(57)【要約】  アルドール縮合においてアセトアルデヒドをアクセプターとしてもドナーとしても受容することができるアルドラーゼを使用して、２分子のアセトアルデヒドを縮合して３−ヒドロキシブタナールを形成する３−ヒドロキシブタナール合成経路を介する、少なくとも１種類の内在性中心代謝中間体からの３−ヒドロキシブタナールまたは３−ヒドロキシブタナールの下流産物の微生物による産生を増強する遺伝子改変をゲノム中に含む、非天然微生物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルドール縮合においてアセトアルデヒドをアクセプターとしてもドナーとしても受容することができるアルドラーゼを使用して、２分子のアセトアルデヒドを縮合して３−ヒドロキシブタナールを形成する３−ヒドロキシブタナール合成経路を介する、少なくとも１種類の内在性の中心代謝中間体からの３−ヒドロキシブタナールまたは３−ヒドロキシブタナールの下流産物の微生物による産生を増強する遺伝子改変をゲノム中に含む、非天然微生物。
【請求項２】
前記遺伝子改変が、前記少なくとも１種類の内在性中心代謝中間体からのアセトアルデヒドの産生、またはアルドラーゼのアルデヒドの利用可能性も増加させる、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項３】
前記遺伝子改変によって、
（ｉ）１種類以上の中心代謝中間体からのアセトアルデヒドの生成に利用される活性を有する酵素をコードする異種性遺伝子が導入され、
（ｉｉ）１種類以上の中心代謝中間体からのアセトアルデヒドの生成に利用される活性を有する少なくとも１種類の内在性酵素が上方制御され、および／または
（ｉｉｉ）アセトアルデヒドを基質として利用する内在性酵素が下方制御または不活性化され、
それによってアセトアルデヒドの産生またはアルドラーゼのアセトアルデヒドの利用可能性を高め、それによってアルドラーゼからの３−ヒドロキシブタナールの産生を増加させる、請求項２に記載の非天然微生物。
【請求項４】
前記遺伝子改変によって３−ヒドロキシブタナールまたは３−ヒドロキシブタナールの下流産物の産生能力が増加し、ここで前記下流産物は３−ヒドロキシブタナールの還元、酸化および／またはコエンザイムＡによるアシル化から直接的または間接的に得られるものである、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
前記下流産物が
（ｉ）１，３−ＢＤＯ、２−ヒドロキシイソ酪酸、クロチルアルコール、クロトン酸、ブタノール、酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシブチルアミン、ポリヒドロキシブチレート、アセトン、イソプロパノール、２−メチルコハク酸から選択され、および／または
（ｉｉ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡ、クロトンアルデヒド、ブチリルＣｏＡ、ブタナール、アセトアセチルＣｏＡ、およびアセト酢酸から選択される中間体を経て得られる、
請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
前記遺伝子改変が存在しない場合には、前記下流産物を産生する能力を欠いている未生物である、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
前記遺伝子改変が、
（ｉ）アルドラーゼをコードする少なくとも１つの異種性遺伝子の導入、及び
（ｉｉ）アルドラーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の上方制御
のいずれか一方である、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８】
前記異種性遺伝子が、３−ヒドロキシブタナール経路に関係する１種類以上の他の酵素もコードする融合タンパク質としてのアルドラーゼをコードしている、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
前記３−ヒドロキシブタナール経路に関係する前記１種類以上の他の酵素が、アルドラーゼの基質であるアセトアルデヒドの供給を増大する活性、または３−ヒドロキシブタナールを下流産物に変換する活性を提供する、請求項８に記載の微生物。
【請求項１０】
前記アルドラーゼがＥＣ４．１．２．４の酵素である、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
アルドラーゼが、２分子のアセトアルデヒドを縮合して３−ヒドロキシブタナールを形成することが可能である、表６の酵素および表６の酵素の変異体のうちから選択される、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
アルドラーゼがデオキシリボースホスフェートアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）である、請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
前記アルドラーゼが大腸菌、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス、アセトバクテリウム・ウッディイ、所望によりピロバクルム・アエロフィルムであってもよいピロバクルム属の種から得られてもよい、請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１４】
前記下流産物が１，３−ＢＤＯであり、且つ、３−ヒドロキシブタナールの１，３−ＢＤＯへの還元と比べてアセトアルデヒドのエタノールへの還元を優先する内在性アルコールデヒドロゲナーゼが前記遺伝子改変によって下方制御または不活性化されている、請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１５】
前記中心代謝中間体がアセチルＣｏＡおよびピルビン酸のうち一方または両方から選択される、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１６】
中心代謝中間体が１つ、２つ、または３つの酵素ステップを介してアセトアルデヒドに変換される、請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１７】
前記遺伝子改変がそれぞれ３−ヒドロキシブタナール経路の酵素をコードする１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、８つ、または９つの異種性遺伝子の導入を含む、請求項１から請求項１６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１８】
前記遺伝子改変が、次の３−ヒドロキシブタナール経路の酵素、すなわち
（ｉ）原料からの中心代謝中間体の生成に利用される活性を有する酵素、
（ｉｉ）中心代謝中間体からのアセトアルデヒドの生成に利用される活性を有する酵素、
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシブタナールの下流産物の生成に利用される活性を有する酵素
のうちの１つ以上をコードする異種性遺伝子の導入を含む、請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１９】
生物ゲノムにコードされる次の代謝経路、すなわちウッド・リュングダール経路、リブロースモノホスフェート（ＲｕＭＰ）経路、逆ＴＣＡ回路、セリン回路、解糖、ペントースリン酸経路、カルビン回路、３−ヒドロキシプロピオン酸回路、ジカルボン酸回路／４−ヒドロキシ酪酸回路のうちの１つ以上によって生物の中でアセチルＣｏＡおよびピルビン酸が生成される、請求項１から請求項１８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２０】
アセトゲン、より好ましくは一酸化炭素資化アセトゲンである請求項１９に記載の微生物。
【請求項２１】
シンガス、ＣＯ２、ＣＯ、およびＨ２、メタノール、糖およびそれらの組合せのうちから選択される原料から３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を産生する能力、または前記原料からの３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物のフラックスを増加させる能力が前記遺伝子改変によって付与されている、ゲノム中にウッド・リュングダール経路が天然でコードされている請求項２０に記載の微生物。
【請求項２２】
メタノール原料からの中心代謝中間体の生成に利用される１種類以上のメチルトランスフェラーゼ酵素をゲノム中にコードしており、前記メチルトランスフェラーゼ酵素が所望により前記微生物にとって異種性であってもよい、請求項１９から請求項２１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２３】
前記メチルトランスフェラーゼ酵素が、メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）、コリノイドプロテイン（ＭｔａＣ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドプロテインメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドプロテインメチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）からなるリストより選択される、請求項２２に記載の微生物。
【請求項２４】
メチロトローフまたはメタノトローフである、請求項１から請求項１９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２５】
メタノール、メタン、およびそれらの両方、のうちから選択される原料から３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を産生する能力、または前記原料からの３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物のフラックスを増加させる能力が前記遺伝子改変によって付与されている、ゲノム中に天然でＲｕＭＰ回路経路またはセリン回路経路がコードされている請求項２４に記載の微生物。
【請求項２６】
中心代謝中間体の生成に利用されるカルビン回路を構成する酵素をゲノム中にコードする請求項１から請求項１９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２７】
ゲノム中に天然でウッド・リュングダール経路がコードされており、且つ、アセチルＣｏＡを酢酸に変換する内在性の酵素が前記遺伝子改変によって下方制御または不活性化されている、請求項２１に記載の微生物。
【請求項２８】
アセチルＣｏＡを酢酸に変換する前記酵素の活性が内在性ホスホトランスアセチラーゼまたは内在性酢酸キナーゼである、請求項２７に記載の微生物。
【請求項２９】
３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物が蓄積しそれを回収することができるように、または３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を酵素的または化学的にさらに変換することができるように、酢酸から３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を産生する能力、または酢酸からの３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物のフラックスを増加させる能力を付与する酵素活性をコードする異種性遺伝子の導入またはそのような酵素活性をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の上方制御が前記遺伝子改変に含まれる、請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３０】
前記酵素の活性が、酢酸からのアセチルＣｏＡを経たアセトアルデヒドの生成に利用されるものである、請求項２７に記載の微生物。
【請求項３１】
前記酵素の活性が、酢酸からのアセチルＣｏＡの生成に使用され、その酵素活性がＥＣ６．２．１．１およびＥＣ２．８．３．８のうちから選択されてもよいアセチルＣｏＡシンテターゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼである、請求項２７から請求項３０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３２】
アセチルＣｏＡ合成活性が、酢酸からのアセチルＣｏＡの生成が可能である、表５の酵素および表５の酵素の変異体のうちから選択される、請求項２７から請求項３１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３３】
前記酵素活性がカルボン酸レダクターゼ活性である、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３４】
カルボン酸レダクターゼ活性が、酢酸のアセトアルデヒドへの還元が可能である、表１の酵素および表１の酵素の変異体のうちから選択される、請求項２９または請求項３３に記載の微生物。
【請求項３５】
３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物が蓄積し、それを回収することができるように、または３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を酵素的または化学的にさらに変換することができるように、中心代謝中間体であるアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を産生する能力、またはアセチルＣｏＡからの３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物のフラックスを増加させる能力を付与する酵素活性をコードする異種性遺伝子の導入またはそのような酵素活性をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の上方制御が前記遺伝子改変に含まれる、請求項１から請求項３４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３６】
前記酵素活性がアセチルＣｏＡからのアセトアルデヒドの生成に利用される、請求項３５に記載の微生物。
【請求項３７】
前記酵素活性がアルデヒドデヒドロゲナーゼであり、所望によりアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼでもよい、請求項３６に記載の微生物。
【請求項３８】
前記酵素活性がＥＣ１．２．７．１、ＥＣ４．１．１．１、ＥＣ１．２．１．１０から選択される、請求項３６または請求項３７に記載の微生物。
【請求項３９】
前記酵素活性が、アセチルＣｏＡのアセトアルデヒドへの変換が可能である表２の酵素および表２の酵素の変異体のうちから選択される、請求項３６から請求項３８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４０】
前記酵素活性が、アセチルＣｏＡのピルビン酸への変換が可能である表３の酵素および表３の酵素の変異体のうちから選択される、請求項３６に記載の微生物。
【請求項４１】
３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物が蓄積し、それを回収することができるように、または３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を酵素的または化学的にさらに変換することができるように、中心代謝中間体であるピルビン酸から３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を産生する能力、またはピルビン酸からの３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物のフラックスを増加させる能力を付与する酵素活性をコードする異種性遺伝子の導入またはそのような酵素活性をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の上方制御が前記遺伝子改変に含まれる、請求項１から請求項２０のいずれか一項、または請求項４０に記載の微生物。
【請求項４２】
前記酵素活性がピルビン酸からのアセトアルデヒドの生成に利用される、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４３】
前記酵素活性がピルビン酸デカルボキシラーゼである、請求項４１または請求項４２に記載の微生物。
【請求項４４】
前記酵素活性が、ＥＣ１．２．７．１、ＥＣ１．２．１．５１、ＥＣ１．２．４．１、ＥＣ１．２．１．１０、ＥＣ４．１．１．１から選択される、請求項４２または請求項４３に記載の微生物。
【請求項４５】
前記酵素活性が、ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換が可能である表３の酵素および表３の酵素の変異体のうちから選択される、請求項４２から請求項４４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４６】
前記酵素活性が、ピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換が可能である表４の酵素および表４の酵素の変異体のうちから選択される、請求項４２から請求項４４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４７】
ピルビン酸を乳酸または他の産物に変換することが可能である内在性酵素が前記遺伝子改変によって下方制御または不活性化されている、請求項４１から請求項４６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４８】
ピルビン酸を乳酸または他の産物に変換することが可能である内在性酵素が、ＬＤＨまたはリンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはピルビン酸ギ酸リアーゼであり、所望により１．１．１．２７または１．１．１．３７または２．３．１．５４から選択されてもよい、請求項３５に記載の微生物。
【請求項４９】
３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯに変換する能力を付与する酵素活性をコードする異種性遺伝子の導入またはそのような酵素活性をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の上方制御が前記遺伝子改変に含まれる、請求項１から請求項４８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５０】
酵素が所望によりＥＣ１．１．１．−として分類されてもよいアルコールデヒドロゲナーゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する、請求項４９に記載の微生物。
【請求項５１】
酵素活性がアセトアルデヒドと比べて３−ヒドロキシブタナールを優先する中鎖アルコールデヒドロゲナーゼである、請求項５０に記載の微生物。
【請求項５２】
酵素活性が、３−ヒドロキシブタナールの１，３−ブタンジオールへの変換が可能である、表７の酵素および表７の酵素の変異体のうちから選択される、請求項４９から請求項５１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５３】
前記３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を産生するために充分な期間にわたって請求項１から請求項５２のいずれか一項に記載の微生物を培養することを含む、３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を生産するためのプロセス方法。
【請求項５４】
前記微生物が請求項２０、請求項２１、請求項２７または請求項２８において規定されるアセトゲンであり、且つ、前記微生物が糖、メタノール、ＣＯ２、Ｈ２、ＣＯ、シンガス、またはその混合物から選択される原料と接触して培養される、請求項５３に記載のプロセス。
【請求項５５】
前記微生物が請求項２２または請求項２３に規定されるアセトゲンであり、且つ、前記微生物がメタノール、および所望によりＣＯ２であってもよいメタノールよりも酸化された補助基質から選択される原料と接触して培養される、請求項５３に記載のプロセス。
【請求項５６】
前記微生物が請求項２４または請求項２５において規定されるメチロトローフまたはメタノトローフであり、且つ、前記微生物がメタノール、メタンから選択される原料と接触して培養される、請求項５３に記載のプロセス。
【請求項５７】
前記微生物が請求項２６において規定される通りであり、且つ、前記微生物が太陽光の下で培養される藻類または光合成細菌である、請求項５３に記載のプロセス。
【請求項５８】
３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を回収することをさらに含む、請求項５３から請求項５７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５９】
３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を、所望により１，３−ブタンジエンおよびメチルエチルケトンから選択されてもよい、化合物に変換することをさらに含む請求項５３から請求項５８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６０】
前記遺伝子改変を親株に導入することを含む、請求項１から請求項５２のいずれか一項に記載の微生物を作製するためのプロセス。
【請求項６１】
前記親株が３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物を産生する能力を欠いている、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６２】
３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物のフラックスを増加させるための請求項６０または請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６３】
前記遺伝子改変が
（ｉ）酵素をコードする少なくとも１つの異種性遺伝子の導入、および
（ｉｉ）酵素をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の上方制御
のいずれかを含む、請求項６０から請求項６２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６４】
請求項６０から請求項６３のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた、または得られる非天然微生物。
【請求項６５】
請求項５３から請求項５９のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた、または得られる下流産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、中間体であるアセトアルデヒドおよび３−ヒドロキシブタナールを経て微生物によって産生され得る汎用化学薬品、例えば１，３−ブタンジオールおよびその誘導体の生産能力が高くなるように改変された微生物、ならびに関連の材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）は食品産業、化学工業、および製造業における用途をはじめとする多数の用途を有する四炭素ジオールである。
【０００３】
１，３−ＢＤＯは伝統的に石油由来のアセチレンからその水和によって生産されている。それにより生じたアセトアルデヒドを次に３−ヒドロキシブタナールに変換し、その後にそれを還元して１，３−ＢＤＯを生成する。近年ではアセチレンはアセトアルデヒドの原料として価格が安いエチレンに置き換えられている。しかしながら、原油が天然ガスよりも相対的に高価になったため、多くのエチレンクラッキング業がより高いマージンを稼ぐためにより軽い天然ガス原料を使用しており、それによってＣ４化学薬品の量が著しく少なくなり、価格が上昇している。
【０００４】
化学薬品製造の環境インパクトを最小限にしつつ、安価で容易に利用可能な原料の柔軟性を増大させることが持続可能な化学工業の２つの目標である。原料の柔軟性は化学薬品製造の一次原料としての広範囲の材料の入手および使用を可能にする方法の導入に依存する。アセチレンまたはエチレンのいずれについても石油系原料に依存していることが、１，３−ブタンジオール、ブタジエン、およびメチルエチルケトンなどの他の価値のある化学薬品への再生可能な、またはより安価な、または非石油由来の原料をベースとするルートを開発することの正当な理由となる。
【０００５】
１，３−ＢＤＯの蓄積に影響するように微生物が改変された公開物には次のもの、すなわち米国特許出願公開第２０１３０１０９０６４号、米国特許出願公開第２０１２０３２９１１３号、欧州特許第２４９５３０５（Ａ１）号、米国特許第８２６８６０７号、米国特許出願公開第２０１１０２０１０６８号、米国特許出願公開第２０１００３３０６３５号および国際公開第２０１４０３６１４０号が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
それでも、持続可能であり、および／または１，３−ブタンジオールおよび他の重要な化学薬品の伝統的な石油系原料よりも安価な微生物、および発酵のためのそれらの使用方法を開発することが当技術分野に貢献することが分かる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、中心代謝中間体であるアセチルＣｏＡおよびピルビン酸を共通経路中間体であるアセトアルデヒドに変換し、次にそれを酵素的に触媒されるアルドール縮合され、最終的に１，３−ブタンジオールまたは他の産物を産生する能力を拡大する、または増強するための生物の改変に関する。より具体的には、本発明の改変生物では２分子のアセトアルデヒドを縮合して３−ヒドロキシブタナールを形成することが可能であるアルドラーゼの基質として、アセチルＣｏＡまたはピルビン酸に由来する一次経路産物としてのアセトアルデヒドが供給される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
３−ヒドロキシブタナールはアルドール縮合の産物であり、次に他の天然代謝経路または非天然代謝経路に入ることができる他の産物または他の中間体に回すことができる。
【０００９】
中間体の例には、２−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡ、クロトンアルデヒド、ブチリルＣｏＡ、ブタナール、アセトアセチルＣｏＡ、およびアセト酢酸が含まれる。
【００１０】
望ましい下流産物には２−ヒドロキシイソ酪酸、クロチルアルコール、クロトン酸、ブタノール、酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、１，３−ブタンジオール、３−ヒドロキシブチルアミン、ポリヒドロキシブチレート、アセトン、およびイソプロパノールが含まれる。
【００１１】
これらの産物は所望によりさらにその他の汎用品、例えばブタジエン、メタクリル酸、２−メチル−１，４−ブタンジオール、メチルテトラヒドロフラン、イソプレンを製造するために回収され、使用され得る。
【００１２】
これらの中間産物、下流産物、および汎用品のうちのいずれも、本明細書において簡潔に表現するため、「下流産物」または「産物」と本明細書において呼ぶことができる。
【００１３】
好ましい産物は１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）である。
【００１４】
本発明の改変生物は、典型的には、適切な代謝中間体を生成するために太陽光、炭水化物、メタノール、合成ガス（シンガス）および／またはメタンのような他の気体状炭素源などの再生可能または安価な原料またはエネルギー源を使用することができる微生物である。
【００１５】
以下でより詳細に説明されるように、中心代謝中間体からのアセトアルデヒドの産生を拡大または増強すること、またはアルドラーゼへのアルデヒドの利用可能性を高めることは、典型的には、
（ｉ）中心代謝中間体のうちの１種類以上からのアセトアルデヒドの生成に利用される活性を有する酵素をコードする異種性遺伝子を導入すること、
（ｉｉ）中心代謝中間体のうちの１種類以上からのアセトアルデヒドの生成に利用される活性を有する少なくとも１種類の内在性酵素を上方制御すること、および／または
（ｉｉｉ）アセトアルデヒドを基質として利用する内在性酵素を下方制御または不活化すること（それによってアセトアルデヒドをアルドラーゼにとってより利用しやすいものにすること）
のうちの１つ以上を含む。
【００１６】
典型的には、２分子のアセトアルデヒドの３−ヒドロキシブタナールへのインビボ縮合が可能であるアルドラーゼ自体も、例えば下で説明されるような異種性アルドラーゼの導入を介した遺伝子操作の産物である。
【００１７】
したがって、これらの変更を組み合わせた遺伝子改変は、中心代謝中間体がアセトアルデヒド中間体を経て３−ヒドロキシブタナールへのフラックスを増加させるように働く。好ましい実施形態ではこの３−ヒドロキシブタナールはその後、下で説明されるような下流産物に仕向けられる。
【００１８】
したがって、１つの態様では、アルドール縮合においてアルデヒドをアクセプターとしてもドナーとしても受容することができるアルドラーゼを使用して２分子のアセトアルデヒドを縮合して３−ヒドロキシブタナールを形成する３−ヒドロキシブタナール合成経路を介する、少なくとも１種類の内在性中心代謝中間体からの３−ヒドロキシブタナールの産生を増強する遺伝子改変をゲノム中に含む非天然微生物が提供される。
【００１９】
当業者によって充分に理解される通り、ある経路の中間産物という背景における「産生の増強」または「量が増加した」産生が産生の増大の結果であることは当然であるが、それは前記微生物の細胞中での産物の絶対濃度または定常期濃度の増加を必要とするものと理解されてはならない。むしろそれは、その産物が蓄積せず、続いてその他の産物に変換される場合であっても、問題のその産物のより速い産生（すなわち、その経路を通過するより高い経路フラックス）を含むことが理解されるものとする。
【００２０】
好ましい生物は、３−ヒドロキシブタナールが１，３−ＢＤＯに還元される１，３−ＢＤＯ合成経路を介する１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）の産生が、前記改変によって増強されている生物である。したがって、以下の開示ではこの実施形態が特に強調される。しかしながら、本発明は３−ヒドロキシブタナールが他の下流産物に変換される改変および経路にも同様に適用されることも理解されるものとし、文脈から別途要求されない限り１，３−ＢＤＯに関連する実施形態の各々は必要な変更を加えてこれらの他の産物に適用されることが理解されるものとする。
【００２１】
前記遺伝子改変は、同じ条件下において同じ原料または同じエネルギー源の上で培養されたときに前記遺伝子改変を含まない対応する基準微生物と比べて前記改変生物が３−ヒドロキシブタナールの、または３−ヒドロキシブタナールを経る（したがって、下流中間体の、または下流中間体を経る）１，３−ＢＤＯなどのその産物へのフラックスを増加させるようなものになる。例えば、前記改変生物は同じ条件下で前記基準生物と比べて少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍多い３−ヒドロキシブタナール、またはより好ましくは１，３−ＢＤＯなどの下流産物を産生してよい。
