールを無血清培地における生産性および生成物の品質についてスクリーニングすることができる。その後、生産性が最高の細胞プールをＦＡＣＳに基づく単一細胞クローニングに供して、モノクローナル株を生成することができる。７．５ｇ／Ｌ培養物を超える生成物力価に相当する、５０または１００ｐｇ／細胞／日を超える比生産性が、有利になり得る。単一細胞クローンにより産生される抗体を、濁度、ろ過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰＭＣ−ＳＥＣ、炭水化物−オリゴ糖マッピング、質量分析、およびＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの結合アッセイについてテストすることもできる。その後、選択されたクローンを、後の使用のために、複数のバイアルに入れて蓄え、冷凍貯蔵することができる。
【０２４８】
発現されたら、抗体をプロテインＡ捕捉、カラムクロマトグラフィー(例えば、疎水性相互作用またはイオン交換)、ウイルス不活化のための低ｐＨなどをはじめとする当該技術分野の標準的手順に従って精製することができる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照）。
【０２４９】
コドン最適化、プロモーター、転写要素およびターミネーターの選択、無血清単一細胞クローニング、細胞バンキング、コピー数増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、無血清単一細胞クローニング、タンパク質力価の改善をはじめとする抗体の商業的生成の方法論（例えば、米国特許第５，７８６，４６４号、米国特許第５，８８８，８０９号、米国特許第６，０６３，５９８号、米国特許第６，１１４，１４８号、米国特許第７，５６９，３３９号、ＷＯ２００４／０５０８８４号、ＷＯ２００５／０１９４４２号、ＷＯ２００８／０１２１４２号、ＷＯ２００８／０１２１４２号、ＷＯ２００８／１０７３８８号、およびＷＯ２００９／０２７４７１号参照）。
【０２５０】
Ｄ．核酸
本発明は、上記の重鎖および軽鎖のいずれかをコードする核酸をさらに提供する。典型的には該核酸は、成熟重鎖および成熟軽鎖に融合したシグナルペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２、１６４、および１６６によりコードされ得るＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３、１６５、および１６７のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド）もコードする。核酸上のコード配列は、該コード配列の発現を確実にする制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどと操作可能に結合され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、単離形態で存在することができ、または１つもしくは複数のベクターにクローニングすることができる。該核酸は、例えば固相合成またはオーバーラップしたオリゴヌクレオチドのＰＣＲにより合成され得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸は、例えば発現ベクター内で、１つの連続する核酸として接続することができ、または別々に存在し、例えば、各々をそれ自体の発現ベクターにクローニングすることができる。
【０２５１】
Ｅ．抗体結合のためのＭＣＡＭエピトープの特徴づけおよびそれに結合する抗体の生成
１．抗体結合のためのＭＣＡＭエピトープ
本発明は、ヒトＭＣＡＭタンパク質内の特異的エピトープに結合し、一部が２１２０．４．１９（ｍ２１２０）と称される抗体と同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する、モノクローナル抗体を提供する。
【０２５２】
ＭＣＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の残基３９、６２、１３３、１４１、１５９、２１２、２２０、２２１、２２３、２２７、２３８、２４１、および／または３９２での突然変異は、ｍ２１２０の特異的結合を破壊する（例えば、実施例に記載された通り陽性対照の野生型ＭＣＡＭと比較して突然変異体ＭＣＡＭへの結合は３０％未満）。残基１４５、１６７、１７５、２０６、２０７、２１６、および２２５での突然変異は、ｍ２１２０の特異的結合の最大効果（低減）を有すると確認された。比較的少数の残基が結合に影響を及ぼし、該残基が典型的な直線性エピトープよりも広い間隔であることから（例えば、３〜２０の連続するアミノ酸）、これらの結果は、ｍ２１２０が立体配座エピトープに結合し得ること、さもなければ結合に影響を及ぼす残基の１つまたは複数が抗体と直接接触せずにそれをアロステリックに実施し得ることを示している。
【０２５３】
ＭＣＡＭの残基３９、６２、１３３、１４１、１４５、１５９、１６７、１７５、２０６、２０７、２１２、２１６、２２０、２２１、２２３、２２５、２２７、２３８、２４１、および３９２の１つまたは複数を含むエピトープ、特に残基１４１および１４５の１つまたは複数を含むエピトープに結合する抗体は、有用な阻害特性をｍ２１２０と共有する可能性がある。したがって、特異的結合がＭＣＡＭの残基１４１および１４５の１つまたは複数、特に残基１４１の突然変異により阻害される抗体は、ｍ２１２０と類似の特性を共有する可能性がある。幾つかのそのような抗体は、ＭＣＡＭの残基１４１および／または１４５を含む、またはそれからなるエピトープに結合する。該エピトープは、特定のアミノ酸（１４１および１４５）の一方もしくは両方を含むエピトープなど直線的であり得るか（例えば、２〜５、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、または５〜７０の連続するアミノ酸）、または該特製のアミノ酸の１つもしくは両方を含む、もしくはそれからなり立体構造的であり得る。
【０２５４】
２．特異的ＭＣＡＭエピトープに結合する抗体の作製
幾つかの抗体は、ｍ２１２０抗体と同じまたはオーバーラップするエピトープに結合する。ヒトＭＣＡＭに対する他の非ヒトモノクローナル抗体、例えばネズミ、モルモット、霊長類、ウサギもしくはラット抗体の生成は、例えば動物を、ヒトＭＣＡＭ、またはヒトＭＣＡＭもしくは所望のエピトープ（「免疫原」）を含むそのヒトＭＣＡＭ  ｃＤＮＡを提示するペプチド断片もしくは細胞株で免疫化すること（レトロウイルスによるコード化または遺伝子銃での免疫化）、および場合によりｍ２１２０と拮抗させて、ＭＣＡＭへの結合に関して得られた抗体をスクリーニングすること、により遂行され得る（全ての目的で参照により組み入れられるＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ，  １９８８）を参照）。場合により該免疫原は、担体分子にコンジュゲートされている。場合により該免疫原は、アジュバントと共に投与される。複数のタイプのアジュバントを、以下に記載される通り用いることができる。完全フロイントアジュバントを、そして次に不完全アジュバントが、実験動物の免疫化に好ましい。典型的にはウサギまたはモルモットが、ポリクローナル抗体を作製するのに用いられる。典型的にはマウスが、モノクローナル抗体を作製するのに用いられる。抗体は、ＭＣＡＭ内の所望のエピトープへの特異的結合に関してスクリーニングされる。
【０２５５】
本発明は、先に記載されたエピトープを対象とする抗体を作製するのに用いられるＭＣＡＭのペプチド断片を提供する。そのようなペプチドの例としては、２〜５、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、または５〜７０の連続するアミノ酸長で、ＭＣＡＭのアミノ酸残基１４１および１４５のうちの少なくとも１つを含むペプチドが挙げられる。これらのペプチドの幾つかにおいて、該ペプチドは、アミノ酸残基１４１および１４５の両方を含む。
【０２５６】
免疫原は、担体分子、典型的にはキャリアポリペプチドにコンジュゲートすることができ、従って該担体にコンジュゲートされた断片への免疫応答の誘発を支援し得る。単一の薬剤を単一の担体に結合させること、薬剤の複数のコピーを担体の複数のコピーに結合させ、それらを互いに結合させること、薬剤の複数のコピーを担体の単一コピーに結合させること、または薬剤の単一コピーを担体の複数のコピーもしくは異なる担体に結合させることが可能である。適切な担体としては、血清アルブミン、スカシガイヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、またはジフテリア（例えば、ＣＲＭ１９７）、大腸菌、コレラ、もしくはＨ．ピロリなどの他の病原菌由来の類毒素、または弱毒化された毒素誘導体が挙げられる。
【０２５７】
免疫原は多くの場合、医薬的に許容し得るアジュバントと共に投与される。該アジュバントは、該ペプチドが単独で用いられた状況に比較して、誘導された抗体の力価、および／または誘導された抗体の結合親和性を増大させる。様々なアジュバントを、ＭＣＡＭの免疫原性断片と併せて用いて、免疫応答を誘発することができる。好ましいアジュバントは、免疫原への本質的応答を増加させながら、該応答の性能形態に影響を及ぼす免疫原のコンフォメーション変化は誘起しない。例示的アジュバントとしては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））が挙げられる（英国特許第２２２０２１１号（現在はＣｏｒｉｘａの一部となっているモンタナ州ハミルトン所在のＣＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）参照）。Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１は、南アメリカ原産のキラジャ・サポナリア・モリナの樹皮から単離されたトリテルペングリコシドまたはサポニンである（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ内のＫｅｎｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，：    Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （編集：Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  １９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号参照）、（Ａｑｕｉｌａ  ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，  ＭＡ； 現在はニューヨーク州ニューヨーク所在のＡｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）。他のアジュバントは、場合により免疫刺激剤、例えばモノホスホリルリピドＡ（Ｓｔｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３６，  ８６−９１  （１９９７）参照）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリマー、および死菌マイコバクテリアと共に使用される、水中油エマルジョン（スクアレンまたはピーナッツ油など）である。別のアジュバントは、ＣｐＧ（ＷＯ９８／４０１００号）である。アジュバントを、治療組成物の成分として活性剤と共に投与することができ、または治療薬の投与前に、治療薬投与と同時に、もしくは治療薬の投与後に、別個に投与することができる。
【０２５８】
３．抗体の型
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、非ヒト、例えばマウスもしくはラット、非ヒト霊長類抗体であり得、またはヒト抗体であり得る。抗体は、キメラ、ベニヤ化、ヒト化、霊長類化などであり得る。
【０２５９】
モノクローナル抗体は、先に記載された方法、ならびにＱｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第６，４０７，２１３号、Ａｄａｉｒの米国特許第５，８５９，２０５号、同第６，８８１，５５７号；Ｆｏｏｔｅの米国特許第６，８８１，５５７号を利用してヒト化される。アクセプター抗体配列は、例えば成熟ヒト抗体可変領域配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体可変領域配列のコンセンサス配列（例えば、上掲のＫａｂａｔ，  １９９１の軽鎖および重鎖可変領域コンセンサス配列）、または生殖細胞系列可変領域配列であり得る。したがってヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体からの一部または全てのＣＤＲと、存在するならば完全にまたは実質的にヒト抗体配列からの可変領域フレームワーク配列および定常領域と、を有する抗体である。同様にヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖からの少なくとも１つ、２つ、そして通常は３つ全てのＣＤＲと、存在するならば実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列からの重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域配列と、を有する。同様にヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖からの少なくとも１つ、２つ、そして通常は３つ全てのＣＤＲと、存在するならば実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列からの軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域と、を有する。ナノボディおよびｄＡｂ以外では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。対応する残基（カバットによる定義）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が、各ＣＤＲの間で同一である場合には、ヒト化抗体内のＣＤＲは、実質的に非ヒト抗体内の対応するＣＤＲからのものである。カバットにより定義された対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が、同一である場合には、抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、実質的にそれぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域のものである。
【０２６０】
