(57)【要約】  本発明は、ＡＰＯＢ遺伝子の２２６５〜２２７７位をターゲッティングする、アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）のコンジュゲートに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンジュゲート部分（領域Ｃ）と結合している、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフを有するオリゴマーを含み、ここで、コンジュゲート部分は、１つ以上のＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項２】
オリゴマーが、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位及び２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群より選択される、少なくとも２つの親和性向上ヌクレオチド類縁体を含む、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項３】
オリゴマーが、配列番号２７：５’  ＧｓＴｓｔｓｇｓａｓｃｓａｓｃｓｔｓｇｓＴｓＣ  ３’に対応し、ここで、大文字が、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを表わし、小文字が、ＤＮＡヌクレオシドを表わし、ＬＮＡシトシンが、５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間の全ての結合が、ｓにより示されているホスホロチオアートである、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項４】
オリゴマーが、ＡｐｏＢを発現している細胞中でのＡｐｏＢの発現をダウンレギュレーション可能である、請求項１〜３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項５】
前記コンジュゲート部分が、開裂性リンカー（Ｂ）を介して、前記オリゴマーに結合している、請求項１〜４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項６】
開裂性リンカーが、開裂性リシンリンカーを含む、請求項５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項７】
コンジュゲート部分が、１〜３個のＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、コンジュゲート部分をオリゴマーに共有結合させるリンカーＹを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項９】
リンカー領域Ｙが、脂肪酸、例えば、Ｃ６リンカーを含む、請求項８記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１０】
コンジュゲート部分が、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分とリンカー（Ｂ及び／もしくはＹ）又はオリゴマーとの間にＰＥＧスペーサを含む、請求項１〜９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１１】
コンジュゲート部分が、ＰＥＧスペーサを介して、開裂性ジ−リシンリンカーにそれぞれ独立して結合している３つのＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１２】
コンジュゲートが、Ｃｏｎｊ１、Ｃｏｎｊ２、Ｃｏｎｊ３、Ｃｏｎｊ４、Ｃｏｎｊ１ａ、Ｃｏｎｊ２ａ、Ｃｏｎｊ３ａ及びＣｏｎｊ４ａからなる群より選択されるコンジュゲート部分を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１３】
配列番号２８又は配列番号３１からなる、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートと、薬学的に許容し得る希釈剤、担体、塩又は補助剤とを含む、
医薬組成物。
【請求項１５】
医薬として使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物。
【請求項１６】
ＡｐｏＢを発現している細胞中において、ＡｐｏＢをｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する方法であって、
前記細胞中においてＡｐｏＢを阻害するために、請求項１〜１４のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を、前記細胞に投与することを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡｐｏＢをターゲッティングするＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）のコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ、アポリポタンパク質Ｂ１００；ＡｐｏＢ−１００、アポリポタンパク質Ｂ−４８；ＡｐｏＢ−４８及びＡｇ（Ｘ）抗原とも知られる）は、脂質の集合及び分泌ならびに別個の分類のリポタンパク質の輸送及びレセプター媒介性取り込みならびに送達になくてはならない役割を果たす、大型の糖タンパク質である。ＡｐｏＢは、循環するリポタンパク質レベルのレギュレーションに重要な役割を果たすため、アテローム硬化症感受性に関連する。同感受性は、アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質の周囲濃度と非常に相互関係を示す。哺乳類に存在する２種類のＡｐｏＢ、その構造及びＡｐｏＢの治療的重要性の更なる詳細については、Davidson and Shelness（Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193）を参照のこと。
【０００３】
ＡｐｏＢ−１００含有リポタンパク質Ｌｐ（ａ）の上昇した血漿レベルは、アテローム硬化症の増大したリスク及びその兆候に関連する。同兆候としては、高コレステロール血症（Seed et al., N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499）、心筋梗塞（Sandkamp et al., Clin. Chew., 1990, 36, 20-23）及び血栓症（Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997, 99, Eli）をあげることができる。
【０００４】
Ｌｐ（ａ）の血漿濃度は、遺伝的要因に強く影響を受け、ほとんどの薬剤及び食餌操作に対して不応性である（Katan and Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399；Vessby et al., Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71）。上昇したＬｐ（ａ）レベルの薬理学的治療は、わずかに成功しているのみであり、アフェレーシスが、最も有効な治療法のままである（Hajjar and Nachman, Annul Rev. Med., 1996, 47, 423-442）。
【０００５】
２種類のアポリポタンパク質Ｂが、哺乳類に存在する。ＡｐｏＢ−１００は、もっぱらヒトの肝臓において合成される、４５３６個のアミノ酸残基を含有する全長タンパク質を表わす（Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193）。ＡｐｏＢ−４８として知られる欠失型は、アミノ末端側の２１５２個の残基と同一であり、全ての哺乳類の小腸において合成される（Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193）。
【０００６】
アポリポタンパク質Ｂについての共通する構造遺伝子が、２つの別個のタンパク質アイソフォームを生成する基礎は、ＲＮＡ編集として知られるプロセスである。部位特異的シトシン−ｔｏ−ウラシル編集反応により、ＵＡＡ停止コドンを生じさせ、アポリポタンパク質Ｂの翻訳を終了させて、ＡｐｏＢ−４８を生成する（Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193）。
【０００７】
哺乳類ＡｐｏＢの治療的重要性は、ヒトＡｐｏＢの過剰発現（Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723；Nishina et al., J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869）、又は、ＡｐｏＢノックアウトマウス（Farese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995, 92, 1774-1778；Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723）のいずれかのトランスジェニックマウス研究を使用して実証されている。
【０００８】
アポリポタンパク質Ｂの機能の阻害を目的にした戦略が、Ｌｐ（ａ）アフェレーシス、抗体、抗体フラグメント及びリボザイムに向けられてきた。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、国際公開第０３／９７６６２号、同第０３／１１８８７号及び同第２００４／４４１８１号、同第２００７／０３１０８１号、同第２００８／１１３８３０号、同第２０１０／１４２８０５号及び同第２０１０／０７６２４８号に開示されている。（配列番号１及び２を有する）ＳＰＣ３８３３及びＳＰＣ４９５５は、ヒトアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）のｍＲＮＡをターゲッティングする活性化合物として、以前に特定された２つのＬＮＡ化合物である。
【０００９】
国際公開第２００７／１４６５１１号には、より長い化合物より明らかに活性があり、毒性が少ない、短い二環式（ＬＮＡ）ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドが報告されている。例示的な化合物は、長さが１４ｎｔｓと考えられる。
【００１０】
van Poelgeest et al.,（American Journal of Kidney Disease, 2013 Oct;62(4):796-800)によれば、ヒトの臨床試験におけるＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドＳＰＣ５００１の投与は、急性腎臓傷害をもたらすおそれがある。
【００１１】
欧州特許第１９８４３８１Ｂ１号、Seth et al., Nucleic Acids Symposium Series 2008 No. 52 553-554及びSwayze et al., Nucleic Acid Research 2007, vol 35, pp687 - 700によれば、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、動物において著しい肝毒性を引き起こす。国際公開第２００７／１４６５１１号によれば、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの毒性は、長さが１２〜１４個のヌクレオチド程度の短いＬＮＡギャップマーを使用することにより避けることができる。欧州特許第１９８４３８１号では、６’置換されている二環式ヌクレオチドを使用して、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの肝毒性の可能性を減少させることが推奨されている。Hagedorn et al., Nucleic Acid Therapeutics 2013によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝毒性の可能性は、その配列及び改変パターンから予測することができる。
【００１２】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ｓｉＲＮＡにおける使用について広く評価されてきた。この場合、それらは、十分なｉｎ  ｖｉｖｏ活性を得るのに必須であると考えられる。例えば、国際公開第２００４／０４４１４１号及び同第２００９／０７３８０９号を参照のこと。同文献には、ＲＮＡ干渉経路を介して遺伝子発現をモデュレーションする改変オリゴマー化合物が言及されている。このオリゴマー化合物は、結合しているオリゴマー化合物の薬物動態学的及び薬力学的特性を改変又は向上させ得る、１つ以上のコンジュゲート部分を含む。
【００１３】
国際公開第２０１２／０８３０４６号、同第２０１２／０８９３５２号及び同第２０１２／０８９６０２号には、ｓｉＲＮＡのための部分をターゲッティングするガラクトースクラスター薬物動態学的モデュレーターが報告されている。
【００１４】
対照的に、単独のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、典型的には、コンジュゲーション又は配合なしに、治療的に投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドについての主なターゲット組織は、肝臓及び腎臓であるが、リンパ節、脾臓及び骨髄を含む広い範囲の他の組織も、アンチセンス治療法を利用できる。
【００１５】
国際公開第２００５／０８６７７５号には、治療的化学部分、開裂性リンカー及びラベル化ドメインを使用した、特定臓器への治療剤のターゲッティング送達が言及されている。開裂性リンカーは、例えば、ジスルフィド基、ペプチド又は制限酵素開裂性オリゴヌクレオチドドメインであることができる。
【００１６】
国際公開第２０１１／１２６９３７号には、小分子リガンドとのコンジュゲーションによる、オリゴヌクレオチドのターゲッティング細胞内送達が言及されている。
【００１７】
国際公開第２００９／０２５６６９号には、ピリジルジスルフィド部分を含有するポリマー（ポリエチレングリコール）リンカーが言及されている。Zhao et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 758 - 766も参照のこと。
【００１８】
Chaltin et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 827 - 836には、アンチセンスオリゴヌクレオチドをカチオン性リポソームに包含させて、デンドリマー送達システムを生じさせるのに使用される、コレステロール改変された、単量体、二量体及び四量体のオリゴヌクレオチドが報告されている。コレステロールは、リシンリンカーを介して、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている。
【００１９】
他の非開裂性コレステロールコンジュゲートが、ｓｉＲＮＡ及びアンタゴミル（antagomir）を肝臓にターゲッティングするのに使用されている。例えば、Soutscheck et al., Nature 2004 vol. 432 173 - 178及びKrutzfeldt et al., Nature 2005 vol 438, 685 - 689を参照のこと。部分的にホスホロチオラート化されているｓｉＲＮＡ及びアンタゴミルについて、肝臓ターゲッティング実体としてのコレステロールの使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に必須であることが見出された。
【００２０】
したがって、向上した有効性及び低下した毒性リスクを有するＡｐｏＢターゲッティングＬＮＡアンチセンス化合物が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際公開第０３／９７６６２号
【特許文献２】国際公開第０３／１１８８７号
【特許文献３】国際公開第２００４／４４１８１号
【特許文献４】国際公開第２００７／０３１０８１号
【特許文献５】国際公開第２００８／１１３８３０号
【特許文献６】国際公開第２０１０／１４２８０５号
【特許文献７】国際公開第２０１０／０７６２４８号
【特許文献８】国際公開第２００７／１４６５１１号
【特許文献９】欧州特許第１９８４３８１号
【特許文献１０】国際公開第２００４／０４４１４１号
【特許文献１１】国際公開第２００９／０７３８０９号
【特許文献１２】国際公開第２０１２／０８３０４６号
【特許文献１３】国際公開第２０１２／０８９３５２号
【特許文献１４】国際公開第２０１２／０８９６０２号
【特許文献１５】国際公開第２００５／０８６７７５号
【特許文献１６】国際公開第２０１１／１２６９３７号
【特許文献１７】国際公開第２００９／０２５６６９号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Davidson and Shelness, Annul Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193
【非特許文献２】Seed et al., N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499
【非特許文献３】Sandkamp et al., Clin. Chew., 1990, 36, 20-23
【非特許文献４】Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997, 99, Eli
【非特許文献５】Katan and Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399
【非特許文献６】Vessby et al., Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71
【非特許文献７】Hajjar and Nachman, Annul Rev. Med., 1996, 47, 423-442
【非特許文献８】Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723
【非特許文献９】Nishina et al., J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869
【非特許文献１０】Farese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995, 92, 1774-1778
【非特許文献１１】American Journal of Kidney Disease, 2013 Oct;62(4):796-800
【非特許文献１２】Seth et al., Nucleic Acids Symposium Series 2008 No. 52 553-554
【非特許文献１３】Swayze et al., Nucleic Acid Research 2007, vol 35, pp687 - 700
【非特許文献１４】Hagedorn et al., Nucleic Acid Therapeutics 2013
【非特許文献１５】Zhao et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 758 - 766
【非特許文献１６】Chaltin et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 827 - 836
【非特許文献１７】Soutscheck et al., Nature 2004 vol. 432 173 - 178
【非特許文献１８】Krutzfeldt et al., Nature 2005 vol 438, 685 - 689
【発明の概要】
【００２３】
本発明は、アシアロ糖タンパク質レセプターターゲッティング部分（領域Ｃ）に共有結合している、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフを有するオリゴマー（領域Ａ）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート（本発明の化合物）を提供する。
【００２４】
本発明は、１つ以上のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含むコンジュゲート部分（領域Ｃ）に共有結合している、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフ（領域Ａ）を有するオリゴマーを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート（本発明の化合物）を提供する。
【００２５】
本発明は、三価のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含むコンジュゲート部分に共有結合している、配列番号２７：５’  ＧＴｔｇａｃｓａｃｔｇＴＣ  ３’のＬＮＡオリゴマー（領域Ａ）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート（本発明の化合物）を提供する。
【００２６】
本発明は、コレステロール部分を含むコンジュゲート部分（領域Ｃ）に共有結合している、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフ（領域Ａ）を有するオリゴマーを含み、ここで、コレステロール含有コンジュゲート部分が、生体開裂性リンカー領域（領域Ｂ）を介してオリゴマーに結合している、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート（本発明の化合物）を提供する。
【００２７】
本発明は、配列番号２７：５’  ＧｓＴｓｔｓｇｓａｓｃｓａｓｃｓｔｓｇｓＴｓＣ  ３’のＬＮＡオリゴマー（領域Ａ）を含み、ここで、大文字が、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを表わし、小文字が、ＤＮＡヌクレオシドを表わし、ＬＮＡシトシンが、５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間の全ての結合が、ホスホロチオアート（ｓ）であり、コンジュゲート部分（領域Ｃ）が、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分又はコレステロール部分を含み、ここで、前記コンジュゲート部分が、生体開裂性リンカー（領域Ｂ）を介して、前記ＬＮＡオリゴマーに結合している、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。
【００２８】
本発明は、本発明の化合物と、薬学的に許容し得る希釈剤、担体、塩又は補助剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００２９】
本発明は、医薬として使用するための、特に、急性冠動脈症候群もしくは高コレステロール血症又は関連する障害、例えば、アテローム硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）からなる群より選択される障害の処置に使用するための、本発明の化合物又は医薬組成物を提供する。
【００３０】
本発明は、アテローム性動脈硬化巣の予防又は減少における医薬として使用するための、本発明の化合物又は医薬組成物を提供する。
【００３１】
本発明は、急性冠動脈症候群もしくは高コレステロール血症又は関連する障害、例えば、アテローム硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）からなる群より選択される障害を処置するための医薬を製造するための、本発明の化合物又は医薬組成物の使用を提供する。
【００３２】
本発明は、急性冠動脈症候群もしくは高コレステロール血症又は関連する障害、例えば、アテローム硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）からなる群より選択される障害を処置する方法であって、有効量の本発明の化合物又は医薬組成物を、高コレステロール血症又は関連する障害を患うか、又は、高コレステロール血症又は関連する障害を患うおそれのある患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００３３】
本発明は、ＡｐｏＢを発現している細胞中において、ＡｐｏＢをｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する方法であって、前記細胞中においてＡｐｏＢを阻害するために、本発明の化合物を前記細胞に投与することを含む、方法を提供する。
【００３４】
本発明は、医学に使用するため、例えば、医薬として使用するための本発明の化合物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】活性化基（すなわち、保護されている反応性基−第３領域として）に結合している、本発明のオリゴマーの非限定的な例示。ヌクレオシド間結合Ｌは、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、例えば、ホスホジエステルであることができる。ＰＯは、ホスホジエステル結合である。化合物ａ）は、１つのＤＮＡ又はＲＮＡを有する領域Ｂを有する。第２及び第１領域間の結合は、ＰＯである。化合物ｂ）は、ホスホジエステル結合により結合している、２つのＤＮＡ／ＲＮＡ（例えば、ＤＮＡ）のヌクレオシドを有する。化合物ｃ）は、ホスホジエステル結合により結合している、３つのＤＮＡ／ＲＮＡ（例えば、ＤＮＡ）のヌクレオシドを有する。一部の実施態様では、領域Ｂは、更なるホスホジエステルＤＮＡ／ＲＮＡ（例えば、ＤＮＡヌクレオシド）により、更に伸長することができる。活性化基は、各化合物の左側に図示されており、場合により、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、あるいは一部の実施態様では、トリアゾール結合を介して、領域Ｂの末端ヌクレオシドに結合していることができる。化合物ｄ）、ｅ）及びｆ）は、領域Ｂと活性化基との間にリンカー（Ｙ）を更に含む。領域Ｙは、例えば、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、あるいは一部の実施態様では、トリアゾール結合を介して、領域Ｂに結合していることができる。
【図２】図１に示されているのと同等であるが、反応性基が、活性化基に代えて使用される化合物。一部の実施態様では、反応性基は、活性化基の活性化（例えば、脱保護）の結果であることができる。非限定的な例において、反応性基は、アミン又はアルコールであることができる。
【図３】本発明の化合物の非限定的な例示。用語体系は、図１と同じである。一部の実施態様では、Ｘは、コンジュゲート、例えば、脂溶性コンジュゲート、例えば、コレステロール又はアシアロ糖タンパク質レセプターターゲッティング部分、例えば、ガラクトースクラスターもしくはＧａｌＮＡｃを含む部分、あるいは、別のコンジュゲート、例えば、本明細書に記載されているものであることができる。加えて又は代えて、Ｘは、ターゲッティング基又は保護基でもよい。一部の態様では、Ｘは、活性化基（図１を参照のこと）又は反応性基（図２を参照のこと）でもよい。Ｘは、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナートを介して、領域Ｂに共有結合していることができ、あるいは、代替結合、例えば、トリアゾール結合（化合物ｄ）、ｅ）及びｆ）におけるＬを参照のこと）を介して結合していることができる。
【図４】本発明の化合物の非限定的な例示。この場合、本化合物は、第３領域（Ｘ）と第２領域（領域Ｂ）との間に任意のリンカーを含む。用語体系は、図１と同じである。適切なリンカーは、本明細書に開示されており、例えば、アルキルリンカー、例えば、Ｃ６リンカーを含む。化合物Ａ、Ｂ及びＣでは、Ｘと領域Ｂとの間のリンカーは、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナートを介して、領域Ｂに結合しており、あるいは、代替結合、例えば、トリアゾール結合を介して結合していることができる（Ｌｉ）。これらの化合物では、Ｌｉｉは、第１（Ａ）と第２領域（Ｂ）との間のヌクレオシド間結合を表わす。
【図５】５ｂは、本発明の化合物の合成方法の非限定的な例を示す。ＵＳは、オリゴヌクレオチド合成支持体を表わす。同支持体は、固体支持体であることができる。Ｘは、第３領域、例えば、コンジュゲート、ターゲッティング基、保護基等である。任意の予備工程において、オリゴヌクレオチド合成支持体に、Ｘを付加させる。他の方法では、予めＸを結合させてある支持体を得ることができる（ｉ）。第１工程において、領域Ｂを合成し（ｉｉ）、続けて、領域Ａを合成する（ｉｉｉ）。その後、オリゴヌクレオチド合成支持体から、本発明のオリゴマー化合物を開裂させる（ｉｖ）。代替法では、予備工程が、領域Ｘとリンカー基（Ｙ）とを結合させてあるオリゴヌクレオチド合成支持体の提供を含む（図５ａを参照のこと）。一部の実施態様では、（存在する場合）Ｘ又はＹのいずれかを、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、あるいは、別の結合、例えば、トリアゾール結合を介して、領域Ｂに結合させる。
【図６】第３領域（Ｘ）と第２領域（Ｂ）との間にリンカー（Ｙ）を含む、本発明の化合物の合成方法の非限定的な例。ＵＳは、オリゴヌクレオチド合成支持体を表わす。同支持体は、固体支持体であることができる。Ｘは、第３領域、例えば、コンジュゲート、ターゲッティング基、保護基等である。任意の予備工程において、オリゴヌクレオチド合成支持体に、Ｙを付加させる。他の方法では、予めＹを結合させてある支持体を得ることができる（ｉ）。第１工程において、領域Ｂを合成し（ｉｉ）、続けて、領域Ａを合成する（ｉｉｉ）。その後、オリゴヌクレオチド合成支持体から、本発明のオリゴマー化合物を開裂させる（ｉｖ）。（図示されているように）一部の実施態様では、開裂工程後に、領域Ｘを、リンカー（Ｙ）に付加させてもよい（ｖ）。一部の実施態様では、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、あるいは、別の結合、例えば、トリアゾール結合を介して、Ｙを領域Ｂに結合させる。
【図７】活性化基を利用する、本発明の化合物の合成方法の非限定的な例。任意の予備工程において、オリゴヌクレオチド合成支持体に、活性化基を結合させ（ｉ）、又は他の方法では、活性化基を有するオリゴヌクレオチド合成支持体を得る。工程ｉｉ）において、領域Ｂを合成し、続けて、領域Ａを合成する（ｉｉｉ）。ついで、オリゴヌクレオチド合成支持体から、オリゴマーを開裂させる（ｉｖ）。ついで、（活性化基を含む）中間体オリゴマーを活性化させ（ｖｉ）又は（ｖｉｉｉ）、第３領域（Ｘ）を、付加させ（ｖｉ）、場合により、リンカー（Ｙ）を介して付加させる（ｉｘ）。一部の実施態様では、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、あるいは、別の結合、例えば、トリアゾール結合を介して、Ｘ（又は、存在する場合、Ｙ）を、領域Ｂに結合させる。
