(57)【要約】  本発明は、Ｂ細胞枯渇療法（例えば抗ＣＤ１９抗体での処置）に反応性がある対象を同定するためのｍｉＲ−６２９の使用を特色とする、組成物および方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定するためのｍｉＲ−６２９の使用を特色とする。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象に対する治療を選択する方法であって、参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、前記低下の検出によって、抗ＣＤ１９抗体療法に対して前記対象が選択される、方法。
【請求項２】
抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定する方法であって、参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、前記低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるものとして前記対象が同定される、方法。
【請求項３】
Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象に対する治療を選択する方法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析によって、参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、前記低下の検出によって、抗ＣＤ１９抗体療法に対して前記対象が選択される、方法。
【請求項４】
抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定する方法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析によって、参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、前記低下の検出によって、抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるものとして前記対象が同定される、方法。
【請求項５】
前記参照レベルが、
前記試料中に存在する他のマイクロＲＮＡの発現レベルとｍｉＲ−６２９発現レベルを比較するか；
抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性がないＢ細胞悪性腫瘍を有する対象から得た試料中のｍｉＲ−６２９発現の範囲を決定するか；または
抗ＣＤ１９抗体処置に対する感受性が低下しているか、化学療法の抗増殖効果に耐性があるか、または化学療法誘導性アポトーシスに耐性がある対象もしくは細胞株中でのｍｉＲ−６２９発現のレベルもしくは範囲を測定すること
によって得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして選択された対象を処置する方法であって、選択された対象に有効量の抗ＣＤ１９抗体を投与することを含み、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することによって前記対象が選択される、方法。
【請求項７】
抗ＣＤ１９抗体での処置および化学療法に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして選択された対象を処置する方法であって、選択された対象に有効量の抗ＣＤ１９抗体および化学療法剤を投与することを含み、参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することによって前記対象が選択される、方法。
【請求項８】
Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象に薬物を投与する方法であって、参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することによって、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして前記対象が同定される、方法。
【請求項９】
Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象においてＢ細胞を枯渇させる方法であって、
（ａ）参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出し、前記低下の検出によって、抗ＣＤ１９抗体療法に反応性があるものとして前記対象が同定され；
（ｂ）抗ＣＤ１９抗体を前記対象に投与し、それによって前記対象においてＢ細胞を枯渇させること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記参照レベルが、
前記試料中に存在する他のマイクロＲＮＡの発現レベルとｍｉＲ−６２９発現レベルを比較し；
抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性がないＢ細胞悪性腫瘍を有する対象から得た試料中のｍｉＲ−６２９発現の範囲を決定するか；または
抗ＣＤ１９抗体処置に対する感受性が低下しているか、化学療法の抗増殖効果に耐性があるか、または化学療法誘導性アポトーシスに耐性がある対象もしくは細胞株中でのｍｉＲ−６２９発現のレベルもしくは範囲を測定すること
によって得られる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象がＢ細胞起源のリンパ腫または白血病を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫または慢性リンパ球性白血病を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記血液試料が、全血、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、血清または血漿である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＣＤ１９抗体が、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ＣＤ１９抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ＣＤ１９抗体がＭＥＤＩ−５５１である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＣＤ１９抗体に対する前記対象の反応にｍｉＲ−６２９が介在する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ｍｉＲ−６２９低下の検出によって、ナチュラルキラー細胞の活性化が上昇しているものとして前記対象が同定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ｍｉＲ−６２９が、血液試料中に存在するかまたはそこから単離されるエキソソームにおいて検出される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象の選択が、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＭ、カテプシンＤ、パーフォリン１、インターフェロン制御因子７、ＣＤ６３、ＣＤ９６、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６およびＣＤ１０７ａまたは前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択されるナチュラルキラー細胞タンパク質の発現のレベルを検出することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ｍｉＲ−６２９に特異的に結合するプライマーまたはプローブを含む、キット。
【請求項２３】
抗ＣＤ１９抗体、およびｍｉＲ−６２９に特異的に結合するプライマーもしくはプローブを含む、キット。
【請求項２４】
Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして同定される対象において抗ＣＤ１９抗体反応性を誘導するかまたは向上させる方法であって、有効量のｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
対象においてＢ細胞を枯渇させる方法であって、抗ＣＤ１９抗体と組み合わせて有効量のｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子を前記対象に投与し、それによって前記対象においてＢ細胞を枯渇させることを含む、方法。
【請求項２６】
前記阻害性核酸分子が、アンチセンス核酸分子、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
抗ＣＤ１９抗体と組み合わせてｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子を含む、組成物。
【請求項２８】
前記阻害性核酸分子が、アンチセンス核酸分子、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記阻害性核酸分子が、抗ＣＤ１９抗体の前にまたはこれと同時に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定する方法であって、参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が上昇していることを検出することを含み、前記上昇の検出によって、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして前記対象が同定される、方法。
【請求項３１】
Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定する方法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析によって、参照レベルと比較して前記対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が上昇していることを検出することを含み、前記上昇の検出によって、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして前記対象が同定される、方法。
【請求項３２】
ｍｉＲ−６２９が、前記血液試料中に存在するかまたはそこから単離されるエキソソーム中で検出される、請求項３０または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この特許出願は、本明細書中で参照により組み込まれる、２０１４年３月４日提出の米国仮特許出願第６１／９４７，７５５号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
電子提出した資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出されるコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列リストが、本明細書中でその全体において参照により組み込まれ、次のとおり特定される：Ｏｎｅ  ８，５８５バイトＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル名「ＭＲ６２９−１００ＷＯ１ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ」２０１５年３月４日作成。
【背景技術】
【０００３】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含むヒト白血病およびリンパ腫の大部分はＢ細胞起源である。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）でＢ細胞限定的な表面抗原を標的とすることによるＢ細胞枯渇に基づく治療アプローチへの注目が次第に集まってきている。ヒト表面抗原分類（ＣＤ）抗原１９は、Ｂ細胞特異的な表面抗原であり、Ｂ細胞起源の悪性腫瘍を処置するための、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）アプローチに対する魅力的な標的である。抗体依存性の細胞の細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）が向上した、親和性最適化および非フコシル化ＣＤ１９モノクローナル抗体は、Ｂ細胞悪性腫瘍の前臨床モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｂ細胞悪性腫瘍は様々な発症機序から生じ、分子レベルでこれらの悪性腫瘍の特徴を調べる方法は患者を層別化するために有用であり、それによって迅速に患者に有効な治療を受けさせるという認識が広まっている。Ｂ細胞悪性腫瘍がある対象の反応性を予測するための方法の改善が早急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
下記のように、本発明は、Ｂ細胞枯渇療法（例えば抗ＣＤ１９抗体での処置）に反応性がある対象を同定するためのｍｉＲ−６２９の使用を特色とする組成物および方法を特色とする。他の実施形態において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象を同定するためのｍｉＲ−６２９の使用を特色とする。
【０００６】
ある態様において、本発明は、全般的に、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象（例えばヒト）に対する治療を選択する方法であって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、その低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体療法に対する対象が選択される、方法を提供する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性がある、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定する方法であって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、その低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるものとして対象が同定される、方法を提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象に対して治療を選択する方法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析により、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、その低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体療法に対する対象が選択される、方法を提供する。
【０００９】
また別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定する方法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析により、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、その低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるものとして対象が同定される、方法を提供する。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして選択される対象を処置する方法であって、有効量の抗ＣＤ１９抗体を被選択対象に投与することを含み、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することによって対象が選択される、方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象に薬物を投与する方法であって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することによって、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象が同定される、方法を提供する。
【００１２】
また別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象においてＢ細胞を枯渇させる方法であって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、この低下の検出によって、抗ＣＤ１９抗体療法に反応性があるものとして対象が同定され；抗ＣＤ１９抗体を対象に投与し、それによって対象においてＢ細胞を枯渇させる、方法を提供する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、ｍｉＲ−６２９に特異的に結合するプライマーまたはプローブを含有するキットを提供する。ある実施形態において、本キットは、抗ＣＤ１９抗体療法に反応性があるものとして対象を選択または同定するための本キットの使用のための指示書をさらに含有する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９抗体、およびｍｉＲ−６２９に特異的に結合するプライマーもしくはプローブを含有するキットを提供する。ある実施形態において、本キットは、抗ＣＤ１９抗体療法に反応性があるものとして対象を選択または同定するための本キットの使用のための指示書をさらに含有する。