ヒト化抗体は、多くの場合、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全て（好ましくはカバットにより定義された通り）を組み込むが、それらは、マウス抗体からのＣＤＲの全てよりも少ないＣＤＲ（例えば、少なくとも３、４、または５つのＣＤＲ）で作製することもできる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：３０７６，  ２００２；  Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３２０：  ４１５−４２８，  ２００２；  Ｉｗａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：１０７９−１０９１，  １９９９；  Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １６４：１４３２−１４４１，  ２０００）。
【０２６１】
幾つかの抗体において、ＣＤＲの一部のみ、即ちＳＤＲと称される結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットが、ヒト化抗体内での結合を保持するのに必要となる。抗原と接触しておらずＳＤＲ内に存在しないＣＤＲ残基は、過去の研究に基づき、コチア超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  ＢｉｏＩ．  １９６：  ９０１，  １９８７）の外側に位置するカバットＣＤＲの領域から、分子モデリングおよび／もしくは経験により、またはＧｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１：  ８６３，  ２００４に記載される通り、同定することができる（例えば、ＣＤＲ  Ｈ２の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、多くの場合必要とならない）。１つまたは複数のドナーＣＤＲ残基が存在しないか、またはドナーＣＤＲ全体が除外された位置にあるそのようなヒト化抗体では、その位置を占有するアミノ酸は、アクセプター抗体配列内の（カバット番号付けによる）対応する位置を占有しているアミノ酸であり得る。含まれるＣＤＲ内のドナーアミノ酸のアクセプターのそのような置換の数は、競合する事柄のバランスを反映する。そのような置換は、ヒト化抗体内のマウスアミノ酸の数を減少させ、その結果、潜在的な免疫原性を低下させる点で、潜在的に有利である。しかし、置換は親和性の変化を引き起こすことができ、好ましくは親和性の有意な低下が回避される。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸も、経験的に選択することができる。
【０２６２】
ヒトアクセプター抗体配列は、場合により多くの公知ヒト抗体配列の中から選択されて、ヒトアクセプター配列可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの高度の配列同一性（例えば、６５〜８５％の同一性）を提供することができる。
【０２６３】
ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸は、ＣＤＲコンフォメーションおよび／または抗原への結合に及ぼす可能な影響に基づいて置換のために選択され得る。そのような可能な影響の研究は、モデリング、特定の位置にあるアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換もしくは突然変異誘発の影響の経験的観察による。
【０２６４】
例えばアミノ酸がネズミ可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合に、合理的には該アミノ酸が、
（１）抗原に非共有結合で直接結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）他の方法でＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å以内である）、
と予測されれば、ヒトフレームワークアミノ酸は、マウス抗体由来の同等のフレームワークアミノ酸により置換され得る。
【０２６５】
他の置換の候補は、その位置にあるヒト免疫グロブリンとしては異常であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の同等の位置にある、またはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置にあるアミノ酸と置換され得る。他の置換候補は、その位置にあるヒト免疫グロブリンとしては異常であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。
【０２６６】
本発明は、先に記載されたＭＣＡＭエピトープに特異的に結合する非ヒト抗体のキメラおよびベニヤ化形態をさらに提供する。
【０２６７】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域を、ヒト軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせた抗体である。そのような抗体は、マウス抗体の結合特異性を実質的または全体的に保持し、ヒト配列の約三分の二である。
【０２６８】
ベニヤ化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲの一部、そして通常は全てと、非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部と、を保持するが、ＢまたはＴ細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出された残基をヒト抗体配列の対応する位置にある残基と置き換えているヒト化抗体の一種である（Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８：４８９，  １９９１）。その結果、ＣＤＲが完全にまたは実質的に非ヒト抗体に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが、置換によってよりヒトと類似した抗体になる。
【０２６９】
ＭＣＡＭへのヒト抗体は、以下に記載された様々な技術により提供される。幾つかのヒト抗体は、拮抗結合実験により、先のＷｉｎｔｅｒのファージディスプレイ法により、また他の方法で実施例に記載されたマウスモノクローナルの１種などの特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように、選択される。ヒト抗体はまた、ＭＣＡＭの断片のみを標的抗原として用いることにより、そして／またはＭＣＡＭの欠失突然変異体のコレクションに対して抗体をスクリーニングすることにより、特定のエピトープ特異性に関してスクリーニングすることができる。
【０２７０】
ヒト抗体を生成する方法としては、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７  （１９８３）；  Ｏｅｓｔｂｅｒｇの米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎらの米国特許第４，６３４，６６６号のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子をはじめとするトランスジェニックマウスの使用 (例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ９３／１２２２７  （１９９３）；米国特許第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第５，７７０，４２９号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６３３，４２５号、同第  ５，６２５，１２６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、Ｎａｔｕｒｅ    １４８，  １５４７−１５５３  （１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８２６  （１９９６）、ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉのＷＯ９１／１０７４１号（１９９１）参照) およびファージディスプレイ法（例えば、ＤｏｗｅｒらのＷＯ９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＷＯ９２／０１０４７号、米国特許第５，８７７，２１８号、同第５，８７１，９０７号、同第５，８５８，６５７号、同第５，８３７，２４２号、同第５，７３３，７４３号および同第５，５６５，３３２号参照）が挙げられる。
【０２７１】
キメラ、ヒト化（ベニヤ化を含む）およびヒト抗体は、典型的には先に記載された通り組換え発現により生成される。
【０２７２】
本発明は、非抗体結合分子をさらに提供する。非抗体結合分子としては、例えばリガンド結合部位を形成する４つの超可変ループを支持するリジッドなβバレルを特徴とするタンパク質構造であるリポカリンスカフォールドに基づくアンチカリンが挙げられる。新規な結合特異性が、機能的提示および選択の誘導と併せたループ領域内の標的ランダム突然変異誘発により操作される（Ｓｋｅｒｒａ  （２００８）  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５：  ２６７７−２６８３）。他の適切なスカフォールドとしては、例えばヒトフィブロネクチンＩＩＩの１０番目の細胞外ドメインに基づくアドネクチンまたはモノボディ（Ｋｏｉｄｅ  ａｎｄ  Ｋｏｉｄｅ  （２００７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３５２：  ９５−１０９）；スタフィロコッカスのプロテインＡのＺドメインに基づくアフィボディ（Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５：  ２６６８−２６７６））；アンキリンリピートタンパク質に基づくＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｄｒｕｇ．  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  １３：  ６９５−７０１）； ヒトＦｙｎプロテインキナーゼのＳＨ３ドメインに基づくフィノマー（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：  ３１９６−３２０４）；スルフォロブス・アシドラリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｌａｒｉｕｓ）由来のＳａｃ７ｄに基づくアフィチン（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３８３：  １０５８−１０６８）；ヒトｙ−Ｂ−クリスタリンに基づくアフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７２：  １７２−１８５）；膜受容体タンパク質のＡドメインに基づくアビマー（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：  １５５６−１５６１）；システインリッチ・ノッティンペプチド（Ｋｏｌｍａｒ  （２００８）  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５：  ２６８４−２６９０）；および操作されたＫｕｎｉｔｚ型阻害剤（Ｎｉｘｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ  （２００６）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｄｅｖ．  ９：  ２６１−２６８）を挙げることができる。論評については、Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ  （２００９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １３：  ２４５−２５５を参照されたい。
【０２７３】
これらの抗体の幾つかにおいて、抗体は、完全にまたは実質的にＷＯ／２０１２／１７００７１号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３号内に記載された抗体、特にＷＯ／２０１２／１７００７１号内のクローン１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２〜２１により定義)およびクローン１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１０により定義）と称される抗体、ならびに１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、ならびに１７４９．１．３と称されるマウス抗ヒトＭＣＡＭモノクローナルクローン、ならびにＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３号に記載された２１２０．４．１９および２１０７．４．１０と称されるラット抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体クローンに由来するＣＤＲ（カバット、コチア、またはその複合により定義）を含む抗体のいずれか１つ、またはそれらの抗体ではない。
【０２７４】
４．抗体を活性についてスクリーニングする方法
本明細書に記載されたＭＣＡＭ抗体の阻害活性は、同じまたは実質的に類似したエピトープ（例えば、ｍ２１２０）と結合する抗体との拮抗結合アッセイ、およびＭＣＡＭとそのリガンドであるラミニン４１１のラミニンα４鎖との結合のブロックをはじめとする様々な方法によりアッセイすることができる。
【０２７５】
例えば、ＭＣＡＭとラミニン４１１のラミニンα４鎖との相互作用を阻害するＭＣＡＭ抗体の活性は、以下の通りスクリーニングすることができる。ＭＣＡＭ発現細胞を（ａ）候補抗体の存在下または非存在下で、ラミニンα４鎖、例えばラミニン４１１のα４鎖を含む組換えポリペプチドとインキュベートすること；（ｂ）例えば蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーにより、細胞へのラミニンα４の結合レベルをモニタリングすること；および（ｃ）ラミニンα４結合レベルが、候補抗体の非存在下よりも存在下で低い場合、前記候補抗体をＭＣＡＭ／ラミニンα４相互作用の阻害物質として同定すること、である。別のスクリーニングプロトコルは、候補抗体の存在下および非存在下で、ＭＣＡＭと共にインキュベートし得るラミニンα４鎖を発現する細胞の集団を使用すること、および細胞集団へのＭＣＡＭの結合をモニタリングすることを含む。候補抗体の存在下での細胞集団へのＭＣＡＭの結合が、非存在下よりも低い場合、候補抗体は、ＭＣＡＭアンタゴニストである。
