(57)【要約】  本発明は、特にシグナル検出が液相の存在下で起こる場合に、スポット（複数可）における分析方法で分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善するための吸収性粒子の使用に関する。本発明は、吸収性粒子を含む液相の存在下で、分析物の存在に対応するシグナルの検出の改善を可能にするスポット（複数可）における分析方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善することを可能にする分析方法であって、
ａ）分析物の検出を目的とする少なくとも１つのスポットを含む、少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体を用意するステップ、
ｂ）分析する検体を前記コンパートメントの前記スポットの存在下に置くステップ、
ｃ）分析物の少なくとも１つの検出リガンドを前記コンパートメントの前記スポットの存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドは直接または間接検出マーカーに結合している、ステップ、
ｄ）前記検出マーカーが間接検出マーカーである場合は、前記検出リガンドに結合している前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントの前記スポットの存在下に置くステップ、
ｅ）ステップｄ）で用いる前記レポーターが間接マーカーに結合している場合は、前記レポーターに結合している前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントの前記スポットの存在下に置くステップ、
ｆ）吸収性粒子を前記コンパートメントの前記スポットの存在下に置くステップであって、前記吸収性粒子は前記コンパートメントの前記スポットと接触している液相に含まれる、ステップ、および
ｇ）前記吸収性粒子を含む前記液相の存在下で、前記コンパートメントの前記スポットで分析物の存在に対応するシグナルを検出するステップ
を含む分析方法。
【請求項２】
前記吸収性粒子が炭素粒子または着色粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグナルが前記固体支持体の底を通してステップｇ）で検出されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｇ）で検出される前記シグナルが発光性化合物によって放出されるシグナルおよび／または蛍光体によって放出されるシグナルであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記吸収性粒子が、ルミノール、イソルミノール、ルミノールまたはイソルミノールの誘導体、電子伝達体および酸化剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む吸収性組成物の形態で提供される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのスポットを含む固体支持体における分析方法において、分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善するための吸収性粒子の使用。
【請求項７】
分析物の存在に対応するシグナルの検出が液相の存在下で実行されることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ比が増加することを特徴とする、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
前記吸収性粒子が炭素粒子または着色粒子であることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
分析物の存在に対応する前記シグナルが化学発光性化合物および／または蛍光体によって放出されることを特徴とする、請求項６から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法の実行に適切な吸収性組成物であって、吸収性粒子、ならびにルミノール、イソルミノール、ルミノールまたはイソルミノールの誘導体、電子伝達体および酸化剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法の実行に適切なキットであって、
少なくとも２つの組成物：
−  ルミノール、イソルミノールおよびルミノールまたはイソルミノールの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第１の組成物、ならびに
−  少なくとも１つの酸化剤を含む第２の組成物
を含み、前記第１の組成物および／もしくは前記第２の組成物は吸収性粒子を含むこと、ならびに／または前記キットは吸収性粒子を含む第３の組成物を含むことを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に分析方法が液相の存在下でシグナルの獲得を必要とする場合の、分析方法の間の分析物の存在に対応するシグナルの検出の改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
分析方法は、検体中の１つまたはいくつかの分析物の潜在的な存在を検出することを可能にする。分析方法は、固体支持体において一般に実行される。分析方法の中で、多重分析方法は、同じ検体の中のいくつかの分析物の潜在的存在の同時検出を可能にする。多重分析方法は、スポットを含む固体支持体またはビーズのセットにおいて実行することができる。
【０００３】
伝統的に、分析方法は、検出する分析物の特異的捕捉リガンドを含む固体支持体またはビーズの少なくとも１つのスポットの存在下に分析する検体を置くステップ、検出して直接または間接マーカーに結合させる分析物の特異的検出リガンドを添加するステップ、次に直接または間接マーカーに結合させたレポーターを添加することによる潜在的発色ステップ、およびシグナル検出ステップ（シグナル獲得ステップとも呼ばれる）を含む。ペルオキシダーゼ酵素タイプの間接マーカーの場合には、酵素の基質の添加は化学発光化合物の生成をもたらす酵素反応を可能にする。シグナルは、次に化学発光によって検出される。
【０００４】
化学発光によるシグナルの検出は、化学発光化合物の連続的生成を可能にするために、原則として、酵素の基質の存在下で、すなわち液相の存在下でシグナルを獲得することを必要とする。実際、洗浄ステップがシグナルを獲得する前に実行されると、残留した基質は排除され、酵素反応は停止する。それでも、化学発光化合物によって放出されるシグナルは、徐々に消去される。その結果として、安定した再生可能な十分なシグナル放出を可能にするために、酵素の基質は固相と接触した液相に存在しなければならない。
【０００５】
しかし、液相の存在下でのマイクロプレートのウェルのスポットでのシグナルの獲得は、光干渉につながる。この光干渉は、いくつかの源を有する。一方では、ウェルの上方へスポットから放出される光子は、化学発光化合物を含む溶液の化合物と相互作用してあらゆる方向に拡散することができ、他方では、光子は、ウェルの壁ならびに液体／空気界面、より具体的にはウェルの壁および化学発光化合物を含む溶液の相互作用によって形成される半月板での媒体の変化によって反映されることもある。
【０００６】
この光干渉は、本当のスポットに対してわずかにシフトしている、「ツインスポット」と呼ばれるスポット、ウェルの周辺に見える光のリング、またはスポットで放出されるシグナルが強力である場合は光の弧さえも生成することができる。したがって、この光干渉は問題のあるバックグラウンドノイズを引き起こし、それは偽陰性または偽陽性結果の源となることがある。例えば、ウェル周囲の光のリングはバックグラウンドノイズの閾値を偏らせることができ、そこで弱いシグナルはバックグラウンドノイズの中でかき消される。光干渉は、スポット周囲の環測定によって実行されるスポットの欠陥の非存在の検証を妨げることもできる。
【０００７】
米国特許第４，３１８，７０７号明細書の文献は、検体中の分析物を検出するための方法であって、リガンド／抗リガンド対の第１のメンバーに結合している吸収性粒子および第２のマーキングされたメンバーの存在下に検体を置くことを含み、吸収性粒子に結合している第１のメンバーに結合した第２のマーキングされたメンバーの量は、分析物の量に関連する、方法を記載する。この文献では、したがって、吸収性粒子がリガンド／抗リガンド対の第１のメンバーに結合しており、対の２つのメンバーが結合している場合、前記対の第２のマーキングされたメンバーのシグナルを消去することを可能にする。
【０００８】
米国特許第８，１６３，５６２号明細書の文献は、好ましくは細胞である細胞コンパートメントが浸る溶液の蛍光からもたらされる望ましくない光を低減することを可能にする試験を記載する。この望ましくない蛍光は、特に試験の間に用いられるプローブまたは化合物から来る。検出されるシグナルは、膜コンパートメントに位置する光子生成因子から来る。その目的のために、膜コンパートメントの外側表面と接触している水溶液で、膜不浸透性であって膜に特異的に結合しない光子低減剤が用いられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、偽陽性または偽陰性の結果を回避しながら得られる結果を確実にするために、スポット（複数可）でのシグナルの獲得が液相の存在下で起こるスポット（複数可）における分析方法との関連で、分析物の存在に対応するシグナルの検出の改善を可能にする解決方法の必要性がある。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
驚くべきことに、スポット分析方法で、吸収性粒子、例えば炭素粒子の使用が、液相の存在下でシグナルの獲得と同時に通常起こるが、スポット（例えば、発光）での分析物の存在に対応する、検出されるシグナルの強度に干渉しないかほとんど干渉しない、望ましくない光干渉の一部または全部の排除を可能にし、適用可能な場合は、スポット（複数可）で対照として存在する蛍光体によって放出される蛍光の検出を可能にすることを発明者らは示した。したがって、本発明による吸収性粒子の使用は、特に偽陽性の結果（「偽陽性」とも呼ばれる）および／または偽陰性の結果（「偽陰性」とも呼ばれる）を生むことを回避することによって、分析方法の終わりに得られる結果を確実にすること、すなわち、前記方法の終わりに得られる前記結果の信頼性を保証することを可能にする。
【００１１】
「偽陽性」は、検体中に検出される１つまたはいくつかの分析物の存在を反映する陽性結果であるが、前記分析物（複数可）は検体中に存在せず、したがって検出されるはずではなかった。
【００１２】
「偽陰性」は、検体中に検出される１つまたはいくつかの分析物の非存在を反映する陰性結果であるが、前記分析物（複数可）は検体中に存在し、検出されるはずであった。
【００１３】
スポットでの分析物の存在に対応する検出されるシグナルは、検体中の分析物の存在の検出および／または前記検体中の前記分析物の数量化を可能にする。
【００１４】
スポットでの分析物の存在に対応する検出されるシグナルは、電磁放射線、特に光放出である。
【００１５】
スポットでの分析物の存在に対応する検出されるシグナルは、好ましくは、発光、例えば化学発光によって検出されるシグナル、および／または蛍光によって検出されるシグナルである。
【００１６】
本発明による吸収性粒子は、スポットでの分析物の存在に対応する検出されるシグナルが発光によって、好ましくは化学発光によって検出されるシグナルである場合は、検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ比の改善を可能にする。
【００１７】
固体支持体のスポット（複数可）に存在する蛍光体は、とりわけ、分析方法の終わりのスポット（複数可）の質（特にそれらの存在、位置および／または完全性）を対照する役目、および／または分析方法の終わりのスポット（複数可）の実際の位置からの分析物（複数可）に対応するシグナルの読取グリッドを規定することによって分析物（複数可）の検出の感受性を改善する役目を果たすことができる。したがって、固体支持体のスポット（複数可）での蛍光体の使用も、スポット分析方法の結果を確実にすることを可能にする。
【００１８】
さらに、本発明による吸収性粒子は、固体支持体のコンパートメントのスポット（複数可）の存在下で前記吸収性粒子の設置を対照することを可能にし、前記吸収性粒子が吸収性組成物の形態で添加される場合は、固体支持体のコンパートメントのスポット（複数可）の存在下で前記吸収性組成物に含まれる任意の化合物の設置を対照することを可能にする。
【００１９】
したがって、本発明による吸収性粒子の使用は、液相の存在下で検出されるシグナルの獲得の間の望ましくない光干渉を部分的または完全に遮蔽および／または吸収することによって、分析方法の間の分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善する（したがって、確実にする）ことを可能にする。シグナル検出の改善は、「検出されるシグナル対バックグラウンド」比を測定することによって評価することができる。
【００２０】
さらに、本発明による分析方法での吸収性粒子の使用は、そのコンパートメント（複数可）の壁（複数可）が透明な材料を含む、またはそれで構成される固体支持体を用いることができるという利点を有し、この種の支持体は不透明な材料を含む、またはそれで構成されるものより安価である。
【００２１】
本発明の第１の目的は、分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善するためにスポット（複数可）における分析方法で用いることができる吸収性組成物を提供することである。
【００２２】
本発明の第２の目的は、分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善することを可能にする分析方法、好ましくは多重分析方法であって、
ａ）分析物の検出を目的とする少なくとも１つのスポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体を用意するステップ、
ｂ）分析する検体を固体支持体の前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｃ）分析物の少なくとも１つの検出リガンドを前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドは直接または間接検出マーカーに結合している、ステップ、
