(57)【要約】シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドを発現する酵母細胞が開示される。いくつかの実施形態では、当該ポリペプチドはＡｐｏＥ２を含む。いくつかの実施形態では、当該ポリペプチドはＡｐｏＥ３を含む。いくつかの実施形態では、当該ポリペプチドはＡｐｏＥ４を含む。Ａｐｏ誘導性毒性を予防または抑制する化合物を同定するために酵母細胞をスクリーニングする方法も開示される。そのようなスクリーニングによって同定された化合物は、アルツハイマー病などの神経変性障害を治療または予防するために使用することができる。ＡｐｏＥ誘導性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定するために酵母細胞をスクリーニングする方法も開示される。当該方法を使用して同定されたＡｐｏＥ誘導性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子及びそのヒト相同体も開示される。ＡｐｏＥ誘導性毒性の修飾遺伝子の発現または活性を調節する化合物を同定する方法も開示される。2017534255.tif 000071
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞であって、前記細胞における前記核酸の発現及び前記ポリペプチドの産生が、前記細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす、前記酵母細胞。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含む、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項３】
前記核酸の発現及び前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、請求項１または請求項２に記載の酵母細胞。
【請求項４】
前記発現構築物が、前記酵母細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項５】
前記発現構築物が、組込み型プラスミドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項６】
前記組込み型プラスミドが、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６、またはそれらの誘導体である、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項７】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項８】
前記誘導性プロモーターが、ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、またはＧＡＬＳである、請求項７に記載の酵母細胞。
【請求項９】
前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・スピーシーズ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ゲオトリクム・スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）、またはゲオトリクム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
薬物排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が破壊されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの遺伝子が、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、またはＥＲＧ６である、請求項１０に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
前記シグナル配列が、天然の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
前記シグナル配列が、酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列と同一である、請求項１２に記載の酵母細胞。
【請求項１４】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ２である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ３である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１６】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ４である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１７】
前記発現構築物を少なくとも２コピー含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１８】
前記発現構築物を少なくとも３コピー含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１９】
前記発現構築物を少なくとも４コピー含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２０】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥタンパク質と検出可能なマーカーとを含むポリペプチドをコードする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２１】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥタンパク質と蛍光タンパク質とを含むポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の酵母細胞。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列に融合しているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２５】
シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２６】
前記酵母細胞が、シグナル配列と、野生型アミロイドβ１−３８、野生型アミロイドβ１−３９、野生型アミロイドβ１−４０、野生型アミロイドβ１−４１、野生型アミロイドβ１−４２、及び野生型アミロイドβ１−４３からなる群より選択されるヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物をさらに含み、任意で、前記アミロイドβタンパク質が、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ、Ｅ２２Ｇ、Ｅ２２Ｑ、Ｅ２２Ｋ、Ｄ２３Ｎ、Ａ４２Ｔ、及びＡ４２Ｖからなる群より選択される突然変異を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２７】
シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、（ｉ）組込み型プラスミドであるか、（ｉｉ）前記酵母細胞のゲノムに組み込まれているか、（ｉｉｉ）誘導性プロモーターを含むか、（ｉｖ）ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、及びＧＡＬＳから選択される誘導性プロモーターを含むか、（ｖ）前記細胞において少なくとも１、２、もしくは３コピー存在するか、（ｖｉ）酵母シグナル配列を含むか、（ｖｉｉ）酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列を含むか、または（ｖｉｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）の任意の組み合わせである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２８】
前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項２９】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ２タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ２媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、請求項２８に記載の酵母細胞。
【請求項３０】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ３タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ３媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、請求項２８に記載の酵母細胞。
【請求項３１】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、過剰発現されるとＡｐｏＥ４媒介性毒性を抑制または増強する酵母遺伝子の遺伝子産物の発現または活性が上昇もしくは低下している、請求項２８に記載の酵母細胞。
【請求項３２】
以下の工程を含む、酵母細胞において毒性を誘導する方法：
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程；及び
前記酵母細胞に対して毒性であるレベルの、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸の発現を誘導する工程。
【請求項３３】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物として同定される、前記方法。
【請求項３４】
ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物として同定される、前記方法。
【請求項３５】
ＡｐｏＥを発現する哺乳動物細胞と候補化合物を接触させる工程、及び前記候補化合物が前記哺乳動物細胞における少なくとも１つのＡｐｏＥ関連表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ４タンパク質でありかつ前記表現型がＡｐｏＥ４関連表現型である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＡｐｏＥ関連疾患のモデルとして機能する非ヒト動物に候補化合物を投与する工程、及び前記候補化合物が前記動物における少なくとも１つのＡｐｏＥ関連疾患表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥ関連疾患表現型がＡｐｏＥ４関連表現型である、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＡｐｏＥ関連疾患がＡｐｏＥ４関連神経変性疾患である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡｐｏＥ４関連疾患が、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法であって、
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程であって、前記酵母細胞が、遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、提供する工程；
前記遺伝子の過剰発現の不在下で前記酵母細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下にて、前記酵母細胞を培養する工程；
前記遺伝子の過剰発現の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して、前記遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して、前記遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子として同定される、前記方法。
【請求項４０】
前記遺伝子が酵母遺伝子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質を含むポリペプチドをコードする、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法であって、
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程であって、前記酵母細胞のある内因性遺伝子が破壊されている、提供する工程；
前記内因性遺伝子が破壊されていない場合に前記酵母細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含む前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、前記酵母細胞を培養する工程；
前記内因性遺伝子が破壊されている場合の細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記内因性遺伝子が破壊されている場合に測定された細胞増殖または生存能力を、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合の細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、前記方法。
【請求項４３】
前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ２タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ３タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ３媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ４タンパク質であり、（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、前記内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、前記遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子として同定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する方法であって、毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項４７】
毒性誘導量のＡｐｏＥ２を発現する細胞を、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
毒性誘導量のＡｐｏＥ３を発現する細胞を、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
毒性誘導量のＡｐｏＥ４を発現する細胞を、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強遺伝子もしくは抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する有効量の化合物と接触させる工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を阻害する有効量の化合物と接触させる工程を含む方法によって、ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を阻害する有効量の化合物、あるいは表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を増強する有効量の化合物と接触させる工程を含む方法によって、ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥを発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって、前記薬剤がＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、前記方法。
【請求項５３】
前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ２を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ２媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ３を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ３媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法が、（ａ）当該細胞の生存能力を低減させる量のＡｐｏＥ４を発現する細胞を提供する工程、（ｂ）前記細胞を、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させる工程、ならびに（ｃ）前記薬剤の存在下で細胞生存能力を測定する工程を含み、前記薬剤の不在下での細胞生存能力と比較したときの前記薬剤の存在下での細胞生存能力の上昇によって前記薬剤がＡｐｏＥ４媒介性毒性を阻害する化合物として同定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記薬剤が合成化合物である、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬剤が、小分子、核酸、タンパク質、抗体、またはペプチド模倣物である、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が酵母細胞である、請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ＡｐｏＥ４媒介性疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体の発現または活性を調節する治療量または予防量の化合物を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項６１】
前記化合物が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子またはそのヒト相同体の発現または活性を増強するか、あるいはＡｐｏＥ媒介性毒性の増強因子またはそのヒト相同体の発現または活性を阻害する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＡｐｏＥ媒介性疾患の存在またはその発症し易さについて個体を評価する方法であって、対象から生体試料を得る工程；表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である酵母遺伝子のヒト相同体によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現または活性について、前記試料を分析する工程；ならびに前記対象からの前記試料中の前記１つ以上のタンパク質の発現または活性を、好適な対照値と比較する工程を含み、前記比較の結果によって、前記対象が前記ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であるかどうかが示される、前記方法。
【請求項６３】
前記試料が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子のヒト相同体によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現または活性について分析され、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有しないかまたはそれを発症するリスクがない個体間での前記１つ以上のタンパク質の発現または活性を表す対照値と比較したときの、前記対象からの前記試料において上昇した前記１つ以上のタンパク質の発現または活性によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であることが示されるか、あるいは、前記試料が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現または活性について分析され、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有しないかまたはそれを発症するリスクがない個体間での前記１つ以上のタンパク質の発現または活性を表す対照値と比較したときの、前記対象からの前記試料において低下した前記１つ以上のタンパク質の発現または活性によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であることが示される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＡｐｏＥ媒介性疾患の存在またはその発症し易さについて個体を評価する方法であって、前記対象におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子及び増強遺伝子のヒト相同体からなる群より選択される遺伝子の少なくとも一部分の配列を得る工程；及び前記対象からの前記配列を好適な対照配列と比較する工程を含み、前記比較の結果によって、前記対象がＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある個体であるかどうかが示され、任意で、前記抑制遺伝子または増強遺伝子が、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている、前記方法。
【請求項６５】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする第１の核酸に機能的に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現構築物を含む細胞であって、（ａ）前記細胞が、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第２の核酸に機能的に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現構築物をさらに含むか、あるいは（ｂ）前記細胞において、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、前記細胞。
【請求項６６】
前記第１の発現構築物、前記第２の発現構築物、またはその両方が、前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６７】
前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、またはその両方が、誘導性プロモーターである、請求項６５または請求項６６に記載の細胞。
【請求項６８】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子内に突然変異を有する、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６９】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子内に遺伝子操作された突然変異を有する、請求項６５に記載の細胞。
【請求項７０】
前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ２タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸が、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７１】
前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ２タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７２】
前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ３タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸が、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７３】
前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ３タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７４】
前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸が、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７５】
前記第１の核酸が、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質を含むポリペプチドをコードし、前記細胞において、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７６】
前記細胞が、アミロイドβタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに含み、任意で、前記ポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドであり、さらに任意で、前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７７】
前記第１の核酸が、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７８】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする配列に機能的に連結された第１のプロモーターを含む第１の核酸を含む細胞であって、（ａ）前記細胞が、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第２の核酸に機能的に連結された第２のプロモーターを含む第２の核酸をさらに含み、前記第１の核酸、前記第２の核酸、またはその両方が、異種核酸であるか、あるいは（ｂ）前記細胞において、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如しており、（ｉ）前記第１の核酸が異種核酸であるか、（ｉｉ）前記細胞が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされる前記タンパク質の発現または活性が低減するように遺伝子操作されているか、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との両方である、前記細胞。
【請求項７９】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ２タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体である、請求項７８に記載の細胞。
【請求項８０】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ３タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体である、請求項７８に記載の細胞。
【請求項８１】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質がヒトＡｐｏＥ４タンパク質であり、前記抑制遺伝子もしくは増強遺伝子が、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体である、請求項７８に記載の細胞。
【請求項８２】
前記ポリペプチドが、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含む、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８３】
シグナル配列とアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８４】
酵母細胞である、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８５】
前記細胞がヒト細胞であり、任意で、前記ヒト細胞が、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞またはｉＰＳ細胞から生成された細胞である、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８６】
前記細胞が神経細胞であり、任意で、前記神経細胞がインビトロで生成される、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８７】
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルで前記第１の核酸を発現するか、またはそれを発現するように誘導され得る、請求項７８〜８６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８８】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記第１の核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、請求項６５〜８７のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物として同定される、前記方法。
【請求項８９】
ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物を同定する方法であって、
候補薬剤の不在下で前記細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの前記第１の核酸の発現を可能にする条件下にて、前記候補薬剤の存在下で、請求項６５〜８７のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇している場合に、前記候補薬剤が、ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物として同定される、前記方法。
【請求項９０】
ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドを発現する哺乳動物細胞と候補化合物を接触させる工程、及び前記候補化合物が前記哺乳動物細胞における少なくとも１つのＡｐｏＥ関連表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥタンパク質がＡｐｏＥ４タンパク質でありかつ前記表現型がＡｐｏＥ４関連表現型である、請求項８８または請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ＡｐｏＥ関連疾患のモデルとして機能する非ヒト動物に候補化合物を投与する工程、及び前記候補化合物が前記動物における少なくとも１つのＡｐｏＥ関連疾患表現型を低減させるかどうかを判定する工程をさらに含み、任意で、前記ＡｐｏＥ関連疾患表現型がＡｐｏＥ４関連表現型である、請求項８８または請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＡｐｏＥ関連疾患がＡｐｏＥ４関連神経変性疾患である、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＡｐｏＥ４関連疾患が、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記化合物の分子標的または前記化合物が関与する生物学的経路もしくはプロセスを同定する工程をさらに含む、請求項３３〜３８、５２〜５９、または８５〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ヒト相同体が、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されている、請求項４６〜９４のいずれか一項に記載の細胞または方法。
【請求項９６】
前記ヒト相同体が、表３に列記されている酵母遺伝子のヒト相同体である、請求項４６〜９４のいずれか一項に記載の方法または細胞。
【請求項９７】
以下の工程を含む、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法：
請求項１〜３１または６５〜８７のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程；
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程；及び
前記ポリペプチドに結合する内因性ポリペプチドまたは内因性脂質を同定する工程であって、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーが同定される、工程。
【請求項９８】
以下の工程を含む、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法：
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞を提供する工程；
前記核酸の発現を可能にする条件下にて前記酵母細胞を培養する工程；及び
前記ポリペプチドに結合する内因性酵母ポリペプチドを同定する工程であって、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーが同定される、工程。
【請求項９９】
以下の工程を含む、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法：
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を、前記核酸の発現を可能にする条件下にて酵母細胞において発現させる工程；ならびに
前記ポリペプチドに結合する内因性脂質または内因性ポリペプチドを同定する工程であって、
（ｉ）ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体を単離すること、及び
（ｉｉ）前記ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性脂質または内因性ポリペプチドを質量分析によって同定することであって、それによって前記内因性脂質または前記内因性ポリペプチドが前記ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーとして同定されることを含む、同定する工程。
【請求項１００】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質が、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４から選択される、請求項９７〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
ヒトＡｐｏＥ結合タンパク質を含む前記ポリペプチドが、検出可能なマーカーを含む、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記検出可能なマーカーが、蛍光タンパク質またはエピトープタグである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記エピトープタグが、タンデムアフィニティー精製タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、Ｖ５タグ、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ、カルモジュリンタグ、Ｅタグ、ＳＰＢタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＶＳＶタグ、Ｆｃ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、及びＦＬＡＧタグからなる群より選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞を溶解する工程をさらに含み、それによって抽出物が生成される、請求項９７〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記抽出物から前記ヒトＡｐｏＥタンパク質を単離する工程をさらに含み、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質複合体が形成される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質を単離する工程が、共免疫沈降、同時精製、アフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、またはイオン交換クロマトグラフィを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性ポリペプチドを同定する工程をさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性ポリペプチドを同定する工程が、質量分析またはエドマン分解を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性脂質を同定する工程を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
内因性脂質を同定する工程が、質量分析を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記結合パートナーが、ＡｐｏＥ関連疾患の治療のための治療標的候補である、請求項９６〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＡｐｏＥ関連疾患が、ＡｐｏＥ４関連神経変性疾患である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＡｐｏＥ４関連疾患が、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
ＡｐｏＥ媒介性毒性に関与する生物学的プロセスまたは生物学的経路を、前記方法の前記工程によって同定された結合パートナーの同一性に基づいて同定する工程をさらに含む、請求項９６〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
アルツハイマー病は、神経原線維変化及びアミロイドβペプチドを含有する斑によって特徴付けられる神経変性障害である。アルツハイマー病（ＡＤ）の患者は、進行性認知症及び人格障害を示す。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解切断は、アミノ酸３８〜４３個の長さを有するアミロイドβ（Ａβ）ペプチドの生成をもたらす。アミロイドβ１−４２ペプチドは、自己凝集する傾向が特に高く、アルツハイマー病の発症に強く結びついている。
【０００２】
