(57)【要約】本発明は、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞（ＤＣ）ワクチンに関する。一実施形態において、活性化抗原負荷ＤＣワクチンは、初回免疫化用量および複数の「ブースター」用量を含む。本発明は、ＨＥＲ−２発現性乳癌において永久的な腫瘍老化を引き起こす際の処置として、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３を両方とも遮断する方法も提供する。
2017522328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンを生成する方法であって、
少なくとも１つの抗原を樹状細胞（ＤＣ）に接触させること、
少なくとも１つのＴＬＲアゴニストで前記ＤＣを活性化させること、
前記ＤＣを、初回免疫化用量および複数のブースター用量を含む複数の用量に凍結保存すること
を含み、前記ＤＣが融解された場合、前記ＤＣが少なくとも１つのサイトカインの有効量を産生して、Ｔ細胞応答を発生させる、方法。
【請求項２】
前記ＤＣを融解することをさらに含み、前記ＤＣが少なくとも１つのサイトカインの有効量を産生して、Ｔ細胞応答を発生させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＬＲアゴニストがＬＰＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＦＮ−γにより前記ＤＣを活性化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結保存することが、前記ＤＣを、約５５％のプラズマライト、約４０％のヒト血清アルブミンおよび約５％のＤＭＳＯを含む凍結用培地中で凍結することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記凍結保存することが、前記ＤＣを、約−７０℃以下の温度で凍結することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
融解後のＤＣの回復率および生存率が、約７０％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
融解後のＤＣの回復率および生存率が、約８０％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＣが少なくとも約１週間、凍結保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記サイトカインがＩＬ−１２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＣがキラー機能を示し、それによって前記ＤＣが標的細胞を溶解することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物において免疫応答を誘発するための、凍結保存された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンであって、前記注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンが、
少なくとも１つの抗原を負荷されたＤＣを含み、
前記ＤＣが、少なくとも１つのＴＬＲアゴニストへの曝露によって活性化されており、
前記ＤＣが、少なくとも１つのサイトカインの有効量を産生して、Ｔ細胞応答を発生させる、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項１５】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項１６】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項１７】
前記ＴＬＲアゴニストがＬＰＳである、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項１８】
前記ＤＣがＩＦＮ−γへの曝露によって活性化されている、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項１９】
前記ワクチンが、約５５％のプラズマライト、約４０％のヒト血清アルブミンおよび約５％のＤＭＳＯを含む凍結用培地中、約−７０℃以下の温度で凍結保存されている、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項２０】
融解後のＤＣの回復率および生存率が、約７０％以上である、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項２１】
融解後のＤＣの回復率および生存率が、約８０％以上である、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項２２】
組成物が少なくとも約１週間、凍結保存される、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項２３】
前記サイトカインがＩＬ−１２である、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
【請求項２４】
哺乳動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１４に記載の前記凍結保存された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンの用量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
癌を有するかまたは発症するリスクのある対象を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に、癌を処置するかまたは癌を発症するリスクを低減するのに有効な量の樹状細胞ワクチンおよびＨＥＲ−２の阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
ケモカイン調節剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ケモカイン調節剤が、ＴＬＲアゴニストである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ケモカイン調節剤が、ＴＬＲ８アゴニストである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌を処置するかまたは前記癌を発症するリスクを低減するのに有効な量の癌医薬を投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌医薬が、手術、抗癌剤、化学療法剤、免疫療法剤およびホルモン療法からなる群から選ばれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫、膵臓癌、消化管癌、脳癌およびその任意の組み合わせからなる群から選ばれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記樹状細胞ワクチンが、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つのＴＬＲアゴニストと接触している、活性化された樹状細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記樹状細胞ワクチンが、前記樹状細胞中の細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用剤および活性化剤と接触している、活性化された樹状細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記作用剤が、細胞質からのカルシウムの輸送を遮断することによって、細胞内カルシウムレベルを上昇させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記作用剤がカルシウムイオノフォアを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記カルシウムイオノフォアが、Ａ２３１８７およびイオノマイシンからなる群から選ばれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記樹状細胞ワクチンが、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンの形態にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
対象の腫瘍部位中の免疫細胞の遊走および活性を改善する方法であって、腫瘍部位中の免疫細胞が腫瘍細胞の攻撃においてより有効であるように、前記腫瘍中の免疫応答を変化させるのに有効な量の樹状細胞ワクチンおよびＨＥＲ−２の阻害剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
ケモカイン調節剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ケモカイン調節剤が、ＴＬＲアゴニストである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ケモカイン調節剤が、ＴＬＲ８アゴニストである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌を処置するかまたは前記癌を発症するリスクを低減するのに有効な量の癌医薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌医薬が、手術、抗癌剤、化学療法剤、免疫療法剤およびホルモン療法からなる群から選ばれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫、膵臓癌、消化管癌、脳癌およびその任意の組み合わせからなる群から選ばれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記樹状細胞ワクチンが、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つのＴＬＲアゴニストと接触している、活性化された樹状細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記樹状細胞ワクチンが、前記樹状細胞中の細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用剤および活性化剤と接触している、活性化された樹状細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
作用剤が、細胞質からのカルシウムの輸送を遮断することによって、細胞内カルシウムレベルを上昇させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記作用剤がカルシウムイオノフォアを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記カルシウムイオノフォアが、Ａ２３１８７およびイオノマイシンからなる群から選ばれる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記樹状細胞ワクチンが、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンの形態にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記樹状細胞ワクチンおよびＨＥＲ−２の阻害剤が、前記腫瘍部位に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
前記樹状細胞ワクチン、ＨＥＲ−２の前記阻害剤および前記ケモカイン調節剤が、前記腫瘍部位に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
癌を有するかまたは発症するリスクのある対象を処置するための方法であって、前記対象においてＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を阻害し、それによってＨＥＲ−２発現性乳癌において腫瘍老化を引き起こすことを含む、方法。
【請求項５４】
ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を阻害することが、前記対象に阻害剤を投与することを含み、前記阻害剤が、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３両方の阻害剤であるかまたはＨＥＲ−２阻害剤およびＨＥＲ−３阻害剤の組み合わせである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記阻害剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、抗体、ペプチド、化学化合物および小分子からなる群から選ばれる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
樹状細胞ワクチンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを前記対象に投与することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを前記対象に投与することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０２５，６７３号、２０１５年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／１６５，４４５号、２０１４年７月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０２５，６８５号、２０１４年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０２９，７７４号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、微生物または癌性細胞からさえもタンパク質抗原を獲得し、Ｔ細胞にこれらの抗原を示し、または「提示」する白血球である。Ｔ細胞は、こうしてＤＣにより活性化され、次いで、脅威に挑戦する全身性の免疫応答を開始する。微生物に対する従来のワクチンは、ワクチン接種された個体内で多くの可能な手段によってＤＣ活性を高め、ワクチン誘発性の免疫応答を増幅する、「アジュバント」として知られる添加剤を含有する。しかしながら、癌に対するワクチンの必要条件は、多くの特有の問題を示す。例えば、従来のアジュバントは、ＤＣが癌に対する最適の免疫を開始することを可能とする適切なシグナルをＤＣに提供しない。腫瘍自体もまた、ＤＣの適切な活性化に影響を及ぼしうる環境を作り出す。
【０００３】
この問題に対する一般的な解決法は、癌患者からＤＣを取り出し、インビトロでそれらに腫瘍抗原を負荷し、次いで、体にそれらを再投与する前に、該細胞に特有の活性化シグナルを供給することである。これは、腫瘍環境の影響により排除された適切なＤＣ活性化を確実にする。体に戻されると、ＤＣはＴ細胞と相互作用して強力な抗腫瘍性免疫を開始する。追加の物質化を受けた（ｅｘｔｒａ−ｃｏｒｐｏｒｅａｌｉｚｅｄ）ＤＣは多くの有効性の問題を解決したが、歴史的に見て、これは価格が実際上の制約となった。例えば、ＤＣワクチンは生きた細胞からなるため、特別な細胞処理およびワクチン生産施設が、治療を投与する医療センターの実際の場所において必要とされた。これは、治療を送達するための高価で非効率的な方法であり、なぜなら、そのような処置を投与する各機関が、特別な用途のための独自の施設を建設し、維持しなければならないからである。
【０００４】
現在、乳癌の管理は、早期診断と積極的な処置の組み合わせに依存し、これは、手術、放射線療法、化学療法およびホルモン療法などの１つまたは複数の処置を含みうる。ハーセプチン（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２陽性乳癌細胞のための標的療法として開発され、（Ｔａｘｏｌの商品名で販売される）分裂抑制剤パクリタキセルを含む他の治療とともに使用されることが多い。
【０００５】
単剤療法としてのハーセプチンの有効性は、３０％未満と推定されており；パクリタキセルなどの微小管安定化薬物とのコンビナトリアル処置は、有効性を約６０％まで増大させる（Ｂｕｒｒｉｓら、２０００年、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２７：１９〜２３頁）。ハーセプチンによる処置は、Ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の蓄積およびその後のＧ１／Ｓ細胞周期の停止を結果として生じ、パクリタキセルは、有糸分裂への移行を停止させ、これは細胞死をもたらしうる。しかしながら、大きな期待にもかかわらず、高用量のハーセプチンまたはパクリタキセルは、望ましくない副作用をもたらす。さらに、癌は、ハーセプチンおよび／またはパクリタキセルに対する抵抗性ができることが多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｕｒｒｉｓら、２０００年、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２７：１９〜２３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、最大限の治療ＤＣワクチンを生産するための組成物および有効な方法ならびにハーセプチンを用いて癌を処置する新しい方法に対する、まだ満たされていない必要性がある。よって、本技術分野には、乳癌および他の悪性腫瘍を処置または予防するためのさらなる免疫治療的アプローチを有することが必要とされている。本発明はこの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と合わせて読まれる場合、より良く理解される。本発明を例解する目的で、現在好ましい実施形態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示された実施形態の配置および手段そのものに限定されないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】凍結保存されたＤＣ１の生存率および収率を示すチャートである。細胞が直接融解され、計数されたとき、細胞の回復率は平均８９％であり、生存率は９５％であった。
【図２】細胞の生存率（ｐ＝．４８０７）および回復率（ｐ＝．１２２０）において有意差がなかったことを示すチャートである。
【図３】両集団が同様の初期（ＬＰＳ添加後７時間）のＩＬ−１２ｐ７０分泌（ｐ＝．０７６８）を有したことを示すチャートである。集団は、３０時間の観察期間にわたって、同等のＩＬ−１２ｐ７０分泌レベルを示し続け、集団間で有意差はなかった。
【図４】集団間で有意差はなかったことと、ＩＬ−１β（ｐ＝０．７９６０）、ＩＬ−１α（ｐ＝０．０８４１）、Ｒａｎｔｅｓ（ｐ＝０．９０２）、ＭＤＣ（ｐ＝０．１５１４）、ＩＬ−１０（ｐ＝．１９３７）、ＭＩＰ−１α（ｐ＝．２６７３）、ＩＰ−１０（ｐ＝０．７３６６）、ＩＬ−６（ｐ＝０．２４）、ＩＬ−５（ｐ＝０．０７３５）、ＴＮＦ−β（ｐ＝０．９４２２）、ＩＬ−１５（ｐ＝０．８８７８）、ＭＩＰ−１β（ｐ＝０．９２１７）、ＴＮＦ−α（ｐ＝０．８９７２）、ＩＬ−８（ｐ＝０．７８４４）の産生を示すチャートである。
【図５】凍結保存されたおよび凍結保存されなかったＤＣからのＩＦＮ−γの産生を示すチャートである。
【図６】Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、乳癌細胞において相乗的に老化を誘導し、必要用量は、ＨＥＲ２発現と逆相関することを示す図である。図６Ａ。ＳＫ−ＢＲ−３乳癌系統が、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γとともに５日間インキュベートされ、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養され、次いで、ＳＡ−β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）発現（老化マーカー）について染色され、未処理の対照細胞と比較された。対のサイトカインのみが老化を誘導した。上のパネル、３つの独立した実験の１つからの代表的データ。下のパネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。図６Ｂ。Ａに記載の細胞の細胞ライセートが、ｐ１５ＩＮＫｂおよびｐ１６ＩＮＫ４ａ発現についてウエスタンブロッティングにより分析された。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。図６Ｃ。Ｔ−４７Ｄ乳癌細胞が、未処理で（１）または以下の濃度のＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γ：１０ｎｇ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍＬ（２）、５０ｎｇ／ｍｌおよび５００Ｕ／ｍＬ（３）、７５ｎｇ／ｍｌおよび７５０Ｕ／ｍＬ（４）、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０００Ｕ／ｍＬ（５）、とともに５日間インキュベートされ、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養された。次いで、細胞をＳＡ−β−ｇａｌについて染色し、対照未処理細胞または陽性対照としての８μＭエトポシドで処理したものと比較された（６）。上のパネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。下のパネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。図６Ｄ。Ｔｈ１サイトカインである、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αによる併用処置は、未処理の対照と比較して、より大きな老化をＳＫ−ＢＲ−３（１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α＋１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ）およびＴ−４７Ｄ（１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α＋１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ）細胞においてもたらし；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（２００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α＋２０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ）は、二重のＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α処理によって大きく影響を受けないままであった。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。
【図７】ＨＥＲ２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞において老化とアポトーシスを誘導することを示す図である。図７Ａ。ｗｔＨＥＲ２（ｐｃＤＮＡＨＥＲ２）または列挙された濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γで５日間処理された空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）でトランスフェクトされ、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ＳＡ−β−ｇａｌ染色が実行された。左パネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。右パネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。図７Ｂ。Ａに記載の細胞の細胞ライセートが、ｐ１５ＩＮＫｂ発現および切断されたカスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティングにより分析された。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。差し込み図。ＨＥＲ２特異的抗体によりプローブされたｐｃＤＮＡＨＥＲ２またはｐｃＤＮＡ３により安定にトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のウエスタンブロット。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。
