(57)【要約】  子宮頸癌の予防および早期検出に有効なツールとしての、特にLNA（ロックド核酸）技術に基づく、発癌性HPVウイルスの存在を検出するためのスクリーニング検査および方法。発癌性HPVゲノムの保存領域を標的とする、リアルタイムPCRによるHPV検出に使用するためのプローブ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料が発癌性ヒトパピローマウイルス（HPV）についての検査で陽性であるかどうかを判定する方法であって、前記方法は、
前記試料を、発癌性HPVゲノムの標的領域のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識されたpan-HPVプローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識されたpan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記pan-HPVプローブは配列ACTTTCGTTT（配列番号25）、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記pan-HPVプローブはACTTTCGTTT（配列番号25）、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記pan-HPVプローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そして前記標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は蛍光である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーはHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68のいずれかの標的領域の増幅のためのプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68の全ての標的領域の増幅のための複数のプライマーの組み合わせと組み合わせることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマーは以下のプライマー対の一対または複数対を含む、
a）HPV16に関して配列番号1および配列番号14
b）HPV18に関して配列番号2および配列番号15
c）HPV33/33nに関して配列番号3および配列番号14
d）HPV31に関して配列番号4および配列番号14
e）HPV35に関して配列番号5および配列番号14
f）HPV39に関して配列番号6および配列番号14
g）HPV45に関して配列番号7および配列番号15
h）HPV51に関して配列番号8および配列番号16
i）HPV52に関して配列番号9および配列番号14
j）HPV56/66に関して配列番号10および配列番号14
k）HPV58に関して配列番号11および配列番号14
l）HPV59に関して配列番号12および配列番号17
m）HPV68に関して配列番号13および配列番号18
先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーは前記プライマー対（a）から（m）の全てを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68の標的領域の増幅のための複数のプライマーと組み合わせ、
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出し、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68についての検査で陽性であることを結論付けること
を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68の標的領域の増幅のための複数のプライマーと組み合わせ、
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出せず、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68についての検査で陰性であることを結論付けること
を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を、HPV33nの標的領域の増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された33nプローブと組み合わせ、前記33nプローブと前記pan-HPVプローブは同一標識を担持し、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された33nプローブまたは前記pan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
をさらに含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記33nプローブは配列ACTTTCGCTT（配列番号26）、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記33nプローブはACTTTCGCTT（配列番号26）、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記pan-HPVプローブおよび前記33nプローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そしてそれらのそれぞれの標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は同一波長の蛍光である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを判定することをさらに含む方法であって、前記方法は、
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示され、
前記16/18プローブは配列ATATCWGATGACGAG（配列番号27）を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
試料が発癌性ヒトパピローマウイルス（HPV）HPV16および/またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを判定する方法であって、前記方法は、
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示され、
前記16/18プローブは配列ATATCWGATGACGAG（配列番号27）、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする、方法。
【請求項１５】
前記16/18プローブはATATCWGATGACGAG（配列番号27）、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された15-ヌクレオチド分子である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記16/18プローブは前記pan-HPVプローブとは異なる標識を担持する、請求項１３または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記16/18プローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そして前記標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は蛍光である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記16/18プローブは前記pan-HPVプローブの波長とは異なる波長で蛍光信号を発する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマーは以下のプライマー対の両方または一方を含む、
a）HPV16に関して配列番号19および配列番号20
b）HPV18に関して配列番号21および配列番号22、
請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記リアルタイムPCRに関して陽性対照試験を実施することをさらに含む方法であって、
前記試料を、前記試料中に存在する対照DNA配列のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、および前記対照DNA配列の増幅に基づいて信号を発することができる標識された対照プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記対照プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記リアルタイムPCRが機能していることが示される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記対照DNA配列はヒトDNAである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料はヒト頸管スミア由来の液体ベースの細胞学的試料である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ヌクレオチド配列ACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列と検出可能な標識とを含む標識された核酸プローブを含む組成物。
【請求項２４】
前記プローブはLNAヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記プローブは蛍光色素分子およびクエンチャーで標識されたACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列からなる配列の10-ヌクレオチド分子である、請求項２３または請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記プローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識される、請求項２３〜２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
HPVの検出のためにリアルタイムPCRを行う際の請求項２３〜２６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２８】
配列番号１〜３２から選択される配列によって特徴付けられるオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
以下を含むことを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応の方法によって発癌性HPVを検出するためのキット、
以下のオリゴヌクレオチド配列から選択されるプライマーの少なくとも一対：
a）HPV16に関して
配列番号１および配列番号14
b）HPV18に関して
配列番号2および配列番号15
ｃ）HPV33/33nに関して
配列番号3および配列番号14
ｄ）HPV31に関して
配列番号4および配列番号14
ｅ）HPV35に関して
配列番号5および配列番号14
f）HPV39に関して
配列番号6および配列番号14
ｇ）HPV45に関して
配列番号7および配列番号15
ｈ）HPV51に関して
配列番号8および配列番号16
ｉ）HPV52に関して
配列番号9および配列番号14
ｊ）HPV56/66に関して
配列番号10および配列番号14
ｋ）HPV58に関して
配列番号11および配列番号14
l）HPV59に関して
配列番号12および配列番号17
ｍ）HPV68に関して
配列番号13および配列番号18。
【請求項３０】
請求項２９で定義される全てのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２９に記載の、キット。
【請求項３１】
配列番号２５〜２８から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項２９または３０に記載の、キット。
【請求項３２】
配列番号２９〜３２から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項２９〜３１に記載の、キット。
【請求項３３】
配列番号２３〜２４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を有する、内部対照としての、一対のプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項２９〜３２に記載の、キット。
【請求項３４】
請求項２９で定義されるオリゴヌクレオチド配列から選択されるプライマーの少なくとも一対を用いるポリメラーゼ連鎖反応を実施し、その特定のプライマー対を含む産物の増幅によりウイルスの存在が証明されることを特徴とする、発癌性HPVを検出するための方法。
【請求項３５】
請求項２９に示した全てのオリゴヌクレオチドを同時に用いたマルチプレックスリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施することを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
配列番号２５〜２８から選択される配列を有する1つまたは複数のオリゴヌクレオチド・プローブの使用をさらに含むことを特徴とする、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
配列番号２９〜３２から選択される配列を有する1つまたは複数のオリゴヌクレオチド・プローブの使用をさらに含むことを特徴とする、請求項３４〜３６のいずれかに一項に記載の、方法。
【請求項３８】
配列番号２３〜２４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を有する、内部対照としての、一対のプライマーの対の使用をさらに含むことを特徴とする、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸癌の診断の分野に関し、特には、子宮頸癌の予防および早期検出における新規なツールとしての、好ましくはLNA（ロックド核酸）技術および関連方法に基づく、発癌性HPVウイルスのスクリーニング検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、依然として世界的規模の主要な健康および社会的な問題である悪性腫瘍である。毎年、この疾患の約500,000の新たな症例が世界中で診断され、診断された女性の半数以上がこの疾患で亡くなっている。全ての女性がこのタイプの癌に罹りやすいが、発生率と死亡率の有意な地理的な違いが指摘されている。
【０００３】
子宮頸癌の症例のほぼ80％が発展途上国で診断されており、それらの国では、この疾患は実際に他の生殖器の癌に比べて女性の死因の第一位に挙げることができる。これらの国では、今後数年間で症例数の増加が予想される。先進国での子宮頸癌の発生率の減少傾向とより低い死亡率は、一般的で体系的な予防と近代的なヘルスケアへの優れたアクセスの導入に関連している。
【０００４】
ポーランドは子宮頸癌の発生率と死亡率が比較的高いそれらの国に属している。それは45歳までの女性で二番目に多い一般的な悪性腫瘍である。毎年約3,500人のポーランド人女性が子宮頸癌と診断され、彼女らの半分はこれが原因で死亡している。このタイプの癌の死亡者数はポーランドが欧州で上位の位置を占めている。
【０００５】
子宮頸癌の治療は、疾患の段階に依存し、疾患の初期段階での局所切除と根治手術、進行した段階での小線源治療と同時化学療法を組み合わせた根治的放射線療法、および転移性疾患の場合の緩和ケアを含む。カルボプラチンおよびパクリタキセルは化学療法治療において最も一般的に使用される。追加の薬物により、進行症例における患者の生存期間が延びる可能性がある。最近の報告では、緩和ケアにおいて平均余命のパラメータを向上させる、この兆候に関して標的療法（ベバシズマブ）の追加適用の可能性が示唆されているが、それはそのような治療の費用に大きな影響を及ぼす。白金抵抗性の場合には、第二選択薬はトポテカンである。
【０００６】