【図８】本発明の化合物の合成方法の非限定的な例。この場合、二官能性オリゴヌクレオチド合成支持体を使用する（ｉ）。このような方法では、いずれかのオリゴヌクレオチドを、最初のシリーズの工程（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）において合成し、続けて、（場合により、リンカー基Ｙを介して）第３領域を結合させる。ついで、本発明のオリゴマー化合物を開裂させることができる（ｖ）。あるいは、工程（ｖｉ）〜（ｉｘ）に示されているように、（場合により、リンカー基（Ｙ）を有する）第３領域を、オリゴヌクレオチド合成支持体に結合させる（これは、任意の予備工程であることができる。）。あるいは他の方法において、（場合によりＹを有する）第３領域を有するオリゴヌクレオチド合成支持体を提供し、ついで、オリゴヌクレオチドを合成する（ｖｉｉ〜ｖｉｉｉ）。ついで、本発明のオリゴマー化合物を開裂させる（ｉｘ）。一部の実施態様では、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、あるいは、別の結合、例えば、トリアゾール結合を介して、Ｘ（又は、存在する場合、Ｙ）を、領域Ｂに結合させる。一部の実施態様では、本方法の前（例えば、予備工程）に、ＵＳは、オリゴヌクレオチドの独立した合成と、基Ｘ、Ｙ（又はＸ及びＹ）の（図示されている）支持体への共有結合とを可能にする、二方向性（二官能性）基を付加させる工程を含む。これは、例えば、トリアゾール又はヌクレオシド基を使用して達成することができる。ついで、オリゴマーが結合している二方向性（二官能性）基を、支持体から開裂させることができる。
【図９】本発明の化合物の合成方法の非限定的な例。最初の工程において、第１領域（Ａ）を合成し（ｉｉ）、続けて、領域Ｂを合成する。一部の実施態様では、ついで、第３領域を、場合により、ホスファートヌクレオシド結合（又は例えば、トリアゾール結合）を介して、領域Ｂに結合させる（ｉｉｉ）。ついで、本発明のオリゴマー化合物を開裂させることができる（ｉｖ）。リンカー（Ｙ）を使用する場合、一部の実施態様では、工程（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）を続けることができる。領域Ｂの合成後、リンカー基（Ｙ）を付加させ、ついで、領域Ｘを（Ｙ）に結合させるか、又は、その後の工程において、領域Ｘを付加させるかのいずれかをする（ｖｉ）。ついで、本発明のオリゴマー化合物を開裂させることができる（ｖｉｉ）。一部の実施態様では、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、あるいは、別の結合、例えば、トリアゾール結合を介して、Ｘ（又は、存在する場合、Ｙ）を、領域Ｂに結合させる。
【図１０】本発明の化合物の合成方法の非限定的な例。この方法では、活性化基を使用する。工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、図９の通りである。ただし、オリゴヌクレオチドの合成（工程ｉｉｉ）後に、活性化基（又は、反応性基）を、場合により、ホスファートヌクレオシド結合を介して、領域Ｂに付加させる。ついで、オリゴヌクレオチドを、支持体から開裂させる（ｖ）。その後、活性化基を活性化させて、反応性基を生成させ、ついで、第３領域（Ｘ）、例えば、コンジュゲート、保護基又はターゲッティング基を、反応性基（活性化された活性化基又は反応性基であることができる）に付加させて、オリゴマー（ｖｉ）を生成する（ｖｉ）。（ｖｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）に示されているように、開裂後、リンカー基（Ｙ）を付加させ（ｖｉｉ）、ついで、領域Ｘを（Ｙ）に結合させるか、又は、その後の工程において、Ｘを付加させるかのいずれかをして、オリゴマーを生成する（ｖｉｉｉ）。工程（ｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）の全ての代替手段を、オリゴヌクレオチド合成支持体上で行うことができ、このような例では、支持体からオリゴマーを開裂させる最後の工程を行うことができることが認識されるべきである。一部の実施態様では、リンヌクレオシド結合基、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボラノホスファート又はメチルホスホナート、あるいは、別の結合、例えば、トリアゾール結合を介して、反応性基又は活性化基を、領域Ｂに結合させる。
【図１１】コレステロール−コンジュゲートによるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるサイレンシング。コンジュゲートしていないＬＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３）、又は、種々のリンカーによりコレステロールに等モル量でコンジュゲートしているＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列については表７を参照のこと）を、１mg/kgの単回投与でマウスに注入し、同マウスを、投与後１、３、７及び１０日で殺処分した。肝臓及び腎臓から、ＲＮＡを単離し、ＡｐｏＢ特異的ＲＴ−ｑＰＣＲに供した。（Ａ）肝臓サンプルからのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの定量を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、同量の生理食塩水対照における平均の割合として示した。（Ｂ）腎臓サンプルからのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの定量を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、同量の生理食塩水対照における平均の割合として示した。
【図１２】下記コンジュゲート部分、コレステロールＣ６、ＦＡＭ、ＴＯＣ及び葉酸を示す。同コンジュゲート部分を、図１〜４に例示されている化合物中のＸ−Ｙ−として使用することができる。波線は、コンジュゲート部分のオリゴマーへの共有結合を表わす。
【図１２Ａ】図１〜４に例示されている化合物中のＸ−Ｙ−として使用することができるＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分を示す。波線は、コンジュゲート部分のオリゴマーへの共有結合を表わす。
【図１２Ｂ】実施例で使用し、表３に列記されている具体的なコレステロールコンジュゲート化合物の一部を示す。Ｌは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わす。Ｌ以外の大文字は、ＤＮＡモノマーを表わす。下付きの「ｓ」は、ホスホロチオアート結合を表わす。上付きの「ＭｅＣ」は、５−メチルシトシン塩基を含有するベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ−モノマーを表わす。下付きの「ｏ」は、ホスホジエステル結合を表わす。
【図１２Ｃ】実施例で使用し、表４に列記されている具体的なＦＡＭコンジュゲート化合物の一部を示す。Ｌは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わす。Ｌ以外の大文字は、ＤＮＡモノマーを表わす。下付きの「ｓ」は、ホスホロチオアート結合を表わす。上付きの「ＭｅＣ」は、５−メチルシトシン塩基を含有するベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わす。下付きの「ｏ」は、ホスホジエステル結合を表わす。
【図１２Ｄ】実施例で使用し、表５に列記されている具体的な葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ＦＡＭ及びＴＯＣコンジュゲート化合物の一部を示す。Ｌは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わす。Ｌ以外の大文字は、ＤＮＡモノマーを表わす。下付きの「ｓ」は、ホスホロチオアート結合を表わす。上付きの「ＭｅＣ」は、５−メチルシトシン塩基を含有するベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わす。下付きの「ｏ」は、ホスホジエステル結合を表わす。
【図１２Ｅ】実施例で使用し、表６に列記されている具体的なＧａｌＮＡｃコンジュゲート化合物の一部を示す。Ｌは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わす。Ｌ以外の大文字は、ＤＮＡモノマーを表わす。下付きの「ｓ」は、ホスホロチオアート結合を表わす。上付きの「ＭｅＣ」は、５−メチルシトシン塩基を含有するベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わす。下付きの「ｏ」は、ホスホジエステル結合を表わす。
【図１３】本発明に使用することができる三価のＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分の例。コンジュゲート１〜４は、４つの適切なＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分を例示する。コンジュゲート１ａ〜４ａは、コンジュゲートをオリゴマー（領域Ａ又は生体開裂性リンカー、例えば、領域Ｂ）に結合させるのに使用される更なるリンカー部分（Ｙ）を有する同じコンジュゲートを意味する。波線は、コンジュゲート部分のオリゴマーへの共有結合を表わす。
【図１３Ａ】配列番号２のオリゴヌクレオチド配列モチーフ及び配列番号２７のＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしているＧａｌＮＡｃコンジュゲート２ａを例示する。これは、配列番号２９の化合物に対応する。
【図１４】コレステロールコンジュゲート部分の例。波線は、コンジュゲート部分のオリゴマーへの共有結合を表わす。
【図１５】種々のコンジュゲートによるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるサイレンシング（実施例４を参照のこと）。生体開裂性リンカーを含まない、ジチオ−リンカー（ＳＳ）を含む、又は、ＤＮＡ／ＰＯ−リンカー（ＰＯ）を含むかのいずれかの種々のコンジュゲートを有するＡＳＯにより、１mg/kgでマウスを処置した。肝臓（Ａ）及び腎臓サンプル（Ｂ）から、ＲＮＡを単離し、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウンについて分析した。生理食塩水（＝１）と比較したデータを示す。
【図１６】実施例７−ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ発現
【図１７】実施例７−血清中の総コレステロール
【図１８】実施例７−肝臓及び腎臓中のオリゴヌクレオチド含量
【図１９】１．０又は２．５mg/kgでの配列番号２８又は２９の単回投与で処置したサルにおける血清ＡｐｏＢ及びＬＤＬ−Ｃレベル。
【図２０】１．０又は２．５mg/kgでの配列番号７又は２０の単回投与で処置したサルにおける血清ＡｐｏＢ及びＬＤＬ−Ｃレベル。
【図２１】０．１mg/kg、０．２５mg/kg又は１．０mg/kgでの配列番号２７、２８又は２９の単回ｉｖ投与で処置したマウスにおける総血清コレステロールレベル。
【図２２】０．１又は０．５mg/kgでの配列番号２７、２８又は２９の複数回投与で処置したサルにおける血清ＡｐｏＢ及びＬＤＬ−Ｃレベル。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドを上回る数多くの改善された特性を有する。コンジュゲートオリゴヌクレオチドの有効性は、顕著に向上している。これにより、対応するコンジュゲートしていない化合物と比較して、用量を少なくすることができ、一方、ＡｐｏＢ発現及び血清コレステロールレベルを低下させることに関して、同程度の効果（例えば、改善されたＥＣ５０及びより広い治療指数）を達成することもできる。更に、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートしている場合、腎臓から肝臓へのいくらかの再分布が観察される。このことは、用量を少なくすることにより達成されるより広い治療指数に加えて、改善された安全性をもたらすことができる。最後に、本発明のコンジュゲートオリゴヌクレオチドの薬力学的半減期は、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドについてより顕著に長くなっていると考えられ、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドと比較して、コンジュゲートオリゴヌクレオチドの効果をより長く継続できるため、投与頻度を少なくできる可能性がある。
【００３７】
オリゴマー
本発明について「オリゴマー」又は「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上のヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド）の共有結合により形成されている分子を意味する。本明細書において、１つのヌクレオチド（単位）は、モノマー又は単位と呼ぶこともできる。一部の実施態様では、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」及び「モノマー」という用語は、互換的に使用される。ヌクレオチド又はモノマーの配列に言及する場合、言及されているものは、塩基、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵの配列であることが認識されるであろう。
【００３８】
本発明は、以下のセクションで更に詳述されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）がコンジュゲート部分（領域Ｃ）と結合している化合物に関する。
【００３９】
本発明の態様は、ＡＰＯＢ遺伝子（配列番号３２）上の２２６５〜２２７７位をターゲッティングするオリゴマー、例えば、ＡＰＯＢ遺伝子上の２２６５〜２２７７位に相補的なオリゴマーを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートである。本態様は、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分又はステロール部分を含むコンジュゲート部分（領域Ｃ）と結合している、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフ又は配列番号２７のオリゴヌクレオチド配列を有するオリゴマーを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。表１に、オリゴマーとコンジュゲートとの具体的な組み合わせを提供する。
【表１】
2017501684.tif 000002
【００４０】
これらの組み合わせは、図１３又は１４における波線を、オリゴマー配列により置き換えることにより可視化することができる。図１２Ｅは、配列番号３１及び２９それぞれに対応する、Ｃｏｎｊ２又はＣｏｎｊ１と、配列番号２７との組み合わせを示す。図１３Ａは、図１２ＥにおけるＣｏｎｊ２ａ化合物の詳細な例である。生体開裂性リンカー（Ｂ）は、コンジュゲート部分（Ｃ）とオリゴマー（Ａ）との間に存在してもよいし、又は、存在しなくてもよいことに留意されたい。Ｃｏｎｊ１〜４及び１ａ〜４ａについて、ＧａｌＮＡｃクラスター中のリシンリンカーを利用するＧａｌＮＡｃコンジュゲートはそれ自体、生体開裂性である。例えば、更なる生体開裂性リンカー（Ｂ）が、使用されてもよいし、又は、使用されなくてもよい。ただし、生体開裂性リンカー（Ｂ）、例えば、本明細書に開示されているホスファートヌクレオチドリンカーの包含が、このようなＧａｌＮＡｃクラスターオリゴマーコンジュゲートの活性を向上させることができることが、予備データから示されている。Ｃｏｎｊ５及びＣｏｎｊ６との使用について、生体開裂性リンカーの使用は、化合物の活性を非常に向上させる。したがって、ステロールを含むコンジュゲート部分が使用される場合、生体開裂性リンカー（Ｂ）、例えば、本明細書に開示されているホスファートヌクレオチドリンカーの包含が推奨される。コンジュゲート部分（及び領域Ｂもしくは領域Ｙ又はＢ及びＹ）は、例えば、配列番号に対して５’又は３’、例えば、領域Ａに対して５’に位置することができる。
【００４１】
本発明の化合物（例えば、オリゴマー又はコンジュゲート）は、ＡｐｏＢをターゲッティングし、例えば、ＡＰＯＢ発現をダウンレギュレーションさせることもでき、又は、動物、ヒトもしくはＡｐｏＢを発現している細胞におけるＡｐｏＢタンパク質レベルを低下させることもできる。好ましい実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、動物又はヒトにおける血清ＡｐｏＢレベルを、等モルレベルで投与された場合の同じ配列を有するコンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドより低いレベルに低下させることができる。好ましくは、血清ＡｐｏＢレベルは、オリゴヌクレオチド化合物が、例えば非限定的に、単回ｓ．ｃ．注入において０．５mg/kgで投与され、注入後７日で測定される場合、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドによるより、コンジュゲートオリゴヌクレオチドにより２倍以上、より好ましくは、３倍又は４倍以上低下される。オリゴヌクレオチド化合物が、例えば非限定的に、単回ｓ．ｃ．注入において０．５mg/kgで投与され、注入後７日で測定される場合、更により好ましくは、血清ＡｐｏＢレベルは、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドによるより、コンジュゲートオリゴヌクレオチドにより５倍以上低下され、最も好ましくは、血清ＡｐｏＢレベルは、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドによるより、コンジュゲートオリゴヌクレオチドにより、少なくとも１０倍以上低下される。これにより、処置に必要とされる治療的有効量を顕著に少なくすることができる。
【００４２】
本発明の化合物は、長さが１０〜２２個、例えば、１０〜２０個、例えば、１２〜２２個の間のヌクレオチド、例えば、１２〜１８個の間のヌクレオチド、例えば、１３〜１６個の間又は１２個もしくは１３個もしくは１４個もしくは１５個もしくは１６個のヌクレオチドであるオリゴマーを含む。オリゴヌクレオチド長の詳細は、以下の別のセクションで説明されている。
【００４３】
一部の実施態様では、オリゴマーは、１つ以上のホスホロチオラート結合ヌクレオシドを含む。ヌクレオチド間結合の詳細は、以下の別のセクションで説明されている。
【００４４】
本発明の化合物は、配列番号２のモチーフを有するオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、改変オリゴマーであり、オリゴヌクレオチドが非天然のヌクレオシド又はヌクレオシド結合を含むことを意味する。本発明の実施態様において、本発明の化合物は、配列番号２のモチーフを有するオリゴマーを含み、ここで、オリゴマーが、機能的効果を有する少なくとも１つのヌクレオチド類縁体を含むか、又は、含有する。この類縁体の機能的効果は、ターゲットに対する向上した結合性及び／又は細胞内ヌクレアーゼに対する向上した抵抗性及び／又は細胞内での向上した輸送を生じさせることができる。ヌクレオチド類縁体の詳細は、以下の別のセクションで説明されている。一部の実施態様では、ヌクレオチド類縁体は、糖改変ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位及び２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群より独立又は従属して選択される糖改変ヌクレオチドである。好ましいヌクレオチド類縁体は、ＬＮＡである。
【００４５】
一部の実施態様では、本発明のオリゴマーは、配列番号２のモチーフに基づいて設計されたギャップマー、例えば、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを含むか、又は、同ギャップマーである。ギャップマー及び他のオリゴマー設計の詳細は、以下の別のセクションで説明されている。好ましい実施態様では、ギャップマーは、配列番号２７に対応する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチドモチーフ」という用語は、固有のオリゴヌクレオチド設計についての基礎を形成し得る塩基、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣの規定配列を有するオリゴヌクレオチド配列を説明する。この場合、一部の塩基は、ヌクレオチド類縁体であり、他の塩基は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。なお、結合は、多様であることができる。
【００４７】
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、配列番号２７、５’  ＧＴｔｇａｃａｃｔｇＴＣ  ３’（ここで、大文字は、ＬＮＡヌクレオシドであり、小文字は、ＤＮＡヌクレオシドである。）のＬＮＡオリゴマー、例えば、ＬＮＡオリゴマー５’  ＧｓＴｓｔｓｇｓａｓｃｓａｓｃｓｔｓｇｓＴｓＣ  ３’（領域Ａ）（ここで、大文字は、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを表わし、小文字は、ＤＮＡヌクレオシドを表わし、ＬＮＡシトシンは、５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間の全ての結合は、ホスホロチオアートである。）を含む。
【００４８】
本発明の化合物は、更なるヌクレオチド領域を含んでもよい。一部の実施態様では、更なるヌクレオチド領域は、生体開裂性ヌクレオチド領域、例えば、ホスファートヌクレオシド配列（第２領域、領域Ｂ）を含む。同領域は、領域Ａを非ヌクレオチド部分、例えば、コンジュゲート基（第３領域又は領域Ｃ）に共有結合させることができる。一部の実施態様では、本発明のオリゴマーの連続したヌクレオチド配列（領域Ａ）は、領域Ｃに直接共有結合している。一部の実施態様では、領域Ｃは、生体開裂性である。リンカーのより詳細は、以下のセクションに見出される。
【００４９】
種々の実施態様において、本発明の化合物は、ＲＮＡ（単位）を含まない。一部の実施態様では、本発明の化合物、第１領域又は（例えば、１つの連続した配列としての）第１及び第２領域は、共に直線状分子であり、又は、直線状分子として合成される。したがって、オリゴマーは、１つの鎖状分子であることができる。一部の実施態様では、オリゴマーは、例えば、同じオリゴマー内の相当領域に相補的である、少なくとも３、４又は５個の連続したヌクレオチドの短い領域を含まない（すなわち、オリゴマーは、二重鎖を形成しない。）。一部の実施態様では、オリゴマーは、（本質的に）二本鎖でなくてよい。一部の実施態様では、オリゴマーは、本質的に二本鎖でなく、例えば、ｓｉＲＮＡでない。
【００５０】
ターゲット
本発明のオリゴマーは、ＡＰＯ−Ｂ遺伝子、例えば、ＡｐｏＢ−１００又はＡｐｏＢ−４８（ＡＰＯＢ）の発現を、適切にダウンレギュレーションすることができる。この点について、本発明のオリゴマーは、典型的には、哺乳類、例えば、ヒトの細胞、例えば、肝臓の細胞における、ＡＰＯＢの阻害に影響を及ぼし得る。一部の実施態様では、本発明のオリゴマーは、ターゲット核酸に結合し、正常な発現レベルと比較して、少なくとも１０％又は２０％、より好ましくは、正常な発現レベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の阻害に影響を及ぼす。一部の実施態様では、０．０４と２５nMとの間、例えば、０．８と２０nMとの間の濃度の本発明の化合物を使用する場合、このようなモデュレーションが見られる。同じ又は異なる実施態様において、発現の阻害は、１００％未満であり、例えば、９８％未満の阻害、９５％未満の阻害、９０％未満の阻害、８０％未満の阻害、例えば、７０％未満の阻害である。発現レベルのモデュレーションは、タンパク質レベルを測定することにより、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続けて、ターゲットタンパク質に対して産生させた適切な抗体を使用するウェスタンブロット等の方法により決定することができる。あるいは、発現レベルのモデュレーションは、ｍＲＮＡレベルを測定することにより、例えば、ノーザンブロット又は定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定することができる。ｍＲＮＡレベルにより測定する場合、適切な用量、例えば、０．０４と２５nMとの間、例えば、０．８と２０nMとの間の濃度を使用する場合、ダウンレギュレーションレベルは、一部の実施態様において典型的には、本発明の化合物の非存在での正常レベルの１０〜２０％の間のレベルである。
【００５１】
したがって、本発明は、ＡＰＯ−Ｂタンパク質及び／又はｍＲＮＡを発現している細胞中でのＡＰＯ−Ｂタンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーション又は阻害する方法であって、本発明の化合物を前記細胞に投与して、前記細胞中でのＡＰＯ−Ｂタンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーション又は阻害することを含む、方法を提供する。適切には、細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞である。一部の実施態様では、投与は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよい。一部の実施態様では、投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもよい。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「ターゲット核酸」という用語は、哺乳類のＡＰＯ−Ｂポリペプチド、例えば、ヒトＡＰＯ−Ｂ１００、例えば、ヒトＡＰＯ−Ｂ１００  ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＡＰＯ−Ｂ１００コード核酸又は天然のその変異体及びそれ由来のＲＮＡ核酸、好ましくは、ｍＲＮＡ、例えば、プレ−ｍＲＮＡであるが、好ましくは、成熟ｍＲＮＡである。ターゲットＡｐｏＢ核酸の例は、NCBIアクセッションナンバーＮＭ＿０００３８４に対応する配列番号３２に提供される。ターゲットＡｐｏＢ核酸は、genbankアクセッションナンバー：ＮＧ＿０１１７９３、ＮＭ＿０００３８４．２、ＧＩ：１０５９９０５３１及びＮＧ＿０１１７９３．１、ＧＩ：２２６４４２９８７にも見出される。これらは全て、参照により本明細書に組み入れられる。一部の実施態様では、例えば、研究又は診断に使用される場合、「ターゲット核酸」は、ｃＤＮＡもしくは上記ＤＮＡ由来の合成オリゴヌクレオチド又はＲＮＡ核酸ターゲットでもよい。本発明のオリゴマーは、好ましくは、ターゲット核酸にハイブリダイゼーションすることができる。ヒトＡＰＯ−Ｂ  ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ配列であり、例えば、成熟したｍＲＮＡターゲット配列にも対応するが、該ｃＤＮＡ配列においては、ウラシルは、チミジンにより置き換えられることが認識されるであろう。
【００５３】
「天然のその変異体」という用語は、規定の分類群、例えば、哺乳類、例えば、マウス、サル、及び好ましくは、ヒト内に本来存在する、核酸配列のＡＰＯ−Ｂ１ポリペプチドの変異体を意味する。典型的には、ポリペプチドの「天然の変異体」に言及する場合、この用語は、染色体転座又は複製によりＡＰＯ−ＢコードゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ、例えば、該ＤＮＡ由来のｍＲＮＡの任意のアレル変異体を包含することもできる。「天然の変異体」は、ＡＰＯ−Ｂ１００  ｍＲＮＡの選択的スプライシング由来の変異体を含むこともできる。したがって、固有のポリペプチド配列を参照すると、例えば、該用語は、例えば、同時翻訳又は翻訳後改変、例えば、シグナルペプチド開裂、タンパク質分解開裂、グリコシル化等によりプロセスされることができる、天然型のタンパク質も含む。
【００５４】
オリゴマー（領域Ａ）は、例えば、ヒトＡＰＯ−Ｂ  ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列の逆相補に対応する、連続したヌクレオチド配列を含むか、又は、同配列からなる。
【００５５】
「対応すること」及び「対応する」という用語は、オリゴマーのヌクレオチド配列（すなわち、ヌクレオ塩基もしくは塩基配列）又は連続したヌクレオチド配列（第１領域／領域Ａ）と、核酸ターゲットの逆相補又はその部分領域との間の比較を意味する。
【００５６】
ヌクレオチド類縁体は、その同等又は対応するヌクレオチドと直接比較される。好ましい実施態様では、オリゴマー（又はその第１領域）は、ターゲット領域又は部分領域に相補的であり、例えば、完全に相補的である。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「逆相補」、「逆相補的」及び「逆相補性」という用語は、「相補」、「相補的」及び「相補性」という用語と互換性である。
【００５８】
「対応するヌクレオチド類縁体」及び「対応するヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド類縁体におけるヌクレオチドと天然のヌクレオチドとが同一であることを示すことを意図している。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンに結合している場合、「対応するヌクレオチド類縁体」は、アデニンに結合している（２−デオキシリボースとは異なる）ペントース単位を含有する。
【００５９】
「ヌクレオ塩基」という用語は、ヌクレオチドの塩基部分を意味し、天然及び非天然の変異体の両方に及ぶ。このように、「ヌクレオ塩基」は、公知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、複素環類縁体及びその互変異性体にも及ぶ。領域ＢのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドは、天然及び／又は非天然のヌクレオ塩基を有する場合があることが認識されるであろう。
【００６０】
ヌクレオ塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン及び２−クロロ−６−アミノプリンを含むがこれらに限定されない。一部の実施態様では、ヌクレオ塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル及び５−メチルシトシンからなる群より独立して選択されることができる。一部の実施態様では、ヌクレオ塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及び５−メチルシトシンからなる群より独立して選択されることができる。
