(57)【要約】  本発明は、新たな化合物（E）-2-（5-（（4-メトキシ-2-（トリフルオロメチル）キノリン-6-イル）メトキシ）-2-（（4-（トリフルオロメチル）ベンジル）オキシ）-ベンジリデン）ヘキサン酸（MTTB）及びその誘導体に関する。本発明の化合物は選択的ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPAR）アンタゴニストとして有用であり、全身性炎症、敗血症及び敗血性ショック等の免疫関連疾患の治療への使用に適応される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）：
【化１】
2017522361.tif 000015
（式中、
R1及びR2は独立して非置換、一置換又は多置換のアリール又はヘテロアリール残基から選択され、
R1及びR2は異なり、
R3は非置換、一置換又は多置換のC1〜C10アルキルであり、該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）の化合物又はその立体異性体、誘導体若しくは塩。
【請求項２】
R3が非置換C1〜C8アルキル、又は非置換C2〜C6アルキル、又は非置換直鎖C4アルキルである、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R1が式（II）：
【化２】
2017522361.tif 000016
（式中、R4〜R8は独立してH、OH、SH、非置換、一置換若しくは多置換のC1〜C18アルキル（該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）、アルケニル、トリフルオロメチル、非置換、一置換若しくは多置換のアリール若しくはヘテロアリール残基、非置換、一置換若しくは多置換のベンジル基、アシル基又はホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、又は分岐した若しくはヘテロ原子若しくはアリールで置換されたアシル基、アルコキシ置換基又は-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、若しくは-OtBu（そのアルキル基は分岐、非分岐又は環状である）、硫黄原子を介して結合したアルキル基又は-SMe若しくは-SEt、又はスルホニル基又は-SO3H、-S02Me、-S02CF3、-SO2C6H4CH3若しくはS02C6H4CH2Br、又は窒素置換基又は-NH2、-NHR、-NRR'（R、R'=アルキル、アリール等）、-NC若しくは-NO2、又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、-CN、又はヘテロ置換基から選択される）を有するラジカルである、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
R4、R5、R7及びR8がHであり、R6がトリフルオロメチル（-CF3）である、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
R2が式（III）：
【化３】
2017522361.tif 000017
（式中、
X及びZは独立してC又はNから選択され、
R9〜R12は独立してH、ヒドロキシル、非置換、一置換若しくは多置換のC1〜C18アルキル（該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）、アルケニル、トリフルオロメチル、非置換、一置換若しくは多置換のアリール若しくはヘテロアリール残基、非置換、一置換若しくは多置換のベンジル基、アシル基又はホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、又は分岐した若しくはヘテロ原子若しくはアリールで置換されたアシル基、アルコキシ置換基又は-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、若しくは-OtBu（そのアルキル基は分岐、非分岐又は環状である）、硫黄原子を介して結合したアルキル基又は-SMe若しくは-SEt、又はスルホニル基又は-SO3H、-S02Me、-S02CF3、-SO2C6H4CH3若しくはS02C6H4CH2Br、又は窒素置換基又は-NH2、-NHR、-NRR'（R、R'=アルキル、アリール）、-NC若しくは-NO2、又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、-CN、又はヘテロ置換基から選択される）のラジカルである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
ZがNであり、XがCである、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
R10及びR12がHであり、R9が-OMet（-OCH3）であり、R11がトリフルオロメチル（-CF3）若しくは（E）-2-（5-（（4-メトキシ-2-（トリフルオロメチル）キノリン-6-イル）メトキシ）-2-（（4-（トリフルオロメチル）ベンジル）オキシ）ベンジリデン）ヘキサン酸（MTTB）である、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物を作製又は化学合成する方法。
【請求項９】
免疫疾患、又は全身性炎症若しくは敗血症の治療又は予防に使用される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
（a）請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物と、（b）敗血症又は全身性炎症の治療に有効な第2の化合物とを含む組合せ。
【請求項１１】
敗血症又は全身性炎症の治療に有効な前記第2の化合物（b）が別のPPARγアンタゴニスト、免疫抑制剤、抗生物質、昇圧剤、コルチコステロイド又は活性化プロテインCから選択される、請求項10に記載の組合せ。
【請求項１２】
免疫疾患の治療に使用される、請求項10又は11に記載の組合せ。
【請求項１３】
細胞と請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物とを接触させることを含む、細胞内のPPARγを阻害するin vitro方法。
【請求項１４】
請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物又は請求項10〜12のいずれか一項に記載の組合せを含み、任意に薬学的に許容可能な担体、アジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな化合物（E）-2-（5-（（4-メトキシ-2-（トリフルオロメチル）キノリン-6-イル）メトキシ）-2-（（4-（トリフルオロメチル）ベンジル）オキシ）ベンジリデン）ヘキサン酸（MTTB）及びその誘導体に関する。本発明の化合物は選択的ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）アンタゴニストとして有用であり、全身性炎症、敗血症及び敗血性ショック等の免疫関連疾患の治療への使用に適応される。
【背景技術】
【０００２】
全身性炎症、敗血症及び敗血性ショックは毎年約60000人の死者を出しており、したがってドイツにおける死亡原因の第3位である致命的な合併症である。この病態の発生率は、高齢化並びに免疫不全患者及び重症患者の数の増加のために上昇している。敗血症は、体内に侵入する細菌及び／又は真菌病原体によって引き起こされる感染に対する身体の応答に起因する複合臨床症候群を含む。通常、強力で複雑な免疫カスケードによりヒトにおける微生物侵入に対する迅速な防御応答が確実になる。しかしながら、免疫防御不全により感染が確立される可能性がある。さらに、過剰な又は調節が不十分な応答が内因的に生成された炎症性化合物の不適応な放出により宿主に悪影響を及ぼす場合もある。敗血症は高炎症段階に続く低炎症段階を特徴とし、この低炎症段階は「免疫麻痺」としても知られている。特に免疫麻痺段階は患者にとって危険である。ここでは適応免疫系のT細胞がアポトーシス及び静止を受ける。したがって患者は二次感染によって死亡することが多い。
【０００３】
敗血症を治療する現在のアプローチは、疾患進行を抑制するために疾患の高炎症段階に焦点を合わせたものである。しかしながら、治療は非常に早期の敗血症の診断に依存するため、現在ほとんど成功していない。他の治療的アプローチは単に疾患の症状を標的とするものである。敗血症の治療のための既知の方法としては、抗生物質、抗体、小分子及びペプチド、プロテインC、酸素による支持療法、静脈内輸液、並びに血圧を上昇させる薬物治療が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、重篤感染の治療における過去数十年の大きな進歩にもかかわらず、敗血症の発生率及び敗血症による死亡率は増加し続けている。したがって、敗血症の予防及び治療のための新たな方法及び組成物が必要とされている。
【０００５】
