(57)【要約】本発明は、概して人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するためのシステムに向けられている。一態様において、本発明のシステムは、宿主細胞、人工内部共生体、人工内部共生体を宿主細胞に導入するための手段、人工内部共生体を有する宿主細胞を遊離の人工内部共生体から分離するための手段、および宿主細胞中の人工内部共生体を検出するための手段を含む。【選択図】図１Ａ、図１Ｂ
2017508452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工内部共生体、真核細胞、容器、該人工内部共生体を該真核細胞中に導入するための手段、および抗人工内部共生体抗体を含むシステムであって、該人工内部共生体、該真核細胞、および該抗体が、該容器の内部にある、前記システム。
【請求項２】
人工内部共生体、真核細胞、容器、該人工内部共生体を該真核細胞中に導入するための手段、および該磁性細菌を含有する該哺乳類細胞を検出するための手段を含むシステムであって、該人工内部共生体が磁性細菌であり、該真核細胞が哺乳類細胞であり、該人工内部共生体および該真核細胞が該容器の内部にある、前記システム。
【請求項３】
人工内部共生体が、レポーターを有するように改変されている、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
レポーターがルシフェラーゼタンパク質または蛍光タンパク質である、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
レポーターが緑色蛍光タンパク質である、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
選択剤をさらに含み、該選択剤が容器の内部にある、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項７】
選択剤が、ゲンタマイシン、カナマイシン、およびクロラムフェニコールからなる群から選択される、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
さらに抗人工内部共生体抗体を含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項９】
抗人工内部共生体抗体がレポーターで標識されている、請求項１または８に記載のシステム。
【請求項１０】
抗人工内部共生体抗体がポリクローナル抗体である、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
導入するための手段が人工内部共生体および真核細胞に磁場をかける、請求項２に記載のシステム。
【請求項１２】
導入するための手段が永久磁石である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
人工内部共生体を真核細胞に導入するための方法であって、以下の工程：該人工内部共生体を容器中に配置し、該真核細胞を該容器中に配置し、該人工内部共生体を該真核細胞中に導入するための手段を用いて該人工内部共生体を該真核細胞中に導入し、そして該人工内部共生体を有する該真核細胞を抗人工内部共生体抗体に曝露させる；を含む、前記方法。
【請求項１４】
人工内部共生体を真核細胞に導入するための方法であって、以下の工程：該人工内部共生体を容器中に配置し（ここで該人工内部共生体は磁性細菌である）、該真核細胞を該容器中に配置し（ここで該真核細胞は哺乳類細胞である）、該人工内部共生体を該真核細胞中に導入するための手段を用いて該人工内部共生体を該真核細胞中に導入し、そして該人工内部共生体を有する真核細胞を検出する；を含む、前記方法。
【請求項１５】
検出のための手段が光学デバイスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類細胞および磁性細菌に選択剤を与える工程をさらに含む、請求項１３〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
導入のための手段が磁性細菌および哺乳類宿主細胞に磁場をかける、請求項１３〜１５に記載の方法。
【請求項１８】
磁性細菌が、レポーターを有するように改変されている、請求項１３〜１５に記載の方法。
【請求項１９】
レポーターが緑色蛍光タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
磁性細菌を有する哺乳類細胞を抗磁性細菌抗体に曝露させる工程をさらに含む、請求項１４〜１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[1]  本発明は、概して、人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するためのシステムに関する。本発明は、本発明のシステムを用いて内部共生体を有する宿主細胞を作製する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
[2]  ミトコンドリア、葉緑体および他の膜結合型細胞小器官は、遺伝性の機能性、例えば光合成を真核細胞に付加する。（それらの退化した環状ＤＮＡにより同定される）そのような細胞小器官は、内部共生体に由来すると信じられている。
【０００３】
[3]  細菌は、様々な真核細胞に存在しない広い範囲の機能性と共に存在している。例えば、１９７５年に、Blakemoreは、地球磁場に沿って方向付け、泳ぐ走磁性細菌（ＭＴＢ）を同定した。(Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science 24: 377-379 (1975)(それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。これらの走磁性細菌は、脂質膜により封入された磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）またはグレイジャイト（Ｆｅ３Ｓ４）で構成されているマグネトソームと呼ばれる磁性構造体を生成する。多数のＭＴＢ種が、それらの最初の発見以来同定されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science 24: 377-379 (1975)
【発明の概要】
【０００５】
[4]  本発明は、人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するためのシステムに関する。一態様において、本発明のシステムは、宿主細胞、人工内部共生体、および人工内部共生体を宿主細胞に導入するための手段を含む。一態様において、本発明のシステムは、宿主細胞、人工内部共生体、人工内部共生体を宿主細胞に導入するための手段、および人工内部共生体を有する宿主細胞を富化するための手段を含む。一態様において、システムはさらに、人工内部共生体を含有する宿主細胞を検出するための手段を含むことができる。一態様において、本発明のシステムは、宿主細胞、人工内部共生体、人工内部共生体を宿主細胞に導入するための手段、および人工内部共生体を含有する宿主細胞を検出するための手段を含む。一態様において、人工内部共生体を導入するための手段は、磁気手段、加速手段、注入手段、電場手段、リガンド−受容体手段、濃縮手段、化学的手段、膜融合手段、および／または食胞回避手段であることができる。一態様において、人工内部共生体を含有する宿主細胞を検出するための手段は、宿主細胞により獲得された人工内部共生体の効率、濃度、および／または量を測定するために用いられることができる。一態様において、検出するための手段は、低周波数の交番磁場の適用後に人工内部共生体を含有する宿主細胞からの熱的応答を測定する。一態様において、検出するための手段は、ＭＲＩまたはＮＭＲを利用して宿主細胞中の人工内部共生体を測定する。一態様において、検出するための手段は、マグノメトリー（ｍａｇｎｏｍｅｔｒｙ）、高熱（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）、ＥＰＲ、メスバウアー、ＳＱＵＩＤまたは他の磁気測定を利用して宿主細胞中の人工内部共生体を測定する。一態様において、人工内部共生体は、ＧＦＰまたは他の光学的に活性なレポーターを発現し、検出のための手段は、ＧＦＰまたは他の光学的に活性なレポーターにより作られる光の量を測定する光学測定を行う。一態様において、人工内部共生体は、非光学的レポーターを発現し、検出のための手段は、非光学的レポーターまたは非光学的レポーターからの信号、分子、もしくは生成物を測定する。
【０００６】
[5]  一態様において、人工内部共生体を導入するための手段は、人工内部共生体が宿主細胞に向かって動くように配置された磁気手段である。一態様において、磁気手段は、永久磁石または電磁石であることができる。一態様において、磁気手段は、宿主細胞および人工内部共生体を収容する容器の付近に、またはそれに隣接して配置される。一態様において、磁気手段は、容器にわたって類似の量の人工内部共生体の宿主細胞中への装填をもたらすように設計されている。一態様において、装填は、人工内部共生体が宿主細胞と接触する容器の部分において類似している。一態様において、磁気手段は、人工内部共生体が宿主細胞中に導入される容器において類似している磁場強度を提供するように設計されている。一態様において、磁気手段は、容器にわたって類似している磁場強度を提供するように設計および／または操作される。一態様において、磁気手段は、容器の底または床の上に容器にわたって類似している磁場勾配を提供するように設計および／または操作される。一態様において、磁場強度は、容器にわたって均一である。一態様において、それぞれの容器における磁場分布は、類似している。一態様において、磁場分布は、それぞれの容器において均一である。一態様において、システムは、複数の容器を有し、磁場分布は、それぞれの容器において類似している。一態様において、システムは、複数の容器を有し、磁場分布は、容器間で均一である。一態様において、人工内部共生体の宿主細胞中への装填は、多数容器のシステムにおいて容器間で類似している。一態様において、多数の容器は、２、６、１２、２４、４８個等のウェルを有する形式を含むマルチウェルプレート形式で配置されており、それは当該技術で周知である。一態様において、プレートは、２×３配列の６ウェルプレートである。一態様において、容器は、例えばフラスコ、発酵槽またはバイオリアクターのようなスケールアップまたは産業的用途に適した容器である。
【０００７】
[6]  本発明は、本発明のシステムを用いて人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するための方法にも関する。一態様において、宿主細胞および人工内部共生体は、同じ容器中に配置され、人工内部共生体を宿主細胞に導入するための手段を施され、次いで人工内部共生体を含有する宿主細胞が得られる。一態様において、宿主細胞および人工内部共生体は、同じ容器中に配置され、人工内部共生体を宿主細胞に導入するための手段を施され、次いで人工内部共生体を含有する宿主細胞が、人工内部共生体を有する宿主細胞を富化するための手段から得られる。一態様において、宿主細胞および人工内部共生体は、同じ容器中に配置され、人工内部共生体を宿主細胞に導入するための手段を施され、次いで人工内部共生体を含有する宿主細胞が、人工内部共生体を含有する宿主細胞を検出するための手段を用いて分析される。一態様において、宿主細胞は、容器表面（単数または複数）に対して接着性である。一態様において、宿主細胞は、懸濁状態で増殖し、容器の表面に付着しない。一態様において、宿主細胞集団は、懸濁細胞および接着細胞の両方を有し、宿主細胞は、懸濁状態で、および容器の表面（単数または複数）に付着して存在する。一態様において、宿主細胞は、接着細胞および懸濁細胞の不均一な集団である。
【０００８】
[7]  本発明は、人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するためのキットにも関する。本発明のキットは、人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するためのシステムの消耗品を含む。キットは、随時取り替えられる必要がある本発明のシステムの物品も含むことができる。一態様において、本発明のキットは、本発明のシステムのための１、２、３、またはより多くの物品を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】[8]  図１Ａ〜Ｃは、人工内部共生体を宿主細胞中に導入するために磁気手段を用いるシステムの模式的描写である。図１Ａは、システムの鳥瞰図であり、図１Ｂは、システムの分解組立図である。図１Ｃは、システムを代替の形式のプレートに適合させる磁気手段を保持するための互換性の挿入物を描写している。
【図１Ｂ】同上
【図１Ｃ】同上
【図２】[9]  図２は、本発明の磁気手段を描写している。
【図３】[10]  図３は、ｇｆｐ＋ＡＭＢ−１を含有するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注射された腫瘍を有するマウスのＭＲＩ画像を描写している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[11]  本発明は、人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するためのシステムに向けられている。
定義
[12]  本明細書で用いられる際、用語“人工内部共生体”は、ヒトの介入により宿主細胞中に導入される、または導入された単細胞生物であって、少なくとも５回の細胞分裂を通して宿主細胞の娘細胞に移された、または移されることができる単細胞生物を指す。一態様において、人工内部共生体は、少なくとも３または４回の細胞分裂を通して移されることができる。一態様において、人工内部共生体は、少なくとも１または２回の細胞分裂を通して移されることができる。人工内部共生体は、宿主細胞に所望の表現型を与え、その表現型は、少なくとも１、２、３、４、または５回の細胞分裂を通して宿主細胞の娘細胞中で維持される。単細胞生物は、ポリペプチド（単数または複数）、核酸（単数または複数）、脂質（単数または複数）、炭水化物（単数または複数）、アミノ酸（単数または複数）、または他の因子（単数または複数）を宿主細胞に分泌する、および／または宿主細胞から輸送することができる。この単細胞生物および宿主細胞の間の連絡は、結果として宿主細胞に関する所望の表現型をもたらすことができる。
【００１１】
[13]  本明細書で用いられる際、用語“細胞の生活環”は、真核細胞の成長、複製、および分裂を伴う一連の事象を指す。それは、Ｇ０（ここで細胞は無活動である）、Ｇ１およびＧ２（ここで細胞は大きさが増大する）、Ｓ（ここで細胞はそのＤＮＡを複製する）、ならびにＭ（ここで細胞は有糸分裂を経て分裂する）として知られる５つの期に分けられる。
【００１２】
[14]  本明細書で用いられる際、用語“娘細胞”は、細胞の分裂により形成される細胞を指す。
[15]  本明細書で用いられる際、用語“必須分子”は、成長または生存に関して細胞により必要とされる分子を指す。
【００１３】
[16]  本明細書で用いられる際、用語“蛍光タンパク質”は、ある波長の光子を吸収し、別の波長の光子を放出するタンパク質を指す。
[17]  本明細書で用いられる際、用語“遺伝子改変された”は、細胞の観察可能または測定可能な特性または特徴が変化するように細胞のＤＮＡを変化させることを指す。
【００１４】
[18]  本明細書で用いられる際、用語“宿主細胞”は、人工内部共生体がその中に居住する（ｒｅｓｉｄｅ）ことができる真核細胞を指す。
[19]  本明細書で用いられる際、用語“細胞内内部共生体”は、その天然の生活環の少なくとも一部を真核生物の細胞の内部で過ごす単細胞生物を指す。
【００１５】
[20]  本明細書で用いられる際、用語“細胞内病原体”は、天然に宿主生物に感染し、結果として宿主生物において疾患をもたらす細菌を指し、感染の間に一部の細菌は宿主細胞に入り、そこで細菌は増殖し、繁殖する。
【００１６】
[21]  本明細書で用いられる際、用語“ルシフェラーゼ”は、化学的事象、例えば化学発光または生物発光から光子を放出するタンパク質を指す。
[22]  本明細書で用いられる際、用語“磁石”または“磁気手段”は、磁場を生成する組成物またはデバイスを意味する。磁石または磁気手段は、永久磁石または電磁石であることができる。
【００１７】
[23]  本明細書で用いられる際、用語“マグネトソーム”は、個々の粒子として、粒子の鎖において、または粒子の他の配列においてのいずれかで（いずれでもよい）鞘（ｓｈｅａｔｈ）または膜により封入された磁鉄鉱（すなわちＦｅ３Ｏ４）またはグレイジャイト（Ｆｅ３Ｓ４）の粒子を指す。
