(57)【要約】  本明細書に記載する発明は、エレクトロポレーションを通じて、配偶子または移植前段階（例えば一細胞胚または接合子）に材料を導入することを通じてトランスジェニック動物（例えば哺乳動物）を生成し、該動物のゲノムに遺伝可能な修飾を導くための、ハイスループット法および試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変哺乳動物を生成する方法であって、エレクトロポレーションを通じて、哺乳動物の配偶子または移植前段階の胚内に材料を導入して、哺乳動物のゲノムを修飾する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
材料を配偶子内に導入する、請求項１の方法。
【請求項３】
配偶子が卵子（ｏｖｕｍ）または卵（ｅｇｇ）である、請求項２の方法。
【請求項４】
配偶子を反対の性別の配偶子と融合させ、そして生産（ｌｉｖｅ−ｂｏｒｎ）遺伝子改変哺乳動物への発生を可能にする工程をさらに含む、請求項２または３の方法。
【請求項５】
移植前段階の胚が一細胞胚（すなわち接合子）、二細胞胚、四細胞胚、初期桑実胚、または後期桑実胚である、請求項１の方法。
【請求項６】
（エレクトロポレーションした）移植前段階の胚を生産遺伝子改変哺乳動物に発生させる工程をさらに含む、請求項５の方法。
【請求項７】
材料がポリヌクレオチド、ポリペプチド、または両方を含む、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列を含む、請求項７の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列にハイブリダイズする、クラスタード・レギュラリー・インタースペースド・ショート・パリンドロミック・リピーツ（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システム・ガイドＲＮＡを含む、請求項７または８の方法。
【請求項１０】
ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム・ガイドＲＮＡの濃度比が、少なくとも約１：１、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約２．５：１、少なくとも約３：１またはそれより高い、請求項９の方法。
【請求項１１】
ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列の濃度が、少なくとも約４０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬ、少なくとも１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも２００ｎｇ／μＬ、少なくとも３００ｎｇ／μＬ、少なくとも４００ｎｇ／μＬ、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、少なくとも６００ｎｇ／μＬ、少なくとも８００ｎｇ／μＬ、または少なくとも１０００ｎｇ／μＬあるいはそれより高い、請求項８〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
材料がドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
ドナーポリヌクレオチドが直鎖または環状二重鎖ＤＮＡ分子である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列に特異的な転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のコード配列を含む、請求項７の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドが、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のコード配列を含む、請求項７の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列に特異的なＢｕＤ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）のコード配列を含む、請求項７の方法。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドが、哺乳動物ゲノム内にランダムに組み込まれるＤＮＡを含む、請求項７の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドがＤＮＡベクターを含む、請求項７〜１７のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む、請求項７〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
哺乳動物が、ヒト、非ヒト霊長類（例えばマーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）、チンパンジー）、齧歯類（例えばマウス、ラット、スナネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、モルモット、ハムスター、コットンラット、ハダカデバネズミ（ｎａｋｅｄ  ｍｏｌｅ  ｒａｔ））、ウサギ、家畜哺乳動物（例えばヤギ、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、ウシ、ウマ、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ））、ペット哺乳動物（例えばイヌ、ネコ）、動物園哺乳動物、有袋類（ｍａｒｓｕｐｉａｌ）、絶滅危惧哺乳動物、およびその非近交系または任意交配集団である、請求項１〜１９のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
配偶子（反対の性別の配偶子と融合した後）または移植前の胚を、エレクトロポレーション後、胚を出産するまで保持することが可能な偽妊娠宿主哺乳動物に移植する、請求項１〜２０のいずれか一項の方法。
【請求項２２】
配偶子（反対の性別の配偶子と融合した後）または移植前の胚を、偽妊娠宿主哺乳動物に移植する前に、エレクトロポレーションを実行する培地から取り除く、請求項２１の方法。
【請求項２３】
哺乳動物ゲノムを、１またはそれより多い塩基対の挿入または欠失によって、異種ＤＮＡ断片の挿入によって、内因性ＤＮＡ断片の欠失によって、内因性ＤＮＡ断片の反転または転位置によって、あるいはその組み合わせによって、修飾する、請求項１〜２２のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
哺乳動物のゲノムを、ＮＨＥＪ、ＨＤＲまたはＨＲによって修飾する、請求項１〜２３のいずれか一項の方法。
【請求項２５】
２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００またはそれより多い配偶子または移植前段階の胚を同時にエレクトロポレーションする、請求項１〜２４のいずれか一項の方法。
【請求項２６】
エレクトロポレーションした移植前段階の胚の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多くが、胚盤胞段階の胚に発生するかまたは生産（ｌｉｖｅ−ｂｏｒｎ）トランスジェニック哺乳動物に発生する、請求項２５の方法。
【請求項２７】
すべての配偶子および移植前段階の胚を同じエレクトロポレーションキュベット中でエレクトロポレーションする、請求項２５または２６の方法。
【請求項２８】
エレクトロポレーション前に、配偶子または移植前段階の胚を前処理して、透明帯を弱める、請求項１〜２７のいずれか一項の方法。
【請求項２９】
配偶子または移植前段階の胚を、酸性タイロード溶液（ＡＴ）または同等物中で前処理する、請求項２８の方法。
【請求項３０】
エレクトロポレーションを：２０〜３０ボルト（例えば２５、２６、または２７ボルト）、パルス期間１〜２ｍｓ（例えば１．５ｍｓ）、１〜３回パルス、パルス間隔１００〜１０００ｍｓ（例えば約１２５〜１３０ｍｓ）のセッティングを用いて、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット中で行う、請求項１〜２９のいずれか一項の方法。
【請求項３１】
配偶子または移植前段階の胚を、エレクトロポレーション後、保存のために凍結し、そして次いで融解する、請求項１〜３０のいずれか一項の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１の方法のいずれか１つによって生成された、遺伝子改変哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する言及
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、その全内容が本明細書に援用される、２０１４年９月２９日出願の米国仮出願第６２／０５６，６８７号の出願日の恩典を請求する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的または遺伝子材料の哺乳動物接合子への送達は、通常、哺乳動物ゲノムを修飾する、例えば遺伝子改変動物モデルを生成する、第一段階である。これは、伝統的に、そして現在、ガラス針を用いることによって、接合子内に所望の生物学的／遺伝子材料をマイクロインジェクションすることによって達成される。
【０００３】
ＤＮＡの直接マイクロインジェクションは、早くも１９８０年代後期に、培養哺乳動物細胞内に、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＴＫ遺伝子を導入するために用いられてきた（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ，  ２２：４７９−４８８，  １９８０年１１月）。しかし、形質転換効率は、小さいｐＢＲ  ３２２／ＴＫ  ＤＮＡをＳＶ４０  ＤＮＡと同時に注入した場合であっても極端に低く、すなわち注入１０００細胞あたり、形質転換体１５であった。さらに、該実験は、成熟した生物の産生を生じず、まして、表現型改変を示しうるものは生じなかった。
【０００４】
約１ヶ月後、Ｇｏｒｄｏｎら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７７：７３８０−７３８４，  １９８０年１２月）は、マウス胚内に、ＴＫ遺伝子（キメラＳＶ４０ウイルスベクター内に取り込まれたもの）をマイクロインジェクションすることに成功し、そしてマウスにおいて、こうしたＴＫ遺伝子がマイクロインジェクションされた胚から発展したことを、初めて報告した。しかし、これらのマウスは、ＴＫ遺伝子産物を発現しなかった。すなわち、これらの実験において、試験動物の表現型改変は達成されなかった。Ｇｏｒｄｏｎらによって報告された結果は、ＳＶ４０ウイルスがマウス胚に導入された際、機能的にそして遺伝子的に不活性であることを以前示した、Ｊａｅｎｉｓｃｈら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７１：１２５０−１２５４，  １９７４）による以前の研究と一致するようである。
【０００５】
続いて、１９８１年６月、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅは、マイクロインジェクションを通じた、胚内への外因性遺伝子材料の導入に関する米国実用出願（Ｕｔｉｌｉｔｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を出願し、この出願は最終的に、外因性遺伝子材料を含有し、そして発現可能である細胞を有する哺乳動物を得るマイクロインジェクション法を記載し、そして広く請求する、マイクロインジェクション分野における広く認可された基礎特許である、米国特許第４，８７３，１９１号の発行を導く。
【０００６】
１９８０年代初期からの多くの改善にも関わらず、マイクロインジェクションは技術的に努力が必要で、労働集約的であり、そして時間が掛かる技術のままである。マイクロインジェクションの成功は、かなりの度合い、作業者の技術的習熟、訓練、および経験のような主観的要因に依存する。マイクロインジェクションは、高価なマイクロインジェクション・セットアップの相当の先行投資、ならびに何年も訓練および経験を積んだ作業者を必要とするため、遺伝子修飾マウスモデルを生成する能力は、しばしば、世界で最高および最適に資金提供された学術機関においてさえ、制限される。
【０００７】
さらに、マイクロインジェクションは、本質的にスループットが低く、接合子を一度に１つずつ操作する必要があり、したがって、ゲノム操作実験のサイズおよび規模を限定する。
【０００８】
エレクトロポレーション、または電気透過処理（ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、外部適用される電場を用いることによって、細胞形質膜透過性および導電率を有意に増加させるプロセスである。エレクトロポレーションは、細胞内にある材料を導入する、例えば細胞に分子プローブ、細胞機能を変化させうる薬剤またはＤＮＡ分子を装填する方法として、分子生物学に用いられてきている。
【０００９】
分子生物学において、エレクトロポレーションのプロセスは、しばしば、細菌、酵母、および植物プロトプラストの形質転換に用いられている。脂質膜に加えて、細菌はまた、脂質膜とは異なり、そしてペプチドグリカンおよびその誘導体で作製される細胞壁も有する。しかし、細胞壁は、天然に多孔性であり、そして激しい環境の衝撃から細菌を防御する堅い殻としてのみ作用する。細菌およびプラスミドをともに混合すると、プラスミドは、エレクトロポレーション後、細胞内にトランスファーされうる。数ミリメートルの距離を渡る数１００ボルトがこのプロセスで典型的に用いられる。
【００１０】
この方法はまた、組織培養細胞、例えば培養哺乳動物細胞においても使用可能である。細菌における形質転換とは対照的に、外来ＤＮＡを真核細胞に導入するプロセスは、一般に、トランスフェクションとして知られる。エレクトロポレーション・キュベットを用いた懸濁において、細胞をトランスフェクションするために、エレクトロポレーションが用いられてきている。
【００１１】
低効率／スループットおよび技術的困難を含む、上述のマイクロインジェクションの多くの障害を克服する、多大なそして明らかな必要性があるにも関わらず、エレクトロポレーションは、当業者によって有望な代替アプローチとしては見なされてきておらず、そして遺伝子材料を哺乳動物胚に導入し、続いて遺伝子改変動物に発生させるためにエレクトロポレーションを使用したという報告はない。
【００１２】
特に、エレクトロポレーションは、以前、組織培養細胞およびマウスにおける移植後胚に主に用いられてきている（Ｍｅｌｌｉｔｚｅら，  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．，  １１８：５７−６３（２００２）；  Ａｋａｍａｔｓｕら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９６：９８８５−９８９０（１９９９）；  Ｐｏｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８１：７１６１−７１６５（１９８４）；  ＯｓｕｍｉおよびＩｎｏｕｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２４：３５−４２（２００１）；  Ｆｕｋｕｃｈｉ−ＳｈｉｍｏｇｏｒｉおよびＧｒｏｖｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１０７１−１０７４（２００１）；ならびにＴａｂａｔａおよびＮａｋａｊｉｍａ，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １０３：８６５−８７２（２００１）を参照されたい）。
【００１３】
１つの研究において、Ｎｅｍｅｃら（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３１：２３３，  １９８９）は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｐＳＶＮＥＯ）をマウス一細胞胚（すなわち接合子）に、エレクトロポレーションを通じて導入しようとする試みを記載した。しかし、ネオマイシン遺伝子を含むＤＮＡは、著者らによると、接合子をエレクトロポレーションに供する前に、電流に曝露する際の外因性ＤＮＡおよび前核の間の距離を減少させるため、接合子の形質膜および透明帯の間の囲卵腔内にまず注入された。著者らは、１つの実験において、サザンブロット分析によって、偽妊娠ＩＣＲレシピエントにトランスファーされた２２６の胚から生じた５５匹の仔において、ネオマイシン遺伝子の取り込みがなかったことが明らかになったと報告した。エレクトロポレーションのパルス中にトランスファーされる総エネルギーを増加させるために設計された、高塩培地を用いた追跡実験において、著者らは再び、予備的データによって、生殖系列伝達が成功しなかったと示唆する予備的データを報告した。
【００１４】
より最近、エレクトロポレーションは、同じ、およびモルホリノをコードするｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡベクターをマウス移植前胚に送達するために、エレクトロポレーションが成功裡に使用されている（Ｇｒａｂａｒｅｋら，  Ｇｅｎｅｓｉｓ，  ３２：２６９−２７６（２００２）；  Ｗａｎｇら，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ３１８：１１２−１２５（２００８）；およびＰｅｎｇら，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ７（８）：ｅ４３７４８．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３７４８（２０１２））。しかし、これらの試薬は、細胞質ゾルで働き、生殖系列を通じて伝達可能な遺伝子修飾を達成するために必要であるように、核では働かない。さらに具体的には、これらの試薬は、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡを分解することによるか、またはｍＲＮＡの翻訳をブロックすることによるか、あるいはその両方によるかのいずれかで、それぞれのターゲット遺伝子の発現を阻害することによって働く。
【００１５】
したがって、外因性生物学的または遺伝子材料を初期胚に導入して、生殖系列伝達を通じて遺伝子改変動物を生成する際に使用するため、マイクロインジェクションの多くの欠点（例えば低効率）を克服する、長年の必要性にも関わらず、当該技術分野には、エレクトロポレーションなどの見たところより単純な技術からは離れる動きが大勢を占めるようである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第４，８７３，１９１号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ，  ２２：４７９−４８８，  １９８０年１１月
【非特許文献２】Ｇｏｒｄｏｎら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７７：７３８０−７３８４，  １９８０年１２月）
【非特許文献３】Ｊａｅｎｉｓｃｈら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７１：１２５０−１２５４，  １９７４）
【非特許文献４】Ｍｅｌｌｉｔｚｅら，  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．，  １１８：５７−６３（２００２）
【非特許文献５】Ａｋａｍａｔｓｕら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９６：９８８５−９８９０（１９９９）
【非特許文献６】Ｐｏｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８１：７１６１−７１６５（１９８４）
【非特許文献７】ＯｓｕｍｉおよびＩｎｏｕｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２４：３５−４２（２００１）
【非特許文献８】Ｆｕｋｕｃｈｉ−ＳｈｉｍｏｇｏｒｉおよびＧｒｏｖｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１０７１−１０７４（２００１）
【非特許文献９】ＴａｂａｔａおよびＮａｋａｊｉｍａ，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １０３：８６５−８７２（２００１）
【非特許文献１０】Ｎｅｍｅｃら（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３１：２３３，  １９８９）
【非特許文献１１】Ｇｒａｂａｒｅｋら，  Ｇｅｎｅｓｉｓ，  ３２：２６９−２７６（２００２）
【非特許文献１２】Ｗａｎｇら，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ３１８：１１２−１２５（２００８）
【非特許文献１３】Ｐｅｎｇら，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ７（８）：ｅ４３７４８．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３７４８（２０１２）
【発明の概要】
【００１８】
本発明の１つの側面は、遺伝子改変哺乳動物を生成する方法であって、エレクトロポレーションを通じて、哺乳動物の配偶子または移植前段階の胚内に材料を導入して、哺乳動物のゲノムを修飾する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１９】
特定の態様において、材料を配偶子内に導入する。例えば、配偶子は、卵子（ｏｖｕｍ）または卵（ｅｇｇ）であってもよい。特定の態様において、方法は、配偶子を反対の性別の配偶子と融合させ、そして生産（ｌｉｖｅ−ｂｏｒｎ）遺伝子改変哺乳動物への発生を可能にする工程をさらに含む。
【００２０】
特定の態様において、移植前段階の胚は、一細胞胚（すなわち接合子）、二細胞胚、四細胞胚、初期桑実胚、または後期桑実胚である。
特定の態様において、方法は、（エレクトロポレーションした）移植前段階の胚を生産遺伝子改変哺乳動物に発生させる工程をさらに含む。
【００２１】
特定の態様において、材料は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド（例えばタンパク質）、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両方を含む。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列を含む。
【００２２】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列にハイブリダイズする、クラスタード・レギュラリー・インタースペースド・ショート・パリンドロミック・リピーツ（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＥＲ−Ｃａｓ）システム・ガイドＲＮＡを含む。
【００２３】
特定の態様において、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム・ガイドＲＮＡの濃度比は、少なくとも約１：１、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約２．５：１、少なくとも約３：１またはそれより高い。
【００２４】
特定の態様において、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列の濃度は、少なくとも約４０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬ、少なくとも１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも２００ｎｇ／μＬ、少なくとも３００ｎｇ／μＬ、少なくとも４００ｎｇ／μＬ、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、少なくとも６００ｎｇ／μＬ、少なくとも８００ｎｇ／μＬ、または少なくとも１０００ｎｇ／μＬあるいはそれより高い。
【００２５】
特定の態様において、材料はドナーポリヌクレオチドをさらに含む。例えば、ドナーポリヌクレオチドは直鎖または環状二重鎖または一本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列に特異的な転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のコード配列を含む。
【００２６】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のコード配列を含む。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列に特異的なＢｕＤ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）のコード配列を含む。
