(57)【要約】本発明は疾患におけるバイオマーカー発現を評価するための方法および使用するための組成物を提供し、多標的化したリステリアベースの前記疾患に対する免疫療法的なアプローチを提供する。関連する態様では、本発明は被験者内の疾患を処置する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生物サンプルを得る工程、ｂ．前記生物サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程、ｃ．前記被験者に組み換え型リステリア株を含む組成物を投与する工程であって、前記リステリアが少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程を含み、前記融合タンパク質が前記生物サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーＰＥＳＴ含有ポリペプチドが融合され、前記リステリア内の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それにより前記被験者内の前記疾患を処置する。
2017511796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における疾患に対して免疫応答を誘発する方法であって、前記方法が、
ａ）前記被験者から生体サンプルを得る工程と、
ｂ）前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、
ｃ）前記被験者に組み換え型リステリア株を含む組成物を投与する工程であって、前記株が少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、
ｉ）前記融合タンパク質が前記生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含み、
ｉｉ）前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、
ｉｉｉ）前記バイオマーカーが、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、
ｉｖ）前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者の中に多標的抗疾患免疫応答を誘発する、工程か、または、
ｄ）各々が組み換え型リステリア株を含む所定の数の組成物を、前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程であって、
ｉ）前記融合タンパク質が前記生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含み、
ｉｉ）前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、
ｉｉｉ）前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、
ｉｖ）各々の組成物の中の各々のリステリア株が前記融合タンパク質中に異なるバイオマーカーを含み、
ｖ）それによって前記被験者の中に前記疾患に対する多標的免疫応答を誘発する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記疾患が、先天性疾患および感染性疾患、ガン、または腫瘍増殖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リステリアベースのワクチンを投与する前の前記被験者から得られた生体サンプル中で前記バイオマーカーが検出される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記生体サンプルが、血液、組織、ＤＮＡ、ＲＮＡ、精子、脳脊髄液、痰、または血清である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リステリアベースのワクチンの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に、ワクチンの代替組成物、もしくはワクチンの代替形態を投与する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ワクチンの代替組成物または代替形態が、前記生体サンプル中で発現されるバイオマーカーを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチン、前記融合タンパク質を含むウイルスベクター、前記融合タンパク質を含むウイルス様粒子、または前記融合タンパク質を発現する組み換え型の生きた非リステリア細菌ベクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
追加的な活性薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記追加的な活性薬剤が、免疫チェックポイント阻害剤、その抗体または断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、またはこれらの組合せである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物または組成物の混合物のブースターを投与する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ワクチンの代替組成物または代替形態のブースター投与量を投与する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記所定の数のバイオマーカーが、各々がその他のものとは異なる１〜１０個のバイオマーカーである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記請求項１のｂ）に記載の組成物内の前記組み換え型リステリアが、各々がその他のものとは異なるバイオマーカーを含む１〜１０個の融合タンパク質を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記請求項１のｄ）に記載の組み換え型リステリア株を含む前記組成物の混合物が、１〜１０個の組成物を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、Ｎ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ＰＥＳＴ配列、またはＮ末端ＡｃｔＡ配列である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リステリア株が、ゲノム突然変異、または前記染色体のｄａｌ／ｄａｔ遺伝子の欠失を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記リステリア株が、ゲノム突然変異、または前記染色体のａｃｔＡ遺伝子の欠失を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リステリア株が、ゲノム突然変異、または前記染色体のｐｒｆＡ遺伝子の欠失を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記リステリア株中の前記核酸配列が、前記リステリアの中の安定な染色体外プラスミド中に存在する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プラスミドが、前記プラスミドの前記リステリア染色体の中への組込をコードする配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プラスミドが、前記リステリア中の前記ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子、ａｃｔＡ遺伝子、または前記ｐｒｆＡ遺伝子内で、前記ゲノム突然変異または欠失を相補するタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオマーカーが腫瘍抗原である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍抗原が前記腫瘍の形成または増殖と関連付けられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍またはその血管系によって前記腫瘍抗原が発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、結果的にＣＤ８  Ｔ細胞／調節性Ｔ細胞抑制因子比の増加をもたらす、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、結果的に前記疾患の再発を防止する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、結果的に前記疾患の治療をもたらす、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患が、ガンまたは腫瘍増殖である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患におけるバイオマーカー発現を評価するための方法および組成物を提供し、かつ多標的化したリステリアベースの前記疾患に対する免疫療法的なアプローチを提供する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマーカーは、何らかの疾患の状態の重篤度もしくは何らかの疾患の存在を反映する、または何らかの疾患と関連付けられ、かつ生物体の特定の疾患の状態または他の何らかの生理学的状態の指標として使用することができる測定可能な特徴である。バイオマーカーは、特定のガンまたは腫瘍などの疾患の状態の存在または進行を識別および／または測定するために使用することができる特異的な細胞、分子、遺伝子、遺伝子産物、酵素、受容体、これらの細胞要素またはホルモンのうちのいずれかの突然変異型とすることができる。さらに、腫瘍およびガンが、腫瘍またはガンの存在を識別する、あるいは腫瘍もしくはガンの進行または治療の効果を測定するために使用される一組の腫瘍バイオマーカーを発現する可能性があることが周知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
バイオマーカーの豊富な使用にもかかわらず、疾患のある状態の増殖または存在およびこれに続く被験者の総合的な健康状態の悪化と直接的に関連付けられる疾患の診断および疾患の進行のモニターのために、疾患によって発現されたバイオマーカーを具体的に標的化するようにこの情報を使用できるようにする治療的なアプローチを開発する必要性がまだある。
【０００４】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、主として抗原提示細胞に感染し、またこれらの細胞の細胞質内に死ぬまで適合する細胞内病原体である。リステリア・モノサイトゲネスおよびこれが生産するタンパク質（リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）と名付けられる）は、細胞ベースの免疫療法のために使用される大多数のアジュバントとは異なり、対象となる抗原をＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質などのリステリアによって発現されるアジュバントタンパク質に融合するとき、抗原特異的治療を提供した後で投与することができ、またはそれ自身抗原特異的治療を提供するために使用することができる、強いアジュバント特性を有する。
【０００５】
本発明は、組み合せによる多標的免疫療法的なアプローチを提供することによってこの必要性に対処するものであり、別個の組成物内に存在する対応するリステリアとは異なる疾患関連抗原を発現する組み換え型リステリア株を各々含む個々の組成物が、疾患を有する被験者に別個に投与され、またはこの組成物を組み合わせて単回ボーラス投与として投与される。本発明は、少なくとも１つの免疫原性のリステリアペプチド（Ｎ末端ＬＬＯ、切断ＬＬＯ、ＡｃｔＡタンパク質断片、またはＰＥＳＴペプチドなどの）に融合された抗原を含む融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを使用することによって、所定の数の疾患関連抗原またはその断片を提供することにより、この必要性にさらに対処する。かかる組成物の使用は、腫瘍、ガン、または２つ以上のバイオマーカーを発現する疾患細胞の亜集団を有するその他の疾患を含む疾患の順調な治療を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、疾患に対する免疫応答を前記疾患を有する被験者内に誘発する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって多標的抗疾患免疫応答を前記被験者内に誘発する。
【０００７】
一態様では、本発明は、疾患に対する免疫応答を前記疾患を有する被験者内に誘発する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を各々が含む組成物の混合物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が前記融合タンパク質中に異なるバイオマーカーを含み、それによって多標的抗疾患免疫応答を前記被験者内に誘発する。
【０００８】
関連する態様では、本発明は、被験者内の疾患を治療する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患を治療する。
【０００９】
関連する態様では、本発明は、被験者内の疾患を治療する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を各々が含む組成物の混合物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患を治療する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、被験者内の疾患の再発を防止する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患の再発を防止する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、被験者内の疾患の再発を防止する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を各々含む組成物の混合物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患の再発を防止する。
【００１２】
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が明らかとなるので、この詳細な説明および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示としてのみ与えられることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
以下の図面は本明細書の一部分を形成し、かつ本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示した具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つ以上を参照することによって本発明をよりよく理解することができる。本特許ファイルまたは本特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。本特許または本特許出願のカラー図面付きの出版物の複製物は、要求に応じ、かつ必要な料金の支払いに応じて米国特許商標局から提供される。
【００１４】
【図１】Ｅ７を発現および分泌するために異なる発現系を使用するＬｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を示す。Ｌｍ−Ｅ７を、Ｌ．モノサイトゲネスゲノム（Ａ）のｏｒｆＺドメインの中へと遺伝子カセットを導入することによって生成した。ｈｌｙプロモーターは、ＨＰＶ−１６  Ｅ７が後に続くＬＬＯのｈｌｙシグナル配列および最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）の発現を駆動する。Ｂ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、ｐｒｆＡ−株ＸＦＬ−をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによって生成した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の融合非溶血性の融合の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有する。ｐＧＧ−５５は、ｐｒｆＡ遺伝子も含有し、インビボでＸＦＬ−７によってプラスミドの保持を選択する。
【図２】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７のＥ７分泌を示す。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ培地中で３７℃にて一晩増殖させた。６００  ｎｍの吸光度においてＯＤによって決定された同等数の細菌をペレット化して、１８  ｍＬの各々の上清をＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をウエスタンブロットによって解析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂでプローブし、それに続いてＨＲＰ共役抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブし、次いでをＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。
【図３】ＬＬＯ−Ｅ７融合の腫瘍免疫療法的な有効性を示す。腫瘍接種の７、１４、２１、２８、および５６日後におけるマウス内の腫瘍サイズがミリメートルで示される。無処置マウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：正方形、Ｌｍ−Ｇａｇ：白ひし形、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。
【図４】ＴＣ−１細胞に曝露されたとき増殖するＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−免疫化マウスからの脾細胞を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、または対照ｒＬｍ株を用いて免疫を与え、かつブーストした。脾細胞を、ブーストの６日後に採取して、示される比で照射したＴＣ−１細胞をプレーティングした。細胞を３Ｈチミジンでパルスして、採取した。ｃｐｍは、（実験的ｃｐｍ）−（非ＴＣ−１対照）と定義された。
【図５Ａ】（Ａ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＥ７を分泌することを実証するウエスタンブロットを示す。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７．００１、レーン３：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３、レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４．
【図５Ｂ】Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（長方形）、Ｌｍ−Ｅ７（楕円）、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（×）を投与したマウス、ならびに無処置マウス（非ワクチン接種、黒三角形）内の腫瘍サイズを示す。
【図６Ａ】４つのＬＭワクチンを作り出すために使用されるプラスミドインサートの概略表示を示す。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７インサートは、使用されるすべてのリステリア遺伝子を含有する。これは、ｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子の最初の１．３ｋｂ（タンパク質ＬＬＯをコードする）、およびＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子を含有する。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂは、シグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、残りの切断ＬＬＯ遺伝子は除外する。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７はＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および切断ＬＬＯの残りを含有する。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。
【図６Ｂ】上のパネル：リステリア構築体は、腫瘍退行を誘発するＰＥＳＴ領域を含有する。下のパネル：２つの別個の実験での腫瘍チャレンジ後２８日目における平均腫瘍サイズ。
【図６Ｃ】脾臓内にＥ７特異的なリンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体を示す。３つの実験からのデータの平均およびＳＥが図示される。
【図７Ａ】ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、これに続いてＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、もしくはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与した、またはワクチンを投与しなかった（無処置）マウスでの、脾臓内でのＥ７特異的なＩＦＮ−ガンマ−分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に浸透する数を示す。
【図７Ｂ】（Ａ）に記述したマウスの脾臓および腫瘍でのＥ７特異的なＣＤ８＋細胞の誘導および浸透を示す。
【図８】腫瘍の中のＥ７特異的なリンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体を示す。（Ａ）１つの実験からの代表的データ。（Ｂ）３つのすべての実験からのデータの平均およびＳＥ。
【図９Ａ】大腸菌−リステリアシャトルプラスミドｐＧＧ５５の概略的なマップを示す。ＣＡＴ（−）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ、Ｏｒｉ  Ｌｍ：リステリアの複製起点、Ｏｒｉ  Ｅｃ：大腸菌のｐ１５複製の起点、ｐｒｆＡ：リステリア病原性調節因子Ａ、ＬＬＯ：Ｃ末端切断リステリオリシンＯ、そのプロモーターを含む、Ｅ７：ＨＰＶ  Ｅ７。選択された制限部位も図示される。
【図９Ｂ】大腸菌−リステリアシャトルプラスミドｐＴＶ３（下記）の概略的なマップを示す。ＣＡＴ（−）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ、Ｏｒｉ  Ｌｍ：リステリアの複製起点、Ｏｒｉ  Ｅｃ：大腸菌のｐ１５複製の起点、ｐｒｆＡ：リステリア病原性調節因子Ａ、ＬＬＯ：Ｃ末端切断リステリオリシンＯ、そのプロモーターを含む、Ｅ７：ＨＰＶ  Ｅ７、ｐ６０−ｄａｌ、ｐ６０プロモーターおよびリステリアｄａｌ遺伝子の発現カセット。選択された制限部位も図示される。
【図１０】ＤＮＡ配列（配列番号：８１）を示すが、これは、リステリア株ＥＧＤのゲノム上のｉｎｌＣ領域の上流および下流を提示する。ＤＮＡ−ｕｐ（赤色）、ｉｎｌＣ遺伝子（青色）、およびＤＮＡ−ｄｏｗｎ（黒色）。
【図１１】ＤＮＡの配列（配列番号：８２）を示すが、これは、温度感受性プラスミド、ｐＫＳＶ７中でクローニングされ、ｉｎｌ  Ｃ欠失突然変異体を作り出す。これらの領域のクローニングのために使用される制限酵素部位は、大文字および下線付きで示される。ＧＡＡＴＴＣ−ＥｃｏＲＩ、ＧＧＡＴＣＣ−ＢａｍＨＩ、およびＣＴＧＣＡｇ−ＰｓｔＩである。ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩインサートは、ベクター、ｐＫＳＶ７内でクローニングされる。
【図１２】Ｌｍ−ｄｄおよびＬｍ−ｄｄＤａｃｔＡ株の概略的な表示を示す。株、Ｌｍ−ｄｄおよびＬｍ−ｄｄDａｃｔＡのｅ染色体のＤＮＡをテンプレートとして使用して、オリゴの１／２およびオリゴの３／４を使用するＰＣＲ産物のサイズを示すゲルが得られた。
【図１３】リステリア染色体のａｃｔＡ遺伝子の上流および下流を提示するＤＮＡ配列（配列番号：６０）を示す。斜字体の領域は、ＬｍｄｄDａｃｔＡ株内に存在する残りのａｃｔＡ配列要素を含有する。下線付きの配列ｇｔｃｇａｃは、ａｃｔＡのＮ−Ｔ領域とＣ−Ｔ領域との間の結合である、ＸｈｏＩの制限部位を表す。
【図１４】ＬＭワクチン株（Ａ）の投与に応答する腫瘍退行を図示する。丸は無処置マウスを表し、逆三角形はＬｍｄｄ−ＴＶ３を投与されたマウスを表し、十文字はＬｍ−ＬＬＯＥ７を投与されたマウスを表す。
【図１５】（Ａ）ｐＡｄｖ１６４のプラスミドマップを示し、これは、構造性のリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、ＬｍｄｄＡ株内の染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失の相補のために、バシラスサチリスｄａｌ遺伝子を持つ。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ  ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、切断ＬＬＯ（１−４４１）のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。（Ｂ）抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内でｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。１０４  ＫＤまでの差を示す帯はｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性のＬＬＯは、５８  ＫＤ帯として検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【図１６】（Ａ）ＮＴ−２細胞を刺激細胞として使用し、かつ３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して、免疫化マウスからの脾細胞内でＨｅｒ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって引き出された細胞毒性Ｔ細胞応答が試験された。Ｌｍ−対照は、すべてのやり方で同一であるが、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）が発現される、ＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づく。（Ｂ）脾細胞によって免疫化ＦＶＢ／Ｎマウスから細胞培地の中へと分泌されたＩＦＮ−ｇが、ＮＴ−２細胞によって処置されたマイトマイシンＣを用いたインビトロの刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。（Ｃ）インビトロでのタンパク質の異なる領域からのペプチドを用いたインキュベーションに応答する、キメラワクチンを用いて免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−ｇ分泌。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。コインキュベーションの７２時間後に採取した細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各々のデータ点は、３倍のデータ＋／−標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図１７】各々の組み換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２ワクチン、または対照リステリアワクチンを６回注射したＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスからの結果を表す。生後６週で免疫化を開始し、２１週目まで３週ごとに継続した。腫瘍の外観を毎週観察して、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージで表現した。＊ｐ＜０．０５、グループ当たりＮ＝９。
【図１８】ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下接種して、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化したことを示す。第２の免疫化の７日後、脾臓を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のためにこれらを抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によって染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図１９】ＦＶＢ／Ｎマウスが１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下接種され、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化されたことを示す。第２の免疫化の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。（Ａ）代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロット。（Ｂ）異なる投与群にわたって全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左のパネル）、および腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）に対するパーセンテージとして表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示される。
【図２０】ｐＡｄｖ１３４プラスミドおよびデュアルプラスミドの概略的な表示を示す。抗原１（Ｘｈｏ  ＩおよびＳｐｅＩ）および抗原２（ＸｂａＩおよびＳａｃＩまたはＢｇｌＩＩ）遺伝子のクローニングのために使用されることになる制限部位が示される。黒色の矢印は転写の方向を表す。ｐ１５  ｏｒｉおよびＲｅｐＲは、リステリアおよび大腸菌複製起点を指す。ｔＬＬＯは切断リステリオリシンＯタンパク質（１−４４１  ａａ）であり、またｔＡｃｔＡは切断ＡｃｔＡ（１−２３３  ａａ）タンパク質である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ−ｄａｌ遺伝子は、ＬｍDｄａｌ  ｄａｔ株内でＤ−アラニンの合成を相補するＤ−アラニン・ラセマーゼをコードする。
【図２１】腫瘍内でのＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの減少を示す。Ｌｍワクチン接種（ＬｍｄｄＡＰＳＡおよびＬｍｄｄＡＥ７）の後に続く、ＭＤＳＣの数（右側パネル上）（Ｂ）およびＴｒｅｇの数（左側パネル上）（Ａ）。
【図２２】図２２Ａ〜Ｄは、リステリアワクチン接種後、ＴＰＳＡ２３腫瘍（ＰＳＡ発現腫瘍）からの単球性ＭＤＳＣがより抑制的でなくなることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。ＰＳＡ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図２２Ａおよび図２２Ｂでは、ホルボールミリステートアセテートおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／Ｉ）は非特異的な刺激を表す。図２２Ｃおよび図２２Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ２２＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２２Ａおよび図２２Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２２Ｂおよび図２２Ｄは、プールした分裂サイクルを示す。
【図２３】図２３Ａ〜Ｄは、リステリアが脾臓の単球性ＭＤＳＣには効果がなく、またこれらは単に抗原特異的な様式で抑制的であるのにすぎないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２３Ａおよび図２３Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２３Ｃおよび図２３Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２３Ａおよび図２３Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２３Ｂおよび図２３Ｄは、プールした分裂サイクルを示す。
【図２４】図２４Ａ〜Ｄは、リステリアワクチン接種の後、腫瘍からの顆粒球性のＭＤＳＣがＴ細胞を抑制する能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。ＰＳＡ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図２４Ａおよび図２４Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２４Ｃおよび図２４Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２４Ａおよび図２４Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２４Ｂおよび図２４Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２５】図２５Ａ〜Ｄは、リステリアが脾臓の顆粒球性ＭＤＳＣには効果がなく、またこれらは単に抗原特異的な様式でのみ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２５Ａおよび図２５Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２５Ｃおよび図２５Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２５Ａおよび図２５Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２５Ｂおよび図２５Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２６】図２６Ａ〜Ｄは、腫瘍からのＴｒｅｇがまだ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。この腫瘍モデルでは、非抗原特異的な様式でのＴｒｅｇの抑制能力にはわずかに減少がある。図２６Ａおよび図２６Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２６Ｃおよび図２６Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２６Ａおよび図２６Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２６Ｂおよび図２６Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２７】図２７Ａ〜Ｄは、脾臓のＴｒｅｇがまだ抑制的であることを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２７Ａおよび図２７Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２７Ｃおよび図２７Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２７Ａおよび図２７Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２７Ｂおよび図２７Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図２８】図２８Ａ〜Ｄは、それらがマウスの腫瘍で見出されたのか、または脾臓で見出されたのかに関わらず、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞分裂には効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図２８Ａおよび図２８Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２８Ｃおよび図２８Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ３＋ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。Ｔｒｅｇの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＴｒｅｇ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２８Ｃ〜図２８Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分からのデータを示す。
【図２９】図２９Ａ〜Ｄは、リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からの単球性ＭＤＳＣが、抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図２９Ａおよび図２９Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図２９Ｃおよび図２９Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図２９Ａおよび図２９Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図２９Ｂおよび図２９Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３０】図３０Ａ〜Ｄは、脾臓の単球性ＭＤＳＣにはリステリア特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図３０Ａおよび図３０Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３０Ｃおよび図３０Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図３０Ａおよび図３０Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３０Ｂおよび図３０Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３１】図３１Ａ〜Ｄは、リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からの顆粒球性ＭＤＳＣが、抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原特異的なＴ細胞および非特異的に刺激されているＴ細胞でも同一の抑制減少が見られるので、ＭＤＳＣの抑制能力の変化は抗原特異的ではない。図３１Ａおよび図３１Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３１Ｃおよび図３１Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図３１Ａおよび図３１Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３１Ｂおよび図３１Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３２】図３２Ａ〜Ｄは、脾臓の顆粒球性ＭＤＳＣにはリステリア特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図３２Ａおよび図３２Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３２Ｃおよび図３２Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。ＭＤＳＣの無い群は、刺激しないままにしたときレスポンダーＴ細胞の分裂を欠いていることを示し、また最後の群（ＰＭＡ／Ｉまたはペプチド添加）はＭＤＳＣ無しで刺激した細胞の分裂を示す。図３２Ａおよび図３２Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３２Ｂおよび図３２Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３３】図３３Ａ〜Ｄは、リステリアワクチン接種後、４Ｔ１腫瘍（Ｈｅｒ２発現腫瘍）からのＴｒｅｇの抑制能力の減少を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。図３３Ａおよび図３３Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３３Ｃおよび図３３Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。この減少は、Ｔｒｅｇの抑制能力の変化はＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的なレスポンダーＴ細胞と非特異的なレスポンダーＴ細胞との両方で見られるので、抗原特異的ではない。図３３Ａおよび図３３Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３３Ｂおよび図３３Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３４】図３４Ａ〜Ｄは、脾臓のＴｒｅｇにはリステリアに特異的な効果がないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。レスポンダーＴ細胞は、抗原特異的であるかどうかに関わらず、すべてが分裂の能力を有する。図３４Ａおよび図３４Ｂでは、ＰＭＡ／Ｉは、非特異的な刺激を表す。図３４Ｃおよび図３４Ｄでは、「ペプチド」という用語は特異的な抗原刺激を表す。パーセント（％）ＣＤ８＋は、エフェクター（レスポンダー）Ｔ細胞の％を表す。図３４Ａおよび図３４Ｃは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。図３４Ｂおよび図３４Ｄは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３５】図３５Ａ〜Ｄは、顆粒球性ＭＤＳＣの抑制能力がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原の組合せとは関係が無いことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネル（図３５Ａおよび図３５Ｃ）は、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネル（図３５Ｂおよび図３５Ｄ）は、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３６】図３６Ａ〜Ｄは、単球性ＭＤＳＣの抑制能力もｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原の組合せとは関係が無いことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネル（図３６Ａおよび図３６Ｃ）は、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネル（図３６Ｂおよび図３６Ｄ）は、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３７】図３７Ａ〜Ｄは、Ｌｍワクチン接種の後、脾臓から精製された顆粒球性のＭＤＳＣがその抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持することを実証する抑制因子アッセイデータを示す（図３７Ａおよび図３７Ｂ）。しかしながら、非特異的な刺激後、活性化したＴ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて）は、まだ分裂の能力を有している（図３７Ｃおよび図３７Ｄ）。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３８】図３８Ａ〜Ｄは、Ｌｍワクチン接種の後、脾臓から精製された単球性のＭＤＳＣがその抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持することを実証する抑制因子アッセイデータを示す（図３８Ａおよび図３８Ｂ）。しかしながら、非特異的な活性化（ＰＭＡ／イオノマイシンによって刺激された）後、Ｔ細胞は、まだ分裂の能力を有している（図３８Ｃおよび図３８Ｄ）。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図３９】図３９Ａ〜Ｄは、レスポンダー細胞が抗原特異的（図３９Ａおよび図３９Ｂ）に活性化されるか、または非特異的（図３９Ｃおよび図３９Ｄ）に活性化されるかに関わらず、Ｌｍで処置した群のいずれかの腫瘍から精製したＴｒｅｇのレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力がわずかに減退したことを実証するための抑制因子アッセイデータを示す。左側のパネルは、各々の群について個別の細胞分裂サイクルを示す。右側のパネルは、プールした分裂のパーセンテージ部分を示す。
【図４０】図４０Ａ〜Ｄは、脾臓から精製したＴｒｅｇがまだ抗原特異的（図４０Ａ〜図４０Ｂ）、および非特異的（図４０Ｃおよび図４０Ｄ）の両方で活性化したレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を有することを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図４１】図４１Ａ〜Ｄは、レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化した（図４１Ａおよび図４１Ｂ）か、または非特異的に活性化した（図４１Ｃおよび図４１Ｄ）かに関わらず、腫瘍Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制する能力を有しないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図４２】図４２Ａ〜Ｄは、レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化した（図４２Ａおよび図４２Ｂ）か、または非特異的に活性化した（図４２Ｃおよび図４２Ｄ）かに関わらず、脾臓Ｔｃｏｎ細胞がＴ細胞の分裂を抑制する能力を有しないことを実証する抑制因子アッセイデータを示す。
【図４３】マウスの乳腺腫瘍におけるＩＳＧ１５の発現亢進。（Ａ）ＦＶＢ／Ｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスからの自発性マウス乳腺腫瘍（ｎ＝９）、およびＦＶＢ／Ｎマウスからの正常な乳腺組織（ｎ＝４）からｍＲＮＡが抽出された。ｃＤＮＡ変換後、ｑＰＣＲ解析を実施して相対的なＩＳＧ１５  ｍＲＮＡ発現を決定した。（Ｂ）抗ＩＳＧ１５抗体を有する正常な乳腺組織およびＨＥＲ２／ｎｅｕ乳腺腫瘍組織からの組織溶解物のウエスタンブロット解析（上のパネル）、ならびに同等のタンパク質負荷を実証するための抗ＧＡＰＤＨ抗体（下のパネル）。（Ｃ）乳腺腫瘍細胞株ＮＴ２および４Ｔ１−ＬｕｃからのｃＤＮＡのｑＰＣＲが、正常な乳腺組織および形質転換していない細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３に対して、ＩＳＧ１５  ｍＲＮＡ（ｎ＝３）の発現について比較された。（Ｄ）ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（ｎ＝７）からの自発性の乳腺腫瘍と比較した、正常な組織（ｎ＝３）のパネルでのＩＳＧ１５発現のｑＰＣＲ解析。
【図４４】リステリアベースのＩＳＧ１５に対するＣＴＬワクチンの構築。（Ａ）ｐｒｆＡ−ＸＦＬ７リステリア株の中へと電気穿孔して、弱毒化したリステリアワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５を構築する、リステリア発現ベクターｐＧＧ３４−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５を図示する図。（Ｂ）Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５の媒体および対照Ｌｍワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡカルチャーからＴＣＡ沈殿したタンパク質のウエスタンブロット解析。沈殿したタンパク質は、マウスＩＳＧ１５（上のパネル）、ニワトリオボアルブミン（中央のパネル）、およびリステリオリシンＯ（下のパネル）に対する抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に供した。（Ｃ）Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５または対照Ｌｍのいずれかを腹腔内に２回ワクチン接種した生後８週間のＢａｌｂ／ｃマウスの脾細胞からのＩＳＧ１５特異的なＩＦＮγ応答のＥＬＩＳｐｏｔ解析。結果は、２×１０６脾細胞当たりのＩＦＮγ分泌ＳＦＣとして図示される。（Ｄ）対照Ｌｍワクチン（２×１０８ＣＦＵ）またはＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかをワクチン接種したメスについてマウス一腹当たりの出産子数。（Ｅ）各々のワクチン接種したメスの群からの同腹の子の生後１日目の平均重量をグラム単位で図示する。
【図４５】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種後のマウスの乳腺腫瘍への治療的な影響。（Ａ）移植したＮＴ２乳腺腫瘍に対するＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５の有効性を決定するための腫瘍負荷研究。ＦＶＢ／Ｎマウスの後脇腹にＮＴ２腫瘍細胞を皮下に移植し、およびこれに続いてＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５または対照Ｌｍをワクチン接種した。実験が終了するまでカリパスを用いて腫瘍サイズをモニターし、腫瘍の体積を計算した。（Ｂ）移植した当初の４Ｔ１−Ｌｕｃ乳腺腫瘍の成長をＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種が制御する能力を決定するための腫瘍負荷研究。Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺組織に４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞を移植し、これに続いてマウスにＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５または対照Ｌｍをワクチン接種した。（Ｃ）乳腺への移植後の４Ｔ１−Ｌｕｃの転移性拡散をＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種が制御する能力を決定するための転移性腫瘍の研究。簡潔に述べると、Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺組織の中へと４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を移植し、これに続いてマウスにＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５または対照Ｌｍをワクチン接種した。移植の３２日後、ワクチン接種した腫瘍を持つマウスからの肺を取り出して、ＰＢＳを用いて灌流した。次いで肺表面の転移性の結節を光学顕微鏡を用いて計数した。
【図４６】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５によってＨＥＲ２／ｎｅｕ＋自発性乳腺腫瘍の進行およびエピトープ拡大が遅延された。（Ａ）Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種が対照Ｌｍワクチン接種と比較して自発性の乳腺腫瘍の進行を遅延することができるかどうかを決定するためにＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルを使用した。ＦＶＢ／Ｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５（２×１０８ＣＦＵ）または対照Ｌｍワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかを、生後６週目に開始して、２１週目まで３週間ごとに継続して６回注射した。腫瘍発生を毎週１回モニターした。（Ｂ）無処置マウスからの自然発生的な乳房の腫瘍におけるＩＳＧ１５特異的なＩＦＮ−γ応答のＥＬＩＳｐｏｔ解析。腫瘍形成させた後、腫瘍を持つマウスに２回（０日目および７日目）対照ＬｍおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種し、これに続いて１４日目に腫瘍を除去し、かつＥＬＩＳｐｏｔ解析した。（Ｃ）実験の完了時に、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したＮＴ２腫瘍を持つＦＶＢ／Ｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスの脾細胞内のＨＥＲ２／ｎｅｕへのエピトープ拡大を実証するＥＬＩＳｐｏｔ解析。（Ｄ）Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種した４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍を持つマウスのＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的なＣＤ８＋６２Ｌ−の腫瘍内のパーセンテージの増加を、対照Ｌｍをワクチン接種したマウスと比較して実証するＴＩＬ四量体解析。
【図４７】ＩＳＧ１５のワクチン接種の治療的な影響は、ＣＤ８に依存する。（Ａ）４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍を持つマウスのＣＤ８枯渇実験。簡潔に述べると、Ｂａｌｂ／ｃマウスに４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞を移植して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５または対照Ｌｍのワクチン接種に加えてＣＤ８＋細胞を枯渇、または疑似枯渇した。（Ｂ）Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５  ＣＤ８が豊富な脾細胞の直接的な細胞溶解活性を測定するためにＷｉｎｎアッセイを実施した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５または対照Ｌｍをワクチン接種したマウスからのＣＤ４が枯渇した脾細胞を４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞と混合して、無処置Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植した。（Ｃ）図４７Ｂに図示する実験からのＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍を有しない生存したマウスのパーセントを図示するグラフ。
【図４８】ＩＳＧ１５特異的なＣＴＬクローンのインビボでの増幅は、結果として抗腫瘍応答をもたらす。メスのＢａｌｂ／ｃマウスの乳腺組織内への４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞の移植後、これに続いてマウスに対照またはＩＳＧ１５エピトープペプチドのいずれかと共にＰＢＳまたはＣｐＧをワクチン接種した。（Ａ）実験の過程を通じて各々の群に対する腫瘍体積が測定された。（Ｂ）実験の最後に最初の腫瘍が取り除かれ、各々のワクチン接種した群に対する平均腫瘍質量が計算された。（Ｃ）加えて、表面転移の検査のために、実験の最後に各々のワクチン接種した群のマウスからの肺が取り出された。ワクチン接種した群について肺表面転移の平均数が計算された。（Ｄ）ＰＢＳおよびｐＩＳＧ１５  ｄ１／ＣＰＧをワクチン接種したマウスからの腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）によるＩＳＧ１５  ｄ１−特異的なＩＦＮ−γ応答のＥＬＩＳｐｏｔ解析。（Ｅ）ＰＢＳおよびｐＩＳＧ１５  ｄ２／ＣｐＧでワクチン接種したマウスからのＴＩＬによるＩＳＧ１５  ｄ２−特異的なＩＦＮ−γ応答のＥＬＩＳｐｏｔ解析。
【図４９Ａ】Ｌｍベースの構築体を発現するＦｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２の設計を示す。各々の遺伝子断片は、ＬＬＯに融合されかつｈｌｙプロモーターの制御下で配置されている発現ベクターｐＧＧ３４にクローニングされた。
【図４９Ｂ】Ｌｍベースの構築体を発現するＦｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２の設計を示す。培養上清からのウエスタンブロットは、列挙された構築体からの各々の融合タンパク質の発現を示す。融合タンパク質検出（下）のために多クローン性のウサギ抗ＰＥＳＴ抗体が使用され、また確認（上）のためにマウス抗ＬＬＯ抗体が使用された。すべてのレーンを同一のウエスタンブロットから取ったことに留意されたい。
【図４９Ｃ】Ｌｍベースの構築体を発現するＦｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２の設計を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞を示すＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔは、各々の構築体を用いた免疫化の後、エキソビボの応答を制限した。無処置群にはＰＢＳを単独で注射し、すべての群は対照Ｌｍ群を含んだ。応答は、各々のＦｌｋ断片について対応するマッピングしたエピトープに対するものである。群当たり、Ｎ＝５である。グラフは、平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー統計検定で、実験は１回繰り返された。
【図５０Ａ】Ｌｍベースの構築体を発現するＦｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２の設計を示す。各々の組み立てられた構築体に対して四角で囲ったクローニングされる領域の、強調表示／太字で示したアミノ酸は、Ｈ２ｄ／ｑＭＨＣ  ＩハプロタイプについてマッピングしたＣＴＬエピトープを示す。
【図５０Ｂ】本発明で使用される断片の一実施形態を示すｆｌｋ遺伝子のマップを示す。
【図５０Ｃ】ｆｌｋ遺伝子の様々な領域に関連して、本発明の一実施形態でｆｌｋ断片がどのように使用されるかの説明図を示す。
【図５０Ｄ】方法に示すように実施したマクロファージ感染アッセイを示す。Ｊ７７４Ａ．１細胞はリステリア構築体を用いてインキュベートされ、洗浄され、次いでゲンチマイシンを用いてインキュベートされ、マクロファージに感染することができ、かつ細胞質の中へと漏れ出すことができる細菌がＡｌｅｘａ−４８８（緑色）で示され、ＰＥ  ＣＤ１１ｂ＋、ｈａｌｏ（赤色）は細胞の形状およびサイズの境界を画定する。
【図５１Ａ】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンが、定着したＨｅｒ−２／ｎｅｕ＋腫瘍の退行をインビボで誘発する可能性があることを示す。各々の構築体を用いて処置したマウスからのＮＴ−２腫瘍体積（ｍｍ３）。グラフは、平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー統計検定で、群当たりＮ＝８で、実験は２回繰り返された。
【図５１Ｂ】様々なＨｅｒ−２／ｎｅｕ領域へのエピトープ拡大を示すＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔｓを示す。６４日目の時点からの脾細胞を、エキソビボでＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドエピトープを用いて再刺激した。グラフは、平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー統計検定で、群当たりＮ＝５のマウスで、実験は１回繰り返された。
【図５１Ｃ】ＮＴ−２腫瘍の初期の定着後にマウスを３週間に３回免疫化したことを示す。この図では、汎内皮マーカーＣＤ３１−ＰＥおよび核に対するＤＡＰＩを使用した染色を示す。右側に示すように、配列セクションにアイソタイプ対照が使用された。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェアによって血管密度の定量化を実施した。グラフは、平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定で、ｎｓ＝有意でないことを示す。
【図５１Ｄ】汎内皮マーカーＣＤ３１−ＰＥ、ＤＡＰＩを使用した核、および核低酸素マーカー低酸素誘導因子−１a（ＨＩＦ−１a）に対する染色を示す。
【図５２Ａ】長期の腫瘍の再チャレンジの記憶を示す完全に退行した腫瘍を有するマウスを示す。完全に退行した腫瘍を有するマウスは、対側の脇腹へのＮＴ−２によって１００日目に再チャレンジした。生理食塩水処置した群は、腫瘍増殖に対する負の対照として使用された。
【図５２Ｂ】腫瘍の無いマウスの１００日目の再チャレンジ後に腫瘍が成長したマウスに対する腫瘍体積を示す。両方のグラフとも単一の実験を指す。Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１群については、腫瘍の無いマウスの数は２／８であり、生理食塩水群については５匹のマウスであった。
【図５３Ａ】抗血管形成ワクチンがＨｅｒ−２／ｎｅｕに耐性があるマウスでは効果的でないことを示す。Ａ．ＦＶＢ／Ｎ野生型（ＷＴ）またはＦＶＢ／Ｎトランスジェニック（Ｔｇ）マウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を皮下注射し、処置を開始する前に腫瘍が触知可能になるまで成長させた。マウスは合計３回免疫化され、腫瘍接種の最高６９日後までの平均腫瘍サイズが本明細書に示される。グラフは、平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定で、実験は２回繰り返された。
【図５３Ｂ】脾臓がエキソビボで様々なＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドで、または負の対照（ｐＧａｇ）として第三者ペプチドで刺激された、ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔｓのために処置されたことを示す。グラフは、平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定で、実験は１回繰り返された。
【図５３Ｃ】各々の群からの腫瘍がＴＩＬのためにプールされ消化されたことを示し、ここでＣＤ８に対して染色したＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＴ細胞a、およびＥＣ１またはＩＣ１特異的な四量体を示す。野生型（ＷＴ）では著しく多いＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＴ細胞が見出されるが、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスでは見出されず、対照Ｌｍ群は、低いバックグラウンド示す。実験は、１回繰り返され、同様の結果が得られた。
【図５４Ａ】原発性腫瘍増殖、腫瘍量の減少、ならびに４Ｔ１実験的転移を用いてチャレンジしたときの罹患率および死亡率の減少を示す抗Ｆｌｋ−１  Ｌｍワクチンで保護されたマウスを示す。Ａ．Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１で保護した動物では原発性皮下４Ｔ１腫瘍の成長がより遅い。マウスは、各々のワクチンで３回免疫化され、次いで５０，０００個の４Ｔ１細胞を皮下および静脈内に注射した。グラフは、腫瘍体積に対する平均±ＳＥＭを示す。
【図５４Ｂ】４Ｔ１細胞を皮下でチャレンジした後の腫瘍の無いマウスのパーセントでの腫瘍量を示す。グラフは、処置群当たり８匹のマウスの平均を示す。
【図５４Ｃ】目視検査および観察に基づいて良好な／健康的なマウスのパーセンテージを示すグラフを表示する。群当たりＮ＝８のマウスである。
【図５４Ｄ】図５４Ｄ。
【図５５Ａ】実験的転移からＦｌｋ−１ワクチンがマウスを保護することができ、乳ガンに対するより攻撃的な腫瘍モデルでは弱いＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープ拡大を誘発することを示す。Ａ．マウスを、各々のワクチンで３回免疫化し、次いで５０，０００個の４Ｔ１細胞を静脈注射し、腫瘍を２５日間成長させ、その後マウスを犠牲にした。肺組織のＨ＋Ｅで染色した薄片を作成し、腫瘍節を手作業で計数した。グラフは、動物の肺の葉当たりの肺転移の数、平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定で、１回実験を繰返し、Ｎ＝５のマウスを示した。
【図５５Ｂ】これらの動物の脾臓が処置され、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  エピトープ拡大に対してＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ内でエキソビボで再チャレンジされることを示す。４Ｔ１細胞株は、マウスＨｅｒ−２／ｎｅｕの低いレベルを確かに発現する。拡散は、Ｆｌｋ−１−Ｅ１免疫化マウスでのみ示される。グラフは、対照Ｌｍ群と比較したウェル当たりのスポットの数に対する平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定で、１回実験が繰り返され、群当たりＮ＝５だった。
【図５５Ｃ】。一連の３週間の間の各々のワクチンの免疫化を介してマウスを保護し、次いで５０，０００個の４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を静脈注射した実験を示し、マウスは肺播種の発生および転移性の割合を求めて週間にわたって長手方向に画像化された。
【図５５Ｄ】１秒当たり、表面積（ｓｒ）１ｃｍ２当たりで捕捉される光子（ｐ）の平均放射輝度がＲＯＩでゲーティングされることを示す。グラフは、平均±ＳＥＭを示し、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定である。マウスに対する有意性は、以下のとおりである。１８日目、Ｆｌｋ−Ｅ１のみが有意；２５日目、対照Ｌｍと比較すると、Ｆｌｋ−Ｅ１とＦｌｋ−Ｉ１との両方が著しく異なる。
【図５６Ａ】形成管形成Ｆｌｋ−１ワクチンを使用する安全性研究を示す。上記のすべての実験で実施したようにマウスを３回免疫化し、次いで交尾させるか、または創傷治癒研究に含めるかのどちらかにした。マウス（ｎ＝５／群）を同系のＦＶＢ／Ｎマウスのオスと交尾させ、交尾後に膣栓を観察して懐胎を確認した。これは交尾後０．５日目とみなされた。総懐胎長さ、出産日での子の質量、および一腹の総数が測定され、グラフは平均±ＳＥＭを、＊ｐ＜０．０５で示す。