ヒトアポリポタンパク質Ｅは、脂質輸送及び代謝において重要な役割を果たす、アミノ酸２９９個の分泌糖タンパク質である。ＡｐｏＥは、主に肝臓内で合成されるが、脳を含むいくつかの他の器官及び組織内でも合成される。中枢神経系において、ＡｐｏＥは、主にアストロサイト及びミクログリアによって産生され、ＡｐｏＥ受容体を介してコレステロールを神経細胞に輸送する。ＡＰＯＥ遺伝子は、３つの一般的な多型対立遺伝子であるε２、ε３、及びε４を有し、これらは、それぞれＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４として知られるＡｐｏＥアイソフォームをコードする。最も一般的なアイソフォームであるＡｐｏＥ３は、それぞれ１１２位及び１５８位にシステイン及びアルギニンを含有し、一方でＡｐｏＥ２は、両方の位置にシステインを有し、ＡｐｏＥ４は、両方の位置にアルギニンを有する。これらのアイソフォームはアミノ酸１個または２個分しか異ならないが、この差異はいくつかの影響を有する。ＡＰＯＥのε４対立遺伝子は、最も十分に認証されている遅発性アルツハイマー病の遺伝的危険因子であり、また、早発性ＡＤのリスク上昇、及び中枢神経系に影響を及ぼす多様な他の疾患に関連する。ＡＰＯＥのε２対立遺伝子は、ＡＤを発症する最も低いリスクに関連し、一方でε３対立遺伝子は、この疾患を発症する中等度のリスクをもたらす。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本発明は、少なくとも部分的には、ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）タンパク質が酵母細胞において発現されると毒性であるという発見に関する。この酵母におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の発見により、ＡｐｏＥ誘導性毒性を調節する化合物または遺伝因子を同定するためにＡｐｏＥ発現酵母細胞を使用するスクリーニングアッセイの実施が可能となる。そのようなスクリーニングによって同定された化合物は、ＡｐｏＥの１つまたは複数のアイソフォームが病理学的役割を果たす疾患の治療または予防のために使用することができる。例えば、そのようなスクリーニングによって同定された化合物は、ＡｐｏＥ４が関与する神経系に影響を及ぼす疾患及び障害、例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療のために使用することができる。
【０００４】
いくつかの態様では、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞であって、当該細胞における当該核酸の発現及び当該ポリペプチドの産生が当該細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす、前記酵母細胞が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、当該核酸の発現及び当該ポリペプチドの産生により、酵母細胞が生存不能となる。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ２タンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ４タンパク質である。
【０００５】
いくつかの実施形態では、発現構築物は、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含み、細胞における核酸の発現及びポリペプチドの産生は、細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、核酸の発現及びポリペプチドの産生により、酵母細胞が生存不能となる。シグナル配列は、ポリペプチドが細胞内の小胞体を標的とすることを引き起こし、小胞体においてポリペプチドは分泌経路に進入する。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、発現構築物によってコードされるポリペプチドのアミノ末端に位置する。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、コードされるポリペプチドの同時翻訳輸送を指示するものである。シグナル配列は、天然のシグナル配列と同一であってもよく、または人工的（非天然の）シグナル配列であってもよい。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、天然の酵母タンパク質のシグナル配列（例えば、酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列）と同一である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、天然の哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質）のシグナル配列と同一である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている発現構築物によってコードされるポリペプチドは、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている発現構築物によってコードされるポリペプチドは、シグナル配列と、リンカーペプチド配列と、ヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むか、またはそれらからなる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドの切断、ひいてはシグナル配列の除去は、ポリペプチド全体の翻訳が完了する前に起こってよい。この現象は、ポリペプチドの少なくともヒトＡｐｏＥタンパク質の部分が翻訳され、細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす限り、「細胞におけるポリペプチドの産生が、細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす」という表現に包含される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている発現構築物によってコードされるポリペプチドは、ヒトＡｐｏＥタンパク質と、１つ以上の異種ペプチド配列とを含有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている発現構築物によってコードされるポリペプチドは、シグナル配列と、ヒトＡｐｏＥタンパク質と、１つ以上の異種ペプチド配列とを含有し得る。「異種ペプチド配列」は、ＡｐｏＥタンパク質配列またはシグナル配列ではない任意のポリペプチド配列を指す。異種ペプチド配列は、ポリペプチドのアミノ末端、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質との間、ヒトＡｐｏＥタンパク質のカルボキシ末端、及び／またはポリペプチドのカルボキシ末端に存在することができる。いくつかの実施形態では、異種ペプチド配列は、「検出タンパク質」を含み、この用語は、検出可能な標識として機能するタンパク質（例えば、蛍光タンパク質、酵素、またはエピトープタグ）を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヒトＡｐｏＥタンパク質と検出タンパク質（例えば、蛍光タンパク質、酵素、またはエピトープタグ）とを含有する融合タンパク質である。例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列と、ヒトＡｐｏＥタンパク質と、検出タンパク質とを含有する融合タンパク質である。蛍光タンパク質の例としては、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びシアン蛍光タンパク質が挙げられる。検出タンパク質として機能し得る酵素には、発光反応において、または有色もしくは別様に検出可能な物質を生成するように、基質に作用することができるものが含まれる。例としては、例えば、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物、ならびに、シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物、ならびに、シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された第１のプロモーター、及び、シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された第２のプロモーターを含む、発現構築物を含む。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞のいずれかにおけるＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ２である。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞のいずれかにおけるＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ３である。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞のいずれかにおけるＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ４である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、当該細胞におけるシグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸の発現及びかかるポリペプチドの産生が、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドが存在しないかまたは発現しない条件下では、細胞の増殖または生存能力の低下において十分な結果をもたらさないであろうことを特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、当該細胞における、シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸の発現及びかかるポリペプチドの産生が、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドが存在しないかまたは発現しない条件下で、細胞の増殖または生存能力の低下をもたらすであろうことを特徴とする。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥを含むポリペプチドをコードする（例えば、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする）核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞は、ヒトアミロイドβタンパク質を含むポリペプチド（例えば、シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチド）をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含まない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている発現構築物は、酵母細胞のゲノムに組み込まれている。例えば、発現構築物は、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６などの組込み型プラスミド、またはそれらの誘導体とすることができる。
【００１３】
酵母細胞は、発現構築物（例えば、その組込みコピー）を１コピー以上（例えば、２コピー、３コピー、４コピー、またはそれよりも多く）有することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、またはＧＡＬＳなどの誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＧＰＤ、ＡＤＨ、ＴＥＦ、ＣＹＣ１、またはＭＲＰ７などの構成的活性型プロモーターである。本発明の酵母細胞が、核酸に機能的に連結されたプロモーターを各々が含む２つ以上の発現構築物を含むか、または、第１及び第２のプロモーターを含む発現構築物を含む実施形態では、プロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・スピーシーズ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ゲオトリクム・スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）、またはゲオトリクム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、酵母細胞において、薬物排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が破壊されている。酵母細胞において、例えば、遺伝子ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、またはＥＲＧ６のうちの１つ以上が破壊されていてもよい。
【００１７】
酵母細胞において毒性を誘導する方法も開示され、これは、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を含む本明細書に記載の酵母細胞を提供する工程；及び酵母細胞に対して毒性であるレベルの核酸の発現を酵母細胞において誘導する工程；による。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列とＡｐｏＥタンパク質とを含む。
【００１８】
ＡｐｏＥ誘導性毒性を予防または抑制する化合物を同定する方法も開示され、これは、候補薬剤の不在下で細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸の発現を可能にする条件下にて、候補薬剤の存在下で、本明細書に記載の酵母細胞を培養する工程；候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程；によるものであり、細胞増殖または生存能力が、候補薬剤の不在下でのものと比較して、候補薬剤の存在下で上昇している場合に、当該候補薬剤は、ＡｐｏＥ誘導性毒性を予防または抑制する化合物として同定される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列とＡｐｏＥタンパク質とを含む。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ誘導性毒性を予防または抑制する化合物は、ＡｐｏＥ関連疾患のための候補治療薬として機能する。
【００１９】
ＡｐｏＥ誘導性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法も開示され、これは、遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、本明細書に記載の酵母細胞を提供する工程；遺伝子の過剰発現の不在下で酵母細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、酵母細胞を培養する工程；遺伝子の過剰発現の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程；によるものであり、（ｉ）細胞増殖または生存能力が、遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して、遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合に、この遺伝子は、アミロイドβ誘導性毒性の抑制遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して、遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合に、この遺伝子は、ＡｐｏＥ誘導性毒性の増強遺伝子として同定される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列とＡｐｏＥタンパク質とを含む。
【００２０】
ＡｐｏＥ誘導性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法も開示され、これは、酵母細胞のある内因性遺伝子が破壊されている、本明細書に記載の酵母細胞を提供する工程；当該内因性遺伝子が破壊されていない場合に当該酵母細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、当該酵母細胞を培養する工程；当該内因性遺伝子が破壊されている場合に、細胞増殖または生存能力を測定する工程；当該内因性遺伝子が破壊されている場合に測定された細胞増殖または生存能力を、当該内因性遺伝子が破壊されていない場合の細胞増殖または生存能力と比較する工程；によるものであり、（ｉ）細胞増殖または生存能力が、当該内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、当該内因性遺伝子が破壊されている場合に上昇している場合に、この遺伝子は、ＡｐｏＥ誘導性毒性の増強遺伝子として同定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、当該内因性遺伝子が破壊されていない場合と比較して、内因性遺伝子が破壊されている場合に低下している場合に、この遺伝子は、ＡｐｏＥ誘導性毒性の抑制遺伝子として同定される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列とＡｐｏＥタンパク質とを含む。内因性遺伝子が破壊されている酵母細胞の使用に対する代替手段として、当該方法は、ＲＮＡ干渉の使用によって内因性遺伝子の発現が抑制されている酵母細胞を使用して行われてもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子を同定する方法は、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子として同定された遺伝子の哺乳動物相同体を同定する工程をさらに含む。
【００２２】
前述の方法のうちの特定のものに従ってＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子として同定された様々な酵母遺伝子、それらによりコードされるタンパク質、そして、これらの遺伝子及びタンパク質の一部に関しては、他の生物（例えば、ヒトなどの哺乳動物種）において見出されるそれらの相同体も開示される。注目すべきことに、本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子として同定されたいくつかの酵母遺伝子は、アルツハイマー病の遺伝的危険因子としてこれまでに同定されているヒト相同体を有する。本開示は、ＡｐｏＥと、こうしたＡＤの遺伝的危険因子のうちの特定のものとの間の遺伝子相互作用を、初めて認識するものとなると考えられる。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子は、表３に列記されている。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子は、小胞輸送に関与する（例えば、ＡＴＧ２０、ＵＢＰ３、ＴＲＳ６５、ＢＲＥ５、ＭＵＫ１、及びＧＹＰ５）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子は、エンドサイトーシスに関与する（例えば、ＲＶＳ１６１、ＯＳＨ２、ＲＶＳ１６７、ＹＡＰ１８０２、及びＯＳＨ３）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子は、ユビキチン化／脱ユビキチン化に関与する（例えば、ＡＰＣ１１、ＵＢＰ３、ＵＢＰ７、ＣＤＣ７３、ＢＲＥ５、及びＲＲＩ２）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子は、脂質代謝に関与する（例えば、ＰＥＲ１、ＭＤＨ３、ＧＰＩ８、ＳＭＰ３、及びＳＵＲ１）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子は、ＤＮＡ修復に関与する（例えば、ＭＧＴ１、ＰＣＤ１、ＣＤＣ７３、及びＲＡＤ１４）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子は、ミトコンドリア機構に関与する（例えば、ＡＴＧ２０、ＭＨＲ１、ＭＲＰ４、ＲＲＭ３、ＩＬＭ１、ＭＳＴ１、ＹＴＡ１２、ＰＯＲ１、及びＭＲＰＬ１０）。
【００２３】
いくつかの態様では、アルツハイマー病の遺伝的危険因子であるヒト相同体を有する酵母遺伝子を過剰発現すると共に特定のＡｐｏＥアイソフォームを発現する酵母細胞であって、該酵母遺伝子の過剰発現が酵母細胞におけるＡｐｏＥの毒性を増強する、酵母細胞が、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある対象であって、特定のＡｐｏＥアイソフォームを発現しておりかつＡＤの遺伝的危険因子を有する、対象を治療するための候補化合物を同定するためのモデル系として機能し得る。
【００２４】
いくつかの態様では、アルツハイマー病の遺伝的危険因子であるヒト相同体を有する酵母遺伝子の活性の発現が低減していると共に特定のＡｐｏＥアイソフォームを発現する酵母細胞であって、該酵母遺伝子の過剰発現が酵母細胞におけるＡｐｏＥの毒性を抑制する、酵母細胞が、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそれを発症するリスクがある対象であって、特定のアイソフォームを発現しておりかつＡＤの遺伝的危険因子を有する、対象を治療するための候補化合物を同定するためのモデル系として機能し得る。
【００２５】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする第１の核酸に機能的に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現構築物を含む細胞も開示され、（ａ）当該細胞は、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第２の核酸に機能的に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現構築物をさらに含むか、あるいは（ｂ）当該細胞において、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそれらのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している。いくつかの実施形態では、第１の核酸は、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、またはその両方が、制御可能（例えば、誘導可能）である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性の低減または欠如は、そのタンパク質をコードする遺伝子内の突然変異から生じる。いくつかの実施形態では、突然変異は、遺伝子操作された突然変異である。いくつかの実施形態では、発現または活性の低減または欠如は、制御可能、例えば、誘導可能である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている酵母遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、表３に列記されている酵母遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、小胞輸送に関与する（例えば、ＡＴＧ２０、ＵＢＰ３、ＴＲＳ６５、ＢＲＥ５、ＭＵＫ１、ＧＹＰ５、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、エンドサイトーシスに関与する（例えば、ＲＶＳ１６１、ＯＳＨ２、ＲＶＳ１６７、ＹＡＰ１８０２、ＯＳＨ３、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、ユビキチン化／脱ユビキチン化に関与する（例えば、ＡＰＣ１１、ＵＢＰ３、ＵＢＰ７、ＣＤＣ７３、ＢＲＥ５、ＲＲＩ２、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、脂質代謝に関与する（例えば、ＰＥＲ１、ＭＤＨ３、ＧＰＩ８、ＳＭＰ３、ＳＵＲ１、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、ＤＮＡ修復に関与する（例えば、ＭＧＴ１、ＰＣＤ１、ＣＤＣ７３、ＲＡＤ１４、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、ミトコンドリア機構に関与する（例えば、ＡＴＧ２０、ＭＨＲ１、ＭＲＰ４、ＲＲＭ３、ＩＬＭ１、ＭＳＴ１、ＹＴＡ１２、ＰＯＲ１、ＭＲＰＬ１０、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ヒト相同体は、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されている遺伝子である。いくつかの実施形態では、ヒト相同体は、表３に列記されている酵母遺伝子の相同体である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ２タンパク質であり、抑制遺伝子または増強遺伝子は、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子、例えば、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、及び３のいずれかまたはより多くに列記されているＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ３タンパク質であり、抑制遺伝子または増強遺伝子は、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子、例えば、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ｂ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制因子または増強因子のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ４タンパク質であり、抑制遺伝子または増強遺伝子は、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制因子または増強因子、例えば、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。
【００２７】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子である酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の哺乳動物相同体をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を生成または提供する工程を含む方法も、本明細書に開示され、このプロモーターは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における発現を指示することができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体はヒト相同体である。いくつかの実施形態では、プロモーターは制御可能（例えば、誘導可能）である。いくつかの実施形態では、タンパク質の発現または活性は誘導可能である。いくつかの実施形態では、当該方法は、発現構築物を哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、哺乳動物細胞において哺乳動物相同体の発現または活性を誘導する工程をさらに含む。本発明の方法に従って生成された哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）も開示される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である酵母遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である酵母遺伝子は、表３に列記されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト遺伝子、または非ヒト哺乳動物に見出されるその相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、表３に列記されている酵母遺伝子の相同体である哺乳動物（例えば、ヒト）遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、小胞輸送に関与する（例えば、ＡＴＧ２０、ＵＢＰ３、ＴＲＳ６５、ＢＲＥ５、ＭＵＫ１、ＧＹＰ５、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、エンドサイトーシスに関与する（例えば、ＲＶＳ１６１、ＯＳＨ２、ＲＶＳ１６７、ＹＡＰ１８０２、ＯＳＨ３、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、ユビキチン化／脱ユビキチン化に関与する（例えば、ＡＰＣ１１、ＵＢＰ３、ＵＢＰ７、ＣＤＣ７３、ＢＲＥ５、ＲＲＩ２、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、脂質代謝に関与する（例えば、ＰＥＲ１、ＭＤＨ３、ＧＰＩ８、ＳＭＰ３、ＳＵＲ１、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、ＤＮＡ修復に関与する（例えば、ＭＧＴ１、ＰＣＤ１、ＣＤＣ７３、ＲＡＤ１４、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子は、ミトコンドリア機構に関与する（例えば、ＡＴＧ２０、ＭＨＲ１、ＭＲＰ４、ＲＲＭ３、ＩＬＭ１、ＭＳＴ１、ＹＴＡ１２、ＰＯＲ１、ＭＲＰＬ１０、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体）。
【００２８】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子である酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の哺乳動物相同体（例えば、ヒト相同体）の発現または活性が低減または欠如するように、哺乳動物細胞を遺伝子操作することを含む方法も、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子である酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の哺乳動物相同体をコードする内因性遺伝子に突然変異を導入することによって遺伝子操作されている。本発明の方法に従って生成された哺乳動物細胞も開示される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である酵母遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト遺伝子、または非ヒト哺乳動物に見出されるその相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、表３に列記されている酵母遺伝子の相同体である哺乳動物（例えば、ヒト）遺伝子である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、小胞輸送に関与する酵母遺伝子（例えば、ＡＴＧ２０、ＵＢＰ３、ＴＲＳ６５、ＢＲＥ５、ＭＵＫ１、及びＧＹＰ５）の相同体であるヒト遺伝子、または非ヒト哺乳動物に見出されるその相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、エンドサイトーシスに関与する酵母遺伝子（例えば、ＲＶＳ１６１、ＯＳＨ２、ＲＶＳ１６７、及びＹＡＰ１８０２）の相同体であるヒト遺伝子、または非ヒト哺乳動物に見出されるその相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、ユビキチン化／脱ユビキチン化に関与する酵母遺伝子（例えば、ＡＰＣ１１、ＵＢＰ３、ＵＢＰ７、ＣＤＣ７３、ＢＲＥ５、及びＲＲＩ２）の相同体であるヒト遺伝子、または非ヒト哺乳動物に見出されるその相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、脂質代謝に関与する酵母遺伝子（例えば、ＰＥＲ１、ＭＤＨ３、ＧＰＩ８、ＳＭＰ３、及びＳＵＲ１）の相同体であるヒト遺伝子、または非ヒト哺乳動物に見出されるその相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、ＤＮＡ修復に関与する酵母遺伝子（例えば、ＭＧＴ１、ＰＣＤ１、ＣＤＣ７３、及びＲＡＤ１４）の相同体であるヒト遺伝子、または非ヒト哺乳動物に見出されるその相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、ミトコンドリア機構に関与する酵母遺伝子（例えば、ＡＴＧ２０、ＭＨＲ１、ＭＲＰ４、ＲＲＭ３、ＩＬＭ１、ＭＳＴ１、ＹＴＡ１２、ＰＯＲ１、及びＭＲＰＬ１０）の相同体であるヒト遺伝子、または非ヒト哺乳動物に見出されるその相同体である。
【００２９】
ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする内因性遺伝子を含む哺乳動物細胞も開示され、当該細胞は、（ａ）ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物をさらに含むか、あるいは（ｂ）ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態では、ヒト相同体は、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されている遺伝子である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、表３に列記されている酵母遺伝子の相同体であるヒト遺伝子である。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）相同体は、小胞輸送に関与する酵母遺伝子（例えば、ＡＴＧ２０、ＵＢＰ３、ＴＲＳ６５、ＢＲＥ５、ＭＵＫ１、及びＧＹＰ５）の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）相同体は、エンドサイトーシスに関与する酵母遺伝子（例えば、ＲＶＳ１６１、ＯＳＨ２、ＲＶＳ１６７、及びＹＡＰ１８０２）の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）相同体は、ユビキチン化／脱ユビキチン化に関与する酵母遺伝子（例えば、ＡＰＣ１１、ＵＢＰ３、ＵＢＰ７、ＣＤＣ７３、ＢＲＥ５、及びＲＲＩ２）の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）相同体は、脂質代謝に関与する酵母遺伝子（例えば、ＰＥＲ１、ＭＤＨ３、ＧＰＩ８、ＳＭＰ３、及びＳＵＲ１）の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）相同体は、ＤＮＡ修復に関与する酵母遺伝子（例えば、ＭＧＴ１、ＰＣＤ１、ＣＤＣ７３、及びＲＡＤ１４）の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）相同体は、ミトコンドリア機構に関与する酵母遺伝子（例えば、ＡＴＧ２０、ＭＨＲ１、ＭＲＰ４、ＲＲＭ３、ＩＬＭ１、ＭＳＴ１、ＹＴＡ１２、ＰＯＲ１、及びＭＲＰＬ１０）の相同体である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ２タンパク質であり、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である酵母遺伝子は、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ３タンパク質であり、抑制遺伝子または増強遺伝子は、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ４タンパク質であり、抑制遺伝子または増強遺伝子は、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子である。
【００３０】
本明細書に記載されている哺乳動物細胞に関連する任意の態様のいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）は、多能性幹細胞または多能性幹細胞から生成された細胞である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、神経幹細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、またはグリア細胞である。いくつかの実施形態では、神経幹細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、またはグリア細胞は、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞）から、または異なる細胞型の体細胞からの分化転換によって、インビトロで生成される。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、ｉＰＳ細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、またはグリア細胞は、ＡｐｏＥ媒介性疾患を患う対象から得られる。
【００３１】
本明細書に記載されているヒト細胞に関連する任意の態様のいくつかの実施形態では、細胞のＡＰＯＥ遺伝子型は、ε２／ε２、ε２／ε３、ε２／ε４、ε３／ε３、ε３／ε４、またはε４／ε４であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４をコードするＡＰＯＥ遺伝子に対してホモ接合性である（すなわち、それらの遺伝子型は、ε２／ε２、ε３／ε３、またはε４／ε４である）。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つのε２対立遺伝子を含む（すなわち、それらの遺伝子型は、ε２／ε２、ε２／ε３、またはε２／ε４である）。いくつかの実施形態では、細胞は、ε２に対してヘテロ接合性である（すなわち、それらの遺伝子型は、ε２／ε３またはε２／ε４である）。いくつかの実施形態では、細胞は、ε２に対してホモ接合性である（すなわち、それらの遺伝子型は、ε２／ε２である）。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つのε３対立遺伝子を含む（すなわち、それらの遺伝子型は、ε２／ε３、ε３／ε３、またはε３／ε４である）。いくつかの実施形態では、細胞は、ε３に対してヘテロ接合性である（すなわち、それらの遺伝子型は、ε２／ε３またはε３／ε４である）。いくつかの実施形態では、細胞は、ε３に対してホモ接合性である（すなわち、それらの遺伝子型は、ε３／ε３である）。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つのε４対立遺伝子を含む（すなわち、それらの遺伝子型は、ε２／ε４、ε３／ε４、またはε４／ε４である）。いくつかの実施形態では、細胞は、ε４に対してヘテロ接合性である（すなわち、それらの遺伝子型は、ε２／ε４またはε３／ε４である）。いくつかの実施形態では、細胞は、ε４に対してホモ接合性である（すなわち、それらの遺伝子型は、ε４／ε４である）。同様に、ヒト対象に関連する任意の態様において、この対象は、様々な実施形態における前述のＡＰＯＥ遺伝子型のいずれを有してもよい。
【００３２】
本明細書に記載されている細胞に関連する任意の態様のいくつかの実施形態では、細胞は、アミロイドβタンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、アミロイドβタンパク質を自然に発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、変異体アミロイドβタンパク質を自然に発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、アミロイドβタンパク質を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作されていない同型の哺乳動物細胞と比べてアミロイドβタンパク質を過剰発現するように遺伝子操作されている哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞であり、変異体アミロイドβタンパク質を発現するように遺伝子操作されている。対象に関連する任意の態様において、当該対象は、アミロイドβタンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態では、対象は、アミロイドβタンパク質を自然に発現し得る。いくつかの実施形態では、対象は、アミロイドβタンパク質を発現するように遺伝子操作されている非ヒト動物である。