【００２７】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物ゲノム内にランダムに組み込まれるＤＮＡを含む。
特定の態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡベクターを含む。特定の態様において、ポリヌクレオチドはＲＮＡを含む。
【００２８】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片をランダムにまたは特異的に哺乳動物ゲノム内に組み込む、トランスポザーゼを含む。
特定の態様において、哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類（例えばマーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）、チンパンジー）、齧歯類（例えばマウス、ラット、スナネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、モルモット、ハムスター、コットンラット、ハダカデバネズミ（ｎａｋｅｄ  ｍｏｌｅ  ｒａｔ））、ウサギ、家畜哺乳動物（例えばヤギ、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、ウシ、ウマ、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ））、ペット哺乳動物（例えばイヌ、ネコ）、動物園哺乳動物、有袋類（ｍａｒｓｕｐｉａｌ）、絶滅危惧哺乳動物、およびその非近交系または任意交配集団である。
【００２９】
特定の態様において、配偶子（反対の性別の配偶子と融合した後）または移植前の胚を、エレクトロポレーション後、胚を出産するまで保持することが可能な偽妊娠宿主哺乳動物に移植する。
【００３０】
特定の態様において、配偶子（反対の性別の配偶子と融合した後）または移植前の胚を、偽妊娠宿主哺乳動物に移植する前に、エレクトロポレーションを実行する培地から取り除く。
【００３１】
特定の態様において、哺乳動物ゲノムを、１またはそれより多い塩基対の挿入または欠失によって、異種ＤＮＡ断片の挿入によって、内因性ＤＮＡ断片の欠失によって、内因性ＤＮＡ断片の反転または転位置によって、あるいはその組み合わせによって、修飾する。
【００３２】
特定の態様において、哺乳動物のゲノムを、ＮＨＥＪ（非相同端連結）、ＨＤＲ（相同組換え修復）またはＨＲ（相同組換え）によって修飾する。
特定の態様において、約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００またはそれより多い配偶子または移植前段階の胚を同時にエレクトロポレーションする。
【００３３】
特定の態様において、エレクトロポレーションした移植前段階の胚の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多くが、胚盤胞段階の胚に発生するかまたは生産トランスジェニック哺乳動物に発生する。
【００３４】
特定の態様において、すべての配偶子および移植前段階の胚を同じエレクトロポレーションキュベット中でエレクトロポレーションする。
特定の態様において、エレクトロポレーション前に、配偶子または移植前段階の胚を前処理して、透明帯を弱める。
【００３５】
特定の態様において、配偶子または移植前段階の胚を、酸性タイロード溶液（ＡＴ）または同等物中で前処理する。
特定の態様において、エレクトロポレーションを：２０〜３０ボルト（例えば２５、２６、または２７ボルト）、パルス期間１〜２ｍｓ（例えば１．５ｍｓ）、１〜３回パルス、パルス間隔１００〜１０００ｍｓ（例えば約１２５〜１３０ｍｓ）のセッティングを用いて、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット中で行う。
【００３６】
特定の態様において、配偶子または移植前段階の胚を、エレクトロポレーション後、保存のために凍結し、そして次いで融解する。
本発明の別の側面は、本発明の方法のいずれか１つによって生成された、遺伝子改変哺乳動物を提供する。
【００３７】
上記および以下で本明細書に記載するいかなる態様も、実施例にのみ記載される（本明細書に援用される）特定の態様を含めて、本発明の任意の他の態様と組み合わせることが可能であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１−１】図１Ａおよび１Ｂは、本方法を用いた、マウス胚におけるＣＲＩＳＰＲ仲介遺伝子破壊を示す。具体的には、図１Ａは、Ｔｅｔ１遺伝子座をターゲットとする胚の遺伝子型決定を示す。ＲＦＬＰ分析を上部パネルに示し、そして配列決定結果を下部パネルに示す。ＲＦＬＰ分析に用いた、ターゲット領域の制限部位を太字および下線で示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を赤で色づける。２つの胚由来の突然変異体アレルを示し、そして突然変異塩基を青で色づける。
【図１−２】図１Ａおよび１Ｂは、本方法を用いた、マウス胚におけるＣＲＩＳＰＲ仲介遺伝子破壊を示す。図１Ｂは、Ｔｅｔ２遺伝子座でターゲティングされる胚の遺伝子型決定を示す。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、本方法を用いた生存マウスにおけるＣＲＩＳＰＥＲ仲介遺伝子破壊を示す。具体的には、図２Ａにおいて：Ｔｅｔ２遺伝子座をターゲティングし、そしてそれぞれ４００ｎｇ／μＬおよび２００ｎｇ／μＬで用いる、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）を、エレクトロポレーションによってマウス胚に送達した。次いで、エレクトロポレーションした胚を偽妊娠雌マウスに移植した。尾の生検試料を新生マウスから採取し、そしてＥｃｏＲＶ酵素とともにＲＦＬＰ法を用いて、遺伝子型決定した。マウス８５Ｃ３由来のＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ消化に対して耐性であり、そして８５Ｃ１０由来の産物は、部分的に耐性である。図２Ｂにおいて：Ｔｅｔ２遺伝子座をターゲティングするＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを、それぞれ、６００ｎｇ／μＬおよび３００ｎｇ／μＬで用いた。マウス８６Ｃ３および８６Ｃ９由来のＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ消化に対して耐性であり、そしてマウス８６Ｃ５、８６Ｃ７および８６Ｃ８由来のものは、部分的に耐性であった。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｄは、本方法を用いた生存マウスにおけるＣＲＩＳＰＥＲ仲介遺伝子破壊を示す。図２Ｃにおいて：マウス８５Ｃ３、８５Ｃ１０、８６Ｃ３、８６Ｃ５、８６Ｃ７、８６Ｃ８、および８６Ｃ９由来のＰＣＲ産物をサンガー配列決定によってプロセシングし、そして野生型試料由来のものに比較した際のクロマトグラムを示した。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｄは、本方法を用いた生存マウスにおけるＣＲＩＳＰＥＲ仲介遺伝子破壊を示す。図２Ｃにおいて：マウス８５Ｃ３、８５Ｃ１０、８６Ｃ３、８６Ｃ５、８６Ｃ７、８６Ｃ８、および８６Ｃ９由来のＰＣＲ産物をサンガー配列決定によってプロセシングし、そして野生型試料由来のものに比較した際のクロマトグラムを示した。
【図２−４】図２Ａ〜２Ｄは、本方法を用いた生存マウスにおけるＣＲＩＳＰＥＲ仲介遺伝子破壊を示す。図２Ｄ：マウス８５Ｃ３、８６Ｃ３および８６Ｃ９由来のＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏベクター内にクローニングし、そして個々のクローンを配列決定した。３匹すべての創始者マウス由来のアレルの中に、ＩＮＤＥＬ突然変異が容易に検出された。
【図３−１】図３Ａは、実験１５由来の１１の創始者マウスの遺伝子型決定の結果を示す。上部パネルは、ＲＦＬＰ分析を伴わないＰＣＲ産物を示す。中央のパネルは、ＥｃｏＲＶを用いたＲＦＬＰ分析を示す。下部パネルは、ＥｃｏＲＩを用いたＲＦＬＰ分析を示す。
【図３−２】図３Ｂは、選択した創始者マウスおよび対照マウスのサンガー配列決定を示す。対照マウスにおける野生型配列に関して変化した配列（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ仲介ＨＤＲを通じる）を下線で示している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
１．概説
遺伝子改変動物（例えばトランスジェニックまたは他の遺伝子改変哺乳動物）を生成する背景において、マイクロインジェクションに関連する生得的な限界を克服するため、本出願者は、方法を、高い生存率を有する遺伝子改変動物の高効率ハイスループット生成に受け入れられるものにする特定の条件下で、生物学的／遺伝子材料を動物（例えば哺乳動物）配偶子または接合子を含む移植前の胚内に送達する、エレクトロポレーションに基づく方法論を開発した。生じた遺伝子修飾は、生殖系列を通じて容易に伝達可能である。
【００４０】
具体的には、例示的な態様において、本発明の方法を用いて、マウス胚（例えば接合子）にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達して、こうして生じる遺伝子修飾／トランスジェニックマウスのゲノムにおいて、ターゲティング化遺伝子修飾を達成した。本明細書で最適化された態様またはプロトコルを含む本発明の方法は、商業的に入手可能なエレクトロポレーターを用いて実施可能であり、一方、最小限の訓練または以前の経験しか必要とせず、そしてしたがって、多数の胚および複数の遺伝子ターゲティングプロジェクトを、平行して、単一の工程でプロセシング可能である。本明細書に記載する本発明の方法を用いて、限定されるわけではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、およびＺＦＮ、またはその組み合わせ等を含む、任意の多様な生物学的、遺伝子、または他の材料を、配偶子および初期胚（例えば接合子を含む哺乳動物移植前胚）に送達可能である。したがって、本明細書記載の技術は、前例のない容易さおよび規模で、動物ゲノム操作を可能にする。
【００４１】
本明細書記載の発明は、部分的に、エレクトロポレーションを用いて、比較的高濃度（例えば以前は毒性レベルと考えられていた濃度）の生物学的／遺伝子材料を配偶子および接合子を含む移植前の胚に送達可能であり、こうした高濃度は、エレクトロポレーションした配偶子および初期段階の胚の核において、望ましい最終結果、例えば配偶子または胚のゲノムの遺伝子修飾を達成するために必要である可能性があり、こうした修飾が生殖系列伝達を通じて伝達されうるという発見に基づく。
【００４２】
具体的には、比較的低濃度のＣａｓ９  ｍＲＮＡ（５０または１００ｎｇ／μＬ）およびｓｇＲＮＡ（２５または５０ｎｇ／μＬ）が前核または細胞質マイクロインジェクション実験において成功裡に用いられた、先のマイクロインジェクション実験に基づき、本出願者は、報告される遺伝子コードプラスミドを用いて、接合子にエレクトロポレーションを試みた（実施例１を参照されたい）。驚くべきことに、エレクトロポレーションした接合子から発生した３．５日胚において、蛍光はまったく観察されなかった。透明帯を弱める前処理を伴う；あるいは他のレポーターまたはフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドを伴う、他の濃度のＤＮＡを用いた類似の実験もまた失敗した。実施例１に言及する実験２〜６を参照されたい。
【００４３】
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含む、エレクトロポレーション実験に用いる試薬は、より高い濃度で用いた際、胚に対して毒性でありうると広く考えられている。
本出願者は、本明細書において、接合子などの初期段階の胚に、比較的高濃度の生物学的材料（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含むポリヌクレオチド）を用いてエレクトロポレーションして、胚またはエレクトロポレーションした胚から発生した動物において、望ましい遺伝子修飾を達成することも可能であることを立証した。実施例２を参照されたい。
【００４４】
本明細書記載の発明は、エレクトロポレーションした配偶子および接合子を含む移植前の胚が生理学的溶液または培地内に放出されない限り、エレクトロポレーションした配偶子および接合子を含む移植前の胚が、通常、発生遅延または抑止を示すか、あるいは生産動物になるまで生き延びないという発見に、さらに部分的に基づく。例えば、溶液または培地は、とりわけ、等張性である。さらに、エレクトロポレーションした配偶子および接合子を含む移植前の胚を、生理学的溶液または培地に放出することによって、通常のエレクトロポレーション培地を除去し（例えばポリヌクレオチドを溶解するために用いる緩衝液、例えばＴＥ）、こうして、該培地中の何らかの有害物質が、続く胚発生を遅延させる可能性をさらに減じる。
【００４５】
例えば、エレクトロポレーションに用いる緩衝液または培地が生理学的溶液または培地でない場合、例えばエレクトロポレーションしようとする材料を溶解するために用いた過剰な（例えば４０％または５０％を超える）緩衝液を含有する場合、こうした緩衝液をエレクトロポレーション後、速やかに除去することが有用でありうる。
【００４６】
特定の態様において、一般的に核酸試薬を溶解するために用いるＴＥまたは他の類似の緩衝液が、エレクトロポレーション培地中にかなりの量（例えば＞４０％または５０％）存在する場合、いくつかの手段を用いて、いかなる潜在的に有害な影響を軽減することも可能である。例えば、１つの態様において、エレクトロポレーションした配偶子または胚を、エレクトロポレーション後、生理学的溶液中で直ちに洗浄することによって、配偶子または胚をＴＥ緩衝液中に浸す時間を最小限にすることも可能である。他の態様において、全体のモル浸透圧濃度が生理学的なものにより近くなるように、ＴＥ緩衝液中に溶解した核酸試薬（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬）を生理学的溶液と適切な比率で混合してもよい。さらに別の態様において、核酸試薬（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬）を生理学的溶液中で直接再構成して、いかなる合併症も回避するかまたは最小限にしてもよい。すなわち、配偶子および接合子を含む移植前の胚を、生理学的溶液または培地、例えば等張性である溶液中でエレクトロポレーションしてもよい。生理学的溶液または培地は、塩組成および浸透圧が血漿と類似である、人工的に調製した溶液であってもよい。
【００４７】
エレクトロポレーションは、実際に、生物学的材料を、本明細書記載の条件下で接合子内に導入可能であるが、生産動物を生成するには、続く発生において接合子が生存する必要がある。エレクトロポレーションした接合子を培養する際の最初の失敗は、望ましい遺伝子修飾がエレクトロポレーションした接合子において起こるかどうかに関わらず、接合子がエレクトロポレーションプロセスを生き延びて、そして生産動物に発生し続けることが不可能であることを示唆するようである。ＡＴ処理が接合子に過剰に損傷を与えて、胚発生を遅延させる可能性があり、そしてＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡなどの送達される試薬が接合子および続く発生に対して毒性である可能性もあるという認識は、さらに、動物において、生殖系列に伝達可能な遺伝子修飾を永続的に導入する有望な手段として、エレクトロポレーションを用いることを支持しない。
【００４８】
本出願者は、本明細書において、例えば、胚盤胞段階の胚への発生成功によって評価されるように、エレクトロポレーションした接合子の生存率は、本発明の方法を用いて、驚くほど高レベル（例えば１００％に近いかまたはさらに１００％に達する）に劇的に改善されうることを立証した。
【００４９】
したがって、本発明の１つの側面は、遺伝子改変動物（例えば哺乳動物）を生成する方法であって、動物（例えば哺乳動物）の配偶子または移植前段階の胚内に、エレクトロポレーションを通じて材料を導入して、動物（例えば哺乳動物）のゲノムを修飾する工程を含む、前記方法を提供する。
【００５０】
関連する側面において、本発明はまた、遺伝子改変動物（例えば哺乳動物）を生成する方法であって、エレクトロポレーションを通じて、動物（例えば哺乳動物）の除核した卵母細胞に材料を導入して、動物（例えば哺乳動物）のゲノムを修飾する工程を含み、エレクトロポレーションショックによって、体細胞を除核卵母細胞と同時に融合させる、前記方法を提供する。体細胞と除核卵母細胞の融合は、ブタクローニングに用いられた方法である。
【００５１】
特定の態様において、材料を配偶子内に導入する。例えば、配偶子は、精子（例えば成熟精子）、極体、あるいは卵子または卵であってもよい。成熟精子を用いる場合、精子をまず誘導して、脱凝縮を経させることも可能である。精子脱凝縮のための技術は、当該技術分野に知られる。例えば、Ｍａｈｉら，  Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｆｅｒｔ．，  ４４：２９３−２９６（１９７５）；  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら，  Ｅｘｐｔｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  ４０：４０２−４１２（１９６５）；およびＷａｇｎｅｒら，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ，  １：３１−４１（１９７８）（すべて本明細書に援用される）を参照されたい。ジスルフィド還元剤の使用を通じた脱凝縮が好ましい。卵を用いる場合、卵は受精していても、または例えば単為生殖によって生じた活性化状態にあってもよい。エレクトロポレーションした極体もまた、半数体の卵を二倍体化するために使用可能である。
【００５２】
配偶子を用いる場合、本発明の方法は、エレクトロポレーションした配偶子を別の配偶子、例えば反対の性別の配偶子と融合させ（例えばエレクトロポレーションした卵を精子と融合させ）、そして融合した配偶子を生産遺伝子改変動物（例えば哺乳動物）に発生させる工程をさらに含む。例えば、精子にエレクトロポレーションした場合、遺伝子修飾が達成された精子細胞を、その後、卵の中に入れて、接合子の形成を可能にする。そしてその逆を行うことも可能である。精子および卵は、どちらも、接合子の形成前にエレクトロポレーションすることが可能である。
【００５３】
反対の性別の配偶子と融合させた後のエレクトロポレーションした配偶子、またはエレクトロポレーション後の移植前の胚を、胚を出産するまで保持することが可能な動物（例えば哺乳動物）である、好ましくは同じ種または系統の偽妊娠宿主動物／哺乳動物内に移植することも可能である。特定の態様において、発生の桑実胚または胚盤胞段階で、偽妊娠宿主動物／哺乳動物への移植を行う。他の態様において、胚のエレクトロポレーション直後に、またはエレクトロポレーションした配偶子を別の配偶子と融合させた直後に、移植を行う。
【００５４】
他の態様において、材料を初期段階の胚、例えば移植前段階の胚に導入する。移植前段階の胚は、一細胞胚（すなわち接合子）、二細胞胚、四細胞胚、八細胞胚、初期桑実胚、または後期桑実胚であってもよい。胚発生はときに、非対称分裂を伴うため、少なくとも一過性に、初期段階の胚が三、五、六、七細胞胚、または対称的胚分裂の結果ではない他の胚であることが可能である。本発明の方法はまた、こうした初期段階の胚にも当てはまる。特定の態様において、方法は、（エレクトロポレーションした）移植前段階の胚を、生産遺伝子改変動物（例えば哺乳動物）に発生させることを可能にすることをさらに含む。例えば、エレクトロポレーション後の移植前の胚を、胚を出産するまで保持することが可能な動物（例えば哺乳動物）である、好ましくは同じ種または系統の偽妊娠宿主動物（例えば哺乳動物）内に移植することも可能である。
【００５５】
特定の態様において、偽妊娠宿主動物（例えば哺乳動物）内に移植する前に、配偶子（反対の性別の配偶子と融合させた後）または移植前の胚を、まず、エレクトロポレーションを行った培地から取り除く。例えば、エレクトロポレーションした配偶子または移植前の胚を、胚発生に適したまたはこれと適合する培地（例えば等張性生理学的溶液または培地）中で１回またはそれより多く、洗浄することも可能である。こうした洗浄はまた、有害でありうるかまたはそうでなければｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのさらなる胚発生を促さない、エレクトロポレーション培地または緩衝液中のいかなる物質も除去する。
【００５６】
この目的のために適した培地には、限定されるわけではないが、Ｍ２培地またはＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）または任意の他の生理学的溶液（適切なイオン強度およびｐＨを持つもの）が含まれる。特定の態様において、洗浄に用いる培地または緩衝液を、動物（例えば哺乳動物）の胚発生に最適な温度（例えば約３７℃）にあらかじめ温めて、いかなる潜在的な温度ショックも減少させるかまたは最小限にする。
【００５７】
特定の態様において、エレクトロポレーション培地は等張性である。
特定の態様において、エレクトロポレーションした配偶子または移植前の胚を洗浄して、ポリヌクレオチドを溶解するために用いた１またはそれより多い緩衝液、例えばＴＥ緩衝液、または金属キレート、例えばＥＤＴＡを含有する同等の緩衝液を取り除く。
【００５８】
特定の態様において、エレクトロポレーションした配偶子または移植前の胚を洗浄して、基礎または減少血清培地、例えばＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カリフォルニア州カールスバッド）、ｓｉＰＯＲＴＴＭ（ＡＭ８９９０またはＡＭ８９９０Ｇ；Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）あるいはエレクトロポレーション培地として使用可能な、その混合物または同等物を除去する。
【００５９】
生殖系列を通じて伝播可能な遺伝子修飾を達成するため、本発明の方法を用いて、配偶子または移植前の胚内に多くの試薬または材料を導入可能である。
特定の態様において、材料は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または両方を含んでもよい。他の態様において、さらなる材料、例えばＮＨＥＪ、ＨＤＲまたはＨＲプロセスを促進するかまたは阻害するように、性質が化学的であるかまたは合成である、さらなる材料もまた、エレクトロポレーションを通じて導入可能である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の機能を促進するかまたは増進するために、特定の化学的試薬が含まれてもよい（以下を参照されたい）。
【００６０】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列を含む。例示的な態様において、Ｃａｓ９タンパク質のコード配列は、ｍＲＮＡ、例えば真核生物における発現に適したコドン最適化ｍＲＮＡである。
【００６１】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物ゲノム中のターゲット配列にハイブリダイズ可能である、クラスタード・レギュラリー・インタースペースド・ショート・パリンドロミック・リピーツ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システム・ガイドＲＮＡを含んでもよい。ガイドＲＮＡは、細胞内生理学的条件下でハイブリダイズ可能であるように、ターゲット配列に配列が十分に類似であればよい。しかし、特定の態様において、ガイドＲＮＡは、ターゲット配列に完全に相補的（または１００％同一）である。
【００６２】
特定の態様において、ガイドＲＮＡは、トランス活性化ｃｒ（ｔｒａｃｒ）配列に融合したガイド配列であってもよい。
特定の態様において、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム・ガイドＲＮＡの濃度比は多様であってもよい。例えば、適切な比は、少なくとも約１：１、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約２．５：１、少なくとも約３：１またはそれより高くてもよい。
【００６３】
他の態様において、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム・ガイドＲＮＡの濃度比は、最大約１：１、最大約１：２、最大約１：４、最大約１：５、最大約１：１０またはそれより低くてもよい。
【００６４】
特定の態様において、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質のコード配列の濃度は、少なくとも約４０ｎｇ／μＬ、少なくとも５０ｎｇ／μＬ、少なくとも１００ｎｇ／μＬ、少なくとも１５０ｎｇ／μＬ、少なくとも２００ｎｇ／μＬ、少なくとも３００ｎｇ／μＬ、少なくとも４００ｎｇ／μＬ、少なくとも５００ｎｇ／μＬ、少なくとも６００ｎｇ／μＬ、少なくとも８００ｎｇ／μＬ、または少なくとも１０００ｎｇ／μＬあるいはそれより高い。
