(57)【要約】  脈管奇形により特徴づけられる病状の治療及び/又は予防に使用するWnt/β-カテニンシグナル伝達の阻害剤。阻害剤は、小分子、タンパク質、ペプチド又はアンチセンス核酸であってもよい。本発明は、医薬組成物及び治療方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脈管奇形により特徴づけられる病状の治療及び/又は予防に使用するWnt/β-カテニンシグナル伝達の阻害剤。
【請求項２】
阻害剤がβ-カテニン阻害剤であって、特にβ-カテニン転写シグナル伝達の阻害剤及び/又はβ-カテニンの核移動の阻害剤である、請求項1に記載の阻害剤。
【請求項３】
阻害剤が小分子阻害剤である、請求項1又は2に記載の阻害剤。
【請求項４】
阻害剤が非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)である、請求項3に記載の阻害剤。
【請求項５】
ケルセチン、ZTM000990、PKF118-310、PKF118-744、PKF115-584、PKF-222-815、CPG049090、PNU-74654、ICG-001、NSC668036、N'-[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]-2-フェノキシベンゾヒドラジド、N'-[(E)-1-(5-メチル-2-チエニル)エチリデン]-2-フェノキシアセトヒドラジド、5-[2-(5-メチル-2-フリル)エチル]-2-(2-チエニル)-1H-インドール、2-(2-フリル)-5-[(E)-2-(5-メチル-2-フリル)エテニル]-1H-インドール、N-[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]-4-(4-ピリジニル)-8-キノリン-アミン、2-(2-フリル)-5-[2-(5-メチル-2-フリル)エチル]-1H-インドール、7-{(2E)-2-[(5-メチル-2-フリル)メチレン]ヒドラジノ}-N-(2-フェニルエチル)-5,6-ジヒドロベンゾ[h]イソキノリン-9-カルボキサミド、1-{[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]アミノ}-3-(4-ピリジニル)-2,4-(1H,3H)-キナゾリンジオン、N-(5-メチル-2-フリル)-N-(2'-フェノキシ[1,1'-ビフェニル]-3-イル)アミン、4-{[7-(5-メチル-2-フリル)-2-ナフチル]オキシ}ピリジン、N-(5-ブロモ-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)-4-ヒドロキシ-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、4-ヒドロキシ-N-(5-メチル-2-フリル)-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、3-[(E)-2-(5-ブロモ-1,3,4-チアジアゾール-2-イル)エテニル]-4-ヒドロキシ-6-フェニル-2H-ピラン-2-オン、N-(5-ブロモ-1,3,4チアジアゾール-2-イル)-4-ヒドロキシ-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、5-[(3-アミノ-1H-1,2,4-トリアゾール-5-イル)メチル]-3-[3-フルオロ-4-(4-モルホリニル)フェニル]-1,3-オキサゾリジン-2-オン、4-[(3-アミノ-1H-1,2,4-トリアゾール-5-イル)メチル]-1-[3-フルオロ-4-(4-モルホリニル)フェニル]-2-イミダゾリジノン、1-ベンズヒドリル-4-(5-ブロモ-2-フロイル)ピペラジン、1-ベンズヒドリル-4-[(5-メチル-2-チエニル)カルボニル]ピペラジン、ベンジル(2E)-2-[1-(4-メチル-2-チエニル)エチリデン]ヒドラジンカルボキシレート、2-(4-クロロフェニル)-6-メチル-5-(5-メチル-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)[1,3]チアゾロ[3,2-b][1,2,4]トリアゾール、N-(5-メチル-3-イソオキサゾリル)-N'-[(5-フェニル-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)カルボニル]尿素、N-[3-(2-{[(5-クロロ-2-チエニル)メチル]スルホニル}ヒドラジノ)-3-オキソプロピル]ベンゼンスルホンアミド-5-[3-(4-フェノキシフェニル)プロピル]-1,3,4-オキサジアゾール-2-オール、N-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-4-フェノキシベンズアミド、4-ヒドロキシ-N-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-2-オキソ-6-フェノキシ-2H-ピラン-3-カルボキサミド、2-フェノキシ-N'-[(Z)-フェニル(2-チエニル)メチリデン]ベンゾ-ヒドラジド、2-アニリノ-N'-[(Z)-2-フリル(フェニル)メチリデン]ベンゾヒドラジド、4-[(Z)-1-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-2-フェニルエテニル]フェニル2-(1-ピロリジニル)エチルエーテル、5-メチル-2-フルアルデヒド[(3Z)-2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]ヒドラゾン、(2Z)-N-[(5-メチル-2-フリル)メチル]-2-[2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]エタンアミド、(2Z)-N-[(3-メチル-5-イソオキサゾリル)メチル]-2-[2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]エタンアミド、(2-クロロ-1,3-チアゾール-5-イル)メチル4-(4-モルホリニルスルホニル)フェニルエーテル、N-(4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-(4-フェノキシブチル)メタンスルホンアミド、N-(6-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-[2-(1-メチル-3-フェニルプロポキシ)エチル]アセトアミド、4-{2-[(5-メチル-2-フリル)メトキシ]ベンジリデン}-1-(4-ピリジニルスルホニル)ピペリジン、4-{2-[(5-ブロモ-2-フリル)メトキシ]ベンジリデン}-1-イソニコチノイルピペリジン、N-(4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-(4-フェニルペンチル)アセトアミド、N-(4,5-ジヒドロ-3H-ナフト[1,2-d]イミダゾール-2-イル)-N-[2-(2-フェニルエトキシ)エチル]メタンスルホンアミド、N'-[(Z)-(5-メチル-2-フリル)(2-ピリジニル)メチリデン]-2-フェノキシベンゾヒドラジド、スリンダク、スリンダクスルフィド、スルホン化スリンダク及びその薬学的に許容できる塩、ヒドロキシマタイレシノール、ヘキサクロロフェン、PPARγアゴニスト又はPPARγ不活性類似体、シリビニン、オオアザミ抽出物(カルドマリアーノ)、EGCG(エピガロカテキン-3-ガラート)、白茶/緑茶、スルフォラファン、レスベラトロール、クルクミン、インドール-3-カルビノール、ウルソル酸、ドコサヘキサエン酸、ゲニステイン、β-ラパコン、サリノマイシン並びにTable 1(表1)に挙げた化合物からなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項６】
阻害剤がスルホン化スリンダク若しくはスリンダクスルフィド若しくはスリンダク又はその類似体若しくは誘導体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項７】
阻害剤が、シリビニン、サリノマイシン、EGCG(エピガロカテキン-3-ガラート)、白茶/緑茶、スルフォラファン、レスベラトロール、クルクミン、インドール-3-カルビノール、ウルソル酸、ドコサヘキサエン酸、ゲニステイン及びβ-ラパコンからなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項８】
Wnt/β-カテニンシグナル伝達阻害剤が、タンパク質又はペプチドである、請求項1に記載の阻害剤。
【請求項９】
タンパク質若しくはペプチドが、直接投与される又は投与した発現系によって発現される、請求項8に記載の阻害剤。
【請求項１０】
タンパク質又はペプチドが、Chibby、アキシン、HDPR1、ICAT若しくはLXXLLペプチドを含む融合タンパク質、OMP-18R5などfrizzledに対する抗体である、請求項8又は9に記載の阻害剤。
【請求項１１】
Wnt/β-カテニンシグナル伝達阻害剤が、アンチセンス核酸分子である、請求項1に記載の阻害剤。
【請求項１２】
阻害剤が、全長アンチセンスベータ-カテニン構築物、ベータ-カテニンsiRNA又はベータ-カテニンshRNAである、請求項11に記載の阻害剤。
【請求項１３】
阻害剤が、対象に投与するのに適切な組換え発現系により発現される、請求項11又は12に記載の阻害剤。
【請求項１４】
組換え発現系が、内皮又は脳内皮特異的プロモーター因子、及び任意選択で、誘導/抑制因子を含む、請求項13に記載の阻害剤。
【請求項１５】
阻害剤が、Chibby、アキシン、HDPR1、ICAT及びLXXLLペプチドを含む融合タンパク質の群から選択されるタンパク質若しくはペプチド、又は全長アンチセンスベータ-カテニン構築物、ベータ-カテニンsiRNA若しくはベータ-カテニンshRNAの群から選択されるアンチセンス核酸分子である、請求項14に記載の阻害剤。
【請求項１６】
阻害剤が、ナノ粒子内にカプセル化され、好ましくはナノ粒子が、病的内皮細胞を標的化するように操作されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１７】
脈管奇形が、内皮間葉転換と関連する、請求項1から16のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１８】
脈管奇形が、中枢神経系及び/又は網膜脈管系に局在する、請求項1から17のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１９】
病状が、進行性骨化性線維異形成症、心臓線維症、腎線維症、肺線維症及び脳幹部海綿状血管腫からなる群から選択される、請求項1から18のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２０】
病状が脳幹部海綿状血管腫である、請求項1から19のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２１】
脳幹部海綿状血管腫が、CCM1(KRIT1)、CCM2(OSM)又はCCM3(PDCD10)の群から選択される遺伝子の少なくとも1つにおける機能消失型突然変異によって引き起こされる、請求項20に記載の阻害剤。
【請求項２２】
脳幹部海綿状血管腫が、散発性又は家族性である、請求項20又は21に記載の阻害剤。
【請求項２３】
請求項1から16のいずれか一項に記載の少なくとも1つの阻害剤の有効量並びに脈管奇形により特徴づけられる病状の治療及び/又は予防に使用する許容可能な医薬媒体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
少なくとも別の治療剤の有効量を更に含む、請求項23に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
他の治療剤が、酸化防止剤、TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、BMPシグナル伝達経路阻害剤、VEGFシグナル伝達経路阻害剤、Yapシグナル伝達経路阻害剤、スタチン及びRhoA GTPaseレベル又は活性の他の阻害剤の群から選択される、請求項24に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
許容可能な医薬媒体がナノ粒子であり、好ましくはナノ粒子が、病的内皮細胞を標的化するように操作されている、請求項23から25のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
必要とする対象にwnt/ベータ-カテニンシグナル伝達の阻害剤の有効量を投与する工程を含む、脈管奇形により特徴づけられる病状を治療及び/又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脈管奇形、特に内皮間葉転換、特に脳幹部海綿状血管腫（Cerebral Cavernous Malformation）により特徴づけられる病状を治療するためのWnt/β-カテニンシグナル伝達阻害剤に関する。阻害剤は、小分子、タンパク質、ペプチド又はアンチセンス核酸であってもよい。本発明は、医薬組成物及び治療方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
脳幹部海綿状血管腫(CCM)として公知の疾患を特徴づける脈管奇形は、主に中枢神経系に集中しており、多重内腔及び脈管漏出を一般に示す{Clatterbuck、2001#17;Wong、2000#18}。病的血管のそのような器官位置により、出血性脳卒中を含めたいくつかの神経学的症状が生じ得る3。ヒトにおいて、CCM1、CCM2及びCCM3として公知の3つの独立した遺伝子のいずれか1つにおける突然変異が、CCMの家族性バリアントと関連づけられている5。マウスモデルにおいて、新生児におけるCCM遺伝子のどの誘導可能な内皮特異的機能喪失型変異6、7も、脳脈管表現型を再現することができる。加えて、CCM3の構成的な内皮選択的不活性化は、脈管発達の一般的な問題のため胚性に致死的である8。まれな症例においてCCM3の神経特異的突然変異が脳脈管表現型を誘導することがあるが9、これらのデータは内皮細胞におけるCCM遺伝子の突然変異がCCM病的表現型に関与することを強く示唆している。しかしながら、内皮細胞におけるこれら遺伝子の作用機序は、今なお殆ど不明である。今日まで、CCM疾患に対する唯一の療法は、手術である4。
【０００３】
培養大動脈内皮細胞におけるCCM1タンパク質のノックダウンは、Wnt/b-カテニンシグナル伝達を促進すると報告されている10。しかしながら、現在まで、in vivoでの脈管病変の形成においてb-カテニン経路が関連するとの指摘は存在していなかった。いくつかの研究は、胚発生中の標準的なWnt/b-カテニンシグナル伝達の活性化が、脳血管形成及び血液脳関門微小血管系の正しい分化に必要であることを示している11〜13。これらの効果は、成人において制御の効かない脈管増殖を防止するために厳格に調節される必要がある。実際、生理的条件において、b-カテニンシグナル伝達は、出生後に鋭く減少し、成人において基本的に検出不可能である13。
【０００４】
WO2009148709は、血管における脈管透過性を低下させる並びに脈管内皮の異常若しくは損傷に関連する症状を治療又は予防するための組成物及び方法について開示している。例えば、開示されている組成物及び方法を使用して、脳幹部海綿状血管腫(CCM)などの脈管異形成を治療することができる。これらの方法は、3-ヒドロキシ-3メチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素の阻害剤など、RhoA GTPaseレベル又は活性を阻害する組成物の使用に一般に関する。本出願は、RhoA GTPase阻害剤の例として、シンバスタチンなどのスタチン分子、又はパミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート及びゾレドロネートなどの含窒素ビスホスホネートを提供する。
【０００５】
WO2012135650において、シクロオキシゲナーゼ阻害活性を欠くスリンダクの誘導体は、それを含有する医薬組成物及び癌の治療又は予防に対する使用と一緒に提供される。スリンダクの誘導体も、慢性炎症性症状を治療するのに適切である。誘導体を調製する方法も提供される。アルツハイマー病におけるその使用も請求される。
【０００６】
Kundu JKら[「Beta-catenin-mediated signaling: a novel molecular target for chemoprevention with anti-inflammatory substances」、Biochimica et Biophysica Acta 1765 (2006):14〜24頁]は、ベータ-カテニン媒介シグナル伝達経路、特に発癌に対するそれの寄与との関係、並びに非ステロイド性抗炎症薬及び抗炎症特性を保有する化学的予防植物化学物質により不適当に活性化したベータ-カテニン媒介シグナル伝達のモジュレーションに重点を置いている。Table1及び2(表1及び2)において、Kunduらは、ベータ-カテニン媒介シグナル伝達経路をモジュレートすることが可能な全ての物質、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)及び抗炎症性植物化学物質の両方を挙げている。他のベータ-カテニン阻害剤及びその作用機序については、Anastas及びMoon、2013、Nature Rev-Cancer、13、11〜26頁; Rosenbluhら、2014、Trends Pharmac. Sci 35、103〜109頁; Takahashi-Yanaga及びKahn、2010、Clin Cancer Res 16、3153〜3162頁に記述されている。
【０００７】
McDonald DAら(「Fasudil decreases lesion burden in murine model of cerebral cavernous malformation」Stroke 43、571〜574頁  2012)において、CCM1疾患のモデルは、Rhoキナーゼ阻害剤、ファスジルで治療された。
【０００８】
しかしながら、現在のところ疾患は、外科的にしか治療できないので、CCMの薬物治療の必要性が今なお存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2009148709
【特許文献２】WO2012135650
【特許文献３】米国特許出願公開第2004/0,204,477号
【特許文献４】米国特許第6,271,257号
【特許文献５】米国特許第6,677,116号
【特許文献６】米国特許第6,066,500号
【特許文献７】米国特許第6,464,687号
【特許文献８】米国特許第6,074,673号
【特許文献９】米国特許出願公開第2002/0,146,830号
【非特許文献】
【００１０】
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【非特許文献２】Wong, J.H.ら、Neurosurgery 46、1454〜1459頁  (2000)
【非特許文献３】Rigamonti, D.ら、The New England journal of medicine 319、343〜347頁  (1988)
【非特許文献４】Li, D.Y.及びWhitehead, K.J.、Stroke 41、S92〜94頁  (2010)
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【非特許文献６】Boulday, G.ら、The Journal of experimental medicine 208、1835〜1847頁(2011)
