(57)【要約】  本発明は、免疫細胞の特異性および反応性を選択された膜抗原に対して再指向化することができる組換えキメラタンパク質である、およびより特定すれば、細胞外リガンド結合が、ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体に由来するｓｃＦＶであり、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対して特異免疫を付与するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。このようなＣＡＲを備えたＴＣＲ  ＫＯ操作された免疫細胞は、肺がん、肛門がん、および多形性神経膠芽腫を処置するのに特に適している。【図１】2017522884.tif 000013
2017522884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２に例示したＶ１〜Ｖ６から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ）であって、前記構造は、
−  モノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ、任意選択でリンカー、特に、式（Ｇ４Ｓ）ｎの（式中、ｎは、１〜３であり、好ましくはｎ＝３である）（配列番号１０の）リンカーを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  膜貫通ドメイン、ならびに
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ）。
【請求項２】
モノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ、式（Ｇ４Ｓ）３の（配列番号１０の）リンカーを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  ＣＤ８アルファに由来する膜貫通ドメイン、ならびに
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む、請求項１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項３】
ヒトＣＤ２８に由来するドメイン、特に、ヒトＣＤ２８に由来する共刺激ドメインを含まない、請求項１または２に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項４】
前記ＶＨおよびＶＬが、配列番号１１〜１４から選択されるポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項１から３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項５】
４−１ＢＢに由来する前記共刺激ドメインが、配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項１から４のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項６】
前記ＣＤ３ゼータシグナリングドメインが、配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項１から５のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項７】
前記ＣＤ８α膜貫通ドメインが、配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項１から６のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項８】
ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項９】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１０】
前記シグナルペプチドが、配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項９に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１１】
前記構造Ｖ１が、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１２】
前記ＦｃγＲＩＩＩαヒンジが、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項１１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１３】
前記構造Ｖ３が、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１４】
前記ＣＤ８αヒンジが、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項１３に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１５】
前記構造Ｖ５が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１６】
前記ＩｇＧ１ヒンジが、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項１５に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１７】
配列番号１５または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１から１０または１１から１２のいずれか一項に記載の構造Ｖ１のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１８】
配列番号２４および配列番号２６から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から１０または１３から１４のいずれか一項に記載の構造Ｖ３のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項１９】
配列番号２５および配列番号２７から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から１０または１５から１６のいずれか一項に記載の構造Ｖ５のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項２０】
ＣＤ８αに由来するシグナルペプチド、ヒンジ、およびＴＭドメインを有する、請求項１から１０または１３から１４または１８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２３】
レンチウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターｐＣＬＤ２７６００である、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
細胞表面膜において、請求項１から２０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞。
【請求項２５】
炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球から選択される免疫細胞、好ましくは細胞傷害性Ｔリンパ球に由来する、請求項２４に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２６】
ＮＫ細胞に由来する、請求項２４に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２７】
ＴＣＲの発現が抑制されている、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項２８】
少なくとも１種のＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍまたはＨＬＡの発現が抑制されている、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項２９】
少なくとも１種の免疫抑制薬または化学療法薬に耐性である、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項３０】
患者における状態を防止または処置する療法において使用するための、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項３１】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞によって特徴付けられる前悪性または悪性がん状態を処置するための、請求項３０に記載の療法において使用するための操作された細胞
【請求項３２】
過剰のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞によって特徴付けられる状態を処置するための、請求項３０から３１のいずれか一項に記載の療法において使用するための操作された細胞
【請求項３３】
状態が、肺がん、肛門がん、残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、および多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、好ましくは残留性もしくは再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、またはＧＢＭから選択されるがんである、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の療法において使用するための操作された細胞
【請求項３４】
がん細胞に障害を与える方法であって、前記がん細胞を、前記がん細胞の障害を引き起こすのに有効な量で請求項２４から２９のいずれか一項に記載の操作された細胞と接触させることを含む方法。
【請求項３５】
免疫細胞を操作する方法であって、
（ｃ）免疫細胞を準備すること、
（ｄ）前記細胞の表面において、請求項１から２０のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを発現させること
を含む方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
（ｄ）免疫細胞を準備すること、
（ｅ）前記細胞内に、請求項２１に記載の、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを導入すること、
（ｆ）前記細胞内に前記ポリヌクレオチドを発現させること
を含む方法。
【請求項３７】
請求項３５から３６のいずれか一項に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
（ｄ）免疫細胞を準備すること、
（ｅ）前記細胞内に、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを導入すること、
（ｆ）ＧＦＲｖＩＩＩに特異的でない少なくとも１種の他のＣＡＲを導入すること
を含む方法。
【請求項３８】
それを必要とする対象を処置する方法であって、
（ｃ）表面においてＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを発現する請求項２４から２９のいずれか一項に記載の操作された細胞を準備すること、
（ｄ）前記操作された細胞を前記患者に投与すること
を含む方法。
【請求項３９】
前記操作された細胞が、ドナーによって提供された免疫細胞を使用して調製される、請求項３８に記載の方法
【請求項４０】
前記ドナーが患者であり、好ましくは前記患者が、請求項３５から３７のいずれか一項に従って操作された患者自体の免疫細胞を使用して処置されることになる、請求項３９に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞の特異性および反応性を、神経膠芽腫、神経膠腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、および前立腺癌を含めたヒト腫瘍に見つかる細胞表面糖タンパク質であるＥＧＦＲｖＩＩＩに対して再指向化（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）することができる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本発明によるＣＡＲは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞内で発現されるとき、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原を持つ悪性細胞を処置するのに特に有用である。得られる操作された免疫細胞は、悪性細胞に対して高レベルの特異性を示し、免疫療法に安全性および有効性を付与する。
【背景技術】
【０００２】
養子免疫療法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成される自己抗原特異的Ｔ細胞の移植を伴い、ウイルス感染症およびがんを処置するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の拡大増殖または遺伝子操作によるＴ細胞の再指向化によって生成することができる（Ｐａｒｋ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２０１１）。ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の移植は、ウイルス感染症および稀有なウイルス関連悪性腫瘍に関連した移植片の処置に使用される十分に確立された手順である。同様に、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および移植は、黒色腫の処置に成功したことが示された。
【０００３】
Ｔ細胞における新規の特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体の遺伝的伝達によって成功裏に生成された（ＣＡＲ）（Ｊｅｎａ、Ｄｏｔｔｉら、２０１０）。ＣＡＲは、単一融合分子中の１つまたは複数のシグナリングドメインと結合しているターゲティング部分からなる合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は、可動性リンカーによって接合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片（ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も成功裏に使用されている。第１の世代のＣＡＲのシグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータまたはＦｃ受容体ガンマ鎖の細胞質領域に由来する。第１の世代のＣＡＲは、Ｔ細胞細胞毒性を成功裏に再指向化することが示されている。しかし、これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏの長期的な拡大増殖および抗腫瘍活性をもたらすことに失敗した。共刺激分子に由来するシグナリングドメイン、ならびに膜貫通ドメインおよびヒンジドメインが付加されて第２および第３の世代のＣＡＲが形成され、ヒトにおけるいくつかの治験の成功をもたらし、この場合、Ｔ細胞を、ＣＤ１９を発現する悪性細胞に対して再指向化することができた（Ｊｕｎｅら、２０１１）。しかし、ＣＤ１９  ＳｃＦｖに関して使用されるシグナリングドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインの特定の組合せは、幾分抗原特異的であったので、いずれの抗原マーカーにも展開できるわけではない。
【０００４】
悪性神経膠腫は、最も一般的で致命的な脳腫瘍である。それでもやはり、最も攻撃的な神経膠腫である神経膠芽腫を有する患者の生存期間は、個々に多様であるが、スタンダードオブケアの改善に起因して過去５年において診断後に１０カ月の平均から１４カ月に改善された。放射線療法は、数十年にわたって、これらの病変部の処置にとって極めて重要であり続けており、強度変調または画像ガイド技法を用いてビームの焦点を合わせ、それを脳腫瘍の不規則な輪郭に適応させ、近傍の極めて重要な構造への線量を最小限にする能力は、大いに改善されている。テモゾロミド、単純な経口投与および好都合な毒性プロファイルを有するアルキル化剤が、放射線療法と併せて、かつその後に使用される。より新しい外科的技法、例えば、蛍光誘導切除および神経内視鏡手法などが、悪性神経膠腫の管理において重要となっている（Ｖａｎ  Ｍｅｉｒら、２０１０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらの進歩にもかかわらず、神経膠芽腫の非侵襲的療法の大きな必要性が依然として存在する。特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ媒介病態の処置、特に、肺がん、肛門がん、残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、および多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、好ましくは残留性もしくは再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、またはＧＢＭの処置にこれらを使用するための「オフザシェルブ（ｏｆｆ  ｔｈｅ  ｓｈｅｌｖｅ）ＣＡＲ  Ｔ細胞」の必要性が存在する。ここで、本発明者らは、神経膠芽腫においてユニークに発現されるが、正常な脳組織内で発現されない糖タンパク質である、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてＰ００５３３と呼ばれる、抗原として上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）（ＮＣＢＩリファレンスＮＭ−００５２２を有する遺伝子によってコードされる）を標的とする有効なキメラ抗原受容体を開発した。本発明は、特に、著しい臨床的利点を有するＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用して、免疫療法によって神経膠芽腫などのヒト腫瘍を処置するための道を開く。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、本明細書で同定した課題を解決する以下の物を提供する。
【０００７】
１．図２に例示したＶ１〜Ｖ６から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ）であって、前記構造は、
−  モノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ、任意選択でリンカー、特に、式（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは、１〜３、好ましくはｎ＝３である）の（配列番号１０の）リンカーを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  膜貫通ドメイン、ならびに
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体。
【０００８】
２．本発明は、
モノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に由来するＶＨおよびＶＬ、式（Ｇ４Ｓ）３の（配列番号１０の）リンカーを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  ＣＤ８アルファに由来する膜貫通ドメイン、ならびに
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む、１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【０００９】
３．本発明は、ヒトＣＤ２８に由来するドメイン、特に、ヒトＣＤ２８に由来する共刺激ドメインを含まない１または２に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１０】
４．本発明は、前記ＶＨおよびＶＬが、配列番号１１〜１４から選択されるポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、１から３のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１１】
５．本発明は、４−１ＢＢに由来する前記共刺激ドメインが、配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、１から４のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１２】
６．本発明は、前記ＣＤ３ゼータシグナリングドメインが、配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、１から５のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１３】
７．本発明は、前記ＣＤ８α膜貫通ドメインが、配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、１から６のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１４】
８．本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、１から７のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１５】
９．本発明は、シグナルペプチドをさらに含む、１から８のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１６】
１０．本発明は、前記シグナルペプチドが、配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヒト化されていてもよい、９に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１７】
１１．本発明は、前記構造Ｖ１が、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、１から１０のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１８】
１２．本発明は、前記ＦｃγＲＩＩＩαヒンジが、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、１１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００１９】
１３．本発明は、前記構造Ｖ３が、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、１から１０のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００２０】
１４．本発明は、前記ＣＤ８αヒンジが、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、１３に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００２１】
１５．本発明は、前記構造Ｖ５が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、１から１０のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００２２】
１６．本発明は、前記ＩｇＧ１ヒンジが、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、１５に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００２３】
１７．本発明は、配列番号１５または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、１から１０または１１から１２のいずれか１つに記載の構造Ｖ１のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００２４】
１８．本発明は、有利には、配列番号２４および配列番号２６から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する、１から１０または１３から１４のいずれか１つに記載の構造Ｖ３のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００２５】
１９．本発明は、配列番号２５および配列番号２７から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有する、１から１０または１５から１６のいずれか１つに記載の構造Ｖ５のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００２６】
２０．本発明は、ＣＤ８αに由来するシグナルペプチド、ヒンジ、およびＴＭドメインを有する、１から１０または１３から１４または１８のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００２７】
一実施形態では、上記１から２０までに記載した本発明の前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの、好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞への、より好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞への前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するＴ細胞の結合、好ましくは前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現する以下のような操作されたＴ細胞の結合を可能にする。
【００２８】
別の実施形態では、上記１から２０までに記載した本発明の前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの、好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞への、より好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞への前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するＴ細胞の結合、好ましくは前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現する以下のような操作されたＴ細胞の結合を可能にし、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞、より好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞を破壊する。
【００２９】
２１．本発明は、１から２０のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３０】
本発明は、ポリペプチド配列が、ヒトＣＤ２８に由来する配列を含有しない、１から２０のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを提供する。
【００３１】
特定の実施形態では、１から２０の本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ヒトＣＤ２８と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸同一性を有する配列を含まない。
【００３２】
特定の実施形態では、１から２０の本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの細胞質内ドメインおよび／または膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８由来配列を含まず、特に、ヒトＣＤ２８と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸同一性を有する配列を有さない。
【００３３】
２２．本発明は、２１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００３４】
２３．本発明は、レンチウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターｐＣＬＤ２７６００である、２２に記載の発現ベクターを提供する。
【００３５】
特定の実施形態では、前記発現ベクターは、上記１から２０に記載の本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲの安定発現を可能にする。
【００３６】
２４．本発明は、細胞表面膜において、１から２０のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞を提供する。
【００３７】
２５．本発明は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球から選択される免疫細胞、好ましくは細胞傷害性Ｔリンパ球に由来する、２４に記載の操作された免疫細胞を提供する。
【００３８】
本発明は、細胞傷害性Ｔリンパ球に由来する、２４に記載の操作された免疫細胞を提供する。
【００３９】
２６．本発明は、ＮＫ細胞に由来する、２４に記載の操作された免疫細胞を提供する。
【００４０】
２７．本発明は、ＴＣＲの発現が抑制されている、２４から２６のいずれか１つに記載の操作された細胞を提供する。
【００４１】
２８．本発明は、少なくとも１種のＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍまたはＨＬＡの発現が抑制されている、２４から２７のいずれか１つに記載の操作された細胞を提供する。
【００４２】
２９．本発明は、少なくとも１種の免疫抑制薬または化学療法薬に耐性である、２４から２８のいずれか１つに記載の操作された細胞を提供する。
【００４３】
３０．本発明は、患者における状態を防止または処置する療法において使用するための、２４から２９のいずれか１つに記載の操作された細胞を提供する。
【００４４】
