(57)【要約】  カエデの一部からガロタンニンを含む化合物を合成し、新規な皮膚美白化合物とする方法を開示する。該方法は、カエデの一部からガロタンニンを単離するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カエデの一部からガロタンニンを含む化合物を合成し、新規な皮膚美白化合物とする方法であって、前記ガロタンニンを前記カエデの一部から単離するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記皮膚美白化合物が、テトラガロイルグルシトールであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記皮膚美白化合物が、以下：
【化１】
2017511382.tif 000006
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記皮膚美白化合物が、以下：
【化２】
2017511382.tif 000007
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガロタンニンを使用する皮膚美白方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２０１４年４月４日に出願の米国特許仮出願第６１／９７５，６６８号の優先権を主張するものであり、その開示はその全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００３】
メラニンの生合成は、１００を超える別個の遺伝子によって集合的に制御される。哺乳動物では、３つの酵素、すなわち、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）およびチロシナーゼ関連タンパク質−２（ＴＲＰ−２）が、全体的なメラニン産生に不可欠である。チロシナーゼは、メラニン形成の調節において中心的役割を果たす。これは、Ｌ−チロシンの３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ）へのヒドロキシル化を触媒する律速酵素であり、結果的にドーパをドーパキノンに酸化する。ＴＲＰ−２は、ドーパクロム互変異性酵素（ＤＣＴ）として働き、即座にドーパキノンを５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸（ＤＨＩＣＡ）にさらに変換するのに対し、ＴＲＰ−１は、ＤＨＩＣＡの酸化を促進し、カルボキシル化インドールキノンを形成する。２種類のメラニン、すなわち、赤色／黄色の亜メラニンおよび黒色／褐色の真性メラニンが産生される。ＴＹＲ酵素は、亜メラニンの合成と真性メラニンの合成の両方に極めて重要に関与し、一方、ＴＲＰ−１およびＤＣＴは真性メラニンの合成の方に多く寄与する。小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）は、メラニン形成酵素の一次転写活性化因子であり、メラニン芽細胞およびメラノサイトの生存、増殖および分化を仲介する根本的な転写制御因子であると思われる。哺乳動物におけるメラニン合成が、一群の酵素および転写因子によって調節される多段階の触媒化を含むことを考慮すると、メラニン形成阻害剤の生物学的分子機序を理解することは重要なことである。
【０００４】
哺乳動物では、皮膚色素は、真皮と表皮との間の基底層の上に位置するメラノサイト細胞のメラノソーム中で産生される。色素沈着は、紫外光への曝露などの、放射線によって誘発される損傷から皮膚を保護することに関して非常に重要な役割を果たしている。しかし、メラニンの過剰産生または異常な蓄積は、そばかす、年齢によるしみ、炎症後色素沈着過剰、および黒色腫すら含めた、多くの皮膚色素沈着過剰障害を引き起こすおそれがある。望ましくない過剰な皮膚色素沈着は、患者の精神的な健康に負担をかけるおそれがあるために、健康上の深刻な問題である。よって、皮膚色素脱失は依然として化粧品産業の切実な研究分野であり、天然源から新規なクラスの安全かつ有効なメラニン形成阻害剤を探索することに多大な研究的関心が寄せられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、皮膚美白能力が強化された、向上した皮膚美白化合物に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本発明は、カエデ（ｍａｐｌｅ  ｔｒｅｅ）の一部からガロタンニンを含む化合物を合成し、新規な皮膚美白化合物とする方法を提供する。該方法は、ガロタンニンをカエデの一部から単離するステップを含む。
【０００７】
ある特定の実施形態では、皮膚美白化合物は、テトラガロイルグルシトール（ｔｅｔｒａｇａｌｌｏｙｌｇｌｕｃｉｔｏｌ）である。さらなる実施形態では、皮膚美白化合物は、以下：
【化１】
2017511382.tif 000002
を含む。
【０００８】
さらなる実施形態では、皮膚美白化合物は、以下：