ｄ）前記検出マーカーが間接検出マーカーである場合は、前記検出リガンドに結合している間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｅ）ステップｄ）で用いるレポーターが間接マーカーに結合している場合は、前記レポーターに結合している間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｆ）吸収性粒子を前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップであって、前記吸収性粒子は前記コンパートメントのスポット（複数可）と接触している液相に含まれる、ステップ、および
ｇ）前記吸収性粒子を含む液相の存在下で、前記コンパートメントのスポット（複数可）で分析物の存在に対応するシグナルを検出するステップ
を含む分析方法を提供することである。
【００２３】
本発明の第３の目的は、スポット（複数可）における分析方法で分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善するための吸収性粒子の使用であって、シグナルの検出の改善が、例えばバックグラウンドノイズの強度の低下によって特徴付けられる、使用に関する。
【００２４】
本発明の第４の目的は、分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善することを可能にする分析方法を実行するためのキットに関する。
【００２５】
検体
分析する検体は、好ましくは生体検体である。
【００２６】
生体検体は、体液、例えば血液、血液派生物（血漿または血清など）、尿、脳脊髄液、唾液の検体、または組織検体、例えば生検によって得られた組織、細胞もしくは細胞のセット、植物抽出物、またはそれらの組合せであってもよい。
【００２７】
血液派生物は、血液試料から得られる任意の産物、特に体液を指す。
【００２８】
分析する検体は、培地および／または培養上清であってもよい。
【００２９】
分析する前に、検体は１つまたはいくつかの前の処理ステップ、例えば希釈、遠心分離、加熱処理、細胞溶解（例えば、１つまたはいくつかのカオトロピック剤、１つまたはいくつかの還元剤および／または加熱による）、抽出、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、マーキングされていない検出リガンドまたはそれらの組合せの添加を受けることができる。マーキングされていない検出リガンドの添加は、それ自体当業者に公知の試験である中和試験を実行するために特に有益である。
【００３０】
検体は、同じ性質または異なる性質であってもよい少なくとも２つの検体の混合物であってもよい。
【００３１】
異なる性質の検体の混合物の例は、血液と血清の混合物、血液と血漿の混合物、血清と血漿の混合物または血液、血清および血漿の混合物である。
【００３２】
本発明による１つの好ましい検体は、血液および／または血液派生物の検体または検体の混合物である。
【００３３】
分析物
検体で検出される分析物は、検体で検出および／または数量化しようとする天然または合成の任意のタイプの化合物であってもよい。
【００３４】
分析物は、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物、脂質、細胞、オルガネラ、ウイルスまたは核酸であってもよい。
【００３５】
細胞は、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物、後生動物細胞、酵母細胞、真菌細胞または原生動物であってもよい。
【００３６】
核酸は、一本鎖または二本鎖の形態の、ホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチドのポリマー、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの類似体、例えばホスホロチオエートまたはチオエステルを指す。
【００３７】
分析物または分析物の少なくとも１つは、例えば、抗原、抗体、抗体断片、ハプテン、ホルモン、ホルモン受容体、酵素または核酸からなる群から選択される。
【００３８】
「抗原」は、本明細書では、抗体または免疫系の細胞によって認識され、免疫応答を誘導することが可能である、天然または合成の分子を指す。抗原は、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物または脂質である。
【００３９】
本明細書では、「ハプテン」は、免疫系が認識することが可能であるが、それが担体分子に結合している場合だけ免疫原性である、低分子量分子を指す。
【００４０】
本出願では、「担体分子」は、タンパク質または炭水化物の担体分子を特に指す。担体分子はポリペプチド（特にタンパク質またはペプチド）であってもよく、それは天然であってもなくても（例えば、組換えタンパク質または合成ペプチド）、官能基化ポリマーであってもなくても（例えば、デキストラン、多糖またはポリリシン）、混合コポリマーであってもなくても（特に異なるアミノ酸のコポリマー、例えばリシン−チロシンコポリマー）または、抗体であってもなくても（特にモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）、例えば免疫グロブリン（Ｉｇとも呼ばれる）であってもなくてもよい。１つの例の担体分子は、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）である。
【００４１】
分析物または分析物の少なくとも１つは、好ましくは、対象で病的であっても病的でなくてもよい状態を診断すること、または病的であっても病的でなくてもよい状態の発症リスクを診断することを可能にする化合物である。非病的状態の例は、妊娠である。
【００４２】
対象は、ヒト、ヒト以外の動物または植物であってもよい。ヒト以外の動物は、好ましくは哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、サル、ウサギ、マウスまたはラットである。
【００４３】
用語「ヒト」は広義で用いられ、特に任意の年齢の男女、例えば小児、児童、青年、成人または高齢者を指す。
【００４４】
分析物または分析物の少なくとも１つが抗原である場合は、それは、好ましくは、感染、例えばウイルス、細菌、真菌または寄生虫によって引き起こされる感染の診断を可能にする抗原である。
【００４５】
分析物または分析物の少なくとも１つが抗体である場合は、それは、好ましくは、感染、例えばウイルス、細菌、真菌または寄生虫によって引き起こされる感染の診断を可能にする抗体である。
【００４６】
一般的に、これは、
−  ウイルス、例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）、ＨＴＬＶ（ヒトＴリンパ親和性ウイルス）、特にＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ、
−  寄生虫、例えばヒトまたはヒト以外の動物でトキソプラズマ症（特にトキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii））、マラリア（特にプラスモディウム属の寄生虫、例えば熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）またはプラスモディウム・ノウレシ（Plasmodium knowlesi））またはシャガス病（特にクルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi））を引き起こすことができる寄生虫、または
−  細菌、例えばヒトまたはヒト以外の動物で梅毒（梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum））またはライム病（特にボレリア属からの細菌）を引き起こすことができる細菌
の１つまたはいくつかの抗原および／または１つまたはいくつかの抗体を含むことができる。
【００４７】
本明細書では、「寄生虫」は、体に関して寄生虫として作用して寄生虫症を引き起こす、後生動物または原生動物を指す。したがって、本発明の意味の範囲内で、寄生虫はウイルスでも、細菌でも真菌でもない。
【００４８】
分析物または分析物の少なくとも１つは、疾患のマーカー、例えば心血管疾患のマーカーまたは糖尿病マーカー、肝炎などの疾患の発生のマーカー、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫によって引き起こされる感染症の発生のマーカー、療法、例えば抗ウイルス療法、抗生物質療法またはがん療法への抵抗性のマーカーであってもよい。
【００４９】
多重分析方法の間、検体で本出願に記載のいくつかの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１６を超える数の）分析物を同時に検出することができる。これは、対象の同じ検体で、１つまたはいくつかの感染症もしくは疾患、感染症もしくは疾患の発生、状態（病的または非病的）、状態（病的または非病的）を発症するリスク、または療法への抵抗性のマーカーを診断することを可能にすることができる。
【００５０】
多重分析方法の間に検出される分析物は、同じ性質のもの（例えば、抗体だけまたは抗原だけ）または異なる性質のもの（例えば、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの抗体）であってもよい。
【００５１】
捕捉リガンド
捕捉リガンドは、固体支持体に、スポットに固定された化合物である。
【００５２】
捕捉リガンドの少なくとも１つは、検体で検出される分析物に特異的である。
【００５３】
捕捉リガンドは、抗体、抗原、ペプチド、炭水化物、脂質または核酸であってもよい。
【００５４】
捕捉リガンドは、好ましくは抗体または抗原である。
【００５５】
捕捉リガンドが抗体である場合は、それは、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。
【００５６】
検出リガンド
検出リガンドは、それが特異的である化合物の存在を明らかにすることを目的とする。
【００５７】
検出リガンドは、抗体、抗原、ペプチド、炭水化物、脂質または核酸であってもよい。
【００５８】
検出リガンドは、好ましくは抗体または抗原である。
【００５９】
検出リガンドが抗体である場合は、それは、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。
【００６０】
検出リガンドは、好ましくは、マーキングされた検出リガンド、すなわち検出マーカーが共有結合または非共有結合によって結合した検出リガンドである。
【００６１】
検出リガンドがマーキングされていない場合は、前記検出リガンドのマーキングされた特異的抗体を用いることによってその検出を得ることができる。
【００６２】
少なくとも１つの検出リガンドは、検体で検出される分析物に特異的である。
【００６３】
検出リガンドは、検出マーカーのいかなる存在も除いて、用いられる捕捉リガンドもしくは用いられる捕捉リガンドの１つと同一であってもよく、および／または、捕捉リガンドもしくは捕捉リガンドの１つが結合するのと同じゾーンでそれが特異的である化合物に結合してもよい。この場合には、前記捕捉リガンドおよび前記検出リガンドが抗体であるならば、それは「同種異系サンドイッチ」を含む。
【００６４】
立体障害による、それらが特異的である化合物に関する捕捉リガンドと検出リガンドの競合を回避するように、捕捉リガンドおよび検出リガンドまたは検出リガンドの１つは、それらが特異的である化合物の別々のゾーンに特異的であってもよい。この場合には、前記検出リガンドおよび前記捕捉リガンドが抗体であるならば、それは「同種異系サンドイッチ」を含む。
【００６５】
好ましい一実施形態では、同じ化合物に特異的である検出リガンドおよび捕捉リガンドは、前記化合物の同じ位置に結合しない。より好ましくは、前記検出リガンドは、前記捕捉リガンドとの結合ゾーンから遠い前記化合物のゾーンに結合する。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、検出リガンドは、検出マーカーのいかなる存在も除いて、捕捉リガンドと同一であり、および／または、特に、それが特異的である化合物が少なくとも２つの同一の結合ゾーンを有する複合体の形である場合、前記捕捉リガンドが結合するのと同じゾーンでそれが特異的である化合物に結合する。
【００６７】
検出マーカー
検出マーカーは、直接マーカーまたは間接マーカーであってもよい。
【００６８】
直接マーカーは、そのシグナルを直接的に、すなわちレポーターの事前の添加を必要とすることなく検出することができるマーカーである。
【００６９】
直接マーカーは、例えば、蛍光体、発光性化合物および蛍光性または発光性のナノ粒子からなる群から選択される。
【００７０】
「発光性」化合物は、電子発光性化合物、熱発光性化合物または化学発光性化合物であってもよい。好ましい一実施形態では、発光性化合物は化学発光性化合物である。
【００７１】
直接マーカーとして用いることができる一例の発光性化合物（より具体的には、熱発光性の化合物）は、ジオキセタン化合物、特に１，２−ジオキセタン化合物、またはジオキセタン化合物の誘導体、例えば１，２−ジオキセタンの誘導体の分子を含む（例えば、注入された）シリカナノ粒子からなる。
【００７２】
間接マーカーは、シグナルの検出がレポーター（第１のレポーターとも呼ばれる）の事前の添加、および前記レポーター自体が間接検出マーク（例えば、酵素）に結合している場合は、前記第１のレポーターに結合している間接検出マーカーの第２のレポーター（例えば、この酵素の基質）の添加を必要とするマーカーである。
【００７３】
間接マーカーは、例えば、酵素、リガンド−受容体対のリガンド、リガンド−受容体対の受容体、ハプテン、抗原および抗体からなる群から選択される。
【００７４】
リガンド−受容体対のリガンドまたは受容体は、例えば、ビオチン、ビオチンの類似体、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはジゴキシゲニンである。
【００７５】
レポーターは、間接マーカーの基質または間接マーカーに特異的に結合する分子であり、前記分子それ自体は直接もしくは間接マーカーであるかまたは直接もしくは間接マーカーにそれ自体結合する。
【００７６】
基質は、例えば、酵素の基質である。
【００７７】
間接マーカーに特異的に結合する分子は、例えば、リガンド−受容体対のリガンドまたは受容体、例えばビオチン、ビオチンの類似体、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはジゴキシゲニンである。