３１．本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞によって特徴付けられる前悪性がん状態または悪性がん状態を処置するための、３０に記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
【００４５】
３２．本発明は、過剰のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞によって特徴付けられる状態を処置するための、３０から３１のいずれか１つに記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
【００４６】
３３．本発明は、状態が、肺がん、肛門がん、残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、および多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、好ましくは残留性もしくは再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、またはＧＢＭから選択されるがんである、３０から３２のいずれか１つに記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
【００４７】
本発明は、状態がＧＢＭである、３０から３２のいずれか１つに記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
【００４８】
本発明は、状態が再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫である、３０から３２のいずれか１つに記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
【００４９】
本発明の前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞、より好ましくはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞に結合する、２４から３２の本発明の操作された細胞も本明細書に開示されている。
【００５０】
好ましくは、実施形態２４から３２のいずれかに記載の開示した本発明の操作された細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞に結合し、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がん細胞の前記生存期間に影響し、より好ましくは、以下の実施形態のいずれかに記載のここで開示した本発明の操作された細胞は、神経膠腫、特に、ＧＢＭに罹患している患者の生存期間を改善する。
【００５１】
３４．がん細胞に障害を与える方法であって、前記がん細胞を、前記がん細胞の障害を引き起こすのに有効な量で２４から２９のいずれか１つに記載の操作された細胞と接触させることを含む方法を提供する。
【００５２】
３５．本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を準備すること、
（ｂ）前記細胞の表面において、１から２０のいずれか１つに記載の少なくとも１種のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを発現させること
を含む方法を提供する。
【００５３】
３６．本発明は、３５に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を準備すること、
（ｂ）前記細胞内に、２１に記載の、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを導入すること、
（ｃ）前記細胞内に前記ポリヌクレオチドを発現させること
を含む方法を提供する。
【００５４】
３７．本発明は、３５から３６のいずれか１つに記載の免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を準備すること、
（ｂ）前記細胞内に、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを導入すること、
（ｃ）ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的でない少なくとも１種の他のＣＡＲを導入すること
を含む方法を提供する。
【００５５】
３８．本発明は、それを必要とする対象を処置する方法であって、
（ａ）表面においてＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを発現する２４から２９のいずれか１つに記載の操作された細胞を準備すること、
（ｂ）前記操作された細胞を前記患者に投与すること
を含む方法を提供する。
【００５６】
３９．本発明は、前記操作された細胞が、ドナーによって提供された免疫細胞を使用して調製される、３８に記載の方法を提供する。
【００５７】
４０．本発明は、前記ドナーが患者であり、好ましくは前記患者が、３５から３７のいずれか１つに従って操作された患者自体の免疫細胞を使用して処置されることになる、３９に記載の方法を提供する。
【００５８】
本発明は、以下のものも提供する：
１．ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、（ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ）であって、ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な抗体の抗原結合ドメイン、リーダー配列、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００５９】
抗原結合ドメインが、配列番号１１または１３を含む軽鎖可変領域を含む、１に記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００６０】
抗原結合ドメインが、配列番号１２または１４を含む重鎖可変領域を含む、１または２に記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００６１】
４．抗原結合ドメインが、配列番号１０を含むリンカーペプチドを含む、１から３のいずれか１つに記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００６２】
５．抗原結合ドメインが、配列番号１または２を含むリーダー配列を含む、１から４のいずれか１つに記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００６３】
６．抗原結合ドメインが、配列番号１のリーダー配列を含む、１から５のいずれか１つに記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００６４】
７．細胞外ヒンジドメインをさらに含む、１から６のいずれか１つに記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００６５】
８．リーダー配列、細胞外ヒンジドメイン、および膜貫通ドメインが、ＣＤ８アルファ鎖に由来する配列（配列番号６）を含む、１から７のいずれか１つに記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００６６】
９．細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインが、４−１ＢＢ  配列番号８、およびＣＤ３ζ（配列番号９）を含み、好ましくはＣＤ２８配列を含まない、１から８のいずれかに記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ。
【００６７】
１０．１から９のいずれに記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【００６８】
１１．１０に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【００６９】
１２．１１に記載の組換え発現ベクターを含む単離初代細胞。
【００７０】
１３．１１に記載の組換え発現ベクターを含むＴＣＲ−ＫＯ単離初代細胞。
【００７１】
１４．１から９に記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを含むＴＣＲ−ＫＯ単離初代細胞。
【００７２】
１５．１２、１３、または１４に記載の少なくとも１種の単離初代細胞を含む初代細胞の集団。
【００７３】
１６．１から９に記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ、１０に記載の核酸、１１に記載の組換え発現ベクター、１２、１３、または１４に記載の単離初代細胞、１５に記載の初代細胞の集団、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【００７４】
１７．好ましくは神経膠腫、より好ましくは神経膠芽腫に罹患している宿主におけるがんの処置または防止において使用するための、１から９に記載のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ、１０に記載の核酸、１１に記載の組換え発現ベクター、１２、１３、もしくは１４に記載の単離初代細胞、１５に記載の単離初代細胞の集団、または１６に記載の医薬組成物。
【００７５】
１．本発明は最後に、図２に例示したＶ１〜Ｖ４から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記構造は、モノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に由来するＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナリングドメインおよび４−１ＢＢに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体を提供する。
【００７６】
２．前記構造Ｖ１が、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００７７】
３．前記構造Ｖ２が、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジおよび４−１ＢＢ膜貫通ドメインを含む、１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００７８】
４．前記構造Ｖ３が、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００７９】
５．前記構造Ｖ４が、ＣＤ８αヒンジおよび４−１ＢＢ膜貫通ドメインを含む、１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８０】
６．前記ＶＨおよびＶＬが、配列番号１１〜１４から選択されるポリペプチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する、１から５のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８１】
７．４−１ＢＢに由来する共刺激ドメインが、配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有する、１から６のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８２】
８．前記ＣＤ３ゼータシグナリングドメインが、配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有する、１から６のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８３】
９．前記ＦｃγＲＩＩＩαヒンジが、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する、１または２のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８４】
１０．前記ＣＤ８αヒンジが、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する、３または４のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８５】
１１．前記ＩｇＧ１ヒンジが、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有する、５に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８６】
１２．前記ＣＤ８α膜貫通ドメインが、配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有する、２または４のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８７】
１３．前記４−１ＢＢ膜貫通ドメインが、配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有する、１、３または５のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８８】
１４．ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、１から１３のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００８９】
１５．配列番号１５および配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、２に記載の構造Ｖ１のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００９０】
１６．配列番号１６および配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、３に記載の構造Ｖ２のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００９１】
１７．シグナルペプチドをさらに含む、１から１６のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００９２】
１８．前記シグナルペプチドが、配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、１７に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ。
【００９３】
１９．１から１８のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
【００９４】
２０．６または７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【００９５】
２１．細胞表面膜において、１から１８のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞。
【００９６】
２２．炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、２１に記載の操作された免疫細胞。
【００９７】
２３．ＮＫ細胞に由来する、２１に記載の操作された免疫細胞。
【００９８】
２４．療法において使用するための２１から２３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【００９９】
２５．ヒトの療法において使用するための２１から２３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【０１００】
２６．状態が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞によって特徴付けられる前悪性がん状態または悪性がん状態である、療法において使用するための２１から２５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【０１０１】
２７．状態が、過剰のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞によって特徴付けられる状態である、療法において使用するための２１から２６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【０１０２】
２８．状態ががん状態である、療法において使用するための２１から２７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【０１０３】
２９．がん状態が、肺がん、肛門がん、または多形性神経膠芽腫である、療法において使用するための２１から２８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【０１０４】
３０．ＴＣＲの発現が、前記免疫細胞内で抑制されている、２１から２９のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【０１０５】
３１．少なくとも１種のＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍまたはＨＬＡの発現が、前記免疫細胞内で抑制されている、２１から３０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【０１０６】
３２．突然変異されて少なくとも１種の免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性が付与されている、２１から３１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【０１０７】
３３．がん細胞に障害を与える方法であって、前記細胞を、前記がん細胞の障害を引き起こすのに有効な量で２１から３２のいずれか１つに記載の操作された細胞と接触させることを含む方法
【０１０８】
３４．免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を準備すること、
（ｂ）前記細胞の表面において、１から１９のいずれか１つに記載の少なくとも１種のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体を発現させること
を含む方法。
【０１０９】
３５．３４に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を準備すること、
（ｂ）前記細胞内に、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを導入すること、
（ｃ）前記細胞内に前記ポリヌクレオチドを発現させること
を含む方法。
【０１１０】
３６．３４に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を準備すること、
（ｂ）前記細胞内に、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを導入すること、
（ｃ）ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的でない少なくとも１種の他のキメラ抗原受容体を導入すること
を含む方法。
【０１１１】
３７．それを必要とする対象を処置する方法であって、
（ａ）表面において１から１９のいずれか１つに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を準備すること、
（ｂ）前記免疫細胞を前記患者に投与すること
を含む方法。
【０１１２】
３８．前記免疫細胞が、ドナーから提供される、３７に記載の方法。
【０１１３】
３９．前記免疫細胞が、患者自体から提供される、３７に記載の方法。
【０１１４】
本発明者らは、異なる構造を有し、異なるＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体に由来する異なるｓｃＦＶを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲを生成した。本発明の好適なＣＡＲポリペプチドは、配列番号１５〜１９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
本発明のより好適なＣＡＲは、Ｖ３またはＶ５構成（表ＡおよびＢ）を有するＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲであり、Ｖ３構成（表Ａ）がさらにより好適であり、さらにより好ましくは、本発明のＣＡＲは、配列番号２４および配列番号２６から選択されるアミノ酸配列を有する、ヒト化されていてもよいＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲである。
【０１１６】
本発明のさらにより好適なＣＡＲは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７から選択されるヒト化ＣＡＲであり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０のアミノ酸が、非ヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲのものと同様の、またはそれより良好なヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに対する選択性および親和性を保持しながらＨＡＭＡ応答を低減するために変更されている。
【０１１７】
用語「同様の」は、０．０５〜０．５の標準偏差（ｎ＝２）で非ヒト化ＣＡＲの親和性を有することを意味する。用語「改善された」は、少なくとも１．２倍増大した非ヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲの親和性を有することを意味する。
【０１１８】
本発明によれば、ヒト化は、ｗｔ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ配列または元のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ配列と少なくとも８０％の同一性を有するＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲも意味する。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非特異的活性化の後（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズおよび組換えＩＬ２を用いて）、ドナーに由来するＴ細胞を、ウイルストランスダクションを使用してこれらのＣＡＲを発現するポリヌクレオチドで形質転換した。ある特定の場合では、Ｔ細胞を、より特に、移植片対宿主反応を防止するためにＴＣＲ（αβ−Ｔ細胞受容体）の成分を破壊することによって、さらに操作して非アロ反応性Ｔ細胞を創製した。
【０１２０】
得られた操作されたＴ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対して様々な程度にｉｎ−ｖｉｔｒｏで反応性を示し、本発明のＣＡＲが、Ｔ細胞の抗原依存性活性化およびまた増殖に寄与し、これらを免疫療法にとって有用にすることを示した。
【０１２１】
得られた操作されたＴ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対してｉｎ−ｖｉｖｏで反応性を示し、本発明のＣＡＲが、ｉｎ−ｖｉｖｏでＴ細胞の抗原依存性活性化およびまた増殖に寄与し、これらを免疫療法にとって有用にすることを示した。
【０１２２】
本発明のＣＡＲをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を、本明細書で詳述する。
【０１２３】
本発明の操作された免疫細胞は、多発性骨髄腫を処置するためなどの治療用途に特に有用である。
【０１２４】
本発明の操作された免疫細胞は、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）（神経膠芽腫、星細胞腫グレードＩＶ、およびグレードＩＶ星細胞腫としても公知）を処置するためなどの治療用途に特に有用である。好ましくは、がんは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞によって特徴付けられる。
【０１２５】
また、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクト、好ましくはＶ３構成を有するＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを備えた操作された免疫細胞であって、ヒンジドメインは、ＣＤ８アルファに由来するヒンジドメインである、操作された免疫細胞が本明細書に開示されている。
【０１２６】
本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ８に由来するヒンジをシグナルペプチドおよび／またはやはりＣＤ８アルファに由来する膜貫通領域と組み合わせたＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトを備えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】本発明による操作された免疫細胞の略図である。この図に提示した操作された免疫細胞は、ＣＡＲをコードするレトロウイルスポリペプチドで形質導入されたＴ細胞である。このＴ細胞は、患者へのより良好でより安全な生着を可能にするようにさらに操作され、それは、本発明の枠組み内で任意選択である。Ｘ遺伝子は、例えば、ＴＣＲの成分（ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ）を発現する遺伝子であり得、Ｙは、ＣＤ５２（Ｃａｍｐａｔｈに関して）またはＨＰＲＴ（６−チオグアニンに関して）のような、免疫抑制薬へのＴ細胞の感受性に関与する遺伝子であり得る。
【図２】異なるＣＡＲ構成（Ｖ１〜Ｖ４）およびＶ５〜Ｖ６の略図である。
【図３】ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトの略図である。
【図４】ＣＡＲ  ｍＲＮＡ生成のための骨格を示す図である。
【図５】ＣＡＲレンチウイルスベクター生成のための骨格を示す図である。
【図６】ＦＡＣＳによって分析された初代Ｔ細胞内のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ発現を示す図である。
【図７】ＥＧＦＲＶＩタンパク質またはＥＧＦＲＶＩＩＩタンパク質を過剰発現するＵ８７神経膠腫細胞のウエスタンブロットによる特徴付けを示す図である。
【図８】標的細胞との共培養後にＦＡＣＳ分析によって評価したＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ脱顆粒能力を示す図である。
【図９】本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
【表１】
2017522884.tif 000003
【０１２９】
【表２】
2017522884.tif 000004
【０１３０】
【表３】
2017522884.tif 000005
【０１３１】
【表４】
2017522884.tif 000006
【０１３２】
【表５】
2017522884.tif 000007
【０１３３】
【表６】
2017522884.tif 000008
【０１３４】
本明細書で具体的に定義されていない限り、使用されるすべての技術用語および科学用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野における当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【０１３５】
本明細書に記載したものと同様のまたは等価なすべての方法および材料を、本明細書を実践または試験するのに使用することができ、適当な方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書に述べられるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めて、支配することになる。さらに、材料、方法、および実施例は、別段に指定されていない限り、例示的なだけであり、限定的であるように意図されていない。
【０１３６】
本発明の実践では、別段に示されていない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣例的な技法が用いられることになり、これらは、当技術分野の技術の範囲内である。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ、２０００、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎ  Ｉｎｃ、Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．ＡｂｅｌｓｏｎおよびＭ．Ｓｉｍｏｎ編集長、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、具体的には、１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編）ならびに１８５巻、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；ならびにＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照。
【０１３７】
【表７】
2017522884.tif 000009
【０１３８】
【表８】
2017522884.tif 000010
【０１３９】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナリング形質導入ドメインを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗原受容体（ＣＡＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲもしくは抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ）の新しい設計に関する。
【０１４０】
一般に、用語「含む」は、「で構成される」を含み、好適な実施形態では、「含む」は、「で構成される」を意味する。
【０１４１】
本発明の実施形態のそれぞれにおいて、用語「含む」は、「で構成される」を意味することができる。
【０１４２】
