(57)【要約】本開示は、可溶性単一特異性抗体複合体を用いてヒトのT細胞またはNK細胞を活性化および増加させるための組成物および方法を提供する。2017528133.tif 000004
2017528133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの可溶性単一特異性複合体を含む組成物と共に、T細胞またはNK細胞を含有するサンプルを培養する段階を含む、T細胞またはNK細胞を活性化する方法であって、各可溶性単一特異性複合体が、T細胞またはNK細胞上の同じ抗原に結合する連結された2つの結合タンパク質を含む、方法。
【請求項２】
前記組成物が少なくとも2つの異なる単一特異性抗体複合体を含み、一方の単一特異性抗体複合体がT細胞またはNK細胞上の第1の抗原に結合し、他方の単一特異性抗体複合体がT細胞またはNK細胞上の第2の抗原に結合する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が少なくとも3つの異なる単一特異性抗体複合体を含み、T細胞またはNK細胞上で、第1の抗原に第1の単一特異性抗体複合体が結合し、第2の抗原に第2の単一特異性抗体複合体が結合し、第3の抗原に第3の単一特異性抗体複合体が結合する、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
結合タンパク質が抗体またはそれらの断片である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
可溶性単一特異性複合体が四量体抗体複合体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
四量体抗体複合体（TAC）が、1つの種に由来する2つの抗体に、該第1の動物種の抗体のFc部位に結合する第2の種由来の2つの抗体分子が結合したもので構成される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
一方の単一特異性抗体複合体がT細胞上の第1の抗原に結合し、他方の単一特異性抗体複合体がT細胞上の第2の抗原に結合する、T細胞を活性化するための、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
第1の抗原がCD3である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
第2の抗原がCD28である、請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
第3の抗原がCD2である、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
T細胞の活性化が、増強されたT細胞増殖である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
T細胞の活性化が、増強されたサイトカイン産生である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
T細胞の活性化が、増強されたT細胞増加である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
一方の単一特異性抗体複合体がNK細胞上の第1の抗原に結合し、他方の単一特異性抗体複合体がNK細胞上の第2の抗原に結合する、NK細胞を活性化するための、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
第1の抗原がCD335である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
第2の抗原がCD2である、請求項14または15記載の方法。
【請求項１７】
NK細胞の活性化が、増強されたNK細胞増殖である、請求項1〜6または請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
NK細胞の活性化が、増強されたサイトカイン産生である、請求項1〜6または請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
NK細胞の活性化が、増強されたNK細胞増加である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
T細胞またはNK細胞がヒトのものである、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2014年9月4日に出願された米国特許仮出願第62/045,591号に対する優先権を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、ヒトのT細胞またはNK細胞を活性化および増加させるための、可溶性単一特異性抗体複合体の方法および組成物に関連する。
【背景技術】
【０００３】
背景
宿主の耐性および適応免疫は、複雑かつ重大な、ヒトの健康の構成要素である。Tリンパ球は、宿主の耐性の維持において主要な役割を担う制御性T細胞；環境刺激に従って免疫応答を行うCD4+ヘルパーT細胞およびCD8+細胞傷害性T細胞のようなエフェクターサブセットを含む、様々なサブセットで構成されている。
【０００４】
インビトロにおけるT細胞の成長および増殖のための方法は、多くの異なるアプローチに基づいて行われてきた。ある状況においては、抗原提示細胞およびIL-2のような、アクセサリー細胞および外因性の増殖因子を使用することによってT細胞を活性化し、増加させる。これには、T細胞の活性化および／または増加の過程においてアクセサリー細胞や増殖因子が存在すること、および補充されることが必要となる。
