(57)【要約】  本明細書において、ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａを認識し、それらに結合し、他の分子とそれらとの相互作用を遮断するモノクローナル抗体が提供される。本明細書において、前記抗体を使用して癌を治療する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＲ２ポリペプチドに特異的に結合し、前記ポリペプチドの結合について１６３−２８Ｂ−１モノクローナル抗体と競合する単離モノクローナル抗体。
【請求項２】
（ａ）１６３−２８Ｂ−１のＶＨＣＤＲ１（配列番号２０）と少なくとも９０％同一である第１のＶＨＣＤＲ；
（ｂ）１６３−２８Ｂ−１のＶＨＣＤＲ２（配列番号２１）と少なくとも９０％同一である第２のＶＨＣＤＲ；
（ｃ）１６３−２８Ｂ−１のＶＨＣＤＲ３（配列番号２２）と少なくとも９０％同一である第３のＶＨＣＤＲ；
（ｄ）１６３−２８Ｂ−１のＶＬＣＤＲ１（配列番号２３）と少なくとも９０％同一である第１のＶＬＣＤＲ；
（ｅ）１６３−２８Ｂ−１のＶＬＣＤＲ２（配列番号２４）と少なくとも９０％同一である第２のＶＬＣＤＲ；および
（ｆ）１６３−２８Ｂ−１のＶＬＣＤＲ３（配列番号２５）と少なくとも９０％同一である第３のＶＬＣＤＲ
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
（ａ）配列番号２０と同一である第１のＶＨＣＤＲ；
（ｂ）配列番号２１と同一である第２のＶＨＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２２と同一である第３のＶＨＣＤＲ；
（ｄ）配列番号２３と同一である第１のＶＬＣＤＲ；
（ｅ）配列番号２４と同一である第２のＶＬＣＤＲ；および
（ｆ）配列番号２５と同一である第３のＶＬＣＤＲ
を含む、請求項２に記載の単離抗体。
【請求項４】
（ａ）配列番号２０と少なくとも９０％同一である第１のＶＨＣＤＲ；
（ｂ）配列番号２１と少なくとも９０％同一である第２のＶＨＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２２と少なくとも９０％同一である第３のＶＨＣＤＲ；および
（ｄ）配列番号１９と少なくとも９０％同一であるＶＬドメイン
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項５】
（ａ）配列番号２０と同一である第１のＶＨＣＤＲ；
（ｂ）配列番号２１と同一である第２のＶＨＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２２と同一である第３のＶＨＣＤＲ；および
（ｄ）配列番号１９と同一であるＶＬドメイン
を含む、請求項４に記載の単離抗体。
【請求項６】
（ａ）配列番号１８と少なくとも９０％同一であるＶＨドメイン；
（ｂ）配列番号２３と少なくとも９０％同一である第１のＶＬＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２４と少なくとも９０％同一である第２のＶＬＣＤＲ；および
（ｄ）配列番号２５と少なくとも９０％同一である第３のＶＬＣＤＲ
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項７】
（ａ）配列番号１８と同一であるＶＨドメイン；
（ｂ）配列番号２３と同一である第１のＶＬＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２４と同一である第２のＶＬＣＤＲ；および
（ｄ）配列番号２５と同一である第３のＶＬＣＤＲ
を含む、請求項６に記載の単離抗体。
【請求項８】
１６３−２８Ｂ−１のＶＨドメイン（配列番号１８）と少なくとも約８０％同一であるＶＨドメインおよび１６３−２８Ｂ−１のＶＬドメイン（配列番号１９）と少なくとも約８０％同一であるＶＬドメインを含む、請求項２に記載の単離抗体。
【請求項９】
１６３−２８Ｂ−１のＶＨドメイン（配列番号１８）と同一であるＶＨドメインおよび１６３−２８Ｂ−１のＶＬドメイン（配列番号１９）と同一であるＶＬドメインを含む、請求項８に記載の単離抗体。
【請求項１０】
１６３−２８Ｂ−１抗体である、請求項９に記載の単離抗体。
【請求項１１】
ＡＧＲ２エピトープＮＨ２−ＩＨＨＬＤＥＣＰＨＳＱＡＬＫＫＶＦＡＥＮＫＥＩＱＫＬＡＥＱ−Ｃ（配列番号２８）に特異的に結合する、ＡＧＲ２ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
腫瘍細胞の膵管腺癌遊走およびゲムシタビン誘導アポトーシスに対する耐性を阻害する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
組換え体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１４】
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはそれらの抗原結合断片である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１５】
Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１６】
ヒト、ヒト化抗体または脱免疫化抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１７】
イメージング剤、化学療法剤、毒素または放射性核種にコンジュゲートしている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１８】
Ｃ４．４Ａポリペプチドに特異的に結合し、前記ポリペプチドの結合について１６２−１Ａ−１モノクローナル抗体と競合する単離モノクローナル抗体。
【請求項１９】
（ａ）１６２−１Ａ−１のＶＨＣＤＲ１（配列番号１２）と少なくとも９０％同一である第１のＶＨＣＤＲ；
（ｂ）１６２−１Ａ−１のＶＨＣＤＲ２（配列番号１３）と少なくとも９０％同一である第２のＶＨＣＤＲ；
（ｃ）１６２−１Ａ−１のＶＨＣＤＲ３（配列番号１４）と少なくとも９０％同一である第３のＶＨＣＤＲ；
（ｄ）１６２−１Ａ−１のＶＬＣＤＲ１（配列番号１５）と少なくとも９０％同一である第１のＶＬＣＤＲ；
（ｅ）１６２−１Ａ−１のＶＬＣＤＲ２（配列番号１６）と少なくとも９０％同一である第２のＶＬＣＤＲ；および
（ｆ）１６２−１Ａ−１のＶＬＣＤＲ３（配列番号１７）と少なくとも９０％同一である第３のＶＬＣＤＲ
を含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
（ａ）配列番号１２と同一である第１のＶＨＣＤＲ；
（ｂ）配列番号１３と同一である第２のＶＨＣＤＲ；
（ｃ）配列番号１４と同一である第３のＶＨＣＤＲ
（ｄ）配列番号１５と同一である第１のＶＬＣＤＲ；
（ｅ）配列番号１６と同一である第２のＶＬＣＤＲ；および
（ｆ）配列番号１７と同一である第３のＶＬＣＤＲ
を含む、請求項１９に記載の単離抗体。
【請求項２１】
（ａ）配列番号１２と少なくとも９０％同一である第１のＶＨＣＤＲ；
（ｂ）配列番号１３と少なくとも９０％同一である第２のＶＨＣＤＲ；
（ｃ）配列番号１４と少なくとも９０％同一である第３のＶＨＣＤＲ；および
（ｄ）配列番号１１と少なくとも９０％同一であるＶＬドメイン
を含む、請求項１８に記載の単離抗体。
【請求項２２】
（ａ）配列番号１２と同一である第１のＶＨＣＤＲ；
（ｂ）配列番号１３と同一である第２のＶＨＣＤＲ；
（ｃ）配列番号１４と同一である第３のＶＨＣＤＲ；および
（ｄ）配列番号１１と同一であるＶＬドメイン
を含む、請求項２１に記載の単離抗体。
【請求項２３】
（ａ）配列番号１０と少なくとも９０％同一であるＶＨドメイン；
（ｂ）配列番号１５と少なくとも９０％同一である第１のＶＬＣＤＲ；
（ｃ）配列番号１６と少なくとも９０％同一である第２のＶＬＣＤＲ；および
（ｄ）配列番号１７と少なくとも９０％同一である第３のＶＬＣＤＲ
を含む、請求項１８に記載の単離抗体。
【請求項２４】
（ａ）配列番号１０と同一であるＶＨドメイン；
（ｂ）配列番号１５と同一である第１のＶＬＣＤＲ；
（ｃ）配列番号１６と同一である第２のＶＬＣＤＲ；および
（ｄ）配列番号１７と同一である第３のＶＬＣＤＲ
を含む、請求項２３に記載の単離抗体。
【請求項２５】
１６２−１Ａ−１のＶＨドメイン（配列番号１０）と少なくとも約８０％同一であるＶＨドメインおよび１６２−１Ａ−１のＶＬドメイン（配列番号１１）と少なくとも約８０％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１９に記載の単離抗体。
【請求項２６】
１６２−１Ａ−１のＶＨドメイン（配列番号１０）と同一であるＶＨドメインおよび１６２−１Ａ−１のＶＬドメイン（配列番号１１）と同一であるＶＬドメインを含む、請求項２５に記載の単離抗体。
【請求項２７】
１６３−２８Ｂ−１抗体である、請求項２６に記載の単離抗体。
【請求項２８】
Ｃ４．４ＡエピトープＮＨ２−ＰＶＲＰＴＳＴＴＫＰＭＰＡＰＴＳＱＴＰＲＱＧＶＥＨＥＡＳＲＤＥＥＰＲＬ−Ｃ（配列番号２９）に特異的に結合する、Ｃ４．４Ａポリペプチドに特異的であるモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
腫瘍細胞の膵管腺癌遊走およびゲムシタビン誘導アポトーシスに対する耐性を阻害する、請求項２９に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項３０】
組換え体である、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３１】
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはそれらの抗原結合断片である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３２】
Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３３】
ヒト、ヒト化抗体または脱免疫化抗体である、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３４】
イメージング剤、化学療法剤、毒素または放射性核種にコンジュゲートしている、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３５】
薬学的に許容可能な担体中で請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項３６】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項３７】
１６３−２８Ｂ−１のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号２０、２１、および２２）を含む抗体ＶＨドメインを含む組換えポリペプチド。
【請求項３８】
１６２−１Ａ−１のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号１２、１３、および１４）を含む抗体ＶＨドメインを含む組換えポリペプチド。
【請求項３９】
１６３−２８Ｂ−１のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号２３、２４、および２５）を含む抗体ＶＬドメインを含む組換えポリペプチド。
【請求項４０】
１６２−１Ａ−１のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号１５、１６、および１７）を含む抗体ＶＬドメインを含む組換えポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３７〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項４２】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体または請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞。
【請求項４３】
哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛細胞または昆虫細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
（ａ）請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体のＶＬおよびＶＨ鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を細胞中で発現させること；ならびに
（ｂ）前記細胞から前記抗体を精製すること
を含む、抗体を製造する方法。
【請求項４５】
癌を治療するために有効な量でＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ相互作用を破壊する薬剤を患者に投与することを含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項４６】
ＡＧＲ２エピトープＮＨ２−ＩＨＨＬＤＥＣＰＨＳＱＡＬＫＫＶＦＡＥＮＫＥＩＱＫＬＡＥＱ−Ｃ（配列番号２８）に特異的に結合する有効量のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法。
【請求項４７】
Ｃ４．４ＡエピトープＮＨ２−ＰＶＲＰＴＳＴＴＫＰＭＰＡＰＴＳＱＴＰＲＱＧＶＥＨＥＡＳＲＤＥＥＰＲＬ−Ｃ（配列番号２９）に特異的に結合する有効量のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法。
【請求項４８】
有効量の請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体を対象に投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法。
【請求項４９】
前記癌が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌、脳腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌または皮膚癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が、膵管腺癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体を全身投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体を、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
少なくとも第２の抗癌療法を前記対象に施すことをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の抗癌療法が、手術療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、ヒト対象である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
患者における癌の治療において使用される、ＡＧＲ２結合抗体を含む組成物。
【請求項５７】
前記抗体が、ＡＧＲ２の結合について１６３−２８Ｂ−１モノクローナル抗体と競合する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
患者における癌の治療において使用される、Ｃ４．４Ａ結合抗体を含む組成物。
【請求項５９】
前記抗体が、Ｃ４．４Ａの結合について１６２−１Ａ−１モノクローナル抗体と競合する、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
患者における癌の治療において使用される、ＡＧＲ２結合抗体およびＣ４．４Ａ結合抗体を含む組成物。
【請求項６１】
前記ＡＧＲ２結合抗体が、ＡＧＲ２の結合について１６３−２８Ｂ−１モノクローナル抗体と競合する、請求項６０の組成物。
【請求項６２】
前記Ｃ４．４Ａ結合抗体が、Ｃ４．４Ａの結合について１６２−１Ａ−１モノクローナル抗体と競合する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
患者における癌の治療において使用される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項６４】
前記癌が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌、脳腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌または皮膚癌である、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記癌が、膵管腺癌である、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記患者が、膵管腺癌を有すると既に判定されている、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記患者が、膵管腺癌を有すると判定される、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗原結合抗体断片である、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項６８の組成物。
【請求項７０】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７１】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７２】
前記抗体が、Ｃ４．４Ａ発現細胞に標的化すべき薬剤に付着している、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記薬剤が、細胞毒性剤、サイトカイン、抗血管新生剤、化学療法剤、診断剤、イメージング剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、酵素、ホルモン、成長因子、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、磁気ビーズ、マイクロデバイス、細胞、核酸、または発現ベクターである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記抗体が、全身投与のために配合される、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記抗体が、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所投与のために配合される、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
少なくとも第２の化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
前記第２の抗癌剤が、化学療法薬、ホルモン、免疫治療薬、またはサイトカインである、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
癌の治療のための医薬品の製造における、ＡＧＲ２結合抗体の使用。
【請求項７９】
癌の治療のための医薬品の製造における、Ｃ４．４Ａ結合抗体の使用。
【請求項８０】
癌の治療のための医薬品の製造における、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項８１】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／０４８，０３７号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、細胞生物学および腫瘍学の分野に関する。より特定すると、本発明は、ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａ結合抗体ならびに抗癌療法におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
前方勾配（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）２（ＡＧＲ２［ｈＡＧ−２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｅｌ，１９９８）またはＧｏｂ−４（Ｋｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）］とも称される）は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のヒトオルソログＸＡＧ−２である。ＸＡＧ−２は、カエル胚中で分泌され、Ｌｙ６スーパーファミリーの受容体Ｐｒｏｄ−１と相互作用することによりその外胚葉パターン形成および両生類四肢再生に関与する（Ａｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。しかしながら、Ｐｒｏｄ−１のヒトホモログは存在しない。ＡＧＲ２がヒトにおいて細胞表面上の受容体を介して機能するか、細胞内で機能するかは不明である。健常成人ヒトにおけるＡＧＲ２の組織分布は、それがムチン産生細胞を保有する器官に制限されることを示す。ＡＧＲ２のマウス遺伝子欠失モデルは、ムチン合成の変化を示した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。他の研究は、ＡＧＲ２がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）ファミリーと類似する配列を保有するという概念を支持している（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＰＤＩタンパク質ファミリーのメンバーは、ジスルフィド結合の形成、還元および異性化を触媒し、それにより、ＥＲ中でのタンパク質成熟の間の中間立体構造を安定化させ得る（Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。しかしながら、正常細胞中でのタンパク質合成におけるＡＧＲ２の役割は、両生類におけるその作用と類似せず、癌において観察されるその役割も説明しない。
【０００４】
