(57)【要約】  本発明は、医療技術分野に関し、具体的に環状ジヌクレオチドｃＧＡＭＰが腫瘍を治療するのにおける応用に関するのである。本発明の研究によれば、ｃＧＡＭＰは多様な腫瘍細胞の生長を抑制することができるし、著しい抗腫瘍作用を有することにより、抗腫瘍薬の製造に使われることができるし、製造された抗腫瘍薬は、毒性が低くて効果がいい。ヌードマウス皮下移植腫瘍モデルによれば、ｃＧＡＭＰは、ヒトの胃癌細胞株ＭＮＫ−４５、ヒトの肺腺癌細胞株Ａ５４９、ヒト大腸癌細胞株Ｌｏｖｏ、ヒト肝臓癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ヒト膵臓癌細胞ＳＷ１９９０のヌードマウス皮下移植腫瘍に対して、すべて著しい抑制作用を有して、動物急性毒性試験によれば、ｃＧＡＭＰの急性毒性は比較的低いので、抗腫瘍薬の製造に使われることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍におけるｃＧＡＭＰの応用。
【請求項２】
抗腫瘍薬の製造におけるｃＧＡＭＰの応用。
【請求項３】
前記腫瘍は、胃癌、肺癌、大腸癌、肝臓癌、前立腺癌または膵臓癌である、請求項２に記載の抗腫瘍薬の製造におけるｃＧＡＭＰの応用。
【請求項４】
ｃＧＡＭＰによって製造された抗腫瘍薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医療技術分野に関し、具体的には、抗腫瘍及び抗腫瘍薬の製造において環状ジヌクレオチド（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｃＧＡＭＰ）を応用する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は、人類の生命と健康にとって深刻な脅威となる重大な疾患の中の一つであり、細胞の過度な増殖と分化異常として現われる。ＷＨＯの専門家の予測によれば、２０２０年における世界人口に占める腫瘍発病者数は、２０００万人に達するとのことで、そのうち死亡者数は１２００万人に達するとのことであり、腫瘍は、今世紀における人類の最も致命的な疾患となっており、人類の生存にとって最も深刻な脅威を与えるものである。発病率と死亡率の高さで言えば、肺癌、大腸癌／直腸癌、胃癌、肝臓癌などの全ては、多様な悪性腫瘍の中で前列を占めている。中国腫瘍登録センターから発表された「２０１２年における中国腫瘍登録年譜」の統計によると、毎年新規に発生した腫瘍病例は、約３１２万例で、平均すると毎日８５５０人の病例が発生していることになり、中国では毎分６人が癌として診断されていることになる。病気の種類から見れば、肺癌、胃癌、大腸癌／直腸癌、肝臓癌と食道癌が、中国悪性腫瘍発病の最上位から第５位までに入る。悪性腫瘍の発病率と死亡率が毎年増えることによって、悪性腫瘍の治療への需要がますます拡大している。
【０００３】
化学療法は、腫瘍を治療する効果的な方法の中の一つである。伝統的な化学療法薬の作用メカニズムは、主にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはタンパク質の合成を防止するとか、またはこのような高分子に対して直接的な作用を起こさせ、腫瘍細胞の分裂と増殖を抑制することにより、腫瘍細胞を死亡させるものである。ある薬は体内ホルモンの均衡を変えることにより腫瘍の成長を抑制することもできる。現在抗腫瘍薬は、（１）抗代謝薬、（２）アルキル化剤、（３）細胞毒素類抗菌素、（４）植物アルカロイドとその他の自然薬、（５）抗腫瘍ホルモン類、（６）白金族元素及びその他の抗腫瘍薬のような６種類の薬として研究開発されている。臨床治療モデルの変化と抗腫瘍薬の標的となり得る幾つかの新たな物質の発見によって、抗腫瘍薬分野の研究開発に大きな変化が起こった。即ち、薬剤の作用メカニズムにおいて、伝統的な非特異性の細胞毒性類薬剤の開発から非細胞毒性類の標的薬剤の開発へと方向を転換したのである。２０１２年においてＦＤＡから許可された抗腫瘍薬のうち、微細分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、特に複数の標的物質に作用するＴＫＩ（約３／４を占める）は、抗腫瘍薬の研究開発において大人気となっており、２０１３年６月までアメリカのＦＤＡから認可されたＴＫＩは、すでに１８種に達している。その他にも、他の注目される有望な作用メカニズムに基づく薬剤の例には、免疫刺激剤、血管生成抑制剤、細胞周期抑制剤、免疫の抑制剤、免疫の刺激剤及びタンパク質キナーゼ抑制剤などが含まれる。
