(57)【要約】  本発明は、腫瘍微小環境に作用する可溶性のβ−グルカンおよび抗癌剤の組み合わせに関する。可溶性のβ−グルカンは、免疫刺激環境を促進し、これによって抗癌剤の有効性の増強が可能となる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性のβ−グルカン；および
免疫抑制を緩和する抗癌剤、を含む組成物。
【請求項２】
免疫抑制を緩和する抗癌剤が、チェックポイント阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−Ｌｌ抗体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
免疫の同時刺激を増強する腫瘍を標的としない抗体をさらに含む、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
抗血管新生薬をさらに含む、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
抗血管新生薬が、抗血管新生抗体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
可溶性のβ−グルカンが、酵母由来である、請求項１−６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
可溶性のβ−グルカンが、β−１，３／１，６のグルカンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
単一の製剤中に提供される、請求項１−８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
可溶性のβ−グルカン成分および免疫抑制を緩和する抗癌剤成分が、別々の製剤中に提供される、請求項１−９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
可溶性のβ−グルカン免疫療法において使用するための、可溶性のβ−グルカンおよび抗ＰＤ−Ｌｌ抗体の使用。
【請求項１２】
抗ＰＤ−Ｌｌ抗体が、非補体活性化の抗体である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
免疫の同時刺激を増強する腫瘍を標的としない抗体をさらに含む、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
可溶性のβ−グルカンが、酵母由来である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
可溶性のβ−グルカンが、β−１，３／１，６のグルカンを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
可溶性のβ−グルカンおよび抗ＰＤ−Ｌｌ抗体が、腫瘍のない生存率を増強するために相乗的に作用する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１７】
可溶性のβ−グルカン免疫療法において使用するための、可溶性のβ−グルカンおよび抗ＶＥＧＦＲ２抗体の使用。
【請求項１８】
抗ＶＥＧＦＲ２抗体が、非補体活性化の抗体である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
可溶性のβ−グルカンおよび抗ＶＥＧＦＲ２抗体が、腫瘍増殖を最小限にするために相乗的に作用する、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
可溶性のβ−グルカンが、酵母由来である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
可溶性のβ−グルカンが、β−１，３／１，６のグルカンを含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項２２】
可溶性のβ−グルカンが、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ‐グルコピラノースを含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項２３】
癌を処置するための方法であって、該方法が、可溶性のβ−グルカンおよび免疫抑制を緩和する抗癌剤を含む組成物を同時投与する工程を含む、方法。
【請求項２４】
可溶性のβ−グルカンおよび免疫抑制を緩和する抗癌剤が、一斉に同時投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
可溶性のβ−グルカンおよび免疫抑制を緩和する抗癌剤が、異なる時間に同時投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
癌に関連する腫瘍細胞が、組成物の同時投与の前に低レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する、請求項２３−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
免疫抑制を緩和する抗癌剤が、抗ＰＤ−Ｌｌ抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
癌が、非小細胞肺癌、乳癌、膵癌、結腸癌、Ｂ細胞リンパ腫、黒色腫および腎細胞癌の１つである、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１４年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０２２，７５４号；２０１４年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／０７６，０９４号；２０１５年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１１５，８９５号、および２０１５年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１４９，８９２号、に基づいて優先権を主張し、参照によって本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、免疫抑制を緩和する抗癌剤を含む腫瘍微小環境に影響する可溶性のβ−グルカンと抗癌剤の組み合わせに関する。β−グルカンは菌性のＰＡＭＰであり、パターン認識受容体、好中球と単球を含む自然免疫細胞上の３型補体受容体（ＣＲ３）と同様に血清中のパターン認識分子Ｃ３によって認識される。酵母由来の多糖体β−グルカン（β（１，６）−［ポリ−１，３）−Ｄ−グルコピラノース］−ポリ−β−Ｄグルコピラノース）は、いくつかの癌の処置用の抗腫瘍モノクローナル抗体と組み合わせた免疫治療剤として開発されている。β−グルカンによって、自然免疫のエフェクター細胞は、補体のＣＲ３依存の機構を介して、補体で覆われた腫瘍細胞を死滅させることができる。多数の動物腫瘍モデルの治験において、どちらか一方の薬剤の単独投与と比較して、可溶性のβ−グルカンと補体活性化酵化した腫瘍を標的とする抗体の併用投与は、有意に腫瘍の成長を抑制し全生存期間を改善するという結果をもたらした。
【０００３】
しかしながら、癌は悪性細胞の集合体と言うだけでなく複雑な「器官」である。それは他の多くの非形質転換細胞を動員し使用する。悪性細胞と非形質転換細胞の間の相互作用は腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を形成する。ＴＭＥの非悪性の細胞は発癌における様々な段階において、動的な、しばしば腫瘍促進の機能を持っている。サイトカイン、ケモカイン、成長因子および、炎症性およびマトリックスリモデリング酵素の複雑で動的なネットワークは、罹患した組織内の細胞間情報伝達を活発にする。したがって、有効に癌を克服するために、ＴＭＥの腫瘍の成長を促進する性質を抑えるための療法が開発されなければならない。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の1態様において、腫瘍微小環境に影響する抗癌剤と組み合わせた可溶性のβ−グルカンの使用と組成物を記載している。
【０００５】
本発明の上記の要約は、本発明の各々開示された実施形態やすべての実施を記載する意図はない。続く記載は実施形態をより具体的に例示する。本出願のいくつかの箇所で、ガイダンスは実施例のリストによって提供される。これらの具体例は様々な組み合わせで使用することができる。各例において、リストの列挙は代表的な群としてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】インビトロでのヒトＭ１とＭ２マクロファージの形態的および機能的な特性。
【図１Ｂ】インビトロでのヒトＭ１とＭ２マクロファージの形態的および機能的な特性。
【図１Ｃ】インビトロでのヒトＭ１とＭ２マクロファージの形態的および機能的な特性。
【図１Ｄ】インビトロでのヒトＭ１とＭ２マクロファージの形態的および機能的な特性。
【図２Ａ】可溶性のβ−グルカン処置されたＭ２マクロファージの形態的、表現型的、機能的な特性。
【図２Ｂ】可溶性のβ−グルカン処置されたＭ２マクロファージの形態的、表現型的、機能的な特性。
【図２Ｃ】可溶性のβ−グルカン処置されたＭ２マクロファージの形態的、表現型的、機能的な特性。
【図２Ｄ】可溶性のβ−グルカン処置されたＭ２マクロファージの形態的、表現型的、機能的な特性。
【図３Ａ】高結合性と低結合性からのβ−グルカン処置されたＭ１とＭ２マクロファージにおけるＣＤ４ Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γとＩＬ−４産生の調節の評価。
【図３Ｂ】高結合性(high binders)と低結合性(low binders)からのβ−グルカン処置されたＭ１とＭ２マクロファージにおけるＣＤ４ Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γとＩＬ−４産生の調節の評価。
【図３Ｃ】高結合性と低結合性からのβ−グルカン処置されたＭ１とＭ２マクロファージにおけるＣＤ４ Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γとＩＬ−４産生の調節の評価。
【図３Ｄ】高結合性と低結合性からのβ−グルカン処置されたＭ１とＭ２マクロファージにおけるＣＤ４ Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γとＩＬ−４産生の調節の評価。
【図４】免疫抑制状況下のβ−グルカン処置されたＭ２とＭ２ａマクロファージにおけるＴ細胞の増殖とＩＦＮ−γの調節の評価。