ＡＧＲ２は、酵母ツーハイブリッドの結果に基づきジストログリカン−１（ＤＡＧ−１）およびＣ４．４Ａに結合することが報告されている（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしながら、哺乳動物細胞中でのこれらの分子の相互作用を支持する証拠もそれらの相互作用の生物学的機能を実証する証拠も提供されなかった。ＡＧＲ２は、遺伝子変化の多様なパターンで様々な組織中で形成される広範な腫瘍、例として、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）ならびに乳癌（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｅｌ，１９９８；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、前立腺癌（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、肺癌（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、および結腸直腸癌（Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）において発現される。ＡＧＲ２は、種々の癌細胞の侵攻的成長および転移を支持する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｉｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｂａｒｒａｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。したがって、ＡＧＲ２およびその受容体は、有用な治療標的として機能し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において、細胞外ＡＧＲ２の機能細胞表面受容体としてＣ４．４Ａ（ＬＹＰＤ３）が同定された。ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａの両方に対する新規モノクローナル遮断抗体ならびに癌の治療におけるそれらの使用方法が本明細書において提供される。
【０００６】
一部の実施形態において、本発明は、ＡＧＲ２ポリペプチドに特異的に結合する単離または組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を対象とする。ある態様において、抗体は、配列番号２６のアミノ酸２５〜１２５に対応するＡＧＲ２ポリペプチドに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、配列番号２８によるＡＧＲ２ポリペプチドに特異的に結合する。配列番号２８は、ヒトＡＧＲ２（配列番号２６）のアミノ酸残基７５から１０３に対応する。本発明者らは、上記定義のＡＧＲ２ポリペプチドについての特異性を有するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片が、ＡＧＲ２に対する従来技術の抗体、特に、モノクローナル抗体Ａｂ５６７０３と比較して使用における顕著な利点を提供することを見出した。さらなる態様において、上記定義のＡＧＲ２ポリペプチドについての特異性を有するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、腫瘍細胞の膵管腺癌遊走およびゲムシタビン誘導アポトーシスに対する耐性を阻害する。ある態様において、抗体は、ＡＧＲ２ポリペプチドの結合について１６３−２８Ｂ−１モノクローナル抗体と競合する。ある態様において、抗体は、１６３−２８Ｂ−１モノクローナル抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の全部または一部を含み得る。さらなる態様において、抗体は、本実施形態の１６３−２８Ｂ−１モノクローナル抗体の軽鎖可変および／または重鎖可変鎖からの第１、第２、および／または第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するアミノ酸配列を含み得る。
【０００７】
ある態様において、単離抗体は、１６３−２８Ｂ−１重鎖および軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ領域と少なくとも８０％、９０％または９５％同一であるＣＤＲ配列を含む。さらなる態様において、抗体は、ＣＤＲの１つ以上における１または２つのアミノ酸置換、欠失または挿入を除き１６３−２８Ｂ−１と同一であるＣＤＲ領域を含む。例えば、抗体は、ＣＤＲ配列が１６３−２８Ｂ−１モノクローナル抗体のＣＤＲに対してＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３中の１または２つのアミノ酸置換を含むＣＤＲを含み得る。したがって、一部の具体的な態様において、本実施形態の抗体は、（ａ）１６３−２８Ｂ−１のＶＨＣＤＲ１（配列番号２０）と少なくとも８０％同一である第１のＶＨＣＤＲ；（ｂ）１６３−２８Ｂ−１のＶＨＣＤＲ２（配列番号２１）と少なくとも８０％同一である第２のＶＨＣＤＲ；（ｃ）１６３−２８Ｂ−１のＶＨＣＤＲ３（配列番号２２）と少なくとも８０％同一である第３のＶＨＣＤＲ；（ｄ）１６３−２８Ｂ−１のＶＬＣＤＲ１（配列番号２３）と少なくとも８０％同一である第１のＶＬＣＤＲ；（ｅ）１６３−２８Ｂ−１のＶＬＣＤＲ２（配列番号２４）と少なくとも８０％同一である第２のＶＬＣＤＲ；および（ｆ）１６３−２８Ｂ−１のＶＬＣＤＲ３（配列番号２５）と少なくとも８０％同一である第３のＶＬＣＤＲを含む。
【０００８】
さらなる態様において、単離抗体は、モノクローナル抗体１６３−２８Ｂ−１の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一である第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、および第３のＶＬＣＤＲ配列を含み、それらはそれぞれ、配列番号２０、２１、２２、２３、２４および２５により表される。一態様において、単離抗体は、モノクローナル抗体１６３−２８Ｂ−１のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【０００９】
別の態様において、単離抗体は、１６３−２８Ｂ−１のＶＨドメイン（配列番号１８）と少なくとも約８０％同一であるＶＨドメインおよび１６３−２８Ｂ−１のＶＬドメイン（配列番号１９）と少なくとも約８０％同一であるＶＬドメインを含む。一態様において、単離抗体は、モノクローナル抗体１６３−２８Ｂ−１のＶＨおよびＶＬドメインと同一であるＶＨおよびＶＬドメインを含む。さらなる態様において、単離抗体は、１６３−２８Ｂ−１抗体である。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明は、Ｃ４．４Ａポリペプチドに特異的に結合する単離抗体または組換えモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合断片を対象とする。ある態様において、抗体は、配列番号２７のアミノ酸２４０〜３４０に対応するＣ４．４Ａポリペプチドに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、配列番号２９によるＣ４．４Ａポリペプチド内のＣ４．４Ａエピトープに特異的に結合する。配列番号２９は、ヒトＣ４．４Ａ（配列番号２８）のアミノ酸残基２６２から２９６に対応する。本発明者らは、上記定義の特異性を有するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片が、Ｃ４．４Ａに対する従来技術の抗体、特にポリクローナル抗体ＡＦ５４２８と比較して使用における顕著な利点を提供することを見出した。さらなる態様において、上記定義のＣ４．４Ａポリペプチドについての特異性を有するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、腫瘍細胞の膵管腺癌遊走およびゲムシタビン誘導アポトーシスに対する耐性を阻害する。ある態様において、抗体は、Ｃ４．４Ａポリペプチドの結合について１６２−１Ａ−１モノクローナル抗体と競合する。ある態様において、抗体は、１６２−１Ａ−１モノクローナル抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の全部または一部を含み得る。さらなる態様において、抗体は、本実施形態の１６２−１Ａ−１モノクローナル抗体の軽鎖可変および／または重鎖可変鎖からの第１、第２、および／または第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するアミノ酸配列を含み得る。
【００１１】
ある態様において、単離抗体は、１６２−１Ａ−１重鎖および軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ領域と少なくとも８０％、９０％または９５％同一であるＣＤＲ配列を含む。さらなる態様において、抗体は、ＣＤＲの１つ以上における１または２つのアミノ酸置換、欠失または挿入を除き１６２−１Ａ−１と同一であるＣＤＲ領域を含む。例えば、抗体は、ＣＤＲ配列が１６２−１Ａ−１モノクローナル抗体のＣＤＲに対してＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３中の１または２つのアミノ酸置換を含むＣＤＲを含み得る。したがって、一部の具体的な態様において、本実施形態の抗体は、（ａ）１６２−１Ａ−１のＶＨＣＤＲ１（配列番号１２）と少なくとも８０％同一である第１のＶＨＣＤＲ；（ｂ）１６２−１Ａ−１のＶＨＣＤＲ２（配列番号１３）と少なくとも８０％同一である第２のＶＨＣＤＲ；（ｃ）１６２−１Ａ−１のＶＨＣＤＲ３（配列番号１４）と少なくとも８０％同一である第３のＶＨＣＤＲ；（ｄ）１６２−１Ａ−１のＶＬＣＤＲ１（配列番号１５）と少なくとも８０％同一である第１のＶＬＣＤＲ；（ｅ）１６２−１Ａ−１のＶＬＣＤＲ２（配列番号１６）と少なくとも８０％同一である第２のＶＬＣＤＲ；および（ｆ）１６２−１Ａ−１のＶＬＣＤＲ３（配列番号１７）と少なくとも８０％同一である第３のＶＬＣＤＲを含む。
【００１２】
さらなる態様において、単離抗体は、モノクローナル抗体１６２−１Ａ−１の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一である第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、および第３のＶＬＣＤＲ配列を含み、それらはそれぞれ、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、および１７により表される。一態様において、単離抗体は、モノクローナル抗体１６２−１Ａ−１のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００１３】
別の態様において、単離抗体は、１６２−１Ａ−１のＶＨドメイン（配列番号１０）と少なくとも約８０％同一であるＶＨドメインおよび１６２−１Ａ−１のＶＬドメイン（配列番号１１）と少なくとも約８０％同一であるＶＬドメインを含む。一態様において、単離抗体は、モノクローナル抗体１６２−１Ａ−１のＶＨおよびＶＬドメインと同一であるＶＨおよびＶＬドメインを含む。さらなる態様において、単離抗体は、１６２−１Ａ−１抗体である。
【００１４】
一部の態様において、本実施形態の抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはそれらの抗原結合断片であり得る。抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体であり得る。抗体は、ヒト、ヒト化、または脱免疫化抗体であり得る。一部の態様において、抗体は、イメージング剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種にコンジュゲートさせることができる。
【００１５】
一実施形態において、１６３−２８Ｂ−１のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号２０、２１、および２２）または１６２−１Ａ−１のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３（配列番号１２、１３、および１４）を含む抗体ＶＨドメインを含む組換えポリペプチドが提供される。別の実施形態において、１６３−２８Ｂ−１（配列番号２３、２４、および２５）または１６２−１Ａ−１（配列番号１５、１６、および１７）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３を含む抗体ＶＬドメインを含む組換えポリペプチドが提供される。
【００１６】
一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体または抗体ＶＨもしくはＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド分子が提供される。
【００１７】
さらなる実施形態において、本実施形態のモノクローナル抗体または組換えポリペプチドを産生する宿主細胞が提供される。一部の態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛細胞、または昆虫細胞である。ある態様において、宿主細胞は、ハイブリドーマ細胞である。
【００１８】
いっそうさらなる実施形態において、本明細書に開示の抗体のＶＬまたはＶＨ鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を細胞中で発現させ、細胞から抗体を精製することを含む、本発明の抗体を製造する方法が提供される。
【００１９】
追加の実施形態において、本明細書に開示の抗体または抗体断片を含む医薬組成物が提供される。このような組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み、追加の活性成分を含有してもしなくてもよい。
【００２０】
本発明の実施形態において、対象に、ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ自己分泌シグナリングループを阻害する有効量の薬剤を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法が提供される。一態様において、薬剤は、ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ相互作用を破壊する薬剤であり得る。
【００２１】
本発明の実施形態において、有効量の本明細書に開示の抗体を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法が提供される。ある態様において、抗体は、本発明のモノクローナル抗体、例えば、１６２−１Ａ−１もしくは１６３−２８Ｂ−１、またはそれらに由来する抗体セグメントを含む組換えポリペプチドである。
【００２２】
ある態様において、癌は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌、脳腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌または皮膚癌であり得る。一態様において、癌は、膵管腺癌であり得る。
【００２３】
一態様において、抗体は、全身投与することができる。追加の態様において、抗体は、静脈内投与、皮内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、または局所投与することができる。本方法は、少なくとも第２の抗癌療法を対象に施すことをさらに含み得る。第２の抗癌療法の例としては、限定されるものではないが、手術療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法が挙げられる。一態様において、対象は、ヒト対象であり得る。
【００２４】
さらなる態様において、本方法は、本発明の組成物を対象に２回以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０回以上など投与することをさらに含み得る。
【００２５】
本発明のある態様によれば、患者の癌を治療するために有効な量のＡＧＲ２結合タンパク質および／またはＣ４．４Ａ結合タンパク質を投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。一部の態様において、方法は、癌を有すると既に判定されており、または癌、例えば、膵管腺癌を有すると判定される患者のいずれかを治療することを含む。
【００２６】
ある実施形態において、ＡＧＲ２結合タンパク質および／またはＣ４．４Ａ結合タンパク質は、抗体であり得、それは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗原結合抗体断片であり得る。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。抗体が抗体断片である実施形態において、好ましい断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ分子が挙げられる。
【００２７】
ある医学または臨床適用のため、抗体は、Ｃ４．４Ａ発現細胞に標的化すべき薬剤に付着させることができる。薬剤は、細胞毒性剤、サイトカイン、抗血管新生剤、化学療法剤、診断剤、イメージング剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、酵素、ホルモン、成長因子、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、磁気ビーズ、マイクロデバイス、細胞、核酸、または発現ベクターであり得る。標的化される分子がタンパク質である場合、それぞれのタンパク質分子および抗体についてのコード領域をインフレームでアラインして「融合」分子の産生を所望により可能とすることができる。しかしながら、他の実施形態において、抗体は、慣用のコンジュゲーション技術を使用して分子にコンジュゲートさせることができる。
【００２８】
ある実施形態は、ＡＧＲ２またはＣ４．４Ａに特異的に結合する単離および／もしくは組換え抗体またはポリペプチドを含む抗体または組換えポリペプチド組成物を対象とする。ある態様において、抗体またはポリペプチドは、本明細書において提供される任意のモノクローナル抗体の全部または一部と（少なくとも、または多くとも）８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一（またはその中で導かれる任意の範囲）である配列を有する。いっそうさらなる態様において、単離および／または組換え抗体またはポリペプチドは、本明細書において提供される配列のいずれかまたはそのような配列の組合せからの（少なくとも、または多くとも）１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の連続アミノ酸を有する。
【００２９】
いっそうさらなる態様において、本実施形態の抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示のアミノ酸配列のいずれかの１つ以上のアミノ酸セグメントを含む。例えば、抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、約、少なくとも、または多くとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５から２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９または２００アミノ酸長（その間の全ての値および範囲を含む）を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸セグメントを含み得る。ある態様において、アミノ酸セグメントは、表１に提供されるＡＧＲ２結合抗体またはＣ４．４Ａ結合抗体のアミノ酸配列の１つから選択される。
【００３０】
いっそうさらなる態様において、本実施形態の抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸セグメントを含み、セグメントは、本明細書において提供される任意の配列中のアミノ酸位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５から２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００において開始し、同一の提供配列中のアミノ酸位置４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５から２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００において終了する。ある態様において、アミノ酸セグメント、またはその一部は、表１に提供されるＡＧＲ２結合抗体またはＣ４．４Ａ結合抗体のアミノ酸配列の１つから選択される。
【００３１】
いっそうさらなる態様において、本実施形態の抗体またはポリペプチドは、ＡＧＲ２結合抗体またはＣ４．４Ａ結合抗体のＶ、ＶＪ、ＶＤＪ、Ｄ、ＤＪ、ＪまたはＣＤＲドメイン（表１に提供）と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一（またはその中で導かれる任意の範囲）であるアミノ酸セグメントを含む。例えば、ポリペプチドは、表１に提供されるＡＧＲ２結合抗体またはＣ４．４Ａ結合抗体のＣＤＲ１、２、および／または３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一（またはそれらから導かれる任意の範囲）である１、２または３つのアミノ酸セグメントを含み得る。
【００３２】
一実施形態において、患者における癌の治療において使用される、ＡＧＲ２結合抗体および／またはＣ４．４Ａ結合抗体を含む組成物が提供される。別の実施形態において、癌の治療のための医薬品の製造におけるＡＧＲ２結合抗体および／またはＣ４．４Ａ結合抗体の使用が提供される。前記ＡＧＲ２結合抗体および／またはＣ４．４Ａ結合抗体は、本実施形態の任意のＡＧＲ２結合抗体および／またはＣ４．４Ａ結合抗体であり得る。
【００３３】
本発明の方法および／または組成物に関して考察される実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して用いることができる。したがって、ある方法または組成物に関する実施形態は、本発明の他の方法および組成物にも同様に適用することができる。
【００３４】
核酸に関して本明細書において使用される用語「コードする」または「コードすること」は、当業者が本発明を容易に理解可能とするために使用され；しかしながら、これらの用語は、それぞれ「含む」または「含むこと」と互換的に使用することができる。
【００３５】
本明細書において使用される「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲において本明細書において使用される語「ａ」または「ａｎ」は、語「含むこと」とともに使用される場合、１つまたは２つ以上を意味し得る。
【００３６】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが特に明示されない限り、「および／または」を意味するために使用され、または代替物が相互に排除されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において使用される「別の」は、少なくとも第２のもの以上を意味し得る。
【００３７】
