(57)【要約】ｍＴｏｒシグナル伝達経路の活性化により哺乳類の卵胞を刺激する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟卵母細胞の発育の促進方法であって、
成熟卵母細胞の発育を促進するのに十分な時間にわたって、機構的ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴｏｒ）経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質をインビボまたはインビトロで卵巣組織と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記成熟卵母細胞が排卵前卵胞内に含有されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記排卵前卵胞が二次卵胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記排卵前卵胞が胞状卵胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
卵巣組織内のリボソームＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）及びリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）のリン酸化の増加方法であって、
リボソームＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）及びリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）のリン酸化を増加させるのに十分な時間にわたって、機構的ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴｏｒ）経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質をインビボまたはインビトロで卵巣組織と接触させる工程を含む、方法。
【請求項６】
前記卵巣組織がインタクトな卵巣中にある、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させる工程がインビボで行われる、請求項１または５に記載の方法。
【請求項８】
前記接触させる工程がインビトロで行われる、請求項１または５に記載の方法。
【請求項９】
前記卵巣組織がインビトロ組織培養中にある、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１０】
前記卵巣組織がヒトのもの、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記卵巣組織がマウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、バッファロー、ヒツジ、ウマ、パンダ、チンパンジー及びゴリラからなる群から選択される哺乳類に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記作用物質がｍＴｏｒを直接活性化する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記作用物質がＭＨＹ１４８５、３ＢＤＯ及びＣＬ３１６，２４３からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記有効量が０．１μＭ〜約１ｍＭである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記卵巣組織を１時間〜４日間接触させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類卵胞の刺激方法であって、
哺乳類卵胞の成長及び発育を刺激するのに十分な投与量及び時間で、ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の少なくとも１種の作用物質を前記哺乳類卵胞と接触させる工程を含む、方法。
【請求項１７】
前記卵胞がインタクトな卵巣中に存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触させる工程がインビボで行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触させる工程がインビトロで行われる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記卵胞がヒト卵胞である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記作用物質がｍＴｏｒを直接活性化する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記作用物質がＭＨＹ１４８５、３ＢＤＯ及びＣＬ３１６，２４３から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記有効量が０．１μＭ〜約１ｍＭ以下である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記卵胞を１時間〜４日間接触させる、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触させる工程の後、卵成熟を誘発するのに有効な投与量及び時間で、前記卵胞をＦＳＨまたはその類似体と接触させる工程を行うことをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触させる工程の後、前記卵胞を採取する工程を行うことをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記活性化した卵胞のインビボレシピエントへの移植をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
着床後、前記レシピエントにＦＳＨまたはその類似体を投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記レシピエントが前記卵胞とオートロガスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
着床後、前記レシピエントにＬＨアゴニストを投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記接触させる工程が、有効量のＰＴＥＮインヒビター及びＰＩ３キナーゼアクティベーターのうち少なくとも一方を前記卵胞と接触させる工程をさらに含む、請求項１６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類の雌の不妊症を治療するための、ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する作用物質の医薬品の調製における使用。
【請求項３３】
前記雌の不妊症が、早期卵巣不全、閉経周辺期、ＦＳＨ低反応性、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣予備能低下、及び加齢性不妊症からなる群から選択される状態に起因する、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記哺乳類の雌がヒトである、請求項３２または３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記作用物質がｍＴｏｒを直接活性化する、請求項３２または３３に記載の使用。
【請求項３６】
前記作用物質がＭＨＹ１４８５、３ＢＤＯ及びＣＬ３１６，２４３から選択される、請求項３２または３３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府援助
本発明は、米国国立衛生研究所によって締結された契約第ＨＤ０６８１５８号の下、政府援助を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類生殖細胞の成長及び成熟は、下垂体前葉によって分泌されるゴナドトロピンをはじめとするホルモン、及び局所パラクリン因子によって複雑に制御されている。成人卵巣内の卵母細胞の大半は、長期の第一減数分裂前期に維持されており、周りを取り囲む卵胞体細胞によって覆われている。周期的に一群の原始卵胞が卵胞成長の段階に入る。この期間中、卵母細胞は体積が大きく増加し、かつ、卵胞顆粒膜細胞の数が増加する。成熟中の卵母細胞は卵胞細胞を増殖させるパラクリン因子を合成し、卵胞細胞は血管新生を亢進する成長分化因子を分泌して卵母細胞を成長させる。ある段階まで進行した後では、体細胞アポトーシスを防止する性腺刺激ホルモンにさらされない限り、卵母細胞及びその卵胞は死滅する。
【０００３】
哺乳類卵巣は、基本的な機能単位としての卵胞からなる。卵胞の総数は若年期に決定され、このプールの枯渇により生殖機能が老化する。各卵胞は発育して、排卵するか、または変性するかのいずれかとなる。個々の卵胞は、最も内側の卵母細胞、それを取り囲む顆粒膜細胞、及び卵胞膜細胞の外層からなる。各卵胞の運命は、内分泌因子及びパラクリン因子によって支配される。卵胞は、原始、一次、及び二次段階を経て発育した後、卵胞腔を獲得する。胞状段階では、思春期後に発生する周期的なゴナドトロピン刺激の下で少数の卵胞が排卵前段階に達し、生殖可能年齢の女性において卵巣エストロゲンの周期的分泌の主な供給源となる。各生殖周期中の排卵前ゴナドトロピンサージに反応して、主席グラーフ卵胞が排卵して受精のために成熟卵母細胞を放出する一方で、残りの卵胞膜及び顆粒膜細胞は変化して黄体になる。
【０００４】
いったん成長プールに入ると、卵胞は、損失を最小限に抑えて、一次、二次、及び初期胞状段階への進行を継続する。ＦＳＨ治療は、主に初期胞状卵胞のアポトーシスを抑制することにより、不妊患者において排卵前卵胞を作り出すために広く用いられている。しかし、患者の中にはＦＳＨ治療に対する反応性が低いものもいるが、これは、月経周期３日目の高い血清ＦＳＨレベル及び低いＡＭＨレベルに反映されるように、患者の卵巣が初期胞状卵胞をほとんど含有していないためである。
【０００５】