【００１８】
[24]  本明細書で用いられる際、用語“走磁性細菌”または“ＭＴＢ”は、磁場を用いてそれらの泳ぐパターンを方向付ける細菌のクラスを指す。
[25]  本明細書で用いられる際、用語“磁性細菌”は、外部の磁場に応答することができる細菌を指す。
【００１９】
[26]  本明細書で用いられる際、用語“哺乳類”は、温血脊椎動物であって、その全てが毛髪を有し、それらの子に授乳する温血脊椎動物を指す。
[27]  本明細書で用いられる際、用語“表現型”は、その遺伝子型の環境との相互作用の結果もたらされる個体の観察可能な特徴のセットを指す。
【００２０】
[28]  本明細書で用いられる際、用語“レポーター”は、宿主細胞に容易に測定される表現型を与えるポリペプチドまたは分子を指す。“光学レポーター”は、光学的に測定されることができるポリペプチドまたは分子を指す。
【００２１】
[29]  本明細書で用いられる際、用語“分泌する”は、膜の一方の側から他方の側へと分子または信号を渡すことを指す。
[30]  本明細書で用いられる際、用語“選択剤”は、選択マーカーの非存在下では人工内部共生体および／または宿主細胞に致死または阻害性である分子、ポリペプチドまたは培養条件のセットを指す。
【００２２】
[31]  本明細書で用いられる際、“選択マーカー”は、細胞中に導入された際に選択に適した特性を与える遺伝子である。
[32]  特定の定義が提供されない限り、本明細書で用いられている全ての他の技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００２３】
[33]  単数形の用語“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、単語“または”は、文脈が別途明確に示さない限り、“および”を含むことが意図されている（そして逆もまた同様である）。物質の濃度またはレベルに関して与えられている数値限定は、おおよそであることが意図されている。従って、濃度が少なくとも（例えば）１０μｇであると示されている場合、その濃度は、少なくともおおよそまたは約１０μｇであると理解されることが意図されている。
【００２４】
人工内部共生体
[34]  本発明の人工内部共生体は、真核細胞中で生存することができる細菌を含む。一態様において、人工内部共生体は、ある表現型を宿主細胞に導入する。一態様において、人工内部共生体により導入されるこの表現型は、娘細胞において維持される。一態様において、宿主細胞は、その表現型を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間維持する。一態様において、人工内部共生体は、その表現型を宿主娘細胞において少なくとも１回の細胞分裂、または少なくとも２回の細胞分裂、または少なくとも３回の細胞分裂、または少なくとも４回の細胞分裂、または少なくとも５回の細胞分裂、または少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０回の細胞分裂を通して安定に維持することができる。別の態様において、人工内部共生体は、表現型を娘細胞において３〜５回の分裂、または５〜１０回の分裂、または１０〜１５回の分裂、または１５〜２０回の分裂において安定して維持することができる。
【００２５】
[35]  本発明の一態様において、人工内部共生体は、プロテオバクテリアである。本発明の一態様において、人工内部共生体は、α−プロテオバクテリアである。１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づく最新の分類学的スキームにおいて、α−プロテオバクテリアは、プロテオバクテリア門内のクラスとして認識されており、７つの主な亜群または目（カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ロドスピリラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、およびパルブルアーキュラ（Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａｌｅｓ））に細分される。（Gupta, R.S. Phylogenomics and signature proteins for the alpha Proteobacteria and its main groups. BMC Microbiology, 7:106 (2007)（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される））
[36]  α−プロテオバクテリア内の主な群の全てをカバーする多数のα−プロテオバクテリアゲノムが配列決定されており、α−プロテオバクテリア内の様々なより高次の分類群（例えば科、目等）の特有の特徴を有する遺伝子またはタンパク質の独特のセットを同定するために用いられることができる情報を提供している（同書）。
【００２６】
[37]  α−プロテオバクテリアの一例は、走磁性細菌（ＭＴＢ）である。ＭＴＢは、プロテオバクテリアおよびニトロスピラ（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ）門の異なる亜群に属する細菌の多様な群であり、大部分はα−プロテオバクテリア内で表される。ＭＴＢは、グラム陰性細胞壁構造（内膜、周辺質、および外膜）を有する。それらは、垂直方向の化学濃度勾配を有する水域または沈殿物に生息しており、主に有酸素−無酸素界面において見付かり、従って微好気性、嫌気性、もしくは通性好気性またはその３つのある組み合わせとして分類される。全てのＭＴＢは化学有機従属栄養性であるが、一部の海洋性株は化学地下独立栄養性に（ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ）増殖することもできる(Bazylinski et al., 2004; Williams et al., 2006)。全てのＭＴＢは、リン脂質二重膜により包まれた磁鉄結晶を含む細胞内構造であるマグネトソームを含有する(Gorby et al., 1988)。
【００２７】
[38]  多数のＭＴＢ種が、１９７５年におけるBlakemoreによるそれらの最初の発見（Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science 24: 377-379 (1975)（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される））以来、当業者に知られており、微生物の１つの群に相当する（Faivre, D. & Schueler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemistry Reviews 108: 4875-4898 (2008)（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される））。ＭＴＢは、プロテオバクテリアおよびニトロスピラ門の異なる亜群において同定されており、系統型のほとんどはα−プロテオバクテリアの一員となっている。現在、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列類似性によりα−プロテオバクテリアとして割り当てられた培養可能なＭＴＢ株は、１９７５年にBlakemoreにより最初に分離された株、マグネトスピリラム・マグネトタクチウム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｕｍ）（以前はアクアスピリラム・マグネトタクチウム（Ａｑｕａｓｐｒｉｌｌｉｕｍ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｕｍ））、Ｍ．グリフィスワルデンス（Ｍ．ｇｒｙｐｈｉｓｗａｌｄｅｎｓｅ）、Ｍ．マグネティカム（Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）ＡＭＢ−１株、Ｍ．ポリモルファム（Ｍ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ）、マグネトスピリラム属の種ＭＳＭ−４およびＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス（Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）、海洋性ビブリオ株ＭＶ−１およびＭＶ−２、海洋性スピリルム株ＭＭＳ−１ならびにマグネトコッカス属の種ＭＣ−１株ならびに他の株を含む。
【００２８】
[39]  人工内部共生体として有用な他の単細胞生物は、例えば以下のものを含む：アナベナ、ネンジュモ属、ジアゾ栄養生物、シアノバクテリア、トリコデスミウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、ベイジェリンキア属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、緑色硫黄細菌、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、根粒バクテリア、フランキア属（Ｆｒａｎｋｉａ）、フラボバクテリウム属（ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）の好気性好塩性古細菌、ハロアナエロビウム目（Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ）（フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の低Ｇ＋Ｃブランド）の発酵性嫌気性菌、赤色好気性サリニバクター属（Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ）（バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の分枝）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、ハロモナス属（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、デルマコッカス属（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、コクリア属（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ミクロモノスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ウィラムジア属（Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ）、ツカムレラ属（Ｔｓｋａｍｕｒｅｌｌａ）、アルテロモナス属（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、コルウェリア属（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）、グラシエコーラ属（Ｇｌａｃｉｅｃｏｌａ）、シュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ポラリバクター属（Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター属（Ａｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、フリゴリバクテリウム属（Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サブタコーラ属（Ｓｕｂｔｅｒｃｏｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｃｕ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レシチナーゼ陽性クロストリジウム属、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、クロマチウム科（Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ）、クロロビウム科（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｃｅａｅ）、ロドスピリラム科（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、チオバシリ属（ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｉ）、ニトロソモナス属（ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ニトロバクター属（ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）（例えばシネココッカス・エロンガトゥス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ））、メタン生成菌、酢酸生成菌、硫酸還元菌、および乳酸菌。
【００２９】
[40]  例えば以下のものを含むいくつかのこれらの単細胞生物のゲノムが、配列決定済みであるかまたは配列決定中である：Ｍ．フリギドゥム（Ｍ．ｆｒｉｇｉｄｕｍ）、Ｍ．ブルトニ（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、Ｃ．シンビオサム（Ｃ．ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）、Ｃ．サイクレリスラエ（Ｃ．ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）、Ｐ．ハロプランクティス（Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、ハロバクテリウム・ラクスプロフンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、ビブリオ・サルモニシダ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、フォトバクテリウム・プロファンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）、Ｓ．ヴィオラセ（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅａ）、Ｓ．フリギディマリーナ（Ｓ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ）、サイクロバクター属の種２７３−４、Ｓ．ベンチカ（Ｓ．ｂｅｎｔｈｉｃａ）、シクロモナス属（Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ）の種ＣＮＰＴ３、モリテーラ属（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）の種、デスルフォタレア・サイクロフィラ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、エグジゴバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）２５５−１５、フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ）、サイクロフレクサス・トルクイズ（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓ）、ポラリバクター・フィラメンタス（Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）、Ｐ．イルジェンシー（Ｐ．ｉｒｇｅｎｓｉｉ）、レニバクテリウム・サルモニナルム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）、ライフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）関連ＰＨＳＣ２０−ｃ１、アシドチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ピクロフィルス・トリドゥス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）、スルフォロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、およびフェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）。