本明細書全体にわたり、用語「約」は、値がデバイスについての固有の誤差の変動を含むことを示すために使用され、本方法は、値、または試験対象の中で存在する変動を決定するために用いられる。
【００３８】
本発明の他の目的、特徴部および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかであるため、説明としてのみ挙げられることを理解すべきである。
【００３９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。これらの図面の１つ以上を本明細書において提示される具体的な実施形態の詳細な説明との組合せで参照することにより本発明をより良好に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ−Ｄ】細胞外ＡＧＲ２は、ＰＤＡＣ細胞侵攻性を刺激する。ＡｓＰＣ−１細胞へのｒＡＧＲ２（０〜５００ｎＭ）の細胞外添加は、（Ａ）細胞増殖、（Ｂ）遊走、および（Ｃ）浸潤の用量依存性増加をもたらした。（Ｄ）ゲムシタビン（Ｇｅｍ）添加は、アポトーシスの増加をもたらした。増殖を対照に対する生存細胞のパーセントとして示す。しかしながら、細胞外ＡＧＲ２は、Ｇｅｍ誘導アポトーシスのレベルを有意に低減させた。示されるデータは、３つの実験についての平均±ＳＥＭである（＊ｐ＜０．０５）。
【図２Ａ−Ｃ】Ｃ４．４Ａおよび他のＬＹ６ファミリー受容体は、ＡＧＲ２と相互作用する。（Ａ）いくつかの候補受容体（ｕＰＡＲ、Ｃ４．４Ａ、およびＣＤ５９）はＡＧＲ２と同時免疫沈降した一方、ＤＡＧ−１は同時免疫沈降しなかった。（Ｂ）精製組換えＡＧＲ２およびＣ４．４Ａもそれらの懸濁液から同時免疫沈降し、ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａの直接的な相互作用を支持した。（Ｃ）ｓｉＲＮＡを２つの異なる濃度において使用してＣ４．４Ａ、ＣＤ５９、およびｕＰＡＲのサイレンシングを達成した。それぞれの抗体を用いるウエスタンブロッティングにより有意にサイレンシングされたものを示し、同一の膜をローディング対照として機能するβ−アクチンについてブロットした。両方の濃度のｓｉＲＮＡは、有意なサイレンシングを示した。示されるマイクログラフは、３つの独立実験の代表物である。
【図３Ａ−Ｅ】Ｃ４．４Ａは、ｒＡＧＲ２媒介機能に要求される。ＡｓＰＣ−１細胞にｓｉＲＮＡを形質移入してＣ４．４Ａ、ＣＤ５９、またはｕＰＡＲをサイレンシングし、次いでＡＧＲ２を用いず（基礎、左欄）およびＡＧＲ２を用いて（１００ｎＭ、右欄）毎日処理した。Ｃ４．４Ａサイレンシングのみが、基礎ならびにｒＡＧＲ２刺激（Ａ）増殖、（Ｂ）遊走、および（Ｃ）浸潤の両方を低減させた。増殖をＳｉ対照（基礎）およびＳｉ対照＋ＡＧＲ２（処理）に対する生存細胞のパーセントとして示す。（Ｄ）Ｓｉ対照細胞において、Ｇｅｍ添加はアポトーシスを刺激し、この効果はＡＧＲ２により改善された。Ｃ４．４Ａのサイレンシング自体はアポトーシスを誘導し、Ｇｅｍ媒介アポトーシスを改善し、ＡＧＲ２の生存効果を停止させ、アポトーシスの有意な増加を示した。示されるデータは、３つの実験についての平均±ＳＥＭである（＊ｐ＜０．０５）。（Ｅ）特異的Ｃ４．４Ａ  ｓｉＲＮＡの効果を決定するため、４つのｓｉＲＮＡ（ＳｉＣ４．４Ａ１〜４）をアポトーシス試験に使用し、同等の結果を有した。
【図４Ａ−Ｃ】ＡＧＲ２の効果は、インテグリンβ１およびラミニン１またはラミニン５とのＣ４．４Ａ相互作用により媒介される。（Ａ）Ｓｉ対照ＡｓＰＣ−１細胞において、Ｇｅｍ添加はアポトーシスを刺激し、ｒＡＧＲ２の添加はこの効果を阻害した。ＡｓＰＣ−１細胞に、ＩＴＧ−β１、ＩＴＧ−β２、ＩＴＧ−β４、ＩＴＧ−α６、ラミニン１、およびラミニン５に対するｓｉＲＮＡも形質移入した。ラミニン１および５ならびにインテグリンβ１のサイレンシングのみが、Ｇｅｍ刺激アポトーシスを増加させ、ＡＧＲ２の生存効果を停止させた。（Ｂ）ｓｉＲＮＡによるラミニン１および５ならびにインテグリンβ１のサイレンシングは、ＡｓＰＣ−１細胞のＡＧＲ２媒介増殖を有意に停止させた。（Ｃ）ＩＴＧ−β１、ＩＴＧ−β２、ＩＴＧ−β４、ＩＴＧ−α６、ラミニン１、およびラミニン５に対する市販の遮断抗体は、ｓｉＲＮＡ処理と類似の効果を示し、ラミニン１および５ならびにインテグリンβ１に対するＡｂのみがＡＧＲ２媒介生存効果を遮断した。示されるデータは、３つの実験についての平均±ＳＥＭである（＊ｐ＜０．０５）。
【図５Ａ−Ｄ】ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ結合および生物学的効果を遮断する高い特異性を有するモノクローナル抗体を開発した。（Ａ）内因性ＰＤＡＣ細胞溶解物（ＳＵ８６．８６）から、ＡＧＲ２（１８ｋＤ）およびＣ４．４Ａ（５０ｋＤ）をそれらのそれぞれの新たに開発されたｍＡｂにより同定した。内因性タンパク質を用いて同定された追加のバンドは組換えタンパク質を用いても観察され、開裂産物を表す可能性が高い。市販の抗体もそれらの分子を認識した。しかしながら、市販Ａｂは、いくつかの非特異的バンドを示した。遮断ｍＡｂは、（Ｂ）ＡＧＲ２刺激ＰＤＡＣ細胞遊走を低減させ、（Ｃ）ＡＧＲ２の生存効果を遮断した一方、市販のＡｂはそうでなかった。（Ｄ）開発されたｍＡｂを使用するＴＭＡに対する免疫組織化学分析は、ＰＤＡＣの強力な標識（矢印により示す）を示したが、正常の膵臓は標識されなかった。
【図６Ａ−Ｉ】ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ抗体によるインビボ処理は、腫瘍成長および転移を低減させ、生存率を改善した。腫瘍成長および転移を、ルシフェリン基質注射後に生存動物生体ルミネセンスイメージングのためにＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）により毎週計測した。実験の終了まで生存したマウスの数を記録した（生存率）。（Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｈ）モデル１−ＡｓＰＣ−１−侵攻性モデル。侵攻性ＡｓＰＣ−１細胞の注射２週間後、腫瘍が０．５ｇ未満と秤量された場合（並行非処理群から外科的に確認）、マウス（ｎ＝６）を対照ＩｇＧまたはｍＡｂ（５ｍｇのＡＧＲ２／Ｃ４．４ＡのｍＡｂのそれぞれの組合せ／ｋｇ／体重／週２回／腹腔内）により、およびＧｅｍ（１００ｍｇ／ｋｇ体重／週１回／腹腔内）を用いてまたは用いずにより７週間まで処理した。（Ａ）組合せｍＡｂにより処理された全てのマウスは、少なくとも６週間生存した一方、全ての対照マウスは６週間以内に死亡した。（Ｂ）腫瘍容積をイメージングにより毎週推定した。Ｇｅｍを有するおよび有さない組合せＩｇＧは、Ｇｅｍを有するおよび有さない対照ＩｇＧと比較して腫瘍容積の低減を示した。腫瘍重量ならびに肝臓および肺への転移を、実験の終了時にエクスビボで対照および処理群間で比較した。ｍＡｂにより処理されたマウスは、大幅に低減した腫瘍成長（Ｇ）および転移発生率（Ｈ）を示した。ゲムシタビン（Ｇｅｍ）は、単独でもｍＡｂとの組合せでも有意な効果を有さなかった。（Ｃ、Ｄ）モデル２−Ｃａｐａｎ２−間質モデル。間質形成Ｃａｐａｎ−２細胞の注射２週間後、マウス（ｎ＝７）を１５ｍｇのＡＧＲ２またはＣ４．４ＡのｍＡｂ／ｋｇ／体重／週２回／腹腔内により処理した。処理を１５週間後に停止させ（１３週間の処理）、生存動物中の腫瘍サイズを生体ルミネセンスにより６３週間までモニタリングした。（Ｃ）いずれかのｍＡｂにより処理は、９週間までに死亡した対照マウスと比較して生存率の２４週間の改善を個々に示した。非処理４８週間後、マウスは腫瘍再発を示さなかった。（Ｄ）平均腫瘍容積変化は、いずれかのｍＡｂにより処理されたマウスがより緩慢な成長を示すことを示した。数匹のマウスにおいて、腫瘍は消失することが観察された。（Ｅ、Ｆ）モデル３−Ｃａｐａｎ−２−寛解試験。Ｃａｐａｎ−２細胞の注射の４週間後、腫瘍が１ｇ超と秤量された場合（並行非処理群から外科的に確認）、マウス（ｎ＝５）をＡＧＲ２もしくはＣ４．４ＡのｍＡｂ  １５ｍｇ／ｋｇ／体重／週２回／腹腔内または両方のｍＡｂの組合せ（それぞれ７．５ｍｇ）により処理した。処理を１２週間後に停止させた。生体ルミネセンスを生存動物に対して１８週間までモニタリングした。（Ｅ）１ｇよりも大きい腫瘍を保有するマウスのｍＡｂによる処理は、処理４週間以内で死亡した対照マウスと比較して１４週間だけそれらの生存率を改善した。（Ｆ）それぞれの処理群についての腫瘍容積の低減を、生体ルミネセンスイメージングにより計測されるとおり示す。（Ｉ）モデル３中で発症した腫瘍の組織学的試験を実施した。パラフィン切片のＴＵＮＥＬ染色は、対照と比較して抗体処理群において増加したアポトーシス細胞を��独または組合せのいずれでも示した。ｐ−ＥＲＫおよびＫｉ−６７についての染色は、対照マウスの癌細胞中の増加した活性を示した一方、抗体処理マウスは、癌細胞中の活性を示さなかった。定量は、ｍＡｂにより処理されたマウスの腫瘍からの切片中の視野当たりのアポトーシス細胞の数の有意な増加を示した（＊ｐ＜０．０５）。
【図７Ａ−Ｄ】細胞外ｒＡＧＲ２媒介機能。（Ａ）膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３およびＭｉａＰａＣａ−２）をこれらの試験に使用した。ｒＡＧＲ２の細胞外添加は、増殖の有意な用量依存性増加を引き起こした（ＢｘＰＣ−３−３倍増加；ＭｉａＰａＣａ−２−４倍増加；ｐ＜０．０５）。膵臓癌細胞を遊走試験のためのＢｏｙｄｅｎチャンバ上で（Ｂ）、および浸潤試験のための浸潤チャンバ上（Ｃ）でｒＡＧＲ２（０〜１００ｎＭ）を用いてまたは用いずにプレーティングした（２×１０４個の細胞）。２２時間後、細胞をメタノールにより固定し、ヘマトキシリンにより染色し、１０のランダム視野中の細胞を１００倍の倍率において撮影し、計数した。ｒＡＧＲ２の細胞外添加は、遊走（ＢｘＰＣ−３−７倍増加；ＭｉａＰａＣａ−２−３倍増加）および浸潤（ＢｘＰＣ−３−１０倍増加；ＭｉａＰａＣａ−２−３倍増加）の有意な用量依存性増加を引き起こした。（Ｄ）アポトーシスの分析のため、ＢｘＰＣ−３細胞をＧｅｍ（１μＭ）およびＡＧＲ２（１００ｎＭ）を用いておよび用いずに処理した。Ｇｅｍ処理は、アポトーシスの有意な増加（１倍）をもたらした。ｒＡＧＲ２の細胞外添加はＧｅｍ誘導アポトーシスを有意に低減させ（５０％の低減）、したがって、癌細胞の生存率を改善した。示されるデータは、３つの実験についての平均±ＳＥである（対照に対して＊ｐ＜０．０５）。
【図８Ａ−Ｉ】候補受容体結合およびサイレンシング。ＡＧＲ２の候補受容体：（Ａ）ＣＤ５９、（Ｂ）ｕＰＡＲおよび（Ｃ）Ｃ４．４Ａの免疫沈降を示すウエスタンブロッティング。市販の抗ＡＧＲ２抗体を使用してＩＰ分析を実施し、ＩｇＧを対照抗体として使用した。免疫沈降した試料をウエスタンブロット分析のためにロードし、ゲルをそれぞれの抗体によりプロービングした。ＡＧＲ２ＩＰは、３つ全ての候補受容体と同時免疫沈降した。レーン１：分子量マーカー；レーン２：溶解物単独；レーン３：溶解物＋ＩｇＧのＡｂ（マウス）；レーン４：溶解物＋抗ＡＧＲ２抗体（マウス）。示されるマイクログラフは、３つの独立実験の代表物である。（Ｄ）組換えＡＧＲ２およびＣ４．４Ａを溶液中で合わせて直接物理的相互作用について試験し、抗ＡＧＲ２抗体を使用してＩＰを実施し、ウエスタンブロッティングによりＣ４．４Ａについてプロービングした。ＩｇＧを対照抗体として使用した。ｒＡＧＲ２は、このプルダウン実験により示されるとおりｒＣ４．４Ａと直接相互作用した。レーン１：分子量マーカー；レーン２：組換えタンパク質＋ＩｇＧのＡｂ（マウス）；レーン３：組換えタンパク質＋抗ＡＧＲ２抗体（マウス）。（Ｅ）膵臓癌細胞系のＲＴ−ＰＣＲは、試験された全ての細胞系中でＣ４．４Ａの発現を示した。示されるマイクログラフは、３つの独立実験の代表物である。（Ｆ）ウエスタンブロットも、試験された全ての膵臓癌細胞系溶解物中でタンパク質レベルにおいてＣ４．４Ａの発現を示した。示されるマイクログラフは、３つの独立実験の代表物である。（Ｇ〜Ｉ）ＡｓＰＣ−１細胞中でｓｉＲＮＡを２つの最終濃度（５および１０ｎＭ）において使用してそれぞれの候補受容体のサイレンシングを一過的に達成した。それぞれの抗体を用いてウエスタンブロッティングを実施し、同一の膜をローディング対照として機能するβ−アクチンによってもブロッティングした。レーン１：分子量マーカー；レーン２：Ｓｉ対照（５ｎＭ）；レーン３：Ｓｉ対照（１０ｎＭ）；レーン４：それぞれのｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）；およびレーン５：それぞれのｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）。両方の濃度のｓｉＲＮＡは、それぞれの受容体のほぼ完全なサイレンシングを示した。示されるマイクログラフは、３つの独立実験の代表物である。
【図９Ａ−Ｄ】Ｃ４．４Ａのサイレンシングは、基礎およびｒＡＧＲ２媒介機能を低減させた。ＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞に、Ｓｉ対照、ＳｉＣ４．４Ａ、ＳｉＣＤ５９、またはＳｉｕＰＡＲを一過的に形質移入した。（Ａ）増殖試験のため、細胞をｒＡＧＲ２を用いずに（基礎）および用いて（１００ｎＭ、毎日）処理し、細胞数を４８時間後にＭＴＳアッセイにより推定した。遊走（Ｂ）および浸潤（Ｃ）に対する候補受容体のサイレンシングの効果を分析した。Ｃ４．４Ａサイレンシングは、基礎ならびにｒＡＧＲ２刺激増殖、遊走、および浸潤の両方を有意に低減させた。他の候補受容体のサイレンシングは、有意な効果を有さなかった。（Ｄ）アポトーシスに関する試験のため、細胞をＧｅｍ（０．５μＭ）およびｒＡＧＲ２（１００ｎＭ）を用いずにまたは用いて処理した。Ｓｉ対照形質移入細胞において、Ｇｅｍはアポトーシスを刺激し、この効果はｒＡＧＲ２の添加により改善された。Ｃ４．４Ａのサイレンシングはそれらの細胞中でアポトーシスを誘導した一方、Ｇｅｍはアポトーシスをさらに増加させなかった。Ｃ４．４Ａサイレンシング後、ｒＡＧＲ２の添加は細胞をＧｅｍの効果から保護しなかった。示されるデータは、３つの実験についての平均±ＳＥである（＊ｐ＜０．０５）。
【図１０Ａ−Ｂ】ＡＧＲ２の効果は、インテグリンβ１とのＣ４．４Ａ相互作用により媒介される。ｓｉＲＮＡのパネルを使用することにより、種々のインテグリンの役割をＡＧＲ２−Ｃ４．４Ａシグナリング複合体の一部として試験した。（Ａ）アポトーシス試験のため、ｓｉＲＮＡ形質移入ＢｘＰＣ−３細胞をＧｅｍ（０．５μＭ）およびＡＧＲ２（１００ｎＭ）を用いずにまたは用いて処理した。Ｓｉ対照形質移入細胞において、ｒＡＧＲ２添加はＧｅｍ媒介アポトーシスを低減させた。対照的に、インテグリンβ１をサイレンシングした場合、Ｇｅｍはアポトーシスを刺激したが、この効果はＡＧＲ２によっては低減しなかった。他のインテグリンのサイレンシングは、ＡＧＲ２媒介生存効果の停止に対していかなる注目すべき効果も有さなかった。ラミニン１および５はＣ４．４Ａと相互作用することが公知であるため、Ｃ４．４Ａ媒介ＡＧＲ２生存効果に対するこれらのラミニンのサイレンシング効果を評価した。ラミニン１および５のサイレンシングは、ＡＧＲ２媒介生存効果を停止させた。（Ｂ）ＡＧＲ２刺激細胞増殖に対するインテグリンβ１のサイレンシングの効果を決定するため、細胞を異なるｓｉＲＮＡにより処理し、４８時間成長させてからＭＴＳアッセイにより分析した。ラミニン１および５ならびにインテグリンβ１のサイレンシングは、ＡＧＲ２媒介増殖を停止させた。示されるデータは、３つの実験についての平均±ＳＥである（＊ｐ＜０．０５）。
【図１１Ａ−Ｄ】開発されたモノクローナル抗体は、ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａタンパク質にそれぞれ結合し、それらの機能を遮断した。内因性溶解物（ＳＵ８６．８６／Ｐａｎｃ−１）から、ＡＧＲ２（１８ｋＤ）およびＣ４．４Ａ（５０ｋＤ）をｍＡｂのパネルにより同定した。しかしながら、市販のＡｂは、非特異的バンドを示した。内因性タンパク質を用いて同定された追加のバンドは、組換えタンパク質を用いて再確認された。アポトーシス試験のため、ＡｓＰＣ−１細胞を、Ｇｅｍ（０．５μＭ）およびｒＡＧＲ２（１００ｎＭ）を用いずにまたは用いて処理し、精製（Ａ）ＡＧＲ２および（Ｂ）Ｃ４．４ＡのＡｂ（１μＭ）により処理した。市販のＡｂは対照として機能した。Ｇｅｍ添加は増加したアポトーシスをもたらした一方、ＡＧＲ２添加は生存利益をもたらした。水平線は、アポトーシス中央値を表す。示されるデータは、３つの実験についての平均±ＳＥである（＊ｐ＜０．０５）。（Ｃ、Ｄ）高い遮断効率を有するとアポトーシスアッセイから選択された精製（Ｃ）ＡＧＲ２および（Ｄ）Ｃ４．４ＡのＡｂを用いて結合アッセイを実施した。抗原性ペプチド（０．５μｇ）をコーティングし、それぞれの精製Ａｂによりプロービングすることにより、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。示されるデータは、３つの実験についての平均±ＳＥである（＊ｐ＜０．０５）。高い特異性および結合に基づき、ＡＧＲ２についてクローン２８Ｂ、およびＣ４．４Ａについて１Ａを選択した。精製Ａｂを４〜２０％の勾配ゲル上でもランさせて重鎖（５０ｋＤ）および軽鎖（２５ｋＤ）の存在を確認した。ＡＧＲ２およびＣ４．４ＡのＡｂは、追加バンドを示さなかった。
【図１２】Ｃａｐａｎ−２腫瘍の生存曲線。グラフは、同所的に形成されたＣａｐａｎ−２腫瘍を有するマウスおよび対照ヒトＩｇＧ（Ｈｕ対照）、ヒト化抗ＡＧＲ２のｍＡｂ（ＨｕＡＧＲ２）またはヒト化抗Ｃ４．４ＡのｍＡｂ（ＨｕＣ４．４Ａ）抗体により処理されたマウスの生存曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、部分的には、Ｃ４．４Ａ（ＬＹＰＤ３）が細胞外ＡＧＲ２の機能細胞表面受容体であるという知見に基づく。本明細書において、Ｃ４．４Ａ（ＬＹＰＤ３）が細胞外ＡＧＲ２の機能細胞表面受容体として同定された。ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ自己分泌ループが癌に対する治療標的であり得るという着想を支持するため、ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａの両方に対するモノクローナル遮断抗体を開発した。これらの抗体によるインビボ処理は、ＰＤＡＣ腫瘍重量および転移を有意に低減させ、生存を延長させた。これらの結果は、ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ相互作用が癌治療法のための治療潜在性を有する標的であることを示唆する。
【００４２】
Ｉ．ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａ
ＡＧＲ２は、いくつかの腫瘍型において不良アウトカムに関連する（Ｂｒｙｃｈｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）が、機序はこれまで不明である。ＡＧＲ２は、タンパク質成熟およびフォールディングに関与すること（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｈｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、カテプシンを調節すること（Ｄｕｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、およびＭＵＣ−１レベルをモジュレートすること（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｎｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）が報告されている。しかしながら、ＡＧＲ２のこれらの役割は、癌遺伝子として作用するその能力（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）も、いくつかの型の癌の侵攻性を増加させるＡＧＲ２の能力も説明しない。したがって、このタンパク質は、複数の細胞内および細胞外機能を有する可能性が高い。潜在的には、この生理学的および病理学的役割は異なる。本試験において、ｒＡＧＲ２の細胞外添加は、ＰＤＡＣ細胞の増殖、遊走、浸潤、および化学耐性を刺激した。これらの作用は、細胞表面受容体の存在を要求した。したがって、これらのデータに基づき、および理論により拘束されるものではないが、癌におけるＡＧＲ２の役割は、それが特異的受容体と相互作用する分泌シグナリング分子である両生類におけるその役割と機序的に類似する。
【００４３】
両生類において、ＡＧＲ２は、Ｐｒｏｄ１（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ヒトにおける受容体のＬｙ６ファミリーに関連するＧＰＩ結合受容体（Ｇａｌａｔ，２００８；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｙｏｒ，２００１）と相互作用することにより四肢成長を促進する。Ｌｙｓ６ファミリーとしては、ｕＰＡＲ、Ｃ４．４Ａ、およびＣＤ５９が挙げられる（Ｇａｌａｔ，２００８；ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。本研究は、Ｌｙｓファミリー受容体（ｕＰＡＲ、Ｃ４．４Ａ、およびＣＤ５９）がＡＧＲ２と同時免疫沈降したことを示し、それはそれらの受容体間の構造的相同性のためである可能性が高い（Ｇａｌａｔ，２００８）。これにもかかわらず、サイレンシングまたは遮断抗体によるＡＧＲ２とＣ４．４Ａとの相互作用の遮断のみが内因性（基礎）および細胞外ｒＡＧＲ２刺激ＰＤＡＣ細胞機能を低減させた。酵母ツーハイブリッド系においてジストグリカン（Ｄｙｓｔｏｇｌｙｃａｎ）−１がＡＧＲ２に結合することが報告されたが、本同時免疫沈降試験はこの相互作用を証明できなかった。驚くべきことに、他の２つの受容体ＣＤ５９およびｕＰＡＲのサイレンシングは、ＰＤＡＣ細胞の遊走をわずかに増加させることが観察された。この観察は予測されなかった。それというのも、従来の報告はｕＰＡＲのサイレンシングがＰＤＡＣ細胞遊走を阻害することが示唆したためである（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。この差異を説明するものは不明瞭であるが、試験が異なる細胞系において実施されていることに起因し得る。これにもかかわらず、本明細書に示されるデータは、ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａが生存機序を活性化させる自己分泌ループに関与するモデルを支持する。
【００４４】
