(57)【要約】  生分解性トレハロースコポリマーの構造および作製方法を開示する。具体的には、生分解性トレハロースコポリマーは、一般構造：Ｒ5−［Ｒ1Ｒ2Ｃ−ＣＲ3Ｒ4］n−［ＤＧ］m−Ｒ6［式中、Ｒ1−Ｒ4は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、およびＲ1−Ｒ4の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロース［ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子である］を含む側鎖であり、ＤＧは生分解性基であり、ならびにＲ5およびＲ6は末端基である］から成る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性トレハロースコポリマーであって、前記コポリマーが、一般構造
Ｒ5−［Ｒ1Ｒ2Ｃ−ＣＲ3Ｒ4］n−［ＤＧ］m−Ｒ6
［式中、Ｒ1−Ｒ4は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、Ｒ1−Ｒ4の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロースを含む側鎖であり、ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子であり、ＤＧは生分解性基であり、Ｒ5およびＲ6は末端基である］
から成る、生分解性トレハロースコポリマー。
【請求項２】
Ｒ5およびＲ6が、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、ジスルフィド還元剤、マイケルアクセプター、マレイミド、マレイミド誘導体、ジハロマレイミド、ビニル基、ビニルスルホン、アクリロイル誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アリール化剤、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、カーボネート、クロロホルメート、アルキルハロゲン、イソシアネート、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジンおよび生体分子から成る群より独立して選択される、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項３】
Ｒ5およびＲ6が、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）2、−Ｓ2Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、−（ＣＨ3）ＣＨＣＯＯ−アリール、−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＳＳ−アリール（ｎ＝１〜１０）および生体分子から成る群より独立して選択される、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項４】
ＤＧが少なくとも１個のエステル基を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項５】
前記エステル基がコポリマーの骨格中に存在する、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項６】
前記エステル基は、開環重合を介して環状ケテンアセタールから生成される、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項７】
前記環状ケテンアセタールが、下記の構造を有する、請求項６に記載のコポリマー。
【化１】
2017524790.tif 000025
【請求項８】
前記コポリマーの分解生成物が非細胞毒性である、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項９】
前記コポリマーの分解生成物が細胞増殖を妨げない、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１０】
前記コポリマーが、下記の構造を有する、請求項１に記載のコポリマー。
【化２】
2017524790.tif 000026
【請求項１１】
前記コポリマーが、インビトロまたはインビボで、塩基性条件下でまたは加水分解によって分解可能である、請求項１０に記載のコポリマー。
【請求項１２】
前記コポリマーが、下記の構造を有する、請求項１に記載のコポリマー。
【化３】
2017524790.tif 000027
【請求項１３】
生分解性トレハロースコポリマーであって、前記ポリマーが、一般構造
Ｒ5−［ＤＧ−ＣＨＲ1−（ＣＲ2Ｒ3）n］m−Ｒ6
［式中、Ｒ1−Ｒ3は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、Ｒ1−Ｒ3の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロースを含む側鎖であり、ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをコポリマーに連結するリンカー分子であり、ＤＧは生分解性基であり、Ｒ5およびＲ6は末端基であり、ｎ＝０〜１０であり、ｍ≧１である］
から成る、生分解性トレハロースコポリマー。
【請求項１４】
Ｒ5およびＲ6が、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、ジスルフィド還元剤、マイケルアクセプター、マレイミド、マレイミド誘導体、ジハロマレイミド、ビニル基、ビニルスルホン、アクリロイル誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アリール化剤、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、カーボネート、クロロホルメート、アルキルハロゲン、イソシアネート、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジンおよび生体分子から成る群より独立して選択される、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１５】
Ｒ5およびＲ6が、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）2、−Ｓ2Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、−（ＣＨ3）ＣＨＣＯＯ−アリール、−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＳＳ−アリール（ｎ＝１〜１０）および生体分子から成る群より独立して選択される、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１６】
ＤＧが少なくとも１個のエステル基を含む、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１７】
前記エステル基がポリマーの骨格中に存在する、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１８】
生体分子を安定化するための生分解性トレハロースコポリマーを合成する方法であって、
（ａ）トレハロース分子を含む側鎖を重合可能なモノマーに組み込むステップ、および
（ｂ）請求項１に記載のコポリマーを得るために、前記生じたモノマーを環状ケテンアセタールと共重合させるステップ
を含む方法。
【請求項１９】
前記コポリマーは、化学合成を介して生成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記重合可能なモノマーが、スチレンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、メタクリルアミドモノマー、ビニルモノマー、ノルボレニルモノマーおよび歪んだ環状アルケンモノマーから成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記環状ケテンアセタールが、下記の構造を有する、請求項１８に記載の方法。
【化４】
2017524790.tif 000028
【請求項２２】
ホモポリマーまたはコポリマーを得るために、前記生じたモノマーを共重合させるステップは、以下の技術に限定されるものではないが、以下の技術：可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合、または開環重合（ＲＯＰ）のいずれか１つによって実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ホモポリマーまたはコポリマーを得るために、前記生じたモノマーを共重合させるステップは、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって実施する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記トレハロースの前記ヒドロキシル基の１つ以上は、アセタールまたはエーテルの形成によって保護される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
生体分子を安定化するための生分解性トレハロースポリマーを合成する方法であって、
ａ）ポリマーを形成するために環状エステルをアルコールで重合させるステップと、ここで前記環状エステルはペンダント官能基を含み、
ｂ）チオール化トレハロースモノマーを調製するステップと、
ｃ）前記生分解性トレハロースポリマーを形成するために、前記ポリマーを前記チオール化トレハロースモノマーと反応させるステップ
を含む方法。
【請求項２６】
前記環状エステルがアリル官能基化カプロラクトン（ａＣＬ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルコールが、開始剤としての第一級アルコールである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記段階ａ）の反応がＲＯＰである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記段階ａ）の反応がさらに触媒を必要とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記触媒がトリアザビシクロデカン（ＴＢＤ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記チオール化トレハロースモノマーが、下記の構造を有する、請求項２５に記載の方法。
【化５】
2017524790.tif 000029
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、すべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年８月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／０３６，９７３号の優先権を主張する。
【０００２】
［連邦政府資金による研究開発の記載］
本発明は、アメリカ国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって与えられた、契約番号ＣＨＥ１１１２５５０の下での連邦政府の支援を得て為された。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
生分解性トレハロースグリコポリマーのための組成物および方法を開示する。具体的には、組成物は、生分解性結合を有する新規トレハロースベースのコポリマーを含み、コポリマーは非細胞毒性生成物へと分解され得る。
【背景技術】
【０００４】
Ａｄａｇｅｎが１９９０年に最初のタンパク質−ポリマーコンジュゲートとして食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されて以来、タンパク質−ポリマーコンジュゲートの分野は大きく成長してきた。現在、これらの生物学的治療薬は、２０１１年には７４億ドルを超える市場に成長した（Ｅｖａｌｕａｔｅ  Ｌｔｄ．Ｄｒｕｇ  ｓａｌｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ；ｗｗｗ．ｅｖａｌｕａｔｅｇｒｏｕｐ．ｃｏｍ）。タンパク質コンジュゲートは、酵素置換療法から過剰活性サイトカインまたは受容体の中和などの新規機能まで、多様な治療適用を有する（Ａｌｃｏｎｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。結果として、タンパク質コンジュゲートの処置期間も有意に変動する。一部の処置は一時的であるが、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは酵素置換療法においても使用され、これは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）または痛風などの慢性疾患を処置するために長期間にわたる注射を必要とする（Ａｌｃｏｎｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００５】
タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、欠損酵素または機能不全酵素の問題に独自の解決を提供するが、それらの慢性使用はインビボで長期的な課題を提起する。現在、食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された１０の治療用タンパク質コンジュゲートのすべてがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を使用する（Ｐｆｉｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｂｉｄｅｌｌｉ，２０１４；Ｂｅｓｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｐｅｌｅｇｒｉ−Ｏ’Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＰＥＧは多くの分野で広く使用されているが、その治療適用ではいくつかの欠陥が認められている。これらには、組織中の蓄積を引き起こす非生分解性および反復投与後の血中クリアランスの加速などの免疫学的応答が含まれる（Ｂｅｓｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０００６】
ポリマー複合体化はまた、典型的にはタンパク質活性部位の立体遮蔽に起因するコンジュゲートの生物活性の低下をもたらす。加えて、タンパク質療法は温度変動および他のストレッサーに暴露された場合に極めて活性喪失を受けやすいので、タンパク質治療薬はしばしば付加的な安定化のための賦形剤と共に製剤されねばならない（“ＦＤＡ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｄａｔａ”，ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ）。ＰＥＧ化は環境ストレッサーに対する安定性を増大させることが多いが、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはすべて、まだ冷蔵される必要があり、安定剤としての賦形剤を含有する（Ｌｅａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｋｅｅｆｅ  ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ，２０１２；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００７】
これらの難点を改善するＰＥＧ代替物が開発されている。例えば、Ｍａｙｎａｒｄのグループの以前の研究は、ペンダントトレハロース単位を含むポリマーが熱、凍結乾燥および電子線照射に対してタンパク質を安定化することを示した（Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。トレハロースは、食品および化粧品産業において広く使用されている賦形剤であり、脱水ストレスに対して動物および植物を保護するのに重要であることが示されている（Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｙ，２００９）。荷電ポリマー、ポリオールおよび他のサッカリドベースの物質を含む他のポリマーは、タンパク質安定化特性を示すことが明らかにされている（Ｋｅｅｆｅ  ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ，２０１２；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｃｏｎｇｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｔｉｄｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらのポリマーすべてが、同じく環境ストレッサーに対する安定化を提供する、ＰＥＧ代替物として活発に検討されている。しかし、これらの例はまだ生分解性ではない。
【０００８】
分解性ポリマーは、特に酵素置換および他の慢性療法に関して、体内でのポリマーの蓄積を回避するために重要である。分解性多糖類コンジュゲートも、バイオポリマー、例えばヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）（Ｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ポリシアル酸（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）およびデキストリン（Ｈａｒｄｗｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｈａｒｄｗｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）などにタンパク質を複合体化させることによって調製されている。制御ラジカル重合（ＣＲＰ）による分解性タンパク質−ポリマーコンジュゲートの合成も最近報告されている（Ｄｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ，２０１５）。これらのコンジュゲートの多くはインビボ半減期の増大を示す。しかし、これらのポリマーの多くは不均一であり、このことはＦＤＡの承認をより難しくすると考えられ、またこれらは必ずしもタンパク質を安定化しない。
【０００９】
我々は、ポリマーがタンパク質を安定化し、生分解するように、明確に定義されたポリエステル骨格およびトレハロース側鎖のポリマーを調製することを目指した。主鎖骨格中にエステルまたはアミドのいずれかを含む明確に定義された生分解性グリコポリマーのこれまでの例は（トレハロースに関して報告されたものはない）、２つの方法で、すなわち、糖官能基化モノマーの重合によって、または反応性ハンドルを含むポリマーの重合後修飾によって、重合された（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｌａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかし、典型的なポリエステルまたはポリアミド合成は無水条件を必要とし、これは典型的な有機溶媒へのトレハロースの低い溶解度と適合性である。それゆえ、反応性ハンドルを含むポリエステルを最初に合成し、後で重合および精製後にトレハロース単位で官能基化することができた。様々な高収率の「クリック」反応がグリコポリマーの合成に関して明らかにされているが、チオール−エン反応は、高い収率で形成することができる安定なチオエーテルを生じる（Ｃａｍｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００１０】
ポリマーは、タンパク質のミスフォールディングおよび変性を防ぐための添加剤として使用し得る。しかし、ポリマーの長い寿命が廃棄物の管理および処分の連鎖的な問題（ｄｏｗｎ‐ｃｈａｉｎ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ）を引き起こすので、食品添加物および薬物成分としてのポリマーの使用および開発はそれ自体の問題を提起する。医療および非医療分野の両方におけるポリマーの広い適用性により、生分解性ポリマーを開発することへの関心は大きく増大している（Ａｇａｒｗａｌ，Ｓ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１０，１，９５３−９６４）。ポリマーが世界中で使用され続けると共に、易分解性「グリーン」ポリマーの合成に向けての動きはますます重要である。
【００１１】
トレハロースは、温度変化および脱水に対する保護を示すことが証明されており2、食品および化粧品産業において広く使用されている、α，α−１，１結合グルコース単位によって形成される非還元性二糖類である。出願人の以前の研究は、ペンダントトレハロース基を有するグリコポリマーが、遊離（非重合）トレハロースおよびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）よりも良好な、熱負荷および凍結乾燥の両方に対する優れた保護を提供することを示した（Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。これらのポリマーは様々な適用のために有望であるが、出願人は本明細書において、ポリマーを分解可能にする技術を開発する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
タンパク質を安定化し、生分解する、および妥当な生産量で容易に合成できる、生分解性ポリマーが当分野で必要とされている。タンパク質および他の生体分子を安定化し（例えば凍結乾燥工程および熱負荷に対して）、同時にエステル加水分解などの簡単な工程を介して分解され得る、分解性トレハロースグリコポリマーが当分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様では、本発明は生分解性トレハロースコポリマーに関する。コポリマーは、一般構造：
Ｒ5−［Ｒ1Ｒ2Ｃ−ＣＲ3Ｒ4］n−［ＤＧ］m−Ｒ6
［式中、Ｒ1−Ｒ4は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、およびＲ1−Ｒ4の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロース［ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子である］を含む側鎖であり、ＤＧは生分解性基であり、ならびに