【００３３】
さらに、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強遺伝子及び抑制遺伝子ならびに／またはそれらの哺乳動物相同体に関する、スクリーニングアッセイ及び治療方法が開示される。いくつかの実施形態では、スクリーニングアッセイは、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する候補化合物を同定するためのものであり、このアッセイは、ＡｐｏＥを発現し、かつＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が上昇または低下している、細胞を利用する。例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する候補化合物を同定する方法が開示され、当該方法は、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする第１の核酸に機能的に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現構築物を含む細胞を培養する工程であって、（ａ）前記細胞が、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第２の核酸に機能的に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現構築物をさらに含むか、あるいは（ｂ）前記細胞において、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している、細胞を、候補薬剤の不在下で細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、候補薬剤の存在下で培養する工程；候補薬剤の存在下で細胞増殖または生存能力を測定する工程；候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程；を含み、細胞増殖または生存能力が、候補薬剤の不在下でのものと比較して、候補薬剤の存在下で上昇している場合に、当該候補薬剤は、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物として同定される。
【００３４】
ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物を同定する方法も本明細書に開示され、当該方法は、候補薬剤の不在下で細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、候補薬剤の存在下で前述の細胞を培養する工程；候補薬剤の存在下で細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程；を含み、細胞増殖または生存能力が、候補薬剤の不在下でのものと比較して、候補薬剤の存在下で上昇している場合に、当該候補薬剤は、ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物として同定される。
【００３５】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する候補化合物を同定する方法も開示され、当該方法は、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を培養する工程であって、前記細胞が、（ａ）ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物をさらに含むか、あるいは（ｂ）ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が低減もしくは欠如するかまたは誘導的に低減もしくは欠如するように遺伝子操作されている、細胞を、候補薬剤の不在下で細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、候補薬剤の存在下で培養する工程；候補薬剤の存在下で細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程；を含み、細胞増殖または生存能力が、候補薬剤の不在下でのものと比較して、候補薬剤の存在下で上昇している場合に、当該候補薬剤は、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物として同定される。
【００３６】
ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物を同定する方法も本明細書に開示され、当該方法は、候補薬剤の不在下で細胞において毒性を誘導するのに十分なレベルでの、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、候補薬剤の存在下で前述の哺乳動物細胞を培養する工程；候補薬剤の存在下で細胞増殖または生存能力を測定する工程；及び候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程；を含み、細胞増殖または生存能力が、候補薬剤の不在下でのものと比較して、候補薬剤の存在下で上昇している場合に、当該候補薬剤は、ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補化合物として同定される。
【００３７】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する（例えば、予防または抑制する）候補化合物を同定する方法のいずれかのいくつかの実施形態では、特定のＡｐｏＥアイソフォーム（ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４タンパク質）を含むポリペプチドを発現する細胞を使用して同定された化合物は、当該化合物の作用が当該特定のアイソフォームに対して特異的であるか否かを判定するために、さらに試験されてもよい。いくつかの実施形態では、当該方法は、当該作用が特定のアイソフォームに対して特異的であると判定する工程を含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、化合物が、ＡｐｏＥアイソフォームのうちの２つまたは３つ全てによって媒介される毒性を調節する（例えば、毒性を予防または抑制する）と判定する工程を含む。いくつかの実施形態では、特定のアイソフォームによって媒介される毒性を予防または抑制する化合物は、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそのリスクがある対象を治療するために有用であり得、ここで、この対象は、特定のアイソフォームを発現する。いくつかの実施形態では、２つ以上のアイソフォームのいずれかによって媒介される毒性を予防または抑制する化合物は、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそのリスクがある対象を治療するために有用であり得、ここで、この対象は、２つ以上のアイソフォームのうち少なくとも１つを発現する。
【００３８】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている遺伝子操作された酵母細胞は、ＡｐｏＥ媒介性疾患の遺伝的危険因子である特定の遺伝子における突然変異または遺伝的変異を有すると共に特定のＡｐｏＥアイソフォームを発現する、ヒト細胞及びヒト対象のためのモデルとして機能し得る。そのようなモデルは、創薬のために、また、疾患リスクを修飾し、かつそれ自体が創薬の標的となり得る、さらなる遺伝因子の同定のために、有用であり得る。
【００３９】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する候補化合物を同定する方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドを発現し、かつＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が上昇または低下している細胞を使用して同定された化合物は、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそのリスクがある対象を治療するために使用され得、ここで、この対象は、疾患を発症するリスクの上昇に関連するか、または疾患の低年齢発症に関連する、ヒト相同体をコードする遺伝子における突然変異または遺伝的変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、化合物を同定するために使用された細胞と同じＡｐｏＥアイソフォームを発現する。例えば、いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２を発現し、かつＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が上昇または低下している酵母細胞において、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制するものとして同定された候補化合物は、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそのリスクがあり、疾患を発症するリスクの上昇に関連するか、または疾患の低年齢発症に関連する、ヒト相同体をコードする遺伝子における突然変異または遺伝的変異を有し、かつＡｐｏＥ２を発現する対象を治療するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３を発現し、かつＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が上昇または低下している酵母細胞において、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制するものとして同定された候補化合物は、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそのリスクがあり、疾患を発症するリスクの上昇に関連するか、または疾患の低年齢発症に関連する、ヒト相同体をコードする遺伝子における突然変異または遺伝的変異を有し、かつＡｐｏＥ３を発現する対象を治療するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４を発現し、かつＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が上昇または低下している酵母細胞において、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制するものとして同定された候補化合物は、ＡｐｏＥ媒介性疾患を有するかまたはそのリスクがあり、疾患を発症するリスクの上昇に関連するか、または疾患の低年齢発症に関連する、ヒト相同体をコードする遺伝子における突然変異または遺伝的変異を有し、かつＡｐｏＥ４を発現する対象を治療するために使用されてもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、化合物（例えば、候補治療薬）を同定する方法のいずれかは、化合物と物理的に相互作用しかつ当該化合物によって活性が阻害されるかまたは上昇する分子標的を同定する工程；発現または活性または修飾状態が化合物の影響を受ける遺伝子及びタンパク質を同定する工程；あるいは、化合物の影響を受けるかまたは化合物の分子標的が関与する生物学的経路もしくはプロセスを同定する工程；をさらに含んでもよい。そのような分子標的、遺伝子、タンパク質、生物学的経路及びプロセス、ならびにそれらの分子成分は、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節するさらなる化合物の同定のための標的として使用されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような分子標的、遺伝子、タンパク質、生物学的経路及びプロセス、ならびにそれらの分子成分は、ＡｐｏＥ関連疾患を治療するかまたはそのリスクを低減させるための候補治療薬である、さらなる化合物の同定のための標的として使用されてもよい。
【００４１】
化合物の分子標的を同定するために使用され得る方法には、例えば、当該化合物が結合するタンパク質を同定するための親和性試薬として当該化合物を使用すること、架橋すること（例えば、当該化合物の架橋可能な類似体を使用すること）、及び当該化合物と架橋されるタンパク質を同定することなどの生化学的方法、ならびに、当該化合物が細胞に及ぼす作用に欠失または過剰発現が著しく影響する遺伝子を同定することなどの遺伝学的方法が含まれる。発現または活性または修飾状態が化合物の影響を受ける遺伝子及びタンパク質を同定するために使用され得る方法には、例えば、発現プロファイリング、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、タンパク質マイクロアレイなどが含まれる。いくつかの実施形態では、酵母におけるＡｐｏＥ媒介性毒性を調節（例えば、阻害）する化合物を同定する工程、及び前述の種類のアッセイまたは他の好適なアッセイのいずれかを行って、当該化合物の分子標的を同定する工程を含む方法が、本明細書に記載されている。
【００４２】
さらに、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法が、本明細書に開示される。前出の酵母細胞もしくは哺乳動物（例えば、ヒト）細胞のいずれか、または本明細書に記載されている任意の酵母細胞もしくは哺乳動物（例えば、ヒト）細胞が、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、ヒトＡｐｏＥタンパク質の発現が細胞に対して毒性である条件下で行われる。他の実施形態では、当該方法は、ヒトＡｐｏＥタンパク質の発現が細胞に対して毒性ではない条件下で行われてもよい。
【００４３】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法であって、本明細書に記載されている細胞を提供する工程；ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程；及びポリペプチドに結合する内因性ポリペプチドまたは内因性脂質を同定する工程であって、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーが同定される、工程；を含む方法が、本明細書に開示される。
【００４４】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法であって、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞を提供する工程；核酸の発現を可能にする条件下にて酵母細胞を培養する工程；及びポリペプチドに結合する内因性酵母ポリペプチドを同定する工程であって、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーが同定される、工程；を含む方法も、本明細書に開示される。
【００４５】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法であって、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を、当該核酸の発現を可能にする条件下にて酵母細胞において発現させる工程；及びポリペプチドに結合する内因性脂質または内因性ポリペプチドを同定する工程；を含む方法も、本明細書に開示され、該同定する工程は、（ｉ）ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体を単離する工程；及び（ｉｉ）ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性脂質または内因性ポリペプチドを質量分析によって同定する工程であって、それによって内因性脂質または内因性ポリペプチドがヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーとして同定される、工程を含む。
【００４６】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する前出の方法のいずれにおいても、ヒトＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４から選択され得る。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はＡｐｏＥ２である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はＡｐｏＥ３である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はＡｐｏＥ４である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥ結合タンパク質を含むポリペプチドは、検出可能なマーカーを含む。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質またはエピトープタグである。いくつかの実施形態では、エピトープタグは、タンデムアフィニティー精製タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、Ｖ５タグ、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ、カルモジュリンタグ、Ｅタグ、ＳＰＢタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＶＳＶタグ、Ｆｃ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、及びＦＬＡＧタグからなる群より選択される。
【００４７】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する前出の方法のいずれも、細胞を溶解して抽出物を生成する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、抽出物からヒトＡｐｏＥタンパク質を単離してヒトＡｐｏＥ複合体を形成させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質の単離する工程は、共免疫沈降、同時精製、アフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、またはイオン交換クロマトグラフィを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性ポリペプチドを同定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性ポリペプチドを同定する工程は、質量分析またはエドマン分解を含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性脂質を同定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、内因性脂質を同定する工程は、質量分析を含む。
【００４８】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する前出の方法のいずれにおいても、結合パートナーは、ＡｐｏＥ関連疾患の治療のための治療標的候補であり得る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ関連疾患はＡｐｏＥ４関連神経変性疾患である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４関連疾患は、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＡｐｏＥ媒介性毒性に関与する生物学的プロセスまたは生物学的経路を、本発明の方法の工程によって同定された結合パートナーの同一性に基づいて同定する工程をさらに含む。
【００４９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法及び材料が本発明の実践または試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料は以下に記載されているものである。本明細書に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含め本出願が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００５０】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】アイソフォーム間で異なるアミノ酸位置（１１２位及び１５８位）及びこれらの違いから生じる構造の違いを示す、ヒトＡｐｏＥアイソフォームであるＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４のモデル構造。（Ｈａｔｔｅｒｓ，ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３１（８）：４４５−４５４，２００６から出典された図）。
【図２】酵母はＡｐｏＥアイソフォーム特異的毒性表現型を示す。（Ａ）Ｋａｒ２ｐシグナル配列とｅＧＦＰに融合しているヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチド（本明細書において「Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ−ｅＧＦＰ」とも称される）をコードする核酸に機能的に連結されたＧＡＬプロモーターを含む発現構築物の一部分の概略図。（Ｂ）酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列−ｅＧＦＰ融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性対照ベクター（各写真の一番上の横列）（本明細書において「Ｋａｒ２ｓｓ−ｅＧＦＰ」とも称される）、あるいはＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２−ｅＧＦＰ融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（各写真の第２の横列）、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３−ｅＧＦＰ融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（各写真の第３の横列）、またはＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ｅＧＦＰ融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（各写真の一番下の横列）のいずれかで形質転換した酵母細胞の写真。これらの酵母細胞を、左から右に漸増する希釈度（より低い酵母細胞濃度）でガラクトース（左の写真）またはグルコース（右の写真）上にスポッティングし、増殖を評定した。実験用及び対照用の形質転換体は、ＡｐｏＥ発現の不在下では等しく良好に増殖したが（グルコース、ＡｐｏＥ「オフ」）、一方で、ＡｐｏＥ発現は細胞増殖を大いに阻害した（ガラクトース、ＡｐｏＥ「オン」）。ＡｐｏＥ２菌株は、構築物を４コピー保有した。ＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４菌株は、構築物を３〜４コピー保有した。相対的な増殖レベルが写真の上に示されている。（Ｃ）示されている通り、ｅＧＦＰ（対照）、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２−ｅＧＦＰ、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３−ｅＧＦＰ、またはＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ｅＧＦＰ融合タンパク質を発現する、ガラクトース含有液体培地中で培養された酵母菌株の増殖曲線を示すグラフ。
【図３】ＡｐｏＥアイソフォームは、酵母において異なるレベルの毒性を示す。（Ａ）ガラクトース含有液体培地中で培養された、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２−ｅＧＦＰ、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３−ｅＧＦＰ、またはＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ｅＧＦＰ融合タンパク質の４個の遺伝子コピーを含有する酵母細胞の増殖曲線のグラフ。（Ｂ）ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４のタンパク質レベル（抗ＧＦＰ抗体を用いて評定されたもの）を、ローディング対照として機能したＰＧＫ１のタンパク質レベルと比較して示すウェスタンブロット。
【図４】ＡｐｏＥ構築物をＧＦＰでタグ付けすることは、それらの毒性に影響を及ぼさない。左のパネル：Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２−ｅＧＦＰ融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（左の縦列）、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３−ｅＧＦＰ融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（中央の縦列）、あるいは酵母Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ｅＧＦＰ融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（右の縦列）で形質転換した酵母細胞の写真。これらの酵母細胞を、ガラクトース（上部分、左及び右のパネル）またはグルコース（下部分、左及び右のパネル）上にスポッティングし、増殖を評定した。右のパネル：Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（左の縦列）、酵母Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（中央の縦列）、またはＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミド（右の縦列）で形質転換した酵母細胞の写真。これらの酵母細胞を、ガラクトース（上部分、左及び右のパネル）またはグルコース（下部分、左及び右のパネル）上にスポッティングし、増殖を評定した。形質転換体は、グルコースプレート上では等しく良好に増殖した。ＡｐｏＥ発現は、タンパク質がｅＧＦＰに融合されていたかどうかに関わらず、対立遺伝子に依存する様式で細胞増殖を阻害した。これらの実験は、２ミクロン発現プラスミド内にあるＡｐｏＥ構築物を用いて行った。
【図５】Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２−ｅＧＦＰ、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３−ｅＧＦＰ、またはＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ｅＧＦＰをコードする発現構築物を異なるコピー数保有する菌株の増殖及びＡｐｏＥタンパク質レベル。（Ａ）ｅＧＦＰ（対照）、及び種々の量のＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４タンパク質を示されている通りに（Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ−ｅＧＦＰ融合体として）発現する、ガラクトース含有液体培地中で培養された酵母菌株の増殖曲線を示すグラフ。（Ｂ）ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４を含有するＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ−ｅＧＦＰ融合タンパク質をコードする示されている発現構築物で形質転換した種々の酵母におけるＰＧＫと比べて異なるレベルのＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４タンパク質（抗ＧＦＰ抗体を使用して評定されたもの）を示すウェスタンブロット。
【図６Ａ】ヒトＡｐｏＥアイソフォームであるＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４のモデル構造。アイソフォーム間で異なるアミノ酸位置（１１２位及び１５８位）、及びこれらの違いから生じるＡｒｇ６１（Ｒ６１）近傍における違いを示している。
【図６Ｂ】Ｒ６１Ｔ突然変異がＡｐｏＥ４の構造をＡｐｏＥ３の構造に似たものにすることを示す、ヒトＡｐｏＥアイソフォームであるＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４のモデル構造（Ｈａｔｔｅｒｓ，ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３１（８）：４４５−４５４，２００６から出典された図）。
【図７】Ｒ６１Ｔ突然変異は、ＡｐｏＥ４に導入されるとＡｐｏＥ３様表現型を回復する。示されている通り、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２−ｅＧＦＰ融合ポリペプチド（一番上の横列）、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３−ｅＧＦＰ融合ポリペプチド（第２の横列）、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ｅＧＦＰ融合ポリペプチド（第３の横列）、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２（Ｒ６１Ｔ）−ｅＧＦＰ融合ポリペプチド（第４の横列）、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３（Ｒ６１Ｔ）−ｅＧＦＰ融合ポリペプチド（第５の横列）、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４（Ｒ６１Ｔ）−ｅＧＦＰ融合ポリペプチド（一番下の横列）をコードするガラクトース誘導性発現プラスミドで形質転換した酵母細胞の写真。これらの酵母細胞を、左から右に漸増する希釈度（より低い酵母細胞濃度）でガラクトース（左の写真）またはグルコース（右の写真）上にスポッティングし、増殖を評定した。実験用及び対照用の形質転換体は、ＡｐｏＥ発現の不在下では等しく良好に増殖した（グルコース、ＡｐｏＥ「オフ」）。Ｒが６１位にあるＡｐｏＥアイソフォームの発現は細胞増殖を大いに阻害し（ガラクトース、ＡｐｏＥ「オン」、上３つの横列）、ＡｐｏＥ４が最も高い効果を示した。ＡｐｏＥ４  Ｒ６１Ｔの毒性は、明らかにＡｐｏＥ４の毒性と比べて低減していた（第３の横列（ＡｐｏＥ４（疾患））と一番下の横列（ＡｐｏＥ４  Ｒ６１Ｔ）とを比較されたい）。相対的な増殖レベルが写真の上に示されている。これらの実験は、２ミクロン発現プラスミド内にあるＡｐｏＥ構築物を用いて行った。
【図８】ＡｐｏＥ誘導性毒性抑制遺伝子を同定するためのスクリーニングに使用されたＡｐｏＥ発現菌株（「ＡｐｏＥ高毒性（ｈｉｔｏｘ）」菌株）のガラクトース含有液体培地における増殖曲線。
【図９Ａ】酵母において抑制因子のスクリーニングを行うための手順を示す概略図。
【図９Ｂ】特定のＡｐｏＥアイソフォームを使用して抑制因子スクリーニングを行うための手順を示す概略図。
【図１０】クリオキノールまたはＮＡＢ２の存在下におけるＡｐｏＥ発現酵母菌株の増殖曲線。
【図１１Ａ】エンドサイトーシスについてのＭＵＰ１アッセイの概略図。図の上部は、ＡｐｏＥ発現構築物（左）及びＭＵＰ１−ｍＫａｔｅ２融合タンパク質をコードするＭＵＰ１レポーター構築物（右）を示す。図の下部は、ガラクトースの存在下及びメチオニンの不在下の条件（−ＭＥＴ、左）、ならびにガラクトース及びメチオニンの存在下（＋ＭＥＴ、右）における、ＡｐｏＥ発現構築物及びＭＵＰ１構築物を保有する酵母菌株の概略図を示す。メチオニンの不在下では、ＭＵＰ１融合タンパク質は細胞膜に留まるが（左）、メチオニンの存在下では、ＭＵＰ１融合タンパク質は細胞内に取り込まれる（右）。
【図１１Ｂ】上パネルは、（ｉ）ヒトＡｐｏＥタンパク質、α−シヌクレイン、またはＡβと、（ｉｉ）ＭＵＰ１レポーター構築物との両方を発現する酵母菌株の蛍光画像を示す。下パネルは、ガラクトース含有培地上の様々な菌株の増殖を示す。
【図１１Ｃ】ＡｐｏＥ４、Ａβ、及びα−シヌクレインは、異なる方法でエンドソーム輸送を妨害する。図１１Ｂで説明された通りに示されている菌株を、８時間にわたってＡｐｏＥ４、Ａβ、及びα−シヌクレインを発現するように誘導した。蛍光顕微鏡写真に示されているように、ＭＵＰ１の輸送は、ＡｐｏＥ４、Ａβ、またはα−シヌクレインの存在下で異なるように見える。
【図１２】ＡｐｏＥ修飾遺伝子スクリーニングの結果の概要。４８０個の遺伝子を再検証分析のために選択した。ベン図（下部）は、示されているＡｐｏＥアイソフォームに関する再検証されたヒットの重複を示す。
【図１３】ＡｐｏＥ４発現は、Ｓｔｅ３のエンドサイトーシスを妨害する。示されている神経変性タンパク質発現構築物を保有する酵母細胞を、ｐＡＧ４２３−Ｓｔｅ３−ｍＫａｔｅ２プラスミドで形質転換し、６〜８時間にわたって、培養培地へのガラクトースの添加によりＳｔｅ３−ｍＫａｔｅ２及び神経変性タンパク質を発現するように誘導した。上の横列は、位相差顕微鏡を使用した細胞の代表的画像を示す。下の横列は、ｍＫａｔｅ２蛍光についての代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。液胞へのＳｔｅ３エンドサイトーシスは、Ａβ及びα−シヌクレインの発現によってのみならず、ＡｐｏＥ４の発現によっても妨害されている。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
いくつかの態様では、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドを産生するように遺伝子操作された酵母細胞が本明細書に記載され、ここで、当該細胞におけるポリペプチドの産生は、当該細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの産生により、酵母細胞が生存不能となる。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥタンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ２タンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ４タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列とＡｐｏＥタンパク質とを含む。
【００５３】
いくつかの態様では、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞が本明細書に記載され、当該細胞における核酸の発現及びポリペプチドの産生は、当該細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの産生により、酵母細胞が生存不能となる。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥタンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ２タンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質はヒトＡｐｏＥ４タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列とＡｐｏＥタンパク質とを含む。
【００５４】
本明細書に記載されているＡｐｏＥ発現酵母細胞は、ＡｐｏＥ誘導性毒性を調節する化合物または遺伝因子、例えば、ＡｐｏＥ誘導性毒性を阻害する化合物を同定するために使用することができる。そのようなスクリーニングによって同定された化合物は、ＡｐｏＥ関連疾患の治療または予防に使用することができる。本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＥ関連疾患」は、対象のゲノムにおけるＡＰＯＥ遺伝子の特定の対立遺伝子の存在と疾患の発症との間に統計的に有意な関連性があること、疾患発症の平均年齢よりも平均して少なくとも３年低い年齢における疾患の発症、または重度もしくは急速に進行する形態の疾患を有することを特徴とする疾患である。いくつかの実施形態では、当該対立遺伝子を少なくとも１コピー有する個体は、母集団内の個体間でのリスクと比較して、またはその特定の対立遺伝子を保有しない個体間でのリスクと比較して、少なくとも１．０５倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．７５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、または５倍高い、疾患発症リスクまたは疾患を有するリスクを有する。個体または群は、同齡であってもよい。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＥ誘導性毒性」及び「ＡｐｏＥ媒介性毒性」は、ＡｐｏＥタンパク質の発現の結果として、またはそれに関連して生じる、１つ以上の細胞機能もしくは構造における低減、障害、または他の異常、増殖もしくは生存能力の低減、あるいはそれらの組み合わせを指すために、互換的に使用される。酵母細胞との関連では、ＡｐｏＥ媒介性毒性は、増殖または生存能力の低減、例えば、生存能力の低減または生存不能、あるいは１つ以上の細胞機能もしくは構造における低減、障害、または他の異常、例えば、エンドサイトーシスもしくは小胞輸送における低減、障害、または他の異常として顕在化し得る。神経細胞またはグリア細胞、例えば、哺乳類の神経細胞またはグリア細胞との関連では、ＡｐｏＥ媒介性毒性は、増殖または生存能力の低減、例えば、生存能力の低減または生存不能、あるいは１つ以上の細胞機能もしくは構造における低減、障害、または他の異常として顕在化し得る。細胞機能は、細胞内で、あるいは細胞それ自体によって、または１つ以上の他の細胞と一緒に、インビトロまたはインビボで（例えば、インビボの組織または器官との関連で）行われる、生物学的プロセス及び経路のいずれをも含む。いくつかの実施形態では、細胞機能は、エンドサイトーシス、小胞輸送、軸索輸送、ミトコンドリア機能（例えば、ＡＴＰ産生）、神経突起伸長、神経伝達、神経発生、または恒常性維持である。インビボのＡｐｏＥ媒介性毒性は、細胞機能障害から死にまで及ぶ、多様な範囲及び多様な方法で顕在化し得る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性は、特定のＡｐｏＥアイソフォームを発現する対象における、ＡｐｏＥ媒介性疾患の発症（またはＡｐｏＥ媒介性疾患の１つ以上の症状もしくは徴候）またはＡｐｏＥ媒介性疾患を発症する傾向の増加によって、対象において証明され得る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性は、少なくとも部分的には、正常対照と比較したときのアミロイドβ凝集体の形成、沈着、蓄積、もしくは存続性の増加、またはアミロイドβ媒介性毒性の上昇として顕在化し得る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性は、正常対照と比較したときの認知、挙動、もしくは記憶の低下または欠陥として顕在化し得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を本明細書に記載されている薬剤と接触させること、またはそれで処置することによって、ＡｐｏＥ媒介性毒性の１つ以上の兆候が軽減される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ関連疾患は、ＡｐｏＥ４をコードするε４対立遺伝子に関連し、ＡｐｏＥ４関連疾患と称され得る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４関連疾患は、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、ＣＡＡ関連脳内出血、血管性認知障害、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、または脆弱Ｘ関連振戦／失調症候群である。ＣＡＡは、脳血管壁におけるタンパク質、主にアミロイドβタンパク質の沈着によって特徴付けられる病態である。ＣＡＡは、ＡＤ患者において高頻度の所見であるが、ＡＤの証拠の不在下でも起こる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ関連疾患は、「アミロイドβ関連疾患」であり、この用語は、例えば、特に脳内でのアミロイド斑の形態における、アミロイドβペプチドの異常に高いレベルの産生、蓄積、及び／または凝集によって特徴付けられるあらゆる病態を指す。アミロイドβ関連疾患には、ＡＤ、ダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、ＣＡＡ、ＣＡＡ関連脳内出血、及び孤発性封入体筋炎が含まれる。ＡｐｏＥ４は、Ａβクリアランスを阻害し得、かつ／またはＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ２と比較してＡβクリアランスの媒介における効率が低いことが示唆されている。免疫組織学的証拠は、Ａβと併せて、ＡＤ患者の脳内の斑におけるＡｐｏＥの存在を実証し、斑におけるＡβ沈着は、非保因者と比較してＡＰＯＥ  ε４保因者においてより豊富である。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、Ａβ媒介性毒性を調節する（例えば、阻害する）化合物及び遺伝因子を同定するために使用され得る。