生殖寿命中にわたって、原始卵胞は最初にリクルートメントを経て一次卵胞の成長プールに入る。ヒト卵巣において、一次卵胞が二次卵胞段階に達するには１２０日超が必要であると推定されている一方で、二次段階から初期胞状段階まで成長するには７１日が必要であると推定されている。いったん成長プールへの進入が開始されると、卵胞は発育して胞状段階に達し、初期胞状段階までは最小限の卵胞損失しか確認されなかった。周期的なリクルートメントの間、循環ＦＳＨの増加により、一群の胞状卵胞はアポトーシス死を免れることができる。この一群の中で、主席卵胞が、高レベルのエストロゲン及び下垂体ＦＳＨ放出を抑制するインヒビンを分泌することにより、優勢となって出現する。その結果、残りの一群はネガティブセレクションされ、最終的には死滅する。同時に、局所成長因子及び脈管構造の増加により主席卵胞がポジティブセレクションされ、これにより、主席卵胞が最後まで成長して最終的に排卵及び黄体化されることが確実となる。周期的なリクルートメントの後で、胞状卵胞が主席グラーフ卵胞になるにはわずか２週間しかかからない。ヒト卵胞の原始段階から排卵前段階までの発育は全体で６ヶ月超を要する。
【０００６】
最小の原始及び一次卵胞から最大の排卵前卵胞まで卵胞が発育するには、段階に応じて異なる刺激因子及び生存因子が必要となる。卵胞を一次から二次、胞状、及び排卵前段階を経て効率的に成熟させる方法は、インビトロ及びインビボ卵胞成熟方法を含み、大きな関心を集めるものである。本発明はこの課題に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
卵胞を排卵前状態に成長させるのに十分な時間にわたって、ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質、特にｍＴｏｒを直接活性化する作用物質を卵胞に接触させることによって、哺乳類卵胞の排卵前段階への成長を刺激する組成物及び方法を提供する。接触は、卵巣を物理的に破壊することなく、すなわち卵巣がインタクトな状態で実施され得る。いくつかの実施形態において、エクスビボ培養において卵胞を作用物質と接触させる。他の実施形態では、インビボで卵胞を作用物質と接触させる。接触をインビボで行う場合、作用物質は卵巣、例えば早期卵巣不全に罹患している女性、多嚢胞性卵巣症候群に罹患している女性、中年の不妊女性の卵巣に対して局所的に投与され得る。有効量とは、卵胞を十分に成長させて排卵前段階に到達させることができる投与量である。
【０００８】
成熟卵母細胞の発育の促進方法であって、成熟卵母細胞の発育を促進するのに十分な時間にわたって、機構的ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴｏｒ）経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質をインビボまたはインビトロで、インタクトな卵巣を含むがこれに限定されない卵巣組織と接触させることを含む、方法を提供する。成熟卵母細胞は排卵前卵胞内で接触させることができる。排卵前卵胞は二次卵胞または胞状卵胞であり得る。卵巣組織はヒトのものであってもよく、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、バッファロー、ヒツジ、ウマ、パンダ、チンパンジー及びゴリラからなる群から選択される哺乳類のものであってもよい。
【０００９】
インタクトな卵巣を含むがこれに限定されない卵巣組織内のリボソームＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）及びリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）のリン酸化の増加方法であって、リボソームＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）及びリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化を増加させるのに十分な時間にわたって、機構的ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴｏｒ）経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質をインビボまたはインビトロで、卵巣組織と接触させることを含む、方法を提供する。卵巣組織はヒトのものであってもよく、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、バッファロー、ヒツジ、ウマ、パンダ、チンパンジー及びゴリラからなる群から選択される哺乳類のものであってもよい。
【００１０】
卵胞の排卵前状態への成長を促進し、成熟卵母細胞の発育を促進し、かつ／または卵巣組織内のリボソームＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）及びリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）のリン酸化を増加させる方法の対象となる作用物質には、ｍＴｏｒを直接活性化する作用物質が含まれる。この作用物質として、ＭＨＹ１４８５、３ＢＤＯ、及びＣＬ３１６，２４３のうちの１種以上が挙げられるが、これらに限定されない。投与量は０．１μＭ〜約１ｍＭであってよく、任意選択により１時間〜４日間の期間のものとされ得る。
【００１１】
本発明の方法は、接触させる工程の後に、卵成熟を誘発するのに有効な投与量及び時間で、卵胞をＦＳＨまたはその類似体と接触させる工程を行うことをさらに含み得る。本方法は、接触させる工程の後に、卵胞を採取する工程を行うことと、任意選択により、活性化した卵胞をインビボレシピエントに移植することと、をさらに含み得る。レシピエントは卵胞とオートロガスであり得る。任意選択により、着床後レシピエントにＬＨアゴニストが投与される。
【００１２】
本発明の方法は、ｍＴｏｒを直接活性化する作用物質とともに、有効量のＰＴＥＮインヒビター及びＰＩ３キナーゼアクティベーターのうち少なくとも一方を卵胞と接触させることをさらに含み得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、女性のヒトを含むがこれに限定されない哺乳類の雌の不妊症を治療するための、ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する作用物質の医薬品の調製における使用を提供する。雌の不妊症は、早期卵巣不全、閉経周辺期、ＦＳＨ低反応性、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣予備能低下、及び加齢性不妊症からなる群から選択される状態に起因し得る。作用物質は、ｍＴｏｒを直接活性化してもよく、作用物質として、ＭＨＹ１４８５、３ＢＤＯ、及びＣＬ３１６，２４３のうちの１種以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
機構的ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）は非定型セリン／スレオニンキナーゼであり、ｍＴＯＲシグナル伝達は細胞成長及び増殖の調節に重要である。ｍＴｏｒを活性化するための対象の作用物質としては、ＭＨＹ１４８５、３−ベンジル−５−（（２−ニトロフェノキシ）メチル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（３ＢＤＯ）、ＣＬ３１６，２４３などの小分子が挙げられるが、これに限定されない。
【００１５】
本発明の方法はさらに、卵胞の成長を活性化する追加の作用物質に卵胞を接触させる工程と組み合わせてもよく、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）インヒビター、及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）アクティベーターのうち少なくとも一方と卵胞を接触させることを含むが、これに限定されない。これにより相加または相乗効果がもたらされる。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態において、インビトロ、例えば器官または組織培養において曝露を実施するが、この場合、少なくとも１つの卵胞をｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質に曝露する。処理した卵胞は、インビトロ目的、例えば、体外受精、胚性幹細胞の生成などに利用してもよく、移植してインビボ用途を実現してもよい。対象となる移植様式としては、物理的に破壊されていない卵巣に存在する卵胞を含む１つ以上の卵胞を腎被膜、皮下部位、ファロピウス管近傍、卵巣部位に移植するものが挙げられるがこれに限定されず、例えば、一方の卵巣が保持され、もう一方の卵巣がエクスビボ処理のために取り出された場合、１つ以上の処理した卵胞は残っている卵巣の部位に移植することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、インビトロ処理の後に、卵巣移植を行い、排卵前卵母細胞の生成のために卵胞を活性化させる、その後に体外または体内受精を行ってもよい。
【００１８】
対象とする個体としては、絶滅危惧種、経済的に重要な動物、早期卵巣不全に罹患している女性、多嚢胞性卵巣症候群に罹患している女性、中年の不妊女性、ヒト胚性幹細胞及び原始生殖細胞に由来する卵胞などが挙げられる。他の実施形態では、インビボで局所的に、例えば卵巣内注入によって曝露を行うか、または個体に全身投与する。
【００１９】
ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質に個体を曝露した後、卵胞成長を開始させるのに有効な濃度の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）またはＦＳＨ類似体（組換えＦＳＨ、インビボ宿主動物における自然発生ＦＳＨ、ＦＳＨ類似体、例えば、ＦＳＨ−ＣＴＰ、ペグ化ＦＳＨなどが含まれる）で個体を処理してもよい。
【００２０】
卵胞が刺激されて排卵前段階になった場合、排卵を誘発する投与量の黄体形成ホルモン（ＬＨ）またはそのアゴニスト（特に、絨毛性ゴナドトロピン、例えば、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）などが挙げられる）で個体を処理してもよく。さらに、ｃ−ｋｉｔリガンド、ニューロトロフィン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４、ＢＭＰ７、白血病抑制因子、塩基性ＦＧＦ、ケラチノサイト成長因子などのうちの１種以上にインビボまたはインビトロで卵胞を曝露してもよい。