【００６１】
一部の実施態様では、オリゴマーに存在する少なくとも１つのヌクレオ塩基が、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン及び２−クロロ−６−アミノプリンからなる群より選択される改変ヌクレオ塩基である。
【００６２】
ヌクレオチド類縁体
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」と言う用語は、糖部分、塩基部分及び共有結合基、例えば、ホスファート又はホスホロチオアートのヌクレオチド間結合基を含むグリコシドを意味し、天然のヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡと、改変されている糖及び／又は塩基部分を含む非天然のヌクレオチドとの両方に及ぶ。同非天然のヌクレオチドは、本明細書において、「ヌクレオチド類縁体」とも呼ぶ。本明細書において、１つのヌクレオチド（単位）は、モノマー又は核酸単位と呼ぶこともある。
【００６３】
生化学分野において、「ヌクレオシド」という用語は、糖部分及び塩基部分を含むグリコシドを意味するのに一般的に使用されるため、ヌクレオチド単位に言及する際に使用することができ、同単位は、オリゴマーのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合により共有結合する。
【００６４】
当業者であれば認識するであろうように、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、５’ヌクレオチド間結合基を含まないが、５’末端基を含んでもよいし、又は、含まなくてもよい。
【００６５】
非天然のヌクレオチドとしては、改変糖部分を有するヌクレオチド、例えば、二環式ヌクレオチド又は２’改変ヌクレオチド、例えば、２’置換ヌクレオチドがあげられる。
【００６６】
「ヌクレオチド類縁体」は、糖及び／又は塩基部分における改変による、天然のヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドの変異体である。類縁体は、オリゴヌクレオチドについての天然のヌクレオチドに対して、原則として単に「サイレント」又は「同等」であることができる、すなわち、オリゴヌクレオチドがターゲット遺伝子の発現を阻害するのに作用する方法おいて機能的効果を有さない。それでも、このような「同等」の類縁体は、例えば、より容易又はより安価に製造され、保存又は製造条件に対してより安定であり、あるいは、タグ又はラベルを提供する場合、有用である場合がある。ただし、好ましくは、類縁体は、例えば、ターゲットに対する向上した結合親和性及び／又は細胞内ヌクレアーゼに対する向上した抵抗性及び／又は細胞内への輸送の向上した容易性を生じさせることにより、オリゴマーが発現を阻害するのに作用する方法において機能的効果を有するであろう。ヌクレオシド類縁体の具体例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213ならびにスキーム１に記載されている。
【化１】
2017501684.tif 000003
【００６７】
このように、オリゴマーは、天然のヌクレオチド−好ましくは、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書では一般的に、「ＤＮＡ」と呼ぶ）、場合により、リボヌクレオチド（本明細書では一般的に、「ＲＮＡ」と呼ぶ）の単純な配列、又は、このような天然のヌクレオチドと１つ以上の非天然のヌクレオチド、すなわち、ヌクレオチド類縁体との組み合わせを含んでもよいし、又は、それらからなってもよい。このようなヌクレオチド類縁体は、ターゲット配列に対するオリゴマーの親和性を適切に向上させてもよい。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「２’−改変」又は「２’−置換」は、Ｈ又はＯＨ以外の置換基を２’位に含む糖を含むヌクレオシドを意味する。２’−改変ヌクレオシドは、非架橋性２’置換基、例えば、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（ここで、各Ｒｍ及びＲｎは、独立して、Ｈ又は置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルである。）を有するヌクレオシドを含むがこれらに限定されない。２’−改変ヌクレオシドは、例えば、糖の他の位置及び／又はヌクレオ塩基において、他の改変を更に含んでもよい。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「２’−Ｆ」は、フルオロ基を２’位に含む糖を意味する。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「２’−ＯＭｅ」又は「２’−ＯＣＨ３」又は「２’−Ｏ−メチル」はそれぞれ、ヌクレオシドを意味する。
【００７１】
適切で、好ましいヌクレオチド類縁体の例は、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供され、又は、その中で参照されている。本発明のオリゴマーに使用することができる他のヌクレオチド類縁体は、三環式核酸を含む。例えば、国際公開第２０１３１５４７９８号を参照されたい。国際公開第２０１３１５４７９８号は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００７２】
オリゴマー中への親和性向上ヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡ又は２’−置換糖の包含により、特異的に結合するオリゴマーのサイズを小さくすることができ、非特異的又は異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズに対する上限を小さくすることもできる。
【００７３】
本発明の一部の実施態様では、本発明のオリゴマーに存在するヌクレオチド類縁体は、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ（インターカレーション核酸−Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925、同文献は、参照により本明細書に組み入れられる）単位及び２’ＭＯＥ単位から独立して選択される。一部の実施態様では、上記種類のヌクレオチド類縁体の１つのみが、本発明のオリゴマー、例えば、第１領域又はその連続したヌクレオチド配列に存在する。
【００７４】
一部の実施態様では、オリゴマーは、少なくとも２つのヌクレオチド類縁体を含む。一部の実施態様では、オリゴマーは、３〜８個のヌクレオチド類縁体、例えば、６又は７個のヌクレオチド類縁体を含む。非常に最も好ましい実施態様では、前記ヌクレオチド類縁体の少なくとも１つは、ロックド核酸（ＬＮＡ）である。例えば、ヌクレオチド類縁体の少なくとも３つ又は少なくとも４つ又は少なくとも５つ又は少なくとも６つ又は少なくとも７又は８つが、ＬＮＡでもよい。一部の実施態様では、全てのヌクレオチド類縁体が、ＬＮＡでもよい。ＬＮＡ類縁体は、別のセクションにより詳述されている。
【００７５】
好ましいヌクレオチド配列モチーフ又はヌクレオチド配列がヌクレオチドのみからなることに言及する場合、その配列により規定される本発明のオリゴマーは、前記配列に存在する１つ以上のヌクレオチドに代えて、対応するヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡ単位又は他のヌクレオチド類縁体を含んでもよいことが認識されるであろう。同類縁体は、オリゴマー／ターゲットの二重鎖の二重鎖安定性／Ｔｍを向上させる（すなわち、親和性向上ヌクレオチド類縁体）。
【００７６】
Ｔｍアッセイ法
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドとターゲットＲＮＡ（ＰＯ）との二重鎖を、ＲＮａｓｅフリー水 ５００mL中に、３mMに希釈し、２×Ｔｍ−バッファー（２００mM ＮａＣｌ、０．２mM ＥＤＴＡ、２０mM リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０） ５００mLと混合する。この溶液を、９５℃に３分間加熱し、ついで、室温において３０分間アニーリングさせる。二重鎖融解温度（Ｔｍ）を、PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を使用するPeltier temperature programmer PTP6を備えるLambda 40 UV/VIS分光計において測定する。温度を、２０℃から９５℃に上げ、ついで、２５℃に下げ、２６０nmにおける吸光を記録する。二重鎖Ｔｍを評価するのに、融解及びアニーリング両方の一次導関数及び極大を使用する。
【００７７】
ＬＮＡ
「ＬＮＡ」という用語は、Ｃ２＊〜Ｃ４＊ビラジカル（ブリッジ）を含む二環式ヌクレオシド類縁体を意味し、「ロックド核酸」として知られている。ＬＮＡは、ＬＮＡモノマーを意味してもよいし、又は、「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」に関して使用される場合、ＬＮＡは、１つ以上のこのような二環式ヌクレオチド類縁体を含有するオリゴヌクレオチドを意味する。一部の態様では、二環式ヌクレオシド類縁体は、ＬＮＡヌクレオチドであるため、これらの用語は、互換的に使用することができる。このような実施態様では、両方とも、リボース糖環のＣ２’とＣ４’との間のリンカー基（例えば、ブリッジ）の存在により特徴付けられることができる。
【００７８】
一部の実施態様では、第１領域（Ａ）に存在する少なくとも１つのヌクレオシド類縁体は、二環式ヌクレオシド類縁体であり、例えば、（領域ＢのＤＮＡ及び／又はＲＮＡを除いて）少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つが、糖改変ヌクレオシド類縁体、例えば、二環式ヌクレオシド類縁体、例えば、ＬＮＡ、例えば、ベータ−Ｄ−Ｘ−ＬＮＡもしくはアルファ−Ｌ−Ｘ−ＬＮＡ（ここで、Ｘは、オキシ、アミノ又はチオである。）又は、本明細書に開示されている他のＬＮＡである。同他のＬＮＡは、ＥＮＡ、（Ｒ／Ｓ）ｃＥＴ、ｃＭＯＥ又は５’−Ｍｅ−ＬＮＡを含むがこれらに限定されない。
【００７９】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物に使用されるＬＮＡは、好ましくは、ベータ−Ｄ及びアルファ−Ｌのアイソフォームを含む、以下に示されている２つの例示的な立体化学異性体の構造を有する。
【化２】
2017501684.tif 000004
【００８０】
具体的に例示的なＬＮＡ単位は、以下に示される。
【化３】
2017501684.tif 000005
【００８１】
好ましいヌクレオチド類縁体は、ＬＮＡ、例えば、オキシ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ及びアルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）ならびに／又はアミノ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ及びアルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）ならびに／又はチオ−ＬＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ及びアルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）ならびに／又はＥＮＡ（例えば、ベータ−Ｄ−ＥＮＡ及びアルファ−Ｌ−ＥＮＡ）である。好ましい実施態様では、ＬＮＡは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００８２】
「チオ−ＬＮＡ」という用語は、上記一般式中のＯがＳ又は−ＣＨ２−Ｓ−から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄとアルファ−Ｌの両方の立体配置をとることができる。
【００８３】
「アミノ−ＬＮＡ」という用語は、上記一般式中のＹが−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−及び−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−（ここで、Ｒは、水素及びＣ１〜４アルキルから選択される。）から選択されるロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄとアルファ−Ｌの両方の立体配置をとることができる。
【００８４】
「オキシ−ＬＮＡ」という用語は、上記一般式中のＹが−Ｏ−を表わすロックドヌクレオチドを含む。これは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）−４’又は４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’と記載することもできる。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄとアルファ−Ｌの両方の立体配置をとることができる。
【００８５】
「ＥＮＡ」という用語は、上記一般式中のＹが−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’位に結合している。）であるロックドヌクレオチドを含む。これは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−４’又は４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’と記載することもできる。
【００８６】
ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡに代えて使用することができる他のＬＮＡヌクレオシドは、国際出願第ＥＰ２０１３／０７３８５８号に提供されている。同出願は、参照により本明細書に組み入れられる。例えば、下記のものである。
【化４】
2017501684.tif 000006
【００８７】
オリゴマー中への親和性向上ヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡ又は２’−置換糖の包含により、特異的に結合するオリゴマーのサイズを小さくすることができ、非特異的又は異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズに対する上限を小さくすることもできる。
【００８８】
長さ
オリゴマーは、長さが合計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個の間の連続したヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含んでもよいし、又は、同配列からなってもよい。長さは、例えば、領域Ａ又は領域Ａ及びＢを含むことができる。
【００８９】
一部の実施態様では、オリゴマーは、長さが合計１０〜２２個、例えば、１２〜１８個、例えば、１３〜１７個又は１３〜１６個又は１２〜１６個又は１２〜１４個の間、例えば、１２、１３、１４、１５、１６個の連続したヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含んでもよいし、又は、同配列からなってもよい。
【００９０】
一部の実施態様では、本発明のオリゴマーは、２２個以下のヌクレオチド、例えば、２０個以下のヌクレオチド、例えば、１８個以下のヌクレオチド、例えば、１５、１６又は１７個のヌクレオチドからなる。一部の実施態様では、本発明のオリゴマーは、２０個未満のオリゴヌクレオチドを含む。
【００９１】
ＲＮＡｓｅリクルートメント
オリゴマー化合物は、ターゲットｍＲＮＡの非ＲＮａｓｅ媒介性分解により、例えば、翻訳の立体障害又は他の方法により機能する場合があることが認識される。一部の実施態様では、本発明のオリゴマーは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈをリクルートすることできる。
【００９２】
このようなオリゴマー、例えば、領域Ａ又は連続したヌクレオチド配列は、少なくとも６つ、例えば、少なくとも７つの連続したヌクレオチド単位、例えば、少なくとも８つ又は少なくとも９つの連続したヌクレオチド単位（残基）、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個の連続したヌクレオチドの領域を含むことが好ましい。相補的なターゲットＲＮＡとの二重鎖に形成された場合、オリゴマーは、ＲＮａｓｅをリクルートすることができる（例えば、ＤＮＡ単位）。ＲＮＡｓｅをリクルートすることができる連続した配列は、本明細書に記載されているギャップマーについて言及された領域Ｙ’であることができる。一部の実施態様では、ＲＮＡｓｅをリクルートすることができる連続した配列、例えば、領域Ｙ’のサイズは、より大きく、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のヌクレオチド単位であることができる。
【００９３】
欧州特許第１２２２３０９号には、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法が提供されている。同方法は、ＲＮａｓｅ  Ｈをリクルートする能力を決定するのに使用することができる。相補的なＲＮＡターゲットと共に提供された場合、オリゴマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈをリクルートすることができ、同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含有し、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオアート結合基を有する、ＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを使用し、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５により提供されている方法を使用して決定される初速度の少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は２０％を超える、pmol/l/分で測定された初速度を有するとみなされる。
【００９４】
一部の実施態様では、オリゴマーは、相補的なＲＮＡターゲット及びＲＮａｓｅ  Ｈと共に提供された場合、ＲＮａｓｅ  Ｈを本質的にリクルートすることができず、pmol/l/分で測定されたＲＮａｓｅ  Ｈの初速度は、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオアート結合基を有する、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを使用し、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５により提供されている方法を使用して決定される初速度の１％未満、例えば、５％未満、例えば、１０％未満又は２０％未満であるとみなされる。
【００９５】
他の実施態様では、オリゴマーは、相補的なＲＮＡターゲット及びＲＮａｓｅ  Ｈと共に提供された場合、ＲＮａｓｅ  Ｈをリクルートすることができ、pmol/l/分で測定されたＲＮａｓｅ  Ｈの初速度は、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオアート結合基を有する、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを使用し、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５により提供されている方法を使用して決定される初速度の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも８０％であるとみなされる。
【００９６】
典型的には、相補的なターゲットＲＮＡと二重鎖に形成された場合、ＲＮａｓｅをリクルートすることができる、連続したヌクレオチド単位を形成するオリゴマーの領域は、ＲＮＡターゲットとの二重鎖等のＤＮＡ／ＲＮＡを形成するヌクレオチド単位からなる。本発明のオリゴマー、例えば、第１領域は、ヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体の両方を含むヌクレオチド配列を含んでもよく、例えば、ギャップマーの形式にあってもよい。
【００９７】
ギャップマー設計
一部の実施態様では、本発明のオリゴマー、例えば、第１領域は、ギャップマーを含むか、又は、同ギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、ＲＮＡｓｅ、例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈをリクルートすることができるヌクレオチドの連続したストレッチ、例えば、本明細書において領域Ｙ’（Ｙ’）と呼ぶ、少なくとも６又は７つのヌクレオチドの領域を含むオリゴマーである。ここで、領域Ｙ’は、親和性向上ヌクレオチド類縁体の領域のそばの５’及び３’の両方に隣接している。例えば、１〜６個のヌクレオチド類縁体の５’及び３’から、ＲＮａｓｅをリクルートすることができるヌクレオチドの連続したストレッチへ、である。これらの領域はそれぞれ、領域Ｘ’（Ｘ’）及びＺ’（Ｚ’）と呼ぶ。Ｘ’及びＺ’領域は、ギャップマーのウイングとも呼ぶことができ、領域Ｙ’は、ギャップマーのギャップとも呼ぶ。ギャップマーの例は、国際公開第２００４／０４６１６０号、同第２００８／１１３８３２号及び同第２００７／１４６５１１号に開示されている。
【００９８】
一部の実施態様では、ＲＮＡｓｅをリクルートすることができるモノマーは、ＤＮＡモノマー、アルファ−Ｌ−ＬＮＡモノマー、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡモノマー（国際出願第ＥＰ２００９／０５０３４９号及びVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300を参照のこと。同文献は、参照により本明細書に組み入れられる）及びＵＮＡ（非結合核酸（unlinked nucleic acid））ヌクレオチド（Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照のこと。同文献は、参照により本明細書に組み入れられる）からなる群より選択される。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２〜Ｃ３のＣ−Ｃ結合が除去されており、ロックされていない「糖」残基を形成している、アンロック核酸である。好ましくは、ギャップマーは、式（５’→３’）Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’の（ポリ）ヌクレオチド配列を含む。式中、領域Ｘ’（Ｘ’）（５’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類縁体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１〜６個のヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡ単位からなるか、又は、同類縁体を含む。領域Ｙ’（Ｙ’）は、（相補的なＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡターゲットと二重鎖に形成された場合）ＲＮＡｓｅをリクルートすることができる少なくとも５つの連続したヌクレオチド、例えば、ＤＮＡヌクレオチドからなるか、又は、同ヌクレオチドを含む。領域Ｚ’（Ｚ’）（３’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類縁体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１〜６個のヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡ単位からなるか、又は、同類縁体を含む。
【００９９】
一部の実施態様では、領域Ｘ’は、１、２、３、４、５もしくは６個のヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡ単位、例えば、２〜５個のヌクレオチド類縁体、例えば、２〜５個のＬＮＡ単位、例えば、３もしくは４個のヌクレオチド類縁体、例えば、３もしくは４個のＬＮＡ単位からなり、及び／又は、領域Ｚ’は、１、２、３、４、５又は６個のヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡ単位、例えば、２〜５個のヌクレオチド類縁体、例えば、２〜５個のＬＮＡ単位、例えば、３又は４個のヌクレオチド類縁体、例えば、３又は４個のＬＮＡ単位からなる。
【０１００】
一部の実施態様では、Ｙ’は、ＲＮＡｓｅをリクルートすることができる、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２個の連続したヌクレオチド、又は、ＲＮＡｓｅをリクルートすることができる、６〜１０個もしくは７〜９個、例えば、８個の連続したヌクレオチドからなるか、又は、同ヌクレオチドを含む。一部の実施態様では、領域Ｙ’は、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチド単位、例えば、１〜１２個のＤＮＡ単位、好ましくは４〜１２個のＤＮＡ単位、より好ましくは６〜１０個のＤＮＡ単位、例えば、７〜１０個のＤＮＡ単位、最も好ましくは８、９もしくは１０個のＤＮＡ単位からなるか、又は、同ＤＮＡ単位を含む。
【０１０１】
一部の実施態様では、領域Ｘ’は、３又は４個のヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡからなり、領域Ｙ’は、７、８、９又は１０個のＤＮＡ単位からなり、領域Ｚ’は、３又は４個のヌクレオチド類縁体、例えば、ＬＮＡからなる。このような設計としては、（Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’）３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４、４−７−３があげられる。
【０１０２】
更なるギャップマー設計は、国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されている。同文献は、参照により本明細書に組み入れられる。米国仮出願第６０／９７７，４０９号の優先権を主張し、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２００８／１１３８３２号は、「ショートマー」ギャップマーオリゴマーに言及している。一部の実施態様では、本明細書に提案されているオリゴマーは、このようなショートマーギャップマーでもよい。
【０１０３】
一部の実施態様では、オリゴマー、例えば、領域Ｘ’は、合計１０、１１、１２、１３又は１４個のヌクレオチド単位の連続したヌクレオチド配列からなっている。ここで、連続したヌクレオチド配列は、式（５’−３’）Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’を含むか、又は、同式である。式中、Ｘ’は、１、２又は３個のヌクレオチド類縁体単位、例えば、ＬＮＡ単位からなり、Ｙ’は、相補的なＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡターゲット）と二重鎖に形成された場合、ＲＮＡｓｅをリクルートすることができる、７、８又は９個の連続したヌクレオチド単位からなり、Ｚ’は、１、２又は３個のヌクレオチド類縁体単位、例えば、ＬＮＡ単位からなる。
【０１０４】
一部の実施態様では、Ｘ’は、１つのＬＮＡ単位からなる。一部の実施態様では、Ｘ’は、２つのＬＮＡ単位からなる。一部の実施態様では、Ｘ’は、３つのＬＮＡ単位からなる。一部の実施態様では、Ｚ’は、１つのＬＮＡ単位からなる。一部の実施態様では、Ｚ’は、２つのＬＮＡ単位からなる。一部の実施態様では、Ｚ’は、３つのＬＮＡ単位からなる。一部の実施態様では、Ｙ’は、７つのヌクレオチド単位からなる。一部の実施態様では、Ｙ’は、８つのヌクレオチド単位からなる。一部の実施態様では、Ｙ’は、９つのヌクレオチド単位からなる。特定の実施態様では、Ｙ’は、１０個のヌクレオシドモノマーからなる。特定の実施態様では、領域Ｙ’は、１〜１０個のＤＮＡモノマーからなるか、又は、同ＤＮＡモノマーを含む。一部の実施態様では、Ｙ’は、１〜９個のＤＮＡ単位、例えば、２、３、４、５、６、７、８又は９個のＤＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、Ｙ’は、ＤＮＡ単位からなる。一部の実施態様では、Ｙ’は、少なくとも１つのアルファ−Ｌの立体配置にあるＬＮＡ単位、例えば、２、３、４、５、６、７、８又は９個の、アルファ−Ｌの立体配置にあるＬＮＡ単位を含む。一部の実施態様では、Ｙ’は、少なくとも１つのアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位を含み、又はここで、アルファ−Ｌの立体配置にあるＬＮＡ単位は全て、アルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。一部の実施態様では、Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’に存在するヌクレオチド数は、（ヌクレオチド類縁体単位−領域Ｙ’−ヌクレオチド類縁体単位）：１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４又は；１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４又は；１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１からなる群より選択される。一部の実施態様では、Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’中のヌクレオチド数は、２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４及び４−７−３からなる群より選択される。特定の実施態様では、領域Ｘ’及びＹ’はそれぞれ、３つのＬＮＡモノマーからなり、領域Ｙ’は、８又は９又は１０個のヌクレオシドモノマー、好ましくは、ＤＮＡモノマーからなる。一部の実施態様では、Ｘ’及びＺ’は両方とも、それぞれ２つのＬＮＡ単位からなり、Ｙ’は、８又は９個のヌクレオチド単位、好ましくは、ＤＮＡ単位からなる。種々の実施態様では、他のギャップマー設計は、領域Ｘ’及び／又はＺ’が、３、４、５又は６個のヌクレオシド類縁体、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖（２’−ＭＯＥ）を含有するモノマー又は２’−フルオロ−デオキシリボース糖を含有するモノマーからなり、領域Ｙ’が、８、９、１０、１１又は１２個のヌクレオシド、例えば、ＤＮＡモノマーからなるものを含む。ここで、領域Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’は、３−９−３、３−１０−３、５−１０−５又は４−１２−４のモノマーを有する。更なるギャップマー設計は、国際公開第２００７／１４６５１１号に開示されている。同文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０５】
