(57)【要約】  本発明は、異種化合物を含むように修飾された毒素を用いて、特異的細胞に対する機能性異種化合物の汎用的な送達プラットフォームを提供する。一の実施形態では、毒素はＡＢ５毒素である。一の実施形態では、ＡＢ５毒素は、ＬＴＩ、ＬＴＩＩ、ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂ、ＬＴＩＩｃおよびＬＴの他の組換え型を含む大腸菌（ＬＴ）由来の熱不安定性エンテロトキシンである。本発明は、使用方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種化合物を組み込むように修飾された毒素を含有する送達プラットフォーム。
【請求項２】
前記毒素がＡＢ５毒素である、請求項１に記載のプラットフォーム。
【請求項３】
前記毒素は、前記Ａ１ドメインを除去するように改変されている、請求項２に記載のプラットフォーム。
【請求項４】
前記毒素が、ＣＴ、ＬＴＩ、ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂ、ＬＴＩＩＣ、および任意の組換えＬＴ誘導体からなる群から選択される、請求項２に記載のプラットフォーム。
【請求項５】
前記毒素がＬＴＩＩａであり、前記異種化合物がβ−ラクタマーゼである、請求項１に記載のプラットフォーム。
【請求項６】
前記異種化合物が、β−ラクタマーゼ、ラクダ抗体、亜鉛依存性プロテアーゼ、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）、Ｅ３結合タンパク質、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、プロテアーゼ、キナーゼ、ｐ５３、フォスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ヒトヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、カスパーゼ補充ドメイン含有タンパク質１５（ＣＡＲＤ１５）、網膜芽腫遺伝子産物（ｐＲＢ）、および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される、請求項１に記載のプラットフォーム。
【請求項７】
β−ラクタマーゼを必要とする対象に、β−ラクタマーゼを組み込むように改変されたＡＢ５毒素を含有する送達プラットフォームを投与する工程を含むボツリヌス中毒の治療方法。
【請求項８】
前記ＡＢ５毒素がＬＴＩ１ａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
異種化合物を必要とする対象に、異種化合物を組み込むように改変された毒素を含有する送達プラットフォームを投与する工程を含むパーキンソン病の治療方法において、前記異種化合物が神経保護剤を含み、かつパーキンソン病を治療する方法。
【請求項１０】
前記毒素がＡＢ５毒素である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記毒素は、前記Ａ１ドメインを除去するように改変されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＢ５毒素がＬＴＩ１ａである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経保護剤が、ＢＤＮＦ、Ｂｒｎ４、およびプログラヌリンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
異種化合物を必要とする対象に、異種化合物を組み込むように改変された毒素を含有する送達プラットフォームを投与する工程を含む嚢胞性線維症（ＣＦ）の治療方法であって、前記異種化合物がＣＦＴＲポリペプチドであり、かつＣＦを治療する方法。
【請求項１５】
前記毒素がＡＢ５毒素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記毒素は、前記Ａ１ドメインを除去するように修飾されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＢ５毒素がＬＴＩ１ａである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互関係
本出願は、２０１４年９月３０日に出願された米国仮出願第６２／０５７，４４７号の優先権を主張する。前記仮出願の全開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって認められた許可ＡＩ１０１３１３およびＡＩ０５７１５３の下で政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
従来、異種タンパク質を細胞に送達するには２つのアプローチ、すなわちウイルスベースおよびタンパク質ベースのアプローチがある。タンパク質ベースの治療法は、遺伝的な感染要素を欠いており、ウイルスベースの治療法よりも有利である。例えば、炭疽毒素の保護抗原（ＰＡ）は、異種タンパク質送達系として開発されている。炭疽毒素レセプターは細胞タイプ間で共通であるため、ＰＡ送達プラットフォームは効率的かつ普遍的である。しかしながら、これはまた、細胞タイプ特異的タンパク質送達プラットフォームとしてのＰＡの限定的な特徴でもある。イムノトキシン（ＩＴ）は、異種タンパク質送達のための別のプラットフォームである。ＩＴ特異性は、「正常な」細胞に関連する標的化された癌細胞上のホストレセプターの発現が上昇しているレセプターを同定することによって増強される。しかしながら、これは標的とされ得る細胞のタイプを制限する。したがって、神経細胞などの特定の細胞に機能的治療を送達することができる送達プラットフォームが必要とされている。
【０００４】
ボツリヌス中毒は、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）によって引き起こされる稀少かつ潜在的に致命的な麻痺性の疾患であり、ヒト推定半数致死量（ＬＤ−５０）は、静脈内または筋肉内投与で１〜２ｎｇ／ｋｇ、吸入時は１０〜２０ｎｇ／ｋｇである。ＢｏＮＴは末梢神経系のニューロンに入り、可溶性ＮＳＦ結合タンパク質レセプター（ＳＮＡＲＥ）タンパク質を長期間（最大６ヶ月間）標的化して切断する、そしてそれは弛緩性麻痺を引き起こし、重症の場合に死に至る可能性がある。ボツリヌス中毒症に対するワクチンや治療法は存在しない。自然発生のボツリヌス中毒症はまれである（年間約１５０例）が、自然発生的または意図的な流行の脅威が存在し、長期にわたる支持療法を必要とする。ボツリヌス中毒の延長された麻痺は、細胞内ＢｏＮＴの長期活性によるため、ＢｏＮＴ中毒の治療プラットフォームの開発は、ニューロンを標的とし、細胞内毒素を直接不活性化するはずである。ＢｏＮＴワクチンおよび中和抗体について有意な進歩がなされたが、細胞内ＢｏＮＴを標的とする特定の療法は、細胞内ＢｏＮＴを阻害可能な特定の化合物を送達するためには開発されていない。
【０００５】
脳におけるタンパク質凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびハンチントン病（ＨＤ）などの神経変性疾患の特徴である。単に疾患の症状を緩和するのではない、これらの神経変性疾患の進行を遅らせる標的療法は、現時点では利用できない。
【０００６】
シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドは、全ての動物細胞膜の成分であり、特にニューロンの原形質膜に豊富に存在する。脳は、ほとんどの非神経組織よりも２０倍から５００倍多くのガングリオシドを含む。高等脊椎動物の神経系では、ＧＭ１ａ、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂのような複合ガングリオシドは、総ガングリオシドの約８０〜９０％を占めるが、単純なガングリオシドＧＭ２およびＧＭ３は、ニューロン外組織により多くみられ、脳組織には存在しない。従って、ガングリオシド、特に複合ガングリオシドを認識するプラットフォームは、ニューロンへの治療薬の送達に関して大きな期待を担う。
【０００７】
ＡＢ５毒素は、モノマー酵素Ａサブユニットおよびペンタマー結合Ｂサブユニットを含む、いくつかの細菌病原体および植物によって合成される。Ａサブユニットは、ジスルフィド結合を介して一緒に連結されたＡ１およびＡ２の２つのドメインからなる単一のポリペプチドである。Ａ１ドメインは、ホスト細胞に対する毒性に応答する触媒ドメインを含む。Ａ２ドメインは、Ｂ−サブユニットの中心孔に浸透するα−ヘリックスからなり、それによってＡ−サブユニットとＢ−サブユニットとを非共有的に固定してホロ毒素を生成する。
【０００８】
ＡＢ５毒素には、コレラ毒素（ＣＴ）ファミリー、百日咳毒素、志賀毒素、およびズブチラーゼ細胞毒素の４つの主なファミリーがある。コレラ毒素（ＣＴ）ファミリーには、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のＣＴならびにエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）（ＬＴＩ、ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂおよびＬＴＩＩｃ）が含まれる。ＬＴは、ＡＤＰ−リボシル化活性を有する酵素的に活性なＡサブユニットと、ＧＭ１（モモシアロガングリオシド）レセプター結合部位を含む５量体Ｂサブユニットの２つの機能的に異なるドメインから構成される多量体タンパク質である。表１は、ＣＴおよびＬＴ  ＡＢ５毒素の生化学的および生物学的特性を示す。ＣＴおよびＬＴ様毒素は、細胞表面にガングリオシドを結合させることによってホスト細胞に入り、エンドサイトーシスを引き起こす。過去２０年間に、ＣＴおよびＬＴは免疫を刺激するアジュバントとして、または自己免疫の抑制のために配備されてきた。ＣＴおよびＬＴはガングリオシドをホストレセプターとして利用する。例えば、ＣＴ、ＬＴＩおよびＬＴＩＩｃはＧＭ１ａに結合し、ＬＴＩＩａはＧＤ１ｂに結合し、そしてＬＴＩＩｂはＧＤ１ａに結合する。
【０００９】
【表１】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
神経変性疾患の症状を緩和するだけでなく、少なくとも神経変性疾患の進行を遅らせることができる治療薬が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書では、異種化合物を含むように改変された毒素を使用する特異的細胞に対する機能的異種化合物の汎用的な送達プラットフォームが提供される。一の実施形態では、毒素はＡＢ５毒素である。一の実施形態では、ＡＢ５毒素は、大腸菌（ＬＴ）由来の熱不安定性エンテロトキシンである。
【００１２】
第１の態様では、本明細書において、異種化合物を組み込むように改変された毒素を含有する送達プラットフォームが提供される。毒素はＡＢ５毒素であり得る。毒素は、Ａ１ドメインを除去するように改変することができる。いくつかの態様では、毒素は、ＣＴ、ＬＴＩ、ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂ、ＬＴＩＩＣ、および任意の組換えＬＴ誘導体からなる群から選択される。毒素はＬＴＩＩａであり得、異種化合物はβ−ラクタマーゼであり得る。しかしながら、他の実施形態では、機能的異種化合物を効果的に伝達する任意の毒素を使用することができる。任意の異種化合物は、本発明により送達することができる。いくつかの実施形態では、異種化合物として、β−ラクタマーゼ、ラクダ抗体、アダム１０および関連プロテアーゼ、ＴＦＥＢ、Ｅ３結合タンパク質、ＢＤＮＦ、プロテアーゼ、キナーゼ、Ｐ５３、ＰＴＥＮ、ｐＲｂ、ＳＯＤ１、ＨＦＥ、ＣＡＲＤ１５、Ｐ５３、ＰＴＥＮ、ｐＲＢ、およびＧＭＣＳＦが挙げられる。
【００１３】
別の態様において、本明細書は、β−ラクタマーゼを必要とする対象に組み込むように改変されたＡＢ５毒素を含有する送達プラットフォームを投与する工程を含み、ボツリヌス中毒を治療する、ボツリヌス中毒の治療方法を提供する。ＡＢ５毒素はＬＴＩＩａとすることができる。
【００１４】
さらなる態様において、本明細書は、異種化合物を必要とする対象に、異種化合物を組み込むように改変された毒素を含有する送達プラットフォームを投与する工程を含むパーキンソン病の治療方法において、前記異種化合物が神経保護剤を含み、かつパーキンソン病を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、毒素はＡＢ５毒素である。毒素は、Ａ１ドメインを除去するように改変することができる。いくつかの態様において、ＡＢ５毒素はＬＴＩＩａである。神経保護剤は、ＢＤＮＦ、Ｂｒｎ４、およびＰｒｏｇｒａｎｕｌｉｎからなる群から選択することができる。
【００１５】