従来の遺伝子プロファイリング研究において、Ｃ４．４Ａは、膵臓癌において高度に発現されるが、正常組織中でも慢性膵炎組織中でも発現されないことが見出された（Ｌｏｇｓｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｃ４．４Ａは、癌細胞転移の調節因子として既に記載されたオーファン受容体である（Ｒｏｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ａｎｄ  Ｐｌｏｕｇ，２００８）。Ｃ４．４Ａは、黒色腫（Ｒｏｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）および非小細胞肺癌（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）の転移を増加させ、Ｃ４．４Ａタンパク質レベルは乳癌（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）および直腸結腸癌（Ｐａｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）における不良予後と相関する。Ｃ４．４Ａは、本明細書において、ＡＧＲ２の機能細胞表面受容体として同定される。Ｃ４．４Ａのサイレンシングまたは抗体媒介遮断は細胞外ＡＧＲ２の効果を排除し、したがって、Ｃ４．４ＡについてのリガンドとしてのＡＧＲ２を支持した。しかしながら、Ｃ４．４Ａの作用の機序は、これまで調査されてこなかった。したがって、Ｃ４．４Ａと相互作用するシグナリング複合体分子を試験して特異的分子を同定した。
【００４５】
他のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合細胞膜受容体と同様、Ｃ４．４Ａは、下流のシグナリング機序を媒介するための細胞内ドメインを有さない。Ｃ４．４ＡおよびＬｙ６ファミリーの別のメンバーｕＰＡＲ間の相同性を基礎として、これらの相互作用は、細胞外マトリックスタンパク質および特異的インテグリン受容体を含む可能性が高い。Ｃ４．４Ａは、α６β４と会合することにより遊走を促進することが公知である（Ｎｇｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｃ４．４Ａは、ラミニン１および５に結合することも既に報告されているが、機能的研究は実施されなかった（Ｐａｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ラミニン１および５は、主としてインテグリンα３β１と相互作用すると考えられる（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。インテグリンα３β１は、膵管細胞により発現される（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ラミニン１、ラミニン５、またはインテグリンβ１のサイレンシングは、ＡＧＲ２処理の効果を停止させ、したがって、ＡＧＲ２媒介Ｃ４．４Ａ受容体複合体へのそれらの関与を示唆した。
【００４６】
ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ自己分泌ループの遮断の潜在的治療利益を試験するため、リガンド（ＡＧＲ２）および受容体（Ｃ４．４Ａ）に対する遮断ｍＡｂを開発した。両方のＡｂは基礎およびＡＧＲ２媒介機能を遮断した。３つの異なる型の前臨床モデルにおいて遮断ｍＡｂを使用する前臨床研究は、腫瘍重量および転移の有意な低減ならびに生存率の改善をもたらした。ｍＡｂにより処理は、ＰＤＡＣのための臨床標準治療のゲムシタビン（Ｇｅｍ）による処理よりも良好な利益を有した。腫瘍の部分または完全寛解が、個々のｍＡｂまたは両方のｍＡｂの組合せによる処理後に数匹のマウスにおいて観察された。処理の数週間後でも、腫瘍再発は観察されなかった。
【００４７】
したがって、ＡＧＲ２は癌細胞の侵攻性を増加させるための細胞外機能を有し、Ｃ４．４ＡはＡＧＲ２の機能受容体である。Ｃ４．４Ａのシグナリング複合体は、ラミニン１、ラミニン５、およびβ１インテグリンを含む可能性が高い。ＡＧＲ２および／またはＣ４．４Ａに対する遮断ｍＡｂは、腫瘍成長および転移を有意に低減させ、顕著に改善された生存率をもたらす腫瘍寛解をもたらした。
【００４８】
ＩＩ．治療抗体
ある実施形態において、ＡＧＲ２またはＣ４．４Ａタンパク質の少なくとも一部に結合し、ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ結合を阻害する抗体またはその断片および疾患の治療におけるその関連使用が企図される。本明細書において使用される用語「抗体」は、任意の免疫学的結合剤、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥならびに抗原結合活性を保持する抗体ＣＤＲドメインを含むポリペプチドを広く指すものとする。抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、もしくは抗原結合抗体断片または天然もしくは合成リガンドからなる群から選択することができる。好ましくは、抗ＡＧＲ２または抗Ｃ４．４Ａ抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。公知の手段により、および本明細書に記載のとおり、ＡＧＲ２タンパク質またはＣ４．４Ａタンパク質、それらのそれぞれのエピトープの１つ以上、または上記のいずれかのコンジュゲートに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体断片、ならびに結合ドメインおよびＣＤＲ（上記のいずれかの遺伝子操作形態を含む）を、そのような抗原またはエピトープが天然資源から単離されているか天然化合物の合成誘導体もしくはバリアントであるかにかかわらず作出することができる。
【００４９】
本実施形態に好適な抗体断片の例としては、限定されるものではないが：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなる「Ｆｖ」断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなる「ｄＡｂ」断片；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合Ｆａｂ断片を含む二価断片のＦ（ａｂ’）２断片、；（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインを会合させて結合ドメインを形成するペプチドリンカーにより結合している単鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）；（ｖｉｉｉ）二重特異的単鎖Ｆｖ二量体（米国特許第５，０９１，５１３号明細書参照）；ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築される多価または多重特異的断片のダイアボディ（米国特許出願公開第２００５０２１４８６０号明細書）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを結合させるジスルフィド架橋の取り込みにより安定化させることができる。ＣＨ３ドメインに結合しているｓｃＦｖを含むミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を作製することもできる（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００５０】
抗体様結合ペプチド模倣体も、実施形態において企図される。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、削減抗体として作用し、より長い血清半減期およびより煩雑でない合成法のある利点を有するペプチドである「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）を記載している。
【００５１】
ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａ  ｍＲＮＡ配列（それぞれ配列番号１および２）を使用して組換えタンパク質およびペプチドを当業者に周知のとおり産生することができる。例えば、このようなｍＲＮＡ配列は、ＡＧＲ２またはＣ４．４Ａタンパク質またはペプチドの産生のための好適な発現系、例えば、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞中に遺伝子操作することができる。
【００５２】
動物に、抗原、例えば、可溶性ＡＧＲ２またはＣ４．４Ａタンパク質を接種してＡＧＲ２またはＣ４．４Ａタンパク質に特異的な抗体を産生することができる。抗原を別の分子に結合またはコンジュゲートさせて免疫応答を向上させることも多い。本明細書において使用されるコンジュゲートは、動物中で免疫応答を誘発するために使用される抗原に結合している任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非タンパク質性物質である。抗原接種に応答して動物中で産生される抗体は、種々の個々の抗体産生Ｂリンパ球から作製される種々の非同一分子（ポリクローナル抗体）を含む。ポリクローナル抗体は、それぞれが同一抗原上の異なるエピトープを認識し得る抗体種の混合集団である。動物中でのポリクローナル抗体産生のための正確な条件を考慮すると、動物血清中の抗体のほとんどは、動物が免疫化された抗原性化合物上の集団エピトープを認識する。この特異性は、目的抗原またはエピトープを認識する抗体のみを選択するための親和性精製によりさらに向上される。
【００５３】
モノクローナル抗体は、単一種の抗体であり、全ての抗体分子が同一のエピトープを認識する。それというのも、全ての抗体産生細胞が単一のＢリンパ球細胞系に由来するためである。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製するためのものと同一の系に沿って開始する。一部の実施形態において、げっ歯類、例えば、マウスおよびラットをモノクローナル抗体の生成において使用する。一部の実施形態において、ウサギ、ヒツジ、またはカエル細胞をモノクローナル抗体の生成において使用する。ラットの使用は周知であり、ある利点を提供し得る。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）を定型的に使用し、一般に、高い割合の安定融合物を生じさせる。
【００５４】
ハイブリドーマ技術は、不死骨髄腫細胞（通常、マウス骨髄腫）とＡＧＲ２またはＣ４．４Ａ抗原により既に免疫化されたマウスからの単一Ｂリンパ球の融合を含む。この技術は、同一抗原またはエピトープ特異性を有する無制限量の構造的同一抗体（モノクローナル抗体）を産生することができるように無限の世代数にわたり単一抗体産生細胞を繁殖させる方法を提供する。
【００５５】
一実施形態において、抗体は、キメラ抗体、例えば、異種非ヒト、ヒト、またはヒト化配列（例えば、フレームワークおよび／または定常ドメイン配列）にグラフトされた非ヒトドナーからの抗原結合配列を含む抗体である。モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖定常ドメインをヒト起源のアナロガスなドメインにより置き換え、インタクト外来抗体の可変領域を残す方法が開発されている。あるいは、「完全ヒト」モノクローナル抗体がヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックなマウス中で産生される。げっ歯類、例えば、マウス、およびヒトアミノ酸配列の両方を有する抗体可変ドメインを組換え構築することによりモノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト形態に変換する方法も開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体においては、超可変ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワークおよび定常領域は、ヒトアミノ酸配列に由来する（米国特許第５，０９１，５１３号明細書および米国特許第６，８８１，５５７号明細書参照）。げっ歯類に特徴的な抗体中のアミノ酸配列をヒト抗体の対応位置中に見出されるアミノ酸配列により置き換えることは、治療的使用の間の有害免疫反応の見込みを低減させることが考えられる。ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞は、遺伝子突然変異または他の変化に供することもでき、それはハイブリドーマにより産生される抗体の結合特異性を変更してもしなくてもよい。
【００５６】
種々の動物種中でポリクローナル抗体を産生する方法、ならびに種々の型のモノクローナル抗体、例として、ヒト化、キメラ、および完全ヒト抗体を産生する方法は、当技術分野において周知であり、容易に予測可能である。例えば、以下の米国特許および特許出願はそのような方法の実施可能要件を提供する：米国特許第３，８１７，８３７号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，９３９，３５０号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，１９６，２６５号明細書；同第４，２７５，１４９号明細書；同第４，２７７，４３７号明細書；同第４，３６６，２４１号明細書；同第４，４６９，７９７号明細書；同第４，４７２，５０９号明細書；同第４，６０６，８５５号明細書；同第４，７０３，００３号明細書；同第４，７４２，１５９号明細書；同第４，７６７，７２０号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；同第４，８６７，９７３号明細書；同第４，９３８，９４８号明細書；同第４，９４６，７７８号明細書；同第５，０２１，２３６号明細書；同第５，１６４，２９６号明細書；同第５，１９６，０６６号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；同第５，４２０，２５３号明細書；同第５，５６５，３３２号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，６２７，０５２号明細書；同第５，６５６，４３４号明細書；同第５，７７０，３７６号明細書；同第５，７８９，２０８号明細書；同第５，８２１，３３７号明細書；同第５，８４４，０９１号明細書；同第５，８５８，６５７号明細書；同第５，８６１，１５５号明細書；同第５，８７１，９０７号明細書；同第５，９６９，１０８号明細書；同第６，０５４，２９７号明細書；同第６，１６５，４６４号明細書；同第６，３６５，１５７号明細書；同第６，４０６，８６７号明細書；同第６，７０９，６５９号明細書；同第６，７０９，８７３号明細書；同第６，７５３，４０７号明細書；同第６，８１４，９６５号明細書；同第６，８４９，２５９号明細書；同第６，８６１，５７２号明細書；同第６，８７５，４３４号明細書；同第６，８９１，０２４号明細書；同第７，４０７，６５９；および同第８，１７８，０９８号明細書。本明細書およびそれらにおいて引用される全ての特許、特許出願公開、および他の刊行物は、本出願において参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
抗体は、任意の動物源、例として、鳥類および哺乳動物から生成することができる。好ましくは、抗体は、ヒツジ、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体である。さらに、最新の技術が、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリーからのヒト抗体についての開発およびスクリーニングを可能とする。例えば、バクテリオファージ抗体発現技術は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９４６，５４６号明細書に記載のとおり特異的抗体を動物免疫化の不存在下で産生することを可能とする。これらの技術は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；およびＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）にさらに記載されている。  
【００５８】
ＡＧＲ２および／またはＣ４．４Ａに対する抗体が、動物種にも、モノクローナル細胞系にも、他の抗体源にも無関係にＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ結合を遮断する能力を有することが十分に予測される。ある動物種は、抗体の「Ｆｃ」部分を介する補体系の活性に起因してそれらがアレルギー応答を引き起こす可能性がより高いため、治療抗体を生成するためにより好ましくない場合がある。しかしながら、全抗体を「Ｆｃ」（補体結合）断片に、および結合ドメインまたはＣＤＲを有する抗体断片に酵素により消化することができる。Ｆｃ部分の除去は、抗原抗体断片が不所望な免疫学的応答を誘発する見込みを低減させ、したがって、Ｆｃを有さない抗体は、予防または治療的治療のために優位的であり得る。上記のとおり、抗体は、他の種中で産生された、または他の種からの配列を有する抗体を動物に投与することから生じる有害な免疫学的結果を低減させ、または排除するためにキメラまたは部分もしくは完全ヒトとなるように構築することもできる。  
【００５９】
置換型バリアントは、典型的には、タンパク質内の１つ以上の部位におけるあるアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含有し、ポリペプチドの１つ以上の特性を、他の機能または特性の損失の有無にかかわらずモジュレートするように設計することができる。置換は、保存的であり得、すなわち、１つのアミノ酸が類似形状または電荷の１つにより置き換えられる。保存的置換は、当技術分野において周知であり、それとしては、例えば、アラニンのセリンへの変化；アルギニンのリジンへの変化；アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸のグルタミンへの変化；システインのセリンへの変化；グルタミンのアスパラギンへの変化；グルタミン酸のアスパラギン酸への変化；グリシンのプロリンへの変化；ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンのロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの変化；リジンのアルギニンへの変化；メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンのチロシンへの変化；ロイシンのメチオニンへの変化；セリンのトレオニンへの変化；トレオニンのセリンへの変化；トリプトファンのチロシンへの変化；チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；およびバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように非保存的であり得る。非保存的変化は、典型的には、残基を化学的に異なるものにより置換すること、例えば、極性または荷電アミノ酸を非極性または非荷電アミノ酸により置換することを含み、逆もまた同様である。  
【００６０】
タンパク質は組換え体であり得、またはインビトロで合成することができる。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質は、細菌から単離することができる。このようなバリアントを含有する細菌を組成物および方法において実現することができることも企図される。結果的に、タンパク質は単離の必要がない。  
【００６１】
組成物中に、１ｍｌ当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの総ポリペプチド、ペプチド、および／またはタンパク質が存在することが企図される。したがって、組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約または多くとも約０．００１、０．０１０、０．０５０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０ｍｇ／ｍｌ以上（またはその中で導かれる任意の範囲）であり得る。このうち、約、少なくとも約、または多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％が、ＡＧＲ２またはＣ４．４Ａに結合する抗体であり得る。  
【００６２】
抗体または好ましくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質に化学的にコンジュゲートさせ、または融合タンパク質として発現させることができる。本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のため、全てのこのような融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫学的部分の定義に含まれる。  
【００６３】
実施形態は、抗体コンジュゲートまたはペイロードを形成するための少なくとも１つの薬剤に結合しているＡＧＲ２およびＣ４．４Ａ、ポリペプチド、およびペプチドに対する抗体および抗体様分子を提供する。診断剤または治療剤としての抗体分子の効力を増加させるため、少なくとも１つの所望の分子または部分を結合させ、共有結合させ、または複合体形成させることが慣用的である。このような分子または部分は、限定されるものではないが、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子であり得る。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞毒性活性を有する分子を含む。抗体に付着したエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、治療酵素、抗生物質、放射標識ヌクレオチドなどが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされたレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、燐光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはリガンド、例えば、ビオチンが挙げられる。  
【００６４】
抗体のそのコンジュゲート部分への付着またはコンジュゲーションのためのいくつかの方法が当技術分野において公知である。一部の付着方法は、例えば、抗体に付着する有機キレート剤、例えば、無水ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ−３−６−ジフェニルグリコウリルを用いる金属キレート錯体の使用を含む。モノクローナル抗体は、カップリング剤、例えば、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩の存在下で酵素と反応させることもできる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製される。  
【００６５】
ＩＩＩ．疾患の治療  本実施形態のある態様は、ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ媒介自己分泌生存ループに関連する疾患または障害を予防または治療するために使用することができる。ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ自己分泌ループの機能化は、ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ相互作用を防止するための任意の好適な薬物により低減させることができる。好ましくは、このような物質は抗ＡＧＲ２または抗Ｃ４．４Ａ抗体である。  
