(57)【要約】  一連の機能ドメインの融合構築物であるキメラタンパク質は、疾患を患っているヒト対象に治療剤を送達するために使用される。一部の実施形態では、キメラタンパク質は、治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域を含む。輸送領域は、対象内の罹患細胞の細胞膜を横切ってキメラタンパク質を移動させる。細胞内の切断領域でキメラタンパク質がひとたび切断されると、治療領域が輸送領域から分離され、治療領域は細胞内で正常に機能することができる。治療領域は、例えば、筋ジストロフィー症、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等の治療において有効であり得る。
2017513921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とするキメラタンパク質。
【請求項２】
前記切断領域が、前記治療領域のＮ末端に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記切断領域が、前記治療領域のＣ末端に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記治療領域が、完全長ジストロフィン、短縮型ジストロフィン、及びこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記輸送領域が、水疱性口内炎ウイルスＧ及び水疱性口内炎ウイルスＧの機能性バリアントからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記水疱性口内炎ウイルスＧバリアントは、少なくとも４つまでのアミノ酸の置換が可能であることを特徴とする、請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記水疱性口内炎ウイルスＧバリアントが、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性からなる群から選択される野生型水疱性口内炎ウイルスＧとの配列同一性を少なくとも有することを特徴とする、請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
前記切断領域が、前記細胞膜を横切る前記キメラタンパク質の輸送の後に切断されるように構成されていることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記切断領域が、膜メタロプロテアーゼの切断部位であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記キメラタンパク質の配列の少なくとも一部が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記切断領域がアミノ酸配列ＰＬＧＬＷＡＬを含み、各アミノ酸が保存的に置換されていてもよいことを特徴とする、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記切断領域がアミノ酸配列Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓ／Ｔ）を含み、Ｐがプロリンを特定し、Ｘが任意の残基であり、Ｈｙが疎水性残基であり、且つＳ／Ｔがセリン又はスレオニンのいずれであってもよいことを特徴とする、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
医学的状態を有する対象を治療する方法において、
治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とする該キメラタンパク質の治療用量を用意するステップと、
該治療用量を該対象に投与するステップと
を特徴とする方法。
【請求項１４】
前記医学的状態が、筋ジストロフィー症、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の医学的状態を有する対象を治療する方法。
【請求項１５】
前記キメラタンパク質の配列の少なくとも一部が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の医学的状態を有する対象を治療する方法。
【請求項１６】
筋ジストロフィー症を有する対象の治療のためのキメラタンパク質であって、配列の少なくとも一部が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択されることを特徴とする配列を有するキメラタンパク質。
【請求項１７】
症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法において、
ヌクレオチド配列をベクター中にクローニングするステップであって、該ヌクレオチド配列が、治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質をコードし、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とする、ステップと、
宿主細胞内に該ベクターをトランスフェクトするステップと、
該宿主細胞を増殖させるステップと、
該宿主細胞から該キメラタンパク質を単離するステップと
を特徴とする該方法。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項１９】
前記治療領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、完全長ジストロフィン、短縮型ジストロフィン、及びこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１７に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項２０】
前記輸送領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、水疱性口内炎ウイルスＧ及び水疱性口内炎ウイルスＧの機能バリアントからなる群から選択されるタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１７に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項２１】
前記切断領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、膜メタロプロテアーゼの切断領域をコードすることを特徴とする、請求項１７に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項２２】
前記症状が、筋ジストロフィー症、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞から前記キメラタンパク質を単離する前記ステップが、前記宿主細胞の溶解液から前記キメラタンパク質を単離するステップを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年３月３日に出願された米国仮出願第６１／９４６，９６１号の利益を主張する、２０１５年３月２日に出願された米国出願第１４／６３５，０１２号の利益を主張する国際出願である。
