(57)【要約】  本発明は、薬物部分の薬剤とヒト繊維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）を標的とする細胞結合剤からなる結合体を提供する。この結合体は、特定の細胞集団を標的とし、細胞内に強力な細胞毒素を送達するように設計され、適合しているので、医薬用途を有する。本発明の結合体は、中程度でしか発現されない重要ながん性受容体を標的とする腫瘍治療と近隣細胞へのバイスタンダー活性とを提供することにより、当該技術分野で既知の他の結合体よりも顕著な利点を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2017511792.tif 000020
［式中、
ｎは１〜１０の整数であり、
Ｒは、ヒトＦＧＦＲ３（配列番号１１）に結合し、配列ＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨ（配列番号４）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＤＴＥＲＰＳ（配列番号５）を有するＣＤＲＬ２、および配列ＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ３を含む細胞結合剤である］。
【請求項２】
前記細胞結合剤が、重鎖可変領域アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）および
軽鎖可変領域アミノ酸配列：
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＫＴＡＴＦＴＣＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨＷＹＲＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＬＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＭＳＧＳＮＦＧＮＴＡＴＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号８）
をさらに含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記細胞結合剤が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記細胞結合剤が、配列番号１０のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖をさらに含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
薬物抗体比が２．０〜５．０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
薬物抗体比が３．５±０．５である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物と、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項８】
付加的な薬剤をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
療法に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
がんの治療において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
対照集団におけるＦＧＦＲ３発現レベルよりも高いＦＧＦＲ３発現レベルを有する患者におけるがんの治療において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記対照集団が、がんに罹患していない少なくとも１つの個体を含む、請求項１１に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせ
を有する患者におけるがんの治療において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせ
を有する患者におけるがんの治療において使用するための化合物であって、
前記治療は、前記患者が（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異（ここで、前記変異は、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される）；（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせを有するかどうかを、前記患者の生体試料中における、（ｉ）Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ変異の１つ以上；（ｉｉ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｉｉｉ）（１）と（２）の組み合わせの存在をエクスビボまたはインビトロで決定することにより決定する工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記がんが膀胱がんまたは多発性骨髄腫である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、同時、別々、または逐次的に別の抗がん治療とともに投与される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記抗がん治療が、抗血管新生剤、化学療法剤、および抗悪性腫瘍剤からなる群より選択される、請求項１６に記載の使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記抗悪性腫瘍剤がシスプラチンである、請求項１７に記載の使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
哺乳動物におけるがんを治療する方法であって、治療を必要とする前記哺乳動物に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含み、前記がんが膀胱がんまたは多発性骨髄腫からなる群より選択される、方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物に別の抗がん治療剤を投与することをさらに含み、前記抗がん治療剤が抗血管新生剤、化学療法剤、および抗悪性腫瘍剤からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗悪性腫瘍剤がシスプラチンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
患者におけるがんを治療する方法であって、
（ａ）前記患者から採取した試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）の発現レベルを測定する工程と（ここで、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される）；
（ｂ）前記ＦＧＦＲ３発現レベルが対照集団において見られるＦＧＦＲ３発現レベルより高い場合に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を前記患者に投与する工程と
を含む、方法。
【請求項２３】
患者におけるがんを治療する方法であって、
（ａ）前記患者から採取した試料中の異常の存在を決定する工程と
［ここで、前記異常は、
（１）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（２）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（３）（１）と（２）との組み合わせであり、
前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される］、
（ｂ）前記異常が存在する場合、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を前記患者に投与する工程と
を含む、方法。
【請求項２４】
がんを有する対象が請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）の発現レベルをエクスビボまたはインビトロで測定することを含み（ここで、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される）、がんに罹患していない個体におけるＦＧＦＲ３発現レベルと比較してＦＧＦＲ３発現レベルが上昇している場合に、前記対象が前記化合物に対する候補であることを示す、方法。
【請求項２５】
がんを有する対象が請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）患者から採取した試料中の異常の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み
［ここで、前記異常は
（１）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（２）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（３）（ａ）と（ｂ）との組み合わせである］、
（ｂ）前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本出願は、２０１３年１２月１８日に出願された米国仮出願第６１／９１７４５７号および、２０１４年１月１６日に出願された米国仮出願第６１／９２８０２５号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、免疫学、がん治療、および標的治療剤の分野に向けられる。より具体的には、本発明は、毒性薬物部分（具体的には細胞毒性剤）と細胞結合剤（より具体的には抗体、さらに具体的には、ヒト繊維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）を標的とする抗体）との、リンカー部分を介する結合体である化合物に向けられる。
【０００３】
典型的な化学療法で行われているように身体全体を全身治療するよりは、むしろ毒性のある標的薬を直接異常細胞に送達することは、標的治療剤の重要な利点である。標的化送達は、正常細胞へのダメージを減少させることにより副作用を最小化するのに役立つ。本発明の結合体は、オフターゲット細胞毒性活性を最小化しながら、特定の細胞集団を標的にし、その細胞中に強力な細胞毒素を送達するように設計され、適合している。本発明は、正常細胞への影響を最小化しながら異常細胞を排除またはその生存率を減少させるための、新規かつ有用な結合体とそれを用いる治療方法を提供する。
【０００４】
本発明は、膀胱がん（移行上皮がん（非筋層浸潤性であって主として局所的疾患）（ＴＣＣ）および筋層浸潤性のがんであって、非常に転移能が高いがん（以下、「Ｍ＋」）を含む）ならびに多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療に関して臨床的に実現されていない必要性に対してなされたものである。米国において、２０１３年に、推定７３，５１０人が膀胱がんとして新たに診断され、１４，８８０のがん関連死の原因となる。膀胱がんは、男性の第４番目に最も多い悪性腫瘍性事象であり、女性においては９番目に最も多いがんである。全ての新規症例の約７０％は、現状の標準的ケア（カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）／放射線／外科手術）を改善する未だ実現されていない高い医学的必要性が存在する有意な突発性再発を伴うＴＣＣ（非筋層浸潤性がん）である。現状では、筋層浸潤性膀胱がんに対する標的療法はなく、標準的ケアは、しばしば毒性のある４つの化学療法剤（メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、およびシスプラチン（ＭＶＡＣ））の細胞毒性のある治療計画の組み合わせである。従って、ほとんどの患者は、最適とは言えないゲムシタビンとシスプラチンの合剤を用いて現在治療されている。多発性骨髄腫は不治の病で、全体生存率は、現在３〜５年の範囲である。現状では、多発性骨髄腫の標準的ケアは、化学療法剤（ビンクリスチン、シクロホスファミド、およびドキソルビシン（全ての薬物はほとんどの患者に毒性があることが示されている）を含む）の細胞毒性のある治療計画と組み合わせるコルチコステロイド（デキサメタゾン）の様々な投薬である。
【０００５】
正常細胞および組織へのダメージを軽減しながら特定の細胞集団を効果的に標的とし、強力な細胞毒素を送達するがん治療の切迫した必要性がある。
【０００６】
従って、本発明は、式Ｉの化合物または医薬的に許容可能なその塩を提供する：
【化１】
2017511792.tif 000002
［式中、
ｎは１〜１０の整数であり、
Ｒは、ヒトＦＧＦＲ３（配列番号１１）に結合し、配列ＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨ（配列番号４）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＤＴＥＲＰＳ（配列番号５）を有するＣＤＲＬ２、および配列ＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ３を含む細胞結合剤である］。本発明を、以下、「結合体１」と称する。
【０００７】
本明細書中の科学的証拠が示唆するのは、本発明の化合物が膀胱がん（筋層浸潤性および非筋層浸潤性）および多発性骨髄腫の現状の標準的ケアよりも優れていて、その化合物は異常細胞を直接的に標的とし、従って、身体の正常細胞へのダメージを減少し、同様に副作用を最小化することである。さらに、本発明の化合物が他の結合体よりも優れているのは、その化合物が、臨床的に実現されていない必要性のある適応症および患者集団を標的とするからだ。現在承認されている結合体カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）とは違って、本発明の化合物は、がんの形成に重要であるが、結合体を用いる標的療法に適用するには充分には過剰発現されていないと一般的に考えられる標的を利用する。現在承認されている結合体アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（登録商標）と違って、本発明の化合物は、オフターゲット毒性を最小化し、従って、アドセトリスの既知の制限要素である副作用を減少させる。最後に、それより前に承認された結合体（例えば、ゲムツズマブ  オゾガマイシン（ｇｅｍｕｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標）−２０００年にＦＤＡにより承認されたが、２０１０年に自主的に取り下げられた））であって、循環中にリンカー不安定性の問題を有する化合物と異なり、本発明の化合物は安定的リンカーを有していて、従って、循環中の不安定性を回避できる。
【０００８】
結合体をデザインおよび設計することは、複雑な取り組みである。それは、単に抗原、薬物部分、リンカー部分、および細胞結合剤を選択するよりもずっと複雑である。（Ｒｉｔｔｅｒ，Ａ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（抗体薬物結合体）；Ｌｏｏｋｉｎｇ  Ａｈｅａｄ  ｔｏ  ａｎ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｃｌａｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ４２−４７（２０１２年１月））。腫瘍抗原、細胞結合剤の結合特異性、薬物部分の作用幾序、および薬物部分を細胞結合剤に連結する方法は全て、本化合物の臨床的活性および許容性を支配するのに鍵となる決定要素である。
【０００９】
本発明の結合体は、新規かつ進歩性のある化合物であって、構成要素の組み合わせ物ではない。本化合物の設計には、互いに相補的な構成単位の官能基（薬物部分、リンカー部分、細胞結合剤）の同定および選択を必要とする。各構成単位は、独自の特徴、利点、および制約を有する官能基である。その設計プロセスは、異なる官能基（限定はされないが、アルキル基、カルボニル基等を含む）から構成される新規小分子のデザインと似ている。本結合体を有効な治療剤とするためには、バランスの取れた特徴、利点、および制約を確保する入念なデザインが要求される。しかしながら、結果は予想できない。非常に広い範囲の薬物部分、リンカー、および細胞結合剤から官能基を選択することは、複雑で予想できるものではない。その官能基は既に開示されていてよい（毒素：ＤＭ４（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ−２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン）（米国特許第７，２７６，４９７号）、リンカー：スルホ−ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル  ４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート））（米国特許第８，２３６，３１９号）、および細胞結合剤：抗体１（米国特許第８，０４３，６１８号））。しかしながら、小分子化合物（例えば、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、およびシスプラチン）の構造活性関係および化学作用に関しては、個々の官能基の知識は、最終化合物の機能性についての知識を授けるものではない。
【００１０】
適切な標的抗原の選択が、本発明の重要な点である。本発明の標的抗原は、ＦＧＦＲ３である。異常な受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）情報伝達は、がんの形成と共にがんの進行に重要な役割を果たす。繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびその同族受容体（ＦＧＦＲ）は、ＲＴＫファミリーの一部である。ＦＧＦおよびＦＧＦＲは、胚発生、組織恒常性、および代謝において重要な役割を果たす。突然変異、染色体融合の発生、または過剰発現を介するＦＧＦＲ３の活性異常は、がん化を誘導するのに十分な活性化型ＦＧＦＲ３過剰発現を伴うがんと直接関連する。
【００１１】
ＦＧＦＲ３情報伝達経路ががん治療において果たす顕著な役割にも関わらず、ＦＧＦＲ３は結合体療法の開発のために選択される抗原とはなっていない。結合体が有効となるためには、腫瘍細胞上に標的が強く発現されることが必須要件と一般的に考えられる。ＦＧＦＲ３は抗原として陽性であるが、正常細胞に対する腫瘍細胞上でのその過剰発現は中程度である。ＦＧＦＲ３は、典型的な結合体（現在ＦＤＡにより承認されているものを含む）にとって、当該技術分野で必要と理解され、有利であると考えられる抗原レベルでは発現していない。ＦＧＦＲ３が中程度のレベルで発現していることを考慮すると、結合体１は予想外に効力がある。結合体１の予想外の効力をさらに奏するＦＧＦＲ３の活性化型突然変異および融合体も同定されている。
【００１２】
従って、細胞結合剤として抗体１を含むように結合体１を設計することが、本発明の重要な点である。結合体１の細胞結合剤として、抗体１は、受容体に結合し、その受容体の内在化と分解を誘導する。古典的考えは、表面抗原の迅速な補充が治療剤の成功の確率を上昇させるのに必要であるというものである。これにも関わらず、結合体１は特に効力があることが判明した。
【００１３】
リンカーとしてスルホ−ＳＰＤＢを選択することも、本発明の重要な点である。細胞内における薬物部分の細胞内代謝を保証することによってその薬物部分の毒性とのバランスをとるために、スルホ−ＳＰＤＢを選択する。しかしながら、スルホ−ＳＰＤＢ結合体は、細胞内で代謝される場合、三種類の代謝産物（リジン−Ｎ（イプシロン）−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ＤＭ４、およびＳ−メチル−ＤＭ４）を生成する。そのうち二つは、バイスタンダー細胞が、遊離薬物（ＤＭ４およびＳ−メチル−ＤＭ４）の送達を介して近隣細胞を死滅させるのを促進することができる。このことはまた、正常細胞の非特異的死滅を介する毒性も増加させる。抗原の発現率によってこの効果はバランスがとられ、従って、認識されていた本発明の結合体の欠点を利点へと変えた。さらに、スルホ−ＳＰＤＢを、いくつかの腫瘍モデルにおいてより優れた効力があることと共に毒性を考慮して、他の切断可能なリンカー（例えば、ＳＰＤＢおよびＳＭＣＣ）に優先して選択した。