【図５Ａ】制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）がある状態での処理されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図５Ｂ】制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）がある状態での処理されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図５Ｃ】制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）がある状態での処理されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図５Ｄ】制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）がある状態での処理されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図５Ｅ】制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）がある状態での処理されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図６Ａ】インビトロで培養されたヒトの未熟な単球由来の樹状細胞（ｉｍＭｏＤＣ）と成熟した単球由来の樹状細胞（ｍＭｏＤＣ）の特性。
【図６Ｂ】インビトロで培養されたヒトの未熟な単球由来の樹状細胞（ｉｍＭｏＤＣ）と成熟した単球由来の樹状細胞（ｍＭｏＤＣ）の特性。
【図７Ａ】ＭｏＤＣｓ成熟に対するβ−グルカンの効果の評価。
【図７Ｂ】ＭｏＤＣｓ成熟に対するβ−グルカンの効果の評価。
【図７Ｃ】ＭｏＤＣｓ成熟に対するβ−グルカンの効果の評価。
【図７Ｄ】ＭｏＤＣｓ成熟に対するβ−グルカンの効果の評価。
【図８Ａ】細胞間接触に起因したＭ２−β−グルカンによって増加したＣＤ４ Ｔ細胞増殖の結果。
【図８Ｂ】細胞間接触に起因したＭ２−β−グルカンによって増加したＣＤ４ Ｔ細胞増殖の結果。
【図８Ｃ】細胞間接触に起因したＭ２−β−グルカンによって増加したＣＤ４ Ｔ細胞増殖の結果。
【図９】可溶性の因子に起因したＭ２−β−グルカンによって増加したＣＤ４ Ｔ細胞増殖の結果。
【図１０】高結合性対低結合性でβ−グルカン処置されたＭ２マクロファージの分析。
【図１１Ａ】高結合性からの血清がある状態で低結合性の単球に由来するＭ２−β−グルカンの機能評価の結果。
【図１１Ｂ】高結合性からの血清がある状態で低結合性の単球に由来するＭ２−β−グルカンの機能評価の結果。
【図１２Ａ】免疫抑制サイトカイン（ＴＣＭ）がある状態で培養された、β−グルカン処置されたＭ２マクロファージ上のＰＤ−Ｌ１アップレギュレーション。
【図１２Ｂ】免疫抑制サイトカイン（ＴＣＭ）がある状態で培養された、β−グルカン処置されたＭ２マクロファージ上のＰＤ−Ｌ１アップレギュレーション。
【図１３】ＭｉａＰａＣａにおけるＰＤ−Ｌ１アップレギュレーション。
【図１４Ａ】骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に対する可溶性のβ−グルカンの効果。
【図１４Ｂ】骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に対する可溶性のβ−グルカンの効果。
【図１５】腫瘍細胞上のβ−グルカンが誘発性のＰＤ−Ｌ１発現の評価
【図１６】ＤＣ１０１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧを使用するマウス研究の結果。
【図１７Ａ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍微小環境に対するインビボでの効果。
【図１７Ｂ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍微小環境に対するインビボでの効果。
【図１７Ｃ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍微小環境に対するインビボでの効果。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
β−グルカンは、例えば、酵母、細菌、藻類、海草、マッシュルーム、カラスムギ、およびオオムギを含む、様々な微生物源および植物源に由来するグルコースのポリマーである。これらのうち、酵母β−グルカンは、その免疫調節性に関して広範囲に評価されてきた。酵母β−グルカンは、例えば、無傷の酵母、チモサン、精製された全グルカン粒子、可溶性にされたチモサン・ポリサッカライド、または高度に精製された可溶性の異なる分子量のβ−グルカンなどの様々な形態として存在することができる。構造上、酵母β−グルカンは、β−（１，６）−グリコシド結合を介して骨格に結合された周期性のβ−（１，３）グルコピラノース分枝を有するβ−（１，３）結合したグルコピラノース骨格として組織化された、グルコースモノマーから構成されている。酵母β−グルカンの異なる形態は、互いとは異なって機能することができる。酵母β−グルカンがその免疫調節効果を発揮する機構は、例えば、その粒子特性または可溶性、三次構造、主鎖の長さ、側鎖の長さ、および側鎖の頻度などの、β−グルカンの異なる形態間の構造の違いによる影響を受け得る。酵母β−グルカンの免疫刺激機能はまた、β−グルカンの構造特性にも依存し得る異なる種における異なる細胞タイプに関与する受容体に依存する。
【０００８】
一般に、β−グルカンの免疫療法は、β−グルカンの任意の適切な形態またはβ−グルカンの２つ以上の形態の任意の組み合わせを被験体に投与することを含み得る。適切なβ−グルカンおよびその自然源からの適切なβ−グルカンの調製物は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２００８／０１０３１１２ Ａ１号に記載されている。いくつかの場合では、β−グルカンは、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母に由来し得る。特定の場合では、β−グルカンは、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ‐グルコピラノースであり得るか又はそれに由来し得、本明細書では、可溶性の酵母由来のβ−グルカンの高度に精製された且つ十分に特徴づけられた形態である、ＰＧＧ（ＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧ，Ｂｉｏｔｈｅｒａ，Ｅａｇａｎ，ＭＮ）とも呼ばれる。さらに、β−グルカンベースの免疫療法は、例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１２／３６７９５に記載されるものなどの修飾された及び／又は誘導されたβ−グルカンの使用を含むことができる。他の場合では、β−グルカン免疫療法は、例えば、粒子可溶性のβ−グルカンまたは粒子可溶性のβ−グルカン調製物を投与することを含むことができ、これら各々は、例えば、米国特許第７，９８１，４４７号に記載されている。
【０００９】
抗癌免疫療法薬は、以下の複数の物理療法によって癌細胞を殺す：１）自然免疫細胞の直接の活性化、２）適応免疫細胞の直接の活性化、３）腫瘍細胞をより免疫原性にすることによる又は腫瘍誘発性免疫抑制を妨害することによる自然免疫細胞および適応免疫細胞両方の間接の活性化。
【００１０】
Ｍ２マクロファージ、Ｎ２好中球および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の骨髄性細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞の機能的な枯渇を直接引き起こすことによって又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の抑制力を間接的に増大させることによって、免疫抑制に重大な役割を果たすという山のような証拠がある。これは、ＴＭＥ中の免疫抑制バランスに対する傾斜した（ｓｋｅｗｅｄ）免疫刺激につながる。ＴＭＥの免疫刺激環境は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞、細胞溶解性および食作用誘発性Ｍ１マクロファージ、細胞傷害性Ｎ１好中球、体液性応答誘発性Ｂ細胞、および抗原提示の免疫原性樹状細胞（ＤＣ）の存在によって大部分が形づくられる。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）などの、免疫刺激サイトカインおよびケモカインは、免疫刺激活性の重要な調整因子である。ＴＭＥの免疫抑制性の性質をバイアスする（ｂｉａｓ）重要な因子は、抗炎症性Ｔｈ２細胞、Ｎ２好中球、Ｍ２マクロファージ、Ｔｒｅｇｓ、および免疫寛容原性ＤＣである。トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）などの、免疫抑制性のサイトカインおよびケモカインは、免疫抑制活性の重要な調整因子である。
【００１１】
可溶性のβ−グルカンは、骨髄由来の細胞（即ち、好中球および単球）上のＣＤ１１ｂに結合する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）であるおかげで、Ｎ１好中球およびＭ１マクロファージの免疫刺激機能を結合且つ増加させ、ＭＤＳＣ、Ｎ２好中球およびＭ２マクロファージの免疫抑制機能を低下させる。この調節は、ＴＭＥ中の異なる先天性および適応性の細胞サブセット間のクロストークにつながり、最終的にバランスを免疫刺激へと傾ける。より具体的には、可溶性のβ−グルカンは、末梢血単球に結合されると、Ｍ１／抗腫瘍形成性の分極状態対Ｍ２／腫瘍形成促進性の分極状態においてマクロファージへの単球の分化を調節し、その結果、マクロファージ免疫刺激機能を増加させるＭ１分極が増強され、マクロファージ免疫抑制機能を低下させるＭ２分極が阻害される。可溶性のβ−グルカンは、Ｍ１表現型へのＭ２再分極に直接作用し、Ｔｈ１分極を促し、可溶性のβ−グルカンにより抗原刺激を受けた自然免疫細胞は、Ｔｒｅｇｓの存在下であっても、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞増殖に間接的に作用するためにサイトカインを生成し、最終的にＴｈ１分極を促す。
【００１２】