【００２１】
本発明の方法に従うｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質による刺激に有効な時間は、通常少なくとも約１時間かつ約５日以下であり、少なくとも約１２時間かつ約４日以下、例えば２、３、または４日であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ＭＨＹ１４８５で卵巣を処理することにより、ｍＴＯＲ経路タンパク質のリン酸化が増加し、インビトロでの二次卵胞発育が促進されたことを示す。Ａ）ＭＨＹ１４８５で卵巣を処理することによってｍＴＯＲならびにＳ６Ｋ１及びｒｐＳ６のリン酸化が増加した。イムノブロッティングの前に１０日齢マウス由来の卵巣をＭＨＹ１４８５で３時間処理した。
【図１Ｂ】Ｂ）卵巣重量の変化である。１０日齢マウス由来の一対の卵巣をＭＨＹ１４８５でインキュベートし、培地は培養の２日目に交換した。４日間のインキュベーションの最後に、卵巣を固定してから重量を測定し、その後、組織学的解析を行った。括弧内の数字は用いた卵巣の数を表す。
【図１Ｃ】Ｃ）卵巣組織像、バー：１００μｍである。
【図１Ｄ】Ｄ）卵胞動態である。
【図２Ａ】ＭＨＹ１４８５により卵巣を短期間で処理した後、同種移植を行うことによって、卵巣移植片において胞状段階への二次卵胞成長が促進されたことを示す。Ａ）移植片重量の変化である。１０日齢マウス由来の卵巣をＭＨＹ１４８５で２日間処理した後、ＦＳＨで５日間毎日処理した成体卵巣切除宿主に移植した。移植の最後に移植片重量を測定し、組織学的解析を行った。括弧内の数字は用いた移植片の数を示す。
【図２Ｂ】Ｂ）卵巣組織像、バー：１００μｍである。
【図２Ｃ】Ｃ）卵胞動態である。ＰＯ：排卵前。
【図３Ａ】ＭＨＹ１４８５での処理及びその後の移植により、成熟卵母細胞及び健康な子を得ることができた。Ａ）ｍＴＯＲアクティベーター処理後の卵母細胞の初期胚発育である。卵巣をＭＨＹ１４８５で２日間処理して活性化し、その後、宿主に５日間移植した。その後、宿主をｅＣＧ及びｈＣＧで処理した。ｈＣＧ注入の１２時間後に、成熟卵母細胞を得て精子で受精させた後４日間培養した。
【図３Ｂ】Ｂ）各胚段階に進行した卵母細胞の割合である。２５日齢のマウスの初期胚発育が対照の役割を果たした。
【図３Ｃ】Ｃ）いくつかの２細胞期胚を偽妊娠宿主に移植したところ、子が出生した。
【図４Ａ】卵胞成長に対するｍＴＯＲ活性化及びＡＫＴ刺激の相加効果を示す。Ａ）移植片重量の増加である。ＭＨＹ１４８５とともにまたはＭＨＹ１４８５なしで、１０日齢マウス由来の卵巣をＩＶＡ薬でインキュベートした。次に、ＦＳＨで５日間毎日処理した宿主に卵巣を移植し、その後、移植片の重量を測定した。
【図４Ｂ】Ｂ）卵巣組織像、バー：１００μｍである。
【図４Ｃ】Ｃ）卵胞動態である。ＰＯ：排卵前。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
哺乳類卵胞の成長及び成熟を調節する組成物及び方法を提供する。ｍＴｏｒを活性化する有効量の少なくとも１種の作用物質に卵胞を曝露することにより、卵胞成長及びその結果として生じる卵成熟を操作することができる。
【００２４】
本発明の方法によって、特に哺乳動物種をはじめとする様々な動物種における用途が見出される。動物モデル、特に小型哺乳類、例えば、ネズミ科、ウサギ目などが実験的研究の対象となる。他の動物種、例えばウマ、ウシ、動物園の希少な動物、例えばパンダ、大型ネコなどが体外受精の改良の恩恵を享受する。とりわけヒトが、体外受精の方法を含む、卵成熟促進の対象となる。本発明の方法による治療の対象となる個体としては、早期卵巣不全、閉経周辺期、ＦＳＨ低反応性、多嚢胞性卵巣症候群、加齢性不妊症に罹患している個体、すなわち４０歳を超える女性などが挙げられるが、これに限定されない。
【００２５】
本発明の実施形態は、多数種の哺乳類の卵胞を含むことができる。本発明は、本特許出願内で具体例として言及した哺乳類の種に限定されるものではないと理解されるべきである。本発明の実施形態は例えば、食肉または乳製品としての商業的価値を有する動物、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、バッファローなどの新鮮なまたは凍結融解した卵胞を含み得る（当然、食肉または乳製品に用いられる哺乳類は文化によって異なり得る）。また、これには、希少なまたは稀な特質（複数可）、例えば重量、サイズ、もしくは構造を含む形態的特徴、または他の所望の特徴、例えば速度、敏捷性、知性などを有する個体に由来する卵胞も含まれ得る。これには、死亡したドナー、または希少なもしくは外来種の哺乳類、例えば、動物標本もしくは絶滅危惧種などに由来する卵胞が含まれ得る。本発明の実施形態は、霊長類（チンパンジー、ゴリラなどが挙げられるがこれらに限定されない）から収集した新鮮なまたは凍結融解した卵胞を含んでもよく、また、海洋哺乳類、例えばクジラまたはイルカなどに由来する卵胞も含み得る。
【００２６】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、特定の実施形態の変形がなされてもよく、それもまた添付の特許請求の範囲内に属するため、以下に記載する本発明の特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。また、用いる用語は、特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって設定される。
【００２７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段文脈により明示されない限り、複数形の言及を含む。別段の定義されない限り、本明細書において用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２８】
卵胞：卵胞は、雌の生殖生物学的な基本単位であり、卵巣内に見出されるほぼ楕円形の細胞集合体で構成される。１つの卵胞は単一の卵母細胞を含む。卵胞は周期的に成長及び発育を開始し、最終的には、通常は単一のコンピテントな卵母細胞が排卵される。卵胞の細胞は、卵母細胞、顆粒膜細胞、ならびに内卵胞膜層及び外卵胞膜層の細胞である。卵胞内の卵母細胞は一次卵母細胞の段階にある。こうした卵母細胞の核は卵核胞と呼ばれる。卵胞内の顆粒膜細胞は卵母細胞を取り囲んでおり、その数はゴナドトロピンに反応して増加する。顆粒膜細胞はまた、卵巣ホルモン合成の調節に関与するペプチドを産生する。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、顆粒膜細胞に作用して細胞表面上に黄体形成ホルモン（ＬＨ）受容体を発現する。顆粒膜細胞は一方で、細胞外マトリックスの薄層、すなわち卵胞基底膜または基底板に囲まれている。基底板の外側では内卵胞膜及び外卵胞膜の層が見出される。
【００２９】
卵巣の体外培養：哺乳類の卵巣またはその断片を培養する方法は当該技術分野において公知であり、本発明の目的のための断片は少なくとも１つの卵胞を含む。典型的には、卵巣の全部または一部を組織培養培地に入れるが、この培地は卵胞細胞の成長または維持に有用な因子を含んでもよく、また、本明細書に記載するように、ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の少なくとも１種の作用物質をさらに含んでもよい。本明細書に記載の実施例を参照されたい。とりわけ、Ｈｏｙｅｒら（２００７）Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ｄｅｖ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．８０（２）：１１３−２５に、さらなる説明を見出すことができる（各参照文献は、参照によって本明細書に明確に援用する）。Ｌｕｖｏｎｉら（２００５）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．；６３（１）：４１−５９では、イヌ卵巣の体外培養について説明している。Ｈａｎｓｅｌ（２００３）Ａｎｉｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｓｃｉ．；７９（３−４）：１９１−２０１では、ウシ卵胞の培養について説明している。
【００３０】
Ｄｅｖｉｎｅら（２００２）  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．７：ｄ１９７９−８９、及びＳｍｉｔｚら（２００２）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．１２３（２）：１８５−２０２に、卵巣組織及び器官の体外培養についての総説が見出され得る。胎児または新生児げっ歯類の完全な卵巣はすでに器官培養系においてインキュベートされている。この技術の応用には、培地で連続的に灌流されているチャンバー内での卵巣のインキュベーション、またはインタクトな脈管構造を介した培地の灌流が含まれる。別のアプローチは、酵素的または機械的解離によって単離された個々の卵胞を培養することである。Ｈｏｖａｔｔａ  （２０００）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １６９（１−２）：９５−７では、ヒトの原始及び一次卵胞の凍結保存について説明している。
【００３１】
卵巣移植：腎臓への卵巣移植は動物試験において十分に確立された手法である。卵巣皮質組織の自家移植は、ヒトにおいて、特に女性が不妊を引き起こす癌治療または手術を受けている状況において広く報告されている。卵巣組織は新鮮なものを移植してもよく、または凍結保存後に移植してもよい。総説としては、Ｇｒｙｎｂｅｒｇら  （２０１２）  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．  ９７（６）：１２６０−８を参照されたい。これは参照により本明細書に明確に援用される。
【００３２】
