(57)【要約】  本開示は、２つのドメイン：イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメイン、およびサイトカイニンヌクレオチドホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインを有する新たなクラスのサイトカイニン生合成酵素であるサイトカイニンシンターゼに関する。本発明は、サイトカイニンシンターゼの組換え産生のための組成物および方法、サイトカイニンシンターゼを含む宿主細胞および形質転換体、ならびに開示されるサイトカイニンシンターゼを含む組成物および製剤を提供する。
2017522001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメイン、およびホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインを含むサイトカイニンシンターゼをコードする配列、ならびに
ｂ．異種配列
を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記コードされるサイトカイニンシンターゼが、（ｉ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のいずれか１つに対して少なくとも５７％のアミノ酸配列同一性を有するか、または（ｉｉ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のコンセンサス配列と共に整列するとき、（ｉ）コンセンサス配列アミノ酸位置１３〜２０において第１のモチーフＧＰＴＸａａ１Ｘａａ２ＧＫＴ（配列番号３０）（式中、Ｘａａ１は、ＧもしくはＡであり、Ｘａａ２は、Ｖ、Ｓ、Ａ、もしくはＴである）；（ｉｉ）コンセンサス配列アミノ酸位置９６〜１０４において第２のモチーフＰＸａａ３Ｘａａ４Ｘａａ５ＧＧＳＸａａ６Ｓ（配列番号３１）（式中、Ｘａａ３は、ＩもしくはＶであり、Ｘａａ４は、ＬもしくはＶであり、Ｘａａ５は、ＶもしくはＣであり、Ｘａａ６は、ＴもしくはＩである）、（ｉｉｉ）コンセンサス配列アミノ酸位置３３３〜３３８において第３のモチーフＸａａ７Ｘａａ８ＹＧＧＧ（配列番号３２）（式中、Ｘａａ７は、ＬもしくはＩであり、Ｘａａ８は、ＶもしくはＩである）、および（ｉｖ）コンセンサス配列アミノ酸位置４２６〜４３８においてＸａａ９ＧＧＹＧＴＸａａ１０ＥＥＬ（配列番号３３）（式中、Ｘａａ９は、ＳもしくはＰであり、Ｘａａ１０は、ＬもしくはＭである）を含む配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記サイトカイニンシンターゼコード配列が、（ｉ）配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列を含むか、または（ｉｉ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記サイトカイニンシンターゼコード配列が、配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記サイトカイニンシンターゼコード配列が、配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記サイトカイニンシンターゼコード配列が、配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のうち１つを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記サイトカイニンシンターゼコード配列が、宿主細胞における発現に最適化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記サイトカイニンシンターゼコード配列が、細菌、酵母、植物、双子葉植物、単子葉植物、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、コムギ、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、コメ（イネ（Oryza sativa））、ヒマワリ、芝生、クリーピングベントグラス（ハイコヌカグサ（Agrostis stolonifera））、トールフェスク（オニウシノケグサ（Festuca arundinacea））、タバコ（タバコ（Nicotiana tabacum））、およびポプラハイブリッドからなる群から選択される宿主細胞における発現に最適化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記異種配列が異種プロモーターであり、前記プロモーターが、前記サイトカイニンシンターゼコード配列に作動可能に連結される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記プロモーターが、細菌プロモーター、異種真菌プロモーター、酵母プロモーター、または植物プロモーターである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記プロモーターが、双子葉類プロモーター、または単子葉類プロモーターである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記プロモーターが、トウモロコシプロモーターである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記プロモーターが、３５Ｓ  ＣａＭＶ、３４Ｓ  ＦＭＶ、ナピン、７Ｓアルファ、７Ｓアルファ'、Ｇｌｏｂ、Ｌｅｃ、ＺｍＧＳ２、ＺｍＳＴＰ１３、またはＺｍＧＳＴＵ６プロモーターである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記サイトカイニンシンターゼコード配列が、第１の上流異種配列および第２の下流異種配列に隣接し、前記第１および第２の異種配列が、（ｉ）８０％を超えて異種性宿主と同一のゲノム配列であり、（ｉｉ）前記宿主への相同組換えによる組込みを触媒するのに適している、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセット。
【請求項１６】
ａ．請求項１５に記載の遺伝子発現カセット；および
ｂ．選択可能なマーカー
を含む組換えベクター。
【請求項１７】
ａ．前記遺伝子発現カセットが、請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含み；
ｂ．前記ベクターが、細菌または酵母において機能的である複製起点を含む、請求項１６に記載の組換えベクター。
【請求項１８】
前記異種配列が、タンパク質融合タグをコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記コードされるタンパク質融合タグが、ポリ−ヒスチジン、ポリ−アルギニン、ハロアルカンデハロゲナーゼ、ストレプトアビジン結合、グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、Ｎ−利用サブスタンスＡ（ＮｕｓＡ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＩ（ＤｓｂＡ）、Ｍｉｓｔｉｃ、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、またはＴｒｐＥ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素抗原（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、１Ｄ４、カルモジュリン結合ペプチド、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、Ｓ−タグ、またはＳｏｆｔａｇ３タンパク質融合タグである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１〜１９からなる群から選択されるポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
形質転換された細菌細胞、形質転換された真菌細胞、形質転換された酵母細胞、または遺伝子導入植物細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
遺伝子導入単子葉植物細胞または遺伝子導入双子葉植物細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
ダイズ宿主細胞またはトウモロコシ宿主細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２２または２３のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む遺伝子導入植物。
【請求項２５】
天然のサイトカイニンシンターゼを含む真菌由来の真菌物質を実質的に含まない、イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメイン、およびホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインを含む単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼ。
【請求項２６】
前記コードされるサイトカイニンシンターゼが、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうちいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、請求項２５に記載の単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼ。
【請求項２７】
タンパク質融合タグに共有結合する、請求項２５または請求項２６に記載の単離されたサイトカイニンシンターゼ。
【請求項２８】
ａ．請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のサイトカイニンシンターゼにより産生されるサイトカイニン；および
ｂ．植物への適用に適した１つまたは複数の不活性な成分
を含む、サイトカイニンシンターゼの適用のための組成物。
【請求項２９】
液体製剤、水溶性濃縮物、乳化性濃縮物、流動性懸濁液、水性懸濁液、噴霧可能な製剤、乾燥製剤、顆粒、ペレット、湿潤性粉末、溶解性粉末、水分散性顆粒、または乾燥流動性製剤からなる群から選択される製剤である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
組換えサイトカイニンシンターゼを産生する方法であって
ａ．請求項２０〜２３からなる群から選択される宿主細胞において組換えサイトカイニンシンターゼを発現させること；および
ｂ．宿主細胞物質から前記サイトカイニンシンターゼを単離すること
を含む方法。
【請求項３１】
サイトカイニン前駆体をサイトカイニンに変換する方法であって、宿主細胞、遺伝子導入植物、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、サイトカイニン前駆体一リン酸（ＡＭＰ）、およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）またはヒドロキシメチルブテニル二リン酸（ＨＭＢＤＰ）のいずれかを、単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼに接触させることを含み、前記単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼが、前記ＡＭＰまたはＤＭＡＰＰをイソペンテニルアデニン（ｉＰ）サイトカイニンまたはトランス−ゼアチン（ｔＺ）サイトカイニンに変換する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に分子生物学および生化学の分野に関する。より具体的には、本発明は、サイトカイニンを産生するあるクラスのサイトカイニンシンターゼ酵素に関する。本発明は、これらの酵素をコードする組換えポリヌクレオチド、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、宿主細胞における、および植物におけるサイトカイニンの産生方法を提供する。本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチドを含む植物および組成物、本発明のサイトカイニンシンターゼ、ならびに／または本発明のサイトカイニンシンターゼにより産生されるサイトカイニンをさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイニンは、通常の成長条件下ならびにストレス条件下での成長および発生プロセスを制御する、植物により産生される小分子である。サイトカイニンが、培養される植物細胞の成長および分化を刺激することは、十分に確立されている。サイトカイニンシグナル伝達は、芽の伸長および根粒形成中に組織の産生と関連することが示された。Faiss et al., Plant J., 12(2): 401-15 (1997); Ferguson et al., Plant Physiol., 149(4): 1929-1944 (2009}, Tirichine et al., Science, 315(5808):104-107 (2007)、およびHeld et al., Plant Cell, 26(2): 678-694 (2014)。例えば、日照り、低温、または過剰な塩に起因する、非生物的ストレス中のサイトカイニン不活性化は、植物生産性の低下、種サイズの低減、先端カーネル発育不全の増大、および結実の低下を導く。（Jones and Setter, in CSSA Special Publication No. 29, pp. 25-42. American Society of Agronomy, Madison, Wis. (1999)）。サイトカイニン生合成酵素の遺伝子導入発現は、非生物的ストレス下を含み、植物生産性を増大することが報告された。Rivero et al., Proc. Natl. Acad. Sciences USA, 104(49) 19631-36 (2007); Merewitz et al., J. Exp. Bot., 63(3): 1315-1328 (2012)。加えて、藻類に由来するサイトカイニンの製剤、およびサイトカイニン（ベンジルアデニン）の他の製剤が、果実サイズ、収量、花、枝分かれ、健康な外観、および他の所望の成長作用を増大させるための農作物、野菜作物、小果樹類、つる植物、樹木の果実、幼木、観賞植物、ならびにゴルフ場への散布を含む使用について、登録され承認された。米国Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ  Ｒｅｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｅｌｉｇｉｂｉｌｉｔｙ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ（ＲＤ）、ＥＰＡ−７３８−Ｒ−９５−０２５、１９９５年１２月、およびＮ−６ベンジルアデニンのＲｅｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｓｅ２０４０（ＰＣ  Ｃｏｄｅ  １１６９０１）、２０１１年３月。植物の葉において、外因性サイトカイニン（ベンジルアデニン）の葉面散布を使用して、乾燥している根の作用を逆転し、それは、反復散布により持続され、側枝の発生を導き得る。Stoll et al. J. Exp. Bot., 51(350): 1627-1634 (2000)。
【０００３】
植物におけるサイトカイニンの生合成は複雑であり、第１および第２の経路を含む。Motkya et al., Plant Physiol. 112: 1035-1043 (1996)。第１の経路において、サイトカイニンは、アデノシンリン酸−イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）の活性で始まる多段階反応において新規に合成され、それはアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とプレニル供与体との縮合を好ましくは触媒して、それぞれｉＰリボシド５’−二リン酸（ｉＰＲＤＰ）またはｉＰリボシド５’−三リン酸（ｉＰＲＴＰ）を形成する。これらの前駆体は、サイトカイニンヌクレオチドホスホリボヒドロラーゼにより加水分解されてサイトカイニンＮ６−（Δ２−イソペンテニル）アデニン（ｉＰ）を形成するか、または代わりに、対応するトランス−ゼアチンヌクレオチド（ｔＺＮ）に変換され、次に加水分解されて、サイトカイニントランス−ゼアチン（ｔＺ）を形成する。第２の経路において、サイトカイニンは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の分解により生み出される。経路の第１段階には、ｔＲＮＡ−イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｔＲＮＡ−ＩＰＴ）酵素が関与し、これはｔＲＮＡを転写後に修飾してプレニル化ｔＲＮＡを作製する。この前駆体はさらに修飾され、アデニンと縮合して、シス−ゼアチンリボシド（ｃＺＲ）を生じ、それは加水分解されて主にシス−ゼアチンを生じる。一般に、第１の経路により産生されるサイトカイニンプールは、生物学的により活性であると解される。
【０００４】
感染性根こぶ病を形成する細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）とヒドロキシメチルブテニル二リン酸（ＨＭＢＤＰ）またはジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）との縮合を優先的に触媒して、トランス−ゼアチンリボシル一リン酸（ｔＺＲＭＰ）を形成し、それは、サイトカイニンヌクレオチドホスホリボヒドロラーゼにより続いて加水分解されて、トランス−ゼアチン（ｔＺ）を形成する、ＩＰＴをコードする２つの遺伝子を有する。故に、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）におけるサイトカイニン生合成のメカニズムは、少なくとも２つの酵素が関与し、ｔＺサイトカイニンを主に産生する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでサイトカイニンを産生するか、またはその産生を制御するために使用され得る新規の組成物および方法が所望される。例えば、サイトカイニンを前駆体から直接的に産生するために単一ポリペプチドを使用する、組成物および方法が所望される。これらは、サイトカイニンの産生のために、さらなる上流または下流のエフェクターの存在にさほど依存しないものであり得る。かかる組成物および方法を使用して、植物に散布するためのサイトカイニン製剤を製造することができる。加えて、前記のものを使用して、植物におけるサイトカイニン産生をモジュレートし、これにより植物成長および発生を調節することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
開示される発明は、２つのドメイン：イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメイン、およびサイトカイニンヌクレオチドホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインを有するサイトカイニン生合成酵素（「サイトカイニンシンターゼ」）をコードする、ある特定の植物に関連する真菌におけるあるクラスの遺伝子の発見に一部基づく。例えば、エピクロエ・フェスツカエ（Epichloe festucae）（ＥｆＣＫＳ）、バランシア・オブテクタ（Balansia obtecta）（ＢｏＣＫＳ）、イリオネクテリア・ラジコラ（Ilyonectria radicola）（ＩｒＣＫＳ）、タケてんぐ巣病菌（Aciculosporium take）（ＡｔＣＫＳ）、アトキンソネラ・ヒポキシロン（Atkinsonella hypoxylon）（ＡｈＣＫＳ）、フザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）（ＦｆＣＫＳ）、および本明細書において開示される他のものを含む、このクラスのサイトカイニンシンターゼの複数のメンバーが同定され、本明細書において特徴付けられる。本発明のサイトカイニンシンターゼを使用して、サイトカイニン前駆体（例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、またはジメチルアリル二リン酸のようなプレニル供与体（ＤＭＡＰＰ））のサイトカイニン（イソペンテニルアデニン）への直接的な変換を触媒することができる。
【０００７】
故に、本発明は、サイトカイニン前駆体（例えば、ＡＭＰまたはＤＭＡＰＰ）を本発明の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼと接触させることを含み、サイトカイニンシンターゼが、前駆体をイソペンテニルアデニンのようなサイトカイニンに変換する方法を提供する。本発明は、先行のイソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）酵素を改良し、それらは、開始ステップを触媒するのみなので、１つまたは複数のさらなる酵素（トランスヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７３５）もしくはホスホリボヒドロラーゼ（ＣＫＡ））が、ＡＭＰまたはＤＭＡＰＰのトランス−ゼアチン（ｔｚ）またはイソペンテニルアデニン（ｉＰ）のようなサイトカイニンへの変換を有効的に完了することを必要とし得る。図２を参照のこと。
【０００８】
本開示は、酵素機能を保持しながら、アミノ酸配列の点で相違するサイトカイニンシンターゼを提供する。故に、本発明は、開示されるサイトカイニンシンターゼに対して少なくとも５７％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼを開示する。本発明は、（ａ）本明細書において開示される２つのドメインのサイトカイニンシンターゼのいずれかのコード配列、および（ｂ）例えば、異種プロモーター配列、ベクター配列、または宿主ゲノム標的配列のような異種ヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドをさらに提供する。ある特定の実施形態において、２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列は、宿主細胞、例えば、細菌、酵母、または植物宿主細胞における発現に最適化される。一部の実施形態において、サイトカイニンシンターゼコード配列は、タンパク質融合タグのような異種アミノ酸配列に共有結合される。
【０００９】
開示される本発明は、機能的に重要なドメイン、モチーフ、および個々の残基を同定し、提供する。例えば、本開示は、イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメイン、およびサイトカイニンヌクレオチドホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインを同定し、および／または作製する方法を提供する。故に、本発明は、これらのモチーフを含む２つのドメインのサイトカイニンシンターゼを提供する。図６の配列アライメントを参照して、第１のモチーフが、コンセンサス位置１３〜２０において同定され：ＧＰＴＸａａ１Ｘａａ２ＧＫＴ（配列番号３０）（式中、Ｘａａ１は、ＧまたはＡであり、Ｘａａ２は、Ｖ、Ｓ、またはＡである）、第２のモチーフが、コンセンサス位置９６〜１０４において同定され：ＰＸａａ３Ｘａａ４Ｘａａ５ＧＧＳＸａａ６Ｓ（配列番号３１）（式中、Ｘａａ３は、ＩまたはＶであり、Ｘａａ４は、ＬまたはＶであり、Ｘａａ５は、ＶまたはＣであり、Ｘａａ６は、ＴまたはＩである）、第３のモチーフが、コンセンサス位置３３３〜３３８において同定され：ＸａａＸａａＹＧＧＧＸａａ７Ｘａａ８ＹＧＧＧ（配列番号３２）（式中、Ｘａａ７は、ＬまたはＩであり、Ｘａａ８は、ＶまたはＩである）、第４のモチーフが、コンセンサス／アライメント位置４２６〜４３８において同定される：Ｘａａ９ＧＧＹＧＴＸａａ１０ＥＥＬ（配列番号３３）（式中、Ｘａａ９は、ＳまたはＰであり、Ｘａａ１０は、ＬまたはＭである）。真菌のサイトカイニンシンターゼにおいて例示される前述のモチーフは、本明細書における実施例８においてより完全に説明される。
【００１０】
真菌の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼのＩＰＴ様ドメインにおいて同定されるモチーフをまた、非真菌のイソペンテニルトランスフェラーゼと比較して、本発明のサイトカイニンシンターゼ内で変動し得る残基が同定された。故に、異なる態様において、本発明は、２つのドメインのサイトカイニンシンターゼであって、ＩＰＴ様ドメイン内の１つまたは複数の開示されるモチーフ（配列番号３０、配列番号３１、もしくは配列番号３２）が、実施例９においてより完全に記載される、非真菌のＩＰＴドメインにおいて同定される、対応するモチーフを含むよう変動する。
【００１１】
加えて、本発明は、アラニン系統的変異導入法の結果により明らかにされる、サイトカイニンシンターゼ活性にとって機能的に重要である、個々のアミノ酸残基を初めて開示する。個々の残基は図６において同定され、活性に対するそれらの効果は図７に示され、本明細書においてより詳細に論じられる。
【００１２】
さらなる実施形態において、２つのドメインのサイトカイニンシンターゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、宿主細胞に形質転換される。一部の実施形態において、宿主細胞は遺伝子導入植物細胞であり、コードされるサイトカイニンシンターゼは、植物細胞においてサイトカイニン活性をモジュレートする。ある特定の実施形態において、植物細胞を再生して、本発明の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子導入植物組織または遺伝子導入植物が作り出される。特定の実施形態において、組換えポリヌクレオチドはコードされるサイトカイニンシンターゼを発現し、これにより、遺伝子導入植物においてサイトカイニンレベルをモジュレートする。さらなる実施形態において、宿主細胞は、コードされるサイトカイニンシンターゼを産生するために使用され得る、発現宿主細胞（例えば、細菌または酵母）である。サイトカイニンシンターゼは、宿主細胞物質から単離されるか、または精製され得る。故に、本発明はまた、ＩＰＴ様ドメインおよびＰＲＨ様ドメインを有する、単離されたまたは精製されたサイトカイニンシンターゼポリペプチドも提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、タンパク質融合タグのような異種アミノ酸配列に融合された、単離されたまたは精製されたサイトカイニンシンターゼを提供する。
【００１３】
本発明は、宿主細胞、植物、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてサイトカイニンを産生するために本発明の組換えポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。１つの態様において、本発明は、宿主細胞、植物、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、サイトカイニン前駆体（例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）またはジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ））をサイトカイニンに直接的に変換する能力がある、２つのドメインのサイトカイニンシンターゼを発現させるために組換えポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。対照的に、先行技術のイソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードする先行技術のポリヌクレオチドはまた、ＡＭＰまたはＤＭＡＰＰのｔＺもしくはｉＰのようなサイトカイニンへの変換を完了するために１つまたは複数のさらなる酵素の発現も必要とする。図２を参照のこと。
【００１４】
なお別の態様において、本発明のサイトカイニンシンターゼを使用して、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてサイトカイニンが産生され得、それは、有効成分としての使用のため単離され、または精製され得る。本発明により産生されるサイトカイニンを不活性な成分と混合して、産業上の散布において、農作物、野菜作物、小果樹類、つる植物、樹木の果実、幼木、観賞植物、および芝生に散布するのに有用である製剤が作り出され得る。
【００１５】
本発明の組成物および方法は、本明細書においてより詳細に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＩＰＴ様ドメインおよびＰＲＨ様ドメインを含む、本発明のサイトカイニンシンターゼのドメイン構造の模式図である。
【図２】図２は、本明細書において開示されるサイトカイニンシンターゼに基づく、植物およびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）におけるサイトカイニン生合成のモデル、ならびに真菌のサイトカイニン生合成のモデルを提供する。
【図３】図３は、過剰発現した組換えエピクロエ・フェスツカエ（Epichloe festucae）サイトカイニンシンターゼ（ＥｆＣＫＳ．１）および切断されたバージョンのＥｆＣＫＳ．１（１〜２５５）を示す、クーマシィー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥジェルの画像を提供し、図３はまた、ＥｆＣＫＳ．１およびＥｆＣＫＳ．１（１〜２５５）を発現する宿主細胞由来の分泌されたサイトカイニンについての培養液アッセイの結果を示す棒グラフも提供する。これらの上部に、図３は、ＥｆＣＫＳ．１およびＥｆＣＫＳ．１（１〜２５５）の模式図をさらに提供する。
【図４】図４は、精製されたＥｆＣＫＳ．１およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来の精製されたイソペンテニルトランスフェラーゼ（ＡｔｕＩＰＴ）の活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す、一対のグラフである。
【図５】図５は、本発明による組換えサイトカイニンシンターゼの分泌された産物についての培養液アッセイの結果を示す、棒グラフである。
【図６】図６は、保存された残基（囲まれた領域）、および示される保存された残基に対する変異の効果：くさび形（▲）により示される活性に対する重度の効果、または塗りつぶされていないひし形（◇）により示される活性に対するわずかな効果を示す、本発明のサイトカイニンシンターゼの配列アライメントである。
【図７】図７は、６６種の異なるアラニンスキャニング置換変異体を含む、組換えサイトカイニンシンターゼ酵素およびその変異体の分泌された産物についての培養液アッセイの結果を示す、棒グラフである。
【図８】図８は、サイトカイニンシンターゼポリペプチドＥｆＣＫＳ．１をコードする、ポリヌクレオチドのｃＤＮＡ配列（配列番号１）を提供する。
【図９】図９は、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号２）、およびコードされるサイトカイニンシンターゼポリペプチドＥｆＣＫＳ．１（配列番号３）を提供する。
【図１０】図１０は、Ｎ末端融合タンパク質（ポリヒスチジン）タグを含む、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号４）、およびコードされるサイトカイニンシンターゼポリペプチドＥｆＣＫＳ．１（配列番号５）を提供する。
【図１１】図１１は、全長ＥｆＣＫＳ．１の位置２５５に対応するアミノ酸において切断され、Ｎ末端融合ポリヒスチジンタグを含む、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号６）、およびＥｆＣＫＳ．１のコードされるＩＰＴ様ドメイン（配列番号７）を提供する。
【図１２】図１２は、サイトカイニンシンターゼポリペプチドＡｔＣＫＳ．１（配列番号９）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号８）を提供する。
【図１３】図１３は、Ｎ末端融合タンパク質（ポリヒスチジン）タグを含む、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号１０）、およびコードされるサイトカイニンシンターゼポリペプチドＡｔＣＫＳ．１（配列番号１１）を提供する。