【００３０】
[41]  多くの細胞内病原体は、それらのゲノム中に、例えば細胞内病原体が標的真核細胞に付着して細胞内病原体の食作用を誘発することを可能にする接着因子をコードする病原性遺伝子を含有するゲノムアイランドを含む。（Juhas, M., van der Meer, J.R., Gaillard, M., Harding, R.M., Hood, D.W., Crook, D.W., Genomic islands: tools of bacterial horizontal gene transfer and evolution, FEMS Microbiol. Rev. 33:376-393 (2009)、それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される）。多くの病原性因子が、ＩＩＩ型またはＩＶ型分泌系を利用している。ある病原性因子は、真核宿主細胞中に分泌され、標的真核細胞内の膜輸送を変化させ、ある病原性因子は、アポトーシスに関わる宿主タンパク質と相互作用する。（Dubreuil, R. and Segev, N., Bringing host-cell takeover by pathogenic bacteria to center stage, Cell. Logis. 1:120-124 (2011)、それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される）。
【００３１】
[42]  一態様において、人工内部共生体は、細胞内病原体または細胞内内部共生体であることが既知である単細胞生物を除外する。
改変された人工内部共生体
[43]  一態様において、α−プロテオバクテリアは、人工内部共生体としてのそれらの機能を高めるように改変されている。人工内部共生体を遺伝子改変するための方法は、当該技術で周知である。一態様において、改変は、人工内部共生体においてプロモーターもしくはリボソーム結合配列を変化させることによって、または特定の遺伝子を削除もしくはサイレンシングすることによって、タンパク質またはＲＮＡの産生を増大または減少させることを含み得る。一態様において、改変は、結果として人工内部共生体に関する所望の特性をもたらす人工内部共生体中のポリペプチドを変化させる変異を含む。例えば、人工内部共生体の所望の特性は、栄養素、因子、補因子または他の分子の宿主細胞への依存であることができるであろう。一態様において、所望の特性は、人工内部共生体が宿主細胞により必要とされる栄養素、因子、補因子または他の分子を作ることを可能にする。ある態様において、所望の特性は、宿主細胞においてある表現型を作り出し、一方で他の態様において、所望の特性は、宿主細胞において表現型を作り出さない。
【００３２】
[44]  一態様において、人工内部共生体の鞭毛タンパク質は、鞭毛タンパク質がもはや発現されないように改変されている。一態様において、単細胞生物は、それがもはや必須分子を合成できないように改変され、それは好ましくは真核宿主細胞により提供される。一態様において、単細胞生物は、単細胞生物のコピー数が娘細胞に表現型を与えるために十分なレベルで維持され得るようにその細胞周期が真核宿主細胞の細胞周期と同調するように、遺伝子改変されている。
【００３３】
[45]  分子生物学のツールが、ＭＴＢの、最も広範にはＡＭＢ−１およびＭ．グリフィスワルデンスＭＳＲ−１株における遺伝子操作のために開発されてきた（Magnetoreception and Magnetosomes in Bacteria, ニューヨーク, Springer, 2007におけるJogler, C. and Schtiler, D.（p 134-138）において総説されている（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される））。２つの他のマグネトスピリラム株およびマグネトコッカス属の種のＭＣ−１株のゲノムも、最近配列決定された。一態様において、これらの株または現在培養可能もしくは培養不能、配列決定済みもしくは配列未決定、既知もしくは未知の他のＭＴＢ株からの遺伝子が、本発明において用いられることができる。
【００３４】
[46]  一態様において、本発明の人工内部共生体は、いくつかのグラム陽性病原体において見付かったコレステロース依存性細胞容解素（ＣＤＣ）、例えばリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）において見付かったコレステロース依存性細胞容解素（リステリオリシンＯまたはＬＬＯ）を用いて改変される。一態様において、ＬＬＯは、組み換え的に生成される。一態様において、ＬＬＯは、人工内部共生体に、ＬＬＯが人工内部共生体をコートするように添加される。一態様において、人工内部共生体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、または５．０μＭのＬＬＯと混合される。ＬＬＯは、０．１〜５．０μＭ、または０．１〜１．０μＭ、１．０〜５．０μＭ、または１．０〜２．０μＭの濃度範囲であることができる。一態様において、人工内部共生体は、ＭＴＢであり、ＭＴＢは、ＬＬＯでコートされる。一態様において、人工内部共生体は、例えばウシ血清アルブミンのような適切な血清アルブミン、または他の適切なキャリヤータンパク質でコートされる。血清アルブミンまたは他のキャリヤータンパク質によるコーティング後、ＬＬＯが、人工内部共生体上にコートされる。一態様において、血清アルブミンまたは他のキャリヤータンパク質は、宿主細胞と同じ種からのものである。
【００３５】
[47]  一態様において、人工内部共生体は、ＬＬＯを組み換え的に発現するように改変されている。一態様において、人工内部共生体は、ＬＬＯを組み換え的に発現し、分泌するように改変されている。一態様において、ＭＴＢは、ＬＬＯを組み換え的に発現するように改変されている。一態様において、ＭＴＢは、ＬＬＯを組み換え的に発現し、分泌するように改変されている。
【００３６】
[48]  一態様において、人工内部共生体は、宿主細胞中のリソソームのｐＨを上げる薬剤と混合される。一態様において、薬剤は、例えばバフィロマイシン、モネンシン、ニゲリシン、アマンタジン、クロロキン、メチルアミン、または塩化アンモニウムである。一態様において、薬剤は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０μＭの濃度で用いられる。薬剤は、０．１〜１０．０μＭ、または０．１〜１．０μＭ、または１．０〜１０．０μＭ、または１．０〜５．０μＭの範囲で用いられることができる。一態様において、メチルアミン、塩化アンモニウムまたは他のそのような薬剤は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０．０ｍＭの濃度で用いられる。そのような薬剤は、０．１〜１０ｍＭ、０．１〜１．０ｍＭ、または１．０〜１０．０ｍＭ、または１．０〜５．０ｍＭの濃度範囲で用いられることができる。
【００３７】
核酸
[49]  本発明の核酸は、発現ベクター、例えばプラスミド、またはウイルスベクター、または線状ベクター、または染色体ＤＮＡ中に組み込まれるベクターを含むことができる。発現ベクターは、ベクターが１以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含有することができる。そのような配列は、様々な細胞に関して周知である。プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２(Kovach et al., 1995, Gene 166:175-176, それは全ての目的のためにそのまま参照により本明細書に援用される)からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に関して適切である。真核宿主細胞、例えば哺乳類細胞において、発現ベクターは、宿主細胞の染色体中に組み込まれることができ、そこでその発現ベクターは宿主の染色体と共に複製する。同様に、発現ベクターは、原核細胞の染色体中に組み込まれることができ、そこでそのベクターは染色体と共に複製する。
【００３８】
[50]  発現ベクターは、一般に、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子も含有する。選択マーカーは、本発明の宿主細胞を含め、原核および真核細胞に関して当該技術で周知である。この遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、その培地中で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求の欠損を補う、または（ｃ）複合培地から入手可能ではない重要な栄養素を補うタンパク質をコードしている（例えばバシラス属に関するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬物を利用する。異種遺伝子によりうまく形質転換されている細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生し、そうして選択計画を生存する。細菌または（哺乳類を含む）真核系における使用のための他の選択マーカーは、当該技術で周知である。ある態様において、選択マーカーは、人工内部共生体により分泌される、または人工内部共生体により宿主細胞中に分泌される核酸によりコードされるタンパク質である。
【００３９】
[51]  異種ポリペプチドを生成するための発現ベクターは、宿主のＲＮＡポリメラーゼにより認識され、標的タンパク質をコードする核酸に作動的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されている誘導性プロモーターも含有することができる。適切なエンハンサー、イントロン、および他の制御配列を伴う誘導性または構成的プロモーター（または制御領域）は、当該技術で周知である。
【００４０】
[52]  ある態様において、ポリペプチドを改変することが望ましい可能性がある。当業者は、所与の核酸コンストラクトにおいて変更を生成する多くの方法を認識しているであろう。そのような周知の方法は、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅、その核酸を含有する細胞の突然変異誘発剤または放射線への曝露、（例えば大きい核酸を生成するためのライゲーションおよび／またはクローニングと合わせての）所望のオリゴヌクレオチドの化学合成、ならびに他の周知の技法を含む。例えば、Giliman and Smith, 1979, Gene 8:81-97、Roberts et al., 1987, Nature 328: 731-734を参照（その両方が、全ての目的のためにそのまま参照により援用される）。
【００４１】
[53]  ある態様において、本発明のポリペプチドをコードする組み換え核酸は、個々の細胞に関する好ましいコドンを提供するように改変されており、それは、選択された細胞におけるその核酸の翻訳を増進する。
【００４２】
[54]  本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドと実質的に均等であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含む。本発明に従うポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらにもっと典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有することができる。本発明は、上記で列挙されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらにもっと典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補配列も提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）またはＲＮＡであることができる。そのようなポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは、当業者には周知であり、例えば所望の配列同一性のポリヌクレオチドをルーチン的に単離することができるハイブリダイゼーション条件を決定するための方法を含むことができる。
【００４３】
[55]  本発明に従うタンパク質類似体をコードする核酸（すなわち、ここで１個以上のアミノ酸が、野生型ポリペプチドと異なるように設計されている）は、部位特異的変異誘発またはプライマー（単数または複数）が所望の点変異を有するＰＣＲ増幅を用いて生成されることができる。適切な変異誘発技法の詳細な記載に関して、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバーおよび／またはAusubel et al., 編者, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, ニューヨークを参照。１９８９年にAngew. Chem. Intl. Ed., 28巻, 716-734ページにおいてEngelsらにより記載された方法（その全てが全ての目的のためにそのまま参照により援用される）を用いる化学合成も、そのような核酸を調製するために用いられることができる。
【００４４】
[56]  “組み換えバリアント”は、組み換えＤＮＡ技法を用いて作製されたアミノ酸挿入、欠失、および置換により天然存在ポリペプチドと異なるあらゆるポリペプチドを指す。どのアミノ酸残基が、対象の活性、例えば酵素活性または結合活性を消失させることなく置き換えられる、付加される、または削除されることができるかの決定における手引きは、特定のポリペプチドの配列を相同性ペプチドの配列と比較し、高い相同性の領域においてなされるアミノ酸配列変化の数を最小限にすることにより、見出されることができる。
【００４５】
[57]  好ましくは、アミノ酸“置換”は、あるアミノ酸の類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸での置き換え、すなわち保存的なアミノ酸の置き換えの結果である。アミノ酸置換は、関わる残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされることができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み；極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み；正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００４６】
[58]  “挿入”または“欠失”は、典型的には約１〜５アミノ酸の範囲である。許容されるバリエーションは、組み換えＤＮＡ技法を用いてポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に作製し、結果として得られた組み換えバリアントを活性に関してアッセイすることにより、実験的に決定されることができる。
【００４７】
[59]  あるいは、機能の変化が所望される場合、変化したポリペプチドまたはキメラポリペプチドを生成するために、挿入、欠失または非保存的変化が、設計されることができる。例えば、そのような変化は、本発明のポリペプチドの生物学的機能または生化学的特徴の１以上を変化させることができる。例えば、そのような変化は、ポリペプチドの特徴、例えばリガンド結合親和性または分解／代謝回転速度を変化させることができる。さらに、そのような変化は、発現に関して選択された宿主細胞における発現、スケールアップ等により適しているポリペプチドを生成するように選択されることができる。
【００４８】
[60]  あるいは、これらの同じまたは類似のポリペプチドをコードしている組み換えバリアントは、遺伝子コードにおける“冗長性”を利用することにより合成または選択されることができる。様々なコドン置換、例えば様々な制限部位を生成するサイレント変化が、プラスミドもしくはウイルスベクター中へのクローニングまたは個々の原核もしくは真核系における発現を最適化するために導入されることができる。ポリヌクレオチド配列における変異は、ポリペプチドまたはポリペプチドに付加される他のペプチドのドメインにおいて反映されて、ポリペプチドのあらゆる部分の特性を改変し、特徴、例えばリガンド結合親和性または分解／代謝回転速度を変化させ得る。