Ｍｔｏｒ：機構的ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）は非定型セリン／スレオニンキナーゼである。遺伝子配列はＧｅｎｂａｎｋにてアクセスすることができ、ヒト配列はＮＭ  ００４９５８．３、タンパク質はＮＰ  ００４９４９．１で表される。ｍＴｏｒは２つの異なる複合体で存在することができる。ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）はｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、ＧβＬ（ｍＬＳＴ８）、及びＤｅｐｔｏｒで構成され、ラパマイシンによって部分的に阻害される。ｍＴＯＲＣ１は、成長因子、栄養、またはエネルギーの利用可能性を反映する複数のシグナルを統合して、条件が好ましい場合には細胞成長を促進するか、またはストレス下ではもしくは条件が好ましくない場合には異化プロセスを促進する。成長因子及びホルモン（例えばインスリン）がＡｋｔを介してｍＴＯＲＣ１にシグナル伝達するが、これによってＴＳＣ２を不活性化させてｍＴＯＲＣ１の阻害を防止する。代替として、ＡＴＰレベルが低いと、ＴＳＣ２がＡＭＰＫ依存的に活性化され、かつＲａｐｔｏｒがリン酸化されて、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達が減少する。アミノ酸利用可能性について、Ｒａｇ及びＲａｇｕｌａｔｏｒ（ＬＡＭＴＯＲ１−３）タンパク質が関与する経路を介してｍＴＯＲＣ１にシグナル伝達される。活性化ｍＴＯＲＣ１は、下流標的（４Ｅ−ＢＰ１及びｐ７０  Ｓ６キナーゼ）のリン酸化によるｍＲＮＡの翻訳、オートファジーの抑制（Ａｔｇ１３、ＵＬＫ１）、リボソーム生合成、及び転写の活性化をはじめとする、下流の複数の生物学的影響を及ぼし、ミトコンドリア代謝または脂質生成をもたらす。ｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）は、ｍＴＯＲ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＧβＬ、Ｓｉｎ１、ＰＲＲ５／Ｐｒｏｔｏｒ−１、及びＤｅｐｔｏｒで構成され、Ａｋｔを活性化することによって細胞生存を促進する。ｍＴＯＲＣ２はまた、ＰＫＣαを活性化することによって細胞骨格ダイナミクスを制御し、ＳＧＫ１リン酸化によりイオン輸送及び成長を制御する。癌、心血管疾患、及び代謝障害を含む多くの病状にはｍＴｏｒシグナル伝達異常が関与している。
【００３３】
ＭＴｏｒシグナル伝達を活性化する作用物質：成長因子及びホルモン、例えばインスリンなどに加えて、複数の小分子ｍＴｏｒアクティベーターが当該技術分野において公知でありかつ用いられており、これには、３−ベンジル−５−（（２−ニトロフェノキシ）メチル）−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（３ＢＤＯ）（Ｇｅら（２０１４）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  １０（６）：９５７−７１を参照）、４，６−ジ−４−モルホリニル−Ｎ−（４−ニトロフェニル）−１，３，５−トリアジン−２−アミン（ＭＨＹ１４８５）（Ｃｈｏｉら（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：８  ｓｐｅｃｉａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｐ１を参照）、５−［（２Ｒ）−２−［［（２Ｒ）−２−（３−クロロフェニル）−２−ヒドロキシエチル］アミノ］プロピル］−１，３−ベンゾジオキソール−２，２−ジカルボン酸（ＣＬ３１６，２４３）（Ｍｉｎｉａｃｉら（２０１３）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．２０１３  Ａｐｒ；４６５（４）：５０９−１６を参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
体外培養でのＭＨＹ１４８５の有効濃度は、約０．１μＭ〜約１μＭ、約１０μＭ、約５０μＭ、及び約１ｍＭ以下であり得る。インビボ用途では、個体及び投与方法に応じて投与量は異なり得るが、例えば、標的組織において濃度がより高くなるように作用物質を局在化させることが望ましい場合もある。他の作用物質の有効濃度は、ＭＨＹ１４８５に対する相対強度の決定に基づいていてもよく、または実験的に決定してもよい。
【００３５】
ＦＳＨ：卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、下垂体前葉の性腺刺激ホルモン産生細胞によって合成及び分泌されるホルモンである。ＦＳＨは、人体の発育、成長、思春期の成熟、及び生殖過程を調節する。ＦＳＨ及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）は生殖において相乗的に作用する。雌においては、卵巣でＦＳＨが未成熟卵胞の成長を刺激して成熟させる。卵胞は成長するにつれてインヒビンを分泌し、これによりＦＳＨ産生が停止する。
【００３６】
ＦＳＨは二量体糖タンパク質である。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、及びｈＣＧのαサブユニットは同一であり、９２アミノ酸を含有する。ＦＳＨは１１８アミノ酸のβサブユニット（ＦＳＨＢ）を有しており、これが特有の生物学的作用を付与し、ＦＳＨ受容体との相互作用を担う。天然ＦＳＨの半減期は３〜４時間である。その分子量は３００００である。
【００３７】
種々のＦＳＨ製剤が臨床用途に利用可能である。この製剤は、卵胞発育を刺激する不妊治療、特にＩＶＦ治療及び子宮内人工授精（ＩＵＩ）において一般的に用いられる。ＦＳＨは、ＬＨと混合させてＰｅｒｇｏｎａｌまたはＭｅｎｏｐｕｒの形態、及び尿中ゴナドトロピンの他のさらに精製された形態で、ならびに組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ）、及びＦｏｌｌｉｓｔｉｍ  ＡＱ、Ｇｏｎａｌ−Ｆ、Ｇｏｎａｌ−ｆ  ＲＦＦ、Ｇｏｎａｌ−ｆ  ＲＦＦ  Ｐｅｎとしての純粋な形態で使用可能である。
【００３８】
ＦＳＨの類似体も臨床的に有用であり、この類似体としては、例えば、天然型から１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸が変更されたすべての生物学的に活性な変異型、ＰＥＧ化ＦＳＨ、単鎖二機能性変異体、ＦＳＨ−ＣＴＰなどが挙げられる。卵巣の反応性を向上させる試みにおいて、ＦＳＨβサブユニットにヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）部分が結合したＦＳＨ−ＣＴＰ（コリフォリトロピンアルファ）、及び単鎖二機能性ＶＥＧＦ−ＦＳＨ−ＣＴＰ（ＶＦＣ）類似体を含むいくつかの長時間作用型ＦＳＨ治療が開発されてきた。ＦＳＨ−ＣＴＰはより長いインビボ半減期を有し、例えば１〜４週間の投与間隔で投与され得る。例えば、Ｌａｐｏｌｔら（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３１：２５１４−２５２０、及びＤｅｖｒｏｅｙら（２００４）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．５  ２０６２−２０７０を参照されたい。これらはそれぞれ、参照により本明細書に明確に援用される。
【００３９】
ＬＨ及びアゴニスト：ＬＨはヘテロ二量体糖タンパク質である。その構造は、他の糖タンパク質ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の構造と類似する。このタンパク質二量体は、α及びβサブユニットと称される非共有結合的に会合した２つの糖ペプチドサブユニットを含有する。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、及びｈＣＧのαサブユニットは同一であり、ヒトでは９２アミノ酸を含有するが、他の脊椎動物種のほぼすべてでは９６アミノ酸を含有する。βサブユニットは様々である。ＬＨは、特有の生物学的作用を付与してＬＨ受容体との相互作用の特異性を担う１２０アミノ酸のβサブユニット（ＬＨＢ）を有する。このβサブユニットはｈＣＧのβサブユニットとの相同性が高く、どちらも同じ受容体を刺激する。ＬＨは、ＦＳＨと混合させてＰｅｒｇｏｎａｌの形態、及び尿中ゴナドトロピンの他の形態で使用可能である。組換えＬＨはルトロピンアルファ（Ｌｕｖｅｒｉｓ）として入手可能である。これらの医薬品はすべて非経口投与される。
【００４０】
ｈＣＧ薬は、ＬＨと同じ受容体を活性化するが、ＬＨよりも安価であり、かつより長い半減期を有するため、ＬＨの代替品として用いられることが多い。ヒト絨毛性ゴナドトロピンは２４４アミノ酸の糖タンパク質である。ｈＣＧゴナドトロピンのβサブユニットは１４５アミノ酸を含有する。他のゴナドトロピンと同様に、ｈＣＧは尿から抽出するか、または遺伝子組換えによるものとすることができる。Ｐｒｅｇｎｙｌ、Ｆｏｌｌｕｔｅｉｎ、Ｐｒｏｆａｓｉ、Ｃｈｏｒａｇｏｎ、及びＮｏｖａｒｅｌは、前者の方法を用いき、妊婦の尿に由来する。Ｏｖｉｄｒｅｌは組換えＤＮＡによる産生物である。代替品としてのウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）は妊馬の絨毛膜で産生される性腺刺激ホルモンである。
【００４１】
ＰＴＥＮインヒビター：ポリペプチドＰＴＥＮ（テンシン相同性を有するホスファターゼ）は、多くの癌において高い頻度で変異している腫瘍抑制因子として同定された。この遺伝子によってコードされるタンパク質はホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸３−ホスファターゼである。これは、テンシン様ドメイン及び二重特異性タンパク質チロシンホスファターゼのものに類似した触媒ドメインを含有する。ほとんどのタンパク質チロシンホスファターゼとは異なり、このタンパク質はホスホイノシチド基質を優先的に脱リン酸化する。これは、ＡＫＴ／ＰＫＢシグナル伝達経路を負に制御することにより、細胞におけるホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸の細胞内レベルを負に制御して腫瘍抑制因子として機能する。ヒトタンパク質の遺伝子配列は、Ｖｏｌｉｎｉａら（２００８）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（１０），Ｅ３３８０、Ｌｉら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（１１），２１２４−２１２９、Ｓｔｅｃｋら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５（４），３５６−３６２、及びＬｉら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５（５３０８），１９４３−１９４７（それぞれ参照により本明細書に明確に援用する）で説明されているように、Ｇｅｎｂａｎｋにて寄託番号ＮＭ＿０００３１４に見出され得る。対象となるＰＴＥＮインヒビターは約０．１ｎＭ〜約１００μＭのＩＣ５０を有し得るが、これは、約１ｎｍ〜約１０μＭ、約１０ｎＭ〜約１μＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭであってもよい。