脂肪細胞において細胞内に発現されるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPAR-γ又はPPARG）は、プロスタノイド及びチアゾリジンジオン（TZD）リガンドに応答した脂肪細胞の遺伝子発現及び分化の調節によるインスリン感度の制御において中心的役割を果たす多機能核内受容体型転写因子である。これは細胞分化転換、癌細胞の末端分化及び炎症過程の変調における中心的存在としても特定されている。該タンパク質は結腸及び乳房上皮細胞、骨髄、白血球細胞株及びT細胞等の他の組織、並びにマクロファージにおいても発現され、TZDの抗炎症作用及びアテローム性動脈硬化症の進行に対するそれらの影響とも関連付けられている。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γの高度発現がヒト原発性及び転移性乳腺癌並びにアルツハイマー病の脳において実証されており、対立遺伝子変異体が散発性結腸癌において報告されている。
【０００６】
核ホルモン受容体スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、PPARγの組織及びリガンド特異的な活性化並びに転写標的遺伝子調節は多段階プロセスである（非特許文献1、非特許文献2）。このプロセスは幾つかの天然及び合成リガンドの特異的結合（非特許文献3、非特許文献4）、レチノイドX受容体α（RXRα）とのヘテロ二量体化、それらの標的遺伝子のプロモーター領域における配列特異的PPARγ応答配列（PPRE）の認識及び相互作用、最終的に補助因子及び他の核共調節タンパク質の動員を伴う（非特許文献5、非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8）。
【０００７】
PPARγは、例えば脂肪細胞タンパク質2（aP2）、分化抗原群36（CD36）、リポタンパク質リパーゼ（LPL）又はグルコース輸送体4（GLUT4）の遺伝子発現を主に誘導する脂質生成及びグルコース代謝におけるその役割のために、治療標的として集中的に研究されている（非特許文献9、非特許文献10）。高い受容体親和性を有する最も顕著な合成PPARγアゴニストはチアゾリジンジオン（TZD）である。これらは2型糖尿病において使用され、インスリン感度を改善し、同時に遊離グルコースレベルの低下をもたらしている（非特許文献11、非特許文献12）。PPARγは他のタンパク質に直接結合し、シグナル伝達を阻害することもできる。転写抑制と呼ばれるこの能力は、PPARγと活性化B細胞核因子「κ軽鎖エンハンサー」（NFkB）、活性化T細胞核因子（NFAT）又は活性化タンパク質1（AP-1）等の他の転写因子との間の直接タンパク質間相互作用によって主に媒介される（非特許文献13、非特許文献14、非特許文献15）。
【０００８】
このようにPPARγは炎症性シグナリングを阻害し、抗炎症応答を誘導する（非特許文献16、非特許文献17）。これに関連して、TZDによるPPARγの活性化は炎症の低減に有効である。in vivoでのTZDの立証済みの有益な効果及び広範な使用とは対照的に、これらは顕著な体重増加、末梢浮腫、鬱血性心不全及び骨折を含む多数の有害な副作用、重大な忍容性及び安全性の問題とも関連する（非特許文献18、非特許文献19）。また一方で、PPARγはアポトーシスを誘導することにより免疫抑制活性を示す。近年、特にPPARγアンタゴニストである2-クロロ-5-ニトロベンズアニリド（GW9662）によるPPARγ拮抗作用（非特許文献20）によって、乳癌等の広範囲の癌型に対する新たな薬物及び治療戦略の開発（非特許文献2、非特許文献21）、並びに免疫及び炎症性疾患の変調（非特許文献22）が導かれた。PPARγタンパク質への不可逆的結合のために、GW9962は治療的使用に好適でない。PPARγの生理学的役割及び臨床的関連性の理解の高まりから、既知の副作用を回避した上で新たなPPARγアゴニスト、アンタゴニスト又は選択的PPARγモジュレーター（SPPARγM）を発見、同定及び特性化する緊急の必要性が強調されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kliewer et al., 1994
【非特許文献２】Seargent et al., 2004
【非特許文献３】Forman et al., 1995
【非特許文献４】Kliewer et al., 1995
【非特許文献５】Nolte et al., 1998
【非特許文献６】Chawla et al., 2001
【非特許文献７】Kliewer et al., 2001
【非特許文献８】Spiegelman et al., 2004
【非特許文献９】Lehmann et al., 1995
【非特許文献１０】Tontonoz et al., 1995
【非特許文献１１】Rangwala et al., 2004
【非特許文献１２】Staels et al., 2005
【非特許文献１３】Yang et al., 2000
【非特許文献１４】Wang et al., 2001
【非特許文献１５】Chen et al., 2003
【非特許文献１６】Pascual et al., 2006
【非特許文献１７】Ricote et al., 2007
【非特許文献１８】Nesto et al., 2003
【非特許文献１９】Nissen et al., 2007
【非特許文献２０】Leesnitzer et al., 2002
【非特許文献２１】Burton et al., 2008
【非特許文献２２】Schmidt et al., 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、今日まで敗血症及び全身性炎症性障害等の病的炎症を特徴とする疾患を治療又は予防するのに十分な治療的アプローチは存在していない。さらに、免疫関連疾患又は他の疾患の治療に適用され得る、より有益な毒性プロファイルを有する選択的PPARアンタゴニストの同定が継続して必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題は、第1の態様において、式（I）：
【化１】
2017522361.tif 000002
（式中、
R1及びR2は独立して非置換、一置換又は多置換のアリール又はヘテロアリール残基から選択され、
R1及びR2は異なり、
R3は非置換、一置換又は多置換のC1〜C10アルキル（alkyl）であり、該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）の化合物又はその立体異性体、誘導体若しくは塩によって解決される。
【００１２】
本発明において「ヘテロアリール」という用語は、環構造中に窒素、酸素又は硫黄であり得る少なくとも1つのヘテロ原子を有する単環式、二環式又は多環式のヘテロ芳香族化合物を包含する。この定義に含まれる代表的なヘテロアリールラジカルは、例えばピリジン、キノリン、ピロール、インドール、チオフェン、ベンズイミダゾール、テトラゾール、ピリミジン（pyrimidine）等である。
【００１３】
「アリール」という用語は好ましくは炭素数6〜10の芳香族ラジカル、例えばフェニル、トリル等を表す。「ヘテロ置換基」という用語は本発明の意味において、少なくとも1つの非炭素鎖原子（ヘテロ原子）、好ましくは酸素、窒素又は硫黄から選択されるヘテロ原子を有する任意の置換基を包含するものとする。
【００１４】
驚くべきことに、本発明の化合物がPPARγアゴニストに対して試験した場合に競合的拮抗作用、本発明の化合物の非常に高い細胞内蓄積、GW9662等の現行の技術水準のPPARγアンタゴニストと比較して低い細胞毒性及び僅かなPPARγアゴニスト作用を呈することが発見された。
【００１５】
本発明の好ましい実施の形態は、R1及びR2が一置換又は多置換のアリール又はヘテロアリールである化合物に関する。
【００１６】
本発明の別の実施の形態は、R3が非置換C1〜C8アルキル、好ましくは非置換C2〜C6アルキル、最も好ましくは非置換直鎖C4アルキルである化合物に関する。
【００１７】
R1は本発明の付加的又は代替的な実施の形態において、好ましくは式（II）：
【化２】
2017522361.tif 000003
を有するラジカルであり得る。
【００１８】
式（II）中、R4〜R8は独立してH、OH、SH、非置換、一置換若しくは多置換のC1〜C18アルキル（該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）、アルケニル、トリフルオロメチル、非置換、一置換若しくは多置換のアリール若しくはヘテロアリール残基、非置換、一置換若しくは多置換のベンジル基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、又は分岐した若しくはヘテロ原子若しくはアリールで置換されたアシル基等、アルコキシ置換基、例えば-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu等（そのアルキル基は分岐、非分岐又は環状である）、硫黄原子を介して結合したアルキル基、例えば-SMe、-SEt等、又はスルホニル基、例えば-SO3H、-S02Me、-S02CF3、-SO2C6H4CH3若しくはS02C6H4CH2Br等、又は窒素置換基、例えば-NH2、-NHR、-NRR'（R、R'=アルキル、アリール等）、-NC若しくは-NO2等、又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、-CN、又はヘテロ置換基から選択される。R4、R5、R7及びR8がHであり、R6がトリフルオロメチル（-CF3）であることが更に好ましい。
【００１９】
付加的又は代替的には、本発明の化合物が式（III）：
【化３】
2017522361.tif 000004
