(57)【要約】  本発明は、ヒトＭＥＴ（ｃ−ＭＥＴ）を標的とする新規の組換え抗体、ならびに少なくとも２つの該抗体の混合物を含む組成物、および癌のようなＭＥＴ介在性障害の処置のための抗体および抗体組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分および第二の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体組成物であって、ここで、
ａ）該第一の抗ＭＥＴ抗体が、それぞれ配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む重鎖(Ｈ）ＣＤＲ１〜３および軽鎖（Ｌ）ＣＤＲ１〜３を有する抗体と、ヒトＭＥＴへの結合について競合するか、またはヒトＭＥＴの同じエピトープに結合し、そして
ｂ）該第二の抗ＭＥＴ抗体が、それぞれ配列番号２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む重鎖Ｈ−ＣＤＲ１〜３および軽鎖Ｌ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体と、ヒトＭＥＴへの結合について競合するか、またはヒトＭＥＴの同じエピトープに結合する、抗体組成物。
【請求項２】
該第一の抗ＭＥＴ抗体が、
ａ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を有する抗体；
ｂ）それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体；
ｃ）配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体；
ｄ）配列番号：６または１４のアミノ酸配列を含むＶＨを有する抗体；
ｅ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）を有する抗体；
ｆ）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する抗体；
ｇ）それぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体；
ｈ）配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する抗体；および
ｉ）配列番号：８または１６のアミノ酸配列を含むＶＬを有する抗体；
ｊ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を有する抗体；
ｋ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３が、およよび配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有数r抗体；
ｌ）それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体；
ｍ）配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨ、および配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬを有する抗体；
ｎ）配列番号：６または１４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号：８または１６のアミノ酸配列を含むＶＬを有する抗体；および
ｏ）配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＣ、および配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＬＣを有する抗体
からなる群より選択される、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項３】
該第二の抗ＭＥＴ抗体が、
ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を有する抗体；
ｂ）それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体；
ｃ）配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨを有する抗体；
ｄ）配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含むＶＨを有する抗体；
ｅ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）を有する抗体；
ｆ）配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する抗体；
ｇ）それぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体；
ｈ）配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬを有する抗体；
ｉ）配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含むＶＬを有する抗体；
ｊ）配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を有する抗体；
ｋ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３、および配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する抗体；
ｌ）それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体；
ｍ）配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨ、および配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬを有する抗体；
ｎ）配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含むＶＬを有する抗体；および
ｏ）配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＣ、および配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＬＣを有する抗体
からなる群より選択される、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項４】
該第一の抗ＭＥＴ抗体のＨ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号：２３および２６のアミノ酸配列を含み、そして
該第二の抗ＭＥＴ抗体のＨ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号：２９および３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項５】
該第一の抗ＭＥＴ抗体のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含み、そして
該第二の抗ＭＥＴ抗体のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体組成物。
【請求項６】
該第一の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：６および８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして
該第二の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：１０および１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項７】
該第一の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：６および８のアミノ酸配列を含み、そして
該第二の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：１０および１２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体組成物。
【請求項８】
該第一の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：１４および１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして
該第二の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：１８および２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項９】
該第一の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：１４および１６のアミノ酸配列を含み、そして
該第二の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号：１８および２０のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
第一の抗ＭＥＴ抗体、第二の抗ＭＥＴ抗体、または両抗体が、アイソタイプＩｇＧ抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項１１】
第一の抗ＭＥＴ抗体、第二の抗ＭＥＴ抗体、または両抗体が、アイソタイプサブクラスＩｇＧ１抗体である、請求項１０に記載の抗体組成物。
【請求項１２】
第一の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分および第二の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体組成物であって、ここで、
該第一の抗ＭＥＴ抗体のＨＣおよびＬＣが、それぞれ配列番号：３４および３３のアミノ酸配列を含み、そして
該第二の抗ＭＥＴ抗体のＨＣおよびＬＣが、それぞれ配列番号：３６および３５のアミノ酸配列を含む、抗体組成物。
【請求項１３】
該組成物中の各抗体が、
ａ）マウスまたはニワトリのＭＥＴに結合しない；
ｂ）ＳＥＭＡドメイン上に存在する残基を含むヒトＭＥＴのエピトープに結合する；
ｃ）ＭＥＴの分解を誘導する；
ｄ）１×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＭＥＴに結合する；
ｅ）ＳＮＵ５、ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＫａｔｏＩＩ、ＯＥ３３およびＯｋａｊｉｍａから選択される少なくとも１つの細胞株のインビトロでの増殖を阻害する；
ｆ）ＭＥＴリン酸化を阻害する；
ｇ）ＭＥＴ下流シグナル伝達を阻害する；
ｈ）ＨＧＦの存在下または不存在下での初代内皮細胞増殖を阻害する；および
ｉ）インビボでの腫瘍増殖を阻害する
からなる群より選択される少なくとも１つの特性を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項１４】
該組成物が、
ａ）ＭＥＴの分解を誘導する；
ｂ）ＳＮＵ５、ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＫａｔｏＩＩ、ＯＥ３３およびＯｋａｊｉｍａから選択される少なくとも１つの細胞株のインビトロでの増殖を阻害する；
ｃ）ＭＥＴリン酸化を阻害する；
ｄ）ＭＥＴ下流シグナル伝達を阻害する；
ｅ）ＨＧＦの存在下または不存在下での初代内皮細胞増殖を阻害する；および
ｆ）インビボでの腫瘍増殖を阻害する
からなる群より選択される少なくとも１つの特性を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
ａ）それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体；および
ｂ）それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体
からなる群より選択される抗体と、ヒトＭＥＴへの結合について競合するか、またはヒトＭＥＴの同じエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
該抗体が、
ａ）そのＨ−ＣＤＲ３が、配列番号：２３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）そのＬ−ＣＤＲ３が、配列番号：２６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｃ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＶＨが、配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する抗体；
ｆ）そのＶＬが、配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する抗体；
ｇ）そのＶＨが、配列番号：６または１４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）そのＶＬが、配列番号：８または１６のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨＣが、配列番号：３４のアミノ酸配列を含む抗体；および
ｊ）そのＬＣが、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群より選択される、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
該抗体が、
ａ）そのＨ−ＣＤＲ３が、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むか；
ｂ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むか；
ｃ）そのＶＨが、配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するか；
ｄ）そのＶＨが、配列番号：６または１４のアミノ酸配列を含むか；または、
ｅ）そのＨＣが、配列番号：３４のアミノ酸配列を含む
重鎖、ならびに
ａ）そのＬ−ＣＤＲ３が、配列番号：２６のアミノ酸配列を含むか；
ｂ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むか；
ｃ）そのＶＬが、配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するか；
ｄ）そのＶＬが、配列番号：８または１６のアミノ酸配列を含むか；または
ｅ）そのＬＣが、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む
軽鎖を含む、請求項１７に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項１９】
該抗体のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２０】
該抗体が、配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびに配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する、請求項１８に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２１】
該抗体が、配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびに配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する、請求項１８に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２２】
該抗体が、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびに配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する、請求項１８に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２３】
該抗体が、
ａ）そのＨ−ＣＤＲ３が、配列番号：２９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｂ）そのＬ−ＣＤＲ３が、配列番号：３２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｃ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含む抗体；
ｄ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｅ）そのＶＨが、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する抗体；
ｆ）そのＶＬが、配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する抗体；
ｇ）そのＶＨが、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）そのＶＬが、配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨＣが、配列番号：３６のアミノ酸配列を含む抗体；および
ｊ）そのＬＣが、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む抗体
からなる群より選択される、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
該抗体が、
ａ）そのＨ−ＣＤＲ３が、配列番号：２９のアミノ酸配列を含むか；
ｂ）そのＨ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含むか；
ｃ）そのＶＨが、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するか；
ｄ）そのＶＨが、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含むか；または、
ｅ）そのＨＣが、配列番号：３６のアミノ酸配列を含む
重鎖、ならびに
ａ）そのＬ−ＣＤＲ３が、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むか；
ｂ）そのＬ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むか；
ｃ）そのＶＬが、配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するか；
ｄ）そのＶＬが、配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含むか；または
ｅ）そのＬＣが、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む
軽鎖を含む、請求項１９に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２５】
該抗体のＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２６】
該抗体が、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびに配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する、請求項２４に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２７】
該抗体が、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する、請求項２６に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２８】
該抗体が、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する、請求項２６に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項２９】
該抗体の重鎖（ＨＣ）が、配列番号：３４のアミノ酸配列を含み、そして該抗体の軽鎖（ＬＣ）が、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３０】
該抗体の重鎖（ＨＣ）が、配列番号：３６のアミノ酸配列を含み、そして該抗体の軽鎖（ＬＣ）が、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３１】
抗体がアイソタイプＩｇＧ抗体である、請求項６から２８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項３２】
抗体がアイソタイプサブクラスＩｇＧ１抗体である、請求項３１に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項３３】
該抗体が、
ａ）マウスまたはニワトリのＭＥＴに結合しない；
ｂ）ＳＥＭＡドメイン上に存在する残基を含むヒトＭＥＴのエピトープに結合する；
ｃ）ＭＥＴの分解を誘導する；
ｄ）１×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＭＥＴに結合する；
ｅ）ＳＮＵ５、ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＫａｔｏＩＩ、ＯＥ３３およびＯｋａｊｉｍａから選択される少なくとも１つの細胞株のインビトロでの増殖を阻害する；
ｆ）ＭＥＴリン酸化を阻害する；
ｇ）ＭＥＴ下流シグナル伝達を阻害する；
ｈ）ＨＧＦの存在下または不存在下での初代内皮細胞増殖を阻害する；および
ｉ）インビボでの腫瘍増殖を阻害する
からなる群より選択される少なくとも１つの特性を有する、請求項１６から３２のいずれか一項に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分。
【請求項３４】
請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗ＭＥＴ抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む、単離された核酸分子。
【請求項３６】
配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載の単離された核酸分子。
【請求項３７】
発現制御配列をさらに含む、請求項３５または３６に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項３８】
請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗ＭＥＴ抗体の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
【請求項３９】
請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗ＭＥＴ抗体の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列を発現する、非ヒトトランスジェニック動物または植物。
【請求項４０】
請求項３８に記載の宿主細胞を提供し、該宿主細胞を抗体またはその部分の発現に適する条件下で培養し、そして得られた抗体またはその部分を単離することを含む、請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分の製造法。
【請求項４１】
第一の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分を発現可能な第一の宿主細胞および第二の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分を発現可能な第二の宿主細胞を提供し、該第一および第二の宿主細胞を抗体またはその部分の発現に適する条件下で培養し、そして得られた抗体または部分を単離することを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体組成物の製造法。
【請求項４２】
第一および第二の宿主細胞を単一のバイオリアクター中で培養する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリクローナル細胞株が、該第一の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を発現可能な第一の宿主細胞および該第二の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を発現可能な第二の宿主細胞を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体組成物を発現可能なポリクローナル細胞株。
【請求項４４】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体組成物の第一および第二の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分の結合特異性を有する、二重特異性結合分子。
【請求項４５】
該二重特異性結合分子が、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体の抗原結合部分；および、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１〜３およびＬ−ＣＤＲ１〜３を有する抗体の抗原結合部分を含む、請求項４４に記載の二重特異性結合分子。
【請求項４６】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体組成物または請求項１５に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、ＭＥＴ介在性障害を有する患者の処置法。
【請求項４７】
請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分、請求項３４に記載の医薬組成物、または請求項４４もしくは４５に記載の二重特異性結合分子を患者に投与することを含む、ＭＥＴ介在性障害を有する患者の処置法。
【請求項４８】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体組成物または請求項１５に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、該患者における癌の処置法。
【請求項４９】
請求項１６から３３のいずれか一項に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分、請求項３４に記載の医薬組成物、または請求項４４もしくは４５に記載の二重特異性結合分子を患者に投与することを含む、該患者における癌の処置法。
【請求項５０】
癌がＭＥＴ活性化に依存する、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
癌が、非小細胞肺癌、胃癌、肝細胞癌、食道癌、結腸直腸癌、乳頭状腎細胞癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、前立腺癌、または副腎皮質癌である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５２】
さらに化学療法剤、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、またはＭＥＴ経路阻害剤を投与することを含む、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
患者がヒトである、請求項４６から５２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／０５１，１９０に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体は、引用により本明細書中に包含される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その内容全体が引用により本明細書中に包含される配列表を含む。２０１５年９月１５日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名称は、110285-0051-WO1_SL.txtであり、そのサイズは７８，４９０バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、抗ＭＥＴ抗体および抗体組成物ならびにＭＥＴと関連する疾患および病状の処置におけるそれらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ＭＥＴ（ｃ−ＭＥＴとしても知られる）は、５０ｋＤａのα−サブユニットおよび１４５ｋＤａのβ−サブユニットを含む受容体チロシンキナーゼである。ＭＥＴに対する既知のリガンドは、細胞分散因子としても公知の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のみである。ＭＥＴへのＨＧＦの結合は、受容体二量体化ならびにβ−サブユニット残基Ｙ１３４９およびＹ１３５６の自己リン酸化をもたらし、ホスホイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−タンパク質キナーゼＢ（Ａｋｔ）経路、シグナル伝達兼転写活性化因子因子（ＳＴＡＴ）経路、マイトージェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、および活性化Ｂ細胞の核因子カッパ−軽鎖エンハンサー（ＮＦκＢ）経路を含む、下流シグナル伝達経路を活性化させる。これは、最終的に、有糸分裂促進、細胞増殖、細胞生存、および細胞運動性の増加をもたらす。ＨＧＦの過剰発現、遺伝子増幅、突然変異、または選択的スプライシング、あるいはＨＧＦリガンド誘導性オートクリン／パラクリンループシグナル伝達を介して、ＭＥＴまたはＨＧＦ活性の調節不全が起こり得る。このような調節不全は、癌浸潤性、血管形成、転移および腫瘍増殖を促進することによって多くの癌において役割を果たし、より悪性の癌表現型および予後不良をもたらす。
【０００５】
ＭＥＴはまた、ＥＧＦＲ、ＴＧＦ−βおよびＨＥＲ３のような他の受容体が関与するシグナル伝達経路と相互作用することが知られており、それらの受容体を標的とする処置に対する耐性に役割を果たし得る。従って、抗ＭＥＴ抗体のようなＭＥＴ阻害剤は、耐性表現型を克服する上で他の受容体阻害剤と組み合わせて有効であり得る。
【０００６】
現在のＭＥＴ阻害剤には、ＭＥＴまたはそのリガンド、ＨＧＦ、および小分子キナーゼ阻害剤のいずれかを標的とすることができる両方のモノクローナル抗体が含まれる。ＭＥＴ経路を標的とする公知の抗体には、ヒト化抗ＭＥＴ抗体オンツズマブ（ＯＡ−５Ｄ５、ＯＡＭ４５５８ｇ、ＭｅｔＭＡｂ）；ヒト化抗ＨＧＦ抗体フィクロツズマブ（ＡＶ−２９９）；ヒト抗ＨＧＦ抗体リルテツマブ（ＡＭＧ１０２）；ヒト化抗ＨＧＦ抗体ＴＡＫ７０１；ヒト化ＩｇＧ４抗ｃ−ＭＥＴ抗体ＬＹ２８７５３５８／ＬＡ４８０；ヒト化抗ｃ−ＭＥＴ抗体ＡＢＴ−７００（Ｈ２２４Ｇ１１）；および、ＡＲＧＸ−１１１抗ｃ−ＭＥＴ抗体（３６Ｃ４）が含まれる。公知の抗ＭＥＴ低分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤には、チバンチニブ、カボザンチニブ、フォルチニブ、ゴルバチニブおよびクリゾチニブが含まれる。しかしながら、抗ＭＥＴ抗体は治療的使用のために承認されていない。
【０００７】
癌の進行におけるＭＥＴの重要な役割を考慮して、ＭＥＴを標的とする新規かつ改良された治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、新規のＭＥＴを標的とする組換え抗体、ならびに２以上のこれらの抗体を含む組成物、および非小細胞肺癌、胃癌、肝細胞癌、食道癌、結腸直腸癌、乳頭状腎細胞癌、腎芽細胞腫、副腎皮質癌、腎細胞癌、前立腺癌、およびＭＥＴを発現もしくは過剰発現するか、またはＭＥＴ経路活性化に依存する他の癌種を含む癌を治療するための抗体および組成物の使用を対象とする。抗体治療を含む、このような癌に対する現在利用可能な治療と比較して、本発明の抗体は、単独で、または２以上のかかる抗体を含む組成物のいずれかで優れた臨床応答を提供すると考えられる。
【０００９】
一態様において、本発明は、第一の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分および第二の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体組成物を提供する。
【００１０】
ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合し、そして第二の抗ＭＥＴ抗体は、ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合する。
【００１１】
ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合し、そして第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する。ある態様において、第一のＭＥＴ抗体は、ＳＥＭＡ−α ブレード（ｂｌａｄｅ） ３に結合することができ、第二のＭＥＴ抗体は、ＳＥＭＡ−α ブレード２に結合することができる。これらの抗体の組み合わせは、両方のエピトープを標的とし、ＭＥＴシグナル伝達経路の驚くべき相乗的阻害効果を生じる。本発明者らは、これらのエピトープの組み合わせた標的化が、ＭＥＴシグナル伝達経路に対して驚くほど高い阻害活性を生じることを見出した。
【００１２】
ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：６または１４のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）を含む。
【００１３】
ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：８または１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を含む。
【００１４】
ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨおよびそれぞれ配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬを含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：６または１４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：８または１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＣおよびそれぞれ配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＬＣを含む。
【００１５】
ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨを含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＣを含む。
【００１６】
ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬを含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＬＣを含む。
【００１７】
ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨおよび配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬを含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある態様において、第二の抗ＭＥＴ抗体は、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＬＣを含む。
【００１８】
本発明はまた、本明細書に記載の第一および第二の抗ＭＥＴ抗体の任意の組み合わせを含む抗体組成物を提供する。
【００１９】