【図１４】図１４は、サイトカイニンシンターゼポリペプチドＢｏＣＫＳ．１（配列番号１３）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号１２）を提供する。
【図１５】図１５は、Ｎ末端融合タンパク質（ポリヒスチジン）タグを含む、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号１４）、およびコードされるサイトカイニンシンターゼポリペプチドＢｏＣＫＳ．１（配列番号１５）を提供する。
【図１６】図１６は、サイトカイニンシンターゼポリペプチドＩｒＣＫＳ．１（配列番号１７）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号１６）を提供する。
【図１７】図１７は、Ｎ末端融合タンパク質（ポリヒスチジン）タグを含む、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号１８）、およびコードされるサイトカイニンシンターゼポリペプチドＩｒＣＫＳ．１（配列番号１９）を提供する。
【図１８】図１８は、サイトカイニンシンターゼポリペプチドＡｈＣＫＳ．１（配列番号２１）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号２０）を提供する。
【図１９】図１９は、Ｎ末端融合タンパク質（ポリヒスチジン）タグを含む、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号２４）、およびコードされるサイトカイニンシンターゼポリペプチドＡｈＣＫＳ．１（配列番号２３）を提供する。
【図２０】図２０は、サイトカイニンシンターゼポリペプチドＦｆＣＫＳ．１（配列番号２５）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号２４）を提供する。
【図２１】図２１は、Ｎ末端融合タンパク質（ポリヒスチジン）タグを含む、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号２６）、およびコードされるサイトカイニンシンターゼポリペプチドＦｆＣＫＳ．１（配列番号２７）を提供する。
【図２２】図２２は、大腸菌（E. coli）コドン最適化コード配列ポリヌクレオチド（配列番号１６）、およびＡｔｕＣＫＳ．１のＮ末端融合ポリヒスチジンタグを有するコードされるＩＰＴ（配列番号１７）を提供する。
【図２３】図２３は、本発明のサイトカイニンシンターゼ間の進化距離を示す、系統樹を提供する。
【図２４】図２４は、本発明の以下のサイトカイニンシンターゼ：配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７を提供する。
【図２５】図２５は、本発明の以下のサイトカイニンシンターゼ：配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１を提供する。
【図２６】図２６は、本発明の以下のサイトカイニンシンターゼ：配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５を提供する。
【図２７】図２７は、本発明の以下のサイトカイニンシンターゼ：配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９を提供する。
【図２８】図２８は、本発明の以下のサイトカイニンシンターゼ：配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３を提供する。
【図２９】図２９は、本発明の以下のサイトカイニンシンターゼ：配列番号５４を提供する。
【図３０】図３０は、本明細書において開示されるサイトカイニンシンターゼのドメイン構造内の４つの機能的モチーフおよびそれらの位置を示す、模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
用語
本発明を記載し特許請求する際に、次の専門用語が、以下で説明される定義に従い使用される。
【００１８】
本明細書で使用される用語「約」は、１０パーセント、規定される値または値の範囲より大きいかまたは小さいことを意味するが、任意の値または値の範囲をこのより広い定義のみに指定することは意図されない。用語「約」が先行するそれぞれの値または値の範囲はまた、規定される絶対値もしくは値の範囲の実施形態を包含することも意図される。用語「約１００％」は、１００％未満を意味する。
【００１９】
本明細書で使用される用語「植物」は、植物全体、および任意の子孫、細胞、組織、または植物部分を含む。用語「植物部分」は、例えば、かつ非限定的に、種子（成熟種子および未成熟種子を含む）；植物伐採物；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、新芽、葉、根、幹、および外移植片）を含む、植物の任意の部分を含む。植物組織または植物器官は、種子、カルス、または構造単位もしくは機能単位に組織化される、植物細胞の任意の他の群であり得る。植物細胞または組織培養物は、細胞または組織が得られた植物の生理学的および形態学的特徴を有する能力、植物を再生する、ならびに植物と同一の遺伝子型を実質的に有する、植物を再生する能力があり得る。対照的に、一部の植物細胞は、再生され植物を生じる能力がない。植物細胞または組織培養物における再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、毛、花、任、穂、穂軸、皮、もしくは茎であり得る。
【００２０】
植物細胞は、植物の構造単位および生理学的単位である。本明細書で使用される、植物細胞は、プロトプラスト、および細胞壁を有するプロトプラストを含む。植物細胞は、単離された単一の細胞、または細胞の凝集体（例えば、脆弱なカルスおよび培養された細胞）の形態であってもよく、より高度に組織化された単位（例えば、植物組織、植物器官、および植物）の部分であってもよい。故に、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または植物全体に再生し得る、細胞もしくは細胞の集合体であってもよい。従って、複数の植物細胞を含み、植物全体に再生される能力がある種子は、本明細書における実施形態において「植物部分」とみなされる。
【００２１】
用語「双子葉植物」または「双子葉植物の」は、２つの子葉を有する植物を指す。例としては、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、キャノーラ、ナタネ、およびカラシのような作物植物が挙げられる。
【００２２】
用語「単子葉植物」または「単子葉植物の」は、単一の子葉を有する植物を指す。例としては、トウモロコシ、コメ、コムギ、オートムギ、およびオオムギのような作物植物が挙げられる。
【００２３】
用語「異種性」は、サイトカイニンキナーゼをコードする、任意の自然に存在するポリヌクレオチドにおいて見られないヌクレオチド配列を記載するために本明細書で使用される。
【００２４】
用語「組換え体」は、ポリヌクレオチドもしくは宿主細胞に関して、ポリヌクレオチドまたは宿主細胞が、組換え方法により変化したことを意味する。例えば、用語組換えポリヌクレオチドは、ライゲーション、クローニング、増幅組換え、または化学修飾により、異種分子（例えば、異種核酸）に共有結合した第１の核酸配列（例えば、本発明のサイトカイニンシンターゼをコードする配列）を含むポリヌクレオチドを指す。用語組換え体はまた、実験室または産業上の設定において人工的に合成された、ポリヌクレオチドも指す。
【００２５】
用語「組換え体」は、ポリペプチドに関して、ポリペプチドが、組換え方法により、例えば、組換えポリペプチドをコードする、組換えポリヌクレオチドを発現させることにより、産生されたことを意味する。用語組換え体はまた、実験室または産業上の設定において人工的に合成された、ポリペプチドも指す。
【００２６】
用語「遺伝子導入の」は、導入遺伝子を含む細胞または生物を指し、例えば「遺伝子導入植物」は導入遺伝子、すなわち、人間の介入の結果として生物のゲノムに人工的に組み込まれた核酸分子を含む植物を指す。
【００２７】
用語「遺伝子導入事象」は、植物に関して、異種ＤＮＡ、例えば、目的の導入遺伝子を含む、発現カセットでの単一の植物細胞の形質転換および再生により産生された、組換え植物を指す。事象という用語は、異種ＤＮＡを含む、最初の形質転換体および／または形質転換体の子孫を指す。事象という用語はまた、形質転換体と別の植物との間での雌雄の外部交雑により生じた子孫も指す。反復親への戻し交配の繰り返し後であっても、挿入されたＤＮＡ、および形質転換された親由来の隣接ＤＮＡは、同一の染色体位置における交配の子孫に存在する。通常、植物組織の形質転換は複数の事象を生じ、そのそれぞれが、植物細胞のゲノム中の異なる位置へのＤＮＡ構築物の挿入を表す。導入遺伝子の発現、または他の所望の特徴に基づき、特定の事象が選択される。主題を開示する実施形態において、特定の事象は、遺伝子座内に、挿入された遺伝子発現カセットポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
本明細書で使用される用語「天然の」または「自然の」は、自然において見られる状態を定義する。「天然のＤＮＡ配列」は、自然の手段または伝統的育種技術により産生されるが、遺伝子操作（例えば、分子生物学／形質転換技術を使用すること）により生じていない、自然に存在するＤＮＡ配列である。
【００２９】
本明細書で使用される用語「コドン最適化された」または「コドン最適化」は、例えば、宿主細胞において、コード配列の転写を改善するために、および／またはコード配列から転写された転写物ＲＮＡ分子の翻訳を改善するために、既存のコード配列を修飾する（またはコード配列をデザインする）プロセスを指す。コドン最適化は、発現宿主生物のコドン優先を適合させるために、コード配列についてコドンを選択することを含むプロセスを含むが、これに限定されない。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが発現することを意図される、宿主の公知のコドン優先の利点を有するように、合成的に調製されるかまたは変更され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、単子葉植物および双子葉植物の植物種の両方における一部の実施形態において発現されてもよいが、ポリヌクレオチド配列は、単子葉植物または双子葉植物の特異的コドン優先およびＧＣ含有量優先を占めるように、修飾されてもよい（例えば、最適化されてもよい）。例えば、Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-98 (Maize codon usage for 28 genes from maize plants)を参照のこと。
【００３０】
本明細書で使用される用語「単離された」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その自然の環境から取り除かれたことを意味する。「単離されたポリヌクレオチド」あるいは「単離されたポリペプチド」はまた、実験室もしくは産業上の条件下において合成されたかまたは増幅された、それぞれ、ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドも包含する。
【００３１】
本明細書で使用される用語「精製された」は、天然または自然環境において分子または化合物と通常関連する夾雑物を実質的に含まない形態の、分子あるいは化合物の単離に関する。用語は、元の組成物の他の成分から分離されたことの結果として純度が増大した、分子または化合物を記載する。
【００３２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する自然に生じるアミノ酸の化学類似体、もしくは修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用する。
【００３３】
本明細書で使用される用語「異種配列」は、（ｉ）別の核酸配列に共有結合され、隣接し、（ｉ）自然の隣接する他の核酸において見られない、任意の核酸配列である。故に、目的の核酸が、その天然の位置から取り除かれ、目的の核酸に隣接する配列を変更する新規位置に挿入されるとき、新規位置における隣接する配列は「異種配列」である。例えば、外因性ＤＮＡ配列は、別の種、ベクター、および／または遺伝子カセット由来の配列を含んでもよい。
【００３４】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、例えば、共有結合する分子である。サブユニット分子は、同一の化学的タイプの分子であり得るか、または異なる化学的タイプの分子であり得る。
【００３５】
本開示の目的のため、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を、かかる制御配列がコード配列および／または転写された配列に隣接するかどうかに関わらず、含む。従って、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソームエントリー部位のような翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座調節領域を非限定的に含み得る。
【００３６】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される、情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡ、もしくは任意の他のタイプのＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集のようなプロセスにより修飾される、ＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化により修飾される、タンパク質も含む。
【００３７】
本明細書で使用される、用語イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメインは、イソペンテニルピロリン酸ドメインの特徴であるＡＴＰ結合カセット輸送体ヌクレオチド結合（ＡＢＣ＿ＡＴＰａｓｅ）ドメインスーパーファミリー（例えば、受託：ｃｌ２１４５５）におけるドメインとして、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＣＢＩ）ＣＣＤ保存ドメインデータベースにより同定されるアミノ酸の配列を指す。かかるドメインは、例えば、ＭｉａＡおよびｍｉａＡ  ｔＲＮＡジメチルトランスフェラーゼｔＲＮＡデルタ（２）−イソペンテニルピロリン酸トランスフェラーゼ（それぞれ、受託：ＣＯＧ０３２４およびＰＲＫ０００９１）、ｔＲＮＡジメチルアリルトランスフェラーゼ（受託：ＴＩＧＲ００１７４、ＰＬＮ０２８４０、またはＰＬＮ０２７４８）；アデニラートイソペンテニルトランスフェラーゼ（受託：ＰＬＮ０２１６５）；ならびにＩＰＰトランスフェラーゼ、ＥＣ：２．５．１．８；ｔＲＮＡデルタ（２）−イソペンテニルピロリン酸トランスフェラーゼ（受託：ｐｆａｍ０１７１５）を含む。ＣＣＤ保存ドメインデータベースに関する情報について、これらが参照により全体として本明細書に組み込まれるMarchler-Bauer A et al. (2015), Nucl. Acids Res., 43:D222-226およびMarchler-Bauer A et al. (2011), Nucl. Acids Res.,39:D225-229を参照のこと。
【００３８】
本明細書で使用される、用語ホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインは、ＴＩＧＲ００７３０ファミリータンパク質および潜在的リジンデカルボキシラーゼの特徴である、細菌のＴｏｌｌ様受容体（ＴＩＲ）ドメインスーパーファミリーにおけるドメイン（例えば、受託ｃｌ２２４４０）としてＮＣＢＩのＣＣＤ保存ドメインデータベースにより同定される、アミノ酸の配列を指す。かかるドメインは、例えば、ＬＯＧ＿ファミリー＿タンパク質＿ＹＪＬ０５５Ｗ（受託ＴＩＧＲ００７３０）；リジンデカルボキシラーゼ（受託ｐｆａｍ０３６４１）；および予想されるロスマンフォールドヌクレオチド結合タンパク質（受託ＣＯＧ１６１１）を含む。ＣＣＤ保存ドメインデータベースに関する情報について、これらが参照により全体として本明細書に組み込まれるMarchler-Bauer A et al. (2015), Nucl. Acids Res., 43:D222-226 and Marchler-Bauer A et al. (2011), Nucl. Acids Res.,39:D225-229を参照のこと。それらがゲノムデータベースにおいて注釈を付けられた程度まで、本明細書において開示されるサイトカイニンシンターゼのＰＲＨ様ドメインは、リジンデカルボキシラーゼとして誤って注釈を付けられた。この注釈はまた、Kurakawa et al. (2007), Nature 445(8): 652-655により検証された、同一のドメインを含有する他のタンパク質にも誤って適用された。
【００３９】
２つの核酸配列もしくは２つのポリペプチド配列の場面において本明細書で使用される、用語「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウに渡り最大一致のため整列されたとき同一である、２つの配列中の残基を指す。
【００４０】
本明細書で使用される、「配列同一性のパーセンテージ」または「配列同一性のパーセント（％）」への言及は、比較ウィンドウに渡り２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較することにより決定される値であって、比較ウィンドウにおける配列の部分が２つの配列の最適なアライメントのため、（付加または欠損を含まない）参照配列と比較され、付加または欠損（すなわち、ギャップ）を含み得る値を指す。パーセンテージは、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が配列の両方で生じて一致する位置の数を得る、その位置の数を決定すること、一致する位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより、算出される。比較のため配列を整列する方法は、当該技術分野において周知である。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムは、例えば、Smith and Watetman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Bioi. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. A cad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Carpet et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Bioi. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) 1 7 EMS Microbial. Lett. 174:247-50において記載される。配列アライメント方法および相同性の計算の詳細な考察は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Bioi. 215:403-10において見ることができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年））が、the National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD)を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で、いくつかの配列解析プログラムと関連した使用のため入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の記載は、ＢＬＡＳＴ（商標）についての「ヘルプ」セクションの下、インターネット上で入手可能である。核酸配列の比較のため、ＢＬＡＳＴ（商標）（ＢＬＡＳＴＮ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」機能は、デフォルトパラメーターを使用して利用され得る。参照配列に対して次第により高い類似性を有する核酸配列は、この方法により評価されるとき、増大するパーセンテージ同一性を示すだろう。アミノ酸配列の比較のため、ＢＬＡＳＴ（商標）（ＢＬＡＳＴＰまたはｂｌａｓｔｐスイート）プログラムは、デフォルトパラメーターと一緒に使用され、それは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスをデフォルトとして利用して、アミノ酸配列のアライメントを作り出し、整列されたアミノ酸がアライメント中のそれぞれの位置において「陽性」（同一または保存的置換）であるかどうかを決定する。Altschul et al. (1997), Nucl. Acids Res. 25(17):3389-3402を参照のこと。
【００４１】
本明細書で使用される、用語「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的相補性の」は、安定かつ特異的な結合が、非ストリンジェントな条件下で核酸分子と標的核酸分子の間で生じるように、十分な程度の相補性を示す用語である。
【００４２】
特定の程度のストリンジェンシーを生じるハイブリダイズ条件は、選択のハイブリダイゼーション方法、ならびにハイブリダイズしている核酸配列の組成および長さ、性質に依存して変動するだろう。一般に、洗浄の回数もストリンジェンシーに影響するが、ハイブリダイゼーションの温度、およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するだろう。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は当業者に公知であり、例えば、Smnbrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, chapters 9, 10 and 11;ならびにHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985において論じられる。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示およびガイダンスは、例えば、Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratoty Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; and Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995において見られ得る。
【００４３】
本明細書で使用される、「中程度のストリンジェンシー」条件は、その下で、２０％より高い配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしないものであり；「高程度のストリンジェンシー」の条件は、その下で、１０％より高いミスマッチを有する配列がハイブリダイズしないものであり；「非常に高程度のストリンジェンシー」の条件は、その下で、５％より高いミスマッチを有する配列がハイブリダイズしないものである。以下は、代表的な、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
【００４４】
高度にストリンジェンシーな条件（少なくとも９０％の配列同一性を有する、配列を検出する）：５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中、６５℃にて、１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中、室温にて、それぞれ１５分間、２回の洗浄；ならびに０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中、６５℃にて、それぞれ２０分間、２回の洗浄。
【００４５】
中程度にストリンジェンシーな条件（少なくとも８０％の配列同一性を有する、配列を検出する）：５×〜６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中、６５〜７０℃にて、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中、室温にて、それぞれ５〜２０分間、２回の洗浄；ならびに１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中、５５〜７０℃にて、それぞれ３０分間、２回の洗浄。
【００４６】
非ストリンジェントな対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を有する配列がハイブリダイズする）：６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中、室温〜５５℃にて、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×〜３×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中、室温〜５５℃にて、それぞれ２０〜３０分間、少なくとも２回の洗浄。
【００４７】
本明細書で使用される、連続する核酸配列に関して、用語「実質的に相同な」または「実質的な相同性」は、ストリンジェントな条件下で参照核酸配列にハイブリダイズする、連続するヌクレオチド配列を指す。例えば、参照核酸配列に実質的に相同である核酸配列は、中程度にストリンジェントな条件下で参照核酸配列にハイブリダイズする、それらの核酸配列である。実質的に相同な配列は、少なくとも８０％の配列同一性を有する。例えば、実質的に相同な配列は、約８１％；約８２％；約８３％；約８４％；約８５％；約８６％；約８７％；約８８％；約８９％；約９０％；約９１％；約９２％；約９３％；約９４％；約９５％；約９６％；約９７％；約９８％；約９８．５％；約９９％；約９９．５％；約９９．９％、および約１００％のような約８０％〜１００％の配列同一性を有し得る。実質的な相同性の特性は、特異的なハイブリダイゼーションと密接に関連する。例えば、核酸分子は、特異的結合が所望される条件下で、非標的配列への核酸の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在するとき、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００４８】
本明細書で使用される、２つの核酸配列分子は、５’から３’方向で読まれた配列の全てのヌクレオチドが、３’から５’方向で読まれたときの他の配列の全てのヌクレオチドに相補的であるとき、「相補的」であるか、または「相補性」を提示すると言われる。参照ヌクレオチド配列に相補的である、ヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補的配列に同一の配列を提示する。これらの用語および記載は、当該技術分野において十分に定義され、当業者によって容易に理解される。
【００４９】
アミノ酸配列間の配列同一性のパーセンテージを決定するとき、アライメントによりもたらされる所定の位置におけるアミノ酸の同一性が、整列された配列を含むポリペプチドの所望の特性に影響することなく相違し得ることは、当業者によって周知である。これらの例において、パーセント配列同一性は、保存的に置換されたアミノ酸間の類似性を占めるよう調節され得る。これらの調節は、当業者によって周知であり、一般に使用される。例えば、Myers and Miller (1988) Computer Applications in Biosciences 4: 11-7を参照のこと。統計的方法は、当該技術分野において公知であり、同定された５，２８６種の最適なゲノム遺伝子座の分析において使用され得る。
【００５０】
本明細書で使用される、用語「作動可能に連結される」は、２つの部分間で機能的関係を確立する、２つの部分間の結合を指す。例えば、２つのアミノ酸配列が、作動可能に連結され得るか、または２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結され、連続する配列を形成し、第１の配列が第２のものに機能性を与える。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するなら、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結される。組換え的に産生されるとき、作動可能に連結されるヌクレオチド配列は、一般的に連続し、必要であれば、同一のリーディングフレームにおいて２つのタンパク質コード領域を結合する。しかしながら、ヌクレオチド配列は、作動可能に連結されるよう連続である必要はない。
【００５１】
制御配列およびコード配列に関して使用されるとき、用語「作動可能に連結される」は、制御配列が、結合されるコード配列の発現に影響することを意味する。「制御配列」、「制御エレメント」、あるいは「調節エレメント」は、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響する、ヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター；翻訳リーダー配列；イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；リプレッサー結合配列；終結配列；ポリアデニル化認識配列などを含み得る。特定の制御配列は、これに作動可能に連結するコード配列の上流および／または下流に位置し得る。または、コード配列に作動可能に連結される、特定の制御配列は、２本鎖核酸分子の関連する相補鎖に位置し得る。さらなる例において、右および左Ｔ−ＤＮＡ境界は、Ｔ−ＤＮＡ配列に作動可能に連結するとき、プラスミドから他の位置へのＴ−ＤＮＡの転移を可能にするだろう。
【００５２】
２つ以上のアミノ酸配列に関して使用されるとき、用語「作動可能に連結される」は、第１のアミノ酸配列が、さらなるアミノ酸配列の少なくとも１つと機能的に関連することを意味する。
【００５３】
本明細書で使用される、用語「形質転換」または「形質転換すること」は、安定な遺伝を遺伝子的にもたらす、核酸もしくはそのフラグメントの宿主生物への導入および組込みを指す。形質転換している核酸を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」、「組換え」、または「形質転換された」生物と称される。形質転換の公知の方法は、例えば、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）により仲介される形質転換（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）、または別のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）の細菌株を使用して、植物材料を形質転換すること）；リン酸カルシウム形質転換；ポリブレン形質転換；エレクトロポレーション；超音波方法（例えば、ソノポレーション）；リポソーム形質転換；マイクロインジェクション；ネイキッドＤＮＡでの形質転換；プラスミドベクターでの形質転換；ウイルスベクターでの形質転換；微粒子銃形質転換（例えば、微粒子照射）；炭化ケイ素ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）により仲介される形質転換；エアロゾルビーム；およびＰＥＧにより仲介される形質転換を含む。
【００５４】
本明細書で使用される、用語「プラスミド」および「ベクター」は互換的であり、宿主細胞において自己複製するか、または染色体に組込みことができ、宿主細胞にとって異種である１つまたは複数の遺伝子を保有する、組換えエレメントを指す。プラスミドおよびベクターは、典型的には、環状２本鎖ＤＮＡ分子である。しかしながら、プラスミドおよびベクターは、１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの直鎖あるいは環状核酸であってもよく、任意の供給源に由来し得、ここで、多数のヌクレオチド配列が、プロモーターフラグメントおよびコードポリヌクレオチド配列を任意の適当な３’未翻訳配列に沿って細胞に導入する能力がある、固有の構築物に結合されるか、あるいは組み換えられていた。例において、プラスミドおよびベクターは、自己複製配列、ゲノム組込み配列、および／またはファージもしくはヌクレオチド配列を含み得る。
【００５５】
用語「遺伝子発現カセット」は、プロモーターの制御下でポリペプチドをコードし、３’−ＵＴＲにより終結する、異種核酸を含む、核酸構築物を指す。