別の態様では、本明細書は、異種化合物を必要とする対象に、異種化合物を組み込むように改変された毒素を含有する送達プラットフォームを投与する工程を含む嚢胞性線維症（ＣＦ）の治療方法であって、前記異種化合物がＣＦＴＲポリペプチドであり、かつＣＦを治療する方法を提供する。いくつかの態様において、毒素はＡＢ５毒素である。毒素は、Ａ１ドメインを除去するように改変することができる。いくつかの態様において、ＡＢ５毒素はＬＴＩＩａである。
【００１６】
本発明はまた、ＢＤＮＦを、それを必要とする対象に組み込むように改変されたＡＢ５毒素を含有する送達プラットフォームを投与する工程を含み、パーキンソン病を治療する、パーキンソン病の治療方法を提供する。一の実施形態では、ＡＢ５毒素はＬＴＩ１ａである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
特許または出願ファイルは、カラーによる少なくとも1つの図面を含む。カラー図面付きの本特許または本特許出願公開のコピーは、請求と必要な手数料の支払いにより、特許庁によって提供される。
【００１８】
【図１】図１は、ＬＴＩＩａおよびβｌａｃ−ＬＴＩＩａの発現を示す。（上）ＬＴＩＩａのＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子を、ジシストロン性Ｔ７プロモーターを用いてｐＥＴ２８で発現させた。Ｂサブユニットは、それぞれ免疫検出および精製のためのＨＡ−Ｈｉｓ６エピトープを含むように改変された。β−ラクタマーゼをコードする遺伝子をサブクローン化して、Ａ１サブユニット（βｌａｃ−ＬＴＩ１ａ）を置換した。（中）ＬＴＩＩａ、βｌａｃ−ＬＴＩＩａ、およびβｌａｃnull−ＬＴＩＩａのＡＢ５構成の略図。（下）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルーで染色した精製ＬＴＩＩａ、βｌａｃ−ＬＴＩＩａ、およびβｌａｃnull−ＬＴＩＩａ。Ｂサブユニット対Ａサブユニットの比はデンシトメトリーによって決定された（Ｂ／Ａ比は各レーンの下に記載する）。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、βｌａｃ−ＬＴＩ１ａによるβｌａｃの用量依存性送達を示す。ラット初代皮質ニューロンを４０ｎＭのβｌａｃ−ＬＴＩＩａと共に３７℃で６０分間インキュベートした。細胞をＣＣＦ２−ＡＭと共に室温で３０分間インキュベートした後、ＬＴＩＩａ結合（抗ＨＡ、左手カラム）およびβｌａｃ（抗ＦＬＡＧ、左から２番目）を検出するためにＩＦをインキュベートした。切断されていないＣＣＦ２が示され（右側から２番目）、切断されたＣＣＦ２（ＣＣＦ２Ｃ）はシアン（右側の列）で示される。（Ｂ）ラット初代皮質ニューロンを４０ｎＭ  ＬＴＩＩａまたは０．１〜４０ｎＭβｌａｃ−ＬＴＩＩａとともに３７℃で６０分間インキュベートした。添加したβｌａｃ−ＬＴＩＩａの関数として、ＣＣＦ２の蛍光に対する切断されたＣＣＦ２の蛍光の比を用いて、ＣＣＦ２の切断を定量した。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ＬＴＩＩａは、ＧＭ１ａに富んだＮｅｕｒｏ−２ａ細胞と比較してＧＤ１ｂに富んだＮｅｕｒｏ−２ａ細胞にカーゴ（βｌａｃ）をより効率的に送達することを示す。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞に、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の１０μｇ／ｍｌのガングリオシドＧＤ１ｂまたはＧＭ１ａを３７℃で３時間負荷した。細胞を洗浄し、４０ｎＭのβｌａｃ−ＬＴＩＩａＢまたはＬＴＩＩａで３７℃で６０分間インキュベートした。細胞を室温で３０分間ＣＣＦ２ＡＭで負荷し、続いて抗ＨＡ抗体（赤色）を用いてＩＦ染色した。未切断のＣＣＦ２は緑色で示され、切断されたＣＣＦ２（ＣＣＦ２ｃ）はシアンで示された。（Ｂ）ＣＣＦ２ｃ／ＣＣＦ２／ＨＡの蛍光強度の比を用いて、ＣＣＦ２基質の切断を定量した。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞にＧＤ１ｂを負荷し、続いて４０ｎＭのβｌａｃ−ＬＴＩＩａ、βｌａｃnull−ＬＴＩＩａまたはＬＴＩＩａと３７℃で６０分間単独または０．１μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、ＣＣＦ２ＡＭを室温で３０分間負荷した。ＣＣＦ２ｃ／ＣＣＦ２／ＨＡの蛍光強度の比を用いて、ＣＣＦ２の切断を定量した。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ニューロンへのβ−ｌａｃ−ＬＴＩＩａの侵入中のＢサブユニットからのβ−ｌａｃの送達および分離を示す。ラット初代皮質ニューロンを４０ｎＭのβｌａｃＦ−ＬＴＩＩａと共に４℃または３７℃で６０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、続いて抗ＨＡ抗体（緑色）および抗ＦＬＡＧ抗体（赤色）を用いてＩＦ染色した。（Ｂ）ＨＡとＦＬＡＧ染色との間の代表的な共局在化を、決定したピアソン係数（ＰＣ）を用いた細胞蛍光図によって示した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、βｌａｃ−ＬＴＩ１ａがＢｏＮＴ摂取された一次皮質ニューロンにおいてＣＣＦ２を切断することを示す。ラット皮質初代ニューロンを２ｎＭのＢｏＮＴ／Ｄと共に３７℃で１６時間インキュベートした。ＢｏＮＴ処理されたニューロンを４０ｎＭのβ−ｌａｃ−ＬＴＩＩａで単独で、または０．１μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）と共に３７℃で６０分間インキュベートし、洗浄した後、室温で３０分間ＣＣＦ２ＡＭを負荷し、続いて完全長のＶＡＭＰ２のみを認識する抗ＨＡ抗体（赤色）および抗ＶＡＭＰ２（マゼンタ）を用いてＩＦ染色した。細胞質性ＣＣＦ２は緑色で示され、切断されたＣＣＦ２（ＣＣＦ２Ｃ）はシアンで示された。（Ｂ）ＶＡＭＰ２／ＨＡの蛍光強度の比を用いて、ＶＡＭＰ２の切断を定量した。（Ｃ）ＣＣＦ２Ｃ／ＣＣＦ２／ＨＡの蛍光強度の比を用いて、ＣＣＦ２基質の切断を定量した。
【図６（１）】図６Ａ〜６Ｃは、ＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩ１ａの概略図である。１ｎＭ濃度のＢｏＮＴ／Ａをラット皮質ニューロンと共に３７℃で２時間インキュベートし、毒素が除去されたら、示された量のＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩＩａ（Ｂ８）をニューロンに添加してさらに３時間インキュベートした。細胞を固定し、細胞マーカーとしてＡｌｅｘａ６４７−ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ；マゼンタ）と共に３０分間インキュベートした。ＩＦアッセイは、ＢｏＮＴ／Ａ処理細胞中のＨＡ（赤色）および切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５ｃ、緑色）を染色した。（Ｃ）１ｎＭ濃度のＢｏＮＴ／Ｄを、ラット大脳皮質ニューロンと共に３７℃で２時間インキュベートし、毒素が除去されたら、示された量のＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩＩａ（Ｂ８）をニューロンに添加してさらに３時間インキュベートした。細胞を固定し、細胞マーカーとしてＡｌｅｘａ  ６４７−ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ；マゼンタ）と共に３０分間インキュベートした。ＩＦアッセイは、ＢｏＮＴ／Ｄ処理細胞におけるインタクトなＶＡＭＰ２（緑色）のＨＡ（赤色）および切断されたＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５ｃ、緑色）を染色した。
【図６（２）】（図６Ｄ）ＢｏＮＴ／Ａ処理細胞の蛍光強度のＳＮＡＰ２５ｃ／ＷＧＡ比およびＢｏＮＴ／Ｄ処理細胞の蛍光強度のＶＡＭＰ２／ＷＧＡ比を測定することにより、切断を定量した。（図６Ｅ）ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｄ（１ｎＭ）を、ラット大脳皮質ニューロンと共に３７℃で２時間インキュベートし、毒素が除去されたら、示された量のＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩＩａ（Ｂ８）をニューロンに添加してさらに一晩インキュベートした。切断は、パネルＤに記載したように定量した。データは、両側スチューデントｔ検定によってＳＥＭとして分析した。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊、Ｐ＜０．００５。バー、２０μｍ。ＮＳ、有意ではない。ｏ／ｎ、一晩。
【図７】図７は、ＬＴＩＩａがＧＭ１ａに富んだＮｅｕｒｏ−２ａ細胞よりもＧＤ１ｂに富んだＮｅｕｒｏ−２ａ細胞により効率的にカーゴ（βｌａｃ）を送達することを示す。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞に、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で１０μｇ／ｍｌのガングリオシドＧＤ１ｂまたはＧＭ１ａを３７℃で３時間負荷した。細胞を洗浄し、４０ｎＭのβｌａｃ−ＬＴＩＩａまたはＬＴＩＩａと共に３７℃で６０分間インキュベートした。細胞を室温で３０分間ＣＣＦ２−ＡＭで負荷し、続いて抗ＨＡ抗体（赤色）を用いてＩＦ染色した。未切断のＣＣＦ２は緑色で示され、切断されたＣＣＦ２（ＣＣＦ２Ｃ）はシアンで示される。データは、両側スチューデントｔ検定によって分析した。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊、Ｐ＜０．００５。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。バー、２０μｍ。
【図８】図８は、ＬＴＩＩａが、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞およびＨｅＬａ細胞よりもより効率的にニューロンにβｌａｃを送達することを示す。４０ｎＭ濃度のβｌａｃ−ＬＴＩＩａをラット皮質ニューロンと共にインキュベートし、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞をＧＤ１ｂまたはＧＭ１ａに負荷し、そしてＨｅＬａ細胞を、ＧＤ１ｂ、ＧＭ１ａ、ＧＭ２、またはＧＤ２と共に３７℃で６０分間負荷した。細胞を室温で３０分間ＣＣＦ２−ＡＭで負荷し、続いて抗ＨＡ抗体を用いてＩＦ染色した。基質ＣＣＦ２の切断は、ＣＣＦ２Ｃ／ＣＣＦ２／ＨＡ蛍光強度比を用いて定量した。破線は、ＩＦによる検出可能な転位に基づいて描かれた。データは、両側スチューデントｔ検定によって分析した。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊、Ｐ＜０．００５。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、機能性異種タンパク質をニューロンに送達するためのプラットフォームとしてＡＢ５毒素を操作することを示す。ＡＢ５毒素は、触媒活性（Ａ１）をコードする触媒ドメイン、大腸菌のコレラ毒素および熱不安定性エンテロトキシンに対するＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性、およびリンカー（Ａ２）からなる。Ａ１およびＡ２はジスルフィド結合によって連結されている。Ａ２は、非共有相互作用によりＢ５オリゴマーを挿入する。（Ｂ）ＬＴＩＩａは、Ａ１ドメインを、βラクタマーゼ（βｌａｃ−ＬＴＩＩａ）、またはＬＴＩＩＡによるニューロンへのタンパク質転位の測定を可能にしＢｏＮＴ中毒性ニューロンのＬＣを不活性化するＢｏＮＴ／Ａ（ＶＨＨ−ＬＴＩＩａ）のＬＣに対する単鎖ラクダ抗体で置換した位置に構築した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、細胞膜を通過するβ−ラクタマーゼ（上）ＣＣＦ２−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の細胞内局在のアッセイである。（中程）細胞質内では、ＣＣＦ２−ＡＭはＥｘ４０９ｎｍおよびＦＲＥＴＥｍ５２０ｎｍ（緑）を有し、β−ラクタマーゼはＣＣＦ２を切断してＥｍを４４７ｎｍ（青）にシフトさせる。（下）ＣＣＦ２開裂反応の略図。（Ｂ）基質ＣＣＦ２の切断は、ＣＣＦC／ＣＣＦ２／ＤｓＲｅｄの蛍光強度の比（β−ｌａｃ発現）を用いて定量した。
【図１１】図１１は、複合ガングリオシドを示す。脳の４つの一般的なガングリオシドを示す。ＧＴ１ｂ、ＧＤ１ｂ、およびＧＤ１ａを含む複数の複合ガングリオシドは脳および運動ニューロンに多く含まれ、ＧＭ１ａはニューロンおよび非神経源の膜に存在する。一連のガングリオシドはＳｉａ６シアル酸（ＳＡ）を有し、ｂ−シリーズガングリオシドはＳｉａ６  Ｓｉａ７  ＳＡを有する。