【００６５】
特定の態様において、材料はドナーポリヌクレオチド（例えばＣＲＩＳＰＲ仲介ＮＨＥＪ、ＨＤＲまたはＨＲを容易にするため）をさらに含む。例えば、ドナーポリヌクレオチドは直鎖または環状二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。こうしたドナーポリヌクレオチドは、導入されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のターゲットでありうるターゲット配列のまたはその周囲の部位特異的修飾を促進するために、含まれてもよい。
【００６６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系以外の、他の材料もまた、本発明の方法を用いて、配偶子または移植前の胚に導入可能である。例えば、特定の態様において、ポリヌクレオチドは、動物（例えば哺乳動物）ゲノム中のターゲット配列に特異的な転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のコード配列を含んでもよい。他の態様において、ポリヌクレオチドは、動物（例えば哺乳動物）ゲノム中のターゲット配列に特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のコード配列を含んでもよい。さらに他の態様において、ポリヌクレオチドは、動物（例えば哺乳動物）ゲノム中のターゲット配列に特異的なＢｕＤ由来ヌクレアーゼ（ＢｕＤＮ）、またはモジュラー塩基対塩基特異的核酸結合ドメイン（ＭＢＢＢＤ）由来ヌクレアーゼのコード配列を含んでもよい。さらに別の態様において、ポリヌクレオチドは、動物（例えば哺乳動物）ゲノム内にランダムに組み込まれるＤＮＡを含んでもよい。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、および／またはＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ）を含んでもよい。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片をランダムにまたは特異的に哺乳動物ゲノム内に組み込むトランスポザーゼを含む。
【００６８】
本発明は、配偶子細胞の合体（ｕｎｉｏｎ）によって、異型配偶子融合、すなわち有性生殖を経る、多細胞真核動物の遺伝子修飾において、適用を有する。こうした動物の例には、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物、硬骨魚、軟骨魚、円口類、節足動物、昆虫、軟体動物、および葉状植物が含まれる。例示的な動物には、哺乳動物、鳥類および魚類が含まれる。
【００６９】
特定の態様において、動物は哺乳動物である（以下を参照されたい）。例えば、哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル、チンパンジー）、齧歯類（例えばマウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コットンラット、ハダカデバネズミ）、ウサギ、家畜哺乳動物（例えばヤギ、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、ウシ、ウマ、ラクダ科）、ペット哺乳動物（例えばイヌ、ネコ）、動物園哺乳動物、有袋類、絶滅危惧哺乳動物、あるいはその非近交系または任意交配集団である。
【００７０】
本発明の方法を用いて、限定されるわけではないが：小さい挿入または欠失（例えば１またはそれより多い塩基対のもの）、異種ＤＮＡ断片の挿入、内因性ＤＮＡ断片の欠失、内因性ＤＮＡ断片の反転または転位置、あるいはその組み合わせを含めて、関与する動物種のゲノムに対して、多くの生殖系列伝達可能修飾を導入することも可能である。同様に、限定されるわけではないが、非相同端連結（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を含む修飾を達成する際に、多くの異なる機構が関与することも可能である。
【００７１】
相同組換え修飾（ＨＤＲ）は、細胞において、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復する機構である。この修復機構は、核に存在するＤＮＡの相同片がある際、大部分は細胞周期のＧ２およびＳ期にある細胞によってのみ使用可能である。
【００７２】
相同ＤＮＡ片が存在しない場合、非相同端連結（ＮＨＥＪ）と呼ばれる別のプロセスを行ってもよい。非相同端連結（ＮＨＥＪ）は、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する別の経路である。ＮＨＥＪは、修復をガイドするために相同配列を必要とする相同組換えとは対照的に、相同テンプレートの必要性を伴わずに、切断端を直接連結するため、「非相同」と称される。ＮＨＥＪは、典型的には、短い相同ＤＮＡ配列（例えばマイクロホモロジー）を利用して修復をガイドする。これらのマイクロホモロジーは、しばしば、二本鎖切断端上の一本鎖オーバーハング中に存在する。オーバーハングが完全に適合性である場合、ＮＨＥＪは、通常、切断を正確に修復する。ヌクレオチドの喪失を導く、不正確な修復もまた起こりうるが、オーバーハングが適合性でない場合にはるかにより一般的である。不適切なＮＨＥＪは転位置およびテロメア融合を導きうる。ＮＨＥＪは、生物界全体で進化的に保存され、そして哺乳動物細胞において、支配的な二本鎖切断修復経路である。
【００７３】
ＮＨＥＪ経路が不活性化されている場合、二本鎖切断は、マイクロホモロジー仲介性末端連結（ＭＭＥＪ）として知られる、よりエラーが起こりやすい経路によって修復されてもよい。この経路において、末端切除によって、切断のいずれかの側での短いマイクロホモロジーが明らかになり、これらは次いで整列されて修復をガイドする。これは、典型的にはＤＳＢ端の一本鎖オーバーハング中ですでに曝露されているマイクロホモロジーを使用する古典的なＮＨＥＪとは対称的である。したがって、ＭＭＥＪによる修復は、マイクロホモロジー間のＤＮＡ配列の欠失を導く。
【００７４】
相同組換えは、相同ＤＮＡの２つの類似のまたは同一の分子間でヌクレオチド配列が交換される遺伝子組換えの一種である。これは、二本鎖切断（ＤＳＢ）として知られる、ＤＮＡの両鎖上で起こる有害な切断を正確に修復するために、細胞によって最も広く用いられる。相同組換えはまた、真核生物が、動物における精子および卵細胞のように、配偶子細胞を作製するプロセスである減数分裂中、ＤＮＡ配列の新たな組み合わせを生じるプロセスでもある。相同組換えは、生命の３つすべてのドメインに渡って、ならびにウイルスにおいて保存される。
【００７５】
本発明の方法は、単一の配偶子または移植前の胚に適しており、そしてまた、約２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００またはそれより多い配偶子または移植前段階の胚に関して、多重化し、そして同時に使用するためにも適しており、例えば、同じエレクトロポレーションキュベット、あるいは多数の類似のまたは同一のキュベット中のいずれかで、同じまたは異なる条件下で、すべて同時にエレクトロポレーションしてもよい。
【００７６】
本発明の方法は、多くの観点でマイクロインジェクションよりも優れている。マイクロインジェクションに比較して、本方法は、はるかにより効率が高く、そしてはるかにより技術的に要求が少なく、そして標準化を受け入れやすいだけでなく、胚の生存率および生殖系列伝達率がどちらもはるかにより高い。例えば、マイクロインジェクションは、典型的には、注入されたマウス胚の約２０〜２５％の生存率を達成する（例えば約２０〜２５％の注入マウス胚が生き延びて、生産仔マウスを生じる）。比較して、エレクトロポレーションした移植前段階の胚（またはエレクトロポレーションし、次いで融合させた配偶子）の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多くが、好ましくはマッチした対照に匹敵する速度で、例えば接合子に関してはエレクトロポレーションの約３．５日後に、胚盤胞段階の胚に発生するか、または生産トランスジェニック哺乳動物に発生する。例えば、マッチした対照は、空のベクター、スクランブル化ｍＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのガイド配列、または緩衝液のみによってエレクトロポレーションされていてもよい、偽エレクトロポレーション配偶子または胚であってもよい。
【００７７】
特定の態様において、エレクトロポレーションした移植前段階の胚（またはエレクトロポレーションし、次いで融合させた配偶子）の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれより多くが、生産トランスジェニック哺乳動物に発生する。
【００７８】
特定の態様において、設計したような遺伝子修飾を含有する生産哺乳動物の割合によって推測される宿主ゲノムのターゲティング効率は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％に近い。
【００７９】
いかなる特定の理論によっても束縛されることは望ましくないが、本方法の高ターゲティング効率は、胚を相同性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ溶液に浸し、そしてエレクトロポレーションに際して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬への類似の曝露を行うという事実による可能性もある。これは、特定の実験を取り巻く技術的能力および要因のレベルが、ターゲティング効率における比較的大きな変動にすべて寄与しうる、対応するマイクロインジェクション実験とはまったく対照的である。
【００８０】
特定の態様において、エレクトロポレーション前に、配偶子または移植前段階の胚を前処理して、透明帯を弱める。例えば、配偶子または移植前段階の胚を、この目的のため、酸性タイロード溶液（ＡＴ）中で前処理することも可能である。
【００８１】
タイロード溶液は、アメリカ人薬理学者Ｍａｕｒｉｃｅ  Ｖｅｊｕｘ  Ｔｙｒｏｄｅによって発明され、そしてリンゲル・ロック溶液の修飾である。これはおおよそ間質液と等張であり、そして主に、生理学的実験および組織培養に用いられる。該溶液は、マグネシウム、糖（通常グルコース）をエネルギー供給源として含有し、そして緩衝剤として重炭酸および／またはＨＥＰＥＳを用いる。いくつかの変動にはまたリン酸および硫酸イオンも含まれる。典型的には、細胞培養適用および生理学的実験に用いる際、９５％酸素５％二酸化炭素で通気する。
【００８２】
酸性タイロード溶液は、典型的には、室温で、以下のものを１００ｍＬの水に溶解し、そしてＡｎａｌａｒ  ＨＣｌ（ＢＤＨ）でｐＨ２．５に調整することによって、調製可能である：ＮａＣｌ、０．８ｇ；ＫＣｌ、０．０２ｇ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２４ｇ；ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；グルコース、０．１ｇ；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．４ｇ。ＰＶＰを添加して、粘性を増加させ、そして胚粘着性を減少させる。溶液をフィルター滅菌して、そしてアリコットで−２０℃で保存してもよい。ＡＴは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの業者から商業的に入手可能である（例えば１００ｍＬパッケージに関してはＳＫＵ  Ｔ１７８８）。
【００８３】
特定の態様において、配偶子または移植前の胚をＡＴ中で約５〜３０秒間、約５〜２０秒間、または約５〜１０秒間、前処理する。ＡＴが希釈されている場合、より長い処理時間もまた使用可能である。適切なＡＴ処理時間は、異なる期間に渡って、配偶子または移植前の胚を処理した後、生存度、処理後の損傷を受けたまたはアポトーシス性の配偶子／胚の割合、あるいは続く発生中の胚の生存率を測定することによって、実験的に決定可能である。
【００８４】
わずかに異なるエレクトロポレーション条件が使用可能であるが、特定の態様において、本発明におけるエレクトロポレーションは：２０〜３０ボルト（例えば２５、２６、または２７ボルト）、パルス期間１〜２ｍｓ（例えば１．５ｍｓ）、１〜３回パルス、パルス間隔１００〜１０００ｍｓ（例えば約１２５〜１３０ｍｓ）のセッティングを用いて、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット中で行う。特定の態様において、類似のパラメータで、適切な調整を伴い、２ｍｍキュベットもまた使用可能である。
【００８５】
特定の実験において、エレクトロポレーション配偶子または胚を、エレクトロポレーション直後に、例えばそれぞれ、別の配偶子と融合させるか、または偽妊娠雌に移植することも可能である。他の態様において、配偶子または移植前段階の胚を、エレクトロポレーション後、保存のために凍結し、そして次いで、次の工程、例えばそれぞれ、別の配偶子との融合または偽妊娠雌への移植のために融解する。さらに別の態様において、エレクトロポレーションした配偶子または胚をまず、凍結保存の前に、（エレクトロポレーションした配偶子の場合、最初に別の配偶子とまず融合させた後）より後期の胚、例えば初期または後期桑実胚、あるいは胚盤胞段階の胚まで発生させてもよい。
【００８６】
標準的技術を用いて、例えばガラス化または緩慢プログラム可能凍結（ＳＰＦ）によって、凍結保存を行ってもよい。
特定の態様において、エレクトロポレーションに用いる移植前の胚、接合子、または配偶子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）によって得られ、凍結保存から回収される。
【００８７】
本発明の別の側面は、本発明の方法のいずれか１つによって生成される、遺伝子改変動物（例えば哺乳動物）を提供する。
本発明を一般的に上述したが、以下のセクションは、組み合わせて、そして一般的な説明の背景で読まれるべきである、本発明の特定の側面に関するさらなる詳細を提供する。
【００８８】
本明細書記載の特定の態様のいずれか１つは、実施例セクションにのみ記載するものを含めて、本発明の任意の１またはそれより多い他の態様と組み合わせ可能であることが意図される。
【００８９】
２．エレクトロポレーションおよびエレクトロポレーター
エレクトロポレーションは、細胞膜上の各ポイントの局所膜内外電位差（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｏｌｔａｇｅ）に依存する、動力学的現象である。所定のパルス期間および形状に関して、エレクトロポレーション現象の出現には、特定の膜内外電位差閾値が存在する（例えば０．５Ｖ〜１Ｖ）。これは、エレクトロポレーション電場規模（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）の閾値の定義につながる（Ｅｔｈ）。Ｅ≧Ｅｔｈの領域内にある細胞のみがエレクトロポレーションされる。第二の閾値（Ｅｉｒ）に到達するかまたはこれを超えると、エレクトロポレーションは細胞の生存性を損ない、不可逆的エレクトロポレーション（ＩＲＥ）を生じる。
【００９０】
エレクトロポレーションは、疎水性二重層コアを受動的に通過して拡散しない可能性がある、大きな高荷電分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の細胞誘導を可能にする。何らかの特定の理論によって束縛されることは望ましくないが、エレクトロポレーションの機構は、細胞膜中にｎｍ規模の水が充填された穴の生成を伴うと考えられる。エレクトロポレーション中、膜中の脂質分子は化学的に改変されず、単に位置をシフトし、水が充填されているために二重層を通じて伝導経路として作用する孔を開放する。
【００９１】
エレクトロポレーションは、通常、いくつかの別個の期を持つ多段階プロセスである。まず、短い電気パルスを適用しなければならない。典型的なパラメータは、膜を渡る、３００〜４００ｍＶ、＜１ｍｓであろう。細胞実験において用いる電位は、これらが長い距離に渡って大量の溶液に適用され、したがって実際の膜に渡って生じる電場は適用したバイアスのわずかな割合でしかないため、典型的にはより大きい。この電位の適用に際して、膜は、周囲の溶液からのイオンの移動を通じて、コンデンサーのように荷電する。臨界場が達成されたら、脂質形態に迅速な局所再編成が起こる。生じる構造は、電気的には伝導性でないが、伝導性の孔の生成を迅速に導くため、「プレ孔」と考えられる。こうしたプレ孔の存在に関する証拠は、大部分、孔の「ちらつき（ｆｌｉｃｋｅｒｉｎｇ）」から来ており、これは、伝導状態および絶縁状態の間の遷移であることを示唆する。これらのプレ孔が小さい（〜３Å）疎水性欠損であることが示唆されてきている。この理論が正しければ、伝導状態への遷移は、孔の縁での再編成によって説明可能であり、ここで、脂質頭部が折りたたまれて、親水性界面が生成される。最後に、これらの伝導性の孔は、直って二重層を再密封するか、または拡大して最終的に破裂するかいずれかである可能性がある。生じる運命は、臨界欠損サイズを超えるかどうかに依存し、これは次いで、適用される場、局所機械ストレス、および二重層の縁のエネルギーに依存する。
【００９２】
本発明にしたがって、配偶子および移植前の胚のエレクトロポレーションは、細胞溶液中に電磁場を生成するアプライアンスである、商業的に入手可能なエレクトロポレーターを用いて実行可能である。エレクトロポレーターの例示的であるが限定しない商業的モデルには：ＢＴＸ（カリフォルニア州サンディエゴ）のＥＣＭＴＭ８３０  Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ、または２００１  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＥＣＭ  ２００１）が含まれる。
【００９３】
典型的なセッティングにおいて、配偶子または移植前の胚の懸濁物を、側面に２つのアルミニウム電極を有する、ガラスまたはプラスチックキュベット内にピペッティングする。エレクトロポレーション前に、配偶子または移植前の胚を、配偶子または移植前の胚内に導入しようとする（生物学的）材料（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質、あるいはその混合物）と穏やかに混合する。混合物は、キュベット（例えば１ｍｍまたは２ｍｍ幅キュベット）内にピペッティングする前に作製しても、またはキュベット中で作製しても、いずれでもよい。典型的には、全部でほぼ２０μＬ体積の懸濁混合物を用いるが、１０〜２００μＬ、２０〜１００μＬ、２５〜７５μＬの総体積もまた使用可能である。次いで、電位および電気容量を設定し（以下を参照されたい）、そしてキュベットをエレクトロポレーター内に挿入する。エレクトロポレーション直後、所定の量（例えば全キュベット内容と等体積、約２０〜２００μＬ、または約１００μＬ）の、胚生存に最適な液体培地をキュベットに添加して、エレクトロポレーションした混合物を洗い流し、そして全内容物を適切な容器（例えば組織培養プレート）中に収集する。
【００９４】
エレクトロポレーションした配偶子または移植前の胚の生存、および培養でのまたは生産動物へのその発生は、エレクトロポレーション培地が生理学的溶液でない場合は、ある程度、その注意深い洗浄および除去に依存する。生理学的溶液は、胚発生に適した等張環境を提供するだけではなく、胚発生/生存を行うことが不可能であるいかなる潜在的に有害な物質も除去しうる。
【００９５】
配偶子または移植前の胚を、好ましくは洗浄後、偽妊娠雌にトランスファーするか、または最適な温度および／または大気条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２または５％Ｏ２／５％ＣＯ２／窒素）で必要な期間インキュベーションした後、発生中の胚、例えば３．５日胚盤胞段階の胚を代理母／偽妊娠雌にトランスファーして、満期まで発生させ、そして生存動物として出産させることも可能である。
【００９６】
ＥＣＭ  ８３０またはＥＣＭ  ２００１モデルにおいて使用可能であるような典型的なエレクトロポレーション条件には：２０〜３０ボルト（例えば２５、２６、または２７ボルト）、パルス期間１〜２ｍｓ（例えば１．５ｍｓ）、１〜３回パルス、パルス間隔１００〜１０００ｍｓ（例えば約１２５〜１３０ｍｓ）のセッティングを用いた、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット中でのエレクトロポレーションの実行が含まれうる。しかし、本明細書に開示する条件は例示目的のものであり、そしてこれに限定されないことが理解されなければならない。当業者は、例えば、導入しようとする分子のサイズおよび量、配偶子または胚のタイプなどに基づいて、パラメータを容易に調節可能である。
【００９７】
エレクトロポレーションは、商業的に入手可能なベンチトップエレクトロポレーター、例えばＢＴＸのＥＣＭ８３０またはＥＣＭ２００１モデル、およびＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（登録商標）デバイス（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）で実行可能である。いくつかの装置は、マルチウェル細胞培養プレートに適合する特別な電極アセンブリを備えて、同時に多数の試料をエレクトロポレーションする可能性を提供する。ベンチトップエレクトロポレーターは、また異なる操作パラメータを設定し、作業者が特定のパラメータ、例えば電場強度を調べるかまたは最適化することを可能にしうる。
【００９８】
３．哺乳動物
上述のように、異性配偶子融合を経る多細胞真核動物以外に、本発明の方法は、ヒト、非ヒト霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル、チンパンジー）、齧歯類（例えばマウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、コットンラット、ハダカデバネズミ）、ウサギ、家畜哺乳動物（例えばヤギ、ヒツジ、ブタ、雌ウシ、ウシ、ウマ、ラクダ科）、ペット哺乳動物（例えばイヌ、ネコ）、動物園哺乳動物、有袋類、絶滅危惧哺乳動物、およびその非近交系または任意交配集団を含む、任意の哺乳動物に特に適している。
【００９９】
特定の態様において、哺乳動物は、マウス、例えば近交系マウスである。
例示的な近交系マウス系統には、限定なしに、近交系マウス系統Ｃ３Ｈ、例えばＣＢＡ、ＤＢＡ、ＦＶＢ、ＮＯＤ、ＢＡＬＢ／ｃ、１２９、Ｃ５７ＢＬ、およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ、Ｃ５７ＢＬ／１０を含むＣ５７ＢＬマウス等が含まれる。
【０１００】