【化２】
2017511382.tif 000003
を含む。
【０００９】
以下の説明は、添付の図面を参照することで、さらに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ギンナリンギンナリン（ｇｉｎｎａｌｉｎｇｉｎｎａｌｉｎ）Ａ〜Ｃ（１〜３）ならびにマプレキシンＦ（４）およびＪ（５）の化学構造を示す図である。
【図２】ＭａｐｌｉｆａのＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラムをグラフ表示する図である。
【図３Ａ】Ｍａｐｌｉｆａが４８時間作用したＢ１６Ｆ１０の細胞生存率をグラフ表示する図である。
【図３Ｂ】Ｍａｐｌｉｆａが７２時間作用したＢ１６Ｆ１０の細胞生存率をグラフ表示する図である。
【図４】ギンナリンギンナリンＡ〜Ｃ（１〜３）がＢ１６Ｆ１０細胞の生存率に及ぼす効果をグラフ表示する図である。
【図５】Ｂ１６Ｆ０細胞における、ギンナリンギンナリンＡ〜Ｃ（１〜３）によるメラニン合成の阻害をグラフ表示する図である。
【図６Ａ】ギンナリンギンナリンで処理したＢ１６Ｆ０細胞における、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２のｍＲＮＡ発現をグラフ表示する図である。
【図６Ｂ】ギンナリンギンナリンで処理したＢ１６Ｆ０細胞における、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２のｍＲＮＡ発現をグラフ表示する図である。
【図７】ギンナリンギンナリンで処理したＢ１６Ｆ０細胞における、メラニン形成関連タンパク質ＭＩＴＦおよびＴＲＰ−２の発現の顕微鏡写真を表示する図である。
【図８】マプレキシンＪと命名されたテトラガロイルグルシトールを合成する方法を示す図である。
【図９】マプレキシンＪを合成するさらなる方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるギンナリンギンナリンＡ〜Ｃのメラニン形成に及ぼす阻害効果の機序は、リアルタイムＰＣＲおよびウエスタンブロット実験を使用することによって解明された。その結果から、ギンナリンギンナリンは、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の遺伝子レベルの発現を時間的におよび用量依存的に下方制御することができ、ＴＲＰ−２遺伝子のタンパク質発現を有意に低減させることが示された。この知見から、ベニカエデ（ｒｅｄ  ｍａｐｌｅ）の葉の中の植物化学物質には抗メラニン形成効果があり、よって化粧用皮膚美白用途を有する可能性があることが示される。
【００１２】
カエデ属（Ａｃｅｒ）は、１２０を超える種からなり、その大半はアジアに見出され、残りは北アメリカを原産とする固有種である。Ａ．ｂｕｅｒｇｅｒｉａｎｕｍ（トウカエデ）およびＡ．ｎｉｋｏｅｎｓｅ（イロハモミジ）を含めたＡｃｅｒ種の植物化学的および生物学的調査によって、Ｂ１６Ｆ１０細胞において抗メラニン形成効果を有するいくつもの化合物が得られた。興味深いことに、北アメリカ東部を原産とするＡ．ｒｕｂｒｕｍ  Ｌ．（ベニカエデ）は、皮膚障害を含めた多くの病気の民間薬として先住アメリカ人によって従来使用されていた。
【００１３】
カエデのガロタンニン、すなわち、ギンナリンＡ〜Ｃ、ならびにマプレキシンＦおよびＪの化学構造を図１に示す。多くの合成化合物、例えばヒドロキノンおよびその誘導体がメラニンの過剰な産生を抑制するために従来より使用されてきたが、有効性の欠如または皮膚刺激性および／もしくは皮膚毒性を含めた潜在的副作用のために、化粧品におけるそれらの用途は制限されてきた。そうしたことから、安全である傾向があり、合成化合物より有害作用が少ないという理由から、天然物および植物抽出物がメラニン形成阻害用途の魅力的な候補として出現してきた。
【００１４】
一連の生体活性ガロタンニンは、カエデの一部から単離された。これらのガロタンニンは、ベニカエデ、サトウカエデ、ウラジロサトウカエデ、シカモア、ノルウェーカエデ、およびクロサトウカエデを含めた、カエデに存在する。この実施形態では、ガロタンニンはベニカエデ（Ａｃｅｒ  ｒｕｂｒｕｍ）種の葉から単離されたものであり、すなわち、ギンナリンギンナリンＡ〜Ｃ、およびマプレキシンＡ〜Ｉと命名された、高効力の抗酸化能力を有する新規な分子であった。他の実施形態は、カエデの側枝、幹、および樹皮の抽出物から単離されたガロタンニンを含む。これらの天然の化合物は、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール部分に（可能な４箇所から）結合した１、２または３個のガロイル基を含有する。
【００１５】