用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、本明細書では、リガンドを結合させることができるオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができることになる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。好適な実施形態では、前記細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の軽（ＶＬ）可変断片および重（ＶＨ）可変断片を含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。前記ＶＬおよびＶＨは、好ましくは表２に示した１３９およびＭＲ１と呼ばれる抗体から選択される。これらは、好ましくは、例えば、配列の配列番号１０を含む可動性リンカーによって一緒に連結されている。言い換えれば、前記ＣＡＲは、配列番号１１〜配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを優先的に含む。
【０１４３】
本発明によるＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担い、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす。言い換えれば、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の通常のエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含めた細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。
【０１４４】
ＣＡＲ中で使用するためのシグナル伝達ドメインの好適な例は、抗原受容体エンゲージメント後にシグナル伝達を開始するように協力して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、２つの別個のクラスの細胞質シグナリング配列、すなわち、抗原依存性一次活性化を開始するもの、および二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすように抗原非依存性様式で作用するものを含む。一次細胞質シグナリング配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含むことができる。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能を果たす様々な受容体の細胞質内尾部中に見つかる詳細がはっきりしているシグナリングモチーフである。本発明で使用されるＩＴＡＭの例は、非限定的な例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものを含み得る。好適な実施形態では、ＣＡＲのシグナリング伝達ドメインは、（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含むことができる。
【０１４５】
より好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲの細胞質内ドメインは、ヒトＣＤ２８に由来するいずれの配列も除外し、ヒトＣＤ２８に由来する配列を含まない。
【０１４６】
さらにより好適な実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲのシグナリングドメインは、配列番号９と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、ＣＤ２８シグナリングドメインに由来するいずれの配列も除外するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む。特定の実施形態では、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答に要求される抗原受容体またはこれらのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子を特異的に結合させ、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のペプチドがロードされたＭＨＣ分子との結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、それだけに限らないが、増殖活性化、分化などを含めたＴ細胞応答を媒介するシグナルをもたらす抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとして、それだけに限らないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドは、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子、例えば、それだけに限らないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどと特異的に結合する抗体も包含する。
【０１４７】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、それだけに限らないが、増殖などの細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびトールリガンド受容体が挙げられる。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【０１４８】
好適な実施形態では、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３．）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。特に、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を構成するアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子を含み、ヒトＣＤ２８に由来する任意の共刺激シグナル分子を除外する。
【０１５０】
本発明によるＣＡＲは、細胞の表面膜上で発現される。したがって、このようなＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含む。適切な膜貫通ドメインの際立った特徴は、細胞、好ましくは本発明において、免疫細胞、特に、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面で発現され、免疫細胞の細胞応答を既定の標的細胞に対して向けるために一緒に相互作用する能力を含む。膜貫通ドメインは、天然源または合成源から得ることができる。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体のサブユニット、例えば、α、β、γ、またはδなど、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２受容体ｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）またはγ鎖、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体ＩＩＩまたはＣＤタンパク質のサブユニット鎖であり得る。代わりに、膜貫通ドメインは、合成であり得、主に疎水性残基、例えば、ロイシンおよびバリンなどを含み得る。好適な実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。
【０１５１】
好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲのＴＭドメインは、ＣＤ８アルファ鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。
【０１５２】
膜貫通ドメインは、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含むことができる。本明細書で使用される用語「ヒンジ領域」は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインにとってさらにフレキシビリティおよびアクセシビリティをもたらすために使用される。ヒンジ領域は、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子のすべてまたは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、もしくはＣＤ２８の細胞外領域のすべてもしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部などに由来し得る。代わりに、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成のヒンジ配列であってもよい。好適な実施形態では、前記ヒンジドメインは、配列番号３、配列番号４、および配列番号５と本明細書でそれぞれ呼ばれるヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、もしくはＩｇＧ１の一部、またはこれらのポリペプチドと好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。
【０１５３】
好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、配列番号４のＣＤ８αに由来するヒンジ、ＣＤ８αに由来するＴＭドメイン、およびＣＤ８αに由来するペプチドシグナルを含む。
【０１５４】
より好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、配列番号４と好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を示すＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８αに由来するＴＭドメイン、およびＣＤ８αに由来するペプチドシグナルを含む。
【０１５５】
本発明によるｃａｒは、一般に、配列番号６または７のポリペプチドと同一性を示す、ＣＤ８αおよび４−１ＢBからより特に選択される膜貫通ドメイン（ＴＭ）をさらに含む。
【０１５６】
好ましくは、本発明によるＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、配列番号６のポリペプチドと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を示すＴＭを含む。
【０１５７】
ヒンジ領域が、ＣＤ８αに由来するヒンジ領域である本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトも本明細書に開示されている。例えば、本発明のＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ８αに由来するヒンジ領域を、ＣＤ８αに由来するシグナルペプチドおよび／またはやはりＣＤ８αに由来する膜貫通領域と組み合わせることができる。
【０１５８】
好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ８αに由来するヒンジ領域を、ＣＤ８αに由来するシグナルペプチドおよびやはりＣＤ８αに由来する膜貫通領域と組み合わせることができる。
【０１５９】
さらにより好適な実施形態では、本発明のＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ８αに由来するヒンジ領域を、ＣＤ８αに由来するシグナルペプチドおよびやはりＣＤ８αに由来する膜貫通領域と組み合わせることができ、ＣＤ２８シグナリングドメインに由来するいずれの配列も除外する。
【０１６０】
標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異が一般に、がん細胞内で観察され、抗原喪失エスケープバリアントを創製する。したがって、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするために、本発明によるＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲは、標的中の異なるエレメントを同時に結合させ、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強するための別の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上に相前後して配置することができ、リンカーによって分離されていてもよい。
【０１６１】
別の実施形態では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＡＲを構成している異なる膜貫通ポリペプチド上に配置することができる。
【０１６２】
別の実施形態では、本発明は、各１つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を準備することと、前記細胞の表面において、各１つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を発現させることとを含む方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を準備することと、前記細胞内に、各１つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することとを含む方法に関する。ＣＡＲの集団とは、各１つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも２、３、４、５、６以上のＣＡＲを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは標的中の異なるエレメントを同時に結合させ、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強することができる。本発明はまた、各１つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む単離免疫細胞に関する。
【０１６３】
本発明は、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、および
ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ）を提供する。
【０１６４】
一実施形態では、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ヒトＣＤ２８に由来する配列を有さない。
【０１６５】
好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ＣＤ２８由来配列を含まず、特に、ヒトＣＤ２８と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸同一性を有する配列を有さない。
【０１６６】
より好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの細胞質内ドメインおよび／または膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８由来配列を含まず、特に、ヒトＣＤ２８と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸同一性を有する配列を有さない。
【０１６７】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインで構成され、ヒトＣＤ２８シグナリングドメインで構成されない細胞内シグナリングドメイン
を含む。
【０１６８】
好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ＣＤ２８に由来するいずれの配列も含有せず、ＣＤ８αに由来するシグナルペプチド（またはリーダー配列）、ＴＭドメイン、およびヒンジを含む。
【０１６９】
一実施形態では、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ヒトＣＤ８α（配列番号１）に由来するリーダー配列、または配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有する、好ましくは配列番号１と１００％の同一性を有するリーダー配列を含む。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、配列番号２のリーダー配列、または配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有する、好ましくは配列番号２と１００％の同一性を有するリーダー配列を含む。
【０１７１】
一実施形態では、本発明は、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来する（ＣＤ８αに由来する）ヒンジ、
−  ヒトＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ）を提供する。
【０１７２】
本発明は、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ヒトＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ）を提供する。
【０１７３】
本発明は、配列番号１または配列番号２のシグナルペプチドを有する本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを包含する。
【０１７４】
本発明では、ｓｃｆｖは、好ましくは４〜２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されたＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な免疫グロブリンの、より好ましくは配列番号１０の重鎖（ＶＨ domain）および軽鎖（ＶＬ domain）（またはＶＨ domainを伴ったＶＬ domain）の可変領域の融合タンパク質である。
【０１７５】
本発明のｓｃｆｖは、ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な抗体に由来し、これは、リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含み、前記ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に一緒に寄与する。
【０１７６】
一実施形態では、本発明の前記ｓｃｆｖは、リーダー配列（またはシグナルペプチド）をさらに含み、好ましくは、前記リーダー配列は、ＶＨドメインに連結されている。
【０１７７】
前記リーダー配列がＶＬドメインに連結されている実施形態は、本発明の一部である。
【０１７８】
好ましくは、前記リーダー配列は、配列番号１または２の、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有している。
【０１７９】
一実施形態では、ＶＨドメインがヒンジに連結されており、別の実施形態では、ＶＬドメインが前記ヒンジに連結されている。
【０１８０】
本発明は、異なる長さを有するヒンジ、好ましくはＣＤ８α、ＩｇＧ１、またはＦＣＲＩＩＩに由来するヒンジ（図２を参照）、より好ましくはＣＤ８αに由来するヒンジ、さらにより好ましくは配列番号４を有するヒンジに連結された抗ＥＧＦＲＶＩＩ  ｓｃｆｖを提供する。
【０１８１】
好ましくは、本発明は、
−  シグナルペプチド、好ましくはＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、より好ましくは配列番号１または配列番号２のＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与する、（ｓｃＦｖ）、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１８２】
より好ましくは、本発明は、
−  ヒトＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与する、（ｓｃＦｖ）、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１８３】
さらにより好ましくは、本発明は、
−  ヒトＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与し、前記ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ヒト化されている、（ｓｃＦｖ）、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ヒトＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１８４】
そしてさらにより好ましくは、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ、
−  ＣＤ８α  ＴＭ、
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む。
【０１８５】
そしてさらにより好ましくは、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  ＶＬ、リンカー、およびＶＨを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ、
−  ＣＤ８α  ＴＭ
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む。
【０１８６】
そしてさらにより好ましくは、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ、
−  ＣＤ８α  ＴＭ、
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
で構成される。
【０１８７】
一実施形態では、前記リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｎのリンカーであり、式中、ｎは、１〜３であり、好ましくはｎ＝３であり、前記配列は、（Ｇ４Ｓ）３であり、より好ましくは配列番号１０のものである。
【０１８８】
本発明の１種のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、
−  ヒトＣＤ８αリーダー配列（ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ヒトＣＤ８αヒンジ、
−  ヒトＣＤ８α  ＴＭ、
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
で構成される。
【０１８９】
一実施形態では、本発明は、
−  配列番号１のヒトＣＤ８αリーダー配列（ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  配列番号１１のＶＨ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１２のＶＬ、または配列番号１３のＶＨ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１４のＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  配列番号４のヒトＣＤ８αヒンジ、
−  配列番号６のヒトＣＤ８α  ＴＭ、
−  配列番号８の４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  配列番号９の細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１９０】
一実施形態では、本発明は、
−  配列番号１のヒトＣＤ８αリーダー配列（ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  配列番号１２のＶＬ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１１のＶＨ、配列番号１４のＶＬ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１３のＶHを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  配列番号４のヒトＣＤ８αヒンジ、
−  配列番号６のヒトＣＤ８α  ＴＭ、
−  配列番号８の４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  配列番号９の細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１９１】
一実施形態では、本発明は、
−  配列番号１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであって、好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、シグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬと分離されたＶＨドメインであって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与し、前記リンカーは、配列番号１０のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、
前記ＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１３のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、
前記ＶＬドメインは、配列番号１２または配列番号１４のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメイン、
−  −  配列番号４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、
−  配列番号６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン、
−  配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢ（または４−１ＢＢ細胞内ドメイン）に由来する共刺激シグナル分子、
−  配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ）を提供する。
【０１９２】
好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ）は、ＣＤ２８、またはヒトＣＤ２８、特に、ヒトＣＤ２８イントラシグナリングドメイン（ｉｎｔｒａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）に由来するいずれの配列も含まない。より好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体（ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲ）は、ヒトＣＤ２８、特に、ヒトＣＤ２８イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まず、ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なｓｃｆｖのＶＨドメインに好ましくは融合されたＣＤ８αに由来するシグナルペプチドをさらに含有する。
【０１９３】
一実施形態では、本発明は、配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１９４】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１９５】
一実施形態では、本発明は、配列番号２６のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１９６】
一実施形態では、本発明は、配列番号２７のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１９７】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４または配列番号２５の、より好ましくは配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１９８】
一実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０１９９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０２００】
一実施形態では、本発明は、配列番号２６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０２０１】
一実施形態では、本発明は、配列番号２７のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０２０２】
一態様では、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインである。
【０２０３】
本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲのいずれも、ＣＡＲの結合特性に著しく影響せず、もしくはそれを変更しない、かつ／または修飾アミノ酸配列を含有するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性に著しく影響せず、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を低減し、もしくは無効にするアミノ酸修飾を有するヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインであり得る。
【０２０４】
「ヒト化」は、ＣＡＲの結合特性に著しく影響せず、もしくはそれを変更しない、かつ／または修飾アミノ酸配列を含有するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性に著しく影響せず、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を低減し、もしくは無効にするアミノ酸修飾を指すように意図されている。
【０２０５】