例えば、ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２３および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３を有し、そして第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２９および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３を有する。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有し、そして第二の抗ＭＥＴ抗体は、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する。
【００２０】
ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：６および８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、第二の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：１０および１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：１４および１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、第二の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：１８および２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：６および８のアミノ酸配列を含み、第二の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：１０および１２のアミノ酸配列を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：１４および１６のアミノ酸配列を含み、第二の抗ＭＥＴ抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号：１８および２０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体のＨＣおよびＬＣは、それぞれ配列番号：３４および３３のアミノ酸配列を含み、第二の抗ＭＥＴ抗体のＨＣおよびＬＣは、それぞれ配列番号：３６および３５のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体組成物のある態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体、第二の抗ＭＥＴ抗体または両方は、アイソタイプＩｇＧの抗体である。任意の態様において、第一の抗ＭＥＴ抗体、第二の抗ＭＥＴ抗体または両方は、アイソタイプサブクラスＩｇＧ１の抗体である。
【００２２】
ある態様において、本明細書に記載の組成物において少なくとも１つ、少なくとも２つ、または全ての抗ＭＥＴ抗体は、以下からなる群より選択される、少なくとも１つの特性、または特性の任意の組み合わせを有する：
・マウスまたはニワトリのＭＥＴに結合しない；
・ＳＥＭＡドメイン上に存在する残基を含むヒトＭＥＴのエピトープに結合する；
・ＭＥＴの分解を誘発する；
・１×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＭＥＴに結合する；
・ＳＮＵ５、ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＫａｔｏＩＩ、ＯＥ３３およびＯｋａｊｉｍａから選択される少なくとも１つの細胞株のインビトロでの増殖を阻害する；
・ＭＥＴリン酸化を阻害する；
・ＭＥＴ下流シグナル伝達を阻害する；
・ＨＧＦの存在下または不存在下での初代内皮細胞増殖を阻害する；および、
・インビボでの腫瘍増殖を阻害する。
【００２３】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体組成物のいずれかは、以下からなる群より選択される、少なくとも１つの特性、または特性の任意の組み合わせを有する：
・ＭＥＴの分解を誘発する；
・ＳＮＵ５、ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＫａｔｏＩＩ、ＯＥ３３およびＯｋａｊｉｍａから選択される少なくとも１つの細胞株のインビトロでの増殖を阻害する；
・ＭＥＴリン酸化を阻害する；
・ＭＥＴ下流シグナル伝達を阻害する；
・ＨＧＦの存在下または不存在下での初代内皮細胞増殖を阻害する；および、
・インビボでの腫瘍増殖を阻害する。
【００２４】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体組成物の何れかおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明はまた、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を提供する。ある態様において、該抗体またはその部分は、ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合する。ある態様において、該抗体またはその部分は、ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合する。
【００２６】
ある態様において、抗体またはその部分は、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する。ある態様において、抗体またはその部分は、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する。
【００２７】
ある態様において、抗体は、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および／または配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３；それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３ならびに／またはそれぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３；配列番号：６もしくは１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨおよび／または配列番号：８もしくは１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬ；または、配列番号：６もしくは１４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび／または配列番号：８もしくは１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。任意の態様において、抗体は、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。任意の態様において、抗体は、配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。任意の態様において、抗体は、配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＬＣを含む。
【００２８】
ある態様において、抗体は、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３；それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３；配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨ；配列番号：６または１４のアミノ酸配列を含むＶＨ；または、配列番号：３４のアミノ酸配列を含むＨＣ、を含む重鎖を含み、配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３；それぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３；配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬ；配列番号：８または１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；または、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むＬＣ、を含む軽鎖をさらに含む。
【００２９】
ある態様において、抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および／または配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３；それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３ならびに／またはそれぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３；配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨ、および／または、配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬ；または、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含むＶＨおよび／または配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。任意の態様において、抗体は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。任意の態様において、抗体は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。任意の態様において、抗体は、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＬＣを含む。
【００３０】
ある態様において、は、抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３；それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３；配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＨ；配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含むＶＨ；または、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＨＣ、を含む重鎖を含み；そして、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３；それぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３；配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶＬ；配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含むＶＬ；または、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＬＣ、を含む軽鎖をさらに含む。
【００３１】
ある態様において、抗体は、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する。
【００３２】
ある態様において、抗体は、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する。
【００３３】
ある態様において、抗体は、配列番号：６または１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号：８または１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【００３４】
ある態様において、抗体は、配列番号：１０または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号：１２または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【００３５】
ある態様において、抗体は、配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【００３６】
ある態様において、抗体は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【００３７】
ある態様において、抗体は、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【００３８】
ある態様において、抗体は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【００３９】
ある態様において、抗体は、配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。
【００４０】
ある態様において、抗体は、配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。
【００４１】
本発明はまた、本明細書に記載のキメラ抗体および抗原結合部分、特に、それぞれ配列番号：６および８または配列番号：１０および１２に関連する重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する抗体および抗原結合部分、のヒト化バージョンを提供する。
【００４２】
本明細書に記載の抗体および抗原結合部分のある態様において、抗体は、アイソタイプＩｇＧのものであり得る。任意の態様において、抗体は、アイソタイプサブクラスＩｇＧ１のものである。
【００４３】
ある態様において、抗体は、以下からなる群より選択される、少なくとも１つの特性、または特性の任意の組み合わせを有する：
・マウスまたはニワトリのＭＥＴに結合しない；
・ＳＥＭＡドメイン上に存在する残基を含むヒトＭＥＴのエピトープに結合する；
・ＭＥＴの分解を誘発する；
・１×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＭＥＴに結合する；
・ＳＮＵ５、ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＫａｔｏＩＩ、ＯＥ３３およびＯｋａｊｉｍａから選択される少なくとも１つの細胞株のインビトロでの増殖を阻害する；
・ＭＥＴリン酸化を阻害する；
・ＭＥＴ下流シグナル伝達を阻害する；
・ＨＧＦの存在下または不存在下での初代内皮細胞増殖を阻害する；および、
・インビボでの腫瘍増殖を阻害する。
【００４４】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分の何れかおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４５】
本発明は、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む、単離された核酸分子を提供する。ある態様において、単離された核酸分子は、配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
本発明はまた、単離された核酸分子を含むベクターを提供し、ここで、該ベクターは、発現制御配列をさらに含む。
【００４７】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む、宿主細胞を提供する。ある態様において、宿主細胞は、配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む、非ヒトトランスジェニック動物または植物を提供し、ここで、該動物または植物は、そのヌクレオチド配列（複数可）を発現する。ある態様において、動物または植物は、配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
本発明はまた、上記の宿主細胞を提供し、該宿主細胞を該抗体またはその部分の発現に適した条件下で培養し、そして得られた抗体またはその部分を単離することを含む、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の製造法を提供する。
【００５０】
本発明はまた、本明細書に記載の第一の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分を発現することができる第一の宿主細胞ならびに本明細書に記載の第二の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分を発現することができる第二の宿主細胞を提供し、該第一および第二の宿主細胞を該抗体またはその部分の発現に適した条件下で培養し、そして得られた抗体またはその部分を単離することを含む、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体組成物の製造法を提供する。任意の態様において、第一および第二の宿主細胞を、単一のバイオリアクターで培養する。他の態様において、第一および第二の宿主細胞を、別個のバイオリアクターで培養する。
【００５１】
本発明はまた、抗ＭＥＴ抗体組成物を発現することができるポリクローナル細胞株を提供し、ここで、該ポリクローナル細胞株には、本明細書に記載の第一の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を発現することができる第一の宿主細胞および本明細書に記載の第二の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を発現することができる第二の宿主細胞が含まれる。
【００５２】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体組成物の第一および第二の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の結合特異性を有する二重特異性結合分子を提供する。任意の態様において、二重特異性結合分子は、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体の抗原結合部分；ならびに、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体の抗原結合部分、を含む。
【００５３】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体組成物または該抗ＭＥＴ抗体組成物を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、ＭＥＴ介在性障害を有する該患者を治療するための方法を提供する。
【００５４】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分または該抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、ＭＥＴ介在性障害を有する該患者を治療するための方法を提供する。
【００５５】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体組成物または該抗ＭＥＴ抗体組成物を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、癌を有する該患者を治療するための方法を提供する。ある態様において、癌は、ＭＥＴ活性化に依存する。任意の態様において、癌は、非小細胞肺癌、胃癌、肝細胞癌、食道癌、結腸直腸癌、乳頭状腎細胞癌、膠芽細胞腫、腎細胞癌、前立腺癌または副腎皮質癌である。
【００５６】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分または該抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、癌を有する該患者を治療するための方法を提供する。さらに、本発明は、癌を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分または該抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分を含む医薬組成物の使用を提供する。さらにまた、本発明は、癌を治療する際に使用するための、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分または該抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分を含む医薬組成物を提供する。ある態様において、癌はＭＥＴ活性化に依存する。任意の態様において、癌は、非小細胞肺癌、胃癌、肝細胞癌、食道癌、結腸直腸癌、乳頭状腎細胞癌、膠芽細胞腫、腎細胞癌、前立腺癌または副腎皮質癌である。任意の態様において、治療はまた、化学療法剤、抗新生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、または別のＭＥＴ経路阻害剤の投与を含む。
【００５７】
本明細書に記載の治療法のある態様において、患者は哺乳動物である。任意の態様において、患者は霊長動物である。特定の態様において、患者はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、互いに試験した１３種のＭＥＴ抗体についての競合マトリックスを示す。少なくとも５０％の阻害を、エピトープビン（epitope bin）(グレーの四角形）を区別するために用いた。点線の四角形：一方向的（Unidirectional）な競合。黒で囲った四角形：同一の抗体との競合。
【００５９】
【図２】図２は、ＨＥＫ２９３細胞上に発現された、異なるヒト、マウス、ニワトリおよびキメラＭＥＴ構築物に対するＭＥＴ抗体の結合のまとめを示す。アミノ酸配列番号（ＡＡ）は、ニワトリまたはマウスのいずれかに置換されたヒトのＭＥＴ配列を意味する。異なる構築物の概略図が示されている。個々のドメインまたはサブドメインが示されている。ＳＰ：シグナルペプチド。ＳＶ５−ＧＰＩ：ＳＶ５ペプチド配列、次いでグリシン−セリンリンカーおよびＧＰＩアンカー。変異の位置の図はおおよそであることが特記される。白色の四角形：ヒトＭＥＴ配列。灰色の四角形：ニワトリ配列。斜線の四角形：マウス配列。トランスフェクト細胞への正の結合を+として示す。（+）弱く結合。- 結合しない。
【００６０】
【図３】図３は、２４時間または４８時間の間、陰性対照抗体９００６、９３３８または９００６＋９３３８で処理した細胞株における、ＭＥＴ受容体レベルのウェスタンブロット分析の結果を示す。
【００６１】
【図４】図４は、２４時間の間、陰性対照抗体９００６＋９３３８、またはＣ８−Ｈ２４１抗体のいずれかで処理した細胞株における、ＭＥＴレベルのシンプルウエスタン分析の結果を示す。
【００６２】
【図５】図５Ａ−５Ｂは、キメラ抗体９００６もしくは９３３８または抗体混合物９００６＋９３３８で処理された細胞株における、ＭＥＴのリン酸化レベルのシンプルウエスタン分析を示す。
【００６３】
【図６】図６Ａ−６Ｂは、キメラ抗体９００６もしくは９３３８または抗体混合物９００６＋９３３８で処理された細胞株における、ＥＲＫ２およびＡＫＴリン酸化レベルのシンプルウエスタン分析を示す。
【００６４】
【図７】図７Ａは、キメラ抗体９００６もしくは９３３８、抗体混合物９００６＋９３３８、または対照抗体で処理した後の、ＨＵＶＥＣの数を示す。合計２５μｇ／ｍｌの抗体を用いる（両者の単独で、および抗体混合物において）。図７Ｂは、４０４時間のインキュベーションの最終時点でのアッセイ結果を示す。データは、未処理細胞（１００％）に対して正規化されている。
【００６５】
【図８】図８Ａは、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦの存在下で、キメラ抗体９００６もしくは９３３８、抗体混合物９００６＋９３３８、または対照抗体で処理した後の、ＨＵＶＥＣの数を示す。合計２５μｇ／ｍｌの抗体を用いる（両者の単独で、および抗体混合物において）。図８Ｂは、４０４時間のインキュベーション／ＨＧＦ刺激の最終時点でのアッセイ結果を示す。データは、未処理細胞（１００％）に対して正規化されている。
【００６６】
【図９】図９Ａ−９Ｂは、種々の量のキメラ抗体９３３８および９００６（それぞれ、ＡおよびＢ）で処理した後の、ＨＵＶＥＣの数の滴定曲線を示す。
【００６７】
【図１０】図１０は、種々の量の抗体混合物９００６＋９３３８で処理した後の、ＨＵＶＥＣの数の滴定曲線を示す。
【００６８】
【図１１】図１１は、図９および１０からの最終時点での結果を示す。データは、未処理細胞に対して正規化されている。
【００６９】
【図１２】図１２Ａ−１２Ｃは、細胞株ＨＣＣ８２７Ｒ１＿ｃｅｔ＃３（１２Ａ）、ＨＣＣ８２７Ｒ１＿ｃｅｔ＃１（１２Ｂ）およびＭＫＮ４５（１２Ｃ）に対する、キメラ（左パネル）またはヒト化（右パネル）９００６、９３３８、または９００６＋９３３８の抗増殖効果を示す代謝活性アッセイの結果を示す。
【００７０】
【図１３】図１３Ａ−１３Ｃは、細胞株ＥＢＣ−１（１３Ａ）、ＫａｔｏＩＩ（１３Ｂ）およびＯｋａｊｉｍａ（１３Ｃ）に対する、キメラ（左パネル）またはヒト化（右パネル）９００６、９３３８、または９００６＋９３３８の抗増殖効果を示す代謝活性アッセイの結果を示す。
【００７１】
【図１４】図１４は、細胞株ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＳＮＵ５およびＫａｔｏＩＩに対する、Ｈｕ９３３８＋Ｈｕ９００６、１３−ＭＥＴ、２８−ＭＥＴおよび１３−ＭＥＴ＋２８−ＭＥＴ抗体の滴定による生存率を示す。
【００７２】
【図１５】図１５は、マウスにおけるヒト非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片の腫瘍増殖に対するキメラ９００６、９３３８、９００６＋９３３８、またはビークル処理の効果を示す。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００７３】
【図１６】図１６は、マウスにおけるヒト非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片の腫瘍増殖に対するビークル処理と比較して、４つの異なる濃度でのキメラ９００６＋９３３８での処置の効果を示す。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００７４】
【図１７】図１７は、マウスにおけるヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−４５の異種移植片の腫瘍増殖に対するキメラ９００６、９３３８、９００６＋９３３８、またはビークル処理の効果を示す。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００７５】
【図１８】図１８は、マウスにおけるヒト胃癌細胞株ＳＮＵ５の異種移植片の腫瘍増殖に対するキメラ９００６、９３３８、９００６＋９３３８、またはビークル処理の効果を示す。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００７６】
【図１９】図１９は、マウスにおけるヒトＨＣＣ患者由来の異種移植片モデルＬＩ１０３７の異種移植片の腫瘍増殖に対するキメラ抗体混合物９００６＋９３３８またはビークル処理の効果を示す。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００７７】
【図２０】図２０は、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片の腫瘍増殖に対する９００６＋９３３８、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８、またはビークル処理の効果を示す。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００７８】
【図２１】図２１は、ヒトの食道胃癌細胞株ＯＥ３３の異種移植片の腫瘍増殖に対する、キメラ９００６＋９３３８、ヒト化９００６＋９３３８（Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８）、またはビークル処理の効果を示す。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００７９】
【図２２】図２２は、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片の腫瘍増殖に対するＣ８−Ｈ２４１、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８またはビークル処理の効果を示す（１群あたりｎ＝１０匹のマウス）。灰色の領域は、処理期間を示す。点線は、Ｃ８−Ｈ２４１処理群の残りのマウス（ｎ＝４）のＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８での再処理の開始を示す。
【００８０】
【図２３】図２３は、ヒト胃癌細胞株Ｈｓ７４６Ｔの異種移植片の腫瘍増殖に対するＣ８−Ｈ２４１、Ｈｕ９００６、Ｈｕ９３３８、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８、またはビークル処理の効果を示す（１群あたりｎ＝８匹のマウス）。灰色の領域は、最初の処理期間を示す。点線は、Ｃ８−Ｈ２４１、Ｈｕ９００６およびＨｕ９３３８群の残りのマウスの、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８での単回投与再処理を示す。
【００８１】
【図２４】図２４は、４種の患者由来の異種移植片モデルにおける腫瘍増殖に対するＣ８−Ｈ２４１、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８またはビークル処理の効果を示す（ＬＵ０８５８、Ｌ１９０１およびＬＵ２５０３について、１群当たりｎ＝５匹のマウス；ＬＸＦＡ０５２６について、１群当たりｎ＝８匹のマウス）。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００８２】
【図２５】図２５は、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片の腫瘍増殖に対する等しい比もしくはスキュー比（skewed ratio）のＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８またはビークル処理の効果を示す（１群当たりｎ＝８匹のマウス）。灰色の領域は、処理期間を示す。
【００８３】
【図２６】図２６は、キメラ９００６抗体の、重鎖および軽鎖可変ドメインヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号：５−８）。ＣＤＲ（配列番号：２１−２６）を矢印で示している。
【００８４】
【図２７】図２７は、キメラ９３３８抗体の、重鎖および軽鎖可変ドメインヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号：９−１２）。ＣＤＲ（配列番号：２７−３２）を矢印で示している。
【００８５】
【図２８】図２８は、ヒト化９００６抗体の、重鎖および軽鎖可変ドメインヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号：１３−１６）。ＣＤＲ（配列番号：２１−２６）を矢印で示している。
【００８６】
【図２９】図２９は、ヒト化９３３８抗体の、重鎖および軽鎖可変ドメインヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号：１７−２０）。ＣＤＲ（配列番号：２７−３２）を矢印で示している。
【００８７】
【図３０】図３０は、ヒト化抗体９００６の完全長軽鎖および重鎖アミノ酸配列（それぞれ配列番号：３３および３４）ならびにヒト化抗体９３３８の完全長軽鎖および重鎖アミノ酸配列（それぞれ配列番号：３５および３６）を示す。ＣＤＲを矢印で示している。
【００８８】
【図３１】図３１は、ＭＥＴの構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
発明の詳細な説明
定義および一般的技術
本明細書において他に定義しない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験においても使用することができるが、例示的な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で言及するすべての刊行物および他の文献は、その全体を引用により本明細書中に包含させる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。多数の文献が、本明細書に引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという承認を構成するものではない。
【００９０】
また、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むもの。一般的に、本明細書に記載されている、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品および医薬品化学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、およびそれらの技術は、よく知られており、当技術分野で一般に使用されている。当該技術分野において一般的に達成されるよう、または本明細書に記載されるように、酵素反応および精製操作は、製造業者の仕様書に従って行われる。
【００９１】
本明細書および態様の全体を通して、用語「有する(have)」および「含む(comprise)」、または変形「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(comprises)」または「含む(comprising)」は、記載された整数または整数の群の包含を意味すると理解されるが、他の整数または整数の群を除外するものではない。
【００９２】
抗体関連の定義
特記しない限り、本明細書で用いる、「ＭＥＴ」は、ヒトＭＥＴ（ヒトｃ−ＭＥＴとしても知られる）を意味する。ヒトＭＥＴポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００２４５．２により入手可能であり、配列番号：１として示されている。ヒトＭＥＴは、１９個のアミノ酸がＩＰＴドメイン３（７５５−７５５：Ｓ→ＳＴＷＷＫＥＰＬＮＩＶＳＦＬＦＣＦＡＳ（配列番号：２））に挿入されている異なるアイソフォーム（アイソフォーム２；配列番号：２）にも存在する。
【００９３】
本明細書で用いる用語“抗体”（Ａｂ）または“免疫グロブリン”（Ｉｇ）は、ジスルフィド結合によって互い結合されている、２つの重鎖（Ｈ）（約５０−７０ｋＤａ）および２つの軽鎖（Ｌ）（約２５ｋＤａ）を含む四量体のことを意味する。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬドメインは、“フレームワーク領域”（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域に存在する（interspersed）“相補性決定領域”（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲ（重鎖のＣＤＲを本明細書中Ｈ−ＣＤＲと記載する；軽鎖のＣＤＲを本明細書中Ｌ−ＣＤＲと記載する）および４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシル末端に以下の順で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各領域へのアミノ酸の割り当ては、ＩＭＧＴ(登録商標)の定義（Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003）；または、Ｋａｂａｔの定義、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 および 1991)）； Chothia ＆ Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); または Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989）にしたがって行われ得る。
【００９４】
用語“組換え抗体”とは、抗体をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む細胞または細胞株から発現される抗体を意味し、ここで、該ヌクレオチド配列（複数可）は、天然にはその細胞に関連していないものである。