【０２７６】
別のモニタリング方法としては、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）および酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がある。
【０２７７】
ＭＣＡＭによるそのリガンド、例えばラミニンα４鎖への結合を阻害する能力に基づいて同定されたＭＣＡＭアンタゴニストは、ＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする炎症状態の処置のための候補物質である。
【０２７８】
ＭＣＡＭ抗体の阻害活性を、インビボで評価することもできる。ＭＣＡＭ抗体の阻害活性を評価するための方法論の一例は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いる。ＥＡＥは、ヒトの多発性硬化症（ＭＳ）の症状と類似した症状を起こすように実験動物で生成された疾患である。例えば、Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ‘ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０６：  １９２０−１９２５  （２００９）を参照されたい。ＥＡＥは一般に、他の動物の中枢神経系とは異なるタンパク質、例えばミエリンに基づくタンパク質の抽出物および全体的な脊髄または脳組織、またはミエリンに特異的に反応するＴ細胞を、動物に注射することにより生成される。ＥＡＥは、ＭＳの再発または進行形態の経過後に用いられる。ＥＡＥは、ＭＳの治療薬を開発するため、そしてＭＳの特異的疾患のプロセスを研究するための、両方に向けた適切な動物モデルとして使用されてきた。例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  １２９：  １９５３−１９７１  （２００６）；およびＳｔｅｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ６０：  １２−２１  （２００６）を参照されたい。
【０２７９】
疾患進行に及ぼすＭＣＡＭブロックの影響が、ＴＨ１７分極をインビボで起こすＥＡＥの治療モデルで検査することができる。マウスをＰＬＰ  １３９−１５１ペプチドで免疫化して、ＥＡＥを誘導する。疾患が発症した後、マウスに候補の抗ＭＣＡＭ抗体またはアイソタイプ対照のいずれかを腹腔内処置し、その後、連日処置した。マウスを盲検で１日１回モニタリングしてスコア付けし、体重を２〜３日ごとに測定した。候補ＭＣＡＭ抗体で処置されたマウスにおける再発の遅延および症状重症度の有意な低下は、有効な候補抗体であることを示している。
【０２８０】
Ｆ．コンジュゲート化抗体
ＭＣＡＭに特異的に結合するコンジュゲート化抗体は、癌もしくは腫瘍細胞を破壊の標的にすること、または自己免疫疾患もしくは神経炎症性疾患に関与する細胞を標的にする際に有用になり得る。そのような抗体は、少なくとも一部がＭＣＡＭの発現に介される任意の疾患を標的とすることにも有用になり得る。例えばそのような抗体は、他の治療薬、他のタンパク質、他の抗体、および／または検出可能な標識でコンジュゲートされ得る。ＷＯ０３／０５７８３８号；米国特許第８，４５５，６２２号を参照されたい。そのような治療薬は、患者における不適切な状態または疾患、例えば自己免疫疾患、神経炎症性疾患、または癌を処置、克服、軽減、予防または改善するのに用いられ得る任意の薬剤であり得る。治療薬としては、細胞傷害薬、細胞増殖抑制剤、放射線治療薬、免疫調整剤、または抗体の活性を促進または増強する任意の生物学的活性剤を挙げることができる。細胞傷害薬は、細胞に有毒な任意の薬剤でもあり得る。細胞増殖抑制剤は、細胞増殖を阻害する任意の薬剤であり得る。免疫調整剤は、免疫応答の発生または維持を刺激または阻害する任意の薬剤であり得る。放射線治療薬は、放射線を発生する任意の分子または化合物であり得る。そのような治療薬が、ＭＣＡＭ特異性抗体、例えば本明細書に記載された抗体に連結されれば、連結された治療薬は、ＭＣＡＭ発現細胞（例えば、Ｔｈ１７発現細胞などの免疫細胞、または悪性メラニン形成細胞などの癌細胞）に対して、他の細胞を上回る特異的親和性を有するであろう。その結果、コンジュゲート化抗体の投与は、ＭＣＡＭ発現細胞を直接標的にし、他の周囲細胞および組織への影響が最小限である。これは、過度に毒性があるためにそれ自体は投与できない治療薬の場合、特に有用になり得る。加えて、より少量の治療薬を用いることができる
【０２８１】
抗体は、免疫毒性として働くように修飾され得る。例えば、米国特許第５，１９４，５９４号を参照されたい。例えば植物由来の細胞毒素であるリシンを、抗体のための二官能性試薬Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物およびリシンのためのスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートを用いることにより、抗体に連結することができる。Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８（１６）：４４６９−４４７６  （１９９８）を参照されたい。連結により、リシンのＢ鎖結合活性を損失するが、リシンのＡ鎖の毒性および抗体の活性のいずれも損傷しない。同様に、リボソーム集合体の阻害剤であるサポニンは、化学的に挿入されたスルフヒドリル基の間のジスルフィド結合を介して抗体に連結し得る。Ｐｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８：１２１５−１２２２  （２００４）を参照されたい。
【０２８２】
放射性同位体、例えばイットリウム９０（９０Ｙ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、放射性銀−１１１、放射性銀−１９９、およびビスマス２１３を、抗体に結合させることもできる。抗体への放射性同位体の結合は、従来の二官能基キレート化剤を用いて実施され得る。放射性銀−１１１および放射性銀−１９９の結合の場合、硫黄に基づくリンカーが用いられ得る。Ｈａｚｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２４−２５：１−７  （１９９４）を参照されたい。銀の放射性同位体の結合は、アスコルビン酸による免疫グロブリンの還元を含み得る。１１１Ｉｎおよび９０Ｙなどの放射性同位体の場合、イブリツモマブチウキセタンを用いることができ、それはそのような同位体と反応して、それぞれ１１１Ｉｎ−イブリツモマブチウキセタンおよび９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタンを形成することになる。Ｗｉｔｚｉｇ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ４８  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ９１−Ｓ９５  （２００１）を参照されたい。
【０２８３】
他の治療薬を、抗体に結合させることもできる。治療薬は通常、細胞傷害性または細胞増殖抑制性である。例えば抗体を、メイタンシン、ゲルダナマイシンなどの毒性化学療法薬、オーリスタチンなどの微小管阻害薬、またはカリケアマイシンンなどの副溝結合薬とコンジュゲートすることができる。他の代表的治療薬としては、自己免疫疾患、神経炎症性疾患もしくは癌の処置、管理、もしくは軽減、または自己免疫疾患、神経炎症性疾患もしくは癌の症状の処置、管理、もしくは軽減に有用であることが知られている薬剤が挙げられる。そのような治療薬の例は、本明細書の他の箇所に開示される。
【０２８４】
抗体は、他のタンパク質にも連結され得る。例えば抗体は、フィノマーと連結され得る。フィノマーは、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する小さな結合タンパク質（例えば、７ｋＤａ）である。それらは、安定していて可溶性であること、ならびにシステイン残基およびジスルフィド結合を欠くことができる。フィノマーは、抗体と同じ親和性および特異性で標的分子に結合するように操作され得る。それらは、抗体に基づく多重特異性融合タンパク質を作製するのに適している。例えばフィノマーは、抗体のＮ末端および／またはＣ末端に融合して、異なる構成の二重および三重特異性ＦｙｎｏｍＡｂを作製することができる。フィノマーは、最適な特性のフィノマーを効率的に選択させるＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ、および細胞アッセイを用い、スクリーニング技術を通してフィノマーライブラリーを利用して選択することができる。フィノマーの例は、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：３１９６−３２０４  （２００７）；  Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  ２０：５７−６８  （２００７）；  Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＡｂｓ．  ４：４９７−５０８  （２０１１）；  Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ６９（Ｐｔ６）：１１２４−１１３７  （２０１３）；およびＢｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  １３：２０３０−２０３９  （２０１４）に開示される。
【０２８５】
本明細書に開示される抗体は、１つまたは複数の他の抗体と連結またはコンジュゲートさせることもできる（例えば、抗体ヘテロコンジュゲートを形成させるため）。そのような他の抗体は、ＭＣＡＭ内の異なるエピトープに結合することができ、または異なる標的抗原に結合することができる。
【０２８６】
抗体は、検出可能な標識と連結させることもできる。そのような抗体は、例えば自己免疫疾患、神経炎症性疾患もしくは癌を診断するため、自己免疫疾患、神経炎症性疾患もしくは癌の進行をモニタリングするため、および／または処置の効能を評価するために、用いることができる。そのような抗体は、自己免疫疾患、神経炎症性疾患もしくは癌を有するもしくはそれに罹患し易い対象、またはそのような対象から得られた適切な生物学的試料において、そのような測定を実施するのに有用になり得る。抗体に連結または結合され得る代表的な検出可能な標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子団；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンなどの蛍光物質；ルミノールなどの発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生体発光物質；放射性銀−１１１、放射性銀−１９９、ビスマス２１３、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、 １７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどの放射性物質；様々なポジトロン断層法を用いるポジトロン発生金属；非放射性常磁金属イオン；ならびに放射線標識された、または特異的放射性同位体にコンジュゲートされた分子が挙げられる。
【０２８７】
治療薬、他のタンパク質、他の抗体、および／または検出可能な標識は、当該技術分野で公知の技術を利用して、ネズミ、キメラ、ベニヤ化、またはヒト化抗体に直接または中間体を通して間接的に、連結またはコンジュゲートされ得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）内のＡｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｐｐ．  ２４３−５６  （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８５）；  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）内のＨｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  ｐｐ．  ６２３−５３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  １９８７）；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）内のＴｈｏｒｐｅ，  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”  ｐｐ．  ４７５−５０６  （１９８５）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ.）内の“Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”  ｐｐ．  ３０３−１６  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）；およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ６２：１１９−５８  （１９８２）を参照されたい。適切なリンカーとしては、例えば切断可能なリンカーおよび切断可能でないリンカーが挙げられる。酸性もしくは還元条件下で、または特異的プロテアーゼへの暴露により、薬物を放出する異なるリンカーを用いることができる。同様に、酸性もしくは還元条件下で、特異的プロテアーゼへの暴露により、または他の定義された条件下で、連結された治療薬、タンパク質、抗体、および／または検出可能な標識を放出する異なるリンカーを用いることができる。
【０２８８】
ＩＶ．処置の方法
本明細書で開示された抗体または他のアンタゴニストはとりわけ、自己免疫疾患、神経炎症性疾患および癌を有する（例えば、ＤＳＭ-ＩＶ-ＴＲまたはＤＳＭ-Ｖの基準など測定業界で認識された基準を満たす）対象、または自己免疫疾患、神経炎症性疾患および癌の一般的集団に比較してリスクの高い対象を処置するため、またはその予防を実行するために用いることができる。高いリスクは、疾患に関連する１つもしくは複数の遺伝子学もしくは生化学的マーカー、または疾患と一致するが診断を確定するには不十分な１つもしくは複数の症状の存在から評価され得る。上述のカテゴリーまたは疾患は、必ずしも互いに排除せず、例えば多発性硬化症は、神経炎症または自己免疫として分類され得る。本発明の方法により処置され得る幾つかの特別な例示的疾患としては、多発性硬化症、パーキンソン病、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、炎症性腸疾患、クローン病、および癌、特にメラノーマなどの固形腫瘍が挙げられる。該方法の実践は、機序の理解に依存しないが、幾つかの方法において、抗体または他のアンタゴニストは、少なくとも一部として、Ｔ細胞（例えば、ＴＨ１７細胞）上で発現されるＭＣＡＭと、ラミニンα４鎖、例えば内皮細胞の表面で発現されるラミニン４１１のα４鎖との相互作用を阻害することにより機能すると考えられる。抗体−薬物コンジュゲートは、典型的には標的細胞内へ取り込まれた後、結合された薬剤の細胞傷害性または細胞増殖抑制性効果をはじめとするさらなる作用機序を有し得る。抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍関連のマクロファージ毒性も誘導し得る。