2006年に、子宮頸癌の発症の主要因であるHPV感染を予防することを目的としたワクチンが発売された。ガーダシル(Gardasil)と呼ばれるワクチンは米国および欧州連合内での使用が承認された。HPV感染に対する別のワクチンはサーバリックス(Cervarix)である。
【０００７】
しかしながら、子宮頸癌は、その発達（すなわち、上皮内腫瘍として知られている、前癌病変）に進む素因がある医学的症状を適切に予防しそして早期診断を行うことによって効果的に予防することができる、数少ない悪性新生物の１つである。女性において定期的に行われる重層扁平または腺上皮の異常細胞を検出することを目的とする頸管スミアの細胞学的試験は、これまでのところ、そのような予防の基本的かつ最も効果的な方法であった。子宮頸癌の集団ベースのスクリーニングにおける細胞学的試験の疑う余地のない値にもかかわらず、この方法の基本的な限界はおよそ60%という比較的低い感度である。多くの科学的研究によれば、感染した女性の一部で子宮頸部の上皮において発癌の過程を直接引き起こす、HPVの数百の既知の種類のうちの１５のグループ、ヒトパピローマウイルス（HPV）のいわゆる発癌性の型（さもなければ、高リスク・ウイルス、高リスクHPV、HR-HPVと呼ばれる）は、進行した前癌病変（いわゆるCIN2、CIN3、上皮内癌）の検出にはるかに効果的である。細胞学的試験およびHPV試験を組み合わせたものの高感度（100％まで）、および細胞学的試験単独と比較してわずかに低い特異性に加えて、前記方法は高い、いわゆるNPV（陰性的中率）指標によっても特徴付けられる。このような複合試験は30歳以上の女性に特に推奨される。子宮頸癌の一次スクリーニングにおけるHPV検査の使用に加えて、細胞学的診断の補完として、前記発癌性HPVのグループによって引き起こされるウイルス感染症の判定も、特にASC-USとLSIL（ポーランド婦人科学会と国際機関の推奨）として知られている診断の場合には、異常な上皮細胞の存在が検出された女性において、いわゆる拡張診断の段階で推奨される。細胞学的調製物において特定の異常を伴う女性における発癌性HPV型の存在に関する検査を実施することによって、より特異的なさらなる診断と考えうる治療が可能になる。
【０００８】
したがって、発癌性HPV型を検出するための分子遺伝学的検査の一般的な使用は、頸管スミアの細胞学的試験に基づく集団ベースのスクリーニング・プログラムの補完として、合理的であると思われる。残念ながら、市販のHPV検査の技術的な理由（低ゲノム相同性を有する数十のHPV型が単一のアッセイにおいて分析されている検査の高複雑度）および費用が原因で、そのような複合予防試験は、ポーランドにおいておよび世界各国での両方において、集団ベースのスクリーニング・プログラムは一般的ではなく、それらは細胞学的スクリーニング検査で異常細胞を検出した場合における拡張診断の段階のみに限定されている。別の問題はHPV検査が統一された系統的基準を欠くことである。
【０００９】
ハイブリッドキャプチャー（ダイジーン）法はHPV診断のためのゴールドスタンダードと考えられている。しかしながら、この方法の診断感度は比較的低い。加えて、前記した検査は既知の発癌性HPV型の一部のみしか検出できない。HPV診断市場で利用可能な検査の大部分は遺伝子型決定（個々のHPV型の判定）法に基づいており、当該法はコスト高となるだけでなく、時間と手間のかかる分析や子宮頸部の形態異常を検出するための方法の特異性の低下を生じる。近年、高リスクの子宮頸癌の発達（型の区別なしに）によって特徴付けられるグループのHPVの感染を検出するためのDNA増幅技術（例えば、PCR）を使用する、異なる分子遺伝学的方法に基づいた、臨床使用が承認されたいくつかの検査（CE-IVD認定）が市場に登場した。しかしながら、一般的に、それらには全ての発癌性HPV型の分析は含まれず、さらにそれらの価格は高いため、ポーランドにおける子宮頸癌の集団ベースのスクリーニング検査にそれらを一般的に使用することはできない。
【００１０】
リアルタイムでのPCR法（リアルタイムPCR）がウイルスの診断に現在広く使用されているが、それは各調査微生物に関して個々のアプローチを必要とする。診断のためにこの方法を使用するには、検査の最高の臨床上の信頼性および、特に、病原体検出および診断特異性の適切な閾値を確実なものにするために、配列、いわゆるプライマーおよび分子プローブ、ならびに反応条件を適切に選択する必要がある。好ましくは、多重反応により複数のHPV型の単一段階の診断が可能になるが、当該反応は非常に困難な作業であり、検出の高い感度と特異性によって特徴付けられる検査をえるための反応を必要とする。
【００１１】
ウイルス学におけるリアルタイムPCRアッセイはマッカイ（Mackay）ら、2002、Nucleic Acid Research,30（6）,1292−1305により検討された。WO08/145366（ミラノ・ビコッカ大学）には、発癌性HPV核酸を同定しかつ定量化する方法が記載されている。前記方法は、試料中のHPVの存在を同定するために一次スクリーンとして5つの独立したリアルタイムPCRアッセイを使用し、最も一般的な発癌性HPV型の存在およびウイルス負荷を決定するために陽性試料について行われるTaqManリアルタイムPRアッセイをさらに使用した。定量的リアルタイムPCRにおいて：Methods and Protocols, Chapter 8 in Methods in Molecular Biology,vol. 1160：87-97 2014において、ブロコッロ（Broccolo）は、子宮頸部試料からの発癌性HPVのDNA負荷の迅速な検出および測定のための自動抽出法と統合されたマルチプレックスリアルタイムPCRプラットフォームを記載している。このシステムでは、2つのマルチプレックスqPCRアッセイ（一次スクリーニング）がHPV-16、-18、-31、-33、-45、-52、および-58（HPV-18および-45は一緒に単一の蛍光色素分子により測定される）を検出しかつ定量化するために行われた。さらに、HPV-18およびHPV-45に特異的なマルチプレックスqPCRアッセイは、前記２株のうちの１株に陽性であることが判明した試料を正確に分類するために使用した。ミカレッシ（Micalessi）らは、7つの多重反応で17のHPV遺伝子型のハイスループット検出用のTaqManベースの定量リアルタイムPCRアッセイが記載され、100コピー以下の分析感度を報告している（Clin. Chem. Lab. Med., 50(4):655-661 2011）。
【００１２】
適切な診断と治療の手順を実行するために発癌性HPV型の存在について検査を行うことに関する大きな需要がある。行われたHPV検査の数は、それらの高いコストと市場での限られた利用可能性のために決して十分なものではない。発癌性HPV型の存在についての安価で臨床的に信頼できる検査の開発により、子宮頸癌の素因となる病状の現代の診断の利用可能性が著しく向上する。
【００１３】
したがって、本発明の目的は液状媒体に集めた頸管スミア（液体ベースの細胞診-LBC）中の発癌性HPV型の高感度で特異的かつ安価な検出を可能にする診断検査を開発することである。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、試料が発癌性ヒトパピローマウイルス（HPV）についての検査で陽性であるかどうかを判定する方法を提供し、前記方法は、
前記試料を、発癌性HPVゲノムの標的領域のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識されたpan-HPVプローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識されたpan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記pan-HPVプローブは配列ACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする。
【００１５】
好ましくは、前記pan-HPVプローブはACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子である。
【００１６】
好ましくは、前記pan-HPVプローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そして前記標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は蛍光である。
【００１７】
好ましくは、前記プライマーはHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68のいずれかの標的領域の増幅のためのプライマーである。
【００１８】
本発明の好ましい方法は、前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68の全ての標的領域の増幅のための複数のプライマーの組み合わせと組み合わせることを含む。
【００１９】
前記プライマーは以下のプライマー対の一対または複数対を含みうる：
a）HPV16に関して配列番号1および配列番号14
b）HPV18に関して配列番号2および配列番号15
c）HPV33/33nに関して配列番号3および配列番号14
d）HPV31に関して配列番号4および配列番号14
e）HPV35に関して配列番号5および配列番号14
f）HPV39に関して配列番号6および配列番号14
g）HPV45に関して配列番号7および配列番号15
h）HPV51に関して配列番号8および配列番号16
i）HPV52に関して配列番号9および配列番号14
j）HPV56/66に関して配列番号10および配列番号14
k）HPV58に関して配列番号11および配列番号14
l）HPV59に関して配列番号12および配列番号17
m）HPV68に関して配列番号13および配列番号18。
【００２０】
さらに好ましい方法において、前記プライマーは前記プライマー対（a）から（m）の全てを含む。
【００２１】
本発明による方法は、前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68の標的領域の増幅のための複数のプライマーと組み合わせ、
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出し、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68についての検査で陽性であることを結論付けること
を含みうる。
【００２２】
本発明による方法は、前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68の標的領域の増幅のための複数のプライマーと組み合わせ、
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出せず、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68についての検査で陰性であることを結論付けること
を含みうる。
【００２３】
本発明による方法は、前記試料を、HPV33nの標的領域の増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された33nプローブと組み合わせ、前記33nプローブと前記pan-HPVプローブは同一標識を担持し、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された33nプローブおよび／または前記pan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
をさらに含むことができ、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記33nプローブは配列ACTTTCGCTT（配列番号26）またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする。
【００２４】
そのような方法において、前記33nプローブはACTTTCGCTT（配列番号26）またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子であってもよい。
【００２５】
前記pan-HPVプローブおよび前記33nプローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識されてもよく、そしてそれらのそれぞれの標的領域の増幅に基づいて発せられる信号は同一波長の蛍光である。
【００２６】
本発明による方法は、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを判定することを含むことができ、前記方法は、
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示され、
前記16/18プローブは配列ATATCWGATGACGAG（配列番号27）またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする。
【００２７】
前記16/18プローブはATATCWGATGACGAG（配列番号27）またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された15-ヌクレオチド分子であってもよい。
【００２８】
前記16/18プローブは前記pan-HPVプローブとは異なる標識を担持してもよい。
【００２９】
前記16/18プローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識されていてもよく、そして前記標的領域の増幅に基づいて発せられる信号は蛍光である。
【００３０】
前記16/18プローブは前記pan-HPVプローブの波長とは異なる波長で蛍光信号を発してもよい。
【００３１】
前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを判定するための本発明による方法において使用されるプライマーは以下のプライマー対の両方または一方を含んでいてもよい：
a）HPV16に関して配列番号19および配列番号20
b）HPV18に関して配列番号21および配列番号22。
【００３２】
本発明による方法は、前記リアルタイムPCRに関して陽性対照試験を実施することをさらに含んでいてもよく、
前記試料を、前記試料中に存在する対照DNA配列のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、および前記対照DNA配列の増幅に基づいて信号を発することができる標識された対照プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記対照プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記リアルタイムPCRが機能していることが示される。
【００３３】
前記対照DNA配列はヒトDNAであってもよい。
【００３４】
本発明による方法において、前記試料はヒト頸管スミア由来の液体ベースの細胞学的試料であってもよい。
【００３５】
本発明はさらにヌクレオチド配列ACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列と、検出可能な標識とを含む標識された核酸プローブを含む組成物を提供する。前記プローブはLNAヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましくは、前記プローブは、蛍光色素分子およびクエンチャーで標識された、ACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列からなる配列の10-ヌクレオチド分子である。前記プローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識されていてもよい。
【００３６】
加えて、本発明はHPVの検出のためにリアルタイムPCRを行う際の本発明による組成物の使用を提供する。
【００３７】
驚くべきことに、本発明者らは上記の目的を実現し、多くの利点、例えば実行の容易さ、低コスト、有利なパラメータ：HPV16/18および他の発癌性HPV型に関する高感度、臨床効果、特異性、および臨床的に所望の検出閾値により特徴付けられる、発癌性HPVの存在に関する診断検査を獲得した。また、以下に立証するように、この検査により大規模なHR-HPV陰性の女性集団における細胞学的試験からの回避を潜在的に可能にすることができる。
【００３８】