【０００２】
開示するのは、筋ジストロフィー症、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等の疾患を患っているヒト対象の治療に使用するために設計された治療構築物を含むキメラ又は融合タンパク質である。
【背景技術】
【０００３】
ジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）は、極めて重要な骨格筋及び心筋の構造的構成要素である。それは、ジストロフィン及びそれと結合する複数のタンパク質を含み、筋肉の膜に構造的安定性を付与する。ＤＧＣのタンパク質間の物理的相互作用は、膜の外から中への機械的な連結の基礎を形成し、生物学的シグナル伝達プロセスを媒介するのに重要な役割を果たしている。これらのタンパク質は、膜が収縮及び弛緩する際に膜を安定化する複雑なネットワークを形成する。これらの相互作用は、筋肉膜の構造的完全性を維持するのに不可欠である。変異によるこれらの構成成分のいずれの欠乏も、構造的安定性を損ない、筋肉損傷をもたらす。
【０００４】
ジストロフィンは、当初、致死性神経筋障害であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー症（ＤＭＤ）におけるその欠損を通して同定された。機能的な完全長ジストロフィンタンパク質が欠乏している骨格筋及び心筋は、収縮−弛緩活動からの裂傷及び損傷を極めて受けやすい。心臓では、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスにおいて行われた大動脈結紮実験は、同様に心臓損傷が加速される結果となる。これらの研究は、収縮によって誘発される損傷に対する細胞膜の保護におけるジストロフィン及びＤＧＣの重要な役割を証明した。
【０００５】
ＤＭＤ患者におけるジストロフィンの欠如は、筋肉膜を収縮による損傷に対して脆弱且つ感受性の状態に置き、機械的安定性及び適切な機械的シグナル伝達の損失を伴うＤＧＣの破壊をもたらす。ジストロフィン欠損筋線維は、結果として筋線維壊死を伴う繰返し連続して起こる収縮を介した損傷を受け、これによって、最終的に筋線維が線維及び脂肪組織によって置き換えられる；筋前駆細胞又は衛星細胞の連続的な枯渇、並びにそれらが増殖、倍加及び分化できないことにより、進行性の変性及び再生効率の不良も生じる。
【０００６】
ジストロフィンは、以下の４つの機能ドメインを有する：アミノ末端にあるカルポニン様アクチン結合ドメイン、２４個のスペクトリン様リピートのセントラルロッドドメイン、カルボキシ末端にあるシステインに富んだ領域、及び極度な螺旋状のカルボキシ末端領域。アミノ末端のアクチン結合ドメインは、ジストロフィンを細胞骨格の線維状アクチンに固定する役割を果たしている。セントラルロッドドメイン内では、１１から１７のスペクトリンリピートがアクチンを結合するための第２の部位を構成する。システインに富んだ領域は、膜貫通タンパク質、ベータ−ジストログリカンの細胞内部分と相互作用し、ジストロフィンを筋細胞膜に固定する。極度なカルボキシル末端は、シントロフィンとのその相互作用を媒介する。
【０００７】
ヒトジストロフィン遺伝子は、これまでに特徴付けされた最大の遺伝子である。それは、７９個のエクソン、数個のスプライシング部位及び幾つかの組織特異的プロモーターを含み、これが、多様な長さのアミノ末端短縮型ジストロフィンタンパク質を形成するさまざまな転写を生じさせる。ジストロフィンは、１１０５８ヌクレオチドの長さであるオープンリーディングフレームを有する巨大な遺伝子であり、研究するのが困難な標的となっている。ジストロフィン遺伝子の大きなサイズは、その高頻度の自然突然変異の原因ともなり、その変異の大部分は欠失である。これらの変異によって引き起こされる重症度の程度は、欠失の種類に依存して異なる。欠失が遺伝子の読み枠の破壊によるジストロフィンタンパク質の完全な欠如をもたらす場合、重症型の筋ジストロフィー症又はＤＭＤが生じ得る。短縮タンパク質の形成につながる欠失は、結果としてベッカー型筋ジストロフィー等のより軽症型の筋ジストロフィー症をもたらす。コード配列のほぼ半分である、５，１０６塩基対を包含しているジストロフィンタンパク質の中央部を除去する１種類の欠失は、極めて軽症型の筋ジストロフィー症を引き起こし、患者は６１歳でも歩行可能であることが報告されている。
【０００８】
ジストロフィン遺伝子は、逆遺伝学によって同定された最初の遺伝子のうちの１つである。ＤＭＤは、若齢男性３５００人に１人の発生率を有するＸ連鎖性の筋ジストロフィー症である。ＤＭＤは、最も一般的な既知の遺伝性疾患のうちの１つである。その発症は、３から５歳までの年齢の間に起こることがあり、疾患の重症度に依存して、罹患した男性は１３歳までに歩行不能になる。他の臨床的特徴には、側弯症、筋肉の衰弱及び損傷、筋肉肥大、心筋症、精神遅滞並びに極めて高い血清クレアチンキナーゼレベルが含まれる。この疾患は、最終的に１５から２５歳までの年齢の間に死亡を引き起こす。これらの患者における最も一般的な死因は、呼吸不全又は心不全である。米国、ヨーロッパ、オーストラリア、カナダ、イスラエル、及び日本のみで何万名もの人々がＤＭＤと共に生活している。
【０００９】
ＤＭＤは、マウス、ネコ及びイヌを含む幾つかの動物においても報告されている。成熟タンパク質の欠乏をもたらす、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３に未成熟終止コドン変異を有するＭｄｘマウスは、疾患の病因を研究するための動物モデルとして長く使用されている。ジストロフィンの欠如は、結果として出生後約３週間で骨格筋壊死の急性発症をもたらし、その後、壊死が徐々に減少するまで変性及び再生が長期間続き、病状安定を有する成体マウス（３〜４ヶ月）において相対的に低いレベルに達する。しかし、病状はＤＭＤにおけるよりもはるかにより良性である。
【００１０】
水疱性口内炎ウイルスは、ヒトにおいて、狂犬病等の、幾つかの疾患を引き起こすことが長い間知られてきた。これらのウイルスは、宿主細胞膜とウイルス膜の融合を促進するＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質としても知られているタンパク質のエンベロープをそれらの周囲に形成することによって宿主に侵入する。ＶＳＶ−Ｇは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープを有するシュードタイピングウイルスベクターによる遺伝子導入のための手段として広範に使用されてきた。哺乳動物細胞の膜内に存在するＬＤＬ受容体は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の受容体及び水疱性口内炎ウイルスの入口の役割をすることが最近示されている。ＬＤＬ受容体は広範囲の哺乳動物の細胞及び組織内に存在するので、これは、水疱性口内炎ウイルスの汎親和性の性質の根拠となるであろう。
【００１１】