【図８】ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を併せて遮断した状態での発現が、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞におけるＴｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる老化誘導およびアポトーシスを亢進することを示す図である。図８Ａ。非標的（ＮＴ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ２およびＨＥＲ３ｓｉＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされ、次いで、列挙された濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γで５日間処理され、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養されたＳＫ−ＢＲ−３細胞において、ＳＡ−β−ｇａｌ染色が実行された。左パネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。右パネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。図８Ｂ。Ａに記載の細胞の細胞ライセートが、ｐ１５ＩＮＫｂ発現および切断されたカスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティングにより分析された。差し込み図。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３特異的抗体でプローブしたＮＴ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＳＫ−ＢＲ−３のウエスタンブロット。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。
【図９】ＨＥＲ２阻害およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体化阻害の組み合わせが、Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによるＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞における老化誘導およびアポトーシスを亢進することを示す図である。図９Ａ。未処理（１）または１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ（２）もしくは１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ（Ｔｚｍ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒ）（３）で処理されたまたは両処理の組み合わせ（４）で５日間処理され、抗体およびサイトカインの非存在下でさらに２回継代培養された、ＳＫ−ＢＲ−３においてＳＡ−β−ｇａｌ染色が実行された。左パネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。右パネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。図９Ｂ。Ａに記載の細胞の細胞ライセートが、ｐ１５ＩＮＫｂまたは切断されたカスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティングにより分析された。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。図９Ｃ。未処理または上記のように処理されたＳＫ−ＢＲ−３細胞のアポトーシスの誘導が、アネキシンＶおよびＰＩについての染色により実行され、フローサイトメトリーにより分析された。上のパネル、プロットは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データである。下のパネル、濃度測定分析。データは、３つの独立した実験からのアネキシンＶ＋ＰＩ＋細胞の平均±ＳＥＭとして表される。
【図１０】トラスツズマブおよびペルツズマブによる併用処理は、ＨＥＲ２過剰発現ヒト乳癌細胞のＣＤ４＋Ｔｈ１介在性の老化およびアポトーシスを亢進することを示す図である。図１０Ａ。トランスウエルシステムを用いて、０．５×１０５個のＳＫ−ＢＲ−３細胞が、１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ（Ｔｚｍ）およびペルツズマブ（Ｐｅｒ）を含むかまたは含まずに、５×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞単独（ＣＤ４＋のみ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞＋０．５×１０５個のＨＥＲ２クラスＩＩペプチド（ＤＣ  Ｈ）または無関係のクラスＩＩＢＲＡＰまたはサバイビンペプチド（ＤＣ  ＢもしくはＤＣ  Ｓ）それぞれでパルスした１型極性化成熟ＤＣ、およびＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＨＥＲ２（ｉＤＣ  Ｈ）でパルスした未成熟ＤＣとともに５日間、共培養された。次いで、細胞は、遮断抗体および免疫系細胞の非存在下で、さらに２回継代培養され、次いで、ＳＡ−β−ｇａｌ発現について染色され、未処理の対照細胞と比較された。上のパネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。下のパネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。図１０Ｂ。トラスツズマブおよびペルツズマブの存在下でＤＣ  Ｈ／ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した場合、ｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ−３発現の増加は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の誘導された老化およびアポトーシスをそれぞれ示唆するが、ＤＣ  Ｂ、ＤＣ  ＳおよびｉＤＣ  Ｈ群からの場合はそうでなかった。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。結果は、３つの独立した実験の代表的なものである。
【図１１】Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、トラスツズマブおよびペルツズマブ抵抗性乳癌細胞を老化およびアポトーシス誘導に対して増感させることを示す図である。図１１Ａ。ＳＡ−β−ｇａｌ染色が、それぞれ、未処理の（１）または５日間、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで処理され（２）、または１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ（Ｔｚｍ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒ）で処理され（３）、または同濃度のトラスツズマブ、ペルツズマブおよびＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの組み合わせで処理され（４）、抗体およびサイトカインの非存在下でさらに２回継代培養されたＨＣＣ−１４１９およびＪＩＭＴ−１細胞において実行された。上のパネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。下のパネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。図１１Ｂ。図１１Ａに記載の細胞の細胞ライセートが、ｐ１５ＩＮＫｂまたは切断されたカスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティングにより分析された。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。
【図１２】ＩＦＮＧＲおよびＴＮＦＲは、乳癌細胞株において、それらのＨＥＲ２レベルに依存せず、同レベルで発現される。固定化されたＭＣＦ−１０Ａ哺乳動物上皮細胞および乳癌細胞株（ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における、ウエスタンブロットにより決定されたＩＦＮＧＲ、ＴＮＦＲおよびＨＥＲ２の発現。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。
【図１３】ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を併せて遮断した状態での発現が、Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる老化誘導を、ＭＣＦ−７乳癌細胞において亢進することを示す図である。図１３Ａ。非標的（ＮＴ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ２およびＨＥＲ３ｓｉＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされ、次いで、列挙された濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γで５日間処理され、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養されたＭＣＦ−７細胞においてＳＡ−β−ｇａｌ染色が実行された。左パネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。右パネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。図１３Ｂ。Ａに記載の細胞の細胞ライセートが、ｐ１５ＩＮＫｂまたは切断されたカスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティングにより分析された。差し込み図。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３特異的抗体でプローブされた、ＮＴ，ＨＥＲ２またはＨＥＲ３またはＨＥＲ２およびＨＥＲ３ｓｉＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のウエスタンブロット。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。
【図１４】Ｔｈ１により産生されたサイトカインの、ＳＫ−ＢＲ−３の老化およびアポトーシスに対する効果を示す図である。図１４Ａ。トランスウエルシステムを用いて、０．５×１０５個のＳＫ−ＢＲ−３細胞が、５×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞単独（ＣＤ４＋のみ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞＋０．５×１０５個のＨＥＲ２クラスＩＩペプチド（ＤＣ  Ｈ）または無関係のクラスＩＩＢＲＡＦペプチド（ＤＣ  Ｂ）それぞれでパルスした１型極性化成熟ＤＣ、およびＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＨＥＲ２（ｉＤＣ  Ｈ）またはＢＲＡＦ（ｉＤＣ  Ｂ）でパルスした未成熟ＤＣとともに５日間、共培養された。次いで、細胞は、免疫系細胞の非存在下で、さらに２回継代培養され、次いで、ＳＡ−β−ｇａｌ発現について染色され、未処理の対照細胞と比較された。ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、ＣＤ４＋／ＤＣ  Ｈで処置されたＳＫ−ＢＲ−３において誘導された老化は、特異的抗体でＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを中和することによって、部分的にレスキューされた（７５．２７％レスキュー）。上のパネル、濃度測定分析。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。下のパネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。図１４Ｂ。ＤＣ  Ｈ／ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した場合、ＤＣ  Ｂ、ｉＤＣ  ＨおよびｉＤＣ  Ｂ群と比較して、ｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ−３発現の増加は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の老化およびアポトーシス誘導を示唆する。ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、ＣＤ４＋／ＤＣ  Ｈで処理したＳＫ−ＢＲ−３において誘導された老化およびアポトーシスは、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α特異的抗体を中和することによって、部分的にレスキューされた。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。結果は、３つの実験の代表的なものである。
【図１５】乳癌細胞株における、へレグリンによるＡＫＴ活性化に対するトラスツズマブおよびペルツズマブの効果を示す図である。図１６Ａ。血清不足のＴ−４７Ｄ、ＨＣＣ−１４１９およびＪＩＭＴ−１細胞が、トラスツズマブ（Ｔｚｍ）およびペルツズマブ（Ｐｅｒ  １０μｇ／ｍｌ、９０分）により処理され、そして、（ＨＲＧ、２０ｎｇ／ｍｌ、５分）で刺激された。上のパネル、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データ。下のパネル、濃度測定分析。データは、トラスツズマブおよびペルツズマブの非存在下でのＨＲＧ反応の％として表し、平均±Ｓ．Ｄ．として表す（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、癌または他の障害の個別化された処置および予防のための、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンを生産するための組成物および方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス１型極性化樹状細胞ワクチン（ＤＣ１）を生産するための組成物および方法を提供する。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、抗原負荷され、予備活性化された状態、つまり、「シリンジレディ（ｓｙｒｉｎｇｅ  ｒｅａｄｙ）、すなわち、（例えば、ＦＤＡ命令による）追加の施設および品質管理／保証ステップを要求するいかなる追加の細胞プロセシングも必要としない、患者への即時注射に好適な、複数用量用アリコートとして樹状細胞を凍結保存する方法を提供する。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン、好ましくは、最大効果を示す注射用複数用量抗原パルス１型極性化樹状細胞ワクチンを効率的に生産する方法を提供する。
【００１３】
一実施形態において、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンは、一人の患者の白血球除去においてＤＣを収集することによって生産される。好ましくは、白血球除去および樹状細胞ワクチンの生産は、その初回免疫化用量および複数の「ブースター」用量からなる活性化された抗原負荷ＤＣワクチンを作り出すためにＤＣが操作される、集中型ワクチン生産施設であることのできる第１の場所において実行される。本発明の利益は、ＦＤＡ命令によるすべての品質管理／品質保証ステップが中央施設において実行されること、ならびに完了および解除後、すべてのワクチン用量が凍結保存され、患者への連続的投与のために遠隔の医療センターへ発送されることである。一実施形態において、本発明のＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンは、投与現場においていかなる義務化された品質管理／品質保証ステップも必要としない。
【００１４】
別の態様において、本発明は、癌を処置するのに有効な治療が、腫瘍部位中の免疫細胞が腫瘍細胞の攻撃においてより有効であるように、腫瘍における免疫応答を変化させることを含む、という発見に基づく。いくつかの場合において、有効な治療は、腫瘍部位中の免疫細胞の遊走および活性を改善することを含む。よって、本発明は、癌を処置するための処置レジメンとして、樹状細胞ワクチンをＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を阻害する組成物（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブなど）とともに使用する組成物および方法を提供する。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、癌を処置するための処置レジメンとして、樹状細胞ワクチンをＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数の遮断とともに使用するための組成物および方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、樹状細胞ワクチンを、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの添加によるＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３の遮断とともに使用する組成物および方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、癌を処置するための処置レジメンとして、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの添加によるＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を遮断する組成物および方法を提供する。
【００１６】
一実施形態において、本発明の処置レジメンは、抗オンコドライバー（ｏｎｃｏｄｒｉｖｅｒ）Ｔｈ１免疫応答（例えば、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）とＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数に関するオンコドライバー遮断を誘導する併用療法を含む。
【００１７】
一実施形態において、本発明の処置レジメンは、癌を処置するために使用可能であり、したがって、あるタイプ抗癌療法であると考えられる。別の実施形態において、本発明の処置レジメンは、手術、化学療法、放射線療法（例えば、Ｘ線）、遺伝子療法、免疫療法、ホルモン療法、ウイルス療法、ＤＮＡ療法、ＲＮＡ療法、タンパク質療法、細胞療法、ナノ療法などを含むが、それに限定されない別の抗癌療法と併用することができる。
【００１８】
一実施形態において、本発明の処置レジメンは、他の抗癌療法を受ける前に使用される。別の実施形態において、本発明の処置レジメンは、他の抗癌療法を受けるのと同時に使用される。別の実施形態において、本発明の処置レジメンは、他の抗癌療法を受けた後に使用される。
【００１９】
定義
別段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものに類似するまたは等価な任意の方法および材料が本発明の実践または試験において使用可能であるが、好ましい方法および材料が記載される。
【００２０】
一般に、本明細書中で使用される専門語ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、本技術分野で周知であり、一般に採用されるものである。
【００２１】
標準的技術が核酸およびペプチド合成に使用される。該技術および手順は、一般に、本技術分野における慣用方法および多様な一般的参考文献（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら、２０１２年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ）に従って実行され、これらが本書類全体にわたって提供される。
【００２２】
本明細書中で使用される専門語ならびに以下に記載の分析化学および有機合成において使用される実験室手順は、本技術分野で周知であり、一般に採用されるものである。標準的技術およびその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。
【００２３】
本明細書中で使用される以下の各用語は、この項におけるそれに関連した意味を有する。
【００２４】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中で、該冠詞の文法的目的語の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例えば、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１つ超の要素を意味する。
【００２５】
本明細書中で使用される「約」は、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合、そのような変動が開示された方法を実行するために適切である場合、特定された値からの±２０％、または±１０％、または±５％、または±１％、または±０．１％の変動を包含することを意図する。
【００２６】
生物、組織、細胞またはその構成要素の関係で使用される場合、用語「異常」は、少なくとも１つの観察可能なまたは検出可能な特徴（例えば、年齢、処置、時間など）において、「正常な」（期待される）各特徴を提示する生物、組織、細胞またはその構成要素と異なる、生物、組織、細胞またはその構成要素を指す。１つの細胞または組織タイプについて正常なまたは期待される特徴は、異なる細胞または組織タイプについては異常であるかもしれない。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「抗原」または「ａｇ」は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫担当細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含みうる。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役目を果たすことを理解する。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来することができる。当業者は、本明細書中でこの用語が使用される場合、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、したがって、「抗原」をコードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長のヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解する。本発明が、１つ超の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、それに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が多様な組み合わせで配置されて所望の免疫応答を誘発することは、すぐに明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によりコードされる必要が全くないことを理解する。抗原が合成により生成可能であるかまたは生体サンプルに由来しうることはすぐに明らかである。そのような生体サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体体液を含むことができるが、それに限定されない。
【００２８】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞を活性化することができる細胞であり、単球／マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含むが、それに限定されない。
【００２９】