【非特許文献７】Chan, A.C.ら、J Clin Invest 121、1871〜1881頁(2011)
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【非特許文献１２】Daneman, R.ら、Proc Natl Acad Sci U S A 106、641〜646頁(2009)
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【非特許文献１４】Kundu JKら、Beta-catenin-mediated signaling: a novel molecular target for chemoprevention with anti-inflammatory substances、Biochimica et Biophysica Acta 1765 (2006): 14〜24頁
【非特許文献１５】Anastas及びMoon、2013、Nature Rev-Cancer、13、11〜26頁
【非特許文献１６】Rosenbluhら、2014、Trends Pharmac. Sci 35、103〜109頁
【非特許文献１７】Takahashi-Yanaga及びKahn、2010、Clin Cancer Res 16、3153〜3162頁
【非特許文献１８】McDonald DAら、Fasudil decreases lesion burden in murine model of cerebral cavernous malformation、Stroke 43、571〜574頁、2012
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明において、本発明者らは、内皮細胞におけるベータカテニン(b-カテニン又はβ-カテニン)の転写活性の改変が、in vivoでのCCMの病的表現型に関与することを発見した。本発明者らは、CCM3タンパク質が実際にin vitro及びin vivoの両方で内皮細胞におけるb-カテニン転写活性の調節因子であることを本明細書において報告する。更に、本発明者らは、b-カテニン媒介転写活性を減少させ得る薬剤が、脳又は網膜脈管奇形の数及び拡大を減少させ、新たな脈管病変の出現を予防し得ることを驚くべきことに発見した。本発明において、NSAIDであるスリンダクスルフィド並びにスルホン化スリンダクなどβ-カテニン媒介活性を減少させ得る化合物が、脳幹部海綿状血管腫(CCM)のモデルである内皮細胞特異的CCM3ノックアウト遺伝子を持つマウスの中枢神経系において脈管病変の数及び容積を有意に減少させることが驚くべきことに発見された。CCMは中枢神経系の血管に影響を及ぼす脈管疾患であり、奇形性、漏出性、出血傾向を生じる。器官位置は、神経学的帰結及び治療的介入の両方に重大であり、その治療的介入は現在まで外科的なものだけである。従って、β-カテニン媒介活性を減少させ得る化合物は、脈管病変の形成を阻害する、特にCCMの家族性バリアントに罹患し、経時的に新たな奇形を発症し続ける患者のための薬理学的ツールを表す。
【００１２】
本発明に示される結果は、脈管奇形により特徴づけられる任意の病状に適用することができる。そのような病状は、内皮細胞における細胞間接合部の解体及びEndMT(内皮間葉転換)、マーカー(Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、Nカドヘリン、Zeb2、Fadiniら、2012年:Margaritiら、2012年; Liら、2012年;Liangら2011年;Steinら、2006年;Mediciら、2012年など)の発現を示す。
【００１３】
本発明は、Wnt/β-カテニン経路、特に、例えばNSAID、スルホン化スリンダク(エキシスリンド)を使用するβ-カテニンシグナル伝達の阻害が、EndMTマーカーの発現を阻害するという驚くべき発見にも基づく。そのようなマーカーは、CCMなどの脈管奇形により特徴づけられる病状に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第1の態様において、本発明は、脈管奇形により特徴づけられる病状の治療及び/又は予防に使用するWnt/β-カテニンシグナル伝達の阻害剤を提供する。好ましくは、阻害剤は、β-カテニン阻害剤、特にβ-カテニン転写シグナル伝達の阻害剤及び/又はβ-カテニンの核移動の阻害剤である。
【００１５】
更に好ましくは、阻害剤は小分子阻害剤である。好ましい実施形態において、阻害剤は、ケルセチン、ZTM000990、PKF118-310、PKF118-744、PKF115-584、PKF-222-815、CPG049090、PNU-74654、ICG-001、NSC668036、N'-[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]-2-フェノキシベンゾヒドラジド、N'-[(E)-1-(5-メチル-2-チエニル)エチリデン]-2-フェノキシアセトヒドラジド、5-[2-(5-メチル-2-フリル)エチル]-2-(2-チエニル)-1H-インドール、2-(2-フリル)-5-[(E)-2-(5-メチル-2-フリル)エテニル]-1H-インドール、N-[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]-4-(4-ピリジニル)-8-キノリン-アミン、2-(2-フリル)-5-[2-(5-メチル-2-フリル)エチル]-1H-インドール、7-{(2E)-2-[(5-メチル-2-フリル)メチレン]ヒドラジノ}-N-(2-フェニルエチル)-5,6-ジヒドロベンゾ[h]イソキノリン-9-カルボキサミド、1-{[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]アミノ}-3-(4-ピリジニル)-2,4-(1H,3H)-キナゾリンジオン、N-(5-メチル-2-フリル)-N-(2'-フェノキシ[1,1'-ビフェニル]-3-イル)アミン、4-{[7-(5-メチル-2-フリル)-2-ナフチル]オキシ}ピリジン、N-(5-ブロモ-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)-4-ヒドロキシ-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、4-ヒドロキシ-N-(5-メチル-2-フリル)-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、3-[(E)-2-(5-ブロモ-1,3,4-チアジアゾール-2-イル)エテニル]-4-ヒドロキシ-6-フェニル-2H-ピラン-2-オン、N-(5-ブロモ-1,3,4チアジアゾール-2-イル)-4-ヒドロキシ-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、5-[(3-アミノ-1H-1,2,4-トリアゾール-5-イル)メチル]-3-[3-フルオロ-4-(4-モルホリニル)フェニル]-1,3-オキサゾリジン-2-オン、4-[(3-アミノ-1H-1,2,4-トリアゾール-5-イル)メチル]-1-[3-フルオロ-4-(4-モルホリニル)フェニル]-2-イミダゾリジノン、1-ベンズヒドリル-4-(5-ブロモ-2-フロイル)ピペラジン、1-ベンズヒドリル-4-[(5-メチル-2-チエニル)カルボニル]ピペラジン、ベンジル(2E)-2-[1-(4-メチル-2-チエニル)エチリデン]ヒドラジンカルボキシレート、2-(4-クロロフェニル)-6-メチル-5-(5-メチル-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)[1,3]チアゾロ[3,2-b][1,2,4]トリアゾール、N-(5-メチル-3-イソオキサゾリル)-N'-[(5-フェニル-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)カルボニル]尿素、N-[3-(2-{[(5-クロロ-2-チエニル)メチル]スルホニル}ヒドラジノ)-3-オキソプロピル]ベンゼンスルホンアミド-5-[3-(4-フェノキシフェニル)プロピル]-1,3,4-オキサジアゾール-2-オール、N-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-4-フェノキシベンズアミド、4-ヒドロキシ-N-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-2-オキソ-6-フェノキシ-2H-ピラン-3-カルボキサミド、2-フェノキシ-N'-[(Z)-フェニル(2-チエニル)メチリデン]ベンゾ-ヒドラジド、2-アニリノ-N'-[(Z)-2-フリル(フェニル)メチリデン]ベンゾヒドラジド、4-[(Z)-1-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-2-フェニルエテニル]フェニル2-(1-ピロリジニル)エチルエーテル、5-メチル-2-フルアルデヒド[(3Z)-2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]ヒドラゾン、(2Z)-N-[(5-メチル-2-フリル)メチル]-2-[2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]エタンアミド、(2Z)-N-[(3-メチル-5-イソオキサゾリル)メチル]-2-[2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]エタンアミド、(2-クロロ-1,3-チアゾール-5-イル)メチル4-(4-モルホリニルスルホニル)フェニルエーテル、N-(4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-(4-フェノキシブチル)メタンスルホンアミド、N-(6-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-[2-(1-メチル-3-フェニルプロポキシ)エチル]アセトアミド、4-{2-[(5-メチル-2-フリル)メトキシ]ベンジリデン}-1-(4-ピリジニルスルホニル)ピペリジン、4-{2-[(5-ブロモ-2-フリル)メトキシ]ベンジリデン}-1-イソニコチノイルピペリジン、N-(4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-(4-フェニルペンチル)アセトアミド、N-(4,5-ジヒドロ-3H-ナフト[1,2-d]イミダゾール-2-イル)-N-[2-(2-フェニルエトキシ)エチル]メタンスルホンアミド、N'-[(Z)-(5-メチル-2-フリル)(2-ピリジニル)メチリデン]-2-フェノキシベンゾヒドラジド、スリンダクスルフィド、スルホン化スリンダク及びその薬学的に許容できる塩、ヒドロキシマタイレシノール、ヘキサクロロフェン、PPARγアゴニスト、又はPPARγ不活性類似体、シリビニン、オオアザミ抽出物(カルドマリアーノ)、EGCG(エピガロカテキン-3-ガラート)、白茶/緑茶、スルフォラファン、レスベラトロール、クルクミン、インドール-3-カルビノール、ウルソル酸、ドコサヘキサン酸、ゲニステイン、β-ラパコン並びにTable1(表1)[http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/]に挙げた化合物からなる群から選択される。
【００１６】
Table1(表1)は、経路の様々な構成要素を標的し、結果としてそれを阻害することによりWntシグナル伝達を阻害することが報告されている化合物を挙げる。総説についてはDodge、Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2011;51:289〜310頁、Chen、Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010 8月号;299(2):G293〜300頁、Barker、Nat Rev Drug Discov. 2006 12月号;5(12):997〜1014頁を参照のこと。これらの阻害剤は全て、本発明の一部を形成する。
【００１７】
【表１】
2017513838.tif 000002
【００１８】
なお好ましくは、阻害剤は、スリンダク若しくはスリンダクスルフィド若しくはスルホン化スリンダク又はその類似体若しくは誘導体である。
【００１９】
スルホン化スリンダクは、エキシスリンド、aptosyn(登録商標)、fgn1又はprevatac(登録商標)とも命名される。
【００２０】
阻害剤は、PDE5(ホスホジエステラーゼ5)の阻害剤又はPKG(タンパク質キナーゼG又はサイクリックGMP依存性タンパク質キナーゼ)の活性剤であってもよい。PDE5及びPKGは、それぞれスリンダクスルフィド及びエキシスリンド両方の直接的及び間接的(サイクリックGMPレベルの調節を介する)な標的であり、ベータ-カテニンのリン酸化の調節並びにベータ-カテニン駆動シグナル伝達経路の阻害に関与する(Tinsleyら、2011; Thompsonら、2000; Liら、2001)。
【００２１】
更に好ましくは、阻害剤は:シリビニン、EGCG(エピガロカテキン-3-ガラート)、白茶/緑茶、スルフォラファン、レスベラトロール、クルクミン、インドール-3-カルビノール、ウルソル酸、ドコサヘキサン酸、ゲニステイン及びβ-ラパコンからなる群から選択される。
【００２２】
好ましい実施形態において、Wnt/β-カテニンシグナル伝達阻害剤は、タンパク質又はペプチドである。好ましくは、タンパク質又はペプチドは、直接投与される又は投与された発現系を介して発現される。
【００２３】
なお好ましくは、タンパク質又はペプチドは、Chibby、アキシン、HDPR1、ICAT若しくはLXXLLペプチド(配列番号19)を含む融合タンパク質、DKK1、OMP-18R5などfrizzledに対する抗体である。
【００２４】
DKK1(Dickkopf、Dkk)は、Wntシグナル伝達の負の調節因子である(Glinka、1998; Niehrs、1999)。Dkkタンパク質は分泌され、システインが豊富である。DkkはWntに結合しないが、Wnt補助受容体LRPと相互作用する。OMP-18R5などfrizzledに対する抗体は、治療及び研究室において使用することができる。それは、複数のFrizzled受容体と相互作用する(Gurneyら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 7月号、17;109(29):11717〜22頁)。
【００２５】
更に好ましくは、Wnt/β-カテニンシグナル伝達阻害剤は、アンチセンス核酸分子である。なお好ましくは、全長アンチセンスベータ-カテニン構築物、ベータ-カテニンsiRNA又はベータ-カテニンshRNAである。
【００２６】
好ましい実施形態において、阻害剤は、対象への投与に適切な組換え発現系によって発現される。
【００２７】
好ましい実施形態において、組換え発現系は、内皮又は脳内皮特異的プロモーター因子、及び任意選択で、誘導/抑制因子を含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、阻害剤は、ナノ粒子内にカプセル化され、好ましくは、ナノ粒子は、病的内皮細胞を標的化するように操作されている。
【００２９】
なお好ましい実施形態において、脈管奇形は、内皮間葉転換により特徴づけられ又は脈管奇形は、内皮間葉転換と関連する(Mediciら、2012; Fadiniら、2012)。本発明の脈管奇形において、内皮間葉転換は存在する。
【００３０】
好ましくは、脈管奇形は、中枢神経系及び/又は網膜脈管系内にある。
【００３１】
なお好ましくは、病状は:進行性骨化性線維異形成症(Medici Dら、Nature Medicine 16:1400頁、2010)、心臓線維症、腎線維症、肺線維症(Medici D及びKalluri R、Semin Cancer Biol 22:379頁、2012)及び脳幹部海綿状血管腫からなる群から選択される。
【００３２】
更に好ましくは、病状は脳幹部海綿状血管腫である。
【００３３】
好ましい実施形態において、脳幹部海綿状血管腫は、CCM1(KRIT1)、CCM2(OSM)又はCCM3(PDCD10)の群から選択される遺伝子の少なくとも1つにおける機能喪失型変異によって引き起こされる。
【００３４】
なお好ましくは、脳幹部海綿状血管腫は散発性又は家族性である。
【００３５】
上で定義した少なくとも1つの阻害剤の有効量並びに脈管奇形により特徴づけられる病状の治療及び/又は予防に使用する許容可能な医薬媒体を含む医薬組成物が、本発明の更なる目的である。
【００３６】
好ましくは、医薬組成物は少なくとも別の治療剤の有効量を更に含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、他の治療剤は:酸化防止剤、TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、BMPシグナル伝達経路阻害剤、VEGFシグナル伝達経路阻害剤、Yapシグナル伝達経路阻害剤、スタチン(例えばHwangら、2013、Int J. Oncol 43、261〜270頁を参照のこと)並びにRhoA GTPaseレベル及び/又は活性の阻害剤の群から選択される。
【００３８】
好ましい実施形態において、許容可能な医薬媒体はナノ粒子であり、好ましくは、ナノ粒子は、病的内皮細胞を標的化するように操作されている。必要とする対象にwnt/ベータ-カテニンシグナル伝達の阻害剤の有効量を投与することを含む、脈管奇形により特徴づけられる病状を治療及び/又は予防する方法が、本発明の更なる目的である。
【００３９】
これらの化合物は、経口を含めた異なる経路により投与することができ、CCM(脳幹部海綿状血管腫、散発性又は家族性形態)患者において脈管奇形を減少させる及び新たな脈管病変の出現を予防するのに安全且つ有効な用量で与えることができる。
【００４０】
本発明において、Wnt/ベータ-カテニンシグナル伝達の阻害剤は、その作用の最終結果としてベータ-カテニンにより駆動される転写応答を阻害する化学的ツールである。そのような阻害剤の標的は、Wnt/ベータ-カテニンシグナル伝達経路の任意のステップ及び分子成分であってもよい。
【００４１】
特に、Wnt/ベータ-カテニンシグナル伝達の阻害剤は、ベータ-カテニン阻害剤である。ベータ-カテニン阻害剤は:ベータ-カテニン活性及び/又はシグナル伝達の阻害剤である。阻害剤は、a)ベータ-カテニンに作用する、b)ベータ-カテニン分解を促進する、c)ベータ-カテニンの発現と干渉する、d)ベータ-カテニンとの結合について他の薬剤と競合することにより直接的又は間接的にベータ-カテニン活性を阻害することができる。阻害剤は、ベータ-カテニン媒介転写及び/又はベータ-カテニン活性の他のレベルの阻害剤であってもよい。阻害剤は、b-カテニン転写シグナル伝達の阻害剤である。阻害剤は、活性b-カテニンの核内蓄積を阻害又は予防することもできる。
【００４２】