【００９５】
用語“抗体組成物”は、２つ以上の抗体またはその抗原結合部分の組み合わせを意味する。抗体組成物は、モノクローナル（すなわち、同一の抗体またはその抗原結合部分の分子からなる）またはポリクローナル（すなわち、同じ抗原上の、または別個の異なる抗原上の、同じかまたは異なるエピトープと反応する２以上の抗体または抗原結合部分からなる）であり得る。
【００９６】
用語“単離されたタンパク質”、“単離されたポリペプチド”または“単離された抗体”は、その起源のまたは派生源の性質によって、（１）その天然の状態でそれに付随する天然で関連する構成要素に関連付けられていない、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、または（４）天然には存在しない、タンパク質、ポリペプチドまたは抗体を意味する。従って、化学的に合成されたか、またはそれが自然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然で関連する構成成分から“単離”されている。タンパク質はまた、当該分野で周知のタンパク質精製技術を用いる単離によって、天然に関連する構成成分を実質的に含まなくなり得る。
【００９７】
本明細書で用いる用語“生殖系列”は、それらが生殖細胞を経由して親から子孫に渡されるような、抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を意味する。生殖系列配列は、Ｂ細胞成熟の過程において組換えおよび超変異(hyper-mutation events)によって改変されている成熟Ｂ細胞における抗体をコードするヌクレオチド配列と区別される。特定の生殖系列配列を利用する抗体は、生殖系列ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と整列するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有し、それは他の何れかの生殖系列ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列とより近接することが特定される。
【００９８】
用語“親和性”は、抗原と抗体との間の引力の尺度を意味する。抗原に対する抗体の内因性の誘引性は、典型的には、特定の抗体−抗原相互作用の結合親和性平衡定数（ＫＤ）として表される。抗体は、ＫＤが≦１ｍＭ、好ましくは≦１００ｎＭのとき、抗原に特異的に結合すると言われる。ＫＤ結合親和性定数は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ(商標)）または例えばＯｃｔｅｔ(商標)システムを用いるバイオレイヤー干渉法により、測定することができる。
【００９９】
用語“ｋｏｆｆ”は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を意味する。ｋｏｆｆ解離速度定数は、例えばＯｃｔｅｔ(商標)システムを用いてバイオレイヤー干渉法により、または表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ(商標)）により、測定することができる。
【０１００】
本明細書で用いる用語“エピトープ”は、抗体または二重特異性結合分子などの関連分子に特異的に結合する抗原の部分（決定因子）を意味する。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般に、特定の三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。エピトープは“直線状”または“立体的”であってよい。直線状エピトープでは、タンパク質（例えば、抗原）と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用の点の全てが、主にタンパク質のアミノ酸配列に沿って直線的に生じ得る。立体的エピトープでは、相互作用点は、アミノ酸の一次配列において互いに分離されたタンパク質上のアミノ酸残基に沿って生じる。抗原上の所望のエピトープが決定されると、当技術分野で周知の技術を用いて、そのエピトープに対する抗体を作製することが可能となる。さらに、抗体の作製および特徴付けは、望ましいエピトープに関する情報を解明し得る。この情報から、抗原への結合を競合する抗体を見出すために競合試験を行うことにより、同じかまたは類似のエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能となる。
【０１０１】
当業者は、当該分野で公知の方法を用いて、抗体が同じエピトープに結合するかどうか、または抗ＭＥＴ抗体との結合について競合するかどうかを決定することができる。一態様において、当業者は、本発明の抗ＭＥＴ抗体を飽和条件下でＭＥＴに結合させて、試験抗体のＭＥＴに結合する能力を測定することができる。試験抗体が対照抗ＭＥＴ抗体と同時にＭＥＴに結合することができる場合、該試験抗体は、対照抗ＭＥＴ抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が同時にＭＥＴに結合することができない場合は、該試験抗体は、本発明の抗ＭＥＴ抗体が結合するエピトープと同じエピトープ、重複するエピトープ、またはそれに近接するエピトープに結合する。この試験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ(商標)、バイオレイヤー干渉法またはフローサイトメトリーを用いて行うことができる。抗ＭＥＴ抗体が別の抗ＭＥＴ抗体と交差競合するかどうかを試験するために、二方向での、すなわち、既知の抗体が試験抗体を阻害するかどうか、および試験抗体が既知の抗体を阻害するかどうかを決定する、上記の競合法を使用することができる。好ましい態様において、試験はＯｃｔｅｔ(商標)を使用して実施される。
【０１０２】
用語“キメラ抗体”は、その最も広い意味で、１つの抗体からの１またはそれ以上の領域と１またはそれ以上の他の抗体からの１またはそれ以上の領域を含む抗体を意味し、一般的に、部分的にヒト起源であり、かつ部分的に非ヒト起源である、すなわち一部が非ヒト動物、例えばマウス、ラットもしくは他のげっ歯動物、またはニワトリなどの鳥類に由来する抗体である。キメラ抗体は、ヒトの抗抗体応答、例えばマウス抗体の場合にはヒトの抗マウス抗体応答の危険性を低減するために、非ヒト抗体よりも好ましい。一般的なキメラ抗体の例は、可変領域配列がマウスであり、一方、定常領域配列がヒトである抗体である。キメラ抗体の場合、非ヒト部分は、抗体をヒト化するためにさらなる変化に供され得る。本明細書に記載のキメラ抗体は、マウス可変ドメイン配列およびヒト定常ドメイン配列を有する。
【０１０３】
用語“ヒト化”は、抗体が完全にまたは部分的に非ヒト起源であるという事実、例えば対象とする抗原でのマウスの免疫化から得られたマウス抗体またはかかるマウス抗体に基づくキメラ抗体を意味し、ヒトにおける免疫応答を回避するか、または最小限に抑えるために特定のアミノ酸、特にフレームワーク領域ならびに重鎖および軽鎖の定常ドメインのアミノ酸を置換することが可能である。抗体と標的抗原との相互作用の特異性は、主に、重鎖および軽鎖の６つのＣＤＲに位置するアミノ酸残基に存在する。従って、ＣＤＲ内のアミノ酸は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間でより可変である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与しているため、例えば、異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特定の抗体由来のＣＤＲ配列を発現する発現ベクターを構築することにより、特定の天然に存在する抗体の性質を模倣する組換え抗体、またはより一般的には所定のアミノ酸配列を有する特定の抗体を発現することが可能である。結果として、非ヒト抗体を“ヒト化”し、かつ元の抗体の結合特異性および親和性を実質的に維持することが可能である。免疫原性を正確に予測し、それによって特定の抗体のヒト抗抗体応答を予測することは不可能であるが、非ヒト抗体はヒト抗体よりも免疫原性が高い傾向がある。異種（通常はげっ歯動物）定常領域がヒト起源の配列で置換されたキメラ抗体は、一般に完全な異種起源の抗体よりも免疫原性が低く、治療用抗体はヒト化または完全ヒト抗体を目指す傾向にある。キメラ抗体または非ヒト起源の他の抗体に関しては、それゆえ、ヒトの抗抗体応答の危険性を低減するためにヒト化され得る。
【０１０４】
キメラ抗体に関して、ヒト化は、一般的に、可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部であるアミノ酸残基は、ほとんどの場合ヒト化に関連して変化させないが、一部の場合には、例えばグリコシル化部位、脱アミド化部位、アスパラギン酸異性化部位または望ましくないシステインもしくはメチオニン残基を除去するために、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることが望ましいと考えられる。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここでは、ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖の連結によって起こる。Ｎ−グリコシル化部位の除去は、好ましくは保存的置換によって、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に変異させることによって達成され得る。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの因子によって起こり得る。アスパラギン残基は、主として配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、およびより低い度合いでＡｓｎ−Ａｌａなどの他のジペプチド配列中に存在する場合、特に脱アミド化を受けやすい。そのような脱アミド化部位、特にＡｓｎ−ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在するときは、それゆえ、一般的には関与する残基の１つを除去する保存的置換によって、その部位を除去することが望ましい。
【０１０５】
抗体配列のヒト化のための多数の方法が当技術分野で公知である；例えばAlmagro ＆ Fransson, Front Biosci. 13: 1619-1633 (2008)による総説を参照のこと。１つの一般的に使用される方法はＣＤＲ移植であり、この方法は、例えばマウス由来のキメラ抗体に関しては、マウス可変領域遺伝子に対するヒト生殖細胞遺伝子対応物の同定およびこのフレームワークへのマウスＣＤＲ配列の移植を含む。ＣＤＲ移植はＫａｂａｔのＣＤＲ定義に基づき得るが、最近の公表文献（Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210-225 (2007)）は、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義（the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）、www.imgt.org）がヒト化の結果を改善し得ることを示唆した（Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)を参照のこと）。ある場合に、ＣＤＲ移植は、そのＣＤＲが由来する親抗体と比較して、ＣＤＲ移植した非ヒト抗体の結合特異性および親和性を低下させ、したがって生物学的活性を低下させ得る。復帰突然変異（“フレームワークリペア”とも言う）は、親抗体の結合特異性および親和性を再構築するために、ＣＤＲ移植した抗体の選択位置、一般的にはフレームワーク領域内に導入され得る。可能な復帰突然変異のための位置の同定は、文献および抗体データベースにおいて入手可能な情報を用いて実施可能である。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は、一般的には抗体分子の表面に位置するものであるが、埋もれた残基または表面露出の度合いが低い残基は、通常変化させない。ＣＤＲ移植と復帰突然変異に代わる代替的ヒト化技術は、非ヒト起源の非表面露出残基を保持し、表面残基をヒト残基に変化させる、表面再構成である。
【０１０６】
特定の場合には、標的エピトープに対する結合親和性を改善するために１またはそれ以上のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることも望ましいであろう。これは“親和性成熟（affinity maturation）”として知られ、例えば抗体のヒト化が結合特異性または親和性の低下をもたらし、復帰突然変異だけでは結合特異性または親和性を十分に改善することができない状況では、場合によりヒト化と併せて実施され得る。種々の親和性成熟方法が当技術分野において公知であり、例えばBurks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)に記載されたインビトロスキャニング飽和突然変異誘発、およびWu et al.  Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998)に記載の段階的インビトロ親和性成熟法が挙げられる。
【０１０７】
本明細書で用いる用語、抗体の“抗原結合部分”（または、単に“抗体の部分”）は、抗原（例えば、ヒトＭＥＴまたはその一部）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれ以上の部分または断片を意味する。全長の抗体の特定の断片が、抗体の抗原結合機能を果たし得ることが示されている。用語“抗原結合部分”に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片：ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；および、（ｖｉ）抗原に特異的に結合することが可能な単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の二つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらをタンパク質一本鎖として作製することを可能にする合成ペプチドリンカーにより、組換え法を用いて結合させることができ、そこで、ＶＬおよびＶＨ領域は、一価の分子形成するペアである（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）。ＶＨおよび／またはＶＬを含む抗原結合分子もまた本発明の範囲内である。ＶＨの場合、分子はまた、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３領域の１またはそれ以上を含んでいてもよい。かかる単一抗体もまた、用語、抗体の“抗原結合部分”に包含されることが意図される。二重特異性抗体のような単一抗体の他の形態もまた包含される。ダイアボディは二価の二重特異性抗体であり、ここで、ＶＨおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いて、該ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させて２つの抗原結合部位を作り出す。
【０１０８】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片のような抗体部分は、全体抗体のパパインまたはペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体の部分および免疫接着分子は、例えば本明細書に記載の、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【０１０９】
一態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で用いる略語“ｍＡｂ”は、モノクローナル抗体、すなわち、細胞の個々のクローン集団によって合成され、分泌された抗体である。クローン集団は、不死化細胞のクローン集団であり得る。ある態様において、クローン集団における不死化細胞は、ハイブリッド細胞−ハイブリドーマ−であり、通常、リンパ腫由来の個々の細胞で免疫化した動物由来の個々のＢリンパ球の融合により産生される。
【０１１０】
抗ＭＥＴ抗体のクラス（アイソタイプ）およびサブクラスは、当技術分野で公知の何れかの方法により決定され得る。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定され得る。かかる抗体は、市販されている。クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットならびに他の技術により決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部を配列決定し、免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列とそのアミノ酸配列を比較し、そして抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定することができる。
【０１１１】
抗ＭＥＴ抗体
本発明は、ヒトＭＥＴに対する抗体、または該抗体の抗原結合部分に関する。本発明は、キメラおよびヒト化形態の両方の新規の抗ＭＥＴ抗体９００６および９３３８を提供する。図２６−３０は、これらの抗体の、全長（ＨＣおよびＬＣ）および可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）重鎖および軽鎖ヌクレオチドならびにアミノ酸配列を示す。以下の表１は、これらの配列の配列番号を提供する。以下の表２は、抗体９００６および９３３８の重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列（キメラ形態とヒト化形態とで同じ）の配列番号を提供する。ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ(登録商標)定義にしたがって割り当てられた。
【０１１２】
【表１】
2017534259.tif 000002
【表２】
2017534259.tif 000003
【０１１３】
任意の態様において、本発明は、
−ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−重配列番号：６のアミノ酸配列を含む鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１１４】
一態様において、本発明は、配列番号：２３または２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を提供する。一態様において、本発明は、配列番号：２６または３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を提供する。一態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：２３または２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および配列番号：２６または３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する。任意の態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、
−配列番号：２３のＨ−ＣＤＲ３配列および配列番号：２６のＬ−ＣＤＲ３配列；または
−配列番号：２９のＨ−ＣＤＲ３配列および配列番号：３２のＬ−ＣＤＲ３配列
を含む。
【０１１５】
一態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、
−それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３；または
−それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３
を含む。
【０１１６】
一態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、
−それぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３；または
−それぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３
を含む。
【０１１７】
一態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、
−それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３；または
−それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３
を含む。
【０１１８】
一態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：６、１０、１４または１８のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを有する。一態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：８、１２、１６または２０のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを有する。一態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：６、１０、１４または１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：８、１２、１６または２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する。任意の態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、
−配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
−配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
−配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
−配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【０１１９】
任意の態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１２０】
任意の態様において、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１２１】
別の面において、本発明は、上記の抗体または部分の変異体を提供し、ここで、該変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換により、抗体またはその部分とは異なる。
【０１２２】
一態様において、本発明は、配列番号：６、１０、１４または１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列である重鎖可変ドメインを含む抗ＭＥＴ抗体、または該抗体の抗原結合部分を提供する。任意の態様において、重鎖可変ドメインは、配列番号：６、１０、１４または１８のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列である。一態様において、本発明は、配列番号：８、１２、１６または２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列である軽鎖可変ドメインを含む抗ＭＥＴ抗体、または該抗体の抗原結合部分を提供する。任意の態様において、軽鎖可変ドメインは、配列番号：８、１２、１６または２０のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列である。抗ＭＥＴ抗体はまた、上記の重鎖および軽鎖可変ドメインの何れかの組み合わせを含み得る。
【０１２３】
一態様において、本発明は、配列番号：３４または３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列である重鎖を含む抗ＭＥＴ抗体、または該抗体の抗原結合部分を提供する。任意の態様において、重鎖は、配列番号：３４または３６のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列である。一態様において、本発明は、配列番号：３３または３５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列である軽鎖を含む抗ＭＥＴ抗体、または該抗体の抗原結合部分を提供する。任意の態様において、軽鎖は、配列番号：３３または３５のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列である。抗ＭＥＴ抗体はまた、上記の重鎖および軽鎖可変ドメインの何れかの組み合わせを含み得る。
【０１２４】
配列同一性とも呼ばれるポリペプチドの配列類似性は、一般的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の改変に割り当てられる類似性の尺度を用いて類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、異なる種の生物に由来する、または野生型タンパク質とその変異体との間の、相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメータを使用することができる、“Ｇａｐ”および“Ｂｅｓｔｆｉｔ”などのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨パラメータを用いるＦＡＳＴＡ（ＧＣＧバージョン６．１のプログラム）を用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリ(query)と検索配列との間の最良の重複の領域のアラインメントおよび配列同一性％を提供する（Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)）。異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと本発明の配列を比較するとき、別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いて、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、とりわけｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)(引用により本明細書中に包含させる)を参照のこと。
【０１２５】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常、少なくとも約２０残基、より一般的に少なくとも約２４残基、一般的に少なくとも約２８残基、好ましくは約３５以上の残基であり得る。
【０１２６】
本発明によれば、あるタイプの行われ得るアミノ酸置換は、化学的に反応することができる抗体中の１つまたは複数のシステインを、例えば、限定されないが、アラニンまたはセリンなどの別の残基に変更することである。一態様において、非カノニカルシステインの置換がある。置換は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域において、または抗体の定常ドメインにおいて作製することができる。ある態様において、システインはカノニカルである。
【０１２７】
別のタイプの行われ得るアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去することである。そのような部位は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域において、または抗体の定常領域で起こり得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体産物において不均一性のリスクを減少させ、従ってその均一性を高めることができる。
【０１２８】
別のタイプのアミノ酸置換は、残基の一方または両方を変更することにより、潜在的な脱アミド部位を形成するアスパラギン−グリシン対を除去することである。
【０１２９】
本発明の変異体のいずれかで行われ得る別のタイプのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。“保存的アミノ酸置換”は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、実質的にタンパク質の機能的特性を変化させない。２以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合において、配列同一性％または類似度は、置換の保存的性質を補正するために上方調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)を参照のこと。
【０１３０】
類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては以下が挙げられる：１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニンおよびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニン。好ましい保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１３１】
あるいは、保存的置換は、Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有するいずれかの変化であると定義され得る。“中程度に保存的な”置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて負でない値を有するいずれかの変化である。
【０１３２】
任意の態様において、本発明の抗体または抗原結合部分のアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変え、および（４）こうしたアナログの他の物理化学的特性もしくは機能特性を賦与するもしくは改変するが、ヒトＭＥＴへの特異的結合性を保持するものを含む。アナログは、天然に存在するペプチド配列への種々の置換を包含し得る。例えば、単一もしくは複数のアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換を、天然に存在する配列中で、例えば分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチドの部分で行い得る。アミノ酸置換はまた、ポリペプチドの活性を改善し得る分子間接触を形成するドメイン(複数可)内でも行い得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変えるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在する免疫グロブリン結合ドメインを構成する逆平行βシートを変えるべきでないか、または親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊すべきではない）。一般に、グリシンおよびプロリンは、逆平行βシートで使用されない。当技術分野で認識されるポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); および、Thornton et al., Nature 354:105 (1991)に記載されている。
【０１３３】
本発明の別の面において、抗体は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載の技術を用いて、その免疫原性を低減するために脱免疫化され得る。
【０１３４】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分のいずれかは、以下からなる群より選択される少なくとも１つの機能的特性を有していてもよい。
−マウスまたはニワトリのＭＥＴに結合しない；
−ＳＥＭＡドメイン上に存在する残基を含むヒトＭＥＴのエピトープに結合する；
−ＭＥＴの分解を誘導する；
−１×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＭＥＴに結合する；
−ＳＮＵ５、ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＫａｔｏＩＩ、ＯＥ３３およびＯｋａｊｉｍａから選択される少なくとも１つの細胞株のインビトロでの増殖を阻害する；
−ＭＥＴリン酸化を阻害する；
−ＭＥＴ下流シグナル伝達を阻害する；
−ＨＧＦの存在下または不存在下での初代内皮細胞増殖を阻害する；および
−インビボでの腫瘍増殖を阻害する
または、該機能的特性の任意の組み合わせ。ある態様において、１またはそれ以上の本発明の抗体または抗原結合部分（および、特に、本発明の抗ＭＥＴ抗体組成物）のＭＥＴへの結合は、受容体を発現する細胞（すなわち、腫瘍細胞）の成長および増殖を阻害し得る。
【０１３５】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分の何れかは、ＨＧＦαおよびＨＧＦβのＭＥＴへの結合を阻害し得る。ある態様において、抗体または部分は、未処理のＨＧＦのＭＥＴへの結合を阻害し得る。
【０１３６】
本明細書で用いる用語“成長を阻害”（例えば、細胞を参照して）には、抗ＭＥＴ抗体もしくは抗原結合部分または抗ＭＥＴ抗体組成物と接触させたときに、該抗体または組成物の不存在下での同じ細胞の増殖と比較して、細胞の増殖（細胞数の増加）または代謝の任意の測定可能な減少を含むことが意図され、例えば、少なくとも約１０％、および好ましくはより高い、例えば少なくとも約２０％または３０％、より好ましくは少なくとも約４０％または５０％、例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％、さらには約１００％の、細胞培養物の増殖の阻害である。以下の実施例に記載の通り、増殖阻害は、例えば、関連する癌細胞株において決定することができる。
【０１３７】
本明細書に記載の方法で得られた抗ＭＥＴ抗体のクラスは、別のクラスに切り替えることができる。本発明の一面では、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子は、それが、ＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列を含まないように、当技術分野で周知の方法を用いて単離される。次いで、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子は、免疫グロブリン分子の異なるクラスから、ＣＬまたはＣＨのアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。これは、上記の通り、ＣＬまたはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成することができる。例えば、元はＩｇＭであった抗ＭＥＴ抗体は、ＩｇＧに切り替えることができる。さらに、クラススイッチは、別のＩｇＧサブクラスに変換するために、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換するために使用されてもよい。所望のアイソタイプを有する本発明の抗体を産生するための好ましい製造法は、抗ＭＥＴ抗体の重鎖をコードする核酸分子および抗ＭＥＴ抗体の軽鎖をコードする核酸分子を単離する工程、重鎖の可変ドメインを得る工程、重鎖の可変ドメインを所望のアイソタイプの重鎖の定常ドメインとライゲーションする工程、細胞において軽鎖およびライゲートした重鎖を発現させる工程、および所望のアイソタイプを有する抗ＭＥＴ抗体を回収する工程を含む。
【０１３８】
本発明の抗ＭＥＴ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子であり得る。一態様において、抗ＭＥＴ抗体は、ＩｇＧ分子であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスである。任意の態様において、抗体はＩｇＧ１サブクラスである。
【０１３９】
