(57)【要約】  本発明は、リガンド‐細胞傷害性薬物抱合体、それらの製造方法および医薬用途に関する。より具体的には、本発明は一般式Pc-(X-Y-D)nのリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体、それらの製造方法およびレセプター調節による癌の治療のための薬剤の製造におけるリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体およびそれらを含む医薬組成物の使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド‐細胞傷害性薬物抱合体が、以下の構造：
【化１】
2017510548.tif 000072
（式中、X1は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され、該アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、それぞれ独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく、
X2は、アルキル、シクロアルキル、アルキル‐シクロアルキル、シクロアルキル‐アルキル、アルキル‐シクロアルキル‐アルキル、ヘテロシクリル、アルキル‐ヘテロシクリル、ヘテロシクリル‐アルキル、アルキル‐ヘテロシクリル‐アルキル、アリール、アルキル‐アリール、アリール‐アルキル、アルキル‐アリール‐アルキル、ヘテロアリール、アルキル‐ヘテロアリール、ヘテロアリール‐アルキル、アルキル‐ヘテロアリール‐アルキル、(CH2)p(OCH2CH2)p、(CH2CH2O)p(CH2)pからなる群から選択され、各ｐは１〜１０から独立して選択される整数であり、該アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
またはX1が水素でないとき、X1とX2はX1とX2を結合している炭素原子と一緒になってシクロアルキル基を形成してもよく、該シクロアルキルは、独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
Sは硫黄原子である）を有する結合ユニットXを含む、リガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項２】
X1が水素またはアルキル、好ましくは水素である、請求項１に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項３】
X2がアルキルまたはアリール、好ましくはアルキル、より好ましくは直鎖アルキルである、請求項１に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項４】
式（I）の構造：
【化２】
2017510548.tif 000073
（I）
（式中：Pcは、リガンドであり；
Xは、請求項１で定義したとおりであり；
Yは、インターバルユニットであり；
Dは、細胞傷害性薬物であり；
ｎは、薬物抗体比であり、ｎは１〜８、好ましくは１〜４から選択される）
を有する、請求項１に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項５】
結合ユニットXがPcポリペプチド鎖のN末端アミノ基またはリジン残基のε‐アミノ基に結合し、ｎが１〜４から選択される、請求項４に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項６】
リガンドが抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項４に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項７】
該抗体の抗原が増殖性疾患の標的細胞および／または組織に発現する細胞表面抗原であり；増殖性疾患が好ましくは癌であり；細胞表面抗原が好ましくは細胞表面レセプターである、請求項６に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項８】
細胞表面レセプターが：
１）HER2 (ErbB2)、
２）HER3 (ErbB3)、
３）HER4 (ErbB4)、
４）CD20、
５）CD22、
６）CD30、
７）CD33、
８）CD44、
９）Lewis Y、
１０）CD56、
１１）CD105、
１２）VEGFR、および
１３）GPNMB
からなる群から選択される、請求項７に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項９】
細胞表面レセプターが：
１）HER2 (ErbB2)、
２）CD 22、
３）CD30、
４）CD33、
５）CD44、
６）CD56、
７）Lewis Y、および
８）GPNMB
からなる群から選択される、請求項８に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１０】
抗体が：
１）トラスツズマブ(HER2)、
２）イノツズマブ (CD22)、
３）ピナツズマブ(CD22)、
４）ブレンツキシマブ(CD30)、
５）ゲムツズマブ (CD33)、
６）ビバツズマブ(CD44)、
７）ロルボツズマブ(CD56)、
８）cBR96 (Lewis Y)、
９）Glematumamab (GPNMB)および
１０）ペルツズマブ
からなる群から選択される、請求項６に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１１】
抗体がHER2タンパクに結合することができ、該抗体が：
１）
i）CDR-L1が配列番号１のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号１に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRであり；
ii）CDR-L2が配列番号２のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号２に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRであり；
iii）CDR-L3が配列番号３のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号３に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRである；
Kabatナンバリングシステムに従って定義されたCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の３つから選択される少なくとも１つのCDRを含む軽鎖、
２）
iv）CDR-H1が配列番号４のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号４に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRであり；
v）CDR-H2が配列番号５のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号５に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRであり；
vi）CDR-H3が配列番号６のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号６に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRである；
Kabatナンバリングシステムに従って定義されたCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の３つから選択される少なくとも１つのCDRを含む重鎖、
を含有する、請求項１０に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１２】
HER2タンパクに結合することができる抗体が軽鎖および/または重鎖を含み、該軽鎖が配列番号7のアミノ酸配列を含み、重鎖が配列番号８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１３】
細胞傷害性薬物がチューブリン阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、DNAアルキル化剤、チロシンキナーゼ阻害薬、およびDNA合成阻害薬、好ましくはチューブリン阻害薬からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１４】
細胞傷害性薬物チューブリン阻害薬がメイタンシノイド類、カリチアマイシン、タキサン、ビンクリスチン、コルヒチン、およびドラスタチン/アウリスタチン、好ましくはメイタンシノイドまたはドラスタチン/アウリスタチンからなる群から選択される、請求項１３に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１５】
Dが式（D1）：
【化３】
2017510548.tif 000074
（式中、R1は、結合手、水素、アルキルまたはシクロアルキル、好ましくは結合手から選択され；
R2は、水素またはアルキルから選択され；
またはR1とR2は、結合した窒素原子と一緒になってヘテロシクリルを形成し、該ヘテロシクリルはさらに独立して、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；または-(CRaRb)e-の構造を形成し、RaとRbは独立して、水素、アルキル、またはヘテロシクリルから選択され、ｅは2〜6から選択される整数であり；
R3は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、ヘテロシクリルおよびアルキル‐ヘテロシクリルからなる群から選択され；
R4は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、ヘテロシクリルおよびアルキル‐ヘテロシクリルからなる群から選択され；
R5は、水素またはメチルから選択され；
R6は、水素またはアルキルから選択され；
R7は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、ヘテロシクリルおよびアルキル‐ヘテロシクリルからなる群から選択され；
R8は、水素、ヒドロキシ、アルキル、シクロアルキル、およびアルコキシからなる群から選択され；
R9は、水素またはアルキルから選択され；
R1がアルキルまたはシクロアルキルから選択され、またはR1とR2が結合した窒素原子と一緒になってヘテロシクリルを形成する場合、該ヘテロシクリルは独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく、
R10は次の構造：
【化４】
2017510548.tif 000075
から選択され、
R1が水素の場合、R10は次の構造：
【化５】
2017510548.tif 000076
から選択され、
R1が結合手の場合、それはインターバルユニットYと結合し、R10は次の構造：
【化６】
2017510548.tif 000077
および
2017510548.tif 000078
から選択され；
ZはO、S、NHおよびN(R14) から選択され；
R11は、水素、ヒドロキシ、アミノ、NHR14、N(R14)2、アルコキシ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、およびアルキル‐ヘテロシクリルからなる群から選択され；またはR11がOである場合、それは、結合した炭素原子に結合している水素を置換して、この炭素原子とカルボニル基（C=O）を形成してもよく；
R12は、アリールおよびヘテロシクリルから選択され、該アリールおよびヘテロシクリルは任意に、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルおよびハロゲンからなる群から選択される1以上の基でさらに置換されていてもよく；
R13は、水素、ヒドロキシ、アミノ、NHR14、N(R14)2、COOR14、アルコキシ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、アルキル‐ヘテロシクリルおよびアルコキシ‐アルコキシ‐アルコキシからなる群から選択され；
R14は、水素またはアルキルから選択され；
R15は、水素、アルキル、アリール、ヘテロサイクリック、(R16O)m-R14および(R16O)m-CH(R17)2からなる群から選択され；
ｍは、１〜１０００から選択される整数であり；
R16は、C2-C8アルキルであり；
R17は、水素、カルボキシル、-(CH2)t-N(R-18)2および-(CH2)t-SO3R14からなる群から選択され；
R18は、水素、アルキル、および-(CH2)t-COOHからなる群から選択され；
ｔは、０〜６から選択される整数であり；
R19は、アリール、シクロアルキル、およびヘテロシクリルからなる群から選択される）
の構造を持つドラスタチン/アウリスタチンから選択される、請求項４に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１６】
Dは式（DM）：
【化７】
2017510548.tif 000079
（式中、R20はOまたはSから選択され；
R21は水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、該アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい）
の構造を持つメイタンシンから選択される、請求項４に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１７】
インターバルユニット-Y-が、次式：
【化８】
2017510548.tif 000080
（式中、YLはアルキル、シクロアルキル、O-アルキル、O-アルコキシ、アリール、アルキル-シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、アルキル-アリール、アルキル-シクロアルキル-アルキル、ヘテロシクリル、アルキル-ヘテロシクリル、ヘテロシクリル-アルキル、アルキル-ヘテロシクリル-アルキル、アリール、アルキル-アリール、アリール-アルキル、アルキル-アリール-アルキル、ヘテロアリール、アルキル-ヘテロアリール、ヘテロアリール-アルキル、アルキル-ヘテロアリール-アルキル、CH2(OCH2CH2)t、(CH2CH2O)tCH2および(CH2CH2O)tからなる群から選択され、ｔは１〜１０から選択される整数であり、好ましくはアルキル基、より好ましくはC2-C8直鎖アルキルであり；
Kkは、Kがアミノ酸であり、ｋが０〜１０から選択される整数、好ましくは２である、アミノ酸ユニットであり、Kkは、好ましくはバリン-シトルリンであり；
Qqは、qが０，１または２である、延長ユニットである）
の構造を有する、請求項４に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１８】
式（II）：
【化９】
2017510548.tif 000081
（式中、Pcは請求項４で定義したとおりであり；
Xは請求項１で定義したとおりであり； 
Tは水素、t-ブチル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル、および2‐（トリメチルシリル）エトキシメチルからなる群、好ましくは水素またはアセチルから選択され；
ｎは１〜８、好ましくは１〜４から選択される）
の構造を持つ化合物。
【請求項１９】
式（III）：
【化１０】
2017510548.tif 000082
（式中、Pcは抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり；
Xは請求項１で定義したとおりであり 
YL、Kk、Qqは請求項１７で定義したとおりであり；
ｎは１〜４から選択され；
Dは請求項１で定義したとおりである）
の構造を有する、請求項１に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項２０】
構造が：
【化１１】
2017510548.tif 000083
2017510548.tif 000084
2017510548.tif 000085
から成る群から選択される、請求項４に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項２１】
Pcがトラスツズマブ、イノツズマブおよびブレンツキシマブ、好ましくはトラスツズマブまたはペルツズマブ、より好ましくはペルツズマブから選択される、請求項２０に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項２２】
【化１２】
2017510548.tif 000086
2017510548.tif 000087
2017510548.tif 000088
からなる群から選択され、
ｎが１〜８、好ましくは１〜４から選択される、請求項４に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項２３】
製造方法が：
１）式IAの化合物と式IBの化合物に還元剤RAを添加して、反応を行い、式ICの化合物を得る；反応系のpHは好ましくは３〜６であり、反応温度は好ましくは０−４０℃である；
【化１３】
2017510548.tif 000089
２）式ICの化合物に脱保護剤を添加してチオール基の保護基Tを除去し、式IDの化合物を得る；反応温度は好ましくは０−４０℃である；
【化１４】
2017510548.tif 000090
３）式IDの化合物と式IEの化合物の間でマイケル（Michael）付加反応を行い、式（III）の化合物を得る、反応温度は好ましくは０−４０℃である；
【化１５】
2017510548.tif 000091
（ここで、反応温度はより好ましくは１５‐３０℃、最も好ましくは２０−２５℃であり；脱保護剤は好ましくはヒドロキシルアミン塩酸塩であり；還元剤RAは好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドであり；
式中、X1およびX2は請求項１で定義したとおりであり；Pcは請求項４で定義したとおりであり；Tおよびｎは請求項１８で定義したとおりであり；YL、Kk、Qqは請求項１７で定義したとおりであり；Dは請求項１５または請求項１６で定義したとおりである）
のステップを含む、式（III）：
【化１６】
2017510548.tif 000092
の抗体‐細胞傷害性薬物抱合体の製造方法。
【請求項２４】
医薬組成物が請求項１〜１７および請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物の治療上の有効量、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２５】
癌が腫瘍関連レセプターを過剰発現する癌であり、該腫瘍関連レセプターが(1)−(8)：
1) HER2(ErbB2),
2) CD22,
3) CD30,
4) CD33,
5) CD44,
6) CD56,
7) Lewis Y、および
8) GPNMB
からなる群から選択される1以上である、癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１７および請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項２４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
in vitroでレセプターを調節する方法であって、該方法は被験者に有効量の請求項１〜１７および請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項２４に記載の医薬組成物を投与することを含み、該レセプターは、
1) HER2(ErbB2),
2) CD22,
3) CD30,
4) CD33,
5) CD44,
6) CD56,
7) Lewis Y、および
8) GPNMB.