【図５６Ｂ】各々のワクチン接種したマウス（Ｎ＝５／群）の背中から一対の殺菌した皮膚生検を作製した。治癒を一日毎に観察した。１４日目に試験したすべての群について治癒が完了し、ほぼ同一の治癒がすべての群について観察された。グラフは、創傷閉鎖までの日数を、平均±ＳＥＭで、＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定で示す。
【図５７】Ｆｌｋ−１ワクチン誘発性エピトープ拡散は、Ｆｌｋ−１とＨｅｒ−２／ｎｅｕとの共有する領域の交差反応に起因するものではない場合がある。マウスを対照ＬｍまたはＦｌｋ−Ｉ１ワクチンのいずれかで３回免疫化した。脾細胞を処置し、エキソビボでＩＦＮ−ｇの分泌のためにペプチドチャレンジに応答して再チャレンジした。含まれるペプチドは、あらかじめマッピングしたｐＦｌｋ−Ｉ１エピトープ（ＰＧＧＰＬＭＶＩＶ、配列番号：１０２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する推定ｐＩＣ１エピトープ（ＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ、配列番号：９９）または問題のエピトープ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕとＦｌｋ−１キナーゼ領域との間の推定共有エピトープ（ＧＲＧＡＦＧＱＶＩ、配列番号：１０３）、および負の対照（ｐＧａｇ）として使用される第三者エピトープである。グラフは、平均±ＳＥＭを示し、Ｎ＝３／群である。
【図５８Ａ】Ｆｌｋ−１ワクチンは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ乳ガンに対する自然発生的な同所性モデルで腫瘍増殖を著しく遅延させることができる。トランスジェニックＦＶＢ−ｒＨｅｒ−２／ｎｅｕマウスを、各々のＦｌｋワクチンで、または対照Ｌｍのみで３回免疫化した。各々のマウスからの腫瘍を、突然変異したＨｅｒ−２／ｎｅｕメッセージについて調べた。メッセージＲＮＡは収集され、ｃＤＮＡが合成されかつ配列された。結果として得られる配列は、野生型配列と並んで対になり、突然変異した残基を決定する。４回以上生じる突然変異のみが真の突然変異と考えられる。すべての突然変異の要約が左側に示され、これはを少なくとも３のＮを示すが、群当たりのマウスは５匹以内である。すべての突然変異データは組み合わせられ、かつラットのＨｅｒ−２／ｎｅｕ野生型配列の上に重ねられる。太字のａａ残基は、ワクチンがＨｅｒ−２／ｎｅｕ領域に対するときに生じる突然変異である。赤色で強調表示したａａ残基は、Ｆｌｋ−１ワクチンを使用したときに生じる突然変異である。青色で強調表示した領域は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキナーゼドメインを示す。緑色で強調表示した領域は、ＡＴＰ結合ドメインを示す。
【図５８Ｂ】腫瘍増殖は、腫瘍の点検の継続を担当する主要なＣＴＬエピトープで生じる突然変異に起因する。「ホットスポット」、すなわち突然変異した残基のストリングをよく見ると、いくつかの突然変異した残基がそれまでにマッピングしたＣＴＬエピトープの中に見出されることがわかった。１つのかかるエピトープは、エピトープのＨ２Ｄｑ  ＭＨＣ  Ｉ分子への固定を担当する主要なアミノ酸の突然変異を示す。他の「ホットスポット」を、新しいＣＴＬエピトープに対して調査した。
【図５９】図５９Ａ。抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕヒトキメラワクチンは、転移性の乳ガン株の保護されたマウスの脳の中での増殖を遅延することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕまたは対照ワクチン接種ＮＹＥＳＯ１のいずれかの各ワクチンで３回免疫化した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞をインビトロで増殖させ、次いで麻酔をかけたマウスの脳の中へとマウス一匹当たり５，０００個の細胞を注射した。低いレベルのマウスにＨｅｒ−２／ｎｅｕ（データ図示せず）細胞を発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞を、指示された日に撮像する前に増殖させた。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞は酵素ルシフェラーゼを生成したが、これらがＤ−ルシフェリンをインビボで代謝するとき、副産物はエキソビボでＸｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００カメラを使用して捕捉され、かつヒートマップを使用して表示される光子である。ピクセルの輝度は、１秒当たり表面積１平方ｃｍ当たりの光子の数としてグラフ表示され、平均放射輝度として提示される。図５９Ｂ。抗ＨＭＷＭＡＡヒトワクチンは、保護されたマウスの脳内では転移性のメラノーマ株の増殖を遅延する可能性がある。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを抗ヒトＨＭＷＭＡＡ−Ｃまたは対照ワクチン接種ＮＹＥＳＯ１のいずれかの各ワクチンで３回免疫化した。Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ細胞をインビトロで増殖させ、次いで麻酔をかけたマウスの脳の中へとマウス一匹当たり５，０００個の細胞を注射した。Ｂ１６Ｆ１０親系統はＨＭＷＭＡＡを発現しないので、したがって唯一のＨＭＷＭＡＡ源は周皮細胞およびグリア細胞上にのみある。ルシフェラーゼ機構および画像を図５９Ａと同様に捕捉する。
【図６０】エンドグリンの配列（ＣＤ１０５）である。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ５にクローニングされた、Ｒｅｉｓｆｅｌｄの群によってクローニングされた配列に基づく本来の断片は、太字でかつ下線付きで示される。この領域の外側にある、ｂ、ｄ、およびｋ  Ｈ−２ハプロタイプに対するいくつかの代替の推定ＣＴＬエピトープ（赤色で強調表示した）があることをＲａｎｋｐｅｐおよび他のＭＨＣエピトープ予測プログラムが示していることに留意されたい。
【図６１】新規のＣＤ１０５ＡおよびＣＤ１０５Ｂを発現するリステリア構築体の設計。Ａ．各々の構築体に対するクローニングされた領域は太字示され、また２つの推定エピトープは下線付きで示され、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＬｍ−ＬＬＯＣＤ１０５Ｂは一緒にほぼエンドグリン遺伝子全体に広がり、より多くの潜在的なＣＴＬエピトープを包含する。Ｂ．各々の下線付きの断片は、アジュバントＬＬＯに融合される発現ベクターｐＧＧ３４の中へとクローニングされた。
【図６２】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａは抗ＬＬＯ抗体およびウエスタンブロット法によって検出される適切なサイズ（〜８０ｋＤ）のタンパク質を発現し、かつ分泌する。ＸＦＬ７株は、ＣＤ１０５Ａプラスミドによって電気穿孔法を使用して形質転換された。３７μｇ／ｍＬおよび２５０μｇ／μＬのクロラムフェニコールおよびストレプトマイシンの上に形質転換されたＸＦＬ７細胞をプレーティングした。２日間のインキュベーション期間の間に形成されたコロニーをＬＢ培地の中で増殖させ、沈降させ、上清および細胞溶解物にウエスタンブロット法に供して、上清内の分泌されたタンパク質として、または細菌細胞の中に捕捉されたｎ内因性タンパク質としてのいずれかで融合タンパク質を検出した。
【図６３】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂは抗ＬＬＯ抗体およびウエスタンブロット法によって検出される適切なサイズ（〜７４ｋＤ）のタンパク質を発現し、かつ分泌する。ＸＦＬ７株は、ＣＤ１０５Ａプラスミドによって電気穿孔法を使用して形質転換された。３７μｇ／ｍＬおよび２５０μｇ／μＬのクロラムフェニコールおよびストレプトマイシンの上に形質転換されたＸＦＬ７細胞をプレーティングした。２日間のインキュベーション期間の間に形成されたコロニーをＬＢ培地の中で増殖させ、沈降させ、上清および細胞溶解物にウエスタンブロット法に供して、上清内の分泌されたタンパク質として、または細菌細胞の中に捕捉されたｎ内因性タンパク質としてのいずれかで融合タンパク質を検出した。
【図６４】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢを用いて免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスでの４Ｔ１腫瘍の増殖（乳房脂肪体内に２×１０５個の細胞を移植した）を対照ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１を用いたものと比較した。マウスは、指示された日に２×１０８ｃｆｕの各々のワクチンを用いてワクチン接種した。
【図６５】図５３Ｂに示す実験からのマウスを３２日目に犠牲にして、肺を取り出し、かつＰＢＳで膨らませた。解剖顕微鏡下で可視的な表面転移を計数した。無処置（ｐ＜０．０１）またはＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ１（ｐ＜０．０５）と比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂに対してのみ有意な減少が観察された。
【図６６】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢを用いた免疫化は、内因性の抗原Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびｇｐ７０へのエピトープ拡大、ならびに脾臓内で抗原特異的なＴ細胞の誘導を誘発する。図５３Ｂに示す実験では、腫瘍移植後２２日目に３匹のマウスから脾臓を取り出し、プールし、示されるペプチドを用いた刺激の後、単細胞懸濁液をＥＬＩＳｐｏｔによって解析した。ＫｄおよびＤｄは、これらのＭＨＣクラスＩ分子に結合することが予測されたエンドグリン配列からの２つのペプチドであることに留意されたい。これらは、ＣＤ１０５Ａ：ＡＧＰＲＴＶＴＶＭ（Ｄｄ）（配列番号：１２０）およびＣＤ１０５Ｂ  ＡＹＳＳＣＧＭＫＶ（Ｋｄ）（配列番号：１２１）の中に常在する。
【図６７】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢを用いた免疫化は、内因性の抗原Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびｇｐ７０へのエピトープ拡大、ならびに腫瘍に浸潤する抗原特異的なＴ細胞の誘導を誘発する。図５３Ｂに示す実験では、腫瘍移植後２２日目に、３匹のマウスから腫瘍を取り出し、プールし、ＦＡＣＳ解析のために処理し、またＥＣ１、ＥＣ２、ＩＣ１およびＡＨ１四量体、抗ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１１Ｂを用いて染色した。ＣＤ１１Ｂー集団は、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ低にゲーティングされ、示される四量体を使用して抗原特異性について解析された。
【図６８】ＦＶＢマウスの皮下に移植したＮＴ−２（１×１０６細胞）腫瘍の増殖に続いて、これはＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢまたは対照ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１で４日目、１１日目、および１８日目に、２×１０８ｃｆｕの各々のワクチンを用いて免疫化された。
【図６９】図６９Ａ〜Ｂ。ＳＯＥ突然変異誘発戦略。ＬＬＯの第４ドメインを突然変異することによってＬＬＯの病毒性の減少／低下が達成された。このドメインは、孔を形成するためにオリゴマー形成する場合に膜に結合できるようにするコレステロール結合部位を含有する。
【図７０】腫瘍測定の日である、様々なリステリアベースの構築体の投与に続く１１日目、１８日目、および２１日目の個別のマウスおよび腫瘍サイズを示すグラフ。
【図７１Ａ】Ａ．２つの抗原を融合タンパク質、ＬｍｄｄＡ２４４Ｇとして発現および分泌するように改変されたリステリア株の構築。抗原Ｈｅｒ２キメラはゲノムのリステリオリシンＯに遺伝学的に融合され、また第２の抗原ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（ＨＭＣ）はプラスミド中の切断リステリオリシンＯに融合される。Ｂ．融合タンパク質ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２およびｔＬＬＯ−ＨＭＣの分泌が、抗ＬＬＯおよび抗ＦＬＡＧ抗体のそれぞれを使用してウエスタンブロットによって検出された。
【図７１Ｂ】Ａ．２つの抗原を融合タンパク質、ＬｍｄｄＡ２４４Ｇとして発現および分泌するように改変されたリステリア株の構築。抗原Ｈｅｒ２キメラはゲノムのリステリオリシンＯに遺伝学的に融合され、また第２の抗原ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（ＨＭＣ）はプラスミド中の切断リステリオリシンＯに融合される。Ｂ．融合タンパク質ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２およびｔＬＬＯ−ＨＭＣの分泌が、抗ＬＬＯおよび抗ＦＬＡＧ抗体のそれぞれを使用してウエスタンブロットによって検出された。
【図７２Ａ】Ａ．ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８の溶血活性がヒツジ赤血球を使用して定量された。１０４０３Ｓと比較すると、二価免疫療法ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８の溶血活性では１．５倍の減少が観察された。Ｂ．Ｊ７７４細胞株での二価免疫療法と一価免疫療法との両方の細胞内増殖。ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８の細胞内増殖は、一価免疫療法ＬｍｄｄＡ１６４およびＬｍｄｄＡ１６８と同様であった。
【図７２Ｂ】Ａ．ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８の溶血活性がヒツジ赤血球を使用して定量された。１０４０３Ｓと比較すると、二価免疫療法ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８の溶血活性では１．５倍の減少が観察された。Ｂ．Ｊ７７４細胞株での二価免疫療法と一価免疫療法との両方の細胞内増殖。ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８の細胞内増殖は、一価免疫療法ＬｍｄｄＡ１６４およびＬｍｄｄＡ１６８と同様であった。
【図７３Ａ】Ａ．定着したＮＴ２腫瘍を一価療法および二価療法で処置したマウスに６日目、１３日目、および２０日目に移植した。無処置群は未処置マウスである。Ｂ．異なる治療および未処置の無処置群の腫瘍の無いマウスのパーセント。Ｃ．ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８処置後の定着したＮＴ２腫瘍の体積。
【図７３Ｂ】Ａ．定着したＮＴ２腫瘍を一価療法および二価療法で処置したマウスに６日目、１３日目、および２０日目に移植した。無処置群は未処置マウスである。Ｂ．異なる治療および未処置の無処置群の腫瘍の無いマウスのパーセント。Ｃ．ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８処置後の定着したＮＴ２腫瘍の体積。
【図７３Ｃ】Ａ．定着したＮＴ２腫瘍を一価療法および二価療法で処置したマウスに６日目、１３日目、および２０日目に移植した。無処置群は未処置マウスである。Ｂ．異なる治療および未処置の無処置群の腫瘍の無いマウスのパーセント。Ｃ．ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８処置後の定着したＮＴ２腫瘍の体積。
【図７４Ａ】Ａ．キメラＨｅｒ２を発現する一価免疫療法（ＬｍｄｄＡ１６４）ならびに二価免疫療法（ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８）の投与後のマウスでのＨｅｒ２特異的な免疫応答の発生。Ｈｅｒ２特異的な免疫応答は、ＦｖＢ  ＩＣ１ペプチドエピトープ−ＲＬＬＱＥＴＥＬＶを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔベースのアッセイで評価された（Ｓｅａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９  Ｆｅｂ  １；１５（３）：９２４−３２．）。Ｂ．ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃを発現する一価免疫応答（ＬｍｄｄＡ１６８）ならびに二価免疫療法（ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８）投与後のマウスでのＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ特異的な免疫応答の発生。Ｈｅｒ２特異的な免疫応答は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイでアフィニティー精製したＨＭＡ−ＭＡＡ−Ｃタンパク質断片を使用して評価された。
【図７４Ｂ】Ａ．キメラＨｅｒ２を発現する一価免疫療法（ＬｍｄｄＡ１６４）ならびに二価免疫療法（ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８）の投与後のマウスでのＨｅｒ２特異的な免疫応答の発生。Ｈｅｒ２特異的な免疫応答は、ＦｖＢ  ＩＣ１ペプチドエピトープ−ＲＬＬＱＥＴＥＬＶを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔベースのアッセイで評価された（Ｓｅａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９  Ｆｅｂ  １；１５（３）：９２４−３２．）。Ｂ．ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃを発現する一価免疫応答（ＬｍｄｄＡ１６８）ならびに二価免疫療法（ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８）投与後のマウスでのＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ特異的な免疫応答の発生。Ｈｅｒ２特異的な免疫応答は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイでアフィニティー精製したＨＭＡ−ＭＡＡ−Ｃタンパク質断片を使用して評価された。
【図７５】定着した４Ｔ１腫瘍は、単剤療法および二価療法で１日目、８日目、および１５日目に治療された。無処置群は未処置マウスである。
【図７６】定着したＮＴ２腫瘍は、単剤療法、二価療法、または連続した単剤療法で治療された。無処置群は未処置マウスである。
【００１５】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一実施形態では、本明細書に提供される発明は、被験者内の疾患と関連付けられるバイオマーカーの発現または存在を評価し、またこれは疾患と関連付けられるバイオマーカーを識別および標的化するために被験者から得られた生体サンプル内で発現され、その結果として被験者内の疾患を治療することを目的とする。別の実施形態では、被験者を治療する方法は、被験者の疾患によって発現される２つ以上のバイオマーカーを標的化する組成物または組成物の混合物を投与することを含む。
【００１７】
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は組み換え型リステリア株を含み、前記株は融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記融合タンパク質は疾患を有する被験者から得られた生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは前記疾患と関連付けられ、また前記バイオマーカーはＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される。別の実施形態では、組み換え型リステリアは融合タンパク質を含む組み換え型ポリペプチドをコードする核酸を含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは融合タンパク質である。
【００１８】
一実施形態では、単一の組成物（組成物の混合物ではなく、すなわち混合物の組織物の部分として独立して投与される）が疾患を有する被験者に投与されるとき、被験者から得られた生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含む少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換え型リステリアをこの組成物が含み、前記バイオマーカーは前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーはＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される。別の実施形態では、リステリアは、各々が疾患と関連付けられる異なるバイオマーカーを含む１つから３つの、１つから４つの、または１つから６つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、リステリアは、各々が疾患と関連付けられるバイオマーカーを含む融合タンパク質をコードする１つから３つの、１つから４つの、または１つから６つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸配列を含む。別の実施形態では、前記少なくとも１つの融合タンパク質の各々の中の各々のバイオマーカーは、核酸配列の中の異なるオープンリーディングフレームから発現される別の融合タンパク質内に存在する別のバイオマーカーとは異なる。
【００１９】
別の実施形態では、組成物が混合物の部分として被験者へ投与されるとき、混合物内の各々の組成物は組み換え型リステリア株を含み、前記株は融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記融合タンパク質は被験者から得られた生体サンプル内で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーはＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、また各々の組成物の中の各々の組み換え型リステリア株は残りからの異なるバイオマーカーを含む。一実施形態では、混合物はワクチン混合物である。別の実施形態では、混合物は、各々が前記疾患およびＰＥＳＴ含有ポリペプチド内で発現されるバイオマーカーの融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む、所定の数の組成物を含む。別の実施形態では、組成物の混合物は組成物の組合せである。
【００２０】
組成物の混合物中の各々の組成物はすべて単一のボーラス投与量で同時に投与されてもよく、または経時的に分離して投与されてもよく、また疾患によって発現される２つ以上のバイオマーカーを標的化することになることを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、組成物の混合物中の各々の組成物はすべて単一のボーラス投与量で同時に投与されてもよく、また疾患によって同時に発現される２つ以上のバイオマーカーを標的化することになる。別の実施形態では、組成物は、疾患によって発現される２つ以上のバイオマーカーを同時に標的化する少なくとも１つの融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む。一実施形態では、少なくとも１つの融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む組成物の混合物内の所定の数の組成物を、同時にまたは経時的に分離して被験者に投与する。
【００２１】
一実施形態では、疾患を有する被験者に組成物の混合物を投与するとき、混合物内の各々の組成物を１日から２日おいて、１日から３日おいて、１日から５日おいて、１日から１０日おいて、または１日から１４日おいて投与する場合がある。
【００２２】
一実施形態では、疾患を有する被験者に組成物の混合物を投与するとき、投与を受ける被験者のために最適であるようにそれまでに決定した所定の投与量で各々の組成物を投与してもよい。かかる最適な投与量は、この混合物を投与する前に臨床医または当業者によって実験的に決定されてもよい。別の実施形態では、混合物は、各々がバイオマーカーおよびＰＥＳＴ含有ポリペプチドの融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む、所定の数の組成物を含む。別の実施形態では、組成物の混合物は、各々がＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合したバイオマーカーの単一の融合タンパク質を発現する組み換え型リステリア株を含む、組成物の組合せである。
【００２３】
一態様では、本発明は、疾患に対する免疫応答を前記疾患を有する被験者内に誘発する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記被験者から得た前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって多標的抗疾患免疫応答を前記被験者内に誘発する。
【００２４】
一実施形態では、少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含むリステリア株は、１つから２つの融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、核酸配列は、１〜３個の融合タンパク質、１〜４個の融合タンパク質、１〜５個の融合タンパク質、１〜１０個の融合タンパク質、２〜３個の融合タンパク質、２〜４個の融合タンパク質、２〜５個の融合タンパク質、または２〜１０個の融合タンパク質をコードする。
【００２５】
一態様では、本発明は、疾患に対する免疫応答を前記疾患を有する被験者内に誘発する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．各々が組み換え型リステリア株を含む所定の数の組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記被験者から得た前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が前記融合タンパク質中に異なるバイオマーカーを含み、それによって多標的抗疾患免疫応答を前記被験者内に誘発する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、被験者内の疾患を治療する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患を治療する。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、被験者内の疾患を治療する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．各々が組み換え型リステリア株を含む所定の数の組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル内に識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ各々の組成物の中の各々のリステリア株が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患を治療する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、被験者内の疾患の再発を防止する方法に関し、この方法は、ａ．前記被験者から生体サンプルを得る工程と、ｂ．前記生体サンプル中の所定の数のバイオマーカーの発現を評価する工程と、ｃ．組み換え型リステリア株を含む組成物を前記被験者に投与する工程であって、前記株が少なくとも１つの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む工程とを含み、前記融合タンパク質が前記生体サンプル中で識別されるバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーが前記疾患と関連付けられ、前記バイオマーカーがＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合され、かつ前記リステリアの中の各々の融合タンパク質が異なるバイオマーカーを含み、それによって前記被験者内の前記疾患の再発を防止する。
【００２９】
一実施形態では、本明細書で提供される疾患は、ガンまたは腫瘍増殖である。別の実施形態では、本明細書で提供される疾患は、感染性疾患、呼吸器疾患、炎症性疾患、または被験者がＴｈ２持続性プロフィールを有する疾患である。別の実施形態では、疾患は局所性疾患、すなわち、特定の疾患部位に局所化された疾患であるか、または全身性疾患である。
【００３０】
一実施形態では、融合タンパク質は転写融合タンパク質である。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、本明細書に提供されるＰＥＳＴ含有ペプチドに融合されるバイオマーカーを含む融合タンパク質を発現する。別の実施形態では、融合タンパク質は本明細書に提供されるバイオマーカーを発現する。
【００３１】
一実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリアはリステリア・モノサイトゲネスである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。各々のタイプのリステリアは本発明の別個の実施形態を表す。
【００３２】
一実施形態では、組成物の混合物が本明細書に提供され、各々の組成物は疾患内に存在する各々の個別のバイオマーカーに対する免疫原性応答を標的化するバイオマーカーを発現する組み換え型リステリア株を含む。別の実施形態では、バイオマーカーは前記疾患と関連付けられた組織の表面上に存在する。別の実施形態では、本明細書に提供される疾患は腫瘍またはガンである。別の実施形態では、バイオマーカーは表面バイオマーカーである。別の実施形態では、バイオマーカーは細胞内バイオマーカーである。別の実施形態では、疾患が腫瘍またはガンである場合、バイオマーカーは腫瘍またはガン血管系と関連付けられた血管新生バイオマーカーである。
【００３３】
一実施形態では、各々がリステリア株を含む所定の数の組成物は、少なくとも１個から約１０個の組成物である。別の実施形態では、所定の数の組成物は、少なくとも１個から約２０個の組成物である。別の実施形態では、所定の数の組成物は、２〜５個の組成物、３〜６個の組成物、４〜７個の組成物、５〜１０個の組成物、６〜１１個の組成物、または７〜１２個の組成物である。
【００３４】
一実施形態では、所定の数のバイオマーカーは、少なくとも１個から約１０個のバイオマーカーである。別の実施形態では、所定の数のバイオマーカーは、少なくとも１個から約２０個のバイオマーカー、少なくとも１個から約３０個のバイオマーカー、少なくとも１個から約４０個のバイオマーカー、少なくとも１個から約５０個のバイオマーカー、少なくとも５１個から約６０個のバイオマーカー、少なくとも７１個から約８０個のバイオマーカー、少なくとも８１個から約９０個のバイオマーカー、または少なくとも１個から約１００個のバイオマーカーである。
【００３５】
「バイオマーカー」という用語が、異種抗原、腫瘍抗原、血管形成抗原、およびこれに類するものを含む抗原を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。この用語は、ガン、腫瘍、感染性疾患、自己免疫疾患、先天性疾患、およびこれに類するものを含むがこれに限定されない疾患と関連付けられるか、または疾患によって発現されるタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドも包含する場合がある。かかるバイオマーカーは、疾患を有する被験者では、健康な宿主でのバイオマーカーの発現の正常なレベルと比較して過剰発現する場合があることも理解されるであろう。別の実施形態では、バイオマーカーを発現する疾患がそれに対して適用された適正な免疫応答無しに自由に進行できるように、被験者はバイオマーカーに対して耐性がある。別の実施形態では、「バイオマーカー」という用語は疾患によって発現される抗原を指す。別の実施形態では、バイオマーカーは、異種抗原またはその断片である。一実施形態では、バイオマーカーは、腫瘍抗原またはその断片である。別の実施形態では、本明細書に提供されるバイオマーカーは、宿主内でアレルギー性または炎症性反応を生じるアレルゲンである。
【００３６】
一実施形態では、「腫瘍マーカー」および「腫瘍抗原」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、腫瘍によって発現される抗原を指す。別の実施形態では、腫瘍マーカーは異種腫瘍抗原またはその断片である。一実施形態では、腫瘍マーカーは前記腫瘍の形成または増殖と関連付けられる。別の実施形態では、腫瘍マーカーは前記腫瘍によってまたは前記腫瘍の血管系によって発現される。別の実施形態では、腫瘍マーカーは腫瘍によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に提供される腫瘍マーカーは、ガンの発生または転移とさらに関連付けられる局所組織環境と関連付けられる。別の実施形態では、腫瘍回避またはガンに対する抵抗と腫瘍マーカーが関連付けられるか、または腫瘍マーカーは血管形成抗原である。別の実施形態では、腫瘍マーカーは腫瘍によって腫瘍の表面上に発現される。別の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍の内側に存在し、腫瘍細胞の溶解に際して細胞外環境に放出される。
【００３７】
一実施形態では、バイオマーカープロファイルまたはバイオマーカー発現レベルの評価は、生体サンプルを疾患を有する被験者から得ることと、前記サンプル内のバイオマーカーの発現レベルを検出することとを含む。一実施形態では、本明細書に提供されるバイオマーカープロファイルは腫瘍マーカープロファイルである。別の実施形態では、腫瘍マーカープロファイルまたは腫瘍マーカー発現レベルの評価は、生体サンプルを腫瘍を有する被験者から得ることと、前記サンプル内の腫瘍マーカーの発現レベルを得ることとを含む。
【００３８】
バイオマーカーの発現レベルを測定するために有用な当該技術分野で既知の任意のアッセイを使用することによってバイオマーカー発現プロファイルを測定してもよいことを当業者はよく理解するであろう。かかるアッセイとしては、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、ＦＡＣＳ、免疫組織化学アッセイ、蛍光ベースのアッセイ、ＰＣＲ、定量ＨＰＬＣ単独もしくは質量分析との組み合わせ、または当該技術分野で既知の任意の他のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、被験者内の疾患（例えば、腫瘍またはガン）を効果的に診断するために、測定される発現プロファイルを健康な被験者からのものなどの対照プロファイルと比較することができる。別の実施形態では、疾患を有する被験者から組み換え型リステリア株を含む組成物を投与する前に得られた生体サンプル内でバイオマーカーが検出可能である。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物を投与するのに最適な時期を決定するために、被験者内の疾患の進行をモニターする方法が本明細書に提供され、この方法は、被験者から生体サンプルを得る工程と、生体サンプル内のバイオマーカーの発現プロファイルを測定する工程とを含み、対照サンプルで観察されるもののレベルに対して被験者内のバイオマーカー発現レベルを測定することは、被験者内での疾患の進行をモニターし、治療的な有効性を最大にするであろう所定の時期に本発明の組成物または組成物の混合物を投与することができるようにする。本発明によって包含される疾患としては、ガン、腫瘍増殖、感染性疾患、または被験者がＴｈ２に偏ったプロファイルを有する疾患が挙げられるがこれらに限定されない。これらの疾患は被験者内での疾患の進行に応じてさらに特徴付けまたは病期分類される。本発明の組成物（複数可）を投与する最適な期間を決定するためにかかる情報を使用することができる。
【００４０】
生体サンプルとしては、組織、血液、血清、ＤＮＡ、ＲＮＡ、尿、精液、滑液、唾液、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を挙げてもよいがこれに限定されないことが当業者によって理解される。
【００４１】
一実施形態では、「Ｔｈ２に偏った被験者」はＴｈ２表現型プロファイルを有する被験者としても知られ、これは被験者内の寄生生物による感染症またはガンが挙げられるがこれに限定されない、感染性疾患の結果としてＴｈｌ免疫応答に欠陥がある、免疫応答を欠いている、または免疫応答が抑制されているものである。別の実施形態では、Ｔｈ２に偏った被験者は、Ｔｈ２応答が被験者内に存在するとは限らないが、被験者内でＴｈｌ応答に対して優位を占める被験者を指す。別の実施形態では、Ｔｈ２に偏った被験者は、被験者内にＴｈ２応答が独占的に存在し、またＴｈｌ応答指標（すなわち、サイトカイン、ケモカイン、または他の既知のマーカー）の最低限またはわずかなレベルを有する被験者を指す。
【００４２】
一実施形態では、含む組成物の混合物は各々１〜５個の組成物を含み、各々が単一の融合タンパク質を発現する組み換え型リステリア株を含む。別の実施形態では、混合物は１〜１０個の組成物、１〜１５個の組成物、５〜１０個の組成物、５〜１５個の組成物、または５〜２０個の組成物を含み、各々がＰＥＳＴ含有ポリペプチドの単一の融合タンパク質およびバイオマーカーを発現する組み換え型リステリア株を含む。別の実施形態では、混合物中の各々の組成物は異なるバイオマーカーを発現するリステリアを含む。
【００４３】
別の実施形態では、もとの組成物または組成物の混合物とは異なるワクチンまたは組成物の代替形態の投与と同時に、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物が投与される。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物の投与とは別個に、ワクチンの代替形態が投与される。ワクチンまたは組成物の代替の形態としては、バイオマーカーおよびＰＥＳＴ含有ペプチドもしくはその断片を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチン、前記融合タンパク質を含むウイルスベクター、本明細書に提供されるバイオマーカーを含むウイルスベクター、前記融合タンパク質を含むウイルス様粒子、本明細書に提供されるバイオマーカーを含むウイルス様粒子、前記融合タンパク質を含む組み換え型ペプチドもしくは組み換え型ポリペプチド、本明細書に提供されるバイオマーカーを発現する細胞ベースのワクチン、または本明細書にさらに提供されるように本明細書に提供されるバイオマーカーを単独でもしくは融合タンパク質の形態で含む生組み換え型非リステリア細菌ベクターが挙げられる場合があるがこれらに限定されないことを当業者は理解するであろう。かかる代替の形態は本明細書に提供される組成物または組成物の混合物と組み合わせて使用されてもよいだけでなく、その投与の前に、または後に投与されてもよいことも当業者は理解するであろう。
【００４４】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質である。
【００４５】
別の実施形態では、上述の方法のいずれかで利用される組成物または組成物の組合せは、本発明のワクチンおよび組成物の特徴のいずれかを有する。
【００４６】
「免疫原性組成物」、「組成物」、および「医薬組成物」という用語は交換可能に使用される場合がある。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記述される組み換え型リステリア、およびアジュバントを包含する場合がある。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるアジュバントを含む。本明細書にさらに提供されるように、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
【００４７】
「医薬組成物」という用語は、リステリア株を医薬的に許容される担体または希釈剤とともに含む組成物を含む治療的に有効な量の活性成分（複数可）を包含する場合がある。
【００４８】
「投与する」という用語は被験者に本発明の組成物との接触をもたらすことを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。一実施形態では、投与をインビトロで、すなわち、試験管内で、またはインビボで、すなわち、生体、例えば、ヒトの細胞または組織の中で遂行することができる。一実施形態では、本発明は、本発明のリステリア株およびその組成物を被験者に投与することを包含する。
【００４９】
一実施形態では、細菌ベクターは、細胞内病原体である。別の実施形態では、ベクターは、細胞毒性病原体に由来する。別の実施形態では、ベクターは、細胞内病原体に由来する。別の実施形態では、細胞内病原体は、主として細胞媒介性免疫応答を誘発する。別の実施形態では、ベクターはサルモネラ株である。別の実施形態では、ベクターはＢＣＧ株である。別の実施形態では、ベクターは細菌ベクターである。別の実施形態では、本発明のベクターを用いて遺伝子導入した樹状細胞を被験者に投与して、被験者の免疫応答を上方制御してもよく、一実施形態では、これはＣＴＬ活性を上方制御することによって遂行される。
【００５０】
別の実施形態では、組み換え型ワクチンベクターは、主としてＴｈ１タイプ免疫応答を誘発する。
【００５１】
別の実施形態では、ベクターはサルモネラ種、シゲラ種、ＢＣＧ、Ｌ．モノサイトゲネス、大腸菌、およびストレプトコッカス・ゴルドニから選択される。別の実施形態では、融合タンパク質は、ファゴリソソーム融合をエスケープし、かつ細胞の細胞質内で生きるように変性した組み換え型細菌ベクターによって送達される。別の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。他の実施形態では、ベクターはワクシニア、アビポックス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、変異ワクシニア株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから選択される。別の実施形態では、ベクターは裸のＤＮＡベクターである。別の実施形態では、ベクターは当該技術分野で既知の任意の他のベクターである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００５２】
一実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ナノ改変ウイルス様物質、またはワクチンで使用するための当該技術分野で既知の任意のウイルスベクターである。別の実施形態では、ウイルスベクターはワクシニアウイルスベクターである。
【００５３】
細胞ベースのワクチンは生細胞または死細胞を含む場合があり、また自己起源または異種起源の腫瘍細胞も含む場合があることを当業者は理解するであろう。
【００５４】
一実施形態では、バイオマーカー発現プロファイルは本明細書に提供されるいずれかのワクチンの投与の前に得られる。
【００５５】
一実施形態では、ペプチドベースのワクチンは、本明細書に提供される腫瘍マーカーまたは抗原に融合された突然変異または除去したコレステロール結合ドメイン（実施例３８〜３９参照）を有する解毒ＬＬＯを含む。別の実施形態では、ガンを含む疾患の多標的化した免疫療法を提供するうえで使用するために、ペプチドベースのワクチンは、本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物と組み合わされる。
【００５６】
別の実施形態では、本発明の方法は本明細書に提供される免疫療法を受容する被験者にブースター投与を投与する工程をさらに含む。別の実施形態では、ブースター投与量は以下の本明細書に提供される組成物または組成物の混合物の初期投与を投与する。別の実施形態では、方法は、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物の初回の投与の後で前記被験者からバイオマーカープロファイルを得る工程と、ブースター投与を投与する工程とをさらに含む。別の実施形態では、本明細書にさらに提供されるように、投与するブースター投与量は本明細書に提供される組成物およびワクチンの代替形態を含む。別の実施形態では、方法は、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物の前回の投与に続いて第２の、第３の、第４の、第５の、等々のバイオマーカープロファイルを得ることと、前記第３の、第４の、第５の、等々のバイオマーカープロファイルを得ることに続いてブースター投与またはワクチンもしくは組成物の代替形態との組み合わせを投与することとをさらに含む。別の実施形態では、バイオマーカーは腫瘍マーカーであり、またバイオマーカープロファイルは腫瘍マーカープロファイルである。別の実施形態では、ブースター投与量は、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物中の組成物のうちの１つの初期投与量と同一または異なる。
【００５７】
一実施形態では、ブースターワクチン接種が単一のプライミングワクチン接種または投与に次いて行われる。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後に単一のブースターワクチン接種をする。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、２回のブースターワクチン接種をする。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、３回のブースターワクチン接種をする。一実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンとの間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンとの間の期間は１週間であり、別の実施形態では、これは２週間であり、別の実施形態では、これは３週間であり、別の実施形態では、これは４週間であり、別の実施形態では、これは５週間であり、別の実施形態では、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブーストワクチンをプライムワクチンの８〜１０週間後に投与する。
【００５８】
異種「プライムブースト」戦略は免疫応答および多数の病原体に対する保護を強化するために効果的であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．  Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）；Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１２２６−３１（２００２）；Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−７（２００１）。プライム注射とブースト注射において異なる形態で抗原を提供すると、抗原に対する免疫応答を最大化するようである。ＤＮＡワクチンプライミングの後にアジュバント中のタンパク質用いたブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達が続くのが抗原特異的な抗体およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のそれぞれの改善の最も効果的なやり方であるようである。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−４５（２００２）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：９５−１０２（２０００）；Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種の研究からの最近のデータは、サルにＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡをプライムでワクチン接種し、ＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）を用いたブーストを後に続けた場合、ＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％  ＰＯＥ）をＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えることがＴ細胞応答を強化することを示唆している。ＤＮＡ／ポロクサマーのプライムの後にＡｄ５−ｇａｇブーストを続けることに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロクサマーを用いない）プライムの後に続くＡｄ５−ｇａｇブーストで、またはＡｄ５−ｇａｇのみで誘発される応答より大きい。Ｓｈｉｖｅｒ、Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願  公開第ＵＳ２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるように、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。このドキュメントは、Ｂ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られる。さらに、米国特許  第６，５００，４３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を目的とする。この特許によると、同時投与は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同一の免疫応答の間の投与を意味し、相互の間が０〜１０日間または３〜７日間であるのが好ましい。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（すべての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属からの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げら��るがこれに限定されない）のものが挙げられる。すべての上記の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ワクチンと称される場合があり、かつ本明細書に提供される組成物の混合物または組成物の組合せは、ワクチンの組合せと称される場合がある。別の実施形態では、ワクチンの組合せは、本明細書に提供される組成物または組成物の組合せに加えて、ワクチンの代替形態を含む場合がある。
【００６０】
ワクチンの組合せまたは投与は、耐性腫瘍もしくは再発腫瘍で検出された変更または本来の治療または投与に続く時点で集められたデータに基づいて調節される（追加的なまたは新しい腫瘍マーカーを標的化するために）場合があることを当業者はよく理解するであろう。例えば、腫瘍がマーカーＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを発現する場合、与えられる免疫療法の全体的な投与は、本明細書に提供されるように、各々の個別のマーカーに対する免疫原性応答を標的化する組み換え型リステリア株を含む組成物または組成物の混合物を含むことになる。一実施形態では、組成物の混合物を投与する場合、単一のボーラスを同時に投与し、組成物の混合物中の少なくとも１つの組成物を異なる時点で投与し、すなわち混合物からの特異的なリステリア株を含む１つの組成物がバイオマーカーＡおよびＢを標的化し、異なる時点で別の組み換え型リステリア株を含む混合物からの別の組成物がバイオマーカーＣおよびＤを標的化する。
【００６１】
別の実施形態では、１０個の組成物混合物のうちの２〜４個の組成物を、混合物中の残りの組成物の前に投与する。別の実施形態では、１０個の組成物混合物のうちの２〜６個の組成物を、混合物中の残りの組成物の前に投与する。別の実施形態では、１０個の組成物混合物のうちの５〜８個の組成物を、混合物中の残りの組成物の前に投与する。別の実施形態では、１０個の組成物混合物のうちのすべての組成物を異なる時点で投与する。別の実施形態では、１０個の組成物混合物のすべての組成物を同時に投与する。別の実施形態では、混合物は５〜１０個の組成物、１１〜１５個の組成物、または１６〜２０個の組成物を含む。
【００６２】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患を有する被験者内の、または被験者の中の疾患部位内の浸潤性Ｔリンパ球／抑制因子細胞比を増加する。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患を有する被験者内の、または被験者の中の疾患部位内のＣＤ８＋  Ｔ細胞／抑制因子細胞比を増加する。別の実施形態では、浸潤性Ｔリンパ球／抑制因子細胞比またはＣＤ８＋  Ｔ細胞／抑制因子細胞比を増加する本明細書に提供される方法は、被験者に本明細書に提供されるワクチンまたは組成物を含む組成物を投与する工程を含む。
【００６３】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患を有する被験者内のまたは被験者の中の疾患部位内の浸潤性Ｔリンパ球／骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）比を増加する。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患を有する被験者内の、または被験者の中の疾患部位内のＣＤ８＋  Ｔ細胞／骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の比を増加する。別の実施形態では、浸潤性Ｔリンパ球／骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）比またはＣＤ８＋  Ｔ細胞／骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）比を増加する方法は、被験者に本明細書に提供されるワクチンまたは組成物を含む組成物を投与する工程を含む。
【００６４】
一実施形態では、浸潤性Ｔリンパ球は、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球（ＴＩＬ）である。一実施形態では、本明細書に提供される抑制因子細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。別の実施形態では、抑制因子細胞は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）である。
【００６５】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、疾患に対して免疫応答を抑制する細胞の量を減少する。別の実施形態では、免疫応答を抑制する細胞は、抑制的細胞である。別の実施形態では、抑制的細胞は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）である。別の実施形態では、抑制的細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
【００６６】
一実施形態では、腫瘍ＭＤＳＣは、予想外に抗原特異的なＴ細胞機能および非特異的なＴ細胞機能の両方を阻害する可能性があり、一方で脾臓ＭＤＳＣは抗原特異的なＴ細胞の機能のみを阻害する可能性がある。下記の実施例で実証されるように（実施例１７〜２０参照）、本明細書に提供される生きた弱毒化リステリアは、疾患部位（例えば、腫瘍部位）におけるＴＩＬの集団と比較して疾患内の抑制因子細胞のパーセントを減少する。
【００６７】
一実施形態では、本明細書に提供されるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）ベースのワクチンによって含まれる組み換え型リステリア株は、対応するエフェクターに対する疾患の部位における抑制因子細胞の比のシフトを用いて疾患の部位におけるＴｒｅｇおよびＭＤＳＣのパーセンテージを減少する。別の実施形態では、本明細書に提供されるＬｍベースのワクチンは、被験者内の疾患の特異的な部位におけるＴｒｅｇおよびＭＤＳＣのパーセンテージならびにＭＤＳＣの絶対数を減少することによって免疫応答を改善するために有用である。かかる部位は、アレルギー、外傷、感染、疾患に起因する炎症性の部位である可能性があり、またはこの部位は腫瘍部位である可能性がある。
【００６８】
別の実施形態では、リステリアで処置したマウスの腫瘍から精製された単球性および顆粒球性の両方のＭＤＳＣは、未処置マウスの腫瘍から精製したＭＤＳＣよりＣＤ８＋  Ｔ細胞の分裂をより少ししか抑制することができないが、一方でこれらの同一の腫瘍を持つマウスの脾臓から精製した単球性および顆粒球性のＭＤＳＣでは、リステリアを用いたワクチン接種後にそれらの機能に変化がない（本明細書の実施例１７〜２０を参照）。一実施形態では、脾臓のＭＤＳＣは抗原特異的な様式で抑制的なので、この効果が見られる。したがって、リステリアを用いる治療は、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣなどの腫瘍抑制的な細胞の腫瘍特異的な阻害を可能にする独特の利点を有する。本明細書に提供される方法および生きた組成物弱毒化リステリア株によって提供される別の予想外の利点は、腫瘍内により少ない量のＴｒｅｇがあること、およびＴ細胞の複製を抑制する能力を持続して失うものがあることである。
【００６９】
別の実施形態では、切断ＬＬＯ発現するリステリアで処置したマウスの腫瘍から精製した単球性および顆粒球性の両方のＭＤＳＣは、未処置マウスの腫瘍から精製したＭＤＳＣよりＣＤ８＋  Ｔ細胞の分裂をより少ししか抑制することができないが、一方でこれらの同一の腫瘍を持つマウスの脾臓から精製した単球性および顆粒球性のＭＤＳＣでは、切断ＬＬＯ発現するリステリアを用いたワクチン接種後にそれらの機能に変化がない（本明細書の実施例２１を参照）。一実施形態では、抗原特異的な様式でのみ脾臓のＭＤＳＣは抑制的であるためこの効果が見られる。したがって、切断ＬＬＯを発現するリステリアを用いた治療は、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣなどの腫瘍特異的な腫瘍抑制的な細胞の阻害を可能にする独特の利点を有する。切断ＬＬＯが発現する生きた弱毒化リステリアによって提供される本明細書に提供される方法および組成物の別の予想外の利点は、腫瘍内により少ない量のＴｒｅｇおよびＭＤＳＣがあること、およびＴ細胞の複製を抑制する能力を持続して失うものがあることであり、またこの効果は異種抗原などのＬＬＯ融合パートナーが無い場合でさえも観察される。
【００７０】
別の実施形態では、切断ＬＬＯを発現する生きた弱毒化リステリア株を投与することは、Ｔｒｅｇ媒介性およびＭＤＳＣ媒介性Ｔ細胞抑制を抑制することによって抗腫瘍Ｔ細胞応答を強化する（本明細書に実施例２１を参照する）。
【００７１】
一実施形態では、被験者内の疾患部位で抑制因子細胞のパーセンテージを減少する方法が本明細書に提供され、この方法は被験者に本明細書に提供される生きた弱毒化リステリア株を含む組成物、または生きた弱毒化リステリアワクチン株を含む組成物の混合物を投与する工程を含む。
【００７２】
別の実施形態では、被験者内の疾患部位で抑制因子細胞のＴ細胞の複製を抑制する能力を減少する方法が本明細書に提供され、この方法は被験者に本明細書に提供される生きた弱毒化リステリア株を含む組成物、または生きた弱毒化リステリアワクチン株を含む組成物の混合物を投与する工程を含む。
【００７３】
一実施形態では、疾患部位における抑制因子細胞の数の減少が疾患を効果的に治療する。別の実施形態では、疾患部位における抑制因子細胞の数の減少が、疾患部位において疾患を有する被験者内の抗疾患免疫応答を強化する。別の実施形態では、免疫応答は細胞媒介性免疫応答である。別の実施形態では、免疫応答は腫瘍浸潤性Ｔリンパ球（ＴＩＬ）免疫応答である。
【００７４】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は被験者内の疾患での抑制因子細胞のパーセンテージを減少し、被験者内の疾患に対する治療的な応答を強化する。
【００７５】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法は被験者内の疾患での抑制因子細胞のＴ細胞の複製を抑制する能力を減少し、被験者内の疾患に対する治療的な応答を強化する。
【００７６】
一実施形態では、「パーセンテージを減少する」という用語は、アッセイまたは免疫応答において測定した際に、疾患部位におけるＴ浸潤性細胞の存在に対するその存在が減退または減少した、ＴｒｅｇまたはＭＤＳＣのいずれかの抑制因子細胞の量を代表するものである。
【００７７】
別の実施形態では、「数の減少」という用語は、本明細書に提供されるリステリアベースのワクチンによって含まれる生きた弱毒化リステリア株、またはこれも本明細書のいずれかに記述される類似の効果を達成するこのワクチンの代替形態の投与の結果減退または減少したＴｒｅｇまたはＭＤＳＣのいずれかの抑制因子細胞の絶対数を指す。
【００７８】
一実施形態では、バイオマーカーまたは腫瘍マーカーが融合されるＰＥＳＴ含有ポリペプチドが本明細書に提供される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、Ｎ末端リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）もしくは切断ＬＬＯ、ＰＥＳＴアミノ酸配列もしくはＰＥＳＴ配列、またはＮ末端ＡｃｔＡ配列もしくは切断ＡｃｔＡである。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、切断ＡｃｔＡ、切断ＬＬＯ、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする孤立核酸、および腫瘍マーカーまたはその免疫原性の断片をコードする孤立核酸を含み、これはプロモーター／調節配列を含む核酸に動作可能にリンクし、これによって核酸が核酸によってコードされるタンパク質の発現を目的とする能力を有するのが好ましい。本発明はベクターも含み、このベクターは本発明の孤立核酸を含む。したがって、本発明は、細胞内での外来性ＤＮＡの同時発現を用いた外来性ＤＮＡの細胞の中への導入のための発現ベクターおよび方法を包含する。これは以下の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記述されるようなものである。
【００８０】
別の実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組合せのストリングを指す。一実施形態では、この用語はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸高分子の単量体単位を指す。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態をとる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述される（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびこの中で引用される参考文献）。別の実施形態では、ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態、またはこれらの群の誘導体とすることができる。追加的に、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖とすることができる。別の実施形態では、この用語は他の種類のバックボーンだが同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態では、この人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチドバックボーンおよびヌクレオチド塩基を含有し、また一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に結合することができる。別の実施形態では、このヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は当該技術分野で既知の未変性の核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、また例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記述される。核酸の生産および使用は、当業者には既知であり、また例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記述される。各々の核酸誘導体は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８１】
「孤立核酸」という用語は、配列から分離された自然に生じる状態で側面にある核酸セグメントまたは核酸断片、例えば、通常断片に隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片、例えば、自然に生じたゲノム内で断片に隣接する配列を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。この用語は、細胞内に自然に添付する、核酸（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはタンパク質）に自然に伴う実質的に他の構成成分から精製した核酸にも適用される。したがって、この用語は、例えば、ベクターの中へと、自己複製プラスミドもしくはウイルスの中へと、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡの中へと組込まれるか、あるいは他の配列とは独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素の消化によって生産されたｃＤＮＡ、またはゲノムの断片もしくはｃＤＮＡの断片）として存在する組み換え型ＤＮＡを含む。これは追加的なポリペプチド配列をコードする雑種遺伝子の部分である組み換え型ＤＮＡも含む。
【００８２】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸は、シグナルペプチドまたは配列も含む。一実施形態では、異種抗原は、リステルアシグナル配列（例えば、溶血素シグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列）などのシグナル配列の使用を通して発現される場合がある。代替的には、例えば、融合タンパク質を作り出すことなく外来遺伝子をＬ．モノサイトゲネスプロモーターから下流で発現することができる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌性（リステリア性または非リステリア性）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対して内在性である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対して外来性である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ｓｅｃＡ１シグナルペプチドなどのリステリア・モノサイトゲネスからのシグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ラクトコッカス・ラクティスからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはバチルス・アントラシスからの保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ｐ６０シグナルペプチドなどの、リステリア・モノサイトゲネスからのｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。追加的に、組み換え型核酸分子は、任意選択的にｐ６０またはその断片をコードする第３ポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、シグナルペプチドは、バシラスサチリスＴａｔシグナルペプチドなどのＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、組み換え型ポリペプチドをコードする同一の翻訳リーディングフレームである。