【０００４】
感染された哺乳動物細胞において、微生物と病毒性のＤＮＡはインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）  の分泌を刺激することにより、力強い内因性の免疫応答を誘導することができる。小胞体（ＥＲ）受容体タンパク質（ＳＴＩＮＧ）は、細胞質ＤＮＡに対して作用する免疫応答にとって必須の要素である。最近の研究によれば、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）はＤＮＡを活性化条件の下で結合した後において、ｃＧＡＭＰの合成に作用する内因性の触媒として機能する。ｃＧＡＭＰは、ＳＴＩＮＧによってＩＮＦ−βの誘導を触発し、ＴＢＫ１とＩＲＦ−３の活性化を媒介し、続いて、ＩＮＦ−β遺伝子の転写を開始させるための第２メッセンジャーとして使用される細胞質ＤＮＡセンサーである。最近の研究報告によれば、組み換え操作されたｃＧＡＳは、ＤＮＡ結合条件の下でｃＧＭＰ−ＡＭＰジヌクレオチドＧＡＭＰの環状化に作用する触媒として機能する。ｃＧＡＳが結合した１８ｂｐ  ｄｓＤＮＡの錯イオンの結晶構造についての研究報告はすでになされており、ｃＧＡＭＰの抗病毒免疫性に関する研究成果の裏付けとなる検証結果もすでに得られている証。ｃＧＡＭＰはＳＴＩＮＧと結合することにより、転写因子ＩＲＦ３が活性化されてインターフェロン−βを生成させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＰｉｎｇｗｅｉＬｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１３，３９（６），１０１９−１０３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、抗腫瘍医療の分野においてｃＧＡＭＰを応用する技術を提供することにある。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、毒性が低く、効果が優れた抗腫瘍薬を製造するために、抗腫瘍薬の製造においてｃＧＡＭＰを応用するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る実験結果によれば、ｃＧＡＭＰは多様な腫瘍細胞の成長を抑制することができ、著しい抗腫瘍作用を有することにより、抗腫瘍薬を製造することに用いられることができる。
【０００９】
本発明において、前記腫瘍は、胃癌、肺癌、大腸癌、肝臓癌、前立腺癌、膵臓癌などを含むが、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、更にｃＧＡＭＰによって製造られた抗腫瘍薬に関する。前記製造された抗腫瘍薬は、毒性が低く、効果が優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、実施例を参照しながら本発明の内容を具体的に説明する。本明細書中で以下に説明した実施例は、本発明をさらに詳細に説明するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。
【００１２】
実施例１：ｃＧＡＭＰの製造
ｃＧＡＭＰ（環状−ＧＭＰ−ＡＭＰ）は、非特許文献１に記載された方法に従って活性化条件の下でＤＮＡを結合した後に、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）を触媒として作用させて、９８％以上の純度で合成したものである。
【００１３】
実施例２：ｃＧＡＭＰ（環状−ＧＭＰ−ＡＭＰ）の抗腫瘍作用を測定するために、マウスの腫瘍モデルを使ってｃＧＡＭＰが動物皮下移植腫瘍の成長を抑制する作用の強さについて測定する。
【００１４】
試験薬
名称：  ｃＧＡＭＰ
性状：  白色粉末
溶媒：  生理食塩水
調製方法：  使用前に生理食塩水の溶液を用いて必要な濃度の溶液を調製する。
