(57)【要約】  本発明は、物理的吸着による、タンパク質によるポリマー性表面の官能化のための方法を提供する。この方法は、膜貫通タンパク質が、ディスプレイのために、タンパク質および／またはペプチドのためのアンカーとして使用されることを可能にする。タンパク質またはペプチドのディスプレイのためのポリマー性基材、ならびに関連するキットおよび使用の方法もまた提供される。
2017508444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化するための方法であって、
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）ｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ；および
ｉｖ）タンパク質サンプルの界面活性剤濃度を、１×臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以下の界面活性剤に低減させるステップ
を含み、タンパク質が、物理吸着によって基材上に固定化される、方法。
【請求項２】
界面活性剤濃度が、０．０５×ＣＭＣ〜１×ＣＭＣに、好ましくは０．０５×ＣＭＣ〜０．７×ＣＭＣに、好ましくは０．０５×ＣＭＣ〜０．３×ＣＭＣに低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膜貫通タンパク質が、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングし得る、またはアンカリングするように改変され得、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質は、ポリマー性基材の表面から空間的に隔てられる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
膜貫通タンパク質が、頭部および足部を含み、頭部および足部が互いから、１または複数の膜貫通ストランドを含む本体によって遠ざけられる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質の頭部が、ループの大部分を含む終端であり、足部が、ターンの大部分を含む終端である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
膜貫通タンパク質が、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される、
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
膜貫通タンパク質が、ディスプレイのために、タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
異種ペプチドが、膜貫通ストランド間で、長いループ中に挿入される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
膜貫通タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端が、循環式並べ替えによって改変される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｎ末端および／またはＣ末端が、ループの代わりに、またはループに隣接して、またはループ内から提供されるように、膜貫通タンパク質が操作されている、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ末端およびＣ末端の両方が同じループ中に提供されるように、膜貫通タンパク質が操作されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
膜貫通タンパク質が、外膜プロテインＡであり、ループが、ループ１、３または４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
膜貫通タンパク質が基材上に固定化された場合に、操作された末端が、基材の表面から離れて延び、タンパク質またはペプチドにディスプレイ部位を提供する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
膜貫通タンパク質が、ディスプレイのために、膜貫通タンパク質とペプチドおよび／またはタンパク質との間に空間距離をとるためのスペーサーを含み、好ましくは、スペーサーは、一方もしくは両方の末端の終端上またはループ内に提供され、好ましくは、スペーサーは、ディスプレイのために、ペプチドまたはタンパク質に融合される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
スペーサーが、膜貫通タンパク質にとってならびに／またはペプチドおよび／もしくはタンパク質にとって異種である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
スペーサーが、親水性、剛性または半剛性である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
スペーサーが、アルファ・ヘリックス、またはＰＴリンカー、またはグリシン−セリン・スペーサー・リンカーを含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ｉ）膜に内在性ではない大きい内部または外部ドメインを除去するように；
ｉｉ）１もしくは複数のループをトランケートするように；および／または
ｉｉｉ）１もしくは複数のループを、例えばループ上でのタンパク質の挿入およびディスプレイを可能にするために親水性スペーサーによって伸長させるように、
膜貫通タンパク質が操作される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
膜貫通タンパク質が、架橋剤なしに、それへのタンパク質結合を可能にするための表面の官能化もしくは改変なしに、および／または脂質単層などの脂質などの安定化剤なしに、ポリマー性基材上に固定化される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
膜貫通タンパク質が、タンパク質の足部中に提供され得る基材結合ドメインへの改変を含まない、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
膜貫通タンパク質が、膜内在性タンパク質、好ましくはイオン・チャネル、好ましくはベータ−バレル・タンパク質、好ましくはポリンである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
膜貫通タンパク質が、真核生物のもの、例えば植物由来、動物もしくは哺乳動物のもの；または原核生物のもの、例えば細菌のものである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
膜貫通タンパク質が、グラム陰性細菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）、好ましくはＯｍｐＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
膜貫通タンパク質が、３つのトランケートされた細胞外ループを含むように改変されたＯｍｐＡであり、ループ１が、保持され、ＰＴリンカーおよび任意選択で親水性アミノ酸を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
膜貫通タンパク質が、ＯＭＰ１５４または表３に列挙されるそのバリアントである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
膜貫通タンパク質が、細胞外ループ１中にＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
膜貫通タンパク質が、細胞外ループ１中にラミニン由来のＹＩＧＳＲモチーフを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
膜貫通タンパク質が、ｉ）全てのトランケートされた細胞外ループ；ｉｉ）タンパク質の細胞外終端（頭部）上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）金表面へのタンパク質の結合を可能にするためのシステイン残基を含むように改変されたＯｍｐＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
膜貫通タンパク質が、末端、好ましくはＮ末端に、アルファ・ヘリックス・スペーサーをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
膜貫通タンパク質が、スペーサーに融合した異種タンパク質またはペプチドをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
膜貫通タンパク質が、ｉ）全てのトランケートされた細胞外ループ；ｉｉ）タンパク質の細胞外終端（頭部）上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）アルファ・ヘリックス・スペーサー配列を含むように改変されたＮ末端；ｉｖ）Ｃ末端上に提供されたＨｉｓタグを含むように改変されたＯｍｐＡであり、ｖ）タンパク質がシステイン残基を含まない、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
膜貫通タンパク質が、ＯＭＰ１４０もしくは表４に列挙されたそのバリアント、またはＦＧＦ１および２をそれぞれ含むＯＭＰ９０および１２８である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
膜貫通タンパク質が、ｉ）タンパク質の細胞外終端（頭部）上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）トランケートされ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインに融合されたＮ末端を含むように改変されたＯｍｐＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
膜貫通タンパク質がＯＭＰ１８である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
膜貫通タンパク質が、図１４の核酸配列によってコードされるＯｍｐＡである、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
膜貫通タンパク質が、２以上の異なるペプチドおよび／またはタンパク質をアンカリングする、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
異種ペプチドおよび／タンパク質が機能的である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
異種ペプチドおよび／またはタンパク質が、そのネイティブの機能、例えば、結合機能、受容体機能、シグナル伝達機能または酵素機能のうち１または複数を保持する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ペプチドおよび／またはタンパク質配列が、増殖因子、タンパク質−タンパク質相互作用または結合に関与するタンパク質またはペプチド、抗体結合モチーフ、エピトープ、抗原、アレルゲン、酵素、触媒、ＤＮＡおよび／または炭水化物との相互作用または結合に関与するタンパク質またはペプチド；低分子との相互作用または結合、例えば、細胞結合、細胞シグナル伝達に関与するタンパク質またはペプチド；細胞外マトリックス・タンパク質からなり得る、これらから誘導され得る、またはこれらとして機能し得る、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
本発明における使用のためのペプチドおよびタンパク質が、タンパク質の結合部位、例えば、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）；増殖因子、例えば、ＦＧＦ１またはＦＧＦ２、インターロイキン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、白血球抑制因子（ＬＩＦ）、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）；例えば、インテグリン、コラーゲン、ラミニンまたはフィブロネクチンなどの膜外マトリックス・タンパク質の細胞結合モチーフ（例えば、表３に記載される）；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質モチーフ、例えば、ＲＧＤＳ、抗原（例えば、ＨＩＶ（例えば）ｐ２４抗原、ＢＭＰ−２、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシン−Ｃ）を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４１】
基材が、メッシュ、繊維、ビーズ、編物もしくは織物、マイクロ・ウェル・プレート、アレイまたは組織培養フラスコからなる群より選択される、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ポリマーが、プラスチック、絹および他のタンパク質性繊維（例えば、毛髪、毛皮（ケラチン・フィラメント）、アクチン・フィラメント、コラーゲン・フィラメントなど）、ならびにグラフェンである、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
プラスチックが、ポリビニル、ポリエチレン・テレフタレート（ＰＥＴ）および高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）および低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）などを含むポリエチレン（ＰＥ）、ポリアクリレート（アクリル）、耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）を含むポリスチレン（ＰＳ）、シリコーン、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリ乳酸コグリコール酸（ＰＧＬＡ））、ポリウレタン、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアミド（ナイロン）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）、ポリエチレン／アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＰＥ／ＡＢＳ）、ベークライト、ゴム、ラテックス、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリカーボネート／アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＰＣ／ＡＢＳ）、ならびにポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）などを含むポリ塩化ビニルである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
タンパク質サンプルが、１×ＣＭＣよりも高い界面活性剤濃度を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）タンパク質サンプルの添加の際に１×以下のＣＭＣが得られるように、ポリマー性基材に希釈剤を添加するステップ；
ｉｖ）ｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ
を含み、タンパク質が、物理吸着によって基材上に固定化される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）基材と共にインキュベートしたときにＣＭＣが１×以下になるように、タンパク質サンプルの界面活性剤濃度を低減させるステップ；
ｉｖ）ｉｉｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ
を含み、タンパク質が、物理吸着によって基材上に固定化される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
界面活性剤濃度が、透析または希釈によって低減され、好ましくは、希釈は、水または緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸塩緩衝液の添加を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
基材を洗浄するステップをさらに含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
基材を無菌化するステップをさらに含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
タンパク質が、均一に、またはパターンで、例えばスポットされて、基材に適用される、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
基材への膜貫通タンパク質の結合を、結合アッセイを用いて決定するステップをさらに含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材であって、膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている、ポリマー性基材。
【請求項５３】
膜貫通タンパク質が、請求項３から４０のいずれか一項に規定されている、請求項５２に記載のポリマー性基材。
【請求項５４】
基材が、請求項４１から４３のいずれか一項に規定されている、請求項５２から５３のいずれか一項に記載のポリマー性基材。
【請求項５５】
膜貫通タンパク質が、均一なまたはパターン化された（例えばスポットされた）様式でその上に固定化されている、請求項５２から５４のいずれか一項に記載のポリマー性基材。
【請求項５６】
その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を含む製品であって、膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている、製品。
【請求項５７】
マイクロ・ウェル・プレート、組織培養フラスコまたはプレート、プラスチック・ビーズ、繊維、メッシュ基材、医療用デバイス、例えば外科用インプラント、ポリマーのマイクロ粒子またはナノ粒子からなる群より選択される、請求項５６に記載の製品。
【請求項５８】
ポリマー性基材が、請求項５２から５５のいずれか一項に規定されている、請求項５６または５７に記載の製品。
【請求項５９】
その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を含む外科用インプラントであって、膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、タンパク質は、そのネイティブの二次構造を保持する、外科用インプラント。
【請求項６０】
ポリマー性基材が、請求項５２から５５のいずれか一項に規定されている、請求項５９に記載の外科用インプラント。
【請求項６１】
サンプル中の成分を結合させる方法であって、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）基材にサンプルを添加するステップ；
ｉｉｉ）基材への任意の成分の結合を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ
を含む方法。
【請求項６２】
基材を洗浄して任意の未結合の材料を除去するステップをさらに含む、目的の成分についてのスクリーニング・アッセイである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
結合した成分の有無を検出するステップをさらに含む、サンプルからの目的の成分の固定化のための方法である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
例えば塩溶出、ｐＨ変化による溶出または競合物の結合によって、任意の結合した成分を溶出させるステップをさらに含む、サンプルからの目的の成分の精製方法である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１から５１のいずれか一項に規定されるポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化するステップをさらに含む、請求項６１から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
サンプルが、ヒトもしくは動物の身体由来である（例えば、唾液、全血、血漿、尿、精液、大便など）、または生成プロセス由来の細胞溶解物もしくは粗製抽出物であり得る、請求項６１から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
成分が、部分、好ましくは結合パートナーによって結合されることが可能である部分であり、好ましくは、核酸、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ハプテン、ホルモン受容体、ビタミン、ステロイド、代謝物、アプタマー、糖、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、細胞、生物（例えば、真菌、細菌、ウイルス、原生生物および多細胞寄生生物）、治療的薬物もしくは非治療的薬物、またはそれらの任意の組み合わせもしくは断片からなる群より選択される、請求項６１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
膜貫通タンパク質が、請求項３から４０のいずれか一項に規定されている、請求項６１から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
基材が、請求項４１から４３のいずれか一項に規定されている、請求項６１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ポリマー性基材が、請求項５２から５５のいずれか一項に規定されている、請求項６１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質と、サンプル中の成分との相互作用を媒介する方法であって、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）成分を含むサンプルを、基材に添加するステップ；
ｉｉｉ）成分と、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質との相互作用を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ
を含む方法。
【請求項７２】
成分が、細胞、好ましくは真核生物細胞または原核生物細胞であり、好ましくは、昆虫細胞、酵母、細菌、植物細胞、藻類および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、例えば、線維芽細胞、幹細胞、誘導多能性幹細胞、ニューロン細胞、肝細胞、筋細胞、造血細胞、上皮細胞、初代細胞、形質転換された細胞株からなる群より選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ペプチドおよび／またはタンパク質が、細胞の増殖、発生および／または分化のためのエフェクターとして作用し得る、請求項７１または７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ペプチドおよび／またはタンパク質が、酵素反応または触媒反応を媒介する、請求項７１から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ペプチドおよび／またはタンパク質が、増殖因子またはその機能的断片またはＥＣＭ結合モチーフ；細胞が増殖、分裂および／もしくは分化するように、または特定の特徴もしくは機能を発現するようにシグナル伝達する受容体タンパク質である、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
膜貫通タンパク質が、ＯＭＰ  ＯＭＰ１５３、１５４、１６２〜１６５、１６７、１７４〜１７９および１８０〜１９２（表３および表４）である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
基材からサンプルを取り出し、そこから任意の反応生成物を精製するステップ、または反応生成物の存在を検出するステップをさらに含む、請求項７１から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
Ｆｃタグ化タンパク質の固定化のための、請求項７１から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
ペプチドおよび／またはタンパク質が、Ｆｃ結合ドメイン、好ましくはプロテインＡ、ＧｍあたはＬのＦｃ結合ドメインである、またはこれらを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
サンプルが、ヒトもしくは動物の身体由来である（例えば、唾液、全血、血漿、尿、精液、大便など）、または生成プロセス由来の細胞溶解物もしくは粗製抽出物であり得る、または反応混合物の細胞培養物であり得る、請求項７１から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
請求項１から５１のいずれか一項に規定されるポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化するステップをさらに含む、請求項７１から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
膜貫通タンパク質が、請求項３から４０のいずれか一項に規定されている、請求項７１から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
基材が、請求項４１から４３のいずれか一項に規定されている、請求項７１から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
ポリマー性基材が、請求項５２から５５のいずれか一項に規定されている、請求項７１から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を改変して、請求項３から４０のいずれか一項に規定されている改変された膜貫通タンパク質を提供するステップ、および宿主細胞からタンパク質を発現させるステップをさらに含む、請求項６１から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
ポリマー性基材、膜貫通タンパク質、および１×ＣＭＣ以下の濃度の界面活性剤を含む、インキュベーション。
【請求項８７】
膜貫通タンパク質が、請求項３から４０のいずれか一項に規定されている、請求項８６に記載のインキュベーション。
【請求項８８】
基材が、メッシュ、繊維、ビーズ、編物もしくは織物、マイクロ・ウェル・プレート、アレイまたは組織培養フラスコからなる群より選択される、請求項８６または８７に記載のインキュベーション。
【請求項８９】
ポリマーが、プラスチック、絹および他のタンパク質性繊維（例えば、毛髪、毛皮（ケラチン・フィラメント）、アクチン・フィラメント、コラーゲン・フィラメントなど）、ならびにグラフェンである、請求項８８に記載のインキュベーション。
【請求項９０】
プラスチックが、ポリビニル、ポリエチレン・テレフタレート（ＰＥＴ）および高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）および低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）などを含むポリエチレン（ＰＥ）、ポリアクリレート（アクリル）、耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）を含むポリスチレン（ＰＳ）、シリコーン、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリ乳酸コグリコール酸（ＰＧＬＡ））、ポリウレタン、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアミド（ナイロン）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）、ポリエチレン／アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＰＥ／ＡＢＳ）、ベークライト、ゴム、ラテックス、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリカーボネート／アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＰＣ／ＡＢＳ）、ならびにポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）などを含むポリ塩化ビニルである、請求項８９に記載のインキュベーション。
【請求項９１】
基材が、膜貫通タンパク質によって結合されていないまたは部分的に結合されている、請求項８６から９０のいずれか一項に記載のインキュベーション。
【請求項９２】
ポリマー性基材、およびディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている膜貫通タンパク質を含むキット。
【請求項９３】
膜貫通タンパク質が、請求項３から４０のいずれか一項に規定されている、請求項９２に記載のキット。
【請求項９４】
基材が、請求項４１から４３のいずれか一項に規定されている、請求項９２または９３に記載のキット。
【請求項９５】
ポリマー性基材が、請求項５２から５５のいずれか一項に規定されている、請求項９２から９４に記載のキット。
【請求項９６】
ポリマー性基材が、膜貫通タンパク質によって結合されていない、請求項９２から９５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９７】
ポリマー性基材への膜貫通タンパク質の物理吸着を可能にするための希釈係数を提供するチャート、希釈剤、緩衝液、基材、免疫グロブリンおよび結合試薬を含む、請求項９２から９６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９８】
１または複数の成分が、個々に包装され、試薬の組み合わせとして供給される、請求項９２から９７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９９】
ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている、請求項３から４０のいずれか一項に規定された膜貫通タンパク質。
【請求項１００】
請求項９９に記載の膜貫通タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１０１】
遺伝子構築物中で提供される、請求項１００に記載の核酸配列。
【請求項１０２】
調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１００または１０１に記載の核酸配列。
【請求項１０３】
選択可能なマーカーに作動可能に連結されている、請求項１００から１０２のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項１０４】
請求項１００から１０３のいずれか一項に規定される核酸配列または遺伝子構築物を含む、組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化する方法に関する。本発明は、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材にも関し、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質のためのアンカーとして機能する。本発明は、本明細書に記載されるようなコートされたポリマー性基材の使用；および本明細書に記載されるようなコートされたポリマー性基材を作製するためのキットにも関する。本明細書に記載されるような新規改変膜貫通タンパク質、およびそれをコードする核酸配列もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