【００１５】
また別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして同定される対象における抗ＣＤ１９抗体反応性を誘導するかまたは上昇させる方法であって、有効量のｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００１６】
また別の態様において、本発明は、対象においてＢ細胞を枯渇させる方法であって、抗ＣＤ１９抗体と組み合わせて有効量のｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子を対象に投与し、それによって対象においてＢ細胞を枯渇させることを含む、方法を提供する。
【００１７】
また別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９抗体と組み合わせてｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子を含む組成物を提供する。
【００１８】
また別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定する方法であって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が上昇していることを検出することを含み、その上昇の検出によってＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象が同定される、方法を提供する。
【００１９】
また別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定する方法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析によって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が上昇していることを検出することを含み、その上昇の検出によってＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象が同定される、方法を提供する。ある実施形態において、参照レベルは、健常対照対象の血液試料中に存在するｍｉＲ−６２９発現のレベルである。
【００２０】
また別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象に対する治療を選択するインビトロ法であって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、その低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体療法に対する対象が選択される、方法を提供する。
【００２１】
また別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定するインビトロ法であって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、その低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるものとして対象が同定される、方法を提供する。
【００２２】
また別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象に対する治療を選択するインビトロ法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析によって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、その低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体療法に対する対象が選択される、方法を提供する。
【００２３】
また別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定するインビトロ法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析によって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含み、その低下の検出によって抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるものとして対象が同定される、方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとしてインビトロ法で選択される対象を処置するための薬剤の製造における抗ＣＤ１９抗体の使用であって、その対象が、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することによって選択される、使用を提供する。ある実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、低フコシル化または非フコシル化されている。また別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。また別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。また別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。また別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【００２５】
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象においてＢ細胞を枯渇させるための薬剤の製造における抗ＣＤ１９抗体の使用であって、その対象が、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が低下していることを検出することを含むインビトロ法において処置に対して選択され、この低下の検出によって、抗ＣＤ１９抗体療法に反応性があるものとして対象が同定される、使用を提供する。ある実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は低フコシル化または非フコシル化されている。また別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。また別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。また別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。また別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして同定される対象の処置のための薬剤の製造における、ｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子の使用を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、対象においてＢ細胞を枯渇させるための薬剤の製造におけるｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子の使用を提供する。ある実施形態において、本阻害性核酸分子は、アンチセンス核酸分子、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【００２８】
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして同定される対象を処置するための薬剤の製造における、抗ＣＤ１９抗体と組み合わせた、ｍｉＲ−６２９を標的とする阻害性核酸分子の使用を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定するインビトロ法であって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が上昇していることを検出することを含み、その上昇の検出によってＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象が同定される、方法を提供する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象を同定するインビトロ法であって、定量的ＰＣＲまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析によって、参照レベルと比較して対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現が上昇していることを検出することを含み、その上昇の検出によってＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象が同定される、方法を提供する。
【００３１】
本明細書中で述べられる本発明の上記態様または何らかの他の態様の何れかの様々な実施形態において、参照レベルは、試料中に存在する他のマイクロＲＮＡの発現レベルとｍｉＲ−６２９発現のレベルを比較するか；抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性がないＢ細胞悪性腫瘍を有する対象から得られる試料中のｍｉＲ−６２９発現の範囲を決定するか；または抗ＣＤ１９抗体処置に対する感受性が低下しているか、化学療法の抗増殖効果に耐性があるかまたは化学療法により誘導されるアポトーシスに耐性がある対象もしくは細胞株におけるｍｉＲ−６２９発現のレベルもしくは範囲を測定することによって得られる。上記態様の他の実施形態において、参照レベルは、Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ  Ｃｔ法を用いたｍｉＲ−６２９の発現の倍単位の変化を測定することによって得られる。上記態様の他の実施形態において、参照レベルは、対象の集団においてｍｉＲ−６２９発現の範囲またはレベルを測定することによって得られる。上記態様の何れかの様々な実施形態において、対象はＢ細胞起源のリンパ腫または白血病（例えば非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫または慢性リンパ球性白血病）に罹患している。上記態様の他の実施形態において、ｍｉＲ−６２９発現は、非反応性の濾胞性リンパ腫の対象と比較して、反応性がある濾胞性リンパ腫の対象から得られる血液試料中で約３から５倍低い。上記態様の他の実施形態において、ｍｉＲ−６２９発現は、非反応性のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の対象と比較して、反応性があるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の対象において約５から７倍低い。上記態様の他の実施形態において、血液試料は、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、血清または血漿である。上記態様の他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。上記態様の他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、低フコシル化または非フコシル化されている。上記態様のさらに他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含有する。上記態様の他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含有する。上記態様の他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含有する。上記態様の他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含有する。上記態様の他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体はＭＥＤＩ−５５１である。上記態様の他の実施形態において、本阻害性核酸分子は、アンチセンス核酸分子、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。上記態様の他の実施形態において、本阻害性核酸分子は、抗ＣＤ１９抗体の前にまたはこれと一緒に投与される。
【００３２】
本発明の他の特性および長所は、発明を実施するための形態および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００３３】
定義
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される技術および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。次の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的定義とともに技術の１つを提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書中で使用される場合、次の用語は、別段の断りがない限り、下記でそれらに帰する意味を有する。
【００３４】
「Ｂ細胞悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞系列の細胞由来の何らかの悪性腫瘍を含む。
【００３５】
「ＣＤ１９」とは、抗ＣＤ１９抗体またはそれらの断片に結合する約９０ｋＤａの抗原を意味する。ＣＤ１９は、幹細胞段階から形質細胞への最終分化を通じてＢ系列細胞で見られる。好ましい実施形態において、本明細書中で開示される抗体（例えばＭＥＤＩ−５５１）により標的とされるＣＤ１９抗原はヒトＣＤ１９抗原である。ある代表的なＣＤ１９抗原の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６９９６６で提供され、配列番号９で下記に示される。
2017510255.tif 000003
【００３６】
「抗ＣＤ１９抗体」は、ＣＤ１９抗原に特異的に結合する抗体またはその断片を意味する。ある実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【００３７】
「ｍｉＲ−６２９」は、次の配列（配列番号１０）（プロセシング前）を有するかまたは含むマイクロＲＮＡを意味する。
2017510255.tif 000004
【００３８】
別の実施形態において、成熟ｍｉＲ−６２９マイクロＲＮＡは、次の配列、配列番号１１を有するかまたは含む。
６１−ｇｕｕｃｕｃｃｃａａｃｇｕａａｇｃｃｃａｇｃ−８２（ｍｉＲ  Ｂａｓｅ受託番号ＭＩＭＡＴ０００３２９８）
【００３９】
例えば、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されているｍｉＲＩＤＩＡＮ  マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９−３ｐヘアピン阻害剤によって、ｍｉＲ−６２９の機能および／または発現を阻害することができる。
【００４０】
「デルタＣＴ法」は、各リンパ腫／白血病患者試料のデルタ−Ｃｔを決定することを意味し、これは、ｍｉＲ−６２９の閾値サイクル（Ｃｔ）値−４種類のハウスキーピング遺伝子（ＲＮＵ４８、ＲＮＵ２４、Ｕ６およびＵ４７）の平均Ｃｔ値として計算される。次いで、全ての正常個体に対する平均デルタ−Ｃｔ値（癌患者試料に対して記載のように計算）を各患者試料に対する個々のデルタ−Ｃｔ値から差し引き、各リンパ腫／白血病患者試料に対するデルタ−デルタ−Ｃｔ値を得る。これは、次の等式によって倍単位の変化に関連付けられる：倍単位の変化＝２＾−（デルタ−デルタ−Ｃｔ）。
【００４１】
この開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法でそれらに対して述べられる意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「基本的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」などは、米国特許法で述べられる意味を有し、この用語はオープンエンドであり、引用されるもの以外のものの存在によって引用されるものの基本的または新規の特徴が変化しない限り、引用されるもの以外のものの存在を許すが、先行技術の実施形態は除く。
【００４２】
Ｂ細胞の「枯渇」は、ベースラインレベルに対する、循環Ｂ細胞および／または特定の組織中のＢ細胞の減少を意味する。特定の実施形態において、枯渇は、処置（例えば抗ＣＤ１９抗体での処置）前の対象に存在するレベルと比較して、少なくとも約２５％、４０％、５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の、またはそれを超える（例えば、９６％、９７％、９８％または９９％）減少である。ある特定の実施形態において、循環および／または特定の組織から実質的に全ての検出可能なＢ細胞を枯渇させる。
【００４３】
「検出する（ｄｅｔｅｃｔ）」は、検出しようとする検体の有無または量を同定することを指す。ある実施形態において、検体はｍｉＲ−６２９である。
【００４４】