からなる群から選択される方法。
【請求項２７】
哺乳動物における癌の治療方法であって、該方法は哺乳動物に治療上の有効量の請求項１〜１７および請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または請求項２４に記載の医薬組成物を投与することを含み、該哺乳動物はヒトであり、該癌は乳がん、卵巣がん、胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、肺がん、大腸がん、腎臓がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、膵臓がん、前立腺がん、膀胱がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Hodgkinリンパ腫、非Hodgkinリンパ腫および再発未分化大細胞リンパ腫、好ましくは乳がん、Hodgkinリンパ腫または再発未分化大細胞リンパ腫；より好ましくはHER2発現と関連する乳がんからなる群から選択される治療方法。
【請求項２８】
癌の治療のための薬剤の製造における、式（IV）の化合物、それらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の使用：
【化１７】
2017510548.tif 000093
（式中：YLはアルキル、シクロアルキル、O-アルキル、O-アルコキシ、アリール、アルキル-シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、アルキル-アリール、アルキル-シクロアルキル-アルキル、ヘテロシクリル、アルキル-ヘテロシクリル、ヘテロシクリル-アルキル、アルキル-ヘテロシクリル-アルキル、アリール、アルキル-アリール、アリール-アルキル、アルキル-アリール-アルキル、ヘテロアリール、アルキル-ヘテロアリール、ヘテロアリール-アルキル、アルキル-ヘテロアリール-アルキル、CH2(OCH2CH2)t、(CH2CH2O)tCH2および(CH2CH2O)tから選択され、ｔは１〜１０から選択される整数であり、好ましくはアルキル基、より好ましくはC2-C8直鎖アルキルであり；
Kkは、Kがアミノ酸であり、ｋが０〜１０から選択される整数、好ましくはｋは２である、アミノ酸ユニットであり、Kkは、好ましくはバリン-シトルリンであり；
Qqは、qが０，１または２である、延長ユニットであり；
R20はOまたはSから選択され；
R21は水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、該アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しい構造を有するリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体群に関する。具体的には、本発明はリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体、並びにそれらの製造方法、それらを含む医薬組成物、および抱合体または医薬組成物の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法は、まだ手術、放射線療法、および標的治療法などの最も重要な抗腫瘍戦略の一つである。多くのタイプの高い効果のある細胞毒があるが、がん細胞と正常細胞の間の小さな差が、毒性と副作用のため臨床におけるこれらの抗腫瘍化合物の広範な使用を制限している。さらに、腫瘍細胞表面の抗原に対する抗腫瘍モノクローナル抗体の特異性が抗体薬物を第一選択抗腫瘍治療薬にしているが、しかしながら抗体が抗腫瘍薬として単独で用いられたとき、有効性はしばしば不満足である。
【０００３】
抗体薬物抱合体（ADC）は、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを安定な化学リンカー化合物を介して生物活性細胞毒と結合し、正常および腫瘍細胞表面の抗原に対する抗体の結合特異性および細胞毒の高い効果の最大の利益を得て、一方で前者の低い効果と後者の過剰な副作用を回避するものである。これは、慣用の伝統的な化学療法薬に比べ、抗体薬物抱合体腫瘍細胞に正確に結合し、正常細胞への影響を減らすことができることを意味する（非特許文献１，２）。
【０００４】
初期のADC薬は、第一にマウスのモノクローナル抗体を用いており、それらの幾つかはヒト免疫応答の結果として標的に到達するのが困難である。次に、初期段階で用いられるドキソルビシンなどのエフェクター分子は低い生物活性をしめしたが、これは第一世代の抗体薬物抱合体の有効性を制限している。さらに、抗体源、結合様式およびリンカーの数が、まだ最適化されていない。
【０００５】
２０００年に、初めての抗体薬物抱合体マイロターグ（ゲムツズマブオゾガマイシン、Wyeth Pharmaceuticals）が急性骨髄性白血病の治療用に米国FDAにより承認された（非特許文献３、特許文献１〜８）。マイロターグは、２０１０年に限られた効力と高い毒性のためにPfizer自身によって取り下げられた、ヒト化CD33抗体−カリチアマイシン抱合体である。
【０００６】
２０１１年８月、アドセトリス（ブレンツキシマブベドチン、Seattle Genetics Inc.）が米国FDAのファストトラックでホジジキンリンパ腫および再発未分化大細胞リンパ腫について承認された（非特許文献４、特許文献９〜１３）。アドセトリスは新規の標的指向化ADC薬であり、薬物を直接リンパ腫細胞の標的CD30に作用させて、エンドサイト−シスの引き金を引き、従って腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。
【０００７】
２０１３年２月、カドサイラ（ado‐トラスツズマブエムタンシン、T-DM1）が、FDAからトラスツズマブ（商品名：ハーセプチン）耐性およびパクリタキセル（特許文献１４、１５）耐性を持ったHER2陽性である進行性または転移性乳がん患者の治療について承認を得た。マイロターグとアドセトリスの両方とも血液腫瘍に対する標的治療法であり、その組織構造は固形腫瘍のものに比べて比較的シンプルである。カドサイラは、固形腫瘍の治療に対してFDAにより承認された最初のADC薬である。
【０００８】
免疫原技術を用いて、カドサイラは高度に活性な有糸分裂阻害剤DM1とRocheのトラスツズマブを安定なチオエーテル結合のリンカーを介して結合させて形成されており、一つのトラスツズマブの平均薬物負荷は約３．５のDM1である。トラスツズマブは患者の乳がん細胞に特異的に結合し、エンドサイト−シス後に細胞内で分解してDM1を放出する。DM1の細胞内凝集濃度は有糸分裂障害による細胞死を起こすのに十分であり、次いで腫瘍病巣が退縮する（しばしば腫瘍増殖の遅延をもたらすハーセプチンmAb単剤療法とは似ていない）。T-DM1はハーセプチンのような細胞増殖の抗体依存性阻害を保持するのみならず、細胞傷害性薬物の潜在的効果を増加させる。そして、その毒素が標的の腫瘍細胞中で放出されるため、その副作用はその治療効果の増加と共に同時に増加することはない。
【０００９】
ペルツズマブ（2C4としても知られる、商品名パージェタ）は、組換えヒト化モノクローナル抗体であり、最初は「HER二量化阻害剤」と呼ばれている。ペルツズマブはHER2と他のHER受容体の二量化をHER2に結合することによってブロックする（非特許文献５〜９）。ペルツズマブは、HER2-高発現および低発現前立腺癌モデルの両方において、腫瘍増殖に関して阻害効果を有することが証明されている（非特許文献１０〜１３）。
【００１０】
HER2細胞外ドメインの膜近傍領域IVサブドメインに位置する結合部位によって下流のシグナル経路を阻害するトラスツズマブ（商品名：ハーセプチン）と異なり、ペルツズマブはドメインII（二量体化ドメイン）への結合によりHER2の異種二量体化を効果的に阻害する。それ故、トラスツズマブはHER2を過剰発現するがん患者、特に乳がん患者に幾らかの効果を有するだけである。トラスツズマブと同じ標的とエンドサイトーシスを有しているが、その異なる作用メカニズムにより、ペルツズマブは二量体化を阻害した後にErbBファミリー受容体により媒介されるシグナル経路をブロックすることができ、そしてHER2シグナル経路をブロックするのみのものより広範な応用を有している（非特許文献１４）。
現在、ADC薬の結合に関して主として２つの技術がある：T-DM1については、細胞傷害性薬物と抗体中のフリーのアミノ基のランダム結合が採用されている（特許文献１６）；一方、アドセトリスについては、ヒンジ領域の還元後、細胞傷害性薬物と抗体中のフリーのチオール基の結合が採用されている（特許文献１７）。両方の結合方法とも不定の薬物抗体比を持った混合物を生成する。例えば、T-DM1の平均の薬物抗体比は３．５であるが、薬物のロード分布は０〜８である。低い薬物抗体比はADCの有効性に影響するが、一方、高い薬物抗体比はより容易に過剰な抗体修飾に導き、その結果、ADC薬が組織マクロファージ系により認識し、破壊される。これはADCの半減期を短くするのみならず、非標的組織における毒素の蓄積のために有毒な副作用を増加させる；アドセトリスについては、抗体ヒンジ領域のジスルフィド結合が還元剤で還元されて、抗体自身の安定性に一定の影響を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】US4970198
【特許文献２】US 5079233
【特許文献３】US 5585089
【特許文献４】US 5606040
【特許文献５】US 5693762
【特許文献６】US 5739116
【特許文献７】US 5767285
【特許文献８】US 5773001
【特許文献９】WO2004010957
【特許文献１０】WO2005001038
【特許文献１１】US7090843A
【特許文献１２】US7659241
【特許文献１３】WO2008025020
【特許文献１４】WO2005037992
【特許文献１５】US8088387
【特許文献１６】WO2005037992
【特許文献１７】WO2004010957
【００１２】
【非特許文献１】Mullard A, (2013) Nature Reviews Drug Discovery, 12:329-332
【非特許文献２】DiJoseph JF, Armellino DC, (2004) Blood, 103:1807-1814
【非特許文献３】Drugs of the Future (2000) 25(7):686
【非特許文献４】Nat. Biotechnol (2003) 21(7):778-784
【非特許文献５】Agus DB, (2002) Cancer Cell (2):127-137
【非特許文献６】Schaefer G, (1997) Oncogene (15): 1385-1394
【非特許文献７】Mendoza N, (2002) Cancer Res (62): 5485-5488
【非特許文献８】Takai N, (2005) Cancer (104): 2701-2708
【非特許文献９】Jackson JG, (2004) Cancer Res (64): 2601-2609
【非特許文献１０】Craft N, (1999) Nat Med (5):280-285
【非特許文献１１】Oxley JD, (2002) J Clin Pathol (55): 118-120
【非特許文献１２】Reese DM, (2001) Am J Clin Pathol (116): 234-239
【非特許文献１３】Agus DB, (2002) Cancer Cell (2): 127-137
【非特許文献１４】Franklin MC, (2001) Cancer Cell (5): 317-328
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
リガンド、具体的には抗体と薬物の結合効果を改善するために、本発明はリガンドと薬物をカップリングするための改善した結合ユニットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、リガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を開示するが、該リガンド‐細胞傷害性薬物抱合体は、以下の構造：
【化１】
2017510548.tif 000002
（式中、X1は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択され、該アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、それぞれ独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく、
X2は、アルキル、シクロアルキル、アルキル‐シクロアルキル、シクロアルキル‐アルキル、アルキル‐シクロアルキル‐アルキル、ヘテロシクリル、アルキル‐ヘテロシクリル、ヘテロシクリル‐アルキル、アルキル‐ヘテロシクリル‐アルキル、アリール、アルキル‐アリール、アリール‐アルキル、アルキル‐アリール‐アルキル、ヘテロアリール、アルキル‐ヘテロアリール、ヘテロアリール‐アルキル、アルキル‐ヘテロアリール‐アルキル、(CH2)p(OCH2CH2)p、(CH2CH2O)p(CH2)pからなる群から選択され、各ｐは１〜１０から独立して選択される整数であり、該アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
またはX1が水素でないとき、X1とX2はX1とX2を結合している炭素原子と一緒になってシクロアルキル基を形成してもよく、該シクロアルキルは、独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；
Sは硫黄原子である）
を有する結合ユニットXを含んでいる。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、X1が水素またはアルキル、好ましくは水素である、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施態様において、X2がアルキルまたはシクロアルキル、好ましくはアルキル、さらに好ましくは直鎖アルキルである、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００１７】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（I）の構造：
【化２】
2017510548.tif 000003
（式中：Pcは、リガンドであり；
Xは、請求項１で定義したとおりであり；
Yは、インターバルユニットであり；
Dは、細胞傷害性薬物であり；
ｎは、薬物抗体比であり、ｎは１〜８から選択される）
を含む、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００１８】
本発明の他の好ましい実施態様において、結合ユニットXがPcポリペプチド鎖のN末端アミノ基またはリジン残基のε‐アミノ基に結合し、ｎが１〜４から選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００１９】
本発明の他の好ましい実施態様において、リガンドが抗体である、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２０】
本発明の他の好ましい実施態様において、該抗体の抗原が増殖性疾患の標的細胞および／または組織に発現する細胞表面抗原であり；増殖性疾患が好ましくは癌であり；細胞表面抗原が好ましくは細胞表面レセプターである、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２１】
本発明の他の好ましい実施態様において、細胞表面レセプターが：
１）HER2 (ErbB2)、
２）HER3 (ErbB3)、
３）HER4 (ErbB4)、
４）CD20、
５）CD22、
６）CD30、
７）CD33、
８）CD44、
９）Lewis Y、
１０）CD56、
１１）CD105、
１２）VEGFR、および
１３）GPNMB
からなる群から選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２２】
本発明の他の好ましい実施態様において、細胞表面レセプターが：
１）HER2 (ErbB2)、
２）CD 22、
３）CD30、
４）CD33、
５）CD44、
６）CD56、
７）Lewis Y、および
８）GPNMB
からなる群から選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２３】
本発明の他の好ましい実施態様において、抗体が：
１）トラスツズマブ(HER2)、
２）イノツズマブ (CD22)、
３）ピナツズマブ(CD22)、
４）ブレンツキシマブ(CD30)、
５）ゲムツズマブ (CD33)、
６）ビバツズマブ(CD44)、
７）ロルボツズマブ(CD56)、
８）cBR96 (Lewis Y)、
９）Glematumamab (GPNMB)および
１０）ペルツズマブ
からなる群から選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施態様において、抗体がHER2タンパクに結合することができ、該抗体が：
１）
i）CDR-L1が配列番号１のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号１に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRであり；
ii）CDR-L2が配列番号２のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号２に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRであり；