現在開発されているＤＭＤ療法は、ＤＮＡに基づく療法及び細胞に基づく療法、並びに細胞経路又は遺伝子発現を変調させる目的の薬剤を含む。エキソンスキッピング、遺伝子療法、幹細胞、又は未成熟終止コドン変異の読み飛ばしを誘導する小分子のいずれかを介して、完全長機能タンパク質又は短い短縮型タンパク質の発現を回復させるための試みがなされてきた。他の有望なアプローチは、ジストロフィン代用物ユートロフィンを促進して、ＤＧＣの分解を安定化又は減少させるための小分子又は組換えタンパク質を含む。
【００１２】
以前から使用されるアプローチは有望であるが、これらのアプローチには以下のような限界があるため、代替の戦略が開発される必要がある；例えば、エキソンスキッピングのために使用されるオリゴヌクレオチドは、心臓等の全ての非骨格の標的筋組織に効果的に送達することができなかった；ジストロフィン遺伝子内の未成熟終止コドンの読み飛ばしを誘導することを目的としたアタルレンは、未成熟終止コドンを示す変異を示す患者亜集団にしか使用することができなかった；アタルレンは、その薬物で治療した患者において臨床試験中に何らかの有意な効果を示すのに十分な効力がなかった。現在、ＤＭＤに利用可能な治療はなく、現在の治療は、プレドニゾン及び支持的なケアを臨床的に使用することによって病気の進行を遅らせることに基づいており、平均余命は３０代である。
【００１３】
従って、望まれるのは、ＤＭＤを有する患者を治療するための単純であるが有効なシステム及び方法である。更に望まれるのは、結果として筋線維の構造的な安定性の増大又は維持、筋肉損傷の制限、及び筋肉強度の向上をもたらす、複数の型の患者全体に亘る複数の型のジストロフィン異常症の治療を可能にする単一のシステム及び方法である。
【発明の概要】
【００１４】
本明細書に開示されているのは、特定の状態の症状を示している患者において、キメラタンパク質を送達することによって、それらの状態に伴う症状を緩和するためのシステム及び方法である。
【００１５】
一部の実施形態では、このシステムは、治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とする該キメラタンパク質を含む。一部の実施形態では、切断領域は、治療領域のＮ末端に配置される。一部の実施形態では、切断領域は、治療領域のＣ末端に配置される。一部の実施形態では、治療領域は、全長のジストロフィン、短縮型(truncated)ジストロフィン、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、輸送領域は、水疱性口内炎ウイルスＧ及び水疱性口内炎ウイルスＧの機能性バリアントからなる群から選択される。一部の実施形態では、水疱性口内炎ウイルスＧバリアントは、少なくとも４つまでのアミノ酸の置換が可能である。一部の実施形態では、水疱性口内炎ウイルスＧバリアントは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性からなる群から選択される野生型水疱性口内炎ウイルスＧとの配列同一性を少なくとも有する。
【００１７】
一部の実施形態では、切断領域は、細胞膜を横切るキメラタンパク質の輸送の後に切断されるように構成されている。一部の実施形態では、切断領域は、膜メタロプロテアーゼの切断部位である。一部の実施形態では、切断領域は、各アミノ酸が保存的に置換され得ることを特徴とする、アミノ酸配列ＰＬＧＬＷＡＬを含む。一部の実施形態では、切断領域は、Ｐがプロリンを特定し、Ｘが任意の残基であり、Ｈｙが疎水性残基であり、且つＳ／Ｔがセリン又はスレオニンのいずれであってもよいことを特徴とする、アミノ酸配列Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓ／Ｔ）を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、キメラタンパク質の配列の少なくとも一部は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択される。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、医学的状態を有する対象を治療する方法において、治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とする該キメラタンパク質の治療用量を用意するステップと、該治療用量を該対象に投与するステップとを特徴とする方法に向けられている。一部の実施形態では、医学的状態は、筋ジストロフィー症、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等を含む。一部の実施形態では、治療領域のヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、治療領域のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８からなる群から選択される配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、症状の治療において使用するためのキメラタンパク質を作製する方法において、治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とする該キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列をベクター中にクローニングするステップと、宿主細胞内に該ベクターをトランスフェクトするステップと、該宿主細胞を増殖させるステップと、該宿主細胞から該キメラタンパク質を単離するステップとを特徴とする方法に向けられている。一部の実施形態では、治療領域のヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、治療領域をコードするヌクレオチド配列は、完全長ジストロフィン、短縮型ジストロフィン、及びこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【００２１】
症状の治療において使用するためのキメラタンパク質を作製する方法の一部の実施形態では、輸送領域をコードするヌクレオチド配列は、水疱性口内炎ウイルスＧ及び水疱性口内炎ウイルスＧの機能バリアントからなる群から選択されるタンパク質をコードする。症状の治療において使用するためのキメラタンパク質を作製する方法の一部の実施形態では、切断領域をコードするヌクレオチド配列は、膜メタロプロテアーゼをコードする。症状の治療において使用するためのキメラタンパク質を作製する方法の一部の実施形態では、医学的状態は、筋ジストロフィー症、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等を含む。症状の治療において使用するためのキメラタンパク質を作製する方法の一部の実施形態では、宿主細胞からキメラタンパク質を単離するステップは、宿主細胞の溶解液からキメラタンパク質を単離するステップを含む。
【００２２】
本発明とみなされる主題は、本明細書に添付の特許請求の範囲に特に示され且つ明確に主張される。本発明の上記及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面と組み合わせて以下の発明を実施するための形態から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本開示の一部の実施形態と一致している、ジストロフィン異常症の治療のためのキメラタンパク質の概略図である。