【００５８】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を発現する、本明細書に記載の酵母細胞及び哺乳動物細胞は、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法において使用されてもよい。当該結合パートナーは、細胞内の任意の結合パートナー及び／または細胞から分泌される任意の結合パートナー、例えば、内因性ポリペプチドまたは内因性脂質であり得る。本発明の方法によって同定される結合パートナーは、ＡｐｏＥ関連疾患の治療のための治療標的候補であり得る。ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーは、ＡｐｏＥ媒介性毒性に関与する生物学的経路または生物学的プロセスに関与する場合もある。
【００５９】
タンパク質及び核酸
いくつかの態様では、ＡｐｏＥ誘導性毒性を阻害する候補化合物を同定するために有用な組成物及び方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、ＡｐｏＥ誘導性毒性の抑制因子または増強因子である遺伝子（及びそれらがコードするタンパク質）（ＡｐｏＥ媒介性毒性の「抑制遺伝子」もしくは「増強遺伝子」、または総称して「修飾遺伝子」もしくは「修飾因子」と呼ばれる場合もある）を同定するために有用な組成物及び方法が、本明細書に記載されている。本明細書に記載されている組成物及び方法のうち特定のものは、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含む融合ポリペプチドを含むか、または使用する。
【００６０】
「ヒトＡｐｏＥタンパク質」という用語には、アミノ酸配列が、天然の野生型ＡｐｏＥタンパク質のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるタンパク質、ならびに、アミノ酸配列が、天然の変異型ＡｐｏＥタンパク質のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるタンパク質が含まれる。ヒトＡＰＯＥは、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号３４８を有する。ＡＰＯＥは、ヒトにおける３つの一般的な対立遺伝子であるＡＰＯＥ  ε２（頻度約８％）、ＡＰＯＥ  ε３（頻度約８０％）、及びＡＰＯＥ  ε４（頻度約１４％）を有する。ヒトＡｐｏＥタンパク質は、１８個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む３１７個のアミノ酸からなる前駆体ポリペプチドとして天然に合成され、これは、切断されて、成熟した２９９個のアミノ酸からなるポリペプチドを産生する。ヒトＡｐｏＥ３前駆体ポリペプチドの配列は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿００００３２．１で確認される。説明の目的のために、成熟した２９９個のアミノ酸からなるヒトＡｐｏＥポリペプチドに基づくアミノ酸の付番が、本明細書において使用されている。
【００６１】
３つの一般的なＡＰＯＥ対立遺伝子によってコードされるタンパク質は、成熟タンパク質におけるの１１２位及び１５８位に位置する２個のアミノ酸において異なる。ＡｐｏＥ２は、残基１１２及び１５８にシステインを有し、ＡｐｏＥ３は、残基１１２にシステイン、そして残基１５８にアルギニンを有し、ＡｐｏＥ４は、残基１１２及び１５８にアルギニンを有する。成熟野生型ヒトＡｐｏＥタンパク質の配列が以下に示されており、１１２位及び１５８位のアミノ酸は太字で示され下線が引かれている。
【００６２】
ＡｐｏＥ２の配列は次の通りである。
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【００６３】
ＡｐｏＥ３の配列は次の通りである。
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【００６４】
ＡｐｏＥ４の配列は次の通りである。
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【００６５】
天然のＡｐｏＥ突然変異にはＡｐｏＥ４（Ｌ２８Ｐ）が含まれ、これは、ＡｐｏＥ４自体の作用を調整した後でも重篤なままである遅発性ＡＤのリスク上昇を保因者に与える（Ｋａｍｂｏｈ，ＭＩ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．１９９９  Ｍａｒ  ２６；２６３（２−３）：１２９−３２）。他のバリアントには、Ｅ１３Ｋ、Ｒ１３６Ｃ、Ｇ１９６Ｓ、Ｑ２４８Ｅ、Ｒ２５１Ｇ、及びＧ２７８Ｗが含まれる（Ｔｉｎｄａｌｅ，ＬＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，３５，７２７ｅ１−  ７２７ｅ３（２０１４））。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質のバリアントが使用され得る。「バリアントヒトＡｐｏＥタンパク質」（「ヒトＡｐｏＥバリアント」とも称される）は、１個以上のアミノ酸において（置換、欠失、及び／または付加、例えば、挿入によって）天然のヒトＡｐｏＥタンパク質とは異なるポリペプチドを含むかまたはそれからなり、自然に発生することは知られておらず、少なくとも２００個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、２９５個、または２９９個のアミノ酸（ヒトＡｐｏＥの全長）の長さにわたって、天然のヒトＡｐｏＥタンパク質と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である。いくつかの実施形態では、バリアントヒトＡｐｏＥタンパク質は、天然のＡｐｏＥタンパク質とは最大３０個のアミノ酸で異なり（例えば、２０個以下のアミノ酸で異なるか、１０個以下のアミノ酸で異なるか、５個以下のアミノ酸で異なるか、４個以下のアミノ酸で異なるか、３個以下のアミノ酸で異なるか、２個以下のアミノ酸で異なるか、または１個のアミノ酸で異なり）、少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合ポリペプチドにて発現されると酵母細胞の増殖または生存能力の低下を引き起こす能力を保持している。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥバリアントは、１つ以上の特定の位置、例えば、６１位または２５５位において、野生型または変異型ＡｐｏＥと異なる。例えば、このバリアントは、Ｒ６１Ｔ改変を保有し得る。いくつかの実施形態では、残基２５３〜２８９の領域内にある１個以上の巨大かつ／または疎水性の残基が、より小さな疎水性残基または極性／荷電残基のいずれかで置き換えられている。例えば、当該改変は、Ｆ２５７Ａ、Ｗ２６４Ｒ、Ｖ２６９Ａ、Ｌ２７９Ｑ、及びＶ２８７Ｅであってもよい。いくつかの実施形態では、当該改変は、野生型ＡｐｏＥタンパク質と比べてバリアントの毒性を低減させる。いくつかの実施形態では、当該改変は、野生型ＡｐｏＥタンパク質と比べてバリアントの毒性を上昇させる。いくつかの実施形態では、バリアントヒトＡｐｏＥタンパク質は、ヒトＡｐｏＥタンパク質の断片（「ヒトＡｐｏＥタンパク質断片」）を含むかまたはそれからなる。ヒトＡｐｏＥタンパク質断片は、ヒトＡｐｏＥタンパク質よりも短く、断片の全長にわたってヒトＡｐｏＥタンパク質と同一である。いくつかの実施形態では、バリアントまたは断片のヒトＡｐｏＥタンパク質は、完全長ヒトＡｐｏＥタンパク質と比べて、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション、またはその両方を有する。いくつかの実施形態では、バリアントまたは断片のヒトＡｐｏＥタンパク質は、ヒトＡｐｏＥタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはその両方から、最大１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、または２５個のアミノ酸を欠いている。いくつかの実施形態では、バリアントは、代替的または付加的に、最大１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、または２５個のアミノ酸、最大で合計５０個のアミノ酸の内部欠失を１つ以上有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントまたは断片のヒトＡｐｏＥタンパク質は、ヒトＡｐｏＥタンパク質の少なくともアミノ酸２７２〜２９９を欠いている。本開示がバリアントまたは断片のヒトＡｐｏＥタンパク質に言及する場合、そのバリアントまたは断片は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、もしくはＡｐｏＥ４のバリアントまたは断片であり得ることが理解されるべきである。本開示がＡｐｏＥタンパク質に言及する場合、本開示は、バリアントＡｐｏＥタンパク質またはＡｐｏＥタンパク質の断片が使用される実施形態を提供することも理解されるべきである。いくつかの実施形態では、例えば、異なるレベルの毒性を有するバリアントが、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子もしくは増強因子である遺伝子の過剰発現または阻害と組み合わせて、スクリーニングに使用され得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「シグナル配列」または「分泌シグナル」という用語は、ポリペプチド内に存在し、かつポリペプチドが細胞内の小胞体を標的化することを引き起こす、ペプチド配列を指す。実施例に記載されている例示的なシグナル配列は、酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列
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である。しかしながら、多種多様なシグナル配列が知られており、本明細書に記載されている融合ポリペプチドの小胞体標的化を引き起こすために使用することができる。シグナル配列は、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．１５５（３）：１８９−９７，Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ−Ｔｓａｐｉｓ（１９９２）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６（５）：５７３−９、及びＰｏｏｌ（２００５）Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２２（１−２）：３−１５において概説されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）のシグナル配列が使用される。例えば、いくつかの実施形態では、天然のヒトＡｐｏＥ前駆体ポリペプチド内に見出されるシグナル配列、例えば、
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が使用され得る。いくつかの実施形態では、ヒトインスリンの前駆体タンパク質（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３６３０）の分泌シグナル配列が使用され得る。ヒトインスリンの前駆体タンパク質の分泌シグナル配列は、配列
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を有する。
【００６８】
ヒトＡｐｏＥタンパク質を含有する、例えば、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含有するポリペプチドは、任意で、ＡｐｏＥタンパク質に融合している第２のドメインを含んでもよい。融合タンパク質の第２のドメインは、例えば、免疫グロブリンドメイン、二量体化ドメイン、標的化ドメイン、安定化ドメイン、精製ドメイン、または検出タンパク質であり得る。例示的な検出タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）（それぞれｅＧＦＰ、ｅＣＦＰ、ｅＹＦＰ、及びｅＢＦＰとして知られるＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、またはＢＦＰの増強版を含む）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｄｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質；ｍＫａｔｅ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素が挙げられる。検出タンパク質の他の例としては、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、Ｖ５タグ、ポリヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ６）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、カルモジュリンタグ、Ｅタグ、ＳＰＢタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＶＳＶタグ、Ｆｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ｍｙｃタグ、及びＦＬＡＧタグなどのエピトープが挙げられる。例えば、ＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端または他の部分でＧＦＰと融合していてもよい。このような融合タンパク質は、組換え酵母細胞におけるＡｐｏＥタンパク質の迅速かつ容易な検出及び同定のための方法を提供する。ＡｐｏＥタンパク質は、１つ、２つ、またはそれよりも多くのドメインと融合していてもよい。例えば、それは、Ｎ末端において第１のドメインと、そしてＣ末端において第２のドメインと融合していてもよい。異種ドメインまたはタンパク質が複数の目的を果たし得ることは、当業者であれば理解するであろう。いくつかの実施形態では、シグナル配列とＡｐｏＥタンパク質との間、ＡｐｏＥタンパク質と第２のドメインとの間、またはその両方に、リンカーペプチドが存在し得る。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、１〜５０アミノ酸長、例えば、５〜２５アミノ酸長であり得る。
【００６９】
細胞がＡｐｏＥタンパク質を発現するように、ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、プラスミドを調製し、細胞に導入する方法も、本明細書に記載されている。「ＡｐｏＥ核酸」という用語は、本明細書に記載されているＡｐｏＥタンパク質のいずれかをコードする配列を含有する核酸を包含する。例示的なＡｐｏＥ核酸としては、ヒトＡｐｏＥ２、ヒトＡｐｏＥ３、またはヒトＡｐｏＥ４をコードするものが挙げられる。
【００７０】
「核酸」という用語は、概して、少なくとも１つの核酸塩基、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ内に見出される天然のプリンまたはピリミジン塩基を含有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの誘導体もしくは模倣物の少なくとも１つの分子または鎖を指す。概して、「核酸」という用語は、少なくとも１つの一本鎖分子を指すが、特定の実施形態では、少なくとも１つの一本鎖分子に対して部分的に、実質的に、または完全に相補的である、少なくとも１本の付加的な鎖も包含する。したがって、核酸は、一本鎖分子を含む特定の配列についての１本または複数本の相補鎖または「相補体」を含む、少なくとも１つの二本鎖分子または少なくとも１つの三本鎖分子を包含してもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞は、ヒトアミロイドβタンパク質をコードする発現構築物をさらに含む。本明細書で使用される場合、「ヒトアミロイドβタンパク質」という用語は、そのアミノ酸配列が、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解プロセシングによって得られ、かつアルツハイマー病などのアミロイド病態に関連する天然の３８〜４３アミノ酸アミロイドβペプチドの配列と同一である、タンパク質を指す。「ヒトアミロイドβタンパク質」という用語には、アミノ酸配列が、天然の野生型アミロイドβペプチドのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるタンパク質、ならびに、アミノ酸配列が、天然の変異体アミロイドβペプチドのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるタンパク質が含まれる。野生型アミロイドβペプチドは、アミロイドβ１−３８、アミロイドβ１−３９、アミロイドβ１−４０、アミロイドβ１−４１、アミロイドβ１−４２、及びアミロイドβ１−４３を含む。ヒトアミロイドβのアミノ酸１〜４３は、次の通りである。
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【００７２】
アミロイドβの突然変異には、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ、Ｅ２２Ｇ（北極型）、Ｅ２２Ｑ（オランダ型）、Ｅ２２Ｋ（イタリア型）、Ｄ２３Ｎ（アイオワ型）、Ａ４２Ｔ、及びＡ４２Ｖが含まれる（付番はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミロイドβペプチドに対するものである）。これらの突然変異は、任意で、アミロイドβペプチド１−３８、１−３９、１−４０、１−４１、１−４２、及び１−４３のうちのいずれに存在してもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドβタンパク質は、シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含む融合ポリペプチドの一部として発現される。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、天然の酵母タンパク質のシグナル配列と同一であり（例えば、シグナル配列は、酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列またはＭＡＴαシグナル配列と同一であり）、ヒトアミロイドβタンパク質は、野生型アミロイドβ１−４２である。シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含有するポリペプチドは、任意で、第２のドメインと融合していてもよい。融合タンパク質の第２のドメインは、任意で、免疫グロブリンドメイン、二量体化ドメイン、標的化ドメイン、安定化ドメイン、精製ドメイン、または検出タンパク質、例えば、ヒトＡｐｏＥを含む融合タンパク質に関して上述した第２のドメインのうちのいずれかとすることができ、同じ目的のいずれのために使用されてもよく、Ｎ末端、Ｃ末端、もしくはタンパク質内の他の場所に位置してもよく、かつ／または、ヒトＡｐｏＥタンパク質について上述したように、リンカーペプチドによってアミロイドβタンパク質に結合していてもよい。シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含むポリペプチドをコードする例示的な核酸構築物、及び酵母細胞へのそれらの導入は、米国特許出願公開第２０１３００２２９８８号及び同第２０１３００４５４８３号に記載されている。これらの文献には、シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含有する融合ポリペプチドが酵母細胞において発現されると毒性であるという発見も記載されている。ある特定の実施形態において、本発明は、任意のかかる核酸構築物を、ヒトＡｐｏＥタンパク質をコードする核酸構築物と組み合わせて、例えば、酵母細胞において使用することを企図している。ある特定の実施形態において、シグナル配列とヒトアミロイドβタンパク質とを含有する融合ポリペプチドは、誘導性プロモーターの制御下で発現され得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドβタンパク質のバリアントを使用することができる。本開示において、「バリアントヒトアミロイドβタンパク質」は、（置換、欠失、及び／または挿入によって）天然のアミロイドβペプチドとは、最大１０個のアミノ酸で異なり（例えば、５個以下のアミノ酸で異なるか、４個以下のアミノ酸で異なるか、３個以下のアミノ酸で異なるか、２個以下のアミノ酸で異なるか、または１個のアミノ酸で異なり）、少なくともいくつかの実施形態では、シグナル配列を含む融合ポリペプチドにて発現されると酵母細胞の増殖または生存能力の低下を引き起こす能力を有する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、酵母細胞は、ヒトＡｐｏＥタンパク質及び第１の検出可能ドメインを含む第１のポリペプチド、ならびにヒトアミロイドβタンパク質及び第２の検出可能ドメインを含む第２のポリペプチドを発現し、第１及び第２の検出可能ドメインは異なり、例えば色によって容易に区別可能である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ヒトＡｐｏＥタンパク質及び第１の検出可能ドメインに融合しているシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、ヒトアミロイドタンパク質及び第２の検出可能ドメインに融合しているシグナル配列を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、シグナル配列とヒトＡｐｏＥタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞は、ヒトアミロイドβタンパク質をコードする発現構築物を含まない。
【００７７】
ＡｐｏＥを含むポリペプチドをコードする例示的な核酸配列は、実施例において提供される。しかしながら、遺伝コードの縮重に起因して、所与のアミノ酸配列が多種多様な核酸配列のいずれによってコードされてもよいことは、当業者であれば理解するであろう。任意のかかる核酸配列を使用して、目的のポリペプチド、例えば、ヒトＡｐｏＥを含むポリペプチドをコードしてもよい。本開示の任意の態様のいくつかの実施形態では、核酸配列は、目的の種の細胞における発現のためにコドン最適化される。例えば、いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥを含むポリペプチドは、酵母内での発現のためにコドン最適化される。
【００７８】
酵母細胞、ベクター
本明細書に記載されている組成物及び方法に使用することができる酵母菌株としては、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバエ、サッカロミセス・クルイベリ、シゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロミセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・クルイベリ、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ・スピーシーズ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ユティリス、カンジダ・カカオイ、ゲオトリクム・スピーシーズ、及びゲオトリクム・フェルメンタンスが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における考察の大部分はサッカロミセス・セレビシエに関するが、これは例示を目的とするものに過ぎない。他の酵母菌株が、Ｓ．セレビシエに代わることができる。
【００７９】
本開示のある特定の態様は、候補治療薬（例えば、医薬品、化学薬剤、または遺伝子薬剤）を同定するためのスクリーニング法に関する。本明細書に記載されている方法は、任意で、ＥＲＧ６遺伝子、ＰＤＲ１遺伝子、ＰＤＲ３遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子、ＳＮＱ２遺伝子、及び／または、膜排出ポンプに影響を及ぼし、かつ／もしくは薬物の透過性を増加させる任意の他の遺伝子において突然変異を有する、酵母菌株において行うことができる。いくつかの実施形態では、この菌株は、ＰＤＲ１及びＰＤＲ３をコードする遺伝子内に突然変異を有する。
【００８０】
本明細書に記載されている融合ポリペプチドをコードする核酸は、プラスミド、線状核酸分子、人工染色体、及びエピソームベクターを含むがこれらに限定されない核酸ベクターを使用して、酵母細胞内にトランスフェクトされ得る。
【００８１】
酵母細胞における組換えプラスミド発現及び複製に使用される３つの周知の系には、組込み型プラスミド、低コピー数のＡＲＳ−ＣＥＮプラスミド、及び高コピー数の２μプラスミドが含まれる。Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，“Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”ｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｋ．Ｇ．Ｈａｒｄｙ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３、及びＹｅａｓｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ，Ｕｎｉｔ  １３．４，Ｅｄｓ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、ならびにそれらの後続文書を参照されたい。
【００８２】
組込み型プラスミドの一例はＹＩｐであり、これは、ハプロイドゲノム１つ当たり１コピーで維持され、メンデルの法則で遺伝する。このようなプラスミドは、目的の遺伝子、細菌の複製起点、及び選択可能な遺伝子（典型的には抗生物質耐性マーカー）を含有し、細菌内で産生される。精製されたベクターは、選択可能な遺伝子内で直線化され、コンピテント酵母細胞を形質転換するために使用される。
【００８３】
低コピー数のＡＲＳ−ＣＥＮプラスミドの一例はＹＣｐであり、これは、自律複製配列（ＡＲＳ１）及び動原体配列（ＣＥＮ４）を含有する。これらのプラスミドは、通常、細胞１個当たり１〜２コピー数で存在する。ＣＥＮ配列の除去はＹＲｐプラスミドを産生し、これは、典型的には細胞１個当たり１００〜２００コピー数で存在する。しかしながら、このプラスミドは、有糸分裂的にも減数分裂的にも不安定である。
【００８４】
高コピー数の２μプラスミドの一例はＹＥｐであり、これは、およそ１ｋｂの長さの配列（２μ配列と呼ばれる）を含有する。２μ配列は、より高いプラスミドコピー数をもたらす酵母レプリコンとして作用する。例えば、コピー数は、細胞１個当たり５０〜１００コピー数、例えば、細胞１個当たり約６０〜８０コピー数であり得る。しかしながら、これらのプラスミドは不安定であり得、維持のための選択を必要とする場合がある。コピー数は、プラスミド上で選択遺伝子を不活性化されたプロモーターに機能的に連結させることによって増加させることができる。
【００８５】
多種多様なプラスミドを、本明細書に記載されている組成物及び方法に使用することができる。いくつかの実施形態では、プラスミドは、組込み型プラスミド（例えば、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６、またはそれらの誘導体）である。例えば、Ａｌｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ａ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”Ｙｅａｓｔ  ２４（１０）：９１３−１９を参照されたい。いくつかの実施形態では、プラスミドは、エピソームプラスミド（例えば、ｐ４２６ＧＰＤ、ｐ４１６ＧＰＤ、ｐ４２６ＴＥＦ、ｐ４２３ＧＰＤ、ｐ４２５ＧＰＤ、ｐ４２４ＧＰＤ、またはｐ４２６ＧＡＬ）である。いくつかの実施形態では、プラスミドは、動原体プラスミド（例えば、ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６、またはそれらの誘導体）である。
【００８６】
使用されるプラスミドの型に関わらず、酵母細胞は、典型的に、化学的方法（例えば、Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、またはＢｕｒｋｅ，ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００５に記載されている方法）によって形質転換される。細胞は典型的に、ＤＮＡ１μｇ当たりおよそ１０４のコロニー形成単位（形質転換細胞）の形質転換効率を達成するように、酢酸リチウムで処理される。酵母は、切断された選択可能なマーカーが、変異した（通常は点突然変異または小欠失）宿主遺伝子と組み換わって機能を回復するように、相同組換えを行う。次いで、形質転換細胞が選択培地上で単離される。当然ながら、核酸を酵母細胞に導入する任意の好適な手段を使用することができる。
【００８７】
本明細書に記載されている酵母ベクター（プラスミド）は、典型的には、酵母複製起点、抗生物質耐性遺伝子、細菌複製起点（細菌細胞内での複製のため）、多重クローニング部位、及び酵母細胞内での維持のための酵母栄養遺伝子を含有する。栄養遺伝子（または「栄養要求性マーカー」）は、ほとんどの場合、次のうちの１つである：１）ＴＲＰ１（ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ）、２）ＵＲＡ３（オロチジン−５'−リン酸デカルボキシラーゼ）、３）ＬＥＵ２（３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）、４）ＨＩＳ３（イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼまたはＩＧＰデヒドロゲナーゼ）、または５）ＬＹＳ２（α−アミノアジピン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）。
【００８８】
本明細書に記載されている酵母ベクター（プラスミド）は、プロモーター配列を含有してもよい。「プロモーター」は、転写の開始及び速度が制御される核酸配列の領域である、制御配列である。これは、特異的な転写核酸配列を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの制御タンパク質及び分子が結合し得る遺伝子要素を含有してもよい。「機能的に連結された」及び「作動可能に位置付けられた」という表現は、プロモーターが、ある核酸配列に対して、その配列の転写開始及び／または発現を制御するために正しい機能的位置及び／または向きにあることを意味する。
【００８９】
プロモーターは、コードセグメント及び／またはエクソンの上流に位置する５'非コード配列を単離することによって得ることができるように、核酸配列と自然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性プロモーター」と称することができる。あるいは、プロモーターは、組換えまたは異種プロモーターであってもよく、これは、その自然環境において通常は核酸配列と関連しないプロモーターを指す。そのようなプロモーターには、他の遺伝子のプロモーター及び非天然のプロモーターが含まれ得る。用いられるプロモーターは、構成的であっても制御可能（例えば、誘導可能）であってもよい。
【００９０】
多様なプロモーター（要素）が、酵母細胞内のＲＮＡの発現を制御するために用いられ得る。誘導性酵母プロモーターの例としては、ガラクトース誘導性プロモーターＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、ＧＡＬＳ、及び銅誘導性プロモーターＣＵＰ１が挙げられる。抑圧性酵母プロモーターの例としては、メチオニン抑圧性プロモーターＭｅｔ２５及びＭｅｔ３が挙げられる。酵母における制御可能な発現を達成するためにｔｅｔＯプロモーターを使用してもよい。構成的酵母プロモーターの例としては、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、翻訳延長因子１αプロモーター（ＴＥＦ）、チトクロムｃ−オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、及びＭＲＰ７が挙げられる。ＡＤＨなどのある特定の遺伝子がグルコース培地中で構成的であり得、グルコースの不在下で抑圧され得ることは理解されよう。グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含む、グルココルチコイドホルモンによって誘導可能なプロモーターを含有する酵母の自律複製発現ベクターも説明されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５６：１１９−１２２（１９９５）、Ｒｏｎｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．；２８３：３１３−２２（１９９７）、Ｆｕｎｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．；３５０：２４８−５７（２００２）を参照されたい。α因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモーターを含有する、さらに他の酵母ベクターが使用されてもよい。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照されたい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ガラクトース以外の炭素源でのＧＡＬプロモーターからの発現、例えば、誘導性発現を可能にする酵母菌株が使用される。いくつかの実施形態では、この菌株は、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインが転写活性化ドメイン及び制御ドメインに融合されている融合タンパク質をコードする組込みまたはエピソーム（例えば、プラスミド由来の）遺伝子を担持する。融合タンパク質は、転写を活性化するその能力が制御ドメインに対する小分子の結合によって制御されることを特徴とする。例えば、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、小分子の不在下では転写を活性化しないが、小分子の存在下では、融合タンパク質は転写を活性化する。例示的な小分子には、例えば、ステロイドホルモンが含まれ、対応する制御ドメインは、小分子に対する受容体の少なくとも一部分を含む。例えば、小分子は、エストロゲン（例えば、エストラジオール）、またはその類似体（例えば、タモキシフェン）であってもよく、対応する制御ドメインは、エストロゲン受容体（ＥＲ）の少なくとも一部分を含む。例示的な活性化ドメインとしては、例えば、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６活性化ドメインなどのウイルスタンパク質活性化ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、この菌株は、Ｇａｌ４−ＥＲ−ＶＰ１６融合タンパク質をコードする組込みまたはエピソーム（例えば、プラスミド由来の）遺伝子を担持する。培地中のエストロゲン受容体リガンド、例えば、エストラジオールの存在は、ガラクトース以外の炭素源でのＧＡＬプロモーターからの発現を可能にする。例えば、Ｇａｏ  ＣＹ  ａｎｄ  Ｐｉｎｋｈａｍ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００；２９（６）：１２２６−３１を参照されたい。目的の分子、例えば、ＡｐｏＥタンパク質の発現を、例えば、ガラクトースまたは他の炭素源を含有する培養培地上で、条件付きにするための多数の方法が存在することは、当業者であれば理解するであろう。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４を含むポリペプチドをコードする核酸の１〜２０個の組込みコピー、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の組込みコピーを保有する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ２を含むポリペプチドをコードする核酸の４個の組込みコピーを保有する。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ２を含むポリペプチドをコードする核酸の１３〜１５個の組込みコピーを保有する。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ３を含むポリペプチドをコードする核酸の２〜１０個の組込みコピー、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の組込みコピーを保有する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ３を含むポリペプチドをコードする核酸の３〜４個の組込みコピーを保有する。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ３を含むポリペプチドをコードする核酸の５〜９個の組込みコピーを保有する。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ４を含むポリペプチドをコードする核酸の１〜５個の組込みコピー、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個の組込みコピーを保有する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ４を含むポリペプチドをコードする核酸の２個の組込みコピーを保有する。いくつかの実施形態では、本発明の酵母細胞は、ＡｐｏＥ４を含むポリペプチドをコードする核酸の３〜４個の組込みコピーを保有する。いくつかの実施形態では、複数コピーが、単一の遺伝子座において組み込まれている。いくつかの実施形態では、１コピー以上が、２つ以上の遺伝子座の各々において組み込まれている。いくつかの実施形態では、細胞内のＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸は、同じプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、細胞内のＡｐｏＥアイソフォームをコードする２つ以上の核酸は、異なるプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、細胞内のＡｐｏＥアイソフォームをコードする２つ以上の核酸は、単一のプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、細胞内のＡｐｏＥアイソフォームをコードする２つ以上の核酸は、同じプロモーターの個別のコピーに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、第１のＡｐｏＥアイソフォームを含むポリペプチドをコードする核酸を１コピー以上、第２のＡｐｏＥアイソフォームを含むポリペプチドをコードする核酸を１コピー以上、及び任意で、第３のＡｐｏＥアイソフォームを含むポリペプチドをコードする核酸を１コピー以上、保有していてもよい。ＡｐｏＥアイソフォームは、任意の組み合わせのＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４であってよい。この核酸は、１つ以上のプロモーターに機能的に連結される。この菌株は、本明細書に記載されているもののような、化合物スクリーニング、遺伝子スクリーニング、またはその両方のために使用され得る。いくつかの実施形態では、この菌株は、本明細書に記載されているもののような、ヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーを同定する方法において使用されてもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に、実施例及び／または図に記載されているＡｐｏＥ２中等度毒性（ｉｎｔｏｘ）、ＡｐｏＥ３中等度毒性、またはＡｐｏＥ４中等度毒性菌株の０．５倍〜２倍のＡｐｏＥポリペプチドを細胞に産生させるかまたは含有させる、構築物を含有する。いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に、実施例及び／または図に記載されているＡｐｏＥ２高毒性、ＡｐｏＥ３高毒性、またはＡｐｏＥ４高毒性菌株の０．５倍〜２倍のＡｐｏＥポリペプチドを細胞に産生させるかまたは含有させる、構築物を含有する。いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に、実施例及び／または図に記載されているＡｐｏＥ２中等度毒性、ＡｐｏＥ３中等度毒性、またはＡｐｏＥ４中等度毒性菌株の０．７５倍〜１．２５倍のＡｐｏＥポリペプチドを細胞に産生させるかまたは含有させる、構築物を含有する。いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に、実施例及び／または図に記載されているＡｐｏＥ２高毒性、ＡｐｏＥ３高毒性、またはＡｐｏＥ４高毒性菌株の０．７５倍〜１．２５倍のＡｐｏＥポリペプチドを細胞に産生させるかまたは含有させる、構築物を含有する。いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に、実施例及び／または図に記載されているＡｐｏＥ２中等度毒性、ＡｐｏＥ３中等度毒性、またはＡｐｏＥ４中等度毒性菌株とほぼ同じ量のＡｐｏＥポリペプチドを細胞に産生させるかまたは含有させる、構築物を含有する。いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に、実施例及び／または図に記載されているＡｐｏＥ２高毒性、ＡｐｏＥ３高毒性、またはＡｐｏＥ４高毒性菌株とほぼ同じ量のＡｐｏＥポリペプチドを細胞に産生させるかまたは含有させる、構築物を含有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの量は、ウェスタンブロットによって、蛍光によって、ＥＬＩＳＡアッセイによって、表面プラズモン共鳴法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）、質量分析、または他の好適なアッセイを使用して、判定されてもよい。本明細書で使用される「約」という用語は、別段の記載がある場合または文脈から明白である場合を除き、概して、ある数からいずれかの方向に（その数字を上回るかまたは下回って）１％の範囲内、もしくはいくつかの実施形態では５％の範囲内、またはいくつかの実施形態ではある数から１０％の範囲内に含まれる数を含む（ただし、かかる数が可能値の１００％を容認不可能なほど超過する場合を除く）。