iii）CDR-L3が配列番号３のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号３に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRである；
Kabatナンバリングシステムに従って定義されたCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の３つから選択される少なくとも１つのCDRを含む軽鎖、
２）
iv）CDR-H1が配列番号４のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号４に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRであり；
v）CDR-H2が配列番号５のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号５に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRであり；
vi）CDR-H3が配列番号６のCDR、または最適アラインメント後、少なくとも１つの配列が配列番号６に対し少なくとも８０％の同一性を有するCDRである；
Kabatナンバリングシステムに従って定義されたCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の３つから選択される少なくとも１つのCDRを含む重鎖、
を含有する、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２５】
本発明の他の好ましい実施態様において、HER2タンパクに結合することができる抗体が軽鎖および/または重鎖を含み、該軽鎖が配列番号7のアミノ酸配列を有し、重鎖が配列番号８のアミノ酸配列を有する、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの  薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２６】
本発明の他の好ましい実施態様において、細胞傷害性薬物がチューブリン阻害薬、DNAアルキル化剤、チロシンキナーゼ阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬およびDNA合成阻害薬、好ましくはチューブリン阻害薬からなる群から選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２７】
本発明の他の好ましい実施態様において、トポイソメラーゼ阻害薬がカンプトテシン、イリノテカン、アクチノマイシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンから選択され；DNA合成阻害薬がフルオロウラシル、シタラビン、アザシチジン、アンシタビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、ブレオマイシン、白金錯体から選択され；DNAアルキル化剤がナイトロジェンマスタード類（シクロホスファミド）、エチリデンヒドラゾノアミン類（チオテパ、マイトマイシン）、メタンスルホン酸エステル類（ブスルファン）、ポリオール類（ジブロモマンニトール）、ニトロソウレア類（カルムスチン）、トリアゼンイミダゾール（ダカルバジン）およびヒドラジン類（プロカルバジン）から選択され；チロシンキナーゼ阻害薬がイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、ダサチニブ、ニロチニブから選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２８】
本発明の他の好ましい実施態様において、細胞傷害性薬物チューブリン阻害薬がメイタンシノイド類、カリチアマイシン、タキサン、ビンクリスチン、コルヒチン、およびドラスタチン/アウリスタチン、好ましくはメイタンシノイドまたはドラスタチン/アウリスタチンからなる群から選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施態様において、Dが式（D1）：
【化３】
2017510548.tif 000004
（式中、R1は、結合手、水素、アルキルまたはシクロアルキル、好ましくは結合手から選択され；R1が水素、アルキルまたはシクロアルキルから選択される場合、Dは式（I）におけるR10を通じてYと結合しており；R1が好ましくは結合手である場合、Dは式（I）におけるR10を通じてYと結合しており；
R2は、水素またはアルキルから選択され；
またはR1とR2は、結合した窒素原子と一緒になってヘテロシクリルを形成し、該ヘテロシクリルはさらに独立して、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよく；または-(CRaRb)e-の構造を形成し、RaとRbは独立して、水素、アルキルまたはシクロアルキルから選択され、ｅは2〜6から選択される整数であり；
R3は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、ヘテロシクリルおよびアルキル‐ヘテロシクリルからなる群から選択され；
R4は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、ヘテロシクリルおよびアルキル‐ヘテロシクリルからなる群から選択され；
R5は、水素またはメチルから選択され；
R6は、水素またはアルキルから選択され；
R7は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、ヘテロシクリルおよびアルキル‐ヘテロシクリルからなる群から選択され；
R8は、水素、ヒドロキシ、アルキル、シクロアルキル、およびアルコキシからなる群から選択され；
R9は、水素またはアルキルから選択され；
R1がアルキルまたはシクロアルキルから選択され、またはR1とR2が、結合した窒素原子と一緒になってヘテロシクリルを形成し、該ヘテロシクリルは独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい場合、R10は以下の構造：
【化４】
2017510548.tif 000005
から選択され、
R1が水素の場合、R10は以下の構造：
【化５】
2017510548.tif 000006
から選択され、
R1が結合手の場合、それはインターバルユニットYと結合し、R10は以下の構造：
【化６】
2017510548.tif 000007
から選択され；
ZはO、S、NHおよびN(R14) から選択され；
R11は、水素、ヒドロキシ、アミノ、‐NHR14、‐N(R14)2、アルコキシ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、およびアルキル‐ヘテロシクリルからなる群から選択され；またはR11がOである場合、それは、結合した炭素原子に結合している水素を置換して、この炭素原子とカルボニル基（C=O）を形成してもよい；
R12は、アリールおよびヘテロシクリルから選択され、該アリールおよびヘテロシクリルは任意に、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルおよびハロゲンからなる群から選択される1以上の基でさらに置換されていてもよく；
R13は、水素、ヒドロキシ、アミノ、NHR14、N(R14)2、COOR14、アルコキシ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルキル‐アリール、アルキル‐シクロアルキル、アルキル‐ヘテロシクリルおよびアルコキシ‐アルコキシ‐アルコキシからなる群から選択され；
R14は、水素またはアルキルから選択され；
R15は、水素、アルキル、アリール、ヘテロサイクリック、(R16O)m-R14および(R16O)m-CH(R17)2からなる群から選択され；
ｍは、１〜１０００から選択される整数であり；
R16は、C2-C8アルキルであり；
R17は、水素、カルボキシル、-(CH2)t-N(R-18)2および-(CH2)t-SO3R14からなる群から選択され；
R18は、水素、アルキル、および-(CH2)t-COOHからなる群から選択され；
ｔは、０〜６から選択される整数であり；
R19は、アリール、シクロアルキル、およびヘテロシクリルからなる群から選択される）
の構造を持つドラスタチン/アウリスタチンから選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３０】
本発明のさらに好ましい実施態様において、
R1は結合手またはアルキルから選択され；
R2は水素またはアルキルから選択され；
R3は水素、アルキルまたはシクロアルキルから選択され；
R4、R5、R6、R7は、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキルまたはヘテロシクリルから任意に選択され；
R8は水素、アルキル、シクロアルキルまたはアルコキシから選択され；
R9は水素またはアルキルから選択され；
R1が‐アルキルから選択される場合、R10は次の構造：
【化７】
2017510548.tif 000008
から選択され；
R1が結合手から選択される場合、それはインターバルユニットYと結合し、R10は次の構造：
【化８】
2017510548.tif 000009
から選択され；
ZはNHから選択され；
R11は水素、ヒドロキシまたはアルキルから選択され；
R12はアリールから選択され、該アリールは任意に、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルおよびハロゲンからなる群から選択される1以上の基でさらに置換されていてもよく；
R13は水素、アルキルまたはCOOR14から選択され；
R14は水素またはアルキルから選択され、該アルキルは任意に、アルコキシまたはアルコキシ‐アルコキシ‐アルコキシでさらに置換されていてもよく；
R19はアリールから選択される、
式（D1）を有するリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３１】
本発明のさらに好ましい実施態様において、式（D1）におけるR3は、水素またはイソプロピルから選択される。
【００３２】
本発明の他の好ましい実施態様において、Dは式（DM）：
【化９】
2017510548.tif 000010
（式中、R20はOまたはSから選択され；
R21は水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、該アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい）
の構造を持つメイタンシンから選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施態様において、DがD1であり、インターバルユニットYが次の式：
【化１０】
2017510548.tif 000011
（式中、YLはアルキル、シクロアルキル、O-アルキル、O-アルコキシ、アリール、アルキル-シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、アルキル-アリール、アルキル-シクロアルキル-アルキル、ヘテロシクリル、アルキル-ヘテロシクリル、ヘテロシクリル-アルキル、アルキル-ヘテロシクリル-アルキル、アリール、アルキル-アリール、アリール-アルキル、アルキル-アリール-アルキル、ヘテロアリール、アルキル-ヘテロアリール、ヘテロアリール-アルキル、アルキル-ヘテロアリール-アルキル、CH2(OCH2CH2)t、(CH2CH2O)tCH2および(CH2CH2O)tからなる群から選択され、ｔは１〜１０から選択される整数であり、好ましくはアルキル基、より好ましくはC2-C8直鎖アルキルであり；
Kkは、Kがアミノ酸であり、ｋが０〜１０から選択される整数、好ましくは２である、アミノ酸ユニットであり、Kkは、好ましくはバリン-シトルリンであり；
Qqは、qが０，１または２である、延長ユニットである）
の構造を有する、リガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３４】
本発明は、また式（III）の中間体化合物の製造に用いられる、式（II）の化合物に関する：
【化１１】
2017510548.tif 000012
式中、Pcは式（I）で定義したとおりであり、
Xは結合ユニットXとして定義され；
Tは水素、t-ブチル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル、および2‐（トリメチルシリル）エトキシメチルからなる群から選択され、好ましくは水素またはアセチルであり；
ｎは１〜４から選択される。
【００３５】
本発明の他の好ましい実施態様において、式（III）：
【化１２】
2017510548.tif 000013
（式中、Pcは抗体であり；
Xは結合ユニットXとして定義され；
YL、Kk、Qqは式（Y）で定義したとおりであり；
ｎは１〜４から選択され；
Dは細胞傷害性薬物である）
の構造からなる、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３６】
本発明の他の好ましい実施態様において、以下の構造：
【化１３】
2017510548.tif 000014
2017510548.tif 000015
2017510548.tif 000016
（式中、Pcはリガンドであり、ｎは薬物抗体比であり、そしてｎは1〜8から選択される）
のいずれか1つからなる、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３７】
本発明の他の具体的な実施態様において、Pcがトラスツズマブ、イノツズマブおよびブレンツキシマブ、好ましくはトラスツズマブまたはペルツズマブ、より好ましくはペルツズマブから選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３８】
本発明の他の具体的な実施態様において、
【化１４】
2017510548.tif 000017
2017510548.tif 000018
（式中、ｎは１〜８、好ましくは１〜4から選択される）；
からなる群から選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３９】
本発明の他の具体的な実施態様において、
【化１５】
2017510548.tif 000019
2017510548.tif 000020
2017510548.tif 000021
（式中、ｎは１〜８、好ましくは１〜4から選択される）；
からなる群から選択される、上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００４０】
本発明は、さらに式（III）の抗体‐細胞傷害性薬物抱合体の製造方法に関し、
【化１６】
2017510548.tif 000022
該製造方法は、以下のステップを含む：
１）      式IAの化合物と式IBの化合物に還元剤RAを添加して、反応系pH３〜６および反応温度０−４０℃の条件下に反応を行い、式ICの化合物を得る、
【化１７】
2017510548.tif 000023
式中、Tはtert-ブチル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、トリフェニルメチル、メトキシメチル、および2‐（トリメチルシリル）エトキシメチルからなる群から選択され、好ましくはアセチルである；
２）      反応温度０−４０℃の条件下で、式ICの化合物に脱保護剤を添加してチオール基の保護基Tを除去し、式IDの化合物を得る；
【化１８】
2017510548.tif 000024
３）      反応温度０−４０℃の条件下で、式IDの化合物と式IEの化合物の間でマイケル（Michael）付加反応を行い、式（III）の化合物を得る、
【化１９】
2017510548.tif 000025
ここで、反応温度は好ましくは１５‐３０℃、最も好ましくは２０−２５℃であり；脱保護剤は好ましくはヒドロキシルアミン塩酸塩であり；還元剤RAは好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドであり；
式中、X1、X2は式Xで定義したとおりであり；Pcはリガンドであり；T、ｎは式（II）で定義したとおりであり；YL、Kk、Qqは式（Y）で定義したとおりであり；Dは細胞傷害性薬物である。
【００４１】
本発明は、さらに医薬組成物が上記のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物の治療上の有効量、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有することを特徴とする、医薬組成物に関する。
【００４２】
本発明は、さらに、癌が腫瘍関連レセプターを過剰発現する癌であり、腫瘍関連レセプターが(1)−(8)：
1) HER2(ErbB2),
2) CD22,
3) CD30,
4) CD33,
5) CD44,
6) CD56,
7) Lewis Y、および
8) GPNMB
からなる群から選択される1以上である、癌の治療のための薬剤の製造における、リガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または上記医薬組成物の使用に関する。
【００４３】
本発明は、さらに、in vitroでレセプターを調節する方法に関し、該方法は被験者に有効量のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または上記の医薬組成物を投与することを含み、該レセプターは、
1) HER2(ErbB2),
2) CD22,
3) CD30,
4) CD33,
5) CD44,
6) CD56,
7) Lewis Y、および
8) GPNMB.