可溶性のβ−グルカンは、自然免疫反応および適応免疫反応を架橋すると知られている２つの先天性の細胞サブセット、単球由来のマクロファージおよび樹状細胞を介して適応免疫反応を誘発し、単球由来のマクロファージおよび樹状細胞の両方上のＰＤ−Ｌ１発現をアップレギュレートする。ＰＤ−Ｌ１アップレギュレーションにもかかわらず、可溶性のβ−グルカン処理した単球由来のマクロファージおよび樹状細胞は、Ｔ細胞の活性化および増殖を増強し、可溶性のβ−グルカンによって誘発された調整された免疫反応は、適応免疫耐性に類似した腫瘍反応を誘発する（即ち、ＰＤ−Ｌ１の表面発現のアップレギュレーション）。
【００１３】
可溶性のβ−グルカンは、非補体活性化の、腫瘍を標的とする免疫抑制を緩和するＭＡｂｓと組み合わせられ得る。例えば、可溶性のβ−グルカンは、黒色腫、腎細胞癌、肺癌などを含むいくつかの癌の処置において抗ＰＤ−Ｌ１の免疫チェックポイント阻害剤（Ｆｃ改変（Ｆｃ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＩｇＧ１ ＭＡｂ）と組み合わせられ得る。抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体の有効性が、腫瘍上のＰＤ−Ｌ１の発現レベルに依存することが報告されてきた。腫瘍上のＰＤ−Ｌ１発現の機構の１つは、適応免疫耐性と呼ばれ、ここでＰＤ−Ｌ１発現は、腫瘍微小環境内の免疫反応の結果として 適応的に引き起こされる（例えば、活性化Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ産生）。可溶性のβ−グルカンは、直接的または間接的にのいずれかでＴｈ１分極を引き起こす。この効果は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートし、それによって、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍活性を増強する。チェックポイント阻害剤の例は、ニボルマブおよびペンブロリズマブである。
【００１４】
可溶性のβ−グルカンは、免疫の同時刺激を増強する、非補体活性化の、腫瘍を標的としないＭＡｂｓと組み合わせられ得る。例えば、いくつかの癌の処置における、ａ）樹状細胞を標的とする、抗ＣＤ４０ ＭＡｂ（ＩｇＧ２ ＭＡｂ）、ｂ）抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢ、Ｔ細胞同時刺激のエンハンサー。
【００１５】
可溶性のβ−グルカンはまた、非補体活性化の、腫瘍を標的としない免疫抑制を緩和する小分子、および非補体活性化の、腫瘍を標的とする免疫抑制を緩和する小分子と組み合わせられ得る。これは、Ｔｈ１分極を促すための癌ワクチン中のアジュバントとして使用することができる。これは、感染の完全な除去を促進するために、慢性疾患（即ちＴＢ）において抑制機構を治療上減少させるべく使用することができる。最終的に、これは、Ｔｈ２優性の自己免疫性疾患におけるＴｈ２−Ｔｈ１バランスを（アレルギー、喘息、アトピー性疾患）Ｔｈ１分極化環境に傾けるために使用され得る。
【００１６】
非補体活性化の免疫抑制を緩和する薬剤が、特に腫瘍を標的としない薬剤に対して好ましいかもしれないが、本発明も、補体活性化の免疫抑制を緩和する薬剤を用いて実施され得る。一例はバビツキシマブであり得る。
【００１７】
本発明は、部分的に、本明細書で使用されるように、抗体製剤または小分子製剤またはＴＭＥに作用させるために投与される任意の製剤であり得る別の医薬製剤とともに、β−グルカンを同時投与することを含む。本明細書で使用されるように、「同時投与された」は、組み合わせの２つ以上の成分が、組み合わせの治療上または予防的な効果が、単独で投与される一方の成分の治療上または予防的な効果より大きくなるように投与されることを指す。２つの成分は、一斉に又は連続して同時投与され得る。同時投与された成分は、１つ以上の医薬組成物において提供され得る。２つ以上の成分の連続する同時投与は、両方の成分が投与された後に一斉に生物学的利用が可能であるように成分が投与される場合を含む。成分が一斉に又は連続して同時投与されるかどうかにかかわらず、成分は、単一の部位または異なる部位で同時投与され得る。
【００１８】
別の態様では、その方法は、抗体、治療抗体、抗腫瘍抗体、または抗体のＦｃ部分などの抗体フラグメントに結合した、β−グルカン部分を含む組成物を被験体に投与する工程を含む。β−グルカン部分と抗体のβ−グルカン複合体を含む、修飾された及び／又は誘導された可溶性のβ−グルカンは、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１２／３６７９５に記載され、これは抗体フラグメントの複合体にも当てはまり得る。β−グルカン部分は、β−１，３／１，６のグルカンであり得るか又はそれに由来し得る。この文脈において、「由来（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」は、複合体が、β−グルカンの１つ以上の原子に取って代わる共有結合を作り出すことによって必然的に調製され得ることを認めている。本明細書で使用されるように、「β−１，３／１，６のグルカンに由来する」は、β−グルカンの一部が、複合体の共有結合を形成するためにβ−グルカンの１つ以上の原子に取って代わった後に複合体の部分として残ることを指す。
【００１９】
β−グルカン、抗体または小分子製剤、及び／又は両方の成分の組み合わせは、「担体」とともに組成物中で製剤され得る。本明細書で使用されるように、「担体」は、溶媒、分散媒、ビヒクル、被覆剤、希釈剤、抗菌剤及び／又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤 、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。そのような薬学的な活性物質のための培地及び／又は薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。従来の培地または薬剤がβ−グルカンまたは抗体と適合性がある場合を除いて、治療用組成物中のその使用が熟考される。補足の有効成分も、組成物に組み込むことができる。
【００２０】
「薬学的に許容可能な」は、生物学的に又は他に望ましくないということがない物質を意図し、即ち、該物質は、望ましくない生物学的作用も引き起こすことなく、または有害な方法で、含まれる医薬組成物の他の成分のいずれとも相互作用することなく、β−グルカン及び／又は医薬製剤とともに個体に投与され得る。
【００２１】
β−グルカン、医薬製剤、及び／又は両方の成分の組み合わせは、医薬組成物へと製剤され得る。いくつかの実施形態では、β−グルカンおよび医薬製剤は、単一の製剤中に提供され得る。他の実施形態では、β−グルカンおよび医薬製剤は、別々の製剤中に提供され得る。医薬組成物は、１つ以上の好ましい投与経路に適した様々な及び／又は複数の形態で製剤され得る。したがって、医薬組成物は、例えば、経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）、あるいは局所（例えば、鼻腔内、肺内、乳腺内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸など）を含む、１つ以上の既知の経路を介して投与され得る。医薬組成物またはその一部は、例えば、（例えばスプレーまたはエアロゾルによる）鼻または呼吸の粘膜への投与などによって粘膜表面に投与され得る。医薬組成物またはその一部はまた、持続放出または遅延放出を介して投与され得る。
【００２２】
製剤は、単位剤形で好都合に存在し得、薬学の技術分野における周知の方法によって調製され得る。薬学的に許容可能な担体とともに組成物を調製する方法は、β−グルカン及び／又は医薬製剤を、１つ以上の副成分を構成する担体との結合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を、液体担体、微粉化した固体担体、またはその両方と一様に及び／又は密に結合させ、その後、必要な場合、生成物を望ましい製剤に形づくることによって調製され得る。
【００２３】
β−グルカン、医薬製剤、及び／又はその両方の成分の組み合わせは、限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル、または混合物の任意の形態を含む、任意の適切な形態で提供され得る。組成物は、任意の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、またはビヒクルとともに製剤中に送達され得る。例えば、製剤は、例えば、クリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアロゾルスプレー、ゲル、ローションなどの、従来の局所剤形で送達され得る。製剤は、例えば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、芳香剤、香味剤、保湿剤、増粘剤などを含む、１つ以上の添加剤をさらに含んでいる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、β−グルカンは、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母に由来し得る。いくつかの実施形態では、β−グルカンは、例えば、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ‐グルコピラノースなどの、β−１，３／１，６のグルカンを含むことができる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、約１００ｎｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分なβ−グルカンを被験体に投与する工程を含むことができる、いくつかの実施形態では、該方法は、β−グルカンをこの範囲外の投与量で投与することによって実行されてもよい。いくつかの実施形態では、該方法は、約１０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約４ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分なβ−グルカンを被験体に投与する工程を含む。
【００２６】