【００４２】
複数の公知のＰＴＥＮインヒビターが当技術分野において知られており、限定はしないが、ビスパーオキソバナジウム化合物（例えばＳｃｈｍｉｄら（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５６６（１−３）：３５−８を参照）が挙げられる。ＩＣ５０＝１８ｎＭでＰＴＥＮを阻害するビスパーオキソ（ビピリジン）オキソバナジン（Ｖ）酸カリウム、ＩＣ５０＝１４ｎＭでＰＴＥＮを阻害するビスパーオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナジン（Ｖ）酸二カリウム、ＩＣ５０＝３８ｎＭでＰＴＥＮを阻害するビスパーオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナジン（Ｖ）酸カリウム、ＩＣ５０＝３１ｎＭでＰＴＥＮを阻害するビスパーオキソ（ピコリナト）オキソバナジン（Ｖ）酸二カリウム、ＣＤＣ２５ホスファターゼファミリーを阻害するＮ−（２−ヒドロキシ−３−メトキシ−５−ジメチルアミノ）ベンジル、Ｎ′−（２−（４−ニトロフェネチル））、Ｎ″−メチルアミン、競合性ＰＴＰインヒビターであるデホスタチン、ＰＴＰインヒビターであるモノパーオキソ（ピコリナト）オキソバナジン（Ｖ）酸塩（ＩＣ５０＝１８μＭ）、及びホスファターゼの広域スペクトルインヒビターであるオルトバナジン酸ナトリウムが含まれる。
【００４３】
追加のＰＴＥＮインヒビターは、とりわけＭｙｅｒｓら（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：１３５１３−１３５１８、Ｇａｒｌｉｃｈら，ＷＯ／２００５／０９７１１９、及びＲｏｓｉｖａｔｚら（２００７）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１，７８０−７９０で説明されている。
【００４４】
代替として、ＰＴＥＮのインヒビターは、ホスファターゼ活性を有することが知られるＰＴＥＮの酵素活性を阻害する作用物質、例えば、ポリヌクレオチド、抗体、小分子などに対する化合物スクリーニングによって同定され得る。化合物スクリーニングは、インビトロモデル、遺伝子組換え細胞もしくは動物、または精製ＰＴＥＮ１タンパク質を用いて行われ得る。結合するまたはホスファターゼ活性を阻害するリガンドまたは基質を同定することができる。電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合に対するイムノアッセイなどをはじめとする様々なアッセイをこの目的に用いてもよい。候補作用物質は、合成または天然化合物のライブラリーをはじめとする様々な供給元から入手される。例えば、ランダム化したオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現をはじめとする、様々な有機化合物及び生体分子のランダム及び指向性合成には多数の手段が利用可能である。代替として、細菌、真菌、植物、及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが入手可能であるか、または容易に製造される。さらに、天然のまたは合成的に生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的、及び生化学的手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを製造するのに用いられ得る。公知の薬理学的作用物質に対して指向性またはランダム化学的修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などを行って、構造類似体を生成してもよい。様々な他の試薬をスクリーニングアッセイ中に含めてもよい。これには、最適なタンパク質−タンパク質結合を助長する、かつ／または非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を低減するために用いられる塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などのような試薬が含まれる。アッセイの効率を向上させる試薬、例えばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などを用いてもよい。構成成分の混合物は、必要な結合が得られる任意の順序で添加される。任意の好適な温度、典型的には４〜４０℃でインキュベーションが行われる。インキュベーション時間は活性が最適なものとなるように選択されるが、迅速な高スループットスクリーニングが容易に行われるように最適化されてもよい。典型的には０．１〜１時間で十分である。
【００４５】
ＰＩ３Ｋアクティベーター：ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼまたはＰＩ３Ｋ）は、細胞成長、増殖、分化、運動、生存、及び細胞内輸送などの細胞機能に関与する酵素ファミリーであり、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）のイノシトール環の３位ヒドロキシル基をリン酸化することができる。
【００４６】
クラスＩのＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩ（３）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール（３，４）−二リン酸（ＰＩ（３，４）Ｐ２）及びホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン酸（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）の生成を担う。ＰＩ３ＫはＧタンパク質共役型受容体及びチロシンキナーゼ受容体によって活性化される。
【００４７】
クラスＩのＰＩ３Ｋは、調節サブユニット及び触媒サブユニットで構成されるヘテロ二量体分子であり、配列類似性からＩＡ及びＩＢの部分集合にさらに分類される。クラスＩのＰＩ３−キナーゼは、ｐ１１０として知られる触媒サブユニット及びｐ８５またはｐ１０１のいずれかに関連する調節サブユニットで構成される。ｐ８５サブユニットはＳＨ２及びＳＨ３ドメインを含有する。
【００４８】
ＰＩ３Ｋのアクティベーターはこの酵素の活性を増加させる。対象となるアクティベーターとしては、限定はしないが、細胞透過性ホスホペプチド（７４０Ｙ−Ｐ）が挙げられ、これはＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットのＳＨ２ドメインに結合して酵素活性を刺激することができる（市販のペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＳＤＧＧＹＭＤＭＳ、修飾：Ｔｙｒ−２５＝ｐＴｙｒ）。他のアクティベーターとしてはｆＭＬＰが挙げられる（Ｉｎｏｕｅ  Ｔ，Ｍｅｙｅｒ  Ｔ（２００８）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＰＩ３Ｋ  ａｎｄ  Ｒａｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａｎ  ＡＮＤ−Ｇａｔｅ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（８）：ｅ３０６８を参照。また、Ｂａｓｔｉａｎら，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；４（６）．Ｊｕｎｅ  ２００６；ＰａｒｋらＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２６５，Ｉｓｓｕｅ  ３，３０  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００９，Ｐａｇｅｓ  ８０−８６も参照。これらを参照により本明細書に援用する）。
【００４９】
治療の候補：生卵胞を保有する任意の女性のヒト被検者が本発明の方法を用いた治療の候補である。典型的には、被検者は早期卵巣不全をはじめとする何らかの形態の不妊症に罹患していることになる。例えば、被検者は、正常な卵母細胞を産生するが、例えば、ＰＣＯＳまたはＰＣＯＳ様卵巣の場合のように受精に関して障害を有する場合もある。本発明の方法は、卵巣刺激プロトコールを伴う従来の体外受精技術では好適な候補とならない女性において特に有用であり得る。従来のＦＳＨ治療に対する反応性の低い患者が含まれる。
【００５０】
上記のように、本発明の方法は、様々な非ヒト動物、通常は哺乳類、例えばウマ、イヌ、ウシなどにおける不妊治療にも有用である。
【００５１】
早期卵巣不全（ＰＯＦ）は１％の女性に発症する。ＰＯＦの公知の原因には、Ｘ染色体または常染色体に関連する遺伝性異常、及び自己免疫性卵巣障害が含まれる。現在のところ、ＰＯＦ患者の不妊治療に対する実証された唯一の手段は、提供された卵母細胞での受胎補助を伴う。癌治療を受けている女性の場合のように、卵巣不全が予測可能な場合には、胚凍結保存、卵巣凍結保存、及び卵母細胞凍結保存が期待されるが、他の選択肢はほとんど存在しない。ＰＯＦの病因の異質性に起因して、患者の卵巣内になおも存在して活性化する残存原始卵胞の量は様々である。
【００５２】
卵胞消耗の程度はＰＯＦ患者間で様々である。初期卵胞の排卵前段階までの発育を促進する本発明の方法を使用して、ＰＯＦ患者の残存卵胞を活性化させることができる。この後、ＩＶＦのために成熟卵母細胞を取り出し、受精卵移植して妊娠させる場合もある。
【００５３】
現代社会では出産年齢が上昇しているため、加齢とともに卵巣予備能が低下する結果、多くの女性、例えば約４０〜４５歳の不妊女性が不妊症を経験している。初期胞状卵胞を排卵前段階まで発育させるのを促進するためにゴナドトロピン治療が広く用いられているが、多くの閉経周辺期の患者はゴナドトロピン療法に反応を示さない。こうした女性は、依然として様々な数の原始卵胞を有しているため、本発明の方法の恩恵を享受する。