HPVゲノムは約8千のヌクレオチドを有し、そして発癌型の間の完全な相同性を有する連続配列の長さは数十塩基対を超えない。HPVのこのような膨大な多様性により、一反応で全ての発癌性HPVウイルスの検出を可能にすることになるハイブリダイゼーション・プローブを最小量で設計をすることができない。この問題は分子プローブにおける修飾されたLNA（ロックド核酸）ヌクレオチドを用いて解決することができる。LNAヌクレオチドはデオキシリボースの分子内の追加のメチレン架橋を含有し、当該架橋はコンフォメーションの変化および分子の剛性化に起因してこのようなヌクレオチドから構築されたオリゴマーの融点および前記ハイブリダイゼーション過程における相補的ヌクレオチド間の結合の安定性を上昇させる。LNAの特性はフェスター＆ウェンゲル（Vester & Wengel）、Biochemistry 43(42): 13233-13241 2004によって検討された。本発明に従い、LNAを使用した結果、有利には、PCRにおいて、反応に最適な温度でPCR増幅産物へのハイブリダイゼーションの高い特異性を伴い、従来のもの、TaqMan型分子プローブと比較して、有意により短いものを適用することが可能となる。著しく短い8〜10ヌクレオチド長のLNA-TaqManプローブ（従来のプローブにおける20〜30ヌクレオチドと比較して）の使用により、異なる発癌性HPV型の間の短い（わずか10〜12塩基対の）相同領域にそれらがより容易にフィッティングでき、その結果、新たな診断検査の開発が可能となる。
【００３９】
子宮頸癌の予防および診断の分野において臨床的に関連する専門知識をえることができるようになる、LNA技術を使用する検査に対する高い需要がある。患者も高度な感度で経済的に利用できるようになる最新の予防試験を受けることを望んでいる。
【００４０】
したがって、HR-HPVと呼ばれる検査、好ましくは、単一の密封された試験管内で行い、TaqManタイプの分子プローブを使用するマルチプレックスリアルタイムPCR技術（マルチプレックスリアルタイムPCR）に基づき、特にバイオインフォマティクス方法を用いて設計された前記検査を開発した。前記プローブには、HPVの存在に関する前記検査で以前は使用されていなかった、LNAの革新的技術が採用された。
【００４１】
好ましくは、8〜10ヌクレオチドまでプローブの長さを短くすることにより、それらの数を、15〜16から単に数個（最適には2〜3）に、有意に減少させることが可能となった。好ましくは、さらに、数本の試験管内で行われる、市場に存在する検査の大部分とは異なり、単一試験管内でのマルチプレックスリアルタイムPCR反応の実施が可能となる。本発明の一実施形態では、特別な製造業者が前記検査のために設計した装置のみならず、大部分の市販のPCR装置でも前記検査を行うことができる、蛍光の異なる発光スペクトルを有する最大3つの異なる汎用の蛍光色素でLNAプローブを最適に標識した。
【００４２】
本発明は、以下に示す配列のリストにおいて定義された、配列番号1〜32から選択される配列によって特徴付けられるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４３】
本発明は以下を含むことを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応の方法によってHPVを検出するためのキットを提供する：
以下のオリゴヌクレオチド配列から選択されるプライマーの少なくとも一対：
a）HPV16に関して：配列番号１および配列番号14
b）HPV18に関して：配列番号2および配列番号15
ｃ）HPV33/33nに関して：配列番号3および配列番号14
ｄ）HPV31に関して：配列番号4および配列番号14
ｅ）HPV35に関して：配列番号5および配列番号14
f）HPV39に関して：配列番号6および配列番号14
ｇ）HPV45に関して：配列番号7および配列番号15
ｈ）HPV51に関して：配列番号8および配列番号16
ｉ）HPV52に関して：配列番号9および配列番号14
ｊ）HPV56/66に関して：配列番号10および配列番号14
ｋ）HPV58に関して：配列番号11および配列番号14
l）HPV59に関して：配列番号12および配列番号17
ｍ）HPV68に関して：配列番号13および配列番号18。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明のキットは前記で定義される全てのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００４５】
好ましくは、本発明のキットは配列番号２５〜２８から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブをさらに含む。
【００４６】
好ましくは、本発明のキットは配列番号２９〜３２から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブをさらに含む。
【００４７】
好ましくは、本発明のキットは配列番号２３〜２４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を有する、内部対照としての、一対のプライマーをさらに含む。
【００４８】
本発明は前記で定義されたオリゴヌクレオチド配列から選択されるプライマーの少なくとも一対を用いたポリメラーゼ連鎖反応を実施し、その特定のプライマー対を含む産物の増幅によりウイルスの存在が証明されることを特徴とする、HPVを検出するための方法を提供する。
【００４９】
本発明による方法の好ましい実施形態において、好ましくは、前記に示した全てのオリゴヌクレオチドを単一段階で使用するマルチプレックスリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施する。
【００５０】
本発明による方法の好ましい実施形態において、好ましくは、配列番号２５〜２８から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブをさらに適用する。
【００５１】
本発明による方法の好ましい実施形態において、好ましくは、配列番号２９〜３２から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブをさらに適用する。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、好ましくは、配列番号２３〜２４から選択されるオリゴヌクレオチド配列を有するプライマー対を内部対照としてさらに適用する。
【００５３】
本発明を実行するために、ヒトDNAおよび/またはDNAの合成断片の選択された配列である、
全ての発癌性HPV型および、好ましくは、内部対照における相同領域の同定および増幅を可能にするプライマーおよびプローブのキットを設計し適合させた。本発明の一実施形態では、好ましくは、前記反応を単一の試験管内で実施し、好ましくは、前記反応の読み出しは市場に存在するリアルタイムPCR装置の大部分で使用される最大４検出チャネルで行った。
【００５４】
1つのリアルタイムPCR反応において、高リスクHPV（HR-HPV）による感染の検出を可能にする2つの10-ヌクレオチドLNA-TaqManプローブを設計した。それらのうちの第一のプローブ、HRP（pan-HPV）は全ての発癌性HPVウイルスに相補的であるが、第二のプローブ、HRP33nは、前記プローブが付く部位に1つのA/Gヌクレオチドの多型を含む、HPV33nの同定された変異体に対して相補的である。好ましくは、HRP pan-HPVおよびHRP33nプローブの5'末端はFAM（フルオレセイン）蛍光色素を用いて標識し、3'末端はBHQ1クエンチャー（ブラックホール・クエンチャー1）を用いて標識した。HRP pan-HPVおよびHRP33nプローブのリアルタイムPCRの読み出しはFAM色素を読み出すように設計されたチャネルにおける波長530nmで行った。
【００５５】
また、好ましくは、PCR検査のための内部対照を設計した。合成短DNA断片からなる系を使用し、77の塩基対を含むオリゴヌクレオチドを標的として設計した。4つのプライマーと10-ヌクレオチドLNA-TaqMan（ICP）プローブの系を合成内部対照の増幅および検出のために設計した。PCRのための２つのプライマーの最適な組み合わせを選択した。前記ICPプローブはその5'末端をROX色素で、そしてその3’末端をBHQ2クエンチャーで標識した。前記ICPプローブのリアルタイムPCRの読み出しは610nmの波長（ROX色素のチャネル）で行った。
【００５６】
研究の目的は、好ましくは、数種の検出チャネルにおいて、好ましくはリアルタイムで実施される、PCRの間に発生する可能性のあるいかなる悪影響の可能性も完全に排除しつつ、十分な感度と特異性で臨床試料中の全ての発癌性HPV型の効率的な増幅を可能にするであろうプライマーの小さなキットを実施可能なように設計することであった。
【００５７】
実施した研究の結果、高リスクHPVのためのプライマーの共通プールを開発した。プライマーの総数ができるだけ小さくなるように前記配列を選択した。したがって、プライマーの特定の配列はいくつかのHPV型に共通している。よって、16、31、33、33n、35、39、52、56、58、HPV型に関する共通リバースプライマー（「逆方向」）および18と45HPV型に関する共通リバースプライマー（「逆方向」）を選択した。さらに、56と66型および33と33n型に関して、それぞれ共通フォワードプライマー（「順方向」）を選択した。
【００５８】
本発明の実施形態によれば、好ましくは、本発明のHR-HPV検査の最終混合物は、15の発癌性HPV型の検出のための18のプライマー（13のフォワードプライマーおよび5つのリバースプライマー）および2つのLNA-TaqManプローブ、合成内部対照のための2つのプライマーおよび1つのTaqManプローブを含む。
【００５９】
HPVの24の型を検出する、周知のPapilloCheck検査で既に調べた、選択された臨床試料（単一の発癌性HPV型のDNAを含む約50の臨床試料、非発癌性HPV型のDNAを含む30の臨床試料、共感染を含む50の臨床試料および30の陰性試料（全ての発癌型を含むHPVの24の型を含まない）を用いて、本発明に従った、プライマーと分子プローブの適切な組み合わせにより、発癌性HPV型（HPV33n変異体を含む）の特異的な検出が可能となり、非発癌性ウイルス型と陰性臨床試料を含む臨床試料の場合には否定的な結果を生じることが立証された。また、前記の24のプライマー、3つのLNAプローブと１つの内部対照（IC）TaqManプローブを用いた反応では、プライマーダイマー型の生成物または他の非特異的なPCR増幅産物は生成されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の主題の実施形態を図面に示したが、図面中、図１は、陽性対照試料、陰性対照試料および陰性臨床試料を用い、発癌性HPVの全てのグループに対してリアルタイムPCRを使用して、例示的な検査でえられた結果を示す。530nmの検出チャネルを使用した。
【００６１】
【図２】図２は、陽性対照試料、陰性対照試料および陰性臨床試料を用い、16および18HPV型のリアルタイムPCRを使用した検査の例示的な実施形態でえられた結果を示す。560nmの検出チャネルを使用した。
【００６２】
【図３】図３は、陽性対照試料、陰性対照試料および陰性臨床試料を用い、前記検査の内部対照（IC）のためのリアルタイムPCRを使用した検査の例示的な実施形態でえられた結果を示す。610nmの検出チャネルを使用した。
【００６３】
【図４】図４Ａ〜Ｄは、本発明の様々な実施形態に従った実施例プローブおよびプライマー、およびそれらがハイブリダイズするHPVゲノムの対応領域の配列を示す。
【００６４】
図４Ａは：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、66、58、59および68を検出するために増幅されかつHR-HPV（pan-HPV）プローブ（probe）（配列番号（SEQ ID NO：）25）が標的とするHPV16 E1遺伝子（配列番号33）の領域を示し;前記プローブがハイブリダイズする標的配列（配列番号34）を太字で示し、下線を引く。前記標的配列の逆相補鎖配列である、HR-HPV（pan-HPV）プローブの配列（5'-actttcgttt-3'、配列番号25/29）も示す。
【００６５】
図４Ｂは、HPV33nを検出するために増幅されかつHPV33nプローブが標的とするHPV33n E1遺伝子（配列番号34）の領域を示し;前記プローブがハイブリダイズする標的配列（配列番号36）を太字で示し、下線を引く）。前記標的配列の逆相補鎖配列である、HR-HPV33nプローブの配列（5'-actttcgctt-3'、配列番号26/30）も示す。
【００６６】
図４Ｃは、HPV16/18プローブが標的とするために増幅されるHPV16 E1遺伝子（配列番号37）およびHPV18 E1遺伝子（配列番号40）の領域を示す。プライマーHPV16 F HEX（配列番号19）およびプライマーHPV16 R HEX（配列番号20）が増幅のためにハイブリダイズする標的配列、およびHPV16/18プローブ（配列番号38）がハイブリダイズする標的配列（配列番号71）を太字で示し、下線を引く。プライマーHPV18 F HEX（配列番号21）とプライマーHPV18 HEX（配列番号22）が増幅のためにハイブリダイズする標的配列、およびHPV16/18プローブ（配列番号39）がハイブリダイズする標的配列を太字で示し、下線を引く。ここで留意すべきは、示されたHPV16/18プローブ（5'-atatctgatgacgag-3'（配列番号39））はマークを付けたように「t」ヌクレオチドを有するが、HPV16/18プローブ配列番号38はこの位置に「a」残基を有するという点である。リバースプライマーHPV18 R HEXは示されるように「a」ヌクレオチドを有するが、示された前記標的配列に関して、その逆相補鎖配列では通常「g」ヌクレオチドとなり;天然のHPV配列はこの位置に「t」ヌクレオチドを有するために、この配列を標的とするために使用されるリバースプライマーはこの位置に「a」を有する。
【００６７】
図４ＤもHPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、66、58、59および68を検出するために増幅されかつHR-HPV（pan-HPV）プローブが標的とするHPV16 E1遺伝子（配列番号41）の領域を示す。プライマーHPV 16 F（配列番号1）およびプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66 R（配列番号14）がハイブリダイズする標的配列を太字で示し、下線を引く。pan-HPVプローブ（配列番号25）がハイブリダイズする標的配列（配列番号34）を太字で示し、下線を引く。
【００６８】
図５Ａ〜Ｍは、本発明の様々な実施形態に従ったプローブとプライマー、および第一の検出チャネル530nmFAMで検出するためにそれらがハイブリダイズするHPVゲノムの対応領域の配列を伴う、HPV株16、18、33、31、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68に関する高リスクHPVゲノムE1領域の配列を示す。
【００６９】
【図５Ａ】図５Ａは、フォワードプライマーHPV16（配列番号1）5'-gcacaggaagcaaaacaacatag-3'およびリバースプライマーHPV16/31/33/33ｎ/35/39/52/56/58/66Rが標的とするHPV16 E1遺伝子の領域5'-agacagcgggtatggcaatac-3'（配列番号45）の位置を示すためにマークを付けた、HPV16 E1遺伝子のヌクレオチド865〜2814（配列番号44）を示す。さらに、配列番号45に示されるHPV16 E1遺伝子の領域の逆相補鎖配列であるリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66R 5'-gtattgccatacccgctgtct-3'（配列番号14）を示す。5'-aaacgaaagt-3'配列は5'-actttcgttt-3' pan-HPVプローブ（配列番号34の逆相補鎖配列である、配列番号25）のハイブリダイゼーションのためのpan-HPVプローブ標的配列である（配列番号34）。前記pan-HPVプローブで検出するために増幅されたHPV16の標的領域は、ヌクレオチド1081〜1274である。
【００７０】