【００４９】
[61]  好ましい方法において、新規の核酸をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異誘発により変化させられる。この方法は、所望のアミノ酸バリアントのポリヌクレオチド配列ならびに変化させるヌクレオチド（単数または複数）の両側で安定な二本鎖を形成するための変化させるアミノ酸の両側における十分な隣接するヌクレオチド（単数または複数）をコードするオリゴヌクレオチド配列を用いる。一般に、部位特異的変異誘発の技法は、当業者には周知であり、この技法は、刊行物、例えばEdelman et al., 1983, DNA 2:183（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される）により例示される。ポリヌクレオチド配列において部位特異的変化をもたらすための多用途かつ効率的な方法が、Zoller and Smith, 1982, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500により公開された（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される）。
【００５０】
[62]  ＰＣＲも、新規の核酸のアミノ酸配列バリアントを作り出すために用いられることができる。少量の鋳型ＤＮＡが出発物質として用いられる場合、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域と配列がわずかに異なるプライマー（単数または複数）が、所望のアミノ酸バリアントを生成することができる。ＰＣＲ増幅は、結果として標的をコードするポリヌクレオチド鋳型とプライマーにより指定される位置において異なる生成物ＤＮＡ断片の集団をもたらす。その生成物ＤＮＡ断片は、プラスミドにおける対応する領域を置き換え、これが所望のアミノ酸バリアントを与える。
【００５１】
[63]  アミノ酸バリアントを生成するためのさらなる技法は、Wells et al., 1985, Gene 34:315（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される）において記載されているカセット変異誘発技法；ならびに、例えばSambrook et al.（上記）およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される）における技法のような当該技術で周知の他の変異誘発技法である。
【００５２】
宿主細胞
[64]  本発明は、人工内部共生体を含有する真核宿主細胞を提供し、ここで、人工内部共生体は、宿主細胞にある表現型を与える。一態様において、人工内部共生体は、遺伝性である。
【００５３】
[65]  ある態様において、本発明の宿主細胞は、動物細胞である。ある態様において、宿主細胞は、哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヒト、ブタ、ウシ、またはイヌの細胞である。マウスは、他の哺乳類に関する、最も詳細にはヒトに関するモデルとしてルーチン的に機能する。（例えば、Hanna, J., Wernig, M., Markoulaki, S., Sun, C., Meissner, A., Cassady, J.P., Beard, C., Brambrink, T., Wu, L., Townes, T.M., Jaenisch, R. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 318: 1920-1923 (2007); Holtzman, D.M., Bales, K.R., Wu, S., Bhat, P., Parsadanian, M., Fagan, A., Chang, L.K., Sun, Y., Paul, S.M. Expression of human apolipoprotein E reduces amyloid-β deposition in a mouse model of Alzheimer’s disease. J. Clin. Invest. 103(6): R15-R21 (1999); Warren, R.S., Yuan, H., Matli, M.R., Gillett, N.A., Ferrara, N. Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis. J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995)を参照（これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される））。動物細胞は、例えば線維芽細胞、上皮細胞（腎臓、乳房、前立腺、肺）、角化細胞、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、および造血細胞を含む。
【００５４】
[66]  ある態様において、宿主細胞は、ヒト癌細胞を含む癌細胞である。以下の細胞株を含む、当業者に周知である多くの癌細胞株が存在する：一般的な上皮腫瘍細胞株、例えばＣｏｃｏ−２、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＣＦ７、非上皮性腫瘍細胞株、例えばＨＴ−１０８０およびＨＬ６０、ならびにＮＣＩ６０細胞株パネル（例えば、Shoemaker, R., The NCI60 human tumor cell line anticancer drug screen. Nature Reviews Cancer 6, 813-823 (2006)を参照（それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される））。加えて、当業者は、原発腫瘍からの癌細胞の獲得に精通している。癌細胞は、例えば固形腫瘍細胞型、造血性癌細胞、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、ならびに特定の組織に関連する癌、例えば前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、メラノーマ、神経膠芽腫、肝臓癌、および癌細胞株のＮＣＩ６０パネルにおける癌細胞のタイプも含む。
【００５５】
[67]  他の態様において、宿主細胞は、幹細胞である。当業者は、例えば胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮神経堤幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、嗅覚成体幹細胞、精巣細胞、および前駆細胞（例えば神経前駆細胞、血管芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、膵前駆細胞、上皮前駆細胞）を含む様々な幹細胞型に精通している。
【００５６】
[68]  一態様において、宿主細胞は、ヒトを含む哺乳類の循環系において見られる細胞である。例えば、赤血球、血小板、形質細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞等、および同じものの前駆細胞。群として、これらの細胞は、本発明の循環性宿主細胞であると定義される。本発明は、これらの循環性細胞のいずれと共に用いられることもできる。一態様において、宿主細胞は、Ｔ細胞である。別の態様において、宿主細胞は、Ｂ細胞である。一態様において、宿主細胞は、好中球である。一態様において、宿主細胞は、巨核球である。
【００５７】
[69]  一態様において、宿主細胞は、植物細胞である。ある態様において、宿主細胞は、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、コメ、ダイズ、ピーナッツ、エンドウマメ、レンズマメおよびムラサキウマゴヤシ、綿、ナタネ、キャノーラ、コショウ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ナス、ユーカリ、樹木、観賞植物、多年生牧草、または飼料作物を含むがそれらに限定されない単子葉または双子葉植物の細胞である。他の態様において、宿主細胞は、クロレラ属、クラミドモナス属、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、またはプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の藻類を含むがそれらに限定されない藻類細胞である。ある態様において、宿主細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の真菌を含むがそれらに限定されない真菌細胞である。
【００５８】
[70]  別の態様において、宿主細胞からの少なくとも１個の遺伝子は、遺伝学的に変化している。ある態様において、相互栄養依存（バイオトロフィー（ｂｉｏｔｒｏｐｈｙ））が、当業者に既知の標的宿主細胞型に特異的な適切な分子生物学の技法を用いた、宿主細胞のある必須高分子に関する人工内部共生体への依存を作り出し、そうしてバイオトロフィーに関する環境圧を確立する宿主細胞の遺伝子改変により、人工内部共生体および宿主細胞の間で確立されることができる。別の態様において、人工内部共生体に関する宿主細胞への栄養依存が、宿主細胞を遺伝学的に変化させて宿主細胞の様々な代謝産物、補因子、ビタミン類、ヌクレオチド、または他の必須分子を合成する能力を排除することにより、確立されることができる。そのような態様において、必須分子は、人工内部共生体により提供されることができる。別の態様において、アミノ酸産生に関する３−ホスホグリセリン酸生合成経路の末端においてセリンをグリシンに変換する酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする宿主細胞遺伝子が、改変されることができる。
【００５９】
人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するためのシステム
[71]  本発明のシステムは、人工内部共生体が宿主細胞中に導入されることを可能にする。一態様において、本発明のシステムは、人工内部共生体、宿主細胞、人工内部共生体を宿主細胞中に導入するための手段、および人工内部共生体を有する宿主細胞を富化するための手段を含む。一態様において、本発明のシステムは、人工内部共生体、宿主細胞、人工内部共生体を宿主細胞中に導入するための手段、および人工内部共生体を含有する宿主細胞を検出するための手段を含む。
【００６０】
[72]  人工内部共生体を導入するための手段は、人工内部共生体の宿主細胞中への導入を補助するための手段を含む。導入するための手段の例は、導入を補助するための磁気手段、導入を補助するための加速手段、導入を補助するための電場手段、導入を補助するための注入手段、導入を補助するためのリガンド−受容体手段、導入を補助するための濃縮手段、導入のための化学的手段、導入のための食胞脱出手段、および導入を補助するための膜融合手段を含む。導入のためのある手段は、これらのカテゴリーの１つより多くに入り得る。
【００６１】
[73]  一態様において、本発明の磁気手段は、磁石である。一態様において、磁石は、永久磁石または電磁石であることができる。一態様において、磁石または複数の磁石は、容器と共に用いられるのに適合している。一態様において、容器は、マイクロタイターディッシュ、ペトリ皿、細胞培養ディッシュ、細胞培養フラスコまたは当業者に既知の他の装置であることができる。一態様において、マイクロタイターディッシュは、６、２４、４８、９６、３８４、１５３６、３４５６、または９６００個のウェル（または容器）を有する。一態様において、マイクロタイターディッシュは、あらゆる商業的に入手可能な形式を含む。一態様において、磁気手段は、１つのマイクロタイタープレートに合うように設計されており、またはそれは、複数のマイクロタイタープレートに合うように設計されている。この態様において、磁気手段は、個々のウェルでの使用に大きさを合わせて作製された、または個々のプレートもしくは複数のプレートに大きさを合わせて作製された、またはプレート中のある量のウェルに大きさを合わせて作製された単一の磁石であることができ、またはそのように作製された複数の磁石であることもできる。一態様において、磁気手段は、試験管または他の容器と共に使用するのに適合している。この態様において、試験管は、微量遠心チューブ、ガラス、Ｐｙｒｅｘ、プラスチックまたは他の試験管を含むあらゆる商業的に入手可能なチューブを含む。この態様において、磁気手段は、単一のチューブまたは複数のチューブと共に使用するために適合していることができる。複数のチューブが用いられる場合、チューブは、ラック中に保持されており、磁気手段は、そのラックと適合可能であるように設計されるであろう。一態様において、容器は、適用に適した体積の液体を保持する。一態様において、容器は、少なくとも０．１ｍｌ、少なくとも０．５ｍｌ、少なくとも１．０ｍｌ、少なくとも２．０ｍｌ、少なくとも５．０ｍｌ、少なくとも１０．０ｍｌ、少なくとも２５．０ｍｌ、少なくとも４０ｍｌ、少なくとも５０．０ｍｌ、少なくとも１００ｍｌ、もしくは少なくとも１０００ｍｌ、または２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０リットル、または２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００リットル、または２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００リットル、または２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００もしくは１０，０００リットル、または２０，０００、３０，０００、４０，０００もしくは５０，０００リットルを保持する。この態様において、磁気手段は、容器と適合可能であるように設計されるであろう。この態様において、磁気手段は１個または複数の磁石である。
【００６２】
[74]  一態様において、磁気手段は、容器中に高磁場勾配を作り出す。一態様において、磁気手段は、個々の容器（例えばマイクロタイターディッシュの単一のウェル）にわたる類似の磁場強度および容器にわたって垂直方向に動く高い勾配を提供する。一態様において、磁気手段は、システム中のそれぞれの容器にわたって、例えばマイクロタイターディッシュもしくはマルチウェル培養プレートのそれぞれのウェルまたはシステム中のそれぞれのチューブにわたって類似の磁場強度および勾配を提供する。一態様において、磁気手段は、システム中のそれぞれのプレートにわたって均一な磁場強度を提供する。
【００６３】
[75]  一態様において、磁気手段は、以下の特性を有する：（１）大きい場の強度および勾配、（２）システム中のそれぞれの個々の容器にわたる類似の場の強度および勾配、ならびに（３）システムのそれぞれの容器にわたる類似の場の強度および勾配。一態様において、磁気手段は、磁気手段のアレイである。一態様において、磁気手段の周期性は、容器のアレイにおけるウェルの周期性と一致している。一態様において、磁気手段は、容器の縁をわずかに越えて伸びているＮｄＦｅＢ永久磁石または電磁石である。一態様において、ＮｄＦｅＢ永久磁石は、層を有し、ここで、その層の少なくとも一部は、他の層と比較して低減した面積を有する。一態様において、ＮｄＦｅＢ永久磁石の一番上の層は、最大であり、それぞれのそれに続く層は、その上の層と比較して低減した面積を有する。一態様において、ＮｄＦｅＢ永久磁石のそれぞれの層は、その他の層と同じ厚さを有する。一態様において、ＮｄＦｅＢ永久磁石の層の少なくとも一部は、異なる厚さを有する。
【００６４】
[76]  一態様において、磁気手段は０．０１〜１テスラの磁場強度を生成する。一態様において、磁気手段は、０〜１００Ｈｚの振動磁場を生成し、一態様において、磁気手段は、低周波数（約２Ｈｚ）および小さい振幅（約０．５〜３ｍｍ）の磁石振動を有する磁場を生成する。一態様において、磁気手段は、例えばＮａｎｏＴｈｅｒｉｃｓ  Ｌｔｄ．の振動磁場を生成するための製品を用いて振動磁場を生成する。振動磁場は、例えば電磁石における電流を変動させることにより、または永久磁石を機械的に振動させることにより作り出されることもできる。
【００６５】
[77]  一態様において、磁性細菌の密度は、磁性細菌の真核宿主細胞に向かう動きが増大するように増大する。この態様において、磁性細菌は、磁場と集団的に相互作用してより高い流速をもたらす。磁性細菌が密に群がる（ｐａｃｋｅｄ）場合、その群は、単一の磁性細菌により経験される磁力の何倍もの磁力を見るであろう。