【００７８】
酵素のレポーターは、例えば、前記酵素の基質である。
【００７９】
発光性化合物の生成を可能にする分子のレポーターは、例えば、基質、酵素または触媒である。
【００８０】
ビオチンのレポーターは、例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンであり、好ましくは直接マーカーまたは間接マーカー、例えば酵素に結合している。
【００８１】
本発明による好ましい間接マーカーは、ビオチンおよび酵素、好ましくは基質との反応によって発光性化合物を生成する酵素である。
【００８２】
１つの例の酵素は、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼまたはアルカリ性ホスファターゼである。
【００８３】
本発明による１つの好ましいビオチンレポーターは、ペルオキシダーゼ、好ましくはホースラディッシュペルオキシダーゼに結合しているストレプトアビジンである。
【００８４】
一例として、分析物の検出リガンドに結合する間接検出マーカーのレポーター（第１のレポーターと呼ばれる）がペルオキシダーゼ酵素に結合している場合は、後続のステップで、このペルオキシダーゼ酵素のレポーター（第２のレポーターとも呼ばれる）、すなわちこの酵素の基質、例えばルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体を添加することが必要である。この場合には、第２のレポーターは基質である。
【００８５】
固体支持体
本発明による分析方法を実行するために用いられる支持体（複数可）は、固体支持体である。
【００８６】
固体支持体は、分析方法を実行するのに適切な任意の材料から作製することができる。
【００８７】
固体支持体は、例えば、ポリマーまたはポリマーの混合物のベースを有する支持体である。本発明による適切な固体支持体は、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリブタジエンまたはそれらの組合せから作製される支持体である。
【００８８】
１つの好ましい固体支持体は、ポリスチレンおよび／またはポリプロピレンから作製される。
【００８９】
本発明による別のタイプの適切な固体支持体は、例えば、無機の固体支持体、例えばガラスである。
【００９０】
支持体は、例えば、プレート、マイクロプレート、スライドまたは膜の形態であってもよい。
【００９１】
固体支持体は、少なくとも１つのコンパートメントを含み、それは分析ゾーンとも呼ばれる。固体支持体のコンパートメント（複数可）は、固体支持体の配向を規定する。固体支持体の上部（前記固体支持体の上面とも呼ばれる）はコンパートメント（複数可）の側に、したがってスポット（複数可）の側に位置する。固体支持体の底（固体支持体の下面とも呼ばれる）は、反対の面である。
【００９２】
本発明の特定の一実施形態により、固体支持体は単一のコンパートメントを含む。前記単一のコンパートメントは、底および１つまたはいくつかの壁を含む、またはそれで構成されるコンパートメントであってもよい。
【００９３】
あるいは、前記単一のコンパートメントは壁を有さなくてもよく、その場合、固体支持体自体と同等であってもよい。コンパートメントの底は、その場合、固体支持体の上面からなることができる。
【００９４】
単一のコンパートメント（１つまたはいくつかの壁を含んでも含まなくてもよい）を含むそのような固体支持体の一例は、スライドまたは膜である。
【００９５】
本発明の別の特定の実施形態により、例えばマイクロプレートであってもよい固体支持体は、少なくとも２つのコンパートメントを含む。
【００９６】
固体支持体が少なくとも２つのコンパートメントを含む場合は、それらがお互いと連絡しないように、すなわち分析方法の実行の間に用いられる様々な組成物（特に溶液）が分析方法の間に１つのコンパートメントから別のものに循環することができないように、それらはお互いから隔離される。
【００９７】
したがって、１つのコンパートメントに添加される溶液は、他のコンパートメントに入らない。例えば、コンパートメント（複数可）は、底および１つまたはいくつかの壁を含む、またはそれで構成され、前記壁（複数可）は、コンパートメント（複数可）がお互いと連絡しないようにお互いからコンパートメント（複数可）を隔離する。
【００９８】
固体支持体は、好ましくはマイクロプレートである。この場合には、一例のコンパートメントは、ウェルである。マイクロプレートは、一般的に９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロプレートである。
【００９９】
特定の一実施形態では、固体支持体が少なくとも２つのコンパートメントを含む場合は、１つのコンパートメントで放出されるシグナルが別のコンパートメントで全くかまたは一部検出されないように、それらをお互いからさらに隔離することができる。その目的のために、コンパートメント（複数可）の壁（複数可）は、不透明な材料を含む、またはそれで構成されてもよい。
【０１００】
「不透明な材料」は、分析物の存在に対応して検出されるシグナルを通過させないかまたは実質的に通過させない材料を特に指す。「検出されるシグナルを実質的に通過させない」は、不透明な材料が、検出されるシグナルの２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下、さらにより好ましくは２％以下、１％以下または０．５％以下しか通過させないことを意味する。不透明な材料の一例は、黒色の材料である。
【０１０１】
別の特定の実施形態では、固体支持体が少なくとも２つのコンパートメントを含む場合は、コンパートメント（複数可）の壁（複数可）は透明な材料を含む、またはそれで構成される。
【０１０２】
別の特定の実施形態では、固体支持体が少なくとも２つのコンパートメントを含む場合は、コンパートメント（複数可）は透明な材料で構成される少なくとも１つの壁および不透明な材料で構成される少なくとも１つの壁を含むことができる。
【０１０３】
「透明な材料」は、分析物の存在に対応して検出されるシグナルの少なくとも８０％、好ましくは検出されるシグナルの少なくとも８５％、より好ましくは検出されるシグナルの少なくとも９０％、より好ましくは検出されるシグナルの少なくとも９５％を通過させる材料を特に指す。
【０１０４】
好ましい一実施形態では、コンパートメントの底を通して分析物の存在に対応して検出されるシグナルの検出を可能にするように、固体支持体のコンパートメント（複数可）の底は、透明な材料を含む、またはそれで構成される。
【０１０５】
不透明な材料の例は、有色ガラス、有色ポリスチレン、有色ポリエチレン、有色ポリプロピレンまたはそれらの組合せである。
【０１０６】
透明な材料の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリメチルペンテン、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリメタクリル酸メチルまたはそれらの組合せである。
【０１０７】
一般的に、分析する１検体につき、固体支持体の少なくとも１つの（例えば１つまたは２つの）コンパートメントが用いられる。
【０１０８】
固体支持体（例えばスライドまたは膜）が単一のコンパートメントを含む本発明の特定の一実施形態では、分析する１検体につき少なくとも１つの（例えば１つまたは２つの）固体支持体が用いられる。
【０１０９】
検体を分析するために用いられる固体支持体のコンパートメントは、少なくとも１つのスポット、少なくとも２つのスポット、少なくとも３つのスポット、例えば３つのスポット、４つのスポットまたは５つのスポット、または少なくとも６つのスポット、好ましくは６つのスポット、７つのスポット、８つのスポット、より好ましくは少なくとも９つのスポット、例えば９つのスポット、１０個のスポット、１１個のスポット、１２個のスポット、１３個のスポット、１４個のスポット、１５個のスポット、１６個のスポットまたは１６を超える数のスポットを含む。
【０１１０】
本明細書では、「スポット」は、目的の少なくとも１つの化合物を含む固体支持体のコンパートメント上の底の表面に位置しているゾーンを指す。したがって、目的の化合物（複数可）は、非共有結合による物理化学的相互作用（例えば、弱い結合タイプの、特にイオン性、ファンデルワールス、水素および／または疎水性の）を通しておよび／または共有結合によってコンパートメントの底の表面に固定することができる。
【０１１１】
スポットは、目的の化合物（複数可）の他に、少なくとも１つのポリマー、特に親水基を含む少なくとも１つのポリマー、例えば少なくとも１つのヒドロゲルを含むことができる。
【０１１２】
「少なくとも」は、本出願の意味の範囲内で、１つまたはいくつかを指し、いくつかは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１６超を特に意味する。
【０１１３】
スポットは、一般に小さい、例えば０．００７８ｍｍ２〜５．３０９ｍｍ２、好ましくは０．１９６ｍｍ２〜３．１４２ｍｍ２、より好ましくは０．５０３ｍｍ２〜２．０１１ｍｍ２の、明確なゾーンに相当する。
【０１１４】
スポットは、円板状または概ね円板状の形状、例えば固体支持体がマイクロプレートまたはスライドである場合は特に卵形を有することができる。
【０１１５】
あるいは、スポットは、例えば固体支持体が膜である場合は、四角または長方形（特にストリップ）を、または任意の他の形状を有することができる。
【０１１６】
スポットは、当業者に周知の技術（例えば、文献米国特許第７，４７０，５４７号明細書、米国特許第６，５７６，２９５号明細書、米国特許第５，９１６，５２４号明細書または米国特許第５，７４３，９６０号明細書を参照）を用いて得られる。
【０１１７】
例えば、スポットは、コンパートメントの表面の特定位置に、目的の前記化合物（複数可）の所定量を含有する溶液の少なくとも１滴を沈着して得られる。
【０１１８】
スポットが少なくとも１つのポリマー（例えば少なくとも１つのヒドロゲル）を含む場合、前記スポットは、前記ポリマーが前に沈着されているコンパートメントの表面の特定位置に、目的の前記化合物（複数可）の所定量を含有する溶液の少なくとも１滴を沈着して得ることができる。
【０１１９】
スポットは、コンパートメントの表面の特定位置での目的の前記化合物（複数可）のｉｎ  ｓｉｔｕ合成によって得ることもできる。目的の前記化合物（複数可）は、この場合、プローブの資格がある。これは、核酸またはペプチドを含むことができる（例えば米国特許第５，１４３，８５４号明細書の文献を参照する）。
【０１２０】
目的の化合物は、例えば、捕捉リガンド、間接マーカーに結合した担体分子、間接マーカーまたは蛍光体であってもよい。
【０１２１】
好ましい一実施形態では、コンパートメントの少なくとも１つのスポットは、検出される分析物に特異的である少なくとも１つの捕捉リガンドを含む。
【０１２２】
有利な一実施形態では、コンパートメントの少なくとも１つのスポット、好ましくはコンパートメントのスポットの全部は、少なくとも２つの目的の化合物を含み、これらの目的の化合物の１つは蛍光体である。前記蛍光体は、分析方法、特に多重分析方法の終わりにスポットの存在、位置および／または完全性を対照するために特に用いられる。例えば、コンパートメントの少なくとも１つのスポットは、分析物に特異的である少なくとも１つの検出リガンドおよび少なくとも１つの蛍光体を含む。
【０１２３】
有利な一実施形態では、固体支持体の各コンパートメントは、同数のスポットを含む。さらに、固体支持体の各コンパートメントは、同数のスポットおよび同じスポット組成を含む。
【０１２４】
別の有利な実施形態では、支持体は、スポットのない、または異なる数のスポットおよび／もしくはスポット組成を有する１つまたはいくつかのコンパートメントを含むことができる。支持体は、例えば、少なくとも２つの別々の群（またはタイプ）のコンパートメントを含むことができ、別々の群の各々は異なる数のスポットおよび／またはスポット組成を有する。
【０１２５】
コンパートメントは、検出する分析物１つにつき少なくとも１つのスポットを一般に含み、各分析物は、例えば、検出する感染症もしくは疾患、感染症もしくは疾患の発生、対象の状態（病的または非病的）、状態（病的または非病的）を発症するリスク、または治療への抵抗性のマーカーに対応することができる。コンパートメントのいくつかのスポットは、同じ分析物を分析することを目的とすることもできる。したがって、コンパートメントは分析物の検出を目的とする少なくとも１つのスポット、好ましくは分析物を検出することを目的とする少なくとも２つのスポットを含む。
【０１２６】
同じスポットがいくつかの異なる捕捉リガンド（例えば、いくつかの抗体および／または抗原）を含むことができ、それらは、例えば、検出される同じ病状、感染症または疾患に特異的（特に、同じウイルス、同じ細菌、同じ真菌または同じ寄生虫に特異的）であるか、または対象の感染症もしくは疾患の同じ発生、同じ状態（病的または非病的）、状態（病的または非病的）を発症する同じリスク、または療法への抵抗性の同じマーカーに特異的である。
【０１２７】
有利な一実施形態では、コンパートメントは、分析方法、特に多重分析方法の少なくとも１つのステップを検証することを可能にする、少なくとも１つの対照スポットを含む。
【０１２８】
シグナルの検出
シグナルの検出は、用いるマーカーのタイプに依存する。
【０１２９】
検出されるシグナルは、電磁放射線である。
【０１３０】
電磁放射線は、光、例えば紫外線、可視光または赤外線であってもよい。紫外線は、１０から３８０ｎｍの波長を有する電磁放射線である。可視光は、３８０ｎｍから７８０ｎｍの波長を有する電磁放射線である。赤外線は、７８０ｎｍから１ｍｍの波長を有する電磁放射線である。
【０１３１】
「シグナルの検出」および「シグナルの獲得」という表現は、本明細書では同義である。
【０１３２】
「シグナルの検出」は、分析物の存在に対応するシグナルの検出または方法の対照に対応するシグナルの検出を特に指す。
【０１３３】
当業者は、用いる検出マーカー（複数可）に基づいてスポットでシグナルを検出する方法を知っている。シグナルは、例えば、固体支持体の底の画像を捕捉するカメラを用いて検出される。
【０１３４】
シグナルの検出は、例えばＲＬＵ（相対的な光の単位）で表されるシグナルの強度を測定することを一般に含む。
【０１３５】
蛍光体タイプの直接マーカーによって放出されるシグナルは、光エネルギーによる励起の後に蛍光によって直接的に読み取ることができる。
【０１３６】
実際、蛍光色素または蛍光性分子とも呼ばれる蛍光体は、光エネルギーによる励起の後に蛍光を放出することが可能な臨床物質である。
【０１３７】