【図１２】図１２は、ＣＴおよびＬＴｓのための構造ベースの配列アライメントである。ＣＴ−ＧＭ１ａ構造中のガングリオシド結合領域、Ｇａｌ４結合領域（シアン）、接触残基（＃）、及びＳｉａ６結合（緑）を示す。ＬＴＩＩｂ（マスタード）およびＳｉａ５（紫）におけるＳｉａ７結合がマークされている。糖残基とＨ結合を形成する残基には赤で印がついている。５つ全てのタンパク質の保存された残基は黄色でハイライトされ、３つのＬＴＩＩ誘導体のみで保存された残基はピンク色でハイライトされている。
【図１３】図１３は、ｐａｎ−ＢｏＮＴ治療法の操作を示す。２つのアプローチが、抗ＢｏＮＴ  ＬＣ療法をコードするであろう。第一に、ＳＮＡＰ２５およびＶＡＭＰ２基質ＳＮＡＰ２５（１４１−２０６）およびＶＡＭＰ２（１ｏ−９４）の非加水分解性ＳＮＡＲＥ結合誘導体は、非加水分解性Ｐ１’変異を７つのＢｏＮＴ血清型をコードするように操作される。最初に個々の高親和性（＋）ＳＮＡＰ２５および高親和性（＋）ＶＡＭＰ２誘導体がＬＴＩＩａのＡｌドメインを置換する。次に、２つのＳＮＡＲＥ療法を細胞内送達のために融合させる。次に、αＬＣ／Ａおよびα−ＬＣ／Ｂナノ体のＶＨＨドメインを含むαＬＣ阻害剤は、細胞内ＬＣ活性を中和するために細胞質に送達される。最初に、個々のラクダ抗体を設計し、ＬＴＩＩａのＡ１ドメインを置換した後、細胞内送達のために融合する。効果を高めるため、Ｆボックスドメインを、Ｅ３ユビキチンリガーゼ分解の標的となるＳＮＡＲＥまたはαＬＣ複合体に加える。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
全般
本発明の材料および方法を記載する前に、本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、材料、および試薬に限定されず、異なる場合があるとされる。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形を含むことに留意されたい。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、交換可能に使用することができることにも留意されたい。
【００２１】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物および特許は、本発明に関連して使用され得る刊行物に報告される化学物質、細胞系、ベクター、動物、器具、統計学的分析および方法論の記載および開示を含む、本明細書で引用された全ての参考文献は、当業者のレベルを示すものとみなされるべきである。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によるそのような開示に先行するものでないことを認めるものとして解釈されない。
【００２２】
本明細書で提供されるシステムおよび方法は、少なくとも部分的に、ＬＴエンテロトキシンが細胞内ＢｏＮＴ軽鎖活性を中和するために治療カーゴをニューロンに特異的に送達することができるという本発明者の発見に基づく。従って、治療剤および他の異種化合物などの機能的「カーゴ」の標的送達のために改変された毒素を用いて、機能的異種化合物を特定の細胞タイプに送達するための汎用的な送達プラットフォームが本明細書で提供される。したがって、本明細書では、ＢｏＮＴ中毒、神経変性疾患およびニューロンにおける潜伏ウイルス感染の治療のための治療薬の標的送達に関する新しいアプローチが提供される。
【００２３】
例示的な実施形態では、機能性カーゴを送達するための汎用的な送達プラットフォームは、本発明で使用するために改変された毒素、すなわち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）を含む。ＬＴは、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）のコレラ毒素（ＣＴ）と機能的、構造的および免疫学的に関連している（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、１９７８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２１：１０３６−１０３９）。ＬＴおよびＣＴは、５つの同一サブユニットＢおよび酵素的に活性なサブユニットＡからなるホロ毒素分子として合成される。チオール還元により、サブユニットＡは、酵素的に活性なＡ１ペプチドおよびより小さいＡ２ペプチドの２つのポリペプチド鎖に解離する。本明細書で使用される用語「ＬＴ」は、任意の腸毒素原性大腸菌株によって産生される任意の熱不安定性エンテロトキシンを指す。用語「ＬＴ」は、大腸菌のＬＴＩ、ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂおよびＬＴＩＩｃエンテロトキシン、ならびにＡ１サブユニット／ドメインのいずれかの部分が異種化合物で置換されているＬＴＩ、ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂ、ＬＴＩＩｃの組換え形態を包含するタンパク質、炭水化物、および／または核酸を含む。この化合物は、特定のヒト、動物または植物の病気に対する特異的治療を含む。「修飾された」とは、毒素の一部が異種化合物で置換されていることを意味する。例示的な実施形態では、毒素は、熱に不安定なエンテロトキシンＡＢ５である。そのような場合、「修飾された」とは、ＡＢ５毒素の毒性触媒ドメインが、機能的「カーゴ」をニューロン細胞の細胞質に送達するための機能的異種化合物で置き換えられていることを意味する（図１）。例えば、いくつかの実施形態において、ＬＴＩＩａ毒素のＡ１ドメイン（残基１〜１７２）は、β−ラクタマーゼまたはＶＨＨ−Ｂ８のような治療化合物を血液脳関門を越えてニューロンに送達することができる細菌毒素の設計された送達プラットフォームを提供するために、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＶＨＨ−Ｂ８）の軽鎖を標的とするβ−ラクタマーゼまたはラクダ科単鎖抗体で置換される。しかしながら、毒素のＡドメインのいかなる領域も、特定の「カーゴ」化合物で効果的に置換可能である。Ｂドメインは、当業者によって決定されるように、特定の細胞への送達のために改変され得る場合もある（図１３も参照のこと）。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「異種化合物」は、送達化合物とは異なる任意の分子または化合物を指す。例示的な実施形態では、標的細胞に治療上または機能上の利益をもたらすことができる任意の分子または化合物を、本発明の汎用的な送達プラットフォームを用いて細胞に送達することができる。異種の化合物には、β−ラクタマーゼ（β−ｌａｃ）、ラクダ抗体、亜鉛依存性プロテアーゼ、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）、Ｅ３結合タンパク質、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、プロテアーゼ、（ＰＴＥＮ）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ヒトヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、カスパーゼ補充ドメイン含有タンパク質１５（ＣＡＲＤ１５）、網膜芽細胞腫遺伝子産物（ｐＲＢ）、および顆粒球マクロファージコロニー（ＧＭ−ＣＳＦ）である。
【００２５】
場合によっては、改変された毒素送達プラットフォームは、ＬＴＩＩａプラットフォームがカーゴ（例えば、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの異種分子）をニューロンに効率的かつ特異的に送達する、β−ｌａｃ−ＬＴＩ１ａを含む。異種分子は、標的化された送達のために改変されたエンテロトキシンに共有結合され得る。
【００２６】
一例として、本明細書で提供されるプラットフォームを使用して送達するための異種化合物または「カーゴ」は、パーキンソン病（ＰＤ）を治療するために特定の細胞に送達するために改変された神経保護剤である。ＰＤは、ドーパミン作動性ニューロンの変性によって引き起こされ得る神経変性疾患である。本明細書中で使用される場合、「神経保護活性」という語は、神経細胞死の予防を指す。その効果は、ニューロン細胞、すなわちニューロンのアポトーシスまたは変性からの保護の形態をとってもよい。（例えば、ＸＴＴ、ＭＴＴ）、形態学的アッセイ（例えば、細胞染色）またはアポトーシス生化学アッセイ（例えば、カスパーゼ３活性など）を含む。ＢＤＮＦ、Ｂｒｎ４、およびＰｒｏｇｒａｎｕｌｉｎのような化合物は、ＰＤまたは１つまたは複数の他の神経変性疾患の神経保護効果を提供し得る。したがって、本明細書で提供される送達プラットフォームによる神経保護剤（例えば、ＢＤＮＦ、Ｂｒｎ４、プログラヌリン）の送達は、パーキンソン病患者における臨床経過を遅らせ、パーキンソン病の症状を治療することができる。ＢＤＮＦは、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ）または糖尿病性末梢ニューロパシー（Ｍｉｚｉｓｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５６：１２９０（１９９７））の治療のための治療剤として知られている。Ｂｒｎ４は、転写因子のＰＯＵドメインファミリーのメンバーである。Ｂｒｎ４はニューロンへのＮＳＣの分化を誘導し、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）とＢｒｎ４の同時トランスフェクションは成熟ドーパミン合成ニューロンへのＮＳＣの分化を促進する。ＰＲＧＮは中枢神経系全体に広く分布し、神経炎症の調節因子として作用し、長期間の神経細胞の生存に重要である。本明細書中で使用される場合、「パーキンソン病症状」には、運動緩慢、随意運動の遅れ、脳から骨格筋へのシグナル伝達の遅延、手、指、前腕、足、口、および顎；硬直、およびバランス不良などパーキンソン病で一般的に観察される症状を含む。さらに、随意的および非自発的筋肉制御の進行性喪失は、ＰＤに関連する多くの二次症状を引き起こす。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書で提供されるプラットフォームは、アルツハイマー病を有するかまたは有すると疑われる対象の細胞に、すなわち亜鉛依存性プロテアーゼの送達がそれらの特異的細胞に有益な細胞に、例えばＡＤＡＭ１０（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１０）、ＡＤＡＭ１７、またはＡＤＡＭ９などの亜鉛依存性プロテアーゼを送達する。ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、および他の関連プロテアーゼ（例えば、膜貫通タンパク質のＡＤＡＭファミリーの他のセクレターゼ）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断し、ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングを開始すると考えられている。ＡＤＡＭ１０免疫染色は、ＡＤ患者の脳において減少することが示されている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００３、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ  ３２（２）：１５３−６０）。ヒトＡＰＰ突然変異（Ｖ７１７Ｉ）を有するトランスジェニックマウスにおけるＡＤＡＭ１０のニューロン過剰発現は、ｓＡＰＰαの分泌を増加させ、Ａβの生成を減少させ、プラークにおけるその沈着を防止した（Ｐｏｓｔｉｎａら、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３（１０）：１４５６−６４）。
【００２８】
別の実施形態では、本明細書で提供されるコンジュゲート送達プラットフォームは、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）を送達する。ＴＦＥＢは、ハンチントン病のマウスモデルにおいて、凝集および神経毒性を低下させることが示されている。ＴＦＥＢはまた、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害（lysosomal storage disorders；ＬＳＤｓ）の治療標的でもある。例えば、ＴＦＥＢの過剰発現はグリコーゲン負荷およびリソソームサイズを減少させ、オートファゴソームプロセシングを改善し、インビトロおよびＰＤのマウスモデルにおいて自食片の蓄積を減少させる（Ｓｐａｍｐａｎａｔｏら、ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｍａｙ；５（５）：６９１−７０６）。