組換え近交系系統を含む他の近交系マウス系統には（限定なしに）：１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ、１２９Ｔ２／ＳｖＥｍｓＪ、１２９Ｘ１／ＳｖＪ、１２９Ｐ３／Ｊ、Ａ／Ｊ、ＡＫＲ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＢＡＬＢ／ｃ  ＢＡＬＢ／ｃＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、Ｃ５８、ＣＢＡ／ＣａＨＮ−Ｂｔｋｘｉｄ／Ｊ、ＣＢＡ／Ｊ、ＤＢＡ／１Ｊ、ＤＢＡ／１ＬａｃＪ、ＤＢＡ／２Ｊ、ＦＶＢ／ＮＪ、ＭＲＬ／ＭｐＪ、ＮＯＤ／ＬｔＪ、ＳＪＬ／Ｊ、ＳＷＲ／Ｊ、ＮＯＲ／ＬｔＪ、ＮＺＢ／ＢｌＮＪ、ＮＺＷ／ＬａｃＪ、ＲＢＦ／ＤｎＪ、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ、ＡＪＴＡＣ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃ、ＢＡＬＢ／ｃＪＢｏｍＴａｃ、ＢＡＬＢ／ｃＡＢｏｍＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｇＡｉＴａｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＴａｃ、ＣＢＡ／ＪＢｏｍＴａｃ、ＤＢＡ／１ＪＢｏｍＴａｃ、ＤＢＡ／２ＮＴａｃ、ＤＢＡ／２ＪＢｏｍＴａｃ、ＦＶＢ／ＮＴａｃ、ＮＯＤ／ＭｒｋＴａｃ、ＮＺＭ／ＡｅｇＴａｃ、ＳＪＬ／ＪｃｒＮＴａｃ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＢＲ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌＢＲ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＢＲ、ＤＢＡ／２ＮＣｒｌＢＲ、ＦＶＢ／ＮＣｒｌＢＲ、Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＣｒｌＢＲ、１２９／ＳｖＰａｓＩｃｏＣｒｌＢＲ、ＳＪＬ／ＪｏｒｌＩｃｏＣｒｌＢＲ、Ａ／ＪｏｌａＨｓｄ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＨｓｄ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＮＨｓｄ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ、ＣＢＡ／ＪＣｒＨｓｄ、ＤＢＡ／２ＮＨｓｄ、ＦＶＢ／ＮＨｓｄ、ＳＡＭＰ１／ＫａＨｓｄ、ＳＡＭＰ６／ＴａＨｓｄ、ＳＡＭＰ８／ＴａＨｓｄ、ＳＡＭＰ１０／ＴａＨｓｄ、ＳＪＬ／ＪＣｒＨｓｄ、ＡＫＲ／ＯｌａＨｓｄ、ＢｉｏｚｚｉＡＢＨ／ＲｉｊＨｓｄ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄ、ＦＶＢ／ＮｈａｎＨｓｄ、ＭＲＬ／ＭｐＯｌａＨｓｄ、ＮＺＢ／ＯｌａＨｓｄ、ＮＺＷ／ＯｌａＨｓｄ、ＳＷＲ／ＯｌａＨｓｄ、１２９Ｐ２／ＯｌａＨｓｄ、ａｎｄ  １２９Ｓ２／ＳｖＨｓｄ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ、１２９Ｘ１／ＳｖＪ、Ｂ１０．Ａ−Ｈ２ａ  Ｈ２−Ｔ１８ａ／ＳｇＳｎＪ、Ｂ１０．Ｄ２−Ｈｃ０  Ｈ２ｄ  Ｈ２−Ｔ１８ｃ／ｏＳｎＪ、Ｂ１０．Ｄ２−Ｈｃ１  Ｈ２ｄ  Ｈ２−Ｔ１８ｃ／ｎＳｎＪ、Ｂ１０．ＲＩＩＩ−Ｈ２ｒ  Ｈ２−Ｔ１８ｂ／（７１ＮＳ）ＳｎＪ、Ｂ６（Ｃ）−Ｈ２−Ａｂ１ｂｍ１２／ＫｈＥｇＪ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｉｌ１０ｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｎｏｓ２ｔｍ１Ｌａｕ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｎｏｓ３ｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｃｄ８ａｔｍ１Ｍａｋ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈ−６ｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｉｆｎｇｔｍ１Ｔｓ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ、Ｂ６．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳｚＪ、Ｂ６．ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ、Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂ／Ｊ、ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ  ＋／＋  Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ、Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ  Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＡＰＯＡ１）１Ｒｕｂ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／��Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ、ＣＢＡ／ＣａＨＮ−Ｂｔｋｘｉｄ／Ｊ、ＣＢＡ／ＣａＪ、ＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、ＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（ＭＭＴＶｎｅｕ）２０２Ｍｕｌ／Ｊ、ＫＫ．Ｃｇ−Ａｙ／Ｊ、ＭＲＬ／ＭｐＪ、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ、ＳＪＬ／Ｊ、ＳＷＲ／Ｊ、Ｂ１０．ＰＬ−Ｈ２ｕ  Ｈ２−Ｔ１８ａ／（７３ＮＳ）ＳｎＪ、ＮＯＮｃＮＺＯ５／ＬｔＪ、ＷＲ、ＢＰＨ／２、ＢＰＬ／１、ＦＳ、Ｐ／Ｊ、Ｐ／Ａ、およびＰＲＯが含まれる。
【０１０１】
特定の態様において、マウスにはまた、すべての遺伝子操作（例えばトランスジェニック、ノックアウト、ノックイン、ノックダウン、レトロウイルス、ウイルス）または化学的誘導突然変異（例えば突然変異体のアーカイブもまた含むＥＮＵ、ＥＭＳ）；放射線誘導突然変異；自発的突然変異／マウス系統上に維持される修飾、特に、例えば、類遺伝子性系統および組換え類遺伝子性系統を含む、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、ＦＶＢ、Ｃ３Ｈ、ＮＯＤ、ＤＢＡ／２、ＢＡＬＢ／ｃ、およびＣＤ−１由来の突然変異体も含まれる。特定の例には：Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ４−Ｐｄｙｎｔｍ１Ｕｔｅ／Ｊ、Ｂ６；１２９Ｐ２−Ｐｅｍｔｔｍ１Ｊ／Ｊ、ＮＯＤ．Ｃｇ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ−Ｂ２ｍｂ／Ｄｖｓ等が含まれる。
【０１０２】
特定の態様において、マウスは、混合近交系系統を含む、２つの近交系系統の交配によって産生されるマウスハイブリッド系統である。例示的なハイブリッド系統には：ＮＺＢＷＦ１／Ｊ、Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊ、Ｂ６ＳＪＬＦ１／Ｊ、ＣＢ６Ｆ１／Ｊ、ＣＢｙＢ６Ｆ１／Ｊ、ＰＬＳＪＬＦ１／Ｊ、ＷＢＢ６Ｆ１／Ｊ−ＫｉｔＷ／ＫｉｔＷ−ｖ、Ｂ６１２９ＰＦ１／Ｊ、ＣＡＦ１／Ｊ、Ｂ６１２９ＰＦ２／Ｊ、Ｂ６１２９ＳＦ１／Ｊ、Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊ、Ｂ６ＡＦ１／Ｊ、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／Ｊ、Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊ、およびＢ６ＳＪＬＦ１／Ｊが含まれる。
【０１０３】
任意のハイブリッド系統において、比率は、５０：５０  Ｆ１から９９：１  Ｆ１まで多様でありうる。
特定の態様において、マウスは、非近交系マウス、例えばＣＤ−１；ＩＣＲ；ブラック・スイス；スイス・ウェブスター；ＮＩＨスイス；ＣＦ−１、およびヌードマウスである。
【０１０４】
特定の態様において、ラットは近交系ラット、例えばＡＣＩ、ブラウン・ノルウェイ（ＢＮ）、ＢＣＩＸ、コペンハーゲン（ＣＯＰ）、ＭＷＦ、Ｄアグーチ（ＤＡ）、Ｇｏｔｏ−Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）、Ｌｅｗｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４（Ｆ３４４）、Ｗｉｓｔａｒ  Ｆｕｒｔｈ（ＷＦ）、Ｗｉｓｔａｒ  Ｋｙｏｔｏ（ＷＫＹ；ＷＫＹＮ１）、またはＺＤＦである。
【０１０５】
特定の態様において、ラットにはまた、すべての遺伝子操作（例えばトランスジェニック、ノックアウト、ノックイン、ノックダウン、レトロウイルス、ウイルス）または化学的誘導突然変異（例えば突然変異体のアーカイブもまた含むＥＮＵ）；放射線誘導突然変異；類遺伝子性系統を含む自発的突然変異／ラット系統上に維持される修飾も含まれる。特定の例には：Ｆ３４４／ＮＴａｃ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ｂ２７）−Ｔｇ（２Ｍ）３３−３Ｔｒｇ；ＨｓｄＡｍｃ：ＴＲ−Ａｂｃｃ２；ＨｓｄＨｌｒ：ＺＵＣＫＥＲ−Ｌｅｐｒｆａ；およびＮＩＨヌードが含まれる。
【０１０６】
特定の態様において、ラットは、２つの近交系系統を交配することによって産生されるラットハイブリッド系統である。例示的なハイブリッド系統には：ＢＨＲ、ＦＢＮＦ１／Ｈｓｄ、およびＬＢＮＦ１／Ｈｓｄが含まれる。
【０１０７】
特定の態様において、ラットは、非近交系ラット、例えば：Ｈｏｌｔｚｍａｎ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓ、Ｗｉｓｔａｒ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎ、ＷＨ、ＷＫＹ、Ｚｕｃｋｅｒ、ＪＣＲ（Ｒｕｓｓｅｌ  Ｒａｔ）、およびＯＦＡである。
【０１０８】
４．ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＢｕＤを用いたゲノム修飾または編集
本明細書記載の発明は、関心対象の動物のゲノムを修飾するかまたは「編集」して、動物の修飾または編集されたゲノムが、生殖系列伝達を通じて伝えられうるように、強力なツールを提供する。
【０１０９】
より具体的には、ゲノム修飾または編集を用いて、関心対象の動物（例えば哺乳動物）のゲノム配列を、例えば異種導入遺伝子を導入するかまたはターゲット内因性遺伝子の発現を阻害することによって、変化させることも可能である。こうした遺伝子改変動物を用いて、例えば、特定の遺伝子疾患または障害に対応する適切な動物モデルを確立することも可能である。こうした動物モデルを用いて、疾患機構、進行、予防、および治療（例えば薬剤スクリーニングおよび臨床前試験）を探究するかまたは研究することも可能である。
【０１１０】
動物モデルにおいて示されうる例示的（限定されない）ヒト疾患または障害には：多様なタイプの癌、心臓疾患、高血圧、代謝およびホルモン障害、糖尿病、肥満、骨粗鬆症、緑内障、皮膚色素沈着疾患、盲目、聴覚消失、神経変性障害（例えばハンチントン病またはアルツハイマー病）、精神性障害（不安および抑鬱を含む）、および先天性欠損（例えば口蓋裂および無脳症）が含まれる。
【０１１１】
現在最も利用可能である動物モデルは、マウスにおいて作製され、そしてこれらは任意の特定のヒト疾患の側面をある程度再現するが、すべては再現しない可能性もある。マウスモデルを用いて模倣することが困難でありうる特定の疾患、例えば多くの神経変性疾患（その大部分が認知欠損を伴うもの）に関して、本発明の方法を用いて、非ヒト霊長類において、動物モデルを生成することも可能である。例えば、障害の特徴的な病理のある程度を、ヒトで生じるように複製したハンチントン病のトランスジェニックモデルが、最近、アカゲザルで開発された（Ｙａｎｇら、２００８）。
【０１１２】
任意の当該技術分野に認識される技術、例えばＺＦＮ／ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、ゲノム編集を行ってもよい（その全テキストおよびすべての引用される参考文献が本明細書に援用される、Ｇａｊら，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ３１（７）：３９７−４０５（２０１３）を参照されたい）。こうした技術は、多様な範囲の細胞タイプおよび生物中の、実質的にいかなる遺伝子も操作することを可能にし、したがって、エラーが起こりやすい非相同端連結（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を特定のゲノム位置で刺激する、ＤＮＡ二本鎖（ＤＳＢ）切断を誘導することによって、広い範囲の遺伝子修飾を可能にする。
【０１１３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、非特異的ＤＮＡ切断ドメインに連結されたプログラム可能配列特異的ＤＮＡ結合モジュールで構成されるキメラヌクレアーゼである。これらは、ジンクフィンガーまたはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工的な制限酵素（ＲＥ）である。ジンクフィンガー（ＺＦ）または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を、任意の所望のターゲットＤＮＡ配列に結合するように操作して、そしてＲＥのＤＮＡ切断ドメインに融合させて、こうして、所望のターゲットＤＮＡ配列に特異的である、操作制限酵素（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）を生成することも可能である。ＺＦＮ／ＴＡＬＥＮを細胞、例えば移植前の胚の細胞（例えば接合子）内に導入した際、ｉｎ  ｓｉｔｕのゲノム編集に用いることも可能である。実際、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの多用途性をヌクレアーゼ以外のエフェクタードメイン、例えば転写活性化因子および抑制因子、レコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ＤＮＡおよびヒストンメチルトランスフェラーゼ、ならびにヒストンアセチルトランスフェラーゼに拡大して、ゲノム構造および機能に影響を及ぼすことも可能である。
【０１１４】
Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメインは、真核生物で見られるＤＮＡ結合モチーフの最も一般的なタイプの１つであり、そしてヒトゲノムにおいて、二番目に最も頻繁にコードされるタンパク質ドメインに相当する。個々のジンクフィンガーは、保存されるββα立体配置中に約３０アミノ酸を有する。特異的ＤＮＡ認識のためのジンクフィンガータンパク質の適用に重要なのは、３より多いジンクフィンガードメインを含有する非天然アレイの開発であった。この進歩は、長さ９〜１８ｂｐのＤＮＡ配列を認識する合成ジンクフィンガータンパク質の構築を可能にする、非常に保存されたリンカー配列の構造に基づく発見によって容易になった。この設計は、複雑なゲノムにおいて、特異的な連続ＤＮＡ配列を認識するジンクフィンガータンパク質を構築するための最適な戦略であることが立証されている。適切なジンクフィンガーは、モジュラー組み立てアプローチによって得られうる（例えば、巨大なコンビナトリアルライブラリーの選択によって、または合理的設計によって生成された、ジンクフィンガーモジュールのあらかじめ選択されたライブラリーを用いる）。６４のありうるヌクレオチド３つ組のほぼすべてを認識するジンクフィンガードメインが開発されてきており、あらかじめ選択されたジンクフィンガーモジュールをタンデムに一緒に連結して、これらの一連のＤＮＡ３つ組を含有するＤＮＡ配列をターゲティングすることも可能である。あるいは、選択に基づくアプローチ、例えばオリゴマー化プール操作（ＯＰＥＮ）を用いて、隣接フィンガー間の背景依存性相互作用を考慮に入れて、ランダム化ライブラリーから新規ジンクフィンガーアレイを選択することも可能である。２つのアプローチの組み合わせもまた用いる。
【０１１５】
操作ジンクフィンガーは、商業的に入手可能である。Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国カリフォルニア州リッチモンド）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）と協同で、ジンクフィンガー構築のための自社プラットホーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発しており、このプラットホームは、研究者がジンクフィンガー構築および検証をまったくバイパスすることを可能にし、そして数千のタンパク質がすでに入手可能である。広く、ジンクフィンガータンパク質技術は、実質的に任意の配列をターゲティングすることを可能にする。
【０１１６】
ＴＡＬエフェクターは、植物病原性ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌によって分泌されるタンパク質であり、１２番目および１３番目のアミノ酸を例外として、反復される非常に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含有するＤＮＡ結合ドメインを含む。これらの２つの位置は、非常に可変性であり（リピート可変２残基、またはＲＶＤ）そして特異的ヌクレオチド認識と強い相関を示す。アミノ酸配列およびＤＮＡ認識の間のこの単純な関係は、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによって、特異的ＤＮＡ結合ドメインの操作を可能にしてきている。ジンクフィンガー同様、モジュラーＴＡＬＥリピートを一緒に連結して、連続ＤＮＡ配列を認識させる。多くのエフェクタードメインが、ターゲティング化遺伝子修飾のため、ＴＡＬＥリピートに融合させるために利用可能であり、これらには、ヌクレアーゼ、転写活性化因子、および部位特異的レコンビナーゼが含まれる。カスタムＴＡＬＥアレイの迅速な組み立ては、「ゴールデンゲート」分子クローニング、ハイスループット固相組み立て、および連結独立性クローニング技術を含む戦略を用いることによって達成可能であり、これらの戦略はすべて、クローニングされた幹細胞のゲノム編集のため、本発明において使用可能である。
【０１１７】
ＴＡＬＥリピートは、当該技術分野で利用可能な多くのツール、例えば１８，７４０のヒトタンパク質コード遺伝子をターゲティングするＴＡＬＥＮのライブラリー（Ｋｉｍら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３１：２５１−２５８（２０１３））を用いて容易に組み立て可能である。カスタム設計ＴＡＬＥアレイもまた、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（フランス・パリ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（米国ケンタッキー州レキシントン）、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州グランドアイランド）を通じて商業的に入手可能である。
【０１１８】
ＲＥ、例えばＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（または切断特異性および／または切断活性を改善するように設計された突然変異を含むＦｏｋＩ切断ドメイン変異体、例えばＳｈａｒｋｅｙ）の末端からの非特異的ＤＮＡ切断ドメインを用いて、酵母アッセイにおいて活性である（また植物細胞においておよび動物細胞においても活性である）ハイブリッドヌクレアーゼを構築してもよい。ＺＦＮ活性を改善するため、一過性低温培養条件を用いてヌクレアーゼ発現レベルを増加させることも可能であり；ＤＮＡ末端プロセシング酵素を伴う部位特異的ヌクレアーゼの同時送達、ならびにＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ修飾細胞の濃縮を可能にする蛍光代理レポーターベクターの使用もまた使用可能である。ＺＦＮ仲介性ゲノム編集の特異性はまた、ニック化ＤＮＡの導入が、エラーが起こりやすいＮＨＥＪ修復経路を活性化することなく、ＨＤＲを刺激するという発見を利用した、ジンクフィンガーニッカーゼ（ＺＦＮｉｃｋａｓｅ）を用いることによって改良されうる。
【０１１９】
アミノ酸配列およびＴＡＬＥ結合ドメインのＤＮＡ認識の間の単純な関係によって、タンパク質が設計可能となる。公的に入手可能なソフトウェアプログラム（ＤＮＡ  Ｗｏｒｋｓ）を用いて、２工程ＰＣＲにおいて組み立てに適したオリゴヌクレオチドを計算することも可能である。操作ＴＡＬＥ構築物を生成するための多くのモジュラー組み立てスキームもまた報告されてきており、そして当該技術分野に知られる。どちらの方法もジンクフィンガーＤＮＡ認識ドメインを生成するためのモジュラーアセンブリ法と概念的に類似である、ＤＮＡ結合ドメインを操作するための合成アプローチを提供する。
【０１２０】
ＴＡＬＥＮ遺伝子が組み立てられたら、当該技術分野に知られる任意の方法、例えばエレクトロポレーションまたは陽イオン性脂質に基づく試薬を用いたトランスフェクションを用いて、プラスミドベクター、多様なウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を用いて、ベクター上で、これらをターゲット細胞内に導入する。あるいは、ＴＡＬＥＮを、ＴＡＬＥＮ発現タンパク質のゲノム組込みの可能性を除去するｍＲＮＡとして細胞に送達してもよい。これはまた、相同組換え修復（ＨＤＲ）のレベルおよび遺伝子編集中の遺伝子移入の成功も劇的に増加させうる。最後に、精製ＺＦＮ／ＴＡＬＥＮタンパク質の細胞内への直接送達もまた使用可能である。このアプローチは、挿入突然変異誘発のリスクを持たず、そして核酸からの発現に頼る送達系よりも、より少ないオフターゲット効果を導き、そしてしたがって、細胞、例えば本幹細胞において、正確なゲノム操作を必要とする研究のために最適に使用可能である。本明細書記載の態様のいずれにおいても、本発明のエレクトロポレーション法にしたがって、ｍＲＮＡまたはタンパク質を配偶子および移植前の胚内に導入可能である。
【０１２１】
ＴＡＬＥＮを用いて、細胞が修復機構で反応する、二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することによって、ゲノムを編集可能である。非相同端連結（ＮＨＥＪ）は、アニーリングのための配列重複をほとんどまたはまったく含まない、二本鎖切断のいずれかの側から、ＤＮＡを再連結する。ＰＣＲによって増幅された２つのアレル間のいかなる相違も検出する、単純なヘテロ二重鎖切断アッセイを行ってもよい。単純なアガロースゲルまたはスラブゲル系上で、切断産物を視覚化することも可能である。あるいは、ＤＮＡを、外因性二本鎖ＤＮＡ断片の存在下で、ＮＨＥＪを通じてゲノム内に導入してもよい。相同組換え修復もまた、トランスフェクションされた二本鎖配列を修復酵素のテンプレートとして用いる際に、ＤＳＢで外来ＤＮＡを導入可能である。ＴＡＬＥＮは、安定修飾ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）クローンを生成して、ノックアウト線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）、ラットおよびゼブラフィッシュを生成するために用いられてきている。
【０１２２】
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、疾患の根底にある原因を正し、したがって、正確なゲノム修飾で症状を永続的に取り除くことが可能である。例えば、ＺＦＮ誘導性ＨＤＲは、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、血友病Ｂ、鎌形細胞疾患、α１−アンチトリプシン欠損および多くの他の遺伝病に関連する遺伝子誘因突然変異を、欠損ターゲット遺伝子を修復することによるか、またはターゲット遺伝子をノックアウトするかいずれかによって、直接修正するために使用されてきている。さらに、これらの部位特異的ヌクレアーゼはまた、被験体配偶子または移植前の胚内で、ターゲット動物ゲノムにおける特定の「安全ハーバー」部位に、療法導入遺伝子を安全に挿入するためにも使用可能である。こうした技術を遺伝子療法で用いて、動物の所定のゲノムにおいて、特定の遺伝子欠損を「修正する」ことも可能である。
【０１２３】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いて、主題の配偶子および移植前の胚内にターゲット化遺伝子改変を効率的に誘導することも可能である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系または「クラスタード・レギュラリー・インタースペースド・ショート・パリンドロミック・リピーツ」は、多数の短い直列リピートを含有し、そして細菌および古細菌に対して獲得免疫を提供する遺伝子座である。ＣＲＩＳＰＲ系は、侵入する外来ＤＮＡの配列特異的サイレンシングのためのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに頼る。用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡプロセシングを促進する非コードＲＮＡであり、そしてＣａｓ９によるＲＮＡガイド切断を活性化するために必要とされる、トランス活性化キメラＲＮＡを表す。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対を形成して、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを切断のため相補的ＤＮＡ部位にガイドする２−ＲＮＡ構造を形成する。
【０１２４】
３タイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が存在する：ＩＩ型系において、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡターゲット認識の際にＤＮＡを切断するＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼとして働く。細菌において、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡガイドＤＮＡ切断を通じて、外来ＤＮＡへの侵入に対して獲得免疫を提供する。ｃｒＲＮＡを再設計することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を再ターゲティング化して、実質的に任意のＤＮＡ配列を切断することも可能である。実際、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび必要なｃｒＲＮＡ構成要素を発現するプラスミドを同時送達することによって、ヒト細胞に対して直接移植可能（ｐｏｒｔａｂｌｅ）であることが示されてきている。これらのプログラム可能ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ｉＰＳ細胞において、多重化遺伝子破壊能およびターゲット化組込みを示し、そしてしたがって、本方法において同様に使用可能である。