本発明との関連で、用いる吸収性粒子はシグナルの検出中に存在しなければならず、シグナルの検出は液相の存在下で実行される。
【０１３８】
本発明による吸収性粒子を用いることにより、スポットで放出される分析物の存在に対応するシグナルを検出することによって、バックグラウンドノイズを減少させること、特に「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比を改善することが可能であり、前記シグナルは、好ましくは固体支持体の底の画像を捕捉することによって検出される。
【０１３９】
好ましい一実施形態では、本発明による分析方法で検出されるシグナルは、化学発光化合物による化学発光によって放出されるシグナルである。
【０１４０】
化学発光は、光の生成をもたらす化学反応である。このタイプの１つの反応は、ルミノール（３−アミノフタルヒドラジド、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−フタラジン−１，４−ジオンとも呼ばれる、原式Ｃ８Ｈ７Ｎ３Ｏ２）、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体の、酸化剤、例えば過酸化水素水または任意の水酸化物による酸化還元である。化学発光反応の間、反応によって生成される分子は励起状態で見出される。これは、化学発光化合物である。光の放出を引き起こすのは、この化学発光化合物の基底状態への復帰である。
【０１４１】
好ましい一実施形態では、化学発光によって検出されるシグナルは、ペルオキシダーゼ酵素とその基質、例えばルミノール、イソルミノール（４−アミノフタルヒドラジドとも呼ばれる）および／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体との反応によって放出される。この反応は、酸化剤、および適用可能であれば、電子伝達体の存在も必要とする。
【０１４２】
ルミノールまたはイソルミノールの誘導体は、好ましくは、全ての可能な改変（複数可）（例えば、化学的および／または酵素的）を通してルミノールまたはイソルミノールからそれぞれ得られる分子である。ルミノールまたはイソルミノールの誘導体は、例えば、ペルオキシダーゼ酵素の基質であり、前記ペルオキシダーゼ酵素とルミノールまたはイソルミノールの前記誘導体との反応は、化学発光化合物の生成を可能にする。
【０１４３】
イソルミノールの誘導体は、例えば、刊行物Dodeigne C. et al (2000), Talanta 51, 415-439, "Chemiluminescence as diagnostic tool. A review"に記載の通り、アミノエチルイソルミノール（またはＡＥＩ）、アミノエチルエチルイソルミノール（またはＡＥＥＩ）、アミノブチルイソルミノール（またはＡＢＩ）、アミノブチルエチルイソルミノール（またはＡＢＥＩ）、アミノペンチルエチルイソルミノール（またはＡＰＥＩ）、アミノヘキシルイソルミノール（またはＡＨＩ）、アミノヘキシルエチルイソルミノール（またはＡＨＥＩ）、アミノオクチルメチルイソルミノール（またはＡＯＭＩ）またはアミノオクチルエチルイソルミノール（またはＡＯＥＩ）であってもよい。
【０１４４】
本発明の別の特定の実施形態により、化学発光によって検出されるシグナルは、アクリジン、セレンテラジン、ジオキセタンもしくは過酸化シュウ酸化合物、またはそれらの誘導体の１つ、特に刊行物Dodeigne C. et al (2000), Talanta 51, 415-439, "Chemiluminescence as diagnostic tool. A review"に記載される化合物の中から選択される基質との酵素的または化学的反応を通して放出される。
【０１４５】
電子伝達体は、例えば、３−（１０’フェノチアジニル）プロパン１−スルホン酸ナトリウム、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ヨードフェニルボロン酸、４−（フェノチアジン−１０−イル）ブタン−１−スルホン酸またはそれらの組合せである。
【０１４６】
酸化剤は、例えば過酸化物、例えば過酸化水素または過ホウ酸ナトリウムである。
【０１４７】
ペルオキシダーゼ酵素とルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体との反応からもたらされるシグナルは、３７５ｎｍから５８０ｎｍ、例えば４２５ｎｍの波長で読み取られる。
【０１４８】
検出されるシグナルは、好ましくはＲＬＵ（相対的な光の単位）で表される。ペルオキシダーゼ酵素は、検出リガンド、例えば分析物の特異的検出リガンドに、またはストレプトアビジンなどの間接検出マーカーのレポーターに結合することができる。
【０１４９】
一般に、化学発光反応は、少なくとも２つの溶液を含むキットを用いて行われる。
【０１５０】
第１の溶液は、ペルオキシダーゼの基質、例えばルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体、ならびに電子伝達体を含む。第２の溶液は、酸化剤を含む。一例として、以下のキットを用いることができる：「Ｉｍｍｕｎ−ｓｔａｒ  ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃ」（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、「ＥＬＩＳＴＡＲ  ＥＴＡ  Ｃ  Ｕｌｔｒａ  ＥＬＩＳＡ」（Ｃｙａｎａｇｅｎ、Ｉｔａｌｙ）、「Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、「Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＨＲＰ」（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）。
【０１５１】
対照として用いられる蛍光体
有利な一実施形態では、固体支持体の少なくとも１つのコンパートメントのスポット（複数可）は、対照として用いられる蛍光体を含む。
【０１５２】
対照として用いられる蛍光体は、好ましくは、分析物の存在に対応するシグナルに、例えば化学発光化合物によって放出されるシグナルに干渉しないかまたはほとんど干渉しない。
【０１５３】
一例として、分析物の存在に対応するシグナルが、ルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体から得られる化学発光化合物である場合は、対照として用いられる蛍光体は、好ましくはおよそ４２５ｎｍ、特に４００ｎｍから５５０ｎｍ、好ましくは３７５ｎｍから５５０ｎｍ、より好ましくは３５０ｎｍから５８０ｎｍの光を放出しない。それは、例えば、４００ｎｍ、３９０ｎｍ、３８０ｎｍ、３７５ｎｍ、３７０ｎｍ、３６０ｎｍもしくは３５０ｎｍ未満の（または以下の）波長だけ、または５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５７０ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍもしくは６００ｎｍを超える（またはそれ以上の）波長だけの光を放出することができる。
【０１５４】
対照として用いられる蛍光体は、例えば、クマリン、ローダミン、カルボピロニン、オキサジン、ベンゾピリリウム、フィコエリトリンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。前記蛍光体は、担体分子、例えばＢＳＡなどのタンパク質に任意選択で結合される。
【０１５５】
対照として用いられる蛍光体は、例えば、クマリン、ローダミン、カルボピロニン、オキサジン、Ｂ−フィコエリトリン、ベンゾピリリウムの誘導体、およびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【０１５６】
対照として用いられる１つの蛍光体は、好ましくは、カルボピロニン、カルボピロニンの誘導体、オキサジン、オキサジン誘導体、ベンゾピリリウム誘導体およびフィコエリトリンからなる群から選択される。
【０１５７】
対照として用いるための１つのさらにより好ましい蛍光体は、カルボピロニン、ベンゾピリリウム誘導体およびフィコエリトリンからなる群から選択される。
【０１５８】
あるいは、対照として用いるための１つの好ましい蛍光体は、カルボピロニン誘導体、ベンゾピリリウム誘導体およびフィコエリトリンからなる群から選択されてもよい。
【０１５９】
対照としてスポットで用いることができる１つの好ましい蛍光体は、例えば、以下の基本構造を含むカルボピロニンである：
【０１６０】
【化１】
2017510810.tif 000002
【０１６１】
例には、Ａｔｔｏ−Ｔｅｃから市販されているＡｔｔｏ  ６３３カルボピロニンおよびその誘導体、特にＡｔｔｏ  ６３３のアミン誘導体が含まれる。
【０１６２】
対照としてスポットで用いることができる好ましい蛍光体の別の例は、名称「色素６３４」（担体分子、例えばＢＳＡに結合した形態）の下でＤｙｏｍｉｃｓ社から市販されている蛍光体であり、その式は以下の通りである：
【０１６３】
【化２】
2017510810.tif 000003
【０１６４】
これは、ベンゾピリリウム誘導体である。
【０１６５】
色素６３４蛍光体は、対照として、スポットでそのアミン形態（色素６３４−アミン）で用いることができる。それは、次に担体分子、特にＢＳＡに結合させるか、または結合させずに用いることができる。
【０１６６】
対照としてスポットで用いることができるベンゾピリリウムに由来する好ましい蛍光体のさらに別の例は、色素６３０のアミン誘導体であり、色素６３０は以下の式を有する：
【０１６７】
【化３】
2017510810.tif 000004
【０１６８】
色素６３０のアミン誘導体は、担体分子、特にＢＳＡに結合させるか、または結合させずに用いることができる。
【０１６９】
吸収性粒子
本明細書では、「吸収性粒子」は、その低減（部分的または完全な）を追求するシグナル、すなわち光干渉の起源のシグナルの放出波長範囲に部分的または完全に重なる波長範囲の光を吸収する粒子を指す。
【０１７０】
分析物の存在を検出するために分析方法で発光性化合物、例えば化学発光化合物が用いられる場合は、本発明による吸収性粒子は、好ましくは、前記発光性化合物の放出波長範囲に完全に重なる波長範囲の光を吸収する。
【０１７１】
一般的に、ルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体へのペルオキシダーゼの反応を用いる発色システムについては、本発明による吸収性粒子は、好ましくは３７５ｎｍから５８０ｎｍの波長範囲を吸収する。
【０１７２】
検体中の分析物の存在を検出するために、および任意選択で検体中の分析物を数量化するために分析方法で蛍光体が用いられる場合は、用いる吸収性粒子は前記蛍光体によって放出されるシグナルの検出を可能にする。したがって、用いる吸収性粒子は、前記蛍光体によって放出されるシグナルが用いられる分析方法で検出可能および／または数量化可能なままである限り、前記蛍光体の励起および／または放出波長範囲に含まれる波長の光の全部または一部を吸収することができる。さらに、好ましくは、吸収性粒子は、前記蛍光体の励起および／または放出波長範囲に対応する光を拡散しない。
【０１７３】
特定の一実施形態では、検体中の分析物の存在を検出するために、および／または検体中の分析物を数量化するために分析方法で蛍光体が用いられる場合は、用いられる吸収性粒子は、前記蛍光体の励起および／または放出波長範囲に対応する波長範囲の光を吸収せず、好ましくは、前記蛍光体の励起および／または放出波長範囲に対応する光を拡散しない。
【０１７４】
好ましい一実施形態では、吸収性粒子によって引き起こされる潜在的な拡散は、特にそれらが拡散するより多くの光を吸収することによって、ウェルの底のシグナルレベルの増加を妨げない。吸光度および拡散は、当業者に公知である技術を用いて測定可能である。
【０１７５】
好ましい一実施形態では、吸収性粒子は赤色では蛍光性ではなく、すなわち、特に塩基性の媒体中でそれらが任意の光によって励起される場合、それらは６２０から７８０ｎｍの波長の光を放出しない。
【０１７６】
特定の一実施形態では、本発明による吸収性粒子は６５７ｎｍで吸収せず、特に６２０から７８０ｎｍの間、６１０から８００ｎｍの間、６００から９００ｎｍの間または５８０から９５０ｎｍの間で吸収せず、それら自体蛍光性ではない。
【０１７７】
好ましくは、本発明との関連で用いられる吸収性粒子は、蛍光性ではない。
【０１７８】
驚くべきことに、本発明による吸収性粒子は、検出されるシグナルに干渉しないかほとんど干渉せずに、例えば、ペルオキシダーゼ酵素とルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体との反応からスポットで局所的にもたらされる化学発光化合物によって放出される光に干渉しないかほとんど干渉せずに、光干渉の起源でシグナルを吸収する。
【０１７９】
本明細書では、「化合物Ｘはシグナルに干渉しないかほとんど干渉しない」という表現は、化合物Ｘの非存在下で測定される強度に対して、前記化合物Ｘの存在下でのシグナルの強度が、２０％以下、好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下しか減少しないことを意味する。
【０１８０】
さらに、本発明による吸収性粒子は、活性化状態に入って、ペルオキシダーゼ酵素とその基質（例えばルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体）との反応によって生成される化学発光化合物の放出波長より高い波長で放出することができるフルオレセインで観察できるような、化学発光化合物とのエネルギー転移を引き起こさない。
【０１８１】
吸収性粒子は、好ましくは５０μｍ未満、好ましくは４０μｍ未満、例えば３０μｍ未満または２０μｍ未満、より好ましくは１０μｍ未満、より好ましくは６μｍ未満、より好ましくは２μｍ未満、より好ましくは１μｍ未満、さらにより好ましくは０．５μｍ未満の直径を有する。例えば、吸収性粒子は、０．４５μｍ未満の直径を有する。
【０１８２】
吸収性粒子の平均直径は、好ましくは０．００５μｍから５０μｍ、０．００５μｍから４０μｍ、０．００５μｍから３０μｍ、０．００５μｍから２０μｍ、０．００５μｍから１０μｍ、０．００５μｍから６μｍ、０．０１μｍから２μｍ、好ましくは０．０１μｍから１μｍ、より好ましくは０．０５μｍから０．５μｍ、さらにより好ましくは０．０５μｍから０．１μｍである。吸収性粒子の平均直径は、例えば、０．０５０μｍまたは０．０７０μｍである。
【０１８３】
「粒子の直径」および「粒子のサイズ」という表現は、本明細書では同義である。