【００２２】
本開示における「非天然」は、３−ヒドロキシブタナールまたは１，３−ＢＤＯなどの下流産物へのフラックスを増加させる適切な改変が人為介入によって参照生物に導入されている事実を表す。
【００２３】
上で説明したように、本発明の微生物は次の改変、すなわち
（ｉ）本明細書に記載される原料のアセトアルデヒドへのフラックスを増加させる、またはアセトアルデヒドを前記アルドラーゼにとってより利用しやすくする改変、
（ｉｉ）本明細書に記載される原料の３−ヒドロキシブタナールまたはその下流産物へのフラックスを増加させる改変、
のうちの１つ以上をそのゲノム内に含むことが好ましい。
【００２４】
例えば本発明は、本明細書に記載される原料を１，３−ＢＤＯに変換する能力を微生物に与える改変であって、前記改変が存在しない場合にその変換を行う能力を欠いている前記微生物にその能力を与える前記改変を包含する。本発明は、本明細書に記載される原料の１，３−ＢＤＯへのフラックスを、そのフラックスが改変前は非常に弱いか、または無視できるものである微生物において増加させる改変も包含する。
【００２５】
前記改変は典型的には本明細書に記載されるアルドラーゼ酵素、ならびにそのアルドラーゼ酵素にアセトアルデヒドを提供する経路に関連する。
【００２６】
前記酵素はデオキシリボースホスフェートアルドラーゼＥＣ４．１．２．４（「ＤＥＲＡ」）またはその変異体、またはアルドール縮合においてアルデヒド（アセトアルデヒド）をアクセプターとしてもドナーとしても受容する能力を有する他の酵素であることが好ましい。
【００２７】
「遺伝子改変」には問題になっている微生物のゲノムの１以上の改変が含まれ得ることが理解されるものとする。
【００２８】
本発明の微生物は前記アルドラーゼに関する次の遺伝子改変、すなわち
（ｉ）前記酵素をコードする少なくとも１つの異種性遺伝子の導入、
（ｉｉ）前記酵素をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の上方制御
のうちのいずれかを含んでよい。
【００２９】
前記改変が前記酵素をコードする異種性核酸の導入である微生物が好ましい実施形態である。
【００３０】
所望により、前記酵素をコードする前記異種性遺伝子は３−ヒドロキシブタナール経路に存在する１種類以上の他の酵素、例えば、前記アルドラーゼの基質であるアセトアルデヒドの供給に関与する酵素もコードする融合タンパク質をコードしていてもよい。
【００３１】
所望により、前記酵素をコードする異種性遺伝子は産物経路の下流に存在する１種類以上の他の酵素、例えば、３−ヒドロキシブタナールの別を産物または中間体への変換に関与する酵素もコードする融合タンパク質をコードしていてもよい。
【００３２】
本文脈における「３−ヒドロキシブタナール経路」または「３−ヒドロキシブタナール合成経路」という用語は、１種類以上の主要化学出発物質または基質（原料）を、縮合されて３−ヒドロキシブタナールを生成する共通経路中間体であるアセトアルデヒドに変換される、ピルビン酸またはアセチルＣｏＡのうちの１つ以上を含む中心代謝中間体に変換する、細胞内で起こる一連の酵素触媒反応を指す。「３−ヒドロキシブタナール（合成）経路」は、３−ヒドロキシブタナールに由来する下流産物、例えば１，３−ＢＤＯへ３−ヒドロキシブタナールを直接的または間接的に変換することに関与する活性を含んでもよい。
【００３３】
したがって、「３−ヒドロキシブタナール経路」酵素という用語はすなわち「３−ヒドロキシブタナール経路」において活性を提供する酵素として解釈されるべきである。
【００３４】
したがって、「３−ヒドロキシブタナール経路」の例は「１，３−ＢＤＯ経路」であり、その経路では１種類以上の主要化学出発物質または基質（原料）がピルビン酸またはアセチルＣｏＡのうちの１つ以上を含む中心代謝中間体を経て１，３−ＢＤＯに変換される一連の酵素触媒反応が細胞内で起こる。つまり、ピルビン酸またはアセチルＣｏＡのうちの１つ以上が次に共通経路中間体であるアセトアルデヒドに変換され、それが縮合されて１，３−ＢＤＯ前駆体である３−ヒドロキシブタナールを形成し、それが次に１，３−ＢＤＯに変換される。
【００３５】
共通経路中間体であるアセトアルデヒドへの中心代謝中間体の変換は１つ以上のステップ（例えば、２、３、４つのステップ）を必要としてよい。
【００３６】
本発明は、初期の基質利用と中心代謝中間体自体の生成に関連する酵素、ならびに中心代謝中間体の共通経路中間体への変換に関与する酵素をはじめとする３−ヒドロキシブタナール経路（例えば１，３−ＢＤＯ）に適切な全ての酵素の導入を包含する。
【００３７】
したがって、アルドラーゼに関連する改変に加え、微生物は１つ以上の他の改変をそのゲノム内に含んでもよい。
【００３８】
例えば、前記微生物はそれぞれ３−ヒドロキシブタナール経路（例えば、１，３−ＢＤＯ）酵素をコードする２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、またはそれ以上の外来性核酸を含んでもよい。
【００３９】
以下でより詳細に説明されるように、本発明は、普通なら選択された経路からフラックスをそらす、例えばアセトアルデヒドのフラックスを前記アルドラーゼからそらす酵素活性のノックアウトまたは他の機能障害も包含する。
【００４０】
１つの態様では本発明は、１，３−ＢＤＯまたは他の下流産物が蓄積し回収することができるように、またはそれを回収せずに酵素的または化学的にさらに変換することができるように、遺伝子操作によってアセチルＣｏＡから１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物を産生する能力を得ている、またはアセチルＣｏＡからの１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物のフラックスを増加させる能力を得ている非天然微生物を特に提供する。
【００４１】
以下でより詳細に説明されるように、アセチルＣｏＡは所望により酢酸を経て利用されてもよい。非限定的な例として、酢酸は次にカルボン酸レダクターゼ活性、例えば、ＥＣ１．２．７．５活性またはＥＣ．１．２．９９．６活性、ＡＴＰもしくはフェレドキシン駆動性活性またはＥＣ１．２．１．３０活性またはＥＣ１．２．１．３活性を介してアセトアルデヒドへ変換され得る。または、酢酸はＥＣ６．２．１．１またはＥＣ２．８．３．８を介してアセチルＣｏＡへ変換され、その後でＥＣ１．２．１．１０を介してアセトアルデヒドへ変換され得る。
【００４２】
あるいはアセチルＣｏＡはピルビン酸を経て（ＥＣ１．２．７．１およびＥＣ４．１．１．１などの酵素を使用する。以下参照）利用されてよく、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）、例えばアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＥＣ１．２．１．１０を使用するアセチルＣｏＡからのアセトアルデヒドの直接合成を介して利用されてよい。
【００４３】
別の態様では本発明は、１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物が蓄積し、それを回収することができるように、またはそれを回収せずに酵素的または化学的にさらに変換することができるように、遺伝子操作によってピルビン酸から１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物を産生する能力を得ている、またはピルビン酸からの１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物のフラックスを増加させる能力を得ている非天然微生物を特に提供する。
【００４４】
以下でより詳細に説明されるように、ピルビン酸は、ＥＣ１．２．７．１またはＥＣ１．２．１．５１またはＥＣ１．２．４．１およびＥＣ１．２．１．１０などの酵素を使用してアセチルＣｏＡを経てアセトアルデヒドに変換され得る。あるいはピルビン酸は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１）を介して直接的にアセトアルデヒドへ変換され得る。
【００４５】
本明細書では「ピルビン酸塩（ｐｙｒｕｖａｔｅ）」と呼んでもよいが、ｐＨおよび他の条件に応じてそれはピルビン酸（ｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ）としても同様に存在してよく、したがって全てのこれらの記述は文脈から別途要求されない限り互換的に使用されることが理解されるものとする。これは必要な変更を加えて本明細書に記載される他の塩または酸、例えば酢酸等にも適用される。
【００４６】
本明細書に記載される遺伝子改変を行うことを含む、本発明による微生物を作製するためのプロセスまたは方法も提供する。
【００４７】
本発明は、微生物によって産生される１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物のフラックスを増加させるための方法であって、本明細書に記載される遺伝子改変のうちの１つ以上をそのゲノムに導入することを含む前記方法をさらに提供する。
【００４８】
したがって、幾つかの実施形態では本発明は、何よりも、伝統的な石油製品の代替的基質からの１，３−ブタンジオールの生産に効果がある微生物の作製に関する。
【００４９】
そのような微生物を作製する方法は、異種性核酸（例えば、少なくとも本明細書に記載されるアルドラーゼをコードするもの）を宿主または祖先のいずれかに導入する先行ステップとそれに続くその宿主内でその核酸を発現するステップ、またはその宿主内でのその核酸の発現させる、または可能にするステップを含むのが典型的である。適切な異種性核酸は以下で述べる。他の実施形態では前記方法は遺伝子操作を使用して天然酵素を上方制御するステップ、および／または競合する経路へのフラックスを減少させるために酵素を抑制するステップを含んでもよい。
【００５０】
中央経路中間体であるアセチルＣｏＡおよびピルビン酸は全ての微生物系に存在するので、本発明において利用される微生物の実際の選択は、その微生物の１，３−ＢＤＯ（または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物）経路の遺伝子の改変または導入の受け入れやすさと共に、使用されることが望まれる原料またはエネルギー源の選択に概ね基づく。本明細書において開示される好ましいプロセスは、再生可能な原料を利用する持続可能な製造実践を伴い、しかし伝統的な石油産物と比べて費用上または環境上の利益を提供し得る他の原料、例えば天然ガス由来のメタノールを使用してもよい。
【００５１】
例えば、本明細書において開示されるそれらのプロセスは、エネルギー消費量および費用を軽減し、且つ、温室ガス排出を低下させるためにシンガス、ＣＯ２、ＣＯ、およびＨ２、メタンおよびメタノール（シェールガスまたは廃棄物由来バイオマス）などの原料を利用してよい。他の原料が本明細書中の他の箇所で述べる。
【００５２】
シンガスは、石炭、石油、天然ガス、バイオマス、または廃棄有機物などのあらゆる有機原料のガス化によって得ることができる主にＨ２とＣＯの混合物である。
【００５３】
文脈から別途要求されない限り、「シンガス」と言う用語が使用される場合、本発明の実施形態は必要な変更を加えて二酸化炭素、一酸化炭素および／または水素、ならびにメタンおよびメタノールなどの他の基質からなる他の混合物に適用されることが理解されるものとする。
【００５４】
したがって、本発明は好ましくは、メタノール、メタンまたは糖を共利用して、または共利用せずに、または単独原料として直接的にメタノール、メタンまたは糖を使用することにより、シンガスまたは他の気体状炭素源（ＣＯ２、ＣＯ）を利用することが可能である微生物を利用する。または、酢酸を含む廃水流。エネルギー源として太陽光を使用することが可能である光合成生物（例えば藻類）も明らかに含まれる。
【００５５】
本発明の別の態様では、１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物を産生するための条件下でその産生のために充分な期間にわたって前述の非天然微生物を培養することを含む、１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物を生産するための方法が開示される。
【００５６】
本明細書において使用される場合、原料上で「培養された」または「培養する」という用語は、前記微生物が適切な産物の産生のために問題の原料を利用することを意味する一般的な意味で使われており、その微生物の生物体量が実際にそのプロセスの間に増加することを意味すると理解されてはならない。
【００５７】
本発明の別の態様では、１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物を生産するためのプロセスであって，本明細書に記載される反応原料上で本発明の微生物を培養することを含み、それによって本発明の微生物がその原料を代謝して中心代謝中間体から１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物を産生する前記プロセスが提供される。
【００５８】
幾つかの実施形態では前記微生物は追加のエネルギー源、例えばヘキソースなどの炭水化物、または太陽光が存在する状態で培養されてよい。
【００５９】
本発明のプロセスは例えば電気透析、溶媒抽出、蒸留、または蒸発濃縮のうちの１つ以上によって１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物のうちの幾らか、または全てを回収することをさらに含んでよい。しかしながら、より好ましくは１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物はｉｎｓｉｔｕで単数または複数の下流産物へ化学的または酵素的に変換されてよい。次にその下流産物が同様の手段によって回収されてもよい。
【００６０】
本発明のプロセスは１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物を医薬製品、美容製品、食品、飼料製品、または化学製品に変換することをさらに含んでよく、それらは所望により不飽和アルコール、アルケン、カルボン酸、エーテル、エステル、またはケトン、例えばメチルエチルケトン、１−ブタノール、２−ブタノール、ブタジエン、イソプレン等であってもよい
【００６１】
したがって、様々な態様において本発明は、本明細書に記載されるように中央経路中間体を１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物に変換する能力を有する１種類以上の異種性タンパク質を含む非天然微生物を提供する。あるいはその異種性タンパク質は、シンガスまたは本明細書に記載される他の基質などの反応原料の１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物へのフラックスを、適切な工業的培養条件下でそのフラックスが改変前は非常に弱いか、または無視できるものである微生物において増加させるものであってもよい。
【００６２】
様々な態様において本発明は、天然タンパク質を上方制御するため（その発現を上昇させるため）、または天然タンパク質の局在を改変するため、または天然タンパク質の活性もしくは特異性を変更するために改変されている非天然微生物であって、それによってシンガスまたは本明細書に記載される他の基質を１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物に変換する能力が与えられている前記微生物であり、前記改変が存在しない場合にその変換を行う能力を欠いている前記微生物を提供する。あるいはその異種性タンパク質は、利用されている原料からの代謝中間体のフラックスを、そのフラックスが改変前は非常に弱いか、または無視できるものである微生物において増加させるものであってよい。
【００６３】
したがって、本発明は、遺伝的に改変された３−ヒドロキシブタナールまたは１，３−ＢＤＯ生合成経路を有し、且つ、シンガスまたは本明細書に記載される他の原料またはエネルギー源を代謝して１，３−ＢＤＯ、または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物を産生する能力を有する非天然微生物を提供する。
【００６４】
次に本発明の幾つかの態様および実施形態をより詳細に述べる。
【００６５】
中央経路代謝産物を生じる代謝経路、およびアセトアルデヒドの産生または利用可能性の増加
ピルビン酸およびアセチルＣｏＡは炭素同化のための広範囲の様々な中央代謝経路の産物である。それらは生命にとって必須である重要な細胞構成要素に変換される。本発明においてそれらは１，３−ＢＤＯ生合成経路内で利用され、その経路は少なくとも部分的にはその微生物の遺伝子操作の結果である。
【００６６】
上で説明したように、利用したい原料に応じて生物が選択されることが典型的である。その生物はアセチルＣｏＡおよび／またはピルビン酸を生じる特定の代謝経路をゲノム中に有するように選択されてよい。例となる代謝経路には
・ウッド・リュングダール経路（図５）
・リブロースモノホスフェート（ＲｕＭＰ）経路（図４）
・逆ＴＣＡ回路（図６）
・セリン回路（図７）
・解糖およびペントースリン酸経路
・３−ホスホグリセリン酸を介するカルビン回路（図９）
・３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路などの他の経路
が含まれる。
【００６７】
これらの中心代謝中間体を生成する経路は当業者によって充分に報告されており、且つ、充分に理解されている。ウッド・リュングダール経路、逆ＴＣＡ回路、セリン回路、ＲｕＭＰ経路およびカルビン回路はＣ１（気体および液体）固定経路の例である。幾つかの事例では解糖と並行してこれらの経路を使用することができる。
【００６８】
例えば、ウッド・リュングダール経路は、解糖とピルビン酸のアセチルＣｏＡへの脱炭酸から生じた還元当量を使用して、排出された２分子のＣＯ２をさらに別のアセチルＣｏＡ分子に固定することによる酸化還元平衡化にとって重要である。
【００６９】
セリン経路またはＲｕＭＰ経路はメタノール、メタンおよびＣＯ２などのＣ１原料の同化のためにメタノトローフ生物およびメチロトローフ生物によって一般的に使用される。これらの経路は当技術分野においてよく記載されており、且つ、よく知られている。ＲｕＭＰ経路の産物は、通常は主にバイオマスに変換されるピルビン酸である。
【００７０】
例えば、脱炭酸を介してアセトアルデヒドへ向かうピルビン酸の捕捉は、記載される発明を用いる１，３−ブタンジオール合成に向かうフラックスを変える。カルビン回路は光エネルギーを使用するＣＯ２同化のために藻類などの光合成生物によって使用される。
【００７１】
セリン回路は、通常はバイオマス合成のためのＣ４構成要素の合成のためにエチルマロニルＣｏＡ経路に入るアセチルＣｏＡを主に産生する。アセチルＣｏＡが例えば膜脂肪酸またはポリ３−ヒドロキシブチレート貯蔵化合物の生合成前駆体として必要とされる場合、ＥＭＣ経路はアセチルＣｏＡの酸化のために必要とされない（Ａｎｔｈｏｎｙ，  Ｃ．著、２０１１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ誌、第９４巻、１０９頁）。したがって、アセチルＣｏＡは、本明細書に記載される経路を使用するアセチルＣｏＡのアセトアルデヒドへの変換を経て１，３−ブタンジオールなどの他のより有用な化合物に利用され得る。
【００７２】
同じ原理がピルビン酸またはアセチルＣｏＡを産物として産生する全ての代謝経路に使用され得る。別の例はこれも２分子のＣＯ２の固定からアセチルＣｏＡを産生する逆ＴＣＡ回路である。アセチルＣｏＡまたはピルビン酸を産生する全てのこれらの中央代謝経路は当技術分野において充分に理解されている。
【００７３】
シンガス、またはＣＯ、ＣＯ２およびＨ２などのガスを利用することが可能である公知の経路を有する様々な微生物
ＣＯ利用生物である微生物は「一酸化炭素資化微生物」と呼ばれている。そのような生物は好気性生物および嫌気性生物であり得る。
【００７４】
これらの微生物のうちの嫌気性の例は、主に酸を産生する微生物（例えば酢酸を産生し、「アセトゲン」と呼ばれる）、主にメタンを産生する微生物、および主に水素を産生する微生物の３つの主なグループに属する。第１のグループは本発明において特に興味深い。
【００７５】
一酸化炭素資化アセトゲンは、重要な中間体であるアセチルＣｏＡを産生するウッド・リュングダール経路（図２）を介してシンガス成分であるＣＯとＨ２を利用することが可能である酢酸生産微生物である。
【００７６】
ウッド・リュングダール経路は当技術分野においてよく知られており（図５を参照されたい）、その経路を２つのブランチ、すなわちメチルブランチ（還元ブランチ）およびカルボニルブランチに分けることができる。メチルブランチはシンガス（ＣＯまたはＣＯ２）をメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に変換し、一方でカルボニルブランチはメチルＴＨＦと共にアセチルＣｏＡに変換される一分子のＣＯを供給する。
【００７７】
本明細書において使用される「アセトゲン」はこの経路を介してＣＯ２／ＣＯを酢酸に還元することができる嫌気性生物を指す。アセトゲンは多種多様な基質、例えば、ヘキソース［グルコース、フルクトースおよびキシロース］、メタノールをはじめとするＣ２化合物およびＣ１化合物［気体および液体］（図２を参照されたい）、ＣＯ２／Ｈ２ガスおよびＣＯガスなどで増殖することができる。アセトゲンは酢酸を直接的に利用することも知られている。
【００７８】
２２の属に対応する１００種類を超える酢酸生産種が流送土砂、泥、土、ならびにシロアリおよびヒトをはじめとする多数の動物の腸管などの様々な生息環境からこれまでに単離されている。それらの２２属のうち、クロストリジウム属およびアセトバクテリウム属が最もよく知られている酢酸生産種を含んでいる（Ｄｒａｋｅら著、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ誌、第１１２５巻：１００〜１０８頁（２００８年））。しかしながら、ウッド・リュングダール経路は実際にはアセトゲンに限定されず、ＣＯ２固定の手段として多数の嫌気性細菌に存在することに留意されたい。
【００７９】
厳密な意味での嫌気性生物として定義されているが、幾つかのアセトゲンは様々な好気的環境または微好気的環境から単離されている（Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉ．誌、２００８年、第１１２５巻、  １００頁）。これらの種類の細菌は一群の酸化ストレス酵素を備えており、ある特定のアセトゲンは様々な手段によって酸素を還元することすらできることが示されている（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，  Ｏ．、博士論文、２０１０年）。クロストリジウム・リュングダリイは気相中の最大で８％の酸素に耐えることが示されている（同書）。
【００８０】
重要なバルク化学薬品が、ＣＯ２などの酸化状態がより高い基質が存在する状態で、シンガス発酵を介して、またはシンガスが存在しないときに炭素源およびエネルギー源として役立ち得るメタノールとのカップリングを介してＣＯ２を使用して独立栄養増殖から生産される可能性があり得るので、アセトゲンは生物工学産業の重要な焦点となりつつある。
【００８１】
アセトゲンはヘキソース（例えばグルコース、フルクトースおよびキシロース）および他の糖を基質として利用することができる。
【００８２】
多数のアセトゲンにおいて酢酸はヘキソース消費の一次産物である。
１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→３ＣＨ３ＣＯＯＨ
【００８３】
ヘキソース消費の経路はエムデン・マイヤーホフ・パルナス経路を介するヘキソースのピルビン酸への酸化で始まり、その後、ピルビン酸はピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼによって酸化されてアセチルＣｏＡ、還元型フェレドキシン、およびＣＯ２になる。その後、そのアセチルＣｏＡはアセチルリン酸を経て酢酸に変換される。
【００８４】
ピルビン酸へ向かう経路の酸化ブランチはＳＬＰによる４ｍｏｌのＡＴＰの合成と共役している。
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋４ＡＤＰ＋４Ｐｉ→２ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ２＋４ＡＴＰ＋８［Ｈ］
【００８５】
次に、ウッド・リュングダール経路２ＣＯ２＋８［Ｈ］＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋ｎＡＴＰを介して２ｍｏｌのＣＯ２を還元してもう１ｍｏｌの酢酸にすることにより、解糖およびピルビン酸：フェレドキシン−オキシドレダクターゼ時に得られた還元当量である８［Ｈ］を再び酸化する。ＳＬＰを介してアセチルＣｏＡから酢酸までの外で生成された正味のＡＴＰの正確な量は未だにわかっていない。
【００８６】
糖または他の有機基質での増殖時にＣＯ２は形式的に電子溜めとして見なすごことができ、本来、ウッド・リュングダール経路をエネルギー保存に結び付ける必要は無い。解糖時にエネルギーが獲得され、ウッド・リュングダール経路の働きによって酸化還元平衡が維持される（図２）。しかしながら、ウッド・リュングダール経路によってＣＯ２と水素または一酸化炭素での増殖、またはメタノールとＣＯ２またはギ酸での増殖も可能になることに注意することが重要である。特に気体状の基質の場合ではウッド・リュングダール経路を正味のＡＴＰ合成に結び付けなければならない。その反応の全体的な自由エネルギー変化（ΔＧｏ＝−９５ｋＪ／ｍｏｌ）によって１〜２ｍｏｌのＡＴＰが合成される可能性がある。
【００８７】
この経路のエネルギー過程は精密に平衡化されている。アセチルＣｏＡからアセチルリン酸を経る酢酸キナーゼ反応においてＳＬＰによって１モルのＡＴＰが生じるが、ホルミル−Ｈ４Ｆシンテターゼ反応において１モルのＡＴＰが消費される。したがって、ＳＬＰによる正味のＡＴＰ増加はゼロであり、より多くのＡＴＰの生成に寄与するイオン勾配駆動性リン酸化も起こることが知られている。
【００８８】
上記のことは、ウッド・リュングダール経路を平衡化するアセチルＣｏＡの酢酸への変換を介したＳＬＰレベルリン酸化ＡＴＰ合成のほとんどの状況下で重要である役割を明確に強調しており、実際に酢酸へのかなりのフラックスが、増殖中のアセトゲンにおいて見られる。酢酸合成は重要なＡＴＰ合成ステップであるので、酢酸合成のフラックスを高収量のいずれかのより有用な化学薬品に向かわせることによりアセトゲンのエネルギー平衡に様々な程度の影響がある。エネルギー過程がより好ましいものであり得るメタノールおよびＣＯ２で増殖する場合でも、多くの場合で酢酸合成の妨害がまだ幾らかの影響を有することがあり得る。さらに、多くのアセトゲンの代謝は主に中央経路中間体アセチルＣｏＡからのバイオマスまたは酢酸のいずれかの効率的な合成のために進化してきた。したがって、アセチルＣｏＡまたは酢酸から直接的に得られる工業製品がアセトゲンを使用するプロセス開発にとって好ましい場合がある。
【００８９】
産物アセトアルデヒドを基質として（アクセプターとしてもドナーとしても）受容することが可能であるアルドラーゼを使用することにより、アセトゲンが高収量および高濃度で天然で蓄積する酢酸から有用化学製品を効率的に生成することが可能になる。
【００９０】
アセチルＣｏＡ由来酢酸をアセトアルデヒドの生成に利用するためのルートが下でより詳細に説明される。アセトアルデヒド生成の好ましいルートはフェレドキシン駆動性アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼの利用に基づく。この酵素的変換はＡＴＰを必要としないので、ＣＯ、ＣＯ２／Ｈ２、またはシンガスなどのＣ１ガスで増殖する細菌にとっては上に記載されたエネルギー過程の理由から特に重要であり得る。アセチルＣｏＡの酢酸への変換を伴う天然のＳＬＰステップは保存されている可能性があるので、ウッド・リュングダール経路のエネルギー過程は変更されない。しかしながらＡＴＰを必要とするルートを含む酢酸還元の他のルートをその系のエネルギー過程が許す場合に利用してもよい。まとめると、通常のエネルギーを必要とせずにアセトアルデヒドなどのＣ２化合物から３−ヒドロキシブタナールなどのＣ４化合物を生成する能力は、工業的な化学薬品合成のために微生物の代謝を効率的に活用する場合に非常に望ましい。
【００９１】
上で記されたように、ＣＯおよびシンガスを利用することが可能である生物は、同じ基本セットの酵素とウッド・リュングダール経路の範囲内の形質転換を介してＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物を利用する能力も概ね有する。微生物によるＣＯ２の酢酸へのＨ２依存的変換は、同じ生物がＣＯも使用することができること、および同じ経路が関与することが明らかにされるずっと前に発見された。
【００９２】
したがって、１つの実施形態では本発明は、もとからウッド・リュングダール経路とシンガス利用能力を有しており、且つ、遺伝子操作によって１，３−ＢＤＯを産生する能力を得ている、または１，３−ＢＤＯのフラックスを増加させる能力を得ている非天然微生物を提供する。
【００９３】
多くのアセトゲンはＣＯ２などの別の酸化状態がより高い共基質が存在する場合にメタノールの存在下で増殖することが示されている。酢酸などの天然産物または１，３−ブタンジオールなどの非天然アセトゲン産物のいずれかにプロセスを進めるためには還元当量の供給が重要である。
【００９４】
水素は主要な還元当量源であるが、同様に例えば、メタノールの異化によっても還元当量（６［Ｈ］）とＡＴＰエネルギーを生成することができる。さらに、図２に示されるように、メタノール利用は予め形成されたメチル基をアセチルＣｏＡの合成に提供し、ホルミル−ＴＨＦシンテターゼによって触媒されるギ酸のホルミル−ＴＨＦへの変換のためのＡＴＰの必要性を失わせるので、メタノール利用はエネルギー論的利点を与える（Ｂａｉｎｏｔｔｉ，  Ａ．ＥおよびＮｉｓｈｉｏ，  Ｎ．著、２０００年、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、第８８巻、１９１頁）。メタノールからのメチル基の移転の具体的なエネルギー要求は明確に理解されていない。しかしながら、触媒量のＡＴＰが前記文献およびＳｔｕｐｐｅｒｉｃｈ，  Ｅ  および  Ｋｏｎｌｅ，  Ｒ著、１９９３年、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第５９巻、３１１０頁において引証されており、メチル基移転につき約０．３ＡＴＰが必要であることを記載している。したがって、ＣＯ２の代わりに予め形成されたメチル基が提供されると約０．７ＡＴＰの節約を達成することができる。触媒量のＡＴＰが必要とされるだけとしても、そのエネルギー利益はより大きなものであり得る。しかしながら、強調したように、メタノールを利用するエネルギー過程の明確な理解は当技術分野において未だに確立されていない。
【００９５】
ＣＯ２の場合では、追加の供給源にはメタンがＣＯ２に変換されるアンモニアプラントと水素プラントにおける副産物としてのＣＯ２の生産；木材燃料および化石燃料の燃焼；ビール、ウイスキーおよび他のアルコール飲料の醸造または他の発酵プロセスにおける糖発酵の副産物としてのＣＯ２の生産；生石灰、すなわちＣａＯの製造における石灰石、すなわちＣａＣＯ３の熱分解；リン酸ナトリウム製造の副産物としてのＣＯ２の生産；および石灰石または白雲石に対する酸性の水の作用によって生じる天然炭酸泉から直接的に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
アセトゲンのメタノール利用能力は特定のメチルトランスフェラーゼを必要とする。そのようなアセトゲンメチルトランスフェラーゼがもとから存在しない場合、メタノールならびに上で述べた他の原料を利用可能とする異種性メチルトランスフェラーゼおよび他の関連タンパク質でアセトゲンを改変することができる。
【００９７】