代替的に、投与量は、処置経過の開始の直前に得られた実際の体重を用いて計算され得る。このように計算された投薬に関して、体表面積（ｍ２）は、以下のＤｕｂｏｉｓ法を使用して、処置経過の開始前に計算される：ｍ２＝（ｗｔ ｋｇ０．４２５×高さｃｍ０．７２５）×０．００７１８４。それ故、いくつかの実施形態では、該方法は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍ２から約１０ｍｇ／ｍ２の投与量を提供するのに十分なβ−グルカンを投与する工程を含むことができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、該方法は、例えば、約１００ｎｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するためのβ−グルカンに特異的に結合する十分な抗体を被験体に投与する工程を含むことができるが、いくつかの実施形態では、該方法は、抗体をこの範囲外の投与量で投与することによって実行されてもよい。いくつかの実施形態では、該方法は、約１０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分な抗体を被験体に投与する工程を含む。
【００２８】
代替的に、投与量は、処置経過の開始の直前に得られた実際の体重を用いて計算され得る。このように計算された投薬に関して、体表面積（ｍ２）は、以下のＤｕｂｏｉｓ法を使用して、処置経過の開始前に計算される：ｍ２＝（ｗｔ ｋｇ０．４２５×高さｃｍ０．７２５）×０．００７１８４。それ故、いくつかの実施形態では、該方法は、約０．０１ｍｇ／ｍ２から約１０ｍｇ／ｍ２の投与量を提供するのに十分な抗体を投与する工程を含むことができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、β−グルカンおよび医薬製剤は、例えば、１週当たり単回投与量から複数回投与量まで同時投与されてもよいが、いくつかの実施形態では、該方法は、β−グルカンおよび医薬製剤をこの範囲外の頻度で同時投与することによって実行されてもよい。特定の実施形態では、β−グルカンおよび医薬製剤は、およそ１年に１回から１週間に１回投与されてもよい。
【００３０】
用語「及び／又は」は、挙げられる要素の１つ又はすべて、あるいは挙げられる要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味し、用語「含む」およびその変形は、これらの用語が明細書および請求項に現われる場合に限定するようには意味していない。別段の定めがない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、交換可能に使用され、１つ又は２つ以上を意味し、エンドポイントによる数値範囲の詳述は、その範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１乃至５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００３１】
前の記載において、特定の実施形態が、明瞭さのために分離して記載され得る。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴との適合性がないことを明確に明記していない限り、特定の実施形態は、１つ以上の実施形態に関連して本明細書で記載される適合可能な特徴の組み合わせを含むことができる。
【００３２】
別々の工程を含む本明細書に開示される方法に関して、該工程は任意の実現可能な順番で行われてよい。また、適宜、２工程以上の任意の組み合わせが一斉に実行されてもよい。  本発明は以下の実施例によって例証される。特定の例、物質、量、および手順が、本明細書で明記されるような本発明の範囲および精神に従って広く解釈されるべきことを理解されたい。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１＞
インビトロでの培養されたヒトのＭ１およびＭ２のマクロファージの樹立および特徴づけ：ヒトの全血からのＣＤ１４＋単球を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配および磁気ビーズ分離を使用して濃縮した（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）。その後、濃縮した単球（１ｍＬ当たり５×１０５細胞）を、６日間、５％の自己血清および１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足したＭ１極性のＸＶｉｖｏ １０培地（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ）または１０％の自己血清および５０ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトマクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足したＭ２極性のＸＶｉｖｏ １０培地の条件下で培養した。β−グルカンの効果を評価するために実行された実験において、全血を、まず３７℃で２時間、ビヒクル（クエン酸ナトリウム緩衝液）または２５μｇ／ｍＬの可溶性のβ−グルカンでインキュベートし、その後、単球を分離し、分化した。マクロファージを表現型分析のために採取する前に、形態を確認した。６日目のマクロファージ培養物（ＭＣＭ）の培養培地を集め、遠心沈殿させて、汚染された細胞ペレットを除去し、その後、ＥＬＩＳＡによる続くサイトカイン分析のために凍結したか、あるいは表面マーカーまたはＣＤ４ Ｔ細胞増殖の評価のためにＣＤ３及びＣＤ２８の刺激を受けたＣＤ４ Ｔ細胞（ＭＣＭ−ＣＤ４ Ｔ）との共培養のセットアップに使用した。マクロファージを、表面マーカーの調節またはＣＤ４ Ｔ細胞増殖に対する効果の評価のために、６日目にＣＤ３及びＣＤ２８またはＣＤ３のみの刺激を受けたＣＤ４ Ｔ細胞（Ｍａｃ−ＣＤ４ Ｔ）との共培養のセットアップに使用した。Ｍａｃ−ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の研究に関して、Ｍ１またはＭ２のマクロファージを、１：１０の比率で、ＣＤ３及びＣＤ２８またはＣＤ３のみの刺激を受けた、ＣＦＳＥ標識化した、自己由来のＣＤ４ Ｔ細胞で培養した。Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーによって実験の終わり（９日目から１１日目）に測定し、結果は、ＣＦＳＥ希釈ピークとしてグラフで示されている。ＣＤ３のみの刺激を受けたＴ細胞の評価を、常に１１日目に行った。定量的結果を、培養条件の各々において三重のウェルの各々に対して計算されたＤｉｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（個体群が受けた細胞分裂の平均数）として報告した。Ｍａｃ−ＣＤ４ Ｔ共培養の培養液上清を、続くサイトカイン分析のために集めた。
【００３４】
Ｍａｃ−ＣＤ４ Ｔ細胞表面マーカーの調節の評価に関して、Ｍ２マクロファージを、上に記載されるようにＴ細胞で共培養し、細胞を８日目、９日目および１０日目に採取し、Ｍ２マクロファージおよびＴ細胞の両方上で表面受容体の染色を行った。
【００３５】
ＭＣＭ−ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の研究に関して、ＣＤ３及びＣＤ２８の刺激を受けた、ＣＦＳＥ標識化したＣＤ４ Ｔ細胞を、５０％のＭＣＭで培養した。Ｔ細胞増殖を、上に記載されるように１１日目に測定した。ＭＣＭ−ＣＤ４ Ｔ細胞共培養の培養液上清を、続くサイトカイン分析のために集めた。ＭＣＭ−ＣＤ４ Ｔ細胞表面マーカーの評価を、上に記載されるように実行した。
【００３６】
Ｍ１およびＭ２のマクロファージを、上に記載されるように調製し、特徴づけ、共培養におけるＡ）形態、Ｂ）表現型、Ｃ）Ｍａｃ−ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の機能評価、およびＤ）サイトカイン分析のために特徴づけた。図１Ａ−図１Ｃは、５つの異なる実験からの代表的な結果を含む。
【００３７】
文献通り、Ｍ１の形態は、より丸みを帯びているように見え、Ｍ２は、より細長い線維芽細胞状であった（図１Ａ）。Ｍ１／Ｍ２に特異的なマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって評価した。平均のＭＦＩを、アイソタイプ対照の染色および表面抗原の染色のために計算し、結果は表１に示される。
【００３８】
【表１】
2017524737.tif 000003
【００３９】
表現型に関する文献と一致して、Ｍ１マクロファージは、典型的に、より高レベルのＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）を発現し、一方でＭ２マクロファージは、より高レベルのＣＤ１６３およびＣＤ１４を発現した。さらに、インビトロで分化したＭ２マクロファージと比較して、Ｍ１マクロファージはまた、図１Ｂで示されるように、ＣＤ４ Ｔ細胞が増殖するのを大きく助けた。増殖の増強と同時に、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生の増加が、Ｍ１およびＣＤ４ Ｔ細胞の共培養の上清において観察された（図１Ｃ）。
【００４０】
Ｍ１およびＭ２のマクロファージ（Ｍ１ａおよびＭ２ａのマクロファージとして指定される）の活性化を含む、ヒトのマクロファージのインビトロでの培養および特徴づけのための代替方法に関する工程が、以下に概説される。この方法論を実験の次の段階で使用した。
【００４１】
【表２】
2017524737.tif 000004
【００４２】
上に記載されるように調製され、特徴づけられた、活性化されたＭ１ａおよびＭ２ｓのマクロファージを、形態および表現型のために特徴づけた。５つの異なる実験からの代表的な結果をここで示す。図１Ｄは、Ｍ１ａおよびＭ２ａのマクロファージの形態を示す。Ｍ１ａ／Ｍ２ａに特異的なマーカーの発現を、フローサイトメトリーによって評価した。平均のＭＦＩを、アイソタイプ対照の染色および表面抗原の染色のために計算し、結果を表２に示す。
【００４３】
【表３】
2017524737.tif 000005
【００４４】
＜実施例２＞
Ｍ２からＭ１への再分極に対するβ−グルカンの影響：
ビヒクルまたはβ−グルカン処理した全血からのＭ１およびＭ２のマクロファージを、上に記載されるように調製した。Ｍ１／Ｍ２に特異的なマーカー（ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＰＤ−Ｌ１を含む）のパネルの発現を、フローサイトメトリーによって測定した。β−グルカンでの前処理は、Ｍ１マクロファージ表現型に作用しなかったが、Ｍ２マクロファージ表現型に作用した。図２Ａで示されるように、ＣＤ１６３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、β−グルカン処理したＭ２マクロファージにおいて下方制御される。さらに、ＣＤ８６の表面発現を、ＰＤ−Ｌ１のタンパク質およびｍＲＮＡの両方のレベルと同様に増強した（図２Ｂ）。