本発明において、細胞培養及び/又は対象においてWntシグナル伝達を特異的に阻害する様々な方法がある。a) LRP/Arrow、Dishevelledなどの経路の様々な構成要素を標的化するRNAiを使用するために、これは、ショウジョウバエS2細胞(Matsubayashi 2004、Congら、2004)に対してだけでなく哺乳動物細胞(Luら、2004)においても非常によく機能することが示された。b)様々な程度にWntシグナル伝達を阻害することが示された様々な小分子がある。Table 1(表1)及びその標的を参照のこと。これらのうちの1つ、IWPは、ポーキュパインを阻害することによってWnt分泌を遮断するのに有効であることが示された(Chenら、2009)。c)(分泌)Wntシグナルは、過剰な、その受容体であるFrizzledのリガンド結合ドメインによって遮断することができる。このドメインは、FRP/Frz形態の天然の融合として最良に作られる。別法として、それは、GPIアンカーを使用して標的細胞の表面上に発現させることができ、それはよく機能する(Cadigan、1998)。d) Wntを阻害する別の方法は、過剰のDickkopf(Dkk)タンパク質を添加することである(Glinka、1998)。これは、細胞培養及びin vivoにおいてよく機能する。Dkkは、Wntに対するLRP補助受容体に結合する。e)細胞内のシグナル伝達を遮断するために、何名かの研究者は、ドミナントネガティブDishevelledを使用した(Wallingford、2000)。f)完全なアキシン、Wnt経路の負の調節因子の過剰発現は、非常によく機能する(Zeng、1997、Itoh、1998; Willert、1999)。g)完全長GSKの過剰発現も、Wntシグナル伝達を効果的に遮断することができる(He、1995)。h)核内のWntシグナル伝達を遮断するために使用できるTCFのドミナントネガティブ形態がある(Molenaar 1996)。i) frizzledに対する抗体、OMP-18R5は、治療及び研究室において使用することができる。それは、複数のFrizzled受容体と相互作用する(Gurneyら、2012)。
【００４３】
本発明において、脈管奇形により特徴づけられる病状は、任意の型及び局在的な異常組織化を伴う区域の血管を提示し、その血管において内皮細胞は、細胞-細胞接触の障害及び/若しくは内皮間葉転換(EndMT)マーカー(Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、N-カドヘリン、Zeb2、Fadiniら、2012: Margaritiら、2012; Liら、2012; Liangら、2011; Steinら、2006; Mediciら、2012など)の発現並びに/又は関門機能の損傷を示す。壁細胞の結合において、そのような周細胞も損なわれ得る。そのような奇形の例は、脳幹部海綿状血管腫(CCM)の病状に見られる。
【００４４】
本発明において、EndMTにより特徴づけられる脈管奇形は、内皮細胞が内皮細胞分化を失った血管の局所異常である。結果として、内皮層の機能は損なわれ、そのような異常に影響を受ける血管の領域は、構造的に異常であり、透過性過剰であり、炎症しており、出血傾向である。
【００４５】
本発明のこの態様によると、脈管奇形により特徴づけられる病状の治療及び/又は予防は、脈管奇形、特にEndMTにより特徴づけられる脈管奇形、特にCCMの少なくとも1つの病徴を緩和するのに有効であり得る。
【００４６】
脈管奇形により特徴づけられる病状の根本原因を治療する場合、病徴の管理が同様に実現され得ると考えられる。病徴の管理により、病徴の重症度を維持し得る(即ち、病徴の悪化又は進行を制御する)、より好ましくは、病徴の重症度を全体に又は一部減少させ得ることを意図している。
【００４７】
病徴には、拡張した血管の異常な集団、てんかん発作、脳卒中病徴、出血及び頭痛、病変がある。病徴は、一般に奇形の位置によって決まり:重症度、期間及び強度に幅があるてんかん発作、腕及び脚の衰弱並びに視力、平衡、記憶及び注意に関する問題などの神経障害、重症度、期間及び強度に幅がある頭痛、周囲の脳組織に損傷を与える場合がある脳内出血と呼ばれる出血を挙げることができる。
【００４８】
ベータ-カテニンの1つ以上の異なる阻害剤のいずれか及びその組合せを使用することができる。これらには、小分子阻害剤、タンパク質及びペプチド阻害剤並びにアンチセンス(RNAi)阻害剤があり得るが、これに限定されない。
【００４９】
典型的な小分子阻害剤には、インドメタシン、スリンダク、スルホン化スリンダク、スリンダクスルフィド、アスピリン、ロフェコキシブ、ジクロフェナク、セレコキシブ、メロキシカム、エトドラク、ナブメトンなどのNSAIDがあるが、これに限定されない。
【００５０】
典型的な小分子阻害剤には、ケルセチン[Parkら、「Quercetin, a potent inhibitor against beta-catenin/Tcf signaling in SW480 colon cancer cells」、Biochem Biophys Res Commun. 328(1):227〜34頁(2005)、全体として参照により本明細書に組み込む];そのそれぞれを全体として参照により本明細書に組み込むTrossetら、「Inhibition of protein-protein interactions: The discovery of druglike beta-catenin inhibitors by combining virtual and biophysical screening」、Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 64(1):60〜67頁(2006)及びBarkerら、「Mining the Wnt Pathway for Cancer Therapeutics」、Nature Reviews Drug Discovery 5:997〜1014頁(2006)に開示されているZTM000990、PKF118-310、PKF118-744、PKF115-584、PKF-222-815、CPG049090、PNU-74654、ICG-001、NSC668036及びその他などの化合物;LC-363(Avalon Pharmaceuticals、Germantown、Md.);Mollらの米国特許出願公開第2004/0,204,477号に開示されているN'-[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]-2-フェノキシベンゾヒドラジド、N'-[(E)-1-(5-メチル-2-チエニル)エチリデン]-2-フェノキシアセトヒドラジド、5-[2-(5-メチル-2-フリル)エチル]-2-(2-チエニル)-1H-インドール、2-(2-フリル)-5-[(E)-2-(5-メチル-2-フリル)エテニル]-1H-インドール、N-[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]-4-(4-ピリジニル)-8-キノリン-アミン、2-(2-フリル)-5-[2-(5-メチル-2-フリル)エチ
ル]-1H-インドール、7-{(2E)-2-[(5-メチル-2-フリル)メチレン]ヒドラジノ}-N-(2-フェニルエチル)-5,6-ジヒドロベンゾ[h]イソキノリン-9-カルボキサミド、1-{[(E)-(5-メチル-2-フリル)メチリデン]アミノ}-3-(4-ピリジニル)-2,4-(1H,3H)-キナゾリンジオン、N-(5-メチル-2-フリル)-N-(2'-フェノキシ[1,1'-ビフェニル]-3-イル)アミン、4-{[7-(5-メチル-2-フリル)-2-ナフチル]オキシ}ピリジン、N-(5-ブロモ-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)-4-ヒドロキシ-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、4-ヒドロキシ-N-(5-メチル-2-フリル)-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、3-[(E)-2-(5-ブロモ-1,3,4-チアジアゾール-2-イル)エテニル]-4-ヒドロキシ-6-フェニル-2H-ピラン-2-オン、N-(5-ブロモ-1,3,4チアジアゾール-2-イル)-4-ヒドロキシ-2-オキソ-6-フェニル-2H-ピラン-3-カルボキサミド、5-[(3-アミノ-1H-1,2,4-トリアゾール-5-イル)メチル]-3-[3-フルオロ-4-(4-モルホリニル)フェニル]-1,3-オキサゾリジン-2-オン、4-[(3-アミノ-1H-1,2,4-トリアゾール-5-イル)メチル]-1-[3-フルオロ-4-(4-モルホリニル)フェニル]-2-イミダゾリジノン、1-ベンズヒドリル-4-(5-ブロモ-2-フロイル)ピペラジン、1-ベンズヒドリル-4-[(5-メチル-2-チエニル)カルボニル]ピペラジン、ベンジル(2E)-2-[1-(4-メチル-2-チエニル)エチリデン]ヒドラジンカルボキシレート、2-(4-クロロフェニル)-6-メチル-5-(5-メチル-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)[1-,3]チアゾロ[3,2-b][1,2,4]トリアゾール、N-(5-メチル-3-イソオキサゾリル)-N'-[(5-フェニル-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル)カルボニル]尿素、N-[3-(2-{[(5-クロロ-2-チエニル)メチル]スルホニル}ヒドラジノ)-3-オキソプロピル]ベンゼンスルホンアミド-5-[3-(4-フェノキシフェニル)プロピル]-1,3,4-オキサジアゾール-2-オール、N-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-4-フェノキシベンズアミド、4-ヒドロキシ-N-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-2-オキソ-6-フェノキシ-2H-ピラン-3-カルボキサミド、2-フェノキシ-N'-[(Z)-フェニル(2-チエニル)メチリデン]ベンゾ-ヒドラジド、2-アニリノ-N'-[(Z)-2-フリル(フェニル)メチリデン]ベンゾヒドラジド、4-[(Z)-1-(3-メチル-5-イソオキサゾリル)-2-フェニルエテニル]フェニル2-(1-ピロリジニル)エチルエーテル、5-メチル-2-フルアルデヒド[(3Z)-2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]ヒドラゾン、(2Z)-N-[(5-メチル-2-フリル)メチル]-2-[2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]エタンアミド、(2Z)-N-[(3-メチル-5-イソオキサゾリル)メチル]-2-[2-オキソ-1-(4-ピリジニル)-1,2-ジヒドロ-3H-インドール-3-イリデン]エタンアミド、(2-クロロ-1,3-チアゾール-5-イル)メチル4-(4-モルホリニルスルホニル)フェニルエーテル、N-(4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-(4-フェノキシブチル)メタンスルホンアミド、N-(6-メトキシ-4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-[2-(1-メチル-3-フェニルプロポキシ)エチル]アセトアミド、4-{2-[(5-メチル-2-フリル)メトキシ]ベンジリデン}-1-(4-ピリジニルスルホニル)ピペリジン、4-{2-[(5-ブロモ-2-フリル)メトキシ]ベンジリデン}-1-イソニコチノイルピペリジン、N-(4,5-ジヒドロナフト[1,2-d][1,3]チアゾール-2-イル)-N-(4-フェニルペンチル)アセトアミド、N-(4,5-ジヒドロ-3H-ナフト[1,2-d]イミダゾール-2-イル)-N-[2-(2-フェニルエトキシ)エチル]メタンスルホンアミド、N'-[(Z)-(5-メチル-2-フリル)(2-ピリジニル)メチリデン]-2-フェノキシベンゾヒドラジド、及��薬学的に許容できるその塩などの化合物、全体として参照により本明細書に組み込む;ヒドロキシマタイレシノール(Mutanenの米国特許第6,271,257号、全体として参照により本明細書に組み込む);ヘキサクロロフェン[Parkら、「Hexachlorophene Inhibits Wnt/[beta]-Catenin Pathway by Promoting Siah-Mediated [beta]-Catenin Degradation」、Molecular Pharmacology Fast Forward (5月30日、2006)、全体として参照により本明細書に組み込む];並びにPPAR[gamma]アゴニスト(例えば、トログリタゾン)及びPPAR[gamma]不活性類似体(例えば、[delta]2TG及びSTG28)[Weiら、「Thiazolidinediones Modulate the Expression of [beta]-Catenin and Other Cell-Cycle Regulatory Proteins by Targeting the F-Box Proteins of Skp1-Cull-F-box Protein E3 Ubiquitin Ligase Independently of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor [gamma]」、Molecular Pharmacology Fast Forward (6月14日、2007)、全体として参照により本明細書に組み込む]がある。
【００５１】
典型的な小分子阻害剤には、植物化学物質シリビニン、オオアザミ抽出物(カルドマリアーノ)、EGCG(エピガロカテキン-3-ガラート)、白茶/緑茶、スルフォラファン、レスベラトロール、クルクミン、インドール-3-カルビノール、ウルソル酸、ドコサヘキサン酸、ゲニステイン、β-ラパコンがある。
【００５２】
典型的なタンパク質及びペプチド阻害剤には、chibby過剰発現[Schuiererら、「Reduced expression of beta-catenin inhibitor Chibby in colon carcinoma cell lines」、World J Gastroenterol 12(10):1529〜1535頁(2006)、全体として参照により本明細書に組み込む];アキシン過剰発現[Nakamuraら、「Axin, an inhibitor of the Wnt signalling pathway, interacts with beta-catenin, GSK-3beta and APC and reduces the beta-catenin level」、Genes Cells 3:395〜403頁(1998)、全体として参照により本明細書に組み込む];HDPR1過剰発現[Yaoら、「HDPR1, a novel inhibitor of the WNT/beta-catenin signaling, is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma: involvement of methylation-mediated gene silencing」、Oncogene 24:1607〜1614頁(2005)、全体として参照により本明細書に組み込む];ICAT過剰発現[Tagoら、「Inhibition of Wnt signaling by ICAT, a novel beta-catenin-interacting protein」、Genes Dev. 14:1741〜1749頁(2000);Genbankアクセッション番号BAB03458、そのそれぞれを全体として参照により本明細書に組み込む];及び全体として参照により本明細書に組み込むBlaschukらの米国特許第6,677,116号に開示されている型のLXXLL(配列番号19)ペプチドがあるがこれに限定されない。これらのタンパク質又はポリペプチド阻害剤は、直接投与する又は後述する遺伝子療法手法によってin vivoで発現させることができる。
【００５３】
典型的なアンチセンスベータ-カテニン構築物には、Greenら、「Beta-catenin Antisense Treatment Decreases Beta-catenin Expression and Tumor Growth Rate in Colon Carcinoma Xenografts」、J Surg. Res. 101(1):16〜20頁(2001);Veeramachaneni、「Down-regulation of Beta Catenin Inhibits the Growth of Esophageal Carcinoma Cells」、J. Thoracic Cardiovasc. Surg. 127(1):92〜98頁(2004);Bennettらの米国特許第6,066,500号に報告されるものがあり、そのそれぞれを全体として参照により本明細書に組み込む。
【００５４】
典型的なsiRNA構築物は、Vermaら、「Small Interfering RNAs Directed Against Beta-catenin Inhibit the in vitro and in vivo Growth of Colon Cancer Cells」、Clin. Cancer Res. 9(4):1291〜300頁(2003)(全体として参照により本明細書に組み込む)に記述されており;ベータ-カテニンに対する他のsiRNAは、Santa Cruz Biotechnology, Inc.から市販されている。
【００５５】
典型的なshRNA構築物は、Gadueら、「Wnt and TGF-[beta] Signaling are Required for the Induction of an in vitro Model of Primitive Streak Formation using Embryonic Stem Cells」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(45):16806〜16811頁(全体として参照により本明細書に組み込む)に記述されており;ベータ-カテニンに対する他のshRNAは、Super Array Bioscience Corporation、OriGene、及びOpen Biosystemsから市販されている。
【００５６】
RNAi薬剤は直接投与する又は遺伝子療法手法によって投与することができる。従って、これらのRNAi薬剤をコードしているDNA分子(発現ベクター)も、投与することができる。
【００５７】
遺伝子療法手法の場合、治療剤は、ポリペプチドであるか又はRNA分子であるかに関わらず、治療剤を発現するDNA分子の形態で患者に投与することができる。In vivoでは、DNA分子の投与後に、治療剤は発現され、患者に対するその効果を発揮して、脈管奇形により特徴づけられる病状を治療及び/又は予防することができる。
【００５８】
本発明の方法に使用する核酸薬剤(RNA及びDNAを含む)は、上記の通り遺伝子療法ベクター及び方法の使用によることを含めた当技術分野に公知の多くの方法で対象に送達することができる。核酸は、遺伝子療法に有用なベクター、例えば、対象の細胞へ移行させ、その中で治療的な核酸薬剤の発現をもたらすことができるベクター内に含有させることができる。そのようなベクターには、染色体ベクター(例えば、人工染色体)、非染色体ベクター、及び合成核酸がある。ベクターには、プラスミド、ウイルス、並びにレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ベクターなどのファージもある。
【００５９】
核酸薬剤は、ex vivo又はin vivo方法を使用して対象に移行させることができる。Ex vivo方法は、後に対象に移行させる又は投与される細胞へのin vitroでの核酸の移行(例えば、トランスフェクション、感染又は注射による)を含む。細胞は、例えば、対象から得られる細胞(例えば、リンパ球)又は同種の細胞であってもよい。例えば、細胞は、対象の特定の組織に直接移植する又は人工ポリマー基材内に封入した後に移植することができる。核酸は、in vivoで対象に送達することもできる。例えば、核酸は、有効な担体、例えば、in vivoで細胞に核酸を効果的に送達することができる任意の製剤又は組成物の中で投与することができる。ウイルスベクター内に含有されている核酸は、ウイルスを使用して感染又は形質導入によりin vivoで細胞に送達することができる。核酸及びベクターは、物理的手段、例えば、エレクトロポレーション、脂質、陽イオン性脂質、リポソーム、DNA銃、リン酸カルシウム沈殿、注射、又はネイキッド核酸の送達により細胞に送達することもできる。