からなる群から選択される。
【００４４】
本発明は、さらに、哺乳動物における癌の治療方法に関し、該方法は哺乳動物に治療上の有効量のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体またはそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物、または上記の医薬組成物を投与することを含み、該哺乳動物はヒトであり、該癌は乳がん、卵巣がん、胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、肺がん、大腸がん、腎臓がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、膵臓がん、前立腺がん、膀胱がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Hodgkinリンパ腫、非Hodgkinリンパ腫および再発未分化大細胞リンパ腫、好ましくは乳がん、Hodgkinリンパ腫または再発未分化大細胞リンパ腫；より好ましくは2+レベルまたはより高いレベルのHER2を過剰発現する乳がん、最も好ましくはHER2発現と関連する乳がんからなる群から選択される。
【００４５】
本発明は、さらに、癌の治療のための薬剤の製造における、式（IV）の化合物、それらの互変異性体、メソマー、ラセミ体、鏡像体、ジアステレオマー、またはそれらの混合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の使用に関する：
【化２０】
2017510548.tif 000026
式中：YLはアルキル、シクロアルキル、O-アルキル、O-アルコキシ、アリール、アルキル-シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、アルキル-アリール、アルキル-シクロアルキル-アルキル、ヘテロシクリル、アルキル-ヘテロシクリル、ヘテロシクリル-アルキル、アルキル-ヘテロシクリル-アルキル、アリール、アルキル-アリール、アリール-アルキル、アルキル-アリール-アルキル、ヘテロアリール、アルキル-ヘテロアリール、ヘテロアリール-アルキル、アルキル-ヘテロアリール-アルキル、CH2(OCH2CH2)t、(CH2CH2O)tCH2および(CH2CH2O)tから選択され、ｔは１〜１０から選択される整数であり、好ましくはアルキル基、より好ましくはC2-C8直鎖アルキルであり；
Kkは、Kがアミノ酸であり、ｋが０〜１０から選択される整数、好ましくはｋは２である、アミノ酸ユニットであり、Kkは、好ましくはバリン-シトルリンであり；
Qqは、qが０，１または２である、延長ユニットであり；
R20はOまたはSから選択され；
R21は水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、該アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、独立して、さらにハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１以上の基で任意に置換されていてもよい。
【００４６】
本発明に従って、N末端アミノ基および/または抗体のリジン残基のアミノ基をフリーのチオール基を有する結合ユニットXに結合した後は、抗体のヒンジ領域における還元反応が回避され、それにより抗体自身の構造への影響が減らされる。さらに、導入した炭素-窒素結合構造は安定であり、体内における循環で容易に分解されず、薬物抗体比は反応条件をさらにコントロールすることにより０‐５の通常の分布範囲内でコントロールすることができる。
【００４７】
発明の詳細な説明
特に定義しない限り、本明細書で用いたすべての技術的および科学的用語は技術分野における当業者によって一般に理解されているものと一致する。類似または同等の方法や物質もまた本発明を実施または試験するために用いることができるが、本明細書は好ましい方法や物質を記載している。以下の用語は、以下の定義に従って本発明を記載し、クレームするために用いられる。
【００４８】
本発明で商標名が用いられる場合、それは商標名の下での製剤、ジェネリック医薬品および活性薬物部分を含むものである。
特に言及しない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いた用語は以下に述べる意味を有する。
【００４９】
用語「アルキル」とは、Ｃ１−Ｃ２０の直鎖または分岐鎖基などの飽和脂肪族ヒドロカルビル基、好ましくは１〜１２個の炭素原子を持つアルキル、より好ましくは、１〜１０個の炭素原子を持つアルキル、最も好ましくは、１〜６個の炭素原子を持つアルキルをいう。代表例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチル、ｎ−ヘプチル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、２，３−ジメチルペンチル、２，４−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、ｎ−オクチル、２，３−ジメチルヘキシル、２，４−ジメチルヘキシル、２，５−ジメチルヘキシル、２，２−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルヘキシル、４，４−ジメチルヘキシル、２−エチルヘキシル、３−エチルヘキシル、４−エチルヘキシル、２−メチル−２−エチルペンチル、２−メチル−３−エチルペンチル、ｎ−ノニル、２−メチル−２−エチルヘキシル、２−メチル−３−エチルヘキシル、２，２−ジエチルペンチル、ｎ−デシル、３，３−ジエチルヘキシル、２，２−ジエチルヘキシル、およびそれらの種々の分岐鎖異性体が挙げられる。１〜６個の炭素原子を持つ低級アルキルがより好ましい。代表例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−エチル―２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２，３−ジメチルブチル等が挙げられる。該アルキル基は置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基はどの置換可能な位置で置換されていてもよく、置換基は好ましくは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルオキシ、アルキルチオール、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、複素環式アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロアルキルチオおよびオキソから成る群から独立して選択される１以上の基である。
【００５０】
用語「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に不飽和の単環式または多環式ヒドロカルビル基をいう。シクロアルキルは３〜２０個の炭素原子、好ましくは３〜１２個の炭素原子、より好ましくは３〜１０個の炭素原子、最も好ましくは３〜８個の炭素原子を有する。単環式シクロアルキルの代表例としては、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル等が挙げられる。多環式シクロアルキルとしては、スピロ環、縮合環または架橋環を持つシクロアルキルが挙げられる。
【００５１】
用語「ヘテロシクリル」とは、３〜２０個の環原子を持つ飽和または部分的に不飽和の単環式または多環式炭化水素基をいい、１以上の環原子はＮ，Ｏ、およびＳ（Ｏ）ｍ（式中、ｍは０と２の間の整数である）から成る群から選ばれるが、環内の−Ｏ−Ｏ−，−Ｏ−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−は除き、残りの環原子は炭素原子である。１〜４個の原子がヘテロ原子である、３〜１２個の環原子が好ましく；３〜１０個の環原子がより好ましい。単環式ヘテロシクリルの代表例としては、これらに限定されないが、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモピペラジニルなどが挙げられる。多環式ヘテロシクリルとしては、スピロ環、縮合環または架橋環を持つヘテロシクリルが挙げられる。
【００５２】
該ヘテロシクリルの環は、アリール、ヘテロアリールまたはシクロアルキルの環に縮合していてもよく、ここでは親構造に結合した環がヘテロシクリルである。代表例としては、これらに限定されないが、以下の基が挙げられる：
【化２１】
2017510548.tif 000027
、など。
【００５３】
ヘテロシクリルは、置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルスルホ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、複素環式アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、複素環式アルキルチオ、およびオキソ基から成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００５４】
用語「アリール」とは、６〜１４員の全て炭素の単環式環または多環式縮合環（即ち、環は隣り合った炭素原子対を共有している）をいい、共役したπ電子系を有している。好ましくは、アリールは、フェニルやナフチル、好ましくはフェニルなどの、６〜１０員である。該アリール環は、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキルの環に縮合していてもよく、ここでは親構造に結合した環がアリールである。代表例としては、これらに限定されないが、以下の基が挙げられる：
【化２２】
2017510548.tif 000028
【００５５】
アリール基は置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオール、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ、およびヘテロシクロアルキルチオから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００５６】
用語「ヘテロアリール」とは、ヘテロ原子がO、SおよびNから成る群から選択される、１〜４個のヘテロ原子と５〜１４個の環原子を有する複素芳香族系をいう。ヘテロアリールは、フリル、チエニル、ピリジニル、ピロリル、Ｎ−アルキルピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリル、テトラゾリルなどの、好ましくは５〜１０員、より好ましくは５〜６員である。該ヘテロアリールは、アリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキルの環に縮合してもよく、ここでは親構造に結合する環がヘテロアリールである。代表例としては、これらに限定されないが、以下の基が挙げられる：
【化２３】
2017510548.tif 000029
【００５７】
該ヘテロアリール基は、置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオール、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、シクロアルキルチオ、およびヘテロシクロアルキルチオから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００５８】
用語「アルコキシ」とは、−Ｏ−（アルキル）および−Ｏ−（無置換シクロアルキル）基の両者をいい、ここでアルキルは上記で定義した通りである。代表例としては、これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、およびシクロヘキシルオキシが挙げられる。該アルコキシは置換されていても、無置換であってもよい。置換されている場合、置換基は好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルスルホ、アルキルアミノ、ハロゲン、チオール、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルコキシ、複素環式アルコキシ、シクロアルキルチオ、および複素環式アルキルチオから成る群から独立して選択される１つ以上の基である。
【００５９】
用語「結合手」とは、“-”として表される共有結合をいう。
用語「ヒドロキシ」とは、−ＯＨ基をいう。
用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子をいう。
用語「アミノ」とは、−ＮＨ２基をいう。
用語「シアノ」とは、‐ＣＮ基をいう。
用語「ニトロ」とは、‐ＮＯ２基をいう。
用語「オキソ基」とは、＝Ｏ基をいう。
用語「カルボキシル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基をいう。
用語「アルコキシカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（アルキル）または（シクロアルキル）基をいい、ここでアルキルは上記で定義した通りである。
用語「ベンジル」とは、メチルベンゾール基：
2017510548.tif 000030
をいう。
【００６０】
用語「任意の」または「任意に」は、続いて記載した出来事や状況が生じても、生じなくてもよいことを意味し、その記載は出来事や状況の事例が生じても、生じなくてもよいことを含んでいる。例えば、「アルキルで任意に置換された複素環式基」は、アルキル基が存在しても、しなくてもよいことを意味し、その記載はアルキルで置換されている複素環式基とアルキルで置換されていない複素環式基の場合を含んでいる。
【００６１】
「置換された」は、基内の１以上の水素原子、好ましくは５まで、より好ましくは１〜３の水素原子が、対応する数の置換基でそれぞれ独立して置換されていることをいう。置換基はそれらの化学的に可能な位置にのみ存在することは言うまでもない。当業者は過剰な努力を払うことなく経験や理論により置換が可能かどうか判断することができる。例えば、フリーの水素を持つアミノまたはヒドロキシル基と不飽和結合を持つ炭素原子（例、オレフィン）の組合せは不安定である。
【００６２】
用語「医薬組成物」は、本発明記載の１以上の化合物またはそれらの生理学的/薬学的に許容される塩またはプロドラッグおよび生理学的/薬学的に許容される担体や賦形剤などの他の化学成分の混合物をいう。医薬組成物の目的は、生体への薬物投与を容易にし、活性成分の吸収を助け、これにより生物活性を実現することである。
【００６３】
用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体の塩の形態をいい、そのような種類の塩は安全性と有効性を有し、in vivoで哺乳動物に必要な生物活性を有している。本発明の抗体‐薬物抱合体化合物は少なくとも１つのアミノ基を含有していて、酸と塩を形成することができる。薬学的に許容される塩の例としては、限定されないが：塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、pears salts、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サリチル酸塩、クエン酸水素塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩が挙げられる。
【００６４】
用語「溶媒和物」とは、１以上の溶媒和分子と本発明のリガンド‐薬物抱合体化合物によって形成された薬学的に許容される溶媒をいう。溶媒和分子の例としては、限定されないが：水、エタノール、アセトニトリル、イソプロピルアルコール、DMSO、酢酸エチルが挙げられる。
【００６５】
用語「リガンド」は、標的細胞に結合した抗原またはレセプターを認識し、それに結合できる巨大分子化合物である。リガンドの役割は、リガンドに結合した標的細胞群に薬物を届けることであり、リガンドとしては、これらに限定されないが、タンパク性のホルモン、レクチン、増殖因子、抗体または細胞に結合することができる他の分子が挙げられる。本発明の実施態様において、リガンドはPcとして表される。結びつける結合は、リガンドのヘテロ原子と結合ユニットの間で形成される。
【００６６】
用語「抗原またはレセプター」は、標的細胞を認識し、それに結合するリガンドにより使用される。本発明において、癌などの増殖性疾患の標的細胞および/または組織に発現する細胞表面抗原またはレセプターに対するリガンドが好ましい；細胞表面レセプターの具体例は、これらに限定されないが、HER2、HER3、HER4、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、Lewis Y、CD56、CD105、VEGFRまたはGPNMBの細胞表面レセプターから選択される。最も好ましくは、HER2、CD22、CD30、CD33、CD44、CD56、Lewis YおよびGPNMBの細胞表面レセプター群から選択されたものである。具体的には、好ましい態様としては、これらに限られないが：トラスツズマブ(HER2)、イノツズマブ(CD22)、ピナツズマブ(CD22)、ブレンツキシマブ(CD30)、ゲムツズマブ(CD33)、ビバツズマブ(CD44)、ロルボツズマブ(CD56)、cBR96 (Lewis Y)またはGlematumamab (GPNMB)が挙げられる。