「ｍｉＲ−６２９阻害性核酸分子」は、哺乳動物細胞に投与されたときに、その結果、ｍｉＲ−６２９の発現を低下させる、２本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡまたはその一部分またはその模倣物を意味する。一般的には、核酸阻害剤は、標的核酸分子の少なくとも一部分もしくはそのオルソログを含むか、または標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部分を含む。ある実施形態において、ｍｉＲ−６２９阻害性核酸分子は、細胞においてｍｉＲ−６２９発現の少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％またはさらに９０〜１００％を阻害する。
【００４５】
「参照」は、比較の基準を意味する。ある実施形態において、参照レベルは、健常対照対象から得られるかまたは抗ＣＤ１９抗体処置に反応性がないＢ細胞悪性腫瘍がある対象から得られる全血試料中のｍｉＲ−６２９発現のレベルである。
【００４６】
「ｍｉＲ−６２９ｓｉＲＮＡ」は、標的細胞においてｍｉＲ−６２９発現を低下させることが可能な２本鎖ＲＮＡを意味する。最適に、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端で２個の塩基突出を有する。個々の細胞に、または動物の体全体にこれらのｄｓＲＮＡを導入することができ；例えば、ｍｉＲ−６２９核酸分子の発現を低下させるために、血流を介してこれらを全身的に導入し得る。
【００４７】
「特異的に結合する」は、抗体、プライマーまたはプローブが本発明のポリペプチドまたは核酸分子を認識し、結合するが、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを天然に含む試料、例えば生体試料中の他の分子を実質的に認識せず、結合しないことを意味する。ある実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、ＣＤ１９ポリペプチドに特異的に結合するものである。代表的な抗ＣＤ１９抗体は当技術分野で公知であり、本明細書中、下記で記載する。
【００４８】
「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ネコまたはマウスを含むが限定されない哺乳動物を意味する。
【００４９】
本明細書中で提供される範囲は、その範囲内の値全てに対する省略と理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０から構成される群のあらゆる数、数の組み合わせまたはそのサブ範囲を含むと理解される。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、障害および／またはそれに付随する症状を軽減するかまたは改善することを指す。ある実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置の結果、Ｂ細胞の枯渇が起こるか、対象における腫瘍の成長または増殖が低下するかもしくは安定するか、悪性細胞の細胞死が増加するか、または患者の生存率が上昇する。当然のことながら、除外されないものの、障害または状態の処置は、障害、状態またはそれに付随する症状が完全に取り除かれることを必要とはしない。
【００５１】
具体的な断りがない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用される場合、「または」という語は、包括的であると理解される。具体的な断りがない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という語は、単数形または複数形であると理解される。
【００５２】
具体的な断りがない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用される場合、「約」という語は、当技術分野で通常の許容範囲内であるように理解され、例えば平均の２標準偏差内である。約は、述べられる値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内であるものとして理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書中で提供される全ての数値は約という語によって修飾される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】抗ＣＤ１９抗体に対する感受性が低い細胞株と比較した、抗ＣＤ１９抗体処置に対する感受性が高いびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株におけるｍｉＲ−６２９発現の低下を示すグラフである。
【図１Ｂ】抗ＣＤ１９抗体投与に対して高いおよび低い感受性を示す細胞株における発現強度ｍｉＲシグネチャーを示すグラフである。図１Ｂは、抗ＣＤ１９抗体処置に対する感受性が高いＤＬＢＣＬ細胞株においてｍｉＲ−６２９が有意に低いことを示す。
【図２】進行疾患（ＰＤ）がある非反応者と比較して、抗ＣＤ１９抗体での処置に対して完全または部分的反応（ＣＲ／ＰＲ）を示すびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者においてｍｉＲ−６２９発現が低いことを示す散布図である。
【図３】濾胞性リンパ腫非反応者（ＰＤ）よりも、抗ＣＤ１９抗体処置に反応した（ＣＲ／ＰＲ）濾胞性リンパ腫患者から得た全血試料中でｍｉＲ−６２９発現が低かったことを示す散布図である。
【図４】非反応者よりも、抗ＣＤ１９抗体処置に対して反応した（ＣＲ／ＰＲ）慢性リンパ球性白血病患者からの全血試料中でｍｉＲ−６２９発現が低かったことを示す散布図である。
【図５Ａ−５Ｂ】処置前の慢性リンパ球性白血病患者から得た全血中で測定したｍｉＲ−６２９発現を示す散布図である。リツキシマブ−ＩＣＥ療法（図５Ｂ）と抗ＣＤ１９抗体−ＩＣＥ療法（図５Ａ）とに対するこの患者の反応の特徴を調べた。
【図５Ｃ−５Ｄ】抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）またはリツキシマブ処置それぞれに対して高および低感受性を呈する細胞株における発現強度ｍｉＲシグネチャーを示す散布図である。
【図５Ｅ】抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）および化学療法に対して反応するＤＬＢＣＬ患者においてベースラインｍｉＲ−６２９発現がより低いことを示す散布図である。この効果はリツキシマブでは観察されなかった。このデータは、全用量（２ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｇ／ｋｇのＭＥＤＩ−５５１および３７５ｍｇ／ｍ2のリツキシマブ）で処置した患者から得た。
【図５Ｆ】抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）および化学療法に対して反応するＤＬＢＣＬ患者においてベースラインｍｉＲ−６２９発現がより低いことを示す散布図である。化学療法は、次のようなＩＣＥまたはＤＨＡＰの何れかを投与した：ＩＶ点滴を介して次のようにＩＣＥを投与する：第２日にメスナとともに２４時間連続してイホスファミド５ｇ／ｍ2；第２日にカルボプラチンＡＵＣ＝５ｍｇ／ｍＬ×分（８００ｍｇ最大）；２１日周期で第１、２および３日にエトポシド１００ｍｇ／ｍ2）。ＤＨＡＰはＩＶ点滴を介して次のように投与する：第１、２、３および４日にデキサメタゾン４０ｍｇ；投与周期の第１日にシスプラチン１００ｍｇ／ｍ2を２４時間連続；２１日周期の第２日にシタラビン２ｇ／ｍ2の３時間点滴を１２時間後に反復（２回投与）。このデータは、２ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）で処置した患者から得た。
【図６Ａ】散布図である。図６Ａは、抗ＣＤ１９抗体に反応した（ＣＲ／ＰＲ）ＤＬＢＣＬ患者において処置前後でｍｉＲ−６２９発現レベルが同様であったことを示す（図６Ａ）。
【図６Ｂ−６Ｃ】散布図である。図６Ｂは、抗ＣＤ１９抗体に反応した（ＣＲ／ＰＲ）ＤＬＢＣＬ患者において処置前後でｍｉＲ−６２９発現レベルが同様であったことを示す（図６Ｂ）。図６Ｃは、進行性疾患（ＰＤ）のＤＬＢＣＬ患者において処置後にｍｉＲ−６２９発現レベルが上昇したことを示す。
【図７Ａ】健常ボランティアと比較して、リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫）の患者においてｍｉＲ−６２９がより高いことを示す散布図である。図７Ａは、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析を用いて得られた結果を示す。
【図７Ｂ】健常ボランティアと比較して、リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫）の患者においてｍｉＲ−６２９がより高いことを示す散布図である。図７Ｂは、ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲを用いて得られた結果を示す。
【図８】指定された細胞タイプにおけるｍｉＲ−６２９発現を示す散布図である。
【図９Ａ】ｍｉＲ−６２９過剰発現に関する。図９Ａは、ｍｉＲ−６２９／ＧＦＰ発現ベクターを示す。
【図９Ｂ−９Ｃ】ｍｉＲ−６２９過剰発現に関する。図９Ｂは、ｍｉＲ−６２９／ＧＦＰ発現ベクターを発現する細胞におけるＧＦＰ発現を示す顕微鏡写真である。図９Ｃは、ＤＬＢＣＬ細胞株Ｋａｒｐａｓ−４２２におけるｍｉＲ−６２９の発現を示すグラフである。レンチウイルスｍｉＲ−６２９発現ベクターの形質転換後、ＧＦＰ発現を用いてＫａｒｐａｓ−４２２細胞を２つの群、低ｍｉＲ−６２９群および高ｍｉＲ−６２９群に選別した。両群でｍｉＲ−６２９発現が上昇したが、ＧＦＰ発現が上昇した群でより高い。
【図１０Ａ−１０Ｂ】未処理対照細胞と比較した、５μＭまたは１０μＭエトポシドで処理したｍｉＲ−６２９過剰発現Ｋａｒｐａｓ−４２２リンパ腫細胞におけるカスパーゼ活性化を示すグラフである。ｍｉＲ−６２９過剰発現によって、Ｋａｒｐａｓ−４２２リンパ腫細胞が化学療法（エトポシド）誘導性のアポトーシスから保護された。ｍｉＲ−６２９過剰発現細胞のマルチクローンを作製した。ｍｉＲ−６２９の発現が上昇するほど、化学療法（エトポシド）誘導性アポトーシスからより良好に保護されることが認められる。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ベクターのみ（スクランブル）を遺伝子移入した対照細胞と比較した、エトポシドで処理した、ｍｉＲ−６２９を過剰発現するＫａｒｐａｓ−４２２リンパ腫細胞における細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。ｍｉＲ−６２９発現によって、化学療法（エトポシド）誘導性の細胞増殖喪失から細胞が保護された。上記のように、ｍｉＲ−６２９過剰発現細胞のマルチクローンを作製した。ｍｉＲ−６２９の発現が上昇するほど、化学療法（エトポシド）−誘導性の増殖喪失からよりよく保護されることが認められる。
【図１２Ａ−１２Ｂ】グラフである。図１２Ａは、ベクターのみを発現する対照細胞と比較した、ｍｉＲ−６２９を低または高レベルで発現するＫａｒｐａｓ４２２細胞におけるインビトロ抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイの結果を示す。ＡＤＣＣの結果は、これらがｍｉＲ−６２９レベル上昇時にＭＥＤＩ−５５１に対するＡＤＣＣ反応のシフトを示すので重要である。理論により縛られることを望むものではないが、これらの結果から、ＭＥＤＩ−５５１に対する反応に介在することにおいて、ｍｉＲ−６２９が直接的役割を有すると思われることが示される。図１２Ｂは、低または高レベルのｍｉＲ−６２９を発現する細胞における自発的な乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を示す。ＬＤＨ放出は、長年にわたりリンパ腫における既知の予後因子となっており、臨床業務において日常的に測定される。これらの結果は、ｍｉＲ−６２９によってリンパ腫細胞株においてＬＤＨ放出が増加したことを示す。したがって、ｍｉＲ−６２９発現レベルは腫瘍の侵襲性と関連すると思われる。これは、一部、ｍｉＲ−６２９とＭＥＤＩ−５５１への反応との間の相関を説明し得る。
【図１３】慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の患者における抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）での処置に対する反応のロジスティック回帰分析を示す。点は反応者（上）および非反応者（下）を表す。このデータは、ｍｉＲＮＡシグネチャー発現がＣＬＬにおけるＭＥＤＩ−５５１反応の予測バイオマーカー候補であることを示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイの結果を示すグラフである。指定の細胞型においてｍｉＲ−６２９を過剰発現させ、次いでこの細胞を抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ５５１）で処理した。
【図１４Ｃ−１４Ｄ】抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイの結果を示すグラフである。指定の細胞型においてｍｉＲ−６２９を過剰発現させ、次いでこの細胞を抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ５５１）で処理した。
【図１５Ａ−１５Ｂ】抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ５５１）処理に対するそれらの感受性が異なった９種類の細胞株においてアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合二次抗体を用いてアッセイしたＣＤ１９（図１５Ａ）およびＣＤ２０（図１５Ｂ）発現を示すグラフである。対照遺伝子移入細胞、ｍｉＲ遺伝子移入細胞および非遺伝子移入細胞において、平均蛍光強度（ＭＦＩ）比率を測定した。ｍｉＲ−６２９過剰発現後にＣＤ１９もＣＤ２０も変化しなかった。
【図１６】ＤＬＢＣＬ患者からのベースライン血液試料中のｍｉＲ−６２９発現レベル（正常血液と比較した倍単位の変化）が、リツキシマブ、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノマイシン（またはドキソルビシン）、（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））とも呼ばれるビンクリスチンおよびプレドニゾロン（Ｒ−ＣＨＯＰ）（Ａｌｅｎｃａｒら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；１７（１２）Ｊｕｎｅ  １５，２０１１）を含む化学療法併用での処置後の患者生存率の上昇を予測するために以前示された血液中のｍｉＲＮＡ発現シグネチャーと相関しないことを示すグラフである。Ｒ−ＣＨＯＰ反応関連ｍｉＲＮＡシグネチャーは、ＤＬＢＣＬ血液中のＭＥＤＩ−５５１反応関連ｍｉＲＮＡシグネチャーと相関しない。
【図１７】ｍｉＲ−６２９を安定的に過剰発現する細胞から単離されたエキソソーム中にｍｉＲ−６２９が存在したことを示すグラフである。実際に、ｍｉＲ−６２９は、これらのエキソソーム中に１２〜２０倍高いレベルで存在した。
【図１８Ａ−１８Ｂ】ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞でのｍｉＲ−６２９ヌクレオフェクションの効果の予備分析を示すグラフである。ｍｉＲ−６２９発現はヌクレオフェクション後に上昇し（図１８Ａ）；細胞溶解経路における遺伝子の発現および関連するナチュラルキラー細胞活性化／接着経路が４０〜６０％低下した。分析した遺伝子には、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＭ、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、パーフォリン１（ＰＲＦ１）、ＣＤ６３、ＣＤ９６およびインターフェロン制御因子７が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
抗ＣＤ１９（１６Ｃ４）抗体配列の記述
2017510255.tif 000005
【００５５】
本発明は、Ｂ細胞枯渇療法（例えば抗ＣＤ１９抗体での処置）に対する反応性がある対象を同定するためのｍｉＲ−６２９の使用を特色とする組成物および方法を提供する。
【００５６】
本発明は、少なくとも一部、抗ＣＤ１９抗体処置への対象の反応性の特徴を調べるために、Ｂ細胞悪性腫瘍がある対象の血液試料中のｍｉＲ−６２９発現を使用することができるという発見に基づく。下記で詳細に報告されるように、インビトロ抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイを用いて抗ＣＤ１９抗体処置に対する高または低感受性を有するものとして多くのヒト非ホジキンＢ細胞リンパ腫細胞株が同定された。抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があったびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫対象から得られた血液試料中でｍｉＲ−６２９発現レベルが低かった。抗ＣＤ１９抗体処置に反応性がある濾胞性リンパ腫対象および慢性リンパ球性白血病対象から得た血液試料中でもｍｉＲ−６２９発現レベルが低かった。
【００５７】
したがって、本発明は、対象血液試料中のｍｉＲ−６２９発現レベルに基づいて、抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があると思われるＢ細胞悪性腫瘍を有する対象を同定するための方法を提供する。
【００５８】
生体試料のタイプ