【００２４】
【図２】ＶＳＶ−ＧのみをトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞のＶＳＶ−Ｇ抗体に対する免疫染色を示している図である。
【００２５】
【図３】図１に示されているＮ末端にＶＳＶ−Ｇを有するキメラジストロフィンタンパク質をトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の抗ＶＳＶ−Ｇ抗体に対する免疫染色を示している図である。
【００２６】
【図４】Ｎ末端にＶＳＶ−Ｇを有するキメラジストロフィンをトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞由来の０．５ｍｌの調整培地で処理されたＤＭＤ患者細胞の抗ジストロフィン抗体での免疫染色を示している図である。
【００２７】
【図５】Ｎ末端にＶＳＶ−Ｇを有するキメラジストロフィンをトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞由来の２．０ｍｌの調整培地で処理されたＤＭＤ患者細胞の抗ジストロフィン抗体での免疫染色を示している図である。
【００２８】
【図６】図１に示されているキメラタンパク質を使用して、医学的状態を有する対象を治療する方法の流れ図である。
【００２９】
【図７】症状の治療において使用するために図１に示されているキメラタンパク質を作製する方法の流れ図である。
【００３０】
【図８】症状の治療において使用するために図７に示されているキメラタンパク質を作製する方法の別の実施形態を示している図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明によって開示されている実施形態は、本明細書に提示されている革新的な教示の多数の可能な有利な使用及び実施形態の単なる例に過ぎない。一般に、本出願の明細書においてなされている言及は、請求されている多様な発明のいずれかを必ずしも限定するものではない。更に、一部の言及は、一部の本発明の特徴に適用されるが、他のものには適用されないこともある。一般に、他に明記されていない限り、単数の要素は複数であってもよく、一般性を失うことなくその逆もまた同様である。図面において、同様の符号は、幾つかの図面を通して、同様の部分を指す。
【００３２】
図１は、本開示の一部の実施形態と一致しているキメラタンパク質の概略図を示している。一部の実施形態では、輸送領域は、治療領域のＮ末端に融合される。一部の実施形態では、輸送領域は、治療領域のＣ末端に融合される。一部の実施形態では、切断領域は、治療領域と輸送領域の間に配置される。本明細書中で使用される場合、「輸送領域」という用語は、互換可能に「送達機構(delivery mechanism)」又は「担体(carriers)」とも呼ばれることがある。一部の実施形態では、輸送領域は、ＶＳＶ−Ｇである。一部の実施形態では、治療領域は、完全長ジストロフィンタンパク質である。一部の実施形態では、治療領域は、短縮型(truncated)ジストロフィンタンパク質である。一部の実施形態では、切断領域は、膜メタロプロテアーゼの切断部位である。
【００３３】
一部の実施形態では、本開示のキメラタンパク質は、配列の少なくとも一部が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択されることを特徴とするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、本開示のキメラタンパク質は、配列の少なくとも一部が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択されることを特徴とするアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、キメラタンパク質のための配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のうちの少なくとも１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、結果として生じるバリアントキメラタンパク質の薬理学的活性が保持される限り、任意の好適な変異、置換、付加、及び欠失がキメラタンパク質になされてもよい。
【００３４】
配列番号１は、本発明の一部の実施形態と一致している、ＶＳＶ−ＧがＮ末端にある、ジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇキメラタンパク質のヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号２は、本発明の一部の実施形態と一致している、ＶＳＶ−ＧがＮ末端にある、ジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇキメラタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号３は、本発明の一部の実施形態と一致している、ＶＳＶ−ＧがＮ末端にある、短縮型ジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇキメラタンパク質のヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号４は、本発明の一部の実施形態と一致している、ＶＳＶ−ＧがＮ末端にある、短縮型ジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇキメラタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号５は、本発明の一部の実施形態と一致している、ＶＳＶ−ＧがＣ末端にある、ジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇキメラタンパク質のヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号６は、本発明の一部の実施形態と一致している、ＶＳＶ−ＧがＣ末端にある、ジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇキメラタンパク質のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号７は、本発明の一部の実施形態と一致している、ＶＳＶ−ＧがＣ末端にある、短縮型ジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇキメラタンパク質のヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号８は、本発明の一部の実施形態と一致している、ＶＳＶ−ＧがＣ末端にある、短縮型ジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇキメラタンパク質のアミノ酸配列である。
【００４２】