【００８３】
別の実施形態では、本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする孤立核酸を本発明は提供する。一実施形態では、孤立核酸は少なくとも６５％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも７５％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも８５％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９０％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９５％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９７％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９９％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。
【００８４】
一実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクターを本発明は提供する。一実施形態では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には２０個以下の塩基を有する短い核酸高分子を指す。一実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを本発明は提供する。一実施形態では、「ポリヌクレオチド」という用語は、一実施形態では５個より多い、別の実施形態では１０個より多い、別の実施形態では２０個より多い、別の実施形態では５０個より多い、数多くのヌクレオチドの鎖を指す。一実施形態では、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、または核酸は、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、または合成ＤＮＡ配列を指す場合がある。この用語は既知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。
【００８５】
一実施形態では本発明はリステリアを提供し、一実施形態ではこれは本発明の孤立核酸またはベクターを含むリステリアワクチン株である。
【００８６】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質は、本明細書に提供されるリステリア株によって発現される。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質は、前記リステリア株の中に存在するプラスミドから発現される。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは、前記リステリアの染色体から発現される。一実施形態では、組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質を含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質である。
【００８７】
別の実施形態では、本明細書に提供される組成物によって含まれる生きた弱毒化ｚリステリア株は、各々第１および第２のポリペプチドをコードする第１および第２のオープンリーディングフレームを含む組み換え型核酸配列を含み、第１および第２のポリペプチドは各々ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその断片を含む。
【００８８】
一実施形態では、エピソームの組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株が本明細書に提供され、核酸分子は各々が第１および第２のポリペプチドをコードする第１および第２のオープンリーディングフレームを含み、第１および第２のポリペプチドは各々ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその断片を含み、また核酸は代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。一実施形態では、「エピソームの」または「エピソーム」という用語はリステリアなどの宿主細胞の中に存在するプラスミドを指す。
【００８９】
別の実施形態では、リステリア株は、各々がＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその断片をコードする１〜５個のオープンリーディングフレームを含む組み換え型ヌクレオチドを含む。一実施形態では、本明細書に提供される異種抗原またはその断片およびＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内で翻訳される。別の実施形態では、本明細書に提供される各々の異種抗原性ポリペプチドおよびＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、分離して翻訳された後で融合される。
【００９０】
一実施形態では、各々がＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその断片をコードする組み換え型リステリア株を含む組成物は、１〜５個の組み換え型核酸を含む。
【００９１】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、Ｎ末端切断ＬＬＯポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、もしくはＰＥＳＴペプチド、またはその断片である。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性の断片である
【００９２】
一実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は異種抗原をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体を欠いている内因性の遺伝子を相補する。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。一実施形態では、リステリアは追加的な代謝酵素をコードする第３のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態では、第３のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、核酸分子は異種抗原またはその断片をコードする第４のリーディングフレームを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株はゲノムのｄａｌ／ｄａｔ遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株はｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子は本明細書に提供される組み換え型リステリアで不活性化される。一実施形態では、「欠いている」という用語は、ゲノム病毒性遺伝子に関連するとき、病毒性遺伝子が突然変異した、または別の方法で染色体から機能的に発現されていないことを意味する。かかる用語は、染色体内の病毒性遺伝子の部分的な欠失または遺伝子全体の欠失も包含する場合がある。
【００９３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第２のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々はプロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９４】
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９５】
別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。
【００９６】
一実施形態では、弱毒化リステリア株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態では、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病毒性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または切断ＬＬＯ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍDａｃｔＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍDＰｒｆＡである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍDＰｌｃＢである。別の実施形態では、弱毒化株はＬｍDＰｌｃＡである。別の実施形態では、株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態では、この株はＥＧＤリステリアバックボーンから構造化される。別の実施形態では、本発明で使用される株は非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。
【００９７】
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は、栄養要求性突然変異体である。別の実施形態では、リステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
【００９８】
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株はＡＡ代謝酵素が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はＤ−グルタミン酸酵素遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子が欠損している。ＣｙｓＫ。別の実施形態では、遺伝子はビタミンＢ１２とは関係のないメチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
【００９９】
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は、酵素遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ｆｏｌＰである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型サブユニットプソイドウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態では、遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はプソイドウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。
【０１００】
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
【０１０１】
別の実施形態では、リステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩／亜硝酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ共輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は主要な促進薬ファミリーの輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はテイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。
【０１０２】
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に提供される。別の実施形態では、リステリアを形質転換するために使用される本明細書に提供される核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリア内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ＡｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。病毒性遺伝子は、組み換え型リステリア内で、当該技術分野で既知の病毒性と関連付けられる任意の遺伝子とすることができることが当業者によって理解されるべきである。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は、ｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ＡｃｔＡ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態では、リステリアはこれらの遺伝子の個別でまたは組合せでの欠失または突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、遺伝子のうちの各々のものを欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本明細書に提供される遺伝子のうちの少なくとも１つでかつ最高１０個を欠いている。一実施形態では、生きた弱毒化リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＢ（ｉｎｌＢ）遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムＡｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＢ遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、リステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するＡｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。
【０１０４】
各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１０５】
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、等々はリステリア株の染色体を欠いている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、等々はリステリア株の染色体および何らかのエピソームの遺伝要素を欠いている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、等々は、病毒性株のゲノムを欠いている。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書に提供される代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で増殖した。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで増殖することになり、一方でＤ−グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする孤立核酸を含む場合、本発明のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生剤、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、この細菌は適切な培地上で選択的な圧力の存在の中で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラスミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【０１０８】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に適合されことを当業者は理解するであろう。
【０１０９】
別の実施形態では、本明細書に提供される構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる。相同的組み換えのための技法は周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ、ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５、１０９（１−２）：１１−７）、およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００５、３７（１）：１９−２４）。別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。この場合、Ｅ７を発現する組み換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、また遺伝子生成物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含むことによって、Ｅ７遺伝子の染色体組込によって作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。各々の技法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１０】
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、また中でも以下のＳｕｎらの文献  （Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：３７７０−３７７８）にＤＰ−Ｌ９６７の構築について記述されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置が未知であるという不利点を有する。
【０１１１】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，  Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子のｃ端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。組込別の実施形態では、本発明は、臨床用途のためのファージベースの染色体組込系をさらに含み、ここでｄ−アラニン・ラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用することができ、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）である。別の実施形態では、「ファージ治癒工程」を避けるためにＰＳＡベースのファージ組込系を使用した。別の実施形態では、これは組込まれた遺伝子を維持するための抗生物質による継続的な選択を要求する。したがって、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を用いた選択を要求しないファージベースの染色体組込系の確立を可能にする。別の方法で、栄養要求性宿主株を相補することができる。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１１２】
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、本明細書に提供されるような方法および組成物の核酸配列をインビトロまたはインビボで、任意の細胞（原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類の細胞を含む）内で構造的にまたは誘導的に発現する目的の任意のファージベースの組み換え型発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞内で再生すること、および適切な条件下でファージ粒子を生成することの両方を可能にすることができる。この用語は線形または円形の発現系を含み、またエピソームのまま、または宿主細胞ゲノムの中へと組込まれた両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０１１３】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ＬＬＯ、ＰＥＳＴ、もしくはＡｃｔＡ配列またはその断片をコードする内因性の核酸配列を用いてエピソームベクターまたはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態でプラスミドは組み換え型リステリアワクチン株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、断片は機能的断片である。別の実施形態では、断片は免疫原性の断片である  別の実施形態では、構築体または核酸分子は、各々が第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび少なくとも第２のオープンリーディングフレームを含み、第１のおよび第２のポリペプチドは各々ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその機能的断片を含む。
【０１１４】
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。別の実施形態では、ＯＲＦの開始端および停止端はｍＲＮＡの端部と同等でないが、通常のｍＲＮＡ中に含まれる。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、一実施形態では、内因性のポリペプチドとともにオープンリーディングフレームとして動作可能にゲノムの中へと組込まれる核酸分子は、内因性のポリペプチドと同一のオープンリーディングフレーム内でゲノムの中へと組込まれた核酸分子である。
【０１１５】
「安定して維持される」とは、別の実施形態では、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失無しでの、核酸分子またはプラスミドの１０世代の間の維持を指す。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１１６】
別の実施形態では、「機能的断片」は、単独でまたは本明細書に提供されるワクチンもしくは組成物内で被験者に投与するときに免疫応答を引き出す能力を有する免疫原性断片である。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、また本明細書にさらに提供されるように、機能的断片は生物活性を有する。
【０１１７】
別の実施形態では、本明細書に提供される抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【０１１８】
一実施形態では、本明細書に提供される疾患は感染性疾患である。一実施形態では、感染性疾患は以下の病原体（しかしこれに限定されない）のうちの１つによって生じたものである。ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピロマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピロマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当該技術分野で既知の任意の他の感染性疾患。
【０１１９】
別の実施形態では、感染性疾患は、家畜の感染性疾患である。別の実施形態では、家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態では、これらの疾患としては、口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、ブタコレラ（ＣＳＦ）、牛の１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）感染によって生じるＩＢＲ、および豚の仮性狂犬病（オーエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト（エルシニア・ペスチス）、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２０】
別の実施形態では、本明細書に提供される疾患は呼吸器または炎症性疾患である。別の実施形態では、呼吸器疾患または炎症性疾患は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の実施形態では、疾患は喘息である。
【０１２１】
一実施形態では、生きた弱毒化リステリア株は、抗炎症剤または気管支拡張剤などの他の治療薬を同時投与せずに喘息の症状を軽減する能力を有する。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、被験者に生きた弱毒化リステリア株および１つ以上の治療薬を同時投与する工程をさらに含む。別の実施形態では、治療薬は抗喘息薬である。別の実施形態では、薬剤は抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤、抗生物質、抗コリン剤、気管支拡張剤、副腎皮質ステロイド、短時間作用型β作動薬、長時間作用型β作動薬、組み合わせ吸入器、抗ヒスタミン剤、またはこれらの組合せである。
【０１２２】
一実施形態では、本明細書に提供される疾患はガンまたは腫瘍である。一実施形態では、本発明の方法で治療されるガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮頸ガンである。別の実施形態では、このガンはＨＥＲ２を含有するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、これは多形性膠芽腫である。別の実施形態では、これは中皮腫である。別の実施形態では、このガンは結腸直腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞性肺ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。別の実施形態では、このガンは口腔咽頭ガンである。別の実施形態では、このガンは肺ガンである。別の実施形態では、このガンは肛門ガンである。別の実施形態では、このガンは結腸直腸ガンである。別の実施形態では、このガンは食道ガンである。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２３】
一実施形態では、本明細書に提供される腫瘍マーカーは、異種腫瘍抗原であり、これは本明細書に「腫瘍抗原」、「抗原性ポリペプチド」、または「抗原」とも称される。別の実施形態では、抗原は、ヒトパピロマウイルス−Ｅ７（ＨＰＶ−Ｅ７）抗原であり、これは一実施形態では、ＨＰＶ１６（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＡＡＤ３３２５３）由来であり、また別の実施形態では、ＨＰＶ１８（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号Ｐ０６７８８）由来である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＨＰＶ−Ｅ６であり、これは一実施形態では、ＨＰＶ１６（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＡＡＤ３３２５２、ＡＡＭ５１８５４、ＡＡＭ５１８５３、またはＡＡＢ６７６１５）由来であり、また別の実施形態ではＨＰＶ１８（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号Ｐ０６４６３）由来である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＣＡＤ３０８４４、ＣＡＤ５４６１７、ＡＡＡ５８８０２、またはＮＰ-００１６３９）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）抗原（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＡＡＫ６９６５２、ＡＡＫ６９６２４、ＡＡＧ３３３６０、ＡＡＦ０１１３９、またはＡＡＣ３７５５１）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはウィルムス腫瘍抗原１であり、これは別の実施形態では、ＷＴ−１テロメラーゼ（遺伝子銀行アクセス  番号Ｐ４９９５２、Ｐ２２５６１、ＮＰ−６５９０３２、ＣＡＣ３９２２０．２、またはＥＡＷ６８２２２．１）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼ（遺伝子銀行アクセス  番号ＮＭ００３２１９（変異体１）、ＮＭ１９８２５５（変異体２）、ＮＭ１９８２５３（変異体３）、またはＮＭ１９８２５４（変異体４）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはプロテイナーゼ３（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ００２７７、Ｍ９６６２８、またはＸ５６６０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＮＰ-００１９１３、ＡＢＩ７３９７６、ＡＡＰ３３０５１、またはＱ９５１１９）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＮＰ-００１８８８、ＡＡＩ２８１１１、またはＡＡＱ６２８４２）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはテスティシン（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＡＡＦ７９０２０、ＡＡＦ７９０１９、ＡＡＧ０２２５５、ＡＡＫ２９３６０、ＡＡＤ４１５８８、またはＮＰ-６５９２０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１抗原（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＣＡＡ０５９０８、Ｐ７８３５８、ＡＡＢ４９６９３、またはＮＰ-６４０３４３）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＰＳＣＡ（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＡＡＨ６５１８３、ＮＰ-００５６６３、ＮＰ-０８２４９２、Ｏ４３６５３、またはＣＡＢ９７３４７）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはインターロイキン（ＩＬ）１３受容体α（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＮＰ-０００６３１、ＮＰ-００１５５１、ＮＰ-０３２３８２、ＮＰ-５９８７５１、ＮＰ-００１００３０７５、またはＮＰ-９９９５０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＣＡＩ１３４５５、ＣＡＩ１０９８５、ＥＡＷ５８３５９、ＮＰ-００１２０７、ＮＰ-６４７４６６、またはＮＰ-００１１０１４２６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはガン胎児抗原（ＣＥＡ）（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＡＡＡ６６１８６、ＣＡＡ７９８８４、ＣＡＡ６６９５５、ＡＡＡ５１９６６、ＡＡＤ１５２５０、またはＡＡＡ５１９７０．）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＭＡＧＥ−Ａ（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＮＰ-７８６８８５、ＮＰ-７８６８８４、ＮＰ-００５３５２、ＮＰ-００４９７９、ＮＰ-００５３５８、またはＮＰ-００５３５３）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはサバイビン（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＡＡＣ５１６６０、ＡＡＹ１５２０２、ＡＢＦ６０１１０、ＮＰ-００１００３０１９、またはＮＰ-００１０８２３５０）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＧＰ１００（一実施形態では、遺伝子銀行受入番号ＡＡＣ６０６３４、ＹＰ-６５５８６１、またはＡＡＢ３１１７６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは当該技術分野で既知の任意の他の抗原性ポリペプチドである。別の実施形態では、組成物および本発明の方法の抗原性ペプチドは抗原性ポリペプチドの免疫原性部分を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１２４】
別の実施形態では、本明細書に提供される抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態では、抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態では、抗原はｐ５３である。別の実施形態では、抗原はメソテリンである。別の実施形態では、抗原はＥＧＦＲＶＩＩＩである。別の実施形態では、抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態では、抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１  Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）、ＬＭＰ−１、カリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）、ＫＬＫ９、Ｍｕｃ、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＦＡＰ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＰＳＡ（前立腺特異的な抗原）、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ−７０）、β−ＨＣＧ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、アンジオゲニン、アンジオポエチン−１、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）もしくは塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミッドカイン、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラヌリン、プロリフェリン、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１）もしくはその断片、ＦＬＫ−１もしくはそのエピトープ、ＦＬＫ−Ｅ１、ＦＬＫ−Ｅ２、ＦＬＫ−Ｉ１、エンドグリンもしくはその断片、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）、Ｔｉｅ２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、エンドグリン、ＴＧＦ−β受容体、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、エフリン、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＶＡＰ−１、Ｅ−セレクチン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、ＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、もしくはＩｄ１／Ｉｄ３、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、アンジオポエチン６、ＣＤ１０５、ＥＤＧ、ＨＨＴ１、ＯＲＷ、ＯＲＷ１もしくはＴＧＦβ共受容体、またはこれらの組合せから選択される。本明細書に提供される抗原の断片の使用も本発明に包含される。
【０１２５】
別の実施形態では、本明細書に提供される異種抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、以下の腫瘍抗原のうちの１つである。ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、結腸直腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組合せである。一実施形態では、抗原は米国特出願公開第２０１１／０１４２７９１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるキメラＨｅｒ２抗原である。
【０１２６】
本明細書に記述していないが当該技術分野で既知の任意の異種抗原を、本明細書に提供される方法および組成物で使用するために、当業者が使用することができるであろうということが理解される。
【０１２７】
別の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５からのヒトパピロマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、またはｐＳＡから選択される。
【０１２８】
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用するための血管形成因子はＶＥＧＦＲ２である。
【０１２９】
一実施形態では、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成（胚循環系の形成）および血管形成（既存の血管系からの血管の増殖）の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。一実施形態では、ＶＥＧＦ活性は、主に脈管内皮の細胞に制限されるが、これは確かに限られた数の他の細胞タイプ（例えば、刺激単球／マクロファージ遊走）に効果を有する。インビトロでは、ＶＥＧＦは内皮細胞有糸分裂誘発および細胞遊走の刺激を示してきた。ＶＥＧＦは、微小血管の透過性も強化し、これはしばしば脈管透過性因子と称される。
【０１３０】
一実施形態では、ＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバーは、細胞表面上でチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）へと結合することによって細胞応答を刺激し、これらを二量体化させ、トランスリン酸化を通して活性化させる。ＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様領域、単一の膜貫通領域、および分割したチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内部分から構成される細胞外部分を有する。
【０１３１】
一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）リガンド、ならびにＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）リガンドである。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ−は既知のほとんどすべての細胞応答をＶＥＧＦに媒介する。ＶＥＧＦＲ−１の機能はあまりよく定義されていないが、一実施形態ではＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ−２結合からの分画を通してＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達を調節すると考えられており、一実施形態では、これは胎芽内での脈管形成の間特に重要である。一実施形態では、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−３受容体のリガンドであり、これは、一実施形態では、リンパ脈管形成を媒介する。
【０１３２】
一実施形態では、本発明の組み換え型リステリアはＶＥＧＦ受容体またはその断片を発現し、これは、一実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２であり、また別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−１であり、さらに別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−３である。
【０１３３】
一実施形態では、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）が活性化した内皮細胞（ＥＣ）上で高度に発現され、新しい血管の形成に関与している。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２はＶＥＧＦの５つのアイソフォームすべてを結合する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２を通したＥＣ上のＶＥＧＦのシグナル伝達は増殖、遊走および最終的な分化を誘発する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のマウスホモログは胎児肝臓キナーゼ遺伝子−１（Ｆｌｋ−１）であり、これは強い治療的な標的であり、また腫瘍増殖、浸潤、および転移において重要な役割を有する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、キナーゼインサートドメイン受容体（タイプＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ）（ＫＤＲ）、表面抗原分類３０９（ＣＤ３０９）、ＦＬＫ１、Ｌｙ７３、Ｋｒｄ−１、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、または６１３０４０１Ｃ０７とも称される。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明の組成物で使用されるＶＥＧＦＲ２タンパク質は以下の配列を有する。
【０１３５】
【化１】
2017511796.tif 000003
（遺伝子銀行受入番号ＮＰ＿０３４７４２．２、ＡＡＨ２０５３０．１、またはＥＤＬ３７８９１．１；配列番号：１３７；核酸配列は遺伝子銀行受入番号ＮＭ＿０１０６１２．２またはＢＣ０２０５３０．１に示される）。一実施形態では、ＡＡ  ６８−２７７は本明細書に記述されるＥ１に対応し、ＡＡ  ５４５−７３０は本明細書に記述されるＥ２に対応し、ＡＡ  ７９２−１０８１は本明細書に記述されるＩ１に対応する。別の実施形態では、上記の配列は本発明のワクチンでＶＥＧＦＲ２断片の供給源として使用される。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３７の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３７の変異体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３７の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３７のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１３６】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は以下の遺伝子銀行エントリのうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する。ＥＤＬ３７８９１．１；ＣＡＡ６１９１７．１；ＢＡＣ２７５３２．１；ＢＡＥ２４８９２．１；ＡＡＨ２０５３０．１；ＡＡＢ２５０４３．１；ＣＡＡ４２０４０．１；またはＣＡＡ５０１９２．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は以下の遺伝子銀行エントリのうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する。ＥＡＸ０５４６２．１；ＥＡＸ０５４６３．１；ＥＡＸ０５４６４．１；ＣＡＡ６１９１６．１；ＢＡＤ９３１３８．１；ＡＡＢ８８００５．１；ＡＡＣ１６４５０．１；ＢＡＧ５７１１４．１；ＡＡＩ３１８２３．１；ＡＣＦ４７５９９．１；ＡＡＡ５９４５９．１；またはＣＡＡ４３８３７．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は以下の遺伝子銀行エントリのうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する。ＥＤＬ８９９１４．１；ＥＤＬ８９９１５．１；ＥＤＬ８９９１６．１；ＡＡＨ８７０２９．１；ＡＡＢ９７５０８．１；またはＡＡＢ９７５０９．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は以下の遺伝子銀行エントリのうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する。ＣＡＱ１３４３８．１；ＡＡＦ０３２３７．１；ＡＡＮ４７１３６．１；ＡＡＬ１６３８１．１；ＡＡＩ２９１５９．１；ＣＡＭ７３１７７．１；ＡＡＢ１８４１５．１；ＡＡＢ４１０４２．１；またはＡＡＢ６２４０５．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は当該技術分野で既知の任意のＶＥＧＦＲ２アミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は上記の遺伝子銀行エントリのうちの１つからの配列の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は上記の遺伝子銀行エントリのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は上記の遺伝子銀行エントリのうちの１つからの配列のアイソフォームである。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は上記の遺伝子銀行エントリのうちの１つからの配列の断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１３７】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は以下の遺伝子銀行エントリのうちの１つに示される核酸配列を有する。ＡＣ１２４６１５．１１；ＡＣ１３４９０３．４；ＡＣ１６０７２３．２；ＡＦ０６１８０４．１；ＡＦ１５３０５８．１；ＣＨ４６６５２４．１；Ｘ８９７７７．１；ＡＫ０３１７３９．１；ＡＫ０５４５１０．１；ＡＫ１４１９３８．１；ＢＣ０２０５３０．１；Ｓ５３１０３．１；Ｘ５９３９７．１；またはＸ７０８４２．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は以下の遺伝子銀行エントリのうちの１つに示される核酸配列を有する。ＡＣ０２１２２０．７；ＡＣ１１１１９４．４；ＣＨ４７１０５７．１；ＥＡＸ０５４６３．１；ＥＡＸ０５４６４．１；Ｘ８９７７６．１；ＡＢ２０９９０１．１；ＡＦ０３５１２１．１；ＡＦ０６３６５８．１；ＡＫ２９３６６８．１；ＢＣ１３１８２２．１；ＢＰ２８０６２１．１；ＣＲ６０６０５５．１；ＥＵ８２６５６３．１；Ｌ０４９４７．１；またはＸ６１６５６．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は以下の遺伝子銀行エントリのうちの１つに示される核酸配列を有する。ＣＨ４７３９８１．１；ＢＣ０８７０２９．１；Ｕ９３３０６．１；またはＵ９３３０７．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は以下の遺伝子銀行エントリのうちの１つに示される核酸配列を有する。ＡＬ９３５１３１．７；ＢＸ２４７９４６．６；ＣＲ７５９７３２．９；ＡＦ１８０３５４．１；ＡＦ４８７８２９．１；ＡＹ０５６４６６．１；ＢＣ１２９１５８．１；ＣＵ４５８９１６．１；Ｕ７５９９５．１；Ｕ８２３８３．１；Ｕ８９５１５．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は当該技術分野で既知の任意のＶＥＧＦＲ２核酸配列を有する。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記の遺伝子銀行エントリのうちの１つからの配列の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は上記の遺伝子銀行エントリのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は上記の遺伝子銀行エントリのうちの１つからの配列のアイソフォームである。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は上記の遺伝子銀行エントリのうちの１つからの配列の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３８】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は本発明の組成物および方法で利用される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸６８〜２７７を含み、これは、一実施形態では、Ｆｌｋ１−Ｅ１と称される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、以下の配列を有する。
【０１３９】
ＲＤＳＥＥＲＶＬＶＴＥＣＧＧＧＤＳＩＦＣＫＴＬＴＩＰＲＶＶＧＮＤＴＧＡＹＫＣＳＹＲＤＶＤＩＡＳＴＶＹＶＹＶＲＤＹＲＳＰＦＩＡＳＶＳＤＱＨＧＩＶＹＩＴＥＮＫＮＫＴＶＶＩＰＣＲＧＳＩＳＮＬＮＶＳＬＣＡＲＹＰＥＫＲＦＶＰＤＧＮＲＩＳＷＤＳＥＩＧＦＴＬＰＳＹＭＩＳＹＡＧＭＶＦＣＥＡＫＩＮＤＥＴＹＱＳＩＭＹＩＶＶＶＶＧＹＲＩＹＤＶＩＬＳＰＰＨＥＩＥＬＳＡＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＬＤＦＴＷＨＳＰＰＳＫＳＨＨＫＫＩＶＮＲ（配列番号：１３８）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３８に示される配列を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３８の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３８の変異体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ  配列は配列番号：１３８の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３８のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１４０】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸５４５〜７３０を含み、これは、一実施形態では、Ｆｌｋ１−Ｅ２と称される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、以下の配列を有する。
【０１４１】
ＶＩＲＧＰＥＩＴＶＱＰＡＡＱＰＴＥＱＥＳＶＳＬＬＣＴＡＤＲＮＴＦＥＮＬＴＷＹＫＬＧＳＱＡＴＳＶＨＭＧＥＳＬＴＰＶＣＫＮＬＤＡＬＷＫＬＮＧＴＭＦＳＮＳＴＮＤＩＬＩＶＡＦＱＮＡＳＬＱＤＱＧＤＹＶＣＳＡＱＤＫＫＴＫＫＲＨＣＬＶＫＱＬＩＩＬＥＲＭＡＰＭＩＴＧＮＬＥＮＱＴＴＴＩＧＥＴＩＥＶＴＣＰＡＳＧＮＰＴＰＨＩＴＷＦＫＤＮＥＴＬＶＥＤＳＧＩＶＬＲＤＧＮＲＮＬＴＩＲＲＶＲＫＥＤＧ（配列番号：１３９）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３９に示される配列を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３９の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３９の変異体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３９の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１３９のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１４２】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸７９２〜１０８１を含み、これは、一実施形態では、Ｆｌｋ１−Ｉ１と称される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、以下の配列を有する。
【０１４３】
ＥＧＥＬＫＴＧＹＬＳＩＶＭＤＰＤＥＬＰＬＤＥＲＣＥＲＬＰＹＤＡＳＫＷＥＦＰＲＤＲＬＫＬＧＫＰＬＧＲＧＡＦＧＱＶＩＥＡＤＡＦＧＩＤＫＴＡＴＣＫＴＶＡＶＫＭＬＫＥＧＡＴＨＳＥＨＲＡＬＭＳＥＬＫＩＬＩＨＩＧＨＨＬＮＶＶＮＬＬＧＡＣＴＫＰＧＧＰＬＭＶＩＶＥＦＣＫＦＧＮＬＳＴＹＬＲＧＫＲＮＥＦＶＰＹＫＳＫＧＡＲＦＲＱＧＫＤＹＶＧＥＬＳＶＤＬＫＲＲＬＤＳＩＴＳＳＱＳＳＡＳＳＧＦＶＥＥＫＳＬＳＤＶＥＥＥＥＡＳＥＥＬＹＫＤＦＬＴＬＥＨＬＩＣＹＳＦＱＶＡＫＧＭＥＦＬＡＳＲＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＬＳＥＫＮＶＶＫＩＣＤＦＧＬＡＲＤＩＹＫＤＰＤＹＶＲＫＧＤＡＲＬＰＬＫＷＭＡＰＥＴＩＦＤＲＶＹＴ（配列番号：１４０）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４０に示される配列を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４０の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４０の変異体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４０の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４０のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１４４】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸１０８２〜１２３７を含み、これは、一実施形態では、Ｆｌｋ１−Ｉ２と称される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、以下の配列を有する。
【０１４５】
ＩＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＳＬＧＡＳＰＹＰＧＶＫＩＤＥＥＦＣＲＲＬＫＥＧＴＲＭＲＡＰＤＹＴＴＰＥＭＹＱＴＭＬＤＣＷＨＥＤＰＮＱＲＰＳＦＳＥＬＶＥＨＬＧＮＬＬＱＡＮＡＱＱＤＧＫＤＹＩＶＬＰＭＳＥＴＬＳＭＥＥＤＳＧＬＳＬＰＴＳＰＶＳＣＭＥＥＥＥＶＣＤＰＫＦＨＹＤＮＴＡＧＩＳＨＹＬＱＮＳＫＲＫＳＲＰＶＳＶＫＴＦ（配列番号：１４１）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４１に示される配列を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４１の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４１の変異体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４１の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２  ＡＡ配列は配列番号：１４１のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１４６】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるＶＥＧＦＲ２断片は、Ｔ細胞エピトープを含有する領域についてＶＥＧＦＲ２アミノ酸配列を解析することに基づき、一実施形態では、そのいくつかが当該技術分野で既知であるエピトープ予測プログラムを通してＶＥＧＦＲ２配列を実行することによって決定され、また別の実施形態では、予測エピトープマッピングによって決定される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、一実施形態では、Ｔ細胞エピトープを含むことが既知であるマウスまたはラットである他の種において、ＶＥＧＦＲ２配列と相同体であるヒト配列を使用することによって使用される。別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるＶＥＧＦＲ２断片は、Ｔ細胞エピトープを含有するＶＥＧＦＲ２の領域に関する当該技術分野での知識に基づく。
【０１４７】
一実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸７６６〜７７４を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は配列ＩＩＬＶＧＴＡＶＩ（配列番号：１４２）を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸７８１〜７８９を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は配列ＬＬＶＩＩＬＲＴＶ（配列番号：１４３）を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸１０３４〜１０４２を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は配列ＩＬＬＳＥＫＮＶＶ（配列番号：１４４）を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸１０７６〜１０８４を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は配列ＴＩＦＤＲＶＹＴＩ（配列番号：１４５）を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用するためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸１０９３〜１１０１を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は配列ＶＬＬＷＥＩＦＳＬ（配列番号：１４６）を含む。
【０１４８】
一実施形態では、エンドグリンタンパク質は以下の配列で示される。
【０１４９】
ＭＤＲＧＶＬＰＬＰＩＴＬＬＬＦＥＩＹＳＦＥＰＴＴＧＬＡＥＲＶＧＣＤＬＱＰＶＤＰＴＲＧＥＶＴＦＴＴＳＱＶＳＥＧＣＶＡＱＡＡＮＡＶＲＥＶＨＶＬＦＬＤＦＰＧＭＬＳＨＬＥＬＴＬＱＡＳＫＱＮＧＴＥＴＲＥＶＦＬＶＬＶＳＮＫＮＶＦＶＫＦＱＡＰＥＩＰＬＨＬＡＹＤＳＳＬＶＩＦＱＧＱＰＲＶＮＩＴＶＬＰＳＬＴＳＲＫＱＩＬＤＷＡＡＴＫＧＡＩＴＳＩＡＡＬＤＤＰＱＳＩＶＬＱＬＧＱＤＰＫＡＰＦＬＣＬＰＥＡＨＫＤＭＧＡＴＬＥＷＱＰＲＡＱＴＰＶＱＳＣＲＬＥＧＶＳＧＨＫＥＡＹＩＬＲＩＬＰＧＳＥＡＧＰＲＴＶＴＶＭＭＥＬＳＣＴＳＧＤＡＩＬＩＬＨＧＰＰＹＶＳＷＦＩＤＩＮＨＳＭＱＩＬＴＴＧＥＹＳＶＫＩＦＰＧＳＫＶＫＧＶＥＬＰＤＴＰＱＧＬＩＡＥＡＲＫＬＮＡＳＩＶＴＳＦＶＥＬＰＬＶＳＮＶＳＬＲＡＳＳＣＧＧＶＦＱＴＴＰＡＰＶＶＴＴＰＰＫＤＴＣＳＰＶＬＬＭＳＬＩＱＰＫＣＧＮＱＶＭＴＬＡＬＮＫＫＨＶＱＴＬＱＣＴＩＴＧＬＴＦＷＤＳＳＣＱＡＥＤＴＤＤＨＬＶＬＳＳＡＹＳＳＣＧＭＫＶＴＡＨＶＶＳＮＥＶＩＩＳＦＰＳＧＳＰＰＬＲＫＫＶＱＣＩＤＭＤＳＬＳＦＱＬＧＬＹＬＳＰＨＦＬＱＡＳＮＴＩＥＬＧＱＱＡＦＶＱＶＳＶＳＰＬＴＳＥＶＴＶＱＬＤＳＣＨＬＤＬＧＰＥＧＤＭＶＥＬＩＱＳＲＴＡＫＧＳＣＶＴＬＬＳＰＳＰＥＧＤＰＲＦＳＦＬＬＲＶＹＭＶＰＴＰＴＡＧＴＬＳＣＮＬＡＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＳＶＬＧＩＴＦＧＡＦＬＩＧＡＬＬＴＡＡＬＷＹＩＹＳＨＴＲＧＰＳＫＲＥＰＶＶＡＶＡＡＰＡＳＳＥＳＳＳＴＮＨＳＩＧＳＴＱＳＴＰＣＳＴＳＳＭＡ（配列番号：１４７、図６０）。一実施形態では、このエンドグリンは、当該技術分野で入手可能ないずれかのエンドグリンであり、以下の受入番号は挙げられるがこれに限定されない。ＣＡＡ５４９１７．１、ＮＰ＿００１０１０９６８．１、ＮＰ＿００１０７４３５６．１、ＡＡＣ６３３８６．１、ＣＡＡ５０８９１。別の実施形態では、ａａ  １７〜３１９は構築体ＣＤ１０５Ａに対応する。別の実施形態では、ａａ  ３５９〜５９９は構築体ＣＤ１０５Ｂに対応する。
【０１５０】
リステリアベースのワクチンは、生きた弱毒化リステリア株の混合物と同時投与される治療薬との両方を含有してもよい。生きた弱毒化リステリア株および同時投与する治療薬はまた、異なる医薬組成物内にあってもよい。
【０１５１】
一実施形態では、薬剤は吸入コルチコステロイド剤を含む、これにはフルチカゾン（Ｆｌｏｖｅｎｔ  Ｄｉｓｋｕｓ、Ｆｌｏｖｅｎｔ  ＨＦＡ）、ブデソニド（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ  Ｆｌｅｘｈａｌｅｒ）、モメタゾン（Ａｓｍａｎｅｘ）、フルニソリド（Ａｅｒｏｂｉｄ）、ベクロメタゾン（Ｑｖａｒ）、および他のものが挙げられる。これらは最も一般的に処方されるタイプの長期喘息薬である。経口コルチコステロイド剤と異なり、これらのコルチコステロイド薬は、副作用のリスクが比較的低く、一般的に長期間の使用が安全である。
【０１５２】
この薬剤はロイコトリエン修飾薬とすることができる。これらの経口薬としては、モンテルカスト（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ）、ザフィルルカスト（Ａｃｃｏｌａｔｅ）、およびジレウトン（Ｚｙｆｌｏ、Ｚｙｆｌｏ  ＣＲ）が挙げられる。これらは最高２４時間まで喘息症状の防止に役立つ。
【０１５３】
さらに、この薬剤を長時間作用型β作動薬（ＬＡＢＡ）とすることができる。これらの吸入薬物治療としては、サルメテロール（Ｓｅｒｅｖｅｎｔ  Ｄｉｓｋｕｓ）、およびホルモテロール（Ｆｏｒａｄｉｌ  Ａｅｒｏｌｉｚｅｒ）が挙げられる。ＬＡＢＡは、気道を開き、炎症を減少する。しかしながらこれらは重篤な喘息発作につながっている。ＬＡＢＡは吸入式コルチコステロイドと組み合わせてのみ使用するべきである。
【０１５４】
一実施形態では、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物はアジュバントを含む。別の実施形態では、アジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントであるか、またはこれを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１５５】
一実施形態では、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物は追加的な活性薬剤を含む。一実施形態では、前記追加的な活性薬剤は腫瘍溶解性ウイルスを含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤はＴ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤はキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は、治療的なまたは免疫調節性モノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む。別の実施形態では、追加的な活性薬剤は改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞を含む。別の実施形態では、本発明の追加的な活性薬剤は、弱毒化腫瘍溶解性ウイルス、Ｔ細胞受容体改変Ｔ細胞（受容体改変Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、治療的または免疫調節性モノクローナル抗体、標的化チミジンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、もしくは改変Ｔ細胞受容体を組み込んだ養子移入細胞、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０１５６】
別の実施形態では、本明細書に提供される組成物または組成物の混合物は追加的な活性薬剤を含む。別の実施形態では、活性薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。
【０１５７】
一実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、プログラム死１（ＰＤ−１）シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤は、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）と相互作用する分子閉鎖ＰＤ−１受容体である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１はＣＤ２７４またはＢ７−Ｈ１としても知られている。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２もＣＤ２７３またはＢ７−ＤＣとして知られている。別の実施形態では、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）と相互作用する分子閉鎖ＰＤ−１受容体は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。別の実施形態では、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）と相互作用する分子閉鎖ＰＤ−１受容体は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。「相互作用する」という用語、またはその文法的に等価な用語は、別の分子と結合する、または別の分子と接触することを包含する場合がある。別の実施形態では、分子はＰＤ−１に結合する。別の実施形態では、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤は、抗ＰＤ１抗体である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはＰＤ−Ｌ１と結合する小分子である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、またはＰＤ−Ｌ２と結合する小分子である。
【０１５８】