【０１２５】
関連するＣａｓタンパク質およびＲＮＡガイド配列、ならびにそのコード配列（例えばＣａｓ９のｍＲＮＡまたはガイドＲＮＡのコード配列）またはこうしたコード配列を含むベクターを含む、任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を本発明の方法で使用してもよい。ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１および米国特許第８，６９７，３５９号に記載されるものを参照されたい（すべて本明細書に援用される）。
【０１２６】
以下に続く説明において、ＲＮＡガイド配列はまた、「ＤＮＡターゲティングＲＮＡ」とも称され、ターゲティング配列を、修飾ポリペプチド（例えばＣａｓ９）とともに含み、ターゲットＤＮＡの部位特異的修飾および／またはターゲットＤＮＡと関連するポリペプチドを提供する。
【０１２７】
以下に続く説明において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系におけるタンパク質のＣａｓ９型はまた、「部位特異的修飾ポリペプチド」とも称される。
ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、関連ポリペプチド（例えば部位特異的修飾ポリペプチド）の活性をターゲットＤＮＡ内の特異的ターゲット配列に向ける。主題のＤＮＡターゲティングＲＮＡは：第一のセグメント（本明細書において、「ＤＮＡターゲティングセグメント」または「ＤＮＡターゲティング配列」とも称される）および第二のセグメント（本明細書において、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」とも称される）を含む。
【０１２８】
ＤＮＡターゲティングＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、ターゲットＤＮＡ中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。主題のＤＮＡターゲティングＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対形成）を通じて、配列特異的方式で、ターゲットＤＮＡと相互作用する。こうしたものとして、ＤＮＡターゲティングセグメントのヌクレオチド配列は、多様であることが可能であり、そしてＤＮＡターゲティングＲＮＡおよびターゲットＤＮＡが相互作用するであろうターゲットＤＮＡ内の位置を決定する。ＤＮＡターゲティングＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントを修飾して（例えば遺伝子操作によって）、ターゲットＤＮＡ内の任意の望ましい配列にハイブリダイズさせることも可能である。
【０１２９】
ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することも可能である。例えば、ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、または約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、ＤＮＡターゲティングセグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することも可能である。ターゲットＤＮＡのヌクレオチド配列（ターゲット配列）に相補的であるＤＮＡターゲティングセグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡターゲティング配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、ターゲットＤＮＡのターゲット配列に相補的であるＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔまたは少なくとも約４０ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、ターゲットＤＮＡのターゲット配列に相補的であるＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、または約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有することも可能である。ターゲットＤＮＡのヌクレオチド配列（ターゲット配列）に相補的であるＤＮＡターゲティングセグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡターゲティング配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することも可能である。
【０１３０】
いくつかの態様において、ターゲットＤＮＡのターゲット配列に相補的であるＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列は、長さ２０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、ターゲットＤＮＡのターゲット配列に相補的であるＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列は、長さ１９ヌクレオチドである。
【０１３１】
ＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列およびターゲットＤＮＡのターゲット配列の間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であることも可能である。いくつかの態様において、ＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列およびターゲットＤＮＡのターゲット配列の間の相補性パーセントは、ターゲットＤＮＡの相補鎖のターゲット配列の最も５’の７つの連続ヌクレオチドに渡って１００％である。いくつかの態様において、ＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列およびターゲットＤＮＡのターゲット配列の間の相補性パーセントは、約２０連続ヌクレオチドに渡って少なくとも６０％である。いくつかの態様において、ＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列およびターゲットＤＮＡのターゲット配列の間の相補性パーセントは、ターゲットＤＮＡの相補鎖のターゲット配列の最も５’の１４の連続ヌクレオチドに渡って１００％であり、そして残りに渡っては０％と同程度に低い。こうした態様において、ＤＮＡターゲティング配列は、長さ１４ヌクレオチドであると見なされうる。いくつかの態様において、ＤＮＡターゲティングセグメントのＤＮＡターゲティング配列およびターゲットＤＮＡのターゲット配列の間の相補性パーセントは、ターゲットＤＮＡの相補鎖のターゲット配列の最も５’の７つの連続ヌクレオチドに渡って１００％であり、そして残りに渡っては０％と同程度に低い。こうした場合、ＤＮＡターゲティング配列は、長さ７ヌクレオチドと見なされうる。
【０１３２】
主題のＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用する。主題のＤＮＡターゲティングＲＮＡは、上述のＤＮＡターゲティングセグメントを通じて、結合したポリペプチドをターゲットＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列にガイドする。主題のＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチを含む。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。
【０１３３】
主題の二重分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む。主題の二重分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡの２つのＲＮＡ分子は、２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドがハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二重鎖ＲＮＡ二重鎖を形成するように、各々、互いに相補的であるヌクレオチドストレッチを含む。
【０１３４】
いくつかの態様において、活性化因子ＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、活性化因子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つ（例えば本明細書に援用されるＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号４３１〜５６２に示されるものなど）、またはその相補体の１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％同一である。例えば、活性化因子ＲＮＡの二重鎖形成セグメント（または活性化因子ＲＮＡの二重鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）は、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号４３１〜５６２に示されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列、またはその相補体の１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。
【０１３５】
いくつかの態様において、ターゲッター（ｔａｒｇｅｔｅｒ）−ＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１（本明細書に援用される）の配列番号５６３〜６７９に示されるターゲッターＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列、またはその相補体の１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％同一である。例えば、ターゲッターＲＮＡの二重鎖形成セグメント（またはターゲッターＲＮＡの二重鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）は、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号５６３〜６７９に示されるｃｒＲＮＡ配列、またはその相補体の１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一である。
【０１３６】
二分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡを、活性化因子ＲＮＡとターゲッターＲＮＡの制御された（例えば条件付き）結合を可能にするように設計することも可能である。二分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、活性化因子ＲＮＡおよびターゲッターＲＮＡの両方がｄＣａｓ９と機能する複合体において結合されない限り機能しないため、二分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、活性化因子ＲＮＡおよびターゲッターＲＮＡの間の結合を誘導可能にすることによって誘導性（例えば薬剤誘導性）になりうる。１つの限定されない例として、ＲＮＡアプタマーを用いて、活性化因子ＲＮＡとターゲッターＲＮＡの結合を制御（すなわち調節）することも可能である。したがって、活性化因子ＲＮＡおよび／またはターゲッターＲＮＡは、ＲＮＡアプタマー配列を含んでもよい。
【０１３７】
ＲＮＡアプタマーは当該技術分野に知られ、そして一般的にリボスイッチの合成型である。用語「ＲＮＡアプタマー」および「リボスイッチ」は、本明細書において、交換可能に用いられ、これらがその一部であるＲＮＡ分子の構造（そしてしたがって特異的配列の利用可能性）の誘導性の制御を提供する、合成および天然両方の核酸配列を含む。ＲＮＡアプタマーは、通常、特定の薬剤（例えば小分子）に特異的に結合する、特定の構造（例えばヘアピン）に折りたたまれる配列を含む。薬剤が結合すると、ＲＮＡのフォールディングに構造的変化が引き起こされ、これは、アプタマーがその一部である核酸の特徴を変化させる。限定されない例として：（ｉ）アプタマーを伴う活性化因子ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬剤に結合されない限り、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ターゲッターＲＮＡに結合不能である可能性もあり；（ｉｉ）アプタマーを伴うターゲッターＲＮＡは、アプタマーが適切な薬剤に結合されない限り、同族活性化因子ＲＮＡに結合不能である可能性もあり；そして（ｉｉｉ）各々、異なる薬剤に結合する異なるアプタマーを含む、ターゲッターＲＮＡおよび活性化因子ＲＮＡは、両方の薬剤が存在しない限り、互いに結合不能である可能性もある。これらの例によって例示されるように、二分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡが誘導性であるように設計してもよい。
【０１３８】
アプタマーおよびリボスイッチの例は、例えば：すべて本明細書にその全体が援用される、Ｎａｋａｍｕｒａら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  ２０１２  Ｍａｙ，  １７（５）：３４４−３６４；  Ｖａｖａｌｌｅら，  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  ２０１２  Ｍａｙ，  ８（３）：３７１−３８２；  Ｃｉｔａｒｔａｎら，  Ｂｉｏｓｅｎｓ．  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，  ２０１２  Ａｐｒ．  １５，  ３４（１）：１−１１；およびＬｉｂｅｒｍａｎら，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．  Ｒｅｖ．  ＲＮＡ，  ２０１２  Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ，  ３（３）：３６９−３８４に見出されうる。
【０１３９】
二分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡ中に含まれてもよいヌクレオチド配列の限定されない例には、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号４３１〜５６２に示される配列、またはＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号５６３〜６７９に示される任意の配列と対形成するその相補体、またはタンパク質結合セグメントを形成するようにハイブリダイズ可能なその相補体のいずれかが含まれる。
【０１４０】
一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、互いに相補的であり、介在ヌクレオチド（「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」）によって共有結合され、そしてハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成し、したがって、ステム−ループ構造を生じる、ヌクレオチドの２つのストレッチ（ターゲッターＲＮＡおよび活性化因子ＲＮＡ）を含む。ターゲッターＲＮＡおよび活性化因子ＲＮＡは、ターゲッターＲＮＡの３’端および活性化因子ＲＮＡの５’端を通じて共有結合されていてもよい。あるいは、ターゲッターＲＮＡおよび活性化因子ＲＮＡは、ターゲッターＲＮＡの５’端および活性化因子ＲＮＡの３’端を通じて共有結合されていてもよい。
【０１４１】
一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡのリンカーは、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することも可能である。例えば、リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約７０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約６０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約４０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約３０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔまたは約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１０ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することも可能である。いくつかの態様において、一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡのリンカーは、４ｎｔである。
【０１４２】
例示的な一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する、ヌクレオチドの２つの相補的なストレッチを含む。いくつかの態様において、一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチドの２つの相補的なストレッチ（または該ストレッチをコードするＤＮＡ）の１つは、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号４３１〜５６２に示される活性化因子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）、またはその相補体の１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％同一である。例えば、一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチドの２つの相補的ストレッチ（または該ストレッチをコードするＤＮＡ）の１つは、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号４３１〜５６２に示されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列、またはその相補体の１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一である。
【０１４３】
いくつかの態様において、一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチドの２つの相補的ストレッチ（または該ストレッチをコードするＤＮＡ）の１つは、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１（本明細書に援用される）の配列番号５６３〜６７９に示されるターゲッターＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列、またはその相補体の１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％同一である。例えば、一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡのヌクレオチドの２つの相補的ストレッチ（または該ストレッチをコードするＤＮＡ）の１つは、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号５６３〜６７９に示されるｃｒＲＮＡ配列、またはその相補体の１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一である。
【０１４４】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの適切な天然存在同族対は、適切な同族対を決定する際に、種の名称および塩基対形成（タンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖に関して）を考慮に入れることによって、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号４３１〜６７９に関してルーチンに決定可能である。
【０１４５】
一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡおよび二重分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡの両方に関して、天然存在ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡと非常にわずか（およそ５０％同一性）しか共有しない人工的配列は、ＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造が保存されている限り、Ｃａｓ９とともに機能して、ターゲットＤＮＡを切断可能である。したがって、（二分子または一分子型のいずれでも）人工タンパク質結合ドメインを設計するために、ＤＮＡターゲティングＲＮＡの天然存在タンパク質結合ドメインのＲＮＡフォールディング構造を考慮に入れてもよい。限定されない例として、天然存在ＤＮＡターゲティングのタンパク質結合セグメントの構造に基づいて、機能する人工ＤＮＡターゲティングＲＮＡを設計してもよい（例えばＲＮＡ二重鎖に沿って同じ数の塩基対を含み、そして天然存在ＲＮＡ中に存在するものと同じ「バルジ」領域を含む）。任意の種由来の任意の天然存在ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対（非常に多様な種由来のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列に関しては、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号４３１〜６７９を参照されたい）に関して、一般の当業者は容易に構造を産生可能であるため、所定の種由来のＣａｓ９（または関連Ｃａｓ９）を用いる際には、その種に関する天然構造を模倣するように、人工的ＤＮＡターゲティングＲＮＡを設計してもよい。したがって、適切なＤＮＡターゲティングＲＮＡは、天然存在ＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造を模倣するように設計されたタンパク質結合ドメインを含む、人工設計ＲＮＡ（非天然存在）であってもよい（適切な同族対を決定する際、種の名前を考慮に入れて、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号４３１〜６７９を参照されたい）。
【０１４６】
タンパク質結合セグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することも可能である。例えば、タンパク質結合セグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することも可能である。
【０１４７】
やはり一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡおよび二重分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡの両方に関して、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約６塩基対（ｂｐ）〜約５０ｂｐの長さを有することも可能である。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約６ｂｐ〜約４０ｂｐ、約６ｂｐ〜約３０ｂｐ、約６ｂｐ〜約２５ｂｐ、約６ｂｐ〜約２０ｂｐ、約６ｂｐ〜約１５ｂｐ、約８ｂｐ〜約４０ｂｐ、約８ｂｐ〜約３０ｂｐ、約８ｂｐ〜約２５ｂｐ、約８ｂｐ〜約２０ｂｐまたは約８ｂｐ〜約１５ｂｐの長さを有することも可能である。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約８ｂｐ〜約１０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約１５ｂｐ、約１５ｂｐ〜約１８ｂｐ、約１８ｂｐ〜約２０ｂｐ、約２０ｂｐ〜約２５ｂｐ、約２５ｂｐ〜約３０ｂｐ、約３０ｂｐ〜約３５ｂｐ、約３５ｂｐ〜約４０ｂｐ、または約４０ｂｐ〜約５０ｂｐの長さを有することも可能である。いくつかの態様において、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、３６塩基対の長さを有する。ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少なくとも約６０％であることも可能である。例えば、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であることも可能である。いくつかの場合、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは１００％である。