任意の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分の１以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成される、大きな免疫接着分子の一部であってよい。そのようなイムノアドヘシンの例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)）、二価およびビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)）が含まれる。他の例には、目的の抗原に特異的に結合するイムノアドヘシンにするために、抗体からの１以上のＣＤＲが共有結合または非共有結合により分子内に組み込まれている場合が含まれる。このような態様では、ＣＤＲ（複数可）は、より大きなポリペプチド鎖の一部として組み込まれ得て、共有結合的に別のポリペプチド鎖に連結され得るか、または非共有結合的に組み込まれてもよい。
【０１４０】
別の態様において、融合抗体またはイムノアドヘシンは、別のポリペプチドに連結された本発明の抗ＭＥＴ抗体の全部または一部を含んで作製され得る。任意の態様において、抗ＭＥＴ抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに連結されている。任意の態様において、ＶＨおよびＶＬドメインが、互いに相互作用して抗原結合部位を形成するように、抗ＭＥＴ抗体のＶＨドメインは、第一のポリペプチドに連結されており、一方、抗ＭＥＴ抗体のＶＬドメインは、第一のポリペプチドと結合する第二のポリペプチドに連結されている。別の好ましい態様において、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができるように（例えば、一本鎖抗体）、リンカーによってＶＬドメインから分離されている。ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、その後、目的のポリペプチドに連結される。さらに、融合抗体は、２（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結されて作製され得る。これは、単一のポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を作製したい場合、または二重特異性抗体を作製したい場合に有用である。
【０１４１】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製するため、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、フレキシブルリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されており、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列は、フレキシブルリンカーにより結合されたＶＬおよびＶＨドメインを有する、連続した一本鎖タンパク質として発現され得る。例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照。１つのＶＨおよびＶＬが用いられる場合、一価であり、２つのＶＨおよびＶＬが用いられる場合、二価であり、または２以上のＶＨおよびＶＬが用いられる場合、多価であり得る。二重特異性または多価抗体は、例えば、ヒトＭＥＴおよび別の分子に特異的に結合するように作製され得る。
【０１４２】
他の態様において、他の修飾抗体は、抗ＭＥＴ抗体をコードする核酸分子を用いて製造できる。例えば、“カッパボディ”（Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)）、“ミニボディ”（Martin et al., EMBO J.  13:5303-9 (1994)）、“二重特異性抗体”（Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993))、または“一本鎖分子(Janusins)” (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) および Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)）を、明細書の教示に従って標準的な分子生物学的技術を用いて調製することができる。
【０１４３】
本発明の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分は、誘導体化するか、または別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結することができる。一般的に、抗体またはその部分は、ＭＥＴの結合が誘導体化または標識によって悪影響を受けないように誘導体化される。従って、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載のヒト抗ＭＥＴ抗体の無傷のおよび改変型の両方を含むことが意図される。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との抗体または抗体部分の結合を仲介し得る、別の抗体（例えば、二重特異性抗体または二重特異性抗体）などの、１または複数の他の分子化合物に（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他によって）機能的に結合され得る。
【０１４４】
誘導体化抗体の１つのタイプは、（例えば、二重特異性抗体を作製するために、同じ種類または異なる種類の）２以上の抗体を架橋することによって作製される。好適な架橋剤は、適当なスペーサーで分離された２つの区別できる反応性基を有するヘテロ二官能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性であるもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が含まれる。このようなリンカーは、Pierce Chemical Company、Rockford、ILから入手可能である。
【０１４５】
抗ＭＥＴ抗体はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または炭水化物基などの化学基で誘導体化することができる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するのに、例えば血清半減期を増加させるのに、有用である。
【０１４６】
本発明の抗体はまた、標識され得る。本明細書で用いる用語“標識”または“標識した”は、抗体中の別の分子の挿入を意味する。一態様において、標識は、例えば、放射標識したアミノ酸の挿入、または標識アビジン（例えば、光学的方法または熱量測定法により検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合などの、検出可能マーカーである。別の態様において、標識またはマーカーは、治療用の、例えば薬物複合体または毒素であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、用いられ得る。ポリペプチドの標識の例には、以下：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、蛍光ランタニド）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、転写活性ポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、ガドリニウムキレートなどの磁性剤、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログなどの毒素が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様にて、標識は、可能性のある立体障害を減ずるために様々な長さのスペースアームにより結合される。
【０１４７】
任意の態様において、本発明の抗体は、中性形態（両性イオン形態を含む）または正もしくは負に帯電した種として存在し得る。ある態様において、抗体は、薬学的に許容される塩を形成する対イオンと複合体を形成することができる
【０１４８】
用語“薬学的に許容される塩”は、対イオンが薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基から誘導された、１または複数の抗体および１または複数の対イオンを含む複合体を意味する。
【０１４９】
薬学的に許容される無機塩基には、適当なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および他の生理的に許容される金属イオンを含むが、これらに限定されない、金属イオンが含まれる。無機塩基から誘導される塩には、例えば、それらの通常の原子価の、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレン、スズ、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガンまたはマンガン塩、カリウム、ルビジウム、ナトリウム、および亜鉛が含まれる。
【０１５０】
本発明の抗体の薬学的に許容される酸付加塩は、以下の酸：ギ酸、酢酸、アセトアミド、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、ショウノウ、炭酸、シクラミン酸を含む以下の酸から調製することができます。デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンディゾ（fendizoic）酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リシン、イソクエン、トリフルオロ酢酸、パモ酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オロチン酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシ酪酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン、カンファースルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサル５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン、ガラクタル酸およびガラクツロン酸が含まれるが、これらに限定されない、酸から製造可能である。
【０１５１】
薬学的に許容される有機塩基としては、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、第四級アンモニウムカチオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コール酸塩、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、およびトロメタモールが挙げられる。
【０１５２】
抗ＭＥＴ抗体組成物
一面において、本発明は、少なくとも２つの本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む抗体組成物を提供する。用語“抗ＭＥＴ抗体組成物”は、少なくとも２つの抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を含む組成物を意味する。
【０１５３】
一態様において、抗体組成物は、第一の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分および第二の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を含み、ここで、第一の抗ＭＥＴ抗体は、以下からなる群より選択される：
−それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−重配列番号：６のアミノ酸配列を含む鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を有する抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３ならびにそれぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：６または１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：８または１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびの配列番号：８アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１４のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：３４のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
そして、第二の抗ＭＥＴ抗体は、以下からなる群より選択される：
−ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１０または１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを有する抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分、；
−配列番号：１２または２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１０のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：１８のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；
−配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：３６のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分。
上記の第一および第二の抗ＭＥＴ抗体の何れかの組み合わせが意図される。
【０１５４】
一態様において、抗体組成物は、
−ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−ヒトＭＥＴへの結合について、それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１５５】
一態様において、抗体組成物は、
−それぞれ配列番号：２１、２２、２３、２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−それぞれ配列番号：２７、２８、２９、３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープン結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１５６】
一態様において、抗体組成物は、
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１５７】
一態様において、抗体組成物は、
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１５８】
一態様において、抗体組成物は、
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−ヒトＭＥＴへの結合について、配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と競合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１５９】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−それぞれ配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６０】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６１】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と同じヒトＭＥＴのエピトープに結合する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６２】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６３】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６４】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３および配列番号：３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６５】
一態様において、抗体組成物は、
−それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６６】
一態様において、抗体組成物は、
−それぞれ配列番号：２４、２５および２６のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−それぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６７】
一態様において、抗体組成物は、
−それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号：２４、２５および２６を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６８】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１６９】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１７０】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
【０１７１】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：１０のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
第一および第二の抗体の上記の同一性パーセントの任意の組合せが意図される。
【０１７２】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：１４のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：１８のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
第一および第二の抗体の上記の同一性パーセントの任意の組合せが意図される。
【０１７３】
一態様において、抗体組成物は、
−配列番号：３４のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：３６のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
を含む。
第一および第二の抗体の上記の同一性パーセントの任意の組合せが意図される。
【０１７４】
二重特異性結合分子
さらなる面において、本明細書に記載の何れか２つの個々の抗体の結合特異性は、１つの二重特異性結合分子に組み込まれ得る。例えば、二重特異性結合分子は、抗ＭＥＴ抗体９００６および９３３８の結合特異性を有し得る。ある態様において、二重特異性結合分子は、
−それぞれ配列番号：２１、２２および２３のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号：２４、２５および２６を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−それぞれ配列番号：２７、２８および２９のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号：３０、３１および３２のアミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
の結合特異性を有し得る。
【０１７５】
ある態様において、二重特異性結合分子は、
−配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
の結合特異性を有し得る。
【０１７６】
ある態様において、二重特異性結合分子は、
−配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号：２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
の結合特異性を有し得る。
【０１７７】
ある態様において、二重特異性結合分子は、
−配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分；および
−配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分
の結合特異性を有し得る。
【０１７８】
二重特異性結合分子は、二重可変ドメイン抗体であってよく、すなわち、抗体の２つのアームが、２つの異なる可変ドメインを含むか、または二重特異性Ｆａｂフラグメントまたは二重特異性ｓｃＦｖのような抗体フラグメントの形態であり得る。
【０１７９】
核酸分子およびベクター
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。ある態様において、異なる核酸分子は、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする。他の態様において、同じ核酸分子は、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする。
【０１８０】
他に特記されない限り、ヌクレオチド配列への言及は、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含すると理解されるべきである。本明細書で言及される用語“ポリヌクレオチド”は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾された形態を意味する。この用語は、一本鎖および二本鎖形態を含む。
【０１８１】
本発明はまた、上記のヌクレオチド配列または配列番号：６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および３３−３６からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の１以上に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。核酸配列の文脈中、用語“配列同一性パーセント”は、最大一致のために整列させた場合に同じである２つの配列中の残基を意味する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、一般的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができ、当技術分野で公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10．0（Genetics Computer Group（GCG），Madison，Wisconsin）の中のプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列と間の最適なオーバーラップの領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する。（Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)；引用により本明細書に包含させる）。他に特記されない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトのパラメータが使用される。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター（ｆａｃｔｏｒ））を用いてＦＡＳＴＡを使用して、または引用により本明細書に包含させるＧＣＧバージョン６．１中に提供されているようなそのデフォルトパラメータを用いてＧａｐを使用して、決定され得る。
【０１８２】
一面において、本発明は、配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ある態様において、核酸分子は、配列番号：５および７、９および１１、１３および１５または１７および１９のヌクレオチド配列を含み得る。
【０１８３】
上記の態様のいずれかにおいて、核酸分子は単離され得る。
【０１８４】
さらなる面において、本発明は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分の鎖の１つを発現するのに好適なベクターを提供する。本明細書で用いる用語“ベクター”は、それが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。ある態様において、ベクターは、プラスミド、すなわち、付加的なＤＮＡセグメントを連結することができるＤＮＡの環状の二本鎖部分である。ある態様において、ベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターである。ある態様において、ベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他の態様では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書中、“組み換え発現ベクター”（または、単に“発現ベクター”）と称される。
【０１８５】
本発明は、本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の重鎖、本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の軽鎖、または本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片、およびそのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１８６】
抗ＭＥＴ抗体またはその部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子は、そのような抗体または部分を産生する任意の供給源から単離され得る。種々の態様において、核酸分子は、ヒトＭＥＴ抗原で免疫した動物から、またはそのようなＢ細胞から産生された不死化細胞から単離された抗ＭＥＴ抗体を発現するＢ細胞から単離される。抗体をコードする核酸を単離する方法は当技術分野において周知である。ｍＲＮＡを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングにおいて使用するためのｃＤＮＡを作製するために使用することができる。任意の態様において、本発明の核酸分子は、単離よりむしろ合成することができる。
【０１８７】
ある態様において、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合された、本発明の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分由来のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。同様に、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合された本発明の抗ＭＥＴ抗体または抗原結合部分由来のＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１８８】
本発明のさらなる面では、重鎖（ＶＨ）および／または軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインをコードする核酸分子は、完全長抗体遺伝子に“変換”されてもよい。一態様において、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸分子は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（複数可）に作動可能に連結され、および／またはＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、重鎖定常（ＣＨ）または軽鎖定常（ＣＬ）ドメインのアミノ酸配列を既にコードする発現ベクター中に挿入することにより完全長抗体遺伝子に変換される。別の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を用いて、ＣＨおよび／またはＣＬドメインをコードする核酸分子にＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を結合させること、例えばライゲーションすることにより、全長抗体遺伝子に変換される。その後、完全長の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子は、それらが導入された細胞から発現させることができ、抗ＭＥＴ抗体が単離される。
【０１８９】
核酸分子は、抗ＭＥＴ抗体を組換え的に大量に発現させるために使用されてもよい。本明細書に記載の通り、核酸分子はまた、キメラ抗体、二重特異性抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、二重特異性抗体、突然変異抗体および抗体誘導体を産生するために使用されてもよい。
【０１９０】
別の態様において、本発明の核酸分子は、特定の抗体配列に対するプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用される。例えば、核酸は、診断方法のプローブとして、またはとりわけ抗ＭＥＴ抗体の可変ドメインをコードする付加的な核酸分子を単離するために使用され得るＤＮＡの領域を増幅するためのＰＣＲプライマーとして、使用することができる。ある態様において、核酸分子はオリゴヌクレオチドである。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、目的の抗体の重鎖および軽鎖の高度可変ドメインに由来する。ある態様において、本明細書に記載の通り、オリゴヌクレオチドは、本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の１以上のＣＤＲの全部または一部をコードする。
【０１９１】
別の態様において、核酸分子およびベクターは、突然変異した抗ＭＥＴ抗体を作製するために使用されてもよい。抗体は、抗体の結合特性を変化させるために、例えば、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて変異させてもよい。例えば、突然変異は、抗ＭＥＴ抗体のＫＤを増加または減少させる、ｋｏｆｆを増加または減少させる、あるいは抗体の結合特異性を変えるために、ＣＤＲ領域の１以上に行われ得る。別の態様において、１以上の変異は、本発明のモノクローナル抗体における生殖細胞系と比較して変化することが知られているアミノ酸残基で行われる。変異は、可変ドメインのＣＤＲ領域またはフレームワーク領域においてか、または定常ドメインにおいて作製することができる。好ましい態様において、変異は可変ドメインにおいて作製される。ある態様において、１以上の変異は、本発明の抗体またはその抗原結合部分の可変ドメインのＣＤＲ領域またはフレームワーク領域において生殖細胞系と比較して変化することが知られているアミノ酸残基で行われる。
【０１９２】
別の態様では、得られたフレームワーク領域（複数可）が対応する生殖細胞系遺伝子のアミノ酸配列を有するように、フレームワーク領域（複数可）が変異している。突然変異は、抗ＭＥＴ抗体の半減期を増加させるためにフレームワーク領域または定常ドメインにおいて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９５６０を参照のこと。フレームワーク領域または定常ドメインにおける突然変異はまた、抗体の免疫原性を変化させることができ、および／または別の分子への共有結合または非共有結合のための部位を提供する。本発明によれば、単一の抗体は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域のいずれか１以上において、または定常ドメインにおいて変異を有していてもよい。
【０１９３】
ある態様において、本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分は、遺伝子が、転写および翻訳調節配列のような必要な発現制御配列に作動可能に連結されるように、上記で得られた、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが含まれる。抗体遺伝子は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図された機能を果たすように、ベクターに連結され得る。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択され得る。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入され得る。一態様において、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法によって発現ベクターに挿入され得る（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）。  
【０１９４】
便利なベクターは、上記のように、任意のＶＨまたはＶＬ配列が容易に挿入および発現され得るように操作された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターにおいて、スプライシングは通常、挿入されたＪ領域におけるスプライスドナー部位とヒトＣドメインに先行するスプライスアクセプター部位との間で起こり、またヒトＣＨエキソン内に生じるスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体上の部位で生じ得る。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１９５】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持し得る。当業者が認めるように、発現ベクターの設計は、調節配列の選択を含め、形質転換すべき宿主細胞の選定、所望タンパク質の発現レベルなどの因子に左右され得る。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞においてタンパク質発現の高レベルを目的とするウイルス要素、例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス、（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよび強力な哺乳動物プロモーター、例えば天然の免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターが含まれる。ウイルス性調節要素およびその配列のさらなる記述について、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、同第４，５１０，２４５号および同第４，９６８，６１５号参照。プロモーターおよびベクターの記載を含む、植物における抗体の発現方法、ならびに植物の形質転換は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，５１７，５２９号を参照のこと。細菌細胞または真菌細胞、例えば、酵母細胞におけるポリペプチドの発現法もまた、当技術分野で周知である。
【０１９６】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子でのベクターの複製を調節する配列などのさらなる配列を有していてもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、一般的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。例えば、選択可能マーカー遺伝子には、（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するための）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、（Ｇ４１８選択用の）ｎｅｏ遺伝子、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子が含まれる
【０１９７】