【００６６】
[78]  一態様において、システムは、使用者および他の設備／デバイスを磁気手段の磁場から保護するための磁気シールド材料を含む。そのような磁気シールド材料は、例えばＧｉｒｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｈｉｅｌｄｉｎｇ薄膜、ＭｕＭｅｔａｌ（登録商標）、Ｃｏ−Ｎｅｔｉｃ（登録商標）、Ｎｅｔｉｃ（登録商標）、ＭａｇｎｅｔＳｈｉｅｌｄ、ＰａｐｅｒＳｈｉｅｌｄ、ならびに当該技術で周知の、および／または商業的に入手可能な他の材料を含む。一態様において、磁気シールド材料は、本発明のシステムに接する設備／デバイスがシステム中の磁気手段の磁場から保護されるように配置される。一態様において、ＮｄＦｅＢ永久磁石は円筒形である。一態様において、ＮｄＦｅＢ永久磁石の層は円筒形である。
【００６７】
[79]  一態様において、導入を補助するための加速手段は、遠心分離または人工内部共生体を加速するための他の手段である。一態様において、磁石または磁気手段が、人工内部共生体を加速するために用いられることができる。この態様において、人工内部共生体は、磁性細菌であることができる。一態様において、電気穿孔法または磁場が、人工内部共生体を加速するために用いられる。(Potrykus, I. Gene transfer methods for plants and cell cultures. Ciba Found Symp 154, 198-208; discussion 208-112 (1990); Wolbank, S. et al. Labeling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank 8, 163-177 (2007) (これらの２つの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。一態様において、細胞内送達は、キャリヤー粒子を必要とせずに細胞または組織に加速された分子または細菌を当てる（ｂｏｍｂａｒｄｉｎｇ）ことにより達成されることができる。(Lian, W.N., Chang, C.H., Chen, Y.-J., Dao, R.-O., Luo Y.-C., Chien, J.-Y., Hsieh, S.-L., Lin, C.-H., Intracellular delivery can be achieved by bombarding cells or tissues with accelerated molecules or bacteria without the need for carrier particles, Experimental Cell Research 313(1): 53-64 (2007); Heng, B.C. & Cao, T. Immunoliposome-mediated delivery of neomycin phosphotransferase for the lineage-specific selection of differentiated/committed stem cell progenies: Potential advantages over transfection with marker genes, fluorescence-activated and magnetic affinity cell-sorting.  Med. Hypotheses 65(2): 334-336 (2005); Potrykus (1990) Ciba Found Symp, Vol. 1 54: 198 (これらの２つの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。
【００６８】
[80]  一態様において、電気穿孔法が、人工内部共生体の導入を補助するための電場手段として用いられる。(Potrykus, I. Gene transfer methods for plants and cell cultures. Ciba Found Symp 154, 198-208; discussion 208-112 (1990); Wolbank, S. et al. Labeling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank 8, 163-177 (2007) (これらの２つの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。
【００６９】
[81]  一態様において、注入手段が、人工内部共生体の宿主細胞中への導入を補助するために用いられる。一態様において、注入手段は、微量注入器である。様々な微量注入器、微量注入器システム、および微量注入技法が、当業者に周知である。微量注入は、利用可能な最も効率のよい移送技法である（本質的に１００％）(同書; Xi, Z. & Dobson, S. Characterization of Wolbachia transfection efficiency by using microinjection of embryonic cytoplasm and embryo homogenate. Appl. Environ. Microbiol. 71(6): 3199-3204 (2005); Goetz, M., Bubert, A., Wang, G., Chico-Calero, I., Vazquez-Boland, J.A., Beck, M., Slaghuis, J., Szalay, A. A., Goebel, W. Microinjection and growth of bacteria in the cytosol of mammalian host cells.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12221-12226 (2001); Microinjection and Organelle Transplantation Techniques: methods and applications, 編者J. E. Celis, A. Graessmann, およびA. Loyter, Academic Press (1986) (これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。
【００７０】
[82]  一態様において、リガンド−受容体手段が、人工内部共生体の宿主細胞中への導入を補助するために用いられる。一部の内部共生体、病原体、または寄生体は、細胞侵入に関するそれら自身の方法を有し、これらの天然のプロセスは、人工内部共生体の内部移行のために利用されることができ、それは結果としていわゆるシンビオソームの生成をもたらす。これらの天然のプロセスは、宿主細胞の受容体および細菌がそれらの表面上に発現するリガンドを必要とし得る。一態様において、人工内部共生体は、組み換えによりリガンドを細胞表面上に発現するように改変されており、改変された人工内部共生体は、宿主細胞にこの方法により侵入する。そのような人工内部共生体または寄生体リガンドの例は、リステリア・モノサイトゲネスからのＩｎｌＡおよびＩｎｌＢならびにエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）からのＰｌａを含む。(Mengaud J, Ohayon H, Gounon P, Mege RM, Cossart P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell 1996; 84:923-32. Braun L, Ghebrehiwet B, Cossart P. gC1q-R/p32, a C1q-binding protein, is a receptor for the InlB invasion protein of Listeria monocytogenes. EMBO J 2000; 19:1458-66. Shen Y, Naujokas M, Park M, Ireton K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell 2000; 103:501-10. Lahteenmaki K, Kukkonen M, Korhonen TK. The Pla surface protease/adhesin of Yersinia pestis mediates bacterial invasion into human endothelial cells. FEBS letters 2001; 504:69-72. Cowan C, Jones HA, Kaya YH, Perry RD, Straley SC. Invasion of epithelial cells by Yersinia pestis: evidence for a Y. pestis-specific invasin. Infection and Immunity 2000; 68:4523-30; Advances in Molecular and Cellular Microbiology, 編者 Richard J. Lamont, 2004, Intracellular Niches of Microbes: A Pathogens Guide Through the Host Cell, 編者Ulrich SchaibleおよびAlbert Haas, 2009, Wiley-VCH, Weinheim, pg. 712 (これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。当該技術で周知である他の侵入タンパク質および遺伝子も、本発明において人工内部共生体の宿主細胞中への導入を促進するために用いられることができる。例えば、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）は、人工内部共生体の宿主細胞の食胞からの放出を促進するために人工内部共生体中に入れて設計されることができる。一態様において、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）は、リステリア・モノサイトゲネス由来であり、または類似の溶解素タンパク質を有することが当該技術で周知の他の病原体に由来する。
【００７１】
[83]  細胞内細菌は、宿主細胞中で生存し、複製するための機序を進化させてきた。細胞内細菌は、食作用により宿主細胞に入ることができ、発生期の食胞はエンドサイトーシス経路へと向けられる。非病原体を有する食胞は、リソソーム区画と融合して結果として細菌の分解をもたらす経路を辿るであろう。病原体は、この運命を回避するための異なる戦略を開発してきた。シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア属、およびフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）を含むわずかな病原性細菌は、食胞から宿主細胞の細胞質ゾル中に脱出する。これらの病原体は、エンドサイトーシス経路および栄養素に乏しい空胞区画に居住する難題を回避する。特性付けられた細胞内病原体のほとんどは、膜結合区画内に留まり、この微小環境（ｎｉｃｈｅ）をそれらの生存および複製を促進するように改変する。これらの因子は、人工内部共生体の生存を助けるために人工内部共生体中で発現させることができる。
【００７２】
[84]  食胞からの脱出は、細菌に駆動されるプロセスであり、病原体は、食胞内部の特定の環境要因により誘発される脱出に関する共通の機序を共有している。細胞質ゾル性病原体は、食胞を脱出して細胞質ゾルに達するために分泌される酵素の産生に頼っている。これらは、リステリア・モノサイトゲネスによるリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）による３型分泌系作用因子ＩｐａＢ（へモリシン）の分泌、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）による未知の機能のタンパク質ＢＰＳＳ１５３９の分泌、リケッチア・プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）によるヘモリシンＣおよびホスホリパーゼ類の分泌、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）によるＩｇｌＣ、ＭｇｌＡおよびＦＴＴ１１０３を含む分泌される酵素を含む。
【００７３】
[85]  宿主細胞侵入のために細菌により分泌される他の細菌性因子は、インベイシン類（大部分は酵素）である。インベイシン類は、細菌の複製および拡散を促進し、細菌のごく近傍で局所的に作用する。インベイシン類の例は、ヒアルロニダーゼ（ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｉ））、コラゲナーゼ（クロストリジウム属）、ノイラミニダーゼ（ビブリオ属およびシゲラ属）、コアグラーゼ（スタフィロコッカス属）、ロイコシジン（スタフィロコッカス属）、ストレプトリシン（ストレプトコッカス属）、へモリシン類（クロストリジウム属）、レシチナーゼ類（クロストリジウム属）、ホスホリパーゼ類（クロストリジウム属）、炭疽菌ＥＦ（バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、百日咳ＡＳＣ（ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、およびインターナリン類（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｎｓ）（Ｌ．モノサイトゲネスのＩｎｌＡ、ＩｎｌＢ）を含む。
【００７４】
[86]  一態様において、改変された人工内部共生体は、その表面上にリガンドを発現し、それは宿主細胞受容体と相互作用して改変された人工内部共生体が内部移行することを可能にする。そのようなリガンドの例は、リステリア・モノサイトゲネスからのＩｎｌＡおよびＩｎｌＢならびにエルシニア・ペスティスからのＰｌａである。
【００７５】
[87]  一態様において、濃縮手段は、宿主細胞付近の人工内部共生体の局所濃度における増大をもたらす。一態様において、濃縮手段は、宿主細胞の局所濃度も増大させる。局所濃度を増大させるための手段の例は、フィルター、膜、真空ポンプ、他の乾燥デバイス、カラム、遠心分離機および磁石を含む。一態様において、宿主細胞および人工内部共生体を含有する体積は、流体がフィルターまたは膜を通過するにつれて低減し、そのフィルターまたは膜は、宿主細胞および人工内部共生体を保持するが、流体は通過させる。一態様において、宿主細胞および人工内部共生体を含有する体積は、真空装置および／または乾燥装置を用いた乾燥により低減する。
【００７６】