ＬＮＡギャップマーは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマー（領域Ａ）である。好ましいＬＮＡギャップマーオリゴマーは、長さが１２〜１６個のヌクレオチドであり、２−８−２のギャップマーモチーフを有する配列番号２のオリゴマーモチーフを含むか、又は、同モチーフからなる。配列番号２７は、このようなＬＮＡギャップマーオリゴマーの例である。
【０１０６】
ヌクレオチド間結合
本明細書に記載されているオリゴマー（例えば、第１及び第２領域）のヌクレオシドモノマーは、ヌクレオシド間結合基を介して互いに結合している。適切には、各モノマーは、結合基を介して、３’に隣接するモノマーに結合している。
【０１０７】
本発明について、オリゴマーの終端における５’モノマーが、５’結合基を含まないが、５’末端基を含んでもよいし、又は、含まなくてもよいことを、当業者であれば理解するであろう。
【０１０８】
「結合基」又は「ヌクレオチド間結合」という用語は、２つのヌクレオチド同士を共有結合させることができる基を意味することを意図している。具体的で、好ましい例としては、ホスファート基及びホスホロチオアート基があげられる。
【０１０９】
本発明のオリゴマー又はその連続したヌクレオチド配列のヌクレオチドは、結合基を介して結合している。適切には、各ヌクレオチドは、結合基を介して、３’に隣接するヌクレオチドに結合している。
【０１１０】
適切なヌクレオチド間結合としては、国際公開第２００７／０３１０９１号に列記されているもの、例えば、（参照により本明細書に組み入れられる）国際公開第２００７／０３１０９１号の第３４頁における第１段落に列記されているヌクレオチド間結合があげられる。
【０１１１】
一部の実施態様では、ヌクレオチド間結合は、（存在する場合）領域Ｂのホスホジエステル結合以外である。ヌクレオチド間結合を、その通常のホスホジエステルから、ヌクレアーゼの攻撃に対してより抵抗性のもの、例えば、ホスホロチオアート又はボラノホスファートに改変するのが好ましい。これら２つは、ＲＮａｓｅ  Ｈにより開裂可能であり、ターゲット遺伝子の発現を減少させるアンチセンス阻害のその経路も可能にする。
【０１１２】
本明細書において提供されている適切な硫黄（Ｓ）含有ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオアート又はホスホジチオアートが好ましい場合がある。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合は、特に第１領域、例えば、ギャップマー、ミクシマー、ａｎｔｉｍｉｒスプライススイッチングオリゴマー及びトータルマー（totalmer）にも好ましい。
【０１１３】
ギャップマーについて、オリゴマー中のヌクレオチド間結合は、ターゲッティングされたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ開裂を可能にするために、例えば、ホスホロチオアート又はボラノホスファートでもよい。ホスホロチオアートは、改善されたヌクレアーゼ抵抗性及び他の理由、例えば、製造の容易性のために好ましい。
【０１１４】
一態様において、第１及び第２領域間、及び場合により、領域Ｂ内のホスホジエステル結合を除いた、本発明のオリゴマーの残りのヌクレオシド間結合について、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類縁体は、ホスホロチオアート基により互いに結合している。一部の実施態様では、少なくとも５０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、第１領域中のヌクレオシド間の全てのヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル（ホスファート）以外であり、例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又はボラノホスファートからなる群より選択される。一部の実施態様では、少なくとも５０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、第１領域中のヌクレオシド間の全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートである。
【０１１５】
国際公開０９１２４２３８号には、中性のヌクレオシド間結合により３’又は５’末端に結合している、少なくとも１つの二環式ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物に言及されている。したがって、本発明のオリゴマーは、中性のヌクレオシド間結合、例えば、１つ以上のホスホジエステル、メチルホスホナート、ＭＭＩ、アミド−３、ホルムアセタール又はチオホルムアセタールにより３’又は５’末端に結合している、少なくとも１つの二環式ヌクレオシドを有してもよい。残りの結合は、ホスホロチオアートでもよい。
【０１１６】
好ましい実施態様では、配列番号２のモチーフを有するオリゴマーのヌクレオチドを結合している全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアート結合である。
【０１１７】
ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分
肝臓に対するターゲッティングは、コンジュゲート部分（Ｃ）の付加により、非常に向上させることができる。したがって、肝細胞における取り込み及び活性を向上させるコンジュゲート部分を使用するのが望ましい。活性の向上は、取り込みを向上させることによってもよいし、又は、肝細胞における化合物の活性を向上させることによってもよい。
【０１１８】
一部の実施態様では、炭水化物部分は、直線状の炭水化物ポリマーではない。ただし、炭水化物部分は、多価でもよく、例えば、２、３又は４個等の同一又は異なる炭水化物部分が、場合により、１つ以上のリンカー（例えば、領域Ｙ）を介して、オリゴマーに共有結合していてもよい。一部の実施態様では、本発明は、本発明のオリゴマーと、炭水化物コンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。一部の実施態様では、本発明は、本発明のオリゴマーと、アシアロ糖タンパク質レセプターターゲッティングコンジュゲート部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ部分とを含むコンジュゲートを提供する。アシアロ糖タンパク質レセプターターゲッティングコンジュゲート部分は、（領域Ｃと呼ぶ）更なる領域の一部を形成する場合がある。
【０１１９】
本発明は、アシアロ糖タンパク質レセプターターゲッティング部分にコンジュゲーションしている改変オリゴヌクレオチド（例えば、ＬＮＡアンチセンス）も提供する。一部の実施態様では、コンジュゲート部分（例えば、第３領域又は領域Ｃ）は、アシアロ糖タンパク質レセプターターゲッティング部分、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン及びＮ−イソブタノイルガラクトサミンを含む。一部の実施態様では、コンジュゲートは、１〜３個のアシアロ糖タンパク質レセプターターゲッティング部分、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、好ましくは、２〜３個のアシアロ糖タンパク質レセプターターゲッティング部分であるＮ−アセチルガラクトサミンを含む。より好ましくは、コンジュゲート部分は、ガラクトースクラスター、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン三量体を含む。一部の実施態様では、コンジュゲート部分は、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）、例えば、一価、二価、三価又は四価のＧａｌＮＡｃを含む。三価のＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、化合物を肝臓にターゲッティングするのに使用することができる。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ホスホジエステル、メチルホスホナートならびにＰＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第５，９９４，５１７号ならびにHangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701、Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792及びMaier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29）及びｓｉＲＮＡ（例えば、国際公開第２００９／１２６９３３号、同第２０１２／０８９３５２号及び同第２０１２／０８３０４６号）と共に使用されており、より最近、ＬＮＡ及び２’−ＭＯＥ改変ヌクレオシド（国際公開第２０１４／０７６１９６号及び同第２０１４／１７９６２０号）と共に使用されている。参考文献におけるＧａｌＮＡｃ及びその中で使用されている具体的なコンジュゲートは、参照により本明細書に組み入れられる。特に、国際公開第２０１４／１７９６２０号中のコンジュゲート部分が、参照により組み入れられる。国際公開第２０１２／０８３０４６号には、開裂性薬物動態学的モデュレーターを含むＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分と共にｓｉＲＮＡが開示されている。同モデュレーターは、本発明における使用に適している。好ましい薬物動態学的モデュレーターは、Ｃ１６疎水性基、例えば、パルミトイル、ヘキサデカ−８−エノイル、オレイル、（９Ｅ，１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル、ジオクタノイル及びＣ１６〜Ｃ２０アシルである。‘０４６の開裂性薬物動態学的モデュレーターは、コレステロールであることもできる。
【０１２０】
ターゲッティング部分（コンジュゲート部分）は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン及びＮ−イソ−ブタノイルガラクトサミン、ガラクトースクラスター及びＮ−アセチルガラクトサミン三量体からなる群より選択することができ、１６個以上の炭素原子を有する疎水性基、１６〜２０個の炭素原子を有する疎水性基、パルミトイル、ヘキサデカ−８−エノイル、オレイル、（９Ｅ，１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル、ジオクタノイル及びＣ１６〜Ｃ２０アシルならびにコレステロールからなる群より選択される薬物動態学的モデュレーターを有することができる。‘０４６に開示されている特定のＧａｌＮＡｃクラスターとしては、（Ｅ）−ヘキサデカ−８−エノイル（Ｃ１６）、オレイル（Ｃ１８）、（９Ｅ，１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル（Ｃ１８）、オクタノイル（Ｃ８）、ドデカノイル（Ｃ１２）、Ｃ−２０アシル、Ｃ２４アシル、ジオクタノイル（２×Ｃ８）があげられる。ターゲッティング部分−薬物動態学的モデュレーターターゲッティング部分は、生理学的に不安定な結合もしくは例えば、ジスルフィド結合又はＰＥＧリンカーを介して、ポリヌクレオチドに結合していてもよい。本発明は、オリゴマーとコンジュゲート基との間のホスホジエステルリンカー（これらは、本明細書において、領域Ｂと呼び、適切には、ＬＮＡオリゴマーと炭水化物コンジュゲート基との間に配置されている。）の使用にも関する。
【０１２１】
肝臓における肝細胞をターゲッティングするために、好ましいターゲッティングリガンドは、ガラクトースクラスターである。
【０１２２】
ガラクトースクラスターは、例えば、２〜４個の末端ガラクトース誘導体を含んで、有する分子を含む。本明細書で使用する場合、ガラクトース誘導体という用語は、ガラクトースと、ガラクトースの親和性以上のアシアロ糖タンパク質レセプターに対する親和性を有するガラクトース誘導体の両方を含む。末端ガラクトース誘導体は、そのＣ−ｌ炭素を介して分子に結合している。アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰｒ）は、肝細胞に固有であり、分岐鎖状のガラクトース−末端糖タンパク質と結合する。好ましいガラクトースクラスターは、アシアロ糖タンパク質レセプターに対する親和性をそれぞれ有する、３つの末端ガラクトサミン又はガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、３つの末端Ｎ−アセチルガラクトサミンを有する。当分野において一般的な他の用語としては、トリ−アンテナ型ガラクトース、三価のガラクトース及びガラクトース三量体があげられる。トリ−アンテナ型ガラクトース誘導体クラスターは、ジ−アンテナ型又はモノ−アンテナ型のガラクトース誘導体構造より高い親和性で、ＡＳＧＰｒに結合することが知られている（Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620；Connolly et al., 1982,1. Biol. Chern., 257,939-945）。nMの親和性を達成するには、多価であることが必要とされる。国際公開第２０１２／０８３０４６号によれば、アシアロ糖タンパク質レセプターに対する親和性を有する１つのガラクトース誘導体の結合では、送達ポリマーと同時投与された場合、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、肝細胞へのＲＮＡｉポリヌクレオチドの機能的な送達が可能でない。
【０１２３】
ガラクトースクラスターは、中心分岐点にそれぞれ結合している、２つ、又は好ましくは、３つのガラクトース誘導体を含んでもよい。ガラクトース誘導体は、サッカライドのＣ−ｌ炭素を介して、中心分岐点に結合している。ガラクトース誘導体は、好ましくは、リンカー又はスペーサを介して、該分岐点に結合している。好ましいスペーサは、フレキシブルな親水性スペーサである（米国特許第５８８５９６８号；Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましいフレキシブルな親水性スペーサは、ＰＥＧスペーサである。好ましいＰＥＧスペーサは、ＰＥＧ３スペーサである。分岐点は、３つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、オリゴマーに対する分岐点の結合を更に可能にする、任意の小分子であることができる。例示的な分岐点基は、ジ−リシンである。ジ−リシン分子は、３つのガラクトース誘導体が結合することができる３つのアミン基と、ジ−リシンがオリゴマーに結合することができるカルボキシル反応性基とを含有する。オリゴマーへの分岐点の結合は、リンカー又はスペーサを介して起こることができる。好ましいスペーサは、フレキシブルな親水性スペーサである。好ましいフレキシブルな親水性スペーサは、ＰＥＧスペーサである。好ましいＰＥＧスペーサは、ＰＥＧ３スペーサ（３つのエチレン単位）である。ガラクトースクラスターは、当分野において公知の方法を使用して、オリゴマーの３’又は５’端に結合させることができる。好ましい実施態様では、ガラクトースクラスターは、オリゴマーの５’端に結合する。
【０１２４】
好ましいコンジュゲート部分は、ガラクトース誘導体、好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）コンジュゲート部分である。より好ましくは、三価のＮ−アセチルガラクトサミン部分が使用される。アシアロ糖タンパク質レセプターに対する親和性を有する他のサッカライドは、ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン及びＮ−イソ−ブタノイルガラクトサミンを含む列記から選択することができる。数多くのガラクトース誘導体のアシアロ糖タンパク質レセプターに対する親和性が研究されており（例えば、Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996,271,6686を参照のこと）、又は、当分野において典型的な方法を使用して容易に決定される。
【０１２５】
本発明のコンジュゲート部分は、好ましくは、１〜３個のＮ−アセチルグルコサミン部分を含む。一部の実施態様では、コンジュゲート部分は、スペーサを介して分岐点に結合している、３つのガラクトース部分又はその誘導体を有するガラクトースクラスターを含む。三価のＮ−アセチルグルコサミンクラスターの非限定的な例は、図１３及び以下の図に示されている。好ましいコンジュゲート部分は、ＰＥＧスペーサを介してジ−リシンに結合している、３つのＧａｌＮＡｃ部分を含む。好ましくは、ＰＥＧスペーサは、３ＰＥＧスペーサである。
【化５】
2017501684.tif 000007
【０１２６】
本発明のコンジュゲートの更なる例は、以下に例示される。
【化６】
2017501684.tif 000008
2017501684.tif 000009
【０１２７】
ここで、ＬＮＡオリゴマー、例えば、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する場合、上記ＧａｌＮＡｃクラスターコンジュゲート中の疎水性又は脂溶性（又は更なるコンジュゲート）部分（すなわち、薬物動態学的モデュレーター）は任意である。
【０１２８】
本研究において使用される具体的なＧａｌＮＡｃクラスター、Ｃｏｎｊ１、２、３、４ならびにＣｏｎｊ１ａ、２ａ、３ａ及び４ａ（ＧａｌＮＡｃクラスターをオリゴマーに結合させる任意のＣ６リンカーと共に示されている）については、図１３を参照のこと。
【０１２９】
本発明の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、配列番号２９又は３１に対応する。
【０１３０】
したがって、ＧａｌＮＡｃクラスター（例えば、ＧａｌＮＡｃ）の各炭水化物部分は、スペーサ、例えば、（ポリ）エチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）、例えば、ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサ−エチレングリコールリンカーを介して、オリゴマーに結合していてもよい。上で示されているように、ＰＥＧ部分は、ガラクトースの糖部分とペプチド（トリリシンが示されている）リンカーとの間にスペーサを形成する。
【０１３１】
一部の実施態様では、ＧａｌＮＡｃクラスターは、ペプチドリンカー、例えば、Ｔｙｒ−Ａｓｐ（Ａｓｐ）トリペプチド又はＡｓｐ（Ａｓｐ）ジペプチドを含む。同ペプチドリンカーは、ビラジカルリンカーを介して、オリゴマー（又は領域Ｙもしくは領域Ｂ）に結合しており、例えば、ＧａｌＮＡｃクラスターは、下記ビラジカルリンカーを含んでもよい。
【化７】
2017501684.tif 000010
Ｒ１は、好ましくは、−Ｃ２Ｈ４−、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ５Ｈ１０−、−Ｃ６Ｈ１２−、１，４−シクロヘキシル（−Ｃ６Ｈ１０−）、１，４−フェニル（−Ｃ６Ｈ４−）、−Ｃ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４−、−Ｃ２Ｈ４（ＯＣ２Ｈ４）２−又は−Ｃ２Ｈ４（ＯＣ２Ｈ４）３−から選択されるビラジカルである。
【０１３２】
炭水化物コンジュゲート（例えば、ＧａｌＮＡｃ）又は炭水化物−リンカー部分（例えば、炭水化物−ＰＥＧ部分）は、分岐点基、例えば、アミノ酸又はペプチドを介して、オリゴマーに共有結合（結合）していてもよい。同分岐点基は、適切に、２つ以上のアミノ基（例えば、３、４又は５つ）、例えば、リシン、ジ−リシン又はトリ−リシン又はテトラ−リシンを含む。トリ−リシン分子は、３つの炭水化物コンジュゲート基、例えば、ガラクトース及び誘導体（例えば、ＧａｌＮＡｃ）ならびに更なるコンジュゲート、例えば、疎水性又は脂溶性部分／基が結合していることができる４つのアミン基と、トリ−リシンがオリゴマーに結合していることができるカルボキシル反応性基とを含有する。更なるコンジュゲート、例えば、脂溶性／疎水性部分は、オリゴマーに結合しているリシン残基に結合していてもよい。
【０１３３】
薬物動態学的モデュレーター
本発明の化合物は、１つ以上の更なるコンジュゲート部分を更に含んでもよい。中でも、例えば、コンジュゲート基が炭水化物部分である場合、脂溶性又は疎水性部分が特に興味深い。このような脂溶性又は疎水性部分は、薬物動態学的モデュレーターとして作用することができ、炭水化物コンジュゲート、炭水化物コンジュゲートをオリゴマーに結合させるリンカー又は複数の炭水化物コンジュゲート（多価コンジュゲート）を結合するリンカー又はオリゴマーに、場合により、リンカー、例えば、生体開裂性リンカーを介して共有結合していてもよい。
【０１３４】
したがって、オリゴマー又はコンジュゲート部分は、薬物動態学的モデュレーター、例えば、脂溶性又は疎水性部分を含んでもよい。このような部分は、国際公開第２０１２／０８２０４６号におけるｓｉＲＮＡコンジュゲートの文脈内に開示されている。疎水性部分は、Ｃ８〜Ｃ３６の脂肪酸を含んでもよく、同脂肪酸は、飽和でもよいし、又は、不飽和でもよい。一部の実施態様では、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、Ｃ２４、Ｃ２６、Ｃ２８、Ｃ３０、Ｃ３２及びＣ３４の脂肪酸が使用することができる。疎水性基は、１６個以上の炭素原子を有してもよい。例示的で、適切な疎水性基は、ステロール、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ−８−エノイル、オレイル、（９Ｅ，１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル、ジオクタノイル及びＣ１６〜Ｃ２０アシルからなる群より選択することができる。国際公開第‘３４６号によれば、１６個より少ない炭素原子を有する疎水性基は、ポリヌクレオチドのターゲッティングを向上させるのにほとんど効果を有さない。ただし、それらは、有効性を向上させるための複数のコピー（例えば、２×、例えば、２×Ｃ８又はＣ１０、Ｃ１２又はＣ１４）に使用することができる。ポリヌクレオチドターゲッティング部分として有用な薬物動態学的モデュレーターは、コレステロール、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基及びアラルキニル基からなる群より選択するこができる。それらはそれぞれ、直鎖状、分岐鎖状又は環状でもよい。薬物動態学的モデュレーターは、好ましくは、炭素及び水素原子のみを含有する炭化水素である。ただし、疎水性を維持する置換又はヘテロ原子、例えば、フッ素は許可することができる。
【０１３５】
一部の実施態様では、コンジュゲートは、炭水化物であるか、もしくは、同炭水化物を含んでもよいし、又は、炭水化物基を含む。一部の実施態様では、炭水化物は、ガラクトース、ラクトース、ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース及びマンノース−６−ホスファートからなる群より選択される。一部の実施態様では、コンジュゲート基は、マンノース又はマンノース−６−ホスファートであるか、又は、マンノース又はマンノース−６−ホスファートを含んでもよい。炭水化物コンジュゲートは、組織、例えば、肝臓及び／又は筋肉の範囲における送達又は活性を向上させるのに使用することができる。例えば、欧州特許第１４９５７６９号、国際公開第９９／６５９２５号、Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21、Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17を参照のこと。
【０１３６】
驚くべきことに、ＬＮＡオリゴマーと共に使用するためのＧａｌＮＡｃコンジュゲートが、薬物動態学的モデュレーターを必要とせず、一部の実施態様では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートが、脂溶性又は疎水性部分、例えば、本明細書に記載されているものに共有結合もしない、例えば、Ｃ８〜Ｃ３６脂肪酸又はステロールを含まないことを、本発明者らは見出した。したがって、本発明は、脂溶性又は疎水性の薬物動態学的モデュレーター又はコンジュゲート部分／基を含まない、ＬＮＡオリゴマーＧａｌＮＡｃコンジュゲートも提供する。
【０１３７】
一部の実施態様では、コンジュゲート部分は親水性である。一部の実施態様では、コンジュゲート基は、脂溶性置換基、例えば、脂肪酸置換基、例えば、Ｃ８〜Ｃ２６、例えば、パルミチル置換基を含まないか、又は、ステロール、例えば、コレステロール置換基を含まない。この点について、本発明の一部は、ＬＮＡオリゴマーＧａｌＮＡｃコンジュゲートが、薬物動態学的モデュレーター、例えば、脂肪酸置換基（例えば、Ｃ８より大きい又はＣ１６より大きい脂肪酸基）を使用しなくても、優れた薬物動態学的特性を有するという、驚くべき発見に基づいている。
【０１３８】
脂溶性コンジュゲート
脂溶性コンジュゲート、例えば、ステロール、スタノール及びステイン、例えば、コレステロール又は本明細書に開示されているものは、例えば、肝臓（典型的には、肝細胞）へのオリゴヌクレオチドの送達を向上させるのに使用することができる。
【０１３９】
一部の実施態様では、コンジュゲート基は、ステロール（例えば、コレステロール、コレステリル、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸及びエルゴステロール）であるか、又は、同ステロールを含んでもよい。一部の実施態様では、コンジュゲートは、トコフェロールであるか、又は、トコフェロールを含む。一部の実施態様では、コンジュゲートは、コレステロールであるか、又は、コレステロールを含んでもよい。
【０１４０】
一部の実施態様では、コンジュゲートは、脂質、リン脂質又は脂溶性アルコール、例えば、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質ならびに脂肪酸、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレライジン酸、リノレン酸及びミリスチン酸であるか、又は、それらを含んでもよい。一部の実施態様では、脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ３０の飽和又は不飽和アルキル鎖を含む。アルキル鎖は、直鎖状又は分岐鎖状でもよい。
【０１４１】
脂溶性コンジュゲート部分は、例えば、オリゴマー化合物の水溶性に対抗させ、細胞浸透性を向上させるのに使用することができる。
【０１４２】
脂溶性部分としては、例えば、ステロール、スタノール及びステロイドならびに関連する化合物、例えば、コレステロール（米国特許第４，９５８，０１３号及びLetsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553）、チオコレステロール（Oberhauser et al, Nucl Acids Res., 1992, 20, 533）、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コラン酸、デオキシコラン酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン、１７−ヒドロキシコルチコステロン、それらの誘導体等があげられる。一部の実施態様では、コンジュゲートは、コレステロール、チオコレステロール、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コラン酸、デオキシコラン酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン及び１７−ヒドロキシコルチコステロンからなる群より選択することができる。他の脂溶性コンジュゲート部分としては、脂肪族基、例えば、直鎖状、分岐状及び環状のアルキル、アルケニル及びアルキニル等があげられる。脂肪族基は、例えば、５〜約５０個、６〜約５０個、８〜約５０個又は１０〜約５０個の炭素原子を有することができる。脂肪族基の例としては、ウンデシル、ドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、テルペン、ボルニル、アダマンチル、それらの誘導体があげられる。一部の実施態様では、脂肪族基中の１つ以上の炭素原子は、ヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ又はＮにより置き換えることができる（例えば、ゲラニルオキシへキシル）。更に適切な脂溶性コンジュゲート部分としては、グリセロールの脂肪族誘導体、例えば、アルキルグリセロール、ビス（アルキル）グリセロール、トリス（アルキル）グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドがあげられる。一部の実施態様では、脂溶性コンジュゲートは、ジ−ヘキシルデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくは１，２−ジ−Ｏ−ヘキシルデシル−ｒａｃ−グリセロール（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651；Shea, et al., Nuc. Acids Res., 1990, 18, 3777）又はそれらのホスホナートである。飽和及び不飽和の脂肪官能基、例えば、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル及び脂肪アミン等は、脂溶性コンジュゲート部分としても機能することができる。一部の実施態様では、脂肪官能基は、約６個〜約３０個の炭素又は約８〜約２２個の炭素を含有することができる。脂肪酸の例としては、カプリン酸、カプリル酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコセン酸等があげられる。
【０１４３】