【図５Ｂ】図５Ｂは、フォワードプライマーHPV18 5'-aggtccacaatgatgcacaag-3'（配列番号2）およびそのリバースプライマーが標的とするHPV18 E1ゲノムの標的領域5'-tcagatagtggctatggctgtt-3'（配列番号47）の位置を示すためにマークを付けた、HPV18 E1遺伝子のヌクレオチド914〜2887配列（配列番号46）を示す。リバースプライマーHPV18/45R 5'-aacagccatagccactatctga-3'（配列番号15）を示し、これは配列番号47に示すHPV18 E1ゲノムの標的領域の逆相補鎖配列である。さらに、5'-actttcgttt-3'（配列番号25）のpan-HPVプローブのハイブリダイゼーションのための5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）のpan-HPVプローブ標的配列を示す（配列番号34は配列番号25の逆相補鎖配列である）。前記pan-HPVプローブを使用した検出のために増幅されたHPV16の標的領域はヌクレオチド1134〜1331である。
【００７１】
【図５Ｃ】図５Ｃは、HPV33に関するフォワードプライマー5'-cagaagatgaggatgaaacagcag-3'（配列番号3）、およびリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rの標的結合部位5'agacagcggatatggcaatac3'（配列番号49）を示すためにマークを付けたHPV33 E1遺伝子のヌクレオチド879〜2813（配列番号48）を示し、その配列において、前記リバースプライマーHPV16/31/35/39/52/56/58/66Rに関する標的配列に対してマークを付けたように塩基の違いa/gがあるため、増幅のために使用するプライマー（配列番号14）と比較した場合5'-gtattgccatatccgctgtct-3'（配列番号50）は前記逆相補鎖配列においてミスマッチc/tを示す。配列5'-aagcgaaagt-3'（配列番号36）は前記HPV33nプローブが標的とするHR-HPV33n領域であり、これは前記pan-HPVプローブ（配列番号25）の共通領域と比較してヌクレオチドの違いa/gを有する。配列5'-actttcgctt-3'（配列番号26）は、前記pan-HPVプローブ（配列番号25）と比較した場合ヌクレオチドの違いt/cを有するHR-HPVプローブ33n（配列番号36の逆相補鎖配列）である。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV33の検出のために使用される前記pan-HPVプローブのための標的配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV33の検出のために使用される前記pan-HPVプローブである（配列番号25は配列番号34の逆相補鎖配列である）。前記pan-HPVプローブを使用して検出するために増幅されたHPV33（および33n）の標的領域はヌクレオチド976〜1285である。
【００７２】
【図５Ｄ】図５Ｄは、フォワードプライマーHPV31 5'-gaggaacatgcagaggctgt-3'（配列番号4）およびリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのための標的配列5'-agacagcgggtatggcaatac-3'（配列番号45）の位置を示すためにマークを付けた、HPV31 E1遺伝子のヌクレオチド862〜2751ヌクレオチド（配列番号51）を示す。配列5'-gtattgccatacccgctgtct-3'（配列番号14）はHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのためのリバースプライマーである（配列番号14は配列番号45に示す標的領域の逆相補鎖配列である）。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV31の検出のために使用される前記pan-HPVプローブのための標的配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV31の検出のために使用される前記pan-HPVプローブである（配列番号25は配列番号34の逆相補鎖配列である）。HPV31の検出のために増幅された標的領域はヌクレオチド1087〜1268である。
【００７３】
【図５Ｅ】図５Ｅは、フォワードプライマーHPV35 5'-atgcacaggaggagcaaaca-3'（配列番号5）、およびリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのための標的領域の位置を示すためにマークを付けた、HPV35 E1遺伝子のヌクレオチド868〜2781ヌクレオチド（配列番号52）を示し、ゲノム配列5'-agacagcggttatggcaattc-3'（配列番号53）は、HPV35の標的配列と前記リバースプライマーのための標的配列との間に2つのヌクレオチドの違いt/gおよびt/aを示す。配列番号53と相補的な、配列5'-gaattgccataaccgctgtca-3'（配列番号54）は、前記リバースプライマー（配列番号14）に対して2つのヌクレオチドの違いt/aおよびa/cを示す。配列5'-agacagcgggtatggcaatac-3'（配列番号45）はリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのための標的配列である。配列5'-gtattgccatacccgctgtct-3'（配列番号14）はHPV35の増幅のために使用されるリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rである（配列番号14は配列番号45の逆相補鎖配列である）。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV35の検出のために使用する前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV35の検出のために使用される前記pan-HPVプローブである（それは配列番号34の逆相補鎖配列である）。検出のために増幅されたHPV35 E1遺伝子の標的領域はヌクレオチド1082〜1276である。
【００７４】
【図５Ｆ】図５Ｆは、フォワードプライマー39F 5'-gtgagacagcacaggtacttttac-3'（配列番号6）およびリバースプライマーHPV16/31/33/35/39/52/56/58/66Rのための標的領域5'-agacagcggatatggcaatac-3'（配列番号49）の位置を示すためにマークされた、HPV39 E1遺伝子のヌクレオチド928〜2871（配列番号55）を示し、そこではHPV39の前記標的配列と前記リバースプライマーのための標的配列との間にヌクレオチドの違いa/gが示される。配列5'-gtattgccatatccgctgtct-3'（配列番号50）は配列番号49の逆相補鎖配列でヌクレオチドの違いc/tを示し、HPV16/31/33/35/39/52/56/58/66R（配列番号14）の増幅のために使用されるリバースプライマーはマークを付けた位置に「c」ヌクレオチドを有する。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV39の検出のために使用する前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV39の検出のために使用される前記pan-HPVプローブである（配列番号25は配列番号34の逆相補鎖配列である）。HPV39の検出のために増幅された標的はヌクレオチド1115〜1339である。
【００７５】
【図５Ｇ】図５Ｇは、フォワードプライマーHPV45 F 5'-ccatgcgcaggaagttcag-3'（配列番号7）、およびリバースプライマーHPV18/45 Rのための標的領域5'-tcagatagtggctatggctgtt-3'（配列番号47）、この領域はHPV18および45の両方のためのリバースプライマーが標的とする、を表すためにマークを付けた、HPV45 E1遺伝子のヌクレオチド914〜2845（配列番号56）を示す。配列5'-aacagccaatagccactatctga-3'（配列番号15）はHPV18/45 Rのためのリバースプライマー（配列番号47の逆相補鎖配列）である。配列5'-aaacgaaagt-3'はHPV45の検出のために使用される前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV45の検出のために使用される前記pan-HPVプローブである（配列番号25は配列番号34の逆相補鎖配列である）。HPV45のための検出のために増幅された標的はヌクレオチド1123〜1331である。
【００７６】
【図５Ｈ】図５Ｈは、フォワードプライマーHPV51 F 5'-acaaagaggctgtgcatcag-3'（配列番号8）およびリバースプライマーHPV51 Rのための標的配列5'-actggacagttatccggacag-3'（配列番号58）を示すためにマークされた、HPV51遺伝子を含むHPV51ゲノムの領域（配列番号57）を示す。配列5'-ctgtccggataactgtccagt-3'（配列番号16）はHPV51 Rのリバースプライマー（配列番号58の逆相補鎖配列）である。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV51の検出のために使用される前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV51の検出のために使用される前記pan-HPVプローブである（配列番号25は配列番号34の逆相補鎖配列である）。検出のために増幅された標的HPV51 E1領域はヌクレオチド1103〜1256である。
【００７７】
【図５Ｉ】図５Ｉは、フォワードプライマーHPV52 5'-gaaggggaggatgatttacatgc-3'（配列番号9）およびリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのための標的領域5'-agacagcggctatggcaatag-3'（配列番号60）の位置を示すためにマークを付けたHPV52 E1遺伝子のヌクレオチド864〜2807を示し、HPV52の標的配列と前記リバースプライマーのための標的配列の間に示されるように2つのヌクレオチドの違いg/cおよびc/gがある。配列5'ctattgccatagccgctgtct-3'（配列番号61）は配列番号60の逆相補鎖配列であり、前記逆相補鎖配列とHPV52の増幅のために使用されるリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66R（配列番号14）の間に、示されるような2つのヌクレオチドの違い、c/gおよびg/cが存在する。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV52の検出のために使用する前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV52の検出のために使用される前記pan-HPVプローブである（配列番号25は配列番号34の逆相補鎖配列である）。HPV52 E1遺伝子を検出するために増幅された標的領域はヌクレオチド1083〜1269である。
【００７８】
【図５Ｊ】図５Ｊは、フォワードプライマーHPV56/66 5'-gcaagtacaaacagcacatgc-3'（配列番号10）およびリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのための標的5'-agacagcgggtatggcaatac-3'（配列番号45）の位置を示すためにマークを付けた、HPV56 E1遺伝子のヌクレオチド895〜2805（配列番号62）を示す。配列5'-gtattgccatacccgctgtct-3'（配列番号14）はHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのためのリバースプライマーの配列（配列番号45の逆相補鎖配列）である。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV56の検出のために使用する前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV52の検出のために使用する前記pan-HPVプローブ（配列番号34の逆相補鎖配列）である。HPV56/66の検出のために増幅された標的はヌクレオチド1104〜1267である。
【００７９】
【図５Ｋ】図５Ｋは、フォワードプライマーHPV56/66 5'-gcaagtacaaacagcacatgc-3'（配列番号10）およびリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのための標的5'-agacagtgggtatggcaatac-3'（配列番号64）の位置を表すためにマークを付けた、HPV66 E1遺伝子のヌクレオチド895〜2787ヌクレオチド（配列番号63）を示し、前記リバースプライマーのための標的配列とHPV66の標的配列の間のヌクレオチドの違いc/tに注意が必要である。配列5'-gtattgccatacccactgtct-3'（配列番号65）は、配列番号64の逆相補鎖配列とHPV66の増幅のために使用するリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66R（配列番号14）の間のヌクレオチドの違いg/aを示す。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV66の検出のために使用する前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV56の検出のために使用する前記pan-HPVプローブ（配列番号34の逆相補鎖配列）である。HPV56/66 E1遺伝子の標的領域はヌクレオチド1104〜1262である。
【００８０】
【図５Ｌ】図５Ｌは、フォワードプライマー58 F 5'-agcccgagcgttgtttaatg-3'（配列番号11）、およびリバースプライマーHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのための標的領域の位置を示すためにマークを付けた、HPV58 E1遺伝子のヌクレオチド883〜2817（配列番号66）を示す。配列5'-agacagcggatatggcaatac-3'（配列番号49）は、HPV16/31/33/33ｎ/35/39/52/56/58/66Rのリバースプライマーのための標的配列に対してヌクレオチドの違いg/aを示す。配列5'-gtattgccatatccgctgtct-3'（配列番号50）は、配列番号49の逆相補鎖配列とHPV58を増幅するために使用するHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rのためのリバースプライマーの間のヌクレオチドの違いc/tを示す。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV58の検出のために使用する前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV58の検出のために使用する前記pan-HPVプローブ（配列番号34の逆相補鎖配列）である。HPV58の検出のために増幅された標的はヌクレオチド1077〜1289である。
【００８１】
【図５Ｍ】図５Ｍは、フォワードプライマーHPV59 F 5'-ggccttgtttaatgtgcaggaag-3'（配列番号12）およびリバースプライマーHPV59 Rが標的とする領域5'-gaaggttamtaacagtgccagaca-3'（配列番号68）の位置を示すためにマークを付けた、HPV59 E1遺伝子のヌクレオチド872〜2806（配列番号67）を示し、mはヌクレオチドの変更c/aを示す。配列5'-tgtctggcactgttaktaaccttc-3'（配列番号17）はHPV59の増幅のために使用したリバースプライマー（配列番号68の逆相補鎖配列）であり、kはヌクレオチドの変更g/tを示す。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV59の検出のために使用する前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV59の検出のために使用する前記pan-HPVプローブ（配列番号34の逆相補鎖配列）である。HPV59 E1遺伝子を検出するために増幅した標的領域はヌクレオチド1172〜1265である。