この実施形態は、酵素および細胞に基づくアッセイにおける、ベニカエデ種の葉からの新規抽出物であるＭａｐｌｉｆａの化粧用皮膚明色／美白への適用を示す。Ｍａｐｌｉｆａは、約４５〜５０％のギンナリンギンナリンＡを、ギンナリンギンナリンＢおよびＣならびにマプレキシンを含めた他のガロタンニンと共に含有する。ＳＡＲ試験から、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール部分に結合したガロイル基の数が増加すると、チロシナーゼ酵素の及ぼす阻害効果が増大することが示された。そこで、最初のテトラガロイル−グルシトール（最大数である４個のガロイル基を含有する）であるマプレキシンＪを合成し、ＳＡＲの観測値を確認した。精製したギンナリンギンナリンＡ〜Ｃを、Ｍａｐｌｉｆａ中の代表的なガロタンニンとして、Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるメラニン産生に及ぼすそれらの阻害効果についてアッセイした。ギンナリンギンナリンＡ（２個のガロイル基を含有する）は、５０μＭでメラニン含有量を明らかに低減させたのに対して、ギンナリンＢおよびＣ（それぞれ１個のガロイル基を含有する）は、わずかな抗メラニン形成効果しか示さなかった。
【００１６】
別の実施形態では、今までに報告された最初のテトラガロイル置換グルシトールである、マプレキシンＪの合成を教示した。マプレキシンＪは、α−グルコシダーゼ阻害の臨床薬であるアカルボースの８０倍の効力があった（２対１６０Ｍ）。マプレキシンＪは、今までに報告されている全てのマプレキシンの中で最も活性の高いα−グルコシダーゼ阻害剤であった。
【実施例】
【００１７】
＜実施例１＞
［ギンナリンギンナリンＡ〜ＣおよびＭａｐｌｉｆａのチロシナーゼ活性に及ぼす効果］
ベニカエデの葉からのギンナリンに富む画分であるＭａｐｌｉｆａ、それと共に５種のフェノール系化合物、すなわち、ギンナリンギンナリンＡ〜Ｃ（１〜３）ならびにマプレキシンＦおよびＪ（４〜５）の、マッシュルームのチロシナーゼ活性に及ぼす阻害効果をアッセイした。それらのＩＣ５０値を表１に示す。Ｍａｐｌｉｆａは、研究室で開発した新規な方法によって調製した。簡潔に述べると、ベニカエデの葉を乾燥させ、水性エタノールに漬けて粗抽出物を得、次いでそれをさらに樹脂カラムで精製し、葉緑素および他の植物色素を除去した。溶媒を除去した後に、Ｍａｐｌｉｆａを灰白色の易流動性の粉末として得た。
【００１８】
Ｍａｐｌｉｆａおよび本発明者らのグループによって以前に単離された信頼できるガロタンニン標準の高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）プロファイルを比較することによって、Ｍａｐｌｉｆａ中の主要なガロタンニンを同定した。１ｍｇ／ｍＬのギンナリンギンナリンＡの原液をＤＭＳＯ中で調製し、次いで段階的に希釈し、それぞれ、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５ｍｇ／ｍＬの濃度の試料を得た。各試料を三重で注入し、濃度に対する平均ピーク面積の百分率をプロットすることによって、直線の６点検量線（ｒ２＝０．９９９７）を構築した。Ｍａｐｌｉｆａ試料は、ＤＭＳＯ中２．２ｍｇ／ｍＬの原液で調製した。全てのＨＰＬＣ−ＵＶ分析は、Ｌｕｎａ  Ｃ１８カラム上に２０μＬの注入量で行い、波長２８０ｎｍの波長でモニタリングした。溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液）および溶媒Ｂ（メタノール、ＭｅＯＨ）からなる勾配溶媒系は、０．７５ｍＬ／分の流量で、次のように使用した：０〜３０分、１０％〜６０％Ｂ；３０〜３５分、６０％〜１００％Ｂ；３５〜４０分、１００％Ｂ；４０〜４１分、１００％〜１０％Ｂ；４１〜５１分、１００％Ｂ。カエデ抽出物中のギンナリンギンナリンＡ〜Ｃの濃度を、検量線に基づいて定量した。
【００１９】
Ｍａｐｌｉｆａ（商標）（ギンナリンＡ富化抽出物）抽出物中にギンナリンＡ〜Ｃ（１〜３）が存在することを示す、Ｍａｐｌｉｆａ（商標）のＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラムを図２に示す。
【００２０】
ギンナリンギンナリンおよびマプレキシンの化学構造を図１に示す。ガロイル基が２個から４個あるガロタンニンは、ガロイル基が１個しかないカエデ属タンニンより活性であることがわかった。１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール部分に２個のガロイル基を有するギンナリンギンナリンＡ（１）は、高い阻害活性を示し、ＩＣ５０値は１８１．９μＭであった。同様に、３個または４個のガロイル基をそれぞれ有する、マプレキシンＦ（４）およびマプレキシンＪ（５）は、２１２．２および１９０．４μＭという同等のＩＣ５０値を示した。しかし、１個しかガロイル基のないガロタンニン、すなわち、ギンナリンギンナリンＢ（２）およびギンナリンギンナリンＣ（３）は、チロシナーゼ酵素に対して弱い阻害効果（それぞれ、ＩＣ５０＝１０４７．３および８５７．８μＭ）しか示さなかった。
【００２１】
【表１】
2017511382.tif 000004
【００２２】