一実施形態では、ＰＤ−１と相互作用する分子は、切断ＰＤ−Ｌ１タンパク質である。別の実施形態では、切断ＰＤ−Ｌ１タンパク質はＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、ＰＤ−１と相互作用する分子は、切断ＰＤ−Ｌ２タンパク質である。別の実施形態では、切断ＰＤ−Ｌ２タンパク質はＰＤ−Ｌ２タンパク質の細胞質ドメインを含む。別の実施形態では、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）と相互作用する分子閉鎖ＰＤ−１受容体は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と相互作用する分子は、切断ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−１模倣体、またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を結合する小分子である。別の実施形態では、切断ＰＤ−Ｌ１タンパク質はＰＤ−１タンパク質の細胞質ドメインを含む。
【０１５９】
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＣＤ８０／８６シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＣＤ８０はＢ７．１としても知られている。別の実施形態では、ＣＤ８６はＢ７．２としても知られている。別の実施形態では、ＣＤ８０シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＤ８０と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＤ８０阻害剤は抗ＣＤ８０抗体である。別の実施形態では、ＣＤ８６シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＤ８６と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＤ８６阻害剤は抗ＣＤ８６抗体である。
【０１６０】
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４はＣＤ１５２としても知られている。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤は、ＣＴＬＡ−４と相互作用する小分子である。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤は抗ＣＴＬＡ−４抗体である。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤である。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、任意の他の抗原発現細胞であり、当該技術分野で既知のＴ細胞シグナル伝達経路阻害剤である。
【０１６１】
当該技術分野で既知の任意の免疫チェックポイントタンパク質を免疫チェックポイント阻害剤によって標的化することができることを当業者は理解するであろう。免疫チェックポイントタンパク質は、以下のものから選択されてもよいがこれに限定されない。プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、または細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤タンパク質は、Ｂ７／ＣＤ２８受容体スーパーファミリーに属するものである。一実施形態では、Ｔ細胞刺激薬は抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞作動薬である。別の実施形態では、Ｔ細胞刺激薬は、ＣＤ１３４またはそのリガンドもしくはその断片、ＣＤ−１３７またはそのリガンドもしくはその断片、あるいは誘導性Ｔ細胞共刺激薬（ＩＣＯＳ）またはそのリガンドもしくはその断片である。
【０１６２】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物をインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。本発明で使用するためのＩＤＯ経路阻害剤としては、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキサルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない当該技術分野で既知の任意のＩＤＯ経路阻害剤を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法は、化学療法的もしくは放射線療法的な療法と併せて、その前に、またはそれに続いても使用される。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物を前記被験者内で抗腫瘍免疫応答を強化する腫瘍キナーゼ阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。腫瘍キナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、特異的な細胞シグナル伝達経路と干渉するように機能し、したがって選択された悪性腫瘍に対する標的特異的な療法を可能にする。ＴＫＩは周知であり、またＴＫＩが以下の表１に示すものおよび抗腫瘍免疫応答を強化することが知られている任意の他のＴＫＩを含むことを当業者は理解するであろう。
【表１−１】
2017511796.tif 000004
【表１−２】
2017511796.tif 000005
【０１６４】
別の実施形態では、被験者に投与する本明細書に提供される免疫原性組成物で提示される免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤）の投与量は、２週間ごとに５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間ごとに５〜１０ｍｇ／ｋｇ、または３週間ごとに１〜２ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量範囲は毎週１〜１０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量範囲は２週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量範囲は３週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量範囲は４週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇである。これらの投与量は例示的であり、限定することを意図しない。
【０１６５】
一実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物は、特異的にＧＩＴＲまたはその部分に結合する抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物は、ＯＸ４０またはその部分に特異的に結合する抗体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物は、ＧＩＴＲまたはその部分に特異的に結合する抗体、およびＯＸ４０に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物はＧＩＴＲに特異的に結合するＬｍ株およびその抗体または機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物はＯＸ４０に特異的に結合するＬｍ株およびその抗体または機能的断片を含む。別の実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物は、Ｌｍ株およびＧＩＴＲまたはその部分に特異的に結合する抗体、ならびにＯＸ４０またはその部分に特異的に結合する抗体を含む。
【０１６６】
同一のまたは異なる組成物に提示する異なる抗体は、同一の形態を有する必要はなく、例えば、１つの抗体はモノクローナル抗体であってもよく、別の抗体はＦＡｂ断片であってもよい。各々の可能性は、本発明の異なる実施形態を表す。
【０１６７】
「抗体機能的断片」という用語は、特異的に抗原に結合する能力を有する無傷の抗体の部分を指す。抗体断片の実施例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、および抗体断片から形成される多選択性抗体が挙げられるがこれに限定されない。
【０１６８】
抗体に関して「結合する」または「特異的に結合する」という用語は、特異的な抗原を認識するが、実質的にサンプル内の他の分子を認識もしくは結合しない抗体またはその機能的断片を包含することを当業者は理解するであろう。例えば、１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種からその抗原にも結合する場合があるが、かかる異種間の反応性はそれ自体抗体の分類を特異的なものとして変更することはない。別の実施例では、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立形質にも結合する場合がある。しかしながら、かかる交差反応は、それ自体抗体の分類を特異的なものとして変更することはない。いくつかの事例では、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質、またはペプチドの第２の化学種との相互作用に関連して使用することができ、相互作用が化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は、特異的なアミノ酸配列ではなく、特異的なタンパク質構造を認識および結合する。
【０１６９】
一実施形態では、本発明の組成物は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）株を含む。別の実施形態では、本明細書に記述されるように、本発明の組成物は抗体またはその機能的断片を含む。
【０１７０】
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、単一の組成物の投与の一部、または組成物の混合物の一部のいずれかとして、本明細書に提供されるような抗体またはその機能的断片、および本明細書に提供されるような組み換え型弱毒化リステリアを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物の各々の構成成分を、本明細書に提供される組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与する。一実施形態では、同時に投与するときでさえも、リステリアベースの組成物と抗体またはその機能的断片とを２つの別個の組成物として投与する場合がある。あるいは、別の実施形態では、リステリアベースの組成物は、抗体またはその機能的断片を含む場合がある。
【０１７１】
一実施形態では、本発明の組成物のいずれかはインターフェロンγの強い先天的な刺激を誘発し、これは、一実施形態では抗血管形成特性を有する。一実施形態では、本発明のリステリアは、インターフェロンγの強い先天的な刺激を誘発し、これは、一実施形態では、抗血管形成特性を有する（Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞による媒介性である（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  ２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管形成特性は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−γ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組合せによって媒介される。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明の組成物のいずれかは１つ以上の抗血管形成タンパク質または因子の生産を誘発する。一実施形態では、抗血管形成タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態では、抗血管形成タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本発明のリステリアは、抗血管形成因子の放出に関与し、したがって一実施形態では、抗原を被験者に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。各々のリステリア株およびそのタイプは、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明は、エピソームの組み換え型核酸分子を含む組み換え型リステリア株を提供し、核酸分子は各々が第１および少なくとも第２のポリペプチドをコードする第１および少なくとも第２のオープンリーディングフレームを含み、第１および少なくとも第２のポリペプチドは各々ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される異種抗原またはその機能的断片を含み、核酸はプラスミド複製対照領域をさらに含む。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第１および少なくとも第２のオープンリーディングフレームからの発現を調節する。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第１のまたは少なくとも第２のオープンリーディングフレームからの異種抗原の発現を抑制する転写リプレッサーをコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第１および少なくとも第２のオープンリーディングフレームから異種抗原発現を誘発する転写インデューサーをコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、核酸分子は、各々が１〜４個の組み換え型ポリペプチドをコードする１〜４個のオープンリーディングフレームを含み、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドに融合される前記組み換え型ポリペプチドは各々が異種抗原またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第１〜第４のオープンリーディングフレームから異種抗原発現を抑制する。別の実施形態では、プラスミド対照領域は、第１〜第４のオープンリーディングフレームから異種抗原発現を誘発する転写インデューサーをコードするオープンリーディングフレームを含む。
【０１７４】
一実施形態では、当該技術分野で既知の異なるタイプの転写調節機構があり、これらは「負の対照」および「正の対照」を含むがこれらに限定されない。負の対照では、調節タンパク質またはリプレッサータンパク質がオペレーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に適切に結合するのを防止する。あるいは、この状態ではプロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼを閉鎖することができない不活性形態でリプレッサータンパク質を合成することができ、次いでコリプレッサーの結合によってＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合するのを防止するためにリプレッサーが活性化される。同化経路（例えば、アルギニン生合成）ではこのタイプの対照が最も頻繁に見られ、コリプレッサーはしばしば同化経路の最終産物である。あるいは、リプレッサータンパク質は、活性形態で合成され、オペレーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合するのを防止する。インデューサーがリプレッサーに結合するときリプレッサーは不活性になり、したがってＲＮＡポリメラーゼは転写を自由に開始するようになる。異化経路（例えば、ラクトース異化作用）ではこのタイプの対照が最も頻繁に見られる。インデューサーは、しばしば分解される基質の形態である。正の対照では、活性化タンパク質と呼ばれる調節タンパク質はオペレーターに結合し、活性化分子はプロモーター領域に結合するＲＮＡポリメラーゼを安定化する。これの実施例はアラビノースの異化作用を含む。調節タンパク質（正の調節と負の調節との両方のための）は調節遺伝子によってコードされ、低いレベルで継続的に合成することができる。これらが自己調節されるようにすることができ、これによって高濃度の調節タンパク質（高いプラスミド生産と関連付けられる）がその自身のオペレーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合するのを抑制する。これは、レベルが下がるまで転写を停止する。これらのタイプの調節のいくつかの実施例としては、ラクトースオペロン、アルギニンオペロン、ジフテリア毒素遺伝子調節系、等々が挙げられる。転写リプレッサーおよびその使用方法は、当該技術分野において直ちに知られ、また本発明での使用が意図される。
【０１７５】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は、臨床の場での使用の前に、本明細書に提供される組み換え型リステリア発現多重融合タンパク質での代謝負担を測定する工程を含む。そうすることによって、当業者は、本明細書に提供される異種抗原を含む融合タンパク質の発現のためにどの最適な条件を使用するかを容易に決定することができる。別の実施形態では、代謝負担の測定は、本発明の時点で当該技術分野で既知の任意の手段によって遂行され、この手段としては、ワクチン株の増殖率、光学濃度の読み取り値、コロニー形成単位（ＣＦＵ）プレーティング、およびこれに類するものの測定が挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態では、細菌細胞上の代謝負担は、細菌細胞の生存能力を測定することによって決定される。細菌生存能力を測定する方法は、当該技術分野において直ちに知られ、かつ利用可能であり、そのいくつかとしては、生存能力計数のための細菌プレーティング、ＡＴＰの測定、およびフローサイトメトリーが挙げられるがこれらに限定されない、ＡＴＰ染色では、検出は、生存細胞からのＡＴＰの量を測定するためのルシフェラーゼ反応の使用に基づき、細胞内のＡＴＰの量は、細胞の生存能力と相関する。フローサイトメトリーとしては、これも当該技術分野で既知の様々なやり方でこの方法を使用することができ、例えば、生きている細菌細胞によって除外される生存能力染料の使用を採用した後に、これを吸収させるか、または死んだ細菌細胞によって吸収させる。当業者は、細菌の生存能力を測定するためのこれらのおよび当該技術分野で既知の任意の他の方法を本発明で使用することができることを直ちに理解するであろう。本発明の時点で当該技術分野で利用可能な、多重異種抗原またはその機能的断片を発現するリステリア株の代謝負担を決定することができるリステリア株の増殖率またはリステリア株によるマーカー遺伝子の発現を測定するための知識を、当業者が実施することができるであろうことが理解されるであろう。
【０１７６】
一実施形態では、「少なくとも第２の核酸分子」という用語は２つ以上の核酸分子を指し、あるいは３つ、４つ、５つなどの核酸分子を指す。別の実施形態では、この用語は、最大１０個までの核酸分子、または最大２０個までの、もしくは最大３０個までの核酸分子を指す。
【０１７７】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は２つ以上の抗原を送達する多価プラスミドを含む。別の実施形態では、プラスミドは、本明細書に記述されるデュアルプラスミドである（図２０および実施例４０を参照）。別の実施形態では、多価プラスミドをコードするエピソームの組み換え型核酸が本明細書に提供される。別の実施形態では、多価プラスミドは２〜５個の抗原を送達する。別の実施形態では、多価プラスミドは２〜１０個の抗原を送達する。別の実施形態では、多価プラスミド内の抗原は、ＰＥＳＴ含有アミノ酸配列に融合される。
【０１７８】
一実施形態では、本明細書に提供されるプラスミドは、染色体外またはエピソームのままであり、すなわち一旦細菌の中へと形質移入しても宿主の細菌の染色体の中へは組込まれない。別の実施形態では、本明細書に提供されるプラスミドは、一旦細菌の中へと形質移入されると宿主細菌の染色体配列の中へと組み込まれる（特異的にまたは無作為的に）組込プラスミドである。
【０１７９】
別の実施形態では、エピソームの組み換え型核酸バックボーンは、配列番号：１を含む配列によってコードされる。別の実施形態では、本明細書に提供されるエピソームの組み換え型核酸は、配列番号：１から構成される配列によってコードされる。別の実施形態では、本明細書に提供されるエピソームの組み換え型核酸は、配列番号：１で示される配列によってコードされる。
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【０１８０】
一実施形態では、多価プラスミドバックボーンは、少なくとも２つの抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む。別の実施形態では、組み換え型エピソームの核酸はプラスミドバックボーン配列、および少なくとも２つの抗原をコードする。別の実施形態では、抗原はプラスミドを搬送する細菌宿主に対する異種抗原である。別の実施形態では、抗原はプラスミドを搬送するリステリア宿主に対する異種抗原である。別の実施形態では、プラスミドバックボーンおよび少なくとも２つの異種抗原をコードする組み換え型エピソーム核酸配列は配列番号：２を含む。別の実施形態では、プラスミドバックボーンおよび少なくとも２つの異種抗原をコードする組み換え型エピソーム核酸配列は配列番号：２から構成される。
【化２−１】
2017511796.tif 000006
【化２−２】
2017511796.tif 000007
【化２−３】
2017511796.tif 000008
【化２−４】
2017511796.tif 000009
【化２−５】
2017511796.tif 000010
【０１８１】
別の実施形態では、配列番号：２の中の配列によってコードされる抗原のうちの１つは、Ｅ７（配列番号：２の中の太字）である。別の実施形態では、Ｅ７配列は配列番号：３で示される。
【０１８２】
Ｃｔｃｇａｇｃａｔｇｇａｇａｔａｃａｃｃｔａｃａｔｔｇｃａｔｇａａｔａｔａｔｇｔｔａｇａｔｔｔｇｃａａｃｃａｇａｇａｃａａｃｔｇａｔｃｔｃｔａｃｔｇｔｔａｔｇａｇｃａａｔｔａａａｔｇａｃａｇｃｔｃａｇａｇｇａｇｇａｇｇａｔｇａａａｔａｇａｔｇｇｔｃｃａｇｃｔｇｇａｃａａｇｃａｇａａｃｃｇｇａｃａｇａｇｃｃｃａｔｔａｃａａｔａｔｔｇｔａａｃｃｔｔｔｔｇｔｔｇｃａａｇｔｇｔｇａｃｔｃｔａｃｇｃｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｃｇｔａｃａａａｇｃａｃａｃａｃｇｔａｇａｃａｔｔｃｇｔａｃｔｔｔｇｇａａｇａｃｃｔｇｔｔａａｔｇｇｇｃａｃａｃｔａｇｇａａｔｔｇｔｇｔｇｃｃｃｃａｔｃｔｇｔｔｃｔｃａｇａａａｃｃａｔａａａｃｔａｇｔ（配列番号：３）。
【０１８３】
一実施形態では、配列番号：２の中の配列によってコードされる抗原のうちの１つは、キメラＨｅｒ２−ｎｅｕ抗原（配列番号：２の中の斜字）である。別の実施形態では、キメラＨｅｒ２−ｎｅｕ配列は配列番号：４で示される。
【０１８４】
ｃｔａｇｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇａｇｃｔｃａｇａｔｃｔｇｔｃｔａａｇａｇｇｃａｇｃｃａｔａｇｇｇｃａｔａａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｇｃｔｇｃａｃｃｇｔｇｇａｔｇｔｃａｇｇｃａｇａｔｇｃｃｃａｇａａｇｇｃｇｇｇａｇａｃａｔａｔｇｇｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｃａｇｃｃａｔｃａｃｇｔａｔｇｃｔｔｃｇｔｃｔａａｇａｔｔｔｃｔｔｔｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｇｇｇｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｃｃｃｔｃａａｃａｃｔｔｔｇａｔｇｇｃｃａｃｔｇｇａａｔｔｔｔｃａｃａｔｔｃｔｃｃｃｃａｔｃａｇｇｇａｔｃｃａｇａｔｇｃｃｃｔｔｇｔａｇａｃｔｇｔｇｃｃａａａａｇｃｇｃｃａｇａｔｃｃａａｇｃａｃｃｔｔｃａｃｃｔｔｃｃｔｃａｇｃｔｃｃｇｔｃｔｃｔｔｔｃａｇｇａｔｃｃｇｃａｔｃｔｇｃｇｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇｃａｔｃｇｃｔｃｃｇｃｔａｇｇｔｇｔｃａｇｃｇｇｃｔｃｃａｃｃａｇｃｔｃｃｇｔｔｔｃｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃｔｃｃｇｃａｔｃｇｔｇｔａｃｔｔｃｃｇｇａｔｃｔｔｃｔｇｃｔｇｃｃｃｔｃｇｇｇｃｇｃａｃａｇｃｔｇｇｔｇｇｃａｇｇｃｃａｇｇｃｃｃｔｃｇｃｃｃａｃａｃａｃｔｃｇｔｃｃｔｃｔｇｇｃｃｇｇｔｔｇｇｃａｇｔｇｔｇｇａｇｃａｇａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｇｇｇｔｔｃｃｇａａａｇａｇｃｔｇｇｔｃｃｃａｇｇｇｃａｃｃｇｔｇｔｇｃａｃｇａａｇｃａｇａｇｇｔｇｇｇｔｇｔｔａｔｇｇｔｇｇａｔｇａｇｇｇｃｃａｇｔｃｃａｃｔｇｃｃｃａｇｔｔｃｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇｃａｇｃｃｃｃａｇｃｃａｇｃｔｇａｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｔｔｇｃａｇｇｇｔｃａｇｃｇａｇｔａｇｇｃｇｃｃａｔｔｇｔｇｃａｇａａｔｔｃｇｔｃｃｃｃｇｇａｔｔａｃｔｔｇｃａｇｇｔｔｃｔｇｇａａｇａｃｇｃｔｇａｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｃｔｇｔｃｃｇｇｃｃａｔｇｃｔｇａｇａｔｇｔａｔａｇｇｔａａｃｃｔｇｔｇａｔｃｔｃｔｔｃｃａｇａｇｔｃｔｃａａａｃａｃｔｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｃｇｇｇｇｃａｇｔｇｔｔｇｇａｇｇｃｔｇｇｇｔｃｃｃｃａｔｃａａａｇｃｔｃｔｃｃｇｇｃａｇａａａｔｇｃｃａｇｇｃｔｃｃｃａａａｇａｔｃｔｔｃｔｔｇｃａｇｃｃａｇｃａａａｃｔｃｃｔｇｇａｔａｔｔｃｔｔｃｃａｃａａａａｔｃｇｔｇｔｃｃｔｇｇｔａｇｃａｇａｇｃｔｇｇｇｇｇｔｔｃｃｇｃｔｇｇａｔｃａａｇａｃｃｃｃｔｃｃｔｔｔｃａａｇａｔｃｔｃｔｇｔｇａｇｇｃｔｔｃｇａａｇｃｔｇｃａｇｃｔｃｃｃｇｃａｇｇｃｃｔｃｃｔｇｇｇｇａｇｇｃｃｃｃｔｇｔｇａｃａｇｇｇｇｔｇｇｔａｔｔｇｔｔｃａｇｃｇｇｇｔｃｔｃｃａｔｔｇｔｃｔａｇｃａｃｇｇｃｃａｇｇｇｃａｔａｇｔｔｇｔｃｃｔｃａａａｇａｇｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｃｇｃａｃａａｔｃｃｇｃａｇｃｃｔｃｔｇｃａｇｔｇｇｇａｃｃｔｇｃｃｔｃａｃｔｔｇｇｔｔｇｔｇａｇｃｇａｔｇａｇｃａｃｇｔａｇｃｃｃｔｇｃａｃｃｔｃｃｔｇｇａｔａｔｃｃｔｇｃａｇｇａａｇｇａｃａｇｇｃｔｇｇｃａｔｔｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｔａｇｇｔｇａｇｔｔｃｃａｇｇｔｔｔｃｃｃｔｇｃａｃｃａｃｃｔｇｇｃａｇｃｃｃｔｇｇｔａｇａｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｃａｔｇｔｃｃａｇｇｔｇｇｇｔｔｃｔａｇａｔ（配列番号：４）。
【０１８５】
別の実施形態では、本明細書に提供される代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、ｉｎｌＡ（インターナリンをコードする）プロモーターが使用される。別の実施形態では、ｈｌｙプロモーターが使用される。別の実施形態では、ａｃｔＡプロモーターが使用される。本開示および本明細書に提供される方法が装備されたとき、異なる転写プロモーター、停止剤、キャリアベクター、または特異的な遺伝子配列（例えば、市販のクローニングベクター内のもの）を本発明の方法および組成物内で順調に使用することができることを当業者は直ちに理解するであろう。本発明で意図されるように、これらの機能性は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販のベクターで提供される。別の実施形態では、非必須ＤＮＡ配列（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）は除去される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１８６】
別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は任意の他のグラム陽性プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリア内で機能する任意の他のプロモーターの制御下で発現する。遺伝子の発現を駆動するために他のプロモーターまたはポリシストロニック発現カセットが使用されてもよいことを当業者は理解するであろう。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１８７】
一実施形態では、「構造性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと動作可能にリンクしたとき、細胞のほとんどのまたはすべての生理学的条件下でヒトの生細胞内に遺伝子産物を生じるヌクレオチド配列である。
【０１８８】
一実施形態では、「誘発性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと動作可能にリンクしたとき、プロモーターに対応する誘導物質が実質的に細胞内に存在するときにのみ生細胞内に生産される遺伝子産物を生じるヌクレオチド配列である。
【０１８９】
一実施形態では、「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと動作可能にリンクしたとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみヒトの生細胞内に生産される遺伝子産物を生じるヌクレオチド配列である。
【０１９０】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、動物宿主は非ヒト動物宿主である  別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の有病率を減少する。別の実施形態では、継代は株を弱毒化し、または別の実施形態では、株の病毒性を少なくする。組み換え型リステリア株を動物宿主を通して継代する方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、米国特許出願番号第１０／５４１，６１４号に記述されている。一実施形態では、これを通してリステリアが継代される動物は、哺乳類であり、一実施形態では、これはマウスである。本発明は、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット、およびこれに類するものなどの哺乳類の継代のための使用を意図する。かかる哺乳類は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）などの様々な卸売業者、流通業者、および研究所を通して当業者に対して入手可能である。組み換え型リステリア株を動物宿主を通して継代する方法は当該技術分野で既知であり、また例えば、米国特許出願番号第１０／５４１，６１４号に記述されている。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１９１】
一実施形態では、ヒトの被験者の疾患を防止する、疾患を治療する、およびワクチン接種を行うための方法および組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明は、動物の被験者の疾患を防止する、疾患を治療する、およびワクチン接種を行うための方法および組成物を提供する。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物の抗腫瘍免疫応答を強化することを目的とする。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物または本明細書に提供される組成物の混合物を投与することによって被験者内の抗腫瘍応答を強化する方法は、他の既知の抗腫瘍または抗ガン療法と組み合わせることができる。別の実施形態では、本発明の組成物を単独でまたはアジュバントが適切であるいずれかの療法と組合せて使用することができ、これは、化学療法または放射線療法などのようにアジュバントを一般的に使用しない設定において有用性を有する場合がある。
【０１９３】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、自己抗原である異種抗原に対する耐性を克服または「破る」方法をさらに提供する。かかる抗原は、様々な腫瘍によって異常に発現される場合があり、これらは本発明の範囲の下で本明細書に提供される方法および組成物を使用することによって治療または予防を受ける。
【０１９４】
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物によって誘発される免疫応答は治療的なものである。別の実施形態では、これは予防的な免疫応答である。別の実施形態では、これは、本明細書に提供される症状に悩まされている被験者内に免疫応答を誘発するための、当該技術分野において利用可能な方法に対して強化された免疫応答である。別の実施形態では、免疫応答は本明細書に提供される被験者を悩ましている腫瘍の除去につながる。
【０１９５】
一実施形態では、腫瘍は、低酸素固形腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は、本明細書に提供される任意のガン、および当該技術分野で既知の任意のガンと関連付けられる任意の腫瘍である。
【０１９６】
一実施形態では、他の治療的なモダリティと組合せられた、組み換え型の弱毒化したリステリア発現する切断リステリオリシンＯは、免疫応答を強化するため、ならびにガンまたは固形腫瘍を含む疾患を防止および治療するために有用である。一実施形態では、他の治療的なモダリティと組合せられた、組み換え型の弱毒化したリステリア発現する切断ＡｃｔＡは、免疫応答を強化するため、ならびにガンまたは固形腫瘍を含む疾患を防止および治療するために有用である。一実施形態では、他の治療的なモダリティと組合せられた、組み換え型の弱毒化したリステリア発現するＰＥＳＴアミノ酸配列は、免疫応答を強化するため、ならびにガンまたは固形腫瘍を含む疾患を防止および治療するために有用である。
【０１９７】
別の実施形態では、治療ワクチンの免疫原性を改善する方法が本明細書に提供され、この方法はワクチンと、多重融合タンパク質を発現する単一の組み換え型リステリアを含む組成物、または各々が本発明の融合タンパク質を発現する組み換え型リステリアを含む組成物の混合物とを被験者に同時投与することを含み、各々の組成物または組成物の混合物はワクチンの免疫原性を強化し、かつ抗原特異的な免疫応答を引き出し、それによってワクチンの免疫原性を改善する。一実施形態では、この方法はワクチンが特異的に対する腫瘍の治療を可能にする。別の実施形態では、ワクチンはドラッグワクチンであり、当該技術分野で既知の化学療法的薬剤、ペプチドワクチン、または任意の他のタイプのワクチンである。
【０１９８】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物で利用されるＬＬＯはリステリアＬＬＯである。一実施形態では、ＬＬＯが由来するリステリアは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）である。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。
【０１９９】
一実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、（配列番号：５）に示される以下の核酸配列によってコードされる。
ａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｔｃｇａｇ（配列番号：５）。
【０２００】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：６の配列を有する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：６に示される配列を含む。
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＬ（配列番号：６）
【０２０１】
この配列に対応するタンパク質の最初の２５個のアミノ酸はシグナル配列であり、また細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、遺伝子銀行受入番号ＤＱ０５４５８８、ＤＱ０５４５８９、ＡＹ８７８６４９、Ｕ２５４５２、またはＵ２５４５２で示される配列を有する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の相同体である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明の組成物（任意の形態の）を構築するために利用されるＬＬＯタンパク質（別の実施形態では、本明細書に提供される組成物内に組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される）は、別の実施形態では、以下の配列を有する。        ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（遺伝子銀行受入番号Ｐ１３１２８、配列番号：１２３、核酸配列は遺伝子銀行受入番号Ｘ１５１２７で示される）。この配列に対応するタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、また細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：１２３の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：１２３の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：１２３の異性体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：１２３の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：１２３の相同体の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：１２３の変異体の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：１２３の異性体の断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２０３】
別の実施形態では、「切断ＬＬＯ」または「ｔＬＬＯ」はＰＥＳＴアミノ酸配列ドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、この用語はアミノ末端において活性化ドメインを含有せず、シスチン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質はｃｔＬＬＯである。別の実施形態では、ｃｔＬＬＯは、全長ＬＬＯであり、この中でコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）は抗原ペプチドまたはそのエピトープによって置き換えられている。別の実施形態では、「置き換える」は、突然変異の置換、または欠失を介することを意味することができる。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質はｍｕｔＬＬＯである。別の実施形態では、ｍｕｔＬＬＯは、その中でＣＢＤが突然変異しているものである。別の実施形態では、ｍｕｔＬＬＯは、その中でＣＢＤ内のアミノ酸が突然変異しているものである。別の実施形態では、突然変異は点突然変異、欠失、反転、置換、またはこれらの組合せである。別の実施形態では、突然変異は、当該技術分野で既知の任意の突然変異である。別の実施形態では、変異型ＬＬＯタンパク質はＣＢＤ内の欠失、置換、もしくは点突然変異の任意の組合せ、および／またはＬＬＯのシグナル配列の欠失を含む。別の実施形態では、ＣＢＤの突然変異がＬＬＯの溶血活性を減少する。別の実施形態では、ＣＢＤはワクチンとして使用される既知のＨＬＡクラスＩ制限エピトープによって置き換えられる。別の実施形態では、変異型ＬＬＯは大腸菌発現系から発現および精製される。
【０２０４】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は５２９アミノ酸全長ＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４００〜４４１アミノ酸から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質と、（ｂ）対象となる異種ペプチドとを含む組み換え型ポリペプチドを提供し、変異型ＬＬＯタンパク質は内部欠失を含有し、内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＬＬＯコレステロール結合ドメインの配列は当該技術分野で周知であり、また本明細書に参照により組み込まれる米国特許第８，７７１，７０２号に記述される。別の実施形態では、内部欠失は、１１〜５０アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、内部欠失は、組み換え型タンパク質またはポリペプチドの溶血活性に関して不活性である。別の実施形態では、組み換え型タンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに関する溶血活性の減少を呈する。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型タンパク質または組み換え型ポリペプチドを含む組み換え型リステリアが本明細書に提供される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を表す。
【０２０６】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質と、（ｂ）対象となる異種ペプチドとを含む組み換え型タンパク質またはポリペプチドを提供し、変異型ＬＬＯタンパク質は内部欠失を含有し、内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインの断片を含む。別の実施形態では、内部欠失は、１〜１１アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、コレステロール結合ドメインの配列は配列番号：１３０で示される。別の実施形態では、内部欠失は、組み換え型タンパク質またはポリペプチドの溶血活性に関して不活性である。別の実施形態では、組み換え型タンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに関する溶血活性の減少を呈する。各々の可能性は本発明の別の実施形態を表す。
【０２０７】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の突然変異した領域は配列番号：１２３の残基Ｃ４８４を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するシスチン残基を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は配列番号：１２３の残基Ｗ４９１を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は配列番号：１２３の残基Ｗ４９２を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は配列番号：１２３の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。相同タンパク質の対応する残基を同定するための方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、配列アライメントを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２０８】
別の実施形態では、突然変異した領域は残基Ｃ４８４およびＷ４９１を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は残基Ｃ４８４およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は残基Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２０９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物内に提供されるＬＬＯタンパク質の突然変異した領域は、変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のコレステロール結合ドメインを含む。例えば、配列番号：３７の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００から構成される突然変異した領域は  そのＣＢＤ（残基４８３〜４９３）を含む。別の実施形態では、突然変異した領域は変異型ＬＬＯタンパク質のＣＢＤの断片、またはその断片である。本明細書に提供されるように、例えば、その各々がＣＢＤの断片である残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２は、アラニン残基に突然変異している（実施例３８）。さらに、本明細書に提供されるように、ＣＢＤの断片、残基４８４〜４９２は、ＮＹ−ＥＳＯ−１からの異種配列で置き換えられる（実施例３９）。別の実施形態では、突然変異した領域は変異型ＬＬＯタンパク質のＣＢＤ、またはその断片に重複する。例えば、配列番号：１２３の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０から構成される突然変異した領域  はそのＣＢＤを含む。別の実施形態では、単一のペプチドは、シグナル配列およびＣＢＤでの突然変異または置換の欠失を有してもよい。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２１０】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯタンパク質での内部欠失はＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤを含む。例えば、配列番号：３７の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００から構成される内部欠失は  そのＣＢＤ（残基４８３〜４９３）を含む。別の実施形態では、内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤの断片である。例えば、残基４８４〜４９２、４８５〜４９０、および４８６〜４８８はすべて配列番号：１２３のＣＢＤの断片である。別の実施形態では、内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤに重複する。例えば、配列番号：１２３の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０から構成される内部欠失は  はそのＣＢＤを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２１１】
一実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４４１から構成される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２１２】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用するＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合のように、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はない。
【０２１３】
別の実施形態では、ストレプトリジンＯ、パーフリンゴリジンＯ、ニューモリシン、等々、またはその断片などの既知のリシンを含む、他の種からのＬＬＯの相同体を本発明で使用してもよい。
【０２１４】
一実施形態では、生きた弱毒化リステリア、または本明細書に提供される組み換え型リステリアは、ＡｃｔＡタンパク質もしくはその断片を発現する。本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片も、本明細書に提供される異種抗原またはその断片に融合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、以下の配列を有する。
【０２１５】
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ  （配列番号：７）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ  ＡＡ配列は配列番号：７に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号：７の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号：７の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は配列番号：７の断片であってもよい。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、配列番号：５のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２１６】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、以下の配列を含む組み換え型ヌクレオチドによってコードされる。
ＡＴＧＣＧＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＴＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＣＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＴＣＧＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＣＡＡＧＴＧＧＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＴＴＧＣＣＡＴＣＧＧＡＴＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＡＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＧＴＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＣＧＴＧＡＴＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＧＧＡＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＡＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡ  ＣＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡ（配列番号：８）。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：８に示される配列を有する。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする本発明の方法および組成物のヌクレオチドは配列番号：８に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号：８の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは配列番号：８の変異体である。別の実施形態では、���ｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号：８の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは配列番号：８のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２１７】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、以下の配列を含む組み換え型ヌクレオチドによってコードされる。
【０２１８】
Ｔｔｔａｔｃａｃｇｔａｃｃｃａｔｔｔｃｃｃｃｇｃａｔｃｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｔｔａａａｔａｃｔｔｔａｇｇｇａａａａａｔｇｇｔｔｔｔｔｇａｔｔｔｇｃｔｔｔｔａａａｇｇｔｔｇｔｇｇｔｇｔａｇａｃｔｃｇｔｃｔｇｃｔｇａｃｔｇｃａｔｇｃｔａｇａａｔｃｔａａｇｔｃａｃｔｔｔｃａｇａａｇｃａｔｃｃａｃａａｃｔｇａｃｔｃｔｔｔｃｇｃｃａｃｔｔｔｔｃｔｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｔｔｔｇｔｔｇｇｔｔｔａｔｃｔｇｇａｔａａｇｔａａｇｇｃｔｔｔｃａａｇｃｔｃａｃｔａｔｃｃｇａｃｇａｃｇｃｔａｔｇｇｃｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔａａｔｔｔｃｃｇｃｔｇｃｇｃｔａｔｃｃｇａｔｇａｃａｇａｃｃｔｇｇａｔｇａｃｇａｃｇｃｔｃｃａｃｔｔｇｃａｇａｇｔｔｇｇｔｃｇｇｔｃｇａｃｔｃｃｔｇａａｇｃｃｔｃｔｔｃａｔｔｔａｔａｇｃｃａｃａｔｔｔｃｃｔｇｔｔｔｇｃｔｃａｃｃｇｔｔｇｔｔａｔｔａｔｔｇｔｔａｔｔｃｇｇａｃｃｔｔｔｃｔｃｔｇｃｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃａａｃａｔｔｇｃｔａｔｔａｇｇｔｃｔｇｃｔｔｔｇｔｔｃｇｔａｔｔｔｔｔｃａｃｔｔｔａｔｔｃｇａｔｔｔｔｔｃｔａｇｔｔｃｃｔｃａａｔａｔｃａｃｇｔｇａａｃｔｔａｃｔｔｃａｃｇｔｇｃａｇｔｔｔｃｇｔａｔｃｔｔｇｇｔｃｃｃｇｔａｔｔｔａｃｃｔｃｇｃｔｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔｇｔｔｔｔｔｔｃｔｔｃｔｔｃｃｃａｔｔｃａｔｃｔｇｔｇｔｔｔａｇａｃｔｇｇａａｔｃｔｔｃｇｃｔａｔｃｔｇｔｃｇｃｔｇｃａａａｔａｔｔａｔｇｔｃｇｇｇｇｔｔａａｔｃｇｔａａｔｇｃａｇｔｔｇｇｃａｇｔａａｔｇａａａａｃｔａｃｃａｔｃａｔｃｇｃａｃｇｃａｔ（配列番号：９）。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：９に示される配列を有する。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする本発明の方法および組成物のヌクレオチドは配列番号：９に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号：９の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは配列番号：９の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号：９の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは配列番号：９のアイソフォームである。別の実施形態では、配列番号：９は配列番号：２の構築体に到達するために使用され、本明細書にも提供される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２１９】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は異種抗原またはその断片に融合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、遺伝子銀行受入番号ＡＡＦ０４７６２に示されるように、配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡ  ＡＡ配列は遺伝子銀行受入番号ＡＡＦ０４７６２に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、遺伝子銀行受入番号ＡＡＦ０４７６２の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、遺伝子銀行受入番号ＡＡＦ０４７６２の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、遺伝子銀行受入番号ＡＡＦ０４７６２の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ  ＡＡ配列は、遺伝子銀行受入番号ＡＡＦ０４７６２のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２２０】
本発明の方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、配列番号：１０で示される配列を有する。
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：１０に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２２１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号：１１に示される配列を含む。
Ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：１１に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２２２】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、遺伝子銀行受入番号ＡＦ１０３８０７に示される配列を含む組み換え型ヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは遺伝子銀行受入番号ＡＦ１０３８０７に示される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは遺伝子銀行受入番号ＡＦ１０３８０７に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、遺伝子銀行受入番号ＡＦ１０３８０７の相同体である  別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、遺伝子銀行受入番号ＡＦ１０３８０７の変異体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、遺伝子銀行受入番号ＡＦ１０３８０７の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、遺伝子銀行受入番号ＡＦ１０３８０７のアイソフォームである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。別の実施形態では、米国特許公開シリアル番号第２０１４／０１８６３８７号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり、この中でＰＥＳＴモチーフは欠失しており、また非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含有する。
【０２２３】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、本発明の組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは全ＡｃｔＡタンパク質をコードする任意の他の配列を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２２４】
一実施形態では、本明細書に提供される生きた弱毒化リステリアまたは組み換え型リステリアはＰＥＳＴ配列ペプチドを発現する。本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列は異種抗原またはその断片に融合される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号：１２）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号：１３）である。別の実施形態では、本明細書に列挙されているＰＥＳＴ  ＡＡ配列のうちの１つを含む任意のＬＬＯ配列への抗原の融合は、抗原に対する細胞媒介性免疫を強化することができる。
【０２２５】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列はリステリアＡｃｔＡタンパク質からのＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：１４）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：１５）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：１６）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：１７）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、上記に記述されるＰＥＳＴ配列の変異体であり、一実施形態では、当業者であれば理解するとおり、これはＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：１８）、ＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：１９）、またはＲＧＧＲＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：２０）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ｌｓｏ遺伝子によってコードされるリステリア・シーリゲリ細胞溶解素由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号：２１）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３５〜５１においてＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：２２）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３８〜５４においてＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：２３）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は配列番号：１４〜２３から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ  ＡＡ配列である。
【０２２６】
ＰＥＳＴアミノ酸配列または「ＰＥＳＴ配列」の同定は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ  ＰＥＳＴ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  （ＰＥＳＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９６；２１（７）：２６７−７１）に記述される。「ＰＥＳＴ配列」は、別の実施形態では、プロリン（Ｐ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、セリン（Ｓ）残基、およびスレオニン（Ｔ）残基が豊富な領域を指す。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、いくつかの正に荷電したアミノ酸を含有する１つ以上のクラスターが脇にある。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はこれを含有するタンパク質の急速な細胞内分解を媒介する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｏｇｅｒｓらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は１つ以上の内部リン酸化部位を含有し、これらの部位におけるリン酸化はタンパク質の分解を進める。
【０２２７】
一実施形態では、原核生物のＰＥＳＴ配列は、例えば、ＬＭについてＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）によって記述されたものおよびＲｏｇｅｒｓ  Ｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）によって記述されたものなどの方法によって同定される。あるいは、この方法に基づいても原核生物からのＰＥＳＴ  ＡＡ配列を同定することができる。ＰＥＳＴ  ＡＡ配列を含むことが期待される他の原核生物は、他のリステリア種に限定されない。一実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｏｇｅｒｓらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒらによって開示されたアルゴリズムと適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ−ｆｉｎｄプログラムを使用してＰＥＳＴ配列が同定される。
【０２２８】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの同定は、特異的なタンパク質配列の中の正に荷電したＡＡ  Ｒ、Ｈ、およびＫに対する初期のスキャンによって達成される。正に荷電した側の間のすべてのＡＡが計数され、これらのモチーフのみがさらに考慮され、これらはウィンドウサイズのパラメータと等しいかそれより大きい多数のＡＡを含有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含有する必要がある。
【０２２９】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの質は、重要なＡＡならびにモチーフの疎水性の局所的な濃縮に基づいてパラメータをスコアリングする手段によって洗練される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴの濃縮は、質量パーセント（ｗ／ｗ）で表現され、ＤまたはＥと等価な１つに対して、Ｐと等価な１つに対して、およびＳまたはＴと等価な１つに対して修正される。別の実施形態では、疎水性の計算は、Ｊ．ＫｙｔｅおよびＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｋｙｔｅ，Ｊ  ａｎｄ  Ｄｏｏｔｌｉｔｔｌｅ，ＲＦ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７、１０５（１９８２））の方法に原理的に従う。
【０２３０】
別の実施形態では、潜在的なＰＥＳＴモチーフの疎水性は、各々のＡＡ種に対するモルパーセントおよび疎水性指数の産物にわたる合計として計算される。以下の式で表現される場合、望ましいＰＥＳＴスコアは局所濃縮項および疎水性項の組合せとして得られる。
【０２３１】
ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指数。
【０２３２】