組換え及びキメラタンパク質は、多様な症状のための療法として市場において入手可能になっており、関節炎等の疾患を治癒させるのに極めて強力であることが立証されている。一部の実施形態では、本開示は、２種のタンパク質間に、膜メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の切断部位となる短いリンカーを用いて又は用いずに、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかでＶＳＶ−Ｇ（又はＶＳＶ−Ｇのバリアント）タンパク質と融合されたジストロフィン（又はジストロフィンの機能変異体若しくは短縮型）タンパク質に向けられる。この療法は、生物学的有効量の組換えジストロフィンタンパク質の投与に基づき、これは種々の筋組織内に形質導入されてジストロフィンの欠乏に伴う病変を寛解させることになる。この療法は、対象が特定の機能タンパク質産生の欠乏を補うのを可能にすることになる。
【００４３】
一部の実施形態では、ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ジストロフィンタンパク質を多様な組織に送達するための輸送領域又は担体の役割をする。ＬＤＬ受容体は、これを通してＶＳＶ−Ｇが細胞に入るための最初の接触を確立するものであるが、これは、広範囲の組織内に存在する。従って、このアプローチは、従来のアプローチにおいて見出される異なる標的部位でのジストロフィンタンパク質の送達に関連した問題を軽減する。一部の実施形態では、本出願のキメラタンパク質中に使用されるＶＳＶ−Ｇは、野生型ＶＳＶ−Ｇである。一部の実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、野生型ＶＳＶ−Ｇのバリアントである。生じたバリアントＶＳＶ−Ｇの細胞膜輸送活性が保持される限り、任意の好適な変異、置換、付加、及び欠失がＶＳＶ−Ｇになされてよい。一部の実施形態では、好適なＶＳＶ−Ｇバリアントは、ＶＳＶ−Ｇの耐熱性及び血清耐性変異株を含み、これは、野生型ＶＳＶ−Ｇに対する以下の点変異を含む：Ｓ１６２Ｔ、Ｔ２３０Ｎ、Ｔ３６８Ａ、又は組み合わされた変異体Ｔ２３０Ｎ＋Ｔ３６８Ａ、若しくはＫ６６Ｔ＋Ｓ１６２Ｔ＋Ｔ２３０Ｎ＋Ｔ３６８Ａ。一部の実施形態では、バリアントＶＳＶ−Ｇは、野生型ＶＳＶ−Ｇと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００４４】
タンパク質を別のタンパク質と融合させることは、時に、それらのタンパク質の機能と干渉してそれらの生物活性における低下につながる。この問題を解決するために、一部の実施形態では、ＭＭＰの切断部位を含む切断領域が提供される。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ジストロフィンとＶＳＶ−Ｇの間に配置される。こうした実施形態では、ジストロフィンは、ＶＳＶ−Ｇを有するキメラ構築物から、それがＭＭＰによって切断されるときにのみ放出されることになる。ＭＭＰは、筋ジストロフィー症を含む、多様な病理学的状態及び炎症の間に過剰発現される。従って、キメラジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇタンパク質が送達によって炎症の部位に到達したときに、ＭＭＰは、筋細胞内への取り込み及び対象のジストロフィン異常症の治療のためにキメラタンパク質を切断してジストロフィンタンパク質を放出する。一部の実施形態では、ＭＭＰ切断部位は、全てのＭＭＰのための既知の推定上の切断部位である、アミノ酸ＰＬＧＬＷＡＬをコードする。一部の実施形態では、ＭＭＰ切断部位は、Ｐがプロリンを特定し、Ｘが任意の残基であり、Ｈｙが疎水性残基であり、且つＳ／Ｔがセリン又はスレオニンのいずれであってもよいことを特徴とする、アミノ酸Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓ／Ｔ）によって定義される配列を含む。一部の実施形態では、ＭＭＰ切断部位は、配列ＰＬＧＬＷＡＬ、Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓ／Ｔ）、並びにこれらのバリアント及び変異から選択される。一部の実施形態では、切断部位は排除される。
【００４５】
この戦略は、ジストロフィンをそれぞれの症状のための目的のタンパク質と置き換えることにより、単一のタンパク質の欠乏によって惹起される他の症状にも拡張され得る。一部の実施形態では、ジストロフィンは、別の治療構築物によって置き換えられる。これらの実施形態では、治療構築物は、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等のような、他の疾患の病理学的状態を治療するために選択されるはずである。一部の実施形態では、キメラタンパク質中に含まれるタンパク質のＮ−及びＣ−末端に他のタンパク質が融合されてもよい。以下の表１は、本開示のキメラタンパク質、並びに、一部の実施形態では、ジストロフィンと置換され得る治療構築物を使用して有効に治療され得る多様な症状を表している。
【表１−１】
2017513921.tif 000003
【表１−２】
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【００４６】
一部の実施形態では、本開示は、ジストロフィン異常症の治療において、上記の実施形態と一致しているキメラタンパク質を使用する方法にも向けられる。図６に示されているように、一部の実施形態では、ジストロフィン異常症を有する対象を治療する方法は、治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とする該キメラタンパク質の治療用量を用意するステップ（６００）と、該治療用量を該対象に投与するステップ（６１０）とを含む。本明細書中で使用される場合、治療用量という用語は、ジストロフィン異常症を治療するのに有効な処方の一部として対象に投与されるキメラタンパク質の任意の好適な容量及び濃度を意味する。特定の投与量は、計画選択の事項であり、対象の特性で変化し得る。
【００４７】
方法：
一部の実施形態では、本開示は、ジストロフィン異常症の治療に使用するために、上記の実施形態と一致しているキメラタンパク質を作製する方法にも向けられる。図７に示されているように、一部の実施形態では、キメラタンパク質を作製する方法は、治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にすることを特徴とする該キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列をベクター中にクローニングするステップ（７００）と、宿主細胞内に該ベクターをトランスフェクトするステップ（７１０）と、該宿主細胞を増殖させるステップ（７２０）と、該宿主細胞から該キメラタンパク質を単離するステップ（７３０）とを含む。一部の実施形態では、図８に示されているように、単離するステップ（７３０）は、宿主細胞の溶解液からキメラタンパク質を単離するステップ（８３０）を含む。キメラタンパク質を作製する方法の一部の実施形態と一致している特殊な例は、以下の通りである：
【００４８】