【００６０】
上記の核酸の非感染性送達に代わるものとして、ネイキッドDNA若しくは感染性形質転換ベクターを使用して送達することができ、それによってネイキッドDNA又は感染性形質転換ベクターは、例えばベータ-カテニンのポリペプチド若しくは核酸阻害剤をコードする組換え遺伝子を含有する。次いで核酸分子は、形質転換細胞において発現される。
【００６１】
組換え遺伝子は、哺乳動物細胞において作動的に互いに結合している上流のプロモーター、任意選択で他の適切な調節因子(即ち、エンハンサー又は誘導因子)、治療用核酸(上述)又はポリペプチドをコードするコード配列、並びに下流の転写終結領域を含む。任意の適切な構成的プロモーター又は誘導可能なプロモーターを使用して組換え遺伝子の転写を調節することができ、当業者は、現在公知であるか今後開発されるかにかかわらずそのようなプロモーターを容易に選択し、利用することができる。プロモーターは、Tie-2プロモーター又はVE-カドヘリンプロモーターなど脈管内皮における発現に特異的であることもでき(Corada Mら、Nature Comm 4:2609頁、2013);Slco1c1など他の脳内皮特異的プロモーターを使用することもできる(D.A. Ridderら、J Exp Med 208 (13):2615頁、2011)。
【００６２】
組織特異的なプロモーターは、例えば、TetO応答因子を使用して誘導可能/抑制可能に作製することもできる。他の誘導可能な因子を使用することもできる。公知の組換え技術を利用して、組換え遺伝子を調製し、(使用する場合)発現ベクターにそれを移行させ、患者にベクター又はネイキッドDNAを投与することができる。典型的な手順は、Sambrookら、1-3 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (第2版1989)に記述されており、全体として参照により本明細書に組み込む。当業者は、そこに記述される手順の公知の変形を使用して、所望する通りに、これらの手順を容易に修飾することができる。
【００６３】
任意の適切なウイルス又は感染性トランスフォーメーションベクターを使用することができる。典型的なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレトロウイルスベクター(レンチウイルスベクターを含む)があるが、これに限定されない。
【００６４】
治療剤は、薬学的に許容できる担体及びベータ-カテニンに作用する、ベータ-カテニン分解を促進することにより直接的に、ベータ-カテニンとの結合について他の薬剤と競合する、又はベータ-カテニンの発現と干渉することにより間接的にベータ-カテニン活性を阻害する1つ以上の活性薬剤を含む医薬組成物の形態で患者に投与されることが好ましい。
【００６５】
好ましくは本発明の医薬組成物は、本明細書に記述される型の脈管奇形により特徴づけられる病状を治療及び/又は予防するのに有効な量の治療剤を含有する単一の単位剤形の形態である。医薬組成物は、適切な賦形剤又は安定剤を含むこともでき、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤若しくは乳剤など固体又は液体形態であってもよい。一般に、組成物は、担体と一緒に約0.01〜99パーセント、好ましくは約5〜95パーセントの活性化合物を含有することになる。治療剤は、適切な担体並びに任意の賦形剤若しくは安定剤と混合した場合、単独で若しくは組成物の形態で投与するかどうかにかかわらず、経口的、非経口的、皮下、経皮的、静脈内、筋肉内、腹膜内、鼻腔内注入により、埋め込みにより、腔内若しくは膀胱内注入により、眼内、動脈内、病変内、粘膜、例えば鼻、咽頭及び気管支への塗布(即ち、吸入)により、又は脳内投与により投与することができる。
【００６６】
殆どの治療目的の場合、治療用物質は、固体又は液体形態の液剤若しくは懸濁剤として経口的に、液体形態の液剤若しくは懸濁剤として注射によって、或は霧状にした液剤若しくは懸濁剤の吸入によって投与することができる。
【００６７】
治療剤を含有する固体単位剤形は、従来通りの型であり得る。固体剤形は、治療剤並びに担体、例えば潤滑剤、及びラクトース、スクロース又はコーンスターチなどの不活性充填剤を含有する通常のゼラチン型などのカプセル剤であってもよい。別の実施形態において、治療剤は、ラクトース、スクロース又はコーンスターチなど従来通りの錠剤基剤を、アカシア若しくはゼラチン様結合剤、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉若しくはアルギン酸などの崩壊剤、及びステアリン酸若しくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と組み合わせて錠剤にされる。
【００６８】
注射可能な調剤の場合、治療剤の液剤又は懸濁剤は、担体として生理的且つ薬学的に許容できる希釈液中に調製することができる。そのような担体には、界面活性剤及びアジュバント、賦形剤若しくは安定剤を含めた薬学的且つ生理的に許容できる他の構成要素が添加されている又はされていない水並びに油など無菌の液体がある。例示的な油は、石油、動物、植物若しくは合成起源のものであり、例えば、落花生油、大豆油又は鉱油である。一般に、特に注射可能な液剤の場合、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連した糖液、並びにプロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールが好ましい液状担体である。
【００６９】
エアゾールとしての使用の場合、液剤又は懸濁剤中の治療剤は、従来通りのアジュバントを含む適切な推進剤、例えばプロパン、ブタン若しくはイソブタンのような炭化水素推進剤、と一緒に加圧エアゾール容器に詰めることができる。治療剤は、ネブライザー又はアトマイザなど、非加圧形態で投与することもできる。
【００７０】
患者に治療剤を直ちに送達することを目的とする上記の製剤に加えて、徐放性製剤も考えられる。好ましくは、徐放性製剤は、治療剤が捕捉されている基材を含む植込み型装置である。薬剤の放出は、材料の選択及び媒体に入れる薬物の量によって制御することができる。Ishikawaらの米国特許第6,464,687号、Guillenの米国特許第6,074,673号など多数の適切な植込み型送達系が、当技術分野に公知であり、そのそれぞれを全体として参照により本明細書に組み込む。
【００７１】
植込み型、徐放性薬物送達系は、薬剤を徐放性送達用として装入することができる任意の適切な生体適合性基材を使用して製剤化することができる。これらには、ミクロスフィア、ヒドロゲル、ポリマー容器、コレステロール基材、ポリマー系及び非ポリマー系などがあるがこれに限定されない。典型的なポリマー基材には、ポリ(エチレン-酢酸ビニル共重合体)、ポリ-L-ラクチド、ポリ-D-ラクチド、ポリグリコール酸、ポリ(ラクチド-グリコリド共重合体)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン、タンパク質性ポリマー、ポリエーテル、シリコーン、及びその組合せがあるがこれに限定されないない。
【００７２】
別法として、DNAをベースとした治療剤の場合、治療剤を送達するのに適切な媒体の1つには、DNAの添加物として陽イオン性脂質、陽イオン性ポリマー又はデンドリマーと複合体形成した可溶性コレステロールがある。好ましくは、コレステロールはシクロデキストリン、好ましくはメチル-(ベータ)-シクロデキストリンを使用して可溶化される。この型の製剤については、Esuvaranathanらの米国特許出願公開第20020146830号に記述されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００７３】
Wnt/β-カテニンシグナル伝達の阻害剤を1つ以上の他の治療剤と組み合わせた使用も考えられる。例えば、脈管奇形により特徴づけられる病状の治療の場合、上で同定したWnt/β-カテニンシグナル伝達の阻害剤の1つによる治療は、脈管奇形により特徴づけられる病状の公知の別の治療と組み合わせられ、その別の治療は酸化防止剤、TGF-βシグナル伝達経路阻害剤、BMPシグナル伝達経路阻害剤、VEGFシグナル伝達経路阻害剤、Yapシグナル伝達経路阻害剤、スタチン(例えばHwangら、2013、Int J. Oncol 43、261〜270頁を参照のこと)、及びRhoA GTPaseレベル及び/又は活性の他の阻害剤並びにその組合せを含むがこれに限定されない。
【００７４】
従って、本発明は、2つ以上の活性薬剤を含む製剤及び治療体系にも関し、その1つはベータ-カテニンの阻害剤である。本発明の好ましい阻害剤は、以下に更に記載され:スリンダク、別名(Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-[4-(メチルスルフィニル)ベンジリデン]インデン-3-酢酸又は2-[(3Z)-6-フルオロ-2-メチル-3-[(4-メチルスルフィニルフェニル)メチレン]インデン-1-イル]酢酸;スリンダクスルフィド、別名(Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-[4-(メチルチオ)ベンジリデン]インデン-3-酢酸又は2-[(3Z)-6-フルオロ-2-メチル-3-[(4-メチルスルファニルフェニル)メチレン]インデン-1-イル]酢酸;スルホン化スリンダク、別名(Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-[4-(メチルスルホニル)ベンジリデン]インデン-3-酢酸又は2-[(3Z)-6-フルオロ-2-メチル-3-[(4-メチルスルホニルフェニル)メチレン]インデン-1-イル]酢酸;リン酸-スリンダク、別名4-ジエトキシホスホリルオキシブチル-(Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-[4-(メチルスルフィニル)ベンジリデン]インデン-3-アセテート又は4-ジエトキシホスホリルオキシブチル2-[(3Z)-6-フルオロ-2-メチル-3-[(4-メチルスルフィニルフェニル)メチレン]インデン-1-イル]アセテート;リン酸-スリンダクスルフィド、別名2-[(3Z)-6-フルオロ-2-メチル-3-[(4-メチルスルファニルフェニル)メチレン]インデン-1-イル]アセテート:リン酸-スルホン化スリンダク、4-ジエトキシホスホリルオキシブチル2-[(3Z)-6-フルオロ-2-メチル-3-[(4-メチルスルホニルフェニル)メチレン]インデン-1-イル]アセテートとして公知である;シリビニン、別名2,3-ジヒドロ-3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-2-(ヒドロキシメチル)-6-(3,5,7-トリヒドロキシ-4-オキソベンゾピラン-2-イル)ベンゾジオキシン;クルクミン、別名(E,E)-1,7-ビス(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン;レスベラトロール、別名3,4',5-トリヒドロキシ-トランス-スチルベン;サリノマイシン、及び医薬として許容されるその塩及びその類似体から選択される。類似体とは、構造が類似しているが、元素組成に関して異なる化合物である。毒性を減少させながら活性を向上させる可能性がある化学修飾(例えば、リン酸化57又はベンジルアミド誘導体化、Whittら、2012、Cancer Prev. Res. 5、822〜833頁)を同定するために、類似体、特にスリンダク代謝産物を産生するための構造研究が非常に活発である。
【００７５】
「薬学的に許容できる塩」は、有機又は無機塩基での塩化により得られる従来通りの非毒性塩を含む。無機塩は、例えば、金属塩、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及び遷移金属塩(ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウムなど)である。塩は、アンモニア又は2級若しくは3級アミン(ジエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリンなど)などの塩基、或は塩基性アミノ酸、又はオサミン(メグルミンなど)、又はアミノアルコール(3-アミノブタノール及び2-アミノエタノールなど)により得ることもできる。
【００７６】
加えて、本発明の化合物は、非溶媒和で及び水、エタノール等など薬学的に許容できる溶媒と溶媒和された形態で存在することができる。
【００７７】
本発明は、脈管奇形により特徴づけられる病状、特に脳幹部海綿状血管腫(CCM)の治療に使用する、スリンダク、スリンダクスルフィド、スルホン化スリンダク、リン酸-スリンダク、リン酸-スリンダクスルフィド、リン酸-スルホン化スリンダク、シリビニン、クルクミン、レスベラトロール及びサリノマイシンから選択される1つ以上の活性成分を薬学的に許容できる担体、賦形剤並びに希釈液と共に含有することにより特徴づけられる医薬組成物も含む。
【００７８】
この発明の化合物は、認められている任意の投与様式又は類似の有用性を供与する薬剤によって投与することができる。従って、投与は、例えば、経口、経鼻、非経口(静脈内、皮下、筋肉内)、口腔、舌下、直腸、局所、経皮、膀胱内又は他の任意の投与経路を使用できる。
【００７９】
化合物は、公知の方法に従って薬学的に製剤化することができる。医薬組成物は、治療要件に基づいて選ぶことができる。そのような組成物は、調合により調製され、経口又は非経口投与に最適に適合され、従って錠剤、カプセル剤、経口合剤、散剤、粒剤、丸剤、注射可能な若しくは点滴可能な溶剤、懸濁剤若しくは坐剤の形態で投与することができる。
【００８０】
経口投与用の錠剤及びカプセル剤は、単位服用量の形態で通常存在し、結合剤、充填材、希釈剤、錠化剤、潤滑剤、界面活性剤、崩壊剤、着色剤、賦香剤及び湿潤剤など従来通りの賦形剤を含有する。錠剤は、当技術分野において周知の方法を使用して被覆することができる。
【００８１】
適切な充填材には、セルロース、マンニトール、ラクトース及び他の類似の薬剤がある。適切な崩壊剤には、ポリビニルピロリドン及びグリコール酸ナトリウム澱粉など澱粉誘導体がある。適切な潤滑剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウムがある。適切な湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムがある。
【００８２】
経口固形組成物は、調合、充填又は錠剤化の従来通りの方法により調製することができる。調合操作を繰り返して、大量の充填材を含有する組成物の全体に活性成分を分布させることができる。そのような操作は従来通りである。
【００８３】
経口液体合剤は、例えば、水性若しくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤又はエリキシルの形態であってもよく、或は使用前に水又は適切な媒体で再構成する乾燥産物として存在することができる。そのような液体合剤は、懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は水素化食用脂;レシチン、ソルビタンモノオレエート又はアカシアなどの乳化剤;アーモンド油、椰子油、グリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコールのエステルなどの油性エステルなど非水媒体(食用油を含み得る);メチル若しくはプロピルp-オキシ安息香酸又はソルビン酸などの防腐剤、及び必要に応じて従来通りの賦香剤又は着色剤など従来通りの添加物を含有することができる。経口処方には、腸溶性に被覆された錠剤又は粒剤など従来通りの徐放性処方もある。
【００８４】
非経口投与(例えばボーラス注射又は持続注入)の場合、化合物及び無菌媒体を含有する液性単位剤形(例えばアンプル又は多回投与用容器中)を調製することができる。化合物は、媒体及び濃度に応じて懸濁又は溶解することができる。非経口液は、媒体に化合物を溶解し、濾過滅菌し、適切なバイアルに充填し、密封することにより通常調製される。都合よく、局部麻酔薬、防腐剤及び緩衝剤などのアジュバントを、媒体に溶解させることもできる。安定性を増加させるために、組成物を、バイアルに充填した後に凍結させ、真空下で水を除去することができる。非経口懸濁剤は、化合物が溶解される代わりに媒体に懸濁され、滅菌媒体に懸濁する前にエチレンオキシドに曝露することにより無菌化され得ることを除いて、実質的に同じ様式で調製される。都合よく、組成物に界面活性剤又は湿潤剤を含めて、本発明の化合物の均一な分布を容易にすることができる。
【００８５】
口腔又は舌下の投与場合、組成物は錠剤、ロゼンジ、パステル若しくはゲルであってもよい。
【００８６】
化合物は、直腸投与ために、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール若しくは他のグリセリドなど従来通りの坐剤基剤を含有する坐剤又は停留浣腸として薬学的に製剤化することができる。
【００８７】
本発明の化合物を投与する別の手段は、局所治療に関する。局所処方は、例えば軟膏、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、ペースト剤を含有することができ並びに/又はリポソーム、ミセル及び/若しくはミクロスフィアを含有することができる。軟膏の例には、植物油、動物性脂肪、半固体炭化水素などの油性軟膏、ヒドロキシステアリンサルフェート(hydroxystearin sulfate)、脱水ラノリン、親水性ワセリン、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、ステアリン酸などの乳化可能な軟膏、様々な分子量のポリエチレングリコールを含有する水溶性軟膏がある。処方の専門家に公知であるように、クリーム剤は粘稠液又は半固体の乳剤であり、油相、乳化剤及び水相を含有する。油相は、ワセリン及びセチル又はステアリン酸アルコールなどのアルコールを一般に含有する。クリーム剤処方中の乳化剤は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は両性界面活性剤から選ばれる。アルコール又はグリセリンなどの分散剤を、ゲル剤調製のために添加することができる。ゲル化剤は、細かく刻む及び/又は混合することにより分散させることができる。
【００８８】
本発明の化合物を投与する更なる方法は、経皮的送達に関する。典型的な経皮処方は、クリーム剤、油剤、ローション剤若しくはペースト剤など従来通りの水性及び非水ベクターを含み、又は膜若しくは医薬用パッチの形態であってもよい。
【００８９】
処方ための参照文献は、Remington (「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」, Lippincott Williams & Wilkins, 2000)による本である。
【００９０】
例えば、CCM病変にあるようなEndMTマーカー(Klf4、Klf2、Ly6a、S100a4、CD44、Id1、a-Sma、Slug、PAI1、N-カドヘリン、Zeb2など、他のマーカーは、Fadiniら、2012:Margaritiら、2012; Liら、2012; Liangら、2011; Steinら、2006; Mediciら、2012に示されている)を発現する病的内皮細胞を標的化するように操作された合成ナノ粒子による投与も、本発明に含まれる(Davisら、2010、Nature 464, 1067〜1071頁; Dashiら、2012 Adv Mater.、24、3864〜3869頁)。小分子、タンパク質、ペプチド、アンチセンス核酸は、そのようなナノ粒子に封入することができる。