試験薬濃度：  １ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ。
【００１５】
動物：
種属、系統、性別、体重、原産地、証明書
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、雄、体重１６−１８ｇ、４−６週齢、ＳＰＦ級、上海ｓｌａｃ実験動物有限責任会社から購入「実験動物品質証明書番号：  ＳＣＸＫ（濾）２００７−０００５」。
飼育条件：
すべてのヌードマウスは、自由に摂食させまた水を飲ませるようにし、（２３±２）℃の温度で、中国人民解放軍Ｘ軍事医科大学動物実験センターで飼育する。すべての飼料及び水は、高圧の殺菌処理を経たもので、すべての実験飼育過程はＳＰＦ級である。
【００１６】
用量の設定
ｃＧＡＭＰをマウスの腹腔に注射し、２個の用量群を以下のように設定した：
１０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ
【００１７】
実験対照
陰性対照：  生理食塩水溶液
陽性対照：  ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、用量  ２０ｍｇ／ｋｇ
【００１８】
投与方法
投与経路：  腹腔内の注射投与
投与体積：  １０ｍｌ／ｋｇ
投与回数：  毎日１回、連続１４日
群毎の動物数：  ８匹
【００１９】
腫瘍細胞株
ヒト胃癌細胞株ＭＮＫ−４５、ヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９、ヒト大腸癌細胞株Ｌｏｖｏ、ヒト肝臓癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３、ヒト膵臓癌細胞ＳＷ１９９０は、すべて中国科学院細胞銀行から購入したものである。
【００２０】
実験における主なステップ
【００２１】
１、腫瘍を皮下移植したモデルマウスを構築し干渉を可能とするステップを以下のように実施する：
腫瘍細胞を培養し、繁殖させ、細胞の対数増殖期に細胞を収集し、濃度が１．０×１０７／ｍｌである細胞懸濁液を製造し、ヌードマウスの右側の前足脇の下に０．２ｍｌの細胞懸濁液を注射して（細胞数は２．０×１０６個／匹）、左右に腫瘍の直径が約５ｍｍ成長することにより、発癌に成功したところで、陰性対照群（腹腔内に生理食塩水を注射した群）、５−ＦＵ群（腹腔内に２０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを注射した群）、ｃＧＭＰ−ＡＭＰ低用量群（腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇのｃＧＭＰ−ＡＭＰを注射した群）及びｃＧＭＰ−ＡＭＰ高用量群（腹腔内に４０ｍｇ／ｋｇのｃＧＭＰ−ＡＭＰを注射した群）のような四つの群に無作為にグループ分けする。毎日１回投与し、連続１４日投与する。１４日後、ヌードマウスを殺して腫瘍の重さを量り、また腫瘍抑制率は以下の公式によって計算を行うことにする。
腫瘍抑制率＝［１−実験群における平均の腫瘍重さ／Ａ群における平均の腫瘍重さ）］×１００％。ただし、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群は実験群である。
【００２２】
続いて、ヒト胃癌細胞株ＭＮＫ−４５、ヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９、ヒト欠場癌細胞株Ｌｏｖｏ、ヒト肝臓癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１、ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３及びヒト膵臓癌細胞ＳＷ１９９０のような６種の皮下移植腫瘍モデルをそれぞれ製造してから、ｃＧＡＭＰの作用を観察する。
【００２３】
２、統計分析
測定データはｘ±ｓで表現され、ＳＰＳＳ１０．０数値解析ソフトウェアによって処理され、また一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）に基づく解析を行うことによって、各群における腫瘍重さの差の顕著性を比較し、有意水準ａは０．０５とした。
【００２４】
結果