「ヒト化」は、ＣＡＲの結合特性（親和性結合活性）を有意に改善することができ、かつ／または修飾アミノ酸配列を含有するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性に著しく影響せず、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を低減し、もしくは無効にするアミノ酸修飾を指すように意図されている。
【０２０６】
このような保存的修飾としては、前記ＣＡＲの前記抗体断片中の、および／または前記ＣＡＲ分子の他の部分のいずれかの中のアミノ酸置換、付加、および欠失が挙げられる。修飾は、抗体中、抗体断片中、または本発明のＣＡＲ分子の他の部分のいずれかの中に、当技術分野で公知の標準技法、例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発などによって、または最適化された生殖系列配列を用いることによって導入することができる。
【０２０７】
用語「保存的配列修飾」または「アミノ酸変化」は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特性に著しく影響しない、またはそれを変更しないアミノ酸修飾を指すように意図されている。このような保存的修飾としては、アミノ酸置換、付加、および欠失が挙げられる。修飾は、本発明の抗体または抗体断片中に、当技術分野で公知の標準技法、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などによって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本発明のＣＡＲ内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えることができ、変更されたＣＡＲを、本明細書に記載の機能アッセイを使用して試験することができる。
【０２０８】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して保存的配列修飾（またはアミノ酸配列変化）を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０２０９】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して２つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０２１０】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して３つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０２１１】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して４つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０２１２】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して５つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供する。
【０２１３】
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して５つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供し、配列番号２４中のすべてのＣＤＲは、保存されている。
【０２１４】
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して１〜１５のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供し、配列番号２４中のすべてのＣＤＲは、保存されている。
【０２１５】
好適な実施形態では、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの配列は、前記ＣＡＲのその標的（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）への結合能力を改変することなく、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス応答）を低減するために、配列番号２４と比較して少なくとも１つのアミノ酸、２〜１５のアミノ酸を変更することによって修飾されている。一実施形態では、前記結合は、改善され得る。
【０２１６】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを提供し、前記少なくとも１つのアミノ酸変化は、初代Ｔ細胞内の前記ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの結合および／または活性にインパクトを有さず、またはこれらを改善する。
【０２１７】
本発明は、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲに関連する、関連した核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、および医薬組成物も提供する。
【０２１８】
ヒンジが、ＣＤ８αのＴＭドメインおよびシグナルペプチドと組み合わせたとき、これらの構造エレメントおよび技術的特徴を組み合わせていない以前のＣＡＲコンストラクトと比較して、前記ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲのＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞へのより良好な親和性および選択性を付与している（図９に見られるように）、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトも本明細書に開示されている。好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対してより良好な親和性および選択性を有する本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトは、Ｖ３構成の技術的特徴を組み合わせ、より好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対してより良好な親和性および選択性を有する本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトは、配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有し、ヒト化されている。
【０２１９】
構造が、これらの構造エレメントおよび技術的特徴を組み合わせていない以前のＣＡＲコンストラクトと比較して、前記ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲのＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞へのより良好な親和性および選択性を付与している（図９に見られるように）、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトも本明細書に開示されている。
【０２２０】
好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対してより良好な親和性および選択性を有する本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトは、Ｖ３構成の技術的特徴を組み合わせ、より好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対してより良好な親和性および選択性を有する本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトは、配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有し、ヒト化されている。
【０２２１】
ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明はまた、本発明による上述したＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。
【０２２２】
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞内への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスなどのプラスミドもしくはウイルスベクター）で構成され得る。
【０２２３】
特定の実施形態では、異なる核酸配列を、２Ａペプチドをコードする配列などのリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む１つのポリヌクレオチドまたはベクター中に含めることができる。ピコルナウイルスのアフタウイルス（Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）亜群中に同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸間にペプチド結合を形成することなく、１つのコドンから次のコドンへのリボソームの「スキップ」を引き起こす（（ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＥｌｌｉｏｔｔ、２００１；Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓら、２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕら、２００８）を参照）。「コドン」とは、リボソームによって１つのアミノ酸残基に翻訳されるｍＲＮＡ上（またはＤＮＡ分子のセンス鎖上）の３つのヌクレオチドを意味する。したがって、２つのポリペプチドを、ポリペプチドがインフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって分離されているとき、ｍＲＮＡ内で単一の連続したオープンリーディングフレームから合成することができる。このようなリボソームスキップ機構は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされるいくつかのタンパク質の発現のためにいくつかのベクターによって使用されることが公知である。
【０２２４】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲが細胞内で発現されることを可能にするベクターは、本発明の別の目的である。好適な実施形態では、前記ベクターは、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの一過性発現を可能にする。より好適な実施形態では、前記ベクターは、細胞のゲノム中に配列を挿入することによって本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの構成的で安定な発現を可能にする。本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの発現および／または本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する細胞の生存期間は、制御することができる。
【０２２５】
一実施形態では、本発明は、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲをコードする配列を含むベクターを提供する。
【０２２６】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７から選択される本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲをコードする配列を含むベクターを提供する。
【０２２７】
より好適な実施形態では、本発明は、本発明のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ９６３２ベクター（図４にあるような）を提供する。
【０２２８】
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７から選択されるＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ９６３２ベクター（図４にあるような）を提供する。
【０２２９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ９６３２ベクター（図４にあるような）を提供する。
【０２３０】
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号２７のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ９６３２ベクター（図４にあるような）を提供する。
【０２３１】
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号２６のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ９６３２ベクター（図４にあるような）を提供する。
【０２３２】
さらにより好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ９６３２ベクター（図４にあるような）を提供する。
【０２３３】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＣＡＲを含むｐＣＬＳ  ２６７００ベクター（図５にあるような）を提供する。
【０２３４】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７から選択されるＣＡＲをコードするＣＡＲ配列を含むｐＣＬＳ  ２６７００ベクター（図５に例示したような）であって、前記ＣＡＲは、ヒト化されていてもよい、ベクターを提供する。
【０２３５】
別のより好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ２６７００ベクター（図５にあるような）を提供する。別のより好適な実施形態では、本発明は、配列番号２５のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ２６７００ベクター（図５にあるような）を提供する。
【０２３６】
別のより好適な実施形態では、本発明は、配列番号２６のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ２６７００ベクター（図５にあるような）を提供する。
【０２３７】
別のより好適な実施形態では、本発明は、配列番号２７のＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬＳ  ２６７００ベクター（図５にあるような）を提供する。
【０２３８】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知）がポリヌクレオチド配列またはベクター配列中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に作動可能に連結されており、すなわち、２つの配列は、正しい読み枠内で接合され、新しく合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に導くように配置されている。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、ある特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列中の他の場所に配置されてもよい（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照）。好適な実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列、配列番号１および２を含む。
【０２３９】
より好適な実施形態では、本発明のＣＡＲのシグナルペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０２４０】
当業者は、遺伝コードの縮重を考慮して、かなりの配列バリエーションがこれらのポリヌクレオチド分子の中で可能であることを認識することになる。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞内の発現について、好ましくはヒト細胞内の発現についてコドン最適化されている。コドン最適化は、所与の種の高度に発現される遺伝子中で一般に稀有であるコドンの、このような種の高度に発現される遺伝子中で一般に頻繁であるコドンによる目的の配列中の交換を指し、このようなコドンは、交換されているコドンのようにアミノ酸をコードする。
【０２４１】
ＣＡＲを備えた免疫細胞を操作する方法：
本発明は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法であって、以前に記載したＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲの１つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを前記免疫細胞内にｅｘ−ｖｉｖｏで導入することを含む方法を包含する。
【０２４２】
本発明は、好ましくは免疫療法のための、より好ましくはがんのさらなる療法のための本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの１つをコードするポリヌクレオチドまたはレンチウイルスベクターを備えた免疫細胞を含む初代免疫細胞も包含する。
【０２４３】
本発明の初代免疫細胞は、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現がん細胞に対するより良好な親和性および選択性を有する本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲコンストラクトを含む。
【０２４４】
好適な実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、免疫細胞内で安定に発現されることを考慮してレンチウイルスベクター（好ましくは図５にあるような）中に含められる。
【０２４５】
さらなる実施形態によれば、前記方法は、前記細胞を遺伝的に修飾してこれらを同種移植により適したものにするステップをさらに含む。
【０２４６】
第１の態様によれば、免疫細胞は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６９１５に記載されたようにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の１種または複数の成分を発現する少なくとも１種の遺伝子を不活化することによって、同種とすることができ、この不活化は、ＨＬＡまたはβ２ｍタンパク質発現をコードまたは調節する遺伝子の不活化と組み合わせることができる。したがって、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクは、著しく低減される。
【０２４７】
別の態様によれば、免疫細胞をさらに遺伝子操作して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性悪性細胞を処置するための標準的なケアとして使用される免疫抑制薬または化学療法処置に対するこれらの耐性を改善することができる。例えば、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）処置およびグルココルチコイド処置の薬物標的であるＣＤ５２およびグルココルチコイド受容体（ＧＲ）を不活化して、細胞をこれらの処置に対して耐性にし、特異的なＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを備えていない患者自体のＴ細胞に優る競合上の利点を細胞に与えることができる。ＣＤ３遺伝子の発現を抑制または低減して、別の免疫抑制薬であるテプリズマブに対する耐性を付与することもできる。ＨＰＲＴの発現は、本発明によって抑制または低減して、特に、急性リンパ芽球性白血病を処置するために化学療法で一般に使用される細胞増殖抑制剤である６−チオグアニンに対する耐性を付与することができる。
【０２４８】
本発明のさらなる態様によれば、免疫細胞を、ＰＤＣＤ１またはＣＴＬＡ−４などのＴ細胞活性化の調節因子として作用する「免疫チェックポイント」として作用するタンパク質をコードする遺伝子を不活化することによって、さらにマニピュレートして細胞をより活性にし、または消耗を制限することができる。その発現が低減または抑制され得る遺伝子の例を、表９に示す。
【０２４９】
【表９】
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【０２５０】
好適な実施形態では、免疫細胞をさらに操作する前記方法は、ＤＮＡ切断によって上述したもののような遺伝子を選択的に不活化するための特異的レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、特にｍＲＮＡを前記Ｔ細胞内に導入することを伴う。より好適な実施形態では、前記レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼまたはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、他のタイプのレアカッティングエンドヌクレアーゼに対してより高い特異性および切断効率をこれまで証明しており、これらを一定のターンオーバーで大規模に操作された免疫細胞を生成するための最適なエンドヌクレアーゼにする。
【０２５１】
送達方法
上述した異なる方法は、細胞内にＣＡＲを導入することを伴う。非限定的な例として、前記ＣＡＲを、１つのプラスミドベクターによってコードされる導入遺伝子として導入することができる。前記プラスミドベクターは、前記ベクターを受け取った細胞を同定および／または選択できるようにする選択マーカーも含有することができる。
【０２５２】
ポリペプチドは、細胞内に前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する結果として、細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕで合成され得る。代わりに、前記ポリペプチドを細胞の外で生成し、次いで細胞に導入することができる。細胞内にポリヌクレオチドコンストラクトを導入するための方法は、当技術分野で公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノム内に組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノム内に組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルス媒介方法を含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞内に導入され得る。例えば、一過性形質転換法としては、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、または粒子ボンバードメントがある。前記ポリヌクレオチドは、細胞内で発現されることを考慮して、ベクター、より特定すれば、プラスミドまたはウイルス中に含めることができる。
【０２５３】
操作された免疫細胞
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを備えた初代免疫細胞（または操作された免疫細胞）は、本発明の別の目的である。好ましくは、前記細胞は、初代Ｔ細胞、より好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞の破壊をもたらす  ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対してＣＴＬ活性を有する初代Ｔ細胞である。
【０２５４】
好ましくは、前記初代Ｔ細胞は、配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを備えている。
【０２５５】
好ましくは、前記初代Ｔ細胞は、配列番号２５のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを備えている。
【０２５６】
好ましくは、前記初代Ｔ細胞は、配列番号２６のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを備えている。
【０２５７】
好ましくは、前記初代Ｔ細胞は、配列番号２７のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを備え、より好ましくは、前記初代Ｔ細胞は、ヒト化されていてもよい、配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを備える。
【０２５８】
本発明は、本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現し、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対して、好ましくはＥＧＦＲＶＩＩＩ発現がん細胞に対してＣＴＬおよび／または脱顆粒活性を呈する初代Ｔ細胞を提供し、好ましくは、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対して、好ましくはＥＧＦＲＶＩＩＩ発現がん細胞に対してＣＴＬおよび／または脱顆粒活性を呈する前記初代Ｔ細胞は、配列番号２７のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを備え、より好ましくは、前記初代Ｔ細胞は、ヒト化されていてもよい、配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを備える。
【０２５９】
本発明は、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞、特に、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現腫瘍細胞を溶解するための本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞も提供する。
【０２６０】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現し、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対して、好ましくはＥＧＦＲＶＩＩＩ発現がん細胞に対してＣＴＬおよび／または脱顆粒活性を呈する初代Ｔ細胞も、本明細書に開示されている。
【０２６１】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現し、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対して、好ましくはＥＧＦＲＶＩＩＩ発現がん細胞に対してＣＴＬおよび／または脱顆粒活性を呈する初代Ｔ細胞も、本明細書に開示されている。
【０２６２】
以下の追加のかつ具体的な主題も提供されている。
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、および
ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞。
【０２６３】
一実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞内で発現されるＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ヒトＣＤ２８に由来する配列を有さない。
【０２６４】
好適な実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞は、ＣＤ２８由来配列を含まない、特に、ヒトＣＤ２８と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸同一性を有する配列を有さないＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する。
【０２６５】
より好適な実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞内の本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの細胞質内および／または膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８由来配列を含まず、特に、ヒトＣＤ２８と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸同一性を有する配列を有さない。
【０２６６】
本発明の初代免疫Ｔ細胞は、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインで構成され、ヒトＣＤ２８シグナリングドメインで構成されない細胞内シグナリグンドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する。
【０２６７】
好適な実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞は、ＣＤ２８に由来する配列を含まず、ＣＤ８αに由来するシグナルペプチド（リーダー配列）、ＴＭドメイン、およびヒンジを含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する。
【０２６８】
一実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞は、ヒトＣＤ８α（配列番号１）に由来するリーダー配列、または配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する、好ましくは配列番号１のリーダー配列を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する。
【０２６９】
別の実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞は、配列番号２のリーダー配列、または配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するリーダー配列を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する。
【０２７０】