多くの適用、例えば、診断的バイオセンサー、免疫診断、外科用インプラント、およびアフィニティ精製のためのバイオプロセシング媒体のための種々の材料上でのタンパク質の固定化のための、単純で規模を変更できる方法が、必要とされている。全ての適用において、タンパク質の構造および機能を保存すること、ならびに性能の最大効率のために基材上にそのタンパク質を正確に配向させることが、重要である。Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．ら（（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：１６１−１７５）に概説されるように、表面上でのタンパク質の固定化のための多数の戦略が存在する。
【０００３】
物理吸着は、タンパク質と表面との疎水性相互作用またはイオン性相互作用に基づく、一般に使用される方法である。物理吸着は、方法論的には単純であるが、量的制御または配向的制御をほとんど提供しない；これは、アンフォールディングを介してタンパク質の機能的特性を変更し得、再現性および効率は可変的である。これは、結合した場合に、タンパク質が、分析物結合のために正確に配向されない可能性があること、または全体的もしくは部分的に変性され非機能的にされ得ることを意味している。これらの方法の多くは、多くのプロセス・ステップがあって複雑であり、大量生産のために規模を変更することが困難である。これらの方法では、対象とするタンパク質の機能の大きな割合が失われることにもなる；例えば、プラスチックＥＬＩＳＡプレートに吸着された抗体の１０％未満は活性であるが、化学的カップリング、例えば、アミン・カップリングは、７５〜１００％の活性喪失を生じる（Ｂｕｔｌｅｒ  Ｊ．Ｅ．ら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５０：７７−９０；Ｂｕｔｌｅｒ  Ｊ．Ｅ．ら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５０：７７−９０；Ｅｓｓｅｒ、Ｐ．（２０１０）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  １１  ｂ；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：１２５−１３１）。
【０００４】
タンパク質を表面に結合させる他の方法には、表面へのタンパク質の共有結合カップリングを可能にするための、アミノ化もしくはカルボキシル化などを介した表面の官能化、または結合を媒介するための表面のコーティング（例えば、ストレプトアビジンもしくはビオチン・コーティング、ポリＬｙｓコーティング、プロテインＡコーティング、またはニッケル・コートされた表面）が含まれる。他の方法には、細菌由来のバイオプラスチックＰＨＡに結合する結合タグ（例えば、ＰｈａＦ）の付加によるタンパク質の改変が含まれる。共有結合カップリングに基づくかかる方法は、安定な連結を提供し、広範なタンパク質に適用され得、良好な再現性を有する。しかし、配向は可変性であり得、化学的誘導体化は、タンパク質の機能を変更し得、安定で相互作用的な表面を必要とする。タンパク質上のタグ（例えば、ヘキサヒスチジン／Ｎｉ−ＮＴＡまたはビオチン／アビジン）を利用する生物学的捕捉方法は、安定な連結を提供し、再現性のある配向でタンパク質を特異的に結合するが、パートナー試薬が、表面上に最初に適切に固定化されなければならない。
【０００５】
ＷＯ２００２０５７７８０は、自己アセンブルした単層での金表面へのタンパク質の結合を記載しており、このタンパク質の生物学的に機能的な部分は、正確に配向され、その活性の１００％近くを保持する。このテクノロジーでは、目的の他のタンパク質およびペプチドが融合され得る足場としての、β−バレル構造化細菌外膜タンパク質（ＯＭＰ）の改変されたバリアントを使用する。この足場は、金の上で固有の自己アセンブル特性を有し、融合パートナーのためのアンカー点として使用される。この融合パートナーは、正確に配向され、機能を保持する。金表面へのＯＭＰの結合は、システインが金表面と共有結合を形成する場合に、タンパク質が正確に配向され、この表面に直接カップリングされるように、ＯＭＰ中の適切な位置においてシステイン残基を含むような、タンパク質の改変に依存する。
【０００６】
これらの方法は、表面との反応を媒介するためのタンパク質中の特定のアミノ酸、システインからの共有結合を受け入れるための表面の改変、およびタンパク質単層を安定化するためのチオ脂質（thiolipid）またはチオアルカンなどの両親媒性分子の存在を必要とするという短所を有する。
【０００７】
表面へのタンパク質結合を必要とする適用は、広範に及び、アッセイ感度を最大化するために、小さい面積にわたる高いタンパク質密度を必要とする場合が多い。プラスチックは、タンパク質ベースのアッセイにおける基材としての使用のための多くの利点を有する。しかし、プラスチック表面の疎水性の性質は、タンパク質の非特異的結合および変性を生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、先行技術に関連する問題点のいくつかを克服または改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様では、ポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化するための方法が提供され、この方法は、
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）ｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ；および
ｉｖ）タンパク質サンプルの界面活性剤濃度を、１×臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以下の界面活性剤に低減させるステップ
を含み、タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化される。
【００１０】
この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングし得る、またはアンカリングするように改変され得る。従って、ポリマー性基材に結合した場合、この膜貫通タンパク質は、好ましくは配向された機能的な様式で、それにアンカリングされたタンパク質またはペプチドをディスプレイすることが可能である。従って、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質は、ディスプレイを補助するために、ポリマー性基材の表面から空間的に隔てられ得る。アンカリングされたタンパク質またはペプチドは、機能的であり得る。
【００１１】
この膜貫通タンパク質は、頭部および足部（ｆｏｏｔ）を含み、この頭部および足部は互いから、１または複数の膜貫通ストランドを含む本体によって遠ざけられる。「アンカー」とは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部のループ中に、ならびに／またはタンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得ることを意味する。「アンカリングするように改変される」とは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を、ならびに／またはタンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作されることを意味する。タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。
【００１２】
従って、本発明の膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【００１３】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質を含む。
【００１４】
スペーサーが、ディスプレイのために、膜貫通タンパク質とペプチドおよび／またはタンパク質との間に空間距離をとるために提供され得る。
【００１５】
一実施形態では、タンパク質サンプルは、１×ＣＭＣよりも高い、例えば１．５×ＣＭＣ、２×ＣＭＣ、２．５×ＣＭＣまたはそれ超の界面活性剤濃度を含み得る。タンパク質サンプルの界面活性剤濃度は、タンパク質が溶液中に残存するのを可能にする濃度である。タンパク質が高濃度、例えば、１．５μＭである場合、タンパク質は、低い界面活性剤濃度でより容易に沈殿する；従って、タンパク質サンプルは、タンパク質の可溶性を維持するために、約２×ＣＭＣ溶液の界面活性剤濃度を有し得る。ポリマー性基材へのタンパク質の結合は、界面活性剤濃度を１×ＣＭＣ以下に低減させることによって達成される。この界面活性剤濃度は、好ましくは、タンパク質が溶液中に残存し、基材に結合できる期間を提供するために、０×ＣＭＣよりも上で維持される。この低減は、希釈もしくは透析、または任意の他の適切な方法によって、達成され得る。
【００１６】
界面活性剤濃度は、タンパク質サンプルとポリマー性基材とのインキュベーション（ステップｉｉｉ）の前に低減され得る。あるいは、界面活性剤濃度は、ポリマー性基材とのインキュベーション時、またはその後に低減され得る。タンパク質の界面活性剤濃度の低減は、ポリマー性基材への膜貫通タンパク質の結合を可能にし、膜貫通タンパク質によってアンカリングされたペプチドまたはタンパク質は、好ましくはディスプレイのために機能的でありかつ配向されている。界面活性剤濃度の低減は、タンパク質の一次もしくは二次構造の改変、または基材の改変もしくは官能化を必要とせずに、ポリマー性基材への膜貫通タンパク質の結合を可能にする。
【００１７】
希釈は、水、緩衝液または任意の他の適切な希釈剤の添加を含み得る。希釈剤は、希釈剤との混合の効果が、タンパク質サンプルの界面活性剤の濃度における、１×ＣＭＣ以下、好ましくは０．０５×ＣＭＣ〜１×ＣＭＣへの低減であることを条件として、界面活性剤を含み得る。
【００１８】
タンパク質サンプルの界面活性剤濃度を低減させるステップはまた、例えば、タンパク質が存在する溶液の容積を増加させることによって、タンパク質濃度を効率的に低減させ得る。この希釈は、基材に結合するのに十分な期間にわたって溶液中にタンパク質が残存するのを可能にするのに十分であるが、界面活性剤濃度は、ポリマー性基材へのタンパク質の物理吸着を可能にするのに十分に低い。
【００１９】
この方法は、基材を洗浄するステップをさらに含み得る。
【００２０】
この方法は、基材を無菌化するステップをさらに含み得る。
【００２１】
タンパク質がその中に提供される界面活性剤は、任意のイオン性、非イオン性または双性イオン性の界面活性剤であり得る。
【００２２】
本発明の第２の態様では、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材が提供され、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている。
【００２３】
ポリマー性基材に結合された（即ち、固定化された）場合、この膜貫通タンパク質は、配向された機能的な様式で、それにアンカリングされたタンパク質またはペプチドをディスプレイすることが可能である。従って、固定化された膜貫通タンパク質によってアンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質は、ディスプレイを補助するために、ポリマー性基材の表面から空間的に隔てられ得る。アンカリングされたタンパク質またはペプチドは、機能的であり得る。
【００２４】
膜貫通タンパク質の使用は、かかるペプチドまたはタンパク質のためのアンカーとして機能することによって、機能的な配向された様式で、小さいペプチドまたはタンパク質がポリマー性基材に結合する際の問題を克服する。従って、ポリマー性基材上に固定化された膜貫通タンパク質上にペプチドおよび／またはタンパク質をディスプレイすることによって、このペプチドおよび／またはタンパク質は、機能、構造を保持し、および／または他の成分との相互作用を可能にする様式で配向され得る。
【００２５】
この膜貫通タンパク質は、第１の態様に関連するものとして規定され得る。従って、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材が提供され得、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【００２６】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質を含む。
【００２７】
スペーサーが、ディスプレイのために、膜貫通タンパク質とペプチドおよび／またはタンパク質との間に空間距離をとるために提供され得る。
【００２８】
この異種ペプチドおよび／タンパク質は、機能的であり得る。
【００２９】
好ましくは、この膜貫通タンパク質は、架橋剤なしに固定化される。従って、このタンパク質は、それへのタンパク質結合を可能にするための表面の官能化または改変なしにポリマー性基材上に固定化される。架橋剤には、例えば、タグ、結合パートナー、例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン、プロテインＡなどが含まれる。
【００３０】
好ましくは、この膜貫通タンパク質は、タンパク質の足部中に提供され得る基材結合ドメインへの改変を含まない。例えば、このタンパク質は、基材結合ドメイン中に、そのネイティブの一次および／または二次配列を含む。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、ポリマー性基材への共有結合を可能にする改変を含まなくてもよい。
【００３１】
好ましくは、この膜貫通タンパク質は、脂質単層などの脂質などの安定化剤の非存在下で固定化される。本明細書では、安定化剤は、界面活性剤を含まない。
【００３２】
好ましくは、この膜貫通タンパク質は、β−バレル・タンパク質である。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、ポリン、好ましくは、グラム陰性細菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）、より好ましくはＯｍｐＡまたはＯｍｐＦである。
【００３３】
本発明の第３の態様では、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を含む製品が提供され、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている。
【００３４】
このポリマー性基材は、本発明の第２の態様に関連するものとして規定され得る。従って、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を含む製品が提供され得、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【００３５】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質を含む。
【００３６】
本発明の第４の態様では、サンプル中の成分を結合させる方法が提供され、この方法は、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）基材にサンプルを添加するステップ；
ｉｉｉ）基材への任意の成分の結合を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ
を含む。
【００３７】
この方法は、基材を洗浄して任意の未結合の材料を除去するステップ；結合した成分の有無を検出するステップ；および／または任意の結合した成分の溶出を、任意選択で含み得る。この方法は、目的の成分についてサンプルをスクリーニングする際、またはサンプルから目的の成分を精製する際、または例えばさらなる反応のために、サンプルから目的の成分を固定化する際に、有用であり得る。
【００３８】
この方法は、本明細書に記載されるように、ポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化するステップを含み得る。
【００３９】
この膜貫通タンパク質は、本発明の第１の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。このポリマー性基材は、本発明の第２の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。従って、この方法は、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）基材にサンプルを添加するステップ；
ｉｉｉ）基材への任意の成分の結合を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ
を含み得、このポリマー性基材は、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含み、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【００４０】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質を含む。
【００４１】
第５の態様では、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質と、サンプル中の成分との相互作用を媒介する方法が提供され、この方法は、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）成分を含むサンプルを、基材に添加するステップ；
ｉｉｉ）成分と、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質との相互作用を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ
を含む。
【００４２】
この膜貫通タンパク質は、本発明の第１の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。このポリマー性基材は、本発明の第２の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。従って、この方法は、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）成分を含むサンプルを、基材に添加するステップ；
ｉｉｉ）成分と、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質との相互作用を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ
を含み得、このポリマー性基材は、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含み、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【００４３】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質を含む。
【００４４】
この成分は、ペプチドおよび／またはタンパク質が、細胞の増殖、発生および／または分化のためのエフェクターとして作用し得るような、細胞であり得る。このペプチドおよび／またはタンパク質は、酵素反応を媒介し得る、または触媒として作用し得る。例えば、このペプチドおよび／またはタンパク質は、増殖因子もしくはシグナル伝達タンパク質であり得、または例えばシグナル伝達経路などの細胞プロセスを誘導し得る。
【００４５】
本発明のポリマー性基材は、例えば、異なる機能を同時に提供するために、１または複数の膜貫通タンパク質を介して、２以上の異なるペプチドおよび／またはタンパク質をアンカリングし得ることが想定される。従って、例えば、細胞結合および増殖因子の組み合わせが、基材上に提供され得る。
【００４６】
本発明の第６の態様では、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を含む外科用インプラントが提供され、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている。
【００４７】
この膜貫通タンパク質は、本発明の第１の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。このポリマー性基材は、本発明の第２の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。
【００４８】
本発明の第７の態様では、ポリマー性基材、膜貫通タンパク質、および１×ＣＭＣ以下の濃度の界面活性剤を含む、インキュベーションが提供される。本発明のこの態様は、本発明のポリマー性基材の生成における中間体に関する。任意の適切な方法が、本発明に記載されるように、界面活性剤濃度の低減のために使用され得る。膜貫通タンパク質の一部は、このインキュベーションにおいて基材上に固定化され得ることが想定される。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化される。この膜貫通タンパク質は、本発明の第１の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。このポリマー性基材は、本発明の第２の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。
【００４９】
本発明の第８の態様では、ポリマー性基材、およびディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている膜貫通タンパク質を含むキットが提供される。この膜貫通タンパク質は、本発明の第１の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。このポリマー性基材は、本発明の第２の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。
【００５０】
本発明の第９の態様では、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている膜貫通タンパク質が提供される。この膜貫通タンパク質は、頭部および足部を含み、この頭部および足部は互いから、１または複数の膜貫通ストランドによって遠ざけられる。「アンカー」とは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部のループ中に異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を、ならびに／またはタンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得ることを意味する。「アンカリングするように改変される」とは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を、ならびに／またはタンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作されることを意味する。
【００５１】
好ましくは、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【００５２】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質を含む。膜貫通タンパク質は、本明細書に規定されるようなタンパク質、例えば、表７に規定されるようなＯＭＰタンパク質であり得る。
【００５３】
本発明の第１０の態様では、膜貫通タンパク質をコードする核酸配列が提供され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている。この膜貫通タンパク質は、本発明の第１の態様およびさらなる態様に関連するものとして規定され得る。
【００５４】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して、本明細書の以下にさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】β−バレル足場タンパク質ＯｍｐＡの定向進化に基づくプラスチック結合性β−バレル・タンパク質の設計を示す図である。ＯＭＰ０は、トランケートされたＮ末端およびＣ末端、アフィニティ精製のための６×Ｈｉｓタグ、ならびに金への共有結合のためのタンパク質の「足部」におけるシステインを有する、元の金結合性の改変されたバージョンのＯｍｐＡである。
【図２】抗ＨＩＶ１−Ｐ２４（Ａ、Ｃ）および抗ＨＩＶ１／２  Ｐ２４（Ｂ、Ｄ）モノクローナル抗体による、ポリスチレン・プレート（Ａ、Ｂ）およびＰｏｌｙｓｏｒｐプレート（Ｃ、Ｄ）上の固定化されたＰ２４抗原およびＰ２４融合タンパク質の検出を示す図である。
【図３】異なる生物学的特性を示す広範なＯＭＰタンパク質でコートされた９６ウェル・ポリスチレン・プレート上のＭＧ６３骨細胞の培養を示す図である。ブランクは、未改変のポリスチレン・ウェルを示し、ＯＭＰ１５４は、未改変の足場タンパク質であり、ＯＭＰ１５４への４アミノ酸ＲＧＤＳの付加によって、細胞結合を有意に増強することができるタンパク質ＯＭＰ１５３が作製される。
【図４】ＯＭＰ１８およびネイティブのプロテインＡについてのＩｇＧ結合機能的アッセイの模式図である。ＯＭＰ１８構造がこの図中に示してある。ステップ１では、タンパク質が、プラスチック表面に結合される；ステップ２では、ＩｇＧが、任意の機能的ＩｇＧ結合ドメインに結合される；ステップ３では、プロテインＡドメインに結合できない、アルカリ・ホスファターゼにコンジュゲート化された抗ｌｇＧ抗体が、既に表面にある任意のＩｇＧに結合される；ステップ４では、比色酵素反応が、固定化されたＩｇＧを有する表面を識別するために実施される。
【図５】表面上の機能的タンパク質の存在について試験するためのイムノアッセイの結果を示す図である。これらのデータは、ＯＭＰベータ・バレル足場アンカーに融合されたプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの固定化が、プラスチック表面でかなり大きな機能を保持していることを明らかに実証している。これ程の優位性は予測されなかったものであり、これは、親水性表面と比較して、疎水性表面上で特に顕著である。親水性表面上であっても、このＯＭＰ１８タンパク質は、ネイティブのプロテインＡよりもかなり高い機能性を示す。
【図６】開放格子（open lattice）３Ｄディスクへと３Ｄ印刷されたポリ乳酸ポリマーを示す図である。これらのディスクを、ＯＭＰ０（未改変のＯｍｐＡ）およびＯＭＰ５（ＦＬＡＧエピトープをディスプレイするように操作されたＯＭＰ０）で処理した。タンパク質処理後、全ての表面が、タンパク質結合を定量化するために、アルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート化抗ＦＬＡＧ抗体で試験できた。
【図７】アルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート化抗体およびＰＮＰＰによるＦＬＡＧエピトープの検出を示す図である。エラー・バーは、標準偏差を示す。本明細書で、ＯｍｐＡとはＯＭＰ０を指すことに留意のこと。類似のレベルの非特異的結合が、タンパク質なしおよびＯＭＰ０で処理した表面上で見られ、ＯＭＰ５処理した表面への抗体結合は、より有意に多かった。
【図８】Ａ．ＯＭＰ３６処理したポリマー繊維、Ｂ．タンパク質なし繊維上で増殖したＤＡＰＩ染色されたＰＣ１２細胞を示す図である。両方の画像は、１０×対物レンズを使用して捕捉した。
【図９】ＯＭＰ３６処理したプレート上での３Ｔ３線維芽細胞の結合および増殖を示す図である。
【図１０】培地中の可溶性ＦＧＦ２との、ポリスチレン上にコートされたＯＭＰ  ＦＧＦの比較を示す図である。
【図１１】ＯＭＰ５９およびＯＭＰ１７１のアラインメントを示す図である。ＯＭＰ５９上には存在するがＯＭＰ１７１からは欠失された細胞外ループおよび長いＣ末端は、ＯＭＰ１７１配列上に点線として示してある。アルファ・ヘリックス・スペーサー配列は、下線を付したＯＭＰ１７１中の変異した残基と共に、イタリックで示してある。ＯＭＰ１７１のＣ末端に独自の２つの余分な親水性残基は、太字で示され、システイン残基は、＊によって示してある。
【図１２】この実験で試験したタンパク質の構造を示す模式図である。
【図１３】ＯＭＰ０およびＯＭＰ１５４のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。伸長されたループ１は、ＯＭＰ１５４配列上にイタリックで示してある。ＯＭＰ１５４において欠失されたループおよびトランケートされたＣ末端尾部は、ＯＭＰ１５４配列上に点線として示してある。小さいモチーフのための挿入部位は、黒色の三角形によって示してある。ＯＭＰ０中に存在するシステインは、ＯＭＰ１５４中ではグリシンに変異されている（下線）。
【図１４】シグナルおよびＣ末端ドメインの除去、ならびにＮ末端ｈｉｓタグおよび１０位におけるシステインの付加によって改変されたＯＭＰ０「野生型」の核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。ＴＭ１は、残基４９〜８４であり；ＯＬ１は、残基８５〜１２６であり；ＴＭ２は、残基１２７〜１６５であり；ＴＭ３は、残基１７５〜２１３であり；ＯＬ２は、残基２１４〜２４９であり；ＴＭ４は、残基２５０〜２８５であり；ＴＭ５は、残基３０１〜３４５であり；ＯＬ３は、残基３４６〜３８７であり；ＴＭ６は、残基３８８〜４２７であり；ＴＭ７は、残基４３６〜４６５であり；ＯＬ４は、残基４６６〜５０７であり；ＴＭ８は、残基５０８〜５４０であり；システインは、残基２８〜３０である。ＴＭ−膜貫通型ストランド（膜を１回通過）、ＯＬ−外側ループ（細胞外ループ）。
【図１５】ＯＭＰ９ループ１循環式並べ替えの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１６】ＯＭＰ１３ループ３循環式並べ替えの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１７】ＯＭＰ１４ループ４循環式並べ替えの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１８】ＯＭＰ１４０の短いループ、アルファ・ヘリックス・スペーサー、Ｃ末端ｈｉｓタグ、システインなしの、核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】短いループおよびトランケートされたＣ末端を有するがループ１が伸長されたＯＭＰ０である、ＯＭＰ１５４の、核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】ＯＭＰ１７０の短いループ、Ｎ末端ｈｉｓタグ、ａａ１２２におけるシステインの、核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図２１】１７０と同様であるが、ｈｉｓタグ後にアルファ・ヘリックス・スペーサーを有する、ＯＭＰ１７１の核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図２２】異なる界面活性剤濃度におけるタンパク質の固定化を示す図である。ＯＭＰ１８タンパク質（最終０．１μＭで）を、９６ウェル・プレート中で、示された界面活性剤濃度で希釈した。１セットのウェルを６時間後に洗浄し、乾燥させたが、吸着を、第２のセットのウェルにおいて２４時間進行させた。洗浄した後、表面を、マウスＩｇＧで探索し、抗マウスＡＰコンジュゲートおよびＰＮＰＰ基質比色反応で検出した。最良の結果が、２４時間吸着させた、０．１２５×ＣＭＣのＤＭ中のＯＭＰ１８で得られた。
【図２３】基材上のタンパク質の飽和の程度を示す図である。ＯＭＰ１８濃度の影響。Ｏｍｐ１８を、０．１２５×ＣＭＣの界面活性剤中に異なる最終濃度に希釈し、２４時間吸着させた。マウスＩｇＧ結合アッセイを、本明細書に記載するように実施した。これらの結果は、表面が、全ての界面活性剤において１００ｎＭ（０．１μＭ）タンパク質でほぼ飽和されたことを実証しており、これを、吸着のための標準的な濃度として選択した。
【図２４】ＯＭＰ９およびＯＭＰ１８スポッティング実験のスキャンを示す図である。白色の紙栓を各ウェル中に配置して、ウェルの底のクリアなスキャンを得た。
【図２５】仮説上の６ストランド・バレル・タンパク質を示す図である。循環式並べ替えは、Ｎ末端およびＣ末端ならびにベータ・ストランドの再配置を生じる。
【図２６】ポリビーズ実験からのサンプルのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す図である。５μｌのヒト血清をレーン１にロードし、全ての他のレーンは、１ｍＬサンプルのうち２０μＬをロードした。ＨＳＡは、ヒト血清アルブミンである。ＶＨは、約５０ｋＤａのＩｇＧの重鎖であり、ＶＬは、約２５ｋＤａの軽鎖である。これらのサンプルは、１ｍＭ  ＤＴＴと共にＳＤＳローディング色素中にあり、９５℃で５分間加熱した。