【０００５】
あるいは、T細胞の活性化および増加のために用いられる試薬は、プレートのような固相表面上または磁気ビーズ上に直接的または間接的に抗CD3抗体を固定化したものの組み合わせからなる。固相化された抗CD3抗体によって提供されるT細胞の一次活性化シグナルに加えて、抗CD28抗体によって提供される二次共刺激シグナルが必要となる。T細胞の増殖を増強するためには、IL-2のような外因性の増殖因子またはサイトカインを加えることもできる。
【０００６】
CD3に対する抗体は、多くのポリクローナルT細胞刺激プロトコールにおける重要な要素である。T細胞受容体によるコグネイト抗原認識がない場合に、固定化抗CD3がヒトT細胞の活性化および増加を仲介できることがDixon et al.によって初めて示された。抗CD3は、T細胞表面上のT細胞受容体複合体の構成要素を架橋することによって、活性化および増殖シグナルカスケードを開始させる；したがって、固定化が必要とされる。続いて、T細胞の十分な活性化には、固定化抗CD3と組み合わせて、固定化または可溶性のいずれかの抗CD28刺激からの第2のシグナルが必要とされることがBaroja et al.によって示された。CD2、LFA-1、およびCD137（4-1BB）などの他のTNFファミリー分子のような接着リガンドによって提供される付加的な共刺激シグナルは、付加的な増殖シグナルまたは生存シグナルをT細胞に与えることが可能である（Smith-Garvin et.al.）。
【０００７】
固定化抗CD3抗体でコーティングした組織培養プレートを用いたT細胞の活性化のための商品はCorningから入手することができ（BioCoat (商標) T細胞活性化プレート、Cat #354725）、当業者に公知の標準法を用いて、研究者によって広範に調製されている。可溶性抗CD28抗体を外因的に加えて、T細胞の活性化および増殖を開始させるために必要な共刺激シグナルを提供することができる（Kruisbeek et. al.）。
【０００８】
米国特許第6,352,694号では、直径4.5umの磁気粒子上に固定化された抗CD3抗体および抗CD28抗体を用いた、T細胞の活性化および増加のための方法が説明されている。
【０００９】
米国特許第8,012,750B2号では、T細胞を活性化するための生分解性装置について説明されている。以前の開示と同様に、方法ではT細胞に結合して活性化することができる抗体で間接的にコーティングした生分解性のミクロスフェアを使用する。
【００１０】
米国特許出願第14/035,089号では、T細胞に活性化シグナルを与えるために抗CD3および／または抗CD28を固定化した柔軟性ナノマトリックスを使用することについて説明されている。そこでは、T細胞活性化抗体が固定化された、T細胞の表面上に形成できる柔軟性の足場として機能する1〜500 nmのサイズのデキストランマトリックスが開示されている。
【００１１】
固定化抗体とは異なり、可溶性の抗体複合体は、より穏やかな活性化シグナルをT細胞に与えることが可能である。米国特許出願公開第2007/0036783号では、T細胞の活性化および増加を開始できる、ある抗CD3抗体に第2の抗CD28抗体が複合したもので構成される、可溶性二重特異性四量体抗体複合体(TAC)の使用について説明される。彼らは、このアプローチによってより穏やかな刺激が与えられ、その結果、活性化により誘導される細胞死が固定化抗体法と比べて低減すると主張している。この出願の発明者らは、四量体抗体複合体が実際に可溶性であり、刺激の過程において培養用プラスチック製品上には吸着されないことを十分には示さなかった。さらに、発明者らは、二重特異性四量体抗体複合体の使用が、刺激を受けたT細胞の活性化および増加に関与するということに特定して述べている。
【発明の概要】
【００１２】
概要
本発明者らは、インビトロにおいてヒトの初代T細胞またはNK細胞を活性化および増加させるために可溶性単一特異性四量体抗体複合体を使用する方法を開発した。特に、本発明者らは、可溶性単一特異性四量体抗体複合体を用いることで、二重特異性四量体抗体複合体を用いた場合を上回るT細胞の活性化が得られることを明らかにした。本発明者らはまた、可溶性単一特異性四量体抗体複合体を用いると、可溶性単一特異性四量体抗体複合体を含まずに培養されたNK細胞と比べて、NK細胞の活性化が促進されることも明らかにした。
【００１３】
可溶性単一特異性TACでは、細胞増加後に大きな磁気粒子を除去する必要がなく、細胞を洗浄していかなる非結合可溶性TAC複合体をも除去できる；また、特定の抗体でコーティングされたプレートまたはマトリックスも必要ないため、固定化抗体法に勝る利点がある。
【００１４】
したがって、本開示は、少なくとも1つの可溶性単一特異性複合体を含む組成物と共に、T細胞またはNK細胞を含有するサンプルを培養する段階を含む、T細胞またはNK細胞を活性化する方法であって、各可溶性単一特異性複合体が、T細胞またはNK細胞上の同じ抗原に結合する連結された2つの結合タンパク質を含む、方法に関連する。
【００１５】
ある態様において、組成物は、少なくとも2つの異なる単一特異性抗体複合体を含み、一方の単一特異性抗体複合体がT細胞またはNK細胞上の第1の抗原に結合し、他方の単一特異性抗体複合体がT細胞またはNK細胞上の第2の抗原に結合する。任意で、組成物は、少なくとも3つの異なる単一特異性抗体複合体を含み、T細胞またはNK細胞上の、第1の抗原に第1の単一特異性抗体複合体が結合し、第2の抗原に第2の単一特異性抗体複合体が結合し、第3の抗原に第3の単一特異性抗体複合体が結合する。