（式中、
X及びZは独立してC又はNから選択され、
R9〜R12は独立してH、ヒドロキシル、非置換、一置換若しくは多置換のC1〜C18アルキル（該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）、アルケニル、トリフルオロメチル、非置換、一置換若しくは多置換のアリール若しくはヘテロアリール残基、非置換、一置換若しくは多置換のベンジル基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、又は分岐した若しくはヘテロ原子若しくはアリールで置換されたアシル基等、アルコキシ置換基、例えば-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu等（そのアルキル基は分岐、非分岐又は環状である）、硫黄原子を介して結合したアルキル基、例えば-SMe、-SEt等、又はスルホニル基、例えば-SO3H、-S02Me、-S02CF3、-SO2C6H4CH3若しくはS02C6H4CH2Br等、又は窒素置換基、例えば-NH2、-NHR、-NRR'（R、R'=アルキル、アリール等）、-NC若しくは-NO2等、又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、-CN、又はヘテロ置換基から選択される）のラジカルであるR2を含む。
【００２０】
本実施の形態では、Zは好ましくはNであり、Xは好ましくはCである。
【００２１】
さらにR10及びR12がHであり、R9が-OMet（-OCH3）であり、R11がトリフルオロメチル（-CF3）であることが好ましい場合もある。
【００２２】
本発明において、式（IV）：
【化４】
2017522361.tif 000005
を有する（E）-2-（5-（（4-メトキシ-2-（トリフルオロメチル）キノリン-6-イル）メトキシ）-2-（（4-（トリフルオロメチル）ベンジル）オキシ）-ベンジリデン）ヘキサン酸（MTTB）が最も好ましい。
【００２３】
特に好ましい化合物のサブグループは、上述のラジカルR1〜R12の定義を有する以下の一般構造式に関する。
【００２４】
一般式（V）：
【化５】
2017522361.tif 000006
を有する化合物。
【００２５】
R2は非置換、一置換又は多置換のアリール又はヘテロアリール残基から選択され、好ましくはR2は式（III）：
【化６】
2017522361.tif 000007
（式中、
X及びZは独立してC又はNから選択され、
R9〜R12は独立してH、ヒドロキシル、非置換、一置換若しくは多置換のC1〜C18アルキル（該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）、アルケニル、トリフルオロメチル、非置換、一置換若しくは多置換のアリール若しくはヘテロアリール残基、非置換、一置換若しくは多置換のベンジル基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、又は分岐した若しくはヘテロ原子若しくはアリールで置換されたアシル基等、アルコキシ置換基、例えば-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu等（そのアルキル基は分岐、非分岐又は環状である）、硫黄原子を介して結合したアルキル基、例えば-SMe、-SEt等、又はスルホニル基、例えば-SO3H、-S02Me、-S02CF3、-SO2C6H4CH3若しくはS02C6H4CH2Br等、又は窒素置換基、例えば-NH2、-NHR、-NRR'（R、R'=アルキル、アリール等）、-NC若しくは-NO2等、又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、-CN、又はヘテロ置換基から選択される）のラジカルである。
【００２６】
本実施の形態では、Zは好ましくはNであり、Xは好ましくはCである。
【００２７】
さらにR10及びR12がHであり、R9が-OMet（-OCH3）であり、R11がトリフルオロメチル（-CF3）であることが好ましい場合もある。
【００２８】
代替的又は付加的には、R4〜R8は独立してH、OH、SH、非置換、一置換若しくは多置換のC1〜C18アルキル（該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）、アルケニル、トリフルオロメチル、非置換、一置換若しくは多置換のアリール若しくはヘテロアリール残基、非置換、一置換若しくは多置換のベンジル基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、又は分岐した若しくはヘテロ原子若しくはアリールで置換されたアシル基等、アルコキシ置換基、例えば-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu等（そのアルキル基は分岐、非分岐又は環状である）、硫黄原子を介して結合したアルキル基、例えば-SMe、-SEt等、又はスルホニル基、例えば-SO3H、-S02Me、-S02CF3、-SO2C6H4CH3若しくはS02C6H4CH2Br等、又は窒素置換基、例えば-NH2、-NHR、-NRR'（R、R'=アルキル、アリール等）、-NC若しくは-NO2等、又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、-CN、又はヘテロ置換基から選択される。R4、R5、R7及びR8がHであり、R6がトリフルオロメチル（-CF3）であるのがより好ましい。
【００２９】
一般式（VI）：
【化７】
2017522361.tif 000008
を有する化合物も好ましい。
【００３０】
R2は非置換、一置換又は多置換のアリール又はヘテロアリール残基から選択され、好ましくはR2は式（III）：
【化８】
2017522361.tif 000009
（式中、
X及びZは独立してC又はNから選択され、
R9〜R12は独立してH、ヒドロキシル、非置換、一置換若しくは多置換のC1〜C18アルキル（該アルキルは直鎖、分岐又は環状であり得る）、アルケニル、トリフルオロメチル、非置換、一置換若しくは多置換のアリール若しくはヘテロアリール残基、非置換、一置換若しくは多置換のベンジル基、アシル基、例えばホルミル、アセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、フマリル、マレイル、スクシニル、ベンゾイル、又は分岐した若しくはヘテロ原子若しくはアリールで置換されたアシル基等、アルコキシ置換基、例えば-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu等（そのアルキル基は分岐、非分岐又は環状である）、硫黄原子を介して結合したアルキル基、例えば-SMe、-SEt等、又はスルホニル基、例えば-SO3H、-S02Me、-S02CF3、-SO2C6H4CH3若しくはS02C6H4CH2Br等、又は窒素置換基、例えば-NH2、-NHR、-NRR'（R、R'=アルキル、アリール等）、-NC若しくは-NO2等、又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、-CN、又はヘテロ置換基から選択される）のラジカルである。
【００３１】
本実施の形態では、Zは好ましくはNであり、Xは好ましくはCである。
【００３２】
さらにR10及びR12がHであり、R9が-OMet（-OCH3）であり、R11がトリフルオロメチル（-CF3）であることが好ましい場合もある。
【００３３】
式（V）及び（VI）の全ての化合物について、上記のR1及びR2に対応するラジカルは異なる。
【００３４】
本発明の別の態様は、本発明の化合物を作製又は化学合成する方法に関する。
【００３５】
本発明の化合物を作製又は化学合成する方法は以下の工程を含むのが好ましい：
【化９】
2017522361.tif 000010
（ここで、R1〜R3は上記で規定される通りであり、Xは反応基、好ましくはCl、Br、OTs又はOTfである）。
【００３６】
次に、更に別の態様は免疫疾患の治療又は予防に使用されるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）のアンタゴニストに関する。本態様では、PPARγアンタゴニストが選択的PPARγアンタゴニスト、ひいてはPPARγを誘導若しくはトランス活性化しないか、又は僅かにしか（好ましくは50 %未満、より好ましくは40 %、30 %、20 %未満、最も好ましくは10 %未満）誘導若しくはトランス活性化しないPPARγアンタゴニストであることが好ましい場合もある。かかる選択的な化合物は、特に本明細書に記載の新たなPPARγアンタゴニスト（antagonists）群の化合物である。
【００３７】
本発明において、PPARγの選択的アンタゴニストが免疫疾患の治療に有用であることが更に見出された。「免疫疾患」又は「免疫関連疾患」という用語は本発明の目的上、免疫系の病的な活性化又は抑制を特徴とする疾患又は病態を指すことが理解されるものとする。好ましい実施の形態では、免疫疾患は全身性炎症又は敗血症である。免疫疾患が低炎症段階の敗血症であるのが最も好ましい。
【００３８】