「ＰＥＳＴアミノ酸配列」、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ様配列」、または「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」という用語が、上記のアルゴリズムを使用して少なくとも＋５のスコアを有するペプチドを包含することができることが理解されるであろう。別の実施形態では、この用語は少なくとも６のスコアを有するペプチドを指す。別の実施形態では、ペプチドは少なくとも７のスコアを有する。別の実施形態では、スコアは少なくとも８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１３である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４５である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２３３】
別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法またはアルゴリズム、例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ＨＭ，  Ｏｃｃｈｉｕｃｃｉ  ＪＭ，  Ａｌｖｅｓ  Ｊ，  Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ  ＪＥ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５  Ｊｕｎ；２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を使用してＰＥＳＴ配列は同定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される。
【０２３４】
ＰＥＳＴ指数は、１の値をＡＡ  Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、適切な長さ（例えば、３０〜３５ストレッチ）の各々のストレッチに対して計算される。ＰＥＳＴ残基の各々に対する係数値（ＣＶ）は、１であり、また他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）の各々に対する係数値は０である。
【０２３５】
ＰＥＳＴ様配列を同定するための各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２３６】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴ配列である。各々のＰＥＳＴ配列およびそのタイプは本発明の別個の実施形態を表す。
【０２３７】
「ＰＥＳＴ配列に融合する」という用語がＰＥＳＴ配列を含むタンパク質断片に融合することを包含する場合があることが理解されるであろう。別の実施形態では、この用語は、タンパク質断片がＰＥＳＴ配列以外に周辺配列を含む事例を含む。別の実施形態では、タンパク質断片はＰＥＳＴ配列から構成される。「融合する」という用語が、それらのそれぞれの端部においてまたは他のものの中に埋め込まれて互いにリンクした、２つのペプチドまたはタンパク質断片のいずれかに融合することも包含することも理解されるであろう。
【０２３８】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型の形態を含むワクチンが本明細書に提供される。
【０２３９】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型の形態の培養液が本明細書に提供される。
【０２４０】
別の実施形態は、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）などのプラスミドであり、これは原核生物の複製起点および原核生物内での発現を容易にするプロモーター／調節要素を有する原核生物発現ベクターである。別の実施形態では、外来ヌクレオチド配列は、プラスミドのサイズを減少しかつその中に定置することができるカセットのサイズを増加するために除去される。
【０２４１】
かかる方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記述されている。
【０２４２】
抗生物質抵抗性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製で一般的に採用される従来の選択およびクローニングプロセスで使用される。本発明で企図される抗生物質抵抗性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシンおよび当該技術分野で周知の他のものに抵抗を与える遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されない。各々の遺伝子は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２４３】
細菌を形質転換するための方法は当該技術分野で周知であり、またこの方法としては塩化カルシウム適格細胞ベースの方法、電気穿孔法、バクテリオファージ媒介性形質導入、化学的および物理的形質転換技法が挙げられる（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本発明のリステリアワクチン株は電気穿孔によって形質転換される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２４４】
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合のための方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）および  Ａｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記述される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２４５】
「形質転換」という用語を「形質移入」いう用語と同じ意味で使用することができ、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために細菌細胞を改変することを指すことが理解されるであろう。「形質転換」という用語がプラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することを指すこともできることも理解されるであろう。
【０２４６】
一実施形態では、本発明では市販のプラスミドが使用される。かかるプラスミドは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）などの様々な供給元から入手可能であり、または当該技術分野で周知の方法を使用して構築することができる。本発明で有用なプラスミドおよび他の発現ベクターは、本明細書のいずれかに記述され、プロモーター／調節配列、グラム陰性およびグラム陽性細菌に対する複製の起点、融合タンパク質をコードする孤立核酸、および分離されたアミノ酸代謝遺伝子をコードする核酸などの特徴を含むことができる。さらに、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする孤立核酸は、かかる孤立核酸の発現を駆動するのに好適なプロモーターを有する。細菌系で発現を駆動するために有用であるプロモーターは当該技術分野で周知であり、またバクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを含む。原核生物プロモーターのさらなる実施例としては、５つのバクテリオファージλのメジャーライトおよびレフトプロモーター（ＰＬおよびＰＲ）と、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、およびｇａｌプロモーター、αアミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ、１９８５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２）およびＳ２８特異的な枯草菌のプロモーター（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４  Ｇｅｎｅ  ３２：１１−２０）と、桿菌のバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ、１９８２、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）と、ストレプトマイシンプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ、１９８６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８）と、が挙げられる。本発明で企図される追加的な原核生物のプロモーターは、例えば、Ｇｌｉｃｋ（１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２）、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ、（１９８６、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、６８：５０５−５１６）、およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ、（１９８４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２）で検討される。本発明で企図されるプロモーター／調節要素のさらなる実施例としては、リステリアのｐｒｆＡプロモーター、リステリアのｈｌｙプロモーター、リステリアのｐ６０プロモーター、およびリステリアのＡｃｔＡプロモーター（遺伝子銀行受入番号ＮＣ＿００３２１０）、またはその断片が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４７】
別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ法を使用して本発明の組み換え型タンパク質が合成される。一実施形態では、これは、ＤＮＡ配列を作り出すことと、特定のプロモーター／調節要素の制御下で本発明のプラスミドなどの発現カセット内にＤＮＡを定置することと、タンパク質を発現することと、に関与する。本発明の組み換え型タンパク質（例えば、非溶血性ＬＬＯ）をコードするＤＮＡは、別の実施形態では、任意の好適な方法によって調製され、この方法としては、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、またはＮａｒａｎｇらのホスホトリエステル法  （１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９）、Ｂｒｏｗｎらのホスホジエステル法  （１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：１０９−１５１）、Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエチルホスホラミダイト法  （１９８１、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１５  １８５９−１８６２）、および米国特許  第４，４５８，０６６号の固定法などの方法による直接化学合成が挙げられる。
【０２４８】
別の実施形態では、一本鎖のオリゴヌクレオチドを生産するために化学合成が使用される。様々な実施形態では、一本鎖をテンプレートとして使用して、相補的な配列を用いたハイブリダイゼーションによって、またはＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、この一本鎖のオリゴヌクレオチドを二本鎖のＤＮＡへと変換する。ＤＮＡの化学合成が約１００個の塩基の配列に限られ一方で、より短い配列の連結によってより長い配列を得ることができることを当業者は認識するであろう。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。
【０２４９】
別の実施形態では、本発明の組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用してクローニングされる。したがって、非溶血性ＬＬＯに対する遺伝子は、クローニングを容易にするために、好適な制限部位を含むセンスプライマーと、例えば、同一でない制限部位などの別の制限部位を含むアンチセンスプライマーとを使用して増幅されたＰＣＲである。
【０２５０】
別の実施形態では、融合タンパク質をコードする組み換え型遺伝子は、各々の宿主に対して適切な発現対照配列に動作可能にリンクする。プロモーター／調節配列は、本明細書のいずれかに詳細に記述される。別の実施形態では、プラスミドは、追加的なプロモーター調節要素、ならびにリボソーム結合部位および転写終結シグナルをさらに含む。真核生物細胞については、対照配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、等々に由来するプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニレーション配列を含む。別の実施形態では、配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
【０２５１】
一実施形態では、「動作可能にリンクする」という用語は並置を指し、そのように記述される構成成分はそれらの意図される様式で機能することができるような関係にある。コード配列に「動作可能にリンクする」対照配列は、コード配列の発現が対照配列に対応する条件の下で達成されるようなやり方で連結される。
【０２５２】
一実施形態では、本発明の組成物または組成物の混合物を投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明のワクチンを投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の免疫療法的な組成物を投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明のリステリアの弱毒化した組み換え型形態を投与する方法が本明細書に提供される。
【０２５３】
一実施形態では、本発明の方法および組成物によって引き出される免疫応答は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介性応答から構成される。    別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介性応答である。
【０２５４】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって引き出される免疫応答はＣＤ４＋  Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ４＋  Ｔ細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞媒介性応答である。
【０２５５】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって引き出される免疫応答は先天的な免疫応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主として先天的な免疫応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、先天的な免疫応答である。先天的な免疫応答の活性化は、Ｍ１マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞（ＤＣ）などのマクロファージの活性化に関与する場合があることを当業者は理解するであろう。
【０２５６】
別の実施形態では、本発明は、ガンまたは感染性疾患またはアレルギーの発生率を減少する方法を提供し、この方法は本発明の組成物を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ガンまたは感染性疾患またはアレルギーを軽快する方法を提供し、この方法は本発明の組成物を投与することを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２５７】
一実施形態では、本発明で使用するための組み換え型リステリア・モノサイトゲネスは異種ペプチドを分泌する。別の実施形態では、本発明で使用するための組み換え型リステリア・モノサイトゲネスは異種ペプチドを発現する。
【０２５８】
別の実施形態では、本発明で使用するための組み換え型リステリア・モノサイトゲネスは、本明細書に記述されるようにＰＥＳＴ含有ポリペプチド（例えば、非溶血性ＬＬＯ）を発現および分泌する。
【０２５９】
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンは、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンは、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンを有する人々を治療するために使用される。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンは、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプの腫瘍などのガンを有する人々の代替的な治療の前または後に使用される。別の実施形態では、かかる治療は、化学療法、外科手術、放射、およびこれに類するものを含む。かかる治療に続いて、本発明のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、本発明のワクチンは、それまでに定着した腫瘍の増殖に効果を持ち、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２６０】
本発明によって投与範囲の様々な実施形態が企図される。一実施形態では、ワクチンベクターの場合は、投与量は０．４ＬＤ５０／回の範囲である。別の実施形態では、投与量は約０．４〜４．９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．５〜０．５９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．６〜０．６９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．７〜０．７９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．８ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は０．４ＬＤ５０／回〜０．８のＬＤ５０／回である。
【０２６１】
別の実施形態では、投与量は細菌数１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数４×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数４×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１１個／回である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２６２】
「相同性」、「相同の」等々という用語は、本明細書に提供される任意のタンパク質またはペプチドに関するとき、一実施形態では、最大パーセントの相同性を達成するため、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮せずに、必要に応じて配列をアラインしギャップを導入した後の対応する未変性ポリペプチドの残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは当該技術分野で周知である。本発明の別の実施形態、方法、および組成物では、本発明の異種抗原またはＬＬＯ配列の相同体を利用する。
【０２６３】
別の実施形態では、「相同性」という用語は、いずれかの核酸配列を参照するとき、対応する未変性核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを同様に示す。
【０２６４】
別の実施形態では、「相同性」という用語は、本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする孤立核酸を指し、これは本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と少なくとも６５％の相同性を共有する。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも７５％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも８５％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９０％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９５％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９７％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９９％の相同性を本発明のシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドをコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、相同性の上記の範囲を、本明細書に提供されるシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドのアミノ酸配列のものを用いるシグナルペプチドまたは組み換え型ポリペプチドのアミノ酸配列間の共有に適用する。別の実施形態では、本明細書に提供されるＰＥＳＴ含有ポリペプチドは組み換え型ポリペプチドである。
【０２６５】
一実施形態では、当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対してコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合があり、これらは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどである。
【０２６６】
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が６０％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態では、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい。別の実施形態では、同一性は１００％である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２６７】
別の実施形態では、相同性は候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介して決定され、その方法は当該技術分野において適切に記述される（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙを参照のこと）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、未変性カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【０２６８】
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において適切に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、また例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。各々の相同性を決定する方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２６９】
別の実施形態では、本発明は、発明の方法を実施するうえで利用される試薬を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。
【０２７０】
「接触する」または「投与する」という用語は、本発明の組成物をガン細胞、被験者、腫瘍、または疾患の部位に直接接触することを包含することができることがよく理解されるであろう。別の実施形態では、この用語は、本発明の組成物をガン細胞、腫瘍、または疾患の部位に間接的に接触することを指す。別の実施形態では、本発明の方法は、これによって化合物が体内を循環する当該技術分野で既知の拡散または任意の他の能動輸送もしくは受動輸送プロセスによって、被験者に本発明の組成物を接触し、その後で組成物がガン細胞、腫瘍、または疾患の部位と接触する方法を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２７１】
別の実施形態では、「遺伝子」および「組み換え型遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。かかる自然の対立遺伝子変異は、典型的には所与の遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を生じる。数多くの異なる個体または生物体の中の対象となる遺伝子を配列決定することによって、代替的な対立遺伝子を同定することができる。これはハイブリダイゼーションプローブを使用して、様々な個体または生物体中の同一の遺伝子座を識別するために、容易に実行することができる。自然の対立遺伝子変異の結果であり、また機能活性を変更しない、ありとあらゆるかかるヌクレオチドの変種および結果として得られるアミノ酸多型もしくは変種が本発明の範囲内であることが意図される。
【０２７２】
別の実施形態では、非経口的に、癌近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内になどの当業者に既知の任意の方法によって、本発明の組成物を被験者に投与する。
【０２７３】
本明細書に提供される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、ゼラチンカプセルを含む。
【０２７４】
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的断片が組み換え型Ｌｍ株を含む組成物から別個に投与されるとき、抗体は、静脈内で、皮下で、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてもよい。一実施形態では、抗体を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。
【０２７６】
一実施形態では、「免疫原性組成物」という用語は本明細書に提供される組み換え型リステリア、ならびにアジュバントおよび抗体もしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せを包含する場合がある。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に提供されるアジュバントを含む。本明細書にさらに提供されるように、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
【０２７７】
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態が範囲の形式で提示される場合がある。範囲の形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、また本発明の範囲の融通の利かない制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記述はすべての可能性のある部分的範囲ならびにその範囲内の個別の数量的な値を具体的に開示されたものと考えるべきである。例えば、１〜６などのような範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、等々などの具体的に開示された小範囲、ならびにこの範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅広さに関わらず適用される。
【０２７８】
本明細書に数値的な範囲が示されるときはいつも、示される範囲内のあらゆる引用された数値（部分または全体）を含むことを意味する。第１に示す数と第２に示す数と「の間の範囲」という句、および第１に示す数「から」第２に示す数「までの範囲」という句は、本明細書で交換可能に使用され、また第１に示す数および第２に示す数ならびにそれらの間のすべての分割した数および整数を含むことを意味する。
【０２７９】
「治療する」という用語は疾患を治癒すること、疾患を防止する、疾患の発生率を減少すること、疾患の症状を軽快すること、疾患の寛解を誘発すること、疾患の進行を遅らせることを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、「減少する」、「抑制する」、および「阻害する」という用語は、より少なくすることまたは減らすことを指す。
【０２８０】
「治療的に有効な投与量」または「治療有効量」という用語は投与されるものに対して望ましい効果を生成する投与量を包含する場合があることを当業者はよく理解するであろう。正確な投与量は既知の技法を使用する当業者によって確認することができるであろう。
【０２８１】
「約」という用語は定量的な用語は、プラスもしくはマイナス５％、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を包含する場合があることを当業者はよく理解するであろう。
【０２８２】
「被験者」という用語は、症状もしくはその後遺症に対する療法を必要とする、または症状もしくはその後遺症に敏感なヒトを含む哺乳類を包含する場合があり、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウス、ならびにヒトを含んでもよいことを当業者はよく理解するであろう。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０２８３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【実施例】
【０２８４】
材料および実験方法（実施例１〜２）
＜実施例１＞
ＬＬＯ−抗原融合が抗腫瘍免疫性を誘発
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍をＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、米国メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）によって提供されたＴＣ−１は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６  および  Ｅ７で低いレベルを発現する腫瘍形成性の高い肺上皮細胞であり、またｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換される。ＴＣ−１を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬのＧ４１８、および１０％のナショナルコレクションタイプ培養液−１０９培地中で、３７°で、１０％のＣＯ２を用いて増殖させた。Ｃ３は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのマウスの胎芽細胞であり、ＨＰＶ  １６の完全なゲノムで不死化し、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換された。ＥＬ−４／Ｅ７は、Ｅ７を用いてレトロウイルスによって形質導入した胸腺腫ＥＬ−４である。
【０２８５】
Ｌ．モノサイトゲネス株および繁殖
使用されたリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソームの発現系内のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」、エピソーム発現系内のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」、染色体へと組込まれる単一コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）である。Ｅ７を、プライマー５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号：２４、ＸｈｏＩ部位は下線付き）および５’−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（配列番号：２５、ＳｐｅＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）へと連結させた。ｐＣＲ２．１をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによって消化してＥ７を切り離してｐＧＧ−５５へと連結した。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性の転写因子ｐｒｆＡをマルチコピーシャトルプラスミド（Ｗｉｒｔｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５：８３１，１９８６）であるｐＡＭ４０１へとクローニングし、ｐＧＧ−５５を生成する。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物（以下に「ΔＬＬＯ」と称される溶血性のＣ末端を欠いている）の最初の４４１  ＡＡの発現を駆動し、これはＸｈｏＩ部位によってＥ７遺伝子に連結され、ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生じ、これは転写されてＬＬＯ−Ｅ７として分泌される。リステリアのｐｒｆＡ陰性株、ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｈａｏ  Ｓｈｅｎによって提供された）のｐＧＧ−５５を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された（図１Ａ〜図１Ｂ）。ｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片は、プライマー５’−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号：２６、ＮｈｅＩ部位は下線付き）、および５’−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号：２７、ＸｈｏＩ部位は下線付き）を用いて作成した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（配列番号：２８、ＸｂａＩ部位は下線付き）、および５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号：２９、ＳａｌＩ部位は下線付き）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｌｍ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーターとＥ７の発現および分泌を駆動するシグナル配列とを含有する発現カセットを、ＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインへと導入することによって生成した。Ｅ７をプライマー５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号：３０、ＢａｍＨＩ部位は下線付き）および５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号：３１、ＸｂａＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲ増幅した。次いでＥ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターの中へと連結させた。ＬＭ株１０４０３Ｓを、ＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む、結果��して得られるプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７を用いて形質転換した。相同性ドメインは相同的組み換えによってＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。クローンをＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みについてスクリーニングした。細菌をブレインハートインフュージョン培地中で、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を用いて（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）、または用いないで（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）、増殖させた。細菌は、アリコートを−８０℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法によって発現を検証した（図２）。
【０２８６】
ウエスタンブロット法
リステリア株をルリア−ベルターニ培地内で３７℃にて増殖させ、６００ｎｍで測定された同一の光学濃度にて採取した。上清をＴＣＡ沈殿させ、０．１ＮのＮａＯＨで補充した１×サンプルバッファー中で再懸濁した。同一量の各々の細胞ペレットまたは各々のＴＣＡ沈殿させた上清を、４〜２０％のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）上に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに移し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）でプローブし、次いでＨＲＰ−共役抗マウス二次Ａｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）でインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ検出試薬で顕色し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を感光させた。
【０２８７】
腫瘍増殖の測定
１日おきにカリパスを表面の最短径および最長径にわたして腫瘍を測定した。これら２つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートル単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを犠牲にした。各々の時点に対する腫瘍の測定値は、生きているマウスに対してのみ示されている。
【０２８８】
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組み換え型の効果
生後６〜８週目のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）は２×１０５ＴＣ−１細胞を左脇腹の皮下に受けた。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径４〜５ｍｍの触知可能なサイズに達した。次いで８匹のマウスの群が、７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０腹腔内で、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）で処置された。
【０２８９】
５１Ｃｒリリースアッセイ
生後６〜８週間のＣ５７ＢＬ／６マウスは腹腔内に０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを免疫化した。免疫化の１０日後、脾臓を採取した。フィーダー細胞として照射されたＴＣ−１細胞（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）を用いて、脾細胞を培養液内に定着し、インビトロで５日間刺激し、次いで以下の標的化を使用して標準的な５１Ｃｒリリースアッセイ内で使用された。ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥＬ−４でパルスしたＥ７  Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（配列番号：３２）。３倍の回数実施したＥ：Ｔ細胞比は、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃にて４時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、５０μｌの上清を各々のウェルから取り出した。Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンター（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いてサンプルをアッセイした。パーセント特異的溶解は、［（実験的計数の一分当たりの計数（ｃｐｍ）−自然発生ｃｐｍ）／（合計ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）］×１００として決定された。
【０２９０】
ＴＣ−１特異的な増殖
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０．１  ＬＤ５０を用いて免疫化し、２０日後に１  ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを用いて腹腔内注射によってブーストした。ブースティングの６日後、免疫化マウスおよび無処置マウスから脾臓を採取した。脾細胞を５×１０５／ウェルで、平底９６−ウェルプレート内に、２．５×１０４、１．２５×１０４、６×１０３、または３×１０３の照射したＴＣ−１細胞／ウェルをＥ７  Ａｇ源として用いて、またはＴＣ−１細胞なし、もしくは１０μｇ／ｍＬのＣｏｎ  Ａ付きで、培養液内に定着した。４５時間後に０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはＴｏｍｔｅｃハーベスター９６（米国コネチカット州Ｏｒａｎｇｅ）を使用して１８時間後採取され、Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。ｃｐｍの変化は、実験的なｃｐｍ−Ａｇを含まないｃｐｍとして計算された。
【０２９１】
フローサイトメトリー解析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）で、０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７を用いて免疫化し、３０日後にブーストした。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ共役）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ共役）、およびＥ７  Ｈ−２Ｄｂ四量体のための３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、）とともに使用して実施した。ブーストの５日後に採取した脾細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（配列番号：３２）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂ四量体を用いて、室温（ｒｔ）にて染色した。四量体は１／２００に希釈して使用され、これらの四量体は、Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ  Ｒ．Ｐｅａｓｅ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、米国ミネソタ州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）およびＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈならびに標準試薬プログラムによって提供された。Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞は解析された。
【０２９２】
Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３日目、１０日目、および１７日目に、０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）を用いて８匹のマウスの群に免疫化し、８匹の動物は処置しないままにした。
【０２９３】
統計
腫瘍径の比較のために、各々の群に対する腫瘍サイズの平均およびが決定され、スチューデントのｔ−検定によって統計的有意性が決定された。ｐ≦０．０５は有意と考えられる。
結果
【０２９４】
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７がＴＣ−１増殖に影響を与える能力に関して比較された。皮下腫瘍がＣ５７ＢＬ／６マウスの左の脇腹に定着した。７日後、腫瘍は触知可能なサイズ（４〜５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に、０．１  ＬＤ５０Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としてのＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰをマウスにワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、定着したＴＣ−１腫瘍の７５％の完全な退行を誘発し、一方でこの群の中の他の２匹のマウスでは腫瘍増殖が制御された（図３）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇを用いた免疫化は、腫瘍退行を誘発しなかった。この実験は複数回繰返され、常にとても類似した結果であった。加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に対しては異なる免疫化プロトコルの下でも類似の結果が達成された。別の実験では、単一の免疫化がマウスの定着した５ｍｍのＴＣ−１腫瘍を治癒することができた。
【０２９５】
他の実験では、２つの他のＥ７を発現する腫瘍細胞株：Ｃ３およびＥＬ−４／Ｅ７で類似の結果が得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するために、腫瘍を除去した動物にＴＣ−１またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞をそれぞれ６０日目または４０日目に再チャレンジさせた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いて免疫化した動物は実験終了まで腫瘍がないままであった（ＴＣ−１の場合１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７に対しては５４日目）。
【０２９６】
したがってΔＬＬＯによる抗原の融合タンパク質としての発現は抗原の免疫原性を強化する。
＜実施例２＞
【０２９７】
ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７治療がＴＣ−１特異的な脾細胞増殖を引き出す
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を有するＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するために、Ｅ７特異的な増殖性の応答、抗原特異的な免疫能の測定が免疫化したマウスで測定された。脾細胞においてＥ７の供給源として照射したＴＣ−１細胞に曝露したとき、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化したマウスからの脾細胞を増殖した。ＴＣ−１比は２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１である（図４）。反対に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照免疫化マウスからの脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖しか示さない。
＜実施例３＞
【０２９８】
ＡｃｔＡ−Ｅ７およびＰＥＳＴ−Ｅ７融合が抗腫瘍免疫性を与える
材料および実験方法
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の構築
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、ａｃｔＡタンパク質の切断版に融合されるＥ７タンパク質を発現するプラスミドを含むＬＭの組み換え型株である。ｐＤＰ−２０２８を修正することによって構造化されたプラスミドベクターｐＤＤ−１をリステリアの中へと導入することによって、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を生成した。ｐＤＤ−１は、ＡｃｔＡ−Ｅ７の発現および分泌を駆動する３１０ｂｐのｈｌｙプロモーターおよびｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）のコピーを発現する発現カセットと、４つのＰＥＳＴ配列を含む１１７０ｂｐのＡｃｔＡ遺伝子（配列番号：１１）（分子の最初の３９０ＡＡから構成される切断ＡｃｔＡポリペプチド、配列番号：１０）と、３００ｂｐのＨＰＶ  Ｅ７遺伝子と、１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（病毒性遺伝子の対照発現）と、形質転換された細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール抵抗性遺伝子）（Ｓｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．，１３０：９２−９７）とを含む。
【０２９９】
ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片は、ｐＧＧ５５（実施例１）から以下の２つのプライマーを使用してＰＣＲ増幅される。５’−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（Ｘｂａ  Ｉ部位は下線付き、配列番号：３３）およびプライマー５’−ＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ−’３（ＮｏｔＩ部位は下線付き。最初の１８個のヌクレオチドはＡｃｔＡ遺伝子重複である、配列番号：３４）。ａｃｔＡ遺伝子は、ＬＭ  １０４０３Ｓ野生型ゲノムから、プライマー５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ−３’（ＮｏｔＩ部位は下線付き、配列番号：３５）およびプライマー５’−ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ−３’（ＸｈｏＩ部位は下線付き、配列番号：３６）を使用してＰＣＲ増幅された。Ｅ７遺伝子は、ｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ−Ｅ７）から、プライマー５’−ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ−３’（ＸｈｏＩ部位は下線付き、配列番号：３７）およびプライマー５’−ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（ＸｍａＩ部位は下線付き、配列番号：３８）を使用してＰＣＲ増幅される。ｐｒｆＡ遺伝子は、ＬＭ１０４０３Ｓ野生型ゲノムから、プライマー５’−ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（ＸｍａＩ部位は下線付き、配列番号：３９）およびプライマー５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（ＳａｌＩ部位は下線付き、配列番号：４０）を使用してＰＣＲ増幅された。ｈｌｙプロモーターａｃｔＡ遺伝子融合（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）は、精製したｐＨｌｙ  ＤＮＡおよび精製したａｃｔＡ  ＤＮＡから、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３３）および下流ａｃｔＡプライマー（配列番号：３６）を使用してＰＣＲ生成されて、ＰＣＲ増幅された。
【０３００】
ｐｒｆＡ遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）に融合されるＥ７遺伝子は、精製したＥ７ＤＮＡおよび精製したｐｒｆＡＤＮＡから、上流Ｅ７プライマー（配列番号：３７）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：４０）を使用したＰＣＲ解析を用いてもスクリーニングされた。
【０３０１】
Ｅ７−ｐｒｆＡ融合産物に融合したｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ融合産物は、精製し融合されたｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ  ＤＮＡ産物および精製し融合されたＥ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ産物から、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３３）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：４０）を使用してＰＣＲ生成およびＰＣＲ増幅され、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）へと連結される。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０’Ｆ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）はｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７で形質転換される。溶解および分離後、プラスミドは、ＢａｍＨＩ（予想される断片サイズは７７０ｂｐおよび６４００ｂｐ（またはインサートがベクターへと戻されるときは：２５００ｂｐおよび４１００ｂｐ））およびＢｓｔＸＩ（予想される断片サイズは２８００ｂｐおよび３９００ｂｐ）を使用して限定解析によってスクリーニングされ、また上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号：３３）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：４０）を使用してＰＣＲ解析によってスクリーニングした。
【０３０２】
ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡインサートはＸｂａ  ＩおよびＳａｌ  Ｉを用いた二重消化によってｐＣＲＩＩから切り離され、またこれもＸｂａ  Ｉ  および  Ｓａｌ  Ｉを用いて消化されたｐＤＰ−２０２８へと連結される。ＴＯＰ１０’Ｆコンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）を  発現系ｐＡｃｔＡＥ７を用いて形質転換した後、クロラムフェニコール耐性クローンを、上流ｐＨｌｙプライマー配列番号：３３）および下流ＰｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号：４０）を使用してＰＣＲ解析によってスクリーニングした。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンを、ブレインハートインフュージョン培地（クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍＬ（ミリリットル）入り、Ｄｉｆｃｏ、米国ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）中で増殖させ、細菌細胞からミディプレップＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用してｐＡｃｔＡＥ７を分離した。ペニシリン処置したリステリア（株ＸＦＬ−７）のｐｒｆＡ陰性株は発現系ｐＡｃｔＡＥ７を用いて形質転換され（Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２２０９−２２１８）に記述されるように）、クローンはプラスミドの保持のためにインビボで選択された。クローンをクロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍＬ）入りのブレインハートインフュージョン中で３７℃にて増殖させた。細菌をアリコートで−８０℃にて凍結した。
【０３０３】
抗原発現のイムノブロット検証
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７を分泌する（約６４ｋＤ）ことを検証するために、リステリア株をルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で３７℃にて増殖させた。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて１×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一の量の各々のＴＣＡ沈殿した上清を４％〜２０％のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に導入し、１：２５００抗Ｅ７モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）でプローブし、次いで１：５０００西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）でプローブした。ブロットはＡｍｅｒｓｈａｍ強化化学発光検出試薬を用いて発色させ、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝露した（図５Ａ）。
【０３０４】
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの構築（図６Ａ）
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがプロモーターおよびｈｌｙ遺伝子のＰＥＳＴ配列のみ、特にＬＬＯの最初の５０個のＡＡを含有すること以外はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を構築するために、ＳＯＥ（重複延長による遺伝子スプライシング）ＰＣＲ技法を使用して、ｈｌｙプロモーターおよびＰＥＳＴ領域を全長のＥ７遺伝子に融合した。Ｅ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片をＬＬＯの最初の４４１個のＡＡを含有するプラスミドｐＧＧ−５５から増幅し、従来のＰＣＲ技法によって一緒にスプライシングした。最終的なプラスミドｐＶＳ１６．５を作り出すために、ｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片およびｐｒｆＡ遺伝子を、インビトロでの選択のためのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１へとサブクローンし、得られたプラスミドを使用してＸＦＬ−７を形質転換した。
【０３０５】
Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがＰＥＳＴ配列を欠いていること以外は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である組み換え型リステリア株である。これは、ＰＥＳＴ含有領域（ｂｐ３３３−３８７）をｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを使用してエピソーム発現系を構築した以外は、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７について本質的に記載されたように作成された。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯなしでＥ７を分泌する組み換え型株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドは、ｈｌｙプロモーターの遺伝子断片、およびＥ７遺伝子に融合したシグナル配列を含有する。この構築体は、染色体の中へと組み込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを発現する本来のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されたＥ７抗原の形態を除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７と完全に同系である。
結果
【０３０６】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７対Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって誘発した抗腫瘍免疫性を比較するために、２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞をマウス内に皮下移植し、触知可能サイズ（おおよそ５ミリメートル［ｍｍ］）まで増殖させた。７日目および１４日目に、マウスをＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０８ＣＦＵ）（十字）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０８ＣＦＵ）（四角）、またはＬｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）（丸）いずれかの１つのＬＤ５０でマウスを腹腔内で免疫化した。２６日目までに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７でのすべての動物は腫瘍がなく、そのままであったが、一方ですべての無処置の動物（三角）およびＬｍ−Ｅ７で免疫化した動物は大きい腫瘍を成長させた（図５Ｂ）。したがって、ＡｃｔＡ−Ｅ７融合でのワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
【０３０７】
加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを、Ｅ７発現腫瘍の退行を生じさせるそれらの能力について比較した。皮下  ＴＣ−１腫瘍は４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に定着した。腫瘍が４〜５ｍｍに達した後、マウスを８匹のマウスの５つの群に分けた。各々の群を４つの組み換え型ＬＭワクチンのうちの１つで処置し、１つの群は未処置のまま放置した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ５／８および３／８の事例では定着した腫瘍の退行を誘発した。いずれの時点においても、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処置したマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的な差はなかった。しかしながら、ＰＥＳＴ配列、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを含まないＥ７を発現したワクチンは、１つを除いて全てのマウスで腫瘍退行を生じなかった（図６Ｂ、上のパネル）。これは２つの実験の代表であり、２８日目における平均腫瘍サイズの統計的に有意な差がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍とＬｍ−Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍との間で観察された（Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定；図６Ｂ、下のパネル）。加えて、四量体陽性脾細胞のパーセンテージの増大は、ＰＥＳＴ含有ワクチンをワクチン接種したマウスの脾臓における３つの実験にわたって再現性が見られた（図６Ｃ）。したがって、ＰＥＳＴ−Ｅ７融合を用いたワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。
＜実施例４＞
【０３０８】
ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列へのＥ７の融合はＥ７特異的な免疫性を強化し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を発生させる
材料および実験方法
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌ（マイクロリットル）の２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞に加えて４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を含む５００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下移植した（ｎ＝３）。マウスを７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内で免疫化し、脾臓および腫瘍を２８日目に採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で、２ミリリットル（ｍＬ）のＲＰ  １０培地を含有する試験管内で４℃にて一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子を用いてミンチし、２ｍｍのブロックへと切断し、３ｍＬの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ−１）とともに３７℃にて１時間インキュベートした。組織懸濁液を、ナイロンメッシュを通して濾過し、四量体およびＩＦＮ−γ染色のために、ＰＢＳ中の５％ウシ胎児血清＋０．０５％のＮａＮ３で洗浄した。
【０３０９】
脾細胞および腫瘍細胞を１０７細胞／ｍＬのブレフェルジンＡの存在下で、１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドを用いて５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４  Ｇ２）中で４℃にて１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、浸透させ、浸透キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して固定し、ＩＦＮ−γに対して染色した。５００，０００事象を２レーザーフローサイトメーター、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して獲得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を使用して分析した。活性化した（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
【０３１０】