【００１６】
ある態様においては、本明細書において説明される、T細胞またはNK細胞上の抗原に結合する結合タンパク質は、抗体またはそれらの断片である。ある態様においては、可溶性単一特異性複合体は四量体抗体複合体（TAC）である。ある態様においてTACは、1つの動物種に由来する2つの抗体に、第1の動物種の抗体のFc部位に結合する第2の種由来の2つの抗体分子が結合したもので構成される。
【００１７】
ある態様において、本明細書で説明される方法は、T細胞を活性化するためのものである。ある態様において本方法は、T細胞上の第1の抗原に結合する1つの単一特異性抗体複合体と、T細胞上の第2の抗原に結合する別の単一特異性抗体複合体を含む組成物と共に、T細胞を含有するサンプルを培養する段階を含む。ある態様においては、第1の抗原はCD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、およびHLA-DRから選択され、第2の抗原はCD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、およびHLA-DRから選択される異なる抗原である。ある態様においては、第1の抗原はCD3である。ある態様においては、第2の抗原はCD28である。ある態様においては、第3の抗原はCD2である。
【００１８】
ある態様において、T細胞の活性化とは、増強されたT細胞の増殖、増強されたサイトカイン産生、および／または増強されたT細胞の発現である。
【００１９】
ある態様において、本開示では、インビトロにおいてヒトT細胞の最適なポリクローナル活性化および増加を誘導するために、ヒトCD3、CD28、およびCD2を標的とする可溶性単一特異性四量体抗体複合体を使用することについて説明する。そのような態様においては、該組成物はCD3、CD28、およびCD2を標的とする3つの異なる可溶性単一特異性複合体を含む。
【００２０】
別の態様においては、本明細書において説明する方法は、NK細胞を活性化するためのものである。ある態様において本方法は、NK細胞上の第1の抗原に結合する1つの単一特異性抗体複合体、およびNK細胞上の第2の抗原に結合する別の単一特異性抗体複合体を含む組成物と共に、NK細胞を含有するサンプルを培養する段階を含む。ある態様においては、第1の抗原はCD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1、およびCD27から選択され、第2の抗原はCD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1、およびCD27から選択される異なる抗原である。ある態様においては、第1の抗原はCD335である。ある態様においては、第2の抗原はCD2である。
【００２１】
ある態様において、NK細胞の活性化とは、増強されたNK細胞の増殖、増強されたサイトカイン産生、および／または増強されたNK細胞の発現である。
【００２２】
ある態様において本開示は、ヒトNK細胞のインビトロにおける活性化および増加を誘導するための、ヒトCD335およびCD2を標的とする可溶性単一特異性四量体抗体複合体の使用について説明する。そのような態様においては、該組成物は、CD335およびCD2を標的とする、2つの異なる可溶性単一特異性複合体を含む。
【００２３】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の好ましい態様を示しているものの、例証として与えられているに過ぎず、ゆえにこの詳細な説明から、本開示の精神および範囲内における様々な変更および改変が当業者には明らかとなることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】CFSE色素希釈法によって評価された、CD3もしくはCD28に特異的な単一特異性TACの混合物を用いた、またはCD3およびCD28に対する二重特異性TACの混合物を用いた、7日間の培養後のヒトT細胞の増殖の結果を示す。
【図２】未処理の、またはブロッキングした組織培養プレートを使用し、可溶性単一特異性TAC組成物およびDynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズを用いたT細胞の活性化および増殖の結果を示す。
【図３】可溶性単一特異性TAC組成物またはDynabead（登録商標） Human T-Activator CD3/CD28ビーズによる刺激後の、短期間細胞内サイトカイン産生アッセイの結果を示す。
【図４】可溶性単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACまたはDynabead（登録商標） Human T-Activator CD3/CD28ビーズを21日間用いて増加させたT細胞の代表的な画像を示す。
【図５】可溶性単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACまたはDynabead（登録商標） Human T-Activator CD3/CD28ビーズのいずれかを用いた、21日間のT細胞増加の結果を示す。