抗ＣＤ１９抗体処置に対する対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の反応性の特徴を調べることにおいて、様々なタイプの生体試料中でｍｉＲ−６２９発現レベルを測定する。ある実施形態において、生体試料は、血液、血清または血漿試料である。ある好ましい実施形態において、生体試料は、末梢血液単核細胞、リンパ球および単球を含む血液試料である。
【００５９】
ｍｉＲ−６２９発現は、非反応性対象（例えば進行性疾患のある対象）での発現レベルよりも、抗ＣＤ１９抗体処置に反応性がある対象から得た血液試料中で少なくとも約３から５倍低いかまたは約５から７倍低いものであり得る。別の実施形態において、ｍｉＲ−６２９発現は、健常対照よりも、Ｂ細胞悪性腫瘍の対象において少なくとも約５、１０、２０または３０倍高い。当技術分野で公知の何れかの方法を用いて倍単位の変化の値を決定する。ある実施形態において、健常ボランティアにおいてまたは抗ＣＤ１９抗体非反応性対象においてｍｉＲ−６２９発現を使用して２-ΔΔCtを計算することによって、倍単位の変化を決定する。
【００６０】
処置方法の選択
本明細書中下記で報告されるように、処置方法を選択する過程において、ｍｉＲ−６２９発現についてＢ細胞悪性腫瘍に罹患している対象を試験し得る。参照レベルと比較してｍｉＲ−６２９発現が低下していることを特徴とする患者は、抗ＣＤ１９処置に反応性があるものとして判定される。
【００６１】
選択された患者に対して多くの標準的処置計画を利用可能である。これらの処置を本発明の方法と組み合わせて使用できる。特定の実施形態において、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチンおよびエトポシド）と組み合わせて抗ＣＤ１９処置を行う。
【００６２】
ＣＤ１９
ヒト表面抗原分類（ＣＤ）抗原１９は、膜貫通受容体のスーパーファミリーを含有する免疫グロブリンドメインに属するＢ細胞特異的な抗原である。ＣＤ１９は、ＣＤ１９発現が下方制御される場合、プロＢ細胞から形質細胞段階のその系統全体を通じてＢ細胞上で発現される。造血幹細胞またはプロＢ細胞段階前のＢ細胞ではＣＤ１９は発現されない。重要なこととして、Ｂ細胞の悪性形質転換後にＣＤ１９の発現が維持され、大部分のＢ細胞悪性腫瘍上でＣＤ１９が発現される。Ｂ細胞悪性腫瘍におけるＣＤ１９の幅広く、比較的安定な発現により、この抗原はｍＡｂに基づく治療のための魅力的な標的となる。
【００６３】
抗ＣＤ１９抗体
抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有する対象は、それらの血液中に存在するｍｉＲ−６２９発現レベルの特徴を調べることによって判定される。処置について選択したら、このような対象に当技術分野で公知の何らかの抗ＣＤ１９抗体を実質的に投与し得る。適切な抗ＣＤ１９抗体としては、例えば公知の抗ＣＤ１９抗体、市販の抗ＣＤ１９抗体または当技術分野で周知の方法を用いて開発された抗ＣＤ１９抗体が挙げられる。
【００６４】
ＭＥＤＩ−５５１は、強力なＡＤＣＣエフェクター機能を有するＣＤ１９  ｍＡｂである。ＭＥＤＩ−５５１は、ＨＢ１２ｂ  ｍＡｂのヒト化および親和性最適化によって開発された、ＣＤ１９  ｍＡｂ抗ＣＤ１９−２の非フコシル化型である（Ｋａｎｓａｓ  ＆  Ｔｅｄｄｅｒ，１９９１；Ｙａｚａｗａら、２００５；Ｈｅｒｂｓｔら、２０１０）。ＭＥＤＩ−５５１は、フコシルトランスフェラーゼ欠損型の産生細胞株でのｍＡｂ抗ＣＤ１９−２の発現によって作製されるが、これはＦｃｃＲＩＩＩＡに対する親和性が向上し、ＡＤＣＣ活性が高まった均一に非フコシル化されたｍＡｂを作製する手順である（Ｈｅｒｂｓｔら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２０１０．３３５（１）：２１３−２２２）。
【００６５】
ある一定の実施形態において、本明細書中に記載の方法および組成物は、抗ＣＤ１９抗体１６Ｃ４（例えば、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１３８３３６号明細書を参照）またはそれらの抗原結合断片を利用する。１６Ｃ４は、強力なＡＤＣＣエフェクター機能を有することが示されているＣＤ１９  ｍＡｂである。１６Ｃ４は、ＨＢ１２ｂ  ｍＡｂのヒト化および親和性最適化により開発された、ＣＤ１９  ｍＡｂ抗ＣＤ１９−２の非フコシル化型である（Ｋａｎｓａｓ  Ｇ  ＳおよびＴｅｄｄｅｒ  Ｔ  Ｆ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１；１４７：４０９４−４１０２；Ｙａｚａｗａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，２００５：１０２（４２）：１５１７８−１５１８３；Ｈｅｒｂｓｔら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２０１０．３３５（１）：２１３−２２２）。１６Ｃ４およびＭＥＤＩ−５５１は両者とも、配列番号２、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む。配列番号２から４および配列番号６から８のＣＤＲは、配列番号１のＶＨおよび配列番号５のＶＬ内に含まれる。このように、当業者にとって当然のことながら、配列番号２から４および６から８のＣＤＲを含む抗体もまた、本発明の方法および組成物において使用し得る。
【００６６】
本開示は、ヒトＣＤ１９に結合する抗体１６Ｃ４の誘導体である抗体を包含する。抗体をコードするヌクレオチド配列において突然変異（例えば、付加、欠失および／または置換）を導入するために、例えば、アミノ酸置換を生成させるために日常的に使用される部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ−介在突然変異誘発を含め、当業者にとって公知の標準的技術を使用し得る。ある実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＫ  ＣＤＲ誘導体は、１６Ｃ４抗ＣＤ１９抗体の元のＶＨおよび／またはＶＫ  ＣＤＲと比較して、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、２未満のアミノ酸置換または１アミノ酸置換を含み得る。別の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＫ  ＣＤＲ誘導体は、１以上の予測される非必須アミノ酸残基（例えば、抗体にとってヒトＣＤ１９に特異的に結合するのに重要でないアミノ酸残基）で保存的アミノ酸置換が生成され得る。突然変異はまた、例えば飽和突然変異誘発などによって、ＶＩＩおよび／またはＶＫ  ＣＤＲコード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入することもでき、活性を保持する突然変異体を同定するために、生物学的活性について、得られた突然変異体をスクリーニングし得る。突然変異誘発後、コードされた抗体を発現させ得、その抗体の活性を決定し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含むが限定されない当業者にとって公知の何らかの方法によって、２個のアミノ酸配列のパーセント同一性を決定し得る。
【００６７】
他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、例えば、それぞれその全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０３３０３２８号明細書、同第２０１３０１８３３０６号明細書、同第２０１１０１０４１５０号明細書に記載されている。ある一定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ＨＤ３７（ＩｇＧ１、ｋａｐｐａ）（ＤＡＫＯ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＢＵ１２（Ｃａｌｌａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４８（１０）：２９８３−７（１９９２））、４Ｇ７（ＩｇＧ１）（Ｍｅｅｋｅｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，３（４）：３０５−２０（１９８４  Ｗｉｎｔｅｒ））を含むが限定されない公知の抗ＣＤ１９抗体である。Ｊ４．１１９（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂ４３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＪ２５Ｃ１（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ）（Ｚｏｌａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６９（ＰＴ６）：４１１−２２（１９９１）；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：１１５７−１１６５（１９９７）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，４１：５３−６０（１９９５））、８９Ｂ（Ｂ４）（ＩｇＧ１）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．；Ｎａｄｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３））および／またはＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ）（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１９８９；およびＰｅｚｚｕｔｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８（９）：２７９３−２７９９（１９８７））。他の実施形態において、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、米国特許出願公開第２００８／０１３８３３６号明細書および同第２００９／０１４２３４９号明細書および米国特許第７，４６２，３５２号明細書および同第７，１０９，３０４号明細書に記載の抗ＣＤ１９抗体の何れかである。代表的な実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、米国特許出願公開第２００８／０１３８３３６号明細書および下記に記載のような、１６Ｃ４抗体またはそれらの抗原結合断片である。
【００６８】
本発明で有用な抗体としては、免疫グロブリン、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成される多特異的抗体（例えば二特異的抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、単ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を呈する抗体断片（例えば抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本明細書中で開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体および上記の何れかのエピトープ結合断片が挙げられる。特に、抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、例えば少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子が挙げられる。
【００６９】
抗ＣＤ１９抗体は、モノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ１９抗体を包含する。本発明の組成物および方法で使用される抗ＣＤ１９抗体は、ネイキッド抗体、免疫複合体または融合タンパク質であり得る。ある一定の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、循環Ｂ細胞を枯渇させるのに十分な量で、ヒト抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＣＤＣ）および／またはアポトーシスに介在する。
【００７０】
本発明の方法で有用な抗ＣＤ１９抗体は、ヒトに投与した場合、Ｂ細胞（例えば悪性Ｂ細胞）を減少させるかまたは枯渇させる。Ｂ細胞の枯渇は、循環Ｂ細胞または特に、骨髄、脾臓、消化管関連リンパ組織および／またはリンパ節などであるが限定されない組織におけるものであり得る。ある実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、循環Ｂ細胞、血液Ｂ細胞、脾臓Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、腹膜Ｂ細胞および／または骨髄Ｂ細胞を枯渇させ得る。ある実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、前駆Ｂ細胞、初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、抗原刺激されたＢ細胞および／または形質細胞を枯渇させる。このような枯渇は、例えば、抗体依存性細胞介在性の細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）によって、および／またはその対象リガンドとのＣＤ１９相互作用の阻止および／または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）、Ｂ細胞増殖の阻害および／またはＢ細胞死の誘導（例えばアポトーシスを介して）によって達成される。
【００７１】
必要に応じて、親抗体と比較してＡＤＣＣ活性が向上するように抗ＣＤ１９抗体を操作する。ＡＤＣＣ活性が向上した抗体変異体を作製するための方法は、当技術分野で公知であり、本明細書中で下記に記載する。ある一定の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、ＡＤＣＣ活性が向上した非フコシル化抗体である。
【００７２】
ある一定の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒトアイソタイプまたはヒト集団で見られる何れかのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４対立遺伝子を有する、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。ヒトＩｇＧクラスの抗体は、血清中の半減期が長いことおよび様々なエフェクター機能の媒介能など、有利な機能的特徴を有する（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １（１９９５））。ヒトＩｇＧクラス抗体は、次の４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４にさらに分類される。ＩｇＧ１サブクラスは、ヒトにおいて高いＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を有する（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７））。
【００７３】
他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、上記に記載のものなどの（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトアイソタイプに対する）公知の抗ＣＤ１９抗体のアイソタイプスイッチ変異体である。他の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体はヒトＣＤ１９に免疫特異的に結合し、当業者にとって公知の方法を用いて評価した場合、解離定数（ＫD）は、３０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、２０００ｐＭ未満、１５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、７５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。他の実施形態において、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９抗原に免疫特異的に結合し得、当業者にとって公知の方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ）を用いて評価したとき、２５から３４００ｐＭ、２５から３０００ｐＭ、２５から２５００ｐＭ、２５から２０００ｐＭ、２５から１５００ｐＭ、２５から１０００ｐＭ、２５から７５０ｐＭ、２５から５００ｐＭ、２５から２５０ｐＭ、２５から１００ｐＭ、２５から７５ｐＭ、２５から５０ｐＭの間の解離定数（ＫD）を有し得る。ある一定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９免疫特異的に結合し得、当業者にとって公知の方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ）を用いて評価したとき、５００ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭまたは５０ｐＭの解離定数（ＫD）を有し得る。
【００７４】
エフェクター機能の操作