【００８２】
【図５Ｎ】図５Ｎは、フォワードプライマーHPV68 F 5'-caaacaggtgacacagtctcag-3'（配列番号13）およびリバースプライマーHPV68 Rのための標的配列5'-agcaaagtcgccattacagga-3'（配列番号70）の位置を示すためにマークを付けたHPV68 E1ヌクレオチド824〜2746（配列番号69）を示す。配列5'-tcctgtaatggcgactttgct-3'（配列番号18）はHPV68のためのリバースプライマー（配列番号70の逆相補鎖配列）である。配列5'-aaacgaaagt-3'（配列番号34）はHPV68の検出のために使用する前記pan-HPVプローブのための標的共通配列である。配列5'-actttcgttt-3'（配列番号25）はHPV68の検出のために使用する前記pan-HPVプローブ（配列番号34の逆相補鎖配列）である。HPV68 E1の検出のために増幅された標的部位はヌクレオチド902〜1137である。
【００８３】
図６Ａおよび６Ｂは、本発明の様々な実施形態に従ったプローブおよびプライマーの配列と共にHPV株16と18に関する高リスクのHPVゲノム E1領域の配列、および第二の検出チャネル560nm HEXで検出するためにそれらがハイブリダイズするHPVゲノムの対応領域を示す。
【００８４】
【図６Ａ】図６Ａは、第二の検出チャネル（560nm）に関するHPV16の増幅のためのフォワードプライマーHPV16 F HEX 5'taatggatggttttatgtagaggct-3'（配列番号19）およびリバースプライマーHPV16 R HEXのための標的配列5'-ataatgattatttaacacaggcag-3'（配列番号71）の位置を示すためにマークを付けたHPV16 E1遺伝子配列ヌクレオチド865〜2814ヌクレオチド（配列番号44）を示す。配列5'-ctgcctgtgttaaataatcattat-3'（配列番号20）はHPV16 R HEXプライマー配列である（配列番号20は配列番号71の逆相補鎖配列である）。配列5'-atatcagatgacgag-3'（配列番号27/31/38）はHR HPV16/18プローブの配列である。第二の検出チャネル（560nm HEX）でのHPV16の増幅および検出のための標的はヌクレオチド909〜1051である。
【００８５】
【図６Ｂ】図６Ｂは、フォワードプライマーHPV18 F HEX 5'-ggctggttttatgtacaagct-3'（配列番号21）およびリバースプライマーHPV18 R HEXが標的とする領域5'-aaggaacattttgtgaacagg-3'（配列番号72）の位置を示すためにマークを付けた、HPV18 E1遺伝子のヌクレオチド914〜2887（配列番号46）を示すが、配列番号46に示す対応するHPV18 E1ゲノム配列に対してヌクレオチドの違いc/tがあることに注意されたい。
【００８６】
配列5'-cctgttcacaaaatgttcctt-3'逆相補鎖配列（配列番号22）は、第二の検出チャネル（560nm HEX）におけるHPV18の増幅のために使用されるHPV18R HEXプライマー配列である。配列5'-atatctgatgacgag-3'（配列番号27/31/39）は、HR HPV16/18プローブ5'-atatcagatgacgag-3'（配列番号27/31/38）に対してヌクレオチドの違いA/Tを示すHPV18の配列である。第二の検出チャネル（560nm HEX）におけるHPV18のための標的領域はヌクレオチド959〜1097である。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
前記したように、そして付随する実施例および図面により詳細に示されるように、本発明の一態様は本明細書に開示されたHPVのための核酸プローブを含む組成物である。前記プローブはリアルタイムPCRにおいて使用するのに適した任意の標識で標識しうる。標準的な標識は直鎖状プローブの両端に位置する、蛍光色素分子およびクエンチャーであり、例えば、前記蛍光色素分子は前記プローブの5'末端に、前記クエンチャーは3'末端に付けられてもよい。前記プローブは本明細書に提示したプローブ配列、またはその逆相補配列（前記プローブが結合するHPVゲノムのE1領域の標的配列に対応する）を含むか、またはそれらからなるヌクレオチド配列を有しうる。例えば、前記ヌクレオチド配列は、本明細書においてHR-HPVプローブとも呼ばれる、pan-HPVプローブACTTTCGTTT（配列番号25）であってもよい。この配列の逆相補鎖配列はAAACGAAAGT（配列番号42）である。
【００８８】
好ましくは、前記プローブは、ヌクレオチド配列がLNAヌクレオチドを含む、LNAプローブ分子である。有利なことに、LNAを含むプローブは、依然としてハイブリダイゼーションの高い特異性をもたらしながら、より短い配列長さを使用することを可能にする。本発明に従ったHPVプローブは、一般に、長さが8、9、10、11、12、13、14、15または16ヌクレオチドである。例えば、プローブの長さは、最大15ヌクレオチドであってもよく、本明細書に提示するプローブ配列またはその逆相補鎖配列を含んでいてもよい。前述したように、LNAヌクレオチドはデオキシリボースの分子内に付加的なメチレン架橋を含有する。これらの追加のメチレン架橋は前記プローブ内の少なくとも８、９または１０のヌクレオチド内に任意に存在する。メチレン架橋は前記プローブ内のいくつかのヌクレオチドに存在しなくてもよい。プローブ配列におけるメチレン架橋の正確な位置の例は、以下の実施例1（d）に示される。
【００８９】
本発明の基礎となる重要な発見の1つは、このような短いLNAプローブが、発癌性HPV型間で相同性の領域に指向しうる、そして広範囲の発癌性HPV株を単一プローブまたは少数のプローブ、例えば1つ、2つ、または3つのプローブを使用して特異的に検出可能とする十分な特異性を伴ってハイブリダイズしうるということである。したがって、本発明によるプローブは複数の発癌性HPVとハイブリダイズすることができる、pan-HPVプローブであってもよい。発癌性HPV株には、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV33n、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68が含まれる。好ましくは、本発明によるpan-HPVプローブは、例えば、以下の表1に示すような、E1遺伝子におけるHPVゲノムの領域を標的とする。
【表１】
2017513522.tif 000002
【００９０】
好ましくは、本発明によるHPV16/18プローブは、例えば、以下の表2に示すような、E1遺伝子におけるHPVゲノムの領域を標的とする。
【表２】
2017513522.tif 000003
【００９１】
本明細書に記載のプローブは、試料中の発癌性HPVの存在を検出するためか、または試料が発癌性HPVについての検査で陽性または陰性であるかどうかを特異的に判定するための診断方法の一部として含まれる、HPVの検出に使用するために提供されてもよい。試料は発癌性HPVに関して検査されるいかなる材料、対象由来の、例えば、ヒト患者由来の生物学的材料を含む試料であってもよい。前記生物学的材料は頸管スミアからえられてもよい。好ましくは、前記試料は、ヒト頸管スミア由来の液体ベースの細胞学的試料である。前記プローブはリアルタイムPCRによるHPV検出に使用するために最適化される。前記プローブと組み合わせて使用するのに適したプライマーも記載され、本発明のさらなる態様を表す。
【００９２】
したがって、本発明の一態様は、試料が発癌性HPVについての検査で陽性であるかどうかを判定する方法であって、前記方法は、
前記試料を、発癌性HPVゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のためのプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識されたpan-HPVプローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識されたpan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示される。
【００９３】
pan-HPVプローブの例は本明細書中に記載されており、例えば、配列ACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列を含む標識されたLNA分子である。前記pan-HPVプローブはACTTTCGTTT（配列番号25）からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子であってもよい。
【００９４】
適切なプライマーの例も本明細書に記載されている。好ましくは、前記プライマーはHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68のいずれかの標的領域の増幅のためのプライマーである。前記方法は、これらのHPV型の全ての増幅のためのプライマーの組み合わせと前記試料を組み合わせることを含んでいてもよいため、前記試料中にHPVが存在すれば、いかなるそのようなHPVの検出も可能となる。
【００９５】
前記pan-HPVプローブが発癌性HPVの特定のセット（例えば、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68のセット）に属する任意のHPVを特異的に検出するために設計されたプローブであってもよいため、全てのこのようなプライマーを用いたアッセイにおける標識した前記pan-HPVプローブからの信号の検出により、結果として、前記試料がこれらの発癌性HPVの少なくとも1つについての検査で陽性であることが示されるが、これらの状況において信号がなければ、前記試料がこれらの発癌性HPVについての検査で陰性であることが示される。前記検査は、以下の実施例で説明するアッセイの検出の限界を考慮して、絶対的な確実性をもたらさない可能性はあるが、本発明の方法は優れた精度と発癌性HPVの検査の代替法との一貫性をもたらすことが示されている。本発明の方法は、所望すれば、1または複数のさらなる技術、例えば、前記試料中の細胞の目視試験などと組み合わせて、発癌性HPVの存在または非存在についてのさらなる信頼性を提供しうる。
【００９６】
異なるHPV特異性の複数のプローブを使用することにより、検出されるHPVの範囲が拡張されかつ/または前記試料中に存在するHPVの型に関する情報が提供できるようになる。例えば、配列番号25の前記pan-HPVプローブは、この標的領域におけるHPV33nゲノム配列の差異に起因して、他の発癌性HPVの標的領域よりもHPV33nの標的領域とより弱く結合する可能性がある。したがって、本発明はHPV33nにおける標的領域により強くハイブリダイズするためのHPV33nのための補助的なプローブを提供する。本明細書に記載する例示的な33nプローブは配列ACTTTCGCTT（配列番号26）またはその逆相補鎖配列を含む。前記33nプローブはACTTTCGCTT（配列番号26）からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子であってもよい。それはLNAプローブであってもよい。HPV33nのためのプローブは本発明の方法においてpan-HPVプローブと組み合わせてもよい。好都合なことに、両プローブが同じに（例えば、同一蛍光色素分子で）標識されている場合は、その後、それらは共通の信号（例えば、同一波長の蛍光）を発することになる。結果的に、この信号の検出により、前記pan-HPVプローブまたは前記33nプローブが結合した任意のHPVの存在が示され、例としては、それにより、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV33n、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68のセットに属する任意の発癌性HPVの存在が示される可能性がある。
【００９７】
したがって、試料が発癌性HPVについての検査で陽性であるかどうかを判定する方法は、前記試料を、HPV33nの標的領域の増幅のためのプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された33nプローブと追加的に組み合わせ、前記33nプローブおよび前記pan-HPVプローブは同一標識を担持し、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された33nプローブまたは前記pan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含んでいてもよく、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示される。
【００９８】
本発明の別の態様は、HPV16および/またはHPV18についての試料を特異的に検査する方法である。HPV16およびHPV18が最も高い発癌性を有しており、子宮頸癌の最大のリスクと関連していると考えられているため、HPVのこれらの株の検出は特に重要である。HPV16/18を検出する方法は単独で行ってもよいが、前記試料中に存在するHPVが型HPV16またはHPV18であるか、またはウイルスの異なる株に属するどうかに関する追加情報を提供するために、前述のpan-HPV検出方法と組み合わせることが有効である。
【００９９】
したがって、試料が発癌性HPVについての検査で陽性であるかどうかを判定する前記方法は、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを追加的に判定することを含んでいてもよく、前記方法は：
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のためのプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含んでいてもよく、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示される。
【０１００】
HPV16およびHPV18のためのプローブの例は、本明細書に提示され、配列ATATCWGATGACGAG（配列番号27）またはその逆相補鎖配列を含むLNA分子を含む。
【０１０１】
組み合わせた検出方法において前記pan-HPV信号からのHPV16/18信号の分離を容易にするために、前記pan-HPVとは異なる信号（例えば、異なる波長での蛍光）を発するように、前記16/18プローブは異なって（例えば、異なる蛍光色素分子で）標識されてもよい。
【０１０２】
所望により、陽性および/または陰性対照が前記方法に含まれてもよい。通常は、前記リアルタイムPCRのための陽性対照試験を実施することは、前記試料を、前記試料中に存在する対照DNA配列（例えば、ヒトDNA）のリアルタイムPCR増幅のためのプライマー、および前記対照DNA配列の増幅に基づいて信号を発することができる標識された対照プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記対照プローブからの信号に関して測定すること
を含むことになり、
前記方法において、前記信号の検出により、前記リアルタイムPCRが機能していることが示される。
【０１０３】
好ましくは、実施例に説明するように、本発明の方法はマルチプレックスで行われる。したがって、前記リアルタイムPCRのための複数のプローブ（pan-HPVプローブ、33nプローブ、16/18プローブおよび対照プローブ：の任意の2つ以上、または全て）およびそれらの対応するプライマーが単一の反応混合物中に含まれていてもよい。異なる標識の使用および異なるチャネルでの信号の検出（例えば、異なる波長での蛍光）により、異なるプローブからの信号を区別することが可能になる。前記反応混合物は前記リアルタイムPCRのために適切な緩衝液および他の試薬を含有することになる。PCRのための試薬および反応条件の例は周知であり、実施例に提示されている。
【０１０４】
本発明の実施形態を以下に示す。
実施例Ｉ．  診断検査の実施形態
本実施形態では、全ての研究した発癌性HPVウイルスの存在および16と18のHPV型の存在を検査試料中で判定した。
【０１０５】
好ましくは、陽性対照試料をHPV16ヌクレオチド配列およびヒトβグロビンの配列の断片から調製した。
【０１０６】