【図６】図6Aは、IL-2を加えたImmunoCult-XF培地において、単一特異性CD335/CD2 TACによって刺激せずに、または刺激して維持されたNK細胞の純度を示す。図6Bは、単一特異性CD335/CD2 TACによって刺激せずに、または刺激して維持された細胞の総数における変化を示す。500 IU/mLのIL-2の存在下におけるNK細胞単独での培養と比較すると、500 IU/mLのIL-2の存在下における、NKp46（CD335）およびCD2 TACカクテルによる刺激後には、NK細胞の活性化の増強が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本開示は、四量体抗体複合体のような単一特異性複合体を用いて、インビトロにおいてヒトのT細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞を活性化および増加させる方法を提供する。
【００２６】
したがって、ある態様において本開示は、少なくとも1つの可溶性単一特異性複合体を含む組成物と共に、T細胞を含有するサンプルを培養する段階を含む、T細胞を活性化する方法であって、各可溶性単一特異性複合体が、T細胞上の同じ抗原に結合する連結された2つの結合タンパク質を含む、方法を提供する。ある態様において本開示はまた、少なくとも1つの可溶性単一特異性複合体を含む組成物と共に、NK細胞を含有するサンプルを培養する段階を含む、NK細胞を活性化する方法であって、各可溶性単一特異性複合体がNK細胞上の同じ抗原に結合する連結された2つの結合タンパク質を含む、方法も提供する。ある態様においては、IL-2および／または、IL-7もしくはIL-15のような、1つもしくは複数の他のサイトカインの存在下においてNK細胞が培養される。ある態様においては、T細胞またはNK細胞はヒトの細胞である。
【００２７】
本明細書において使用される「可溶性単一特異性複合体」という用語は、同じ抗原に結合する、互いに直接的または間接的に連結された2つの結合タンパク質を含む複合体を意味する。2つの結合タンパク質は可溶性であり、表面、粒子またはビーズ上には固定化されない。ある態様においては、結合タンパク質はT細胞上の同じ抗原に結合する。他の態様においては、結合タンパク質はNK細胞上の同じ抗原に結合する。
【００２８】
ある態様においては、2つの結合タンパク質は同じ結合タンパク質であり、抗原上の同じエピトープに結合する。
【００２９】
本明細書において使用される「二重特異性複合体」という用語は、各結合タンパク質がT細胞またはNK細胞上の異なる抗原に結合する、互いに直接的または間接的に連結された2つの異なる結合タンパク質を含む複合体を意味する。
【００３０】
「T細胞を活性化する」という用語は、T細胞の増殖を誘導すること、T細胞からのサイトカイン産生を誘導すること、およびT細胞の増加を誘導することを含むが、それらに限定されない。
【００３１】
「T細胞上の抗原」は、CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、およびHLA-DRを含むが、それらに限定されず、T細胞を活性化する任意の抗原であり得る。
【００３２】
「NK細胞を活性化する」という用語は、NK細胞の増殖を誘導すること、NK細胞からのサイトカイン産生を誘導すること、およびNK細胞の増加を誘導することを含むが、それらに限定されない。
【００３３】
「NK細胞上の抗原」は、CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1およびCD27を含むが、それらに限定されず、NK細胞を活性化する任意の抗原であり得る。
【００３４】
特定の態様においては、結合タンパク質は抗体またはそれらの断片である。使用できる抗体断片は、組換え供給源由来の、および／またはトランスジェニック動物個体において作製された、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、およびdsFv断片を含む。抗体または断片は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、およびヒトを含む任意の種に由来することが可能である。キメラ抗体誘導体、即ちヒトではない動物の可変領域とヒトの定常領域とを組み合わせた抗体分子も、本発明の範囲内に企図される。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラット、または他の種の抗体に由来する抗原結合ドメインをヒト定常領域と共に含む、ヒト化抗体を含み得る。キメラ抗体を作製するためには従来法を使用することができる（例えば、Morrison et al.；Takeda et al.、Cabilly et al.、米国特許第4,816,567号；Boss et al.、米国特許第4,816,397号；Tanaguchi et al.、欧州特許第171496号；欧州特許公報第0173494号、英国特許第GB2177096B号を参照のこと）。ヒト化抗体の調製については、EP-B 10 239400において説明されている。ヒト化抗体は商業的に生産することも可能である（Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain.）。キメラ抗体は、対応する非キメラ抗体と比べて、ヒト対象における免疫原性がより低いことが期待される。ヒト化抗体は例えば国際公開公報第00/61635号において説明されるように、さらに安定化させることが可能である。
【００３５】
T細胞抗原またはNK細胞抗原に結合する抗体またはそれらの断片は、商品として入手することが可能であるか、または、当業者が調製することが可能である。
【００３６】
ある態様においては、同じ抗原に結合する2つの抗体またはそれらの断片が直接的に連結されている。抗体の直接的な連結は、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸（SPDP）の使用により、1つの抗体を他の抗体に化学的に結合させることによって調製することができる。