Ｒ5およびＲ6は末端基である］
から成る。
【００１４】
１つの実施形態では、Ｒ5およびＲ6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、ジスルフィド還元剤、マイケルアクセプター、マレイミド、マレイミド誘導体、ジハロマレイミド、ビニル基、ビニルスルホン、アクリロイル誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アリール化剤、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、カーボネート、クロロホルメート、アルキルハロゲン、イソシアネート、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジンおよび生体分子から成る群より独立して選択される。
【００１５】
１つの実施形態では、Ｒ5およびＲ6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）2、−Ｓ2Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、−（ＣＨ3）ＣＨＣＯＯ−アリール、−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＳＳ−アリール（ｎ＝１〜１０）および生体分子から成る群より独立して選択される。
【００１６】
１つの実施形態では、ＤＧは少なくとも１個のエステル基を含む。
【００１７】
１つの実施形態では、エステル基はコポリマーの骨格中に存在する。
【００１８】
１つの実施形態では、エステル基を、開環重合を介して環状ケテンアセタールから生成する。
【００１９】
１つの実施形態では、環状ケテンアセタールは、下記の構造を有する。
【００２０】
【化１】
2017524790.tif 000002
【００２１】
１つの実施形態では、コポリマーの分解生成物は非細胞毒性であり、コポリマーの分解生成物は細胞増殖を妨げない。
【００２２】
１つの実施形態では、コポリマーは、下記の構造を有する。
【００２３】
【化２】
2017524790.tif 000003
【００２４】
１つの実施形態では、コポリマーは、インビトロまたはインビボで、塩基性条件下でまたは加水分解によって分解可能である。
【００２５】
１つの実施形態では、コポリマーは、下記の構造を有する。
【００２６】
【化３】
2017524790.tif 000004
【００２７】
１つの態様では、本発明は生分解性トレハロースコポリマーを開示し、ここでポリマーは、一般構造：
Ｒ5−［ＤＧ−ＣＨＲ1−（ＣＲ2Ｒ3）n］m−Ｒ6
［式中、Ｒ1−Ｒ3は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、およびＲ1−Ｒ3の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロース［ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをコポリマーに連結するリンカー分子である］を含む側鎖であり、ＤＧは生分解性基であり、ならびにＲ5およびＲ6は末端基であり、ならびにｎ＝０〜１０であり、ｍ≧１である］
から成る。
【００２８】
１つの実施形態では、Ｒ5およびＲ6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、ジスルフィド還元剤、マイケルアクセプター、マレイミド、マレイミド誘導体、ジハロマレイミド、ビニル基、ビニルスルホン、アクリロイル誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アリール化剤、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、カーボネート、クロロホルメート、アルキルハロゲン、イソシアネート、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジンおよび生体分子から成る群より独立して選択される。
【００２９】
１つの実施形態では、Ｒ5およびＲ6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）2、−Ｓ2Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、−（ＣＨ3）ＣＨＣＯＯ−アリール、−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＳＳ−アリール（ｎ＝１〜１０）および生体分子から成る群より独立して選択される。
【００３０】
１つの実施形態では、ＤＧは少なくとも１個のエステル基を含む。
【００３１】
１つの実施形態では、エステル基はポリマーの骨格中に存在する。
【００３２】
１つの態様では、本発明は、生体分子を安定化するための生分解性トレハロースコポリマーを合成する方法であって、（ａ）トレハロース分子を含む側鎖を重合可能なモノマーに組み込むステップ、および（ｂ）請求項１に記載のコポリマーを得るために、生じたモノマーを環状ケテンアセタールと共重合させるステップを含む方法を開示する。
【００３３】
１つの実施形態では、コポリマーを、化学合成を介して生成する。
【００３４】
１つの実施形態では、重合可能なモノマーは、スチレンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、メタクリルアミドモノマー、ビニルモノマー、ノルボレニルモノマーおよび歪んだ環状アルケンモノマーから成る群より選択される。
【００３５】
１つの実施形態では、環状ケテンアセタールは、下記の構造を有する。
【００３６】
【化４】
2017524790.tif 000005
【００３７】
１つの実施形態では、ホモポリマーまたはコポリマーを得るために、生じたモノマーを共重合させるステップは、以下の技術に限定されるものではないが、以下の技術：可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合、または開環重合（ＲＯＰ）のいずれか１つによって実施される。
【００３８】
１つの実施形態では、ホモポリマーまたはコポリマーを得るために、生じたモノマーを共重合させるステップは、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって実施する。
【００３９】
１つの実施態様では、トレハロースのヒドロキシル基の１つ以上を、アセタールまたはエーテルの形成によって保護する。
【００４０】
１つの態様では、本発明は、生体分子を安定化するための生分解性トレハロースポリマーを合成する方法を開示する。この方法は、ａ）ポリマーを形成するために、環状エステルをアルコールで重合させるステップと、ここで環状エステルはペンダント官能基を含み、ｂ）チオール化トレハロースモノマーを調製するステップと、ｃ）生分解性トレハロースポリマーを形成するために、ポリマーをチオール化トレハロースモノマーと反応させるステップを含む。
【００４１】
１つの実施形態では、環状エステルはアリル官能基化カプロラクトン（ａＣＬ）である。
【００４２】
１つの実施形態では、アルコールは、開始剤としての第一級アルコールである。
【００４３】
１つの実施形態では、段階ａ）の反応はＲＯＰである。
【００４４】
１つの実施形態では、段階ａ）の反応はさらに触媒を必要とする。
【００４５】
１つの実施形態では、触媒はトリアザビシクロデカン（ＴＢＤ）である。
【００４６】
１つの実施形態では、チオール化トレハロースモノマーは、下記の構造を有する。
【００４７】
【化５】
2017524790.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、トシル化トレハロース４の1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図２】図２は、トシル化トレハロース４の13Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図３】図３は、トシル化トレハロース４のＨＳＱＣ  ２Ｄ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図４】図４は、チオアセテートトレハロース５の1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図５】図５は、チオアセテートトレハロース５の13Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図６】図６は、チオールトレハロース６の1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図７】図７（ａおよびｂ）は、ａ）ポリ１〜３、赤色：ポリ１、青色：ポリ２、緑色：ポリ３のゲル浸透クロマトグラムおよびｂ）ポリ３のサイズ排除クロマトグラフィを示すグラフのセットである。
【図８】図８は、アリル官能基化ポリ（カプロラクトン）の1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）を示すグラフである。
【図９】図９は、アセテート保護トレハロース−カプロラクトンポリマーの1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）を示すグラフである。
【図１０】図１０は、アセタール末端官能基化トレハロース−カプロラクトンの1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、官能基化後に調製したメタクリレート末端基を有するポリ（カプロラクトン）の1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図１２】図１２（ａおよびｂ）は、トレハロース−ＣＬによるリゾチーム（ａ）およびβ−Ｇａｌ（ｂ）の安定化を示すグラフのセットである。＃＃＃：同じ重量当量のトレハロースと比較したｐ＜０．００１。＃＃：同じ重量当量のトレハロースと比較したｐ＜０．０１。＃：同じ重量当量のトレハロースと比較したｐ＜０．０５。***：陰性対照と比較したｐ＜０．００１。＊＊：陰性対照と比較したｐ＜０．０１。*：陰性対照と比較したｐ＜０．０５。白色は添加物なしであり、暗色はトレハロースカプロラクトンポリマーを添加しており、および灰色はトレハロースを添加している。
【図１３】図１３は、リゾチームの安定化におけるトレハロース−カプロラクトンポリマー（暗色）とスチレニルエーテルトレハロースポリマー（ＳＥＴポリ；灰色）の比較を示すグラフである。***：陰性対照と比較したｐ＜０．００１。**：陰性対照と比較したｐ＜０．０１。白色は添加物なしである。
【図１４】図１４は、５％ＫＯＨでの分解前および分解後のカプロラクトン−トレハロースポリマーのサイズ排除クロマトグラムを示すグラフのセットである。
【図１５】図１５は、トレハロース−カプロラクトンポリマーのリゾチームへの複合体化を表示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、トレハロース−カプロラクトンポリマーのＧ−ＣＳＦへの複合体化を表示する銀染色でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示すグラフである。
【図１７】図１７は、ペル−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース５の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ペル−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース５の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図１９】図１９は、２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース６の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図２０】図２０は、２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース６の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図２０】図２０は、２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−６−Ｏ−メタクリレート−α，α−トレハロース７の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図２２】図２２は、２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−６−Ｏ−メタクリレート−α，α−トレハロース７の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ＢＭＤＯ−ｃｏ−ｂＭＡポリマーの1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ3ＣＮ中）を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ポリ１〜３、橙色：ポリ１（ポリ（ＢＭＤＯ−コ−ｂＭＡ）；青色：ポリ２（ポリ（ＢＭＤＯ−コ−アセテートトレハロースＭＡ）；緑色：ポリ３（ポリ（ＢＭＤＯ−コ−トレハロースＭＡ）のゲル浸透クロマトグラムを示すグラフである。
【図２５】図２５は、ＢＭＤＯアリールピークおよびトレハロースピークを示すトレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ５の1Ｈ−ＮＭＲを示すグラフである。
【図２６】図２６は、ＴＭＳ保護基の除去前（黒色、上）および除去後（灰色、下）のトレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ４〜５のＩＲスペクトルの相違を示すグラフである。
【図２７】図２７は、ＴＭＳ−トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ４の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示すグラフである。
【図２８】図２８は、ＴＭＳ−トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ４のＩＲスペクトル（ニート）を示すグラフである。
【図２９】図２９は、トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ５の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ）を示すグラフである。
【図３０】図３０は、トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ５のＩＲスペクトル（ニート）を示すグラフである。
【図３１】図３１（ａおよびｂ）は、ａ）賦形剤としてトレハロースホモポリマーおよびコポリマー（リゾチームに対して１００重量当量）と共に９０℃で２０分間加熱する前および加熱後のリゾチームの活性ならびにｂ）４℃での賦形剤混合物の最初の活性に対する活性として提示した、賦形剤としてトレハロースホモポリマーおよびコポリマーの添加を伴う熱ストレス後のリゾチームの活性を示すグラフのセットである。添加物なしと比較して、*＝ｐ＜０．０１、**＝ｐ＜０．００１。トレハロースホモポリマーと比較して、＃＝ｐ＜０．０１、＃＃＝ｐ＜０．００１。
【図３２】図３２は、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によって観測した、５％ＫＯＨ中でのトレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ５の分解を示すグラフである。
【図３３】図３３は、５％ＫＯＨ中でのポリ３の分解を示すグラフである。
【図３４】図３４は、ＢＭＤＯ−トレハロースポリマーＧ−ＣＳＦコンジュゲートのＦＰＬＣ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。各レーンは連続的画分である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
［全般］
本発明の材料および方法を説明する前に、本発明は、記載されている特定の方法、プロトコル、材料および試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は後日に出願される非仮出願によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【００５０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの」および「その」は、文脈上明らかに異なる指示がない限り複数の言及を包含する。同様に、「１つの」、「１つ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。「含む」、「包含する」および「有する」という用語は交換可能に使用することができる。
【００５１】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価の任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料をここで述べる。本明細書で具体的に言及されているすべての出版物および特許は、本発明に関連して使用し得る、出版物中で報告されている化学物質、装置、統計解析および方法を説明し、開示することを含むすべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中で引用されるすべての参考文献は、当分野の技術水準を示すとみなされるべきである。本明細書中のいかなる内容も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００５２】
［定義］
組成物および関連する方法を説明する前に、本発明は記載されている特定の方法、プロトコル、材料および試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は後日に出願される非仮出願によってのみ限定される。
【００５３】
本明細書で述べる本発明は、生分解性結合を有する、生分解性トレハロースグリコポリマーのための組成物および方法を提供する。本発明はまた、生体分子に添加または結合した有効量の生分解性トレハロースグリコポリマーを使用して構造を保護するまたは維持することによって生体分子を安定化するための手段も提供する。
【００５４】
本発明の１つの実施形態によれば、開示されるトレハロースベースのコポリマーは、生分解性と安定化能力の両方を示す。生分解性トレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、凝集、コンフォメーション変化および／または分解、例えば天然タンパク質の変性などに対してタンパク質分子を安定化するのに使用され、厳しい環境またはストレス環境中でタンパク質を所望の立体配置に維持するのを助け、意図される機能はその天然状態のタンパク質と少なくとも同等であるように維持されるかまたはタンパク質がストレス環境で有する低い活性に比べて増強される。タンパク質は、例えば熱、電磁放射線、せん断応力、タンパク質分解による、または還元、酸化もしくはカルバミル化などの化学修飾による分解に対して安定化され得るが、生分解性トレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは特定の条件下で分解可能であり、分解生成物は非細胞毒性で、細胞増殖を妨げない。
【００５５】
一部の実施形態では、生分解性トレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、塩基条件（例えば５％ＫＯＨ）下で２４時間後に完全に分解され得る。１つの実施形態では、生分解性トレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、水溶液中でのエステル加水分解によって水溶液中で緩やかに分解され得る。２４時間塩基条件下に供することによって加水分解を加速し、分解を検討することができる。
【００５６】
生分解性トレハロースベースのコポリマーを生成するための１つの方法は、環状ケテンアセタールが開環重合を受けて、成長するポリマー骨格中でエステルを生成する段階を含み得る。この方法はまた、ＡＴＲＰ、ＲＡＦＴまたはＮＭＰを用いることによって１個のトレハロースベースのモノマーと環状ケテンアセタールを共重合させる段階も含み得る。
【００５７】
生分解性トレハロースベースのコポリマーを生成するための別の方法は、環状ケテンアセタールを別のモノマーと共重合させ、活性部位を有する生分解性骨格コポリマーを生成する段階を含み得る。この方法はまた、トレハロースを活性部位で生分解性骨格コポリマーに結合する段階も含み得る。
【００５８】
生分解性トレハロースベースのポリマーを生成するための１つの方法は、環状エステルをアルコールで重合させてポリマーを形成する段階を含み得、ここで環状エステルはペンダント官能基を含む。この方法はまた、ポリマーをチオール化トレハロースモノマーと反応させ、生分解性トレハロースポリマーを形成する段階も含み得る。
【００５９】
「アリール」という用語は、炭素環式（非複素環式または複素環式）芳香環または単環式、二環式もしくは三環式環系を指す。芳香環または環系は、一般に６〜１０個の炭素原子から成る。アリール基の例には、フェニル、ビフェニル、ナフチルおよびテトラヒドロナフチルが含まれるが、これらに限定されない。フェニルなどの６員アリールが好ましい。
【００６０】
「アルキル」という用語は、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖炭化水素基を指す。例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）、イソプロピル（ｉ−Ｐｒ）、ブチル（Ｂｕ）、イソブチル（ｉ−Ｂｕ）、ｓｅｃ−ブチル（ｓ−Ｂｕ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が含まれる。文脈上別の解釈が要求されない限り、「アルキル」という用語は、その基が２つの位置で結合されるように１個少ない水素原子を含む、すなわち二価のアルキル基も包含する。メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含む「Ｃ1-4アルキル」および「Ｃ1-3アルキル」が好ましく、メチルが特に好ましい。
【００６１】