【００６７】
本明細書において、「抗体」は望ましい生物活性を示す抗体のいかなる形態をもいう。従って、それは最も広い意味で、特に、これらに限定されないが、全長の抗体、抗体結合フラグメントまたはそれらの誘導体などに用いられる。抗体のソースとしては、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、遺伝子改変抗体（例、二重特異性抗体）が挙げられる。
【００６８】
用語「全長の抗体」とは、ジスルフィド結合で架橋した４つのポリペプチド鎖（即ち、２つの重鎖と２つの軽鎖）から成る免疫グロブリンポリマー（IgMなど）をいう。各重鎖は重鎖可変領域（VHと略す）のフラグメントと重鎖定常領域のフラグメントから成り、重鎖定常領域は３つのドメイン：CH1、CH2およびCH3から成っている。各軽鎖は軽鎖可変領域（VLと略す）のフラグメントと軽鎖定常領域のフラグメントから成り、軽鎖定常領域は１つのドメイン（CL1）から成っている。VHとVL領域は、さらに相補性決定領域（CDR）と名付けられた超可変領域と、フレームワーク領域（FR）と呼ばれ、各相補性決定領域の間に分散している、より保存されたドメインに分けることができる。
【００６９】
用語「抗体結合フラグメントまたは誘導体」としては、抗原と結合して複合体を形成することができる、いかなる天然起源の、酵素的に得られた、合成された、または遺伝子改変のポリペプチドまたは糖タンパクが含まれる；典型的には、それは少なくとも親抗体の抗原結合領域または可変領域（例、１以上のCDR）の部分を含み、そして少なくとも親抗体の何らかの結合特異性を保持している。「抗体結合フラグメントまたは誘導体」は、抗体から誘導してもよく、例えばタンパク分解手法や遺伝子組み換え技術（抗体の可変領域および定常領域の部分を発現するDNAの操作と発現を含む）などの適当な標準的手法により全長の抗体を再編成することによって得てもよい。「抗体結合フラグメントまたは誘導体」としては、これらに限定されないが、(i) Fabフラグメント；(ii) F(ab')2フラグメント；(iii) Fdフラグメント；(iv) Fvフラグメント；(V)単鎖Fv (scFv)；(vi) dAbフラグメント；および(vii)抗体の超可変領域の模倣アミノ酸残基の最小認識単位（例、単離した相補性決定領域（CDR））が挙げられる。二価抗体、三価抗体、四価抗体およびマイクロ抗体などの他の改変分子も「抗体結合フラグメントまたは誘導体」の範囲に入る。
【００７０】
「Fabフラグメント」は、完全な軽鎖と重鎖VHおよびCH1機能ドメインからなっている。Fab分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００７１】
「Fc」領域は、抗体CH1およびCH2ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含んでいる。２つの重鎖フラグメントは２以上のジスルフィド結合とCH3ドメインの疎水性効果によって一緒に保たれている。
【００７２】
「Fab'フラグメント」は、軽鎖と重鎖VHおよびCH1機能ドメインを含み、さらにCH1ドメインとCH2ドメインの間の領域を含有しており、そのためジスルフィド結合が２つのFab'フラグメントの２つの重鎖の間で形成でき、F(ab')2分子を形成できる。
【００７３】
「F(ab')2フラグメント」は、CH1ドメインとCH2ドメインの間の部分的な定常領域を含んでいる２つの軽鎖と２つの重鎖を含有しており、そのため鎖間のジスルフィド結合が２つの重鎖間で形成できる。それ故、F(ab')2フラグメントは２つの重鎖間のジスルフィド結合により一緒に保たれた２つのFab'フラグメントから成っている。
【００７４】
「Fvフラグメント」は、軽鎖または/および重鎖可変領域（VH）機能ドメインから成る。
【００７５】
「Fc領域」は、IgGのCH2とCH3機能ドメインに相当し、何らかの抗原結合活性はなく、それはエフェクター分子および細胞と相互作用した抗体分子の部分である。
【００７６】
「ヒンジ領域」は、抗体FabフラグメントをFcフラグメントと結合させるために用いられる。本発明において、二重特異性融合タンパクをFcフラグメントに結合させることができる。
【００７７】
本発明の抗体は、好ましくは標的細胞の細胞表面抗体と結合する特異抗体である；具体例としては、限定されないが、以下の抗体が挙げられる：
細胞表面抗原HER2（乳がん細胞の表面に最も存在）に対する抗体；B細胞リンパ腫を過剰発現する殆どのCD-20またはCD22抗原に対する抗体；細胞表面抗原CD33に対する抗体（細胞表面抗原はいくつかのヒト骨髄腫、特に急性骨髄性白血病に多く見られる）；細胞表面抗原CD30、CD44、Lewis Y、CD56、CD105、VEGFRまたはGPNMBに対する抗体；さらに、トラスツズマブ（商標名Herceptin(登録商標)）などの他の市販抗体もリガンドとして用いることができる。トラスツズマブは乳がんの治療、HER2を過剰発現する転移性乳がんの治療に用いられるヒト化抗HER2抗体である。
【００７８】
用語「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチドの間の配列の類似性をいう。２つの比較する配列の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められているとき、例えば、２つのDNA分子の各位置がアデニンで占められているなら、２つの分子はその位置で同一である。２つの配列の間の同一性のパーセンテージが、関数：２つの配列の共通のマッチまたは同一の位置／比較する位置の数×１００として出される。例えば、最適配列比較において、２つの配列の１０の位置のうち、６の位置がマッチまたは同一なら、２つの配列の同一性は６０％である。一般には、２つの配列を比較して最大の同一性パーセンテージを得る。
【００７９】
用語「インターバルユニット」（Y）は二官能性の化合物で、本発明のリガンドと細胞傷害性薬物を連結してリガンド‐インターバルユニット‐薬物抱合体を生成するために用いられ、または抗腫瘍関連抗原の免疫複合体を生成するために用いられる。そのような免疫複合体は細胞傷害性薬物を腫瘍細胞に選択的に届けることができる。
【００８０】
用語「細胞傷害性薬物」は、腫瘍細胞における通常の増殖を強力に破壊できる化学分子を意味する。原則として、細胞傷害性薬物は高い十分な濃度で腫瘍細胞を死滅させるが、特異性に欠けるため、腫瘍細胞を死滅させるときに、正常細胞のアポトーシスも起こし、重篤な副作用を起こす。本発明の実施態様において、細胞傷害性薬物はDで表し、例としては、限定されないが：チューブリン阻害薬、DNAアルキル化剤、チロシンキナーゼ阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、またはDNA合成阻害薬、好ましくはチューブリン阻害薬が挙げられる。
【００８１】
アウリスタチンは、物理特性とドラッガビリティ（druggability）の最適化を容易にする、比較的容易にリフォームした化学構造を持った完全な合成薬物である。抗体抱合に用いるアウリスタチン誘導体としてはモノメチルアウリスタチンE（MMAE）およびモノメチルアウリスタチンF（MMAF）が挙げられ、前者は天然のチューブリンポリメラーゼ阻害薬ドラスタチン１０から誘導された合成ペンタペプチドであり、C末端に2-アミノ-1-オール-フェニルプロピルを添加することによって合成されている。種々のヒト腫瘍細胞株に対するMMAE阻害活性は１ナノモル以下である。MMAE自身の細胞傷害性活性を減らすために、MMAFについては、ドラスタチン１０のC末端にフェニルアラニンを導入していて、構造中へのカルボキシル基の導入のため、MMAFは膜通過の能力が乏しくなり、それ故、細胞に対する生物活性は著しく減少しているが、抗体と結合した後は細胞に対する阻害活性は実質的に増加している（US7750116）。
【００８２】
用語「チューブリン阻害薬」とは、チューブリンの重合を阻害または促進し、その結果細胞の有糸分裂過程を妨げることにより抗腫瘍効果を発揮する化合物群をいう。例としては、限定されないが：メイタンシノイド、カリチアマイシン、タキサン、ビンクリスチン、コルヒチン、ドラスタチン/アウリスタチンが挙げられ、好ましくはメイタンシノイドまたはドラスタチン/アウリスタチンから選択され；より好ましくは式D1またはDMの化合物から選択される。
【００８３】
用語「DNAアルキル化剤」とは、体内でカルボカチオンまたは他の陽イオンまたは他の活性親電子基を生成し、さらに細胞中のDNAにおいて豊富な電子を含む基と共有結合をして（アミノ、メルカプト、ヒドロキシ、カルボキシル、ホスホリルなど）、DNAの構造変化や切断を引き起こし、その結果腫瘍細胞の死滅に導くことができる化合物群をいう。例としては、限定されないが：ナイトロジェンマスタード類（シクロホスファミド）、エチリデンヒドラゾノアミン類（チオテパ、マイトマイシン）、メタンスルホン酸エステル類（ブスルファン）、ポリオール類（ジブロモマンニトール）、ニトロソウレア類（カルムスチン）、トリアゼンイミダゾール（ダカルバジン）およびヒドラジン類（プロカルバジン）が挙げられる。
【００８４】
用語「チロシンキナーゼ阻害薬」とは、アデノシン三リン酸（ATP）としてチロシンキナーゼに結合することができる競合的阻害薬群をいい、またチロシンキナーゼ活性を遮断し、チロシン類縁体として細胞増殖を阻害する化合物群もいう。例としては、限定されないが：イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、ダサチニブ、ニロチニブなどが挙げられる。
【００８５】
用語「タンパク合成阻害薬」とは、標的細胞によって合成されるタンパクに影響を与えることができる化合物群をいう。タンパク合成阻害薬はDNA複製、RNA転写などのタンパク合成の各ステップに作用し、開始因子、伸長因子およびリボソームを阻害することによって役割を果たす。例としては、限定されないが：アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド、およびクロラムフェニコールが挙げられる。
【００８６】
用語「薬物抗体比」とは、上記式（I）の各リガンドにロードされた細胞傷害性薬物の平均数をいい、薬物量と抗体量の比としても表され、各リガンド（Pc）に対してロードされる薬物の範囲は１−８細胞傷害性薬物（D）であり、本発明の実施態様において、薬物抗体比はｎとして表され、カップリング反応後の各ADC分子における薬物の平均数は、UV/可視スペクトル法、マススペクトル法、ELISA試験、およびHPLC特性同定などの慣用的な方法によって同定される。
【００８７】
本発明において、ｎは結合部位の数によって制限してもよく、本発明の１つの実施態様において、細胞傷害性薬物は結合ユニットによりN末端アミノ基および/またはリジン残基のε-アミノで結合させたが、概して、カップリング反応で抗体に結合する薬物分子の数は理論最大値より少ない。
【００８８】
限定されないが、次の方法はリガンド細胞傷害性薬物抱合体のロード量をコントロールするために用いることができ、この方法には：
(1) 結合する試薬とMAbのモル比をコントロールする、
(2) 反応時間と温度をコントロールする、
(3) 異なる反応試薬を選択する
ことが含まれる。
【００８９】
用語「結合ユニット」とは、一方の端で炭素原子を通じてリガンドに共有結合をし、他端で硫黄原子を通じて細胞傷害性薬物に共有結合した化学構造フラグメントをいう。本発明において、結合ユニットは一般式（X）として定義されている。結合ユニットは、還元的アミノ化の方法で抗体のアミノ基に、好ましくは抗体のN末端におよび/またはリジン残基のε-アミノに結合する。
【００９０】
用語「インターバルユニット」は、二官能性の化合物フラグメントであり、結合ユニットを細胞傷害性薬物とカップリングさせ、最終的にリガンド‐細胞傷害性薬物抱合体を形成するために用いられる；そのようなカップリング方式は細胞傷害性薬物を結合ユニットに選択的に届けることができる。本発明において、インターバルユニットは好ましくは一般式（Y）として示される。
【００９１】
用語「アミノ酸ユニット」とは、延長ユニットが存在する場合、下記の構造式YRのカルボニル基が延長ユニットと結合できることをいう。延長ユニットが存在しない場合、YRは細胞傷害性薬物のアミノ酸に直接結合する。本発明の実施態様において、アミノ酸ユニット-Kk-として表される。
【化２４】
2017510548.tif 000031
-Kk-は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチドまたはデカペプチドであり、-K-ユニットは、それぞれ独立して次の構造式KaまたはKbから成り、ｋは０−１０の整数である：
【化２５】
2017510548.tif 000032
式中、R23は水素またはメチルであり；
R24は水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、ベンジル、p-ヒドロキシベンジル、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-ピリジルメチル-、3-ピリジルメチル-、4-ピリジルメチル-、フェニル、またはシクロヘキシル、
【化２６】
2017510548.tif 000033
であり；
R25は、-アリール-、-アルキル-アリール-、-シクロアルキル-、-アルキル-シクロアルキル-、-シクロアルキル-アルキル-、-アルキル-シクロアルキル-アルキル-、-ヘテロシクリル-、-アルキル-ヘテロシクリル-、-ヘテロシクリル-アルキル-、-アルキル-ヘテロシクリル-アルキル-、-アリール-、-アルキル-アリール-、-アリール-アルキル-、-アルキル-アリール-アルキル-、-ヘテロアリール-、-アルキル-ヘテロアリール-、-ヘテロアリール-アルキル-、-アルキル-ヘテロアリール-アルキル-である。
【００９２】
一つの実施態様において、-Kk-はジペプチド、好ましくは-バリン-シトルリン-、-フェニルアラニン-リジン-または-N-メチルバリン-シトルリン-、より好ましくは-バリン-シトルリン-である。
【００９３】
他の実施態様において、-Kk-はジペプチド、好ましくは
2017510548.tif 000034
および
2017510548.tif 000035
である。
【００９４】
用語「アミノ酸」とは、分子構造がアミノ基とカルボキシル基を含み、そしてアミノ基とカルボキシル基が‐CH‐構造に直接結合している有機化合物をいう。式はH2NCHRCOOHである。炭素原子に対するアミノ基の結合位置によって、それはα、β、γ、δ、ε ......-アミノ酸に分けられる。生物学の分野において、天然のタンパク構造を構成するアミノ酸はそれらの特異的な性質を有している、即ち：アミノ基がα‐炭素原子に直接結合している、即ち、Gly(グリシン)、Ala(アラニン)、Val(バリン)、Leu(ロイシン)、Ile (イソロイシン)、Phe(フェニルアラニン)、Trp(トリプトファン)、Tyr (チロシン)、Asp(アスパラギン酸)、His(ヒスチジン)、Asn(アスパラギン), Glu (グルタミン酸)、Lys (リジン)、Gln(グルタミン)、Met (メチオニン)、Arg (アルギニン) 、Ser(セリン)、Thr(スレオニン)、Cys (システイン)、Pro(プロリン)などのα‐アミノ酸である。
【００９５】
本発明の一つの実施態様において、アミノ酸は
2017510548.tif 000036
および
2017510548.tif 000037
から選択される。
【００９６】
用語「延長ユニット」とは、アミノ酸ユニットが存在するときは、それが細胞傷害性薬物と共にアミノ酸ユニットを結合できるケース、またはアミノ酸ユニットが存在しないときは、延長ユニットはYRカルボニル基により細胞傷害性薬物に結合した化学構造になるケースをいう。本発明の実施態様において、延長ユニットは-Qq-として表され、ｑは0，1，2から選択される。
【００９７】
１つの好ましい実施態様において、Qはp−アミノベンジルアルコール構造である。この態様において、in vivoでの薬物放出の可能なメカニズムがスキーム１に示されている（Toki BE, Cerveny CG, J Org. Chem. 2002 (67) 1866-1872）：
【化２７】
2017510548.tif 000038
式中：WはC1-C8アルキル、ハロゲン、ニトロまたはシアノから選択される；
ｗは0−4から選択される整数である。
慣用の医薬組成物の製法はChinese pharmacopoeiaで見られる。
【００９８】