【図２７】０％ＳＤＳウェルをＳＤＷで洗浄したことを示す図である。全ての洗浄は、３連で実施し、示されるデータは、３つのウェルの平均である。ＰＮＰＰ基質溶液との反応を１５分間実施させたので、３Ａ４０５単位よりも大きい非常に高い読み取りが存在する。
【図２８】Ｔｗｅｅｎ（商標）による洗浄後のＯＭＰ２０３およびＯＭＰ１８の検出を示す図である。Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用した。
【図２９】イムノアッセイ・シグナルに対する洗浄頻度の影響を示す図である。Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を使用した。ＰＮＰＰとのインキュベーションを、室温で５分間実施した。
【図３０】ｘ軸の下に示されるような種々の薬剤による洗浄後の、イムノアッセイからのデータを示す図である。
【図３１】ＯＭＰ２０３の検出からの吸光度読み取りを示す図である。
【図３２】種々のＥＣＭモチーフをディスプレイするＯＭＰタンパク質でコートされたポリスチレン上でのＭＧ６３細胞の培養の結果を示す図である。
【図３３】Ａｌｖｅｔｅｘの多孔性３Ｄ構造の電子顕微鏡写真を示す図である。
【図３４】ＯＭＰタンパク質で処理された３Ｄポリスチレン上のアルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート化ＩｇＧの検出の結果を示す図である。
【図３５】数日間の液浸１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００後のＰＬＡ上のＯＭＰタンパク質の抗体検出を示す図である。
【図３６】動的光散乱実験からのデータを示す図である。このプロットは、１時間の過程にわたる平均粒子サイズの変化を示す。
【図３７】事前希釈後のＯＭＰ２０３検出のイムノアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、物理的吸着による、タンパク質によるポリマー性表面の官能化のための異なるアプローチに基づく。本発明の方法は、物理吸着の利点をなおも保持しつつ、共有結合を必要とすることがない、即ち、タンパク質または基材のいずれかの化学的改変を必要とすることなく、チオ脂質およびチオアルカンなどの安定化化合物の存在を必要とすることがない、ポリマー性基材上への膜貫通タンパク質の固定化を可能にする。本発明の方法は、膜貫通タンパク質が、ディスプレイのために、タンパク質および／またはペプチドのためのアンカーとして使用されるのを可能にする。アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質は、ポリマー性表面に直接固定化されないので、機能および／または構造を保持し、ディスプレイのために配向される。従って、これらの膜貫通タンパク質は、ディスプレイのためのアンカーとしてのそれらの使用を可能にする様式で、基材に結合される。
【００５７】
本発明は、ｉ）非共有結合的に（例えば、ファン・デル・ワールス相互作用もしくはイオン性結合によって）；ｉｉ）基材結合性残基を含めるような、膜貫通タンパク質の基材結合ドメイン（例えば、足部）への改変（例えば、一次もしくは二次構造への改変）なしに；ｉｉｉ）それへの膜貫通タンパク質結合を可能にするための基材の官能化もしくは改変なしに；および／またはｉｖ）脂質などの安定化剤の非存在下で、膜貫通タンパク質がポリマー基材上に固定化されるのを可能にする。さらに、本発明の方法は、ｉｖ）好ましくは、ペプチドおよび／またはタンパク質が、ディスプレイのために機能的でありかつ配向されるように、膜貫通タンパク質が、ディスプレイのために、ペプチドおよび／またはタンパク質をアンカリングするのを可能にする。好ましくは、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質は、ディスプレイのために利用可能であるように、ポリマー性基材の表面から離れて方向付けられる。
【００５８】
膜貫通タンパク質の高度に疎水性の性質とは、高濃度の界面活性剤（１×ＣＭＣよりも高い、好ましくは２×ＣＭＣ）によって安定化されない限り、溶液中でそれらが沈殿することを意味する。これはまた、かかるタンパク質が表面に結合しないようにする。界面活性剤の存在は、表面への疎水性相互作用によるタンパク質の結合を防止し、固定化は、良くても非効率的であることが予測された。しかし、予測されなかったことに、低い界面活性剤濃度でのタンパク質の希釈は、アンカリングされたペプチドおよび／タンパク質の機能的で配向されたディスプレイを可能にする様式で、ポリマー性表面への膜貫通タンパク質の固定化を可能にしたことが見出された。本発明に従うポリマー性基材への膜貫通タンパク質の固定化は、先行技術の固定化方法とは別である。驚くべきことに、本発明者らは、タンパク質が膜貫通タンパク質によって表面にアンカリングされる場合、本発明の方法が、機能性における大きな増加を生じることを示した。本発明の大きな利点は、図２に示されるような、膜貫通タンパク質（ＯＭＰ１７０型足場）へのＨＩＶ抗原（Ｐ２４タンパク質）の融合によって例示される。
【００５９】
本明細書で、基材は、タンパク質が固定化され得る表面を含む。この基材は、その上での固定化のためにタンパク質を受容できる任意の適切な形態を取り得る。基材は、好ましくは固体である（即ち、ゲルでも液体でもない）。基材は、平滑な表面を含み得るか、または質感を持たせられ得る。この基材またはその表面は、メッシュ、繊維、ビーズ、編物もしくは織物、ウェルもしくはマイクロ・ウェル・プレート、組織培養フラスコまたは任意の他の表面であり得る。この基材は、少なくともその結合表面上に、ポリマー材料を含む。基材は、１または複数の異なるポリマーを含み得る。この基材は、好ましくは、むき出しのポリマー表面を含み、これは、このポリマー表面が、基材へのタンパク質の結合を補助するために他の材料（例えば、タンパク質、例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）でコートされていないこと、または結合を媒介するために、アミド化もしくはカルボキシル化などによって官能化されていないことを意味する。
【００６０】
ポリマー（ポリマー性基材）には、プラスチック、絹および他のタンパク質性繊維（例えば、毛髪、毛皮（ケラチン・フィラメント）、アクチン・フィラメント、コラーゲン・フィラメントなど）、ならびにグラフェンが含まれ得る。ポリマーは、プラスチックであり得る。プラスチックは、当業者に公知であり、これには、ポリビニル、ポリエチレン・テレフタレート（ＰＥＴ）および高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）および低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）などを含むポリエチレン（ＰＥ）、ポリアクリレート（アクリル）、耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）を含むポリスチレン（ＰＳ）、シリコーン、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリ乳酸コグリコール酸（polylactic coglycolic acid）（ＰＧＬＡ））、ポリウレタン、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアミド（ナイロン）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）、ポリエチレン／アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＰＥ／ＡＢＳ）、ベークライト、ゴム、ラテックス、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリカーボネート／アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＰＣ／ＡＢＳ）、ならびにポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）などを含むポリ塩化ビニルが含まれ得る。このポリマーは、天然または合成であり得る。基材が作製される有機ポリマーに加えて、このポリマーは、１０〜５０重量％の非有機または有機添加剤を含み得る。ポリマーは、生分解性であり得る。
【００６１】
ポリマー性基材は、疎水性、親水性もしくは両親媒性、またはそれらの２以上の組み合わせであり得る。一実施形態では、ポリマー性基材の少なくとも一部は、疎水性である。
【００６２】
本明細書では、膜とは、周囲の環境から細胞の内側を分離するように細胞を取り囲む細胞膜（形質膜または原形質膜としても公知）を指す。膜という用語は、本明細書では、内膜および外膜の両方を含む。用語「膜外」とは、膜を越えたところ、例えば、必要に応じて、細胞外空間、ペリプラズム空間または原形質空間を指す。ペリプラズム、原形質または細胞外に対する本明細書での言及は、膜中のタンパク質のネイティブの位置に関してなされる。細胞膜は、細胞膜を横切る連絡およびトランスポートを補助するためのタンパク質が包埋される、リン脂質二重層を含む。従って、本明細書に規定されるような膜を貫通するタンパク質は、このリン脂質二重層を貫通するタンパク質である。
【００６３】
異種ペプチドまたはタンパク質とは、ペプチドまたはタンパク質部分が、天然に、言及される生成物と天然には関連しないことを意味する。これは、外来であるとも言われ得る。従って、アンカリングされたペプチドもしくはタンパク質配列またはスペーサーは、膜貫通タンパク質にとって異種であり得、これは、これらのペプチドおよび／またはタンパク質が、膜貫通タンパク質中に天然に見出されないことを意味する。
【００６４】
操作されたタンパク質または核酸配列は、例えば、ネイティブの核酸またはタンパク質配列とは一次、二次または三次配列が異なる核酸配列またはタンパク質を提供するために、組換えタンパク質またはＤＮＡテクノロジーを使用して、人の手によって改変されたものである。タンパク質は、ネイティブ・タンパク質とは空間的に異なるように操作され得、これは、操作された二次または三次構造としても記載され得る。
【００６５】
本発明では、ペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合によって接続されるアミノ酸のストリングである。タンパク質は、ポリペプチドとも呼ばれ得る。アミノ酸は、天然、非天然またはそれらの組み合わせであり得る。これらは、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸であり得る。ペプチドおよびタンパク質は、化学的に合成され得る、または天然もしくは組換えの供給源から精製され得る。タンパク質は、二次構造を有し得、任意選択で三次構造を有し得る。他方で、ペプチドは、二次または三次構造を一般には欠く、短い直鎖状のアミノ酸鎖を記述する。ペプチドは、２以上のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質は、２０以上のアミノ酸残基を含み得る。
【００６６】
用語「核酸配列（複数可）」とは、本明細書で使用する場合、任意の長さであるが好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの、一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド・ポリマーを意味し、これには、非限定的な例として、遺伝子のコードおよび非コード配列、センスおよびアンチセンス配列相補体、エクソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリペプチド、単離および精製された天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマーおよび断片が含まれる。
【００６７】
本明細書では、膜貫通タンパク質とは、そのネイティブ形態で細胞膜中に存在し、膜を貫通するタンパク質を指す。膜貫通タンパク質は、本明細書で、膜内在性タンパク質または膜貫通型タンパク質とも呼ばれ得る。膜貫通タンパク質は、１または複数の膜貫通ストランドを含む本体によって空間的に分離される頭部および足部を含む。「貫通する」とは、タンパク質が、細胞膜の脂質二重層の少なくともほとんどを横切って延びることを意味する。従って、本発明の目的のために、「膜貫通」には、膜境界を越えて延びるタンパク質または膜境界を完全には横切って延びないタンパク質が含まれ得る。これらは、本明細書に規定されるように、膜を横切って進むことができるが膜を貫通しないタンパク質からは識別され得る。膜貫通タンパク質は、膜を一回貫通することを意味する１回通過タンパク質であり得るか、または膜を１もしくは複数回貫通することを意味する複数回通過タンパク質であり得る。膜貫通タンパク質は、１または複数のポリペプチドを含み得る。典型的には、そのネイティブ形態で、膜貫通タンパク質は、細胞膜を横切るトランスポート、イオン交換、細胞シグナル伝達または連絡において、リンカーまたは酵素として、および膜バイオジェネシスにおいて、役割を有し得る。
【００６８】
「通過」とは、タンパク質による膜の貫通、または膜の実質的な貫通を意味する。従って、１回通過タンパク質は、膜を１回貫通し、頭部または足部のいずれかにおいてＮ末端を有し、他方においてＣ末端を有する。従って、１回通過タンパク質は、膜外ループを有さない。２回通過タンパク質は、膜を２回貫通し、その結果、Ｎ末端およびＣ末端の両方が、頭部または足部から突出する。２回通過タンパク質は、単一のターンまたはループを含む。あるいは、膜貫通タンパク質は、Ｘストランド・タンパク質と呼ばれ得、これは、それらが、脂質二重層を貫通する規定された数のストランドを有することを意味している。本明細書では、脂質二重層を横切って貫通することを指す場合、用語「通過」および「ストランド」は、相互交換可能に使用され得る。
【００６９】
膜貫通タンパク質は、その性質上、本明細書に規定されるように膜中に存在し膜を貫通するサイズおよび形状のものであるように、二次構造を含む。従って、この用語は、二次構造を実質的に欠く、短いペプチド配列または直鎖状の配列は含まない。さらに、膜にアンカリングされ、膜の外側に主に存在するタンパク質は、本発明での使用に適切でないことが予測される。当業者は、用語「膜貫通」が、本発明から、膜境界を部分的に越えて延びる、または膜境界間の領域の大部分のみにわたって延びるタンパク質を排除するように、厳格に解釈されるべきではないことを理解している。
【００７０】
膜貫通タンパク質は、アルファ−ヘリックス構造を含み得る。かかる膜貫通タンパク質は、細菌細胞の内膜または真核生物の形質膜中に、時折は外膜中に、見出され得る。膜貫通タンパク質の大部分は、アルファ−ヘリックスである。あるいは、膜貫通タンパク質は、ベータ−バレル立体配置を含み得る。かかるタンパク質は、グラム陰性細菌の外膜、グラム陽性細菌の細胞壁、ならびにミトコンドリアおよび葉緑体の外膜中に見出される。複数回通過膜貫通タンパク質は、二次構造の単位（例えばベータ−ストランド）を繋ぐ連結部（例えば、ターン）を含み得る。かかる連結部は、細胞質ゾル、ペリプラズムまたは細胞外液などの水相に露出され得る。
【００７１】
本明細書に記載される膜貫通タンパク質は、水中で凝集する。
【００７２】
本発明の膜貫通タンパク質は、天然に存在し得る、または組換えであり得る。本発明の膜貫通タンパク質は、操作され得る。
【００７３】
本発明での使用に好ましい膜貫通タンパク質は、ベータ・バレル構造を含む膜貫通タンパク質である。ベータ・バレル・タンパク質は、中空、円柱状構造またはバレル形状を取る、大きいベータ−シートを含む。このベータ・バレル中では、ベータ・シートのベータ・ストランドは、逆並行様式で配置されるが、並行ストランドを含むいくつかのベータ−バレル・タンパク質が同定されている。疎水性残基は、バレルの外面に向かって配向され得、親水性残基は、内面に面する。ベータ・バレル中の隣接ベータ・ストランドは、配列中で隣接であり得（「アップおよびダウン・ベータ・バレルとも呼ばれる）または配列中で非隣接であり得る（グリーク・キー（Ｇｒｅｅｋ  ｋｅｙ）またはグリーク−キー（Ｇｒｅｅｋ−ｋｅｙ）バレルとも呼ばれる）。ベータ・バレル・タンパク質は、任意の数のストランド、例えば、８〜２２のベータ・ストランドを含み得る。ベータ・バレル・タンパク質は、偶数のベータ・ストランドまたは奇数のベータ・ストランドを含み得る。
【００７４】
膜貫通タンパク質の隣接ストランドまたはヘリックス、例えばベータ・バレルは、各々、ターンまたはループによって連結される。ターンは、アミノ酸鎖が方向を変化させる、タンパク質中の二次構造のエレメントである。ターンには、タイト・ターン（tight turn）（α、β、γ、δおよびπ−ターンを含む）、マルチプル・ターン（multiple turn）、ヘアピン・ターンが含まれる。ターンは、典型的には、ターンの残基間の水素結合の性質によって規定される。ターン、特にβ−ターンは、典型的には、膜貫通タンパク質のペリプラズム終端に見出される。β−ターンは、β−ベンドまたはタイト・ターンとも呼ばれ得る。β−ターンは、ポリペプチド鎖が約１８０°折り畳まったタンパク質の領域である。ターンは、β−ターンの２〜６アミノ酸残基、より好ましくは４アミノ酸を含み得る。β−ターンは、プロリンおよびグリシン残基を含み得る。ベータ−バレル・タンパク質中の各ターンは、例えば、Ｔ１、Ｔ２などと番号付けされ得る。典型的には、ターンは、膜外ではない。膜貫通タンパク質のループは、典型的にはターンよりも長く、膜から膜外空間中へと延び得る。ループは、高い配列可変性を示し、一般には二次構造を欠く。ループは、典型的には性質が疎水性であり得る膜貫通タンパク質の膜貫通部分（例えば、ベータ−ストランドまたはバレル構造）と比較して、性質が親水性であり得る。ループは、Ｌ１、Ｌ２などと示され得る。
【００７５】
膜貫通タンパク質は、典型的には、膜の一方の側にターンを含み、膜の他方の側にループを含む。主にループを含むタンパク質の終端は、本明細書でタンパク質の頭部と呼ばれる。主にターンを含むタンパク質の終端は、本明細書でタンパク質の足部と呼ばれる。外膜タンパク質（即ち、グラム陰性細菌、葉緑体およびミトコンドリアのもの）では、これらのループは、一般に、細胞外空間に面するタンパク質の一方の側で全て見出される。本明細書では、これは、外膜タンパク質の頭部である。ターンおよび末端を含む終端は、一般に、ペリプラズム空間に面し、本明細書でタンパク質の足部と呼ばれる。１または複数のアルファ・ヘリックス・ストランドが、膜を貫通し、タンパク質の本体を形成する。内膜タンパク質または真核生物膜タンパク質では、ループは、タンパク質の、ペリプラズムまたは原形質に面する終端上に見出され得る。従って、頭部は、膜外ドメイン、例えばループの大部分を含む終端として、本明細書で規定される。足部は、タンパク質のもう一方の終端よりも少ない膜外ドメインを有し、ターンを主に含む終端である。
【００７６】
Ｎ末端およびＣ末端は、タンパク質の終端であり、Ｃ末端は、遊離カルボキシル（ＣＯＯＨ）を含み、Ｎ末端は、遊離アミノ（ＮＨ２）基を含む。本明細書では、末端に対する言及は、終端ＮもしくはＣ残基、またはＮ末端もしくはＣ末端尾部、あるいはそれらの一部に対する言及を含む。膜貫通タンパク質について、尾部は、膜から突出するＮ末端またはＣ末端に隣接する部分である、即ち、尾部は、膜貫通ストランドとＮ末端またはＣ末端残基との間の部分である。尾部は、２以上のアミノ酸残基、例えば、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれ超のアミノ酸残基を含み得る。ＯｍｐＡタンパク質の尾部は、残基１７〜４８（Ｎ末端）および１８０〜２０７（Ｃ末端）として図１４に示してある。好ましい一実施形態では、タンパク質の操作は、Ｎ末端および／またはＣ末端尾部を含むようにタンパク質のループを並べ替えるステップを含み、好ましくは、この尾部は、アミノ酸１７〜４８（Ｎ末端）および／もしくは１８０〜２０７の配列、またはそれらの一部を含む。
【００７７】
この膜貫通タンパク質は、膜内在性タンパク質、好ましくは、ベータ−バレル・タンパク質、好ましくは、ポリンであり得る。この膜貫通タンパク質は、イオン・チャネル、リガンドに対する受容体、酵素などであり得る。
【００７８】
ベータ・バレル・タンパク質には、細胞膜を横切って拡散することができないイオンおよび他の低分子のためのトランスポーターとして天然に機能するポリンが含まれる。ループは、ベータ・ストランド間に提供される。ポリンには、外膜のポリンである、グラム陰性細菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）が含まれる。これらには、８ストランドβ−バレル、ＯｍｐＩＩとしても公知のＯｍｐＡ、および１６ストランドβ−バレルのホモトリマーであるＯｍｐＦ（ポリンｏｍｐＦ外膜タンパク質１Ａとも呼ばれる）が含まれる。他のベータ−バレル・タンパク質には、ミトコンドリアおよび葉緑体中に存在するプレタンパク質トランスロカーゼ、ならびにリポカリンが含まれる。
【００７９】
本発明での使用のための膜貫通タンパク質は、真核生物または原核生物のものであり得る。これは、細菌のものであり得る。これは、植物由来または哺乳動物のものであり得る。
【００８０】
本発明における使用のための膜貫通タンパク質は、当業者に入手可能である。本発明における使用のための公知のベータ・バレル・タンパク質の例には、以下が含まれる：（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ  ２０１１  Ａｕｇ  ２１（４）５２３−５３１）：
８ストランド・タンパク質：Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓのＡｉｌ（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＱＲＡ、３ＱＲＣ）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのＮｓｐＡ（１Ｐ４Τ）；Ｅ．ｃｏｌｉのＯｍｐＡ（１ＱＪＰ、ＩＢＸＷ、１Ｇ９０、２ＧＥ４、２ＪＭＭ）；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＯｍｐＡ（２Ｋ０Ｌ）；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａのＯｍｐＡ（３ＬＤＴ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＯｍｐＷ（２Ｆ１Ｖ、２Ｆ１Ｔ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＯｍｐＸ（１ＱＪ８、１ＯＲＭ、１Ｑ９Ｆ、１Ｑ９Ｇ、１ＱＪ９）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＯｐｒＧ（２Ｘ２７）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＰａｇＰ（１ＭＭ４、１ＭＭ５、３ＧＰ６、１ＴＨＱ）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰａｇＬ（２ＥＲＶ）；Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓのＴｔｏＡ（３ＤＺＭ）；
１０ストランド・タンパク質：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＯｍｐＴ（１Ｉ７８）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのＯｐｃＡ（１Ｋ２４、２ＶＤＦ）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓのＰｌａ（２Ｘ５５、２Ｘ５６）；
１２ストランド・タンパク質：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＥｓｐＰ（２ＱＯＭ）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＥｓｔＡ（３ＫＶＮ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＨｂｐ（３ＡＥＨ）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａのＨｉａ（２ＧＲ８）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＬｐｘＲ（３ＦＩＤ）；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉのＩｃｓＡ（３ＭＬ３）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＮａｌＰ（１ＵＹＮ、１ＵＹＯ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＮａｎＣ（２ＷＪＱ、２ＷＪＲ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＯＭＰＬＡ（１ＱＤ５、１ＱＤ６、１ＦＷ２、１ＦＷ３、１ＩＬＤ、１ＩＬＺ、１ＩＭＯ）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＯｐｒＭ（１ＷＰ１）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＴｏｌＣ（１ＥＫ９）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＴｓｘ（１ＴＬＷ、１ＴＬＹ、１ＴＬＺ）；Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａのＶｃｅＣ（１ＹＣ９）；
１４ストランド・タンパク質：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのα−ＨＬ（７ＡＨＬ、３Ｍ２Ｌ、３Ｍ３Ｒ、３Ｍ４Ｄ、３Ｍ４Ｅ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＦａｄＬ（１Ｔ１６、３ＤＷＮ、２Ｒ４Ｌ、２Ｒ４Ｎ、２Ｒ４Ｏ、２Ｒ４Ｐ、２Ｒ８８、２Ｒ８９、２Ｒ８Ａ、１Ｔ１Ｌ）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＦａｄＬ（３ＤＷＯ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＯｍｐＧ（２Ｆ１Ｃ、２ＩＷＶ、２ＩＷＷ、２ＪＱＹ、２ＷＶＰ、２Ｘ９Ｋ）；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉのＴｂｕＸ（３ＢＲＹ）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのＴｏｄＸ（３ＢＳ０、３ＢＲＺ）；
１６ストランド・タンパク質：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＦｈａＣ（２ＱＤＺ、２ＮＪＴ）；ＭｓｐＡ（１ＵＵＮ）；Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのＯｍｐ３２（１Ｅ５４）；Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのＯｍｐ３２（２ＦＧＱ、２ＦＧＲ）；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＯｍｐＫ３６（１ＯＳＭ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＯｍｐＣ（２Ｊ１Ｎ、２Ｊ４Ｕ、２ＸＥ１、２ＸＥ２、２ＸＥ３、２ＸＥ５、２ＸＧ６）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＯｍｐＦ（２ＺＦＧ、１ＢＴ９、３ＦＹＸ、１ＧＦＭ、１ＧＦＮ、１ＧＦＯ、１ＧＦＰ、１ＧＦＱ、３ＨＷ９、３ＨＷＢ、１ＨＸＴ、１ＨＸＵ、１ＨＸＸ、３Ｋ１９、３Ｋ１Ｂ、１ＭＰＦ、３Ｏ０Ｅ、２ＯＭＦ、２ＯＰＦ）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＯｐｒＰ（２Ｏ４Ｖ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＰｈｏＥ（１ＰＨＯ）；Ｇｄｐａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（２ＰＯＲ）；Ｇｄｐａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｌａｓｔｉｃａ（１Ｈ６Ｓ、１ＰＲＮ、２ＰＲＮ、３ＰＲＮ、５ＰＲＮ、６ＰＲＮ、７ＰＲＮ、８ＰＲＮ）；ＰｏｒＢ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（３Ａ２Ｒ、３Ａ２Ｓ、３Ａ２Ｔ、３Ａ２Ｕ）；
１８ストランド・タンパク質：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｐｆ−５のＢｅｎＦ（３ＪＴＹ）；ＬａｍＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（１ＭＰＭ、１ＭＰＮ、１ＭＰＯ、１ＭＰＱ、１ＡＦ６、１ＭＡＬ）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＬａｍＢ（２ＭＰＲ）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＯｐｄＫ（２ＱＴＫ）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＯｐｒＤ（２ＯＤＪ）；またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＳｃｒＹ（１Ａ０Ｔ、１Ａ０Ｓ、１ＯＨ２）；
１９ストランド・タンパク質：Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓのＶＤＡＣ１（３ＥＭＮ）；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＶＤＡＣ１（２Ｋ４Ｔ、２ＪＫ４）
２２ストランド・タンパク質：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＢｔｕＢ（１ＮＱＥ、１ＮＱＦ、２ＧＵＦ、２ＧＳＫ、１ＮＱＧ、１ＮＱＨ、１ＵＪＷ、２ＹＳＵ、３Ｍ８Ｂ、３Ｍ８Ｄ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＣｉｒ（２ＨＤＩ、２ＨＤＦ）；ｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＦａｕＡ（３ＥＦＭ）；ＦｅｃＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（１ＫＭＯ、１ＰＮＺ、１ＫＭＰ、１ＰＯ０、１ＰＯ３）；ＦｅｐＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（１ＦＥＰ）；ＦｈｕＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（１ＢＹ３、１ＢＹ５、１ＦＣＰ、２ＦＣＰ、１ＦＩ１、２ＧＲＸ、１ＱＦＦ、１ＱＦＧ、１ＱＪＱ、１ＱＫＣ）；ＦｐｔＡ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（１ＸＫＷ）；ＦｐｖＡ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（２Ｗ７５、２Ｏ５Ｐ、２Ｗ１６、２Ｗ６Ｔ、２Ｗ６Ｕ、２ＩＡＨ、２Ｗ７６、２Ｗ７７、２Ｗ７８、１ＸＫＨ）；ＨａｓＲ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（３ＣＳＬ、３ＣＳＮ、３ＤＤＲ）；ＳｈｕＡ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、トランスポーター（３ＦＨＨ）；および
２４ストランド・タンパク質：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＰａｐＣ（３ＦＩＰ）
【００８１】
ａＧｄｐ−一般拡散ポリン。ＰＤＢ  ＩＤは、括弧内に提供される。列挙されたＰＤＢ  ＩＤについてのさらなる情報は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）において見出され得る。
【００８２】