【０２８９】
神経炎症状態は、ＣＮＳ炎症および／または細胞／組織損傷を特徴とする。兆候としては、グリア活性化の増進、炎症促進性サイトカイン／ケモカインレベルの上昇（例えば、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１β）、血液脳関門透過性の上昇、および／またはＣＮＳへの免疫細胞（例えば、白血球）動員／侵入の増加を挙げることができる。神経炎症は多くの場合、免疫系の慢性的な細胞活性化（即ち、自己免疫関連の神経炎症）に関連して慢性的であるが、代わりまたは追加として急性エピソードを有し得る。
【０２９０】
多発性硬化症は、少なくとも４つのサブタイプのいずれかにおける処置に向けて改善可能な疾患である。再発寛解型ＭＳ（ＲＲ−ＭＳ）は、ＭＳの最も一般的形態であり、明確に規定された増悪／再発（急性発作）の後、部分的または完全な回復を特徴とする。再発期と再発期の間は疾患が進行しない。最初（診断の時点で）ＲＲ−ＭＳは、新たに診断された対象全体の約８５％を占める。体温上昇は無症候または古い病変を明らかにし得るため、再発の確定には、発熱または併発性疾病（「インフルエンザ」または尿管感染など）に関連しない、少なくとも２４時間存在する新たな症状または兆候が必要となる。
【０２９１】
一次性進行型（ＰＰ−ＭＳ）は、明確な再発を有さずに開始から連続的である。プラトー（安定期）も存在し得る。ＭＳ対象全ての１０〜１５％がこの群に入り、高齢者で生じる傾向がある。女性が約２：１で優占的である他の形態とは異なり、この群では女性と男性との比率が等しい。同じくＰＰ−ＭＳは、脳ＭＲＩ変化が少なく、ミエロパシー／脊髄関連変化がより多い傾向がある。
【０２９２】
二次性進行型（ＳＰ−ＭＳ）は、ＲＲ−ＭＳとして開始し、後の着実な進行が、再発を伴って、または再発を伴わずに起こる。再発寛解型対象のおよそ５０％は、二次性進行型に進行する。
【０２９３】
個体の約５％に起こる進行再発型（ＰＲ−ＭＳ）は、混合型再発（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ  ｒｅｌａｐｓｅｓ）（回復を伴う、または伴わない）の発病から進行性である。
【０２９４】
ＭＳの診断は通常、医療歴、神経学的検査および様々なテスト、例えば磁気共鳴造影（ＭＲＩ）、誘発電位（ＥＰ）および髄液分析に基づく。ＭＳの確定診断は、脳、脊髄および視神経を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の少なくとも２つの離れた領域にある損傷の証拠と、全ての他の可能な診断から少なくとも１ヶ月離れて起こった損傷およびその診断の排除の証拠と、を必要とする。当該技術分野で認識された基準によりＭＳの診断を有する対象を治療的に処置することだけでなく、本発明の方法を予防的に用いて個別に処置し、健常個体の一般的集団と比較してＭＳに進行するリスクの高い対象において少なくとも１つの兆候または症状を予防すること（ｐｌａｃｉｎｇ）もできる。例えば、該方法を用いて、最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）と称されるＭＳ様の症候群の１回の発作（再発または増悪とも呼ばれる）を有して引き続きＭＳを発症し得る、または発症し得ない個体を処置することができる。ＭＳを発症するリスクのある個体は、他の方法のうちでも血清中のタンパク質ＫＩＲ４．１への抗体の存在によっても同定され得る。
【０２９５】
神経炎症性疾患には、パーキンソン病もある。パーキンソン病の症状には、振戦（例えば、手、腕、脚、顎、および顔面の震え）；四肢および胴体の硬直またはこわばり；動作緩慢または運動緩徐；姿勢動揺または平衡機能および協調運動の障害；うつおよび他の情動変化；嚥下、咀嚼、および会話の困難；尿の問題または便秘；皮膚の問題；不眠がある。パーキンソン病は、そのような症状、ならびに／または他の疾患を除外する脳のスキャンおよび／もしくは他のテストから診断することができる。
【０２９６】
本発明の方法を用いて、癌の成長または転移を阻害することができる。癌は、造血系の悪性腫瘍または固形腫瘍、即ち過剰な細胞成長または増殖により生じた細胞塊で、前癌病変をはじめとする良性または悪性のいずれかであり得る。転移癌は、最初に発生した場所から体内の別の場所に広がった癌を指す。転移癌細胞により形成された腫瘍は、転移腫瘍または転移と呼ばれ、それは癌細胞が身体の別の部分に広がる工程を指すために用いられる用語でもある。一般に転移癌は、最初の、または原発性の癌と同じ名称および同じ型の癌細胞を有する。癌の例としては、メラノーマ、カルチノーマ、ブラストーマ、およびサルコーマが挙げられる。癌は、白血病などの血液の悪性腫瘍、またはリンパ腫などのリンパ系悪性腫瘍も挙げられる。そのような癌のより特別な例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸系癌をはじめとする胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、グリオーマ、グリオブラストーマ、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、精巣癌、および頭頸部癌が挙げられる。
【０２９７】
自己免疫性疾患としては、全身性自己免疫性疾患、臓器または組織特異性自己免疫性疾患、および自己免疫型発現を示す疾患が挙げられる。これらの疾患において、身体は、抗原の１つに対して細胞性および／または液性免疫応答を発して、抗原の破壊を誘導し、破滅的および／または致死的結末に至る可能性がある。細胞の応答が存在する場合、それはＢ細胞もしくはＴ細胞、またはその両方であり得る。インターロイキン（ＩＬ）−１７およびＩＬ−２２の産生を特徴とするＴヘルパー細胞系列であるＴｈ１７細胞が、組織に侵入して、ヒトの多発性硬化症およびマウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）をはじめとする病原性自己免疫応答を促進することが報告されている。例えば、Ｃｕａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：  ７４４−７４８  （２００３）；  Ｉｖｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １２６：  １１２１−１１３３  （２００６）を参照されたい。ＴＨ１７細胞は、組織への特異的動員および浸潤により炎症反応を開始または伝搬し得る。
【０２９８】
自己免疫性疾患の例としては、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性多腺性症候群、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、インスリン抵抗性糖尿病（２型糖尿病）、免疫性不妊、自己免疫性アジソン病、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、ヘルペス状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、白斑、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、スティフ・マン症候群、急性リウマチ熱、交感性眼炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、側頭動脈炎、ベーチェット病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、線維筋痛症、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎、高安動脈炎、脂肪織炎、類天疱瘡、原因不明の脈管炎、ＡＮＣＡ陰性の脈管炎、ＡＮＣＡ陽性の脈管炎、全身エリテマトーデス、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、全身性壊死性血管炎  ウェゲナー肉芽腫、ＣＲＥＳＴ症候群、リン脂質抗体症候群、シェーングレン症候群、好酸球性胃腸炎、非定型局所皮膚炎（ａｔｙｐｉｃａｌ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、心筋症、感染後症候群、感染後心内膜炎、セリアック病、多発性硬化症、サルコイドーシス、クローン病、および乾癬が挙げられる。
【０２９９】
抗体または他のアンタゴニストは、有効レジメンで投与され、これは開始を遅延させる、重症度を低下させる、さらなる増悪を阻害する、および／または処置される疾患（例えば、癌）の少なくとも１つの兆候もしくは症状を軽減する投与量、投与経路および投与頻度を意味する。患者が、障害を既に罹患している場合、レジメンは、治療有効レジメンと称することができる。患者が、一般的集団に比較して障害のリスクが高いが、まだ症状に見舞われていない場合、レジメンは予防有効レジメンと称することができる。幾つかの例において、治療または予防有効性は、病歴対象または同じ患者の過去の経験に比較して、各患者において観察することができる。他の例において、治療または予防有効性は、未処置患者の対照集団に比較して、処置患者集団において前臨床または臨床試験で実証することができる。
【０３００】
抗体の例示的投与量は、０．１〜２０、もしくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、０．５、１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇ)または固定投与量として１０〜１５００ｍｇである。投与量はとりわけ、患者の状態、およびもしあるならば事前の処置への応答、処置が予防か、または治療か、そして障害が急性か、または慢性かに依存する。
【０３０１】
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔または筋肉内であり得る。幾つかの抗体および幾つかの状況では、静脈内または皮下投与による全身循環への投与が好ましい。静脈内投与は、例えば３０〜９０分などの期間にわたる輸液によるものであり得る。
【０３０２】
投与頻度は、とりわけ、循環内の抗体の半減期、患者の状態および投与経路に依存する。該頻度は、患者の状態の変化または処置される障害の進行に応じて、１日１回、週１回、月１回、年４回、または不規則な間隔であり得る。静脈内投与の例示的頻度は、一連の処置の間に週１回および年４回であるが、より多い、または少ない頻度での投与も可能である。皮下投与の場合、例示的投与頻度は、１日１回〜月１回であるが、より多い、または少ない頻度での投与も可能である。
【０３０３】
投与される投与回数は、障害が急性であるか、または慢性であるか、そして処置に対する障害の応答に依存する。急性障害または慢性障害の急性増悪の場合、多くの場合、１〜１０回で十分である。場合により分割された形態での、単回ボーラス投与が、急性障害または慢性障害の急性増悪で十分となることもある。処置は、急性障害の再発または急性増悪の場合、反復することができる。慢性障害の場合、抗体を規則的間隔で、例えば週１回、２週間に1回、月１回、年４回、少なくとも１、５もしくは１０年間、または患者の一生にわたり６ヶ月ごと投与され得る。
【０３０４】
本明細書に開示された抗体または他のアンタゴニストでの処置は、処置される障害に対して効果的な別の処置と併用することができる。併用処置薬は、別個の投与に向けて配合させることができる。多発性硬化症の処置のためのさらなる治療薬としては、以下のものの１つまたは複数が挙げられる：テリフルノミド、インターフェロンβ−１α、インターフェロンβ−１ｂ、グラチラマー酢酸塩、フィンゴリモド、およびミトキサントロン、またはコルチコステロイド、例えばプレドニゾン、メチルプレドゾロン、もしくはデキサメタゾン。
【０３０５】
癌のさらなる治療薬としては、アルキル化剤、例えばカルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、およびシクロホスファミド；代謝拮抗薬、例えばフルオロウラシル、フロキシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサートおよびヒドロキシ尿素；植物アルカロイドおよび抗生物質をはじめとする天然産物、例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、マイオキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびＴａｘｏｌ（パクリタキセル）または関連化合物、例えばＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）；トポイソメラーゼ１阻害剤イリノテカン；テモゾロミドおよびＧｌｉａｄｅｌ（登録商標）、カルムスチン；チロシンキナーゼの阻害剤，例えばＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）（スニチニブリンゴ酸塩）、Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）およびＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）またはＩｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）；血管形成阻害剤；およびモノクローナル抗体、例えばＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）；または上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体への抗体、例えばＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）が挙げられる。
【０３０６】
パーキンソン病を処置するためのさらなる薬剤としては、レオパド、ベンザセリド、カルビドパ、ドパミンアゴンスト、非麦角系ドパミンアゴニスト、カテコール−Ｏ−メチル（「ＣＯＭＴ」）阻害剤、例えばエンタカペン（ｅｎｔａｃｏｐｏｎｅ）またはトルカポン（ｔｏｌｃｏｐｏｎｅ）、モノアミンオキシダーゼ（「ＭＡＯ」）阻害剤、例えばラサギリン（ｒａｓａｇａｌｉｎｅ）、アマンタジン、または抗コリン作動薬が挙げられる。
【０３０７】