本明細書に記載の医学的使用のためのPPARγのアンタゴニストは、好ましくは本明細書の上記及び下記の発明の化合物であり、最も好ましくは化合物MTTBである。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「治療」及び「治療する」という用語は、疾患にかかるリスクがある患者又は疾患にかかっている疑いがある患者、及び病気の患者又は疾患若しくは医学的状態を患っていると診断された患者の治療を含む予防的（prophylactic or preventive）治療、及び治癒的又は疾患修飾治療の両方を指す。「治療」及び「治療する」という用語は、疾患を患っていないが、病的に活性な又は抑制された免疫等の不健康な病態の発症の影響を受けやすい可能性がある個体における健康の維持及び／又は増進も指す。その結果として、「有効量」は個体における疾患又は医学的状態を治療するか、又はより一般には栄養的、生理学的若しくは医学的な利益を個体にもたらす量である。
【００４０】
好ましくは本発明の免疫疾患の治療又は予防は、免疫疾患を患っているか、又は発症するリスクがある対象に対する治療上有効な用量の上記PPARγのアンタゴニストの投与を含む。免疫疾患の治療又は予防は上記対象への付加的な治療活性化合物の投与を含んでいてもよく、付加的な治療活性化合物は敗血症、全身性炎症又は敗血性ショック等の免疫疾患の治療に有効及び／又は有益である。
【００４１】
本発明の付加的な治療活性化合物は別のPPARγアンタゴニスト、免疫抑制剤、抗生物質、昇圧剤、コルチコステロイド又は活性化プロテインCから選択されるのが好ましい。
【００４２】
本発明の化合物の治療上活性又は有効な用量は、概して1日当たり0.1 mg/kg〜100mg/kg（患者の体重）、好ましくは1日当たり0.5mg/kg〜20 mg/kgの範囲であり、正確な用量は臨床医によって治療対象の病態の性質及び重症度、患者の体質等を考慮することで認められている基準に従って決定される。用量の決定は当業者のレベル内である。本発明の化合物は一般に最大28日間の期間にわたって投与される。より一般に、該タンパク質は1週間以下にわたって、多くの場合1日〜3日間の期間にわたって投与される。概して、本発明の化合物の治療有効量は敗血症の低炎症段階の臨床的に顕著な減少をもたらすのに十分な量である。
【００４３】
概して、投与される本発明のPPARγアンタゴニストの投与量は患者の年齢、体重、身長、性別、全身病状及び既往歴等の因子によって異なる。典型的には、服用者に約1 pg/kg〜10 mg/kg（作用物質の量／患者の体重）の範囲内の投与量の本発明のPPARγアンタゴニストを与えるのが望ましいが、より少ない又は多い投与量を状況に応じて投与することもできる。本発明の医薬組成物の具体的な実施の形態は本明細書で下記に提示する。
【００４４】
本発明の目的は（a）PPARγのアンタゴニストと、（b）敗血症又は全身性炎症の治療に有効な第2の化合物とを含む組合せによって付加的に解決される。
【００４５】
本発明の組合せは、好ましくは作用物質（a）として本明細書で上に記載されるようなPPARγのアンタゴニスト、最も好ましくはMTTB又はその誘導体を含む。作用物質（b）である敗血症又は全身性炎症の治療に有効な第2の化合物は、別のPPARγアンタゴニスト、免疫抑制剤、抗生物質、昇圧剤、コルチコステロイド又は活性化プロテインCから選択されるのが好ましい。
【００４６】
本発明の組合せは、本明細書で上に記載されるような免疫疾患の治療に使用される。
【００４７】
さらに、細胞内のPPARγを阻害するin vitro（exvivo）方法を提供する。該方法は細胞と本明細書に前述される化合物とを接触させる工程を含む。
【００４８】
疾患及び病態
本発明は過剰な細胞のアポトーシスを特徴とする疾患、例えば慢性HIV、EBV若しくはHCV感染、アルツハイマー病、パーキンソン病、又は虚血性心疾患等の免疫関連疾患又は病的アポトーシスの治療又は予防における治療剤として有用な新たなPPARγアンタゴニスト群を提供する。本発明に従うと、化合物及び組成物は病的な免疫又は炎症応答の活性化を特徴とする病態の治療及び／又は予防に特に有用である。特に本発明は敗血症、敗血性ショック及び全身性炎症性障害の治療の提供を目指すものである。
【００４９】
免疫関連疾患の治療又は予防のための組成物及びキット
本出願の別の態様は、免疫関連疾患の治療又は予防のための組成物、医薬組成物及びキットに関する。1つの実施の形態において、組成物は、場合により薬学的に許容可能な担体と合わせて本明細書に記載の化合物、組合せ又は組成物を含む。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という語は、医薬投与に適合した任意及び全ての溶媒、可溶化剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、滑沢剤、制御放出ベヒクル、ナノ粒子、リポソーム、希釈剤、乳化剤、保湿剤、滑沢剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤又は抗真菌剤、等張性吸収遅延剤等を含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び作用物質の使用は、当該技術分野においてよく知られている。任意の従来の媒体又は作用物質が本活性化合物と不適合である場合を除き、本組成物への使用が検討される。補助物質も本組成物に組み込むことができる。或る特定の実施の形態において、薬学的に許容可能な担体は血清アルブミンを含む。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するよう配合される。投与経路の例として、非経口、例えば髄腔内、動脈内、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮（局所）、及び経粘膜投与が挙げられる。
【００５２】
非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈液、例えば注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン；プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸、及び等張性を調節するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを含み得る。pHを酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調節することができる。非経口製剤をガラス又はプラスチック製のアンプル、携帯用シリンジ又は反復用量用バイアルに封入することができる。
【００５３】
注射使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末がある。静脈内投与において、好適な担体には、生理食塩水、静菌性水、クレモフォールEL（商標）（BASF、ニュージャージ州、パーシッパニー）又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）がある。全ての場合において、注射用組成物は滅菌されるものとし、シリンジ通過性（syringability）が容易である範囲の流体であるものとする。組成物は製造及び保存の条件下において安定する必要があり、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保護する必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコール液等）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であってよい。適度な流動性は、例えばレシチン等のコーティング剤の使用により、分散液の場合は必要となる（required）粒子径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により実現することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール（mannitol）、ソルビトール、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、組成物中に吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むことによりもたらされ得る。
【００５４】
滅菌注射溶液を、適切な溶媒中に必要となる量の活性化合物（例えばニューレグリン）と、必要な場合、上記に列挙した成分の1つ又は組合せとを組み込み、その後濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体及び必要とする上記に列挙した他の成分を含有する滅菌ベヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより先程の滅菌濾過したその溶液から活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【００５５】