更なる実施態様では、脂溶性コンジュゲート基は、６〜約５０個、１０〜約５０個又は１４〜約４０個の炭素原子を有する多環式芳香族基であることができる。多環式芳香族基の例としては、ピレン、プリン、アクリジン、キサンテン、フルオレン、フェナントラセン、アントラセン、キノリン、イソキノリン、ナフタレン、それらの誘導体等があげられる。他の適切な脂溶性コンジュゲート部分としては、メントール、トリチル（例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ））、フェノキサジン、リポ酸、リン脂質、エーテル、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、それらの誘導体等があげられる。オリゴマー化合物の脂溶性コンジュゲートの調製は、当分野において、例えば、Saison-Behmoaras et al, EMBO J., 1991, 10, 1111；Kabanov et al., FEBSLett., 1990, 259, 327；Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75, 49；Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229及びManoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651等に十分説明されている。
【０１４４】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に対して親和性を有するコンジュゲート部分を含有するオリゴマー化合物は、効果的なターゲッティング送達システムを提供するのに役立つことができる。腫瘍細胞におけるＬＤＬについてのレセプターの高い発現レベルは、ＬＤＬをこれらの細胞への薬剤の選択的送達のための魅力的な担体にする（Rump, et al., Bioconjugate Chem., 1998, 9, 341；Firestone, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 105；Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）。ＬＤＬに対して親和性を有する部分としては、多くの脂溶性基、例えば、ステロイド（例えば、コレステロール）、脂肪酸、それらの誘導体及びそれらの組み合わせがあげられる。一部の実施態様では、ＬＤＬに対する親和性を有するコンジュゲート部分は、コラン酸のジオレイルエステル、例えば、ケノデオキシコール酸及びリトコール酸であることができる。
【０１４５】
一部の実施態様では、脂溶性コンジュゲートは、ビオチンでもよいし、又は、ビオチンを含んでもよい。一部の実施態様では、脂溶性コンジュゲートは、グリセリドもしくはグリセリドエステルでもよいし、又は、グリセリドもしくはグリセリドエステルを含んでもよい。
【０１４６】
脂溶性コンジュゲート、例えば、ステロール、スタノール及びステイン、例えば、コレステロール又は本明細書に開示されているものは、例えば、肝臓（典型的には、肝細胞）へのオリゴヌクレオチドの送達を向上させるのに使用することができる。
【０１４７】
下記参考文献：Kobylanska et al., Acta Biochim Pol. (1999); 46(3): 679 - 91、Felber et al,. Biomaterials (2012) 33(25): 599-65；Grijalvo et al., J Org Chem (2010) 75(20): 6806 - 13、Koufaki et al., Curr Med Chem (2009) 16(35): 4728-42、Godeau et al J. Med. Chem. (2008) 51(15): 4374-6及び国際公開第２０１３／０３３２３０号には、脂溶性コンジュゲートの使用にも言及されている。
【０１４８】
本発明の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、配列番号２８に対応する。
【０１４９】
リンカー（例えば、領域Ｙ）
結合又はリンカーは、対象となる１つの化学基又はセグメントを、１つ以上の共有結合を介して、対象となる別の化学基又はセグメントと結合させる、２つの原子間の結合である。コンジュゲート部分（又はターゲッティングもしくは保護部分）は、直接又は結合部分（リンカーもしくはテザー）−リンカーを介して、オリゴマー化合物に結合することができる。リンカーは、第３領域、例えば、コンジュゲート部分をオリゴマー化合物（例えば、領域Ｂ）に共有結合させるのに役立つ二官能性部分である。一部の実施態様では、リンカーは、繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマー、例えば、エチレングリコール又はアミノ酸単位を含む。リンカーは、少なくとも２つの官能基を有することができ、一方は、オリゴマー化合物に結合するためのものであり、他方は、コンジュゲート部分に結合するためのものである。リンカー官能基の例は、オリゴマーもしくはコンジュゲート部分において求核基と反応するために求電子性であることができ、又は、求電子基と反応するために求核性であることができる。一部の実施態様では、リンカーの官能基としては、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、ホスホラミダート、ホスホロチオアート、ホスファート、ホスファイト、不飽和（例えば、二重又は三重結合）等があげられる。リンカーの一部の例としては、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、６−アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸ又はＡＨＡ）、６−アミノへキシルオキシ、４−アミノ酪酸、４−アミノシクロへキシルカルボン酸、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミド−カプロアート）（ＬＣＳＭＣＣ）、スクシンイミジル  ｍ−マレイミド−ベンゾイラート（ＭＢＳ）、スクシンイミジル  Ｎ−ｅ−マレイミド−カプロイラート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル  ６−（ベータ−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノアート（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル  Ｎ−（ａ−マレイミド  アセタート）（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、ベータ−アラニン（ベータ−ＡＬＡ）、フェニルグリシン（ＰＨＧ）、４−アミノシクロヘキサン酸（ＡＣＨＣ）、ベータ−（シクロプロピル）アラニン（ベータ−ＣＹＰＲ）、アミノドデカン酸（ＡＤＣ）、アリレンジオール（alylene diol）、ポリエチレングリコール、アミノ酸等があげられる。
【０１５０】
コンジュゲート部分をオリゴマー化合物に結合させるのに有用であり得る、広い各種の更なるリンカー基が、当分野において公知である。多くの有用なリンカー基の概観は、例えば、Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350に見出すことができる。ジスルフィド結合は、オリゴヌクレオチドの３’末端をペプチドに結合させるのに使用されてきた（Corey, et al., Science 1987, 238, 1401; Zuckermann, et al, J Am. Chem. Soc. 1988, 110, 1614；及びCorey, et al., J Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8524）。Nelson, et al., Nuc. Acids Res. 1989, 17, 7187には、ビオチンをオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させるための結合試薬が記載されている。この試薬、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ−ＤＭＴ−３−アミノ−１，２−プロパンジオールは、Clontech Laboratories（Palo Alto, Calif.）から、3'-Amineという名称で市販されている。Glen Research Corporation（Sterling, Va.）から、3'-Amino-Modifier試薬という名称でも市販されている。この試薬は、Judy, et al., Tetrahedron Letters 1991, 32, 879に報告されているように、ペプチドをオリゴヌクレオチドに結合させるのにも利用された。オリゴヌクレオチドの５’−末端に結合させるための同様の市販の試薬は、5'-Amino-ModifierＣ６である。これらの試薬は、Glen Research Corporation（Sterling, Va.）から入手できる。これらの化合物又は類似するものは、Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161において、フルオレセインをオリゴヌクレオチドの５’−末端に結合させるのに利用された。他の化合物、例えば、アクリジンは、ポリメチレン結合を介して、オリゴヌクレオチドの３’末端ホスファート基に結合する（Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297）。上記の基はいずれも、単独のリンカーとして、又は、１つ以上の更なるリンカーとの組み合わせにおいて使用することができる。
【０１５１】
リンカー及びオリゴマー化合物のコンジュゲートの調製におけるその使用は、当分野全体を通して、例えば、国際公開第９６／１１２０５号及び同第９８／５２６１４号ならびに米国特許第４，９４８，８８２号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５８０，７３１号；同第５，４８６，６０３号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６６７，０２５号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２４５，０２２号；同第５，１１２，９６３号；同第５，３９１，７２３号；同第５，５１０４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５７４，１４２号；同第５，６８４，１４２号；同第５，７７０，７１６号；同第６，０９６，８７５号；同第６，３３５，４３２号；及び同第６，３３５，４３７号、国際公開第２０１２／０８３０４６号に提供されている。これらの文献はそれぞれ、全体を引用例として本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、生理学的不安定な結合は、通常遭遇する条件下、又は、哺乳類の体内で遭遇するものに類似する条件下において開裂可能である、不安定な結合である（開裂性リンカーとも呼ぶ）。生理学的に不安定な結合基は、特定の生理学的条件下において存在する場合、それらが化学変換（例えば、開裂）を受けるように選択される。哺乳類の細胞内条件は、哺乳類の細胞内で遭遇するものにおいて見出され、又は、哺乳類の細胞内で遭遇するものに類似する、化学条件、例えば、ｐＨ、温度、酸化的又は還元的な条件又は作用剤及び塩濃度を含む。哺乳類の細胞内条件としては、例えば、タンパク質分解性又は加水分解性酵素に由来する、哺乳類の細胞内に通常存在する酵素活性の存在があげられる。一部の実施態様では、開裂性リンカーは、例えば、ターゲット細胞中で発現される場合があるヌクレアーゼに感受性である。なお、本明細書に詳細に記載されているように、リンカーは、ヌクレオシド、例えば、ＤＮＡヌクレオシドに結合している、短い領域（例えば、１〜１０個）のホスホジエステルでもよい。
【０１５３】
化学変換（不安定な結合の開裂）は、薬学的に許容し得る作用剤を細胞に加えることにより開始させてもよいし、又は、不安定な結合を含有する分子が適切な細胞内及び／又は細胞外環境に達するのと同時に発生してもよい。例えば、ｐＨに不安定な結合は、分子が酸性エンドソームに入る際に開裂してもよい。このように、ｐＨに不安定な結合は、エンドソーム開裂性結合であると考えることができる。酵素開裂性結合は、酵素、例えば、エンドソームもしくはリソソーム又は細胞質に存在するものに曝された際に開裂してもよい。ジスルフィド結合は、分子が細胞の細胞質のより還元性の環境に入る際に開裂してもよい。このように、ジスルフィドは、細胞質開裂性結合であると考えることができる。本明細書で使用する場合、ｐＨに不安定な結合は、酸性条件（ｐＨ７未満）下で選択的に破壊される不安定な結合である。このような結合は、エンドソームに不安定な結合とも呼ぶことができる。細胞のエンドソーム及びリソソームは、７未満のｐＨを有するためである。
【０１５４】
オリゴマーに結合した生体開裂性コンジュゲート
オリゴマー化合物は、場合により、オリゴマー（領域Ａと呼ぶ）とコンジュゲート（領域Ｃと呼ぶ）との間に位置する第２領域（領域Ｂ）を含んでもよい。領域Ｂは、リンカー、例えば、開裂性リンカー（生理学的に不安定な結合とも呼ぶ）であることができる（実施例６を参照のこと）。
【０１５５】
ヌクレアーゼ感受性の生理学的に不安定な結合
一部の実施態様では、本発明のオリゴマー（オリゴマー化合物とも呼ぶ）（又はコンジュゲート）は、下記３つの領域を含む
ｉ）配列番号２のモチーフを有するオリゴヌクレオチドを含む第１領域（領域Ａ）
ｉｉ）生体開裂性リンカーを含む第２領域（領域Ｂ）
ｉｉｉ）コンジュゲート部分、ターゲッティング部分、活性化部分を含む第３領域（Ｃ）、ここで、第３領域は、第２領域に共有結合している。
【０１５６】
本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、リシンリンカー（領域Ｂ）がＮ−アセチルガラクトサミン基（領域Ｃ）及びオリゴマー（領域Ａ）を、場合により、更なるリンカーＹを介して結合させるように構築することができる。更なるリンカーＹは、リシンリンカーとオリゴマーとの間に挿入されている。リシンリンカーに結合しているＮ−アセチルガラクトサミン基は、領域Ｂが領域Ｃに埋め込まれているコンジュゲート部分（領域Ｃ）とも考えることができる。したがって、リンカーＹは、領域Ｃ及びＡ間にあることができる。
【０１５７】
三価のＧａｌＮＡｃコンジュゲートについて、各ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴマー（配列番号２又は配列番号２７）に更に結合している生体開裂性リンカー（例えば、ジ−リシン又はトリ−リシンリンカー）に結合していることができる。場合により、更なるリンカー（Ｙ）は、生体開裂性リシンリンカーとオリゴマーとの間に挿入することができる。リンカーＹは、例えば、脂肪酸、例えば、Ｃ６リンカーであることができる。リンカーＹに加えて、生理学的に開裂性のリンカー領域Ｂが、オリゴマーとリンカーＹとの間に挿入することができる。
【０１５８】
一部の実施態様では、領域Ｂは、ホスファートヌクレオチドリンカーでもよい。例えば、このようなリンカーは、コンジュゲートがステロール、例えば、コレステロール又はトコフェロールである場合に使用することができる。ホスファートヌクレオチドリンカーは、他のコンジュゲート、例えば、炭水化物コンジュゲート、例えば、ＧａｌＮＡｃにも使用することができる。
【０１５９】
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、オリゴマーをジ−リシンリンカーに結合させるスペーサ及びＣ６リンカーに結合している、３つのＮ−アセチルガラクトサミン単位を含む。このような構築物の例は、図１３及び１３Ａに示されている。更なる実施態様では、ＰＥＧスペーサは、ＧａｌＮＡｃ部分とリシンリンカー（例えば、Ｃｏｎｊ１ａ及びＣｏｎｊ２ａ）との間に挿入される。更なる実施態様では、生理学的に不安定なヌクレオチドリンカーは、Ｃ６リンカーとオリゴマーとの間に挿入することができる。
【０１６０】
ペプチドリンカー
一部の実施態様では、生体開裂性リンカー（領域Ｂ）は、ポリＧａｌＮＡｃコンジュゲート、例えば、三量体ＧａｌＮＡｃコンジュゲートに使用することができる、ペプチド、例えば、トリリシンペプチドリンカーである。
【０１６１】
使用することができる当分野において公知の他のリンカーとしては、ジスルフィドリンカーがあげられる。
【０１６２】
ホスファートヌクレオチドリンカー
一部の実施態様では、領域Ｂは、１〜６個のヌクレオチドを含み、第１領域の５’又は３’ヌクレオチドに、例えば、ヌクレオシド間結合基、例えば、ホスホジエステル結合を介して共有結合している。この場合、下記のいずれかである。
ａ．第１及び第２領域間のヌクレオシド内結合は、ホスホジエステル結合であり、第１領域に隣接する［例えば、すぐ隣りの］第２領域のヌクレオシドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかであり、及び／又は
ｂ．第２領域の少なくとも１つのヌクレオシドは、ホスホジエステル結合したＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドである。
【０１６３】
一部の実施態様では、領域Ａ及び領域Ｂは、長さが１３〜１６個のヌクレオチドの、１つの連続したヌクレオチド配列を形成する。
【０１６４】
一部の態様では、第１及び第２領域間のヌクレオシド間結合は、第２領域の一部と考えることができる。
【０１６５】
一部の実施態様では、第２及び第３領域間にリン含有結合基が存在する。リン結合基は、例えば、ホスファート（ホスホジエステル）、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又はボラノホスファート基であることができる。一部の実施態様では、このリン含有結合基は、第２領域と第３領域に結合しているリンカー領域との間に位置している。一部の実施態様では、ホスファート基は、ホスホジエステルである。
【０１６６】
したがって、一部の態様では、オリゴマー化合物は、少なくとも２つのホスホジエステル基を含む。ここで、少なくとも１つは、本発明の上記説明に基づく通りである。他のものは、第２及び第３（コンジュゲート）領域間に、場合により、リンカー基と第２領域との間に位置している。
【０１６７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１領域、及び場合により、第２領域でもよいし、又は、同領域を含んでもよい。この態様において、一部の実施態様では、領域Ｂは、（核酸）ターゲットに相補的な、連続したヌクレオ塩基配列の一部を形成してもよい。他の実施態様では、領域Ｂは、ターゲットに対する相補性を欠いてもよい。
【０１６８】
一部の実施態様では、第２領域の少なくとも２つの連続したヌクレオシドは、ＤＮヌクレオシド（例えば、少なくとも３又は４又は５個の連続したＤＮＡヌクレオチド）である。
【０１６９】
このような実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、下記式：
５’−Ａ−ＰＯ−Ｂ［Ｙ）Ｘ−３’又は３’−Ａ−ＰＯ−Ｂ［Ｙ）Ｘ−  ５’
に基づいて記載することができる。
【０１７０】
式中、Ａは、領域Ａであり、ＰＯは、ホスホジエステル結合であり、Ｂは、領域Ｂであり、Ｙは、任意の結合基であり、Ｘは、コンジュゲート、ターゲッティング基、保護基又は反応性もしくは活性化基である。
【０１７１】
一部の実施態様では、領域Ｂは、３’−５’又は５’−３’：ｉ）領域Ａの５’ヌクレオシドへのホスホジエステル結合と、ｉｉ）ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド、例えば、ＤＮＡヌクレオシドと、ｉｉｉ）更なるホスホジエステル結合を含む。
５’−Ａ−ＰＯ−Ｂ−ＰＯ−３’又は３’−Ａ−ＰＯ−Ｂ−ＰＯ−５’
【０１７２】
更なるホスホジエステル結合は、領域Ｂのヌクレオシドを、１つ以上の更なるヌクレオシド、例えば、１つ以上のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと結合させるか、又は、場合により、結合基（Ｙ）を介して、（コンジュゲート、ターゲッティングもしくは保護基又は反応性もしくは活性化基である）Ｘに結合させてもよい。
【０１７３】
一部の実施態様では、領域Ｂは、３’−５’又は５’−３’：ｉ）領域Ａの５’ヌクレオシドへのホスホジエステル結合と、ｉｉ）２〜１０個の間のホスホジエステル結合したＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド、例えば、ＤＮＡヌクレオシドと、場合により、ｉｉｉ）更なるホスホジエステル結合を含む。
５’−Ａ−［ＰＯ−Ｂ］ｎ−［Ｙ］−Ｘ  ３’又は３’−Ａ−［ＰＯ−Ｂ］ｎ−［Ｙ］−Ｘ  ５’
５’−Ａ−［ＰＯ−Ｂ］ｎ−ＰＯ−［Ｙ］−Ｘ  ３’又は３’−Ａ−［ＰＯ−Ｂ］ｎ−ＰＯ−［Ｙ］−Ｘ  ５’
【０１７４】
ここで、Ａは、領域Ａを表わし、［ＰＯ−Ｂ］ｎ（ここで、ｎは、１〜１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。）は、領域Ｂを表わし、ＰＯは、領域ＢとＸ（又は存在する場合、Ｙ）との間の任意のホスホジエステル結合基である。
【０１７５】
一部の実施態様では、本発明は、下記式：
５’  ［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］  ３’−Ｙ−Ｘ
５’  ［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］−ＰＯ  ３’−Ｙ−Ｘ
５’  ［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］  ３’−Ｘ
５’  ［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］−ＰＯ  ３’−Ｘ
３’  ［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］  ５’−Ｙ−Ｘ
３’  ［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］−ＰＯ  ５’−Ｙ−Ｘ
３’  ［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］  ５’−Ｘ
３’  ［領域Ａ］−ＰＯ−［領域Ｂ］−ＰＯ５’−Ｘ
の１つに基づく（又は、含む）化合物を提供する。
【０１７６】
領域Ｂは、例えば、
５’  ＤＮＡ  ３’
３’  ＤＮＡ  ５’
５’  ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−３’
３’  ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−５’
５’  ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ  ３’
３’  ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ  ５’
５’  ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ  ３’
３’  ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ  ５’
５’  ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ  ３’
３’  ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ−ＰＯ−ＤＮＡ  ５’
を含んでもよいし、又は、それらからなってもよい。
【０１７７】
ホスファート結合した生体開裂性リンカーは、ＤＮＡ及びＲＮＡ以外のヌクレオシドを利用することができると認識されるべきである。生体開裂性ヌクレオチドリンカーは、例えば、実施例７におけるアッセイ法を使用して特定することができる。
【０１７８】
一部の実施態様では、本発明の化合物は、生体開裂性リンカー（生理学的に不安定なリンカー、ヌクレアーゼ感受性の生理学的に不安定な結合又はヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ぶ）、例えば、ホスファートヌクレオチドリンカー（例えば、領域Ｂ）又はペプチドリンカーを含む。同生体開裂性リンカーは、オリゴマー（又は連続したヌクレオチド配列もしくは領域Ａ）をコンジュゲート部分（又は領域Ｃ）に結合させる。
【０１７９】
実施例７に示されているアッセイ法における開裂に対する感受性は、リンカーが生体開裂性又は生理学的に不安定であるかどうかを決定するのに使用することができる。
【０１８０】
本発明の生体開裂性リンカーは、ターゲット組織、例えば、肝臓及び／又は腎臓中での開裂に対して感受性である（すなわち、生理学的に不安定である）リンカーを意味する。ターゲット組織中で見られる開裂速度が、血清中で見出される開裂速度より速いのが好ましい。組織（例えば、肝臓又は腎臓）中及び血清中での開裂レベル（％）を決定するのに適した方法は、実施例６に見出される。一部の実施態様では、本発明の化合物における生体開裂性リンカー（生理学的に不安定なリンカー又はヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ぶ）、例えば、領域Ｂは、実施例７の肝臓又は腎臓ホモジネートアッセイ法において、少なくとも約２０％が開裂され、例えば、少なくとも約３０％が開裂され、例えば、少なくとも約４０％が開裂され、例えば、少なくとも約５０％が開裂され、例えば、少なくとも約６０％が開裂され、例えば、少なくとも約７０％が開裂され、例えば、少なくとも約７５％が開裂される。一部の実施態様では、実施例７におけるアッセイ法に使用された場合、血清中での開裂（％）は、約３０％未満であり、約２０％未満、例えば、約１０％未満、例えば、５％未満、例えば、約１％未満である。
【０１８１】
一部の実施態様では、本発明の化合物における生体開裂性リンカー（生理学的に不安定なリンカー又はヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ぶ）、例えば、領域Ｂは、同じでも、又は、異なってもよく、Ｓ１ヌクレアーゼ開裂に感受性である。Ｓ１開裂に対する感受性は、実施例７に示されているＳ１ヌクレアーゼアッセイ法を使用して評価することができる。一部の実施態様では、本発明の化合物における生体開裂性リンカー（生理学的に不安定なリンカー又はヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ぶ）、例えば、領域Ｂは、実施例６において使用されるアッセイ法に基づくＳ１ヌクレアーゼとの１２０分のインキュベーション後に、少なくとも約３０％が開裂され、例えば、少なくとも約４０％が開裂され、例えば、少なくとも約５０％が開裂され、例えば、少なくとも約６０％が開裂され、例えば、少なくとも約７０％が開裂され、例えば、少なくとも約８０％が開裂され、例えば、少なくとも約９０％が開裂され、例えば、少なくとも９５％が開裂される。
【０１８２】
第２領域における配列選択
一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドの領域Ａ及びＢが、相補的なターゲット配列に対してアライメントされた場合、領域Ｂは、相補配列を形成しない。
【０１８３】
一部の実施態様では、オリゴヌクレオチドの領域Ａ及びＢが、相補的なターゲット配列に対してアライメントされた場合、領域Ｂは、相補配列を形成する。この観点において、領域Ａ及びＢは共に、ターゲット配列に対して相補的な１つの連続した配列を形成してもよい。
【０１８４】
一部の実施態様では、領域Ｂ中の塩基配列は、ターゲット組織もしくは細胞又は細胞内区画に存在する主なエンドヌクレアーゼ開裂酵素に基づく、任意のエンドヌクレアーゼ開裂部位を提供するように選択される。この観点において、ターゲット組織及び非ターゲット組織から細胞抽出物を単離することにより、領域Ｂに使用するためのエンドヌクレアーゼ開裂配列が、非ターゲット細胞（例えば、腎臓）と比較して、所望のターゲット細胞（例えば、肝臓／肝細胞）において優勢な開裂活性に基づいて選択することができる。この観点において、ターゲットをダウンレギュレーションするための化合物の活性は、所望の組織／細胞について最適化することができる。
【０１８５】
一部の実施態様では、領域Ｂは、配列ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ又はＧＧのジヌクレオチドを含む。ここで、Ｃは、５−メチルシトシンでもよく、及び／又は、Ｔは、Ｕにより置き換えられてもよい。一部の実施態様では、領域Ｂは、配列ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＴＡＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＴＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＡＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＧＡ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＣＡＧ、ＧＴＡ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＧＡ、ＧＧＴ、ＧＧＣ及びＧＧＧのトリヌクレオチドを含む。ここで、Ｃは、５−メチルシトシンでもよく、及び／又は、Ｔは、Ｕにより置き換えられてもよい。一部の実施態様では、領域Ｂは、配列ＡＡＡＸ、ＡＡＴＸ、ＡＡＣＸ、ＡＡＧＸ、ＡＴＡＸ、ＡＴＴＸ、ＡＴＣＸ、ＡＴＧＸ、ＡＣＡＸ、ＡＣＴＸ、ＡＣＣＸ、ＡＣＧＸ、ＡＧＡＸ、ＡＧＴＸ、ＡＧＣＸ、ＡＧＧＸ、ＴＡＡＸ、ＴＡＴＸ、ＴＡＣＸ、ＴＡＧＸ、ＴＴＡＸ、ＴＴＴＸ、ＴＴＣＸ、ＴＡＧＸ、ＴＣＡＸ、ＴＣＴＸ、ＴＣＣＸ、ＴＣＧＸ、ＴＧＡＸ、ＴＧＴＸ、ＴＧＣＸ、ＴＧＧＸ、ＣＡＡＸ、ＣＡＴＸ、ＣＡＣＸ、ＣＡＧＸ、ＣＴＡＸ、ＣＴＧＸ、ＣＴＣＸ、ＣＴＴＸ、ＣＣＡＸ、ＣＣＴＸ、ＣＣＣＸ、ＣＣＧＸ、ＣＧＡＸ、ＣＧＴＸ、ＣＧＣＸ、ＣＧＧＸ、ＧＡＡＸ、ＧＡＴＸ、ＧＡＣＸ、ＣＡＧＸ、ＧＴＡＸ、ＧＴＴＸ、ＧＴＣＸ、ＧＴＧＸ、ＧＣＡＸ、ＧＣＴＸ、ＧＣＣＸ、ＧＣＧＸ、ＧＧＡＸ、ＧＧＴＸ、ＧＧＣＸ及びＧＧＧＸのテトラヌクレオチドを含む。ここで、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ｃ及びそれらの類縁体からなる群より選択されてもよい。ここで、Ｃは、５−メチルシトシンでもよく、及び／又は、Ｔは、Ｕにより置き換えられてもよい。（天然の）ヌクレオ塩基、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ｃに言及する場合、これらは、同等の天然のヌクレオ塩基（例えば、相補ヌクレオシドとの塩基対）と同様に機能するヌクレオ塩基類縁体により置き換えられてもよい。
【０１８６】
アミノアルキル中間体