【００４５】
次に、ビヒクルまたはβ−グルカン処理したＭ１またはＭ２のマクロファージを、ＣＤ３及びＣＤ２８の刺激を受けた、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識化した自己由来のＣＤ４ Ｔ細胞で培養し、Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーによって実験の終わりに測定した。結果を、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（個体群が受けた細胞分裂の平均数）として定量的に報告した。図２Ｃは、Ｔ細胞をβ−グルカン処理したＭ２マクロファージとともに共培養するによって実行された代表的なＣＦＳＥ希釈Ｔ細胞増殖アッセイであり、その結果は、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増強するβ−グルカン処理したＭ２マクロファージの能力を示す。
【００４６】
ＣＦＳＥ希釈Ｔ細胞増殖アッセイからの培養液上清（図２Ｂ）も、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−ガンマレベルに対して測定した。図２Ｄは、ＩＦＮ−ガンマ産生の同時の増加を示すＩＦＮ−ガンマレベルの代表的なグラフである。したがって、β−グルカンは、Ｍ２からＭ１への再分極に作用し、抗腫瘍性のＴｈ１分極を促す。
【００４７】
＜実施例３＞
高結合性（ｂｉｎｄｉｎｇ）の被験体と低結合性の被験体からの細胞におけるＭ２からＭ１への再分極に対するβ−グルカンの効果の比較：可溶性のβ−グルカンの好中球および単球への結合を評価する初期の研究は、被験体が異なる結合能を有することを明らかにした。さらなる研究で、可溶性のβ−グルカンが高結合性の被験体の免疫細胞の少なくともいくつかに結合し、高結合性の被験体がまた、より高レベルの天然の抗β−グルカン抗体を有していたことが分かった。機能研究は、一般的な結合のカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆｓ）および抗体値を特定し、これは、被験体を高結合性（β−グルカンに対する高応答）および低結合性（β−グルカンに対する低応答）を有するものとして特定するために使用された。
【００４８】
この目的のために、高結合性および低結合性からの可溶性のβ−グルカン処理した単球に由来するＭ１／Ｍ２マクロファージの評価を行った。高結合性および低結合性からのＭ１およびＭ２のマクロファージを、Ａ）表現型、Ｂ）ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の増強、およびＣ）ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生の調節のために続けて評価した。図３Ａ−図３Ｃは、４つの異なる実験からの代表的な結果である。
【００４９】
マーカーのパネルの発現は、ビヒクル処理した及びβ−グルカン処理した、高結合性由来のＭ１およびＭ２のマクロファージのためのフローサイトメトリーによって評価した（ＣＤ１６３を２回評価した）。中央のＭＦＩを、アイソタイプ対照の染色および表面抗原の染色のために計算し、結果を表３に示す。
【００５０】
【表４】
2017524737.tif 000006
【００５１】
ＣＤ１６３およびＣＤ８６を、ビヒクル処理した及びβ−グルカン処理した低結合性由来のＭ１およびＭ２のマクロファージのためのフローサイトメトリーによって評価した。平均のＭＦＩを、アイソタイプ対照の染色および表面抗原の染色のために計算し、結果を表４に示す。
【００５２】
【表５】
2017524737.tif 000007
【００５３】
重要な結果として、β−グルカン処理したＭ２マクロファージは、重要なＭ２マーカーの１つであるＣＤ１６３のより低い発現を有していた。興味深いことに、この結果は、ＣＤ１６３の発現として高結合性にとって特異的であり、ビヒクル処理した及びβ−グルカン処理したＭ２マクロファージ間では同じままであった。
【００５４】
次に、ＣＤ３およびＣＤ２８の刺激を受けたＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増強する、高結合性および低結合性からの可溶性のβ−グルカン処理した単球に由来するＭ１／Ｍ２マクロファージの能力を評価した。図３Ａは、高結合性におけるＣＤ４ Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示し、一方で図３Ｂは、低結合性における結果を示す。β−グルカン処理したＭ２マクロファージは、高結合性においてビヒクル処理したＭ２マクロファージで観察されたものと比較して、ＣＤ３及びＣＤ２８の刺激を受けたＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増強する著しくより高い能力を有したが、低結合性においては増殖の増強はなかった。さらに、β−グルカン処理したＭ１マクロファージは、高結合性または低結合性のいずれかにおいてビヒクル処理したＭ２マクロファージと比較して、この機能的な能力の差を示さなかった。
【００５５】
その後、ビヒクル処理した及びβ−グルカン処理したＭ２マクロファージのＩＦＮγおよびＩＬ−４産生の調節を評価した。増殖の増強と同時に、ＩＬ−４ではなくＩＦＮ−γの産生の著しい増加が、高結合性においてβ−グルカン処理したＭ２マクロファージとＣＤ４ Ｔ細胞の共培養で観察された（図３Ｃ）が、低結合性では観察されなかった（図３Ｄ）。したがって、β−グルカン処理した単球由来のＭ２マクロファージは、高結合性の被験体においてＭ１様である。
【００５６】
＜実施例４＞
免疫抑制条件でのＭ２からＭ１への再分極に対するβ−グルカンの効果：
免疫抑制サイトカインの存在下でのβ−グルカン処理したＭ２ａおよびβ−グルカン処理したＭ２のマクロファージの表現型および機能の評価を実行した。Ｍ２またはＭ２ａのマクロファージを、上に記載されるように調製した。３日目に、腫瘍調整培地（ＴＣＭ）を、培養物の量の７０％を占めるＭ２マクロファージ培養物に加え、その後、６日目にＣＤ１６３の発現および機能活性を評価した。膵癌細胞株であるＢｘＰＣ３からのＴＣＭは、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４などを含む、いくつかの免疫抑制サイトカインを含有すると示されてきた。Ｍ２ａマクロファージを、上に記載されるようにＩＬ−４において培養した。
【００５７】
ＴＣＭ中で培養されたＩＬ−４およびＭ２マクロファージにおいて培養されたβ−グルカン処理したＭ２ａマクロファージを、最初に、ＣＤ１６３およびＣＤ８６の発現のために評価した。ＣＤ１６３およびＣＤ８６を、フローサイトメトリーによって評価し、平均のＭＦＩを、アイソタイプ対照の染色および表面抗原の染色のために計算し、結果を表５に示す。
【００５８】
【表６】
2017524737.tif 000008
【００５９】
Ｍ−ＣＳＦを使用する前のＭ２分化実験で見られるように、ＴＣＭ中で培養されたβ−グルカン処理した単球はまた、ＣＤ１６３の著しいダウンレギュレーションを示した。さらに、β−グルカン処理したＭ２マクロファージは、より高いＨＬＡ−ＤＲ発現を有していた（データは示されず）。
【００６０】
その後、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を調節する能力の機能評価を、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖アッセイによって実行した（各条件において３回または６回の反復）。ＩＬ−４中で培養されたＴＣＭおよびＭ２ａマクロファージにおいて培養されたβ−グルカン処理したＭ２マクロファージは、ビヒクル処理したＭ２およびＭ２ａのマクロファージで観察されたものと比較して、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増強する能力を維持した。増殖の増強と同時に、ＩＦＮ−γの産生の著しい増加が、マクロファージおよびＣＤ４ Ｔ細胞の共培養で観察された（図４）。
【００６１】
上記の実施例は、可溶性のβ−グルカンが、ＣＤ１６３の発現の減少、ＣＤ８６の発現の増加、およびＣＤ４ Ｔ細胞増殖を抑制するＭ２の能力の阻害によって実証されるように、Ｍ２分極を阻害する及びより多くのＭ１様細胞を引き起こす能力を有することを実証している。Ｍ−ＣＳＦまたは腫瘍調整培地（ＴＣＭ）と組み合わせたＩＬ−４の存在によってシミュレートされた、免疫抑制条件下であっても、可溶性のβ−グルカンは、Ｍ２分極を阻害し、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を助けるその能力を増強することができた。Ｍ２可溶性のβ−グルカンによるＣＤ４ Ｔ細胞増殖の増強は、炎症促進性、Ｔｈ１極性化サイトカイン、ＩＦＮ−γの増加により達成され、免疫抑制サイトカインＩＬ−４の産生の変化はなかった。
【００６２】
＜実施例５＞
Ｔｒｅｇの存在下でのＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖及び活性化に対するβ−グルカンの効果：血漿を得るために、２５μｇ／ｍＬのβ−グルカン又はビヒクルで全血を６時間処理し、遠心沈殿させ、血漿を取り除いた。５０，０００の自己ＣＦＳＥ標識化ＰＢＭＣを、５０，０００のＴ細胞活性化ＣＤ３／２８ビーズ（Ｔ細胞の拡大と活性化のためのＤＹＮＡＢＥＡＤＳヒトＴ−活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８）の存在下で３日間、処理した血漿中で培養した。培養の終わりに、ＰＢＭＣをＣＤ４及びＣＤ８で染色し、Ｔ細胞増殖をＣＦＳＥ希釈により測定した。図５Ａにおいて典型的なＣＦＳＥ希釈プロットにより示されるように、β−グルカンで処理した全血からの血漿は、ビヒクルで処理した対照と比較して、ＣＤ４とＣＤ８の両方の増殖を著しく増大させた。
【００６３】
次に、ＣＤ４及びＣＤ８の細胞活性化に対する可溶性のβ−グルカンの効果を示すために、上述のＴ細胞増殖アッセイを再び行なった。しかし、３日目に、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂの産生及びＣＤ２５のアップレギュレーションを含む活性化のマーカーのために、細胞を染色した。図５Ｂに示されるグラフは、β−グルカンで処理した血漿がＣＤ４及びＣＤ８の細胞活性化を増強することを実証している。
【００６４】