本明細書中で用いる用語“発現制御配列”は、それらが連結するコーディング配列の発現およびプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適する転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および、所望により、タンパク質分泌を増強する配列を含む。このような調節配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような調節配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。真核生物では、一般に、このような調節配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語“調節配列”は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに必須である成分を意味しており、また、その存在が有利である追加成分、例えばリーダー配列や融合パートナー配列も含む。
【０１９８】
本発明の抗体および抗体組成物を産生するハイブリドーマ法
任意の態様において、本発明は、（ａ）非ヒトトランスジェニック動物をＭＥＴ、ＭＥＴの一部またはＭＥＴを発現する細胞もしくは組織で免疫化し；（ｂ）該トランスジェニック動物にＭＥＴに対する免疫応答をマウントするのを可能にし；（ｃ）該トランスジェニック動物から抗体産生細胞を単離し；（ｄ）抗体産生細胞を不死化し；（ｅ）不死化した抗体産生細胞の個々のモノクローナル集団を生成し；そして、（ｆ）不死化した抗体産生細胞をスクリーニングして、ＭＥＴに対する抗体を同定すること、を含む、ＭＥＴに対するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を産生する細胞株を作製するための方法を提供する。
【０１９９】
別の面において、本発明は、ヒト抗ＭＥＴ抗体を産生する細胞株を提供する。ある態様において、該細胞株は、ハイブリドーマ細胞株である。ある態様において、ハイブリドーマは、上記の通り、マウスハイブリドーマである。他の態様において、ハイブリドーマは、非ヒト、ラットなどの非マウス種、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマで産生される。別の態様において、ハイブリドーマは、ヒトハイブリドーマである。
【０２００】
別の態様において、トランスジェニック動物は、ＭＥＴ抗原で免疫化され、初代細胞、たとえば脾臓または末梢血Ｂ細胞は、免疫化されたトランスジェニック動物から単離され、そして所望の抗原に特異的な抗体を産生する個々の細胞が識別される。個々の細胞からポリアデニル化ｍＲＮＡを単離し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、可変ドメイン配列にアニールするセンスプライマー、例えば、ヒト重鎖および軽鎖の可変ドメイン遺伝子のＦＲ１領域のほとんどまたは全てを認識する縮重プライマー、および定常または連結領域配列にアニールするアンチセンスプライマーを用いて行う。重鎖および軽鎖可変ドメインのｃＤＮＡは、そのような重鎖およびκまたはλコンセンサスドメインなどのそれぞれの免疫グロブリン定常領域を有するキメラ抗体として、任意の適する宿主細胞、例えば骨髄腫細胞中でクローニングし、発現されている。Babcook et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:7843-48 (1996)を参照のこと。抗ＭＥＴ抗体は、本明細書中に記載のように同定し、単離することができる。
【０２０１】
ファージディスプレイライブラリー
本発明は、ヒト抗体のライブラリーをファージ上に合成する工程、該ライブラリーをＭＥＴまたはその抗体結合部分でスクリーニングする工程、ＭＥＴに結合するファージを単離する工程、およびファージから抗体を得る工程を含む、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を産生する方法を提供する。一例として、ファージディスプレイ技術に使用するための抗体のライブラリーを調製するための一方法は、非ヒト動物をＭＥＴまたはその抗原部分で免疫化して免疫応答を作成する工程、免疫化した動物から抗体産生細胞を抽出する工程；抽出した細胞から本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするＲＮＡを単離する工程、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成する工程、プライマーを用いてｃＤＮＡを増幅する工程、および抗体がファージ上で発現されるようにファージディスプレイベクターへｃＤＮＡを導入する工程を含む。本発明の組換え抗ＭＥＴ抗体は、このようにして得ることができる。
【０２０２】
本発明の組換えヒト抗ＭＥＴ抗体は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。好ましくは、ライブラリーは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨ ｃＤＮＡを用いて生成された、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製およびスクリーニングするための方法は当技術分野で公知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するためのキットが市販されている（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号２７−９４００−０１；および、Stratagene SurfZAP(商標) phage display kit、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングに使用することができる他の方法および試薬もある（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、およびＷＯ９２／０９６９０；Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum Antibod Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J Mol Biol 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc Acid Res 19:4133-4137 (1991); and Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982 (1991)（全て、引用により本明細書中に包含させる）。
【０２０３】
一態様において、所望の特徴を有するヒト抗ＭＥＴ抗体を単離および産生するために、本明細書に記載のヒト抗ＭＥＴ抗体は、第一に、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３(引用により本明細書中に包含させる)に記載のエピトープインプリンティング法を用いて、ＭＥＴに対して同様の結合活性を有するヒト重鎖および軽鎖配列を選択するために用いられる。この方法で用いる抗体ライブラリーは、好ましくは、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)；および、Griffiths et al., EMBO J 12:725-734 (1993)(全て、引用により本明細書中に包含させる)に記載の通りに、製造およびスクリーニングされたｓｃＦｖライブラリーである。ｓｃＦｖ抗体ライブラリーは、好ましくはヒトＭＥＴを抗原として用いてスクリーニングされる。
【０２０４】
最初のヒトＶＬおよびＶＨドメインが選択されると、“ミックスアンドマッチ”試験が実行可能であり、そこで、最初に選択されたＶＬおよびＶＨセグメントの異なる対が、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択するためにＭＥＴ結合についてスクリーニングされる。また、抗体の質をさらに改善するために、好ましいＶＬ／ＶＨ対（複数可）のＶＬおよびＶＨセグメントを、好ましくは、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域内で、天然の免疫応答中の抗体の親和性成熟を担当するインビボでの体細胞変異プロセスにおいて、ランダムに変異させることができる。このインビトロ親和性成熟は、ＶＨ ＣＤＲ３またはＶＬ ＣＤＲ３のそれぞれに相補的なＰＣＲプライマーを用いてＶＨおよびＶＬドメインを増幅することによって達成することができ、そこで、プライマーは、得られたＰＣＲ産物が、ランダムな突然変異がＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ３領域に導入されたＶＨおよびＶＬセグメントをコードするように、特定の位置に４つのヌクレオチド塩基のランダム混合物を“スパイク”されている。これらのランダムに突然変異したＶＨおよびＶＬセグメントは、ＭＥＴへの結合について再スクリーニングされ得る。
【０２０５】
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーからの本発明の抗ＭＥＴ抗体のスクリーニングおよび単離後、選択された抗体をコードする核酸は、ディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）から回収することができ、他の発現ベクターに標準的な組換えＤＮＡ技術によってサブクローニングされる。所望であれば、本明細書に記載されるように、核酸はさらに、本発明の他の抗体形態を作成するために操作され得る。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現させるために、本明細書に記載の通り、抗体をコードするＤＮＡを、組換え発現ベクターにクローニングし、哺乳動物宿主細胞に導入される。
【０２０６】
非ハイブリドーマ宿主細胞ならびに抗体および抗体組成物の製造法
本発明のさらなる面は、本発明の抗体組成物ならびに抗体およびその抗原結合部分の製造法に関する。本発明のこの面の一態様は、抗体を発現し得る組換え宿主細胞を提供し、抗体の発現に適した条件下で該宿主細胞を培養し、そして得られた抗体を単離することを含む、本明細書で定義される抗体を産生するための方法に関する。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現によって産生される抗体は、本明細書中、“組換え抗体”と称される。本発明はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞、およびそれにより産生される抗体を提供する。
【０２０７】
本明細書で用いる用語“組換え宿主細胞”（または、単に“宿主細胞”）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。本発明は、例えば、上記の本発明のベクターを含み得る宿主細胞を提供する。本発明はまた、例えば、本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、あるいはその両方、を含む、宿主細胞を提供する。“組換え宿主細胞”および“宿主細胞”は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味することが理解されるべきである。突然変異または環境的影響によって、続く世代で特定の修飾が起こりうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、なお、本明細書で用いる用語“宿主細胞”の範囲内に含まれる。
【０２０８】
抗ＭＥＴ抗体をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターは、好適な哺乳動物細胞、植物細胞、細菌細胞または酵母宿主細胞のトランスフェクションに使用され得る。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための何れか公知の方法によって行うことができる。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は当技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（複数可）の封入、および核へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションが含まれる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入することができる。細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号を参照のこと。植物細胞を形質転換する方法は当技術分野で知られており、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換が含まれる。細菌および酵母細胞を形質転換する方法も当技術分野で周知である。
【０２０９】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野において周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３フリースタイル細胞（Invitrogen）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多数の他の細胞株が含まれる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することよって選択される。使用することができる他の細胞株は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞などの昆虫細胞株である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生されるか、または、より好ましくは、宿主細胞が増殖する培養培地中に抗体を分泌させる。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。植物宿主細胞には、例えば、タバコ、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、小麦、ジャガイモなどが含まれ、細菌宿主細胞としては、大腸菌およびストレプトミセス種が含まれる。酵母宿主細胞には、分裂酵母、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア酵母が含まれる。
【０２１０】
さらに、その産生細胞株からの本発明の抗体またはその抗原結合部分の発現は、公知の多数の技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、ＥＰ特許０２１６８４６号、同第０２５６０５５号、同第０３２３９９７号および同第０３３８８４１号に関連して、全体または部分的に議論されている。
【０２１１】
また、異なる細胞株によってまたはトランスジェニック動物において発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化パターンを有することが多い。しかしながら、本明細書において提供される核酸分子によってコードされるか、または本明細書に提供されるアミノ酸配列を含むすべての抗体は、抗体のグリコシル化状態に関係なく、より一般的には、翻訳後修飾（複数可）の有無に関わらず、本発明の一部である。
【０２１２】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも２つの抗ＭＥＴ抗体を含む抗体組成物を産生するための方法に関し、該方法は、
−第一の宿主細胞が、本発明の第一の抗ＭＥＴ抗体を発現可能であり、第二の宿主細胞が、本発明の第二の抗ＭＥＴ抗体を発現可能である、少なくとも第一および第二の宿主細胞を提供し；
−抗ＭＥＴ抗体の発現に適する条件下で第一および第二の宿主細胞を培養し；そして
−得られた抗体を単離すること
を含む。
【０２１３】
本発明の抗体またはその抗原結合部分または抗体組成物は、組み換えモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造について当技術分野で一般的に公知の方法により製造され得る。故に、本発明の単一抗体の製造の場合、組換えモノクローナル抗体の製造について当技術分野で公知の何れかの方法が使用可能である。抗体の混合物を含む本発明の抗体組成物の製造に関して、個々の抗体は別個に製造され得て、すなわち、各抗体を別個のバイオリアクターで製造するか、または個々の抗体を、単一のバイオリアクターで共に製造し得る。抗体組成物が２以上のバイオリアクターで製造されるとき、精製された抗体組成物は、各バイオリアクターから個々に精製された上清から得られた抗体を集めることにより得られ得る。多数のバイオリアクターにおけるポリクローナル抗体組成物の製造のための種々の方法が、ＷＯ２００９／１２９８１４（引用により本明細書中に包含される）に記載されており、該方法では、細胞株または抗体製剤を上流のより後の時点で、または下流のプロセシングの前もしくはプロセシング中に組み合わせる。
【０２１４】
単一のバイオリアクター中で個々の複数の抗体を製造する場合、これは、例えばＷＯ２００４／０６１１０４またはＷＯ２００８／１４５１３３（両方とも、引用により本明細書中に包含される）に記載の通りに実施され得る。ＷＯ２００４／０６１１０４に記載の方法は、個々の宿主細胞のゲノムへの抗体コーディング配列の部位特異的組み込みに基づき、ＷＯ２００８／１４５１３３に記載の方法は、単一のバイオリアクターにおける抗体の製造にランダム組み込みを用いる別法に関する。
【０２１５】
本発明の抗体および組成物を製造するのに好適な方法に関するさらなる情報は、ＷＯ２０１２／０５９８５７（引用により本明細書中に包含される）に見出され得る。
【０２１６】
トランスジェニック動物および植物
本発明の抗ＭＥＴ抗体およびその抗原結合部分はまた、目的の免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックである哺乳動物または植物の作製、およびそれから回収可能な形態での抗体の産生を介してトランスジェニック的に製造することができる。哺乳動物におけるトランスジェニック生産に関連し、抗ＭＥＴ抗体および部分は、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳汁中に産生され、乳汁から回収することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、同第５，７５６，６８７号、同第５，７５０，１７２号、および同第５，７４１，９５７号を参照のこと。ある態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物は、上記の通り、ヒトＭＥＴまたはその免疫原性部分で免疫化される。植物において抗体を作製する方法は、例えば、米国特許第６，０４６，０３７号および同第５，９５９，１７７号に記載されている。
【０２１７】
ある態様において、非ヒトトランスジェニック動物または植物は、本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分をコードする１以上の核酸分子（例えば、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分をコードする上記の核酸分子の何れか）を、標準的なトランスジェニック技術によって動物または植物に、導入することにより作製される。例えば、米国特許第６，４１７，４２９号を参照のこと。トランスジェニック動物を作製するために用いられるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞または体細胞または受精卵であることがであり得る。トランスジェニック非ヒト生物は、キメラ、非キメラのヘテロ接合、および非キメラホモ接合体であり得る。例えば、例えば、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics:A Practical Approach, Oxford University Press (2000); および、Pinkert, Transgenic 動物 Technology:A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)参照。ある態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、目的の重鎖および／または軽鎖をコードするターゲティング構築物による標的破壊および置換を有する。非ヒトトランスジェニック動物または植物は、例えば、本発明の抗ＭＥＴ抗体の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方をコードするヌクレオチド配列を含み得る。好ましい態様では、トランスジェニック動物は、ヒトＭＥＴに特異的に結合する、重鎖および軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を含み、発現する。抗ＭＥＴ抗体または部分は、任意のトランスジェニック動物において作製することができる。好ましい態様において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマである。非ヒトトランスジェニック動物は、例えば、血液、乳汁、尿、唾液、涙、粘液および他の体液中に該コード化されたポリペプチドを発現することができる。
【０２１８】
医薬組成物
本発明の別の面は、本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分または抗ＭＥＴ抗体組成物を有効成分として（または、唯一の有効成分として）含む医薬組成物である。かかる医薬組成物は、任意の本明細書に記載の抗ＭＥＴ抗体組成物または抗体またはその抗原結合部分を含み得る。ある態様において、組成物は、ＭＥＴ介在性障害（例えば、ＭＥＴの過剰発現により特徴付けられる障害）および／または癌の改善、予防および／または処置を目的とする。任意の態様において、組成物は、非小細胞肺癌、胃癌、肝細胞癌、食道癌、結腸直腸癌、乳頭状腎細胞癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、前立腺癌、および／または副腎皮質癌の改善、予防、および／または処置を目的とする。
【０２１９】
一般に、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤（複数可）と共に製剤として投与されるのに適している。用語“賦形剤”は、本発明の化合物以外の任意の成分を記載するために本明細書中で使用される。賦形剤（複数可）の選択は、特定の投与様式、溶解性および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに剤形の性質などの要因に依存する。本明細書で用いる、“薬学的に許容される賦形剤”には、生理学的に適合性である任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される賦形剤の一例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせがある。多くの場合、例えば、組成物中にマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの、糖類、ポリアルコールなどの等張剤を含むことが好ましい。薬学的に許容される物質のさらなる例は、湿潤剤、および抗体の貯蔵寿命または有効性を向上させる湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの少量の補助物質である。
【０２２０】
本発明の医薬組成物およびその製造方法は、当業者には容易に明らかであろう。このような組成物およびそれらの製造方法は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995）に見いだされ得る。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ（適正製造基準）条件下で製造される。
【０２２１】
本発明の医薬組成物は、単一単位用量として、または単一の単位用量を複数として、バルクで調製、包装、または販売され得る。本明細書で用いる“単位用量”は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、対象に投与される有効成分の投与量にほぼ等しいか、またはそのような投与量の好都合な一部、例えば、半分または３分の１のような用量である。
【０２２２】
当技術分野で許容されるペプチド、タンパク質または抗体を投与するための任意の方法は、本発明の抗体および抗原結合部分に適切に使用することができる。
【０２２３】
本発明の医薬組成物は、一般的に、非経腸投与に適する。本明細書で用いる、医薬組成物の“非経腸投与”には、対象の組織の物理的なブリーチングおよび組織内のブリーチ（breach）を経て医薬組成物を投与することにより、一般的に直接投与で、血流、筋肉内、または内臓へ投与することにより特徴づけられる任意の投与経路が含まれる。従って、非経腸投与は、組成物の注射による、外科的切開を介して組成物を適用することによる、組織貫通非外科的創傷を通しての組成物の適用などによる、医薬組成物の投与を含むが、これらに限定されない。特に、非経腸投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、滑液嚢内注射または注入；および、腎臓透析注入技術が含まれるように意図されるが、これらに限定されない。局所灌流もまた意図される。好ましい態様には、静脈内および皮下経路が含まれる。
【０２２４】
非経腸投与に適する医薬組成物の製剤は、一般的に、滅菌水または滅菌等張生理食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた有効成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製、包装または販売され得る。注射用製剤は、例えばアンプルまたは防腐剤を含む多用量容器のように、単位投与量形態で調製、包装、または販売され得る。非経腸投与のための製剤としては、油性または水性ビークル、ペーストなどの、懸濁液、溶液、エマルジョンが含まれるが、これらに限定されない。かかる製剤はさらに、懸濁剤、安定剤、または分散剤を含むが、これらに限定されない、１以上の追加の成分を含んでもよい。非経腸投与のための製剤の一態様において、有効成分は、再構成される組成物の非経腸投与前に適切なビークル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で再構成するための乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。非経腸製剤はまた、塩、炭水化物および緩衝剤などの賦形剤を含有してもよい水溶液（好ましくはｐＨ３から９）を含むが、いくつかの用途のために、それらがより適切に無菌の非水性溶液として製剤され得るか、または無菌の、発熱物質を含まない水などの適切なビークルと共に使用される乾燥形態として製剤され得る。非経腸投与形態の例としては、溶液または懸濁液の無菌水溶液中、例えば、水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液が挙げられる。所望であれば、このような投与量形態は、適切に緩衝され得る。有用である他の非経腸的に投与可能な製剤には、微結晶形態の有効成分を含むもの、またはリポソーム調製物中に有効成分を含むものが含まれる。非経腸投与のための製剤は、即時型および／または変更型の放出がなされるように製剤することができる。変更型放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的指向性放出、およびプログラム放出が含まれる。
【０２２５】
例えば、一面において、無菌の注射用溶液は、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に必要量で、抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分または抗ＭＥＴ抗体組成物を組み込み、必要に応じて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒体および上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌ビークル中に有効化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分の粉末に加えて、予め濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、また、分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また、界面活性剤を使用することによって、維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、その組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩やゼラチンを含めることによって、および／または放出調節コーティング（例えば、徐放性コーティング）を用いることによって行うことができる。
【０２２６】
本発明の抗体はまた、鼻腔内にまたは吸入によって投与することができ、一般的には、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末の形態（混合物として、単独で、または混合成分粒子として、例えば、好適な薬学的に許容される賦形剤と混合した形態）で、適切な噴射剤を使用してまたは使用せずに、経鼻などの加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは微細な霧を生成するために電気流体力学を用いるアトマイザー）、または適切な噴射剤を使用しもしくは使用しないネブライザーとして、または、点鼻液として投与され得る。
【０２２７】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは、一般的に、例えば、分散、可溶化または有効成分の放出を延長するのに好適な薬剤、溶媒としての噴射剤（複数可）を含む、本発明の抗体の溶液または懸濁液を含む。
【０２２８】
乾燥粉末または懸濁液製剤における使用に先立って、薬剤製品は、一般的に、吸入による送達に適した大きさ（一般的には５ミクロン未満）に微粉化される。これは、スパイラルジェットミリング、流動床ジェットミリング、ナノ粒子を形成するための超臨界流体プロセシング、高圧均質化、または噴霧乾燥などの任意の適切な粉砕方法によって行うことができる。
【０２２９】
インヘイラーまたはインサフレーター（例えば、ゼラチンまたはＨＰＭＣ製）において使用するためのカプセル剤、ブリスター剤およびカートリッジ剤は、本発明の化合物、適切な粉末ベースおよび動作調整剤の粉末ミックスを含有するように製剤化することができる。
【０２３０】
細かい霧を発生するための電気流体力学を用いるアトマイザーにおいて使用するのに適している溶液製剤は、１動作につき好適な用量の本発明の抗体を含有することができ、動作容積は、１μｌから１００μｌまで変化させ得る。
【０２３１】
吸入／鼻腔内投与を目的とする本発明の製剤には、メントールおよびレボメントールなどの適当な香味剤、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味剤を添加することができる。
【０２３２】
吸入／鼻腔内投与のための製剤は、即時型放出および／または調節型放出であるように製剤化することができる。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出およびプログラム放出が含まれる。
【０２３３】
乾燥粉末吸入器およびエアロゾルの場合に、投与量単位は、計量された量を送達するバルブによって決定される。本発明による単位は、一般的には、本発明の抗体の計量された用量、または“一吹き（puff）”を投与するように設計される。全体の１日用量は、一般的には単回用量で投与されるか、またはより通常には、１日を通して分割用量として投与される。
【０２３４】
本発明の抗体および抗体部分はまた、経口投与用に製剤され得る。経口投与は、化合物が胃腸管に入るような嚥下を、かつ／または化合物が口から直接、血流に入る頬、舌または舌下投与を含んでもよい。
【０２３５】
経口投与に適している製剤には、錠剤などの固体、半固体および液体系；多成分粒子もしくはナノ粒子、液体または粉末を含有する軟質または硬質カプセル；ロゼンジ（液体充填を包含）；チューイング剤；ゲル；急速分解投与形態；フィルム；卵形剤；スプレー；ならびに頬／粘膜接着パッチが包含される。 液体製剤には、懸濁剤、液剤、シロップおよびエリキシルが包含される。
【０２３６】
液体製剤には、懸濁剤、液剤、シロップおよびエリキシルが包含される。このような製剤を、軟質または硬質カプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース製）中の充填剤として使用することもでき、一般的には、担体、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロースまたは適切なオイルならびに１種または複数の乳化剤および／または懸濁化剤を含む。液体製剤はまた、固体、例えばサシェからの再構成により調製することもできる。
【０２３７】
免疫複合体
本発明の抗体組成物および抗体およびその抗原結合部分の治療的使用のための別のオプションは、免疫複合体の形態であり、すなわち、抗体またはその抗原結合部分と、抗がん剤などの１つまたは複数の薬剤音の複合体である。２以上の抗ＭＥＴ抗体を含む本発明の組成物は、免疫複合体の形態で単一の抗体を含んでもよく、またはそれらは、免疫複合体の形態で２以上の抗体を含んでいてよい。
【０２３８】
細胞毒性物質（例えば、従来の化学療法剤および他の小分子抗癌剤）、サイトカイン（この場合、コンジュゲートは“イムノサイトカイン”と称し得る）、毒素（この場合、コンジュゲートを“免疫毒素”と称し得る）および放射性核種などを含む様々な種類の抗癌剤を、本発明の抗体に結合させることができる。少数の免疫複合体は既に臨床使用に関して承認されている。これらには、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（９０Ｙに結合したマウス抗ＣＤ２０抗体）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（１３１Ｉに結合したマウス抗ＣＤ２０抗体）およびＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（カリケアマイシンに結合したヒト化抗ＣＤ３３抗体）が含まれる。臨床試験で検討されている他の免疫複合体には、例えばドキソルビシンまたはメイタンシノイド化合物に結合した抗体が含まれる。臨床治験で検討されている免疫毒素には、切頭型シュードモナス外毒素Ａに結合したいくつかの抗体が含まれる。ＩＬ−２に結合したヒト化ＥｐＣＡＭ抗体を含む免疫サイトカインも試験されている。
【０２３９】
細胞毒性剤に結合させた本発明の抗体の場合、これらは、例えば、アルキル化剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、カペシタビン、ゲムシタビン）、アントラサイクリン（例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ）ならびに植物アルカロイド（例えばドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン類、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド類）を含む、化学療法剤の主要なクラスのいずれかに属し得る。免疫複合体の使用は、抗癌剤を腫瘍に特異的に向かわせるため、本発明の抗体に基づく免疫複合体は、有利には、カリケアマイシンもしくはメイタンシン誘導体などの高度細胞毒性剤、または細菌毒素（例えばシュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素）もしくは植物毒素（例えばリシン）などの毒素に基づき得る。
【０２４０】
免疫複合体中の結合した抗癌剤は、一般に、血清中では比較的安定であるが、免疫複合体が標的細胞内にインターナライズされたときに薬物の放出を可能にする、不安定なリンカーによって抗体に連結される。好適なリンカーとしては、例えば、血清中の中性ｐＨでは安定であるが、インターナリゼーション後にリソソーム内の弱酸性条件下で酸加水分解を受ける化学的リンカー、細胞内チオールによって切断されるジスルフィドリンカー、および血清中で安定であるが、細胞内区画では酵素切断を受けるペプチドリンカーが挙げられる。
【０２４１】
種々の結合方法が、本発明の２またはそれ以上の抗体を含む組成物において想定され得る。例えば、２つの抗体に関しては、抗体を２もしくはそれ以上の異なる抗癌剤に結合するか、または一方の抗体を、他方の抗体に結合した酵素などの作用物質によって活性化されるプロドラッグに結合することが可能である。抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）の一般的な概念が、モノクローナル抗体に関して記載されており、ここでは、ｍＡＢ−酵素複合体により腫瘍に対して標的化された酵素によってプロドラッグが活性化されるが、本発明は、この方法を特定の条件に適合させる可能性を提供し得る。故に、正常組織への損傷を回避または低減しつつ、腫瘍細胞の死滅を特異的に増大させることが可能であり得る。