一実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞は、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来する（ＣＤ８αに由来する）ヒンジ、
−  ヒトＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する。
【０２７１】
一実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞は、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ヒトＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する。
【０２７２】
本発明は、配列番号１または配列番号２のシグナルペプチドを含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞を包含する。
【０２７３】
本発明は、ヒンジ、好ましくはＣＤ８α、ＩｇＧ１、またはＦＣＲＩＩＩに由来するヒンジ（図２を参照）、より好ましくはＣＤ８αに由来するヒンジ、さらにより好ましくは配列番号４を有するヒンジに連結された抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖを含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２７４】
好ましくは、本発明は、
−  シグナルペプチド、好ましくはＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、より好ましくは配列番号１または配列番号２のＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与する、（ｓｃＦｖ）、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２７５】
より好ましくは、本発明は、
−  ヒトＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与する、（ｓｃＦｖ）、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２７６】
さらにより好ましくは、本発明は、
−  ヒトＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与し、前記ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ヒト化されている、（ｓｃＦｖ）、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ヒトＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２７７】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞は、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ、
−  ＣＤ８α  ＴＭ、
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む。
【０２７８】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞は、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  ＶＬ、リンカー、およびＶＨを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ、
−  ＣＤ８α  ＴＭ、
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む。
【０２７９】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞は、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ、
−  ＣＤ８α  ＴＭ、
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
で構成される。
【０２８０】
一実施形態では、前記リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｎのリンカーであり、式中、ｎは、１〜３であり、好ましくはｎ＝３であり、前記配列は、（Ｇ４Ｓ）３であり、より好ましくは配列番号１０のものである。
【０２８１】
本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞は、
−  ヒトＣＤ８αリーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ヒトＣＤ８αヒンジ、
−  ヒトＣＤ８α  ＴＭ、
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む。
【０２８２】
一実施形態では、本発明は、
−  配列番号１のヒトＣＤ８αリーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  配列番号１１のＶＨ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１２のＶＬ、または配列番号１３のＶＨ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１４のＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  配列番号４のヒトＣＤ８αヒンジ、
−  配列番号６のヒトＣＤ８α  ＴＭ、
−  配列番号８の４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  配列番号９の細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２８３】
一実施形態では、本発明は、
−  配列番号１のヒトＣＤ８αリーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  配列番号１２のＶＬ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１１のＶＨ、配列番号１４のＶＬ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１３のＶＨを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  配列番号４のヒトＣＤ８αヒンジ、
−  配列番号６のヒトＣＤ８α  ＴＭ、
−  配列番号８の４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  配列番号９の細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２８４】
一実施形態では、本発明は、
−  配列番号１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであって、好ましくは、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、シグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインであって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与し、前記リンカーは、配列番号１０のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、
前記ＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１３のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、
前記ＶＬドメインは、配列番号１２または配列番号１４のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメイン、
−  −  配列番号４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、
−  配列番号６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン、
−  配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢ（または４−１ＢＢ細胞内ドメイン）に由来する共刺激シグナル分子、
−  配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２８５】
好適な実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞内で発現される本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ＣＤ２８由来、またはヒトＣＤ２８由来、特に、ヒトＣＤ２８イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まない。より好適な実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞内で発現される本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ヒトＣＤ２８由来、特に、ヒトＣＤ２８イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まず、ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なｓｃｆｖのＶＨドメインに好ましくは融合されたＣＤ８αに由来するシグナルペプチドをさらに含有する。
【０２８６】
一実施形態では、本発明は、配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２８７】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２８８】
一実施形態では、本発明は、配列番号２６のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２８９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２７のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２９０】
好適な実施形態では、本発明は、配列番号２４または配列番号２５、より好ましくは配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２９１】
より好適な実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対して、好ましくはＥＧＦＲＶＩＩＩ発現がん細胞に対してＣＴＬおよび／または脱顆粒活性を呈する配列番号２４または配列番号２５、より好ましくは配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２９２】
一実施形態では、本発明は、配列番号２４のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２９３】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２９４】
一実施形態では、本発明は、配列番号２６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２９５】
一実施形態では、本発明は、配列番号２７のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０２９６】
本発明はまた、細胞を操作する前記方法によって得られやすい単離された細胞または細胞株に関する。特に、前記単離細胞は、上述した本発明の少なくとも１種のＣＡＲを含む。別の実施形態では、前記単離細胞は、各１つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む。特に、前記単離細胞は、ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝的に修飾された免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機構とは独立に増殖する。
【０２９７】
本発明の範囲内において、以前に記載した方法のいずれか１つに従って得られる単離免疫細胞、好ましくはＴ細胞も包含される。前記免疫細胞は、先天的および／または適応的免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与される造血起源の細胞を指す。本発明による前記免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より特定すれば、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。前記単離細胞はまた、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択される樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞であり得る。別の実施形態では、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の拡大増殖および遺伝的修飾の前に、細胞源を、様々な限定されない方法によって対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めたいくつかの限定されない源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態では、当業者に利用可能で公知の任意の数のＴ細胞株が使用され得る。別の実施形態では、前記細胞は、健康なドナー、がんと診断された患者、または感染症と診断された患者に由来し得る。別の実施形態では、前記細胞は、異なる表現型特性を提示する細胞の混合集団の一部である。本発明の範囲において、以前に記載した方法による形質転換Ｔ細胞から得られる細胞株も包含する。免疫抑制処置に耐性であり、以前の方法によって得られやすい修飾細胞は、本発明の範囲内に包含される。
【０２９８】
好適な実施形態として、本発明は、機能的ＴＣＲを発現せず、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対して反応性である、上述したＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを備えたＴ細胞またはＴ細胞の集団を、患者へのその同種移植のために提供する。
【０２９９】
Ｔ細胞の活性化および拡大増殖
Ｔ細胞の遺伝的修飾の前であっても後であっても、本発明の遺伝的に修飾された免疫細胞が活性化されており抗原結合機構とは独立に増殖する場合でも免疫細胞、特に本発明のＴ細胞は、例えば、米国特許６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載された方法を一般に使用してさらに活性化および拡大増殖され得る。Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖され得る。
【０３００】
一般に、本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞の表面でＣＤ３  ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激してＴ細胞に対して活性化シグナルを創製する作用物質との接触によって拡大増殖される。例えば、化学物質、例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、または分裂促進レクチン様フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などを、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを創製するのに使用することができる。
【０３０１】
非限定的な例として、Ｔ細胞集団を、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、または表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触、またはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の同時刺激について、アクセサリー分子を結合させるリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、胎児ウシ血清もしくはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、１Ｌ−４、１Ｌ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、−１０、−２、１Ｌ−１５、ＴＧＦｐ、およびＴＮＦ−、または当業者に公知の細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）のための任意の他の添加剤を含めた増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および生存能に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地、またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ  ５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤としては、それだけに限らないが、界面活性剤、プラズマネート、ならびに還元剤、例えば、Ｎ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどが挙げられる。培地として、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加された、無血清の、または適切な量の血清（もしくは血漿）、または規定されたセットのホルモン、ならびに／またはＴ細胞の増殖および拡大増殖に十分な量のサイトカインを補充された、ＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １、ならびにＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的な培養液中にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養液中に含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％  ＣＯ２）下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特性を呈し得る。
【０３０２】
別の特定の実施形態では、前記細胞は、組織または細胞と共培養することによって拡大増殖され得る。前記細胞はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、前記細胞を対象内に投与した後の対象の血液中で拡大増殖され得る。
【０３０３】
治療用途
本発明は、本発明の別の目的である本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞および薬学的に許容できるビヒクルを含む組成物を提供する。
【０３０４】
特に免疫療法のための医薬としての本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞も本明細書に開示されている。
【０３０５】
がんの処置において使用するための、または炎症を減弱するための本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞も本明細書に開示されている。
【０３０６】
別の実施形態では、異なる方法によって得られる単離細胞または以前に記載した前記単離細胞に由来する細胞株を、医薬として使用することができる。別の実施形態では、前記医薬は、がんを処置するのに、特に、その必要のある患者におけるＢ細胞リンパ腫および白血病を処置するのに使用することができる。別の実施形態では、本発明による前記単離細胞または前記単離細胞に由来する細胞株は、その必要のある患者におけるがんの処置のための医薬の製造において使用することができる。
【０３０７】
用語「がん」は、１つまたはいくつかのタイプの細胞の急速で制御されない増殖によって特徴付けられる疾患を指す。がんの例は、本明細書に記載されており、それだけに限らないが、神経膠芽腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵がん、結腸直腸がん、腎がん、肝がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんが挙げられる。好ましくは、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲで防止または処置されるがんは、神経膠腫、好ましくは神経膠芽腫、より好ましくは多発性神経膠芽腫である。
【０３０８】
用語「ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現に関連した疾患」は、本明細書では、それだけに限らないが、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現に関連した疾患、または様々ながん、例えば、神経膠芽腫（神経膠芽腫幹細胞を含む）；乳癌、卵巣癌、および非小細胞肺癌；頭頸部扁平上皮癌；髄芽腫、結腸直腸がん、前立腺がん、および膀胱癌などの腫瘍細胞を含めたＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞の活性に関連した状態を含む。溶解（ｌｙｓｅ）は、それにより本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対して作用し、腫瘍を低減または排除し、宿主の免疫細胞の腫瘍部位への浸潤を促進し、抗腫瘍応答を増強／拡張する機構の１つである。
【０３０９】
別の態様では、本発明は、その必要のある患者を処置するための方法であって、以下のステップの少なくとも１つを含む方法を利用する。
（ａ）以前に記載した方法のいずれか１つによって入手可能な免疫細胞を準備するステップ、
（ｂ）前記患者に前記形質転換免疫細胞を投与するステップ。
【０３１０】
一実施形態で、本発明の前記Ｔ細胞は、ロバストなｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞拡大増殖を起こすことができ、長い量の時間にわたって持続することができる。
【０３１１】
前記処置は、回復的、治癒的、または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部であり得る。自己とは、患者を処置するのに使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）互換性ドナーに起源を持つことを意味する。同種とは、患者を処置するのに使用される細胞、または細胞の集団が、前記患者に起源を持たず、ドナーに起源を持つことを意味する。
【０３１２】
開示した方法とともに使用され得る細胞は、以前のセクションに記載されている。前記処置は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞、特に、過剰のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞によって特徴付けられる前悪性がん状態または悪性がん状態と診断された患者を処置するのに使用することができる。このような状態は、肺がん、肛門がん、および多形性神経膠芽腫などのがんにおいて見つかる。
【０３１３】
本発明のＣＡＲを用いて処置されるがんのタイプとしては、それだけに限らないが、肺がん、肛門がん、および多形性神経膠芽腫が挙げられる。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。
【０３１４】
本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに関連した疾患および障害を処置するための組成物および方法を提供する。ＥＧＦＲｖＩＩＩに関連した疾患または障害の一例は、神経膠腫である。
【０３１５】
神経膠腫は、グリア細胞（例えば、神経細胞を囲繞および支持し、乏突起膠細胞、星状細胞、ミクログリア、および上衣細胞を含む細胞）内で始まる中枢神経系のがんを指す。神経膠腫は、これらの詳細な病理組織型に従って７つを超えるタイプ、例えば、神経膠芽腫および未分化星細胞腫などに分類される。
【０３１６】
病期（腫瘍サイズ、遠位転移の存在）および組織学的悪性度が、原発性脳腫瘍の悪性度の程度を判定するとき使用される。組織学的悪性度は、ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ（（２００２）Ｋａｎｅｈａｒａ＆Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に従って４つのレベル、すなわちＧ１〜Ｇ４に分類され、これらは、それぞれＷＨ０１〜ＷＨ０４に対応する。数値が大きいほど、悪性度の程度が高い。例えば、神経膠芽腫の悪性度は、Ｇ４（ＷＨ０４）であり、一方、未分化星細胞腫の悪性度はＧ３（ＷＨ０３）であり、Ｇ３およびＧ４はともに悪性と分類される。
【０３１７】
したがって、特定の実施形態によれば、本発明の方法は、悪性神経膠腫を標的とする。他の態様では、本発明は、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）または多発性神経膠芽腫を標的とする。
【０３１８】
さらなる実施形態では、本発明の組成物および方法は、それだけに限らないが、未分化星細胞腫、巨細胞神経膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起膠腫、未分化上衣細胞腫、脈絡叢癌、未分化神経節膠腫、松果体芽腫、髄上皮腫、上衣芽細胞腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍を含めた他の神経膠腫の処置において使用される場合がある。
【０３１９】
神経膠芽腫は、成人における最も一般的な原発性脳腫瘍である。毎年悪性原発性脳腫瘍と診断される患者の半分超が、多形性神経膠芽腫を有する。多形性神経膠芽腫は、高い増殖指数、微小血管増殖、および局所的なネクローシスを伴った未分化の、高度に細胞性の腫瘍である。
【０３２０】
これらの病変部の高度に増殖性の特質は、複数の分裂促進効果から生じる可能性が高い。ＧＢＭのホールマークの１つは、内皮増殖である。多数の血管新生増殖因子およびこれらの受容体の宿主が、ＧＢＭにおいて見つかる。
【０３２１】
多形性神経膠芽腫の予後は、悲惨なままである。生存時間は、患者の大部分について２年未満である。
【０３２２】
原発性多形性神経膠芽腫は、グリア細胞から新規に発症し、典型的には６カ月未満の病歴を有し、高齢患者においてより一般的であり、小細胞組織構造（ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）を提示する。続発性の多形性神経膠芽腫は、既存の低グレード神経膠星状細胞腫から数カ月または数年にわたって発症し、主に若者に影響し、巨細胞組織構造（ｇｉａｎｔ−ｃｅｌｌ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）を提示する。
【０３２３】
悪性神経膠腫は、高グレードの神経膠腫としても公知である。これらは、脳および脊髄に影響し得る。一部の態様では、本発明の組成物および方法は、脳悪性神経膠腫、例えば、未分化星細胞腫（ＡＡ）、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、未分化乏突起膠腫（ＡＯ）、および未分化乏突起星細胞腫（ＡＯＡ）の中で選択されるものを担持する対象を処置するのに使用することができる。
【０３２４】
本発明の組成物および方法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞もしくは組織を有するとして特徴付けられている、またはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞もしくは組織を有すると疑われる対象を処置するのに使用することができる。例えば、本発明による処置から恩恵を受ける対象としては、例えば、頭蓋内圧の増大の結果として頭痛、吐き気および嘔吐、発作、視覚の喪失、疼痛、脱力感、四肢のしびれ、ならびに／または脳神経障害の１つまたは複数の存在によって立証されるような、神経膠腫を有する対象、または神経膠腫を有すると疑われる対象が挙げられる。特定の実施形態では、処置される神経膠腫は、多形性神経膠芽腫である。本実施形態によれば、多形性神経膠芽腫は、脳または脊髄内に存在し得る。
【０３２５】
本発明では、免疫細胞は、プリンヌクレオチド類似体、プラチン（シスプラチンまたはカルボプラチン）、抗トポイソメラーゼＩ（イリノテカン）、抗トポイソメラーゼＩＩ（エトポシド）、メトトレキセート（葉酸類似体）から選択される薬物に対してなどの化学療法に対して耐性である初代免疫細胞、単離初代免疫細胞、単離初代免疫Ｔ細胞、単離初代免疫ＮＫ細胞、単離初代免疫ＴＣＲ−ＫＯ  Ｔ細胞、好ましくは単離初代免疫ＴＣＲ−ＫＯ  Ｔ細胞を意味する。
【０３２６】
好ましくは、本発明は、神経膠芽腫、より特定すれば、多発性神経膠芽腫の処置で使用するための本発明の効率的なＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞を提供する。より好ましくは、本発明は、神経膠芽腫、より特定すれば、多発性神経膠芽腫の処置で使用するための、ヒト化されていてもよい、配列番号２４の本発明の効率的なＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞を提供する。
【０３２７】
一実施形態では、患者は、残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠芽腫を有する患者である。
【０３２８】
別の実施形態では、本発明は、神経膠芽腫、より特定すれば、多発性神経膠芽腫の処置で使用するための本発明の効率的なＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞を提供する。より好ましくは、本発明は、未分化星細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫、膠肉腫、または神経上皮腫を有する患者の処置で使用するための、ヒト化されていてもよい、配列番号２４の本発明の効率的なＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞を提供する。