メタノールで増殖する能力をアセトゲンに与えるために必要とされる酵素の例には
メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）
コリノイドプロテイン（ＭｔａＣ）、
メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドプロテインメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）、
メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドプロテインメチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）、
コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）
が含まれる。
【００９８】
メチロトローフおよびメタノトローフは天然でメタノールおよび／またはメタンでも増殖し、Ｃ１代謝のために、例えば、ＲｕＭＰ経路（図４）またはセリン回路経路（図７）を利用する。ウッド・リュングダール経路の場合のようにＣ１代謝のセリン回路とＲｕＭＰ経路の両方が当技術分野において充分に記載されており、且つ、充分に理解されている。
【００９９】
したがって、１つの実施形態では本発明は、天然でゲノム中にＲＵＭＰ経路またはセリン回路経路がコードされており、且つ、メタノールまたはメタンの利用能力を有しており、且つ、遺伝子操作によって１，３−ＢＤＯを産生する能力を得ている、または１，３−ＢＤＯのフラックスを増加させる能力を得ている非天然微生物を提供する。
【０１００】
微細藻類またはシアノバクテリアなどの光合成生物は、カルビン回路を介するＣＯ２固定のために太陽光（光エネルギー）を利用することができる独立栄養生物または従属栄養生物である。産物は、糖に、またはピルビン酸とアセチルＣｏＡに変換され得るグリセルアルデヒド−３−リン酸である。
【０１０１】
多種多様な微生物が従属栄養性であり、エントナー・ドゥドロフ経路、エムデン・マイヤーホフ経路、またはペントースリン酸経路などの解糖経路を介して糖を炭素源およびエネルギー源として利用することができる。全ての糖同化経路が当技術分野において充分に理解されている。これらの経路の産物は、例えば、リンゴ酸、オキサロ酢酸、コハク酸またはフマル酸などの細胞構成要素の供給のためにＴＣＡ回路に入るため、アセチルＣｏＡに変換され得るピルビン酸である。
【０１０２】
アセトゲンに関して上で述べたように、通常は従属栄養生物と見なされない多数の生物（例えばアセトゲンまたはメチロトローフ）も糖が供給される場合には従属栄養増殖可能である。
【０１０３】
光従属栄養生物は従属栄養性光栄養生物である。すなわち、光従属栄養生物は、エネルギーのために光を使用するが、それらの唯一の炭素源として二酸化炭素を使用することができず、代わりに炭水化物、脂肪酸、およびアルコール等を利用する生物である。光従属栄養生物の例には紅色非硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、およびヘリオバクテリアが含まれる。したがって、本発明において利用されるときの原料は、望ましい場合は炭素源および／またはエネルギー源の全体または一部として糖を含んでよく、または実際に糖からなる。
【０１０４】
代謝中間体のアセトアルデヒドへの変換に適切な酵素が下の実施例および図３により詳細に述べる。簡単に説明すると、
【０１０５】
ルート１はカルボン酸レダクターゼ活性（活性Ａ）を介して、例えば、ＥＣ１．２．７．５活性またはＥＣ１．２．９９．６活性、ＡＴＰもしくはフェレドキシン駆動性活性またはＥＣ１．２．１．３０活性またはＥＣ１．２．１．３活性を使用してアセチルＣｏＡから酢酸（酢酸生産微生物の天然産物）を経てアセトアルデヒドへ進行する。
【０１０６】
ルート２はアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）、例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＥＣ１．２．１．１０を使用するアセチルＣｏＡからのアセトアルデヒドの直接合成（活性Ｂ）を含む。
【０１０７】
ルート３はＥＣ１．２．７．１またはＥＣ１．２．１．５１またはＥＣ１．２．４．１およびＥＣ１．２．１．１０などの酵素を使用するピルビン酸のアセチルＣｏＡを経るアセトアルデヒドへの変換（活性ＣおよびＢ）を含む。
【０１０８】
ルート４は例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１）を直接的に介するピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換（活性Ｄ）を含む。
【０１０９】
ルート５はＥＣ１．２．７．１およびＥＣ４．１．１．１などの酵素を使用するアセチルＣｏＡのピルビン酸を経るアセトアルデヒドへの変換（活性ＥおよびＤ）を含む。
【０１１０】
ルート６はＥＣ６．２．１．１またはＥＣ２．８．３．８およびＥＣ１．２．１．１０などの酵素を使用する酢酸のアセチルＣｏＡを経るアセトアルデヒドへの変換（活性ＦおよびＢ）を含む。本発明のあらゆる所与の生物においてこれらのルートのうちの１以上が利用され得ることが理解されるものとする。
【０１１１】
酵素アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．７．５）は多数のアセトゲンおよび他の生物に見られ、その酵素は不活性化カルボン酸を対応するアルデヒドに還元可能であることが示されている（Ｗｈｉｔｅ，  Ｈら著、Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｌｅｒ誌、１９９１年、第３７２巻（第１１号）９９９頁；Ｗｈｉｔｅ，  ＨおよびＳｉｍｏｎ，  Ｈ．著、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、１９９２年、第１５８巻、８１頁；Ｆｒａｉｓｓｅ．  ＬおよびＳｉｍｏｎ，  Ｈ．著、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、１９８８年、第１５０巻３８１頁；Ｂａｓｅｎら著、２０１４年、ＰＮＡＳ誌、第１１１巻（第４９号）、１７６１８頁）。Ｋｏｐｋｅ，  Ｍ．ら著、ＰＮＡＳ誌、２０１０年、第１０７巻、１５３０５頁はアセトゲンであるクロストリジウム・リュングダリイにおいて酢酸をアセトアルデヒドへ還元することができる遺伝子について記述している。
【０１１２】
酢酸の還元と別個に、または併せて使用することが可能である、アルドラーゼに供給するためのアセトアルデヒドをアセトゲンにおいて生成する代替的手段は以下の通りである。
【０１１３】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）またはアセチルＣｏＡをアセトアルデヒドへ変換することが可能であるあらゆるアルデヒドデヒドロゲナーゼを直接的に使用してもよい。上で説明したように、この場合ではアセチルＣｏＡの酢酸への変換のＳＬＰステップが失われる。この喪失に対する幾らかの補償は、ＣＯ、ＣＯ２／Ｈ２またはシンガスなどのガスで増殖したときのウッド・リュングダール経路に由来するイオン勾配リン酸化から達成される可能性がある。ＡＴＰは還元型フェレドキシンに共役しているＮＡＤ（Ｐ）還元を介して合成されてもよいが、メタノールおよびＣＯ２または別の酸化状態がより高い共基質のでの増殖が、メタノール異化から還元当量およびＡＴＰを供給するための潜在的なより好ましいエネルギー過程と潜在力から最も適している可能性がある。代替的手段の別の例はカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）酵素（ＥＣ１．２．９９．６）を含む。これらの酵素はＡＴＰによる活性化を介してカルボン酸の対応するアルデヒドへの還元を触媒する。このルートのエネルギー過程はアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを介するアセチルＣｏＡからのアセトアルデヒド合成について述べられたエネルギー過程と類似する。１，３−ブタンジオール経路における対応するアルデヒドの合成のためのカルボン酸レダクターゼの使用が、合成経路が異なっているが、米国特許第８２６８６０７号明細書に記載されている。
【０１１４】
これらのルートにおいて利用される他の酵素が下の実施例により詳細に述べる。
【０１１５】
天然酵素の下方制御
本発明の改変生物は、普通なら３−ヒドロキシブタナール経路の中間体のフラックスを他の産物またはバイオマスに向かわせ得る酵素の活性をターゲティングする（下方制御する、ノックアウトする、または阻害する）ように改変され得る。このように遺伝子をターゲティングする方法は当技術分野において知られており、また、以下に述べられる。
【０１１６】
アセトゲンではアセチルＣｏＡの酢酸への変換に由来するＡＴＰ合成の損失が生体エネルギー論によって許容される場合にホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子または酢酸キナーゼ（ａｃｋ）遺伝子のターゲティングによって酢酸の蓄積が減少し得る。これによってアセチルＣｏＡのレベルを増加させることができ、そのアセチルＣｏＡは直接的に、またはピルビン酸を経て利用され得る。したがって、ルート２を利用する場合、ＥＣ２．３．１．８（ホスホトランスアセチラーゼ）またはＥＣ２．７．２．１（酢酸キナーゼ）または両方をターゲティングすることが望ましい場合がある。
【０１１７】
ルート３またはルート４またはルート５またはルート６を利用する場合、ピルビン酸が乳酸になって失われることを防ぐためにＬＤＨ活性（ＥＣ１．１．１．２７または１．１．１．３７；後者はリンゴ酸デヒドロゲナーゼであるが、ピルビン酸を基質として受容することが知られている）をターゲティングすること、および／または（適切な場合）ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＥＣ２．３．１．５４）をターゲティングすることが望ましい場合がある。全ての場合において、ピルビン酸が他の産物になって失われることを防ぐ、または最小限にすることが目的である。
【０１１８】
代わりに、または加えて、他のある目的のために、例えばエタノール産生のためにアセトアルデヒドを基質として利用する内在性酵素（例えばアルコールデヒドロゲナーゼ）を下方制御または不活性化することによって前記アルドラーゼへのアセトアルデヒドの利用可能性を高めることが望ましい場合がある。前記アルドラーゼへのアセトアルデヒドの利用可能性を高めることで前記アルドラーゼからの３−ヒドロキシブタナールの産生が増加する。
【０１１９】
追加の例として、３−ヒドロキシブタナールの１，３−ＢＤＯへの還元と比べてアセトアルデヒドのエタノールへの還元を優先するいずれかのアルコールデヒドロゲナーゼをターゲティングすることが特に望ましい場合がある。これらのアセトアルデヒドをエタノールにする酵素は一般的にＥＣ１．１．１．１に分類される。
【０１２０】
アルドラーゼ酵素
本発明の改変生物ではアセチルＣｏＡまたはピルビン酸に由来するアセトアルデヒドが、（図３の「反応Ｇ」を介して）２分子のアセトアルデヒドを縮合して３−ヒドロキシブタナールを形成することが可能であるＤＥＲＡ型アルドラーゼ（デオキシリボースホスフェートアルドラーゼ，ＥＣ４．１．２．４，ＤＥＲＡまたは「ＤＥＲＡ様」酵素）に基質を供給するために使用される。例となる酵素が表６に提示されている。
【０１２１】
天然デオキシリボースホスフェートアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）反応は次の通りである。
【数１】
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【０１２２】
リン酸化型基質が好ましいが、大半の野生型酵素は２分子の非リン酸化アルデヒドの縮合を触媒する。主にアセトアルデヒドおよび別のアルデヒド。ほぼ同等の優先度でリン酸化型基質と非リン酸化型基質を受容するＤＥＲＡの例がＺｈｏｎｇ−Ｙｕ，  Ｙ．ら（Ｊ．  Ｉｎｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．誌、  ２０１３年、第４０巻、２９頁）によって説明されている。
【０１２３】
重要な製薬中間体の合成のためのＤＥＲＡの進化と開発が過去２５年間にわたって大きな注目を受けている（ＤｅＳａｎｔｉｓ，  Ｇら著、Ｂｉｏｏｒｇ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．誌、２００３年、第１１号、４３頁）。しかしながら、１，３−ブタンジオールまたは他の下流産物の合成のために非天然経路にＤＥＲＡ型酵素を組み入れることはこれまでに示唆されていなかった。
【０１２４】
ある特定の条件の下では多くのＤＥＲＡ酵素によって３分子のアセトアルデヒドの逐次連続縮合が触媒されることも可能であるが、それは本文脈の中では回避されることが好ましい。運が良いことに２回のアセトアルデヒドのアルドール縮合を伴うその望ましくない連続反応（図８）はＤＥＲＡ触媒アルドール縮合の支配的な反応ではないことが一般的である。望ましいモノアルドール産物（３−ヒドロキシブタナール）が蓄積し、その反応に２回目のアセトアルデヒド付加を受け入れさせるには高レベルの野生型ＤＥＲＡ酵素が必要である（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ、２０１０年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎｓ社）。したがって、モノアルドール（３−ヒドロキシブタナール）の捕捉と他の産物への方向付けが、例えば、１，３−ブタンジオールへの還元によって実現可能である。さらに、その２回目のアルドール縮合の触媒について非常に非効率的であるためにモノアルドールである３−ヒドロキシブタナールだけを産生するＤＥＲＡ酵素が知られている（そしてそのような酵素を作製することができる）（例えば、ピロバクルム・アエロフィルム由来のＤＥＲＡ酵素について記載する米国特許第７４０２７１０号明細書を参照されたい）。米国特許第７４０２７１０号明細書は３−ヒドロキシブタナールなどのＣ４ヒドロキシアルデヒドの合成について記載しているが、代謝経路の文脈では、またはその経路の酵素によってアセトアルデヒドが供給される場合では記載されていない。米国特許第７４０２７１０号明細書では単離されたＤＥＲＡ酵素調製物にアセトアルデヒドが外因的に添加される。
【０１２５】
アセトアルデヒドと３−ヒドロキシブタナールの両方について、多くのＤＥＲＡが１００ｍＭを超えるアルデヒド濃度で不活化されることが知られており、この濃度より下の濃度に対して感受性を有することもあり、およびこのことがクロロアセトアルデヒドおよび２分子のアセトアルデヒドの連続縮合を介したスタチン中間体の合成へのＤＥＲＡの適用を制限するものであった（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ、２０１０年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎｓ社）。本発明の背景ではＤＥＲＡは、アセトアルデヒド基質が先行経路酵素からの新規合成を介して供給される、１，３−ブタンジオールおよび他の価値のある化学薬品の合成の非天然経路の一部として使用される。したがって、本発明のプロセスにおけるアルデヒド濃度は決して１００ｍＭに近づくことはなく、したがってこの濃度のアセトアルデヒドに対する感受性は重要ではない。アセトアルデヒドと３−ヒドロキシブタナールの両方が前記経路の中間体であり、１，３−ブタンジオールまたは他の標的化学薬品への炭素フラックスを最大にするための経路酵素の充分な活性を確実にすることによりこれらの中間体の蓄積が回避される。
【０１２６】
野生型ＤＥＲＡアルドラーゼが大腸菌において過剰発現され、スタチン医薬のキラルラクトールの合成のための高強度プロセスとして運用されている（Ｏｓｌａｊ，  Ｍ．ら著、Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ誌、第８巻（第５号）、１頁）。そのプロセスは逐次連続合成での２−置換アセトアルデヒドとアセトアルデヒドの対応するラクトールへの縮合を伴うフェドバッチアプローチを含む。このプロセスは完全細胞系として運用されたが、それらの反応物質はそれらの細胞に供給されたのであって、その場で生成されたのではなかった。さらに、中心代謝中間体からの内在性アセトアルデヒドの産生または利用可能性を増加させる改変は行われなかった。
【０１２７】
本発明のプロセスは微生物への２−置換アセトアルデヒドおよび／またはアセトアルデヒドのバッチ供給を利用しない。
【０１２８】
融合体
上で説明したように、ＤＥＲＡなどの前記アルドラーゼは、前記アルドラーゼの基質であるアセトアルデヒドの供給に関与する１種類以上の他の酵素もコードする融合タンパク質として、または化学薬品もしくは他の手段（例えばスキャフォールディンまたはドッケリン）を使用してそのような他の酵素に連結した融合タンパク質として提供され得る。本明細書に記載される反応Ｂ、反応Ｄおよび反応Ａを触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはピルビン酸デカルボキシラーゼまたはＡＯＲなどのカルボン酸レダクターゼ（表２、表４、表１を参照されたい）とＤＥＲＡの融合体が例に含まれる。実施例１１はＤＥＲＡ−ＥｕｔＥ融合体の作製を示している。
【０１２９】
他の実施形態ではＤＥＲＡなどの前記アルドラーゼは、下流産物経路に関与する１種類以上の他の酵素もコードする融合タンパク質として、または化学薬品もしくは他の手段（例えばスキャフォールディンまたはドッケリン）を用いてそのような他の酵素に連結した融合タンパク質として提供され得る。その酵素は、例えば、３−ヒドロキシブタナールの別の産物または中間体への変換に関与するものであり得る。表７に記載される酵素が実施例の中に含まれている。
【０１３０】
１，３  ＢＤＯおよび下流産物の生産、および１，３−ＢＤＯの用役
３分子目のアセトアルデヒドの追加的縮合は、アルドラーゼによって触媒されたアセトアルデヒド縮合の産物である３−ヒドロキシブタナールのアルデヒド部分を対応するアルコールに還元することにより防止される。３−ヒドロキシブタナールは、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼによって、例えば、ＥＣ１．１．１．−に分類される酵素を使用して（図３中の「反応Ｈ」を介して）１，３−ブタンジオールに還元される。
【０１３１】
この反応は中鎖アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼ、理想的にはＣ４以上のアルコールを優先するものによって触媒されることが好ましい。例えば、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、２０００年、第６６巻、５２３１頁を参照されたい。より具体的には前記酵素はアセトアルデヒドのエタノールへの還元と比べて３−ヒドロキシブタナールの１，３−ＢＤＯへの還元を優先することが好ましい（実施例９）。Ｗａｌｅｓ，  ＭおよびＦｅｗｓｏｎ，  Ｃ．著、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、１９９４年、第１４０巻、１７３頁によって記載されるアルコールデヒドロゲナーゼは長鎖アルコールに対する選択性も重ねて示す。酸化方向で測定されているが、そのデヒドロゲナーゼは１，４−ブタンジオールも基質として受容する。２，３−ブタンジオールは基質ではなく、このことは二級アルコールではなく、望ましい一級アルコールが３−ヒドロキシブタナール還元に特異的に用いられることを明らかに示している。３−ヒドロキシブタナールの１，３−ブタンジオールへの変換に利用することが望ましい他の酵素は、下の実施例３および表７に記載されている。
【０１３２】
１，３−ブタンジオール経路内での３−ヒドロキシブタナールレダクターゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ）の使用が米国特許出願公開第２０１３０１０９０６４号明細書に記載されているが、３−ヒドロキシブタナールの合成のための本開示の経路についての示唆はその中に無い。
【０１３３】
１，３−ＢＤＯは多数の産業上の用途を有する。例えば、１，３−ＢＤＯは食品用着香剤用の有機溶媒として一般的に使用されている。ポリウレタン樹脂およびポリエステル樹脂用のコモノマーとしても使用されており、且つ、血糖低下剤として広く使用されている。光学活性を有する１，３−ＢＤＯは生物活性化合物および液晶の合成に有用な出発物質である。１，３−ブタンジオールの別の用途は、脱水によって１，３−ブタンジエンおよびメチルエチルケトンなどの他の重要な化学薬品を得ることであり（Ｉｃｈｉｋａｗａら著、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ誌、第２３１巻：１８１〜１８９頁（２００５年）；Ｉｃｈｉｋａｗａら著、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ誌、第２５６巻：１０６〜１１２頁（２００６年））、１，３−ブタンジエンは合成ゴム（例えばタイヤ）、ラテックスおよび樹脂の製造に使用される重要な化学薬品である。１，３−ブタンジオールの化学変換によって生産される１，３−ブタンジエンおよび産物のその他の例が図１に示されている。
【０１３４】
３−ヒドロキシブタナールからの他の下流産物の生産
アルドール縮合産物である３−ヒドロキシブタナールを１，３−ＢＤＯ以外の産物にすることもできることが理解されるものとする。その意味で、様々な直近の下流産物またはその後の下流産物を生み出す多数の可能な非天然ＤＥＲＡベース経路の分岐点として３−ヒドロキシブタナールを見ることができる。
【０１３５】
非限定的な例として、３−ヒドロキシブタナールを変換（例えば、酸化、還元）して
・３−ヒドロキシ酪酸
・１，３−ブタンジオール
にすることができ、それを次にそのまま利用または回収することができ、または他の天然代謝経路もしくは非天然代謝経路を介して他の産物に変換することができる。３−ヒドロキシ酪酸は生物分解性プラスチックモノマーとしての有用である。
【０１３６】
さらに、例えばブタナールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．５７）、または一連の他の産物へ代謝的にアクセスすることを可能にし得るＥＣ１．２．１．１０などの別のアルデヒドデヒドロゲナーゼを使用して３−ヒドロキシブタナールを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡなどの代謝中間体に変換することもできる。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｃ２アルデヒド（例えばアセトアルデヒド）と比べたＣ４アルデヒドに対する選択性が改善されるように変異されている。例えばＢａｋｅｒらはアセトアルデヒドと比べてブタナールを優先する変異体についてＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌、２０１２年６月５日；第５１巻（第２２号）：４５５８〜６７頁、２０１２年５月２１日電子出版で述べている。この酵素は３−ヒドロキシブタナールの３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換に有用であり得る。幾つかの他の酵素がＣ４アルデヒドに対する天然の選択性を有している。Ｙａｎ，  Ｒ．ＴおよびＣｈｅｎ，  Ｊ．  Ｓ．著、１９９０年、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、第５６巻、（第９号）２５９１頁。これらの酵素のうちのいずれも、所望により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成するそれらの活性を本発明の背景で最適化するためにさらに改変される可能性がある。
【０１３７】
３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに由来する下流産物には
・２−ヒドロキシイソ酪酸（メタクリル酸合成の中間体）、
・ポリヒドロキシブチレート（これも生物分解性プラスチックに有用である）、
・クロチルアルコール（酵素的または化学的に１，３−ブタジエンに変換され得る）
が含まれる。
【０１３８】
ブタノール（酵素的または化学的に１，３−ブタンジエンに変換され得る）  他の下流産物にはクロトン酸、酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシブチルアミン、ポリヒドロキシブチレート、アセトン、およびイソプロパノールが含まれる。
【０１３９】
３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからの産物の合成は確立された生化学である。例えば次の参照文献、Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ，  Ｕ．ら著、２０１４年、ｍｂｉｏ誌、第５巻、（第５号）、１頁（酪酸）；Ｔｏｒｂｅｎ，  Ｈ．ら著、２０１０年、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．誌、第８８巻、４７７頁（２−ヒドロキシイソ酪酸）；Ｎａｄｙａ，  Ｙ．ら著、２０１２年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．誌、第２８７巻（第１９号）１５５０２頁（２−ヒドロキシイソ酪酸）；Ｒｅｈｍ，  Ｂ．Ｈ．  ２００７年、Ｃｕｒｒ．  Ｉｓｓｕｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第９巻（第１号）、４１頁（ポリヒドロキシブチレート）；Ｌｅｅ，  Ｓ．Ｙら著、２００８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．誌、第１０１巻（第２号）、２０９頁（ブタノール）；米国特許８５８０５４３号；国際公開第２０１３０５７１９４号（クロチルアルコール）に記載されている通りである。
【０１４０】
アセトゲンにおける酢酸を経る３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへのルートは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが、例えば、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを経て供給される場合に普通なら失われるＡＴＰエネルギーを犠牲にすることなくこの中間体の生成を可能にする。これはアセチルＣｏＡからの酢酸形成の阻止によって酢酸キナーゼ反応から生成されるＡＴＰ分子が失われるからである。アセトアセチルＣｏＡの生成は大半の条件下でエネルギー論的には好ましくない。本明細書に記載されるＤＥＲＡ経路を通る、酢酸を経る３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの経路は酢酸生成のエネルギー過程を保持している。したがって、エネルギー論的により好ましいルートを通って同じ産物に到達する。重要な中間体分岐点はＤＥＲＡ産物の３−ヒドロキシブタナールである。
【０１４１】
遺伝子改変および宿主
本明細書において提供される指針に基づき、当業者は発現可能な形態で導入されるコード核酸の数が、選択された微生物宿主のあらゆる３−ヒドロキシブタナールまたはそれに由来する下流産物（例えば１，３−ＢＤＯ）の経路の欠損を反映することを理解するであろう。したがって、本発明の非天然微生物は、本明細書において示される３−ヒドロキシブタナールまたはそれに由来する下流産物（例えば１，３−ＢＤＯ）の経路を構成する酵素またはタンパク質をコードする１つ、２つ、３つ、または最大ですべての核酸を有し得る。幾つかの例ではそれらの非天然微生物は１，３−ＢＤＯ（または３−ヒドロキシブタナールに由来する他の下流産物）の生合成を促進または最適化する、または他の有用な機能をその宿主微生物に与える他の遺伝子改変を含むこともできる。
【０１４２】
好ましい微生物が本明細書において議論されており、それらには特に出芽酵母、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、オガテア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、コマガテラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母が含まれる。
【０１４３】
他の好ましい微生物には、モーレラ・サーモアセティカ、モーレラ・サーモオートトロフィカ、サーモアセトエニウム・ファエウム（Ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｐｈａｅｕｍ）、サーモアナエロバクター・キブ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕ）、アセトバクテリウム・ウッディイ、クロストリジウム・カルボキシディボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・フォルミコアセティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・グライコリカム、クロストリジウム・マグナム、クロストリジウム・マヨムベイ、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、クロストリジウム・アセティクム、クロストリジウム・オートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・スカトロゲネス、アセチトマクラム・ルミニス、アセトゲニウム・キブイ、ユウバクテリウム・リモサム、オキソバクター・フェニジイ、アセトバクテリウム・ツンドラエ、アセトバクテリウム・ノテラエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｔｅｒａｅ）、アセトバクテリウム・カービノリカム、アセトバクテリウム・デハロゲナンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ）、アセトバクテリウム・フィメタリウム、アセトバクテリウム・マリクム、アセトバクテリウム・パルドサム、アセトバクテリウム・ウィリンガエ、アセトハロビウム・アラビクム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂｉｃｕｍ）、アセトネマ・ロングム、アセチトマクラム・ルミニス、アセトアナエロビウム・ノテラエ、アセトバクテリウム・バキイ、ブチリバクテリウム・メトリトロフィクム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｌｙｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ブラウティア・ハイドロゲノトロフィカ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ブラウティカ・ココイデス（Ｂｌａｕｔｉｃａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ブラウティア・シンキイ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｃｈｉｎｋｉｉ）、ペプトストレポコッカス・プロダクタス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、スポロミュサ・アシドボランス、スポロミュサ・アエリボランス、スポロミュサ・マロニカ、スポロミュサ・オバテ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔｅ）、スポロミュサ・パウシボランス、スポロミュサ・リザエ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｒｈｉｚａｅ）、スポロミュサ・シルバセティカ、スポロミュサ・スパエロイデス（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐａｅｒｏｉｄｅｓ）、スポロミュサ・ターミティダ、バチルス・メタノリカス、メチロバクテリウム・エクストルケンス、メチロバチラス・フラゲラテス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）、メチロバチラス・グリコゲネス、メチロバチラス・プラテンシス、ハイドロゲノバクター・サーモフィラス、アシドモナス・メタノリカ、メチロコッカス・カプスラータス、メチロフィルス・メチロトロファス、メチロフィルス・フラブス、メチロフィルス・ルテウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、メチルアシディフィルウ・インフェルノルム（Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ）、メチリビウム・ペトロレイフィルム（Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ハイドロゲニバチラス・シュレゲリイ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）、ラクトコッカス属の種、ラクトバチラス属の種、バチラス属の種、ゲオバチラス属の種、コリネバクテリウム属の種、クレブシエラ・オキシトカ、ラルストニア属の種、アルカリゲネス属の種、キュープリアビダス属の種などの細菌が含まれる。