本発明は、（例えば、末端、５’又は３’）アミノアルキル、例えば、Ｃ２〜Ｃ３６アミノアルキル基、例えば、Ｃ６及びＣ１２アミノアルキル基等を含むアンチセンスＬＮＡオリゴマー（配列番号２）を含む、ＬＮＡオリゴマー中間体を更に提供する。アミノアルキル基は、標準的なオリゴヌクレオチド合成の一部として、例えば、（例えば、保護）アミノアルキルホスホラミダイトを使用して、ＬＮＡオリゴマーに付加することができる。アミノアルキルとＬＮＡオリゴマーとの間の結合基は、例えば、ホスホロチオアートもしくはホスホジエステル、又は例えば、本明細書に言及されている他のヌクレオシド結合基の１つでもよい。アミノアルキル基は、例えば、ＬＮＡオリゴマーの５’又は３’に、例えば、ヌクレオシド結合基、例えば、ホスホロチオアート又はホスホジエステル結合により共有結合していることができる。
【０１８７】
本発明は、ＬＮＡオリゴマーの連続的な合成、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成を含むＬＮＡオリゴマーを合成する方法であって、例えば、オリゴヌクレオチド合成の最初又は最終ラウンド等の間に、アミノアルキル基をオリゴマーに付加する工程を含む、方法を提供する。本合成方法は、コンジュゲートをアミノアルキル−ＬＮＡオリゴマーに反応させる工程（コンジュゲーション工程）を更に含んでもよい。コンジュゲートは、本明細書に記載されているように、適切なリンカー及び／又は分岐点基、ならびに場合により、更なるコンジュゲート基、例えば、疎水性もしくは脂溶性基を含んでもよい。コンジュゲーション工程は、オリゴマーが固体支持体に結合している間（例えば、オリゴヌクレオチド合成後であるが、固体支持体からのオリゴマーの溶出前）、又は、その後（すなわち、溶出後）に行われることができる。本発明は、本発明のオリゴマーの合成における、アミノアルキルリンカーの使用を提供する。
【０１８８】
製造／合成方法
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成（又は製造）する方法を提供する。前記方法は、下記のいずれかを含む。
ａ）下記の１つを第３領域に結合させる、固相オリゴヌクレオチド合成支持体を提供する工程
ｉ）リンカー基（−Ｙ−）
ｉｉ）コンジュゲート、ターゲッティング基、保護基、反応性基（例えば、アミノもしくはアルコール）又は活性化基からなる群より選択される基（Ｘ−）
ｉｉｉ）−Ｙ−Ｘ基
及び
ｂ）領域Ｂ、続けて、領域Ａを連続的にヌクレオチド合成する工程、
及び／又は
ｃ）第１領域（Ａ）及び第２領域（Ｂ）を連続的にヌクレオチド合成する工程、ここで、合成工程に続けて、
ｄ）第３領域［下記を含むホスホラミダイト］を付加する工程
ｉ）リンカー基（−Ｙ−）
ｉｉ）コンジュゲート、ターゲッティング基、保護基、反応性基［例えば、アミノもしくはアルコール］又は活性化基からなる群より選択される基（Ｘ−）
ｉｉｉ）−Ｙ−Ｘ基
続けて、
ｅ）固相支持体からオリゴマー化合物を開裂させる工程、ここで場合により、前記方法は、下記から選択される更なる工程を更に含む。
ｆ）第３基が活性化基である場合、活性化基を活性化させて、反応性基を生じさせ、続けて、コンジュゲート、保護又はターゲッティング基を、場合により、リンカー基（Ｙ）を介して反応性基に付加する工程
ｇ）第３領域が反応性基である場合、コンジュゲート、保護又はターゲッティング基を、場合により、リンカー基（Ｙ）を介して反応性基に付加する工程
ｈ）第３領域がリンカー基（Ｙ）である場合、コンジュゲート、保護又はターゲッティング基を、リンカー基（Ｙ）に付加する工程
【０１８９】
ここで、工程ｆ）、ｇ）又はｈ）は、オリゴヌクレオチド合成支持体からオリゴマー化合物を開裂する前、又は、同開裂後のいずれかで行われる。一部の実施態様では、本方法は、標準的なホスホラミダイト化学を使用して行われてもよい。なお、領域Ｘ及び／又は領域Ｘ又は領域Ｘ及びＹは、オリゴマー内への包含前にホスホラミダイトとして提供されてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを製造する方法の非限定的な態様を例示する、図５〜１０を参照されたい。
【０１９０】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成（又は製造）する方法を提供する。前記方法は、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフを有するオリゴマー（領域Ａ）、及び場合により、第２領域（Ｂ）を有するオリゴマーを連続的にオリゴヌクレオチド合成する工程を含む。ここで、合成工程に続けて、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分又はステロール部分を含むコンジュゲート部分のホスホラミダイトを付加し、続けて、固相支持体からオリゴマー化合物を開裂させる工程を行う。Ｎ−アセチルガラクトサミン部分又はステロール部分は、対応するセクションに記載されているものから選択することができる。好ましい実施態様では、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分は、Ｃｏｎｊ１ａ又はＣｏｎｊ２ａから選択される。
【０１９１】
ただし、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分又はステロール部分を含むコンジュゲート部分のホスホラミダイトを、固体支持体からの開裂後に付加させてもよいことが認識される。あるいは、本合成方法は、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフを有するオリゴマー（領域Ａ）、及び場合により、第２領域（Ｂ）を合成し、続けて、支持体からオリゴマーを開裂させる工程と、その後に、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分又はステロール部分を含むコンジュゲート部分を、オリゴマーに付加させる工程とを含んでもよい。第３領域の付加は、例えば、オリゴマー合成の最終工程において、（支持体上で）アミノホスホラミダイト単位を付加させることにより達成することができる。第３領域は、支持体からの開裂後に、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分又はステロール部分を含むコンジュゲート部分をオリゴマーに結合させるのに使用することができる。開裂性リンカーがヌクレオチド領域でない実施態様において、領域Ｂは、非ヌクレオチド開裂性リンカー、例えば、ペプチドリンカーでもよく、同非ヌクレオチド開裂性リンカーは、コンジュゲート部分（領域Ｃとも呼ぶ）の一部を形成することができ、又は、領域Ｙ（もしくはその一部）であることができる。
【０１９２】
本方法の一部の実施態様では、コンジュゲート部分（例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）は、活性化基（活性化された官能基）を含み、本合成方法において、活性化されたコンジュゲートは、オリゴマー、例えば、アミノ結合オリゴマーに付加される。アミノ基は、標準的なホスホラミダイト化学により、例えば、オリゴマー合成の最終工程としてオリゴマーに付加されてもよい（典型的には、オリゴマーの５’端にアミノ基をもたらすであろう）。例えば、オリゴヌクレオチド合成の最終工程中に、保護アミノ−アルキルホスホラミダイト、例えば、ＴＦＡ−アミノＣ６ホスホラミダイト（６−（トリフルオロアセチルアミノ）−ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト）が使用される。
【０１９３】
コンジュゲート部分（例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）は、ＮＨＳエステル法により活性化することができ、ついで、アミノ結合オリゴマーが付加される。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、コンジュゲート部分、例えば、ＧａｌＮＡｃについての活性化基として使用することができる。
【０１９４】
本発明は、本発明の方法により調製されたオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。
【０１９５】
一部の実施態様では、ステロール部分を含むコンジュゲート部分は、ホスファートヌクレオシド結合、例えば、本明細書に記載されているもの、例えば、ホスホジエステルもしくはホスホロチオアートを介して、又は、代替基、例えば、トリアゾール基を介して、領域Ｂに共有結合（結合）することができる。
【０１９６】
一部の実施態様では、第１及び第２領域間のヌクレオシド間結合は、第２領域の１番目（又は１番目のみ）のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドに結合しているホスホジエステルである。あるいは、領域Ｂは、少なくとも１つのホスホジエステル結合したＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含む。
【０１９７】
一部の実施態様では、第２領域は、ホスホジエステル結合している場合がある、更なるＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含む。第２領域は、例えば、コンジュゲート、ターゲッティング基、反応性基及び／又は保護基である場合がある、第３領域に更に共有結合している。
【０１９８】
一部の態様では、本発明は、第１領域、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分とを結合させる、不安定領域である第２領域の提供に基づいている。不安定領域は、少なくとも１つのホスホジエステル結合したヌクレオシド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のホスホジエステル結合したヌクレオシド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。一部の態様では、オリゴマー化合物は、開裂性（不安定な）リンカーを含む。この観点において、開裂性リンカーは、好ましくは、領域Ｂ（又は、一部の実施態様では、領域Ａ及びＢ間）に存在する。
【０１９９】
あるいは、一部の実施態様では、本発明は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオシドに結合している、少なくとも１つの末端（５’及び／又は３’）ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを有する、非ホスホジエステル結合した、例えば、ホスホロチオアート結合したオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を提供する。ここで、末端ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドは、コンジュゲート部分、ターゲッティング部分又は保護部分に、場合により、リンカー部分を介して更に共有結合している。
【０２００】
組成物
本発明のオリゴマー、特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬配合物及び組成物に使用することができる。適切には、このような組成物は、薬学的に許容し得る希釈剤、担体、塩又は補助剤を含む。国際公開第２００７／０３１０９１号には、適切で、好ましい薬学的に許容し得る希釈剤、担体及び補助剤が提供されている。同文献は、参照により本明細書に組み入れられる。適切な用量、配合、投与経路、組成、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ方式も、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。同文献も、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物又は配合物を調製するために、薬学的に許容し得る活性又は不活性な物質と混合することができる。医薬組成物を配合するための組成及び方法は、数多くの基準により決まる。同基準は、投与経路、疾患の度合い又は投与されるべき用量を含むがこれらに限定されない。
【０２０２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート化合物を、適切な薬学的に許容し得る希釈剤又は担体と組み合わせることにより、医薬組成物に利用することができる。薬学的に許容し得る希釈剤としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）があげられる。ＰＢＳは、非経口的に送達されるべき組成物に使用するのに適した希釈剤である。
【０２０３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート化合物を含む医薬組成物は、動物、例えば、ヒトへの投与において、任意の薬学的に許容し得る塩、エステル又はこのようなエステルの塩を包含し、生物学的に活性な代謝産物又はその残留物を（直接又は間接的に）提供することができる。したがって、例えば、本開示は、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート化合物の薬学的に許容し得る塩、プロドラッグ、このようなプロドラッグの薬学的に許容し得る塩又は生物学的同等物にも導かれる。適切な薬学的に許容し得る塩は、ナトリウム及びカリウム塩を含むがこれらに限定されない。一部の実施態様では、本発明のオリゴマーは、プロドラッグが作用部位、特に肝細胞に送達されると、コンジュゲート部分がオリゴヌクレオチドを開裂させる、プロドラッグである。
【０２０４】
好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物は、非経口経路、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入；又は頭蓋内、例えば、くも膜下腔内もしくは心室内投与により投与される。一実施態様において、活性なオリゴマー又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内に投与される。コンジュゲート部分が、ステロールである場合に、静脈内投与が特に適切である。別の実施態様では、活性なオリゴマー又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下に投与される。コンジュゲート部分が、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分である場合に、皮下投与が特に適切である。
【０２０５】
応用
本発明のオリゴマー、特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、診断、治療及び予防用の研究試薬として利用することができる。
【０２０６】
研究において、このようなオリゴマー又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、（典型的には、ｍＲＮＡを分解又は阻害することにより、タンパク質形成を妨害することにより）細胞及び実験動物中でのＡｐｏＢタンパク質の合成を特異的に阻害することにより、ターゲットの機能分析及び治療的介在のためのターゲットとしてのその有用性の評価を容易にするのに使用することができる。
【０２０７】
診断において、オリゴマーは、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又は類似の技術により、細胞及び組織中でのＡＰＯＢ発現を検出及び定量するのに使用することができる。
【０２０８】
治療について、ＡＰＯＢの発現をモデュレーションすることにより処置することができる疾患又は障害を有することが疑われる動物又はヒトが、本発明のオリゴマー化合物、特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与することにより処置される。さらに、治療的又は予防的に有効量の１つ以上の本発明のオリゴマーもしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は組成物を投与することにより、ＡＰＯＢの発現に関連する疾患又は症状を有するか、又は、同疾患又は症状になりやすいことが疑われる哺乳類を処置する、例えば、ヒトを処置する方法が提供される。本発明のオリゴマー、コンジュゲート又は医薬組成物は、典型的には、有効量で投与される。
【０２０９】
好ましい実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、２．０〜２．５mg/kgの間の用量、より好ましくは、１．５と２．０mg/kgとの間の用量、より好ましくは、１．０と１．５mg/kgとの間の用量、更により好ましくは、０．５と１．０mg/kgとの間の用量、及び最も好ましくは、０．１と０．５mg/kgとの間の用量を使用して、有効量で投与される。
【０２１０】
好ましい実施態様では、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、処置前のＡｐｏＢ血清レベルと比較した場合、動物又はヒトにおける血清ＡｐｏＢレベルを低下させる。
【０２１１】
本発明は、本明細書に言及されている障害を処置するための医薬を製造するための、記載されている本発明の化合物又はコンジュゲートの使用、又は、本明細書に言及されている障害を処置する方法も提供する。
【０２１２】
本発明は、本明細書に言及されている障害を処置する方法であって、本明細書に記載されている本発明の化合物及び／もしくは本発明のコンジュゲートならびに／又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法も提供する。
【０２１３】
医療適用
本発明のオリゴマー、特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲート及び他の組成物は、ＡｐｏＢの変異型の過剰発現又は発現に関連する症状の処置に使用することができる。
【０２１４】
本発明は、本明細書に言及されている疾患、障害又は症状を処置するための医薬の製造における本発明の化合物の使用を、更に提供する。
【０２１５】
一般的には、本発明の一態様は、ＡＰＯＢの異常なレベル及び／又は活性に関連する症状を患うか、又は、同症状に感受性の哺乳類を処置する方法であって、治療的に有効量の、ＡＯＰＢをターゲッティングするオリゴマー又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、哺乳類に投与することを含む方法を対象にする。好ましくは、オリゴマーは、１つ以上のＬＮＡ単位を含む。本発明のオリゴマー、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、典型的には、有効量で投与される。
【０２１６】
一部の実施態様では、本明細書に言及されている疾患又は障害は、ＡＰＯＢ遺伝子又はタンパク質生成物がＡＰＯＢに関連するか、もしくは、ＡＰＯＢと相互作用する遺伝子における変異に関連する場合がある。したがって、一部の実施態様では、ターゲットｍＲＮＡは、ＡＰＯＢ配列の変異型である。
【０２１７】
本発明の興味深い態様は、本明細書に言及されている疾患、障害又は症状を処置するための医薬を調製するための、本明細書に定義されているオリゴマー（化合物）、又は、本明細書に定義されているコンジュゲートの使用を対象にする。
【０２１８】
本発明の方法は、好ましくは、ＡｐｏＢの異常なレベル及び／又は活性により引き起こされる疾患に対する治療又は予防に利用される。
【０２１９】
あるいは、一部の実施態様では、本発明は、ＡｐｏＢの異常なレベル及び／又は活性を処置する方法であって、本発明のオリゴマーもしくは本発明のコンジュゲート又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を、更に対象にする。
【０２２０】
本発明は、医薬として使用するための、本明細書に定義されているオリゴマー、組成物又はコンジュゲートにも関する。
【０２２１】
本発明は、ＡｐｏＢの異常なレベル及び／もしくは活性又はＡＰＯＢの変異型（アレル変異体、例えば、本明細書に言及されている疾患の１つに関連するもの）の発現を処置するための医薬を製造するための、本明細書に定義されている化合物、組成物又はコンジュゲートの使用に、更に関する。
【０２２２】
更に、本発明は、疾患又は症状、例えば、本明細書に言及されているものを患う対象を処置する方法に関する。
【０２２３】
処置を必要とする患者は、疾患もしくは障害を患っている患者、又は、同疾患もしくは障害を患うおそれのある患者である。
【０２２４】
一部の実施態様では、本明細書で使用する場合、「処置」という用語は、存在している疾患（例えば、本明細書で言及されている疾患又は障害）の治療、又は、疾患の予防、すなわち、予防の両方を意味する。したがって、一部の実施態様では、本明細書に言及されている処理は、予防的であることができることが認識されるであろう。
【０２２５】
一実施態様では、本発明は、高コレステロール血症及び関連する障害を処置するための化合物もしくは化合物を含む組成物、又は、高コレステロール血症及び関連する障害を処置するために、このような化合物もしくは組成物を使用する処置方法に関する。ここで、高コレステロール血症に言及する場合、「関連する障害」という用語は、アテローム硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、ＡＰＯＢにおける機能的変異の獲得、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）からなる群より選択される１つ以上の症状を意味する。
【０２２６】
組み合わせ処置
一部の実施態様では、本発明の化合物は、別の治療剤との組み合わせに使用するためのものである。例えば、スタチン等のＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼの阻害剤は、例えば、代謝性疾患の処置に広く使用されている（国際公開第２００９／０４３３５４号を参照のこと。同文献は、組み合わせ処置の例について、参照により本明細書に組み入れられる）。組み合わせ処置は、他のコレステロール降下性化合物でもよく、例えば、胆汁酸塩封鎖樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール及びコレセベラム塩酸塩）、ＨＭＧＣｏＡ−レダクターゼ阻害剤（例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、プレバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン及びフラバスタチン）、ニコチン酸、フィブラート誘導体（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート及びシプロフィブラート）プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、植物性スタノールエステル、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ）、インプリタピド、胆汁酸輸送体（頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体）の阻害剤、肝臓のＣＹＰ７ａのレギュレーター、エストロゲン置換療法（例えば、タモキシフェン）及び抗炎症物質（例えば、糖質コルチコイド）からなる群より選択される化合物から選択されてもよい。スタチンとの組み合わせが、特に好ましい場合がある。
【０２２７】
本発明の具体的な実施態様
１．  コンジュゲート部分（領域Ｃ）と結合している、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフを有するオリゴマーを含み、ここで、コンジュゲート部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分又はステロール部分を含む、
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２．  オリゴマーが、少なくとも２つの親和性向上ヌクレオチド類縁体を含む、実施態様１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
３．  ヌクレオチド類縁体が、糖改変ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位及び２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群より独立又は従属して選択される糖改変ヌクレオチドである、実施態様２記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
４．  オリゴマーが、ＬＮＡ含有オリゴマーである、実施態様１〜３のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
５．ＬＮＡ単位が、ベータ−Ｄ−Ｘ−ＬＮＡ又はアルファ−Ｌ−Ｘ−ＬＮＡ（ここで、Ｘが、オキシ、アミノ又はチオである）、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ｃＭＯＥ及び５’−Ｍｅ−ＬＮＡからなる群より選択される、実施態様３又は４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６．  ＬＮＡが、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施態様５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７．  オリゴマーが、ギャップマーである、実施態様１〜６のいずれか１つ記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
８．  ギャップマーが、６〜１０個のヌクレオチドのギャップの各側（５’及び３’）に、１〜３個のヌクレオチド類縁体のウイングを含む、実施態様７記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
９．  ギャップマー設計が、２−８−２、２−７−３、３−７−２及び３−６−３からなる群より選択される、実施態様７又は８記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１０．  オリゴマーが、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート及びボラノホスファートからなる群より選択される１つ以上のヌクレオシド結合を含む、実施態様１〜９のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１１．  オリゴマーが、ホスホロチオアートヌクレオシド結合を含むか、又は、ホスホロチオアートヌクレオシド結合からなる、実施態様１〜１０のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１２．  オリゴマーが、配列番号２７：５’  ＧｓＴｓｔｓｇｓａｓｃｓａｓｃｓｔｓｇｓＴｓＣ  ３’に対応し、ここで、大文字が、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを表わし、小文字が、ＤＮＡヌクレオシドを表わし、ＬＮＡシトシンが、５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間の全ての結合が、ｓにより示されているホスホロチオアートである、実施態様１〜１１のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１３．  オリゴマーが、ＡｐｏＢを発現している細胞中でのＡｐｏＢの発現をダウンレギュレーション可能である、実施態様１〜１２のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１４．  ＡｐｏＢのダウンレギュレーションが、動物又はヒトにおいてである、実施態様１３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１５．  コンジュゲート部分が、コレステロール又はトコフェロール、例えば、Ｃｏｎｊ５ａ及びＣｏｎｊ６ａと示されているものから選択されるステロールを含む、実施態様１〜１４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１６．  前記コンジュゲート部分が、開裂性リンカー（Ｂ）を介して、前記オリゴマーに結合している、実施態様１〜１５のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１７．  開裂性リンカーが、ペプチドリンカー、ポリペプチドリンカー、リシンリンカー又は生理学的に不安定なヌクレオチドリンカーからなる群より選択される部分を含む、実施態様１６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１８．  生体開裂性リンカーが、生理学的に不安定なヌクレオチドリンカーを含む、実施態様１６又は１７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
１９．  生理学的に不安定なヌクレオチドリンカーが、オリゴマーの連続した配列の５’又は３’端と隣接しており、ＡｐｏＢのターゲット配列と相補的な塩基対合を形成してもよいし、又は、同塩基対合を形成しなくてもよい、１つ以上の連続したＤＮＡホスホジエステルヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５又は６個のＤＮＡホスホジエステルヌクレオチドを含むホスホジエステルヌクレオチド結合である、実施態様１７又は１８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２０．  ホスホジエステルヌクレオチド結合（又は生体開裂性リンカー）が、１、２又は３個のＤＮＡホスホジエステルヌクレオチド、例えば、２つのＤＮＡホスホジエステルヌクレオチド、例えば、５’  ＣＡ  ３’のジヌクレオチドを含む、実施態様１９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２１．  生体開裂性リンカーが、開裂性のリシンリンカー、例えば、ジ−リシンを含む、実施態様１６又は１７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２２．  コンジュゲート部分が、１つ以上のＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、実施態様１〜１４又は１６〜２１のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２３．  コンジュゲート部分が、２又は３個のＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、実施態様１〜１４又は１６〜２１のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２４．  コンジュゲート部分が、三価のＮ−アセチルガラクトサミンクラスターを含む、実施態様１〜１４又は１６〜２３のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２５．  オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、コンジュゲート部分をオリゴマーに共有結合させるリンカーＹを含む、実施態様１〜２４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２６．  リンカー領域Ｙが、脂肪酸、例えば、Ｃ６〜Ｃ１２リンカー、好ましくは、Ｃ６リンカーを含む、実施態様２５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