「生分解性」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトの身体、組織および細胞ならびに生物（例えば細菌）が正常に機能する中で無害な生成物に分解される能力を指す。
【００６２】
「生分解性結合」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトの身体、組織および細胞ならびに生物が正常に機能する生物学的条件下で解離性であるまたは切断される化学結合を指す。１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの生分解性結合、例えばエステル、アミド、ジスルフィドまたはリン酸塩結合を含むポリマーを開示する。１つの実施形態では、本発明のコポリマーは、コポリマーの骨格上に少なくとも１つの生分解性結合を含み得る。
【００６３】
「生分解性ポリマー」という用語は、本明細書で使用される場合、その意図される目的後に分解してその天然副生成物、例えばガス（ＣＯ2、Ｎ2）、水、他の低分子有機または無機副生成物、バイオマスおよび無機塩を生じる特定の型のポリマーを指す。１つの実施形態では、生分解性ポリマーは合成によって作製され、主としてエステル、アミド、ジスルフィド、アセタール、イミン、オキシム、ディールス−アルダー付加物、オルトエステル、ヒドラゾン、シス−アコニトリル、カーボネート、カルバメート、カルバミド、グリコシドサッカリド結合、無水物、ホスホエステル、ホスホ無水物、イミノカーボネート、シアノアクリレート、ホスファゼン、ホスホルアミデート、アミド−エナミン、尿素、ウレタンまたは自然系で分解することができる任意の官能基から成る。生分解性ポリマーは、しばしば縮合反応、開環重合および金属触媒によって合成され得る。１つの実施形態では、本発明の生分解性ポリマーは、タンパク質または任意の他の生体分子を安定化することができるトレハロースを含む。１つの実施形態では、生分解性ポリマー（例えばカプロラクトンポリマー）は、開環反応を用いることによって生成され得る。１つの実施形態では、生分解性ポリマー（例えばＢＭＤＯポリマー）は、ラジカル重合を用いることによって生成され得る。
【００６４】
「ペンダント官能基」という用語は、本明細書で使用される場合、コポリマーの骨格からのペンダント分枝である官能基を指す。１つの実施形態では、ペンダント官能基は、付加的な官能基、例えばトレハロースをコポリマーの骨格に結合することができる位置を提供する。
【００６５】
「ストレス環境」という用語は、本明細書で使用される場合、生体分子の機能特性または活性を低下させる環境を意味する。例えば、環境は、天然のタンパク質に比べてまたはタンパク質がその天然状態で有するものに比べて、タンパク質の機能特性または活性を低下させ得る。ストレス環境は、高温または低温であり得る、有害な熱環境を作り出す温度、有機溶媒などの溶媒、プロテアーゼの存在、ｐＨおよび／または緩衝剤の欠如を含み得る。
【００６６】
本明細書で使用される「生体分子」という用語は、タンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび医薬組成物を指すが、これらに限定されない。そのような生体分子は、熱、乾燥、光、貯蔵、酵素への暴露、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼならびにｐＨ変動を含むがこれらに限定されない環境ストレスにさらされる。
【００６７】
本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、１個のアミノ酸（またはアミノ酸残基）のα−炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が隣接アミノ酸のα−炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合されるようになる場合に生じる、ペプチド結合を介して連結された２個以上の個別アミノ酸（天然に存在するか否かにかかわらず）の任意の化合物を指す。これらのペプチド結合およびそれらを含む原子（すなわちα−炭素原子、カルボキシル炭素原子（およびそれらの置換基酸素原子）ならびにアミノ窒素原子（およびそれらの置換基水素原子）は、タンパク質の「ポリペプチド骨格」を形成する。加えて、本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語を包含すると理解される。同様に、タンパク質フラグメント、類似体、誘導体および変異体は、本明細書では「タンパク質」と称されるか称されてもよく、特に指示されない限り「タンパク質」であるとみなされる。タンパク質の「フラグメント」という用語は、タンパク質の全アミノ酸残基より少ないアミノ酸残基を含むポリペプチドを指す。認識され得るように、タンパク質の「フラグメント」は、アミノ末端、カルボキシル末端および／または内部で（例えば自然のスプライシングによる）切断されたタンパク質の形態であってよく、また変異体および／または誘導体であってもよい。タンパク質の「ドメイン」もまたフラグメントであり、天然に存在するタンパク質に対応する生化学的活性を付与するのに必要とされるタンパク質のアミノ酸残基を含む。本明細書で使用される「タンパク質」という用語は「タンパク質コンジュゲート」も包含し、これは、分子または対象物に互いに連結された「タンパク質」を含む化合物複合体を指す。「複合体」という用語は、本明細書では少なくとも２つの成分を含む化合物を意味するのに使用される。タンパク質は、天然に存在してもよく、その供給源から単離されていてもよい。タンパク質はＤＮＡ組換えまたは突然変異技術を用いて生産され得る。タンパク質は、まるごとの動物においてまたは真核もしくは原核細胞においてインビボで産生され得る。あるいは、タンパク質は、例えば大腸菌溶解物、コムギ胚芽抽出物またはウサギ網状赤血球を使用して、無細胞インビトロ翻訳などのインビトロ法を用いて生成してもよい。無細胞インビトロ翻訳法は、インビトロ転写後に、例えばファージまたはリボソームディスプレイ後に用いることができる。
【００６８】
タンパク質の例には、限定されることなく、リゾチーム、アデノシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、哺乳動物尿酸オキシダーゼ、インターフェロン、抗ＴＮＦαＦａｂ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、持続性エリスロポエチン受容体活性化剤、ｈＧＨアンタゴニストＢ２０３６、インスリン、インスリンヒト吸入剤、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリンリスプロ、イソフェンインスリン、インスリンデテミル、インスリングラルギン、持続型インスリン亜鉛、酢酸プラムリンチド、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトトロピン、メカセルミン、メカセルミンリンファバート、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ｉｉｉ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、プロテインＣ濃縮物、β−グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、イズルスルファーゼ（イズロン酸−２−スルファターゼ）、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ−β（ヒトα−ガラクトシダーゼＡ）、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、膵酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プール免疫グロブリン、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、エポエチン−α、ダルベポエチン−α、サルグラモスチム（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＧＭ−ＣＳＦ）、オプレルベキン（インターロイキン１１；ＩＬ１１）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ルトロピン−α、Ｉ型α−インターフェロン、インターフェロンアルファコン１、コンセンサスインターフェロン、アルデスロイキン（インターロイキン２（ＩＬ２）、表皮胸腺細胞活性化因子（ＥＴＡＦ）、アルテオラーゼ（組織プラスミノーゲン活性化因子；ｔＰＡ）、レテプラーゼ（ｔＰＡの欠失ムテイン）、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、第ＶＩＩａ因子、ドロトレコギン−α（活性化プロテインＣ）、サケカルシトニン、テリパラチド（ヒト副甲状腺ホルモン残基１−３４）、エクセナチド、オクトレオチド、ジボテルミン−α（組換えヒト骨形成タンパク質２；ｒｈＢＭＰ２）、組換えヒト骨形成タンパク質７（ｒｈＢＭＰ７）、酢酸ヒストレリン（ゴナドトロピン放出ホルモン；ＧｎｒＨ）、パリフェルミン（ケラチノサイト増殖因子；ＫＧＦ）、ベカプレルミン（血小板由来増殖因子；ＰＤＧＦ）、トリプシン、ネシリチド、Ａ型ボツリヌス毒素、Ｂ型ボツリヌス毒素、コラーゲス（Ｃｏｌｌａｇｅｓ）、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ−α、ヒアルロニダーゼ（ウシ、ヒツジ）、ヒアルロニダーゼ（組換えヒト）、パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、レピルジン、ビバリルジン、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化剤複合体；ＡＰＳＡＣ）、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、アバタセプトアナキンラ、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アレファセプト、エファリズマブ、ナタリズマブ、エクリズ��ブ、抗胸腺細胞グロブリン（ウサギ）、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、オマリズマブ、パリビズマブ、エンフビルチド、アブシキシマブ、ガラガラヘビ科（Ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ）多価免疫Ｆａｂ（ヒツジ）、ジゴキシン免疫血清Ｆａｂ（ヒツジ）、ラニビズマブ、デニロイキンジフチトクス、イブリツモマブ・チウキセタン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブおよびＩトシツモマブが含まれる。
【００６９】
変性タンパク質は、タンパク質が、折りたたまれていないタンパク質および／または部分的に折りたたまれた再生中間体（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）として非天然形態であるような、完全変性または部分的変性もしくは再生であり得る。変性タンパク質を含有する水溶液または乾燥試料は、これらの形態の１つ以上を含み得る。天然のタンパク質は、折りたたまれた機能的高次構造である。一部のタンパク質は、水溶液中または乾燥試料中に、夾雑凝集物および／または封入体の形態でも存在し得る。
【００７０】
「安定性」という用語は、貯蔵後のタンパク質または他の生体分子の天然の生物活性機能の維持を指す。本発明は、同一の環境条件下でトレハロース安定化剤なしで貯蔵した場合に比べて、タンパク質機能の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の安定性を提供する。例えば、インスリンのようなタンパク質を本明細書で述べるトレハロースベースのポリマーまたはコポリマーと複合体化させた場合、このインスリンタンパク質は、インスリン単独ではせいぜいそのもとの生物活性の２０％しか保持できないのに比べて、その天然生物活性の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれを超える割合を保持することが想定される。当業者は、保持される生物活性のパーセントがタンパク質およびストレス依存性であることを認識する。さらに、裸の／非修飾タンパク質に比べて複合タンパク質がその生物活性または機能を維持することができる時間の長さは、それがさらされる環境ストレッサーに依存して異なる。本明細書で述べる複合タンパク質は、同一の環境条件下で非複合天然タンパク質より少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍長く生物活性を保持できることが想定される。
【００７１】
本明細書で使用される「抗体」または「抗体分子」という用語は、免疫グロブリン分子または抗原結合ドメインを含む他の分子を指す。本明細書で使用される「抗体」または「抗体分子」という用語は、したがって、全抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびキメラ抗体を包含することが意図されている。
【００７２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体はまた、「ヒトモノクローナル抗体」も包含し、これは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生産することができる。
【００７３】
「キメラ抗体」という用語は、通常は組換えＤＮＡ技術によって作製される、ある供給源または種に由来する可変領域、すなわち結合領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体を指す。キメラ抗体はまた、マウス可変領域とヒト定常領域を含み得る。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよびヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。「キメラ抗体」の他の形態は、そのクラスまたはサブクラスがもとの抗体から改変または変更されているものである。そのような「キメラ」抗体は「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体を生産するための方法は、今や当分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を含む。
【００７４】
「抗体」という用語はまた、ヒト化抗体、ヒト抗体および組換えヒト抗体も包含する。「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンの特異性に比べて異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変されている抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して「ヒト化抗体」を作製する。特に好ましいＣＤＲは、キメラおよび二官能性抗体に関して上記で言及した抗原を認識する配列を示すものに対応する。
【００７５】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含する。可変重鎖は、好ましくは生殖細胞系配列ＤＰ−５０に由来し、可変軽鎖は生殖細胞系配列Ｌ６に由来する。この抗体の定常領域はヒトＩｇＧ１型の定常領域である。
【００７６】
「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって作製、発現、創製または単離されるすべてのヒト抗体、例えばＳＰ２−０、ＮＳＯもしくはＣＨＯ細胞（ＣＨＯ  Ｋｌのような）などの宿主細胞からまたはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を包含する。そのような組換えヒト抗体は、再配列形態のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。
【００７７】
「抗体」という用語はまた、抗原結合ドメインを含む「抗体フラグメント」または「抗体由来フラグメント」も包含する。本明細書で使用される「抗体フラグメント」という用語は、抗原結合機能を示す任意の適切な抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ二量体、ミニボディ、モノボディ、ダイアボディおよびそれらの多量体ならびに二重特異性抗体フラグメントを包含することが意図されている。抗体は従来の技術を用いてフラグメント化することができる。例えばＦ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。生じたＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ジスルフィド架橋を還元するように処理してＦａｂ’フラグメントを生成することができる。パパイン消化はＦａｂフラグメントの形成をもたらすことができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよび他のフラグメントも、組換え技術によって合成することができるかまたは化学合成することができる。抗体フラグメントを作製するための技術は当分野において周知であり、記述されている。
【００７８】
抗体または抗体フラグメントは、天然に生産され得るかまたは全面的もしくは部分的に合成によって生成することができる。したがって抗体は、任意の適切な供給源、例えば組換え供給源に由来してもよくおよび／またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物において生産してもよい。したがって、抗体分子はインビトロまたはインビボで作製することができる。好ましくは、抗体または抗体フラグメントは、一般に抗原結合部位を含む抗体軽鎖可変領域（ＶL）および抗体重鎖可変領域（ＶH）を含有する。抗体または抗体フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域の全部または一部を含むことができる。好ましくは、重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域である。さらに、抗体または抗体フラグメントは、κ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域の全部または一部を含むことができる。そのような定常領域の全部または一部は、天然に生産され得るかまたは全面的もしくは部分的に合成であり得る。そのような定常領域の適切な配列は当分野において周知であり、実証されている。
【００７９】
本明細書で使用される「フラグメント」という用語は、生物学的関連性のあるフラグメント（機能的フラグメント）、例えば抗原結合に寄与し得るもしくは抗原結合を可能にする、例えば抗原結合部位の一部もしくは全部を形成する、または抗原の機能の阻害もしくは低減に寄与し得る、または抗原とその天然リガンドとの相互作用の防止に寄与し得るフラグメントを指す。したがってフラグメントは、本発明の抗体の重鎖可変領域（ＶHドメイン）および／または軽鎖可変領域（ＶLドメイン）を含む。フラグメントはまた、抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはＶHドメインの１つ以上、または抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはＶLドメインの１つ以上を含み得る。
【００８０】
本明細書で使用される「糖ポリマー」という用語は、３つ以上の単糖類、二糖類または三糖類単位を含むポリマーおよびオリゴマー糖分子を包含する。糖ポリマーは直鎖または非直鎖の両親媒性糖ポリマー誘導体であり得る。具体的には、糖ポリマーは、限定されることなく、トレハロース、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、キシルロースおよびリブロースを含む１つ以上の糖を含有する。糖ポリマーは、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、プルラン、マンナン、キチン、キトサン、イヌリン、レバン、キシラン、シクロデキストリン（ただしα、βまたはγシクロデキストリンではない）、シクロアミロースまたはそれらの誘導体であり得る。
【００８１】
糖ポリマー、特に本発明における使用に適するトレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、適切な濃度および適切な条件下で、（１）ストレス環境において天然生体分子の機能的特性を保持するために天然生体分子をその天然状態に維持するまたは（２）変性した生体分子を研究者が所望する非天然状態に維持することができるものである。適切なトレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、疎水性アミノ酸側鎖を保護するまたは正味の生体分子電荷もしくは水素結合特徴を改変することができるものである。適切なトレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーはまた、水捕捉能力を有するものまたは水素結合特徴を有するものも含み得る。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「グリコポリマー」という用語は、１つ以上のサッカリド部分、例えば多糖類またはグリコサミノグリカンを含む任意のポリマーを指す。
【００８３】
「トレハロースベースのモノマー」という用語は、本明細書で使用される場合、モノマーの側鎖に共有結合した少なくとも１個のトレハロースを含むモノマーを指す。
【００８４】
「開環重合」または「ＲＯＰ」という用語は、本明細書で使用される場合、連鎖重合の一形態を指し、前記重合ではポリマー鎖の末端が反応中心として働き、その位置でさらに環状モノマーがその環系を開環することによって反応して、より長いポリマー鎖を形成することができる。成長中心はラジカル、アニオンまたはカチオンであり得る。ノルボルネンまたはシクロオクタジエンなどの一部の環状モノマーは、金属触媒を使用することによって高分子量ポリマーに重合させることができる。ＲＯＰは、主要な群のバイオポリマーの合成の汎用的方法、特にバイオポリマーが多量に必要とされる場合に、汎用的方法であり続けている。１つの実施形態では、本発明におけるカプロラクトンポリマーはＲＯＰによって生成され得る。
【００８５】
「生理的条件」という用語は、本明細書で使用される場合、人工的な実験室条件に対比して、その生物または細胞系に関して自然界で生じ得る外部または内部環境の条件を指す。２０〜４０℃の温度範囲、１の大気圧、４〜８のｐＨ、１〜２０ｍＭのグルコース濃度、大気中酸素濃度および地球の重力は、大部分の地球生物に関する生理的条件の例である。
【００８６】