【０１４４】
１つの実施形態では宿主は大腸菌ではない。
【０１４５】
本発明において使用されるコード核酸の供給源にはコードされる遺伝子産物が言及する反応を触媒することができるあらゆる種が含まれ得る。そのような種には古細菌と真正細菌を含む細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物、およびヒトを含む哺乳類動物を含むがこれらに限定されない原核生物と真核生物の両方が含まれる。
【０１４６】
核酸の例となる供給源が本明細書に記載されている。しかしながら、利用可能な多数の完全ゲノム配列を用いて必要な１，３−ＢＤＯ生合成活性（例えば本明細書に記載されるアルドラーゼ型の酵素）をコードする遺伝子を、例えば、既知の遺伝子のホモログ、オーソログ、パラログおよび非オーソロガス遺伝子変位、および生物間での遺伝的変異の交換を含む、近縁または遠縁の種の１つ以上の遺伝子について同定することは当業者にとって日常的で周知のことであり、本明細書における教示に照らし合わせて本文脈において実行され得る。
【０１４７】
結果として、本開示に照らし合わせると、モーレラ・サーモアセティカなどの特定の生物を参照して本明細書に記載される３−ヒドロキシブタナールまたはそれに由来する下流産物（例えば１，３−ＢＤＯ）の生合成を可能にする代謝改変を容易に他の微生物に適用することができる。当業者は１種類の生物において例示される代謝改変を等しく他の生物にも適用することができることを知るであろう。
【０１４８】
当業者は特定のタンパク質または核酸が例えば受託番号または他の預託識別証明を参照して言及されるときはその配列の機能変異体が使用される場合もあることを理解する。本発明は主に酵素活性に関係しているので、機能変異体は言及された酵素によって触媒される反応と同じ基質から産物への反応を触媒するが、異なる配列を有しているものになることが理解されるものとする。変異体の非限定的な例には次のものが含まれる。
【０１４９】
（ｉ）列挙または言及された配列を使用して単離可能である新規の天然核酸。これらにはアレル（１か所以上の塩基に多型または変異を含む）、パラログ、アイソジェン、または関連酵素と同じファミリーに属する他の相同遺伝子が含まれ得る。異なる微生物種または他の種のオーソログまたはホモログも含まれる。
【０１５０】
したがって、本明細書において言及される遺伝子のホモログであるアミノ酸配列をコードする核酸分子を使用することが本発明の範囲内に含まれる。相同性は以下で議論されるようにヌクレオチド配列レベルおよび／またはアミノ酸配列レベルの相同性であり得る。異なる種または株に由来するホモログは列挙された配列によって生じる表現型と類似の表現型を生じる産物をコードする。
【０１５１】
（ｉｉ）本開示に照らし合わせて当業者によって調製され得る人工核酸。そのような派生物は、例えば、部位特異的変異形成または無作為変異形成によって、または直接合成によって調製され得る。その変異体核酸は本明細書において言及される配列の全体または一部を有する元の核酸から直接的または間接的に（例えば、１段階以上の増幅ステップまたは複製ステップを経て）作製されることが好ましい。
【０１５２】
多数の理由のため、変更が望ましいこともあり得る。例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位を導入または除去するか、またはコドン使用を変更すること場合があり得る。
【０１５３】
あるいは、配列の変更によってその核酸中の１個以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失または置換のうちの１つ以上（例えば幾つか）による派生物を作製し、コードされるポリペプチド中の１個以上（例えば数個）のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換することができる。
【０１５４】
コードされるポリペプチドの活性（例えば特異性）または安定性を変更する、または発達させるため、他の望ましい変異は無作為変異または部位特異的変異形成であり得る。変異は保存的変異によるもの、すなわちイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基の別の疎水性残基に対する置換、または１つ極性残基の別の極性残基に対する置換、リシンへのアルギニンの置換、アスパラギン酸へのグルタミン酸の置換、またはアスパラギンへのグルタミンの置換などであり得る。当業者によく知られているように、保存的置換によるポリペプチドの一次構造の変更は、その配列に挿入されているアミノ酸の側鎖が置換されて失われたアミノ酸の側鎖と類似の結合および接触を形成することが可能であり得るので、そのペプチドの活性を大きく変更しない可能性がある。このことはペプチドの立体構造の決定に重要である領域にあるときでもそうである。非保存的置換を有する変異体も含まれる。当業者によく知られているように、ペプチドの立体構造の決定に重要ではないそのペプチドの領域の置換は、それらの置換がそのペプチドの三次元構造を大きく変えないので、そのペプチドの活性を大きく変更しない可能性がある。ペプチドの立体構造または活性の決定に重要な領域ではそのような変異がそのポリペプチドに有利な特性を与える可能性がある。実際に、上で記載された変異のような変異がそのペプチドにやや有利な特性、例えば変化した安定性または特異性を与える可能性がある。
【０１５５】
本明細書において使用される場合、「変異体」核酸という用語はこれらの可能性の全てを包含する。ポリペプチドまたはタンパク質の文脈で使用されるとき、それはその変異体核酸のコードされる発現産物を表している。
【０１５６】
次に変異体に関する本発明の態様の幾つかをより詳細に述べる。
【０１５７】
配列同一性は、実施例において使用されるように初期設定を使用してＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のＢＬＡＳＴｐ（タンパク質）またはＭｅｇａｂｌａｓｔ（核酸）を使用することで評価され得る。
【０１５８】
本明細書において開示される配列の変異体は少なくとも５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、または７０％、または８０％の同一性を有することが好ましく、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有することが最も好ましい。そのような変異体は本明細書において「実質的に相同である」と言及され得る。
【０１５９】
核酸断片が前記酵素の特定の機能部分（すなわち、その酵素の生物活性をコードしている部分）をコードする場合があり得る。したがって、本発明は本明細書において開示される全長ポリペプチドの断片、特にそれらのポリペプチドの活性部分の作製および使用を提供する。ポリペプチドの「活性部分」は、前記全長ポリペプチドよりも短いが、その必須生物活性を保持しているペプチドを意味する。
【０１６０】
一般的に言えば、当業者は本明細書に記載される遺伝子組み換え操作のためにベクターの構築およびプロトコルのデザインが充分に可能である。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を必要に応じて含む、適切な調節配列を含む適切なベクターを選択または構築することができる。これ以上の詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、１９９２年を参照されたい。
【０１６１】
本明細書において使用される場合、特にそのベクターがゲノムへの組換えのために細胞に核酸を導入するために使用される予定である場合、「ベクター」は必ずしもプロモーターまたは他の調節配列を含まない。
【０１６２】
しかしながら発現目的のためには、ベクター中の核酸は典型的には微生物宿主細胞中での転写のための適切なプロモーターまたは他の調節配列の制御下にあり、そのようなプロモーターまたは他の調節配列に機能可能であるように連結される。その核酸は本来のプロモーターを含んでよい。ｃＤＮＡの場合ではこれは宿主細胞中での発現のための適切なプロモーターまたは他の調節配列の制御下にあってよい。
【０１６３】
「プロモーター」は下流に（すなわち二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上の３’方向に）機能可能であるように連結されたＤＮＡの転写を開始することができるヌクレオチドの配列を意味する。「機能可能であるように連結された」は、そのプロモーターから開始される転写にとって適切に配置および配向されて同じ核酸分子の一部として連結されたことを意味する。プロモーターに機能可能であるように連結されたＤＮＡはそのプロモーターの「転写開始制御下」にある。１つの実施形態ではそのプロモーターは誘導可能プロモーターである。プロモーターに適用される場合の「誘導可能」という用語は当業者によく知られている。基本的に、誘導可能プロモーターの制御下での発現は加えられた刺激に応答して「スイッチが入れられる」か、または増加する。その刺激の性質はプロモーター間で異なる。幾つかの誘導可能プロモーターは適切な刺激が存在しない状態では微弱な、または検出不可能なレベルの発現させる（または発現させない）。他の誘導可能プロモーターは刺激が存在しない状態で検出可能な恒常的発現をさせる。刺激が存在しない状態での発現のレベルがどのようなものであれ、正しい刺激が存在する状態ではどんな誘導可能プロモーターからでも発現が増加する。
【０１６４】
本開示は、適切な酵素の選択、それらの酵素の対応する遺伝子の産生宿主へのクローニング、これらの遺伝子の安定性と発現の最適化、競合経路の転写減弱化または機能欠失、所望の産物を産生するための遺伝子操作株の発酵条件の最適化、および発酵後の産物形成についてのアッセイにより、どのように経路を改変して生物に入れることができるか教示している。
【０１６５】
「異種性」という用語は対象のヌクレオチドの遺伝子／配列（例えば、アルドラーゼをコードしている）が遺伝子操作を用いて、すなわち人為介入によって宿主細胞またはその祖先に導入されていることを表すために本明細書において広く使用されている。宿主細胞にとって異種性の核酸はその型、亜種、または種の細胞において非天然になる。したがって、その異種性核酸は、ある微生物のコード配列またはその微生物に由来するコード配列であって、異なる微生物内に配置されたコード配列を含み得る。ある核酸配列をその核酸配列またはホモログがもとから見られる細胞に配置するが、発現制御のためのプロモーター配列などの１つ以上の調節配列に機能可能であるように連結するなど、その細胞内では天然に存在しない核酸にその核酸配列を連結して、および／または隣接させて前記細胞内に前記核酸配列を配置することがさらに可能である。
【０１６６】
本文脈における「形質転換された」は、異種性核酸のヌクレオチド配列がその細胞の特徴のうちの１つ以上を変更し、したがって３−ヒドロキシブタナールまたはそれに由来する下流産物（例えば１，３−ＢＤＯ）に関する表現型を変更することを意味する。
【０１６７】
本発明において使用されるときの「核酸」はｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび修飾核酸または核酸類似体（例えばペプチド核酸）を含み得る。ＤＮＡ配列が例えば図の参照によって明示されている場合、ＲＮＡ等価物が生じる場合は文脈から別途必要とされない限りＴにＵが置換されたＲＮＡ等価物が包含される。本発明による核酸分子は天然環境から実質的に純粋または均質な形態で、または起源の種の他の核酸を含まずに、または実質的に含まずに単離および／または精製され、且つ、二本鎖または一本鎖で提供され得る。本明細書において使用される場合、「単離された」という用語はこれらの可能性の全てを包含する。それらの核酸分子は全合成または部分合成のものであり得る。特にそれらの核酸分子は、自然界では一緒に見つからない（連続的に並んでいない）核酸配列がライゲートされているか、またはそうでなければ人工的に結合されているという点で組み換え型であり得る。核酸は下で述べる配列のうちのいずれかを含み得る、それらの配列のうちのいずれかからなり得る、またはそれらの配列のうちのいずれかから基本的になり得る。
【０１６８】
本明細書における方法では所望の酵素をコードする１つの遺伝子に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を担持するグラム陽性細菌に利用可能なあらゆるシャトルベクターをモーレラ・サーモアセティカまたは目的の他の微生物の形質転換に使用することができる。
【０１６９】
グラム陽性種またはアセトゲンにおいて、およびより具体的にはクロストリジウム種またはアセトゲンにおいてプラスミドの複製に関与する少なくとも一つの遺伝子を挿入することにより発現プラスミドが得られる。アセトゲンにその所望の遺伝子を導入することが可能であるプラスミドは、それが酢酸生産細菌における複製および増幅に関与する少なくとも一つの遺伝子を含んでいる限り、特に限定されない。その具体的な例にはｐＡＫ２０１（Ｋｉｍ，  Ａ．およびＢｌａｓｈｅｋ，  Ｈ．  Ｐ．著、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第５５巻（第２号）：３６０〜３６５頁（１９８８年））、ｐＨＢ１０１（Ｂｌａｓｃｈｅｋ  Ｈ．  Ｐ．ら著、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．誌、第１４７巻（第１号）：２６２〜２６６頁（１９８１年））、ｐＭＴＬ８０００モジュール式プラスミドシリーズ（Ｈｅａｐ，  Ｊ．Ｔ．ら著、Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第７８巻：７９〜８５頁（２００９年））のうちのいずれか、ｐＭＳ１、ｐＭＳ２、ｐＭＳ３、ｐＭＳ４、ｐＫＶ１２（Ｓｔａｅｔｚ，  Ｍ．ら著、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、１０３３〜１０３７頁（１９９４年））、ｐＵＢ１１０（ＭｃＫｅｎｚｉｅら著、１９８４年）、ｐＩＭＰ１（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｌら著、１９９２年）、ｐＩＴＦ（Ｄｏｎｇ，  Ｈ．ら著、２０１０年）が含まれる。アセトゲン内での使用に適切であることが知られているプラスミドのその他の例は英国のノッチンガム大学から入手可能なｐＭＴＬ８００００（Ｋｏｐｋｅ，  Ｍ．ら著、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、３３９４〜３４０３頁、２０１４年）である。
【０１７０】
ｐＵＢ１１０または上で言及したプラスミドのうちのいずれかとｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，  Ｃ．ら著、Ｇｅｎｅ誌、第３３巻：１０３〜１１９頁（１９８５年））またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋／−）などの一般的な大腸菌クローニングベクターのキメラである新規シャトルベクターを容易に作製および試験することができる。これらのキメラプラスミドはプラスミド単離のために大腸菌内で増殖され、そのプラスミドによって発現される抗生物質遺伝子に対して本来感受性であるモーレラ・サーモアセティカまたは別のアセトゲンもしくはグラム陽性細菌の遺伝子操作作業に使用される。必要な場合、サブクローニングを用いて既存のプラスミド上の抗生物質耐性カセットを標的生物の抗生物質感受性に基づいて適切なもので置き換えることができる。ハイフィデリディＤＮＡポリメラーゼならびに制限酵素消化、ライゲーションおよび大腸菌形質転換を含む分子サブクローニングを用いるＤＮＡ増幅の標準的技術をプラスミドの改変に用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、１９８９年）。
【０１７１】
モーレラ・サーモアセティカの抗生物質耐性が液体培養物中およびプレート上で検査され、選別条件が特定されている。１つの実施形態ではカナマイシンおよびクロラムフェニコールを遺伝子操作モーレラ・サーモアセティカ株の選別のための抗生物質マーカーとして利用してよい。
【０１７２】
必要な活性のオペロン、またはそのオペロンの１遺伝子を２つの使いやすい制限部位の間でマルチクローニングサイトにライゲーションすることができる。
【０１７３】
導入された異種性遺伝子について最適の遺伝子発現を達成するため、当業者によく知られた技術を用いて標的生物向けにそれらの異種性遺伝子のコドンを最適化することができる。
【０１７４】
遺伝子産物発現の検出および定量を簡単にするため、当業者に理解されるようにクローン化された遺伝子配列にＮ末端タグ配列またはＣ末端タグ配列を付加することができる。
【０１７５】
多数のクロストリジウム種を予めメチル化されたＤＮＡベクターで形質転換することに成功している。形質転換可能なＤＮＡのメチル化は宿主による分解からそれを防御する。形質転換可能ＤＮＡのインビボメチル化はＴｏｐ１０（ｐＡＮ２）などのメチル化大腸菌株（Ｋｕｉｔら著、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．誌、第９４巻：７２９〜７４１頁（２０１２年））内でのその増殖によって達成される。
【０１７６】
異種性（または外来性；それらの用語は互換的に使用される）遺伝子は、モーレラ・サーモアセティカおよびアセトバクテリウム・ウッディイによって本明細書において例示される選択された宿主細胞に、接合、電気穿孔、化学薬品形質転換、形質導入、形質移入および電気融合を含むがこれらに限定されない当技術分野においてよく知られている技術を用いて導入され得る。電気穿孔および接合についてはウェルシュ菌、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・セルロリティカムおよびアセトバクテリウム・ウッディイの公開プロトコルを使用してよい。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、例えば標的代謝中間体および／または１，３−ＢＤＯのフラックスを増加させるため、または代謝経路をバイオマス生成からそらすために宿主微生物細胞において遺伝子をターゲティングする、または不活化することが望ましい場合がある。一例は、３−ヒドロキシブタナール経路からのピルビン酸の損失を最小化することである。
【０１７８】
モーレラ・サーモアセティカまたは他のアセトゲンにおいて遺伝子を恒久的に不活化するため、当技術分野においてよく知られている組込み型変異導入技術または遺伝子置換技術による遺伝子欠失のためのプラスミドを構築することができる。組込み型変異形成および遺伝子置換は宿主ゲノムから望ましくない遺伝子を選択的に不活化することができる。そのような方法はクロストリジウム株の代謝改変変異体を作製するために開発され、そのための使用に成功している（Ｇｒｅｅｎら著、１９９６年）。この技術では標的遺伝子の断片は選択マーカーと共に非複製ベクターにクローン化され、それにより非複製組込み型プラスミドが生じる。その非複製プラスミド内の部分的遺伝子は親染色体内の元の標的遺伝子の内部相同領域と組み代わること（二重交差）ができ、それにより標的遺伝子、この特定の例ではＩｄｈ座位の挿入不活性化が生じる。遺伝子置換（二重組換えによる）の使用はベクターの選択を持続する必要が無い、より安定した遺伝子操作株の作製を可能にするので、それは挿入不活性化（一重組換え）よりも好ましい。アセトゲンにおける二重交差について記載する一例が実施例５に示されている。
【０１７９】
競合経路を取り除くために１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の遺伝子の完全欠失または部分欠失を有する非天然微生物を、この技術を使用して同じように作製することができる。
【０１８０】
それらの標的遺伝子の発現の低下を遺伝子破壊の代替法として用いることもできる。これは、遺伝子発現を完全に消失させるのではなく阻害する標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡの発現を用いて達成され得る。そのアンチセンスＲＮＡ系は、完全な不活性化によってその生物に損害を与える、またはその生物にとって致死的である可能性がある遺伝子の発現を低下させることができるという利点を有する、所望の遺伝子の簡便な遺伝子ノックダウンアプローチとして機能する。
【０１８１】
遺伝子発現を下方制御するためにアンチセンス遺伝子または部分遺伝子配列を使用するときにヌクレオチド配列は、標的遺伝子の「センス」鎖から転写される通常のｍＲＮＡに相補的であるＲＮＡが転写によって産出されるように「逆方向」のプロモーターの制御下に置かれる。例えば、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら著、１９８７年；Ｓｍｉｔｈら著、（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ誌、第３３４巻、７２４〜７２６頁を参照されたい。
【０１８２】
配列コード配列に対応する完全配列（アンチセンスについては逆方向）を使用する必要は無い。例えば、充分な長さの断片を使用してよい。様々なサイズの、およびコード配列の様々な部分に由来する断片をスクリーニングしてアンチセンス阻害のレベルを最適化することは当業者にとって日常的な作業である。開始ＡＴＧコドン、およびおそらくは開始コドンの１ヌクレオチド以上の上流のヌクレオチドを含むことが有利な場合がある。遺伝子の保存配列、例えば、１つ以上の遺伝子に特徴的である調節配列などの配列をターゲティングすることがもう一つの可能性である。
【０１８３】
使用される配列は約５００ヌクレオチド以下であり得、場合により約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチドであり得る。長めの断片、および一般的には約５００ヌクレオチドよりもずっと長いヌクレオチド、例えば約６００ヌクレオチドよりも長いヌクレオチド、約７００ヌクレオチドよりも長いヌクレオチド、約８００ヌクレオチドよりも長いヌクレオチド、約１０００ヌクレオチドよりも長いヌクレオチド、またはそれよりも長いヌクレオチドなどが可能であれば好ましいが、ずっと短めの長さのオリゴヌクレオチド、１４〜２３ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用することが可能である場合もあり得る。
【０１８４】
配列の完全な相補性または類似性は必須ではないが、標的配列の発現の下方制御に使用される配列とその標的配列に完全な配列同一性が存在することが好ましい場合がある。１ヌクレオチド以上のヌクレオチドが使用された配列において標的遺伝子と異なっていてよい。したがって、本発明に準拠して遺伝子発現の下方制御に使用される配列は利用可能な配列から選択された野生型配列（例えば遺伝子）、または上で記載された定義でのそのような配列の変異体であり得る。その配列がオープン・リーディング・フレームを含む必要は無く、または翻訳可能であるＲＮＡを明記する必要は無い。
【０１８５】
形質転換、発現およびアンチセンスＲＮＡ阻害ツールの適用がクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｄｅｓａｉ  Ｒ．ら著Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  ＆  Ｅｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第６５巻（第３号）：９３６〜９４５頁（１９９９年）、（Ｆｉｅｒｒｏ−Ｍｏｎｔｉ  ＩＰら著、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．誌、第１７４巻（第２３号）：７６４２〜７６４７頁（１９９２年））、およびクロストリジウム・セルロリティカム（Ｐｅｒｒｅｔ  Ｓ．ら著、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第５１巻（第２号）：５９９〜６０７頁（２００４年））などの中温性クロストリジウムならびにサーマス・サーモフィルスなどの好熱菌（Ｍｏｒｅｎｏ，  Ｒ．ら著Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．誌、７８０４〜７８０６頁（２００４年））について実証されており、且つ、本明細書において適用され得る。
【０１８６】
標的遺伝子の下方制御発現のための魅力的なアプローチは本来のプロモーターを活性が低いプロモーター、例えば別の遺伝子のプロモーターで置換することである。これは当技術分野においてよく知られている二重組換え技術／遺伝子置換技術によって達成され得る。あるいは、発現はリボソーム結合部位を変えること、またはＲＢＳと翻訳開始コドンとの間の間隔を変えること、または効率性が低い開始コドンを使用することにより低下し得る。
【０１８７】
これらの試験研究の結果により作製された変異体の表現型を解析し、同様にモーレラ・サーモアセティカまたは他のアセトゲンの遺伝子を操作することができる。最適の結果を達成するために方法、プラスミドおよび条件を変更することによりさらに最適化を実施して遺伝的系を開発することができる。具体的には、モーレラ・サーモアセティカなどの特定の生物を参照して本明細書に記載される１，３−ＢＤＯの生合成を可能にする代謝改変は、原核生物および真核生物を同様に含む他の微生物に容易に適用され得る。
【０１８８】
本明細書中のどの副題も簡便さのためだけに含まれており、本開示を多少なりとも限定するものと解釈されてはならない。
【０１８９】
次に以下の非限定的な図および実施例を参照して本発明をさらに説明する。本発明の他の実施形態は、これらから当業者に想到されるであろう。
【０１９０】
本明細書において引用された全ての参照文献およびそれらの参照文献に付随する要約の開示は、それが本発明を実施するために当業者によって使用され得る限りは、ここで相互参照によって本明細書に特異的に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】ブタジエンおよびメチルエチルケトンを含む工業的に重要な化学薬品への１，３−ブタンジオールの化学的変換の例を示す図である。Ｉｃｈｉｋａｗａら著、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ誌、第２５６巻：１０６〜１１２頁（２００６年）
【図２】メタノールを含む、または含まずに気体状炭素源から３分子のアセチルＣｏＡ（３分子の酢酸）を合成するためのウッド・リュングダール経路を示す図であって、メタノールの投入点を示している図である。関連の化学反応式は次の通りである：４ＣＨ３ＯＨ＋２ＣＯ２→３ＣＨ３ＣＯＯＨ；１２ＣＯ＋６Ｈ２Ｏ→３ＣＨ３ＣＯＯＨ＋６ＣＯ２；１２Ｈ２＋６ＣＯ２→３ＣＨ３ＣＯＯＨ＋６Ｈ２Ｏ。ウッド・リュングダール経路は解糖とピルビン酸の脱炭酸に由来する還元当量を使用して解糖系（ピルビン酸脱炭酸）に由来するＣＯ２を固定することもできる。
【図３】中心代謝中間体であるアセチルＣｏＡまたはピルビン酸からの共通経路中間体アセトアルデヒドを経る１，３−ブタンジオールの合成のための代謝経路（ルート１、ルート２、ルート３、ルート４、ルート５およびルート６）を示す図である。これらのステップを触媒するために必要な酵素活性が活性Ａ、活性Ｂ、活性Ｃ、活性Ｄ、活性Ｅ、活性Ｆ、活性Ｇ、および活性Ｈとして記載される。これらの活性をコードする例となる遺伝子配列は表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に見られる。  ルート１はカルボン酸レダクターゼ活性、例えば、ＥＣ１．２．７．５活性またはＥＣ．１．２．９９．６活性、ＡＴＰもしくはフェレドキシン駆動性活性またはＥＣ１．２．１．３０活性またはＥＣ１．２．１．３活性を介してアセチルＣｏＡから酢酸（酢酸生産微生物の天然産物）を経てアセトアルデヒドへ進行する。  ルート２はアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）、例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＥＣ１．２．１．１０を使用するアセチルＣｏＡからのアセトアルデヒドの直接合成を含む。  ルート３はＥＣ１．２．７．１またはＥＣ１．２．１．５１またはＥＣ１．２．４．１およびＥＣ１．２．１．１０などの酵素を使用するピルビン酸のアセチルＣｏＡを経るアセトアルデヒドへの変換を含む。  ルート４はピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１）を介するピルビン酸のアセトアルデヒドへの直接の変換を含む。  ルート５はＥＣ１．２．７．１およびＥＣ４．１．１．１などの酵素を使用するアセチルＣｏＡのピルビン酸を経るアセトアルデヒドへの変換を含む。  ルート６はＥＣ６．２．１．１またはＥＣ２．８．３．８およびＥＣ１．２．１．１０などの酵素を使用する酢酸のアセチルＣｏＡを経るアセトアルデヒドへの変換（活性ＦおよびＢ）を含む。  アルドール縮合においてアルデヒドをアクセプターとしてもドナーとしても受容することができるアルドラーゼ、例えば、デオキシリボースホスフェートアルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）を使用して２分子のアセトアルデヒドを縮合して３−ヒドロキシブタナールが形成される。３−ヒドロキシブタナールはアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼによって、例えば、ＥＣ１．１．１．１、ＥＣ１．１．１．２、ＥＣ１．１．１．７２またはＥＣ１．１．１．２６５またはＥＣ１．１．１．２８３に分類される酵素を使用して１，３−ブタンジオールに還元される。
【図４】ＲｕＭＰ経路およびその経路のＴＣＡ回路との関係を示す図（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、２００３年、第６９巻、３９８６頁より改変）である。ＲｕＭＰ経路の一次産物であるピルビン酸はＴＣＡ回路に入る前にアセチルＣｏＡに変換される。ピルビン酸またはアセチルＣｏＡのいずれかを、共通経路中間体であるアセトアルデヒドに直接変換することによって、１，３−ブタンジオールを合成するためのアルドール縮合においてアセトアルデヒドをドナーとしてもアクセプターとしても受容することが可能であるＤＥＲＡ型アルドラーゼの基質を供給することができる。