【００３７】
別の態様においては、可溶性単一特異性複合体において2つの抗体が間接的に連結されている。「間接的に連結された」は、2つの抗体が互いに共有結合的に直接連結してはいないが、免疫複合体のように連結部分を介して付着されていることを意味する。好ましい態様においては、四量体抗体複合体を調製することによって、2つの抗体が間接的に連結される。四量体抗体複合体は、同じ抗原に結合する同じ動物種由来のモノクローナル抗体を、第1の動物種の抗体のFc断片を標的とする、第2の動物種のおよそ等モル量のモノクローナル抗体と混合することによって調製できる。第1および第2の抗体は、第1の動物種の抗体のFc断片を標的とする第2の動物種のモノクローナル抗体のおよそ等モル量のF(ab’)2断片を用いて反応させることもできる（四量体抗体複合体およびそれを調製する方法の説明については、参照として本明細書に組み入れられるLansdorpの米国特許第4,868,109号を参照のこと）。
【００３８】
ある態様において、組成物は、各々がT細胞上の異なる抗原に結合する、少なくとも2つの異なる単一特異性複合体を含む。ある態様において、組成物は、少なくとも2つの異なる可溶性単一特異性複合体を含み、少なくとも2つの異なる可溶性単一特異性複合体の各々はCD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、およびHLA-DRからなる群より選択される、異なる抗原に結合する。
【００３９】
特定の態様においては、1つの単一特異性複合体がCD3に結合し、第2の単一特異性複合体がCD28に結合する。
【００４０】
別の態様において、組成物は、T細胞上の3つの異なる抗原のうちの1つに各々が結合する、少なくとも3つの異なる可溶性単一特異性複合体を含む。そのような態様においては、どの2つの単一特異性複合体も同じ抗原には結合しない。  
【００４１】
特定の態様において、組成物は、1つがCD3に特異的であり、2つ目がCD28に特異的であり、3つ目がCD2に特異的である、3つの異なる可溶性単一特異性複合体を含む。
【００４２】
特定の態様においては、可溶性単一特異性複合体の存在下におけるT細胞の活性化は、2つの異なる結合タンパク質または抗体を含み、その各々がT細胞上の異なる抗原に結合する、二重特異性複合体を用いたT細胞の活性化を上回る。
【００４３】
T細胞を含有するサンプルは、全血、T細胞を含むアフェレーシスサンプルもしくは末梢血単核細胞、精製初代ヒトT細胞、または不死化ヒトT細胞株を含むが、それらに限定されず、T細胞の活性化が所望される任意のサンプルでよい。
【００４４】
ある態様において、組成物は、NK細胞上の異なる抗原に各々が結合する、少なくとも2つの異なる単一特異性複合体を含む。
【００４５】
特定の態様においては、1つの単一特異性複合体がCD335に結合し、第2の単一特異性複合体がCD2に結合する。
【００４６】
別の態様において、組成物は、NK細胞上の2つの異なる抗原のうちの1つに各々が結合する、少なくとも2つの異なる可溶性単一特異性複合体を含む。そのような態様においては、どの2つの単一特異性複合体も同じ抗原には結合しない。ある態様において、組成物は、少なくとも2つの異なる可溶性単一特異性複合体を含み、少なくとも2つの異なる可溶性単一特異性複合体の各々はCD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1およびCD27からなる群より選択される、異なる抗原に結合する。
【００４７】
特定の態様において、組成物は、1つがCD335に特異的であり、2つ目がCD2に特異的である、2つの異なる可溶性単一特異性複合体を含む。ある態様において、組成物は、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1、およびCD27から選択される抗原に対して特異的な、少なくとも1つの付加的な可溶性単一特異性複合体を含む。
【００４８】
特定の態様においては、可溶性単一特異性複合体の存在下におけるNK細胞の活性化は、可溶性単一特異性複合体を用いないNK細胞の活性化を上回る。
【００４９】
NK細胞を含有するサンプルは、全血、NK細胞を含むアフェレーシスサンプルもしくは末梢血単核細胞、精製初代ヒトNK細胞、または不死化ヒトNK細胞株を含むが、それらに限定されず、NK細胞の活性化が所望される任意のサンプルでよい。
【００５０】
組成物
本開示は、可溶性単一特異性複合体がT細胞またはNK細胞上の同じ抗原に結合する連結された2つの結合タンパク質を含む、少なくとも1つの可溶性単一特異性複合体を含む組成物をも包含する。
【００５１】
別の態様において、組成物は、1つの可溶性単一特異性複合体がT細胞またはNK細胞上の1つの抗原に結合し、第2の可溶性単一特異性複合体がT細胞またはNK細胞上の異なる抗原に結合する、2つの可溶性単一特異性複合体を含む。
【００５２】
別の態様において、組成物は、各々の複合体がT細胞上の異なる抗原に結合する、3つの可溶性単一特異性複合体を含む。特定の態様においては、抗原はCD3、CD28、およびCD2である。
【００５３】
別の態様において、組成物は、各々の複合体がNK細胞上の異なる抗原に結合する、2つの可溶性単一特異性複合体を含む。特定の態様においては、抗原はCD335およびCD2である。
【００５４】
使用
本開示は、治療におけるその使用を含むが、それに限定されず、活性化されたT細胞またはNK細胞の全ての使用を包含する。
【００５５】