【０３２９】
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するためのＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対して、好ましくはＥＧＦＲＶＩＩＩ発現がん細胞に対してＣＴＬおよび／または脱顆粒活性を呈する本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞も本明細書に開示されている。
【０３３０】
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、および
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞が本明細書に提供されている。
【０３３１】
好適な実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞は、ＣＤ２８由来配列を含まず、特に、ヒトＣＤ２８と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸同一性を有する配列を有さないＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現し、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するために提供される。
【０３３２】
より好適な実施形態では、本発明の初代免疫Ｔ細胞内の本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲの細胞質内および／または膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８由来配列を含まず、特に、ヒトＣＤ２８と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０のアミノ酸同一性を有する配列を有さず、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するために提供される。
【０３３３】
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒンジ、
−  膜貫通ドメイン、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインで構成され、ヒトＣＤ２８シグナリングドメインで構成されない細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３３４】
好適な実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、ＣＤ２８に由来する配列を含まず、ＣＤ８αに由来するシグナルペプチド（リーダー配列）、ＴＭドメイン、およびヒンジを含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３３５】
一実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、ヒトＣＤ８αに由来するリーダー配列、または配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する、好ましくは配列番号１のリーダー配列を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３３６】
別の実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、配列番号２のリーダー配列、または配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するリーダー配列を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３３７】
一実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来する（ＣＤ８αに由来する）ヒンジ
−  ヒトＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３３８】
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、結合ドメイン、
−  ヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ
−  ヒトＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  ヒトＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する本発明の初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３３９】
本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、配列番号１または配列番号２のシグナルペプチドを含むＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を包含する。
【０３４０】
本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、ヒンジ、好ましくはＣＤ８α、ＩｇＧ１、またはＦＣＲＩＩＩに由来するヒンジ（図２を参照）、より好ましくはＣＤ８αに由来するヒンジ、さらにより好ましくは配列番号４を有するヒンジに連結された抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖを含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３４１】
本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、ヒンジ、好ましくはＣＤ８αに由来するヒンジ、ＣＤ８αに由来するＴＭ、およびＣＤ８αに由来するシグナルペプチド、さらにより好ましくは配列番号４を有するヒンジ、ＣＤ８αに由来するＴＭ、およびＣＤ８αに由来するシグナルペプチドに連結された抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖを含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３４２】
好ましくは、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫の処置で使用するための、
−  シグナルペプチド、好ましくはＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、より好ましくは配列番号１のＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与する、（ｓｃＦｖ）、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ、
−  ＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３４３】
より好ましくは、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  ヒトＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与する、（ｓｃＦｖ）、
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ
−  ＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３４４】
さらにより好ましくは、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  ヒトＣＤ８アルファに由来するシグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメインを含む（ｓｃＦｖ）であって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与し、前記ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ヒト化されている、（ｓｃＦｖ）
−  ヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ
−  ＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン（ＴＭ）
−  ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３４５】
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ
−  ＣＤ８α  ＴＭ
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３４６】
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）
−  ＶＬ，リンカー、およびＶＨを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ
−  ＣＤ８α  ＴＭ
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含むＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３４７】
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  リーダー配列（例えば、ＣＤ８αリーダー配列またはＣＤ８αシグナルペプチド）
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ＣＤ８αヒンジ
−  ＣＤ８α  ＴＭ
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
で構成される本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３４８】
一実施形態では、前記リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｎのリンカーであり、式中、ｎは、１〜３であり、好ましくはｎ＝３であり、前記配列は、（Ｇ４Ｓ）３であり、より好ましくは配列番号１０のものである。
【０３４９】
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  ヒトＣＤ８αリーダー配列（ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）、
−  ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  ヒトＣＤ８αヒンジ
−  ヒトＣＤ８α  ＴＭ
−  ４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞が提供されている。
【０３５０】
一実施形態では、本発明は、
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  配列番号１のヒトＣＤ８αリーダー配列（ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）
配列番号１１のＶＨ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１２のＶＬ、または配列番号１３のＶＨ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１４のＶＬを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  配列番号４のヒトＣＤ８αヒンジ、
−  配列番号６のヒトＣＤ８α  ＴＭ
−  配列番号８の４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子
−  配列番号９の細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３５１】
一実施形態では、本発明は、
がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  配列番号１のヒトＣＤ８αリーダー配列（ＣＤ８αリーダーまたはＣＤ８αシグナルペプチド）
配列番号１２のＶＬ、配列番号１０のリンカー、配列番号１１のＶＨ、配列番号１４のＶＬ、配列番号１０のリンカー、および配列番号１３のＶＨを含む抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖであって、有利には、ｓｃｆｖは、ヒト化されている、抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ  ｓｃｆｖ、
−  配列番号４のヒトＣＤ８αヒンジ、
−  配列番号６のヒトＣＤ８α  ＴＭ
−  配列番号８の４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、
−  配列番号９の細胞内ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３５２】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための、
−  配列番号１または２のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであって、好ましくは、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、シグナルペプチド、
−  リンカーによってＶＬと分離されたＶＨドメインであって、前記ＶＨおよびＶＬは、ＥＧＦＲＶＩＩＩへの結合に寄与し、前記リンカーは、配列番号１０のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、
前記ＶＨドメインは、配列番号１１または配列番号１３のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、
前記ＶＬドメインは、配列番号１２または配列番号１４のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、リンカーによってＶＬドメインと分離されたＶＨドメイン、
−  −  配列番号４のポリペプチドと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８アルファ鎖に由来するヒンジ、
−  配列番号６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ８アルファ（α）に由来する膜貫通ドメイン、
−  配列番号８からなるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢ（または４−１ＢＢ細胞内ドメイン）に由来する共刺激シグナル分子、
−  配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３５３】
好適な実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための初代免疫Ｔ細胞内で発現される本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ＣＤ２８、またはヒトＣＤ２８、特に、ヒトＣＤ２８イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まない。
【０３５４】
より好適な実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための本発明の初代免疫Ｔ細胞内で発現される本発明のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲは、ヒトＣＤ２８、特に、ヒトＣＤ２８イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まず、ＥＧＦＲＶＩＩＩに特異的なｓｃｆｖのＶＨドメインに好ましくは融合されたＣＤ８に由来するシグナルペプチドをさらに含有する。
【０３５５】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３５６】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２５のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３５７】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２６のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３５８】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２７のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３５９】
好適な実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２４または配列番号２５の、より好ましくはがん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３６０】
より好適な実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２４または配列番号２５の、より好ましくは、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するためのＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞に対して、好ましくはＥＧＦＲＶＩＩＩ発現がん細胞に対してＣＴＬおよび／または脱顆粒活性を呈する配列番号２４のＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３６１】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２４のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３６２】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２５のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３６３】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２６のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代Ｔ免疫細胞を提供する。
【０３６４】
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置で使用するための配列番号２７のポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＥＧＦＲＶＩＩＩ  ＣＡＲを発現する初代免疫Ｔ細胞を提供する。
【０３６５】
本発明による操作された免疫細胞を用いた処置は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群から選択されるがんに対する１つまたは複数の療法と組み合わせたものであり得る。
【０３６６】
本発明の好適な実施形態によれば、前記処置は、免疫抑制処置を受けている患者に投与することができる。実際に、本発明は、好ましくは、少なくとも１種の免疫抑制剤に対して、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活化に起因して耐性にされた細胞または細胞の集団を利用する。この態様では、免疫抑制処置は、患者内の本発明によるＴ細胞の選択および拡大増殖を助けるはずである。
【０３６７】
本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、インプランテーション、または移植によるものを含めた任意の好都合な様式で実施され得る。本明細書に記載の組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ管内注射によって、または腹腔内に、患者に投与することができる。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、静脈内注射によって好ましくは投与される。
【０３６８】
細胞または細胞の集団の投与は、体重１ｋｇ当たり１０４〜１０９細胞、好ましくは、これらの範囲内のすべての整数値の細胞数を含めて１０５〜１０６細胞／体重１ｋｇの投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、１回または複数回の用量で投与することができる。別の実施形態では、細胞の前記有効量は、単回用量として投与される。別の実施形態では、細胞の前記有効量は、ある時間にわたって１回を超える用量で投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、任意の供給源、例えば、血液銀行またはドナーなどから得ることができる。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態の所与の細胞型の有効量の最適な範囲の判定は、当技術分野の技術の範囲内である。有効量は、治療的または予防的な利益をもたらす量を意味する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の特質に依存することになる。
【０３６９】
別の実施形態では、細胞またはこれらの細胞を含む組成物の前記有効量は、非経口的に投与される。前記投与は、静脈内投与であり得る。前記投与は、腫瘍内に注射によって直接行うことができる。
【０３７０】
本発明のある特定の実施形態では、細胞は、それだけに限らないが、作用物質を用いた処置、例えば、ＭＳ患者のための抗ウイルス療法、シドフォビルおよびンターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知）、もしくはナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｔｉｍａｂ）処置、またはＰＭＬ患者のための他の処置などを含めた任意の数の妥当な処置モダリティーと併せて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、または他の抗体療法など、細胞毒（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｌｉｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存ホスファターゼカルシニュリンを阻害し（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子誘導シグナリングにとって重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｙａら、１９９１；Ｌｉｕ、Ａｌｂｅｒｓら、１９９２  Ｂｉｅｒｅｒ、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、１９９３）。
【０３７１】
さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法と併せて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、Ｂ細胞除去療法、例えば、ＣＤ２０と反応する作用物質、例えば、リツキサンなどの後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法を用いた標準的な処置を受け、その後に末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の実施形態では、移植の後に、対象は、本発明の拡大増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、拡大増殖された細胞は、手術前または後に投与される。
【０３７２】
他の定義
−  ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、１文字コードに従って本明細書で指定され、この中で例えば、Ｑは、Ｇｌｎまたはグルタミン残基を意味し、Ｒは、Ａｒｇまたはアルギニン残基を意味し、Ｄは、Ａｓｐまたはアスパラギン酸残基を意味する。
【０３７３】
−  アミノ酸置換は、１つのアミノ酸残基の別のアミノ酸残基との置き換えを意味し、例えば、ペプチド配列中のアルギニン残基のグルタミン残基との置き換えは、アミノ酸置換である。
【０３７４】
−  ヌクレオチドは、以下の通り指定される。１文字コードが、ヌクレオシドの塩基を指定するのに使用される。ａは、アデニンであり、ｔは、チミンであり、ｃは、シトシンであり、ｇは、グアニンである。縮重ヌクレオチドについて、ｒは、ｇまたはａ（プリンヌクレオチド）を表し、ｋは、ｇまたはｔを表し、ｓは、ｇまたはｃを表し、ｗは、ａまたはｔを表し、ｍは、ａまたはｃを表し、ｙは、ｔまたはｃ（ピリミジンヌクレオチド）を表し、ｄは、ｇ、ａ、またはｔを表し、ｖは、ｇ、ａ、またはｃを表し、ｂは、ｇ、ｔ、またはｃを表し、ｈは、ａ、ｔ、またはｃを表し、ｎは、ｇ、ａ、ｔ、またはｃを表す。
【０３７５】
−  本明細書では、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成される断片などのヌクレオチドならびに／またはポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、もしくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性形態）、または両方の組合せであるモノマーから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分において変化を有し得る。糖修飾としては、例えば、１つまたは複数の水酸基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基との置き換えを含み、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、立体的および電子的に同様の構造体、例えば、アザ糖および炭素環糖類似体などと置き換えることができる。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換体がある。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこのような連結部の類似体によって連結することができる。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。
【０３７６】
−  キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、特異的抗標的細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成するために、標的細胞に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体ベース特異性を、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子を意図している。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（ｓｃＦｖＦｃ：ζ）の細胞内シグナリングドメインに融合された細胞外単鎖抗体（ｓｃＦｖＦｃ）からなり、Ｔ細胞内で発現されるとき、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識を再指向化する能力を有する。本発明で使用されるＣＡＲの一例は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原に対してＣＡＲであり、非限定的な例として、アミノ酸配列：配列番号１５〜１８、好ましくは配列番号２４〜２７、より好ましくは配列番号２４；より好ましくはヒト化された配列番号２４〜２７、より好ましくはヒト化された配列番号２４を含み得る。
【０３７７】
本発明のＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞とは、特異的抗標的細胞免疫活性（ＣＴＬ活性）を呈するキメラタンパク質を生成するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する少なくとも１つの結合ドメイン、例えば、所望の腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に対する抗体ベース特異性を、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子を発現する初代Ｔ細胞を意図している。
【０３７８】