【図５】ウッド・リュングダール経路を示す図である。ピルビン酸またはアセチルＣｏＡのいずれかを、共通経路中間体であるアセトアルデヒドに直接的に変換することによって、１，３−ブタンジオールを合成するためのアルドール縮合においてアセトアルデヒドをドナーとしてもアクセプターとしても受容することが可能であるＤＥＲＡ型アルドラーゼの基質を供給することができる。Ｆｕｎｇ  Ｍｉｎ  Ｌｉｅｗ、Ｍｉｃｈａｅｌ  ＫｏｐｋｅおよびＳｅａｎ  Ｄｅｎｎｉｓ  Ｓｉｍｐｓｏｎ著、（２０１３年）、  Ｇａｓ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  Ｌｉｑｕｉｄ，  Ｇａｓｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｉｄ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  −  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｚｈｅｎ  Ｆａｎｇ教授（編）、ＩＳＢＮ：９７８−９５３−５１−１０５０−７、Ｉｎ  Ｔｅｃｈ、ＤＯＩ：１０．５７７２／５２１６４より改変。アセチルＣｏＡに由来する酢酸を、アルドラーゼへ供給するためのアセトアルデヒドに直接還元することもできる。
【図６】逆ＴＣＡ回路を示す図である。ピルビン酸またはアセチルＣｏＡのいずれかを、共通経路中間体であるアセトアルデヒドに直接変換することによって、１，３−ブタンジオールを合成するためのアルドール縮合においてアセトアルデヒドをドナーとしてもアクセプターとしても受容することが可能であるＤＥＲＡ型アルドラーゼの基質を供給することができる。Ｍａｒ．  Ｄｒｕｇｓ．誌、２０１１年、第９巻、７１９頁より改変。
【図７】セリン回路を示す図である。アセチルＣｏＡを共通経路中間体であるアセトアルデヒドに直接的に変換して、１，３−ブタンジオールを合成するためのアルドール縮合においてアセトアルデヒドをドナーとしてもアクセプターとしても受容することが可能であるＤＥＲＡ型アルドラーゼの基質を供給することができる。中央代謝経路はＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）もピルビン酸に変換し、それは前に記載されたように脱炭酸されてアセトアルデヒドになり得る。
【図８】デオキシリボースホスフェートアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）により触媒されるアセトアルデヒドの縮合を示す図である。一回目の縮合の産物である３−ヒドロキシブタナールがさらに縮合することなく蓄積し、または酵素および反応条件によって二回目のアセトアルデヒド付加の対象となる。
【図９】糖合成（または利用）に連結および／またはピルビン酸またはアセチルＣｏＡへの変換に直接的に連結されているカルビン回路を示す図である。ピルビン酸またはアセチルＣｏＡのいずれかを、共通経路中間体であるアセトアルデヒドに直接的に変換することによって、１，３−ブタンジオールを合成するためのアルドール縮合においてアセトアルデヒドをドナーとしてもアクセプターとしても受容することが可能であるＤＥＲＡ型アルドラーゼの基質を供給することができる。
【図１０】アセトゲンにおける異種性遺伝子の発現の成功を示す、０．１ｇ／ＬのＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸）を含む寒天プレート上で培養されたアセトバクテリウム・ウッディイを示す図である。この系は他の異種性遺伝子の発現を確認するためのレポーターとしても作用し得る。  符号Ａ１：プラスミドｐＥＰ５５を担持するアセトバクテリウム・ウッディイのコロニー１Ａ２：プラスミドｐＥＰ５５を担持するアセトバクテリウム・ウッディイのコロニー２Ｂ１：プラスミドｐＥＰ５６を担持するアセトバクテリウム・ウッディイのコロニー１Ｂ２：プラスミドｐＥＰ５６を担持するアセトバクテリウム・ウッディイのコロニー２Ｃ：関係の無い遺伝子を発現するｐＥＰプラスミドを担持する陰性対照アセトバクテリウム・ウッディイ
【図１１】ＬＤＨ遺伝子をエリスロマイシン耐性マーカーで置換することによりアセトバクテリウム・ウッディイＬＤＨノックアウト変異体を構築するためのクローニングストラテジーを示す図である。
【図１２】一重交差組換えイベントおよび完全プラスミドの組込みによるＬＤＨ遺伝子の破壊によりアセトバクテリウム・ウッディイＬＤＨノックアウト変異体を構築するためのクローニングストラテジーを示す図である。
【図１３】２０ｍＭのフルクトースおよび４０ｍＭのＤＬ−乳酸の存在下でのアセトバクテリウム・ウッディイ野生型およびアセトバクテリウム・ウッディイ変異体の増殖を示す図である。Ａｗ＝アセトバクテリウム・ウッディイ野生型、プラスミド＝プラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙ−ｐＡＭβ１を有するアセトバクテリウム・ウッディイ形質転換体、ｄＬＤＨ＝二重交差ＬＤＨノックアウト。ＳＲ＝一重交差ＬＤＨノックアウト。
【図１４】アセトバクテリウム・ウッディイ野生型およびアセトバクテリウム・ウッディイ変異体によるフルクトースの利用と酢酸の産生を示す図である。Ａｗ＝アセトバクテリウム・ウッディイ野生型、Ｐ＝プラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙ−ｐＡＭβ１を含有するアセトバクテリウム・ウッディイ形質転換体、ｄＬＤＨ＝二重交差ＬＤＨノックアウト。ＳＲ＝一重交差ＬＤＨノックアウト。
【図１５】アセトバクテリウム・ウッディイ野生型およびアセトバクテリウム・ウッディイ変異体による乳酸の利用と酢酸の産生を示す図である。Ａｗ＝アセトバクテリウム・ウッディイ野生型、Ｐ＝プラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙ−ｐＡＭβ１を有するアセトバクテリウム・ウッディイ形質転換体、ｄＬＤＨ＝二重交差ＬＤＨノックアウト。ＳＲ＝一重交差ＬＤＨノックアウト。
【図１６】ＤＥＲＡ酵素を組み入れている様々な経路の組合せから産生された産物である１，３−ブタンジオールの代表的なマススペクトロメトリーデータを示す図である。
【図１７】３−ヒドロキシブタナールから得られる下流産物の例を示す図である。
【実施例】
【０１９２】
方法と材料―１，３−ブタンジオールを産生するようにアセトゲンに導入するための遺伝子のクローニング、発現、および活性アッセイ
選択した宿主において１，３−ブタンジオール経路を構成するアプローチはその宿主生物に既に存在する経路遺伝子に依存する。経路の構成に適すると考えられる内在性遺伝子を過剰発現させ、その経路を介する１，３−ブタンジオールへの充分なフラックスを確実にすることができる。
【０１９３】
１，３−ブタンジオール産生株を作製するために必要な代謝改変ステップはピルビン酸またはアセチルＣｏＡまたはそれらの両方がアセトアルデヒド源として選択されるかどうかに依存する。アセトアルデヒドの後続の変換は全てのルートに共通である。例えばルート１について、アセトアルデヒドはアセチルＣｏＡから酢酸を経て得られる。酢酸は、リットル当たり数十グラムまで蓄積することができる天然のアセトゲン産物である。例えば、ＣＯ２およびＨ２で増殖しているアセトゲンのアセトバクテリウム・ウッディイから４４ｇ／ｌが得られた（Ｄｅｍｌａｒ，  Ｍ．ら著、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．誌、２０１１年、第１０８巻、４７０頁）。充分な還元当量およびＡＴＰ（可能であれば）が存在する状態で酢酸のアセトアルデヒドへの還元が可能であるカルボン酸レダクターゼ、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼまたは他の酵素（例となる配列が表１に提示されている）の過剰発現によりアセトアルデヒドへの変換が可能になる。この例では発酵用のバイオマス産生以外で全ての炭素フラックスを酢酸またはアセチルＣｏＡに最適化することが望ましい。生合成に必要ではない乳酸などの副産物の蓄積はそれぞれの遺伝子、例えば乳酸デヒドロゲナーゼ（実施例５）のノックアウトにより回避される。リンゴ酸またはフマル酸などの細胞合成に必要な代謝産物の過剰産生は、ボトルネックを避けるために適正で平衡がとれた炭素のフラックスによって回避される。
【０１９４】
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いるアセチルＣｏＡのアセトアルデヒドへの直接的変換（内在性酵素の過剰発現、または例えば表２のｅｕｔＥの導入）は、酢酸蓄積が存在しない状態で（ルート２）、またはフラックスが酢酸を介して、または直接にアセトアルデヒドへ向かっている場合に酢酸蓄積を伴う状態で進行し得る。選択されたルートは、供給された原料に関連し得る生物エネルギー論的要件に影響される可能性がある。一次中心代謝中間体をアセトアルデヒドへ直接的に変換することが非常に好ましい。アセチルＣｏＡの酢酸への変換に由来するＡＴＰ合成の損失が生体エネルギー論によって許容される場合に１つ以上のホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子または酢酸キナーゼ（ａｃｋ）遺伝子のノックアウトによってアセトゲンにおいて酢酸の蓄積を防止することができる（実施例６および８）。さらに、本来の調節によって酢酸の蓄積を防止してよいし、またはウッド・リュングダール経路活性を維持しながら酢酸合成からフラックスをそらす変異によって酢酸の蓄積を防止してよい。例えば、硝酸が存在する状態でのアセトゲンのモーレラ・サーモアセティカ（クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）より改称）のＣＯおよびメタノール上での増殖は、重要なウッド・リュングダール関連遺伝子の発現の抑制のために酢酸を蓄積しなかった（Ｓｅｉｆｒｉｔｚ，  Ｃ．ら著、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．誌、１９９３年、第１７５巻、８００８頁）。その例では充分なＡＴＰが硝酸呼吸から供給されるようであった。ピルビン酸シンターゼ（ＥＣ１．２．７．１、表３）を使用してピルビン酸を経てアセチルＣｏＡをアセトアルデヒドへ変換することもできる（ルート５）。この例ではアセトアルデヒド以外のピルビン酸由来の産物へ向かう炭素フラックスの損失を回避することが特に望ましい（例えば、ＬＤＨのターゲティングが望ましい場合がある）（実施例５）。
【０１９５】
ピルビン酸が一次中心代謝中間体である場合、表４の例となる配列を使用する脱炭酸を介してピルビン酸をアセトアルデヒドへ直接的に変換する（ルート４）こと、および望ましくない経路（例えばＬＤＨまたはピルビン酸ギ酸リアーゼ）のターゲティングによりフラックスを最適化することが好ましい。しかしながら、ルート３（ＴＣＡ回路に入る前の天然代謝ルート）または表３に示されている遺伝子配列を用いることによりピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換させることがあるいは好ましい場合がある。
【０１９６】
過剰発現された内在性または異種性のＤＥＲＡ（例となる配列が表６に示されている）を介して最大量のアセトアルデヒドを３−ヒドロキシブタナールに変換することが望ましい。したがって、酸化産物または還元産物（酢酸またはエタノール）に向かう損失は、望ましくない遺伝子、例えば、アセトアルデヒドに対して高い活性を有する短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ、または非アセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えばＥＣ１．２．１．５）のノックアウトによって回避されるべきである。３−ヒドロキシブタナールの還元は、Ｃ２アルデヒド（アセトアルデヒド）と比べてＣ４アルデヒド（３−ヒドロキシブタナール）を優先する内在性のアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼの過剰発現、またはそのような異種性のアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼの導入によって達成される（例えば、実施例９）。そのような例は上で述べられており、例となる配列が表７に示されている。
【０１９７】
アセトゲンへの異種性遺伝子の導入が実施例７に記載されており、この方法はあらゆる異種性遺伝子、例えば、１，３−ブタンジオール経路内の遺伝子の導入に相互適用され得る。
【０１９８】
実施例１―中央経路代謝産物からのアセトアルデヒド合成および１，３−ＢＤＯ合成のためのルート
アセチルＣｏＡの１，３−ブタンジオールへの全体的変換は採用されるルートに応じて３ステップまたは５ステップのいずれかで達成され（図３）、共通経路中間体であるアセトアルデヒドへの全体的変換は１ステップまたは３ステップで達成される。アセトアルデヒドおよび３−ヒドロキシブタナールを介して得られる他の産物は上に記載されている（図１７も参照されたい）。
【０１９９】
ピルビン酸の１，３−ブタンジオールへの全体的変換は採用されるルートに応じて３ステップまたは４ステップのいずれかで達成され（図３）、共通経路中間体であるアセトアルデヒドへの全体的変換は１ステップまたは２ステップで達成される。
【０２００】
アセトアルデヒドから１，３−ブタンジオールへの２ステップは全ての１，３，−ブタンジオール合成ルートに共通である。
【０２０１】
それらの経路の説明をアセトアルデヒド合成のためのルート（ルート１、ルート２、ルート３、ルート４、ルート５およびルート６）と後続のＤＥＲＡによって触媒されるアルドール縮合を介するアセトアルデヒドの１，３−ブタンジオールへの変換のためのルートとして提供する。
【０２０２】
ルート１―アセチルＣｏＡの酢酸を経るアセトアルデヒドへの変換
アセトゲンはもともと糖またはＣ１原料（シンガス、ＣＯ２／Ｈ２、ＣＯ２およびメタノール）からウッド・リュングダール経路に由来するアセチルＣｏＡの変換を介して酢酸を高収量で産生する。収率は理論値の約８０％以上であることが典型的である。例えば、Ａ．Ｅ．  Ｂａｉｎｏｔｔｉら著、１９８８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ誌、第８５巻（第２号）、２２３〜２２９頁。例えば、ＣＯ２、Ｈ２、ＣＯ、またはメタノールをアセチルＣｏＡに変換するウッド・リュングダール経路の改変を介して、または増殖培地の最適化によってずっと高い収率が達成可能であり得ることが予想される。基本的には、アセトゲンではアセチルＣｏＡの一般的な運命はバイオマスの形成または維持に向かうか、またはＡＴＰを生成する酢酸合成に向かうかのどちらかである。ウッド・リュングダール経路はＡＴＰを必要とするので大半の事例では（増殖条件に応じて）その系のエネルギー需要のバランスを取るために酢酸合成が必要とされる。酢酸は大半のアセトゲンの主要な天然産物である。
【０２０３】
カルボン酸レダクターゼ酵素を使用して酢酸をアセトアルデヒドへ還元することができる。そのような酵素活性は主に還元型フェレドキシン（アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ）またはＡＴＰのいずれかを使用してカルボン酸部分の熱力学的に不利な還元を推進し、ＥＣ１．２．７．５、ＥＣ１．２．１．３０、ＥＣ１．２．９９．６．またはＥＣ１．２．１．３に分類される傾向がある。カルボン酸レダクターゼおよびアルデヒドオキシドレダクターゼという用語は本文献において互換的に使用される。アルデヒドデヒドロゲナーゼはカルボン酸の還元が可能である酵素を記述するためにも使用される。
【０２０４】
カルボン酸のマグネシウム、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨに依存的な還元を触媒して対応するアルデヒドとする、充分に研究されたカルボン酸レダクターゼの例をノカルディア・イオウェンシスに見ることができる（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら著、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．誌、第２８２巻：４７８〜４８５頁  （２００７年））。この酵素はｃａｒ遺伝子によってコードされており、大腸菌中にクローン化され、機能発現された（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら著、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．誌、第２８２巻：４７８〜４８５頁  （２００７年））。ｎｐｔ遺伝子産物の発現によって翻訳後修飾をによって前記酵素の活性が改善された。ｎｐｔ遺伝子は不活性アポ酵素を活性ホロ酵素に変換する特異的なホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードしている。この酵素の天然基質はバニリン酸であり、その酵素は乳酸と同じくらい小さな芳香族基質と脂肪族基質を広く受容する（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら著、Ｒ．  Ｎ．  Ｐａｔｅｌ編、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ内の第１５章、４２５〜４４０頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社、ボカラトン、フロリダ州（２００６年））。酢酸への活性は記載されていなかった。しかしながら、乳酸への高い活性から、前記酵素は３個ほどの少数の炭素原子を含む分子を受容することができることが示唆されている。したがって、この酵素はその天然型で、または発展形の酵素として酢酸還元に使用される可能性がある。
【０２０５】
その他の充分に研究された酵素はＣ６〜Ｃ１８の酸に対する野生型基質選択性を有するマイコバクテリウム・マリナム由来の例である（Ｋａｌｉｍ  Ａｋｈｔａｒ，  Ｍ．ら著、ＰＮＡＳ誌、２０１３年、第１１０巻、８７頁）。カルボン酸の還元が可能な酵素は、当技術分野において一般的な酵素進化技術を用いて酢酸への活性を上昇させるように、上述の通りに進化または変異導入してもよい。ストレプトマイセス属のｇｒｉＣ遺伝子およびｇｒｉＤ遺伝子も酸還元の多様な能力を有するカルボン酸レダクターゼをコードする。Ｓｕｚｕｋｉら著、２００７年、Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．誌、第６０巻（第６号）３８０頁。
【０２０６】
アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ酵素はＡＴＰではなくフェレドキシンを使用してカルボン酸還元を推進し、それらの酵素は多数のアセトゲンおよび他の生物に存在する（Ｗｈｉｔｅ，  Ｈら著、Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｌｅｒ誌、１９９１年、第３７２巻（第１１号）９９９頁；Ｗｈｉｔｅ，  ＨおよびＳｉｍｏｎ，  Ｈ．著、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、１９９２年、第１５８巻、８１頁；Ｆｒａｉｓｓｅ．  ＬおよびＳｉｍｏｎ，  Ｈ．著、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、１９８８年、第１５０巻、３８１頁；（Ｂａｓｅｎら著、２０１４年、ＰＮＡＳ誌、第１１１巻（第４９号）、１７６１８頁）。モーレラ・サーモアセティカ由来のカルボン酸還元酵素が精製および特徴解析されている。Ｗｈｉｔｅ，  Ｈ．ら著、Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ誌、１９８９年、第１８４巻、８９頁。さらに、プロピオンアルデヒドへのプロピオン酸の還元を用いると、対応するアルデヒドが反応中に取り除かれたときに特異的な活性が上昇することが示された。本発明にそのような酵素を適用した場合、産物であるアセトアルデヒドはＤＥＲＡ酵素によって絶えず取り除かれることになり、充分に蓄積しないと予測された。Ｈｕｂｅｒ，  Ｃ．ら著、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、１９９５年、第６４巻、１１０頁。
【０２０７】
酢酸還元の例となる遺伝子が表１に示されている。クロストリジウム・リュングダリイに由来するアルデヒドオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）遺伝子のＣＬＪＵ＿２０１１０およびＣＬＪＵ＿２０２１０は酢酸をアセトアルデヒドへ還元することが報告されている。Ｋｏｐｋｅ，  Ｍ．ら著、ＰＮＡＳ誌、２０１０年、第１０７巻、１５３０５頁。したがって、目的の還元へ向かう野生型酵素の活性を示している。様々な著者が、エタノール生産アセトゲンにおいて酢酸からアセトアルデヒドを経てエタノールを合成するためにＡＯＲ酵素が誘導される条件も記載した（Ｍｏｃｋら著、２０１５年、Ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｈ２  ａｎｄ  ＣＯ２  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．誌、第１９７巻（第１８号）、２９６５頁；Ｎａｌａｋａｔｈ，  Ｈ．ら著、２０１５年、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第１８６巻、１２２頁）。上で記載されたように、本発明の生物では中間体であるアセトアルデヒドからのエタノール産生に関与するアルコールデヒドロゲナーゼをターゲティングまたはノックアウトすることにより、ＤＥＲＡ酵素によって触媒されるアセトアルデヒドからの３−ヒドロキシブタナールの合成を促進することが望ましい場合がある。
【０２０８】
その他のアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ源は、一酸化炭素を推進力として酢酸からアセトアルデヒドを経てエタノールを効果的に合成するためにこの酵素を使用している、好熱菌であるサーモコッカス属の種（Ｋｅｓｅｎ，  Ｊ．Ｈ．著、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．誌、１９９５年、第１７７巻、４７５７頁）とピロコッカス属の種（Ｂａｓｅｎら著、２０１４年、ＰＮＡＳ誌、第１１１巻（第４９号）、１７６１８頁）である。主にアルデヒドの対応する酸への酸化について記載されているが、酢酸の還元も言及されている。酸についてのＫｍ値はアルデヒドについてのものよりも高いようであり、当技術分野において知られている標準的酵素進化技術を用いて酢酸還元に対する前記酵素の効率を改善することが可能である。アルデヒド酸化方向でアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼを使用することがＫｌｅｔｚｉｎ，  Ａ．，ら著、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．誌、１９９５年、第１７７巻、４８１７頁によってさらに記載されている。
【０２０９】
大腸菌のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＨ）は３−ヒドロキシプロピオン酸を対応するアルデヒドに還元することが示されており、同様に３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの好ましい酸化が示されている。Ｊｉ−Ｅｕｎ，  Ｊ．ら著、  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ誌、２００８年、第８１巻、５１頁。この酵素はアセトアルデヒドを酢酸に酸化することも示された。したがって、これらの著者によって前記酵素が可逆的であることが示されているので、酢酸の還元に向かう活性が予期される。
【０２１０】
【表１−１】
2017534268.tif 000003
【表１−２】
2017534268.tif 000004
【表１−３】
2017534268.tif 000005
【０２１１】
その他のｃａｒ遺伝子とｎｐｔ遺伝子、およびカルボン酸の還元（活性Ａ）が可能である（またはそれに関与する）酵素をコードする他の遺伝子は、表１の例に対する配列相同性に基づいて特定され得る。
【０２１２】
ルート２―アセチルＣｏＡのアセトアルデヒドへの直接的変換
アセトアルデヒドは可逆的酵素であるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＥＣ１．２．１．１０を介してアセチルＣｏＡから合成され得る。
【０２１３】
この酵素をコードする遺伝子はアシネトバクター属の種、バークホルデリア・ゼノボランス、大腸菌、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｒｕｎ−Ｔａｏ，  ＹおよびＪｉａｎｎ−Ｓｈｉｎ，  Ｃ．著、１９９０年、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第５６巻、２５９１頁；Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、１９９９年、第６５巻（第１１号）、４９７３頁）、クロストリジウム・クルイベリ、シュードモナス属の種（Ｐｉａｔｔ，  Ａら著、１９９５年，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第１４１巻、２２２３頁；Ｓｏｏｎｙｏｕｎｇ，  Ｈ．ら著、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．誌、第２５６巻、４６９頁）、プロピオニバクテリウム属の種およびサーモアナエロバクター・エタノリカスなどの多種多様な生物に見られる。
【０２１４】
多数のアセトゲンが、例えばモーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｔｈ＿１７７６）、アセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、１９９２年、第１５８巻、１３２頁）、クロストリジウム・リュングダリイのＣＬＪＵ＿ｃ１１９６０のようにアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子についてもアノテートされている。
【０２１５】
ｅｕｔオペロンのｅｕｔＥ遺伝子もアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしている。サルモネラ・エンテリカのｅｕｔＥ遺伝子が大腸菌にクローン化されており、グルコース上での増殖からアセチルＣｏＡの還元を経てアセトアルデヒドを効率的に産生することが示されている（Ｈｕｉｌｉｎ，  Ｚ．ら著、２０１１年、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第７７巻、６４４１頁）。これは、アセチルＣｏＡから始まる１，３−ブタンジオール経路においてＤＥＲＡ型酵素触媒アルドール縮合にアセトアルデヒド基質を効率的に供給することができる酵素の優れた実例である。１，３−ＢＤＯ経路においてｅｕｔＥを使用してアセチルＣｏＡからアセトアルデヒドをＤＥＲＡに送るために１，３−ブタンジオール産生が実施例１０に示されている。
【０２１６】
【表２−１】
2017534268.tif 000006
【表２−２】
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【０２１７】
アセトアルデヒドへのアセチルＣｏＡの変換（活性Ｂ）が可能である酵素をコードする他の遺伝子は、表２の例に対する配列相同性に基づいて特定され得る。
【０２１８】
ルート３．ピルビン酸のアセチルＣｏＡを経るアセトアルデヒドへの変換
ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換は、ＥＣ１．２．７．１（ピルビン酸シンターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ）などの酵素を使用して行われ得る。これらのフェレドキシン共役酵素は前記アセトゲンなどの嫌気性生物において特に共通するが、他の好気性生物またはハイドロゲノバクター・サーモフィラスなどの通性嫌気性生物にも存在する。
【０２１９】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体も、ＴＣＡ回路に入るためにピルビン酸（例えば、解糖から生成したもの）をアセチルＣｏＡへ変換することに関与する、当技術分野において充分に理解されている中央代謝酵素である。
【０２２０】
後続するアセチルＣｏＡのアセトアルデヒドへの変換はルート２において説明されている。
【０２２１】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０２２２】
ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換（活性Ｃ）が可能である酵素をコードする他の遺伝子は、表３の例またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の共通配列に対する配列相同性に基づいて特定され得る。
【０２２３】
ルート４．ピルビン酸のアセトアルデヒドへの直接的変換
ピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換は当技術分野においてよく知られている。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、原核生物の細胞質および真核生物のミトコンドリアにおいてピルビン酸のアセトアルデヒドと二酸化炭素への脱炭酸を触媒するホモ四量体酵素（ＥＣ４．１．１．１）である。それは２−オキソ酸カルボキシラーゼ、α−ケト酸カルボキシラーゼ、およびピルビン酸デカルボキシラーゼとも呼ばれる。嫌気条件下ではこの酵素は発酵によりエタノールを産生するために酵母、特にサッカロマイセス属の酵母において生じる発酵プロセスの一部である。ピルビン酸デカルボキシラーゼはピルビン酸をアセトアルデヒドおよび二酸化炭素に変換することによりこのプロセスを開始する。
【０２２４】
ピロコッカス・フリオサスのピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（表３）はアセトアルデヒドへのピルビン酸の脱炭酸を触媒することも示されている（Ｍａ，  Ｋ．ら著、１９９７年、ＰＮＡＳ誌、第９４巻、９６０８頁）。
【０２２５】
実施例１２、実施例１３および実施例１４は、新規の非天然１，３−ＢＤＯ経路においてピルビン酸からアセトアルデヒドをＤＥＲＡに送るためにピルビン酸デカルボキシラーゼを使用する１，３−ブタンジオールの産生を示している。表４．アセトアルデヒドへのピルビン酸の脱炭酸（活性Ｄ）に適用される酵素を発現する遺伝子の例。
【０２２６】
【表４−１】
2017534268.tif 000011
【表４−２】
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【０２２７】
ピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換（活性Ｄ）が可能である酵素をコードする他の遺伝子は、表４の例に対する配列相同性に基づいて特定され得る。
【０２２８】
ルート５．アセチルＣｏＡのピルビン酸を経るアセトアルデヒドへの変換
アセチルＣｏＡのピルビン酸への変換（活性Ｅ）は、可逆的酵素であるピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ピルビン酸シンターゼ、ＥＣ１．２．７．１）を使用して達成され得る。この酵素をコードする遺伝子配列が表３に記載されている。
【０２２９】
後続するピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換はルート４において説明されている。
【０２３０】
ルート６．酢酸のアセチルＣｏＡを経るアセトアルデヒドへの変換