「抗原負荷ＡＰＣ」または「抗原パルスＡＰＣ」は、抗原に曝露され、抗原により活性化されたＡＰＣを含む。例えば、ＡＰＣは、例えば、抗原の存在下での培養中、インビトロでＡｇ負荷することができる。ＡＰＣは、抗原への曝露によってインビボで負荷することもできる。「抗原負荷ＡＰＣ」は、従来、２つの方法のうちの１つ：（１）抗原ペプチドとして知られる、小さなペプチド断片がＡＰＣの外側に直接「パルス」される；または（２）ＡＰＣが全タンパク質またはタンパク質粒子とともにインキュベートされ、次いで、これがＡＰＣにより消化される、により調製される。これらのタンパク質は、ＡＰＣによって小さなペプチド断片に消化され、最終的には、ＡＰＣ表面に運搬され、提示される。さらに、抗原負荷ＡＰＣは、抗原をコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することによっても作り出されうる。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答に起因する障害として定義される。自己免疫疾患は、不適切かつ過剰な自己抗原への反応の結果である。自己免疫疾患の例としては、中でも、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、ジストロフィー型表皮水泡症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、リウマチ関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられるが、それに限定されない。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「自己の」は、それが後で再導入される個体と同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「Ｂ細胞」は、骨髄および／または脾臓に由来する細胞と定義される。Ｂ細胞は、抗体を産生する形質細胞に発達する。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「癌」は、その独特の形質−正常な制御の喪失−が未制御の増殖、分化の喪失、局部組織への浸潤、および／または転移をもたらす細胞の過剰増殖として定義される。例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌および肺癌が挙げられるが、それに限定されない。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「凍結保存された」または「凍結保存」は、凍結保存用培地中に再懸濁され、約−７０℃以下の温度で凍結された細胞を指す。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「凍結保存用培地」は、細胞サンプル中の少なくともいくらかの細胞が、融解後、回復され、生存能力のあるままでいられるように、凍結に備えて細胞サンプルと混合された任意の培地を指す。
【００３６】
用語「樹状細胞」（ＤＣ）は、インビボ、インビトロ、エクスビボまたは宿主もしくは対象中に存在するか、あるいは造血幹細胞または単球に由来することができる抗原提示細胞である。樹状細胞およびそれらの前駆細胞は、多様なリンパ器官、例えば、脾臓、リンパ節から、ならびに骨髄および末梢血から単離することができる。ＤＣは、樹状細胞体から複数の方向に広がる薄いシート（葉状仮足）を有する特徴的な形態を有する。典型的に、樹状細胞は、高レベルのＭＨＣおよび共刺激（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）分子を発現する。樹状細胞は、Ｔ細胞の抗原特異的な分化をインビトロで誘導することができ、インビトロおよびインビボで一次Ｔ細胞応答を惹起することができる。
【００３７】
本明細書中で使用される「活性化ＤＣ」は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストに曝露されたＤＣである。活性化ＤＣは、抗原を負荷されてもされなくてもよい。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「成熟ＤＣ」は、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）を含む分子を発現する樹状細胞と定義される。対照的に、未成熟樹状細胞は、低レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）分子を発現し、まだなお抗原を取り込むことができる。「成熟ＤＣ」は、インビボ、インビトロ、エクスビボまたはＤＣ１−極性化された（すなわち、完全に細胞性免疫を促進することができる）宿主もしくは対象に存在する抗原提示細胞も指す。
【００３９】
「疾患」は、動物の健康状態であって、ここで、該動物はホメオスタシスを維持することができず、該疾患が寛解させられないと、該動物の健康は悪化し続ける。
【００４０】
動物における「障害」は、該動物がホメオスタシスを維持することができる健康状態であるが、該障害が存在しないよりは好ましくない健康状態である。未処置で放置した場合、障害は動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
【００４１】
患者により経験された疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の重症度または頻度が低減される場合、該疾患または障害は「緩和される」。
【００４２】
本明細書中で、「有効量」または「治療的有効量」は交換可能に使用され、本明細書に記載の特別な生物学的結果を達成するために有効な化合物、製剤、材料または組成物の量を指す。そのような結果は、本技術分野で好適な任意の手段によって決定されるウイルス感染の阻止を含みうるが、それに限定されない。
【００４３】
本明細書に記載の「内因性」は、生物、細胞、組織または系に由来するかまたはその内部で産生される任意の材料を指す。
【００４４】
本明細書に記載の用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外部から導入されるかまたは外部で産生される任意の材料を指す。
【００４５】
「エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性」癌は、ＥＲの発現についての試験で陽性の結果が出る癌である。反対に「ＥＲ陰性」癌は、そのような発現についての試験で陰性の結果が出る。ＥＲの状態の分析は、本技術分野で知られた任意の方法により実行することができる。
【００４６】
「ＨＥＲ受容体」は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属し、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１，ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）受容体を含む、受容体タンパク質チロシンキナーゼである。一般に、ＨＥＲ受容体は、細胞外ドメインを含み、これは、ＨＥＲリガンドを結合し、ならびに／または別のＨＥＲ受容体分子；脂溶性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；および数個のリン酸化されうるチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナリングドメインと二量体化しうる。ＨＥＲ受容体は、「天然配列」のＨＥＲ受容体またはその「アミノ酸配列バリアント」でありうる。好ましくは、ＨＥＲ受容体は、天然配列のヒトＨＥＲ受容体である。
【００４７】
「ＨＥＲ経路」は、ＨＥＲ受容体ファミリーによって仲介されるシグナリングネットワークを指す。
【００４８】
「ＨＥＲ活性化」は、任意の１つまたは複数のＨＥＲ受容体の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化は、（例えば、ＨＥＲ受容体または基質ポリペプチド中のＨＥＲ受容体リン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインにより引き起こされる）シグナル伝達を結果として生じる。ＨＥＲ活性化は、目的のＨＥＲ受容体を含むＨＥＲダイマーに結合しているＨＥＲリガンドにより仲介されうる。ＨＥＲダイマーに結合しているＨＥＲリガンドは、ダイマー中の１つまたは複数のＨＥＲ受容体のキナーゼドメインを活性化し、それによって、１つもしくは複数のＨＥＲ受容体中のチロシン残基のリン酸化および／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどのさらなる基質ポリペプチド（複数可）中のチロシン残基のリン酸化を結果として生じうる。
【００４９】
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患と定義される。代表的な過剰増殖性疾患としては、癌または自己免疫疾患が挙げられるが、それに限定されない。他の過剰増殖性疾患は、例えば、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、または炎症性腸疾患を含みうる。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「阻害する」は、例えば、対照値と比較して約１０パーセント、活性または機能を抑制または遮断することを意味する。好ましくは、活性は、対照値と比較して５０％、より好ましくは７５％、さらに好ましくは９５％抑制または遮断される。本明細書中で使用される「阻害する」は、分子、反応、相互作用、遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現、安定性、機能または活性を、測定可能な量だけ低減するかまたは完全に防止することも意味する。阻害剤は、例えば、タンパク質、遺伝子およびｍＲＮＡに結合して、部分的にまたは完全に、刺激を遮断し、活性化を減少させ、防止し、遅延させ、不活性化し、脱感作し、または安定性、発現、機能および活性を下方制御する化合物、例えば、アンタゴニストである。
【００５１】
本明細書中で使用される「指導用資料」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用される刊行物、記録、ダイアグラムまたは任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの指導用資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を入れた容器に添付され、または該核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を入れた容器とともに発送することができる。あるいは、指導用資料は、レシピエントによって指導用資料および化合物が協同的に使用される意図をもって、容器とは別に発送されうる。
【００５２】
「単離された」は、自然の状態から変更されるまたは除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは、「単離され」ていないが、その自然の状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同一の核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在しうるか、または例えば、宿主細胞などの非自然の環境中に存在しうる。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「調節すること」により、処置または化合物の非存在下の対象における応答のレベルおよび／またはその他は同一であるが未処置の対象における応答のレベルと比較した、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を仲介することが意味される。この用語は、自然のシグナルまたは応答を攪乱させおよび／または影響を及ぼし、それによって対象、好ましくはヒトにおいて有益な治療反応を仲介することを包含する。
【００５４】
本明細書中で使用される「集団」は、均一な、実質的に均一な、または不均一な細胞の培養物を含む、単離された培養物への言及を含む。一般に、「集団」は、「単離された」細胞の培養物とも見なされうる。
【００５５】
本明細書中で使用される「組換え細胞」は、組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
【００５６】
本明細書中で使用される「サンプル」または「生体サンプル」は、器官、組織、エキソソーム、血液、血漿、唾液、尿および他の体液を含むが、これに限定されない、対象からの生体物質を意味する。サンプルは、対象から得られた材料の任意の供給源でありうる。
【００５７】
本明細書中で使用される「シグナル１」は、一般に、活性化されたＤＣからＴ細胞へ伝えられる第１の生化学的シグナルを指す。シグナル１は、ＤＣの表面において発現された抗原によって提供され、Ｔ細胞受容体を通してＴ細胞により感知される。
【００５８】
本明細書中で使用される「シグナル２」は、ＤＣからＴ細胞に提供される第２のシグナルを指す。シグナル２は、通常、（他の共刺激分子が知られているが）ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である、活性化されたＤＣにおける「共刺激」分子により提供され、表面受容体ＣＤ２８を通してＴ細胞により感知される。
【００５９】
本明細書中で使用される「シグナル３」は、一般に、活性化されたＤＣにより提供された（通常はサイトカインである）可溶性タンパク質から生成されるシグナルを指す。これらは、Ｔリンパ球上の受容体を通して感知される。３番目のシグナルは、現在の脅威に最もよく対処するために、どの形質的または機能的特徴を獲得すべきかをＴ細胞に指導する。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「特異的に結合する」により、抗体などの、別の分子または特徴を認識し、それに結合するが、サンプル中の他の分子または特徴を実質的に認識せず、それに結合しない分子が意味される。
【００６１】
用語「対象」、「患者」、「個体」などは、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載の発明に受け入れられるインビトロまたはインサイチュいずれかの任意の動物またはその細胞を指す。ある一定の非限定的な実施形態において、患者、対象または個体はヒトである。
【００６２】
本明細書中で使用される用語「Ｔ細胞」は、様々な細胞性免疫応答に参加する胸腺由来細胞と定義される。
【００６３】
細胞に関して本明細書中で使用される用語「Ｔヘルパー」は、当業者により同定可能な様々な細胞タイプを含むリンパ球（あるタイプの白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）の下位群を示す。特に、本開示によるＴヘルパー細胞は、（Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７などの）エフェクターＴｈ細胞を含む。これらのＴｈ細胞は、他の白血球を刺激するかまたはそれと相互作用するサイトカイン、タンパク質またはペプチドを分泌する。
【００６４】
本明細書中で使用される「Ｔｈ１Ｔ細胞」は、高レベルのサイトカインＩＦＮ−γを産生し、宿主細胞および癌の内部に生存する一定の病原微生物に対して効果が高いと考えられるＴ細胞を指す。
【００６５】
本明細書中で使用される「Ｔｈ１７Ｔ細胞」は、高レベルのサイトカインＩＬ−１７およびＩＬ−２２を産生し、粘膜表面上に生存する一定の病原微生物に対して効果が高いと考えられるＴ細胞を指す。
【００６６】
「治療的有効量」は、患者に投与された場合に疾患の症状を寛解させる、本発明の化合物の量である。「治療的有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患の状態およびその重症度、処置される患者の年齢などに依存して変動する。治療的有効量は、自身の知識および本開示を考慮して、当業者により日常的に決定することができる。
【００６７】
用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、本明細書に記載の治療的または予防的手段を指す。「処置」の方法は、疾患もしくは再発した疾患の１つもしくは複数の症状を予防し、癒し、遅延させ、重症度を低減し、もしくは寛解させるため、またはそのような処置の非存在下での予測を超えて対象の生存を延長させるための、そのような処置を必要とする対象、例えば、疾患もしくは障害に苦しむ対象、または最終的にそのような疾患もしくは障害にかかる可能性がある対象への、本発明の組成物の投与を採用する。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「Ｔｏｌｌ様受容体」または「ＴＬＲ」は、生来の免疫系において役割を果たすタンパク質のクラスと定義される。ＴＬＲは、微生物由来の構造的に保存された分子を認識する、単一膜貫通型非触媒作用性受容体である。ＴＬＲは、リガンドに結合した際に、免疫細胞の反応を活性化する。
【００６９】
本明細書中で使用される用語「Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト」または「ＴＬＲアゴニスト」は、免疫細胞の反応を活性化するためにＴＬＲに結合するリガンドと定義される。
【００７０】
本明細書中で使用される用語「ワクチン」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへのその投与後に、免疫応答を誘発するために使用される材料として定義される。対象への導入に際して、ワクチンは、抗体、サイトカインの産生および／または他の細胞応答を含むが、それに限定されない、免疫応答を誘発することができる。
【００７１】
範囲：本開示全体を通して、本発明の多様な態様が範囲の形式で表されうる。範囲の形式における記載は、単に便利さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲への柔軟性のない制限と解釈されるべきでない。よって、範囲の記載は、すべての可能な部分的範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１から６までのような範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの部分範囲ならびに例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３および６などのその範囲内の個々の数を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず、当てはまる。
【００７２】
説明
本発明は、ＤＣの調製を含む。一実施形態において、ＤＣ調製物は、９０％超純粋である。別の実施形態において、ＤＣ調製物は、完全に活性化される。例えば、ＤＣは、サイトカインおよび／またはＴｏｌｌ様受容体リガンドによって活性化され、この状態は、本発明の凍結保存技術によって完全に維持される。本発明のＤＣ調製物の利益は、１回の白血球除去（患者収集物）から、いかなる専門の細胞プロセシング施設またはさらなる品質管理試験も要求されることなく、離れた処置場所において必要に応じて融解されうる、初回ワクチン＋複数（例えば、１０以上）の「ブースター」用量に効率的に凍結保存されるということである。
【００７３】
本明細書中で考慮されるとおり、本発明は、Ｔ細胞に対するより強いシグナルを生成して、より強力なＤＣに基づくワクチンを結果としてもたらす際に優れた機能性を有するＤＣを生成し、凍結保存するための方法を提供する。そのような細胞を有効に凍結保存することによって、後の使用のためにサンプルを貯蔵し、融解することができ、それによって、ワクチン生産の間に成分除去およびエルトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）を繰り返す必要性を低減することができる。ＤＣを凍結し、次いで、後にそれらを融解することが可能であることは有益である。なぜなら、それは、１ラウンドのワクチン生産が、小部分に分割され、凍結され、次いで、数週間、数か月または数年にわたって、免疫を強化する「ブースター」接種を与えるために、１回に１つずつ患者に投与されうることを意味するからである。
【００７４】
一実施形態において、本発明は、一人の患者の白血球除去においてＤＣを収集することによって生産された、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンを含む。ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンは、初回免疫化用量および複数の「ブースター」用量を含む。ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンは、凍結保存され、投与現場における特別な必要条件（例えば、ＦＤＡ命令によるＱＣ／ＱＡステップ）のない患者への一連の投与のために、離れた医療センターに発送することができる。
【００７５】
本発明は、凍結保存され、続いて融解された活性化ＤＣが、新たに採取されて活性化されたＤＣと同じく臨床的に有効であるような、抗原提示ならびに多様なサイトカインおよびケモカイン産生におけるそれらの効力ならびに機能性を融解後に保持するやり方でのこれらの活性化ＤＣの凍結保存にも関する。
【００７６】
本発明は、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を遮断するとともに抗ＨＥＲ−２  ＣＤ４  Ｔｈ１細胞を活性化することによって、細胞における腫瘍老化およびアポトーシスを誘導することにも関する。よって、本発明は、ＨＥＲ−２発現性乳癌における腫瘍老化を促進するために、ＨＥＲ−２に関するオンコドライバー遮断によって抗オンコドライバーＴｈ１免疫応答を促進するための組み合わせおよび方法を含む。一実施形態において、抗オンコドライバーＴｈ１免疫応を促進することは、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを含む。一実施形態において、ＨＥＲ−２に関するオンコドライバー遮断は、トラスツズマブおよびペルツズマブを含むが、それに限定されない、ＨＥＲ−２を遮断する任意の組成物を含む。
【００７７】
一実施形態において、本発明は、ＨＥＲ−２発現性乳癌の老化を誘導するための、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３の１つまたは複数を遮断することとＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの添加の組み合わせのための組成物および方法を含む。一実施形態において、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、ＣＤ４  Ｔｈ１細胞から分泌される。
【００７８】
一実施形態において、ＨＥＲ２は、乳癌細胞の老化およびアポトーシスを誘導するＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのメカニズムにおいて必要とされる。
【００７９】
一実施形態において、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、トラスツズマブおよびペルツズマブに対する感受性を乳癌抵抗性細胞に回復させる。一実施形態において、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−αは、癌患者に広く影響を及ぼす治療剤に対する抵抗性を取り消す。
【００８０】
ＤＣに基づく免疫療法
ＤＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役目を果たす多能性単球に由来する。ＤＣは、末梢組織において普遍的であり、そこで抗原を捕捉する準備ができている。抗原の捕捉に際して、ＤＣは抗原を小ペプチドにプロセシングし、二次的リンパ器官に向かって移動する。リンパ器官内で、ＤＣはナイーブＴ細胞に対して抗原ペプチドを提示し、それによって、Ｔ細胞分化を極性化させるシグナルのカスケードを開始する。曝露に際し、ＤＣは、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ結合ペプチドのいずれかに結合した抗原分子を提示し、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞をそれぞれ活性化する（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：２７１〜２９６頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２、２４５〜２５２頁；Ｓｔｅｉｎｍａｎら、２００７年、Ｎａｔｕｒｅ  ４４９：４１９〜４２６頁；Ｇｉｎｈｏｕｘら、２００７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  ２０４：３１３３〜３１４６頁；Ｂａｎｅｒｊｅｃら、２００６年、Ｂｌｏｏｄ  １０８：２６５５〜２６６１頁；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９９年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １８９：６１１〜６１４頁；Ｒｅｉｄら、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１１４〜１２１頁；Ｂｙｋｏｖｓｋａｉａら、１９９９年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．  ６６：６５９〜６６６頁；Ｃｌａｒｋら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  ２：２５７〜２７２頁）。
【００８１】