本開示の方法および組成物は、癌の養子免疫療法、急性もしくは持続性の病原体感染（ウイルス性、真菌性、細菌性、寄生虫性）、ワクチンの効力の調節、または自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病の免疫抑制を含むが、それらに限定されないT細胞またはNK細胞を必要とする任意の疾患または状態の治療においてインビボで用いるために、エクスビボにおいてT細胞またはNK細胞を増加させる目的で使用することができる。
【００５６】
以下の非限定的な実施例は、本開示を例証するものである：
【実施例】
【００５７】
実施例1
単一特異性CD3 TACおよびCD28 TACは、二重特異性CD3/CD28 TACの混合物と比較して、ヒトT細胞におけるより盛んな増殖を誘導する（図1）。二重特異性CD3/CD28 TACは、最初に等量の抗CD3抗体と抗CD28抗体とを混合することによって調製した。等量のラット抗マウスIgG1を添加して、二重特異性TACを形成させた。その結果生じたTAC混合物は、25％の単一特異性抗CD3 TAC、25％の単一特異性抗CD28 TAC、および50％の二重特異性抗CD3/抗CD28 TACを含有する（四量体抗体複合体およびそれを調製する方法の説明については、参照として本明細書に組み入れられる、Lansdorpの米国特許第4,868,109号を参照のこと）。
【００５８】
単一特異性CD3 TACおよびCD28 TACカクテルは、等量の抗CD3抗体または抗CD28抗体のいずれかを等量のラット抗マウスIgG1と混合することによって調製した。その結果生じた単一特異性TACを1：1の比率で混合し、50％抗CD3 TACと50％抗CD28 TACからなる単一特異性CD3およびCD28 TACカクテルを調製した。
【００５９】
RosetteSep（商標）を用いたネガティブ分離によって、新鮮なヒト全血からヒトT細胞を濃縮した（STEMCELL Technologies Inc.,Vancouver, Canada）。濃縮したCD4+T細胞を最終濃度1uMのCFDA-SEによって標識した。標識後、CFSE標識T細胞をXVIVO-15培地（Lonza, Basel, Switzerland）に再懸濁した。
【００６０】
1％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するリン酸緩衝液（PBS）で、96ウェル平底組織培養プレートを4℃で一晩ブロッキングした。1％HSAでブロッキングされたウェルにて、いずれも最終濃度0.5ug/mLの単一特異性CD3およびCD28 TACの存在下において、または二重特異性CD3/CD28 TACと共に、CFSE標識細胞を培養した。外因的なIL-2は培養に加えなかった。加湿した37℃、5％ CO2のインキュベーターにおいてサンプルを7日間培養した。培養7日後、CFSE色素希釈法（細胞増殖の指標）、ならびにCD4およびCD8の発現について、フローサイトメトリーによってサンプルを評価した。
【００６１】
結果から、単一特異性CD3およびCD28 TACは、二重特異性CD3/CD28 TACと比較して、CD4+T細胞およびCD8+T細胞のより盛んな増殖を誘導することが示される。刺激を受けていないCD4+T細胞およびCD8+T細胞の増殖は最低限であり、各々1.2％と1.5％であった。二重特異性TACによる刺激での27.4％と比較して、単一特異性TACによる刺激を受けたCD4+T細胞では、増殖は54.7％であった。二重特異性TACによる刺激での15.9％と比較して、単一特異性TACによる刺激を受けたCD8+ T細胞では、増殖は33.0％であった。本結果では、培養7日後にCFSE色素希釈法によって評価すると、単一特異性TAC単独でT細胞の増殖を誘導することができ、25％の単一特異性CD3およびCD28 TACならびに50％の二重特異性TACを含有する混合物では、T細胞増殖の誘導における効率がより低いことが示される。
【００６２】
実施例2
CD3およびCD28 TACと組み合わせた可溶性単一特異性CD2 TACは、ヒトT細胞の最適な活性化を誘導する（図2）。単一特異性TACは、実施例1において説明されるように調製した。抗ヒトCD3を用いて、抗CD3に対して特異的な単一特異性TACを調製した。抗ヒトCD28を用いて、単一特異性抗CD28 TACを調製した。抗ヒトCD2を用いて単一特異性抗CD2 TACを調製した。未処理のままの、または1％ HSAでブロッキングした96ウェルプレートにおいて、単一特異性TACの様々な組み合わせと共に、またはDynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズと共に、CFSE標識した精製ヒトT細胞を培養した。XVIVO-15培地における培養3日後のフローサイトメトリーによって、T細胞増殖（CFSE色素希釈法）に対するi)抗CD3 TAC単独、ii)抗CD3 TACおよび抗CD28 TAC、または、iii)抗CD3 TAC、抗CD28 TAC、および抗CD2 TACの組み合わせ効果を評価した。培養第6日目にGuava ViaCountアッセイを用いて生細胞数計測を行った。
【００６３】
細胞培養前に、96ウェル組織培養プレートのウェルは未処理のままとしたか、または、1％HSA含有PBSによって4Cで一晩ブロッキングした。細胞を培養する前に、PBSによってウェルを洗浄した。HSAによって抗体複合体が組織培養用プラスチック製品へ固定化されるのを回避し、懸濁液中の可溶性TACにより刺激が仲介されることが確実となる。
【００６４】
Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズ（サンプル#5および#10）は、ウェルの前処理に影響を受けず、CD4+T細胞およびCD8+T細胞双方の高レベルの増殖を誘導する。T細胞の増加にDynabeads（登録商標）を使用した場合、第6日目における総生細胞数はプレート処理間で同様である。CD3 TAC単独ではT細胞の増加を誘導するのに十分ではない（サンプル#2および#6）が、その一方、単一特異性CD3およびCD28 TACの組み合わせは、ウェルが未処理のままの場合、高レベルのT細胞増殖を誘導できる（サンプル#3）。1％ HSAでブロッキングしたウェルにおいてCD3およびCD28 TACを使用した場合には（サンプル#8）、同じ刺激を与えた未処理のウェルと比較してT細胞の増殖は著しく減少し、第6日目での総生細胞数が1.09E6から2.46E5にまで減っている。対照的に、単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACの組み合わせでは、Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズと同様に、HSAによるウェルのブロッキングの影響は最小限であった（サンプル#4および#9）。これらのデータから総合すると、単一特異性CD3およびCD28 TACのプレートへの固定化が、T細胞を活性化する際のその効果に影響することが示唆される。しかし、T細胞を刺激するために単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACの組み合わせを使用すれば、その効果はプレートへの固定化とは無関係に生じ、単一特異性TACは可溶型の様式で機能する。ビーズ表面に抗CD3および抗CD28抗体が固定化されているため、Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズもプレートの前処理には影響を受けない。
【００６５】
実施例3
可溶性単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACはT細胞によるサイトカイン産生を誘導できる（図3）。可溶性単一特異性TAC構築物の様々な組み合わせ、またはDynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズの存在下において、RosetteSep（商標）で濃縮したヒトT細胞を4時間培養した（図3）。培養にブレフェルジンAを加え、細胞内におけるサイトカイン蓄積をさせ、培養後にフローサイトメトリーによって評価を行った。培養を採取し、固定および透過処理の後に、細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカインについて染色した。
【００６６】
結果から、刺激4時間後のT細胞において、CD3 TAC単独ではIL-2とIFNγのいずれのサイトカイン産生も誘導されないことが示される（サンプル#1）。CD3およびCD28 TACの組み合わせでは、CD4+T細胞およびCD8+T細胞で各々2.4％および2.45％のIL-2産生が誘導される（サンプル#2）。CD3およびCD28 TACは、CD4+T細胞で0.5％、およびCD8+T細胞で1.0％のIFNγ産生をも誘導した。単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACの組み合わせでは、CD3およびCD28 TACのみのものと比較して、T細胞によるより高いレベルのIL-2およびIFNγの産生が誘導された（サンプル#3）。Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズでは、CD3、CD28、およびCD2の組み合わせと同様のレベルのIL-2が誘導されたが、IFNγはより高いレベルで誘導された（サンプル#4）。これらの結果から総合すると、CD3およびCD28 TACのみの場合と比較して、単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACの組み合わせでは、CD4+T細胞およびCD8+T細胞による、より高いレベルのサイトカイン産生を誘導することができるが、その一方、Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズは、より高いレベルのIFNγを誘導することが示される。IL-2はT細胞の増殖および分化の誘導を促進する一方、IFNγは抗ウイルス免疫応答の誘導に関与するエフェクターサイトカインである。
【００６７】
実施例4
21日間の工程における、Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズによる刺激を受けたT細胞と比較した、単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TAC による刺激を受けたT細胞の代表的な画像（10×および20×拡大）（図4）。EasySep（商標）によって濃縮したヒトT細胞を、30 U/mL組換えヒトIL-2の存在下において、ビーズ対細胞の比率を1：1としたDynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズ、または、最終濃度0.5ug/mLの単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACのいずれかと共に培養した。細胞の成長について培養をモニタリングし、細胞濃度は0.5〜2×10E6 細胞/mLに維持した。Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズまたは単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACによって、培養第7日目および第17日目にT細胞を再刺激した。