【０１４８】
ＤＮＡターゲティングＲＮＡおよび部位特異的修飾ポリペプチドは複合体を形成する。ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、ターゲットＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むことによって、複合体にターゲット特異性を提供する（上述の通り）。複合体の部位特異的修飾ポリペプチドは、部位特異的活性を提供する。言い換えると、部位特異的修飾ポリペプチドは、ＤＮＡターゲティングＲＮＡの少なくともタンパク質結合セグメントとの会合によって、ＤＮＡ配列（例えば染色体配列または染色体外配列、例えばエピソーム配列、小環状配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）にガイドされる。
【０１４９】
部位特異的修飾ポリペプチドは、ターゲットＤＮＡ（例えばターゲットＤＮＡの切断またはメチル化）および／またはターゲットＤＮＡに会合するポリペプチド（例えばヒストンテールのメチル化またはアセチル化）を修飾する。部位特異的修飾ポリペプチドはまた、本明細書において、「部位特異的ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位特異的修飾ポリペプチド」と称される。
【０１５０】
いくつかの態様において、部位特異的修飾ポリペプチドは、天然存在修飾ポリペプチドである。他の場合、部位特異的修飾ポリペプチドは、天然存在ポリペプチドではない（例えば以下に論じるようなキメラポリペプチド、または修飾されている、例えば突然変異、欠失、挿入されている天然存在ポリペプチド）。
【０１５１】
例示的な天然存在部位特異的修飾ポリペプチドは、天然存在Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１エンドヌクレアーゼの限定されないそして包括的でないリストとして、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１（本明細書に援用される）の配列番号１〜２５５に示される。これらの天然存在ポリペプチドは、本明細書に開示するように、ＤＮＡターゲティングＲＮＡに結合し、それによって、ターゲットＤＮＡ内の特異的配列に導き、そしてターゲットＤＮＡを切断して、二重鎖切断を生じる。
【０１５２】
部位特異的修飾ポリペプチドは、２つの部分、ＲＮＡ結合部分および活性部分を含む。いくつかの態様において、部位特異的修飾ポリペプチドは：（ｉ）ＤＮＡターゲティングＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分であって、ＤＮＡターゲティングＲＮＡがターゲットＤＮＡ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ＲＮＡ結合部分；および（ｉｉ）部位特異的酵素活性（例えばＤＮＡメチル化のための活性、ＤＮＡ切断のための活性、ヒストンアセチル化のための活性、ヒストンメチル化のための活性等）を示す活性部分であって、酵素活性部位がＤＮＡターゲティングＲＮＡによって決定される、前記活性部分を含む。
【０１５３】
他の態様において、部位特異的修飾ポリペプチドは：（ｉ）ＤＮＡターゲティングＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分であって、ＤＮＡターゲティングＲＮＡがターゲットＤＮＡ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ＲＮＡ結合部分；および（ｉｉ）ターゲットＤＮＡ内の転写を調節する（例えば転写を増加させるかまたは減少させる）活性部分であって、ターゲットＤＮＡ内の調節される転写の部位が、ＤＮＡターゲティングＲＮＡによって決定される、前記活性部分を含む。
【０１５４】
いくつかの態様において、部位特異的修飾ポリペプチドは、ターゲットＤＮＡを修飾する酵素活性（例えばヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミン化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリラーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する。
【０１５５】
他の場合、主題の部位特異的修飾ポリペプチドは、ターゲットＤＮＡと関連するポリペプチド（例えばヒストン）を修飾する酵素活性（例えばメチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する。
【０１５６】
例示的な部位特異的修飾ポリペプチドをさらに以下に提供する。
具体的には、いくつかの態様において、部位特異的修飾ポリペプチドは、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の図３に示されるＣａｓ９／Ｃｓｎ１アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に、あるいはＵＳ  ２０１４−００６８７９７  Ａ１の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に示されるアミノ酸配列いずれかの対応する部分（すべて本明細書に援用される）に、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
いくつかの態様において、核酸（例えばＤＮＡターゲティングＲＮＡ）は、１またはそれより多い修飾、例えば塩基修飾、主鎖修飾等を含み、新規のまたは増進された特徴（例えば改善された安定性）を有する核酸を提供する。当該技術分野に知られるように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。こうした複素環塩基の２つの最も一般的なクラスはプリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドはヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸基が、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結されていることも可能である。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、互いに隣接するヌクレオシドに共有結合して、直鎖ポリマー性化合物を形成する。次に、この直鎖ポリマー性化合物のそれぞれの端がさらに連結されて、環状化合物を形成することも可能であるが、直鎖化合物が一般的には適切である。さらに、直鎖化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有してもよく、そしてしたがって、完全または部分的二本鎖化合物を産生する方式でフォールディングしていてもよい。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成すると称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の連結または主鎖は、３’から５’のホスホジエステル連結である。
【０１５８】
修飾を含有する適切な核酸の例には、修飾主鎖または非天然ヌクレオシド間連結を含有する核酸が含まれる。核酸（修飾主鎖を有するもの）には、主鎖中にリン原子を保持するものおよび主鎖中にリン原子を持たないものが含まれる。
【０１５９】
中にリン原子を含有する適切な修飾オリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’連結を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、ならびに１またはそれより多いヌクレオチド間連結が３’から３’、５’から５’または２’から２’連結である反転極性を有するものが含まれる。反転極性を有する適切なオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間連結の最も３’で単一の３’から３’連結、すなわち塩基性であってもよい単一の反転ヌクレオシド残基を含む（核酸塩基は欠けているかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）。多様な塩（例えばカリウムまたはナトリウム）、混合塩および遊離酸型もまた含まれる。
【０１６０】
いくつかの態様において、主題の核酸は、１またはそれより多いホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（天然ホスホジエステルヌクレオチド間連結は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−と示される）を含む。ＭＭＩ型ヌクレオシド間連結は、上記に引用される米国特許第５，４８９，６７７号に開示される。適切なアミドヌクレオシド間連結は、米国特許第５，６０２，２４０号に開示される。どちらも本明細書に援用される。
【０１６１】
やはり適切であるのは、例えば米国特許第５，０３４，５０６号（本明細書に援用される）に記載されるようなモルホリノ主鎖構造を有する核酸である。例えば、いくつかの態様において、主題の核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。これらの態様のいくつかにおいて、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル連結を置換する。
【０１６２】
リン原子を含まない適切な修飾ポリヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、あるいは１またはそれより多い短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間連結によって形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ連結（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルキレン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。
【０１６３】
主題の核酸はまた、核酸模倣体であってもよい。用語「模倣体」は、ポリヌクレオチドに適用される際、フラノース環のみまたはフラノース環およびヌクレオチド間連結の両方が非フラノース基で置換されるポリヌクレオチドを含むよう意図され、フラノース環のみの置換はまた、当該技術分野において、糖代替物とも称される。複素環塩基部分または修飾複素環塩基部分は、適切なターゲット核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。こうした核酸の１つであり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中の主鎖は、ＰＮＡにアミド含有主鎖を与える、２またはそれより多い連結アミノエチルグリシン単位である。複素環塩基部分は、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を記載する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが：米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号が含まれる。すべて本明細書に援用される。
【０１６４】
研究されてきている別のクラスのポリヌクレオチド模倣体は、モルホリノ環に付着した複素環塩基を有する連結モルホリノ単位に基づく（モルホリノ核酸）。モルホリノ核酸中のモルホリノ単量体単位を連結する、いくつかの連結基が報告されてきている。非イオン性オリゴマー化合物を生じるために、連結基の１つのクラスが選択されてきている。非イオン性モルホリノに基づくオリゴマー化合物が、細胞タンパク質と望ましくない相互作用を有する可能性はより低い。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、細胞タンパク質と望ましくない相互作用を形成する可能性がより低い、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣体である（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．  ＢｒａａｓｃｈおよびＤａｖｉｄ  Ｒ．  Ｃｏｒｅｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４１（１４）：４５０３−４５１０（２００２））。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号（本明細書に援用される）に開示される。単量体サブユニットを連結する多様な異なる連結基を有する、ポリヌクレオチドのモルホリノクラス内の多様な化合物が調製されてきている。
【０１６５】
ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環で置換される。古典的ホスホラミダイト化学反応にしたがった、オリゴマー化合物合成のために、ＣｅＮＡ  ＤＭＴに保護されたホスホラミダイト単量体が調製され、そして用いられてきている。完全修飾ＣｅＮＡオリゴマー化合物およびＣｅＮＡで修飾された特定の位を有するオリゴヌクレオチドが調製され、そして研究されてきている（本明細書に援用されるＷａｎｇら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２２：８５９５−８６０２（２０００）を参照されたい）。一般的に、ＣｅＮＡ単量体のＤＮＡ鎖への取り込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加させる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然複合体と類似の安定性を持つ、ＲＮＡおよびＤＮＡ相補体との複合体を形成した。天然核酸構造内にＣｅＮＡ構造を取り込む研究は、容易なコンホメーション適応を進めるため、ＮＭＲおよび円二色性によって示された。
【０１６６】
さらなる修飾には、２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結されて、それによって２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン連結を形成し、それによって二環糖部分を形成する、ロック化核酸（ＬＮＡ）が含まれる。連結は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基であってもよく、式中、ｎは１または２である（Ｓｉｎｇｈら，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ４：４５５−４５６（１９９８））。ＬＮＡおよびＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡと、非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０°Ｃ）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および優れた可溶性特性を有する。ＬＮＡを含有する強力でそして非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されてきている（本明細書に援用されるＷａｈｌｅｓｔｅｄｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９７：５６３３−５６３８（２０００））。
【０１６７】
ＬＮＡ単量体、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシルの合成および調製とともに、そのオリゴマー化、および核酸認識特性が記載されてきている（本明細書に援用されるＫｏｓｈｋｉｎら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５４：３６０７−３６３０（１９９８））。ＬＮＡおよびその調製はまた、どちらも本明細書に援用される、ＷＯ  ９８／３９３５２およびＷＯ  ９９／１４２２６にも記載される。
【０１６８】
核酸にはまた、１またはそれより多い置換糖部分も含まれうる。適切なポリヌクレオチドは：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルより選択される糖置換基を含み、式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１−１０アルキルまたはＣ２−１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。特に適切であるのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の適切なポリヌクレオチドは：Ｃ１−１０低次アルキル、置換低次アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基より選択される糖置換基を含む。適切な修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎら，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  ７８：４８６−５０４（１９９５））、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに適切な修飾には、以下の実施例にも記載するような、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基が含まれ、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。
【０１６９】
他の適切な糖置換基には、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が含まれる。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位にあってもよい。適切な２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。類似の修飾もまた、オリゴマー化合物上の他の位で作製してもよく、特に、３’末端ヌクレオシド上または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位であってもよい。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。
【０１７０】
主題の核酸にはまた、核酸塩基（当該技術分野において、しばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換も含まれてもよい。本明細書において、「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれる。さらなる修飾核酸塩基には、三環ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，’：４，５）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が含まれる。
【０１７１】
複素環塩基部分には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換されているものもまた含まれてもよい。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（本明細書に援用される）に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ８５８−８５９ページ，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．  Ｉ．監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９０に開示されるもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，  ３０：６１３に開示されるもの；ならびにＳａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  第１５章，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２８９−３０２ページ，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，  Ｂ．監修，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３に開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基の特定のものは、オリゴマー化合物の結合アフィニティを増加させるために有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されてきており（Ｓａｎｇｈｖｉら監修，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９９３，  ｐｐ．  ２７６−２７８）、そして例えば２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた際に、適切な塩基置換である。
【０１７２】
主題の核酸の別のありうる修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増進させる、ポリヌクレオチドへの、１またはそれより多い部分またはコンジュゲートの化学的連結を含む。これらの部分またはコンジュゲートには、一次または二次ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基が含まれうる。コンジュゲート基には、限定されるわけではないが、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増進させる基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を増進させる基が含まれる。適切なコンジュゲート基には、限定されるわけではないが、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。薬力学的特性を増進させる基には、取り込みを改善する基、分解に対する耐性を増進させる基、および／またはターゲット核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。薬物動態学的特性を増進させる基には、主題の核酸の取り込み、分布、代謝または排出を改善する基が含まれる。
【０１７３】
コンジュゲート部分には、限定されるわけではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：６５５３−６５５６（１９８９））；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．，  ４：１０５３−１０６０（１９９４））；チオエーテル、例えばヘキシル−５−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ６６０：３０６−３０９（１９９２））；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．，  ３：２７６５−２７７０（１９９３））；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：５３３−５３８（１９９２））；脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：１１１１−１１１８（１９９１））；Ｋａｂａｎｏｖら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２５９：３２７−３３０（１９９０））；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  ７５：４９−５４（１９９３））；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３６：３６５１−３６５４（１９９５））；Ｓｈｅａら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：３７７７−３７８３（１９９０））；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １４：９６９−９７３（１９９５））；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３６：３６５１−３６５４（１９９５））；パルミトイル部分（Ｍｉｓｈｒａら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２６４：２２９−２３７（１９９５））；あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  ２７７：９２３−９３７（１９９６））が含まれ；これらの文献はすべて本明細書に援用される。