【００９４】
いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に、実施例及び／または図に記載されているＡｐｏＥ２中等度毒性、ＡｐｏＥ３中等度毒性、またはＡｐｏＥ４中等度毒性菌株とほぼ同じレベルの毒性を細胞に示させる、構築物を含有する。いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に、実施例及び／または図に記載されているＡｐｏＥ２高毒性、ＡｐｏＥ３高毒性、またはＡｐｏＥ４高毒性菌株とほぼ同じレベルの毒性を細胞に示させる、構築物を含有する。いくつかの実施形態では、「低毒性（ｌｏｗｔｏｘ）」菌株は、実施例及び／または図に記載されている中等度毒性菌株よりも少ないコピーを有する。例えば、いくつかの実施形態では、低毒性菌株は、ＡｐｏＥ２を含むポリペプチドをコードする核酸を２〜３コピー、ＡｐｏＥ３を含むポリペプチドをコードする核酸を１〜２コピー、またはＡｐｏＥ４を含むポリペプチドをコードする核酸を１コピー、有する。いくつかの実施形態では、酵母菌株は、発現時に毒性を引き起こさない構築物を含有する。いくつかの実施形態では、毒性レベルは、固形培養培地上で培養された酵母において測定される。いくつかの実施形態では、毒性レベルは、液体培養培地上で培養された酵母において測定される。いくつかの実施形態では、液体培養培地上で培養された酵母の毒性レベルは、ＡｐｏＥタンパク質が発現される条件下に酵母細胞を置いた後、約２０〜約６０時間に１回以上測定される。例えば、いくつかの実施形態では、毒性レベルは、ＡｐｏＥタンパク質が発現される条件下に酵母細胞を置いた後、２０〜４０時間の間の１つ以上の時点と４０〜６０時間の間の１つ以上の時点とでほぼ同じである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、細胞増殖は、光学密度６００（ＯＤ６００）または細胞計数に基づいて測定される。いくつかの実施形態では、２つの菌株は、それらのＯＤ６００もしくは細胞の数が互いの±２０％以内、±１０％以内、または±５％以内である場合、ＡｐｏＥが発現される条件下にこれらの菌株が置かれた（または別の毒性誘導条件が課された）後の所与の時点で、ほぼ同じレベルの毒性を示す。
【００９６】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子
ある特定の遺伝子の過剰発現はＡｐｏＥ媒介性細胞毒性の調節をもたらすことが分かっている。これらの遺伝子のうち１個以上の発現を調節する化合物、またはコードされたタンパク質のうち１つ以上の活性を調節する化合物を使用して、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節することができる。毒性の調節、例えば、毒性の抑制または増強は、多様な異なる用途を有し得る。本発明のいくつかの態様では、これらの遺伝子のうち１個以上の発現を調節する化合物、またはコードされたタンパク質のうち１つ以上の活性を調節する化合物を使用して、ＡｐｏＥ媒介性毒性、例えば、ＡｐｏＥ４媒介性毒性を阻害することができる。本発明のいくつかの態様では、これらの遺伝子のうち１個以上の発現を調節する化合物、またはコードされたタンパク質のうち１つ以上の活性を調節する化合物を使用して、ＡｐｏＥ関連疾患、例えば、ＡｐｏＥ４関連疾患、例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患を治療または予防することができる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子のうち１個以上の発現を調節する化合物、またはコードされたタンパク質のうち１つ以上の活性を調節する化合物を使用して、ＡｐｏＥ媒介性毒性を増強することができる。ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強は、例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害する遺伝子または化合物のさらなるスクリーニングを容易にするため、かつ／またはＡｐｏＥ媒介性障害の潜在的な治療薬を同定もしくは特性化するためのさらなるモデル系の開発において、有用であり得る。
【００９７】
付随する実施例に詳述されるように、酵母細胞におけるＡｐｏＥの発現に関連する細胞毒性を調節する（例えば、抑制または増強する）いくつかの遺伝子が同定されている。表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３は、過剰発現時にＡｐｏＥ毒性の増強遺伝子または抑制遺伝子として同定されている遺伝子の遺伝子名及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＳＧＤ）ＩＤ、ならびに（表１Ａ、１Ｂ、及び３において）これらの遺伝子によってコードされるタンパク質に関する非限定的な記述的情報を列記している。これらの遺伝子は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４のいずれかを含むポリペプチドをコードする発現構築物を保有する酵母菌株内で行われた、酵母読み取り枠のプール型スクリーニングにおいて同定された。一次スクリーニングにおいて少なくとも１つのＡｐｏＥアイソフォームの毒性の調節因子として同定されたヒットを、個別に形質転換して、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４のいずれかを含むポリペプチドをコードする発現構築物を保有する酵母菌株にすることによって試験した。再検証されたヒットの部分集合（実施例７参照）が、表３に列記されている。各遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質の配列は、とりわけＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑデータベース、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）データベース、またはＳＧＤなどの様々なデータベースから得ることができる。
【００９８】
酵母細胞におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子として同定されたいくつかの酵母遺伝子は、ヒトにおける１個以上の相同遺伝子を有する。本明細書に記載されている酵母モデル系においてＡｐｏＥが毒性を誘導する機序は、ヒト細胞においてＡｐｏＥ（例えば、ＡｐｏＥ４）が毒性を誘導する機序と同様であることが予想される。酵母細胞においてＡｐｏＥ媒介性毒性を調節するものと同定された酵母遺伝子の多くが、ヒトにおける相同遺伝子を有する。結果として、同定された酵母遺伝子（及びそれらのコードされたタンパク質）のヒト対応物は、ヒト細胞においてＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する、例えば、抑制するための、有用な標的となることが予想される。概して、酵母遺伝子の「対応物」（「相同体」と互換的に使用される）、例えば、ヒト対応物は、配列類似性、構造的類似性、及び／または機能的類似性に基づいて同定され得る。いくつかの実施形態では、Ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅ（完全に配列決定された様々な真核生物ゲノムの注釈付き遺伝子の中から相同体を自動検出するためのシステム、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅにてワールドワイドウェブ上で利用可能）が使用される。当然ながら、配列及び／または他の特徴に基づいて相同体を同定する他の手段を使用してもよい。相同遺伝子が、該遺伝子によってコードされるタンパク質の相同性核酸配列、相同性アミノ酸配列、またはその両方として同定されてもよいことは理解されよう。相同構造は、例えば、ＮＭＲ、Ｘ線結晶学、分子モデリング、または他の方法によって決定される、予測されるかもしくは実験的に決定される２次元または３次元構造に基づいて同定されてもよい。ヒト遺伝子に関する本発明の任意の態様のいくつかの実施形態では、ヒト遺伝子は、本明細書において特定された酵母抑制因子または増強因子の相同体であり、当該相同性は、例えば、Ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅ、ＢｉｏＭａｒｔ−Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＢＬＡＳＴ検索、構造的相同性を使用して、かつ／または相同性機能に基づいて同定されてもよい。
【００９９】
表１Ａまたは表１Ｂにおいて特定されるいくつかの酵母遺伝子は、１つ以上のヒト相同体を有する。表１Ｃ及び１Ｄは、それぞれ、表１Ａ及び１Ｂに列記されている酵母遺伝子のヒト相同体、ならびにそれらの対応するＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号を列記している。表１Ａまたは表１Ｂにおいて単一のアスタリスクで同定されている遺伝子は、アルツハイマー病危険因子である１つ以上のヒト相同体を有する。
【０１００】
表２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、本明細書において特定されるヒト相同体のうちの特定のものに関する公式記号（ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）遺伝子ＩＤ番号を列記している。ＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾因子である酵母遺伝子の相同体として本明細書において特定されるいくつかのヒト遺伝子は、アルツハイマー病の既知の遺伝的危険因子であり、すなわち、かかる遺伝子の特定の対立遺伝子またはかかる遺伝子内の突然変異が、ＡＤと関連する。例えば、これらの遺伝子の一部のある特定の対立遺伝子は、ＡＤを有しない対照群よりも著しく高い頻度でＡＤを有する個体に存在することが分かっており、故にＡＤの危険対立遺伝子と見なされる。（ＡＤの遺伝的危険因子を同定した研究の説明、及び他の関連情報については、Ｌａｍｂｅｒｔ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１３；４５（１２）：１４５２−８、及びこの文献中の参考文献を参照されたい）。既知のアルツハイマー病危険因子であるヒト相同体が、表２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃに列記されている。ヒト相同体遺伝子のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤが、表２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃに列記されている。加えて、ＡＸＬ２（表１Ａ）及びＳＴＥ６（表１Ｂ）は、ＡＤ危険因子であるヒト相同体を有する酵母修飾因子である。それらのヒト相同体は、それぞれ、ＤＳＧ２（遺伝子ＩＤ１８２９）及びＡＢＣＡ７（遺伝子ＩＤ１０３４７）である。本開示の態様が、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト相同体に言及する場合は必ず、本開示は、ＤＳＧ２及びＡＢＣＡ７に関連する実施形態を提供する。
【０１０１】
表３は、ＡｐｏＥ４を発現する酵母細胞における増強因子または抑制因子として再検証されたヒットの部分集合を列記している（実施例７参照）。表３に列記されている酵母遺伝子のヒト相同体を含むさらなる詳細は、本明細書において、例えば、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃにおいて確認することができる。
【０１０２】
各遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質の配列は、とりわけＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑデータベースまたはＵｎｉＰｒｏｔデータベースなどの様々なデータベースから得ることができる。
【０１０３】
（表１Ａ）過剰発現されるとＡｐｏＥ毒性を調節する酵母遺伝子
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＊少なくとも２つの菌株においてｐ＜０．００４で有意
【０１０４】
（表１Ｂ）過剰発現されるとＡｐｏＥ毒性を調節する酵母遺伝子
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＊少なくとも２つの菌株においてｐ＜０．００４で有意
【０１０５】
（表１Ｃ）表１Ａに列記されている酵母遺伝子のヒト相同体
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【０１０６】
（表１Ｄ）表１Ｂに列記されている酵母遺伝子のヒト相同体
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【０１０７】
（表２Ａ）ＡｐｏＥ２媒介性毒性の修飾遺伝子
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＊１．０超の効果サイズは、過剰発現された場合に遺伝子がＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制因子であることを示す。１．０未満の効果サイズは、過剰発現された場合に遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強因子であることを示す。
【０１０８】
（表２Ｂ）ＡｐｏＥ３媒介性毒性の修飾遺伝子
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＊１．０超の効果サイズは、過剰発現された場合に遺伝子がＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制因子であることを示す。１．０未満の効果サイズは、過剰発現された場合に遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強因子であることを示す。
【０１０９】
（表２Ｃ）ＡｐｏＥ４媒介性毒性の修飾遺伝子
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＊１．０超の効果サイズは、過剰発現された場合に遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制因子であることを示す。１．０未満の効果サイズは、過剰発現された場合に遺伝子がＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強因子であることを示す。
【０１１０】
（表３）再検証されたＡｐｏＥ４毒性の修飾遺伝子の一覧（実施例７参照）
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【０１１１】
表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト遺伝子のヌクレオチド及びタンパク質配列、ならびにそれらのコードされたタンパク質は、これらの遺伝子の発現またはコードされる遺伝子産物の活性を調節する化合物（核酸、ペプチド、抗体、及び小分子を含むがこれらに限定されない）を生成及び／または同定するために使用することができる。例えば、以下にさらに記載されているように、遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ薬剤を、ｍＲＮＡ配列に基づいて設計することができる。これらのタンパク質は、組換えＤＮＡ法を用いて産生され、免疫原または親和性試薬として、抗体もしくはアプタマーの産生または選択のために、あるいはこのタンパク質に結合するかもしくはその活性を調節する化合物を同定するための小分子ライブラリのスクリーニングにおいて使用することができる。上述のように、遺伝コードの縮重に起因して、所与のアミノ酸配列が多種多様な核酸配列のいずれによってコードされてもよいことは、当業者であれば理解するであろう。任意のかかる核酸配列は、例えば、任意の目的のためのタンパク質を発現する目的で、タンパク質をコードするために使用され得る。
【０１１２】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾因子である酵母遺伝子の相同体であるヒト遺伝子のうちの特定のものは、例えば、スプライス変異または代替的な開始コドンの使用の結果として、同じゲノム配列に由来する特定のタンパク質の１つを超えるアイソフォームをコードしてもよい。本明細書における方法及び組成物のある特定の実施形態は、特定のアイソフォーム、例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑデータベースにおける参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）を有するか、もしくはＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおけるアクセッション番号を有する、任意のアイソフォームを対象とするか、またはそれを使用してもよい。いくつかの実施形態では、アイソフォームは、成人ヒト脳において（例えば、海馬及び／または大脳皮質などの、ＡＤを有する個体において典型的に影響を受ける１つ以上の領域において）通常は発現される。いくつかの実施形態では、アイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて特定される標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）アイソフォームである。ＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾因子である酵母遺伝子の相同体であるヒト遺伝子のうちの特定のものは、複数の異なる対立遺伝子を有してもよい。本明細書における方法及び組成物のある特定の実施形態は、任意のかかる対立遺伝子を対象とするか、またはそれを使用してもよい。いくつかの実施形態では、対立遺伝子は、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病に関連する。
【０１１３】
ＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾因子として同定された酵母遺伝子及びコードされるタンパク質のうち少なくとも一部の対応物は、多様な非ヒト多細胞生物、例えば、蠕虫、ハエ、マウス、ラット、及び／または非ヒト霊長類に存在する。いくつかの実施形態では、かかる遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子産物は、多様な目的のために使用され得る。例えば、これらの遺伝子は、例えば、それらが由来する生物の細胞において、過剰発現、阻害、または無効化され（例えば、突然変異または少なくとも部分的な欠失によって）、それによって、かかる細胞内のＡｐｏＥ媒介性毒性を調節するために使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する化合物を同定するため、または他の系で同定された化合物を特性化するため、スクリーニングに使用される。いくつかの実施形態では、その動物種に天然である対応物が過剰発現、阻害、または無効化されている非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））が生成されてもよい。いくつかの実施形態では、かかる動物は、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する化合物をスクリーニングまたは特性化するために使用される。
【０１１４】
本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子として同定された遺伝子は、後続の節（例えば、スクリーニングアッセイに関する節）においては「標的遺伝子」と称される場合があり、それらによりコードされるタンパク質は「標的タンパク質」と称される場合がある。かかる用語が、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上における酵母遺伝子、ならびに他の生物（例えば、ヒト）におけるそれらの対応物を指すことが理解されよう。本明細書において提供される遺伝子の名称は、別段の記載がある場合または文脈から明白である場合を除き、その遺伝子及びそのコードされた遺伝子産物、例えば、タンパク質への言及を包含するものと理解されるべきである。例えば、遺伝子の発現を調節すること（例えば、阻害することまたは上昇させること）に言及する場合、そのような言及は、ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質のレベルでその遺伝子の発現を調節すること（例えば、ｍＲＮＡのレベルを調節すること及び／またはタンパク質のレベルを調節すること）を包含するものと理解されるべきである。例えば、遺伝子を過剰発現することは、その遺伝子によってコードされるタンパク質を過剰発現することを包含し、このタンパク質は、細胞または細胞の祖先に導入されている核酸（例えば、発現構築物）によってコードされてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子産物の発現または活性は、少なくともまたは約２５％、５０％、または１００％上昇する。いくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子産物の発現または活性は、少なくともまたは約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、もしくはそれ以上上昇する。遺伝子を阻害または無効化することは、細胞もしくは生物のゲノム内の遺伝子を阻害または無効化すること、あるいは遺伝子の発現産物、例えば、その遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質を阻害または無効化することを包含する。遺伝子の活性を調節することは、その遺伝子によってコードされる産物、例えば、タンパク質の活性を調節することを包含する。いくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子産物の発現または活性は、少なくともまたは約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくはそれ以上低減する。いくつかの実施形態では、発現または活性は、検出不可能にされる。
【０１１５】
表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている酵母遺伝子、もしくは表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト相同体の発現を調節すること、ならびに／またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を調節することは、例えば、ＡｐｏＥ発現細胞におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の調節をもたらすと予想される。例えば、酵母内で過剰発現されると毒性を抑制することが分かったそれらの遺伝子については、概して、これらの遺伝子もしくはそれらのヒト対応物の発現を増強すること、及び／またはこれらの遺伝子もしくはそれらのヒト対応物によってコードされるタンパク質の活性を増強することが、例えば、ＡｐｏＥ発現細胞におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制をもたらすと予想される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の酵母抑制因子またはそれらのヒト対応物のうちの特定のものの発現または活性の阻害が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を抑制し得る。酵母内で過剰発現されると毒性を抑制することが分かったそれらの遺伝子については、概して、これらの遺伝子の発現及び／またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害することが、例えば、ＡｐｏＥ発現細胞におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の増強をもたらすと予想される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の酵母抑制因子またはそれらのヒト対応物のうちの特定のものの発現または活性の増強が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を増強し得る。
【０１１６】
酵母内で過剰発現されると毒性を増強することが分かったそれらの遺伝子については、概して、これらの遺伝子もしくはそれらのヒト対応物の発現を阻害すること、及び／またはこれらの遺伝子またはそれらのヒト対応物によってコードされるタンパク質の活性を阻害することが、例えば、ＡｐｏＥ発現細胞におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制をもたらすと予想される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の酵母増強因子またはそれらのヒト対応物のうちの特定のものの発現または活性の阻害が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を抑制し得る。酵母内で過剰発現されると毒性を増強することが分かったそれらの遺伝子については、いくつかの実施形態では、これらの遺伝子の発現の増強及び／またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の増強が、例えば、ＡｐｏＥ発現細胞におけるＡｐｏＥ媒介性毒性の増強をもたらすと予想される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の酵母増強因子またはそれらのヒト対応物のうちの特定のものの発現または活性の増強が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を抑制し得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ関連毒性の酵母抑制因子もしくは増強因子またはそのヒト相同体の発現または活性を増強または阻害することの効果は、少なくとも部分的にアイソフォーム特異的であり得る。例えば、酵母抑制因子が、３つのＡｐｏＥアイソフォームのうちの１つまたは２つの毒性を抑制するがその他の毒性を抑制しない場合、その発現または活性またはそのヒト相同体の発現または活性の調節は、この酵母抑制因子が毒性を抑制する特定のアイソフォームのうちの１つ以上によって媒介される毒性にのみ著しく影響する場合がある。いくつかの実施形態では、抑制因子は、ＡｐｏＥ２により誘導される毒性のみを抑制する。いくつかの実施形態では、抑制因子は、ＡｐｏＥ３のみにより誘導される毒性のみを抑制する。いくつかの実施形態では、抑制因子は、ＡｐｏＥ４により誘導される毒性のみを抑制する。いくつかの実施形態では、抑制因子は、２つ以上のアイソフォーム、例えば、ＡｐｏＥ４及び少なくとも１つの他のアイソフォームにより誘導される毒性を抑制する。いくつかの実施形態では、増強因子は、ＡｐｏＥ２により誘導される毒性のみを増強する。いくつかの実施形態では、増強因子は、ＡｐｏＥ３のみにより誘導される毒性のみを増強する。いくつかの実施形態では、増強因子は、ＡｐｏＥ４により誘導される毒性のみを増強する。いくつかの実施形態では、増強因子は、２つ以上のアイソフォーム、例えば、ＡｐｏＥ４及び少なくとも１つの他のアイソフォームにより誘導される毒性を増強する。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ関連毒性の酵母抑制因子もしくは増強因子またはそのヒト相同体の発現または活性を増強または阻害することの効果は、アイソフォーム特異的でない場合がある。換言すると、ＡｐｏＥ関連毒性の酵母抑制因子もしくは増強因子またはそのヒト相同体の発現または活性の調節は、いずれのＡｐｏＥアイソフォームによって媒介される毒性にも著しく影響することになる。いくつかの実施形態では、抑制因子または増強因子は、第１のアイソフォームを発現する酵母菌株において同定され、異なるアイソフォームを発現する菌株において、この異なるアイソフォームにより誘導される毒性を抑制または増強する能力について試験されてもよい。いくつかの実施形態では、任意の１つ以上のＡｐｏＥアイソフォームにより誘導される毒性を調節する（例えば、阻害する）抑制因子または増強因子が同定されてもよい。
【０１１８】
いくつかの態様では、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする第１の核酸に機能的に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現構築物を含む細胞が本明細書に記載され、（ａ）当該細胞は、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体によってコードされるポリペプチドをコードする第２の核酸に機能的に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現構築物をさらに含むか、あるいは（ｂ）当該細胞において、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性が低減または欠如している。いくつかの実施形態では、第１の発現構築物、第２の発現構築物、またはその両方が、細胞のゲノムに組み込まれている。いくつかの実施形態では、第２の核酸によってコードされるポリペプチドは、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子または増強遺伝子によってコードされるタンパク質と、異種ポリペプチド、例えば、検出タンパク質（例えば、蛍光タンパク質、酵素、またはエピトープタグ）などの第２のタンパク質の少なくとも一部分とを含む、キメラタンパク質または融合タンパク質である。したがって、第２の核酸によってコードされるポリペプチドは、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制遺伝子もしくは増強遺伝子によってコードされるタンパク質を含むか、またはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態では、かかる細胞、例えば、酵母細胞または哺乳動物（例えば、ヒト）細胞は、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する（例えば、阻害する）化合物を同定するためのスクリーニングにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、ＡＤの既知の遺伝的危険因子であるヒト相同体を有する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、ＡＤの既知の遺伝的危険因子であるヒト相同体を有しない。本明細書で使用される場合、ＡｐｏＥ媒介性疾患の遺伝的危険因子に関する「既知の」は、その遺伝子またはその１つ以上のバリアントが、本出願の出願日時点でＡｐｏＥ媒介性疾患の遺伝的危険因子として同定されていることを意味する。
【０１１９】
いくつかの態様では、ヒトＡｐｏＥを発現し、かつ、ＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾遺伝子である酵母遺伝子（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている酵母遺伝子）を過剰発現するか、またはその発現が低減もしくは欠如している、酵母細胞が本明細書に記載され、かかる酵母遺伝子のヒト相同体は、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、ＡＤの遺伝的危険因子である。いくつかの実施形態では、かかる酵母細胞は、遺伝的危険因子を保有する罹患対象を治療するのに特に役立つ候補薬剤（例えば、小分子）を同定するための個別化されたモデルとして機能し得る。いくつかの実施形態では、かかる細胞においてスクリーニングを行って、かかる化合物を同定する。例えば、いくつかの実施形態では、酵母遺伝子が過剰発現時にＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子である場合、ＡｐｏＥを発現し、かつその酵母遺伝子の発現が低減または欠如している酵母細胞は、その酵母遺伝子のヒト相同体の危険対立遺伝子を有する対象のためのモデルとして機能し得る。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子が過剰発現時にＡｐｏＥ媒介性毒性の増強因子である場合、ＡｐｏＥを発現し、かつその酵母遺伝子を過剰発現する酵母細胞は、その酵母遺伝子のヒト相同体の危険対立遺伝子を有する対象のためのモデルとして機能し得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥを発現する酵母は、ＡｐｏＥによって撹乱される生物学的経路を同定するため、及び／またはＡｐｏＥ媒介性毒性と相関する表現型を同定するために使用される。そのような生物学的経路またはプロセスにおいて作用する遺伝子及びそれらのコードされたタンパク質は、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する、例えば、抑制するための、有用な標的であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書において（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上において）特定される酵母遺伝子またはヒト対応物と同じ生物学的経路もしくはプロセスにおいて作用するか、あるいはかかる酵母遺伝子またはヒト対応物の発現または活性の内因性阻害因子または活性化因子として作用する遺伝子（及びそれらのコードされたタンパク質）は、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する、例えば、抑制するための、有用な標的であり得る。かかる遺伝子の発現または活性を調節する化合物は、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。いくつかの実施形態では、目的の酵母遺伝子またはヒト対応物と同じ生物学的経路もしくはプロセスにおいて作用する遺伝子（及びそれらのコードされたタンパク質）は、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／にてワールドワイドウェブ（ＷＷＷ）上で利用可能、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ；２５（１）：２５−９（２０００））、ＫＥＧＧ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／にてＷＷＷ上で利用可能、Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｇｏｔｏ，Ｓ．；ＫＥＧＧ：Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２７−３０（２０００）、Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２，Ｄ１９９−Ｄ２０５（２０１４））、ＭｅｔａＣｙｃ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａｃｙｃ．ｏｒｇ／にてＷＷＷ上で利用可能、Ｃａｓｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２：Ｄ４５９−Ｄ４７１  ２０１４）、Ｒｅａｃｔｏｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ／にてＷＷＷ上で利用可能、Ｃｒｏｆｔ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４７２−７，（２０１４））、ＳＴＫＥ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｋｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇにてＷＷＷ上で利用可能）、及びＢｉｏＣａｒｔａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｃｏｍにてＷＷＷ上で利用可能）などの知識基盤を使用して決定され得る。