表１は、５種のフェノール類、ギンナリンＡ〜ＣおよびマプレキシンＦ〜Ｊの、チロシナーゼ酵素に対する阻害活性（ＩＣ５０）を示す。ＩＣ５０は、三連の独立した実験からの平均±標準偏差として示す。＊陽性対照。
【００２３】
＜実施例２＞
［ＭａｐｌｉｆａおよびギンナリンギンナリンＡ〜Ｃが作用したＢ１６Ｆ１０細胞の細胞生存率］
Ｍａｐｌｉｆａ抽出物に存在するギンナリンギンナリンＡ〜Ｃの抗メラニン形成活性をさらに調査するために、細胞ベースのアッセイを用いてマウスの黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞についてメラニン含有量を測定した。細胞アッセイ用にギンナリンギンナリンの非毒性濃度を決定するために、ＭＴＳアッセイを使用してＢ１６Ｆ１０細胞についての細胞生存率を最初に評価した。ＭＴＳアッセイは、先に述べた通りであるが変更を加えて行った。試験試料（精製されたガロタンニンの場合は１〜１００μＭ、およびＭａｐｌｉｆａ抽出物の場合は６．２５〜２００μｇ／ｍＬの濃度範囲内）での２４、４８または７２時間のいずれかの処理の終了時に、２０μＬのＭＴＳ試薬を電子カップリング剤、フェナジンメントスルファート（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｎｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）と組み合わせてウェルに添加し、加湿したインキュベータ中で細胞を３７℃で３時間インキュベートした。４９０ｎｍでの吸光度を分光光度計（ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏ  ｖ．４．６ソフトウェアによって操作される、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ＣＡ、ＵＳＡ）でモニタリングし、対照集団に対する細胞数を得た。試料で処理した細胞における増殖の阻害は、対照（０．１％ＤＭＳＯ）細胞と比較した百分率として表した。データは、平均値±標準偏差として示し、それらは３回の別々の実験から得られた。データの統計解析には対応のない両側スチューデントｔ検定を使用し、Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０ソフトウェアを使用して行った。ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。
【００２４】
マウスの黒色腫Ｂ１６Ｆ１０は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ロックビル、ＭＤ）から購入した。細胞を、１０％ｖ／ｖウシ胎児血清、１％ｖ／ｖ可欠アミノ酸および１％ｖ／ｖ抗生物質溶液を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｗｉｌｋｅｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＲＩ）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。原液として試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、次いで増殖培地で所望の最終濃度に希釈した。最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％未満であった。
【００２５】
黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞を段階濃度のＭａｐｌｉｆａ（６．２５、１２．５、２５、５０、１００、および２００μｇ／ｍＬ）で４８時間および７２時間処理した。加えて、種々の濃度（０、５、１０、２５、および５０μＭ）のギンナリンギンナリンＡ〜Ｃで７２時間処理し、細胞生存率を非処理の対照群と比較することによって決定した。各値は、三連の独立した実験からの平均±標準偏差として表す。図３Ａおよび３Ｂは、Ｍａｐｌｉｆａ（商標）が４８時間および７２時間作用したときＢ１６Ｆ１００細胞の生存率に及ぼす効果を示す。Ｍａｐｌｉｆａは、６．２５〜１００μｇ／ｍＬの濃度で非毒性であった。
【００２６】
同様に、図４では、ギンナリンギンナリンＢおよびＣの全てが０〜５０μＭの全ての濃度でＢ１６Ｆ１０細胞に対して非毒性（細胞生存率＞９０％）であることが見出されたのに対して、ギンナリンギンナリンＡは、低濃度（５および１０μＭ）で非毒性であるが、２５および５０μＭの濃度でＢ１６Ｆ１０細胞生存率をそれぞれ８７．０％および８９．５％にわずかに低減させた。図４は、ギンナリンＡ〜Ｃ（１〜３）がＢ１６Ｆ１０細胞の生存率に及ぼす効果を示す。ギンナリン（１〜３）を段階濃度（２〜５０μＭ）で７２時間処理した後、黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞の生存率をＭＴＳアッセイで決定した。各値は、三連の独立した実験からの平均±標準偏差として示す。細胞に基づくアッセイにおいて安全かつ有効なメラニン形成阻害剤をスクリーニングする、以前の試験からの知見によれば、４０μｇ／ｍＬが細胞のメラニン形成アッセイの閾値濃度である。本試験においてギンナリンギンナリンの濃度の全ては公表されたこの閾値より低く、非毒性の用量であれば、安全なメラニン形成阻害剤となると考えることができる。