【００２９】
別の実施形態では、細胞内マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を疼痛メディエーターとして機能するように特定の細胞に送達することができる。ｍｉＲＮＡは遺伝子発現の重要な調節因子である。例えば、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ｂは、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおいて急速な内向き電流および活動電位を誘導する。
【００３０】
使用方法
一の実施形態では、本発明の汎用的な送達プラットフォームを使用して、治療上有効な量の機能性治療タンパク質を、それを必要とする対象に送達することができる。「対象」とは、哺乳動物および非哺乳動物を意味する。「哺乳動物」は、ヒト、ヒト以外の霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種を含む哺乳類のクラスのメンバーを意味するが、これらに限定されない。ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、およびブタなどの家畜（farm animals）；ウサギ、イヌ、およびネコなどの家畜（domestic animals）；ラット、マウスおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物；等が挙げられる。非哺乳動物の例としては、鳥類などが挙げられるが、これらに限定されない。「対象」という用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。「それを必要とする対象」とは、治療を必要とする疾患または状態と診断された動物またはヒト対象を意味する。
【００３１】
具体的には、本明細書で提供される汎用的な送達プラットフォームは、特定の状態または疾患を治療するために、治療有効量の異種の機能的な治療化合物を、対象の特定の細胞に送達するために使用され得る。例えば、一の実施形態では、本発明の汎用的な送達プラットフォームは、ボツリヌス中毒を治療するために、機能異種タンパク質（例えば、β-ラクタマーゼ）のニューロンの細胞質への効率的な送達に有用である。
【００３２】
本明細書で使用される「治療上有効な量」は、疾患を治療するために対象に投与されたときに、疾患に対するそのような治療を行うのに十分な化合物の量を指す。「治療有効量」は、化合物、治療される疾患状態、治療される疾患の重篤度または相対的な健康状態、投与経路および形態、専門の医師または獣医師による判断、およびその他の要因により異なる。本発明の目的において、「治療する（treating）」または「治療（treatment）」は、疾患、状態または障害に対抗する目的で患者の管理およびケアを示す。これらの用語は、予防的、すなわち、予防的および緩和的治療の両方を包含する。
【００３３】
「治療する」には、症状または合併症の発症を予防し、症状または合併症を緩和し、または疾患、状態もしくは障害を排除するための本発明の化合物の投与が含まれる。例えば、一の実施形態では、本発明の汎用的な送達プラットフォームは、ホスト生理学における分子欠陥を修復するためにＬＴ送達療法に「機能獲得」利益をもたらす治療化合物を送達するために使用され得る。いくつかの疾患では、標的分子のわずかな割合で機能を置き換えることは、疾患の進行を遅らせるのに有効であり得る。例えば、大部分の嚢胞性線維症（ＣＦ）症例は、不安定なｍＲＮＡおよび短縮型ＣＦ膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をもたらすΔＦ５０８変異または時期尚早終止コドン（ＰＴＣ）に由来する。ＣＦ患者は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ媒介性Ｃｌ（−）輸送の小胞体から非ＣＦで観察されるものの１０％以上への放出を促進することにより、輸送障害を部分的に修正することにより、その状態の劇的な改善を見ることができることが示されているヒト気管支上皮培養物であり、ＣＦ患者において臨床的利益をもたらすと予想されるレベルである。ＣＦを補正するための新しいストラテジーは、タンパク質標的、すなわちΔＦ５０８−ＣＦＴＲプロセシング／生物発生を促進し、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲチャネル活性を増強する過剰発現またはｓｉＲＮＡノックダウンを明らかにしてきた（Ｃｏｌｌａｗｎら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．７（４）：４９５−５０６（２０１０））。
【００３４】
本発明の汎用的な送達プラットフォームは、例えば、ボツリヌス中毒症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ポンペ病、帯状疱疹、神経膠腫を含む脳腫瘍、ＡＬＳ、ＣＦ、脊髄損傷、ヘモクロマトーシス、クローン病、癌、ＨＩＶ、白血病、結核などがある。表２に示すように、本発明の汎用的な送達システムは、どのＬＴプラットフォームが使用されるかを調整することによって、特定の状態または疾患を標的とするように調節可能である。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
治療化合物の用量は、治療する状態に依存する。送達する化合物の有効性によって決定する従来の投薬量がこの送達システムで使用されることが期待される。さらに、ＬＴ送達系またはその「カーゴ」が免疫刺激性を示す場合、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの結合ドメイン内の免疫刺激性エピトープを同定および排除したＰａｓｔａｎおよび共同研究者によって記載されているように、免疫応答を刺激するエピトープがマッピングされ、排除される外毒素Ａ（ＥＴＡ）を使用して、治療薬としてのＥＴＡの使用を促進する。
【００３７】
本発明のこれらおよび他の特徴、目的および利点は、以下の説明からよりよく理解されるであろう。説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面が参照され、本発明の実施形態が限定ではなく例示として示される。好ましい実施形態の説明は、すべての修正、均等物および代替物をカバーし、本発明を限定するものではない。したがって、本発明の範囲を解釈するためには、本明細書に記載された特許請求の範囲を参照すべきである。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、例示のためにのみ提供されており、決して本発明の範囲を限定するものではない。実際、本明細書に示され説明されたものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の説明および以下の実施例から当業者に明らかになるだろうし、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【００３９】
［実施例１］
材料および方法
プラスミドの構築
大腸菌コドン最適化配列ＬＴＩＩａ（アクセッション番号ＪＱ０３１７１１）のＡサブユニットおよびＢサブユニットを、二重ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を用いて合成し、発現のためにＰＥＴ２８ａベクターにサブクローニングした。Ｈｉｓ６およびＨＡ２エピトープを精製および免疫蛍光検出のためにＢサブユニットのＣ末端にそれぞれ付加した。ＬＴＩＩａＡサブユニットおよびＢサブユニットは、ペリプラズムへの同時翻訳分泌のためのリーダー配列をコードする。ＬＴＩＩａ（アミノ酸１〜１７２）のＡ１サブユニットをＴＥＭ１β−ラクタマーゼ（βｌａｃ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＷ４５１６３．１：アミノ酸２４〜２８６）に置き換え、３Ｘ  ＦＬＡＧタグをβｌａｃ−ＬＴＩＩａを産生するβ−ｌａｃ（βｌａｃ−ＬＴＩＩａ）の下流にした（図１）。部位特異的突然変異誘発（Ｓ４５Ａ）は、β−ｌａｃ活性を欠くβｌａｃnull−ＬＴＩＩａを産生した。βｌａｃおよびβｌａｃnullをコードするＤＮＡも、ＤｓＲｅｄｍｏｎｏＮ１をサブクローニングし、それぞれｐβｌａｃ−Ｄｓｒｅｄおよびｐβｌａｃnull−Ｄｓｒｅｄを構築した。Ｃ末端３Ｘ  ＦＬＡＧタグを有するＢｏＮＴ／Ａ（ＡＬｃ−Ｂ８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＪ６４３０７０、アミノ酸７−１２１）に特異的な単一ドメインラクダ抗体（ＶＨＨ）をコードするＤＮＡは、ＬＴＩＩａのＡ１サブユニットをコードし、ＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩ１ａを産生する配列（アミノ酸１−１７２）に置き換わった。構築物をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００４０】
タンパク質の発現および精製
ＬＴＩＩａ、βｌａｃ−ＬＴｌｌａ、βｌａｃnull−ＬＴｌｌａ、βｌａｃＦ−ＬＴＩＩおよびＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩＩａをコードするプラスミドを、大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換体を、同じ抗生物質を含む液体培養物（ＬＢ、４００ｍｌ）の接種物であるカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天プレート上で一晩増殖させた。Ｔ７プロモーター発現が１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発されたら、３７℃で０．６のＯＤ６００まで細胞を培養した。細胞を１５０ｒｐｍ、１６℃で一晩培養した。細胞をペレット化し、２５％スクロースを含む２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．９中に懸濁した。細胞を氷上でリゾチーム（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ中０．１６ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、７０ｍＭ  ＭｇＣｌ2（最終）を添加し、５０００×ｇで２０分間遠心分離して可溶性ペリプラズムを細胞から分離した。Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質を、ペリプラズムから、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。単離したタンパク質を、２０ｍＭ塩化ナトリウムおよび４０％グリセロールを含有する２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．９中で透析した。アリコートを−８０℃で保存した。
【００４１】
細胞および試薬
Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−１３１）を１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を、製造業者により示唆されるように、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐβｌａｃ−Ｄｓｒｅｄまたはｐβｌａｃnull−Ｄｓｒｅｄで形質転換した。ラット初代皮質ニューロンは、前述の様にして培養した。端的には、０．５ｍＭグルタマックス−Ｉ（カタログ番号３５０５０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２％Ｂ２７サプリメント（カタログ番号１７５０４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＰｒｉｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（カタログ番号２１１０３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でラットＥ１８皮質ニューロンまたはラットＥ１８海馬ニューロン（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ  ＬＬＣ）を培養した。培地の半分を５日ごとに補充した。ニューロンは、播種後１０〜１４日目に使用した。ボツリヌス神経毒Ｄ型（ＢｏＮＴ／Ｄ）をＣ．ボツリヌス菌株１８７３から単離した。他のＢｏＮＴ血清型からの毒素の単離は、前述の方法と同様の方法により１５０ｋＤａタンパク質を単離した。マウスの比活性は、１．１×１０8ＬＤ50ユニット／ｍｇであった。
【００４２】