酢酸のアセチルＣｏＡへの変換はアセチルＣｏＡシンテターゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼ、例えばＥＣ６．２．１．１またはＥＣ２．８．３．８を使用して達成可能であり、その後、ＥＣ１．２．１．１０（ルート２）を介してアセトアルデヒドへ変換され得る。酢酸のアセチルＣｏＡへの変換が可能である酵素をコードする遺伝子配列の例が表５に示されている。
【０２３１】
【表５−１】
2017534268.tif 000013
【表５−２】
2017534268.tif 000014
【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【０２３２】
酢酸からのアセチルＣｏＡの合成（活性Ｆ）に適用される酵素をコードする他の遺伝子は、表５の例に対する配列相同性に基づいて特定され得る。
【０２３３】
実施例２―アセトアルデヒドの３−ヒドロキシブタナールへの変換
中間体化合物３−ヒドロキシブタナールを介する本明細書に記載される合成
３−ヒドロキシブタナールの合成は、２分子のアセトアルデヒドのアルドール縮合が可能である酵素を使用して達成される。この反応はデオキシリボースホスフェートアルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）によって触媒される。このアルドラーゼは、スタチン中間体の合成について詳細に研究されている大腸菌を例として、広範囲の微生物から供給され得る。
【０２３４】
ＥＣ４．１．２．４として分類されるタンパク質をコードする遺伝子を特定するためにＮＩＨ  Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）公開ヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ）を使用することができる。ＥＣ４．１．２．４という注釈がつけられた細菌遺伝子の数は２０１４年７月６日現在で１１３７であり、門ごとでは３９４例がフィルミクテス門に存在し、３８７例がプロテオバクテリア門に存在し、１５３例が放線菌門に存在し、５０例がシアノバクテリア門に存在し、そして１５３例がその他に存在する。ＥＣ４．１．２．４という注釈がつけられた５２例の古細菌遺伝子も存在する。これらのデータが表６に要約されている。
【０２３５】
【表６−１】
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【表６−２Ａ】
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【表６−２Ｂ】
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【表６−２Ｃ】
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【表６−２Ｄ】
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【０２３６】
２分子のアセトアルデヒドを縮合することが可能である（活性Ｇ）酵素をコードする他の遺伝子は、表６の例に対する配列相同性に基づいて特定され得る。
【０２３７】
実施例３―３−ヒドロキシブタナールの１，３−ブタンジオールへの還元
アルデヒドの対応するアルコールへの還元が可能である酵素（ＥＣ１．１．１．−）をコードする遺伝子は自然界に広く分布しており、この用途に関してはＥＣ１．１．１．７８、ＥＣ１．１．１．２６５、ＥＣ１．１．１．３７３、ＥＣ１．１．１．１、ＥＣ１．１．１．２、ＥＣ１．１．１．２１、ＥＣ１．１．１．２６、ＥＣ１．１．１．３１、ＥＣ１．１．１．７１、ＥＣ１．１．１．７２、ＥＣ１．１．１．７７およびＥＣ１．１．１．２８３に概ね分類される。アルデヒドレダクターゼ酵素またはアルコールデヒドロゲナーゼ酵素（両方の用語が、アルデヒドの還元が可能である酵素を指す）がアセトアルデヒドなどのＣ２アルデヒドと比べてＣ４アルデヒドを優先することが、本用途にとって望ましい。例えば基質としてアセトアルデヒドを好むエタノール合成に関与するアルコールデヒドロゲナーゼは本用途については好ましくないが、当技術分野においてよく知られている技術を用いる、よく記述された短鎖デヒドロゲナーゼまたはレダクターゼを改良して長鎖アルデヒドに対する基質選択性を変更することが可能である。
【０２３８】
この反応は、例えばＣ４以上のアルコールに対する選択性を示した中鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｒＡ遺伝子）によって触媒され得る。Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、２０００年、第６６巻、５２３１頁を参照されたい。さらに、アシネバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＢ８２５０および出芽酵母Ｄ２７３−１０Ｂに由来する長鎖アルコールを優先するアルコールデヒドロゲナーゼがＷａｌｅｓ，  ＭおよびＦｅｗｓｏｎ，  Ｃ．著、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、１９９４年、第１４０巻、１７３頁によって記載されている。酸化方向で測定されたが、前記デヒドロゲナーゼは１，４−ブタンジオールも基質として受容する。２，３−ブタンジオールは基質ではなく、このことは二級アルコールではなく、望ましい一級アルコールが、３−ヒドロキシブタナール還元用途に特異的であることを明らかに示している。
【０２３９】
その他の優れた候補酵素はｖａｎ  Ｉｅｒｓｅｌ，  Ｍ．  Ｆ．  Ｍら著、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、１９９７年、第６３巻、４０７９頁によって記載される出芽酵母変種ｕｖａｒｕｍ  Ｗ３４に由来するｂｃＡＬＤ、ＧＲＥ＿２（ＥＣ１．１．１．２８３にも分類されるＥＣ１．１．１．２６５）である。この酵素はブタナールおよび誘導体に対して強い選択性を示し、アセトアルデヒドに対しては弱い選択性を有する。Ｋｍはアセトアルデヒドで１５８ｍＭであり、ブタナールで２．７６ｍＭであり、２−メチルブタナールで１．８５ｍＭであり、３−メチルブタナールで０．２１ｍＭである。アセトアルデヒドと比べたＣ４アルデヒド（ブタナール）に対するＧＲＥ２由来デヒドロゲナーゼの選択性が実施例９において示されている。これらのデータより、このデヒドロゲナーゼがアセトアルデヒドと比べて３−ヒドロキシブタナールに対して選択的優先性を示す予測が確認された。
【０２４０】
別の優れた例はグルコノバクター・オキシダンス（Ｒｉｃｈｔｅｒ，  Ｎ．ら著、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．誌、２００９年、第１０巻、１８８８頁）のＧＯＸ１６１５遺伝子である。この酵素は特性が明らかにされており、長鎖基質およびヒドロキシ置換基質と比べてアセトアルデヒドの還元に対して非常に弱い選択性を有することが示されている。３−ヒドロキシブタナールは還元方向で特に検査されなかった。しかしながら、１，３−ブタンジオールは望ましくない酸化方向で検査され、弱い活性が報告された。したがって、提示されたデータに基づくと、この酵素は望ましくないアセトアルデヒドの還元と比べて３−ヒドロキシブタナールの還元に対して望ましい選択性を示し、また、１，３−ブタンジオール産物に対する弱い酸化活性を有することが考えられる。新規の非天然１，３−ＢＤＯ経路内でＧＯＸ１６１５を用いた３−ヒドロキシブタナールの１，３−ブタンジオールへの選択的還元が実施例１２、実施例１３および実施例１４に示されている。アセトアルデヒドと比べたＤＥＲＡ産物の３−ヒドロキシブタナールに対するその予想される選択性は実施例９によっても確認されている。
【０２４１】
その他の例にはＣ３以上のアルコールに対する選択性を有することが報告されている大腸菌のｙｑｈＤが含まれる。Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら著、  ２００４年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第３４２巻：４８９〜５０２頁。アルコールデヒドロゲナーゼは還元方向または酸化方向で作用することが可能である可逆的酵素であることが理解されている。クロストリジウム・アセトブチリカムのｂｄｈ  Ａ遺伝子とｂｄｈ  Ｂ遺伝子（ｂｄｈ  Ｉタンパク質とｂｄｈ  ＩＩタンパク質）はブタナールをブタノールに変換する酵素をコードする（Ｗａｌｔｅｒら著、１９９２年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．誌、第１７４巻：７１４９〜７１５８頁）。新規の非天然１，３−ＢＤＯ経路内での３−ヒドロキシブタナールの１，３−ブタンジオールへの還元のためにｂｄｈＩＩブタノールデヒドロゲナーゼ（ｂｄｈＢ遺伝子）を使用することが実施例１２において示されている。さらに、ブタノールデヒドロゲナーゼの例にはクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムのｂｄｈとクロストリジウム・ベイジェリンキイのＣｂｅｉ＿１７２２、Ｃｂｅｉ＿２１８１およびＣｂｅｉ＿２４２１（Ｇｅｎｅ  ａｎｎｏｕｎｃｅ．誌、２０１２年、第１９４巻（第１９号）、５４７０頁）が含まれる。上で記載されたＧＲＥ＿２に加えてメチルグリオキサールレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２８３）として分類される他の遺伝子産物も候補であり得る（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ誌、１９８８年、第１７１巻、２１３頁）。出芽酵母のその他のアルデヒドレダクターゼ遺伝子候補にはアルデヒドレダクターゼのＧＲＥ３、ＡＬＤ２−６およびＨＦＤ１、グリオキシレートレダクターゼのＧＯＲ１およびＹＰＬ１１３Ｃ、およびグリセロールデヒドロゲナーゼＧＣＹ１（Ａｔｓｕｍｉら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４５１巻：８６〜８９頁、２００８年）が含まれる。
【０２４２】
【表７−１】
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【表７−２】
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【０２４３】
３−ヒドロキシブタナールの１，３−ブタンジオールへの変換（活性Ｈ）が可能である酵素をコードする他の遺伝子は、表７の例に対する配列相同性に基づいて特定され得る。
【０２４４】
実施例４―１，３−ブタンジオールまたは他の下流産物の産生用のアセトゲン株の培養
１，３−ブタンジオールなどの３−ヒドロキシブタナールの下流産物の産生のために唯一の、または主要な炭素源およびエネルギー源としてシンガスが添加された完全合成培地、半合成培地、または非合成培地の中で組換えアセトゲン株を培養してよいことが当技術分野においてよく知られている。その他のエネルギー源または炭素源の例は硝酸、メタノールまたは糖であり得る。本実施例のアセトゲン株は厳密な嫌気性生物であるので嫌気条件を維持することが非常に望ましい。当業者が理解する通り、発酵機に移る前の野生型生物および遺伝子改変生物を使用する最初の試験は、厚いゴム栓とボトルを密封するために使用されるアルミクリンプキャップを備える小型のボトルの中で行われ得る。
【０２４５】
各遺伝子操作株について三組の培養物など、適切な複製培養物を培養することができ、形成された産物について培養上清を検査することができる。例えば、培地中のシンガス組成物、その遺伝子操作産生宿主中で形成された代謝中間体、１，３−ブタンジオールおよび副産物を時間の関数として測定することができ、且つ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＧＣ（ガスクロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリー）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー）などの方法、または当技術分野においてよく知られている日常的技法を用いる他の適切な分析方法によって分析することができる。
【０２４６】
必要に応じて示差屈折率検出器またはＵＶ検出器を使用するＨＰＬＣ、または当技術分野においてよく知られている他の適切なアッセイおよび検出方法によって酢酸、ピルビン酸、アセチルＣｏＡ、３−ヒドロキシブタナール、１，３−ブタンジオールおよび中間体または他の所望の産物を定量することができる。異種性ＤＮＡ配列または過剰発現された内在性ＤＮＡ配列から発現される個々の酵素またはタンパク質の活性も、当技術分野においてよく知られている方法を用いてアッセイされ得る。
【０２４７】
連続培養、回分培養、または流加培養で発酵を行うことができる。これらのプロセスの全てが当技術分野においてよく知られている。シンガス発酵についての重要な工程に関する考慮事項は高いバイオマス濃度と良好な気液間物質移動である。Ｂｒｅｄｗｅｌｌら著、（１９９９年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．誌、第１５巻：８３４〜８４４頁。一酸化炭素は酸素と比べて低い水溶性を有するので連続ガス散布発酵が推奨され、マススペクトロメトリーと定期的液体試料収集、および上で述べた分析による不断の排ガス分析を含む制御発酵機で連続ガス散布発酵を行うことができる。伝統的なアプローチを用いてメタノールまたは糖などの他の原料をその発酵機に供給することができる。
【０２４８】
実施例５．アセトバクテリウム・ウッディイにおける乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ノックアウトの生成
【０２４９】
【表８】
2017534268.tif 000025
【表９】
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【０２５０】
アセトバクテリウム・ウッディイ用の培地
嫌気技術を使用してその培地を調製し、その培地はＮ２−ＣＯ２大気（８０：２０）下で１０００ｍｌにつき次のものを含有していた。
【０２５１】
【表１０】
2017534268.tif 000027
【０２５２】
炭素源およびマグネシウムを嫌気性生物滅菌ストック溶液（それぞれ２Ｍのフルクトースまたは乳酸と０．７５Ｍ）からオートクレーブの後に添加した。
【０２５３】
固形培地については１５ｇ／Ｌで寒天を添加し、オートクレーブの前に溶解酸素を取り除くためにその培地を煮沸し、その後でガス流の下で冷却した。
【０２５４】
【表１１】
2017534268.tif 000028
【０２５５】
【表１２】
2017534268.tif 000029
【０２５６】
【表１３】
2017534268.tif 000030
【０２５７】
ＬＤＨノックアウト変異体の構築
乳酸デヒドロゲナーゼノックアウト変異体を構築するために２つのストラテジーに従った。
【０２５８】
（１）全長ＬＤＨ遺伝子がエリスロマイシンカセットで置換される２回の交差組換えプロセスを伴うもの（図１１）。
（２）クローニングプラスミド全体の組込みを起こしてＬＤＨ遺伝子を分断する一回の組換えイベント（図１２）。
【０２５９】
アセトバクテリウム・ウッディイのＬＤＨノックアウト変異体用のプラスミドを構築するためにｐＵＣ１９を基本プラスミドとして使用した。まず、エリスロマイシン抗生物質カセットをＢａｍＨＩおよびＸｂａｌの制限部位にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙを作った。エリスロマイシン耐性カセットは、遺伝子特異的プライマー（ＥｒｙＦｏｒ、ＥｒｙＸｂａＲｅｖ）および鋳型としてのプラスミドｐＴＲＫＨ２を使用してＰＣＲによって増幅された。抗生物質耐性が機能することは１５０〜３００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンが存在する状態で、このプラスミドを含有する大腸菌ＤＨ１０Ｂの増殖によって確認された。
【０２６０】
プラスミドがアセトバクテリウム・ウッディイのゲノムへランダムに組み込まれないことを確実にするため、アリコットを使用してアセトバクテリウム・ウッディイを形質転換した。予期されたように、数回の試みの後に得られたエリスロマイシン耐性細菌は無かった。
【０２６１】
ストラテジー（１）について、鋳型としてのゲノムＤＮＡと上流領域用の遺伝子特異的プライマー（０１Ｆｏｒ、０１Ｒｅｖ）と下流領域用の遺伝子特異的プライマー（０２Ｆｏｒ、０２Ｒｅｖ）を使用してＬＤＨ遺伝子の上流と下流の約１０００ｂｐの隣接領域を増幅した。その上流領域をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの領域にクローン化してプラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙ−ＬＤＨｕｐを作り、次にそれを使用して下流領域をＸｂａＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化してプラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙ−ＬＤＨｕｐ−ＬＤＨｄｏｗｎ（プラスミドｐＥ０１−０２）を作った。ストラテジー（２）ではプライマー１６Ｆｏｒ／１６Ｒｅｖを使用してゲノムＤＮＡからＰＣＲによってＬＤＨ遺伝子の７２８ｂｐ断片を作製し、このＰＣＲ産物をｐＵＣ１９−ＥｒｙのＸｂａＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化してプラスミド（ｐＥ１６）が生じた。
【０２６２】
プラスミドｐＥ０１−０２を使用してアセトバクテリウム・ウッディイを形質転換した。次の全ての手順は嫌気条件下で行われた。新鮮な５ｍｌの終夜培養物のうちの１ｍｌを使用して１０ｍｌの培地に植菌し、約０．５のＯＤ６００までアセトバクテリウム・ウッディイを培養した。ハンゲートチューブ中で細胞を４℃、４０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離し、そして１０ｍｌの氷冷嫌気的２７０ｍＭショ糖溶液で２回洗浄した。そのペレットを２００μＬのショ糖に再懸濁し、それを氷上で嫌気チャンバーの中に移した。４μｌの各プラスミドを４０μｌの細胞に添加し、０．２ｃｍ幅の電気穿孔キュベットに移し、そして氷上で５分間にわたって保持した。電気穿孔のために次の設定を使用した：１０ｋＶの電気パルス、４００Ωの電気抵抗、および２５μＦ。電気穿孔の後にさらに５分間にわたってそれらの細胞を氷上に保持した後に９６０μｌの培地を添加した。形質転換細胞を３０℃で一晩にわたって培養し、その後で必要な抗生物質（２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン）を含む５０ｍｌの培地に移した。一重交差耐性細胞が４８時間以内に増殖した。必要な抗生物質（５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン）を含む固形培地上にその液体培養物のアリコットを播種した。４〜５日後にシングルコロニーが得られ、それらのシングルコロニーを採取し、エリスロマイシンの存在下で５ｍｌの培養物に培養した。
【０２６３】
二重交差ノックアウトのために制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して前記プラスミドを切断してＬＤＨ上流領域および下流領域で挟まれたエリスロマイシン遺伝子を含む約３８３７ｂｐの直鎖状断片を得た。その直鎖状断片をゲル抽出し、その断片を使用してアセトバクテリウム・ウッディイを形質転換した。上で記載されたようにアセトバクテリウム・ウッディイの形質転換を行った。３〜４日後にエリスロマイシン耐性培養物を得た。その培養物を固形培地上に播種し、５〜６日後にコロニーを得た。
【０２６４】
両方の事例においてプライマーＥｒｙＦｏｒ、ＥｒｙＸｂａＲｅｖを使用してエリスロマイシン遺伝子の存在についてコロニーをスクリーニングし、二重交差の事例ではプライマーセット１３Ｆｏｒ／Ｒｅｖを使用してＬＤＨ遺伝子の不在についてコロニーをスクリーニングした。後者の事例では２個のコロニーがＬＤＨ遺伝子の不在を示した。
【０２６５】
それらの２個のコロニーならびに一重交差組換え（ＳＲ）の２個のコロニーを採取し、フルクトースおよび乳酸上でのそれらの増殖について解析した。アセトバクテリウム・ウッディイ野生型の２つの培養物（Ａｗ１、Ａｗ２）およびプラスミドｐＵＣ１９−ｐＡＭβ１−Ｅｒｙを含有するアセトバクテリウム・ウッディイの２つの培養物（Ｐ１、Ｐ２）を対照株として使用した。プラスミドｐＵＣ１９−ｐＡＭβ１−ＥｒｙはプラスミドｐＴＲＫＨ２由来のグラム陽性レプリコンｐＡＭβ１をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位とＫｐｎＩ部位にクローン化し、その後でエリスロマイシンカセットをＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化しすることによって構築された。その後、これまでに記載されたようにそのプラスミドをアセトバクテリウム・ウッディイに形質転換し、２〜３日後に耐性増殖が得られた。シングルコロニーを採取し、ｐＡＭβ１レプリコンについての特異的プライマー（ｐＡＭβ１Ｆｏｒ、ｐＡＭβ１Ｒｅｖ）と同様にエリスロマイシン遺伝子についての特異的プライマー（ＥｒｙＦｏｒ、ＥｒｙＸｂａＲｅｖ）を使用するＰＣＲによってそのプラスミドについてそれらのシングルコロニーを分析した。
【０２６６】
増殖曲線のために５００μｌの新しい終夜培養物を使用して５０ｍｌの嫌気性生物培養物に植菌した。２０ｍＭのフルクトースまたは４０ｍＭのＤＬ−乳酸（（乳酸）のいずれかを基質として使用した。２ｍｇ／ｍｌのストック濃度として水中にエリスロマイシンを調製した。４日間の期間にわたって１ｍｌの試料を１日に２回採取した。この１ｍｌのうちの５００μｌをΟＤ６００測定のために使用した。残りの５００μｌを遠心分離し、ＨＰＬＣ分析のために上清を−２０℃で凍結した。
【０２６７】
図１３はフルクトース培地における得られた増殖曲線を示している。ここで全ての変異体は対照株（Ａｗ１、Ａｗ２、Ｐ１、およびＰ２）と同様に増殖した。対照的に乳酸中で培養されると変異体については増殖が得られず、予期された乳酸デヒドロゲナーゼノックアウトの表現型が確認された（図１３）。
【０２６８】
ＨＰＬＣ分析のため、１０μｌの試料をＨＰＬＣカラムＲｅｚｅｘ  ＲＯＡ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈ＋（３００×７．８ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｘ社）に注入した。使用した移動相は１００％の０．０１ＮのＨ２ＳＯ４であった。試料を０．６ｍｌ／分の流速で３０分間にわたって分析した。培養物のＨＰＬＣ分析により、フルクトースが消費され、同様の速度および量でそれらの変異体によって酢酸が産生されることが示された（図１４）。対照的に、それらの変異体によって乳酸が消費されることは無く、一方で対照株は乳酸を利用し、酢酸を産生する（図１５）。
【０２６９】
加えて、二重交差ノックアウトは一重交差変異体（ＳＲ）と対照的に安定である。５日後に乳酸上での増殖が観察されるが、それはおそらくはエリスロマイシンの分解とそれによって次に可能になる、前記カセットがゲノムから除去され、機能的ＬＤＨ遺伝子が得られる２回目の組換えステップに起因する。ＨＰＬＣデータによってもＳＲ１およびＳＲ２によって５日後に乳酸が時間をかけて利用され、酢酸が産生されることが確認された（データを示さず）。その構築されたベクターを使用して安定なノックアウト変異体を作製し得ることがそれらの結果から確認される。
【０２７０】
実施例６．アセトバクテリウム・ウッディイにおけるホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）遺伝子ノックアウトの作製
プライマー：
ＥｒｙＦｏｒ                      ｇｇＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＡＴＡＣＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣ
ＥｒｙＸｂａＲｅｖ                ｇｇＴＣＴＡＧＡＴＴＧＡＡＣＣＣＧＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧ
Ｐｒ１＿ｃｉｓＦｏｒ              ｇｇＡＣＴＡＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＣ
Ｐｒ４＿ｉｏｒＲｅｖ                ｇｇＣＴＧＣＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＡＧＣ
Ｐｒ５＿ＰＴＡｆｒａｇ１Ｒｅｖ    ＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＴＡＣＣＡＡＡＴＴＡＴＣＴＧＣＧＴＣＧ
Ｐｒ６＿ＰＴＡｆｒａｇ３Ｆｏｒ    ＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣ
【０２７１】
プラスミド：
ｐＵＣ１９      アンピシリン耐性
ｐＴＲＫＨ２    エリスロマイシン耐性、グラム陽性筋および大腸菌用のレプリコン
ｐＵＣ１９−Ｅｒｙ
ｐＵＣ１９−Ｅｒｙ−ＡＰＴＡ２
【０２７２】
ストラテジー
プライマーＥｒｙＦｏｒおよびＥｒｙＸａｂＲｅｖを使用してプラスミドｐＴＲＫＨ２からエリスロマイシン耐性遺伝子を増幅し、ｐＵＣ１９にクローン化して非複製プラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙを作った。ＰＴＡノックアウトカセットを次のように構築した。プライマーＰｒ１＿ｃｉｓＦｏｒおよびＰｒ５＿ＰＴＡｆｒａｇ１Ｒｅｖを使用してアセトバクテリウム・ウッディイのゲノムＤＮＡからＰＴＡ遺伝子の上流領域ならびにＰＴＡ遺伝子のＮ末端部分を増幅した。Ｐｒ４＿ｉｏｒＲｅｖおよびＰｒ６＿ＰＴＡｆｒａｇ３Ｆｏｒを使用してＰＴＡ遺伝子のＣ末端部分ならびに下流領域を増幅した。ＳＯＥ  ＰＣＲおよびプライマーＰｒ１＿ｃｉｓＦｏｒおよびＰｒ４＿ｉｏｒＲｅｖを使用してこの２つの断片を一つにクローン化した。そのように構築されたノックアウトカセットはＰＴＡ遺伝子のＮ末端部分とＣ末端部分だけからなる改変ＰＴＡ遺伝子配列を含有する。両方の部分は前回のＰＣＲによって導入されたＮｏｔＩ制限部位によって分けられている。そのノックアウトカセットをｐＵＣ１９−ＥｒｙのＸｂａＩ部位とＰｓｔＩ部位にクローン化してプラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙ−ΔＰＴＡ２を作った。
【０２７３】
プラスミドｐＵＣ１９−Ｅｒｙ−ΔＰＴＡ２を使用してアセトバクテリウム・ウッディイを形質転換した。次の全ての手順は嫌気条件下で行われた。１０ｍｌの培養物にアセトバクテリウム・ウッディイを植菌し、約０．５のＯＤ６００まで培養した。ハンゲートチューブ中で細胞を４℃、４０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離し、１０ｍｌの１０氷冷した嫌気的２７０ｍＭショ糖溶液で２回洗浄した。そのペレットを２００μＬのショ糖に再懸濁した。４μｌのプラスミドを４０μｌの細胞に添加し、０．２ｃｍ幅の電気穿孔キュベットに移し、そして氷上で５分間にわたって保持した。電気穿孔のために次の設定を使用した：１０ｋＶの電気パルス、４００Ωの電気抵抗、および２５μＦ。電気穿孔の後にさらに５分間にわたってそれらの細胞を氷上に保持した。形質転換細胞を培地中に回収し、嫌気性生物を３０℃で６時間にわたって培養し、その後、必要な抗生物質（２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン）を含む５０ｍｌの培地に移した。増殖が得られるまでその培養物を３０℃で培養した。固形培地にその培養物のアリコットを播種した。５〜７日後にシングルコロニーが得られ、それらのシングルコロニーを採取し、エリスロマイシンの存在下で１０ｍｌに培養した。
【０２７４】
前記プラスミドの組込みを確認するための特異的プライマーによってそれらの培養物を遺伝学的に分析した。エリスロマイシンを含まない液体培地にその培養物を継代して前記プラスミドをループアウトさせ、２回目の組換えイベントを経て安定なＰＴＡノックアウトを生成させた。そのようなイベントが起こるまで継代培養物を固形培地に播種した。エリスロマイシンが存在する状態、および存在しない状態でのレプリカプレーティングによりＰＴＡノックアウトクローンをスクリーニングした。エリスロマイシンの存在下で増殖することができないクローンを採取し、ＰＣＲによりＰＴＡ遺伝型について分析し、その遺伝型を確認した。
【０２７５】
実施例７．アセトバクテリウム・ウッディイにおける異種性遺伝子発現およびタンパク質産生
【０２７６】
プライマー
Ｐｒ５５
ｇａＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＴＴＡＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣ
Ｐｒ５４
ＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣ
【０２７７】
ストラテジー
遺伝子特異的プライマーを使用して大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ（ＤＥ３）由来の恒常プロモーターの配列を含むｕｉｄＡ（ＧＵＳ）を増幅した。プライマーＰｒ５５はエンテロコッカス・フェカーリスのエリスロマイシン耐性遺伝子のプロモーターに由来する配列を含み、プライマーＰｒ５６はクロストリジウム・リュングダリイＰＴＡ遺伝子のプロモーター配列を含む。
【０２７８】
アセトバクテリウム・ウッディイの中で複製可能であるプラスミドにそれらの増幅断片をクローン化した。その複製プラスミド（ｐＥＰ）はエリスロマイシン遺伝子（実施例６において説明される）ならびにｐＡＭβ１レプリコンを担持する。しかしながら、アセトバクテリウム・ウッディイに適切な他のどのレプリコンも使用することができる。このように、エンテロコッカス・フェカーリスのプロモーターの制御下のｕｉｄＡ遺伝子を担持するｐＥＰ５５とＣｌｊプロモーターの制御下のｕｉｄＡ遺伝子を担持するｐＥＰ５６という２種類のプラスミドが作製された。
【０２７９】
作製されたプラスミドを使用してアセトバクテリウム・ウッディイを形質転換した。次の全ての手順は嫌気条件下で行われた。１０ｍｌの培養物にアセトバクテリウム・ウッディイを植菌し、約０．５のＯＤ６００まで培養した。ハンゲートチューブ中で細胞を４Ｃ、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１０ｍｌの１０氷冷嫌気的２７０ｍＭショ糖溶液で２回洗浄した。そのペレットを２００μＬのショ糖に再懸濁した。４μｌのプラスミドを４０μｌの細胞に添加し、０．２ｃｍ幅の電気穿孔キュベットに移し、そして氷上で５分間保持した。電気穿孔のために次の設定を使用した：１０ｋＶの電気パルス、４００Ωの電気抵抗、および２５μＦ。電気穿孔の後にさらに５分間それらの細胞を氷上に保持した。形質転換細胞を培地中に回収し、嫌気性生物を３０Ｃで６時間にわたって培養し、その後、必要な抗生物質（２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン）を含む５０ｍｌの培地に移した。増殖が得られるまでそれらの培養物を３０Ｃで培養した。２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含む固形培地にそれらの培養物のアリコットを播種した。５〜７日後にシングルコロニーを得た。各形質転換について２個の独立したコロニーを採取し、エリスロマイシンの存在下で１０ｍｌに培養した。
【０２８０】
ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸、０．１ｇ／Ｌの終濃度）を含む嫌気性生物選択培地に前記培養物を再画線し、図１０に見られるように紫外光下で見える蛍光産物を生じさせることによってｕｉｄＡの機能性を確認した。