【００２７】
＜実施例３＞
［メラニン含有量に及ぼすギンナリンギンナリンＡ〜Ｃの効果］
段階濃度のギンナリンギンナリンＡ〜Ｃで処理した黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞中で生合成されたメラニンの含有率を、対照群との比較によって評価した。メラニン含有量は、リャン（Ｌｉａｎｇ）およびホー（Ｈｏ）によって記載された方法の変法を使用して決定した。簡潔に述べると、Ｂ１６Ｆ１０細胞（細胞５×１０４個／ウェル）をまず２４ウェルのプレートに２４時間播種し、次いで、培地を種々の濃度の試験試料を含有する新しいＤＭＥＭ培地に変えた。７２時間のインキュベーションの後、トリプシン処理を通して細胞を収穫し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。次いで、１０％ＤＭＳＯを含有する１Ｎ  ＮａＯＨに細胞を溶解し、８０℃で１時間加熱した。試料を室温まで冷却した後、メラニン含有量を４００ｎｍで分光光度的に測定した。
【００２８】
図５は、ギンナリンＡ〜ＣによるＢ１６Ｆ１０細胞における細胞内メラニン含有量の抑制を示す。細胞は、ギンナリンＡ〜Ｃで７２時間処理し、メラニン含有量を対照群と比較した。各値は、三連の独立した実験の平均±標準偏差として示す。図５において、ギンナリンギンナリンは低濃度（５および１０μＭ）でメラニン生合成に有意な阻害活性を示さなかったが、ギンナリンギンナリンＡは、比較的高用量でメラニンの形成を低減させた。２５μＭおよび５０μＭのギンナリンＡで処理したＢ１６Ｆ１０におけるメラニン含有量は、対照群におけるそれと比較して、それぞれ７９．１％および５６．７％に明らかに減少し、一方、ギンナリンＣは、２５μＭおよび５０μＭでメラニンレベルをそれぞれ８９．７％および６８．８％にわずかに低減させた。加えて、２５μＭおよび５０μＭのギンナリンＢで処理した細胞のメラニンレベルは、対照群と比較して９０．０％に留まった。
【００２９】
ギンナリンＡ〜Ｃがチロシナーゼ関連遺伝子およびタンパク質発現に及ぼす効果は、次のように見出された。メラニン生合成は、多段階経路を含む。メラニン合成に及ぼすギンナリンの阻害効果の分子機序を決定するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞における、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２を含めたメラニン形成関連遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲを使用することによって分析した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を６ウェルプレートに細胞２．０×１０５個／ウェルの密度で植えた。２４時間インキュベートした後、細胞を２μＭまたは１０μＭのギンナリンで４８時間または７２時間処理した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用して、全ＲＮＡを細胞から単離した。オリゴ（ｄＴ）１８プライマを使用して、全ＲＮＡのうち１マイクログラムを一本鎖ｃＤＮＡに変換し、ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ検出システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、マンハイム、ドイツ）を使用して定量した。サイバーグリーンを使用して試料の処理を実行し、参照用ハウスキーピング遺伝子としてのｂ２ｍ  ｒＲＮＡのレベルと比較した。定量的リアルタイムＰＣＲの条件は、適正なフォワードおよびリバースプライマを使用して各遺伝子に最適化した。使用したプライマは、補足資料に一覧表示する。全てのオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（ＣＡ）によって合成された。
【００３０】
図６Ａおよび６Ｂは、ギンナリンで処理したＢ１６Ｆ０細胞におけるＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２のｍＲＮＡ発現を示す。細胞を１０μＭのギンナリンを用いてまたは用いずにそれぞれ４８時間および７２時間処理した。図６Ａおよび６Ｂに示すように、１０μＭのギンナリンを用いてまたは用いずに細胞を４８時間（Ａ）および７２時間（Ｂ）処理した。１０μＭのギンナリンＡで４８時間または７２時間処理した後、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２のｍＲＮＡ発現は有意に低減した。ギンナリンＢは、ＴＹＲの発現を４８時間および７２時間でわずかに１０．０％および７．５％減少させたに過ぎなかったが、ＭＩＴＦ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２のｍＲＮＡ発現を４８時間および７２時間で有意に減少させた。加えて、ギンナリンＣは、ＴＲＰ−１の発現レベルを全ての時点で減少させず、ＴＹＲおよびＴＲＰ−２の発現をわずかに減少させたに過ぎなかったが、ＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現を４８時間および７２時間で有意に下方制御した。