血漿分離前の６時間のインキュベーション期間にわたって全血を処理した時に、増殖の増大は最大であり、このことは、Ｔ細胞増殖に対するこの効果が間接的機構の結果（即ち、先天性の免疫細胞によるサイトカイン放出）であることを示している。β−グルカンによるＴ細胞増殖の増大が直接的又は間接的であるかを判定するために、後に未処置の（ビヒクル）全血からの血漿を、自己ＰＢＭＣを加える前にβ−グルカン又はビヒクルで処理したことを除いて、上述のようにＴ細胞増殖アッセイを行った。ＣＦＳＥ希釈を、ＦＬＯＷＪＯソフトウェアを用いてＤｉｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘにより定量化し、ビヒクル対照制御に対する倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）としてプロットした。図５Ｃに示される結果は、β−グルカンの増強された効果が間接的機構によるものであることを示している。
【００６５】
このようなＰＢＭＣ培養物がＴｒｅｇを含有しているため、Ｔｒｅｇの抑制能は、可溶性のβ−グルカンの存在下で変わるものと思われ、β−グルカンがＴｒｅｇの抑制に影響したかを判定するために研究を行った。（上述の）β−グルカンで処理又はビヒクルで処理した全血からの血漿を、２５，０００の分離されたＣＦＳＥ標識化自己ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−）に加えて、それに伴い分離された自己Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の数は増加し、その結果ウェルの比率が増加した。次に、細胞を３日間、５０，０００のＴ細胞活性化ＣＤ３／２８ビーズで刺激した。その後、ＣＦＳＥ希釈により増殖を測定し、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘにより定量化して、それを用いて共培養におけるＴｒｅｇの％抑制を計算した。％抑制＝１００−（ＴｒｅｇウェルのＤｉｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ／１：０のウェルのＤｉｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）／１００。結果を図５Ｄに示す。β−グルカンで処理した全血からの血漿は、ビヒクルで処理した全血からの血漿と比較して、Ｔｒｅｇの抑制能の著しい減少を示した。
【００６６】
β−グルカンによるＴｒｅｇの抑制はまた、結果としてＩＦＮ−ガンマの産生の増大をもたらした。Ｔｒｅｇ抑制アッセイを上述のように行い、共培養の３日後、ＩＦＮ−ガンマの産生のために上清を分析した。図５Ｅは、８：１であるＴ細胞とＴｒｅｇの比率で培養されたウェルからのＩＦＮ−ガンマの産生の結果を示している。まとめると、これらの結果は、β−グルカンが、抗腫瘍の適応可能なエフェクター機能の増強を結果としてもたらすＴｒｅｇ機能と共に、ＣＤ４及びＣＤ８の増殖に影響することを示している。
【００６７】
＜実施例６＞
インビトロで培養されたヒト未成熟単球由来の樹状細胞（ｉｍＭｏＤＣ）及び成熟単球由来の樹状細胞（ｍＭｏＤＣ）の樹立と特性付け：マクロファージ及び樹状細胞が、自然免疫と適応免疫を架橋する２つの重要な抗原提示細胞であると仮定して、ヒト単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）に対する、可溶性のβ−グルカンの表現型効果及び機能効果も評価した。可溶性のβ−グルカン又はビヒクルで処理した全血から濃縮した単球を、樹状細胞の分化のために、適切なサイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、加えてＩＬ−４を含有する培地で培養した。インビトロでの培養、及びヒトＭｏＤＣの評価のための方法に含まれる工程を、以下に概説する。
【００６８】
【表７】
2017524737.tif 000009
【００６９】
上述のように調製したｉｍＭｏＤＣとｍＭｏＤＣを図６Ａに示す。ｍＭｏＤＣの形態は、長い突出部又は樹状突起の存在を特徴とする。
【００７０】
ｍＭｏＤＣを、フローサイトメトリーによってＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲの発現のために評価し、中間のＭＦＩをアイソタイプ対照染色及び表面抗原染色のために計算して、結果を表６に示す。
【００７１】
【表８】
2017524737.tif 000010
【００７２】
ｍＭｏＤＣは、成熟及び同時刺激のマーカーであるＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、同様にＨＬＡ−ＤＲの表面発現の増大を示した。更に、これらｍＭｏＤＣはまた、ＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞拡大の増加を誘発する、同種の混合リンパ球反応（各条件において４つの複製）における免疫原性を示した（図６Ｂ）。
【００７３】
＜実施例７＞
ＭｏＤＣの成熟に対するβ−グルカンの効果：高結合性と低結合性の、可溶性のβ−グルカンで処理した全血から調製したｍＭｏＤＣの表現型評価と機能評価を行った。高結合性と低結合性からのｍＭｏＤＣを上述のように調製した。ｍＭｏＤＣを、フローサイトメトリーによってＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲの発現のために評価し、中間のＭＦＩをアイソタイプ対照染色及び表面抗原染色のために計算して、結果を表７に示す。
【００７４】
【表９】
2017524737.tif 000011
【００７５】
高結合性に由来するβ−グルカンで処理したｍＭｏＤＣ上でのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＨＬＡ−ＤＲの発現の増加は、これらｍＭｏＤＣが低結合性由来のものよりも成熟していることを示す。
【００７６】
高結合性由来のβ−グルカンで処理したｍＭｏＤＣはまた、低結合性由来の細胞（図７Ｂ）の上でのＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞拡大（図７Ａ）の増加を再度誘発する、アロ−ＭＬＲにおける免疫原生の増加（各条件において４つの複製）を示した。
【００７７】
加えて、高結合性由来のβ−グルカンで処理したｍＭｏＤＣは、低結合性由来の細胞及びビヒクルで処理したｍＭｏＤＣの上でのＩＦＮ−γの産生を調節することができた（図７Ｃ）。
【００７８】
β−グルカンで処理した単球由来のＭｏＤＣは、免疫抑制条件においてさえも更に成熟している。ＭｏＤＣを上述のように調製した。０日目に培養物の容量の７０％を占めるためにＴＣＭを加え、ＴＣＭは培養期間中に存在していた。その後、ＴＣＭの存在下で培養されたｍＭｏＤＣを、表現型の変化のために評価した。中間のＭＦＩをアイソタイプ対照染色及び表面抗原染色のために計算し、結果を表８に示す。
【００７９】
【表１０】
2017524737.tif 000012
【００８０】
＜実施例８＞
細胞間接触及び可溶性因子が、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージによりＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増大させる：読み取り情報としてＣＤ４ Ｔ細胞増殖を用いて、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージにより増殖を開始させる際の細胞間接触又は可溶性因子の要件を調べた。マクロファージとＴ細胞との間の細胞間接触を調べるために、ＣＤ２８が存在しない状態でβ−グルカンで処理したＭ２マクロファージと共培養した時に、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を測定し、表面活性化マーカーの同時刺激及び調節を、共培養中のβ−グルカンで処理したＭ２マクロファージとＴ細胞の両方の上で調べた。
【００８１】
細胞間接触の評価を以下のように行なった：ビヒクル及びβ−グルカンで処理したＭ２マクロファージ、及び、ＣＤ３＆ＣＤ２８で刺激したＣＤ４ Ｔ細胞共培養物に対してＣＤ３のみで刺激したＣＤ４ Ｔ細胞共培養物を、ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖とＩＦＮ−γの産生の測定のために利用した。
【００８２】
図８Ａに示されるように、外生的なＣＤ２８抗体がない状態でＣＤ４ Ｔ細胞と共に培養された、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージは、ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を増強する能力が著しく高いことを実証した。増殖の増強に付随して、著しく増加したＩＦＮ−γの産生を、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージとＣＤ４ Ｔ細胞の共培養において観察した（図８Ｂ）。
【００８３】
マクロファージとＣＤ３＆ＣＤ２８で刺激したＴ細胞の両方の上での表面マーカー発現の変化も測定した。共培養物からの、ビヒクル及びβ−グルカンで処理したＭ２マクロファージとＣＤのＴ細胞を、同時刺激又は同時抑制分子の調節のためにフローサイトメトリーによって評価した。図８Ｃと表９は、２つの異なる実験の典型的な結果である。
【００８４】
【表１１】
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【００８５】
試験した全ての表面マーカーの中で、ビヒクルで処理したＭ２マクロファージ上での表面発現と比較して、ＣＤ８６（８日目）とＰＤ−Ｌ１（９日目）の表面発現の相対的な増加を、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージの表面上で観察した。ＰＤ−１（９日目）の発現増加を、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージと共に共培養したＴ細胞の表面上に観察した。
【００８６】