【００５６】
用語「選択可能なマーカー」は、発現が、遺伝子もしくはポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ構築物またはベクターで形質転換された細胞の同定を可能にする、遺伝子あるいはポリヌクレオチドを指す。選択可能なマーカーの非限定的な例として、除草剤耐性、抗生物質抵抗性、および目に見えるレポーターマーカーを挙げられる。
【００５７】
用語「合成」または「合成する」は、酵素的合成または化学的プロセスを使用したその構成部分からの特定の化合物の形成を指す。
【００５８】
本明細書で使用される、用語「誘導体」は、本開示において説明される配列の修飾を指す。かかる修飾の説明は、細菌種において、本明細書において開示されるコード配列の機能を保存するか、わずかに変化させるか、もしくは増大する、本明細書において開示されるプラスミド／ベクター内のコード配列またはオペロンの核酸配列に関する１つあるいは複数の塩基の置換、挿入、および／または欠損であるだろう。かかる誘導体は、例えば、配列構造を予想し、最適化するためのコンピューターモデリング技術を使用して、当業者により容易に決定され得る。故に、用語「誘導体」はまた、本開示の実施形態を生み出す際に使用するための開示される機能性を有することができるように、本明細書における開示されるコード配列と実質的な配列同一性を有する核酸配列も含む。
【００５９】
詳細な説明
開示される発明は、それぞれ本明細書においてサイトカイニンシンターゼと称される新たなクラスのポリペプチドを提供する。開示される発明はまた、サイトカイニンシンターゼをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のサイトカイニンシンターゼは、２つのドメイン：イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメイン、およびホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインを有する。特定の実施形態において、ＩＰＴ様ドメイン、およびＰＲＨ様ドメインは、図１に示される通り、一緒に共有結合し得る。
【００６０】
植物およびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）における従来のアデノシンリン酸イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）と異なり、開示されるサイトカイニンシンターゼはＰＲＨ様ドメインに共有結合する。さらに、開示されるサイトカイニンシンターゼのＩＰＴ様ドメインは、植物またはアグロバクテリア（Agrobacteria）において公知のＩＰＴのアミノ酸配列に近似せず、共に、公知のｔＲＮＡ−ＩＰＴ酵素に近似しない。例えば、本明細書において開示される、エピクロエ・フェスツカエ（Epichloe festucae）サイトカイニンシンターゼ（ＥｆＣＫＳ）は、酵母ｔＲＮＡ−ＩＰＴに対して３０％未満の配列同一性、および植物シロイヌナズナ属（Arabidopsis）アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ（植物ＩＰＴ１）に対してなおより低い配列同一性、および基準のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）ＩＰＴに対して１０％未満の配列同一性を有するＩＰＴ様ドメインを含む。驚くべきことに、開示されるサイトカイニンシンターゼは、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）由来のサイトカイニン（ｉＰ）の新規生合成についての複数のアッセイにおいて活性を提示する。
【００６１】
本明細書において開示される活性の驚くべき性質は、ＰＲＨドメインを含有する酵素の非常にわずかな特徴が存在するという事実により強調される。さらに、ＰＲＨ様ドメインをコードする遺伝子は、サイトカイニンを作製しない多くの生物において見られる。それ故に、サイトカイニンシンターゼをサイトカイニン産生に結びつける前に、開示されるサイトカイニンシンターゼ活性が、本明細書において開示される本発明を予想することはできなかった。
【００６２】
単離されたポリヌクレオチドおよびコドン最適化ポリヌクレオチド
一態様において、本発明は、本明細書において開示される２つのドメインのサイトカイニンシンターゼをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書において使用される用語、単離された、はポリヌクレオチドが、その自然の環境から取り除かれたこと、あるいはポリヌクレオチドが、例えば、実験室もしくは産業上の設定において、非自然的に合成されるか、または増幅されたことを意味する。故に、一実施形態において、本発明は、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のサイトカイニンシンターゼをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のサイトカイニンシンターゼをコードする、単離されたポリヌクレオチドも提供する。ある特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、精製されたポリヌクレオチド、例えば、かかるポリヌクレオチド、またはその天然もしくは自然環境における類似のものと通常関連する他の分子を実質的に含まないものである。従って、例えば、配列番号３、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、または配列番号２５のサイトカイニンシンターゼをコードする単離されたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドが乾燥重量で非ポリヌクレオチドの細胞物質を５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多く含まないように精製され得る。または、例えば、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のサイトカイニンシンターゼをコードする単離されたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドが、乾燥重量で非ポリヌクレオチドの細胞物質を５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多く含まないように精製され得る。ポリヌクレオチドの純度を達成し、確かにする方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Tan et al., J. Biomedicine and Biotech., Article ID 574398 (2009); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); and Adila et al. Mal. J. Microbiol., 3(1): 7-13 (2007)を参照のこと。
【００６３】
特定の実施形態において、前述のサイトカイニンシンターゼをコードする単離されたポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）であり、これらの実施形態のある特定の例において、単離されたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドが、乾燥重量で非ポリヌクレオチドの細胞物質を５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多く含まないように、精製される。
【００６４】
他の実施形態において、本発明は、前述のサイトカイニンシンターゼのそれぞれに相同である、サイトカイニンシンターゼをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、コードされた相同体がサイトカイニンシンターゼ活性を有する、単離されたポリヌクレオチドを提供する。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つに実質的に相同である、サイトカイニンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。実施例４においてアミノ酸配列同一性解析により示される通り、本発明は、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して少なくとも５７％または５８％のアミノ酸配列同一性を有し、サイトカイニンシンターゼ活性を有する、ポリヌクレオチドおよびコードされるサイトカイニンシンターゼを提供する。本発明はまた、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して少なくとも６０％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し、サイトカイニンシンターゼ活性を有する、ポリヌクレオチドおよびコードされるサイトカイニンシンターゼを提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８０％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を有する、ポリヌクレオチドおよびコードされるサイトカイニンシンターゼを提供する。ある特定の例において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼをコードする。さらなる例において、配列番���３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つに対して約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。任意選択で、サイトカイニンシンターゼをコードする単離されたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドが、乾燥重量で非ポリヌクレオチドの細胞物質を５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多く含まないように精製される。変動し得るアミノ酸、および相同なサイトカイニンシンターゼにおいて大部分保存されるべきものが、以下でより詳細に論じられる。サイトカイニンシンターゼ活性相同サイトカイニンシンターゼは、任意の方法、例えば、本明細書において開示される方法、または当該技術分野において公知の方法により決定され得る。
【００６５】
なお別の実施形態において、本発明は、配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに実質的に相同である、サイトカイニンシンターゼをコードする、さらなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。実質的に相同な単離されたポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８０％〜約１００％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のヌクレオチド配列同一性を有し得る。任意選択で、サイトカイニンシンターゼをコードするこの単離されたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドが、乾燥重量で非ポリヌクレオチドの細胞物質を５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多く含まないように精製される。
【００６６】
別の態様において、本発明はまた、本明細書において開示されるサイトカイニンシンターゼのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、コード配列が、宿主細胞における発現のためコドン最適化される、単離されたポリヌクレオチドも提供する。コード配列をコドン最適化するための特定の宿主細胞および方法は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される。故に、この態様の一実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号３、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、または配列番号２５のうち１つのサイトカイニンシンターゼをコードし、（ｉｉ）例えば、細菌、酵母、植物、双子葉植物、単子葉植物、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、コムギ、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、コメ、ヒマワリ、芝生、クリーピングベントグラス、トールフェスク、タバコ、またはポプラハイブリッド細胞のような宿主細胞における発現のためコドン最適化される、コード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つのサイトカイニンシンターゼをコードし、（ｉｉ）例えば、細菌、酵母、植物、双子葉植物、単子葉植物、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、コムギ、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、コメ、ヒマワリ、芝生、クリーピングベントグラス、トールフェスク、タバコ、またはポプラハイブリッド細胞のような宿主細胞における発現のためコドン最適化される、コード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００６７】
さらなる実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも６０％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼをコードし、（ｉｉ）例えば、細菌、酵母、植物、双子葉植物、単子葉植物、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、コムギ、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、コメ、ヒマワリ、芝生、クリーピングベントグラス、トールフェスク、タバコ、またはポプラハイブリッド細胞のような宿主細胞における発現のためコドン最適化される、コード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８０％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼをコードし、（ｉｉ）例えば、細菌、酵母、植物、双子葉植物、単子葉植物、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、コムギ、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、コメ、ヒマワリ、芝生、クリーピングベントグラス、トールフェスク、タバコ、またはポプラハイブリッド細胞のような宿主細胞における発現のためコドン最適化される、コード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、コドン最適化された、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼをコードし得る。別の例において、本発明は、（ｉ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つに対して約８０％以上；８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼをコードし、（ｉｉ）例えば、細菌、酵母、植物、双子葉植物、単子葉植物、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、コムギ、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、コメ、ヒマワリ、芝生、クリーピングベントグラス、トールフェスク、タバコ、またはポプラハイブリッド細胞のような宿主細胞における発現のためコドン最適化される、コード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。変動し得るアミノ酸、および相同なサイトカイニンシンターゼにおいて大部分保存されるべきものが、以下でより詳細に論じられる。任意選択で、サイトカイニンシンターゼをコードする、単離された、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドが、乾燥重量で非ポリヌクレオチドの細胞物質を５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多く含まないように精製される。
【００６８】
本発明のコドン最適化ポリヌクレオチドは、細菌、酵母、植物、双子葉植物、単子葉植物、トウモロコシ（トウモロコシ（Zea mays））、ダイズ（ダイズ（Glycine max））、キャノーラ（セイヨウアブラナ（Brassica napus）もしくはブラッシカ・ラパ（Brassica rapa））、ワタ（リクチメン（Gossypium hirsutum）もしくはゴシピウム・バルバデンセ（Gossypium barbadense））、コムギ（例えば、コムギ（Triticum aestivum）もしくはデュラムコムギ（Triticum durum））、またはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、コメ（例えば、イネ（Oryza sativa））における発現のためコドン最適化され得る。他の実施形態において、本発明のコドン最適化ポリヌクレオチドは、ヒマワリ（ヒマワリ（Helianthus annuus））、芝生、クリーピングベントグラス（例えば、ハイコヌカグサ（Agrostis stolonifera））、トールフェスク（オニウシノケグサ（Festuca arundinacea））、タバコ（タバコ（Nicotiana tabacum））、およびポプラ（例えば、ポプラ属（Populus）のメンバー）ハイブリッド、またはユリノキ（Liriodendron tulipifera）における発現のためコドン最適化され得る。特定の種において観察されるコドン使用頻度ならびにパターンに基づきコドンを最適化する方法は周知であり、例えば、公的に入手可能なコドン使用データベースおよびソフトウエアパッケージを使用して行われ得る。例えば、Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28(1): 292 (2000); Bode et al., Nucl. Acids Res., 37(Web Server issue):W214-221 (2009); Liu et al., Mol. Bioi. Rep., 37(2)6777-684 (2010); Y. Batard et al., Arch. Biochem. Biophys., 379: 161-169 (2000); Gustafsson et al., Trends in Biotech, 22(7): 346-3536 (2004)を参照のこと。
【００６９】
本発明の単離されたポリヌクレオチドのいずれかが、既存の核酸鋳型を必要としない、人工遺伝子合成の方法を使用して、新規に合成され得る。一部の実施形態において、かかる方法は、本発明の合成の単離されたポリヌクレオチドを完全に生じるための、例えば、アニーリング、ライゲーション、および／またはポリメラーゼ反応により続いて構築される、遺伝子フラグメントの固相ＤＮＡ合成を含む。例えば、Schwartz et al., Nat. Methods, 9(9): 913-915 (2012)およびTian et al., Mol. BioSyst., 5:714-722 (2009)を参照のこと。他の実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、および／または変異誘発（必要であれば）のようなより従来の組換え技術により生み出され得る。例えば、サイトカイニンシンターゼをコードするｃＤＮＡが、エピクロエ・フェスツカエ（Epichloe festucae）、エピクロエ・ガンスエンシス（Epichloe gansuensis）、バランシア・オブテクタ（Balansia obtecta）、イリオネクテリア・ラジコラ（Ilyonectria radicola）、タケてんぐ巣病菌（Aciculosporium take）、アトキンソネラ・ヒポキシロン（Atkinsonella hypoxylon）、またはフザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）のような植物関連真菌から生み出され、それぞれ、ＥｆＣＫＳ、ＢｏＣＫＳ、ＩｒＣＫＳ、ＡｔＣＫＳ、ＡｈＣＫＳ、またはＦｆＣＫＳのような本発明の２つのドメインサイトカイニンシンターゼをコードする非自然的ポリヌクレオチドが作製され得る。かかるｃＤＮＡを、ＰＣＲ、変異誘発、部位指定変異誘発により修飾して、変異体、例えば、本発明のコドン最適化された、単離されたポリヌクレオチドを作製してもよい。
【００７０】
組換えポリヌクレオチド、宿主細胞、および関連する方法
さらなる態様において、本発明は、異種ポリヌクレオチド配列に共有結合した、本明細書において開示される、サイトカイニンシンターゼコードポリヌクレオチドのいずれかを含む組換えポリヌクレオチドを提供する。異種配列は、サイトカイニンシンターゼコード配列に共有結合した、自然に見られない、任意の配列であり得る。かかる異種配列の例としては、異種プロモーター配列、ベクター配列、遺伝子カセット配列、プロモーター配列、終結配列、またはタンパク質融合タグをコードする配列が挙げられる。
【００７１】
故に、一実施形態において、本発明は、サイトカイニンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、以下の配列のうち１つに共有結合した異種配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、結合したコード配列が、
（ｉ）サイトカイニンシンターゼ、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）をコードする；
（ｉｉ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに実質的に相同であるサイトカイニンシンターゼをコードする；
（ｉｉｉ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約５７％以上、約５８％以上、約６０％以上、約６２％以上、約６３％以上、約６４％以上、約６５％以上、約６６％以上、約６７％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼをコードする；
（ｉｖ）配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）を含む；
（ｖ）配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して実質的に相同である、配列を含む；
（ｖｉ）配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約５７％以上、約５８％以上、約６０％以上、約６２％以上、約６３％以上、約６４％以上、約６５％以上、約６６％以上、約６７％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のヌクレオチド配列同一性を有する配列を含む；
（ｖｉｉ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つのサイトカイニンシンターゼをコードするコドン最適化配列を含む、
（ｖｉｉｉ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約５７％以上、約５８％以上、約６０％以上、約６２％以上、約６３％以上、約６４％以上、約６５％以上、約６６％以上、約６７％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼをコードするコドン最適化配列を含む；
（ｉｘ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼ変異体をコードするコドン最適化配列を含む、
（ｘ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４；のサイトカイニンシンターゼをコードする、
（ｘｉ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４；のうち１つに実質的に相同であるサイトカイニンシンターゼをコードする、
（ｘｉｉ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つに対して約５７％以上、約５８％以上、約６０％以上、約６２％以上、約６３％以上、約６４％以上、約６５％以上、約６６％以上、約６７％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼをコードする、
（ｘｉｉｉ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のサイトカイニンシンターゼをコードするコドン最適化配列を含む、
（ｘｉｖ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つに対して約５７％以上、約５８％以上、約６０％以上、約６２％以上、約６３％以上、約６４％以上、約６５％以上、約６６％以上、約６７％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼをコードする、コドン最適化配列を含む、
（ｘｖ）前述の（ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれか１つの２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列であって、コード配列は、図６における（配列番号３、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２５の）コンセンサス配列と共に整列するとき、（ｉ）コンセンサス配列アミノ酸位置１３〜２０において第１のモチーフ：ＧＰＴＸａａ１Ｘａａ２ＧＫＴ（配列番号３０）（式中、Ｘａａ１は、ＧまたはＡであり、Ｘａａ２は、Ｖ、Ｓ、Ａ、またはＴである）；（ｉｉ）コンセンサス配列アミノ酸位置９６〜１０４において第２のモチーフ：ＰＸａａ３Ｘａａ４Ｘａａ５ＧＧＳＸａａ６Ｓ（配列番号３１）（式中、Ｘａａ３は、ＩまたはＶであり、Ｘａａ４は、ＬまたはＶであり、Ｘａａ５は、ＶまたはＣであり、Ｘａａ６は、ＴまたはＩである）；（ｉｉｉ）コンセンサス配列アミノ酸位置３３３〜３３８において第３のモチーフ：Ｘａａ７Ｘａａ８ＹＧＧＧ（配列番号３２）（式中、Ｘａａ７は、ＬまたはＩであり、Ｘａａ８は、ＶまたはＩである）、および（ｉｖ）コンセンサス配列アミノ酸位置４２６〜４３８において第４のモチーフ：Ｘａａ９ＧＧＹＧＴＸａａ１０ＥＥＬ（配列番号３３）（式中、Ｘａａ９は、ＳまたはＰであり、Ｘａａ１０は、ＬまたはＭである）も含む。図６における、用語「コンセンサス配列と共に整列するとき」は、（ｘｖ）のサイトカイニンシンターゼコード配列が、本明細書における実施例６において記載される、配列番号３、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２５と共に整列することを意味する。図３０における模式図は、（ｘｖ）の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列内の４つのモチーフの相対的位置を示す。
【００７２】
本発明のある特定の実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、ベクター配列、発現カセット、異種プロモーター（例えば、植物プロモーター、細菌プロモーター、異種真菌プロモーター、もしくは酵母プロモーター）、または異種ターミネーター配列（例えば、植物、細菌、もしくは酵母において使用するため）に共有結合した、前述の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｉ）〜（ｘｖ）のいずれかを含む。組換えポリヌクレオチドは、細菌、酵母または植物のような宿主細胞において、コードされたサイトカイニンシンターゼの組換え発現のため使用することができる。故に、組換えポリヌクレオチドは、細菌における発現のためコード最適化され、細菌ベクター、発現カセット、および／またはプロモーターに共有結合する、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、あるいは（ｘｖ）のコード配列を含み得る。組換えポリヌクレオチドは、酵母における発現のためコード最適化され、酵母ベクター、発現カセット、および／またはプロモーターに共有結合する、コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、あるいは（ｘｖ）を含み得る。組換えポリヌクレオチドは、植物における発現のためコドン最適化され、植物ベクター、発現カセット、および／またはプロモーターに共有結合する、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、あるいは（ｘｖ）のコード配列を含み得る。特定の例において、組換えポリヌクレオチドは、双子葉植物もしくは単子葉植物における発現に最適化され、それぞれ、双子葉植物もしくは単子葉植物のため、ベクター、発現カセット、および／またはプロモーターに共有結合する、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、あるいは（ｘｖ）のコード配列を含む。他の特定の例において、組換えポリヌクレオチドは、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、コムギ、もしくはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）における発現に最適化され、それぞれ、トウモロコシ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、コムギ、またはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のためのベクター、発現カセット、および／またはプロモーターに共有結合する、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、あるいは（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、あるいは（ｘｖ）のコード配列を含む。なお他の特定の例において、組換えポリヌクレオチドは、コメ、ヒマワリ、芝生、クリーピングベントグラス、トールフェスク、タバコ、もしくはポプラハイブリッドにおける発現に最適化され、それぞれ、コメ、ヒマワリ、芝生、クリーピングベントグラス、トールフェスク、タバコ、またはポプラハイブリッドのためのベクター、発現カセット、および／または  プロモーターに共有結合する、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、あるいは（ｘｖ）のコード配列を含む。ベクター、発現カセット、およびプロモーターは、以下でより詳細に論じられる。
【００７３】
さらなる例において、組換えポリヌクレオチドは、植物における発現のためコード最適化され、植物ベクターもしくは発現カセットに共有結合する、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）のコード配列を含み得る。組換えポリヌクレオチドは、酵母もしくは細菌宿主細胞における発現のためコード最適化され、それぞれ、酵母プロモーターもしくは細菌プロモーターに共有結合する、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）のコード配列を含み得る。
【００７４】