【００６６】
「治療」および「治療すること」は、対象への治療剤の投与もしくは適用、または疾患もしくは健康関連状態の治療利益を得る目的のための対象への処置もしくはモダリティの実施を指す。例えば、治療は、ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ媒介自己分泌生存ループを阻害する医薬有効量の抗体の投与を含み得る。  
【００６７】
「対象」および「患者」は、ヒトまたは非ヒトのいずれか、例えば、霊長類、哺乳動物、および脊椎動物を指す。特定の実施形態において、対象はヒトである。  
【００６８】
本出願全体にわたり使用される用語「治療利益」または「治療的に有効」は、対象の健全性をこの病態の医学的治療に関して促進し、または向上させるあらゆるものも指す。これとしては、限定されるものではないが、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低減が挙げられる。例えば、癌の治療は、例えば、腫瘍のサイズの低減、腫瘍の浸潤性の低減、癌の成長速度の低減、または転移の予防を含み得る。癌の治療は、癌を有する対象の生存の延長も指し得る。  
【００６９】
ＡＧＲ２またはＣ４．４Ａに結合する抗体は、癌を治療するために投与することができる。癌は、固形腫瘍、転移性癌、または非転移性癌であり得る。ある実施形態において、癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮中で生じ得る。  
【００７０】
癌は、具体的には、限定されるものではないが、以下の組織型のものであり得る：新生物、悪性；上皮性悪性腫瘍；上皮性悪性腫瘍、非分化型；巨大および紡錘型細胞癌；小細胞癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；乳頭癌；扁平上皮細胞癌；リンパ上皮性癌：基底細胞癌；石灰化上皮癌；移行上皮細胞癌；乳頭移行上皮細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合肝細胞癌および胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープの腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支−肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性細胞癌；好酸性細胞癌；好酸球腺腫；好塩基性細胞癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺腫；乳頭および濾胞性腺腫；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢胞腺癌；ムチン性腺腫；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒層細胞腫瘍、悪性；男性胚細胞腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；繊維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑液肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛上皮腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；原線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；グリア芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅覚神経性腫瘍；
髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン（ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ細胞性；悪性リンパ腫、巨細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の規定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；プラズマ細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸性白血病；単球性白血病；マスト細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；および有毛細胞性白血病。  
【００７１】
Ａ．医薬製剤  阻害抗体を含有する治療組成物の臨床適用が考慮される場合、一般に、意図される適用に適切な医薬または治療組成物を調製することが有益である。これは、典型的には、本質的にパイロジェン、およびヒトまたは動物に有害であり得る任意の他の不純物を有さない医薬組成物の調製を要する。複合体を安定とし、標的細胞による取り込みを可能とする適切な緩衝液を用いることもできる。ある実施形態において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態において、活性化合物は、例えば、約２％から約７５％の間の重量の単位、または約２５％から約６０％の間、およびその中で導かれる任意の範囲を含み得る。
【００７２】
本実施形態の治療組成物は、有利には、液体の液剤または懸濁剤のいずれかとして注射組成物の形態で投与され；注射前の液体中の液剤、または液体懸濁剤に好適な固形形態を調製することもできる。これらの製剤は、乳化することもできる。  
【００７３】
語句「薬学的にまたは薬理学的に許容可能な」とは、動物、例えば、ヒトに適宜投与された場合に有害反応も、アレルギー反応も、他の副作用も起こさない分子実体および組成物を指す。抗体または追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）の投与については、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される無菌、発熱原性、一般的安全性、および純度規格に適合すべきであることが理解される。  
【００７４】
本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に公知である任意のおよび全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール性／水性溶液、生理食塩溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルなど）、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、風味剤、色素、流体および栄養補充剤、それらの類似の材料ならびにそれらの組合せを含む。医薬組成物中の種々の構成要素のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。  
【００７５】
用語「単位用量」または「投与量」は、対象における使用に好適な物理的に区別される単位を指し、それぞれの単位は、投与、すなわち、適切な経路および治療レジメンに伴って上記の所望の応答を起こすよう計算された所定量の治療組成物を含有する。治療の回数および単位用量の両方に従って投与すべき量は、所望される効果に依存する。  
【００７６】
患者または対象に投与される本実施形態の組成物の実際の投与量は、身体的および生理学的因子、例えば、対象の体重、年齢、健康状態、および性別、治療される疾患の種類、疾患侵攻の程度、以前または同時的な治療的介入、患者の突発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療物質の効能、安定性、および毒性により決定することができる。例えば、用量は、１回の投与当たり約１μｇ／ｋｇ／体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（このような範囲は介在する用量を含む）以上、およびその中で導かれる任意の範囲もなす。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例において、約５μｇ／ｋｇ／体重から約１００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲、約５μｇ／ｋｇ／体重から約５００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲などを投与することができる。投与を担当する担当医は、いずれにしても、組成物中の活性成分の濃度および個々の対象に適切な用量を決定する。  
【００７７】
活性化合物は、非経口投与用に配合することができ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、またはさらには腹腔内経路を介する注射用に配合することができる。典型的には、このような組成物は、液体の液剤または懸濁剤のいずれかとして調製することができ；注射前の液体の添加時に液剤または懸濁剤を調製するための使用に好適な固体形態を調製することができ；また、この製剤は乳化することもできる。  
【００７８】
注射使用に好適な医薬形態としては、無菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む配合物；ならびに無菌注射液剤または分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。全ての場合において、この形態は無菌でなければならず、それを容易に注射することができる程度に流体でなければならない。これはまた、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば、細菌または真菌の汚染作用に対して保存しなければならない。  
【００７９】
タンパク質性組成物は、中性または塩形態に配合することができる。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）が挙げられ、それは、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸などにより、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などにより形成される。遊離カルボキシル基により形成される塩を、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導することもできる。  
【００８０】
医薬組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒を含み得る。コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合、要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することもできる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中の使用によりもたらすことができる。  
【００８１】
治療組成物の液剤は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと好適に混合している水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物中で、および油中で分散液を調製することもできる。通常の保存および使用条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。  
【００８２】
本発明の治療組成物は、有利には、液体の液剤または懸濁剤のいずれかとして注射組成物の形態で投与され；注射前の液体中の液剤、または懸濁剤に好適な固体形態を調製することもできる。これらの製剤は乳化することもできる。このような目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。例えば、組成物は、リン酸緩衝生理食塩水１ミリリットル当たり１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは最大約１００ｍｇのヒト血清アルブミンを含有し得る。他の薬学的に許容可能な担体としては、水溶液、非毒性賦形剤、例として、塩、保存剤、緩衝液などが挙げられる。  
【００８３】
非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、生理食塩溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなどが挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤が挙げられる。保存剤としては、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスが挙げられる。医薬組成物中の種々の構成要素のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。  
【００８４】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、哺乳動物の眼への適用に好適である。例えば、配合物は、液剤、懸濁剤、またはゲル剤であり得る。一部の実施形態において、組成物は、生分解性インプラント、例えば、硝子体内インプラントまたは眼内挿入物、例えば、結膜面に対する配置のために設計された眼内挿入物を介して投与される。一部の実施形態において、治療剤は、医療デバイスまたはインプラントデバイスをコーティングする。本発明の配合物は、点眼薬の形態の水溶液で眼に適用することができる。これらの点眼薬は、単回投与アンプルから送達することができ、それは好ましくは、無菌であり得、したがって、配合物の静菌構成要素を不要とする。あるいは、点眼薬は、複数回投与ボトルから送達することができ、それは好ましくは、それが送達される場合に配合物から保存剤を抽出するデバイスを含み得、そのようなデバイスは当技術分野において公知である。他の態様において、本発明の構成要素は、眼瞼下方に配置される溶解性挿入物を形成する濃縮ゲルまたは類似のビヒクルとして眼に送達することができる。  
【００８５】
追加の配合物は、経口投与に好適である。経口配合物としては、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような典型的な賦形剤が挙げられる。組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放配合物または散剤の形態を取る。  
【００８６】
本発明の治療組成物は、古典的な医薬製剤を含み得る。本発明による治療組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般経路を介する。これとしては、経口、鼻腔、バッカル、直腸、経腟または局所経路が挙げられる。局所投与は、化学療法誘導脱毛症または他の皮膚過剰増殖障害を予防するために皮膚癌の治療に特に有利であり得る。あるいは、投与は、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によるものであり得る。このような組成物は、通常、生理学的に許容可能な担体、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に許容可能な組成物として投与される。肺、または気道の病態の治療のため、エアロゾル送達を使用することができる。エアロゾルの容量は、約０．０１ｍＬおよび０．５ｍＬの間である。  
【００８７】
治療組成物の有効量は、意図される目的に基づき決定される。例えば、当業者は、因子、例えば、対象のサイズおよび重量；血管新生または疾患侵攻の程度；対象の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに投与が局部か全身かを考慮して所与の対象に投与すべき本発明の抗体の有効量を容易に決定することができる。用語「単位用量」または「投与量」は、対象における使用に好適な物理的に区別される単位を指し、それぞれの単位は、その投与、すなわち、適切な経路および治療レジメンに伴って上記の所望の応答を起こすために計算された所定量の治療組成物を含有する。治療の回数および単位用量の両方に従って投与すべき量は、所望される保護または有効に依存する。  
【００８８】
治療組成物の正確な量は担当医の判断にも依存し、それぞれの個体に特有である。用量に影響する因子としては、患者の身体的および臨床的状態、投与経路、および意図される治療目的（例えば、治癒に対する症状の緩和）ならびに特定の治療物質の効能、安定性および毒性が挙げられる。  
【００８９】
Ｂ．併用治療
ある実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、第２または追加の治療法との組合せでＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ相互作用を阻害するためのＡＧＲ２またはＣ４．４Ａに対する抗体または抗体断片を含む。このような治療法は、ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ媒介自己分泌生存ループに関連する任意の疾患の治療において適用することができる。例えば、疾患は癌であり得る。
【００９０】
併用療法を含む方法および組成物は、治療または保護効果を向上させ、および／または別の抗癌療法もしくは抗過剰増殖性疾患療法の治療効果を増加させる。治療法および予防法ならびに組成物は、所望の効果、例えば、癌細胞の殺傷および／または細胞過剰増殖の阻害を達成するために有効な組み合わされた量で提供することができる。この方法は、細胞を抗体または抗体断片および第２の治療法の両方と接触させることを含み得る。組織、腫瘍、または細胞は、薬剤（すなわち、抗体もしくは抗体断片または抗癌剤）の１つ以上を含む１つ以上の組成物もしくは薬理学的配合物と接触させることができ、組織、腫瘍、および／または細胞を２つ以上の区別される組成物もしくは配合物と接触させることができ、１つの組成物は、１）抗体もしくは抗体断片、２）抗癌剤、または３）抗体もしくは抗体断片および抗癌剤の両方を提供する。さらに、このような併用療法は、化学療法、放射線療法、手術療法、または免疫療法とともに使用することができることも企図される。
【００９１】
用語「接触させる」および「曝露させる」は、細胞に適用される場合、治療構築物および化学療法剤または放射線療法剤を標的細胞に送達し、または標的細胞と直接並置して配置する方法を説明するために本明細書において使用される。細胞殺傷を達成するため、例えば、両方の薬剤を、細胞を殺傷し、または細胞の分裂を防止するために有効な組み合わせた量で細胞に送達する。  
【００９２】
阻害抗体は、抗癌治療前、抗癌治療中、抗癌治療後、またはそれらの組合せで投与することができる。投与は、同時から数分、数日、数週間に及ぶ間隔であり得る。抗体または抗体断片を抗癌剤と別個に患者に提供する実施形態において、一般に、それぞれの送達の時間の間に相当な時間が満了しないことを確保し、その結果、２つの化合物は有利に併用効果を依然として患者に及ぼし得る。このような場合、抗体療法および抗癌療法を互いに対して約１２から２４または７２時間以内に、より特定すると、互いに対して約６〜１２時間以内に患者に提供することができることが企図される。一部の状況において、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６、または７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合、治療のための期間をかなり延長させることが望ましい場合がある。  
【００９３】
ある実施形態において、治療過程は、１〜９０日間以上（このこのような範囲は介在する日数を含む）継続する。ある薬剤を１日目から９０日目（このこのような範囲は介在する日数を含む）のいずれかの日に、もしくはそれらの任意の組合せで投与することができ、別の薬剤を１日目から９０日目（このような範囲は介在する日数を含む）のいずれかの日に、もしくはそれらの任意の組合せで与えることが企図される。１日以内（２４時間の期間）に、患者に薬剤の１回または複数回投与を与えることができる。さらに、治療過程後、抗癌治療が施されない期間が存在することが企図される。この期間は、患者の状態、例えば、患者の予後、体力、健康状態などに応じて、１〜７日間、および／または１〜５週間、および／または１〜１２ヶ月間以上（このこのような範囲は介在する日数を含む）継続し得る。治療周期は、必要に応じて繰り返されることが予測される。  
【００９４】
種々の組合せを用いることができる。以下の例について、抗体療法は「Ａ」であり、抗癌療法は「Ｂ」である：Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。  
【００９５】
本実施形態の任意の化合物または治療法の患者への投与は、薬剤の毒性を考慮して（毒性である場合）、そのような化合物の投与のための一般的プロトコルに従う。したがって、一部の実施形態において、併用療法に起因する毒性をモニタリングするステップが存在する。  
【００９６】
１．化学療法  広範な化学療法剤を本実施形態により使用することができる。用語「化学療法」は、癌を治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を示すために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性の様式、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか、およびどの段階に影響を及ぼすかにより分類される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋するその能力、ＤＮＡ中にインターカレートするその能力、または核酸合成に影響を及ぼすことにより染色体および有糸分裂異常を誘導するその能力に基づき特徴付けすることができる。  
【００９７】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例として、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタードなど；ニトロスレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマＩＩおよびカリチアマイシンオメガＩＩ）；ダイネマイシン、例として、ダイネマイシンＡ；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗菌性発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラルナイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラルナイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗副腎薬、例えば、ミトタンおよびトリロスタンなど；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフロルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル  ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；カル��プラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる。  