四量体染色のために、Ｈ−２Ｄｂ四量体にフィコエリスリン（ＰＥ）共役Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号：３２）を負荷し、室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）共役ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−共役ＣＤ８bで４℃にて３０分間染色した。細胞を、脾臓および腫瘍内の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を比較して解析した。
結果
【０３１１】
抗原特異的免疫性を強化するＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の能力を解析するために、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかで免疫化し、あるいは未処置とした（無処置）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群からのマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または無処置マウスにおけるよりも、より高いパーセンテージのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）および四量体特異的なＣＤ８＋細胞（図７Ｂ）を含有した。
【０３１２】
別の実験では、腫瘍を持つマウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍の中のＥ７特異的なリンパ球のレベルを測定した。０．１のＬＤ５０の４つのワクチンを用いて、７日目および１４日目にマウスを処置した。腫瘍を２１日目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＥ７／Ｄｂ四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増大が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いてワクチン接種したマウスで見られた（図８Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図８Ｂ）。
【０３１３】
したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
【０３１４】
材料および実験方法（実施例５〜１０）
細菌株、形質転換、および選択
大腸菌株ＭＢ２１５９が、標準的なプロトコルを使用して、形質転換のために使用された。細菌細胞は、Ｈ２Ｏを用いた洗浄によって電気穿孔法のために準備された。
【０３１５】
大腸菌株ＭＢ２１５９（Ｓｔｒｙｃｈ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００１  Ｍａｒ  １５；１９６（２）：９３−８）は、Ｄ−アラニン・ラセマーゼを合成することができないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損突然変異体である。同様に、リステリア株Ｌｍ  ｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）は、ｄａｌ遺伝子およびｄａｔ遺伝子の部分的な欠失に起因してＤ−アラニン・ラセマーゼを合成することができない。
【０３１６】
プラスミド構築
公開されているｐｌｃＡ遺伝子の配列を使用して（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８９  ５７、３６９５−３７０１）、染色体ＤＮＡから遺伝子を増幅するためにＰＣＲが使用される。次いで、増幅された製品はＳａｌＩを生成したおよびＸｂａＩを生成したＤＮＡ端部を使用してｐＡＭ４０１へと連結され、ｐＤＰ１４６２を生成する。
【０３１７】
ｐｒｆＡを単独で含有するプラスミドｐＤＰ１５００は、ｐＤＰ１４６２から、ｐｌｃＡ遺伝子、塩基４２９〜１３４９（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）を除去することによって、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩを用いた制限、それらを鈍らせるためのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用したＤＮＡ端部の処置、および細胞内連結の後、構造化される。
【０３１８】
ｐｌｃＡプロモーターおよびｐｌｃＡの３’端部の一部を含有するプラスミドｐＤＰ１４９９は、ｐｌｃＡ内部断片、塩基４２８〜８８２（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８９  ５７，３６９５−３７０１）を、ＰｓｔＩおよびＮｓｉＩを用いた制限ならびに細胞内連結の後ｐＤＰ１３３９から除去することによって構造化された。    
【０３１９】
ｐＤＰ１５２６（ｐＫＳＶ７：：ΔｐｌｃＡ）は、ＢＡＭＨＩおよびＸｂａＩ、４６８ｂｐのｐｌｃＡの５’端部を含有するｐＡＭ４０１：：ｐｌｃＡからのＸｂａＩおよびＮｓｉＩで生成した断片（塩基８８２〜１３５１、Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）、および５０１ｂｐのｐｌｃＡの３’端部を含有するｐＡＭ４０１：：ｐｌｃＡ  ｐｒｆＡからのＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで生成した断片（塩基７７〜４２９、Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）で制限されたｐＫＳＶ７の単一の３部分からなる連結によって構造化された。
【０３２０】
ｐｒｆＡプロモーター、塩基１〜４２９（Ｍｅｎｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．、同上）は、ｐＤＰ１４６２のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ二重消化によって分離され、またこれに続いて断片はＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで制限されたｐＫＳＶ７へと連結され、ｐＤＰ１４９８を生成した。２つのランダムにＨｉｎｄＩＩＩで生成した長さがおよそ３ｋｂである１０４０３Ｓ染色体ＤＮＡ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩで制限されたｐＫＳＶ７へと連結され、ランダム組み込み対照プラスミドｐＤＰ１５１９およびｐＤＰ１５２１を生成した。
【０３２１】
Ｌ．モノサイトゲネス突然変異体株の構築  
Ｌ．モノサイトゲネス株ＤＰ−Ｌ１３８７は、構造化されたＳＬＣＣ  ５７６４のＴｎ９１７−ＬＴＶ３バンクから、減少したレシチナーゼ（ＰＣ−ＰＬＣ）を用いて突然変異体として分離された（前述されているように（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０，１７２，３７３８−３７４４））。Ｔｎ９１７−ＬＴＶ３挿入の部位はトランスポゾン染色体ＤＮＡ結合をシークエンシングすることによって決定される（前述されているように（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９０  ５８，３７７０−３７７８））。Ｌ．モノサイトゲネスはプラスミドＤＮＡを用いて形質転換される（前述されているように（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、同上））。Ｌ．モノサイトゲネス内のｐＡＭ４０１、ｐＫＳＶ７、およびこれらの誘導体の維持のための選択的な圧力が、培地１ｍＬ当たり１０μｇのクロラムフェニコールの存在下でかけられた。加えて、ｐＫＳＶ７誘導体の維持は、３０℃（グラム陽性細菌内でのプラスミド複製のために許容できる温度）における増殖を必要とした。    
【０３２２】
Ｌ．モノサイトゲネス染色体の中へのｐＫＳＶ７誘導体の組み込みは、プラスミド上のＬ．モノサイトゲネスＤＮＡ配列とこれらの対応する染色体の対立遺伝子との間の相同的組み換えによってによって生じた。組込突然変異体は、培地１ｍＬあたり１０μｇのクロラムフェニコールを含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）培地中で４０℃（ｐＫＳＶ７の複製を許容しない温度）にておよそ３０世代の間増殖することによって富化された。これに続いて各々の組込み株を、培地１ｍＬあたり１０μｇのクロラムフェニコールを含有するＢＨＩ寒天培養基上でコロニー精製し、４０℃にてインキュベートした。各々の組込み株から分離された染色体ＤＮＡのサザンブロット解析は組込まれたプラスミドの存在を確認した。
【０３２３】
ＤＰ−Ｌ１５５２の構築は、上述のように、部分二倍体中間体を生成するためのｐＫＳＶ７誘導体ｐＤＰ１５２６の組込みによって達成された。組込まれたプラスミドの細胞内の相同的組み換えを通した自然発生的な切り離しが低い頻度で生じる。プラスミドが染色体から切り離された細菌を、ＢＨＩ培地中で３０℃におけるおよそ５０世代の間の増殖によって濃縮した。この工程の間の選択圧の特性は、未知であるが、組込まれている温度感応性プラスミドを含有する株のわずかな増殖欠陥に起因しているかもしれない。切り離し事象、すなわち３’の欠失の配列の間の相同的組み換えから結果として得られもののおよそ５０％は、結果として染色体上の野生型対立遺伝子に対するΔｐｌｃＡの対立遺伝子の交換を生じる。
【０３２４】
切り離されたプラスミドは細菌をＢＨＩ中で４０℃にておよそ３０世代増殖することによって回復される。染色体上にΔｐｌｃＡ対立遺伝子を保持するプラスミドから回復した細菌は、ＢＨＩ寒天培養基／２．５％の卵黄／２．５％のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＢＨＩ／卵黄寒天培養基）の５ｍＬの覆いを含有するＢＨＩ寒天培養基プレート上で増殖した後、コロニーを包囲する濁ったゾーンを生成できないことによって識別される。濁りゾーンは、卵黄中のＰＩのＰＩ−ＰＬＣ加水分解の結果から生じ、不溶性のジアシルグリセロールの沈殿が得られる。Ｌ．モノサイトゲネス染色体上の正しいｐｌｃＡ欠失は、ＰＣＲおよび欠失にわたる配列決定を使用して欠失した対立遺伝子を増幅することによって確認される。
【０３２５】
したがって、ＰＩ−ＰＬＣ陰性突然変異体（ｐｌｃＡ欠失突然変異体）は、本発明により弱毒化Ｌ．モノサイトゲネスワクチンを生成するために使用される場合がある。他の突然変異体、すなわち、ａｃｔＡ欠失突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、およびｐｌｃＡとｐｌｃＢとの両方を欠いている二重変異体が同じ方法を使用して作成され、これらのすべては、弱毒化Ｌ．モノサイトゲネスワクチンを生成するためにも本開示により使用されてもよい。本開示が与えられると、当業者は上述のものに加えて他の弱毒化突然変異体を作り出すことができることになる。
【０３２６】
Ｌｍｄｄの構築
ｄａｌ遺伝子は、染色体遺伝子と温度感受性シャトルプラスミドｐＫＳＶ７（Ｓｍｉｔｈ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９２  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；７４（７−８）：７０５−１１）との間の二重対立遺伝子交換によって当初不活性化され、これはエリスロマイシン耐性遺伝子を、本来の８５０ｂｐのｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の５′端部からの４５０ｂｐの断片とｄａｌ遺伝子ＰＣＲ産物の３′端部からの４５０ｂｐの断片との間で搬送する。これに続いて、遺伝子の８２％をカバーするｄａｌ欠失突然変異体は、相同性領域を望ましい欠失を包囲する無傷の遺伝子（遺伝子の上流および下流の配列を含む）の５′および３′端部から搬送するｐＫＳＶ７を用いた類似の交換反応によって構造化された。ＰＣＲ解析は、この染色体の欠失の構造を確認するために使用される。
【０３２７】
染色体のｄａｔ遺伝子は、類似の対立遺伝子交換反応によって不活性化される。ｐＫＳＶ７は、無傷のｄａｔ遺伝子の５′および３′の両方の端部からＰＣＲに由来する４５０ｂｐの断片を搬送するように修正される（配列の上流および下流の遺伝子を含む）。これらの２つの断片は適切なＰＣＲによって連結される。この構築体の染色体の中への交換は、結果としてＰＣＲ解析によって確認されたｄａｔ遺伝子の中心塩基の３０％の欠失をもたらす。
【０３２８】
細菌培養およびリステリアのインビボ継代
大腸菌は以下の標準的な方法で培養された。リステリアをＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ、米国ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）＋５０mｇ／ｍＬのストレプトマイシンの中で２５０ｒｐｍのシェーキングで３７℃にて増殖させ、対数増殖フェーズの間に採取した。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７については、３７mｇ／ｍＬのクロラムフェニコールが培地に追加された。増殖速度論の決定のために、細菌を１０ｍＬのＬＢ＋抗生剤中で１６時間の間増殖させた。ＯＤ６００ｎｍが測定され、培養液密度が株の間で標準化された。培養液はＬＢ＋の好適な抗生物質および適用可能な場合はＤ−アラニン中へ１：５０に希釈された。
【０３２９】
マウス中でのＬＭの継代
１×１０８ＣＦＵを腹腔内（ｉ．ｐ．）で  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの中へと注射した。３日目に脾臓を分離し、ＰＢＳ中で均質化した。脾臓懸濁液のアリコートをＬＢプレート上に適用可能な抗生物質と共にプレーティングした。いくつかのコロニーが拡張し、混合して注射ストックを定着した。
【０３３０】
抗生物質抵抗性因子を有しないプラスミドｐＴＶ３の構築
ｐ６０−ｄａｌカセットの構築．抗生物質抵抗性遺伝子を有しないベクターの構築での第１の工程は、切断ｐ６０プロモーターの融合のｄａｌ遺伝子への構築である。ＬＭアラニン・ラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子（フォワードプライマー：５’−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ−３’、配列番号：４１）（リバースプライマー：５’−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＧ−３’、配列番号：４２）および最小ｐ６０プロモーター配列（フォワードプライマー：５’−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＴＡＧ  ＴＣＣ−３’、配列番号：４３）（リバースプライマー：５’−ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３’、配列番号：４４）がＬＭ株１０４０３ＳのゲノムからのＰＣＲ増幅によって分離された。プライマーは、重なった延長部の接合（ＳＯＥ）−ＰＣＲによるｐ６０およびｄａｌのこれに続く融合のために、ｐ６０配列の上流ＰａｃＩ部位と、ｄａｌ配列の下流のＮｈｅＩ部位（制限部位を太字で示す）と、ｐ６０プロモーターの下流の重なっているｄａｌ配列（最初の１８ｂｐ）とを導入した。切断ｐ６０プロモーターの配列は以下のとおりである。ＣＡＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣ（配列番号：４５）（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７３：４６６８−７４，１９９１）。ＳＯＥ−ＰＣＲを使用して、ｐ６０およびｄａｌ  ＰＣＲ産物はクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）へと融合およびクローニングされる。
【０３３１】
抗生物質抵抗性遺伝子のｐＧＧ５５からの除去。これに続くｐＧＧ５５からクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を除去するためおよびｐ６０−ｄａｌカセットを導入するためのクローニング戦略は、グラム陽性複製領域（ｏｒｉＲｅｐ；  Ｂｒａｎｔｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １８：４７８３−４７９０，１９９０）の間欠的な除去ももたらす。グラム陽性ｏｒｉＲｅｐを再導入するために、配列（ＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＣＴＡＧＴＡＧ、配列番号：４６）の上流にＮａｒＩ／ＥｈｅＩ部位を追加する５’プライマー、および配列（ＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ、配列番号：４７）の下流にＮｈｅＩ部位を追加した３’−プライマーを使用してｐＧＧ５５からｏｒｉＲｅｐをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物はクローニングベクターｐＣＲ２．１の中へとクローニングされ、配列が検証された。
【０３３２】
ｐ６０−ｄａｌ配列をｐＧＧ５５ベクターの中へと組込むために、ｐ６０−ｄａｌ発現カセットはＰａｃＩ／ＮｈｅＩ二重消化によってｐＣＲ−ｐ６０ｄａｌから切り離された。ｐＧＧ５５内のグラム陽性細菌に対する複製領域は、ｐＣＲ−ｏｒｉＲｅｐからＰＣＲ（プライマー１、５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧ−３’、配列番号：４８）；（プライマー２、５’−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’、配列番号：４９）によって増幅され、ＥｈｅＩおよびＮｈｅＩに対して追加的な制限部位を導入する。ＰＣＲ産物はｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）へと連結され、配列は検証された。複製領域はＥｈｅＩ／ＮｈｅＩ消化によって切り離され、ベクターｐＧＧ５５はＥｈｅＩおよびＮｈｅＩで二重消化され、両方のＣＡＴ遺伝子をプラスミドから同時に除去する。２つのインサート、ｐ６０−ｄａｌおよびｏｒｉＲｅｐ、ならびにｐＧＧ５５断片は一緒に連結され、ｐＴＶ３を産する（図９）。ｐＴＶ３はｐｒｆＡ（病原性調節因子Ａ）遺伝子も含有する。この遺伝子はｐＴＶ３の機能のためには必要ないが、追加的な選択されたマーカーが必要かまたは望ましい状況では使用することができる。
【０３３３】
リアルタイムＰＣＲのためのＤＮＡの準備
総リステリアＤＮＡはＭａｓｔｅｒｐｕｒｅ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して準備された。リステリアは２４時間の間３７℃にて培養されてから、２５ｍＬのルリア−ベルターニ培地（ＬＢ）中で２５０ｒｐｍで振盪された。細菌細胞は遠心分離によってペレット化され、５ｍｇ／ｍＬのリゾチームで補足されたＰＢＳ中で再懸濁されてから、３７℃にて２０分の間インキュベートされ、その後ＤＮＡが分離された。
【０３３４】
リアルタイムＰＣＲに対する標準的な標的ＤＮＡを得るために、ＬＬＯ−Ｅ７遺伝子はｐＧＧ５５（５’−ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号：５０）、５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧ  ＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：５１））からＰＣＲ増幅され、ベクターｐＥＴｂｌｕｅ１（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）へとクローニングされる。同様に、ｐｌｃＡアンプリコンはｐＣＲ２．１へとクローニングされる。大腸菌はｐＥＴ−ＬＬＯＥ７およびｐＣＲ−ｐｌｃＡでそれぞれ形質転換されてから、精製されたプラスミドＤＮＡはリアルタイムＰＣＲで使用するために準備された。
【０３３５】
リアルタイムＰＣＲ
Ｔａｑｍａｎプライマープローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）は、プラスミド標的としてＥ７を用いてＡＢＩ  ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するように設計され、以下のプライマー、５’−ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号：５２）；５’−ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号：５３）；５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＧＴＡ  ＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号：５４）およびワンコピー遺伝子ｐｌｃＡ（ＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧ−３’（配列番号：５５）、５’−ＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：５６）；５’−ＴＥＴ−ＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＡ  ＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’；配列番号：５７）を、リステリアゲノム標的化として使用する。
【０３３６】
０．４mＭのプライマーおよび０．０５ｍＭのプローブを、製造業者による推奨に従ってＰｕＲＥ  Ｔａｑ  ＲＴＧ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）と混合した。各々の標的に対して精製したプラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ−ＬＬＯＥ７、およびｐＣＲ−ｐｌｃＡ（内部標準）を用いて標準曲線が準備され、既知のサンプルにおいて遺伝子コピー番号を計算するために使用された。Ｅ７コピー／ｐｌｃＡコピーの平均比は、標準曲線に基づいて計算され、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７に対する結果をＬｍ−Ｅ７（ゲノムの中へと組込まれたＥ７遺伝子のシングルコピーを有するリステリア株）からの結果で割ることによって較正された。すべてのサンプルを各々のｑＰＣＲアッセイ中で３回実行し、これは３回繰り返された。サンプル間の変化を、ＫｙＰｌｏｔソフトウェアを使用するＴｗｏ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって解析した。ｐ＜０．０５の場合、結果は統計的に有意であると見なされた。
【０３３７】
増殖の測定
細菌を３７℃にて、２５０ｒｐｍのシェーキングで、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地＋／−１００マイクログラム（mｇ）／ｍＬのＤ−アラニンおよび／または３７mｇ／ｍＬのクロラムフェニコール中で増殖させた。開始種材料はＯＤ６００ｎｍの測定値に基づいて、すべての株に対して同じとなるように調節された。
【０３３８】
溶血性溶解アッセイ
４×１０９ＣＦＵのリステリアが解凍され、遠心分離（１分間、１４０００ｒｐｍ）によってペレット化され、１Ｍのシスチンを有する１００mＬのＰＢＳ（ｐＨ５．５）中で再懸濁された。細菌は、１：２で段階希釈され、分泌されたＬＬＯを活性化するために３７℃にて４５分間インキュベートされた。線維素を取り除いたヒツジ全血（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｈｏｒｎｂｙ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を５倍量のＰＢＳで２回洗浄し、上清が透明のままになるまで６倍量のＰＢＳ−システインで３〜４回洗浄し、洗浄工程の間に３０００×ｇで８分間細胞をペレット化し、次いで１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるようにＰＢＳ−システイン中で再懸濁した。１００mｌの１０％洗浄血液細胞を１００mｌのリステリア懸濁液と混合し、さらに３７℃にて４５分間インキュベートした。次いで溶解していない血液細胞を遠心分離（１０分間、１０００×ｇ）によってペレット化した。１００mｌの上清を新しいプレートの中へと移し、ＯＤ５３０ｎｍが決定され、サンプル希釈に対してプロットされた。
【０３３９】
Ｌｍｄｄ−Ｔｖ３の治療的有効性  
１０５ＴＣ−１（ＡＴＣＣ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８）の皮下に移植し、約７日間増殖させ、その後腫瘍は触知可能になった。ＴＣ−１は、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７で不死化したＣ５７ＢＬ／６上皮細胞株であり、また皮下移植すると腫瘍を形成する活性化したｒａｓを用いて形質転換されている。マウスは、腫瘍細胞の移植後７日目および１４日目に０．１ＬＤ５０の適切なリステリア株で免疫化されている。非免疫化対照群（無処置）も含まれた。腫瘍増殖は電子カリパスを用いて測定された。
【０３４０】
ＡｃｔＡ欠失突然変異体の発生
Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、病毒性因子、ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化された。ａｃｔＡのＬｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンド内でのインフレーム欠失は、下流遺伝子発現上のあらゆる極性効果を避けるように構造化された。Ｌｍｄａｌ  ｄａｔDａｃｔＡは、ＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によるＮ末端における最初の１９アミノ酸およびＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。染色体スポットの中への遺伝子の欠失が、ａｃｔＡ欠失領域の外部をアニーリングするプライマーを使用して検証された。これらは、図１２に示すように、プライマー３（Ａｄｖ  ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ）（配列番号：５８）および４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ）（配列番号：５９）である。ＰＣＲ解析をＬｍｄｄおよびＬｍ−ｄｄDＡｃｔＡから分離された染色体ＤＮＡ上で実施した。Ｌｍ−ｄｄ染色体のＤＮＡ内のプライマー対１、２および３、４の２つの異なるセットで増幅した後のＤＮＡ断片のサイズは、３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂとなると予想された。しかしながら、Ｌｍ−ｄｄDａｃｔＡについては、プライマーの対１、２および３、４を使用するＰＣＲの予想されるサイズは、１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂである。したがって、図１２のＰＣＲ解析はａｃｔＡの１．８ｋｂ領域は株、Ｌｍ−ｄｄDａｃｔＡ内では除去されていることを確認する。ＤＮＡ配列決定を、株、Ｌｍ−ｄｄDａｃｔＡ（図１３、配列番号：６０）内の領域を含有するａｃｔＡの欠失を確認するためにＰＣＲ産物上でも実施した。
【０３４１】
【化３】
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【０３４２】
炎症性サイトカインの生産：
ＲＡＷ  ２６４．７などのマクロファージは、ＬｍｐｒｆＡ−（ｐＧＧ５５）、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡΔｉｎｌＣ、およびＬｍｄａｌ  ｄａｔΔｉｎｌＣなどの異なるリステリアバックボーンに感染し、様々なサイトカインのレベルを定量するために異なるＥＬＩＳＡベースのキットを使用して上清を異なる時点で採取した。定量化されたサイトカインとしてはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６が挙げられる。
【０３４３】
インビボでのサイトカインの生産：
インビボでのサイトカイン生産および好中球の採用を測定するために、異なる１０８ＣＦＵのＬｍｐｒｆＡ−（ｐＧＧ５５）、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ、Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡΔｉｎｌＣ、およびＬｍｄａｌ  ｄａｔ  ΔｉｎｌＣ、リステリア対照、または等価な体積の生理食塩水をＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内に注射した。１２時間後、マウスを屠殺し、２ｍＬのＰＢＳで腹膜腔を洗浄した。プレーティングした後増殖培地上で腹膜洗浄を細菌の負荷について調べ、ＭＩＰ−１a、ＫＣ、ＭＣＰ等々などの炎症誘発性のサイトカインの解析を行った。フローサイトメトリーを使用して、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、およびＦ４／８０などのマーカーを用いて染色した後に好中球およびマクロファージの数を決定し、さらにＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してこれらの集団を定量化した。
【０３４４】
トランスウェル遊走アッセイ：
ｉｎｌＣ欠失株を用いたマクロファージまたは樹状細胞に由来する骨髄の感染に続く好中球の遊走の増加があるかどうかを決定するためにこのアッセイを行った。骨髄に由来するマクロファージまたは樹状細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６などのマウスから分離され、これらはｉｎｌＣ欠失突然変異体または対照リステリアに感染した。Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒトランスウェルプレートを使用して、感染した細胞を使用してトランスウェルアッセイを設定した。アッセイは、当初３、５、または８マイクロメートルポアトランスウェルプレートを使用して標準化された。好中球の遊走を試験するためには、プレートの底部に感染したＡＰＣをプレーティングし、チャンバー内のウェルの上部に好中球をプレーティングした。異なる時点で、底部に遊走した好中球の数を決定するために細胞を計数した。
【０３４５】
Ｌｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡΔｉｎｌＣ突然変異体の治療的有効性：
概念の証拠として、ｉｎｌＣ突然変異体の治療的な有効性を決定するために、ヒトの前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）を腫瘍抗原として使用した。バックボーンＬｍｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ  ｉｎｌＣは、プラスミド、ｐＡｄｖ１４２を用いて形質転換され、これはヒトＰＳＡに対する発現カセットを含有し、結果としてＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２が得られる。株ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２は、融合タンパク質、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現および分泌のために特徴付けられる。さらに、株ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２はマウスの中でインビボで２回継代されたが、インビボで２回の継代の後に得られたコロニーを融合タンパク質、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現および分泌について調べた。ワクチンの通常在庫は第２のインビボ継代の後で得られたコロニーから準備されたが、これは治療的な効果および免疫原性の評価のために使用された。
【０３４６】
腫瘍微小環境への影響：
ＬｍｄｄＡ、ＬｍｄｄＡΔａｃｔＡ、ＬｍｄｄＡΔＰｌｃＡ、ＬｍｄｄＡΔＰｌｃＢ、ＬｍｄｄＡΔｐｒｆＡ、ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２、ＬｍｄｄＡ１４２、および他の対照株が腫瘍微小環境内で免疫細胞の浸潤を生じる能力が決定された。この研究では、マウスに１×１０６ＴＰＳＡ２３腫瘍細胞を０日目に接種し、７日目、１４日目、および２１日目に１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２、ＬｍｄｄＡ１４２、および他の対照株をワクチン接種した。２８日目に腫瘍を採取して、Ｇｒ−１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＮＫ１．１、およびＣＤ６２Ｌなどの異なる細胞表面マーカーを用いてさらに染色のために処置した。これらのマーカーを使用して、調べられる異なる細胞集団としては、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）、好中球（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋）、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｆｏｘｐ３＋）およびエフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋  ＣＤ３＋  ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）が挙げられる。さらにエフェクターＴ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−a、およびＩＬ−２などのエフェクターサイトカインを生産するそれらの機能的な能力のために特徴付けられる。腫瘍内の調節性Ｔ細胞およびＭＤＳＣは、Ｔ細胞増殖の抑制を生じるそれらの能力を試験された。
結果
＜実施例５＞
【０３４７】
アミノ酸代謝酵素を含有するプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、大腸菌およびＬＭ内に、インビトロおよびインビボの両方で保持される
Ｄ−アラニン・ラセマーゼに基づく栄養要求性相補系が、抗生物質耐性遺伝子を使用せずにＬＭ中へのプラスミド保持を媒介するために利用された。大腸菌株ＭＢ２１５９は、Ｄ−アラニン・ラセマーゼを合成することができないａｌｒ（−）／ｄａｄＸ（−）欠損突然変異体である。同様に、リステリア株Ｌｍ  ｄａｌ（−）／ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）は、ｄａｌ遺伝子およびｄａｔ遺伝子の部分的な欠失に起因してＤ−アラニン・ラセマーゼを合成することができない。大腸菌−リステリアシャトルベクターｐＡＭ４０１に基づくプラスミドｐＧＧ５５を、ｐＴＶ３を生成するためのリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、両方のＣＡＴ遺伝子を除去し、かつこれらをｐ６０−ｄａｌ発現カセットで置き換えることによって修正した（図９）。いくつかのコロニーからＤＮＡを精製した。
＜実施例６＞
【０３４８】
代謝酵素を含有するプラスミドは細菌の病毒性を増加しない
病毒性はＬＬＯ機能に関連しているので、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３とＬｍ−ＬＬＯＥ７との間の溶血性溶解活性が比較される。このアッセイは赤血球の溶解によってＬＬＯ機能を試験したが、これは培養上清、精製したＬＬＯ、または細菌細胞を用いて実施することができる。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７より高い溶血性溶解活性を示した。
【０３４９】
インビボでの病毒性はＬＤ５０値を決定することによっても測定され、これはより直接的で、したがってより正確な病毒性の測定手段である。Ｌｍｄｄ−ＴＶ３のＬＤ５０（０．７５×１０９）は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７のもの（１×１０９）に大変近く、これは代謝酵素を含有するプラスミドが細菌の病毒性を増加しないことを示す。
＜実施例７＞
【０３５０】
代謝酵素を含有するプラスミドによる抗腫瘍免疫性の誘導
代謝酵素含有プラスミドのガンワクチンとしての有効性は腫瘍退行モデルで決定された。ＴＣ−１細胞株モデルが使用され、これはＨＰＶワクチン発生のためにうまく特徴付けられ、かつこれはＬｍｄｄ−ＴＶ３またはＬｍ−ＬＬＯＥ７で免疫化した後の類似サイズの定着した腫瘍退行の制御された比較を可能にする。２つの別個の実験では、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３およびＬｍ−ＬＬＯＥ７を用いたマウスの免疫化は、結果として類似の腫瘍退行（図１４）をもたらし、ワクチン接種した群の間には統計的に有意な差異はない（ｐ＜０．０５）。すべての免疫化マウスは、６３日後でも生きていたが、非免疫化マウスはその腫瘍の直径が２０ｍｍに達したときに犠牲にしなければならなかった。回復したマウスは実験終了時まで腫瘍を有しないままであった。
【０３５１】
したがって、代謝酵素含有プラスミドは治療的なガンワクチンとして有効である。治療的なガンワクチンに対して要求される免疫応答は、予防的なガンワクチンに対して要求される免疫応答より強いので、これらの結果は予防的なガンワクチンに対する有用性も実証する。
＜実施例８＞
【０３５２】
ｉｎｌＣ欠失突然変異体はケモカインおよびサイトカインの著しく高いレベルを生成する。
ｉｎｌＣ欠失突然変異体は、著しく高いレベルのケモカイン（ＭＩＰ−１a、ＫＣ（ＩＬ−８のマウスホモログ）、ＭＣＰなどの）を生成し、結果として感染部位に対する好中球および白血球の浸潤が得られる。したがって、異なるリステリア株が腹腔内に投与されたとき、ｉｎｌＣ突然変異体はこれらのサイトカインおよびケモカインの産生の増加を実証し、これは、注射の１２時間後に得られた腹水中の好中球およびマクロファージを引き付ける。さらに、ｉｎｌＣ欠失突然変異体は対照株と比較したときに著しく高いレベルの炎症性サイトカインを生成した。
＜実施例９＞
【０３５３】
ｉｎｌＣ欠失突然変異体は好中球の遊走を誘発する
ｉｎｌＣ欠失突然変異体に感染したマクロファージは、他の対照株と比較したとき、異なる時点で好中球の遊走の著しい増加を示す。この実験の結果は、感染の間にこの株の好中球などの免疫細胞を引き付ける能力を強く支持する。
＜実施例１０＞
【０３５４】
ｉｎｌＣ欠失突然変異体は治療的な抗腫瘍応答に影響を与える
ＬｍｄｄＡ１４２とＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２との両方を使用した抗腫瘍研究の結果は、相互に大変同等であり、また腫瘍の治療的な退行が観察された。さらに、それの先天的な応答および炎症誘発性のサイトカインの分泌の増加を生成する能力のレベルが高いので、ＬｍｄｄＡｉｎｌＣ１４２の２回の投与量は株ＬｍｄｄＡ１４２の３回の投与と同等である。
【０３５５】
材料および方法（実施例１１〜１６）
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）によって合成され、またＤＮＡ配列決定はＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ（米国ニュージャージー州Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ）によって行われた。フローサイトメトリー試薬はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての試薬は、示されない限りＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓｅ）から入手した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ州Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ）によって合成された。完全なＲＰＭＩ  １６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。多クローン性の抗ＬＬＯ抗体が前述されており、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
【０３５６】
マウスおよび細胞株
すべての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａまたはＲｕｔｇｅｒｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいてＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコルに従って実施した。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼育された。ＮＴ−２腫瘍細胞株は高いレベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述したように増殖した。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから得られ、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、米国ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、また完全なＣ−ＲＰＭＩ培地中で増殖した。生物発光の作業は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）のＳｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＡＩＦ）によるガイダンスに従って実行された。
【０３５７】
リステリア構築体および抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、親切にもＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＭａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ博士によって供与され、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）へとクローニングされた全長のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、ＰＣＲによってｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表２に示されるオリゴを使用して、ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つの区分、すなわちＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとして使用された。
（表２：ヒトＨｅｒ−２−キメラのクローニングのためのプライマー）
【表２】
2017511796.tif 000012
【０３５８】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築体はＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法およびテンプレートとしての各々の別個のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕ区分による直接融合によって生成された。プライマーを表３に示す。
（表３：異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列）
【表３】
2017511796.tif 000013
【０３５９】
異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列。
【０３６０】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り離され、Ｌｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４で、ＬＬＯの切断非溶血性断片を用いてインフレームでクローニングされた。インサート、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロモーターの配列はＤＮＡ配列決定解析によって確認された。このプラスミドは電子コンピテントＡｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、ＬｍｄｄＡへと電気穿孔され、ストレプトマイシン（２５０mｇ／ｍＬ）を含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天培養基プレート上で陽性クローンが選択された。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似のリステリア株が比較の目的で使用された。これらは前述した。すべての研究で、無関連リステリア構築体（Ｌｍ対照）が、免疫系でリステリアのの抗原と無関係な効果を説明するために含まれる。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４と同一のリステリアプラットフォームに基づくが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現および分泌が試験された。各々の構築体はインビボで２回継代された。
【０３６１】
細胞毒性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群が、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２  ＩＣＩ、またはＬｍ対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。ＮＴ−２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイトマイシンＣ（血清を含まないＣ−ＲＰＭＩ媒体中２５０mｇ／ｍＬ）で３７℃にて４５分間処置した。５回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した脾細胞を用いて１：５の比（刺激薬：レスポンダー）で  ５日間、３７℃にて、５％ＣＯ２で共インキュベートした。標的として３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞のラベルが付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを実施した。４時間のインキュベーションの後、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ２）を５９０ｎｍにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが（実験群での溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）として定義された。
【０３６２】
免疫化マウスからの脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの群が、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週間後、ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞が分離され、５×１０６細胞／ウェルにて２４ウェルプレートでマイトマイシンＣで処置したＮＴ−２細胞の存在下でＣ−ＲＰＭＩ培地中で共培養された。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞は、１mＭのＨＬＡ−Ａ２特異的なペプチドまたは１mｇ／ｍＬの組み換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タンパク質（大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された）の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが２４時間または７２時間後に得られ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して試験した。
【０３６３】
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究
生後６週間のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４／群）に５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、またはＬｍ対照を６回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に２回観察し、これらは最高５２週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が１ｃｍ２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ内で−２０℃にて保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質内の突然変異の効果を決定するために、ゲノムＤＮＡ分離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。
【０３６４】
脾臓および腫瘍内の調節性Ｔ細胞へのＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）で移植した。７日目、１４日目、および２１日目に、これらに１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照で免疫化、または無処置のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＦＡＣＳ解析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在について試験した。簡潔に述べると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファーを用いて消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後で、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全なＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中で再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体を用いて染色し、続いて抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥを用いて透過処理および染色した。４色ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー解析を実施し、ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを解析した。
【０３６５】
統計的解析
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに対してスチューデントのｔ検定を使用し、これらを３回行った。これらの解析では、０．０５未満（＊印をつけた）のｐ値は統計的に有意であると考えられる。Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべてのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック研究のために、群あたり８〜１４匹のマウスを使用し、すべての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために、群あたり少なくとも８匹のマウスを使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍研究を除いて、すべての研究を少なくとも１回は繰り返した。
結果
＜実施例１１＞
【０３６６】
Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の発生：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については前述した。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）との直接融合によって生成された。キメラのタンパク質は、タンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（これは構築体Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に使用される）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果としてプラスミドｐＡｄｖ１６４が得られる（図１５Ａ）。これらの２つのプラスミドバックボーンの間には２つの大きい違いがある。１）組み換え型細菌のインビトロでの選択のためにｐＡｄｖ１３８はクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用しているが、ｐＡｄｖ１６４はバシラスサチリスからのＤ−アラニン・ラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を寄生し、これはｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠いているＬｍｄｄＡ株内でインビトロでの選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、ＦＤＡによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、これはインビボでのＬｍｄｄ株の相補に必要ないので、プラスミド（以下の配列および図１５Ａを参照）中でｐＡｄｖ１６４はｐｒｆＡ遺伝子のコピーを有しない。ＬｍｄｄＡワクチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖したＴＣＡ沈殿した細胞培養上清の中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のもの（図１５Ｂ）と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用して〜１０４ＫＤの帯域として抗ＬＬＯ抗体によって検出される。負の対照としてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
【０３６７】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図１５参照）：
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＜実施例１２＞
【０３６８】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である。
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、ＬＬＯに対してＨｅｒ２に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラより低い溶解活性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアワクチンを注射したマウス（図１６Ａ）ではＣＴＬ活性は検出されなかった。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によってＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできる（図１６Ｂ）。これはマイトマイシンＣで処置されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清の中で検出され、これらは高いレベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原（図１９Ｃ）を発現する。
【０３６９】
ヒトＭＨＣクラスＩエピトープのＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化後の適切な処置および提示は、ＨＬＡ−Ａ２マウスで試験された。免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックからの脾細胞は、マッピングしたＨＬＡ−Ａ２で制限されたエピトープに対応するペプチドと７２時間の間共インキュベートされ、このペプチドはＨｅｒ２／ｎｅｕ分子の細胞外（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ配列番号：７４もしくはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ配列番号：７５）ドメイン、または細胞内（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ配列番号：７６）ドメインに位置する（図１６Ｃ）。組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質は、正の対照、および無関連ペプチド、または負の対照としてペプチドなしで使用された。この実験からのデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
＜実施例１３＞
【０３７０】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２より有効である。
ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果が、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２とＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物において比較され、この動物は生後２０〜２５週間で繁殖の遅い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、２１〜２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。４５週には、５０％を超えるＡＤＸＳ３１−１６４をワクチン接種したマウス（９匹のうち５匹）は、まだ腫瘍がなく、これはＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を用いて免疫化したマウスの２５％と比較される。５２週には、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化した８匹のうち２匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた（図１７）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４はより弱毒化しているにもかかわらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２より有効であることを示す。
＜実施例１４＞
【０３７１】
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子での突然変異。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ（ハーセプチン）（Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインでエピトープを標的化するモノクローナル抗体）を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。いかなるワクチン接種した腫瘍サンプルのＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の中にも突然変異が観察されなかったことは、代替的なエスケープ機構を示唆するの（データ示さず）。
＜実施例１５＞
【０３７２】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の著しい減少を生じる。
脾臓および腫瘍内での調節性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫化の後脾細胞および腫瘍内のリンパ球が分離され、Ｔｒｅｇのために染色した。これらは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたが、別個に解析したとき、ＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無関連リステリアワクチンまたは無処置の動物と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化は、脾臓内のＴｒｅｇの頻度については効果を有しないことを示した（図１８参照）。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在は少なからぬ影響を生じた（図１９Ａ）。処置されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３＋  Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連ワクチンについては４．２％に減少し、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％と腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１に減少した（図１９Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、処置されていないマウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
＜実施例１６＞
【０３７３】
２つの異種抗原を同時に送達するデュアルプラスミドの構築
ＡｃｔＡプロモーター領域およびａｃｔＡのＮ−末端の１〜２３３アミノ酸に対応するＤＮＡは、リステリアゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、以下のプライマーＡｃｔＡ−Ｆ−５’−ａｔｃｃｃｇｇｇｔｇａａｇｃｔｔｇｇｇａａｇｃａｇｔｔｇｇｇ−３’（ＸｍａＩ）（配列番号：７７）およびＡｃｔＡ−Ｒ−ａｔｔｃｔａｇａｔｔｔａｔｃａｃｇｔａｃｃｃａｔｔｔｃｃｃｃｇｃ（ＸｂａＩ）（配列番号：７８）を使用して増幅される。クローニングのために使用される制限部位は下線付きである。ＸｍａＩ／ＸｂａＩ区分は、プラスミドｐＮＥＢ１９３内でクローニングされ、ｐＮＥＢ１９３−ＡｃｔＡを作り出す。キメラＨｅｒ２であるさらなる抗原２は、プライマーＣｈ−Ｈｅｒ２−Ｆ−５’−ａｔｔｃｔａｇａａｃｃｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｇｃｔｃｃｇｃｃａｃ−３’（ＸｂａＩ）（配列番号：７９）およびＣｈ−Ｈｅｒ２−Ｒ−５’−ｇｔｃｇａｃａｃｔａｇｔｃｔａｇｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇａｇｃｔｃａｇａｔｃｔｇｔｃｔａａｇａｇｇｃａｇｃｃａｔａｇｇｇｃ−３’（ＲＥ部位−ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ−ＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ）（配列番号：８０）を使用してＰＣＲ増幅される。Ｃｈ−Ｈｅｒ２のＸｂａＩおよびＳａｌＩ断片はプラスミドｐＮＥＢ１９３−ＡｃｔＡ中でクローニングされ、ｐＮＥＢ１９３−ＡｃｔＡ−Ｃｈ−Ｈｅｒ２プラスミドを作り出す。ＨｉｓタグＤＮＡ配列は、ＳａｃＩ制限部位とＳｐｅＩ制限部位との間Ｃｈ−Ｈｅｒ２リバースプライマー配列中に含まれる。プラスミドｐＮＥＢ１９３−ＡｃｔＡ−Ｃｈ−Ｈｅｒ２から、ｔＡｃｔＡ−Ｃｈ−Ｈｅｒ２−Ｈｉｓに対応するＸｍａＩ／ＳｐｅＩ断片は、ＸｍａＩ／ＳｐｅＩで制限されたｐＡｄｖ１３４内でクローニングしてデュアルプラスミドを作り出すために切り離される。
【０３７４】
次いで２つの組み換え型抗原を融合タンパク質と同時に送達するリステリアベースのプラスミドを生成した。このプラスミドによって発現される２つの融合タンパク質は、ｔＬＬＯ−抗原１とｔＡｃｔＡ−抗原２とを含む。抗原１の発現および分泌はｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下であり、またこれはリステリオリシンＯ（切断ＬＬＯまたはｔＬＬＯ）の非溶血性断片への融合として発現される。抗原２の発現および分泌はａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の制御下であり、またこれはＡｃｔＡ（切断ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）の１〜２３３アミノ酸への融合として発現される。抗生剤マーカーを含まないプラスミドｐＡｄｖ１３４の構築は前述されており、これはｔＬＬＯ−抗原１融合タンパク質の発現のための遺伝子カセットを含有する。ｐＡｄｖ１３４内のｔＬＬＯ−抗原１の下流を提示するＳｐｅＩおよびＸｍａＩ制限部位は、ａｃｔＡプロモーター−ｔＡｃｔＡ−抗原２ＤＮＡ区分のクローニングのために使用される（図２０）。制限部位ＸｂａＩ、ＳａｃＩ、およびＢｇｌＩＩは、ＸｂａＩ／ＳａｃＩ、またはＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩにおける抗原２インサートのクローニングを容易にするためにカセット内に追加される。ＨｉｓタグのためのＤＮＡ配列コーディングがｔＡｃｔＡ−抗原２−ｈｉｓ融合タンパク質の検出を容易にするためにＳａｃＩ部位の後に追加された。デュアルプラスミドは２つの異なる抗原を融合タンパク質として同時に発現および分泌することができる。
【０３７５】
材料および方法（実施例１７〜２１）
ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ機能
腫瘍がマウスに、腫瘍モデルに依存して脇腹または生理学的部位に移植された。次いで７日後に、マウスはワクチン接種され、初期ワクチン接種日は使用する腫瘍モデルに依存する。次いでワクチンが与えられた一週間後に、マウスはブースターワクチンを投与された。
【０３７６】
次いでブーストの１週間、または浸潤性腫瘍モデルの場合はブーストの３〜４日後にマウスは犠牲にされ、腫瘍および脾臓が採取された。腫瘍を採取する５日前に、レスポンダーＴ細胞の目的で使用するために、腫瘍を持っていないマウスはワクチン接種された。標準的な方法を使用して脾細胞が準備された。
【０３７７】
簡潔に述べると、腫瘍および脾臓の両方の単細胞懸濁液が調製された。脾臓を手作業で潰し、赤血球を溶解した。腫瘍を細かく刻み、コラゲナーゼ／デオキシリボヌクレアーゼを用いてインキュベートした。代替的に、ＧＥＮＴＬＥＭＡＣＳ（商標）解離器を腫瘍解離キットとともに使用した。
【０３７８】
ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキットおよびカラム、またはａｕｔｏＭＡＣｓセパレーターを使用して腫瘍および脾臓から精製された。次いで細胞を計数した。
【０３７９】
単細胞懸濁液を調製し、赤血球を溶解した。次いでＣＦＳＥを用いてレスポンダーＴ細胞にラベルを付けた。
【０３８０】
ウェル当たり１×１０５のＴ細胞密度にて、９６ウェルプレート内に、レスポンダーＴ細胞（すべての分裂サイクルうの段階からの）対ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇの比が２：１となるように細胞を一緒にプレーティングした。次いで、適切なペプチド（ＰＳＡまたはＣＡ９）を用いて、または非特異的にＰＭＡ／イオノマイシンを用いてレスポンダーＴ細胞を刺激した。３７℃にて２日間、５％のＣＯ２を用いて、細胞を遮光下でインキュベートした。２日後、細胞をＦＡＣＳのために染色し、ＦＡＣＳマシンで解析した。