経口組成物は一般に不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらをゼラチンカプセルに封入し、又は錠剤に圧縮することができる。経口治療剤投与のため、本活性化合物を賦形剤とともに組み込むことができ、錠剤、トローチ又はカプセルの形態において使用することができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用する液体担体を用いて調製することができ、この場合液体担体中の化合物は経口に適用され、すすぎ、吐き出し又は飲み込まれる。薬学的に相溶性のある結合剤及び／又は補助材料は本組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれか又は類似の性質の化合物を含有することができる：微晶質セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチン等の結合剤；デンプン若しくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）若しくはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはステーテス（Stertes）等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤；スクロース若しくはサッカリン等の甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ風味剤等の着香剤。
【００５６】
吸入による投与において、化合物を好適な推進剤、例えば二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器若しくはディスペンサー又はネブライザーからエアロゾル噴霧剤の形態において送達する。
【００５７】
全身投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであってよい。経粘膜又は経皮投与において、浸透する障壁に適した浸透剤を配合物に使用する。このような浸透剤は概ね当該技術分野において知られており、例えば経粘膜投与において、浄化剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体がある。経粘膜投与は鼻内噴霧剤又は座薬の使用により実現することができる。経皮投与において、医薬組成物を当該技術分野において一般に知られている軟膏剤、軟膏、ゲル又はクリームに配合する。
【００５８】
或る特定の実施の形態において、医薬組成物を活性成分が持続放出又は制御放出されるように配合する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性の、生適合性ポリマーを使用することができる。このような配合物を調製する方法は、当業者には明らかである。材料はまた例えばAlza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から市販のものを得ることができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含有した、感染細胞を標的とするリポソームを含む）又はポリ（dl−ラクチド−コ−グリコリド）を用いて調製されるものを含むナノ粒子も薬学的に許容可能な担体として使用することができる。これらは当業者に知られた方法により調製することができる。
【００５９】
投与の容易さ及び投与量の一様性において経口又は非経口組成物を単位剤形に配合することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形は、被治療対象における単一の投与量として適した物理的に個別の単位を含み、それぞれの単位は必要となる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるよう算出された活性化合物の所定の量を含有する。本発明の単位剤形の特性は、活性化合物の独自の特徴及び実現される具体的な治療効果、並びに個々の対象（individuals）の治療におけるこのような活性化合物を化合する技術分野に固有の制限により示され、それらに直接左右される。
【００６０】
このような化合物の毒性及び治療有効性を細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手法、例えばLD50（集団の50 %の致死用量）及びED50（集団の50%に治療的に有効な用量）により決定することができる。毒性及び治療効果の用量比は治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。治療指数が大きい化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用することができるが、感染していない細胞への考えられ得る損傷を最小限にし、それにより副作用を少なくするために、このような化合物を対象とし、罹患組織部位に送達する系を設計するには注意を払うべきである。
【００６１】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトに使用する投与量の範囲を定める際に使用することができる。このような化合物の投与量は毒性がほとんど又は全くないED50の血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用する剤形及び利用する投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物において、治療有効用量を、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量を、細胞培養において決定されたように、IC50（すなわち、症状の50 %阻害を得る試験化合物の濃度）の血中血漿濃度を得るよう動物モデルにおいて定めることができる。このような情報を使用し、より正確にヒトに有用な用量を決定することができる。医薬組成物を、投与の説明書とともに容器、パック又はディスペンサーに含むことができる。
【００６２】
ここで、本発明を添付の図面及び配列を参照し、以下の実施例において更に説明するがそれらに限定されるものではない。本発明の目的として、本明細書において引用された全ての参照文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】MTTBの化学構造及びコンピュータモデリングを示す図である。対応するリガンドはMTTBの全ての構造的特徴：酸性頭部基、隣接親油性部分、及び反対部位に芳香族置換基を有する中央芳香族コアを含む（A）。ドッキングプロトコルをまとめると1つの単一結合様式が得られた（B）。カルボン酸部分はリシン265とのイオン相互作用及びセリン323の主鎖アミドとの水素結合に関与する。芳香族部分及びαアルキル鎖は疎水性部位を占有し、有利な相互作用を示す。
【図２】HEK293T細胞におけるPPARγアゴニスト、PPARγアンタゴニスト及びSPPARγMの動態特性化を示す図である。PPARγ依存性トランス活性化アッセイを用いて、種々の濃度（0.01 μM〜10 μM）の化合物による24時間の刺激後のPPARγアゴニストであるロシグリタゾン、アンタゴニストであるGW9662並びに2つのSPPARγMであるFMOC-L-ロイシン及びMCC-555のアゴニスト作用を検証した（A）。アゴニスト（1 μMのロシグリタゾン）刺激に対する応答の時間経過におけるアンタゴニスト作用を10 μMのGW9662及びFMOC-L-ロイシン及びMCC-555を用いて決定するために（B）、PPARγ依存性トランス活性化アッセイを再度用いた。値は4回の実験の平均±SEMである。各実験を四連で行った。
【図３−１】漸増濃度のロシグリタゾンに対するin vitroでのMTTBのアンタゴニスト作用とGW9662のアンタゴニスト作用との比較を示す図である。HEK293T細胞（A及びB）及びJurkat T細胞（C及びD）におけるMTTB（A及びC）及び参照PPARγアンタゴニストGW9662（B及びD）のアゴニスト作用及びアンタゴニスト作用を検証するために、PPARγ依存性トランス活性化アッセイを用いた。細胞株を漸増用量（0.1 μM〜10 μM）のロシグリタゾン、MTTB又はGW9662を単独で又は同じ濃度のロシグリタゾンとともに用いたMTTB及びGW9662（1 μM又は10 μM）の存在下で24時間培養した。HEK293T細胞におけるロシグリタゾンに対する応答のMTTB拮抗作用のIC50値を決定するために、MTTB拮抗作用の用量応答曲線をPPARγ依存性トランス活性化アッセイを用いて作成した（E）。データは漸増濃度のMTTB（0.1μM〜50 μM）の存在下で24時間の1 μMアゴニスト（ロシグリタゾン）刺激に対する応答を示す。全ての値は4回の実験の平均±SEMである。各実験をHEK293T細胞では四連、Jurkat T細胞では三連で行った。アンタゴニスト単独による統計的有意差が、HEK293T細胞及びJurkat T細胞において濃度がx μM及びy μMのMTTBの存在下でロシグリタゾン（1 μM〜10 μM）に応答して得られた（p<0.05）。
【図３−２】同上
【図４】競合的PPARγアンタゴニストMTTB及びPPARγアンタゴニストGW9662のin vitroでの細胞毒性を示す図である。HEK293T細胞、HuT-78細胞及びJurkatT細胞の細胞生存性を、種々の濃度（0.1 μM〜30 μM）のMTTB（A）又はPPARγアンタゴニストGW9662（B）による24時間の刺激後にMTTアッセイによって決定した。細胞生存性を以下の方程式から算出した：サンプルのMTT光学密度（OD）値／対照（DMSOで処理した細胞）のMTT OD値。データは溶媒DMSO対照に対するパーセントとして示し、3回の個別（separate）実験の平均±SEMとして表した。各実験を八連で行った。