好ましくは、１つの対照陽性試料と１つの対照陰性試料を各アッセイに適用した。本実施形態において、前記陽性対照試料により、実施した反応の正当性（前記陽性対照試料に劣化がなく、試薬の活性が適切であり、装置の温度プロファイルが正しく、反応が阻害されていないこと）が示される。陰性対照試料により、HPVを含む生物学的材料または増幅されたPCR産物によるDNAの溶出液および試薬の汚染がDNAの単離および増幅反応の準備の間に発生したかどうかの検証が可能となる。少なくとも1つの検出チャネルにおいて陽性信号が前記陰性対照試料に関して検出された場合は、前記陰性対照試料または試薬の汚染が発生したことを意味する。
【０１０７】
さらに、各臨床検査試料がHR HPVを検出するために必要なDNAの十分な量を含むかどうかを確認するために適用されるヒトβグロビンの配列の断片を含む、内部対照（IC）を使用した。また、前記内部対照からの信号により、DNA単離が適切に実施され、反応阻害物がなかったことが示される。好ましくは、前記陽性対照試料は前記内部対照の配列を含む。前記陰性対照試料は当然3つの検出チャネルにおいて陰性の結果を生じる。
【０１０８】
１．本発明で使用したプライマー、プローブおよび対照試料の配列
【表３】
2017513522.tif 000004
【０１０９】
【表４】
2017513522.tif 000005
【０１１０】
【表５】
2017513522.tif 000006
【０１１１】
【表６】
2017513522.tif 000007
【０１１２】
2．本発明の反応混合物中のプライマーおよびプローブの適用濃度
【表７】
2017513522.tif 000008
【０１１３】
【表８】
2017513522.tif 000009
【０１１４】
【表９】
2017513522.tif 000010
【０１１５】
【表１０】
2017513522.tif 000011
適切な量のプライマーおよびプローブを上記の濃度で調製した。前記混合物を調製する前に、全ての成分をボルテックスし、遠心分離した。その後、前記混合物を適当な部分に分割し、試験管に入れた。
【０１１６】
３．Master MIX MabPROBE分析の説明
Real-Time Master MIX MabProbeは、リアルタイムPCR用の2.083倍濃縮混合物である。それには、モノクローナル抗体でブロックされたTaqポリメラーゼおよびリアルタイムPCRのために必要な他の成分が含まれる。前記混合物の成分は最終混合物に適切な部分で組み合わされ、その最終混合物を使用することにより汚染および人的エラーのリスクが低減した。前記キットは、以下を含む：
-Master MIX MabPROBE
-プローブおよびプライマーの混合物
-陽性対照試料
-陰性対照試料
-水
前記Master MIX MabPROBE混合物の組成：
-Run MAbポリメラーゼ0.104 U/μl
-反応緩衝液：トリス塩酸20.83mM pH8.0、
KC1 104nM
MgCl2 - 10.42mM
-dNTP - 2.75mM（0.69mMの各dNTP）
-PCR安定剤
前記検査の全構成成分は暗所にて20℃で保存されている。再融解および構成成分の再凍結により、それらの活性の劣化は引き起こされない。それらはドライアイス上での輸送を要する。
【０１１７】
４．検査プロトコル：
a.全ての成分を氷上に置く。プライマー、プローブおよび前記Master MIX MabPROBE混合物、陽性対照試料および陰性対照試料をボルテックスし、短時間遠心分離する。
【０１１８】
b.以下の表に、一反応用の成分の量を示す。より多くの分析を行うためには、検査試料、陽性対照および陰性対照を考慮して、前記混合物の組成を適切に再計算する必要がある。1：200の希釈でのUNG酵素の添加は任意であり、それを水と置換してもよい。個々の構成成分の適切な量をエッペンドルフ型の1.5ml試験管中で一緒に混合し、その後、えられた混合物をボルテックスし、短時間遠心分離する。
【表１１】
2017513522.tif 000012
【０１１９】
c.前記反応を実施するために使用される装置専用の試験管に19μlの前記混合物を入れる。
【０１２０】
d.次に、引き続いて各試験管に6μlの検査DNA、陽性対照および陰性対照を添加し数回再ピペッティングを行う。このようにして調製した混合物を短時間遠心分離する。
【０１２１】
e.サーマルサイクラーに試料を入れる。
【表１２】
2017513522.tif 000013
【０１２２】
前記検査は以下の装置で確認した。
ライトサイクラー（Light Cycler）2.0、ライトサイクラー・ロシュ96、ライトサイクラー・ロシュ480、バイオラッドCFXTouch。色補正を必要とする装置は、正しい形式でのファイルを伴う検査または自己実行補正のための色素キットの製造元が提供している。
【０１２３】
５．結果の解釈
本発明によれば、特定の試料中のウイルスの存在は、その特定のプライマー対を含む産物の増幅によって証明される。
【０１２４】
本実施形態では、HPVウイルスの存在を示す反応産物が、前記検査試料に関して観察された蛍光の変化の結果として作成された対数増加曲線の分析により同定された。陽性試料は陰性試料中の蛍光の比較的一定なレベルに対する蛍光レベルの対数増加によって特徴付けられた。好ましくは、前記分析は適切な対照：陰性、陽性および内部対照を用いて実施された。えられた画像を図１〜３に示す。
【０１２５】
図１に、好ましくは、陽性対照試料、陰性および陽性対照試料ならびに陰性臨床試料を用いた、全ての発癌性検査HPV型に関するリアルタイムPCRの結果を示した。本発明の実施形態によれば、調査した試料中の発癌性HPVの存在または不存在が530nmでの検出チャネルで読み出される。前記陽性臨床試料中のPCR産物の対数増加により、全ての調査した発癌性HPV型のグループから少なくとも1つの存在が示される。前記陰性臨床試料中でPCR産物の対数増加がないことにより、発癌性HPVの存在を欠くことが立証される。好ましくは、陽性および陰性対照試料は530nmでの検出チャネルに適用された。前記結果の解釈を容易にするために、前記対照試料を臨床検査試料と比較することが好ましい。
【０１２６】
図２に、好ましくは、陽性対照試料、陰性および陽性対照試料ならびに陰性臨床試料を用いた、16および18HPV型に関するリアルタイムPCRの結果を示した。本発明の実施形態によれば、調査した試料中の16または18HPV型の存在または不存在が560nmでの検出チャネルで読み出される。前記陽性臨床試料中のPCR産物の対数増加により、調査した発癌性16および18HPV型から少なくとも1つの存在が示される。前記陰性臨床試料中でPCR産物の対数増加がないことにより、発癌性16および18HPVの存在を欠くことが立証される。好ましくは、陽性および陰性対照試料は560nmでの検出チャネルに適用された。前記結果の解釈を容易にするために、前記対照試料を臨床検査試料と比較することが好ましい。
【０１２７】
図３に、好ましくは、陽性対照試料、陰性および陽性対照試料ならびに陰性臨床試料を用いた、内部対照（IC）に関するリアルタイムPCRの結果を示した。本発明の実施形態によれば、調査した試料中の前記内部対照（IC）の存在または不存在が610nmでの検出チャネルで読み出される。前記陽性対照試料中ならびに前記陽性および陰性臨床試料中のPCR産物の対数増加により、ヒトβグロビンの断片の存在が示され、反応の正確な経過および全ての調査した発癌性HPV型を検出するのに必要とされるDNAの適切な量についての証拠がもたらされる。前記陰性臨床試料中でPCR産物の対数増加が存在しないことにより、ヒトDNAまたは増幅されたPCR産物による汚染の存在がないことが示唆される。前記結果の解釈を容易にするために、前記対照試料を臨床検査試料と比較することが好ましい。
【０１２８】
本実施形態は本発明の範囲を限定する実施例ではない。前記反応産物は当業者に知られている任意の方法によって同定することができる。
【０１２９】
好ましくは、調査した試料中に存在する前記ウイルスの任意の特定の配列を同定するために配列決定を行うことができる。
【０１３０】
プライマーHPV16 FおよびHPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66Rの対からえられた例示的なPCR産物を以下に示した（配列番号：43）：
HPV16 F
5’GCACAGGAAGCAAAACAACATAGAGATGCAGTACAGGTTCTAAAACGAAAGT ATTTGGGTAGTCCACTTAGTGATATTAGTGGATGTGTAGACAATAATATTAGTCC TAGATTAAAAGCTATATGTATAGAAAAACAAAGTAGAGCTGCAAAAAGGAGATT ATTTGAAAGCGAAGACAGCGGGTATGGCAATAC3’
HPV16/31/33/33n/35/39/52/56/58/66R
【０１３１】
実施例ＩＩ．  発癌性HPV型の検出のためのプライマーおよび分子プローブの異なるキットの有効性の評価
第一のステップには、16/18HPVに関する追加の検出チャネルを分離するために、前述のプライマーおよび分子プローブの組成の改変が含まれた。疫学的データによれば、HPV16およびHPV18は、感染女性における最も高い発癌性と子宮頸癌の発症のリスクによって特徴付けられる。したがって、臨床目的のために、具体的には、集団ベースのスクリーニング検査のために使用されるHPV検査にとって、発癌性HPVの感染を識別するだけでなく、前記の調査した試料中のHPV16/18の存在を判定することも可能にすることが推奨される。したがって、全ての発癌性HPV型のグループおよび内部対照のための系を用いる単一反応においてHPV16/18の区別を可能にする複数のプライマーと1つの分子プローブの追加キットを設計した。実施した研究の結果、HPV16およびHPV18に関する4つのプライマーと、560nmでのチャネルにおけるアンプリコンの検出を可能にする、HEX蛍光色素で標識された１つの短いプローブTaqMan-LNAをえた。全ての発癌性HPV型についての共通領域から約700bpの距離に位置する、HPVゲノムのE1領域を、プライマーおよび共通LNAプローブのための標的配列として選択した。この場合、前記内部対照系をリアルタイムPCRのために好ましく改変した。βグロビンについての参照ヒト遺伝子の方を選んで前記合成ヌクレオチドを排除した。2つのプライマーおよびROX色素（610nmでの検出チャネル）で標識したTaqManプローブを、前記試料中に潜在的に存在する、HPV粒子と一緒にこの遺伝子の一段増幅（single-stage amplification）のために設計した。その結果、標的反応混合物は26のプライマーと4つの分子プローブを含んだ。以前に遺伝子型決定の細胞学的試料の検査を行った結果として、プライマーダイマー型の生成物も、他の非特異的なPCR増幅産物のいずれも観察されなかった。
【０１３２】
前記分析の目的は、プライマーおよびLNA-TaqManプローブの選択された構成が臨床細胞学的材料中の発癌性HPV型の検出において最も高い効率によって特徴付けられているかどうかを確認することであった。プライマーおよびプローブの潜在的に最適な系を含む新規な検査の比較分析は、パラメータ、例えば、発癌性HPV型の検出の感度と特異性、全ての発癌型を含む、個々のHPV型の検出閾値、および、CE-IVD認証により臨床使用が承認されている、臨床的に検証されたHPV PapilloCheck検査（グライナー・バイオワン（Greiner Bio-One））でえられた結果との相関、を評価することにより行われた。
【０１３３】
前記分析には、発癌性HPV型（hrHPV）の存在に関する新規検査および検証されたPapilloCheck検査の結果の1256対が含まれる。その材料は、西ポモージェ県とヴィエルコポルスカ県に居住する女性から集められ、彼女らには、定期的な予防細胞学的試験に参加し、通常の細胞学的結果の患者720人（57.3％）と、診断カテゴリーASC-US（n=249;19.8％）、ASC-H（n=20;1.6％）、L-SIL（n=232;18.5％）とH-SIL（n=34;2.7％）およびL-SIL/H-SIL（n=1;0.1％）に属する、異常な上皮細胞の存在が細胞学的試験で明らかとなった選択された女性536人（42.7％）が含まれる。調査した前記女性の平均年齢は33.4±9.6歳（範囲：16〜66歳）に相当した。リアルタイムPCRのためのDNAは、サーベックスブラシコンビブラシ（ロバース）を用いて、シュアパス（SurePath）液状媒体（ベクトン・ディッキンソン）に集めた細胞学的試料（頸管スミア）から単離された。DNAの単離はNucliSense EasyMAG装置（ビオメリュー）において磁気ビーズを使用して自動的に行われた。DNA増幅はライトサイクラー96装置（ロシュ）で行われた。PrepStainロボット（ベクトン・ディッキンソン）を用いて調製した、薄層細胞学的スライドは、コンピュータ支援スクリーニング（フォーカルポイントGSシステム（Focal Point GS system）、ベクトン・ディッキンソン）を使用して細胞形態学者と病理学者の経験豊富なチームによって評価された。hrHPVおよびPapilloCheck検査を用いて行った細胞学的および分子遺伝学的検査の結果は統計解析に供された。設計したhrHPV検査で選択したHPVの検出閾値（ウイルス粒子/ゲノムの最小コピー数）を決定した。この目的のために、言及されたウイルス（ヒトパピローマウイルスのための第一WHO国際標準、国立生物学的製剤研究所、英国）の既知数のコピーのHPV16およびHPV18の参照材料を購入した。
【０１３４】
HPV16およびHPV18標準の11連続希釈を行って、リアルタイムPCRを用いて以下の検出閾値を定義するために、一連の操作を３回繰り返して標準曲線をえた：
HPV16標準：HR-HPV（FAM）チャネル-対照希釈 1：128-ウイルスの2×104コピー
16/18HPVチャネル（HEX）-対照希釈 1：2048-ウイルスの3.33×103のコピー
HPV18標準：HR-HPVチャネル（FAM）-対照希釈 1：128-ウイルスの5×104のコピー
16/18HPVチャネル（HEX）-対照希釈 1：2048-ウイルスの1.92×103のコピー
【０１３５】
注目すべきは、第二の検出チャネルにおける16/18HPVの検出閾値は、第一の検出チャネルにおける全ての発癌性HPVのグループと比較して低いことであり、このことは前記検査（高い発癌性のHPV型を標的とする）の臨床的有効性の点で有利な現象であると思われる。また、前記新規検査と参照PapilloCheck検査の前記した相関係数を考慮すると、発癌性HPV型の検出閾値は両検査に関して類似していると結論付けることができることが強調されるべきである。
【０１３６】
前記hrHPV検査の構成成分の他の微生物との可能な交差反応も評価した。この目的のために、入手可能な文献（P. Gajerら: Temporal dynamics of the Human vaginal microbiota、Science Translational Medicine 2012, 4, 132ra52；S. S.ウィトキン(Witkin)、W.J. レッダー（Ledger）：Complexities of the uniquely human vagina. Science Translational Medicine 2012, 4, 132fs1 1：を含む）の検討に基づき、４２菌株、女性の生殖器官の標準的な生理学的な常在菌、および泌尿生殖器系の最も一般的な感染症を引き起こす病原体を選択した。選択した細菌の参照株は、ATCC：国際的なバイオリソースセンターで購入し、それらは以下を包含した：大腸菌（Escherichia coli）ATCC 11775、大腸菌（Escherichia coli）ATCC 8739、プロテウス・ブルガリスATCC 6380、プロテウス・ミラビリスATCC 7002、表皮ブドウ球菌ATCC 49461、ストレプトコッカス・アガラクティエ（B）ATCC 12386、リステリア・モノサイトゲネス（4e）ATCC 19118、リステリア・モノサイトゲネス（4e）ATCC 19118、リステリア・イノキュア（6a）ATCC 33090、ラクトバチルス・ガセリATCC 19992、ラクトコッカス・ラクチスATCC 19435、ラクトバチルス・アシドフィルスATCC 4356、カンジダ・アルビカンスATCC 10231、コリネバクテリウム・ウレアリティクムATCC 43044、オリゲラ・ウレトラリスATCC 17960、アエロコッカス・ヴィリダンスATCC 700406、淋菌ATCC 49226、ガードネレラ・バジナリスATCC 14018、ベイヨネラ・パルブラATCC 10790、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムATCC 25586、ゲメラ・モルビロルムATCC 27824、アクチノマイセス・オドントリティカスATCC 17929、ペプトストレプトコッカス・アネロビウスATCC 27337、パルビモナス・マイクラATCC 33270、ウレアプラズマ・パルブムATCC 27813、ペプトニフィラス・アサッカロリチカスATCC 14963、フィネゴルディア・マグナATCC 29328、ポルフィロモナス・レビイATCC 29147、プレボテラ・レーシェイATCC 15930。