本明細書で、用語「ＯＭＰＸＸ」または「ＯＲＬＡＸＸ」（ここで、Ｘは数値である）は、本発明での使用のための好ましい足場に関して使用されている。用語法「ＯＭＰ」は、限定的ではなく、本明細書に規定されるような任意の適切な膜貫通タンパク質が、本発明を達成するために、任意の特定の「ＯＭＰＸＸ」または「ＯＲＬＡＸＸ」足場に関して記載されるように改変され得る。本発明での使用のための好ましい膜貫通タンパク質は、本明細書に記載されるＥ．ｃｏｌｉのＯＭＰ、好ましくは図１４のＯＭＰ０である。さらなる好ましい膜貫通タンパク質は、表７に規定されるＯＭＰＸＸのいずれか１つである。本発明は、各々「ＯＭＰＸＸ」に具体的に関して記載されるように改変された膜貫通タンパク質をその範囲内に含み、本明細書に記載されるようなかかるタンパク質を含む方法および製品を使用する。
【００８３】
適切な膜貫通タンパク質は、二次構造の分析によって同定され得る。タンパク質の二次構造は、３次元構造の形成を生じる残基間水素結合によって規定される。二次構造には、残基および生じた結合の数および型に依存して、α−ヘリックス、β−シートおよび種々のターンが含まれる。アミノ酸は、二次構造を形成するそれらの能力が異なっており、ペプチドまたはタンパク質の二次構造をアミノ酸配列から予測することを可能にする。任意の適切な予測方法が、一次構造から膜貫通タンパク質、特にベータ−バレル・タンパク質を同定するために、本発明において使用され得る（例えば以下を参照のこと：Ｂａｒｔｏｎ（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ５  ｐ３７２−３７６；Ｊｏｎｅｓ（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ２９２  ｐ１９５−２０２；ＰｉｒｏｖａｎｏおよびＨｅｒｒｉｎｇａ（２０１０）Ｃｈａｐｔｅｒ  １９：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  編者Ｏ  ＣａｒｕｇｏおよびＦ  Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ＤＯＩ  １０．１００７／９７８−１−６０３２７−２４１−４）。かかる方法はまた、改変されたまたは合成のタンパク質配列のフォールディングを予測するため、従って二次構造を予測するために、膜貫通タンパク質の改変の間に本発明において使用され得る。
【００８４】
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、それより上でミセルが自発的に形成される界面活性剤の濃度として規定される。ＣＭＣを上回る濃度では、界面活性剤は、親油性タンパク質と複合体を形成する。ＣＭＣより下では、界面活性剤は、膜タンパク質を可溶化することなく、単に膜中に分配される。膜貫通タンパク質のβ−バレル・コアの高度に疎水性の性質とは、高濃度の界面活性剤（１×ＣＭＣよりも高い）によって安定化されない限り、溶液中でそれらが沈殿することを意味する。これはまた、かかるタンパク質が表面に結合しないようにする。
【００８５】
ＣＭＣは、界面活性剤に依存して変動し、例えば、ＳＤＳは、７〜１０ｍＭのＣＭＣを有し；ドデシルマルトシドは、０．１５ｍＭのＣＭＣを有し；オクチルグルコシドは、２０〜２５ｍＭのＣＭＣを有する。従って、ＳＤＳについての７〜１０ｍＭの界面活性剤濃度は、１×ＣＭＣと表される。０．３ｍＭのドデシルマルトシドの界面活性剤濃度は、２×ＣＭＣと表される、など。
【００８６】
希釈係数は、サンプル中のタンパク質および界面活性剤の出発濃度、ならびに希釈後の必要とされる作業濃度に依存し、１×ＣＭＣ以下のＣＭＣ、および基材に結合するのに十分な時間にわたってその濃度の界面活性剤中でタンパク質が溶解度を保持するタンパク質濃度を提供するために、公知の希釈技術を使用することに基づいて、当業者によって計算され得る。タンパク質が可溶性であるか否かは、利用可能な溶解度アッセイを使用して、当業者によって容易に決定され得る。タンパク質が不溶性である場合、このタンパク質は沈殿し、濁った溶液を形成する。濁度は、例えば、４００ｎｍにおける吸光度を測定することによって測定され得る。あるいは、単純な視覚的評価が、濁った溶液を検出するために使用され得、これは、もはや可溶性ではないタンパク質を示す。
【００８７】
本発明の方法は、ｉ）のタンパク質サンプルの界面活性剤濃度を、１×ＣＭＣ以下に低減させるステップを含む。好ましくは、このＣＭＣは、０より上で維持される。従って、ＣＭＣは、０．０５×ＣＭＣ〜１×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜１×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜１×ＣＭＣ、または０．０５×ＣＭＣ〜０．９×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜０．９×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜０．９×ＣＭＣ、または０．０５×ＣＭＣ〜０．８×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜０．８×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜０．８×ＣＭＣ、または０．０５×ＣＭＣ〜０．７×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜０．７×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜０．７×ＣＭＣ、または０．０５×ＣＭＣ〜０．６×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜０．６×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜０．６×ＣＭＣ、または０．０５×ＣＭＣ〜０．５×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜０．５×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜０．５×ＣＭＣ、または０．０５×ＣＭＣ〜０．４×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜０．４×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜０．４×ＣＭＣ、または０．０５×ＣＭＣ〜０．３×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜０．３×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜０．３×ＣＭＣ、または０．０５×ＣＭＣ〜０．２×ＣＭＣ、０．０７５×ＣＭＣ〜０．２×ＣＭＣ、好ましくは０．１×ＣＭＣ〜０．２×ＣＭＣに低減され得る。
【００８８】
好ましくは、これらの値は、タンパク質サンプルをポリマー性基材と共にインキュベートした後のインキュベーション混合物の界面活性剤濃度であるが、界面活性剤濃度における低減は、インキュベーション前に実施され得ることが想定される。これらのパラメーター内で、タンパク質は、溶液中で粒状物へと沈殿することが防止されるが、その代わり、ポリマー性基材に結合することが助長される。
【００８９】
任意の特定の界面活性剤についての適切な希釈係数は、ディスプレイのためのペプチドおよび／またはタンパク質にアンカリングされた膜貫通タンパク質による基材の飽和の程度、ならびに基材と共にインキュベートした場合のタンパク質の溶解度を試験することによって、当業者によって容易に決定され得る。適切な希釈係数は、基材の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または少なくとも９５％飽和を提供し、タンパク質は、少なくとも６時間、好ましくは少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１０時間、最も好ましくは一晩（即ち、１２〜２４時間）、溶液中に残存する。飽和は、以下に記載されるような結合アッセイを使用して決定され得る。
【００９０】
任意の適切な界面活性剤が使用され得る。好ましい界面活性剤は、タンパク質を安定化する界面活性剤であり、溶液からタンパク質が沈殿するのを防止するが、タンパク質が基材と相互作用しそれと結合するのを可能にする。最も好ましくは、この界面活性剤は、ｎ−オクチルグルコシド、ドデシルマルトシドまたはＴｈｅｓｉｔからなる群より選択され得る。界面活性剤は、単独で、または好ましくは上に規定したものから選択される１もしくは複数の他の界面活性剤と組み合わせて、使用され得る。好ましくは、同じ界面活性剤が、タンパク質サンプルを用意するためにタンパク質に両方添加するために使用され、界面活性剤は、希釈剤と組み合わせて希釈において使用される。
【００９１】
適切な緩衝液には、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸塩緩衝液、および当業者によって適切な緩衝液として認識される任意の他の緩衝液が含まれる。
【００９２】
このタンパク質は、溶液中に、または乾燥生成物として提供され得る。好ましくは、このタンパク質は、界面活性剤が添加される緩衝液中で提供される。タンパク質が乾燥生成物として提供される場合、この方法は、適切な緩衝液、例えば、ＲＯＧ−８（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＯＧ）中にタンパク質を溶解させるさらなるステップを含み得る。
【００９３】
本発明の方法では、タンパク質サンプルの界面活性剤濃度は、基材とのインキュベーション前に低減され得る。さらに、またはあるいは、界面活性剤濃度は、サンプルおよび基材のインキュベーション後に低減され得る。一実施形態では、希釈剤は、サンプルとのインキュベーションの前に基材に添加され得、これは、インキュベーションの際のサンプルの界面活性剤濃度を効率的に低減させる。従って、ステップｉｉ）は、基材をタンパク質と共にインキュベートする前に、ポリマー性基材に希釈剤を添加するステップを含み得る。
【００９４】
従って、この方法は、
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）タンパク質サンプルの添加の際に１×以下のＣＭＣが得られるように、ポリマー性基材に希釈剤を添加するステップ；
ｉｖ）ｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ
を含み得、このタンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化される。
【００９５】
この方法は、
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）基材と共にインキュベートしたときにＣＭＣが１×以下になるように、タンパク質サンプルの界面活性剤濃度を低減させるステップ；
ｉｖ）ｉｉｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ
を含み得、このタンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化される。
【００９６】
このタンパク質は、任意の適切な様式で基材に添加され得、例えば、パターン化され得る（例えば、スポットされ得る）。
【００９７】
このインキュベーションは、好ましくは、室温以下（しかし０℃よりも上）で実施される。好ましくは、このインキュベーションは、少なくとも６時間、好ましくは少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１０時間、最も好ましくは１２〜２４時間にわたって維持される。２４時間は、最適なインキュベーション期間である。一実施形態では、この方法は、基材を洗浄するステップをさらに含む。この基材は、好ましくは無菌の、任意の適切な緩衝液、水、または界面活性剤もしくはエタノールを含む溶液、例えば、ＴＢＳ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥ、７０％エタノール、Ｔｗｅｅｎ、または脱イオン水で洗浄され得る。洗浄するステップは、基材から任意の未結合の材料および任意の残留界面活性剤を除去するという目的を有する。この基材は、乾燥され得る。これは、さらに無菌化され得る。これは、販売のために包装され得る。
【００９８】
基材への膜貫通タンパク質の結合は、例えば結合アッセイを含む、当該分野の任意の適切な方法を使用して決定され得る。典型的な結合アッセイでは、この基材は、膜貫通タンパク質の結合部位に結合することができる、またはそれによってアンカリングされたペプチドもしくはタンパク質に結合することができるリガンド（例えば、ＩｇＧ）と共にインキュベートされ得る。任意の未結合のリガンドは、洗浄するステップによって除去される。次いで、結合したリガンドは、例えば、測定され得るシグナルを含む場合には直接的に、または例えば、リガンドに特異的な第２の結合メンバーを使用することによって間接的に、検出され得る。この第２の結合メンバーは、酵素または触媒または他のマーカー、例えば蛍光タグにコンジュゲート化された抗体であり得、検出は、基質とのインキュベーションおよび生成されたシグナルの量を測定することによって実施され得る。任意の適切なシグナルが使用され得、その多くの例が、当業者に公知であり利用可能である。好ましいシグナルは、電磁スペクトル、例えば、発色団およびフルオロフォア、ならびに酵素基質系、例えば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ／ＴＭＢにおいて検出され得るものである。他は、当業者に公知である。後者の場合、リガンドに特異的な結合メンバーは、シグナル基質を触媒して比色出力を生成する酵素に結合され得る。好ましいシグナルは、増幅系を使用するものである。基質に対して作用して発色団を生成し得る酵素標識、例えば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、ベータ・ガラクトシダーゼが、最も好ましい。適切な基質には、ＴＭＢ  ＡＢＴＳ、ＯＰＤ（ＨＲＰ用）、ｐＮＰＰ（ＡＰ用）およびＯＮＰＧ（ベータ・ガラクトシダーゼ用）が含まれる。
【００９９】
生成されたシグナルは、基材への膜結合タンパク質の結合の程度（即ち、基材の飽和の程度）の指標、ならびにそれにアンカリングされた任意のペプチドまたはタンパク質が変性していないかどうか、およびリガンド結合に利用可能かどうかの指標を提供する。飽和されるとは、最大量のタンパク質が基材に結合されていること、即ち、基材が完全に占有されていることを意味する。
【０１００】
従って、本発明の方法は、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意し、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている。
【０１０１】
「固定化された」とは、タンパク質が、基材に結合され、水、および／または界面活性剤（例えば０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０）を含む緩衝液で洗浄した後に結合したままであることを意味する。
【０１０２】
この膜貫通タンパク質は、基材上に均一に、または所定のパターン、例えばスポッティングで、提供され得る。本発明は、基材への本発明の膜貫通タンパク質のパターンでの適用を含む、表面をパターン化する方法もまた含み得る。好ましくは、このパターンは、予め決定される。表面をパターン化する適切な方法には、リトグラフィー、インクジェット、液滴噴射（droplet injection）および当業者に公知の他の方法が含まれる。
【０１０３】
物理吸着は、非共有結合、例えば、ファン・デル・ワールス相互作用、疎水性相互作用、電荷相互作用による、表面への化合物の物理的吸着である。物理吸着は、タンパク質と基材との間の化学反応ではなく、非共有結合である。
【０１０４】
本発明者らは、予想外なことには、膜貫通タンパク質が、物理吸着によってポリマー性基材に結合され得、アンカリングされたペプチドまたはタンパク質をディスプレイすることが可能であり得ることを示した。従って、本発明の方法は、膜貫通タンパク質が、ポリマー性基材上に固定化されること、ならびにディスプレイのために機能的でありかつ配向され得るペプチドおよび／またはタンパク質をディスプレイするためのアンカーとして機能することを可能にする。基材への膜貫通タンパク質のこの結合、ならびに機能的な配向された様式でディスプレイされるペプチドおよび／またはタンパク質のためのアンカーとしてのその有効性とは、ポリマー性基材が、結合アッセイならびに他の方法論において有用性を有することを意味する。従って、本発明は、その上に固定化された膜貫通タンパク質を有するポリマー性基材を初めて提供し、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている。
【０１０５】
アンカーとは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部のループ中に異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を、ならびに／またはタンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得ることを意味する。従って、膜貫通タンパク質は、膜貫通タンパク質の頭部においてディスプレイされるペプチドもしくはタンパク質に結合する、またはそれに融合される。従って、この膜貫通タンパク質ならびにペプチドおよび／またはタンパク質は、単一のポリペプチド鎖として発現され得る。
【０１０６】
アンカリングするように改変されるとは、基材上に固定化された場合に、それがペプチドまたはタンパク質をディスプレイするのを可能にするために、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を、ならびに／またはタンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作されることを意味する。従って、ペプチドまたはタンパク質は、タンパク質の頭部においてディスプレイされ得る。この改変は、アンカリングされたタンパク質またはペプチドが、基材の表面から空間的に隔てられることを可能にし、好ましくは、膜貫通タンパク質または表面によって立体的に障害されないようにする。従って、アンカリングされたペプチドまたはタンパク質は、機能的であり得、結合または他の相互作用のために利用可能であり得る。タンパク質の頭部においてＮ末端および／またはＣ末端を提供するための操作は、循環式並べ替えによって達成され得る。この循環式並べ替えとは、タンパク質の全体的三次構造に対する実質的な影響なしに、タンパク質の特徴の順序が変更されることを意味する。これは、当該分野で利用可能な技術を使用する、膜貫通タンパク質の一次構造の操作によって達成され得る。従って、膜貫通タンパク質は、Ｎ末端および／またはＣ末端が足部ではなくタンパク質の頭部から延びるように操作され得る。末端は、ループの代わりに、またはループに隣接して、ループ内から、提供されるように操作され得る。一実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端は、ループから延びるように操作される。これは、Ｎ末端および／またはＣ末端を含むようにループを操作することによって達成され得る。好ましくは、Ｎ末端およびＣ末端の両方が並べ替えられる場合、これらは、同じループ中に提供されるように操作され得る。従って、ループの一部は、Ｎ末端を形成し得、ループの一部は、Ｃ末端を形成し得る。かかる状況では、このループは２つに分かれ、ループ構造ではなく２つのドメインを形成する。従って、ループの全てまたは一部は、Ｎ末端および／またはＣ末端によって置き換えられ得る。タンパク質がＯＭＰである場合、このループは、ループ１、３または４であり得る。基材上に固定化された場合に、操作された末端は、基材の表面から離れて延び、タンパク質またはペプチドに、有効なディスプレイ部位を提供する。スペーサーもまた、それにアンカリングされたペプチドまたはタンパク質のディスプレイをさらに補助するために、一方または両方の末端の終端上に提供され得る。
【０１０７】
一実施形態では、ループまたはＮ末端もしくはＣ末端は、それに連結されたペプチドまたはタンパク質を基材から空間的に遠ざけるように機能するスペーサー配列を含み得る。
【０１０８】
この異種ペプチドおよび／またはタンパク質は、膜貫通タンパク質によってディスプレイのためにアンカリングされる。これは、基材上に固定化された場合に、ペプチドおよび／またはタンパク質が基材の結合表面から空間的に遠ざけられ、従って、目的の成分によるアクセス（例えば、結合反応における）のために利用可能であるような位置において、膜貫通タンパク質中に提供されることを意味する。好ましくは、ディスプレイのためにアンカリングされるとは、目的の成分とのその相互作用を防止し得る膜貫通タンパク質との立体障害から、空間的に遠ざけられることを意味する。異種ペプチドまたはタンパク質のディスプレイは、本明細書に記載されるような検出アッセイを使用して確認され得る。
【０１０９】
アンカリングされたタンパク質は、好ましくは、任意の二次構造を保持し、従って、それが機能を保持することを可能にする。「その二次構造を保持する」とは、実質的に全てのアンカリングされたタンパク質（即ち、結合したタンパク質の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）が、そのネイティブの二次構造を有することを意味する。タンパク質のネイティブの二次構造は、非変性条件下でフォールディングされた構造である。タンパク質のいくらかの変性が、結合の際に生じ得ることが想定されるが、タンパク質の全体的二次構造は、ネイティブの二次構造と実質的に同じであり、いずれの変性も、タンパク質の全体的フォールディングまたはリガンドに結合するその能力に対する顕著な影響を有さない。二次構造は、本明細書でコンフォメーションとも呼ばれ得る。
【０１１０】
異種ペプチドが膜貫通タンパク質のループ中に挿入される場合、好ましくは、それは、膜貫通ストランド間で、長いループ中に挿入される。これは、好ましくは、ループの中央に向かって提供される。このループは、ペプチド配列の挿入の前にトランケートされ得る。このループは、例えばスペーサーによって、ペプチド配列の挿入に加えて延長され得る。あるいは、ペプチド配列が、ネイティブのループ中に導入され得、その結果、ループは、そのネイティブ形態と比較して延長される。改変されたループは、ネイティブのループよりも長くても短くてもよい。ループ中に挿入される場合、異種ペプチドは、任意の適切な長さであり得るが、好ましくは、膜貫通タンパク質の二次構造を妨害し得る二次構造を取るには短すぎる。例えば、適切な長さは、３〜７０アミノ酸であり得る。異種ペプチド配列は、Ｎ末端、Ｃ末端または両方において提供され得る。異種配列（ペプチドまたはタンパク質）は、末端の終端に、または末端を形成する配列内に、独立して提供され得る。好ましくは、これは、Ｎ末端、好ましくは、Ｎ末端の終端において提供される。末端は、ペプチドまたはタンパク質にアンカー（ディスプレイ）部位を提供するために、本明細書に記載されるように操作され得る。
【０１１１】
機能的とは、ペプチドおよび／またはタンパク質が、そのネイティブの機能、例えば、結合機能、受容体機能、シグナル伝達機能または酵素機能のうち１または複数を保持することを意味する。
【０１１２】
この膜貫通タンパク質は、頭部および足部を含み、この頭部および足部は互いから、１または複数の膜貫通ストランドを含む本体によって遠ざけられる。「アンカー」とは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部のループ中に異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を、ならびに／またはタンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得ることを意味する。「アンカリングするように改変される」とは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を、ならびに／またはタンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作されることを意味する。タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。
【０１１３】
従って、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得る；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得る；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作され得る；および／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作され得る。
【０１１４】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。
【０１１５】
異種ペプチドは、任意のペプチド配列、好ましくは、機能的ペプチド配列であり得る。ペプチド配列は、増殖因子、タンパク質−タンパク質相互作用または結合に関与するタンパク質またはペプチド、抗体結合モチーフ、エピトープ、抗原、アレルゲン、酵素、触媒、ＤＮＡおよび／または炭水化物との相互作用または結合に関与するタンパク質またはペプチド；低分子（薬物など）との相互作用または結合、細胞結合または細胞シグナル伝達に関与するタンパク質またはペプチド；細胞外マトリックス・タンパク質；ならびに任意の目的のために、ポリマー性表面上でのディスプレイに望まれ得る実際に任意の他のタンパク質またはペプチドからなり得る、これらから誘導され得る、またはこれらとして機能し得る。本発明での使用のためのペプチドおよびタンパク質の具体的な例には、タンパク質の結合部位、例えば、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）；増殖因子、例えば、ＦＧＦ１またはＦＧＦ２、インターロイキン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、白血球抑制因子（ＬＩＦ）、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）；例えば、インテグリン、コラーゲン、ラミニンまたはフィブロネクチンなどの膜外マトリックス・タンパク質の細胞結合モチーフ（例えば、表３に記載される）；細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質モチーフ、例えば、ＲＧＤＳ、抗原（例えば、ＨＩＶ（例えば）ｐ２４抗原、ＢＭＰ−２、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシン−Ｃ）、ならびに当業者に公知の実際に任意の他のペプチドおよびタンパク質が含まれる。このペプチド配列は、２以上のかかるペプチド配列の任意の組み合わせを含み得る。
【０１１６】
好ましくは、このペプチドまたはタンパク質は、増殖因子であり得る。このペプチドまたはタンパク質は、任意の増殖因子のものであり得る。好ましい増殖因子は、ＦＧＦ１またはＦＧＦ２である。一実施形態では、増殖因子は、融合タンパク質に、好ましくは、膜貫通タンパク質のＮ末端またはＣ末端に直接、アンカリングされ得る。好ましくは、スペーサーは、膜貫通タンパク質と増殖因子との間に提供され得る。スペーサーの提供は、増殖因子および膜貫通タンパク質が、発現の際に独立してリフォールディングすることを可能にする。さらに、膜貫通タンパク質からの増殖因子の空間的分離は、増殖因子がポリマー性表面の上に延び、膜貫通タンパク質による立体障害なしに増殖因子として機能的であるのを可能にする。ポリマー性表面上への増殖因子の提供は、細胞培養技術において、例えば、細胞の増殖および／または分化を促進するために、特定の適用を有する。
【０１１７】
異種ペプチドおよび／またはタンパク質と組み合わせたスペーサー配列の使用は、ポリマー性基材から離れて配向させることによって、ペプチドまたはタンパク質のディスプレイを改善する。スペーサーの提供は、異種タンパク質および膜貫通タンパク質が発現の際に独立してリフォールディングすることもまた可能にし得、従って、膜貫通タンパク質にアンカリングされた機能的な異種ペプチドまたはタンパク質を得る可能性を増加させる。スペーサーによって提供される空間的分離は、異種ペプチドまたはタンパク質が、基材または膜貫通タンパク質による立体障害なしに、ポリマー性表面の上に延び、機能的であることを可能にする。スペーサーは、ループ中に、ならびに／またはＮ末端および／もしくはＣ末端の終端において、提供され得る。スペーサーは次に、例えば結合のために、ペプチドまたはタンパク質に融合され得る。従って、Ｎ末端および／またはＣ末端は、より大きい配列のディスプレイのために使用され得るが、それは、二次構造の影響に関して同じ制限が適用される可能性があまり高くないからである。スペーサーは、膜貫通タンパク質にとって、ならびに／またはペプチドおよび／もしくはタンパク質にとって異種であり得る。スペーサーは、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端の遊離終端に、１つの終端においてアンカリングされたアルファ・ヘリックス配列であり得る。スペーサーは、好ましくは異種ペプチドまたはタンパク質に隣接して、ループ中に提供され得る。スペーサーは、親水性、剛性または半剛性であり得る。スペーサーは、任意の適切な一次配列または二次配列を含み得るが、好ましくは、シグナル伝達、結合または他の機能などの機能を欠く。好ましいスペーサーは、アルファ・ヘリックス、または例えばＰｏｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：２０９１−２０１１  ２００６に記載されるようなＰＴリンカー、またはグリシン−セリン・スペーサー・リンカー、例えば、ＰＬｒｉｇｉｄ、２ａａ  ＧＳリンカー、６ａａ［ＧＳ］ｘリンカー、１０ａａ［ＧＳ］ｘリンカー、１０ａａ可動性タンパク質ドメイン・リンカー、８ａａタンパク質ドメイン・リンカー、Ｓｐｌｉｔフルオロフォア・リンカー；Ｆｒｅｉｂｕｒｇ  ｓｔａｎｄａｒｄ、１５ａａ可動性グリシン−セリン・タンパク質ドメイン・リンカー；Ｆｒｅｉｂｕｒｇ  ｓｔａｎｄａｒｄ、短いリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）、中間のリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）×２、長いリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）×３、ＧＳＡＴリンカー、ＳＥＧ、ＳＥＧ−リンカー、ＧＳＡＴ−リンカー、Ｚ−ＥＧＦＲ−１９０７短−リンカー、Ｚ−ＥＧＦＲ−１９０７中間−リンカー、Ｚ−ＥＧＦＲ−１９０７長−リンカー、Ｚ−ＥＧＦＲ−１９０７＿ＳＥＧ−リンカー、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３可動性ペプチド・リンカー、短い融合タンパク質リンカー：ｓｔａｎｄａｒｄ  ２５  ｐｒｅｆｉｘ／ｓｕｆｆｉｘを有するＧＧＳＧ、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２５  Ｐｒｅｆｉｘ／Ｓｕｆｆｉｘを有する長い１０ＡＡ融合タンパク質リンカー、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２５  Ｐｒｅｆｉｘ／Ｓｕｆｆｉｘを有する中間の６ＡＡ融合タンパク質リンカー：ＧＧＳＧＧＳ（ｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｄｏｍａｉｎｓ／Ｌｉｎｋｅｒ）を含み得る。アルファ・ヘリックス配列は、例えば、図１２のＯＭＰ１７３に示されるように、異種ペプチドまたはタンパク質への融合のために提供され得る。
【０１１８】
本発明は、膜貫通タンパク質が、Ｎ末端および／もしくはＣ末端またはループにおいて提供される異種ペプチドまたはタンパク質への結合パートナーの結合を可能にする様式で、基材に結合されるという利点を有する。これは、タンパク質が典型的には混乱した様式で基材に結合される、または結合が可能であるように適所（例えば、脂質単層）にタンパク質を保持するためのさらなる薬剤を必要とする先行技術の方法とは対照的である。本発明では、驚くべきことに、実質的に全てのアンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質が、それが結合または相互作用のためにディスプレイされるのを可能にする様式で、配向される。従って、本発明では、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、ポリマー性基材表面から離れて配向され、結合または相互作用のためにディスプレイされる。これは、本明細書に記載されるような、例えば、基材への結合の検証に関して本明細書に記載されるような、結合アッセイまたは当該分野で利用可能な他の技術を使用して確認され得る。