ジストロフィンタンパク質は、参照により本明細書にその内容の全体が組み込まれている、特許出願第０７／１３６，６１８号及び系統ＩＤ２２４７３６１６の下で、Ｋｕｎｋｅｌらによって記載されている。ヒトのジストロフィンタンパク質の完全なｍＲＮＡ配列は、遺伝子バンクで受託番号Ｍ１８５３３、Ｍ１７１５４、Ｍ１８０２６、及びＭ２０２５０の下で入手可能である。
【００４９】
以下の試験は全て、切断領域を有さず且つ治療用ジストロフィンのＮ末端に輸送領域としてＶＳＶ−Ｇを有するキメラジストロフィンタンパク質に対して行われた。
【００５０】
完全長ヒト（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）ジストロフィンのｃＤＮＡを有するプラスミドは、Ｔｒａｎｓｏｍｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、６０１  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｙ、Ｓｕｉｔｅ  １２２２、  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ  ３５８０６から供給された。クローニングベクターｐＲＫ−Ｆｌａｇ−Ｍｙｃ（Ｓｉｇｍａ）、及びＶＳＶ−Ｇ  ｃＤＮＡを有するｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を入手した。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ｐＲＫ−Ｆｌａｇ−ＭｙｃベクターのＡｐａＩ及びＮｏｔＩ部位でクローニングされ、それによってＦｌａｇタグはＶＳＶ−Ｇと置き換えられた。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、鋳型としてｐＭＤ２．Ｇベクターを、且つフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ５’  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＡ  ３’及び５’  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ３’を使用してクローニングされた。
【００５１】
次に、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれＣＣＧ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＴＡ及びＴＡＣ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＴＡＣを用いてジストロフィンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅するためにＰＣＲが行われた。これらは、制限酵素部位Ｎｏｔ  Ｉ及びＳａｌ  Ｉを含むように設計されている。ジストロフィンＯＲＦは、ＶＳＶ−Ｇに続くｐＲＫ−Ｆｌａｇ−ＭｙｃベクターのＮｏｔ  Ｉ及びＳａｌ  Ｉ部位でクローニングされ、ＶＳＶ−ＧがＮ末端にあるキメラジストロフィンが得られた。ＰＣＲを行うためにＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  ＰＣＲキットが使用された。
【００５２】
Ｎ末端のＶＳＶ−Ｇを有するジストロフィン及び短縮型ジストロフィンのキメラ遺伝子配列は、ＩＤＴ  ＤＮＡによってその適正技術を使用して合成され、タンパク質発現に適切なベクター中にバキュロウイルス系を使用して挿入された。バキュロウイルス系を使用したタンパク質精製の方法は、十分に確立されており、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００５３】
キメラ配列が作製されたら、キメラジストロフィンタンパク質は、それが確実に適切に発現されるように哺乳動物細胞内にトランスフェクトされた。ＨＥＫ−２９３細胞は、６ウェルプレート中のカバーガラス(coverslips)上に６０％のコンフルエンスで播種された。細胞は、ＰｒｏｍｅｇａからのＶｉａｆｅｃｔ（商標）試薬を使用して、ＶＳＶ−Ｇタンパク質単独又はキメラジストロフィン−ＶＳＶ−Ｇタンパク質のいずれかを含むベクターをトランスフェクトされた。トランスフェクションの１日後に培地は通常の培地（ＤＭＥＭ中に１０％のＦＢＳ）に交換された。トランスフェクション４８時間後、細胞からの培地が取り出された。
【００５４】
図２及び３に示されているように、カバーガラス上に播種されたトランスフェクト細胞は、ジストロフィンキメラタンパク質発現の検出のために固定及び染色され、ＶＳＶ−Ｇ単独のものと比較された。固定のために、細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で洗浄され、４％のパラホルムアルデヒド溶液中で１０分間固定された。細胞はＤＰＢＳ中で再び洗浄され、次いで、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００での更なる５分間の処理が行われた。ＤＰＢＳ中での３回の洗浄後、細胞は、１０％のＢＳＡ中で１時間ブロッキングされた。次いで、ＶＳＶ−Ｇタンパク質に対する一次抗体（ＶＳＶ−Ｇ−タグ抗体、ｐＡｂ、ウサギ、供給源：ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）又はジストロフィンに対する一次抗体（モノクローナル抗ジストロフィン、クローンＭＡＮＤＹＳ８）が、２．５％のＢＳＡ−ＤＰＢＳ中で１：１００の希釈で添加され、１時間半インキュベートされた。細胞は、ＤＰＢＳ中で再び洗浄された。抗ＶＳＶ−Ｇ一次抗体に対する抗ウサギＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体又は抗ジストロフィン一次抗体に対する抗マウステキサスレッドコンジュゲート二次抗体も、２．５％のＢＳＡ−ＤＰＢＳ中で１：１００の希釈で添加され、３０分間インキュベートされた。細胞は、ＤＰＢＳ中で洗浄され、ＤＰＢＳ中でＤＡＰＩで染色された。細胞は、抗退色封入剤中にマウントされた。
【００５５】
染色されたトランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞は、蛍光顕微鏡下で間接的な免疫蛍光について検出された。トランスフェクト細胞は細胞質内で蛍光を示し、キメラタンパク質の発現が確認された（図３）。ＶＳＶ−Ｇタンパク質単独の分布は、キメラタンパク質のものとは異なっていた（図２）。
【００５６】
ＤＭＤ患者細胞（ＧＭ０５１６９及びＧＭ０３６０４  Ａ）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから供給された。調整培地でのＤＭＤ患者細胞の処理のために、ＧＭ０５１６９及びＧＭ０３６０４  Ａ細胞は、６ウェルプレート中のカバーガラス上に播種された。ＨＥＫ２９３細胞は上記のようにトランスフェクトされ、培地はトランスフェクション２４時間後に交換された後に更に４８時間放置された。トランスフェクション７２時間後、トランスフェクト細胞からの培地は、回収されて遠心分離された。（１５％のＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地の添加によって２ｍｌの総容量にされている）異なる量のＨＥＫトランスフェクション調整培地２．０ｍｌ、１．０ｍｌ、及び０．５ｍｌがＤＭＤ患者細胞に添加され、次いで、細胞は上記のように固定されて染色された。