【００９８】
２．放射線療法  ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ線、および／または放射性同位体の腫瘍細胞への指向性送達として一般に公知のものが挙げられる。他の形態のＤＮＡ損傷因子、例えば、マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号明細書および同第４，８７０，２８７号明細書）、およびＵＶ照射も企図される。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線についての線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたり５０から２００レントゲンの１日線量から、２０００から６０００レントゲンの単回線量に及ぶ。放射性同位体についての投与量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度および型、および腫瘍性細胞による取り込みに依存する。  
【００９９】
３．免疫療法  当業者は、追加の免疫療法を本実施形態の方法との組合せで、またはそれとともに使用することができることを理解する。癌治療に関して、免疫療法薬は、一般に、癌細胞を標的化および破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）がそのような例である。ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）（イピリムマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、承認された抗ＣＴＬＡ−４抗体の一例である。ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペンブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）およびＯＰＤＩＶＯ（登録
商標）（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ）は、承認された抗ＰＤ−１抗体の例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の一部のマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で、治療法のエフェクターとして機能し得、または他の細胞を動員して実際に細胞殺傷に影響を及ぼし得る。抗体は、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲートさせることもでき、単に標的化薬剤として機能する。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。  
【０１００】
免疫療法の一態様において、腫瘍細胞は、標的化に適する、すなわち、大多数の他の細胞には存在しないあるマーカーを担持しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはいずれも、本実施形態に関して標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、およびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替態様は、抗癌効果を免疫賦活効果と組み合わせることである。免疫賦活分子、例として、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮ、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、および成長因子、例えばＦＬＴ３リガンドも存在する。  
【０１０１】
現在調査中のまたは使用される免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号明細書および同第５，７３９，１６９号明細書；Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号明細書および同第５，８４６，９４５号明細書）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号明細書）である。１つ以上の抗癌療法を本明細書に記載の抗体療法と用いることができることが企図される。  
【０１０２】
４．手術  癌を有する者の約６０％が、何らかの型の手術、例として、予防手術、診断または病期分類手術、治癒手術、および緩和手術を受ける。治癒手術は、癌性組織の全部または一部を物理的に除去し、摘出し、および／または破壊する切除を含み、他の治療法、例えば、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法とともに使用することができる。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除に加えて、手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡下手術（モース手術）が挙げられる。  
【０１０３】
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部の切除時、体内に腔が形成され得る。追加の抗癌療法を用いてその領域への灌流、直接注射、または局所適用により治療を達成することができる。このような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎に、または１、２、３、４、および５週間毎に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月毎に繰り返すことができる。これらの治療は、投与量も変動するものである。  
【０１０４】
５．他の薬剤  他の薬剤を本実施形態のある態様との組合せで使用して治療の治療効力を改善することができることが企図される。これらの追加の薬剤としては、細胞表面受容体およびギャップジャンクションの上方制御に影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤および分化誘導剤（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導因子に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、または他の生物学的薬剤が挙げられる。ギャップジャンクションの数を上昇させることによる細胞間シグナリングの増加により、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果が増加する。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤または分化誘導剤を本実施形態のある態様との組合せで使用して治療の抗過剰増殖効力を改善することができる。細胞接着阻害剤は、本実施形態の効力を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤抗体、例えば、ｃ２２５を本実施形態のある態様との組合せで使用して治療効力を改善することができることがさらに企図される。  
【０１０５】
ＩＶ．キットおよび診断薬  本実施形態の種々の態様において、治療剤ならびに／または他の治療および送達剤を含有するキットが構想される。一部の実施形態において、キットは、本実施形態の治療物の調製および／または投与に企図される。キットは、本実施形態の医薬組成物のいずれかを含有する１つ以上の密封バイアルを含み得る。キットは、例えば、少なくとも１つのＡＧＲ２またはＣ４．４Ａ抗体ならびに本実施形態の構成要素を調製、配合、および／もしくは投与するための、または本発明の方法を１つ以上のステップを実施するための試薬を含み得る。一部の実施形態において、キットは、キットの構成要素と反応しない容器、例えば、エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、またはチューブである好適な容器も含み得る。容器は、滅菌可能材料、例えば、プラスチックまたはガラス製であり得る。  
【０１０６】
キットは、本明細書に記載の方法の手順ステップの概要を示す指示書をさらに含み得、本明細書に記載のまたは当業者に公知のものと実質的に同一の手順に従う。指示情報は、コンピュータを使用して実行された場合、医薬有効量の治療剤を送達する実際または仮想の手順を表示させる機械可読指示を含有するコンピュータ可読媒体中に存在し得る。  
【０１０７】
Ｖ．実施例  以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示の技術は、本発明者により、本発明の実施において十分に機能することが発見された技術を表し、したがって、それの実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることを当業者が認識すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態に多くの変更を行うことができ、依然として本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに同様または類似の結果を得ることを認識すべきである。  
【０１０８】
材料および方法  細胞系。ＮＩＨ３Ｔ３、ＢｘＰＣ３、ＳＵ８６．８６、ＭｉａＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１およびＣａｐａｎ−２細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。細胞系アイデンティティは、ＤＮＡフィンガープリンティング（ＰＯＷＥＲＰＬＥＸ（登録商標）１６  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して確認した。１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で細胞を定型的に培養し、５％のＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃において維持した。  
【０１０９】
抗体および組換えタンパク質。ＡＧＲ２（マウスポリクローナル）、ＤＡＧ−１、ＣＤ５９（カタログ番号ａｂ５６７０３、ａｂ１０５５０４、ａｂ９１８２、ＡｂＣａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ラミニン１、ラミニン５、ＩＴＧβ１、α６、β４（ｓｃ−７４４１７、ｓｃ−２０１４５、ｓｃ−９９３６、ｓｃ−１０７３０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、Ｃ４．４Ａ、ｕＰＡＲ（カタログ番号ＡＦ５４２８、ＭＡＢ８０７、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ｐ−ＥＲＫ（カタログ番号９１６０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、β−アクチン（カタログ番号Ａ２０６６、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および対照ＩｇＧ（カタログ番号ＯＢ０１０７０１；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）についての抗体を購入した。ヒトおよびマウスＡＧＲ２タンパク質は９６％の相同性を有し（Ｂｒｙｃｈｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、したがって、ヒト組換え（ｒＡＧＲ２）（ａｂ６４０１３、ＡｂＣａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を全ての試験に使用した。組換えＣ４．４Ａも購入した（５４２８−Ｃ４−０５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。  
【０１１０】
ｓｉＲＮＡの一過的形質移入。以下の設計済およびバリデート済のｓｉＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）から購入した：ｓｉ対照（カタログ番号１０２７２８１）、ｓｉＡＧＲ２（カタログ番号ＳＩ０４２７４５２２）、ｓｉＣ４．４Ａ（カタログ番号ＳＩ００１０５７００、７０７、７１４、７２１）、ｓｉＵＰＡＲ（カタログ番号ＳＩ０３０３３２８９）、ｓｉＣＤ５９（カタログ番号ＳＩ０３０５２６１６）、ラミニン１（α１）（カタログ番号ＳＩ０２７７９５１１）、ラミニン５（β３）（カタログ番号ＳＩ０２６６４１１６）、インテグリンα６（カタログ番号ＳＩ０２６５４０７８）、インテグリンβ１（カタログ番号ＳＩ００３００５７３）、インテグリンβ２（カタログ番号ＳＩ０３６４８８４８）、およびインテグリンβ４（カタログ番号ＳＩ０２６６４１０９）。細胞にｓｉＲＮＡ（５または１０ｎＭ）をＨＩＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）形質移入試薬（カタログ番号３０１７０５；Ｑｉａｇｅｎ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）により形質移入し、溶解物を７２時間後に調製した。  
【０１１１】
ＩＰ試験。市販のＡＧＲ２抗体（２μｇ；ＡｂＣａｍ）を使用してＡＧＲ２をＳＵ８６．８６溶解物（１００μｇ）から免疫沈降させ、ウエスタンブロッティングを実施した。次いで、同一の膜をそれぞれの抗体について個々に、およびプール抗体によりプロービングした。さらに、ｒＡＧＲ２およびｒＣ４．４Ａを溶解緩衝液中で一緒に懸濁させ（それぞれ２μｇ）、ＩＰを実施した。ＩｇＧ（マウス）が対照として機能した。ウエスタンブロッティングイメージングおよび処理をＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）により実施した。  
【０１１２】
細胞成長、遊走、浸潤およびアポトーシスアッセイ。野生型およびｓｉＲＮＡ形質移入ＰＤＡＣ細胞をｒＡＧＲ２（０〜５００ｎＭ）と、抗体（ポリクローナル市販または新たに開発したｍＡｂ）（１μＭ）の存在および不存在下で成長させた。培地を毎日リフレッシュした。細胞数を４８時間後に既に記載（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）のＭＴＳアッセイにより推定した。それぞれの細胞系についての基礎値の差を回避するため、データを適切な対照と比較した生存細胞の率として表す。遊走および浸潤アッセイは、既に記載（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）のとおり２４時間において実施した。ゲムシタビン（Ｇｅｍ）をＧｅｍ感受性ＢｘＰＣ−３細胞（１μＭ）およびＧｅｍ耐性ＡｓＰＣ−１細胞（５μＭ）（Ａｒｕｍｕｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．２００９）に添加して７２時間後にアポトーシスアッセイを既に記載（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）のとおり実施した。ｓｉＲＮＡ形質移入自体
が基礎アポトーシスを誘導するため、ｓｉＲＮＡが形質移入された細胞をより低濃度のＧｅｍ（ＢｘＰＣ３：０．５μＭ；ＡｓＰＣ−１：１μＭ）により処理した。  
【０１１３】
免疫組織化学（ＩＨＣ）染色。既に記載（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）のとおり、ｍＡｂ（１：１０００）により組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）スライドに対してＩＨＣを実施し、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して発色させた。結果を病理学者により盲目的に評価し、発現レベルを陽性または陰性として分類し（それぞれ腫瘍細胞の＞１０％または＜１０％の細胞質染色）および高程度、中程度、または染色なしとしての染色強度として分類した。アポトーシス細胞をパラフィン切片中で蛍光標識ＴＵＮＥＬ染色（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ３２５０）により検出した。ＭａｐＫ経路の活性化をｐ−ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９１６０；１：１０００）のレベルの分析により評価し、癌細胞の増殖指数をＫｉ−６７染色（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＲＭ−９１０６−Ｓ０；１：２００）により計測した。  
【０１１４】
遮断モノクローナル抗体開発。ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａに対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＵＴ  ＭＤＡＣＣのモノクローナル抗体コア（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｒｅ）において非コンジュゲート抗原性ペプチドを使用して開発した。ＫＬＨコンジュゲートペプチドを使用するＥＬＩＳＡにより標的認識についていくつかのハイブリドーマコロニー（それぞれの抗体について２４００）をスクリーニングした。次いで、選択されたハイブリドーマコロニーをクローニングし、ＥＬＩＳＡにより再度スクリーニングして最大親和性を有するものを選択した。選択されたクローンをサブクローニングし、プロテインＡカラムを使用して精製した。抗体特異性、遮断能、および純度のバリデーションを、組換えおよび細胞溶解物タンパク質に対するウエスタンブロッティング、機能スクリーニング（アポトーシスアッセイ）、結合アッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイ）、および選択Ａｂの純度の分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により実施した（図１１Ａ〜Ｄに示す）。選択抗体を用いるインビトロバリデーション実験は、癌細胞遊走および浸潤の阻害ならびにＧｅｍ誘導アポトーシスを増加させる能力を含んだ。高い親和性および機能遮断能を有する上位候補抗体、それぞれＡＧＲ２およびＣ４．４Ａに対するものを精製し、さらに使用してインビボ実験を実施した。最終選択クローンはＡＧＲ２について２８Ｂ、Ｃ４．４Ａについて１Ａであった。抗体をＡＧＲ２についてＩｇＧ１、Ｃ４．４ＡについてＩｇＧ２ｂとしてサブタイピングした。インビボ実験のための精製抗体をモノクローナル抗体コアにおいて産生した。
【０１１５】
インビボ試験。ＵＴ  ＭＤＡＣＣ規制基準およびＩＵＣＡＣ委員会承認に従って無胸腺ヌードマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊ−雌−９週齢）（ＮＣＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いてインビボ実験を実施した。ルシフェラーゼ標識細胞（０．２５×１０６個）により同所性腫瘍を発症させた。ＩｇＧ（カタログ番号ＯＢ０１０７０１；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）が対照Ａｂとして機能した。
【０１１６】
モデル１（ＡｓＰＣ−１−侵攻性細胞モデル）−侵攻性ＡｓＰＣ−１細胞の注射２週間後、腫瘍が０．５ｇ未満と秤量された場合（並行非処理群から外科的に確認）、マウス（ｎ＝６）を対照またはｍＡｂ（５ｍｇのＡＧＲ２／Ｃ４．４ＡのｍＡｂのそれぞれの組合せ／ｋｇ／体重／週２回／腹腔内）により、およびＧｅｍ（１００ｍｇ／ｋｇ体重／週１回／腹腔内）を用いてまたは用いずに対照マウスの全てが死亡するまで（７週間）処理した。腫瘍重量ならびに肝臓および肺への転移を、実験の終了時にエクスビボで対照および処理群間で比較した。
【０１１７】
モデル２（Ｃａｐａｎ−２−間質モデル）−間質形成Ｃａｐａｎ−２細胞の注射２週間後、マウス（ｎ＝７）を１５ｍｇのＡＧＲ２またはＣ４．４Ａ抗体／ｋｇ／体重／週２回／腹腔内により処理した。処理を１５週間後に停止させ（１３週間の処理）、生存動物中の腫瘍サイズを生体ルミネセンスにより６３週間までモニタリングした。
【０１１８】
モデル３（Ｃａｐａｎ２−寛解試験）−Ｃａｐａｎ−２細胞の注射の４週間後、腫瘍が１ｇ超と秤量された場合（並行非処理群から外科的に確認）、マウス（ｎ＝５）をＡＧＲ２もしくはＣ４．４ＡのｍＡｂ  １５ｍｇ／ｋｇ／体重／週２回／腹腔内または両方のｍＡｂの組合せ（それぞれ７．５ｍｇ）により処理した。処理を１２週間後に停止させた。生体ルミネセンスを生存動物に対して１８週間までモニタリングした。腫瘍成長および転移は、ルシフェリン基質注射後にＩＶＩＳ（登録商標）生存動物生体ルミネセンスイメージングシステムにより毎週計測した（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）。生存するマウスの数を毎週記録し、元の群サイズの率として示した。
【０１１９】
統計分析。全てのインビトロ実験を三つ組で実施し、３つ以上の別個の場合で実施した。表されるデータは、３つ以上の独立実験の平均±ＳＥＭである。７〜１０匹のマウスの群を用いてインビボ実験を実施した。統計的有意差をＡＮＯＶＡ分析（ニューマン−コイルス多重比較検定）により決定し、＜０．０５のＰ値として定義した。
【０１２０】
実施例１
細胞外ＡＧＲ２はインビトロＰＤＡＣ侵攻性および化学耐性を刺激する
ＡＧＲ２がＰＤＡＣ細胞により高度に発現および分泌され、化学耐性に寄与することが既に示された（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。本明細書において細胞外ＡＧＲ２（ｒＡＧＲ２）がＡＧＲ２発現の効果を模倣するか否かを評価した。ＰＤＡＣ細胞系は不均一であるため、複数の細胞モデルＢｘＰｃ−３（Ｇｅｍに感受性である上皮表現型）、ＡｓＰＣ−１、およびＭｉａＰａＣａ−２細胞（Ｇｅｍに高度に耐性である間葉表現型）（Ａｒｕｍｕｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を使用した。
【０１２１】