ＤＣは、適応免疫応答の誘導、協調および調節に関与し、免疫系の自然アームおよび適応アームのエフェクター間の連絡を統合する役目も果たす。これらの特徴は、ＤＣを免疫療法のための強力な候補とした。ＤＣは、マクロピノサイトーシスおよび受容体依存性エンドサイトーシスによって環境をサンプリングする独特の能力を有する（Ｇｅｒｏｅｒら、２００８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：１５５〜１６４頁；Ｓｔｏｉｔｚｎｅｒら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５７：１６６５〜１６７３頁；Ｌａｎｚｅｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３４８〜３５４頁；Ｄｅｌａｍａｒｒｅら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０７（５７１５）：１６３０〜１６３４頁）。
【００８２】
ＤＣは、その抗原提示能力を高めるために成熟シグナルも必要とする。ＤＣは、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０Ｌまたはカルシウムシグナル伝達物質などの追加の成熟シグナルを提供することによって、（第２のシグナル分子としても知られる）ＣＤ８０およびＣＤ８６などの表面分子の発現を上方制御する（Ｃｚｅｒｎｉｅｅｋｉら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３８２３〜３８３７頁；Ｂｅｄｒｏｓｉａｎら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２３：３１１〜３２０頁；Ｍａｉｌｌｉａｒｄら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４、５９３４〜５９３７頁；Ｂｒｏｓｓａｒｔら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９２：４２３８〜４２４７頁；Ｊｉｎら、２００４年、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６５：９３〜１０３頁）。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含むサイトカインの混合物が、ＤＣを成熟させる能力を有することが確立されている（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、２０００年、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍ．Ｒｅｓ．  ２９２：３２５〜３３２頁）。ＤＣは、抗原でパルスされる前に、カルシウムイオノフォアによっても成熟されうる。
【００８３】
ＰＫＲおよびＭＤＡ−５などの病原体認識受容体（Ｋａｌａｌｉら、２００８年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１：２６９４〜２７０４頁；Ｎａｌｌａｇａｔｌａら、２００８年、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．  ５（３）：１４０〜１４４頁）に加えて、ＤＣは、病原体からの危険性を感知することもできるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）として知られる一連の受容体も含有する。これらのＴＬＲが誘発されると、一連の活性変化がＤＣにおいて誘発され、これがＴ細胞の成熟およびシグナル伝達をもたらす（Ｂｏｕｌｌａｒｔら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７（１１）：１５８９〜１５９７頁；Ｋａｉｓｈｏら、２００３年、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．  ３（４）：３７３〜３８５頁；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（５５２８）：２５３〜２５６頁；Ｎａｐｏｉｉｔａｎｉら、２００５年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６（８）：７６９〜７７６頁）。ＤＣは、ナチュラルキラーγ−δＴ細胞およびα−βＴ細胞などの細胞介在性応答の多様なアームを活性化し、拡張することができ、いったん活性化されると、ＤＣはその免疫化能力を保持する（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：２７１〜２９６頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５〜２５２頁；Ｒｅｉｄら、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：１１４〜１２１頁；Ｂｙｋｏｖｓｋａｉａら、１９９９年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：６５９〜６６６頁；Ｃｌａｒｋら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  ２：２５７〜２７２頁）。
【００８４】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストにより活性化された、成熟し抗原負荷されたＤＣであって、好ましくは疾患過程の早期に使用された場合に、臨床的に有効な免疫応答を誘発することのできるＤＣを含む。本発明のＤＣは、望ましいレベルのサイトカインおよびケモカインを産生し、さらに、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する能力を有する。
【００８５】
一実施形態において、本発明は、抗原パルスされた樹状細胞ワクチンの大規模生産の方法を提供する。一実施形態において、該方法は、急速に樹状細胞を成熟させること、該樹状細胞を凍結保存すること、および凍結保存された細胞を融解することを含み、ここで、融解された樹状細胞は、Ｔ細胞応答を発生させるのに有効な量の少なくとも１つのサイトカインを産生する。
【００８６】
一実施形態において、樹状細胞の成熟は、該細胞をＩＦＮ−γおよびＬＰＳと接触させることを含む。
【００８７】
一実施形態において、融解された細胞は、ＤＣ１表現型を維持して、Ｔｈ１に極性化された免疫応答を推進する。
【００８８】
一実施形態において、融解された細胞は、主としてＴ細胞を増感させる能力を維持する。
【００８９】
負荷された（パルスされた）免疫細胞の生成
本発明は、抗原に曝露されたまたは抗原で「パルスされた」細胞を含む。例えば、ＤＣなどのＡＰＣは、例えば、抗原の存在下でのエクスビボの培養によってインビトロで、または抗原への曝露によってインビボでＡｇ負荷されうる。
【００９０】
当業者は、ＡＰＣの表面上の抗原の提示を促進するために十分な時間、該ＡＰＣを抗原に曝露するやり方で、ＡＰＣが「パルスされ」うることも容易に理解する。例えば、ＡＰＣは、抗原ペプチドとして知られ、ＡＰＣの外側に直接「パルス」される、小ペプチド断片の形態の抗原に曝露することができるか（Ｍｅｌｉｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４年）、またはＡＰＣは、全タンパク質もしくはタンパク質粒子とともにインキュベートすることができ、これらは次いでＡＰＣにより消化される。これらの全タンパク質は、ＡＰＣによって小ペプチド断片に消化され、最終的にＡＰＣ表面に運ばれて、提示される（Ｃｏｈｅｎら、１９９４年）。ペプチドの形態の抗原は、本明細書に記載の標準的な「パルス」技術によって細胞に曝露されうる。
【００９１】
いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、外来のまたは自己抗原の形態の抗原は、該抗原の免疫原性形態を保持するために本発明のＡＰＣによってプロセシングされる。抗原の免疫原性形態は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞により認識され、それを刺激することのできる抗原の形態を生成するための、断片化による抗原のプロセシングという意味を含む。好ましくは、そのような外来抗原または自己抗原は、ＡＰＣによってペプチドにプロセシングされるタンパク質である。ＡＰＣによって生成される関連ペプチドは、免疫原性組成物としての使用のために抽出され、精製されうる。ＡＰＣによってプロセシングされたペプチドは、ＡＰＣによってプロセシングされたタンパク質に対する寛容性を誘発するためにも使用されうる。
【００９２】
本発明の「パルスＡＰＣ」としても知られる、抗原負荷されたＡＰＣは、インビトロまたはインビボでＡＰＣを抗原に曝露することによって生成される。ＡＰＣがインビトロでパルスされる場合、ＡＰＣは培養皿に蒔かれ、抗原がＡＰＣに結合するために十分な量で十分な時間、抗原に曝露される。抗原のＡＰＣへの結合を達成するために必要な量および時間は、本技術分野で知られているかまたは本明細書に開示された方法を用いることによって決定されうる。当業者に知られた他の方法、例えば、イムノアッセイまたは結合アッセイは、抗原への曝露後にＡＰＣ上の抗原の存在を検出するために使用されうる。
【００９３】
本発明のさらなる実施形態において、ＡＰＣは、ＡＰＣによる特定のタンパク質の発現を可能とするベクターでトランスフェクトされうる。ＡＰＣによって発現されるタンパク質は、次いでプロセシングされ、細胞表面上に提示される。次いで、トランスフェクトされたＡＰＣは、ベクターによってコードされたタンパク質に対する免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物として使用されうる。
【００９４】
本明細書の他の場所で検討されるとおり、ベクターは、それに対する免疫原性応答が望まれるタンパク質をコードし、発現する特定のポリヌクレオチドを含むように調製される。好ましくは、細胞を感染させるためにレトロウイルスベクターが使用される。より好ましくは、細胞を感染させるためにアデノウイルスベクターが使用される。
【００９５】
別の実施形態において、ベクターは、ＡＰＣ上の受容体によって認識されるタンパク質またはその部分をコードするようにウイルスベクターを改変し、それによって該ベクターによるＡＰＣ受容体の占有がベクターのエンドサイトーシスを開始し、ウイルスベクターの核酸によってコードされた抗原のプロセシングおよび提示を可能とすることによって、ＡＰＣを標的としうる。ウイルスにより送達される核酸は、ウイルスにとって自然のものであってよく、これは、ＡＰＣ上で発現された場合、次いでプロセシングされ、ＡＰＣのＭＨＣ受容体上に提示される。
【００９６】
本明細書において考慮されるとおり、多様な方法が、宿主細胞中へポリヌクレオチドをトランスフェクトするために使用されうる。該方法は、リン酸カルシウム沈降法、リポフェクション法、微粒子銃、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、コロイド分散系（すなわち、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む、脂質に基づく系）を含むが、それに限定されない。これらの方法は、本技術分野で理解され、当業者がこれらの方法を実行できるように、公開文献に記載されている。
【００９７】
別の実施形態において、負荷されたＡＰＣを別な方法で生成するために、抗原をコードするポリヌクレオチドが発現ベクター中にクローニングされ、該ベクターをＡＰＣ中に導入することができる。細胞中へ核酸を導入するための多様なタイプのベクターおよび方法が、利用可能な公開文献中で議論されている。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞中へトランスフェクトすることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入が、パルスされた細胞をもたらすことは容易に理解される。
【００９８】
本発明は、タンパク質、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの形態の全抗原をＡＰＣに負荷することを含むが、それに限定されない、ＡＰＣをパルスするための多様な方法を含む。しかしながら、本発明は、ＡＰＣをパルスするために使用される特定の形態の抗原に限られると理解されるべきでない。むしろ、本発明は、抗原負荷されたＡＰＣを生成するための本技術分野で知られた他の方法を包含する。好ましくは、ＡＰＣは、定義された抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされる。その配列が知られた遺伝子産物に対応するｍＲＮＡは、適切なプライマーおよび転写反応と合わせた逆転写酵素−ポリメラーゼ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてインビトロで容易に生成することができる。ｍＲＮＡによるＡＰＣのトランスフェクションは、パルスされたＡＰＣを生成するための他の抗原負荷技術よりも有利である。例えば、顕微鏡的量の組織、すなわち、腫瘍組織からＲＮＡを増幅する能力は、多数の患者へのワクチン接種のためのＡＰＣの用途を広げる。
【００９９】
抗原組成物がワクチンとして有用であるためには、抗原組成物は、細胞、組織または哺乳動物（例えば、ヒト）における抗原への免疫応答を誘導しなければならない。本明細書中で使用される「免疫学的組成物」は、抗原（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば、抗原発現ベクター）または抗原もしくは細胞の構成要素を発現もしくは提示する細胞を含みうる。具体的な実施形態において、抗原組成物は、本明細書に記載の任意の抗原のすべてもしくは一部、またはその免疫機能的等価物を含むかまたはコードする。他の実施形態において、抗原組成物は、追加の免疫刺激剤またはそのような作用剤をコードする核酸を含む混合物中にある。免疫刺激剤は、追加の抗原、免疫調節剤、抗原提示細胞またはアジュバントを含むが、それに限定されない。他の実施形態において、１つまたは複数の追加の作用剤（複数可）が、任意の組み合わせで、抗原または免疫刺激剤に共有結合される。ある一定の実施形態において、抗原組成物は、ＨＬＡのアンカーモチーフアミノ酸にコンジュゲーションされるかまたはそれを含む。
【０１００】
本明細書中で考慮されるワクチンは、その核酸および／または細胞の構成要素の点で異なりうる。非限定例において、抗原をコードする核酸は、アジュバントとともに製剤化することもできる。もちろん、本明細書に記載の多様な組成物が追加の構成要素をさらに含みうることは理解される。例えば、１つまたは複数のワクチン構成要素が脂質またはリポソーム中に含まれうる。別の非限定例において、ワクチンは、１つまたは複数のアジュバントを含みうる。本発明のワクチンおよびその多様な構成要素は、本明細書に開示されたまたは本開示に照らして当業者に知られるであろう任意の方法によって調製されおよび／または投与されうる。
【０１０１】
本発明の抗原組成物が、固相合成による化学合成および化学反応の他の生成物からのＨＰＬＣによる精製、または本発明の抗原を含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）のインビトロの翻訳システムもしくは生きた細胞における発現による生産を含むがそれに限定されない、本技術分野で周知の方法により作られうることは理解される。さらに、抗原組成物は、生体サンプルから単離された細胞の構成要素を含むことができる。抗原組成物は、単離され、１つもしくは複数の望ましくない低分子量の分子を除去するために大規模に透析されおよび／または所望のビヒクル中のより容易な製剤化のために凍結乾燥される。もしあるとすれば、ワクチン成分において行われるアミノ酸の追加、突然変異、化学修飾などが、エピトープ配列の抗原認識を実質的に妨害しないことが好ましいということがさらに理解される。
【０１０２】
本発明の１つまたは複数の抗原決定基に対応するペプチドまたはポリペプチドは、一般に、少なくとも５アミノ酸残基または６アミノ酸残基の長さでなければならず、最大約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個または約５０個の残基を含みうる。ペプチド配列は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から入手可能なものなどの自動化ペプチド合成機を用いるペプチド合成のような当業者に知られた方法によって合成されうる。
【０１０３】
より長いペプチドまたはポリペプチドも、例えば、組換え手段によって調製されうる。ある一定の実施形態において、例えば、本発明の多様な組成物および方法のための抗原組成物をインビトロまたはインビボで生成するために、本明細書に記載の抗原組成物および／または構成要素をコードする核酸が使用されうる。例えば、ある一定の実施形態において、抗原をコードする核酸は、例えば、組換え細胞中のベクターに含まれる。核酸は、発現されて抗原性配列を含むペプチドまたはポリペプチドを生成しうる。ペプチドまたはポリペプチドは、細胞から分泌されるか、または細胞の一部としてもしくは細胞内に含まれうる。
【０１０４】
ある一定の実施形態において、抗原をコードする核酸により哺乳動物を形質転換するかまたはそれを接種することによって、免疫応答が促進されうる。次いで、標的哺乳動物内に含まれる１つまたは複数の細胞が、哺乳動物への核酸の投与後に、該核酸によりコードされる配列を発現する。ワクチンは、例えば、抗原のペプチドまたはポリペプチド配列の全部または一部をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）の形態であることもできる。核酸によるインビボでの発現は、例えば、プラスミドタイプのベクター、ウイルスベクターまたはウイルス／プラスミド構築物ベクターによることができる。
【０１０５】
別の実施形態において、核酸は、適切な抗原またはその免疫機能的等価物をコードする配列の全体または一部をコードするコード領域を含む。もちろん、核酸は、１つまたは複数の免疫調節剤またはアジュバントを含むものを含むが、それに限定されない、追加の配列を含みおよび／またはコードしうる。
【０１０６】
抗原
本明細書中で考慮されるとおり、本発明は、免疫応答を誘発するためにＡＰＣに負荷されるのに好適な任意の抗原の使用を含みうる。一実施形態において、腫瘍抗原が使用されうる。腫瘍抗原は、２つの広いカテゴリー：共通腫瘍抗原；および独特の腫瘍抗原に分けられることができる。共通抗原は、多くの腫瘍によって発現されるが、独特の腫瘍抗原は、物理的または化学的発癌物質により誘導された突然変異に起因することができ、したがって、個々の腫瘍によってのみ発現される。ある一定の実施形態において、共通腫瘍抗原が本発明のＤＣに負荷される。他の実施形態において、独特の腫瘍抗原が本発明のＤＣに負荷される。
【０１０７】
本発明との関連で、「腫瘍抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある一定の態様において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚部癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの腺癌を含むが、それに限定されない癌に由来する。
【０１０８】
悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原としての役目を果たすことのできる多数のタンパク質を発現する。これらの分子は、黒色腫中のＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ１００ならびに前立腺癌中の前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの組織特異抗原を含むが、それに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプイムノグロブリンは、個々の腫瘍に独特の真に腫瘍特異的なイムノグロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９．ＣＤ２０、イディオタイプ）は、大した成果のないモノクローナル抗体による受動免疫療法のための標的として使用されてきた。
【０１０９】
腫瘍抗原およびその抗原性癌エピトープは、初代臨床分離株、細胞株のような天然源から精製され、単離されうる。癌ペプチドおよびその抗原性エピトープも、化学合成によりまたは本技術分野で知られた組換えＤＮＡ技術によって得られうる。化学合成のための技術は、Ｓｔｅｗａｒｄら（１９６９年）；Ｂｏｄａｎｓｋｙら（１９７６年）；Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（１９８３年）；およびＳｃｈｒｏｄｅｒら（１９６５年）に記載されている。さらに、Ｒｅｎｋｖｉｓｔら（２００１年）に記載のとおり、本技術分野においては多数の抗原が知られている。アナログまたは人工的に修飾されたエピトープは具体的に記載されないが、当業者は、本技術分野における標準的な手段によってそれらをどのように得るかまたは生成するかを認識している。抗体によって同定され、Ｓｅｒｅｘ法（Ｓａｈｉｎら（１９９７年）およびＣｈｅｎら（２０００年）を参照されたい）によって検出される他の抗原は、Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのデータベース中に確認される。
【０１１０】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣによる提示のための微生物抗原を含みうる。本明細書中で考慮される微生物抗原は、ウイルス、細菌または真菌起源でありうる。感染性ウイルスの例としては：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−ＩＩＩなどのヒト免疫不全症ウイルス；およびＨＩＶ−ＩＰなどの他の単離株）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、ルベラウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水泡性口内炎ウイルス、ラビウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンターウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、バリセラゾスターウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（バリオーラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；および未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全サテライトと考えられる）デルタ肝炎の病原体、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部感染した；クラス２＝非経口感染した（すなわち、Ｃ型肝炎））；Ｎｏｒｗａｌｋおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）が挙げられる。
【０１１１】
感染性細菌の例としては：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ（例えば、Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．  ａｖｉｕｍ、Ｍ．  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．  ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．  ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｇｒｏｕｐ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｉｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、ＬｅｐｔｏｓｐｉｒａおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉが挙げられる。
【０１１２】
感染性真菌の例としては：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ，Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられる。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉを含む他の感染性生物（すなわち、原生生物）。 
【０１１３】
ＤＣの活性化
最終的に無菌性の炎症を刺激する（先に臨床試験において優位を占めていた）従来のＤＣに基づくワクチンが、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＰＧＥ２およびＩＬ−１βの組み合わせを含むサイトカインカクテル混合物を使用して生成された成熟ＤＣからなる一方、ＤＣを成熟させ、シグナル生成を刺激するために、本発明はその代わりにＴＬＲアゴニストを利用する。
【０１１４】