【０１８４】
吸収性粒子の直径は、当業者に周知である任意の適切な方法から、例えば粒子アナライザー、例えばＮａｎｏｔｒａｃ  ＮＰＡ１５０タイプのものを用いて測定することができる。
【０１８５】
本明細書では、「平均直径」は、吸収性粒子の直径の平均を指し、各直径は考慮される吸収性粒子と同じ体積を有する同等の球の直径によって規定される。
【０１８６】
有利な一実施形態では、本発明による吸収性粒子は、スポット（複数可）で対照として存在する蛍光体によって放出されるシグナルの検出をさらに可能にする。そのような吸収性粒子は、例えば、段落「対照としてスポット（複数可）に存在する蛍光体によって放出されるシグナルの検出をさらに可能にする吸収性粒子を選択するための方法」において下で規定される吸収性粒子選択方法を用いて得られ、または得ることができる。
【０１８７】
本発明による吸収性粒子は、例えば、炭素粒子および着色粒子からなる群で選択される。
【０１８８】
本発明による吸収性粒子は、異なる（少なくとも２つの）タイプ（または群）の粒子の混合物で構成されてもよく、前記粒子のタイプはそれらの吸収スペクトルおよび／またはそれらの平均直径が異なる。
【０１８９】
したがって、着色粒子は、例えば着色粒子の混合物、好ましくは異なる着色粒子の混合物の形態で供与することができ、着色粒子の前記混合物の吸収スペクトルは、好ましくは、検出される分析物に対応するシグナル（例えばルミノール、イソルミノールおよび／またはそれらの誘導体の１つのシグナル）の放出波長範囲に完全に重なっている。異なる色の２つ以上（例えば、３つ）のタイプの粒子を、混合することができる。
【０１９０】
好ましくは、着色粒子の混合物で用いられる着色粒子は、黒色の粒子を含まない。
【０１９１】
本発明による吸収性粒子は、例えば、黄色の粒子とマゼンタ色の粒子の混合物である。
【０１９２】
混合物の形態で供与される粒子は、前記混合物が可視光の全てを吸収するように選択することができる。
【０１９３】
炭素粒子は、好ましくはカーボンブラック粒子である。
【０１９４】
カーボンブラックは、非晶質および元素形態の炭素である。
【０１９５】
黄色の粒子は、例えば、ブタナミド、２−［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−３−オキソ−、モノ（４−スルホフェニル）の誘導体およびナトリウム塩を含む組成物の形態で供与される。
【０１９６】
マゼンタ色の粒子は、例えば、水、ベンゼンスルホン酸、（５，７，１２，１４−テトラヒドロ−２，９−ジメチル−７，１４−ジオキソキノ［２，３−ｂ］アクリジニル）およびナトリウム塩を含む組成物の形態で供与される。
【０１９７】
マゼンタ色の粒子と黄色の粒子の混合物は、例えば、黄色とマゼンタ色の粒子を１：１の重量比で含む。
【０１９８】
したがって、驚くべきことに、本発明による吸収性粒子は、化学発光によって検出されるシグナルに、および、適用可能であれば、対照としてスポットに存在する蛍光体によって放出される蛍光に干渉しないかほとんど干渉せずに、化学発光化合物から来る光干渉を部分的または完全に低減することを可能にする。
【０１９９】
有利には、本発明による吸収性粒子の存在は肉眼で見ることができ（特に、固体支持体の材料より暗いか明るい均一な輝度を有するディスクとして出現する）、したがってそのことは、固体支持体のコンパートメントのスポット（複数可）の存在下で吸収性粒子の設置を対照することを可能にし、前記吸収性粒子が吸収性組成物の形態で添加される場合は、固体支持体のコンパートメントのスポット（複数可）の存在下で前記吸収性組成物に含まれる任意の化合物の設置を対照することを可能にする。
【０２００】
当業者は、例えば前記吸収性の粒子のいくつかの濃度を試験することによって、所望の改善されたシグナル検出を得るために、スポットにおける多重分析方法で用いられる吸収性粒子の最適な量を容易に決定することができる。
【０２０１】
好ましい一実施形態では、吸収性粒子は、炭素粒子、特にカーボンブラック粒子である。
【０２０２】
本発明との関連で用いられる炭素粒子は、好ましくは５０μｍ未満、好ましくは４０μｍ未満、３０μｍ未満または２０μｍ未満、より好ましくは１０μｍ未満または６μｍ未満の直径を有する。特定の一実施形態により、前記炭素粒子は、２μｍ未満、好ましくは１μｍ未満、より好ましくは０．５μｍ未満の直径を有する。例えば、本発明との関連で用いられる炭素粒子は、０．４５μｍ未満の直径を有する。
【０２０３】
本発明との関連で用いられる炭素粒子の平均直径は、好ましくは０．００５μｍから５０μｍ、０．００５μｍから４０μｍ、０．００５μｍから３０μｍ、０．００５μｍから２０μｍ、０．００５μｍから１０μｍまたは０．００５μｍから６μｍである。特定の一実施形態により、前記炭素粒子の平均直径は、０．００５μｍから２μｍ、好ましくは０．０１μｍから１μｍ、より好ましくは０．０５μｍから０．５μｍ、さらにより好ましくは０．０５μｍから０．１μｍである。炭素粒子の平均直径は、例えば、０．０５μｍまたは０．０７μｍである。
【０２０４】
炭素粒子は、例えば米国特許第７，６５５，２０９号明細書またはＥＰ０，４８１，０３４の文献に記載の、当業者に周知である任意の方法を用いて得ることができる。
【０２０５】
有利な一実施形態では、炭素粒子の表面に官能基が付着している。これらの官能基は、例えば、ポリマーまたは界面活性剤を用いずに、安定した均一な分散液を得ることを可能にする。用いることができる官能基は、例えば、ＥＰ０，４８１，０３４の文献に記載のものである。
【０２０６】
対照としてスポット（複数可）に存在する蛍光体によって放出されるシグナルの検出をさらに可能にする吸収性粒子を選択するための方法
本発明は、固体支持体のスポット（複数可）に存在する蛍光体によって放出されるシグナルの検出をさらに可能にする、吸収性粒子を選択するための方法であって、
ａ）試験する吸収性粒子または試験する吸収性粒子の混合物を含む液相を、固体支持体のコンパートメントのスポット（複数可）と接触させるステップであって、前記コンパートメントのスポットの少なくとも１つは蛍光体を含む、ステップ、
ｂ）試験する前記吸収性粒子または試験する吸収性粒子の前記混合物を含む前記液相の存在下で前記蛍光体によって放出されるシグナルを検出するステップ、および
ｃ）その存在下でステップｂ）で検出されるシグナルが前記蛍光体を含むスポット（複数可）を局在化することを可能にする吸収性粒子または吸収性粒子の混合物を選択するステップ
を含む方法にも関する。
【０２０７】
試験するまたは試験する混合物に含まれる吸収性粒子は、その低減（部分的または完全な）を追求するシグナル、すなわち光干渉の起源のシグナルの放出波長範囲に部分的または完全に重なる波長範囲の光を吸収する粒子である。
【０２０８】
ステップａ）は、試験する吸収性粒子の各々または吸収性粒子の混合物の各々について実行される。
【０２０９】
ステップａ）では、試験する吸収性粒子または試験する吸収性粒子の混合物は、前記吸収性粒子または吸収性粒子の前記混合物の異なる濃度を試験するために、例えば異なる濃度でいくつかのコンパートメントで添加することができる。
【０２１０】
試験する吸収性粒子の各々または試験する吸収性粒子の異なる混合物の各々について、異なるコンパートメントが用いられる。
【０２１１】
吸収性粒子のベースを有する吸収性組成物
好ましい一実施形態では、「吸収性粒子」の段落において上で規定される吸収性粒子は、吸収性組成物の形態で供与される。
【０２１２】
したがって、本発明は、スポット上での多重分析方法のシグナルの検出を改善する（したがって確実にする）ことを可能にする、上で規定される吸収性粒子を含む吸収性組成物にも関する。
【０２１３】
本明細書では、本発明による吸収性粒子を含む吸収性組成物は、分散液と呼ばれる。
【０２１４】
「分散液」は液体中の固体粒子の混合物を表し、前記固体粒子は、０．００５μｍから５０μｍ、０．００５μｍから４０μｍ、０．００５μｍから３０μｍ、０．００５μｍから２０μｍ、０．００５μｍから１０μｍ、０．００５μｍから６μｍ、０．０１μｍから２μｍ、好ましくは０．０１μｍから１μｍの平均直径を有する。
【０２１５】
本発明による吸収性組成物は、１％から８０％の吸収性粒子、好ましくは２％から６０％の吸収性粒子、より好ましくは５％から５０％の吸収性粒子、より好ましくは７％から４０％の吸収性粒子、さらにより好ましくは１０％から３０％の吸収性粒子を含むことができ、百分率は吸収性組成物の総重量の重量百分率によって表される。例えば、吸収性組成物は、１０％から２０％の吸収性粒子、より好ましくは１２％から１８％の吸収性粒子を含むことができ、百分率は吸収性組成物の総重量の重量百分率によって表される。例えば、吸収性組成物は、１５％の吸収性粒子を含み、百分率は吸収性組成物の総重量の重量百分率によって表される。
【０２１６】
有利な一実施形態では、吸収性組成物は、吸収性粒子と、ビヒクル、結合剤および添加剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物とを含む。
【０２１７】
吸収性組成物で用いられるビヒクルは、溶媒、例えば水であってもよい。
【０２１８】
吸収性組成物で用いられる溶媒は、例えば、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、アセテート、グリコールエーテル、アルコールまたはそれらの組合せであってもよい。
【０２１９】
結合剤は、吸収性組成物の粘度を調整することを特に可能にする。
【０２２０】
結合剤の例は、フェノール樹脂および／またはコポリマーである。
【０２２１】
添加剤は、例えば、殺生物剤および／または消泡剤である。
【０２２２】
本発明による１つの好ましい吸収性組成物は、吸収性粒子、水、任意選択でナトリウム塩、および任意選択で殺生物剤を含む、またはそれからなり、前記吸収性粒子は１つまたはいくつかの官能基に結合することができる。本発明による１つのさらにより好ましい吸収性組成物は、炭素粒子（好ましくはカーボンブラック粒子）、水、任意選択でナトリウム塩、および任意選択で殺生物剤を含む、またはそれからなり、前記炭素粒子は、１つまたはいくつかの官能基、例えば４−カルボキシフェニル−、ヒドロキシ−および／または４−スルホフェニル基に結合することができる。
【０２２３】
有利には、前記組成物を混ぜることを必要とせずに経時的に安定したままである粒子の均一な分散液を有するように、吸収性粒子は吸収性組成物中でほとんど沈殿しない。
【０２２４】
容易にピペット操作することができるように、吸収性組成物は比較的低い粘度を好ましくは有する。
【０２２５】
吸収性組成物は、好ましくは０．５ｃｐから３ｃｐ、より好ましくは１ｃｐから２．５ｃｐの粘度を有する。吸収性組成物は、例えば、２．１ｃｐの粘度を有する。
【０２２６】
粘度は、当業者に周知である任意の適切な方法により、例えば回転粘度計、例えばＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄタイプのものを用いて測定することができる。
【０２２７】
吸収性組成物のｐＨは、好ましくは７から１２、好ましくは８から１０、例えば９．７である。
【０２２８】
表面張力は、好ましくは６０ダイン／ｃｍから８０ダイン／ｃｍ、好ましくは６５ダイン／ｃｍから７５ダイン／ｃｍ、例えば７０ダイン／ｃｍである。
【０２２９】
表面張力は当業者に周知である任意の適切な方法により、例えばＫｒｕｓｓタイプの張力計を用いて測定することができる。
【０２３０】
有利な一実施形態では、吸収性組成物は、ポリマーも界面活性剤も含まない。
【０２３１】
吸収性組成物は、Ｃａｂｏｔ（米国）によるＣＡＢ−Ｏ−ＪＥＴ（登録商標）３５２Ｋ製品、ＣＡＢ−Ｏ−ＪＥＴ（登録商標）４００製品、ＣＡＢ−Ｏ−ＪＥＴ（登録商標）２００製品、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ（米国）によるＡｑｕａｂｌａｋ（登録商標）５１０９製品、Ａｑｕａｂｌａｋ（登録商標）６１５２製品、Ａｑｕａｂｌａｋ（登録商標）６３５３製品、またはそれらの組合せを含む、またはそれらからなることができる。
【０２３２】
吸収性組成物は、Ｃａｂｏｔ（米国）によるＣＡＢ−Ｏ−ＪＥＴ（登録商標）２７０製品の形態で供与される黄色の吸収性粒子、およびＣａｂｏｔ（米国）によるＣＡＢ−Ｏ−ＪＥＴ（登録商標）２６０Ｍ製品の形態で供与されるマゼンタ色の吸収性粒子の混合物を含む、またはそれからなることもできる。
【０２３３】
吸収性組成物は、上記の特徴の１つもしくはいくつか、または全てを含むことができる。
【０２３４】
本発明による１つの好ましい吸収性組成物は、以下の特徴の少なくとも１つ、好ましくは以下の特徴の少なくとも２つ、少なくとも３つもしくは少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全てを有する：
−  吸収性組成物は、０．５μｍ未満、例えば０．４５μｍ未満の直径を有する吸収性粒子を含む、
−  吸収性組成物は、０．０６μｍから０．１μｍの平均直径、例えば０．０７０μｍの平均直径を有する吸収性粒子を含む、
−  吸収性組成物は、その表面に官能基が付着している吸収性粒子を含む、
−  吸収性組成物は、１２％から１８％の吸収性粒子、例えば１５％の吸収性粒子を含み、百分率は吸収性組成物の総重量の重量百分率によって表される、
−  吸収性組成物は、６５ダイン／ｃｍから７５ダイン／ｃｍ、例えば７０ダイン／ｃｍの表面張力を有する、
−  吸収性組成物は、８から１０、例えば９．５のｐＨを有する、および／または
−  吸収性組成物は、１ｃｐから２．５ｃｐの粘度、例えば２．１ｃｐの粘度を有する。
【０２３５】
本発明による吸収性組成物は、使用前に、特に水、または用いられるシグナルの検出に適合する、特に発光性化合物の生成につながる酵素反応に適合する任意の他の溶媒、例えば本出願に記載の溶媒に希釈することもできる。例えば、本発明による吸収性組成物は、１０〜２０００倍、好ましくは１００〜１０００倍、例えば１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍に希釈することができる。
【０２３６】
前述の通り、吸収性組成物は、黄色の粒子とマゼンタ色の粒子の混合物を含む、またはそれからなることもできる。
【０２３７】
有利には、吸収性組成物は、吸収性粒子、および発光性化合物、特に化学発光性化合物の生成に関与する少なくとも１つの化合物を含む。
【０２３８】