Ｖ．配合剤
非経口投与用の医薬組成物は、好ましくは滅菌されており、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位投与剤型（即ち、一回の投与での投与量）で提供され得る。医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的および医薬的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤を用いて配合され得る。配合は、選択された投与経路に依存する。注射の場合、抗体は、水性溶液中に、好ましくは生理学的に適合性の緩衝剤、例えばハンクス液、リンガー液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝剤（注射部位での不快感を軽減するため）中に配合され得る。該溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤を含有し得る。あるいは抗体は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で溶解するために凍結乾燥形態であり得る。
【０３０８】
本発明は、本明細書に記載された抗体もしくは他のアンタゴニスト、緩衝剤、１つもしくは複数の糖および／またはポリオールならびに界面活性剤を含み、約５．５〜約７の範囲内のｐＨを有する配合剤を提供する。該配合剤は、液体形態または凍結乾燥形態での貯蔵用に調製され得る。凍結乾燥形態で貯蔵される場合、該配合剤は、液体（例えば、滅菌水）で、本明細書に記載された濃度および特性になるように再溶解され得る。凍結乾燥組成物が、特定の成分濃度およびｐＨの配合剤を作製するのに水を添加することにより再溶解可能とある場合、凍結乾燥配合剤は、単に水を添加することによりそのように再溶解され得ることを意味する（即ち、更なる量の成分を供給せず、またはｐＨを変化させる酸もしくは塩基を添加せず）。該凍結乾燥配合剤が凍結乾燥前（ｐｒｅｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の配合剤と同じ容量に再溶解される場合には、凍結乾燥前の液体配合剤の濃度および特性もまた、以下に記載されたものに従い得る。容量が異なる場合、配合剤の濃度は、比例して調整されなければならない。例えば再溶解される容量が凍結乾燥前の容量の半分である場合には、凍結乾燥前の配合剤中の成分濃度を、再溶解される配合剤中の濃度の半分にしなければならない。
【０３０９】
場合により抗体は、以下に記載される通り配合剤に再懸濁され、凍結乾燥前の貯蔵のために一時的に凍結され、凍結乾燥されて、凍結乾燥前と同じ濃度に水で再溶解される。そのような配合剤は、好ましくは凍結、凍結乾燥、貯蔵、および再溶解の間じゅう抗体を安定化させなければならず、加えて非経口投与に適していなければならない。例示的ワークフローにおいて、精製された抗体は、配合剤に約４０ｍｇ／ｍＬで再懸濁され、袋の中で−４０℃で凍結保存される。袋は、室温で３時間解凍され、内容物は、プールされる。配合剤は、０．２ミクロン滅菌フィルターで滅菌ろ過される。バイアルに配合剤５．４ｍＬを充填して、凍結乾燥する。凍結乾燥バイアルは、２〜８℃で貯蔵される。凍結乾燥バイアルは、滅菌水（例えば、配合剤に応じておよそ５．０〜５．４ｍＬ滅菌水）を添加することにより再溶解される。再溶解された生成物５ｍＬを、その後、患者への静脈内輸注のための通常の生理食塩水、乳酸加リンガー液、または５％デキストロース液などを２０〜１００ｍＬ含むＩＶバッグのポートに添加する。
【０３１０】
幾つかの配合剤は、増量剤を含み、それは糖／ポリオール成分と同じであっても、または同じでなくてもよい。典型的には該配合剤は、例えば０．２μｍまたは０．２２μｍフィルターを用いた滅菌ろ過により滅菌されている。該配合剤はまた、凍結および解凍に関して以下にさらに定義される通り、低レベル〜検出不能レベルの断片化および／または凝集により概ね安定している。別の配合剤でも、約４０℃で少なくとも３ヶ月置いた凍結乾燥ケーキの再溶解後に安定している。幾つかの配合剤において、約５％未満の抗体が、配合剤中に凝集物として存在する。
【０３１１】
幾つかの配合剤において、該抗体は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する。幾つかの配合剤において、該抗体は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する。幾つかの配合剤において、該抗体は、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する。例えば、該抗体は、約３５〜４５ｍｇ／ｍＬまたは約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。該抗体は、約５０ｍｇ／バイアル〜約５００ｍｇ／バイアル、またはそれを超える滅菌液体投与剤型で存在し得る。該抗体は、約４０ｍｇ／バイアル〜約５００ｍｇ／バイアルの凍結乾燥投与剤型で存在し得る。例えば該抗体は、約２５０ｍｇ〜約３５０ｍｇ／バイアルまたは約２００ｍｇ／バイアルの滅菌液体または凍結乾燥投与剤型で存在し得る。
【０３１２】
該配合剤は、本明細書に記載された抗体のいずれかを含み得る。幾つかの配合剤において、配合された抗体は、（ｉ）位置３２（カバットの番号付け）がＮ、Ｓ、またはＱであり得ること、および位置３３（カバットの番号付け）がＧまたはＡであり得ることを除き、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１の３つのカバットＣＤＲを含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１と少なくとも９０％同一である、成熟重鎖可変領域と、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３の３つのカバットＣＤＲを含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３と少なくとも９０％同一である、成熟軽鎖可変領域と、を含む抗体である。そのような配合剤において、該成熟重鎖可変領域の位置１（カバットの番号付け）は、Ｅによって占有され得る。幾つかの配合剤において、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する。例えば幾つかの配合剤において、該成熟重鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１のアミノ酸配列を有し、該成熟軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３のアミノ酸配列を有する。
【０３１３】
別の配合剤において、配合された抗体は、本明細書に記載の単離された抗ＭＣＡＭ抗体である。そのような配合剤において、該単離された抗ＭＣＡＭ抗体は、アミノ酸残基１４１を含むエピトープでヒトＭＣＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）に結合する。
【０３１４】
緩衝剤、例えばヒスチジン、コハク酸塩、およびクエン酸塩緩衝剤は、抗体に適したｐＨを実現するために開示された配合剤中で用いられる。幾つかの配合剤は、約５．５〜約７の範囲内のｐＨ、例えば５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０のｐＨを有する。幾つかの配合剤は、約５．５〜約６．５のｐＨを有する。幾つかの配合剤は、約６．０のｐＨを有し、他の配合剤は約６．５のｐＨを有する。幾つかの配合剤において、ヒスチジン緩衝剤は、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度、例えば約１５〜２５ｍＭまたは約２０ｍＭの濃度で存在する。
【０３１５】
配合剤に適した糖および／またはポリオールとしては、トレハロースおよびスクロース、またはその組み合わせが挙げられる。糖／ポリオールは、増量剤、凍結保護剤、および／または張度調整剤として働く。例えば幾つかの配合剤は、約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するトレハロース、または約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロースを含む。幾つかの配合剤は、約２２０ｍＭの濃度で存在するトレハロースを含む。別の配合剤は、約２２０ｍＭの濃度で存在するスクロースを含む。幾つかのそのような配合剤は、約２５０〜４００、３００〜４００、または３〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内、例えば２８７または２９５ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を特徴とする。
【０３１６】
配合剤は、界面活性剤を含有して、抗体の凝集および表面への吸収を減少させることができる。適切な界面活性剤としては、約０．００５〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０が挙げられる。ポリソルベート２０は、他の方法では抗体の配合在中に起こる凝集または混濁の著しい増加を防止する。ポリソルベート２０は、約０．０１％〜約０．０５％の範囲内の濃度で存在し得る。例えば該濃度は、０．００５％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、または０．０５％であり得る。あるいは幾つかの配合剤において、ポリソルベート２０は、約０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．１５ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．３５ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．４５ｇ／Ｌ、または０．５ｇ／Ｌの範囲内の濃度で存在する。幾つかの配合剤は、０．２ｇ／Ｌの濃度のポリソルベート２０を含む。
【０３１７】
例示的配合剤（液体、凍結乾燥前、または凍結乾燥後の再溶解）は、約５．５〜約７の範囲内のｐＨを特徴とし、（ａ）約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度の本明細書に記載された抗体；（ｂ）約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で存在するヒスチジン緩衝剤；（ｃ）約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するトレハロースおよび約２００ｍＭ〜約２６０ｍＭの範囲内の濃度で存在するスクロースから選択される１つまたは複数の糖およびポリオール（「糖／ポリオール」）；ならびに（ｄ）約０．００５〜約０．０５重量％の範囲内の濃度で存在するポリソルベート２０、を含む。一例において、該配合剤は、（ａ）本明細書に記載された任意の抗体；（ｂ）約２０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝剤；（ｃ）約２２０ｍＭの濃度のスクロース；（ｄ）約０．０２％の濃度のポリソルベート２０；および約６．０のｐＨ、を含み得る。別の例において、該配合剤は、（ａ）本明細書に記載された任意の抗体；（ｂ）約２０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝剤；（ｃ）約２２０ｍＭの濃度のトレハロース；（ｄ）約０．０２％の濃度のポリソルベート２０；および約６．５のｐＨ、を含み得る。
【０３１８】
幾つかの凍結乾燥配合剤は、（ａ）本明細書に記載された抗体；（ｂ）ヒスチジン緩衝剤；（ｃ）トレハロースまたはスクロース；および（ｄ）ポリソルベート２０を含む。該凍結乾燥配合剤は、約２００ｍｇの抗体を含み得る。幾つかの凍結乾燥配合剤は、滅菌水で再溶解することが可能である。幾つかの凍結乾燥配合剤は、１００〜３００または１５０〜２５０ｍｇの抗体、１０〜２０または１４〜１６ｍｇのヒスチジン、３００〜４５０または３５０〜４００ｍｇのスクロース、および０．５〜１．５ｍｇまたは０．７５〜１．２５ｍｇのポリソルベート２０を含む。他の凍結乾燥配合剤は、１００〜３００または１５０〜２５０ｍｇの抗体、１０〜２０または１４〜１６ｍｇのヒスチジン、３６０〜５００または４００〜４５０ｍｇの無水トレハロース、および０．５〜１．５ｍｇまたは０．７５〜１．２５ｍｇのポリソルベート２０を含む。
【０３１９】
例示的凍結乾燥配合剤は、２００ｍｇの抗体、１５．５ｍｇのヒスチジン、３７６ｍｇのスクロース、および１ｍｇのポリソルベート２０を含む。別の例示的凍結乾燥配合剤は、２００ｍｇの抗体、１５．５ｍｇのヒスチジン、４１６ｍｇの無水トレハロース、および１ｍｇのポリソルベート２０を含む。幾つかのそのような配合剤は、約５ｍＬの容量に再溶解され得る。他の凍結乾燥配合剤は、この段落に開示されたいずれか（例えば、４００ｍｇ抗体、３１ｍｇヒスチジン、７５２ｍｇスクロース、および２ｍｇポリソルベート２０）と同じ成分を同じ割合で、しかし異なる量で含む。
【０３２０】
凍結乾燥配合剤は、約３０〜５０または３５〜４５ｍｇ／ｍＬ、例えば約４０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度；（ｂ）約１０〜３０または１５〜２５ｍＭ、例えば約２０ｍＭの濃度で存在するヒスチジン緩衝剤；（ｃ）約１６０〜３３０または２００〜２６０ｍＭ、例えば約２２０ｍＭの濃度で存在するスクロースまたはトレハロース；（ｄ）約０．１〜約０．３または０．１５〜０．２５ｇ／Ｌ、例えば約０．２ｇ／Ｌの濃度で存在するポリソルベート２０、および（ｅ）約５．５〜６．５、例えば約６．０（スクロースが存在する場合）または６．５（トレハロースが存在する場合）のｐＨ、に再溶解され得る。
【０３２１】
液体または再溶解された凍結乾燥配合剤は、好ましくは実質的に等張であり、これは約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水のモル浸透圧濃度を示す。幾つかの配合剤は、２７０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有する。幾つかの配合剤は、約２８７または約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有する。液体または再溶解された凍結乾燥配合剤は、３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水よりも高張または低張（２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水未満）でもあり得る。
【０３２２】