【００９１】
上述の使用並びに方法は、スリンダク、スリンダクスルフィド、スルホン化スリンダク、リン酸-スリンダク、リン酸-スリンダクスルフィド、リン酸-スルホン化スリンダク、シリビニン、クルクミン(例えばChengら、2013、Int J. of Oncology 43、895〜902頁を参照のこと)、レスベラトロール及びサリノマイシンから選択される化合物の投与に関して追加の治療剤の同時又は遅延させた共投与の可能性も含む。
【００９２】
これまで言及した使用及び方法において、スリンダク、スリンダクスルフィド、スルホン化スリンダク、リン酸-スリンダク、リン酸-スリンダクスルフィド、リン酸-スルホン化スリンダク、シリビニン、クルクミン、レスベラトロール並びにサリノマイシンから選択される化合物の調剤は、患者の型及び症状、疾患重症度の程度、投与の様式及び時間、食事及び薬物の組合せを含めた様々な要因に応じて変化し得る。指標として、0.001〜1000mg/kg/日の用量範囲で投与できる。特定の患者に対する至適用量の決定は、当業者に周知である。好ましい用量範囲は、1〜10mg/kg/日、最も好ましい範囲は、10〜100mg/kg/日である。なお好ましい用量範囲は、100〜200mg/kg/日である。更に好ましい用量範囲は、200〜500mg/kg/日である。なお好ましい用量範囲は、500〜1000mg/kg/日である。好ましくは、本発明の阻害剤は、経口投与される。
【００９３】
慣行として、組成物には、問題の治療に使用する書面又は印刷された説明書が通常添付される。
【００９４】
本発明は、以下の図を参照する非限定的な例により例示されることになる:
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】CCM3-ECKO(CCM3の内皮細胞特異的ホモ接合欠失)マウスの脳及び網膜血管の内皮細胞は、b-カテニン転写活性の向上を示す。a〜c. Pecam-陽性(内皮)細胞におけるb-カテニン転写活性の遺伝子レポータであるb-galに対する野生型(WT)並びにCCM3-ECKOマウス(CCM3遺伝子の内皮特異的不活性化を持つマウス)由来脳切片(a、b)及び網膜(c、フラットマウント)(a、c、XY軸; b、X軸に沿ったZ投影)の代表的な免疫染色を示す図である。核は、DAPIで染色した。矢印、b-gal陰性の核;矢じり、b-gal陽性の核。内皮細胞核を、63x倍率で、50個のランダムな視野で計数した。内皮細胞のPecam標識を使用するランダムな視野の計数による定量化(方法を参照のこと)は、CCM3- ECKO脳内皮細胞において野生型BAT-galマウス由来の対照脳内皮細胞のb-gal陽性の核(視野当たり0.86±0.15個の陽性の核;陽性の核は全内皮核600個のうち7.2%であった)が、6倍(視野当たり6.0±1.7個の陽性の核;陽性の核は全内皮核700個のうち42.9%であった)にまで有意に増加したことを示した(p < 0.05; t検定)。これらのCCM3-ECKO脳内皮細胞において、b-gal陽性の核は、樹立空洞及び毛細管拡張症の両方に同様に分布した。b-Gal陽性の核は、CCM3- ECKOマウス由来脳及び網膜内皮細胞の両方において対照細胞より多かった。網膜(c)について、中央領域の2つの静脈を示す。a〜cのサンプルは、dpn 9の同腹子の子由来である。スケールバー、20mm。
【図２】培養CCM3-ノックアウト内皮細胞は、活性b-カテニンの細胞-細胞接合部からの非局在化及び核への濃縮を示し、ここでb-カテニンは転写的に活性である。a、b.活性b-カテニンに対する野生型(WT)及びCCM3-ノックアウト(KO)内皮細胞の代表的な免疫染色を示す図である。初代培養(a)及び細胞系(b)。核は、DAPIで染色した。矢じり、b-カテニン陽性の核。これらのCCM3-ノックアウト内皮細胞においてCCM3転写産物は70%〜90%減少し(初代培養)、rtPCRで検出できなかった(系)。スケールバー、20mm。c.野生型(WT)並びにCCM3-ノックアウト(KO)内皮の細胞系の膜(M)、細胞質(C)及び核(N)画分の代表的な細胞分画及びウェスタンブロッティングを示す図である。全体、膜及び核の活性b-カテニンは、それぞれ、34%〜42%低下、58%〜75%低下、51%〜66%増加し;活性b-カテニンは、WT内皮細胞に対してCCM3-ノックアウトの細胞質において殆ど検出できなかった。野生型において、CCM3は細胞質に濃縮され; CCM3ノックアウトにおいて、CCM3はウェスタンブロッティングによって検出されなかった。d、e.野生型(WT)及びCCM3-ノックアウト(KO)内皮細胞系における、典型的なb-カテニン転写標的(d)並びにドミナントネガティブTcf4の発現無し(-)及び有り(+)での内皮前駆表現型/EndMTマーカー(e)の定量化を示す図である。データは、独立した3回の実験の3回繰り返したrtPCRアッセイの平均(±SD)である。CCM3ノックアウトの標的でないチューブリン転写産物a及びbは、ドミナントネガティブTcf4により修正されなかった(未発表の結果)。対照(WT)に対するCCM3ノックアウトについて**、p <0.01。CCM3ノックアウト+GFP(-)に対するCCM3ノックアウト+ドミナントネガティブTcf4(+)について^、p <0.05; ^^、p <0.01(t検定)。
【図３】CCM3-ノックアウト内皮細胞は、b-カテニン標的遺伝子の転写のスリンダクスルフィド阻害及び核から付着接合部への活性b-カテニンの再局在化の誘導を示す。a.  初代培養の野生型(WT)及びCCM3-ノックアウト(KO)脳内皮細胞における、rtPCRによるb-カテニン標的遺伝子Klf4、Ly6a、S100a4及びId1の転写のスリンダクスルフィド阻害の定量化(bを参照のこと)を示す図である。基本条件下でのWTに対するCCM3-ノックアウトの比較について*、p < 0.05; **、p < 0.01(t検定)。媒体処理したCCM3ノックアウトに対するCCM3ノックアウト+スリンダクスルフィドの比較について^^、p < 0.01(t検定)。b. rtPCRにより(a)で試験した遺伝子の転写のドミナントネガティブTcf4阻害の定量化を示す図である。基本条件下でのWTに対するCCM3-ノックアウトの比較について*、p < 0.05; **、p < 0.01(t検定)。CCM3ノックアウト+GFP(-)に対するCCM3ノックアウト+ドミナントネガティブTcf4(+)スルフィドの比較について^、p < 0.05; ^^、p < 0.01(t検定)。c.  スリンダクスルフィド処理下の初代培養の脳内皮細胞の代表的な免疫染色を示す図である。これらCCM3-ノックアウト内皮細胞における核(DAPI染色における対応する矢じりを参照のこと)から細胞-細胞接合部への活性b-カテニンのスリンダクスルフィド媒介再分布(媒体処理したKOの矢じり)。活性b-カテニン及びVE-カドヘリンの共局在化が、KOにおけるスリンダクスルフィド処理後に観察される。スケールバー、15mm。下の2行:これらのCCM3-ノックアウト内皮細胞におけるKlf4及びS100a4の過剰発現のスリンダクスルフィド阻害(白色の核、矢じり)。全核はDAPI陽性であるか又は白線により輪郭が描かれる。これらのCCM3-ノックアウト内皮細胞においてKlf4は核だけにあり、S100a4は核と細胞質の両方にある。スケールバー、30mm。
【図４】CCM3-ECKOマウスの脳血管の内皮細胞は、b-カテニン転写活性のスリンダクスルフィド阻害及び拡散している分布から付着接合部へのVE-カドヘリンの再局在化の誘導を示す。CCM3-ECKOマウスのスリンダクスルフィド処理無し(媒体)及び有りでの脳切片の代表的な免疫染色。a. Pecam陽性(内皮)細胞におけるb-カテニン転写活性の遺伝子レポータである、核におけるb-gal反応性のスリンダクスルフィド媒介消滅(下段、矢じりに対する上段、矢印)を示す図である。各パネルは、XY軸(主な画像)、及びX軸に沿ったZ投影(下)を示す。核は、DAPIで染色した。スケールバー、25mm。b.  対応させた野生型(WT)マウス(右パネル、矢じり)と類似の分布に対する、これら血管CCM3-ECKO内皮細胞における拡散している分布から細胞-細胞接合部へのVE-カドヘリンのスリンダクスルフィド媒介再分布を示す図である(中央パネル、矢じり)。a及びbにおける切片は、dpn 9の同腹子の子由来である。スケールバー、30mm。
【図５】CCM3- ECKOマウスの脳血管の内皮細胞が、前駆細胞及びEndMTマーカーの過剰発現のスリンダクスルフィド阻害を示す図である。代表的な免疫染色は、これらの血管CCM3- ECKO内皮細胞(Pecam陽性;イソレクチンB4陽性)の核内に濃縮されたKlf4(上段、矢じり)、S100a4(中段、矢じり)、及びId1(下段、矢じり)を示す。対応させた野生型(WT)マウス(右パネル、矢印)と類似の分布に対して、スリンダクスルフィドは、Klf4、S100a4及びId1(矢印)に対するこの核反応性を強く減少させる。脳切片は、dpn 9の同腹子の子由来である。スケールバー、30mm。
【図６】CCM3-ECKOマウスにおける脳及び網膜血管は、病変のスリンダクスルフィド誘導減少を示す。a.  暗赤紫色(複数の空洞)、単一空洞及び毛細管拡張症(Telang.)である、CCM3-ECKOマウスのスリンダクスルフィド処理無し(媒体)及び有りでの脳切片の脈管病変の代表的な免疫染色を示す図である。病変は、以下の通りに分類される63。b.  上パネル:(a)に例示される脳病変の定量化(詳細については方法を参照のこと)。5つの独立した同産子由来同腹子(dpn 9の子):媒体処理(n=8)又はスリンダクスルフィド処理(n=7)。*、p < 0.005、ウィルコクソンの符号付き検定。下段のパネル:脳病変サイズの定量化(mm、方法を参照のこと)。*、p < 0.05、t検定。c. (媒体)により処理していないがスリンダクスルフィドにより処理している野生型(WT)及びCCM3-ECKOマウス(dpn 9の同腹子の子)の網膜血管のPecam(内皮細胞)に対する代表的な免疫染色を示す図である。多重内腔脈管病変(矢じり)は、静脈(矢印)から発達する。スリンダクスルフィド(下段右)は、奇形(矢じり)及び静脈直径(矢印)を減少させる(eも参照のこと)。d. (c)に例示される網膜脈管病変の定量化を、脈管病変に影響を受ける網膜周辺部のパーセンテージとして示す図である(媒体及びスリンダクスルフィド両方についてn=14、方法を参照のこと)。*、p < 0.05、t検定。e. (c)に例示した網膜脈管病変の代表的な免疫染色を示す図である。周辺の脈管奇形と同様に、スリンダクスルフィドは、静脈直径の減少を誘導した(詳細については本文を参照のこと)。これらCCM3-ECKOマウスの動脈は、この異常な表現型(内皮細胞イソレクチンB4標識)を示さない。スケールバー、100mm(a); 700mm(c); 60mm(e)。
【図７】CCM3-ECKOマウスにおける脳内皮細胞は、TGF-β/BMPシグナル伝達の活性化より早いβ-カテニン転写活性の向上を示す。a. CCM3組換え(1dpn)後の早い(3dpn)及び遅い(9dpn)時点での内皮細胞(ポドカリキシン陽性、緑色)における、β-カテニン転写活性の遺伝子レポータであるβ-gal(赤色、上パネル)及びTGF-β/BMPシグナル伝達の活性化のマーカーであるp-Smad1(赤色、下パネル)に対する、野生型(WT)並びにCCM3-ECKOマウス由来脳切片の代表的な免疫染色を示す図である。DAPI染色された核は青色である。b.  β-gal(赤色)、p-Smad1(緑色)及びポドカリキシン(青色)に対する共染色を示す図である。(a)及び(b)において、3dpnの子における脈管奇形(aにおいて空洞及びbにおいて毛細管拡張症)の内皮細胞において、矢印、β-gal陽性及びp-Smad1陽性の核;中抜き矢印、p-Smad1陰性の核。差し込み図、囲んだ領域の拡大図。スケールバー、50μm; a)  の差し込み図において10μm。c. 3及び9dpnでのWT並びにCCM3-ECKOの子の脳切片におけるβ-gal陽性及びp-Smad1陽性内皮細胞の定量化を示す図である。少なくとも450個の核の総数を、3つの独立した実験において対応させた同腹子の子由来サンプルの各条件について63×倍率で、40個のランダムな視野で計数した。指示した対照に対して*、p < 0.01(t検定)。
【図８】TGF-β/BMPシグナル伝達はより大きな病変においてのみ検出可能だが、CCM3-ECKOマウスにおける脳内皮細胞は、任意のサイズの病変及び疑似正常血管におけるβ-カテニン媒介転写の向上を示す。a. 9dpnの野生型(WT)並びにCCM3-ECKOマウス由来脳切片の内皮細胞(ポドカリキシン陽性、緑色)におけるβ-gal(赤色、上パネル)及びp-Smad1(ホスホSer463/465)(赤色、下パネル)に対する代表的な免疫染色を示す図である。核は、DAPIで染色した(青色)。疑似正常な血管及びサイズが増加した脈管病変が、CCM3- ECKOに示される。矢印、p-Smad1陽性又はβ-gal陽性の核;中抜き矢印、p-Smad1陰性の核。スケールバー、50μm。類似の結果が、p-Smad3抗体を使用して得られた(未発表の結果)b.及びc.  各条件で計数した少なくとも250個の内皮核の総数に対するβ-gal陽性又はp-Smad1陽性内皮核のパーセンテージを示す図である。対応させた同腹子CCM3-ECKO(5匹)及びWT(5匹)のマウス由来脳切片において、β-gal陽性及びp-Smad1陽性並びに内皮細胞核を63×の拡大で、20個のランダムな視野で計数した。*、p < 0.05、t検定。
【図９−１】(図９a)CCM3-ECKOマウスにおける脳内皮細胞は、β-カテニン転写活性の向上に関連して幹細胞/EndMTマーカーを発現する。1dpnでのCCM3組換え後の3dpn(出生後日数)並びに9dpnにおける、ポドカリキシン(青色、内皮細胞を同定するため)及び異なる幹細胞/EndMTマーカー(Klf4、緑色)と組み合わせたβ-gal(赤色)に対する野生型(WT)並びにCCM3-ECKOマウス由来脳切片の代表的な免疫染色を示す図である。矢印は、β-gal及び幹細胞/EndMTマーカー両方を発現している内皮核(ポドカリキシン陽性細胞)を指し示す(合成、各パネルにおける右列、黄色を参照のこと)。スケールバー、40μm。(図９ｂ)CCM3-ECKOマウスにおける脳内皮細胞は、β-カテニン転写活性の向上に関連して幹細胞/EndMTマーカーを発現する。1dpnでのCCM3組換え後の3dpn(出生後日数)並びに9dpnにおける、ポドカリキシン(青色、内皮細胞を同定するため)及び異なる幹細胞/EndMTマーカー(Ly6a、緑色)と組み合わせたβ-gal(赤色)に対する野生型(WT)並びにCCM3-ECKOマウス由来脳切片の代表的な免疫染色を示す図である。矢印は、β-gal及び幹細胞/EndMTマーカー両方を発現している内皮核(ポドカリキシン陽性細胞)を指し示す(合成、各パネルにおける右列、黄色を参照のこと)。スケールバー、40μm。(図９ｃ)CCM3-ECKOマウスにおける脳内皮細胞は、β-カテニン転写活性の向上に関連して幹細胞/EndMTマーカーを発現する。1dpnでのCCM3組換え後の3dpn(出生後日数)並びに9dpnにおける、ポドカリキシン(青色、内皮細胞を同定するため)及び異なる幹細胞/EndMTマーカー(S100a4、緑色)と組み合わせたβ-gal(赤色)に対する野生型(WT)並びにCCM3-ECKOマウス由来脳切片の代表的な免疫染色を示す図である。矢印は、β-gal及び幹細胞/EndMTマーカー両方を発現している内皮核(ポドカリキシン陽性細胞)を指し示す(合成、各パネルにおける右列、黄色を参照のこと)。スケールバー、40μm。(図９ｄ)CCM3-ECKOマウスにおける脳内皮細胞は、β-カテニン転写活性の向上に関連して幹細胞/EndMTマーカーを発現する。1dpnでのCCM3組換え後の3dpn(出生後日数)並びに9dpnにおける、ポドカリキシン(青色、内皮細胞を同定するため)及び異なる幹細胞/EndMTマーカー(Id1、緑色)と組み合わせたβ-gal(赤色)に対する野生型(WT)並びにCCM3-ECKOマウス由来脳切片の代表的な免疫染色を示す図である。矢印は、β-gal及び幹細胞/EndMTマーカー両方を発現している内皮核(ポドカリキシン陽性細胞)を指し示す(合成、各パネルにおける右列、黄色を参照のこと)。スケールバー、40μm。
【図９−２】(図９ｅ)3及び9dpnでのWT及びCCM3-ECKO子の脳切片における内皮核陽性β-gal、Klf4、S100a4及びId1(単一の陽性)、並びにそれらの共局在化の定量化を示す図である。各幹細胞/EndMTマーカーとβ-galとの共局在化に関して、本発明者らは内皮細胞の2つの集団である:本発明者らがEndMT陽性の核の数を計数したβ-gal陽性集団及び本発明者らがβ-gal陽性の核の数を計数したEndMT陽性集団を区別した。この分析は、Klf4、S100a4及びId1の発現が、3dpnの子においてβ-カテニン転写活性と高度に関連づけられ、一方で9dpnの子では部分的に分離することを示す。少なくとも600個の核の総数を、3つの独立した実験において対応させた同腹子の子由来サンプルの各条件について63×倍率で、50個のランダムな視野で計数した。それぞれのWT値に対して*、p < 0.05(t検定); 3dpn CCM3-ECKOの子の値に対して^、p < 0.05。
【図１０】培養CCM欠損内皮細胞におけるEnd-MTマーカー及びβ-カテニン標的遺伝子の誘導。培養内皮におけるCCM1又はCCM2又はCCM3いずれかの欠失が、それぞれのWTと比較したaxin2の転写の向上によって示される通り、b-カテニン駆動転写の活性化を誘導することを示す図である。EndMtマーカー(Klf4、Cd44及びS100a4)も上方制御される。図はrtPCRを報告する。
【図１１】核β-カテニンは、CCM1-KO内皮細胞において転写的に活性であり、EndMTマーカーの転写を活性化する。a.  活性β-カテニン(残基37/41において脱リン酸化されている)が、培養CCM1- KO内皮細胞の核に濃縮し(矢印)、一方で野生型内皮細胞においては核に存在せず、細胞-細胞接触に局在することを示す図である。b.  核β-カテニンが、Top-fopフラッシュアッセイにおいてWTに対する転写応答の向上により示される通り、CCM1-KO内皮細胞において転写的に有効であることを示す図である。c.  β-カテニンが、エキシスリンド阻害によって示されるように、CCM1-KO内皮細胞におけるEndMTマーカーの発現に関与することを示す図である。それぞれの溶媒処理値に対して*、p < 0.05(t検定)。
【図１２−１】（図１２ａ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。無刺激のCCM3-ノックアウト(KO)内皮細胞におけるAxin2及びS100a4両方の転写のβ-カテニンに駆動される活性化が、ポーキュパイン阻害剤IWP2によって阻害されなかったことを示す図である。（図１２ｂ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。無刺激のCCM3-ノックアウト(KO)内皮細胞におけるAxin2及びS100a4両方の転写のβ-カテニンに駆動される活性化が、ポーキュパイン阻害剤IWP12によって阻害されなかったことを示す図である。（図１２ｃ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。野生型並びにCCM3-ノックアウト両方の内皮細胞系におけるAxin2及びS100a4両方の転写のβ-カテニンに駆動される活性化が、Lrp競合剤Dkk1(0.5μM)によっても阻害されなかったことを示す図である。（図１２ｄ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。野生型並びにCCM3-ノックアウト両方の内皮細胞系においてLrp競合剤Dkk1(0.5μM)が、Axin2のWnt3a誘導刺激を効果的に阻害したことを示す図である。S100a4の転写は、野生型細胞においてもWnt3aにより誘導されず、CCM3-ノックアウト細胞においてもDkk1により阻害されなかった。