【００１４】
設計と結合体形成は骨が折れるが、本発明の結合体は、驚くべきことに、がんの進行に重要な役割を果たす中程度に発現される抗原において、特異的細胞集団を効果的に標的とし、正常組織へのダメージを軽減しながら強力な細胞毒素を送達するがん治療を可能にする。
【００１５】
本発明の１つの側面は、前記結合体１である。本発明はまた、細胞結合剤が、重鎖可変領域アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）
および軽鎖可変領域アミノ酸配列：
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＫＴＡＴＦＴＣＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨＷＹＲＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＬＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＭＳＧＳＮＦＧＮＴＡＴＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号８）をさらに含む、化合物に関する。
【００１６】
本発明は、細胞結合剤が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、化合物に関する。本発明は、細胞結合剤が、配列番号１０のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖をさらに含む、化合物に関する。
【００１７】
本発明の一つの側面では、前記化合物の薬物抗体比（本明細書中では「ＤＡＲ」とも称される）は、２．０〜５．０である。本発明の別の側面では、化合物のＤＡＲは、３．５±０．５である。
【００１８】
本発明はまた、前記化合物と、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。その医薬組成物は、付加的な薬剤をさらに含み得る。
【００１９】
本発明の一つの側面は、療法に使用するための化合物である。別の側面は、がんの治療において使用するための化合物である。
【００２０】
別の側面では、本発明は、対照集団におけるＦＧＦＲ３発現レベルよりも高いＦＧＦＲ３発現レベルを有する患者におけるがんの治療において使用するための化合物である。一つの側面では、対照集団は、がんに罹患していない少なくとも１つの個体を含む。
【００２１】
別の側面において、本発明は、患者におけるがんの治療において使用するための化合物であり、患者が上昇したＦＧＦＲ３発現レベルを有し、そして治療が、前記患者が上昇したＦＧＦＲ３発現レベルを有するか否かを、前記患者の生体試料中のＦＧＦＲ３発現レベルをエクソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）またはインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で測定し、前記試料におけるＦＧＦＲ３発現レベルと対照試料におけるＦＧＦＲ３発現レベルとを比較することにより決定する工程を含む。
【００２２】
一つの側面では、対照試料は、がんに罹患していない個体からの生体試料である。
【００２３】
さらなる側面では、患者の生体試料は、血液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される。さらに別の側面では、対照試料は患者の生体試料と同じ供給源由来である。例えば、患者の生体試料は血液サンプルで、対照試料もまた血液サンプルである。
【００２４】
別の側面では、本発明は、（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびその組み合わせからなる群より選択される変異；（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせを有する患者におけるがんの治療において使用するための化合物である。
【００２５】
別の側面では、本発明は、（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびその組み合わせからなる群より選択される変異；（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせを有する患者におけるがんの治療において使用するための化合物であって、その治療は、前記患者が（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異（ここで、前記変異は、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される）；（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせを有するかどうかを、前記患者の生体試料における、（ｉ）Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ変異の１つ以上；（ｉｉ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせの存在をエクスビボまたはインビトロで決定することにより決定する工程を含む。
【００２６】
さらなる側面では、患者の生体試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される。
【００２７】
いくつかの側面では、がんは膀胱がんまたは多発性骨髄腫である。
【００２８】
別の側面では、化合物を、同時、別々、または逐次的に別の抗がん治療とともに投与する。抗がん治療を、抗血管新生剤、化学療法剤、および抗悪性腫瘍剤からなる群より選択する。本発明の一つの側面では、抗悪性腫瘍剤はシスプラチンである。
【００２９】
本発明はまた、哺乳動物におけるがんを治療する方法であって、治療を必要とする前記哺乳動物に、有効量の本化合物を投与する工程を含み、前記がんが膀胱がんまたは多発性骨髄腫からなる群より選択される、方法に関する。本方法は、前記哺乳動物に付加的な抗がん治療剤を投与する工程をさらに含んでいてもよく、前記抗がん治療剤が抗血管新生剤、化学療法剤、および抗悪性腫瘍剤からなる群より選択される。一つの側面では、抗悪性腫瘍剤はシスプラチンである。
【００３０】
本発明の１つの側面は、患者におけるがんを治療する方法であって、（１）前記患者から採取した試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）の発現レベルを測定する工程と（ここで、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される）、（２）前記ＦＧＦＲ３発現レベルが対照集団において見られるＦＧＦＲ３発現レベルより高い場合に、前記化合物を前記患者に投与する工程とを含む方法である。
【００３１】
本発明の１つの側面は、患者におけるがんを治療する方法であって、（１）前記患者から採取した試料中の異常の存在を決定する工程と［ここで、前記異常は、（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびその組み合わせからなる群より選択される変異、（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせであり、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される］、（２）前記異常が存在する場合、前記化合物を前記患者に投与する工程とを含む方法である。
【００３２】
本発明の１つの側面は、患者におけるがんを治療する方法であって、（１）前記患者から採取した試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）のＳ２４９Ｃ変異の存在を決定する工程であって、前記試料が、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される工程と（２）Ｓ２４９Ｃ変異が存在する場合、前記化合物を前記患者に投与する工程とを含む方法である。
【００３３】
本発明の１つの側面は、患者におけるがんを治療する方法であって、（１）前記患者から採取した試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）のＲ２４８Ｃ変異の存在を決定する工程であって、前記試料が、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される工程と（２）Ｒ２４８Ｃ変異が存在する場合、前記化合物を前記患者に投与する工程とを含む方法である。
【００３４】
本発明の別の側面は、患者におけるがんを治療する方法であって、（１）前記患者から採取した試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）のＹ３７３Ｃ変異の存在を決定する工程であって、前記試料が、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される工程と（２）Ｙ３７３Ｃ変異が存在する場合、前記化合物を前記患者に投与する工程とを含む方法である。
【００３５】
本発明の別の側面は、患者におけるがんを治療する方法であって、（１）前記患者から採取した試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）のＹ３７５Ｃ変異の存在を決定する工程であって、前記試料が、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される工程と（２）Ｙ３７５Ｃ変異が存在する場合、前記化合物を前記患者に投与する工程とを含む方法である。
【００３６】
本発明の別の側面は、患者におけるがんを治療する方法であって、（１）前記患者から採取した試料中のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体の存在を決定する工程であって、前記試料が、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される工程と（２）前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体が存在する場合、前記化合物を前記患者に投与する工程とを含む方法である。
【００３７】
本発明の１つの側面は、がんを有する対象が本化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）発現レベルをエクスビボまたはインビトロで測定することを含み（ここで、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される）、がんに罹患していない個体におけるＦＧＦＲ３発現レベルと比較してＦＧＦＲ３発現レベルが上昇している場合に、前記対象が本化合物に対する候補であることを示す、方法である。
【００３８】
別の側面は、がんを有する対象が本化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記患者から採取した試料中の異常の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み［ここで、前記異常は、（１）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびその組み合わせからなる群より選択される変異、（２）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体、または（３）（ａ）と（ｂ）との組み合わせである］、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択され、前記変異が検出された場合に、前記対象が本化合物に対する候補であることを示す、方法である。
【００３９】
本発明の１つの側面は、がんを有する対象が本化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）のＳ２４９Ｃ変異の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択され、Ｓ２４９Ｃ変異が検出された場合に、前記対象が本化合物に対する候補であることを示す、方法である。
【００４０】
本発明の１つの側面は、がんを有する対象が本化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）のＲ２４８Ｃ変異の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択され、Ｒ２４８Ｃ変異が検出された場合に、前記対象が本化合物に対する候補であることを示す、方法である。
【００４１】
別の側面は、がんを有する対象が本化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）のＹ３７３Ｃ変異の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択され、Ｙ３７３Ｃ変異が検出された場合に、前記対象が本化合物に対する候補であることを示す、方法である。
【００４２】
別の側面は、がんを有する対象が本化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）のＹ３７５Ｃ変異の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択され、Ｙ３７５Ｃ変異が検出された場合に、前記対象が本化合物に対する候補であることを示す、方法である。
【００４３】
別の側面は、がんを有する対象が本化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択され、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体が検出された場合に、前記対象が本化合物に対する候補であることを示す、方法である。
【００４４】
本明細書中で使用する用語「抗原」は、細胞の表面に位置するタンパク質を含む。抗原には、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然もしく合成化合物が含まれてよい。好ましくは、抗原は折りたたまれたポリペプチドまたはタンパク質である。特異的リガンドはタンパク質または受容体に結合し、シグナル伝達および細胞活性の変化を開始させる。抗体はまた抗原に結合し、リガンド結合とその結果起こるシグナル伝達をブロックすることができる。用語「抗原」、「受容体」、「標的」、または「標的抗原」を、本明細書中では相互に置き替えて使用する。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「異常」は、野生型、標準、正常、または予期できる範囲から外れた抗原の配列における任意の変化を含む。異常には遺伝子異常が含まれる。異常には、全ての型の変異および融合体が含まれる。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「変異」には、ゲノムのヌクレオチド配列の変化を含み、抗原のアミノ酸配列の変化も含まれる。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「融合体」には、元は別々のタンパク質をコードしている二以上の遺伝子の連結を介して作られるタンパク質が含まれる。融合遺伝子は、染色体転座により一つの遺伝子のエクソンを第二の遺伝子由来のインタクトなエクソンと置換する場合に、一般的に作られる。この転座により単一の遺伝子ができて、それが、転写、スプライシング、および翻訳されて、機能的な融合タンパク質を産生する。
【００４８】
野生型ＦＧＦＲ３の過剰発現は、がん化の誘導に十分である。変異を介するＦＧＦＲ３（配列番号１１）の恒常的、リガンド非依存的活性を結果として生じる異常活性化は、がんと直接結びつけられてきた。同定された変異には、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、およびＹ３７５Ｃが含まれる。標的ＦＧＦＲ３のエクソンを、トランスフォーミング酸性コイルドコイルタンパク質３（ＴＡＣＣ３）のエクソンとスプライシングしてできたいくつかの融合タンパク質（本明細書中では「ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体」として使用する）は、多数のがんで同定されてきた。表５に見られるこれらの変異およびいくつかの融合体は、ＦＧＦＲ３の感受性を向上し、従って、本発明の結合体をより受容可能である。
【００４９】
本明細書中で使用される用語「過剰発現」は、遺伝子の過剰な発現を含み、その遺伝子は、（１つ以上の受容体を含む）その産物のレベルを上昇させ、それは、受容体活性化と情報伝達の増加と関連する。抗原性のある受容体を「過剰発現」するがんは、細胞表面での受容体レベルが、同じ組織の非がん細胞と比べて有意に上昇している。免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを介して細胞表面に存在する受容体タンパク質レベルの増加を評価することによるか、または、受容体の帰結する核酸の細胞におけるレベルを、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザンブロット、ノザンブロット、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して測定することにより、診断的または予後解析的アッセイ中で、受容体の過剰発現を決定し得る。
【００５０】
過剰発現は、有限のものというよりはむしろ、連続的なものである。受容体の細胞表面発現または受容体の細胞表面相対密度を、中央蛍光強度（ＭＦＩ）により測定することができる。例えば、ＦＧＦＲ３細胞表面発現は、膀胱がん細胞株ＢＦＴＣ−９０５（野生型）において１１，０００個の受容体が存在し、そして、ＲＴ１１２膀胱がん細胞株（野生型およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合受容体を有する）において１６，０００個のＦＧＦＲ３受容体が存在する。（表５を参照されたい）。カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）は、ＴＤＭ１としても知られ、米国で承認された結合体の２つの内の１つであるが、それは、転移性乳がん中で平均２百万個の受容体であるＨＥＲ−２を標的とする。（Ｌｏｈｒｉｓｃｈら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ２８、Ｎｏ６、Ｓｕｐｐｌ１８：３−１１（２００１年））。ＦＧＦＲ３は過剰発現可能ではあるが、ＦＧＦＲ３タンパク質発現量は中程度である。そして、高度に過剰発現されると考えられる他のがん関連タンパク質（例、ＨＥＲ−２）の量と比べると、その腫瘍対正常の発現差異は有意ではない。
【００５１】
本明細書中で使用する用語「結合体」は、細胞結合剤（例えば、抗体またはその断片）に連結される薬物部分またはその誘導体を指し、一般式：（Ｄ−Ｌ）ｎ−Ｒ（式中、Ｄは薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｒは抗体または抗体断片を含む細胞結合剤であり、ｎは各細胞結合剤に連結する薬物部分およびリンカーの数を規定する整数である）と定義される。結合体はまた、「免疫結合体」、「抗体薬物結合体」、または「ＡＤＣ」としても知られる。
【００５２】
本発明の結合体は、モノクローナル抗体−マイタンシノイド結合体であって、抗ＦＧＦＲ３抗体（抗体１）上の利用可能なリジン残基を、切断可能なリンカー（スルホ−ＳＰＤＢ）およびジスルフィド結合を介してリンカーに連結した活性化型マイタンシノイド（ＤＭ４）に共有結合させることにより形成される。
【００５３】
結合体は、特定の細胞集団を標的とし、細胞内に強力な細胞毒素を送達するように適合した化合物である。結合体は、投与される場合、異常細胞中に取り込まれるまでは基本的に無毒のプロドラッグと考えることもできる。
【００５４】