【図５】in vitroでのMTTB及びGW9662の細胞内蓄積を示す図である。HEK293T細胞、HuT-78細胞及びJurkatT細胞を10 μM MTTB（A）又は10 μM GW9662（B）で24時間刺激した。種々の時点で細胞を採取し、蓄積をLC-MS/MSによって決定された5×105細胞当たりの細胞内濃度（I）対細胞外濃度（E）（μmol）のパーセンテージとして表した。値は3回の実験の平均±SEMである。
【図６】MTTBによる処理後の敗血症モデルにおけるマウスの生存を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６４】
材料及び方法
化学物質及び試薬
全ての化学物質及び試薬は最高純度グレードであり、特記されない限り、AppliChem GmbH（ドイツ、ダルムシュタット）、Carl Roth GmbH（ドイツ、カールスルーエ）、Alfa Aesar GmbH（ドイツ、カールスルーエ）、ApolloScientific（英国、マンチェスター）及びSigma-Aldrich Chemie GmbH（ドイツ、シュネルドルフ）から市販されているものとした。PPARγアンタゴニストのGW9662、SPPARγMのN-（9-フルオレニルメトキシカルボニル）-L-ロイシン（FMOC-L-ロイシン）及びネトグリタゾン（MCC-555）はCayman Chemical Company（米国、アナーバー）から入手し、PPARγアゴニストのロシグリタゾンはEnzo Life Sciences GmbH（ドイツ、レラハ）から入手した。細胞培養培地及び添加物はPAA Laboratories GmbH（ドイツ、ケルベ）及びSigma-AldrichChemie GmbHから購入した。
【００６５】
細胞培養
ヒトT細胞78（HuT-78）細胞（Gazdar et al., 1980）、Jurkat T細胞（Schneider et al., 1977）、及びサル空胞化ウイルス40のラージT抗原を安定発現するヒト胎児腎臓293細胞（HEK293T細胞）（Graham et al., 1977）は、LGC Standards GmbH（ドイツ、ヴェーゼル）から入手した。HuT-78細胞及びJurkat T細胞はロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地中、HEK293T細胞はダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で加湿5 %二酸化炭素雰囲気において37℃で培養した。
【００６６】
どちらの培地も10 %（v/v）の熱不活性化ウシ胎仔血清、100単位/mlのペニシリン及び100 μg/mlのストレプトマイシンを含有するものであった。培地を週3回交換し、細胞をコンフルエンシーに達するまで継代した。DMSOを使用する際には、いかなる場合でもDMSOの最終濃度が0.1 %を超えず、使用した細胞株において細胞毒性は認められなかった。
【００６７】
培養細胞株の一過性トランスフェクション
PPARγ依存性トランス活性化アッセイのために、1ウェル当たり1×104のHEK293T細胞を96ウェルプレートに播種し、上記のように一晩培養して、HEK293T細胞を付着させた。翌日、HEK293T細胞をJetPRIMETMトランスフェクション試薬（PEQLAB Biotechnologie GmbH、ドイツ、エアランゲン）を用いて、製造業者によって説明されるように1ウェル当たり0.01 μgのpFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD（Manfred Schubert-Zsilavecz教授（ドイツのInstituteof Pharmaceutical Chemistry, Department of Biochemistry, Chemistry andPharmacy, Goethe-University Frankfurt am Main）の好意により提供された）、1ウェル当たり0.09 μgのpFR-Luc（Stratagene、米国、ラホヤ）及び1ウェル当たり0.0005 μgのpRL-CMV（Promega GmbH、ドイツ、マンハイム）で一過性にトランスフェクトした。4時間後、トランスフェクション培地を置き換え、HEK293T細胞を新鮮成長培地中で更に24時間培養した。1ウェル当たり1×106のHuT-78細胞及びJurkat T細胞の一過性トランスフェクションのために、Super-Fect（商標）トランスフェクション試薬（QIAGEN GmbH、ドイツ、ヒルデン）をメーカーによって説明されるように1ウェル当たり0.2 μgのpFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD、1ウェル当たり0.8 μgのpFR-Luc及び1ウェル当たり0.05μgのpRL-CMVとともに使用した。24時間後に1 mlの新鮮成長培地を添加し、細胞を更に48時間培養した。96ウェルプレートフォーマットを用いたHEK293T細胞におけるPPARγ依存性トランス活性化アッセイは四連で行い、12ウェルプレートフォーマットを用いたHuT-78細胞及びJurkat T細胞におけるPPARγ依存性トランス活性化アッセイは三連で行った。
【００６８】
培養細胞株のPPARγ依存性トランス活性化アッセイ
PPARγ依存性トランス活性化アッセイは、ハイブリッドタンパク質PPARγ-LBD-GAL4-DBDをコードするベクターpFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD、及びホタルルシフェラーゼ遺伝子の前にGAL4応答配列を保有するレポーターベクターpFR-Lucに基づく。これら2つのベクターを上記のように、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼをコードする対照ベクターpRL-CMVと組み合わせて共トランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼ活性をトランスフェクション効率に対して正規化した。トランスフェクションに続いて、細胞をMTTB、FMOC-L-ロイシン、MCC-555、GW9662及びロシグリタゾンとともに様々な時間（2時間〜48時間）及び漸増濃度（0.01 μM〜10 μM）でロシグリタゾン（0.01 μM〜10 μM）を用いて又は用いずにインキュベートした。トランス活性化を、96ウェルプレートフォーマットを用いてMithras LB940マルチモードリーダー（Berthold Technologies、ドイツ、バートヴィルトバート）で分析した。MTTBのIC50値を、GraphPad Software Prism（米国、ラホヤ）を用いてデータをS字用量応答曲線に適合することによって決定した。
【００６９】
細胞生存性研究
HuT-78細胞、Jurkat T細胞及びHEK293T細胞を96ウェルプレートに1ウェル当たり5×104細胞の密度で播種し、上記のように一晩培養して、HEK293T細胞を付着させた。翌日、培地を様々な濃度のMTTB（1 μM〜30 μM）及びGW9662（1 μM〜30 μM）を含有する新鮮細胞特異的成長培地に置き換えた。対照としてDMSO単独を使用した。24時間の刺激の後、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）溶液（リン酸緩衝食塩水（PBS）中5 mg/ml）を添加し、細胞を37℃で更に2時間インキュベートした（Mosmann, 1983）。その後、細胞をMTT溶解バッファーに溶解させた。細胞溶解に続いて、細胞生存性を560 nmの吸光度でMithras LB940マルチモードリーダーにおいて測定した。96ウェルプレートフォーマットを用いた細胞生存性研究は八連で行った。
【００７０】
細胞内MTTB及びGW9662蓄積の決定
MTTB及びGW9662の細胞内蓄積を決定するために、HuT-78細胞、Jurkat T細胞及びHEK293T細胞を12ウェルプレートに1ウェル当たり5×104細胞の密度で播種し、上記のように一晩培養して、HEK293T細胞を付着させた。翌日、培地を10 μMのMTTB及び10 μMのGW9662を含有する新鮮細胞特異的成長培地に置き換えた。MTTB及びGW9662による24時間の処理の後、細胞及び上清を採取し、LC-MS/MSによって分析した。蓄積は細胞内濃度対細胞外濃度の比率（I/E）のパーセンテージとして表した。
【００７１】
コンピュータモデリング
コンピュータドッキングをMolecular Operating Environmentソフトウェアスイート2012.10（Chemical Computing Group Inc.、カナダ、モントリオール）を用いて行った。構造における水素の帰属はProtonate3Dルーチン（Labute, 2009）を用いて行った。
【００７２】
統計分析
全てのデータを平均±平均の標準誤差（SEM）として示す。各実験を少なくとも3回行った。統計分析は、ボンフェローニの多重比較検定又は対応のない及び対応のあるスチューデントt検定によってそれぞれ修正した一元又は二元分散分析を用いて行った。p<0.05である場合に差を有意であるとみなした。
【００７３】
実施例1：MTTBの合成
本発明の化合物、特にMTTBは4段階プロセスで合成する。以下ではEは反応物を指し、Pは反応の生成物を指す。
【００７４】
段階1：
【化１０】
2017522361.tif 000011