β−グルカンで処理したＭ２マクロファージから分泌された可溶性因子が必要か否かを判定するために、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージＭＣＭ（５０％の容量）と共に共培養したＣＤ４ Ｔ細胞増殖の測定を行い、ＭＣＭでインキュベートしたＴ細胞上での表面活性化マーカーの調節を観察した。図９は、２つの異なる実験の典型である。ＣＤ４ Ｔ細胞増殖アッセイにより評価した時、ＣＤ４ Ｔ細胞と共に共培養された、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージＭＣＭは、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージＭＣＭと比較してＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を増強する能力が著しく高いことを実証した（図９）。加えて、ビヒクル及びβ−グルカンで処理したＭ２マクロファージＭＣＭにおいて培養されたＣＤ４ Ｔ細胞を、同時刺激又は同時抑制分子（ＣＤ８０、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１）の調節のために評価した。驚くことに、どのＴ細胞マーカーにも変化は観察されなかった（データは示さず）。
【００８７】
＜実施例９＞
高結合性ｖｓ低結合性における、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージの分析：前述で議論したように、被験体における抗β−グルカン抗体（ＡＢＡ）の閾値は、β−グルカン免疫療法に重要であることが示された。それ故、Ｍ１／Ｍ２の極性化を調節するβ−グルカンの能力におけるＡＢＡ閾値の重要性を調べた。高結合性対低結合性におけるＭ１／Ｍ２の極性化を調節するβ−グルカンの能力を、表現型評価及び機能評価の両方により判定した。
【００８８】
４つの高結合性及び４つの低結合性からのＭ２マクロファージを調製し、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を調節するそれらの能力について評価した。様々なＣＤ４ Ｔ細胞増殖条件からの上清を、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて測定した。図１０に示す結果は、４つの異なる実験からの典型である。ビヒクルで処理したＭ２マクロファージとＣＤ４ Ｔ細胞の共培養において生成されたＩＮＦ−γのレベルに対する倍率変化を、４つのドナー各々についてプロットする。
【００８９】
低結合性において、β−グルカンは、Ｍ１／Ｍ２極性化条件における単球由来のマクロファージ上で何れの表現型マーカーも調節せず（データは示さず）、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖アッセイによる低結合性の機能評価において、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージは、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増強せず、ＩＦＮ−γの産生を増大させなかった。
【００９０】
＜実施例１０＞
血清交差研究：β−グルカンが低結合性においてＭ１／Ｍ２極性化の調節を示さなかったので、より高レベルのＡＢＡを含有する血清の存在下での低結合性からの単球を用いたβ−グルカンによる調節（高結合性からの血清交差）を、評価した。これを試験するために、Ｍ２マクロファージを、若干の改変と共に上述のように調製した。低結合性の全血を遠心沈殿させて血漿を取り除き、次いで、高結合性から得た血清で細胞を再構築した。再構築した血液を、３７℃で２時間、ビヒクル又はβ−グルカン（２５μｇ／ｍＬ）で処理した。抗β−グルカン特異的モノクローナル抗体及びその後のフローサイトメトリーの使用により、単球を結合性について評価した。その後、全血中のビヒクル又はβ−グルカンで処理した単球を分離し、Ｍ２マクロファージに分化して、Ｍ２細胞（データは示さず）又はＭＣＭの何れかを用いて、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増強し（各条件において６つの複製）且つ上述の方法を使用してＩＦＮ−γの産生を増大させるそれらの能力について評価した。
【００９１】
低結合性の全血中の単球は、β−グルカンに結合しなかったが、より高レベルのＡＢＡを含有する高結合性の血清が低結合性の全血に加えられた時、著しく高い結合性を示した（図１１Ａ）。加えて、高結合性の血清を渡る、低結合性のβ−グルカンで処理したＭ２マクロファージからのＭＣＭは、ビヒクルで処理したＭ２マクロファージと共に観察されたものと比較して、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を増強する能力が著しく高い。増殖の増強に付随して、著しく増加したＩＦＮ−γの産生を、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージとＣＤ４ Ｔ細胞の共培養において観察した（図１１Ｂ）。
【００９２】
＜実施例１１＞
免疫抑制サイトカイン（ＴＣＭ）の存在下で培養された、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージ上でのＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーション：単球又はＭ２マクロファージを上述のように調製した。３日目に、培養物の容量の７０％を占めるためにＴＣＭを加えて、その後、ＣＤ４ Ｔ細胞と共に再び共培養された時にＴＣＭによるＰＤ−Ｌ１の発現を評価した。
【００９３】
ＴＣＭにおいて培養された、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージは、ＰＤ−Ｌ１のより高度の表面発現を有していた（図１２Ａ）。ＣＤ４ Ｔ細胞と共に共培養された時にも、発現は増加した（図１２Ｂ）。
【００９４】
上述のシステムを使用して、β−グルカンが、重要なＭ２マーカーであるＣＤ１６３の発現の減少により、及び、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を抑えるＭ２の能力を阻害することにより実証されるように、Ｍ２極性化を阻害する能力を有していることを実証した。免疫抑制環境下でさえ、Ｍ−ＣＳＦと組み合わせたＩＬ−４（データは示さず）又は腫瘍調整培地（ＴＣＭ）の何れかの存在により刺激されると、β−グルカンは、Ｍ２極性化を阻害し、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を支援する能力を増強することができた。Ｍ２−β−グルカンによるＣＤ４ Ｔ細胞増殖の増強は、炎症促進性、Ｔｈ１極性化サイトカイン、ＩＦＮ−γの増加を伴い、免疫抑制サイトカインのＩＬ−４の産生における変化は無かった。Ｔ細胞活性化及びＩＦＮ−γの産生の増加により予測されるように、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージ上のＰＤ−Ｌ１及びＴ細胞上のＰＤ−１の表面発現の増加を、観察した。細胞により分泌された可溶性因子と同様に、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージ自体も、ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖の増強に重要である。最後に、β−グルカンは、より高レベルのＡＢＡを有している健康なドナーからの細胞においてのみＭ２極性化を阻害した。
【００９５】
＜実施例１２＞
ＭｉａＰａＣａにおけるＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーション：β−グルカン及びビヒクルで処理したＭ２マクロファージ、並びにβ−グルカンで処理したＭ２マクロファージ＋ＡＢＡを、高結合性の血清及び低結合性の血清と共に培養し、腫瘍細胞上でのＰＤ−Ｌ１の発現を評価した。図１３は、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージが、高結合性において腫瘍細胞上でのＰＤ−Ｌ１の発現を増加させ、及びＡＢＡの付加により、β−グルカンで処理したＭ２マクロファージが低結合性において腫瘍細胞上でのＰＤ−Ｌ１の発現も増加したことを示す。
【００９６】
＜実施例１３＞
骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に対する可溶性のβ−グルカンの効果：ＭＤＳＣは、血液、リンパ節、及び骨髄中に、並びに癌を患う大半の患者と実験動物中の腫瘍部位にて蓄積し、適応免疫及び自然免疫の両方を阻害する。ＭＤＳＣは、腫瘍により分泌され及び宿主により分泌された因子により誘発され、その多くは炎症促進性分子である。炎症促進性メディエータによるＭＤＳＣの誘発は、免疫監視機構と抗腫瘍免疫をダウンレギュレートし、それにより腫瘍増殖を促進するＭＤＳＣの蓄積を、炎症が促進するという仮説を引き起こした。
【００９７】
ＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧでの処置を受けている症例研究の被験体から様々な時間で血液を抜き、それをＭＤＳＣの存在について分析した。第１の採血を、注入前、８つのサイクル、１日目に行った。図１４Ａに示されるように、ＣＤ３３＋、ＭＤＳＣの大きな集団は、末梢血に存在する。第２の採血を、注入後、８つのサイクル、１日目に行った。図１４Ａの第２のパネルに示されるように、輸液後数時間以内に、ＭＤＳＣは一時的に消滅する。最後の血液サンプルを、注入前、８つのサイクル、１５日目に採取した。ＣＤ３３＋ＭＤＳＣは、末梢血中に再び存在する。
【００９８】
別の研究において、ヒト臍帯血をＣＤ３４＋細胞のために濃縮し、９日間培養して、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（ＭＤＳＣ）を産生した。その後、可溶性のβ−グルカン又はクエン酸緩衝液（対照）でＭＤＳＣを処理し、Ｔ細胞増殖を抑えるそれらの能力を評価した。Ｔ細胞増殖アッセイを、処理した又は未処理のＭＤＳＣに対するＣＤ８のＴ細胞の比率を２：１として行った。図１４Ｂに示されるように、β−グルカンで処理したＭＤＳＣは、Ｔ細胞増殖に対しあまり抑制的ではなかった。
【００９９】
これらの結果は、β−グルカンがＭＤＳＣ集団を調節することで、それらに末梢血循環を一時的に残させ、且つＴ細胞増殖をあまり抑制させないことを示す。故に、１以上の癌の免疫療法薬又は化学療法薬を、特に一時的にＣＤ３３＋細胞集団が無い期間中に、可溶性のβ−グルカンと組み合わせて投与する場合、治療は腫瘍に対してより有効である。
【０１００】
＜実施例１４＞
β−グルカンで処理したＭ２マクロファージ／ＭｏＤＣとＴ細胞共培養からの上清は、腫瘍細胞上でのＰＤ−Ｌ１発現を誘発する：Ｍ２マクロファージとＭｏＤＣを上述のように調製した。その後、マクロファージとＭｏＤＣを、前述のようなＴ細胞増殖アッセイに使用した。これら増殖アッセイからの上清を集め、ＮＳＣＬＣ、乳房、膵臓、結腸、及びＢ細胞リンパ腫を含む様々な腫瘍細胞株でインキュベートした。これら腫瘍細胞株上でのＰＤ−Ｌ１の発現を、フローサイトメトリーにより４８時間後に評価した。図１５には、３つの異なる実験の典型的な結果が示されている。