記載された配合剤のいずれかは、本明細書の成分として記載されたもの以外の医薬賦形剤、担体などを用いずに生成することができる。該配合剤の特性に影響を及ぼさない他の成分がわずかな量で存在する場合には、そのような配合剤は、列挙された成分からなる、または本質的に列挙された成分からなると記載することができる。配合剤は、好ましくはヒトへの投与のために薬物の調製に関してＦＤＡにより認可された、または認可され得る適正製造基準（ＧＭＰ）の下で製造される。
【０３２３】
本発明は、３８℃〜４２℃で少なくとも約３０日間、少なくとも約３ヶ月間、またはより長期間、安定性を有する（例えば、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）による評価として）抗体配合剤を包含する。そのような配合剤はまた、２０℃〜２４℃で少なくとも約１年間、および／または２℃〜４℃で少なくとも３年間安定性を有し得る。凍結乾燥配合剤の安定性は、凍結乾燥状態での貯蔵に関して評価される。配合剤は、時間および温度のこれらの特定の組み合わせの１つまたは複数でインキュベーションした後に、低レベル〜検出不能なレベルの断片化および／または低レベル〜検出不能なレベルの凝集に関する以下の定義に適合する場合には、安定していると見なされる。より詳細には、開示された配合剤は、低レベル〜検出不能なレベルの抗体凝集および／もしくは断片化、または開始レベルを超える断片化および／もしくは凝集の低レベル〜検出不能なレベルの増進（例えば、約５％未満の凝集）を示す。低レベル〜検出不能なレベルの断片化を有する配合剤は、例えば、非分解抗体を表し、それぞれが５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または０．５％以下の総タンパク質を有する別の単一ピークを含まない、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより測定された単一ピーク、または還元キャピラリーゲル電気泳動（ｒＣＧＥ）による２つのピーク（一方は抗体重鎖および抗体軽鎖のそれぞれに対応する）の中に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の総タンパク質を含有する。低レベル〜検出不能なレベルの凝集を有する配合剤は、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）での測定で、タンパク質重量で約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、または約０．５％以下の凝集を含有する。例えば幾つかの配合剤において、該抗体の約５％未満が、凝集体として存在する。安定した配合剤はまた、例えば初期の測定可能な値の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％であるＥＬＩＳＡおよび／または更なる機能的アッセイにより測定可能な結合親和性を有する生物学的活性（複数可）の損失をほとんど、または全く示さない。
【０３２４】
ＶＩ．キット
本発明は、本明細書に開示されたＭＣＡＭ抗体または他のアンタゴニストと、関連の材料、例えば使用説明書（例えば、添付文書）と、を含むキット（例えば、容器）をさらに提供する。使用説明書は、例えばＭＣＡＭアンタゴニスト、および場合により１つまたは複数のさらなる薬剤の投与のための説明書を含み得る。ＭＣＡＭアンタゴニスト（複数可）の容器は、単位用量、バルク包装（例えば、反復投与用包装）、またはサブユニット用量（ｓｕｂ−ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅｓ）であり得る。
【０３２５】
添付文書は、表示、使用、投与量、投与、そのような治療製品の使用に関する禁忌および／または警告についての情報を含む治療製品の商業包装に慣例的に含まれた説明書を指す。
【０３２６】
キットは、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液などの医薬的に許容し得る緩衝剤を含む第二の容器も含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈液、フィルター、針、およびシリンジをはじめとする、商業的見地およびユーザーの見地から望ましい他の材料も含み得る。
【０３２７】
以上または以下に引用された全ての特許出願、ウェブサイト、他の発行物、アクセッション番号などは、個々の事柄が参照により組み入れられることを具体的かつ個別に示すのと同程度に、全ての目的で全体として参照により組み入れられる。異なるバージョンの配列が、異なる時間のアクセッション番号と関連づけられる場合、本出願の有効出願日のアクセッション番号に関連づけられたバージョンを意味する。該有効出願日は、実際の出願日、または適用可能ならばアクセッション番号を参照する優先権出願の出願日の早いほうを意味する。同様に、異なるバージョンの発行物、ウェブサイトなどが、異なる時間に発行された場合、他に断りがなければ、本出願の有効出願日の時点で最も新しく発行されたバージョンを意味する。他に具体的に示されない限り、本発明の任意の特色、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解のために、図示及び実施例により若干詳細に記載したが、特定の変更および修正を添付の特許請求の範囲の範囲内で実践し得ることは自明であろう。
【０３２８】
実施例
材料および方法
抗体の作製／特徴づけ
ネズミＭＣＡＭに結合可能な抗体の作製では、ＭＣＡＭ−Ｆｃを、ネズミＭＣＡＭの細胞外ドメインをヒトＩｇＧに融合することにより作製し、標準的技術を利用してＣＨＯ細胞内で生成させた。Ｌｏｕ／Ｍラットを、ＣＦＡ中のＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）１００μｇで免疫化した。ラットを、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中のＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）で２週間間隔で２回、追加免疫した。標準のプロトコルを利用して免疫化されたラットからハイブリドーマを作製し、クローンをＣｌｏｎｅｐｉｘにより選択した。ＣＨＯ細胞を全長ネズミＭＣＡＭ遺伝子でトランスフェクトし、ネオマイシンおよび標準の技術を用いて安定発現について選択した。親ＣＨＯ細胞（ＭＣＡＭ陰性）を、標準の技術を利用してカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で蛍光標識し、非標識ＭＣＡＭトランスフェクトＣＨＯ細胞と１：１比で混合した。ハイブリドーマ上清をこの細胞混合物と共に３０分間インキュベートし、潜在的なＭＣＡＭ特異性抗体の結合を、フローサイトメトリーにより蛍光標識された抗ラット二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ）で検出した。
【０３２９】
ＭＣＡＭ特異性抗体について陽性とスクリーニングされたハイブリドーマの上清を、蛍光標識されたマウスＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍＬ）と共に３０分間プレインキュベートした後、ラミニンα４発現細胞株ＷＭ２６６４に添加して、該細胞株へのＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質の結合の中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）をフローサイトメトリーにより測定した。
【０３３０】
ヒトＭＣＡＭへの結合が可能なラット抗体の作製については、ｈＭＣＡＭ−Ｆｃを、ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインをヒトＩｇＧに融合することにより作製し、標準的技術を利用してＣＨＯ細胞内で生成させた。Ｌｏｕ／Ｍラットを、ＣＦＡ中のｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）２５０μｇで免疫化した。ラットを、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中のｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）で２週間間隔で２回、追加免疫した。標準のプロトコルを利用して免疫化されたラットからハイブリドーマを作製し、クローンをＣｌｏｎｅｐｉｘにより選択した。ＣＨＯ細胞を全長ヒトＭＣＡＭ遺伝子でトランスフェクトし、ネオマイシンおよび標準の技術を用いて安定発現について選択した。親ＣＨＯ細胞（ＭＣＡＭ陰性）を、標準の技術を利用してカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で蛍光標識し、非標識ヒトＭＣＡＭトランスフェクトＣＨＯ細胞と１：１比で混合した。ハイブリドーマ上清をこの細胞混合物と共に３０分間インキュベートし、潜在的なＭＣＡＭ特異性抗体の結合を、フローサイトメトリーにより蛍光標識された抗ラット二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ）で検出した。
【０３３１】
ヒトＭＣＡＭへの結合が可能なマウス抗体の作製については、ｈＭＣＡＭ−Ｆｃを、ヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインをヒトＩｇＧに融合することにより作製し、標準的技術を利用してＣＨＯ細胞内で生成させた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＣＦＡ中のｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）５０μｇで免疫化した。マウスを、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中のｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）で２週間間隔で２回、追加免疫した。標準のプロトコルを利用して免疫化されたマウスからハイブリドーマを作製し、クローンをＣｌｏｎｅｐｉｘにより選択した。ＣＨＯ細胞を全長ヒトＭＣＡＭ遺伝子でトランスフェクトし、ネオマイシンおよび標準の技術を用いて安定発現について選択した。親ＣＨＯ細胞（ＭＣＡＭ陰性）を、標準の技術を利用してカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で蛍光標識し、非標識ヒトＭＣＡＭトランスフェクトＣＨＯ細胞と１：１比で混合した。ハイブリドーマ上清をこの細胞混合物と共に３０分間インキュベートし、潜在的なヒトＭＣＡＭ特異性抗体の結合を、フローサイトメトリーにより蛍光標識された抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ）で検出した。
【０３３２】
ヒトＭＣＡＭ特異性抗体について陽性とスクリーニングされたハイブリドーマの上清を、蛍光標識されたｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍＬ）と共に３０分間プレインキュベートした後、ラミニンα４発現細胞株ＷＭ２６６４に添加して、該細胞株へのｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質の結合の中和をフローサイトメトリーにより測定した。
【０３３３】
核酸およびタンパク質の操作
ＣＤＲの測定では、総ＲＮＡを、ＲＮＡｑｕｏｕｓ−４ＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてハイブリドーマ細胞から単離し、ｃＤＮＡ合成に用いた。第一および第二の鎖のｃＤＮＡを、得られたｄｓｃＤＮＡの５‘末端にライゲートされたｃＤＮＡアダプターを用いて、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から改変された方法を利用して合成した。特異的リバースプライマーを、重鎖および軽鎖の両方についての特異的抗体アイソタイプ定常領域配列に基づいて設計し、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたＶＬおよびＶＨ断片の両方のＰＣＲ増幅においてアダプタープライマーと共に用いた。増幅されたＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ヌクレオチド配列を決定した。同定されたクローンの配列を、ＶＬおよびＶＨの同一性％について比較した。
【０３３４】
上清中のＩＬ−１７濃度の測定では、ＥＬＩＳＡを、市販のキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。
【０３３５】
実施例１．抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体の作製
ヒトＭＣＡＭタンパク質を対象とするマウスおよびラットモノクローナル抗体を、先の材料および方法に記載された通り作製した。モノクローナル抗体とヒトＭＣＡＭとの特異的結合を、ヒトＭＣＡＭでトランスフェクトされた細胞に結合するモノクローナル抗体の能力を評価することにより確認した。このために、トランスフェクトされていない細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、非標識ヒトＭＣＡＭトランスフェクト細胞と混合した。それゆえ、トランスフェクトされていない細胞を識別することができた。
【０３３６】
これらの技術を利用して、８２３の独立したマウス融合クローンが単離され、ヒトＭＣＡＭへの結合が可能な抗体を発現することが示された。加えて、１５２の独立したラット融合クローンが単離され、ヒトＭＣＡＭへの結合が可能な抗体を発現することが示された。
【０３３７】
次に、抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体を用いて、リガンドへのヒトＭＣＡＭの結合をブロックする能力をテストした。ヒトＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍＬ）をアイソタイプ対照抗体または被験モノクローナル抗体１０μｇ／ｍＬと共にＰＢＳ中で３０分間プレインキュベートした。混合物を健常な脊髄組織切片に添加し、次に先の材料および方法に記載された通り蛍光顕微鏡測定により特徴づけた。さらに、ヒトＭＣＡＭ遺伝子でトランスフェクとされた親ＣＨＯ細胞（ＣＨＯＫ１）またはＣＨＯ細胞を、ＣＨＯ培地（ＤＭＥＭ）、組換えラミニン４１１（１０μｇ／ｍＬ）、または組換えラミニン５１１（即ち、ラミニン１０（α５β１γ１））（１０μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４５分間プレインキュベートした。細胞を洗浄し、ラミニン５１１ではなくラミニン４１１のＭＣＡＭへの特異的結合を、フローサイトメトリーにより全ラミニン抗体で検出した。ラミニンインキュベーションの前に、ヒトＭＣＡＭをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞と、抗ＭＣＡＭ抗体（２０μｇ／ｍＬ）とをプレインキュベートすることにより、ラミニン４１１へのヒトＭＣＡＭの結合を排除した。