【００３１】
さらに、ウエスタンブロットを使用して、Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるメラニン形成関連酵素のタンパク質発現に及ぼすギンナリンの制御を評価した。Ｂ１６Ｆ１０細胞における、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の発現を含めた、メラニン生合成関連タンパク質の発現を、ウエスタンブロットによって測定した。ギンナリンを用いて７２時間インキュベーションした後、細胞からタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いでポリフッ化ビニリデン膜に移した。Ｔｗｅｅｎを有するトリス緩衝生理食塩水中５％脱脂粉乳で膜をブロッキング処理し、続いて一次抗体と共に一晩インキュベーションした。ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ＮＪ）を使用して、Ｘ線フィルム上でバンドを可視化した。抗体、供給源、および希釈液の一覧は、補足資料に一覧表示する。
【００３２】
ギンナリンは、５μＭおよび１０μＭ、４８時間でメラニン生合成関連酵素のタンパク質発現に下方制御効果を示さず（データは図示せず）、ギンナリンと共に７２時間インキュベーションしたＢ１６Ｆ１０細胞においてもこれらのタンパク質の発現を低減させなかった。しかし、１０μＭのギンナリンＡ〜Ｃで７２時間処理した黒色腫細胞では、ＴＲＰ−２のタンパク質発現は、ギンナリンＡ〜Ｃによって、それぞれ８７．９％、９２．０％および６９．５％減少した（図６Ｂ）。図７は、ギンナリンで処理したＢ１６Ｆ０細胞におけるメラニン形成関連タンパク質ＭＩＴＦおよびＴＲＰ−２の発現を示す。細胞を１０μＭのギンナリンを用いてまたは用いずに７２時間処理し、ＭＩＴＦおよびＴＲＰ−２のタンパク質発現をウエスタンブロット法によって分析した。
【００３３】
＜実施例４＞
［α−グルコシダーゼ阻害活性を有するテトラガロイルグルシトールであるマプレキシンＪの合成］
マプレキシンＪと命名された、最初のテトラガロイルグルシトールを合成する方法を図８に示す。没食子酸（１，１０１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２ｍＬ）中に溶解させた。この溶液にイミダゾール（５１３ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳ、５２１ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）を添加し、次いでこの混合物を窒素下室温で２４時間撹拌した。白色の結晶性固体生成物が形成し、反応溶液から析出した。ヘキサン１００％から出発するヘキサン：酢酸エチルの勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィを使用して、トリシリル保護された没食子酸（２）を析出物から単離した（２４４ｍｇ、８２％）。化合物２の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルからのピークを積分することによって、ＴＢＤＭＳによる３個の置換の存在を確認した。保護されたカルボン酸が確実になくなるように、化合物２と、酢酸（６．９ｍｇ）およびＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）を含む乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１ｍＬ）との加水分解反応を室温で２４時間行った。加水分解生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルから、以下のように３個のＴＢＤＭＳ保護基が保持されていることを確認した：ＣＨ３ＯＤ、５００ＭＨｚ（１Ｈ）にて、δ０．０９（ｓ，６Ｈ，（ＣＨ３）２−Ｓｉ）、０．２０（ｓ，１２Ｈ，（ＣＨ３）４−Ｓｉ）、０．８８（ｓ，１８Ｈ，（ＣＨ３）６−Ｃ）、０．９４（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ３）３−Ｃ）、７．１１（ｓ，２Ｈ，芳香族プロトン２および６）（図８）。
【００３４】