【０３８１】
Ｔ細胞応答の解析
ＥＬＩＳＡによるサイトカイン解析のために、脾細胞を採取して、ウェル当たり１５０万細胞にて４８ウェルプレートに培地、ＳＥＡ、またはｃｏｎＡ（正の対照として）の存在中にプレーティングした。７２時間の間のインキュベーションの後、上清を採取して、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ）を用いてサイトカインレベルを解析した。抗原特異的なＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔのために、脾細胞を採取して、プレート当たり３０万および１５万細胞にてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔプレート内に、培地、特異的なＣＴＬペプチド、無関連ペプチド、特異的なヘルパーペプチド、またはｃｏｎＡ（正の対照として）の存在中にプレーティングした。２０時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳｐｏｔｓ（ＢＤ）を実施し、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）によってスポットを計数した。１００万脾細胞当たりのスポットの数をグラフにした。
【０３８２】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、  Ｚ１を使用して脾細胞を計数した。ｇａｇ−ＣＴＬ、ｇａｇ−ｈｅｌｐｅｒ、培地、無関連抗原、およびｃｏｎ  Ａ（正の対照）を用いた再刺激後のＣＤ８＋  Ｔ細胞を生産するＩＦＮ−γの頻度が、標準的なＩＦＮ−γベースのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して決定された。
【０３８３】
簡潔に述べると、５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ  Ｒ４６−Ａ２と、最適な希釈で使用される多クローン性のウサギの抗ＩＦＮ−γ（親切にもＰｈｉｌｌｉｐ  Ｓｃｏｔｔ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａによって提供された）とを使用してＩＦＮ−γを検出した。ＩＦＮ−γのレベルは、マウスのｒＩＦＮ−γ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を使用した標準曲線との比較によって計算された。プレートはペルオキシダーゼ−共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｂ（ＩＦＮ−γ）を使用して開発された。次いでプレートを４０５ｎｍで読み取った。アッセイに対する検出の下限値は３０ｐｇ／ｍＬである。
結果
＜実施例１７＞
【０３８４】
リステリアワクチン処置後の抑制細胞機能
０日目に腫瘍をマウスに移植した。７日目にマウスにＬｍｄｄａ−Ｅ７またはＬｍｄｄＡ−ＰＳＡを用いてワクチン接種した。１４日目に腫瘍を採取して、ワクチン接種した群および無処置群に対する浸潤性ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの数およびパーセンテージを測定した。リステリア処置したマウスの腫瘍で、ＭＤＳＣとＴｒｅｇとの両方のパーセンテージ、およびＭＤＳＣの絶対数の減少が見出されたが、脾臓または排出リンパ節（ＴＬＤＮ）では同じ効果は観察されなかった（図２１）。
【０３８５】
腫瘍内でＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ（両者とも脾臓および腫瘍のＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ）の存在中でのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＣＡ９、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ２（図２２〜３４）を用いた免疫化の効果を解明するために、上記の実験での腫瘍を持つマウスから分離された脾細胞および抽出された腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を、プールし、ＣＤ３およびＣＤ８のために染色した。各々のカラムは特定の細胞分裂段階におけるＴ細胞集団の％を表し、特定の処置群（無処置、ペプチド−ＣＡ９またはＰＳＡ処置、ＭＤＳＣ／Ｔｒｅｇなし、およびＭＤＳＣ＋ＰＭＡ／イオノマイシンなし）の下で下位群にグループ分けした（図２２〜３４参照）。
【０３８６】
提示するＴｒｅｇおよびＭＤＳＣのパーセンテージについて腫瘍を持つマウスからの血液を解析した。Ｌｍワクチン接種後のマウスの血液ではＭＤＳＣとＴｒｅｇとの両方の減少があった。
＜実施例１８＞
【０３８７】
脾臓以外のＴＰＳＡ２３腫瘍からのＭＤＳＣは、リステリアワクチン接種後に抑制性が低下する。
非特異的に活性化した無処置マウスの細胞および特異的に活性化した細胞（ＰＳＡ、ＣＡ９、ＰＭＡ／イオノマイシン）を有するＴＰＳＡ２３腫瘍から分離された単球性および顆粒球性のＭＤＳＣを使用して抑制因子アッセイを実行した。結果は、Ｌｍワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたＭＤＳＣは、無処置マウスの腫瘍からのＭＤＳＣと比較して活性化したＴ細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した。（図２２および図２４のＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＬＬＯで処置した群を参照、図中右側のパネルは右側のパネルからのプールした細胞分裂データを表す）。加えて、ＭＤＳＣが存在せずかつ細胞が刺激されていない／活性化している、未処置マウスからのＴレスポンダー細胞は、その親状態（休止状態）のままであるのに対して（図２２および図２４）、ＰＭＡまたはイオノマイシンで刺激されたＴ細胞は複製しているのが観察された（図２２および図２４）。さらに、Ｇｒ＋Ｌｙ６Ｇ＋およびＧｒｄｉｍＬｙ６Ｇ−ＭＤＳＣの両方とも、リステリアワクチンを用いた処置後、抑制がより低くなることが観察された。これは、ＰＳＡ特異的なＴ細胞および非特異的な（ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した）Ｔ細胞の両方の分割を抑制するこれらの能力を減少するために適用される。
【０３８８】
さらに、非特異的に活性化した無処置マウスの細胞を用いてＴＰＳＡ２３腫瘍から分離されたＭＤＳＣを使用して実施した抑制因子アッセイは、Ｌｍワクチン接種した群からの腫瘍から分離されたＭＤＳＣが、無処置マウスの腫瘍からのＭＤＳＣと比較して、活性化したＴ細胞の分裂を抑制する能力が減退していることを実証した（図２２および図２４参照）。
【０３８９】
加えて、すぐ上で考察した図２２および図２４に関する観察は、脾臓のＭＤＳＣを使用したときには観察されなかった。後者では、無処置群からの脾細胞／Ｔ細胞、リステリアで処置した群（ＰＳＡ、ＣＡ９）、およびＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した群（正の対照）のすべてが同じレベルの複製を実証した（図２３および図２５）。したがって、これらの結果はリステリア媒介性の腫瘍内の抑制因子細胞の阻害が抗原特異的なおよび非特異的な様式で作用するのに対して、これらは抗原特異的な様式でのみ抑制的なので、リステリアは脾臓の顆粒球性のＭＤＳＣには何も効果を有しないことを示す。
＜実施例１９＞
【０３９０】
腫瘍調節性Ｔ細胞の抑制の減少
リステリア処置後ＴＰＳＡ２３腫瘍から分離されたＴｒｅｇを使用して、抑制因子アッセイを実施した。リステリアを用いた処置後、腫瘍からのＴｒｅｇの抑制能力の減少が観察されたが（図２６）、しかしながら脾臓のＴｒｅｇはそれでも抑制的なままであることが見出された（図２７）。
【０３９１】
対照として、ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇの代わりに従来のＣＤ４＋Ｔ細胞が使用され、細胞分裂には効果を有しないことが見出された（図２８）。
＜実施例２０＞
【０３９２】
４Ｔ１腫瘍からのＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ（ただし脾臓ではない）は、リステリアワクチン接種後、より抑制が低下する。
４Ｔ１腫瘍を使用して上記と同様に同一の実験を実施したところ、同一の観察を得た。すなわち、リステリアワクチン接種後、ＭＤＳＣは抑制がより少なくなる（図２９および図３１）、リステリアは脾臓の単球性ＭＤＳＣには特異的な効果を有しない（図３０および図３２）、リステリアワクチン接種の後、４Ｔ１腫瘍からのＴｒｅｇの抑制能力の減少がある（図３３）、およびリステリアが脾臓のＴｒｅｇの抑制能力に効果を有しない（図３４）。
【０３９３】
最後にリステリアが脾臓のＴｒｅｇの抑制能力には効果を有しないことが観察された。
＜実施例２１＞
【０３９４】
顆粒球性および単球性ＭＤＳＣの抑制能力の変化は、ｔＬＬＯの過剰発現に起因する。
ＬＬＯプラスミドは、ＴＡＡまたは無関連抗原のいずれかを用いたリステリアワクチンと類似の結果を示す（図３５）。これは、顆粒球性のＭＤＳＣの抑制能力の変化がｔＬＬＯの過剰発現に起因し、融合抗原のパートナリングとは無関係であることを意味する。空のプラスミド構築体単独でもＭＤＳＣの抑制能力の変化を導くが、プラスミド上に切断ＬＬＯを含有するワクチンのいずれかとは正確に同一のレベルではない。３つの独立した実験の平均は、空のプラスミドとｔＬＬＯを有する他のプラスミドと（腫瘍抗原を有するものと有しないものと）の間の抑制の差異が有意であることを示す。抗原特異的な刺激されたレスポンダーＴ細胞が使用されるか、または抗原に非特異的な刺激されたレスポンダーＴ細胞が使用されるかという事実に関わらず、ＭＤＳＣ抑制能力の減少は同一である。
【０３９５】
顆粒球性のＭＤＳＣと同様に、３つの独立した実験の平均は、腫瘍から精製した単球性ＭＤＳＣのＬｍが空のプラスミドワクチンを用いたワクチン接種後の抑制能力の観察された差異が、他のワクチン構築体と比較して有意であることを示す（図３６）。
【０３９６】
上記の観察と同様に、脾臓から精製した顆粒球性のＭＤＳＣは、Ｌｍワクチン接種後もそれらの抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持する（図３７）。しかしながら非特異的な刺激後、活性化したＴ細胞（ＰＭＡ／イオノマイシンを有する）はまだ分裂する能力を有している。これらの結果のいずれもＬＬＯのみまたは空のプラスミドワクチンの使用によって変更されず、これはＬｍベースのワクチンが脾臓の顆粒球性のＭＤＳＣには影響しないことを示す（図３７）。
【０３９７】
同様に、脾臓から精製した単球性のＭＤＳＣは、Ｌｍワクチン接種後もそれらの抗原特異的なレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力を保持する（図３７）。しかしながら、非特異的な活性化（ＰＭＡ／イオノマイシンによって刺激された）後、Ｔ細胞は、まだ分裂の能力を有している。これらの結果のいずれもＬＬＯのみまたは空のプラスミドワクチンの使用によって変更されず、これはＬｍワクチンが脾臓の単球性のＭＤＳＣには影響しないことを示す（図３８）。
【０３９８】
レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化されるか、または非特異的に活性化されるかに関わらず、Ｌｍで処置した群のいずれかの腫瘍から精製したＴｒｅｇは、レスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力がわずかに減退している。特に、非特異的に活性化したレスポンダーＴ細胞については、それでも空のプラスミドを有するワクチンがＬＬＯをプラスミドに含有するすべてのワクチンと同じ結果を示す。この実験を他のものと平均化すると、差異が有意でないことを示す（図３９）。
【０３９９】
脾臓から精製したＴｒｅｇは、抗原特異的なおよび非特異的な活性化したレスポンダーＴ細胞の分裂を抑制する能力をまだ有する。脾臓のＴｒｅｇの抑制能力にはＬｍ処置の効果はない（図４０）。
【０４００】
Ｔｃｏｎ細胞は、レスポンダー細胞が抗原特異的に活性化したか、または非特異的に活性化したかに関わらず、Ｔ細胞の分裂を抑制する能力を有しない。これはこれらの細胞が非抑制的であるという事実と一致している。Ｌｍはこれらの細胞には効果を有さず、細胞が腫瘍から精製されても、またはマウスの脾臓から精製されても違いはなかった（図４１〜図４２）。
【０４０１】
材料および方法（実施例２２〜２８）
マウス
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのメスのＢａｌｂ／ｃ（生後６〜８週）を４Ｔ１腫瘍株の関与するすべての実験に利用した。Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのメスのＦＶＢ／ＮＪマウス（生後６〜８週）をＮＴ２腫瘍株の関与するすべての実験に利用した。ＦＶＢ／ＮＪバックグラウンドのラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス株を、自然発生的な腫瘍形成が関与する研究および自発性乳腺腫瘍形成の防止研究に利用し、これらは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼育された。すべてのマウス実験はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの研究機関動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規制に従って実施した。
【０４０２】
リステリア株
弱毒化リステリアベースのＩＳＧ１５ワクチンを構築するために、まず、Ｂａｌｂ／ｃマウスから、マウスのＩＳＧ１５をコードする遺伝子をマウスのＩＳＧ１５  ｃＤＮＡを含有する構築体から、以下のプライマー：Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５．ＦＯＲ  ５’−ＴＡＡＴ−ＣＴＣＧＡＧ−ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＡＡＡ−３’（配列番号：８３）、およびＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５．ＲＥＶ  ５’−ＡＴＴＡ−ＡＣＴＡＧＴ−ＴＴＡＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＣＣ−３’（配列番号：８４）を使用して増幅した。フォワードプライマー内の下線付きのＸｈｏＩ配列およびリバースプライマー内の下線付きのＳｐｅＩ配列を連結のために利用した。各々の断片アンプリコンは消化され、またリステリア発現プラスミド、ｐＧＧ３４へと連結される制限酵素である。各々の配列は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、切断リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）をコードする配列に下流で遺伝学的に融合される。これに続いて、ｐＧＧ３４−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５は、弱毒化リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）株、ＸＦＬ７へと電気穿孔され、コロニーを含有するプラスミドはＢＨＩ−クロラムフェニコールプレート上の耐性に対して選択される。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５の適正な構築を確認するために、弱毒化リステリアベースのワクチンをＢＨＩ−クロラムフェニコール選択培地内で増殖し、分泌したタンパク質をトリクロロ酢酸を用いて沈殿させた。ＳＤＳサンプルバッファー内で沸騰した後、分泌したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析にかけ、ＰＶＤＦ膜へと移送した。抗マウスＩＳＧ１５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて膜上でウェスタン解析を実施し、ｔＬＬＯ−ＩＳＧ１５融合タンパク質、３Ａ１１．２モノクローナル抗体を有する抗ニワトリオボアルブミン、およびＢ３−１９モノクローナル抗体を有する野生型ＬＬＯの分泌を確認した。ニワトリオボアルブミンに遺伝学的に融合されたｔＬＬＯから構成される対照ワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡが、同様に構造化された。すべてのリステリアベースのワクチンは腹腔内（ｉ．ｐ．）に  ２×１０８または５×１０８ＣＦＵのいずれかの２００μｌのＰＢＳで投与した。対照ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹＥＳＯ−１は同様に構造化された。
【０４０３】
細胞株
転移性の乳ガン腫瘍株４Ｔ１をＢａｌｂ／ｃマウスでの腫瘍移植研究で利用した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現するＮＴ２乳ガン細胞株をＦＶＢマウス内の腫瘍移植研究のために利用した。４Ｔ１−Ｌｕｃを、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、および５０mｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用いて補助したＤＭＥＭ内で維持した。ＮＴ２細胞を、１０％のウシ胎児血清、２０mｇ／ｍＬのインシュリン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、および５０mｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用いて補助したＲＰＭＩ  １６４０培地内で維持した。形質転換していないＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞株をＡＴＣＣから得た。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、および５０mｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用いて補助したＤＭＥＭ内で維持した。
【０４０４】
マウスの正常な組織および腫瘍組織内のＩＳＧ１５発現
ＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ抽出キットを使用して組織または細胞からＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡへと変換された。次いでｃＤＮＡは、ＩＳＧ１５に対して特異的なプライマーｑＩＳＧ１５．ＦＯＲ  ５’−ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧ−３’（配列番号：８５）、ｑＩＳＧ１５．ＲＥＶ  ５’−ＴＴＡＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＣＣ−３’（配列番号：８６）、１８Ｓ  ｒＲＮＡ  １８ＳＲＮＡ．ＦＯＲ  ５’−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡ−３’（配列番号：８７）、１８ＳＲＮＡ．ＲＥＶ  ５’−ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号：８８）、b−ａｃｔｉｎ  ＡＣＴＩＮ．ＦＯＲ  ５’−ＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡＡ−３’（配列番号：８９）、およびＡＣＴＩＮ．ＲＥＶ  ５’−ＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号：９０）を用いてｑＰＣＲ解析に供した。ＩＳＧ１５発現は、１８Ｓ  ｒＲＮＡ（図４３Ｃおよび図４３Ｄ）またはb−ａｃｔｉｎ（図４３Ａ）のいずれかに標準化された。
【０４０５】
乳腺組織溶解物のウエスタンブロット解析
ＦＶＢ／Ｎマウス（ｎ＝４）からの正常な乳腺組織、およびＦＶＢ／ＮバックグラウンドのＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（ｎ＝９）からの自発性乳腺腫瘍組織が切り取られ、溶解物の中へと処理された。簡潔に述べると、組織サンプルを液体Ｎ２中で急速冷凍し、粉砕し、プロテアーゼ阻害剤カクテルで補助した溶解バッファー（２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．０２％サポニンを含むＰＢＳ）中で可溶化した。溶解物を４×ＬＤＳサンプル負荷バッファーと混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。分離したタンパク質のＰＶＤＦ膜への移送後、抗マウスＩＳＧ１５抗体を用いてウエスタンブロット解析を実施した。別個に、同一の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、総タンパク質をタンパク質負荷の測定として可視化するためにゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｓｔａｉｎで染色した。
【０４０６】
ＩＳＧ１５ペプチドを用いた腫瘍免疫療法。
４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞（１０５）をＢａｌｂ／ｃマウスの乳腺組織の中へと移植し、これに続いてマウスに５日目、１２日目、および１９日目に、対照（ＨＩＶ−ｇａｇ  Ｈ−２ＫｄＣＴＬエピトープペプチド（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）（配列番号：  mm    ９１）、またはＩＳＧ１５特異的なペプチド（１００mｇ））、ｐＩＳＧ１５  ｄ１（ＲＧＨＳＮＩＹＥＶ）（配列番号：９２）、およびｐＩＳＧ１５  ｄ２（ＬＧＰＳＳＴＶＭＬ）（配列番号：９３）と混合した１００μｌのＰＢＳまたは５０μｇのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のいずれかを１００mＬのＰＢＳ中で、頸部リンパ節の近傍に皮下でワクチン接種した。実験の手順を通して腫瘍体積を垂直カリパス測定によってモニターした。腫瘍体積は、（腫瘍径）３／２として計算した。
【０４０７】
ＩＳＧ１５ペプチド腫瘍負荷研究
４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞（１０５）を乳腺組織の中へと移植し、これに続いて４日目、１１日目、および１８日目にマウスに、１００μｌのＰＢＳ中に５０μｇのＣｐＧを単独で、または１００μｌのＰＢＳ中にＣｐＧ（５０μｇ）を対照もしくはＩＳＧ１５特異的なペプチド（１００μｇ）とともに、のいずれかで頚部リンパ節近傍に皮下でワクチン接種した。３２日目の実験終了時、各々のワクチン接種した群の腫瘍質量を測定し、ＥＬＩＳｐｏｔ解析および肺転移測定で記述されるように、転移性腫瘍研究で記述されるように、ＩＳＧ１５特異的なＩＦＮ−γ応答のために腫瘍を解析した。
【０４０８】
転移性腫瘍研究
４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞（１０５）を乳腺組織の中へと移植し、これに続いて４日目、１１日目、および１８日目にマウスにペプチドベースのワクチンまたはリステリアベースのワクチンのいずれかをワクチン接種した。次いでマウスは３２日目に犠牲にされ、肺を分離し、かつＰＢＳを用いて灌流した。次いで肺表面の転移性の結節をＦｏｓｔｅｃ  ８３７５照明器およびリングライトに取り付けられたニコンＳＭＺ１Ｂズーム実体顕微鏡を用いて肺ごとに計数した。
【０４０９】
ＥＬＩＳｐｏｔ解析
９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）を１００μｌのＰＢＳ中の１５μｇ／ｍＬのラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体でコーティングした。４℃にて一晩インキュベーションした後、ウェルを１０％のウシ胎児血清で補助したＤＭＥＭで洗浄し、かつブロックした。図２Ｃに対して、各々の実験的群からの脾細胞が、ＨＩＶ−ｇａｇ  Ｈ−２ＫｄＣＴＬエピトープペプチド（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）（配列番号：９１）または予想されたＩＳＧ１５特異的なＨ−２ＫｄＣＴＬエピトープペプチド、ＩＳＧ１５−ｄ１（ＲＧＨＳＮＩＹＥＶ）（配列番号：９２）、およびＩＳＧ１５−ｄ２（ＬＧＰＳＳＴＶＭＬ）（配列番号：９３）（５μｇ／ｍＬ）プラスＩＬ−２（５Ｕ／ｍＬ）とともにウェルに追加された。ＩＳＧ１５特異的なＨ−２ＫｄＣＴＬエピトープは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌから入手できるＲＡＮＫＰＥＰ予測ソフトウェアを使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウス内のＩＳＧ１５タンパク質配列から予測された。図４７Ｂに対して、各々の実験的群からの脾細胞が、ＨＩＶ−ｇａｇ  Ｈ−２ＫｄＣＴＬエピトープペプチド（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）（配列番号：９１）またはＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的なＨ−２ＫｄエピトープペプチドＨｅｒ２−ＥＣ１（ＰＹＮＹＬＳＴＥＶ）（配列番号：９４）、Ｈｅｒ２−ＥＣ２（ＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬ）（配列番号：９５）、およびＨｅｒ２−ＩＣ１（ＰＹＶＳＲＬＬＧＩ）（配列番号：９６）とともにウェルに追加された。細胞は３７℃にて２４時間インキュベートされた。プレートを洗浄し、続いて１００μｌのＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのビオチン化したＩＦＮ−γ抗体（クローンＲ４−６Ａ２、ＭＡＢＴＥＣＨ、米国オハイオ州Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ）を用いて４℃にて一晩インキュベーションした。洗浄後、１００μｌのＰＢＳ中の１：１００のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼが添加され、室温にて１時間インキュベートされた。洗浄後に１００μｌの基質を追加し、室温にて１５分間インキュベートすることによってスポットが発色した。顕色はｄＨ２Ｏ中で良く洗浄することによって停止し、ＥＬＩＳｐｏｔリーダーを用いてスポット形成細胞（ＳＦＣ）を計数した。
【０４１０】
枯渇実験
マウスに０．５ｍｇのa−ＣＤ８抗体（モノクローナル抗体クローン２．４３）を、腫瘍移植後６日目、７日目、８日目、１０日目、１２日目、および１４日目に注射することによって４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍を持つマウス内でＣＤ８＋細胞を枯渇した。マウスの対照群を、同じ条件下でも処置したが、アイソタイプが適合したβ−ガラクトシダーゼに対して特異的な対照抗体を用いた。同時腫瘍負荷研究は、本明細書の方法の項の「Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５を用いた腫瘍免疫療法」に記述される通りに忠実に従った。
【０４１１】
エフェクター細胞のインビボ決定のためのＷｉｎｎアッセイ。
Ｗｉｎｎアッセイを、いくつかの修正を加えて、前述されているように実施した。簡潔に述べると、対照Ｌｍを２回ワクチン接種したまたはＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５を２回ワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウス（２×１０７）のいずれかからのＣＤ４を枯渇した脾細胞（ＣＤ４＋Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いて枯渇し、ＦＡＣＳ解析によって確認した）とを、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞（２×１０５）とを、１個の腫瘍細胞に対して１００個のＣＤ４−枯渇した脾細胞の比で混合して、乳腺組織内に移植した。次いで、本明細書の方法の項の「Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５を用いた腫瘍免疫療法」に記述されるように腫瘍の発生を測定した。
【０４１２】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的な腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の検出
Ｂａｌｂ／ｃマウスに４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍を移植し、対照ＬｍまたはＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５を用いて腹腔内で免疫化し、７日後にブーストした。ブースティングの９日後に腫瘍を採取して、単細胞懸濁液の中へと手動で解離した。次いで腫瘍細胞懸濁液をＦｉｃｏｌｌで精製して遠心分離後に密度の低い部分を除外することによって死滅した細胞および細胞のデブリを除去した。次いで、残った腫瘍細胞を、ＣＤ８（５３-６．７、ＦＩＴＣ共役）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ；ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ共役）、およびＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＥＣ２  Ｈ−２Ｄｑ四量体−ＰＥ共役（ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦに対して特異的、配列番号：９７）についてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓ  ソフトウェアとともにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕ  フローサイトメーターを使用して、３色フローサイトメトリーに供した。四量体が国立アレルギー感染症研究所（米国）の四量体コア施設によって提供され、１／２００の希釈で使用された。結果を上記に記述されるように、対照Ｌｍワクチン接種と比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５の能力を誘発四量体＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ−、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的なＴＩＬと比較するために解析した。
【０４１３】
統計的解析
自発性のＨＥＲ２／ｎｅｕ乳腺腫瘍を用いて遺伝子発現研究に適用されるウェルチの補正を用いて、すべての最終腫瘍体積、転移性の負荷、および免疫応答研究のためにスチューデントの片側ｔ検定を実施した。自発性のＨＥＲ２／ｎｅｕ乳腺腫瘍発生研究のためにログランク検定を実施した。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．０ａ（ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を使用して統計的解析を実施した。すべての比較に対する有意なｐ値を以下のように図に示した。＊＝ｐ値＜０．０５、＊＊＝ｐ値＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ値＜０．００１。
結果
＜実施例２２＞
【０４１４】
マウスの乳房の腫瘍内のＩＳＧ１５の発現亢進
ヒト悪性腫瘍のＩＳＧ１５の発現亢進は多数の腫瘍モデルでうまく特徴付けられた。しかしながら、マウスの腫瘍モデルでの類似のＩＳＧ１５のレベル増加については証拠が不足している。マウスのモデルで乳ガンに対してＩＳＧ１５発現が亢進されたかどうかを決定するために、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスからの自発性のマウス乳腺腫瘍、マウス乳腺腫瘍細胞株、および正常でかつ形質転換していない乳腺組織および細胞株のパネルでＩＳＧ１５発現を測定した。ヒトの乳ガンで観察されるように、正常なマウス乳腺組織と比較して、自発性のマウス乳腺腫瘍ではＩＳＧ１５  ｍＲＮＡの発現は著しく亢進した（図４３Ａ）。タンパク質生産の亢進の結果として生じた、ＩＳＧ１５  ｍＲＮＡの発現の亢進を確認するために、正常なマウスおよびＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍マウスの乳腺組織の溶解物を用いて抗ＩＳＧ１５抗体のウエスタンブロット解析を実施した。正常なマウス乳腺組織（図４３Ｂ、上のパネル、レーン１）と比較して、ＩＳＧ１５タンパク質の共役形態（２０ｋＤマーカーの上方のバンド）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ乳腺腫瘍組織では亢進した（図４３Ｂ、上のパネル、レーン２〜５）。ＩＳＧ１５タンパク質の非共役形態の発現亢進は、マウスの乳腺腫瘍組織（図４３Ｂ、上のパネル、レーン２および４）でも、正常な乳腺組織（図４３Ｂ、上のパネル、レーン１）と比較して明らかである。等価なタンパク質負荷は、同じ溶解物を用いてハウスキーピングタンパク質、ＧＡＰＤＨの発現を精査することによって明らかである（図４３Ｂ、下のパネル、レーン１〜５）。ＩＳＧ１５  ｍＲＮＡ発現は、正常なマウス乳腺組織および形質転換していないマウス細胞株、ＮＩＨ−３Ｔ３と比較して、マウスの乳腺腫瘍細胞株、４Ｔ１−Ｌｕｃ、およびＮＴ２で同様に亢進した（図４３Ｃ）。非悪性組織内でのＩＳＧ１５発現亢進の心配を軽減するために、ＩＳＧ１５  ｍＲＮＡ発現を正常なマウス組織のパネルでＨＥＲ２／ｎｅｕマウス乳房腫瘍組織と比較して解析した。乳腺腫瘍組織内のＩＳＧ１５  ｍＲＮＡの著しい発現亢進が、各々の正常な組織タイプに対して比較したとき同様に観察された（図４３Ｄ）。この発現解析は、ＩＳＧ１５発現がマウスの乳ガンモデルで著しく亢進していることを確認する。ＩＳＧ１５  ｍＲＮＡが正常な組織のパネルで名目的に発現されるという所見とともに、このことはＩＳＧ１５が期待できる新規の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である可能性があることを示唆する。
＜実施例２３＞
【０４１５】
ＩＳＧ１５特異的なＣＴＬワクチンの構築
ＩＳＧ１５に対する新規のＴＡＡとしての可能性を評価するために、亢進したＩＳＧ１５発現を有する腫瘍を標的化するためのリステリアベースのＣＴＬワクチンが開発された。ワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５の構築は、Ｂａｌｂ／ｃマウスからのマウスＩＳＧ１５遺伝子を、融合タンパク質の適正な分泌を可能にするためのシグナル配列を含有するリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）発現ベクターｐＧＧ３４内にすでに存在する切断形態のリステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）をコードする遺伝子の下流に遺伝学的に融合することによって遂行された。これに続いてｐＧＧ３４−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５構築体は、弱毒化コンピテントＬｍ株、ＸＦＬ７の中へと電気穿孔した（図４４Ａ）。ｔＬＬＯ−ＩＳＧ１５融合タンパク質の適正な分泌を、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５増殖培養液の培地からＴＣＡ沈殿したタンパク質に対して抗マウスＩＳＧ１５抗体を用いたウエスタンブロット解析によって確認した（図４４Ｂ、上のパネル）。ニワトリオボアルブミンに融合されたｔＬＬＯの融合タンパク質の類似の生産および分泌は、抗オボアルブミン抗体を用いてプローブしたとき、発明者らの対照Ｌｍから観察された（図４４Ｂ、中央のパネル）。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５および対照Ｌｍから分泌されたタンパク質は、同等の分泌されたタンパク質負荷を確認するために野生型ＬＬＯ抗体でもプローブされた（図４４Ｂ、下のパネル）。ＩＳＧ１５特異的なＣＴＬ応答の発生を、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５および対照Ｌｍワクチンとの両方をメスのＢａｌｂ／ｃマウスに６週目から開始して毎週投与することによって測定した。ＲＡＮＫＰＥＰによって予測された対照エピトープおよび２つのＩＳＧ１５特異的なＨ２−Ｋｄ−制限ＣＤ８＋  Ｔ細胞エピトープに対するＩＦＮ−γ応答を調査するために、第３のワクチン接種の１週間後、各々のワクチン接種群からの脾細胞をＥＬＩＳｐｏｔ解析に供した。対照ペプチドの刺激と比較して、各々の予測されるＩＳＧ１５特異的なＣＴＬエピトープを用いた刺激後のＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したマウスからの脾細胞においてのみＩＦＮ−γを分泌するＳＦＣの著しい増加が観察された（図４４Ｃ）。これらの結果はＩＳＧ１５に対する弱毒化したＬｍベースのＣＴＬワクチンによってＩＳＧ１５特異的な適応性の応答を生成することができることを示唆する。
【０４１６】
一方で、正常な条件の下では、正常な組織内ではＩＳＧ１５発現は低いかまたは検出できないレベルであるが、しかしながら妊娠中に胎盤の移植部位におけるＩＳＧ１５発現亢進に対する証拠がある。ＩＳＧ１５特異的な免疫応答がＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したメスのマウスの生殖能力に厳しく影響する場合があるかどうかを決定するために、妊娠研究を実施した。対照Ｌｍをワクチン接種したメスのマウスと比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したメスのマウスの生殖能力は、一腹の総数および子の重量によって測定して、著しく損なわれはしなかった（それぞれ図４４Ｄおよび図４４Ｅ）。明白な悪影響を有しないＩＳＧ１５特異的な適応性免疫応答の生成は、マウスの乳ガンに対するモデルでのその有効性の調査を助長するものである。
＜実施例２４＞
【０４１７】
ＬＭ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種後のマウスの乳房腫瘍への治療的な影響
当初、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５によって生成されたＩＳＧ１５特異的な適応性免疫応答の乳ガンに対する治療的な潜在能力を、移植した乳ガンの原発性および転移性のマウスモデルに対して調査した。ＮＴ２腫瘍細胞のＦＶＢ／Ｎマウスの後脇腹への皮下移植、およびこれに続くＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５を用いたワクチン接種は、結果として対照ワクチン接種と比較して腫瘍体積を著しく減少した（図４５Ａ）。同様に、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５治療的なワクチン接種は、乳腺組織を移植した４Ｔ１−Ｌｕｃ原発性腫瘍の増殖を著しく阻害した（図４５Ｂ）。４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍の乳腺の中に移植した後自然に転移する能力は、乳ガンについてより侵攻性のモデルに対するＩＳＧ１５特異的なＣＴＬ応答の有効性へのさらなる調査を可能にする。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５投与後、対照Ｌｍと比較して、４Ｔ１−Ｌｕｃ転移性肺病変の外観の著しい減少が観察された（図４５Ｃ）。
＜実施例２５＞
【０４１８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５によるＨＥＲ２／ＮＥＵ＋自発性乳腺腫瘍およびエピトープ拡大の進行の遅延
より臨床的に関連するヒト乳房腫瘍発生のモデルでもＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５が治療的な有効性を提供することができるかどうかを決定するために、治療的な介入なしに自発性の乳腺腫瘍を発生する生後４か月を過ぎたＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルを利用した。メスのトランスジェニックマウスに生後６週目から２１週目まで、３週間ごとにＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５または対照Ｌｍをワクチン接種し、これに続いて乳腺腫瘍発生についてモニターした。対照Ｌｍをワクチン接種した群と比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５を投与したマウスは腫瘍の進行に有意な遅延を実証した（ｐ＜０．０００１）（図４６Ａ）。事実、８０パーセントを超えるＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したマウスが生後４９週まででもまだ腫瘍を有しない一方で、すべての対照Ｌｍをワクチン接種したマウスは３１週間の進行時間の中間値で、乳腺腫瘍を発生した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種後のＩＳＧ１５特異的なＣＴＬの自発性腫瘍の中への浸潤が、この進行の遅延のために可能性のある機構とすることができるかどうかを決定するために、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種後にこれらの腫瘍のＴＩＬでＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ解析を実施した。自発性腫瘍を形態させた後、腫瘍を持つマウスに対照ＬｍワクチンまたはＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５のいずれかを０日目と７日目との２回ワクチン接種した。最後のワクチン接種の一週間後、腫瘍を切り離し、ＴＩＬ精製し、かつＥＬＩＳｐｏｔ解析のために処理した。そのＩＳＧ１５エピトープペプチド刺激後にＩＦＮγを分泌する能力によって測定されるように、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５でワクチン接種したマウスの腫瘍は、予想通り、対照Ｌｍワクチン接種したマウスの腫瘍より有意に多数のＩＳＧ１５特異的なＴＩＬを含有する（図４６Ｂ）。これらの結果は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５による自発性乳腺腫瘍の進行の遅延は、ある程度ＩＳＧ１５特異的なＣＴＬの浸潤によって媒介されることを示唆する。
【０４１９】
最近の研究は、ガンワクチンの臨床的な有効性がそのクロスプライミングおよび追加的なＴＡＡへのエピトープ拡大を刺激する能力と有意に相関することを実証している。類似の結果がＬｍベースのガンワクチンを使用して以前に観察され、追加的なＴＡＡへのエピトープ拡大の発生はワクチンの有効性と関連付けられた。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種の後にエピトープ拡大が発生するかどうかを評価するために、対照ＬｍまたはＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５のいずれかの投与後のＮＴ２腫瘍を持つマウスからの脾細胞を用いてＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的な応答を検出するためのＥＬＩＳｐｏｔを実施した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したマウスの脾細胞は、対照Ｌｍをワクチン接種したマウスと比較して有意により多数の既知のＣＴＬエピトープ特異的なＳＦＣをＨＥＲ２／ｎｅｕの中に含有する（図４６Ｃ）。この結果は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５のワクチン接種が結果として追加的なＴＡＡへのエピトープ拡大をもたらすことを示唆する。事実、エピトープ拡大に対する証拠は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを非常に弱く発現する腫瘍細胞株である４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍に対するＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５ワクチン接種後でも観察される。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したマウスからの４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍は、対照Ｌｍをワクチン接種したマウスからの４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍より有意に高いパーセンテージのＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的なＣＤ８＋６２Ｌ−  ＴＩＬを含有する（図４６Ｄ）。ＨＥＲ２／ｎｅｕへのエピトープ拡大は何らかの治療的な有効性を提供する場合があるが、心毒性の安全性への懸念を保証するためにこの２次応答が十分に確実なものであるかどうかは不明である。まとめると、これらの腫瘍負荷研究は、ＩＳＧ１５に対するワクチン接種が、原発性の移植したマウスの乳腺腫瘍の増殖を阻害し、転移性の拡散を阻害し、自発性乳腺腫瘍の進行を遅延し、追加的なＴＡＡへのエピトープ拡大を生成することができることを実証する。
＜実施例２６＞
【０４２０】
ＩＳＧ１５のワクチン接種の治療的な影響は、ＣＤ−８に依存する
確実なＩＦＮ−γ応答および有意な治療的な腫瘍の影響の発生は強いＣＴＬ応答を示唆するものであるが、一方でＩＳＧ１５特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞機能のＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５有効性への依存性を調査した。４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍を持つマウスでのＣＤ８＋細胞の枯渇は、対照抗体を用いた疑似枯渇と比較してＬｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５の抗腫瘍有効性を完全に破棄する（図４７Ａ）。ＩＳＧ１５特異的なＣＴＬ腫瘍細胞溶解のインビボでの手段として、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞のために濃縮した脾細胞が４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍形成を直接的に阻害することができるかどうかを評価するためにＷｉｎｎアッセイを実施した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５または対照Ｌｍのいずれかを２回ワクチン接種したマウスからの脾細胞のＣＤ４＋細胞を枯渇し、４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞とともに短時間インキュベートした。次いで腫瘍細胞および脾細胞混合物をＢａｌｂ／ｃマウスの乳腺組織の中へと移植し、腫瘍進行をモニターした。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５をワクチン接種したマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮した脾細胞は、対照Ｌｍをワクチン接種したマウスからのものと比較して腫瘍増殖を有意に阻害した（図４７Ｂ）。さらに、対照Ｌｍ脾細胞を受容したマウスはすべて移植後２１日目までに腫瘍を発生したが、一方でＩＳＧ１５特異的な脾細胞を受容したマウスの４０％は４３日目にはまだ腫瘍を有していなかった（図４７Ｃ）。この結果は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＳＧ１５が、結果として腫瘍細胞の直接溶解をもたらすＣＤ８に依存する適応性の免疫応答を誘発し、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される可能性があることを示唆する。
＜実施例２７＞
【０４２１】
ＩＳＧ１５特異的なＣＴＬクローンのインビボでの増幅が結果として抗腫瘍応答をもたらす
単一のＩＳＧ１５特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの増幅が結果として抗腫瘍有効性をもたらすかどうかを評価するために、マウスに４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍細胞を移植し、ＰＢＳ単独もしくはアジュバント、ＣｐＧ  ＯＤＮ、各々のＩＳＧ１５  Ｈ２Ｋｄエピトープペプチドを混合したもの、または対照ペプチドを用いてワクチン接種した。ＣｐＧ  ＯＤＮおよびＩＳＧ１５  Ｈ２Ｋｄペプチドを用いてワクチン接種したマウスでは、ＰＢＳ単独および対照ペプチドワクチン接種と比較して４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍体積および腫瘍質量が有意に減少した（それぞれ図４８Ａおよび図４８Ｂ）。４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍肺転移も、各々のＩＳＧ１５ペプチドを用いたワクチン接種後、ＰＢＳ単独または対照ペプチドワクチン接種と比較して著しく減少した（図４８Ｃ）。さらに、各々のＩＳＧ１５  Ｈ２Ｋｄエピトープペプチドを用いた刺激に応答するＩＦＮγ分泌が、それらのそれぞれのＩＳＧ１５  Ｈ２Ｋｄエピトープペプチドを用いてワクチン接種したマウスからのＴＩＬでのみ観察され、標的となった腫瘍と取引する順調な増幅ＩＳＧ１５特異的なＣＴＬがあることを示唆する（図４８Ｄおよび図４８Ｅ）。これらのデータは、ＩＳＧ１５特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増幅がＩＳＧ１５の発現亢進により腫瘍の増殖を直接的に阻害することを強く示唆する。
【０４２２】
材料および方法（実施例２８〜３７）
マウス。
メスのＦＶＢ／ＮマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼育された。マウスは実験開始時に生後６〜８週間であり、実験はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの研究機関動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規制に従って行われた。
【０４２３】
ペプチドおよび抗体。
抗マウスＣＤ３１、抗マウスＣＤ８a−ＰＥ、ラットＩｇＧ２ａ−ＰＥアイソタイプ対照はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から購入した。ウサギの抗リステリア抗血清多クローン性の抗体、セロタイプ１、４はＤｉｆｃｏ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ウサギの抗ＨＩＦ−１aはＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（米国コロラド州Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ）から購入した。ヤギの抗ウサギＡｌｅｘａ−４８８二次抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＤＡＰＩはＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）から購入した。ラット抗マウスＩＦＮ−ｇ（クローンＡＮ１８）はＭＡＢＴＥＣＨ（米国オハイオ州Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ）から購入した。ラット抗マウスＩＦＮ−ｇ（クローンＸＭＧ１．２）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｅｉｇｏ）から購入した。融合タンパク質発現のためにウエスタンブロットで使用する抗体は、ＬＬＯタンパク質の最初の１３残基（ＰＥＳＴ）まで育てた多クローン性のウサギの血清（Ｓｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．６４：８８２１−８８２５）、または抗ＬＬＯマウス抗体、全長ＬＬＯ特異的な、ハイブリドーマ上清から生成した、クローン＃Ｂ５−１９（Ｅｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１４：５０３−５１２）のいずれかである。すべてのペプチドはＥＺＢｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ州Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ）から購入した。四量体は米国国立衛生研究所エイズ研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のＡｍｙ  Ｓｔｏｕｔ博士および参照試薬プログラム（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）から提供された。使用された四量体はすべてＰＥ−共役Ｈ−２Ｄｑであり、またＨｅｒ−２／ｎｅｕ領域のためのペプチド、ＥＣ１（ＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬ；配列番号：９８）、ＥＣ２（ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦ；配列番号：９７）、またはＩＣ１（ＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ；配列番号：９９）のいずれかを含有する。これらの研究で使用されたペプチドは以下のものである。Ｆｌｋ−Ｅ１２１０−２１９（ＴＹＱＳＩＭＹＩＶ；配列番号：１００）、Ｆｌｋ−Ｅ２６１３−６２２（ＭＦＳＮＳＴＮＤＩ；配列番号：１０１）、Ｆｌｋ−Ｉ１９０６−９１５（ＰＧＧＰＬＭＶＩＶ；配列番号：１０２）、Ｆｌｋ−Ｉ１８３９−８４８（ＧＲＧＡＦＧＱＶＩ；配列番号：１０３）；（Ｈｅｒ２−ｐＥＣ１３０２−３１０（ＰＹＮＹＬＳＴＥＶ；配列番号：９４）、Ｈｅｒ２−ｐＥＣ２４２０−４２９（ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦ；配列番号：９７）、Ｈｅｒ２−ｐＩＣ１７３２−７４１（ＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ；配列番号：９９）、ＨＩＶ−ｐＧａｇ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ；配列番号：９１）。
【０４２４】
ＥＬＩＳｐｏｔ
ペプチドの刺激に応答するマウスの脾細胞によるＩＦＮ−−ｇの分泌は、酵素にリンクしたイムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって試験された。頻度の低い、抗原特異的な細胞に対して得ることができる感度のレベル、および抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよび抗Ｆｌｋ−１特異的なＴ細胞のためにインビトロ操作なしに直接エキソビボで試験することができることから、発明者らは他のアッセイよりもＥＬＩＳｐｏｔの使用を好んだ。簡潔に述べると、分離された脾細胞を、ウェル当たり１×１０６細胞でプレーティング、または１０mｇ／ｍＬペプチドおよび５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で７mｇ／ｍＬのラット抗マウスＩＦＮ−ｇ抗体（クローンＡＮ１８、ＭＡＢＴＥＣＨ、米国オハイオ州Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ）でコーティングした９６ウェルプレートにわたって滴定した。次に、ビオチン化した抗ＩＦＮ−ｇ抗体（クローンＸＭＧ１．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を各々のウェルに、最終濃度が２mｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃にて一晩インキュベーションした後、プレートをストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：１０００希釈）、続いて基質ＴＭＢ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＡＢＣキット）を用いて室温で１時間顕色させた。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｃ．Ｔ．Ｌ．スキャナーおよび計数ソフトウェア（ＣＴＬ、米国オハイオ州Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）を使用してスポットを計数した。
【０４２５】
細胞株。
細胞培養培地および補助剤はＧｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。ＮＴ−２およびＪ７７４Ａ．１細胞は前述されているように維持した。細胞培養はすべて３７℃および５ＣＯ２に保持した。蛍ルシフェラーゼ遺伝子（４Ｔ１−Ｌｕｃ）を安定して発現する４Ｔ１および４Ｔ１細胞はＥｌｌｅｎ  Ｐｕｒｅ博士（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の親切な供与品であり、また細胞培養培地の中で維持した。
【０４２６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンの構築。
Ｆｌｋ−１遺伝子源はＲａｌｐｈ  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ博士（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）によって寛大にも提供されたＤＮＡワクチンプラスミドであった。残基６８〜１０８１に対応する断片は、以下のプライマーを使用しＰＣＲによって増幅される。Ｆｌｋ−Ｅ１（Ｆ）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＡＴＴ−３’（配列番号：１０４）、Ｆｌｋ−Ｅ１（Ｒ）：５’ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＣＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴ−３’（配列番号：１０５）、（ＡＡ６８−２７７）；Ｆｌｋ−Ｅ２（Ｆ）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＡＡＡＴＴＡ−３’（配列番号：１０６）、Ｆｌｋ−Ｅ２（Ｒ）：５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号：１０７）、（ＡＡ５４５−７３０）；Ｆｌｋ−Ｉ１（Ｆ）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：１０８）、Ｆｌｋ−Ｉ１（Ｒ）：５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＡＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号：１０９）、（ＡＡ７９２−１０８１）。ＸｈｏＩ配列はフォワード（Ｆ）プライマーに対して下線付き、ＳｐｅＩ配列はリバース（Ｒ）プライマーに対して下線付き、終止コドンは太字である。ＰＣＲ産物はｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと連結され、配列決定によって確認され、これに続いてＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた二重消化によって切り離される。断片は下流でｐＧＧ３４ベースのプラスミドへと連結され、その発現がｈｌｙプロモーターによって駆動されるＬＬＯタンパク質の最初の４４１残基に対してコードする遺伝子に融合される。ｐＧＧ３４プラスミドの構築はいずれかに詳細に記述されている。結果として得られるプラスミドを、Ｌｍ株１０４０３Ｓに由来するＰｒｆＡ欠損のＬｍ株ＸＦＬ−７の中へと電気穿孔した。陽性クローンは、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用いて補助されたブレインハートインフージョン（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ）プレート上で選択された。結果として得られた染色剤は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１と名付けられた
【０４２７】
Ｌｍワクチン投与物の増殖および調製
ワクチンストックは−８０℃にて１０％のグリセロール中で１×ＰＢＳの中に保持した。各々のストックをクロラムフェニコール／ストレプトマイシンプレート上に筋状にし、一晩増殖した。選択した抗生物質の下の５ｍＬのＢＨＩ培地の培養液で一晩増殖させるために単一のコロニーを使用した。３７℃にて撹拌インキュベーター内でこの培養液をさらに４時間延長し、微生物密度が０．４〜０．８ＯＤ６００に達するまで増殖させ、この時点で微生物を洗浄し、１０％のグリセロール内で冷凍滅菌して、使用するまで−８０℃にて保持した。生成した各々のロットについてストックを滴定した。１つの連続的な実験のためには単一のロットを使用し、各々の繰返しには異なるロットを使用し、ロット間の変化は観察されなかった。ウエスタンブロットによる融合タンパク質発現について、抗ＰＥＳＴ抗体および抗ＬＬＯ抗体を用いて各々のロットをチェックした。各々の投与のために、１つのバイアルを選択して、希釈して使用する前に、解凍して１×ＰＢＳ内で２回洗浄し、使用しなかった微生物は破棄した。
【０４２８】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンの腫瘍増殖に及ぼす効果
ＮＴ−２腫瘍細胞の１×１０６を２００μｌのＰＢＳでＦＶＢ／Ｎマウスの脇腹に皮下で注射した。腫瘍接種後４日目に、５×１０８ＣＦＵの、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２、またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１の何れかを用いて、マウスに腹腔内で免疫化した。この投与量は、マウスに悪影響を及ぼすことが観察された最少投与の１／１０として決定されたが、これはすべての実験に使用された。免疫化を毎週繰り返し、すべての実験に対してワクチンを合計３回投与した。対照群では、マウスは対照Ｌｍワクチン、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１１０１−１５６を受容した。ＬＬＯまたはリステリアの感染に対する免疫応答を制御するためのＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１１０１−１５６は無関連Ｌｍワクチンまたは第三者Ｌｍワクチンとして作用し、発明者らは一般的にこのワクチンを対照として試験ワクチンと同等の濃度で使用する。カリパスを用いて３日ごとに腫瘍を測定し、各々の個別の腫瘍について最短表面径（幅）と最長表面径とを記録した。以下の式を使用して腫瘍体積の計算を実施した。［（幅）２×長さ×０．５２］。直径が２０ｍｍに達するを開放創または腫瘍をマウスが発生した場合、そのマウスを犠牲にした。腫瘍を有しないで生存しているＮＴ−２にチャレンジしたマウスは、第１の接種の少なくとも１０週間後に同じ細胞株を用いて反対側の脇腹で再チャレンジした。
【０４２９】
腫瘍免疫蛍光
腫瘍接種後６４日目に、マウスを犠牲にし、ＮＴ−２腫瘍を外科的に切り離し、ＯＣＴ寒剤中で凍結保存し、凍結切片を作製し８〜１０ｍｍの厚さの切片を提供した。免疫蛍光のために、サンプルを解凍し、４％のホルマリンを使用して固定した。ブロッキング（２．４Ｇ２コンディショニングした培地／１０％のＦＢＳ／５％の正常なラットおよびマウス血清）した後、ブロッキング溶液内で一次抗体を用いて加湿チャンバー内で３７℃にて１時間切片を染色した。一次染色に対して使用したのと同一の手順に従って、二次抗体を用いてサンプルを染色した。製造業者の取扱説明書によりＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色を実施した。ＨＩＦ−１aに対する細胞内染色をＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ／１％のＢＳＡ溶液中で行った。退色防止剤入りの封入溶液（Ｂｉｏｍｅｄａ）を使用してスライドにカバーグラスをかけ、２４時間硬化させ、Ｓｐｏｔ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（ｖｓ．２００６）およびＢＸ５１シリーズＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡を使用して撮像するまで４℃にて保持した。Ｓｐｏｔ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して画像マージし、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェア（ｖｓ．２００６）を使用してＲＯＩをゲーティングした後で定量化を実施した。すべての画像は、同じ露出時間に対してキャプチャした３つの異なるチャネルのシリーズをマージした。抗ＣＤ３１を使用する微小血管密度の定量化のために、発明者らはマウス腫瘍モデル内のＭＶＤ測定のために類似の戦略を使用して、解析を既に公表した成果に基づくようにした。
【０４３０】
転移研究および生物発光撮像
マウスに合計３回のワクチン接種を行い、最終ワクチン接種の７日後、組込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子（４Ｔ１−Ｌｕｃ）を発現する５０，０００の４Ｔ１細胞を静脈内に注射した。撮像の前に対応する基質である２００μｌのＰＢＳ中のＤ−ルシフェリンを５〜１０ｍｇ／マウスにて腹腔内に注射した。麻酔に続いてケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）腹腔内注射下で、マウスをＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ撮像システム（Ｘ−１００）（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ）の暗いチャンバー内に定置した。ＣＣＤカメラを用いて写真画像および蛍光画像をキャプチャし、ＸｅｎｏｇｅｎからのＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（バージョン２．１１）を使用して製造業者の取扱説明書に従って蛍光輝度を定量した。長手方向撮像を少なくとも腫瘍接種後４週間まで毎週実施した。すべてのマウスを同じ露出および露光時間で撮像した。画像は標準化した画像を示す。病理学研究のために、肺組織を除いて同一の実験を実施した。肺組織は灌流し、抽出し、ワックス包埋し、腫瘍の計数を行う（手作業で）前にＨ＋Ｅを用いて染色した。