【０３３８】
この技術を利用すると、先に記載された８２３の独立したマウス融合クローンのうちの８７、および１５２の独立したラット融合クローンのうちの２６が、ヒトＭＣＡＭタンパク質とそのリガンドであるラミニンのα４鎖との相互作用をブロックすることが可能な抗体を発現することが示された。
【０３３９】
実施例２．抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体のさらなる特徴づけ
（ｉ）ヒトＭＣＡＭに結合すること、および（ｉｉ）ヒトＭＣＡＭとラミニンのα４鎖との相互作用をブロックすること、が可能である先の実施例１に記載された８７の独立したマウス融合クローンおよび２６の独立したラット融合クローンを、以下の通りさらに特徴づけた。最初に、ラミニンのα鎖へのヒトＭＣＡＭの結合をブロックするモノクローナル抗体の能力に関するＩＣ５０定量を、以下のとおり測定した。ヒトＭＣＡＭを発現するＣＨＯ細胞を、抗ヒトＭＣＡＭ抗体（様々な濃度）と共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、未結合の抗体を洗い流し、細胞を２０μｇ／ｍＬの組換えヒトラミニン４１１と共に３７℃で４５分間インキュベートした。その後、未結合のラミニンを洗い流し、細胞表面に結合したラミニンを蛍光標識された抗ラミニン抗体で検出した。洗浄した後、表面に結合したラミニンの量をフローサイトメトリーにより検出して、ＩＣ５０を平均蛍光強度に基づいて計算した。
【０３４０】
先に記載されたアッセイを用いると、６つの独立した抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体クローンを、ヒトＭＣＡＭに結合すること、および細胞表面上で発現されるヒトＭＣＡＭとその結合リガンドであるヒトラミニン４１１との相互作用をブロックする最大能力を有すること、として同定した。これらの６つの抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体クローンは、本明細書において、（ｉ）マウス抗ヒトＭＣＡＭモノクローナルクローン１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、および１７４９．１．３、ならびに（ｉｉ）ラット抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体クローン２１２０．４．１９および２１０７．４．１０、と称される。これらの抗体の重鎖および軽鎖と、それらの超可変領域とのアミノ酸および核酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９〜９２に示される。より具体的には先のアッセイにおいて、モノクローナル抗体クローン１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９および２１０７．４．１０のＩＣ５０を、それぞれ０．４６９μｇ／ｍＬ、０．４３１μｇ／ｍＬ、０．３０７μｇ／ｍＬ、０．５４５μｇ／ｍＬ、０．８８８μｇ／ｍＬ、および０．２９０μｇ／ｍＬであると決定された。さらに、各モノクローナル抗体の特異的結合親和性を測定するために実施された実験から、それぞれが高い親和性でヒトＭＣＡＭタンパク質に結合し得ることが実証された（図示しない）。そのため、これらの特異的モノクローナル抗体のそれぞれは、ヒトＭＣＡＭに結合する能力、および細胞で発現されたヒトＭＣＡＭとそのα４ラミニン結合リガンドとの相互作用を阻害する能力が、非常に高かった。これに反して、２つの対照抗体である、非特異的ヒトＩｇＧ１抗体、および過去に記載されたＡＢＸ−ＭＡ１と称される完全なヒト抗ＭＣＡＭ抗体（例えば、Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２：５１０６  （２００２）、ならびに米国特許第６，９２４，３６０号、同第７，０６７，１３１号、および同第７，０９０，８４４号参照）は、両者ともヒトＭＣＡＭとそのラミニン４１１対象物との結合相互作用をブロックすることはできなかった。そのため、先に同定された６つの特異的モノクローナル抗体は、（ｉ）生存する細胞の表面のヒトＭＣＡＭに高い親和性で結合すること、および（ｉｉ）細胞で発現されたヒトＭＣＡＭとα４ラミニンポリペプチド鎖を含むラミニンタンパク質との相互作用をブロックすること、という両方の新規な能力を有する。
【０３４１】
実施例３．抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体のためのドメイン結合分析
ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析を用いて、モノクローナル抗体クローン１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９および２１０７．４．１０により認識され、結合されたヒトＭＣＡＭタンパク質上の抗原エピトープの位置を決定した。以下のプロトコルを用いた：ＦｏｒｔｅＢｉｏ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃバイオセンサーを用いて、全長ＭＣＡＭｈＦｃタンパク質を含む様々なＭＣＡＭｈＦｃドメインをバイオセンサー表面に固定した。これらのドメインまたは全長タンパク質への結合を検出するために、これらのセンサーを、ＭＣＡＭ特異性クローン１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９、または２１０７．４．１０抗体に浸漬した。これらの試料を黒色９６ウェルプレートにロードした後、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄを以下の通りプログラムした：ベースライン＃１で６０秒；様々なドメインをロードするために１８０秒；ベースライン＃２で６０秒；ドメインへの抗体の会合に１８０秒、そしてドメインからの抗体の解離に２４０秒。
用いられた試薬および供給量：
１．ＭＣＡＭｈＦｃ最終濃度＠５μｇ／ｍＬ
２．抗体クローン１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９および２１０７．４．１０クローン＠５μｇ／ｍＬ
３．速度実験のためのＦｏｒｔｅＢｉｏ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサー、カタログ番号１８−５０６０
４．Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅの黒色９６ウェルプレート、カタログ番号６５５２０９
５．ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ装置
６．２０％ＦＣＳを含む新しい組織培地ＤＭＥＭを、希釈用緩衝剤として用いた。
これらの分析の結果は、以下の通りである。
【０３４２】
モノクローナル抗体クローン１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、および１７４９．１．３は全て、ヒトＭＣＡＭタンパク質のアミノ酸２４４〜３２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）により具体的に規定されたヒトＭＣＡＭタンパク質のドメイン３に見出される抗原エピトープに結合することが示された。これらのモノクローナル抗体は、ヒトＭＣＡＭドメイン１（即ち、アミノ酸１９〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、ドメイン２（即ち、アミノ酸１３９〜２４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、またはドメイン１と２との組み合わせ（即ち、アミノ酸１９〜２４２）に結合することができなかった。こうしてモノクローナル抗体クローン１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、および１７４９．１．３は、ヒトＭＣＡＭタンパク質のドメイン３内に位置する新規な抗原エピトープを規定する。
【０３４３】
モノクローナル抗体クローン２１２０．４．１９および２１０７．４．１０は、それぞれヒトＭＣＡＭドメイン１（即ち、アミノ酸１９〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）と、ドメイン２（即ち、アミノ酸１３９〜２４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）との組み合わせにより規定された抗原エピトープに結合することが示された。これらの２つのモノクローナル抗体のいずれも、それ自体はヒトＭＣＡＭドメインに結合しなかった。したがってモノクローナル抗体クローン２１２０．４．１９および２１０７．４．１０は、ヒトＭＣＡＭタンパク質ドメイン１および２の両方の存在により決定された新規な抗体エピトープを規定する。
【０３４４】
先の事柄とは逆に、過去に記載された完全なヒト抗ＭＣＡＭ抗体ＡＢＸ−ＭＡ１は、先に記載されたもの、即ちヒトＭＣＡＭドメイン１のみを完全に規定し、その中に含まれる抗原エピトープ、とは異なる抗原エピトープに結合する。
【０３４５】
これらの結果を考慮すると、モノクローナル抗体クローン１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９および２１０７．４．１０のそれぞれは、（ｉ）ヒトＭＣＡＭに結合すること、および（ｉｉ）ヒトＭＣＡＭとα４ラミニン含有タンパク質との相互作用をブロックすること、の両方が可能であるが、ＡＢＸ−ＭＡ１抗体は、ヒトＭＣＡＭへの結合のみ可能で、ヒトＭＣＡＭとα４ラミニン含有タンパク質との相互作用をブロックすることができないため、これらの結果から、ヒトＭＣＡＭドメイン２、ヒトＭＣＡＭドメイン３、およびそれらの組み合わせが、α４ラミニン鎖との結合相互作用において役割を担うことが実証される。これを考慮すると、ヒトＭＣＡＭドメイン２、ヒトＭＣＡＭドメイン３、および／またはそれらの組み合わせがヒトＭＣＡＭとα４ラミニンとの相互作用をブロックすることが可能な薬剤としての用途を見出し、それによりその相互作用から得られる本明細書に記載の様々な結果を阻害するための用途を見出すことが明らかである。逆に、ヒトＭＣＡＭドメイン１によってのみ規定された抗原エピトープに結合する抗体（本明細書に記載されたＡＢＸ−ＭＡ１抗体など）は、ＭＣＡＭ／α４ラミニン相互作用およびその様々な下流の生物学的結果をブロックするのに有用ではない。
【０３４６】
実施例４．ショットガン式突然変異誘発エピトープマッピング
抗ＭＣＡＭ抗体結合に関して該当する様々なアミノ酸残基を、ショットガン式突然変異誘発と、真核細胞内で変異された標的タンパク質の大きなライブラリーの発現および分析を可能にするハイスループット細胞発現技術と、を利用して同定した。ヒトＭＣＡＭタンパク質内での各残基を、個別にアラニンまたは他の特定の残基に変異させて、機能の変化をアッセイした。タンパク質は、標準の哺乳動物細胞株の中で発現させた。
【０３４７】
表１は、ショットガン式突然変異誘発ライブラリーを作製するのに用いられた試薬および方法の概要を示す。
【表１】
2017510567.tif 000003
【０３４８】
全長ヒトＭＣＡＭを、哺乳動物の高発現ベクター内にコドン最適化、合成およびサブクローニングすることに成功した。この親構築物を、その後、配列確認し、免疫検出法により哺乳動物細胞発現について検証した。
【０３４９】
免疫蛍光法によりＭＣＡＭに結合した２１２０４．１９抗体およびマウス血清の検出を、ハイスループットショットガン式突然変異誘発形式に向けて最適化することに成功した。各一次抗体の系列希釈物を、３８４ウェル形式で単一希釈の二次抗体と共にテストした。抗体を、ヒトＭＣＡＭを発現する２９３ＴおよびＢＨＫ細胞の検出に関してテストした。最適なアッセイ条件を、完全な突然変異ライブラリーをスクリーニングするように選択した。
【０３５０】
５４５のクローン（５３６のうちの５２８のアラニン突然変異体および１７のうちの１７の部位特異的突然変異体）からなり、各クローンがアラニンへ（アラニン残基はセリンに置換されいる）または特定の残基への単一残基置換を有する、ＭＣＡＭ突然変異ライブラリーを作製して、配列確認した。残基３５、６６、１６１、２６１、３４２、３８０、４１４、および４３５は、ライブラリー内に表されていない。突然変異ライブラリーを、マウス血清への結合に関する免疫検出により、三重測定でスクリーニングした。これにより、核突然変異体クローンについて細胞表面発現を検証した。
【０３５１】
複数回の最適化を実施して、マッピングに適した条件を決定した。以下の変数を評価した：複数のラミニン濃度および抗ラミニン二次抗体濃度、非特異的結合を減少させるための様々なブロッキング緩衝剤、複数の細胞型、ならびに複数の洗浄ステップ。
【０３５２】
突然変異ライブラリーを、２１２０．４．１９抗体への結合に関する免疫検出により三重測定でスクリーニングした。反応性を各突然変異体で定量して、結合損失を示す点突然変異体を同定した。
【０３５３】
モノクローナル抗体および血清の反応性を、各突然変異体クローンについて定量して、表面発現に影響を及ぼさずに結合の損失を示す点突然変異体を同定した。各抗体の重要な残基を、各突然変異体クローンの血清結合プロファイルに対する、モノクローナル抗体結合プロファイルの比較により同定した。
【０３５４】
ＢＨＫ細胞を、３８４ウェル形式で野生型（ＷＴ）ＭＣＡＭまたはベクター単独のいずれか単独でトランスフェクトし、次に免疫検出した。各抗体の系列希釈（４μｇ／ｍｌで開始）を、ＷＴまたはベクター単独に対する免疫反応性についてテストした（表２）。各ポイントは、四重測定の平均を表す。
【表２】
2017510567.tif 000004
【０３５５】
２１２０．４．１９およびマウス血清の免疫検出およびエピトープマッピングのための最適なスクリーニング条件を決定した。これらの条件を利用すると、各抗体から、ロバストなシグナル、高いシグナル／バックグランド比、および多重測定間の低い変動性が実証された。これらのデータから、これらの条件がハイスループットなエピトープマッピングの成功に適することが示される。２１２０．４．１９での最終的なスクリーニング濃度０．２５μｇ／ｍＬおよびマウス血清の１：８００希釈が用いられた。Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから得られた二次抗体を、２１２０．４．１９および血清の検出のために１：４００で使用した。表３は、ハイスループットな免疫検出に最適化された実験パラメータを示す。
【表３】
2017510567.tif 000005
【０３５６】