一般に、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識を再指向化し、標的細胞の破壊を誘導する。−  用語「エンドヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる任意の野生型またはバリアント酵素を指す。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を切断しないが、「標的配列」または「標的部位」とさらに呼ばれる特異的ポリヌクレオチド配列でＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を認識および切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、長さが１２塩基対（ｂｐ）超、より好ましくは１４〜５５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を有するとき、レアカッティングエンドヌクレアーゼに分類することができる。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、規定される遺伝子座でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによってＨＲを著しく増大させる（Ｐｅｒｒｉｎ、Ｂｕｃｋｌｅら、１９９３；Ｒｏｕｅｔ、Ｓｍｉｈら、１９９４；Ｃｈｏｕｌｉｋａ、Ｐｅｒｒｉｎら、１９９５；ＰｉｎｇｏｕｄおよびＳｉｌｖａ、２００７）。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＰａｑｕｅｓおよびＤｕｃｈａｔｅａｕ、２００７）、操作されたジンクフィンガードメインのＦｏｋ  Ｉなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（ＰｏｒｔｅｕｓおよびＣａｒｒｏｌｌ、２００５）、ＣＲＩＳＰＲシステムに由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（Ｇａｓｉｕｎａｓ、Ｂａｒｒａｎｇｏｕら、２０１２；Ｊｉｎｅｋ、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら  ２０１２；Ｃｏｎｇ、Ｒａｎら、２０１３；Ｍａｌｉ、Ｙａｎｇら、２０１３）、または化学的エンドヌクレアーゼ（Ｅｉｓｅｎｓｃｈｍｉｄｔ、Ｌａｎｉｏら、２００５；Ａｒｉｍｏｎｄｏ、Ｔｈｏｍａｓら  ２００６）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼでは、化学的切断因子またはペプチド性切断因子が、特定の標的配列を認識する核酸または別のＤＮＡのポリマーにコンジュゲートされており、それによって切断活性を特定の配列に標的化する。化学的エンドヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列を結合させることが公知のオルトフェナントロリン、ＤＮＡ切断分子、および三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の合成ヌクレアーゼ様コンジュゲートも包含する（ＫａｌｉｓｈおよびＧｌａｚｅｒ、２００５）。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。
【０３７９】
−  「ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）とは、典型的には転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する核酸結合ドメイン、および核酸標的配列を切断するための１つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を意図している。触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメイン、より好ましくは、例えば、Ｉ−ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡ、およびＦｏｋ−Ｉのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＯｎｕＩのようなメガヌクレアーゼ、またはその機能性バリアントに融合させることができる。より好適な実施形態では、前記ヌクレアーゼは、モノマーＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。モノマーＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、特異的な認識および切断のために二量体化を必要としないＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ、例えば、ＷＯ２０１２１３８９２７に記載された操作されたＴＡＬリピートのＩ−ＴｅｖＩの触媒ドメインとの融合物などである。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、細菌種ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）に由来するタンパク質であり、複数のリピート配列を含み、各リピートは、１２位および１３位に２つの残基を含み（ＲＶＤ）、これらは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的である。同様のモジュラー塩基対塩基核酸結合性質（ＭＢＢＢＤ）を有する結合ドメインも、異なる細菌種において出願人が最近発見した新しいモジュラータンパク質に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、ＴＡＬリピートより多くの配列変異性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識と関連したＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、およびＴを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴ、およびＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態では、極めて重要なアミノ酸１２および１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧに対するこれらの特異性をモジュレートするために、特に、この特異性を増強するために、他のアミノ酸残基へと突然変異させることができる。ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、既に記載されており、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子修飾を刺激するのに使用されている（Ｂｏｃｈ、Ｓｃｈｏｌｚｅら、２００９；ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、２００９；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ、Ｃｅｒｍａｋら、２０１０；Ｌｉ、Ｈｕａｎｇら、２０１１）。カスタムメイドＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、商標名ＴＡＬＥＮ（商標）（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ、８  ｒｕｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｏｉｘ  Ｊａｒｒｙ、７５０１３  Ｐａｒｉｓ、フランス）の下で市販されている。
【０３８０】
本発明によるレアカッティングエンドヌクレアーゼはまた、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。最近、新しいゲノム操作ツールが、ＩＩ型原核生物ＣＲＩＳＰＲ（群生性等間隔短回文反復配列）適応免疫系に由来するＲＮＡガイドＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｇａｓｉｕｎａｓ、Ｂａｒｒａｎｇｏｕら  ２０１２；Ｊｉｎｅｋ、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、２０１２；Ｃｏｎｇ、Ｒａｎら、２０１３；Ｍａｌｉ、Ｙａｎｇら、２０１３）に基づいて開発された（総説（Ｓｏｒｅｋ、Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２０１３）を参照）。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、細菌内で最初に発見され、ウイルスまたはプラスミドの外来ＤＮＡに対する防御として機能する。ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム操作は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短い配列モチーフに多くの場合隣接した標的配列の選択によって最初に進行する。標的配列選択の後、この標的配列に相補的な特定のｃｒＲＮＡが操作される。ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型システムに要求されるトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）がｃｒＲＮＡと対形成され、準備されたＣａｓ９タンパク質に結合される。Ｃａｓ９は、ｔｒａｃＲＮＡのｃＲＮＡとの塩基対合を促進する分子アンカーとして作用する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、２０１１）。この三元複合体では、デュアルｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ構造体は、エンドヌクレアーゼＣａｓ９を同族標的配列へと導くガイドＲＮＡとして作用する。Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体による標的認識は、標的配列とｃｒＲＮＡとの間の相同性について標的配列をスキャンすることによって開始される。標的配列−ｃｒＲＮＡ相補性に加えて、ＤＮＡターゲティングは、プロトスペーサーに隣接する短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ  −  ＰＡＭ）の存在を必要とする。デュアルＲＮＡと標的配列との間の対形成の後、Ｃａｓ９は、ＰＡＭモチーフの３塩基上流に平滑二本鎖切断を引き続いて導入する（Ｇａｒｎｅａｕ、Ｄｕｐｕｉｓら、２０１０）。
【０３８１】
レアカッティングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称の下でも公知であるホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野で周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ、２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖−または二本鎖切断を生じさせる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、長さが１２〜４５塩基対（ｂｐ）、通常長さが１４〜４０ｂｐの範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、またはＧＩＹ−ＹＩＧエンドヌクレアーゼに対応し得る。本発明による好適なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩバリアントであり得る。
【０３８２】
−  「送達ベクター（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）」または「送達ベクター（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」は、本発明で必要とされる作用物質／化学物質、および分子（タンパク質または核酸）を細胞接触の状態にする（すなわち「接触させる」）、または細胞もしくは細胞内コンパートメント内部に送達する（すなわち、「導入する」）のに本発明で使用することができる任意の送達ベクターを意図している。これには、それだけに限らないが、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学キャリア、ポリマーキャリア、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、エマルジョン、または他の適切なトランスファーベクターが含まれる。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、巨大分子（遺伝子、タンパク質）、または他のベクター、例えば、Ｄｉａｔｏｓによって開発されたプラスミド、ペプチドなどの送達を可能にする。これらの場合では、送達ベクターは、分子キャリアである。「送達ベクター（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）」または「送達ベクター（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」とは、トランスフェクションを実施する送達方法も意図している。
【０３８３】
−  用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」または「ベクター（ｖｅｃｔｏｒｓ）」は、核酸分子であって、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明における「ベクター」としては、それだけに限らないが、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成核酸からなり得る線状もしくは環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が挙げられる。好適なベクターは、自律複製（エピソームベクター）することができ、および／またはこれらが連結されている核酸の発現（発現ベクター）することができるベクターである。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されており、例は、図４および図５にある。
【０３８４】
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）など、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなど、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスタイプ１および２、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）、ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリポックス）を含めた二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血症−肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。
【０３８５】
−  「レンチウイルスベクター」とは、これらの相対的に大きいパッケージング能力、低減された免疫原性、および大きい範囲の異なる細胞型を高効率で安定に形質導入するこれらの能力のために遺伝子送達に非常に有望であるＨＩＶベースレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、３種（パッケージング、エンベロープ、およびトランスファー）またはそれ超のプラスミドを産生細胞内に一過性にトランスフェクトした後に生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用によって標的細胞に侵入する。侵入の際、ウイルスＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、二本鎖線状ウイルスＤＮＡであり、それは、感染細胞のＤＮＡ内にウイルスを組み込むための基質である。「組込みレンチウイルスベクター（またはＬＶ）」とは、非限定例として、標的細胞のゲノムを組み込むことができるベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはＮＩＬＶ）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用によって標的細胞のゲノムを組み込まない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【０３８６】
−  送達ベクターおよびベクターは、任意の細胞透過化技法、例えば、ソノポレーション、もしくは電気穿孔、またはこれらの技法の派生法などと共に用い、または組み合わせることができる。
【０３８７】
−  細胞（ｃｅｌｌ）または細胞（ｃｅｌｌｓ）とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためのこれらの生物に由来する任意の真核生物生細胞、初代細胞、および細胞株を意図している。
【０３８８】
−  「初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ）」または「初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）」とは、非常に少ない集団倍加を受けており、したがって、連続的な腫瘍形成性のまたは人工的に不死化された細胞株と比較して、これらが由来する組織の主要な機能的成分および特性をより代表する、生きている組織（すなわち、生検材料）から直接採取され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖のために確立された細胞を意図している。
【０３８９】
非限定的な例として、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；ジャーカット細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；Ｍｏｌｔ４細胞からなる群から選択することができる。
【０３９０】
すべてのこれらの細胞株は、本発明の方法によって改変して、目的の遺伝子またはタンパク質を生成し、発現させ、定量化し、検出し、試験するための細胞株モデルをもたらすことができる。これらのモデルは、研究および生産および様々な分野、例えば、非限定的な例として、化学物質、生物燃料、治療剤、および農学などにおいて目的の生物活性分子をスクリーニングするのにも使用することができる。
【０３９１】
−  「突然変異」とは、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子）またはポリペプチド配列中の、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ超のヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図している。突然変異は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響し得る。これは、ゲノム配列の構造、またはコードされたｍＲＮＡの構造／安定性にも影響し得る。
【０３９２】
−  「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基の突然変異または置き換えによって得られるリピートバリアント、バリアント、ＤＮＡ結合バリアント、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを意図している。
【０３９３】
−  「機能性バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性突然変異体を意図している。このような突然変異体は、その親タンパク質もしくはタンパク質ドメインと比較して同じ活性もしくは追加の性質、またはより高いもしくはより低い活性を有し得る。
【０３９４】
−  「同一性」は、２つの核酸分子間またはポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって判定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基によって占有されているとき、分子は、その位置で同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列によって共有されている位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。ＦＡＳＴＡ、またはＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の一部として利用可能であるＢＬＡＳＴを含めた、様々な整列アルゴリズムおよび／またはプログラムを２つの配列間の同一性を計算するのに使用することができ、例えば、デフォルトの設定を用いて使用することができる。例えば、本明細書に記載の特定のポリペプチドと少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有し、好ましくは実質的に同じ機能を呈するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図されている。別段に示されていない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくことになる。ＢＬＡＳＴＰが使用されるとき、パーセント類似性は、ＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコア配列対中の全残基の数および画分を示し、ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、整列スコアが正の値を有し、互いに同様である残基の数および画分を示す。本明細書に開示のアミノ酸配列とこれらの程度の同一性もしくは類似性、または任意の中間の程度の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列が、企図されており、本開示によって包含されている。同様のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードを使用して推定され、慣例的な手段によって、特に、遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。
【０３９５】
−  「シグナル−形質導入ドメイン」または「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のペプチドのロードされたＭＨＣ分子との結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、それだけに限らないが、増殖活性化、分化などを含めたＴ細胞応答を媒介するシグナルをもたらす抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとして、それだけに限らないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体を結合させるアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドは、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子、例えば、それだけに限らないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどと特異的に結合する抗体も包含する。
【０３９６】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、それだけに限らないが、増殖などの細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびトールリガンド受容体が挙げられる。
【０３９７】
「共刺激シグナル」は、本明細書では、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖および／または主要な分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションに導くシグナルを指す。
【０３９８】
用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、本明細書では、リガンドに結合することができるオリゴ−またはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができることになる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染症、自己免疫疾患、ならびにがん細胞と関連したものが挙げられる。
【０３９９】
用語「対象」または「患者」は、本明細書では、非ヒト霊長類およびヒトを含めた動物界のすべてのメンバーを含む。一実施形態では、患者は、神経膠腫、好ましくは残留性または再発性ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋神経膠腫を有するヒトである。患者は、本発明による処置から恩恵を受けることができる。
【０４００】
本発明の上記書面による記載は、本発明を作製および使用する様式およびプロセスを、当業者がそれを作製および使用することが可能になるように提供し、この可能化は、特に添付の特許請求の範囲の主題についてもたらされ、それは、元の記載の一部を構成する。
【０４０１】
数値的な制限または範囲が本明細書で述べられている場合、終点は、含まれている。また、数値的な制限または範囲内のすべての値およびサブ範囲は、明示的に書かれているように具体的に含まれている。
【０４０２】
上記記載は、当業者が本発明を作製および使用することが可能になるように提示されており、特定の用途およびその要件との関連で提供されている。好適な実施形態の様々な改変は、当業者に容易に明らかとなり、本明細書に規定される一般的な原理は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく他の実施形態および用途に適用することができる。したがって、本発明は、示した実施形態に限定されるように意図されておらず、本明細書に開示の原理および特徴と一致する最も広い範囲が与えられるように意図されている。
【０４０３】
一般的な方法
ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ
ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、全体が参照により本明細書に組み込まれている文書ＵＳ２０１０／０１０５１３６およびＵＳ２０１０／０１０５１３６Ａ１で以前に記載された方法に従って異なるｓｃｆｖを使用して調製した。
【０４０４】
ＣＡＲのスクリーニングおよび選択
−  初代Ｔ細胞培養
Ｔ細胞を、フィコール勾配密集培地（Ｆｉｃｏｌｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｅｄｉｕｍ）を使用してＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ、Ｐａｒｉｓ、フランス）によって提供されたバフィーコート試料から精製した。ＰＢＭＣ層を回収し、Ｔ細胞を、市販のＴ細胞濃縮キットを使用して精製した。精製したＴ細胞を、２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２、５％ヒト、および１：１のビーズ：細胞比のＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で活性化した。
【０４０５】
−  ＣＡＲ  ｍＲＮＡトランスフェクション
異なるＣＡＲコンストラクトをコードするＣＡＲ  ｍＲＮＡのトランスフェクションを、Ｔ細胞を精製および活性化した後の４日目または１１日目に行った。細胞を、Ｘ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地中で直ちに希釈し、５％  ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。ＩＬ−２を、２０ｎｇ／ｍＬで電気穿孔して２時間後に添加した。
【０４０６】
−  ＣＡＲの発現を可能にする組換えレンチウイルスベクターを用いたＴ細胞形質導入
Ｔ細胞の、ＣＡＲを発現する組換えレンチウイルスベクターによる形質導入を、Ｔ細胞を精製／活性化して３日後に実施した。ＨＥＫ−２９３細胞内のゲノムプラスミドおよびヘルパープラスミドのトランスフェクションによってＶｅｃｔａｌｙｓ  ＳＡ（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）によって生成されたレンチウイルスベクターを使用することができる。形質導入を５の感染の多重度で実施した。Ｔ細胞の表面のＣＡＲ検出を、マウスＩｇＧ１  Ｆｃ断片と一緒に融合したヒトＥＧＦＲＶＩＩＩタンパク質の細胞外ドメインからなる組換えタンパク質（ＬａｋｅＰｈａｒｍａによって生成された）を使用して実施する。このタンパク質のＣＡＲ分子への結合を、タンパク質のマウスＦｃ部分を標的とするＰＥ−コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出し、フローサイトメトリーによって分析する。
【０４０７】
初代Ｔ細胞内の特定の遺伝子の不活化
初代Ｔ細胞内の特定の遺伝子の不活化は、Ｔ細胞内にＣＡＲを導入する前または後に実施することができる。
【０４０８】
少なくとも１種の遺伝子を不活化し、１、２、または３種の遺伝子を１ステップで不活化することができる。好適な実施形態では、２種の遺伝子、好ましくはＴＣＲアルファ遺伝子、およびプリンヌクレオチド類似体、プラチン（シスプラチンまたはカルボプラチン）、抗トポイソメラーゼＩ（イリノテカン）、抗トポイソメラーゼＩＩ（エトポシド）、メトトレキセート（葉酸類似体）から選択される薬物に対する耐性を付与する遺伝子を不活化する。
【０４０９】
一般に、ヘテロ二量体ヌクレアーゼ、特に、標的遺伝子内でスペーサーによって分離された２つの長い配列（ハーフ標的と呼ばれる）を標的とするＴＡＬＥ−ヌクレアーゼを設計および生成する。
【０４１０】
各ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼコンストラクトを、適切な哺乳動物発現ベクター内でクローニングすることができる。標的ゲノム配列を切断するＴＡＬＥ−ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、プロモーターの下流にコード配列を担持するプラスミドから合成することができる。抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズで予め活性化された精製したＴ細胞を使用し、半分のＴＡＬＥ−ヌクレアーゼの両方をコードする２つのｍＲＮＡのそれぞれをトランスフェクトする。細胞を、可溶性抗ＣＤ２８で再活性化して様々な時間について細胞増殖を測定し、活性化マーカーＣＤ２５を検出して細胞の活性化状態を評価することができる。
【０４１１】
−  脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａ動員）
Ｔ細胞を、様々なレベルの標的タンパク質（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）を発現する等量の細胞と一緒に、９６ウェルプレート中でインキュベートした。共培養を、５％  ＣＯ２とともに３７℃で６時間維持した。ＣＤ１０７ａ染色を、対照として抗ＣＤ４９ｄ、抗ＣＤ２８、および１×モネンシン溶液と一緒に、共培養の開始時に蛍光性抗ＣＤ１０７ａ抗体を添加することによって、細胞刺激中に行った。６時間のインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生存能力色素（ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ）および蛍光色素コンジュゲート抗ＣＤ８を用いて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脱顆粒活性を、ＣＤ８＋／ＣＤ１０７ａ＋細胞の％として、ＣＤ８＋細胞の中のＣＤ１０７ａ染色の平均蛍光強度信号（ＭＦＩ）を判定することによって判定した。脱顆粒アッセイを、ｍＲＮＡをトランスフェクトして２４時間後に実施した。