必要に応じて、抗ＣＤ１９抗体療法に反応性があるものとして判定された対象に、例えばＢ細胞悪性腫瘍を処置することにおいて抗体の有効性を促進するためにエフェクター機能に関して改変される抗ＣＤ１９抗体を投与する。代表的なエフェクター機能は、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害活性またはＡＤＣＣであり、これは、非特異的な細胞傷害活性細胞が標的細胞上で結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在性反応である。細胞傷害活性細胞またはエフェクター細胞は、１以上のＦｃＲを発現する白血球であり得る。エフェクター細胞は、マウスにおいて少なくともＦｃガンマＲＩ、ＦＣガンマＲＩＩ、ＦｃガンマＲＩＩＩおよび／またはＦｃガンマＲＩＶを発現する。ＡＤＣＣに介在するヒト白血球には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害活性Ｔ細胞および好中球が含まれる。これらの細胞の中で、ＡＤＣＣに介在するための最初の細胞はＮＫ細胞であり、これはＦｃガンマＲＩＩＩを発現する。単球は、ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ、ＦｃガンマＲＩＩＩおよび／またはＦｃガンマＲＩＶを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２（１９９１）でまとめられている。
【００７５】
抗体のエフェクター機能を促進するためのある方法は、改変グリコフォームを作製することによる。改変グリコフォームは、当業者にとって公知の何らかの方法によって、例えば改変または変異発現株を使用することによって、１以上の酵素、例えばＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）と同時発現させることによって、様々な生物または様々な生物からの細胞株においてＦｃ領域を含む分子を発現させることによって、またはＦｃ領域を含む分子を発現させた後、炭水化物を修飾することによって、作製される。操作したグリコフォームを作製するための方法は当技術分野で公知であり、これには、それぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる、Ｕｍａｎａら、１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０：Ｄａｖｉｅｓら、２００１  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書（米国特許出願第１０／２７７，３７０号明細書）；米国特許出願公開第２００３／０００３０９７号明細書（米国特許出願第１０／１１３，９２９号明細書）；国際公開第００／６１７３９Ａ１号パンフレット；国際公開第０１／２９２２４６Ａ１号パンフレット；国際公開第０２／３１１１４０Ａ１号パンフレット；国際公開第０２／３０９５４Ａ１号パンフレット；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ．ＴＭ．ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ．ＴＭ．ｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載のものが含まれるが限定されない。例えば、それぞれその全体において参照により本明細書中に組み込まれる、国際公開第０００６１７３９号パンフレット；ＥＡ０１２２９１２５号明細書；米国特許出願公開第２００３０１１５６１４号明細書：Ｏｋａｚａｋｉら、２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照。結果としてＦｃ領域に存在するグリコシル化部位（例えばＩｇＧのアスパラギン２９７）が除去される１以上のアミノ酸置換も生成させ得る。さらに、必要なグリコシル化機序を欠く細菌細胞において非グリコシル化抗体を作製し得る。
【００７６】
フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮＡｃ構造が増加している抗体など、グリコシル化のタイプが変化している抗体も作製することができる。このようなグリコシル化パターンの変化から、抗体のＡＤＣＣ能が向上することが明らかにされた。例えばグリコシル化機序が変化した宿主細胞で抗体を発現させることによって、このような炭水化物修飾を遂行し得る。グリコシル化機序が変化した細胞は、当技術分野で記載されており、本開示の組み換え抗体を発現させ、それによってグリコシル化に変化が起こった抗体を生成させるために宿主細胞として使用することができる。例えば、それぞれが全体において参照により本明細書中に組み込まれる、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１ならびに米国特許第６，９４６，２９２号明細書；欧州特許第１，１７６，１９５号明細書；国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット；および国際公開第９９／５４３４２号パンフレットを参照。
【００７７】
ある実施形態において、抗ＣＤ１９は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）の向上に介在する変異Ｆｃ領域を含む。ある実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、還元末端においてフコースがＮ−アセチルグルコサミンに結合されない、Ａｓｎ２９７に連結される複合Ｎ−グリコシド連結糖鎖を有するＦｃ領域を含み、このＦｃ領域は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）の向上に介在する。
【００７８】
当技術分野で公知および本明細書中に記載のインビトロアッセイは、本開示の組成物および方法で使用される抗ＣＤ１９抗体がＡＤＣＣに介在可能であるか否かを決定するために使用することができる。代表的なアッセイは米国特許第５，５００，３６２号明細書または米国特許第５，８２１，３３７号明細書に記載されている。注目すべきことに、このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心のある分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えばＣｌｙｎｅｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６（１９９８））で開示されるものなどの動物モデルで評価し得る。このアッセイはまた、市販のキット、例えばＣｙｔｏＴｏｘ  ９６．ＴＭ．（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行い得る。
【００７９】
Ｂ細胞悪性腫瘍
Ｂ細胞悪性腫瘍は、特異的なＢ細胞サブセットの病的増殖を特徴とし、例えば前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病は、プロＢ細胞／プレＢ細胞発生段階に対応するＢ細胞の異常な増殖を特徴とする。悪性Ｂ細胞は、ＣＤ１９などの正常なＢ細胞マーカーの細胞表面発現を維持する。したがって抗ＣＤ１９抗体は、ヒト対象で悪性Ｂ細胞を枯渇させ得る。
【００８０】
本明細書中で記載のような抗ＣＤ１９抗体を含む治療は、Ｂ細胞悪性腫瘍を含むＢ細胞疾患を処置するために使用することができる。代表的なＢ細胞悪性腫瘍としては、低グレード／濾胞性ＮＨＬ、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中間グレード／濾胞性ＮＨＬ、中間グレードびまん性ＮＨＬ、高グレード免疫芽球性ＮＨＬ、高グレードリンパ芽球性ＮＨＬ、高グレード小型非切れ込み細胞ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫および巨大腫瘤病変ＮＨＬを含む、Ｂ細胞サブタイプ非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；バーキットリンパ腫；多発性骨髄腫；プレＢ急性リンパ芽球性白血病および初期Ｂ細胞前駆体由来の他の悪性腫瘍；リンパ球系共通急性白血病（ＡＬＬ）；免疫グロブリン突然変異ＣＬＬおよび免疫グロブリン−非突然変異ＣＬＬを含む慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；Ｎｕｌｌ−急性リンパ芽球性白血病；ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症；胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬおよび３型ＤＬＢＣＬを含むびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；プロリンパ球性白血病；軽鎖疾患；形質細胞腫；骨硬化性ミクローマ（ｏｓｔｅｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｍｙｃｌｏｍａ）；形質細胞白血病；意義不明の単クローン性免疫グロブリン異常症（ＭＧＵＳ）；くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）；緩徐進行型多発性骨髄腫（ＩＭＭ）；古典的および結節性リンパ球優勢型を含む、ホジキンリンパ腫：リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；および胃粘膜関連性リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫を含む、辺縁帯リンパ腫が挙げられるが限定されない。
【００８１】
これらの癌の再発の処置も企図される。リンパ球優勢型ホジキン病（ＬＰＨＤ）は、放射線または化学療法にもかかわらず頻繁に再発する傾向があるタイプのホジキン病である。慢性リンパ球性白血病は、４種類の主要なタイプの白血病のうちの１つである。成熟Ｂ細胞と呼ばれるリンパ球の癌である、慢性リンパ球性白血病は、血液、骨髄およびリンパ組織における細胞の進行性の蓄積を呈する。緩徐進行型リンパ腫は、多数の寛解および再発期間の後、平均対象生存期間が６から１０年の間である、成長が遅い難治性の疾患である。
【００８２】
所望のレベルのＢ細胞枯渇は疾患に依存する。ある実施形態において、Ｂ細胞の枯渇は、抗ＣＤ１９抗体の標的であり、疾患の進行を低下させるかまたは排除するのに十分である。疾患進行は、医師により、例えば腫瘍成長（サイズ）、癌細胞タイプの増殖、転移を監視することによって、および／または特定の癌の他の兆候および症状を監視することによって、評価する。ある実施形態において、Ｂ細胞枯渇は、少なくとも約２、３、４、５または６カ月、疾患の進行を遅らせるかまたは排除するのに十分である。他の実施形態において、Ｂ細胞枯渇は、少なくとも約６、９または１２カ月またはさらには約２、３、４または５年にわたり寛解の時間を延長させるのに十分である。別の実施形態において、Ｂ細胞枯渇は、疾患を治癒させるのに十分である。ある一定の実施形態において、癌対象におけるＢ細胞枯渇は、処置前のベースラインレベルの少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはさらには１００％、悪性Ｂ細胞の数またはレベルを低下させる。
【００８３】
新生物の処置の有効性または成功を評価するためのパラメーターは、医師（例えば腫瘍学者）にとって公知である。一般に、医師は疾患進行の低下、寛解時間の延長、安定疾患の存在を求める。Ｂ細胞新生物の場合、測定可能な基準としては、例えば無増悪期間、全生存および／または無増悪生存期間の延長が挙げられ得る。白血病の場合、寛解の度合いを判定するために骨髄生検を行い得る。完全寛解は、処置後３０日に白血病細胞が対象の骨髄で見られる全細胞の５％未満を構成するものとして定義され得る。
【００８４】
次の参考文献は、リンパ腫および慢性リンパ球性白血病、それらの診断、処置および処置の有効性を測定するための標準的な医学的手順を記載する。Ｃａｎｅｌｌｏｓ  Ｇ  Ｐ，Ｌｉｓｔｅｒ，Ｔ  Ａ，Ｓｋｌａｒ  Ｊ  Ｌ：Ｔｈｅ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９８；ｖａｎ  Ｂｅｓｉｅｎ  ＫおよびＣａｂａｎｉｌｌａｓ，Ｆ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ，Ｓｔａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｃｈａｐ．７０，ｐｐ  １２９３−１３３８，ｉｎ：Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｈｏｆｆｍａｎら（ｅｄｉｔｏｒｓ）．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００；およびＲａｉ，ＫおよびＰａｔｅｌ，Ｄ：Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃｈａｐ．７２，ｐｐ  １３５０−１３６２，ｉｎ：Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｈｏｆｆｍａｎら（ｅｄｉｔｏｒｓ）．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００。
【００８５】
キット
本発明は、抗ＣＤ１９抗体処置に対する対象の反応性の特徴を調べるためのキットを提供する。
【００８６】
ある実施形態において、本キットは、単位剤形でＣＤ１９ポリペプチドに特異的に結合する有効量の抗体を含有する治療用組成物を含む。
【００８７】
本発明の診断キットは、ｍｉＲ−６２９の相対的発現を測定するための試薬（例えばｍｉＲ−６２９およびハウスキーピング参照遺伝子の両方に対するＴａｑＭａｎプライマー／プローブ）を提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本キットは、治療用または診断用組成物を含有する滅菌容器を含み；このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパックまたは当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート加工紙、金属箔または薬剤を保持するのに適切な他の材料製であり得る。
【００８９】
ある実施形態において、本発明のキットは、ｍｉＲ−６２９発現および抗ＣＤ１９抗体を測定するための試薬を含む。必要に応じて、本キットは、ｍｉＲ−６２９発現を測定するための説明書および／またはＢ細胞悪性腫瘍、例えば抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるものとして選択される悪性腫瘍を有する対象に抗ＣＤ１９抗体を投与するための説明書をさらに含む。特定の実施形態において、説明書は、次のうち少なくとも１つを含む：治療剤の説明；投与スケジュールおよびＢ細胞悪性腫瘍またはその症状の処置または予防のための投与；注意；警告；効能；禁忌；過剰量摂取情報；有害反応；動物薬理；臨床試験；および／または参考文献。説明書は、容器（存在する場合）上に直接印刷されていてもよいし、またはラベルとして容器に貼付されてもよいし、または容器中でまたは容器とともに個別のシート、パンフレット、カードもしくはホルダーとして供給されてもよい。
【００９０】
阻害性核酸
阻害性核酸分子は、核酸分子またはポリペプチドの発現を阻害するオリゴヌクレオチドである。下記で詳細に報告されるように、本発明は、血液試料中のｍｉＲ−６２９発現を測定することによって、抗ＣＤ１９抗体での処置に反応性がある対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を同定するための方法であって、参照物と比較したｍｉＲ−６２９発現の低下の検出によって、抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるＢ細胞悪性腫瘍を有するものとして対象が同定される方法を提供する。この発見の観点において、対象においてｍｉＲ−６２９の発現を低下させる方法によって、対象において抗ＣＤ１９抗体反応性が誘導されるかまたは促進されると思われる。
【００９１】
したがって、本発明は、ｍｉＲ−６２９を標的とし、その発現を低下させる１本鎖および２本鎖阻害性核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似体）を提供する。代表的な阻害性酸分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが挙げられる。
【００９２】
ｓｉＲＮＡ
短い２１から２５ヌクレオチドの２本鎖ＲＮＡは、遺伝子発現を下方制御することにおいて有効である（参照により本明細書によって組み込まれる、Ｚａｍｏｒｅら、Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８，２００１）。ＭｃＣａｆｆｒｅｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９．２００２）によって、哺乳動物におけるｓｉＲＮＡアプローチの治療的有効性がインビボで明らかになった。
【００９３】
ｍｉＲ−６２９の配列を考慮して、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６２９の発現を低下させるために設計され得る。このようなｓｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６２９発現を低下させるために対象に全身的に投与され得る。ｍｉＲ−６２９を標的とする２１から２５ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、例えばＢ細胞悪性腫瘍を処置するための治療薬として使用される。
【００９４】