本発明のある態様によれば、ＴＬＲリガンドの組み合わせによるＤＣの刺激は、ＩＬ−１２産生量の増大に導く。さらに、ＴＬＲアゴニストの組み合わせによるＤＣの活性化は、より明白なＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答をもたらす（Ｗａｒｇｅｒら、２００６年、Ｂｌｏｏｄ、１０８：５４４〜５５０頁）。したがって、本発明のＤＣは、ＴＬＲを誘発するこれらのリガンドへの曝露によって、ＩＬ−１２などのＴｈ１駆動性サイトカインを分泌することができる。例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γに対するＴＬＲ３アゴニストであるポリ（Ｉ：Ｃ）の添加は、安定したレベルのＩＬ−１２産生を特徴とする、強力な１型極性化ＤＣを生成することができる（Ｈｅｉｆｌｅｒら、１９９６年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６：６５９〜６６８頁）。ある一定の実施形態において、ＴＬＲアゴニストの曝露の前に抗原がＤＣに負荷される。他の実施形態において、抗原はＴＬＲアゴニストの曝露に続いてＤＣに負荷することができる。
【０１１５】
本発明のある態様によれば、それによって細菌感染を刺激する生体分子（例えば、ＬＰＳ）によって細胞が活性化される、一人の患者の白血球除去においてＤＣを収集することによって、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンが生産される。この独特の活性化方法は、ＴＮＦ，ＩＬ−６、ＰＧＥ２およびＩＬ−１βのサイトカインカクテルにより成熟されたＤＣ（「従来の成熟」）においては認められない品質をＤＣに付与し、これは、無菌性の炎症も刺激する（Ｌｏｍｂａｒｄｉら、２００９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８２：３３７２〜３３７９頁）。
【０１１６】
一実施形態において、本発明のＤＣは、ＴＬＲ４アゴニスト、細菌性リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＴＬＲ７／８アゴニスト、レシミキド（ｒｅｓｉｍｉｑｕｏｄ）（Ｒ８４８）および／またはＩＦＮ−γの組み合わせにより活性化することができる（Ａｍａｔｉ  ｅｔ  ａｌ，、２００６年、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ、１２：４２４７〜４２５４頁）。ＴＬＲ４アゴニストおよび細菌性ＬＰＳによってＤＣを活性化することによって、従来の成熟方法を介して生成されたＤＣ１に少なくとも実質的に（表現型が）同一のＤＣが生成される。これらのＤＣは，ＣＤ８３，ＣＤ８０，ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲを含む表面分子を高発現する。他の実施形態において、リポテイコ酸（ＬＴＡ）などのＴＬＲ２アゴニスト、ポリ（Ｉ：Ｃ）などのＴＬＲ３アゴニストおよび／またはＭＰＬなどのＴＬＲ４アゴニストが使用されうる。本明細書中で考慮されるとおり、任意のＴＬＲアゴニストまたはＴＬＲアゴニストの組み合わせが、そのようなリガンドが活性化ＤＣによるサイトカインおよびケモカインシグナルの生成を刺激するという条件で、ＤＣを活性化するために使用することができる。本発明による使用のために、多くの他のＴＬＲアゴニストが本技術分野で知られており、公開文献中に見られうる。
【０１１７】
ＤＣと従来の方法で成熟されたＤＣの間に表現型の類似性があるとしても、本発明のＤＣは、多くの顕著な利点を示す。
【０１１８】
凍結保存
培養開始および活性化後、細胞が採取され、ワクチンが凍結保存される。例えば、末梢血単球が、白血球除去によって得られる。細胞は、ある期間、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む血清フリー培地中で培養され、所望の抗原による細胞のパルスが続く。所望の抗原で細胞をパルスした後、抗原でパルスされた樹状細胞がＩＦＮ−γ、続いてＴＬＲアゴニスト（例えば、ＬＰＳ）とともにインキュベートされる。活性化された抗原パルス樹状細胞が採取され、凍結保存用培地中で凍結保存され、液体窒素中で貯蔵される。一実施形態において、凍結保存用培地は、５５％のプラズマライト、４０％のヒト血清アルブミンおよび５％のＤＭＳＯを含む。
【０１１９】
本発明の凍結保存態様は、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンの生成を可能とする。本発明の利点は、複数用量抗原パルス樹状細胞が、Ｔ細胞機能にとって決定的なシグナルを生成するそれらの能力を融解後に保持することである。本明細書中で考慮されるとおり、本発明は、当業者により理解されるであろう多様な凍結保存技術および凍結保存用培地を含む。例えば、ある一定の実施形態において、凍結保存用培地は、５５％のプラズマライト、４０％のヒト血清アルブミンおよび５％のＤＭＳＯを含む。よって、本発明は、初回免疫化用量および複数の「ブースター」用量を含む、本発明の複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンを生産する能力を、集中エリアにおいて提供する。したがって、複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンは、特別なＦＤＡの品質管理／品質保証要件を要求されることなく、投与現場における患者への連続的投与のために離れた医療センターに発送することができる。
【０１２０】
一実施形態において、本発明の樹状細胞ワクチンは、複数回投与のためのアリコートで凍結保存される。例えば、細胞は３０×１０６細胞／ｍＬの濃度で凍結保存される。例えば、細胞の体積に等しい容量の凍結保存用培地のバッグが準備される。迅速に作業しながら、凍結保存用培地が細胞バッグに添加され、ラベルされた凍結バイアルに細胞が移される。一実施形態において、バイアルは速度制御冷凍庫を用いて凍結される。例えば、凍結バイアルは、自動速度制御冷凍庫を用いて１℃／分で凍結され、気相窒素中に貯蔵される。
【０１２１】
一実施形態において、バイアルは、速度制御冷凍庫を用いて凍結される。バイアルは、凍結チャンバー中に置かれ、液体窒素が電子ソレノイドバルブを通してチャンバーに入る。蒸発はほとんど瞬時であるため、液体窒素がチャンバーに入る速度を制御することが、熱が吸収され、凍結チャンバーおよびその内容物から除去される速度を直接制御する。
【０１２２】
本明細書中で考慮されるとおり、本発明は、当業者に理解されるであろう多様な凍結保存技術および凍結保存用培地を含む。例えば、ある一定の実施形態において、培養細胞のための凍結保存用培地は、約５５％のプラズマライト、約４０％のヒト血清アルブミンおよび約５％のＤＭＳＯを含みうる。他の実施形態において、凍結保存用培地は、血清フリーでありうる。ある一定の実施形態において、速度制御された凍結を使用することができ、一方、他の実施形態は、例えば約−７０℃〜−８０℃にわたる温度の冷凍庫中に置かれた、凍結保存用培地と混合された細胞のバイアルが入った遮蔽容器の使用を含むことができる。本発明は、そのような細胞の臨床応用をさらに容易化し、大規模な除去法およびエルトリエーションステップを反復する必要性を低減するようなやり方で、活性化されたＤＣを保存する方法を提供する。本明細書中で考慮されるとおり、凍結保存技術は、小規模および大規模バッチの両方のために使用されうる。
【０１２３】
活性化ＤＣの広範な用途を考慮する場合、凍結保存された活性化ＤＣの安定した供給を提供する能力は、そのような細胞の多様な治療用途を容易化しうる、大きな利益を表す。例えば、活性化ＤＣの大規模培養は、細胞の個々の用量が後に任意の具体的免疫療法プロトコールにおいて使用可能であるように、本発明の方法に従って、初回免疫化用量および複数の「ブースター」用量を含む適切なサイズのアリコート中に凍結保存されうる。ある一定の実施形態において、活性化ＤＣは、約−７０℃以下の温度で２〜２４週間凍結保存可能である。約−１２０℃以下などの、より低い温度においては、活性化ＤＣは少なくとも１年以上、凍結保存されうる。
【０１２４】
代表的な一実施形態において、ＤＣは、ヒト血清および約５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中に懸濁される。あるいは、ウシ胎仔血清のような他の血清タイプが使用されうる。懸濁された細胞は、１．８ｍｌバイアルなどのより小さなサンプルに等分され、約−７０℃以下で貯蔵可能である。他の実施形態において、凍結保存用培地は、約２０％の血清および約１０％のＤＭＳＯを含むことができ、懸濁された細胞は、約−１８０℃で貯蔵可能である。なおさらなる実施形態は、約５５％のプラズマライトおよび約５％のＤＭＳＯを含有する培地を含みうる。他の代表的な凍結保存用培地は、約１２％のＤＭＳＯおよび約２５〜４０％の血清を含みうる。
【０１２５】
本明細書に記載の本発明は、特定濃度の血清を含みうるが、当業者には、凍結保存用培地中の血清の正確な量が変動してよく、いくつかの実施形態においては、全く存在しなくてもよいが、一般的には、約１％〜３０％の範囲内であると理解されるべきである。もちろん、約５０％の細胞生存率および／または約５０％細胞回復率をもたらす任意の血清濃度を、本発明の任意のＤＣ組成物中で使用することができ、ならびに本明細書に記載の任意の凍結保存方法とともに使用することができる。選択された凍結保存用培地中の凍結保存細胞を回復する場合、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、またはさらに８０％の細胞生存率および細胞回復率が望まれる。
【０１２６】
同様に、本明細書に記載の本発明は、特定濃度のＤＭＳＯを含みうるが、当業者は、いくつかの実施形態においてＤＭＳＯが全く存在しなくてもよいが、他の実施形態においては、約５％〜約２０％もの高い濃度が凍結保存用培地中で使用され、本明細書に記載の凍結保存方法に含まれてよいことを認識すべきである。一般に、約５％から約１０％までの間などの低濃度のＤＭＳＯが好ましい。しかしながら、融解後、少なくとも５０％の細胞生存率および少なくとも５０％の細胞回復率、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％およびさらに好ましくは約９０％以上の細胞生存率および回復率となる任意の濃度のＤＭＳＯが使用されうる。
【０１２７】
本明細書に記載の本発明は、速度制御された凍結への言及を含みうるが、速度制御されたまたは速度制御されないやり方での凍結方法が日常的に使用可能であることは、当業者に理解されるべきである。本明細書に記載の多様な凍結保存媒体が、血清を含みうるかまたは血清フリーであってよいことも、当業者に理解されるべきである。血清フリー培地の例としては、ＸＶＩＶＯ  １０、ＸＶＩＶＯ  １５、ＸＶＩＶＯ  ２０，ＳｔｅｍＰｒｏならびに任意の市販の血清フリー培地が挙げられる。血清フリーの凍結用培地を利用する場合、本発明の凍結保存方法は、一般に、抗原性である可能性のある感染性作用物質、抗体および外来タンパク質、ならびに典型的に血清ベースの凍結用培地中に認められるいかなる他の外来分子を含まない。
【０１２８】
負荷された抗原、活性ＤＣの凍結保存は、ＴＬＲアゴニストによるＤＣの活性化後の任意の時点で起こることができる。一実施形態において、活性化ＤＣは、ＴＬＲアゴニストへの曝露の約６〜８時間後に凍結保存される。好ましくは、活性化された細胞を凍結保存するために選ばれる時点は、細胞のシグナル生成、特にＩＬ−１２生成の最大化に基づくべきである。
【０１２９】
本発明は、大規模な樹状細胞ワクチンを生産するための組成物および方法を提供する。一実施形態において、樹状細胞ワクチンの大規模生産は、癌または他の障害の個別化された処置および予防のための、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンの生産を可能とする。一実施形態において、本発明は、大規模な抗原パルス１型極性化樹状細胞ワクチン（ＤＣ１）を生産するための組成物および方法を提供する。
【０１３０】
一実施形態において、本発明は、抗原負荷され、予備活性化された状態、つまり、「シリンジレディ」、すなわち、（例えば、ＦＤＡ命令による）追加の施設および品質管理／保証ステップを要求するいかなる追加の細胞プロセシングも必要としない、患者への即時注射に好適な樹状細胞を大規模に凍結保存する方法を提供する。
【０１３１】
一実施形態において、本発明は、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン、好ましくは、最大の有効性を示す注射用複数用量抗原パルス１型極性化樹状細胞ワクチンを効率的に生産する方法を提供する。
【０１３２】
組成物またはキット構成要素のパッケージング
本発明の組成物（またはキット構成要素）のための好適な容器は、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）などを含む。これらの容器は、無菌的であるべきである。
【０１３３】
組成物／構成要素がバイアル中に入れられる場合、バイアルはガラスまたはプラスチック材料で作られることが好ましい。バイアルは、組成物が加えられる前に滅菌されることが好ましい。ラテックス感受性の患者の問題を回避するために、バイアルはラテックスを含まない栓で密封されることが好ましく、すべてのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、単一用量のワクチンを含みうるか、または１つ超の用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含みうる。好ましいバイアルは、無色ガラスで作られる。
【０１３４】
バイアルは、予め充填されたシリンジがキャップに挿入され、シリンジの内容物がバイアル中へ排出され、バイアルの内容物をシリンジに戻すことができるように、適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有することができる。バイアルからシリンジを取り外した後、次いで針が取り付けられ、組成物を患者に投与することができる。キャップは、キャップが利用可能となる前にシールまたはカバーをはずさなければならないように、シールまたはカバーの内側に置かれることが好ましい。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的な取り出しを許容するキャップを有しうる。
【０１３５】
組成物／構成要素がシリンジ中に詰められる場合、シリンジは、それに取り付けられた針を有しうる。針が取り付けられていない場合、組み立ておよび使用のために別の針がシリンジに供給されうる。そのような針は、さやに納められうる。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージの針が典型的である。シリンジには、記録保持を容易化するために、ロット番号、シーズン（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｅａｓｏｎ）および内容物の使用期限を印刷することのできる剥離用ラベルが提供されうる。シリンジ中のプランジャーは、吸入中にうっかりプランジャーが外れることを防ぐために、ストッパーがあることが好ましい。シリンジは、ラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを有しうる。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含有する。シリンジは、一般に、針の取り付け前に先端を剥ぐための先端キャップを有し、先端キャップはブチルゴムで作られることが好ましい。シリンジおよび針が別々に包装される場合、針はブチルゴムのさやを備えていることが好ましい。
【０１３６】
容器は、例えば、子供への送達を容易化するために、半分の用量の体積を示すために印をつけることができる。例えば、０．５ｍｌの用量を含有するシリンジは、０．２５ｍｌの体積を示す印を有しうる。
【０１３７】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりもホウケイ酸ガラスで作られた容器を使用することが好ましい。
【０１３８】
キットまたは組成物は、ワクチンの詳細、例えば、投与のための指示、ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットとともに（例えば、同じ箱に）包装されうる。上記指示は、例えば、ワクチン接種に続くアナフィラキシー反応の場合に、すぐに利用可能なアドレナリンの溶液を保持することなどの警告も含みうる。
【０１３９】
疾患を処置するための方法
本発明は、病原性微生物、自己免疫障害によって引き起こされる疾患および／または過剰増殖性疾患の処置および／または予防の方法も包含する。
【０１４０】
本発明の使用により処置または予防されうる疾患は、ウイルス、細菌、酵母、寄生虫、原虫、癌細胞などにより引き起こされる疾患を含む。本発明の医薬組成物は、汎用の免疫賦活剤（ＤＣ活性化組成物またはシステム）として使用することができ、したがって疾患の処置における用途を有する。本発明の医薬組成物を利用して処置および／または予防されることのできる代表的疾患としては、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプシュタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、はしか、水痘、パピローマウイルスなどのウイルス起源の感染症；肺炎、結核、梅毒などの細菌起源の感染症；またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などの寄生虫起源の感染症が挙げられるが、それに限定されない。
【０１４１】
本発明の医薬組成物（形質導入ＤＣ、発現ベクター、発現構築物など）を用いて処置または予防されうる新生物発生前または過剰増殖状態は、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などを含むが、それに限定されない。
【０１４２】
本発明の組成物を用いて処置されうる癌は、原発性または転移性黒色腫、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞種、ＮＰＣ，膀胱癌、子宮頚部癌などを含むが、それに限定されない。
【０１４３】
本発明のＤＣ活性化システムを用いて治療されうる他の過剰増殖性疾患は、リウマチ関節炎、炎症性腸疾患、骨関節炎、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化、（腺腫様過形成、前立腺上皮内腫瘍などの）新生物発生前の病変、インサイチュの癌腫、口腔内毛状白斑症または乾癬を含むが、それに限定されない。
【０１４４】
本発明の組成物を用いて処置されうる自己免疫障害は、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、気管炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、リウマチ関節炎、強皮症、シェーグレン症候群および自己免疫性甲状腺炎；癌、血液透析および体外循環の合併症；ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫および寄生虫様感染症；ならびに外傷を含むが、それに限定されない。
【０１４５】
処置の方法において、本発明の組成物の投与は、「予防」または「治療」目的のいずれかのためでありうる。予防的に与えられる場合、特定の実施形態においては、さらなる症状が発生するのを予防するためまたは現在の症状が悪化するのを予防するために、１つまたは複数の症状の発症後にワクチンが与えられるにもかかわらず、本発明の組成物は任意の症状に先立って与えられる。組成物の予防的投与は、任意の後続の感染症または疾患を予防または寛解させる役目を果たす。治療的に与えられる場合、医薬組成物は、感染症または疾患の症状の発症時またその後に与えられる。したがって、本発明は、病因物質への予想される曝露または疾患状態のいずれかの前、あるいは感染症または疾患の開始後に与えられうる。
【０１４６】
組成物の有効量は、免疫応答の亢進のこの選ばれた結果を達成する量であり、そのような量は、当業者により日常的に決定されうる。例えば、癌または病原体に対する免疫系の不全を処置するのに有効な量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への曝露に際して抗原特異的な免疫応答の発生をもたらすのに必要な量でありうる。この用語は、「十分な量」の同義語でもある。
【０１４７】
任意の具体的な適用のための有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される具体的組成物、対象のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などの因子に依存して変動しうる。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の具体的な組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【０１４８】
治療適用
本発明は、凍結保存から融解された場合に、顕著なレベルのサイトカインおよびケモカインを産生する、抗原負荷された活性化ＡＰＣの生成を含み、ここで、負荷された抗原および活性化ＡＰＣは、哺乳動物、好ましくはヒトの免疫療法において使用される。ＡＰＣによって提示された抗原への応答は、抗原に対する細胞溶解性Ｔ細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答、および／または抗原応答を、本技術分野で知られた方法を用いてモニターすることによって測定されうる。
【０１４９】
本発明は、哺乳動物において免疫応答を亢進する方法であって、哺乳動物（例えば、患者）から得られた単球から未成熟のＤＣを生成するステップ；未成熟のＤＣを、抗原性組成物を含む組成物でパルスするステップ；抗原負荷されたＤＣを少なくとも１つのＴＬＲアゴニストで活性化するステップ；活性化された、抗原負荷されたＤＣを融解し、次いで活性化された、抗原負荷されたＤＣを、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法を含む。該組成物は、少なくとも１つの抗原を含み、さらに哺乳動物におけるエクスビボの免疫化および／またはインビボの治療のためのワクチンでありうる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１５０】
エクスビボの手順は、本技術分野で周知であり、以下により完全に議論される。手短に言えば、細胞は哺乳動物（好ましくはヒト）から単離される。細胞は、哺乳動物レシピエントに投与されて、治療効果を提供する。哺乳動物レシピエントは、ヒトでありえ、細胞は、レシピエントに関して自己のものでありうる。あるいは、細胞は、レシピエントに関して同種、同系または異種のものでありうる。
【０１５１】
一実施形態において、末梢血単球は、白血球除去およびエルトリエーションの組み合わせによって患者から得られる。単球は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含むＳＦＭ中で一夜培養することができる。翌日、未成熟のＤＣが抗原でパルスされ、続いて、ＤＣがＩＦＮ−γおよびＬＰＳと接触させることができる。活性化ＤＣは、次いで、凍結保存用培地中に懸濁され、免疫療法における使用の準備ができるまで凍結される。
【０１５２】
凍結保存されたＤＣは、新たに活性化されたＤＣに匹敵する細胞の回復パーセントおよび生存パーセントを生じるために有効な条件下、エクスビボで培養することができる。凍結保存されたサンプルから生成されたＤＣは、新たに調製されたＤＣと同様の安定性を示すことができる。さらに、凍結保存された成熟ＤＣと新たに調製されたＤＣとの比較は、実質的に同一の表現型ならびにシグナル生成プロフィールを示すことができる。本明細書中で考慮されるとおり、ＤＣは、小規模および大規模の両方で、約−７０℃〜−８０℃の温度で、本明細書に記載の多様な凍結保存用培地中、約２〜２４週間保存することができる。約−１２０℃未満の温度において、貯蔵時間は、ＤＣの細胞回復率、生存率および機能性に影響を及ぼすことなく、無限にまたは少なくとも２４週間を超えて延長することができる。例えば、ある一定の実施形態において、活性化された細胞は、少なくとも１年間保存することができ、シグナルを生成するそれらの能力を融解後になお保持することができる。本明細書全体を通じて説明されるとおり、本発明は、細胞の融解に際して、有効な回復および生存プロフィールを提供し、さらに、本明細書に記載の凍結保存条件は、ＤＣがそれらのシグナルプロフィールを保持する能力に影響しない。
【０１５３】
代表的な実施形態において、凍結保存は、ＤＣの活性化後に、約５５％のプラズマライト、約４０％のヒト血清アルブミンおよび約５％のＤＭＳＯを含む凍結保存用培地に細胞を再懸濁することによって実行されうる。該混合物は、次いで、１．８ｍｌバイアルに等分され、凍結チャンバー中で一夜、約−８０℃で凍結される。次いで翌日、バイアルは液体窒素タンクに移すことができる。約２〜２４週間の凍結保存後、凍結されたＤＣは、融解され、それらの回復率および生存率について検査することができる。そのようなＤＣの回復率は、約７０％以上であり、生存率は、約７０％以上でありうる。他の実施形態において、ＤＣまたは単球でさえ、細胞活性化の前に凍結保存することができる。
【０１５４】
あるいは、造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボでの増殖のための手順が、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１９９，９４２号に記載され、これは、本発明の細胞に適用することができる。米国特許第５，１９９，９４２号に記載の細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子が、細胞の培養および増殖のために使用可能である。