ヌードマウスの皮下に腫瘍細胞を接種してから製造された皮下移植腫瘍モジュールとして、５−ＦＵとｃＧＡＭＰの全サンプルは、腫瘍の成長を明らかに抑制することができるし、１４日間投与した後の腫瘍重さは、陰性対照群（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）と比べて著しく軽い。これは、ｃＧＡＭＰが抗腫瘍作用を有していることを意味する。具体的な結果は表１〜表６を参照すればよい。
【００２５】
ヌードマウスにヒト胃癌細胞株ＭＮＫ−４５を皮下移植することにより発癌させた腫瘍に対してｃＧＡＭＰを作用させた場合の測定結果
（ｎ＝８，ｍｅａｎ±ＳＤ）
【表１】
2017513869.tif 000002
注：  ＊  Ｐ＜０．０５ｖｓ  陰性対照群、＊＊  Ｐ＜０．０１ｖｓ陰性対照群。
【００２６】
ヌードマウスにヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９を皮下移植することにより発癌させた腫瘍にｃＧＡＭＰを作用させた場合の測定結果
（ｎ＝８，ｍｅａｎ±ＳＤ）
【表２】
2017513869.tif 000003
注：  ＊  Ｐ＜０．０５ｖｓ  陰性対照群、＊＊  Ｐ＜０．０１ｖｓ陰性対照群。
【００２７】
ヌードマウスにヒト大膓癌細胞株Ｌｏｖｏを皮下移植することで発癌させた腫瘍にｃＧＡＭＰを作用させた場合の測定結果
（ｎ＝８，ｍｅａｎ±ＳＤ）
【表３】
2017513869.tif 000004
注：  ＊  Ｐ＜０．０５ｖｓ  陰性対照群、＊＊  Ｐ＜０．０１ｖｓ陰性対照群。
【００２８】
ヌードマウスにヒト肝臓癌細胞株ＳＭＭＣ−７７２１を皮下移植することにより発癌させた腫瘍にｃＧＡＭＰを作用させた場合の測定結果
（ｎ＝８，ｍｅａｎ±ＳＤ）
【表４】
2017513869.tif 000005
注：  ＊  Ｐ＜０．０５ｖｓ  陰性対照群、＊＊  Ｐ＜０．０１ｖｓ陰性対照群。
【００２９】
ヌードマウスにヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３を皮下移植することにより発癌させた腫瘍にｃＧＡＭＰを作用させた場合の測定結果
（ｎ＝８，ｍｅａｎ±ＳＤ）
【表５】
2017513869.tif 000006
注：  ＊  Ｐ＜０．０５ｖｓ  陰性対照群、＊＊  Ｐ＜０．０１ｖｓ陰性対照群。
【００３０】
ヌードマウスにヒト膵□癌細胞ＳＷ１９９０を皮下移植することにより発癌させた腫瘍にｃＧＡＭＰを作用させた場合の測定結果
（ｎ＝８，ｍｅａｎ±ＳＤ）
【表６】
2017513869.tif 000007
注：  ＊  Ｐ＜０．０５ｖｓ  陰性対照群、＊＊  Ｐ＜０．０１ｖｓ陰性対照群。
【００３１】
実施例３、ｃＧＡＭＰの急性毒性についての研究結果
【００３２】
実験材料
ＩＣＲマウス２０匹（上海ｓｌａｃ実験動物有限責任会社から購入「実験動物品質証明書番号：ＳＣＸＫ（濾）２００７−０００５」）、雄と雌はそれぞれ半分、体重１８〜２２ｇ、動物は顆粒状の飼料で飼育し、自由に摂食させまた水を飲ませるようにする。
【００３３】
ｃＧＡＭＰは実施例１によって製造され、生理食塩水から濃度が２００ｍｇ／ｍＬである溶液として調製される。
【００３４】
実験方法
ＩＣＲマウスの体重に応じて、しっぽの静脈に１０ｍｌ／ｋｇのｃＧＡＭＰを一度注射することで、即ち、２ｇ／ｋｇを注射することにより投与した後、マウスの投与後１４日以内の毒性反応及び死亡状況を観察する。結果によれば、マウスにしっぽ静脈注射による投与を一度行った後、マウスの活動は正常であった。投与後、１４日以内に、マウスの死亡は発生しておらず、１５日目にマウスを全部殺してから解剖し、肉眼でそれぞれの臓器を検査した結果、いずれも著しい病変が発生していなかった。
【００３５】
実験結果
前記急性毒性に関する実験結果によれば、静脈注射による投与の最大許容量ＭＴＤは２ｇ／Ｋｇ以上で、この結果、ｃＧＡＭＰの急性毒性は比較的に低いということを表明している。
【国際調査報告】
2017513869.tif 000008
2017513869.tif 000009
2017513869.tif 000010
2017513869.tif 000011
2017513869.tif 000012
2017513869.tif 000013