ＡｓＰＣ−１細胞において、ｒＡＧＲ２による処理は増殖（３倍）、遊走（１０倍）、および浸潤（３倍）を濃度依存的に増加させた（図１Ａ〜Ｃ）。類似の効果がＢｘＰＣ−３およびＭｉａＰａＣａ−２細胞系について観察された（図７Ａ〜Ｃ）。治療剤に対する癌細胞耐性に対するｒＡＧＲ２の効果を決定するため、ＰＤＡＣ細胞をｒＡＧＲ２の存在および不存在下でＧｅｍにより処理した。ＡｓＰＣ−１細胞は高度に耐性であるが、５μｍのＧｅｍの濃度においてアポトーシスの有意な３倍増加が誘導された（図１Ｄ）。ｒＡＧＲ２との同時処理は、Ｇｅｍの効果をほぼ対照レベルに低減させ（＞５０％の低減）、強力な生存効果を実証した。ＡＧＲ２処理は、よりＧｅｍ感受性であるＢｘＰＣ３細胞についてさらに大きい効果を有した（図７Ｄ）。したがって、細胞外組換えＡＧＲ２は、ＡＧＲ２発現について既に観察されたＰＤＡＣ細胞に対する効果（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を再現した。
【０１２２】
実施例２
Ｃ４．４ＡはＡＧＲ２の機能受容体である
ＡＧＲ２の候補受容体を文献から選択し、ＡＧＲ２機能における重要性について試験した。Ｌｙ６受容体ファミリーメンバーｕＰＡＲ、Ｃ４．４Ａ、およびＣＤ５９はＡＧＲ２と同時免疫沈降した一方（図２Ａ）、ＤＡＧ−１は同時免疫沈降しなかった（図８Ａ〜Ｃ）。それぞれの受容体の機能重要性を決定するため、ｓｉＲＮＡを使用してそれらをサイレンシングし、有意なサイレンシングを確認した（図２Ｃおよび図８Ｇ〜Ｉ）。Ｃ４．４Ａのサイレンシングのみが基礎細胞増殖、遊走、および浸潤を有意に低減させ、ＡｓＰＣ−１細胞（図３Ａ〜Ｃ）およびＢｘＰＣ−３細胞（図９Ａ〜Ｃ）におけるｒＡＧＲ２刺激細胞増殖、遊走、および浸潤をほぼ完全に停止させた。他方で、ＣＤ５９およびｕＰＡＲのサイレンシングはＡｓＰＣ−１細胞遊走を有意に増加させた。
【０１２３】
Ｃ４．４Ａサイレンシングは、Ｇｅｍに対するＡＧＲ２媒介化学耐性も遮断した（図３Ｄおよび図９Ｄ）。Ｃ４．４Ａ単独、およびＧｅｍとの組合せのサイレンシングは、アポトーシスの有意な増加比率（２倍）をもたらし、それは対照細胞のＧｅｍ処理についての観察されたものよりも大きな増加であった（図３Ｄ）。重要なことに、Ｇｅｍから細胞を保護するＡＧＲ２処理の能力は、Ｃ４．４Ａサイレンシング後に停止した。オフターゲット効果を制御するため、４つのｓｉＲＮＡ配列をＣ４．４Ａについて試験し、そのそれぞれは同等の結果を示した（図３Ｅ）。これらのデータは、細胞外ＡＧＲ２の効果がＣ４．４Ａとの相互作用により媒介されるという着想を支持する。
【０１２４】
ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａが直接相互作用するか、複合体中での会合によってのみ相互作用するかを決定するため、ｒＡＧＲ２およびｒＣ４．４Ａを他のタンパク質の不存在下で合わせ、同時免疫沈降を実施した。ｒＡＧＲ２およびｒＣ４．４Ａ間の直接相互作用が、このアッセイにおける明らかなバンドの存在により示された（図２Ｂ）。９つのＰＤＡＣ細胞系をＣ４．４Ａ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現についても試験し、それは全ての細胞系中に存在することが観察された（図８Ｄ〜Ｆ）。
【０１２５】
実施例３
Ｃ４．４Ａはインテグリンβ１ならびにラミニン１および５を活性のために要求する
この受容体ファミリーのメンバーｕＰＡＲの既に同定されたシグナリング複合体に照らし（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，２０１０）、インテグリンおよび細胞外マトリックス構成要素を含むＣ４．４Ａシグナリングに関与し得る表面受容体を調査した。Ｃ４．４Ａは、ラミニン１および５に結合することが報告されたが、機能結果は不明であった（Ｐａｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、候補インテグリンならびにラミニン１および５をサイレンシングし、ＡＧＲ２媒介Ｇｅｍ耐性効果を評価した。ラミニン１、ラミニン５、またはインテグリンβ１のサイレンシングは、ＡＧＲ２の保護効果を完全に停止させた一方、インテグリンβ２、β４、またはα６のサイレンシングは効果を有さなかった（図４Ａ）。同様に、ラミニン１、ラミニン５、およびインテグリンβ１に対する市販の遮断抗体は、増殖のＡＧＲ２媒介刺激および化学保護効果も停止させた（図４Ｂ〜Ｃ）。ＢｘＰＣ−３細胞系についての類似の結果を図１０Ａ〜Ｂに示す。まとめると、これらのデータは、ラミニン１および５ならびにインテグリンβ１がＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ受容体複合体に関与することを示唆する。
【０１２６】
実施例４
開発されたＡＧＲ２およびＣ４．４Ａモノクローナル抗体は高度に特異的であり、Ｃ４．４ＡへのＡＧＲ２の結合を遮断する
癌におけるＡＧＲ２およびＣ４．４Ａの役割をさらに理解するため、抗体を使用してそれらの相互作用を遮断した。市販抗体は、ＡＧＲ２（１８ｋＤ）およびＣ４．４Ａ（５０ｋＤ）を認識する一方（図５Ａ）、ＡＧＲ２誘導細胞遊走（図５Ｂ）もＧｅｍ耐性（図５Ｃ）を遮断しなかった。したがって、それぞれの抗原を認識し、それらの相互作用を遮断するＡＧＲ２およびＣ４．４ＡのｍＡｂ（それぞれ１６３−２８Ｂ−１および１６２−１Ａ−１）を開発した（図５Ａ）。ＡＧＲ２（ＣＩＨＨＬＤＥＳＰＨＳＱＡＬＫＫＶＦＡＥＮＫＥＩＱＫＬＡＥＱ；配列番号３）およびＣ４．４Ａ（ＣＰＶＲＰＴＳＴＴＫＰＭＰＡＰＴＳＱＴＰＲＱＧＶＥＨＥＡＳＲＤＥＥＰＲＬ；配列番号４）に対する非コンジュゲート抗原性ペプチドを、アジュバントとともにＢａｌｂ／Ｃマウス中に６週間皮下注射した。脾臓を回収し、骨髄腫細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と融合し、ＫＬＨコンジュゲートペプチドを使用するＥＬＩＳＡによりハイブリドーマをスクリーニングした。候補ハイブリドーマを、ウエスタンブロット分析による抗原に対するそれらの結合効率の確認により同定した。両方の抗体は、市販の抗体と比較してそれらの組換えおよび内因性タンパク質のそれぞれの結合を示した（図５Ａ）。新規ｍＡｂは、膵臓癌細胞溶解物のウエスタンブロット中の非特異的バンドの欠落により示されるとおり、市販の抗体よりも特異的であった。プロテインＡカラムを使用してハイブリドーマのさらなる精製を実施し、精製タンパク質を機能遮断アッセイについて試験した。新規ｍＡｂは細胞遊走のＡＧＲ２刺激およびＧｅｍに対する耐性を遮断した一方、市販の抗体は効果を有さなかった（図５Ｂ〜Ｃ）。遊走アッセイを実施し、遊走の基礎およびＡＧＲ２媒介刺激は、非特異的抗体と比較して両方の遮断抗体（１６３−２８Ｂ−１および１６２−１Ａ−１）の添加時に停止した一方、市販のＡＧＲ２およびＣ４．４Ａ抗体はＡＧＲ２の機能を遮断しなかった。アポトーシスアッセイをＡｓＰＣ−１細胞において実施した。ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａ抗体（それぞれ１６３−２８Ｂ−１および１６２−１Ａ−１）はＡＧＲ２媒介生存効果を停止させ、したがって、アポトーシスを改善した一方、非特異的抗体ならびに市販ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａ抗体は改善しなかった。
【０１２７】
実施例５
ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａは膵臓癌において広く発現される
開発されたｍＡｂを使用して患者組織（ＴＭＡ−組織マイクロアレイ）においてＡＧＲ２およびＣ４．４Ａの発現パターンも評価した（図５Ｄ）。両方の抗体は、ＰＤＡＣの強力な標識を示したが、正常膵臓は標識されなかった。ＡＧＲ２については、１４０人の１０５人（７５％）が陽性であり、それぞれの染色は４６％（高程度）、２９％（中程度）、および２５％（染色なし）であった。高レベルのＡＧＲ２発現は、患者集団全体およびステージ２患者におけるより高頻度のリンパ節転移に関連した（ｐ＜０．０５）。ＡＧＲ２発現および分化間の弱い相関も存在した。Ｃ４．４Ａについては、７４人の６７人（９１％）が陽性であり、それぞれの染色は５２％（高程度）、３９％（中程度）、および９％（染色なし）であった。これらのデータは、ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａが両方とも進行ＰＤＡＣ中で高度に発現されることを裏付ける。両方の分子は、一緒に発現される傾向がある。それというのも、ＰＤＡＣ患者におけるＡＧＲ２およびＣ４．４Ａの発現間の相関が有意であるためである（ｐ＜０．０００１、相関係数０．７４（スピアマンのｒ））。
【０１２８】
実施例６
ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ自己分泌ループの阻害は潜在的な治療利益を提供する
ＡＧＲ２／Ｃ４．４Ａ自己分泌ループの阻害の潜在的な治療利益を評価するため、遮断ｍＡｂによる処理が前臨床モデルにおいて有する効果を試験した。侵攻性細胞モデル（モデル１）（図６Ａ〜Ｂ）においては、高度に腫瘍形成性、転移性およびＧｅｍ耐性細胞系のＡｓＰＣ−１を使用した。Ｇｅｍを用いてまたは用いずに両方のｍＡｂの組合せの効果を試験した。マウスにルシフェラーゼ発現ＡｓＰＣ−１細胞を同所注射し、腫瘍を２週間形成させてから処理を開始した。処理の４週間後（合計６週間後）、対照Ａｂ群における全てのマウスは死亡し、他のマウスを屠殺して腫瘍重量および転移を比較した。このとき、Ｇｅｍとの組合せの対照Ａｂにより処理されたマウスの３０％、ＡＧＲ２およびＣ４．４ＡのｍＡｂの組合せ（それぞれ、１６３−２８Ｂ−１および１６２−１Ａ−１）により処理されたマウスの１００％、およびｍＡｂおよびＧｅｍの組合せにより処理されたマウスの８０％が、生存したままであった。実験を７週間の終了時に完了させた。対照Ａｂと比較して、組合せのｍＡｂ処理は腫瘍重量を３３％だけ低減させ（ｐ＜０．０３）、転移の発生率を６６％だけ低減させた（ｐ＜０．０５）（図６Ｇ〜Ｈ）。ＧｅｍとｍＡｂとの組合せは有意な利点を有さなかった。それというのも、この組合せは４０％だけの腫瘍重量の低減（ｐ＜０．００３）および５０％だけの転移の発生率の低減（ｐ＜０．０５）をもたらしたためである。モデル１においてＧｅｍ処理との組合せにおいて実質的な利益が得られなかったため、Ｇｅｍ処理をモデル２および３において考慮しなかった。ｍＡｂによる処理は、対照Ａｂ処理マウスと比較して動物の体重を低減させず、この経路の遮断に伴う全身毒性の欠落を示唆した。
【０１２９】
間質モデル（モデル２）（図６Ｃ〜Ｄ）においては、Ｇｅｍ耐性の高密度間質形成するが転移しない細胞系のＣａｐａｎ−２を使用した。対照Ａｂ群におけるマウスは９週間（７週間の処理）以内に全て死亡した（図６Ｃ）。このとき、ＡＧＲ２のｍＡｂ（１６３−２８Ｂ−１）により処理されたマウスの４３％およびＣ４．４ＡのｍＡｂ（１６２−１Ａ−１）により処理されたマウスの５７％が生存していた。処理を１５週間後（１３週間の処理後）に中断し、動物をそれらが死亡し、または重症になるまで生存させた。生存時間中央値（動物の５０％が生存した時点）は、対照Ａｂについて６週間であり、ＡＧＲ２のｍＡｂについて９週間であり、Ｃ４．４ＡのｍＡｂについて１０週間であった（ｐ＜０．０５）。ＡＧＲ２およびＣ４．４ＡのＡｂの両方の処理は、対照Ａｂと比較して腫瘍容積を５０％だけ低減させた（ｐ＜０．０５）（図６Ｄ）。一部のマウス（ＡＧＲ２のｍＡｂ処理の１／７；Ｃ４．４ＡのｍＡｂ処理の３／７）は、生体ルミネセンスイメージングにより示され、外科的試験により確認されるとおり、完全な腫瘍寛解を示した。第６３週後、１匹のマウスがＡＧＲ２のＡｂおよびＣ４．４ＡのＡｂ群のそれぞれにおいて生存していた。屠殺後、これらの動物を試験し、腫瘍の証拠は観察されなかった。
【０１３０】
腫瘍が１ｇ超である場合、癌細胞移植の５週間後から開始する寛解試験（モデル３）をマウスに対して実施した（図６Ｅ〜Ｆ）。この試験において、対照Ａｂ群における全てのマウスは処理開始３週間後（合計８週間後）に死亡した。このとき、それぞれのｍＡｂ処理群の６０％が生存した。ｍＡｂによる処理を１２週間後に中断し、マウスをそれらが死亡し、または重症になるまで生存させた。生存時間中央値は、対照Ａｂ処理動物について８週間であり、ＡＧＲ２またはＣ４．４ＡのｍＡｂ処理動物について１２週間であり、ＡＧＲ２およびＣ４．４ＡのｍＡｂの組合せにより処理された動物について１１週間であった（ｐ＜０．０５）。このモデルについて、生体ルミネセンスイメージングにより毎週計測された腫瘍の低減が示される（図６Ｆ）。ＡＧＲ２のｍＡｂにより処理された５匹のマウスの１匹は、その腫瘍の完全寛解を示した。生存マウス中の遺残腫瘍の分析は、ｍＡｂ処理群において高レベルのアポトーシス細胞を示した（図６Ｉ）。ｐ−ＥＲＫレベルの分析は、この経路の活性が抗体処理群において完全に停止することを示した。増殖指標Ｋｉ−６７の分析は、ｍＡｂ処理群に対する染色を示さなかった。類似の結果が他のＰＤＡＣ細胞モデルにおいて観察された。
【０１３１】
実施例７
１６２−１Ａ−１および１６３−２９Ｂ−１モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ領域のシーケンシング
細胞培養。１６２−１Ａ−１および１６３−２８Ｂ−１ハイブリドーマ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）および１×ペニシリン−ストレプトマイシンミックス（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃において７．５％のＣＯ２インキュベーター中で成長させた。
【０１３２】
アイソタイピング。１６２−１Ａ−１および１６３−２８Ｂ−１ハイブリドーマ細胞のそれぞれにより産生されたマウスモノクローナル抗体のアイソタイプを、以下のとおりＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中で１／１，０００希釈された１００μＬ／ウェルの以下の５つのヤギポリクローナル抗体の１つ（全てＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ製）により４℃において一晩コーティングした。
１．γ鎖特異的抗マウスＩｇＧ
２．γ１鎖特異的抗マウスＩｇＧ
３．γ２ａ鎖特異的抗マウスＩｇＧ
４．γ２ｂ鎖特異的抗マウスＩｇＧ
５．μ鎖特異的抗マウスＩｇＭ
【０１３３】
ウェルを洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）により洗浄し、３００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ緩衝液（２％の脱脂粉乳および０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）により室温において３０分間ブロッキングし、洗浄緩衝液により洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ緩衝液およびそれぞれのハイブリドーマの培養上清の１：１混合物をＥＬＩＳＡプレートに２つ組でアプライした。ＥＬＩＳＡプレートを室温において１時間インキュベートし、洗浄緩衝液により洗浄した後、ＥＬＩＳＡ緩衝液中で１／１，０００希釈された１００μＬ／ウェルの以下の２つのヤギポリクローナル抗体（両方とも、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ製）の１つを使用して結合抗体を室温において３０分間検出した。
Ａ．ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスカッパ鎖ポリクローナル抗体
Ｂ．ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスラムダ鎖ポリクローナル抗体
【０１３４】
洗浄緩衝液により洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＡＢＴＳ（登録商標）基質（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を添加することにより発色を実施し、１００μＬ／ウェルの２％のシュウ酸を添加することにより停止させた。吸光度を４０５ｎｍにおいて読み取った。
【０１３５】
アイソタイピングの結果は１６２−１Ａ−１：ＩｇＧ２ｂ／カッパおよび１６３−２８Ｂ−１：ＩｇＧ１／カッパであった。
【０１３６】
マウス免疫グロブリン可変領域遺伝子のクローニングおよびシーケンシング。トータルＲＮＡを約５×１０６個の１６２−１Ａ−１および１６３−２８Ｂ−１細胞のそれぞれから、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を供給業者のプロトコルに従って使用して抽出した。ＳＭＡＲＴＥＲ（商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を供給業者のプロトコルに従って使用して５’−ＲＡＣＥのためのオリゴｄＴプライミングｃＤＮＡを合成した。重鎖および軽鎖についての可変領域ｃＤＮＡを、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、マウス重鎖および軽鎖定常領域に特異的にアニールする３’プライマー、ならびにＳＭＡＲＴＥＲ（商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにおいて提供される５’−ＲＡＣＥプライマー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ）を使用した。
【０１３７】
重鎖可変領域（ＶＨ）のＰＣＲ増幅のため、３’プライマーは以下に示される配列を有する。
ＭＣＧ１：５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ−３’（γ１鎖用）（配列番号５）
ＭＣＧ２Ｂ：５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ−３’（γ２ｂ鎖用）（配列番号６）
【０１３８】
カッパ軽鎖可変領域（ＶＬ）のＰＣＲ増幅のため、３’プライマーは以下に示される配列を有する。
ＭＣＫ：５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号７）
【０１３９】
増幅されたＶＨおよびＶＬ  ｃＤＮＡを、配列決定のためにｐＪｅｔ１．２ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中にサブクローニングした。ＤＮＡシーケンシングは、Ｔｏｃｏｒｅ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）において以下の２つのプライマーを用いて実施した。
ＪｅｔＦｗｄ：５’−ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣ−３’（配列番号８）
ＪｅｔＲｅｖ：５’−ＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号９）
【０１４０】
いくつかの重鎖および軽鎖クローンをシーケンシングし、典型的なマウス重鎖および軽鎖可変領域と相同性であるユニーク配列を同定した。それぞれのＶ遺伝子についてのコンセンサスｃＤＮＡ配列を、少なくとも４つの独立クローンについて得た。
【０１４１】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子の配列。１６２−１Ａ−１および１６３−２８Ｂ−１モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を表１に示す。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）の定義に従うＣＤＲ１、２および３の配列に実線により下線を引いた。
【０１４２】
【表１】
2017534251.tif 000002
【０１４３】
実施例８
寛解試験−Ｃａｐａｎ−２腫瘍における生存曲線
ルシフェリンにより標識されたＣａＰａｎ−２細胞（１５０万個の細胞）により同所性腫瘍を発症させ、腫瘍を並行実験において計測してそれが約１ｇサイズの腫瘍に達するまでより大きく成長させた（５週間）。マウスをビヒクル（ヒトＩｇＧアイソタイプ対照−カタログ番号０１６０−０１、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）（Ｈｕ対照と示す、ｎ＝５）、またはＡＧＲ２ヒト化Ａｂ（ＨｕＡＧＲ２として示す、ｎ＝７）、またはＣ４．４Ａヒト化Ａｂ（ＨｕＣ４．４Ａとして示す、ｎ＝７）、（２５ｍｇ／ｋｇ体重／腹腔内／週２回）のいずれかにより４０週間まで処理した。腫瘍を生体ルミネセンスイメージングにより毎週計測した。生存曲線が図１２に示されるとおり計測された。対照群が１００％の死亡を示すとき、ＨｕＡＧＲ２群は７１％の生存率を示し、ＨｕＣ４．４Ａは８７％の生存率を示した。生存時間中央値は、対照について１０週間であり、ＨｕＡＧＲ２について１６週間であり、ＨｕＣ４．４Ａ群について１８週間であった。生存曲線の比較（ログランクマンテル・コックス検定）は、ＨｕＡＧＲ２（ｐ＝０．０１１８）およびＨｕＣ４．４Ａ（ｐ＝０．００３２）処理群が対照群と比較して生存率の有意な改善を示す（ｐ＜０．０５）ことを示唆した。
【０１４４】
理論実施例９
１６３−２８Ｂ−１および１６２−１Ａ−１抗体についての結合エピトープの決定
１６３−２８Ｂ−１および１６２−１Ａ−１についての結合エピトープを実験的に決定することができる。ＡＧＲ２およびＣ４．４Ａタンパク質配列中の体細胞突然変異を導入することができ、得られる配列の抗体結合を計測してエピトープをなすアミノ酸を同定することができる。この技術を使用して直線状および立体構造エピトープの両方をマッピングすることができる。高スループット突然変異誘発マッピングは、包括的突然変異ライブラリーを利用する別のアプローチであり、それぞれのクローンは、ユニークアミノ酸突然変異（保存的、非保存的、またはアラニン）を含有し、ライブラリー全体は標的タンパク質中のあらゆるアミノ酸をカバーする。突然変異ライブラリーからの数百のプラスミドクローンを３８４ウェルマイクロプレート中に個々にアレイし、哺乳動物細胞中で発現させ、抗体結合について試験する。抗体結合に要求されるアミノ酸は、蛍光反応性の損失により同定し、タンパク質構造上にマッピングしてエピトープを可視化することができる。
【０１４５】
本明細書に開示および特許請求される方法の全ては、本開示に照らして過度の実験なしで構成し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきた一方、変法を本明細書に記載の方法に、および本方法のステップにおいて、またはステップの順序において、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱せずに適用することができることが当業者には明らかである。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある薬剤は、本明細書に記載の薬剤に代えて用いることができる一方、同一または類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換物および改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内と考えられる。