結合体試料の平均負荷を、本明細書中では、ＤＡＲ、マイタンシノイド対抗体比「ＭＡＲ」、または「薬物負荷」と称する。本明細書中で使用するＤＡＲは、細胞結合剤一つ（例えば、抗ＦＧＦＲ３抗体）に連結または結合される薬物分子（例えば、マイタンシノイド）の数を指す。ＤＡＲは特定の結合体分子に対する正確な値（例えば、式（Ｉ）中のｎ）を有する一方で、多数の分子を含む試料を記載するために使用される場合には、その値はしばしば平均値であると理解される。これは、互いに異なる薬物抗体比を有する様々な結合体分子の存在のためである。一つの側面では、一つの細胞結合剤に連結可能な薬物分子の数は、平均約１〜約１０であってよい。本発明の一つの側面では、ＤＡＲは平均２〜８である。本発明の他の側面では、ＤＡＲは平均２〜５である。本発明のさらに他の側面では、ＤＡＲは平均３〜５である。本発明のさらに他の側面では、ＤＡＲは平均３〜４である。いくつかの側面では、ＤＡＲが「約ｎ」の意味は、ＤＡＲの測定値がｎ±０．５の範囲内であることである。本発明の一つの側面では、ＤＡＲは平均３．５±０．５である。結合体の抗腫瘍活性は、同じ細胞結合剤に少ない数の薬物を連結させた薬物負荷に比べると、より高い効力を有し得る。一方で、連結される薬物の数を増加させると、細胞結合剤の薬物動態の特性が変化するという代償があるが、効能が向上し得る。結合体のために使用される方法ならびにＤＡＲを測定および計算する方法論および技術は、化合物のＤＡＲ値に影響する可能性がある。
【００５５】
ＤＡＲが一貫且つ再現性のあることは、特定のＡＤＣに関して、一貫した用量の送達と薬物動態を保証する。ＤＡＲが低いと、結果として、細胞毒性活性がより低い結合体ができる。しかしながら、ＤＡＲが高いと、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における、受容体への親和性、受容体への結合および阻害活性ならびに結合体の安定性に影響を及ぼし得る。
【００５６】
本明細書中で使用される用語「毒素」は、細胞の成長または増殖に副作用を有し、その結果、細胞の死（細胞死を含む）を生じる、または、いくつかの様式では細胞生存率を減少させる能力のある任意の物質である。本明細書中で使用される用語「細胞毒素」または「細胞傷害性薬物」には、細胞質中で活性化される毒素が含まれる。
【００５７】
本明細書中で使用される用語「薬物部分」、「薬物」、または「ペイロード（弾頭）」には、毒素、細胞毒素、または細胞傷害性薬物が含まれる。薬物部分の一つの型には、マイタンシンに分類される化合物が含まれる。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「マイタンシノイド」には、細胞分裂時に細胞の増殖を阻害する、微小管を標的とする化合物である細胞毒素が含まれる。この毒素には、「ＤＭ４」（式ＩＩ）として知られる、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ−２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシンが含まれる。
【化２】
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【００５９】
マイタンシノイドは、従来のがん化学療法剤に比べて１００〜１０００倍細胞毒性のあることが示されている。非常に効力があるが、マイタンシノイドは、第一相臨床試験で患者に全身投与された場合、毒性が強すぎることが証明されている。しかしながら、標的薬治療（例えば、結合体）の一部として投与された場合、マイタンシノイドが非常に細胞毒性が強いという性質は異常細胞またはダメージ細胞へと直接的に送達されて、従って、標的または抗原を発現していない正常細胞における全身性毒性作用を軽減する。この利点は、二つの要素がある。第一に、細胞毒性がより強いことは、より効率的な細胞死および細胞生存率の減少を可能とする。第二に、細胞毒性がより強いことは、細胞に対して同等の効果を得るためにより低い投与量で投与することを可能にし得る。これは、副作用事象の減少した、患者に対するより強力な治療オプションを提供する。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「リンカー部分」または「リンカー」は、薬物部分に細胞結合剤を連結する結合剤として働く化学部分を指す。より具体的には、リンカー部分は、細胞結合剤を薬物部分に共有的に結合させる共有結合または原子を含む。リンカーは、がん細胞内でペイロードを代謝により放出することを可能にする任意の架橋化合物であってよく、さらに、代謝産物依存性のバイスタンダー細胞死を促進してもよい。リンカーは、本化合物または本抗体が活性を保った状態で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフィド結合切断に感受性があるか、または、実質的に抵抗性であってもよい。
【００６１】
薬物部分を、例えば、ジスルフィド結合を介して、細胞結合剤、本発明では、抗体１、つまり、本結合体の抗ＦＧＦＲ３抗体に連結する。リンカー分子または架橋剤は、細胞結合剤のリジン残基または他の残基と反応することができる反応性化学基を含む。細胞結合剤と反応する反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルであり得る。さらに、リンカー分子は、薬物部分と反応してジスルフィド結合を形成することができるジチオピリジルであり得る反応性化学基を含む。
【００６２】
例えば、細胞結合剤は、架橋試薬で修飾され得る。そして、そのように誘導体化された、保護されていないまたは保護されたチオ基を含有する細胞結合剤を、その後、ジスルフィドまたはチオ含有マイタンシノイドと反応させて結合体を作製する。その結合体は、クロマトグラフィー（限定はされないが、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー捕獲クロマトグラフィーを含む）、透析、または、接線流ろ過により精製可能である。
【００６３】
スルホ−ＳＰＤＢまたはｓＳＰＤＢ（本明細書中では互いに置き換えて使用される）、つまり、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート、化学式ＩＩＩは、還元性細胞内環境である標的細胞内のサイトゾルにおいて本結合体を切断可能にする切断可能なリンカーである。式ＩＩＩ：
【化３】
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【００６４】
切断可能なリンカーとして、スルホ−ＳＰＤＢは、遊離薬物（結合体の代謝プロセスによって生じるＤＭ４およびＳ−メチル−ＤＭ４）によるバイスタンダー細胞死の向上を可能にする。本発明では、結合体の抗体は、表面に露出した遊離のリジン残基を介してリンカーと連結されており、次に、チオ基を介して結合体の細胞毒素と連結されている。マイタンシノイドと結合される場合、荷電代謝産物の疎水性は減少し、そのことによりＭＤＲ排出ポンプの活性を減少させ、従って、ＭＤＲ−１特異的多剤耐性の減少を介して、殺細胞効果が増加する機会を提供する。
【００６５】
本明細書中で使用される表現「細胞結合剤に連結」または「抗ＦＧＦＲ３抗体または断片に連結」は、適切な架橋基を介して細胞結合剤（例えば、結合体１の抗ＦＧＦＲ３抗体）に結合した少なくとも一つの薬物誘導体含む結合体分子またはその前駆体を指す。
【００６６】
結合体の代謝経路は、しかしながら、標的細胞による取り込みによって様々に異なる。マイタンシノイド結合体は、低ｐＨのリソソーム中で、その細胞結合構成要素の迅速な分解を経る。その結果、細胞結合剤の１つのアミノ酸（リジン残基）にリンカーを介して結合されるマイタンシノイド薬物からの代謝産物の放出を生じる。ジスルフィドで連結された結合体（例えば、スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）の場合、マイタンシノイド修飾リジン残基は、ジスルフィドが還元されて、チオ含有薬物を放出する。その薬物は、その後、メチル化（おそらく細胞内メチルトランスフェラーゼ酵素により触媒される）されて、非常に強力なＳ−メチル−マイタンシノイド（Ｓ−メチル−ＤＭ４）を生じるか、または、単に、非修飾マイタンシノイド（ＤＭ４）が産生され得る。放出される薬物は、バイスタンダー効果として定義および記載される効果を介して、細胞外へと拡散し、近隣細胞の生存率を減少させることができる。ほとんどの細胞表面受容体に観察される標的の不均質性を考慮すると、「バイスタンダー」現象は、インビボの殺細胞の重要なメカニズムとなる可能性がある。なぜなら、腫瘍集団の全ての細胞が、抗原を同程度に発現するとは限らないからである。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、つまり、ジスルフィド結合で相互連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。個々の鎖は、類似したサイズ（１１０〜１２５アミノ酸）および構造であるが、互いに異なる機能を有するドメインに折りたたむことができる。抗体を、本明細書中では、「Ａｂ」と省略する場合がある。
【００６８】
軽鎖は、一つの可変領域（本明細書中ではＶＬと省略する）および／または一つの定常領域（本明細書中ではＣＬと省略する）を含み得る。ヒト抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、カッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかである。本明細書中で使用される表現ＶＬは、κ型軽鎖（Ｖκ）およびλ型軽鎖（Ｖλ）由来の可変領域の両者を含むことを意図している。重鎖はまた、一つの可変領域（本明細書中ではＶＨと省略する）および／または、抗体のクラスもしくはアイソタイプに依存して、三つもしくは四つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）（本明細書中では、ＣＨと総称する）を含み得る。ヒトでは、アイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧはさらに、サブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ１〜２およびＩｇＧ１〜４）へと分けられる。本発明は、任意の前記クラスまたはサブクラスの抗体を含む。ヒトＩｇＧ１が、本発明の結合体の抗体に関する好ましいアイソタイプである。
【００６９】
三つの領域（超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）が、各ＶＬおよびＶＨ中に見出され、それらは、フレームワーク（本明細書中ではＦＲと省略される）と呼ばれる可変性の低い領域により支持されている。カバット番号付け法（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫目的タンパク質の配列）、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版番号：９１−３２４２（１９９１年））、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け法（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１−９１７。Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８９；３４２：８７７−８８３）、および／またはＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）に従って、アミノ酸を特定のＣＤＲ領域またはドメインに帰属させる。各ＶＨおよびＶＬは、三つのＣＤＲおよび四つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。ＶＬおよびＶＨ領域からなる抗体部分は、Ｆｖ（可変断片）と記載され、そして、抗原結合部位を構成する。短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一つのポリペプチド鎖に一つのＶＬ領域および一つのＶＨ領域を含む抗体断片（ここで、一つの領域のＮ末端と他の領域のＣ末端とがフレキシブルなリンカーによって連結されている）である。
【００７０】
抗体１、つまり本発明の結合体の細胞結合剤は、ラムダ（λ）軽鎖を有するモノクローナル抗体である。結合体１の抗体構造物は、結合を最小限の立体障害で可能にする位置に典型的には約１００個の遊離リジン側鎖残基を含む。この抗体は、ＦＧＦＲ３（ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ））の両スプライシング型に非常に特異的で、そして、ＦＧＦＲ３と結合して取り込まれる。しかしながら、抗体１は、ほとんどの抗体より若干低い等電点を有していて、そのことは安定性と結合プロセスに影響を及ぼし得る。さらに、抗体１は、ＦＧＦＲ３受容体に結合すると受容体の分解を誘導し、そのことは一般的に欠点として考えられる。ｐＩが低くλ軽鎖を有するので、抗体１は、本化合物に特有の難題を付与する。不安定性の難題にも関わらず、本結合体は驚くほど効力があることが証明されている。
【００７１】
用語「単離」は、細胞環境中に見いだされる他の高分子種から遊離しているまたは実質的に遊離している抗体、タンパク質、ペプチド、または核酸を指す。本明細書中で使用される「実質的に遊離している」とは、存在する高分子種の（モルベースで）８０％より多くの量、好ましくは９０％より多くの量、より好ましくは９５％より多くの量で、目的タンパク質、ペプチド、または核酸が含まれることを意味する。「単離された」抗体の例には、アフィニティー精製された抗体、インビトロでハイブリドーマまたは他の細胞株により作製された抗体、およびトランスジェニックマウス由来のヒト抗体が含まれる。
【００７２】
本明細書中で使用される用語「裸の抗体」は、結合されていない抗体材料を指す。
【００７３】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す（例えば、集団を構成する個々の抗体は、起こり得る天然の突然変異または存在する可能性のあるマイナーな翻訳後変化を除いては実質的に同一である）。モノクローナル抗体は、非常に特異的で、単一の抗原部位（決定基またはエピトープとしても知られる）に対して向けられる。さらに、従来の（ポリクローナル）抗体調製物（様々な決定基に対する様々な抗体を典型的に含む）と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の性質を指すが、任意の特定の方法により抗体の産生を必要とするとは解釈されない。モノクローナル抗体を、本明細書中では、「ｍＡｂ」と省略する場合がある。
【００７４】
本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体（Ｋａｂａｔら（上記）に記載されている）が含まれる。本発明の結合体のヒト抗体は、例えばＣＤＲ中の、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な変異導入法によるか、または、インビボでの体細胞突然変異により導入された変異）を含む。ヒト抗体は、少なくとも一つの位置が別のアミノ酸残基（例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていない、活性を向上させるアミノ酸残基）で置換されていてもよい。しかしながら、本明細書中で使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列由来のＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列間へと移植された抗体を含むことを意図していない。本明細書中で使用される、「ヒト抗体」の産生方法は、ヒトで製造される抗体を含むことを意図していない。
【００７５】
表現「組換えヒト抗体」は、組換え手段により調製、発現、作製、または単離されるヒト抗体（例えば、宿主細胞にトランスフェクションされる組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えヒト抗体コンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を形質導入した動物から単離された抗体、または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることに関与する任意の他の手段により調製、発現、作製、または単離された抗体）を含む。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。
【００７６】
従って、本発明の結合体の抗体には、限定はされないが、単離抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換えヒト抗体、モノクローナル抗体、その特定部分および変異体を含むが、各々は少なくも一つのＣＤＲを含む。
【００７７】
抗体またはその断片の特異性は、親和性に基づいて決定可能である。親和性（抗体と抗原の解離に関する平衡定数（ＫＤ）で表される）では、抗原性決定基と抗体結合部位との間の結合強度を測定する。親和性を、例えば、表面プラズモン共鳴により測定する。
【００７８】
本発明の抗体またはその断片は、細胞外ドメイン部分（本明細書中では単に「ドメイン」または「ＥＣＤ」と称する）上に位置しているＦＧＦＲ３のエピトープに結合する。本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、本発明の抗体により認識される、抗原上の個別の三次元的部位を指す。
【００７９】
本明細書中に具体的に記載される抗体に加え、他の「実質的に同等な」改変抗体を、当業者に周知の様々な組換えＤＮＡ技術を利用して、容易に設計および製造することができる。例えば、フレームワーク領域は、いくつかのアミノ酸置換、末端および中間への付加ならびに欠失等により、一次構造レベルで天然配列から変化し得る。さらにまた、各種ヒトフレームワーク領域は、本発明に含まれるヒト化免疫グロブリンに関して、その基礎として単独または組み合わせて使用され得る。一般的に、遺伝子改変は、各種周知技術（例えば、部位特異的変異導入法）により、容易に実現可能である。
【００８０】
本発明は、本明細書中に開示されるように、ＶＨ領域の任意の一つ若しくはその部分、またはＶＨ  ＣＤＲの任意の一つ（その任意の変異体を含む）を含む重鎖結合体の抗ＦＧＦＲ３抗体構成要素をコードする核酸配列を含む。本発明の結合体の抗体構成要素には、抗体１と同じＣＤＲ領域ならびに／または抗体１と同じ軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域を含む抗体が含まれる。
【００８１】
結合体１の抗体は、当該技術分野で既知の方法により産生可能である。これらの方法には、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５）により記載される免疫学的方法；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１３（Ｂｕｒｄｏｎら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ編、１９８４）；およびＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）により記載される組換えＤＮＡ法が含まれる。結合体１の抗体は、ｓｃＦｖまたは抗原結合部位（Ｆａｂ）の形のＶＨおよびＶＬドメインの組み合わせを保持するライブラリーから取得可能でもある。ＶＨおよびＶＬドメインは、合成、部分合成、または天然由来のヌクレオチドによりコードされ得る。本発明は、ヒト抗体断片を保持するファージディスプレイライブラリーにより作製することができる。ヒト抗体の他の供給源は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するように設計されたトランスジェニックマウスである。
【００８２】
単一ドメイン抗体の結合の一次決定基であるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、またはその組み合わせにより定義されたＣＤＲ内に位置し得る。しかし、そのアミノ酸残基には、他の残基（例えば、さもなければ、ＶＨ−ＶＬヘテロ二量体のＶＨ−ＶＬ境界領域中に埋め込まれ得る残基）が含まれていてもよい。
【００８３】
ベクターの形質転換と結合体１の抗体の発現のための好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞（例えば、ＮＳ０細胞（非分泌性（０）マウスミエローマ細胞）、２９３細胞、ＳＰ２０細胞、ＣＨＯ細胞、およびリンパ由来（例えば、リンパ腫）細胞、ミエローマ細胞、およびハイブリドーマ細胞等の他の細胞株）である。他の真核生物宿主（例えば、酵母）も、代替的に使用可能である。
【００８４】