用語「担体」は本発明の薬物に用いられ、人体に入る薬物の様式を変え、そしてin vivo分布を変え、薬物の放出速度と標的器官への薬物送達をコントロールするシステムをいう。薬物担体放出とターゲッティングシステムは、薬物の分解と損失を減らし、副作用を減らし、そしてバイオアベイラビリティを改善することができる。例えば、担体として用いた高分子界面活性剤は、その特有の両親媒性構造のために自己集合して種々の形態で凝集物を形成する。好ましい例としては、ミセル、エマルション、ゲル、液晶、小胞などが挙げられる。これらの凝集物は薬物分子を包み込む能力を有しているのみならず、膜に対して良い透過性を示し、優れた薬物担体として用いることができる。
【００９９】
用語「賦形剤」は、医薬製剤において主薬以外の付属物であり、アクセサリーとも云われる。例えば、錠剤における結合剤、フィラー、崩壊剤、潤滑剤；軟膏、クリームなどの準固形製剤におけるマトリックス部分；液体製剤における保存剤、抗酸化剤、香味料、芳香剤、共溶媒、乳化剤、溶解剤、浸透圧調節剤、着色剤などが賦形剤といわれる。
【０１００】
用語「希釈剤」もフィラーとして知られており、その主な目的は錠剤の重量と容積を増やすことである。希釈剤の添加は一定の容積を確実にするのみならず、主要成分の容量逸脱を減らし、薬物の圧縮成形性を改善する。医薬錠剤が油性成分を含んでいる場合、吸収剤を添加し、オイル物質を吸収して、「ドライ」状態を維持しなければならず、これが錠剤の形成を容易にする。デンプン、乳糖、カルシウム塩、結晶セルロースなどである。
【０１０１】
医薬組成物は無菌の注射用水溶液の形態であってもよい。実際の許容される溶剤および溶媒としては、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。無菌の注射用製剤は、活性成分が油相に溶解している無菌の注射用水中油型マイクロエマルションである。例えば、活性成分は大豆油とレシチンの混合物に溶解する。次いで、オイル溶液を水とグリセリン溶液の混合物に加え、処理してマイクロエマルションを形成する。注射溶液またはマイクロエマルションは大量に局所注射により患者の血流中に注射してもよい。または、好ましくは、該溶液およびマイクロエマルションは本発明化合物の一定の循環濃度を維持する方法で投与する。そのような一定の濃度を維持するために、継続的な静脈内輸送デバイスが用いられる。そのようなデバイスの例はDeltec CADD-PLUS. TM. 5400静脈ポンプである。
【０１０２】
医薬組成物は、筋肉内および皮下投与用の無菌の注射用水またはオイル懸濁液の形態でもよい。公知技術に従い、上記したこれらの適当な分散剤または湿潤剤を懸濁剤と一緒に用いて懸濁液を調製できる。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒で調製した無菌注射用溶液または懸濁液、例えば1,3-ブタンジオールにより調整した溶液でもよい。また、無菌の不揮発性油は溶媒または懸濁媒体として便利に用いることができる。この目的のために、合成グリセリドまたはジグリセリドなどの不揮発性ブレンドオイルを用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も同様に注射溶液の製造に用いることができる。
【０１０３】
用語「還元剤」は、酸化還元反応において失う電子または偏向する電子をもつ物質である。広い意味で還元剤自身は還元性を持つ抗酸化剤でもあり、酸化されると、その生成物は酸化生成物と呼ばれる。本発明の実施態様において、還元剤はRAで表され、還元剤の例としては、限定的ではないが：H2、炭素（C）一酸化炭素（CO）、還元鉄粉（Fe）、亜鉛（Z）、アルカリ金属（一般にLi、Na、Kで用いる）、他の活性金属（例、Mg、Al、Ca、Laなど）、塩化スズ（SnCl2による）、シュウ酸、水素化ホウ素カリウム（KBH4）、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaCNBH3）、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（(CH3COO)3BHNa）、リチウムアルミニウムヒドリド（NaBH4）、ジ亜リン酸、ジ亜リン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム（Na2S2O3）が挙げられ、本発明の還元剤は好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドである。
【０１０４】
用語「メルカプト保護基」とは、チオール基と他の化学基の両方が反応に関与する場合、反応が特定の基にのみ起こり、チオール基が影響を受けることを防止することを確実にするために、チオールを反応が完結するまで保護し、次いで保護基を除去するというケースをいう。本発明の実施態様において、メルカプト保護基はTとして表した。メルカプト保護基の例としては、限定的ではないが、-tert-ブチル、-アセチル、-n-プロピオニル、-iso-プロピオニル、-トリフェニルメチル、-メトキシメチル、-2-(トリメチルシリル)エトキシメチルが挙げられ、本発明のメルカプト保護基は、好ましくはアセチルである。
【０１０５】
用語「がん」とは、悪性腫瘍としても知られるが、コントロールできない細胞の成長及び増殖メカニズムによって引き起こされる疾患や病気をいう。異なる発生部位により、癌の病理学的特徴は異なり、例としては、限定的ではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、すい臓がん、骨がん、乳がん、卵巣がん、前立せんがん、食道がん、胃がん、口腔がん、鼻腔がん、喉頭がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、肝細胞がん、胆管細胞がん、絨毛がん、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、グリオーマ、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、into blood cells tumor、乏突起神膠腫、髄膜腫がん、皮膚がん、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、急性リンパ性白血病 "ALL"、B細胞性急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性T細胞性白血病、急性骨髄性白血病 "AML"、急性前骨髄球性白血病 "APL"、急性単球性白血病、急性白血病、急性原発性巨核球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病 "CML"、慢性リンパ性白血病 "CLL"、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
【０１０６】
本明細書において、結合フラグメントの以下の略号は、適切な構造に対応している：
MCは式（V）で示されるフラグメントである：
【化２８】
2017510548.tif 000039
Valは、バリンフラグメントである；
Citは、シトルリンフラグメントである；
PABは、1,4-アミノベンジル-カルバモイルフラグメントであり、Dに結合して、式（VI）で示される構造を持つ、
【化２９】
2017510548.tif 000040
【０１０７】
本明細書において、以下の細胞傷害性薬物の略号は以下に示した定義を持つ：
MMAEはモノメチル-アウリスタチンE（分子量：７１８）、構造は式（VII）で示す：
【化３０】
2017510548.tif 000041
MMAFは、N-メチル バリン-バリン-ドライソロイシン(Dil)-ドラプロイン(dolaproine) (Dap)-フェニルアラニン（MW:７３１．５）であり、構造は式（VIII）で示される：
【化３１】
2017510548.tif 000042
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ヌードマウスにおけるNCI-N87ヒト胃癌異種移植片についての化合物１６、化合物１７、化合物１８、および陽性コントロール化合物３５の有効性を示す。
【図２】腫瘍を有するヌードマウスの体重に関する化合物１６、化合物１７、化合物１８、陽性コントロール化合物３５の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
好ましい実施態様
本発明を以下の具体的実施例に基づいてさらに説明する。これらの実施例は単に発明を明示するためのもので、発明の範囲を限定するものではない。
化合物の構造は核磁気共鳴（ＮＭＲ）および／またはマススペクトル（ＭＳ）により同定した。ＮＭＲはBruker AVANCE-400で測定した。溶媒は重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）および重水素化メタノール（ＣＤ３ＯＤ）で、内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いた。ＮＭＲのケミカルシフト（δ）は１０−６（ｐｐｍ）で示した。
ＭＳはFINNIGAN LCQAd (ESI)マススペクトロメータ（製造者：Thermo、型：Finnigan LCQ advantage MAX）で測定した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はAgilent 1200DAD 高圧液体クロマトグラフィースペクトロメーター（Sunfire C18 150x4.6mmクロマトグラフィーカラム）およびWaters 2695-2996 高圧液体クロマトグラフィースペクトロメーター（Gimini C18 150x4.6mmクロマトグラフィーカラム）で測定した。
薄層シリカゲルクロマトグラフィー（TLC）についてはYantai Huanghai HSGF254またはQingdao GF254シリカゲルプレートを用いた。ＴＬＣで用いたプレートの厚さは０．１５ｍｍ〜０．２ｍｍで、生成物の精製に用いたプレートの厚さは０．４ｍｍ〜０．５ｍｍであった。
カラムクロマトグラフィーでは、通常、担体としてYantai Huanghai 200-300メッシュシリカゲルを用いた。
本発明の公知の出発物質は、技術分野で慣用の合成方法により製造できるか、またはABCR GmbH & Co. KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、Accela ChemBio Inc.、またはDari Chemical Companyなどから購入できる。
特に明示しない限り、以下の反応は、窒素雰囲気またはアルゴン雰囲気下で行った。
用語「アルゴン雰囲気」または「窒素雰囲気」は、反応フラスコが１Ｌのアルゴンまたは窒素の風船を備えていることをいう。
特に明記しない限り、実施例で用いた溶液は水溶液をいう。
特に明示しない限り、実施例における反応温度は２０℃〜３０℃の範囲の室温であった。
反応の進行は薄層クロマトグラフィー（TLC）でモニターし、そして展開溶媒の系としては：A：ジクロロメタンとメタノールの系、B：ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの系、C：石油エーテルと酢酸エチルの系、D：アセトンが挙げられる。溶媒の容積比は化合物の極性に従って調節した。
カラムクロマトグラフィーによる化合物精製の溶出系および薄層クロマトグラフィーによる展開溶媒としては：Ａ：ジクロロメタンとメタノールの系、Ｂ：ｎ−ヘキサンと酢酸エチルの系、Ｃ：ジクロロメタンとアセトンの系、Ｄ：ｎ−ヘキサン，Ｅ：酢酸エチルが挙げられる。溶媒の容積は化合物の極性により調節し、そしてときには、少量のトリエチルアミンおよび酸性またはアルカリ試薬も添加した。
本発明の化合物の構造はQ-TOF LC/MSにより測定した。Q-TOF LC/MSに関しては、Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole - Time of Flight Mass Spectrometer および Agilent 1290-Infinity UHPLC (Agilent Poroshell 300SB-C8 5μm, 2.1 X 75mm Column)が用いられた。
本発明の公知の出発物質は、先行技術における公知の方法を採用または用いることにより合成されるが、特定の条件が示されていない以下の実施例における実験方法は慣用の条件または製品製造者が推奨する条件に従って実施することができる。特定の供給源が示されていない実験試薬は、一般に市場から購入された慣用の試薬である。
【実施例１】
【０１１０】
中間体の調製
薬物としての中間体の調製
１．PCT特許出願WO2004010957に開示された方法を用いて以下の中間体化合物1〜6
を調製した。
2017510548.tif 000043
２．PCT特許出願WO2005081711に開示された方法を用いて以下の中間体化合物7〜11を調製した。
2017510548.tif 000044
３．米国特許出願US7750116に開示された方法を用いて以下の中間体化合物12〜14を調製した。
2017510548.tif 000045
【０１１１】
４．中間体化合物15の調製
【化３２】
2017510548.tif 000046
合成経路は次の通りである。
【化３３】
2017510548.tif 000047
ステップ１：3-（マレイミド）プロピオン酸
b-アラニン1a(2.29g, 25.8mmol)及び無水マレイン酸(2.52g, 25.8mmol)を酢酸20mLに溶解し、還流まで加熱した後、２時間撹拌した。減圧下で反応溶液を濃縮し、残渣を共沸蒸留のためトルエンで処理し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで再結晶させた後、濾過し、乾燥させ、標記の生成物3-（マレイミド）プロピオン酸1b(2.80g, 収率：64.3%)の無色結晶を得た。
MS m/z (ESI):170.04[M+1].
ステップ２：3-（マレイミド）プロピオン酸スクシンイミドエステル
氷浴中で3-（マレイミド）プロピオン酸1b(2.80g, 16.6mmol)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(2.25g, 19.9mmol)をDMF30mlに溶解し、0°Cに冷却した。N、N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(6.85g, 33.2mmol)を添加しながら10分間撹拌した。次に、反応混合物を室温まで加熱し、終夜撹拌した。濾過後、濾液をジクロロメタン80mlと混合し、それぞれ水(60ml×3)、5%重炭酸ナトリウム水溶液(60ml×3)及び生理食塩の飽和溶液(50ml×3)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、3-（マレイミド）プロピオン酸スクシンイミドエステル1c (2.76g, 収率：62.5%)の白色固体を得た。
MS m/z (ESI):267.06[M+1].
ステップ３：（1r、4r）-4-（t-ブトキシカルボニル-アミノメチル）シクロヘキシルメタン酸
（1r、4r）-4-（アミノメチル）シクロヘキシルメタン酸1d(4.72g, 30.0mmol)及び水酸化ナトリウム(1.28g, 32.0mmol)を水20ml及びtert-ブタノール44mlの混合溶媒に溶解した。次に、tert-ブチルジカーボネート(6.99g, 32.0mmol)を添加した。反応溶液を室温で18 時間撹拌した後、水100mlを添加し、n-ヘキサン(100ml×3)で洗浄した。水層を4°Cに冷却し、クエン酸飽和水溶液でpHを３に調整した。酸性化した溶液を酢酸エチル(50ml×3)で抽出し、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、（1r、4r）-4-（t-ブトキシカルボニル-アミノメチル）シクロヘキシルメタン酸1e (7.33g, 収率：95%)の無色結晶を得た。
MS m/z (ESI):258.17[M+1].
ステップ４：（1r、4r）-4 -（（tert-ブトキシカルボニルアミノ）メチル）シクロヘキシルメタン酸スクシンイミドエステル
氷浴の中で（1r、4r）-4-（t-ブトキシカルボニル-アミノメチル）シクロヘキシルメタン酸1e (7.33g，28.5mmol)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(3.87g, 34.2mmol)をDMF35mlに溶解し、0°Cに冷却した。これにN、N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(11.76g, 57.0mmol)を添加しながら10分間撹拌した。そして、反応混合物を室温に加熱し、終夜撹拌した。濾過後、濾液にジクロロメタン90mlを加え、それぞれ水(60ml×3)、5% NaHCO3水溶液(60ml×3)及び生理食塩の飽和溶液(50ml×3)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液は減圧下で濃縮し、（1r、4r）-4 -（（tert-ブトキシカルボニルアミノ）メチル）シクロヘキシルメタン酸スクシンイミドエステル1f (6.75g, 収率：66.8%) のほぼ白色の固体を得た。
MS m/z (ESI):355.18 [M+1].