【０４１２】
−  ＩＦＮガンマ放出アッセイ
ｍＲＮＡをトランスフェクトして２４時間後に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、様々なレベルの標的タンパク質を発現する細胞株と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした。上清を回収し、細胞培養液上清中のＩＦＮガンマ検出をＥＬＩＳＡアッセイによって行った。
【０４１３】
−  細胞傷害性アッセイ
Ｔ細胞を、同じウェル中で１０，０００の標的細胞（様々なレベルの標的タンパク質を発現する）または（陰性対照）細胞と一緒にインキュベートした。標的および対照細胞を、蛍光細胞内色素（ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ）で標識した後、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞とともに共培養した。共培養物を３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生存能力色素で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞または陰性対照細胞）の生存能を判定し、特異的細胞溶解の％を計算した。細胞傷害性アッセイを、ｍＲＮＡをトランスフェクトして４８時間後に実施した。
【０４１４】
−  抗腫瘍マウスモデル
免疫不全マウスの側腹部に腫瘍細胞（神経膠芽腫）または標的タンパク質発現ルシフェラーゼ細胞をインプラントする。引き続いて、細胞をマウスの脳内にインプラントした。マウスのさらなる世代への連続移植は、ｉｎ  ｖｉｖｏゼノグラフト細胞株の維持を継続する。マウスは、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を注射する前に、またはそれと一緒に抗がん処置を任意選択で受けた。次いでマウスに、異なる用量の試験されるＣＡＲ＋  Ｔ細胞、またはＣＡＲレンチウイルスベクターで形質導入されなかったＴ細胞をｉｖ注射する（腫瘍細胞株を注射して２日後または７日後）。生物発光信号を、異なる動物における腫瘍進行を追跡するために、Ｔ細胞注射の日（Ｄ０）、Ｔ細胞注射後のＤ７、１４、２１、２８、および４０に判定する。
【０４１５】
Ｃｈｅｎ、Ｊｉａｎら、Ａｎｙ  ｏｔｈｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａ  ｓｕｃｈ  ａｓ  ｔｈｏｓｅ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｉｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａ：  Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ、ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ：１４９巻、１、３６〜４７は、本試験に適している。
【０４１６】
臨床試験
主目的
脳腫瘍、神経膠芽腫、または膠肉腫、特に、神経膠芽腫、より特定すれば、多発性神経膠芽腫を有する患者中の、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するＴＣＲ  ＫＯ初代Ｔ細胞（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ操作されたＴリンパ球）の投与の安全性および有効性を評価するため。
【０４１７】
骨髄非破壊的であるがリンパ枯渇性の準備レジメン後に抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ操作されたＴリンパ球およびアルデスロイキンを任意選択で受けている患者の６カ月の無増悪生存期間を判定するため。
【０４１８】
二次的目的
・抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ操作されたＴリンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ生存期間を判定する
・処置後の放射線透過写真術による変化を評価する
【０４１９】
適格性：
・ＩＨＣまたはＲＴ−ＰＣＲによって判定されたＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する組織学的に証明された神経膠芽腫または膠肉腫
・化学療法の有無にかかわらず放射線療法を用いた先の標準的な処置に失敗
・６０％超またはそれに等しいカルノフスキースコア
許容できる制限内の心臓、肺、および実験室パラメータ
【０４２０】
設計：
・試験は、第Ｉ／ＩＩ相設計を使用して行った。
・患者は、シクロホスファミドおよびフルダラビンからなる骨髄非破壊的であるがリンパ球枯渇性の準備レジメン、その後ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍反応性、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ操作されたＴリンパ球、任意選択でそれに加えてＩＶアルデスロイキンの静脈内注入を受けた。
・ＭＴＤを判定した後、試験を第ＩＩ相部分に進めた。
・治験の２相部分では、患者を２つの群にした。
〇処置の開始時にステロイド使用を必要とする再発性悪性神経膠腫を有する患者
〇処置の開始時にステロイドを必要としない再発性悪性神経膠腫を有する患者
【０４２１】
試験タイプ  介入性
試験相  １相〜２相
試験設計
割り当て：ランダム化されていない
エンドポイント分類：安全性／効力試験
介入モデル：単一群割り当て
マスキング：オープンラベル
主目的：処置
【０４２２】
条件
神経膠腫（悪性）
神経膠芽腫、多発性神経膠芽腫
脳腫瘍
【０４２３】
介入
・生物製剤：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ操作されたＴリンパ球
０日目に（フルダラビンを最後に投薬して１〜４日後）、細胞を患者ケアユニットで２０〜３０分にわたって静脈内に（ｉ．ｖ．）注入した。
・薬物：ビヒクルなし（ｎｏｎｅ  ｏｆ  ｖｅｈｉｃｌｅ）
・薬物：アルデスロイキン
およそ８時間毎（＋／−１時間）に１５分にわたるアルデスロイキン（全体重に対して）７２，０００ＩＵ／ｋｇ  ＩＶ（細胞注入の２４時間に開始して最大で５日わたって最大で１５用量継続する）。
・薬物：フルダラビン
５日間３０分にわたって毎日フルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日のＩＶＰＢ。
・薬物：シクロホスファミド
１時間にわたってＤ５Ｗ  ２５０ｍｌ中シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日×２日のＩＶ。
【０４２４】
試験群
実験：単一群−
患者は、シクロホスファミドおよびフルダラビンからなる骨髄非破壊的であるがリンパ球枯渇性の準備レジメン、その後抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ操作されたＴリンパ球の静脈内注入を受けた。
【０４２５】
介入：
・  生物製剤：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ操作されたＴリンパ球
・  薬物：なし
・  薬物：上記の通りのアルデスロイキン
・  薬物：上記の通りのフルダラビン
・  薬物：上記の通りのシクロホスファミド
【０４２６】
本発明を一般に記載してきたが、さらなる理解を、ある特定の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。これらは、例示のみの目的で提供されており、別段の指定のない限り限定的であるように意図されていない。
【実施例】
【０４２７】
（実施例１）
ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲを発現するＴＣＲアルファ不活化細胞の増殖。
Ｔ細胞受容体アルファ定常鎖領域（ＴＲＡＣ）遺伝子内で１５ｂｐのスペーサーによって分離された２つの長さ１７ｂｐの配列（ハーフ標的と呼ぶ）を標的とするヘテロ二量体ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼを設計および生成した。各ハーフ標的は、表１０に列挙したハーフＴＡＬＥ−ヌクレアーゼのリピートによって認識される。
【０４２８】
【表１０】
2017522884.tif 000012
【０４２９】
各ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼコンストラクトを、Ｔ７プロモーターの制御下で哺乳動物発現ベクター中に制限酵素消化を使用してサブクローニングした。ＴＲＡＣゲノム配列を切断するＴＡＬＥ−ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを、Ｔ７プロモーターから下流にコード配列を担持するプラスミドから合成した。
【０４３０】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズで７２時間の間に予め活性化された精製したＴ細胞に、両方のハーフＴＲＡＣ＿Ｔ０１  ＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする２つのｍＲＮＡのそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクトして４８時間後に、同じドナーに由来する異なる群のＴ細胞を、以前に記載したＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ（配列番号１５〜１８）の１つをコードするレンチウイルスベクターでそれぞれ形質導入した。形質導入後２日に、ＣＤ３ＮＥＧ細胞を、抗ＣＤ３磁気ビーズを使用して精製し、形質導入して５日後に、細胞を可溶性抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で再活性化した。
【０４３１】
細胞増殖を、１週間に２回細胞をカウントすることによって再活性化後最大で３０日にわたって追跡した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するＴＣＲアルファ不活化細胞の増殖の増大が、特に抗ＣＤ２８で再活性化したとき、形質導入されていない細胞と比較して観察された。
【０４３２】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞が活性化状態を示すか否かを調査するために、活性化マーカーＣＤ２５の発現を、形質導入して７日後にＦＡＣＳによって分析する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入された精製した細胞を、形質導入されていない細胞と比較してこれらの活性化を評価するために、これらの表面におけるＣＤ２５発現についてアッセイする。ＣＤ２５発現の増大が、ＣＤ２８再活性化条件または無再活性化条件の両方において予期される。
【０４３３】
本発明は、神経膠芽腫を処置するための上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を標的とする操作されたＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  ＴＣＲ  ＫＯ  Ｔ細胞を提供する。
【０４３４】
本発明は、多発性神経膠芽腫を処置するための上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を標的とする操作されたＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  ＴＣＲ  ＫＯ  Ｔ細胞を提供する。
【０４３５】
（実施例２）
ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ−Ｔ
神経膠芽腫を処置するための上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を標的とする操作されたＣＡＲ  Ｔ細胞の開発。
【０４３６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、最も一般的なＥＧＦＲ突然変異体であり、エクソン２〜７のインフレーム欠失からなる。この欠失は、トランケートされた細胞外リガンド結合ドメインをもたらし、タンパク質をリガンド非依存性様式で構成的に活性にする。ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現は、腫瘍形成能を増強し、細胞運動性を促進し、放射線および化学療法に対する耐性を付与することが示されている。ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現は、神経膠芽腫の２４〜６７％において報告されているが、いずれの正常組織においても報告されていないため、ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた免疫療法の魅力的な標的である（図１）。
【０４３７】
１．ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ：
１．１．コンストラクト
４種のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを設計し（図２および図３）、全体が参照により本明細書に組み込まれている文書ＵＳ２０１０／０１０５１３６およびＵＳ２０１０／０１０５１３６Ａ１で以前に記載されたように異なるｓｃｆｖを使用して調製した。特許ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２９８６１でＲｏｓｅｎｂｅｒｇによって記載された１３９抗体に由来する１３９ｓｃｆｖ、または特許ＵＳ２０１０／０１０５１３６Ａ１でＣａｒｔｅｒによって記載されたＭＲ１抗体に由来するＭＲ１  ｓｃｆｖを使用した。２つの異なるＣＡＲ構成（図２および図３）を設計し、４１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ζ活性化ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、および２つの異なるヒンジ、ＣＤ８αヒンジ（Ｖ３構成）またはＩｇＧ１ヒンジ（Ｖ５構成）を用いて調製した（配列番号２４〜配列番号２７）。
【０４３８】
本発明者らは、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇによって記載されたＣＡＲも、その活性を検証するために生成した（図３）。
コンストラクトを、設計したＣＡＲの一過性発現およびスクリーニングのためにｐＣＬＳ９６３２（図４）中に挿入した。ＣＡＲコンストラクトを、ＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用することによってこの骨格中に導入した。
【０４３９】
同じコンストラクトを、初代Ｔ細胞内のさらなる形質導入のためにＸｍａＩとＳｐｅＩ制限部位との間のｐＣＬ２６７００  ｐｓｅｗ  ＥＦ１ａ  ＢＦＰベクター（ｐＣＬ２６７００ベクター）（図５）内に挿入した。
【０４４０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、１３９−Ｖ３  ＣＡＲ（配列番号２４）および１３９−Ｖ５（配列番号２５）ＣＡＲ、ＭＲ１−Ｖ３（配列番号２６）およびＭＲ１−Ｖ５  ＣＡＲ（配列番号２７）であった。
【０４４１】
したがって、本発明は、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲをコードする配列を含むｐＣＬ２６７００  ｐｓｅｗ  ＥＦ１ａ  ＢＦＰベクター、例えば、配列番号２４をコードする配列を含むｐＣＬ２６７００  ｐｓｅｗ  ＥＦ１ａ  ＢＦＰベクター、
配列番号２５をコードする配列を含むｐＣＬ２６７００  ｐｓｅｗ  ＥＦ１ａ  ＢＦＰベクター、
配列番号２６をコードする配列を含むｐＣＬ２６７００  ｐｓｅｗ  ＥＦ１ａ  ＢＦＰベクター、
配列番号２７をコードする配列を含むｐＣＬ２６７００  ｐｓｅｗ  ＥＦ１ａ  ＢＦＰベクターなど、好ましくは、配列番号２４をコードする配列を含むｐＣＬ２６７００  ｐｓｅｗ  ＥＦ１ａ  ＢＦＰベクターを提供する。
【０４４２】
１．２．ＣＡＲ発現（図６）
ＣＡＲ  ｍＲＮＡを、抗ＣＤ３ＣＤ２８コートビーズおよびＩＬ−２によって活性化して５日後に初代ＴＣＲ  ＫＯ  ＴまたはＴ細胞内にトランスフェクトした。ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって評価した。１３９−Ｖ３  ＣＡＲおよび１３９−Ｖ５  ＣＡＲが検出された。他のＣＡＲ発現は、使用した構成（Ｖ３またはＶ５）にかかわらず、この手法を使用することによって低く（ＭＲ１）、または検出不可能であった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇによって設計されたＣＡＲ）（図６）。
【０４４３】
２．ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株の生成（図７）
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲの機能性を試験するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するＵ８７細胞株を生成した。
【０４４４】
２．１．Ｕ８７細胞内のＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの過剰発現
２．１．１．細胞株開発
ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲＶＩ）またはＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するＵ８７細胞を生成し、ＦＡＣＳおよびウエスタンブロットによって特徴付けた（図７）。図７は、ＥＧＦＲＶＩ（１７０Ｋｄａ）またはＥＧＦＲＶＩＩＩ（１５５Ｋｄａ／１４０Ｋｄａ）タンパク質を過剰発現するＵ８７神経膠腫細胞を示す。
【０４４５】
ＦＡＣＳ分析によって得た結果は、細胞の５６．６％が検出可能レベルのＥＧＲＦＶＩを発現し、細胞の５７．３％が検出可能レベルのＥＧＲＦＶＩＩＩを発現することを示した。これらのＥＧＦＲＶＩ発現細胞およびＥＧＦＲＶＩＩＩ発現細胞を最終的に選別し、単離した。
【０４４６】
２．１．２．ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的細胞としての新しい細胞株の検証
２．１．２．１．脱顆粒アッセイ
細胞株およびＣＡＲコンストラクトを検証するために、脱顆粒アッセイを、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するＴ細胞とともにこれらの新しい標的細胞に対して実施した（図３）。ＣＡＲＴ脱顆粒をフローサイトメトリーによって評価した。読み取りは、標的細胞とともに５時間インキュベートした後のＴ細胞形質膜におけるＣＤ１０７ａ発現である。意外にも、ＣＡＲ  １３９−Ｖ３、ＣＡＲ  １３９−Ｖ５、ＭＲ１−Ｖ３、およびＭＲ１−Ｖ５は、これらの発現が低かったときでも脱顆粒することができた。対照的に、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＣＡＲは、これらの実験条件において活性を示さないことを示した。
【０４４７】
図８は、標的細胞とともに共培養した後のＦＡＣＳ分析によって評価したＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲＴ脱顆粒能力を示す。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＣＡＲは、検出不可能であり、脱顆粒せず、したがってさらに試験しなかった。
【０４４８】
２．１．２．２．細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイを、４種のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するＴ細胞とともにこれらの新しい標的細胞に対して実施した。本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ、結果は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の特異的溶解を示したが（図９）、ＥＧＦＲｖＩ（Ｕ８７−ＥＧＦＲ）細胞もＵ８７  ｗｔ細胞についても特異的溶解を示さなかった。図９は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性アッセイを示す。
【０４４９】
得られたデータは、本発明のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、特にＶ３構造のものは、コロニー化した脊髄および脳内でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで神経膠腫細胞を著しく低減することができたことを示す。
【０４５０】
ＣＡＲポリペプチド配列の例：
枠に入った配列は、好適なＶＨおよびＶＬ配列に対応する。ＶＨおよびＶＬは、ＣＡＲ有効性を改善するために交換してもよい。
【０４５１】
１３９−ｖ１（配列番号１＋配列番号１５）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＶＱＶＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＳＳＧＷＳＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＩＶＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＨＳＹＰＬＴＳＧＧＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
１３９−ｖ２（配列番号１＋配列番号１６）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＶＱＶＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＳＳＧＷＳＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＩＶＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＨＳＹＰＬＴＳＧＧＧＴＫＶＥＩＫＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＭＲ１−ｖ１（配列番号１＋配列番号１７）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＫＬＳＣＶＴＳＧＦＴＦＲＫＦＧＭＳＷＶＲＱＴＳＤＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＴＧＧＹＮＴＹＹＳＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＬＹＹＣＴＲＧＹＳＳＴＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＡＳＬＳＶＡＴＧＥＫＶＴＩＲＣＭＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮＷＹＱＱＫＰＧＥＰＰＫＦＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＴＧＴＤＦＶＦＴＩＥＮＴＬＳＥＤＶＧＤＹＹＣＬＱＳＦＮＶＰＬＴＦＧＤＧＴＫＬＥＫＡＬＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＭＲ１−ｖ２（配列番号１＋配列番号１８）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＫＬＳＣＶＴＳＧＦＴＦＲＫＦＧＭＳＷＶＲＱＴＳＤＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＴＧＧＹＮＴＹＹＳＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＬＹＹＣＴＲＧＹＳＳＴＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＡＳＬＳＶＡＴＧＥＫＶＴＩＲＣＭＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮＷＹＱＱＫＰＧＥＰＰＫＦＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＴＧＴＤＦＶＦＴＩＥＮＴＬＳＥＤＶＧＤＹＹＣＬＱＳＦＮＶＰＬＴＦＧＤＧＴＫＬＥＫＡＬＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
【０４５２】
配列
配列番号２８：Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＣＡＲ
ＭＶＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＩＶＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＨＳＹＰＬＴＳＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＶＱＶＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＳＳＧＷＳＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊
配列番号２４：１３９−ｖ３
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＩＶＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＨＳＹＰＬＴＳＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＶＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＳＳＧＷＳＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊
配列番号２５：１３９−ｖ５
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＩＶＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＨＳＹＰＬＴＳＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＶＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＳＳＧＷＳＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊
配列番号２６：ＭＲ１−ｖ３
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＫＬＳＣＶＴＳＧＦＴＦＲＫＦＧＭＳＷＶＲＱＴＳＤＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＴＧＧＹＮＴＹＹＳＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＬＹＹＣＴＲＧＹＳＳＴＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＡＳＬＳＶＡＴＧＥＫＶＴＩＲＣＭＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮＷＹＱＱＫＰＧＥＰＰＫＦＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＴＧＴＤＦＶＦＴＩＥＮＴＬＳＥＤＶＧＤＹＹＣＬＱＳＦＮＶＰＬＴＦＧＤＧＴＫＬＥＫＡＬＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊
配列番号２７：ＭＲ１−ｖ５
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＱＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＫＬＳＣＶＴＳＧＦＴＦＲＫＦＧＭＳＷＶＲＱＴＳＤＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＴＧＧＹＮＴＹＹＳＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＬＹＹＣＴＲＧＹＳＳＴＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＥＬＴＱＳＰＡＳＬＳＶＡＴＧＥＫＶＴＩＲＣＭＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮＷＹＱＱＫＰＧＥＰＰＫＦＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＴＧＴＤＦＶＦＴＩＥＮＴＬＳＥＤＶＧＤＹＹＣＬＱＳＦＮＶＰＬＴＦＧＤＧＴＫＬＥＫＡＬＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊
【０４５３】
参考文献
【図１】
2017522884.tif 000014
【図２】
2017522884.tif 000015
【図３】
2017522884.tif 000016
【図４】
2017522884.tif 000017
【図５】
2017522884.tif 000018
【図６】
2017522884.tif 000019
【図７】
2017522884.tif 000020
【図８】
2017522884.tif 000021
【図９】
2017522884.tif 000022
【配列表】
2017522884000001.app
【国際調査報告】
2017522884.tif 000023
2017522884.tif 000024
2017522884.tif 000025
2017522884.tif 000026