【００６８】
Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズ、ならびに単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACによって刺激を受けた培養では、同様の特徴を有するT細胞の増殖および増加が誘導される。Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズにおいて使用された4.5umビーズは、培養の中にはっきりと見える。Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズとは対照的に、TACによって刺激された培養では、下流のいかなる機能アッセイの前にも、細胞サイズのビーズがフローサイトメトリーのような下流での分析法を干渉し得るという理由でビーズを除去する必要がない。
【００６９】
実験例5
単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACと比較した、Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズを用いたヒトT細胞の長期培養および増加（図5）。30 U/mLの組換えヒトIL-2の存在下において、ビーズ対細胞の比率が1：1のDynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズ、または最終濃度0.5ug/mLの単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACのいずれかと共に、EasySep（商標）で濃縮した1×10E6 ヒトT細胞を培養した。細胞の成長について培養をモニタリングし、細胞濃度は0.5〜2×10E6細胞/mLに維持した。Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズまたは単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACを用いて、培養第7日目および第17日目にT細胞を再刺激し、培地を新鮮な培地に定期的に置き換えた。
【００７０】
第0日目において、EasySep（商標）で濃縮した1×10E6 T細胞を24ウェル組織培養プレートにプレーティングし、Dynabead（登録商標）Human T-Activator CD3/CD28ビーズまたは単一特異性CD3、CD28、およびCD2 TACを用いて刺激した。示された時点に、トリパンブルーと共に血球計算器を用いて総細胞数および生細胞数を計測した。結果から、TACによる刺激を受けた培養では、培養21日後に総T細胞数の増加と生T細胞数の増加がもたらされたことが示される。
【００７１】
実施例6
EasySep Human NK Cell Isolation Kit（STEMCELL Technologies, Cat#17955）を用いたネガティブ分離によってヒトNK細胞を単離した。500 IU/mLの組換えヒトIL-2を添加し、血清を含まず、かつ異種成分を含まないImmunoCult-XF培地（STEMCELL Technologies, Cat#10981）において、単離されたNK細胞（CD45+ CD3- CD56+）を1×106細胞/mLの細胞密度で培養した。NK細胞は付加的な刺激を受けなかった（刺激なし）か、または、各抗体の最終濃度0.5ug/mLの単一特異性CD335/CD2 TAC複合体によって刺激を受けた。第3、6、8、10、および13日目に、Nucelocounterを用いて総生細胞数を計測し、フローサイトメトリーによってNK細胞の純度を評価した。培養は、500 IU/mLのIL-2を添加した新鮮なImmunoCult-XF培地を加えて〜1×10^6細胞/mLを維持した。
【００７２】
図6Aにおいて示されるように、EasySepを用いて単離され、IL-2を添加したImmunoCult-XF培地において維持されたNK細胞では、付加的な刺激を受けたかどうかに関わらず、第0日目から第6日目にかけて84.5％から94％に純度が増加した。培養第13日目までNK細胞の純度は同様のレベルで維持された。
【００７３】
図6Bにおいて示されるように、単一特異性CD335/CD2 TAC複合体によって刺激を受けたNK細胞では、第8日目から第10日目の間に細胞数が増加し、CD335/CD2刺激培養においてNK細胞数が1.72倍増加した時点である第13日目まで増加が続いた。
【００７４】
好ましい実施例であると現在考えられることに関して本開示は説明してきたが、本開示は、開示された実施例に限定されるものではないことが理解されるべきである。反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる、様々な改変および同等の態様を包含することが意図される。
【００７５】
各々の刊行物、特許または特許出願がその全体が参照により組み入れられると具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００７６】
本明細書において参照される文献についての引用の詳細
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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