２７．  Ｎ−アセチルガラクトサミン部分が、フレキシブルな親水性スペーサを含む、実施態様１〜１４又は１６〜２６のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２８．  親水性スペーサが、ＰＥＧスペーサである、実施態様２７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２９．  コンジュゲート部分が、ＰＥＧスペーサを介してジ−リシンに結合している、３つのＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、実施態様１〜１４又は１６〜２８のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
３０．  コンジュゲートが、Ｃｏｎｊ１、Ｃｏｎｊ２、Ｃｏｎｊ３、Ｃｏｎｊ４、Ｃｏｎｊ１ａ、Ｃｏｎｊ２ａ、Ｃｏｎｊ３ａ及びＣｏｎｊ４ａからなる群より選択されるコンジュゲート部分を含む、実施態様１〜１４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３１．  コンジュゲート部分が、Ｃｏｎｊ２又はＣｏｎｊ２ａ、最も好ましくは、Ｃｏｎｊ２ａを含む、実施態様３０記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
３２．  コンジュゲート部分（領域Ｃ）が、薬物動態学的モデュレーター、例えば、長さがＣ６より大きい脂肪酸基を含まない、実施態様１〜３１のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
３３．  配列番号２８又は配列番号３１又は配列番号２９からなる、実施態様１記載のアンチセンスオリゴマー。
３４．  実施態様１〜３３のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートと、薬学的に許容し得る希釈剤、担体、塩又は補助剤とを含む、
医薬組成物。
３５．  動物又はヒトにおける血清ＡｐｏＢレベルを低下させるのに使用するための、実施態様１〜３４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物。
３６．  医薬として使用するための、実施態様１〜３４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物。
３７．  医薬として使用するための、例えば、急性冠動脈症候群もしくは高コレステロール血症又は関連する障害、例えば、アテローム硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）からなる群より選択される障害を処置するための、実施態様１〜３４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物。
３８．  急性冠動脈症候群もしくは高コレステロール血症又は関連する障害、例えば、アテローム硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）からなる群より選択される障害の処置に使用するための、実施態様１〜３４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物。
３９．  急性冠動脈症候群もしくは高コレステロール血症又は関連する障害、例えば、アテローム硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）からなる群より選択される障害を処置するための医薬を製造するための、実施態様１〜３４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物の使用。
４０．急性冠動脈症候群もしくは高コレステロール血症もしくは関連する障害、例えば、アテローム硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）からなる群より選択される障害を処置する方法であって、有効量の実施態様１〜３４のいずれか１つ記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を、高コレステロール血症又は関連する障害を患うか、又は、患うおそれのある患者に投与することを含む、
方法。
４１．  ＡｐｏＢを発現している細胞中において、ＡｐｏＢをｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する方法であって、前記細胞中においてＡｐｏＢを阻害するために、実施態様１〜３４のいずれか１つ記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を、前記細胞に投与することを含む、
方法。
【０２２８】
実施例
オリゴヌクレオチドＡｐｏＢターゲッティング化合物
以下の表は、ＡｐｏＢ遺伝子（NCBIアクセッションナンバー  ＮＭ＿０００３８４及び配列番号３２）に相補的なオリゴヌクレオチド配列モチーフと、実施例において使用したオリゴヌクレオチド設計を示す。
【表２】
2017501684.tif 000011
【表３】
2017501684.tif 000012
【表４】
2017501684.tif 000013
【表５】
2017501684.tif 000014
【表６】
2017501684.tif 000015
【０２２９】
表３〜６において、大文字は、ＬＡＮヌクレオシド（例えば、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ）であり、小文字は、ＤＮＡオリゴヌクレオシドである。ＬＮＡシトシンは、５−メチルシトシンである。オリゴヌクレオチド（オリゴ）配列中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である。
【０２３０】
マウス実験
特に断りない限り、マウス実験を、下記のように行うことができる。
【０２３１】
投与量及ぶサンプリング
７〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ６−Ｎマウスを使用した。動物は、年齢及び性別を一致させた（試験１、２及び４にはメス、試験３にはオス）。化合物を、尾の血管内にｉ．ｖ．注入した。途中の血清サンプリングのために、２〜３滴の血液を、顔面静脈に穴をあけることにより収集した。最後の出血を、下大動脈から採取した。血清を、ゲル含有血清分離管（Greiner）に収集し、分析まで凍結を維持した。
【０２３２】
示されている情報に基づいて、生理食塩水中に配合した１mg/kg（又は、示されている量） アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）又は生理食塩水単独を、単回投与において、Ｃ５７ＢＬ６マウスにｉ．ｖ．投与した。動物を、例えば、投与後４もしくは７日目（又は示されているタイミング）で殺処分し、肝臓及び腎臓をサンプリングした。
【０２３３】
ＲＮＡ単離及びｍＲＮＡ分析
組織からのｍＲＮＡ分析を、Qantigene  ｍＲＮＡ定量キット（「bDNA-assay」、Panomics/Affimetrix）を使用し、製造メーカーのプロトコールに従って行った。組織ライゼートのために、５０〜８０mg 組織を、プロテイナーゼＫを含有する溶解バッファー １mL中で超音波処理により溶解させた。ライゼートを、ＲＮＡ抽出することなく、bDNA-assayに直接使用した。ターゲット及びＧＡＰＤＨ用のプローブセットを、Panomicsから特注設計で得た。分析のために、ターゲット遺伝子について得た発光単位を、ハウスキーパーＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【０２３４】
ＡＬＴ、ＡＳＴ及びコレステロールについての血清分析を、「Cobas INTEGRA 400 plus」臨床化学プラットフォーム（Roche Diagnostics）において、血清 １０μLを使用して行った。
【０２３５】
オリゴヌクレオチド定量のために、蛍光ラベルＤＮＡプローブを、組織ライゼート中の対象となるオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションさせる。同じライゼートを、正確に秤量した量の組織によって、bDNA-assay用に使用する。ヘテロ二重鎖を、ＡＥＸ−ＨＰＬＣ及び蛍光検出を使用して定量する。
【０２３６】
実施例１：化合物の合成
オリゴヌクレオチドを、ホスホロアミダイトの手法を使用して、１μmolスケールでのOligomaker 48において、ウリジンユニバーサル支持体上で合成した。合成の最後に、オリゴヌクレオチドを、固体支持体からアンモニア水を使用して、６０℃で５〜１６時間開裂させた。オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、又は、固相抽出により精製し、ＵＰＬＣにより特徴決定し、分子量を、ＥＳＩ−ＭＳにより更に確認した。より詳細については、以下を参照のこと。
【０２３７】
オリゴヌクレオチドの伸長
β−シアノエチル−ホスホラミダイト（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、ＬＮＡ−Ｔ又はＣ６−Ｓ−Ｓリンカー）の結合を、アセトニトリル中０．１M ５’−Ｏ−ＤＭＴ−保護アミダイト及びアセトニトリル中のＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）（０．２５M）の溶液をアクチベータとして使用することにより行う。最後のサイクルについて、市販のＣ６−結合したコレステロールホスホラミダイトを、ＤＣＭ中０．１Mで使用した。ホスホロチオアート結合を導入するためのチオール化を、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン  ９：１中０．０１M）を使用することにより行う。ホスホジエステル結合を、ＴＨＦ／ピリジン／水  ７：２：１中０．０２M ヨウ素を使用して導入する。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるものである。固相合成コンジュゲーション後について、市販のＣ６アミノリンカーホスホラミダイトを、固相合成の最後のサイクルに使用した。脱保護及び固体支持体からの開裂後、アミノ結合した脱保護オリゴヌクレオチドを単離した。コンジュゲートを、標準的な合成法を使用して、官能基の活性化により導入した。
【０２３８】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製
粗製化合物を、Phenomenex Jupiter C18  １０μ  １５０×１０mmカラムにおいて、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。０．１M 酢酸アンモニウム  ｐＨ８及びアセトニトリルを、５mL/分の流速において、バッファーとして使用した。収集した画分を凍結乾燥させて、精製した化合物を、典型的には白色の固体として与えた。
【０２３９】
略語
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ  ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
【０２４０】
実施例２．コレステロール−コンジュゲートによるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでのノックダウン
生理食塩水、又は、１mg/kg コンジュゲートしていないＬＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３）、もしくは、等モル量の種々のリンカーによりコレステロールにコンジュゲートしているＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下の表７を参照のこと）を、単回投与において、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに注入し、以下の表に基づいて、１〜１０日目に殺処分した。ＲＮＡを、肝臓及び腎臓から単離し、ＡｐｏＢ特異的プライマー及びプローブによるｑＰＣＲに供して、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウンについて分析した。
【表７】
2017501684.tif 000016
【０２４１】
大文字は、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わし、小文字は、ＤＮＡモノマーを表わし、下付きの「ｓ」は、ホスホロチオアート結合を表わし、上付きの「ｍ」は、５−メチルシトシン塩基を含有するベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表わし、上付きの「ｏ」は、オキシ−ＬＮＡを表わす。
【０２４２】
材料及び方法
【表８】
2017501684.tif 000017
2017501684.tif 000018
【０２４３】
投与量
到着時に約２０ｇであったＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍメスの動物に、（０日目の体重に基づいて）体重１kg当たりに、上記表に基づいて生理食塩水中に配合した化合物又は生理食塩水単独 10mLを、ｉ．ｖ．投与した。
【０２４４】
肝臓及び腎臓組織のサンプリング
動物を、７０％ＣＯ２−３０％Ｏ２で麻酔し、頸椎脱臼により、上記表に基づいて殺処分した。肝臓の大きな葉の半分及び１つの腎臓を細かく刻み、RNAlaterに浸した。
【０２４５】
トータルＲＮＡの単離及び第１鎖の合成
トータルＲＮＡを、Qiagen RNeasyキット（Qiagen cat. no. 74106）を使用し、製造メーカーの説明書に従って、RLT-溶解バッファーの存在下において、ビーズ粉砕することによりホモジナイズした、最大３０mg 組織から抽出した。第１鎖の合成を、Ambionからのリバーストランスクリプターゼ試薬を使用し、製造メーカーの説明書に従って行った。
【０２４６】
各サンプルについて、０．５μg トータルＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリー水で（１０．８μL）に調節し、ランダムデカマー（５０μM） ２μL及びｄＮＴＰミックス（２．５mM 各ｄＮＴＰ） ４μLと混合し、７０℃で３分間加熱した。その後、サンプルを、氷上で急速に冷却した。１０×バッファーＲＴ ２μL、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（１００U/μL） 1μL及びＲＮａｓｅ阻害剤（１０U/μL） ０．２５μLを、各サンプルに加え、続けて、４２℃で６０分間インキュベーションし、９５℃で１０分間酵素を熱不活性化させ、ついで、サンプルを、４℃に冷却した。ｃＤＮＡサンプルを、１：５で希釈し、製造メーカーのプロトコールに従って、Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x（Applied Biosystems、Cat #4364103）及びTaqman gene expression assay（mApoB  Mn01545150_m1及びmGAPDH  #4352339E）を使用するＲＴ−ＱＰＣＲに供し、Applied Biosystems RT-qPCR機器(7500/7900又はViiA7)において、ファーストモードで処理した。
【０２４７】
結果を、図１１に示す。
【０２４８】
結論
ホスホジエステル骨格を有する２又は３個のＤＮＡから構成されているリンカーにより、ＡｐｏＢ  ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたコレステロール（配列番号６及び７）は、ＡｐｏＢの肝臓特異的ノックダウンについて優位性を示した（図１１）。結論として、開裂性リンカーによりコレステロールとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド（配列番号６及び７）は、コンジュゲートしていない化合物（配列番号３）、ならびに、安定的なリンカーによるコレステロールコンジュゲート（配列番号４）及びジスルフィドリンカーによるコレステロールコンジュゲート（配列番号５）と比較して、肝臓組織におけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウンの有効性及び持続性を向上させ、腎臓組織中での配列番号６及び配列番号７のノックダウン活性をほとんど伴わなかった。
【０２４９】
実施例３．種々のコンジュゲートによるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでのサイレンシング
ＡｐｏＢ化合物の活性における種々のコンジュゲーション部分及びリンカーの影響を調査するために、配列番号３を、モノＧａｌＮＡｃ、葉酸、ＦＡＭ又はトコフェロールのいずれかに、非開裂性リンカー又は生体開裂性リンカー（ジチオ（ＳＳ）もしくはホスホジエステル骨格（ＰＯ）を有する２つのＤＮＡヌクレオチド）を使用してコンジュゲートさせた。加えて、モノＧａｌＮＡｃを、ＧａｌＮＡｃクラスター（コンジュゲート２ａ）と比較した。より詳細な構築物については、表５を参照のこと。Ｃ５７ＢＬ６Ｉｎマウスを、生理食塩水対照又は単回投与の１もしくは０．２５mg/kg ＡＳＯコンジュゲートで、ｉ．ｖ．処置した。７日後、動物を殺処分し、ＲＮＡを、肝臓及び腎臓サンプルから単離し、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ発現について分析した。
【０２５０】
材料及び方法
【表９】
2017501684.tif 000019
【０２５１】
投与量及ぶサンプリング
単回投与の１mg/kgもしくは０．２５mg/kg 生理食塩水中に配合したＡＳＯ又は生理食塩水単独を、上記表に基づいて、Ｃ５７ＢＬ６マウスにｉ．ｖ．投与した。投与後７日目、動物を殺処分し、肝臓及び腎臓をサンプリングした。ＲＮＡ単離及びｍＲＮＡ分析。トータルＲＮＡを、肝臓及び腎臓サンプルから抽出し、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、分岐したbranched DNA assayを使用して分析した。
【０２５２】
結果を、図１５に示す。
【０２５３】
結論
ＤＮＡ／ＰＯ−リンカーによりＡｐｏＢ化合物にコンジュゲートしているトコフェロール（配列番号２６）は、コンジュゲートしていないＡｐｏＢ化合物（配列番号３）と比較して、肝臓におけるＡｐｏＢノックダウンを向上させたが、腎臓における活性は低かった（図１５Ａ及びＢを比較のこと）。このことは、腎臓から肝臓にＡｐｏＢ化合物を向かわされるトコフェロールの能力を指し示す。非開裂性トコフェロールコンジュゲート（配列番号２４）及びＳＳ−結合トコフェロールコンジュゲート（配列番号２５）は、両組織において不活性であった。非開裂性リンカーによるモノ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（配列番号１７）及び生体開裂性ＤＮＡ／ＰＯリンカーによるモノ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（配列番号１９）は、コンジュゲートしていない化合物（配列番号３）の腎臓における活性を保持する傾向を示し、一方、肝臓における活性を改善させる。ＳＳ−リンカーの導入は、両組織における活性を低下させた（図１５Ａ及びＢを比較のこと）。種々のＧａｌＮＡｃコンジュゲート、例えば、モノＧａｌＮＡｃＰＯのコンジュゲーション（配列ン番号１９）及びＧａｌＮＡｃクラスターのコンジュゲーション（配列番号２０）は、肝臓又は腎臓のいずれかへの焦点を有する化合物活性の見事な切換えも可能にする。開裂性ＤＮＡ／ＰＯ−リンカーによる葉酸及びＦＡＭコンジュゲート（配列番号１６及び２３）は、コンジュゲートしていない化合物（配列番号３）と同等に挙動する。なおここで、非開裂性（配列番号１４及び２１）又はＳＳ−リンカー（配列番号１５及び２２）の導入は、両組織における化合物活性を低下させる（図１５ａ及び１１５ｂを比較のこと）。
【０２５４】
実施例４Ａ：非ヒト霊長類におけるコンジュゲートしていない抗−ＡｐｏＢ  ＬＮＡ化合物の効果
下記実施例は、コンジュゲートしていない抗−ＡｐｏＢ  ＬＮＡ化合物の有効性を互いに比較する目的で、２種類のサルでの研究からのデータを比較する。
【０２５５】
配列番号３及び配列番号２７は、カニクイザルにおける複数回投与研究において、以前に試験されている。配列番号３についての研究からのデータは、以前に公開されている（Straarup et al, Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, pages 7100-7110）。
【０２５６】
配列番号２７の研究は、Bridge Laboratories 32 Kexue Yuan Road, Zhongguancun Life Science Park, Changping District, Beijing 102206, People’s Republic of Chinaにおいて行われた。この研究の目的は、２週間又は１３週間投与した場合の、オス及びメスのカニクイザルにおける配列番号２７の毒性を評価すること、ならびに、６週及び８週の観察期間中、続けて、２週及び１３週の処置期間中のそれぞれにおける可逆性、進行性及び／又は可能性ある遅延型効果を評価することであった。投与初日の年齢は、２．０〜４．０歳であった。投与初日の体重は、２．０〜４．０kgであった。配列番号２７は、注入当たりに１、４、８又は２４mg/kgで投与された。１、６、１１、１６、２３、３０、３７、４４、５１、５８、６５、７２、７９及び８６日目に、動物に注入された。
【０２５７】
２つの研究において得られたＬＤＬ−Ｃ低下における効果を、以下の表８に示されたように、類似する時点で比較した。
【表１０】
2017501684.tif 000020
【０２５８】
両化合物（配列番号３及び配列番号２７）は、各研究において、ＬＤＬ−Ｃを、生理食塩水（対照）動物におけるＬＤＬ−Ｃの６０％に低下させ、この効果は、種々の用量で十分達成された。配列番号３は、２mg/kg 配列番号３の２回の投与（合計用量２×２mg/kg）において、オス及びメスのカニクイザルに投与された場合、配列番号２７についてより顕著に高い活性を実証し、最終的な薬理学的終点（ＬＤＬ−Ｃの低下）において、４mg/kg 配列番号２７の４回の投与（合計用量４×４mg/kg）と同じ効果を有した。
【０２５９】
実施例４Ｂ：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究
この研究についての第１の目的は、カニクイザルへの抗−ＡｐｏＢ  ＬＮＡコンジュゲート化合物の１回の遅い静脈内ボーラス注入後７週にわたって、選択した脂質マーカーを調査し、同化合物のサルにおける可能性のある毒性を評価することであった。この研究に使用した化合物は、配列番号７、２０、２８及び２９とし、０．６２５及び２．５mg/mLの初濃度で、滅菌した生理食塩水（０．９％）中に調製した。
【０２６０】
少なくとも２４月齢のメスザルを使用し、水道水へのフリーアクセスを与え、１８０ｇ OWM(E) SQC SHORT expanded diet（Dietex France, SDS, Saint Gratien, France）を、動物当たりに毎日配った。加えて、果物又は野菜を、各動物に毎日与えた。動物を、処置期間の開始前に、研究条件に少なくとも１４日の期間順応させた。この期間中に、処置前調査を行った。１mg/kgの用量で、動物にｉ．ｖ．投与した。投与容量を、０．４mL/kgとした。２匹の動物を、群当たりに使用した。３週間後、データを分析し、より高い及びより低い投与計画を使用する動物の第２群を開始した。予備的投与設定を、２．５mg/kgとし、又は、第１データセットに基づいてそれより低くした。
【０２６１】
投与配合を、１日目に一度投与した。動物を、処置後７週の期間観察した。１日目は、処置期間の初日に対応する。（群当たりの）臨床的観察、体重及び食餌摂取を、研究前及び研究中に記録した。
【０２６２】
血液をサンプリングし、分析を下記時点で行った。
【表１１】
2017501684.tif 000021
【０２６３】
血液生化学
下記パラメータを、以下に示した場合において、生存している全ての動物について決定した。
・完全な生化学パネル（以下の完全なリスト）  −８、１５及び５０日目
・肝臓安全性（ＡＳＡＴ、ＡＬＰ、ＡＬＡＴ、ＴＢＩＬ及びＧＧＴのみ）  ４、８、２２及び３６日目
・脂質プロファイル（総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ及びトリグリセリド）ならびにＡｐｏ−Ｂのみ  −１、４、８、２２、２９、３６及び４３日目
【０２６４】
血液（約１．０mL）を、（ADVIA 1650血液生化学分析機を使用する）リチウムヘパリン管に採取した。Ａｐｏ−Ｂ、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン、グルコース、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素、クレアチニン、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、クレアチンキナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ、総タンパク質、アルブミン、アルブミン／グロビン比。
【０２６５】
血液の分析
ＡｐｏＢ分析のための血液サンプルを、−８、−１、４、８、１５、２２、２９、３６、４３及び５０日目に収集した。血液を、（＋４℃を維持するように設定された）冷蔵条件下において、１０００ｇで１０分間遠心分離した。血清を、３本の個々の管に移し、分析まで−８０℃で保存した。
【０２６６】
他の分析
国際公開第２０１０１４２８０５号には、（参照により本明細書に組み入れられる）下記分析：ｑＰＣＲ、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ分析のための方法が提供されている。他の分析としては、ＡｐｏＢタンパク質ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡ（Mercodia No. 10-1106-01）による血清Ｌｐ（ａ）分析、組織及び血清のオリゴヌクレオチド分析（薬剤含量）、サンプル、標準−及びＱＣ−サンプルの抽出、ＥＬＩＳＡによるオリゴヌクレオチド含量の決定があげられる。
【０２６７】
配列番号２７のコンジュゲート化合物（配列番号２８及び２９）についてのデータを、図１９に示す。配列番号３のコンジュゲート（配列番号７及び２０）についてのデータを、図２０に示す。特に、ＮＨＰ研究において、親化合物（配列番号３）が、実施例４Ａに記載されているように、配列番号２７の親化合物より活性であるにもかかわらず、配列番号３のコンジュゲート化合物（配列番号７及び２０）は、使用した用量において、ＡｐｏＢ又はＬＤＬコレステロールにおける顕著な低下をもたらさなかった（図２０）。ＡｐｏＢターゲッティング化合物のいずれによっても、肝毒性又は腎毒性の兆候はなかった。特に、配列番号２７−ＧａｌＮＡｃ化合物（配列番号２９）は、急速で、非常に効果的なＡｐｏＢ及びＬＤＬのダウンレギュレーションを提供した。同ダウンレギュレーションは、広い期間（研究全体の長さ）にわたって維持された。このことは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートした配列番号２７の化合物（配列番号２９）が、急速な初期ノックダウン及び長い持続性の両方に関して、コレステロールコンジュゲートより効果的であることを実証した（図１９）。ただし、コレステロールコンジュゲートした配列番号２７（配列番号２８）も、２．５mg/kgの用量で、非常に良好な効果を有した。このことは、ＧａｌＮＡｃ化合物が、コンジュゲートしていない親化合物及び別のコンジュゲーション技術を使用した化合物の両方と比較して、比較的低頻度で、より少ない用量で投与することができることの兆候である。
【０２６８】
実施例５：ラットにおける肝臓及び腎臓の毒性評価
本発明の化合物を、げっ歯類、例えば、マウス又はラットにおける、その毒性プロファイルについて評価することができる。例として、下記プロトコールを使用することができる。Wistar Han Crl:WI（Han）を、約８週齢の年齢で使用する。この年齢において、オスは、約２５０ｇの重量であるべきである。全ての動物が、SSNIFF R/M-H pelleted maintenance diet（SSNIFF Spezialdiaten GmbH, Soest, Germany）及びボトルに入った（０．２２μmフィルタでろ過した）水道水へのフリーアクセスを有する。投与当たりに１０及び４０mg/kgの用量レベルを使用し（皮下投与）、１及び８日目に投与する。動物を、１５日目に安楽死させる。尿及び血液サンプルを、７及び１４日目に収集する。臨床病理評価を、１４日目に行う。体重を、研究前、投与初日及び解剖前１週間に測定する。群当たりの食餌消費を、毎日評価するものとする。血液サンプルを、絶食の６時間後に、尾の血管から採取する。下記血清分析：赤血球数、平均赤血球容積、ヘマトクリット、ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球ヘモグロビン、血小板数、白血球数、細胞形態学による白血球百分率、網状赤血球数、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン、グルコース、尿素、クレアチニン、総ビリルビン、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、総タンパク質、アルブミン、アルブミン／グロビン比を行う。尿分析は、α−ＧＳＴ、β−２  ミクログロブリン、カルビンジン、クルステリン、シスタチンＣ、ＫＩＭ−１、オステオポンチン、ＴＩＭＰ−１、ＶＥＧＦ及びＮＧＡＬを行なう。７つの検体（カルビンジン、クルステリン、ＧＳＴ−α、ＫＩＭ−１、オステオポンチン、ＴＩＭＰ−１、ＶＥＧＦ）を、パネル１（MILLIPLEX（登録商標） MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 1, RKTX1MAG-37K）において定量するものとする。３つの検体（β−２  ミクログロブリン、シスタチンＣ、リポカリン−２／ＮＧＡＬ）を、パネル２（MILLIPLEX（登録商標） MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 2, RKTX2MAG-37K）において定量するものとする。ラットの尿中のこれらのバイオマーカー濃度を測定するためのアッセイは、Luminex xMAP（登録商標）の技術に基づいている。抗−α−ＧＳＴ／β−２  ミクログロブリン／カルビンジン／クルステリン／シスタチンＣ／ＫＩＭ−１／オステオポンチン／ＴＩＭＰ−１／ＶＥＧＦ／ＮＧＡＬ抗体でコートしたマイクロスフェアを、２種類の蛍光染料で色分けする。下記パラメータを決定する（尿、ADVIA 1650を使用）。尿タンパク質、尿クレアチニン、定量的パラメータ：容量、ｐＨ（10-Multistix SGテストストリップ／Clinitek 500尿分析機を使用）、比重（屈折計を使用）。半定量的パラメータ（10-Multistix SGテストストリップ／Clinitek 500尿分析機を使用）：タンパク質、グルコース、ケトン、ビリルビン、亜硝酸塩、血液、ウロビリノーゲン、（顕微観察による）沈降物の細胞学。定性的パラメータ：外観、色。殺処分後、体重ならびに腎臓、肝臓及び脾臓の重量を測定し、体重に対する臓器の比を算出した。腎臓及び肝臓サンプルを取得し、凍結又はホルマリン中での保存のいずれかをするものとする。顕微鏡分析を行う。