[88]  一態様において、膜融合手段が、人工内部共生体の宿主細胞中への導入を補助するために用いられる。一態様において、人工内部共生体は、リポソームに媒介されるプロセスにより宿主細胞に導入される。ミトコンドリアおよび葉緑体は、リポソーム中に封入された場合に効率的に真核細胞中に導入されている。(Bonnett, H. T. Planta 131, 229 (1976); Giles, K.; Vaughan, V.; Ranch, J.; Emery, J. Liposome-mediated uptake of chloroplasts by plant protoplasts. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 16(7) 581-584 (これらの２つの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。数多くのリポソーム融合プロトコルおよび薬剤が利用可能であり、過度の実験操作なく当業者により用いられることができる。(例えばBen-Haim, N., Broz, P., Marsch, S., Meier, W., Hunziker, P. Cell-specific integration of artificial organelles based on functionalized polymer vesicles. Nano Lett. 8(5): 1368-1373 (2008)を参照、それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される)。細胞内送達は、キャリヤー粒子を必要とせずに細胞または組織に加速された分子または細菌を当てることにより達成されることができる(Lian, W., Chang, C., Chen, Y., Dao, R., Luo, Y., Chien, J., Hsieh, S., Lin, C. Experimental Cell Research 313(1): 53-64 (2007); Heng, B.C. & Cao, T. Immunoliposome-mediated delivery of neomycin phosphotransferase for the lineage-specific selection of differentiated/committed stem cell progenies: Potential advantages over transfection with marker genes, fluorescence-activated and magnetic affinity cell-sorting. Med. Hypotheses 65(2): 334-336 (2005); Potrykus (1990) Ciba Found Symp, Vol. 1 54: 198 (これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。加えて、リポソームの取り込みは、インキュベーション条件の操作、リポソームの電荷のバリエーション、受容体の媒介、および磁気的増進により増進されることができる。(例えば、Pan et al. Int. J. Pharm. 358: 263 (2008); Sarbolouki, M.N. & Toliat, T. Storage stability of stabilized MLV and REV liposomes containing sodium methotrexate (aqueous & lyophilized). J. Pharm. Sci. Techno., 52(10): 23-27 (1998); Elorza, B., Elorza, M.A., Sainz, M.C., Chantres, J.R. Comparison of particle size and encapsulation parameters of three liposomal preparations. J. Microencapsul. 10(2): 237-248 (1993); Mykhaylyk, O., Sanchez-Antequera, Y., Vlaskou, D., Hammerschmid, E., Anton, M., Zelphati, O. and Plank, C. Liposomal Magnetofection. Methods Mol. Bio., 605: 487-525 (2010)を参照(これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。赤血球に媒介される移行は、リポソームの融合に類似しており、試験された全ての細胞型にわたって高い効率および有効性を有することが示されている(Microinjection and Organelle Transplantation Techniques; Celis et al. 編者; Academic Press: ニューヨーク, 1986 (それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。典型的には、赤血球は、浸透圧ショック法または電気穿孔法により装填される（ｌｏａｄｅｄ）(Schoen, P., Chonn, A., Cullis, P.R., Wilschut, J., and Schuerrer, P. Gene transfer mediated by fusion protein hemagglutinin reconstituted in cationic lipid vesicles. Gene Therapy 6: 823-832 (1999); Li, L.H., Hensen, M.L., Zhao, Y.L., Hui, S.W. Electrofusion between heterogeneous-sized mammalian cells in a pellet: potential applications in drug delivery and hybridoma formation.  Biophysical Journal 71:479-486 (1996); Carruthers, A., & Melchior, D.L. A rapid method of reconstituting human erythrocyte sugar transport proteins. Biochem. 23: 2712-2718 (1984) (これら��３つの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される)。あるいは、赤血球は、造血性前駆細胞に単細胞生物を装填し、それらを誘導して分化させ、拡張して単細胞生物を含有する赤血球にすることにより、間接的に装填されることができる。
【００７７】
[89]  一態様において、天然の手段が、人工内部共生体を宿主細胞中に導入するために用いられる。本発明の人工内部共生体は、宿主細胞中に、天然の食作用、誘導される食作用、マクロピノサイトーシス、他の細胞性取り込みプロセス等を含むがそれらに限定されない当業者に既知のいくつかの方法により導入されることができる。(Microinjection and Organelle Transplantation Techniques, Celis et al. 編者; Academic Press: ニューヨーク, 1986およびその中の参考文献を参照(全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。天然に貪食性の細胞は、ＭＴＢを含む細菌を取り込むことが示されている(Burdette, D.L., Seemann, J., Orth, K. Vibrio VopQ induces PI3-kinase independent autophagy and antagonizes phagocytosis. Molecular microbiology 73: 639 (2009); Wiedemann, A., Linder, S., Grassi, G., Albert, M., Autenrieth, I., Aepfelbacher, M. Yersinia enterocolitica invasin triggers phagocytosis via β1 integrins, CDC42Hs and WASp in macrophages. Cellular Microbiology 3: 693 (2001); Hackam, D.J., Rotstein, O.D., Schreiber, A., Zhang, W., Grinstein, S. Rhois required for the initiation of calcium signaling and phagocytosis by Fcγ receptors in macrophages. J. of Exp. Med. 186(6): 955-966 (1997); Matsunaga, T., Hashimoto, K., Nakamura, N., Nakamura, K., Hashimoto, S. Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes. Applied Microbiology and Biotechnology 31(4): 401-405 (1989) (これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。
【００７８】
[90]  一態様において、化学的手段が、人工内部共生体の宿主細胞中への導入を補助するために用いられる。一態様において、宿主細胞は、宿主細胞が人工内部共生体を獲得する増大した能力を有するように、化学物質で処理される。一態様において、人工内部共生体は、人工内部共生体が宿主細胞中に導入される増大した能力を有するように、化学物質（単数または複数）で処理される。一態様において、宿主細胞および人工内部共生体の両方が、化学物質（単数または複数）で処理される。最近の研究は、非貪食性の細胞型が、様々な因子：培地および化学的因子、生物学的因子（例えばバキュロウイルス、タンパク質因子、遺伝子ノックイン等）と共培養された際に細菌をエンドサイトーシスで取り込む（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅ）ように誘導され得ることを示している(例えば、Salminen, M., Airenne, K.J., Rinnankoski, R., Reimari, J., Valilehto, O., Rinne, J., Suikkanen, S., Kukkonen, S., Yla-Herttuala, S., Kulomaa, M.S., Vihinen-Ranta, M. Improvement in nuclear entry and transgene expression of baculoviruses by disintegration of microtubules in human hepatocytes. J. Virol. 79(5): 2720-2728 (2005); Modalsli, K.R., Mikalsen, S., Bukholm, G., Degre, M. Microinjection of HEp-2 cells with coxsackie B1 virus RNA enhances invasiveness of Shigella flexneri only after prestimulation with UV-inactivated virus. APMIS 101: 602-606 (1993); Hayward, R.D. & Koronakis, V. Direct nucleation and bundling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella. The EMBO Journal 18: 4926-4934 (1999); Yoshida, S., Katayama, E., Kuwae, A., Mimuro, H., Suzuki, T., Sasakawa, C. Shigella deliver an effector protein to trigger host microtubule destabilization, which promotes Rac1 activity and efficient bacterial internalization. The EMBO Journal 21: 2923-2935 (2002); Bigildeev et al. J. Exp Hematol., 39: 187 (2011); Finlay, B.B. & Falkow, S. Common themes in microbial pathogenicity revisited. Microbiol. and Mol. Biol. Rev. 61: 136-169 (1997)を参照(これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。
【００７９】
[91]  一態様において、化学的穿孔法が、人工内部共生体の導入を補助するために用いられる。一態様において、宿主の細胞膜は、透過処理剤で処理される。一態様において、透過処理剤は、例えば界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）、ジギトニン、孔形成性ポリペプチド（例えばストレプトリシンＯ）、サポニン、および宿主細胞膜を透過性にすることが当該技術で周知の他の薬剤から選択される。一態様において、低張溶液が、化学的穿孔法において流体および人工内部共生体の宿主細胞中への流入を誘導するために用いられる。一態様において、低張条件が、人工内部共生体の宿主細胞中への導入を補助するために、細胞透過処理剤と組み合わせられる。そのような化学的穿孔法を記載している参考文献は、例えばMedepalli, K., Alphenaar, B.W., Keynton, R.S., Sethu, P., A new technique for reversible permeabilization of live cells for intracellular delivery of quantum dots, Nanotechnol. 24:205101 (2013); Hapala, I., Breaking the barrier: methods for reversible permeabilization of cellular membranes, Crit. Rev. Biotechnol. 17:105-122 (1997); Miyamoto, K., Yamashita, T., Tsukiyama, T., Kitamura, N., Minami, N., Yamada, M., Imai, H., Reversible membrane permeabilization of mammalian cells treated with digitonin and its use for inducing nuclear reprogramming by Xenopus egg extracts, Cloning Stem Cells 10:535-542 (2008); Johnson, J.A., Gray, M.A., Karliner, J.S., Chen, C-H., Mochly-Rosen, D., An improved permeabilization protocol for introduction of peptides into cardiac myocytes: application to protein Kinase C research, Circ. Res. 79:1086-1099 (1996)を含み、これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される。
【００８０】
[92]  一態様において、天然の手段は、マクロピノサイトーシスまたは“細胞飲作用”も含み、それは、数多くの細菌およびウイルスが細胞内侵入のために用いている方法である(分子画像化および造影剤データベース（ＭＩＣＡＤ）[オンラインのデータベース]中のZhang (2004);ベセスダ(メリーランド州):国立医学図書館(米国)、NCBI; 2004-2011 (これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。細菌を取り込むように細胞を誘導するために用いられることができる様々なプロトコルが存在する。いくつかの薬剤、例えば核酸、タンパク質、薬物および細胞小器官が、リポソーム中に封入され、細胞に送達されている(Ben-Haim, N., Broz, P., Marsch, S., Meier, W., Hunziker, P. Cell-specific integration of artificial organelles based on functionalized polymer vesicles. Nano Lett. 8(5): 1368-1373 (2008); Lian, W., Chang, C., Chen, Y., Dao, R., Luo, Y., Chien, J., Hsieh, S., Lin, C. (これらの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。
【００８１】
[93]  一態様において、人工内部共生体を有する宿主細胞を富化するための手段は、選択剤、選択培地、人工内部共生体により導入された表現型を用いて宿主細胞を検出および選別するデバイス（例えば細胞選別機）、人工内部共生体により宿主細胞に与えられた表現型に基づいて宿主細胞を分離するクロマトグラフィーカラム等であることができる。一態様において、選択剤は、抗生物質または人工内部共生体もしくは宿主細胞に毒性もしくは阻害性である他の薬剤であることができる。人工内部共生体に毒性または阻害性である選択剤は、その薬剤に曝露した人工内部共生体を殺すかまたは阻害すると考えられ、宿主細胞により取り込まれている人工内部共生体は、宿主細胞によりその薬剤から保護されることができる。宿主細胞に毒性または阻害性である選択剤は、人工内部共生体（または改変された人工内部共生体）により解毒されることができ、従って人工内部共生体を含有する宿主細胞は、その選択剤に耐性であることができる。一態様において、宿主細胞が成長するために必要であり、宿主細胞が作ることができない栄養素を欠いている選択培地が用いられる。この態様において、人工内部共生体（または改変された人工内部共生体）は、欠けている栄養素を宿主細胞に提供し、従って人工内部共生体を有する宿主細胞は、選択培地において成長することができる。