【０１２１】
例えば、本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾因子として同定されたいくつかの遺伝子は、エンドサイトーシスにおいて機能する。実施例６に記載されているように、ＡｐｏＥを発現する酵母は、撹乱されたエンドサイトーシスを示し、したがって、エンドサイトーシス及びエンドサイトーシス経路に関与する遺伝子が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を緩和する化合物の同定のための標的として同定される。いくつかの実施形態では、エンドサイトーシスに関与するＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子は、ＲＶＳ１６１、ＯＳＨ２、ＲＶＳ１６７、ＹＡＰ１８０２、ＯＳＨ３、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体である。
【０１２２】
本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾因子として同定されたいくつかの遺伝子は、小胞輸送において機能する。いくつかの実施形態では、小胞輸送に関与するＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子は、ＡＴＧ２０、ＵＢＰ３、ＴＲＳ６５、ＢＲＥ５、ＭＵＫ１、ＧＹＰ５、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体である。
【０１２３】
本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾因子として同定されたいくつかの遺伝子は、ユビキチン化／脱ユビキチン化において機能する。いくつかの実施形態では、ユビキチン化／脱ユビキチン化に関与するＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子は、ＡＰＣ１１、ＵＢＰ３、ＵＢＰ７、ＣＤＣ７３、ＢＲＥ５、ＲＲＩ２、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体である。
【０１２４】
本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾因子として同定されたいくつかの遺伝子は、脂質代謝において機能する。いくつかの実施形態では、脂質代謝に関与するＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子は、ＰＥＲ１、ＭＤＨ３、ＧＰＩ８、ＳＭＰ３、ＳＵＲ１、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体である。
【０１２５】
本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子として同定されたいくつかの遺伝子は、ＤＮＡ修復において機能する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復に関与するＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子は、ＭＧＴ１、ＰＣＤ１、ＣＤＣ７３、ＲＡＤ１４、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体である。
【０１２６】
本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子として同定されたいくつかの遺伝子は、ミトコンドリア機構において機能する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア機構に関与するＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子は、ＡＴＧ２０、ＭＨＲ１、ＭＲＰ４、ＲＲＭ３、ＩＬＭ１、ＭＳＴ１，ＹＴＡ１２、ＰＯＲ１、ＭＲＰＬ１０、またはそれらの哺乳動物（例えば、ヒト）相同体である。
【０１２７】
スクリーニングアッセイ
本開示のある特定の態様は、ＡｐｏＥ誘導性毒性を調節する（例えば、阻害する）候補薬剤または遺伝因子についてスクリーニングする方法を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているスクリーニング法は、ＡｐｏＥタンパク質を発現するように遺伝子操作された酵母細胞を使用する。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性疾患を治療するための化合物についてスクリーニングする方法は、（ａ）ＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドを発現するように遺伝子操作された酵母細胞を提供する工程、（ｂ）酵母細胞を候補化合物と接触させる工程、及び（ｃ）酵母細胞を生存能力について評価することを含み、候補化合物の不在下での酵母細胞の生存能力と比較したときの酵母細胞の生存能力の上昇は、候補化合物が候補治療薬であることを示す。核酸、ポリペプチド、小分子化合物、及びペプチド模倣物を含む様々な種類の候補薬剤（「候補化合物」、「被験薬剤」、または「被験化合物」とも称される）が、本明細書に記載されている方法を使用してスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、酵母細胞を候補薬剤と接触させることによって、候補薬剤をスクリーニングすることができる。例えば、酵母細胞は、候補薬剤を含有する液体培地中で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、酵母細胞を、遺伝子産物をコードする核酸構築物と接触させることによって、遺伝子薬剤をスクリーニングすることができる。例えば、ＡｐｏＥ誘導性毒性を調節する遺伝子を同定するために、多様な遺伝子産物を発現するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングしてもよい。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、例えば化学的スクリーニングのために、膜排出ポンプに影響するように、または薬物の透過性を上昇させるように設計された、１つ以上の突然変異を保有する酵母菌株を使用することができる。例えば、ＥＲＧ６遺伝子、ＰＤＲ１遺伝子、ＰＤＲ３遺伝子、及び／またはＰＤＲ５遺伝子内に突然変異を有する酵母菌株が用いられることが想定される。例えば、膜排出ポンプをコードする１個以上の遺伝子または膜排出ポンプをコードする遺伝子（ｅｒｇ６、ｐｄｒ１、ｐｄｒ３、及び／またはｐｄｒ５）の発現を指示する転写因子内に突然変異を有する酵母菌株が、多くのスクリーニングに使用されて、増殖制御因子の同定に成功している（Ｊｅｎｓｅｎ−Ｐｅｒｇａｋｅｓ  ＫＬ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４２：１１６０−７）。酵母は、膜排出ポンプをコードするいずれか１個以上の遺伝子または膜排出ポンプの発現を制御する転写因子の突然変異を保有するように遺伝子操作されていてもよい。いくつかの態様では、ＡｐｏＥタンパク質を発現するように遺伝子操作されており、かつ、膜排出ポンプをコードするいずれか１個以上の遺伝子または膜排出ポンプをコードする遺伝子の発現を指示する転写因子内に突然変異を有する酵母細胞が、本明細書に記載されている。
【０１２９】
酵母の魅力的な一態様は、毒性を緩和する潜在性を有する小分子、遺伝子、ペプチド、及び他の化合物を同定し得る高スループットスクリーニングを行うことの可能性である。毒性スクリーニングは、ＡｐｏＥと相互作用する化合物を選択する能力のみならず、未だ同定されていない標的を含め、それら自体は細胞毒性ではない上流標的または下流標的と相互作用し得る化合物を選択する能力をも有するという利点を有する。したがって、厳密な作用機序に関わらず、本明細書に記載されているスクリーニング法によって同定される薬剤は、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病における治療利益をもたらすことが期待される。
【０１３０】
本明細書に記載されている方法のいずれかを使用してスクリーニングまたは同定される化合物は、様々な化学的分類を含むことができるが、典型的には、５０〜２，５００ダルトンの範囲内の分子量を有する有機小分子が使用され得る。いくつかの実施形態では、この小分子は、質量において約２キロダルトン（ｋＤａ）未満である。いくつかの実施形態では、この小分子は、約１．５ｋＤａ未満、または約１ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態では、この小分子は、約８００ダルトン（Ｄａ）、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、または１００Ｄａ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、非ポリマー性である。いくつかの実施形態では、小分子は、アミノ酸ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、ヌクレオチドではない。いくつかの実施形態では、小分子は、糖類ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、複数の炭素−炭素結合を含有し、１つ以上のヘテロ原子及び／またはタンパク質との構造的相互作用（例えば、水素結合）に重要な１つ以上の官能基、例えば、アミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、そしていくつかの実施形態では少なくとも２つの官能基を含むことができる。小分子は、上記の官能基のうちの１つ以上で任意に置換される、１つ以上の環状炭素もしくは複素環式構造及び／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む場合が多い。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、化合物には、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体または構造類似体、ポリヌクレオチド、核酸アプタマー、及びポリヌクレオチド類似体を含むがこれらに限定されない、生体分子が含まれ得る。
【０１３２】
化合物は、化合物ライブラリ、天然物ライブラリ、及び、ランダムペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリを含む、いくつかの潜在源から同定することができる。化合物ライブラリは多様な化学構造物からなり、その一部は、既知の化合物の類似体、あるいは他の創薬スクリーニングで「ヒット」もしくは「リード」として同定された類似体または化合物であり、その他は天然物から得られ、さらに他のものは、非指向性合成有機化学から発生する。天然物ライブラリは、微生物、動物、植物、または海洋生物のコレクションであり、これらは、（１）土壌、植物、もしくは海洋微生物からのブロスの発酵及び抽出、または（２）植物もしくは海洋生物の抽出によって、スクリーニング用の混合物を生成するために使用される。天然物ライブラリは、ポリペプチド、非リボソームペプチド、及びそれらのバリアント（非天然）を含む。概要については、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−６８（１９９８）を参照されたい。コンビナトリアルライブラリは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物から混合物として構成される。これらのライブラリは、従来の自動合成法、ＰＣＲ、クローニング、または独自の合成法によって、比較的容易に調製される。関心対象の化合物ライブラリには、非ペプチドコンビナトリアルライブラリ、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、多重並行合成物コレクション、組換え体、及びポリペプチドライブラリが含まれる。コンビナトリアルケミストリー及びそれから生成されるライブラリの概要については、Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照されたい。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、スクリーニングされる候補薬剤は、天然の化合物であっても人工化合物であってもよい。ある特定の実施形態では、候補薬剤は、合成または天然化合物の大きなライブラリからスクリーニングすることができる。一例は、ヒトが使用することができるＦＤＡ認可化合物のライブラリである。加えて、化合物ライブラリは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＡＫｏｓ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ａｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ａｕｒｏｒａ（Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｂｉｏｎｅｔ（Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ，ＵＫ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣｈｅｍＤｉｖ，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｌｏｃｋ  Ｌｔ，（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｔｄ（Ｏｂｎｉｎｓｋ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｅｎａｍｉｎｅ（Ｋｉｅｖ，Ｕｋｒａｉｎｅ）、Ｅｖｏｔｅｃ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ，ＮＪ）、Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｏｔａｖａ，（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）、ＰｈａｒｍＥｘ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｏｓｓｉｐｅｅ，ＮＨ）、Ｓｐｅｃｓ（Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＴｉｍＴｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ  ＯＮ）、ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｋｉｅｖ，Ｕｋｒａｉｎｅ）、Ｖｉｔａｓ−Ｍ，（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｚｅｌｉｎｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、及びＢｉｃｏｌｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を含むがこれらに限定されない、いくつかの企業から市販されている。コンビナトリアルライブラリも利用可能であり、調製することができる。細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物、発酵ブロス（例えば、土壌、細菌、または真菌の発酵ブロス）の形態の天然化合物のライブラリは、市販されており、または当該技術分野において周知の方法によって容易に調製することができる。いくつかの実施形態では、ライブラリは、例えば、少なくとも１００種、少なくとも１，０００種、少なくとも１０，０００種、少なくとも１００，０００種、少なくとも２５０，０００種の化合物、少な���とも５００，０００種以上の化合物、例えば、最大１００万〜２００万種、またはそれよりも多くの化合物を含んでもよい。化合物は、マルチウェルプレート内に配されてもよい。それらは、溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中に溶解されても、乾燥形態で、例えば、粉体または固体として提供されてもよい。
【０１３４】
例えば、本明細書におけるものなどのライブラリの使用による、被験化合物の同定によって、その後に被験化合物「ヒット」または「リード」を修飾して、「ヒット」または「リード」がＡｐｏＥ媒介性毒性を予防もしくは抑制し、かつ／またはアミロイドβ媒介性毒性を予防もしくは抑制する能力を最適化することが可能となる。そのような最適化は、本開示の一態様である。例えば、スクリーニングにおいてヒットとして同定された化合物の類似体を得ること（例えば、合成すること）が可能である。いくつかの実施形態では、あるヒットの複数の類似体が、例えば、そのヒットと比べて１つ以上の変更された特性（例えば、物理化学特性、薬物動態特性、及び／または薬力特性）、例えば、１つ以上の改善された特性を有する類似体を同定するために試験される。特性の改善は、例えば、効力の上昇、標的タンパク質に対する結合親和性の上昇、オフターゲット効果の低減、非標的分子に対する親和性の低下、毒性の低減、半減期の増加、生体利用能の上昇（例えば、経口生体利用能の上昇）、安定性の上昇（インビトロ及び／またはインビボ）、溶解性の上昇（例えば、水溶性の上昇）、血液脳関門を横断する能力の上昇（例えば、そのような通過が神経変性疾患の治療に有用な場合）、血漿タンパク質結合性の上昇または低下（ある特定の実施形態ではこれらのいずれかが望ましい場合がある）などであり得る。最適化は、ヒット構造の経験的修飾（例えば、関連する構造を有する化合物を合成し、それらを、細胞不含もしくは細胞ベースのアッセイにおいて、または非ヒト動物において試験すること）によって、医薬品化学の確立された原理を使用して、計算的手法を使用して、またはそれらの組み合わせによって、達成することができる。いくつかの実施形態では、ヒット化合物の構造を検査してファルマコフォアを同定し、これを使用して、さらなる化合物を設計することができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ関連毒性に対する化合物の作用は、少なくとも部分的にアイソフォーム特異的であり得る。例えば、化合物は、３つのＡｐｏＥアイソフォームのうちの１つまたは２つの毒性を調節（例えば、阻害）するが、その他の毒性は調節（例えば、阻害）しない。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡｐｏＥ２により誘導される毒性のみを阻害する。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡｐｏＥ３により誘導される毒性のみを阻害する。いくつかの実施形態では、化合物は、ＡｐｏＥ４により誘導される毒性のみを阻害する。いくつかの実施形態では、化合物は、２つ以上のアイソフォーム、例えば、ＡｐｏＥ４及び少なくとも１つの他のアイソフォームにより誘導される毒性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ関連毒性に対する化合物の作用は、アイソフォーム特異的でない場合がある。換言すると、その化合物は、いずれのＡｐｏＥアイソフォームによって媒介される毒性にも著しく影響する（例えば、それを阻害する）。いくつかの実施形態では、化合物は、第１のアイソフォームを発現する酵母菌株において、ＡｐｏＥ媒介性毒性の調節因子、例えば、阻害因子として同定され、異なるアイソフォームを発現する菌株において、この異なるアイソフォームにより誘導される毒性を阻害または増強する能力について試験されてもよい。いくつかの実施形態では、任意の１つ以上のＡｐｏＥアイソフォームにより誘導される毒性を調節する（例えば、阻害する）化合物が同定されてもよい。
【０１３６】
実施例６に詳述されるように、酵母細胞におけるＡｐｏＥの発現は、エンドサイトーシスの欠陥をもたらした。この生物学的所見に加えて、遺伝子スクリーニングにおいて同定されたいくつかの毒性抑制因子が、エンドサイトーシスにおいて機能するタンパク質をコードする。したがって、２つの明確に異なる手法が、エンドサイトーシスの欠陥をＡｐｏＥ媒介性毒性の細胞内影響として同定する。酵母細胞におけるエンドサイトーシスを測定するための例示的なアッセイが、実施例６に記載されている。このアッセイでは、正常に細胞内に取り込まれる（例えば、適切な条件下における）野生型タンパク質（例えばメチオニントランスポーターＭＵＰ１など）のエンドサイトーシスをモニタリングする。本明細書に詳述されるように、ＡｐｏＥの発現は、ＭＵＰ１のエンドサイトーシスを阻害する。スクリーニング法を行って（例えば、本明細書に記載されている候補薬剤を使用して）、ＡｐｏＥを発現する細胞においてエンドサイトーシスを調節する（増加または減少させる）化合物を同定することができる。エンドサイトーシスを増加させる化合物は、ＡｐｏＥ媒介性毒性の低減及びＡｐｏＥ媒介性疾患の治療のための候補治療薬となることが予想される。エンドサイトーシスを測定するために（本明細書に記載されているスクリーニング法で）使用され得るさらなるアッセイは、当該技術分野で既知である。
【０１３７】
本明細書に記載されているように試験または同定される化合物は、任意の化学的または生物学的方法によって合成することができる。本明細書に記載されているように試験または同定される化合物は、純粋であってもよく、または１つ以上のさらなる成分を含有する組成物中に存在してもよい。化合物は、アッセイで、生理学的に、または薬学的に許容される希釈剤もしくは担体（以下参照）中で調製することができる。
【０１３８】
本開示のある特定の実施形態は、遺伝子スクリーニングに関する。例えば、ゲノムライブラリ、読み取り枠ライブラリ、及び破壊ライブラリをスクリーニングして、ＡｐｏＥ誘導性毒性の遺伝子外抑制因子または増強因子を見出すことができる。過剰発現または破壊される特定の遺伝子を決定することができる。いくつかの実施形態では、増殖する能力が低減または増強している個別の形質転換体が単離され、形質転換体内で過剰発現または破壊される特定の遺伝子が決定される。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、例えば、実施例に記載されているように、プールスクリーニングが行われ得る。ある特定の実施形態では、プールスクリーニングは、プロモーターの制御下の個別の読み取り枠を各々が含むベクターのプールで形質転換されている酵母細胞を同時培養する工程を含む。適切なレベル（すなわち、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子の不在下で毒性を検出可能に誘導するのに十分であろうレベル）でＡｐｏＥが発現される条件下にて、好適な期間にわたって細胞を培養した後、ＤＮＡを採取し、高スループット配列決定を行って、ＡｐｏＥ発現が誘導されなかった対照培養物中でのＯＲＦの提示と比較して、培養物中で過剰提示された、または提示不足のＯＲＦを同定する。ある特定の実施形態では、プールスクリーニングは、個別のＯＲＦの破壊を保有する酵母細胞を同時培養する工程を含む。この破壊は、破壊されたＯＲＦの同定を可能にする分子バーコードとして機能する、明確に異なるＤＮＡセグメントの挿入を含んでもよい。
【０１４０】
スクリーニング（例えば、化合物についての及び／または抑制因子もしくは増強因子についての）は、多様な異なる条件下で行うことができる。所望の場合、化合物は、多様な増殖条件下で、かつ多様な遺伝的背景においてスクリーニングすることができる。例えば、多様な異なる培養培地を使用することができる。培養培地は、異なる炭素源、例えば、グルコース、グリセロール、ガラクトース、ラフィノースなどの異なる糖を含有することができる。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、またはそれよりも多くの異なる培養条件（例えば、異なる炭素源を含有する培養培地）を使用して、複数のスクリーニングが行われ、少なくとも２つの異なる培養条件下で「ヒット」として同定された化合物または遺伝子が同定される。
【０１４１】
ある特定の実施形態は、酵母系で同定された候補薬剤（例えば、小分子）を１つ以上の他のモデル系で試験することを含む方法を提供する。かかるモデル系としては、細胞ベースのモデル、例えば、哺乳動物細胞、ならびに蠕虫、ハエ、及び非ヒト哺乳動物モデルなどのインビボ動物モデルが挙げられるが、これらに限定されない。非哺乳動物細胞または生物は、ヒトＡｐｏＥを含むポリペプチドを発現するように遺伝子操作されていてもよい。非ヒト哺乳動物細胞または生物は、任意のヒトＡｐｏＥアイソフォームを含むポリペプチドを発現するように、またはその生物において天然である内因性ＡｐｏＥ対応物を含むポリペプチドを過剰発現するように、遺伝子操作されていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、成熟ヒトＡｐｏＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、成熟ヒトＡｐｏＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、または成熟ヒトＡｐｏＥ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に融合された、ヒトＡｐｏＥシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、成熟ヒトＡｐｏＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、成熟ヒトＡｐｏＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、または成熟ヒトＡｐｏＥ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に融合された、ヒトインスリン前タンパク質シグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト生物に天然であるタンパク質由来のシグナル配列が使用され得る。例えば、マウスまたはラットなどの非ヒト哺乳動物由来のシグナル配列が使用され得る。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物由来のシグナル配列は、その生物に天然であるＡｐｏＥまたはインスリン分泌シグナル配列である。マウスＡｐｏＥ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ１１８１６を有する。ラットＡｐｏＥ遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ  ２５７２８を有する。
【０１４２】
ヒト細胞は、いずれのＡＰＯＥ遺伝子型のものであってもよい。いくつかの実施形態では、それらは、任意のヒトＡｐｏＥアイソフォームを過剰発現し、かつ／または任意のＡｐｏＥ突然変異を誘導するように遺伝子操作されていてもよい。細胞は、神経前駆細胞、神経細胞、グリア前駆細胞、グリア細胞、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、ＡＤを患う対象から得られてもよい。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）からのリプログラミングによって、または分化転換によって得られてもよい。以下にさらに記載されているヒト細胞を得る方法または遺伝子操作する方法を使用して、その細胞を得るかまたは遺伝子操作してもよい。
【０１４３】
ある特定の実施形態は、酵母においてＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾遺伝子として同定されている遺伝子及びタンパク質、例えば、他のモデル系で本明細書において特定された遺伝子及びタンパク質（及び／またはそれらの対応物）を試験することを含む方法を提供する。例えば、ＡｐｏＥ誘導性毒性の修飾遺伝子として同定された酵母遺伝子の蠕虫、ハエ、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）対応物が、それぞれ、蠕虫、ハエ、齧歯動物、または、そのような種類の生物から得られる細胞（例えば、初代細胞または細胞株、例えば、不死化細胞株）において過剰発現または阻害もしくは無効化されることができ、あるいは、対応物であるヒト遺伝子が、非ヒト細胞または非ヒト動物において過剰発現されることができる。いくつかの態様では、本発明は、かかる非ヒト動物及び細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、単離された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、動物から単離された初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞株が使用される。細胞は、任意のアイソフォームのヒトＡｐｏＥを発現するように遺伝子操作されていてもよい。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾遺伝子である酵母遺伝子のヒト相同体を発現もしくは過剰発現するように、または当該ヒト相同体の発現が低減するかもしくは当該発現を欠くように、遺伝子操作されていてもよい。ヒト細胞は、様々な実施形態において任意のＡＰＯＥ遺伝子型を有し得る。それらは、任意のＡＰＯＥ対立遺伝子に対してホモ接合性であってもヘテロ接合性であってもよい。
【０１４５】
「遺伝子操作された細胞」及び「遺伝子改変された細胞」という用語には、遺伝子改変をもたらす手段に供される細胞、ならびにその修飾を受け継ぐそれらの子孫が含まれることは理解されよう。同様に、「遺伝子操作された生物」及び「遺伝子改変された生物」には、遺伝子改変をもたらす手段に供される生物、ならびにその修飾を受け継ぐそれらの子孫が含まれる。
【０１４６】
いくつかの態様では、選択された標的遺伝子またはそれらのタンパク質産物の発現または活性を調節する（すなわち、上昇または低下させる）化合物を同定するための方法（本明細書において「標的遺伝子スクリーニングアッセイ」とも称される）が、本明細書に記載されている。かかる化合物としては、例えば、ポリペプチド、ペプチド、抗体、ペプチド模倣物、ペプトイド、無機小分子、非核酸有機小分子、核酸（例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド）、炭水化物、あるいは、標的タンパク質に結合するか、または例えば、標的遺伝子の発現もしくは標的タンパク質の活性に対して刺激作用もしくは阻害作用を有する、他の薬剤が挙げられる。上述の被験化合物及び／または化合物ライブラリのいずれも、標的遺伝子スクリーニングアッセイに使用され得る。こうして同定された化合物は、治療プロトコルにおいて、かつ／またはさらなるスクリーニング法において、標的遺伝子または標的タンパク質の発現または活性を調節するために使用することができる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本発明の標的遺伝子スクリーニングアッセイは、被験試料（すなわち、標的核酸または標的タンパク質を含有する試料）中の標的核酸または標的タンパク質の発現または活性に対する被験化合物の作用をアッセイすることを伴う。被験化合物の存在下での発現または活性は、対照試料（すなわち、同じ条件下だが被験化合物を用いずにインキュベートされている標的タンパク質を含有する試料）における発現または活性と比較され得る。対照と比較した被験試料中での標的核酸または標的タンパク質の発現または活性の変化は、その被験化合物が標的核酸または標的タンパク質の発現または活性を調節し、候補薬剤であることを示す。化合物は、本明細書に記載されている標的タンパク質によって媒介される１つ以上の活性を調節するそれらの能力について試験され得る。例えば、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている遺伝子の発現またはタンパク質の活性を調節する化合物は、ＡｐｏＥを発現する細胞において毒性を調節するそれらの能力について試験され得る。そのような活性について化合物をアッセイする方法は、当該技術分野で既知である。場合により、化合物は、標的遺伝子の発現もしくは標的タンパク質への結合に直接影響するその能力（例えば、細胞内の標的ＲＮＡの量を低下させること、または細胞内の標的タンパク質の量を低下させることによる）について試験され、かつ／または代謝作用もしくは標的タンパク質に関連する表現型を調節するその能力について試験される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、細胞内の標的タンパク質またはその生物活性部分の基質である候補または被験分子をスクリーニングするためのアッセイが提供される。いくつかの実施形態では、アッセイは、標的タンパク質に結合するか、または標的タンパク質もしくはその生物活性部分の活性を調節する、候補または被験化合物をスクリーニングするためのものである。かかる化合物には、標的タンパク質とそのリガンドまたは受容体との間の相互作用を妨害するものが含まれる。いくつかの実施形態では、アッセイは、かかる化合物を同定するためのスクリーニングを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、細胞ベースアッセイが用いられ、このアッセイでは、標的タンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を、被験化合物と接触させる。その後、標的タンパク質の発現または活性を調節する被験化合物の能力が判定される。この細胞は、例えば、酵母細胞または哺乳動物起源の細胞、例えば、ラット、マウス、またはヒト細胞であってもよい。
【０１５０】
被験化合物が標的タンパク質に結合する能力、または化合物（例えば、標的タンパク質基質）に対する標的タンパク質の結合を調節する能力を評価することもできる。これは、例えば、標的タンパク質に対する化合物（例えば基質）の結合性が、複合体内で標識された化合物（例えば基質）を検出することによって判定され得るように、化合物（例えば基質）を、放射性同位体または酵素標識とカップリングすることによって、達成することができる。あるいは、標的タンパク質を放射性同位体または酵素標識とカップリングして、複合体内の標的タンパク質基質に対する標的タンパク質の結合性を調節する被験化合物の能力をモニタリングすることもできる。例えば、化合物（例えば、標的タンパク質基質）は、直接的か間接的かを問わず、１２５１、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識することができ、放射性同位体は、放射線放出（ｒａｄｉｏｅｍｉｓｓｉｏｎ）の直接計測によって、またはシンチレーション計測によって検出される。あるいは、化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識することができ、酵素標識は、適切な基質の産物への変換率の決定によって検出される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、化合物が細胞内または細胞表面で標的タンパク質と相互作用する能力は、相互作用物のいずれをも標識することなく評価され得る。例えば、様々なイオンの細胞内濃度、代謝物、ｐＨ、または他のパラメータの変化が、好適な指示薬（例えば、イオン感応性またはｐＨ感応性のタンパク質もしくは小分子）を使用して検出され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、細胞不含アッセイが提供され、このアッセイでは、標的タンパク質またはその生物活性部分を被験化合物と接触させて、標的タンパク質またはその生物活性部分に結合する被験化合物の能力を評価する。概して、本明細書に記載されているアッセイで使用される標的タンパク質の生物活性部分には、他の分子との相互作用に関与する断片、例えば、高い表面確率スコアを有する断片が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞不含アッセイは、標的タンパク質と被験化合物との反応混合物を、この２つの成分が相互作用及び結合し、その結果、除去及び／または検出され得る複合体を形成することを可能にする条件下で、かつそれに十分な時間で、調製することを伴う。２つの分子間の相互作用は、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を使用して検出することもできる（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照されたい）。第１の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、その放出された蛍光エネルギーが第２の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収され、次にそれが、吸収されたエネルギーに起因して蛍光を発することができるように、選択される。代替的に、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを使用してもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」のものから区別され得るように、異なる波長の光を発する標識が選択される。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てる距離に関連するため、分子間の空間的関係を評定することができる。分子間で結合が起こる状況では、このアッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光発光は最大となるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当該技術分野において周知である標準的な蛍光定量的検出手段（例えば、蛍光光度計の使用）によって簡便に測定することができる。
【０１５３】
別の実施形態では、標的タンパク質が標的分子に結合する能力は、リアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）を使用して判定することができる（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６３：２３３８−２３４５，１９９１、及びＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５：６９９−７０５，１９９５）。「表面プラズモン共鳴法」または「ＢＩＡ」は、相互作用物のいずれをも標識することなく、生体特異的相互作用を実時間で検出する（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。結合表面における質量の変化（結合事象の兆候）は、表面付近の光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらし、生体分子間の実時間の反応の指標として使用することができる検出可能シグナルがもたらされる。
【０１５４】