本発明の他の実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、タンパク質融合タグをコードする配列に共有結合する、前述の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｉ）〜（ｉｘ）のいずれかを含む。コードされるタンパク質融合タグは、ポリ−ヒスチジン、ポリ−アルギニン、ハロアルカンデハロゲナーゼ、ストレプトアビジン結合、グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、Ｎ−利用サブスタンスＡ（ＮｕｓＡ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＩ（ＤｓｂＡ）、Ｍｉｓｔｉｃ、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、またはＴｒｐＥ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素抗原（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、１Ｄ４、カルモジュリン結合ペプチド、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、Ｓ−タグ、またはＳｏｆｔａｇ３タンパク質融合タグであり得る。これらは、本発明の任意のサイトカイニンシンターゼを産生するか、単離するか、または精製する方法において使用することができる。
【００７５】
宿主細胞、植物、および本発明の組換えサイトカイニンシンターゼを作製する方法
別の態様において、本発明はまた、サイトカイニンシンターゼをコードする、本明細書において開示される単離されたもしくは組換えポリヌクレオチドの任意の実施形態または例を含む、宿主細胞を提供する。別の態様において、本発明は、本発明の単離されたもしくは組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に形質転換することまたはトランスフェクトすることを含む、かかる宿主細胞を作製する方法を提供する。従って、本発明は、前述の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｉ）〜（ｉｘ）のうち１つ（もしくは複数）を含む、上で開示された組換えポリヌクレオチドを内部に持つ、細菌、酵母または植物宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態において、２つのドメインの組換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがコドン最適化される適当な宿主細胞において、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、または（ｉｘ）を含む。例えば、本発明は、細菌に最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、または（ｉｘ）を含む、細菌細胞を提供する。別の例において、本発明は、酵母に最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、または（ｉｘ）を含む、酵母細胞を提供する。細菌および酵母宿主細胞の形質転換またはトランスフェクション方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)を参照のこと。
【００７６】
なお他の例において、本発明は、双子葉植物に最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入双子葉植物細胞；単子葉のためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入単子葉植物細胞；トウモロコシのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、または（ｉｘ）を含む、遺伝子導入トウモロコシ植物細胞；ダイズのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入ダイズ植物細胞；キャノーラのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入キャノーラ植物細胞；ワタに最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）を含む、遺伝子導入ワタ植物細胞；コムギに最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入コムギ植物細胞；およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物細胞を提供する。なお他の例において、本発明は、コメのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）を含む、遺伝子導入コメ植物細胞；ヒマワリのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入ヒマワリ植物細胞；クリーピングベントグラスのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入クリーピングベントグラス植物細胞；トールフェスクのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入トールフェスク植物細胞；タバコのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を��む、遺伝子導入タバコ植物細胞；およびポプラのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入ポプラ細胞を提供する。
【００７７】
別の態様において、本発明は、前述の植物宿主細胞のいずれかから再生される、遺伝子導入植物を提供する。この点において、組換えポリヌクレオチドは、植物形質転換体のためのベクターもしくは発現カセットに共有結合する、上述の（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）のコドン最適化コード配列を含み得る。例えば、本発明は、双子葉植物に最適化され、例えば、適当なベクターまたは発現カセット内にある、コドン最適化コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入双子葉植物；単子葉のためコドン最適化される、コドン最適化コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入単子葉植物；トウモロコシのためコドン最適化される、コドン最適化コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入トウモロコシ植物；ダイズのためコドン最適化される、コドン最適化コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入ダイズ植物；キャノーラのためのコドン最適化される、コドン最適化コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入キャノーラ植物；ワタに最適化される、コドン最適化コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入ワタ植物；コムギに最適化される、コドン最適化コード配列（ｖｉｉｉ）（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入コムギ植物；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物、およびコメのためコドン最適化される、コドン最適化コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入コメ植物を提供する。なお他の例において、本発明は、ヒマワリのためコドン最適化される、コドン最適化コード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入ヒマワリ植物；クリーピングベントグラスのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入クリーピングベントグラス植物；トールフェスクのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入トールフェスク植物；タバコのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、ま��は（ｘｖ）を含む、遺伝子導入タバコ植物；およびポプラのためコドン最適化される、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、遺伝子導入ポプラを提供する。
【００７８】
遺伝子導入植物を作製するために植物を形質転換する方法は、当該技術分野において公知であり、以下でより詳細に論じられる。
【００７９】
本発明はまた、本明細書において開示される、組換えサイトカイニンシンターゼを作製する方法も提供する。一態様において、方法は、２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｉ）〜（ｘｖ）のいずれかを含む、前述の宿主細胞のいずれかにおいてサイトカイニンシンターゼを発現させることを含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、上で開示された（ｉ）〜（ｘｖ）のいずれか１つのサイトカイニンシンターゼコード配列が、タンパク質融合タグをコードする配列に共有結合して、（ｉ）〜（ｘｖ）のいずれか１つによりコードされるサイトカイニンシンターゼを検出すること、単離すること、および精製することを促進する、組換えポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、宿主細胞は、ポリヌクレオチドがコドン最適化される、適当な宿主細胞において、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、組換えポリヌクレオチドを含む。例えば、本発明の組換えサイトカイニンシンターゼを作製する方法は、細菌に最適化され、任意選択でタンパク質融合タグに共有結合する、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、細菌細胞において、サイトカイニンシンターゼを発現させることを含み得る。別の例において、方法は、酵母に最適化され、任意選択でタンパク質融合タグに共有結合する、コドン最適化された２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、酵母細胞においてサイトカイニンシンターゼを発現させることを含み得る。
【００８０】
さらなる実施形態において、方法は、例えば、乾燥重量で宿主細胞物質を５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多く含まないように、発現されたサイトカイニンシンターゼを宿主細胞から単離すること、および任意選択でコードされたサイトカイニンシンターゼを精製することを含み得る。
【００８１】
本発明の単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼ
別の態様において、本発明は、２つのドメイン：イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメイン、およびサイトカイニンヌクレオチドホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインを有する単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼを提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）の単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼを提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４の単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼを提供する。ある特定の実施形態において、単離されたサイトカイニンシンターゼは精製され、かかるポリヌクレオチドまたはその天然または自然環境における類似のものと通常関連する他の分子を実質的に含まない。従って、例えば、配列番号３、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４の単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼは、サイトカイニンシンターゼが、乾燥重量で、５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多くの細胞および他の（非サイトカイニンシンターゼ）物質を含まないように精製され得る。精製されたサイトカイニンシンターゼが他の物質を含まない程度は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析およびタンパク質染色での分析を含む、当該技術分野で公知の方法により容易に決定することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)を参照のこと。
【００８２】
別の実施形態において、本発明は、前述のサイトカイニンシンターゼのそれぞれに相同であり、サイトカイニンシンターゼ活性を有する、単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼを提供する。単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼは、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つに実質的に相同であり得る。例えば、単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼは、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して、約５７％以上、約５８％以上、約６０％以上、約６２％以上、約６３％以上、約６４％以上、約６５％以上、約６６％以上、約６７％以上、約７０％以上、約７５％以上、または約８０％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を有し得る。ある特定の例において、単離されたあるいは組換えサイトカイニンシンターゼは、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。さらなる例において、単離されたあるいは組換えサイトカイニンシンターゼは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つに対して約８０％以上；約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。任意選択で、単離されたあるいは組換えサイトカイニンシンターゼ変異体は、単離されたポリヌクレオチドが、乾燥重量で細胞物質または他の物質を５０％より多く、６０％より多く、７��％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、もしくは９９％より多く含まないように精製される。
【００８３】
アミノ酸は、図６において示される配列アライメントによりもたらされるガイダンスを使用して、本発明の特定のサイトカイニンシンターゼへの置換、欠損、または付加により変化し得る。こうして生じたサイトカイニンシンターゼ誘導体は、任意の公知の方法、例えば、本明細書において開示される方法、または当該技術分野において公知の方法を使用して、サイトカイニンシンターゼ活性を確認するために容易に試験され得る。例えば、Barry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4776-4780 (1984)およびKakimoto, Plant Cell Physiol., 42 (7): 677-685 (2001)を参照のこと。この点において、配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）の配列は、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）または配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）のいずれかの配列に約６０％のみ同一であり、なお３つ全てが、図６に示されるサイトカイニンシンターゼ活性を提示する。配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）の配列は、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）または配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）に７０％未満同一であり、なおこれらの３つの全ても、図６に示されるサイトカイニンシンターゼ活性を提示する。それ故に、当業者は、前述の配列の機能的サイトカイニンシンターゼ誘導体が、複数の置換、欠損、または付加により容易に作製され得ることを理解するだろう。特定の実施形態において、機能的サイトカイニンシンターゼ誘導体は、図６において同定される保存されたアミノ酸残基の大部分もしくは全てが変化しないとき、複数の置換、欠損、または付加を含み得る。
【００８４】
図６におけるサイトカイニンシンターゼ内の保存されたアミノ酸残基は、囲みにより示される。本発明の特定の実施形態において、サイトカイニンシンターゼ誘導体は図６における配列の１つに基づき、示される保存されたアミノ酸残基のいずれか（例えば、タンパク質融合タグを付加するときに容易に変化し得る、描かれる配列の第１の位置における開始メチオニンを除く）を変化させることなく、作製される。他の実施形態において、少数（例えば、１、２、３、４、５、または６つ）のかかる保存された残基は、保存的置換により変化し得る。
【００８５】
加えて、サイトカイニンシンターゼは、サイトカイニンシンターゼ活性のわずかな効果を有すると同定される保存されたアミノ酸位置において変化し得る。図６は、変更したとき、（◇により示される）塗りつぶされていないひし形による活性に対してわずかな効果を有する、保存されたアミノ酸を示す。サイトカイニンシンターゼ活性に対してわずかな効果を有する変異を含む、サイトカイニンシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、野生型活性より低いものが所望されるとき、使用することができる。従って、本発明は、野生型活性から少量低減した活性（例えば、わずかな効果を有するとして図６および以下の表９に示される変異体）の範囲にある活性を有する、サイトカイニンシンターゼを提供する。図６はまた、図６において（くさび形（▲）により示される）活性に対して重大な効果を有するとして同定されるアミノ酸に対する変異も示す。本明細書において具体的に開示されるサイトカイニンシンターゼにおいて、種々の保存されたアミノ酸を変異誘発することの効果についてのさらなる詳細については、実施例５、ならびに以下の表８および９を参照のこと。
【００８６】
加えて、図６におけるサイトカイニンシンターゼ配列のうち保存されていないアミノ酸残基（囲まれていない残基）のセクションにおける有意なバリエーション、および本明細書において実施例において開示されるサイトカイニンシンターゼ活性アッセイ結果を考慮して、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）  配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４の配列のそれぞれが、サイトカイニンシンターゼ活性を依然保持しながら、最大５、最大１０、最大１５、最大２０、最大２５、最大３０、最大３５、または最大４０個のアミノ酸付加、欠損、または置換を含むよう変化し得ることは容易に明らかである。この点において、バリエーションが保存的置換であるなら、高い確率の活性の保持も生じるだろう。アミノ酸は、次のクラス：非極性、無電荷の極性、塩基性、および酸性に入り得る。１つのクラスのアミノ酸が同一タイプの別のアミノ酸で置換される保存的置換は、変異体の生物学的活性を物質的に最も変化させそうにない。表１は、それぞれのクラスに属するアミノ酸の例のリストを提供する。
【００８７】
【表１】
2017522001.tif 000003
【００８８】
ある場合において、非保存的置換も作製され得る。決定的な要因は、これらの置換が、変異体のサイトカイニンシンターゼ活性を有意に損なってはいけないことである。配列レベルにおいて異なるが、同一または類似の全体的な本質的３次元構造、表面電荷分布などを保持する、サイトカイニンシンターゼ変異体もデザインすることができる。例えば、米国特許第７０５８５１５号明細書；Larson et al., Protein Sci., 11: 2804-2813 (2002); Stemmer, Nature, 370:389-391 (1994); Stemmer, Bio/Technology, 13: 549-553 (1995)およびCrameri et al. Nat. Med., 2: 100-103. (1996), Crameri et al., Nat. Biotech. 14: 315-319 (1996), Crameri et al., Nat. Biotech., 15: 436-438 (1997)、ならびに米国特許第８，５１３，４９２号明細書を参照のこと。例えば、（図６におけるコンセンサスアライメントのそれぞれ、位置３４３もしくは３６７において示される）メチオニンまたはロイシンについてのアラニンの保存的置換は、サイトカイニンシンターゼ変異体の活性に有意に影響しない。
【００８９】
前述のものの特定の例において、単離されたまたは組換えサイトカイニンシンターゼは、タンパク質融合タグに共有結合する。故に、本発明は、
（ａ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のサイトカイニンシンターゼ；
（ｂ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに実質的に相同である、サイトカイニンシンターゼ；
（ｃ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約５７％以上、約５８％以上、約６０％以上、約６２％以上、約６３％以上、約６４％以上、約６５％以上、約６６％以上、約６７％以上、約７０％以上、約７５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼ；
（ｄ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８０％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼ；
（ｅ）配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、もしくは配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のうち１つに対して約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼ；
（ｆ）最大５、最大１０、最大１５、最大２０、最大２５、最大３０、最大３５、もしくは最大４０個のアミノ酸付加、欠損、または置換を有する配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、および配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）の配列を含む、サイトカイニンシンターゼ、
（ｇ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のサイトカイニンシンターゼ、
（ｈ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４のうち１つに対して約８０％以上；約８１％以上；約８２％以上；約８３％以上；約８４％以上；約８５％以上；約８６％以上；約８７％以上；約８８％以上；約８９％以上；約９０％以上；約９１％以上；約９２％以上；約９３％以上；約９４％以上；約９５％以上；約９６％以上；約９７％以上；約９８％以上；約９８．５％以上；約９９％以上；約９９．５％以上；または約９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有する、サイトカイニンシンターゼ、
（ｉ）最大５、最大１０、最大１５、最大２０、最大２５、最大３０、最大３５、もしくは最大４０個のアミノ酸付加、欠損、または置換を有する配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４の配列を含む、サイトカイニンシンターゼ、あるいは
（ｊ）前述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、または（ｉ）のいずれか１つのサイトカイニンシンターゼであって、図６におけるコード配列とのアライメントにおける配列が、図６のアライメントコンセンサス位置１３〜２０（配列番号３０）に対応する、コンセンサス位置９６〜１０４（配列番号３１）における、コンセンサス位置３３３〜３３８（配列番号３２）における、およびコンセンサス／アライメント位置４２６〜４３８（配列番号３３）におけるモチーフを含む、サイトカイニンシンターゼに結合するタンパク質融合タグを含む、単離されたサイトカイニンシンターゼを提供する。
【００９０】
特定の例において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、または（ｊ）のサイトカイニンシンターゼは、ポリ−ヒスチジン、ポリ−アルギニン、ハロアルカンデハロゲナーゼ、ストレプトアビジン結合、グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、Ｎ−利用サブスタンスＡ（ＮｕｓＡ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＩ（ＤｓｂＡ）、Ｍｉｓｔｉｃ、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、またはＴｒｐＥ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素抗原（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、１Ｄ４、カルモジュリン結合ペプチド、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、Ｓ−タグ、またはＳｏｆｔａｇ３タンパク質融合タグである、タンパク質融合タグに結合する。
【００９１】
サイトカイニンの製剤および使用方法
本発明の単離されたあるいは組換えサイトカイニン、例えば、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、または（ｊ）のサイトカイニンシンターゼを、不活性な成分と混合して、食用作物、飼料作物、野菜作物、温室食用作物、温室非食用作物、森林定植している屋外の住居用植物、および／または屋内の住居用植物への散布に有用である、製剤を作り出すことができる。
【００９２】
故に、本発明は、以下の植物クラス：
食用作物：アニス、アスパラガス、バナナ、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、ニンジン（上部を含む）、ササゲ（エルサレム／マーブルマメ）、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、フェンネル、ガルバンゾ（ヒヨコマメを含む）、ニンニク、リーク、レタス、メロン、カンタループ、ハネデュー、マスクメロン、スイカ、オクラ、タマネギ、パセリ、モモ、コショウ、ペッパー（チリタイプ）、プランタン、カボチャ、ラディッシュ、シャロット、ホウレンソウ、スカッシュ（全てまたは未特定）、イチゴ、サツマイモ、コムギ、ヤムイモ、
食用作物および飼料作物：リンゴ；マメ；乾燥型マメ；リョクトウ；多肉マメ（リマ）；多肉マメ（スナップ）；ビーツ；柑橘；コーン；飼料用コーン；コーン（ポップまたはスィート）；ワタ；カウピー／黒ササゲマメ；ブドウ；葉野菜；オレンジ；ピーナッツ；フィールドピー；キマメ；ササゲ；ジャガイモ／アイルランド；コメ；モロコシ；モロコシ；ダイズ糖ビーツ；トマト；ライコムギ；コムギ、
飼料作物：アルファルファ、ケープ、ルピナス、
温室食用作物：アスパラガス；バナナ；マメ；ブロッコリー；ブロッコリー、中国産；芽キャベツ；キャベツ；ニンジン（上部を含む）；カリフラワー；セロリ；ポップコーン；スィートコーン；キュウリ；ウリ科の野菜；ナス；レタス；メロン；ネクタリン；タマネギ；パセリ；パセリ、カブの根；モモ；コショウ；ペッパー（チリタイプ）；オオバコ；ポテト、ホワイト／アイルランド；カボチャ；ラディッシュ；シャロット；ホウレンソウ；スカッシュ（全てまたは未特定）；スカッシュ（冬）；スカッシュ（ズッキーニ）；イチゴ；サツマイモ；トマト、
非食用作物：市販／産業用の芝生、果実（未特定）、ゴルフコースターフ、ナツメ、鑑賞用芝生およびターフ、鑑賞用芝農場（ターフ）、レクリエーションエリアの芝生、小さな果実、
屋外の住居用および温室非食用：鑑賞用および／または日よけの木、鑑賞用草木、鑑賞用芝生およびターフ、鑑賞用隠花植物、鑑賞用木の茂みおよびつる植物、
森林：森林植樹（森林再生プログラム）、マツ（森／防風林）、
屋外の住居用：鑑賞用芝生およびターフ、
屋内の住居用：鑑賞用の木、鑑賞用草木、鑑賞用隠花植物
のうち１つもしくは複数への散布に適した１つまたは複数の適当な、不活性な成分との混合物中に（本明細書に記載される本発明のサイトカイニンシンターゼにより産生される）サイトカイニンを含む、サイトカイニンシンターゼ製剤を提供する。
【００９３】
本発明はまた、サイトカイニンを植物レギュレーターとして散布する方法も提供する。方法は、前述の植物クラスの１つ、すなわち、食用作物、食用作物および飼料作物、飼料作物、温室食用作物、非食用作物、屋外の住居用もしくは温室非食用植物、森林植物、屋外の居住用植物、または屋内の居住用植物に属する植物に適した１つまたは複数の不活性な成分との混合物中に（本明細書に記載される発明のサイトカイニンシンターゼにより産生される）サイトカイニンを含む、製剤を散布することを含む。一部の散布において、サイトカイニン製剤は、作物または植物クラスに依存して、適当な収穫前間隔で散布される。
【００９４】
本明細書に記載される植物クラスに散布するため本発明により提供されるサイトカイニン製剤は、溶媒もしくはアジュバントから選択される、１種または複数の不活性な成分と混合される（本明細書に記載される本発明のサイトカイニンシンターゼにより産生される）サイトカイニンを含む。得られた混合物は、本明細書に記載される本発明のサイトカイニンシンターゼにより産生される、サイトカイニンを含む、液体製剤、水溶性濃縮物、乳化性濃縮物、流動性懸濁液、水性懸濁液、噴霧可能な製剤、乾燥製剤、顆粒、ペレット、湿潤性粉末、溶解性粉末、水分散性顆粒、または乾燥流動性製剤を形成し得る。
【００９５】
本発明はまた、前述のサイトカイニン製剤の１つまたは複数における使用のためサイトカイニンを製造する方法を提供する。一般に、方法は、本明細書において開示されるサイトカイニンシンターゼを合成すること、または発現させることを含む。サイトカイニンシンターゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するか、または宿主細胞において発現させることができる。例えば、サイトカイニンシンターゼを発現する宿主細胞は、発酵容器において培養することができる。一部の実施形態において、合成された、または発現されたサイトカイニンシンターゼは、精製されるか、もしくは単離され得る。他の実施形態において、合成された、あるいは発現されたサイトカイニンは、実質的な精製もしくは単離なしで、またはいかなる精製もしくは単離なしで、直接使用される。サイトカイニンシンターゼは、出発物質の基質（例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、またはジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ））と共に提供され、次に、サイトカイニンシンターゼが、サイトカイニン（イソペンテニルアデニン）に変換し得る。サイトカイニンを単離するかまたは精製し、次に、不活性な成分と混合して、サイトカイニン製剤を作製することができる。
【００９６】
コドン最適化
本発明は、サイトカイニンシンターゼをコードするポリヌクレオチドであって、コード配列が宿主細胞（例えば、植物細胞）における発現のため修飾されている、ポリヌクレオチドを提供する。
【００９７】