【００８２】
[94]  一態様において、人工内部共生体は、人工内部共生体を有する宿主細胞が人工内部共生体を欠く宿主細胞から分離されることを可能にする表現型を宿主細胞に与える。例えば、人工内部共生体が蛍光性タンパク質またはルシフェラーゼを含有する場合、それは、光を発する表現型を宿主細胞に与えることができる。この光を発する表現型は、発せられた光に基づいて検出および選別する細胞選別機を用いて人工内部共生体を有する宿主細胞を人工内部共生体を有しない宿主細胞から分離するために用いられることができる。代替の例において、人工内部共生体は、宿主細胞に磁性表現型を与える磁性細菌である。この磁性表現型は、様々な手段により人工内部共生体を有する宿主細胞を富化するために用いられることができる。例えば、人工内部共生体を有する宿主細胞の流動を遅らせるために磁場が用いられることができ、または人工内部共生体を有する宿主細胞を優先的に沈降させるために磁場が用いられることができ、または人工内部共生体を有する宿主細胞を優先的に保持するために磁場が用いられることができる。一態様において、宿主細胞に磁性表現型を与えた人工内部共生体を含有する宿主細胞を富化するために磁性カラムが用いられる。
【００８３】
[95]  一態様において、システムは、人工内部共生体を有する宿主細胞を検出するための手段を有する。一態様において、検出するための手段は、人工内部共生体により宿主細胞に与えられた表現型を検出するデバイスであることができる。人工内部共生体は、宿主細胞に新しい特性、例えば光学的特性（例えば光の放射）もしくは磁性特性を提供することができ、または人工内部共生体は、細胞の特性、例えば表面タンパク質の発現、大きさ、付着能力、表面電荷、重量、密度、形状、選択剤に対する耐性、特定の栄養素を代謝する能力等を変化させることができる。これらの新しい、または変化した宿主細胞の特性を検出するための手段は、当該技術で周知であり、例えば、人工内部共生体から発せられた光を検出することができる光学デバイス、または人工内部共生体からのマグネトソームの磁性特性を検出することができるデバイス、例えばＭＲＩシステム、磁気粒子画像化（ＭＰＩ）システム、磁気緩和スイッチング（ＭＲＳ）システム、磁気共鳴分光計、超伝導量子干渉デバイス（ＳＱＵＩＤ）、磁気計、核磁気共鳴（ＮＭＲ）システム、および電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）システム、およびメスバウアー分光計、磁気円二色性システム、蛍光活性化細胞選別機システム（ＦＡＣＳ）、および自動化された細胞計数器を含む。
【００８４】
[96]  一態様において、人工内部共生体の検出は、宿主細胞中に導入された人工内部共生体の効率、濃度、および／または量を測定するための品質管理（“ＱＣ”）および／または品質保証（“ＱＡ”）工程として行われる。一態様において、人工内部共生体は、磁性細菌であり、磁性細菌を有する宿主細胞の磁性特性が、宿主細胞中に導入された磁性細菌（人工内部共生体）の効率、濃度、および／または量を定量化するために測定される。一態様において、人工内部共生体は、光学的特性を宿主細胞中に導入し、ＱＣおよび／またはＱＡ工程は、光の量または他の光学的特性を、宿主細胞中に導入された人工内部共生体の効率、濃度、および／または量を測定するために測定する。一態様において、間接的測定が、宿主細胞中に導入された人工内部共生体の効率、濃度、および／または量を定量化するために行われる。例えば、人工内部共生体は、宿主細胞の内部の人工内部共生体と反応する試薬を用いて測定されることができる。または、システムは、宿主細胞中に導入された人工内部共生体の尺度として、培地中に残っている残留人工内部共生体を測定することができる。一態様において、試薬は、人工内部共生体に特異的である（例えば抗体）。一態様において、試薬は、宿主細胞中に分泌された人工内部共生体により作られた生成物と相互作用する。一態様において、抗体は、人工内部共生体全体または人工内部共生体の特定の抗原を用いて作製されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。一態様において、抗体は、人工内部共生体の表面上の抗原（単数または複数）を認識する。一態様において、抗体は、ＡＭＢ−１上の表面抗原を認識するポリクローナルウサギ抗体である（ウサギはＡＭＢ−１全体で免疫される）。一態様において、人工内部共生体は、（上記のように改変されていることができる）磁性細菌であり、ポリクローナルウサギ抗体が、当該技術で周知の技法を用いて真核宿主細胞中の磁性細菌を検出するために用いられる(Immunocytochemical Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 115 (編者Lorette C. Javois) January 15, 1999、それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される)。例えば、磁性細菌が真核宿主細胞に導入された後、宿主細胞は、固定および透過処理され、蛍光標識された抗体が宿主細胞に入って磁性細菌をタグ付けすることを可能にする(Immunocytochemical Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 115 (編者Lorette C. Javois) January 15, 1999、それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される)。次いで、抗体の結合から得られる信号の強度が、宿主細胞中の磁性細菌を測定するために用いられることができる。あるいは、抗体は、未標識であることができ、磁性細菌に結合した抗体の検出は、抗磁性細菌抗体を認識する二次抗体を用いて実施される(Immunocytochemical Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 115 (編者Lorette C. Javois) January 15, 1999、それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される)。一態様において、二次抗体は、レポーターで標識されていることができる。
【００８５】
[97]  一態様において、検出のための手段は、温度を測定し、交番磁場中に配置された際の人工内部共生体を有する宿主細胞の熱応答が、人工内部共生体を評価するために用いられる。一態様において、交番磁場は、約１００ｋＨｚ〜５００ｋＨｚの範囲の周波数を有する。人工内部共生体（例えば磁性細菌）は、交番磁場からエネルギーを吸収し、このエネルギーを熱として放熱させる。一態様において、熱の放出は、宿主細胞中の人工内部共生体を定量化するために測定および使用されることができる。一態様において、本発明のシステムは、この熱測定を、適用に関して適切な量の人工内部共生体が宿主細胞内に存在することを保証するためのＱＡ／ＱＣ工程として実施する。
【００８６】
[98]  一態様において、検出のための手段は、宿主細胞による光散乱を測定する。一態様において、検出のための手段は、人工内部共生体、例えば磁性細菌を含有する宿主細胞が磁場をかけられた際の光散乱を測定する。この態様において、宿主細胞が十分な磁性細菌を含有する場合、磁性細菌を有する宿主細胞は、磁場中で低光散乱または高光散乱配向のどちらかに向くであろう。これは、磁場中での配向を可能にするために十分な人工内部共生体を受け入れた宿主細胞の定量化を可能にする。一態様において、本発明のシステムは、この光散乱検出測定を、適用に関して適切な量の人工内部共生体が宿主細胞内に含有されていることを保証するためのＱＡ／ＱＣ工程として実施する。
【００８７】
[99]  一態様において、検出のための手段は、人工内部共生体により作られるレポーター（例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼ）の（例えば光学的）特性を測定する。一態様において、レポーターからの信号は、宿主細胞中の人工内部共生体を定量化するために測定および使用される。一態様において、レポーターは、人工内部共生体において構成的に発現されている。一態様において、レポーターは、誘導性制御領域、例えば当該技術で周知である誘導性制御領域により発現され、システムは、誘導する条件を提供し、次いでレポーターを測定する。一態様において、本発明のシステムは、このレポーターの測定を、適用に関して適切な量の人工内部共生体が宿主細胞内に存在することを保証するためのＱＡ／ＱＣ工程として実施する。
【００８８】
[100]  一態様において、ＱＡ／ＱＣ測定は、得られた信号を、既知の量のレポーターを用いて作製された標準曲線に対して比較する。一態様において、本発明のシステムは、ＱＡ／ＱＣ測定を実施し、標準曲線からの情報を利用して適切な量の人工内部共生体が宿主細胞内に存在するかどうかを決定する。
【００８９】
宿主細胞中の人工内部共生体を検出するためのキットおよび方法
[101]  本発明のキットは、本発明のシステムにおいて用いられるであろう消耗品を含む。キットは、システムが用いられる際に消費される、または定期的に取り替えられる必要があるシステムの物品を含む。システムにおいて用いられる消耗品は、例えば人工内部共生体、宿主細胞、培地、選択剤、容器、磁気カラム、組織培養処理されたディッシュ、人工内部共生体に特異的な抗体、宿主細胞中の人工内部共生体の検出における使用のための他の試薬および付属品（例えば容器）を含む。定期的に取り替えられるであろう物品は、例えば、システムにおいて用いられるカラム、微量注入のための針等を含む。
【００９０】
[102]  一態様において、本発明のキットは、本発明のシステムにおいて用いられる１、２、３、４、またはより多くの消耗品を含む。一態様において、キットは、人工内部共生体を、または人工内部共生体を培地と共に、または人工内部共生体、培地、および選択剤を含む。一態様において、キットの培地は、細菌を殺すかまたは著しく破壊することができ、例えば、培地は、ゲンタマイシンを含有することができる。この方法では、宿主細胞内部の内部共生体のみが生存するであろう。
【００９１】
[103]  一態様において、キットは、磁性細菌、磁性細菌に特異的な抗体、磁石、選択剤、およびレポーターを含み、またはキットは、前記のもののあらゆる組み合わせを含むことができる。キットは、磁気カラムも含有することができる。一態様において、キットの磁性細菌は、レポーターで改変されている。一態様において、レポーターは、ＧＦＰである。一態様において、キット中の抗体は、蛍光標識で標識されている。一態様において、キットは、抗磁性細菌抗体を検出するための二次抗体を含む。一態様において、選択剤が磁性カラム中に含有されている。一態様において、キットは、磁性細菌および磁石を含む。
【００９２】
[104]  本発明は、以下の実験的詳細からよりよく理解されるであろう。しかし、当業者は、論じられた特定の方法および結果は、その後に続く特許請求の範囲においてより完全に記載されている本発明を単に説明するだけのものであることを、容易に理解するであろう。
【実施例】
【００９３】
実施例１：レポーターを有する人工内部共生体を含有する宿主細胞
Ａ．ｇｆｐ＋ＡＭＢの構築
[105]  ｅＧＦＰに関する発現ベクター：ｇｆｐ遺伝子の上流のシャイン・ダルガノ配列を含むｅＧＦＰ、およびシャイン・ダルガノ配列を有しないｅＧＦＰを、潜在性の（ｃｒｙｐｔｉｃ）広い宿主範囲のベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２中にクローニングした(Kovach, M.E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 166, 175-176, (1995) (それは全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。ＡＭＢ（ＡＴＣＣ  ７００２６４）を、このコンストラクトを用いて形質転換した。(Matsunaga, T. et al. Complete genome sequence of the facultative anaerobic magnetotactic bacterium Magnetospirillum sp. strain AMB-1. DNA Res. 12, 157-166 (2005); Burgess J.G., et al. Evolutionary relationships among Magnetospirillum strains inferred from phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences. J. Bacteriol. 175: 6689-6694 (1993); Matsunaga T, et al. Gene transfer in magnetic bacteria: transposon mutagenesis and cloning of genomic DNA fragments required for magnetosome synthesis. J. Bacteriol. 174: 2748-2753 (1992); Kawaguchi R, et al. Phylogeny and 16s rRNA sequence of Magnetospirillum sp. AMB-1, an aerobic magnetic bacterium. Nucleic Acids Res. 20: 1140, (1992) (これらの４つの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される))。
【００９４】
[106]  形質転換は、Goulian, M. van der Woude, M.A. A simple system for converting lacZ to gfp reporter fusions in diverse bacteria. Gene 372, 219-226 (2006); Scheffel, A. Schueler, D. The Acidic Repetitive Domain of the Magnetospirillum gryphiswaldense MamJ Protein Displays Hypervariability but Is Not Required for Magnetosome Chain Assembly. J Bacteriol. September; 189(17): 6437-6446 (2007)により記載されたような供与体大腸菌株を用いたコンジュゲーションにより達成された(これらの２つの刊行物のそれぞれは、全ての目的のためにそのまま参照により援用される)。接合反応は、定められた微好気性条件下で、陽性形質転換体に関して選択するためにＤＡＰの非存在下で、１０日間培養された。
【００９５】
[107]  コンジュゲーション後、シャイン・ダルガノ配列を有する、および有しないｇｆｐ＋ＡＭＢ形質転換体は、うまくＧＦＰ蛍光を示した。シャイン・ダルガノ配列を含有する形質転換体は、この配列を有しない形質転換体よりも高いレベルのＧＦＰ蛍光を示した。結果として生じた蛍光は、１００倍の倍率で４８８ｎｍの励起で観察された際にｇｆｐ＋ＡＭＢ細胞を残さなかった（ｎｏｔ  ｌｅａｖｅ）。
【００９６】
[108]  ｇｆｐ＋ＡＭＢの磁性特性が、ＭＲＩにより分析された。ｇｆｐ＋ＡＭＢは、画像化特性を最適化し、特性付けるために、寒天プラグ（ａｇａｒ  ｐｌｕｇ）中に１．５Ｔ機器を用いて懸濁された。
【００９７】
[109]  細胞の可視化が、２つの皮下腫瘍（１つはその左側腹部に、１つはその右側腹部に）を有するマウスにおいて試験された。導入されたｇｆｐ＋ＡＭＢを含有する１．５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞が、マウスの左側腹部上の腫瘍中に直接注射された。導入された細胞を有しない同等の数の対照ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞が、マウスの右側腹部において注射された。マウスは、Ｔ２ｗパルスシーケンスを有するベンチトップ１Ｔ  ＭＲＩを用いて画像化された。結果として得られた画像は、マウスの右側における腫瘍において暗い領域（導入されたｇｆｐ＋ＡＭＢを含有するＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の注射の部位）を示したが、マウスの右側における腫瘍においては信号を示さず、ここで、対照ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、左側の腫瘍中に注射された。これらの結果は、図３において示されている。