抗体は、当該技術分野で知られる任意の方法（硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムにより析出し、その後、生理食塩水に対して透析し、イオン交換クロマトグラフィーし、アフィニティーまたは免疫アフィニティークロマトグラフィーすると共に、ゲルろ過またはゾーン電気泳動することを含む）により単離または精製可能である。結合体１の抗体の好ましい精製方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである。
【００８５】
マイタンシノイドを合成可能な技術には、限定はされないが、米国特許第７，４３２，０８８号、第７，３０１，０１９号、第７，５９８，３７５号、ＲＥ３９，１５１、第７，４１１，０６３号中に記載されるものが挙げられる。
【００８６】
本発明の結合体は、当該技術分野で既知の各種方法（例えば、米国特許第７，８１１，５７２号、第８，３８３，１２２号、第６，４４１，１６３号、第７，３６８，５６５号、第７，８１１，５７２号、第８，１６３，８８８号、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号、第２０１１／０１６６３１９号、第２０１２／０２５３０２１号、および第２０１２／０２５９１００号中に記載されている）により調製可能である。
【００８７】
本発明の結合体を調製する代替的方法は、抗体を３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、そして、反応液（５０ｍＭのＥＰＰＳ、２０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．２））へと１０倍量の透析容量で透析ろ過し、そして、さらに、４５ｇ／Ｌへと濃縮する。スルホ−ＳＰＤＢ（１０ｍＭ）に対して１．２のモル比のＤＭ４（１２ｍＭ）と、抗体に対して４．６８のモル比のスルホ−ＳＰＤＢとを、１６７ｍＭのＥＰＰＳ、６６．７ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．２）、および７０．０％（ｖ／ｖ）のＤＭＡ中で反応させる。インサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での反応を、２０±３℃で１０±４時間実行し、その後、ＤＭＡを有する抗体へ加えて、５０ｍＭのＥＰＰＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．２±０．２）および５．０％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）中で、最終抗体濃度２０ｍｇ／ｍＬを達成する。結合反応を２０．０±３．０℃で１６±８時間実施する。反応後、結合体形成用混合物のｐＨを、６．５％（ｖ／ｖ）の１Ｍ酢酸を添加することにより迅速にｐＨ５．０へと調整する。ｐＨを調整した混合物を２０ｍｇ／ｍＬへと濃縮し、基礎製剤バッファー（１０ｍＭアセテート、ｐＨ５．０±０．１）に対して１６倍量の透析容量で透析ろ過する。精製結合体を、スクロース（４５％、ｗ／ｖ）およびポリソルベート−２０（１０％、ｗ／ｖ）の濃縮保存液を使用して、１０ｍＭアセテート、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）（ｐＨ５．０）中に、５．０ｍｇ／ｍＬで製剤化する。
【００８８】
抗体１分子当たりのマイタンシノイド分子の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度の比を分光光度計を使って測定することにより決定可能である。質量分析法は、結合体形成プロセスの再現性をモニターすることを可能にする。抗体に対するマイタンシノイド分子の平均数は、例えば、１〜１０、２〜８、２〜５、３〜５、３〜４、または３．５±０．５であってよい。
【００８９】
商業的に耐えうる結合体製品を製造するためには、結合体形成プロセスおよびバッファー交換は効率的でなければならない。結合体１の開発中に分かったのは、化合物が溶解性という難題を有していて、一般的に使用される結合体形成バッファーを利用する場合に、溶液から析出する傾向があったということである。総表面電荷および等電点（ｐＩ）等の因子（分子が中性または総電荷をもたないという点）は、分子の溶解性を変化させ、そして、析出を生じるという安定性の問題を生じ得る。各種方法を使用した多数の取り組みでは、凝集体および析出物を含む結合体材料が生じてしまった。凝集と析出の許容レベルは、化合物の用途に依存する。許容レベルは、臨床試験または商業的生産を意図する材料に対しては、しばしばより低い。結合体１のどの性質（複数可）がこれらの問題を引き起こした可能性があるのかは知られていない。結合体１に関しては、反応ｐＨおよび製剤化ｐＨにおいて抗体および結合体の溶解性を維持するのに要求されるイオン強度の差があるために、塩基性ｐＨでの結合体形成は難しいことが証明された。具体的には、抗体１は、反応に使用される塩基性ｐＨで低イオン強度のバッファー中に析出した。一方、結合体１は、結合体の製剤化に使用される酸性ｐＨで高イオン強度のバッファー中に析出した。結合体形成バッファーのイオン強度は、抗体１の塩基性ｐＨ反応バッファーへのバッファー交換を可能にするが、結合体１の酸性ｐＨ製剤化バッファーへのバッファー交換を可能にするのに十分なほどに低いことが要求される。また、イオン強度を要求レベルに低下させるために、反応混合物の希釈液を用いてもよい。懸命に設計した後に、結局分かったのは、溶液から析出せず、溶解性を維持するために他の望ましくない添加剤または技術を必要としない安定かつ活性のある化合物を生成するよう反応が完了するために、ｐＨと塩との間のバランスを結合体１が必要としたことである。
【００９０】
マイタンシンペイロードを構成要素とする結合体は、標的媒介活性を介するかおよび／またはインビトロで非特異的に増殖細胞を抑制または死滅させる能力に関して評価可能である。例えば、細胞株（例えば、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２９２、およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ）は、結合体の非標的型細胞毒性の評価に容易に使用可能である。評価される細胞は、４〜５日間化合物に暴露されてよく、生存細胞の割合を既知の方法により直接的アッセイ中で測定可能である。ＩＣ５０値は、その後、アッセイ結果から計算可能である。結合体１の標的媒介細胞毒性活性はまた、様々なレベルでＦＧＦＲ３抗原を発現する細胞株を使用することにより評価可能でもある。
【００９１】
いくつかの側面では、結合体は、以下により詳細に定義される％Ｔ／Ｃで決定される腫瘍体積を減少させることができる。
【００９２】
有効量の結合体を哺乳動物に投与することにより、その哺乳動物中の腫瘍増殖を治療する方法を、本発明は提供する。本発明に係る適切な治療条件は、ＦＧＦＲ３を優先的に発現する腫瘍細胞と関係する。任意の特定のメカニズムに拘束されることを意図するわけではないが、本方法はがん細胞の増殖の治療のために提供され、例えば、ＦＧＦＲ３の発現により引き起こされるか、または、それに関与する腫瘍性増殖、骨転移、器官移植拒絶または免疫疾患（例えば、自己免疫疾患）におけるがん細胞増殖が含まれる。
【００９３】
本発明の文脈における「治療」または「治療する」は、療法的治療（病気または疾患と関連する基礎症状または望ましくない生理学的変化の進行を減速、減弱、または逆転すること、あるいはある状態の臨床症状を改善することを含む）を指す。有益なまたは所望の臨床結果には、限定はされないが、症状の緩和、病気または疾患の程度の減弱、病気または疾患の安定化（すなわち、病気または疾患が悪化しないこと）、病気または疾患の進行の遅延または減速、病気または疾患の改善または寛解、および病気または疾患の（部分的または全体的）軽減（検出できるものもあれば検出不能なものもある）が含まれる。治療はまた、治療を受けない場合に予期される生存に比較した場合の生存の延長も意味し得る。治療を必要とする者には、既に病気を有する者が含まれる。一つの側面では、本発明は医薬として使用可能である。
【００９４】
本発明の方法では、治療的有効量の本発明の結合体を、治療を必要とする哺乳動物または患者に投与する。さらに、本発明の医薬組成物には、治療的有効量の本発明の結合体が含まれ得る。「治療的有効量」、「有効投薬量」とは、必要な投与量および期間で、所望の治療的結果を達成するのに有効な量を指す。結合体の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する結合体の能力等の因子に従って変わり得る。他の因子には、投与、標的部位、患者（患者はヒトまたは動物である）の生理的状態、および投与される他の医薬が含まれる。本発明の化合物はヒトへの投与に特に有用であるが、他の哺乳動物へも投与可能である。本明細書中で使用される用語「哺乳動物」には、限定はされないが、ヒト、実験動物、家庭用ペット、および家畜が含まれる。治療的有効量はまた、治療的に有益な効果が、結合体の任意の毒性または有害作用を上回る量である。
【００９５】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整可能である。治療投与量は、当業者に既知の日常的方法を使用して、安全性と効力を最適化するために用量設定可能である。投薬スケジュール（静脈内（ｉ．ｖ．）もしくは非静脈内投与、局所投与もしくは全身投与、またはこれらの組み合わせ）は、単回ボーラス投与または持続点滴から一日当たり複数回の投与（例えば、４〜６時間ごと）の範囲に典型的にあるか、あるいは、治療を行う医師および患者の状態により指示されるものである。結合体１の治療的有効量の例示的な非制限的範囲は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは３〜３５ｍｇ／ｋｇ、およびさらに好ましくは５〜２０ｍｇ／ｋｇである。投薬量と頻度は、患者を治療する医師により決定され、１ｍｇ／ｋｇ未満から１００ｍｇ／ｋｇを超える用量を、一日一回、週あたり三回、一週間に一回、二週間に一回、またはそれよりは少ない頻度で与えることが含まれ得る。しかしながら、本発明は任意の特定の用量に限定されないことに留意されたい。
【００９６】
結合体は、１つ以上の他の抗がん治療（限定はされないが、抗血管新生剤、化学療法剤、および抗悪性腫瘍剤を含む）と組み合わせて投与可能である。任意の適する抗がん剤（例えば、化学療法剤、放射線照射、抗体、またはそれらの組み合わせ）が使用可能である。
【００９７】
抗がん剤には、限定はされないが、抗悪性腫瘍剤、抗体、アジュバント、およびプロドラッグが含まれる。当該技術分野で現在知られるか、または評価中の抗悪性腫瘍剤は、各種クラス（例えば、細胞分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレーター性抗体、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生体反応調整剤、抗ホルモン剤、および抗血管新生剤を含む）に分類可能である。アルキル化剤の例には、限定はされないが、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンが含まれる。代謝拮抗剤の例には、限定はされないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）が含まれる。そして、トポイソメラーゼ阻害剤には、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、トポテカン（トポイソメラーゼＩ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）（トポイソメラーゼＩＩ）が含まれる。抗悪性腫瘍剤が放射線照射である場合、放射線源は、治療されている患者に対する外部照射（体外照射療法ＥＢＲＴ）または内部照射（近接照射療法−ＢＴ）のいずれであってもよい。投与される抗悪性腫瘍剤の用量は、多数の因子（例えば、薬剤のタイプ、治療されている腫瘍のタイプと重症度、および薬剤の投与経路を含む）に依存する。しかしながら、本発明は任意の特定の用量または投薬計画に限定されないことを強調しておきたい。一つの側面では、シスプラチンは、本発明の好ましい抗悪性腫瘍剤となる。
【００９８】
本発明の結合体はまた、腫瘍増殖または血管新生に関与する他の細胞表受容体を阻害および／または制御する抗体および／または小分子阻害剤と共に投与可能である。結合体はまた、１つ以上の適切なアジュバント（例えば、サイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３）または他の免疫調整剤（例えば、限定されないが、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチド））と組み合わせて投与可能である。
【００９９】
本発明では、いずれかの適した方法または経路を使用して、本発明の結合体を投与する、および任意に、抗悪性腫瘍剤および／または他の受容体のアンタゴニストを同時投与する。本発明の併用療法では、結合体を、同時、別々、または逐次的に別の薬剤（限定はされないが、シスプラチンを含む）と共に投与してもよい。本発明に従って利用される抗悪性腫瘍剤投与計画には、患者の悪性腫瘍状態の治療に最適であると考えられる任意の投与計画が含まれる。様々な悪性腫瘍には、特定の抗腫瘍結合体および特定の抗悪性腫瘍剤の使用が必要とされ、患者ごとに決定される。投与経路には、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋中投与が含まれる。投与されるアンタゴニストの投薬の用量および頻度は、多数の因子（例えば、アンタゴニストのタイプ、治療されている腫瘍のタイプと重症度、およびアンタゴニストの投与経路を含む）に依存する。しかしながら、本発明はいずれかの特定の投与方法または投与経路に限定されないことを強調しておきたい。
【０１００】
本発明の結合体治療目的で哺乳動物に使用する場合、好ましくは医薬組成物として製剤化される。そのような医薬組成物とその調製方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．ら編、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９９５年）を参照されたい。
【０１０１】
患者でのＦＧＦＲ３発現レベルを、ＦＧＦＲ３の閾値発現レベルと比較し得る。これらの閾値レベルを、各種ソース（限定はされないが、がんの動物モデル、患者の腫瘍のマイクロアレイデータ、または、対照患者集団を含む対照集団において見られるレベルを含む）から採用してもよい。
【０１０２】
ＦＧＦＲ３発現レベルは、各種方法（市販のキットを含む）で測定可能である。ＦＧＦＲ３発現レベルの測定には、限定はされないが、タンパク質またはｍＲＮＡ測定が含まれてよい。そのような技術の一つにおいて、ＦＧＦＲ３標準またはサンプルを、ヒトＦＧＦＲ３のＥＣＤに対する抗体でプレコーティングしたプレートに添加して、ＦＧＦＲ３と抗体を結合させる。非結合ＦＧＦＲ３および他のタンパク質を洗浄後、ホースラディッシュパーオキシダーゼで標識した抗ＦＧＦＲ３抗体（ＦＧＦＲ３のＥＣＤを認識する）を加える。ホースラディッシュパーオキシダーゼに連結した二次抗体は、基質をウエルに加えた際に青みがかった光を放つ。色の強度は、プレートに特異的に結合したＦＧＦＲ３の量に相関する。
【０１０３】
腫瘍組織または細胞においてＦＧＦＲ３を測定するのに使用される第二のそのような技術では、規定レベルのＦＧＦＲ３を安定的に発現するように設計された細胞から作製される標準、ＦＧＦＲ３陰性の細胞、および／または哺乳動物もしくは患者サンプルを、免疫組織化学染色用に調製する。組織または細胞を、ホルマリンで固定してパラフィン包埋する。固定組織を、免疫組織化学染色用にスライド上に準備する。スライドを、ヒトＦＧＦＲ３に対する一次抗体とインキュベートする。非結合抗体を洗い流した後に、一次抗体に結合し且つホースラディッシュパーオキシダーゼで標識された二次抗体を、スライド上にインキュベートする。ホースラディッシュパーオキシダーゼに連結された二次抗体は、基質をスライドに加えた際に青みがかった光を放つ。色の強度は、組織スライドに見いだされるＦＧＦＲ３の量に相関する。
【０１０４】
全ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体のレベルは、同様に測定可能である。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３標準またはサンプルを、抗体へのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の結合を可能にするために、ヒトＦＧＦＲ３のＥＣＤに対する抗体でプレコーティングしたプレートに添加する。非結合ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３および他のタンパク質を洗浄後、二次抗体（ＦＧＦＲ３タンパク質に転座したＴＡＣＣ３タンパク質ドメインを認識する）を加える。ホースラディッシュパーオキシダーゼに連結された二次抗体は、基質をウエルに加えた際に青みがかった光を放つ。色の強度は、プレートに見いだされるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の量に相関する。
【０１０５】
患者のＦＧＦＲ３の変異状態の同定は、各種方法（市販のキットを含む）で実施可能である。一つのそのような技術では、細胞または組織サンプルを溶解し、ＤＮＡを単離する。単離ＤＮＡを、７０％エタノールで洗浄、乾燥、そして水中に再懸濁する。ＤＮＡサンプルをその後、目的変異を含むことが知られるＦＧＦＲ３遺伝子領域を増幅するよう具体的にデザインされたプライマーと共にＰＣＲ反応物中に入れる。得られたＰＣＲ産物を精製して、配列決定する。ＦＧＦＲ３は、次世代シークエンシング、リアルタイムＰＣＲ、または他の検出方法もしくはゲノム方法を介しても同定可能である。
【０１０６】
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合状態の同定は、各種方法（市販のキットを含む）で実施可能である。一つのそのような技術では、細胞または組織サンプルを溶解し、全ＲＮＡを単離する。単離された全ＲＮＡをその後使用して、ｃＤＮＡを合成する。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合配列を含む領域を増幅するようにデザインされた特定のＰＣＲプライマーを、その後、ＰＣＲ反応物中でｃＤＮＡと共に使用する。ＰＣＲ反応物を、その後、ＰＣＲ産物を分離するのに使用されるゲル上で流す。融合体を保持するようにトランスフェクションされた細胞株から作製された標準とともに、ゲルに流す。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体はまた、標準的リアルタイムＰＣＲおよび蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを用いて検出可能である。
【０１０７】
ＦＧＦＲ３の発現レベル、ＦＧＦＲ３の変異、ＦＧＦＲ３の融合体、またはそれらの組み合わせの測定または検出を、同時、別々、または逐次的に完了し得る。その測定または検出は、各種技術（多モードハイスループットＰＣＲを含む）を用いて実行可能である。
【０１０８】
本発明はまた、腫瘍増殖および／または血管新生を阻害するキットであって、治療的有効量の本結合体を含むキットを含む。キットは、本結合体および付加的な抗がん剤（抗悪性腫瘍剤または治療（限定はされないがシスプラチンを含む）を含む）をさらに含み得る。代替的にまたはそれに加えて、キットは、例えば、以下に議論される腫瘍形成または血管新生に関与する付加的な増殖因子受容体（ＥＧＦＲを含む）の任意の適切なアンタゴニストを含み得る。本発明のキットは、アジュバントをさらに含んでもよい。
【０１０９】
従って、結合体１は、調査方法、診断方法、または治療方法（当該分野で既知の方法）のために、インビボおよびインビトロで使用可能である。本明細書中に開示される本発明の原理における変更が当業者によりなされ得る。そして、そのような改変が本発明の範囲内に含まれることを意図している。
【０１１０】
本明細書中に開示される本発明の原理におけるバリエーションが当業者によりなされ得ることは理解および期待されることである。そして、そのような改変が本発明の範囲内に含まれることを意図している。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、いずれにしても本発明の範囲を限定するようには解釈されるべきではない。従来法（例えば、ベクターおよびプラスミド構築、ポリペプチドをコードする遺伝子をそのようなベクターおよびプラスミドへ挿入すること、プラスミドを宿主細胞に導入すること、ならびに遺伝子および遺伝子産物の発現およびその測定において採用される方法）の詳細な説明は、多数の刊行物（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）およびＣｏｌｉｇａｎ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社（２００７年）を含む）から入手可能である。