【０２４２】
抗癌性免疫複合体に関するさらなる情報については、Wu et al., Nature Biotechnology 23(9):1137-1146 (2005); Schrama et al., Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159 (2006); and Rohrer, Chimica Oggi/Chemistry Today 27(5):56-60 (2009)を参照のこと。
【０２４３】
本発明の抗体および組成物の治療的使用
一面において、本発明の抗ＭＥＴ抗体およびその抗原結合部分および抗ＭＥＴ組成物は、ＭＥＴ介在性障害の処置に使用される。ある態様において、ＭＥＴ介在性障害とは、ＭＥＴの過剰発現により特徴付けられる状態である。任意の態様において、医薬組成物は、癌、例えば、非小細胞肺癌、胃癌、肝細胞癌、食道癌、結腸直腸癌、乳頭状腎細胞癌、グリア芽腫、副腎皮質癌、腎細胞癌、前立腺癌、およびＭＥＴを発現するかもしくは過剰発現するかまたはＭＥＴ経路活性化に依存する他の癌の処置に使用するためのものである。
【０２４４】
ある面において、抗体または抗体組成物は、異常なＭＥＴの過剰活性によって特徴付けられる、癌などの疾患を治療するために使用される。ある態様において、異常な過剰活性は、遺伝子増幅、タンパク質の過剰発現、ＭＥＴ活性化遺伝子変異（例えば、点突然変異または異常な遺伝子スプライシング事象）、またはＨＧＦの過剰発現から生じる。
【０２４５】
特定の面において、本発明の抗ＭＥＴ抗体およびその抗原結合部分および抗ＭＥＴ組成物は、別のチロシンキナーゼ受容体を標的とする薬剤による治療に耐性である患者を治療するために使用することができる。ある態様において、患者は、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤による治療に耐性である。任意の態様において、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４を標的とする。特定の態様において、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲを標的とする。別の態様では、ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤は、ＨＥＲ３を標的とする。ＥｒｂＢキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パンティヌムマブ（pantinumumab）、トラスツマブ、またはそれらの任意の組合せから選択され得る。
【０２４６】
“処置する(treat)”、“処置(treating)”および“処置(treatment)”は、生物学的障害および／またはその付随する症状の少なくとも１つを緩和または抑止する方法を意味する。本明細書で用いる、疾患、障害または病状の“軽減”は、疾患、障害、または病状の症状の重症度および／または発生頻度を低下させることを意味する。さらに、本明細書での“処置(treatment)”への言及は、治癒的、緩和的および予防的治療への言及を含む。
【０２４７】
一面において、処置の対象、または患者は、哺乳動物、好ましくはヒト対象である。該対象は、男性または女性のいずれであっても、いかなる年齢であってもよい。
【０２４８】
“治療的有効量”とは、治療される障害の症状の１以上をある程度に軽減するとき、投与される治療薬の量を意味する。
【０２４９】
本発明の治療用組成物中の個々の抗体の間の比、または同時に投与される本発明の個々の抗体の場合には、連続的にまたは別々に、多くの場合、抗体は等量で投与されるが、必ずしもそうである必要はない。したがって、２つの抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分を含む本発明の組成物は、多くの場合約１：１の比でそれらを含有し得るが、個々の抗体の特性に応じて、抗体またはその部分の非均等量で使用することが望ましい。例えば、２つの抗体組成物中の別の抗体またはその部分に対する１つの抗体またはその部分の割合は、例えば、５から９５％の間、１０から９０％の間、２０から８０％の間、３０から７０％の間、４０から６０％の間、または４５から５５％の間である。
【０２５０】
本発明の抗体組成物または抗体または抗原結合部分は、単独で、または１以上の他の薬物もしくは抗体（またはそれらの任意の組み合わせなど）と組み合わせて投与され得る。したがって、以下に詳述するように、本発明の医薬組成物、方法および使用はまた、他の活性剤との組み合わせ（同時投与）の態様を包含する。
【０２５１】
１またはそれ以上の他の治療剤とその抗体組成物および抗体および抗原結合部分を参照して、本明細書で用いる用語“共投与（co-administration）”および“併用投与”は、以下を意味し、包含することを意図する：
−処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分および治療剤(複数可)のこのような組み合わせの同時投与であって、かかる成分が単一剤形に共に製剤されるとき、該患者に実質的に同時に該成分が放出される、
−処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分および治療剤（複数可）のこのような組み合わせの実質的同時投与であって、かかる成分が互いに別個の剤形に分離して製剤されるとき、該患者に実質的に同時に投与されることにより、該患者に実質的に同時に該成分が放出される、
−処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分および治療剤（複数可）のこのような組み合わせの連続投与であって、かかる成分が互いに別個の剤形に分離して製剤されるとき、各投与間に有意な時間間隔で該患者に連続で投与されることにより、該患者に実質的に異なる時間に該成分が放出される；および、
−処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分および治療剤（複数可）のこのような組み合わせの連続投与であって、かかる成分が単一剤形に共に製剤されるとき、該成分が制御された様式で放出されることにより、それらが該患者に同時に、連続して、ならびに／または同時におよび／または異なる時間に重複して放出されて、各部分が同一または異なる経路のいずれかによって投与され得る。
【０２５２】
本発明の抗体組成物および抗体およびその抗原結合部分は、独立型療法として、すなわち、追加の治療的処置なしで投与され得る。あるいは、本発明の抗体組成物および抗体およびその抗原結合部分を用いた治療は、少なくとも一つの追加の治療的処置（併用療法）を含んでいてよい。ある態様において、抗体組成物または抗体またはその抗原結合部分は同時投与され得るか、または癌を治療するための別の薬物／薬物と共に製剤され得る。類かの治療的処置は、例えば、化学療法剤、抗腫瘍剤、または抗血管形成剤、別の抗癌抗体、および／または放射線療法を含み得る。
【０２５３】
本発明の抗体組成物、抗体、または抗原結合部分と癌細胞の最終分化を誘導することが知られている薬剤との組合せにより、効果をさらに向上させることができます。そのような化合物は、例えば、レチノイン酸、ｔｒａｎｓ−レチノイン酸、ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニル酪酸、神経増殖因子、ジメチルスルホキシド、活性型ビタミンＤ３、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート、ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド、トランスフォーミング増殖因子−ベータ、酪酸、サイクリックＡＭＰ、およびベスナリノンからなる群より選択され得る。
ある態様において、化合物は、レチノイン酸、フェニル酪酸、オールトランスレチノイン酸および活性型ビタミンＤからなる群より選択される。
【０２５４】
本発明の抗ＭＥＴ抗体組成物または抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分および少なくとも１種の他の薬剤を含む医薬品は、癌療法において、同時、個別または連続投与のための併用処置として使用され得る。化学療法化合物としては、問題の特定の癌の処置に適する任意の化学療法剤、例えば、アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチンおよび／またはオキサリプラチンなどの白金誘導体；植物アルカロイド(alkoid)、例えばパクリタキセル、ドセタキセルおよび／またはイリノテカン；抗腫瘍抗生物質、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン(luteomycin)および／またはマイトマイシン；トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ならびに／または、代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシルおよび／または他のフルオロピリミジンからなる群より選択される薬物であり得る。
【０２５５】
また、本発明の抗ＭＥＴ抗体またはその抗原結合部分または抗ＭＥＴ抗体組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に関連する補助療法において使用され得ることも考えられる。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、細胞内Ｍｇ−ＡＴＰ部位に関して競合することによりリガンド誘導性受容体リン酸化を阻害する、合成の、主にキナゾリン由来の低分子量分子である。従って、本発明の抗体組成物およびＭＥＴを標的とする少なくとも１種のＴＫＩを含む医薬品は、癌療法における同時、別個または連続投与のための併用処置としても使用され得る。
【０２５６】
任意の面において、本発明の抗体組成物および抗体およびその抗原結合部分は、ＭＥＴまたはＨＧＦを標的とし得る、ＭＥＴ経路の別の阻害剤と併用投与され得る。ある態様において、該阻害剤は、ＡＭＧ１０２、ＡＭＧ２０８、ＡＭＧ４５８、ＡＲＱ１９７、ＡＶ２９９、ＢＡＹ−８５３４７４、ＣＧＥＮ２４１、ＤＮ３０、Ｅ７０５０、ＥＭＤ１２０４８３１、ＥＭＤ１２１４０６３、ＩＮＣＢ２８０６０、ＪＮＪ３８８７７６０５、Ｋ２５２ａ、ＬＹ−２８７５３５８、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−２４６１、ＭＰ−４７０、ＮＫ４、ＯＡ−５Ｄ５、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＧＸ−５２３、ＳＵ５４１６、ＳＵ１１２７４、ＴＡＫ７０１、ＸＬ１８４、ＸＬ８８０、カボザンチニブ、クリゾチニブ、フィクラツズマブ、フェレチニブ（foretinib）、ゴルバチニブ（golvatinib）、オナルツズマブ(onartuzumab)、リロツムマブ（rilotumumab）、およびチバンチニブからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【０２５７】
ある態様において、本発明の抗体組成物および抗体およびその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ阻害剤（例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ）またはヒートショックプロテイン９０（ｈｓｐ９０）阻害剤（例えば、１７−ＡＡＧ）と併用投与され得る。
【０２５８】
他の態様において、本発明の抗体組成物および抗体およびその抗原結合部分は、例えばＶＥＧＦに対する抗体（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））と組み合わせて使用し得る。さらに他の態様では、本発明の抗体組成物は、免疫系の細胞を刺激することが知られている薬物と組み合わせて使用してもよく、そのような併用処置は、本発明の抗体組成物の効果の免疫介在性増強をもたらす。そのような免疫刺激剤の例としては、組換えインターロイキン（例えばＩＬ−２１およびＩＬ−２）が挙げられる。
【０２５９】
本発明の抗体組成物および抗体およびその抗原結合部分は、上記の通り治療法に使用することができ、上記の通り治療に使用するためのものであってよく、および／または、上記の通り治療のための薬剤の製造における使用のためのものであってよいことが理解される。
【０２６０】
用量および投与経路
本発明の抗体組成物は、問題の病状の処置に有効な量で、すなわち所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で投与され得る。治療的有効量は、処置される特定の病状、患者の年齢、性別および体重などの因子、ならびに抗体が単独処置として投与されるか、または１もしくはそれ以上の付加的な抗癌処置剤と組み合わせて投与されるかによって異なり得る。
【０２６１】
投与量レジメンは、最適な所望の治療応答を提供するために調整され得る。例えば単回ボーラスとして投与されるか、いくつかの分割用量を経時的に投与されるか、または治療対象の緊急性によって指示される投与量の減少または増加を伴って投与され得る。投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位形態で非経腸組成物を製剤することがとりわけ有利である。本明細書で用いる、投与量単位形態とは、治療される患者／対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位；必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の有効化合物を含む各単位、を意味する。本発明の投与量単位形態の仕様は、一般的に、（ａ）化学療法剤の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためのそのような有効化合物の調合の技術分野に固有の制限に左右され、それらに直接依存する。
【０２６２】
従って、当業者は本明細書で提供される開示に基づいて、用量および投与レジメンが療法の技術分野において周知の方法に従って調整されることを理解しているであろう。すなわち、最大耐用量は容易に確立することができ、患者に検出可能な療法的利益をもたらす有効量も決定することができ、それぞれの薬剤を投与して検出可能な療法的利益を患者に提供するための時間的要件も決定することができる。従って、本明細書において特定の用量および投与レジメンが例示されるが、これらの例は本発明の実施において患者に提供することができる用量および投与計画を一切限定しない。
【０２６３】
投与量の値は緩和すべき病状のタイプおよび重篤度により様々であってよく、それには１回量または複数回用量が含まれてよいことは特記すべきである。さらに、あらゆる特定の対象に関して、具体的な投与量レジメンは個々の要求およびその組成物を投与する、またはその投与を監督する人の専門的な判断に従って時間の経過に伴って調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載の投与量範囲は例示的なものでしかなく、特許請求される組成物の範囲または実用を制限することを意図していないことは理解されるべきである。さらに、本発明の組成物を用いる投与量レジメンは、疾患の種類、患者の年齢、体重、性別および医学的状態、病状の重篤度、投与経路、ならびに用いる特定の抗体を含む種々の要因に基づき得る。従って、投与量レジメンは広範に変化し得るが、標準的な方法を用いて常套的に決定することができる。例えば、用量は、薬物動態学的または薬力学的パラメータに基づいて調整されてよく、それには毒性作用および／または臨床検査値のような臨床作用が含まれ得る。従って、本発明は当業者により決定されるような患者内の用量の段階的増大を包含する。適切な投与量およびレジメンの決定は関連する技術分野において周知であり、当業者は一度本明細書で開示される教示を提供されればそれが包含されることを理解し得る。
【０２６４】
本発明の抗体組成物の好適な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であると考えられる。抗体組成物は、例えば、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、および例えば最大５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大３０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大２０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大１５ｍｇ／ｋｇまでの投与量で投与され得る。投与は、通常は好適な間隔で、例えば週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、担当医師が適切と判断する期間に亘って繰り返され、担当医師は場合により必要に応じて用量を増加または減少させ得る。
【０２６５】
腫瘍治療のための有効量は、患者において疾患の進行を安定化させる、および／または症状を改善する、好ましくは、例えば腫瘍サイズを縮小することによって、疾患の進行を止めるその能力によって測定され得る。癌を阻害する本発明の抗体または組成物の能力は、例えば実施例に記載の通り、インビトロアッセイによって、ならびにヒト腫瘍における効果を予測する好適な動物モデルにおいて評価され得る。好適な投与量レジメンは、個々の特定状況において最適の治療応答を提供するために選択され、例えば単回ボーラスとしてまたは持続点滴として、および場合によりそれぞれの症例の緊急性によって指示される投与量の調整を伴って投与される。
【０２６６】
診断的使用および組成物
本発明の抗体はまた、診断的方法において有用である（例えば、インビトロ、エキソビボ）。例えば、抗体は、患者からのサンプル（例えば、組織サンプル、または炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液、もしくは尿のような体液サンプル）中のＭＥＴのレベルを検出および／または測定するために使用可能である。好適な検出および測定方法としては、フローサイトメトリー、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光分析法、放射免疫測定法、および免疫組織学のような免疫学的方法が挙げられる。本発明はさらに、本明細書に記載の抗体を含む複数部分のキット（例えば、診断用キット）を包含する。
【０２６７】
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみの目的であり、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２６８】
本明細書中に記載される全ての文献、特許および特許出願は、引用により本明細書中に包含される。上記の発明は理解を明確にする目的のために例示および実施例によっていくらか詳細に説明してきたが、本発明の教示を考慮して当業者に容易に明らかなように、特定の変更および修正が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の範囲内において行われ得る。
【実施例】
【０２６９】
実施例
実施例１：抗ＭＥＴ抗体のクローニング
抗ＭＥＴ抗体は、ＷＯ２００５／０４２７７４に記載の通り、本質的にＳｙｍｐｌｅｘ(商標) を用いて得た。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７およびＣ３Ｈマウスを、ＭＥＴを過剰発現するヒト癌細胞株（ＨＣＴ−１１６）、組換えヒトＭＥＴタンパク質（Sino Biologicals）、リガンド（ＨＧＦ）と予めインキュベートした組換えヒトＭＥＴタンパク質、またはトリプシン消化したＭＥＴを用いて隔週で免疫化した。脾臓および鼠径リンパ節から得られたマウス血漿細胞をＦＡＣＳで選別し、ＶＨおよびＶＬをコードする配列の連鎖は、選別された血漿細胞上で遂行され、一段階の多重オーバーラップ・エクステンションＲＴ−ＰＣＲ、その後のネステッドＰＣＲに基づく二段階ＰＣＲ手順を利用して、配列の同族の対合を促進させた。同族のＶＨおよびＶＬ配列の連鎖のための原理は、ＷＯ２００５／０４２７７４およびMeijer et al., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)に詳細に記載されている。
【０２７０】
ＭＥＴに対する結合特異性を有する抗体を同定するために、上記で得られたＶＨおよびＶＬをコードする配列を、全長の抗体として発現させた。これは、ＷＯ２０１２／０５９８５８に記載の方法を用いて、発現ベクターにＶＨおよびＶＬをコードする対のレパートリーを挿入し、そして宿主細胞にトランスフェクションすることを含む。
【０２７１】
産生された抗体の特異性は、ＭＥＴタンパク質の細胞外ドメインまたはヒト免疫グロブリンＦｃドメインに翻訳的に融合したＭＥＴタンパク質の細胞外ドメインの何れかを抗原として用いてＥＬＩＳＡにより決定した。Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（カタログ番号４６４７１８）を、４℃で一晩、ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えＭＥＴタンパク質でコーティングした。プレートを、５０μｌの２％ミルク−ＰＢＳ−Ｔでブロッキングする前に、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で１回洗浄した。プレートをＰＢＳ−Ｔで再度洗浄し、次いで、２０μｌの２％ミルク−ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３トランスフェクタントからの上清１０μｌを添加し、室温で１時間インキュベートし、その後、プレートをＰＢＳ−Ｔで１回洗浄した。２％ミルク−ＰＢＳ−Ｔで１：２５０００希釈した二次抗体（ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトκ軽鎖、Ｓｅｒｏｔｅｃ社、カタログ番号ＳＴＡＲ  １００Ｐ）を、ウェルに結合した抗体を検出するために添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで１回洗浄し、次いで、２５μｌの基質（Kem-En-Tec Diagnostics、カタログ番号４５１８）を添加し、５分間インキュベーションした。インキュベーション後に２５μｌの１Ｍ硫酸を添加して反応を停止した。特異的シグナルを４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー上で検出した。ＥＬＩＳＡデータから、陽性の抗体クローンを同定し、配列分析およびＭＥＴへの結合の検証のために選択した。
【０２７２】
実施例２：機能的抗ＭＥＴ抗体混合物のスクリーニング
本実施例は、リード候補を同定するための、ＭＥＴを標的とするキメラモノクローナル抗体およびこれらのモノクローナル抗体の混合物のインビトロでの試験を記載する。モノクローナル抗体および混合物は、癌細胞株ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＯＥ３３およびＳＮＵ５の増殖を阻害する能力について評価した。
【０２７３】
方法
ヒトのＭＥＴを標的とするマウス由来の抗体を、ヒト癌細胞株のインビトロでの増殖を阻害するそれらの能力についてアッセイした。モノクローナル抗体および２−抗体混合物（２つのモノクローナル抗体の１：１混合物）を、２％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを添加したＲＰＭＩ１６４０グルタマックス培地中、１００μｇ／ｍｌの最終総抗体濃度に希釈して、５μｇ／ｍｌの終濃度を得た。その後、適切な数の細胞（ＥＢＣ１：１５００細胞／ウェル、ＭＫＮ４５：２０００細胞／ウェル、ＯＥ３３  ４３００細胞／ウェルおよびＳＮＵ５：８００細胞／ウェル）を、３８４ウェルプレート中の試験プレートに添加し、抗体と共に、加湿インキュベーター中で３７℃にて４日インキュベートした。その後、ＷＳＴ−１試薬をプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍ（基準波長）で測定した。６２０ｎＭでの吸光度を４５０ｎＭでの吸光度から差し引いた。代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を、以下のように未処理対照の割合として計算した：
【化１】
2017534259.tif 000004
代謝活性は生存細胞の数と相関し、より低い％ＭＡＣは抗体によるより高いレベルの細胞増殖阻害に対応することを意味すると考えられる。
【０２７４】
結果
抗体混合物は、癌細胞株のパネル間の細胞増殖を阻害するそれらの能力に基づいてランク付けした。細胞株ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＯＥ３３およびＳＮＵ５の代謝活性に対するモノクローナル抗体および２つの抗体の混合物の生存率の結果を、表３に示す。７つの異なる混合物が、平均５０％未満に代謝活性を阻害する。
【０２７５】
最も効果的な混合物のうち、２つの抗体９００６および９３３８の組み合わせが、広範な細胞増殖阻害活性を示した。興味深いことに、各抗体単独は、組み合わせよりも低い効果を示し、２つの抗体が相乗的に作用し得ることが示唆された。９００６＋９３３８に加えて、他の高度に効果的な混合物としては、９２０６＋９２３２、８９５５＋９３３８、９２０６＋９３３８、９００６＋９２３２、８９５５＋９００６、８９５５＋９０９６および８９５５＋９２３２が挙げられることが表３から分かる。さらに、これらの上から８つの混合物が、比較的少数の個々のモノクローナル抗体、特に８９５５、９００６、９２３２、９３３８および９２０６に基づいていることは明らかである。
【０２７６】
【表３】
2017534259.tif 000005
【化２】
2017534259.tif 000006
【化３】
2017534259.tif 000007
【化４】
2017534259.tif 000008
【化５】
2017534259.tif 000009
【化６】
2017534259.tif 000010
【化７】
2017534259.tif 000011
【０２７７】
実施例３：９００６および９３３８抗体のヒト化
本実施例は、９００６および９３３８抗体のマウス抗体フレームワーク領域のヒト化について記載する。抗体のヒト化は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに適用したとき、最小限の免疫原性を有する分子を作製するために実施される。
【０２７８】
方法
９００６および９３３８抗体のヒト化を、“ＣＤＲ移植”アプローチを用いて行った。まず初めに、元のマウス生殖細胞系遺伝子を、マウス生殖細胞系ＶおよびＪ遺伝子データベースに対して９００６（図２６）および９３３８（図２７）のＶ遺伝子配列をブラスト検索することによって同定した。これは、最も近いマウス生殖細胞系遺伝子は、９００６のアミノ酸配列の可変重鎖および可変軽鎖遺伝子についてＩＧＨＶ９−１＊０２／ＩＧＨＪ４＊０１およびＩＧＫＶ８−２８＊０１／ＩＧＫＪ２＊０１であることを示唆した。同様に、最も近いマウス生殖細胞系遺伝子は、９３３８のアミノ酸配列の可変重鎖および可変軽鎖遺伝子についてＩＧＨＶ１−４＊０１／ＩＧＨＪ３＊０１およびＩＧＫＶ４−７９＊０１／ＩＧＫＪ４＊０１であった。第二に、抗体ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、抗体の機能および／または構造において役割を果たし得るフレームワーク領域内の体細胞突然変異を同定するために、マウス生殖細胞系に対してアラインさせた。このような残基は、所謂“復帰突然変異”残基として最終ヒト化抗体遺伝子に含まれ得る。その後、９００６および９３３８の可変抗体配列をヒト免疫グロブリンデータベースに対してブラスト検索して、そのフレームワーク領域が抗体のヒト化のために使用され得る最も近いヒト生殖細胞系を同定した。抗体９００６について、保持されたヒト生殖細胞系は、可変重鎖および可変軽鎖遺伝子のそれぞれについてＩＧＨＶ７−４−１＊０２／ＩＧＨＪ６＊０１およびＩＧＫＶ４−１＊０１／ＩＧＫＪ２＊０１であった。抗体９３３８について、保持されたヒト生殖細胞系は、可変重鎖および可変軽鎖遺伝子のそれぞれについてＩＧＨＶ１−６９＊０８／ＩＧＨＪ１＊０１およびＩＧＫＶ３−１１＊０１／ＩＧＫＪ２＊０１であった。最後に、各抗体について、キメラ抗体由来のＣＤＲ領域を、選択したヒトフレームワークおよびＪ遺伝子セグメント中に移植した。ＣＤＲ配列をＩＭＧＴ(登録商標)に従って定義づけた。
【０２７９】
結果
最終的なヒト化９００６および９３３８抗体配列を、それぞれ図２８および図２９に示す。
【０２８０】
実施例４：抗ＭＥＴ対照抗体類縁体のクローニング
本実施例は、アミノ酸配列の供給源および抗ＭＥＴ対照抗体の類縁体の作製に使用される最終的な抗体フォーマットを示す。列挙された抗体のいくつかは、広範囲に特徴付けられ、明確に定義されたエピトープを有している。数多くの抗体が臨床評価に入っている。
【０２８１】
方法
表４の抗体類縁体の可変重鎖および軽鎖ドメインをコードするアミノ酸配列を、列挙された特許または特許出願から得た。タンパク質配列は、ヒトのコドン対比表を用いてＤＮＡ配列に逆変換した。対応するＤＮＡ配列を遺伝子合成し、完全長抗体の発現をもたらす、一定のヒト重鎖または軽鎖ドメインを含有する発現ベクターにクローニングした。唯一の例外は、Ｆａｂ断片として発現させた５Ｄ５抗体である。発現のために選択したヒト抗体アイソタイプは、適用可能なＦｃ領域に導入された追加の突然変異と共に抗体フォーマットカラムに表示される。ＣＨＯ細胞を、標準的なハイブリドーマ培養技術を用いて増殖させた、ハイブリドーマクローンＨＢ−１２０９３を除いて、標準的なタンパク質発現システムを使用して、対応する発現プラスミドでトランスフェクトした。対応する抗体上清を、標準的なプロテインＡ精製カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
【０２８２】
【表４】
2017534259.tif 000012
【０２８３】
実施例５：ＭＥＴ抗体のエピトープビニング（epitope binning）
本実施例は、ＭＥＴ抗体がペアごとの競合パターンに基づくエピトープビン(bin)にグループ分けを示す。異なるエピトープビンに属する抗体はＭＥＴ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上の異なるエピトープを認識する。
【０２８４】
方法
ペアごとの抗体競合の調査を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４機器（Fortebio, USA）を用いてバイオレイヤー干渉法（BioLayer Interferometry: BLI）分析によって行った。市販のヒトＭＥＴ Ｆｃ融合タンパク質（R＆D Systems）を、抗ヒトＦｃセンサーチップ（Fortebio, USA）およびハーセプチン陰性対照抗体でブロックした残余の抗Ｆｃ部位上に捕捉した。抗原コーティングされた表面を、８０μｇ／ｍｌの抗ＭＥＴ抗体濃度で飽和させ、その後、競合結合試験でペアごとの抗ＭＥＴ抗体の組み合わせを評価した。センサー表面を１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）と共にインキュベーションして再生し、新たな競合サイクルに再利用した。
【０２８５】
結果
１３個の試験したＭＥＴ抗体の競合パターンを図１に示す。ＭＥＴ抗体は、１２の異なるエピトープビンのグループに分かれることが見いだされた。抗体Ｈｕ９００６は、Ｃ８−Ｈ２４１と重複する異なるエピトープに結合することが見いだされた。しかしながら、Ｃ８−Ｈ２４１も、Ｈｕ９３３８および３６Ｃ４によって阻止されたが、Ｈｕ９００６は阻止されなかったため、エピトープはＣ８−Ｈ２４１とは異なっていた。その結果、Ｈｕ９００６およびＣ８−Ｈ２４１は、異なるエピトープビンに割り当てられた。Ｈｕ９３３８のエピトープは、３６Ｃ４と重複し、両抗体は、試験したパネル内の他の抗体と同一の競合パターンを示し、これらは結果的に同じエピトープビンに割り当てられた。
【０２８６】
抗体２２４Ｇ１１、２８−ＭＥＴ、５Ｄ５、９２０６および１３−ＭＥＴは、いくつかの例では単一方向の阻害を示した。この観察された現象は、アロステリック効果によって引き起こされる可能性があり、繰り返し競合実験で観察された。
【０２８７】
実施例６：ＨＧＦリガンド遮断活性についてのＭＥＴ抗体の分析
本実施例は、抗ＭＥＴ抗体のパネルが、バイオレイヤー干渉法分析を用いて競合アッセイを行うことにより、ＨＧＦリガンド遮断活性について分析された方法を示す。
【０２８８】
方法
ＨＧＦリガンド遮断活性の検討を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４機器（Fortebio, USA）を用いて、バイオレイヤー干渉法（BioLayer Interferometry: BLI）分析によって行った。市販のヒトＭＥＴ Ｆｃ融合タンパク質（R＆D Systems）を、抗ヒトＦｃセンサーチップ（Fortebio, USA）およびハーセプチン陰性対照抗体でブロックした残余の抗Ｆｃ部位上に捕捉した。次に、抗原コーティングされた表面を、８０μｇ／ｍｌ（５３３ｎＭ）の抗ＭＥＴ抗体濃度（５Ｄ５Ｆａｂ断片は、２６．７μｇ／ｍｌ（５３３ｎＭ）に希釈された）で飽和させた。その後、抗体でＭＥＴを飽和した後、ＨＧＦリガンド遮断活性を、２０μｇ／ｍｌ（２２２ｎＭ）で試験したヒトＨＧＦリガンド（R＆D Systems）と共にインキュベートすることにより評価した。ハーセプチンＩｇＧ１を陰性対照抗体として使用した。
【０２８９】
結果
競合分析の結果を以下の表５に示す。抗体Ｈｕ９００６およびＨｕ９３３８は両方とも、ＨＧＦリガンド結合を約８０％阻害することが見いだされたが、５Ｄ５ Ｆａｂは、ＨＧＦ結合を完全に（１００％）阻害することが見いだされた。等モル濃度のＨｕ９００６およびＨｕ９３３８を混合したとき（８０μｇ／ｍｌの総濃度、５３３ｎＭ）、ＨＧＦリガンド結合は、約９０％阻害された。この結果、より効率的なＨＧＦリガンド遮断活性は、抗体Ｈｕ９００６とＨｕ９３３８を１：１で混合することにより得られた。抗体Ｃ８−Ｈ２４１および３６Ｃ４は、ＨＧＦリガンド結合をそれぞれ約８０％および７５％阻害することが見いだされたが、抗体１３−ＭＥＴおよび２８−ＭＥＴは、ＨＧＦ結合をそれぞれ約８０％および５０％阻害した。アゴニスト作用を示す抗体５８８２および陰性対照抗体ハーセプチンは、ＨＧＦ結合を阻害しなかった（３−７％のＨＧＦ結合阻害）。
【０２９０】
【表５】
2017534259.tif 000013
【０２９１】
実施例７：抗ＭＥＴ抗体のエピトープマッピング
本実施例は、本発明のＭＥＴ抗体の結合エピトープが、細胞上に発現されたキメラＭＥＴ構築物への結合を分析することにより、ＳＥＭＡ−αドメイン中のブレード（ｂｌａｄｅ）２または３にマッピングされた方法を示す。本実施例はまた、本発明の抗体のエピトープが、試験した対照抗体類縁体と如何に異なるかを示す。
【０２９２】
方法
ヒトＭＥＴ受容体は、９０７アミノ酸（残基２５−９３２）の細胞外ドメインからなる。該細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列によって定義された、ＳＥＭＡドメイン（残基２７−５１５）、システインに富むプレキシンセマフォリンインテグリンドメイン（ＰＳＩドメイン、残基５２０−５６１）および４つの免疫グロブリン様ドメインに細分され得る。ＩＰＴ１：ＡＡ５６３−６５５。ＩＰＴ２：ＡＡ６５７−７３９。ＩＰＴ３：ＡＡ７４２−８３６。ＩＰＴ４：ＡＡ８３７−９３２。ドメインの定義は、Gherardi et al., Proc Natl Acad Sci U S A.  100(21):12039-44 (2003) および Uniprot entry P08581に記載されている。ＳＥＭＡドメインは、７枚の羽根のプロペラ構造に折り畳まれた７つのβシート（ブレード）からなる（Stamos J. et al., EMBO J. 23:2325-2335. (2004)）。フリン切断部位は、αおよびβ鎖にＳＥＭＡドメインを分割する、位置３０７−３０８に存在する。ＳＥＭＡ−αドメインは、ブレード１−４から構成されるアミノ酸残基２７−３０７によりコード化され、ＳＥＭＡ−βドメインは、ブレード５−７から構成されるアミノ酸残基３０８−５１５によりコード化される。ＳＥＭＡ−αドメインは、ＨＧＦリガンドのβ鎖のための結合部位を含むが、ＨＧＦ  α鎖のＭＥＴ結合部位は、含まないままである（Merchant et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 110(32):E2987-96 (2013)）。僅かに１個のレポートが、ＭＥＴ  ＥＣＤのＩＰＴ３およびＩＰＴ４ドメインもまた、高親和性ＨＧＦ結合を仲介することを報告している（Basilico et al., J Biol Chem.  283(30):21267-21277 (2008))。