【０１１９】
膜貫通タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端は、改変され得る。例えば、Ｎ末端またはＣ末端の一方または両方が、例えば、疎水性を増加させるため、または上記のように異種配列を導入するために、トランケートされ得る。
【０１２０】
結合特性を改善するための膜貫通タンパク質の基本的構造への他の改変が、行われ得る。これらには以下が含まれる：膜に内在性ではない大きい内部または外部ドメインの欠失；バレルの親水性を低減させるための１または複数のループのトランケーション；例えばループ上でのタンパク質の挿入およびディスプレイを可能にするための親水性スペーサーによる１または複数のループの伸長；Ｎ末端および／またはＣ末端の空間的位置を変更するための循環式並べ替え；精製タグ（例えば、ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグなど）の導入。Ｎ末端またはＣ末端の一方または両方は、その構造的および／または機能的特性を変更するために、１または複数のアミノ酸欠失、置換または挿入を含むように改変され得る。膜貫通タンパク質の１または複数のループは、本明細書に記載されるように操作され得る。
【０１２１】
例えば、典型的には親水性であるタンパク質の１または複数のループをトランケートすることによって、タンパク質の疎水性を増加させることが望まれ得る。これは、プラスチック表面の官能化の必要なしに、または基材への共有結合のための特定のアミノ酸などの結合部分を導入するためのタンパク質の改変なしに、疎水性基材へのタンパク質の結合を改善するように機能し得る。膜貫通タンパク質の長い親水性ループのうち１または複数の短縮は、アッセイにおいて、血清または他のマトリックス・タンパク質からの非特異的結合を低減させるという利点をさらに有する。
【０１２２】
タンパク質の疎水性は、タンパク質が凝集し水を反発する傾向の尺度である。タンパク質の疎水性は、一次構造中に存在するアミノ酸の係数であるが、二次構造の係数でもある。従って、タンパク質の異なる部分は、疎水性または親水性であり得る。クロマトグラフィー法、露出面積法、分配法を含む、アミノ酸残基の疎水性を分類するための種々の方法が存在する。値は、ヒドロパシー指数と呼ばれ得る。ヒドロパシー・プロットまたはＸ線構造分析は、アミノ酸配列の長さにわたって疎水性を予測するために使用され得る。その尺度は、２０アミノ酸の疎水性特性および親水性特性に基づく。５〜２０アミノ酸の移動「ウインドウ」は、配列中の各点（Ｙ座標）において合計されたヒドロパシーを決定する。次いで、これらの合計は、そのそれぞれの位置（Ｘ座標）に対してプロットされる（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｊｏｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９８２）１５７  １０５−１３２）。例えばポリマー性基材へのタンパク質の結合を補助するために膜貫通タンパク質の疎水性を変更することが望まれる実施形態では、提案された改変が疎水性における所望の変化を生じるかどうかを決定するために、ヒドロパシー・プロットが、任意の改変の前および後に、ループの疎水性を予測する際に有用であり得る。実施形態では、例えば、典型的には親水性であるタンパク質の１または複数のループをトランケートすることによって、例えば、タンパク質の疎水性を増加させることが望まれ得る。
【０１２３】
本発明での使用のための膜貫通タンパク質は、少なくとも１つのループを含み、従って、膜を少なくとも２回貫通するものである。本発明での使用のための膜貫通タンパク質は、２以上のループを含み得る。膜貫通タンパク質の各ループは、そのタンパク質の１または複数の他のループとは、長さおよび構造が異なり得る。タンパク質を改変することが望まれる場合、任意の１つのさらなるループが、例えばタンパク質の疎水性を増加させるために、本明細書に記載されるようにトランケートされ得、疎水性基材への方向付けられた固定化を可能にし得る。トランケートされるループの数は、タンパク質、およびループから生じる親水性の低減が望まれる程度に依存する。これは、任意の特定のループの特異的配列および長さの係数であり得る。一次配列分析、ならびに任意選択でＸ線結晶解析およびヒドロパシー・プロッティングなどの方法を使用して、当業者は、トランケートされる適切なループ（複数可）およびいくつのアミノ酸分トランケートされるかを決定するために、ループのおよび改変された膜貫通タンパク質の、予測された親水性／疎水性性質を評価できる。溶媒相分配、ＲＰＬＣ、ＴＬＣを含む方法が、疎水性を決定するために当該分野で利用可能である。好ましい方法には、タンパク質を操作する場合に決定を行うための、Ｘ線構造および予測的ヒドロパシー・プロット（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ）の分析が含まれる。
【０１２４】
トランケートされるループの数は、タンパク質のネイティブ立体配置に基づく数によって規定され得、Ｃ末端は、ペリプラズム側に存在する。２回または３回またはそれより多く通過するタンパク質では、１または複数のループがトランケートされ得る。好ましい一実施形態では、１つを除いて全てのループがトランケートされ得る。本明細書では、ループの番号付けは、細胞質ゾル側にあるネイティブＣ末端に基づく。
【０１２５】
「トランケートされた」とは、ループが、そのネイティブ形態と比較して、長さが低減されていることを意味する。長さにおける低減は、ループからの１または複数のアミノ酸残基の欠失によって達成される。ループがトランケートされる程度は、タンパク質の改変によって達成される疎水性の程度、およびタンパク質の三次構造に対する欠失の影響などの因子に依存する。従って、「トランケートされた」とは、ループの全てまたは一部が除去され得ることを意味する。好ましくは、本発明に従う改変された膜貫通タンパク質は、そのネイティブの三次構造を保持する。従って、膜貫通タンパク質がベータ−バレル・タンパク質である場合、改変されたタンパク質は、好ましくは、ベータ−バレル三次コンフォメーションを保持する。従って、好ましくは、１または複数のループの短縮または除去は、そのネイティブ形態と比較して、タンパク質の最終的な三次構造に顕著には影響を与えない。タンパク質中の各ループは、タンパク質中の１もしくは複数の他のループとは異なって、またはタンパク質中の１もしくは複数の他のループと同じ方法で、改変され得る。好ましくは、ループは、制限なしに、好ましくは、タンパク質の三次構造の変更なしに、それが膜貫通型ストランドを接続するのを可能にする長さまで、トランケートされる。好ましくは、ループは、膜の外側の水相中に延びないように、トランケートされる。
【０１２６】
本明細書に記載されるような膜貫通タンパク質の１または複数のループのトランケーションは、タンパク質の疎水性を増加させるように、およびまたタンパク質への非特異的結合を低減させるように機能する。界面活性剤の存在下で、タンパク質は、疎水性基材に結合することができる。従って、タンパク質は、タグも官能化もリンカー配列も必要とせずに、ポリマー性基材に直接固定化される。好ましくは、頭部は、ポリマー性基材から離れて方向付けられ、そうして、例えばスクリーニング・アッセイにおいて、結合のために利用可能である。好ましくは、基材に固定化された場合、このタンパク質は、その二次構造および三次構造を維持し、好ましくは、結合部位のディスプレイのために正確に配向される。好ましくは、このタンパク質は機能的である。好ましくは、このタンパク質は、分析物またはリガンドに結合するために配向され、結合することが可能である。好ましくは、このタンパク質は、複数のタンパク質が実質的に同じ様式で配向されるように、基材の表面上に非ランダムに組織化される。好ましくは、このタンパク質は、結合部位などの任意の機能的部位が露出されるように、好ましくは溶液／反応表面に向かって方向付けられるように、基材上に位置させる。
【０１２７】
改変された膜貫通タンパク質中に保持されたループは、挿入または置換のいずれかによって、親水性残基を含むように改変され得る。ループ中に親水性残基を導入することの目的は、疎水性基材から反発されるようにすること、ならびにループおよびその活性内容物を、アクセス可能であるように表面の上に位置させることである。かかる親水性残基は、スペーサー・ペプチドの一部であっても、またはそれに付加されてもよい。
【０１２８】
タンパク質は、タグ、例えば、ポリヒスチジン・タグを含むように改変され得る。ポリヒスチジン・タグは、６以上のヒスチジン残基を含み得る。このタグは、本明細書で、Ｈｉｓ６タグ、６×ｈｉｓタグまたはヘキサ−ｈｉｓタグと呼ばれ得る。他の適切なタグには、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたは他の小さいアフィニティ・タグが含まれる。タグは、Ｃ末端またはＮ末端上に提供され得る。末端は、本明細書に記載されるように改変され得る。タグは、トランケートされたＣ末端またはＮ末端上に提供され得る。
【０１２９】
タンパク質は、特に、ポリマー性基材と接触することになるタンパク質の一部において、１または複数のネイティブ・システイン残基を除去するために改変され得る。従って、ループのうち１または複数は、（欠失または置換によって）１または複数のネイティブ・システイン残基を除去するために改変され得る。かかる改変は、プラスチック基材に結合されることになる、プラスチックと金などの他の基材とに結合する二重機能性を示す必要がないタンパク質にとって、適切であり得る。
【０１３０】
上記改変に加えて、膜貫通タンパク質は、タンパク質の生物学的活性および／または三次構造を顕著に変更することなしに、１つまたはいくつかのアミノ酸の１または複数の保存的置換を含むように改変され得る。当業者は、かかるアミノ酸置換を行う方法を了解している。
【０１３１】
ＯｍｐＡは、８回通過タンパク質であり、これは、ＯｍｐＡが、バレル形状を形成し、各々が膜を貫通する、８つのベータ・ストランドを含むことを意味する。
【０１３２】
一実施形態では、ＯｍｐＡは、３つのトランケートされた細胞外ループを含むように改変され得る。好ましくは、各ループは、ターンの長さ、好ましくは、４アミノ酸のベータ−ターンまで、トランケートされる。一実施形態では、４つの細胞外ループのうち３つがトランケートされる。ループ１は保持され、ＰＴリンカーおよび親水性アミノ酸で改変される（図１４を参照のこと）。一実施形態では、残りのループは延長される。好ましくは、細胞外ループは、親水性残基の導入によって延長される。好ましくは、このループは、ペプチド・スペーサー配列および／または親水性残基の導入によって延長される。このタンパク質は、本明細書でＯＭＰ１５４と呼ばれる。ＯＭＰ１５４のバリアントは、表３に記載される。
【０１３３】
改変された膜貫通タンパク質は、細胞外ループ１中にＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を含み得る。この様式で改変されたＯｍｐＡは、本明細書でＯＭＰ５と呼ばれる。
【０１３４】
改変された膜貫通タンパク質は、細胞外ループ１中にラミニン由来のＹＩＧＳＲモチーフを含み得る。このタンパク質は、本明細書でＯＭＰ３６と呼ばれる。
【０１３５】
改変された膜貫通タンパク質は、ｉ）好ましくは、各々ベータ−ターンの長さまでトランケートされた、全てのトランケートされた細胞外ループ；ｉｉ）タンパク質の細胞外終端（頭部）上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）アルファ・ヘリックス・スペーサー配列を含むように改変されたＮ末端；ｉｖ）金表面へのタンパク質の結合を可能にするためのシステイン残基を含み得る。このタンパク質は、金およびプラスチック基材に結合できる。好ましくは、そのタンパク質骨格は、ＯｍｐＡの循環式に並べ替えられたベータ・バレルである（図１４）。好ましくは、このアルファ・ヘリックス・スペーサーは、ＩｇＧに結合しないＳ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡのＢドメインの変異形態である（その配列は、Ｋｉｍら（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．２０７  ｐ１８６３−１８７０に開示されている）。このタンパク質は、本明細書でＯＭＰ１７１と呼ばれる。アルファ・ヘリックス・スペーサーを欠くバージョンは、本明細書でＯＭＰ１７０と呼ばれる。タンパク質がスペーサーに融合される、かかる膜貫通タンパク質の改変されたバージョンが提供される。一実施形態では、このタンパク質は、ＨＩＶ抗原ｐ２４であり、このタンパク質は、本明細書でＯＭＰ１７３と呼ばれる。
【０１３６】
一実施形態では、改変された膜貫通タンパク質は、ｉ）好ましくは、各々ベータ−ターンの長さまでトランケートされた、全てのトランケートされた細胞外ループ；ｉｉ）タンパク質の細胞外終端（頭部）上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）アルファ・ヘリックス・スペーサー配列を含むように改変されたＮ末端；ｉｖ）Ｃ末端上に位置させたＨｉｓタグを含み、ｖ）このタンパク質は、システイン残基を含まない。これらの改変は、多数のシステイン残基を含む大きい増殖因子の融合を可能にし、全長の発現されたタンパク質のみがＨｉｓ−タグを含むことを確実にすることを助ける。好ましくは、このタンパク質骨格は、ＯｍｐＡの循環式に並べ替えられたベータ・バレルである。このタンパク質は、本明細書でＯＭＰ１４０と呼ばれる。
【０１３７】
ＯＭＰ１４０のバリアントは、表４に記載される。ＯＭＰ９０および１２８−は、ＯＭＰ５９足場中に、ＦＧＦ１および２を含む（ＯＭＰ５９は、アルファ−ヘリックス・スペーサーを有するＯＭＰ９であり、図１１に示してある）。
【０１３８】
一実施形態では、改変された膜貫通タンパク質は、ｉ）タンパク質の細胞外終端上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）トランケートされ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインに融合されたＮ末端を含む。これらの改変は、タンパク質への抗体のＦｃ領域へのタンパク質の融合を可能にする。このタンパク質は、本明細書でＯＭＰ１８と呼ばれる。
【０１３９】
本発明の一態様では、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている膜貫通タンパク質が提供される。この膜貫通タンパク質は、頭部および足部を含み、この頭部および足部は互いから、１または複数の膜貫通ストランドによって遠ざけられる。「アンカー」とは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部のループ中に異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を、ならびに／またはタンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得ることを意味する。「アンカリングするように改変される」とは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を、ならびに／またはタンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作されることを意味する。
【０１４０】
好ましくは、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【０１４１】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。好ましくは、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質を含む。
【０１４２】
本発明は、本発明の膜貫通タンパク質に対するバリアントの膜貫通タンパク質を含む。好ましくは、バリアント・タンパク質は、一次配列が異なり得るが、本発明の改変された膜貫通タンパク質と実質的に同一な二次三次構造を保持し得る。実質的に同一とは、タンパク質が、例えば１０〜５００アミノ酸の適切なウインドウにわたって、少なくとも４０％、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。ペプチドまたはタンパク質の配列同一性は、例えば、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公に入手可能なｂｌ２ｓｅｑにおけるＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴスイートのプログラム、バージョン２．２．５［２００２年１１月］から）；ＥＭＢＯＳＳ−ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／において利用可能）およびＧＡＰ（Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０、２２７−２３５．）；Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら  １９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １１（２２）４６７３−４６８０）を使用して、当該分野で利用可能な方法によって決定され得る。
【０１４３】
好ましい一実施形態では、膜貫通タンパク質は、本明細書に記載される通りである。好ましくは、これはＯｍｐＡである。
【０１４４】
膜貫通タンパク質への改変は、任意の適切な技術によって導入され得、その多くが、当業者に公知である。例えば、組換えＤＮＡテクノロジーは、改変された膜貫通タンパク質として発現される膜貫通タンパク質をコードする核酸配列に改変を導入するために使用され得る。組換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ）中に提供される。
【０１４５】
本発明の一態様では、本明細書に記載されるような改変された膜貫通タンパク質をコードする核酸配列が提供される。膜貫通タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に記載されるような改変された膜貫通タンパク質を提供するために操作され得る。
【０１４６】
ＯｍｐＡは、ＯｍｐＡ、ｃｏｎ、ｔｏｌＧおよびｔｕｔとして当該分野で公知の遺伝子によってコードされる。遺伝子座の名称は、ｂ０９５７およびＪＷ０９４０である。ＯｍｐＡをコードする核酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム配列中に開示され（ｈｔｔｐ：／／ｂｍｂ．ｍｅｄ．ｍｉａｍｉ．ｅｄｕ／ｓｏｕｒｃｅｓ／１）、本明細書では図１４に開示される。図１４に示される配列は、野生型遺伝子の操作された形態である。細胞外ループをコードする配列には下線が付される。細胞外ループＬ１は、核酸８５〜１２６によってコードされる；Ｌ２は、核酸２１４〜２４９によってコードされる；Ｌ３は、核酸３４６〜３８７によってコードされる；Ｌ４は、核酸４６６〜５０７によってコードされる。Ｃ末端プロリンは、核酸５８９〜５９１によってコードされる。Ｎ末端メチオニンは、核酸１〜３によってコードされる。ループに介在する配列は、表１に記載されるように、膜貫通ベータ・ストランドをコードする。
【０１４７】
ＯｍｐＦ（ＴＯＬＦまたはＣＭＬＢまたはＣＯＡまたはＣＲＹまたはＢ０９２９としても公知）もまた、本明細書において使用され得る。
【０１４８】
本発明は、本発明の膜貫通タンパク質をコードするバリアント核酸配列を含む。本発明の膜貫通タンパク質をコードする配列に対する、バリアントまたは機能的に等価な配列の配列同一性は、所定の比較ウインドウにわたって、２つのアラインされた配列またはそれらの断片を比較し、同一な残基が存在する位置の数を決定することによって、決定される。この比較ウインドウは、配列の全てまたは一部を含み得、例えば、ウインドウは、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドまたはそれ超を含む。典型的には、配列同一性は、百分率として表現される。ヌクレオチド配列の配列同一性の測定は、デフォルト・パラメーターを使用して、コンピューターにより実行される数学的アルゴリズム、例えば、ＡＬＩＧＮ（バージョン２．０）、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）ならびにＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４（１９９８））を使用する、当業者に周知の方法である。
【０１４９】
好ましくは、核酸分子は、例えば宿主細胞における本発明の改変された膜貫通タンパク質の発現のために使用され得る、遺伝子構築物中で提供される。
【０１５０】
好ましくは、この核酸分子は、それが作動可能に連結されたコード配列の発現（即ち、転写または翻訳）を調節する任意の核酸配列である調節エレメントに作動可能に連結される。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、アクセプターおよびドナー・スプライス部位を含むスプライシング・シグナル、停止コドン、アンバーもしくはオーカー・コドン、転写因子結合部位、リボソーム結合部位、ＩＲＥＳ、ならびに標的化配列、例えば、細胞区画化シグナル（例えば、細胞質ゾル、核、形質膜、小胞体、ミトコンドリア、葉緑体、リソソーム、エンドソームまたはゴルジ体への）および／または分泌シグナルが含まれる。他の調節配列は、当業者に公知であり得る。本発明の遺伝子構築物は、任意の１または複数（２、３、４、５、６など）の調節配列を含み得る。１または複数の調節エレメントが、５’ＵＴＲ中に提供され得る。さらに、３’ＵＴＲもまた提供され得る。
【０１５１】
本発明に関して、プロモーターは、核酸の転写を指向する制御配列として定義され得る。プロモーターには、転写の開始部位近傍の必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターには、任意選択で、転写の開始部位から数千塩基も離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー・エレメントもまた含まれ得る。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターのいずれも、本発明における使用のために含まれる。
【０１５２】
任意の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種遺伝子発現に使用されるプロモーターの一般的な例は、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｔ７、ａｒａ  ｏｍｐ、ラムダ・ファージである；しかし、任意のプロモーターが、これらの融合タンパク質を発現させるために使用され得る。誘導性プロモーターとは対照的に、構成的プロモーターは、ほとんどの環境条件下で機能する。多数の異なる構成的プロモーターが、本開示の方法に関して利用され得る。本発明での使用に好ましいプロモーターには、Ｔ７、ａｒａおよびｔａｃが含まれる。
【０１５３】
本発明の核酸分子は、選択可能なマーカーに作動可能に連結され得る。核酸分子が遺伝子構築物中で提供される場合、この構築物は、選択可能なマーカーを含み得る。一実施形態では、この選択可能なマーカーは、核酸分子に作動可能に連結され得る。あるいは、この選択可能なマーカーは、例えば、別々のプロモーターおよび／または他の調節エレメントの制御下で、核酸分子とは独立して制御され得る。
【０１５４】
適切な選択マーカーは、当業者に周知であり、これには、発現の際に検出可能な表現型を提供する任意の核酸配列が含まれ得る。典型的には、発現されたポリペプチドは、好ましくは細胞に有影響を与えることなしに、細胞内で検出可能である。例えば、この選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質、または適切な薬剤と接触させた場合にシグナルを生じる、ルシフェラーゼなどの酵素であり得る。他の選択的マーカーには、特定の条件下で、例えば、特定の栄養素の非存在下で、またはそれなしでは細胞にとって有害である薬剤の存在下で増殖する選択的能力を細胞に付与するものが含まれる。本発明での使用に好ましい選択可能なマーカーには、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンおよびテトラサイクリン耐性が含まれるが、他のものが、当業者に公知であり入手可能である。
【０１５５】
本発明での使用に適切な遺伝子構築物には、例えば、ウイルス・ベクター、プラスミド（環状または直鎖状）、ファージミド、直鎖状ＤＮＡを含むベクターが含まれる。本発明での使用に好ましい遺伝子構築物には、Ｏｍｐ融合タンパク質の過剰発現のための誘導性プロモーターを有するプラスミドが含まれる。ベクターは、本明細書に規定されるような１または複数の選択可能なマーカー、例えばネイティブ核酸との相同組換えを可能にするための１または複数のクローニング部位、本明細書に規定されるような１または複数の調節エレメント、および１または複数の複製起点を含み得る。本明細書に規定されるような２以上の核酸分子は、所望に応じて、単一のベクター中に提供され得る。これらは、別々の調節制御下にあり得る、または同じ調節エレメントに作動可能に連結され得る。
【０１５６】
本明細書に記載されるような核酸配列または遺伝子構築物は、本発明の改変された膜貫通タンパク質の発現のために宿主細胞中に提供され得る。組換えタンパク質の発現に適切な宿主細胞には、真核生物細胞または原核生物細胞、好ましくは後者が含まれる。適切な宿主細胞は、当業者に公知であり利用可能であり、これには、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢＬ２１、ＢＬ２１  ＡＩ、ＢＬＲおよびＲｏｓｅｔｔａ−２が含まれる。本明細書に記載されるような遺伝子構築物を含む宿主細胞もまた提供され得る。この宿主細胞は、組換えであり得る。
【０１５７】
本発明は、サンプル中の成分を結合させ方法を提供し、この方法は、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）基材にサンプルを添加するステップ；
ｉｉｉ）基材への任意の成分の結合を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ
を含む。
【０１５８】
好ましくは、基材へのサンプルの添加後、この基材は、任意の分析物を基材に結合させるのに適切な期間にわたってインキュベートされ得る。このインキュベーション期間は、アッセイおよびサンプル型に依存して変動し得るが、典型的には、実施されているアッセイに依存して、５分間〜２４時間、より好ましくは１０分間〜１時間であり得る。
【０１５９】
本発明の方法は、サンプル中の目的の成分の存在または非存在を検出するための、スクリーニング・アッセイであり得る。かかるアッセイでは、検出の前に、アッセイの精度を最大化するために、この方法は、任意の未結合の材料を除去するために基材を洗浄するステップを含み得る。洗浄するステップは、好ましくは無菌の、任意の適切な緩衝液、水、または界面活性剤もしくはエタノールを含む溶液、例えば、ＴＢＳ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥ、７０％エタノール、Ｔｗｅｅｎ、または脱イオン水を用いて実施され得る。
【０１６０】
結合した成分の検出は、例えば、分析物に特異的な結合パートナーを用いた結合アッセイを使用して、当該分野の任意の適切な方法を使用して実施され得る。典型的な結合アッセイでは、この基材は、分析物に特異的な結合パートナー（例えば、ＩｇＧ）と共にインキュベートされ得る。次いで、結合した分析物は、例えば、測定され得るシグナルを含む場合には直接的に、または例えば、第１の結合パートナーに特異的な第２の結合メンバーを使用することによって間接的に、検出され得る。この第２の結合パートナーは、酵素または触媒または他のマーカー、例えば蛍光タグにコンジュゲート化された抗体であり得、検出は、基質とのインキュベーションおよび生成されたシグナルの量を測定することによって実施され得る。任意の適切なシグナルが使用され得、その多くの例が、当業者に公知であり利用可能である。好ましいシグナルは、電磁スペクトル、例えば、発色団およびフルオロフォア、ならびに酵素基質系、例えば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ／ＴＭＢにおいて検出され得るものである。他は、当業者に公知である。後者の場合、リガンドに特異的な結合メンバーは、シグナル基質を触媒して比色出力を生成する酵素に結合され得る。好ましいシグナルは、増幅系を使用するものである。基質に対して作用して発色団を生成し得る酵素標識、例えば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、ベータ・ガラクトシダーゼが、最も好ましい。適切な基質には、ＴＭＢ  ＡＢＴＳ、ＯＰＤ（ＨＲＰ用）、ｐＮＰＰ（ＡＰ用）およびＯＮＰＧ（ベータ・ガラクトシダーゼ用）が含まれる。比色出力は、視覚的に、または光の吸光度における変化を測定することによって定量的に、測定され得る。この方法は、シグナルに基づいて分析物の量の定量的な値を得るために、生成されたシグナルを標準チャートと比較するステップをさらに含み得る。
【０１６１】
このサンプルは、ヒトもしくは動物の身体由来であり得る（例えば、唾液、全血、血漿、尿、精液、大便など）、または生成プロセス由来の細胞溶解物もしくは粗製抽出物であり得る。
【０１６２】
成分は、任意の部分、好ましくは、結合パートナーによって結合されることが可能なものであり得る。非限定的に選択されたリガンドには、核酸、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ハプテン、ホルモン受容体、ビタミン、ステロイド、代謝物、アプタマー、糖、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、細胞、生物（例えば、真菌、細菌、ウイルス、原生生物および多細胞寄生生物）、治療的薬物もしくは非治療的薬物、またはそれらの任意の組み合わせもしくは断片が含まれる。好ましくは、この成分は、免疫学的に活性なタンパク質またはポリペプチド、例えば、抗原性ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０１６３】
この方法は、サンプルからの目的の成分の精製のためにも使用され得る。かかる方法は、スクリーニング方法に関して上記したとおりであり得、ここで、成分を検出するステップの代わりに、任意の結合した成分が基材から溶出され得る。任意の結合した生成物は、当該分野で公知の方法、例えば、塩溶出、ｐＨ変化による溶出、競合物の結合による溶出を使用して、基材から溶出され得る。
【０１６４】
この方法は、例えば本明細書に記載されるように、例えばさらなる反応のために、サンプルから目的の成分を固定化するためにも使用され得る。例えば、ペプチドおよび／またはタンパク質は、Ｆｃドメインを示す成分（例えば、Ｆｃタグ化組換えタンパク質）を固定化するように機能し得るＦｃ結合ドメイン（例えば、プロテインＡ、ＧまたはＬ由来）を含み得る。かかる固定化は、例えば、結合アッセイ、細胞培養などにおいて種々の使用を有し得る。
【０１６５】
この方法は、本明細書に記載されるように、ポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化するステップを含み得る。好ましくは、このポリマー性基材は、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含み、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、異種ペプチドおよび／またはタンパク質を含む。この膜貫通タンパク質は、頭部および足部を含み、この頭部および足部は互いから、１または複数の膜貫通ストランドによって遠ざけられる。アンカーとは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部のループ中に異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を、ならびに／またはタンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得ることを意味する。アンカリングするように改変されるとは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を、ならびに／またはタンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作されることを意味する。
【０１６６】