【図１２−２】（図１２ｅ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。Wnt補助受容体Lrp6が、野生型内皮細胞と比較してCCM3-ノックアウトにおいて基本条件及びWnt3a刺激後の両方で活性化(リン酸化)が少ないことを示す図である。（図１２ｆ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。定量化した3回の独立した実験のウェスタンブロットの代表例を示す図である。WTに対して*、p < 0.05(t検定)。（図１２ｇ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。野生型内皮細胞においてWnt3aによる急性刺激(48時間)が、幹細胞/EndMTマーカーの発現を誘導できないことを示す図である。WTに対して*、p < 0.05(t検定)。（図１２ｈ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。野生型内皮細胞においてWnt受容体を迂回する、β-カテニンの構成的活性形態Lef-ΔβCTA(Vleminckxら、1999)による持続的刺激(7日)が、幹細胞/EndMTマーカーの発現を誘導することを示す図である。WTに対して*、p < 0.05(t検定)。（図１２ｉ）CCM3-ノックアウト内皮細胞は、β-カテニンシグナル伝達の細胞自律性、Wnt受容体から独立した活性化を示す。野生型内皮細胞において典型的なβ-カテニン標的遺伝子(Axin2、Ccnd1、Nkd1)及び幹細胞/EndMTマーカー(S100a4、Id1)の活性化が、siRNAによるVE-カドヘリンサイレンシングに対して早い反応である(48時間)ことを示す図である。siRNAによるCCM3のノックダウンに対する類似の急性応答については、図17を参照のこと。陰性対照siRNA処理細胞に対して*、p < 0.05(t検定)。
【図１３】内皮細胞においてVE-カドヘリンサイレンシング後の接合部の解体は、活性β-カテニンの核蓄積を誘導する。しかしながら、Smad1リン酸化は、向上しない。a.野生型内皮細胞系におけるsiRNAによるVE-カドヘリン急性下方制御後(48時間)の活性β-カテニン(赤色)及びVE-カドヘリン(緑色)の代表的な免疫染色を示す図である。接合部の解体及びVE-カドヘリン下方制御(矢印)は、活性β-カテニンの核蓄積を伴う(矢じり、核を示しているDAPIは、青色である)。対照(Ctr siRNA)は、陰性(無標的)siRNAで処理した。スケールバー、30μm。b.同じ細胞におけるVE-カドヘリンノックダウンが、ウェスタンブロットで測定されるSmad1のリン酸化を刺激しなかったことを示す図である。
【図１４】CCM1、2及び3欠失の共通の特徴は、接合部の解体である。脈管海綿腫(LESION)の内側を覆う内皮細胞が、無秩序な付着接合部を示す図である(VE-カドヘリン染色、赤色)。CCM1-ECKO、CCM2-ECKO及びCCM3-ECKOの子(7dpn及び1dpnにおいてCCM遺伝子除去)の脳切片を示す。比較して、野生型(WT)同腹子の脳内皮細胞において、VE-カドヘリンは細胞-細胞接触に一様に分布する。核は、DAPIにより青色である。CCM- ECKO脳由来切片における黄色の囲み領域を、下段パネルに拡大する。
【図１５】CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2マウスにおけるCre-組換え酵素の内皮選択的発現(Cre-組換え酵素のタモキシフェン誘導内皮細胞特異的発現及びCCM3遺伝子組換えに対する)の後に、このマウスモデルの脳及び網膜は、脈管病変の形成を示す。Cre組換え酵素が動脈においても活性な場合でも、これらの奇形は静脈血管から発症する。a. CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2マウスを、dpn1にタモキシフェン(方法に記載の通り、10mg/kg体重)で処理して、Cre組換え酵素の内皮細胞選択的発現及びfloxed/floxed CCM3遺伝子の組換えを誘導した(CCM3-ECKOマウス)図である。解剖後の肉眼で見える外見は、小脳及び網膜に明白な病変を示した(矢じり)。脳において、いくつかの表在性脈管奇形を観察することもできるが(小さい矢じり)、本文に示すように、殆どの病変は、切片化し、免疫染色した後でしか検出できない。これらの病変は、タモキシフェンによる処理の3〜4日後に現れ始め、サイズが徐々に増加した。タモキシフェン処理の10日後から、これらCCM3- ECKOマウスは、明白な小脳出血によって死に始めた。タモキシフェンは、Cre組換え酵素を発現しなかったCreERT2陰性のCCM3-floxed/floxed-Cdh5(PAC)マウス及びヘテロ接合性CCM3-floxed/+-Cdh5(PAC)-CreERT2マウスの両方においていかなる表現型も誘導しなかった。野生型(WT)マウスは、タモキシフェンによって処理したCCM3+/+-Cdh5(PAC)-CreERT2マウスであった。タモキシフェンを溶解するために使用した媒体で処理したCCM3-floxed/floxed-Cdh5(PAC)-CreERT2マウスも、WT表現型を示した。スケールバー、1cm。b. CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2マウスをRosa 26-強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)マウス(Srinivasら、2001)と交配して、EYFPの発現によりCre-組換え酵素の発現を監視した図である。CCM3+/+-Cdh5(PAC)-CreERT2-R26-EYFPマウス及びCCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2-R26-EYFP(CCM3-ECKO)マウス由来の網膜血管において、Cre誘導組換え(上記の通り、タモキシフェン処理による)は、レポータ遺伝子EYFPの発現により示される。これは、これらマウスモデルの両方の動脈(矢じり)、静脈(矢印)及び微小血管において頻繁に起こり、EYFP及びPecam(内皮細胞のマーカー)標識の広範な共局在化として見られた。CCM3転写産物は、CCM3- ECKOの子の新たに単離した脳微小血管においてrtPCRにより評価した通り、媒体処理した野生型マウスと比較して80%以上減少した。スケールバー、200mm。c. CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2(CCM3-ECKO)マウスの網膜において、奇形が脈管網の静脈側にだけ発症することを示す図である。奇形は網膜において形態学的に(bのように)及びエンドムチン陽性染色(矢印)によって区別できる。矢じりは動脈血管を示し、それはエンドムチン陰性及びイソレクチンB4陽性である。本発明者らは、CCM1(Maddalunoら、2013)及びCCM2(Bouldayら、2011)両方の内皮特異的除去後にも、類似の静脈特異的異常を観察した。スケールバー、700mm。b及びcにdpn9同腹子マウスの子由来網膜を示す。
【図１６】CCM3-ノックアウト内皮の細胞系は、b-カテニン標的遺伝子及び前駆細胞/EndMTマーカーの転写のスリンダクスルフィド阻害(a)、核への活性b-カテニンの局在化の阻害及びVE-カドヘリンと一緒の付着接合部への結合の誘導(b)、b-カテニン及びVE-カドヘリンの共免疫沈降複合体の消失の阻害(c)、並びにTop/Fopフラッシュアッセイにおけるルシフェラーゼレポータ遺伝子のb-カテニン/Tcf4依存的転写の阻害(d)を示す。a.これらの野生型(WT)並びにCCM3-ノックアウト内皮系におけるb-カテニン標的遺伝子(Axin2)及び内皮前駆細胞/EndMTマーカー(Klf4、S100a4)の過剰発現に対するスリンダクスルフィド、スルホン化スリンダク及びb-カテニンシグナル伝達経路の異なるステップを標的化すると報告されている他の薬物の作用の定量化を示す図である。スリンダクスルフィド並びにスルホン化スリンダクは、これらCCM3-ノックアウト内皮細胞に見られるAxin2、Klf4及びS100a4の転写の強い誘導の最大の阻害を示す。ここで試験した他の薬物の中で、サリノマイシンはAxin2及びS100a4しか有意に減少させなかったが、シリビニンはこれらの3つの転写産物に対して有効であった。データは、独立した少なくとも3回の実験の平均rtPCR値であり、それぞれ3回繰り返して実施した。媒体処理CCM3-ノックアウト内皮細胞におけるそれぞれの転写産物に対して*、p < 0.05、**、p <0.01(t検定)。更なる詳細については方法を参照のこと。同等の結果が、CCM3のノックアウト後に5〜25回継代した細胞で得られた。b.これら野生型(WT)及びCCM3-ノックアウト内皮細胞系における付着接合部から核への活性b-カテニンの再局在化に対するスリンダクスルフィドの効果の代表的な免疫染色を示す図である。これらCCM3-ノックアウト内皮細胞において活性b-カテニン及びVE-カドヘリンは、細胞-細胞接点(付着接合部)から消失した(上の主要なパネル、XY軸;下の小さいパネル、X軸に沿ったZ投影)。活性b-カテニン(KO媒体、矢じり)は、核内に濃縮される(DAPI染色における対応する矢じりを参照のこと)(右パネル)。スリンダクスルフィドによる処理は、付着接合部への活性b-カテニンの分布を回復させ(右パネル、スリンダクスルフィド、矢じり及び右下の小さいパネル、スリンダクスルフィド、小さい矢じり、Z軸に沿った分布)、活性b-カテニン及びVE-カドヘリンの共局在化が観察される(矢じり)。X軸に沿ったZ投影の下段パネル:これらCCM3-ノックアウト内皮細胞において内皮細胞における先端極性マーカー、ポドカリキシンは、先端極性の消失を示す。CCM1ノックアウトについて報告されているように、ポドカリキシンは先端表面から再局在化されて(左パネル、WT、矢印)、CCM3ノックアウトで基底側に異所的に分布される(右パネル、媒体、矢じり)46。核は、白線により輪郭を描く(DAPI)。スリンダクスルフィドは、ポドカリキシンの適切な先端分布を再確立する(右パネル、スリンダクスルフィド、矢印)。スケールバー、30mm。c. b-カテニン及びVE-カドヘリンの共免疫沈降複合体に対するスリンダクスルフィドの効果の代表的なウェスタンブロッティング(上段)並びに定量化(下段)を示す図である。上段:全抽出物及びVE-カドヘリン抗体(IP:VE)による免疫沈降物の野生型(WT)並びにCCM3-ノックアウト内皮細胞でのウェスタンブロッティング。スリンダクスルフィド処理により、CCM3ノックアウトにおけるVE-カドヘリンのレベル��減少が回復された(全スリンダクスルフィド-KO及び媒体-WTにおいて比較する)。下段:b-カテニン/VE-カドヘリン比として測定した共免疫沈降複合体で、スリンダクスルフィド処理により、CCM3ノックアウトにおけるb-カテニンとVE-カドヘリンの間の有意に減少した結合(35%±0.32 SD、*、p < 0.05、媒体-WTに対する媒体-KO)は、野生型細胞(WT)において観察されたレベルに回復した(媒体-KOに対するスリンダクスルフィド-KO、^、p < 0.05、t検定)。ウェスタンブロッティングのバンドの定量化を、ImageJ使用して独立した3回の実験の平均として評価した。d.スリンダクスルフィドが、Top/Fopフラッシュアッセイにおけるルシフェラーゼレポータ遺伝子のb-カテニン/Tcf4依存的転写の著しい増加(媒体-WTに対する媒体-KO、**、p < 0.01、t検定)を阻害した(媒体-KOに対するスリンダクスルフィド-KO、^、p < 0.05、t検定)ことを示す図である(詳細については方法を参照のこと)。トランスフェクション効率(b-ガラクトシダーゼ活性)に対して標準化したTop-フラッシュとFop-フラッシュ値の比を、媒体-WTにおける比との比較の倍率変化(相対的Top/Fop-フラッシュ値)として示す。
【図１７】CCM3-ノックアウト内皮細胞系は、内皮前駆細胞/EndMTマーカーの過剰発現のスリンダクスルフィド阻害を示す20。野生型(WT)と比較して、これらCCM3-ノックアウト(KO)内皮細胞においてKlf4、S100a4、Id1及びCD44の発現が増加したことを示す代表的な免疫染色を示す図である。核は、DAPIで染色した(白線により輪郭を描く)。CCM3ノックアウトにおけるKlf4(上の行)及びId1(3行目)の過剰発現は、核に限定された(KO、媒体における白色の核に対する矢じり)。同様に、S100a4(2行目)は、核(KO、媒体、白色の核、矢じり)及び細胞質(KO、媒体)両方にあり、一方でCD44(下の行)は殆ど細胞質にあった(KO、媒体)。これらCCM3-ノックアウト(KO)内皮細胞においてスリンダクスルフィドによる処理(右側のパネル)は、これらタンパク質の過剰発現を強く減少させた。図3に示すように、同等の結果が、CCM3-ノックアウト脳内皮細胞の初代培養において得られた。スケールバー、30mm。
【図１８】方法に記載の通り、媒体又はスリンダクスルフィドで処理した(dpn2から)CCM3-ECKOの子(dpn9)は、脳血管における奇形のスリンダクスルフィド減少を示す。Pecam(内皮細胞)の脳切片の代表的な免疫染色。a.背面から脳に入る上矢状静脈洞の血管を示す図である。CCM3ノックアウト(媒体)では、大きな直径を持つまっすぐな血管が、空洞を形成する分芽分岐（budding branch）において終結することが見られる。同等の血管において、このCCM3ノックアウトにおけるスリンダクスルフィド処理は、これらの血管の直径を大きく減少させ、正常な末端分枝を明らかに促進する。パネルは、20×倍率で得られたサンプルの共焦点光切片の最大投影を示す。スケールバー、100mm。b. a.のように処理したCCM3-ECKOの子の内部矢状面の病変を示す図である。CCM3ノックアウト(媒体)において、ガレンの大大脳静脈の末端領域は、分枝状血管の終端に形成されるように見える暗赤紫色の病変を示す(矢じり)。このCCM3ノックアウトにおけるスリンダクスルフィド処理は、暗赤紫色分芽端を大きく減少させる。スケールバー、100mm。
【図１９】スリンダクスルフィドの効果と同様に、CCM3-ノックアウト内皮細胞系は、細胞-細胞接点(付着接合部)からの活性b-カテニン及びVE-カドヘリンの消失、核における活性b-カテニンの蓄積、並びに前駆細胞/EndMTマーカーの過剰発現のスルホン化スリンダク阻害を示す。これらCCM3-ノックアウト内皮細胞における細胞-細胞接点からの活性b-カテニンの消失(上の行)及び核へのその再局在化(2行目)(KO、媒体、矢じり)が、スルホン化スリンダク処理により阻害されたことを示す代表的な免疫染色を示す図である。核は、DAPIで染色した。同様に、細胞-細胞接点からのVE-カドヘリン消失は、スルホン化スリンダク処理により阻害された(3行目)。これらCCM3-ノックアウト(KO)内皮細胞におけるKlf4(核、媒体、矢じり)及びS100a4(細胞質及び核)の過剰発現は、スルホン化スリンダク処理によっても強く減少した(最下段の行)。VE-カドヘリン、Klf4及びS100a4染色において核(DAPI)は、白線により輪郭を描く。スケールバー、30mm。
【図２０】スリンダクスルフィドの効果と同様に、CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2-BAT-gal(CCM3-ECKO)マウスは、脳血管における奇形のスルホン化スリンダク減少を示す。これらのマウスを、dpn1でタモキシフェン(10mg/kg体重、方法に記載の通り)で処理して、Cre組換え酵素の内皮細胞選択的発現及びfloxed/floxed CCM3遺伝子の組換えを誘導した(CCM3-ECKOマウス)。また、dpn2から開始して毎日媒体又はスルホン化スリンダク(30mg/kg)でそれらを処理した。a.解剖後のdpn9マウスの子の脳の肉眼で見える外見が、CCM3- ECKOマウスの小脳において明白な病変を示した(矢じり)図である。スケールバー、0.65cm。下パネル:小脳の更なる倍率。スケールバー、0.3cm。b. 3回媒体処理した及び3回スルホン化スリンダク処理したCCM3-ノックアウトマウス由来の脳全体(62に記述される、方法を参照のこと)における暗赤紫色(多重内腔)、単一空洞、又は毛細管拡張症病変として平均脳病変の定量化を示す図である。脳を、矢状軸に沿って切片化し(150mm切片、ビブラトーム)、Pecam(内皮細胞)に対して免疫染色し、広視野蛍光顕微鏡検査(10×及び20×倍率)により検査した。暗赤紫色、単一空洞及び毛細血管拡張症病変についてそれぞれ*、p = 0.0053、0.006、0.004(ウィルコクソン検定)。c. VE-カドヘリン、Klf4及びS100a4の局在化の代表的な免疫染色を示す図である。左:媒体処理したCCM3-ECKOマウスにおけるVE-カドヘリンの拡散状態から、スルホン化スリンダクは、細胞-細胞接合部へその局在化を回復させた(矢じり)。中央、右:媒体処理したCCM3-ECKOマウスにおけるKlf4(中央)並びにS100a4(右)の発現に対する核染色から、スルホン化スリンダクは、Klf4及びS100a4両方に対するこの核反応性を減少させた。内皮細胞は、イソレクチンB4又はPECAMにより染色される。スケールバー、15mm。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
方法
CCM3-ECKOマウスを生成するためのCCM3-flox/floxマウスにおける内皮細胞特異的組換え
CCM3-flox/floxマウスを、TaconicArtemis(Koeln、Germany)で生成した。マウスCCM3遺伝子のエクソン4及び5に隣接して2つのP-lox配列を挿入して、Cre組換え酵素による切除後に機能喪失型変異を作製した。これらのCCM3-flox/floxマウスを、Cre-組換え酵素のタモキシフェン誘導可能な内皮細胞特異的発現及びCCM3遺伝子組換えのためにCdh5(PAC)-CreERT2マウス(Wangら、2010)と交配した。CCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)-CreERT2マウスを、BAT-galマウス(Marettoら、2003)と更に交配して、b-カテニン転写シグナル伝達の活性化を監視し、及びRosa 26-強化緑色蛍光タンパク質(EYFP)(Rosa26EYFP)マウス(Srinivasら、2001)と更に交配して、EYFPの発現によりCre-組換え酵素の発現を監視した。14に記述の通り、タモキシフェン(Sigma)をトウモロコシ油及び10%エタノールに(10mg/mLで)溶解し、次いでdpn1〜2の子への単回胃内投与(35mg/kg体重)の前にトウモロコシ油に1:5に希釈した。対照(野生型)マウスには、タモキシフェンを溶解するのに使用した媒体(トウモロコシ油+2%エタノール)で処理したCCM3-flox/flox-Cdh5(PAC)CreERT2-BAT-galマウス、及びタモキシフェンで処理したCCM3+/+- Cdh5(PAC)CreERT2-BAT-galマウスを含めた。
【００９７】
CCM3-ECKOマウスについて上で詳述した通り、CCM1-ECKO及びCCM2-ECKOをCCM1-flox/flox及びCCM2-flox/floxマウスから得た、Maddalunoら、2013及びBouldayら(2011)も参照のこと。
【００９８】
マウス遺伝子型判定