ステップ５：S-2 -（（1r、4s）-4 -（（tert-ブトキシカルボニルアミノ）メチル）-N-メチル-N-シクロヘキシルフォルミル）プロパン酸
（1r、4r）-4-（（tert-ブトキシカルボニルアミノメチル）シクロヘキシルメタン酸スクシンイミドエステル1f (6.75g, 19.0mmol) 及びN-メチル-L-アラニン1g (1.96g , 19.0mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル/水の容量比1:1の混合溶媒90mlに溶解した後、 トリエチルアミン(4.05g, 40mmol)を添加した。この混合物は室温で６時間反応した後、減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチル100mlに溶解し、生理食塩の飽和溶液(80ml×3)で洗浄し た。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過した。濾液は減圧下で濃縮し、ジクロロメタン/メタノール (50:1)を展開液とした薄層クロマトグラフィーで残渣を精製し、S-2 -（（1r、4s）-4-（（tert-ブトキシカルボニルアミノ）メチル）-N-メチル-N-シクロヘキシルフォルミル）プロパン酸1h(4.78g, 収率：73.5%)のほぼ白色の固体を得た。
MS m/z (ESI):343.22 [M+1].
ステップ６
メイタンシノール1i(565.5mg, 1.0mmol, Wayne CW, Sharon DW及びEmily ECらがJ.Med.Chem, 2006, 49, 4392-4408に発表した周知の合成法で調製したもの)及びS-2-（1r、4s）-4-（（tert-ブトキシカルボニルアミノ）メチル）-N-メチル-N-シクロヘキシルフォルミル）プロパン酸1h(2.05g, 6.0mmol) をジクロロメタン20mlに溶解した。 N、N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.30g, 6.3mmol)をジクロロメタン5mlに溶解し、上記の反応溶液に加えた。この混合物に1M塩化亜鉛のジエチルエーテル溶液(1.2ml, 1.2mmol)をゆっくり滴定し、室温で2 時間撹拌した。その後、反応溶液を酢酸エチル30mlに溶解し、濾過した。濾液をそれぞれ重炭酸ナトリウムの飽和溶液(15ml×2)及び生理食塩の飽和溶液(10ml×2)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン/メタノール(50:1)を展開液とした薄層クロマトグラフィーで残渣を精製し、化合物1j(201.8mg, 収率：22.7%)のほぼ白色の固体を得た。
MS m/z (ESI):889.43 [M+1].
ステップ７
化合物1j(88.9mg, 0.1mmol)をジクロロメタン8mlに溶解した後、トリフロロ酢酸 (12.6mg, 0.11mmol)を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチル20mlに溶解し、5%炭酸ナトリウム水溶液(6ml×3)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濾過した。濾液は減圧下で濃縮し、化合物1m (76.8mg, 収率：97.3%)のほぼ白色の固体を得た。
MS m/z (ESI):789.38 [M+1].
ステップ８
化合物1m(76.8mg, 0.097mmol)及び3-（マレイミド）プロピオン酸スクシンイミドエステル1c(29.3mg, 0.11mmol)をN、N'-ジメチルホルムアミド10.0mlに溶解した後、トリエチルアミン(30.6mg, 0.3mmol)を添加した。この混合物を室温で８時間反応させた後、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチル20mlに溶解し、生理食塩の飽和溶液(10ml×3)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。ジクロロメタン/メタノール(40:1)を展開液とした薄層クロマトグラフィーで残渣を精製し、化合物15(40.6mg, 収率：44.5%)のほぼ白色の固体を得た。
MS m/z (ESI):940.41 [M+1].
【０１１２】
抗体としての中間体の調製
従来の方法（例えば、ベクター構築、HEK293細胞導入(Life Technologies Cat. No. 11625019)、精製及び発現）に従って以下の抗体を調製した。
１．抗体配列
（１）特異的に標的HER2と結合できるトラスツズマブ： 
軽鎖の配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC      SEQ ID NO: 1
重鎖の配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK        SEQ ID NO: 2
（２）特異的に標的CD22と結合できるイノツズマブ： 
軽鎖の配列：
DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC          SEQ ID NO: 3
重鎖の配列：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK            SEQ ID NO: 4  
（３）特異的に標的CD30と結合できるブレンツキシマブ：
軽鎖の配列：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC           SEQ ID NO: 5
重鎖の配列：
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSLSLSPGK       SEQ ID NO: 6           
（４）特異的に標的HER2と結合できるペルツズマブ：
軽鎖CDR-L1の配列: KASQDVSIGVA               SEQ ID NO.7
軽鎖CDR-L2の配列: SASYRYT                   SEQ ID NO.8
軽鎖CDR-L3の配列: QQYYIYPYT                 SEQ ID NO.9
重鎖CDR-H1の配列: DYTMD                     SEQ ID NO.10
重鎖CDR-H2の配列: DVNPNSGGSIYNQRFKG         SEQ ID NO.11
重鎖CDR-H3の配列: NLGPSFYFDY                SEQ ID NO.12
軽鎖の配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC         SEQ ID NO.13
重鎖の配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK         SEQ ID NO.14         
【実施例２】
【０１１３】
抗体薬物抱合体化合物16の調製
【化３４】
2017510548.tif 000048
合成経路は次の通りである。
【化３５】
2017510548.tif 000049
【０１１４】
ステップ１：トラスツズマブ-プロパンチオールエチルエステル
32.0ml(1.49mmol)のトラスツズマブ原液(6.9mg/mlのPBS溶液、pH=6.3)を同容量の0.1M 酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に変換した。3-アセチル-メルカプト-プロピオンアルデヒド(0.79mg, 5.98mmol)をアセトニトリル3.0mlに溶解した後、上記緩衝液に滴定し、さらに水1.0mlに溶解したシアノ水素化ホウ素ナトリウム(0.92mg, 14.6mmol)を滴下した。これを25°Cで3時間撹拌した。反応終了後に脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.2)で精製を行い、濃度4.8mg/mlのトラスツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(16a)溶液45.1mlを得た。
ステップ２：トラスツズマブ-プロパンチオール
トラスツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(16a)溶液(ステップ1で調製されたもの)を2Mヒドロキシルアミン塩酸塩73mLと混合した。これを25°Cで１時間撹拌した後、脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.2)で精製を行い、濃度3.0mg/mlのトラスツズマブ-プロパンチオール(16b)溶液71.3mlを得た。
ステップ３：トラスツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-Val-Cit-PAB-MMAE(化合物16)
化合物1(MC-Val-Cit-PAB-MMAE, 19.1mg, 14.5mmol) をアセトニトリル7mlに溶解した後、トラスツズマブ-プロパンチオール(16b)溶液(ステップ2で調製されたもの)を添加した。 この反応溶液を25°Cで4時間撹拌した後、脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム (溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.2)で精製し、無菌条件下で0.2mmのフィルターで濾過し、濃度2.03mg/mlのトラスツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-Val-Cit-PAB-MMAE (16)溶液101.0mlを得た。この溶液を無菌条件下で0.2mmのフィルターで濾過し、-20°Cで冷凍保存した。
Q-TOF LC/MS: 148381.5(MAb+0D), 149613.2(MAb+1D), 151169.8(MAb+ 2D), 152587.7(MAb+3D), 153868.1(MAb+4D), 155484.4(MAb+5D). 
n=1.9. 
【実施例３】
【０１１５】
実施例３：抗体薬物抱合体化合物22の調製
【化３６】
2017510548.tif 000050
合成経路は次の通りである。（上記と一貫して）
【化３７】
2017510548.tif 000051
【０１１６】
ステップ１：イノツズマブ-1-メチルプロパンチオールエチルエステル
S-(3-オキソブチル）チオ-酢酸エチル(0.70mg, 4.32mmol)をアセトニトリル3.0mlに溶解した後、20.0ml(1.08mmol)のイノツズマブ原液(8.1mg/mlのPBS溶液、pH=6.0)に滴定した。トリメトキシ水素化ホウ素ナトリウム(2.29mg, 10.8mmol)を水2.0mlに溶解し、上記の反応溶液に滴定し、30°Cで48時間撹拌した。その後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25 ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.2)で精製し、濃度5.4mg/mlのイノツズマブ-1-メチルプロパンチオールエチルエステル(22a)溶液29.2mlを得た。
実施例２のステップ２及び３の方法に従って化合物22を調製した。また、化合物2をステップ３に用いた。
Q-TOF LC/MS: 149611.1(MAb+0D), 151039.9(MAb+1D), 152470.6(MAb+ 2D), 153904.4(MAb+3D), 155317.0(MAb+4D), 156757.9(MAb+5D). 
n=1.8.
実施例２に記載の抗体薬物抱合体16の調製法を参考に、それぞれ対応する抗体（トラスツズマブ、イノツズマブ、ブレンツキシマブ）及び細胞傷害性薬物を用いて抗体薬物抱合体17〜21、24〜27、29及び30を調製した。
2017510548.tif 000052
2017510548.tif 000053
2017510548.tif 000054
実施例３に記載の抗体薬物抱合体22の調製法を参考に、それぞれ対応する抗体（イノツズマブ、ブレンツキシマブ）及び薬物を用いて抗体薬物抱合体23及び28を調製した。
2017510548.tif 000055
実施例４、５、６及び７に従い抗体ペルツズマブ及びそれぞれ対応する薬物を用いて抗体薬物抱合体31，32，33及び34を調製した。
2017510548.tif 000056
【実施例４】
【０１１７】
抗体薬物抱合体化合物31の調製
【化３８】
2017510548.tif 000057
合成経路は次の通りである。
【化３９】
2017510548.tif 000058
【０１１８】
ステップ１：ペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル
G-25サイズ排除カラムを用いてペルツズマブ原液(20mM L-ヒスチジン酢酸及び120mMスクロースの緩衝系に保存されたもの、pH =5.7)を100mM 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH = 4.3-4.5)に変換した後、約10.0mg/ml の濃度に濃縮し、P-mAb 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液 (13.5mmol)200mlを得た。3-アセメチル-メルカプト-プロピオンアルデヒド(14.3mg, 0.108mmol)をアセトニトリル20mlに溶解した後、上記の緩衝液に滴定した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(173mg, 2.7mmol) を水10mlに溶解し、上記の反応溶液に滴定し、25°Cで3時間撹拌した。その後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、濃度6.5mg/mlのペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(31a)溶液300mlを得た。
ステップ２：ペルツズマブ-プロパンチオール
2Mヒドロキシルアミン塩酸塩6.0mLをペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(31a) 溶液(ステップ1で調製されたもの)に加え、25°Cで１時間撹拌した。その後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、濃度4.3mg/mlのペルツズマブ-プロパンチオール(31b)溶液450mlを得た。
ステップ３：ペルツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-MMAF
化合物12(MC-MMAF, 125mg, 13.5mmol)をアセトニトリル45mlに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール(31b)溶液(ステップ2で調製されたもの)に加えた。 25°Cで4時間撹拌した後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、濃縮し、無菌条件下で0.2mmのフィルターで濾過し、濃度8.02mg/mlのペルツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-MMAF(化合物31)溶液240mlを得た。それを-20°Cで冷凍保存した。
【実施例５】
【０１１９】
抗体薬物抱合体化合物32の調製
【化４０】
2017510548.tif 000059
合成経路は次の通りである。
【化４１】
2017510548.tif 000060
【０１２０】
ステップ１：ペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル
G-25サイズ排除カラムを用いてペルツズマブ原液(20mM L-ヒスチジン酢酸及び120mMスクロースの緩衝系に保存されたもの、pH =5.7)を100mM酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液 (pH = 4.3-4.5) に変換した後、約10.0mg/mlの濃度に濃縮し、2.0mlのP-mAb酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液 (0.135mmol)を得た。3-アセチル-メルカプト-プロピオンアルデヒド(0.15mg, 1.1μmol)をアセトニトリル0.2mlに溶解し、上記の緩衝液に滴定した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム (173mg, 2.7mmol)を水0.2mlに溶解し、上記の反応溶液に滴定し、25°Cで3時間撹拌した。その後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、濃度6.5mg/mlのペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(31a)溶液3.0mlを得た。
ステップ２：ペルツズマブ- プロパンチオール
2Mヒドロキシルアミン塩酸塩0.06mLをペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(31a)溶液(ステップ1で調製されたもの)に加え、25°Cで１時間撹拌した。反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、濃度3.8mg/ml のペルツズマブ-プロパンチオール(31b)溶液5.0mlを得た。
ステップ３：ペルツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-MMAE