【００９８】
Ｂ．マウス胚細胞中への微量注入。
[110]  ｇｆｐ＋ＡＭＢが、１７０個の２細胞期のマウス胚のそれぞれの１個の細胞中に微量注入された。細胞あたり約１０５個のｇｆｐ＋ＡＭＢに至るまでの対数スケールアップにわたる６つの濃度（５６５ｎｍにおける光学密度により推定された）が注入された。微量注入後の細胞の死亡率は、異なる注射濃度にわたって一定であった。最高濃度（１０５ＭＴＢ／細胞）で注入された細胞の蛍光および微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を重ねた画像が、比較された。注入されていない対照は、低レベルの自己蛍光を示した。所与の時点における８細胞胚中の異なる水平面での切片が、比較された。それぞれの胚において、注射された細胞に由来する全ての４つの細胞は、有意な蛍光を示したが、注入されていない内部対照に由来する４つの細胞は、いずれも有意な蛍光を示さなかった。
【００９９】
[111]  胚を注入後３日間発生させた。それぞれの濃度レベルにおいて、胚は３日間全部に至るまでの間生存して２５６細胞胞胚期へと発生し、移植に関して十分に健康に見えた。それぞれの胞胚内の数多くの細胞が有意な蛍光を示し、これは、真核宿主細胞を含む胚が胞胚期へと発生した際に、人工内部共生体が多数回の細胞分裂にわたって娘細胞へと移されたことを実証している。１つのそのような胞胚が、図２において示されており、ここで、パネルＡは、胞胚の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を示し、パネルＢは、同じ画像のグレースケール蛍光捕捉を示し、胞胚全体にわたる数多くの細胞における蛍光を示している。
【０１００】
[112]  共焦点顕微鏡法が、胚全体における総ＧＦＰ蛍光を時間の経過にわたって胚の８細胞期で開始する様々な時点において測定することにより４つの個々の胚全体にわたるＧＦＰの総発現を定量化するために用いられた。図３は、時間の経過にわたる胚の蛍光の変化を示す。これは、胚が２細胞期から２５６細胞胞胚期まで進行する際に宿主細胞の蛍光表現型が維持されたように、人工内部共生体のコピー数が少なくとも７世代の間娘細胞において維持されたことを示している。
【０１０１】
[113]  これらの結果は、微量注入により送達された場合、ｇｆｐ＋ＡＭＢは即時に排除または分解されず、そして３日間の実験の過程にわたって発生している胚に対して毒性ではなかったことを実証している。微量注入された胚は正常に分裂し、これはｇｆｐ＋ＡＭＢが病原性マーカーを示さず、毒性化合物も分泌しないことを示唆している。それらは、多くの細胞分裂にわたって娘細胞に移され、細胞質中に含有され、点状であり、十分に分布し、真核宿主細胞の蛍光表現型が少なくとも７世代を通して娘細胞において維持されたように、娘宿主細胞内でコピー数を維持した。これらの結果は、ＡＭＢは細胞内で安定して維持されることができ、少なくとも７回の細胞分裂にわたって娘細胞に移されることを実証している。
【０１０２】
実施例２．人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するための磁気システム
[114]  この態様において、磁気システムが、磁性細菌を含有する宿主細胞を作製するために用いられる。システムは、改変された人工内部共生体、宿主細胞、ＮｄＦｅＢ、グレードＮ５２磁石、組織培養ディッシュ、選択剤を含む、および含まない宿主細胞培地、選択剤を有する磁気カラム、ならびにＦＡＣＳ選別機を含む。
【０１０３】
[115]  人工内部共生体であるマグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）７００２６４（商標））が、それをカナマイシン耐性を有し、発現カセット中にｅＧＦＰを有する移行可能なプラスミドを含有する大腸菌株ＢＷ２９４３７と接合させることにより改変される。カナマイシン陽性のＭ．マグネティカムＡＭＢ−１コロニーが単離され、ＧＦＰ発現が蛍光顕微鏡法により検証される。
【０１０４】
[116]  ｇｆｐ＋ＡＭＢ−１が、ｇｆｐ＋ＡＭＢ−１を０．６μＭ  ＬＬＯの溶液中に入れることにより、リステリオリシンＯタンパク質（ＬＬＯ）で処理される。ｇｆｐ＋ＡＭＢ−１は、ＬＬＯ溶液中で室温において１０〜３０分間インキュベートされ、次いでｇｆｐ＋ＡＭＢ細胞は、ＰＢＳで洗浄される。
【０１０５】
[117]  宿主細胞は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１である。６ウェル組織培養ディッシュおよびＮｄＦｅＢ、グレードＮ５２磁石が、ＬＬＯでコートされた改変されたＭ．マグネティカムｇｆｐ＋ＡＭＢ−１のＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞中への導入を補助するために用いられる。培地は、１０％ウシ胎児血清を補われたＤＭＥＭである。培地は、選択剤としてゲンタマイシンまたはストレプトマイシンも含有することができる。ゲンタマイシンまたはストレプトマイシンを含有する、またはそれと共にインキュベートされたＭＡＣＳ（登録商標）磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）が、システムにおいて、ＬＬＯでコートされた改変されたｇｆｐ＋Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１を有するＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞を人工内部共生体を有しないＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞から分離するために用いられる。蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）が、ＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞中の人工内部共生体の存在を確証するために、そして蛍光性人工内部共生体を有するＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞を蛍光性人工内部共生体を欠いている宿主細胞から分離するために用いられる。
【０１０６】
[118]  ＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞は、６ウェル組織培養ディッシュ中で、４０〜７０％コンフルエンスまで増殖し、１０％ウシ胎児血清を補われた１ｍｌのＤＭＥＭ中で再懸濁されたＬＬＯでコートされた１．５×１０５個のｇｆｐ＋Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１を上に重ねられる。次いで、ディッシュはＮｄＦｅＢ、グレードＮ５２磁石上に載せられる。細胞は、磁石上で３時間インキュベートされる。このインキュベーション後、細胞はゲンタマイシンまたはストレプトマイシンを含む培地中に置かれる。組み込まれなかった細菌を除去するための４８時間のインキュベーション後、宿主細胞は、トリプシン処理され、磁気カラムを通される。人工内部共生体を有する宿主細胞は、磁石の除去後に成長培地を用いた溶離により磁気カラムから分離される。分離された宿主細胞は、ＦＡＣＳ選別機を通される。ＦＡＣＳ選別機は、蛍光性人工内部共生体を含有するＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞に関して富化する。
【０１０７】
[119]  これらの分離された人工内部共生体を有する宿主細胞は、あらゆる数の下流の適用のために用いられることができる。
実施例３  人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するための加速システム
[120]  この態様において、加速システムが、磁性細菌を含有する宿主細胞を作製するために用いられる。そのシステムは、改変された人工内部共生体、宿主細胞、遠心分離機、組織培養ディッシュ、選択剤を含む、および含まない宿主細胞培地、磁気カラム、ならびにＦＡＣＳ選別機を含む。
【０１０８】
[121]  人工内部共生体であるマグネトスピリラム・マグネティカムＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）７００２６４（商標））が、それをカナマイシン耐性を有し、発現カセット中にｅＧＦＰを有する移行可能なプラスミドを含有する大腸菌株ＢＷ２９４３７と接合させることにより改変される。カナマイシン陽性のｇｆｐ＋Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１コロニーが単離され、ＧＦＰ発現が蛍光顕微鏡法により検証される。
【０１０９】
[122]  宿主細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞である。６ウェル組織培養ディッシュおよびＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴまたは類似の卓上遠心分離機が、ｇｆｐ＋Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１のＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞中への導入を補助するために用いられる。培地は、１０％ウシ胎児血清を補われたＤＭＥＭである。培地は、選択剤としてゲンタマイシンまたはストレプトマイシンも含有することができる。ＭＡＣＳ（登録商標）磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）が、システムにおいて、ｇｆｐ＋Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１を有するＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞を人工内部共生体を有しないＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞から分離するために用いられる。ＦＡＣＳ分離機が、ＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞中の人工内部共生体の存在を確証するために、そして蛍光性人工内部共生体を有するＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞を蛍光性人工内部共生体を欠いている宿主細胞から分離するために用いられる。
【０１１０】
[123]  ＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞は、６ウェル組織培養ディッシュ中で４０〜７０％コンフルエンスまで増殖し、１０％ウシ胎児血清を補われた１ｍｌのＤＭＥＭ中で再懸濁された１．５×１０５個のｇｆｐ＋Ｍ．マグネティカムＡＭＢ−１を上に重ねられる。次いで、ディッシュはＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機上に据え付けられる。細胞は、遠心分離機中で２０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離され、次いで３時間インキュベートされる。このインキュベーション後、細胞はゲンタマイシンまたはストレプトマイシンを含む培地中に置かれ、４８時間のインキュベーション後、磁性カラムを通される。人工内部共生体を有する宿主細胞は、磁石の除去後に成長培地を用いた溶離により磁気カラムから分離される。次いで、分離された宿主細胞は、ＦＡＣＳ選別機を通される。ＦＡＣＳ選別は、蛍光性人工内部共生体を含有するＭＤＡ−ＭＢ２３１宿主細胞に関して富化する。
【０１１１】
[124]  これらの分離された人工内部共生体を有する宿主細胞は、あらゆる数の下流の適用のために用いられることができる。
実施例４：人工内部共生体を有する宿主細胞を作製するためのマルチウェルの磁気システム
[125]  図１Ａは、人工内部共生体を宿主細胞中に導入するために磁気手段を利用するシステムを描写している。システムは、真核宿主細胞および人工内部共生体（例えば磁性細菌）を保持するためのマルチウェル容器（２）を有する大きな土台（１）を含む。
【０１１２】
[126]  図１Ｂは、大きな土台（１）、多数の容器（またはウェル）を有するプレート（２）、磁気手段（４）を保持するための互換性の挿入物（３）、マルチウェルプレートのための蓋（５）、およびマルチウェルプレートを方向付けるためのバンパー（６）を有するシステムの分解組立図を描写している。
【０１１３】
[127]  図１Ｃは、１２ウェルプレートと共に使用するための（６個の代わりに）１２個の磁気手段を保持するための代替形式の挿入物（７）を描写している。
[128]  図２は、３層を有するように作製されたＮｄＦｅＢ永久磁石である磁気手段を描写しており、ここで、一番上の層が一番大きく、それぞれのそれに続く層は先行する層よりも小さい面積を有する。ＮｄＦｅＢ永久磁石の一番上の層は、磁気手段と共に用いられるための容器の直径より大きい直径を有する。その磁気手段に関する設計は、マルチウェルプレートの個々のウェルにわたって類似している磁場強度をもたらす。この態様において、互換性の挿入物は、磁気手段とかみ合う（ｍａｔｅ）ように作られていることができる（すなわち、それぞれの穴は、磁気手段の層と合う段を有する）。一態様において、磁気手段は、互換性の挿入物中の穴に固定されている。一態様において、磁気手段は、接着剤により穴に固定されている。
【０１１４】
[129]  システムが、人工内部共生体を導入するために用いられる場合、以下の工程が用いられることができる。宿主細胞が、６ウェルプレートのウェル中に導入される。宿主細胞は、ウェルの表面に接着するか、および／または培地中で懸濁されている。宿主細胞は、人工内部共生体、例えばＭＴＢの導入の前に、増殖相に置かれることができる。人工内部共生体（ＭＴＢ）が、宿主細胞を含有するウェルに添加され、６ウェルプレートが図１Ａのシステム中に配置される。宿主細胞およびＭＴＢは、磁気手段の上で１〜１６時間一緒にインキュベートされ、次いでプレートはシステムから取り外される。宿主細胞に入らなかったＭＴＢは、宿主細胞を洗浄することにより除去される。場合により、ＭＴＢを有する宿主細胞は、ＭＴＢを有する、および有しない宿主細胞を磁気カラム上を通し、それにより、導入されたＭＴＢが磁気カラムと相互作用してそれらが居住する細胞の流動を妨げるため、ＭＴＢを有する宿主細胞がより遅くカラムを通過することにより、ＭＴＢを有しない（または所望の表現型をもたらすには不十分なＭＴＢを有する）宿主細胞から分離される。ＭＴＢを有する宿主細胞は、分離され、次いであらゆる数の下流の適用において用いられることができる。
【０１１５】
[130]  本明細書で論じられ、引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、そのまま参照により本明細書に援用される。開示された発明は、記載された特定の方法論、プロトコルおよび材料に、これらは変動し得るため、限定されないことは、理解されている。本明細書で用いられた用語法は、特定の態様を記載する目的のためだけのものであり、添付された特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することは意図されていないことも、理解されている。
【０１１６】
[131]  当業者は、ルーチン的な実験操作より多くを用いずに、本明細書で記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識する、または確かめることができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【符号の説明】
【０１１７】
１  土台
２  マルチウェル容器
３  互換性の挿入物
４  磁気手段
５  蓋
６  バンパー
７  代替形式の挿入物
【図２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際調査報告】
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