Ｎｅｕ−２ａ細胞および初代皮質ニューロンにおけるβｌａｃ−ＬＴＩＩａＢおよびＬＴＩＩａのエントリーおよび転位
Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞に、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の１０μｇ／ｍｌのガングリオシドＧＤ１ｂまたはＧＭ１ａを３７℃で３時間負荷した。細胞を洗浄し、無血清ＤＭＥＭ中の４０ｎＭのβ−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢまたはＬＴＩＩａと３７℃で６０分間インキュベートした。初代ニューロンを、３７℃または４℃で６０分間、４０ｎＭのＬＴＩＩａ、β−ｌａｃ−ＬＴＩＩａBを含む神経基底培地（Ｂ２７およびグルタマックスを補充）でインキュベートした。細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、ＣＣＦ２−ＡＭ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＨＢＳＳ中で最終濃度１×を得るために製造業者により示唆されるように調製した６Ｘ）を充填した。試料を室温で３０分間インキュベートし、洗浄し、免疫蛍光染色を下記のように行った。
【００４３】
ＢｏＮＴ中毒ニューロンに対するＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩＩａＢの効果
ラット皮質ニューロンを１ｎＭのＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｄとともに３７℃で２時間インキュベートし、毒素を除去し、示された量のＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩＩａＢ（Ｂ８）をニューロンとともに３７℃で３時間インキュベートした。細胞を固定し、室温（室温）で３０分間、Ａｌｅｘａ６４７−小麦胚芽凝集素と共にインキュベートした。以下に記載するように、免疫蛍光（ＩＦ）染色は、ＢｏＮＴ／Ｄ処理細胞におけるＢｏＮＴ／Ａ切断ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＰ２５ｃ）またはインタクトなＶＡＭＰ２を検出した。ＳＮＡＲＥ基質の切断は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒細胞に対する蛍光強度ＳＮＡＰ２５ｃ／ＷＧＡおよびＢｏＮＴ／Ｄ中毒細胞に対するＶＡＭＰ２／ＷＧＡの比を用いて定量した。この実験の他のパラメーターについて、ニューロンを１ｎＭのＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｄと共に、示された量のＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩＩａと共に３７℃で一晩インキュベートし、ＳＮＡＲＥ基質切断を上述の通り評価した。
【００４４】
ＩＦ染色
細胞をＤＰＢＳ中の４％（重量／体積）パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、ＤＰＢＳ中４％ホルムアルデヒド中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１５分間ＲＴで透過処理し、ＤＰＢＳ中１５０ｍＭグリシンと共に室温で１０分間インキュベートし、ＤＰＢＳで２回洗浄し、ＩＦ染色を行った。処理した細胞をブロッキング溶液（１０％正常ヤギ血清、２．５％冷魚皮膚ゼラチン（シグマ）、０．１％トリトンＸ−１００，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＤＰＢＳ中）で１時間（室温）インキュベートし、続いて一次抗体（抗ＨＡ抗体（ロシュ）および抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ））を抗体インキュベーション溶液（５％正常ヤギ血清、１％冷フィッシュスキンゼラチン、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ｉｎＤＰＢＳ）中、４℃で一晩インキュベートした。細胞をＤＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、抗体インキュベーション溶液中のヤギまたはラットＩｇＧ  Ａｌｅｘａ標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に１時間（室温）インキュベートした。細胞を３回洗浄し、ＤＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで１５分間（室温）固定し、ＤＰＢＳで洗浄した。装着試薬Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ  ＡＦ−３（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、ＣＦＩ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ＶＣ  １００×オイル、開口数（ＮＡ）１．４９タイプの対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００全反射蛍光（ＴＩＲＦ）  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣｏｏｌＳｎａｐ  ＨＱ２カメラを使用してキャプチャした。ニコンＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓを用いて画像解析を行った。図はＣａｎｖａｓ  Ｘ（ＡＣＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してコンパイルした。
【００４５】
データ分析および統計
画像は、等しい露光時間および条件で生成された。画像強度分析および共局在分析は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．４８ｂ（ＮＩＨ）を用いて行った。データ統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ）を用いて行った。
【００４６】
結果
βｌａｃは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞において触媒的に活性である。
ＦＲＥＴベースのアッセイを使用して、神経細胞のβｌａｃを測定した。端的には、細胞を、細胞膜を通過し、細胞質のエステラーゼによってＣＣＦ２に変換される複素環小分子であるＣＣＦ２−ＡＭと共にインキュベートした。細胞内ＣＣＦ２はＦＲＥＴ特性を有する。４０９ｎｍで励起すると、ＣＣＦ２は５２０ｎｍ（緑色）でＦＲＥＴ発光を示すが、β−ｌａｃはＣＣＦ２を切断し、ＦＲＥＴ信号は消失し、発光は４４７ｎｍ（青色）にシフトする。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞をｐβ−ｌａｃ−Ｄｓｒｅｄまたはｐβｌａｃnull−Ｄｓｒｅｄでトランスフェクトし、ＣＣＦ２の励起／発光プロフィールについてアッセイした。βｌａｃ−Ｄｓｒｅｄを発現するが、βｌａｃnull−Ｄｓｒｅｄを発現しない細胞は、ＣＣＦ２のβｌａｃ依存性切断を支持する青色蛍光を示した（図２）。
【００４７】
βｌａｃ−ＬＴＩＩａはＡＢタンパク質に組換えられる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、βｌａｃ−ＬＴＩＩａからＡＢタンパク質複合体への組換えを評価した。親和性で精製したＬＴＩＩａ、βｌａｃ−ＬＴＩＩａおよびβｌａｃnull−ＬＴＩＩａは、Ａ：Ｂ比が５．４と５．２のＬＴＩＩａキメラおよびＢサブユニット内のＡまたはβｌａｃ−Ａ２の大きさに対応する二つのバンドを含む。タンパク質を、Ｂサブユニット上に位置する親和性エピトープを用いて精製したため、ＬＴＩＩａとβｌａｃ−ＬＴＩＩａＢのＡサブユニットの検出は、βｌａｃ−ＬＴＩＩａβ内のＡ−Ｂ組換えを支持する（図１）。
【００４８】
ＬＴＩＩａは、機能的なカーゴ（β−ｌａｃ）をニューロンに送達する。
ＬＴＩＩａが機能的異種タンパク質をニューロンに送達できるかどうかを試験するために、キメラＬＴＩＩａ誘導体β−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢを操作した。一次ラット皮質ニューロンへの酵素的に活性なβｌａｃの適切な送達を、ＣＣＦ２  ＦＲＥＴ切断アッセイによって試験した。初代ラットニューロンとのβ−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢのインキュベーションは、ＣＣＦ２切断（シアン）を示したが、ＬＴＩＩａとのインキュベーションは、ＣＣＦ２切断をもたらさなかった（図３Ａ〜Ｃ）。この結果は、機能的異種タンパク質（β−ｌａｃ）をニューロンに送達するＬＴＩＩａの能力を支持する。β−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢの滴定は、０．１ｎＭのβ−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢの量で処理した細胞でβ−ｌａｃ活性の検出によると、ＣＣＦ２の切断量に比例した。
【００４９】
異種タンパク質送達が「オフターゲット」効果を有するかどうかに対処するために、複合ガングリオシドによるβ−ｌａｃの好ましい送達、および送達がＢＦＡ感受性経路を介するかどうかについて、ＬＴＩＩａを評価した。ＬＴＩＩａは最も高い親和性でガングリオシドＧＤ１ｂに結合し、より低い親和性でＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＭ１およびＧＤ２に結合する。Ｔ８４細胞におけるＧＭ１ａは、ＬＴＩ１ａによるシグナル伝達を媒介しない。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞は、ＧＤ１ｂのような複合ガングリオシドを発現しないが、外因性ガングリオシドとのインキュベーション時に、その膜にガングリオシドを負荷することができる。膜を外因性ガングリオシドと共にインキュベートすると、ＬＴＩＩａはＧＭ１ａ処理細胞よりもＧＤ１ｂ処理細胞にβ−ｌａｃを２倍以上効率的に送達し、ＧＭ１ａと比較してＧＴＩｂに対するＬＴＩＩａの高い親和性と一致した。ＢＦＡは、分泌経路における小胞輸送を阻害する真菌代謝産物であり、真核細胞におけるエンドソームとゴルジ体組織／ＥＲとの間の小胞交換を阻害する。ＢＦＡは、天然ＬＴについて報告されているように、ＧＤ１ｂ負荷Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞およびラット初代ニューロンの両方において、ＬＴｌｌａによるβｌａｃ転位を阻害した。これらの実験は、β−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢが「オフターゲット」の輸送特性を有さないことを示している。
【００５０】
β−ｌａｃカーゴとβ−ｌａｃＬＴＩＩａＢのＢサブユニットの輸送をさらに調べるために、ＦＬＡＧエピトープをβ−ｌａｃのＣ末端に操作してカーゴ局在を検出し、一方ＨＡエピトープはＢサブユニット検出を可能にした。ＦＬＡＧタグは、β−ｌａｃ活性に関するＦＲＥＴベースの切断アッセイ（図４Ａ−Ｂ）によって決定されるように、ＬＴＩＩＡによるカーゴの転位に影響しなかった。ＦＬＡＧおよびＨＡエピトープは、４℃でニューロンにβ−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢをインキュベートすると０．６４のピアソン係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ：ＰＣ）を有し、細胞結合時の共局在化のベースラインを示した。３７℃で１時間インキュベートすると、ＦＬＡＧ／ＨＡのＰＣは０．４３に減少し、２つのエピトープ間の分離パターンを示した。これはニューロン内のＬＴＩＩａのＢサブユニットからの神経細胞の進入およびカーゴの分離を支持する（図４Ａ、４Ｂ）。
【００５１】
ＬＴＩＩａは、機能的なカーゴ（β−ｌａｃ）をＢｏＮＴ／Ｄ−中毒ニューロンに送達する。ボツリヌス神経毒素は、シナプス小胞の融合を防ぐためにＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。ＬＴＩＩａがＢｏＮＴ中毒ニューロンの治療送達プラットフォームとして機能することができるかどうかを判定するために、ＬＴＩＩａがＢｏＮＴ／Ｄ中毒ニューロンにβ−ｌａｃを送達する能力を、ＣＣＦ２  ＦＲＥＴアッセイによって測定した。ラット初代ニューロンを２ｎＭのＢｏＮＴ／Ｄと共に一晩インキュベートして、内因性ＶＡＭＰ２を切断し、ＩＦ染色により確認した（図５Ａ〜５Ｃ）。これらのニューロンのβ−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢとのインキュベーションは、ＢｏＮＴ／Ｄに暴露されなかった対照ニューロンと同様のＣＣＦ２切断をもたらした。これは、ＬＴＩＩａによるβｌａｃの侵入および転位がＢｏＮＴ／Ｄ中毒ニューロンにおいて阻害されないことを示す（図５Ａ、５Ｃ）。したがって、ＬＴＩＩａは、ＢｏＮＴ治療のための有用な送達プラットフォームであり得る。