遺伝子コードは、６４通りの可能性のあるコドンと重複するが、大抵の生物は、これらのコドンのサブセットを優先的に使用する。種において最も頻繁に使用されるコドンは「最適コドン」と呼ばれ、あまり頻繁に使用されないものは、「稀な」または「低利用コドン」として分類される。Zhang et al. (1991) Gene 105:61-72。コドンは、「コドン最適化」として時に言及されるプロセスにおける特定の宿主の好ましいコドン使用を反映するように修飾され得る。特定の宿主に好ましいコドンを含有する最適化されたコード配列は、例えば、翻訳の割合が増大されるか、または所望の特性（例えば、非最適化配列から産生される転写物と比較して、より長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物が産生され得る。
【００９８】
一部の実施形態において、本発明は、核酸から発現されるべき所望のポリペプチドまたは遺伝子産物（例えば、特定のサイトカイニンシンターゼポリペプチド）からデザインされるか、またはそれに由来する、コドン最適化核酸を提供する。特定の実施形態において、発現されるべき所望のポリペプチドは、目的の参照アミノ酸配列；例えば、参照タンパク質（例えば、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、または配列番号５４）、または参照タンパク質ドメイン（例えば、ＩＰＴ様ドメイン、もしくはＰＲＨ様ドメイン）からデザインされるか、あるいはそれに由来し得る。
【００９９】
一部の実施形態において、核酸分子のサイトカイニンシンターゼコード領域のみをコドン最適化して、本発明の合成サイトカイニンシンターゼ遺伝子がデザインされる。特定の実施形態において、合成核酸分子のヌクレオチド配列は、コードされるポリペプチド（例えば、サイトカイニンシンターゼタンパク質）の１次構造が変更されないように最適化される。コードされるポリペプチドの構造は、最大程度まで、ポリペプチドのアミノ酸配列により決定される。故に、コードされるポリペプチドについての所望の構造は、遺伝子コードの縮重、および標準的コドン使用により決定されるそのヌクレオチドコード配列に制限を設ける。
【０１００】
本発明の合成核酸配列は、当業者に公知の様々な理由のためデザインされ、生み出され；例えば、発現が増大され、新たな宿主細胞または生物において発現されるべき核酸配列が適合され、機能的および／または非機能的変異がコードされるポリペプチドに導入され得る。典型的には、参照アミノ酸配列が自然に生じる遺伝子産物（例えば、天然のサイトカイニンシンターゼ）、または自然に生じる遺伝子産物の部分（例えば、単離されたＩＰＴ様もしくはＰＲＨ様ドメイン）である、実施形態において、参照アミノ酸配列をコードする自然に生じる核酸配列は、例えば、ゲノムデータベースを検索すること、または供給源ゲノムからクローニングすることにより得られ得る。多くの場合において、かかる核酸配列の相同体またはオルソログはまた、他の生物のゲノムにおいても見られ得る。
【０１０１】
様々な方法が、予め決定されたパラメーターに従い核酸分子のコード配列を最適化するため、当業者にとって利用可能である。例えば、当業者は、検査によりコード配列を最適化して、例えば、発現宿主生物のコドン使用バイアスにうまく合致させ得る。より一般的には、コンピューターにより実行されるソフトウエアプログラムを使用して、コード配列が最適化され得る。かかるソフトウエアプログラムは、目的のコードされるポリペプチドの発現に影響し得る因子、転写物の翻訳開始の割合に影響し得る因子、およびコードされるポリペプチドもしくはその前駆体の翻訳の延長の割合に影響し得る因子を含む群から選択される因子を最適化する、１つまたは複数のアルゴリズムを含み得る。かかるソフトウエアプログラムの特定の例としては、非限定的に、ＯｐｔＧｅｎｅ（商標）（Ｏｃｉｍｕｍ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧ（商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（商標）（ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲにてワールドワイドウェブにおける公開使用において入手可能）、およびＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）が挙げられる。一部の実施形態において、サイトカイニンシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、ヘミコドン表（米国特許出願公開第２００３／０１８２６８５号明細書）を使用して、単子葉および双子葉宿主細胞の両方における発現に最適化された。
【０１０２】
コドン最適化はまた、例えば、供給源生物において低利用コドンとして認識されるコドン配列のコドンが、新たな発現宿主において低利用として認識されるコドンに変化している、「コドン協調」として時に言及されるプロセスも含む。このプロセスは、翻訳／伸長中に自然かつ適当な休止を導入することにより、発現されたポリペプチドが正常にフォールディングすることを助け得る。Birkholtz et al. (2008) Malaria J. 7:197-217。
【０１０３】
核酸配列によりコードされる、目的のポリペプチドの発現に影響し得る因子は、ポリペプチドのアミノ酸をコードするよう選択される特定のコドンにより影響され得る。鋳型核酸配列からのｍＲＮＡの産生の割合に影響する因子としては、転写のため使用されるＲＮＡポリメラーゼタイプ；発現系に存在するＲＮＡポリメラーゼレベル；および使用される転写プロモーター配列が挙げられる。ｍＲＮＡレベルはまた、ｍＲＮＡ分解割合によっても影響され得、それは、順に、ｍＲＮＡを不安定化するモチーフ；ＲＮＡｓｅ認識配列；ｍＲＮＡ２次構造；およびポリＡ付加シグナルによって影響され得る。ｍＲＮＡレベルはまた、翻訳開始部位における、リボソーム結合部位における、開始コドンにおける、および／またはコード配列の最初の１０〜５０個のコドンの周り（またはオープンリーディングフレーム内の他の場所、もしくはその内部または続き）のｍＲＮＡ構造；オープンリーディングフレーム以前、またはその内部に存在する翻訳終端モチーフ；ｍＲＮＡスプライシングおよび／または核外輸送を指示するか、変化させるか、あるいは修飾するもののような転写された配列内のシグナルによっても影響され得る。鋳型配列からのｍＲＮＡ産生の割合に影響する因子の特定の例は、ヌクレオチドリピートにより誘導されるポリメラーゼスリッページである。ヌクレオチドリピートにより誘導されるポリメラーゼスリッページは、フレームシフト変異をもたらし得る、ＤＮＡポリメラーゼのスリッページまたはスタッターを引き起こすことが示された、ヌクレオチド配列リピートを含む。かかるヌクレオチドリピートはまた、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページも引き起こし得る。例えば、高いＧ＋Ｃ含有量バイアスを有する生物において、より高い程度のＧまたはＣヌクレオチドリピートが存在し得る。それ故に、ＲＮＡポリメラーゼスリッページを誘導する確率を低減する一方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの伸長されたリピートを変化させることを含む。
【０１０４】
特定の転写物についての翻訳開始の速度に影響し得る因子は、リボソーム結合部位の配列；リボソーム結合部位の上流の配列；開始コドン周囲の配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；内部リボソームエントリー部位の存在、相対的位置、および配列；リボソームエントリー部位（またはｍＲＮＡのリボソーム結合部位もしくは５’末端）と開始コドン間の配列および距離；翻訳開始部位におけるｍＲＮＡ構造；リボソーム結合部位におけるｍＲＮＡ構造；開始コドンにおけるｍＲＮＡ構造；コード配列の最初の１０〜５０個のコドン周囲のｍＲＮＡ構造；最初の１０〜２０個のコドンの配列；最初の１０〜２０個のコドンのＧＣバイアス；開始コドンに隣接するコドンにおいて使用されるコドン；開始コドン（ＡＵＧ、ＵＵＧ、またはＧＵＧ）の配列；リボソーム濃度；発現の誘導前の成長条件；発現中の成長条件；発現の導入前の温度；ならびに発現中の温度を含む。
【０１０５】
特定の転写物についての翻訳開始の割合に影響し得る因子の特定の例としては、代替の翻訳開始、および干渉ｍＲＮＡ２次構造が挙げられる。代替の翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能する能力がある、１つまたは複数のモチーフを偶然含有する、合成ポリヌクレオチド配列を生じ得る。これらの部位は、遺伝子内部部位からの切断されたタンパク質の翻訳の開始をもたらすことができる。精製中に取り除くことが困難であり得る、切断されたタンパク質を産生する確率を低減する一方法は、最適化ポリヌクレオチド配列から推定内部ＲＢＳ配列を修飾することを含む。干渉２次構造は、ＲＢＳ配列または開始コドンを隔離し、タンパク質発現の低減と相関し得る。ステム−ループ構造はまた、転写の停止および減弱にも関与し得る。故に、最適化ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列のＲＢＳおよび遺伝子コード領域において最小の２次構造を含有して、改善された転写および翻訳を可能にし得る。
【０１０６】
翻訳の延長の割合に影響し得る因子は、荷電ｔＲＮＡのレベルを含み（Elf et al. (2003) Science 300:1718-22）、それは、ｔＲＮＡ濃度、ｔＲＮＡ荷電割合、およびアミノ酸利用可能性に依存する。例えば、宿主生物のコドン利用バイアスによる稀な（または好ましくない）コドンにより誘導される翻訳の停止は、異種タンパク質発現の割合を低減し得る。稀なコドンにより誘導される翻訳の停止は、宿主生物において稀に使用され、入手可能なｔＲＮＡプールにおけるそれらの不足に起因したタンパク質翻訳に対する負の効果を有し得る、目的のポリヌクレオチドにおけるコドンの存在を含む。これらの因子はまた、リボソームｔＲＮＡ選択の割合（デコード割合）も含み、それは、コドンとアンチコドンの相互作用の強度；先行するコドン（Ｐ−部位コドン）；先行するコドンのゆらぎ塩基；および読み取られるコドンのゆらぎ塩基に依存する。リボソームフィデリティーに影響し得る因子は、ホモポリマー伸展、Ｇ／Ｃアイランド、Ａ／Ｔアイランド、および停止部位近くのホモポリマー伸展のような、リボソームフレームシフトに影響するものを含む。さらに、一部のポリペプチドは、リボソーム出口チャネルにおいて障害され、それは、ポリペプチドの最初の１０〜２０個のアミノ酸の配列に一部依存する。前述のものを考慮して、宿主生物において最適な翻訳を改善する一方法は、合成核酸配列において修飾される稀な宿主コドンをもたらし得る、コドン最適化を行うことを含む。
【０１０７】
異種タンパク質発現に（間接的ではあるが）影響し得る、核酸配列エレメントの別のクラスは制限部位を含む。故に、核酸配列の最適化は、例えば、転写単位の宿主発現ベクターへの後のサブクローニングと干渉し得る、制限部位の修飾を含み得る。
【０１０８】
本発明の一部の実施形態において、サイトカイニンシンターゼをコードする核酸は、参照サイトカイニンシンターゼ核酸（例えば、配列番号１（ＥｆＣＫＳ）、配列番号８（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１２（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１６（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２０（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２４（ＦｆＣＫＳ）または配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１  配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４のコード配列）によりコードされるアミノ酸配列を（例えば、インシリコ翻訳により）まず推定することにより、コドン最適化され得る。さらなる実施形態において、サイトカイニンシンターゼのアミノ酸配列を直接使用して、コドン最適化核酸配列が得られ得る。例えば、サイトカイニンシンターゼのアミノ酸配列（核酸配列から推定されるか、または直接提供されるかのいずれか）を使用して、例えば、予め決定されたパラメーターによりコード配列を最適化する能力がある、コンピューターにより実行されるソフトウエアプログラムを使用することにより、サイトカイニンシンターゼをコードするコドン最適化核酸配列（例えば、インシリコ逆翻訳）が推定され得る。特定の例において、コドン最適化核酸は、標準的遺伝子コード、および発現宿主生物のための適当なコドン利用バイアスの表を使用して推定され得る。一部の実施形態において、サイトカイニンシンターゼタンパク質をコードする複数のコドン最適化核酸配列を推定することが所望され得る。
【０１０９】
核酸配列の全てまたは一部が最適化され得る。一部の例において、発現の所望のモジュレーションは、全体的な参照サイトカイニンシンターゼコード核酸を本質的に最適化することにより達成され得る。他の例において、所望のモジュレーションは、全てではないが一部の参照サイトカイニンシンターゼコード核酸を最適化することにより達成され得る。
【０１１０】
本発明のコドン最適化ポリヌクレオチドをコードする合成サイトカイニンシンターゼは、様々な用途における使用のために、例えば、組換えポリペプチドを産生するため；新規発現系を開発するため；発現特性を他の核酸配列のものと比較するため；および診断用途、ならびに宿主生物において水がれストレス耐性を導入しまたは増大させるためにデザインすることもできる。合成遺伝子の産生に関するさらなるガイダンスは、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第９７／１３４０２号明細書、ならびに米国特許第６，１６６，３０２号明細書および第５，３８０，８３１号明細書において見ることができる。
【０１１１】
本発明の組換えポリヌクレオチドにおける使用のための異種配列
植物プロモーター。植物における遺伝子の発現を指示する、多数のプロモーターは、本明細書において開示されるサイトカイニンシンターゼ配列に作動可能に連結し、例えば、遺伝子発現カセットを作り出すことができる。かかるプロモーターは、恒常的、化学的に制御される、誘導可能な、組織特異的な、および種子優先性のプロモーターから選択することができる。核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、宿主細胞に適した強力な恒常的プロモーターは、発現されたタンパク質の発現および精製のため典型的に使用される。
【０１１２】
本発明の組換えポリヌクレオチドにおいて異種配列として使用され得る、植物プロモーターの例としては、ＺｍＳＥＥ１に由来するプロモーター配列（Li et al. Plant (cell Reports, 22: 816-821 (2004) and Robson et al., Plant Biotechnol. J. 2: 101-112 (2004)）、ＳＡＧ１２由来のプロモーター配列（Gan et al.t Science, 270: 1986-1988 (1995); Sykorova et al., J. Experimental Botany, 59: 377-387 (2008); Zhang et al., Journal of Integrative Plant Biology, 52: 653-669 (2010); Zhang et al., J. American Society for Horticultural Science, 135: 108-115 (2010)）、ＳＡＵＲ由来のプロモーター配列（Li et al., Developmental biology, 153: 386-395 (1992)）、トウモロコシｈｓｐ７０由来のプロモーター配列（Medford et al., 11le Plant Cell Online, 1; 403-413 (1989)）；ＺｍＵＢＩ１由来のプロモーター配列（Hu et al., Plant Cell Reports, 23: 705-709 (2005)）、キンギョソウ（Antirrhinum majus）由来のカルコンシンターゼ（ｃｈｓ）プロモーター配列（ＰＣＨＳ）（Wang et al., Functional Plant Biology, 24: 661-672 (1997)）、タンパク質分解酵素阻害剤ＩＩ（ＰＩ−ＩＩＫ）プロモーター配列（Smigocki et al, Plant Molecular Biology, 23; 325-335 (1993)）；およびＳＡＲＫ由来のプロモーター配列（Rivero et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 104: 19631-19636 (2007)）が挙げられる。
【０１１３】
本発明の組換えポリヌクレオチドにおいて使用され得る、植物プロモーターのさらなる非限定的な例としては、シロイヌナズナ（A. thaliana）ユビキチン−１０（ｕｂｉ−１０）に由来するプロモーター配列（Callis, et al., J. Biol. Chem., 265:12486-12493(1990)）；アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）マンノピンシンターゼ由来のプロモーター配列（Δｍａｓ）（Ｐｅｔｏｌｉｎｏら、米国特許第６，７３０，８２４号明細書）；および／またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）由来のプロモーター配列（Verdaguer et al., Plant Molecular Biology, 31:1129-1139 (1996)）が挙げられる。他の恒常的プロモーターは、例えば、コアカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Odell et al. Nature 313:810-812 (1985)）；コメアクチンプロモーター（McElroy et al., Plant Cell 2;l63-171 (1990)）；トウモロコシユビキチンプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号明細書；Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989)およびChristensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)）；ｐＥＭＵプロモーター（Last et al., Theor. Appl. Genet., 81:581-588(1991)）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号明細書）；トウモロコシヒストンプロモーター（Chaboute et al. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)）；などを含む。
【０１１４】
他の有用な植物プロモーターは、組織特異的および誘導可能なプロモーターを含む。誘導可能なプロモーターは、インデューサーに応答して、１つまたは複数のＤＮＡ配列もしくは遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化する能力があるものである。インデューサーは、タンパク質、代謝産物、成長調節因子、除草剤、もしくはフェノール化合物のような化学剤であり得るか、またはインデューサーは、熱、低温、塩、もしくは毒性エレメントにより課せられる生理学的ストレスであり得る。他のインデューサーは、ウイルスのような病原体または病因物質の作用を介して間接的に作用する。誘導可能な制御エレメントを含有する植物細胞は、例えば、噴霧、灌水、加熱、もしくは類似の方法により、インデューサーを細胞または植物に外部で適用することにより、インデューサーに曝露され得る。
【０１１５】
任意の誘導可能なプロモーターが、本開示の実施形態において使用され得る。Ward et al., Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993)を参照のこと。典型的な誘導可能なプロモーターは、エクジソン受容体プロモーター（米国特許第６，５０４，０８２号明細書）；銅に応答するＡＣＥ１システム由来のプロモーター（Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4567-4571 (1993)）；ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤に応答する、トウモロコシ由来のＩｎ２−１およびＩｎ２−２遺伝子（米国特許第５，３６４，７８０号明細書；Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) and Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)）；Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991)）；または転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導される、ステロイドホルモン遺伝子由来のプロモーター、Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421 (1991)およびMcNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257；前応急的除草剤として使用される疎水性求電子性化合物により活性化される、トウモロコシＧＳＴプロモーター（米国特許第５，９６５，３８７号明細書および国際特許出願公開第９３／００１２９４号明細書を参照のこと）；ならびにサリチル酸により活性化される、タバコＰＲ−１ａプロモーター（Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-la Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System," Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9): 1796-800)を参照のこと）を含む。目的の他の化学的に制御されるプロモーターは、テトラサイクリンで誘導可能な、ならびにテトラサイクリンで抑制可能なプロモーターを含む（例えば、Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237、ならびに米国特許第５，８１４，６１８号明細書および第５，７８９，１５６号明細書を参照のこと）。
【０１１６】
目的の他の制御可能なプロモーターは、転写がそれぞれ低温もしくは熱への曝露に応答して作用し得る、低温応答性制御エレメントまたは熱ショック制御エレメント（Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, (1992)）；嫌気的条件により誘導可能な、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Gerlach et al., Proc. Nat/. A cad. Sci. USA 79:2981-2985 (1982); Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-6628 (1987)）；およびマメｒｂｃＳ遺伝子またはマメｐｓａＤｂ遺伝子に由来する光により誘導可能なプロモーター（Yamamoto et al., Plant J. 12(2):255-265 (1997)）；光により誘導可能な制御エレメント（Feinbaum et al. Mol. Gen. Genet. 226:449 (1991); Lam and Chua, Science 248:471 (1990); Matsuoka et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 (1993); Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138）、植物ホルモン誘導可能制御エレメント（Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905 (1990); Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225 (1990)）などを含む。誘導可能な制御エレメントはまた、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤に応答する、トウモロコシＩｎ２−１またはＩｎ２−２遺伝子のプロモーター（Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227:229-237 (1991); Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38 (1994)）、およびトランスポゾンＴｎ１０のＴｅｔリプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237 (1991)）でもあり得る。ストレスで誘導可能なプロモーターは、Ｐ５ＣＳのような塩／水ストレスで誘導可能なプロモーター（Zang et al., (1997) Plant Sciences 129:81-89）；ｃｏｒ１５ａのような低温で誘導可能なプロモーター（Hajela et al., Plant Physiol. 93:1246-1252 (1990)）、ｃｏｒ１５ｂ（Wilhelm et al., Plant Mol. Biol. 23: 1073-1077(1993)）、ｗｓｃ１（Ouellet et al., (1998) FEBS Lett. 423-324-328）、ｃｉ７（Kirch et al., Plant Mol Biol. 33:897-909 (1997)）、ｃｉ２１Ａ（Schneider et al., Plant Physiol. 113:335-45 (1997)）；Ｔｒｇ−３１のような水がれで誘導可能なプロモーター（Chaudhary et al., Plant Mol. Biol., 30:1247-57 (1996)）、ｒｄ２９（Kasuga et al., Nature Biotechnology 18:287-291 (1999)）；Ｒａｂ１７（Vilardell et al., Plant Mol. Biol. 17:985-93 (1991)）およびオスモチン（Raghothama et al., Plant Mol. Biol. 23:1117-28 (1993)）のような浸透圧で誘導可能なプロモーター；ならびに熱ショックタンパク質のような熱で誘導可能なプロモーター（Barros et al., Plant Mol. 19:665-75 (1992); Marrs et al., Dev. Genet. 14:27-41 (1993)）、ｓｍＨＳＰ（Waters et al, J Experimental Botany 47:325-338 (1996)）、ならびにパセリユビキチンプロモーター由来の熱ショックで誘導可能なエレメント（国際公開第０３／１０２１９８号明細書）を含む。他のストレスで誘導可能なプロモーターは、ｒｉｐ２（米国特許第５，３３２，８０８号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０２１７３９３号明細書）、ならびにｒｄ２９ａ（Yamaguchi-Shinozaki et al., Mol. Gen. Genetics 236:331-340 (1993)）を含む。ある特定のプロモーターは、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）ｐＭＡＳプロモーター（Guevara-Garda et al., Plant J. 4(3):495-505 (1993)）、およびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）ＯＲＦ１３プロモーター(Hansen et al., Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343 (1997)）を含む、傷害により誘導可能である。
【０１１７】
組織優先性のプロモーターを利用して、特定の植物組織内での転写および／または発現の増強が標的にされ得る。優先的な発現に言及するとき、これの意味するものは、他の植物組織より特定の植物組織において高いレベルでの発現である。プロモーターのこれらのタイプの例としては、ファゼオリンプロモーターによりもたらされるもののような、種子優先性の発現（Bustos et al., The Plant Cell Vol.1, 839-853 (1989)）、およびトウモロコシグロブリン−１遺伝子（Belanger, et al. Genetics 129:863-972 (1991)）が挙げられる。双子葉植物について、種子優先性のプロモーターには、マメβ−ファゼオリン、ナピン、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。単子葉植物について、種子優先性のプロモーターには、トウモロコシ１５ｋＤａのゼイン、２２ｋＤａのゼイン、２７ｋＤａのゼインｎ、γ−ゼイン、ワキシー、シュランケン１、シュランケン２、グロブリン１、ＺｍＧＳ２、ＺｍＳＴＰ１３、ＺｍＧＳＴＵ６などが挙げられるが、これらに限定されない。種子優先性のプロモーターはまた、例えば、γ−ゼインの胚乳優先性のプロモーター、タバコ由来の潜在性プロモーター（Fobert et al., Plant J. 4: 567-577 (1994)）、トウモロコシ由来のＰ−遺伝子プロモーター（(Chopra et al., Plant Cell 7:1149-1158 (1996), Erratum in Plant Cell. 1:109 (1997)）、トウモロコシ由来のグロブリン−１プロモーター（Belenger and Kriz, Genetics 129: 863-972 (1991)）、ならびにトウモロコシ核心の種皮または外皮への発現を指示する、プロモーター、例えば、果皮特異的グルタミンシンセターゼプロモーター（Muhitch et al., Plant Science 163:865-872 (2002)）のような、種内部の特異的組織に優勢に遺伝子発現を指示する、これらのプロモーターも含む。
【０１１８】
プロモーターに加えて、遺伝子発現カセット（例えば、ベクター中にあり得る）は、原核生物もしくは真核生物のいずれかの宿主細胞において、核酸の発現に必要とされる全てのさらなるエレメントを含有する、転写単位または発現カセットを典型的に含有する。故に、典型的な発現カセットは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含有する。遺伝子発現カセットはまた、当該技術分野で公知の方法に従い、作動可能に連結されるさらなるエレメント：転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要なシグナルを含んでもよい。加えて、発現カセットは、エンハンサー、および／または異種スプライシングシグナルを含んでもよい。
【０１１９】
遺伝子発現カセットの成分。遺伝子発現カセットの他の成分は、実施形態として提供される。例としては、選択可能なマーカー、標的配列もしくは制御配列、最適化輸送ペプチド配列のような輸送ペプチド配列（米国特許第５，５１０，４７１号明細書を参照のこと）、ＲＢ７  ＭＡＲ（Thompson and Myatt, Plant Mol. Biol., 34: 687-692 (1997)、および国際特許公開第９７２７２０７号明細書を参照のこと）のような安定化配列、またはリーダー配列、イントロンなどが挙げられる。植物発現ベクターおよびレポーター遺伝子の一般的な記載ならびに例は、Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al., eds; CRC Press pp. 89-119 (1993)において見ることができる。適当な発現ベクターの選択は、宿主、および発現ベクターを宿主に導入する方法に依存するだろう。遺伝子発現カセットはまた、目的の異種ヌクレオチド配列の３’末端において、植物において機能的な転写および翻訳終結領域も含むだろう。終結領域は、本開示の実施形態のプロモーターヌクレオチド配列と共に天然であり得るか、目的のＤＮＡ配列と共に天然であり得るか、別の供給源に由来し得る。都合のよい終結領域は、オクトピンシンターゼ、ならびにノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）終結領域（Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982) and Shaw et al. Nucl. Acids Research vol 12, No. 20 pp7831-7846(nos) (1984)）のような、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉ−プラスミドから入手可能であり；Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (l991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990); Ballas et al., Nucl. Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucl. Acids Res. 15:9627-9639 (1987)も参照のこと。