【０１１２】
結合体１のためのヒト抗ＦＧＦＲ３抗体の発現および精製
各抗体に関して、適した方法（例えば、ＰＣＲクローニング）により、抗体１用の適した重鎖ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１２）を適した発現プラスミド（例えば、ｐＧＳＨＣ）中に設計し、そして、抗体１用の適した軽鎖ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１３）を適した発現プラスミド（例えば、ｐＧＳＬＣ）中に設計する。安定細胞株を樹立するために、適した宿主細胞株（例えば、ＮＳ０またはＣＨＯ細胞）中に、直線化した重鎖および軽鎖プラスミドをエレクトロポレーションにより共にトランスフェクションする。そして、適した培地（例えば、透析したウシ胎仔血清とグルタミン合成酵素サプリメントを有するグルタミン不含有ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養する。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体発現に関してクローンをスクリーニングし、最も産生量の高いクローンを選択し、スピナーフラスコ中で培養する。適した方法（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）により抗体を精製する。
【０１１３】
表１は、本発明の結合体１の抗体１のアミノ酸配列および配列番号を提供する。全てのＣＤＲ配列を、ＡｂＭ定義を使用して決定する。
【０１１４】
【表１】
2017511792.tif 000005
【０１１５】
結合体１の結合体形成方法
本発明の結合体は、当該技術分野で既知の各種方法（例えば、米国特許第７，８１１，５７２号、第８，３８３，１２２号、第６，４４１，１６３号、第７，３６８，５６５号、第８，１６３，８８８号、ならびに米国出願公開第２０１１／０００３９６９号、第２０１１／０１６６３１９号、第２０１２／０２５３０２１号、および第２０１２／０２５９１００号中に記載されている）により調製可能である。上に開示された方法は、結果として生じる収量、純度、モノマー、凝集体、遊離マイタンシノイドのパーセンテージ、断片化等が様々である。適切な結合体形成方法の選択は、エンドユーザーの要求に依存している。
【０１１６】
本発明の一つの側面では、「ワンステップ」プロセスで、第２０１２／０２５３０２１号に記載される一般法を用いて、スルホ−ＳＰＤＢを使用して抗体１をＤＭ４に結合させる。より具体的には、抗体１を１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、そして反応バッファーに透析ろ過する。５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．２）で、９％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）を添加したバッファー中に、１０ｍｇ／ｍＬの抗体１と抗体に対し５．６ｍｏｌのＤＭ４を混合する。５．１ｍｏｌのスルホ−ＳＰＤＢを加えることにより、この混合物中で抗体１と結合体を形成させ、１５℃で２０時間反応させる。酢酸を用いて、結合体混合物のｐＨを５．０に調整し、２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１２倍量の透析容量の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）含有バッファーに対して透析ろ過する。１０ｍＭのアセテート、９％スクロース（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（ｐＨ５．０）を含むバッファー中で５．０ｍｇ／ｍＬの結合体を製剤化する。
【０１１７】
結合体１のＤＡＲのＵＶ測定
上記で調製した結合体１材料を使用し、ＵＶ吸収を利用して、結合体１中での、ＤＭ４対抗体１のＤＡＲを評価する。
【０１１８】
２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでの結合体の吸光度を測定することによりＤＡＲを計算する。これらの波長でのＤＭ４および抗体の両者の吸光係数を使用して、溶液中のＤＭ４および抗体の総濃度を測定する。ＤＡＲを、ＤＭ４／抗体のモル比により定義する。
【０１１９】
１ｃｍの経路長の石英キュベットにおいて２８０ｎｍおよび２５２ｎｍで結合体溶液の吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＤＵ８００分光光度計を使用して測定することによりサンプル濃度を決定する。光散乱が対象波長での吸光度示数に影響を与えないことを保証するため、非吸収領域（３２０ｎｍ）での測定結果も記録する。２８０ｎｍでの吸光度の結果が装置の比例領域にあるようにバッファーでサンプルを希釈し（吸光度対象が０．７〜１．５（または０．５〜０．９ｇ／Ｌ））、そして、適切な希釈係数を濃度計算中で使用する。以下の等式により濃度を決定する。
【０１２０】
等式（１）  ＤＭ４のモル濃度、ＣＤＭ４（Ｍ）：
【数１】
2017511792.tif 000006
【０１２１】
等式（２）  結合体１のモル濃度、ＣＡ（Ｍ）：
【数２】
2017511792.tif 000007
【０１２２】
等式（３）  結合体１の濃度、ＣＡ（ｍｇ／ｍＬ）：
ＣＡ（ｍｇ／ｍＬ）＝ＣＡ（Ｍ）×１４５，６００
【０１２３】
等式（４）  マイタンシノイド対抗体比、ＤＡＲ：
【数３】
2017511792.tif 000008
【０１２４】
略語：
ＣＤＭ４：ＤＭ４濃度
ＣＡ：抗体１濃度
ＤＡＲ：マイタンシノイド対抗体比
Ａ２８０：２８０ｎｍでの吸光度
Ａ２５２：２５２ｎｍでの吸光度
ε２８０：２８０ｎｍでの吸光係数
ε２５２：２５２ｎｍでの吸光係数
【０１２５】
ＤＭ４に関する定数：
εＤＭ４，２５２：２６０１０Ｍ−１ｃｍ−１
εＤＭ４，２８０：５３２３Ｍ−１ｃｍ−１
吸光係数比（２５２ｎｍ／２８０ｎｍ）、ε２５２／ε２８０：４．８９
分子量：７８０．４ｇ／ｍｏｌ
【０１２６】
Ｄ１１抗体に関する定数
εＡ，２８０：１．７ｍＬ／（ｍｇ＊ｃｍ）または２４０，３６０Ｍ−１ｃｍ−１
吸光係数比（２５２ｎｍ／２８０ｎｍ）、ε２５２／ε２８０：０．３５
分子量：１４５．６ｋＤａ
【０１２７】
等式１は、２５２ｎｍでの抗体による吸収分を差し引くことにより、溶液中でのＤＭ４濃度を決定する。等式２は、ＤＭ４による吸収分を差し引くことにより、抗体濃度を決定する。ＤＡＲを、ＤＭ４濃度と抗体濃度の比率を計算することにより決定する（等式４）。
【０１２８】
１７０ｍＭリン酸カリウム、２１２ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．０）で、１５％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを添加したものを用いる無勾配モードでのサイズ排除ＨＰＬＣによりモノマーを決定する。１５０μｇの結合体を導入する。２８０ｎｍでの溶出をモニターする。凝集体を、主ピーク前に溶出する全てのピークを合わせた面積として計算する。低分子量種を、主ピークより後に溶出する全ての分離したピークを合わせた面積として計算する。
【０１２９】
デュアルカラムＳＥＣ／逆相ＨＰＬＣにより遊離マイタンシノイドレベルを測定する。２０％アセトニトリルを用いて結合体溶液を調製し、室温で３０分間インキュベートし、解析の前まで５℃で保存する。結合体をサイズ排除カラム（ＳＥＣ）上へと注入し、結合体を形成した抗体をカラムを通して洗浄する。一旦結合体が溶出されると、カラムの溶出物を、Ｃ−１８カラムに変えて入れると、そこでは、残存小分子が結合し、そして、３５分かけて勾配プログラム（０．１％ＴＦＡを有する２０％のアセトニトリル／０．１％ＴＦＡを有する８０％の水）により溶出される。ピーク面積を合算する。検量線由来の傾きを利用してＤＭ４含有量を決定する。遊離マイタンシノイドのパーセンテージは、ＤＭ４全体のモル数（ＵＶ  ＤＡＲ法により決定される）に対する遊離ＤＭ４のモル数（このデュアルカラムＨＰＬＣ法により決定される）の比率に１００を乗じたものである。
【０１３０】
【表２】
2017511792.tif 000009
【０１３１】
結合体１の代表的ロットのＤＡＲは３．５±０．５であった。
【０１３２】
ヒトＦＧＦＲ３に対する結合動力学およびアフィニティー：表面プラズモン共鳴アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））による解析
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置（ランニングバッファーと２５℃に設定した解析温度でプライムした）上で表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、ヒトＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）（ＦＧＦＲ３のスプライシング型の一つ）に対する結合アフィニティーおよび結合ストイキオメトリを測定する。２つのフローセル上に、固定化した受容体ｈｕＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）を含むＣＭ５チップ（標準的ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して作製した）を使用する。ランニングバッファー中に、６０ｎＭを起点とする２倍系列希釈（合わせて６個の希釈物）により、結合体１のサンプルを調製する。受容体を２．５μｇ／ｍＬ（５５ＲＵ）で固定化する。各解析サイクルは、（１）３０μＬ／分、１８０秒の接触時間でのサンプル注入、（２）９００秒、３０μＬ／分でバッファーを注入することによる解離、（３）接触時間３０秒、流速４０μＬ／分にて０．５％ＳＤＳ溶液中での再生からなる。標準的なことであるが二回参照してデータを処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００評価ソフトウエアバージョン４．１を使用して１：１結合モデルに適合させて、会合速度（ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１単位）、解離速度（ｋｏｆｆ，ｓ−１単位）、およびＲｍａｘ（ＲＵ単位）を決定する。平衡解離定数（ＫＤ）を、関係式ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算する。ＫＤは、モル濃度単位で示される。
【０１３３】
抗体１のＫＤは、１．３×１０−１０Ｍである。結合体１がｈｕＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）に結合する際の平均会合速度（ｋｏｎ）は（２．２７±０．００１）×１０５であり、解離速度（ｋｏｆｆ）は（１．８７±０．１３）×１０−４である。表１は、ｎ＝３の独立した実験から計算された標準偏差を有する実験結果のまとめを示す。結合体１が生理学的ｐＨおよびイオン強度下でｈｕＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）に結合する際のＫＤは、（８．２３±０．５９）×１０−１０Ｍである。
【０１３４】
【表３】
2017511792.tif 000010
【０１３５】
従って、結合体形成により、裸の非結合型抗体のリガンド結合機能性の変化はない。
【０１３６】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
リガンドＦＧＦ１のヒトＦＧＦＲ３（ＩＩＩＢ）への結合をブロックする結合体１
標準的９６穴Ｍｕｌｔｉ−Ａｒｒａｙ（登録商標）プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）（ＭＳＤ（登録商標））＃Ｌ１５ＸＡ−６）を、ウエル当たり１００ｎｇのヒトＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）−Ｆｃ（５μＬ／ウエルの２０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液）でスポットコーティングする。そして、カバーをつけて、室温で一晩インキュベートする。ウエル中の非特異的結合をブロックするために、各ウエルに１５０μＬの５％のＭＳＤブロッキング溶液Ａ（Ｒ９３ＢＡ−１）を加え、そして、室温で１時間インキュベートする。別の９６穴ＥＬＩＳＡプレート中に、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳ−Ｔ）、１％ＢＳＡ中の試験物を１μｇ／ｍＬで開始する１：３系列希釈物として調製する。ブロッキング溶液を捨て、これらの希釈物をウエル当たり３０μＬで、コーティング且つブロッキングされたＭＳＤプレートの適切なウエルに移し、そして、室温で１時間穏やかに撹拌する。プレートを傾けて溶液を捨て、２００μＬ／ウエルのＰＢＳ−Ｔで二度洗浄する。ウエル当たり３０μＬの１μｇ／ｍＬのルテニウムで標識したＦＧＦ１（ＰＢＳ−Ｔ、１％ＢＳＡ，、１０μｇ／ｍＬヘパリン（シグマカタログ＃Ｈ３１４９−５０ＫＵ））を、プレートに加えて、そして、暗所にて室温、１時間穏やかに撹拌する。再度プレートを傾けて溶液を捨て、２００μＬ／ウエルのＰＢＳ−Ｔで二度洗浄する。洗浄後、１５０μＬの１×ＭＳＤ（登録商標）Ｒｅａｄバッファー（ＭＳＤ、＃Ｒ９２ＴＣ−２）を、各ウエルに加える。電気化学的刺激があると、結合したＦＧＦ−１上のルテニウム標識が、６２０ｎｍで発光する。ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）画像解析装置の２４００プレートリーダー（ＭＳＤ、  ＃１２５０）中の電荷結合素子カメラにより、ＥＣＬシグナルを検出する。電気化学発光（相対光ユニット（ＲＬＵ）として測定された）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウエアバージョン６．０を用いてプロットする。ソフトウエアのログ［阻害剤］対応答関数を利用する非線形回帰曲線適合解析により、ＩＣ５０値を計算する。
【０１３７】
結合体１は、ＦＧＦ１のＦＧＦＲ３への結合を、３．６ｎＭのＩＣ５０で阻害する。このことは、ＦＧＦＲ３への結合に加えて、結合体１は、同族のリガンド（ＦＧＦ１）がＦＧＦＲ３に結合するのも阻害するというブロッキング機能があることを支持する。
【０１３８】
抗体１はＦＧＦ１およびＦＧＦ９がＦＧＦＲ３へ結合するのを阻害する。
変異、融合体、および野生型（ＷＴ）を含むＦＧＦＲ３の各種型を保持する細胞株のリガンド誘導性増殖を中和する抗体１（結合体１の抗体構成要素）の能力を評価する。
【０１３９】
ＢａＦ３は、マウスＩＬ−３に依存して生存するマウスプロＢ細胞株である。受容体をＢａＦ３細胞に導入すると、その細胞は、外部から供給されるＩＬ−３を必要とせずに、その受容体リガンドに応答して増殖することができる。
【０１４０】
レトロウイルスによる形質導入により、野生型または変異型ヒトＦＧＦＲ３を発現するＢａＦ３細胞株を調製する。各株は、ピュロマイシン耐性安定株のプールである。ＢａＦ３培養培地（マウスＩＬ−３およびピュロマイシン含む）中で、細胞密度２０，０００〜１，０００，０００細胞／ｍＬで、細胞株を維持する。そして、新しい培養培地で１〜４日ごとに希釈する。３Ｈチミジン取り込みアッセイで使用されるＢａＦ３＋ＦＧＦＲ３細胞を、アッセイ前１〜３日に、２０〜５０，０００細胞／ｍＬに希釈する。アッセイに関しては、細胞培養密度は、１００，０００〜１，０００，０００細胞／ｍＬの間である。始めに、ＢａＦ３＋ＦＧＦＲ（ＩＩＩ３ｂ）ＷＴ細胞、ＢａＦ３＋ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）ＷＴ細胞における用量依存的刺激による３Ｈチミジン取り込みに関して、ＦＧＦ−１（酸性ＦＧＦ）および／またはＦＧＦ−９を試験する。そして、ＢａＦ３＋ＭＳＣＶ空ベクター対照細胞と比較する。ＢａＦ３株を１，０００ｒｐｍで３分間室温で遠心分離し、そして、２０ｍＬのＢａＦ３アッセイ培地で３回洗浄する（各洗浄後同様に遠心分離する）。２００，０００細胞／ｍＬまたは８００，０００細胞／ｍＬのＢａＦ３＋ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）ＷＴ細胞株、ＢａＦ３＋ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）ＷＴ細胞株、またはＢａＦ３＋空ベクター細胞株１００μＬ（２０，０００または８０，０００細胞／ウエル）を、９６穴組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（商標）番号３５−３０７２）の内部の６０個のウエルに加える。５０μＬの４×ヘパリン（終濃度５〜１０μｇ／ｍＬ）（またはアッセイ培地）をそのウエルに加える。（ポリプロピレンプレート中の）アッセイ培地中にＦＧＦ−１またはＦＧＦ−９を系列希釈（１：２〜１：５）する。５０μＬの４×ＦＧＦ１、４×ＦＧＦ−９、またはアッセイ培地単独を、ウエルに（三つ組みで）加える。蒸発を減らすために、２５０μＬのアッセイ培地またはダルベッコＰＢＳを、端のウエルに加える。７２時間、３７℃、５％ＣＯ２、および９５％ＲＨで、細胞をインキュベートする。一つのウエルに対して、２０μＬのＤ−ＰＢＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ番号２４０６６０５）中の０．１ｍＣｉ／ｍＬチミジン−［メチル−３Ｈ］を、インキュベーションの最後の６時間加える。−８０℃でアッセイプレートを凍結し、３７℃で融解し、そして、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ（商標）回収器（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６（ＧＦ／Ｃプレート）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ番号６００５１７４）上に回収する。ＵｎｉＦｉｌｔｅｒプレートを乾燥させ、そして、ウエル当たり２０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−０シンチレーション試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ番号６０１３６１１）を加える。フィルタープレート上の取り込まれた３Ｈチミジンを、１分間ウエルごとに、１４５０−０２１Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で計数する。野生型ＦＧＦＲ３または変異体ＦＧＦＲ３上でのＦＧＦ−１またはＦＧＦ−９の活性の中和に関して抗体１を評価するために、一定量のヒトＦＧＦ−１またはヒトＦＧＦ−９を使用する（ＦＧＦ−１：ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）発現細胞には８０ｎｇ／ｍＬ、ＦＧＦ��３（ＩＩＩｂ）発現細胞には８００ｎｇ／ｍＬ；ＦＧＦ−９：ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）発現細胞には１００ｎｇ／ｍＬ、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）発現細胞には８００ｎｇ／ｍＬ）。これらの濃度のＦＧＦ−１またはＦＧＦ−９は、アッセイ培地単独と比べると、３Ｈ−チミジン取り込みが少なくとも２倍増加する。濃度値をμｇ／ｍＬからｎＭに換算するために、以下の式を使用する。
【０１４１】
μｇ／ｍＬでの濃度×換算倍率＝ｎＭでの濃度
式中、換算倍率は、ＭＷ（分子量）に逆比例する；モノクローナル抗体（そのＭＷを１５０ｋＤと仮定する）の換算倍率は、６．６６７である。ＦＧＦ−１：分子量＝１５．５ｋＤ、従って、換算倍率は６４．４５である。ＦＧＦ−９：分子量＝２３ｋＤ、従って、換算倍率は４３である。
【０１４２】