本発明の阻害性核酸分子は、発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）介在性ノックダウンのために２本鎖ＲＮＡとして使用し得る。ＲＮＡｉは、関心のある特異的なタンパク質の細胞発現を低下させるための方法である（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２：２３９−２４５，２００１；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．１５：４８５−４９０，２０００；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．１２：２２５−２３２、２００２；およびＨａｎｎｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２４４−２５１，２００２で概説）。ｄｓＲＮＡの遺伝子移入によるかまたはプラスミドに基づく発現系を用いたｓｉＲＮＡの発現によるかの何れかでの細胞へのｓｉＲＮＡの導入は、哺乳動物細胞において機能喪失表現型を生成させるために次第に使用されるようになってきている。
【００９５】
本発明のある実施形態において、本発明の核酸塩基オリゴマーの８から１９の連続核酸塩基を含む２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を作製する。ｄｓＲＮＡは、２本鎖になっているＲＮＡの２本の別個の鎖または自己二重鎖化している１本鎖ＲＮＡ（低分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ）であり得る。一般的には、ｄｓＲＮＡは、約２１または２２塩基対であるが、必要に応じてより短くてもよいし、またはより長くてもよい（最長約２９核酸塩基）。ｄｓＲＮＡは、標準的技術（例えば化学合成またはインビトロ転写）を用いて作製することができる。キットは、例えばＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）から入手可能である。哺乳動物細胞中でｄｓＲＮＡを発現させるための方法は、それぞれが参照により本明細書によって組み込まれる、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎら．Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．１６：９４８−９５８，２００２．Ｐａｕｌら．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８，２００２；Ｓｕｉら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：５５１５−５５２０，２００２；Ｙｕら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００，２００２；およびＬｅｅら．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５  ２００２に記載されている。
【００９６】
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ステムループ構造を有するＲＮＡ配列を含む。「ステムループ構造」は、主に１本鎖ヌクレオチド（ループ部分）の領域によって片側で連結される２本鎖または二重鎖（ステム部分）を形成することが知られているかまたは予想されるヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸を指す。「ヘアピン」という用語は、本明細書中でステムループ構造を指すためにも使用される。このような構造は当技術分野で周知であり、本用語は、当技術分野でのその公知の意味で一貫して使用される。当技術分野で公知であるように、二次構造は、正確な塩基対形成を必要としない。したがって、ステムは１以上の塩基ミスマッチまたはバルジを含み得る。あるいは、塩基対形成は正確であり得、すなわちミスマッチを全く含まない。リンカー、例えば核酸リンカー、ｍｉＲＮＡフランキング配列、他の分子またはそれらのいくつかの組み合わせなどを通じて複数のステムループ構造を互いに連結させ得る。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、「低分子ヘアピンＲＮＡ」という用語は、従来のステムループｓｈＲＮＡを含み、これは前駆ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）を形成する。範囲内にいくつかの変動があり得る一方で、従来のステムループｓｈＲＮＡは、１９から２９ｂｐの範囲のステムおよび４から３０ｂｐの範囲のループを含み得る。ｓｈＲＮＡは、持続性のサイレンシングおよび殆どあらゆる細胞型への高収率送達を提供するために、ＤＮＡベクターから発現され得る。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。代表的なウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスおよびトリウイルスベクターを含むレトロウイルスが挙げられ、このようなベクターを含むことによって、安定な１コピーのゲノム組み込みが可能になる。レトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳房腫瘍ウイルスが挙げられるが限定されない。パッケージング細胞株を形質導入して産生細胞株を形成させるために、レトロウイルスプラスミドベクターを使用することができる。遺伝子導入することができるパッケージング細胞の例としては、その全体において参照により本明細書中に組み込まれるＭｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４（１９９０）に記載されるような、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが限定されない。本ベクターは、当技術分野で公知の何らかの手段を通じてパッケージング細胞を形質導入させ得る。産生細胞株は、ＤＮＡ複製タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成させる。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボの何れかで真核細胞に対して形質導入を行い得る。形質導入された真核細胞は、ＤＮＡ複製タンパク質を発現する。
【００９８】
インビボで核酸分子の発現を阻害するために、本発明のアンチセンス配列を含む触媒的ＲＮＡ分子またはリボザイムを使用することができる。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列が含まれることによって、それらにＲＮＡ−切断活性が付与され、それによってコンストラクトの活性が上昇する。標的ＲＮＡ−特異的なリボザイムの設計および使用は、それぞれが参照により組み込まれる、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１．１９８８および米国特許出願公開第２００３／０００３４６９Ａ１号明細書に記載されている。
【００９９】
したがって、本発明はまた、結合アーム、８から１９連続核酸塩基を有するアンチセンスＲＮＡを含む触媒的ＲＮＡ分子も特色とする。本発明の好ましい実施形態において、ハンマーヘッド型またはヘアピンモチーフにおいて触媒的核酸分子が形成される。このようなハンマーヘッド型モチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８：１８３，１９９２により記載されている。ヘアピンモチーフの例は、１９８８年９月２０日提出の米国特許出願第０７／２４７，１００号明細書の一部継続出願である、１９８９年９月２０日提出のＨａｍｐｅｌら、“ＲＮＡ  Ｃａｔａｌｙｓｔ  ｆｏｒ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：４９２９，１９８９およびＨａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２９９，１９９０により記載されている。これらの特異的なモチーフは、本発明中で限定的ではなく、当業者は、本発明の酵素性核酸分子において重要であるのは、それが、標的遺伝子ＲＮＡ領域の１以上に対して相補的である特異的な基質結合部位を有することであるということおよびそれが、分子にＲＮＡ切断活性を付与するその基質結合部位内またはその周囲にヌクレオチド配列を有することを認識する。
【０１００】
基本的に、細胞に核酸コンストラクトを導入するためのあらゆる方法を使用することができる。核酸を導入する物理学的方法としては、コンストラクトを含有する溶液の注入、コンストラクトにより被覆された粒子によるボンバードメント、細胞、組織試料または生物を核酸の溶液中に浸漬することまたはコンストラクト存在下での細胞膜のエレクトロポレーションが挙げられる。発現コンストラクトの細胞への効率的導入およびコードされるｓｈＲＮＡの転写の両方を遂行するために、ウイルス粒子中にパッケージ化されたウイルスコンストラクトを使用することができる。脂質介在担体輸送、化学物質介在輸送、例えばリン酸カルシウムなど、細胞に核酸を導入するための技術分野で公知である他の方法を使用することができる。したがって、次の活性の１以上を行う構成要素とともに、ｓｈＲＮＡをコードする核酸コンストラクトを導入し：細胞によるＲＮＡ取り込みを促進するか、二重鎖のアニーリングを促進するか、アニーリングした鎖を安定化するか、または標的遺伝子の阻害を促進することができる。
【０１０１】
細胞内での発現の場合、ＤＮＡベクター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの何れかを含むプラスミドベクターを使用することができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターによって内因性ｍｉＲＮＡの発現を調節し、一部の場合ではｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと比較した場合、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターにより最も効率的に駆動される（Ｄｉｃｋｉｎｓら、２００５，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９：９１４−９２１）。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターを含むが限定されない、誘導性プロモーターまたは条件的発現系によって、ｓｈＲＮＡの発現を調節し得る。本発明に関する有用なプロモーターの例は、テトラサイクリン誘導性プロモーター（ＴＲＥ−ｔｉｇｈｔを含む）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、テトラサイクリントランス活性化因子系および逆テトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）系である。細胞または組織特異的なプロモーターとして構成的プロモーターを使用することもできる。多くのプロモーターはユビキタスであり、全ての細胞および組織タイプにおいてこれらが発現されるようになっている。ある一定の実施形態は、テトラサイクリン応答性プロモーター、インビトロおよびインビボ研究における最も有効な条件的遺伝子発現系の１つを使用する。誘導性ｓｈＲＮＡの説明に対して、それぞれが参照により本明細書によって組み込まれる、国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０９０１号（国際公開第２００４−０２９２１９Ａ２号パンフレット）およびＦｅｗｅｌｌら、２００６，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １１：９７５−９８２を参照のこと。
【０１０２】
ポリヌクレオチドの送達
ネイキッドポリヌクレオチドまたはその類似体は、哺乳動物細胞に入り、関心のある遺伝子の発現を阻害することが可能である。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸塩基オリゴマーの細胞への送達を促す処方物を利用することが所望され得る（例えば、それぞれが参照により本明細書によって組み込まれる、米国特許第５，６５６，６１１号明細書、同第５，７５３，６１３号明細書、同第５，７８５，９９２号明細書、同第６，１２０，７９８号明細書、同第６，２２１，９５９号明細書、同第６，３４６，６１３号明細書および同第６，３５３，０５５号明細書を参照）。
【０１０３】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当業者の範囲内に十分ある、分子生物学の従来の技術（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学および免疫学を使用する。このような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８９）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” ADDIN ENRfu “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献において詳細に説明される。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、このように、本発明を為し、実施することにおいて考慮され得る。特定の実施形態に対する特に有用な技術は、続くセクションにおいて論じる。
【０１０４】
続く実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療法の作製および使用法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、発明者らがそれらの発明としてみなすものの範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：抗ＣＤ１９抗体感受性細胞株においてｍｉＲ−６２９レベルが低下した。
【０１０６】
インビトロ抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイを用いて、抗ＣＤ１９抗体処理に対して感受性が高いまたは低いものとして多くのヒト非ホジキンＢ細胞リンパ腫細胞株が同定された。特に、抗ＣＤ１９抗体処理に対して感受性が高いものとして、Ｋａｒｐａｓ−４２２、ヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｏｃｉ−Ｌｙ−１９、びまん性大細胞型リンパ腫、ＳＵＤ−ＨＬ−６、濾胞性Ｂ細胞リンパ腫（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ２９５９（商標））およびＴｏｌｅｄｏ細胞株、非ホジキンリンパ腫モデル系が同定された。一方で、抗ＣＤ１９抗体処理に対して感受性が低いものとして、ＤＢ（びまん性大細胞型リンパ腫）、ＡＲＨ−７７（ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞株）およびＲＬ（非ホジキンリンパ腫Ｂ細胞株）が同定された。
【０１０７】
これらの細胞株のマイクロＲＮＡ発現を分析することによって、これらの細胞株の特徴を評価した。マイクロＲＮＡ／ｍｉＲＮＡは、複数の標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する低分子１本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡに対する役割が循環器疾患、糖尿病、癌および他の疾患において同定されている。様々な治療薬に対する反応を予想することにおけるｍｉＲＮＡに対する役割は十分には理解されていない。
【０１０８】
興味深いことに、抗ＣＤ１９抗体処理に対する感受性が様々であるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬまたはＤＬＢＬ）細胞株間で発現が異なった１７種類のｍｉＲＮＡが同定された。これらの相違は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲを含む複数プラットフォームを用いて観察された。
【０１０９】
次のマイクロＲＮＡは顕著に異なった：ｍｉＲ−６２９；ｍｉＲ−９９ｂ；ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｅ；ｍｉＲ−１５ａ；およびｍｉＲ−２９ａ。最も顕著な相違はｍｉＲ−６２９の発現におけるものであった。ｍｉＲ−６２９発現レベルは、抗ＣＤ１９抗体に対する感受性が低い細胞株よりも、抗ＣＤ１９抗体処理に対する感受性が高いびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株において顕著に低かった（図１Ａおよび１Ｂ）。低対高感受性を判定することにおいて、インビトロＡＤＣＣアッセイにおいて、高感受性細胞株に対するＥＣ５０は、低感受性細胞株よりも少なくとも１００倍（他の場合では１０００倍以上）低かった。
【０１１０】
まとめると、ｍｉＲ−６２９発現は、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤ−５５１）を用いたインビトロＡＤＣＣに対する高感受性（ｎ＝４）と低感受性（ｎ＝３）の細胞株間で顕著に異なった。この効果は、抗ＣＤ１９抗体に対する反応性に特異的であると思われる。ｍｉＲ−６２９発現の変化は、リツキシマブに対する反応性と相関しなかった。
【０１１１】
実施例２：抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者において、ｍｉＲ−６２９発現が減少した。