【００５２】
ＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩ１ａは、ラット皮質ニューロンにおけるＳＮＡＰ２５のＢｏＮＴ／Ａ切断を阻害した。抗ボツリヌス中毒治療のための送達プラットフォームとしてのＬＴＩＩａの有用性を評価するために、ＬＴＩＩａキメラを、Ａ１サブユニットがＢｏＮＴ／Ａ（Ｂ８）のＬＣを標的として阻害することが既に示されている一本鎖可変領域ラクダ抗体と交換した場所で操作した
（ＶＨＨ−ＬＴＩ１ａと称する）（図６Ａ）。
【００５３】
初代皮質ニューロンを１ｎＭのＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｄとともに３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、種々の量のＶＨＨ−ＬＴＩＩａとともに３時間インキュベートし、次に切断されたＳＮＡＰ２５（ＢｏＮＴ／Ａまたは全長ＶＡＭＰ２（ＢｏＮＴ／Ｄ処理細胞）で処理した（図６Ｂ、６Ｃ）。切断されたＳＮＡＰ２５は、ＢｏＮＴ／Ａ単独で処理された細胞で検出されたが、ＶＨＨ−ＬＴＩＩａで処理されたＢｏＮＴ／Ａ貪食細胞は、切断されたＳＮＡＰ２５の用量依存的減少を示した（図６Ｄ、６Ｅ）。コントロールは、ＶＨＨ−ＬＴＩＩａがＢｏＮＴ／ＤによるＶＡＭＰ２の切断を阻害しなかったので、ＶＨＨ−ＬＴＩＩａ阻害が血清型に依存することを示した。ＶＨＨ−ＬＴＩＩａはまた、一晩インキュベートした細胞におけるＢｏＮＴ／Ａプロテアーゼ活性を阻害し、このＢｏＮＴ／Ａ治療の効果の潜在的寿命を示した。これは、ＢｏＮＴ中毒ニューロンへの機能的療法の送達の最初の例である。
【００５４】
考察
この実施例では、神経組織に富んだ複合ガングリオシドＧＤ１ｂに対するＬＴＩＩａの高親和性に基づいて、ニューロン特異的治療送達システムの開発のためにＬＴＩＩａを選択した。ＬＴＩＩａは、レポーターカーゴとして、外因性ＧＤ１ｂ（図５）および初代皮質ニューロンを負荷したＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の両方にβ−ｌａｃを送達した。ラットの一次皮質ニューロン（図５）およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞（図６）のすべてにおいてβ−ｌａｃの転位が検出された。ＬＴＩＩａは、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＭ１、およびＧＤ２に対する低い親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＤ１ｂに対する高い親和性を有する。したがって、ＬＴＩＩａは、神経細胞の送達プラットフォームとして開発することができる。今後の研究では、ニューロンに特有のガングリオシドを結合するようにＬＴＩＩａを工学的に調整することにより、ニューロン特異性を最適化する。
【００５５】
β−ｌａｃ−ＬＴＩＩａＢをニューロン特異的送達プラットフォームとして試験した。β１ａｃカーゴは、ＢｏＮＴ／Ｄによる中毒化ニューロンに入り、転位し、ＢｏＮＴ中毒後の治療送達プラットフォームとしてのＬＴＩＩａの有用性を支持した（図８）。治療ラクダ科単一ドメインタンパク質ＶＨＨ−Ｂ８がＬＴＩＩａプラットフォームを介してＢｏＮＴ／Ａ中毒ニューロンに送達されたとき、ＶＨＨ−Ｂ８はＢｏＮＴ／ＡによるＳＮＡＰ２５切断を阻害した（図８）。
【００５６】
ＢｏＮＴの軽鎖はニューロン内で活性を維持し、６ヶ月まで弛緩性麻痺を引き起こす可能性がある。治療用カーゴの送達は、ニューロン内部のＢｏＮＴ  ＬＣを中和するために不可欠である。ＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩＩａは、ＢｏＮＴ／Ａによって中毒されたニューロンと３時間インキュベートしたときだけでなく、ＢｏＮＴｓ中毒後治療としてアプローチを示唆するＢｏＮＴ／Ａと共にニューロンと一晩インキュベートしたときにもＳＮＡＰ２５切断を阻害した（図９）。ＶＨＨ−Ｂ８−ＬＴＩ１ａがＢｏＮＴ／ＤによるＶＡＭＰ２切断に影響しなかったという事実は、この治療プラットフォームの特異性をさらに確認する（図８）。
【００５７】
ＢｏＮＴワクチンおよび中和抗体の開発は過去２０年で進歩しているが、ＢｏＮＴが神経細胞に入った後に治療法を提供することはできない。発明者ら研究で初めて、細胞内ＢｏＮＴ軽鎖活性を中和するために特異的に治療カーゴをニューロンに送達するためのプラットフォームとしてＬＴＩＩａ使用された。
【００５８】
本発明のＬＴＩＩα誘導体は、ニューロンにおける神経変性疾患、ＢｏＮＴ中毒、および潜伏ウイルス感染を治療するための治療薬を送達するための新しいアプローチを提供する。
【００５９】
［実施例２］
ＬＴＩＩ送達プラットフォームの有効性およびニューロン特異性の特徴付け
実施例1に記載のＬＴＩＩａ送達プラットフォームは異種タンパク質をＡＢ５コンフォメーションに組み換え、２つの独立したカーゴβ−ｌａｃおよびラクダ抗体を、ＢＦＡ感受性経路を介してニューロンの細胞質に送達した。これは、ＬＴＩＩａ誘導体がネイティブＬＴＩＩａのように輸送され、「オフターゲット」メカニズムを介して輸送されないことを示した。実施例１はまた、ＬＴＩＩａ送達のニューロン特異性を示すＧＭ１ａと比較して、ＬＴＩＩａカーゴ送達がホストレセプターとしてのＧＤ１ｂでより効率的であったことを示す。
【００６０】
この実施例において、本発明者らは、ＬＴＩＩ送達プラットフォームの有効性およびニューロン特異性を特徴づける。第１に、本発明者らはＬＴのＢサブユニットの免疫応答を不活性化する。部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）は、ＬＴＩのＢサブユニットをコードするＤＮＡへの変化を操作してＨ５７Ｓ置換を行い、免疫調節活性を排除する。ＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂのＢサブユニットは、ＴＬＲ２と直接接触するＬ７３Ａ／Ｓ７４Ｄ置換を行うＴＬＲ１／２応答領域（ＬＴ−ＢＩＩａの残基６８〜７４）を排除するように操作される。それぞれの個々の突然変異は、マクロファージにおけるＬＴＢ媒介サイトカイン活性化をバックグラウンドレベル近くまで低下させる。突然変異Ｂサブユニットおよびホロ毒素ＬＴＩＩ形態を、ＴＨＰ−１由来の単球を用いてサイトカイン刺激について評価する。固相結合は、ＴＬＲ２結合を排除する突然変異が、ガングリオシド結合を保持しているかどうかを試験する。これらの実験は共に、ＬＴ毒素のＢサブユニットの固有の免疫調節特性を排除するであろう。
【００６１】
ニューロンの細胞サブタイプに対するＬＴＩＩａ（ＧＤ１ｂに結合する）、ＬＴＩＩｂ（ＧＤＩａに結合する）、およびＬＴＩ（ＧＭ１ａに結合する）によるカーゴ送達の指向性の決定
本発明者らは、ＬＴＩＩａが、培養ニューロン細胞またはＨｅＬａ細胞のような非ニューロン細胞よりも一次皮質ニューロンにカーゴをより効率的に送達し、一次ニューロンのＬＴＩＩａの指向性を支持することを示した。この実施例では、初代ニューロン細胞（脊髄、運動ニューロン、海馬および脳ニューロン、ＢｒａｉｎＢｉｔｓから購入）、培養ニューロン細胞（ＰＣ−１２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３１、及びＣ６グリア細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０７）、および非ニューロン細胞（上皮細胞、ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２および内皮細胞、ＡＴＴＣ  ＰＣＳ−１００−０１０）を含むニューロンのサブセットに対するＬＴＩＩ毒素の指向性を扱う。細胞を単層として培養し、βｌａｃ−ＬＴＩＩａ、βｌａｃ−ＬＴＩＩｂまたはβｌａｃ−ＬＴＩと共にインキュベートする。予備実験結果に記載されているように、β−ｌａｃをレポーターとして用い、各ＬＴ−誘導体の転位有効性を決定する。培養されたニューロン細胞および非ニューロン細胞に、個々の複合ガングリオシドを負荷し、βｌａｃ−ＬＴＩＩａ、βｌａｃ−ＬＴＩＩｂまたはβｌａｃ−ＬＴＩに対する感受性について試験する。これらの実験は、ニューロンのサブセットのためのＬＴＩＩ誘導体の有効性アレイおよびカーゴ転位のためのガングリオシドの選択性を確立する。これは、脳の特有の領域内の個々のＬＴ誘導体の好ましい標的の同定を容易にすることができるニューロンのサブセット内のＬＴ誘導体に対する潜在的な異種性の初期の指標となる。
【００６２】
細胞結合および細胞内輸送効率の測定
ＬＴＩＩａ（ＧＤＩ１ｂに対する高親和性）、ＬＴＩＩｂ（ＧＤＩａに対する高親和性）、およびＬＴＩ（ＧＭ１ａに対する高親和性）は、触媒活性の有無にかかわらず、Ａサブユニット（ＦＬＡＧ）またはＢサブユニット（ＨＡ）２つのドメインの細胞内移動を追跡する。２つのプローブされたエピトープ間の共局在を測定するピアソン係数（ＰＣ）は、細胞膜（結合形態）上のＬＴＩＩ誘導体のＡサブユニットおよびＢサブユニットの会合を確立し、次いでＡサブユニットおよびＢサブユニットの会合をＬＴＩＩ誘導体は、カーゴタンパク質の細胞内送達効率を確立するために細胞内に進行する。
【００６３】
細胞の細胞質へのカーゴ転位効率の測定
βｌａｃ−ＬＴＩＩａ、βｌａｃ−ＬＴＩＩｂまたはβｌａｃ−ＬＴＩは、ＣＣＦ２の切断（細胞質へのβｌａｃ転位の定量的アッセイ）として細胞の細胞質へのカーゴ送達の効率を測定するために使用される。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＢＦＡ）治療へのカーゴ転位の感度は、ネイティブＬＴについて観察されるように、輸送（trafficking）および転位がゴルジを介して進行するかどうかを決定する。したがって、ＢＦＡ感受性は、ＬＴＩＩ誘導体による潜在的な「オフターゲット」の輸送の評価である。Ｎｅｕｒｏ−２ａのような培養されたニューロン細胞は、複合ガングリオシドを制限しており、これらの細胞の原形質膜は、ＧＴ１ｂ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ１ａ、およびＧＭ１ａを含む外因性ガングリオシドとのインキュベーションにより「負荷」され、ガングリオシドは輸送および転位に影響を与える。ガングリオシドのローディング効率は、ガングリオシド特異的抗体（α−ＧＴ１ｂ抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および特定のクラスのガングリオシド（ＧＭ１ａに独占的に結合するＣＴＢ）に結合する毒素を用いて確立される。
【００６４】
細胞内輸送がＬＴＩＩによるカーゴ送達の有効性にいかに影響するかの測定
Ａ２のＣ末端のＲＤＥＬ配列は、Ａ１サブユニットの細胞質への転位を促進するためにＬＴＩＩを小胞体に標的化し、ＲＤＥＬ配列の欠失はＬＴの輸送を他の送達経路に再分配する。ＲＤＴＩはＡ２のＬＴＩＩ（ａ−ｃ）から削除され、ＬＴＩＩエントリーおよびβ−ｌａｃ転位効率への影響を決定する。ピアソン係数（ＰＣ）は、プローブされたエピトープとの間の共局在を測定し、ＬＴＩＩ誘導体の進入の進展およびサイトゾルへの細胞内送達β−ｌａｃカーゴの効率を確立する。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａによるカーゴ転位の感度は、ゴルジを通る輸送プロセスと代替入場経路が効率的な転位または送達サイトの変更を提供するかどうかを測定する。これまでの研究では、βｌａｃ−コレラ毒素誘導体は、一次培養ニューロン内のβｌａｃ−ＬＴＩＩａ誘導体（末梢、樹状突起および軸索に伸びる）とは異なる細胞内位置（中央）にカーゴを送達したので興味深い。ＢＦＡ感受性の評価はまた、種々のＬＴＩＩ誘導体による潜在的な「オフターゲット」輸送を決定するだろう。これらの実験は共に、Ｃ末端ＲＤＥＬ配列の細胞内輸送とカーゴ転位効率に及ぼす影響を測定する。
【００６５】
予想される結果
本発明者らは、ＬＴＢＩＩ毒素のＴＬＲ１／２結合領域およびＬＴＩを有する免疫調節領域における突然変異がＴＬＲ１／２レセプターとの関連を低下させ、サイトカイン産生を低下させて（刺激されていない）レベルを制御すると予想する。本発明者らは、これらの突然変異がガングリオシド結合、Ｂサブユニットの五量体状態、またはＡ２リンカーと組み換える能力に影響を及ぼすとは予想しない。
【００６６】