これらのうち様々なアッセイにおいて、標的タンパク質または被験物質は、固相上に固着される。固相上に固着された標的タンパク質／被験化合物複合体は、反応の最後に検出され得る。概して、標的タンパク質は固体表面上に固着され、被験化合物（これは固着されない）は、直接的か間接的かを問わず、本明細書において考察される検出可能な標識で標識することができる。標的タンパク質、抗標的タンパク質抗体、またはその標的分子のいずれかを固定化して、タンパク質の一方または両方の複合形態から非複合形態への分離を促進すること、ならびにアッセイの自動化に順応することが望ましい場合がある。標的タンパク質に対する被験化合物の結合、または被験化合物の存在下及び不在下における標的分子との標的タンパク質の相互作用は、反応物質を収容するのに好適な任意の反応槽内で達成することができる。そのような反応槽の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管が挙げられる。一実施形態において、タンパク質の一方または両方がマトリクスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的タンパク質の融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸収させることができ、これらはその後、被験化合物または被験化合物、及びいずれかの吸収されていない標的タンパク質と組み合わされる。次いでこの混合物は、複合体形成に貢献する条件下で（例えば、塩及びｐＨの生理条件で）インキュベートされる。インキュベーション後、このビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄してあらゆる未結合の成分を除去し、ビーズの場合はマトリクスが固定化され、例えば上述のように複合体が直接的か間接的かを問わず決定される。あるいは、複合体は、マトリクスから解離することができ、標準的技法の使用により標的タンパク質の結合または活性のレベルが判定される。標的タンパク質をマトリクス上に固定化するための他の技法には、ビオチンとストレプトアビジンとの抱合が含まれる。ビオチン化された標的タンパク質は、当該技術分野で既知の技法の使用によりビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−サクシニミド）から調製され、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレートのウェル内に固定化され得る。このアッセイを行うためには、固定化されていない成分を、固着された成分を含有する被覆表面に添加する。反応が完了した後、形成されたあらゆる複合体が固体表面上に固定化されたまま残るような条件下で、未反応の成分を（例えば、洗浄により）除去する。固体表面上に固着された複合体は、いくつかの方法で検出することができる。それまでに固定化されていない成分が事前標識されている場合、表面上に固定化された標識の存在は、複合体が形成されたことを示す。それまでに固定化されていない成分が事前標識されていない場合、間接標識を使用して、例えば、固定化された成分に特異的な標識抗体を使用することで、表面上に固着され���複合体を検出することができる（抗体は次に、例えば、標識抗Ｉｇ抗体で直接的に標識するか、または間接的に標識することができる）。
【０１５５】
場合により、このアッセイは、標的タンパク質と反応性であるが、標的タンパク質がその標的分子に結合することに干渉しない抗体を用いて行われる。そのような抗体は、プレートのウェルに誘導体化することができ、未結合の標的タンパク質が、抗体抱合によってウェル内に捕捉される。ＧＳＴ固定化複合体に関して上述したものに加えて、かかる複合体を検出するための方法には、標的タンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用した複合体の免疫検出、ならびに標的タンパク質に関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【０１５６】
あるいは、細胞不含アッセイを液相で行うことができる。そのようなアッセイでは、反応産物は、分画遠心法（例えば、Ｒｉｖａｓ  ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１８：２８４−７，１９９３を参照されたい）、クロマトグラフィ（ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ）、電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）、及び免疫沈降（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）を含むがこれらに限定されない、いくつかの標準的技法のいずれかによって、未反応の成分から分離される。そのような樹脂及びクロマトグラフィ技法は、当業者に既知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，１１：１４１−１４８，１９９８、Ｈａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．，６９９：４９９−５２５，１９９７）。さらに、蛍光エネルギー移動もまた、溶液から複合体をさらに精製することなく結合を検出するために、本明細書に記載されているように簡便に用いられ得る。
【０１５７】
このアッセイには、標的タンパク質またはその生物活性部分を標的タンパク質に結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させる工程、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる工程、及び被験化合物が標的タンパク質と相互作用する能力を判定する工程が含まれ得、被験化合物が標的タンパク質と相互作用する能力を判定する工程には、被験化合物が、既知の化合物と比較して、標的タンパク質もしくはその生物活性部分に優先的に結合する能力、または標的分子の活性を調節する能力を判定する工程が含まれる。
【０１５８】
標的タンパク質は、インビボで、１つ以上の細胞巨大分子または細胞外巨大分子、例えばタンパク質などと相互作用することができる。この考察の目的では、そのような細胞巨大分子及び細胞外巨大分子は、本明細書において「結合パートナー」と称される。そのような相互作用を妨害する化合物は、標的タンパク質の活性を制御するのに有用である。かかる化合物としては、抗体、ペプチド、及び小分子などの分子を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、相互作用を妨害する薬剤の同定に使用するための標的タンパク質は、本明細書において特定される標的タンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明は、標的タンパク質または標的タンパク質と同じ生物学的経路もしくはプロセスで機能する別のタンパク質の下流エフェクターの活性の調節によって標的タンパク質の活性を調節する、被験化合物の能力を判定するための方法を提供する。例えば、適切な標的におけるエフェクター分子の活性、または適切な標的に対するエフェクターの結合は、本明細書に記載されているように判定することができる。標的タンパク質とその結合パートナー（複数下）との間の相互作用に干渉する化合物を同定するためには、標的タンパク質及び結合パートナーを含有する反応混合物を、この２つの産物が複合体を形成することを可能にする条件下で、かつそれに十分な時間で調製する。阻害性薬剤を試験するためには、被験化合物の存在下での反応混合物（被験試料）及びその不在下での反応混合物（対照試料）を準備する。被験化合物は、初めに反応混合物中に含めることもでき、または、標的遺伝子及びその細胞性もしくは細胞外結合パートナーを後に添加する時に添加することもできる。対照反応混合物は、被験化合物を伴わずに、または対照化合物と共にインキュベートする。次いで、標的タンパク質と細胞性または細胞外結合パートナーとの複合体の形成を検出する。対照反応物における複合体の形成、及び被験化合物を含有する反応混合物においてより少ない複合体の形成は、その化合物が、標的タンパク質と相互作用的な結合パートナーとの相互作用に干渉することを示す。かかる化合物は、発現または活性または標的タンパク質を阻害するための候補化合物である。付加的に、被験化合物及び正常な標的タンパク質を含有する反応混合物における複合体形成を、被験化合物及び変異体の標的遺伝子産物を含有する反応混合物における複合体形成と比較することもできる。この比較は、変異体の相互作用を妨害するが正常な標的タンパク質の相互作用は妨害しない化合物を同定することが望ましい場合に重要となり得る。
【０１５９】
結合アッセイは、液相で行うことも異種形式で行うこともできる。異種アッセイ系の一種では、標的タンパク質または相互作用的な細胞性もしくは細胞外結合パートナーのいずれかが、固体表面（例えば、マイクロタイタープレート）上に固着され、一方で、固着されない種は、直接的か間接的かを問わず標識される。固着された種は、非共有結合または共有結合によって固定化することができる。あるいは、固着させる種に特異的な固定化抗体を使用して、その種を固体表面に固着させることもできる。このアッセイを行うためには、固定化される種のパートナーを、被験化合物の存在下または非存在下で被覆表面に曝露する。反応が完了した後、未反応の成分は（例えば、洗浄により）除去され、形成されたあらゆる複合体が、固体表面に固定化されたまま残る。固定化されていない種が事前標識されている場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。固定化されていない種が事前標識されていない場合、間接標識を使用して、例えば、初めは固定化されない種に特異的な標識抗体を使用することで、表面上に固着された複合体を検出することができる（抗体は次に、例えば、標識抗Ｉｇ抗体で直接的に標識するか、または間接的に標識することができる）。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する被験化合物を検出することができる。
【０１６０】
別の実施形態では、標的発現の調節因子（ＲＮＡまたはタンパク質）が同定される。例えば、細胞または細胞不含混合物を被験化合物と接触させて、標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を、被験化合物の不在下での標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと相対的に評価する。標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が被験化合物の不在下よりもその存在下で多い場合、この被験化合物は、標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激因子（候補化合物）として同定される。あるいは、標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が被験化合物の不在下よりもその存在下で少ない（統計的に有意に少ない）場合、この被験化合物は、標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の阻害因子として同定される。標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、本明細書に記載されている方法及び当該技術分野で既知の方法、例えば、それぞれ、標的ｍＲＮＡを検出するためのノーザンブロット、マイクロアレイハイブリダイゼーション、逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、もしくはＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）、または標的タンパク質を検出するためのウェスタンブロットもしくはイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、蛍光標識抗体、ＳＰＲ）などによって判定することができる。
【０１６１】
別の態様では、本明細書に記載されている方法は、本明細書に記載されているアッセイの２つ以上の組み合わせに関連する。例えば、調節剤は、細胞ベースまたは細胞不含のアッセイを使用して同定することができ、この薬剤が標的タンパク質の活性を調節する能力は、インビボで、例えば、動物において確認することができる。動物は、例えば、正常な動物であっても、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病の動物モデルであってもよい。
【０１６２】
本発明の態様はさらに、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイによって同定された薬剤に関連する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているように同定された薬剤（化合物）（例えば、標的タンパク質調節剤、ｓｉＲＮＡ、標的タンパク質特異性抗体、または標的タンパク質結合パートナー）は、かかる薬剤を用いた治療の有効性、毒性、副作用、または作用機序を判定するために適切な動物モデルにおいて試験される。さらに、上述のスクリーニングアッセイによって同定された薬剤は、本明細書に記載されているように治療に使用することができる。標的タンパク質の発現または活性を調節する化合物（標的タンパク質調節因子）は、その標的タンパク質（例えば、標的タンパク質の発現または活性の低下）と関連する生物学的または生化学的作用に影響する能力について、当該技術分野で既知の方法及び本明細書に記載されている方法の使用により試験することができる。例えば、化合物がＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する能力は、アルツハイマー病のインビトロまたはインビボモデルを使用して試験することができる。
【０１６３】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナー
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法が、本明細書に開示される。前出の酵母細胞もしくは哺乳動物（例えば、ヒト）細胞のいずれか、または本明細書に記載されている任意の酵母細胞もしくは哺乳動物（例えば、ヒト）細胞が、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法において使用され得る。ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーは、内因性ポリペプチドであってもよい。本明細書で使用される場合、「内因性タンパク質」は、生物、組織、または細胞内に起源をもつタンパク質である。典型的には、内因性タンパク質は、例えば、生物の野生型ゲノムによってコードされる、天然のタンパク質である。他の実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーは、内因性脂質であってもよい。本明細書で使用される場合、「内因性脂質」は、生物、組織、または細胞内に起源をもつ脂質である。典型的には、内因性脂質は、天然の脂質である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーは、本明細書に記載されている標的タンパク質と見なされてもよい。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーは、治療標的候補であってもよい。
【０１６４】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法であって、本明細書に記載されている細胞を提供する工程；ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程；及びポリペプチドに結合する内因性ポリペプチドまたは内因性脂質を同定する工程であって、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーが同定される、工程；を含む方法が、本明細書に開示される。
【０１６５】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法であって、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む酵母細胞を提供する工程；核酸の発現を可能にする条件下にて酵母細胞を培養する工程；及びポリペプチドに結合する内因性酵母ポリペプチドを同定する工程であって、それによってヒトＡｐｏＥタンパク質結合パートナーが同定される、工程；を含む方法も、本明細書に開示される。
【０１６６】
ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法であって、ヒトＡｐｏＥタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸を、当該核酸の発現を可能にする条件下にて酵母細胞において発現させる工程；及びポリペプチドに結合する内因性脂質または内因性ポリペプチドを同定する工程；を含む方法も、本明細書に開示され、該同定する工程は、（ｉ）ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体を単離する工程；及び（ｉｉ）ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性脂質または内因性ポリペプチドを質量分析によって同定する工程であって、それによって内因性脂質または内因性ポリペプチドがヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーとして同定される、工程を含む。
【０１６７】
ヒトＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４から選択され得る。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ２である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ３である。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ４である。本明細書に記載されているかまたは当該技術分野で既知であるヒトＡｐｏＥタンパク質もしくはそのバリアントのうちのいずれも、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法において使用され得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥ結合タンパク質を含むポリペプチドは、検出可能なマーカーを含む。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質またはエピトープタグである。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質である。本明細書に記載され、かつ／または当該技術分野で既知である蛍光タンパク質のうちのいずれも、本発明の方法において使用され得る。他の実施形態では、検出可能なマーカーは、エピトープタグである。いくつかの実施形態では、エピトープタグは、タンデムアフィニティー精製タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、Ｖ５タグ、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、キチン結合タンパク質タグ、カルモジュリンタグ、Ｅタグ、ＳＰＢタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＶＳＶタグ、Ｆｃ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、及びＦＬＡＧタグからなる群より選択される。しかしながら、他の好適なエピトープタグが当該技術分野で知られており、本発明の方法において使用され得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法は、細胞を溶解して抽出物を生成することを伴い得る。任意の好適な細胞溶解方法が、本発明の方法において使用され得る。当業者は、異なる細胞が異なる好適な細胞溶解方法を有することを認識している。酵母細胞の溶解は、例えば、機械的溶解（例えば、ビーズ叩解（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｉｎｇ）または乳鉢及び乳棒を用いた凍結酵母細胞の粉砕）、液体均質化（例えば、フレンチプレス）、超音波処理、酵素消化（例えば、ザイモリアーゼもしくはリチカーゼによる、またはアルカリ（例えば、ＮａＯＨ）溶解などを伴い得る。哺乳動物細胞の溶解は、例えば、洗剤ベースの細胞溶解、機械的溶解（例えば、Ｗａｒｉｎｇブレンダー）、液体均質化（例えば、フレンチプレス、ダウンス型ホモジナイザー）、超音波処理、凍結融解などを伴い得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抽出物からヒトＡｐｏＥタンパク質を単離してヒトＡｐｏＥ複合体を形成させることを伴う。タンパク質を単離する任意の好適な方法が、本発明の方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質を単離する工程は、共免疫沈降、同時精製、アフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、またはイオン交換クロマトグラフィを含む。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーが、抽出物からヒトＡｐｏＥタンパク質を単離する際に使用される。他の実施形態では、ヒトＡｐｏＥタンパク質に特異的に結合する抗体が、例えば、免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィによるヒトＡｐｏＥタンパク質の単離に使用される。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性ポリペプチドを同定する工程を伴う。例えば、ウェスタンブロット、質量分析、エドマン分解など、内因性ポリペプチドを同定するための任意の好適な方法が、本発明の方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性ポリペプチドを同定する工程は、質量分析またはエドマン分解を含む。質量分析（ＭＳ）の任意の好適な方法、例えば、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析）、及び液体クロマトグラフィ（ＬＣ）−ＭＳ、例えば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、内因性ポリペプチドを同定してもよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ヒトＡｐｏＥタンパク質複合体内に存在する内因性脂質を同定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、内因性脂質を同定する工程は、質量分析を含む。他の実施形態では、内因性脂質を同定する工程は、代謝標識及び薄層クロマトグラフィを含む。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）質量分析、及びガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を含む、質量分析の任意の好適な方法を使用して、内因性脂質を同定してもよい。
【０１７３】
本発明の方法によって同定されるヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーは、ＡｐｏＥ関連疾患の治療のための治療標的候補であってもよい。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ関連疾患は、ＡｐｏＥ４関連神経変性疾患である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４関連疾患は、アルツハイマー病、血管性認知障害、脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、または多発性硬化症である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡｐｏＥ媒介性毒性に関与する生物学的プロセスまたは生物学的経路を、本発明の工程によって同定された結合パートナーの同一性に基づいて同定する工程をさらに含んでもよい。
【０１７４】
標的遺伝子またはタンパク質の発現または活性の調節因子
標的遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する方法は、多様な化合物を使用して達成することができる。標的タンパク質の発現または活性を阻害または増強するために有用であり得る化合物には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、非核酸有機小分子、無機小分子、抗体またはその断片、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びリボザイムが含まれる。かかる化合物を同定及び／または産生する例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【０１７５】
核酸
標的ＲＮＡを標的化する分子、例えば、核酸は、本明細書に記載されている方法のうちの特定のもの、例えば、標的タンパク質発現の阻害に関して、例えば、アルツハイマー病などのＡｐｏＥ媒介性疾患を治療するために有用である。かかる核酸の例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現を阻害する低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの二本鎖ＲＮＡが挙げられる。本明細書に記載されている有用な核酸分子または構築物としては、例えば、各鎖内に１５〜３０個のヌクレオチド、例えば、各鎖内に１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個のヌクレオチド（例えば、１９〜２１個のヌクレオチド）を含む、ｓｉＲＮＡ分子が挙げられ、その鎖のうちの１本は、標的ｍＲＮＡ内の標的領域に対して実質的に相補的、例えば、少なくとも８０％（またはそれ以上、例えば、８５％、９０％、９５％、または１００％）相補的であり、例えば、３個、２個、１個、または０個のミスマッチ（すなわち、非相補的）ヌクレオチドを有し、他方の鎖は、第１の鎖に対して実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５個のヌクレオチドの長さ、例えば、１５〜３０個のヌクレオチドの長さの、二本鎖部分を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、一方または両方の鎖上に３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１〜５個のヌクレオチド、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のヌクレオチドの長さであり、この長さは、２本の鎖上で同じであっても異なっていてもよい。当該技術分野で既知であるように、ｓｈＲＮＡは同様の二本鎖部分を含むが、鎖はループ構造で接続されている。
【０１７６】
ｄｓＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、当該技術分野で既知の方法を使用して生成することができる。例えば、それらは、化学合成することができ、ＤＮＡ鋳型からインビトロまたはインビボで転写することができる。ｄｓＲＮＡ分子は、当該技術分野で既知の方法を使用して設計することができる。多様な異なるコンピュータプログラムが、ｓｉＲＮＡ設計を支援するために利用可能である。例えば、Ｍｕｈｏｎｅｎ  Ｐ  ＆  Ｈｏｌｔｈｏｆｅｒ  Ｈ（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；６２３：９３−１０７を、多数のｓｉＲＮＡ設計ツールの概説及びウェブサイトへのリンクについて参照されたい。ｓｉＲＮＡの配列は、「オフターゲット」効果の可能性を低減させるように選択され得る。例えば、ゲノムに特有の（例えば、ヒトゲノムに特有の）配列を、ｓｉＲＮＡ設計のための標的配列として選択することができる。所望の場合、陰性対照ｓｉＲＮＡ（「スクランブル型」）を使用して、標的遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡの効果を確認し、かつ／またはアミロイドβ媒介性毒性に対するｓｉＲＮＡの効果を確認することができる。かかるｓｉＲＮＡは概して、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、適切なゲノムに対する著しい配列相補性を有しない。そのような陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をランダムにスクランブルすることによって設計することができ、この陰性対照が適切なゲノムにおいていずれの他の遺伝子に対する相同性も欠いていることを確実にするために、相同性検索を行うことができる。対照は、選択されたｓｉＲＮＡ配列に適切な数の塩基ミスマッチを導入することによって設計することもできる。
【０１７７】
本明細書に記載されている方法のうちの特定のものに有用である核酸組成物には、ｓｉＲＮＡと架橋ｓｉＲＮＡ誘導体との両方が含まれる。架橋は、組成物の薬物動態を変更するため、例えば、体内での半減期を減少させるために使用することができる。したがって、本発明は、２本の鎖が架橋されるように実質的に相補的な２本の核酸鎖を有するｓｉＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡ誘導体を含む。例えば、鎖のうちの１本の３'ＯＨ末端を修飾することができ、または２本の鎖を架橋し、３’ＯＨ末端において修飾することができる。ｓｉＲＮＡ誘導体は、単一の架橋（例えば、ソラレン架橋）を含有することができる。場合により、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ誘導体は、例えば、その３'末端に、ビオチン分子（例えば、光切断可能ビオチン）、ペプチド（例えば、Ｔａｔペプチド）、ナノ粒子、ペプチド模倣物、有機化合物（例えば、蛍光色素などの色素）、またはデンドリマーを有する。この方法でｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ誘導体を修飾することは、対応する未修飾のｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ誘導体と比較して、結果として得られるｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ誘導体の細胞取り込みを向上させること、またはその細胞標的化活性を増強することができ、細胞内のｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ誘導体の追跡のために有用であり、あるいは、ｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を対応するｓｉＲＮＡと比較して向上させることができる。
【０１７８】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後または翻訳後レベルにおける遺伝子発現を制御することができる、およそ２２個のヌクレオチドの長さの内因性非コードＲＮＡである。多数の動物遺伝子が、時として細胞もしくは組織特異的、または発生段階特異的な様式で、ｍｉＲＮＡによって制御される。ｍｉＲＮＡは、およそ７０個のヌクレオチド前駆体ＲＮＡステムループ（これはより長いＲＮＡ前駆体から得られる）から切除される。ｍｉＲＮＡ前駆体のステム配列を、標的ｍＲＮＡに対して実質的に相補的な配列と置換することによって、新規のｍｉＲＮＡを発現するベクター構築物を使用してｓｉＲＮＡを産生して、哺乳動物細胞において特異的ｍＲＮＡ標的に対するＲＮＡｉを開始することができる。他の実施形態では、標的遺伝子の発現を阻害する天然の内因性ｍｉＲＮＡが同定されるか、または人工ｍｉＲＮＡが設計される。そのようなｍｉＲＮＡは、過剰発現するか、または細胞もしくは対象に送達してもよく（標的遺伝子を阻害するために）、あるいは、標的遺伝子の発現を上方制御するために（例えば、ｍｉＲＮＡに対してアンチセンスである「アンタゴミル」と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドを使用して）その作用を阻害してもよい。
【０１７９】
アンチセンス核酸は、本発明のある特定の実施形態において標的タンパク質の発現を阻害するために有用である。アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列がＲＮＡ（例えば、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の全てまたは一部に対して実質的に相補的である、一本鎖分子である。アンチセンス核酸分子は、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域もしくはコード領域の全てまたは一部に対してアンチセンスであり得る。当該技術分野で既知であるように、非コード領域（「５'及び３'非翻訳領域」）は、コード領域に隣接する５'及び３'配列であり、アミノ酸に翻訳されない。本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて、当業者は、本明細書において特定される遺伝子を標的化するためのいくつかの適切なアンチセンス分子のうちのいずれかを選択し、合成することができる。例えば、核酸（例えば、標的核酸）の長さに及ぶ１５〜３０個のヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを調製し、続いて、遺伝子の発現の阻害について試験することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個のヌクレオチドの長さ、またはそれより長くてもよい。本明細書に記載されているアンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手段を用いる化学合成及び／または酵素的連結反応を使用して構築することができる。
【０１８０】
場合により、標的遺伝子の発現を調節するために、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡまたはアンチセンス分子のプールが使用される。このプールは、標的遺伝子を標的とする少なくとも２個、３個、４個、５個、８個、または１０個の異なる配列から構成される。
【０１８１】
アプタマーは、それらがタンパク質リガンドに特異的に結合することを可能にする構造を有する核酸分子であり、標的タンパク質活性を特異的に低下させる手段を提示する（例えば、Ｏｓｂｏｍｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１：５−９，１９９７、及びＰａｔｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１：３２−４６，１９９７、Ｍａｙｅｒ  Ｇ．（２００９）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４８（１５）：２６７２−８９を参照されたい）。アプタマーは、試験管内進化法と呼ばれる技法（ＳＥＬＥＸ、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．（２００７）２４（４）：３８１−４０３において概説されている）を使用して同定することができる。本発明は、本明細書において特定される標的タンパク質に特異的に結合し、かつそれを阻害する、アプタマーの同定を提供する。
【０１８２】
核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、アプタマー）は、標準的ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、非標準的ヌクレオチド（これは、天然のヌクレオチドであってもそうでなくてもよい）、または、例えば、分子の生物学的安定性を上昇させるように、もしくは相補性核酸間に形成される二本鎖の物理的安定性を上昇させるように設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを含むことができる。核酸は、修飾塩基、修飾骨格（例えば、修飾された糖、及び／または修飾されたヌクレオチド間結合（ＤＮＡ及びＲＮＡ内に見出される塩基、糖、及びリン酸ジエステル骨格と比較して）を含むヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸修飾は、核酸を安定化するように（例えば、ヌクレアーゼに対するその感応性を低減させるように）、または別様に体内でのその半減期を減少させるように選択される。修飾されたヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、Ｓ−カルボキシメチルアミノメチル−Ｚ−チオイイリジリ−ｅ（ｔｈｉｏｉｉｒｉｄｉｒｉ−ｅ）、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル（ｔｈｉｏｕｒ−ａｃｉｌ）、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５'−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。修飾された糖としては、例えば、２’−Ｏアルキル誘導体が挙げられる。修飾されたヌクレオチド間結合には、例えば、ホスホロチオエート誘導体、ペプチド核酸、モルホリノ及びロックド核酸、ならびにグリコール核酸及びトレオース核酸構造の使用が含まれる。本発明の様々な実施形態で使用するための例示的な核酸修飾、例えば、ｓｉＲＮＡの考察については、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ，Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６．３．１−１６．３．２２，２００９を参照されたい。修飾は、一方または両方の鎖内に存在してよく、様々な実施形態において、鎖全体に位置しても特定の位置に位置してもよい。複数の異なる修飾を組み合わせて使用することができる��
【０１８３】
核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、またはアンチセンス核酸）の例示的な投与経路としては、組織部位における、例えば注射による、直接投与が挙げられる。例えば、それらは、脳に直接投与されてもよい。あるいは、核酸分子は、選択された細胞または組織を標的とするように任意に修飾され、全身投与されてもよい。例えば、全身投与の場合、例えば、細胞表面受容体もしくは抗原に結合するペプチド、小分子、または抗体と核酸分子を結合させることによって、選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原に分子が特異的に結合するように、分子を修飾することができる。
【０１８４】
核酸、例えば、ｓｉＲＮＡは、多様な手段、例えば、カチオン性リポソームトランスフェクション及び電気穿孔によって、細胞内に送達することができる。配列の安定性または細胞取り込みを向上させるように修飾されている配列を使用することができる。そのような安定化分子は、標的タンパク質発現を低下させるための対象への投与などのインビボ法に特に有用である。化合物、例えば、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡは、それらの標的を細胞または組織、例えば、脳に定める多様な部分に抱合され得る。例えば、ビタミンＥ（αトコフェロール）をｓｉＲＮＡに抱合させることができ、抱合されたｓｉＲＮＡは、任意にＨＤＬと共に送達される。いくつかの実施形態では、化合物は、神経細胞によって発現される受容体に結合する部分に抱合される。発現は、細胞にｓｉＲＮＡ分子（または他の核酸）を発現させるベクター（例えば、ウイルスベクター）を、細胞、例えば、神経細胞に送達することによって達成することができる。このベクターは、低分子ヘアピン型ＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ前駆体をコードする配列またはアンチセンスＲＮＡをコードする配列が、目的の細胞型における発現を指示するプロモーター（例えば、Ｐｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター）に機能的に連結されている、組換え核酸を含むことができる。