「原子移動ラジカル重合」または「ＡＴＲＰ」という用語は、本明細書で使用される場合、遷移金属触媒を介して炭素−炭素結合が形成する、可逆的不活性化ラジカル重合の一例を指す。原子移動段階は、均一なポリマー鎖成長の責任を担う反応の鍵となる段階である。
【００８７】
「可逆的付加開裂連鎖移動」または「ＲＡＦＴ」という用語は、本明細書で使用される場合、チオカルボニルチオ化合物（または同様のＲＡＦＴ剤）の形態の連鎖移動剤を使用して、フリーラジカル重合の間に生成される分子量および多分散性に対する制御を与える、数種の可逆的不活性化ラジカル重合の１つを指す。
【００８８】
「ニトロキシド媒介ラジカル重合」または「ＮＭＰ」という用語は、アルコキシアミン開始剤を使用して、十分に制御された立体化学および非常に低い多分散性指数を有するポリマーを生成するラジカル重合の方法を指す。
【００８９】
［本発明］
１つの態様では、本出願は、生分解性トレハロースベースのコポリマーおよび前記コポリマーを作製する方法を開示する。
【００９０】
１つの態様では、本発明は、分解性トレハロースグリコポリマーを開示する。好ましくは、前記トレハロースグリコポリマーは生分解性である。本発明におけるトレハロースグリコポリマーはコポリマーであり得る。
【００９１】
１つの実施形態では、本発明のトレハロースコポリマーは、下記（１）の一般構造から成る。
【００９２】
Ｒ5−［Ｒ1Ｒ2Ｃ−ＣＲ3Ｒ4］n−［ＤＧ］m−Ｒ6      （１）
［式中、Ｒ1−Ｒ4は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、およびＲ1−Ｒ4の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロース［ここでＬは、トレハロースの−ＯＨ基の少なくとも１つを介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子である］を含む側鎖であり、ＤＧは生分解性基であり、ならびにＲ5およびＲ6は末端基である］
【００９３】
一部の実施形態では、Ｒ5およびＲ6の末端基は、活性化ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、ジスルフィド還元剤、マイケルアクセプター、マレイミド、マレイミド誘導体、ジハロマレイミド、ビニル基、ビニルスルホン、アクリロイル誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アリール化剤、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、カーボネート、クロロホルメート、アルキルハロゲン、イソシアネート、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジン、アルキン、それらの誘導体およびそれらの組合せまたは生体分子の天然もしくは非天然官能基と反応することができる任意の末端基から成る群より独立して選択される。
【００９４】
１つの実施形態では、Ｒ5およびＲ6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、ジスルフィド還元剤、マイケルアクセプター、マレイミド、マレイミド誘導体、ジハロマレイミド、ビニル基、ビニルスルホン、アクリロイル誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アリール化剤、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、カーボネート、クロロホルメート、アルキルハロゲン、イソシアネート、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジンおよび生体分子から成る群より独立して選択される。
【００９５】
１つの具体的な実施形態では、Ｒ5およびＲ6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）2、−Ｓ2Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、−（ＣＨ3）ＣＨＣＯＯ−アリール、−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＳＳ−アリール（ｎ＝１〜１０）、−Ｈおよび生体分子から成る群より独立して選択される。
【００９６】
１つの実施形態では、Ｌ−トレハロースではないＲ1−Ｒ4のいずれかは、水素またはアルキル基のどちらかである。１つの具体的な実施形態では、アルキル基は、好ましくはメチル基である。
【００９７】
１つの実施形態では、Ｒ1−Ｒ4の１つはアルキル基であり、Ｒ1−Ｒ4の２つは水素である。１つの具体的な実施形態では、アルキル基は、好ましくはメチル基である。
【００９８】
１つの実施形態では、ＤＧの生分解性官能基には、エステル、アミドまたはジスルフィド基、アセタール、イミン、オキシム、ディールス−アルダー付加物、オルトエステル、ヒドラゾン、シス−アコニトリル、カーボネート、カルバメート、カルバミド、グリコシドサッカリド結合、無水物、ホスホエステル、ホスホ無水物、イミノカーボネート、シアノアクリレート、ホスファゼン、ホスホルアミデート、アミド−エナミン、尿素、ウレタンまたは自然系で分解することができる任意の基または自然系で分解することができる任意の他の基が含まれ得る。１つの好ましい実施形態では、ＤＧの生分解性基は少なくとも１個のエステル基を含む。より好ましくは、エステル基はコポリマーの骨格中に存在する。
【００９９】
１つの実施形態では、骨格上にＤＧの生分解性基を有するコポリマーは、環状ケテンアセタールと他のモノマーの開環重合（ＲＯＰ）反応を介して合成され得る。環状ケテンアセタールは、コポリマーの骨格中にＤＧの生分解性基、すなわちエステルを提供する。
【０１００】
１つの実施形態では、コポリマーに分解性基を導入することができる環状ケテンアセタールまたはモノマーには、５，６−ベンゾ−２−メチレン−１，３−ジオキセパン２−メチレン−１，３−ジオキセ−５−ペン、２−エチリデン−４−メチル−１，３−ジオキサン、２−エチリデン−４−エチル−１，３−ジオキサン、２−エチリデン−１，３−ジオキサン、１−ビニル−４，７−ジオキサスピロ−［２，４］ヘプタン、１−ビニル−４，９−ジオキサスピロ−［２．６］ノナン、１−ビニル−６，７−ベンゾ−４，９−ジオキサスピロ［２．６］ノナン、９，９−二置換−４−メチレン−３，５，８，１０−テトラオキサビシクロ［５．３．０］デカン、３，９−ビス−メチレン−２，４，８，１０−テトラオキサ−スピロ［５，５］ウンデカンまたは２−メチレン−１，３，６−トリオキソカンが含まれ得る。
【０１０１】
１つの好ましい実施形態では、エステル基を、環状ケテンアセタールからＲＯＰ反応を介して生成する。より好ましくは、環状ケテンアセタールは、下記の構造を有するＢＭＤＯである。
【０１０２】
【化６】
2017524790.tif 000007
【０１０３】
１つの実施形態では、（１）の一般構造を有するコポリマーは、任意の適切な重合反応を用いることによって環状ケテンアセタールともう１つ別のモノマーから生成し得る。別の実施形態では、重合反応には、フリーラジカル重合、可逆的付加開裂（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合、または開環重合（ＲＯＰ）が含まれ得る。１つの実施形態では、本発明の分解性トレハロースコポリマーを、環状ケテンアセタール、例えばＢＭＤＯともう１つ別のモノマーとのＲＡＦＴ反応を介して合成する。
【０１０４】
１つの実施形態では、前記の別のモノマーはトレハロースを含む。出願人の以前のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２３２３５号は、本発明に適する多くのトレハロースベースのモノマーを開示する。実施例２は、一部の例示的なモノマーおよびそのようなモノマーを作製する方法を示す。
【０１０５】
１つの実施形態では、トレハロースコポリマーは特定の生理的条件下で分解され得る。１つの実施形態では、生理的条件にはインビトロまたはインビボでの塩基性条件または加水分解が含まれ得る。出願人は、当業者に認識される他の適切な生理的条件もトレハロースコポリマーの分解のために使用し得ると想定する。１つの好ましい実施形態では、コポリマーの分解生成物は非細胞毒性であり、前記生成物は細胞増殖を妨げない。実施例２のスキーム１０は、分解を加速する塩基性条件下でのトレハロースコポリマーの１つの例示的な生分解を示す。
【０１０６】
１つの好ましい実施形態では、本発明のトレハロースコポリマーは、下記の構造（２）を有する。
【０１０７】
【化７】
2017524790.tif 000008
【０１０８】
実施例２は、トレハロースコポリマー（２）を作製する合成方法を示す。スキーム１０は、塩基性条件下でのトレハロースコポリマー（２）の生分解を示す。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、本発明のトレハロースコポリマーは、下記の構造（３）を有する。
【０１１０】
【化８】
2017524790.tif 000009
【０１１１】
別の好ましい実施形態では、本発明のトレハロースコポリマーは、下記の構造（３）を有する。
【０１１２】
【化９】
2017524790.tif 000010
【０１１３】
１つの実施形態では、生分解性トレハロースコポリマーはトレハロース官能基化カプロラクトンであり得る。ポリ（カプロラクトン）は、インビボ適用（例：Ｍｏｎｏｃｒｙｌ（登録商標）縫合糸）に関してＦＤＡに承認されている周知のポリマーである。出願人は、チオール−エン化学によるチオール化トレハロースでのポリ（カプロラクトン）の修飾が生分解性トレハロースグリコポリマーを生成することを明らかにする。出願人は、多くの他の方法もポリマーを修飾するために使用し得ると想定する。例えば、アルキン／アジドクリック化学または当業者に認識される任意の他の方法も、ポリマーを修飾するために使用し得る。
【０１１４】
１つの実施形態では、トレハロース官能基化カプロラクトンはＲＯＰを介して合成し得る。
【０１１５】
１つの実施形態では、生分解性トレハロースポリマーは、一般構造：
Ｒ5−［ＤＧ−ＣＨＲ1−（ＣＲ2Ｒ3）n］m−Ｒ6
［式中、Ｒ1−Ｒ3は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、およびＲ1−Ｒ3の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロース［ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをコポリマーに連結するリンカー分子である］を含む側鎖であり、ＤＧは生分解性基であり、ならびに
Ｒ5およびＲ6は末端基であり、ならびにｎ＝０〜１０であり、ｍ≧１である］
から成る。
【０１１６】
１つの実施形態では、Ｒ5およびＲ6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、ジスルフィド還元剤、マイケルアクセプター、マレイミド、マレイミド誘導体、ジハロマレイミド、ビニル基、ビニルスルホン、アクリロイル誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アリール化剤、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドおよびグリオキサール（還元的アミノ化を受けているまたは受けていない）、エポキシド（オキシランとも呼ばれる）、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、カーボネート、クロロホルメート、アルキルハロゲン、イソシアネート、アミノオキシ（ヒドロキシルアミン）、ヒドラジンおよび生体分子から成る群より独立して選択される。
【０１１７】
１つの具体的な実施形態では、Ｒ5およびＲ6は、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アリール、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）2、−Ｓ2Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）、−（ＣＨ3）ＣＨＣＯＯ−アリール、−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）n−ＳＳ−アリール（ｎ＝１〜１０）、−Ｈおよび生体分子から成る群より独立して選択される。
【０１１８】
１つの実施形態では、ＤＧは少なくとも１個のエステル基を含む。
【０１１９】
１つの実施形態では、エステル基はポリマーの骨格中に存在する。
【０１２０】
１つの好ましい実施形態では、トレハロース官能基化カプロラクトンは、の構造（４）を有する。
【０１２１】
【化１０】
2017524790.tif 000011
【０１２２】
１つの実施形態では、出願人は、他の骨格構造も分解性トレハロースコポリマーを生成するのに使用し得ると想定する。具体的な骨格には、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ無水物、キトサン、ヒアルロン酸、ポリ（アミド）またはポリ（アミノ酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ（β−マロン酸）、ポリ（プロピレンフマレート）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［１，４−ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート−ａｌｔ−エチルオキシホスフェート］、ポリ［１，６−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン］、ポリ（セバシン酸）およびエチルグリシネートポリホスファゼンが含まれ得る。これらの適切な骨格の一部の化学構造は以下のように含まれる。
【０１２３】
【化１１】
2017524790.tif 000012
【０１２４】
１つの実施形態では、生分解性トレハロースコポリマーは生体分子、例えばタンパク質への良好な安定化特性を示す。
【０１２５】
一部の実施形態では、生分解性トレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、塩基条件（例えば５％ＫＯＨ）下で２４時間後に完全に分解され得る。１つの実施形態では、生分解性トレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、水溶液中でのエステル加水分解によって水溶液中で緩やかに分解され得る。２４時間塩基条件下に供することによって加水分解を加速し、分解を検討することができる。
【０１２６】
１つの実施形態では、生分解性トレハロースホモポリマーまたはコポリマーは、生体分子をホモポリマーまたはコポリマーに化学的に結合した場合に生体分子を安定化する。実施例１（例えばスキーム４）は、結合後のタンパク質（例えばリゾチーム）に対する生分解性トレハロースコポリマーの安定化特性を示す。
【０１２７】
１つの実施形態では、生分解性トレハロースコポリマーはまた、例えば化学結合形成の不在下で、それらを賦形剤として使用した場合も生体分子を安定化することができる。実施例１（例えば図１２）は、コポリマーを賦形剤として使用した場合の凍結乾燥ストレスに対するタンパク質（例えばリゾチームおよびβ−Ｇａｌ）への生分解性トレハロースコポリマーの安定化特性を示す。したがって、出願人の以前のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２３２３５号（例えば生体分子を安定化するための多くのトレハロースベースのポリマーを開示している）に記載されているものと同様に、生分解性トレハロースコポリマーは生体分子、例えばタンパク質への良好な安定化特性を示す。
【０１２８】
１つの態様では、本発明は、生体分子を安定化するための上記で論じた生分解性トレハロースコポリマーを合成する方法または工程に関する。
【０１２９】
出願人は、上記で論じた生分解性トレハロースコポリマーが、当業者に認識される任意の適切な方法によって合成され得ると想定する。
【０１３０】
例えば、以下で論じるように、１個のトレハロースベースのモノマーを合成し、その後トレハロースベースのモノマーを環状ケテンアセタールと共重合させて、所望の生分解性トレハロースコポリマーを合成し得る。あるいは、骨格に結合したペンダント官能基を有する骨格コポリマーを合成し得る。その後、ペンダント官能基を介してトレハロース基をコポリマーに結合し、所望の生分解性トレハロースコポリマーを形成し得る。
【０１３１】
１つの実施形態では、出願人は、臭素官能基化カプロラクトンモノマーを合成し、スズ触媒を用いて重合させ得ることを特筆する（例えばＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９参照）。ペンダントブロミドを、アジド−アルキン「クリック」化学を用いて［例えばアジ化ナトリウムおよび糖類（グルコース、マルトースおよびマンノース）によって置換して］導入し得る。ブロックコポリマーはまた、非官能基化カプロラクトンと共重合させ、その後ミセルに自己集合させることによっても作製し得る。
【０１３２】
オリゴ糖も、短鎖ＰＥＧ鎖で官能基化し、分解性代替物のための生分解性骨格として使用し得る（Ｃｏｎｇｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。デキストランは、二糖モノマーのＡＴＲＰのための生分解性マクロ開始剤として使用し得る5。
【０１３３】
さらに、出願人は、分解性ポリマーを、環状ケテンアセタール（ＣＫＡ）とガラクトピラノース官能基化スチレンモノマーの共重合を介して合成し得ることを特筆する（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１３４】
１つの実施形態では、生分解性トレハロースコポリマーを、化学合成を介して生成する。好ましくは、生分解性トレハロースコポリマーを、ＲＡＦＴ重合、ＡＴＲＰ、ＮＭＰ、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合またはＲＯＰを含む重合反応を用いることによって生成する。より好ましくは、生分解性トレハロースコポリマーを、ＲＡＦＴ重合、ＡＴＲＰ、ＮＭＰまたはＲＯＰを用いることによって生成する。
【０１３５】
生分解性トレハロースコポリマーを合成するための好ましい方法および工程を実施例１および２で述べる。
【０１３６】
１つの実施形態では、生体分子を安定化するための生分解性トレハロースコポリマーを合成する方法は、（ａ）トレハロース分子を含む側鎖を重合可能なモノマーに組み込む段階、および（ｂ）生じたモノマーを環状ケテンアセタールと共重合させ、コポリマーまたはグリコポリマーを得る段階を含む。
【０１３７】
１つの好ましい実施形態では、重合可能なモノマーは、スチレンモノマー、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマー、メタクリルアミドモノマー、ビニルモノマー、ノルボレニルモノマーおよび歪んだ環状アルケンモノマーから成る群より選択される。さらに好ましくは、重合可能なモノマーは、メタクリレートモノマーである。
【０１３８】
１つの実施形態では、環状ケテンアセタールには、５，６−ベンゾ−２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＢＭＤＯ）、２−メチレン−４−フェニル−１，３−ジオキサラン（ＭＰＤＬ）、２−メチレン−１，３−ジオキサラン、２−メチレン−４−ヘキシル−１，３−ジオアラン、２−メチレン−４−デシル−１，３−ジオアラン、２，４−ジメチレン−１，３−ジオキサラン、２，５−ジメチレン−１，３，−ジオキサン、２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＭＤＯ）、２，５−メチレン−１，３−ジオキサン、４，７−ジメチル−２−メチレン−１，３−ジオキセパン、４−フェニル−２−プロペニレン−１，３−ジオキサラン、２−メチレン−１，３−ジオキセ−５−ペン、２−エチリデン−４−メチル−１，３−ジオキサン、２−エチリデン−４−エチル−１，３−ジオキサン、２−エチリデン−１，３−ジオキサン、１−ビニル−４，７−ジオキサスピロ−［２，４］ヘプタン、１−ビニル−４，９−ジオキサスピロ−［２．６］ノナン、１−ビニル−６，７−ベンゾ−４，９−ジオキサスピロ［２．６］ノナン、９，９−二置換−４−メチレン−３，５，８，１０−テトラオキサビシクロ［５．３．０］デカン、３，９−ビス−メチレン−２，４，８，１０−テトラオキサ−スピロ［５，５］ウンデカンまたは２−メチレン−１，３，６−トリオキソカンが含まれ得る。
【０１３９】
１つの好ましい実施形態では、環状ケテンアセタールは５，６−ベンゾ−２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＢＭＤＯ）であり得る。
【０１４０】
１つの実施形態では、生じたモノマーを共重合させて生分解性トレハロースコポリマーを得る段階は、限定されるものではないが、ＲＡＦＴ重合、ＡＴＲＰ、ＮＭＰ、シアノキシル媒介フリーラジカル重合、従来のラジカル重合またはＲＯＰの技術のいずれか１つによって実施する。好ましくは、生じたモノマーを共重合させてホモポリマーまたはコポリマーを得る段階は、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合またはＲＯＰによって実施する。
【０１４１】
１つの実施形態では、他の方法または工程も、本発明の生分解性トレハロースコポリマーを生成するために使用し得る。例えば、骨格上に生分解性結合を有し、および骨格に結合したペンダント官能基を有するコポリマーを合成し、後でペンダント官能基を介してトレハロース基をコポリマーの骨格に結合し得る。
【０１４２】
１つの実施形態では、生体分子を安定化するための生分解性トレハロースコポリマーを合成する方法は、（ａ）重合可能なモノマーを共重合させ、非トレハロースコポリマーを得る段階、および（ｂ）トレハロース分子を含む側鎖を非トレハロースコポリマーまたはグリコポリマーに組み込み、分解性トレハロースコポリマーを形成する段階を含み得る。出願人は、トレハロースをホモポリマーまたはコポリマーに組み込み得る、非トレハロースホモポリマーまたはコポリマー上の官能基が存在すると想定する。
【０１４３】
１つの具体的な実施形態では、生体分子を安定化するための生分解性トレハロースポリマーを合成する方法は、ａ）環状エステルをアルコールで重合させてポリマーを形成する段階、ここで環状エステルはペンダント官能基を含む、ｂ）チオール化トレハロースモノマーを調製する段階、ｃ）ポリマーをチオール化トレハロースモノマーと反応させ、生分解性トレハロースポリマーを形成する段階を含み得る。
【０１４４】