【００５７】
ＤＭＤ患者細胞は、次いで、培地から患者細胞へのキメラタンパク質形質導入について蛍光顕微鏡下で解析された。図４及び５に示されているように、トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞調整培地の処理は、患者細胞の細胞質内での蛍光によって示されるように、実際に結果として、培地中に分泌されたキメラタンパク質の形質導入をもたらした。
【００５８】
ジストロフィンタンパク質とのＶＳＶ−Ｇタンパク質の融合は、ジストロフィンタンパク質が標的筋組織内に入るのを促進するであろうと仮定された。ＶＳＶ−Ｇは、過剰発現されたときに、ゲシクルとして知られている小胞内に分泌される小胞タンパク質である。従って、発現によってトランスフェクション培地中と同様にキメラジストロフィンタンパク質が分泌され得ることが想定された。キメラタンパク質について蛍光陽性を示しているＤＭＤ患者細胞は、ＨＥＫ−２９３トランスフェクト細胞の培地中にキメラタンパク質が分泌され、ＤＭＤ患者細胞への調整培地の処理により、患者細胞によってキメラタンパク質が取り上げられていることを証明する。
【００５９】
上記のように、一部の実施形態では、キメラタンパク質の発現及び機能性は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡを、組換えタンパク質産生のためのバキュロウイルス中に挿入することによって確認される。組換えタンパク質産生のためのバキュロウイルス中へのＤＮＡ挿入は市販のｐＯＥＴ１トランスファープラスミド（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して達成され、製造業者のプロトコールによってバキュロウイルス媒介性タンパク質発現のために組換えバキュロウイルスストックが調製される。
【００６０】
キメラタンパク質は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１又はＴｎｉ等の市販の細胞系及び市販の培養培地を含むフラスコ又はバイオリアクター内で培養される昆虫細胞の懸濁液培養物を感染させるための組換えバキュロウイルスストックを使用して製造業者のプロトコールによって作製される。感染された培養物は、次いで、感染後４８及び９６時間の間に回収され、キメラタンパク質は、親和性、イオン交換、疎水性相互作用、及びサイズ排除等の１つ又は複数の方法を含むカラムクロマトグラフィーによって培養培地又は清澄化された細胞溶解液から精製される。
【００６１】
精製されたキメラタンパク質は、１つ又は複数のジストロフィン特異的一次抗体を使用してウエスタンブロットによって同定される。タンパク質純度は、シプロオレンジ又はクマシーブルーで染色されたＳＤＳ  ＰＡＧＥのデンシトメトリー解析、及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって決定される。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は同様の製剤緩衝液中でのタンパク質安定性は、タンパク質単分散度における経時的な変化及び複数回の凍結／解凍サイクル後の変化を検出するための分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）によって評価される。精製されたタンパク質試料中のエンドトキシンレベルは、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞溶解液（ＬＡＬ）アッセイによって測定される。
【００６２】
上記の方法によって作製された精製されたキメラタンパク質は、ジストロフィン異常症の間に観察される病理学的影響を改善させるその活性の更なる検証のためにｍｄｘマウス内に投与される。全ての動物試験は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって行われる。
【００６３】
異なるバックグラウンドのｍｄｘマウスのバリアント（ＤＢＡ／２Ｊ）が、この試験に使用される。１８匹のヘミ接合性Ｄ２．Ｂ１０−Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ雄変異体マウス及び６匹のＤＢＡ／２Ｊ雄対照マウスが、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ施設において作製される。６匹のＤ２．Ｂ１０−Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ雄変異体マウス、２８日±３日齢、の３つの群は、キメラタンパク質又はビヒクルを６週間投与される。６匹のＤＢＡ／２Ｊ雄対照、２８日±３日齢、の１つの群は、キメラタンパク質投与ビヒクルのみを投与される。
【００６４】
処置期間の終了時に、以下の測定が行われる：
−  血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性。血清ＣＫは、眼窩後出血によって採取されて直ちに且つ分析まで凍結された血清からＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＡＵ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ分析計で測定される；
−  骨格筋によるエバンスブルー色素（ＥＢＤ）取り込み。ＥＢＤは、安楽死の２４時間前であるがＣＫ測定のための血清採取後に注射される。安楽死後、腓腹筋が採取されて瞬間凍結される。筋は、次いで、ホモジナイズされ、溶解液は清澄化され、分光光度法によって上清中のＥＢＤ濃度が測定される；
−  組織学。例示目的のためのヘマトキシリン及びエオシン染色、筋線維形態計測、萎縮／肥大の程度の定量化及び中央に位置している核のためのレチクリン染色、並びに線維症の可視化のためのマッソントリクローム染色が行われる。犠死後、１本の後脚及び１つの片側横隔膜が採取され、パラホルムアルデヒド中で固定される。筋は、解剖されて、パラフィン包埋され、横断切片化される。筋毎に３つの切片を調製して、１群当たり２匹のマウスでの例示目的のためのヘマトキシリン及びエオシン、並びに自動化された線維サイズ測定及び中央の核の計数のためのレチクリン染色で染色される；
−  四頭筋、心筋、及び横隔膜における抗ジストロフィン免疫蛍光。前脛骨筋及び四頭筋が使用される。１つの四頭筋及び心臓が、凍結切片化用に固定なしで瞬間凍結され、横断切片が、抗ジストロフィン免疫蛍光によって染色される；並びに
−  前脛骨筋におけるＲＮＡ抽出及び以下のｍＲＮＡの定量：炎症のマーカー、線維症のマーカー、筋線維再生のマーカー。１つの前脛骨筋は、ＲＮＡで保存される。その後、ＲＮＡは、抽出され、逆転写されて、以下のｍＲＮＡがサイバーグリーンｑＰＣＲによって定量化される：Ｍｐｅｇ１及びＬｇａｌｓ３（マクロファージマーカー）、Ｌｙ６ｃ１（線維化促進性単球マーカー）、Ｔｎｆ−アルファ（炎症性サイトカイン）、新生児ミオシン（線維再生マーカー）、及びコラーゲンＩ。