【０１２０】
遺伝子発現カセットは、５’リーダー配列をさらに含有することができる。かかるリーダー配列は、翻訳を増強するために作用し得る。翻訳リーダーは、当該技術分野において公知であり、例示の目的で、ピコルナウイルスリーダー、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）、Elroy-Stein et al., Proc. Nat. A cad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチ（Tobacco Etch）ウイルス）、Carrington and Freed, J. Virology, 64:1590-1597 (1990)、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）、Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、Macejak et al., Nature 353:90-94 (1991)；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の翻訳されていないリーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）、Jobling et al., Nature 325:622-625 (1987)；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）、Gallie et al, (1989) Molecular Biology of RNA, pages 237-256；およびトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）、Lomtnel et al., Virology 81:382-385 (1991)を含む。Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987)も参照のこと。
【０１２１】
遺伝子発現カセット構築物はまた、イントロンのような翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列も含有し得る。１つのかかるイントロンの例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１のイントロンである。Chaubet et al., J Mol. Biology. 225:569-574 (1992)。
【０１２２】
発現カセットが、特定の小器官、具体的には、色素体、アミロプラスト、もしくは小胞体に指示されるか、または細胞の表面においてもしくは細胞外に分泌される、遺伝子産物を発現することが所望される場合において、発現カセットは、輸送ペプチドのコード配列をさらに含むことができる。かかる輸送ペプチドは、当該技術分野において周知であり、アシル担体タンパク質についての輸送ペプチド、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット、植物ＥＰＳＰシンターゼ、およびヒマワリ（Helianthus annuus）（米国特許第５，５１０，４１７号明細書）、トウモロコシ（Zea mays）Ｂｒｉｔｔｌｅ−１葉緑体輸送ペプチド（Nelson et al., Plant Physiol. 117(4): 1235-1252 (1998); Sullivan et al., Plant Cell 3 (12): 1337-48 (1991); Sullivan et al., Planta 196(3):477-84 (1995); Sullivan et al., J. Biol. Chem. 267(26):18999-9004 (1992)）などを含むが、これらに限定されない。加えて、最適化輸送ペプチド（米国特許第５，５１０，４７１号明細書）のようなキメラ葉緑体輸送ペプチドが、当該技術分野において公知である。さらなる葉緑体輸送ペプチドが、米国特許第５，７１７，０８４号明細書、および米国特許第５，７２８，９２５号明細書において既に記載されている。当業者は、産物を特定の小器官に発現させる際に利用可能である多くのオプションを容易に理解するだろう。例えば、オオムギアルファアミラーゼ配列を頻繁に使用して、発現を小胞体に指示する（Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)）。
【０１２３】
組換えＤＮＡテクノロジーの使用は、例えば、宿主細胞内での核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することにより、形質転換された核酸分子の発現の調節を改善することができることを当業者は理解するであろう。加えて、プロモーター配列を遺伝子的に操作して、天然のプロモーターと比較して発現のレベルが改善され得る。核酸分子の発現を調節するのに有用な組換え技術は、核酸分子の１つまたは複数の宿主細胞染色体への安定な組込み、ベクター安定性配列のプラスミドへの付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ、もしくはコザック配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン利用に対応する核酸分子の修飾、および転写物を不安定化する配列の欠損が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
形質転換された細胞もしくは組織、または植物部分もしくは植物の選択のためのレポーターあるいはマーカー遺伝子は、形質転換ベクターに含まれ得る。選択可能なマーカーの例としては、除草剤または抗生物質のような代謝拮抗物質に対する耐性を確実にするもの、例えば、メトトレキサートに対する耐性を確実にする（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149 (1994)）、ジヒドロ葉酸還元酵素；Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, (1983); Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, (1991)）も参照のこと；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシン、およびピューロマイシンに対する耐性を確実にするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995 (1983）、およびFraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)）、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を確実にするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Marsh, Gene 32:481-485, (1984); see also Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:1.03-108, (1985); Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, (1995)も参照のこと）；細胞が、トリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞が、ヒスチジンの代わりにヒストールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047, (1988)）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（国際特許出願公開第９４／２０６２７号明細書）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する耐性を確実にするオルニチンデカルボキシラーゼ（DFMO; McConlogue, 1987, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）；ならびにブラストサイジンＳに対する耐性を確実にする、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, (1995)）が挙げられる。
【０１２５】
さらなる選択可能なマーカーには、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニルウレア耐性を確実にする変異体アセト乳酸シンターゼ（Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, (1988)）、アトラジンに対する耐性を確実にする、変異体ｐｓｂＡ（Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, (1993)）、または変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第５，７６７，３７３号明細書を参照のこと）あるいはグルホシネートのような除草剤に対する耐性を確実にする、他のマーカーが挙げられる。適当な選択可能なマーカー遺伝子の例としては、クロラムフェニコールに対する耐性をコードする遺伝子（Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, (1983)）；ストレプトマイシン（(Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, (1987)）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:1.31-137 (1996)）；ブレオマイシン（Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, (1990)）；スルホンアミド（Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, (1990)）；ブロモキシニル（Stalkeret al., Science 242:419-423, (1988)）；グリホサート（Shaw et al., Science 233:478-481, (1986)）；ホスフィノトリシン（DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, (1987)）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
選択的遺伝子の使用のための１つのオプションは、グルホシネート耐性をコードするＤＮＡであり、一実施形態において、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターの制御下のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子、またはｂａｒ遺伝子であり得る。これらの遺伝子は、ビアラホスに対する耐性を確実にする。（Wohlleben et al., (1988) Gene 10: 25-37); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., BioTechnology 11:835, 1993; White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; and Anzai et al, Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989）を参照のこと。ｐａｔ遺伝子のバージョンは、米国特許第６，０９６，９４７号明細書に記載される、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子である。
【０１２７】
加えて、マーカーをコードするポリヌクレオチドを含有する植物細胞の同定を促進するマーカーが利用されてもよい。植物細胞を破壊することなく、配列の存在が測定可能な産物を産生し、産物を産生し得る、スコア化可能またはスクリーニング可能なマーカーが有用である。例として、種々の発色基質が公知である、酵素をコードする、β−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（例えば、米国特許第５，２６８，４６３号および第５，５９９，６７０号明細書）；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Jefferson et al., EMBO J 6(13): 3901-3907 (1987)）；ならびにアルカリホスファターゼが挙げられる。好ましい実施形態において、使用されるマーカーは、ベータ−カロチンまたはプロビタミンＡである（Ye et al., Science 287:303-305-(2000)）。遺伝子は、コメの栄養を増強するために使用されるが、この場合において、それは、スクリーニング可能なマーカーとして代わりに利用され、目的の遺伝子に結合した遺伝子の存在は、もたらされた金色により検出される。遺伝子が、植物への栄養上の貢献のため使用される状況と異なり、より少量のタンパク質がマーキングの目的に十分である。他のスクリーニング可能なマーカーは、例えば、植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の産生を制御する産物をコードするＲ−遺伝子座遺伝子を含む、アントシアニン／フラボノイド遺伝子（Taylor and Briggs, The Plant Cell 2: 115-127 (1990)における論述を参照のこと）（Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)）；トウモロコシＣ１遺伝子のようなフラボノイド色素の生合成を制御する遺伝子（Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. 242:40-48 (1994)）、およびトウモロコシＣ２（Wienand et al., Mol. Gen. Genet. 203:202-207 (1986)）；Ｂ遺伝子（Chandler et al., Plant Cell 1:1175-1183 (1989)）、ｐ１遺伝子 (Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:4587-4591 (1991); Grotewold et al., Cell 76:543-553 (1994); Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39: 11-19）；青銅色の遺伝子座遺伝子（Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049）などを一般に含む。
【０１２８】
適当なマーカーのさらなる例としては、シアノ蛍光タンパク質（ＣＹＰ）遺伝子（Bolte et al., J. Cell Science 117: 943-54 (2004)、およびKato et al., Plant Physiol 129: 913-42 (2002)）、黄色蛍光タンパク質遺伝子（ＥｖｒｏｇｅｎのＰＨＩＹＦＰ（商標）；Bolte et al., J. Cell Science 117: 943-54 (2004)を参照のこと）；その存在が、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション測定、蛍光分光法、弱光ビデオカメラ、光子カウントカメラまたは複数ウェルルミノメトリー（Teeri et al. EMBO J. 8:343 (1989)）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（Sheen et al., Plant J. 8(5):777-84 (1995)）を使用することによって検出されるルシフェラーゼをコードするｌｕｘ遺伝子；およびマーカー遺伝子で形質転換された植物細胞が赤色であり、故に、視覚で選択可能であるＤｓＲｅｄ２（Dietdch et al., Biotechniques 2(2):286-293 (2002)）が挙げられる。さらなる例としては、種々の発色基質が公知である酵素をコードする（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737）；発色性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80: 1101 (1983)）；α−アミラーゼ遺伝子（Ikuta et al., Biotech. 8:241 (1990)）；およびチロシンをＤＯＰＡおよびドパキノンに酸化し、順に縮合して、容易に検出可能な化合物メラニンを形成する能力がある酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129:2703 (1983)）が挙げられる。明らかに、多くのかかるマーカーが利用可能であり、当業者に公知である。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、発現カセット中の遺伝子産物をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は、カセットおよび／または植物において目的の別のヌクレオチド配列と任意選択で組み合わせることができる。例えば、ある種の実施形態において、導入遺伝子は、グリホサートもしくは別の除草剤に対してさらなる耐性または抵抗性をもたらし、および／または昆虫もしくは疾患、および／または栄養性増強剤を選択するための耐性をもたらし、および／または食餌、食品、産業、医薬、もしくは他の使用において有用である、農学的特性、および／またはタンパク質もしくは他の産物を改善する、目的の別のヌクレオチド配列と組み合わせるか、あるいは「スタック」することができる。植物ゲノム内の目的の２つ以上の核酸配列の「スタッキング」は、例えば、２つ以上の事象を使用する従来の植物育種、目的の配列を含有する構築物での植物の形質転換、遺伝子導入植物の再形質転換、または相同組換えを介した組込みを通じての新たな形質の付加を介して、達成され得る。
【０１３０】
目的のかかるヌクレオチド配列には、以下で提供される（１）害虫もしくは疾患に対する耐性、（２）除草剤に対する耐性、および（３）価値を付加する特性を確実にする、遺伝子またはコード配列のそれらの例が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
１．害虫もしくは疾患に対する耐性を確実にする遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物疾患耐性遺伝子。植物防御は、植物における疾患耐性遺伝子（Ｒ）の産物と病原体における対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の産物の間の特異的相互作用によりしばしば活性化される。多様な植物を、クローニングされた耐性遺伝子で形質転換して、特定の病原体株に耐性である植物が操作され得る。かかる遺伝子の例としては、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）に対する耐性についてのトマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、シュードモナス・シリンガエｐｖ．トマト（Pseudomonas syringae pv. tomato）に対する耐性について、タンパク質キナーゼをコードするトマトＰｔｏ遺伝子（Martinet al., Science 262:1432 (1993)）、およびシュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）に対する耐性についてのシロイヌナズナ属（Arabidopsis）ＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al., Cell 78:1089 (1994)）が挙げられる。
【０１３２】
（Ｂ）Ｂｔ  δ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列のような、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体もしくはその上でモデル化された合成ポリペプチド（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）、および植物の殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5389-94 (1996)を参照のこと）。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５、および３１９９８の下、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）から購入することができる。
【０１３３】
（Ｃ）いくつかのウケザキクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列（VanDamme et al. Plant Molec. Biol. 24:825 (1994)）のようなレクチン。
【０１３４】
（Ｄ）昆虫害虫に対する殺虫剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体のような、ビタミン結合タンパク質。米国特許第５，６５９，０２６号明細書を参照のこと。
【０１３５】
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、タンパク質分解酵素阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。かかる遺伝子の例としては、コメシステインタンパク質分解酵素阻害剤（Abe et al., J. Biol. Chern. 262:16793 (1987)）、タバコタンパク質分解酵素阻害剤Ｉ（Huub et al., Plant Molec. Biol. 21:985 (1993)）、およびα−アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993)）が挙げられる。
【０１３６】
（Ｆ）エクジステロイドおよび幼若ホルモンのような昆虫特異的ホルモンもしくはフェロモン、その変異体、それに基づく模倣物、またはクローニングされた幼若ホルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化因子のバキュロウイルス発現のようなそのアンタゴニストもしくはアゴニスト（Hammock et al., Nature 344:458 (1990)）。
【０１３７】
（Ｇ）発現の際に、罹患した害虫の生理機能を破壊する、昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。かかる遺伝子の例としては、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, J. Biol. Chem. 269(1):9-12 (1994)）、ディプロプテラ・プンクタータ（Diploptera punctata）において同定されたアラトスタチン（Pratt, Biochem Biophys Res Commun. 163(3): 1243-7 (1989)）、および昆虫特異的、麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号明細書）が挙げられる。
【０１３８】
（Ｈ）サソリ昆虫毒性ペプチド（Pang, Gene 116:165 (1992)）のような、ヘビ、ハチなどにより天然で産生される、昆虫の特異的毒液。
【０１３９】
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体、または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与する酵素。
【０１４０】
（Ｊ）生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含む、修飾において関与する酵素；例えば、自然のものであるか合成のものであるかを問わない、解糖酵素、タンパク分解酵素、脂質分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、およびグルカナーゼ。かかる遺伝子の例としては、カラー遺伝子（ＰＣＴ公開番号第９３／０２１９７号明細書）、キチナーゼコード配列（例えば、受託番号３９９９６３７および６７１５２の下、ＡＴＣＣから得ることができる）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., Insect Molec. Biol. 23:691 (1993)）、およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21:673 (1993)）が挙げられる。
【０１４１】
（Ｋ）シグナル伝達を刺激する分子。かかる分子の例としては、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（(Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994)）、およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., Plant Physiol. 104:1467 (1994)）が挙げられる。
【０１４２】
（Ｌ）疎水性モーメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号および第５，６０７，９１４号明細書を参照のこと；後者は、疾患耐性を確実にする合成抗菌ペプチドを教示する。
【０１４３】
（Ｍ）シュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に遺伝子導入タバコ植物耐性を与える、セクロピン−β溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., Plant Sci. 89:43 (1993)）のような、膜透過酵素、チャネル形成剤、またはチャネルブロッカー。
【０１４４】
（Ｎ）ウイルス浸潤性タンパク質、またはそれに由来する複合体毒素。例えば、形質転換された植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、コートタンパク質遺伝子が由来するウイルスにより、ならびに関連するウイルスにより作用される、ウイルス感染症および／または疾患発症に耐性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ポテトウイルスＸ、ポテトウイルスＹ、タバコエッチ病ウイルス、タバコラットルウイルス、およびタバコモザイクウイルスに対する、コートタンパク質により仲介される耐性が、形質転換された植物に与えられた。例えば、Beachy et al. Ann. Rev. Phytopathol. 28:451 (1990)を参照のこと。
【０１４５】
（Ｏ）昆虫特異的抗体、またはそれに由来する免疫毒素。故に、昆虫の腸における重大な代謝機能に対して標的化された抗体は、影響された酵素を不活性化し、これにより、昆虫を殺傷するだろう。例えば、Taylor et al., Abstract #497, Seventh lnt'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions shows enzytnatic inactivation in transgenic tobacco via production of single-chain antibody fragments (1994)。
【０１４６】
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現する遺伝子導入植物が、ウイルスの攻撃から保護されることを示す、Tavladoraki et al., Nature 266:469 (1993)を参照のこと。
【０１４７】
（Ｑ）病原体または寄生虫により天然で産生される、開発が注力されるタンパク質。故に、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁をホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼで可溶化することにより、真菌のコロニー形成および植物栄養素放出を促進する（Lamb et al., Biol Technology 10:1436 (1992)）。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする、遺伝子のクローニングおよび特徴付けは、（Toubart et al., Plant J. 2:367 (1992)）により記載される。
【０１４８】
（Ｒ）真菌疾患に対する増大した耐性をもたらす、オオムギリボソーム不活性化遺伝子のような、植物により天然で産生される、開発が注力されるタンパク質（Longemann et al., Bio/Technology 10:3305 (1992)）。
【０１４９】
（Ｓ）ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを使用して、標的遺伝子の発現が阻害されるＲＮＡ干渉。一例におけるＲＮＡ分子は、部分的または完全に２本鎖であり、それは、サイレンシング応答を誘発し、これにより、ｄｓＲＮＡの小分子干渉ＲＮＡへの切断をもたらし、それは、次に相同なｍＲＮＡを破壊する標的化複合体に組み込まれる。例えば、Ｆｉｒｅら、米国特許第６，５０６，５５９号明細書；Ｇｒａｈａｍら、米国特許第６，５７３，０９９号明細書を参照のこと。
【０１５０】
２．除草剤に対する耐性を確実にする、遺伝子またはコード配列
（Ａ）イミダザリノン、スルホンアニリド、もしくはスルホニルウレア系除草剤のような、成長するポイントまたは成長点を阻害する、除草剤に対する耐性あるいは抵抗性をコードする遺伝子。このカテゴリーにおける典型的な遺伝子は、ＡＨＡＳ酵素（Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)）としても公知である、変異体ＡＬＳ酵素をコードする（Lee et al., EMBO J. 7:1241 (1988)）。
【０１５１】
（Ｂ）変異体ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子により、またはＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）のような遺伝子、ならびにグルホシネート（ｐａｔおよびｂａｒ遺伝子；ＤＳＭ−２）、およびアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子）のような他のホスホノ化合物による代謝の不活性化を通じて与えられる、グリホサートに対する耐性または抵抗性をコードする、１つあるいは複数のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート耐性を確実にし得る、ＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する、米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照のこと。変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下に得ることができ、変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，７６９，０６１号明細書において開示される。欧州特許出願第０３３３０３３号明細書、および米国特許第４，９７５，３７４号明細書は、Ｌ−ホスフィノトリシンのような除草剤に対する耐性を確実にする、グルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ホスフィノトリシンアセチル−トランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願第０２４２２４６号明細書において提供される。De Greef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現する、遺伝子導入植物の産生を記載する。セトキシジムおよびハロキシホップのような、アリールオキシフェノキシプロピオン酸ならびにシクロヘキサンジオンに対する耐性を確実にする遺伝子の典型例は、Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)により記載される、Ａｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２、およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子である。