以下のプローブを、マウス遺伝子型判定に使用した:野生型CCM3対立遺伝子:5'GAT AGG AAT TAT TAC TGC CCT TCC 3'(配列番号1)、5'GAC AAG AAA GCA CTG TTG ACC 3'(配列番号2); Cre組換え酵素により誘導された組換え後に欠失したCCM3遺伝子:5'GAT AGG AAT TAT TAC TGC CCT TCC 3'(配列番号3)、5'GCT ACC AAT CAG CTT CTT AGC CC 3'(配列番号4)、Cdh5(PAC)-CreERT2遺伝子:5'CCA AAA TTT GCC TGC ATT AAC GGT CGA TGC 3'(配列番号5)、5'ATC CAG GTT ACG GAT ATA GT 3'(配列番号6);BAT-gal遺伝子:5'CGG TGA TGG TGC TGC GTT GGA 3'(配列番号7)、5'ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC 3'(配列番号8); Rosa 26 EYFP遺伝子:5'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3'(配列番号9)、5'GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3'(配列番号10)、5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3'(配列番号11)。
【００９９】
スリンダクスルフィド及びスルホン化スリンダクによる処理
スリンダクスルフィド(Sigma)及びスルホン化スリンダク(Sigma)両方をDMSOに溶解し、トウモロコシ油に1:50に更に希釈した。それらを、組換え誘導の1日後に開始して、毎日胃内投与した(30mg/kg体重)。対照マウスを、媒体(トウモロコシ油+2%DMSO)だけで、同時に処理した。本発明者らは、媒体処理したCCM3-ECKOマウスと比較して薬物処理したマウスにおいて脈管病変からの出血又は死亡率の増加のいずれも観察しなかった。
【０１００】
IWP2、IWP12、DKK1及びWnt3aによる処理
指示したアッセイの48時間前に薬物をコンフルエント細胞に添加した。両方ともSigma-Aldrich製のIWP2及びIWP12の終濃度は、0.5、2.5□Mであった。薬物処理の場合、薬物をDMSOに溶解し、対照処理(媒体)は終濃度0.1% DMSOであった。マウス組換えDkk1(R&D)は、細胞当たり0.5□Mであった。マウス組換えWnt3a(R&D)は、図の説明に指示した時間に5ng/mLであった。
【０１０１】
CCM3-flox/floxマウスからの内皮細胞のin vitro単離、培養及び組換え
前述の通り13、CCM3-flox/floxマウス(8〜10週齢)由来内皮細胞を、脳から単離した。前述の通り59、floxed CCM3遺伝子の組換えを、培養1日目にAdenoCreウイルスベクターで細胞を処理することにより誘導した。対照内皮細胞は、AdenoCreの代わりにAdenoGFPで処理した同じ内皮細胞標品のアリコートであった。本文に記載の通り、次いで細胞を、分析前に更に7日間に及んで培養で維持した。薬物処理は、細胞を加工する48時間前であった。
【０１０２】
いくつかの実験において、CCM3-flox/floxマウス(8〜10週齢)の肺由来内皮細胞系を、ポリオーマミドルT遺伝子(polyoma middle T gene)60のレトロウイルス発現により培養で不死化した。CCM3遺伝子の除去は、AdenoCreウイルスベクターで実現した(対照細胞においてはAdenoGFP)。次いでこれらの細胞を、このCCM3切除の効果について検出可能な変化無しに25継代まで培養で維持した。これらの内皮細胞系は、in vitroの脳内皮細胞の初代培養及びin vivoの脳内皮細胞両方と同等の方法でCCM3の非存在に反応した。
【０１０３】
培養細胞の薬物処理
薬物を、指示したアッセイの48時間前にコンフルエント細胞に添加した。使用した終濃度は、以下の通りであった: 135mMスリンダクスルフィド、125mMスルホン化スリンダク、200mMシリビニン、40mMクルクミン、40mMレスベラトロール、及び250mMサリノマイシン(全てSigma-Aldrich製)。薬物処理の場合、これら全てをDMSOに溶解し、対照処理(媒体)は終濃度0.1% DMSOであった。
【０１０４】
脳切片、網膜及び培養細胞の蛍光顕微鏡検査のための免疫染色
マウスの子由来脳及び眼を、解剖後直ちに3%パラホルムアルデヒド中で固定し、この固定を4℃で終夜続けた。網膜を、全組織標本として染色直前に眼から解剖した。固定した脳を、4%低融点アガロースに封埋し、ビブラトーム(1000 plus、The Vibratome Company、St. Louis、MO、US)を使用して矢状軸(150mm)に沿って切片化した。
【０１０５】
脳切片及び網膜を、それぞれ12ウェル及び96ウェルプレート中で浮遊サンプルとして染色した。それらを、0.01%チメロサールを含有するリン酸緩衝食塩水(PBS)中に0.5% Triton X100及び5%ロバ血清を含む1%魚皮ゼラチン中で、4℃で終夜ブロッキングした。サンプルを、0.01%チメロサールを含有するPBS中に0.25% Triton X100を含む1%魚皮ゼラチンに希釈した一次抗体と4℃で終夜インキュベートした。PBS中の0.1%Triton X100による洗浄後、二次抗体を、0.01%チメロサールを含有するPBS中に0.25% Triton X100を含む1%魚皮ゼラチン中に室温で4時間添加した。DAPIとのインキュベーションはPBS中で4時間であり、続いてPBSで数回洗浄し、3%パラホルムアルデヒドにより室温で5分間固定した後、PBS中で更に洗浄した。脳切片を、DAPIと共にVectashieldに封入し、カバーグラスをマニキュアで固定し;網膜を、DAPIと共にProlong goldに封入した。
【０１０６】
これまでに記述されている通り46、in vitroで培養した細胞を固定し、染色した。
【０１０７】
抗体
以下の抗体を使用した:抗Pecam(ハムスター; MAB1398Z、Millipore);抗b-ガラクトシダーゼ(ニワトリ; ab9361、Abcam);抗VE-カドヘリン(ラットモノクローナル; 550548、BD Biosciences);抗VE-カドヘリン(ヤギ; sc-6458、Santa Cruz); Ser37及びThr41で脱リン酸化された抗-活性b-カテニン(マウスモノクローナルクローン8E7、Millipore);抗全b-カテニン(マウスモノクローナル; Cell Signaling);抗S100a4(ウサギ; 07-2274、Millipore);抗Klf4(ヤギ; AF3158、R&D);抗CD44(ラット; 553131、BD Biosciences);抗ID1(ウサギ; sc-488、Santa Cruz);抗aSMA(マウスモノクローナル; F3777、Sigma);抗GFP(ウサギ; A-6455、Invitrogen);抗ポドカリキシン(ヤギ; AF1556、R&D);抗リン酸ヒストンH3(ウサギ; ab51776、Millipore);抗CCM3(ウサギ; Eurogentec);抗p-Smad1(ウサギ; 9516、Cell Signaling);抗エンドムチン(ウサギ; sc-65495、Santa Cruz);抗α-チューブリン(マウスモノクローナル; T9026、Sigma)。Alexa555コンジュゲートストレプトアビジン(Molecular Probes)で表されるビオチンコンジュゲートイソレクチンB4(Vector Lab)も使用して、網膜及び脳切片中の内皮細胞を同定した。
【０１０８】
免疫蛍光検査用の二次抗体は、適当な動物種の免疫グロブリンに対してロバにおいて産生させた抗Alexa448及び抗Alexa555、並びにCy3コンジュゲート抗体(Molecular Probes又はJackson Laboratories)であった。
【０１０９】
ウェスタンブロッティング用の二次抗体は、HRPに連結した抗マウス、抗ラット及び抗ウサギ抗体(Cell Signaling)、並びにHRPに連結した抗ヤギ抗体(Promega)であった。
【０１１０】
rtPCR
RNA抽出を、RNeasyキット(74106; Promega)で実行した。RNA(1μg)を、ランダムヘキサマーで逆転写した(High Capacity cDNA Archive kits; Applied Biosystems)。cDNAを、7900 HTサーモサイクラー(ABI/Prism)を使用してTaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)で増幅させた。各サンプルについて、発現レベルを、比較閾値サイクル(ct)法で決定し、18S及びグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)をコードしているハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。増幅には、rtPCRにおいてマウス転写産物を認識すると確認されている以下のプローブ(Applied Biosystems)を使用した: Axin2, Nkd1, Lef1, ccnd1, cMyc, , Klf4, Ly6a, S100a4, Id1, Cdh2, Acta2, CD44。CCM3 mRNA転写産物を同定するためのプローブは、注文設計した:フォワード、CGAGTCCCTCCTTCGTATGG(配列番号12);リバース、GCTCTGGCCGCTCAATCA(配列番号13);レポータ配列、CTGATGACGTAGAAGAGTACA(配列番号14)。
【０１１１】
Top/Fop-フラッシュアッセイ
レポータ標的のb-カテニン依存的転写を検出するために、Top-フラッシュプラスミドを使用し(0.3mg/cm2細胞培養面積)、そのプラスミドは、ホタルルシフェラーゼの転写を制御するTcf/Lef結合部位を7つ含有する(Lluisら、2008)。製造業者(Invitrogen)の説明書に従ってLipofectamine 2000を使用して、これを肺から内皮細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション効率に対してルシフェラーゼ発現を標準化するために、b-galを構成的に発現するpCMVプラスミドを共トランスフェクトした(0.1mg/cm2)。陰性対照として、最小プロモーター及びホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に6つの変異させた(即ち、不活性の)Tcf/Lef部位を含有するFopフラッシュプラスミドを使用した(0.3mg/cm2)。上記の通り、標準化のために、これをb-galプラスミドと共トランスフェクトした。ホタルルシフェラーゼ及びb-galの同時検出のために、Dual-Light Reporter Gene assay system(Applied Biosystems)を使用した。細胞抽出及び化学発光の検出(Glomax 96マイクロプレート照度計; Promega)を、製品説明書に従って実施した。
【０１１２】
ウェスタンブロッティング及び免疫沈降
標準的な手順を使用して抽出し、ウェスタンブロッティング及び免疫沈降によりタンパク質含有量を分析した46。核分画については、以前に記述されている62。
【０１１３】
病変負荷の判定
病変を分類及び計数するために、上並びに方法に記載の通りdpn 9の同腹子の子由来の脳全体を切片化し、Pecamに対して免疫染色した。次いで切片を、広視野蛍光顕微鏡(10×及び20×)下で検査した。63に記載の通り、病変を、暗赤紫色(多数の空洞、2つ以上の隣接する空洞の群)、単一空洞(25個以上の赤血球を収容する最大直径を持つ単一の拡張血管)又は毛細管拡張(異常な拡張内腔を持つ蛇行小血管)に分類した。病変の総数は、病変の全ての型を合計することにより算出した。
【０１１４】
切片が厚さ150mmであったので、補正を、2つの切片にまたがり得る暗赤紫色病変の数に適用した。従って、暗赤紫色病変の数を、2.5で割った。病変を計数し、処理が分らない2名の観察者によりそれぞれ独立に分類した。
【０１１５】
暗赤紫色病変及び単一空洞の最大直径を、統計比較に使用した。
【０１１６】
siRNA実験
Lampugnaniら、2010に記載の通り、VE-カドヘリン発現を、マウスVE-カドヘリンに対するsiRNAオリゴ[Smart pool、Thermo Scientific;標的配列:AGACAGACCCCAAACGUAA(配列番号15)、GAAAAUGGCUUGUCGAAUU(配列番号16); AGGGAAACAUCUAUAACGA(配列番号17); CCGCCAACAUCACGGUCAA(配列番号18)]のそれぞれ、及び形質導入にLipofectamine 2000を使用してサイレンシングした。
【０１１７】
統計解析
ノンパラメトリックウィルコクソンの符号付き検定を使用して、in vivo薬物処理後の病変負荷の統計的有意性を決定した。対応のないスチューデントの両側t検定を使用して、他のin vitro及びin vivo分析における統計的有意性を決定した。有意義水準を、p < 0.05に設定した。
【実施例】
【０１１８】
結果
b-カテニンの転写活性は、内皮細胞特異的CCM3-ノックアウトマウスの内皮細胞においてin vivoで向上する
Cre-組換え酵素のタモキシフェン誘導可能な内皮細胞特異的発現及びCCM3遺伝子組換えのために、ここで示すin vivoマウス系を、CCM3-floxed/floxedマウスとCdh5(PAC)-CreERT2  マウス14との交雑によって最初に生成した。次いでこれらのマウスを、核b-ガラクトシダーゼ(b-gal)レポータ遺伝子のb-カテニン活性化発現を示すBAT-galマウス15と更に交雑した。これまでCCM26について報告されているように、出生後に誘導されるCCM3遺伝子の内皮特異的不活性化を持つこれらのマウス(CCM3-ECKO)は、患者におけるCCM脈管病変と同程度に脳並びに網膜脈管系において著しい奇形及び出血を示した。これは、同一マウスモデルのCCM2に対して6並びに固有のマウス系のCCM2及びCCM3に対して7これまでに報告されている。CCM3 ECKOマウスは中枢神経系に脈管奇形を発症するので、このモデルは、下記の薬物処理を試験するためのツールを提供する。この実験モデルの詳細については、方法及び図15を参照のこと。
【０１１９】
ここで、対応させた対照動物と比較して、核b-galレポータ遺伝子のb-カテニン依存的転写は、新生児CCM3-ECKOの脳血管の内皮細胞においてin vivoで増大する。図1a及び1bにおける免疫染色で例示されるように、内皮細胞のPECAM標識を使用するランダムな視野で計数することによる定量化は、野生型BAT- galマウス由来の対照脳内皮細胞のb-gal陽性の核(視野当たり0.86±0.15個の陽性の核;記録した全600個の内皮核のうち7.2%の陽性の核)が、CCM3- ECKO脳内皮細胞において4倍に有意に増加した(視野当たり5.0±1.7個の陽性の核;記録した全700個の内皮核のうち36%の陽性の核、p < 0.05; t検定)ことを示した(dpn 9の同腹子の子)。これらのCCM3-ECKO脳内皮細胞において、b-gal陽性の核は、樹立された空洞並びに毛細管拡張(脈管病変において67%のb-gal陽性の内皮核)及び疑似正常血管(疑似正常血管において15%のb-gal陽性の内皮核)の両方に分布した。
【０１２０】
b-galの発現は、対照野生型BAT- galマウス由来のものと比較すると、CCM3- ECKOマウスの網膜内皮細胞においても観察された(図1c)。CCM3-floxed/floxedマウスの脳から単離した内皮細胞(図2a、WT、初代培養)を、in vitroにおけるCCM3遺伝子組換え後のもの(CCM3-ノックアウト脳内皮細胞;方法を参照のこと)(図2a、KO、初代培養)と比較し、組換え後の内皮細胞は核に活性b-カテニン(即ち、Ser37及びThr4116に対して脱リン酸化されている)を示した。この効果は、活性b-カテニン(図2a)及びVE-カドヘリン(図3c、媒体)両方の接合部からの非局在化として見られる付着接合部の組織化に対する強い改変と並行するものであった。in vivoにおける内皮接合部からのVE-カドヘリンの同様の無秩序化については、図4b、媒体を参照のこと。
【０１２１】
脳由来の新たに単離される内皮細胞の供給並びに1回目のin vitro継代後の極めて限られた有糸分裂指数の両方の制限のため、そのb-カテニンの核分布及びシグナル伝達の詳細な分析はできなかった。従って、本発明者らは、上のように17CCM3がin vitroで再結合される培養内皮細胞系を確立した(CCM3-ノックアウト内皮細胞系)(方法を参照のこと)。これらのCCM3-ノックアウト内皮細胞系において、本発明者らは、免疫蛍光検査(図2b)及び細胞分画の両方によりb-カテニンの核局在化の向上を確認した(図2c)。
【０１２２】
加えて、外来性ルシフェラーゼ遺伝子のベータ-カテニン及びTcf/Lef依存的転写を、Top/Fopフラッシュレポータアッセイで測定した。これらのCCM3-ノックアウト内皮系において、b-カテニンの転写活性は、対照野生型細胞と比較して2.7倍に有意に増加した(±0.2 SD; p < 0.01)(図16d)。更に、b-カテニン転写活性のいくつかの典型的な内在性標的の発現は、これらのCCM3-ノックアウト内皮系(即ち、Axin2、Lef1、Ccnd118)において増加し、ドミナントネガティブTcf417をコードするアデノウイルスベクターによるin vitro感染により阻害された(図2d)。
【０１２３】
b-カテニン転写シグナル伝達が、他の細胞型における分化及び上皮間葉転換(EMT)の過程を調節することが示された22、23、24ので、本発明者らは、内皮前駆細胞表現型19及び内皮間葉転換(EndMT) 20、21両方の獲得/維持に関係する遺伝子の発現も分析した。加えて、EndMTが、内皮特異的CCM1ノックアウトのマウスモデルにおける脈管病変の発達に重要な役割を担っていることが判明した[Maddaluno、L.ら、Nature 498 (7455):492頁、2013]。対照細胞と比較してKlf425、26、Ly6a27、28及びS100a429、20、Id130、31、Cdh220、Acta220の転写が、CCM3-ノックアウト内皮細胞において有意に向上したことが判明した(図2e、内皮系及び図3b、初代培養)。加えて、上記のように、これらの増加は、ドミナントネガティブTcf417により阻害されたので、b-カテニン転写活性に依存していた(図2e)。これらの遺伝子の転写の向上は、タンパク質発現の増加にも対応した(図17及び19の媒体処理CCM3-ノックアウト、内皮系、及び図3c初代内皮細胞、並びに図5及び図20の媒体処理CCM3-ECKO脳内皮細胞におけるin vivo上方調節を参照のこと)。
【０１２４】
従って、内皮細胞におけるCCM3発現の抑止は、in vivo及びin vitro両方でのb-カテニン転写活性及び標的遺伝子発現の増加もたらす。これらのデータに照らして、本発明者らは、これらCCM3- ECKOマウスの脳脈管病変に対するin vivoでの抗b-カテニン薬剤の効果を調査した。
【０１２５】
スリンダクスルフィドは、CCM3- ECKOマウス由来内皮細胞におけるb-カテニン転写活性並びに内皮前駆細胞及びEndMTマーカーの発現を減少させる
次いで本発明者らは、in vitro実験モデルにおいて、b-カテニンシグナル伝達に影響を及ぼすと記述され32、最も重要なことに、既に臨床用途にある一連の薬剤:スリンダクスルフィド、スルホン化スリンダク33、34、シリビニン35、クルクミン36及びレスベラトロール37、38を最初に試験した。現在までその使用は実験モデルに限定されているが、Wnt受容体シグナル伝達の既報の阻害剤であるサリノマイシン39も含めた。
【０１２６】
CCM3-ノックアウト内皮細胞系において、スリンダクスルフィド及びスルホン化スリンダクは、b-カテニン転写活性の内在性標的の発現の阻害に対してこれらのうち最も有効であった(上記参照)(図16a)。加えて、Top/Fopフラッシュレポータアッセイによる測定の通りスリンダクスルフィドは、b-カテニン転写活性を減少させた(図16d)。