【００５４】
多嚢胞性卵巣症候群は、軽度肥満、不規則な月経または無月経、及びアンドロゲン過剰の徴候（例えば多毛、にきび）を特徴とする臨床的症候群である。ほとんどの患者が卵巣に多数の嚢胞を含有する。診断は、妊娠試験、ホルモン測定、及び男性化腫瘍を除外するための画像診断によって行われる。治療は対症療法である。多嚢胞性卵巣症候群は、５〜１０％の女性に発症し、不明確な病因による無排卵または排卵機能不全及びアンドロゲン過剰を伴う。多嚢胞性卵巣症候群は一般に、卵巣嚢胞の存在によってではなく臨床的症候群として定義される。卵巣は平滑で肥厚した被膜とともに拡大している場合もあり、通常のサイズのものである場合もある。典型的には、卵巣は、閉鎖細胞が中に含まれる２〜６ｍｍの多数の卵胞嚢胞、場合によってはより大きな嚢胞を含有する。エストロゲンレベルが上昇すると、子宮内膜増殖症、及び最終的には子宮体癌のリスクが増加する。アンドロゲンレベルが上昇することが多いと、代謝症候群のリスクが増加して男性型多毛症の原因となる。長期にかけて、アンドロゲン過剰は、高血圧をはじめとする心血管障害のリスクを増加させる。
【００５５】
卵成熟の促進方法
胞状及び排卵前卵胞までの発育を刺激するのに十分な時間にわたって、ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質、特にｍＴｏｒを直接活性化する作用物質を卵胞に接触させることによって、インビトロ及びインビボで哺乳類卵胞の発育を促進する方法を提供する。任意選択により、ＰＴＥＮのインヒビター及びＰＩ３Ｋのアクティベーターの一方または両方も、卵胞の成長開始を相加的に誘発するのに有効な濃度で卵胞に接触させる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態において、インビトロ、例えば器官または組織培養において曝露を実施し、この場合、少なくとも１つの卵胞をｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質に一時的に曝露する。いくつかの実施形態において、インタクトな卵巣をこのようにして処理する。
【００５７】
処理した卵胞は、インビトロ目的、例えば、体外受精、胚性幹細胞の生成などに利用してもよく、または移植してインビボ用途を実現してもよい。対象となる移植様式としては、卵巣のすべてまたは断片を含む１つ以上の卵胞を、腎被膜、ファロピウス管、皮下部位、卵巣部位に移植するものが挙げられるがこれに限定されず、例えば、一方の卵巣が保持され、もう一方の卵巣がエクスビボ処理のために取り出された場合、１つ以上の処理した卵胞は残っている卵巣の部位に移植され得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、インビトロ方法では、ｍＴｏｒ経路活性化の処理と卵巣の切断とを組み合わせ、さらにホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）インヒビター、及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）アクティベーターのうち少なくとも一方と卵胞を接触させる。これにより、卵胞の成長及び分化を刺激する相加効果が得られる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、インビトロ処理の後で卵巣移植を行い、その後に体外または体内受精を行ってもよい。
【００６０】
ＭＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を阻害する作用物質、または阻害されたＭＴｏｒシグナル伝達の下流で作用する作用物質の少なくとも一方の有効量に曝露した後、卵胞成長を開始させるのに有効な濃度の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）またはＦＳＨ類似体（組換えＦＳＨ、インビボ宿主動物における自然発生ＦＳＨ、ＦＳＨ類似体、例えば、ＦＳＨ−ＣＴＰ、ペグ化ＦＳＨなどが含まれる）で個体を処理してもよい。
【００６１】
卵胞が刺激されて胞状段階になった場合、排卵を誘発する投与量の黄体形成ホルモン（ＬＨ）またはそのアゴニストで個体を処理してもよく、そのアゴニストとしては特に、絨毛性ゴナドトロピン、例えば、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）などが挙げられる。さらに、ｃ−ｋｉｔリガンド、ニューロトロフィン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４、ＢＭＰ７、白血病抑制因子、塩基性ＦＧＦ、ケラチノサイト成長因子などのうちの１種以上にインビボまたはインビトロで卵胞を曝露してもよい。
【００６２】
ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する作用物質の投与量は、上記のように前胞状卵胞を刺激して胞状卵胞への発育を誘発するのに十分な量であり、そのため、用いられる具体的な作用物質、培養において作用物質が供給される時間の長さ、卵胞の状態などによって異なる。濃度を実験的に決定するためには当該技術分野において公知の方法が用いられ得る。有効成分の毒性及び治療有効性は、細胞培養及び／または実験動物における標準的な薬学的手法に従って決定することができ、これには、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療有効性のある投与量）の決定が含まれる。毒性と治療効果との間の投与量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【００６３】
一例として、少なくとも約１時間〜約２４時間の一時的な時間、先に示した濃度のｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する作用物質と卵胞培養物を接触させ得るが、この時間は約６〜約１２時間であってもよい。濃度は作用物質（複数可）の効力を反映するように調節してよい。
【００６４】
卵胞成熟の後、卵胞内に存在する卵母細胞をインビトロ目的に利用してもよい。いくつかの実施形態では、卵母細胞を直接用い、また、他の実施形態では卵成熟を調節する１種以上の因子と卵胞を接触させるが、例えば、インビトロで卵成熟を誘発するのに十分な濃度のＦＳＨまたはＦＳＨ類似体と培養物を接触させてもよく、この場合、ＦＳＨまたはＦＳＨ類似体は、組換え、修飾、天然のものなどであり得る。インビトロ成熟後、卵母細胞は、移植のために体外受精させてもよく、幹細胞株の生成のために体外受精させてもよく、様々な研究目的などのために受精させずに利用してもよい。
【００６５】
ｃ−ｋｉｔリガンド（Ｈｕｔｔら，２００６、Ｐａｒｒｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎｎｅｒ，１９９９）、ニューロトロフィン（Ｏｊｅｄａら，２０００）、血管内皮増殖因子（Ｒｏｂｅｒｔｓら，２００７）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４（Ｔａｎｗａｒら，２００８）、ＢＭＰ７（Ｌｅｅら，２００１）、白血病抑制因子（Ｎｉｌｓｓｏｎら，２００２）、塩基性ＦＧＦ（Ｎｉｌｓｓｏｎら，２００１）、ケラチノサイト成長因子（Ｋｅｚｅｌｅら，２００５）などのうち１種以上の存在下で卵胞をさらに培養してもよく、この場合、これらの因子（複数可）は、ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する作用物質とともに添加してもよい。例えば、ＦＳＨによる卵成熟の後に、ｅＣＧ及び／またはＨＣＧをはじめとするＬＨアゴニストを投与してもよい。
【００６６】
他の実施形態において、卵胞は成熟のために動物レシピエントに移植され得る。上記のように、卵巣部位、腎臓部位、皮下部位などにおける卵巣またはその断片の移植方法が当該技術分野において公知である。卵巣組織を卵巣に移植する場合、追加のインビトロ操作を行わずとも受精は進行し得る。卵巣組織を卵巣以外の部位、例えば、皮下部位に移植する場合では、その後、体外受精のために卵母細胞が取り出され得る。レシピエントは、卵母細胞の成熟のために内在性ＦＳＨを供給し得るか、または組換え、長時間作用型ＦＳＨ−ＣＴＰなどをはじめとする外来性ＦＳＨもしくはＦＳＨ類似体をこの目的のために供給され得る。
【００６７】
他の実施形態において、インビボで曝露を行い、卵巣に局所投与するか、または個体に全身投与する。ヒトに対してある範囲の投与量を処方する際に細胞培養及び／または動物試験から得られたデータを用いることができる。有効成分の投与量は、典型的にはＥＤ５０を含み毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内である。用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、投与量はこの範囲内で変化し得る。少なくとも約６時間、通常は少なくとも約１２時間、有効濃度のものを個体と接触させるが、この時間は、少なくとも約１日、かつ約１週間以内であってよく、通常は約３日以内となり得る。
【００６８】
組成物はまた、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される非毒性の担体である希釈剤も含むことができ、この希釈剤は、動物またはヒトに投与するための医薬組成物を製剤化するために一般に用いられる賦形剤として定義される。希釈剤は配合物の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例として、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー液、ブドウ糖液、及びハンクス液が挙げられる。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤、添加剤などを含むことができる。組成物はまた、生理的条件に近づけるための追加の物質、例えばｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、ならびに界面活性剤なども含むことができる。
【００６９】