【０１３７】
行った実験の過程で、前記hrHPV検査においてプライマーおよびプローブの設計した系と前記微生物との間に交差反応はえられなかった。
【０１３８】
結論として：前記した研究により、3つの検出チャネルにおける発癌性HPV型、HPV16/18および内部対照の一段増幅に好都合なプライマーおよび反応混合物の最適なキットの開発がもたらされた。
【０１３９】
1256人の女性のグループにおいて前記新規検査と前記参照検査（PapilloCheck）の結果との相関関係の比較研究をさらなる統計分析の目的で行った。
【０１４０】
前記参照検査と類似するHPV16/18および他の発癌性HPV型に関する臨床的に所望する検出閾値がえられた。
【０１４１】
女性の生殖器官に存在する他の微生物と前記新規検査との交差反応は認められず、それによって前記検査の高い特異性が証明される。
【０１４２】
実施例ＩＩＩ．  発癌性HPVウイルスの存在を検出するための新規なHR-HPV検査の有効性に関する結果分析と統計
HR-HPVのための新規検査の診断価値を決定するために、検証されたPapilloCheck検査（グライナーバイオワン）に関連するその感度と特異性を測定した。後者の検査は、文献に詳細に記載されている、HPV16/18を含む、HR-HPV感染症のための最適な診断精度によって特徴付けられると仮定された。したがって、それを前記新規検査のための参照として使用した。また、両検査の相関係数を求めた。これは定性試験の検証の場合に適用する標準的な手順であり、これにより、現在使用されているゴールドスタンダードを新規ツールと置き換えることができるかどうかの決定が可能になる。前記分析はNZOZ Meditestによりえられた細胞学的および分子遺伝学的試験の結果に基づいて行われた。
【０１４３】
前記新規検査の結果と前記参照検査の結果の間の相関のレベルは、ケンドールのタウb相関係数の値に基づいて評価した。真陽性および真陰性の結果の割合として理解される前記参照検査と比較した前記新規検査の感度および特異性は、それぞれ、ROC分析に基づいて評価した。全ての統計的計算はStatistica 10ソフトウェアパッケージ（スタットソフト（StatSoft）、米国オクラホマ州タルサ）を用いて行った。
【０１４４】
調査したグループ全体におけるHR-HPVの検出
1256対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は630（50.2％）の陽性結果と626（49.8％）の陰性結果をもたらした。前記参照検査は647（51.5％）の陽性結果と609（48.5％）の陰性結果をもたらした。
【表１３】
2017513522.tif 000014
前記新規検査の18（2.9％）の陽性結果の場合に、前記参照検査は陰性結果を生じた。前記新規検査の35（5.6％）の陰性結果の場合に、前記参照検査は陽性結果を生じた。両検査に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.9159327と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して94.6％の感度と97.0％の特異性によって特徴付けられることが示された。
【０１４５】
調査したグループ全体におけるHPV16/18の検出
1256対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は230（18.3％）の陽性結果と1026（81.7％）の陰性結果をもたらした。前記参照検査は238（18.9％）の陽性結果と1018（81.1％）の陰性結果をもたらした。
【表１４】
2017513522.tif 000015
前記新規検査の7（3.0％）の陽性結果の場合に、前記参照検査は陰性結果を生じた。前記新規検査の15（1.5％）の陰性結果の場合に、前記参照検査は陽性結果を生じた。両検査に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.9424401と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して93.7％の感度と99.3％の特異性によって特徴付けられることが示された。
【０１４６】
細胞診で正常を示すグループにおけるHR-HPVの検出
720対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は154（21.4％））の陽性結果と566（78.6％）の陰性結果をもたらした。前記参照検査は165（22.9％）の陽性結果と555（77.1％）の陰性結果をもたらした。
【表１５】
2017513522.tif 000016
前記新規検査の9（5.8％）の陽性結果の場合に、前記参照検査は陰性結果を生じた。前記新規検査の20（3.5％）の陰性結果の場合に、前記参照検査は陽性結果を生じた。両検査に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.8841279と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して87.9％の感度および98.4％の特異性によって特徴付けられることが示された。
【０１４７】
細胞診で正常を示すグループにおけるHPV16/18の検出
720対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は52（7.2％））の陽性結果と668（92.8％）の陰性結果をもたらした。前記参照検査は53（7.4％）の陽性結果と667（92.6％）の陰性結果をもたらした。
【表１６】
2017513522.tif 000017
前記新規検査の3（5.8％）の陽性結果の場合に、前記参照検査は陰性結果を生じた。前記新規検査の4（0.6％）の陰性結果の場合に、前記参照検査は陽性結果を生じた。両検査に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.9281394と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して92.5％の感度および99.6％の特異性によって特徴付けられることが示された。
【０１４８】
細胞診で異常（最小ASC-US）を示すグループにおけるHR-HPVの検出
536対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は476（88.8％）の陽性結果と60（11.2％）の陰性結果をもたらした。前記参照検査は482（89.9％）の陽性結果と54（10.1％）の陰性結果をもたらした。
【表１７】
2017513522.tif 000018
前記新規検査の9（1.9％）の陽性結果の場合に、前記参照検査は陰性結果を生じた。前記新規検査の15（25.0％）の陰性結果の場合に、前記参照検査は陽性結果を生じた。両検査に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.7658275と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して96.9％の感度と83.3％の特異性によって特徴付けられることが示された。
【０１４９】
細胞診で異常（最小ASC-US）を示すグループにおけるHPV16/18の検出
536対の検査の結果の合計を分析した。前記新規検査は178（33.2％）の陽性結果と358（66.8％）の陰性結果をもたらした。前記参照検査は185（34.5％）の陽性結果と351（65.5％）の陰性結果をもたらした。
【表１８】
2017513522.tif 000019
前記新規検査の4（2.2％）の陽性結果の場合に、前記参照検査は陰性結果を生じた。前記新規検査の11（3.1％）の陰性結果の場合に、前記参照検査は陽性結果を生じた。両検査に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.9379317と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は前記参照検査と比較して94.1％の感度および98.9％の特異性によって特徴付けられることが示された。
【０１５０】
結論
ケンドールのタウb係数の分析により、前記新規検査の結果は76.6％から91.5％までに及ぶHR-HPV検出の範囲内で前記参照PapilloCheck検査の結果との非常に高い相関によって特徴付けられることが明らかとなった。95％の理想的な閾値に近い（92.8％〜94.2％の）、より高いレベルの相関がHPV16/18の検出に関してえられた。
【０１５１】
前記新規検査の高い診断精度は高感度（hrHPVに関して87.9％〜96.9％およびHPV16/18に関して92.5％〜94.1％）および特異性（HR-HPVに関して83.3％〜98.4％およびHPV16/18に関して98.9％〜99.3％）によって確認される。HPV16/18の検出に関する新規検査の非常に高い特異性は、特に注目に値し；えられた値により、前記検査の陰性結果によってほぼ100％の確率でHPV16またはHPV18感染の存在が排除されることが証明される。前記新規検査の高レベルの相関、感度および特異性が細胞診で正常な結果および異常な結果を示す患者の両方のサブグループで観察されたという事実により、このツールの汎用性が確認される。
【０１５２】
結論として：行った調査の結果、本発明に従ったhrHPV検査の結果の、十分に検証され、臨床的な商用参照検査（PapilloCheck）の結果との、非常に高い相関関係がえられ、かつ本発明に従ったhrHPV検査の高感度および特異性は、前記参照検査（PapilloCheck）に関連して確認された。
【０１５３】
前癌病変および子宮頸癌を検出するための新規HR-HPV検査の臨床的有効性の判断
顕微鏡像との相関のさらなる統計的分析および前記新規検査の臨床的有効性の判断のためにシュアパス液状媒体上に収集した子宮頸部由来の細胞診試料において前記新規hrHPV検査を用いて、5000人の女性が関わる臨床的な集団ベースの研究を実施した。
【０１５４】
前記分析は、前癌病変および子宮頸癌の予防試験および診断における前記新規hrHPV検査の臨床的有用性を判断することを目的とした。前記新規検査の診断の有効性を判断するために、子宮頸癌予防の一部である、定期的な細胞学的試験に参加した女性の大規模なグループを調査した。ベクトン・ディッキンソン社の標準化シュアパス法を用いて調製し、2001年のベセスダ分類システムに従って資格のある細胞形態学者と病理学者によって評価された、液状媒体中の細胞学的スライドの顕微鏡画像との、えられた分子遺伝学的結果の相関を決定した。顕微鏡評価のより高い客観性をえるために、前記スライドをコンピュータ評価自動スクリーニング（ベクトン・ディッキンソン社のフォーカルポイント（FocalPoint）システム）を用いてさらに評価した。
【０１５５】
前記分析には、5000対のHR-HPVの存在のための前記新規検査の結果と液状媒体上の細胞学的試験の結果が含まれていた。その材料は、定期的な細胞学的試験に参加した西ポモージェ県とヴィエルコポルスカ県からの継続した女性から採取した。HR-HPVの存在に関する検査を担当医から指示された患者と婦人科および腫瘍学的に異常な病歴の女性は前記分析から除外した。調査した女性の平均年齢は33.6±10.1歳（範囲：16〜67歳）に相当した。前記細胞学的試験の結果には、4825（96.5％）の正常調製物（異常上皮細胞なし）、77（1.55％）のASC-USに相当する病変を伴う調製物、6（0.1％）のASC-Hに相当する病変を伴う調製物、77（1.55％）のL-SILに相当する病変を伴う調製物、および15（0.3％）のH-SILに相当する病変を伴う調製物が含まれていた。
【０１５６】
前記と同様に、リアルタイムPCRのためのDNAは、サーベックスブラシコンビブラシ（ロバース）を用いて、シュアパス液状媒体（ベクトン・ディッキンソン）に集めた細胞学的試料（頸管スミア）から単離された。DNAの単離はNucliSense EasyMAG装置（ビオメリュー）において磁気ビーズを使用して自動的に行われた。PCRはPIRO自動ピペッテング・ステーション（ドルニエ（Dornier） LTF）を用いて準備した。DNA増幅はライトサイクラー96装置（ロシュ）で行われた。前述したように、PrepStainロボット（ベクトン・ディッキンソン）を用いて調製した、薄層細胞学的スライドは、コンピュータ支援スクリーニング（フォーカルポイントGSシステム、ベクトン・ディッキンソン）を使用して細胞形態学者と病理学者の経験豊富なチームによって評価された。細胞学的および分子遺伝学的検査の結果を統計分析に供した。
【０１５７】
前癌病変および子宮頸癌を検出するための新規HR-HPV検査の結果分析ならびに臨床的有効性の統計値
HR-HPVに関する前記新規検査の臨床的有用性を判断するために、液状媒体（シュアパス、ベクトン・ディッキンソン）での細胞学的試験に関連した陽性予測値（PPV）および陰性予測値（NPV）の値を用いた。このように、HR-HPVの存在について前記新規検査の陽性結果を示す患者において細胞学的試験の異常な結果および前記検査の陰性結果を伴う細胞学的試験の正常な結果がえられる確率を決定した。前記新規検査の高い陰性予測値が確認された場合には、その陰性結果により細胞学的試験から外すことが可能となり、その陽性結果はその実行のための基準となる可能性がある。
【０１５８】
前記新規hrHPV検査の結果と前記細胞学的試験の結果の間の相関のレベルは、ケンドールのタウb相関係数の値に基づいて評価した。前記陽性予測値（PPV、HR-HPVの存在についての前記検査の陽性結果を示す個体における細胞学的試験の異常な結果の確率）と前記陰性予測値（NPV、HR-HPVの存在についての前記検査の陰性結果を示す個体における細胞学的試験の正常な結果の確率）は、ROC分析に基づいて評価した。全ての統計的計算はStatistica 10ソフトウェアパッケージ（スタットソフト、米国オクラホマ州タルサ）を用いて行った。
【０１５９】
前記細胞学的試験の異常な結果（ASCUS最小）に対するHR-HPV検出
5000対のhrHPV検査と細胞学的試験の結果の合計を分析した。前記新規検査は403（8.1％）の陽性結果と4597（91.9％）の陰性結果をもたらした。前記細胞学的試験の結果は175（3.5％）の異常スライドと4825（96.5％）の正常スライドを含んでいた。
【表１９】
2017513522.tif 000020
前記新規検査で陽性結果を示す235（58.3％）の患者の場合、前記細胞学的試験では正常な結果を生じた。前記新規検査で陰性結果を示す7（0.2％）の患者の場合、前記細胞学的試験では異常な結果を生じた。HR-HPVの存在についての前記検査と細胞学的試験の結果に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.6152294と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は、細胞学的試験の結果と比較して、41.7％の陽性予測値（PPV）と99.8％の陰性予測値（NPV）によって特徴付けられることが示された。
【０１６０】
前記細胞学的試験の異常な結果（H-SIL）に対するHR-HPV検出
5000対のhrHPV検査と細胞学的試験の結果の合計を分析した。前記新規検査は403（8.1％）の陽性結果と4597（91.9％）の陰性結果をもたらした。前記細胞学的試験の結果は15（0.3％）のH-SILに対応する病変を伴うスライドと4985（99.7％）の正常スライドまたはH-SILよりも低い強度のスライドを含んでいた。
【表２０】
2017513522.tif 000021
前記新規検査で陽性結果を示す388（96.3％）の患者の場合、前記細胞学的試験ではH-SILに対応する病変がないことが明らかになった。前記新規検査で陰性結果を示す患者において、前記細胞学的試験ではH-SILに対応する病変がないことが明らかになった。HR-HPVの存在についての前記検査と細胞学的試験の結果に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.1852669と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は、細胞学的試験の結果と比較して、3.7％の陽性予測値（PPV）と100.0％の陰性予測値（NPV）によって特徴付けられることが示された。