【０１７４】
コンジュゲートには、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞浸透ペプチドとしても知られる）が含まれてもよく、該ドメインは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞内小器官膜、または小胞膜を横断することを促進する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、あるいは有機または無機化合物を指すことも可能である。別の分子に付着するＰＴＤは、小さい極性分子から大きな巨大分子および／またはナノ粒子に渡る可能性もあり、分子が膜を横断し、例えば細胞外空間から細胞内空間、または細胞質ゾルから細胞内小器官内に移動することを促進する。いくつかの態様において、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば部位特異的修飾ポリペプチド）のアミノ末端に共有結合する。いくつかの態様において、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば部位特異的修飾ポリペプチド）のカルボキシル末端に共有結合する。いくつかの態様において、ＰＴＤは、核酸（例えばＤＮＡターゲティングＲＮＡ、ＤＮＡターゲティングＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等）に共有結合する。例示的なＰＴＤには、限定されるわけではないが、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞内への進入を導くために十分な数のアルギニンを含むポリアルギニン残基（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０アルギニン）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ９（６）：４８９−４９６（２００２））；ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉら，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ５２（７）：１７３２−１７３７（２００３））；一部切除ヒト・カルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２１：１２４８−１２５６（２００４））；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７：１３００３−１３００８（２０００））；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫが含まれる。例示的なＰＴＤには、限定されるわけではないが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；３アルギニン残基から５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが含まれる。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列には、限定されるわけではないが、以下のいずれかが含まれる：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；ＲＫＫＲＲＱＲＲ；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ；およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ。いくつかの態様において、ＰＴＤは活性化可能ＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａら，  Ｉｎｔｅｇｒ．  Ｂｉｏｌ．  （Ｃａｍｂ），  １（５−６）：３７１−３８１（Ｊｕｎｅ，  ２００９））。ＡＣＰＰは、純電荷をほぼゼロにまで減少させ、そしてそれによって細胞への接着および取り込みを阻害する、マッチポリアニオン（例えばＧｌｕ９または「Ｅ９」）に切断可能リンカーを通じて連結された、ポリカチオンＣＰＰ（例えばＡｒｇ９または「Ｒ９」）を含む。リンカーの切断に際して、ポリアニオンが放出されて、ポリアルギニンおよびその生得的な接着性がアンマスクされ、したがって、ＡＣＣＰを「活性化」して膜を横断する。
【０１７５】
例示的なＤＮＡターゲティングＲＮＡを以下にさらに記載する：
いくつかの態様において、適切なＤＮＡターゲティングＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む。２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子の第一のもの（活性化因子ＲＮＡ）は、配列番号４３１〜５６２に示されるヌクレオチド配列またはその相補体のいずれか１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％ヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子の第二のもの（ターゲッターＲＮＡ）は、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７の配列番号５６３〜６７９に示されるヌクレオチド配列またはその相補体のいずれか１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％ヌクレオチド配列同一性を示す。
【０１７６】
いくつかの態様において、適切なＤＮＡターゲティングＲＮＡは、単一ＲＮＡポリヌクレオチドであり、そしてＵＳ  ２０１４−００６８７９７の配列番号４３１〜５６２に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％ヌクレオチド配列同一性を有する第一のヌクレオチド配列、およびＵＳ  ２０１４−００６８７９７の配列番号４６３〜６７９に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つに、少なくとも８つの連続ヌクレオチドのストレッチに渡って、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％ヌクレオチド配列同一性を有する第二のヌクレオチド配列を含む。
【０１７７】
いくつかの態様において、ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、二重分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡであり、そしてターゲッターＲＮＡは、その５’端でターゲットＤＮＡに相補的なヌクレオチドのストレッチに連結した配列５’ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３’を含む。いくつかの態様において、ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、二重分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡであり、そして活性化因子ＲＮＡは、配列５’ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’を含む。
【０１７８】
いくつかの態様において、ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、単一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡであり、そしてその５’端でターゲットＤＮＡに相補的なヌクレオチドのストレッチに連結した配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−リンカー−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’を含む（ここで「リンカー」は、任意のヌクレオチド配列を含みうる任意のリンカーヌクレオチド配列を示す）。他の例示的な単一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡには、ＵＳ  ２０１４−００６８７９７（本明細書に援用される）の配列番号６８０〜６８２に示されるものが含まれる。
【０１７９】
特定の態様において、配偶子または移植前の胚において、機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提供するには、ＤＮＡターゲティングＲＮＡまたはガイド配列が、関心対象の動物、例えばマウスまたはラットから得られる配偶子または移植前の胚内に導入されればよいように、部位特異的修飾ポリペプチド（例えばＣａｓ９）が、恒常的にまたは条件的に（例えば組織または細胞タイプ特異的にまたは誘導性に）こうした動物における導入遺伝子として発現されてもよい。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、または粒子仲介送達法によって送達されるガイドＲＮＡを用いて、ニューロン、免疫細胞、および内皮細胞における成功したゲノム編集を示す、Ｐｌａｔｔら，  ＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，  Ｃｅｌｌ  ｈｔｔｐ：／／ｄｘ  ｄｏｔ  ｄｏｉ  ｄｏｔ  ｏｒｇ  ｓｌａｓｈ  １０．１０１６  ｓｌａｓｈ  ｊ  ｄｏｔ  ｃｅｌｌ  ｄｏｔ  ２０１４．０９．０１４（本明細書に援用される）を参照されたい。導入遺伝子のＣａｓ９タイプは、例えば遍在性のプロモーター（例えばＣＡＧプロモーター）によって駆動可能であり、そしてＣｒｅ−ｌｏｘＰ系（例えば細胞タイプまたは組織特異的Ｃｒｅドライバー）あるいは当該技術分野に周知のその同等物または変異体を用いることによって誘導性になりうる。
【０１８０】
特定の態様において、Ｃａｓ９発現動物は繁殖性であり、正常な同腹仔サイズを有し、形態学的異常を提示せず、そして／またはホモ接合体に繁殖可能である。
本発明の高効率ハイスループットエレクトロポレーション法と組み合わせて、こうした部位特異的修飾ポリペプチド発現動物（例えばマウスまたはラット）をｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット遺伝子スクリーンに用いて、例えば腫瘍抑制、幹細胞再生、ウイルス複製の宿主決定要因、および発癌性増殖の制御因子など多くの重要な生物学的プロセスのいずれかに関与する遺伝子を同定することも可能であるし、そしてこれをゲノム規模のまたはターゲティング化ｓｇＲＮＡライブラリーと直接組み合わせて、新規生物学を明らかにすることも可能である。
【実施例】
【０１８１】
本明細書に記載する実施例は、例示目的のみのためのものであり、そして限定されない。しかし、実施例に記載する条件は、一般的な適用可能性を有し、そして本明細書に記載する発明の任意の１またはそれより多い他の態様と組み合わせうると意図される、記載する発明の特定の態様を構成することも可能である。
【０１８２】
遺伝子修飾マウスは、遺伝子機能およびヒト疾患を研究するための重要なモデルとして働き、そして主に、慣用的な遺伝子ターゲティングまたは導入遺伝子技術を用いて生成されてきている。典型的な慣用的遺伝子ターゲティング実験において、所望の遺伝子修飾をまず、相同組換えを通じて、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞内に導入し、そして意図される突然変異を所持するクローン性に得られたＥＳ細胞クローンを単離する（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、２００５）。続いて、ターゲティング化ＥＳ細胞を野生型胚盤胞内に注入する。ターゲティング化ＥＳ細胞のいくつかは、生じるキメラ動物の生殖系列に寄与し、したがって、ターゲティング化遺伝子修飾を含有するマウスが生成される（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、２００５）。
【０１８３】
有効ではあるが、遺伝子ターゲティングはコストが掛かりそして時間が掛かり、そして生殖系列適格性ＥＳ細胞株の入手可能性および性能に非常に依存する。
生殖系列適格性ＥＳ細胞株の必要性を回避するため、特異的遺伝子破壊を含む動物を生成するために、一細胞胚内に直接注入可能なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｕｒｎｏｖら、２０１０）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（ＢｏｇｄａｎｏｖｅおよびＶｏｙｔａｓ、２０１１）を含む、部位特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いた代替方法論が開発されてきている（Ｃａｒｂｅｒｙら、２０１０；Ｇｅｕｒｔｓら、２００９；Ｓｕｎｇら、２０１３；Ｔｅｓｓｏｎら、２０１１）。二本鎖切断部位（ＤＳＢ）に隣接する相同性を含む一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはプラスミドが提供される場合、相同組換え（ＨＲ）によって、ゲノム内に、定義される修飾を導入することも可能である（Ｂｒｏｗｎら、２０１３；Ｃｕｉら、２０１１；Ｍｅｙｅｒら、２０１０）。
【０１８４】
最近、ＲＮＡがガイドするクラスタード・レギュラリー・インタースペースド・ショート・パリンドロミック・リピーツ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ系（Ｈｓｕら、２０１４）を用いて、単一および多数の遺伝子において突然変異を所持するマウス、ならびにレポーターおよび条件付アレルを所持するマウスを、一工程で生成するための方法（Ｗａｎｇら、２０１３；Ｙａｎｇら、２０１３）が確立されてきている。
【０１８５】
類似のアプローチを用いて、遺伝子改変動物が多様な種から生成されてきている（Ｃｈａｎｇら、２０１３；Ｈａｉら、２０１４；Ｈｗａｎｇら、２０１３；Ｌｉら、２０１３ａ；Ｌｉら、２０１３ｂ；Ｎｉｕら、２０１４）。トランスジェニックマウスを生成する伝統的なアプローチと同様、これらの研究はすべて、一細胞接合子内にヌクレアーゼ構成要素を送達するために、マイクロインジェクションを使用する。
【０１８６】
本明細書記載の方法論は、生物学的／遺伝子材料、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を哺乳動物（例えばマウス）接合子に送達するためにエレクトロポレーションを使用し、そしてターゲティング化遺伝子修飾を所持する生存トランスジェニック動物（例えばマウス）を生成することに成功している。
【０１８７】
実施例１  マウス接合子および推定上の接合子への、レポーターコードポリヌクレオチドのエレクトロポレーション
本実験は、マウス接合子または推定上の接合子（省略して「接合子」）にレポーター遺伝子コードプラスミドをエレクトロポレーションした結果を記載する。
【０１８８】
遍在性の発現を支持するＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを所持するｐＭＡＸＧＦＰベクター（Ｌｏｎｚａ、米国）を本実験のために選択した。Ｂ６Ｄ２Ｆ２マウス胚を収集し、そして酸性タイロード溶液（ＡＴ）（Ｐ／Ｎ  Ｔ１７８８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で５秒間処理し、ＫＯＳＭａａ／ＢＳＡ（Ｐ／Ｎ  Ｚｅｋｓ−０５０、Ｚｅｎｉｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で２回洗浄し、そして２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｐ／Ｎ  ３１９８５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に入れた。次いで、２５μＬ中の胚を等体積（２５μＬ）のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中の８０ｎｇ／μＬのｐＭＡＸＧＦＰと混合して、最終ＤＮＡ濃度を約４０ｎｇ／μＬとし、そして混合物を１ｍｍエレクトロポレーションキュベット内に装填し、そして：３０ボルト、パルス期間１ｍｓ、２回パルス、パルス間隔１００ｍｓ（ＥＣＭ８３０、ＢＴＸ）のセッティングを用いてエレクトロポレーションした。
【０１８９】
エレクトロポレーション後、胚を１００μＬのあらかじめ平衡化したＫＯＳＭａａ／ＢＳＡで回復させ、そして続いて組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で３．５日間培養した。培養３．５日後、胚を、ＧＦＰ発現に関して、蛍光顕微鏡下で観察した。調べた３つの胚では、蛍光は観察されなかった（実験１）。
【０１９０】
透明帯層は、接合子内へのプラスミド進入に対して物理的バリアを提示しうるため、実験２および３において、出願者は、透明帯に穴を空けることによって、透明帯を除去することによって、またはＡＴ中で胚を１０秒間処理することによって、透明帯層を弱めるかまたは破壊することを試みる一方、同時に、ｐＭＡＸＧＦＰの濃度を２０ｎｇ／μＬから４０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬに変化させた。再び、調べた胚の中では蛍光はまったく観察されなかった。
【０１９１】
６−フルオレセインアミダイト（６−ＦＡＭ）（４０、１００、および５００ｎｇ／μＬ）、Ｔｕｒｂｏ  ＧＦＰ  ｍＲＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ（２５ｎｇ／μＬ）またはｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（４０および１００ｎｇ／μＬ）で標識したオリゴヌクレオチドを含む他のレポーター系において、調べた胚の中では蛍光は観察されなかった（実験４、５、および６）。ＧＦＰシグナルを持つ唯一の胚が１つの場合で観察されたが、胚は死亡しているかまたは発生が遅れていた。
【０１９２】
実施例２  マウス接合子および推定上の接合子への、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のエレクトロポレーション
本実験は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ仲介ターゲティング化遺伝子破壊のための、本発明の方法を用いた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のマウス接合子または推定上の接合子（省略して「接合子」）への送達を示す。
【０１９３】
この目的のため、Ｔｅｔ１エクソン４およびＴｅｔ２エクソン３をターゲットとして選択し、先に記載されたガイドＲＮＡを用いた（本明細書に援用されるＷａｎｇら、２０１３）。Ｔｅｔ１およびＴｅｔ２系の好適さは、Ｓａｃ１（Ｔｅｔ１）またはＥｃｏＲＶ（Ｔｅｔ２）制限部位がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）近位配列と重複することである。こうしたものとして、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を用い、ターゲット部位を含む胚から増幅されるＰＣＲ産物を用いて、突然変異体アレルを検出することも可能である（Ｗａｎｇら、２０１３）。
【０１９４】
実験６において、マウスＢ６Ｄ２Ｆ２接合子をまず、ＡＴで１０秒間処理し、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ／Ｔｅｔ１  ｓｇＲＮＡと４０／２０ｎｇ／μＬまたは１００／５０ｎｇ／μＬで混合し、そして記載するようにエレクトロポレーションした。次いで、胚が胚盤胞に発生するまで、３．５日間培養した。次いで、全ゲノム増幅およびＰＣＲ分析のため、胚を採取した。
【０１９５】
Ｓａｃ１制限酵素を用いて、ターゲット部位を含むＰＣＲ産物をＲＦＬＰによって分析した。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）およびＴｅｔ１  ｓｇＲＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）の混合物を用いた場合、エレクトロポレーションした接合子から発生させた胚に突然変異は検出されなかった。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）およびＴｅｔ１  ｓｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）の混合物を用いた場合、１６のＡＴ処理胚のうちの３つ、そしてＡＴ処理を行わなかった１６の胚のうち１つが、ＲＦＬＰ分析に基づいて、Ｔｅｔ１遺伝子座で突然変異体アレルを所持することが見出された（図１Ａ）。突然変異を、サンガー配列決定によってさらに確認した（図１Ａ）。
【０１９６】
次に、実験７において、さらにより高い濃度のＣａｓ９  ｍＲＮＡ（４００ｎｇ／μＬ）＋Ｔｅｔ２  ｓｇＲＮＡ（２００ｎｇ／μＬ）をマウス接合子内にエレクトロポレーションし、そして９つのＡＴ処理胚のうち４つが、Ｔｅｔ２遺伝子座に二重アレル突然変異を所持することが見出された（図１Ｂ）。
【０１９７】
したがって、Ｔｅｔ１およびＴｅｔ２遺伝子はどちらも、エレクトロポレーションが送達するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えばＣａｓ９  ｍＲＮＡ＋ｓｇＲＮＡ）を用いて、マウス接合子において、効率的にターゲティング可能である。
【０１９８】
その一方、異なるプラスミド濃度、すなわち２００ｎｇ／μＬ、４００ｎｇ／μＬ、および８００ｎｇ／μＬプラスミドＤＮＡを用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコードプラスミド（Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの形でＣＲＩＳＰＲ試薬の送達に対する代替物として）のエレクトロポレーションを試みた。２００ｎｇ／μＬ群において、スクリーニングした総数１２のうち、１つの突然変異体胚が同定された。したがって、接合子内へのＤＮＡのエレクトロポレーションもまた達成可能であるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の場合、ｍＲＮＡ／ガイドＲＮＡの組み合わせは、ＤＮＡよりもより効率的であるようであった。
【０１９９】
本実験およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いた他の実験において、以下の方法を用いて、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを産生した。
簡潔には、野生型Ｃａｓ９遺伝子（Ｃｏｎｇら、２０１３）を所持するｐｘ３３０プラスミドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、Ｃａｓ９コード配列の増幅のためのＤＮＡテンプレートとして働いた。順方向プライマーにＴ７プロモーター配列を付加し、そしてＣａｓ９野生型遺伝子のコード配列に隣接する逆方向プライマーと対形成させた。Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物を精製し、そしてｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を行った。ｓｇＲＮＡ合成のため、Ｔ７プロモーター配列をｓｇＲＮＡテンプレート／順方向プライマーに付加し、そしてＩＶＴテンプレートをＰＣＲ増幅によって生成した。Ｔ７−ｓｇＲＮＡ  ＰＣＲ産物をカラム精製し、そしてＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＩＶＴのためのテンプレートとして用いた。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの両方をＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて精製し、そしてキットとともに提供される溶出緩衝液で溶出させた。ＩＶＴ反応からのアリコットをアガロースゲル上で分離して、反応からの品質を評価した。