【０１５２】
（Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）のような、光合成を阻害する除草剤に対する耐性または抵抗性をコードする遺伝子。Przibilla et al., Plant Cell 3: 169 (1991)）は、クラミドモナス属（Chlamydomonas）を形質転換するための変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用を記載する。米国特許第４，８１０，６４８号明細書におけるニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、ならびにこれらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１、および６７４４２の下、入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現は、Hayes et al. Biochem. J. 285:173 (1992)により記載される。
【０１５３】
（Ｄ）パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）に結合する、除草剤に対する耐性または抵抗性をコードする遺伝子。これは、イソオキサゾール（欧州特許第４１８１７５号、欧州特許第４７０８５６号、欧州特許第４８７３５２号、欧州特許第５２７０３６号、欧州特許第５６０４８２号、欧州特許第６８２６５９号明細書、米国特許第５，４２４，２７６号明細書）、特にイソキサフルトールを含み、それは、トウモロコシについての選択的除草剤、ジケトニトリル（欧州特許第４９６６３０号明細書、および欧州特許第４９６６３１号明細書）、特に２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（欧州特許第６２５５０５号、欧州特許第６２５５０８号明細書、米国特許第５，５０６，１９５号明細書）を含む、特にスルコトリオン、およびピラゾリナートのような除草剤である。植物において過剰量のＨＰＰＤを産生する遺伝子は、例えば、米国特許第６，２６８，５４９号および第６，２４５，９６８号明細書、ならびに米国特許公開第２００３００６６１０２号明細書に記載される遺伝子を含む、かかる除草剤に対する耐性または抵抗性をもたらし得る。
【０１５４】
（Ｅ）アリールオキシフェノキシプロピオン酸（ＡＯＰＰ）除草剤に対する耐性または抵抗性も確実にし得る、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）のようなフェノキシオーキシン除草剤に対する耐性または抵抗性をコードする遺伝子。かかる遺伝子の例として、米国特許第７，８３８，７３３号明細書において記載される、α−ケトグルタラート依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が挙げられる。
【０１５５】
（Ｆ）フルオキシピルまたはトリクロピルのような、ピリジルオキシオーキシン除草剤に対する耐性または抵抗性も確実にし得る、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）のようなフェノキシオーキシン除草剤に対する耐性または抵抗性をコードする遺伝子。かかる遺伝子の例として、国際特許公開第２００７／０５３４８２号明細書において記載される、α−ケトグルタラート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が挙げられる。
【０１５６】
（Ｇ）ジカンバに対する耐性または抵抗性をコードする遺伝子（例えば、米国特許公開第２００３０１３５８７９号明細書を参照のこと）。
【０１５７】
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する、除草剤に対する耐性または抵抗性をもたらす遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号明細書を参照のこと）。
【０１５８】
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳ  ＩＩ）のコアタンパク質に結合する、トリアジン除草剤（例えば、アトラジンン）および尿素誘導体（例えば、ジウロン）除草剤に対する耐性または抵抗性をもたらす遺伝子（Brussian et al., EMBO J. 8(4): 1237-1245 (1989）を参照のこと）。
【０１５９】
３．付加価値形質を確実にするか、または寄与する、遺伝子。
（Ａ）例えば、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）を、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ＡＣＰ脱飽和酵素で形質転換して、植物のステアリン酸含有量を増大させることによる、修飾された脂肪酸代謝（Knultzon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624 (1992)）。
【０１６０】
（Ｂ）フィチン酸塩含有量の低減。
【０１６１】
（１）アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子（Van Hartingsveldt et al., Gene 127:87 (1993)）のような、フィターゼコード遺伝子の導入は、フィチン酸塩の分解を増強し、これにより、さらに遊離したリン酸塩を形質転換された植物に付加する。
【０１６２】
（２）フィチン酸塩含有量を低減する遺伝子が導入され得る。トウモロコシにおいて、これは、例えば、低レベルのフィチン酸により特徴付けられるトウモロコシ変異体に関与する、単一の対立遺伝子と関連するＤＮＡをクローニングし、次に再導入することにより、成し遂げられ得る（Raboy et al., Maydica 35:383 (1990)）。
【０１６３】
（Ｃ）例えば、植物を、でんぷんの分岐パターンを変化させる酵素をコードする遺伝子で形質転換することにより影響された、修飾された炭水化物組成物。かかる酵素の例としては、ストレプトコッカス・ミューカス（Streptococcus mucus）フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（Shiroza et al., J. Bacteriol. 170:810 (1988)）、枯草菌（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., Mol. Gen. Genel. 200:220 (1985)）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ（Pen et al., Biolfechnology 10:292 (1992)）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al., (1993)）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., J. Biol. Chetn. 268:22480 (1993)）、およびトウモロコシ胚乳でんぷん分岐酵素ＩＩ（Fisher et al., Plant Physiol. 102:10450 (1993)）が挙げられる。
【０１６４】
遺伝子導入植物細胞および植物
本発明の組換えポリヌクレオチドは、植物細胞に導入され（形質転換され）得る。多種多様な植物および植物細胞系は、上で開示される種々の形質転換方法のうち１つまたは複数を使用して、本開示のサイトカイニンシンターゼ遺伝子発現構築物を含むように操作され得る。実施形態において、操作するための標的植物および植物細胞には、穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、コメ、アワ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ポテト、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉野菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、コニファーおよびマツの木（例えば、モミ、エゾマツ）；ファイトレメディエーションにおいて使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）、ならびに実験目的のため使用される植物（例えば、シロイヌナズナ属（Arabidopsis））を含む作物のような、それらの単子葉植物および双子葉植物が挙げられるが、これらに限定されない。故に、開示される方法および組成物を使用して、上記の、２つのドメインのサイトカイニンシンターゼコード配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｉ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、または（ｘｖ）を含む、本発明の組換えポリヌクレオチドで形質転換された、アスパラガス属（Asparagus）、アベナ属（Avena）、ブラシカ属（Brassica）、シトラス属（Citrus）、キトルルス属（Citrullus）、カプシクム属（Capsicum）、ククルビタ属（Cucurbita）、ダウクス属（Daucus）、ムカシヨモギ属（Erigeron）、ダイズ属（Glycine）、ゴシッピウム属（Gossypium）、ホルデウム属（Hordeum）、アキノノゲシ属（Lactuca）、ロリウム属（Lolium）、ナス属（Lycopersicon）、マルス属（Malus）、マニホット属（Manihot）、タバコ属（Nicotiana）、オオアラセイトウ属（Orychophragmus）、オリザ属（Oryza）、ペルセア属（Persea）、ファセオルス属（Phaseolus）、ピスム属（Pisum）、ピルス属（Pyrus）、プルヌス属（Prunus）、ラファヌス属（Raphanus）、セカレ属（Secale）、ソラヌム属（Solanum）、ソルガム属（Sorghum）、トリチカム属（Triticum）、ビチス属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）、およびトウモロコシ（Zea mays）由来の種を含むが、これらに限定されない、遺伝子導入植物ならびに遺伝子導入植物細胞が生じ得る。特に、本発明は、植物または植物細胞における発現に最適化される、組換えポリヌクレオチド（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉｉ）、（ｘｉｖ）、もしくは（ｘｖ）のコード配列を含む、遺伝子導入構築物を含む、前述の遺伝子導入植物あるいは植物細胞のうち１つを提供する。
【０１６５】
発明の組換えポリヌクレオチドと共に使用され得る植物形質転換方法には、部位特異的微粒子照射、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）形質転換方法、リン酸カルシウム形質転換方法、ポリブレン形質転換方法、エレクトロポレーション形質転換方法、超音波形質転換方法、リポソーム形質転換方法、マイクロインジェクション形質転換方法、ネイキッドＤＮＡ形質転換方法、プラスミドベクター形質転換方法、ウイルスベクター形質転換方法、炭化ケイ素により仲介される形質転換方法、エアロゾルビーム形質転換方法、またはＰＥＧ形質転換方法が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、任意の植物形質転換方法を使用して、ＤＮＡまたは任意の他のポリヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムに挿入され得る。故に、任意の、効率的な形質転換／トランスフェクション方法が利用され得る。
【０１６６】
双子葉植物ならびに単子葉植物についての生物学的および物理学的形質転換プロトコール（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech, 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc. Boca Raton, pp. 67-88 (1993)）を含む、多数の植物形質転換の方法が開発されている。加えて、遺伝子発現カセットを含むベクター、および植物細胞または組織形質転換、および植物の再生のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養方法が入手可能であり、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 8 (1993)で入手可能である。遺伝子発現カセットを含むＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するための、多数の技術が入手可能である。それらの技術は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）もしくはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換剤として使用する、解除されたＴ−ＤＮＡでの形質転換、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波方法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃（微粒子照射）、炭化ケイ素ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）により仲介される形質転換、エアロゾルビーム、またはポリエチレングリコールにより仲介される形質転換、ならびに他の可能性のある方法9-119 (1993)を含む。
【０１６７】
例えば、本発明によるサイトカイニンシンターゼをコードする遺伝子発現カセットは、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入され得る。かかる植物形質転換方法は、例えば、塩化カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはエレクトロポレーションにより仲介されるＤＮＡの取込みを介したプロトプラスト形質転換（Paszkowski et al. EMBO J 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al. Molec. Gen. Genet. 199:169-177 (1985); Fromm et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828 (1985); and Shimamoto Nature 338:274-276 (1989))およびelectroporation of plant tissues (D'Halluin et al. Plant Cell 4:1495-l505 (1992)を参照のこと）を含む。
【０１６８】
サイトカイニンシンターゼをコードする発現ベクターは、ＤＮＡ粒子照射のような微粒子銃方法を使用して、植物組織に直接導入され得る（例えば、Klein et al. Nature 327:70-73 (1987)を参照のこと）。微粒子銃方法は、ＤＮＡを微粒子銃の表面上に担持する、微粒子銃により仲介される形質転換を含む。この方法において、発現ベクターは、植物細胞壁および膜を透過するのに十分な速度まで微粒子銃を加速する微粒子銃装置で植物組織に導入される。Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。
【０１６９】
さらなる植物細胞形質転換の方法は、炭化ケイ素ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）により仲介されるＤＮＡ取込みを介したマイクロインジェクションを含む（Kaeppler et al. Plant Cell Reporter 9:415-418 (1990)）。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞に導入され得る（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／２４５，６８５号明細書を参照のこと）。
【０１７０】
遺伝子発現カセットを含むベクターを植物に導入する、広く利用される方法は、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の自然の形質転換システムに基づく。Horsch et al., Science 227:1229 (1985)。シロイヌナズナ（A. tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換するのに有用であることが公知の植物病原体土壌菌である。シロイヌナズナ（A. tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドはそれぞれ、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を担持する。Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）ベクターシステム、およびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）により仲介される遺伝子導入の方法の記載もまた、例えば、Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)、ならびに米国特許第４，９４０，８３８号および第５，４６４，７６３号明細書で入手可能である。
【０１７１】
アグロバクテリウム属（Agrobacterium）が、植物形質転換のため使用されるとき、サイトカイニンシンターゼをコードするＤＮＡは、中間ベクターと称される特定のプラスミドに、またはバイナリーベクターにクローニングされ得る。中間ベクターは、ヘルパープラスミド（接合）の不存在下でアグロバクテリウム属（Agrobacterium）において複製することができない。日本タバコスーパーバイナリーシステムが、かかるシステムの例である（Komari et al., (2006) Methods in Molecular Biology No. 343による総説：Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) (K. Wang, ed.) Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.l5-41; and Komori et al., Plant Physiol. 145:1155-1160 (2007)を参照のこと）。
【０１７２】
バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）の両方において複製することができる。それらは、右および左Ｔ−ＤＮＡ境界領域によりフレームされる、選択マーカー遺伝子、およびリンカーまたはポリリンカーを含む。バイナリーベクターは、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）に直接形質転換され得る（Holsters, 1978）。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）は、プラスミド、例えば、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への移送に典型的には必要である、ｖｉｒ領域を担持するＴｉまたはＲＩプラスミドを含む宿主細胞として使用され得る。
【０１７３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主の病原性を使用して、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）バイナリーＴ  ＤＮＡベクター技術（Bevan, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721 (1984)）、もしくは共培養方法（Horsch et al. Science 227:1229-1231 (1985)）により感染される、一倍体組織または細胞に、本明細書において開示されるサイトカイニンシンターゼをコードするＤＮＡを含有するＴ鎖の挿入が指示され得る。一般的に、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）形質転換システムを使用して、双子葉植物が操作される（Bevan et al. Ann. Rev. Genet 16:357-384 (1982); Rogers et al. Methods Enzymol. 118:627-641 (1986)）。アグロバクテリウム属（Agrobacterium）形質転換システムをまた使用して、ＤＮＡが単子葉植物および植物細胞に形質転換され、ならびに形質導入され得る。米国特許第５、５９１，６１６号明細書；Hernalsteen et al. EMBO J 3:3039-3041 (1984); Hooykass-Van Slogteren et al. Nature 311:763-764 (1984) Grimsley et al. Nature 325:1677-179 (1987); Boulton et al. Plant Mol. Biol. 12:31-40 (1989)；およびGould et al. Plant Physiol. 95:426-434(1991)を参照のこと。
【０１７４】
植物形質転換による、遺伝子発現カセットを含む遺伝子構築物の導入後、植物細胞は、シュートおよび根のような分化している組織の出芽の際に成長され、成熟した植物が生じ得る。一部の実施形態において、複数の植物が生じ得る。植物を再生する方法は、当業者に公知であり、例えば、Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic PublishersおよびPlant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)において見ることができる。本明細書に記載される、遺伝的に修飾された植物は、発酵培地において培養されるか、または土壌のような適当な培地において成長され得る。一部の実施形態において、高等植物に適した成長培地には、土壌、砂、根の成長を支持する任意の他の粒子状媒体（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）、または水耕栽培、ならびに適当な光、水、および高等植物の成長を最適化する栄養補助剤が含まれるが、これらに限定されない、任意の植物用成長培地を含み得る。
【０１７５】
前述の植物形質転換技術により生じる、形質転換された植物細胞を培養して、本発明によるサイトカイニンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを含む植物全体を再生し得る。かかる再生技術は、組織培養成長培地におけるある種の成長ホルモンの操作に依存し、典型的には、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーに依存する。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans, et al. "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985において記載される。再生はまた、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚、またはその部分から得られ得る。かかる再生技術は、Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987)において一般的に記載される。
【０１７６】
形質転換される植物細胞、カルス、組織、または植物は、操作された植物物質を、ＤＮＡを形質転換する際に存在するマーカー遺伝子（異種配列）によりコードされる形質について選択するか、またはスクリーニングすることにより同定され、単離され得る。かかる選択およびスクリーニング方法は、当業者に周知である。例えば、選択は、操作された植物物質を、形質転換する遺伝子構築物が耐性を与える阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地において生長させることにより行われ得る。さらに、形質転換された植物および植物細胞はまた、組換え核酸構築物に存在し得る、任意の視覚可能なマーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、またはｇｆｐ遺伝子）の活性についてスクリーニングすることにより、同定され得る。加えて、分子確認方法を使用して、遺伝子導入植物が同定され得る。かかる方法は、分子ビーコン、加水分解プローブアッセイ、他にＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）およびＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイとして公知のものの使用を含む。
【０１７７】
他の実施形態において、遺伝子発現カセットは、第２の植物が、従来の植物育種技術において、異種配列を含有するように、細胞への形質転換、ならびに配列を有する植物を別の植物と交配させることを含み、核酸を細胞のゲノムに挿入する場面で導入され得る。かかる育種技術は、当業者に周知である。植物育種技術の論述については、Poehlman Breeding Field Crops, AVI Pub1ication Co., Westport Conn, 4th Edit. (1995)を参照のこと。戻し交配方法を使用して、遺伝子が植物に導入され得る。この技術は、植物に形質を導入するために何十年も使用されている。この、および周知である他の植物育種方法の記載の例は、Poehlman, supra and Plant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988)のような参考文献において見ることができる。典型的な戻し交配プロトコールにおいて、目的の元々の変種（反復親）が、導入されるべき目的の単一の遺伝子を担持する第２の変種（非反復親）に交配される。次に、この交配から得られた子孫は反復親に再度交配され、反復親の所望の形態学的および生理学的特徴の本質的に全てが、非反復親由来の単一の導入された遺伝子に加えて、変換された植物において回復される植物が得られるまで、プロセスが繰り返される。
【０１７８】
本明細書に記載される例および実施形態は、説明の目的のみであること、およびそれに照らして、種々の修飾または変更が、当業者に示唆され、かつこの出願ならびに添付の請求の範囲の主旨および範囲内に含まれるべきであることが理解されるべきである。これらの例は、制限と解釈されるべきでない。
【実施例１】
【０１７９】
本発明による真菌サイトカイニンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドベクターおよび宿主細胞の調製。大腸菌（E. coli）発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）をＮｃｏＩ制限酵素で切断し、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（「ＡＰ」）で処理した。酵素の両方を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、米国から得た。ＮｃｏＩ切断およびＡＰで処理したベクターを、製造元（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、米国）の指示に従い、ＱＩＡＱＵＩＣＫ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。ベクター約５０ナノグラムを、大腸菌（E. coli）についてコドン最適化し、以下の真菌サイトカイニンシンターゼ：配列番号３（ＥｆＣＫＳ．１）、配列番号７（切断ＥｆＣＫＳ．１（アミノ酸１〜２５５））、配列番号１５（Ｎ−ポリヒスチジン−ＢｏＣＫＳ．１）、配列番号１９（Ｎ−ポリヒスチジン−ＩｒＣＫＳ．１）、配列番号１１（Ｎ−ポリヒスチジン−ＡｔＣＫＳ．１）、配列番号２３（Ｎ−ポリヒスチジン−ＡｈＣＫＳ．１）、および配列番号２７（Ｎ−ポリヒスチジン−ＦｆＣＫＳ．１）をコードする、３つの合成２本鎖ＤＮＡフラグメントと混合した。比較のため、同一のベクター配列、および大腸菌（E. coli）についてコドン最適化し、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）ＩＰＴ配列番号２９（Ｎ−ポリヒスチジン−ＡｔｕＩＰＴ）をコードする、配列を含む構築物を作り出した。ベクター、および真菌サイトカイニンシンターゼのそれぞれをコードする合成遺伝子フラグメントを、製造元の指示に従い、ＮＥＢのＧｉｂｓｏｎアセンブリー法および２×Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（登録商標）を使用して、最終ベクターにアセンブルした。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー反応産物を希釈し、製造元の指示に従い、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）のＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０コンピテント大腸菌（E. coli）細胞に形質転換した。細胞を、選択のため５０マイクログラム／ミリリットルのカナマイシン硫酸塩を含有するＬＢ寒天に播種し、真菌サイトカイニンシンターゼのそれぞれのクローンを配列決定して、本発明によるサイトカイニンシンターゼの完全なコード配列を有するベクターを含有する宿主細胞を同定した。
【実施例２】
【０１８０】
本発明が提供するサイトカイニンシンターゼ活性のスクリーニングおよび定量化の方法。配列番号３（ＥｆＣＫＳ．１）、配列番号７（切断ＥｆＣＫＳ．１（アミノ酸１〜２５５））をコードするポリヌクレオチドベクターを、実施例１により生じた宿主細胞から単離し、ベクターを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｏｒｐのＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（E. coli）タンパク質発現株に形質転換した。形質転換のそれぞれ由来の単一のコロニーを、１５ミリリットルの培養チューブ中、５０マイクログラム／ミリリットルのカナマイシン硫酸塩を含有するＬＢブロス３ミリリットルに接種し、３７℃にて、２５０ＲＰＭのオービタルシェーカーにおいて４〜６時間成長させた。次に、細胞を新鮮なＬＢブロス３ミリリットルに、最終ＯＤ６００、０．１まで希釈した。細胞を１時間、３７℃にて、２５０ＲＰＭの振盪機において成長させ、次に、氷に移した。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）インデューサーを含有するＬＢ５００マイクロリットルを加えて、１００マイクロモルの最終ＩＰＴＧ濃度を作製した。次に、これらの培養物を１８℃にて、２５０ＲＰＭの振盪機において一晩成長させ、総タンパク質およびサイトカイニンシンターゼ活性の分析のため、試料を採取した。
【０１８１】
培養液５００マイクロリットルを取り、１４，０００ＲＰＭにて２分間遠心分離し、細胞ペレットをＬＤＳバッファー２００μＬに再懸濁することにより、総タンパク質を分析した。試料を９９℃にて加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＥＳバッファー中の４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル上にロードした。ゲルを、クーマシーブルー試薬で染色し、ＥｆＣＫＳ．１（約４９ｋＤａ）および切断ＥｆＣＫＳ．１（約３０ｋＤａ）の過剰発現した遺伝子産物の存在を、図３に示す分子量標準への比較により確認した。