ＢａＦ３株（ピュロマイシン耐性を獲得後２〜８回継代した）を１，０００ｒｐｍで３分間室温で遠心分離し、そして、２０ｍＬのＢａＦ３アッセイ培地で３回洗浄する。４００，０００細胞／ｍＬの、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）ＷＴ、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）ＷＴ、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）変異体、またはＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）変異体を発現するＢａＦ３細胞５０μＬ（２０，０００細胞／ウエル）を、９６穴組織培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（商標））の内部の６０個のウエルに加える。別の希釈プレート（ポリプロピレン製）中で、抗体１またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体をアッセイ培地中に（４×の最大作業濃度へと）希釈する。アッセイ培地中に抗体をさらに系列希釈（１：３）する。５０μＬの各試験濃度の抗体をＢａＦ３細胞含有ウエルに加える。１処理当たり三つ組みにしたウエルを使用して試験する。抗体の代わりに、５０μＬのアッセイ培地を「培地単独」対照および「ＦＧＦ単独」対照用に加える。ヘパリンおよびＦＧＦの添加前に、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で４５分間、細胞と抗体との混合物を含むプレートをインキュベートする。５０μＬの４×ヘパリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を全てのウエルに加える。５０μＬの４×ＦＧＦ１若しくは４×ＦＧＦ−９（アッセイ培地中に希釈した）、またはアッセイ培地単独を、ウエルに（三つ組みで）加える。蒸発を減らすために、２５０μＬのアッセイ培地を、端のウエルに加える。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２および９５％ＲＨで、７２時間（ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）ＷＴまたは変異体発現細胞の場合）〜９６時間（ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）ＷＴまたは変異体発現細胞の場合）インキュベートする。一つのウエルに対して、２０μＬのＤ−ＰＢＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ番号２４０６６０５）中の０．１ｍＣｉ／ｍＬチミジン−［メチル−３Ｈ］を、インキュベーションの最後の６時間加える。取り込まれた３Ｈ−チミジンを回収し、そして、上記したように、１４５０−０２１Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ液体シンチレーションカウンターを使用して計数する。
【０１４３】
【表４】
2017511792.tif 000011
【０１４４】
表４では、抗体１（結合体１の抗体構成要素）は、ＷＴおよび変異型受容体ＦＧＦＲ３を保持する細胞株のＦＧＦ１およびＦＧＦ９リガンド誘導性増殖を、効果的に中和する。
【０１４５】
細胞毒性試験
ＦＧＦＲ３を過剰発現する腫瘍細胞株への結合体１の細胞毒性
結合体１の細胞毒性を測定するために、ＦＧＦＲ３を発現する膀胱がん細胞株と多発性骨髄腫細胞株のＦＧＦＲ３細胞表面相対密度を決定する。
【０１４６】
４８時間細胞株を培養し、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）細胞剥離バッファー（酵素不含有）（Ｇｉｂｃｏ、＃１３１５１−０１４）を用いて回収し、そして、細胞を計数する。細胞を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、冷却ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で一度洗浄し、そして、冷却ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。氷上で１時間、９６穴丸底プレート中のＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）染色バッファー（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、３％ＢＳＡ）中で、３０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを用いて細胞をブロッキングする。ブロッキング後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして、上清を除去する。１００μＬのＦＡＣＳ染色バッファーを、非染色対照ウエルに加える。ＦＡＣＳ染色バッファー中の１５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８−標識抗体１（ＦＧＦＲ３の内在化をモニターするのに使用される）、抗ＫＬＨ抗体（非標的型対照結合体）、またはｃｈＫＴＩ抗体（非標的型対照結合体）の１００μＬを、細胞を含む適切な試験ウエルに加える。バッファーと抗体を空のウエルに加え、その後、２滴の各標準ビーズ溶液（Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）ビーズキット（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ、＃８１６Ｂ））を、適切なウエルへ加える。１時間氷上で暗所にて、プレートをインキュベートする。細胞とビーズを二度ＦＡＣＳ洗浄バッファー（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％ＢＳＡ）で洗浄する。ＦＡＣＳ洗浄バッファー中で５μｇ／ｍＬの５０μＬの７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）中に細胞を再懸濁し、ビーズを５０μＬのＦＡＣＳ洗浄バッファーに再懸濁する。ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標）ＨＴＦＣでウエルを測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを使用して解析する。ＦｌｏｗＪｏにより作成されたメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）値を、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂから提供されたＥｘｃｅｌスプレッドシートに挿入して、抗体結合容量（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ）（ＡＢＣ）を決定する。報告された値は、裸の抗体１を使用して測定した特異的ＡＢＣ値から、抗ＫＬＨ抗体またはｃｈＫＴＩ抗体を使用して測定した非特異的ＡＢＣ値を差し引いた結果である（表５中の「ＦＧＦＲ３の細胞表面発現（ＡＢＣ）」とラベルされる列を参照されたい）。上記方法論を使用して、表５に明示してリストしていないが、本明細書中で議論される他の細胞株のＡＢＣを決定したことに留意されたい。
【０１４７】
【表５】
2017511792.tif 000012
【０１４８】
細胞表面上でのＦＧＦＲ３の発現が増加するにつれ、細胞毒性も増加する傾向が観察された。これらのデータはまた、細胞での細胞毒性の向上を結果として生じるＦＧＦＲ３変異および／または融合体の存在下で、結合体１への感受性が増加することを支持する。
【０１４９】
細胞毒性試験：抗体１（本発明の抗体構成要素）は細胞毒性のあるペイロードを選択的に送達可能である。
抗体１（本発明の抗体構成要素）は細胞毒性のあるペイロードを、腫瘍細胞へ選択的に送達可能である。
【０１５０】
９０μＬの完全培地中に、ウエル当たり２５００細胞で、９６穴組織培養プレートに細胞を蒔き、そして、５％ＣＯ２を含む湿潤環境中、４時間３７℃でインキュベートする。このインキュベーションが終わる直前に、試験物を、丸底９６穴プレートに、完全培地を用いて３倍系列希釈物に希釈する。４時間のインキュベーション後、１０μＬの希釈した抗体と一定量の結合したＦａｂ（１０ｎＭ）を混合し、細胞プレート中の対応するウエルに加え、そして、５％ＣＯ２を含む湿潤環境中、９６時間３７℃でインキュベートする。このインキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り出し、そして、全ての今後の工程のために室温になるようにさせる。１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ＃ＴＢ２８８）を各ウエルへ加え、そして、光から保護して２時間プレートをインキュベートする。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ（登録商標）Ｍ５ｅ多モードマイクロプレートリーダーで、発光シグナルを検出する。実験対象ウエルを非処理対照ウエルのパーセンテージとして計算する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６を使用してデータをプロットし、そして、正規化応答に対する阻害剤のログ、可変勾配を使用して分析してＩＣ５０を決定する。
【０１５１】
１２０，０００個の抗原を発現する多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１［ｔ（４；１４）、Ｙ３７３Ｃ］で見られる有意な細胞毒性（ＩＣ５０＝０．１１ｎＭ）は、抗体１（結合体１の抗体構成要素）がＦＧＦＲ３との結合を介してペイロードを送達することができることを立証する。このデータが示唆するのは、評価される多数の膀胱がん細胞株（ＲＴ−１１２（ＴＡＣＣ３））は〜１６，０００個の抗原を発現するのに対して、ＢＦＴＣ−９０５（野生型）は〜１１，０００個の抗原を発現する）および多発性骨髄腫がん細胞株（ＫＭＳ−１１［ｔ（４；１４）、Ｙ３７３Ｃ］は〜１２０，０００個の抗原を発現するのに対して、ＯＰＭ−２［ｔ（４；１４）、Ｋ６５０Ｅ］は〜５１，０００個の抗原を発現し、ＬＰ−１［ｔ（４；１４）］（野生型）は〜９，０００個の抗原を発現する）を横断して比較する場合に見られるように、ＦＧＦＲ３抗原密度および変異状態が増加するにつれて細胞毒性能も増加することである。結合体の細胞毒性活性の重要な要素は抗原密度であるが、ＦＧＦＲ３の変異状態と組になる抗原密度もまた、いくつかの細胞株では重要であり得る。
【０１５２】
【表６】
2017511792.tif 000013
【０１５３】
膀胱がん細胞株（ＲＴ１１２−ＴＡＣＣ３）、ＭＭ（ＫＭＳ−１１［ｔ（４；１４）Ｙ３７３Ｃ］、ＯＰＭ−２［ｔ（４；１４）、Ｋ６５０Ｅ］、胃がん細胞株Ｋａｔｏ−ＩＩＩ、ならびにトランスフェクションされたＢａｆ３−ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）およびＢａｆ３−ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）細胞株は、結合体１の選択的細胞毒性死滅作用に感受性がある。この効能はＦＧＦＲ３の表面発現およびＦＧＦＲ３の変異状態と相関する。
【０１５４】
結合体１を用いる膀胱がん細胞株の細胞毒性試験
結合体１は、各種型のＦＧＦＲ３を過剰発現する多数のインビトロ膀胱がん細胞株において細胞毒性がある。
【０１５５】
９０μＬの完全培地中に、ウエル当たり２５００細胞で、９６穴組織培養プレートに細胞を蒔き、そして、５％ＣＯ２を含む湿潤環境中、４時間３７℃でインキュベートする。このインキュベーションが終わる直前に、試験物を、丸底９６穴プレートに、完全培地を用いて３倍系列希釈物に希釈する。４時間のインキュベーション後、１０μＬの希釈した抗体を細胞プレートの対応するウエルに加え、そして、５％ＣＯ２を含む湿潤環境中、９６時間３７℃でインキュベートする。このインキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り出し、そして、全ての今後の工程のために、そのプレートが室温になるようにさせる。１００μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ＃ＴＢ２８８）を各ウエルへ加え、そして、光から保護して２時間プレートをインキュベートする。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ（登録商標）Ｍ５ｅ多モードマイクロプレートリーダーで、発光シグナルを検出する。実験対象ウエルを非処理対照ウエルのパーセンテージとして計算する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６を使用してデータをプロットし、そして、正規化応答に対する阻害剤のログ、可変勾配を使用して分析してＩＣ５０を決定する。
【０１５６】
結果は、分子（結合体１）を用いてＦＧＦＲ３が過剰発現する膀胱がん細胞株の各々を処理した場合、結合体１の有意な細胞毒性を示す（表５を参照されたい）。この化合物はＵＭＵＣ−１４腫瘍細胞株（受容体を恒常的に活性化する変異をＥＣＤに含むＦＧＦＲ３を過剰発現している）において、若干より強力である。ネガティブ対照であるアイソタイプを合わせた結合体は、任意のそれら株において結合体１で見られた、その濃度範囲での細胞毒性を示さない。膀胱がん細胞株ＫＵ−１９−１９（ＦＧＦＲ３を過剰発現していない）を実験に含めて、非特異的細胞毒性を評価する。結合体１は、ＫＵ−１９−１９株に対して細胞毒性はない。この結果は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合受容体の存在下または非存在下において、ＦＧＦＲ３のＷＴ、ＦＧＦＲ３の変異体Ｓ２４９ＣまたはＹ３７３Ｃを過剰発現する細胞株で、特異的インビトロ細胞毒性が、結合体１により誘導可能であることを示す。
【０１５７】
ＦＧＦＲ３内在化
ＦＧＦＲ３の変異状態、表面発現、および受容体が媒介する抗体取り込みの間の関係を理解するために、生細胞イメージング、フローサイトメトリー、および各種生化学解析を用いてインビトロ試験を実施する。これらの因子が如何に組み合って最終的に結合体の細胞毒性に影響するかを決定する。
【０１５８】
本明細書中のデータは、ＦＧＦＲ３の内在化の比率の増加がＦＧＦＲ３変異（Ｓ２４９Ｃ変異体およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体）と関連すること、ならびに、これらの異常が結合体１への感受性の向上と相関することを実証する。抗体取り込みの定量解析を、各種変異を保持し、表面でのＦＧＦＲ３レベルを様々に発現する細胞株の一団で実施する。これらの細胞株には、ＲＴ−４（ＴＡＣＣ３エクソン−４、表面密度である抗体結合容量（ＡＢＣ）は〜２９，０００）、ＵＭＵＣ−１４（Ｓ２４９Ｃ、ＡＢＣは〜２７，０００）、ＲＴ−１１２（ＴＡＣＣ３エクソン−１０、ＡＢＣは〜１６，０００）、ＢＦＴＣ−９０５（ＷＴ、ＡＢＣは〜１１，０００）、ＫＵ−１９−１９（ＷＴ、ＡＢＣは≦４，０００）、およびＵＭＵＣ−３（ＷＴ、ＡＢＣは≦４，０００）（一部、表５および６を参照されたい）が含まれる。
【０１５９】
Ａｌｅｘａ４８８蛍光標識抗体と生細胞共焦点顕微鏡解析によるこれらの細胞株の初期特徴解析は、膀胱がん細胞株の一団においてヒトＩｇＧ対照（ｃｈＫＴＩ）と比較すると、抗ＦＧＦＲ３抗体である抗体１の特異的取り込みを実証する。
【０１６０】
ＲＴ−１１２細胞における抗体１−Ａｌｅｘａ４８８（６７ｎＭ）の受容体媒介取り込みは、抗体添加後２４時間で明らかであった。生細胞実験では、抗体１が細胞内に取り込まれるのが観察される。
【０１６１】
並行する生細胞実験では、ｐＨ活性化型色素（ｐＨｒｏｄｏ（商標）：中性ｐＨで最小限の蛍光を示し、ｐＨが低下するにつれ蛍光強度が増加する）を使用して、リソソームへの抗体−受容体複合体の輸送を定量化する。対照ＩｇＧ抗体と比較する場合、抗体１添加の際にｐＨ−色素シグナルの蓄積の有意な増加が観察された。そして、この効果は受容体が媒介するもので、ＦＧＦＲ３を発現しない対照細胞（Ｂａｆ３Ｒ２）はバックグランドを超える認識可能なシグナルを生成しなかった。
【０１６２】
蛍光標識抗体１および対照抗体ｃｈＫＴＩ（抗体１−Ａｌｅｘａ４８８およびｃｈＫＩＴ−Ａｌｅｘａ４８８）を、同じ一団の細胞株とインキュベートし、そして、標識抗体を４８時間の期間をかけて取り込む。サンプルを、０．５、１、２、４、６、２４、および４８時間で回収し、そして、フローサイトメトリーにより細胞に結合した蛍光を定量化する。
【０１６３】
結果は、一団の細胞株に渡って、抗体１−Ａｌｅｘａ４８８の取り込みの程度に有意な差異があることを強調する。Ｓ２４９Ｃ変異を保持するＵＭＵＣ−１４細胞は、最もＦＧＦＲ３抗体を取り込み、それは、量と速度の両者に関して、対照の９倍より大きい。一方、ＴＡＣＣ３融合体を含む細胞株ＲＴ−１１２およびＲＴ−４は、バックグラウンドの約７倍、抗体１−Ａｌｅｘａ４８８を取り込む。ＢＦＴＣ−９０５、ＫＵ−１９１９、およびＵＭＵＣ−３（野生型を低発現する細胞株に相当する）は、抗体１の取り込みがほとんど無いか認識できないことを実証する。これらのデータは、表面にある受容体の密度が抗体取り込みの唯一の決定因子であることを示す。前記データは、受容体輸送および結合体により誘導される細胞毒性を活性化するＦＧＦＲ３変異ならびに／またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が取り込みに重要な役割を果たす可能性があることを強調する。
【０１６４】
効力モデル
複数の腫瘍異種移植モデル（細胞株および患者由来のモデルの両者を含む）において、結合体１の抗腫瘍活性を評価する。そして、非結合型の裸の抗体である抗体１と比較する。対照は、ビヒクルまたは非特異的抗体処置対照（ｃｈＫＴＩまたはＫＬＨおよび非標的型対照（つまり、ｃｈＫＴＩ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４））からなる。
【０１６５】
結合体１を用いる処置は、多様なＦＧＦＲ３抗原発現パターンを有する多数のヒト膀胱がんおよび多発性骨髄腫異種移植モデルにおける腫瘍退縮または静止を生じる抗腫瘍活性を示す。各試験において、結合体１は裸の抗体１と比べて高い抗腫瘍効力を示す。処置は、切断型カスパーゼ３の誘導によりモニターされる腫瘍細胞のアポトーシスの誘導により腫瘍増殖を阻害する。
【０１６６】
機関の動物実験員会により承認され、米国農務省および国立衛生研究所の現在の規制と基準に従って実施される動物実験方法を使用する。
【０１６７】
雌免疫不全（胸腺欠損）またはＮＯＤ／ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）マウスのわき腹中に、ＨＢＳＳ中のまたは５０％マトリゲルの混合物として、ヒト膀胱がん細胞株または多発性骨髄腫細胞株を移植後の異種移植モデル、あるいは、新鮮な３−４ｍｍの腫瘍断片を移植後の異種移植モデルを作製する。腫瘍断片を調製し、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルガイドラインに従って、無菌技術を使用して移植を実施する。
【０１６８】
腫瘍が規定サイズ（典型的には２００〜３００ｍｍ３）に達したら、腫瘍保持マウスを腫瘍体積によりランダム化する。そして、処置群（典型的には、ビヒクル、ｃｈＫＴＩもしくはＫＬＨ抗体対照、抗体１（裸のｍＡｂ対照）、ＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４もしくはｃｈＫＴＩ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（非標的型結合体対照）および結合体１を含む）の一つに振り分ける。試験物を、ボーラス尾静脈注射を介して、単回または反復（典型的には週に一回または隔週）のいずれかの投薬スケジュールで静脈内（ｉ．ｖ．）投与する。大多数の試験では、化合物の暴露およびアポトーシスのマーカーを測定するために、それぞれ、ＥＤＴＡ入り血漿および腫瘍組織を特定の時点で回収する。結合体１の血漿中濃度を、３種類のＥＬＩＳＡ（結合体の抗体部分に特異的なもの（トータルアッセイ）、抗体部分とマイタンシンペイロードの両者を認識するもの（結合体アッセイ）、および遊離マイタンシンを検出するもの（遊離アッセイ））を使用して測定する。手短には、トータルアッセイに関しては、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）を有する分子を捕獲し、抗ヒトＩｇＧ分子を使用して検出する。結合体アッセイに関しては、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）を有する分子を捕獲する。そして、抗マイタンシン抗体を使用して結合体を検出する。従って、このアッセイは、ペイロード：抗体比に感度がよい。遊離アッセイでは、まず、全てのタンパク質を、アセトンを使用してサンプルから析出させる。一方で、遊離マイタンシンは上清中に残存する。その上清を取り出して、競合ＥＬＩＳＡで解析する。