還流冷却器、アルゴン供給部、隔壁及びマグネットスターラーを備える三つ口反応器内で、E1（1当量）及びCs2CO3（1.3当量）をジメチルホルムアミド（DMF）に不活性ガス下で懸濁し、僅かに加熱する（約60℃で約15分間）。室温（RT）まで冷却した後、E2（1当量）を数ミリリットルのDMF中で隔壁を介して迅速に添加し、撹拌下で加熱せずに反応させる。約1.5時間後に溶媒を真空（vacuum）下でほぼ完全に乾燥するまで除去する。50 mlのH2Oを50 mlの酢酸エチルとともに添加し、相分離する。含水相を酢酸エチルで3回抽出し、有機相をMgS04で乾燥させ、完全に乾燥するまで蒸発させる。残渣（remainings）にカラムクロマトグラフィーを行い、単離後に生成物を2回再結晶化した（ヘキサン／酢酸エチル）。
【００７５】
段階2：
【化１１】
2017522361.tif 000012
還流冷却器、アルゴン供給部、隔壁及びマグネットスターラーを備える三つ口反応器内で、P1（1当量）及びCs2CO3（1.3当量）をジメチルホルムアミド（DMF）に不活性ガス下で懸濁し、僅かに加熱する（約60℃で約15分間）。室温（RT）まで冷却した後、E3（1当量）を数ミリリットルのDMF中で隔壁を介して迅速に添加し、撹拌下で加熱せずに反応させる。約1.5時間後に溶媒を真空下でほぼ完全に乾燥するまで除去し、50 mlのH2Oを50 mlの酢酸エチルとともに添加し、相分離する。含水相を酢酸エチルで3回抽出し、有機相をMgS04で乾燥させ、完全に乾燥するまで蒸発させる。残渣にカラムクロマトグラフィーを行い、単離後に生成物を2回再結晶化した（ヘキサン／酢酸エチル）。
【００７６】
段階3：
【化１２】
2017522361.tif 000013
還流冷却器、アルゴン供給部、隔壁及びマグネットスターラーを備える三つ口反応器に、NaH（1.3当量）を初めにアルゴン下で添加し、次いでテトラヒドロフラン（THF）で懸濁する。約15分間撹拌し、冷却した後、THF中のE4（1.3当量）を数分以内に滴加する。E4は、それぞれのα-ブロモエステルを亜リン酸トリエチル中で還流させ、蒸留してE4を得ることによりアルブーゾフ反応で調製することができる。次いで、混合物を30分〜60分間氷浴内で撹拌する。隔壁を介してTHF中のアルデヒド（1当量）を滴加する。反応をTLCによって観察する。反応が完了した後（約1時間〜3時間）、溶媒を除去し、反応をカラムクロマトグラフィーに供する。精製生成物P3を再結晶化する（ヘキサン／酢酸エチル）。
【００７７】
段階4：
【化１３】
2017522361.tif 000014
還流冷却器及び熱浴を備える反応器内で、THF中のエステルをH2Oに溶解したLiOH一水和物（10当量）と合わせる。メタノールを溶液が単相となるまで添加し、完全に加水分解するまで40℃〜60℃で撹拌しながら加熱する。約12時間〜72時間後にTHF及びメタノールを真空下で蒸発させる。酸を2N HC1で沈殿させる。溶媒を沈殿物から除去し（removing）、乾燥させた後、最終生成物を再結晶化により得る。
【００７８】
実施例2：MTTBはPPARγ-LBDにドッキングする
以前の研究では、共結晶化リガンドの類似性がPPARγについて知られる顕著な誘導適合のために受容体結合リガンド構造の予測モデリングに不可欠であることが示されている（Weber et al., 2012）。したがって、本発明者らは比較（comparison）のためにPPARγ-LBD（PDBコード：2HFP）と複合した強力なスルホンカルボキサミドアンタゴニストのX線構造を選んだ（Hopkins et al., 2006）。
【００７９】
対応するリガンドはMTTBの全ての構造的特徴：酸性頭部基、隣接親油性部分、及び反対部位に芳香族置換基を有する中央芳香族コアを含む（図1A）。図1Bに示されるようにドッキングプロトコルをまとめると1つの単一結合様式が得られた。カルボン酸部分はリシン265とのイオン相互作用及びセリン342の主鎖アミドとの水素結合に関与する。芳香族部分及びαアルキル鎖は疎水性部位を占有し、有利な相互作用を示す。共結晶化（上記参照）リガンドの部分に位置するファーマコフォア特徴をリガンド配置に用いた。水分子は結合部位に残存していた。PPARγ-LBDにおけるドッキングによく適していることが示されているαHBスコア（Weber et al., 2012）を、精緻化のために力場ベースの関数である初期スコアリングGBVI/WSA dGに用いた。
【００８０】
実施例3：MTTBはPPARγのロシグリタゾン誘導性トランス活性化を阻害する
PPARγアンタゴニストのGW9662（非特許文献20）、SPPARγMのFMOC-L-ロイシン（Rocchi et al., 2001）及びMCC-555（Reginato et al., 1998）、並びにPPARγアゴニストのロシグリタゾン（Willson et al., 1996）のアゴニスト作用及びアンタゴニスト作用を細胞レベルで分析するために、HEK293T細胞におけるPPARγ依存性トランス活性化アッセイを用いた。ホタルルシフェラーゼ発光値及び対照ウミシイタケルシフェラーゼ発光値を各サンプルにおいて決定した。ホタルルシフェラーゼ発光対ウミシイタケルシフェラーゼ発光の比率を使用して、ルシフェラーゼ活性値を正規化した。
【００８１】
PPARγ受容体相互作用因子に対するアゴニスト濃度曲線は、24時間の刺激後に異なる過程を示した（図2A）。ロシグリタゾンのみが高いアゴニスト作用を示し、PPARγを用量依存的にトランス活性化した。驚くべきことに、不可逆的完全PPARγアンタゴニストであるGW9662はアゴニスト作用を示し、DMSO対照処理と比較して3倍高い用量非依存的なPPARγのトランス活性化をもたらした。より高濃度（1 μM超）のSPPARγMのMCC-555はPPARγをトランス活性化した。いずれの場合にも、FMOC-L-ロイシンはアゴニスト作用を示さなかった。図2Bに示されるように、PPARγアンタゴニストGW9962のみがアゴニスト（1 μMロシグリタゾン）刺激に対する応答の時間経過を阻害した。SPPARγM、FMOC-L-ロイシンもMCC-555も、HEK293T細胞において何らアンタゴニスト作用を示さなかった。FMOC-L-ロイシン及びMCC-555のアゴニスト作用が非常に弱く、アンタゴニスト作用が存在しないことから、以下の実験及び分析への参照化合物としてのGW9662の使用が促された。
【００８２】
提案されているMTTBとPPARγ-LBDとの相互作用を検証し（図1B）、HEK293T細胞及びJurkatT細胞における潜在的アゴニスト作用及びアンタゴニスト作用を試験するために、化合物をPPARγ依存性トランス活性化アッセイにおいても試験した。細胞を単独又は組み合わせた種々の用量のMTTB及びロシグリタゾンとともに24時間培養した。図3A及び図3Cに示されるように、MTTBはHEK293T細胞及びJurkat T細胞においてアゴニスト作用を示さなかった。どちらの細胞株においても、MTTBは競合的アンタゴニスト／部分アゴニスト特徴を有するPPARγのロシグリタゾン誘導性トランス活性化の用量依存的な阻害をもたらした。参照化合物GW9662は完全拮抗作用を示し、HEK293T細胞及びJurkat T細胞において用量非依存的にロシグリタゾン媒介性PPARγトランス活性化を阻害した（図3B及び図3D）。しかしながら、GW9662は単独でPPARγを活性化し、トランス活性化アッセイにおいて両方の細胞株で驚くほど高いアゴニスト作用を示した。図3Eに示されるように、MTTBはHEK293T細胞において24時間後にロシグリタゾン（1 μM）のアゴニスト活性を4.3 μMのIC50値で阻害することが可能であった。
【００８３】
実施例4：細胞生存に対するMTTB及びGW9662の効果
HEK293T細胞、HuT-78細胞及びJurkatT細胞の生存に対するMTTB及び参照化合物GW9662の効果を調査するために、細胞を漸増用量（1 μM〜30 μM）のMTTB又はGW9662に24時間供した。細胞生存性をMTTアッセイによって分析した。MTTBは最大10 μMの濃度で細胞障害効果を有しなかった（図4A）。MTTBは3つ全ての細胞株において同等の生存性の喪失を示した。対照的に、GW9662は使用した細胞株において様々な細胞毒性を示した（図4B）。HEK293T細胞においては、30 μMの濃度まで生存性の喪失は検出可能でなかった。しかしながら、HuT-78細胞及びJurkat T細胞においては、GW9662はそれぞれ20 μM及び30 μM超の濃度で明らかに細胞毒性であった。
【００８４】
実施例5：MTTBは高い細胞内蓄積を示す
MTTB（10 μM）及び参照PPARγアンタゴニストGW9662（10μM）の細胞内蓄積のパーセンテージの時間経過をLC-MS/MSによって分析した。図5Aに示されるように、MTTBは24時間後にHuT-78細胞及びJurkat T細胞においておよそ10 %までの急速な持続した時間非依存的な細胞内蓄積を示した。HEK293T細胞においては、細胞内MTTB濃度における時間依存的な増大が見られ、24時間後におよそ25 %の細胞外濃度が達成された。図5Bに示されるように、GW9662はHEK293T細胞において時間とともに減少するMTTBと比較して10倍低い細胞内蓄積を示した。HuT-78細胞及びJurkat T細胞においては、GW9662の細胞内蓄積はMTTBよりも約100倍低かった（図5A）。特にHuT-78細胞においては、急速な時間依存的な細胞内GW9662蓄積の減少が見られた。
【００８５】
実施例6：MTTBは敗血症のマウスモデルにおける生存を顕著に高める