【０１８２】
サイトカイニンシンターゼ活性を、培養液アッセイによりアッセイした。一晩培養液の２ミリリットル試料を、１５，０００ＲＰＭにて３分間遠心分離し、培養液上清を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）のＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８  ５μＭ  ＨＰＬＣカラム上でサイトカイニンおよびサイトカイニン前駆体を分離し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）のＧ１９６９Ａ飛行時間型質量分析検出器に結合したＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ高速液体クロマトグラフィーシステム（ＨＰＬＣ−ＴＯＦ）を使用して分離した化合物を分析することにより、直接分析した。使用した移動層は、０．１％ｖ／ｖギ酸を含むＨＰＬＣグレードの水、および０．１％ｖ／ｖギ酸を含むＨＰＬＣグレードのメタノールであった。使用した勾配は、０％メタノール、１分間、１〜５分の６０％メタノールまでの直線的勾配、５〜７分の６０〜８０％メタノールの直線的勾配、および７〜１０分の０％メタノールであった。これらの条件を使用して、トランス−ゼアチンが、約３．１分においてカラムから溶出し、イソペンテニルアデニンが、約４．４分においてカラムから溶出し、イソペンテニルアデニンリボシドが、５．６分において溶出し、イソペンテニルアデノシン−５’−一リン酸が、約７．２〜７．６分の間に溶出する。
【０１８３】
陽イオンモードのＴＯＦ検出器でのこれらの培養液アッセイのため、イソペンテニルアデニン（ｉＰ、２０４．１２４）、イソペンテニルアデノシンリボシド（ｉＰＲ、３３６．１６６）、イソペンテニルアデノシン−５’−一リン酸（ｉＰＲＭＰ、４１６．１３３）、およびトランスまたはシス−ゼアチン（ｔＺもしくはｃＺ、２２０．１１９）の、質量電荷比（ｍ／ｚ）に対応するイオンをクロマトグラムから抽出し、それを使用して、培養液中の種のそれぞれの量を定量化した。
【０１８４】
培養液アッセイの結果を、図３の棒グラフにおいて示す（エラーバーは、３つの生物学的複製物の標準偏差を表す）。これらの結果は、開示する組換えポリヌクレオチドを使用して、宿主細胞において本発明による２つのドメインのサイトカイニンシンターゼを発現させ得ること、および組換えサイトカイニンシンターゼが活性であり、サイトカイニン（イソペンテニルアデニン）を生じることを示す。
【実施例３】
【０１８５】
本発明のサイトカイニンシンターゼおよびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）対照の精製、精製したサイトカイニンシンターゼによりもたらされたサイトカイニンシンターゼ活性の確認および定量化。ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（E. coli）宿主細胞を、Ｎ末端６×ヒスチジンタグのコード配列を有するエピクロエ・フェスツカエ（Epichloe festucae）サイトカイニンシンターゼ（ＥｆＣＫＳ）遺伝子（Ｎ−ポリヒスチジンＥｆＣＫＳ）（配列番号４）を含有するベクター、および製造元Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、米国）の指示に従い、ＴＡＫＡＲＡ  ｐＧｒｏ７シャペロン発現プラスミドで形質転換した。形質転換のそれぞれ由来の単一のコロニーを、２５０ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコ中、５０マイクログラム／ミリリットルのカナマイシン硫酸塩およびクロラムフェニコールを含有するＬＢブロス７５ミリリットルに接種し、３０℃にて、２５０ＲＰＭの振盪機において一晩成長させた。一晩培養した培養液１５ミリリットルを、ＬＢブロス１リットルを含有するそれぞれの２．８リットルのフェルンバッハフラスコ３つに接種した。ＬＢブロスの接種した１リットルのそれぞれは、カナマイシン硫酸塩およびクロラムフェニコール、１ミリリットル当たり５０マイクログラムを含有し、３７℃および２５０ＲＰＭにおいて１．５時間成長させた。次に、培養液のそれぞれを氷上に置き、Ｌ−アラビノース（最終濃度０．７５ミリグラム／ミリリットル）およびＩＰＴＧ（最終濃度１００マイクロモル）を添加した。１８℃および２５０ＲＰＭにおいて８時間、培養液を振盪した。次に、８０００ＲＰＭにおいて１５分間、培養液を遠心分離した。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、および２ｍＭジチオスレイトールを含有する、バッファーＡ約１２５ミリリットルに、細胞ペレットを再懸濁した。マイクロフルイダイザーを使用して、細胞を溶解した。２０，０００ＲＰＭにおいて２０分間、溶解した細胞を遠心分離した。スーパーループにロードし、１分当たり５ｍＬにて、５ミリリットルのＨｉｓＰｒｅｐ  ＦａｓｔＦｌｏｗ（登録商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン））に、清澄化した溶解物を注入した。カラムに清澄化した溶解物をロードした後、カラムをバッファーＡ１０カラム容量で洗浄した。次に、６カラム容量について２０ミリモルのイミダゾールを添加したバッファーＡで、カラムを洗浄した。２００ミリモル  イミダゾールを添加したバッファーＡで、カラムからＥｆＣＫＳを溶出した。カラムからの溶出の５分以内に、サイトカイニンシンターゼ活性について、溶出したタンパク質をアッセイした。
【０１８６】
比較のため、以下の相違：Ｌ−アラビノース添加を省略し、ＩＰＴＧでの導入および遠心分離後、バッファーＡ約４０ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁したことを伴い、上記の通り、Ｎ末端６×ヒスチジンタグに融合したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＡｔｕＩＰＴ）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（E. Coli）宿主細胞中のプラスミドベクターから発現させた。細胞を溶解し、超音波処理し、遠心分離し、得られた清澄化した溶解物をスーパーループにロードし、１分当たり５ｍＬにて、５ミリリットルのＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ（登録商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。カラムに清澄化した溶解物をロードした後、カラムをバッファーＡ８カラム容量で洗浄した。次に、ＥｆＣＫＳについて上記した通り、添加したバッファーでカラムを洗浄し、ＡｔｕＩＰＴを溶出した。
【０１８７】
１００マイクロモルのアデノシン−５'−一リン酸（ＡＭＰ）および０．１ｍｇ／ｍＬジメチルアリル二リン酸を添加したバッファーＡにおいて、溶出したタンパク質分画を２倍に希釈することにより、サイトカイニンシンターゼ活性をアッセイした。等容量の反応混合物を２％ｖ／ｖギ酸溶液と混合することにより、アッセイをクエンチした。実施例２において記載したＨＰＬＣ−ＴＯＦ法を使用して、クエンチしたアッセイを直接分析した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素活性アッセイのため、バッファーおよび酵素を含有するが反応物を含有しない注入で、クロマトグラムをブランク補正し、２６８ナノメートルにおける溶出した産物の吸光度を使用して、サイトカイニンおよびサイトカイニン前駆体を定量化した。
【０１８８】
図４の第１のパネルにおいて示す結果は、本発明による、精製した組換えサイトカイニンシンターゼ（ＥｆＣＫＳ）が、サイトカイニン生合成活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏでもたらすことを示す。ＥｆＣＫＳの唯一の検出可能な産物は、サイトカイニン（イソペンテニルアデニンまたはｉＰ）であった。対照的に、図４の第２のパネルにおいて示す通り、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＡｔｕＩＰＴ）の唯一の検出可能な産物は、残りの明らかに未変換のＡＭＰ反応物と併せたイソペンテニルアデノシン−５’−一リン酸（ｉＰＲＭＰ）であった。これらの結果はまた、ＡｔｕＩＰＴと比較して、本発明のサイトカイニンシンターゼが、新規かつ異なる産物特異性を有することも示す。
【実施例４】
【０１８９】
さらなる真菌の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼ酵素およびアミノ酸配列同一性分析パーセンテージの同定。以下の植物に関連する真菌：エピクロエ・フェスツカエ（Epichloe festucae）（ＥｆＣＫＳ）、バランシア・オブテクタ（Balansia obtecta）（ＢｏＣＫＳ）、イリオネクテリア・ラジコラ（Ilyonectria radicola）サイトカイニンシンターゼ（ＩｒＣＫＳ）、タケてんぐ巣病菌（Aciculosporium take）（ＡｔＣＫＳ）、アトキンソネラ・ヒポキシロン（Atkinsonella hypoxylon）（ＡｈＣＫＳ）、およびフザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）（ＦｆＣＫＳ）において、サイトカイニンシンターゼ配列を同定した。配列誤差および誤って予想したエクソンの存在について、配列を手動で検査した。
【０１９０】
ＢＬＡＳＴ（商標）（ＢＬＡＳＴＰまたはｂｌａｓｔｐ  ｓｕｉｔｅ）プログラム、およびＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、アミノ酸配列同一性について、サイトカイニンシンターゼ配列を分析した。プログラムは、サイトカイニンシンターゼのそれぞれの対について単一の配列アライメントを生成し、同一のアミノ酸の数（アミノ酸パーセント同一性）、「陽性物」（ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスによる陽性置換と同一であるか、またはそれとして分類されるアミノ酸）、およびアライメントにおけるそれぞれの位置におけるギャップを決定した。Altschul et al. (1997), Nucl. Acids Res 25(17):3389-3402を参照のこと。以下の表は、ＥｆＣＫＳ、ＡｔＣＫＳ、ＢｏＣＫＳ、ＩｒＣＫＳ、ＡｈＣＫＳ、およびＦｆＣＫＳの各ペアワイズＢＬＡＳＴｐアライメントについてのアミノ酸同一性、陽性物、ギャップのパーセンテージを提供する。アライメントのそれぞれにおける位置のそれぞれにおいて、同一、「陽性物」、またはギャップである、アミノ酸の数を、関連するアライメントの位置の数（長さ）にわたって丸括弧内に示す。
【０１９１】
【表２】
2017522001.tif 000004
【０１９２】
【表３】
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【０１９３】
【表４】
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【０１９４】
【表５】
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【０１９５】
【表６】
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【０１９６】
【表７】
2017522001.tif 000009
【０１９７】
以下の実施例５において記載する、サイトカイニンシンターゼ活性を確認する実験と組み合わせて、前述のものが示すのは、本発明が、例えば、機能的サイトカイニンシンターゼ活性を保持する、開示される配列に対して、少なくとも５７％〜５８％のアミノ酸配列同一性を有する変化したアミノ酸配列を有するサイトカイニンシンターゼ（例えば、少なくとも７０％〜７１％の「陽性物」を有する、ＥｆＣＫＳ−ＦｆＣＫｓ、ＡｔＣＫＳ−ＦｆＣＫｓ、ＢｏＣＫＳ−ＦｆＣＫｓ、およびＡｈＣＫＳ−ＦｆＣＫＳを参照のこと）を提供することである。本発明は、機能的サイトカイニンシンターゼ活性を保持する、開示される配列に対して少なくとも６３％〜６４％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼ（例えば、少なくとも７５％〜７８％の「陽性物」を有する、ＡｔＣＫＳ−ＢｏＣＫＳ、ＡｔＣＫＳ−ＩｒＣＫＳ、ＩｒＣＫＳ−ＦｆＣＫｓ、ＡｔＣＫＳ−ＡｈＣＫＳ、ＢｏＣＫＳ−ＩｒＣＫＳ、ＩｒＣＫＳ−ＡｈＣＫＳ、ＡｈＣＫＳ−ＦｆＣＫＳを参照のこと）を提供する。本発明は、機能的サイトカイニンシンターゼ活性を保有する、開示される配列に対して少なくとも６５％〜６８％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼ（例えば、少なくとも８０％の「陽性物」を有する、ＥｆＣＫＳ−ＡｔＣＫＳ、ＥｆＣＫＳ−ＢｏＣＫＳ、およびＥｆＣＫＳ−ＩｒＣＫＳを参照のこと）を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、機能的サイトカイニンシンターゼ活性を保有する、開示される配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカイニンシンターゼ（例えば、少なくとも８３％の「陽性物」を有するＥｆＣＫＳ−ＡｈＣＫＳを参照のこと）を提供する。
【実施例５】
【０１９８】
本発明が提供するサイトカイニンシンターゼ活性のスクリーニングおよび定量化の方法。ポリ−ヒスチジンタンパク質融合タグにＮ末端において結合した以下のサイトカイニンシンターゼ、配列番号５（Ｎ−ポリヒスチジン−ＥｆＣＫＳ．１）、配列番号７（Ｎ−ポリヒスチジン−切断ＥｆＣＫＳ．１（アミノ酸１〜２５５）；配列番号１１（Ｎ−ポリヒスチジン−ＡｔＣＫＳ．１）、配列番号１５（Ｎ−ポリヒスチジン−ＢｏＣＫＳ．１）、配列番号１９（Ｎ−ポリヒスチジン−ＩｒＣＫＳ．１）、（ｖ）配列番号２２（Ｎ−ポリヒスチジン−ＡｈＣＫＳ．１）、および配列番号２７（Ｎ−ポリヒスチジン−ＦｆＣＫＳ．１）をコードするポリヌクレオチドベクターを、実施例１により生じた宿主細胞から単離し、ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（E. coli）タンパク質発現株に形質転換し、実施例２において記載した培養液アッセイにより、サイトカイニンシンターゼ活性を直接分析した。
【０１９９】
図５において示す培養液アッセイの結果は、前述の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼの全てが、陰性対照の切断ＥｆＣＫＳ．１（アミノ酸１〜２５５）（配列番号７）を発現する宿主細胞に対して、サイトカイニン（イソペンテニルアデニン）の宿主細胞分泌の１０倍より大きな増大を生じることを示す。配列番号１５および２２について、トランス−ゼアチン（ｔＺ）の宿主細胞分泌の増大も検出した。これらの結果は、開示する組換えポリヌクレオチドを使用して、宿主細胞において本発明による２つのドメインのサイトカイニンシンターゼを発現させ得ること、および組換えサイトカイニンシンターゼが、サイトカイニンを活性に生じることを示す。
【実施例６】
【０２００】
サイトカイニンシンターゼのうちの保存された残基の同定、およびサイトカイニンシンターゼ機能に影響を及ぼす、保存された残基を同定するための試験。Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ複数配列アライメントアルゴリズム（デフォルト設定）を使用して、ＥｆＣＫＳ、ＡｔＣＫＳ、ＢｏＣＫＳ、ＩｒＣＫＳ、ＡｈＣＫＳ、およびＦｆＣＫＳ配列を整列し、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：複数配列アライメントの新規方法において記載される、Ｊａｌｖｉｅｗソフトウエアパッケージで視覚化した。全体として参照により本明細書に組み込まれるNotredame et al., J. Mol. Biol. 302(205-217) 2000。次に、アライメントを使用して、サイトカイニンシンターゼ配列の８０％より多くが保存される、アミノ酸残基を同定した。囲みにより示す保存された残基を含む、複数配列アライメントを図６において示す。
【０２０１】
個々のアミノ酸残基を標的化した変異のため選択して、配列保存および他の近くの保存された残基への近さの程度に基づき、サイトカイニンシンターゼ機能に対するそれらの効果を決定した。選択した残基を、図６の関連するアライメントの下、くさび形により示す。ＥｆＣＫＳ．１．Ｅｃ．ｈｉｓ（配列番号４）を含有するプラスミドを、部位特異的変異誘発により変化させて、６６種の異なる標的化変異を作り出した。
【０２０２】
単一プライマー部位特異的変異誘発についての以下のプロトコールを使用して、標的化変異を生じた。ＥｆＣＫＳ．１．Ｅｃ．ｈｉｓを含有するｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミド（上の実施例３を参照のこと）４００ナノグラムを、総容量５０マイクロリットルにおいて１００ナノモルの、所望の変異を含有する変異原性プライマー、２００マイクロモルｄＮＴＰ、１マイクロリットルＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、および１×Ｐｆｕ反応バッファーと混合した。以下の条件：９５℃にて３分間の開始変性、続いて以下の；９５℃３０秒間、５３℃１分間、６８℃１５分間の１８サイクル、および６８℃にて３０分間の最後の伸長ラウンドでのポリメラーゼ連鎖反応により、プラスミドを増幅した。変異原性ＰＣＲ反応混合液（４マイクロリットル）を、総反応容量２０マイクロリットルにおいて０．５マイクロリットルＤｐｎ１制限酵素、および１×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、米国）に加えた。制限酵素切断物を、３７℃にて２．５〜３時間インキュベーションした。制限酵素切断が完了した後、６マイクロリットルの制限酵素切断物を使用して、製造元の指示に従い、ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０大腸菌（E. coli）細胞を形質転換した。細胞を、ＬＢ＋カナマイシン硫酸塩プレートに播種し、一晩成長させた。単一コロニーを選択し、それを使用して、標的化変異を有するプラスミドの、配列を確認したクローンを単離した。次に、標的化変異を含有する配列を確認したプラスミドのそれぞれを使用して、製造元の指示に従い、ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１  ＤＥ３大腸菌（E. Coli）を形質転換した。単離した単一コロニーを使用して、ｐＥＴ２８ａベクター中にＥｆＣＫＳ．１．Ｅｃ．ｈｉｓ．の標的化変異のそれぞれを含有する、ＢＬ２１  ＤＥ３大腸菌（E. coli）を含有するグリセロールストックを生じた。
【０２０３】
グリセロールストックを使用して、ＬＢブロス＋カナマイシン硫酸塩６００マイクロリットルを含有する深いウェルの９６ウェルプレートに接種し、３３℃および２５０ＲＰＭにて約１５時間成長させた。培養物を使用して、ＬＢブロス＋カナマイシン硫酸塩２ｍＬを含有する、３枚の深いウェルの２４ウェルプレートに接種した。次に、培養物を３６℃にて２．５時間成長させて、５０マイクロモルＩＰＴＧに導入した。導入時の細胞のＯＤ６００は、０．６５〜０．７０であった。導入した培養物を、１８℃および２５０ＲＰＭにおいて成長させた。培養液３００マイクロリットルを深いウェルのプレートから取り出すことにより、４時間、８時間、および１６時間において、試料を採取した。培養試料を４，０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離し、上清を、０．２ミクロンのフィルターを通してろ過し、サイトカイニンの定量化のため９６ウェルのプレートに移した。定量化は、実行時間を低減するための勾配に対する修飾を伴った、上の実施例２において記載されるＨＰＬＣ−ＭＳ飛行時間型（ＨＰＬＣ−ＴＯＦ）システムにろ過滅菌した２０マイクロリットルを注入することを含む。使用した勾配は、３．５分で２％メタノールから７０％メタノール、７０％メタノールで１．５分、次に、０．９分で２％メタノールまでであった。変異体にわたってサイトカイニン産生を正規化するために、イソペンテニルアデニンについての抽出したイオンクロマトグラムピーク面積（２０４．１２４ｍ／ｚ）を、２２０．１１９ｍ／ｚにある抽出したイオンクロマトグラムピーク面積、成長中にブロスに排出される通常の大腸菌（E. coli）代謝の副生物で割った。残基が試験した時間ポイントのそれぞれにおいて、野生型ＥｆＣＫＳ．１．Ｅｃ．ｈｉｓに対して、ＬＢブロスにおけるサイトカイニン蓄積を実質的に低減したなら、残基は機能的であると決定した。
【０２０４】
図７における棒グラフは、ヒスチジンタグ付けしたＥｆＣＫＳ（「野生型」）および陰性対照のヒスチジンタグ付けした切断ＥｆＣＫＳ．１（配列番号７）に関連して、導入の１６時間後に、サイトカイニンシンターゼ活性に対する変異のそれぞれの効果を示す。変異体のそれぞれの活性を、ヒスチジンタグ付けしたＥｆＣＫＳ（配列番号５）におけるアラニン置換のアミノ酸位置への参照により、ｘ軸に沿って示す。表８は、野生型ＥｆＣＫＳ（配列番号５）、切断ＥｆＣＫＳ（アミノ酸１〜２５５）陰性対照（配列番号７）の導入の１６時間後、８時間後、および４時間後におけるサイトカイニンシンターゼ活性を示す。表９は、アラニンスキャニング置換変異体の導入の１６時間後、８時間後、および４時間後におけるサイトカイニンシンターゼ活性を示す。表９の第１のカラム（列Ｇ２３〜Ｗ５００）は、ヒスチジンタグ付けしたＥｆＣＫＳ（配列番号５）中のアラニンで置換したアミノ酸位置を指し、第２のカラム（列Ｇ１３〜Ｗ４９０）は、野生型ＥｆＣＫＳ（配列番号３）中の対応するアミノ酸位置を指す。
【０２０５】
【表８】
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【０２０６】
【表９−１】
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【０２０７】
【表９−２】
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【０２０８】
【表９−３】
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【０２０９】
表９における変異体のそれぞれについて、野生型ＥｆＣＫＳ（配列番号３）中の対応するアミノ酸位置を、配列番号５のＮ末端に付加したヒスチジンタグに起因して１０個のアミノ酸を置換することにより決定する。さらに、対応するアミノ酸位置のそれぞれを、図６を参照することにより、ＥｆＣＫＳ、ＡｔＣＫＳ、ＢｏＣＫＳ、ＩｒＣＫＳ、ＡｈＣＫＳ．１、およびＦｆＣＫＳにおいて決定することができ、それは、サイトカイニンシンターゼ配列のそれぞれにおいて、変化したとき、（ｉ）活性に対する高度な効果（くさび形▲により示す）、または（ｉｉ）活性に対する低度な効果（塗りつぶされていないひし形◇により示す）を有する、保存されたアミノ酸を示す。
【０２１０】
前述の結果は、アミノ酸残基が、サイトカイニンシンターゼ活性の野生型レベルを保つために、本発明のサイトカイニンシンターゼにおいて保存されるべきガイダンスをもたらす。故に、本発明は、例えば、開示されるアミノ酸と共に整列するとき（図６の通り）、活性に対する高度もしくは低度の効果を有するとして表９および図７において同定した残基を含む、開示される配列に対して少なくとも５７％〜５８％のアミノ酸配列同一性（例えば、ＥｆＣＫＳ−ＦｆＣＫｓ、ＡｔＣＫＳ−ＦｆＣＫｓ、ＢｏＣＫＳ−ＦｆＣＫｓ、およびＡｈＣＫＳ−ＦｆＣＫＳを参照のこと）；開示される配列に対して少なくとも６３％〜６４％のアミノ酸配列同一性（例えば、ＡｔＣＫＳ−ＢｏＣＫＳ、ＡｔＣＫＳ−ＩｒＣＫＳ、ＩｒＣＫＳ−ＦｆＣＫｓ、ＡｔＣＫＳ−ＡｈＣＫＳ、ＢｏＣＫＳ−ＩｒＣＫＳ、ＩｒＣＫＳ−ＡｈＣＫＳ、ＡｈＣＫＳ−ＦｆＣＫＳを参照のこと）；開示される配列に対して少なくとも６５％〜６８％のアミノ酸配列同一性（例えば、ＥｆＣＫＳ−ＡｔＣＫＳ、ＥｆＣＫＳ−ＢｏＣＫＳ、およびＥｆＣＫＳ−ＩｒＣＫＳを参照のこと）；または開示される配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性（例えば、ＥｆＣＫＳ−ＡｈＣＫＳを参照のこと）を有する、機能的サイトカイニンシンターゼを提供する。
【０２１１】
前述の結果はまた、他の実施形態において、本発明は、少量が低減する、サイトカイニンシンターゼ活性を有するサイトカイニンシンターゼを提供することも示す。一部の実施形態において、本発明は、例えば、開示されるアミノ酸と共に整列するとき（図６の通り）、活性に対する低度の効果を有するとして表９および図７において同定した残基を含む、開示される配列に対して少なくとも５７％〜５８％のアミノ酸配列同一性；開示される配列に対して少なくとも６３％〜６４％のアミノ酸配列同一性；開示される配列に対して少なくとも６５％〜６８％のアミノ酸配列同一性；または開示される配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、機能的サイトカイニンシンターゼを提供する。
【実施例７】
【０２１２】
さらなる真菌の２つのドメインのサイトカイニンシンターゼ酵素およびアミノ酸配列同一性分析パーセンテージのさらなる同定。さらに、本発明による、イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメインおよびホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメインをコードする真菌遺伝子についてゲノムデータベースを検索することにより、サイトカイニンシンターゼ配列を同定した。配列誤差および誤って予想したエクソンの存在について、さらなるサイトカイニンシンターゼを手動で検査し、アッセイしてサイトカイニンシンターゼ活性を確認する。本発明のさらなるサイトカイニンシンターゼのアミノ酸配列を、配列番号３４〜５４として提供し、図２４〜２９において示す。表１０は、アミノ酸配列のそれぞれについての真菌供給源（ならびに対応する遺伝子Ｉｄ（ｇｉ／ｊｇｉ）、または図２３における系統樹において使用する、サイトカイニンシンターゼについての略語）を示す。
【０２１３】
【表１０】
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【実施例８】
【０２１４】
本発明のサイトカイニンシンターゼにおける機能的モチーフの同定、およびサイトカイニンシンターゼ機能に影響を及ぼす、保存された残基を同定するための試験。
【０２１５】
図６において示すアライメント、ならびに実施例６および表８において記載した部位特異的変異誘発結果を、実施例７において同定したさらなるサイトカイニンシンターゼを考慮して分析し、真菌サイトカイニンシンターゼのそれぞれにおいて有意なモチーフを機能的に同定した。図６のアライメントにおけるコンセンサスアミノ酸配列位置に言及して、以下の４つのモチーフを同定した：（１）コンセンサス配列アミノ酸位置１３〜２０におけるＧＰＴＸａａ１Ｘａａ２ＧＫＴ（配列番号３０）（式中、Ｘａａ１は、ＧまたはＡであり、Ｘａａ２は、Ｖ、Ｓ、Ａ、またはＴである）、（２）コンセンサス配列アミノ酸位置９６〜１０４におけるＰＸａａ３Ｘａａ４Ｘａａ５ＧＧＳＸａａ６Ｓ（配列番号３１）（式中、Ｘａａ３は、ＩまたはＶであり、Ｘａａ４は、ＬまたはＶであり、Ｘａａ５は、ＶまたはＣであり、Ｘａａ６は、ＴまたはＩである）、（３）コンセンサス配列アミノ酸位置３３３〜３３８におけるＸａａ７Ｘａａ８ＹＧＧＧ（配列番号３２）（式中、Ｘａａ７は、ＬまたはＩであり、Ｘａａ８は、ＶまたはＩである）、および（４）コンセンサス配列アミノ酸位置４２６〜４３８におけるＸａａ９ＧＧＹＧＴＸａａ１０ＥＥＬ（配列番号３３）（式中、Ｘａａ９は、ＳまたはＰであり、Ｘａａ１０は、ＬまたはＭである）。以下の表１１は、本明細書において開示するそれぞれの真菌サイトカイニンシンターゼの中の例示する前述のモチーフに対応する正確な配列を示す。
【０２１６】
【表１１】
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【０２１７】
前述のものは、（ｉ）イソペンテニル転移（ＩＰＴ）様ドメイン、（ｉｉ）ホスホリボヒドロラーゼ（ＰＲＨ）様ドメイン、および（ｉｉｉ）前述の４つのモチーフのそれぞれを含む、２つのドメインのサイトカイニンシンターゼに関する本発明の実施形態を示す。
【実施例９】
【０２１８】
ＩＰＴ様ドメインまたはＰＲＨ様ドメインを有する非真菌タンパク質中の機能的モチーフの確認、および修飾したサイトカイニンシンターゼを作製するためのそれらの使用。
【０２１９】
ＩＰＴ様ドメインを含有するタンパク質を、前述の実施例８において同定した第１および第２のモチーフの存在について調べた。表１２は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）イソペンテニルトランスフェラーゼの細菌相同体（遺伝子ＩＤ（ｇｉ）により同定する相同体のそれぞれ）において同定した、かかるモチーフの代表的なセットを提供する。
【０２２０】
【表１２】
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【０２２１】
表１３は、大腸菌（Escherichia coli）ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼの細菌相同体（遺伝子ＩＤ（ｇｉ）により同定する相同体のそれぞれ）において同定した、かかるモチーフの代表的なセットを提供する。
【０２２２】
【表１３】
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【０２２３】
表１４は、植物アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼの細菌相同体（遺伝子ＩＤ（ｇｉ）により同定する相同体のそれぞれ）において同定した、かかるモチーフの代表的なセットを提供する。
【０２２４】
【表１４】
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【０２２５】
ＰＲＨ様ドメインを含有するタンパク質を、前述の実施例８において同定した第３および第４のモチーフの存在について調べた。表１５は、植物サイトカイニンリボシド５'−一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ（遺伝子ＩＤ（ｇｉ）により同定する相同体のそれぞれ）において同定した、かかるモチーフの代表的なセットを提供する。
【０２２６】
【表１５】
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【０２２７】
前述の証拠は、本発明により開示する４つのモチーフが、ＩＰＴ様ドメインまたはＰＲＨ様ドメインのいずれかを有する、非真菌タンパク質中で機能的であることを支持する。前述のものはまた、表１２、１３もしくは１４において開示したモチーフ１、モチーフ２、およびモチーフ１とモチーフ２の両方を含むよう、および／または表１５におけるモチーフ３、モチーフ４、もしくはモチーフ３とモチーフ４の両方を含むよう、本明細書において開示するサイトカイニンシンターゼを修飾するためのガイダンスを提供する。故に、図６において示す、配列番号３（ＥｆＣＫＳ）、配列番号９（ＡｔＣＫＳ）、配列番号１３（ＢｏＣＫＳ）、配列番号１７（ＩｒＣＫＳ）、配列番号２１（ＡｈＣＫＳ）、または配列番号２５（ＦｆＣＫＳ）のコンセンサス配列と共に整列するとき、本明細書において開示する任意のサイトカイニンシンターゼを以下の通りに修飾し得る：（ａ）コンセンサス配列アミノ酸位置１３〜２０におけるモチーフ１（配列番号３０）を、表１２、１３または１４におけるモチーフ１のアミノ酸で置換する、（ｂ）コンセンサス配列アミノ酸位置９６〜１０４におけるモチーフ２（配列番号３１）を、表１２、１３または１４におけるモチーフ２のアミノ酸で置換する、（ｃ）コンセンサス配列アミノ酸位置３３３〜３３８におけるモチーフ３（配列番号３２）を、表１５におけるモチーフ３のアミノ酸で置換する、（ｄ）コンセンサス配列アミノ酸位置３３３〜３３８におけるモチーフ４（配列番号３３）を、表１５由来のモチーフ４のアミノ酸で置換する、（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の２つ以上のモチーフ置換の組み合わせ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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