【０１５５】
多様な細胞選択技術が、細胞を同定し、細胞集団から分離するために知られている。例えば、モノクローナル抗体（または他の特異的な細胞結合性タンパク質）を、マーカータンパク質または細胞上に認められる表面抗原タンパク質に結合するために使用することができる。数種のそのようなマーカーまたは細胞表面抗原が、本技術分野で知られている。
【０１５６】
ワクチン製剤
本発明は、免疫療法における使用に好適なワクチン製剤をさらに含む。ある一定の実施形態において、ワクチン製剤は、癌および感染性疾患のような疾患の予防および／または処置のために使用される。一実施形態において、癌の予防および／または処置のための本発明によるワクチンの患者への投与は、癌を除去するための外科手術の前もしくは後、癌の処置のための化学療法の前もしくは後、および癌の処置のための放射線療法の前もしくは後、およびその任意の組み合わせにおいて行われることができる。他の実施形態において、ワクチン製剤は、別の組成物または医薬製品と併用してまたは組み合わせて投与されうる。本発明が、癌を有さないが、癌を発症するリスクがあるかもしれない個体において癌を予防するためにも使用可能であることは理解されるべきである。
【０１５７】
本発明により調製された癌ワクチンの投与は、癌ワクチンの一部を形成する抗原の選択によってある程度決定される、癌の予防または処置に広く適用可能である。本発明の実践に従って好適に処置されうる癌は、制限されることなく、肺、乳房、卵巣、子宮頸部、結腸、頭部および頸部、膵臓、前立腺、胃、膀胱、腎臓、骨、肝臓、食道、脳、精巣、子宮の癌ならびに多様な白血病およびリンパ腫を含む。
【０１５８】
一実施形態において、本発明によるワクチンは、処置される腫瘍または癌細胞に由来することができる。例えば、肺癌の処置において、肺癌ワクチンを生産するために、肺癌細胞が上記のように処理される。同様に、乳癌ワクチン、結腸癌ワクチン、膵臓癌ワクチン、胃癌ワクチン、膀胱癌ワクチン、腎臓癌ワクチンなどが、ワクチンがそこから生産された腫瘍または癌細胞の予防および／または処置のための実践によって、免疫療法剤として生産され、採用される。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明によるワクチンは、述βとおり、哺乳動物に影響を及ぼす多様な感染性疾患を処置するために、病原体によって培地中に排出された関連抗原を収集することによって調製することもできる。同じ疾患を引き起こす様々な生物によって発現される免疫原性および防御性抗原のタイプには不均一性があるため、重要な様々な抗原を発現する生物のプールからワクチンを調製することによって、多価ワクチンが調製されうる。
【０１６０】
本発明の別の実施形態において、ワクチンは、鼠径部リンパ節へのリンパ節内注射によって投与することができる。あるいは、ワクチンは、ワクチン標的に依存して、処置されている患者の四肢、上肢および下肢に皮内または皮下投与することができる。一般に、このアプローチは、感染性疾患の予防または処置を含んで、黒色腫および他の癌のために満足のいくものであるが、筋肉内または血流中などの他の投与経路も使用されうる。
【０１６１】
さらに、ワクチンは、ワクチンの活性および患者の反応を強化するために、アジュバントおよび／または免疫調節剤とともに与えられることができる。そのようなアジュバントおよび／または免疫調節剤は、当業者により理解されており、利用可能な公開文献中に手軽に記載されている。
【０１６２】
本明細書中で考慮されるとおり、生成されるワクチンのタイプに依存して、ワクチンの生産は、所望により、バイオリアクターまたは発酵槽またはバルクで細胞を増殖させるために好適な他のそのような容器もしくは装置中で細胞を培養することによって、スケールアップすることができる。そのような装置においては、任意の材料または抗原が培地中で分解される前にそのような材料または抗原を回収するために、培地が規則的に、頻繁にまたは連続的に収集される。
【０１６３】
所望により、本発明によって産生され、回収されたワクチンまたは抗原を含有し、持続的または断続的な放出に好適な装置または組成物は、実際には、そのような材料の体内への比較的遅いまたは時限放出のために、体内に埋め込まれるかまたは局所的にそこへ投与されることもありうる。
【０１６４】
ワクチン調製における他のステップは、特定のワクチンの要件を満たすために、個別化することができる。そのような追加のステップは、当業者により理解される。例えば、収集されたある抗原性材料は、濃縮され、いくつかの場合には、洗剤で処理され、移植における同種抗原を除去するために超遠心分離されうる。
【０１６５】
併用療法
本発明は、癌を処置するのに有効な治療を提供し、ここで、該治療は、腫瘍部位における免疫細胞が腫瘍細胞の攻撃においてより有効であるように、腫瘍における免疫応答を変化させることを含む。いくつかの場合において、有効な治療は、腫瘍部位における免疫細胞の遊走および活性を改善することを含む。一実施形態において、本発明は、樹状細胞ワクチンをＨＥＲ２およびＨＥＲ３のうちの１つまたは複数の阻害剤と組み合わせて、癌を処置するための処置レジメンとして使用する組成物および方法を提供する。別の実施形態において、処置レジメンは、樹状細胞ワクチン、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のうちの１つまたは複数の阻害剤、ならびにケモカイン調節剤の使用を含む。一実施形態において、ケモカイン調節剤は、ケモカイン活性化剤である。ケモカイン活性化剤の一例は、ＴＬＲ８アゴニストである。
【０１６６】
一実施形態において、本発明は、癌を処置するための処置レジメンとして、樹状細胞ワクチンをＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３の遮断と組み合わせて使用する組成物および方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、樹状細胞ワクチンを、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによるＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３の遮断と組み合わせて使用する組成物および方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、癌を処置するための処置レジメンとして、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによってＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３を両方とも遮断する組成物および方法を提供する。
【０１６７】
一実施形態において、本発明の処置レジメンは、癌を処置するために使用することができ、したがって、あるタイプの抗癌療法と見なすことができる。別の実施形態において、本発明の処置レジメンは、手術、化学療法、放射線療法（例えば、Ｘ線）、遺伝子療法、免疫療法、ホルモン療法、ウイルス療法、ＤＮＡ療法、ＲＮＡ療法、タンパク質療法、細胞療法およびナノ療法を含むが、それに限定されない、別の抗癌または抗腫瘍療法との併用療法の関連において使用することができる。
【０１６８】
一実施形態において、本発明は、対象における癌の処置または予防のための別の癌医薬と組み合わせた本発明の処置レジメンを含む。他の癌医薬は、本発明の処置レジメンとともに相乗的な量でまたは多様な用量でまたは多様な時間スケジュールで投与される。本発明は、本発明の処置レジメンのみの組み合わせまたは所望の癌医薬との組み合わせの併用に関するキットおよび組成物にも関する。
【０１６９】
一実施形態において、本発明の処置レジメンは、別の抗癌療法を受容する前に使用される。別の実施形態において、本発明の処置レジメンは、別の抗癌療法を受容するのと同時に使用される。別の実施形態において、本発明の処置レジメンは、別の抗癌療法を受容した後に使用される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象におけるＥＲ陰性の乳癌を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象におけるＥＲ陰性であり、ＨＥＲ２陽性の乳癌を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、乳癌は、転移性乳癌である。いくつかの実施形態において、乳癌は、ステージＩ、ステージＩＩまたはステージＩＩＩにある。
【０１７１】
別の実施形態において、本発明の処置レジメンは、癌を処置するために使用される現存の治療剤と組み合わせて使用されうる。本明細書に別記された抗腫瘍性治療剤と組み合わせた本発明の処置レジメンの潜在的治療効率を評価するために、これらの組み合わせは、本技術分野で知られた方法に従って抗腫瘍活性について試験されうる。
【０１７２】
一態様において、本発明は、本発明の処置レジメンが、化学療法剤、抗細胞増殖剤またはその任意の組み合わせを含むが、それに限定されない、抗腫瘍剤などの治療剤と併用されうる。
【０１７３】
本発明は、いかなる具体的な化学療法剤にも限定されるべきでない。むしろ、任意の化学療法剤を本発明の処置レジメンとともに使用することができる。例えば、以下の非限定的な代表的クラス：アルキル化剤；ニトロソウレア；代謝拮抗薬；抗腫瘍性抗生物質；植物アルカロイド；タキサン；ホルモン剤および種々雑多な作用剤、の任意の慣用の化学療法剤が本発明に含まれる。
【０１７４】
アルキル化剤は、細胞中に存在する条件下で多くの電気陰性基にアルキル基を負荷し、それによってＤＮＡ複製を妨害して、癌細胞が繁殖するのを防ぐ、それらの能力のゆえにそのように名付けられる。ほとんどのアルキル化剤は、細胞周期に非特異的である。特定の態様において、それらは、ＤＮＡ二重らせん鎖中のグアニン塩基を架橋することによって腫瘍成長を停止させる。非限定的な例としては、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、メクロレタミン、ヒドロクロライド、メルファラン、プロカルバジン、チオテーパおよびウラシルマスタードが挙げられる。
【０１７５】
代謝拮抗薬は、細胞周期の合成（Ｓ）期の間にＤＮＡ中への塩基の取り込みを防ぎ、正常な発生および分裂を禁止する。代謝拮抗薬の非限定的な例としては、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサートおよびチオグアニンなどの薬物が挙げられる。
【０１７６】
一般に、細胞分裂に必要な酵素を妨害することにより、または細胞を取り囲む膜を変化させることによって細胞分裂を防ぐ、多様な抗腫瘍性抗生物質がある。このクラスに含まれるのは、ＤＮＡの構造を破壊し、その機能を終了させることによって細胞分裂を防ぐ、ドキソルビシンなどのアンスラサイクリンである。これらの作用剤は、細胞周期に非特異的である。抗腫瘍性抗生物質の非限定的な例としては、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃおよびミトキサントロンが挙げられる。
【０１７７】
植物アルカロイドは、有糸分裂を阻害もしくは停止させるか、または細胞増殖に必要なタンパク質を細胞が作ることを防ぐ酵素を阻害する。しばしば使われる植物アルカロイドは、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含む。しかしながら、本発明は、これらの植物アルカロイドにのみ限定されると解釈されるべきでない。
【０１７８】
タキサンは、細胞機能において重要な微小管と呼ばれる細胞構造に影響を及ぼす。正常な細胞増殖において、細胞が分裂を開始したときに微小管が形成されるが、いったん細胞が分裂を停止すると、微小管は解体または破壊される。タキサンは、癌細胞が微小管で詰まり過ぎて、増殖し分裂できなくなるように、微小管が解体することを禁止する。非限定的な代表的タキサンとしては、パクリタキセルおよびドセタキセルが挙げられる。
【０１７９】
ホルモン剤およびホルモン様薬物は、例えば、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を含む、ある一定のタイプの癌のために利用される。それらはしばしば、それらの有効性を高めるために、他のタイプの化学療法剤とともに採用される。性ホルモンは、女性または男性ホルモンの作用または産生を変化させるために使用され、乳癌、前立腺癌および子宮内膜癌の成長を遅くするために使用される。これらのホルモンの産生を阻害（アロマターゼ阻害剤）または作用を阻害（タモキシフェン）することは、しばしば治療の補助として使用することができる。他のいくつかの腫瘍もホルモン依存性である。タモキシフェンは、乳癌細胞の増殖を促進するエストロゲンの活性を妨害するホルモン剤の非限定例である。
【０１８０】
種々雑多な作用剤は、これらも本発明において有用なブレオマイシン、ヒドロキシウレア、Ｌ−アスパラギナーゼおよびプロカルバジンのような化学療法剤を含む。
【０１８１】
抗細胞増殖剤は、さらに、アポトーシス誘導剤または細胞毒性剤として定義することができる。アポトーシス誘導剤は、グランザイム、Ｂｃｌ−２ファミリーの一員、シトクロームＣ、カスパーゼまたはそれらの組み合わせでありうる。代表的なグランザイムとしては、グランザイムＡ，グランザイムＢ、グランザイムＣ、グランザイムＤ、グランザイムＥ、グランザイムＦ、グランザイムＧ、グランザイムＨ、グランザイムＩ、グランザイムＪ、グランザイムＫ、グランザイムＬ、グランザイムＭ、グランザイムＮまたはそれらの組み合わせが挙げられる。他の特定の態様において、Ｂｃｌ−２ファミリーの一員は、例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｏｋまたはそれらの組み合わせである。
【０１８２】
さらなる態様において、カスパーゼは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、細胞毒性剤は、ＴＮＦ−α、ゲロニン、プロジギオシン、リボソーム阻害タンパク質（ＲＩＰ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌体外毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ＶａｃＡ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ＹｏｐＴ、Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ、ジエチレントリアミン五酢酸、イロフルベン、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ毒素、ミトギリン、リシン、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、サポリン６またはそれらの組み合わせである。
【０１８３】
一実施形態において、本発明の処置レジメンは、抗腫瘍剤とともに使用され、ここで、抗腫瘍剤は、抗腫瘍性アルキル化剤、抗腫瘍性代謝拮抗薬、抗腫瘍性抗生物質、植物由来抗腫瘍剤、抗腫瘍性プラチナ錯体、抗腫瘍性カンプトテシン誘導体、抗腫瘍性チロシンキナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、インターフェロン、生体応答修飾剤、ホルモン性抗腫瘍剤、抗腫瘍性ウイルス剤、血管新生阻害剤、分化誘導薬、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／ＡＫＴ阻害剤、細胞周期阻害剤、アポトーシス阻害剤、ｈｓｐ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、ＤＮＡ修復阻害剤、抗血管新生剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、Ｈｅｒ−２を標的とする作用剤、ホルモンアンタゴニスト、成長因子受容体を標的とする作用剤または薬学的に許容できるその塩である。いくつかの実施形態において、抗腫瘍剤は、シタビン、カペシタビン、バロピシタビンまたはゲムシタビンである。いくつかの実施形態において、抗腫瘍剤は、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｓｕｔｅｎｔ、Ｎｅｘａｖａｒ、Ｒｅｃｅｎｔｉｎ、ＡＢＴ−８６９、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、ラパチニブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ラパチニブ、タモキシフェン、ステロイド系アロマターゼ阻害剤、非ステロイド系アロマターゼ阻害剤、Ｆｌｕｖｅｓｔｒａｎｔ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｐａｎｉｔｕｍｉｍａｂ、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）の阻害剤、およびＣＰ−７５１８７１からなる群から選ばれる。
【０１８４】
一実施形態において、抗腫瘍剤は、化学療法剤である。本明細書中で使用される化学療法剤は、癌の処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテーパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラミラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ）；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチンおよび９−アミノカンプトテシンを含む）カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）ＣＣ−１０６５；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）デュオカルミシン；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドハイドロクロライド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特に、カリケアミシンγＩＩおよびカリケアミシンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ、３３：１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン（クロモフォアおよび関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）などの抗生物質、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ）、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ）、ペグ化リポソ��ムドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ）およびデオキシドキソルビシンを含む）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、エポチロンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アムシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナール；フォリン酸などの葉酸補充因子（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン、エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ）などのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン、ＰＳＫポリサッカライド複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸、トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテーパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、パクリタキセルのアルブミン改変された（ａｌｂｕｍｉｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）；クロラムブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどのプラチナ剤；チューブリンの重合化が微小管を形成することを防ぐ、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ）、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ）、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ、ＦＩＬＤＥＳＩＮ）およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）を含むビンカス（ｖｉｎｃａｓ）；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＧＩＮ）を含むレチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳＯまたはＯＳＴＡＣ）、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ）、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ）、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ）、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ）、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ）またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ）などのビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの、異常な細胞増殖に関与するシグナリング経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ．ＲＴＭ．ワクチンなどのワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮワクチンおよびＶＡＸＩＤワクチン；トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ）；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ）；ＢＡＹ−４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン；ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）；ＣＣＬ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ）のようなＢｃｌ−２阻害剤；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸または誘導体；ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、および５−ＦＵおよびロイコボビンと併用したオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）による処置レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸのような、上記のうちの２つ以上の併用療法が挙げられる。
【０１８５】
本明細書に記載のこれらの方法は、決して包括的なものではなく、特定の適用に合う方法は当業者に明らかである。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を及ぼすことが知られている化合物との類似によりさらに概算することができる。
【実験例】
【０１８６】
本発明は、以下の実験例に関連してさらに詳細に説明される。これらの例は、例示の目的のためにのみ提供され、別段の定めのない限り、制限的であることを企図されない。したがって、本発明は、以下の例に制限されると解釈されるべきでなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意のおよびすべての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１８７】
さらなる説明をせずとも、当業者は、先の記載および以下の実例を用いて、本発明を成し、利用し、請求項に記載の方法を実践することができる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘し、決して本開示の残りの部分を制限すると解釈されるべきでない。
【０１８８】
（実施例１）
凍結保存した予備活性化複数用量樹状細胞ワクチン