１つの実施形態では、生体分子を安定化するための生分解性トレハロースポリマーは、側鎖官能基を有するメタクリレートベースのポリマーであり得る。
【０１４５】
１つの実施形態では、環状エステルはカプロラクトンである。好ましくは、環状エステルはアリル官能基化カプロラクトン（ａＣＬ）である。アリル基は、トレハロース基を結合することができるペンダント官能基として使用される。実施例１は、アリル官能基化カプロラクトン（ａＣＬ）を、文献の手順（Ｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）に従って１段階で合成し得ることを示す。
【０１４６】
１つの実施形態では、アルコールは第一級アルコールである。第一級アルコールは、ａＣＬの重合のための開始剤として使用し得る。
【０１４７】
１つの実施形態では、段階ａ）の重合はＲＯＰである。１つの実施形態では、段階ａ）のＲＯＰはさらに触媒を必要とし得る。好ましくは、触媒は、有機触媒のトリアザビシクロデカン（ＴＢＤ）である。
【０１４８】
１つの実施形態では、チオール化トレハロースモノマーは、下記の構造を有する。
【０１４９】
【化１２】
2017524790.tif 000013
【０１５０】
実施例１（スキーム１）は、チオール化トレハロースモノマー単位を合成するための方法および工程を示す。
【０１５１】
１つの実施形態では、チオール−エン反応を使用してコポリマーをチオール化トレハロースモノマーと連結し、生分解性トレハロースコポリマーを形成した。
【０１５２】
本発明の他の実施形態および使用は、本明細書からの考察および本明細書で開示される本発明の実施から当業者には明らかである。すべての定期刊行物の引用ならびに米国／外国特許および特許出願を含む、何らかの理由により本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照により明確におよび完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書で例示され、説明される特定の試薬、製剤、反応条件等に限定されるのではなく、以下の特許請求の範囲に含まれるそれらの改変形態を包含することが理解される。
【実施例】
【０１５３】
［実施例１］
［カプロラクトンポリマー］
本明細書において我々は、開環重合（ＲＯＰ）を用いた生分解性トレハロースポリマーの合成を説明する。我々は、このポリマーが、タンパク質に添加した場合、加熱などのストレッサーに対して生体分子を安定化することを示す。タンパク質リゾチームへのその後の複合体化を、還元的アミノ化を用いて明らかにした。我々は、これらのポリマーが、その生分解性と安定化能力の組合せに起因してタンパク質−ポリマー治療薬における改善されたＰＥＧ代替物として機能し得ると期待する。これらはまた、賦形剤としても有用に添加し得る。
【０１５４】
［合成方法］
（チオール化トレハロースモノマー単位の合成）
チオール官能基化トレハロース分子を１９％の全体的収率で５段階にて合成した（スキーム１；化合物の数字は実施例１中に限定される）。簡単に説明すると、トレハロースの第一級アルコールを、かさ高いトリチル保護基を使用して選択的に官能基化し、酢酸無水物を使用して残りのヒドロキシルをアセテートエステルに変換し、２を形成した。酸性条件下でトリチルエーテルを脱保護し、その後露出されたアルコールをトシル化して、トシルエステル４を生じさせ、これを、求核試薬カリウムチオアセテートを用いて置換して、チオアセテートエステル５を得た。より不安定なチオエステルの選択的除去によってチオール化トレハロース６を得た。
【０１５５】
【化１３】
2017524790.tif 000014
【０１５６】
［実験の詳細］
トシルトレハロース４。二口丸底フラスコ中で、モノヒドロキシルヘプタアセチルトレハロース（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）（１．０８ｇ、１．６９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）に溶解した。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（４１ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（（０．４ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応溶液を氷水浴中で０℃に冷却した。トシルクロリド（９７０ｍｇ、５．１ｍｍｏｌ）を固体として緩やかに添加し、溶液を０℃でさらに３０分間撹拌した後、室温に１４時間温めた。粗混合物をさらなるＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、水およびブラインで洗浄した。次に有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  ４：１  ＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ）によって精製し、パリパリした白色固体を得た（１．０６２ｇ、１．３４ｍｍｏｌ、７９．５％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ  ｉｎ  ＣＤＣｌ３）δ：７．７４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），５．４７−５．４１（ｍ，２Ｈ），５．１４（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），５．０５−５．０１（ｍ，３Ｈ），４．９３−４．８９（ｍ，２Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．１４−３．９４（ｍ，５Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ）．13Ｃ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ  ｉｎ  ＣＤＣｌ3）δ：１６９．０，１６９．９，１６９．６，１６９．６，１６９．５，１６９．５，１４５．３，１３２．４，１２９．９，１２８．０，９２．８，９２．３，７０．０，６９．７，６９．７，６９．３，６８．６，６８．４，６８．２，６８．１，６７．５，６１．７，２１．７，２０．７，２０．７，２０．６，２０．６，２０．６，２０．５．ＩＲ：ν＝２９５０，１７４４，１４３２，１３６８，１２２１，１１９０，１１７７，１１３８，１０７９，１０３５，１０１６，９８８，９１１，８６２，８０５ｃｍ-1．ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）Ｃ33Ｈ44Ｏ21Ｓ［Ｍ＋Ｈ2Ｏ］+の計算値８０８．２０９６；実測値８０８．２２２６。図１は、トシル化トレハロース４の1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示す。図２は、トシル化トレハロース４の13Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示す。図３は、トシル化トレハロース４のＨＳＱＣ  ２Ｄ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）を示す。
【０１５７】
チオアセテートトレハロース５。二口丸底フラスコ中で、トシル化トレハロース４（１．０８ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。カリウムチオアセテート（４８０ｍｇ、４．２０ｍｍｏｌ）を添加し、反応溶液を８０℃に１４時間加熱した。室温に冷却した後、ＤＭＦを減圧下で除去した。粗褐色固体をＣＨ2Ｃｌ2に再溶解し、水、飽和ＮａＨＣＯ３（２×）、水およびブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗油をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  ４：１  ＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ）によって精製し、３をパリパリした黄褐色固体として得た（８３５．２ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ、８９％）。1Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ  ｉｎ  ＣＤＣｌ3）δ：５．４５（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，２Ｈ），５．２６（ｄｄ，Ｊ＝４，１１．２Ｈｚ，２Ｈ），５．０５−４．９１（ｍ，４Ｈ），５．１６（ｄｄ，１Ｈ），４．００（ｄｄ，１Ｈ），３．８８−３．８７（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｄｄｄ，１Ｈ），３．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１４．４，１Ｈ），２．９４（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１４．４，１Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ）．13Ｃ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１９４．６，１７０．６，１６９．９，１６９．９，１６９．９，１６９．７，１６９．７，１５９．６，９１．４，９１．２，７０．９，７０．０，７０．０，６９．８，６９．６，６９．３，６８．５，６８．２，６１．８，３０．４，２９．８，２０．７，２０．６，２０．６，２０．６，２０．５．ＩＲ：ν＝２９５７，１７４６，１６９４，１４３１，１３６７，１２１２，１１６１，１１３４，１０３４，９８１，９６２，９００，８０３ｃｍ-1．図４は、チオアセテートトレハロース５の1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）を示す。図５は、チオアセテートトレハロース５の13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）を示す。
【０１５８】
チオール化トレハロース６。２０ｍＬスクリュートップバイアル中で、チオアセチル化トレハロース５（６２８．３ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ＤＭＦ（１８ｍＬ）に溶解した。酢酸（５１μＬ、０．９０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を１０分間撹拌した。次にヒドラジン水和物（Ｈ2Ｏ中７０〜８２％、５５μＬ、０．９０ｍｍｏｌ）を添加し、反応溶液を２１℃でさらに２時間撹拌した。アセトン（７５μＬ）を添加して反応を停止させた。溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、ブラインで２回洗浄して、その後ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒および残留ＤＭＦを、ベンゼンからフリーズドライすることによって減圧下で除去し、明黄褐色固体を得た（５９７ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ、＞９９％）。図６は、チオールトレハロース６の1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）を示す。
【０１５９】
（反応性ペンダント単位を有するポリ（カプロラクトン）の合成およびトレハロース部分の導入）
ポリカプロラクトンを、医薬分野でのこれまでの使用により、ならびにその重合および修飾に関して十分に開発された化学のために（Ｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｉｌｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、骨格として選択した。アリル官能基化カプロラクトン（ａＣＬ）を、最初に文献の手順（Ｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）に従って１段階で合成した。ａＣＬのＲＯＰを、官能性のトルエン中で実施した。特性づけの容易さのために。複合体化のために使用するポリマーに関しては、２，２−ジエトキシエタノールを保護されたタンパク質反応性基として使用した。
【０１６０】
【化１４】
2017524790.tif 000015
【０１６１】
次にアセテート保護トレハロースチオールを、ジメトキシフェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）を光開始剤とする光開始チオール−エン反応を介して導入した（Ｃａｍｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。1Ｈ−ＮＭＲにおける５．７ｐｐｍのアリルピークの喪失によって完全な変換を確認した。ＧＰＣによる各々の修飾後にポリエステル骨格の完全性を確認し、アセテート保護トレハロース単位の結合後に分子量は増大し、幅の有意の広がりはなかった（図７ａ）。
【０１６２】
アセテート基の除去は、ＤＭＦ中のヒドラジンまたはＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ  Ｋ2ＣＯ3のいずれかを使用することによって骨格の加水分解なしで達成することができた。ポリマーを有機溶媒中でＧＰＣによって分析した場合、わずかな広がりを認めたが（図７ａ）、ポリマーを水性溶媒中でＳＥＣによって分析した場合は、そのようなＤ（英文明細書ではＤに−と表記）の増大は見られなかった（図７ｂ）。それゆえＤ（英文明細書ではＤに−と表記）の増大は多糖類ヒドロキシルとカラム固定相の相互作用に起因するものであり、骨格エステルの開裂によるものではないと仮定した。多糖類ヒドロキシルとカラム固定相の、そして骨格エステルの開裂によるものではない。
【０１６３】
これらの化学への修飾を行い得る。チオール反応性マレイミドおよびピリジルジスルフィド基を含む、他のタンパク質反応性官能基を使用し得る。これらは、官能性アルコール開始剤を用いてまたはオメガヒドロキシル基での重合後エステル化を介して導入し得る。メタクリレート基をエステル化によって導入した、実例としての重合後修飾をスキーム３に示す。
【０１６４】
【化１５】
2017524790.tif 000016
【０１６５】
クリック化学の性質も変化させ得る。例えば、アジド−アルキン（Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）またはビニルスルホン−チオール（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）などの試薬の対を使用して、トレハロース部分をカプロラクトン骨格に結合し得る。
【０１６６】
［実験の詳細］
（ポリ（アリル−カプロラクトン）の代表的な開環重合）２５ｍＬ二口丸底フラスコに撹拌子を装備し、火炎乾燥した。トリアザビシクロデカン（６．６ｍｇ、４７μｍｏｌ）を添加し、フラスコを排気して、窒素を３回再充填した。無水トルエン（６００μＬ）および２，２−ジエトキシエタノール（３．３ｍｇ、トルエン１０μＬ中２２μｍｏｌ）を窒素パージしたシリンジによって添加し、開始剤−触媒混合物を２１℃で３０分間撹拌した後、アリル−カプロラクトン（１９３ｍｇ、１２７０μｍｏｌ）を窒素パージしたシリンジによって添加した。反応混合物を２１℃で撹拌し、アリコートを1Ｈ−ＮＭＲ分析にためにシリンジで取り出した。所望の変換が達成された後（５．５時間）、Ｈ2Ｏ／ＭｅＯＨで反応を停止させ、残留モノマーおよび触媒をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜（ＭＷＣＯ  １ｋＤ）でＭｅＯＨに対して透析することによって除去し、ポリマーを無色の油として得た。図８は、アリル官能基化ポリ（カプロラクトン）の1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）を示す。
【０１６７】
（チオール−エン反応による官能性ポリエステルの合成）１．５ｍｍサンプルバイアル中で、ポリ（アリル−カプロラクトン）（１５．６ｍｇ）を無水ＴＨＦ（７００μＬ）に溶解した。チオールトレハロース４（２０８ｍｇ）および２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（１３．５ｍｇ）を添加し、バイアルをゴム隔膜で密封して、１０分間脱気し、ハンドヘルドＵＶランプ（λ＝３６５ｎｍ）に４時間暴露した。次に粗溶液を冷ＭｅＯＨ中に沈殿させ、酢酸保護トレハロースポリエステルを得た。図９は、アセテート保護トレハロース−カプロラクトンの1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ＭＨｚ）を示す。
【０１６８】
（トレハロースポリエステルの脱保護）ヒドラジンをトレハロースアセテートエステルの包括的脱保護のために使用して、ポリエステル骨格の塩基触媒加水分解を回避し、同時にヒドロキシルアミン末端基を露出させた34。あるいは、Ｋ2ＣＯ3を弱塩基として使用し得る。２０ｍＬスクリュートップバイアル中で、アセチル化トレハロースポリエステルをＤＭＦまたはＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨに溶解した。ヒドラジン（Ｈ2Ｏ中７８〜８２％）またはＫ2ＣＯ3（５０ｍＭ）を添加し、反応溶液を、ヒドラジンについては２０時間またはＫ2ＣＯ3については３時間撹拌した。反応が進行すると共に、ヒドラジンアセテートの形成を微細な白色沈殿物として観察することができた。これらの反応を停止させるため、アセトンを添加した。すべての脱保護に関して、反応混合物をＨ2Ｏで希釈し、１ｋＤ  ＭＷＣＯの透析チューブを用いて５０％ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏに対して透析した。図１０は、アセタール官能基化トレハロース−カプロラクトンの1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）を示す。
【０１６９】
（メタクリロイルクロリドでのアセテート保護トレハロース−カプロラクトンの修飾）アセテート保護トレハロース−カプロラクトン（１５ｍｇ）を無水ジクロロメタン１ｍＬに溶解した。無水トリエチルアミン（２１μＬ、分子ふるいで乾燥した）を添加し、混合物を手早く撹拌して、０℃に冷却した。次にメタクリロイルクロリド（１５μＬ）を添加し、混合物を０℃で１時間およびその後室温で撹拌した。２８時間後、混合物を濃縮し、粗固体をＤＣＭ  ２００μＬに再溶解して、冷ＭｅＯＨ  １５ｍＬ中に沈殿させた。固体を１０分間の遠心分離によって分離し、溶液を除去した。溶解と沈殿を反復し、生成物を減圧下で乾燥して、白色固体を明らかにした。図１１は示す。
【０１７０】
［トレハロース−カプロラクトンを賦形剤として使用したモデルタンパク質の安定化］
タンパク質を安定化するこれらの生分解性トレハロースポリマーの能力を、熱および凍結乾燥ストレスアッセイを介して確認した。我々は以前に、トレハロースポリマーを使用して熱負荷に対するリゾチームの安定化および凍結乾燥に対するβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）の安定化をそれぞれ明らかにした（Ｍａｎｃｉｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ，２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。それゆえ、生分解性トレハロースポリマーを試験するのにもこれらのタンパク質を選択した。最初に、リゾチームを９０℃に２０分間加熱することによってストレスを与えた。ポリマーの濃度範囲および有効性を測定するため、試料を５〜２５重量当量のトレハロース−ＣＬならびにトレハロース単独の両方で調製した。市販のキットを使用してリゾチームの活性を測定し、ここではフルオレセイン標識ミクロコッカス・リゾデイクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）の溶解から生じる蛍光によってタンパク質活性を測定する。トレハロース−ＣＬを賦形剤として含有するリゾチーム試料は天然活性の最大６６％までを保持し、一方リゾチーム単独は４％の保持を示した（図１２ａ）。添加物としてのトレハロースは陰性対照と有意に異ならなかった。
【０１７１】
凍結乾燥ストレスに対するβ−Ｇａｌの安定化も測定した。３回の１２時間乾燥サイクルを、添加物としてのトレハロース−ＣＬおよびトレハロースと共にまたはこれらなしで実施した。β−Ｇａｌの活性はオルト−ニトロフェノールガラクトース（ＯＮＰＧ）との反応によって測定した。β−Ｇａｌと共にインキュベートした場合、ＯＮＰＧからの黄色のｏ−ニトロフェノールの放出を４０５ｎｍで観測することができる。トレハロース−ＣＬを賦形剤として含有する試料は天然活性の最大８４％までを保持し、一方非安定化タンパク質は１６％だけを保持した（図１２ｂ）。このタンパク質に関して、高当量のトレハロースはポリマーと同程度にβ−Ｇａｌを安定化することができ、２５当量のトレハロースで最大６７％までを保持した。
【０１７２】
トレハロース−ＣＬおよび以前に述べたスチレニルエーテルトレハロース（ＳＥＴ）ポリマーも、それらのリゾチームの安定化に関して直接比較した（図１３）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。この試験では、トレハロース−ＣＬはリゾチームの天然活性の最大６１％までを保持し、一方ＳＥＴポリマーは６７％までを保持した。したがって、分解性トレハロースグリコポリマーは安定化能力において非分解性のものと同様であった。
【０１７３】
［実験の詳細］
（タンパク質活性）
リゾチームおよびβ−ガラクトシダーゼを以前に記述したように検定した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。簡単に説明すると、市販のキットを使用してリゾチームの活性を測定し、ここではフルオレセイン標識ミクロコッカス・リゾデイクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）の溶解から生じる蛍光によってタンパク質活性を測定する。β−Ｇａｌの活性はオルト−ニトロフェノールガラクトース（ＯＮＰＧ）との反応によって測定した。β−Ｇａｌと共にインキュベートした場合、ＯＮＰＧからの黄色のｏ−ニトロフェノールの放出を４０５ｎｍで観測することができる。
【０１７４】
［実験的ストレッサー］