突然変異ライブラリーを、表面発現（マウス血清結合）およびモノクローナル抗体結合について、三重測定でアッセイした。各生データのポイントは、バックグランドが差し引かれて、野生型ＭＣＡＭ反応性の値に標準化された。結果を図１に示す。２１２０．４．１９の平均モノクローナル抗体結合値を、平均表面発現値の関数としてプロットした（図１、灰色の菱形）。３０％未満のモノクローナル抗体反応性、および５０％を超えるマウス血清結合の閾値を適用して、モノクローナル抗体結合については陰性であるが表面発現については陽性であるクローン（図１、黒色の菱形）を同定した。
【０３５７】
各クローンの平均モノクローナル抗体反応性を表面発現全体（平均血清反応性）に比較して評価することにより、２１２０．４．１９の重要な残基を同定した（表４）。抗体結合に関与する残基を、モノクローナル抗体結合については陰性であるが（ＷＴの３０％未満）表面発現については陽性である（ＷＴの５０％を超える）ものとして同定した。平均反応性（および標準偏差）を、各重要な残基について示す。
【表４】
2017510567.tif 000006
【０３５８】
ショットガン式突然変異誘発マッピングにより同定された重要なアミノ酸から、２１２０．４．１９抗体のための結合部位が示唆される。データから、２１２０．４．１９が主として第二のＩｇＧドメインに結合しながらコンフォメーションとして複雑なエピトープに結合することが示される。
【０３５９】
重要な残基は、第二および／または第三のＩｇドメインのジスルフィド結合により寄与された構造安定性大きく依存すると思われる。２１２０．４．１９への結合は、第二のＩｇドメインのジスルフィド結合されたシステイン１６１および２２３の一方または両方を含む重要な残基の集団によって支援される。
【０３６０】
実施例５．抗体およびラミニン結合のための確認的ＭＣＡＭエピトープマッピング
ヒトＭＣＡＭ上の２１２０．４．１９の結合部位を同定するために、ヒトＭＣＡＭ  Ｉｇ１およびＩｇ２の相同性モデルを、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｍａｅｓｔｒｏを用いることによりヒトＢＣＡＭ  Ｉｇ１およびＩｇ２モデルで構築した（図２Ａ）。構造情報およびショットガン式突然変異誘発情報に基づく２０の点突然変異体を設計し、作製した。これらの突然変異体を哺乳動物細胞上で提示し、ＦＡＣＳを利用してＭＣＡＭ突然変異体への２１２０．４．１９およびラミニンα４の結合をテストした。３つのＭＣＡＭ単一突然変異体Ｉ１４１Ａ、Ｄ２１６ＡおよびＹ３１８Ａから、ラミニンα４結合の完全な損失が実証された。Ｉ１４１Ａから、２１２０．４．１９結合の完全な損失が実証され、Ｐ４５Ｖから、２１２０．４．１９結合の有意な損失が実証された。
【０３６１】
データをさらに確認するために、それぞれＩ１４１Ａ、Ｉ１４５Ｖ、Ｄ２１６ＡおよびＹ３１８Ａを発現する安定した細胞株を作製した。ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイを、先に記載された通り精製されたタンパク質で実施した。対照ＡＢＸ−ＭＡ１抗体は、野生型ＭＣＡＭおよびＭＣＡＭ突然変異体に結合した。２１２０．４．１９は、ＭＣＡＭ  Ｉ１４１Ａ突然変異体への有意な結合を示さなかった。加えて、２１２０．４．１９は、それぞれＭＣＡＭ  Ｐ１４５ＶおよびＤ２１６Ａへの結合の大きな低減を実証した。同じくＭＣＡＭ突然変異体Ｐ１４５Ｖへの２１２０．４．１９の結合が急速な解離定数（Ｋ  ｏｆｆ）を実証した。
【０３６２】
実施例６．ヒト化抗ＭＣＡＭ２１２０抗体の作製
様々なヒト化抗ＭＣＡＭ抗体を、以下のプロトコルに従って作製した。最初、可変領域の三次元分子モデルを、ＪＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ所有のアルゴリズムを利用して構築した。次に、ＣＤＲ構造の形成に重要で、抗原への結合に必須であるフレームワークアミノ酸残基を、分子モデルを用いて同定した。並行して、それぞれＶＨおよびＶＬアミノ酸配列への高い相同性を有するｃＤＮＡ由来ヒトＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を、選択した。最後に、ＣＤＲ配列を、ＣＤＲ構造または抗原結合に重要なフレームワークアミノ酸残基と共に、ＶＨおよびＶＬから対応する選択されたヒトフレームワーク配列内へ移植した。
【０３６３】
図３は、様々な２１２０重鎖および軽鎖配列のアライメントを表す。残基の番号付けは、加バット番号付けに従っている。ＣＤＲ情報および抗原結合に関与するフレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基への異なる突然変異を、抗体のバージョンに応じて同定した。
【０３６４】
２１２０抗体の例示的突然変異を図３Ａ（ＣＤＲ−Ｈ１（Ｓ３０Ｔ内、ＣＤＲ−Ｈ１とＣＤＲ−Ｈ２の間（Ｉ１３７ＶおよびＬ４８Ｉ）、およびＣＤＲ−Ｈ２とＣＤＲ−Ｈ３の間（Ｋ７１Ｒ）にある枠で囲まれた残基は、ＣＤＲの接触に影響を及ぼし、Ｓ３０Ｔ、Ｉ３７Ｖ、Ｌ４８Ｉ、およびＫ７１Ｒ突然変異は、ＣＤＲ−Ｈ２後のさらなる突然変異（Ｔ６８Ｓ）と一緒になって、ＣＤＲの接触に影響を及ぼす）、および図３Ｂに示す（ＣＤＲ−Ｌ１とＣＤＲ−Ｌ２の間（Ｌ４６ＶおよびＹ４９Ｆ）およびＣＤＲ−Ｌ２とＣＤＲ−Ｌ３の間（Ｖ５８Ｉ）の枠で囲まれた残基が、ＣＤＲ接触に影響を及ぼし、ＣＤＲ−Ｌ１とＣＤＲ−Ｌ２の間（Ｌ４６ＶおよびＹ４９Ｆ）の枠で囲まれた残基が、ＣＤＲの接触に影響を及ぼし、Ｌ４６Ｖ、Ｙ４９ＦおよびＶ５８Ｉ突然変異が、ＣＤＲ−Ｌ１の前のさらなる突然変異（Ｔ２２Ｎ）と一緒になって、抗体／抗原相互作用に影響を及ぼす）。
【０３６５】
各鎖の複数のバージョンを設計した（標準ｖｓ積極的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）または保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ））。Ｎ−脱アミド化モチーフ（ＮＧ）を含むそれらの抗体では、アスパラギンまたはグリシンへの突然変異を、標準のバージョンに導入した。様々なヒト化Ｖ領域を、異種シグナル配列で合成し、ヒトＣＫ（ＶＬ）またはヒトＩｇＧ１（ＶＨ）を含む発現ベクターにクローニングした。
【０３６６】
重鎖および軽鎖プラスミドを、製造業者のプロトコルに従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。発現された抗体を、プロテインＡ  ＰｈｙＴｉｐカラム（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）で精製して、ＯＤ２８０で定量した。
【０３６７】
ヒト化抗体の見かけの親和性を、以下のプロコルに従って拮抗ＥＩＳＡで親げっ歯類またはキメラ抗体と比較した。
【０３６８】
ＥＬＩＳＡプレートを、組換えｈＭＣＡＭ−Ｈｉｓでコーティングして、カゼイン緩衝剤でブロックし、非特異的結合を防止した。ビオチン化されたげっ歯類またはキメラ抗体を、３倍上昇濃度の非標識拮抗物質（ヒト化抗体、げっ歯類、またはキメラ）の存在下、または非存在下で、飽和に満たない濃度で添加した。洗浄して未結合の抗体を除去した後、ストレプトアビジンＨＲＰを添加して、ビオチン化抗体を検出した。ＥＬＩＳＡをＴＭＢ基質で発色させて、ＯＤ４５０で測定した。非標識拮抗物質のＩＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウエアを用いて測定した。
【０３６９】
表５は、ヒト化配列の設計を要約している。
【表５】
2017510567.tif 000007
【０３７０】
重鎖および軽鎖プラスミドを、製造業者のプロトコルに従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。発現された抗体を、プロテインＡ  ＰｈｙＴｉｐカラム（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）で精製して、ＯＤ２８０で定量した。
【０３７１】
ヒト化抗体の見かけの親和性を、以下のプロコルに従って拮抗ＥＩＳＡで親げっ歯類またはキメラ抗体と比較した。
【０３７２】
ＥＬＩＳＡプレートを、組換えｈＭＣＡＭ−Ｈｉｓでコーティングして、カゼイン緩衝剤でブロックし、非特異的結合を防止した。ビオチン化されたげっ歯類またはキメラ抗体を、３倍上昇濃度の非標識拮抗物質（ヒト化抗体、げっ歯類、またはキメラ）の存在下、または非存在下で、飽和に満たない濃度で添加した。洗浄して未結合の抗体を除去した後、ストレプトアビジンＨＲＰを添加して、ビオチン化抗体を検出した。ＥＬＩＳＡをＴＭＢ基質で発色させて、ＯＤ４５０で測定した。非標識拮抗物質のＩＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウエアを用いて測定した。
【０３７３】
親和性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄを用いて測定した。抗ヒトＦｃセンサーを用いて、ヒト化抗体を捕捉し、複数の濃度のｈＭＣＡＭＨｉｓ被分析物を用い、１：１フィッティングモデルを利用して親和性を測定した。
【０３７４】
抗体の能力を、以下のプロトコルに従ってラミニン／ＦＡＣＳアッセイで測定した：組換えラミニン４１１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａｔｅ）を、様々な濃度のヒト化、げっ歯類またはキメラ抗体の存在下、または非存在下でｈＭＣＡＭ発現ＣＨＯ細胞に添加した。３０〜４５分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄して、ＡＦ６５０にコンジュゲートされた抗ラミニン（ＮｏｖｕｓＢｉｏ）を添加して、結合されたラミニンを検出した。細胞をフローサイトメトリーに供試して、ラミニン結合シグナルを測定した。
【０３７５】
表６はトランスフェクションに用いられた構築物を示している。
【表６】
2017510567.tif 000008
【０３７６】
表７は、特異的トランスフェクション実験を記載している。
【表７】
2017510567.tif 000009
【０３７７】
表８は、トランスフェクションの１回目の、ＦｏｒｔｅＢｉｏおよび拮抗ＥＬＩＳＡにより測定されたげっ歯類親抗体に比較したヒト化抗体の相対的親和性、ならびに発現レベルを示す。
【表８】
2017510567.tif 000010
【０３７８】
表９は、トランスフェクションの２回目の、げっ歯類親抗体と比較したＦｏｒｔｅＢｉｏ、拮抗ＥＬＩＳＡ、および機能的ブロッキングのデータ（ラミニン／ＦＡＣＳアッセイ）により測定された親和性、ならびに発現レベルを示す。
【表９】
2017510567.tif 000011
【０３７９】
総括すると、データから、様々な２１２０ヒト化抗体がＦｏｒｔｅＢｉｏによる測定で親和性の５倍を超える低下を有すること、そして親和性および能力の２倍未満の低下を有したＶＨ５ＶＬ３（Ｇ−Ａ  Ｎ−脱アミド化突然変異体ＶＨ／保存的ＶＬ）を除き、ほとんどが拮抗ＥＬＩＳＡおよびラミニンブロックアッセイによる測定で見かけの親和性および能力の２〜３倍を超える低下を有すること、が実証された。
【０３８０】
特定の候補抗体を再度発現させて、ＦｏｒｔｅＢｉｏによる親和性およびＩＣ５０についてテストした。結果を、以下の表１０に示す。
【表１０】
2017510567.tif 000012
【０３８１】
実施例７．ヒト化２１２０抗体の修飾
先に記載されたＤＮＡ操作方法を利用し、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  ＪＢＣ．  ２８６：１１２１１−７，  ２０１１に従って、２１２０．４．１９抗体成熟重鎖可変領域のラットおよびヒト化バージョンの変異体を構築した。位置Ｈ１（カバット番号付け）のグルタミンからグルタミン酸への置換を有する２１２０．４．１９、ｈ２１２０ＶＨ１、ｈ２１２０ＶＨ２、ｈ２１２０ＶＨ３、ｈ２１２０ＶＨ４、およびｈ２１２０ＶＨ５の変異体を構築した（図４Ａ）。これらの変異体は、２１２０．４．１９．Ｑ１Ｅ、ｈ２１２０ＶＨ１．Ｑ１Ｅ、ｈ２１２０ＶＨ２．Ｑ１Ｅ、ｈ２１２０ＶＨ３．Ｑ１Ｅ、ｈ２１２０ＶＨ４．Ｑ１Ｅ、およびｈ２１２０ＶＨ５．Ｑ１Ｅと称され、ＳＥＱ  ＤＩ  ＮＯ：１５６〜１６１に示される。ＳＥＱ  ＤＩ  ＮＯ：１５７〜１６１により同定されたヒト化バージョンを、図４Ａのアライメントに示す。様々なラットおよびヒト化抗体を、ｈ２１２０ＶＨ１．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ１；ｈ２１２０ＶＨ１．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ２；ｈ２１２０ＶＨ１．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ３；ｈ２１２０ＶＨ２．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ１；ｈ２１２０ＶＨ２．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ２；ｈ２１２０ＶＨ２．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ３；ｈ２１２０ＶＨ３．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ１；ｈ２１２０ＶＨ３．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ２；ｈ２１２０ＶＨ３．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ３；ｈ２１２０ＶＨ４．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ１；ｈ２１２０ＶＨ４．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ２；ｈ２１２０ＶＨ４．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ３；ｈ２１２０ＶＨ５．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ１；ｈ２１２０ＶＨ５．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ２；およびｈ２１２０ＶＨ５．Ｑ１Ｅ＋ｈ２１２０ＶＬ３をはじめとする修飾された可変重鎖を用いて構築することができる。
【図１】
2017510567.tif 000013
【図２Ａ】
2017510567.tif 000014
【図２Ｂ】
2017510567.tif 000015
【図２Ｃ】
2017510567.tif 000016
【図３Ａ】
2017510567.tif 000017
【図３Ｂ】
2017510567.tif 000018
【図４Ａ】
2017510567.tif 000019
【図４Ｂ】
2017510567.tif 000020
【配列表】
2017510567000001.app
【国際調査報告】
2017510567.tif 000021
2017510567.tif 000022
2017510567.tif 000023