化合物11(MC-MMAE, 1.3mg, 1.4ummol)をアセトニトリル0.55mlに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール(31b)溶液(ステップ2で調製されたもの)に加えた。25°Cで4時間撹拌した後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、無菌条件下で0.2mmのフィルターで濾過し、濃度2.4mg/mlのペルツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-MMAE(化合物32)溶液8.0mlを得た。これを-20°Cで冷凍保存した。
【実施例６】
【０１２１】
抗体薬物抱合体化合物33の調製
【化４２】
2017510548.tif 000061
合成経路は次の通りである。
【化４３】
2017510548.tif 000062
【０１２２】
ステップ１：ペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル
G-25サイズ排除カラムを用いてペルツズマブ原液 (20mM L-ヒスチジン酢酸及び120mMスクロースの緩衝系に保存されたもの、pH =5.7)を100mM 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH = 4.3-4.5)に変換し、約10.0mg/mlの濃度に濃縮し、200mlのP-mAb酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(13.5mmol)を得た。3-アセチル-メルカプト-プロピオンアルデヒド(14.3mg, 0.108mmol)をアセトニトリル20mlに溶解した後、上記の緩衝液に滴定した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム (173mg, 2.7mmol)を水10mlに溶解し、反応溶液に滴定し、25°Cで3時間撹拌した。その後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、濃度6.5mg/mlのペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(31a)溶液300mlを得た。
ステップ２：ペルツズマブ-プロパンチオール
2M ヒドロキシルアミン塩酸塩6.0mLをペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(31a)溶液(ステップ１で調製されたもの)に加え、25°Cで１時間撹拌した。そして、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、濃度4.3mg/mlのペルツズマブ-プロパンチオール(31b)溶液450mlを得た。
ステップ３：ペルツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-VC-PAB-MMAF
化合物7(MC-VC-PAB-MMAF, 180mg, 13.5mmol)をアセトニトリル45mlに溶解し、ペルツズマブ-プロパンチオール (31b) 溶液 (ステップ2で調製されたもの)に加えた。25°Cで4時間撹拌した後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS 溶液、pH6.3)で精製し、濃縮した。無菌条件下で0.2mmのフィルターで濾過し、濃度8.0mg/mlのペルツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-VC-PAB-MMAF(化合物33)溶液240mlを得た。これを-20°Cで冷凍保存した。
【実施例７】
【０１２３】
抗体薬物抱合体化合物34の調製
【化４４】
2017510548.tif 000063
合成経路は次の通りである。
【化４５】
2017510548.tif 000064
【０１２４】
ステップ１：ペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル
G-25サイズ排除カラムを用いてペルツズマブ原液(20mM L-ヒスチジン酢酸及び120mMスクロースの緩衝系に保存されたもの、pH=5.7)を100mM 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液 (pH = 4.3-4.5)に置換し、約10.0mg/mlの濃度に濃縮し、約2.0mlのP-mAb酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(0.135mmol)を得た。3-アセチル-メルカプト-プロピオンアルデヒド(0.15mg, 1.1umol)をアセトニトリル0.2mlに溶解した後、上記の緩衝液に滴定した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム (173mg, 2.7mmol) を水0.2mlに溶解した後、上記の反応溶液に滴定し、25°Cで3時間撹拌した。その後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相:2mM EDTAを含む0.05M PBS 溶液、pH6.3) で精製し、濃度6.5mg/mlペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(31a) 溶液3.0mlを得た。
ステップ２：ペルツズマブ-プロパンチオール
2M ヒドロキシルアミン塩酸塩0.06mLをペルツズマブ-プロパンチオールエチルエステル(31a)溶液(ステップ1で調製されたもの)に加え、25°Cで１時間撹拌した後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 2mM EDTAを含む0.05M PBS溶液、pH6.3)で精製し、濃度3.8mg/mlのペルツズマブ-プロパンチオール(31b)溶液5.0ml を得た。
ステップ３：ペルツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-VC-PAB-MMAE
化合物1(MC-VC-PAB-MMAE, 1.7mg, 1.4ummol)をアセトニトリル0.55mlに溶解し、 ペルツズマブ-プロパンチオール(31b)溶液(ステップ2で調製されたもの)に加えた。25°Cで4時間撹拌した後、反応溶液を脱塩し、Sephadex G25ゲルカラム(溶出相: 2mM EDTAを含む0.05M PBS 溶液、pH6.3)で精製し、濃縮し、無菌条件下で0.2mmのフィルターで濾過し、濃度2.4mg/mlペルツズマブ-プロピル-1-硫黄-MC-VC-PAB-MMAE(化合物34)8.0mlを得た。 これを-20°Cで冷凍保存した。
【実施例８】
【０１２５】
陽性対照としての抗体薬物抱合体化合物35の調製
【化４６】
2017510548.tif 000065
合成経路は次の通りである。
【化４７】
2017510548.tif 000066
特許US20050169933に開示された方法を用いて抗体薬物抱合体化合物35を調製した。
以下の試験例は本発明を説明するためであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【試験例】
【０１２６】
生物学的評価
【試験例１】
【０１２７】
BT474細胞増殖アッセイ
目的
BT474細胞の増殖について本発明のサンプルの阻害効果を試験する。
物質：
本発明のサンプル：抗体薬物抱合体化合物１６（以下、化合物と呼ぶ）、化合物１７、化合物１８、化合物３１−３４
陽性コントロール薬物：化合物３５；
BT474細胞：Chinese Academy of Sciences Cell Bankから購入、Catalog No: TCHu143；
CCK-8：Cell Counting Kit-8、Dojindoから入手、Catalog No: CK04；
FBS：ウシ胎児血清、Gibcoから入手、Catalog No: 10099-141；
RPMI1640：Hycloneから入手、Catalog No: SH30809.01B；
NOVOSTAR Multifunctional Microplate Reader (BMG)。
方法：
１．10% FBSと15,000のBT474細胞を含む100μlのRPMI1640培地を９６穴プレートの各ウェルに添加し、37 °C、5% CO2でインキュベーター中で培養した。
２．サンプルは10% FBSを含むRPMI1640培地で２倍勾配で希釈した、全部で９希釈、初期濃度は5μg/mlであった。
３．希釈した薬物は、BT474細胞を前もって蒔いた９６穴プレートに移した。50μl/ウェル。各濃度は三つ組で添加した。一方、何の薬物もないウェルを三つ組でコントロールとしてセットした。その後、細胞は37°C、5% CO2の条件下で連続して培養した。
４．９６時間後、各ウェルに発色のため10μlのCCK-8溶液を添加し、37 °C、5% CO2でインキュベーター中に置いた。４時間の発色後、OD450値をELISA microplate readerで読み取り、Graphpad Prism 5ソフトウェアで処理してIC50値を得た。
結果：
本発明化合物の生物活性が上記の方法により得られた；計算したIC50値を下記の表１に示す：
2017510548.tif 000067
結論：好ましい本発明化合物の全てがBT474細胞の増殖に対して著しい阻害活性を有している。
【試験例２】
【０１２８】
Daudi細胞増殖アッセイ
目的
Daudi細胞の増殖について本発明のサンプルの阻害効果を試験する。
物質と装置：
本発明のサンプル：化合物２２、化合物２３、化合物２４、化合物２５；
RPMI1640：Hycloneから入手、Catalog No: SH30809.01B；
Pen Strep (P/S)、Gibcoから購入、Catalog No 15140；
CCK-8：Cell Counting Kit-8、Dojindoから入手、Catalog No: CK04；
75cm TC-Treated Culture Flask、Corning Incorporatedから入手、Item: 430641；
PBS：Gibcoから購入、Catalog No: 20012-027；
DaudiヒトBurkitt'sリンパ腫細胞、Chinese Academy of Sciences Cell Bankから購入、Catalog No: TcHu140；
NOVOSTAR Multifunctional Microplate Reader (BMG)；
抗体イノツズマブ：陽性コントロール。
方法：
１．DaudiヒトBurkitt'sリンパ腫細胞を10%FBSおよび1% P/Sを含むRPMI1640培地中でインキュベートした。試験当日に、細胞密度を5×104細胞/mlに調整し、90ulの培地を９６穴プレートの各ウェルに添加した。
２．サンプルはPBSで４倍勾配で希釈した、全部で９希釈；初期濃度は2.5ug/mlであった。
３．希釈した薬物は、DaudiヒトBurkitt'sリンパ腫細胞を前もって蒔いた９６穴プレートに移した。10μl/ウェル。コントロールウェルに10μlのPBSを添加した。その後、細胞は37 °C、5% CO2のインキュベーターで連続して培養した。
４．７２時間後、各ウェルに10μlのCCK-8発色溶液を添加し、37 °C、5% CO2でインキュベーター中に置いた。４時間の発色後、OD450値をELISA microplate readerで読み取り、Graphpad Prism 5ソフトウェアで処理してIC50値を得た。
2017510548.tif 000068
結論：好ましい本発明化合物の全てがDaudiヒトBurkitt'sリンパ腫細胞の増殖に対して著しい阻害活性を有している。
【試験例３】
【０１２９】
NCI-N87についての阻害率の試験
目的
ヌードマウスにおけるヒト胃がんNCI-N87細胞（ATCC、CRL-5822）異種移殖片の増殖阻害についての本発明の抗体細胞傷害性薬物抱合体の効力を評価し、比較する。
試験薬物
本発明のサンプル：化合物１６；化合物１７；化合物１８；化合物３１。
陽性コントロール薬物：化合物３５；
調製方法：生理食塩水で処方する。
動物
BALB/cA-ヌードマウス、６-７週令、雌、Shanghai SLAC laboratory Animal Co., Ltd. Certificate No.: SCXK (Shanghai) 2012-0002から購入。居住環境：SPFレベル。
方法：
ヌードマウスにNCI-N87ヒト胃がん細胞を皮下に接種した。腫瘍の容積が100-200mm3に達した時、動物をランダムにグループ化した（D0）。投与量とスケジュールは表１に示した。腫瘍の容積と重量は週に２-３回測定し、データを記録した。腫瘍容積（V）を次のようにして計算した：
V＝1/2×a×b2
式中：ａおよびｂは、それぞれ長さと幅を表す。
T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100%
式中、ＴとＣは試験の最後に測定し、T0とC0は試験の最初に測定した。
【０１３０】
2017510548.tif 000069
D0：最初の投与時。P値、対コントロール群；試験開始時のマウスの数：コントロール群、n = 10、処置群、n = 6。
【０１３１】
2017510548.tif 000070
D0：最初の投与時；P値対溶媒群、**p<0.01、対化合物３５の3 mg/kg群；全てに対して、Student’s tテストを用いた。試験開始時のマウスの数：コントロール群n = 10、処置群n = 6。
【０１３２】
結果
最初の試験群では、化合物１６（3、10mg/kg、IV、D0、7、14）はヌードマウスに皮下に移植したHER2を高度に発現する胃がんNCI-N87の増殖を著しく阻害し、阻害率はそれぞれ８５％と１５６％であり、部分腫瘍退縮は１/６と６/６マウスで生じた；化合物１８の同じ投与量及びスケジュールでNCI-N87についての阻害率はそれぞれ７４％と１５０％であり、投与量が高いほど６/６マウスで部分腫瘍退縮を起こした；コントロール化合物３５のNCI-N87に対する阻害率はそれぞれ６６％と１４５％であり、投与量が高いほど６/６マウスで部分腫瘍退縮を起こした；コントロール化合物１７のNCI-N87に対する阻害率はそれぞれ１７％と５０％であった。腫瘍を有するマウスは上記で示したようにこれらの薬物に十分に耐えた。腫瘍増殖に対する試験化合物の阻害効果は表１と図１に示した。投与中、死亡は生じず、各群のマウスの体重は図２に見られるように投与中著しく減少しなかったが、これは現在の投与量が重大な副作用を持たないことを示している。
【０１３３】
２つ目の試験群において、化合物３１（1、3、10 mg/kg、IV、週１回、全２回）はヌードマウスに皮下に移植したHER2を高度に発現する胃がんNCI-N87の増殖を用量依存的に阻害し、阻害率はそれぞれ４８％、１１８％および２００％であり、3 mg/kg群に対し、部分腫瘍退縮が４/６で見られ、10 mg/kg群に対し、完全腫瘍退縮が６/６で見られた；コントロール化合物３５（3、10 mg/kg、IV、週１回、全２回）について、NCI-N87に対する阻害率はそれぞれ８６％と１７８％であり；10 mg/kg群に対し、部分腫瘍退縮が２/６で見られ、完全腫瘍退縮は４/６で見られた。腫瘍を有するマウスはこれらの薬物に十分に耐えた。化合物３１のNCI-N87に対す有効性は陽性コントロール化合物３５のものより強かった（(P <0.01、3 mg/kg群で比較）（表４）。
【試験例４】
【０１３４】
SK-BR-3細胞増殖アッセイ
目的
CCK法を用いることによりDaudi細胞の増殖に対するサンプルの阻害効果を試験し、IC50によりサンプルのin vitro活性を評価する
物質
SK-BR-3細胞：ATCC、Catalog No: HTB-30；
McCoy's 5A培地； Gibcoより購入、Catalog No: 16600-108；
CCK-8：Cell Counting Kit-8、Dojindoから入手、Catalog No: CK04；
PBS：Gibcoより購入、Catalog No: 20012-027；
方法：
１．SK-BR-3細胞を10%FBSを含有するMcCoy's 5A培地で培養し、週に２〜３回、１：３または１：６の継代比で週に２〜３回継代した。細胞継代のために、培地を吸引し、細胞付着層を5mlの0.25％トリプシンで洗浄し、次いでトリプシンを吸引して、細胞をインキュベーター中で３〜５分間消化し、そして新鮮な培地を添加して再懸濁した。
２．100μLの細胞懸濁液を10%FBSを含有するMcCoy's 5A培地の培養液と共に5×104細胞/mlの細胞密度で９６穴プレートの各ウェルに添加し、９６穴プレートの周辺には100μLの10%FBSを含有するMcCoy's 5A培地を添加のみした。
３．細胞付着の２４時間後、培地を取り除き、90μLの2%FBSを含有するMcCoy's 5A培地を各ウェルに添加した。
４．サンプルはPBSで異なる濃度に勾配希釈し、異なる濃度のサンプル10μLを９６穴プレートの各ウェルに添加した。各濃度は二度繰り返した。
５．プレートはインキュベーター中で３日間インキュベートした（３７℃、５％CO2）。
６．10μLのCCK-8溶液を各ウェルに添加した（OD値の読み取りに影響する恐れがあるので、ウェルに泡立てないように注意）。
７．インキュベーターでのインキュベーションの３時間後、吸光度値を450nmでELISA microplate readerにより読み取った。
結果：
2017510548.tif 000071
結論：本発明の好ましい化合物はSK-BR-3細胞の増殖阻害に対して著しい効果を有する。
【図１】
2017510548.tif 000094
【図２】
2017510548.tif 000095
【配列表】
2017510548000001.app
【国際調査報告】
2017510548.tif 000096
2017510548.tif 000097
2017510548.tif 000098
2017510548.tif 000099
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