【０２００】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを、記載されるように行った（Ｇｕｓｃｈｉｎら、２０１０）。マウスまたは胚由来のゲノムＤＮＡを抽出し、そして以下の条件下で、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った：９５℃５分間；３５ｘ（９５℃３０ｓ、６０℃３０ｓ、６８℃４０ｓ）；６８℃２分間；４℃で保持。次いで、ＰＣＲ産物を変性させ、アニーリングし、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）で処理した。次いで、産物を１０％アクリルアミドＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＢＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で分離し、エチジウムブロミドで染色し、そして視覚化した。ＲＦＬＰ分析のため、１０μｌのＴｅｔ１またはＴｅｔ２  ＰＣＲ産物を、Ｓａｃ１（Ｔｅｔ１）またはＥｃｏＲＶ（Ｔｅｔ２）で消化し、そしてＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）染色アガロースゲル（２％）上で分離した。配列決定のため、ＰＣＲ産物を直接配列決定するか、またはＴｏｐｏクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、そして個々のクローンをサンガー配列決定によって配列決定した。
【０２０１】
実施例３  エレクトロポレーションしたマウス接合子の発生
接合子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養および分析は、遺伝子編集技術に関連する多数のパラメータが、迅速なターンアラウンド時間でそして好ましくはより低い操作費用で試験および分析可能であることに基づいて、重要なアプローチである。しかし、慣用的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系を用いてエレクトロポレーションした接合子を培養した際、続く胚発生は、遅延するかまたは中止されるようであった。しばしば、例えば５０／２５ｎｇ／μＬから１０００／５００ｎｇ／μＬまでの多様な濃度範囲での、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡのエレクトロポレーション後、胚は、３．５日間の培養期間終了時に、一細胞、二細胞、または四細胞段階、桑実胚段階、そして場合によって胚盤胞段階のものを含む、異なる発生段階に進行した（実験８）。対照的に、エレクトロポレーションしていない対照胚は、同じ期間終了時、ＡＴで前処理したかまたはしないかに関わらず、胚盤胞段階に達した。いくつかの実験において（実験１０および１１）、実験中のすべての群の胚は、胚盤胞段階に到達できなかった。
【０２０２】
エレクトロポレーションした接合子を培養した際のこうした最初の失敗は、所望の遺伝子修飾がエレクトロポレーションした接合子で起こるかどうかに関わらず、接合子がエレクトロポレーションプロセスを生き延びて、そして生産動物に発生し続けることが不可能でありうることを示唆するようである。ＡＴ処理が接合子に過剰に損傷を与えて、胚発生を遅延させる可能性があり、そして送達する試薬、例えばＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡが接合子およびその続く発生に対して毒性でありうるという認識は、さらに、動物において生殖系列伝達可能遺伝子修飾を永続的に導入する有望な手段としてエレクトロポレーションを用いることに疑いを投げかける。
【０２０３】
エレクトロポレーションした接合子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生が劣っている問題を解決する試みの中で、出願者は、驚くべきことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件を変化させることによる（表１）、より具体的には、典型的にはポリヌクレオチド緩衝液（例えばＴＥ緩衝液）および減少血清培地（例えばＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地）を含むエレクトロポレーション培地中のいかなる潜在的に有害な物質も洗い流すことによる、解決策を同定した。エレクトロポレーションした接合子の生存および発生に対するこの劇的な効果は、本明細書に記載する実験において立証される。
【０２０４】
特に、Ｂ６Ｄ２Ｆ１／Ｊドナー雌マウスを過排卵させて、胚収率を最大限にした。各ドナー雌に、５ＩＵ（ｉ．ｐ．注射）の妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を投与し、そして約４７時間後、５ＩＵ（ｉ．ｐ．注射）のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を投与した。
【０２０５】
ｈＣＧ投与直後、雌を１：１でＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｊ繁殖用雄と交尾させた。２４時間後、交尾プラグの存在に関して、雌をチェックした。交尾プラグを示す雌を安楽死させ、そして卵管を切除して、そしてＭ２培地に入れた。次いで、約０．３ｍｇ／ｍＬの濃度でヒアルロニダーゼを含むＭ２培地に、卵管を入れた。膨大部を溶解させ、そしてヒアルロニダーゼを含有するＭ２培地中で、卵丘細胞が剥がれ落ちるまでインキュベーションすることによって、卵母細胞の塊を取り除いた。接合子を収集し、そして新鮮なＭ２培地で２回洗浄した後、ＣＯＯＫ  ＭＩＮＣベンチトップインキュベーター中、２４時間、オイル下で平衡化しておいたＲＣＶＬ培地小滴に入れた。
【０２０６】
酸性タイロード溶液を融解し、そして１００μＬの滴をペトリ皿に入れ、１滴で５０接合子を処理するものとした。ＥＰ（エレクトロポレーション）と同定された接合子をＲＣＶＬ培地から取り除き、そして１００μＬ滴の（あらかじめ温めた）Ｍ２培地中に入れた。５０の群で、接合子を酸性タイロード溶液に１０秒間入れ、そして次いで取り除き、そして３つの１００μＬ滴のあらかじめ温めたＭ２培地を通じて洗浄した。次いで、処理した接合子をエレクトロポレーションに備えてＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地の５〜１０μＬ滴に入れた。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地滴あたりの接合子の数および滴の数は、実行している実験のパラメータにしたがって多様であった。
【０２０７】
実験１４および１５の両方に関して、ＣＲＩＳＰＲ混合物はＣａｓ９  ｍＲＮＡ／Ｔｅｔ２  ｓｇＲＮＡを含有し、２００／１００、４００／２００、および６００／３００ｎｇ／μＬで用いた。さらに、実験１５に関して、ＥｃｏＲＶ部位（ＧＡＴＡＴＣ）をＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）に変換するための突然変異を所持するドナーオリゴヌクレオチドもまた、２００、４００、または２００ｎｇ／μＬで提供した。混合物を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で、実験群あたり１０μＬにして、そして１０μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中の胚に添加した。次いで、総内容物２０μＬを１ｍｍキュベット内に装填し、そしてエレクトロポレーションを送達した（３０ボルト、パルス期間１ｍｓ、２回パルス、パルス間隔１００〜１０００ｍｓ）。
【０２０８】
エレクトロポレーション完了時、次の工程（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養および／または偽妊娠雌へのトランスファー）の前に、エレクトロポレーションした配偶子または移植前の胚を洗浄することが望ましい場合、胚をキュベットから１００μＬのあらかじめ温めたＫＳＯＭａａ／ＢＳＡ培地中に回収し、そして連続して３つの１００μＬ滴のあらかじめ温めたＭ２培地を通過させて、いかなる残渣エレクトロポレーション溶液（１：１のＴＥ緩衝液およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地）も洗い落とした。次いで、接合子を生存性に関して評価した。健康であると判断されたものを、特定病原体不含（ＳＰＦ）手術室に輸送するため、９５０μＬのあらかじめ温めたＭ２培地を含有するクライオバイアル内にトランスファーした。
【０２０９】
ＳＰＦ施設において、ｐ１０００ピペットを用いて、クライオバイアルから接合子を取り除き、そしてＣＯＯＫ  ＭＩＮＣベンチトップインキュベーター中、２４時間、オイル下で平衡化させておいたＲＣＶＬ培地の培養小滴に入れた。トランスファーする際、胚をＲＣＶＬ小滴から取り除き、そしてあらかじめ温めた１００μＬ滴のＭ２培地に入れて、そしてＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＡＨ（動物実験健康）ルーチン法９４−０９などの標準的なプロトコルにしたがって、ＣＢＹＢ６Ｆ１／Ｊ偽妊娠雌内にトランスファーした。
【０２１０】
マウスサブセットを誕生時に分析した。これらのため、マウスが誕生した際に尾の生検試料を採取し、そしてＥｃｏＲＶ消化を伴うＲＦＬＰによって分析した（図２Ａおよび２Ｂ）。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ４００ｎｇ／μＬおよびｓｇＲＮＡ  ２００ｎｇ／μＬの群からスクリーニングした１３匹のうち２匹のマウス由来のＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶ消化に対して耐性である（創始者８５Ｃ３）か、または部分的に耐性であった（８５Ｃ１０）（図２、パネルＡ）。
【０２１１】
それぞれ、６００ｎｇ／μＬおよび３００ｎｇ／μＬのより高い濃度のＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを用いた場合、５匹のマウスがＲＦＬＰアッセイによって分析した際、陽性であり（創始者８６Ｃ３、８６Ｃ５、８６Ｃ７、８６Ｃ８および８６Ｃ９）、このうち２つ（８６Ｃ３および８６Ｃ９）がＥｃｏＲＶ消化に対して完全に耐性である一方、３つ（８６Ｃ５、８６Ｃ７および８６Ｃ８）が部分的に耐性であった。ＰＣＲ産物のサンガー配列決定によって、７匹のマウスのうち６匹に関して突然変異体アレルの存在が確認された（図２Ｃ、８５Ｃ３、８５Ｃ１０、８６Ｃ３、８６Ｃ７、８６Ｃ８および８６Ｃ９）一方、１つは低存在量の突然変異アレルを所持する可能性もある（８６Ｃ５）。さらに、創始者８５Ｃ３、８６Ｃ３および８６Ｃ９をｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏベクターにクローニングし、そして個々のクローンを配列決定した際、Ｔｅｔ２ターゲット部位のＰＡＭ近傍領域に正確に位置するＩＮＤＥＬ突然変異が、予期されるように、検出された（図２Ｄ）。
【０２１２】
１週齢になった際、これらの２つの実験からの残りのマウスを分析した。尾の生検試料を採取し、そして先に記載されるようにＲＦＬＰによって分析し、そしてその結果を、これらのマウスから増幅されるＰＣＲ産物のサンガー配列決定によって確認した。表１に要約するように、これらの２つの実験間の創始者効率において、濃度依存性の改善が観察された。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを２００ｎｇ／μＬで、そしてｓｇＲＮＡを１００ｎｇ／μＬで用いた際、スクリーニングした３４匹のうち、１匹の創始者が同定された（３．２％）。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ４００ｎｇ／μＬおよびｓｇＲＮＡ  ２００ｎｇ／μＬに濃度を増加させた際、創始者効率は４８．３％に増加した（スクリーニングした２９匹のうち、１４匹の創始者マウス）。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ６００ｎｇ／μＬおよびｓｇＲＮＡ  ３００ｎｇ／μＬに濃度をさらに増加させた際、効率は４５．５％であった（スクリーニングした３３匹のうち、１５匹の創始者マウス）。驚くべきことに、実験１５に関して、１００％の創始者効率が達成され、スクリーニングした１１匹のマウスすべてが、突然変異体アレルを所持した（図３）。
【０２１３】
ＣＲＩＳＰＲ仲介ＨＤＲもまた、実験１５で試験し、ここで、ドナーオリゴヌクレオチドを実験設計に取り込んだ。
具体的には、接合子にエレクトロポレーションし、そしてマウスを誕生させ、そして遺伝子型決定した。４６６ｂｐのＰＣＲ産物を増幅し、この増幅産物はターゲット部位を含み、ＥｃｏＲＶ消化に曝露して、ＮＨＥＪ突然変異を所持するアレルを検出し、そしてＥｃｏＲＩ消化に曝露して、ＨＤＲアレルを検出した。成功したＨＤＲアレルは他の実験群では検出されなかったが、ＥｃｏＲＩによって切断されたアレルを所持する２匹の創始者マウス（図３、パネルＡ、８６ＥＰ１１および８６ＥＰ１４）が検出され、そしてこれらは、４００ｎｇ／μＬのＣａｓ９  ｍＲＮＡ、２００ｎｇ／μＬのＴｅｔ２遺伝子座の３’ＵＴＲをターゲティングするｓｇＲＮＡ、および４００ｎｇ／μＬのｓｓＤＮＡドナーでエレクトロポレーションした群から得られた。この群の中で、１１匹のマウスすべてが、ＥｃｏＲＶ消化に対して耐性であるアレルを所持する。創始者８６ＥＰ１１〜８６ＥＰ１５は、ＥｃｏＲＶによって切断可能なアレルを検出可能なレベルで所持しないようであり、１１匹すべての創始者マウスにＮＨＥＪ突然変異が存在することが示唆される。１１の試料をＥｃｏＲ１に曝露すると、試料８６ＥＰ１１および８６ＥＰ１４由来のアレルのいくつかは部分的にＥｃｏＲＩによって消化されることが示され、これらの２つの試料由来のＨＤＲアレルの存在が示唆された。
【０２１４】
次いで、創始者８６ＥＰ１１および８６ＥＰ１４からＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、そして個々のクローンを配列決定した。図３、パネルＢに示すように、試料８６ＥＰ１１−４および８６ＥＰ１４−４は、ＥｃｏＲＩ部位を所持し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに仲介されたドナーｓｓＤＮＡからのこの部位の取り込みが成功したことが示唆される。
【０２１５】
多様な異なるエレクトロポレーション・セットアップ・パラメータを、一連の実験でさらに試験し、そしてその結果を以下に要約した：
１．  ２０Ｖ、２回パルス、１００ｍｓ間隔、０回洗浄
ａ．  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ２００ｎｇ／μＬ＋Ｔｅｔ２  ｓｇＲＮＡ  １００ｎｇ／μＬ
ｂ．  結果：１２％が胚盤胞段階に到達（２／１７）、遺伝子ターゲティングは観察されない
２．  ２０Ｖ、２回パルス、１００ｍｓ間隔、３回洗浄
ａ．  Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：５００／２５０、４００／２００、２００／１００ｎｇ／μＬ
ｂ．  結果：平均９１％が胚盤胞（５０／５５）
３．  ２０Ｖ、２回パルス、１ｓ間隔、３回洗浄
ａ．  Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：８００、６００、４００、３００、２００、１００ｎｇ／μＬ
ｂ．  ２００ｎｇ／μＬでの結果（バッチ１）：１００％胚盤胞（１６／１６）、１４．３％ターゲティング（１／７）
ｃ．  ２００、３００、４００ｎｇ／μＬでの結果（バッチ２）：９５．８％胚盤胞（４６／４８）、結果未決定
ｄ．  結果（バッチ３）：多数回洗浄、胚を偽妊娠雌マウスにトランスファー、誕生未決定
４．  ２０Ｖ、３回パルス、１ｓ間隔、１回洗浄
ａ．  Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：４００、２００ｎｇ／μＬ
ｂ．  ２００ｎｇ／μＬでの結果（バッチ１）：８２．３％胚盤胞（１４／１７）、ターゲティングなし
ｃ．  ４００および２００ｎｇ／μＬでの結果（バッチ２）：９３．８％胚盤胞（３０／３２）、結果未決定
５．  ２０Ｖ、３回パルス、１ｓ間隔、３回洗浄
ａ．  Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：２００ｎｇ／μＬ
ｂ．  結果：８８．９％胚盤胞（１６／１８）、ターゲティングなし
６．  ３０Ｖ、２回パルス、１ｓ間隔、３回洗浄
ａ．  Ｃａｓ９／Ｔｅｔ２：４００、３００、２００ｎｇ／μＬ
ｂ．  ２００ｎｇ／μＬでの結果：９４％胚盤胞（１５／１８）、ターゲティングなし
ｃ．  ３００ｎｇ／μＬでの結果：８４％胚盤胞（１６／１９）、１６％ターゲティング（３／１９）、４００ｎｇ／μＬでのターゲティングなし
要約すると、結果は、エレクトロポレーションしたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いた遺伝子修飾成功が、用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬の濃度に依存することを示唆する。エレクトロポレーション実験において、伝統的なマイクロインジェクション実験と比較して、試薬濃度は限定要因であることをやめ、そしてより高い濃度の試薬（例えばＣａｓ９  ｍＲＮＡでは４００ｎｇ／μＬを、そしてｓｇＲＮＡでは２００ｎｇ／μＬを超えて）を用いて遺伝子編集マウスが生成されることが見出された。
【０２１６】
データはまた、透明帯を、例えばＡＴ処理によって弱めると、接合子エレクトロポレーションに有益でありうることもまた示唆する。しかし、長期の処理は回避すべきである。
最後に、だが最小ではなく、本方法を用いたＣＲＩＳＰＲ仲介遺伝子ターゲティングは、実験セットアップ中のパラメータの特定の変動で成功裡に行われうる。エレクトロポレーションした接合子の発生の成功を確実にするため、エレクトロポレーションした接合子を、エレクトロポレーション完了時に、胚発生に最適な生理学的溶液または培地で１回または複数回（例えば２、３、４回）リンスする必要がありうる。例えば、エレクトロポレーションした接合子を、あらかじめ温めたＭ２培地の滴（１００μＬ）に連続して通過させて、接合子を培養に入れるかまたは子宮環境にトランスファーする前に、残渣エレクトロポレーション溶液（例えば１：１のＴＥ緩衝液およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標））を洗い流してもよい。
【０２１７】
表１  実験１４および１５の要約
【０２１８】
【表１】
2017534295.tif 000002
【０２１９】
本発明の方法の詳細な例示的（限定されない）態様を以下に提供する：
１．  １ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｐ／Ｎ  Ａ２１５３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した１００μＬ  ＫＳＯＭａａ  Ｅｖｏｌｖｅ（Ｐ／Ｎ  Ｚｅｋｓ−０５０、Ｚｅｎｉｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のアリコットを、９６ウェル平底組織培養プレート上にデポジットし、そして一細胞接合子を受け入れるまで、ＨｅｒａＣｅｌｌインキュベーター中、３７℃／５％ＣＯ２で平衡化した。
【０２２０】
２．  Ｂ６Ｄ２Ｆ１雌マウスに、５国際単位（ＩＵ）の妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、Ｐ／Ｎ  ＨＯＲ−２７２、ＰｒｏＳｐｅｃ、イスラエル・レホヴォト）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、そして約４８時間後、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、Ｐ／Ｎ  ＨＯＲ−２５０、ＰｒｏＳｐｅｃ、イスラエル・レホヴォト）をｉ．ｐ．注射した。次いで、雌マウスをＢ６Ｄ２Ｆ１雄マウスと交尾させた。交尾プラグに関して陽性であったものを、頸椎脱臼（ＣＤ）によって安楽死させた。切除した生殖管から、受精胚をフラッシュした。
【０２２１】
３．  Ｂ６Ｄ２Ｆ２マウスから一細胞接合子を収集し、酸性タイロード溶液（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ１７８８；またはＥＭＢＲＹＯＭＡＸ（登録商標）Ｐ／Ｎ  ＭＲ−００４−Ｄ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅなどの同等物）中で１０秒間処理し、ＫＳＯＭａａ  Ｅｖｏｌｖｅで２回洗浄し、そして組織培養ディッシュまたはプレート（３５ｍｍ、Ｐ６０、９６ウェル）中で、１０μＬ滴のあらかじめ温めたＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｐ／Ｎ  ３１９８５、Ｇｉｂｃｏ）に入れた。
【０２２２】
４．  「生物学的材料」（ＣＲＩＳＰＲに関しては、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、および場合によってドナーオリゴヌクレオチド；または代替物として同じものをコードするＤＮＡから本質的になる）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０μＬ体積に再構成し、そしてＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中の接合子の１０μＬ滴に添加する。
【０２２３】
５．  「生物学的材料」に浸した接合子を取り除き、そしてＢＴＸモデル６１０（Ｐ／Ｎ  ４５０１２４、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）の２ｍｍキュベットのチャンバーにデポジットした。キュベットを軽く叩いて、ポリヌクレオチド／接合子溶液または懸濁物が、キュベットの２つのコンダクターの間に移動し、気泡が混合物中にトラップされないことを確実にした。
【０２２４】
６．  キュベットをＢＴＸキュベットチャンバー（ＥＣＭ８３０）内に入れ、そして以下のセッティング（またはその変動、例えば本明細書に開示するもの）を用いてエレクトロポレーションする：
ａ．  電位：３０Ｖ
ｂ．  パルス間隔：１２５〜１３０ｍｓ
ｃ．  パルス期間：１ｍｓ
ｄ．  パルス数：２回
７．  キュベットパッケージから供給されているプラスチックピペットを用いて、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルから、８０〜１００μＬのあらかじめ温めた培地（例えばＫＳＯＭａａ／ＢＳＡ培地）を取り除き、そしてキュベットに培地を穏やかに添加する。キュベットからすべての内容物を取り除き、そして混合物をウェルに排出する。
【０２２５】
８．  あらかじめ温めたＭ２培地の２〜３の１００μＬ滴に、エレクトロポレーションした接合子を連続して通過させ、いかなる残渣エレクトロポレーション溶液も洗い流す。
９．  洗浄した接合子を所持する９６ウェルプレートを直ちにインキュベーターに戻す。
【０２２６】
１０．  ３７℃／５％ＣＯ２で３．５日間胚を培養し、発生の胚盤胞段階に到達させ、そして次いで分析のため採取した。
１１．  ＧＥＮＯＭＥＰＬＥＸ（登録商標）一細胞全ゲノム増幅キット（Ｐ／Ｎ  ＧＡ４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、胚ゲノムを増幅した。次いで、増幅したゲノムを、ターゲット部位を含むプライマー対を用いた、ＰＣＲ反応（ＡＣＣＵＰＲＩＭＥＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ系、Ｐ／Ｎ  １２３３９−０１６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；またはＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ、Ｐ／Ｎ  Ｒ０５０Ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のテンプレートとして用いた。ＰＣＲ産物を清浄化し、そしてサンガー配列決定によって、ヌクレオチド配列を分析した。
【０２２７】
１２．  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよび場合によるＤＮＡドナーを合成し、そして注射混合物を先に記載されるように調製した（Ｗａｎｇら、２０１３；Ｙａｎｇら、２０１３）。
【０２２８】
参考文献
【０２２９】
【化１−１】
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【０２３０】
【化１−２】
2017534295.tif 000004
【０２３１】
本明細書記載のすべての参考文献は、本明細書に援用される。
【図１−１】
2017534295.tif 000005
【図１−２】
2017534295.tif 000006
【図２−１】
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【図２−２】
2017534295.tif 000008
【図２−３】
2017534295.tif 000009
【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
2017534295.tif 000012
【国際調査報告】
2017534295.tif 000013
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