従って、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得る；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得る；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作され得る；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作され得る。
【０１６７】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。
【０１６８】
本発明は、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質と、サンプル中の成分との相互作用を媒介する方法もまた提供し、この方法は、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）成分を含むサンプルを、基材に添加するステップ；
ｉｉｉ）成分と、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質との相互作用を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ
を含む。
【０１６９】
好ましくは、この方法は、本明細書に記載されるように、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップを含む。
【０１７０】
このサンプルは、ヒトもしくは動物の身体由来であり得る（例えば、唾液、全血、血漿、尿、精液、大便など）、または生成プロセス由来の細胞溶解物もしくは粗製抽出物であり得る、または反応混合物の細胞培養物であり得る。
【０１７１】
成分は、アンカリングされたペプチドまたはタンパク質と相互作用することが可能なものであり得る。これは、例えば、核酸、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ハプテン、ホルモン受容体、ビタミン、ステロイド、代謝物、アプタマー、糖、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、細胞、生物（例えば、真菌、細菌、ウイルス、原生生物および多細胞寄生生物）、治療的薬物もしくは非治療的薬物、またはそれらの任意の組み合わせもしくは断片を含む、任意の部分であり得る。この成分は、免疫学的に活性なタンパク質またはポリペプチド、例えば、抗原性ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。好ましくは、この成分は細胞である。細胞は、原核生物細胞、例えば、真菌もしくは細菌細胞、または真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞であり得る。
【０１７２】
好ましくは、基材へのサンプルの添加後、この基材は、ペプチドおよび／またはタンパク質とサンプルの成分との任意の反応を可能にするのに適切な期間にわたってインキュベートされ得る。このインキュベーション期間は、アッセイおよびサンプル型に依存して変動し得るが、典型的には、実施されているアッセイに依存して、５分間〜２４時間、より好ましくは１０分間〜１時間であり得る。
【０１７３】
この成分が細胞である場合、アッセイは、例えば、細胞が増殖、分裂および／もしくは分化するように、または特定の特徴もしくは機能を発現するようにシグナル伝達するペプチドまたはタンパク質を提供するなど、細胞培養物に細胞相互作用を提供する際に有用であり得る。例えば、タンパク質は、基材を細胞培養物と共にインキュベートした場合に細胞表面上の受容体と相互作用する増殖因子であり得る。あるいは、ペプチドは、細胞表面上の受容体と再度相互作用して、特定の細胞の特徴または分化を促進し得る、ＥＣＭモチーフを含み得る。細胞結合アッセイでの使用のための改変されたＯＭＰタンパク質の例には、ＯＭＰ１５３、１５４、１６２〜１６５、１６７、１７４〜１７９および１８０〜１９２（表３および表４）が含まれる。
【０１７４】
表面コートされた基材を使用して細胞の増殖および／または分化を促進するための方法、ならびに細胞培養の方法は、当該分野で公知であり、それらの教示は、細胞の増殖および／または分化を促進する細胞培養の方法において本発明の基材を使用することに、容易に適用され得る（例えばＨｅｌｇａｓｏｎおよびＭｉｌｌｅｒ（編）（２００４）Ｂａｓｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  １５８８２９２８４３を参照のこと）。
【０１７５】
本発明の方法での使用のための細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。この細胞は、昆虫細胞、酵母、細菌、植物細胞、藻類および動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞であり得る。これは、細胞株であり得る。動物および哺乳動物細胞の線維芽細胞、幹細胞、誘導多能性幹細胞、ニューロン細胞、肝細胞、筋細胞、造血細胞、上皮細胞、初代細胞、形質転換された細胞株。
【０１７６】
この方法は、例えば、ペプチドおよび／またはタンパク質が酵素または触媒をコードする場合、酵素アッセイにおいても有用であり得る。サンプルとのインキュベーションの際に、アンカリングされた酵素または触媒は、サンプル中の成分と反応して、反応生成物を提供する。この方法は、基材からサンプルを取り出し、そこから任意の反応生成物を精製するステップ、または反応生成物の存在を検出するステップをさらに含み得る。
【０１７７】
この方法は、アッセイ、例えば、細胞培養アッセイにおいて必要とされるペプチドまたはタンパク質を固定化するために使用され得る。上記のように、例えば、ペプチドおよび／またはタンパク質は、Ｆｃドメインを示す成分（例えば、Ｆｃタグ化組換えタンパク質）を固定化するように機能し得るＦｃ結合ドメイン（例えば、プロテインＡ、ＧまたはＬ由来）を含み得る。かかる固定化は、例えば、結合アッセイ、細胞培養などにおいて種々の使用を有し得る。
【０１７８】
本発明は、ポリマー性基材、膜貫通タンパク質、および１×ＣＭＣ以下の濃度の界面活性剤を含む、インキュベーションもまた提供する。好ましくは、この膜貫通タンパク質、基材および界面活性剤は、本明細書に記載される通りである。このインキュベーションは、本発明のポリマー性基材または製品の製造における中間体を反映し、ポリマー性基材は、本明細書に規定されるような膜貫通タンパク質と共にインキュベートされ、インキュベーション中の界面活性剤濃度は、１×ＣＭＣ以下である。このポリマー性基材は、未結合であり得るか、またはその上に固定化される膜貫通タンパク質と部分的に結合され得る。
【０１７９】
本発明の第９の態様では、ポリマー性基材、およびディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている膜貫通タンパク質を含むキットが提供される。この膜貫通タンパク質は、頭部および足部を含み、この頭部および足部は互いから、１または複数の膜貫通ストランドによって遠ざけられる。アンカーとは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部のループ中に異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を、ならびに／またはタンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得ることを意味する。アンカリングするように改変されるとは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を、ならびに／またはタンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作されることを意味する。従って、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材が提供され得、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【０１８０】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。
【０１８１】
このキットは、ポリマー性基材への膜貫通タンパク質の物理吸着を可能にするための希釈係数を提供するチャート、希釈剤、緩衝液、基材、免疫グロブリンおよび結合試薬をさらに含み得る。このキットは、供給および輸送のために包装され得る。キットの成分は、個々に包装され得、本発明の方法を実施するための試薬の組み合わせとして供給され得る。
【０１８２】
本発明の方法は、ポリマー性基材上へのタンパク質の固定化の前に、本明細書に記載されるように、膜貫通タンパク質を改変するステップをさらに含み得る。
【０１８３】
本発明の方法は、プラスチック基材上への改変された膜貫通タンパク質の固定化の前に、膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を改変して、本明細書に記載されるような改変された膜貫通タンパク質を提供するステップ、および宿主細胞からタンパク質を発現させるステップをさらに含み得る。
【０１８４】
本発明は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を含む製品もまた提供する。この膜貫通タンパク質は、頭部および足部を含み、この頭部および足部は互いから、１または複数の膜貫通ストランドによって遠ざけられる。アンカーとは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部のループ中に異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を、ならびに／またはタンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含み得ることを意味する。アンカリングするように改変されるとは、膜貫通タンパク質が、タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を、ならびに／またはタンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作されることを意味する。従って、その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材が提供され得、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、この膜貫通タンパク質は、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部においてＮ末端および／もしくはＣ末端を含むように操作される；ならびに／または
ｉｖ）タンパク質の頭部において１もしくは複数のループを含むように操作される。
【０１８５】
タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部の操作されたループ中に、ディスプレイのために、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質が提供され得る。
【０１８６】
製品には、マイクロ・ウェル・プレート、組織培養フラスコまたはプレート、プラスチック・ビーズ、繊維、メッシュ基材、医療用デバイス、例えば外科用インプラント、ポリマーのマイクロ粒子またはナノ粒子が含まれ得る。その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を含む外科用インプラントが提供され、この膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、このタンパク質は、そのネイティブの二次構造を保持する。
【実施例】
【０１８７】
本発明者らのβ−バレル・ベースのタンパク質のポリマーへの結合およびその機能を調査するために、以下のアプローチを採用した：
１．ポリマー上のタンパク質の検出のためのイムノアッセイ
ＯＭＰ１８（ＯｍｐＡに融合させたＳＰＡの２つのＩｇＧ結合性Ｂドメイン）およびネイティブＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡ（５つのＩｇＧ結合ドメイン）の比較。
種々のポリマー上のＦＬＡＧタグ化ＯＭＰタンパク質の検出
特異的抗体を用いた、ＯＭＰ足場に融合させたヒトＨＩＶ  ｐ２４抗原の検出、およびネイティブ抗原との比較
２．細胞培養
ＯＭＰ０足場タンパク質との細胞結合の比較、およびＯＭＰ足場上にディスプレイされたＥＣＭタンパク質モチーフまたは増殖因子を含む種々の構築物。
【０１８８】
ベータ−バレル化足場を用いてアンカリングされたネイティブのプロテインＡまたはプロテインＡドメインへのＩｇＧの結合
どの足場も、第２の独立したタンパク質のためのアンカーとして有効であるためには、表面に吸着された場合のそのタンパク質の機能を改善しなければならない。ベータ−バレル化足場についてこれを試験するために、一連のＩｇＧ結合タンパク質のうちの１つであって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡのＩｇＧ結合性Ｂドメインのタンデム・リピートを有するＯＭＰ１８を、ＯＭＰ９足場のＮ末端に融合させて使用し、実験を実施した。ＯＭＰ９は、図１に示され、全ての細胞外ループ、金結合のためのシステイン残基、循環式に並べ替えられたＮ末端およびＣ末端、ならびに短縮されたＮ末端を含む金結合性ベータ・バレル・タンパク質であり、このＮ末端は、ＯＭＰ１８において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡのＩｇＧ結合性Ｂドメインのタンデム・リピートに融合されている。この後者のドメインは、抗体のＦｃ領域に結合し、抗原結合領域を露出されたままにする。
【０１８９】
ＯＭＰ１８は、吸着されたまたはアミン・カップリングしたプロテインＡよりも高い効率で、金バイオセンサー表面上にＩｇＧ抗体を捕捉できる（未公開データ）。これが、ＯＭＰ足場を介してプラスチックに係留されたプロテインＡドメインについて当てはまるかどうかを試験するために、図４に記載された型のイムノアッセイにおいて、ポリスチレン表面上のＯＭＰ１８対プロテインＡの固定化の比較を実施した。このシナリオでは、正確に配向されたタンパク質が、不正確に配向されたまたは変性したタンパク質よりも多い量の抗体に結合し、それによって、免疫検出から改善されたシグナルを得ることが想定された。
【０１９０】
プラスチック・ウェル・プレートへのＯＭＰ１８およびプロテインＡのタンパク質吸着
１つの疎水性２４ウェル・プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１つの「親水性」プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用した。ＯＭＰ１８（ロット１５９１０ＢＥ１６５１１ＬＨ）は、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）＋０．２５％ＯＧ（ｎ−オクチルグルコシド）中に７０μｇ／ｍＬ（２μＭ）であり、ネイティブＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ７３８７；ロット０５５Ｋ０９２６１）は、ＰＢＳ＋０．２５％ＯＧ中に８４μｇ／ｍＬ（２μＭ）であった。
【０１９１】
３００μＬのタンパク質溶液を、両方のプレート上のウェルに適用した。ブランク・ウェル（タンパク質なし）を、ＰＢＳ＋０．２５％ＯＧだけで調製した。これらのプレートを、室温（ＲＴ）でロッキング・プラットフォーム（ロッカー）上で一晩インキュベートした。ウェルを、各タンパク質を用いて３連でコートした。
【０１９２】
プラスチック上のＯＭＰ１８をネイティブのプロテインＡと比較するためのイムノアッセイ
これらのウェルを、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（本明細書でＴＢＳ−Ｔと呼ばれる）で１回洗浄した。全ての洗浄およびインキュベーションは、特記しない限り、３００μＬの溶液を用いたことに留意のこと。Ｔｒｉｓ緩衝食塩水＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０＋３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（本明細書でＴＢＳ−ＴＢと呼ばれる）中２μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａカタログ番号１５３８１、ロット０２５Ｋ７５８０）を、各型の２つのウェルに添加し、ＴＢＳ−Ｔを、抗体なしのコントロール・ウェルに添加し、ロッカー上でＲＴで１時間インキュベートした。マウスＩｇＧ溶液およびＴＢＳ−Ｔ溶液を除去し、ウェルを、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＴＢＳ−Ｔ中に１／５０００希釈したウサギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３６８８、ロット１０３Ｋ９１５７）を、全てのウェルに添加した。これらのウェルを、ロッカー上で室温で１時間維持した。コンジュゲートを除去し、ウェルを３×ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。２００μＬの（ＰＮＰＰ）基質を、各ウェルに添加し、暗中で室温で３０分間インキュベートした。この反応を、脱イオン水中３ＭのＮａＯＨ溶液５０μｌの添加によって停止させた。ウェルの内容物を、０．７５ｍＬの脱イオン水と混合し、４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  １２４０分光光度計において測定した。
【０１９３】
生データは、表１中にあり、棒グラフとして図５にプロットしてある。
【０１９４】
【表１】
2017508444.tif 000003
【０１９５】
ＰＬＡ上でのＦｌａｇタグ化ＯＭＰ足場の使用
疎水性ポリマーとして、ポリ乳酸（ＰＬＡ）を、ＯＭＰタンパク質が結合され得る材料として良好な候補であるとみなした。これを評価するために、いくつかの３Ｄ印刷したＰＬＡディスクを、Ｋ  Ｄａｌｇａｒｎｏ博士（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得た。ディスクの構造は図６に示してある。
【０１９６】
ＰＬＡディスク上へのタンパク質吸着
疎水性４８ウェル・プレート（Ｎｕｎｃ）を使用して、処理の間ディスクを保持した。ＯＭＰ０（金結合を可能にするために１０位においてシステイン残基を含む、改変されたＯｍｐＡタンパク質；（Ｏｍｐ０の配列については、図１３を参照のこと））。（ロット９１０１２ＢＥ１２３１３）およびＯＭＰ５（ロット８９１０ＢＥ１８２１３）を、以前と同様に希釈された界面活性剤を含むＰＢＳ中に３２μＭに希釈した。６００μＬを、各ＰＬＡディスクに添加し、コントロール・ディスクを、タンパク質を欠く同じ溶液で処理した。この４８ウェル・プレートを、パラフィルムで密封し、４℃で１６時間貯蔵した。各ＰＬＡディスクを、無菌化した５００μＬの脱イオン水（ロット２５１０１３ＹＤ）で２回洗浄して、過剰な未結合のタンパク質を除去した。ＯＭＰ５は、細胞外ループ１中にＦＬＡＧエピトープを有するＯｍｐＡである。このＦＬＡＧエピトープは、ＤＹＫＤＤＤＤＫである。
【０１９７】
ＯＭＰ５の抗体検出
１：１０００希釈のＭ２抗ＦＬＡＧアルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート化抗体（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ９４６９；ロット０９１Ｍ６２８７）を、ＴＢＳ−Ｔ中で調製した。処理したＰＬＡディスクを、新たな４８ウェル・プレート（Ｎｕｎｃ）に移し、５００μＬの希釈された抗体を、各ＰＬＡディスクに添加した。室温で３０分間の後、抗体溶液を除去し、各ディスクを、５００μＬのＴＢＳ−Ｔ中で５分間、２回インキュベートした。５００μＬの１  Ｓｔｅｐ  ＰＮＰＰ試薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号；ロットＮＩ１４４７３６１２）を各ＰＬＡディスクに添加し、室温で５分間の後、この反応を、５００μＬの１Ｍ  ＮａＯＨ（ロット）の添加によって停止させた。２００μＬの溶液を、ＰＬＡディスクを含む各ウェルから取り出し、９６ウェル・プレートに移した。これらのウェルの吸光度を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣマイクロプレート・リーダーを使用して４０５ｎｍで測定した。
【０１９８】
生データは、表２中にあり、棒グラフとして図７にプロットしてある。
【０１９９】
【表２】
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【０２００】
ポリエステル繊維およびポリスチレン・プレート上にＥＣＭモチーフをディスプレイするためのＯＭＰ足場の使用
ＯＭＰが、金上に配向された単層としてアセンブルされた改変されたＯｍｐＡタンパク質であること７、およびβ−バレルへのインテグリン結合モチーフの付加が、金表面への細胞の結合を改善し得ること９が、以前に示されている。本明細書に詳述する実験では、ポリエステル繊維へのこれらのタンパク質の結合が、細胞の結合を改善するかどうかを試験した。
【０２０１】
エレクトロスピニングしたポリエステル繊維から製造されたディスクとの、ＯＭＰタンパク質の使用
ポリエチレン・コアと共に、エレクトロスピニングしたポリプロピレン繊維から製造されたディスクは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給されたものであり、タンパク質溶液から界面活性剤を除去するために透析を使用して、ＯＭＰ３６でコートした。ＯＭＰ３６は、ラミニン由来のＹＩＧＳＲモチーフを含む。タンパク質で処理した後、これらの繊維ディスクに細胞を播種し、結合した細胞の数を、顕微鏡によって評価した。
【０２０２】
タンパク質処理ポリマー繊維。
エレクトロスピニングしたポリマー・サンプルを、ＲＯＧ−８緩衝液中１０μｇ／ｍＬで５ｍＬのＯＭＰ３６（ロット２２６０５ＢＥ２３４０７）と共に、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｒｃディスポディアライザー（dispodialyser）（１５０００ダルトン分子量カット・オフ；ロット３２０５９２２）中に配置し、２連サンプルを、タンパク質なしＲＯＧ−８で処理した。透析バッグを、８００ｍＬの透析緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含む１リットルのビーカー中に配置し、マグネチック・スターラを使用して、溶液を穏やかに撹拌した。２時間、３０時間、３８時間および４日の時点で、透析緩衝液を除去し、新鮮な緩衝液で置き換えた。５日後、ポリマー・サンプルを、透析チュービングから取り出し、脱イオン水で洗浄した。
【０２０３】
細胞を用いて、エレクトロスピニングしたポリマー繊維を試験する
ポリマー・ディスクを、７０％エタノール中に１０分間浸漬して、細胞の添加の前にそれらを無菌化した；この後、ＰＢＳ（ロット１５３０７ＳＰ）中での短時間の洗浄を行って、任意の残留エタノールを除去した。ＰＣ１２ニューロン細胞（継代２７、約９０％コンフルエント）を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％胎仔ウシ血清を含む）中に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁した。
【０２０４】
３ｍｌの細胞を、２連のＯＭＰ３６処理したポリマー・ディスクおよびタンパク質なしＲＯＧ−８処理したポリマー・ディスクに添加した。これらの細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃で５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。１６時間後、これらのディスクを、４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒド（ＢＤＨ；ロットＫ３２２５９６４８）を含むＰＢＳ中に室温で１０分間浸漬し、その後、１μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（ロット５０３０７ＳＰ）を含むＰＢＳ中に３０分間浸漬させた。細胞を、蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
【０２０５】
ＤＡＰＩ染色は、各繊維状材料上の多数の細胞の核を明らかに示すが、ＯＭＰ３６処理した繊維上には、さらに多くの細胞が存在する。
【０２０６】
細胞による、ポリスチレン・プレート上の吸着されたＯＭＰ足場
上で、β−バレル化分子が、ポリエステル繊維上に吸着された場合であっても細胞結合を改善することがなおもできたことが示された。次いで、類似の効果が、プレート上でタンパク質を乾燥させることのみによって、ポリスチレン組織培養マルチ−プレート上で達成できるかどうかを試験した。
【０２０７】
ポリスチレン・プレートのタンパク質処理
６ウェルおよび１２ウェルの組織培養改変型（親水性）ＮｕｎｃｌｏｎΔプレート（Ｎｕｎｃ）を、４℃で１６時間、以前と同様に、０．２５％ＯＧを有するＰＢＳ中でＯＭＰ３６と共にインキュベートした。６ウェル・プレートは、１ウェル当たり５００μＬのタンパク質を含み、２４ウェル・プレートは、１ウェル当たり３００μＬのタンパク質を含んでいた。インキュベーション後、各ウェルを、脱イオン水で２回洗浄し、次いで、７０％エタノールをスプレーして無菌化した。これらのプレートを、細胞培養フード中に１０分間置いて、ほとんどのエタノールを蒸発させ、次いで、各ウェルを、無菌ＰＢＳで洗浄した。
【０２０８】
３Ｔ３マウス線維芽細胞を用いて、タンパク質処理したプレートを試験する
３Ｔ３線維芽細胞（継代１４７  約７０％コンフルエント）を、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して回収し、ダルベッコ改変イーグル培地（１０％胎仔ウシ血清を含む）１ｍｌ当たり５×１０４細胞で再懸濁した。６ウェル・プレート中の３つの未処理のウェルおよび３つのタンパク質処理したウェルに、各々、３ｍＬの細胞を播種した。２４ウェル・プレート中の４つの未処理のウェルおよび４つのタンパク質処理したウェルに、各々、７５０μＬの細胞を播種した。プレートを、加湿細胞培養インキュベーター中で３７℃で５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。１６時間のインキュベーション後、培地を、各プレートから廃棄し、４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒド（ＢＤＨ；ロットＫ３２２５９６４８）を含むＰＢＳ、室温で３０分間、その後、１μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（ロット５０３０７ＳＰ）を含むＰＢＳ中で１０分間とした。細胞を、蛍光顕微鏡を使用して可視化し、１ウェル当たり自由なランダムな視野中の細胞の数を計数した。
【０２０９】
データを、図９に示されるバー・チャートでプロットする。ＯＭＰ３６でポリスチレン・プレートを処理することで、ポリスチレンへの細胞の結合は改善される。
【０２１０】
細胞培養のための増殖因子のディスプレイのためのＯＭＰ足場の使用
第１の細胞培養実験は、表面への細胞の結合を増強することを標的としたが、タンパク質テクノロジーを、ＯＭＰ足場中へのより大きいタンパク質およびペプチドの挿入を可能にするために開発したので、本発明者らは、増殖因子などのかなり大きい標的を含めることに、本発明者らの興味を広げた。操作のための標的として選択した最初の２つの増殖因子は、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１、酸性ＦＧＦ）および線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２、塩基性ＦＧＦ）であった。本明細書に報告した研究には、ポリスチレン・プレートにＦＧＦ１およびＦＧＦ２を結合させ、マウス３Ｔ３線維芽細胞を用いて、効果を試験する実験が包含される。
【０２１１】
タンパク質処理ポリスチレン・プレート
５００μＬの２μＭタンパク質溶液を、０．２５％ｎ−オクチルグルコシドを含むダルベッコ・リン酸緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａから供給されたＤ−ＰＢＳ、ロット０９０５１２ＳＰ）中で調製した；ＯＭＰ０（ロット２３０５１１）、ＯＭＰ９０（ＦＧＦ１；ロット１７０８０９ＢＥ２０１００９）およびＯＭＰ１２８（ＦＧＦ２；ロット１２０１１１ＢＥ１７０１１１）。１００μＬの各タンパク質溶液を、９６ウェル・ポリスチレン・プレートのうちの４ウェルに添加し、これに、１ウェル当たり１００μＬのＤ−ＰＢＳが続いた。この９６ウェル・プレートを、パラフィルムで包み、４〜８℃で一晩貯蔵した。１６時間後、タンパク質溶液を除去し、各ウェルを、１００μＬの、脱イオン水中１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で洗浄し、その後、２回の１００μＬ脱イオン水洗浄を行った。この９６ウェル・プレートを、風乾し、次いでプラスチック中に密封し、４〜８℃で貯蔵した。
【０２１２】
３Ｔ３線維芽細胞を用いて、ＦＧＦ処理したプレートを試験する
マウス３Ｔ３線維芽細胞（継代１５７、約９０％コンフルエント）を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；１０％胎仔ウシ血清を含む）中に１×１０４細胞／ｍＬで再懸濁した。１２のタンパク質コートされたウェルおよび４つの未処理のウェルに、各々、２００μＬの細胞懸濁物を播種した。さらなる４つの未処理のウェルに、１２．５ｎｇ／ｍＬの可溶性ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む２００μＬの細胞懸濁物を播種した。細胞を播種したプレートを、加湿インキュベーター中で３７℃で５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。未結合の細胞を含む培地を廃棄し、４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒド（ＢＤＨ；ロットＫ３２２５９６４８）を含む１００μｌのＤ−ＰＢＳを、各ウェルに添加し、室温で３０分間の後、このＤ−ＰＢＳを、１００μＬのＣｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ溶液（Ｐｒｏ−Ｌａｂ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；ロットＫ１２５６０）で置き換え、さらに３０分間のインキュベーション後、この染色溶液を廃棄し、各ウェルを、１００μＬの脱イオン水で３回洗浄した。細胞を播種したウェルを、倒立顕微鏡を使用して試験し、１ウェル当たり１つのランダムな視野を選択して、全ての可視的細胞を計数した。
【０２１３】
データを以下の図１０に示す。ＯＭＰ９０（ＦＧＦ１）およびＯＭＰ１２８（ＦＧＦ２）の両方が、１２．５ｎｇ／ｍＬの可溶性ＦＧＦ２の存在下で線維芽細胞を培養する場合に観察される分裂促進効果を再現する。ポリスチレン・ウェルをＯＭＰ０（ＯｍｐＡ足場）で処理することは、２４時間後に観察される細胞の数に対して影響を有さない。ＯＭＰ９０および１２８の分裂促進効果は、タンパク質が、金コートされたカバー・ガラス上の配向されたタンパク質単層として自己アセンブルした場合、類似である。
【０２１４】
ベータ−バレル・タンパク質足場の操作されたバリアント
Ｌｅｃｋｂａｎｄ，Ｄ．およびＬａｎｇｅｒ，Ｒ．（１９９１）は、タンパク質の安定な固定化のためのアプローチを記載している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ３７：２２７−２３７）。本明細書に記載される研究は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯｍｐＡタンパク質の誘導体を用いて実施されてきた。
【０２１５】
発現クローンの構築