臨床試験第ＣＰ２０４号、第１相試験、Ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＭＥＤＩ−５５１，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ１９，ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ（再発または治療不応の進行Ｂ細胞悪性腫瘍の成人対象における、ＣＤ１９に対するヒト化モノクローナル抗体、ＭＥＤＩ−５５１の用量漸増試験）で単独薬剤として抗ＣＤ１９抗体処置で処置した、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者からのベースライン全血試料中でｍｉＲ−６２９発現レベルを測定した。
【０１１２】
完全または部分寛解しているものとして抗ＣＤ１９抗体処置を受けた患者を分類した。
・ＣＲ／ＰＲ（完全または部分寛解）：５例びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、６例濾胞性リンパ腫、３例慢性リンパ球性白血病
・ＰＤ（進行性疾患）：１０例びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、２例濾胞性リンパ腫および３例慢性リンパ球性白血病
・ＳＤ（安定疾患）：４例びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、３例濾胞性リンパ腫および９例慢性リンパ球性白血病
【０１１３】
ＭＥＤＩ−５５１またはリツキシマブ＋ベンダムスチン（ＣＰ−１０１９）で処置した慢性リンパ球性白血病患者からのベースライン末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）試料中でｍｉＲ−６２９発現レベルを測定した。
・２２例ＭＥＤＩ−５５１処置患者（１０例ＣＲ／ＰＲ；３例ＰＤ；４例ＳＤ）
・１２例リツキシマブ処置患者（６例ＣＲ／ＰＲ；２例ＰＤ；２例ＳＤ）
【０１１４】
驚くべきことに、非反応者（ＰＤ）と比較して、ｍｉＲ−６２９発現は、抗ＣＤ１９抗体での処置に対する完全または部分寛解（ＣＲ／ＰＲ）を示すびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者において顕著に低かった（約７倍）（図２）。抗ＣＤ１９抗体での処置前に全血試料中でｍｉＲ−６２９発現を測定した。まとめると、第Ｉ相臨床試験データから、ベースラインｍｉＲ−６２９発現が、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）に対して反応したびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者において低かったことが明らかになった。興味深いことに、正常対照対象から得られた血液試料中に存在するｍｉＲ−６２９レベルと比較して、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を有する患者の試料において、ｍｉＲ−６２９発現が顕著に上昇していた。
【０１１５】
抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）＋ＩＣＥ／ＤＨＡＰまたはリツキシマブ＋ＩＣＥ／ＤＨＡＰの何れかで処置される患者間で、ｍｉＲ−６２９発現のレベルを比較した。ｍｉＲ−６２９レベルは、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチンおよびエトポシド）／ＤＨＡＰと組み合わせた抗ＣＤ２０抗体療法に反応する者と比較して、ＩＣＥ／ＤＨＡＰと組み合わせて投与した抗ＣＤ１９抗体処置に反応する患者において、上昇または低下することとして特徴付けを行った。これらの試験はまた、リツキシマブでの処置に反応する患者と比較した場合、抗ＣＤ１９抗体に反応するＤＬＢＣＬ患者においてｍｉＲ−６２９が特異的に低下するという何らかの変化の特性も明らかにする。この試験の結果を図５で示す。
【０１１６】
実施例３：抗ＣＤ１９抗体処置に反応性がある濾胞性リンパ腫患者においてｍｉＲ−６２９発現が低下した。
抗ＣＤ１９抗体での処置前に濾胞性リンパ腫患者から得られた全血試料中でｍｉＲ−６２９発現レベルを測定した。ｍｉＲ−６２９発現は、正常血液と比較して、濾胞性リンパ腫血液中で顕著に上昇する。
【０１１７】
（図３）において、ｍｉＲ−６２９発現は、濾胞性リンパ腫非反応者（ＰＤ）よりも、抗ＣＤ１９抗体処置に反応した濾胞性リンパ腫患者（ＣＲ／ＰＲ）から得られた全血試料中でかなり低かった（約５倍）。
【０１１８】
実施例４：慢性リンパ球性白血病患者においてｍｉＲ−６２９発現が上昇する
正常対照対象から得られた血液と比較した場合、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の患者から得られた全血中でｍｉＲ−６２９発現が上昇した。予備的結果は、慢性リンパ球性白血病非反応者よりも、抗ＣＤ１９抗体処置に反応した慢性リンパ球性白血病患者（ＣＲ／ＰＲ）から得られた全血試料中のｍｉＲ−６２９発現がより低かったことを示すと思われる（図４）。これらの最初の観察がさらなる患者で確認されよう。
【０１１９】
実施例５：予備的データは、抗ＣＤ１９抗体−ＩＣＥ（ベンダムスチン）処置に反応性がある慢性リンパ球性白血病患者においてｍｉＲ−６２９発現が低下したことを示す。
処置前に慢性リンパ球性白血病患者から得られた全血中でｍｉＲ−６２９発現を測定した。リツキシマブ−ＩＣＥ治療と抗ＣＤ１９抗体−ＩＣＥ治療に対する患者の反応の特徴を調べた（図５Ａおよび５Ｂ）。試料サイズが小さかったものの、リツキシマブ−ＩＣＥで処置した、ＣＲ／ＰＲとＰＤ患者との間で、ｍｉＲ−６２９発現レベル間の関連は見られなかった（図５Ｂ）。一方で、抗ＣＤ１９抗体−ＩＣＥに反応性がある慢性リンパ球性白血病患者においてｍｉＲ−６２９発現レベルはより低かった。
【０１２０】
実施例６：抗ＣＤ１９抗体処置に反応性があるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者においてｍｉＲ−６２９発現がより低かった
抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）に対する感受性が高いびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株においてｍｉＲ−６２９発現がより低かった（図５Ｃ）。リツキシマブに対するそれらの感受性に基づいて、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株においてこのような相関は認められなかった（図５Ｄ）。ＣＰ１０８８試験でびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者において同様の観察がなされた（図５Ｅ）。
【０１２１】
処置前にびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者から得られた全血試料中でｍｉＲ−６２９発現を測定した。続いて１９名の患者を抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）および化学療法（ＩＣＥまたはＤＨＡＰ）で処置した。１７名の患者をリツキシマブで処置した。興味深いことに、ｍｉＲ−６２９発現は、非反応者（ＳＤ／ＰＤ）と比較して、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）処置に反応した患者（ＣＲ／ＰＲ）において顕著に低かった（約４倍）（図５Ｅ）。これは、２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）で患者が処置されたか否かにかかわらず当てはまった（図５Ｅおよび５Ｆ）。リツキシマブ反応性に関してこのような相関は認められなかった（図５Ｅ）。
【０１２２】
実施例７：抗ＣＤ１９抗体処置に反応しなかった患者においてｍｉＲ−６２９発現レベルが上昇した。
興味深いことに、ｍｉＲ−６２９発現レベルは、抗ＣＤ１９抗体に反応したＤＬＢＣＬ対象（ＣＲ／ＰＲ）において処置前後で同様であった（図６Ａおよび６Ｂ）。一方で、ｍｉＲ−６２９発現レベルは、進行性疾患の患者（ＰＤ）において処置後に上昇する傾向があった（図６Ｃ）。これらの結果から、癌進行がこのマイクロＲＮＡのレベルと相関するように、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）に対する反応性においてｍｉＲ−６２９が特異的な役割を果たすことが示される。
【０１２３】
実施例８：ｍｉＲ６２９発現は、健常対照と比べてリンパ腫患者において高い。
ｍｉＲ−６２９は、ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲ（図７Ｂ）を用いるかまたはｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析（図７Ａ）を用いて測定した場合、リンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫）の全患者において、健常ボランティアと比較して高い。実施例１〜６において、ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲによってｍｉＲ−６２９を測定した。
【０１２４】
リンパ腫血液中のｍｉＲ−６２９の起源は不明である。それにもかかわらず、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫または慢性リンパ球性白血病におけるＢ細胞数の変化を反映するものではないと思われる。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫または慢性リンパ球性白血病患者におけるｍｉＲ−６２９レベルとベースラインＢ細胞数（ＣＤ１９またはＣＤ２０）との間で関連は認められなかった。
【０１２５】
健常全血と比較して、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者の全血中でより高い程度までｍｉＲ−６２９が発現された（最小１６倍）。ｍｉＲ−６２９レベルは、他の細胞タイプと比較して、正常単球およびＢ細胞において高かった。ｍｉＲ−６２９発現は、ＣＤ１４+およびＣＤ１９+細胞においてより高い。これらのレベルは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫／濾胞性リンパ腫患者において認められるものよりもかなり低いままである（図８）。
【０１２６】
実施例９：ｍｉＲ−６２９過剰発現は、化学療法誘導性アポトーシスおよび細胞増殖喪失を防ぐ
図９Ａで示されるｍｉＲ−６２９発現ベクターを用いて、ｍｉＲ−６２９過剰発現Ｋａｒｐａｓ−４２２細胞株を作製した。Ｋａｒｐａｓ−４２２細胞は、ｍｉＲ−６２９が低レベルであり、インビトロＡＤＣＣで抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）に対する感受性が非常に高かったＤＬＢＣＬ細胞株である。本細胞はまた、ｍｉＲ−６２９発現レベルを視覚的に監視できるようにするＧＦＰレポーターも発現した（図９Ｂ）。ｍｉＲ−６２９発現ベクターまたはｍｉＲ−６２９前駆体挿入物を含まなかった対照ベクターを用いて細胞に対して遺伝子移入を行った。次いでこの細胞をＧＦＰ発現に基づいてＦＡＣＳによってｍｉＲ−６２９−高およびｍｉＲ−６２９−低発現集団に選別した。限界希釈によってｍｉＲ−６２９発現単細胞クローンも作製した。ｍｉＲ−６２９発現の相対レベルを図９Ｃで示す。
【０１２７】
図１０Ａおよび１０Ｂは、ｍｉＲ−６２９を過剰発現するＫａｒｐａｓ−４２２リンパ腫細胞におけるカスパーゼ活性化を示す。興味深いことに、ｍｉＲ−６２９過剰発現によって、Ｋａｒｐａｓ−４２２リンパ腫細胞が化学療法（エトポシド）誘導性アポトーシスから保護された（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０１２８】
ｍｉＲ−６２９過剰発現によって、Ｋａｒｐａｓ−４２２リンパ腫細胞が化学療法（エトポシド）誘導性の細胞増殖喪失からも保護される（図１１Ａおよび１１Ｂ）。したがってＢ細胞悪性腫瘍においてｍｉＲ−６２９レベルを低下させるための方法は、化学療法に対する細胞感受性（すなわち、化学療法が細胞増殖を減少させ、アポトーシスを増加させる能力）を復活させると予想される。
【０１２９】
実施例１０：ｍｉＲ−６２９過剰発現は自発的乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を増加させた
ｍｉＲ−６２９過剰発現は、インビトロでの自発的ＬＤＨ放出の増加およびインビトロＡＤＣＣでの抗ＣＤ１９抗体処置に対するＥｃ５０の僅かなシフトと関連した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【０１３０】
実施例１１：ベースラインｍｉＲ−６２９発現はＭＥＤＩ−５５１および化学療法に対する反応を予想する
図１３は、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）またはリツキシマブで処置した患者の反応のロジスティック回帰分析およびｍｉＲＮＡシグネチャー発現（処置前ＰＢＭＣ試料中で測定、健常ボランティアでの発現に対する倍単位の変化として示す）を提供する。両ｍｉＲＮＡデータおよび≧１ポストベースライン疾患評価を有した患者のみを分析に含めた。図１３で示される曲線は、回帰モデルに基づくｍｉＲＮＡシグネチャーレベルにわたる反応の可能性予測を示す。２曲線の交差（処置・バイオマーカー交互作用（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｂｙ−ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を示す）は、ｍｉＲＮＡシグネチャーが慢性リンパ球性白血病での抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）反応性に対する予測的バイオマーカーであると思われることを示す。ベースラインｍｉＲ−６２９発現によって、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）および化学療法に対する反応が予測されるが、リツキシマブおよび化学療法（ＩＣＥ−ベンダムスチン）に対する反応は予測されない。
【０１３１】
実施例１２：ｍｉＲ−６２９発現変化の効果。
抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ５５１）での処理に対する感受性におけるｍｉＲ−６２９の変化の効果を探った。ヒト白血病およびリンパ腫細胞株  Ｄａｕｄｉ、ＴｏｌｅｄｏおよびＲＬをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し；Ｋａｒｐａｓ  １１０６Ｐ、Ｋａｒｐａｓ  ４２２、ＯＣＩ−Ｌｙ−１９、ＭＥＣ２をＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＰｒｉｍｅＦｅｃｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２４時間にわたり、５０μＭのｍｉＲ−６２９模倣物（Ｋａｒｐａｓ  １１０６Ｐ、Ｋａｒｐａｓ  ４２２、Ｄａｕｄｉ、ＭＥＣ２、ＯＣＩ−Ｌｙ−１９、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＴｏｌｅｄｏ）、ｍｉＲ−６２９ヘアピン阻害剤（ＲＬおよびＡＲＨ−７７）または個々の陰性対照オリゴヌクレオチド（全てＤｈａｒｍａｃｏｎより）を用いて、細胞株に対して遺伝子移入を行った。それらの個々の蛍光標識モノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＣＤ１９およびＣＤ２０表面発現を測定した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表面発現を報告し、非遺伝子移入ならびにｍｉＲ−６２９および陰性対照遺伝子移入細胞に対して平均を算出した。ｍｉＲ−６２９を過剰発現させた場合、ＭＥＣ−２およびＤａｕｄｉ細胞株は、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ５５１）に対して１５〜２５％の感受性低下を示し（図１４Ａおよび１４Ｂ）、一方でＴｏｌｅｄｏおよびＳＵ−ＤＨＬ−６細胞株では細胞傷害性について１５〜２０％の差が観察された（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。
【０１３２】
抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ５５１）での処理に対する感受性が異なった９種類の細胞株においてＣＤ１９およびＣＤ２０表面発現におけるｍｉＲ−６２９過剰発現の効果をアッセイした（図１５Ａおよび１５Ｂ）。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）複合抗体を用いてＣＤ１９およびＣＤ２０発現を測定した。対照遺伝子移入細胞、ｍｉＲ遺伝子移入細胞および非遺伝子移入細胞において平均蛍光強度（ＭＦＩ）比率を測定した。ｍｉＲ−６２９過剰発現に対する反応において、ＣＤ１９またはＣＤ２０表面発現の変化は観察されなかった。このことから、ＣＤ１９およびＣＤ２０発現の変化は、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ５５１）に対する細胞の感受性の差を説明するものではないことが示唆される。
【０１３３】