組成物はまた、様々な安定化剤のいずれか、例えば抗酸化剤なども含むことができる。医薬組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボ安定性を向上させるか、またはさもなければ薬理学的特性を向上させる（例えば、ポリペプチドの半減期を延長する、毒性を低下させる、溶解性または吸収性を向上させる）様々な公知の化合物との複合体とすることができる。そのような修飾または複合体形成剤の例として、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩が挙げられる。組成物のポリペプチドはまた、インビボ特質を向上させる分子との複合体とすることもできる。そのような分子としては、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質が挙げられる。
【００７０】
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に、様々な種類の投与に好適な製剤に関するさらなる教示を見出すことができる。薬物送達方法の簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照されたい。
【００７１】
ｍＴｏｒ経路におけるシグナル伝達を活性化する有効量の作用物質は、様々な異なる方法で投与することができる。例としては、経口、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮下、経皮、卵巣内の方法による組成物の投与が挙げられる。薬剤の投薬形態に関して、化合物は、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよく、または単独で、もしくは適切な会合で、かつ他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて用いてもよい。
【００７２】
用語「単位剤形」は、本明細書で用いる場合、ヒト及び動物対象に対する単回投与量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とともに所望の効果をもたらすのに十分な量として計算された所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の新規単位剤形の仕様は、用いられる特定の化合物、及び達成されるべき効果、ならびに宿主における各化合物に関連した薬力学に依存する。
【００７３】
全身投与の典型的な投与量は、１回の投与につき対象の重量１ｋｇ当たり０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。典型的な投与量として、錠剤１個を１日２〜６回服用するか、または比例的により高い含有量の活性成分を含有する徐放性カプセルもしくは錠剤１個を１日１回服用することができる。徐放効果は、異なるｐＨ値で溶解するカプセル材料、浸透圧によって徐々に放出されるカプセル、または任意の他の公知の放出制御手段により得ることができる。
【００７４】
当業者は、具体的な化合物、症状の重症度、被検者の副作用に対する感受性の関数として、投与レベルが変化し得ることを容易に理解するであろう。特定の化合物の中には他のものよりも効力が高いもある。当業者であれば、所与の化合物の好ましい投与量を様々な手段により容易に決定することができる。好ましい手段は所与の化合物の生理的効力を測定することである。
【００７５】
こうした曝露の後、個体は、成熟卵母細胞を放出するのに有効な濃度の、インビボ宿主動物における自然発生ＦＳＨ、ＦＳＨ類似体、例えば、ＦＳＨ−ＣＴＰ、単鎖類似体、ペグ化ＦＳＨなどが含まれるがこれらに限定されない組換えＦＳＨまたはＦＳＨ類似体により処理してもよい。個体はまた、上記のようにＬＨアゴニストで処理してもよい。代替として、上記のように卵巣から卵母細胞を取り出してインビトロ操作に用いてもよい。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製及び使用方法についての完全な開示及び説明を提供するために記載するものであり、本発明とみなされるものの範囲を限定することを意図するものではない。用いる数値（例えば、量、温度、濃度など）については、正確性を確保するように努めたが、ある程度の実験誤差及び偏差が許容されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏度であり、圧力は大気圧またはその近傍のものである。
【００７７】
実施例１
ｍＴＯＲ活性化後の卵胞成長の促進：ＡＫＴスティミュレーターの相乗効果
哺乳類卵巣は、基本的な機能単位としての卵胞からなる。最初の卵胞のリクルートメント中、未知の卵巣内機構により少数の休眠原始卵胞が刺激または解放されて成長を開始する。いったん成長プールに入ると、卵胞は一次、二次、及び胞状段階を経て成熟し、成熟卵母細胞を含有する排卵前卵胞となる。哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）は、ハエからヒトにわたって保存されたセリン／スレオニンキナーゼであり、多タンパク質ｍＴＯＲＣ１複合体の一部である。栄養因子、ストレス、酸素、エネルギー、及び他の要因の影響下で、ラパマイシン感受性ｍＴＯＲＣ１複合体は、タンパク質、脂質、及びオルガネラの生合成を含む多様な同化プロセスを促進することにより、かつオートファジーなどの異化プロセスを制限することにより、細胞成長及び増殖を正に制御する。対照的に、結節性硬化症複合体１（ＴＳＣ１）または２（ＴＳＣ２）の腫瘍抑制因子はｍＴＯＲＣ１活性を負に制御する。ＴＳＣ１またはＴＳＣ２の不活性変異の結果として、拡大した細胞を含有する多数の良性腫瘍を特徴とする疾患である結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）がもたらされる。
【００７８】
変異マウスを用いた研究により、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２の卵母細胞特異的欠失が新生児動物におけるすべての原始卵胞の成長を促進し、これにより卵胞プール全体が枯渇し、その後の早期卵巣不全の表現型がもたらされることが示された。同様に、ＡＫＴシグナル伝達の上流であるＰＴＥＮ遺伝子の卵母細胞特異的欠失もまた、ＡＫＴ活性を増加させ、その後休眠卵胞が全体的に活性化される。興味深いことに、ＴＳＣ１及びＰＴＥＮの二重欠失は、単独変異マウスと比較して、卵母細胞成長及び卵胞活性化が相乗的に亢進する。より大きな卵胞として、二次卵胞の顆粒膜細胞におけるＴＳＣ１を破壊した変異マウスもまた、卵胞成長の亢進を示し、排卵能力が上昇してより多くの子を出産し、その後の早期卵巣不全の表現型がもたされる。
【００７９】
ｍＴＯＲアクティベーターであるＭＨＹ１４８５の有効性を利用して、インビトロ活性化−移植アプローチを用いて幼若マウスにおける二次卵胞成長を刺激し、成熟卵母細胞を含有する排卵前卵胞を得た。
【００８０】
結果：
ＭＨＹ１４８５処理によるｍＴＯＲ経路タンパク質のリン酸化の刺激：ラット肝細胞及びＰＣ３細胞株においてｍＴＯＲ経路を活性化するＭＨＹ１４８５の能力を示す最近の研究に基づいて、ＭＨＹ１４８５処理後、卵巣におけるｍＴＯＲ及びこのシグナル伝達経路の下流タンパク質のリン酸化を調査した。１０日齢マウス由来の卵巣を１０μＭのＭＨＹ１４８５で３時間インキュベートした後、イムノブロッティング解析を行った。図１Ａに示すように、ＭＨＹ１４８５での処理により、ｍＴＯＲ総含有量に影響を及ぼすことなくホスホｍＴＯＲレベルが増加した。活性化したｍＴＯＲＣ１複合体はリボソームＳ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）のＴｈｒ３８９をリン酸化させることにより、それを活性化させて次にリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）をリン酸化させ、リボソーム生合成を促進する。卵巣組織におけるＳ６Ｋ１及びｒｐＳ６リン酸化をさらに監視した。図１Ａに示すように、ＭＨＹ１４８５処理により、全Ｓ６Ｋ１レベル及び全ｒｐＳ６レベルに影響を及ぼすことなく下流のＳ６Ｋ１及びｒｐＳ６タンパク質のリン酸化も増加した。これらの知見は、卵巣におけるｍＴＯＲシグナル伝達経路を刺激するＭＨＹ１４８５の能力を示している。
【００８１】
ＭＨＹ１４８５での処理によるインビトロ及びインビボでの卵胞成長の促進：１０日齢マウス由来の卵巣は、外植片培養モデルを用いて、投与量を増加させたＭＨＹ１４８５で処理した。図１Ｂに示すように、卵巣を４日間処理した結果、卵巣重量は投与量に依存して増加した。組織学的解析（図１Ｃ）及び卵胞の計数（図１Ｄ）により、初期二次段階から後期二次段階への卵胞成長の亢進が示された。
【００８２】
１０日齢卵巣をインビトロで２日間にわたってＭＨＹ１４８５でさらに処理し、その後、ＦＳＨで５日間毎日処理した成体宿主に移植した。図２Ａに示すように、ＭＨＹ１４８５での処理により移植片重量が増加した。組織学的解析（図２Ｂ）及び卵胞計数（図２Ｃ）を行ったところ、胞状／排卵前卵胞の発育が亢進し、それに伴い初期二次卵胞が減少し、かつ一次卵胞が増加したことが明らかとなった。このモデルを用いて、宿主をｅＣＧで２日間さらに処理して排卵前卵胞の成長を促進させ、その後、ｈＣＧを注入して卵成熟を促進させた。ｈＣＧ注入の１２時間後に、体外受精のために排卵前卵胞から成熟卵母細胞を穿刺して取り出した。図３Ａに示すように、ＭＨＹ１４８５で前処理した卵巣から得た卵母細胞は胚盤胞に発育することができた。ＭＨＹ１４８５で処理していない２５日齢マウス（対照）から得た成熟卵母細胞と比較すると、各胚段階に発育した卵母細胞の割合に基づいて、同等な初期胚発育が明らかとなった（図３Ｂ）。ＭＨＹ１４８５で前処理した移植片に由来する２細胞胚のいくつかを偽妊娠代理母に移植したところ、健康な子が出生した（図３Ｃ）。
【００８３】
ｍＴＯＲアクティベーターでの処理によるＡＫＴスティミュレーターによって促進される卵胞成長の亢進：以前の知見では、ＰＴＥＮインヒビター及びホスホイノシトール−３−キナーゼアクティベーターをはじめとするＡＫＴスティミュレーターの二次卵胞成長を促進する能力が示された。そのため、１０日齢卵巣をｍＴＯＲアクティベーター及びＡＫＴスティミュレーターの両方で処理することによる複合効果について試験した。ＭＨＹ１４８５とともにまたはＭＨＹ１４８５なしで、インビトロ活性化（ＩＶＡ）プロトコールで慣例的に用いられる最適な投与量のＰＴＥＮインヒビターｂｐｖ（ｈｏｐｉｃ）及び７４０ＹＰ（ホスホイノシトール−３−キナーゼに対するアクティベーター）により、１０日齢マウス由来の卵巣を処理した。図４Ａに示すように、ＭＨＹ１４８５及びＩＶＡ薬の併用処理により移植片重量がさらに増加した。組織学的解析（図４Ｂ）及び卵胞計数（図４Ｃ）により、胞状／排卵前卵胞が増加し、それに伴い原始卵胞が減少したことが示された。