【０２８１】
１，３−ブタンジオール経路の構成時の、および複製プラスミド上の強力な恒常プロモーター下で発現する他のいずれかの異種性遺伝子（例えばＤＥＲＡ、ｅｕｔＥ等）のアセトバクテリウム・ウッディイへの導入に対して上で記載されたものと同じストラテジーを適用することができる。上記のレポーター遺伝子ｕｉｄＡがオペロン内にクローン化されたとき、そのレポーター遺伝子を使用して他のいずれかの遺伝子の発現を確認することができる。さらに、発現効率は蛍光強度に関係しているのでｕｉｄＡの発現を使用してプロモーター強度を決定し、したがってプロモーターを選択することができる。遺伝的安定性を高めるためにはゲノムに異種性遺伝子を導入してよい。
【０２８２】
実施例８．相同組換えによるモーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３のホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）変異体の作製
序論
モーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３のゲノム配列は公開されており（Ｐｉｅｒｃｅら著、２００８年）、受託番号ＮＣ＿００７６４４を用いてＮＣＢＩにおいて入手可能である。モーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３についての中央炭素代謝のＫＥＧＧマップ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗ＿ｐａｔｈｗａｙ？ｍｔａ０１２００）を使用して２つの推定上のホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）であるＭｏｔｈ＿０８６４およびＭｏｔｈ＿１１８１（ＥＣ２．３．１．８）を特定した。それらはアイソザイムのようであり、配列相同性に基づいて細菌性プロパンジオール利用タンパク質のＰｄｕＬスーパーファミリーのメンバーであると特定されている。リン酸アセチル／ブタリルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ／ＰＴＢ）スーパーファミリーのメンバーはモーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３のゲノム中に特定されず、クロストリジウム・チロブチリカムの部分的ＰＴＡ（Ｚｈｕら著、２００５年）のＢＬＡＳＴＰ検索は有意なアラインメントを返さなかった。
【０２８３】
Ｍｏｔｈ＿０８６４ノックアウトプラスミドおよびＭｏｔｈ＿１１８１ノックアウトプラスミドの構築
ノックアウトプラスミドバックボーンの構築
可動性シャトルベクターｐＳ７９７は最終コンストラクトを構成する所望の遺伝要素のうちの３つの要素、すなわち大腸菌向けのｐＭＢ１複製オリジン、抗生物質選択マーカー（ｂｌａ）およびＲＫ４由来接合伝達オリジン（ｏｒｉＴ）（ＹａｋｏｂｓｏｎおよびＧｕｉｎｅｙ著、１９８４年）を既に有しているので、モーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３ノックアウトプラスミドの構築のためのバックボーンとしてそのシャトルベクターが使用される。モーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３用の熱安定性（ｐＪＨ１由来）カナマイシン耐性遺伝子が以前に文献中に記載されており（Ｉｗａｓａｋｉら著、２０１３年）、本来のＧ３ＰＤＨプロモーターに融合したストレプトコッカス・ファエカリス（Ｓ．  ｆａｅｃａｌｉｓ）ｐＪＨ１カナマイシン耐性遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｖ０１５４７）に由来する遺伝子配列を使用して、さらに改変することなくそれを合成した。染色体組換えイベントがあったモーレラ属にのみカナマイシン耐性が維持され得ることを確実にするため、ノックアウトプラスミドバックボーンはモーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３用のレプリコンを含んでいないことに注意されたい。したがって、モーレラ・サーモアセティカＡＴＣ３９０７３のカナマイシン耐性トランスコンジュガントは完全に推定上の一重交差（ＳＣＯ）染色体変異体である。
【０２８４】
【表１４】
2017534268.tif 000031
【０２８５】
Ｍｏｔｈ＿０８６４およびＭｏｔｈ＿１１８９のそれぞれ２８２ｂｐおよび１７６ｂｐの内部領域に隣接する約１ｋｂの上流領域と下流領域を、適合するオーバーハング型末端を付けてモーレラ・サーモアセティカのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。次にＳＯＥ（スプライシング・バイ・オーバーラップエクステンション）ＰＣＲを用いて各遺伝子のそれらの２つの隣接領域を約２ｋｂの単一の分子に組み立てた。これらの組み立てられたノックアウトカセットを独立してＥＭＰ  ＰＣＲ（Ｕｌｒｉｃｈら著、２０１２年）によりノックアウトプラスミドバックボーンｐＤＨ１６０に組み入れて２つの新しいコンストラクトであるｐＤＨ１７７およびｐＤＨ１８０（それぞれＭｏｔｈ＿０８６４ノックアウトプラスミドおよびＭｏｔｈ＿１１８９ノックアウトプラスミド）を作製した。
【０２８６】
モーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３におけるＭｏｔｈ＿０８６４およびＭｏｔｈ＿１１８９の独立したＳＣＯ変異体株の作製
ノックアウトプラスミドを使用して独立して大腸菌接合ドナー株Ｓ１７−１を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む選択寒天培地上でその結果の株を維持する。各遺伝子のノックアウトのため、接合ドナー株と接合レシピエント株（後者はブレインハートインヒュージョン寒天（ＢＨＩＡ；Ｏｘｏｉｄ社）に２％（重量／体積）フルクトースを添加した物（ＢＨＩＡＦ）の上で培養され、５５℃で保温された野生型モーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３である）の終夜増殖からの１０μｌの「白金耳量」に等しいバイオマスを乳状にし、ＢＨＩＡ上に広げる。その接合混合物を３７℃で８時間にわたって培養し、その後で滅菌スプレッダーを使用して１ｍｌの予備還元ＡＴＣＣ培地１７５４中に再懸濁する。その乳状にされた接合混合物をＡＴＣＣ培地１７５４中に１０−１から１０−６倍に希釈し、各希釈物の２００μｌを選択寒天（１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＢＨＩＡＦ）上に広げ、嫌気ジャーの中において５５℃で培養する。８〜１０日以内にトランスコンジュガントモーレラコロニー（推定上のＳＣＯ）が回収されることが典型的である。これは接合を用いるモーレラ属の種の遺伝的形質転換の初めての記述であると考えられる。
【０２８７】
モーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３におけるＭｏｔｈ＿０８６４およびＭｏｔｈ＿１１８９の二重交差（ＤＣＯ）安定変異体の作製
次の方法は、連続的継代後の相同組換えによりＳＣＯより作製される染色体欠失変異体を単離するために使用され得る。モーレラ・サーモアセティカＡＴＣＣ３９０７３の個々の単離されたトランスコンジュガントコロニーを使用して独立して密封ハンゲートチューブ中の２０ｍｌのアリコットの予備還元ＡＴＣＣ培地１７５４に植菌することができ、それらのコロニーを培地が濁るまで少なくとも２４時間にわたって培養する。これが継代第１代である。培養後に４ｍｌの継代培養物を密封血清ボトル中の４ｍｌの５０％（体積／体積）予備還元グリセロールに添加し、そして−８０℃で貯蔵する。さらに、１００μＬの継代培養物をＡＴＣＣ培地１７５４中に１０−１から１０−６倍に希釈し、各希釈物の２００μｌを選択寒天（１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＢＨＩＡＦ）上に広げ、シングルコロニーを単離するために嫌気ジャーの中において５５℃で培養する。最後に２００μｌの継代培養物を使用して密封ハンゲートチューブ中の２０ｍＬのアリコットの予備還元ＡＴＣＣ培地１７５４に植菌し、培地が濁るまで少なくとも２４時間にわたって培養する（継代第２代）。カナマイシン感受性コロニーが単離されるまでＳＣＯの継代を進める（下記参照）。
【０２８８】
各継代から単離されたシングルコロニー（約１００個）を、１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む、またはＢＨＩＡＦと含まないものの上にレプリカプレーティングし、５５℃で培養する。カナマイシン感受性コロニーは推定上の二重交差変異体である（すなわち、２回目の組換えイベントの後にノックアウトプラスミドが失われている）。推定上のＤＣＯ変異体からゲノムＤＮＡを調製し、標的遺伝子をＰＣＲでクローン化し、デザインした欠失変異についてチェックするためにシーケンシングする。
【０２８９】
実施例８の参照文献
Ｉｗａｓａｋｉ，  Ｙ．，  Ｋｉｔａ，  Ａ．，  Ｓａｋａｉ，  Ｓ．，  Ｔａｋａｏｋａ，  Ｋ．，  Ｙａｎｏ，  Ｓ．，  Ｔａｊｉｍａ，  Ｔ．，  Ｋａｔｏ，  Ｊ．，  Ｎｉｓｈｉｏ，  Ｎ．，  Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｋ．，およびＮａｋａｓｈｉｍａｄａ，  Ｙ．著、（２０１３年）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ３９０７３．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．誌、第３４３巻、８〜１２頁。
Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｅ．，  Ｘｉｅ，  Ｇ．，  Ｂａｒａｂｏｔｅ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｅ．，  Ｈａｎ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｄｅｔｔｅｒ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｐ．，  Ｂｒｅｔｔｉｎ，  Ｔ．Ｓ．，  Ｄａｓ，  Ａ．，  Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ，  Ｌ．Ｇ．ら著、（２００８年）Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  （ｆ．  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第１０巻、２５５０〜２５７３頁。
Ｕｌｒｉｃｈ，  Ａ．，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｋ．Ｒ．，およびＳｃｈｗａｒｔｚ，  Ｔ．Ｕ．著、（２０１２年）Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｇａｐｒｉｍｉｎｇ  ＰＣＲ  （ＥＭＰ）  Ｃｌｏｎｉｎｇ-  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  ＤＮＡ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ａｎｙ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ誌、第７巻、ｅ５３３６０頁。
Ｙａｋｏｂｓｏｎ，  Ｅ．Ａ．，およびＧｕｉｎｅｙ，  Ｄ．Ｇ．著、（１９８４年）Ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＲＫ２  ｐｌａｓｍｉｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｒｉｇｉｎ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｔｎ５．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．誌、第１６０巻、４５１〜４５３頁。
Ｚｈｕ，  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｘ．，およびＹａｎｇ，  Ｓ．−Ｔ．著、（２００５年）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｔａ  ｇｅｎｅ−  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．誌、第９０巻、１５４〜１６６頁。
【０２９０】
実施例９．３−ヒドロキシブタナールの１，３−ブタンジオールへの還元のための酵素
序論
本実施例は、実施例３に述べたようにＣ２アルデヒド（アセトアルデヒド）と比べてＣ４アルデヒド（モデル基質のブタナールと標的の３−ヒドロキシブタナール）に対して選択性を示す能力を選択されたレダクターゼについて説明する。この必要とされる原理の実証にグルコノバクター・オキシダンスのＧＯＸ１６１５、クロストリジウム・アセトブチリカムのＢｄｈＢ、および出芽酵母のＧＲＥ２が選択された。これらの３つの選択された酵素についてクローニング、精製および酵素アッセイの説明が続く。
【０２９１】
【表１５】
2017534268.tif 000032
【０２９２】
ａ）ＧＯＸ１６１５
ＧＯＸ１６１５発現プラスミドの構築
プライマーＰｒ８９（５’−ＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣ）およびプライマーＰｒ９０（５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＣＣＧＴＧＣＣ）を使用してグルコノバクター・オキシダンスＧＯＸ１６１５遺伝子を増幅した。その遺伝子は前もって商業ＤＮＡ合成により得られ、プラスミドに入れられていた。そのアンプリコンをｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローン化した。後者のコンストラクトについてはニッケル親和性クロマトグラフィーによって前記酵素の精製を容易にするためにＧＯＸ１６１５コード配列にＮ末端６−Ｈｉｓタグを付加した。
【０２９３】
製造業者のプロトコルに従い、且つ、５５℃のアニーリング温度を使用してＱ５プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用してＰＣＲを実施した。それにより生じたＰＣＲ産物（１００８ｂｐ）をゲル抽出により精製し、その後でＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼとＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用して消化した。それらの制限酵素の熱による不活性化（製造業者のプロトコル）の後、消化されたＰＣＲ産物をｐＥＴ１４ｂおよびｐＥＴ３ａにライゲーションし、そしてライゲーションミックスのアリコットを使用して大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。Ｔ７フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用するコロニーＰＣＲ（５５℃のアニーリングでＴａｑポリメラーゼを使用する）によってＧＯＸ１６５１５遺伝子の存在について形質転換体をスクリーニングした。各形質転換から２つの陽性クローンをプラスミドＤＮＡ抽出のために採取し、制限消化により正しいコンストラクトをさらに確認した。それらの陽性クローンを１５％のグリセロール中に−８０℃で貯蔵した。（ｐＥＴ１４ｂ−ＧＯＸ１６１５はｐＤＨ３５８およびｐＤＨ３５９；ｐＥＴ３ａ−ＧＯＸ１６１５はｐＤＨ３５１、ｐＤＨ３５３）。その後、プライマーｐＥＴ３ａ−ＦおよびプライマーｐＥＴ３ａ−Ｒを使用するシーケンシングにより発現プラスミドｐＤＨ３５８を確認した。
【０２９４】
ＧＯＸ１６１５の発現と精製
プラスミドｐＤＨ３５８（ｐＥＴ１４ｂ−ＧＯＸ）を使用して大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を形質転換し、それにより生じた株（ＤＨ３６９）を１５％のグリセロール中に−８０℃で貯蔵した。ＤＨ３６９およびベクター対照株ＤＨ２２８のシングルコロニーを５０ｍＬのチューブ中の５ｍＬの自動誘導性培地（リットル当たり、６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、５ｇのイーストエクストラクト、５ｇのＮａＣｌに１０ｍＬの６０％（体積／体積）のグリセロール、５ｍＬの１０％（重量／体積）のグルコース、２５ｍＬの８％（重量／体積）のラクトースをフィルター滅菌し、オートクレーブ後に加える；Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．Ｗ．著、２００５年）に植菌し、それらの培養物を２２５ｒｐｍで絶えず振盪しながら３７℃で一晩にわたって培養した。１ｍＬのアリコットの細胞を遠心分離により収集し、細胞ペレットを２００μｌのＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に再懸濁した。室温で２０分間保温した後にその混合物を１４０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を保持した。それにより生じたペレットを２００μｌの５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．０に再懸濁した。上清試料およびペレット試料を２×ＳＤＳ緩衝液と１：１で混合し、１０分間煮沸し、１４０００×ｇで２分間遠心分離し、その後で５μｌの各試料を１２％ゲルＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに負荷してＧＯＸ１６１５タンパク質の存在を確認した。
【０２９５】
Ｈｉｓタグ付きＧＯＸ１６１５の精製のため、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ中で培養された１ｍＬの終夜ＤＨ３６９培養物を使用して１００ｍＬの同じ培地に植菌した。細胞を３７℃で０．６〜０．９のＯＤ６００ｎｍまで培養した。０．４ｍＭのＩＰＴＧを用い、且つ、２００ｒｐｍで振盪しながら細胞を１８℃で一晩培養して遺伝子発現を誘導した。その培養物を遠心分離によって収集し、後続のステップのために試料を４℃で保持した。そのペレットを５ｍＬの結合緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール）に再懸濁し、１０％の振幅でパルスとパルスの間に３０秒の休止時間を加える５回の３０秒間の処理によって氷上で超音波処理した。その溶解細胞懸濁液を４℃、１４０００×ｇで１５分間の遠心分離により清澄化し、製造業者のプロトコルに従ってＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰ  ５ｍＬカラムとＡＫＴＡ  ｓｔａｒｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社）を使用する親和性精製によりその清澄化された細胞溶解物からＧＯＸ１６１５を精製した。精製タンパク質を−８０℃で貯蔵した。
【０２９６】
Ｃ２基質およびＣ４基質を使用するＧＯＸ１６１５レダクターゼ活性のアッセイ
１．５ｍＬのＵＶキュベットの中で直にアッセイを１ｍＬの体積で実施した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費を３４０ｎｍで測定した。その反応は１００μＬの基質溶液の添加により開始され、２〜５分間測定された。
【０２９７】
３−ヒドロキシブタナール（技術的等級）をＢＯＣから購入した。したがって、その標準品は純粋ではなかったので、活性が線形範囲にあるときは最小活性である。
【０２９８】
下に示されている結果は、ＧＯＸ１６１５は活基質としてのアセトアルデヒドに対する活性と比べて３−ヒドロキシブタナールを含むＣ４アルデヒドに対する望ましい選択性を示すことを明らかにしている。
【０２９９】
【表１６】
2017534268.tif 000033
【０３００】
ｂ）ＢｄｈＢ
ＢｄｈＢ発現プラスミドの構築
クロストリジウム・アセトブチリカムのｂｄｈＢ遺伝子を商業ＤＮＡ合成により得て、独立してそれを発現ベクターｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１４ｂに組み入れた。後者についてはＥＭＰ  ＰＣＲを用いて６−Ｈｉｓタグをコードする３’配列をインフレームで組み入れた。シーケンスされたクローンｐＤＨ３６５、クローンｐＤＨ３６６（ｐＥＴ１４ｂ−ＢｄｈＢ）およびクローンｐＤＨ３８０、クローンｐＤＨ３８１（ｐＥＴ３ａ−ＢｄｈＢ）を使用して大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換し、１５％のグリセロール中に−８０Ｃで貯蔵した。
【０３０１】
ＢｄｈＢの発現と精製
プラスミドｐＤＨ３６５（ｐＥＴ１４ｂ−ＢｄｈＢ、ＭＰ１）を使用してＢＬ２１＊（ＤＥ３）を形質転換した。作製された培養物を１５％グリセロール含有ＬＢの中に−８０℃で貯蔵した（ＤＨ３７２）。４００ｍＬの自動誘導性培地（Ｆｏｒｅｍｅｄｉａ社）培養物にグリセロールストックから植菌し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２０〜２４時間培養した。その培養物を遠心分離し（４０００ｒｐｍ、３０分、４＝Ｃ）、ペレットを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で２回洗浄し、そして５ｍＬのＺｎＳＯ４およびＤＴＴを含む結合緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０、５ｍＭのイミダゾール、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁した。細胞をグラスビーズにより溶解し（５．５ｍ／秒の速度を２０秒のサイクルを４回で、サイクルとサイクルの間に氷上で２分）、細胞溶解物を４℃、４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により清澄化し、ＧＯＸ１６１５の精製について前に記載したように５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラムとＡＫＴＡ９００システムを使用して精製を行った。全ての手順が嫌気条件下で行われた。
【０３０２】
Ｃ２基質およびＣ４基質を使用するＢｄｈＢレダクターゼのアッセイ
アセトアルデヒドおよびブタナールに対するＢｄｈＢの活性を嫌気条件下、２５℃において１ｍｌの反応体積で測定した。１ｍＭのＤＴＴと０．１ｍＭのＺｎＳＯ４を含む５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５の中で酵素アッセイを実施した。ゴム栓で密封した使い捨てＵＶキュベットの中で反応を実施した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費を３４０ｎｍで測定した。その反応は１００μｌの基質の添加により開始された。線形反応を１０分の範囲にわたって測定した。次のデータが得られた。
【０３０３】
【表１７】
2017534268.tif 000034
【表１８】
2017534268.tif 000035
【０３０４】
別の実験では３−ヒドロキシブタナールが基質であることも示された。ＮＡＤＨ補因子と５ｍＭの３−ヒドロキシブタナールで速度は０．０１２μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質であった。
【０３０５】
ｃ）ＧＲＥ２
ＧＲＥ２発現プラスミドの構築
プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーペアＰｒ９１（５’−ＧＣＣＡＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＣＡＧＧ）およびＰｒ９２（５’−ＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＴＧＣＣＣＴＣ）を使用して出芽酵母ゲノムＤＮＡからＧＲＥ２をＰＣＲにより増幅した。その１０３８ｂｐのＰＣＲ産物をゲル抽出により精製し、その後で当技術分野においてよく知られている方法で５’側のＮｄｅＩ酵素切断部位と３’側のＢａｍＨＩ酵素切断部位を介して発現プラスミドｐＥＴ１４ｂおよびｐＥＴ３ａに制限クローン化した。それにより生じたライゲーションミックスを使用して独立してケミカルコンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂのアリコットを形質転換した。各ライゲーションについて成功したクローンをコロニーＰＣＲにより特定し、プラスミドミニプレップ物の制限分析によりその成功をさらに確認した。生じたプラスミドに次のＩＤを割り当てた：ｐＥＴ１４ｂ−ＧＲＥ２はｐＤＨ３６０；ｐＥＴ３ａ−ＧＲＥ２はｐＤＨ３７６。
【０３０６】
ＧＲＥ２の発現と精製
プラスミドｐＤＨ３６０を使用して大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を形質転換した。タンパク質産生のため，それにより生じた株（ＤＨ３７０）を使用して１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地に植菌し、０．６〜０．９のＯＤ６００まで３７℃で培養した。０．４ｍＭのＩＰＴＧ、および２００ｒｐｍで振盪しながら１８℃で１８時間にわたる培養を用いてＧＲＥ２発現を誘導した。
【０３０７】
誘導処理された細菌を遠心分離により回収し、タンパク質精製を次のように行った。すなわち、細菌を５ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール）に再懸濁し、１０％の振幅でパルスとパルスの間に３０秒の休止時間を加える５回の３０秒間の処理によって氷上で超音波処理した。溶解した細菌を１５０００ｒｐｍおよび４℃の遠心分離により回収した。その上清のアリコットをＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分析のために保持した後で残りの上清を１０カラム体積の結合緩衝液で平衡化された３ｍＬまたは５ｍＬのニッケル親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎ社、ＮＴＡ）にロードした。通過画分をＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分析のために収集した。結合しなかったタンパク質を１５ｍｌの結合緩衝液および１５ｍｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのイミダゾール）でそのカラムから洗浄した。再度、通過画分をＳＤＳゲル分析のために収集した。最後に、結合したタンパク質を１０ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのイミダゾール）で溶出した。溶出画分中のタンパク質の存在をブラッドフォードアッセイにより短時間で確認し、その後でＧＲＥ２の存在についてＳＤＳ‐ＰＡＧＥによってさらに分析した。精製後すぐにＰＤ１０カラムを使用して酵素含有画分の緩衝液を５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０に交換した。精製酵素をアッセイまで４℃で貯蔵した。
【０３０８】
Ｃ２基質およびＣ４基質を使用するＧＲＥ２レダクターゼ活性のアッセイ
アセトアルデヒドおよびブタナールに対するＧＲＥ２の活性を試験した。反応を２５℃において１ｍＬの反応体積で行った。ゴム栓で密封した使い捨てＵＶキュベットの中で酵素アッセイを実施した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費を３４０ｎｍで測定した。その反応は１００μｌの基質の添加により開始された。線形反応を２〜５分の範囲にわたって測定した。次のデータが得られた。次のデータは、アセトアルデヒドと比べた長鎖アルデヒドであるブタナールに対する必要とされる選択性を示している。上の例について示されたように、ＧＲＥ２は３−ヒドロキシブタナールに対して活性を有することが考えられる。
【０３０９】
【表１９】
2017534268.tif 000036
【０３１０】
実施例９の参照文献
Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｆ．Ｗ．著、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｓｈａｋｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．誌、２００５年５月、第４１巻（第１号）：２０７〜３４頁。
【０３１１】
実施例１０．アセチルＣｏＡからの１，３−ブタンジオールの産生（ルート２、図３）
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼからアセトアルデヒドがＤＥＲＡに供給され、ＧＯＸ１６１５レダクターゼを使用してＤＥＲＡの産物である３−ヒドロキシブタナールが１，３−ブタンジオールに還元される経路のインビトロでの例を以下に説明する。その他の方法が下の実施例１１で説明される。これらのデータは、ヒドロキシブタナールおよび下流産物（ここでは１，３−ブタンジオール）の合成を行うためにどのように先行する経路酵素からアセトアルデヒドをＤＥＲＡに供給することができるかということを示している。
【０３１２】
【表２０】
2017534268.tif 000037
【０３１３】
ＥｕｔＥを含む溶菌液の発現と調製
空ｐＥＴ３ａベクター（ＤＨ２２８）またはＤＥＲＡ：ＥｕｔＥ融合体（ＤＨ３５７；下の実施例１１）のいずれかを担持する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）細胞を種培養として、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌのイーストエクストラクト、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）に植菌した。３７℃での終夜培養の後に培養物を０．１のＯＤ５９０ｎｍまで希釈し、５０ｍｌの同じ培地の中で０．４〜０．６のＯＤ５９０ｎｍになるまで３７℃で培養した。その後、０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加し、続いて振盪しながら一晩にわたって１８℃で培養することによりタンパク質発現を誘導した。
【０３１４】
終夜培養の後、誘導処理された細菌を４℃、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により回収した。その後、ペレットを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で２回洗浄し、そして２ｍｌの溶解緩衝液（１ｍＭのＤＴＴおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（ＳｉｇｍａＦａｓｔ、Ｓｉｇｍａ社、Ｓ８８２０）を含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０）に再懸濁した。細胞を前に記載されたように超音波処理によって溶解した。それにより生じた溶菌液を４℃、１５，０００×ｇで５分間にわたる遠心分離ステップにより清澄化し、上清を回収した。
【０３１５】
アッセイ体積の１０分の１の体積の溶菌液と共に下に示す試薬を使用して２５℃で任意に１２０時間にわたって１，３−ブタンジオールの産生を行った。