リゾチームに関する熱試験を、以前に記述したように実施した。リゾチームを０．０２ｍｇ／ｍＬで９０℃にて２０分間加熱した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。次に酵素溶液を希釈し、ＥｎｚＣｈｅｋ活性キットを使用して活性を検定した。β−ガラクトシダーゼに関する凍結乾燥試験を、以前に記述したように実施した。β−Ｇａｌを３回の１２時間凍結乾燥サイクルに供した後、希釈した。４０５ｎｍでｏ−ニトロフェノールガラクトース（ＯＮＰＧ）の加水分解を観測することによって活性を検定した。
【０１７５】
［トレハロース−カプロラクトンポリマーの分解］
５％ＫＯＨで処理した後のカプロラクトン−トレハロースポリマーの分解も明らかにした。２４時間後のＳＥＣによる分析は、ポリマーの完全な喪失を伴う低分子量断片（Ｍｎ＝３００）への劇的なシフトを示した（図１４）。より長いインキュベーション後にさらなる分解は認められず、これらのピークが置換された６−ヒドロキシルヘキサン酸モノマー単位に対応することを示唆した。このデータは、ポリマーがエステル加水分解によって分解可能であることを示す。
【０１７６】
［実験の詳細］
（トレハロース−カプロラクトンの分解）
１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中で、トレハロースポリエステル（３ｍｇ）を５％ＫＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、４℃の回転プレート上に置いた。１および５日後にアリコート（３００μＬ）を取り、等容量の５％ＨＣｌで中和し、凍結乾燥して溶媒を除去した後、ＳＥＣ移動相に再溶解した。
【０１７７】
［還元的アミノ化によるトレハロース−カプロラクトンのリゾチームへの複合体化およびコンジュゲートの安定化］
トレハロース−ＣＬポリマーが賦形剤として有効な安定剤であることを確認した後、ポリマーをモデルタンパク質としてのリゾチームに結合した。官能性アルコールをＲＯＰ開始剤として使用することにより、アセタールをポリマーのα末端に導入した。酸性加水分解によってアルデヒドを露出させ、このアルデヒドは、リゾチーム上の６個のリシンアミノ酸の１つ以上による還元的アミノ化を受けた（スキーム４）（Ｄｉａｍｏｎｄ，１９７４）。
【０１７８】
【化１６】
2017524790.tif 000017
【０１７９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってコンジュゲートを観察した（図１５）。還元的アミノ化は部位選択的複合体化技術ではないので（Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、モノコンジュゲートとビスコンジュゲートの混合物を認めた。
【０１８０】
加えて、トレハロース−カプロラクトンの複合体化を、重要な治療用タンパク質である顆粒球刺激増殖因子（Ｇ−ＣＳＦ）を用いて実施した（図１６）。
【０１８１】
［実験の詳細］
（リゾチームへの複合体化）アセタール官能基化トレハロース−ＣＬポリマー（７ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ２．０（１５０μＬ）に溶解し、５０℃に５時間加熱した。溶液を室温に冷却し、０．２Ｍ  Ｎａ2ＰＯ4（４５μＬ）でｐＨ６．０に調整した。水中の３．３ｍｇ／ｍＬリゾチームの溶液（９８μｇ、３０μＬ）を添加し、コンジュゲートを４℃で３０分間混合した後、水中の４０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣＮＢＨ3の溶液（２０μＬ）を添加した。次にコンジュゲートを２１℃で１９時間インキュベートした後、粗混合物を３ｋＤ  ＭＷＣＯの遠心フィルタで濃縮した。コンジュゲートの収率の粗分析をした
【０１８２】
［サマリー］
タンパク質−ポリマーコンジュゲートは重要な種類の治療用生物学的製剤である。しかし、それらの慢性使用は、インビボでの蓄積と免疫原性に起因する懸念をもたらす。加えて、タンパク質は、貯蔵および輸送の間の不安定性、増大する患者と臨床コスト（ｃｌｉｎｉｃ  ｃｏｓｔ）という問題を抱える。これらのトレハロース−カプロラクトンポリマーは、２つの重要な酵素、リゾチームおよびβ−ガラクトシダーゼをそれぞれ熱および凍結乾燥ストレスに対して安定化することが示されている。加えて、前記ポリマーは塩基性条件下で分解することが示されている。最後に、リゾチームおよび治療用タンパク質Ｇ−ＣＳＦへの成功裏の複合体化を明らかにした。これらの物質は、タンパク質−ポリマーコンジュゲートについての業界標準品としてＰＥＧに取って代わり、これまでの難点を克服する潜在的可能性を有する。
【０１８３】
［実施例２］
［ＢＭＤＯポリマー］
（背景）
生分解性ポリマーの合成に向けての１つの方法は、ラジカル開環重合（ＲＲＯＰ）によるポリマー骨格へのエステル部分の導入に焦点を合わせる。環状ケテンアセタール（ＣＫＡ）は周知のクラスのビニルモノマーであり、ＲＲＯＰを受けて骨格中にエステルを含む線状ポリマーを生成する。ＣＫＡの一部の例としては、５，６−ベンゾ−２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＢＭＤＯ）、２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＭＤＯ）および２−メチレン−４−フェニル−１，３−ジオキソラン（ＭＰＤＬ）、ならびに多様な環サイズおよび置換パターンを有する他のモノマーが含まれる（Ａｇａｒｗａｌ，２０１０）。これらのモノマーは、数ある中でも特にスチレン、メチルメタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）およびビニルアセテートなどの周知のビニルモノマーと重合し得る（Ａｇａｒｗａｌ，２０１０；Ｇｏｍｅｚ  ｄ’Ａｙａｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これらのコポリマーは文献で十分に裏付けられており、これらのコポリマーの加水分解から生じる分解生成物は非細胞毒性であることが示されている（Ｄｅｌｐｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ガラクトピラノース部分を含む分解性グリコポリマーがこの経路によって合成されているが（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、タンパク質の安定化は示されておらず、トレハロースを含む分解性ポリマーはまだ合成されていない。
【０１８４】
増殖因子は重要な治療薬である。例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は好中球の増殖を刺激するためのタンパク質薬物である。化学療法で処置される癌患者は、好中球減少症または異常に低いレベルの好中球を発症する危険性が高い。ＰＥＧ化形態のＧ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｌａｓｔａは、典型的には骨髄前駆体を刺激して好中球を形成し、感染に対抗するために化学療法後の患者において投与される。具体的には、多くの理由から分解性で安定化されたポリマー−タンパク質コンジュゲートを合成することが重要である。タンパク質治療薬は、輸送の間にそれらの活性を低下させる環境ストレッサーの影響を受けやすい（“ＦＤＡ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｄａｔａ”；ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ）。加えて、ＰＥＧは組織中に蓄積することが示されているため、非生分解性は慢性使用において問題を引き起こす可能性がある。
【０１８５】
本明細書では、ラジカル開環重合を用いた生分解性トレハロースポリマーの合成を述べる。共重合および重合後技術の両方を用いて、これらのポリマーを得るために２つのアプローチをとる。
【０１８６】
［合成方法］
［分解性環状ケテンアセタールモノマーの合成］
最初に、公知の手順を用いてＢＭＤＯおよび２−メチレン−４−フェニル−１，３−ジオキソラン（ＭＰＤＬ）を合成した（Ｂａｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｂａｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。ブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールとベンゼンジメタノールを、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）を使用して縮合し、臭素化ＢＭＤＯ前駆体を７６％収率で生成した（スキーム５ａ；化合物の数字は実施例２中に限定される）。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドでの脱離および蒸留による精製によってＢＭＤＯを８７％収率で得た。同様に、触媒量のＴｓＯＨでのスチレングリコールとブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールの縮合はシスおよびトランス臭素化生成物の混合物をもたらし、これらを分離せず、脱離させて、蒸留後に単一ＭＰＤＬ生成物を４０％収率で得た（スキーム５ｂ；化合物の数字は実施例２中に限定される）。
【０１８７】
【化１７】
2017524790.tif 000018
【０１８８】
［保護されたメタクリレートトレハロースモノマーの合成］
３段階の手順に従ってトリメチルシリル（ＴＭＳ）保護メタクリレートトレハロースモノマーを合成した（スキーム６；化合物の数字は実施例２中に限定される）。最初に、ＴＭＳ−Ｃｌを使用して８７％収率でトレハロースを完全にＴＭＳ保護し、次に穏やかな塩基性条件を用いて第一級ヒドロキシルを選択的に除去した。次にメタクリロイルクロリドを使用して遊離ヒドロキシルの１つに重合可能な基を導入することができ、ＴＭＳ保護モノマー７を２９％の全体的収率で得た。
【０１８９】
【化１８】
2017524790.tif 000019
【０１９０】
（ペル−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース５）手順を文献から適合させた（Ｓｉｚｏｖｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。トレハロース（２．０ｇ、５．８ｍｍｏｌ）をピリジン（５０ｍＬ）に溶解し、均一になるまで２０分間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、クロロトリメチルシラン（７．１１ｍＬ、５６．１ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を０℃でさらに３０分間撹拌し、室温に温めた。１６時間後、反応物を再び０℃に冷却し、ｐＨ９の冷炭酸緩衝液（５０ｍＭ、１５０ｍＬ）に注ぎ入れた、３×７０ｍＬヘキサンで抽出することによって水系後処理を実施した。有機層を合わせ、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、その後ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を除去し、生成物をベンゼンからフリーズドライして、固体／油を得た（４．７ｇ、５．１１ｍｍｏｌ、８７％収率）。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：４．９１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．７９（ｄｔ，Ｊ＝１．４，９．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６８−３．６７（ｍ，４Ｈ），３．４３（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｄｄ，Ｊ＝３．２，９．６Ｈｚ，２Ｈ），０．１４−０．１０（ｍ，７２Ｈ）．13Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ＝９４．４，７３．６，７３．２，７２．９，７１．８，６２．２，１．２，０．９，０．２，−０．３．ＥＳＩ−ＭＳ（ＭｅＣＮ）：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ36Ｈ86ＮａＯ11Ｓｉ8［Ｍ＋Ｎａ］+：９４１．４２，ｏｂｓｅｒｖｅｄ：９４１．２６．図１７は、ペル−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース５の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示す。図１８は、ペル−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース５の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示す。
【０１９１】
（２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース６）手順は、文献の手順から適合させた（Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９９２）。アルゴン下の乾燥１００ｍＬ丸底フラスコ中で、５（１．０ｇ、１．０８７ｍｍｏｌ）を無水エタノール（３０ｍＬ）に溶解し、３０分間撹拌して溶解させた。反応物を０℃に冷却し、メタノール（３０ｍＬ）中のＫ2ＣＯ3（１５０ｍｇ、１．０８７ｍｍｏｌ）の懸濁液を２０分間かけて滴下した。反応物を０℃で２時間撹拌した。クエンチングするため、氷酢酸（０．１ｍＬ）を添加して中和し、メタノールを回転蒸発によって除去した。粗生成物をヘキサンとブラインの組合せに再溶解し、ヘキサンで３回抽出した。有機層を合わせ、Ｍｇ2ＳＯ4で乾燥して、溶媒を減圧下で除去した。粗固体をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィ（４：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製し、白色固体を得た（６５１ｍｇ、０．８３９ｍｍｏｌ、７７％収率）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：４．９０（ｄ，２Ｈ），３．９１−３．８４（ｍ，４Ｈ），３．７１−３．６８（ｍ，４Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ），３．４１（ｄｄ，２Ｈ），１．７３（ｄｄ，２Ｈ）．13Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：９４．６，７３．３，７２．９，７２．８，７１．４，６１．７，１．０，０．９，０．０．図１９は、２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース６の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示す。図２０は、２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−α，α−トレハロース６の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示す。
【０１９２】
（２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−６−Ｏ−メタクリレート−α，α−トレハロース７）乾燥二口５０ｍＬフラスコ中で、６（２．７０ｇ、３．４９ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ  ５０ｍＬに溶解した。ＤＭＡＰ（４２．６ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃に冷却した。次に、メタクリロイルクロリド（４２６μＬ、４．３７ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解した。メタクリロイルクロリド溶液およびトリエチルアミン（１．８３ｍＬ、１０．４８ｍｍｏｌ）を同時に滴下した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、その後室温に温めた。１６時間後、反応物を０℃に冷却し、ｐＨ９の冷炭酸緩衝液（４００ｍＬ）に注ぎ入れた。層を分離し、水層をヘキサンで２回洗浄した。有機層を合わせ、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ4で乾燥し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィ（１１：２  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ溶離液）によって精製して、白色固体を得た（１．３４ｇ、１．５９ｍｍｏｌ、４５％収率）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．１５（ｓ，１Ｈ），５．６０（ｔ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，２Ｈ），４．４１（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｄｄ，Ｊ＝１２．１，３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０４（ｄｔ，Ｊ＝６．８，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｑ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８３（ｄｔ，Ｊ＝９．４，３．６Ｈｚ，１ｈ），３．７３−３．６４（ｍ，２Ｈ），３．５４（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．４２（ｄｄｄ，Ｊ＝９．３，３．１，０．８Ｈｚ，１Ｈ），１．８８（ｓ，３Ｈ），１．７２（ｄｄ，Ｊ＝７．５，５．３Ｈｚ，１Ｈ），０．１６−０．１２（ｍ，５４Ｈ）．13Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６７．２４，１３６．１１，１２５．８９，９４．６０，９４．４７，７３．５７，７３．３３，７２．９７，７２．８１，７２．６５，７１．８１，７１．３８，７０．８０，１８．４１，１．０７９，１．０１４，０．８６，０．８５．ＥＳＩ−ＭＳ（ＭｅＣＮ：ＣＨＣｌ3、９：１）：Ｃ34Ｈ76Ｏ13Ｓｉ6［Ｍ＋ＮＨ4］+の計算値：８６０．４１、実測値：８６０．２３。図２１は、２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−６−Ｏ−メタクリレート−α，α−トレハロース７の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示す。図２２は、２，３，４，２’，３’，４’−ヘキサキス−Ｏ−（トリメチルシリル）−６−Ｏ−メタクリレート−α，α−トレハロース７の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示す。
【０１９３】
［ＲＡＦＴ条件下でのＢＭＤＯの共重合］
ＲＡＦＴを用いて環状ケテンモノマーＢＭＤＯを共重合させ、明確に定義されたコポリマーを得た。２つの方法に従った。一方の例では、その後の官能基化のために反応性ハンドルを有するメタクリレートコモノマーを使用した。他方の例では、ＴＭＳ保護メタクリレートトレハロースを共重合のために直接使用した。
【０１９４】
最初の例では、アルケン官能基化メタクリレートモノマーとＢＭＤＯの共重合およびそれに続くチオール−エン修飾により、かさ高い親水性トレハロース部分のその後の導入を可能にした。３−ブテニルメタクリレート（ｂＭＡ）を文献の手順に従って合成した；３−ブテン−１−オールをトリエチルアミンの存在下にメタクリロイルクロリドで処理し、ｂＭＡを５３％収率で得た（Ｃａｍｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１９５】
次にＲＡＦＴ重合を用いてＢＭａとＢＭＤＯを共重合させた（スキーム７）。ＣＫＡはメタクリレートより活性の低いモノマーであり、ＢＭＤＯをポリマー鎖に成功裏に組み込むには、トリチオカーボネートなどのより緩やかな移動係数を有するＣＴＡを必要とする。これらの条件はｂＭＡとＢＭＤＯの共重合の成功をもたらした（図２３）。
【０１９６】
【化１９】
2017524790.tif 000020
【０１９７】
異なるモノマー反応性はＲＡＦＴコポリマーへの低いＢＭＤＯ組込みをもたらしたが、これは生分解性トレハロースポリマーの合成においては好都合である。ポリマーの大部分は、安定化能力を保持するためにトレハロース単位で構成されるべきである。ＤＭＦ溶媒ピークは正確なＧＰＣ測定を妨げたが、共重合のために必要なＣＴＡとメタクリレートモノマーとのミスマッチは、不適切に制御されたＢＭＤＯ−メタクリレート共重合に典型的な、広幅Ｄ（英文明細書ではＤに−と表記）をもたらすと予想される（Ｄｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ，２０１５）。
【０１９８】
次に、アリル官能基化ポリマーを、上記で述べたように合成したチオール化トレハロースとのチオール−エン反応のための基質として使用した。
【０１９９】
【化２０】
2017524790.tif 000021
【０２００】
成功裏の修飾に続いて、骨格エステルの開裂が起こっていないことを確実にするためゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）を実施し得る（図２４）。
【０２０１】
２番目の例では、トレハロース含有メタクリレートモノマー４を直接使用した（スキーム９）。メチルメタクリレートはスチレンよりもＢＭＤＯと共重合するより大きな傾向を示すため、メタクリレートベースのトレハロースモノマーを選択した。加えて、酸性ＴＭＳ脱保護の間の末端基開裂を最小限に抑えるため、アミド含有ピリジルジスルフィドＣＴＡを使用した。
【０２０２】
【化２１】
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【０２０３】
この重合は成功し、ＢＭＤＯの組込みをもたらした。1Ｈ−ＮＭＲは、最終精製ポリマーにおけるアリールピークの存在を示し、トレハロースメタクリレートモノマーとＢＭＤＯの共重合の成功を確認した（図２５）。ＢＭＤＯの組込みは、３．２〜４．５ｐｐｍのトレハロースピークと７．０〜７．５ｐｐｍのアリール領域の積分を比較することにより、２８％と算定された。
【０２０４】
不安定なＴＭＳ基はその後、赤外分光法によって確認されたように、希酸で容易に開裂された（図２６）。脱保護後、遊離ヒドロキシル基に対応する、３３７０ｃｍ-1の広幅ピークが現れた。