【０１４６】
参照文献
以下の参照文献は、それらが例示的な手順または他の詳細な補助を本明細書に記載のものに提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
米国特許第３，８１７，８３７号明細書
米国特許第３，８５０，７５２号明細書
米国特許第３，９３９，３５０号明細書
米国特許第３，９９６，３４５号明細書
米国特許第４，１９６，２６５号明細書
米国特許第４，２７５，１４９号明細書
米国特許第４，２７７，４３７号明細書
米国特許第４，３６６，２４１号明細書
米国特許第４，４６９，７９７号明細書
米国特許第４，４７２，５０９号明細書
米国特許第４，６０６，８５５号明細書
米国特許第４，７０３，００３号明細書
米国特許第４，７４２，１５９号明細書
米国特許第４，７６７，７２０号明細書
米国特許第４，８１６，５６７号明細書
米国特許第４，８６７，９７３号明細書
米国特許第４，８７０，２８７号明細書
米国特許第４，９３８，９４８号明細書
米国特許第４，９４６，７７８号明細書
米国特許第５，０２１，２３６号明細書
米国特許第５，０９１，５１３号明細書
米国特許第５，１６４，２９６号明細書
米国特許第５，１９６，０６６号明細書
米国特許第５，２２３，４０９号明細書
米国特許第５，４０３，４８４号明細書
米国特許第５，４２０，２５３号明細書
米国特許第５，５６５，３３２号明細書
米国特許第５，５７１，６９８号明細書
米国特許第５，６２７，０５２号明細書
米国特許第５，６５６，４３４号明細書
米国特許第５，７３９，１６９号明細書
米国特許第５，７６０，３９５号明細書
米国特許第５，７７０，３７６号明細書
米国特許第５，７８９，２０８号明細書
米国特許第５，８０１，００５号明細書
米国特許第５，８２１，３３７号明細書
米国特許第５，８２４，３１１号明細書
米国特許第５，８３０，８８０号明細書
米国特許第５，８４４，０９１号明細書
米国特許第５，８４６，９４５号明細書
米国特許第５，８５８，６５７号明細書
米国特許第５，８６１，１５５号明細書
米国特許第５，８７１，９０７号明細書
米国特許第５，９６９，１０８号明細書
米国特許第６，０５４，２９７号明細書
米国特許第６，１６５，４６４号明細書
米国特許第６，３６５，１５７号明細書
米国特許第６，４０６，８６７号明細書
米国特許第６，７０９，６５９号明細書
米国特許第６，７０９，８７３号明細書
米国特許第６，７５３，４０７号明細書
米国特許第６，８１４，９６５号明細書
米国特許第６，８４９，２５９号明細書
米国特許第６，８６１，５７２号明細書
米国特許第６，８７５，４３４号明細書
米国特許第６，８８１，５５７号明細書
米国特許第６，８９１，０２４号明細書
米国特許第６，９４６，５４６号明細書
米国特許第７，４０７，６５９号明細書
米国特許第８，１７８，０９８号明細書
Ａｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｃｅｍｅｎｔ  ｇｌａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ＸＡＧ−２．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，７２：１１５−１３０，１９９８．
Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，１９９７．
Ａｒｕｍｕｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６９：５８２０−５８２８，２００９．
Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，Ｒｅｖｉｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ｄｅ  Ｃｈｉｌｅ，１２６（７）：８３８−８４５，１９９８．
Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３，１９９４．
Ｂａｒｒａｃｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７５：１８４８−１８５７，２００９．
Ｂｒｙｃｈｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ２：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｙｅｒ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，３０４：１−７，２０１１．
Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４（１０）：２３３７−２３４７，１９９８．
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｙｏｒ，Ｔｈｅ  ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５８：１９６９−１９８７，２００１．
Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４（Ｐｔ  １１）：３０２７−３０３７，１９９８．
ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｎｅｗｔ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ｏｆ  ＣＤ５９  ｉｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｘｉｍｏｄｉｓｔａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｍｐｈｉｂｉａｎ  ｌｉｍｂ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．，３：５４７−５５５，２００２．
Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１（５）：３８９−３９８，１９９８．
Ｄｕｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＧＲ２  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７１：７０９１−７１０２，２０１１．
Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｈＡＧ−２  ａｎｄ  ｈＡＧ−３，ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｇｅｎｅ  Ｃ４．４ａ  ａｎｄ  ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８８：５７９−５８５，２００３．
Ｇａｌａｔ，Ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ−ｆｉｎｇｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６５：３４８１−３４９３，２００８．
Ｇｏｌｄｆｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ａｌｐｈａ３  ｌａｍｉｎｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ，ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ４  ａｎｄ  ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１２：２６１５−２６２９，１９９９．
Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０，１９９２．
Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＧＲ２  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７：４７７３−４７８２，２０１２．
Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７８（４）：４８０−４８５，１９９８．
Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ４．４Ａ，ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，５８：２６０−２６６，２００７．
Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ，３７（４）：３４７−３５３，１９９８．
Ｈｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＤＩ）−ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ２（ＡＧＲ２）ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：４４８５５−４４８６８，２０１１．
Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．，３：３，２０１２．
Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：３０５５−３０６１，１９９６．
Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎ．，６６（１１）：５３２９−５３３６，１９９８．
Ｉｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＧＲ２  ｆｏｒ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９４：１０５７−１０６５，２００６．
Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ａｎｄ  Ｐｌｏｕｇ，Ｔｈｅ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  Ｃ４．４Ａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５：２５５９−２５７３，２００８．
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，５０：１６２５−１６３２，２００２．
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１．
Ｋｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｇｏｂ−４，ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４４４：４３４−４３８，１９９９．
Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ４．４Ａ  ａｔ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｆｒｏｎｔ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０１：２２６９−２２７７，２０１０．
Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓａｌａｍａｎｄｅｒ  ｌｉｍｂ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃ．Ｒ．Ｂｉｏｌ．，３３０：４８５−４９０，２００７．
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４９：２０９−２１６，２００３．
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｃｅｍｅｎｔ  ｇｌａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：３７９６−３８０５，２００５．
Ｌｏｇｓｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：２６４９−２６５７，２００３．
Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３，１９９２．
Ｎｇｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂｏｕｎｄ  ａｎｄ  Ｅｘｏｓｏｍａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃ４．４Ａ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  α（６）β（４）Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ＭＴ１−ＭＭＰ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１４：９５−１０７，２０１２．
Ｎｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＧＲ２  ｉｓ  ａ  ＳＭＡＤ４−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ＭＵＣ１  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３２：３８６７−３８７６，２０１３．
Ｐａｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｙ６  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ｃ４．４Ａ  ｂｉｎｄｓ  ｌａｍｉｎｉｎｓ  １  ａｎｄ  ５，ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ａｎｄ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１５：７２４−７３３，２００５．
Ｐａｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ４．４Ａ  ａｓ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９７：１１４６−１１５６，２００７．
Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＡＧＲ２  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｕｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ，１０６：６９５０−６９５５，２００９．
Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈａｇ２  ａｎｄ  Ｈａｇ３  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．，３６：７３４−７４０，２００５．
Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（２４）：１４４１１−１４４１６，１９９８．
Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｍａｎｎｅｒ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＤＭＲ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７：２６６６−２６７５，２００７．
Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ２  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８：７８１１−７８１８，２００８．
Ｒｏｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｉｎｇ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１７：１９８９−２００２，１９９８．
Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６９（２）：１４７−１５５，１９９６．
Ｓｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ４．４Ａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１６：３４４−３４７，２００１．
Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：４９９３−４９９７，２００５．
Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：１６７８−１６８５，２００１．
Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｕＰＡＲ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：２３−３６，２０１０．
Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１，１９９４．
Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｐｉｌｉｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  ３  ｂｅｔａ  １．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０８：８３１−８３８，１９９５．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｅｌ，ｈＡＧ−２，ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  ｃｅｍｅｎｔ  ｇｌａｎｄ  ｇｅｎｅ  ＸＡＧ−２，ｉｓ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５１：１１１−１１６，１９９８．
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ，ＡＧＲ２，ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８：４９２−４９７，２００８．
Ｗｕｅｒｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒａｔ  Ｃ４．４Ａ．Ｇｅｎｅ，２６２：３５−４１，２００１．
Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＲＫ／ｐ３８  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４１：１７３１−１７３８，２００９．
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＧＲ２，ａｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，４３：２４９−２５９，２００５．
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｅｔｈ  ａｎｄ  ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  Ａｇｒ２−／−ｍｉｃｅ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３３８：２７０−２７９，２０１０．
Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ａｒｒａｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，２４５：３０３−３１４，２００７．
【図１Ａ−Ｄ】
2017534251.tif 000003
【図２Ａ−Ｂ】
2017534251.tif 000004
【図２Ｃ】
2017534251.tif 000005
【図３Ａ−Ｂ】
2017534251.tif 000006
【図３Ｃ−Ｅ】
2017534251.tif 000007
【図４Ａ】
2017534251.tif 000008
【図４Ｂ】
2017534251.tif 000009
【図４Ｃ】
2017534251.tif 000010
【図５Ａ−Ｂ】
2017534251.tif 000011
【図５Ｃ−Ｄ】
2017534251.tif 000012
【図６Ａ−Ｂ】
2017534251.tif 000013
【図６Ｃ−Ｄ】
2017534251.tif 000014
【図６Ｅ−Ｆ】
2017534251.tif 000015
【図６Ｇ−Ｈ】
2017534251.tif 000016
【図６Ｉ】
2017534251.tif 000017
【図７Ａ−Ｂ】
2017534251.tif 000018
【図７Ｃ−Ｄ】
2017534251.tif 000019
【図８Ａ】
2017534251.tif 000020
【図８Ｂ】
2017534251.tif 000021
【図８Ｃ】
2017534251.tif 000022
【図８Ｄ】
2017534251.tif 000023
【図８Ｅ】
2017534251.tif 000024
【図８Ｆ】
2017534251.tif 000025
【図８Ｇ】
2017534251.tif 000026
【図８Ｈ】
2017534251.tif 000027
【図８Ｉ】
2017534251.tif 000028
【図９Ａ−Ｂ】
2017534251.tif 000029
【図９Ｃ−Ｄ】
2017534251.tif 000030
【図１０Ａ】
2017534251.tif 000031
【図１０Ｂ】
2017534251.tif 000032
【図１１Ａ】
2017534251.tif 000033
【図１１Ｂ】
2017534251.tif 000034
【図１１Ｃ】
2017534251.tif 000035
【図１１Ｄ】
2017534251.tif 000036
【図１２】
2017534251.tif 000037
【配列表】
2017534251000001.app
【国際調査報告】
2017534251.tif 000038
2017534251.tif 000039
2017534251.tif 000040
2017534251.tif 000041
2017534251.tif 000042
2017534251.tif 000043