【０１０１】
Ｔ細胞は、それらのエフェクター機構に３つのシグナルを必要とする。シグナル１は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ分子のコンテキストにおいて提示された抗原であり、シグナル２は、ＡＰＣ上の膜共刺激分子により提供され、及びシグナル３は、エフェクター機能のための環境で産生されたサイトカインである。ＰＤ−Ｌ１などの共阻害分子は、Ｔ細胞のエフェクター機能を阻害することができる。
【０１０２】
インビトロでのβ−グルカンで処理した単球由来のマクロファージと樹状細胞は、より高い発現レベルのＰＤ−Ｌ１を有しているが、処置はまた、Ｔ細胞エフェクター機能の増強を可能にする、共刺激分子ＣＤ８６（シグナル２）、及びサイトカイン（シグナル３）の発現を増大させる。
【０１０３】
β−グルカンにより誘発された、より広範囲の自然免疫及び適応的免疫反応も、腫瘍細胞株上でのＰＤ−Ｌ１発現を増強する。これらの結果は、免疫細胞と腫瘍細胞の両方の上でβ−グルカンにより誘発されたＰＤ−Ｌ１発現のアップレギュレーションが、チェックポイント阻害剤での癌免疫療法によりそれを有望な組み合わせパートナーにすることを実証する。
【０１０４】
β−グルカンが、共刺激分子の発現及び免疫刺激サイトカインの産生の増加といった、代償機構によるＰＤ−Ｌ１アップレギュレーションの阻害作用を相殺する能力も有していることに注目することも、等しく重要である。
【０１０５】
＜実施例１５＞
ＴＭＥに対する、抗血管新生薬と組み合わせた可溶性のβ−グルカンの効果：腫瘍血管新生は、ＴＭＥにおける免疫機能を変え、その結果免疫抑制環境をもたらす。抗ＶＥＧＦＲ２抗体ＤＣ１０１（マウスラムシルマブ）などの抗血管新生薬は、癌治療に有用であると証明されてきた。可溶性のβ−グルカンは、より多くの抗腫瘍の環境に対してＴＭＥを歪めることができるので、ＤＣ１０１と組み合わせて用いることで、マウスにおけるＮＣＩ−Ｈ４４１非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の皮下異種移植片を処置し、ＤＣ１０１抗体の効果を増大させる。
【０１０６】
６〜８週齢のメスの胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に、０．２ｍｌの用量で５ｘ１０６ Ｈ４４１腫瘍細胞を皮下注射した。以下の薬剤により平均腫瘍容積が約１５０ｍｍ３に到達した場合、マウスに二週に一回投薬した：
・０．２ｍｌ／マウスのビヒクル
・１．２ｍｇ／マウスのＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧ（Ｂｉｏｔｈｅｒａ， Ｉｎｃ．）
・１０ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇのＤＣ１０１（Ｃｌｏｎｅ： ＤＣ１０１ Ｃａｔａｌｏｇ＃： ＢＥ００６０）
１０日目と最後の投薬後２時間で血液サンプルを採取した。
【０１０７】
処置群は、ビヒクル（ＰＢＳ対照）、ＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧのみ、ＤＣ１０１のみ、及びＤＣ１０１＋ＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧを含んでいた。一旦大きさが１５０ｍｍ３の群平均に到達したら、腫瘍を処置群に無作為化した。１０ｍｇ／ｋｇの処置群の結果を図１６に示す。
【０１０８】
グラフから明らかなように、ＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧ＋ＤＣ１０１（補体活性化、腫瘍を標的としない抗体（ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ））は、腫瘍の増殖を最小限にするよう相乗的に作用した。故に、（補体活性化、腫瘍を標的としない抗体であるか、又はそうでない場合もある）抗血管新生薬と組み合わせた可溶性のβ−グルカンは、有効な癌治療である。
【０１０９】
＜実施例１６＞
抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた可溶性のβ−グルカンは腫瘍の無い生存率を増強する：別の動物研究において、マウスにＭＣ３８腫瘍細胞を注入し、処置群に無作為化した。８〜１２週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に、０．１ｍｌの容量で１ｘ１０６のＭＣ３８腫瘍細胞、即ち低レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する結腸腺癌腫を皮下注射した。３日目に始めてから二週に一回、マウスに以下の薬剤を投薬した：
・０．２ｍｌ／マウスのビヒクル
・１．２ｍｇ／マウスのＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧ（Ｂｉｏｔｈｅｒａ，Ｉｎｃ．）
・１００μｇ／マウスの抗ＰＤＬ−１ Ｃｌｏｎｅ： １０Ｆ．９Ｇ２ ＢｉｏＸｃｅｌｌ Ｃａｔａｌｏｇ＃： ＢＥ０１０１
血液サンプルを、投薬１の１時間前、投薬３の２時間後、エンドポイント、及び最後の投薬（２０日目）の２時間後に集めた。処置群は、ビヒクル（ＰＢＳ対照）、ＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧのみ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ、及び抗ＰＤ−Ｌ１＋ＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧを含んでいた。一旦大きさが１５０ｍｍ３の群平均に到達したら、腫瘍を処置群に無作為化した。結果を表１０に示す。
【０１１０】
【表１２】
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【０１１１】
再び、抗ＰＤ−Ｌ１抗体＋可溶性のβ−グルカンの組み合わせは、腫瘍の無い生存率を効果的に増強するよう相乗的に作用した。
【０１１２】
腫瘍上でのＰＤ−Ｌ１発現は、抗ＰＤ−１抗体反応性のためのバイオマーカーであることも、注目されたい。それ故、可溶性のβ−グルカンが腫瘍上でのＰＤ−Ｌ１発現を誘発するので、可溶性のβ−グルカンは、抗ＰＤ−１抗体の有効性も増強する。このことは、上述の可溶性のβ−グルカンでの処理により誘発されたＰＤ−１発現の増大により確認される。
【０１１３】
＜実施例１７＞
可溶性のβ−グルカンと抗血管新生薬のＴＭＥに対するインビボでの効果：Ｈ１２９９ＮＳＣＬＣ腫瘍を持つマウスに、他のマウスの研究について上述されるようにベバシズマブ（抗血管新生抗体）とＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧを投与した。図１７Ａに示されるように、ベバシズマブとＩＭＰＲＩＭＥ ＰＧＧの組み合わせを投与した処置群は、ＰＤ−Ｌ１発現の増加を示し、図１７Ｂは、アルギナーゼ１のダウンレギュレーションを示しており、図１７Ｃは、ベバシズマブ単独を投与した群のものと比較した、ＴＭＥのＣ１１ｂ陽性の自然免疫浸潤細胞中のｉＮＯＳ発現における増加を示す。ｉＮＯＳの増加とアルギナーゼ１の減少は、Ｍ１、即ち免疫賦活性環境を示すマーカーである。このデータは、可溶性のβ−グルカンが抗血管新生薬の有効性を増大し且つインビボでＴＭＥを調節することを明確に示している。
【０１１４】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋとＲｅｆＳｅｑにおける塩基配列登録、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列登録、及び、ＧｅｎＢａｎｋとＲｅｆＳｅｑにおける注釈されたコーディング領域の翻訳）は、それらの全体において参照により組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文献の開示との間に、何らかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示が適用される（ｇｏｖｅｒｎ）。前述の詳細な説明と実施例は、明確な理解のためだけのために提供されるものである。そこからは不必要な制限を理解することができない。本発明は、請求項により定められる発明内に含まれる。当業者に明白な変更について示され且つ記載される、正確な詳細に制限されることはない。
【０１１５】
他に示されない限り、明細書と請求項において使用される、成分の量や分子量などを表わす数字は全て、用語「約」により全ての例において修正されていると理解されるものである。従って、その他に反対に示されない限り、本明細書及び請求項で述べられた数のパラメータは、本発明によって得られるよう求められる所望の特性に依存して変わり得る、およそのものである。少なくとも、及び、均等論を請求項の範囲に制限されないように、各数的パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の四捨五入の技術の適用により、解釈されねばならない。
【０１１６】
本発明の広い範囲を説明する数値域とパラメータがおよそのものであるにもかかわらず、特定の実施例で述べられた数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、全ての数値は、それた各々の試験測定値において見出される標準偏差から必ず結果として生じる範囲を本質的に含有している。
【０１１７】
全ての見出しは読者の利便性のためのものであり、そのように特定されない限り、この見出しに従うテキストの意味を制限するためには使用されるものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
2017524737.tif 000019
【図２Ｂ】
2017524737.tif 000020
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2017524737.tif 000022
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2017524737.tif 000029
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【国際調査報告】
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