化合物２（１８７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびグルシトール（３、１０．４ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ、２ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、６１．４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を添加し、続いて４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、７４．４ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を窒素下室温で９６時間撹拌した。この反応混合物に水を添加し、この溶液を、酢酸エチルを使用して抽出した（×３）。合わせた有機層をブライン溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィを使用して精製し、化合物４を得た。ヘキサン１００％から出発するヘキサン：酢酸エチルの勾配溶媒系を用いるシリカゲルクロマトグラフィを使用して、エステル化生成物を単離した。化合物４（８４３ｍｇ、６４．６％）を単離し、その構造を、３個の糖メチンおよび糖メチレンとそれぞれの没食子酸のカルボニル炭素とのＨＭＢＣ相関によって確認した。
【００３５】
化合物４の脱保護をフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）の存在下で遂行した。化合物４（５０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２ｍＬ）に溶解させた。ＴＢＡＦ（６１．１ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を窒素雰囲気下室温で１０分間撹拌した。逆相ＨＰＬＣを使用して粗生成物を精製し、最終生成物である化合物５（１０ｍｇ、５２．３％）を得、これを特性評価し、マプレキシンＪという一般名を付けた。
【００３６】
１Ｄおよび２ＤのＮＭＲスペクトルデータを詳細に分析することによって（１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣを含む）マプレキシンＪ（５）の構造を確定することができた（図２および表１を参照されたい）。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹのスペクトルから、図９に太字で示す、グルシトールの糖コア（Ｃ−１からＣ−６まで）の存在が明らかになった。ＨＭＢＣスペクトルのデータから、グルシトールコアの３個のメチン（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４）およびメチレン（Ｃ６）へのガロイル置換基の連結が認められた。質量分析法の分析から、提示した構造が確認された（Ｃ３４Ｈ２８Ｏ２１；７７２．１１２３）：ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−７７１．５４２１；［Ｍ＋Ｎａ］＋７９５．１４０３。
【００３７】
マプレキシンＪをインビトロでのα−グルコシダーゼ阻害活性について評価し、それに加えて、以前に単離されたガロタンニンであるマプレキシンＤおよびマプレキシンＦ（それぞれ２個および３個のガロイル置換基を含有する）でも評価した。α−グルコシダーゼ阻害の臨床薬であるアカルボースを陽性対照として使用した。表２に示すように、４個のガロイル置換基を含有するマプレキシンＪは、二置換および三置換であるマプレキシンＤおよびＦより、それぞれ６００倍および５倍効力が高く、臨床薬であるアカルボースより８０倍効力が高かった。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
今までに報告された最初のテトラガロイルグルシトールである、マプレキシンＪと命名された高効力なα−グルコシダーゼ阻害剤の全合成について説明するものである。現行の試験および以前の観察に基づくと、グルシトールコア上のガロイル置換基の数が、α−グルコシダーゼ阻害活性に関して実際に極めて重要である。ある特定の実施形態では、テトラガロイルグルシトール部分は、α−グルコシダーゼ阻害活性を向上させるための構造類似体の合成の足場としての機能を果たすこととなる。
【００４０】
特定の実施形態は、説明を目的として示している。それが網羅的であることも、本発明の範囲を本明細書に記述した特定の形態に限定することも意図するものではない。いくつかの実施形態に関して本発明を説明してきたが、述べてきた通りの本発明の趣旨および範囲内から逸脱することなく種々の変形をなすことができることが、当業者であれば理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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