実施例１３：Ｒ−ＣＨＯＰマイクロＲＮＡシグネチャーと抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）マイクロＲＮＡシグネチャー（ｍｉＲ−６２９発現）との間に相関関係は存在しない。
ｍｉＲＮＡシグネチャーは、リツキシマブ、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノマイシン（またはドキソルビシン）、（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））とも呼ばれるビンクリスチンおよびプレドニゾロン（Ａｌｅｎｃａｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１；１７：４１２５−３５）を含む、化学療法併用Ｒ−ＣＨＯＰで処置されたびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者において生存率上昇を予測することが示された。ＤＬＢＣＬ患者からのベースライン血液試料中のこのシグネチャーの発現とｍｉＲ−６２９の発現との間で相関関係は認められなかった（図１６）。この結果は、臨床的に観察されていたＭＥＤＩ−５５１反応に関連するｍｉＲＮＡシグネチャーの特異性を裏付ける。
【０１３４】
実施例１４：エキソソーム中でｍｉＲ−６２９が観察された。
エキソソームは、腫瘍細胞を含め、全てでないとしても殆どの細胞型によって体液に放出される細胞由来の小胞である。証拠から、腫瘍発生および進行に関与する過程におけるエキソソームが介在する細胞間コミュニケーションに対する重要な役割が示唆される。Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃４４７８３５９）を用いて、ｍＩＲ−６２９またはｍｉＲＮＡスクランブル対照の何れかを安定に過剰発現するＫａｒｐａｓ−４２２細胞株の上清からエキソソームを単離した。細胞培地を回収し、２，０００ｘｇで３０分間スピン処理し、細胞および残屑を除去した。細胞不含培地を新しい試験管に移し、０．５体積のＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔで処理した。均一溶液になるまで、ピペッティングまたはボルテックス処理によって培地および試薬をよく混合した。４℃で一晩試料を温置した。温置後、試料を１０，０００ｘｇで４℃にて１時間スピン処理した。上清を吸引し、廃棄し、ペレット化したエキソソームを０．２体積のエキソソーム再懸濁緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃４４７８５４５）中で再懸濁した。再懸濁したエキソソームを室温で５〜１０分間温置した。変性溶液を３７℃に予め温め、１体積をエキソソーム懸濁液に添加した。溶液を氷上で１０分間温置し、次いで出発エキソソーム試料体積に比例して１体積の酸：フェノール：クロロホルムを用いて抽出した。試料を３０〜６０秒間ボルテックス処理し、ＲＴにて１３，０００ｘｇで５’スピン処理した。水相を新しい試験管に移し、試料あたり１．２５体積のＥｔＯＨを添加した。徹底的に混合した後、７００ｕＬ試料をＺｙｍｏカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＺＲ  ＲＮＡ  ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ，ｃａｔ＃Ｒ１０６０／Ｒ１０６１）上に置き、１０，０００ｘｇで１５秒間スピン処理した。全ての溶解液がフィルターを通過するまでこの手順を繰り返した。洗浄Ｉを７００ｕＬで添加し、上記のようにスピン処理した。５００ｕＬを用いて洗浄ＩＩを行い、上記のようにスピン処理し、１Ｘ繰り返した。残りの液体を除去するために、１０，０００ｘｇでの最終スピンを１分間行った。２０ｕＬの予め加熱した（９５℃）ヌクレアーゼ不含水を用いて、新しい回収チューブでエキソソームＲＮＡを溶出させた。１０，０００ｘｇで３０秒間カラムをスピン処理し、溶出液をさらなる５ｕＬヌクレアーゼ不含水とともに同じカラムに再び載せ、同じ条件下で２回目のスピン処理を行った。試料の品質を調べ、Ｐｉｃｏ  Ａｇｉｌｅｎｔチップを用いて半定量化した。興味深いことに、ｍｉＲ−６２９過剰発現細胞株により分泌されたエキソソーム中でｍｉＲ−６２９が同定された。これらのエキソソーム中で対照細胞に対して１２〜２０倍、ｍｉＲ−６２９が過剰発現された（図１７）。
【０１３５】
理論により縛られることを望むものではないが、腫瘍由来ｍｉＲ−６２９は、エキソソームを介してナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に送達され得、それによってＮＫ細胞活性化が低下する。ＮＫ細胞は、炎症性サイトカインを産生し、自発的に標的細胞を死滅させる顆粒リンパ球である。ｍｉＲ−６２９のベースラインレベルが高い場合、この仮説から、ＮＫ細胞活性が低いことが示唆される。したがって抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ５５１）は、ＮＫ細胞介在性抗体に依存性である細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を通じた活性が低くなり、処置に対する反応不良につながり得る。ベースラインでの低ｍｉＲ−６２９は、リツキサン（リツキシマブとも呼ばれる）に対する反応を上昇させるとは予想されないが、これは、リツキサンが、ＮＫ細胞介在性ＡＤＣＣに加えて、他の作用機序を通じて働くからであり、一方でＭＥＤＩ５５１は他の作用機序で働くことはない。
【０１３６】
実施例１５：ｍｉＲ−６２９過剰発現はＮＫ細胞機能を変化させる
細胞溶解経路遺伝子（例えば、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＭ、カテプシンＢおよびＤ、パーフォリン１）、細胞表面／接着分子（例えばＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ６３グラニュロフィジン（ｇｒａｎｕｌｏｐｈｙｓｉｎ））およびＮＫ細胞活性化受容体を含め、ＮＫ細胞活性化中に変化させられることが知られている遺伝子の発現を分析することによって、ＮＫ細胞機能におけるｍｉＲ−６２９の効果を評価する。ＮＫ細胞機能は、インターフェロンγまたはグランザイムＢ  ＥＬＩＳＡにおいてアッセイすることもできる。グランザイムは、細胞傷害活性Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞内で細胞質顆粒により放出されるセリンプロテアーゼである。グランザイムは、癌細胞を含め、標的細胞においてプログラム細胞死を誘導する。
【０１３７】
最初の結果から、ｍｉＲ−６２９過剰発現によってＮＫ細胞機能が変化することが示される（図１８Ａおよび１８Ｂ）。ｍｉＲ−６２９ヌクレオフェクション後に、ＮＫ細胞機能におけるｍｉＲ−６２９過剰発現の効果を分析した。ｍｉＲ−６２９レベルは、ヌクレオフェクション後に上昇した（図１８Ａ）。この上昇の結果、細胞溶解経路およびＮＫ活性化／接着に関連する遺伝子が４０〜６０％低下した。分析した遺伝子には、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グランザイムＭ、カテプシンＤ、パーフォリン１、ＣＤ６３、ＣＤ９６およびインターフェロン制御因子７が含まれる（図１８Ｂ）。次の方法を用いてヌクレオフェクションを行い、０．２〜１．５ｅ６細胞／ｍＬの密度で、３〜４日ごとに継代を行い、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ＃２００−０２）を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）培地中でＮＫ−９２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２４０７）を維持した。次のようにＡｍａｘａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  ＲおよびＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ装置（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ＮＫ−９２細胞に対してヌクレオフェクションを行った。適切な数のウェルに１．５ｍＬの培地を満たし、加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で予備温置することによって、１２ウェルの組織培養プレートを準備した。０．４５ｍＬ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを２．０５ｍＬ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒに添加することによって、ヌクレオフェクション希釈標準溶液を調製した。１回のヌクレオフェクションに対して、５ｅ６個の細胞をＲＴにて９０ｘｇで１０分間遠心沈殿させ、１００ｕＬ  ＲＴヌクレオフェクション希釈標準溶液中で再懸濁し、２００ｎＭ  ｍｉＲ−６２９模倣物、阻害剤またはスクランブル対照と組み合わせた。細胞／ＲＮＡ懸濁液をキュベットに移し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ装置に置き、Ｕ−００１ＮＫプログラムを適用した。このキュベットを装置から取り出し、５００ｕＬの予め平衡化した培地を添加した。次いで準備した１２−ウェルプレートに試料を移し（ウェルあたり最小体積およそ２ｍＬ培地／細胞）、加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で温置した。本明細書中、上記で報告されるように、ｍｉＲ−６２９の発現は、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）を用いたインビトロ抗体依存性細胞傷害活性に対して高感受性である細胞株と低感受性である細胞株との間で顕著に異なっていたが、リツキシマブの場合はこのようなことはなかった。（いくつかあるｍｉＲ中で特に）ｍｉＲ−６２９をＢ細胞悪性腫瘍における第１相試験および第２相臨床試験での試験のために予め指定して、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）処置に対する患者の反応を予想することにおいて臨床的有用性を評価した。驚くべきことに、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）での処置に反応したかまたは反応できなかったびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の患者間でｍｉＲ−６２９発現がベースライン血液試料中で顕著に異なっていた。この影響は、単剤（Ｐｈ１）および化学療法併用試験（Ｐｈ２）において再現性があった。この影響はリツキシマブでは認められなかった。興味深いことに、ｍｉＲ−６２９が低レベルである患者ほど、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）に対する反応率の上昇を示したが、リツキシマブに対しては示されなかった。この観察は、少なくとも部分的には、エキソソームでのその存在を介するか、または他の手段を通じるかの何れかで、ｍｉＲ−６２９がＮＫ細胞活性化マーカーを変化させることができることによるものであり得る。これらの結果から、抗ＣＤ１９抗体（ＭＥＤＩ−５５１）に対する反応への介在におけるｍｉＲ−６２９についての役割が裏付けられるが、リツキシマブについては当てはまらない。
【０１３８】
ＲＮＡ単離
マイクロＲＮＡ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、リンパ腫および白血病患者または健常ボランティアからのＰＡＸｇｅｎｅ血液チューブからトータルＲＮＡを抽出した。慢性リンパ球性白血病患者からの細胞株およびＰＢＭＣ試料の場合、ｍｉＲＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の説明書に従い、試料を単離した。分光光度測定により（２６０／２８０＞１．９）ＲＮＡ純度および濃度を決定した。ＲＮＡ６０００  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上でＲＮＡの品質を評価した。
【０１３９】
ＴａｑＭａｎ  Ｑ−ＰＣＲ
ＴａｑＭａｎ分析の場合、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  ＲＴおよびｍｉＲＮＡプライマープールを用いて、製造者の説明書に従い、２５０〜３００ｎｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。１２．５μＬ  ２Ｘ  ＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、２．５μＬ  １０Ｘ  Ｍｅｇａｐｌｅｘ  ＰｒｅＡｍｐプライマー、７．５μＬ  Ｈ2Ｏおよび２．５μＬ  ＲＴ生成物を含有する反応中でＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘおよびｍｉＲＮＡプライマープールを用いて、得られたｃＤＮＡを予備増幅させた。サイクル後、増幅させた試料をＤＮＡ懸濁緩衝液（ＴＥＫｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）中で１：４希釈し、−２０℃で保持するか、またはＰＣＲのためにすぐに使用した。ｍｉＲ−６２９およびハウスキーピング参照遺伝子ＲＮＵ４４、Ｕ６、Ｕ４７およびＲＮＵ２４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に特異的なＴａｑＭａｎアッセイを用いて、ＢｉｏＭａｒｋ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍによって予備増幅物質におけるリアルタイムＰＣＲを行った。サイクル閾値（Ｃｔ）の値が２８を上回るものを計算から除外した。４個の参照遺伝子（ＲＮＵ４４、Ｕ６、Ｕ４７およびＲＮＵ２４）の平均を用いて、デルタＣｔ値（ΔＣｔ）を計算した。デルタＣｔ値を比較のために使用する場合、デルタＣｔ値が高いほど、ｍｉＲ−６２９発現が低くなるように、デルタＣｔが発現に逆相関することに留意することが重要である。対照としての健常ボランティアにおけるｍｉＲ−６２９発現を用いて２-ΔΔCtを計算することによって、倍単位の変化の値を決定した。
【０１４０】
安定細胞株作製
２〜２０のＭＯＩでｍｉＲ−６２９またはスクランブルｍｉＲＮＡ対照を過剰発現するレンチウイルスベクター（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いてびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株Ｋａｒｐａｓ−４２２に対して形質転換を行った。形質転換した細胞を１〜２週間増殖させた。ＲＦＰを利用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって細胞を高ｍｉＲ−６２９および低ｍｉＲ−６２９集団に選別した。限界希釈法を用いてクローンも作製した。ＴａｑＭａｎ  ＱＰＣＲによってｍｉＲ−６２９の過剰発現を評価した。
【０１４１】
細胞増殖およびアポトーシスアッセイ
ｍｉＲ−６２９過剰発現リンパ腫細胞を５μＭまたは１０μＭのエトポシドで処理し、次いで細胞増殖およびアポトーシスを測定した。製造者のプロトコールに従い、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、エトポシド処理から２４時間および４８時間後に細胞増殖を測定した。製造者のプロトコールに従い、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、エトポシド処理から４８時間後にカスパーゼ活性化を測定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ．Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で全ての発光データを回収した。
【０１４２】
統計学的分析
ウェルチｔ検定またはマン・ホイットニーのノンパラメトリックＵ検定を用いてマイクロＲＮＡ発現の倍単位の変化の値を分析した。＜０．０５のｐ値を有意とみなした。
【０１４３】
他の実施形態
前述の説明から、様々な使用および状態に本発明を導入するために本明細書中に記載の発明に対して改変および変更がなされ得ることが明らかである。このような実施形態も次の特許請求の範囲の範囲内に入る。
【０１４４】
本明細書中の可変要素のあらゆる定義における要素の一覧の列挙は、挙げられる要素の何らかの単一要素または組み合わせ（またはサブコンビネーション）としてその可変要素の定義を含む。本明細書中の実施形態の列挙は、何らかの単一の実施形態としての、または何らかの他の実施形態またはそれらの一部と組み合わせた、実施形態を含む。
【０１４５】
本願で言及される全ての特許および刊行物は、各独立特許および刊行物が、具体的および個々に、参照により組み込まれるべきであることが示される場合と同程度まで参照によって本明細書中に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ−５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−９Ｃ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１４Ｃ−１４Ｄ】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2017510255.tif 000032
2017510255.tif 000033