MTTBの活性を以前に公表されている敗血症マウスのマウスモデルにおいて試験した（RittirschD, Huber-Lang MS, Flierl MA, Ward PA. Immunodesign of experimental sepsis bycecal ligation and puncture. Nat Protoc 2009;4:31-36）。簡潔に述べると、盲腸結紮及び穿刺モデル（CLP）をRittirsch et al.によって記載されるように、20ゲージ穿刺針を用いて行い、又はシャム（sham）マウスについては結紮及び穿刺を行わなかった。MTTB負荷ナノ粒子を結紮及び穿刺の3時間後に腹腔内適用した。図6は、対照ナノ粒子と比較したin vivoでのMTTB処理敗血症マウスの顕著な生存率を示す。これは、敗血症等の免疫疾患の治療における本発明の化合物の適用性の驚くべき実証である。
【００８６】
論考及び結論
PPARγ分子間相互作用及びシグナル伝達経路の広範な明確化、並びに分子、細胞及び臨床状況におけるその活性化は、治療上有用なPPARγアゴニスト及びSPPARγMの設計に対する非常に有益な洞察をもたらした（Willson et al., 2000、Sporn et al., 2001、Balint et al., 2006）。天然及び合成リガンドによるPPARγ活性化は十分に確立されているが（非特許文献3、非特許文献4）、PPARγ拮抗作用についてはほとんど知られていない。しかしながら、PPARγ拮抗作用の生物学的関連性の理解の高まりにより、既知の副作用を示さない新たな治療上有用なPPARγアンタゴニストの発見の臨床的必要性が強調される。
【００８７】
現在、GW9662は最もよく記載されている最も顕著なPPARγアンタゴニストであるが（非特許文献20）、不可逆的PPARγ拮抗作用を含む有害な特性を示す。したがって、本発明者らは新たな競合的PPARγアンタゴニスト群の有望なプロトタイプとしての構造的に関連した化合物のスクリーニングからMTTBを同定し、特性化した。市販のPPARγアンタゴニストGW9662と比較すると、MTTBはPPARγの阻害及び免疫応答を調節する可能性をもたらし、炎症状態における制御治療的使用によく適している可能性がある。
【００８８】
Leesnitzer及び同業者に従って、本発明者らはロシグリタゾン媒介性PPARγトランス活性化が完全に阻害される、GW9662による非競合的な不可逆的拮抗作用を観察した（非特許文献20）。ロシグリタゾン及びGW9662によるHEK293T細胞及びJurkatT細胞の共処理から、予想されるアンタゴニスト作用が明らかになった。興味深いことに、GW9662単独は用量非依存的なおよそ3倍のPPARγトランス活性化をもたらし、これは本発明者の知る限りではこれまでに報告されていない。これらの結果から、GW9662がHEK293T細胞及びJurkatT細胞の両方において古典的な完全PPARγアンタゴニストではなく、むしろ強いアンタゴニスト活性及び明白な用量非依存的アゴニスト活性を有するSPPARγM（Olefsky etal., 2000、Knouff et al., 2004）として作用することが示唆される。PPARγタンパク質での不可逆的結合及び用量非依存的アゴニスト作用のために、GW9962は治療的使用に好適でない。
【００８９】
GW9662は、PPARγのリガンド結合部位におけるシステイン285残基を共有結合的に修飾することによって、無細胞及び細胞ベースのアッセイ（3.3nMのIC50）並びにヒト乳腺腫瘍細胞株の両方において高い親和性及び選択性を有する強力なPPARγアンタゴニストとして作用することが報告されている（非特許文献20、非特許文献2）。結果として、GW9662はPPARγ活性化及びシグナリングを完全かつ不可逆的に抑止する。本発明者らはSPPARγM、FMOC-L-ロイシン及びMCC-555の中程度又は弱い効果しか観察しなかったが、GW9662及びMTTBはHEK293T細胞及びJurkatT細胞の両方においてロシグリタゾンの作用を強く阻害した。MTTBはHEK293T細胞において4.3 μMのIC50で中程度の用量依存的な競合的アンタゴニスト活性を、細胞株におけるGW9662によるPPARγの拮抗作用について報告されるよりも低い濃度（concentrations）で示した。このロシグリタゾン媒介性PPARγトランス活性化に対するMTTBの競合的アンタゴニスト効力をJurkat T細胞においても検証した。GW9662とは対照的に、MTTBはHuT-78細胞及びJurkatT細胞の両方においてより低い細胞毒性を示し、試験した濃度で炎症細胞に対して毒性効果ではなく薬理効果を示す可能性があることが示される。MTTBの取込みがGW9662より僅か10倍しか高くないHEK293T細胞とは対照的に、HuT-78細胞及びJurkat T細胞へのGW9662と比較しておよそ100倍高いMTTBの細胞内蓄積という本発明者の観察は、リンパ球に対する潜在的選択性を示唆するものである。
【００９０】
興味深いことに、MTTBの構造分析及びコンピュータドッキング分析から、PPARγ-LBDに対するMTTBの潜在的親和性が強調され、PPARγでのMTTB、アンタゴニストのGW9662及びアゴニストのロシグリタゾンの間の結合特徴の違いが際立つ（Chandra et al., 2008）。
【００９１】
したがってMTTBは、その外部残基の修飾によりPPARγ結合親和性を高めるリード化合物として使用される。構造的に類似するPPARγ TZD完全アゴニストであるロシグリタゾン及びピオグリタゾンについて既に示されているように、リガンド受容体相互作用における僅かな変化が薬理の違いをもたらすことを考慮すると（Berger et al., 2005、非特許文献19）、構造的修飾はMTTBのアンタゴニスト作用を更に改善し得る。
【００９２】
GW9662は強いアンタゴニスト活性のために、生物学的プロセスにおけるPPARγの役割を研究する細胞培養系及び動物モデルにおける研究ツールとして広く使用される。GW9662結合の不可逆的性質とは対照的に、MTTBはPPARγタンパク質に可逆的に結合するようである。まとめると、競合的拮抗作用、低い部分作動作用、低い細胞毒性及び高い細胞内取込みは潜在的治療用途のためのMTTBの安全な反復投与を可能にし得る特性である。動物モデルにおける更なる研究が計画されている。MTTBを用いて本明細書に提示される結果から、MTTBが新たな競合的PPARγアンタゴニスト群のプロトタイプであり、炎症性障害及び免疫学的障害の制御治療に対して広く適用可能な治療的アプローチの有望な候補であることが示される。
【符号の説明】
【００９３】
図2
HEK293T cells  HEK293T細胞
Luciferaseactivity (fold increase relative to DMSO)  ルシフェラーゼ活性（DMSOに対する倍増加）
Concentration  濃度
rosiglitazone  ロシグリタゾン
FMOC-L-leucine  FMOC-L-ロイシン
Time [h]  時間（時間）
図3
HEK293T cells  HEK293T細胞
Luciferaseactivity (fold increase relative to DMSO)  ルシフェラーゼ活性（DMSOに対する倍増加）
Concentration  濃度
rosiglitazone  ロシグリタゾン
Jurkat Tcells  Jurkat T細胞
MTTB activityrelative to 1μM rosigitazone  1μMのロシグリタゾンに対するMTTB活性
Logconcentration of MTTB  MTTBの対数濃度
図4
Cellviability relative to DMSO  DMSOに対する細胞生存性
Concentrationof MTTB  MTTBの濃度
Jurkat Tcells  Jurkat T細胞
HEK293T cells  HEK293T細胞
HuT-78 cells  HuT-78細胞
Concentrationof GW9662  GW9662の濃度
図5
Accumulation (I/E)of MTTB  MTTBの蓄積（I/E）
Time [h]  時間（時間）
Jurkat Tcells  Jurkat T細胞
HEK293T cells  HEK293T細胞
HuT-78 cells  HuT-78細胞
Accumulation(I/E) of GW9662  GW9662の蓄積（I/E）
図6
Survival ratein [%]  生存率（%）
Time afterligation/puncture [h]  結紮／穿刺後の時間（時間）
non-loadednano particles  非負荷ナノ粒子
MTTB-loadednano particles  MTTB負荷ナノ粒子
【図１】
2017522361.tif 000018
【図２】
2017522361.tif 000019
【図３−１】
2017522361.tif 000020
【図３−２】
2017522361.tif 000021
【図４】
2017522361.tif 000022
【図５】
2017522361.tif 000023
【図６】
2017522361.tif 000024
【国際調査報告】
2017522361.tif 000025
2017522361.tif 000026
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