したがって、本発明による１つの好ましい吸収性組成物は、吸収性粒子、化学発光性化合物の生成に関与する少なくとも１つの化合物、水、任意選択でナトリウム塩および任意選択で殺生物剤を含む、またはそれからなり、前記吸収性粒子はおそらく１つまたはいくつかの官能基に結合している。本発明による１つのさらにより好ましい吸収性組成物は、炭素粒子（好ましくはカーボンブラック粒子）、化学発光性化合物の生成に関与する少なくとも１つの化合物、水、任意選択でナトリウム塩および任意選択で殺生物剤を含む、またはそれからなり、前記炭素粒子はおそらく１つまたはいくつかの官能基、例えば４−カルボキシフェニル−、ヒドロキシ−および／または４−スルホフェニル基に結合している。
【０２３９】
驚くべきことに、吸収性粒子および化学発光性化合物の生成に関与する少なくとも１つの化合物のベースを有するそのような組成物は、経時的に安定している。
【０２４０】
表現「経時的に安定した」は、同じ分析方法の実行の間、Ｄ０に吸収性組成物を用いて検出されるシグナルが、前記吸収性組成物を４℃および／または３７℃で少なくとも１カ月の間、好ましくは４℃で少なくとも３カ月、例えば４℃で３カ月、６カ月、１年または２年の間保った後に前記吸収性組成物を用いて検出されるシグナルと実質的に同一であることを意味する。
【０２４１】
表現「実質的に同一」は、検出されるシグナルが、４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下しか異ならないことを意味する。
【０２４２】
したがって、吸収性組成物は、分析方法との関連で用いられる、特に発色ステップ（複数可）の間に用いられる１つもしくはいくつかの組成物および／または１つもしくはいくつかの化合物と混合することができる。
【０２４３】
有利な一実施形態では、本発明による吸収性組成物は、ルミノール、イソルミノール、ルミノールまたはイソルミノールの誘導体、電子伝達体および酸化剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物をさらに含む。
【０２４４】
ルミノール、イソルミノール、ルミノールまたはイソルミノールの誘導体、ペルオキシダーゼ酵素、電子伝達体および酸化剤は、特に上で規定される通りである。
【０２４５】
１つの好ましい吸収性組成物は、吸収性粒子、例えば炭素粒子、ルミノール、イソルミノール、ルミノールまたはイソルミノールの誘導体、および任意選択で電子伝達体の中から選択される少なくとも１つの化合物を含む。
【０２４６】
別の好ましい吸収性組成物は、吸収性粒子、例えば炭素粒子、および少なくとも１つの酸化剤、例えば過酸化物を含む。
【０２４７】
本発明による吸収性組成物は、有利には少なくとも１つの溶媒を含む。
【０２４８】
吸収性組成物で用いられる溶媒は、好ましくは、発光性化合物の生成につながる酵素反応、例えばペルオキシダーゼとルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体との反応に適合する。
【０２４９】
吸収性組成物で用いることができる１つの好ましい溶媒は、水である。
【０２５０】
好ましい吸収性組成物の別の例は、吸収性粒子、例えば炭素粒子を含み、ルミノール、イソルミノール、ルミノールもしくはイソルミノールの誘導体、電子伝達体または酸化剤をいずれも含まない。例えば、そのような吸収性組成物は、炭素粒子および溶媒、例えば水を含む、またはそれからなる。
【０２５１】
スポット（複数可）における分析方法を実行するためのキット
本発明はさらに、特に少なくとも１つのスポットを含む固体支持体を使用して、分析方法を実行するためのキットであって、
少なくとも２つの組成物：
−  ルミノール、イソルミノールおよびルミノールまたはイソルミノールの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第１の組成物、
−  酸化剤および電子伝達体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、好ましくは少なくとも１つの酸化剤および任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第２の組成物
を含み、第１の組成物および／または第２の組成物は吸収性粒子を含むこと、および／または前記キットは吸収性粒子を含む第３の組成物を含むことを特徴とするキットに関する。
【０２５２】
吸収性粒子および固体支持体は、特に上で規定される通りである。
【０２５３】
本発明は、特に少なくとも１つのスポットを含む固体支持体を使用して、分析方法を実行するためのキットであって、
−  吸収性粒子ならびにルミノール、イソルミノールおよびルミノールまたはイソルミノールの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第１の吸収性組成物、
−  酸化剤および電子伝達体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、好ましくは少なくとも１つの酸化剤および任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第２の組成物
を含むキットに特に関する。
【０２５４】
本発明は、特に少なくとも１つのスポットを含む固体支持体を使用して、分析方法を実行するためのキットであって、
−  ルミノール、イソルミノールおよびルミノールまたはイソルミノールの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第１の組成物、ならびに
−  吸収性粒子ならびに酸化剤および電子伝達体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、好ましくは少なくとも１つの酸化剤および任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第２の吸収性組成物
を含むキットに特に関する。
【０２５５】
本発明は、特に少なくとも１つのスポットを含む固体支持体を使用して、分析方法を実行するためのキットであって、
−  ルミノール、イソルミノールおよびルミノールまたはイソルミノールの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第１の組成物、
−  酸化剤および電子伝達体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み、好ましくは少なくとも１つの酸化剤および任意選択で少なくとも１つの電子伝達体を含む第２の組成物、ならびに
−  吸収性粒子を含む第３の吸収性組成物
を含むキットに特に関する。
【０２５６】
分析方法は、有利には多重分析方法である。
【０２５７】
シグナルの検出の改善
上で規定される吸収性粒子または上で規定されるそれらを含む吸収性組成物の使用は、特にシグナルの検出が液相の存在下で実行される場合は、スポット（複数可）における分析方法、好ましくはスポットにおける多重分析方法でシグナルの検出を改善する（したがって確実にする）ことを可能にする。
【０２５８】
「シグナルの検出を改善する」は、特にバックグラウンドノイズを減少させること、より詳細には吸収性粒子またはそれらを含む吸収性組成物の非存在下で得られる「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比に対して、それらの存在下で「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比を改善することを意味する。
【０２５９】
「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比の改善を評価するための「検出されるシグナル」は、例えば、検体で検出される分析物の存在下で所与のスポット（すなわち、前記スポットが見出される位置）で測定されるか、または検出される分析物の既知量の存在下で所与のスポット（すなわち、前記スポットが位置する位置）で測定されるシグナルの強度である。
【０２６０】
好ましくは、「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比の改善を評価するための「検出されるシグナル」は、吸収性粒子の非存在下で光干渉、例えば光の弧および／またはツインスポットおよび／または光のウェブを誘導する量で存在する分析物の存在下で所与のスポット（すなわち、前記スポットが見出される位置）で測定されるシグナルの強度である。
【０２６１】
スポットで測定されるシグナルの強度は、ＲＬＵ（相対的な光の単位）で一般に表される。
【０２６２】
当業者は、特に固体支持体の下に有利に位置するカメラを用いて、用いる検出マーカー（複数可）に基づいてスポット（すなわち、前記スポットが見出される位置）でシグナルを検出する方法を知っている。
【０２６３】
「バックグラウンドノイズ」は、スポットを含まない固体支持体のコンパートメントのバックグラウンドゾーンで測定される光強度である。
【０２６４】
バックグラウンドノイズは、ＲＬＵ（相対的な光の単位）で一般に表される。
【０２６５】
例えば検出されるシグナルを増加させてバックグラウンドノイズを減少させることによって、または検出されるシグナルを減少させ、なおさらにバックグラウンドノイズを減少させることによって「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比が増加すると、「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比の改善は存在する。
【０２６６】
本発明による吸収性粒子の使用は、好ましくは、吸収性粒子の非存在下に対して吸収性粒子の存在下で、「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比を少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、例えば少なくとも３０％または少なくとも４０％増加させることを可能にする。
【０２６７】
本発明は、化学発光の発色に基づくスポット（複数可）における分析方法、特にスポットにおける多重分析方法に特に適する。実際、化学発光によって放出されるシグナルが、シグナルを増幅することによって、捕捉リガンド−分析物−検出リガンド相互作用の検出を可能にするために、酵素反応がシグナルの検出の間続くこと、したがって、シグナルの検出時に酵素の基質がスポットにおいて液相中に存在することが必要である。
【０２６８】
本発明との関連で、例えば吸収性組成物の形態で供与される吸収性粒子は、シグナルの検出時に存在しなければならない。
【０２６９】
吸収性粒子は、化学発光反応のために必要な１つまたはいくつかの化合物の添加の前に、添加と同時にまたは添加の後に添加することができる。全ての場合に、吸収性粒子は、シグナルの獲得時に存在しなければならない。
【０２７０】
化学発光反応のために必要な化合物は、一般に酵素（例えば、ペルオキシダーゼ酵素）、酵素の基質（例えば、ルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体）、任意選択で少なくとも１つの他の化合物、例えば酸化剤（例えば、過酸化物）および／または電子伝達体（例えば、３−（１０’フェノチアジン）プロパン１−スルホン酸ナトリウム）である。
【０２７１】
シグナルの検出を改善するための方法
本発明は、分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善すること（したがって確実にすること）を可能にする分析方法、特に多重分析方法であって、
ａ）分析物の検出を目的とする少なくとも１つのスポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体を用意するステップ、
ｂ）分析する検体を前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｃ）分析物の少なくとも１つの検出リガンドを前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドは直接または間接検出マーカーに結合している、ステップ、
ｄ）前記検出マーカーが間接検出マーカーである場合は、前記検出リガンドに結合している間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｅ）ステップｄ）で用いるレポーターが間接マーカーに結合している場合は、前記レポーターに結合している間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｆ）吸収性粒子を前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップであって、前記吸収性粒子は前記コンパートメントのスポット（複数可）と接触している液相に含まれる、ステップ、および
ｇ）前記吸収性粒子を含む液相の存在下で、前記コンパートメントのスポット（複数可）で分析物の存在に対応するシグナルを検出するステップ
を含む、またはそれからなる分析方法に特に関する。
【０２７２】
本発明による方法は、好ましくは先ずステップａ）を含み、次にステップｂ）およびｃ）を含むが、それらはその順序で、またはステップｂ）の前にステップｃ）の順序、またはステップｂ）およびｃ）を同時に実行してもよく、次にステップｄ）、次にステップｅ）およびｆ）を含むが、それらはその順序で、またはステップｅ）の前にステップｆ）、またはステップｅ）およびｆ）を同時に実行してもよく、次にステップｇ）を含む。
【０２７３】
好ましい一実施形態では、ステップｆ）は、ステップｅ）と同時に実行される。
【０２７４】
シグナルの検出時に吸収性粒子が存在するように、洗浄ステップはステップｆ）とステップｇ）の間（ステップｅ）がステップｆ）の前、後または同時に実行されるかどうかにかかわらず）に実行されない。
【０２７５】
ステップｃ）がステップｂ）の前に実行される場合は、ステップｃ）とｂ）の間に洗浄ステップはない。
【０２７６】
表現「化合物Ｘをコンパートメントの１つまたはいくつかのスポットの存在下に置く」は、化合物Ｘが前記スポット（複数可）を含むコンパートメントに添加され、前記コンパートメントは好ましくは検体を分析することを目的とし、前記化合物Ｘは好ましくは溶液、分散液または懸濁液などのそれを含む組成物の形態で供与されることを特に意味する。
【０２７７】
同じステップの間に少なくとも２つの化合物がコンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置かれる場合、および／または少なくとも２つのステップｂ）〜ｆ）が同時に実行される場合は、前記化合物は前記スポット（複数可）の存在下に別々に置かれてもよく、すなわち、別々の組成物の形態（特に別々の溶液、分散液または懸濁液の形態）で供与されてもよく、あるいは、前記化合物または化合物のいくつかは、１つまたはいくつかの混合物の形態でコンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置かれてもよい。