【０４３１】
妊娠および創傷治癒安全性研究。
生後６〜８週のメスのＦＶＢ／Ｎマウスに対照ＬｍワクチンまたはＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンの何れかを３週連続して免疫化した。４週目に安全性研究を実施した。妊娠および生殖能力について、１群当たり５匹のマウスを個別に収容していたオスと交尾させた。交尾をモニターし、膣栓の存在によって確認した。懐胎時に、誕生時の子の体重および一腹の総数を測定した。この研究で利用した創傷治癒アッセイを前述した方法に従って行った。簡潔に述べると、マウスに麻酔をかけ、毛を除去し、皮膚を無菌ワイプで洗浄した。滅菌した生検ツール（Ａｃｕｄｅｒｍ）を使用して２つの円形状の直径３ｍｍの創傷を皮膚から打ち抜いた。創傷は処置されず、感染は見られなかった。創傷閉鎖までの平均時間をモニターし、目に見えるかさぶたを残さずに傷跡が形成されたとき完了したと見なした。
【０４３２】
統計的解析および定量化の方法。
非パラメトリックなマン・ホイットニー検定を使用してデータを解析した。すべての生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用した。すべての統計的解析はＰｒｉｓｍソフトウェアｖｓ．４．０ａ（２００６）を用いて行った。統計的有意性はｐ＜０．０５の値に基づいている。発明者らは、すべての非−トランスジェニック研究で１群当たり少なくとも８匹のマウスを含んだ。すべての研究を少なくとも１回繰り返した。
＜実施例２８＞
【０４３３】
ＬＬＯ−ＦＬＫ−１構築体の構築
各々Ｆｌｋ−１の異なる領域を含有する合計３つの構築体、Ｅ１（ＡＡ６８〜２７７）、Ｅ２（ＡＡ５４５〜７３０）およびＩ１（７９２〜１０８１）を試験した（図４９Ａ）。領域を予測されるエピトープに基づいて選択した。発明者らはこれらのワクチンをＦＶＢ／Ｎベースの乳ガンモデルで試験することに興味があるので、試験に使用されるモデルハプロタイプのために最も適切であることになる断片をクローンすることを決定した（すなわち、ＦＶＢ／Ｎ、Ｈ２ｑ）。選択されたＥ１、Ｅ２、およびＩ１領域はＨ−２ｑマウスＭＨＣ  Ｉハプロタイプのためにいくつかの潜在的なエピトープを含有していた（図５０Ａ）。
【０４３４】
各々の断片を切断ＬＬＯタンパク質を有する融合タンパク質としてクローニングした（図４９Ａ）。ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１融合タンパク質がＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１構築体によって生産および分泌されたかどうかを試験するために、発明者らは培養上清からのタンパク質を  多クローン性の抗ＰＥＳＴ抗体（図４９Ｂ下図）または抗ＬＬＯ抗体（図４９Ｂ上図）を使用してウエスタンブロット（図４９Ｂ）によって解析した。各々の融合構築体のための帯域は、ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１（〜８１ｋＤａ）、ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２（〜７８ｋＤａ）、およびＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１（〜８９ｋＤａ）を検出した。６０〜７０ｋＤａ程度の帯域は内因性のＬＬＯであり、切断融合タンパク質ＬＬＯは６０〜５０ｋＤａ程度であることが見出された。発明者らの融合タンパク質がＬＬＯ−Ｆｌｋにリンクしていることを示すために抗ＬＬＯブロットが対照として使用される。Ｊ７７４Ａ．１マクロファージでの複製によって証明されるように、３つの構築体すべてがファゴリソソームを感染、増殖、およびエスケープすることができる（図５０Ｄ）。また、各々のワクチンをマウスのクローニングされたＦｌｋ−１領域に対して、ＩＦＮ−ｇ脾細胞応答によって示されるようにエキソビボで免疫化することもできた（図４９Ｃ）。これらのＦＶＢ／Ｎ  ＥＬＩＳｐｏｔ実験で再チャレンジのために使用されたペプチドを、本来は免疫優勢Ｆｌｋ−１エピトープとしてＨ２ｄＢａｌｂ／ｃマウス内でマッピングした。おそらくＨ２ｄ分子とＨ２ｑ分子との高い相同性に起因して、Ｈ２ｄを識別したエピトープはＨ２ｑエピトープとして機能することもできるので、発明者らはＨ２ｄマッピングしたエピトープをＨ２ｑモデルで日常的に使用する。
＜実施例２９＞
【０４３５】
ＨＥＲ−２／ＮＥＵを発現する腫瘍モデル内でのＬＭ−ＬＬＯ−ＦＬＫ−１ワクチンの治療的な有効性
発明者らのワクチンのＨｅｒ−２／ｎｅｕ＋乳房腫瘍の退行を誘発する能力を試験するために、発明者らは、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕを導入遺伝子として過剰発現し、かつ本来ＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウス内の自然発生的乳腺腫瘍に由来するＮＴ−２腫瘍モデルを使用した。ＮＴ−２細胞株はＦｌｋ−１分子を発現せず、したがって発明者らの対象となる抗原は宿主血管系上にのみ位置する。細胞をインビトロで増殖させ、皮下でＦＶＢ／Ｎマウスの脇腹の中へと移植した。４日目に、触知可能な（直径およそ４〜５ｍｍ）腫瘍が形成されたときに、マウスにワクチン接種し、次いで合計で３回のワクチン接種を毎週ブーストした。ワクチンＦｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１は退行を誘発することができ、一部のマウスでは移植した腫瘍の完全な撲滅（Ｆｌｋ−Ｅ１：２／８、Ｆｌｋ−Ｉ１：２／８）を接種後６４日目までに誘発することができる（図５１Ａ）。しかしながら、Ｆｌｋ−Ｅ２は腫瘍増殖を制御することができず、これは対照Ｌｍで処置した群と同様である。完全に退行した腫瘍を有するマウスに腫瘍接種後１００日目にＮＴ−２を反対側に用いて再チャレンジし、新しい腫瘍の再増殖は観察されず、寿命の長い抗腫瘍免疫性を示唆する（図５２Ａおよび図５２Ｂ）。
【０４３６】
６４日目の腫瘍の微小血管密度（ＭＶＤ）を汎内皮細胞マーカーＣＤ３１を用いて染色することによって評価し、また核マーカーＤＡＰＩを用いて対比染色した。予想したように、Ｆｌｋ−Ｅ２処置群からの腫瘍内のＭＶＤは対照処置されたマウスからのものと似ていた。しかしながら、Ｆｌｋ−Ｉ１で処置したマウスでＣＤ３１＋血管の密度の減少が見られ、Ｆｌｋ−Ｅ１ワクチン接種を使用してさらなる減少が観察された（図５１Ｃ）。ＣＤ３１＋血管のこの減少はＦｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１で処置した群での核低酸素マーカー、低酸素誘導因子−１a（ＨＩＦ−１a）に対する染色の増加と相関するが、対照群では相関しない（図５１Ｄ）。腫瘍ＭＶＤの減少に加えてこれらのＨｅｒ−２／ｎｅｕ＋腫瘍の退行は、腫瘍血管形成に関与する抗ＶＥＧＦＲ２細胞毒性Ｔ細胞死滅内皮細胞に起因し、観察された退行の結果として得られる腫瘍損傷または増殖制限につながる可能性があると仮説を立てることができる。これに続いて、貪食された腫瘍の破片が局所の樹状細胞によって排出リンパ節内に交差提示される可能性があり、そのエピトープがＦＶＢ／Ｎマウス内にそれまでにマッピングされた抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＣＴＬに提示される。この分子間エピトープ拡大が生じると、最大の退行を呈するマウスが抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の高い頻度も有するであろうと期待することになる。この仮説を試験するために、発明者らは６４日目のマウスから脾細胞を採取して、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの３つの異なる領域からの３つの既知のエピトープを用いて再チャレンジするＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔを実施した。発明者らは、以前ＣＴＬエピトープをＨｅｒ−２／ｎｅｕ分子の異なる領域のためにマッピングしたことがあり、インビトロでの刺激および増幅を必要とするいくつかの細胞毒性アッセイとは異なり、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは頻度の低い特異的なＴ細胞を検出するのに十分なだけ敏感なので、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ応答を測定するためにＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用することを決定した。Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１が最大のエピトープ拡大を示し、一方でＦｌｋ−Ｅ２は最低のエピトープ拡大を示し（図５１Ｂ、＊ｐ＜０．０５）、インビボで見出される腫瘍退行の範囲と強い相関を示すことを発明者らは見出した（図５１Ａ）。
＜実施例３０＞
【０４３７】
抗血管形成が誘発する腫瘍退行は内因性の腫瘍抗原へのエピトープ拡大に依存する
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕエピトープ拡大の存在は腫瘍退行が抗血管イベントのみに依存するだけでなく、腫瘍抗原Ｈｅｒ−２／ｎｅｕへの免疫応答にも依存する可能性があることを示唆した。この仮説を試験するために、発明者らは２つの最も効能のあるワクチン、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１を使用して同じ実験を繰り返したが、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスの接種に加えて、その同系の祖先株、ＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックの中へと皮下でＮＴ−２細胞も注射した。これはラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ分子に対する強い耐性を提示する。この場合も、以前示したように、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１は野生型ＦＶＢ／Ｎマウスの中でＮＴ−２腫瘍の増殖を減速した（図５３Ａ、左パネル）。しかしながら、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ応答が耐性によって限られているトランスジェニック宿主では、発明者らはすべての腫瘍の結果を観察した（図５３Ａ、右のパネル）。Ｆｌｋ−Ｅ１ワクチン接種に対して示されるように（図５３Ｃ）、これらの両方の結果が脾臓内および腫瘍部位において実証された内因性のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対して観察されるエピトープ拡大に影響を与える（図５３Ｂ）。このことは腫瘍退行のためには抗血管イベントは十分でないが、腫瘍死および最終的な退行のためにはむしろ腫瘍の血管系へと直接腫瘍細胞へとの両方を組み合わせた効果が必要とされることを示唆する。
＜実施例３１＞
【０４３８】
ＬＭ−ＬＬＯ−ＦＬＫ−１ワクチン断片を用いたワクチン接種が実験的転移の増殖を防止する
抗血管形成ワクチンに対する重要な使用目的は乳ガン転移の治療または防止とすることができる。転移する腫瘍細胞は、新しい血管の発生に高度に依存しているが、より小さい腫瘍は新しい血管系に完全に依存してはいない。しかしながら、腫瘍がある特定のサイズを超えて増殖すると、新しい血管の形成に高度に依存するようになり、したがって抗ＶＥＧＦＲ２  ＣＴＬに対する標的とすることができるようになるという仮説が立てられている。発明者らのワクチンが乳房の腫瘍の解離に対して保護することができるかどうかを試験するために、インビトロで培養された腫瘍細胞のマウスの尾静脈の中への直接接種を含む実験的転移システムを使用して、いくつかの下流器官、特に肺を急速にコロニー化した。ＮＴ−２モデルは尾静脈ワクチン接種後肺をうまくコロニー化しなかったので（データ図示せず）、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの侵攻性のマウスの乳ガン細胞株である４Ｔ１を使用した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、もしくはＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１、または対照Ｌｍワクチンのいずれかを用いてＢａｌｂ／ｃマウスに３週間の間に３回免疫化した。次いでマウスに５０，０００の４Ｔ１細胞を静脈内に注射し、同じ動物に皮下でも注射した。皮下部位注射を実施し、これにより原発性腫瘍増殖を測定することができるが、一方で静脈注射は転移を模倣したものである。Ｆｌｋ−１ワクチンで処置したマウスは対照マウスと比較して、腫瘍増殖が長くなり、原発性皮下腫瘍サイズが遅くなり、生存しているものが増加し、罹患率が減少した（図５４）。原発性４Ｔ１腫瘍に対して見られるような不良な応答とは異なり、シーディング速度および各々の動物の中に見出された転移の総数は、対照マウスと比較して処置した動物では著しく低かった（図５５Ａ）。おそらく４Ｔ１がマウスＨｅｒ−２／ｎｅｕを弱く発現するため、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕへのエピトープ拡大の低いレベルが観察された（図５５Ｂ）。
【０４３９】
Ｆｌｋ−１に対する免疫化が実験的転移を用いた肺組織のシーディングを防止することができるという仮説をより厳しく試験するために、非侵襲性撮像を使用して個別の腫瘍細胞および質量を可視化することができる生物発光モデルを使用した。Ｌｍ−Ｆｌｋ−Ｅ１および−Ｉ１ワクチンを用いた数ラウンドのワクチン接種の後、蛍ルシフェラーゼ遺伝子（４Ｔ１−Ｌｕｃ）を発現する５０，０００の４Ｔ１細胞をマウスに静脈注射した。毎週、マウスに麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基材（Ｄ−ルシフェリン）を注射し、かつ撮像した。肺シーディングは１１日目までに明らかになり、対照処置したマウスは２５日目までに４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞によって迅速にコロニー化した状態になったが、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１で処置したマウスのいずれも少なくとも３２日目まで肺シーディングのいかなる兆候も示さず、この時点で対照で処置したマウスは病気になり、犠牲にされた（図５５Ｃ）。３２日目には、Ｆｌｋ−１でワクチン接種したマウスのうちの２５％のみが何らかの肺腫瘍を示した。Ｌｍ−Ｆｌｋ−Ｅ１処置群については、腫瘍細胞に対するシグナルが２５日目には観察されたが、３２日目には観察されなかったので、この時点ではこの生物発光法によっては腫瘍質量は検出不可能であった可能性がある。２５日目のこの非常に小さいシグナルは１０００細胞の閾値より低く、後続の週の間に一部の細胞質量を失ってシステムに対する検出限界より下に下がっている可能性がある。対照Ｌｍを用いて免疫化したマウスは肺腫瘍によって急速に疾病になったが、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１  Ｌｍワクチン接種は腫瘍量、進行する時間（対照で処置したものの２５日目に対してＦｌｋ−１で処置したものは３２日目）、および最終的な疾患（図５４に示すような罹患率の減少）を遅延した。
＜実施例３２＞
【０４４０】
ＦＬＫ−１を用いた免疫化はマウスでは創傷治癒、妊娠、または生殖能力に影響を有しない
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンが血管形成阻害と関連付けられる毒性を生じるかどうかを評価するために、発明者らは免疫化マウスでの創傷治癒、妊娠、および生殖能力を研究した。マウスに、交尾する前または滅菌創傷パンチを行う前に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１、対照Ｌｍ、または生理食塩水単独を用いて３回免疫化した。発明者らは交尾したマウスを交尾から懐胎までの長さの間、平均の子の体重、および一腹の総数を観察した。創傷パンチは滅菌であったが、マウスは一緒にケージに入れていた。前述される方法に従って創傷治癒技法が後に続いた。各々の免疫化群からの５匹のマウスの毛を剃り、１匹の動物当たり２つの滅菌した創傷パンチを行い、次いで経時的に治癒させた。創傷閉鎖の時間を測定した。創傷閉鎖の時にかさぶたが残っておらず、完全な創傷治癒の完了と見なした。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２、またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１を用いた免疫化は、生殖能力、懐胎長さ、または誕生時の子の体重には影響を有しない（図５６Ａ）。同様に、免疫化は創傷閉鎖に必要な時間に有意な影響を有しない（図５６Ｂ）。
【０４４１】
Ｆｌｋ−Ｉ１の免疫化の後で観察されたＨｅｒ−２／ｎｅｕへの免疫応答がＦｌｋ−１とＨｅｒ−２／ｎｅｕとの間の共有するエピトープ間の交差反応に起因するかどうかを評価するために、Ｆｌｋ−Ｉ１ワクチンを用いて免疫化したＦＶＢ／ＮマウスをＦＬＫ−Ｉ１８３９−８４８への免疫性について評価した。これはラットＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ（配列番号：９９）に対して交差反応性である。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１を用いたマウスのワクチン接種は、それまでにマッピングしたＦｌｋ−Ｉ１エピトープＰＧＧＰＬＭＶＩＶ（配列番号：１０２）に対する優れた応答につながる。しかしながら、マウスＦｌｋ−Ｉ１８３９−８４８エピトープまたは相同性ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＩＣ１７３２−７４１エピトープのいずれかに対する有意な応答は見られなかった（図５７）。したがってＦｌｋ−Ｉ１の免疫化後に観察されたＨｅｒ−２／ｎｅｕへの免疫応答は、エピトープ拡大に起因する可能性が最も高く、共有エピトープ間の交差反応に起因するものではない。
【０４４２】
まとめると、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンは、一部の定着した乳房の腫瘍を撲滅し、残りの腫瘍内の微小血管密度を減少し、腫瘍の再チャレンジおよび実験的転移に対して保護し、腫瘍に関連する抗原Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの様々な領域へのエピトープ拡大を誘発することができる。腫瘍撲滅はＨｅｒ−２／ｎｅｕへのエピトープ拡大に依存し、腫瘍血管系の減少のみに起因するのではないことが見出された。しかしながら、ワクチン有効性は通常の創傷治癒には影響せず、また妊娠に関する毒性の副作用も有しない。したがって、抗血管形成ワクチンは内因性の腫瘍タンパク質へのエピトープ拡大を駆動する宿主血管系に対する耐性を克服することができ、活性腫瘍の退行を促進する。したがって、単一のワクチンを使用して腫瘍血管系および内因性の腫瘍抗原（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）との両方を標的化する新規の方法を本明細書に提示した。
＜実施例３３＞
【０４４３】
エスケープ突然変異体中に生じる突然変異
マウス
ＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼育された。マウスは実験開始に際して使用されるとき生後６〜８週間であり、実験はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの研究機関動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規制に従って行われた。
【０４４４】
リステリアワクチン株。
使用された株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１である。株Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹＥＳＯ１を抗原特異性のための第三者対照ワクチンとして使用した。細菌を３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用いて補助されたブレインハートインフージョン（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ）プレート上で選択し、次いで培養液内で増殖し、−８０℃にて１ｍＬのアリコートで凍結した。注射のために、投与の前にワクチンを滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した。
【０４４５】
自発性腫瘍保護。
抗Ｆｌｋ−１リステリアワクチンが自然発生的に生じる腫瘍に影響する能力を試験するために、発明者らはラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ分子を過剰発現して乳腺腫瘍を自然発生するメスのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスを使用した。これらの長期間保護研究のために、メスのマウス（Ｎ＝１５）に生後６週に開始して合計６回免疫化し、３週間ごとに生後２１週まで腹腔内で免疫化した。ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１、またはＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹＥＳＯ−１を０．１ＬＤ５０でＰＢＳ中に懸濁させて注射した。腫瘍量を毎週追跡した。腫瘍のサイズが１０ｍｍを超えると、動物を犠牲にして、腫瘍解析のために取り出した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用するカプラン・マイヤーログランク検定を使用して、各々のワクチン群と対照群との間の腫瘍増殖の発症の時点を比較して、自発性の腫瘍増殖の差異の統計的解析を行った。
【０４４６】
突然変異の解析およびマッピング。
腫瘍を新鮮なまま切り離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液の中へと定置し、４℃にて２週間未満の間保存する。保存された腫瘍からをＱｉａｇｅｎ  ｍＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）使用してｍＲＮＡを抽出し、次いでＰＣＲを介してｃＤＮＡを生成した。他のところ（Ｓｉｎｇｈ、２００７）に記述されるように、個別のＰＣＲサンプルをさらに分割してＨｅｒ−２／ｎｅｕの各々の個別の断片を、各々５００〜８００ｂｐのストレッチ（ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＩＣ１、ＩＣ２）で配列決定できるようにした。配列決定はＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＣＨＯＰ）のシークエンシング施設によって行い、次いで４Ｐｅａｋｓソフトウェア１．７．２を使用して解析した。４つ以上の個別のＰＣＲおよび配列決定の反応で発生しなかった突然変異は、ＰＣＲが誘発した突然変異として破棄した。ＭａｃＰｙＭｏｌを使用して分子モデリングを行った。
【０４４７】
ＰＣＲプライマー配列：
ＥＣ１  ＦＰ：ＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＣ（配列番号：１１０）
ＥＣ１  ＲＰ：ＴＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＴＡＴＴＣＧ（配列番号：１１１）
ＥＣ２  ＦＰ：ＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣ（配列番号：１１２）
ＥＣ２  ＲＰ：ＧＡＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＴＴＧＣ（配列番号：１１３）
ＥＣ３  ＦＰ：ＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣ（配列番号：１１４）
ＥＣ３  ＲＰ：ＴＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣ（配列番号：１１５）
ＩＣ１  ＦＰ：ＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧ（配列番号：１１６）
ＩＣ１  ＲＰ：ＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＣＧＧ（配列番号：１１７）
ＩＣ２  ＦＰ：ＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧ（配列番号：１１８）
ＩＣ２  ＲＰ：ＴＴＴＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＡＧＡＣＣ（配列番号：１１９）
【０４４８】
ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現するトランスジェニックＦＶＢ／ＮマウスにＦｌｋ−Ｅ１、Ｆｌｋ−Ｉ１、または対照Ｌｍを生後６週から３週間ごとにワクチン接種し、最終ワクチン接種後、腫瘍を毎週測定した。対照Ｌｍ−ワクチン接種と比較して、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１を用いたワクチン接種は腫瘍を有しないマウスのパーセンテージを増加した。３５週と４０週との間に、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１をワクチン接種したマウスの中に腫瘍を発生した多数のマウスがいた。各々のマウスからの腫瘍を、突然変異したＨｅｒ−２／ｎｅｕメッセージについて調べた。メッセージＲＮＡは収集され、ｃＤＮＡが合成されかつ配列決定された。結果として得られる配列は、野生型配列と並んで対になり、突然変異した残基を決定する。４回以上生じた突然変異のみを真の突然変異と見なした（図５８Ａ）。「ホットスポット」または突然変異した残基のストリングの中の突然変異した残基のうちのいくつかは、それまでにマッピングしたＣＴＬエピトープの中にある。１つのかかるエピトープは、エピトープのＨ２Ｄｑ  ＭＨＣ  Ｉ分子への固定を担当する主要なアミノ酸の突然変異を示す（図５８Ｂ）。
＜実施例３４＞
【０４４９】
乳房およびメラノーマ脳転移の標的化
上に記述したような方法を使用して実験を実施した。
【０４５０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕまたは対照ワクチン接種ＮＹＥＳＯ１のいずれかの各々のワクチンを用いて３回免疫化した。安定して蛍ルシフェラーゼ遺伝子（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉｎｎｅｓｏｔａのＪｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ研究室から入手したＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞）を発現するマウスの乳ガン細胞をインビトロで増殖させ、次いで麻酔をかけたマウスの脳の中へとマウス当たり５，０００細胞で注射した。低いレベルのマウスにＨｅｒ−２／ｎｅｕ（データ図示せず）細胞を発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞を、示される日に撮像する前に増殖させた。ＮＹＥＳＯ１−ワクチン接種したマウスでは脳転移が明らかに見られたが、一方で抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕワクチン接種は転移の実験的導入後３日目、８日目、および１１日目では脳腫瘍を制御した（図５９Ａ）。
【０４５１】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを抗ヒトＨＭＷＭＡＡ−Ｃまたは対照ワクチン接種ＮＹＥＳＯ１のいずれかの各ワクチンで３回免疫化した。Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃマウスメラノーマ細胞（ＵＣＳＦのＪｅｆｆ  Ｍｉｌｌｅｒ研究室から入手）をインビトロで増殖させ、次いで麻酔をかけたマウスの脳の中へとマウス一匹当たり５，０００個の細胞を注射した。Ｂ１６Ｆ１０親系統はＨＭＷＭＡＡ（人的伝達）を発現せず、したがってＨＭＷＭＡＡの唯一の源は周皮細胞およびグリア細胞である。抗ヒトＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃを用いたマウスのワクチン接種は転移の実験的導入後１１日目および１５日目で脳腫瘍を減少した（図５９Ｂ）。したがって、ＨＭＷ−ＭＡＡＣまたはＨｅｒ−２／ｎｅｕのいずれかを用いたワクチン接種は、腫瘍細胞がＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない場合でさえも脳転移に対して保護的である。
＜実施例３５＞
【０４５２】
新規の抗ＣＤ１０５／エンドグリンリステリアベースのワクチン治療の構築
エンドグリンのやや大きい断片（図６０）を発現するＬｍ株の構築体は、ＬＬＯに融合されると断片を分泌しないので、２つの新規なＬｍ構築体、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａ（ａａ１７〜３１９）およびＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂ（３５９〜５８８）へと設計し直された。これらはエンドグリン遺伝子のほぼ全体にわたり（図６１Ａ）、かつＲＡＮＫｐｅｐを使用して決定され、以前に標的化されていたエンドグリンの領域の外側にある推定ＣＴＬエピトープを含む（図６０）。より免疫優性エピトープをこれらの新規の構築体の中に潜在的に含むことによって、ＣＴＬエピトープのプールの増幅がワクチン有効性を強化するために使用される。さらに、融合タンパク質をより小さくし、かつ構築体から疎水性の高い領域を除去することによって、これらの融合タンパク質をＬｍによってよりよく分泌させる。これらの断片をコードする遺伝子はＣＤ１０５ｐＧＧ−３４の中へとクローニングされる（図６１Ｂ）。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａ（図６２）およびＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂ（図６３）の両方は適切なサイズの断片を発現および分泌した。
＜実施例３６＞
【０４５３】
ＬＭ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢがＢＡＬＢ／Ｃマウス内の乳房腫瘍４Ｔ１の原発性増殖および転移性増殖に対して影響を及ぼす
ＢＡＬＢ／ｃマウスの４Ｔ１乳房腫瘍、乳腺の中へと移植すると急速に転移するので、より悪性である乳房腫瘍モデルを実施例８に示すワクチンの最初の試験として選択した。２×１０５４Ｔ１細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪体内に移植した。１日目、８日目、および１５日目、または４日目、１１日目、および１８日目のいずれかに、マウスに２×１０８ｃｆｕの各々のワクチンを用いてワクチン接種した。無処置マウスまたは対照をワクチン接種したマウスと比較すると、両方のワクチン療法は腫瘍増殖の著しい減速を示した（図６４）。３２日目には、マウスを犠牲にして、その肺を取り出して転移性拡散について調べた。興味深いことに、肺表面の転移でＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂのみが統計的に有意な減少を示した（図６５）。
【０４５４】
次に、これらのマウスでＣＴＬ応答を調べた。最初の試みとして、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別することができるエンドグリン分子の免疫原性領域を決定するために、２つの断片をＲＡＮＫｐｅｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＲＡＮＫＰＥＰ／）およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）による解析に供した。これから２つの最も有望なペプチド、ＣＤ１０５Ａに対して：ＡＧＰＲＴＶＴＶＭ（配列番号：１２０）（Ｄｄｂｉｎｄｅｒ）、ＣＤ１０５Ｂに対して：ＡＹＳＳＣＧＭＫＶ（配列番号：１２１）（Ｋｄバインダー）が選択された。エンドグリン配列内でのこれらの位置は、図６１Ａで下線付きとした。
【０４５５】
４日目、１１日目、および１８日目、最後のワクチン接種に続く４日間にワクチン接種した、図１６Ｂに示すマウスから取った脾細胞を刺激するためにこれら２つのペプチドをＥＬＩＳｐｏｔ解析に使用した。しかしながら、ＨＩＶ  Ｇａｇからの対照のＨ−２ｄ制限ペプチドと比較して、これらはインターフェロンγを分泌するＴ細胞を刺激しなかった。このことはこれらがＣＴＬエピトープでないことを示唆する（図５５）。４Ｔ１によって低いレベルで発現される２つの内因性の腫瘍抗原へのエピトープ拡大も解析した。第１のものは、内因性のエコトロピックマウスの白血病ウイルスからのエンベロープ糖タンパク質、ｇｐ７０である。ｇｐ７０由来のＬｄ制限を有するＡＨ１と呼ばれるエピトープ、ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号：１２２）をＢａｌｂ／ｃマウスに対してマッピングした。興味深いことに、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡとＢとの両方がこの抗原へのエピトープ拡大を誘発したことが見出された。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕへのエピトープ拡大も調査された。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＥＣ１、およびＥＣ２の細胞外ドメイン内の２つの既知のエピトープ、ならびに細胞内ドメインからのものを使用した。対照ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１と比較していずれのエンドグリンワクチンについてもＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔｓのＩＣ１に対する有意な増加はないことが観察されたが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａワクチンを使用するＥＣ１およびＥＣ２への拡散が見られた（図６５）。
【０４５６】
マウスからの腫瘍を抗原特異的な浸潤性Ｔ細胞について調べ、これからＨｅｒ−２／ｎｅｕおよびｇｐ７０特異的なＴ細胞のために脾細胞を採取し、ＦＡＣＳおよび四量体解析を使用した。ＥＣ１、ＥＣ２、およびＡＨ１特異的な腫瘍内のＴ細胞の著しい増加が観察され、またＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ワクチン接種したマウスからのＩＣ１特異的なＴ細胞の、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１でワクチン接種したものと比較すると控えめな増加も観察された（図６６）。
＜実施例３７＞
【０４５７】
ＦＶＢ  ＨＥＲ−２／ＮＥＵトランスジェニックマウスに由来するＨＥＲ−２／ＮＥＵ陽性の乳房腫瘍ＮＴ２の増殖に影響するためのＬＭ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢの使用に関する研究
移植可能なＨｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍ＮＴ２を使用してエンドグリンワクチンをＦＶＢマウス内の他の乳房の腫瘍モデルで試験した。さらに、１×１０６腫瘍細胞をＦＶＢマウスに皮下で移植して、これらに４日目、１１日目、および１８日目に２×１０８ｃｆｕの各々のワクチンでＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢを用いて免疫化した。対照ワクチンとしてＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１を使用した。両方のワクチンは腫瘍増殖に有意な影響を受け（図６７）、６０日目には、ワクチン接種していない群またはＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹＥＳＯ１を用いてワクチン接種した群では腫瘍がないものがいなかったのと比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａを用いて免疫化したマウスの５０％には腫瘍がなく、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂを用いてワクチン接種したマウスの２５％には腫瘍がなかった。
＜実施例３８＞
【０４５８】
ＬＬＯコレステロール結合ドメインの部位特異的突然変異生成
ＣＢＤ内に不活性化点突然変異を導入するために、以下の戦略を使用して、部位特異的な突然変異誘発をＬＬＯに対して実施した。結果として得られるタンパク質は、「ｍｕｔＬＬＯ」と称される。
【０４５９】
ＬＬＯのｐＥＴ２９ｂの中へのサブクローニング
野生型ＬＬＯのアミノ酸配列は、
【化４】
2017511796.tif 000014
である。シグナルペプチドおよびコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）は下線付きであり、ＣＢＤ内の３つの重要な残基（Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２）は太字の斜字体である。
【０４６０】
６×Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）を、ＬＬＯのＣ末端領域に追加した。Ｈｉｓタグ付きＬＬＯのアミノ酸配列は、
【化５】
2017511796.tif 000015
であった。
【０４６１】
Ｈｉｓタグ付きＬＬＯタンパク質をコードする遺伝子をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩを用いて消化して、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩをＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間の発現ベクターｐＥＴ２９ｂの中へとサブクローンした。ＬＬＯタンパク質をコードする遺伝子の配列は、
【化６−１】
2017511796.tif 000016
【化６−２】
2017511796.tif 000017
である。下線付き配列は、配列の最初から順に、ＮｄｅＩ部位、ＮｈｅＩ部位、ＣＢＧコードする領域、６×Ｈｉｓタグ、およびＢａｍＨＩ部位である。次の工程で突然変異するように常在するＣＢＤは太字斜字体である。
重なった延長部による接合（ＳＯＥ）ＰＣＲ
【０４６２】
工程１：ＰＣＲ反応＃１および＃２をｐＥＴ２９ｂ−ＬＬＯテンプレート上で実施した。プライマー＃１および＃２を利用するＰＣＲ反応＃１は、ＣＢＤへの突然変異の導入を含む、ＮｈｅＩ部位とＣＢＤとの間の断片を増幅した。プライマー＃３および＃４を利用するＰＣＲ反応＃２は、ＣＢＤへの同じ突然変異の導入を含む、ＣＢＤとＢａｍＨＩ部位との間の断片を増幅した（図６９Ａ）。
【０４６３】
ＰＣＲ反応＃１サイクル：Ａ）９４℃にて２分３０秒、Ｂ）９４℃にて３０秒、Ｃ）５５℃にて３０秒、Ｄ）７２℃にて１分、工程Ｂ〜Ｄを２９回繰り返す（合計３０サイクル）、Ｅ）７２℃にて１０分。
【０４６４】
ＰＣＲ反応＃２サイクル：Ａ）９４℃にて２分３０秒、Ｂ）９４℃にて３０秒、Ｃ）６０℃にて３０秒、Ｄ）７２℃にて１分、工程Ｂ〜Ｄを２９回繰り返す（合計３０サイクル）、Ｅ）７２℃にて１０分。
【０４６５】
工程２：ＰＣＲ反応＃１および＃２の産物を混合し、アニールさせ（突然変異したＣＢＤをコードする領域において）、プライマー＃１および＃４を用いてＰＣＲをさらに２５サイクル実施した（図８Ｂ）。ＰＣＲ反応サイクル：Ａ）９４℃にて２分３０秒、Ｂ）９４℃にて３０秒、Ｃ）７２℃にて１分、工程Ｂ〜Ｃを９回繰り返す（合計１０サイクル）、プライマー＃１および＃４を追加する、Ｄ）９４℃にて３０秒、Ｅ）５５℃にて３０秒、Ｆ）７２℃にて１分、工程Ｄ〜Ｆを２４回繰り返す（合計２５サイクル）、Ｇ）７２℃にて１０分。
【０４６６】
プライマー配列：
プライマー１：ＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＧＴ（配列番号：１２６、ＮｈｅＩ配列は下線付き）。
プライマー２：
【化７】
2017511796.tif 000018
（配列番号：１２７、ＣＢＤコードする配列は下線付き、突然変異したコドンは太字の斜字体）。
プライマー３：
【化８】
2017511796.tif 000019
（配列番号：１２８、ＣＢＤコードする配列は下線付き、突然変異したコドンは太字の斜字体）。
プライマー４：ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＴＧＧ（配列番号：１２９、ＢａｍＨＩ配列は下線付き）。
野生型ＣＢＤ配列は、ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ（配列番号：１３０）である。
突然変異したＣＢＤ配列は、ＥＡＴＧＬＡＷＥＡＡＲ（配列番号：１３１）である。
【０４６７】
突然変異したＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片の配列は、
【化９】
2017511796.tif 000020
である。
＜実施例３９＞
【０４６８】
ＬＬＯ  ＣＢＤのＣＴＬエピトープを用いた部分的な置き換え
部位特異的な突然変異誘発をＬＬＯ上で実施し、ＣＢＤの９つのアミノ酸（ＡＡ）を抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１からのＣＴＬエピトープで置き換えた。ＣＢＤ（配列番号：１３０）の配列  は、配列ＥＳＬＬＭＷＩＴＱＣＲ（配列番号：１３３、突然変異した残基に下線付き）で置き換えられ、これは「ｃｔＬＬＯ」と称される」ＮＹ−ＥＳＯ−１からのＨＬＡ−Ａ２で制限されたエピトープ１５７−１６５を含有する。
【０４６９】
使用されるサブクローニング戦略は、前出の実施例と類似である。
【０４７０】
使用されるプライマーは、以下のとおりである。
プライマー１：ＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＧＴ（配列番号：１２６、ＮｈｅＩ配列は下線付き）。
プライマー２：
【化１０】
2017511796.tif 000021
（配列番号：１３４、ＣＢＤコードする配列は下線付き、突然変異した（ＮＹ−ＥＳＯ−１）コドンは太字の斜字体）。
プライマー３：
【化１１】
2017511796.tif 000022
（配列番号：１３５、ＣＢＤコードする配列は下線付き、突然変異した（ＮＹ−ＥＳＯ−１）コドンは太字の斜字体）。
プライマー４：ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＴＧＧ（配列番号：１２９、ＢａｍＨＩ配列は下線付き）。
【０４７１】
結果として得られるＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ断片の配列は、以下のとおりである。
【化１２】
2017511796.tif 000023
＜実施例４０＞
【０４７２】
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの乳腺内に移植した４Ｔ１腫瘍の増殖におけるデュアルＣＨＥＲ２−ＣＡ９リステリアワクチンの抗腫瘍有効性
実験の詳細：
組み換え型Ｌｍ（ＬｍｄｄＡ−ｃＨｅｒ２／ＣＡ９）を生成した。このＬｍ株は、標的腫瘍細胞を多重化するために、プラスミドを切断ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）への融合として使用して、キメラＨｅｒ２（ｃＨｅｒ２）タンパク質をゲノムリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）およびヒト炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）の断片への融合として染色体に発現および分泌する。
【表４】
2017511796.tif 000024
【０４７３】
ワクチン力価：
ＬｍｄｄＡ−ＰＳＡ−６．５×１０８
ＬｍｄｄＡ−ＣＡ９−１．４×１０１０
ＬｍｄｄＡ−ｃＨＥＲ２−１．０５×１０１０
デュアルｃＨｅｒ２−ＣＡ９（ＬｍｄｄＡ）−１．５×１０９
【０４７４】
実験プロトコル：
４Ｔ１細胞を１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−Ｇｌｕ、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ中で増殖した。注射の日に、細胞をトリプシン処理し、次いでＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を計数して、７×１０３細胞／５０mｌで再懸濁した。
【０４７５】
腫瘍を各々のマウスの乳腺内に移植した。１群当たり１６匹のマウスとした。３日後マウスにワクチン接種した。４日目に、各々の群内の４匹のマウスを安楽死させ、腫瘍増殖について調べた。１０日目に、マウスに各々のワクチンのブーストを与えた。１１日目に、各々の群内の４匹のマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。１８日目に、各々の群内の４〜５匹のマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。２１日目に、各々の群内の残りのマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。
結果
【０４７６】
４日目に、腫瘍はかろうじて触知可能であったので、測定は行わなかった。
【表５】
2017511796.tif 000025
【０４７７】
数字は２種混合ワクチン（２つの異種抗原を発現する組み換え型リステリア）が当初（１１日目）腫瘍質量に大きい影響を有することを示す（図７０）。安楽死させた２匹のマウスには腫瘍がなく、またもう一方は対照より小さく、ＣＡ９単独およびｃＨＥＲ２をワクチン接種したマウスのサイズと同程度であった。１８日目までに、いくつかの群の数匹のマウスで多発性腫瘍が測定される可能性がある。ＰＢＳおよびＰＳＡ対照マウスはＣＡ９単独およびｃＨＥＲ２、または２種混合ワクチン群よりずっと大きい腫瘍を有する。２種混合ワクチン群は、腫瘍量が大きい１つの異常値を有し、これを除けばその群に対する平均は最小であることになる。いくつかの群のマウスが重症とみられ、死につつあったため、実験を早期に終了した。しかしながら最後の測定では、２種混合ワクチン群のマウスは腫瘍が最も小さかった（図７０）。これは腫瘍増殖の制御のレベルに起因する可能性があり、これは早期に効果が見られた。
【０４７８】
結論として、２種混合ワクチンは、単独のワクチンまたは対照を用いて達成されるレベルより高い、２種混合ワクチン群としてのマウスが実験終了時に最も低い腫瘍量を有する、４Ｔ１モデルでの腫瘍制御の初期レベルを示す（図７０参照）。
【０４７９】
先行する実施例は、本発明の実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
＜実施例４１＞
【０４８０】
両方の異種抗原に対する免疫応答を引き出す、ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＴＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８融合タンパク質の同時発現および分泌による、抗腫瘍活性を強化した組み換え型Ｌ．モノサイトゲネスベクターの開発。
材料および方法：
ｐＡＤＶ１６８プラスミドの構築  ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ断片は、ｐＣＲ２．１−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８プラスミドからＸｈｏＩおよびＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼでの二重消化によって切り離される。この断片はすでにＸｈｏＩおよびＸｍａＩを用いて消化されたｐＡＤＶ１３４プラスミド内でクローニングされてＥ７遺伝子を切り離す。ｐＡＤＶ１６８プラスミドは、ＲＦＬＰおよび配列解析のために、ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）大腸菌株ＭＢ２１５９およびスクリーニング陽性クローンをエレクトロコンピテントへと電気穿孔させる。
【０４８１】
Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８、ならびに対照株ＬｍｄｄＡ−１６８、Ｌｍｄｄ−１４３／１３４およびＬｍｄｄＡ−１４３／１３４の構築。Ｌｍｄｄ、Ｌｍｄｄ−１４３、およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ｐＡＤＶ１６８プラスミドまたはｐＡＤＶ１３４プラスミドのいずれかで形質転換される。形質転換細胞を、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）で補助し、Ｄ−アラニンを含まないブレインハートインフージョン寒天培養基（ＢＨＩｓ培地）プレート上で選択した。個別のクローンをＬＬＯ−ＰＳＡ、ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８、およびｔＬＬＯ−Ｅ７分泌のために、細菌培養上清の中でウエスタンブロットによって、抗ＬＬＯ、抗ＰＳＡ，または抗Ｅ７抗体を使用してスクリーニングした。各々の株から選択されたクローンは、インビトロおよびインビボでの病毒性について評価されることになる。各々の株は最も安定な組み換え型クローンを選択するためにインビボで２回継代される。簡潔に述べると、各々の構築体から選択されたクローンを、増殖し、１×１０８ＣＦＵ／マウスで４匹のマウスの群に腹腔内に注射した。１日目および３日目に脾臓を採取し、均質化し、ＢＨＩ−寒天培養基プレート上にプレーティングした。第１継代後、各々の株から１つのコロニーが選択され、インビボで２回目に継代された。ベクターがその生存能力を損なうレベルまでさらに弱毒化するのを防止するために、独特の弱毒化レベルを有する２つのベクター内の構築体（Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８）を生成した。
【０４８２】
２つの抗原を融合タンパク質、ＬｍｄｄＡ２４４Ｇとして発現および分泌するように改変されたリステリア株の構築。抗原Ｈｅｒ２キメラはゲノムのリステリオリシンＯに遺伝学的に融合され、また第２の抗原ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（ＨＭＣ）はプラスミド中の切断リステリオリシンＯに融合される（図７１Ａ）。融合タンパク質ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２およびｔＬＬＯ−ＨＭＣの分泌が、抗ＬＬＯおよび抗ＦＬＡＧ抗体をそれぞれを使用してウエスタンブロットによって検出された（図７１B参照）。
【０４８３】
溶血性アッセイ。ファゴリソソームのエスケープを生じるゲノムＬＬＯの能力を決定するために、標的細胞として対照野生型１０４０３ＳおよびＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８ならびにヒツジ赤血球の分泌された上清を使用して溶血性アッセイを実施した。
【０４８４】
Ｊ７７４細胞でのインビトロの細胞内複製。マウスのマクロファージ様Ｊ７７４細胞株を使用してインビトロでの細胞内増殖アッセイを実施した。簡潔に述べると、単独のワクチン（ＬｍｄｄＡ１６４およびＬｍｄｄＡ１６８）または二価免疫療法のいずれか一方を用いて、Ｊ７７４細胞を媒体中で抗生剤なしで１：１のＭＯＩで１時間の間感染させた。感染後１時間の時点で、１０mｇ／ｍＬのゲンタマイシンで細胞を処置して細胞外細菌を殺した。定期的な時間間隔でサンプルを採取して、細胞内のＣＦＵの数を定量するために細胞を水で溶解した。溶解物の１０倍の段階希釈をＢＨＩプレート上に二重にプレーティングして、各々のサンプルでコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。
【０４８５】
インビボでの病毒性研究。４匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（生後７週）の群に、（１×１０８および１×１０９ＣＦＵ／回）の２つの異なる、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１６８、Ｌｍｄｄ−１４３／１３４、またはＬｍｄｄＡ−１４３／１３４株の投与量を腹腔内で注射した。マウスを生存性およびＬＤ５０推定について２週間の間追跡調査した。１×１０８より大きいＬＤ５０は、他のＬｍベースのワクチンでのそれまでの経験に基づいて許容可能な値を構造化する。
結果
【０４８６】
ｐＡＤＶ１６８プラスミドが順調に構造化されると、正しいＨＭＷ−ＭＡＡ配列の存在のために配列決定される。これらの新しい株の中のこのプラスミドは、各々の構築体に対して特異的なＬＬＯ融合タンパク質を発現および分泌する。これらの株を、ＡｃｔＡが不完全な（ＬｍｄｄＡ）株のために、少なくとも１×１０８ＣＦＵで、おそらく１×１０９ＣＦＵより高いＬＤ５０を用いて高度に弱毒化し、これはａｃｔＡ遺伝子を欠いていて、その結果として細胞間の拡散の能力を欠いている。
【０４８７】
組み換え型Ｌｍ（ＬｍｄｄＡ−ｃＨｅｒ２／ＨＭＣ）を生成した。このＬｍ株は、プラスミドを切断ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）への融合として使用してゲノムリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）およびＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８の断片（ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＣまたはＨＭＣとも名付けられた）への融合として、キメラＨｅｒ２（ｃＨｅｒ２）タンパク質を、ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８と同時に称される標的腫瘍細胞および腫瘍血管系へ染色体に発現および分泌する。ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＨＭＣおよびＬＬＯ−ｃＨｅｒ２の両方の発現および分泌が、ウエスタンブロットによって抗ＦＬＡＧおよび抗ＬＬＯ特異的な抗体を使用して検出された（図７１Ｂ）。さらに、ワクチンＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８は、ＬｍｄｄＡ−２４４Ｇの病毒性を安定化するためおよびこれが組み換え型融合タンパク質の発現を維持していることを確認するために、マウスの中でインビボで２回継代された（図７１Ｂ）。ワクチンＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８は、２回のインビボでのマウスの継代後、その融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＨＭＣおよびＬＬＯ−ｃＨｅｒ２の両方の発現および分泌する能力を保持していた。
【０４８８】
株ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８は、染色体のＬＬＯを融合タンパク質ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２として発現し、これはＬＬＯのファゴリソソームのエスケープを生じる機能的な能力に影響する場合がある。これを決定するために、標的細胞として対照野生型１０４０３ＳおよびＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８、ならびにヒツジ赤血球の分泌された上清を使用して溶血性アッセイを実施した。図７２Ａに示されるように、ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８の溶血性能力には野生型の高度に病毒性のＬｍ株１０４０３Ｓと比較すると１．５倍の減少がある。
【０４８９】
さらに、融合タンパク質ＬＬＯ−ｃＨｅｒ２の発現がＬｍｄｄＡ−ｃＨｅｒ２／ＨＭＣのマクロファージが感染するためおよびその細胞内増殖の能力にいかなる有害な効果も生じないかどうかを調べるために、細胞Ｊ７７４のようなマウスマクロファージを使用して細胞感染アッセイを実施した。図７２Ｂに特定するように、結果はシングル抗原またはデュアル抗原のいずれかを発現する異なるリステリアベースの免疫療法の細胞内増殖挙動が、同様に、２つの抗原の共発現がＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８の標的細胞内タンパク質に免疫学的応答を提示する能力にいかなる変化も生じないことを示唆することを示した。
＜実施例４２＞
【０４９０】
Ｌｍｄｄ−２４４Ｇ／１６８を用いた免疫化に際して引き出される免疫応答および抗腫瘍効果の検出。
Ｌｍｄｄ−２４４Ｇ−１６８株を用いた免疫化の際のマウスで、これらの抗原に対するＩＦＮ−γ産生の検出などの標準的な方法を使用して、ｃＨｅｒ２およびＨＭＷ−ＭＡＡに対する免疫応答を研究した。デュアル発現ベクターの治療的な有効性をＮＴ２乳房腫瘍モデルで試験した。
【０４９１】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ。発明者らは、２つの抗原、Ｈｅｒ２およびＨＭＷ−ＭＡＡ特異的な免疫応答をＦｖＢマウスの中に生成するための二価免疫療法の能力を評価した。ＬｍｄｄＡ１３４（Ｌｍ−対照）、ＬｍｄｄＡ１６４、およびＬｍｄｄＡ２４４Ｇ／１６８などの異なる免疫療法を用いてマウス（３匹／群）に０日目に免疫化して、１４日目にブーストした。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な免疫応答を２１日目に採取した脾臓内で検出した。キットの取扱説明書に従ってＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行い、脾細胞を細胞内領域（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ）（配列番号７６）に特異的なペプチドエピトープで刺激した。
【０４９２】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ。免疫化マウスの脾細胞内でのＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ特異的な免疫応答の発生は、ＨＭＡ−ＭＡＡ−Ｃタンパク質を用いて２日間細胞を刺激することによって決定された。ＩＦＮ−γ放出はマウスインターフェロンγ  ＥＬＩＳＡキットを使用して実施したＥＬＩＳＡによって検出された。
【０４９３】
抗腫瘍有効性。マウスＮＴ２乳房腫瘍モデルを使用して、抗腫瘍有効性を調べた。ＦｖＢマウスに０日目に１×１０６のＮＴ２細胞を移植して、右の脇腹に定着した腫瘍に６日目から１週間ごとの間隔で異なる免疫療法を用いて３つの免疫化の処置を開始した。研究終了まで、週に２回腫瘍をモニターした。腫瘍径が１．５ｃｍより大きくなった場合、マウスを安楽死させた。
結果
【０４９４】
次に、マウスのＮＴ２乳房腫瘍モデルを使用してＬｍｄｄＡ２４４Ｇの抗腫瘍治療的な有効性を調べた。定着したＮＴ２腫瘍を右の脇腹に持つＦｖＢマウスを、モノ抗原ＬｍｄｄＡ１６４（ＣｈＨｅｒ２）、ＬｍｄｄＡ１６８（ＨＭＣ）、または二価免疫療法ＬｍｄｄＡ２４４Ｇ−１６８を発現する異なる免疫療法のいずれかを用いて、一週間間隔で３とおりの免疫化で処置した。一価免疫療法および二価免疫療法の両方を用いた処置は、図７３Ａおよび図７３Ｃに示すように、ＮＴ２腫瘍の減少を生じた。しかしながら、二価免疫療法を用いた処置後、ＮＴ２腫瘍増殖の制御へのより強い影響が観察された。各々の群の中の腫瘍の無いマウスのパーセントの追加的な解析は、一価免疫療法で処置した群（４０％未満）と比較すると、二価免疫療法を用いた処置が腫瘍を有しないマウスを最も多く（７０％）生成したことを確認した。リステリア・モノサイトゲネスを療法のためのベクターとして使用して２つの抗原を同時に標的化することが結果として抗腫瘍有効性の強化をもたらすことを、これらの観察は支持する。
【０４９５】
二価免疫療法の能力は、２つの抗原、Ｈｅｒ２およびＨＭＷ−ＭＡＡ特異的な免疫応答をＦｖＢマウスの中に生成すると評価された。ＬｍｄｄＡ１３４（無関連対照）、ＬｍｄｄＡ１６４、およびＬｍｄｄＡ２４４Ｇ／１６８などの異なる免疫療法を用いてマウスに０日目に免疫化して、１４日目にブーストした。細胞内領域に対して特異的なペプチドエピトープを使用するＥＬＩＳｐｏｔベースのアッセイを使用してＨｅｒ２／ｎｅｕ特異的な免疫応答を検出した。Ｈｅｒ２を発現する一価免疫療法および二価免疫療法の両方は、ＥＬＩＳｐｏｔベースのアッセイを使用して検出される同等のレベルの免疫応答を生成した（図７４参照）。
【０４９６】
免疫化マウスの生成およびその脾細胞内のＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ特異的な免疫応答がＥＬＩＳＡを使用して検出された。シングルコピー（一価免疫療法）またはマルチコピー（二価免疫療法）のいずれかをベースとする発現を使用するＬｍからの腫瘍抗原の発現は、同等のレベルの抗原特異的な免疫応答を生成する（図７４参照）。
＜実施例４３＞
【０４９７】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺内に移植した４Ｔ１腫瘍の増殖におけるデュアルｃＨＥＲ２−ＨＭＷ−ＭＡＡリステリアワクチンの抗腫瘍有効性。
実験の詳細：
組み換え型Ｌｍ（ＬｍｄｄＡ−ｃＨｅｒ２／ＨＭＷ−ＭＡＡ）を生成した。このＬｍ株は、標的腫瘍細胞を多重化するために、プラスミドを切断ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）への融合として使用して、キメラＨｅｒ２（ｃＨｅｒ２）タンパク質をゲノムリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）および高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）への融合として染色体に発現および分泌する。
【表６】
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【０４９８】
ワクチン力価：
ＬｍｄｄＡ−ＰＳＡ−６．５×１０８
ＬｍｄｄＡ−ＨＭＷ−ＭＭＡ−１．４×１０１０
ＬｍｄｄＡ−ｃＨＥＲ２−１．０５×１０１０
デュアルｃＨｅｒ２−ＨＭＷ−ＭＭＡ（ＬｍｄｄＡ）−１．５×１０９
【０４９９】
実験プロトコル：
【０５００】
４Ｔ１細胞を１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−Ｇｌｕ、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ中で増殖した。注射の日に、細胞をトリプシン処理し、次いでＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を計数して、７×１０３細胞／５０mｌで再懸濁した。
【０５０１】
腫瘍を各々のマウスの乳腺内に移植した。１群当たり１６匹のマウスとした。３日後マウスにワクチン接種した。８日目に、各々の群内の４匹のマウスを安楽死させ、腫瘍増殖について調べた。８日目に、マウスに各々のワクチンのブーストを与えた。１５日目に、各々の群内の４匹のマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。１５日目に、マウスに各々のワクチンの別のブーストを与えた。１５日目、２１日目、２８日目、および３５日目に、各々の群内の４〜５匹のマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。４２日目に、各々の群内の残りのマウスを安楽死させ、腫瘍を測定した。
結果
【０５０２】
結果を図７５に要約した。グラフは２種混合ワクチン（２つの異種抗原を発現する組み換え型リステリア）が腫瘍体積に大きい影響を有することを示す（図７５）。二価療法を受けているマウス内の腫瘍の体積は、対照と、モノＨＭＷ−ＭＭＡおよびｃＨＥＲ２ワクチン接種したマウスとの両方より小さい。ＰＢＳおよびＰＳＡ対照マウスはモノＨＭＷ−ＭＭＡおよびｃＨＥＲ２群と体積が同等の腫瘍を有する。
【０５０３】
結論として、２種混合ワクチンは、４Ｔ１モデルで初期レベルの腫瘍制御を示し、２種混合ワクチン群は実験終了時の腫瘍量が最も小さいので、これはモノワクチンまたは対照マウスを用いて達成されたレベルより高い（図７５参照）。
＜実施例４４＞
【０５０４】
ＮＴ２乳房腫瘍モデルの増殖でのデュアルおよび連続的ＣＨＥＲ２−ＨＭＷ−ＭＡＡリステリアワクチンの抗腫瘍有効性の比較研究
実験の詳細：
マウスのＮＴ２乳房腫瘍モデルを使用して抗腫瘍有効性を調べた。ＦｖＢマウスに０日目に１×１０６のＮＴ２細胞を移植して、右の脇腹に定着した腫瘍に６日目から１週間ごとの間隔で異なる免疫療法を用いて３つの免疫化の処置を開始した。研究終了まで、週に２回腫瘍をモニターした。腫瘍径が１．５ｃｍより大きくなった場合、マウスを安楽死させた。
【表７】
2017511796.tif 000027
結果
【０５０５】
マウスのＮＴ２乳房腫瘍モデルを使用して異なるリステリアワクチン組織物の抗腫瘍の治療的な有効性を調べた。１×１０８の、単独の抗原ＬｍｄｄＡ１６４（ＣｈＨｅｒ２）、ＬｍｄｄＡ１６８（ＨＭＣ）を発現する療法、または同時に投与する両方の抗原を発現する療法の組合せ（二価療法）のいずれかの異なる免疫療法を用いた５つの免疫化を用いて、一週間間隔で、定着したＮＴ２腫瘍を右の脇腹に持つＦｖＢマウスを処置した。加えて、単独の抗原ＬｍｄｄＡ１６４（ＣｈＨｅｒ２）、ＬｍｄｄＡ１６８（ＨＭＣ）を発現する療法、同時に投与する両方の抗原を発現する療法の組合せ（二価療法）、または各々の単独の抗原の連続的な投与の組合せ（ｃＨｅｒ２に続いてＨＭＷ−ＭＡＡ）のいずれかの異なる免疫療法を用いて、組合せ療法対連続的療法を実施した。後者では、３回の毎週の投与でＬｍｄｄＡ１６４（ＣｈＨｅｒ２）を投与して、ＬｍｄｄＡ１６８（ＨＭＣ）の３回の毎週の投与が後に続いた。結果を図７６に要約した。図７６に示されるように、すべての組織物はＮＴ２腫瘍体積のほぼ均等な減少を生じた。これらの観察は、２つの一価構築体の同時投与または連続的な投与が、腫瘍増殖を制御するうえで二価構築体と少なくとも同等であることを示す（図７６）。
【０５０６】
添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を記述してきたが、本発明は厳密に実施形態に限定されず、かつ添付の特許請求の範囲に定義されるように、当業者によって本発明の範囲または趣旨から逸脱することなくこれらに様々な変更および修正がなされてもよいことが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５０Ｄ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５１Ｄ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５４Ｄ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５５Ｄ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７３Ｃ】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７５】
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【図７６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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