【０３１６】
アセチルＣｏＡからの１，３−ＢＤＯの産生に使用された試薬と濃度
グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用して補因子のリサイクルが達成された。
【０３１７】
【表２１】
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【０３１８】
対照反応は、ＤＥＲＡまたは溶菌液を加えないｐＨ７．０の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液の中に１０ｍＭのアセトアルデヒド、０．１５ｍＭのＮＡＤＨ、０．１５ｍＭのＮＡＤＰＨ、０．１ｍｇ／ｍＬのＧＤＨおよび０．０１１ｍｇ／ｍＬのＧＯＸ１６１５から構成された。アセトアルデヒドの３−ヒドロキシブタナールへの非生物的化学縮合を介して産生された１，３−ＢＤＯは無いことがこの対照により確認された。
【０３１９】
１，３−ＢＤＯ，エタノールおよびアセトアルデヒドの検出はＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、Ｒｅｚｅｘ  ＯＡ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈ＋カラム、３００×７．８ｍｍ）を用いて実施された。
【０３２０】
【表２２】
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【０３２１】
対照反応（１０ｍＭのアセトアルデヒドのみを含む）は検出可能な１，３−ブタンジオールを示さなかった。
【０３２２】
１，３−ブタンジオールがＬＣ／マススペクトロメトリーにより確認された。代表的なマススペクトロメトリーデータが図１６に示されている。
【０３２３】
実施例１１．ＥｕｔＥ：ＤＥＲＡ融合タンパク質の構築
序論
大腸菌内で発現された異種性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＣ）とアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＥ）の融合体は、ＡＤＨに対して２０倍低い比活性を有しているにもかかわらず（Ｌｅｗｉｃｋａら著、２０１４年）、個々に発現された酵素単独と比較すると改善されたエタノール産生を示すことが以前に明らかにされている。アセトアルデヒド（本発明に関連する細胞傷害性で揮発性の中間体）の基質チャネリングは観察されたエタノールタイターの改善に起因した。
【０３２４】
ＤＥＲＡとアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えばｅｕｔＥ）の機能的酵素融合体、または例えばＤＥＲＡとピルビン酸デカルボキシラーゼまたはＤＥＲＡと酢酸の還元が可能な酵素の機能的酵素融合体は、アセトアルデヒド中間体の基質チャネリングか、またはＤＥＲＡ活性部位の周りの基質濃度の局所的上昇のいずれかによってアセチルＣｏＡの３−ヒドロキシブタナールへの変換（またはピルビン酸もしくは酢酸の３−ヒドロキシブタナールへの変換）を改善するように同じように機能することが考えられる。原理的には完全ＤＥＲＡ経路のどの構成要素も経路のパフォーマンスを最適化するために融合タンパク質として導入することができる。
【０３２５】
酵素を融合しない場合、生合成経路を構成するタンパク質は、それらを極近傍に保持する他のアプローチによって連結されてもよい。例えば、細胞内に「エタノールバイオリアクター」を作製するためにＮ末端ターゲティングペプチドを使用することによる細菌微小区画への局在化（Ｌａｗｒｅｎｃｅら著、２０１４年）、またはタンパク質を複合体内に配置するための細菌性スキャフォールディンの使用可能性（Ｄｉｎｇら著、２００３年）。これらの技術は本発明に等しく適用される可能性がある。
【０３２６】
ＥｕｔＥ：ＤＥＲＡ融合体の構築
リンカーを付加せずにインバースＰＣＲを用いて既存のポリシストロン性発現オペロンから対応する開始コドンと終止コドンを除去することにより大腸菌Ｋ１２のＤＥＲＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ２６９７４．１）とＥｕｔＥ（サルモネラ・チフィムリウムＬＴ２；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ２１３５７．１）を含む酵素融合体が構築され、それにより生じた融合体酵素は機能することがわかった。酵素融合体を作製するための次の方法は、１，３−ブタンジオールまたは他の化学薬品の合成を目的としてＤＥＲＡを含む代謝経路を構成する酵素のうちの１つ以上に適用され得る。
【０３２７】
ＰＣＲ産物（発現プラスミド全体を含む）が再びライゲーションされると２つのコード配列が１つの連続するオープン・リーディング・フレームに融合されるように、インバースＰＣＲにより隣接するＤＥＲＡ遺伝子とＥｕｔＥ遺伝子との間にある遺伝子間領域（プラスミドｐＤＨ２９１、すなわちｐＥＴ３ａ−ＤＥＲＡ−ＥｕｔＥ−ＧＯＸ１６１５中のＤＥＲＡコード配列の終止コドンと下流のＥｕｔＥコード配列の開始コドンを含む）を除去するためにダイバージェントプライマーペアＡＰＢ１４２Ｆ（５’−ＡＡＴＣＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧ；５’リン酸化）およびＡＰＢ１４３Ｒ（５’−ＧＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＣＴＴＡＣ）をデザインした。直鎖状の７．８ｋｂのＡＰＢ１４２／ＡＰＢ１４３インバースＰＣＲ産物を精製し、ライゲーションし、そしてそれを使用してケミカルコンピテント大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。２つのカルベニシリン耐性形質転換体を選択的培地上で二次培養し、それぞれＤＨ３３７およびＤＨ３３８という株ＩＤを割り当てた。ＤＨ３５６株（大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＤＨ３３７）、ＤＨ３５７株（大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＤＨ３３８）、ＤＨ３０１（大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＤＨ２９１）およびＤＨ２２８株（大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ／ｐＥＴ３ａ；陰性対照）を使用して独立して１００μｇ／Ｌのカルベニシリンを含む６ｍＬの自己誘導性培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ著、２００５年）に植菌し、そして２２５ｒｐｍ、３７℃で一晩（１６〜１８時間）にわたって培養した。培養後、バイオマスを遠心分離により回収し、０．１ｍＭの酸で洗浄したグラスビーズを使用してＦａｓｔＰｒｅｐビーズビーター内で５．５ｍ／秒を４回でそのバイオマスを溶解した。可溶性画分（上清）を遠心分離（ベンチトップ遠心分離機内において４℃で１３．４ｋｒｐｍ）により回収し、１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによりタンパク質を展開してＤＨ３５６株とＤＨ３５７株の両方において７６．７６ＫＤａのＤＥＲＡＥ−ＥｕｔＥ融合タンパク質の発現を確認した。
【０３２８】
実施例１０に記載された通り前記融合タンパク質を発現させた。融合タンパク質はアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（ｅｕｔＥ）とデオキシリボース−５−Ｐ−ホスフェートアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）活性の両方に関して活性を有することが確認された。アセチルＣｏＡまたはデオキシリボース−５−Ｐ−ホスフェートのいずれかからのアセトアルデヒド産物をそれぞれ検出するためのアルコールデヒドロゲナーゼ共役アッセイを使用して実施例１３に記載されるようにアッセイを実施した。測定された活性は４．２μｍｏｌ／分／ｍｇおよび５μｍｏｌ／分／ｍｇであった。
【０３２９】
実施例１１の参照文献
Ｄｉｎｇ  ＳＹ，  Ｌａｍｅｄ  Ｒ，  Ｂａｙｅｒ  ＥＡ，  Ｈｉｍｍｅｌ  ＭＥ．著、Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ誌（ニューヨーク）、２００３年、第２５巻：２０９〜２５頁。
Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＡＤ，  Ｆｒａｎｋ  Ｓ，  Ｎｅｗｎｈａｍ  Ｓ，  Ｌｅｅ  ＭＪ，  Ｂｒｏｗｎ  ＩＲ，  Ｘｕｅ  ＷＦ，  Ｒｏｗｅ  ＭＬ，  Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ  ＤＰ，  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  ＭＢ，  Ｈｏｗａｒｄ  ＭＪ，  Ｗａｒｒｅｎ  ＭＪ．著、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．誌、２０１４年７月１８日；第３巻（第７号）：４５４〜６５頁。
Ｌｅｗｉｃｋａ  ＡＪ，  Ｌｙｃｚａｋｏｗｓｋｉ  ＪＪ，  Ｂｌａｃｋｈｕｒｓｔ  Ｇ，  Ｐａｓｈｋｕｌｅｖａ  Ｃ，  Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ−Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ  Ｋ，  Ｔａｕｔｖａｉｓａｓ  Ｄ，  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  Ｈ，  Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｈ，  Ｘｉａｏ  Ｗ，  Ｓｌｉｋａｓ  Ｊ，  Ｈｏｒｓｆａｌｌ  Ｌ，  Ｅｌｆｉｃｋ  Ａ，  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｃ．著、Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．誌、２０１４年１２月１９日；第３巻（第１２号）：９７６〜８頁。
【０３３０】
実施例１２．ピルビン酸デカルボキシラーゼ（単離酵素）を使用するピルビン酸からの１，３−ブタンジオールの産生。ルート４、図３
序論
ピルビン酸デカルボキシラーゼからアセトアルデヒドがＤＥＲＡに供給され、ＧＯＸ１６１５レダクターゼまたはｂｄｈＢデヒドロゲナーゼを使用してＤＥＲＡの産物である３−ヒドロキシブタナールが１，３−ブタンジオールに還元される経路のインビトロでの例を以下に説明する。この仕事は、ピルビン酸からの１，３−ブタンジオールの産生に関する詳細なデータを提供する。ピルビン酸濃度の増加はＤＥＲＡ酵素へのアセトアルデヒド供給量の増加をもたらす。
【０３３１】
これらのデータは、ヒドロキシブタナールおよび下流産物（ここでは１，３−ブタンジオール）の合成を行うためにどのように先行する経路酵素からアセトアルデヒドをＤＥＲＡに供給することができるかということを示している。
【０３３２】
ピルビン酸濃度を上昇させたときの１，３−ブタンジオール産生
０．５Ｕ／ｍｌで出芽酵母ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ１）（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ９４７４）を使用するピルビン酸の脱炭酸によってアセトアルデヒドを前記酵素系（１ｍｌ）に供給した。ピルビン酸は５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭおよび５０ｍＭの濃度で添加された。その反応は１２ｍｇの大腸菌デオキシリボース−５−Ｐアルドラーゼ（ＤＥＲＡ、３．６ユニット／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ社）および０．０１１ｍｇ／ｍｌの精製されたＧＯＸ１６１５も含んだ。０．１ｍｇ／ｍｌの終濃度で添加されたシュードモナス属の種（Ｓｉｇｍａ社、１９３５９）由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）によってＮＡＤＰＨ補因子（０．１５ｍＭ）がリサイクルされた。反応物質と産物の濃度をＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、Ｒｅｚｅｘ  ＯＡ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈ＋カラム、３００×７．８ｍｍ）によりモニターした。その反応を任意の９６時間２５℃で保温した。
【０３３３】
【表２３】
2017534268.tif 000040
【０３３４】
ｂｄｈＢデヒドロゲナーゼを使用する例が下に提示されている。ピルビン酸が３０ｍＭの濃度で供給されたこと、およびｂｄｈＢが０．０７ｍｇ／ｍｌの濃度で添加されたことを除いて同じ方法が使用された。
【０３３５】
【表２４】
2017534268.tif 000041
【０３３６】
１，３−ブタンジオールを全ての事例においてＬＣ／マススペクトロメトリーにより確認した。代表的なマススペクトロメトリーデータが図１６に示されている。
【０３３７】
様々なＤＥＲＡ濃度における５ｍＭまたは３０ｍＭのピルビン酸からの１，３−ブタンジオール産生
基質としての５ｍＭまたは３０ｍＭのピルビン酸とＧＯＸ１６１５向けのＧＤＨ補因子リサイクルを含む反応が、大腸菌ＤＥＲＡ（３．６ユニット／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ社）の量を１２ｍｇ、６ｍｇ、３ｍｇ、１．５ｍｇ、０．７５ｍｇに変更したことを除いて上記のように準備された。反応物質と産物を上記のようにモニターした。
【０３３８】
反応を任意に９６時間にわたって２５℃で保温した。
【０３３９】
【表２５】
2017534268.tif 000042
【０３４０】
全ての事例において１，３−ブタンジオールをＬＣ／マススペクトロメトリーにより確認した。代表的なマススペクトラムが図１６に示されている。
【０３４１】
まとめると、ＤＥＲＡ酵素を改良（例えば、より良好なカイネティクスに向けて改良）するか、または１，３−ブタンジオールの還元の方向へ選択的レダクターゼをさらに改良するかのいずれかによって副産物としてのエタノールの産生を改善することができる。
【０３４２】
実施例１３．様々な微生物起源から選択されたＤＥＲＡを使用するピルビン酸からの１，３−ブタンジオールの産生
序論
本実施例は、一連の微生物のＤＥＲＡが新規のインビボ非天然代謝経路の一部として中間体である３−ヒドロキシブタナールへの２分子のアセトアルデヒドの縮合にとって適切であり得ることを示す。
【０３４３】
【表２６】
2017534268.tif 000043
【０３４４】
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス株ＮＧ８０−２のＤＥＲＡホモログのゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス株Ｋ１０４１からの単離とシーケンシング
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス株ＮＧ８０−２（この株については公開されたゲノム配列が存在する）の遺伝子ＧＴＮＧ＿２４３５のホモログをゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスＫ１０４１から特定し、ＰＣＲでクローン化し、そしてシーケンシングした。鋳型としてのＧＮＴＧ＿２４３５配列に基づいてＰＣＲプライマーＡＰＢ１０６Ｆ（５’−ＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧ）およびプライマーＡＰＢ１０７Ｒ（５’−ＴＴＡＡＴＡＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＧ）をデザインし、Ｑ５ハイフィデリディＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）および製造業者が推奨するＰＣＲ反応条件と共にそれらのプライマーを使用してゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスＫ１０４１ゲノムＤＮＡからおおよその６７２ｂｐ産物をＰＣＲでクローン化し、アガロースゲル電気泳動によりそれを確認した。平滑末端ＰＣＲ産物向けの製造業者のプロトコルに従ってＣｌｏｎｅＪＥＴ  ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してクローニングベクターｐＪＥＴ１．２にそのＰＣＲ産物を直接ライゲーションし、それにより生じたライゲーションミックスを使用してケミカルコンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換し、１００μｇ／ｍＬの濃度でカルベニシリンを含むルリア寒天（ＬＡ；Ｓｉｇｍａ社）上で培養することにより形質転換体を選択した。３７℃で１６時間の培養の後に回収された形質転換体大腸菌ＤＨ１０Ｂコロニーを、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＡにレプリカプレーティングし、そしてコロニーＰＣＲ反応においてプライマーペアＡＰＢ１０６ＦおよびｐＪＥＴ１．２リバースシーケンシングプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をＤｒｅａｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と共に使用してＡＰＢ１０６Ｆ／ＡＰＢ１０７Ｒクローン化ＰＣＲ産物の存在についてチェックし、ＰＣＲ陽性形質転換体コロニー中のおおよその７２９ｂｐ産物の存在をアガロースゲル電気泳動により確認した。これらのうちの２つにそれぞれＤＨ２０８およびＤＨ２０９という株ＩＤを付けてそれらを貯蔵した。これらの株からアルカリ溶解によってプラスミドを単離し、ｐＪＥＴ１．２フォワードプライマーおよびリバースシーケンシングプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してそれらのプラスミドをシーケンシングしてゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス株Ｋ１０４１のＧＮＴＧ＿２４３５ホモログの配列を得た。その後、ＧＮＴＧ＿２４３５とのヌクレオチド配列相同性と翻訳された一次アミノ酸配列内の保存ドメインのＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴウェッブサーバーを使用した特定の両方からこの遺伝子は推定上のＤＥＲＡをコードするものと特定された。Ｋ１０４１ホモログの配列を下に再現する。
【０３４５】
ＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡＴＡＣＧＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＧＡＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＣＴＡＴＧＣＧＡＣＧＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＣＧＡＧＣＴＴＴＣＣＧＡＣＡＣＴＧＡＴＧＴＣＣＧＣＧＴＣＴＧＣＡＣＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＧＡＡＡＣＡＡＡＧＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＣＧＣＴＡＴＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＡＧＴＣＧＡＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＣＧＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＴＡＡＣＧＡＴＧＡＡＣＴＣＧＴＴＧＡＧＣＧＣＧＡＣＡＴＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＡＴＣＧＡＡＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＡＴＴＡＣＧＴＡＡＡＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＧＡＣＧＧＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧＣＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＴＣＣＧＣＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧＣＧＡＴＧＡＴＴＧＡＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＣＧＣＧＣＡＴＴＧＧＧＡＣＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＡ
【０３４６】
大腸菌、アセトバクテリウム・ウッディイ、ピロバクルム・アエロフィルムおよびゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスのデオキシリボース−５−Ｐアルドラーゼ（ＤＥＲＡ）を含む発現ベクターの構築
公開された遺伝子配列（ＮＣＢＩ  ＧＩＤ：１４６５５７８）を鋳型として使用してＰａＤＥＲＡを商業ＤＮＡ合成により得て、それをプラスミド上に載せた。ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスのＤＥＲＡを上で記載されたように単離した。大腸菌およびアセトバクテリウム・ウッディイは、公開されたゲノム配列を鋳型として使用してデザインされたプライマーを使用してそれらのそれぞれのゲノムＤＮＡから直接的に単離された。最終的な発現コンストラクトを作製するために当技術分野においてよく知られている方法を用い、５’側のＮｄｅＩ制限部位と３’側のＢａｍＨＩ制限部位を付けて標的ＤＥＲＡの各々をＰＣＲにより増幅し、その後でプラスミドにコードされるＴ７誘導可能プロモーターとインフレームになるように標準的制限酵素ベースクローニング方法を使用してｐＥＴ３ａ発現プラスミドバックボーンの対応する部位に独立してそれらの各々を二次クローン化した。
【０３４７】
１，３−ブタンジオール産生のためのＤＥＲＡの発現、およびＤＥＲＡを含む溶菌液の調製
空ｐＥＴ３ａベクターまたは大腸菌、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス、アセトバクテリウム・ウッディイおよびピロバクルム・アエロフィルムのクローン化ＤＥＲＡのいずれかを担持する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）の株は１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む５０ｍＬの市販の自動誘導培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ社）中において２５０ｒｐｍで振盪されながら３０℃で培養された。終夜培養の後、細菌を前に記載されたようにビーズビーティングにより溶解した。それにより生じた溶菌液を活性アッセイの前に遠心分離により清澄化した。各溶菌液のＤＥＲＡ活性は、アセトアルデヒド産物の検出のためにＮＡＤＨ共役アッセイを使用してデオキシリボース−５−リン酸に対する逆アルドール方向で決定された。０．１５ｍＭのＮＡＤＨ、５ｍＭの２−デオキシリボース５−リン酸（Ｓｉｇｍａ社、Ｄ３１２６）および１０Ｕ／ｍｌのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社、Ａ７０１１）を使用してそのアッセイを実施した。
【０３４８】
溶菌液が希釈され、そして次の体積当たりの活性および比活性で次の反応が行われた。
【０３４９】
【表２７】
2017534268.tif 000044
【０３５０】
０．５Ｕ／ｍｌで酵母ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ９４７４）を使用するピルビン酸の脱炭酸を介してアセトアルデヒドを前記酵素系（１ｍＬ）に供給した。ピルビン酸を５ｍＭおよび３０ｍＭの濃度で添加した。その反応は、必要に応じて２Ｕ／ｍｌ、２０Ｕ／ｍｌ、または０．３Ｕ／ｍｌの濃度のクローン化ＤＥＲＡと０．０３３ｍｇ／ｍｌの精製ＧＯＸ１６１５（実施例９）も含む。０．１ｍＭのチアミンピロリン酸、１ｍＭのＭｇＳＯ４および１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７の中でアッセイを実施した。０．１ｍｇ／ｍｌの終濃度で添加されたシュードモナス属の種のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（Ｓｉｇｍａ社、１９３５９）と１０ｍＭのグルコースによってＧＯＸ１６１５（０．１５ｍＭ）向けのＮＡＤＰＨ補因子がリサイクルされた。その反応を任意の９６時間にわたって２５０ｒｐｍで振盪しながら２５℃で保温し、そして分析の前に氷上で冷却した。反応物質と産物の濃度をＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、Ｒｅｚｅｘ  ＯＡ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈ＋カラム、３００×７．８ｍｍ）によりモニターした。対照は、ＤＥＲＡ溶菌液を加えないｐＨ７．０の緩衝液の中に５ｍＭおよび３０ｍＭのピルビン酸、０．５Ｕ／ｍｌのＰＤＣ、０．１５ｍＭのＮＡＤＰＨ、０．１ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ、１０ｍＭのグルコースおよび０．０３３ｍｇ／ｍｌのＧＯＸ１６１５から構成された。アセトアルデヒドの３−ヒドロキシブタナールへの非生物的化学縮合を介して産生された１，３−ブタンジオールは無いことがこの対照により確認された。
【０３５１】
【表２８】
2017534268.tif 000045
【表２９】
2017534268.tif 000046
【表３０】
2017534268.tif 000047
【表３１】
2017534268.tif 000048
【０３５２】
全ての事例において１，３−ブタンジオールをＬＣ／マススペクトロメトリーにより確認した。代表的なマススペクトラムが図１６に示されている。
【０３５３】
実施例１４．クローン化全経路オペロンを使用するピルビン酸からの１，３−ブタンジオールの産生
序論
オペロンとして発現される完全な１，３−ＢＤＯ生合成経路の例示のため、ＥｃＤＥＲＡ遺伝子、ＰＤＣ１遺伝子およびＧＯＸ１６１５遺伝子をラクトース誘導性Ｔ７プロモーター（発現ベクターｐＥＴ３ａ中）の下で単一のポリシストロン性オペロンに組み立て、それらの遺伝子を活発に発現させて大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）細胞溶解物中で１，３−ＢＤＯを産生させた。
【０３５４】
サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清型チフィムリウムＬＴ２株のアルデヒドオキシドレダクターゼ（ｅｕｔＥ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ４１７９３、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＧＩＤ：１２５３９８５）をＥｃＤＥＲＡのアセトアルデヒド基質の内在性供給源として最初に使用した。後の実施形態ではこのコンストラクト内のｅｕｔＥを置き換えるために出芽酵母由来のクローン化ＰＤＣ１が下で説明されるように使用された。
【０３５５】
ＥｃＤＥＲＡおよびＰＤＣとＧＯＸ１６１５の発現ベクターの構築
プラスミドｐＤＨ３８４（ｐＥＴ３ａ−ＥｃＤＥＲＡ−ＥｕｔＥ−ＧＯＸ１６１５）内のＧＯＸ１６１５の５’ＵＴＲに対して相同な２４ｂｐを用いてＰＤＣ１遺伝子を出芽酵母ゲノムＤＮＡ（ＳＧ  ＩＤ  Ｓ０００００４０３４、およびＣａｎｄｙら著、１９９１年）からＰＣＲでクローン化した。その後、ＰＤＣ１が最終的なコンストラクト内のｅｕｔＥコード配列に置き換わるように、そしてまた元々のリボソーム結合部位とインフレームでクローン化されるように、ＥＭＰ  ＰＣＲを用いてその精製されたＰＣＲ産物をｐＤＨ３８４に組み入れて発現プラスミドｐＤＨ５２７（ｐＥＴ３ａ−ＥｃＤＥＲＡ−ＰＤＣ１−ＧＯＸ１６１５）を作製した。
【０３５６】
発現オペロンの発現、および発現オペロンを含む溶菌液の調製
誘導処理された大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株の細胞溶解液を実施例１３において説明されたように調製した。
【０３５７】
０．１ｍＭのチアミンピロリン酸、１ｍＭのＭｇＳＯ４および１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７の中でアッセイを実施した。ピルビン酸を５ｍＭおよび３０ｍＭの終濃度まで添加した。下に記載されるユニットの発現したＰＤＣ、ＤＥＲＡおよびＧＯＸ１６１５を含むようにその溶菌液を希釈した。その反応を任意の９６時間にわたって２５０ｒｐｍで振盪しながら２５℃で保温し、そして実施例１３において説明されたＨＰＬＣによる分析の前に氷上で冷却した。
【０３５８】
２−デオキシリボース−５−リン酸を基質として使用するＮＡＤＨ共役アッセイを使用してクローン化ＤＥＲＡの活性を実施した。０．１５ｍＭのＮＡＤＨ、５ｍＭの２−デオキシリボース５−リン酸（Ｓｉｇｍａ社、Ｄ３１２６）および１０Ｕ／ｍｌアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社、Ａ７０１１）を使用してそのアッセイを実施した。１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１５ｍＭのＮＡＤＨおよび１０Ｕ／ｍｌのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社、：Ａ７０１１）を使用する共役アッセイを使用してＰＤＣの活性を実施した。１０ｍＭのブタナールおよび０．１５ｍＭのＮＡＤＰＨを使用してＧＯＸ１６１５の活性を実施した。
【０３５９】
【表３２】
2017534268.tif 000049
【表３３】
2017534268.tif 000050
【０３６０】
１，３−ブタンジオールを全ての事例においてＬＣ／マススペクトロメトリーにより確認した。代表的なマススペクトラムが図１６に示されている。
【０３６１】
これらのデータは、２分子のアセトアルデヒドの縮合にとって重要な酵素であるＤＥＲＡを含む完全にクローン化された新規の非天然代謝経路の１，３−ブタンジオール合成能力の実証に成功している。
【０３６２】
実施例１４の参照文献
Ｃａｎｄｙ  ＪＭ，  Ｄｕｇｇｌｅｂｙ  ＲＧ，  Ｍａｔｔｉｃｋ  ＪＳ．著、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、１９９１年１２月、第１３７巻（第１２号）：２８１１〜５頁。
【図１】
2017534268.tif 000051
【図２】
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【図３】
2017534268.tif 000053
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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