【０２９３】
ヒトＭＥＴアイソフォーム１のｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩからダウンロードした（受託番号ＮＭ＿０００２４５．２；アミノ酸配列は配列番号：１に示されている）。ヒトＭＥＴはまた、１９アミノ酸（ＳＴＷＷＫＥＰＬＮＩＶＳＦＬＦＣＦＡＳ（配列番号：２））が、ＩＰＴドメイン３のＳ７５５に置換される、異なるアイソフォーム（アイソフォーム２）に存在する。リーダーペプチド配列を含むアイソフォーム２のアミノ酸配列は、配列番号：２に記載されている。完全長ニワトリおよびマウスＭＥＴタンパク質配列は、ＮＣＢＩからダウンロードした（それぞれ、受託番号ＮＰ＿９９０５４３（配列番号：３）およびＮＰ＿０３２６１７（配列番号：４））。各ドメインまたはサブドメインを順次ニワトリのＤＮＡ配列で置換した、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のキメラヒト／ニワトリドメイン交換変異体は、完全なヒト、マウスまたはニワトリＭＥＴ ＥＣＤ遺伝子と共に合成された遺伝子であった。ＳＥＭＡドメインの７つのブレードの各々が順次ヒトからマウス配列に交換されたキメラ構築物もまた合成した。
【０２９４】
ブレード結合特異性を決定するために使用される構築物は、以下の通りであった（数字は、マウス配列に交換された配列を言う）：マウスブレード１：ＡＡ２５−８３。マウスブレード１−２：ＡＡ２５−１６２。マウスブレード１−３：ＡＡ２５−２３３。マウスブレード１−４：ＡＡ２５−２９５。マウスブレード１−５：ＡＡ２５−４３０。マウスブレード１−６：ＡＡ２５−４７９。マウスブレード１−７：ＡＡ２５−５１３。逆の構築物もまた作製した。マウスＰＳＩ−ＩＰＴ４：（ＡＡ５１５−９３２）。マウスブレード７−ＩＰＴ４：（ＡＡ４８０−９３２）。マウスブレード６−ＩＰＴ４：（ＡＡ４３１−９３２）。マウスブレード５ｂ−ＩＰＴ４：（ＡＡ３８２−９３２）。マウスブレード５ａ−ＩＰＴ４：（ＡＡ２９３−９３２）。マウスブレード４−ＩＰＴ４：（ＡＡ２３４−９３２）。マウスブレード３−ＩＰＴ４：（ＡＡ１６３−９３２）。マウスブレード２−ＩＰＴ４：（ＡＡ８４−９３２）。ブレード１−４は、ＳＥＭＡ−αサブドメインに位置し、ブレード５−７は、ＳＥＭＡ−βサブドメインに位置した。
【０２９５】
最近、ラマ（llama）配列がＭＥＴ ＳＥＭＡドメインのヒト配列と交換された他のキメラ構築物が報告された（Basilico C. et al. J. Clin Invest. 124:3172-3186 (2014)）。これらの構築物は、ラマＭＥＴ配列が一般に利用できなかったので、マウス配列がラマ配列の代わりに挿入された修飾を有する以外、同様に合成された。追加のキメラタンパク質の配列の定義は以下の通りである（ＡＡ番号は、マウス配列に交換された配列を言う）：ＬＳ１：ＡＡ２５−１２２、ＬＳ２：ＡＡ２５−２２４、ＬＳ３：ＡＡ２５−３１２、ＬＳ４：ＡＡ２５−３７１、ＬＳ５：ＡＡ２５−４７３。ＳＥＭＡ−αサブドメイン中のＬＳ１−３残基およびＳＥＭＡ−βサブドメイン中のＬＳ４−６。最後に、ＳＥＭＡ−αサブドメインにおけるヒトＭＥＴ ＥＣＤ配列の１５ＡＡが順次マウス配列に交換された構築物を、直鎖状エピトープのより詳細なマッピングのために合成した。構築物１０９−１２０について、１１アミノ酸のみをマウス配列に交換した。各構築物は、２アミノ酸が重複するように設計され、１５ＡＡまでの置換を有する全２２種の構築物が、ブレード１（ＡＡ８９−３１３）の後にヒトＭＥＴ ＳＥＭＡ−αサブドメイン配列を含むように作製された。
【０２９６】
上記のすべての合成キメラまたは野生型構築物を、ＳＶ５ペプチドタグ、グリシンセリンリンカーおよび目的の遺伝子にこのカセットをＣ末端融合させた結果生じたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーのコーディング配列を含む発現ベクター中にサブクローニングした（Bouquin T. et al., J. Biotechnol. 125:516-528 (2006)。作製した発現構築物を、ＨＥＫ２９３細胞の一時的ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ(商標) トランスフェクションに使用し、産生された融合タンパク質を、ＧＰＩアンカーを介して細胞膜に標的化した。ＭＥＴ抗体を、ｉＱｕｅ(登録商標) スクリーナー（IntelliCyt corporation）を用いるフローサイトメトリーによりトランスフェクト細胞への結合について分析した。抗体は、５０μｇ／ｍｌから始めて３倍希釈を用いて８点の滴定実験で試験し、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)６４７色素を用いて検出した。ＭＥＴ構築物の発現レベルを、ビオチニル化抗ＳＶ５ｍＡｂ ＭＣＡ１３６０Ｂによりモニターし、ストレプトアビジンＡＰＣ Ｃｙ７で検出した。陰性対照ニワトリまたはマウスＭＥＴ構築物について５０μｇ／ｍｌで試験した全ての抗体の平均蛍光として定義されたカットオフ値＋４つの標準偏差値を、ドメイン交換またはブレード交換構築物に対する特異的結合からバックグラウンド結合を識別するために使用した。単一のアミノ酸または１５アミノ酸がマウス配列に交換された構築物と結合する抗体は、変異がＳＥＭＡ−αサブドメインに位置し、そしてＳＥＭＡ−βサブドメインに対して指向性の５Ｄ５の結合に影響を与えないことが示されたため、３μｇ／ｍｌで試験した５Ｄ５結合に対して正規化された。
【０２９７】
結果
野生型およびキメラのヒト、ニワトリまたはマウスＭＥＴ  ＥＣＤコンストラクトの表面発現レベルを、ＳＶ５染色で評価した。すべての評価した構築物は十分に発現され、ニワトリＳＥＭＡ−βサブドメインを含む構築物を除いて、ＳＶ５抗体で染色することができた。構築物に結合する各ＭＥＴ抗体の力価を評価した（データは示していない）。異なる試験をしたキメラ構築物に結合する抗体のまとめを図２に示す。ＳＥＭＡ−αサブドメイン中の１５ＡＡセグメントが順次マウスに交換されている、ヒトＭＥＴ  ＥＣＤ構築物に対する抗体結合の差のまとめを表６に示し、ＳＥＭＡ−αサブドメイン中の表面に露出した残基がマウス配列に変異されたヒトＭＥＴ  ＥＣＤ構築物に対する抗体結合の差のまとめを表７に示す。最後に、すべてのエピトープ所見のまとめを表８に示す。
【０２９８】
５Ｄ５および２２４Ｇ１１を除く、全ての試験した抗体は、ＳＥＭＡ−αサブドメインに結合することが見いだされた。
【０２９９】
ＳＥＭＡ−αドメインに変異を導入するキメラ構築物を用いる詳細なエピトープマッピングは、配列セグメントＡＡ９９−１１３がマウスに交換されたとき、Ｈｕ９３３８が、結合の有意な減少（５Ｄ５と比べて３６％の結合）によって示されるようにブレード２に位置する直鎖状エピトープに結合することを示した（表６）。Ｈｕ９３３８のためのエピトープは別にあり、試験したＭＥＴパネル内の他の抗体で見いだされなかった。Ｈｕ９００６は、単一アミノ酸が点変異したＭＥＴ構築物またはマウスＭＥＴ配列の１５ＡＡの挿入を有するＭＥＴ構築物はいすれも、完全なヒトＭＥＴ ＥＣＤと比べて、ｈｕ９００６の顕著に異なる結合を示さなかった。その結果、ｈｕ９００６のエピトープは、抗ＭＥＴ抗体パネルの他のメンバーと比べて異なっていた。Ｈｕ９３３８およびＨｕ９００６がそれぞれブレード２および３に位置するエピトープに結合するという発見は、これらの抗体が非競合的であり、かつ異なるエピトープビンに属することと矛盾しない。
【０３００】
アゴニスト作用を示す抗体５８８２はまた、ブレード３（ＡＡ１６３−２２４）に結合することが見いだされたが、位置Ｆ２０６、Ｄ２０８、Ｈ２０９およびＰ２１０の接触残基がマウス配列と交換されたとき、これらの位置で５Ｄ５と比較して少なくとも５０％以下の結合であることが明らかにされた。重要なことに、これらの近接する位置の変異が、パネル内の他の抗体の結合に影響を及ぼさず、５８８２の強力なアゴニスト活性が、これらの４つの置換によって定義された領域の結合に関連していることが示された。
【０３０１】
Ｃ８−Ｈ２４１抗体は、ブレード２および３の両方に位置するエピトープに結合することが見いだされた。ブレード交換構築物は、この抗体がブレード３（ＡＡ１６３−２２４）中の重要なエピトープに結合することを示したが、さらに、ブレード２中の１５ＡＡ（ＡＡ１１９−１３３）または２４ＡＡ  ブレード３（ＡＡ２０９−２３３）がマウス配列に交換されたとき、構築物への結合の低下が観察されたことにより（５Ｄ５と比べてそれぞれ６８−３０％の結合）、エピトープの改良（refinement）が得られ得る。最後に、５Ｄ５と比較して１９％のみの結合が得られたブレード３中で同定された接触残基（Ｋ２２３）は、Ｃ８−Ｈ２４１抗体のコアエピトープがブレード３に位置することを示した。この結果は、ＨＤ交換質量分析により決定されたＣ８−Ｈ２４１の直鎖状エピトープが、位置１２３−１２８、１４４−１５６、１９２−１９５および２２０−２２７に存在したことを示し、先に報告されたデータ（Liu L. et al., Clin. 癌. Res. 20:6059-6070 (2014)）とよく一致した。
【０３０２】
最後に、本発明者らは、より詳細に３６Ｃ４のエピトープをマッピングすることができた。Ｂａｓｉｌｉｃｏら（Basilico C. et al. J. Clin Invest. 124:3172-3186 (2014)）は、ブレード２および３に存在すべき３６Ｃ４のエピトープ（ＡＡ９８−１９９）を記載するが、本発明者らは、特異性を、ブレード２中の位置１２９−１４３の直鎖状エピトープ（５Ｄ５と比較して５８％の結合）と、ブレード３中の位置Ｈ２０９の接触残基（５Ｄ５と比較して４３％の結合）に分けることができることを示した。位置Ｈ２０９の接触残基はまた、アゴニスト作用を示す５８８２抗体と共有されるが、５８８２はまた接触残基が結合する位置に近接する３つの他の位置にも結合するため、アゴニスト特性は明確に異なった。
【０３０３】
ＳＥＭＡドメインに結合する５Ｄ５の結晶構造は、先に報告されており（Merchant M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110:E2987-E2996 (2013)）、試験により、５Ｄ５が、ＳＥＭＡ  βサブドメインの主にブレード５および６を認識したことが示されている。位置Ｑ３２８、Ｒ３３１、Ｌ３３７およびＮ３３８の重要なアミノ酸残基がブレード５に存在し、これらの残基がマウス残基に改変されたとき、結合親和性が顕著に減少した。この結果は、本発明者らの結合分析と一致し、ブレード５中の重要なエピトープ（ＡＡ３１３−３７１）を認識することを明確に示している。
【０３０４】
本発明者らはまた、抗体２２４Ｇ１１が、Ｂａｓｉｌｉｃｏら（Basilico C. et al. J. Clin Invest. 124:3172-3186 (2014)）によって提供された情報と一致して、ＩＴＰ１ドメインを認識したことを見出した。
【０３０５】
【表６】
2017534259.tif 000014
【０３０６】
【表７】
2017534259.tif 000015
【０３０７】
【表８】
2017534259.tif 000016
【０３０８】
実施例８：キメラおよびヒト化抗ＭＥＴ抗体に対する親和性の測定
本実施例は、抗ＭＥＴ抗体９００６および９３３８のヒト化変異体が、それらのキメラ対応物に匹敵する親和性を有することを示しており、該ヒト化抗体が、キメラ抗体の完全な機能活性を有することを示唆している。さらに、該ヒト化抗ＭＥＴ抗体は、ヒトおよびカニクイザルＭＥＴ  ＥＣＤの両方に同等な結合を示す。
【０３０９】
方法
精製したヒト化およびキメラ９００６および９３３８変異体の動態結合分析を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）バイオセンサー（Fortebio, USA）またはＸＰＲ−３６表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー（Bio-Rad, USA）上で実施した。
【０３１０】
Ｈｉｓタグを付したヒトまたはカニクイザルＭＥＴ  ＥＣＤ抗原を、Sinobiological(中国)から購入した。結合動態は、既報（Canziani et al., Anal Biochem 325(2):301-307 (2004))の通り、抗ＭＥＴ抗体を固定し、溶液中の一価ＭＥＴ抗原を保持することによって一価の抗原の条件下で測定した。可能な限り低い抗ＭＥＴ抗体濃度を、非特異的結合および物質移動限界を阻止するために適用した。Ｏｃｔｅｔシステムにおいて抗体反応速度を測定するために、１．５μｇ／ｍｌの濃度の抗体を抗ヒトＦｃセンサー（Fortebio, USA）上に捕捉し、ヒトＭＥＴ ＥＣＤ抗原（１００ｎＭ）への結合について、を連続的に７回の２倍希釈により試験した。測定を、１０００ｒｐｍのプレート回転速度を用いて行い、センサーを再生し、１％ＢＳＡおよび０．００１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む、１０ｍＭグリシン：ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１．５）またはＰＢＳ緩衝液に３回暴露する間の短い５秒間の交換によって再利用した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＸＰＲ−３６機器で行った表面プラズモン共鳴実験のために、抗ＭＥＴ抗体を０．２５−０．５μｇ／ｍｌの濃度に調整し、モノクローナル抗ヒトＦｃ抗体（Biacore, Denmark）を固定化することにより生成された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ表面上に捕捉した。抗ＭＥＴ抗体を、２５ｎＭから１．５６ｎＭまでの２倍の濃度範囲でヒトまたはカニクイザルＭＥＴ ＥＣＤへの結合について試験し、その後、３Ｍ ＭｇＣｌ２再生バッファー（Biacore, Denmark）を用いて表面を再生した。記録された結合応答を、二重参照（double referencing）を使用して、結合速度定数（ｋｏｎまたはｋａ）、解離速度定数（ｋｏｆｆまたはｋｄ）および親和性（ＫＤ）定数の計算のために単純ラングミュア１：１結合モデルに適合させた。
【０３１１】
結果
Ｏｃｔｅｔのバイオセンサーを用いる動態測定により、３つの復帰突然変異を有する９００６のヒト化変異体（Ｈｕ９００６）および復帰突然変異を有さない９３３８のヒト化変異体（Ｈｕ９３３８）が、キメラ親抗体と比較してヒトＭＥＴ抗原に対してわずかに改善された親和性を有することが示された（表９）。
【０３１２】
【表９】
2017534259.tif 000017
【０３１３】
Ｂｉｏ−ＲａｄのＸＰＲ３６  ＳＰＲ機器を用いる反応速度測定により、Ｈｕ９００６およびＨｕ９３３８が、ｐＭ範囲の親和性でヒトおよびカニクイザルＭＥＴ  ＥＣＤの両方を認識することが示された（表１０）。
【０３１４】
【表１０】
2017534259.tif 000018
【０３１５】
実施例９：抗ＭＥＴ抗体を用いるＭＥＴの分解
本実施例は、抗ＭＥＴ抗体９００６および９３３８が、単独でまたは組み合わせで、ＭＥＴの分解を誘導することを実証する。２つの抗体の組合せは、何れかの抗体単独よりも有効にＭＥＴ受容体の分解を誘導する。
【０３１６】
方法
個々の抗ＭＥＴ抗体９００６および９３３８、９００６および９３３８の混合物、ならびにＣ８−Ｈ２４１類縁体（表４参照）により誘導されるＭＥＴ受容体の分解レベルを調べるために、ウェスタンブロット分析またはシンプルウェスタン分析を２４または４８時間の間、抗体で処理したＳＮＵ５細胞、ＥＢＣ１細胞およびＭＫＮ４５細胞の全細胞溶解物に対して行った。要するに、Ｔ−７５培養フラスコ中で増殖させ、５０％コンフルエントのときに培養培地を除去し、細胞を洗浄し、そして２０μｇ／ｍｌの全抗体濃度のＣ８−Ｈ２４１、９００６、９３３８、９３３８＋９００６、または陰性対照抗体（非哺乳動物標的に対するヒトＩｇＧ１）の何れかで、２４時間または４８時間、加湿インキュベーター中で３７℃にて処理した。全細胞溶解物を、標準的なＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製した。総タンパク質濃度をＢＣＡアッセイを用いて決定し、１−１０μｇのタンパク質を、Ｓａｌｌｙ装置（ProteinSimple）での単純ウェスタン自動化イムノアッセイによって、またはＭＥＴ対する一次検出抗体を用いたウェスタンブロット分析によって分析した。β−アクチンに対する抗体を、ウェスタンブロット分析のためのローディングコントロールとして用いた。
【０３１７】
結果
ウェスタンブロット試験による結果（図３）は、個々の抗体（とりわけ９００６）での処理が、試験した全ての細胞株においてＭＥＴの分解を誘導することを示す。しかしながら、抗ＭＥＴ抗体混合物９３３８＋９００６は、試験した全ての細胞株において個々の抗体（９００６または９３３８）と比較して増強されたＭＥＴ受容体の分解を誘導する。９００６＋９３３８またはＣ８−Ｈ２４１での処理の２４時間後または４８時間後の細胞ＭＥＴ受容体レベルを、３種の細胞株ＳＮＵ５、ＥＢＣおよびＭＫＮ４５における単純ウェスタン分析により比較した。図４に示された結果は、３種全ての細胞株において９００６＋９３３８で処理した後にＭＥＴ分解が増強されたことを実証する。
【０３１８】
実施例１０：抗ＭＥＴ抗体によるＭＥＴリン酸化および下流シグナル伝達の阻害
本実施例は、抗ＭＥＴ抗体９００６および９３３８が、ＭＥＴリン酸化および下流シグナル伝達（ｐＥＲＫ２およびｐＡＫＴのレベルによって決定される）に差異効果および細胞依存的効果を有することを実証する。抗ＭＥＴ抗体混合物９００６＋９３３８は、ＭＥＴリン酸化および下流シグナル伝達の効率的阻害を誘導する。
【０３１９】
方法
抗ＭＥＴ抗体９００６および９３３８ならびに抗ＭＥＴ抗体混合物９００６＋９３３８により誘導されるＭＥＴリン酸化および下流シグナル伝達の阻害レベルを調べるために、単純ウェスタン分析を、抗体で２４時間処理したＭＫＮ４５細胞およびＥＢＣ−１細胞の全細胞溶解物で実施した。細胞を、６ウェルプレート中で増殖させた。５０％コンフルエントに達したとき、培養培地を除去し、そして細胞を１ｘＰＢＳで洗浄して、２０μｇ／ｍｌの全抗体濃度の抗体（９００６、９３３８、９００６＋９３３８、または陰性対照抗体Ｓｙｎａｇｉｓ(登録商標)）で、２４時間、加湿インキュベーター中で３７℃にて処理した。全細胞溶解物を、標準的なＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製した。総タンパク質濃度をＢＣＡアッセイを用いて決定し、約１ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、Ｓａｌｌｙ装置（自動化サイズベースのイムノアッセイシステム、ProteinSimple）での単純ウェスタン自動化イムノアッセイによって、ならびにリン酸化ＭＥＴ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５およびＴｙｒ１３４９）、リン酸化ＥＲＫ２（ｐＥＲＫ２）、およびリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）に対する一次抗体を用いて分析した。β−アクチンに対する抗体を、ローディングコントロールとして用いた（データは示さず）。
【０３２０】
結果
ＭＥＴのリン酸化レベル（図５）ならびにＥＲＫ２およびＡＫＴのリン酸化レベル（図６）の単純ウェスタン分析からの結果は、９００６または９３３８単独での処理が、試験した細胞株におけるリン酸化に対する差異効果および細胞株依存的効果を誘導することを示す。しかしながら、抗ＭＥＴ抗体混合物９００６＋９３３８は、ＭＫＮ４５細胞およびＥＢＣ−１細胞の両方において、モノクローナル抗ＭＥＴ抗体９００６または９３３８での処理と比較してＭＥＴリン酸化および下流シグナル伝達の効果的な阻害を誘導する。
【０３２１】
実施例１１：初代内皮細胞におけるキメラ抗ＭＥＴ抗体の抗増殖作用
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、感受性の血管モデルにおける生物学的効果を評価するのに適した初代内皮細胞である。抗ＭＥＴ抗体９００６および９３３８ならびに抗体混合物９００６＋９３３８は、ＭＥＴリガンドＨＧＦの不在下および存在下の両方で、ＨＵＶＥＣの増殖を阻害し得ることが示された。
【０３２２】
材料および方法
皮膚線維芽細胞を解凍し、９６ウェルプレート中の培養培地に播種した。室温で線維芽細胞の沈降後、ＧＦＰ標識したＨＵＶＥＣのバイアルを解凍した。培養培地に再懸濁したＨＵＶＥＣを、線維芽細胞懸濁液の上部に添加し、３７℃にて５％ＣＯ２下、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ装置（Essen Bioscience）中で一晩培養した。一晩のインキュベーション後、共培養細胞から培地を除去し、増殖培地で置き換え、さらに２４時間インキュベートした。翌日、アッセイ培地を調製し、異なるリガンド／抗体混合物をアッセイ培地中に合わせ、混合した。増殖培地を除去し、抗体／リガンドの異なる組み合わせを含むアッセイ培地と交換した。培地を２〜３日毎に抗体／リガンド混合物を含む新鮮なアッセイ培地と交換した。ＧＦＰ−ＨＵＶＥＣの写真を、４時間ごとに記録した。細胞数、細胞ネットワークの長さ、およびネットワーク分岐点の数を含むいくつかの細胞パラメータを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅソフトウェアを用いて分析した。
【０３２３】
結果
図７−１１は、抗体９００６および９３３８の初代内皮細胞増殖を特異的に阻害する効果を示し、対照的に、無関係の抗体対照はいかなる阻害効果も示さなかった。抗体混合物９００６＋９３３８は、特にＨＧＦが培地中に存在するとき、ＨＵＶＥＣ増殖の優れた阻害を示す。
【０３２４】
実施例１２：キメラおよびヒト化抗ＭＥＴ抗体のインビトロでの比較
本実施例は、キメラ９００６、キメラ９３３８およびキメラ９３３８＋９００６と、ヒト化変異体、すなわちヒト化９００６（Ｈｕ９００６）、ヒト化９３３８（Ｈｕ９３３８）およびヒト化９３３８＋９００６（Ｈｕ９３３８＋Ｈｕ９００６）とのインビトロでの比較を記載する。モノクローナル抗体および混合物を、数種の癌細胞株：Ｏｋａｊｉｍａ、ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＨＣＣ８２７Ｒ１＿ｃｅｔ＃３、ＨＣＣ８２７Ｒ１＿ｃｅｔ＃１およびＫａｔｏＩＩの増殖を阻害するその能力について評価した。
【０３２５】
方法
９００６、９３３８、９３３８＋９００６（２つの成分の１：１混合物）、Ｈｕ９００６、Ｈｕ９３３８およびＨｕ９３３８＋Ｈｕ９００６（２つの成分の１：１混合物）と、陰性対照抗体（Ｓｙｎａｇｉｓ(登録商標)）とを、２％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを添加したＲＰＭＩ１６４０グルタマックス培地中１００μｇ／ｍｌの最終総抗体濃度に希釈し、最高の抗体濃度を含む１ウェル当たり２５μｇ／ｍｌの終濃度を得た。その後、抗体を２倍の連続希釈を行い、１７種までの異なる濃度を得た。関連する細胞の数（Ｏｋａｊｉｍａ：１０００細胞／ウェル、ＥＢＣ１：７５０細胞／ウェル、ＭＫＮ４５：５００細胞／ウェル、ＨＣＣ８２７Ｒ１＿ｃｅｔ＃３：５００細胞／ウェル、ＨＣＣ８２７Ｒ１＿ｃｅｔ＃１：５００細胞／ウェル；ＫａｔｏＩＩ：７５０細胞／ウェル）を、３８４ウェルプレートにおける実験ウェルに添加し、抗体と共に４日間、加湿インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。次いで、ＷＳＴ−１試薬をプレートに添加し、１時間、３７℃にてインキュベートした。吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍおよび６２０ｎｍ（参照波長）で測定した。６２０ｎＭでの吸光度を４５０ｎＭでの吸光度から差し引き、代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を、実施例２に記載の通り、未処理対照の％として計算した。
【０３２６】
結果
図１２および１３は、キメラおよびヒト化９００６および９３３８抗体ならびにキメラおよびヒト化９００６＋９３３８抗体混合物の、細胞株ＨＣＣ８２７Ｒ１＿ｃｅｔ＃３（１２Ａ）、ＨＣＣ８２７Ｒ１＿ｃｅｔ＃１（１２Ｂ）、ＭＫＮ４５（１２Ｃ）、ＥＢＣ−１（１３Ａ）、ＫａｔｏＩＩ（１３Ｂ）、およびＯｋａｊｉｍａ（１３Ｃ）に対する滴定からの生存率の結果を示す。Ｈｕ９００６、Ｈｕ９３３８およびＨｕ９３３８＋Ｈｕ９００６は、それらのキメラ対応物と同等の抗増殖作用を有することがグラフから明らかである。
【０３２７】
実施例１３：ヒト化９３３８＋９００６および１３−ＭＥＴ＋２８−ＭＥＴのインビトロでの比較
本実施例は、ヒト化９３３８＋９００６（Ｈｕ９３３８＋Ｈｕ９００６）、１３−ＭＥＴ、２８−ＭＥＴおよび１３−ＭＥＴ＋２８−ＭＥＴのインビトロでの試験を記載する（表４参照）。モノクローナル抗体および混合物を、４種の癌細胞株：ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＳＮＵ５およびＫａｔｏＩＩの増殖を阻害するその能力について評価した。
【０３２８】
方法
抗体Ｈｕ９３３８＋Ｈｕ９００６（２つの成分の１：１混合物）、１３−ＭＥＴ、２８−ＭＥＴおよび１３−ＭＥＴ＋２８−ＭＥＴ（２つの成分の１：１混合物）と、陰性対照抗体（Ｓｙｎａｇｉｓ(登録商標）)とを、上記の通り、ＥＢＣ１（５００細胞／ウェル）、ＭＫＮ４５（７５０細胞／ウェル）、ＳＮＵ５（７５０細胞／ウェル）およびＫａｔｏＩＩ（７５０細胞／ウェル）における抗代謝効果について試験した。
【０３２９】
結果
Ｈｕ９３３８＋Ｈｕ９００６、１３−ＭＥＴ、２８−ＭＥＴおよび１３−ＭＥＴ＋２８−ＭＥＴ抗体の、細胞株ＥＢＣ１、ＭＫＮ４５、ＳＮＵ５およびＫａｔｏＩＩにおける滴定からの生存率の結果を図１４に示す。抗ＭＥＴ抗体が、試験した細胞株によって異なるレベルの有効性および効能を有することが明らかになった。しかしながら、Ｈｕ９３３８およびＨｕ９００６の組み合わせは、試験したすべての細胞株において、１３−ＭＥＴ、２８−ＭＥＴおよび１３−ＭＥＴ＋２８−ＭＥＴと比較して代謝活性の優れた阻害を示す。
【０３３０】
実施例１４：ヒトＥＢＣ−１腫瘍異種移植片モデルにおけるキメラ９００６＋９３３８抗体混合物のインビボでの有効性
本実施例は、ヒトＭＥＴ増幅させた非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片における９００６＋９３３８抗体混合物のインビボでの有効性を実証する。
【０３３１】
方法
５×１０６  ＥＢＣ−１細胞を、８−９週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍を、週に３回、ノギスにより二次元で測定し、腫瘍体積をｍｍ３単位で、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。１２０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを無作為化し、処理を開始した。マウスに、ビークル緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）、モノクローナル抗体９００６、モノクローナル抗体９３３８、またはモノクローナル抗体９００６＋９３３８の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。全ての抗体処理は、５０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。従って、９００６処理および９３３８処理動物は、９００６または９３３８のそれぞれを５０ｍｇ／ｋｇで投与し、一方、９００６＋９３３８で処理した動物は、２５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与した。
【０３３２】
結果
接種後１０日目に、１２０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを８匹毎の４群に無作為化し、処理を開始した。図１５に示すように、モノクローナル抗体９３３８による処理は、ビークル対照と比較して、動物における腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった。対照的に、９００６での処理は腫瘍増殖遅延をもたらし、一方、９００６＋９３３８での処理は、処理中の増殖の安定化をもたらし、このモデルにおけるすべての他の処理よりも優れていた。ビークル処理または９００６もしくは９３３８単独処理の群の試験は、腫瘍過成長または腫瘍関連潰瘍により処理期間中に終了し、一方、９００６＋９３３８群の動物は、処理を完了し、処理終了後２から３週間観察した。
【０３３３】
実施例１５：ヒトＥＢＣ−１腫瘍異種移植片モデルにおける、キメラ９００６＋９３３８抗体混合物の漸増用量のインビボでの有効性
本実施例は、ヒトＭＥＴ増幅された非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片における９００６＋９３３８抗体混合物の漸増用量のインビボでの効果を実証する。
【０３３４】
方法
５×１０６  ＥＢＣ−１細胞を、８−９週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍を、週に３回、ノギスにより二次元で測定し、腫瘍体積をｍｍ３単位で、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。１５０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを無作為化し、処理を開始した。マウスに、ビークル緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）またはモノクローナル抗体９００６＋９３３８の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。９００６＋９３３８の１：１混合物を、注入用量当たり、５０、２５、５または１ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。
【０３３５】
結果
接種後１１日目に、１５０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを１０匹毎の５群に無作為化し、処理を開始した。図１６に示すように、ビークル対照処理した動物と比較して、低濃度の９００６＋９３３８（１ｍｇ／ｋｇ）で処理した動物では、腫瘍増殖は影響を受けなかった。５ｍｇ／ｋｇの９００６＋９３３８での処理は、後の時点での腫瘍増殖遅延をもたらし、一方で、２５または５０ｍｇ／ｋｇの９００６＋９３３８での処理は、同等のレベルの強力な腫瘍増殖阻害と増殖安定化をもたらした。
【０３３６】
実施例１６：ヒトＭＫＮ−４５腫瘍異種移植片モデルにおける、キメラ９００６＋９３３８抗体混合物のインビボでの有効性
本実施例は、ヒトＭＥＴ増幅させた胃癌細胞株ＭＫＮ−４５の異種移植片における９００６＋９３３８抗体混合物のインビボでの有効性を実証する。
【０３３７】
方法
５×１０６  ＭＫＮ−４５細胞を、８−９週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍を、週に３回、ノギスにより二次元で測定し、腫瘍体積をｍｍ３単位で、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。８０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを無作為化し、処理を開始した。マウスに、ビークル緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）、モノクローナル抗体９００６、モノクローナル抗体９３３８、またはモノクローナル抗体９００６＋９３３８の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。全ての抗体処理は、５０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。従って、９００６処理および９３３８処理動物は、９００６または９３３８のそれぞれを５０ｍｇ／ｋｇで投与し、一方、９００６＋９３３８で処理した動物は、２５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与した。
【０３３８】
結果
接種後１０日目に、８０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを８匹毎の４群に無作為化し、処理を開始した。図１７に示すように、モノクローナル抗体９００６または９３３８単独により処理した動物では、ビークル対照処理した動物と比較して、腫瘍増殖がわずかに阻害された。対照的に、９００６＋９３３８での処理は、処理中の増殖の安定化をもたらし、このモデルにおけるすべての他の処理よりも優れていた。ビークル処理または９００６単独処理の群の試験は、腫瘍過成長または腫瘍関連潰瘍により処理期間中に終了し、一方、９３３８群および９００６＋９３３８群の動物は、処理を完了した。９００６＋９３３８群は処理終了後２週間観察し、この期間のほとんどの間、増殖安定化が保持された。
【０３３９】
実施例１７：ヒトＳＮＵ５腫瘍異種移植片モデルにおけるキメラ９００６＋９３３８抗体混合物のインビボでの有効性
本実施例は、ヒトＭＥＴ増幅させた胃癌細胞株ＳＮＵ５の異種移植片における９００６＋９３３８抗体混合物のインビボでの有効性を実証する。
【０３４０】
方法
１×１０７  ＳＮＵ５細胞を、８−９週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍を、週に３回、ノギスにより二次元で測定し、腫瘍体積をｍｍ３単位で、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。１６５ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを無作為化し、処理を開始した。マウスに、ビークル緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）、モノクローナル抗体９００６、モノクローナル抗体９３３８、またはモノクローナル抗体９００６＋９３３８の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。全ての抗体処理は、５０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。従って、９００６処理および９３３８処理動物は、９００６または９３３８のそれぞれを５０ｍｇ／ｋｇで投与し、一方、９００６＋９３３８で処理した動物は、２５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与した。
【０３４１】
結果
接種後１５日目に、１６５ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを８匹毎の４群に無作為化し、処理を開始した。図１８に示すように、モノクローナル抗体９００６または９３３８単独または９００６＋９３３８抗体混合物により処理した動物で、ビークル対照処理した動物と比較して、腫瘍の緩解が観察された。９００６または９００６＋９３３８での処理は、９３３８での処理よりも優れており、９００６処理群および９００６＋９３３８処理群において、処理終了後５０日以上、腫瘍の緩解が保持された。
【０３４２】
実施例１８：ヒト肝細胞癌の患者由来の異種移植片モデルにおけるキメラ９００６＋９３３８抗体混合物のインビボでの有効性
本実施例は、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の患者由来の異種移植片モデル（ＬＩ１０３７）における９００６＋９３３８抗体混合物のインビボでの有効性を実証する。
【０３４３】
方法
モデルＬＩ１０３７の腫瘍源は、肝臓癌患者の腫瘍に由来し、それをヌードマウスの皮下にて維持した。腫瘍を３ｍｍ３断片に刻み、１つの断片を各マウスの片方の前面脇腹に皮下移植した。動物を、腫瘍が平均２２０ｍｍ３の体積に達したときに、処理群に無作為化した。マウスに、ビークル緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）またはモノクローナル抗体９００６＋９３３８の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。全ての抗体処理は、５０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。従って、９００６処理および９３３８処理動物は、９００６または９３３８のそれぞれを５０ｍｇ／ｋｇで投与し、一方、９００６＋９３３８で処理した動物は、２５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与した。
【０３４４】
結果