【０１２７】
従って、本発明者らはCCM3ヌル表現型に対するスリンダクスルフィドの効果を更に分析した。CCM3-ノックアウト脳内皮細胞の初代培養において、本発明者らは、スリンダクスルフィドが、内在性b-カテニン標的遺伝子の発現を効果的に阻害することを発見した(図3a、及び上の通りドミナントネガティブTcf4による阻害、図3bを参照のこと)。同時に、スリンダクスルフィドは活性b-カテニンの核局在化を強く阻害し、一方で細胞-細胞接合部におけるその濃度を増加させた(図3c)。同時に、VE-カドヘリンも、これらの細胞(図3c)及びCCM3-ノックアウト内皮の細胞系(図16b)において細胞-細胞接点へより局在化した。
【０１２８】
一貫して、共免疫沈降及びウェスタンブロッティング分析により、CCM3-ノックアウト内皮系においてスリンダクスルフィドは、b-カテニンとVE-カドヘリンの間の減少した結合(マイナス35%±0.32 SD、p < 0.05)を回復させた(図16c)。
【０１２９】
b-カテニン標的遺伝子の転写の阻害と同時に、CCM3-ノックアウト内皮細胞においてスリンダクスルフィドは、それぞれのタンパク質の過剰発現も阻害した(図3c、初代培養及び図17、内皮細胞系)。
【０１３０】
次いで新生児マウスにおいてCCM3-ECKOの誘導後にスリンダクスルフィドをin vivoで調査した。本発明者らは、スリンダクスルフィドによる処理が、核のレポータ遺伝子b- gal(図4a)及び脳脈管系の内皮細胞におけるb-カテニン標的遺伝子(図5)の発現も阻害することを発見した。VE-カドヘリンも、スリンダクスルフィドで処理した新生児CCM3- ECKOマウスの脳血管においてin vivoで内皮細胞-細胞接合部により多く局在化するように見えた(図4b)。
【０１３１】
スリンダクスルフィドは、CCM3-ECKOマウスの脳及び網膜における脈管病変の発達を減少させる
本研究の重要な態様は、スリンダクスルフィドによるb-カテニンシグナル伝達の阻害が、CCM3- ECKOの子において脈管病変も減少させ得るかどうかである。実際本発明者らは、脈管病変の平均個数及び容積がスリンダクスルフィド処理により減少したことを発見した。図6aの免疫染色に例示し、図6bにおいて定量化した通り、媒体処理CCM3-ECKOの子における脳当たりの脈管病変の平均個数(±SD)は、166.8±22個、スリンダクスルフィド処理では72.6±9個の脈管病変であり(p < 0.005;ノンパラメトリックのウィルコクソンの符号付き検定)、媒体処理CCM3-ECKOの子における暗赤紫色病変の平均最大直径(±SD)は、386±56mm及びスリンダクスルフィド処理では244±38mmであった(p < 0.05、t検定)。スリンダクスルフィド処理は、単一空洞の最大直径を有意に減少させなかった。
【０１３２】
CCM3-ECKOマウスの網膜においてスリンダクスルフィド処理も脈管奇形を阻害した。これらのマウスにおいて、網膜は、脈管網の周辺に特に集中している多重内腔脈管病変を示す。そのような病変は、静脈から発達し、まっすぐであるが拡大する(静脈マーカーエンドムチンについて図6c及び6e並びに図15のWT及びCCM3-ECKOに対する媒体を比較する)。スリンダクスルフィドは、CCM3-ECKOマウスにおけるこの異常な脈管網を部分的に正常化した(図6c及び6d)。加えて、これらCCM3-ECKOマウスの網膜を特徴づける静脈の最も内部の管の肥大は、スリンダクスルフィド後に阻害された(スリンダクスルフィド-ECKOにおける35±7.8mmに対して媒体-ECKOにおける89.5±7.1mm、WT及びKOそれぞれについて14個の網膜における30回の測定の平均±SD)(図6e並びに図18a及び18b、CCM3-ECKOの子の脳における血管直径及び静脈に対するスリンダクスルフィドの効果)。変動において、動脈はこの異常な表現型を示さない(図6c及び6e)。
【０１３３】
上で報告したデータは、スリンダクスルフィドがCCM患者において治療活性を有し得ることを強く示唆する。しかしながら、この薬物が血小板中のシクロオキシゲナーゼを阻害することは出血のリスクを増加させる可能性があると報告されている。従って、本発明者らは、抗シクロオキシゲナーゼ活性を欠いており33、凝固反応に影響がないスルホン化スリンダクを試験した。スリンダクスルフィド処理後に観察した通り、培養CCM3-ノックアウト内皮細胞系においてスルホン化スリンダクも、活性b-カテニンの核蓄積を減少させ、細胞-細胞接合部を回復させた(図19)。加えて、スリンダクスルフィドがそうであったように(上記参照)、スルホン化スリンダクは、b-カテニン標的遺伝子の発現を阻害した(例えば図19のKlf4及びS100a4を参照のこと)。In vivoで試験した場合、CCM3-ECKOマウスの脳においてスルホン化スリンダクは、スリンダクスルフィドと同等のレベルに病変の数を減少させた[無処理の対照におけるマウス脳当たりの病変の平均個数(±SD)は、153.5±28であり、スルホン化スリンダク処理では68.6±10まで減少した、p < 0.01;ノンパラメトリックウィルコクソンの符号付き検定;図20a及び20b]。加えて、in vivoで、CCM3-ECKOマウスの脳血管内皮において、スルホン化スリンダクはKlf4及びS100a4の発現を阻害した(図20c)。CCM1- ECKOマウスの脳においてスルホン化スリンダク(エキシスリンド)が、海綿腫病変の形成を阻害することを示す同様の結果も得られた。
【０１３４】
CCM3-ECKOマウスの脳海綿腫の内皮細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達の活性化の動力学
CCM3 ECKOマウスモデルは、患者においても観察されるような最も重篤な表現型を発症するので、原理実験の証明において、特に薬物の阻害活性の試験において第一選択である。
【０１３５】
図7に報告した通り、β-カテニンシグナル伝達は、病変において早く向上し、そのような活性化は、本発明者らがCCM表現型の維持に関与すると報告した(Maddalunoら、2013)TGF-β/BMP経路の活性化に先行する。
【０１３６】
使用したin vivoマウス系をCCM3-flox/floxマウスとCdh5(PAC)-CreERT2マウスとの交雑によって生成して、Cre-組換え酵素のタモキシフェン誘導可能な内皮細胞特異的発現及びCCM3遺伝子組み換え(CCM3-ECKOマウス)を得た。次いでこれらのマウスを、核β-ガラクトシダーゼ(β-gal)のβ-カテニン活性化発現を示すBAT-galレポータマウス(16)と交雑した。
【０１３７】
図7a(上パネル)に報告されるように、本発明者らは、対応させた対照と比較してCCM3-ECKOマウスにおいて内皮細胞の核内で有意に高いβ-カテニン転写シグナルを観察することができた。CCM3組換え誘導(1dpn)後の早い段階(3dpn)だったのでこの差異を検出することができた。CCM3-ECKOマウスの脳切片においてβ-gal陽性の核を持つ内皮細胞は、疑似正常血管及び任意のサイズの空洞の両方において発見され得る(図8)。それに対し、別々の切片(図7a、下パネル)及びβ-galに対する共染色(図7b)において、リン酸-Smad1(p-Smad1)染色は、3dpnの子においてCCM3除去後に向上しなかったが、9dpnの子において増加した(図7c)。同様の結果を、p-Smad3に対して得た(不掲載)。P-Smad1は、中〜大きなサイズの病変においてのみ有意に高かった(9dpnの子において最大直径≧50μm)(図8)。
【０１３８】
この結果は、新たな病変の開始の阻害に対するβ-カテニンシグナル伝達の薬理学的標的化を強く支持する。de novo病変の外見は、患者において見慣れた形態のCCMに特有の特徴である。スリンダクスルフィド及びスルホン化スリンダクを使用してβ-カテニンシグナル伝達を阻害する突然変異させた表現型の復帰に関するin vitroデータを、図4及び図19に示す。
【０１３９】
β-カテニンシグナル伝達とEndMTマーカーの発現との相関により、CCM3-ECKOマウスの脳海綿腫の内皮細胞における2つの過程の動態をin vivoで分析する
幹細胞/EndMTマーカー(Klf4、Ly6a、S100a4及びId1)の発現は、3dpnのCCM3- ECKOの子において高く(図9a〜d及びe、単一の陽性)、β-gal陽性の核を持つ内皮細胞に集中した(図9e、共局在化)。9dpnにおいて、CCM3-ECKOの子の内皮細胞におけるβ-gal発現は低下したが、幹細胞/EndMTマーカーは高いままであった(図9e)。これまでの段落において論議した通り現在のところ、樹立された病変におけるβ-カテニンシグナル伝達の役割は詳細な調査中である
【０１４０】
活性化β-カテニン駆動転写の標準的な標的であるaxin2並びにEndMTマーカーは、CCM3に加えてCCM1及びCCM2遺伝子(図10)の除去後に、培養の内皮細胞において実際に向上する。
本発明者らは、CCM3-KO内皮細胞において既に報告されている通り(図2)、培養CCM1 KO内皮細胞を詳細に分析して、活性β-カテニン(Ser37及びThr41において脱リン酸化され、プロテアソーム分解を免れる図11a)の核の局在化を観察した。加えて、Top/Fopフラッシュレポータアッセイで測定した外来性ルシフェラーゼ遺伝子発現(β-カテニン/Tcf/Lef依存的転写の活性化の尺度;図11b)の2倍の増加によって指示される通り、そのような核β-カテニンは転写活性がある。最も重要なことに、スルホン化スリンダク(エキシスリンド)を使用するβ-カテニンシグナル伝達の阻害は、培養CCM1 KO内皮細胞においてEndMTマーカーの発現を阻害する(図11c)。これらのデータは、任意のCCM遺伝子の突然変異が、脱分化した表現型の獲得(EndMTマーカーの発現、図11)に関連してβ-カテニンシグナル伝達を誘導するという概念を支持する。
【０１４１】
加えて、図3においてCCM3 KO内皮細胞について報告した通り、スルホン化スリンダク(エキシスリンド)は、培養CCM1 KO内皮細胞において内皮の細胞-細胞接触の再組織化を誘導する。同様の結果は、CCM2 KOモデルにおいても得られた。
【０１４２】
β-カテニンシグナル伝達が、内皮細胞におけるCCM除去に応答して活性化される機序
CCM3-ノックアウト内皮細胞におけるβ-カテニン媒介転写の活性化は:a)外来性Wntの非存在下で観察された;b)リガンド産生を阻害するポーキュパイン阻害剤IWP2及びIWP12(26、27)並びにWnt補助受容体Lrp5/6の競合剤(26、27)である、リガンド-受容体相互作用の阻害剤、Dkk1は、典型的なβ-カテニンの転写を阻害しなかった(図12 a〜d);c) Lrp6リン酸化が、増加しなかった(図12e及びf);d)外来性Wnt3aによる刺激は、幹細胞/EndMTマーカーの発現を誘導しなかったが、β-カテニン、Lef-ΔβCTA (28)の構成的に活性な形態は誘導した(図12g及びh)ので細胞自律的であった。
【０１４３】
総合すれば、これらのデータは、CCM3-ノックアウト内皮細胞におけるβ-カテニンの核局在化及び転写活性の向上が、古典的リガンド-受容体相互作用に依存しないことを示す。
【０１４４】
本発明者らは、内皮接合部由来VE-カドヘリンのサイレンシング又は解体が、β-カテニンシグナル伝達を上方制御できることを以前に報告した (18) 。一貫して、本発明者らは、siRNAによるVE-カドヘリンのサイレンシングが、典型的なβ-カテニン標的(Axin2、Ccnd1及びNkd1、図12i)に加えてEndMTマーカー(S100a4及びId1)の発現を活性化し、活性β-カテニンの核の局在化を促進することをここで観察した(図13a)。反対に、VE-カドヘリンノックダウンは、Smad1のリン酸化を向上させなかった(図13b)。
【０１４５】
これらのデータは、CCMにおいてβ-カテニンシグナル伝達の第1の引金はVE-カドヘリン接合部の解体であり、次に細胞質におけるβ-カテニンの放出及び核移動を引き起こすことを示唆する。この過程は、病変進行に対するTGF-β/BMPシグナル伝達の活性化に先立ち、おそらくそれに関与する。
【０１４６】
興味深いことに、CCM1- ECKO、CCM2- ECKO及びCCM3- ECKOについて報告されている通り、内皮細胞における細胞間接合部の解体は、CCM遺伝子のいずれかの除去により誘導される脳海綿腫の共通の特徴を表す(図14)。本発明者らは、CCM1患者の脳海綿腫におけるVE-カドヘリンの無秩序化を以前に報告した(Lampugnaniら、2010)。従って、接合部のVE-カドヘリンの無秩序化は、マウスモデル及び患者両方において脈管空洞奇形の内側を覆う内皮細胞の一般的な特徴を現わす。実験マウスモデルにおいて上で報告した通り、これは、患者においても核移動の向上及びβ-カテニン駆動転写の増加を伴うVE-カドヘリンからのβ-カテニンの解離と同時に起こる可能性がある。現在のところ、患者の脳海綿腫におけるβ-カテニンシグナル伝達の活性化の直接的な証明は、ヒトサンプルにおいてそのような活性化のマーカーを検出する技術的な制限のため非常に難しい。要約すると、これらの結果は、脈管奇形により特徴づけられる病状、特にCCM患者の治療に対する抗β-カテニン化合物の使用を支持する。
【０１４７】
ここで、本発明者らは、CCM3遺伝子の内皮細胞選択的欠失が、脳内皮細胞においてb-カテニン転写シグナル伝達をin vivoで活性化することを報告する。このマウスモデルにおいてNSAIDスリンダクスルフィド並びにスルホン化スリンダクによるb-カテニン転写活性の薬理学的阻害が、脳及び網膜脈管奇形の数及び容積を減少させることは、内皮細胞におけるb-カテニン転写シグナル伝達がCCM3媒介脈管病変の発病に関与することを示唆する。
【０１４８】
CCM奇形は、それだけではないが、患者及びマウスモデルの中枢神経系において主に発症する6、8。CCM病状の内皮における調節解除したb-カテニンシグナル伝達の重要な役割と一致して、標準的なWnt経路は、血液脳関門にある内皮細胞の表現型を指定するための確立された決定因子である11〜13。しかしながら、Wntシグナル伝達は、中枢神経系における異常な血管増殖及び形態形成を避けるために、出生後に無効にされなければならない11〜13。内皮特異的なb-カテニン機能獲得マウスモデルにおいて、本発明者らは、CCM3- ECKOにおいてここで観察した病変と同等の脈管病変を網膜において観察した40。腫瘍細胞において、標準的なWntシグナル伝達の持続的な誘導は、増殖及び浸潤の増加と関係がある18、24。特に、b-カテニン媒介転写活性化により、癌細胞は、上皮から間葉系表現型へと切り替わる(EMT)18、24。本発明者らは、CCM3-ノックアウト内皮細胞が、表現型において同様の変化を受け、EMT/EndMTの一連の典型的な遺伝子を上方制御することをここで報告する20。従って、合理的な仮説は、CCM病変が、制御の効かない動態及び脳血管の内皮細胞におけるb-カテニンシグナル伝達の位置に起因するということである。
【０１４９】
網膜並びに脳内皮細胞においてNorrin/Frizzled4による標準的なWnt経路の活性化が、細胞自律的及び細胞非自律的両方のシグナル伝達によって発達及び維持プログラムを誘導すると最近報告された41。これは、中枢神経系の異なる領域における局所脈管表現型を説明することができる41。CCMにおいて調節解除されたb-カテニンシグナル伝達は、Wnt/b-カテニン経路の内皮自律的活性化若しくは環境Wntに対する変異した内皮細胞の異常な応答、又はその2つの組合せのいずれかによって支持される可能性がある。本発明者らのデータは、これらの機序の少なくとも1つ目が、CCM3遺伝子の除去後の培養内皮細胞において作動するように見えることを示す。実際、いくつかのb-カテニン標的及び前駆細胞/EndMTマーカーの発現はドミナントネガティブTcf4により阻害されるので、その発現は、CCM3-ノックアウト内皮細胞における基本条件でb-カテニン転写シグナル伝達によって活性化される。Glading及びGinsberg10は、RNA干渉を使用するCCM1の除去後に、培養のウシ大動脈内皮細胞及び初代ヒト動脈内皮細胞においてb-カテニン転写活性の同様の活性化を報告した。in vitro及びin vivo両方で、上皮細胞におけるCCM1によるb-カテニンシグナル伝達の阻害も報告された。加えて、ApcMin/+マウスにおけるb-カテニン駆動腸腺腫の表現型が、CCM1+/-バックグラウンドにおいて悪化すると報告された。これは、他の細胞並びに内皮細胞におけるb-カテニンシグナル伝達にCCM1及びおそらくCCM3より一般的な調節する役割があることを示唆する。家族性CCM患者において腸及び他の新生組織形成の発生が増加するように見えないので、CCM病状に対する脈管並びに器官の局在化の特異性は、内皮の分化及び/又は器官における局所的要因が、突然変異した表現型の発現に関してWnt/b-カテニンシグナル伝達と協調することを示唆する42。特に、CCM3について知られている限り、ニューロン細胞におけるこの遺伝子の突然変異は星状細胞を活性化し、この病状に似ている脈管病変を生じさせる9。従って、これは神経血管の単位内の細胞クロストークの重要性を補強する。
【０１５０】
活性b-カテニンの核蓄積は、突然変異した遺伝子型の著しい特徴であるように見えるが、本発明者らは、CCM3-ノックアウト内皮細胞の核内へのb-カテニンの濃縮を駆動する過程の直接的な指標を持たない。一般に、b-カテニンの核蓄積を調節する分子機構の問題は、実質的に不明なままである(総説については18を参照のこと)。しかしながら、核内への濃縮の増加と同時に、本発明者らは、CCM3の内皮細胞特異的欠失の、本発明者らのin vitro及びin vivo両方のモデルにおいてb-カテニンが細胞-細胞接合部から分離することを観察した。接合部b-カテニンは、VE-カドヘリン、付着接合部の膜貫通構成要素43、及びb-カテニン破壊複合体44と殆どの場合関連している。CCM3-ノックアウト内皮細胞において、付着接合部は、CCM145、46及びCCM26の除去後にも観察されるように無秩序である。加えて、CCM1の除去後にも観察されるように10、VE-カドヘリンと結合したb-カテニンは、ここで減少する。このb-カテニンとVE-カドヘリンとの結合の低下は、核内への活性b-カテニンの蓄積を伴うことが推測される。僅かな内皮細胞、及びVE-カドヘリン-ノックアウト内皮細胞において観察されるように、核内への活性b-カテニンのこの濃縮は、内皮細胞における接合部安定性の低下の条件を特徴づける17。これらの場合の両方において、b-カテニンの総量は、更に非常に低いレベルに減少する。但し残りの活性b-カテニンは核に蓄積する。活性b-カテニンの総量が実際に低下するので、核内への活性b-カテニンの「受動的」再分布によるプロテアソーム分解の阻害は、可能性が低くいように見える。
【０１５１】
特に興味深いことに、本発明者らは、b-カテニン転写シグナル伝達の2つの阻害剤であるスリンダクスルフィド及びスルホン化スリンダクを同定し、これらはCCM3- ECKOマウスにおいて脈管病変の発達も阻害する。これらの薬剤は両方とも、ヒト患者の結腸癌に対して著しい化学的予防効力を有するNSAIDであり、他の型の癌の実験モデルにおいて評価中である47〜52。スルホン化スリンダクは、抗血小板活性を欠くので、CCMなどの脈管奇形により特徴づけられる病状の療法に対してスリンダクスルフィドより潜在的に興味深い。スルホン化スリンダクに対するスリンダクスルフィドの相対的な効力は、癌の型によって変わる33、53〜56。結論として、特異的薬理学的ツールによる内皮細胞におけるb-カテニンシグナル伝達の標的化は、特にCCM患者において、脈管奇形の減少及び新たな脈管病変の出現の予防に有効な戦略を表す。
【０１５２】
[参考文献] 
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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