これらの大規模なワクチンを生産できるように、腫瘍抗原でパルスした完全に活性化したＤＣ１ワクチンを生産し、それにより完全に活性化したＤＣ１ワクチンを複数用量シリンジレディ６パックＤＣ１ワクチンとして凍結保存するプロセスを開発した。ＤＣ１は、本明細書中に別記したように、ＤＣ１として凍結保存され、活性化される。例えば、それらを４０％のヒト血清アルブミンおよび５％のＤＭＳＯを含む５５％のプラズマライト培地中で凍結保存する。これらのワクチンは、実験室で生成され、広範に試験され、患者への投与のためにＦＤＡにより設定された品質基準を一貫して満たす。
【０１８９】
本明細書に開示される実験および例において採用される材料および方法をここに記載する。
【０１９０】
凍結保存のための完全に活性化されたＤＣの調製
新たにエルトリエーションした骨髄単球を、６ウエルマイクロプレート中で培養した（１２×１０６細胞／ウエル）。培地は、Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）からなるものであった。添加したＧＭＣＳＦの最終濃度は、５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ４は、１０００Ｕ／ｍｌであった。３７℃で５％ＣＯ２中、細胞を一夜培養した。いくつかのバッチにおいて、１６〜２０時間後、細胞を適切なペプチドでパルスし、さらに６〜８時間培養し、その後、１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γを添加した。ＴＬＲアゴニスト、ＬＰＳ（ＴＬＲ４、１０ｎｇ／ｍｌ）またはＲ８４８（ＴＬＲ８、１μｇ／ｍｌ）で樹状細胞を成熟させた。成熟時間は、少なくとも約６時間であった。その後、ＴＬＲアゴニストで活性化したＤＣは、凍結保存または直ちに使用する準備ができていた。
【０１９１】
Ｔｈ１極性化サイトカインＩＬ−１２の産生を誘導するために、サイトカインＩＦＮ−γ、またはＴＬＲアゴニスト細菌性ＬＰＳおよび／またはＲ８４８の組み合わせでＤＣを活性化する。これは、ＩＦＮ−γを産生するＴ細胞を誘導するはずである。あるいは、ＤＣは、ＡＴＰ、細菌性ＬＴＡ，ＬＰＳおよびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の組み合わせで活性化することができる。これは、ＩＬ−２３、ＩＬ−６およびＩＬ−１βの増幅を引き起こし、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２分泌性Ｔｈ１７細胞により支配される免疫応答をもたらすことができる。
【０１９２】
ＤＣの凍結保存
優しくこすってＤＣを採取した。すべての培地および細胞を毎回、湿った氷に保持した。約８００ＲＰＭで１０分間遠心分離することによって細胞を優しく洗浄した。細胞（例えば、１０×１０６細胞）を、５％のＤＭＳＯを含む５５％のプラズマライト、４０％のヒト血清アルブミンの凍結用培地中で凍結保存し、液体窒素中に貯蔵した。
【０１９３】
本明細書に表す実験の結果をここに記載する。
【０１９４】
複数用量ＤＣ１ワクチン
細胞の回復率、生存率および無菌を評価するために、実験を行った。手短に言えば、白血球除去と向流エルトリエーション法（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）の組み合わせによって末梢血単球を得て、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む血清フリー培地中で一夜培養した。翌日、それらをＨＥＲ−２ペプチド、次いで、ＩＦＮ−γ、続いてＬＰＳでパルスした。４０時間でＤＣ１を採取し、５％のＤＭＳＯを含む５５％のプラズマライト、４０％のヒト血清アルブミンの凍結用培地中で凍結保存し、液体窒素中に貯蔵した。１週間後、それらを融解し、生存率、収率、エンドトキシン検査および無菌性培養を含む出荷基準を得た。１２個の培養はすべて、細菌の増殖がなく、エンドトキシン０．１ＥＵ未満であった。図１は、凍結保存したＤＣ１の生存率を示す。図１に見られるように、細胞を直接融解し、計数した場合の細胞の回復率は、平均８９％であり、生存率は９５％であった。これらのデータは、ＤＣ１ワクチンの凍結保存および生存率が、ＦＤＡが許容可能な７．５％未満のＤＭＳＯを含有する培地中で維持されることを実証する。
【０１９５】
凍結保存後に細胞機能が維持されることを観察した。複数用量ＤＣ１ワクチンの融解後３６時間、ＩＬ−１２およびＴｈ１ケモカインが産生された。融解した細胞は、融解の６時間後から３６時間後まで、高レベルのＩＬ−１２を産生した。ＩＬ−１２のこれらのレベルは、凍結保存した単球から作った調製ＤＣ１ワクチンに匹敵する。
【０１９６】
本明細書に表す結果は、乳癌のＨＥＲ−２腫瘍標的抗原に対して増感された、凍結保存し、予備活性化した複数用量樹状細胞ワクチンが、治療上有効であることを実証する。しかしながら、本発明は、さらに様々な病態生理学的状態に適用可能である。
【０１９７】
複数用量シリンジレディパックＤＣ１ワクチンは、ＨＥＲ−２非発現性乳癌において使用可能である。ＨＥＲ−２は、すべての乳癌の約２５％において発現される。検出可能なレベルのＨＥＲ−２を産生しない乳癌は、ワクチン接種の影響を受けにくい可能性がある。この制約に取り組むために、追加の標的タンパク質がワクチンに添加されうる。例えば、高レベルのＨＥＲ−２を産生しない多くの乳癌は、代わりに、ＨＥＲ−１およびＨＥＲ−３を含む他の関連タンパク質を産生する。いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、これらの他のタンパク質をワクチンに添加することは、これら他の乳癌表現型の標的化を可能とすると考えられる。
【０１９８】
複数用量シリンジレディパックＤＣ１ワクチンは、乳癌以外の他の癌タイプに使用可能である。ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３などの予想される標的タンパク質は、卵巣、前立腺、膵臓、結腸直腸、胃、頭部および頸部、および非小細胞肺癌、ならびに他の一般的な癌を含む、他のタイプの癌にも存在しうる。
【０１９９】
複数用量シリンジレディパックＤＣ１ワクチンは、ＨＩＶまたはＣ型肝炎ウイルスのような慢性の感染症を含むが、それに限定されない慢性の感染性疾患を処置するために使用可能である。ここで、これらのウイルスに特異的なタンパク質は、ＨＥＲ−２または他の癌タンパク質に取って代わり、これらの持続性感染に対する患者の免疫応答を動員するだろう。亢進された免疫がウイルス負荷ならびに付随する疾患の症状および進行を大きく低減するか、または感染を完全に解消することを助けることが可能である。
【０２００】
複数用量シリンジレディパックＤＣ１ワクチンは、自己免疫疾患を処置するために使用可能である。リウマチ関節炎およびループスのような疾患は、免疫系が誤って体の正常組織を攻撃するときに発症する。現行のワクチン／免疫療法製剤が、免疫応答を開始し、増強するようにデザインされているにもかかわらず、いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、病的な免疫応答のスイッチを切るようにＤＣを誘導するワクチンの生産中に、インビトロのシグナルがＤＣに提供されうると考えられる。
【０２０１】
（実施例２）
活性化ＤＣ１の凍結保存が、癌治療に適した大規模な樹状細胞ワクチンを作成する
樹状細胞に基づくワクチン療法は、様々な癌に対する将来有望な指向型療法である。ＤＣをＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増感を最適化して腫瘍エピトープを認識し、抗腫瘍免疫を誘発する表現型にＤＣを成熟させるために、様々な戦略が採用されてきたが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４アゴニストを用いる血清フリー培地（ＳＦＭ）中の単球の迅速な成熟を採用する方法を利用するように実験をデザインし、結果として、免疫応答をＴｈ１型応答に極性化させ、ＩＬ−１２依存性メカニズムによって増感を誘発することのできる成熟ＤＣを生じた。結果は、早期乳癌における補助療法として使用されるこのワクチン戦略の能力を実証する。成熟した状態での樹状細胞（ＤＣ）の凍結乾燥は、個別化された治療のより容易な作成および到達性を許容する。
【０２０２】
樹状細胞の迅速な成熟
新たに成熟させたＤＣ（ＤＣ１）および成熟した状態で凍結乾燥し（ｃｒｙｏＤＣ）、その後融解したＤＣを、生存率および回復率に関して、ならびにフローサイトメトリーによる細胞表面マーカーの発現によって決定した表現型の成熟度に関して比較した。樹状細胞の機能を、多様なサイトカイン、特にインターロイキン１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）の産生を測定することによって決定した。これらの細胞のナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を刺激する能力も評価した。
【０２０３】
生存率（ｐ＝．４８０７）および回復率（ｐ＝．１２２０）において有意差はなかった（図２）。
【０２０４】
両集団は、同様の初期（ＬＰＳ添加後７時間）ＩＬ−１２ｐ７０分泌（ｐ＝．０７６８）を有した。該集団は、３０時間の観察期間にわたって同等のＩＬ−１２ｐ７０分泌レベルを示し、集団間で有意差はなかった（図３）。
【０２０５】
集団およびＩＬ−１β（ｐ＝０．７６９０）、ＩＬ−１α（ｐ＝０．０８４１）、Ｒａｎｔｅｓ（ｐ＝０．９０２）、ＭＤＣ（ｐ＝０．１５１４）、ＩＬ−１０（ｐ＝．１９３７）、ＭｌＰ−１α（ｐ＝．２６７３）、ＩＰ−１０（ｐ＝０，７３６６）、ＩＬ−６（ｐ＝０．２４）、ＩＬ−５（ｐ＝０．０７３５）、ＴＮＦ−β（ｐ＝０．９４２２）、ＩＬ−１５（ｐ＝０．８８７８）、ＭＩＰ−１β（ｐ＝０．９２１７）、ＴＮＦ−α（ｐ＝０．８９７２）、ＩＬ−８（ｐ＝０．７８４４）産生の間に有意差はなかった。（図４）。
【０２０６】
ＤＣ成熟度を意味する細胞表面マーカーは、ＤＣ１とｃｒｙｏＤＣ間で発現に有意差を示さない。両集団は、非特異的なアロ抗原ＣＤ４＋Ｔ細胞応答ならびに抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞認識とＴｈ１極性化応答を誘発した。ＣＤ８０、８３および８６は、ＤＣの成熟を示し、発現には有意差がなかった。各集団と共培養した異なるドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞により機能的能力が誘導され、非特異的なアロ抗原応答およびＩＮＦ−γを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞を結果として生じた（ＤＣ１  １０７．４０ｎｇ／ｍＬおよびｃｒｙｏＤＣ１  １２９．２３ｎｇ／ｍＬ）。２つの集団を腫瘍抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養することによって惹起した抗原特異的な増感は、両群について同等のＩＦＮ−γ分泌を誘発し、ＴＨ１極性化応答をもたらす（図５）。
【０２０７】
本明細書に表される結果は、ＤＣ１の迅速な成熟方法が、機能的に成熟した状態で凍結保存可能であり、表現型および機能を維持し、したがって、癌治療における世界的使用のためのシリンジレディＤＣ１を製造するために使用可能であることを実証する。
【０２０８】
Ｔｈ１極性化免疫反応を推進するためにＤＣ１表現型を維持するとともに、本明細書に表される結果は、ｃｒｙｏＤＣが主としてＴ細胞を増感する能力を維持したことを実証する。ＩＦＮ−γおよびＬＰＳによって成熟したＤＣ１が、サイトカインにより成熟したＤＣに比べて、主としてＣＤ４＋Ｔ細胞を増感する能力の亢進を示すため、これは、成熟戦略にも関連している可能性がある。
【０２０９】
凍結保存した成熟ＤＣの調製のための本プロトコールは、現行の適正製造規範ガイドラインに容易に適合することができ、それによって新たな治療の利用可能性を増大させる。
【０２１０】
（実施例３）
ＣＤ４Ｔ細胞由来のサイトカインおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎが、ＨＥＲ−２高発現性乳癌細胞をＣＤ８Ｔ細胞による殺滅に対して感受性とする
ＨＥＲ−２高発現性乳癌細胞が、これら癌細胞をＣＤ８Ｔ細胞に対して可視的とし、これらの免疫細胞により殺滅可能とする細胞表面上の分子を下方制御することが実証されている。ＣＤ４細胞により産生されるサイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）を、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと併用した場合、ＨＥＲ−２を中程度および高度に発現する乳癌細胞において、それらのクラスＩ分子発現の増大を引き起こすことが示されている。この結果として、ＣＤ８Ｔ細胞は、乳癌細胞をさらによく見ることができ、それらを殺滅しまたはサイトカインを産生してそれらを殺滅することができる。
【０２１１】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを樹状細胞ワクチン（例えば、ＤＣ１ワクチン）と組み合わせて使用することの治療効果を評価するために治験をデザインした。
【０２１２】
ＨｅｒｃｅｐｔｉｎをＤＣ１ワクチンと併用する第Ｉ相ＤＣ１Ｓワクチン試験をデザインした。例えば、ＨＥＲ−２高発現性ＤＣ１Ｓを有する患者のために、２つの用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎと併用したＤＣ１ワクチンを第１週および第４週に受容するように、第Ｉ相試験をデザインした。いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、ＨＥＲ−２発現性ＤＣ１Ｓを有する患者において、この組み合わせが完全応答率を３０％から５０％超まで増大させると考えられる。
【０２１３】
さらに、第ＩＩＩ相ＤＣ１Ｓワクチン試験をデザインした。例えば、エストロゲン非依存性（ＥＲ陰性）、ＨＥＲ−２陽性ＤＣ１Ｓを有する患者における乳癌の再発を予防するために、ワクチン試験を開発した。試験には３つの処置群：１）標準治療（手術および放射線）、２）手術前にＤＣ１ワクチンを受容する、および３）手術前にＤＣ１ワクチン＋Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを受容する、がある。いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、処置に対して完全に応答する患者は、手術後に放射線を回避することができる。この試験が、ＤＣ１Ｓを有する患者におけるワクチンを用いた再発の予防を実証する役目を果たすとも考えられる。
【０２１４】
さらに、早期の侵襲性ＨＥＲ−２陽性乳癌を有する患者における、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと併用する第Ｉ相ネオアジュバントＤＣ１ワクチンをデザインした。例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｏｎとケモカイン調節剤（例えば、ケモカイン活性化剤）を伴うワクチンの組み合わせが、ＨＥＲ−２発現性の小さな侵襲性乳癌を手術前に除去し、化学療法の必要性を回避するか否かを試験するために、第Ｉ相試験をデザインした。いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、免疫応答を中断する免疫抗体を添加する可能性のある（手術前の）このネオアジュバント戦略が、乳癌の処置のための毒性のある化学療法の必要性を排除し、したがって、免疫療法をこの疾患のためのケアの標準としうると考えられる。すなわち、本明細書に開示される処置レジメンは、本発明のワクチンレジメンによって修復可能な自然の免疫応答を用いて乳癌を根絶させるための探求を一歩前進させる。本明細書中で議論するレジメンは、腫瘍内の免疫応答を変化させることによって免疫細胞を腫瘍中へ推進し、免疫細胞のブレーキを外すことによって免疫細胞がより長く働けるようにできる。ＤＣ１ワクチンをＨｅｒｃｅｐｔｉｎと組み合わせ、ケモカイン調節剤も添加することは、乳房中の腫瘍内の免疫細胞の遊走および活性を改善すると考えられる。
【０２１５】
いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、多くの癌において、多数の優れた免疫戦闘細胞（ｉｍｍｕｎｅ−ｆｉｇｈｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）が存在すれば、患者は任意のタイプの治療において成績向上すると考えられる。これは、腫瘍が除去される前に、腫瘍と戦うために免疫細胞が腫瘍中に入れば、患者は、手術、化学療法および放射線を含む他の治療において成績向上し、より良く反応する可能性があることを意味する。
【０２１６】
いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、癌を処置するのに有効な治療は、手術の前に腫瘍内の免疫応答を迅速に変化させて、乳癌および他のタイプの癌を有する患者のアウトカムを改善する作用剤を含む。この戦略は、結腸癌、黒色腫、肺、脳、膵臓、前立腺、食道などを含むが、それに限定されない多様な癌に適用可能である。
【０２１７】
ワクチン接種後に乳房中へ遊走するタイプの免疫細胞、細胞を引き入れるタイプのケモカインおよび癌細胞の除去を助けるためにそれらが発現する分子を測定し、定量するための免疫蛍光アッセイを開発するために実験をデザインした。これらのアッセイは、複数の細胞タイプが同時に可視化されることを可能とし、腫瘍の微小管胸内でそれらがどこに位置するかを示す。ワクチン接種した患者のうちの少なくとも何人かにおいて、その腫瘍がケモカインを産生して、環境中へ細胞を動員して腫瘍細胞を殺滅することが観察されている。
【０２１８】
（実施例４）
ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３遮断の組み合わせ
本明細書中に表される結果は、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３の遮断の組み合わせが、ＨＥＲ−２発現性乳癌における永久的な腫瘍老化を引き起こす際に、抗ＨＥＲ−２ＣＤ４Ｔｈ１細胞に関してきわめて有効であることを実証する。
【０２１９】
ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３を一緒に遮断する組み合わせならびにＣＤ４Ｔｈ１細胞由来のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの添加が、ＨＥＲ−２発現性乳癌のほとんど完全な老化を引き起こすことが観察された。これは、高度および中程度にＨＥＲ−２を発現する乳癌細胞両方の様々な細胞株において証明されている。結果は、この組み合わせが、予防および再発予防にとって有力なものでありうることを実証する。
【０２２０】
これらの実験において採用した材料および方法をここに記載する。
【０２２１】
細胞培養および処理
ヒト乳癌細胞株、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＨＣＣ−１４１９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、１０％ＦＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を追加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で増殖させた。ＪＩＭＴ−１細胞をＯｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）から入手し、同じ完全培地中で増殖させた。正常な不死化ＭＣＦ−１０細胞をＫａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）から入手し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌのインスリン、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素、３０ｍＭの重炭酸ナトリウム、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンおよび５％のウマ胎仔血清を追加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。すべての細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で増殖させた。
【０２２２】
３００，０００個の乳癌細胞を、指示した濃度のヒト組換えＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびヒト組換えＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で５日間処理し、次いで、サイトカイン不存在下でさらに２回継代培養した。細胞を老化関連β−ガラクトシダーゼ酵素（ＳＡ−β−ｇａｌ）検出に供するか、または溶解し、ｐ１５ＩＮＫ４ｂおよびｐ１６ＩＮＫ４ａについてのウエスタンブロット分析に供した。
【０２２３】
いくつかの場合において、細胞を１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブおよびペルツズマブ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）で、指示した回数、処理した。この処理を、サイトカインまたはヒト組換えへレグリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせた。
【０２２４】
同量の細胞を、トランスウエルシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の下のチャンバー中で、１０×１０５個のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞および１０５個の成熟（すなわち、Ｉ型極性化）または未成熟ヒトＤＣと共培養して上のチャンバー中でも培養した。ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞は、選択試験の対象（Ｓｈａｒｍａら、２０１２年、Ｃａｎｃｅｒ  １１８：４３５４〜４３６２頁）から入手した。成熟および未成熟ＤＣをクラスＩＩ由来ＨＥＲ２または対照の無関係（ＢＲＡＦおよびサバイビン）ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で５日間、３７℃でパルスした。対照ウエルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみを含有した。さらに、ＤＣ／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養上清の存在下で０．５×１０５個の細胞を５日間、３７℃でインキュベートした。両アプローチにおいて、次いで、サイトカイン不存在下で細胞をさらに２回継代培養し、老化試験（ｐＨ６におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性ならびにｐ１５ＩＮＫ４ｂおよびｐ１６ＩＮＫ４ａのウエスタンブロット）またはアポトーシス試験（切断されたカスパーゼ３のウエスタンブロット）に供した。ＤＣおよびＤＣ４＋Ｔ細胞の共培養とのインキュベーションの６０分前に以下の抗体：ポリクローナルヤギＩｇＧ抗ヒトＴＮＦ−α（０．７５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−αあたり０．０６μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γあたり０．３μｇ／ｍｌ）ならびに対応する陰性対照としてのヤギＩｇＧアイソタイプ（すべてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）を添加して、Ｔｈ１産生サイトカインを中和した。
【０２２５】
プラスミドのトランスフェクション
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、２μｇのｗｔＨＥＲ２発現ベクター（ｐｃＤＮＡＨＥＲ２）で４８時間、一過性にトランスフェクトした。対照として、２μｇの空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）で細胞をトランスフェクトした。両ベクターは、Ｄｒ．Ｍａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）の厚意により提供された。抗体を含まない完全培地中で、細胞をＴｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）でトランスフェクトした。導入効率を、トランスフェクションの４８時間後にウエスタンブロットにより評価した。
【０２２６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トランスフェクション