【０１６９】
回収した腫瘍組織をＭＳＤ（登録商標）を使用して切断型カスパーゼ３に関して解析する。スナップ凍結腫瘍断片（約１００〜２００ｍｍ３）を、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩを使用して溶解する。ハミルトンＳＴＡＲ液体ハンドラーを使用して澄ませた溶解物のタンパク質濃度を標準化し、そして、解析のためにＭＳＤプレート中に押し付けて入れる。切断型カスパーゼ３および全長カスパーゼ３に関して、別々の３８４穴プレートを使用して、製造元のプロトコルに従ってＭＳＤ  ＣＣ３を実施する（結果を切断型／全長の比率として表現する）。ブロッキングとインキュベーション工程の後、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬ４０６（商標）プレート洗浄機を使用してプレートを洗浄し、そして、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｓｅｃｔｏｒ（登録商標）２４００画像解析装置を使用して解析する。データ解析（１方向ＡＮＯＶＡ統計解析を含む）のために、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウエアを使用する。
【０１７０】
腫瘍体積をカリパスで測定し、少なくとも週二回体重を記録し、その後、週に一回測定を引き続き行う。腫瘍体積を、式：体積＝［（π／６）  ｌ×ｗ２］（式中、πは３．１４に等しく、ｗは幅に相当し、ｌは長さに相当する）により計算する。処置期間を以下のように決定する：１）予め決められた期間（例えば、作用機序試験中の組織学的解析のための終了）、２）試験エンドポイントに到達する（すなわち、統計学的に有意な腫瘍増殖阻害が達成されるか、または、抗腫瘍効果が明白である）、あるいは３）臨床的エンドポイントに到達する（例えば、腫瘍の負荷が、動物福祉または生存に影響する）。
【０１７１】
実験処置の抗腫瘍効力をＴ／Ｃ比（％）として表す。以下に手短に述べるように計算する。
【０１７２】
％Ｔ／Ｃ＝１００×ΔＴ／ΔＣ（ΔＴ＞０の場合）
式中、ΔＴ＝試験最終日の薬物処置群の平均腫瘍体積  −  投薬開始日の薬物処置群の平均腫瘍体積；ΔＣ＝試験最終日の対照群（各試験において規定される）の平均腫瘍体積  −  投薬開始日の対照群の平均腫瘍体積である。ΔＴ＜０の場合、％Ｔ／Ｃの代わりに退縮（％Ｒｅｇ）を、式＝１００×ΔＴ／初期Ｔを使用して計算する。もし腫瘍が≧５０％退縮を達成したら、それは部分応答（ＰＲ）とする。もし検出不能ならば、腫瘍は完全応答（ＣＲ）を有する。群間で腫瘍増殖を比較するために、最終日まで通して反復測定分散分析（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ）を使用し、ＪＭＰ統計ディスカバリーパッケージ（Ｖ．９．、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用してｐ値（Ｐ）を決定する。
【０１７３】
表７は、本明細書中で試験された腫瘍異種移植モデルのまとめである。以下に再現されるＦＧＦＲ３受容体密度（ＡＢＣ）を、表５にして報告した。
【０１７４】
【表７】
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【０１７５】
ＲＴ１１２ヒト膀胱がん異種移植モデルにおける結合体１の効力
ＲＴ−１１２（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３）ヒト膀胱がん異種移植モデルにおいて三回独立して試験して、結合体１の反復静脈内投薬後の抗腫瘍効力および応答耐久性を評価する。ＲＴ−１１２（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３）は、最近報告されたのであるがＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合を保持するヒト膀胱がん細胞株であって、ＦＡＣＳ／ＢＡＮＧＳ解析により測定すると１６，０００個の受容体を発現する。
【０１７６】
平均腫瘍体積の範囲が２２０〜２７０ｍｍ３に達した場合に、腫瘍体積によりマウスをランダム化する。ランダム化に引き続いて、腫瘍異種移植片を有する動物（ｎ＝６〜１２／群）に、ビヒクル対照（１０μＬ／ｇ；１０ｍＭのＴｒｉｓ、８０ｍＭのＮａＣｌ、３．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．５））、ＫＬＨ、対照抗体１、ＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、または結合体１のいずれかを投薬する。
【０１７７】
これらの試験では、作用機序の試験のために、別の群のＰＫ／ＰＤコホート動物（ｎ＝４）を含める。これらの試験では、５ｍｇ／ｋｇの用量のＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、または、２．５および５ｍｇ／ｋｇの用量の結合体１の単回静脈内投薬を行う。そして、血漿および腫瘍組織を得るために、２４時間および９６時間で動物を安楽死させる。血漿サンプルを化合物の血漿中濃度に関して評価し、腫瘍組織をアポトーシスマーカーに関して解析する。
【０１７８】
ＲＴ−１１２試験１では、腫瘍断片異種移植片を有する動物（ｎ＝６／群）は、ランダム化の後、ビヒクル対照（１０μＬ／ｇ；１０ｍＭのＴｒｉｓ、８０ｍＭのＮａＣｌ、３．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．５））、ＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）、または結合体１（５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの、１４日間隔で合計２回の静脈内投薬を受ける。
【０１７９】
表８に示すように、結合体１は、５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＲＴ−１１２腫瘍増殖を阻害し、二回の静脈内投薬後に、９９日目まででは６匹の動物中６匹（１００％）で完全応答（ＣＲ）を生じ、そして、１５４日目では８６％退縮（６匹中５匹が完全退縮）を生じる。これらの６匹の動物の内、５匹中４匹の生存マウスは、２１１日目までを通して腫瘍がないままである。一方で、単回投与動物中では腫瘍の再増殖が観察される。５ｍｇ／ｋｇのＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の投薬では、６匹の動物中２匹でＣＲが生じる。
【０１８０】
ＲＴ−１１２試験２（反復投薬効力試験）では、細胞移植後に作製された腫瘍保持マウス（ｎ＝１２／群）は、ＵＳＰ生理食塩水（１０μｌ／ｇ）、抗体１（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）または結合体１（５ｍｇ／ｋｇ）の合計３回の静脈投薬（１３、３５、および４９日目）を受ける。この試験では、５ｍｇ／ｋｇで投薬される結合体１は、２回投薬後の４７日目に、ビヒクル対照と比較（ｐ＜０．０００１）して、４４％の腫瘍退縮を生じる。最終投薬後１００日間を超えて、応答は維持され、１２匹の動物中９匹が完全応答（ＣＲ）を達成する。５ｍｇ／ｋｇで投薬されるＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、生理食塩水対照と比較（ｐ＝０．０２）して、Ｔ／Ｃが４６％である。結合体１は裸の抗体１よりも有意に効力があり、比較対象の１０ｍｇ／ｋｇで投薬される裸の抗体１は、Ｔ／Ｃが５５％である。
【０１８１】
ＲＴ−１１２試験３は、用量応答試験（ｎ＝８／群）であり、そこでは、結合体１の抗腫瘍効力を、１．２５、２．５、および５ｍｇ／ｋｇで、合計５回の静脈投薬（２１日目および３５日目、その後３回の週に一回の投薬）後に評価する。この試験の対照は、ＫＬＨ（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗体１（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／ｋｇ）である。ＰＫ／ＰＤ動物のコホート（ｎ＝４）は、５ｍｇ／ｋｇのＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、または、２．５および５ｍｇ／ｋｇの結合体１の単回静脈内投薬を受ける。
【０１８２】
２．５または５ｍｇ／ｋｇで投薬される結合体１により生じる腫瘍退縮は、それぞれ、９３％または１００％（８２日目）に対応する。１６６日目までを通して、１．２５ｍｇ／ｋｇでは２／５が完全応答、２．５および５ｍｇ／ｋｇでの投薬後は、それぞれ、８／８の各動物が完全応答であることを、結果は示す。１．２５ｍｇ／ｋｇで投薬される結合体１は、腫瘍の静止を生じる。５ｍｇ／ｋｇで投薬されるＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は腫瘍の静止を生じ、２／７の動物で完全退縮がある。そして、この効果はビヒクル対照と比較して、統計学的に有意（ｐ＝０．０２）であった。退縮した腫瘍は、観察期間（＞１６０日）中、再増殖しなかった。
【０１８３】
【表８】
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【０１８４】
血漿サンプルを化合物の血漿中濃度に関して評価し、腫瘍組織をアポトーシスマーカーに関して解析する。結合体１の血漿中濃度−時間プロフィールは、結合体１および全ＩｇＧに対するＥＬＩＳＡにより測定すると、サンプル採取時間（９６時間）の全範囲に渡り、２．５および５．０ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与では用量依存的濃度（それぞれ、１２．６および３２．５μｇ／ｍＬ（２４時間））であることを示す。さらに、結合体１処置へのＲＴ−１１２の応答は腫瘍組織内で検出することができ、切断型カスパーゼ３レベル（化合物の可能な作用モードを表す）の用量依存的増加を示す。
【０１８５】
これらＲＴ−１１２試験では、結合体１は、用量依存的で有意な効力を生じ、大多数の動物において完全応答を結果として生じた。そして、その効果は持続可能（１００日よりも長く）であった。結合体１は、裸の抗体である抗体１よりも有意に効力があった。
【０１８６】
ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱がん異種移植モデルにおける結合体１の効力
ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱がん異種移植片における裸の抗体１と比較される結合体１のインビボ効力は、ＲＴ−１１２（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３）モデルとは遺伝学的に異なるものである。ＵＭＵＣ−１４細胞株は、約２７，０００個の受容体密度（ＦＡＣＳ解析およびＢＡＮＧＳにより決定される）を発現し、その受容体は、Ｓ２４９Ｃ変異を保持していることを考慮すると、恒常的に活性がある。
【０１８７】
ＨＢＳＳ中に懸濁された５×１０６個のＵＭＵＣ−１４細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）マウス（雌、５〜６週齢）の皮下に接種する。各群の平均腫瘍体積が２４０〜２５０ｍｍ３となるように、動物を処置群にランダム化して割り当てる。１４日間隔で分けられた２回の投薬または４回の週一回の投薬のいずれかで、抗体１および結合体１を静脈内投与する。対照として使用するのは、結合体製剤化バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、８０ｍＭのＮａＣｌ、３．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．５））、または５ｍｇ／ｋｇの非標的型ｃｈＫＴＩ抗体、ｃｈＫＴＩ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、もしくはＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のいずれかである。
【０１８８】
ＵＭＵＣ−１４モデルの第一試験では、腫瘍移植後１７日目および３１日目に投薬される５ｍｇ／ｋｇの用量の結合体１は、１０／１０の動物でＵＭＵＣ−１４異種移植片の完全退縮を生じる。この結果は、腫瘍がない状態が、〜１５日間維持されることを示している。処置停止約３０日後に、腫瘍の再増殖が観察された。７８日目および８１日目にこれらの腫瘍を再処置すると、５ｍｇ／ｋｇで投薬される結合体１は腫瘍サイズを減少させず、これは、腫瘍に耐性が発生したことを示唆する。
【０１８９】
１０ｍｇ／ｋｇで投薬される裸の抗体１および５ｍｇ／ｋｇで投薬されるＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の両者は、腫瘍増殖に有意な影響を与えない。結合体１の血漿中レベルは、投薬後４８時間で、〜８７μｇ／ｍＬに到達し、投与後早くて４８時間で、切断型カスパーゼ３の有意な増加が観察される。
【０１９０】
ＵＭＵＣ−１４モデルの第二試験では、４回の週一回の結合体１投薬後に、腫瘍の無い状態が有意に延長する。結合体１は、用量依存的様式で、ＵＭＵＣ−１４腫瘍増殖を阻害する。５ｍｇ／ｋｇでは８匹の動物中８匹で完全腫瘍退縮を達成し、２．５ｍｇ／ｋｇでは腫瘍静止に至り、そして、１．２５ｍｇ／ｋｇでは効果がなかった。動物は、〜３０日間腫瘍が無いままであるが、その後、腫瘍は再増殖を開始する。
【０１９１】
【表９】
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【０１９２】
ＵＭＵＣ−１４ヒト膀胱がん試験では、反復静脈内投薬後に１００％ＣＲを実現する有意な効果に引き続いて、腫瘍の再増殖が起こる。
【０１９３】
ＢＦＴＣ−９０５（ＦＧＦＲ３野生型（ＷＴ））ヒト膀胱がん異種移植モデルにおける結合体１の効力
野生型ＦＧＦＲ３の発現存在下での結合体１の効力を測定する。ＨＢＳＳ中に懸濁された２×１０６個のＢＦＴＣ−９０５を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）の皮下に接種する。ランダム化の後、週一回のスケジュールで抗体１および結合体１を静脈内投与する。対照として使用するのは、ＫＬＨまたはｃｈＫＴＩ抗体のいずれかと非標的型ＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはｃｈＫＴＩ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のいずれかである。併用療法試験では、週一回シスプラチンを腹腔内投与する。
【０１９４】
結合体１処置は、ＢＦＴＣ−９０５異種移植片で用量依存的抗腫瘍効力を示し、５ｍｇ／ｋｇで腫瘍静止を達成する一方で、１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇでは腫瘍増殖を有意に阻害する。結合体１とシスプラチンの組み合わせは１０／１０のＰＲを有する腫瘍退縮を生じ、その効果はそれぞれの単独療法よりも有意に大きいものである。結合体１は、切断型カスパーゼ３の組織レベルの増加傾向を示す。
【０１９５】
【表１０】
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【０１９６】
ＢＦＴＣ−９０５（野生型ＦＧＦＲ３）ヒト膀胱がん異種移植用細胞株では、約１１，０００個の受容体密度（ＦＡＣＳ解析およびＢＡＮＧＳにより決定される）を発現する。結合体１は、より高い試験用量でしか、腫瘍静止を実現しなかった。シスプラチンとの組み合わせでは、結合体１とシスプラチンの併用療法は結合体１単独の効果を有意に増強し、１０／１０のＰＲを有する腫瘍退縮を生じる。その組み合わせ効果は、ブリス（Ｂｌｉｓｓ）独立法で定義される場合の相加効果よりも大きい。
【０１９７】
ＫＵ−１９−１９（ＦＧＦＲ３陰性）ヒト膀胱がん異種移植モデルにおける結合体１の効力
ＦＧＦＲ３陰性膀胱がん（ＫＵ−１９−１９）異種移植モデルで結合体１を評価して、結合体１の特異性を立証する。手短に言うと、ＨＢＳＳ中に懸濁されるＫＵ−１９−１９細胞を、２×１０６細胞／マウスで、Ｎｕ／ｎｕ（雌、５〜６週齢）に皮下接種する。ランダム化の後、週一回のスケジュールで抗体１および結合体１を静脈内投与する。対照として使用するのは、ｃｈＫＴＩ抗体および非標的型ｃｈＫＴＩ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４である。
【０１９８】
【表１１】
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【０１９９】
予想されたように、週一回のスケジュールにより５ｍｇ／ｋｇで投薬された結合体１は、ＫＵ−１９−１９腫瘍に対する抗腫瘍効果は示さず、このことは、ＦＧＦＲ３抗原に対する試験物の特異性を示す。同様に、裸の抗体（抗体１）およびｃｈＫＴＩ−スルホ−ＳＤＰＤ−ＤＭ４（両者とも週一回５ｍｇ／ｋｇで投薬される）も抗腫瘍活性を示さなかった。
【０２００】
ＫＭＳ−１１ヒト多発性骨髄腫異種移植モデルにおける結合体１の効力
ＫＭＳ−１１およびＫＭＳ−１１ＬＰ（ルシフェラーゼ陽性）ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）異種移植モデルにおいて結合体１のインビボ効力を評価する。ＫＭＳ−１１は高いレベルのＦＧＦＲ３（〜１２０，０００）を発現し、染色体転座（ｔ（４；１４））と一つの点変異Ｙ３７３Ｃを有している。ＫＭＳ−１１ＬＰは、ルシフェラーゼ陽性でより高いレベルのＦＧＦＲ３抗原（〜１５９，０００）を発現するＫＭＳ−１１親株からの誘導体である。
【０２０１】
ＨＢＳＳ中に懸濁された１０×１０６個のＫＭＳ−１１またはＫＭＳ−１１ＬＰ細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）マウス（雌、５〜６週齢）の皮下に接種する。腫瘍は、平均腫瘍体積が〜３００ｍｍ３に達したら、動物を処置群にランダムに割り当てる。単回、週一回、または隔週のいずれかで、抗体１と結合体１を静脈内投与する。対照として使用するのは、結合体製剤化バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、８０ｍＭのＮａＣｌ、３．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．５））、または非標的型ＫＬＨ抗体とＫＬＨ−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のいずれかである。
【０２０２】
ＫＭＳ−１１試験１において、結合体１単回投薬での処置はＫＭＳ−１１腫瘍の増殖を有意に阻害するが、初期の腫瘍静止に引き続いて腫瘍再増殖が起こる。回収された腫瘍組織の解析は切断型カスパーゼ３レベルの有意な増加を示し、その増加は投薬後１２時間で開始し、２４時間でピークを迎える。
【０２０３】
より積極的な投薬スケジュールを用いる場合、結合体１の効力は有意に改善する。ＫＭＳ−１１試験３では、合計５回の結合体１の週一回の投薬は、７匹の動物中２匹で完全応答を生じる一方で、７匹の動物中５匹で部分応答を達成する。しかしながら、この投薬スケジュールを用いる非標的型結合体対照も有意な効果がある。
【０２０４】
【表１２】
2017511792.tif 000019
【０２０５】
これらの試験は、結合体１で処置したＫＭＳ−１１ＬＰ異種移植片（親株ＫＭＳ−１１（１１９，０００個）に比べて若干高い抗原密度（１５２，０００個）を発現する）における有意かつ強力な効力を示す。結合体１処置は、１４日ごとに投与される合計３回の投薬後に、１０匹の動物中１０匹で完全応答を生じる。そして、腫瘍の無い状態が、観察期間である７０日目までの間維持される。
【０２０６】
追加的配列
配列番号１１
ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳＥＳＬＧＴＥＱＲＶＶＧＲＡＡＥＶＰＧＰＥＰＧＱＥＬＶＦＧＳＧＤＡＶＥＬＳＣＰＰＰＧＧＧＰＭＧＰＴＶＷＶＫＤＧＴＧＬＶＰＳＥＲＶＬＶＧＰＱＲＬＶＬＮＡＳＨＥＤＳＧＡＹＳＣＲＱＲＬＴＲＶＬＣＨＦＳＶＲＶＴＤＡＰＳＳＧＤＤＥＤＧＥＤＥＡＥＤＴＧＶＤＴＧＡＰＹＷＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡＡＧＮＰＴＰＳＩＳＷＬＫＮＧＲＥＦＲＧＥＨＲＩＧＧＩＫＬＲＱＱＷＳＬＶＭＥＳＶＶＰＳＤＲＧＮＹＴＣＶＶＥＮＫＦＧＳＩＲＱＴＹＴＬＤＶＬＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＱＴＡＶＬＧＳＤＶＥＦＨＣＫＶＹＳＤＡＰＨＩＱＷＬＫＨＶＥＶＮＧＳＫＶＧＰＤＧＴＰＹＶＴＶＬＫＴＡＧＡＮＴＴＤＫＥＬＥＶＬＳＬＨＮＶＴＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＦＳＨＨＳＡＷＬＶＶＬＰＡＥＥＥＬＶＥＡＤＥＡＧＳＶＹＡＧＩＬＳＹＧＶＧＦＦＬＦＩＬＶＶＡＡＶＴＬＣＲＬＲＳＰＰＫＫＧＬＧＳＰＴＶＨＫＩＳＦＰＬＫＲＱＶＳＬＥＳＮＡＳＮＳＳＮＴＰＬＶＲＩＡＲＬＳＳＧＥＧＰＴＬＡＮＶＳＥＬＥＬＰＡＤＰＫＷＥＬＳＲＡＲＬＴＬＧＫＰＬＧＥＧＣＦＧＱＶＶＭＡＥＡＩＧＩＤＫＤＲＡＡＫＰＶＴＶＡＶＫＭＬＫＤＤＡＴＤＫＤＬＳＤＬＶＳＥＭＥＭＭＫＭＩＧＫＨＫＮＩＩＮＬＬＧＡＣＴＱＧＧＰＬＹＶＬＶＥＹＡＡＫＧＮＬＲＥＦＬＲＡＲＲＰＰＧＬＤＹＳＦＤＴＣＫＰＰＥＥＱＬＴＦＫＤＬＶＳＣＡＹＱＶＡＲＧＭＥＹＬＡＳＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＶＬＶＴＥＤＮＶＭＫＩＡＤＦＧＬＡＲＤＶＨＮＬＤＹＹＫＫＴＴＮＧＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＡＬＦＤＲＶＹＴＨＳＤＶＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＴＬＧＧＳＰＹＰＧＩＰＶＥＥＬＦＫＬＬＫＥＧＨＲＭＤＫＰＡＮＣＴＨＤＬＹＭＩＭＲＥＣＷＨＡＡＰＳＲＰＴＦＫＬＶＥＤＬＤＲＶＬＴＶＴＳＴＤＥＹＬＤＬＳＡＰＦＥＹＳＰＧＧＱＤＴＰＳＳＳＳＳＧＤＤＳＶＦＡＨＤＬＬＰＰＡＰＰＳＳＧＧＳＲＴ
【０２０７】
配列番号１２
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【０２０８】
配列番号１３
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【配列表】
2017511792000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年7月25日(2016.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2017511792.tif 000021
［式中、
ｎは１〜１０の整数であり、
Ｒは、ヒトＦＧＦＲ３（配列番号１１）に結合し、配列ＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨ（配列番号４）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＤＴＥＲＰＳ（配列番号５）を有するＣＤＲＬ２、および配列ＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ３を含む細胞結合剤である］。
【請求項２】
前記細胞結合剤が、重鎖可変領域アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）および
軽鎖可変領域アミノ酸配列：
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＫＴＡＴＦＴＣＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨＷＹＲＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＬＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＭＳＧＳＮＦＧＮＴＡＴＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号８）
をさらに含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記細胞結合剤が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記細胞結合剤が、配列番号１０のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖をさらに含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
薬物抗体比が３．５±０．５である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物と、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項７】
がんの治療において使用するための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
対照集団におけるＦＧＦＲ３発現レベルよりも高いＦＧＦＲ３発現レベルを有する患者におけるがんの治療において使用するための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせ
を有する患者におけるがんの治療において使用するための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせ
を有する患者におけるがんの治療において使用するための医薬組成物であって、
前記治療は、前記患者が（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異（ここで、前記変異は、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される）；（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせを有するかどうかを、前記患者の生体試料中における、（ｉ）Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ変異の１つ以上；（ｉｉ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせの存在をエクスビボまたはインビトロで決定することにより決定する工程を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記がんが膀胱がんまたは多発性骨髄腫である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記化合物が、同時、別々、または逐次的に別の抗がん治療とともに投与される、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
がんを有する対象が請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）の発現レベルをエクスビボまたはインビトロで測定することを含み（ここで、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される）、がんに罹患していない個体におけるＦＧＦＲ３発現レベルと比較してＦＧＦＲ３発現レベルが上昇している場合に、前記対象が前記化合物に対する候補であることを示す、方法。
【請求項１４】
がんを有する対象が請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）患者から採取した試料中の異常の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み
［ここで、前記異常は
（１）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（２）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（３）（１）と（２）との組み合わせである］、
（ｂ）前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される、
方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
別の側面は、がんを有する対象が本化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記患者から採取した試料中の異常の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み［ここで、前記異常は、（１）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびその組み合わせからなる群より選択される変異、（２）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体、または（３）（１）と（２）との組み合わせである］、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択され、前記変異が検出された場合に、前記対象が本化合物に対する候補であることを示す、方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
抗体１に関する定数
εＡ，２８０：１．７ｍＬ／（ｍｇ＊ｃｍ）または２４０，３６０Ｍ−１ｃｍ−１
吸光係数比（２５２ｎｍ／２８０ｎｍ）、ε２５２／ε２８０：０．３５
分子量：１４５．６ｋＤａ
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
抗体１のＫＤは、１．３×１０−１０Ｍである。結合体１がｈｕＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）に結合する際の平均会合速度（ｋｏｎ）は（２．２７±０．００１）×１０５であり、解離速度（ｋｏｆｆ）は（１．８７±０．１３）×１０−４である。表３は、ｎ＝３の独立した実験から計算された標準偏差を有する実験結果のまとめを示す。結合体１が生理学的ｐＨおよびイオン強度下でｈｕＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ）に結合する際のＫＤは、（８．２３±０．５９）×１０−１０Ｍである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
これらの試験は、結合体１で処置したＫＭＳ−１１ＬＰ異種移植片（親株ＫＭＳ−１１（１１９，０００個）に比べて若干高い抗原密度（１５２，０００個）を発現する）における有意かつ強力な効力を示す。結合体１処置は、１４日ごとに投与される合計３回の投薬後に、１０匹の動物中１０匹で完全応答を生じる。そして、腫瘍の無い状態が、観察期間である７０日目までの間維持される。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  式Ｉの化合物：
【化４】
2017511792.tif 000022
［式中、
ｎは１〜１０の整数であり、
Ｒは、ヒトＦＧＦＲ３（配列番号１１）に結合し、配列ＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨ（配列番号４）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＤＴＥＲＰＳ（配列番号５）を有するＣＤＲＬ２、および配列ＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ３を含む細胞結合剤である］。
［２］  前記細胞結合剤が、重鎖可変領域アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）および
軽鎖可変領域アミノ酸配列：
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＫＴＡＴＦＴＣＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨＷＹＲＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＬＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＭＳＧＳＮＦＧＮＴＡＴＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号８）
をさらに含む、［１］に記載の化合物。
［３］  前記細胞結合剤が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、［２］に記載の化合物。
［４］  前記細胞結合剤が、配列番号１０のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの軽鎖および配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの重鎖をさらに含む、［３］に記載の化合物。
［５］  薬物抗体比が２．０〜５．０である、［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物。
［６］  薬物抗体比が３．５±０．５である、［１］〜［４］のいずれかに記載の化合物。
［７］  ［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物と、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
［８］  付加的な薬剤をさらに含む、［７］に記載の医薬組成物。
［９］  療法に使用するための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１０］  がんの治療において使用するための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１１］  対照集団におけるＦＧＦＲ３発現レベルよりも高いＦＧＦＲ３発現レベルを有する患者におけるがんの治療において使用するための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１２］  前記対照集団が、がんに罹患していない少なくとも１つの個体を含む、［１１］に記載の使用のための［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１３］  （ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせ
を有する患者におけるがんの治療において使用するための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１４］  （ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせ
を有する患者におけるがんの治療において使用するための化合物であって、
前記治療は、前記患者が（ａ）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異（ここで、前記変異は、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される）；（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせを有するかどうかを、前記患者の生体試料中における、（ｉ）Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ変異の１つ以上；（ｉｉ）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または（ｉｉｉ）（１）と（２）の組み合わせの存在をエクスビボまたはインビトロで決定することにより決定する工程を含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１５］  前記がんが膀胱がんまたは多発性骨髄腫である、［１０］〜［１４］のいずれかに記載の使用のための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１６］  前記化合物が、同時、別々、または逐次的に別の抗がん治療とともに投与される、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の使用のための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１７］  前記抗がん治療が、抗血管新生剤、化学療法剤、および抗悪性腫瘍剤からなる群より選択される、［１６］に記載の使用のための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１８］  前記抗悪性腫瘍剤がシスプラチンである、［１７］に記載の使用のための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１９］  哺乳動物におけるがんを治療する方法であって、治療を必要とする前記哺乳動物に、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物を投与することを含み、前記がんが膀胱がんまたは多発性骨髄腫からなる群より選択される、方法。
［２０］  前記哺乳動物に別の抗がん治療剤を投与することをさらに含み、前記抗がん治療剤が抗血管新生剤、化学療法剤、および抗悪性腫瘍剤からなる群より選択される、［１９］に記載の方法。
［２１］  前記抗悪性腫瘍剤がシスプラチンである、［２０］に記載の方法。
［２２］  患者におけるがんを治療する方法であって、
（ａ）前記患者から採取した試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）の発現レベルを測定する工程と（ここで、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される）；
（ｂ）前記ＦＧＦＲ３発現レベルが対照集団において見られるＦＧＦＲ３発現レベルより高い場合に、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物を前記患者に投与する工程と
を含む、方法。
［２３］  患者におけるがんを治療する方法であって、
（ａ）前記患者から採取した試料中の異常の存在を決定する工程と
［ここで、前記異常は、
（１）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（２）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（３）（１）と（２）との組み合わせであり、
前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される］、
（ｂ）前記異常が存在する場合、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物を前記患者に投与する工程と
を含む、方法。
［２４］  がんを有する対象が［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、前記対象の試料中のＦＧＦＲ３（配列番号１１）の発現レベルをエクスビボまたはインビトロで測定することを含み（ここで、前記試料は、血液、血清、血漿、尿、および組織からなる群より選択される）、がんに罹患していない個体におけるＦＧＦＲ３発現レベルと比較してＦＧＦＲ３発現レベルが上昇している場合に、前記対象が前記化合物に対する候補であることを示す、方法。
［２５］  がんを有する対象が［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物に対する候補であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）患者から採取した試料中の異常の存在をエクスビボまたはインビトロで決定することを含み
［ここで、前記異常は
（１）ＦＧＦＲ３（配列番号１１）の変異であって、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される変異；
（２）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体；または
（３）（ａ）と（ｂ）との組み合わせである］、
（ｂ）前記試料は、血液、血清、血漿、尿、組織、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、循環腫瘍細胞、および循環ＤＮＡからなる群より選択される、
方法。
【国際調査報告】
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2017511792.tif 000024
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