【０２６９】
ラットの安全性研究を、CiToxLabs, Franceにおいて行った。オスのWistarラット（ｎ＝４／群）を、研究に選択した。なぜなら、使用した研究設定（用量範囲及びタイムコース）において、Wistar Hanラットは、ヒトにおける腎臓（及びある程度肝臓）の毒性を予測するのが以前に実証されているためである。コンジュゲートしたＬＮＡ化合物（１０mg/kg）又は対応するコンジュゲートしていない「親化合物」（４０mg/kg）を、１日目及び８日目において、動物にｓ．ｃ．注入した。尿を、７日目及び１４日目に収集し、分析まで氷上で維持した。尿サンプルを遠心分離し（約３８５ｇ、＋４℃、５分）、泌尿器傷害マーカーのパネルを、Luminex xMAP（登録商標）技術に基づく多重アッセイ法により分析した。本研究における尿腎臓傷害マーカーのパネルの範囲外であるＫＩＭ−１（腎臓傷害マーカー１）は、尿腎臓傷害マーカーのメタ分析において、ＫＩＭ−１について近年説明されているように（Vlasakova et al, Evaluation of the Relative Performance of Twelve Urinary Biomarkers for Renal Safety across Twenty Two Rat Sensitivity and Specificity Studies Toxicol. Sci. December 21, 2013）、最も大きい動的範囲及び最も明確なシグナルを実証した。結果を、表９に示す。
【表１２】
2017501684.tif 000022
【０２７０】
いずれの化合物も、ラットの尿中に懸念されるレベルのｋｉｍ−１を与えなかったが、配列番号２のコレステロールコンジュゲート（配列番号２８）は、配列番号１のＧａｌＮＡｃコンジュゲート（配列番号２０）より低い平均ｋｉｍ−１レベルを与えた。配列番号２８及び配列番号２０についての尿ｋｉｍ−１タンパク質は、同じ時点での腎臓組織学分析により実証されているように、明確な小管毒性を示すラットからの尿におけるｋｉｍ−１レベルと比較しても低いことに留意されたい。
【０２７１】
実施例６：ＦＡＭラベルコンジュゲートを有するＡｐｏＢターゲッティング化合物
表４に示されている、種々のＤＮＡ／ＰＯ−リンカーによるＦＡＭラベルアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を、Ｓ１ヌクレアーゼ抽出物、肝臓もしくは腎臓ホモジネート又は血清のいずれかによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ開裂に供した。
【０２７２】
Ｓ１ヌクレアーゼ開裂
種々のＤＮＡ／ＰＯ−リンカーによるＦＡＭラベルオリゴヌクレオチド １００μMを、ヌクレアーゼバッファー（６０Upr、１００μL）におけるＳ１ヌクレアーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ開裂に、２０及び１２０分間供した（以下の表を参照のこと）。酵素活性を、バッファー溶液にＥＤＴＡを加えることにより停止させた。ついで、この溶液を、Dionex DNApac p-100カラム及びｐＨ７．５での１０mM〜１Mの範囲の勾配の過塩素酸ナトリウムを使用する、Dionex Ultimate 3000におけるＡＩＥ  ＨＰＬＣ分析に供した。開裂性及び非開裂性のオリゴヌクレオチド含量を、６１５nmでの蛍光検出器及び２６０nmでのｕｖ検出器の両方を使用して、標準に対して決定した。結果を、表１０に示す。
【表１３】
2017501684.tif 000023
【０２７３】
結論
ＰＯリンカー（又は、本明細書において領域Ｂと呼ぶ）は、開裂されるコンジュゲート（又は基Ｃ）をもたらす。同リンカーの長さ及び／又は配列組成の両方を、領域Ｂの核酸分解的開裂に対する感受性をモデュレーションするのに使用することができる。ＤＮＡ／ＰＯ−リンカーの配列は、ヌクレアーゼＳ１抽出物において２０分後に見られるように、開裂速度をモデュレーションすることができるため、領域Ｂについて（例えば、ＤＮＡ／ＰＯ−リンカーについて）の配列選択は、血清及びターゲット組織の細胞における開裂レベルをモデュレーションするのにも使用することができる。
【０２７４】
ホモジネート及び血清による開裂
肝臓及び腎臓ホモジネートならびに血清を、配列番号９のオリゴヌクレオチドと、組織１ｇ当たりに２００μgの濃度に加えた（以下の表を参照のこと）。ＮＭＲＩマウスから収集した肝臓及び腎臓サンプルを、ホモジナイゼーションバッファー（０．５％ Igepal CA-630、２５mM Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００mM ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（１N ＮａＯＨにより調節））中でホモジナイズした。ホモジネートを、３７℃で２４時間インキュベーションし、その後、ホモジネートを、フェノール−クロロホルムで抽出した。肝臓及び腎臓ならびに血清からの抽出物中の開裂性及び非開裂性オリゴヌクレオチドの含量を、上記ＨＰＬＣ法を使用して、標準に対して決定した。結果を、表１１に示す。
【表１４】
2017501684.tif 000024
【０２７５】
結論
ＰＯリンカー（又は、本明細書において領域Ｂと呼ぶ）は、肝臓又は腎臓ホモジネート中でのオリゴヌクレオチドからのコンジュゲート（又は、基Ｃ）の開裂をもたらすが、血清中では同開裂をもたらさない。注記：上記アッセイ法における開裂は、開裂性リンカーの開裂を意味し、オリゴマー又は領域Ａは、機能的にインタクトなままであるべきである。
【０２７６】
実施例７に示されているアッセイ法における開裂に対する感受性は、リンカーが生体開裂性であるか、又は、生理学的に不安定性であるかどうかを決定するのに使用することができる。
【０２７７】
実施例７：ＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートによるｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウン、組織含量及び血清総コレステロール
【表１５】
2017501684.tif 000025
【０２７８】
領域Ａ：大文字は、ＬＮＡヌクレオシド（例えば、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ）であり、小文字は、ＤＮＡヌクレオシドである。下付きのｓは、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を表わす。ＬＮＡシトシンは、場合により、５−メチルシトシンである。領域Ｂ：２ＰＯリンカーは、配列領域Ａに対する５’であり、ホスホジエステル結合により結合している（  ）中に示された２つのＤＮＡヌクレオシドを含む。領域Ｂの３’ＤＮＡヌクレオシドと領域Ａの５’ＬＮＡヌクレオシドとの間のヌクレオシド間結合も、ホスホジエステルである。Ｃ６リンカーの形式における結合基（Ｙ）（表には示さず）は、コンジュゲート基を領域Ｂ（配列番号７）又は領域Ａ（配列番号２０及び３０）に結合させるのに使用されている。
【０２７９】
生理食塩水、あるいは、０２５mg/kg コンジュゲートしていないＬＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３）、又は、等モル量の、ＧａｌＮＡｃ１（配列番号３０）、ＧａｌＮＡｃ２（配列番号２０）もしくはコレステロール（２ＰＯ）（配列番号７）にコンジュゲートしているＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを、単回投与において、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、ｉｖ又はｓｃのいずれかで注入し、以下の表（実験設計）に基づいて、１〜７日目に殺処分した。
【０２８０】
ＲＮＡを、肝臓及び腎臓から単離し、ＡｐｏＢ特異的プライマー及びプローブを使用するｑＰＣＲに供して、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウンについて分析した。オリゴヌクレオチド含量を、ＥＬＩＳＡ法を使用して測定した。血清中の総コレステロールを測定した。結果を、図１６及び１７に示す。
【０２８１】
材料及び方法
実験設計
【表１６】
2017501684.tif 000026
【０２８２】
投与量
到着時に約２０ｇであったＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍメスの動物に、（０日目の体重に基づいて）体重１kg当たりに、上記表に基づいて、生理食塩水中に配合した化合物又は生理食塩水単独 10mLを、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．投与した。
【０２８３】
肝臓及び腎臓組織のサンプリング
動物を、７０％ＣＯ２−３０％Ｏ２で麻酔し、頸椎脱臼により、上記表に基づいて殺処分した。肝臓の大きな葉の半分及び１つの腎臓を細かく刻み、RNAlaterに浸した。もう半分の肝臓及びもう１つの腎臓を凍結させ、組織分析に使用した。
【０２８４】
トータルＲＮＡの単離及び第１鎖の合成
トータルＲＮＡを、Qiagen RNeasyキット（Qiagen cat. no. 74106）を使用し、製造メーカーの説明書に従って、RLT-溶解バッファーの存在下において、ビーズ粉砕することによりホモジナイズした、最大３０mg 組織から抽出した。第１鎖の合成を、Ambionからのリバーストランスクリプターゼ試薬を使用し、製造メーカーの説明書に従って行った。
【０２８５】
各サンプルについて、０．５μg トータルＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリー水で（１０．８μL）に調節し、ランダムデカマー（５０μM） ２μL及びｄＮＴＰミックス（２．５mM 各ｄＮＴＰ） ４μLと混合し、７０℃で３分間加熱した。その後、サンプルを、氷上で急速に冷却した。１０×バッファーＲＴ ２μL、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（１００U/μL） 1μL及びＲＮａｓｅ阻害剤（１０U/μL） ０．２５μLを、各サンプルに加え、続けて、４２℃で６０分間インキュベーションし、９５℃で１０分間酵素を熱不活性化させ、ついで、サンプルを、４℃に冷却した。ｃＤＮＡサンプルを、１：５で希釈し、製造メーカーのプロトコールに従って、Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x（Applied Biosystems、Cat #4364103）及びTaqman gene expression assay（mApoB  Mn01545150_m1及びmGAPDH  #4352339E）を使用するＲＴ−ＱＰＣＲに供し、Applied Biosystems RT-qPCR機器(7500/7900又はViiA7)において、ファーストモードで処理した。肝臓及び腎臓中のオリゴヌクレオチド含量を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０２８６】
血清コレステロール分析
殺処分直前に、後眼窩洞血を、血清調製のために、S-monovette Serum-Gelバイアル（Sarstedt, Numbrecht, Germany）を使用して収集した。血清を、ABX Pentra Cholesterol CP（Triolab, Brondby, Denmark）を使用し、製造メーカーの説明書に従って、総コレステロールについて分析した。
【０２８７】
結論
ＡｐｏＢ  ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたＧａｌＮＡｃ１及びＧａｌＮＡｃ２（配列番号３０及び２０）は、コンジュゲートしていないＡｐｏＢ  ＬＮＡより良好なＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンを示した（図１６）。ＧａｌＮＡｃ１について、コンジュゲート（配列番号３０）は、ｉｖ投与がｓｃ投与より良好であると考えられる。これは、驚くべきことである。反対のことが、別のＧａｌＮＡｃクラスターについて報告されているためである（Alnylam, 8th Annual Meeting of the Oligonucleotide Therapeutics Society）。総コレステロール（ＴＣ）データは、ＧａｌＮＡｃクラスターコンジュゲート（配列番号３０及び２０）が、コンジュゲートしていない化合物（配列番号３）及びコレステロールコンジュゲート化合物（配列番号７）より、ｉｖ及びｓｃ投与の両方において、どの程度良好な効果を提供するかを示す（図１７、ａ及びｂ）。オリゴヌクレオチドの組織含量（図１８、ａ〜ｆ）は、親化合物と比較して、コンジュゲートが肝臓における取り込みをどの程度向上させ、一方、腎臓における取り込みをほとんど提供しないかを示す。これは、ｉｖ及びｓｃ投与の両方について保っている。ｉｖ投与した場合、ＧａｌＮＡｃ１（配列番号３０）は、ＧａｌＮＡｃ２（配列番号２０）と比較した場合、非常に優れた肝臓における取り込みを提供する。ただし、活性は両化合物について良好であるため、ＧａｌＮＡｃ２コンジュゲートは、ＧａｌＮＡｃ１コンジュゲートより高い特異的活性を誘導すると考えられる。このことは、薬物動態学的モデュレーターを有しないＧａｌＮＡｃコンジュゲートが、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に特に有用であることができる。
【０２８８】
実施例８．ＧａｌＮＡｃ−コンジュゲートによるｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウン及び血清総コレステロール
ＡｐｏＢ化合物の活性における種々のコンジュゲーション部分の作用の持続性を調査するために、配列番号２７を、コレステロール＋生体開裂性リンカー（ホスホジエステル骨格（ＰＯ）を有する２つのＤＮＡヌクレオチド；配列番号２８）又はＧａｌＮＡｃクラスター（配列番号２９）のいずれかにコンジュゲートさせた。より詳細な構築物については、表６を参照のこと。生理食塩水対照、又は、単回投与の０．１、０．２５もしくは１．０mg/kg 配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９それぞれを、Ｃ５７ＢＬ６Ｉｎマウスに、ｉ．ｖ．注入した（コンジュゲートしているものは、コンジュゲートしていない配列番号２７に対して等モルで投与した）。各化合物の単回注入後４、７、１０、１４及び２４日目の血漿コレステロールの分析により、効果をモニターした。４匹の動物の群を、単回注入後４、１４及び２４日目に殺処分し、ＲＮＡを、肝臓及び腎臓サンプルから単離し、実施例７に記載されているＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ発現について分析した。結果を、表１３に示す。
【表１７】
2017501684.tif 000027
【０２８９】
データを、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、同じ時点で殺処分した生理食塩水処置動物のパーセントとして表した。データは、平均±ＳＤである。
【０２９０】
総血清コレステロールを、０、４、７、１０、１４及び２４日目に、実施例７に記載されているように分析した。結果を、図２１に示す。
【０２９１】
配列番号２７を有するオリゴヌクレオチドのコレステロール及びＧａｌＮＡｃコンジュゲート型は両方とも、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドと比較して、肝臓におけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの向上したダウンレギュレーションを示す。特に、ＧａｌＮＡｃコンジュゲーションは、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチド及びコレステロールコンジュゲーションの両方と比較した場合、改善した効果をもたらす。同じ効果が、総血清コレステロールレベルにおいて観察される。ここで、両コンジュゲートは、１．０mg/kgの用量で非常に効率的である。用量を少なくした場合、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（配列番号２９）は、コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチド及びコレステロールコンジュゲーションの両方と比較した場合、より効率的であると考えられる。
【０２９２】
実施例９：非ヒト霊長類研究；複数回ｓ．ｃ．注入
この非ヒト霊長類研究の目的は、化合物を皮下注入（ｓ．ｃ．）により投与した場合における、繰り返し投与設定における抗−ＡｐｏＢ化合物の有効性及び安全性を評価することであった。この研究に使用した化合物を、配列番号２７、２８及び２９とし、０．６２５及び２．５mg/kgの初濃度で、滅菌した生理食塩水（０．９％）中に調製した。
【０２９３】
少なくとも２４月齢のオスザルを使用し、水道水へのフリーアクセスを与え、１８０ｇ OWM(E) SQC SHORT expanded diet（Dietex France, SDS, Saint Gratien, France）を、動物当たりに毎日配った。加えて、果物又は野菜を、各動物に毎日与えた。動物を、処置期間の開始前に、研究条件に少なくとも１４日の期間順応させた。この期間中に、処置前研究を行った。動物に、注入当たりに０．１mg/kg又は０．５mg/kgの用量で、週に１回、４週間ｓ．ｃ．投与した。１日目、８日目、１５日目及び２２日目における注入により、４週の期間にわたり合計４回注入した。投与容量を、注入当たりに０．４mL/kgとした。２匹の動物のみを含有する、コンジュゲートしていないオリゴマー（配列番号２７）についての群を除いて、４匹の動物を、群当たりに使用した。４回目で最後の投与後、動物を、１週間（２９日目）観察した。その後、肝臓のＡｐｏＢ転写レギュレーション、脂質パラメータ、肝臓及び腎臓組織学ならびに肝臓及び腎臓の組織分布を研究するために、動物の内の２匹を殺処分した。残りの２匹の動物を、更に７週間続けた。１日目は、処置期間の初日に対応する。臨床観察ならびに体重及び摂取（群当たり）を、研究前及び研究中に記録した。
【０２９４】
血液及び組織をサンプリングし、下記時点で分析した。
【表１８】
2017501684.tif 000028
【０２９５】
血液（約１．０mL）を、リチウムヘパリン管に採取し、（ADVIA 1650血液生化学分析機を使用して）ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン、グルコース、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素、クレアチニン、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、クレアチンキナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ、総タンパク質、アルブミン、アルブミン／グロビン比を分析した。
【０２９６】
血液の分析
ＡｐｏＢ分析のための血液サンプルを、−８、−１、４、８、１５、２２、２９、３６、４３及び５０日目に、群１〜１６の動物のみ（すなわち、抗−ＡｐｏＢ化合物により処置した動物）から収集した。静脈血（約２mL）を、各動物における適切な血管から、血清分離チューブ（ＳＳＴ）内に収集し、室温で少なくとも６０±３０分間凝固させた。血液を、（＋４℃を維持するように設定された）冷蔵条件下において、１０００ｇで１０分間遠心分離した。血清を、３本の個々の管に移し、ＥＬＩＳＡによるＡｐｏＢタンパク質の分析まで−８０℃で保存した。
【０２９７】
国際公開第２０１０／１４２８０５号に記載されている他の分析は、ｑＰＣＲ、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ分析である。他の分析としては、ＥＬＩＳＡ（Mercodia No. 10-1106-01）による血清Ｌｐ（ａ）分析、組織及び血清のオリゴヌクレオチド分析（薬剤含量）、サンプル、標準−及びＱＣ−サンプルの抽出、ＥＬＩＳＡによるオリゴヌクレオチド含量決定があげられる。
【０２９８】
配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９についてのデータを、図２２に示す。これから、両コンジュゲートオリゴマー（配列番号２８及び２９）は、２回目の注入の時点において、コンジュゲートしていないオリゴマー（配列番号２７）より、同等の用量において効果的であった。特に、配列番号２７−ＧａｌＮＡｃ化合物（配列番号２９）は、血清ＡｐｏＢ及びＬＤＬ−Ｃの、急速で、用量依存性の非常に効果的なダウンレギュレーションを提供した。このことは、実施例５に記載されている単回投与実験におけるのと全く同じであり、配列番号２７のＧａｌＮＡｃコンジュゲーションが、配列番号２７のコレステロールコンジュゲーションより効果的であった、すなわち、配列番号２９の有効性は、配列番号２８の有効性より優れていることを実証した。これは、ＧａｌＮＡｃ化合物が、コンジュゲートしていない親化合物及び別のコンジュゲーション技術、例えば、コレステロールコンジュゲーションを使用する化合物（例えば、配列番号２８）の両方と比較して、比較的低頻度で、より少ない用量で投与することができることの兆候である。配列番号２７−ＧａｌＮＡｃ化合物（配列番号２９）は、２２日目の最後の注入後に、非常に長く継続する効果も示した。最後の処置後８週でも、血清中のＡｐｏＢ及びＬＤＬコレステロールレベルは、処置前のベースラインに戻っていなかった。配列番号２７−コレステロール化合物（配列番号２８）についての場合も同様であった。このことは、これらのコンジュゲート化合物の長い薬力学的半減期を示す。
【０２９９】
肝臓及び腎臓のオリゴヌクレオチド含量を、最後の注入後１週、すなわち、研究の２９日目に分析した。オリゴヌクレオチド含量を、（本質的には、Lindholm et al, Mol Ther. 2012 Feb;20(2):376-81に記載されているように）ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡを使用し、配列番号２７を使用して、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９で処置した動物からのサンプルのための検量線を作製し、（コンジュゲートしている）配列番号２８又は配列番号２９を検量線の作製に使用した場合に、結果の変化がないように調整した後に分析した。結果を、表１４に示す。
【表１９】
2017501684.tif 000029
【０３００】
上記表に実証されているように、配列番号２９（ＧａｌＮＡｃコンジュゲーション）は、コンジュゲートしてない化合物（配列番号２７）及びコレステロールコンジュゲート化合物（配列番号２８）の両方の、各化合物の等モル量の４週間のｓ．ｃ．注入後と比較して、肝臓／腎臓分布における強力なシフトを実証している。より高い肝臓／腎臓比へのシフトは、維持又は改善した有効性と共に、より高いｖｓより低い肝臓／腎臓比のオリゴヌクレオチド組織含量を有する化合物についての改善した安全性プロファイルをもたらすことが期待される。
【図９】
2017501684.tif 000030
【図１０】
2017501684.tif 000031
【図１２Ｂ】
2017501684.tif 000032
【図１２Ｃ】
2017501684.tif 000033
【図１２Ｄ−２】
2017501684.tif 000034
【図１２Ｅ】
2017501684.tif 000035
【図１３−１】
2017501684.tif 000036
【図１３−２】
2017501684.tif 000037
【図１３−３】
2017501684.tif 000038
【図１３Ａ】
2017501684.tif 000039
【図１４】
2017501684.tif 000040
【図１】
2017501684.tif 000041
【図２】
2017501684.tif 000042
【図３】
2017501684.tif 000043
【図４】
2017501684.tif 000044
【図５】
2017501684.tif 000045
【図６】
2017501684.tif 000046
【図７】
2017501684.tif 000047
【図８】
2017501684.tif 000048
【図１１】
2017501684.tif 000049
【図１２】
2017501684.tif 000050
【図１２Ａ】
2017501684.tif 000051
【図１２Ｄ−１】
2017501684.tif 000052
【図１５】
2017501684.tif 000053
【図１６】
2017501684.tif 000054
【図１７ａ）】
2017501684.tif 000055
【図１７ｂ）】
2017501684.tif 000056
【図１８ａ）】
2017501684.tif 000057
【図１８ｂ）】
2017501684.tif 000058
【図１８ｃ）】
2017501684.tif 000059
【図１８ｄ）】
2017501684.tif 000060
【図１８ｅ）】
2017501684.tif 000061
【図１８ｆ）】
2017501684.tif 000062
【図１９】
2017501684.tif 000063
【図２０】
2017501684.tif 000064
【図２１】
2017501684.tif 000065
【図２２】
2017501684.tif 000066
【配列表】
2017501684000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月4日(2015.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンジュゲート部分（領域Ｃ）と結合している、配列番号２のオリゴヌクレオチドモチーフを有するオリゴマーを含み、ここで、コンジュゲート部分は、１つ以上のＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項２】
オリゴマーが、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位及び２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群より選択される、少なくとも２つの親和性向上ヌクレオチド類縁体を含む、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項３】
オリゴマーが、配列番号２７：５’  ＧｓＴｓｔｓｇｓａｓｃｓａｓｃｓｔｓｇｓＴｓＣ  ３’に対応し、ここで、大文字が、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡを表わし、小文字が、ＤＮＡヌクレオシドを表わし、ＬＮＡシトシンが、５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間の全ての結合が、ｓにより示されているホスホロチオアートである、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項４】
オリゴマーが、ＡｐｏＢを発現している細胞中でのＡｐｏＢの発現をダウンレギュレーション可能である、請求項１〜３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項５】
前記コンジュゲート部分が、開裂性リンカー（Ｂ）を介して、前記オリゴマーに結合している、請求項１〜４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項６】
開裂性リンカーが、開裂性リシンリンカーを含む、請求項５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項７】
コンジュゲート部分が、１〜３個のＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、コンジュゲート部分をオリゴマーに共有結合させるリンカーＹを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項９】
リンカー領域Ｙが、脂肪酸、例えば、Ｃ６リンカーを含む、請求項８記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１０】
コンジュゲート部分が、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分とリンカー（Ｂ及び／もしくはＹ）又はオリゴマーとの間にＰＥＧスペーサを含む、請求項１〜９のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１１】
コンジュゲート部分が、ＰＥＧスペーサを介して、開裂性ジ−リシンリンカーにそれぞれ独立して結合している３つのＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１２】
コンジュゲートが、Ｃｏｎｊ１、Ｃｏｎｊ２、Ｃｏｎｊ３、Ｃｏｎｊ４、Ｃｏｎｊ１ａ、Ｃｏｎｊ２ａ、Ｃｏｎｊ３ａ及びＣｏｎｊ４ａからなる群より選択されるコンジュゲート部分を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１３】
配列番号２９又は配列番号３１からなる、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートと、薬学的に許容し得る希釈剤、担体、塩又は補助剤とを含む、
医薬組成物。
【請求項１５】
医薬として使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物。
【請求項１６】
ＡｐｏＢを発現している細胞中において、ＡｐｏＢをｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する方法であって、
前記細胞中においてＡｐｏＢを阻害するために、請求項１〜１４のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を、前記細胞に投与することを含む、
方法。
【国際調査報告】
2017501684.tif 000067
2017501684.tif 000068
2017501684.tif 000069