各場合において、アミノ酸の新規配列を、ＤＮＡ配列に戻し翻訳して、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のためにコドン最適化した。これらのＤＮＡ断片を、信頼のもとで、新規遺伝子の目的または機能のいずれの知識もなしに、外部請負業者Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって、カセットまたは遺伝子全体として合成した。各基礎の足場型についてのさらなる詳細は、以下に提供される（２．５．３．以降）。β−バレル・タンパク質の新規改変のための発現クローンの分子構築を、他（Ｓａｒｎｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ）に詳細に記載される標準的な分子生物学技術を使用して実施した。正確な構築物を、制限分析によって最初に同定し、信頼のもとで、配列の目的または機能のいずれの知識もなしに、外部請負業者Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって実施されたＤＮＡ配列決定によって検証した。これらの新規β−バレル・タンパク質を、以下のセクションに記載されるように、プラスチック上での固定化のための、目的の他のタンパク質およびペプチドの融合のための足場として使用した。
【０２１６】
ＨＩＶ  Ｐ２４抗原に融合させたＯＭＰ１７０型足場
このテクノロジーの顕著な利点を例示するために、本発明者らは、ＨＩＶ  ｐ２４タンパク質に融合したＯＭＰ１７０型β−バレル・タンパク質のバリアントを作製し、抗体による顕著に改善された認識を実証した。これらの実験は、Ｂｏｏｋ  ５５に記録されている。ＯＭＰ１７０およびＯＭＰ１７１は、トランケートされたループおよびトランケートされたＣ末端を有する２つの足場タンパク質である。これらはまた、システインをインタクトなままで有し、その結果、これらのタンパク質は、金およびプラスチックの両方の上で使用され得る。さらに、ＯＭＰ１７０は、Ｎ末端において、β−バレルから融合部位を分離するアルファ・ヘリックス・スペーサーを有する−これは、これらのドメインを分離し、より有効なリフォールディングを可能にする。このアルファ・ヘリックス・スペーサーは、ＩｇＧに結合しないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡのＢドメインの変異形態である。その構築は、Ｋｉｍら  Ｋｉｍ，Ｈ．Ｋ．（２０１０）Ｎｏｎｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０７：１８６３−１８７０によって報告されたＤドメインの変異バージョンに基づく。ＯＭＰ１７１と、アルファ−ヘリックス・スペーサーを有するＯＭＰ９であるＯＭＰ５９とのアラインメントは、図１１に示してある。
【０２１７】
融合タンパク質の構築および精製
主要サブタイプ（Ｃ、Ｂ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、ＣＲＦ０１＿ＡＧおよびＣＲＦ０３＿ＡＢ）由来のヒトＨＩＶ  Ｐ２４タンパク質コンセンサス配列を有する新規組換え融合タンパク質を、ＯＭＰ１７１足場タンパク質に融合させた（図１２）。ＯＭＰ足場への融合のためのＰ２４コンセンサスのコード配列を、アミノ酸配列を戻し翻訳し、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のためにコドン最適化することによって、生成した。これを、標準的な分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記）を使用して、足場コード配列とライゲーションさせた。ネイティブＰ２４は、Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ  Ｉｎｃから購入した組換えＨＩＶ  Ｐ２４抗原であった（カタログ番号ＨＩＶ−００７−Ｂ０６４６、ロットＨＩＶ１３０７５９）。ＯＭＰ１７１および１７３を精製し、以下に記載するように、封入体からリフォールディングさせた（以下の一般的方法を参照のこと）。
【０２１８】
プラスチック・プレート上での固定化
ネイティブＰ２４を、ＰＢＳ緩衝液中で４μｇ／ｍＬに希釈した。ＯＭＰ１７１および１７３を、０．２５％（ｗ／ｖ）ＯＧを含むＰＢＳ中で２μＭに希釈した。２００μＬの希釈されたタンパク質を、９６ウェルの未処理ポリスチレン・プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３３７０）のウェルに添加し、Ｐｏｌｙｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ  ＃４７５０９４）にも添加した。タンパク質を、４℃で一晩結合させ、次いで、２００μＬのオートクレーブした脱イオン水（ＳＤＷ）で３回洗浄し、即座に使用した。
【０２１９】
抗Ｐ２４抗体を用いた検出
２つの型のモノクローナル抗Ｐ２４抗体を、Ｃａｐｒｉｃｏｒｎから購入した：１．マウス由来の抗ＨＩＶ１−Ｐ２４モノクローナル抗体（カタログ番号ＨＩＶ−０１８−４８２９４、ロットＨＩＶ１２２９３６）；２．マウス由来の抗ＨＩＶ１／２  Ｐ２４モノクローナル抗体（カタログ番号ＨＩＶ−０１８−４８３０４、ロットＨＩＶ１１１６４１）。
１．ウェルを、ＴＢＳ−ＴＢでブロッキングした。室温で３０分間。
２．２つの抗体を、各々、ＴＢＳ−ＴＢ中で０．５、１、１０、５０、１００、５００および１０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。２００μｌの各濃縮物を、各型の抗原表面の３つのウェルに添加した。ゼロ・コントロールを、ＴＢＳ−ＴＢ単独の添加によって、各表面上で実施した。室温で３０分間。
３．これらのウェルを、２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
４．２００μＬの、ＴＢＳ−ＴＢ中１／１００００希釈の二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３６８８、ロット１０３Ｋ９１５７）を、各ウェルに添加した。室温で３０分間。
５．これらのウェルを、２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
６．１００μＬのｐ−ニトロフェニルリン酸液体基質（Ｓｉｇｍａ）を、各ウェルに添加した。室温で１５分間。
７．各ウェルへの５０μＬの３Ｍ  ＮａＯＨの添加によって反応を停止。
８．プレート・リーダーを使用してＡ４０５を測定。
【０２２０】
データ・プロットは図１３に示してある。表面に直接吸着されたネイティブＰ２４抗原は、ポリスチレン・プレート上では、いずれの抗体によっても全く認識されなかった。Ｐｏｌｙｓｏｒｐプレート上で、ネイティブＰ２４は、両方の抗体でシグナルを示したが、抗ＨＩＶ１−Ｐ２４モノクローナルによるシグナルは、抗ＨＩＶ１／２  Ｐ２４と比較してかなり低かった。β−バレル足場との融合物として提示されるＰ２４タンパク質は、両方の抗体で、両方の型のプレート上で優れた結果を生じた。これらの結果は、ネイティブＰ２４と比較して、予測よりもかなり良好であり、足場単独（ＯＭＰ１７１）に対する非特異的結合は存在しなかった。これらのデータは、β−バレル足場アンカーを介して表面に結合されたＰ２４が、最もあり得ることには活性なアクセス可能な配向での正確な構造の提示に起因して、ネイティブＰ２４と比較して、抗体認識について高度に機能的であることを示している。有利な効果は、本発明者らが予測した、または可能であると考えたものよりも、かなり大きかった。従って、このβ−バレル足場テクノロジーは、表面上に固定化された場合の融合パートナーの機能の保持の重要な要件を満たし、現在の技術水準を顕著に改善する。
【０２２１】
小さいペプチド・モチーフのディスプレイのための改変されたβ−バレル足場
３〜５０アミノ酸の小さいペプチド・モチーフのディスプレイは、より大きいタンパク質と比較して、異なる課題を提示する。これらは、表面から十分に持ち上げられない可能性があり、隠されたままであり得、バルク・タンパク質中においてアクセス不能であり得る。小さいモチーフのディスプレイの主要な適用のうちの１つは、そのモチーフが細胞表層の成分と相互作用するのに十分に露出される必要がある細胞培養においてであるので、これは不利である。
【０２２２】
この目的のために、本発明者らは、親水性アミノ酸および半剛性ＰＴリンカーにより伸長されたループ上での小さいモチーフの挿入を可能にする足場骨格を設計した（ＯＭＰ１５４型）。このＰＴリンカーは、天然に存在するアミノ酸配列である（Ｐｏｏｎ，Ｄ．Ｋ．Ｙ．ら（２００６）Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  Ｌｉｎｋｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ  Ｘｙｌａｎａｓｅ  Ｃｅｘ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：２０９１−２０１１）
【０２２３】
融合タンパク質の構築および精製
ＯＭＰ０足場タンパク質を改変して、４つの細胞外ループのうち３つを除去し、基本的な改変された足場を、ＯＭＰ１５４と名付けた。ＯＭＰ０とＯＭＰ１５４との間の差異は、図１４のアラインメント中に示してある。
【０２２４】
ＯＭＰ１５４をコードする遺伝子を、ＩＤＴにおいて合成し、クローニングし、標準的な分子生物学手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記）を使用して検証し、本発明者らの標準的な方法（以下の一般的方法を参照のこと）を使用して精製した。
【０２２５】
ＯＭＰ１５４骨格足場タンパク質が完成したところで、表３に示されるように、種々の挿入をその中に作製した。
【０２２６】
【表３】
2017508444.tif 000005
【０２２７】
これらのタンパク質を、完全コード配列の遺伝子合成によって、または標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記）を使用し、ｐＯＭＰ１５４発現プラスミドにおけるループの中央のクローニング部位中に、目的のモチーフをコードする小さい二本鎖オリゴヌクレオチド・カセットを挿入することによって作製した。これらのタンパク質を、以下の一般的方法という表題のセクションに記載されるように、発現および精製した。
【０２２８】
ポリスチレン上での小さいペプチド・モチーフの固定化
１μＭのタンパク質を、以前と同様に、希釈界面活性剤溶液を含むＰＢＳ中で調製した。これを、以前と同様に、ウェル・プレートの各ウェルに添加した。１６時間後、各ウェルを、２００μＬの無菌化脱イオン水で２回洗浄して、過剰な未結合のタンパク質を除去した。
【０２２９】
小さいペプチド・モチーフで処理したプレート上でのＭＧ６３細胞の培養
タンパク質処理した９６ウェル・プレートに、７０％エタノールをスプレーし、細胞培養フード中に１０分間置いて、エタノールを蒸発させた。次いで、各ウェルを、Ｄ−ＰＢＳで洗浄して、任意の未蒸発のエタノールを除去した。ＭＧ６３骨肉腫細胞（継代５）を、約８０％コンフルエントまで増殖させ、その後、それらを、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収した。細胞を、ＤＭＥＭ（１０％胎仔ウシ血清を含む）中に１×１０４細胞／ｍＬで再懸濁した。１００μＬの細胞懸濁物を、９６ウェル・プレートの各ウェルに添加し、次いで、このプレートを、加湿細胞培養インキュベーター中で３７℃で５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした。
【０２３０】
小さいペプチド・モチーフで処理したプレート上で培養した細胞の定量化
各ウェル中の結合した細胞の数の半定量的評価を可能とするために、ＰＮＰＰアッセイを使用し、細胞内酸性ホスファターゼを利用してＰＮＰＰ試薬の色変化を生じさせた。ＰＮＰＰ試薬を、ＰＮＰＰ試薬緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；ロット２２０１１３ＳＰ）中に１ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ（ＳｉｇｍａロットＳＬＢＣ５４６６Ｖ）を溶解させることによって調製した。細胞培地を、全てのウェルから除去し、１００μＬのＰＮＰＰ試薬を各ウェルに添加し、この９６ウェル・プレートを、アルミ・ホイル中に包み、３７℃で２時間インキュベートした。この反応を、各ウェルへの１０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨ（ロット０２１１１１ＤＳ）の添加によって停止させた。穏やかな振盪後、８５μＬを、各ウェルから新たな９６ウェル・プレートに移し、４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣプレート・リーダーを使用して測定した。
【０２３１】
これらの結果は、本発明者らが、異なるタンパク質からの広範な効果について予測したことと一致しており、ＯＭＰ１５４は、表面の疎水性を低減させ、従って細胞が結合するのをより容易にすることによって、ブランク・ウェルと比較して細胞結合を改善する。類似のレベルの改善が、試験したタンパク質のうちの大きな割合で見られる。ＭＧ６３細胞は、表面のＯＭＰ１５３、１７７および１７８上で増殖させた場合に、ＯＭＰ１５４と比較して、増強された細胞結合を示す。ＯＭＰ１５３は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチンなどにおいて見出される、多数の異なる細胞型と相互作用する非常に強力なインテグリン結合モチーフであるＲＧＤＳモチーフをディスプレイする。ＯＭＰ１７７および１７８は共に、石灰化した骨において見出されるＥＣＭ成分、ビトロネクチン・モチーフをディスプレイする。これらの結果は、ＯＭＰ１５４ベースのタンパク質が、細胞が相互作用するためにアクセス可能な方法で、それらの操作されたモチーフをディスプレイすることを明確に示している。試験したタンパク質のいくつかを用いると、骨肉腫細胞株ＭＧ６３の結合が顕著に増強される。
【０２３２】
増殖因子に融合させたＯＭＰ１４０型足場
組織培養プレート上での固定化された増殖因子の提示のための、このテクノロジーの顕著な利点を例示するために、本発明者らは、表４に列挙したような種々の増殖因子に融合させたＯＭＰ１４０型β−バレル・タンパク質のバリアントを作製した。ＯＲＬ１４０は、トランケートされた細胞外ループおよびトランケートされたＣ末端を有する足場タンパク質である。これはＣ末端においてｈｉｓタグを有し、これにより、全長の発現されたタンパク質のみがｈｉｓタグを有し、金属アフィニティ・クロマトグラフィーによって精製され得ることが保証される。これは、増殖因子などの大きいタンパク質の融合を可能にし、大きいタンパク質を過剰発現する場合に生じ得る中途翻訳停止に関する懸念を緩和する。これはまた、システイン残基が除去されている。ほとんどの増殖因子は、構造および機能の維持に必須の多数の内部ジスルフィド架橋を有する；足場中に存在するシステインは、これらの特異的ジスルフィド架橋の形成を妨害し得、足場のシステインなしバリアントは、この問題を緩和する。
【０２３３】
Ｃ末端Ｈｉｓ−タグ、システイン残基の欠如、およびＣ末端ＮＱ残基の欠如を別にすれば、ＯＭＰ１４０は、ＯＭＰ１７１と同一であることに留意のこと（図９を参照のこと）。
【０２３４】
融合タンパク質の構築および精製
ＯＭＰ１４０コード配列を、ＩＤＴによって合成し、標準的な方法（ｓａｍｂｏｏｒｋ、上記）を使用して発現ベクター中にクローニングした。ＯＭＰ１４０との一連の新規融合タンパク質を、それらが融合タンパク質のＮ末端にあるように、増殖因子をコードする合成カセット（ＯＭＰにおいて設計し、Ｅ．ｃｏｌｉのためにコドン最適化した）をｐＯＭＰ１４０中にライゲーションすることによって作製した。今日までに作製した構築物のリストは、表４に示してある。
【０２３５】
【表４】
2017508444.tif 000006
【０２３６】
これらのタンパク質を、セクション３．１に記載したように発現および精製したが、それらのためのリフォールディング条件は変動した：標準的なリフォールディング緩衝液に、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．４Ｍアルギニンを補充した。
【０２３７】
一般的方法
タンパク質の精製およびリフォールディング
ＯＭＰタンパク質を、１リットルのＬＢ選択的培地におけるＩＰＴＧ誘導によって、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株において封入体として発現させた。細胞を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で溶解し、封入体を、Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ中の洗浄プロトコールを使用して富化した。
【０２３８】
封入体を、ＨＴＢＢ緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、８Ｍ尿素ｐＨ７．４、濾過および脱気した）中に可溶化した。可溶化した調製物を、予めプログラミングした結合−洗浄−溶出方法を使用して、画分収集器を備えたＡＫＴＡＰｒｉｍｅシステムで、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での固定化された金属アフィニティ・クロマトグラフィーによって精製した−この溶出は、ＨＴＢＢ＋２５０ｍＭイミダゾール中でのステップ溶出であった。溶出からのピーク画分を収集し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって純度を決定した。目的のタンパク質について９５％を越えて均一であると思われる画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濃縮器を使用して濃縮して、１ｍＬ未満の容積にした。精製されたタンパク質を、リフォールディング緩衝液（５０ｍＭエタノールアミン、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＯＧ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中への希釈（少なくとも１０分の１の係数）によってリフォールディングした。
【０２３９】
リフォールディングの程度を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上でのバンドシフトによって推定し、さらなる検証を、必要に応じて、円二色性分光法および機能的アッセイによって実施した（本明細書では示さず）。
【０２４０】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル、緩衝液および染色剤を、製造業者の指示に従って使用した。
【０２４１】
ＯＭＰ１８の結合に対する界面活性剤の影響
界面活性剤の影響を試験するために、本発明者らは、ＯＭＰタンパク質をポリスチレン表面に結合させることにおけるそれらの適切性について、生物学において一般に使用されるいくつかの界面活性剤を検討した。
【０２４２】
以下の表５は、界面活性剤およびそれらの特性を列挙している。
【０２４３】
【表５】
2017508444.tif 000007
【０２４４】
界面活性剤の現実的な比較を得るために、本発明者らは、濃度を決定するための係数としてＣＭＣを使用し、例えば、２２．５ｍＭのＯＧを１×ＣＭＣとして規定する、または０．３ｍＭのＤＭを、２×ＣＭＣとして規定するなどした。
【０２４５】
第１の実験では、３つ全ての界面活性剤を、ＣＭＣ周辺の種々の濃度で使用して、６時間または２４時間にわたってＯＭＰ１８を固定化し、上記のように免疫検出を実施した。１μＭ濃度のＯＭＰ１８タンパク質を、２×ＣＭＣの界面活性剤を含むＰＢＳ中で調製した。これを、一連の希釈で９６ウェル・プレートのウェルに添加して、各界面活性剤について、２×、１×、０．５×および０．２５×ＣＭＣを得た。
【０２４６】
１セットのウェルを洗浄し、６時間後に処理し、第２のセットを２４時間インキュベートした。洗浄乾燥後、イムノアッセイを、１μｇ／ｍＬの単一マウスＩｇＧ濃度を用いた以外は、上記のように実施した。
【０２４７】
データは、図２２中にグラフで示してある。
【０２４８】
ＣＭＣ以上の高い界面活性剤濃度では、イムノアッセイからの低いシグナルによって示されるように、表面へのタンパク質の結合はほとんど存在しない。全ての場合において、沈殿は、最も低い界面活性剤濃度では観察されなかった。
【０２４９】
各場合において、Ｏｒｌａタンパク質との６〜２４時間のインキュベーションは、最適な結果を生じた。
【０２５０】
ＯＭＰ１８濃度の影響
この実験は、表面性能に対するＯＭＰ１８濃度の影響を決定することを目的とした。特定の適用のために表面上のタンパク質の量を制限することが有用であり得、表面密度を制御する能力が望まれる。
【０２５１】
ＯＭＰ１８を、９６ウェルの未処理のポリスチレン・プレートのウェルにおいて、ＰＢＳ緩衝液中０．１２５×ＣＭＣの界面活性剤中に異なる濃度で希釈した。各ウェルは、２００μＬの溶液を有し、プレートを、４℃で一晩インキュベートした。洗浄および乾燥の後、免疫検出を、１μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを用いて、上記のように実施した。
【０２５２】
データは、図２３中にグラフで示してある。
【０２５３】
このデータは、表面が、１００ｎＭでのタンパク質の添加によって飽和に近いこと、およびタンパク質濃度（および上に示したような界面活性剤濃度）を変動させることによって被覆度を制御することが可能であることを示している。
【０２５４】
表面上でのパターン・スポッティング
例えばアレイ化、細胞培養、薬物発見などの多数の適用のために、表面上にタンパク質のパターンを作製することが有用である。本明細書に記載される方法は、印刷およびパターン化に適用可能であるべきである。
【０２５５】
１０μＬスポットのＯＭＰ９（コントロール・タンパク質）およびＯＭＰ１８（ＯＭＰ９足場上のＩｇＧ結合ドメイン）を、６ウェル・ポリスチレン・プレートの底にピペッティングし、ＲＴで湿度チャンバ上に一晩吸着させた（スポットは、これらの条件では一晩では乾燥しなかった）。
【０２５６】
タンパク質は、各スポットにおいて、０．４×ＣＭＣの界面活性剤中５μＭの最終濃度であった。これらのウェルを、２×２ｍＬ  ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、水で１回洗浄して乾燥させた。
【０２５７】
２ｍＬ  ＴＢＳ−Ｔ＋３％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。
【０２５８】
次いで、ＴＢＳ−Ｔ＋３％ＢＳＡ中０、０．１または１μｇ／ｍＬの、１ｍＬのマウスＩｇＧを、各ウェルに添加し、１５分間インキュベートした。
【０２５９】
ＴＢＳ−Ｔによる３×２ｍＬの洗浄後、１ｍＬの抗マウスＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートの１／１００００希釈を添加し、ＲＴで１５分間インキュベートした。
【０２６０】
これらのウェルを、３×２ｍＬのＴＢＳ−Ｔで洗浄し、水で１回洗浄した。
【０２６１】
ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を添加し（０．５ｍＬ）、ＲＴで１５分間インキュベートした。
【０２６２】
反応を、３×２ｍＬの水で洗浄することによって停止させ、ウェルを乾燥させた。
【０２６３】
プレートのスキャンは図２５に示してある。暗い影は、タンパク質が結合した領域を示す。これらは、スポットを配置した場所に対応する。
【０２６４】
この場合、１０μｌの溶液は、５．５ｍｍの平均直径でスポットへと広がった。このスポットのサイズは、細胞培養適用にふさわしい。より高い濃度で、より低い容積のタンパク質を使用することによって、より小さいスポットを作製することが可能であるはずである。ポリクローナル抗体とＯＭＰ９とのいくらかの交差反応性が通常は存在することに留意されたい。
【０２６５】
これらのデータは、表面上にＯＭＰタンパク質を固定化するための方法が、より正確で洗練されたパターン化およびリトグラフ技術に適用可能であるはずであることを示唆している。
【０２６６】
Ｏｍｐタンパク質によるポリスチレン・ビーズの官能化
本発明者らは、平面プラスチック表面上でのＯＭＰタンパク質の改善された機能を実証しており、機能におけるこれらの利点および改善が、バイオプロセシングなどの多数の適用において重要な粒子およびビーズ上で再現できるかどうかを試験することが望まれた。これを例示するために、本発明者らは、ＯＭＰ８５タンパク質（Ｏｍｐ足場に融合されたプロテインＧドメイン）またはそのネイティブ形態のブドウ球菌プロテインＡでポリスチレン・ビーズをコートし、コートされたビーズを捕捉剤として使用して、ヒト血清からＩｇＧを精製することを試みた。
【０２６７】
１μｍ直径のポリビーズを、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．から取得した。０．５ｇのポリビーズの懸濁物を、２０ｍＬのＰＢＳ＋０．０１％ＳＤＳにおいて作製して、２．５％固体、即ち、４．５５×１０１０粒子／ｍＬを含む調製物を得た。ポリビーズへのプロテインＡまたはＯＭＰ８５の結合を、１ｍＬの２．５％ポリビーズ、０．５ｍｇのタンパク質および０．１２５×ＣＭＣの濃度のドデシルマルトシド（ＤＭ）を含むＰＢＳの、２ｍＬの最終容積において実施した。さらなる「未処理」サンプルを、１ｍＬのポリビーズおよび１ｍＬのＰＢＳを混合することによって調製した。全てを、完全に混合した後４℃で一晩放置した。ポリビーズを遠心分離し、１ｍＬのＴＢＳ−Ｔ中での再懸濁および遠心分離によって３回洗浄した。次いで、各ペレットを、０．５ｍＬのＴＢＳＴ中に再懸濁し、０．５ｍＬのヒト血清を添加し、ＲＴで１０分間インキュベートした。ポリビーズを遠心分離し、ペレットを、４×１ｍＬ  ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。上清を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上での分析のために保存した。結合したＩｇＧを、１ｍＬの５０ｍＭ酢酸Ｎａ  ｐＨ２．５中での、洗浄されたペレットの再懸濁によって溶出させ、その後、即座に遠心分離および５０μＬの３Ｍ  ＮａＯＨによる上清の中和を行った。
【０２６８】
サンプルを、図２６に示されるように、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で分析した。ポリビーズ実験からのサンプルのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。５μｌのヒト血清をレーン１にロードし、全ての他のレーンは、１ｍＬサンプルのうち２０μＬをロードした。ＨＳＡは、ヒト血清アルブミンである。ＶＨは、約５０ｋＤａのＩｇＧの重鎖であり、ＶＬは、約２５ｋＤａの軽鎖である。これらのサンプルは、１ｍＭ  ＤＴＴと共にＳＤＳローディング色素中にあり、９５℃で５分間加熱した。未処理のビーズからの溶出中にはＩｇＧは存在しないが、ＯＭＰ８５処理したビーズは、溶出中に精製されたＩｇＧを含んでいた。プロテインＡ処理したビーズもまた、精製されたＩｇＧを有していたが、かかる少量では、これらは、上に示されるゲル・スキャン中においては可視的ではない。これは、ＯＭＰ８５が、ポリビーズに結合でき、ＩｇＧ結合について高度に機能的であることを明らかに実証した。
【０２６９】
種々の薬剤による洗浄に対する、タンパク質コートされた表面の耐久性
改変されたＯｍｐタンパク質でコートされた表面の耐久性を試験するために、本発明者らは、一般に使用される洗浄剤および清浄剤に対する、コートされた表面のレジリエンスを試験した。ウェル・プレートを、標準的なプロトコールを使用してｏｍｐタンパク質でコートし、次いで、清浄剤で洗浄し、その後、上記のように免疫検出した。予備実験では、ＯＭＰ２０３でコートされたウェルを、異なる濃度のＳＤＳで５分間洗浄し、アルカリ・ホスファターゼにコンジュゲート化された抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体による検出を実施した。結果は図２７に示す。
【０２７０】
０％ＳＤＳのウェルを、ＳＤＷで洗浄した。全ての洗浄は、３連で実施し、示されるデータは、３つのウェルの平均である。ＰＮＰＰ基質溶液との反応を１５分間実施させたので、３Ａ４０５単位よりも大きい非常に高い読み取りが存在する。結論：ＳＤＳは、タンパク質の顕著な量を除去せず、このことは、タンパク質が一旦プラスチック表面に結合されると、それらが強力な界面活性剤によって取って代わられることはないことを示している。
【０２７１】
類似の実験を、ＯＭＰ２０３およびＯＭＰ１８でコートされたウェルに対して実施したが、今回は、異なる濃度のＴｗｅｅｎ  ２０を使用した。データは図２８に示してある。これらのタンパク質は、Ｔｗｅｅｎ  ２０による洗浄に対してレジリエントであることがやはり証明された。最も標準的なＥＬＩＳＡプロトコールは、複数回の界面活性剤洗浄を必要とするので、１〜７サイクルの洗浄の影響を試験した。ＯＭＰ２０３コートされたウェルを、変動する回数の界面活性剤含有溶液の洗浄で洗浄した（Ｂｏｏｋ  ５９  ｐ４４、ｐ５５）。３つのウェルの１セットを水（ＳＤＷ）で洗浄したが、他のウェルは、界面活性剤で最大７回まで洗浄した。データは図２９に示す。
【０２７２】
種々の他の洗浄条件もまた試験した。プレートを、ＯＭＰ１８またはＯＭＰ２０３のいずれかでコートした。今回、ウェルを、試験洗浄溶液と共にＲＴで１５分間インキュベートし、その後、水で洗浄し、上記のように検出アッセイを完了した。ＯＭＰ１８アッセイは、マウスＩｇＧの結合と、その後の抗マウスＡＰコンジュゲートによる検出とを必要としたことに留意のこと。結果は図３０に示す。Ｘ軸の下に示されるような種々の薬剤による洗浄後の、イムノアッセイからのデータ。ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドである；Ａｒｇ−アルギニン；ＯＧ−オクチルグルコシド；ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸である；Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（商標）ＩＩを使用した。未処理のウェルは水だけで洗浄したことに留意のこと。各データ・ポイントは、３つのウェルからの読み取りの平均である。試験した洗浄条件が、表面から顕著な量のタンパク質を除去できたことに留意のこと。
【０２７３】
このデータは、苛酷な薬剤、例えば、ＨｅｌｌｍａｎｅｘＩＩ（登録商標）、強力な酸、強力な塩基、カオトロープ、例えば、尿素およびアルギニン、ならびに一般的な界面活性剤および溶媒による洗浄にさらされたポリスチレンに結合したｏｍｐタンパク質のレジリエンスを実証している。ポリスチレンへのＯＭＰタンパク質の結合は、非常に頑強であり、取って代わることが困難である。洗浄剤へのより長期の曝露の影響を試験するために、ＯＭＰ２０３でコートされたプレートを、洗浄剤と共に一晩インキュベートし、抗ＦＬＡＧ−ＡＰコンジュゲートによるイムノアッセイによって分析した。結果は図３１に示してある。
【０２７４】
読み取りは、やはり非常に高く、プレート・リーダーについての飽和限界を上回った。しかし、以前のデータと比較して、ウェル間により高い程度のバリエーションが存在し、３Ｍ  ＮａＯＨ浸漬は、顕著に低減されたシグナルを有し、これは、３Ｍ  ＮａＯＨ浸漬が、表面結合したタンパク質を除去または破壊したことを示している。それにもかかわらず、表面結合したＯＭＰ２０３タンパク質は、苛酷な界面活性剤緩衝液、例えば、薄めていないＨｅｌｌｍａｎｅｘＩＩ、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、８Ｍ  尿素、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む他の全ての薬剤中での一晩の浸漬において、異常なレジリエンスを実証した。
【０２７５】
Ｏｒｌａタンパク質コートされたポリスチレンへの、細胞の増強された結合
種々の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）由来モチーフ（表の裏面を参照のこと）をディスプレイするＯＭＰタンパク質を、本発明者らの標準的なプロトコールを使用して、Ｓａｒｓｔｅｄｔ疎水性９６ウェル・プレートの３連のウェルにおいてコートした。これらのプレートに、７０％エタノールをスプレーし、細胞培養キャビネット中に配置し、１０分後、残留エタノールを廃棄し、各ウェルを、２００μＬのダルベッコ・リン酸緩衝食塩水で洗浄した。ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞を、トリプシンを使用して７５ｃｍ２の細胞培養フラスコから回収し、タンパク質コートされたウェル上に播種し、１×１０４細胞／ｍＬを含む細胞懸濁物２００μＬを、各ウェルに添加した。これらの細胞を、加湿細胞培養インキュベーター中で３７℃で一晩インキュベートした。
【０２７６】
【表６】
2017508444.tif 000008
【０２７７】
１６時間のインキュベーション後、各ウェル中の結合した細胞の数を、酸性ホスファターゼ・アッセイを使用して評価した。このアッセイでは、細胞を、界面活性剤を含む酸性緩衝液で破壊する。これは、細胞内の酸性ホスファターゼを露出させ、この酵素は、無色のパラ−ニトロフェニルリン酸（Ｐｎｐｐ）を、黄色化合物パラ−ニトロフェノールに変換する。ウェル中のより多くの細胞は、４０５ｎｍにおける光の吸光度を測定することによって容易に検出され得る、パラ−ニトロフェノールへのＰｎｐｐの変換の増加を引き起こす。