接種後２１日目に、２２０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを４匹毎の２群に無作為化し、処理を開始した。図１９に示すように、９００６＋９３３８抗体混合物で処理した動物において、ビークル対照で処理した動物と比較して、腫瘍増殖の阻害が観察された。
【０３４５】
実施例１９：ヒトＥＢＣ−１腫瘍異種移植片モデルにおける、キメラおよびヒト化抗体混合物のインビボでの比較
本実施例では、キメラ９００６＋９３３８抗体混合物およびヒト化Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８抗体混合物のインビボでの有効性を、ヒトＭＥＴ増幅させた非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片において比較した。
【０３４６】
方法
５ｘ１０６  ＥＢＣ−１細胞を、８−９週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍を、週に３回、ノギスにより二次元で測定し、腫瘍体積をｍｍ３単位で、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。細胞接種後２０日目に、〜１３０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを１０匹毎の３群に無作為化し、処理を開始した。マウスに、ビークル緩衝液、キメラ９００６＋９３３８の１：１混合物、またはヒト化の９００６＋９３３８（Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８）の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。全ての抗体処理は、５０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。従って、９００６＋９３３８およびＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８で処理した動物は、２５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与された。
【０３４７】
結果
図２０に示すように、ビークル対照処理動物と比較して、９００６＋９３３８およびＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８で処理した動物の両方において、腫瘍の緩解が観察された。Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８および９００６＋９３３８の腫瘍阻害効果は、高度に類似していることが明らかとなった。
【０３４８】
実施例２０：ヒトＯＥ３３腫瘍異種移植片モデルにおける、キメラおよびヒト化抗体混合物のインビボでの比較
本実施例では、キメラ９００６＋９３３８抗体混合物およびヒト化Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８抗体混合物のインビボでの有効性を、ヒトＭＥＴ増幅させた食道胃癌細胞株ＯＥ３３の異種移植片で比較する。
【０３４９】
方法
ＯＥ３３腫瘍を、これまでに確立された腫瘍から直列的に移植した。腫瘍は、試験時点で８回継代されていた。〜１ｍｍ３の腫瘍断片を、８−９週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下移植した。腫瘍を、週に３回、ノギスにより二次元で測定し、腫瘍体積をｍｍ３単位で、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。腫瘍接種後３０日目に、２００ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを７匹毎の３群に無作為化し、処理を開始した。マウスに、ビークル緩衝液、キメラ９００６＋９３３８の１：１混合物、またはヒト化の９００６＋９３３８（Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８）の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。全ての抗体処理は、３０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。従って、９００６＋９３３８およびＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８で処理した動物は、１５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与された。
【０３５０】
結果
図２１に示されるように、ビークル対照処理動物と比較して、９００６＋９３３８およびＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８で処理した動物の両方において、腫瘍の緩解が観察され、増殖曲線は高度に類似していた。
【０３５１】
実施例２１：ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、モノクローナル抗体Ｃ８−Ｈ２４１およびＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８抗体混合物のインビボでの比較
本実施例では、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８抗体混合物および比較としてのモノクローナル抗体Ｃ８−Ｈ２４１（表４参照）のインビボでの有効性を、ヒトＭＥＴ増幅させた非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１およびヒトＭＥＴ増幅させた胃癌細胞株Ｈｓ７４６Ｔ（ＭＥＴのエクソン１４の欠失を有する）において比較する。
【０３５２】
方法
５ｘ１０６  ＥＢＣ−１細胞または３．７ｘ１０６  Ｈｓ７４６Ｔ細胞を、雌の無胸腺マウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍を、週に３回、ノギスにより二次元で測定し、腫瘍体積をｍｍ３単位で、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。ＥＢＣ−１について１４０ｍｍ３の平均腫瘍サイズおよびＨｓ７４６Ｔについて１２０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを無作為化し、処理を開始した。
【０３５３】
ＥＢＣ−１に対する処理スケジュール：マウスに、ビークル緩衝液、モノクローナル抗体Ｃ８−Ｈ２４１、またはモノクローナル抗体Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。観察の２１日後に、Ｃ８−Ｈ２４１群の残りのマウスに、腫瘍細胞接種後の１３９日の試験終了まで、週に３回、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８を用いて再処理した。
【０３５４】
Ｈｓ７４６Ｔに対する処理スケジュール：マウスに、ビークル緩衝液、モノクローナル抗体Ｃ８−Ｈ２４１、モノクローナル抗体Ｈｕ９００６、モノクローナル抗体Ｈｕ９３３８またはモノクローナル抗体Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８の１：１混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行った。１週間の観察後、Ｈｕ９００６、Ｈｕ９３３８およびＣ８−Ｈ２４１群の全ての残りのマウスに、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８の単回投与による処理を行い、９日間観察した。
【０３５５】
全ての抗体処理は、５０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。従って、Ｃ８−Ｈ２４１、Ｈｕ９００６およびＨｕ９３３８で処理した動物は、５０ｍｇ／ｋｇの抗体を投与した、一方、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８で処理した動物は、２５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与した。
【０３５６】
結果
ＥＢＣ−１：接種後１５日目に、１４０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを１０匹毎の３群に無作為化し、処理を開始した。図２２に示されるように、ビークル対照処理動物と比較して、Ｃ８−Ｈ２４１で処理したマウスにおいて、限定された応答が観察された。対照的に、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８での処理は、腫瘍の緩解を誘導した。最後の投与の２１日後に、５００ｍｍ３の平均腫瘍体積で、Ｃ８−Ｈ２４１処理群の残りのマウスに、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８での再処理を行った。図２２はまた、該マウスが二次処理に応じて腫瘍の緩解を有したことを示す。
【０３５７】
Ｈｓ７４６Ｔ：接種後３５日目に、１２０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを８匹毎の５群に無作為化し、処理を開始した。図２３に示されるように、ビークル対照処理動物と比較して、Ｃ８−Ｈ２４１、Ｈｕ９００６またはＨｕ９３３８で処理したマウスにおいて、限定された初期阻害応答が観察されたが、処理期間のほぼ中間で、腫瘍が再成長を始めた。対照的に、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８での処理は、８匹すべての処理マウスで、腫瘍の緩解と完全な腫瘍の退縮を誘導した。最後の投与の９日後に、Ｃ８−Ｈ２４１、Ｈｕ９００６およびＨｕ９３３８処理群中の残りのマウスに、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８の単回投与での再処理をした。図２３はまた、該マウスが二次処理に応じて腫瘍の緩解を有したことを示す。
【０３５８】
実施例２２：４名のヒト患者由来の異種移植片モデルにおける、モノクローナル抗体Ｃ８−Ｈ２４１およびＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８抗体混合物のインビボでの比較
本実施例では、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８抗体混合物および比較物モノクローナル抗体Ｃ８−Ｈ２４１（表４参照）のインビボでの有効性を、４名のヒトＭＥＴを増幅させた非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者由来の異種移植片モデルにおいて比較した。
【０３５９】
方法
各マウスを、腫瘍形成（development）のためのモデルＬＸＦＡ０５２６、ＬＵ０８５８、ＬＵ１９０１またはＬＵ２５０３（直径２−３ｍｍ）からの原発性ＮＳＣＬＣ組織断片を脇腹に皮下接種した。腫瘍を、二次元でノギスにより週に２回測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）を、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。
【０３６０】
平均腫瘍サイズが１００〜２００ｍｍ３に達したときに、マウスを３群に無作為化し（１群当たり、ｎ＝５から８匹のマウス）、処理を開始した。マウスに、Ｃ８−Ｈ２４１モノクローナル抗体、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８抗体混合物（等しい割合で混合した単一のモノクローナル抗体）またはビークル緩衝液対照のいずれかを、腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、３週間まで観察した。
【０３６１】
全ての抗体処理は、５０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与した。従って、Ｃ８−Ｈ２４１で処理した動物は、５０ｍｇ／ｋｇの抗体を投与され、一方、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８で処理した動物は、２５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与された。
【０３６２】
結果
図２４に示すように、４つのモデルにおいてＣ８−Ｈ２４１処理時の異なる応答が観察された。対照的に、Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８での処理は、４つすべてのモデルにおいて、Ｃ８−Ｈ２４１処理と比較して、優れた有効性および／または進行の遅延と共に腫瘍の緩解を誘導した。Ｃ８−Ｈ２４１は、別のＭＥＴ増幅させた初代ＭＥＴ増幅による異種移植片ＮＳＣＬＣモデル（ＬＸＦＡ−１６４７）において顕著に有効であることが既に報告されている（Liu et al. Clin Cancer Res. 20:6059-6070 (2014)）。
【０３６３】
実施例２３：ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８抗体混合物の等しい比およびスキュー比（skewed ratio）の組成物のインビボでの比較
本実施例において、の２つの抗体Ｈｕ９００６およびＨｕ９３３８の異なる比率からなる混合物インビボでの有効性を、ヒトＭＥＴ増幅させた非小細胞肺癌細胞株ＥＢＣ−１の異種移植片において比較した。
【０３６４】
方法
５ｘ１０６  ＥＢＣ−１細胞を、８−９週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍を、週に３回、ノギスにより二次元で測定し、腫瘍体積をｍｍ３単位で、式：（幅）２×長さ×０．５によって計算した。細胞接種後１３日目に、１５０ｍｍ３の平均腫瘍サイズで、マウスを１０匹毎の３群に無作為化し、処理を開始した。マウスに、ビークル緩衝液、１：１、２：１または１：２の抗体比のモノクローナル抗体Ｈｕ９００６＋Ｈｕ９３３８混合物の腹腔内注射による計１０回の処理を週に３回行い、その後、観察した。抗体処理は、いずれかを５０ｍｇ／ｋｇで投与するか、または、スキュー比の抗体混合物について、以下の通り１０ｍｇ／ｋｇの総抗体濃度で投与された：１：１比の処理動物は、２５ｍｇ／ｋｇの各抗体を含む混合物を投与された。１：２比の処理動物は、１０ｍｇ／ｋｇの総投与のために３ｍｇ／ｋｇのＨｕ９００６および７ｍｇ／ｋｇのＨｕ９３３８を含む混合物を投与されるか、または５０ｍｇ／ｋｇの総投与のために１７ｍｇ／ｋｇのＨｕ９００６および３３ｍｇ／ｋｇのＨｕ９３３８を含む混合物を投与された。同様に、２：１比の処理動物は、１０ｍｇ／ｋｇの総投与のために７ｍｇ／ｋｇのＨｕ９００６および３ｍｇ／ｋｇのＨｕ９３３８を含む混合物を投与されるか、または５０ｍｇ／ｋｇの総投与のために、３３ｍｇ／ｋｇのＨｕ９００６および１７ｍｇ／ｋｇのＨｕ９３３８を含む混合物を投与された。
【０３６５】
結果
図２５に示す通り、等しい比およびスキュー比の両者でのＨｕ９００６＋Ｈｕ９３３８の投与、および両用量での処理とも、腫瘍の緩解を誘導した。腫瘍の緩解レベルは、等しい比およびスキュー比の両者で単一の抗体組成物で腫瘍の成長阻害をもたらすことを示している、全ての試験した抗体処理に類似していることが明らかとなった。
【０３６６】
【表１１】
2017534259.tif 000019
【０３６７】
配列表
配列番号：1 (ヒト MET アイソフォーム1 アミノ酸配列）:
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS
配列番号：2 (ヒト MET アイソフォーム2 アミノ酸配列）:
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISTWWKEPLNIVSFLFCFASGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS
配列番号：3 (ニワトリ MET アミノ酸配列）:
MKPVTAYPSGIILFLFALLQRSHGQCKEAAKKSEMNLNVKYDLPNFITETPIQNVVLYKHHVYIGAVNKIYVLNETLQNISVYKTGPILESPGCAPCEDCKDKANLSNSVWKDNVNMALLLETYYDDQLISCGSVSGGVCHRHIIPPDNPADIESEVHCMYSPQVDGEADNCPDCVVSTLGTKVLVTEKDRFVNFFVGNTMTSAFQPPHVLHSISVRRLKETQDGFEFLTDQSYIDILPQFRDSYPIKYVHAFEHDHFVYFLTVQRESLDSQTFHTRIIRFCTLDSEMRSYMEMPLECIFTEKRRKRSIRKEVFNILQAAYVSKPGAALAHEMGLGLIDDILYGVFAQTNQIPQEPTNRSAVCAVSVRTINEFFNKIVDKQNMKCLQHFYGKDSKYCLNRAFSRNASYCRAQDDEYRLEVTTPLQRVDLFMGQFNNILLTSISVFTKGNLTIANLGTSEGRFMQIVVSRSEPTAPHVSFQLDSHAVSPQVVVEQSAAADGYTLVVTGKKITKVPLNGPGCHHFQSCSQCLLAPAFMRCGWCGQQCLRAPECNGGTWTQETCLPRVYEILPSSAPLEGGTKLTLCGWDFGFSKNNRFELRNTVVHIGGQICALEAKSSNKNKLECTAPAAKNASFNISSSVSVGHGKTLFNTFSYVNPIITSISPTYGPKSGGTLLTIAGKYLNSGKSRRIFVGEKPCSLKSTSESSVECYTPAQRIPQEYRVRVGIDGAIRDAKGYFTYREDPVVLKIHPAKSFLSGGSTITAQGINLNSVCFPRMVITVPKLGMNFSVACSHRSSSEIICCTTPSLKAFNLQPPFVTKVFFIFDGVSSLYFDFDYVNNPVFKHFEKPVLISRSNPNVLEIKGNHIDSEAVKGEVLKVGNKSCENLLLQSETILCTVPSDLLKSNSELNIEWKQEVLSTVIGKVLIRQDQNFTGLIAGVVSTSVLIYIFLVFFLWRRKKKQIKDLGSDLVRYDGRVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSSESVDYRSTFLEDQFPSMSQNGSCRPAQYPHSDLSPILSSGDSDLASPLLQTNVHIDISALNPDLVKEVQHVVIGADSLMVHFSEVIGRGHFGCVSHGTLLDNDGRKIHCAVKSLNRITDLEEVAQFLKEGIIMKDFTHPNVLSLLGICLPNEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDVYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNSFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKPEMRPAFSELVSKISTIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSQDNTDMDVDT
【０３６８】
配列番号：4 (マウス MET アミノ酸配列）:
MKAPTVLAPGILVLLLSLVQRSHGECKEALVKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVVLHGHHIYLGATNYIYVLNDKDLQKVSEFKTGPVLEHPDCLPCRDCSSKANSSGGVWKDNINMALLVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVLPPDNSADIQSEVHCMFSPEEESGQCPDCVVSALGAKVLLSEKDRFINFFVGNTINSSYPPGYSLHSISVRRLKETQDGFKFLTDQSYIDVLPEFQDSYPIKYIHAFESNHFIYFLTVQKETLDAQTFHTRIIRFCSVDSGLHSYMEMPLECILTEKRRKRSTREEVFNILQAAYVSKPGANLAKQIGASPSDDILFGVFAQSKPDSAEPVNRSAVCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARSDEYRTEFTTALQRVDLFMGRLNQVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVLSRTAHLTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHPSNQNGYTLVVTGKKITKIPLNGLGCGHFQSCSQCLSAPYFIQCGWCHNQCVRFDECPSGTWTQEICLPAVYKVFPTSAPLEGGTVLTICGWDFGFRKNNKFDLRKTKVLLGNESCTLTLSESTTNTLKCTVGPAMSEHFNVSVIISNSRETTQYSAFSYVDPVITSISPRYGPQAGGTLLTLTGKYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSDSILECYTPAQTTSDEFPVKLKIDLANRETSSFSYREDPVVYEIHPTKSFISGGSTITGIGKTLNSVSLPKLVIDVHEVGVNYTVACQHRSNSEIICCTTPSLKQLGLQLPLKTKAFFLLDGILSKHFDLTYVHNPVFEPFEKPVMISIGNENVVEIKGNNIDPEAVKGEVLKVGNQSCESLHWHSGAVLCTVPSDLLKLNSELNIEWKQAVSSTVLGKVIVQPDQNFAGLIIGAVSISVVVLLLSGLFLWMRKRKHKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGACRQVQYPLTDLSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIEEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITIYLLQGRRLLQPEYCPDALYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISSIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLPSQDNIDGEGNT
配列番号：5 (キメラ 9006 重鎖可変ドメイン核酸配列）:
CAGATCCATTTGGGGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTTTAGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGTTGATGACTTGAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACATGGCTACATATTTCTGTGCAAGGAAAGGGATTGCGAGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCGAGT
配列番号：6 (キメラ 9006 重鎖可変ドメインアミノ酸配列）:
QIHLGQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFRMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYVDDLKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARKGIARAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号：7 (キメラ 9006 軽鎖可変ドメイン核酸配列）:
AACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGATGGTCACTATGAGTTGTAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAGACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTCAACTTTTGATCTTCGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCGTCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
【０３６９】
配列番号：8 (キメラ 9006 軽鎖可変ドメインアミノ酸配列）:
NIVMTQSPSSLSVSAGEMVTMSCKSSQSLLDSGNQKNYLAWYQQKPGQPPQLLIFGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTVSSVQAEDLAVYYCQNDHSYPYTFGGGTKLEIK
配列番号：9 (キメラ 9338 重鎖可変ドメイン核酸配列）:
CAGGTCCAACTGCAACAGCCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAGGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGTTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCAGTGGTCATATTGAGAACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATTTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGACGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCGAGT
配列番号：10 (キメラ 9338 重鎖可変ドメインアミノ酸配列）:
QVQLQQPGAELAKPGASVRMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGHIENNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYYCARGRFAYWGQGTLVTVSS
配列番号：11 (キメラ 9338 軽鎖可変ドメイン核酸配列）:
GATATTGTGATGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCTGGGGAGAAGGTCACCTTGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCGGCTACTTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAGTCAACAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCTCTTATTTCTGCCATCAGTGGAGTAGTTACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
配列番号：12 (キメラ 9338 軽鎖可変ドメインアミノ酸配列）:
DIVMTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSGYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTVNSMEAEDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLELK
配列番号：13 (ヒト化 9006 重鎖可変ドメイン核酸配列）:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGATCCGAGCTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTACCAACTTCCGGATGAACTGGGTCAAGCAGGCCCCAGGCCAGGGCCTGAAATGGATGGGCTGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGTGGACGACCTGAAGGGCAGATTCGTGTTCTCCCTGGACACCTCCGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCTCCAGCCTGAAGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGAAGGGAATCGCCAGAGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTCTCGAGT
配列番号：14 (ヒト化 9006 重鎖可変ドメインアミノ酸配列）:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNFRMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYVDDLKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARKGIARAMDYWGQGTTVTVSS
【０３７０】
配列番号：15 (ヒト化 9006 軽鎖可変ドメイン核酸配列）:
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACTCTCTGGCCGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACTCCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTTTGGCGCCTCCACCCGGGAATCTGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACCACTCCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
配列番号：16 (ヒト化 9006 軽鎖可変ドメインアミノ酸配列）:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSYPYTFGQGTKLEIK
配列番号：17 (ヒト化 9338 重鎖可変ドメイン核酸配列）:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTGAAGAAACCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTACATCAACCCCTCCAGCGGCCACATCGAGAACAACCAGAAATTCAAGGACCGCGTGACCATCACCGCCGACAAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCAGATTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTCTCGAGT
配列番号：18 (ヒト化 9338 重鎖可変ドメインアミノ酸配列）:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGHIENNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRFAYWGQGTLVTVSS
配列番号：19 (ヒト化 9338 軽鎖可変ドメイン核酸配列）:
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACCCTGTCTCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCTACCCTGTCCTGCTCCGCCTCCTCCTCTGTGTCCTCCGGCTACCTGTACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACTCTACCTCCAACCTGGCCTCCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTTCACCTTTGGCTCCGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
配列番号：20 (ヒト化 9338 軽鎖可変ドメインアミノ酸配列）:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSYPFTFGSGTKLEIK
配列番号：21 (9006 重鎖CDR1 アミノ酸配列）:
GYTFTNFR
配列番号：22 (9006 重鎖CDR2 アミノ酸配列）:
INTYTGEP
配列番号：23 (9006 重鎖CDR3 アミノ酸配列）:
ARKGIARAMDY
配列番号：24 (9006 軽鎖CDR1 アミノ酸配列）:
QSLLDSGNQKNY
配列番号：25 (9006 軽鎖CDR2 アミノ酸配列）:
GAS
配列番号：26 (9006 軽鎖CDR3 アミノ酸配列）:
QNDHSYPYT
配列番号：27 (9338 重鎖CDR1 アミノ酸配列）:
GYTFTSYW
【０３７１】
配列番号：28 (9338 重鎖CDR2 アミノ酸配列）:
INPSSGHI
配列番号：29 (9338 重鎖CDR3 アミノ酸配列）:
ARGRFAY
配列番号：30 (9338 軽鎖CDR1 アミノ酸配列）:
SSVSSGY
配列番号：31 (9338 軽鎖CDR2 アミノ酸配列）:
STS
配列番号：32 (9338 軽鎖CDR3 アミノ酸配列）:
HQWSSYPFT
配列番号：33 (ヒト化 9006 軽鎖アミノ酸配列）:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号：34 (ヒト化 9006 重鎖アミノ酸配列）:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNFRMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYVDDLKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARKGIARAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号：35 (ヒト化 9338 軽鎖アミノ酸配列）:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号：36 (ヒト化 9338 重鎖アミノ酸配列）:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGHIENNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【図１】
2017534259.tif 000020
【図２】
2017534259.tif 000021
【図３】
2017534259.tif 000022
【図４】
2017534259.tif 000023
【図５】
2017534259.tif 000024
【図６】
2017534259.tif 000025
【図７】
2017534259.tif 000026
【図８】
2017534259.tif 000027
【図９】
2017534259.tif 000028
【図１０】
2017534259.tif 000029
【図１１】
2017534259.tif 000030
【図１２】
2017534259.tif 000031
【図１３】
2017534259.tif 000032
【図１４】
2017534259.tif 000033
【図１５】
2017534259.tif 000034
【図１６】
2017534259.tif 000035
【図１７】
2017534259.tif 000036
【図１８】
2017534259.tif 000037
【図１９】
2017534259.tif 000038
【図２０】
2017534259.tif 000039
【図２１】
2017534259.tif 000040
【図２２】
2017534259.tif 000041
【図２３】
2017534259.tif 000042
【図２４】
2017534259.tif 000043
【図２５】
2017534259.tif 000044
【図２６】
2017534259.tif 000045
【図２７】
2017534259.tif 000046
【図２８】
2017534259.tif 000047
【図２９】
2017534259.tif 000048
【図３０】
2017534259.tif 000049
【図３１】
2017534259.tif 000050
【配列表】
2017534259000001.app
【国際調査報告】
2017534259.tif 000051
2017534259.tif 000052
2017534259.tif 000053