【０２７８】
少なくとも１つのコンパートメントのスポットの存在下に、異なる化合物がある特定の時間、例えば１秒から２時間、好ましくは１分から１時間、より好ましくは５分から５０分、さらにより好ましくは１０分から４０分の間置かれる。
【０２７９】
当業者は、各インキュベーションステップのための適切な温度を決定する方法を知っている。インキュベーションの温度は、例えば４℃、１９℃から２４℃、３７℃または４０℃の温度であってもよい。
【０２８０】
ステップｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）の間に用いられる異なる構成成分は、当業者に周知である。例えば、それらは抗原−抗体およびマーカー−レポーター複合体の形成を可能にする。
【０２８１】
本方法は、スポットに、またはスポットに直接的もしくは間接的に結合している様々な化合物に結合していない化合物を排除することを可能にする、１つまたはいくつかの洗浄ステップをさらに含む。
【０２８２】
一般的に、洗浄ステップは、用いる各コンパートメントで洗浄溶液を分配（例えば、４００μｌの量）および吸引するために、少なくとも１つのサイクル、好ましくは少なくとも２つのサイクル、より好ましくは３〜６サイクルからなる。
【０２８３】
ステップｂ）〜ｇ）は、検体が分析される、分析物を検出することを目的とする少なくとも１つのスポットを含む固体支持体の各コンパートメントのために特に実行される。
【０２８４】
ステップａ）は少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体を用意することからなり、前記コンパートメントは、分析物の検出を目的とする少なくとも１つのスポット、好ましくは分析物の検出を目的とする少なくとも２つのスポットを含む。
【０２８５】
ステップａ）は、分析方法が前記固体支持体を用いて実行されること、すなわち、前記固体支持体を用いることを特に意味する。
【０２８６】
固体支持体は、特に、「固体支持体」の段落において上で規定される通りである。
【０２８７】
有利な一実施形態では、固体支持体は、その中の少なくとも１つのスポットがスポット（複数可）のための対照として蛍光体を含む、少なくとも１つのコンパートメントを含み、好ましくは、固体支持体は、そのスポットがスポットのための対照として蛍光体を含む、少なくとも１つのコンパートメントを含む。
【０２８８】
ステップｂ）では、分析する検体は固体支持体のコンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置かれる。
【０２８９】
分析する検体および検出する分析物（複数可）は、特に、「検体」および「分析物」の段落において上で規定される通りである。
【０２９０】
ステップｃ）では、分析物の少なくとも１つの検出リガンドが前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置かれ、分析物の前記検出リガンドは直接または間接検出マーカーに結合している。
【０２９１】
分析物の検出リガンドは、特に上で規定される通りである。
【０２９２】
好ましい一実施形態では、分析物の検出リガンドは、好ましくはビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンからなる群から選択される、間接検出マーカーに結合している。
【０２９３】
検出マーカーが間接検出マーカーである場合は、本方法は、前記検出リガンドに結合している間接検出マーカーのレポーター（第１のレポーターとも呼ばれる）を前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くことを含む、またはそれからなるステップｄ）を含み、前記レポーターも同様に直接または間接マーカー、好ましくは間接マーカーに結合している。
【０２９４】
好ましい一実施形態では、分析物の検出リガンドに結合している間接検出マーカーのレポーターは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンからなる群から選択される。
【０２９５】
例えば、分析物の検出リガンドはビオチンに結合しており、ビオチンのレポーターは、直接または間接検出マーカー、好ましくは間接検出マーカーに結合しているストレプトアビジンである。
【０２９６】
ステップｄ）で用いられるレポーター（すなわち、第１のレポーター）が間接マーカーに結合している場合は、本方法は、前記レポーターに結合している間接検出マーカーのレポーター（すなわち、第２のレポーター）を前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くことからなるステップｅ）をさらに含む。
【０２９７】
例えば、分析物の検出リガンドはビオチンに結合しており、ビオチンのレポーターは酵素に結合しているストレプトアビジンである。酵素のレポーター（すなわち、第２のレポーター）は、次に前記酵素の基質である。
【０２９８】
ステップｆ）では、吸収性粒子が前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置かれる。
【０２９９】
吸収性粒子は、特に、「吸収性粒子」の段落において上で規定される通りである。
【０３００】
特に、吸収性粒子は、好ましくは炭素粒子、例えばカーボンブラックの粒子、または着色粒子の混合物、例えば黄色の粒子とマゼンタ色の粒子の混合物である。
【０３０１】
吸収性粒子は、「吸収性組成物」の段落で上で規定される吸収性組成物の形態で供与されてもよい。
【０３０２】
有利な一実施形態では、吸収性粒子は、ルミノール、イソルミノール、ルミノールまたはイソルミノールの誘導体、電子伝達体および酸化剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む吸収性組成物の形態で供与される。
【０３０３】
吸収性組成物が、ルミノール、イソルミノール、ルミノールまたはイソルミノールの誘導体、電子伝達体および酸化剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物をさらに含む場合は、ステップｅ）およびｆ）はしたがって同時に実行される。
【０３０４】
ステップｆ）の終わりに、吸収性粒子は、前記コンパートメントのスポット（複数可）と接触している液相に含まれる。
【０３０５】
本明細書では、「前記コンパートメントのスポット（複数可）と接触している液相」は、液体組成物が前記コンパートメントに存在することを意味し、前記組成物は、例えば、溶液、分散液または懸濁液であってもよい。
【０３０６】
ステップｆ）の液相は、特にステップｆ）がステップｅ）の前に実行されるかどうかによって、本発明による吸収性組成物を含む、またはそれからなることができる。
【０３０７】
ステップｆ）の液相は、特にステップｆ）がステップｅ）の前に実行されるかどうかによって、本発明による吸収性組成物を含む、またはそれからなることができる。ステップｆ）がステップｅ）と同時にまたはそれの後に実行される場合は、ステップｅ）の液相は吸収性組成物を含むことができる。
【０３０８】
ステップｇ）は、前記コンパートメントのスポット（複数可）で分析物の存在に対応するシグナルを検出することを含み、前記シグナルの検出は、前記吸収性粒子を含む液相の存在下で実行される。
【０３０９】
ステップｇ）の液相は、特にステップｆ）がステップｅ）の後に実行される場合は、ステップｆ）の液相と同一であってもよい。
【０３１０】
ステップｇ）の液相は、特にステップｆ）がステップｅ）の前に実行される場合は、ステップｆ）の液相と異なってもよい。
【０３１１】
吸収性粒子が吸収性組成物の形態で供与される場合は、ステップｇ）の液相は前記吸収性組成物を含む、またはそれからなる。
【０３１２】
分析物（複数可）を検出するために分析方法でいくつかの異なる検出マーカーが用いられる場合は、ステップｇ）は、用いられる検出マーカー存在するのと同じくらい多くの異なるシグナルを検出することを含む。
【０３１３】
分析物の存在に対応してステップｇ）で検出されるシグナルは、例えば、発光性化合物、好ましくは化学発光性化合物によって放出されるシグナルおよび／または蛍光体によって放出されるシグナルである。
【０３１４】
好ましい一実施形態では、分析物の存在に対応してステップｇ）で検出されるシグナルは、発光性化合物、好ましくは化学発光性化合物によって放出されるシグナルであり、および任意選択で蛍光体によって放出されるシグナルである。
【０３１５】
１つのより好ましい実施形態では、分析物の存在に対応してステップｇ）で検出されるシグナルは、蛍光体によって放出されるシグナルではない。
【０３１６】
好ましくは、分析物の存在に対応してステップｇ）で検出されるシグナルは、化学発光性化合物によって放出されるシグナルである。
【０３１７】
したがって、ステップｇ）は、分析物の存在に対応する前記コンパートメントのスポット（複数可）で放出されるシグナルを検出することを少なくとも含み、分析物の存在に対応するシグナルは好ましくは化学発光性化合物によって放出される。
【０３１８】
好ましい一実施形態では、ステップｇ）で検出される分析物の存在に対応するシグナルは、したがって、化学発光性化合物によって放出される。好ましい一実施形態では、ステップｇ）は、したがって、前記吸収性粒子を含む液相の存在下で、化学発光による前記コンパートメントのスポット（複数可）での分析物の存在に対応するシグナルを検出することを含む。
【０３１９】
さらに、ステップｇ）は、固体支持体の少なくとも１つのコンパートメントのスポット（複数可）の１つ、いくつかで対照として存在する蛍光体によって放出されるシグナルの検出を有利には含むことができる。
【０３２０】
当業者は、例えば発光性化合物を通して、または蛍光体を通して、前記発光性化合物または前記蛍光体の性質に基づいて、放出されるシグナルを測定する方法を知っている。
【０３２１】
シグナルは、好ましくは、固体支持体の底を通してステップｇ）で検出される。
【０３２２】
シグナルの検出は、好ましくはスポット（複数可）で放出されるシグナルの強度の測定を含み、前記測定は、好ましくは固体支持体の底を通して、すなわち固体支持体の下面で実行される。
【０３２３】
シグナルの検出は、特に固体支持体の底の画像を捕捉するカメラを用いて実行される。したがって、測定されるシグナルは、固体支持体の下面の方へ前記固体支持体を横断するシグナルである。
【０３２４】
カメラは、例えば固体支持体の底の方に向くことができ、または光学システム（例えば１つもしくはいくつかのミラー、プリズムおよび／または１つもしくはいくつかのレンズを含む、またはそれらからなることができる）を用いて固体支持体の底の画像を捕捉することができる。
【０３２５】
蛍光体によって放出されるシグナルの強度の測定は、蛍光体の励起スペクトルに対応する光で好ましくは固体支持体の底からコンパートメント（複数可）を照らすことを必要とする。
【０３２６】
したがって、本発明による方法は、特にシグナル検出が液相の存在下で実行される場合に、スポット（複数可）における分析方法で分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善することを可能にする。
【０３２７】
シグナル検出の改善は、バックグラウンドノイズの低下、好ましくは「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比の増加を含む、またはそれからなる。
【０３２８】
「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比は、特に上で規定される通りである。
【０３２９】
分析方法、特に多重分析方法で分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善することを可能にする１つの好ましい方法は、
ａ）分析物の検出を目的とする少なくとも１つのスポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体を用意するステップであって、前記スポットは前記分析物の捕捉リガンド、および好ましくは蛍光体を含む、ステップ、
ｂ）分析する検体を前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｃ）分析物の少なくとも１つの検出リガンドを前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドは間接検出マーカー、好ましくはビオチンに結合している、ステップ、
ｄ）前記検出リガンドに結合している間接検出マーカーのレポーター、好ましくはストレプトアビジンを前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｅ）ステップｄ）で用いられるレポーターがペルオキシダーゼ酵素に結合している場合は、前記酵素の基質、例えばルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体を前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップ、
ｅ１）ステップｄ）で用いられるレポーターがペルオキシダーゼ酵素に結合している場合は、少なくとも１つの酸化剤、例えば過酸化物、および任意選択で少なくとも１つの電子伝達体、例えば３−（１０’フェノチアジニル）プロパン１−スルホン酸ナトリウムを、前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップであって、前記ステップｅ１）はステップｅ）の前、ステップｅ）の後、またはステップｅ）と同時に実行することができる、ステップ、
ｆ）吸収性粒子、好ましくは炭素粒子または黄色の粒子およびマゼンタ色の粒子の混合物を前記コンパートメントのスポット（複数可）の存在下に置くステップであって、前記吸収性粒子は前記コンパートメントのスポット（複数可）と接触している液相に含まれ、ステップｆ）はステップｅ）の前もしくは後、ステップｅ１）の前もしくは後、またはステップｅ）および／もしくはステップｅ１）と同時に実行することができる、ステップ、ならびに
ｇ）前記吸収性粒子を含む液相の存在下で、前記コンパートメントのスポット（複数可）で分析物の存在に対応するシグナルを検出するステップ
を含む、上で規定される方法である。
【０３３０】
本発明による方法は、上で規定されるキットを使用して実行することができる。
【０３３１】
シグナル検出を改善する吸収性粒子の使用