ＬＴＩＩ誘導体は、一次ニューロンの各固有のサブセットに入ると独特の有効性および輸送パターンを有し、ガングリオシドの各クラスを有する培養ニューロン細胞との独特の関連性を有する。カーゴ転位、細胞質中へのβｌａｃの送達、ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂ、およびＬＴＩの可能性、およびガングリオシドがカーゴ転位効率にどのように影響を及ぼすかは独特であろう。培養されたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞中の、ＧＴ１ｂ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ１ａ、およびＧＭ１ａのＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂおよびＬＴＩの好ましい結合を確立することにより、各ＬＴ誘導体による個々のクラスのガングリオシドによる輸送転位の効率および輸送効率を相関させることができる。これは、特定のガングリオシドとの関連が輸送（trafficking）やカーゴ輸送にどのように影響するかを定義する。ＬＴＩＩａまたはＬＴＩＩｂがカーゴをニューロンに運ぶのに最も効率的かどうかは予測できないが、ＬＴＩＩａおよびＣＴとのこれまでの研究に基づいて、どちらのＬＴＩＩ誘導体もＬＴＩと比較して、カーゴをより効率的に輸送することが予測される。
【００６７】
Ａ２のＣ末端からのＣ末端ＲＤＥＬの欠失は、カーゴ転位の効率および位置を高めることができるエンドソーム進入経路にＬＴＩＩａを分配すると予想される。本発明者らは、ＲＤＥＬの除去が、細胞質へのカーゴの送達を遅延させるが、トランスロケーションの効率性を遅らせると予測し、カーゴの細胞内局在部位を変化させ、これは治療の有効性に影響し得る。この予測は、異なる細胞内輸送を観察したコレラ毒素およびＲＤＥＬ配列の除去を伴うＡサブユニット転位を用いた初期の研究に基づいている。
【００６８】
代替アプローチ
本発明者らは、Ｂサブユニット内の点突然変異（point mutations）を操作することに問題はないと予想しているが、これが効率的でない場合、オーバーラップＰＣＲ突然変異誘発を用いてこれらの突然変異を起こすことができる。変異したＢサブユニットが残留免疫活性を保持する場合、第３の点突然変異はＴＬＲ１／２結合領域内で操作される。トリプル変異Ｂサブユニットは、他の機能（ガングリオシド／五量体化／Ａ２リンカーアセンブリ）もまた影響を受けるかどうかを決定するための生物学的特性について試験される。ＴＬＲ２モジュレーションを低下させる突然変異も、Ａ２オリゴマーをＢオリゴマーに組み換える能力を低下させるといういくつかの懸念がある。もし、Ａ２組換えがより保存的な突然変異により影響を受ける場合は、Ａ２リンカーを促進するＢサブユニットの７３／７４残基を操作するが、ＴＬＲ１／２を介した免疫刺激を排除するだろう。例えば、ＴＬＲ−２−Ｂサブユニット相互作用は主に疎水性であるため、ＴＬＲ１／２相互作用を排除するために疎水性のクラス変化は、Ａ２リンカー−Ｂサブユニット相互作用に影響を及ぼさずに使用される。
【００６９】
ガングリオシドのクラスがＬＴＩＩ誘導体の輸送またはカーゴ転位効率に影響しない場合、異種カーゴを最も効率的に組み立てるＬＴ−ＩＩ誘導体は、その後の実験に利用される。さらに、ＲＤＥＬの欠失がＡサブユニットＢオリゴマー相互作用を無効にする場合、保存的置換はゴルジへの標的化を排除するがサブユニット会合は保持するＲＤＥＬを交換するように設計される。
【００７０】
この実施例は、潜在的サイトカイン刺激を排除し、特定のガングリオシドレセプター相互作用および細胞内輸送がカーゴ転位の効率および部位にどのように影響するかを定義する、タンパク質送達プラットフォームとしてのＬＴＩＩ誘導体の最適化を行う。このカタログ化されたＬＴＩＩ誘導体のセットを有することにより、本出願の他のセクションで分析される特定のカーゴに対するＬＴ−ＩＩ誘導体の転位効率を試験する機会が提供される。
【００７１】
［実施例３］
ニューロンに対するＬＴＩＩのニューロン結合特異性の最適化
この実施例では、複合ガングリオシドを結合させることによってニューロンに結合するＢサブユニットの特異性および有効性をどのように高めることができるかを示す。ＧＴ１ｂ、ＧＤ１ｂ、およびＧＤ１ａを含む、脳に多く含まれるいくつかの複合ガングリオシドが存在し（図１１）、ＧＭ１ａはニューロンおよび非神経源の膜に存在する。このねらいの目標は、複合ガングリオシドＧＴ１ｂを標的とすることにより、ＬＴＩＩ療法の「オフターゲット」効果を低減することである。ＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂはＧＴ１ｂに結合するように設計される。
【００７２】
具体的には、ＬＴＩＩａについては、ＬＴＩＩｂ由来のシアル酸結合ポケットを付加することにより、ＧＤ１ｂ結合部位をＧＴ１ｂ結合部位に変化させる。さらに、ＬＴＩＩｂについては、ＬＴＩＩａ由来のシアル酸結合ポケットを付加することによって、ＧＤ１ａ結合部位をＧＴ１ｂ結合部位に変更する。
【００７３】
方法
複合ガングリオシドＧＴ１ｂへのＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂの結合を強化する。突然変異誘発は、５’シアル酸についてはＬＴＩＩａ内に結合ポケットを生成し、７’シアル酸についてはＬＴＩＩｂを生成してＧＴ１ｂに対する親和性を増加させる。ＬＴＩＩａは天然にＧＤ１ｂに結合するので、ＧＴ１ｂに結合する能力を加えるためには、ＧＤ１ｂ結合部位へのＳｉａ５結合部位の付加が必要であろう。Ｓｉａ５部位を含む残基は、コレラ毒素−ＧＭ１ａ構造（ＰＤＢ：ＬＴＩＩｂ（ＰＤＢ：１ＴＩＩ）上にモデル化することによって誘導された。この分析は、残基５０−５９がＳｉａ５結合部位ポケットを含み、残基３０−３５がＳｉａ７結合部位を含むことを予測した（図１２）。したがって、ＬＴＩ１ａのＢサブユニットをコードするＤＮＡに改変する突然変異は、Ｓｉａ５部位を導入するように突然変異誘発し、５１−ＹＩＰＧＧＲ−５６（配列番号１）→ＲＩＳＲＡＫ（配列番号２）およびＬＴＩ１ｂのＢサブユニットをコードするＤＮＡは、Ｓｉａ７部位、３０−ＩＮＮＮＴＤ−３５（配列番号３）→ＶＮＴＮＴＲ（配列番号４）（表３）を導入するように、突然変異誘発する。
【００７４】
【表３】
2017534598.tif 000005
【００７５】
記載されるように生成されたＬＴＩＩ誘導体のガングリオシド結合親和性は、親和性の変化を確立するための固相アッセイおよび精製されたガングリオシドについて測定される。さらに、ガングリオシド特異性の変化は、上記のように、ガングリオシド富化Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞およびラット初代皮質ニューロンにおける突然変異誘発βｌａｃ−ＬＴＩＩ誘導体からのβｌａｃの侵入および転位の効率の変化における相関を試験する。
【００７６】
予想される結果
ＧＴ１ｂ結合は、天然型ＬＴＩＩと比較していくつかの直接的なガングリオシド相互作用を有するため、ＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂ送達プラットフォームの有効性を増加させるはずである。ＬＴＩＩａはＬＴＩＩｂよりもガングリオシドに対して本質的に高い親和性を有するので、突然変異誘発されたＬＴＩＩａは修飾されたＬＴＩＩｂよりも高い親和性でＧＴ１ｂに結合することが予想される。したがって、この分析は、ガングリオシド親和性が送達有効性にどのように影響を及ぼすのか測定する機会を提供する。本発明者らは、ＬＴＩＩａのＧＭ１ａへの結合が、生産的中毒（productive intoxication）に至らないことを他の研究者が示しているので、ＧＭ１ａに対するＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂの本質的な結合が改変される必要はないと予想する。
【００７７】
代替アプローチ
主な関心事は、ＧＴ１ｂのＳｉａ５に結合するＬＴＩＩａのポケットを提供するために追加の改変が必要であり得ることである。２組の突然変異がＧＴ１ｂ結合を可能にするのに十分でない場合、Ｓｉａ５部位を含むポケットは、Ｓｉａ５ポケットに隣接するＬＴＩＩａ  Ｙ４９ＲおよびＩ３９Ｍを突然変異させることによってサイズが増大する。別の関心事は、提案された２つのＡｌａ突然変異が、ＧＭ１ａに対する親和性を減少させるためにＬＴＩＩａ−Ｓｉａ６相互作用を破壊するのに十分ではないことである。この場合、Ｓｉａ６−ＬＴＩＩａ相互作用を減少させるためにＴ１７間の水素結合を破壊するように作られたより嵩高い疎水性残基が導入されるであろう。ＧＭ１ａに対する改変ＬＴＩＩａまたはＬＴＩＩｂの本質的な結合の場合、本発明者らはＳｉａ６相互作用のＢサブユニットの領域をＥ１１およびＨ１３のＣＴ同等物にマッピングし（図１３）、ＧＭ１ａに対する改変ＬＴＩＩａまたはＬＴＩＩｂの親和性を減少するためにこの領域を突然変異誘発するだろう。
【００７８】
Ｂサブユニットが特定のクラスのガングリオシドに結合するようにＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂの結合特性を最適化することにより、各ガングリオシドへの輸送がどのようにして送達および治療領域に影響を与えるかを決定する。
【００７９】
［実施例４］
Ｐａｎ血清型ＢｏＮＴ療法の操作のためにＢｏＮＴ療法を送達するためのＬＴＩＩの操作
この実施例は、ＬＴＩＩａがＢｏＮＴ中毒に対する療法として単鎖ラクダ抗体（Ｂ８）を送達したという本発明者らの判定を拡大する。この治療法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢｏＮＴを中和し、および／または細胞内で発現させるとＢｏＮＴを中和するが、治療としては使用しない。細胞内ＬＣ活性を中和するための治療アプローチには、ａ）一本鎖ラクダ（ＶＨＨ）β−ＬＣ抗体（〜１４ｋＤａ）の送達が含まれる。Ｓｈｏｅｍａｋｅｒらは、ＶＨＨが高親和性（Ｋｄ〜１ｎＭ）でＢｏＮＴ−ＬＣに結合し、ＢｏＮＴプロテアーゼ活性を阻害し（Ｋ（１）〜１ｎＭ）、哺乳動物の神経細胞内で発現されると結合特異性および阻害機能を保持することを示した。
【００８０】
本発明者らは、結合および加水分解に関与する特異的残基および基質内のＬＣの親和性を減少及び増加させる基質内の特異的突然変異を同定してＢｏＮＴ−ＬＣと基質との間の相互作用をマッピングした、この情報を使用して非加水分解性で高親和性ＳＮＡＰ２５およびＶＡＭＰ２基質は、細胞内ＬＣ阻害剤として操作されるだろう。
【００８１】
汎血清型ＢｏＮＴ療法の操作に対処するための高親和性ＳＮＡＲＥ基質阻害剤およびラクダ科単一ドメイン抗体療法の融合、およびｄ）ユビキチン分解経路への標的療法−ＬＣ複合体へのβＴｒＣＰのＥ３リガーゼ結合ドメインの付加。Ｓｈｏｅｍａｋｅｒおよび共同研究者らは、Ｅ３リガーゼ結合ドメインＦボックス（１７５−２９３）の添加が細胞内ＶＨＨのクリアランスを高めることを観察した。ロジスティックでは、初期実験により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＮＡＲＥ切断および培養初代ニューロンにおけるＢｏＮＴ中毒に対する治療有効性が確立される。最も有力な治療法は、ＢｏＮＴ中毒のマウスモデルで試験される。
【００８２】
カーゴ−ＬＴ誘導体の操作のための一般的な戦略は、βｌａｃまたはβ−ＢｏＮＴ／Ａ  Ｂ８ラクダ科単鎖抗体−ＬＴＩＩａキメラを工学的に行ったように、標的ＬＴ（ＬＴＩＩａ、ＬＴＩＩｂ、またはＬＴＩ）のＡサブユニット１−１７０アミノ酸の置換である。（図１６Ａ〜１６Ｃ）。
【００８３】
ＢｏＮＴ−ＡおよびＢｏＮＴ−Ｂを中和する一本鎖ラクダ科β−ＬＣ抗体（ＶＨＨ）
表４は、ＬＴＩＩａによって送達される治療用カーゴとして使用されるβ−ＬＣ−ラクダ科ＶＨＨの一次アミノ酸配列を示す。ＢｏＮＴ血清型特異性を、異種血清型ＢｏＮＴで試験する。
【００８４】
【表４】
2017534598.tif 000006
【００８５】
ＢｏＮＴ療法としてのＳＮＡＲＥ結合阻害剤（高親和性（ＨＡｆ）−ＳＮＡＰ２５およびＨＡｆ−ＶＡＭＰ２）
本発明者らは、各ＢｏＮＴ血清型に対して最適なＳＮＡＲＥ結合ドメインを以前決定した。ＳＮＡＰ２５（残基１４１−２０６）は、ＳＮＡＲＥ結合に影響しないがＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｅ、およびＣ切断（Ｒ１９８Ａ、Ｉ１８１ＥおよびＡ１９９Ｄ）をブロックする３つの突然変異をコードする。ＢｏＮＴ／Ａ切断のためにＰ１−Ｐ１’残基間にグリシンも挿入されるので、この添加はＬＣ／Ａに対する親和性を約１０倍に増強した。ＶＡＭＰ２（残基１０−９４）は、ＬＣ−ＳＮＡＲＥ結合に影響を与えないが、ＢｏＮＴ血清型Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧ切断（Ｆ７７Ａ、Ｌ６０Ａ、Ｋ５９Ａ、およびＧ８２Ｄ）および親和性を高める４つの突然変異ＬＣ／Ｂ〜７０倍（Ｖ４２Ａ、Ｖ４３Ａ、Ｄ４４Ａ、Ｉ４５Ａ）であった。この療法は、「新しい」ＢｏＮＴ／Ｆおよび推定されるＢｏＮＴ／Ｈ8などの「新しい」ＢｏＮＴ血清型の同定によって改変することができることに留意されたい。複数のＬＣ血清型に対する高親和性の非加水分解性ＳＮＡＲＥ基質の利用は、これらの基質を天然のＳＮＡＲＥタンパク質と比較して好ましいものとすべきである。