【０２０５】
（ＲＡＦＴ条件下でのＢＭＤＯと４の共重合）乾燥シュレンクフラスコ中で、４（１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を無水トルエン（８０μＬ）に溶解した。次にＡＩＢＮの原液（無水トルエン５００μＬ中２．８ｍｇ）９μＬおよびＣＴＡの原液（無水トルエン６０μＬ中２．４ｍｇ）１５μＬの両方を添加した。ＢＭＤＯ（１９．２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をトルエン（４６μＬ）に溶解し、シュレンク管に移した。シュレンク管を、圧が１６０ｍＴｏｒｒで一定なままになるまで、５回の凍結脱気（ｆｒｅｅｚｅ−ｐｕｍｐ−ｔｈａｗ）サイクルに供し、その後管にアルゴンを戻し充填して、７０℃に加熱した。１８時間後、酸素に暴露することによって重合を停止させ、続いて液体窒素に浸漬した。変換パーセントを粗反応混合物の1Ｈ−ＮＭＲによって評価し、次にこの混合物をジクロロメタン（０．５ｍＬ）から冷メタノール（５０ｍＬ）中に３回沈殿させることによって精製して、白色固体を得た（６９．２ｍｇ、１１．６ｎｍｏｌ、回収率７４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：８．５６−８．４２（ｓ，１Ｈ），７．６８−６．８６（ｍ，２２１Ｈ），５．５２−５．２６（ｓ，３２Ｈ），５．２６−４．５５（ｍ，２８６Ｈ），４．５６−４．２５（ｓ，５４Ｈ），４．２５−３．１８（ｍ，８８６Ｈ），３．０７−２．７０（ｓ，４４Ｈ），２．７０−１．８２（ｍ，２２４Ｈ），１．６４−１．４５（ｓ，１０８Ｈ），１．４５−０．９１（ｍ，２９４Ｈ），０．４７−０．２８（ｓ，４３７６Ｈ）．ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ-1）：２９５８，１７３２，１３８２，１２４９，１１５９，１０９７，１０７４，１００７，９６４，８９６，８６９，８３３，７４５。図２７は、ＴＭＳ−トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ４の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ3）を示す。図２８は、ＴＭＳ−トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ４のＩＲスペクトル（ニート）を示す。
【０２０６】
［ＴＭＳ基の除去］
２０ｍＬシンチレーションバイアル中で、ポリ（ＴＭＳ−保護トレハロース−ｃｏ−ＢＭＤＯ）（６９ｍｇ）を５：１  ＴＨＦ：ＭｅＯＨ（６ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  ＨＣｌ（０．１５ｍＬ）を添加した。バイアルをボルテックスし、３分以内に白色沈殿物が形成し始めた。バイアルを１０分間静置し、その後ファルコンチューブに移して、１０分間遠心分離した。生じた沈殿物を５：１  ＴＨＦ：ＭｅＯＨ（６ｍＬ）で３回洗浄した。３回目の後、沈殿物を１：１  Ｈ2Ｏ：ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、１５ｍＬチューブ中で３ｋＤの分子量カットオフ値にて超遠心分離を実施した。ポリマーをＨ2Ｏ：ＭｅＯＨで１回およびＨ2Ｏで１回洗浄し、その後凍結乾燥して水を除去し、白色綿状固体を得た（３２．４ｍｇ、１１．２ｍｍｏｌ、回収率９６％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ：８．４８−８．２７（ｓ，１Ｈ），７．９８−７．６９（ｓ，２Ｈ），７．５６−６．７８（ｄ，１０８Ｈ），５．３４−４．９６（ｄ，２１８Ｈ），４．５７−３．１４（ｍ，１０６４Ｈ），２．９９−２．７５（ｓ，２８Ｈ），２．６９−２．４０（ｍ，５６Ｈ），２．４０−２．２４（ｓ，２６Ｈ），２．２４−１．６３（ｍ，１９０Ｈ），１．６３−１．４６（ｓ，２４Ｈ），１．４３−０．７７（ｔ，２６２Ｈ）．ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ-1）：３３７０，２９２７，２３４４，１７１４，１４５０，１３６７，１２５０，１１４８，１１０４，１０７５，１０４３，９８７，９４０．図２９は、トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ５の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ）を示す。図３０は、トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー、ポリ５のＩＲスペクトル（ニート）を示す。
【０２０７】
［分解性ＢＭＤＯ含有ポリマーを賦形剤として使用したタンパク質の安定化］
チオ−エン化学によって修飾したポリマー（ポリ３）および直接共重合によって形成したポリマー（ポリ５）を、賦形剤としてタンパク質を安定化するそれらの能力に関して評価した。
【０２０８】
２番目の例（ポリ５）では、生じた脱保護コポリマーを、次に、熱ストレスに対してタンパク質を安定化するその能力に関して試験し（図３１）、メタクリレートトレハロースホモポリマー（すなわちＢＭＤＯを含まないポリマー）および添加物なしと比較した。具体的には、モデルタンパク質であるリゾチームに９０℃で２０分間ストレスを与え、ポリマーを添加しなかった場合、その生物活性は最初の活性の１２％に低減した。
【０２０９】
トレハロース−ＢＭＤＯコポリマーは９７％のリゾチーム活性を保持し、一方トレハロースホモポリマー単独では、リゾチームを最初の活性の５７％に安定化した（図３１ａ）。これらのデータは、トレハロースグリコポリマーの骨格へのＢＭＤＯの組込みが、タンパク質を安定化するポリマーの能力に有害な影響を及ぼさないことを指示する。実際に、トレハロースの希釈は、リゾチームのより有効な安定剤であるポリマーをもたらす。ポリマー骨格に沿って糖部分を希釈することが生物学的活性の増大をもたらし得ることは他の系で公知である（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌａｄｍｉｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））。
【０２１０】
９０℃の熱ストレスに対してリゾチームを安定化することに加えて、賦形剤としてコポリマーを有する試料は、リゾチーム単独と比較して４℃で活性の増大を明らかにした。この増大は、以前にモノマートレハロースによるグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）の安定化に関して観察されており、糖がタンパク質−基質相互作用を増強または安定化することに起因すると考えられる（Ｐａｚ−Ａｌｆａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。我々は、ポリマー自体がアッセイの基質であることを不可能にした。それゆえ活性を、４℃での賦形剤混合物の活性に関しても提示した（図３１ｂ）。このように表すと、すべての場合に熱ストレス後に活性が低下した；しかしトレハロース−ＢＭＤＯコポリマーは、図３１ｂに示すように、添加物なし（１２％活性）またはホモポリマー（５１％活性）よりもまだ統計的により良好な安定剤（６７％活性）であった。
【０２１１】
［トレハロース−ＢＭＤＯコポリマーを伴うリゾチームの熱ストレス］
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中の０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム原液を調製し、トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー（リゾチームに対して１００当量）またはメタクリレートトレハロースホモポリマー（リゾチームに対して１００当量）と混合した。試料を０．０２１ｍｇ／ｍＬ（１ｋＵ／ｍＬ）の濃度にさらに希釈し、２０μＬアリコートを０．５ｍＬ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブ中で調製した。各々のアリコートを５００ｒｐｍで２０分間９０℃に加熱し、その後４℃に冷却して、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）リゾチーム活性アッセイを使用して活性を一斉に評価するまで、試料を４℃で保存した。
【０２１２】
［リゾチーム活性アッセイ（ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標））］
リゾチーム−グリコポリマー溶液２０μＬを含有するアリコートをＰＢＳ  ｐＨ７．４で１００μＬに希釈した。生じた溶液５０μＬを取り出し、９６ウェルプレートにおいてＦＩＴＣ（１ｍｇ／ｍＬ）で標識したミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）５０μＬと共に３７℃で３０分間インキュベートした。生じた蛍光を測定し（吸収４８０ｎｍ／放出５３０ｎｍ）、公知の濃度曲線に対して定量化した。有意性を決定するための統計値はスチューデントｔ検定を用いて算定した；＋／−としての信頼度％＝ｔ（標準偏差）／（試験の回数）１／２、ｐ＜１−信頼度％／１００。
【０２１３】
［塩基性条件下での分解性ＢＭＤＯ含有ポリマーの分解］
ポリ３およびポリ５を、塩基性条件下で分解するそれらの能力に関して評価した。最初に、ポリ５を５％ＫＯＨで処理し、分子量を１〜５日間の間隔で評価した。１日後、ゲル浸透クロマトグラムは分子量の有意の減少を示したが、その日以降はさらなる変化を示さず、ポリマーが完全に分解したことを示唆した（図３２）。加えて、分解生成物のＧＰＣトレースは二峰性であり、すべての断片が同じ分子量とは限らないことを指示した。これは、分解性単位がポリマーバックグラウンドに沿ってランダムに配置されるランダムコポリマーに関して予想されるものである。
【０２１４】
ＢＭＤＯ−トレハロースポリマーを５％ＫＯＨ溶液に溶解した。試料を凍結乾燥し、ＧＰＣ移動相に溶解して、ＨＣｌで中和し、その後ＧＰＣによって分析した（図３３）。
【０２１５】
［塩基性条件下でのコポリマーの分解］
トレハロース−ＢＭＤＯコポリマー（５ｍｇ）を５％ＫＯＨ  １．００ｍＬに溶解した。溶液をボルテックスし、２３℃および１０００ｒｐｍでサーモシェーカー上に置いた。アリコート（２００μＬ）を取り出し、１、３および５日目に凍結乾燥した。
【０２１６】
【化２２】
2017524790.tif 000023
【０２１７】
［治療用タンパク質、Ｇ−ＣＳＦへの分解性ＢＭＤＯ含有ポリマーの複合体化］
Ｇ−ＣＳＦに結合したＢＭＤＯ−トレハロースポリマーを、Ｇ−ＣＳＦタンパク質のＮ末端メチオニン残基を標的とする還元的アミノ化を用いて作製した。組換えヒトＧ−ＣＳＦ（２００μｇ、１０．６ｎｍｏｌ）をｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に希釈した。ＢＭＤＯ−トレハロースポリマー（１５ｍｇ、１．０７μｍｏｌ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（３．８４ｍｇ、６１．１μｍｏｌ）を添加した。複合体化反応物を４℃で７２時間インキュベートした。１００ｍＭ  ＨＣｌを添加してｐＨを４．０に調整し、粗混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。次に遊離ポリマーと非結合タンパク質の分離のためにコンジュゲートをＦＰＬＣによって精製した（図３４）。
【０２１８】
要約すると、ＲＡＦＴ重合によってＢＭＤＯ単位を含有する生分解性トレハロースポリマーを合成する２つの方法を提示する。ポリマーは、保護されたモノマーの重合によってまたは反応性ペンダント単位を有するポリマーの重合後修飾によって作製する。これらのポリマーは、賦形剤としてモデルタンパク質を安定化し、塩基性条件下で分解することが示された。加えて、治療用タンパク質としてのＧ−ＣＳＦへの複合体化も実証された。これらのコンジュゲートは持続的療法に有用であり、ポリマーの不必要な蓄積を伴わずに安定化をもたらす。
【０２１９】
我々は、凍結乾燥工程に対してタンパク質および他の生体分子を安定化し、同時にエステル加水分解を介して分解され得るトレハロースグリコポリマーを合成することを提案する（スキーム１１）。
【０２２０】
【化２３】
2017524790.tif 000024
【０２２１】
［仮説に基づく実施例３］
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ベースのポリマーの共有結合は、安定化および循環時間の改善を介してタンパク質治療薬の薬物動態を改善することが公知である（Ｋｎｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。いくつかのＦＤＡで承認されたＰＥＧ化治療薬が市販されている（Ａｌｃｏｎｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。加えて、制御ラジカル重合（ＣＲＰ）によって開発された、ポリ（エチレングリコールメチルエーテルメタクリレート）（ＰＥＧＭＡ）などの分枝ＰＥＧ様ポリマーへのタンパク質複合体化は、ＰＥＧ化と比較して薬物動態を改善することが示されている（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。これらの利点にもかかわらず、ＰＥＧ化はタンパク質の活性低下をもたらすことがあり（Ｒｏｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｍｉｌｔｏｎ，１９９８）、またＰＥＧ化治療薬での長期的な処置は、肝臓および脾臓における蓄積、過敏症、抗ＰＥＧ  ＩｇＭ抗体の発現ならびにリソソーム病症候群をもたらし得る（Ｍａｒｋｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。それゆえ、これらの問題を回避するため、骨格中に分解性結合および／または分解性部分を含むＰＥＧ様ポリマーが求められている（Ｄｕｒｏ−Ｃａｓｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２２２】
ポリマーとタンパク質との結合部位の分解性連結は、しばしば、インビボでポリマーからタンパク質が放出され（加水分解的、酵素的または還元的に）、その結果活性を回復することができるように導入される（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。そのような連結には、マレイルアミノペプチド結合（Ｇａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔ，１９８７）、カルバメート（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、エステル（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、ジスルフィド（Ｗｏｇｈｉｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ヒドラゾン（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ａｎｄ  Ｍｅｎｏｎ−Ｒｕｄｏｌｐｈ，１９９７）およびオキシム（Ｇａｅｒｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｏｆｆｏｒｄ，１９９６）結合が含まれる。例えば、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）は、インターフェロンα−２ｂへの分解性カルバメート結合を用いて設計された（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｍｉｌｔｏｎ，２００１）。ＲｏｂｅｒｔｓとＨａｒｒｉｓは、分解性エステル結合を介したリゾチーム（Ｌｙｚ）のＰＥＧ化を報告した。エステルの加水分解後、Ｌｙｚの活性は天然活性の６０％に回復された（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，１９９８）。しかし、ＰＥＧ骨格は非分解性であり、したがってポリマー蓄積に関連する負の影響は存続する。この蓄積を防ぐため、酵素的または加水分解的に分解可能な部分、例えばエステル（Ｉｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ビニルエーテル（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、アセタール（Ｄｉｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、オキシムまたはウレタン（Ｙａｎ−Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ならびに還元感受性ジスルフィド（Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）がＰＥＧの骨格に導入されている。主鎖分解性ＰＥＧはまだタンパク質治療薬に結合されていない。いくつかの骨格分解性ポリマー−タンパク質コンジュゲートが開発されている。これらのコンジュゲートの大部分は、糖ベースまたは糖由来ポリマー、例えばヒドロキシエチルデンプン（Ｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ポリシアル酸（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、デキストラン（Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｉｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）またはデキストリン（Ｈａｒｄｗｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）から成る。最近、開環重合を使用して、ウシ血清アルブミンに共有結合されたポリ（ε−カプロラクトン）が合成された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２２３】
ＣＲＰは、容易な末端基の官能基化、明確に定義されたポリマー分子量および多種多様なモノマーとの適合性を提供する。それゆえ、明確に定義されたＰＥＧ様ポリマー−タンパク質治療薬を開発する手段としてＣＲＰ技術の開発に多大の注意が払われている（Ｇｒｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ，２０１０）。そのようなＰＥＧ様ポリマーの骨格はまた、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｒｉａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）およびニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）（Ｄｅｌｐｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を含むＣＲＰ技術と環状ケテンアセタール（ＣＫＡ）のラジカル開環重合（ｒＲＯＰ）のカップリングを介して分解性結合で修飾されている。ＣＫＡはまた、分解性単位をポリマー骨格に導入する手段として可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合およびキサントゲン酸塩の交換による高分子設計（ＭＡＤＩＸ）によって重合されてきたが、これらの技術はまだＰＥＧ様ポリマーには適用されていない（Ｈｅｄｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｋｏｂｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。加えて、何らかのＣＲＰ法によって開発された分解性ポリマーは、まだタンパク質に共有結合されていない。
【０２２４】
本発明の他の実施形態および使用は、本明細書からの考察および本明細書で開示される本発明の実施から当業者には明らかである。すべての定期刊行物の引用ならびに米国／外国特許および特許出願を含む、何らかの理由により本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照により明確におよび完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書で例示され、説明される特定の試薬、製剤、反応条件等に限定されるのではなく、以下の特許請求の範囲に含まれるそれらの改変形態を包含することが理解される。
【０２２５】
［文献］
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２８．Ｈａｒｄｗｉｃｋｅ，Ｊ．；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．；Ｍｏｓｅｌｅｙ，Ｒ．；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．；Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｗ．；Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００８，１３０，２７５．
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３３．Ｄｅｌｐｌａｃｅ，Ｖ．；Ｔａｒｄｙ，Ａ．；Ｈａｒｒｉｓｓｏｎ，Ｓ．；Ｍｕｒａ，Ｓ．；Ｇｉｇｍｅｓ，Ｄ．；Ｇｕｉｌｌａｎｅｕｆ，Ｙ．；Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，３７６９．
３４．Ｈｅｄｉｒ，Ｇ．Ｇ．；Ｂｅｌｌ，Ｃ．Ａ．；Ｉｅｏｎｇ，Ｎ．Ｓ．；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｅ．；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｉ．Ｒ．；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｒ．Ｋ．；Ｄｏｖｅ，Ａ．Ｐ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１４．
３５．Ｓｉｅｇｗａｒｔ，Ｄ．Ｊ．；Ｂｅｎｃｈｅｒｉｆ，Ｓ．Ａ．；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ａ．；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏ．；Ｍａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ，Ｋ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２００８，８７Ａ，３４５．