本発明は、少なくとも１つのスポットを含む固体支持体における分析方法、特に多重分析方法で分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善する（したがって確実にする）ための、吸収性粒子の使用に特に関する。
【０３３２】
固体支持体は、特に、「固体支持体」の段落において上で規定される通りである。
【０３３３】
固体支持体は少なくとも１つのコンパートメントを特に含み、前記コンパートメントは、分析物の検出を目的とする少なくとも１つのスポット、好ましくは分析物の検出を目的とする少なくとも２つのスポットを含む。
【０３３４】
吸収性粒子は、特に、「吸収性粒子」の段落において上で規定される通りである。特に、吸収性粒子は、好ましくは炭素粒子、例えばカーボンブラックの粒子、または着色粒子の混合物、例えば黄色の粒子とマゼンタ色の粒子の混合物である。
【０３３５】
本発明は、吸収性粒子が、好ましくは炭素粒子、好ましくはカーボンブラックの粒子、または着色粒子の混合物、例えば黄色の粒子とマゼンタ色の粒子の混合物であることを特徴とする、上で規定される使用に特に関する。
【０３３６】
吸収性粒子は、「吸収性組成物」の段落において上で規定される吸収性組成物の形態で供与されてもよい。
【０３３７】
１つのより好ましい実施形態では、本発明は、スポット（複数可）における分析方法、特にスポット（複数可）における多重分析方法で分析物の存在に対応するシグナルの検出を改善するための、炭素粒子、好ましくはカーボンブラック粒子、または着色粒子の混合物、好ましくは黄色の粒子とマゼンタ色の粒子の混合物の使用に特に関する。
【０３３８】
本発明は、より詳細には、分析物の存在に対応するシグナルの検出が液相の存在下で実行されることを特徴とする、上で規定される使用に関する。
【０３３９】
シグナルの検出は、好ましくはスポット（複数可）で放出されるシグナルの強度の測定を含み、前記測定は、好ましくは固体支持体の下面で実行される。シグナルの検出は、特に固体支持体の底の画像を捕捉するカメラを用いて実行される。
【０３４０】
上で示されるように、カメラは、例えば固体支持体の底の方に向くことができ、または光学システム（例えば１つもしくはいくつかのミラー、プリズムおよび／または１つもしくはいくつかのレンズを含む、またはそれらからなることができる）を用いて固体支持体の底の画像を捕捉することができる。
【０３４１】
本発明は、検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ比が増加することを特徴とする、上で規定される方法に特に関する。
【０３４２】
「検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ」比は、特に上で規定される通りである。
【０３４３】
本発明は、分析物の存在に対応するシグナルが化学発光性化合物および／または蛍光体によって、好ましくは化学発光性化合物によって放出されるシグナルであることを特徴とする、上で規定される使用に好ましくは関する。
【０３４４】
本発明は、分析方法が、上で規定される固体支持体、特にその中の少なくとも１つのスポットがスポット（複数可）のための対照として蛍光体を含む、少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体、好ましくは、そのスポットがスポットのための対照として蛍光体を含む、少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体を使用して実行される、上で規定される使用にも関する。
【０３４５】
本発明は、上で規定されるキットを使用して上で規定されるスポットにおける多重分析方法でシグナルの検出を改善する（したがって確実にする）ための、吸収性粒子の使用にも関する。
【０３４６】
本発明の他の特徴および利点は、例として非限定的に提供される以下の実施例を通じてより明らかになる。これらの実施例および図は、その範囲を限定することなく本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０３４７】
【図１】マイクロプレートのウェルの断面図である。透明なフィルムで構成されるウェルの底に、３つの実際のスポットが示される。下を指している中空の矢印は、カメラの方へ向かう実際に有益な放出を示す。ベタの矢印は、ウェル中の光線の経路を示す。これらの矢印は、液体媒体中の光の拡散、ウェルの壁、液体／空気界面および半月板での反射から生じる光アーチファクトの存在を例示する。
【図２】マイクロプレートのウェルの断面図である。透明なフィルムで構成されるウェルの底に、３つの実際のスポットが示される。下を指している中空の矢印は、カメラの方へ向かう実際に有益な放出を示す。ベタの矢印は、ウェル中の光線の経路およびこれらの光線の強度を示す。黒色の円は、液体媒体中で放出される光を吸収することを可能にし、このように、液体媒体中の光の拡散ならびにウェルの壁、空気／液体界面および半月板での光アーチファクトを減少させる吸収性粒子を示す。
【図３】吸収性組成物を添加していない、検体Ｓ１を有するウェルの画像である。１：光のリング。２：光の弧。
【図４】吸収性組成物を１／１０００に希釈した、検体Ｓ１を有するウェルの画像である。
【図５】吸収性組成物を１／５００に希釈した、検体Ｓ１を有するウェルの画像である。
【図６】吸収性組成物を１／２００に希釈した、検体Ｓ１を有するウェルの画像である。
【図７】吸収性組成物を１／１００に希釈した、検体Ｓ１を有するウェルの画像である。
【図８】吸収性組成物を添加していない、検体Ｓ２を有するウェルの画像である。矢印は、ツインスポットを示す。
【図９】図８と同じ条件の下であるが１／２００に希釈した吸収性組成物の存在下での検体Ｓ２を有するウェルの画像である。
【図１０】炭素粒子を含む吸収性組成物の希釈に基づいた、ウェルの底の輝度レベル（下の曲線）の参照条件（炭素粒子なし）および参照スポットのシグナル（上の曲線）に対する正規化された強度を示す図である。
【図１１】炭素粒子を含む吸収性組成物の希釈の検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ比の改善を示す図である。
【図１２】存在する液相の光学密度に基づいた、吸収性粒子（上の曲線）の添加の場合、および色素（下の曲線）の添加の場合の、吸収性溶液のない条件に対する参照スポットのシグナル強度の進展を示す図である。
【図１３】吸収性粒子存在下での蛍光によるスポットの検出を示す図である。
【実施例】
【０３４８】
材料および方法
１ウェルにつき９つのスポットを含む９６ウェルのマイクロプレートを用いて、多重分析方法を実行する（第１のラインに１から３の番号を付けた３つのスポット、第２のラインに４から６の番号を付けた３つのスポットおよび第３のラインに７から９の番号を付けた３つのスポット）。
【０３４９】
スポット番号１は、用いた参照検体Ｓ１に高濃度で存在する分析物ＡＨの特異的捕捉リガンドを含む。
【０３５０】
分析方法の間、３７℃で４０分の間、検体Ｓ１をウェルのスポットの存在下に置く。ウェルの洗浄後、分析物の、または参照検体Ｓ１に存在する分析物ＡＨに対応し、ビオチンに結合している特異的検出リガンドをウェルに添加する。３７℃で１５分のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ酵素に結合しているストレプトアビジンレポーターをウェルに添加する。３７℃で１５分のインキュベーションの後、ウェルを洗浄する。製造業者のマニュアルに従って、「ＥＬＩＳＴＡＲ  ＥＴＡ  Ｃ  Ｕｌｔｒａ  ＥＬＩＳＡ（Ｃｙａｎａｇｅｎ、イタリア）」キットを発色ステップのために用いる。それは、２つの溶液を供与することからなる：酵素の基質、すなわちルミノールおよび電子伝達体（３−（１０’フェノチアジニル）プロパン１−スルホン酸ナトリウム）を含む溶液Ａ、ならびに酸化剤（過酸化物溶液）を含む溶液Ｂ。シグナルを獲得する前に、適用可能であれば、炭素粒子を含む吸収性組成物の希釈溶液をウェルに添加する。吸収性組成物は溶液Ｂまたは溶液Ａとの混合物で添加することができ、２つのモードで得られる結果に注目すべき差はない。この実施例で用いられる吸収性組成物は、Ｃａｂｏｔ（米国）によるＣＡＢ−Ｏ−ＪＥＴ（登録商標）３５２Ｋ製品である。
【０３５１】
酵素反応から生じる化学発光生成物による化学発光によって放出されるシグナルは、テレセントリック対物レンズを通してＣＤＤカメラでとられる画像を用いて測定される。
【０３５２】
ウェルの底の輝度レベルも、同じ画像において測定される。
【０３５３】
蛍光によるシグナルを測定するために、６２０ｎｍの波長を中心とする赤色光を放出する照明システムが、固体支持体の下面を均一に照明する。カメラのインプット部に配置され、６８０ｎｍを中心とした帯域幅を有するフィルターは、この赤色励起光を削除することを可能にする。それは、スポットに存在する蛍光体によって放出される光の通過を可能にする。スポットによって蛍光によって放出されるシグナルは、この装置を用いて測定される。
【０３５４】
結果
（ｉ）炭素粒子の存在下でのシグナルの検出の改善
検体Ｓ１の場合は、分析物ＡＨに対応するスポット（スポット格子中のスポット番号１）で、非常に強い光が放出される。
【０３５５】
参照条件（図３を参照）の下では、吸収性組成物の非存在下、すなわち炭素粒子の分散液の非存在下で、ウェルの底の全周辺部に、平面−凹面レンズとして作用する液体を通して認められるウェルの垂直壁の像からもたらされる光のリング（１）を見ることができる。このリングは高輝度の分析物に対応するスポットの近くで極めて強いことを証明することができ、したがって光の弧（２）を有することができる。したがって、ウェルの底の全体に光のウェブが存在する。
【０３５６】
懸濁液状の炭素粒子の存在下で、ウェルの周辺部の光リングの消失および光のウェブの低減を見ることができる（図４〜７を参照）。
【０３５７】
吸収性組成物の非存在下では、スポットから離れて、バックグラウンドの液体の表面のスポットの反射からもたらされる、わずかにより小さい光のスポットが時には見られる（検体Ｓ２の図８を参照）。懸濁液状の炭素粒子の存在下では、前に観察されたスポットの反射の消失を見ることができる（図９を参照）。
【０３５８】
検体Ｓ１の場合、参照スポットのシグナルの強度（スポット８またはスポットＡｒｅｆ）およびウェルの底の輝度レベルは、ＲＬＵ（相対的な光の単位）数で測定されている（表１を参照）。
【０３５９】
表１に示す結果は、２つの異なるプレートからのものである。第１のプレートは１／１０００および１／５００の希釈溶液に対応し、第２は１／２００および１／１００の希釈溶液に対応する。
【０３６０】
【表１】
2017510810.tif 000005
【０３６１】
より多くの炭素粒子を添加すると、光強度が減少することが分かる。興味深い効果は、ウェルの底の輝度レベルが参照スポットのシグナルのレベルより速やかに減少することである（表１および図１０を参照）。ウェルの底の輝度は望ましくないと考えられ、数量化しようとするシグナルの測定でノイズを発生する。したがって、懸濁液状の炭素粒子を添加することによって、検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ比が改善されると結論づけることができる。
【０３６２】
【表２】
2017510810.tif 000006
【０３６３】
表２および図１１に示す結果は、炭素粒子の濃度を増加させる場合の検出されるシグナル対バックグラウンドノイズ比の改善を示す。
【０３６４】
（ｉｉ）炭素粒子対タートラジンで得られた性能の比較
タートラジンを添加した溶液を含有するウェルおよび懸濁液状の炭素粒子を添加した溶液を含有するウェルの光学密度（ＯＤ）を、４５０ｎｍ（最大化学発光放出の近く）で研究した。発明者らは、驚くべきことに、タートラジンも液相でシグナルを獲得すると起こる光干渉の一部または全部を排除することを可能にすることを実際示した。
【０３６５】
【表３】
2017510810.tif 000007
【０３６６】
【表４】
2017510810.tif 000008
【０３６７】
表３および４に示す結果は、２５０μｇ／ｍｌのタートラジンの濃度の使用について、０．３のＯＤが得られることを示す。１／１０００に希釈した炭素粒子の分散液で、同等値が得られる。参照スポットにおいて、炭素粒子の存在下で８％の、タートラジンの存在下で１２％のシグナル損失が観察される。４０００μｇ／ｍｌの濃度のタートラジンの使用については、３．８近くのＯＤが得られる。１／１００に希釈した炭素粒子の分散液で、同等値が得られる。参照スポットにおいて、炭素粒子の存在下で２０％未満の、タートラジンの存在下で５０％超のシグナル損失が観察される。したがって、懸濁液状の炭素粒子の添加は、等しい光学密度の液相で検出されるシグナル減少への影響がより少ないので、タートラジンより有利である（図１２を参照）。
【０３６８】
（ｉｉｉ）吸収性粒子の存在下での蛍光によるスポットの検出
マイクロプレートのスポットで対照として存在する蛍光体によって放出されるシグナルが、吸収性粒子の存在下で実際に検出されることも確認された。
【０３６９】
図１３で分かるように、Ｃａｂ−Ｏ−Ｊｅｔ３５２Ｋ製品を含む吸収性溶液（１／２００希釈）の存在下で、蛍光によって検出されるシグナルは、ウェルの底に対してスポットの位置を非常に明らかに規定することを可能にする。したがって、吸収性溶液の添加は、対照としてスポットに存在する蛍光体による蛍光によって放出されるシグナルの検出を阻止しない。
【０３７０】
しかし、蛍光によって得られるバックグラウンドノイズは、それらの非存在下で得られるバックグラウンドノイズに対して吸収性粒子の存在下で２倍になる。その結果、この検出されるシグナル対ノイズ比は半減する。
【図１】
2017510810.tif 000009
【図２】
2017510810.tif 000010
【図３】
2017510810.tif 000011
【図４】
2017510810.tif 000012
【図５】
2017510810.tif 000013
【図６】
2017510810.tif 000014
【図７】
2017510810.tif 000015
【図８】
2017510810.tif 000016
【図９】
2017510810.tif 000017
【図１０】
2017510810.tif 000018
【図１１】
2017510810.tif 000019
【図１２】
2017510810.tif 000020
【図１３】
2017510810.tif 000021
【国際調査報告】
2017510810.tif 000022
2017510810.tif 000023
2017510810.tif 000024
2017510810.tif 000025
2017510810.tif 000026
2017510810.tif 000027