【０１６１】
前記細胞学的試験の異常な結果（ASCUS最小）に対するHR-HPV16/18検出
5000対の検査と細胞学的試験の結果の合計を分析した。前記新規検査は169（3.4％）の陽性結果と4831（96.6％）の陰性結果をもたらした。前記細胞学的試験の結果は175（3.5％）の異常スライドと4825（96.5％）、正常スライドを含んでいた。
【表２１】
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前記新規検査で陽性結果を示す98（58.0％）の患者の場合、前記細胞学的試験では正常な結果を生じた。前記新規検査で陰性結果を示す104（2.2％）の患者の場合、前記細胞学的試験では異常な結果を生じた。HPV16/18の存在についての前記検査と細胞学的試験の結果に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.3919416と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は、細胞学的試験の結果と比較して、42.0％の陽性予測値（PPV）と97.8％の陰性予測値（NPV）によって特徴付けられることが示された。
【０１６２】
前記細胞学的試験の異常な結果（H-SIL）に対するHPV16/18検出
5000対の検査および細胞学的試験の結果の合計を分析した。前記新規検査は169（3.4％）陽性結果と4831（96.6％）の陰性結果をもたらした。前記細胞学的試験の結果は15（0.3％）のH-SILに対応する病変を伴うスライドと4985（99.7％）の正常スライドまたはH-SILよりも低い強度のスライドを含んでいた。
【表２２】
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前記新規検査で陽性結果を示す159（94.1％）の患者の場合、前記細胞学的試験ではH-SILに対応する病変がないことが明らかになった。前記新規検査で陰性結果を示す5（0.1％）の患者において、前記細胞学的試験ではH-SILに対応する病変が明らかになった。HR-HPVの存在についての前記検査と細胞学的試験の結果に関するケンドールのタウb相関係数はb=0.1921027と同等であった。
ROC分析により、前記新規検査は、細胞学的試験の結果と比較して、5.9％の陽性予測値（PPV）と99.9％の陰性予測値（NPV）によって特徴付けられることが示された。
【０１６３】
結論
前記新規検査の臨床的価値の分析により、それが液状媒体上の細胞学的試験の結果と比較すると、最適な陰性予測値（97.8％から100％まで）によって特徴付けられることが明らかとなった。特に高いNPV値（HR-HPVについて陰性結果は100％、HPV16/18について陰性結果は99.9％）は前癌性病変（H-SIL）に関してえられた。特にASC-USとASC-H型の細胞学的診断のグループにおいて、必ずしも全ての細胞学的異常が、活動性HPV感染に付随して起こるとは限らないことを考慮すると、より低いレベルの前記陽性予測値を完全に理解できる。従来の細胞診に比べて前記hrHPV検査に関する予測値のより一層好ましい係数が達成できることが期待され、これは液状媒体上の細胞学的方法（液体ベースの細胞診、LBC）と比較して異常な子宮頸部の上皮細胞を検出する際の有効性がより低いことを特徴とする。
【０１６４】
えられた結果により、前記新規検査で陰性結果の場合には、細胞学的試験の必要がないことが示される。そのため、前記新規検査を使用することで、大規模なHPV陰性の女性集団における細胞学的試験の回避を潜在的に可能性にすることができ、これにより大幅な節約ができることになる。
【０１６５】
しかしながら、前記検査のより低い陽性予測値のため、その陽性結果のそれぞれの場合に細胞診を適応すべきである。これに関連して、前記新規検査の別の利点：それが液状媒体上の細胞学的試験のために使用されるのと同じ材料で実行されるという事実、が強調されるべきである。したがって、前記hrHPV検査で陽性結果の場合には、前記細胞学的検査は、患者から追加的なスミアの収集を必要とせず、同じ材料を用いて行うことができる。このことによりかなり診断手順の時間が短縮され、大幅にそのコストが削減される。
【０１６６】
結論として：行った調査の結果に基づいて、本発明に従った、前記hrHPV検査は液状媒体（シュアパス）上の細胞学的試験の結果と比較して最適な陰性予測値（97.8％から100％まで）によって特徴付けられ、そして高い臨床効果を伴う前記新規hrHPV検査の使用により、大規模なHR-HPV陰性女性集団において細胞学的試験を回避できることが潜在的に可能になることが見出された。
【０１６７】
本発明は、細胞学的試験およびHPV試験の特徴を組み合わせた検査である、革新的な診断ツールを可能にする。予防プログラムへの本発明による検査の実施により、大幅に子宮頸癌のスクリーニングの有効性が高められ、さらなる診断と治療のコストが合理化されるであろう。また、単純なHPV検査の使用は、好ましくは液状媒体（LBC）上の細胞診由来の材料におけるリアルタイムPCR法に基づいて、予防プログラムに参加する研究室での診断プロセスの大幅な自動化と処理能力を潜在的に可能にする。前記検査の適用により、子宮頸癌のリスクの判定と適切な治療の選択が可能になる。加えて、HPV診断で以前は使用されていなかった、LNA技術の革新的な使用により、最も高い臨床レベルの診断への共通アクセスが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月6日(2017.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料が発癌性ヒトパピローマウイルス（HPV）についての検査で陽性であるかどうかを判定する方法であって、前記方法は、
前記試料を、発癌性HPVゲノムの標的領域のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識されたpan-HPVプローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識されたpan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記pan-HPVプローブは配列ACTTTCGTTT（配列番号25）、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記pan-HPVプローブはACTTTCGTTT（配列番号25）、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子であり、かつ／または前記pan-HPVプローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そして前記標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は蛍光である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーはHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68のいずれかの標的領域の増幅のためのプライマーであり、かつ／または前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68の全ての標的領域の増幅のための複数のプライマーの組み合わせと組み合わせることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーは以下のプライマー対の一対または複数対を含む、
a）HPV16に関して配列番号1および配列番号14
b）HPV18に関して配列番号2および配列番号15
c）HPV33/33nに関して配列番号3および配列番号14
d）HPV31に関して配列番号4および配列番号14
e）HPV35に関して配列番号5および配列番号14
f）HPV39に関して配列番号6および配列番号14
g）HPV45に関して配列番号7および配列番号15
h）HPV51に関して配列番号8および配列番号16
i）HPV52に関して配列番号9および配列番号14
j）HPV56/66に関して配列番号10および配列番号14
k）HPV58に関して配列番号11および配列番号14
l）HPV59に関して配列番号12および配列番号17
m）HPV68に関して配列番号13および配列番号18
および／または前記プライマーは前記プライマー対（a）から（m）の全てを含む、
先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68の標的領域の増幅のための複数のプライマーと組み合わせ、
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出し、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66またはHPV68についての検査で陽性であることを結論付けること
を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試料を、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68の標的領域の増幅のための複数のプライマーと組み合わせ、
前記標識されたpan-HPVプローブからの信号を検出せず、そして
前記試料がHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66およびHPV68についての検査で陰性であることを結論付けること
を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記試料を、HPV33nの標的領域の増幅のための複数のプライマー、および前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された33nプローブと組み合わせ、前記33nプローブと前記pan-HPVプローブは同一標識を担持し、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された33nプローブまたは前記pan-HPVプローブから発せられた信号に関して測定すること
をさらに含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記試料が発癌性HPVについての検査で陽性であることが示され、
前記33nプローブは配列ACTTTCGCTT（配列番号26）、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とし、かつ／または前記33nプローブはACTTTCGCTT（配列番号26）、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された10-ヌクレオチド分子である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記pan-HPVプローブおよび前記33nプローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そしてそれらのそれぞれの標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は同一波長の蛍光である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを判定することをさらに含む方法であって、前記方法は、
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示され、
前記16/18プローブは配列ATATCWGATGACGAG（配列番号27）を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
試料が発癌性ヒトパピローマウイルス（HPV）HPV16および/またはHPV18についての検査で陽性であるかどうかを判定する方法であって、前記方法は、
前記試料を、HPV16およびHPV18ゲノムの標的領域のリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、ならびに前記標的領域の増幅に基づいて信号を発することができる標識された16/18プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記標識された16/18プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、信号の検出により、前記試料がHPV16またはHPV18についての検査で陽性であることが示され、
前記16/18プローブは配列ATATCWGATGACGAG（配列番号27）、またはその逆相補鎖配列を含む標識されたロックド核酸（LNA）分子であることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
前記16/18プローブはATATCWGATGACGAG（配列番号27）、またはその逆相補鎖配列からなる配列の標識された15-ヌクレオチド分子である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記16/18プローブは前記pan-HPVプローブとは異なる標識を担持する、請求項９または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記16/18プローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識され、そして前記標的領域の増幅に基づいて発せられる前記信号は蛍光である、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記16/18プローブは前記pan-HPVプローブの波長とは異なる波長で蛍光信号を発する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーは以下のプライマー対の両方または一方を含む、
a）HPV16に関して配列番号19および配列番号20
b）HPV18に関して配列番号21および配列番号22、
請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記リアルタイムPCRに関して陽性対照試験を実施することをさらに含む方法であって、
前記試料を、前記試料中に存在する対照DNA配列、好ましくはヒトDNAのリアルタイムPCR増幅のための複数のプライマー、および前記対照DNA配列、好ましくはヒトDNAの増幅に基づいて信号を発することができる標識された対照プローブと組み合わせ、
リアルタイムPCRのための条件を準備し、そして
前記対照プローブからの信号に関して測定すること
を含み、
前記方法において、前記信号の検出により、前記リアルタイムPCRが機能していることが示される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記試料はヒト頸管スミア由来の液体ベースの細胞学的試料である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列ACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列と検出可能な標識とを含む標識された核酸プローブを含む組成物。
【請求項１９】
前記プローブはLNAヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記プローブは蛍光色素分子およびクエンチャーで標識されたACTTTCGTTT（配列番号25）またはその逆相補鎖配列からなる配列の10-ヌクレオチド分子である、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記プローブはその5’末端で蛍光色素分子を用いてかつその3'末端でクエンチャーを用いて標識される、請求項１８〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
HPVの検出のためにリアルタイムPCRを行う際の請求項１８〜２１のいずれかに記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
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