３６．Ｋｏｂｂｅｎ，Ｓ．；Ｅｔｈｉｒａｊａｎ，Ａ．；Ｊｕｎｋｅｒｓ，Ｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４，ｎ／ａ．
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４１．Ｌｉ，Ｆ．；Ｐｅｉ，Ｄ．Ｆ．；Ｈｕａｎｇ，Ｑ．Ｒ．；Ｓｈｉ，Ｔ．Ｆ．；Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ  Ｐｏｌｙｍ  ２０１４，９９，７２８．
４２．Ｘｉａｏ，Ｎ．；Ｌｉａｎｇ，Ｈ．；Ｌｕ，Ｊ．Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ２０１１，７，１０８３４．
４３．Ｅｖａｌｕａｔｅ  Ｌｔｄ．Ｄｒｕｇ  ｓａｌｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｖａｌｕａｔｅｇｒｏｕｐ．ｃｏｍ．
４４．Ａｌｃｏｎｃｅｌ，Ｓ．Ｎ．Ｓ．；Ｂａａｓ，Ａ．Ｓ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１１，２，１４４２．
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４７．Ｐｅｌｅｇｒｉ−Ｏ’Ｄａｙ，Ｅ．Ｍ．；Ｌｉｎ，Ｅ．−Ｗ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，１４３２３．
４８．Ｃｈｉ，Ｅ．Ｙ．；Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．；Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２００３，２０，１３２５．
４９．“ＦＤＡ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｄａｔａ”，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ
５０．Ｌｅａｄｅｒ，Ｂ．；Ｂａｃａ，Ｑ．Ｊ．；Ｇｏｌａｎ，Ｄ．Ｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２００８，７，３９．
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５２．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｈ．；Ｋｉｍ，Ｓ．−Ｈ．；Ｄｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｇ．；Ｗｏｎｇ，Ｄ．Ｙ．；Ｌｏｏ，Ｊ．Ａ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１３，５，２２１．
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５４．Ｌｅｅ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｅ．−Ｗ．；Ｌａｕ，Ｕ．Ｙ．；Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．；Ｂａｔ，Ｅ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，２５６１．
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５６．Ｌｅｅ，Ｊ．；Ｋｏ，Ｊ．Ｈ．；Ｌｉｎ，Ｅ．−Ｗ．；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｐ．；Ｒｕｃｈ，Ｆ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１５，６，３４４３．
５７．Ｊａｉｎ，Ｎ．Ｋ．；Ｒｏｙ，Ｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００９，１８，２４．
５８．Ｃｏｎｇｄｏｎ，Ｔ．；Ｎｏｔｍａｎ，Ｒ．；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｍ．Ｉ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，１５７８．
５９．Ｓｔｉｄｈａｍ，Ｓ．Ｅ．；Ｃｈｉｎ，Ｓ．Ｌ．；Ｄａｎｅ，Ｅ．Ｌ．；Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ，Ｍ．Ｗ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０１４，１３６，９５４４．
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６４．Ｈａｒｄｗｉｃｋｅ，Ｊ．Ｔ．；Ｈａｒｔ，Ｊ．；Ｂｅｌｌ，Ａ．；Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．；Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｗ．；Ｍｏｓｅｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１１，１５２，４１１．
６５．Ｄｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｇ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１５，６５，３０５．
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６７．Ｓｌａｖｉｎ，Ｓ．；Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．；Ｈａｄｄｌｅｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．；Ｂｅｃｅｒ，Ｃ．Ｒ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１，４７，４３５．
６８．Ｃａｍｐｏｓ，Ｌ．Ｍ．；Ｋｉｌｌｏｐｓ，Ｋ．Ｌ．；Ｓａｋａｉ，Ｒ．；Ｐａｕｌｕｓｓｅ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．；Ｄａｍｉｒｏｎ，Ｄ．；Ｄｒｏｃｋｅｎｍｕｌｌｅｒ，Ｅ．；Ｍｅｓｓｍｏｒｅ，Ｂ．Ｗ．；Ｈａｗｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００８，４１，７０６３．
６９．Ｅｎｄｅ，Ａ．Ｅ．ｖ．ｄ．；Ｋｒａｖｉｔｚ，Ｅ．Ｊ．；Ｈａｒｔｈ，Ｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００８，１３０，８７０６．
７０．Ｓｉｌｖｅｒｓ，Ａ．Ｌ．；Ｃｈａｎｇ，Ｃ．−Ｃ．；Ｅｍｒｉｃｋ，Ｔ．Ｊ  Ｐｏｌｙｍ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１２，５０，３５１７．
７１．Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｂ．；Ｑｕａｎｓａｈ，Ｊ．Ｋ．；Ｅｍｒｉｃｋ，Ｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２，４０，１９８３．
７２．Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｂ．；Ｂｒｅｉｔｅｎｋａｍｐ，Ｒ．Ｂ．；Ｅｍｒｉｃｋ，Ｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００５，１２７，７４０４．
７３．Ｐｒａｔｔ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｏｈｍｅｉｊｅｒ，Ｂ．Ｇ．Ｇ．；Ｌｏｎｇ，Ｄ．Ａ．；Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｒ．Ｍ．；Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００６，１２８，４５５６．
７４．Ｌｏｈｍｅｉｊｅｒ，Ｂ．Ｇ．Ｇ．；Ｐｒａｔｔ，Ｒ．Ｃ．；Ｌｅｉｂｆａｒｔｈ，Ｆ．；Ｌｏｇａｎ，Ｊ．Ｗ．；Ｌｏｎｇ，Ｄ．Ａ．；Ｄｏｖｅ，Ａ．Ｐ．；Ｎｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｆ．；Ｃｈｏｉ，Ｊ．；Ｗａｄｅ，Ｃ．；Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｒ．Ｍ．；Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００６，３９，８５７４．
７５．Ｗａｎｇ，Ｒ．；Ｃｈｅｎ，Ｗ．；Ｍｅｎｇ，Ｆ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｒ．；Ｄｅｎｇ，Ｃ．；Ｆｅｉｊｅｎ，Ｊ．；Ｚｈｏｎｇ，Ｚ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１１，４４，６００９．
７６．Ｔａｋａｓｕ，Ａ．；Ｈｏｕｊｙｏｕ，Ｔ．；Ｉｎａｉ，Ｙ．；Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００２，３，７７５．
７７．Ｌｅｅ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｅ．Ｗ．；Ｌａｕ，Ｕ．Ｙ．；Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．；Ｂａｔ，Ｅ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，２５６１．
７８．Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｒ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７４，８２，３７１．
７９．Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９８，８７，１４４６．
８０．Ｇｏｍｅｚ  ｄ’Ａｙａｌａ，Ｇ．；Ｍａｌｉｎｃｏｎｉｃｏ，Ｍ．；Ｌａｕｒｉｅｎｚｏ，Ｐ．；Ｔａｒｄｙ，Ａ．；Ｇｕｉｌｌａｎｅｕｆ，Ｙ．；Ｌａｎｓａｌｏｔ，Ｍ．；Ｄ’Ａｇｏｓｔｏ，Ｆ．；Ｃｈａｒｌｅｕｘ，Ｂ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ａ，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５２，１０４．
８１．Ｄｅｌｐｌａｃｅ，Ｖ．；Ｔａｒｄｙ，Ａ．；Ｈａｒｒｉｓｓｏｎ，Ｓ．；Ｍｕｒａ，Ｓ．；Ｇｉｇｍｅｓ，Ｄ．；Ｇｕｉｌｌａｎｅｕｆ，Ｙ．；Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，３７６９．
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８３．Ｘｉａｏ，Ｎ．；Ｌｉａｎｇ，Ｈ．；Ｌｕ，Ｊ．Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ２０１１，７，１０８３４．
８４．“ＦＤＡ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｄａｔａ”，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ
８５．Ｂａｉｌｅｙ，Ｗ．Ｊ．；Ｗｕ，Ｓ．Ｒ．；Ｎｉ，Ｚ．Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １９８２，１８３，１９１３．
８６．Ｂａｉｌｅｙ，Ｗ．Ｊ．；Ｎｉ，Ｚ．；Ｗｕ，Ｓ．Ｒ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９８２，１５，７１１．
８７．Ｓｉｚｏｖｓ，Ａ．；Ｘｕｅ，Ｌ．；Ｔｏｌｓｔｙｋａ，Ｚ．Ｐ．；Ｉｎｇｌｅ，Ｎ．Ｐ．；Ｗｕ，Ｙ．；Ｃｏｒｔｅｚ，Ｍ．；Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｔ．Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０１３，１３５，１５４１７．
８８．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９２，２３７，３１３．
８９．Ｃａｍｐｏｓ，Ｌ．Ｍ．；Ｋｉｌｌｏｐｓ，Ｋ．Ｌ．；Ｓａｋａｉ，Ｒ．；Ｐａｕｌｕｓｓｅ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．；Ｄａｍｉｒｏｎ，Ｄ．；Ｄｒｏｃｋｅｎｍｕｌｌｅｒ，Ｅ．；Ｍｅｓｓｍｏｒｅ，Ｂ．Ｗ．；Ｈａｗｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００８，４１，７０６３．
９０．Ｄｅｃｋｅｒ，Ｃ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１５，６５，３０５．
９１．Ｗａｄａ，Ｍ．；Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｙ．；Ｍｉｕｒａ，Ｙ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１，２，１８２２．
９２．Ｋａｎａｉ，Ｍ．；Ｍｏｒｔｅｌｌ，Ｋ．Ｈ．；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，９９３１．
９３．Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．；Ｃａｉｒｏ，Ｃ．Ｗ．；Ｓｔｒｏｎｇ，Ｌ．Ｅ．；Ｏｅｔｊｅｎ，Ｋ．Ａ．；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１４９２２．
９４．Ｌａｄｍｉｒａｌ，Ｖ．；Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ｇ．；Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．；Ｃａｕｅｔ，Ｓ．；Ｉｒｗｉｎ，Ｊ．Ｌ．；Ｈａｄｄｌｅｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００６，１２８，４８２３．
９５．Ｐａｚ−Ａｌｆａｒｏ，Ｋ．Ｊ．；Ｒｕｉｚ−Ｇｒａｎａｄｏｓ，Ｙ．Ｇ．；Ｕｒｉｂｅ−Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｓ．；Ｓａｍｐｅｄｒｏ，Ｊ．Ｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９，１４１，１３０．
【図１】
2017524790.tif 000030
【図２】
2017524790.tif 000031
【図３】
2017524790.tif 000032
【図４】
2017524790.tif 000033
【図５】
2017524790.tif 000034
【図６】
2017524790.tif 000035
【図７】
2017524790.tif 000036
【図８】
2017524790.tif 000037
【図９】
2017524790.tif 000038
【図１０】
2017524790.tif 000039
【図１１】
2017524790.tif 000040
【図１２】
2017524790.tif 000041
【図１３】
2017524790.tif 000042
【図１４】
2017524790.tif 000043
【図１５】
2017524790.tif 000044
【図１６】
2017524790.tif 000045
【図１７】
2017524790.tif 000046
【図１８】
2017524790.tif 000047
【図１９】
2017524790.tif 000048
【図２０】
2017524790.tif 000049
【図２１】
2017524790.tif 000050
【図２２】
2017524790.tif 000051
【図２３】
2017524790.tif 000052
【図２４】
2017524790.tif 000053
【図２５】
2017524790.tif 000054
【図２６】
2017524790.tif 000055
【図２７】
2017524790.tif 000056
【図２８】
2017524790.tif 000057
【図２９】
2017524790.tif 000058
【図３０】
2017524790.tif 000059
【図３１】
2017524790.tif 000060
【図３２】
2017524790.tif 000061
【図３３】
2017524790.tif 000062
【図３４】
2017524790.tif 000063
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月19日(2017.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
１つの実施形態では、コポリマーに分解性基を導入することができる環状ケテンアセタールまたはモノマーには、５，６−ベンゾ−２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＢＭＤＯ）、２−メチレン−４−フェニル−１，３−ジオキサラン（ＭＰＤＬ）、２−メチレン−１，３−ジオキサラン、２−メチレン−４−ヘキシル−１，３−ジオアラン、２−メチレン−４−デシル−１，３−ジオアラン、２，４−ジメチレン−１，３−ジオキサラン、２，５−ジメチレン−１，３，−ジオキサン、２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＭＤＯ）、２，５−メチレン−１，３−ジオキサン、４，７−ジメチル−２−メチレン−１，３−ジオキセパン、４−フェニル−２−プロペニレン−１，３−ジオキサラン、２−メチレン−１，３−ジオキセ−５−ペン、２−エチリデン−４−メチル−１，３−ジオキサン、２−エチリデン−４−エチル−１，３−ジオキサン、２−エチリデン−１，３−ジオキサン、１−ビニル−４，７−ジオキサスピロ−［２，４］ヘプタン、１−ビニル−４，９−ジオキサスピロ−［２．６］ノナン、１−ビニル−６，７−ベンゾ−４，９−ジオキサスピロ［２．６］ノナン、９，９−二置換−４−メチレン−３，５，８，１０−テトラオキサビシクロ［５．３．０］デカン、３，９−ビス−メチレン−２，４，８，１０−テトラオキサ−スピロ［５，５］ウンデカンまたは２−メチレン−１，３，６−トリオキソカンが含まれ得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
（反応性ペンダント単位を有するポリ（カプロラクトン）の合成およびトレハロース部分の導入）
ポリカプロラクトンを、医薬分野でのこれまでの使用により、ならびにその重合および修飾に関して十分に開発された化学のために（Ｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｉｌｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、骨格として選択した。アリル官能基化カプロラクトン（ａＣＬ）を、最初に文献の手順（Ｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）に従って１段階で合成した。ａＣＬのＲＯＰを、官能性アルコールを開始剤とし、トリアザビシクロデカン（ＴＢＤ）を有機触媒として用いてトルエン中で実施した（スキーム２）。ＴＢＤは、室温でのその高い活性および空気に対する相対的安定性により選択された（Ｐｒａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｌｏｈｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。賦形剤として使用するトレハロースポリマーに関しては、特性づけの容易さのために２−メチルプロパノールを使用した。複合体化のために使用するポリマーに関しては、２，２−ジエトキシエタノールを保護されたタンパク質反応性基として使用した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
アセテート基の除去は、ＤＭＦ中のヒドラジンまたはＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ  Ｋ２ＣＯ３のいずれかを使用することによって骨格の加水分解なしで達成することができた。ポリマーを有機溶媒中でＧＰＣによって分析した場合、わずかな広がりを認めたが（図７ａ）、ポリマーを水性溶媒中でＳＥＣによって分析した場合は、そのようなＤ（英文明細書ではＤに−と表記）の増大は見られなかった（図７ｂ）。それゆえＤ（英文明細書ではＤに−と表記）の増大は多糖類ヒドロキシルとカラム固定相の相互作用に起因するものであり、骨格エステルの開裂によるものではないと仮定した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
［実験の詳細］
（リゾチームへの複合体化）アセタール官能基化トレハロース−ＣＬポリマー（７ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ２．０（１５０μＬ）に溶解し、５０℃に５時間加熱した。溶液を室温に冷却し、０．２Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４（４５μＬ）でｐＨ６．０に調整した。水中の３．３ｍｇ／ｍＬリゾチームの溶液（９８μｇ、３０μＬ）を添加し、コンジュゲートを４℃で３０分間混合した後、水中の４０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣＮＢＨ３の溶液（２０μＬ）を添加した。次にコンジュゲートを２１℃で１９時間インキュベートした後、粗混合物を３ｋＤ  ＭＷＣＯの遠心フィルタで濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってコンジュゲートの収率の粗分析を実施した後、混合物を３０ｋＤ  ＭＷＣＯに対する遠心ろ過によって精製した。
【国際調査報告】
2017524790.tif 000064