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ＳＭＡＲＴ  Ｐｏｏｌ：ＯＮ  ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  ＨＥＲ２  ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ３  ｓｉＲＮＡおよびＳＭＡＲＴ  Ｐｏｏｌ：ＯＮ−ＴＡＲＲＧＥＴｐｌｕｓ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｏｏｌを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。以下の標的配列を使用した：ＨＥＲ２：ＵＧＧＡＡＧＡＧＡＵＣＡＣＡＧＧＵＵＡ（配列番号１）、ＧＡＧＡＣＣＣＧＣＵＧＡＡＣＡＡＵＡＣ（配列番号２）、ＧＧＡＧＧＡＡＵＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＧ（配列番号３）、ＧＣＵＣＡＵＣＧＣＵＣＡＣＡＡＣＣＡＡ（配列番号４）；ＨＥＲ３：ＧＣＧＡＵＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＵＡ（配列番号５）、ＡＧＡＵＵＧＵＧＣＵＣＡＣＧＧＧＡＣＡ（配列番号６）、ＧＣＡＧＵＧＧＡＵＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧ（配列番号７）、ＵＣＧＵＣＡＵＧＵＵＧＡＡＣＵＡＵＡ（配列番号８）；非標的化：ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ、ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡ、ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡ（配列番号９）、ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＣＵＡ（配列番号１０）。３００，０００個の細胞を、血清フリー培地中、ＲＮＡｉ  Ｍａｘ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈａｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｓｉＲＮＡ配列（２５ｎＭ）でトランスフェクトし、１時間後、培地に１０％のＦＢＳを追加した。１６時間後、細胞を、４８時間の血清飢餓、続いて、様々な指定された処理、および発現レベルをチェックするためのウエスタンブロットに供した。
【０２２７】
ｐＨ６におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３％のホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで再度洗浄した。新たに調製した、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）からの老化関連酸性βガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）染色液とともに（ＣＯ２を含まずに）３７℃で一夜、製造者の指示のとおりにインキュベートした。
【０２２８】
ウエスタンブロット分析
ＭＣＦ−１０Ａ、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＭＣＦ−７、Ｔ−４７  ＤまたはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からライセートを調製した。５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール、７０％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＭｇ２Ｃｌおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するバッファー中で細胞を溶解した。ライセートを、４℃で１５分間、１２，０００×ｇで遠心分離した。タンパク質を同じバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈａｎｏｌｏｇｉｅｓ）に可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質をＰＶＤＦへエレクトロブロットした。以下の抗体：すべて、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）からのｐ１５ＩＮＫ４ｂ（Ｋ−１８）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ（５０．１）、ＩＦＮ−γＲα（Ｃ−２０）、ＨＥＲ３（Ｃ−１７）、；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのビンキュリン（Ｖ９１３１）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）からのＨＥＲ２（２９Ｄ８）、切断されたカスパーゼ３（８Ｇ１０）およびＴＮＦ−Ｒ１（Ｃ２５Ｃ１）でメンブレンをイムノブロットした。洗浄後、メンブレンをＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）とともにインキュベートした。エンハンストケミルミネッセンス（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システムＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓを用いることによって可視化した。
【０２２９】
フローサイトメトリーによる細胞死の解析
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、未処理とし、ＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、トラスツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）およびペルツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、トラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせで２４時間処理した。インキュベーション後、製造者の指示に従ってＦＩＴＣ−アネキシン  Ｖ  アポトーシス検出キット（ＢＤバイオサイエンシズ）を用いて、アポトーシス誘導を検出した。手短に言えば、未処理のおよび処理したＳＫＢＲ−３細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度でアネキシン  Ｖ結合バッファーに再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を５μｌのＰＩおよび５μｌのＦＩＴＣ−アネキシン  Ｖとともに、室温で１５分間、暗所でインキュベートした。インキュベーション後、１５０μｌのアネキシン  Ｖ結合バッファーを添加し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析し、ＣＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓソフトウエアによりデータ解析した。ＵＶ照射した細胞を陽性対照として使用した。
【０２３０】
腫瘍発生試験
異種移植実験のために、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（２００μｌのＰＢＳ中、２×１０６細胞）を６週齢の雌性無胸腺（ヌード）マウス（Ｆｏｘｎｎｕ、Ｈａｒｌａｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、５頭のマウス／群）の側腹部に注射した。腫瘍が蝕知可能な場合、動物をトラスツズマブおよびペルツズマブ（３０μｇ／ｋｇ）でｓ．ｃ．処置し、次いで、ｈｒＴＮＦ−αおよびｈｒＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｋｇ）を週２回ｓ．ｃ．注射した。腫瘍形成を蝕知によりモニターし、ｍｍ３で表した腫瘍体積をキャリパーで週２回測定した：幅２×長さ／２。すべての動物実験を、施設のガイドラインを遵守して実行した。
【０２３１】
実験の結果をここに記載する。
【０２３２】
サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γが、相乗して乳癌細胞における老化を誘導する
免疫系細胞が産生したサイトカインが、腫瘍細胞において特異的な老化応答を誘導することができた場合には、ＳＫ−ＢＲ−３細胞をヒト組換え腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）単独またはその組み合わせとともに３７℃において５日間インキュベートした。次いで、細胞をさらに２回継代培養し、老化試験に供した。両サイトカインの組み合わせは、ウエスタンブロットにより検出した対照未処理細胞または各サイトカイン単独に比べて増加した老化関連酸性βガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）染色（図６Ａ）ならびに老化関連マーカーｐ１５ＩＮＫ４ｂおよびｐ１６ＩＮＫ４ａの高発現（図６Ｂ）により証明された、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の老化誘導をもたらした。同様の結果が、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ乳癌細胞株（データは示さない）において得られた。したがって、Ｔ−４７Ｄ細胞を、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの数種の濃度のＴＮＦ−α、および１００〜１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ、またはその組み合わせで処理した。老化表現型の誘導は用量依存性であったことを観察した（図６Ｃ）。同様の結果を、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４およびＭＣＦ−７細胞において認めた。
【０２３３】
乳癌細胞中のＨＥＲ２発現レベルと老化を誘導するために必要なＴｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの用量との間の逆相関
ＨＥＲ２発現レベルが、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる５日間、３７℃における処理、続いてサイトカインを含まずにさらに２回継代培養したことにより、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞において誘導された老化に役割を演じるか否かを決定するために実験をデザインした。実際に、高いサイトカイン濃度を伴う中程度のＨＥＲ２発現細胞株（Ｔ−４７Ｄ、図６ＤおよびＭＣＦ−７、データは示さない）と比較して、低用量のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによって、ＨＥＲ２高発現細胞株（ＳＫ−ＢＲ−３、図６ＤおよびＢＴ−４７４、データは示さない）においてＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の量が増大した。しかしながら、最高濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γでさえ、ＨＥＲ２低発現性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においては老化を誘導することができなかった（図６Ｄ）。これらの結果は、老化を誘導するＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γとＨＥＲ２発現レベルの間の相間を明白に証明する。
【０２３４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞における、Ｔｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ介在性の老化およびアポトーシスのためにＨＥＲ２が必要である
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、野生型ＨＥＲ２プラスミド（ｐｃＤＮＡＨＥＲ２）で安定にトランスフェクトし、高濃度のＴＮＦ−α（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（２０００Ｕ／ｍｌ）で５日間、３７℃で処理し、続いてサイトカイン非存在下でさらに２回継代培養した場合にのみ、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞（図７Ａ）およびｐ１５ＩＮＫ４ｂ発現（図７Ｂ）が強力に増加した。とりわけ，ＨＥＲ２−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を高濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γとともに培養した場合に、比較的多くの青い老化細胞があっただけでなく、細胞量が顕著に少なかったことがわかったため、実験を繰り返し、活性カスパーゼ３を検出するために細胞をウエスタンブロットに供した（図７Ｂ）。対照の空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）によってトランスフェクトした細胞の上昇濃度のＴＮＦ−α、７５〜２００ｎｇ／ｍｌおよびＩＦＮ−γ、７５０〜２０００Ｕ／ｍｌの組み合わせによる、上記と同じ条件における処理は、ＳＡ−β−ｇａｌ染色（図７Ａ）またはｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ３発現（図７Ｂ）により評価した老化誘導に対して効果がなかった。この知見は、ＨＥＲ２が、乳癌細胞におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ誘導性老化およびアポトーシスのメカニズムに必要であることを強固にした。
【０２３５】
サイトカイン受容体は、乳癌細胞において同様のレベルで発現される
ＨＥＲ−２高発現性細胞株ＳＫ−ＢＲ−３およびＢＴ−４７４、中程度のＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ、ならびに低度のＨＥＲ２正常不死化ＭＣＦ−１０乳癌細胞株のようなＨＥＲ−２低発現性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株は、ウエスタンブロット解析により同様のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α受容体発現を示した（図１２）。この結果は、これら２つのサイトカイン受容体の発現レベルが、ＨＥＲ２発現レベルに依存しないことを実証する。これは、正常な乳房中の様々な相におけるこれらサイトカインの作用を説明する報告に合致する。ＴＮＦ−αは、正常な乳腺の増殖、発達および枝分かれ形態に関与する（Ｌｅｅら、２０００年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１：３７６４〜３７７３頁）。受容体ＴＮＦＲ１の発現は、ＴＮＦ−αにより誘導される乳房上皮細胞の増殖を仲介し、ＴＮＦＲ２の活性化は、カゼイン蓄積を誘導する（Ｖａｒｅｌａら、１９９６年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：４９１５〜４９２４頁）。同様に、ＩＦＮ−γの活性型は、ほとんどすべての正常細胞の表面上に発現されるその受容体と相互作用する（Ｅａｌｉｃｋら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２；６９８〜７０２頁；Ｆｒｒａｒら、１９９３年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１：５７１〜６１１頁）。
【０２３６】
ＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現遮断の組み合わせが、乳癌細胞においてｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる老化誘導を亢進する
サイトカインの組み合わせにより処理したＨＥＲ−２高発現性および中程度発現性細胞株における老化およびアポトーシス表現型の亢進を示す先の結果が、ｓｉＲＮＡによるＨＥＲ２およびＨＥＲ３のノックダウンの効果の研究に導いた。乳癌においてＨＥＲ２／ＨＥＲ３シグナリングを遮断することの治療効果は、数種の研究において実証されている（Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４：５８７８〜８７頁；Ｂｅｒｇｈｏｆｆら、２０１４年、Ｂｒｅａｓｔ  １４：Ｓ０９６０〜９７７６頁）。ＨＥＲ３欠失細胞におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの組み合わせ処理は、老化またはアポトーシス細胞の数を亢進しなかったが、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３ｓｉＲＮＡによるダブルノックダウンは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ染色（図８Ａ）およびｐ１５ＩＮＫ４ｂ発現レベル（図８Ｂ）を強力に増大させた。同時に、活性カスパーゼ３のウエスタンブロットによって、ダブルノックダウンおよびサイトカインにより処理した細胞の高度なアポトーシ誘導を観察した（図８Ａ）。同様の結果を、ＭＣＦ−７細胞（図１３）、ＢＴ４７４およびＴ４７Ｄ細胞において認めた。
【０２３７】
ＨＥＲ２阻害およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体化阻害の組み合わせが、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞におけるＴｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの老化誘導およびアポトーシスを亢進する
トラスツズマブおよびペルツズマブは、ＨＥＲ２陽性乳癌を処置するために、クリニックにおいて広く使用されてきた抗体である。翻訳的アプローチにおけるＴｈ１サイトカイン誘導性の老化およびアポトーシスを研究するために、実験をデザインして、トラスツズマブおよびペルツズマブでＳＫ−ＢＲ−３細胞を前処理し、次いで、細胞をＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γで５日間、３７℃において処理し、続いてサイトカインおよび抗体のない状態でさらに２回継代培養した。サイトカインのみで処理した細胞と比較して、完全な処理を受けた細胞において、ＳＡ−β−ｇａｌ染色により測定した青色の細胞の量が大きく増加し（図９Ａ）、ウエスタンブロットにより測定したｐ１５ＩＮＫ４ｂの発現が増大したこと（図９Ｂ）を観察した。興味深いことに、この二重処理は、ウエスタンブロットによる活性カスパーゼ３発現の増加（図９Ｂ）およびフローサイトメトリー分析によるアネキシンｖおよびヨウ化プロピジウム陽性細胞の量の増加の両方によって、アポトーシスの誘導に対しても顕著な効果を有した（図９Ｃ）。
【０２３８】
ＣＤ４＋Ｔｈ１を介する、ＨＥＲ２過剰発現性ヒト乳癌細胞の老化およびアポトーシス
インビボで免疫系細胞によって産生されたサイトカインが腫瘍細胞における特異的な老化およびアポトーシスも誘導できたことを確認するために、実験をデザインして、トランスウエル培養システムを用いてＨＥＲ２クラスＩＩペプチドで刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞とＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞を共培養した。３７℃において５日間、細胞を共培養し、次いで、免疫系細胞を含まない完全培地中でさらに２回継代培養した。この共培養は、ＳＡ−β−ｇａｌ染色（図１０Ａ）の量の増加およびウエスタンブロットにより検出したｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ３の発現増加（図１０Ｂ）により証明された、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の老化およびアポトーシスをもたらした。未成熟の樹状細胞（ＤＣ）または成熟ＤＣプラス無関係のクラスＩＩ（ＢＲＡＦまたはサバイビン）ペプチドのいずれかで刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の老化もアポトーシスも誘導することができなかった（図１０）。
【０２３９】
観察した老化およびアポトーシスは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、トラスツズマブおよびペルツズマブの存在下、トランスウエル中でＣＤ４−Ｔ細胞で刺激したＨＥＲ２クラスＩＩペプチドと共培養した場合に、大きく増強された。この結果は、ＳＡ−β−ｇａｌ染色（図１０Ａ）ならびにｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ３の発現レベル（図１０Ｂ）の増大によって明白に証明された。
【０２４０】
別のアプローチとして、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞−成熟ＤＣの共培養からの上清と共培養し、同様の特異的老化応答を観察した。ＣＤ４＋Ｔ細胞−成熟ＤＣの共培養上清から得た、Ｔｈ１刺激性サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＧ−αを、ＥＬＩＳＡを用いて先に確認した。両実験アプローチにより、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを遮断する中和抗体によって、ＳＫ−ＢＲ−３の老化およびアポトーシスを一部救済することができた（図１４）。
【０２４１】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞において、免疫系細胞の数の増加が、両アプローチによってより高度なＳＡ−β−ｇａｌ染色、ｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ３の発現レベルを誘導したため、この効果が用量依存的であったことも観察した。
【０２４２】
Ｔｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γが、トラスツズマブおよびペルツズマブ抵抗性乳癌細胞を、老化およびアポトーシス誘導に対して増感させる
Ｔｈ１サイトカインが老化およびアポトーシスを誘導できるメカニズムを引き続き解明して、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、乳癌抵抗性細胞にトラスツズマブおよびペルツズマブに対する感受性を回復させることができたと考えられる。トラスツズマブおよびペルツズマブによる処理が、Ｔ−４７Ｄ感受性細胞とは反対に、２つの抵抗性細胞株、ＨＣＣ−１４１９（Ｏ‘Ｂｒｉｅｎら、２０１０年、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６：１４８９〜５０２頁）およびＪＩＭＴ−１（Ｏ‘Ｂｒｉｅｎら、２０１０年、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６：１４８９〜５０２頁；Ｔｎｎｅｒら、２００４年、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  １２：１５８５〜９２頁）においてＡＫＴの活性化を防止することができなかった（図１６）。
【０２４３】
ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる処理は、ＨＣＣ−１４１９およびＪＩＭＴ−１細胞において、用量依存的に老化およびアポトーシスを誘導した。細胞をトラスツズマブおよびペルツズマブで処理した場合、高用量であっても老化およびアポトーシスを証明することはできなかった（図１１）（データは示さない）。しかしながら、サイトカインおよび抗体による二重処理は、ＨＣＣ−１４１９およびＪＩＭＴ−１細胞において、ＳＡ−β−ｇａｌアッセイによる老化を誘導し（図１１Ａ、１１Ｃ）、ｐ１５ＩＮＫ４ｂの発現を増大させた（図１１Ｂ、１１Ｄ）。さらに、サイトカインと抗体の組み合わせは、ＨＣＣ−１４１９およびＪＩＭＴ−１細胞において、細胞死を有効に誘導した（図１１Ｂ、１１Ｄ）。この結果は、Ｔｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γが、癌患者に広く影響を及ぼす、治療剤に対する抵抗性を復帰させることができたことを実証する。
【０２４４】
本明細書中に引用された各特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態に関して開示されたが、本発明の他の実施形態および変形が、本発明の真の趣旨および範囲を離れることなく、他の当業者によって考案されうることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての実施形態および等価な変形を含むと解釈されることを企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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