【００６５】
本発明の１つ又は複数の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多様な改変がなされ得ることが理解されるであろう。従って、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年1月4日(2016.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にし、前記輸送領域が、水疱性口内炎ウイルスＧ及び水疱性口内炎ウイルスＧの機能性バリアントからなる群から選択されることを特徴とするキメラタンパク質。
【請求項２】
前記切断領域が、前記治療領域のＮ末端に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記切断領域が、前記治療領域のＣ末端に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
前記治療領域が、完全長ジストロフィン、短縮型ジストロフィン、及びこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記水疱性口内炎ウイルスＧバリアントは、少なくとも４つまでのアミノ酸の置換が可能であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記水疱性口内炎ウイルスＧバリアントが、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性からなる群から選択される野生型水疱性口内炎ウイルスＧとの配列同一性を少なくとも有することを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記切断領域が、前記細胞膜を横切る前記キメラタンパク質の輸送の後に切断されるように構成されていることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
前記切断領域が、膜メタロプロテアーゼの切断部位であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記キメラタンパク質の配列の少なくとも一部が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記切断領域がアミノ酸配列ＰＬＧＬＷＡＬを含み、各アミノ酸が保存的に置換されていてもよいことを特徴とする、請求項８に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記切断領域がアミノ酸配列Ｐ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓ／Ｔ）を含み、Ｐがプロリンを特定し、Ｘが任意の残基であり、Ｈｙが疎水性残基であり、且つＳ／Ｔがセリン又はスレオニンのいずれであってもよいことを特徴とする、請求項８に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
医学的状態を有する対象を治療する方法において、
治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質であって、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にし、水疱性口内炎ウイルスＧ及び水疱性口内炎ウイルスＧの機能性バリアントからなる群から選択されることを特徴とする該キメラタンパク質の治療用量を用意するステップと、
該治療用量を該対象に投与するステップと
を特徴とする方法。
【請求項１３】
前記医学的状態が、筋ジストロフィー症、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の医学的状態を有する対象を治療する方法。
【請求項１４】
前記キメラタンパク質の配列の少なくとも一部が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の医学的状態を有する対象を治療する方法。
【請求項１５】
筋ジストロフィー症を有する対象の治療のためのキメラタンパク質であって、配列の少なくとも一部が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び薬理学的に許容されるこれらの等価物からなる群から選択されることを特徴とする配列を有するキメラタンパク質。
【請求項１６】
症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法において、
ヌクレオチド配列をベクター中にクローニングするステップであって、該ヌクレオチド配列が、治療領域、輸送領域、及び該治療領域と該輸送領域の間に配置された切断領域により特徴付けられるキメラタンパク質をコードし、該輸送領域が細胞膜を横切る該キメラタンパク質の輸送を可能にし、水疱性口内炎ウイルスＧ及び水疱性口内炎ウイルスＧの機能性バリアントからなる群から選択されることを特徴とする、ステップと、
宿主細胞内に該ベクターをトランスフェクトするステップと、
該宿主細胞を増殖させるステップと、
該宿主細胞から該キメラタンパク質を単離するステップと
を特徴とする該方法。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項１８】
前記治療領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、完全長ジストロフィン、短縮型ジストロフィン、及びこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１６に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項１９】
前記切断領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、膜メタロプロテアーゼの切断領域をコードすることを特徴とする、請求項１６に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項２０】
前記症状が、筋ジストロフィー症、捻曲性骨異形成症、悪性黒色腫、ポルフィリン症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症、アイカルディ・グチエール症候群、嚢胞性線維症、早老症、マルファン症候群、結節性硬化症、副腎白質ジストロフィー症等を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞から前記キメラタンパク質を単離する前記ステップが、前記宿主細胞の溶解液から前記キメラタンパク質を単離するステップを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の症状の治療に使用するためのキメラタンパク質を作製する方法。
【国際調査報告】
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