【００８６】
Ｐａｎ−ＢｏＮＴ療法：（ＨＡｆ−ＳＮＡＰ２５−ＨＡｆ−ＶＡＭＰ２−ＬＴＩＩ）およびＢｏＮＴ／Ａ−ＢｏＮＴ／Ｂ療法
オーバーラップＰＣＲは、汎血清型ＢｏＮＴ療法の発生に向けてＬＴＩＩに組換えられるＳＮＡＰ２５−ＶＡＭＰ２−ＬＴＩＩおよびαＬＣ／Ａ−ＬＣ／Ｂ−ＬＴＩＩ遺伝子融合体を操作する（α−ＬＣ／Ａ−α−ＬＣ／Ｂ）。ＳＮＡＲＥタンパク質またはラクダ科α−ＬＣｓＶＨＨｓの融合は、柔軟性を促進するために（ＧＧＧＧＳ）３ペプチドリンカーを含み得る。
【００８７】
シス−Ｅ３ユビキチンリガーゼＦボックスの添加による治療効果の増強
Ｆボックスをコードする遺伝子（Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合ドメイン、βＴｒＣＰの残基１７５−２９３）はＳＮＡＰ２５−ＶＡＭＰ２に融合され、β−ＬＣ阻害剤は細胞内ＢｏＮＴ  ＬＣｓをクリアするための活性基盤（ユビキチンターゲティング）を含む。
【００８８】
治療剤をコードするＤＮＡは、全体のＰＣＲによってＬＴＩＩプラットフォームに操作されるであろう。ＤＮＡは検証のために配列決定される。以前にＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｂ中毒初代ニューロンを標的化し、ピアソン係数を測定するか、または細胞内ＳＮＡＲＥタンパク質の切断を測定することによって、治療用ＬＴＩＩａ誘導体の転位効率および中和能を評価する。非特異的効果のコントロールには、それぞれＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｂ中毒に対するＳＮＡＰ２５−ＬＴＩＩおよびＶＡＭＰ２−ＬＴＩＩの誘導体の滴定が含まれ、予想される結果は相同なＢｏＮＴ血清型療法によるＢｏＮＴチャレンジに対する保護であるが異種血清型療法ではない。ＬＴＩＩ成分のガングリオシド特異性は、ＬＴＩＩａ（Ｔ３４Ｉ）突然変異などのガングリオシド結合を欠く突然変異ＬＴＩＩ誘導体の有効性を試験することによって確立される。ＢｏＮＴ中毒後の治療投与の初期時間は、長期ＢｏＮＴ／Ａ中毒を検出するための初代ラット脊髄細胞を確立した当グループの最近の発表に基づいて、１時間から１ヶ月の範囲である。治療は、０．１ｎＭ〜４０ｎＭで力価測定され、初代ラット皮質ニューロンにおけるβｌａｃ−ＬＴＩＩキメラについて、カーゴの送達のための用量応答が観察され、ＳＮＡＰ２５の再生は、時間の経過とともにウェスタンブロッティングによってモニターされる。この定量化により、ＢｏＮＴ−ＬＴＩＩａ療法の転位効率を最適化するためのＬＴＩＩａ送達プラットフォームのその後の改変が可能になる。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂを中和するα−ＬＣインヒビターは〜４０ｋＤａであり、汎血清型ＢｏＮＴを開発する潜在的有用性を示しているが、最も複雑な汎血清型のＳＮＡＲＥ結合インヒビターのサイズは約３０ｋＤａであるＳＮＡＲＥ結合阻害剤を併用した治療法。実験は、酵素基質切断反応においてＬＣ活性を中和する有効性を確立し、治療に対する調整は、カーゴとプラットフォームとの間の距離を調整することを含む。
【００８９】
予想される結果
本発明者らは、治療用ＬＴＩＩキメラを操作することは容易であるが、発現および精製を最適化するには、培養条件および精製プロトコルの滴定が必要であると予想する。治療用ＬＴＩＩは、我々が設計し、暫定結果のセクションで説明した派生物に基づいて、効率的に組み換えるべきである。α−ＬＣラクダ−ＬＴＩＩａの有効性は、ＢｏＮＴ血清型特異的である必要がある。ＳＮＡＲＥ結合阻害剤療法の利点は、「新しい」ＢｏＮＴ血清型の発見に対処するためにＳＮＡＲＥ阻害剤を改変する能力である。Ｅ３ユビキチンリガーゼＦボックスの添加は、治療の中和有効性を増強し、より速い治療効率をもたらすはずである（図１３）。本発明者らは、このプラットフォームが免疫刺激性であることを証明するとは予想していない。
【００９０】
代替アプローチ
他のラクダ−ＬＴＩＩまたはＳＮＡＰ２５−ＶＡＭＰ２−ＬＴＩＩ誘導体がＢｏＮＴチャレンジに対して限定された防御力を有する場合、実験は酵素反応におけるＬＣ活性を中和する有効性を測定する限定されたＢｏＮＴ中和の基礎を確立する。これはまた、ＬＣを中和するのに必要な微分量の推定を可能にする。これらの実験は、ＬＣ中和プロセスにおける律速段階に関する情報を提供する。本発明者らは、Ａサブユニットに沿った代替部位にカーゴを挿入することにより、より効率的なタンパク質発現および／またはＡＢ５構造への組み込みをもたらすことができると予想している。タンパク質構造の保存のための構造ベースの予測を使用して、安定性またはアセンブリが操作されたカーゴＬＴキメラのいずれかを制限することが証明される場合、いくつかのカーゴ挿入部位が試験される。また、Ｄ４α−ＬＣ／Ａラクダは、中和能を有するＢ８−α−ＬＣ／Ａラクダ−ＬＴＩＩａと比較して試験される。この分析は、ラクダのＶＨＨｓの中和メカニズムの新しい情報を提供すべきである。ＦボックスＥ３ユビキチン化リガーゼの効果は、インビトロではなく細胞モデルにおいてのみ評価することができる。ＬＴＩＩａまたはカーゴが免疫刺激性を示す場合、免疫応答を刺激するエピトープは、治療薬としてのＥＴＡの使用を容易にするため、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＴＡ）の結合ドメイン内の免疫刺激性エピトープを同定および除去したＰａｓｔａｎおよび共同研究者によって示されたようにマッピングされるだろう。高親和性のＳＮＡＲＥ阻害剤がＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂに対する有力な治療法であると証明された場合、タンパク質モデリングは他のＢｏＮＴ血清型−ＳＮＡＲＥ基質の相互作用を予測し、ＳＮＡＲＥ阻害剤に変異を導入する。タンパク質療法は、トランスにおいて、有効性試験対融合タンパク質を試験するために添加してもよい。発見された新しい治療法をＬＴＩＩプラットフォームに組み込むことができる。
【００９１】
この実施例は、ＬＴプラットフォームによってニューロンに送達され得る最適な治療を同定し、各ＬＴ誘導体の生産のための最適な安定性および最適な効率を確立するのに役立つ。
【００９２】
［実施例５］
マウス−／＋トランスα−ＢｏＮＴ抗血清でのＢｏＮＴ療法の有効性の測定
細胞培養実験で同定された最も強力な中和α−ＢｏＮＴ  カーゴ−ＬＴＩＩ療法を、ＢｏＮＴ中毒のマウスモデルにおける治療法として試験する。この分析により、ＢｏＮＴ／Ａの標準的な調製物を用いた平均死亡時間曲線（ＡＴＴＤ）が確立される。ＩＶ法は、濃縮ＢｏＮＴ溶液で３０〜７０分で毒性データを得、ＩＰ法はより希釈したＢｏＮＴ溶液で３〜４日で完了する。本発明者らはまた、α−ＢｏＮＴ抗血清のトランス付加が補充物治療戦略としての毒素負荷を低下させるかどうかを決定するためにトランスに添加されるウサギ汎血清型特異的α−ＢｏＮＴ−ＨＣＲ（ＡＧ）抗血清（Ｃｏｖａｎｃｅによって産生される）を生成した。これは、細胞内の軽鎖の細胞内寿命に加えて、ＢｏＮＴ中毒の持続性を高める細胞外ＢｏＮＴの存在を示すであろう。
【００９３】
ボツリヌス中毒の平均死亡時間曲線（ＡＴＴＤ）モデルにおけるＢｏＮＴ療法の有効性の測定
細胞培養実験における最も強力な中和抗ＢｏＮＴ  ｃａｒｇｏ−ＬＴＩＩａは、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂチャレンジを用いて、ＢｏＮＴ中毒のマウスモデルにおける治療として試験される。この分析は、ＢｏＮＴ／Ａの標準的な調製物から確立された平均死亡時間曲線（ＡＴＴＤ）を確立することができる。ＩＶ法は、濃縮ＢｏＮＴ溶液で３０〜７０分で毒性データを得、ＩＰ法はより希釈したＢｏＮＴ溶液で３〜４日で完了する。最初に、ＢｏＮＴ療法はＢｏＮＴチャレンジ（１０ＬＤ50）で、その後ＢｏＮＴチャレンジ（チャレンジ後１時間から開始し、観察された結果データでこの時間を延長）に続いて投与される。最初の治療法は、接種量に対して４０ｎＭで投与され、最初のチャレンジ実験の結果に基づいて上下に滴定される。ＢｏＮＴ療法による検出された防御の後に、異種ＢｏＮＴ血清型を用いたチャレンジ実験が、先に説明したように「オフターゲット」効果を試験する。ＢｏＮＴ治療に対するホスト応答（炎症促進性免疫サイトカイン産生）および免疫原性（ＬＴＩＩａまたはカーゴに対する抗体の刺激）は、ＢｏＮＴ治療後２４および４８時間で血清を収集することによって決定する。
【００９４】
ＢｏＮＴ中毒の吸入および食品媒介モデルにおけるＢｏＮＴ療法の有効性の測定
上記で同定された最適なＢｏＮＴ療法は、マウスチャレンジ実験において、食品および吸入ボツリヌス中で評価する。これらチャレンジ実験では、ＢｏＮＴ複合体が最も兵器化された形態であるため、ＢｏＮＴ複合体を使用する、なぜならこれらの形態は安定性が増加し容易に製造できるからである。ＢｏＮＴ／Ａ複合体は、単離されたＢｏＮＴ／Ａよりも経口経路による毒性が著しく高いことが示されているが、吸入経路において毒素有効性の差は観察されていない。食物媒介性のボツリヌス中毒症では、マウスは、胃内胃管栄養法によって胃の中に直接送達された測定された量のＢｏＮＴにチャレンジする。吸入モデルでは、マウスに、イソフルランで軽く麻酔をし、頭部が直立したままの状態で、ＢｏＮＴ（このモデルは５０μｌまで耐える）を１つの鼻孔に入れ、先に説明したように排水を最小にするために吸引される。両手順は、バイオセーフティキャビネットで行われる。両方の投与経路で、４時間以内に死亡を引き起こす血清型ごとにＢｏＮＴ投与量が決定される（ＢｏＮＴ／Ａ  ５０ＬＤ５０単位、毒素２μｇ、ＩＰ注入後４時間以内に死亡する）。これはチャレンジ試験の開始用量となり、その後マウスが最初のチャレンジで生存する場合には１０倍に増加する。マウスは、チャレンジの１時間後にＢｏＮＴチャレンジと共に、またはＢｏＮＴチャレンジの後、ＢｏＮＴ中毒の２，３、および４時間後までＢｏＮＴ治療で治療される。
【００９５】
予想される結果
この実施例は、ボツリヌス中毒の平均死亡時間曲線（ＡＴＴＤ）モデル、次いで吸入ボツリヌス中毒および食中毒ボツリヌスムに対する保護のための最適化されたβ−ＢｏＮＴ療法の防御有効性を確立する。本発明者らは、ＢｏＮＴが末梢神経系に分布する血流に入った後に作用を発揮するため、ボツリヌス中毒の各モデルに対して、この治療法が高いレベルの保護を提供することを期待している。吸入ボツリヌス中毒のモデルとしてのＢｏＮＴの鼻腔内送達は以前から使用されてきたが、鼻腔内送達はエアロゾル曝露を完全に模倣するものではなく、毒性がより高くなる可能性がある。
【００９６】
代替アプローチ
経口または吸入ボツリヌス中毒を引き起こすのに必要なＢｏＮＴの濃度は、ＢｏＮＴ／Ａについてのみ詳細に記載されており、ＩＰまたはＩＶ注射よりも有意に低い。したがって、この研究では、他のＢｏＮＴ血清型に対応する濃度が確立される。経口強制飼養を用いて、ＢｏＮＴ／Ａと比較して有効性の低下が障害にならないように、十分に大きな容量を投与することができる。しかし、鼻腔内送達の場合、送達され得る最大量は５０μｌである。我々の毒素精製は、通常、濃度が０．２〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の高濃度の毒素につながるため、ＢｏＮＴ／Ａと比較して最大５０倍の有効性があるＢｏＮＴ送達には十分である。しかし、ＢｏＮＴ血清型が鼻腔内経路によってさほど強力でない場合、プロトコルは、チャレンジ用量を低下する、または反復用量の毒素を与えることによって調整する。
【００９７】
本発明は、前述の実施例に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に含まれるすべてのそのような改変および変形を包含する。
【図１】
2017534598.tif 000007
【図２】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６（１）】
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【図６（２）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年6月1日(2017.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって認められた許可ＡＩ１０１３１３、ＡＩ０５７１５３、およびＡＩ０９５２７４の下で政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月14日(2017.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017534598000001.app
【国際調査報告】
2017534598.tif 000021
2017534598.tif 000022