【００８４】
試験により、ｍＴＯＲ及び下流タンパク質のリン酸化を刺激し、卵巣外植片培養において二次卵胞成長を亢進し、同種移植片において胞状／排卵前卵胞の生成を促進するｍＴＯＲアクティベーターの能力が示された。ＰＴＥＮ−ＡＫＴ−ＦＯＸＯ３シグナル伝達経路に加えて、ＴＳＣ１及びＴＳＣ２遺伝子が卵母細胞特異的に欠失したマウスを用いた広範囲に及ぶ研究に基づいて、卵母細胞におけるＴＳＣ１−ＴＳＣ２複合体によるｍＴＯＲＣ１活性の抑制が、原始卵胞の休眠を維持するための必要条件であると明らかにされている。ＰＴＥＮ及びＴＳＣ１／２は両方ともｒｐＳ６のリン酸化／活性化を抑制するが、これはＳ６Ｋ１における異なるスレオニン残基のリン酸化を制御することによるものである。こうしたこれまでの知見は、原始卵胞休眠の制御におけるＡＫＴ及びｍＴＯＲ１シグナル伝達経路の役割を示している（Ａｄｈｉｋａｒｉ  ＆  Ｌｉｕ（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ９，１６７３−１６７４）。
【００８５】
二次卵胞については、Ｔｓｃ１の破壊（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ５４０５２）、または二次卵胞の顆粒膜細胞におけるＡＫＴシグナル伝達経路の活性化（Ｆａｎら（２００８）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２２，２１２８−２１４０）も卵胞発育を促進する。本明細書に記載のｍＴＯＲ及びＡＫＴシグナル伝達アクティベーターによる処理後の卵胞成長の亢進は、インビボ移植が短期間であったことから、顆粒膜細胞によって媒介される卵胞成長の刺激を反映しているものと考えられる。
【００８６】
本発明での卵胞動態の解析により、ｍＴＯＲアクティベーターへの短期間曝露が移植片における初期二次卵胞の胞状／排卵前段階への成長を促進すると示された。ＭＨＹ１４８５により二次卵胞を刺激して胞状卵胞を誘導した後、ゴナドトロピンによって動物をさらに処理することにより、胚盤胞及び生育可能な子に発育することのできる成熟卵母細胞を含有する多数の排卵前卵胞を生成することができた。本知見は、ｍＴＯＲシグナル伝達アクティベーターへの短期間曝露により、ＡＫＴシグナル伝達スティミュレーターと同様に、不妊治療の基礎を提供することを示している。本明細書に記載されるｍＴＯＲアクティベーターの卵胞成長を促進する能力とは対照的に、ラパマイシン（ｍＴＯＲシグナル伝達のインヒビター）の長期間注入することにより、ＰＴＥＮ変異マウスにおける卵胞発育が抑制され（Ａｄｈｉｋａｒｉら（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ５３８１０）、卵胞成長を停止することにより高齢ラットの妊娠可能期間が延長される（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｅ  ５２３，８２−８７）。
【００８７】
早発卵巣不全の患者及び受精能が低下した中年女性では受精能は損なわれるが、その卵巣には依然として少数の前胞状卵胞を含有している。以前の研究では、ヒト卵巣断片をＡＫＴスティミュレーター（ＰＴＥＮインヒビター及びＰＩ３Ｋアクティベーター）に短期間曝露することにより卵胞成長が促進され、早発卵巣不全の患者の部分母集団において、移植片における成熟卵母細胞を生成させることができ、新規不妊治療アプローチをもたらすことが示された。本データにより、ＡＫＴスティミュレーター及びｍＴＯＲアクティベーターの両方でプレインキュベートした卵巣移植片における卵胞成長の亢進がさらに示された。こうしたインビトロにおけるｍＴＯＲアクティベーターへの一時的な卵巣特異的曝露は、ＡＫＴスティミュレーターによる処理と組み合わせると、ＡＫＴスティミュレーター単独での使用した場合と比較して、不妊治療の成果を向上させる。
【００８８】
方法：
動物：ＣＤ−１及びＢ６Ｄ２Ｆ１マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設において水及び餌を自由に摂取させながら１２時間の明期／暗期の下で飼育した。マウスは地域の動物実験委員会のガイドラインに従って処理した。
【００８９】
イムノブロッティング解析：１０日齢のマウス由来の卵巣をＭＨＹ１４８５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で３時間処理し、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有するＭ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてタンパク質を抽出した。上清中のタンパク質濃度をビシンコニン酸法（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）によって測定した。等量のタンパク質ライセートを４〜１２％のＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）含有ＭＯＰＳ緩衝液に充填し、０．４５μＭ孔のニトロセルロース膜（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）に転写した。一次抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から、ウサギ二次抗体はＬＩ−ＣＯＲから入手した。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像検出器を用いて画像を生成した。
【００９０】
卵巣外植片培養及び卵胞計数：１０日齢マウス由来の卵巣を培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に載置し、０．１％のＢＳＡ、０．１％のＡｌｂｕｍａｘ  ＩＩ、インスリン−トランスフェリン−セレン、０．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸及びペニシリン−ストレプトマイシンを含有する４００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、培地の薄い層で卵巣を覆うようにメンブレンインサートの下で培養した。卵巣を１〜１０μＭのＭＨＹ１４８５で処理し、培養２日後に培地を交換して４日間培養した。培養の最後に、卵巣をホルマリンで固定して重量を測定した。いくつかの卵巣をパラフィン包埋して連続切片に切断した。卵胞計数のために切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、同じ卵胞を再計数することを避けるために、明瞭に染色された卵母細胞核を有する卵胞のみを数えた。
【００９１】
卵巣組織移植：１０日齢マウス由来の一対の卵巣を、プレート培養インサート上で、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．２３ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、３０ｍＩＵ／ｍｌのＦＳＨ、５０ｍｇ／Ｌの硫酸ストレプトマイシン及び７５ｍｇ／ＬのペニシリンＧを含有するＭＥＭα培地中で培養した。卵巣を３〜２０μＭのＭＨＹ１４８５で４８時間処理し、培地は培養２４時間後に交換した。同一ドナー由来の一対の卵巣（ＭＨＹ１４８５で処理済または未処理）を同一の成体卵巣切除宿主（９〜１０週齢）の腎被膜下に５日間移植して、毎日ＦＳＨ（１ＩＵ／動物）を注入した。移植の最後に、重量測定及び組織学的解析のために移植片を採取した。何匹かに対しては、移植前に、１０日齢マウス由来の卵巣をＩＶＡ薬（１日目は３０μＭのＰＴＥＮインヒビター：ｂｐｖ（ｈｏｐｉｃ）、２日間は１５０μｇ／ｍＬのホスホイノシトール−３−キナーゼのアクティベーター７４０ＹＰ）で処理した。
【００９２】
体外受精及び受精卵移植：１０日齢のＢ６Ｄ２Ｆ１マウス由来の卵巣を１０μＭのＭＨＹ１４８５で２日間処理し、その後、宿主の腎被膜に５日間移植した。移植から５日後に、動物を１０ＩＵのウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）で４８時間処理し、その後、１０ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を注入した。１２時間後、移植片を採取して卵母細胞をＭ２培地（Ｃｙｔｏｓｐｒｉｎｇ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）中に回収した。対照として、２５日齢のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスを５ＩＵのｅＣＧで４８時間処理し、続いて５ＩＵのｈＣＧで処理し、その後、卵母細胞を回収した。体外受精のために、Ｂ６Ｄ２Ｆ１雄マウス由来の精子をヒト卵管液培地（Ｃｙｔｏｓｐｒｉｎｇ）中に収集し、３７℃で１時間プレインキュベートした。その後、卵母細胞を精子（２〜３×１０５／ｍｌ）で６時間受精させ、受精卵をＫＳＯＭ培地（Ｃｙｔｏｓｐｒｉｎｇ）に移して胚盤胞に発育させた。受精卵移植のために、同系の精管切除雄とあらかじめ交配させた８週齢の偽妊娠ＣＤ１マウスの卵管に２細胞胚を移植した。
【００９３】
本明細書で引用したすべての刊行物及び特許出願は、あたかも個別の刊行物または特許出願がそれぞれ参照により援用される具体的かつ個別に示されているように、参照により本明細書に援用される。本出願の出願日より前の開示のみに関連して、本明細書で述べた刊行物が提供される。本明細書中のいかなる記載も、本発明が先行発明を理由にかかる開示に先行する権利を有しないと認めるものであると解釈されるべきではない。
【００９４】
理解を明確にする目的で例証及び例示によりある程度詳細に上記の発明を説明したが、本発明の教示を踏まえて、本発明に対して、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある程度の変更及び修正がなされ得ることが当業者には直ちに明らかになるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際調査報告】
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2017528459.tif 000016