【０２７８】
培地を、各ウェルから除去し、１００μＬの、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１ｍｇ／ｍＬ  Ｐｎｐｐを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５を、各ウェルに添加した。このプレートを、アルミ・ホイル中に包み、３７℃で２時間インキュベートした。この反応を、各ウェルへの１０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって停止させた。各ウェルからの８５μＬ溶液を、新たな９６ウェル・プレートに移し、４０５ｎｍにおける吸光度を、プレート・リーダーを使用して測定した（Ｂｏｏｋ  ５８  ｐｐ１０−２５）。
【０２７９】
図３２は、種々のＥＣＭモチーフをディスプレイするＯｒｌａタンパク質でコートされたポリスチレン上でのＭＧ６３細胞の培養の結果を示す。
【０２８０】
結論；異なるサイズの、異なるＥＣＭタンパク質由来のＥＣＭモチーフをディスプレイするＯＭＰタンパク質は、コントロールＯＭＰ１５４タンパク質でコートされたウェルと比較して、結合したＭＧ６３細胞の数を増加させることができる。
【０２８１】
３Ｄポリスチレンのタンパク質官能化
ポリスチレン・プレートに使用した標準的なポリスチレン・コーティング・プロトコールは、３Ｄ細胞培養材料Ａｌｖｅｔｅｘ、Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ  Ｌｔｄ．の商標などの他のポリスチレン材料をコートするタンパク質に適合させ得る（図３３を参照のこと）。
【０２８２】
Ａｌｖｅｔｅｘ（Ｂｏｏｋ  ５２  ｐｐ１３７−１４１）の表面積がより広いことに対応するために、使用するタンパク質濃度は、１．６μＭから１５μＭに上昇させた。Ａｌｖｅｔｅｘの３つのサンプルを、コントロールｏｍｐＡタンパク質で処理し、３つを、ＩｇＧ結合タンパク質ＯＭＰ８５で処理した。処理したサンプルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）２ｍＬで２回洗浄した。アルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート化抗マウスＩｇＧを、ＴＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００希釈し、５００μＬの希釈抗体を、各Ａｌｖｅｔｅｘサンプルに添加し、室温で１時間インキュベートした。各サンプルを、５００μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、その後、６００μＬのパラ−ニトロフェニルリン酸（Ｐｎｐｐ）試薬を添加した。１０分後、１ｍＬのＰｎｐｐ試薬を、各ウェルから取り出し、４０５ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。
【０２８３】
図３４：ＯＭＰタンパク質で処理された３Ｄポリスチレン上でのアルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート化ＩｇＧの検出。
【０２８４】
結論：３ＤポリスチレンをＯＭＰ８５で処理することで、コントロールｏｍｐＡタンパク質でコートされた表面と比較して、ＩｇＧの結合は増加する。
【０２８５】
ＯＭＰタンパク質は、多数の異なる形式のポリスチレン；２Ｄプレートならびにフラスコ、ビーズおよび３Ｄ構造を官能化するために使用できる。
【０２８６】
ポリ（乳酸）へのタンパク質結合
今日までの研究のほとんどは、種々の形式のポリスチレンに対するｏｍｐＡタンパク質の使用を試験してきた。タンパク質結合のための同じ方法が、ポリ乳酸（ＰＬＡ）などの他の材料をタンパク質コートするために使用され得る。この例では、ＦＬＡＧエピトープをディスプレイするｏｍｐＡ、ＯＭＰ５を、ポリスチレンに使用したのと同じ希釈方法を使用して、３Ｄ印刷したＰＬＡ３の３ｍｍ×８ｍｍの足場上に固定化した（Ｂｏｏｋ  ５８  ｐｐ２８−５３）。
【０２８７】
図６は、３Ｄ印刷した２ｍｍ×８ｍｍのＰＬＡディスクのクロス・ハッチ構造を示す。
【０２８８】
１８個のＰＬＡディスクを、ＦＬＡＧエピトープをディスプレイするように改変されたｏｍｐＡ、ＯＭＰ５で処理したが、これは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して容易に検出され得る。ＯＭＰ５の３２μＭ溶液を調製し、３７．５μＬのタンパク質および５６２．５μＬのリン酸緩衝食塩水を、各ＰＬＡディスクに添加した。これらのディスクを、４〜８℃で一晩インキュベートし、次の日に、これらを５００μＬの無菌脱イオン水で３回洗浄した。これらのディスクを、３つずつ６群に分割し、各群を、異なる日数にわたって、３７℃でＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の１％溶液中に浸漬させた。
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による処理なし
・１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１日間
・１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で２日間
・１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で３日間
・１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で４日間
・１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で７日間
【０２８９】
各時点において、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を、全てのサンプルにおいて、除去し置き換えて、サンプルから除去された任意のタンパク質の再結合を防止した。
【０２９０】
終了時点において、全てのディスクを、５００μＬのＴＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、１μｌ／ｍＬのＭ２アルカリ・ホスファターゼ・コンジュゲート化抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧを含む５００μＬ中で室温で３０分間インキュベートした。各ディスクを、５００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いで、新たな４８ウェル・プレートに移した。５００μＬのＰｎｐｐ試薬を、各ディスクに添加し、室温で１０分間の後、この反応を、５００μＬの１Ｍ  ＮａＯＨの添加によって停止させた。
【０２９１】
２００μＬのＰｎｐｐ試薬を、各ディスクから取り出し、９６ウェル・プレート中に配置し、全てのサンプルの４０５ｎｍにおける吸光度を、プレート・リーダーを使用して測定した。
【０２９２】
図３５は、数日間の液浸１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００後のＰＬＡ上のＯＭＰタンパク質の抗体検出を示す。
【０２９３】
結論：ＯＭＰ５でＰＬＡを処理することで、ＰＬＡへのＭ２抗ＦＬＡＧ抗体の結合は増加する。
【０２９４】
ＯＭＰ５処理したＰＬＡを１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に１日間浸漬することで、ＰＬＡへのＭ２抗ＦＬＡＧ抗体の結合は減少される。ＰＬＡを１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に任意のより長い間浸漬することで、抗体結合がさらに低減されることはない。
【０２９５】
タンパク質の事前希釈
プラスチック表面へｏｍｐ足場を結合させるための方法は、界面活性剤の希釈に依存する。標準的なプロトコールは、ｉｎ  ｓｉｔｕでの希釈を必要とする、即ち、希釈剤が、表面に最初に添加され、次いで、タンパク質溶液が、希釈剤に添加される。この２ステップ・プロセスは、マイクロ液滴（microdroplet）またはナノ液滴（nanodroplet）パターン化などの一部の技術では、正確に達成することは困難である。この場合、ｅｘ  ｓｉｔｕで事前希釈し、単一液滴として表面に適用することが望ましい。変性したｏｍｐタンパク質は溶液から沈殿し脱落するので、それらが界面活性剤なしの緩衝液中に直接希釈できないことは知られている。
【０２９６】
しかし、界面活性剤中に貯蔵されたリフォールディングされたタンパク質の希釈の影響は、知られていない。事前希釈および短期貯蔵の影響を試験するための一連の実験を実施した。
【０２９７】
ａ）動的光散乱
０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質ｏｍｐ２０８の溶液を、２×ＣＭＣ（０．３ｍＭ）のＤＭ（ドデシルマルトシド）を有するＰＢＳ中で調製した。この溶液中のタンパク質の平均粒子サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ−ｎａｎｏ機器での動的光散乱測定によって、７．９ｎｍ（±０．９ｎｍ）であると決定された。
【０２９８】
次いで、ｏｍｐ２０８の２ｍｇ／ｍＬ溶液の２０×希釈を、ＰＢＳを含むキュベット中で行い、平均粒子サイズを、１時間の過程にわたってモニタリングした。この実験を２回実施し、３回の読み取りを、各時点において取得した。データは図３６に示す。
【０２９９】
図３６は、動的光散乱実験からのデータを示す。このプロットは、１時間の過程にわたる平均粒子サイズの変化を示す。
【０３００】
このデータは、希釈後に、粒子サイズが、約８ｎｍから４５〜５５ｎｍに増加するが、その後、このレベルで１時間安定であったことを示している。これらのデータは、希釈の直後に幾分かの凝集が存在するが、凝集体が、少なくとも１時間にわたって４５〜５５ｎｍの定常状態にあることを示している。
【０３０１】
ｂ）事前希釈後のイムノアッセイ
本発明者らは、事前希釈が、プラスチック表面へのｏｍｐタンパク質の物理吸着に影響を与えるかどうかを試験した。ｏｍｐ２０３の希釈を行った：２μＭのｏｍｐ２０３、ＰＢＳ中０．１×ＣＭＣのＤＭ。希釈直後に、これの２００μＬを、９６ウェルの未処理ポリスチレン・プレートの３つのウェルに添加した（０時点）。次いで、最大６時間まで１時間間隔で、２００μＬのサンプルを、事前希釈した溶液から取り出し、毎回３連で同じプレート上のウェルに添加した。６時間の時点で、タンパク質を標準的なプロトコールに従ってウェル中に直接希釈した、コントロール・セットのウェルもまた調製した（これを、図３８のグラフ中に、−１サンプルとしてプロットした）。図３７は、事前希釈後のＯＭＰ２０３検出のイムノアッセイの結果を示す。このデータは、タンパク質が事前希釈後にプラスチックに結合する能力が、少なくとも６時間損なわれないままであることを示している。
【０３０２】
【表７ａ】
2017508444.tif 000009
【０３０３】
【表７ｂ】
2017508444.tif 000010
【０３０４】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、単語「含む」および「含有する」ならびにそれらのバリエーションは、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味し、これは、他の部分、添加剤、成分、整数またはステップを排除することを意図しない（および排除しない）。本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、単数形は、文脈が他を要求しない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈が他を要求しない限り、複数ならびに単一を企図すると理解すべきである。
【０３０５】
本発明の特定の態様、実施形態または例と併せて記載される特徴（feature）、整数、特徴（characteristics）、化合物、化学部分または基は、それと両立しない場合を除き、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解すべきである。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示される全ての特徴、および／またはそうして開示された任意の方法もしくはプロセスの全てのステップは、かかる特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本発明は、任意の上述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示される特徴の任意の新規の１つもしくは任意の新規の組み合わせ、またはそうして開示された任意の方法もしくはプロセスのステップの任意の新規の１つもしくは任意の新規の組み合わせに及ぶ。
【０３０６】
読者の注意は、本出願と関連して本明細書と同時にまたはその前に出願され、本明細書と共に公衆の閲覧に付される全ての論文および文書に向けられ、全てのかかる論文および文書の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図６】
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【図８】
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【図２４】
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【図２６】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月15日(2016.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化するための方法であって、
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）ｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ；および
ｉｖ）タンパク質サンプルの界面活性剤濃度を、１×臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以下の界面活性剤に低減させるステップ
を含み、タンパク質が、物理吸着によって基材上に固定化される、方法。
【請求項２】
界面活性剤濃度が、０．０５×ＣＭＣ〜１×ＣＭＣに、好ましくは０．０５×ＣＭＣ〜０．７×ＣＭＣに、好ましくは０．０５×ＣＭＣ〜０．３×ＣＭＣに低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膜貫通タンパク質が、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングし得る、またはアンカリングするように改変され得、アンカリングされたペプチドおよび／またはタンパク質は、ポリマー性基材の表面から空間的に隔てられる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
膜貫通タンパク質が、
ｉ）タンパク質の頭部のループ中に、または膜貫通ストランド間の長いループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉ）タンパク質の頭部のＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；
ｉｉｉ）タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；ならびに／あるいは
ｉｖ）タンパク質の頭部の操作されたＮ末端および／もしくはＣ末端において、またはタンパク質の頭部に提供される１もしくは複数のループ中に、異種ペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む；ならびに／あるいは
ｖ）膜貫通タンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端が、循環式並べ替えによって改変される、
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｎ末端およびＣ末端が、ｉ）ループの代わりに；ｉｉ）ループに隣接して；ｉｉｉ）またはループ内から、好ましくは同じループ中に提供されるように、膜貫通タンパク質が操作される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
膜貫通タンパク質が、外膜プロテインＡであり、ループが、ループ１、３または４である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
膜貫通タンパク質が、ディスプレイのために、膜貫通タンパク質とペプチドおよび／またはタンパク質との間に空間距離をとるためのスペーサーを含み、好ましくは、スペーサーは、膜貫通タンパク質にとってならびに／またはペプチドおよび／もしくはタンパク質にとって異種である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
スペーサーが、親水性、剛性または半剛性であり、好ましくは、アルファ・ヘリックス、またはＰＴリンカー、またはグリシン−セリン・スペーサー・リンカーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｉ）膜に内在性ではない大きい内部または外部ドメインを除去するように；
ｉｉ）１もしくは複数のループをトランケートするように；および／または
ｉｉｉ）１もしくは複数のループを、例えばループ上でのタンパク質の挿入およびディスプレイを可能にするために親水性スペーサーによって伸長させるように、
膜貫通タンパク質が操作される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
膜貫通タンパク質が、ｉ）膜内在性タンパク質、好ましくはイオン・チャネル、好ましくはベータ−バレル・タンパク質、好ましくはポリンである；および／あるいはｉｉ）真核生物のもの、例えば植物由来、動物もしくは哺乳動物のもの；または原核生物のもの、例えば細菌のものである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
膜貫通タンパク質が、グラム陰性細菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）、好ましくはＯｍｐＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
膜貫通タンパク質が、ｉ）３つのトランケートされた細胞外ループを含むように改変されたＯｍｐＡであって、ループ１が、保持され、ＰＴリンカーおよび任意選択で親水性アミノ酸を含む、ＯｍｐＡ；ｉｉ）ＯＭＰ１５４または表３に列挙されるそのバリアント；ｉｉｉ）細胞外ループ１中にＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を含む膜貫通タンパク質；ｉｖ）細胞外ループ１中にラミニン由来のＹＩＧＳＲモチーフを含む膜貫通タンパク質からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
膜貫通タンパク質が、ｉ）全てのトランケートされた細胞外ループ；ｉｉ）タンパク質の細胞外終端（頭部）上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）金表面へのタンパク質の結合を可能にするためのシステイン残基を含むように改変されたＯｍｐＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
膜貫通タンパク質が、末端、好ましくはＮ末端に、アルファ・ヘリックス・スペーサーをさらに含み、さらに好ましくは、スペーサーに融合した異種タンパク質またはペプチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
膜貫通タンパク質が、ｉ）全てのトランケートされた細胞外ループ；ｉｉ）タンパク質の細胞外終端（頭部）上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）アルファ・ヘリックス・スペーサー配列を含むように改変されたＮ末端；ｉｖ）Ｃ末端上に提供されたＨｉｓタグを含むように改変されたＯｍｐＡであり、ｖ）システイン残基を含まない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
膜貫通タンパク質が、ＯＭＰ１４０もしくは表４に列挙されたそのバリアント、またはＦＧＦ１および２をそれぞれ含むＯＭＰ９０および１２８である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
膜貫通タンパク質が、ｉ）タンパク質の細胞外終端（頭部）上に位置させたＮ末端およびＣ末端；ｉｉｉ）トランケートされ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインに融合されたＮ末端を含むように改変されたＯｍｐＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
膜貫通タンパク質がＯＭＰ１８である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
膜貫通タンパク質が、図１４の核酸配列によってコードされるＯｍｐＡである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
基材が、メッシュ、繊維、ビーズ、編物もしくは織物、マイクロ・ウェル・プレート、アレイまたは組織培養フラスコからなる群より選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ポリマーが、プラスチック、絹および他のタンパク質性繊維（例えば、毛髪、毛皮（ケラチン・フィラメント）、アクチン・フィラメント、コラーゲン・フィラメントなど）、ならびにグラフェンである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
プラスチックが、ポリビニル、ポリエチレン・テレフタレート（ＰＥＴ）および高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）および低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）などを含むポリエチレン（ＰＥ）、ポリアクリレート（アクリル）、耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）を含むポリスチレン（ＰＳ）、シリコーン、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリ乳酸コグリコール酸（ＰＧＬＡ））、ポリウレタン、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリアミド（ナイロン）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）、ポリエチレン／アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＰＥ／ＡＢＳ）、ベークライト、ゴム、ラテックス、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリカーボネート／アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＰＣ／ＡＢＳ）、ならびにポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）などを含むポリ塩化ビニルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質サンプルが、１×ＣＭＣよりも高い界面活性剤濃度を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）タンパク質サンプルの添加の際に１×以下のＣＭＣが得られるように、ポリマー性基材に希釈剤を添加するステップ；
ｉｖ）ｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ
を含み、タンパク質が、物理吸着によって基材上に固定化される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ｉ）界面活性剤中の膜貫通タンパク質のサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）ポリマー性基材を用意するステップ；
ｉｉｉ）基材と共にインキュベートしたときにＣＭＣが１×以下になるように、タンパク質サンプルの界面活性剤濃度を低減させるステップ；
ｉｖ）ｉｉｉ）のタンパク質サンプルを、ｉｉ）のポリマー性基材と共にインキュベートするステップ
を含み、タンパク質が、物理吸着によって基材上に固定化される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
基材を洗浄および／もしくは無菌化するステップ、ならびに／または基材への膜貫通タンパク質の結合を、結合アッセイを用いて決定するステップをさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材であって、膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変され、好ましくは、膜貫通タンパク質は、請求項３から１９のいずれか一項に規定されており、および／または基材は、請求項２０から２２のいずれか一項に規定されている、ポリマー性基材。
【請求項２８】
請求項２７に規定されるポリマー性基材を含む製品であって、好ましくは、マイクロ・ウェル・プレート、組織培養フラスコまたはプレート、プラスチック・ビーズ、繊維、メッシュ基材、医療用デバイス、例えば外科用インプラント、ポリマーのマイクロ粒子またはナノ粒子からなる群より選択される製品。
【請求項２９】
サンプル中の成分を結合させる方法、またはアンカリングされたペプチドおよび／もしくはタンパク質と、サンプル中の成分との相互作用を媒介する方法であって、
ｉ）その上に固定化された膜貫通タンパク質を含むポリマー性基材を用意するステップであって、膜貫通タンパク質は、物理吸着によって基材上に固定化され、膜貫通タンパク質は、ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、ステップ；
ｉｉ）基材にサンプルを添加するステップ；
ｉｉｉ）任意の成分と、基材のアンカリングされたタンパク質またはペプチドとの、結合または相互作用を可能にする条件下で、基材をサンプルと共に維持するステップ；ならびに任意選択で
ｉｖ）基材からサンプルを取り出し、そこから任意の成分を精製するステップ、または任意の成分の存在を検出するステップ
を含む方法。
【請求項３０】
ｉ）基材を洗浄して任意の未結合の材料を除去するステップをさらに含む、目的の成分についてのスクリーニング・アッセイである、またはｉｉ）結合した成分の有無を検出するステップをさらに含む、サンプルからの目的の成分の固定化のための方法である；またはｉｉｉ）例えば塩溶出、ｐＨ変化による溶出もしくは競合物の結合によって、任意の結合した成分を溶出させるステップをさらに含む、サンプルからの目的の成分の精製方法である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から２５のいずれか一項に規定されるポリマー性基材上に膜貫通タンパク質を固定化するステップをさらに含む、請求項２９または３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
サンプルが、ヒトもしくは動物の身体由来である（例えば、唾液、全血、血漿、尿、精液、大便など）、または生成プロセス由来の細胞溶解物もしくは粗製抽出物であり得る、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
成分が、部分、好ましくは結合パートナーによって結合されることが可能である部分であり、好ましくは、核酸、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ハプテン、ホルモン受容体、ビタミン、ステロイド、代謝物、アプタマー、糖、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、細胞、生物（例えば、真菌、細菌、ウイルス、原生生物および多細胞寄生生物）、治療的薬物もしくは非治療的薬物、またはそれらの任意の組み合わせもしくは断片からなる群より選択され、成分が、真核生物細胞または原核生物細胞であり、好ましくは、昆虫細胞、酵母、細菌、植物細胞、藻類および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、例えば、線維芽細胞、幹細胞、誘導多能性幹細胞、ニューロン細胞、肝細胞、筋細胞、造血細胞、上皮細胞、初代細胞、形質転換された細胞株からなる群より選択される、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
膜貫通タンパク質が、請求項３から１９のいずれか一項に規定されており、および／または基材が、請求項２０から２２のいずれか一項に規定されており、および／またはポリマー性基材が、請求項２７に規定されている、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
膜貫通タンパク質が、ＯＭＰ  ＯＭＰ１５３、１５４、１６２〜１６５、１６７、１７４〜１７９および１８０〜１９２（表３および表４）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
好ましくは、ペプチドおよび／またはタンパク質が、Ｆｃ結合ドメイン、好ましくはプロテインＡ、ＧまたはＬのＦｃ結合ドメインである、またはこれらを含む、Ｆｃタグ化タンパク質の固定化のための、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ポリマー性基材、膜貫通タンパク質、および１×ＣＭＣ以下の濃度の界面活性剤を含む、インキュベーションであって、好ましくは、膜貫通タンパク質は、請求項３から１９のいずれか一項に規定されており、および／または基材は、請求項２０から２２のいずれか一項に規定されており、および／またはポリマー性基材は、請求項２７に規定されている、インキュベーション。
【請求項３８】
ポリマー性基材、およびディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている膜貫通タンパク質を含むキットであって、好ましくは、膜貫通タンパク質は、請求項３から１９のいずれか一項に規定されており、および／または基材は、請求項２０から２２のいずれか一項に規定されており、および／またはポリマー性基材は、請求項２７に規定されている、キット。
【請求項３９】
ポリマー性基材への膜貫通タンパク質の物理吸着を可能にするための希釈係数を提供するチャート、希釈剤、緩衝液、基材、免疫グロブリンおよび結合試薬を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
ディスプレイのために、異種タンパク質またはペプチドをアンカリングする、またはアンカリングするように改変されている、請求項３から１９のいずれか一項に規定された膜貫通タンパク質。
【請求項４１】
請求項４０に記載の膜貫通タンパク質をコードする核酸配列であって、好ましくは、核酸配列は、遺伝子構築物中で提供される、核酸配列。
【請求項４２】
請求項４１に規定される核酸配列または遺伝子構築物を含む、組換え宿主細胞。
【請求項４３】
ペプチドおよび／またはタンパク質配列が、増殖因子、タンパク質−タンパク質相互作用または結合に関与するタンパク質またはペプチド、抗体結合モチーフ、エピトープ、抗原、アレルゲン、酵素、触媒、ＤＮＡおよび／または炭水化物との相互作用または結合に関与するタンパク質またはペプチド；低分子との相互作用または結合、例えば、細胞結合、細胞シグナル伝達、に関与するタンパク質またはペプチド；細胞外マトリックス・タンパク質からなり得る、これらから誘導され得る、またはこれらとして機能し得る、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法、インキュベーション、インプラントまたはキット。
【国際調査報告】
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