【０１８５】
ウイルス媒介性送達機序は、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスを含み、そのようなウイルスから得られるゲノムの少なくとも一部を含むベクターも、例えば、研究目的または治療目的で、細胞においてｓｈＲＮＡ及び／またはｍｉＲＮＡ前駆体を発現させるために用いられる。
【０１８６】
ナノ粒子及びリポソームを使用して、核酸、例えば、オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡを、細胞または生物（例えば、非ヒト動物またはヒト）に送達することもできる。同様に、いくつかの実施形態では、ウイルス遺伝子送達、直接注射、ナノ粒子粒子媒介性注射、またはリポソーム注射を使用して、ｓｉＲＮＡを発現するか、またはそれを細胞または非ヒト動物もしくはヒトに導入してもよい。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたは標的タンパク質の発現または活性を阻害する他の化合物は、標的ＲＮＡレベルが少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、または９５％低減されるとき、ＡｐｏＥの望ましくない効果を緩和するのに有効である。場合により、標的ＲＮＡレベルは、１０％、２５％、５０％、または７５％以上低減されないことが望ましい。標的遺伝子発現（またはその低減）のレベルを判定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、標的ＲＮＡのレベルは、細胞（例えば、細胞株の）または対象由来の試料に、例えば、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＲＮＡ−ＳＥＱを用いることによって判定することができる。標的タンパク質のレベルは、例えば、ウェスタンブロット、イムノアッセイ法などを使用して測定することもできる。そのような方法は、例えば、標的ｍＲＮＡまたはタンパク質に対する、小分子、ペプチド、抗体、核酸、または他の化合物の作用を評定するために使用することができる。
【０１８８】
ポリペプチド
単離された標的タンパク質、その断片、及びそのバリアントが、本明細書において提供される。これらのポリペプチドは、例えば、抗体を産生するための免疫原として、スクリーニング法において、または、例えば、標的タンパク質の投与によって対象を治療する方法において使用することができる。「単離された」もしくは「精製された」ポリペプチドまたはその生物活性部分は、タンパク質が得られる細胞源もしくは組織源に由来する細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは、化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という言い回しには、目的のポリペプチドが、それが単離されるかまたは組換え産生される細胞の細胞構成要素から単離される、ポリペプチドの調製物が含まれる。したがって、細胞性物質を実質的に含まないポリペプチドには、約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量による）の異種タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも称される）を有するポリペプチドの調製物が含まれる。概して、ポリペプチドまたはその生物活性部分が組換え産生されるとき、それは培養培地も実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満に相当する。概して、ポリペプチドが化学合成によって産生されるとき、それは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、それは、ポリペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、ポリペプチドのそのような調製物は、目的のポリペプチド以外の化学的前駆体または化合物を約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量による）有する。標的タンパク質の発現をアッセイして、発現の量を判定することができる。タンパク質発現をアッセイするための方法は当該技術分野で既知であり、ウェスタンブロット、免疫沈降、質量分析、及びラジオイムノアッセイを含む。調製物中の全タンパク質または全乾燥重量の割合としての標的タンパク質の量は、標準的方法を使用して判定することができる。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、標的タンパク質の「生物活性部分」は、完全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的機能を保持する標的タンパク質の一部分を含む。生物活性部分は、完全長タンパク質の活性とは規模が異なる活性を有してもよい。例えば、生物活性部分は、活性完全長部分の２０％〜１００％の活性を有してもよい。いくつかの実施形態では、生物活性部分は、完全長部分と比べて上昇した活性を有してもよい（例えば、完全長部分に存在する阻害性ドメインを生物活性部分が欠いている場合）。いくつかの実施形態では、生物活性部分は、第２の分子、例えば、異なるタンパク質との相互作用に関与する能力を保持してもよい。標的タンパク質の生物活性部分には、完全長標的タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、標的タンパク質の少なくとも１つの活性を示すポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、生物活性部分は、標的タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。いくつかの実施形態では、その活性は、アミロイドβ媒介性毒性を抑制または増強する能力である。いくつかの実施形態では、その活性は、酵素活性である。
【０１９０】
標的タンパク質の生物活性部分は、例えば、１０個、２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、またはそれよりも多くのアミノ酸の長さであるポリペプチドとすることができる。それは、例えば、親ポリペプチドと１０％〜９９．９％同じ長さであってもよい。標的タンパク質の生物活性部分は、標的タンパク質媒介性活性を調節する薬剤、例えば、標的タンパク質活性を阻害する化合物を開発するための標的として使用することができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、本明細書に開示される配列（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているアクセッション番号、遺伝子名、または遺伝子識別子の下に見出されるか、あるいは表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているアクセッション番号、遺伝子名、または遺伝子識別子の下に見出される核酸もしくは遺伝子によってコードされる、アミノ酸）と同一の配列を有する。他の有用なポリペプチドは、任意のかかる配列と実質的に同一（例えば、少なくとも約４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）であり、（ａ）標的タンパク質の少なくとも１つの機能的活性を保持するが、天然の対立遺伝子変異もしくは変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるか、または、（ｂ）所望の場合、変更された（例えば、ドミナントネガティブとしての）機能的活性を示す。作動薬（模倣物）として、あるいは拮抗剤として機能し得る、変更されたアミノ酸配列を有するバリアントが、本明細書において提供される。バリアントは、変異誘発、例えば、離散点突然変異またはトランケーションによって生成することができる。作動薬は、天然のポリペプチドの生物活性と実質的に同じ生物活性、またはその部分集合を保持することができる。ポリペプチドの拮抗剤は、天然のポリペプチドの活性のうちの１つ以上を、例えば、そのポリペプチドを含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーと競合的に結合することによって阻害することができる。したがって、限定された機能のバリアントを用いる治療によって、特異的な生物学的効果を誘発することができる。天然のポリペプチドの生物活性の部分集合を有するバリアントを用いた対象の治療は、天然のポリペプチドを用いた治療と比べてより少ない副作用を対象に及ぼし得る。いくつかの実施形態では、バリアント標的タンパク質は、標的タンパク質のドミナントネガティブ型である。ドミナントネガティブは、例えば、標的タンパク質作用の阻害が所望される方法において使用することができる。配列の比較及び２個の配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成される。いくつかの実施形態では、２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３，１９７０）アルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、なら��にギャップ重み１６及び長さ重み１を使用して決定される。２個のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス、ギャップ重み４０、及び長さ重み１を使用して決定することができる。
【０１９１】
概して、本明細書において言及されるアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴ  ２．０プログラムを使用して決定することができ、このプログラムは、インターネット上でｎｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴにて公衆に利用可能である。いくつかの実施形態では、配列比較は、ギャップ無し（ｕｎｇａｐｐｅｄ）アライメントを使用し、またデフォルトパラメータ（Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリクス、ギャップ存在コスト１１、１残基当たりのギャップコスト１、及びラムダ比０．８５）を使用して行われる。いくつかの実施形態では、デフォルトパラメータが使用される。ＢＬＡＳＴプログラムで使用される数学アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２，１９９７に記載されている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、標的タンパク質において予測される非必須アミノ酸残基は、概して、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは、飽和変異誘発などによって、標的タンパク質コード配列の全てまたは一部に沿って、突然変異をランダムに導入することができ、結果として生じる変異体を、標的タンパク質の生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。コードされるタンパク質は、組換え発現させることができ、タンパク質の活性を判定することができる。
【０１９２】
標的タンパク質の少なくとも一部分（例えば、生物活性部分）と、検出タンパク質（例えば、蛍光タンパク質、酵素、またはエピトープタグ）などの第２のタンパク質の少なくとも一部分（例えば、生物活性部分）とを含む、キメラタンパク質または融合タンパク質がまた、本明細書において提供される。
【０１９３】
標的タンパク質（例えば、ヒト標的タンパク質）またはその断片もしくはバリアントあるいは標的タンパク質を含むキメラタンパク質または融合タンパク質をコードする核酸が提供され、かかる核酸は、例えば、発現ベクター内のプロモーターに機能的に連結される。かかる核酸は、例えば、治療目的または研究目的でタンパク質を発現するために、例えば、タンパク質をインビボで（例えば、治療目的でヒト対象において、または動物モデルにおいて）またはインビトロで産生するために（例えば、治療、研究、または他の目的でタンパク質を産生するために）用いられる。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥを含むポリペプチドを発現し、標的タンパク質を含むポリペプチドを発現もしくは過剰発現するか、または標的タンパク質の発現が低減もしくは欠如している細胞、例えば、酵母細胞が、細胞モデルとして、例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する化合物または修飾遺伝子を同定するために用いられる。いくつかの実施形態では、タンパク質を過剰発現するか、またはタンパク質の減少した発現を有する、単離哺乳動物細胞が、細胞モデルとして有用である。プロモーターは、目的の細胞、例えば、細菌、酵母または他の真菌、植物、無脊椎動物（例えば、昆虫、蠕虫、ハエ）、脊椎動物（例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、もしくはヒト、またはトリ）においてタンパク質の発現を指示するように適切に選択されてよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは制御可能（例えば、誘導可能）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、神経細胞、グリア細胞、またはそれらの前駆体に対して、組織型または細胞型特異的である。当業者であれば、好適なプロモーター及び発現ベクターならびに細胞内に核酸を導入する方法を把握しているであろう。例えば、哺乳動物細胞における使用に好適な制御可能プロモーターには、テトラサイクリン応答性プロモーター、ホルモン応答性プロモーターなどの小分子によって制御可能なものが含まれる。哺乳動物系で一般的に使用される構成的プロモーターには、サルウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）及びサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）などのウイルスプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ヒト延長因子１αプロモーター（ＥＦ１Ａ）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、及びヒトβ−アクチンプロモーターなどの哺乳動物起源のプロモーター、ならびにＣＡＧプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、相同マウスもしくは他の非ヒト哺乳動物またはトリ遺伝子由来のプロモーターを、ある特定の実施形態におけるヒト遺伝子由来のプロモーターの代わりに使用してもよい。哺乳動物細胞において有用な制御可能プロモーターには、テトラサイクリン応答要素（ＴＲＥ）プロモーター（テトラサイリンまたはドキシサイクリンなどのその誘導体を使用して誘導可能）が含まれ、その転写は、どのｔｅｔトランス活性化因子（テトラサイクリンもしくはその誘導体の存在下で発現を遮断する（Ｔｅｔ−Ｏｆｆ）テトラサイクリントランス活性化因子（ｔＴＡ）、またはテトラサイクリンもしくはその誘導体の存在下で発現を作��させる（Ｔｅｔ−Ｏｎ）リバーステトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が使用されるかに応じて、誘導または抑圧され得る。イントロン配列及び／またはポリアデニル化シグナルがまた、例えば、発現効率を上昇させるために、発現構築物内に含まれ得ることは理解されよう。本明細書に記載されている、細胞内に核酸を導入するか、もしくは対象に核酸を投与する方法、または当該技術分野で既知であるその他のものが、任意の目的の核酸を細胞または非ヒト動物に送達するために使用される。例えば、かかる方法は、例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性の細胞または非ヒト動物モデルを生成する目的のために、ＡｐｏＥをコードする核酸を細胞または非ヒト動物に送達するために使用されてもよい。
【０１９４】
抗体
いくつかの態様では、本発明は、本明細書において特定される標的タンパク質、例えば、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されているか、または本明細書に記載れる方法のうちの１つ以上において別様に用いられる標的タンパク質に結合する、抗体を提供する。本明細書で使用される「抗体」は、本発明の様々な実施形態において、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または一本鎖抗体、ならびにそれらのＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦａｂ発現ライブラリ断片、ｓｃＦＶ分子、ならびにエピトープ結合断片とすることができる。標的タンパク質またはその断片は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的技法を使用して抗体を生成するために免疫原として使用することができる。完全長ポリペプチドまたはタンパク質を使用することができ、あるいは、抗原性ペプチド断片を免疫原として使用することもできる。タンパク質の抗原性ペプチドは、典型的には、標的タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも８個（例えば、少なくとも１０個、１５個、２０個、または３０個）のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産生された抗体がポリペプチドと特異的な免疫複合体を形成するような、標的タンパク質のエピトープを包含する。 
【０１９５】
免疫原は典型的に、好適な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）を免役することによって抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現または化学合成されたポリペプチドを含有することができる。この調製物は、フロイントの完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫刺激薬をさらに含むことができる。
【０１９６】
ポリクローナル抗体は、好適な対象を免疫原としての標的タンパク質で免疫することによって、上述のように調製することができる。免疫された対象における抗体価は、標準的技法によって、例えば、固定化されたポリペプチドを使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などで、経時的にモニタリングすることができる。所望の場合、抗体分子を哺乳動物から（例えば、血液から）単離して、プロテインＡクロマトグラフィなどの周知の技法によってさらに精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫後の適切な時点において、例えば、特異的抗体価が最も高いとき、抗体産生細胞を対象から得て、標準的技法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５に最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４：７２，１９８３）、ＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）、またはトリオーマ技法などによって、モノクローナル抗体を調製するために使用することができる。ハイブリドーマを産生するための技術は周知である。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、目的のポリペプチドに結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって、検出することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代替手段として、目的のポリペプチドを用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングすることによって、ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定及び単離することができる。ファージディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングのためのキットは市販されている。付加的に、標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して作製することができる、ヒト部分と非ヒト部分との両方を含む、キメラ及びヒト化型のモノクローナル抗体などの組換え抗体が、本明細書において提供される。そのようなキメラ及びヒト化型モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法によって産生することができる。完全ヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。そのような抗体は、例えば、内因性免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないが、ヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができる、トランスジェニックマウスを使用することで、産生することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、標的タンパク質の全てまたは一部分を用いて、通常の様式で免疫される。この抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化中に再配列し、その後、クラススイッチ及び体細胞突然変異を受ける。したがって、そのような技法を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ抗体を産生すること��可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３，１９９５）を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術の詳細な考察、ならびにかかる抗体を産生するためのプロトコルについては、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、及び米国特許第５，５４５，８０６号を参照されたい。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技法を使用して生成することができる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する。（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９−９０３，１９９４）。モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体を産生する方法には、ファージディスプレイなどのディスプレイ技法も含まれる。
【０１９７】
標的タンパク質に対する抗体は、ポリペプチドを（例えば、細胞溶解物または細胞上清中で）検出して、その存在量及び発現パターンを評定するために使用することができる。この抗体は、例えば、例として、所与の治療レジメンの有効性を判定するために、臨床試験手順の一部として組織内のタンパク質レベルをモニタリングするために診断に使用することもできる。抗体を検出可能物質にカップリングすることによって、検出を容易にすることができる。検出可能物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、及び放射性材料が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の一例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性材料の例としては、１２５１、１３１１、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。抗体は、例えば、研究目的または治療目的で、標的タンパク質の活性を調節するために使用することもできる。抗体は多くの場合それらの標的を阻害するが、それらが結合するエピトープによっては、それらの標的を活性化する場合があり、すなわち、標的の内因性阻害因子に結合する抗体は、標的の活性を増強することができる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、１つ以上の特定の生化学的活性及び／または生物学的機能を有し、そのような機能を調節する化合物が同定される。例えば、標的タンパク質は、生化学反応を触媒する酵素であってもよく、酵素の制御因子（例えば、活性化因子または阻害因子）であってもよい。酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼに大まかに分類することができる。（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／にて利用可能なＥｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ：Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｙ  Ｃａｔａｌｙｓｅを参照されたい）。例示的な酵素としては、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、及びＧＴＰアーゼが挙げられる。例示的な酵素制御因子としては、例えば、グアニンヌクレオチド交換因子が挙げられる。
【０１９９】
化合物は、本明細書に記載されている標的タンパク質によって媒介される１つ以上の酵素活性または酵素制御活性を調節するそれらの能力について試験され得る。当業者であれば、かかる酵素の調節因子を同定するために好適なアッセイを把握しているであろう。例えば、多種多様な酵素アッセイ、例えば、とりわけキナーゼ、ホスファターゼ、ＡＴＰアーゼ、ＧＴＰアーゼ、及びユビキチン化活性についてのアッセイを行うためのキットが市販されている。いくつかの実施形態では、好適なアッセイは、（ｉ）標的タンパク質，好適な基質，及び被験化合物を適切な条件下にてインキュベートすること、ならびに（ｉｉ）その反応の１つ以上の産物の産生を検出することを伴い、被験化合物の不在下で予想されるであろう反応産物の量と比較したときの反応産物の量の増加は、この被験化合物が酵素の活性を増強することを示し、被験化合物の不在下で予想されるであろう反応産物の量と比較したときの反応産物の量の減少は、この被験化合物が酵素の活性を阻害することを示す。検出は、様々な実施形態において定性的であっても定量的であってもよい。「適切な条件」は、反応産物が検出のための合理的な時間枠（例えば、秒単位、分単位、時間単位）において検出可能な量で出現するように、標的タンパク質が（被験化合物の不在下で）反応を効果的に触媒するであろう条件下を指す。適切な条件には、例えば、適切な温度、ｐＨ、塩濃度、１つ以上の有機もしくは無機補因子の存在、及び／またはエネルギー源などが含まれ得る。多くの酵素が、ある範囲の異なる条件、例えば、ある範囲の値の温度、ｐＨ、塩濃度などを耐容可能である場合が多いことは理解されよう。いくつかの実施形態では、酵素は多サブユニットタンパク質であり、その場合、アッセイ構成要素は、少なくとも触媒サブユニット、そして任意で、酵素の１つ以上の付加的なサブユニット、例えば、自然に触媒サブユニットと複合体を形成するそれらのサブユニットを含むことができる。任意で、基質のうちの少なくとも１つが、反応物もしくは反応産物の検出を容易にするために（例えば、放射標識、比色標識、蛍光標識、発光標識、もしくは酵素標識などで標識されるか、または、比色シグナル、蛍光シグナル、発光シグナルが、反応発生に際して精製される。いくつかの実施形態では、酵素反応が、非蛍光部分を蛍光部分に変換し、その後、蛍光部分を検出することができる。いくつかの実施形態では、基質は、フルオロフォア及びダーククエンチャーを含有し、ダーククエンチャーは、フルオロフォアからエネルギーを吸収し、このエネルギーを熱として消散する。基質の切断に際し、ダーククエンチャーがフルオロフォアから分離され、その結果、フルオロフォアからのエネルギーはもはや吸収されず、検出することができ、それにより反応を検出する手段が提供される。
【０２００】
機能的アッセイを使用して、本明細書において特定される遺伝子またはタンパク質の発現または活性の調節因子、あるいは本明細書において特定される遺伝子またはタンパク質が関与する生物学的経路もしくはプロセスを調節するものを同定することもできる。例えば、ハイコンテンツスクリーニングは、タンパク質の局在化、または本明細書において特定される遺伝子もしくはタンパク質が関与するプロセスの変化を分析するための、自動撮影、細胞選別などの使用を伴い得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、計算に基づく薬物設計及び／または仮想スクリーニングが、本明細書において特定されるタンパク質の調節因子を同定するために使用され得る。計算に基づく薬物設計及び／または仮想スクリーニングは、本明細書において特定されるタンパク質の２次元または３次元構造に基づき得る。ある特定の実施形態では、化合物の構造は、化合物に到達可能であるタンパク質の領域（例えば、「ポケット」）に結合する能力についてスクリーニングされ得る。この領域は、既知もしくは潜在的な活性部位、または化合物に到達可能なタンパク質の任意の領域、例えば、間隙の表面上の凹面領域であってもよい。多様なドッキング及びファルマコフォアベースのアルゴリズムが当該技術分野で知られており、そのようなアルゴリズムを実装するコンピュータプログラムが利用可能である。一般的に使用されるプログラムとしては、Ｇｏｌｄ、Ｄｏｃｋ、Ｇｌｉｄｅ、ＦｌｅｘＸ、Ｆｒｅｄ、及びＬｉｇａｎｄＦｉｔが挙げられる（それらの最新版を含む）。例えば、Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０（３）：１９４−２−２，２００６、ＭｃＩｎｎｅｓ  Ｃ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；１１（５）：４９４−５０２，２００７を参照されたい。多数の小分子構造が利用可能であり、仮想スクリーニングに使用することができる。化合物構造のコレクションは、時として「仮想ライブラリ」と称される場合がある。例えば、ＺＩＮＣは、仮想スクリーニングに使用することができる数百万の市販の化合物の構造を収容する公的に利用可能なデータベースである（ｈｔｔｐ：／／ｚｉｎｃ．ｄｏｃｋｉｎｇ．ｏｒｇ／、Ｓｈｏｉｃｈｅｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．，４５（１）：１７７−８２，２００５）。約２５０，０００個の小分子構造を収容するデータベースが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｕ．Ｓ．）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２／）にて利用可能である。いくつかの実施形態では、例えば、最大５０，０００個、１００，０００個、２５０，０００個、５００，０００個、または最大１００万個、２００万個、５００万個、１０００万個、またはそれよりも多くの、複数の小分子がスクリーニングされ得る。化合物は、点数化し、任意で、標的に結合するそれらの潜在力によって格付けすることができる。仮想スクリーニングで同定された化合物は、標的タンパク質に結合するそれらの能力及び／もしくはその活性を調節する（例えば、阻害する）それらの能力を確認するため、かつ／またはＡｐｏＥ媒介性毒性に対するそれらの作用を評定するために、細胞不含もしくは細胞ベースのアッセイにおいて、または動物モデルにおいて試験することができる。
【０２０２】
標的タンパク質を調節する被験化合物の同定によって、その後に被験化合物「ヒット」または「リード」を修飾して、「ヒット」または「リード」が、例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性を予防もしくは抑制し、かつ／またはアミロイドβ媒介性毒性を予防もしくは抑制する能力を最適化することが可能となる。そのような最適化は、本開示の一態様であり、ＡｐｏＥ発現酵母細胞を使用して同定された被験化合物について上述のように行われ得る。
【０２０３】
計算的手法を使用して、本明細書に記載されている物理的スクリーニングまたは仮想スクリーニングのいずれかにおいて同定された化合物の１つ以上の物理化学特性、薬物動態特性、及び／または薬力特性を予測することができる。例えば、吸収、分配、代謝、及び排泄（ＡＤＭＥ）パラメータを予測することができる。そのような情報は、例えば、さらなる試験または修飾のためのヒットを選択するために使用することができる。例えば、「薬様」分子に典型的な特徴を有する小分子を選択することができ、かつ／または１つ以上の望まれない特徴を有する小分子を回避することができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性の酵母抑制因子または増強因子の相同体として特定されるヒトタンパク質は、非ヒト細胞、例えば、酵母細胞に導入される。いくつかの実施形態では、かかる細胞は、ヒトタンパク質の活性を調節する化合物を同定するスクリーニングを行うために使用される。例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子もしくは増強因子の作用と反作用するか、またはそれを増補する化合物が同定され得る。いくつかの実施形態では、該非ヒト細胞における対応物である相同タンパク質をコードする遺伝子は、無効化されるか、または欠失していてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、酵母細胞において、本明細書においてＡｐｏＥ媒介性毒性抑制因子または増強因子として特定される酵母遺伝子が欠失しており、対応物のヒト遺伝子が当該酵母細胞において発現される。例えば、対応物のヒト遺伝子は、任意に誘導性プロモーターの制御下で酵母ゲノムに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、毒性誘導量のＡｐｏＥを発現する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、化合物のスクリーニング及び／またはさらなる特性化は、脊椎動物細胞もしくは組織、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、もしくはヒト）細胞もしくは組織、または非ヒト動物を使用して行われる。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されている脊椎動物細胞のいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞は、神経系細胞、例えば、神経細胞またはグリア細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、前脳、中脳、皮質、海馬、または線条体などの脳の領域からのものである。いくつかの実施形態では、神経細胞は、皮質神経細胞を含む。いくつかの実施形態では、神経細胞は、海馬神経細胞を含む。いくつかの実施形態では、神経細胞は、錐体神経細胞を含む。いくつかの実施形態では、神経細胞は、コリン作動性神経細胞を含む。いくつかの実施形態では、神経細胞は、グルタミン酸作動性神経細胞を含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、神経細胞及びグリア細胞を含む混合培養物が使用される。いくつかの実施形態では、組織は、脳組織、例えば、脳切片、例えば、非ヒト動物からの海馬脳切片を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥ媒介性毒性に関連する少なくとも１つの表現型を示し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥに関連する少なくとも１つの表現型を示し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥを含むポリペプチドをコードする異種遺伝子、及び／またはＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾遺伝子である酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の哺乳動物相同体をコードする異種遺伝子を含む。
【０２０６】
バイオマーカー及び予測法；キット
いくつかの態様では、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、ＡＤのバイオマーカーを同定する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ある方法は、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上において特定される酵母遺伝子の相同体であるヒト遺伝子、例えば、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上において特定されるヒト遺伝子の配列における多型性もしくは突然変異、または本明細書において特定されるヒト遺伝子の発現もしくはそのコードされるタンパク質の活性の変化を同定する工程、ならびに（ｂ）当該多型性、突然変異、または変化が、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、ＡＤの発症と相関するかどうかを判定する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって同定されるヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーは、ＡｐｏＥ媒介性疾患のバイオマーカーであり得る。かかる方法は、例えば、加齢、認知、ならびにＡＤまたは別のＡｐｏＥ媒介性疾患の研究、例えば、疫学的研究からの利用可能な遺伝子同定、臨床、及び病理データを用いてもよい。当該技術分野で既知のデータ及び試料収集ならびに方法（例えば、統計的方法）を使用して、相関性を特定及び／または確認することができる。いくつかの実施形態では、全ゲノム関連研究が行われる。いくつかの実施形態では、症例対照研究が行われる。いくつかの実施形態では、本明細書において特定される遺伝子内にある、ｄｂＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ）において利用可能な１つ以上のＳＮＰまたは他のヌクレオチド変異が、ＡｐｏＥ媒介性疾患との関連について評価される。
【０２０７】
相関性が確認されたら、それは、例えば、本発明に記載されているように同定された化合物を使用する療法、またはＡＤなどのＡｐｏＥ関連疾患を治療するために用いられることが当該技術分野で知られている療法から利益を受け得る対象の同定において使用され得る。例えば、そのような対象は、早期治療（症状の発症前）から利益を受け得、かつ／あるいは、遺伝子によってコードされる遺伝子産物（例えば、タンパク質）の発現または活性を調節する化合物を用いる治療、またはいくつかの実施形態では遺伝子産物自体を用いる治療から利益を受け得る。
【０２０８】
いくつかの態様では、ＡｐｏＥ関連疾患、例えば、ＡＤを発症するリスクが上昇している対象を同定するための方法が、本発明に記載されている。本発明のうちの特定のものは、ヒト対象が、参照配列と比較して、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上において特定される酵母遺伝子のヒト相同体（例えば、表２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上において特定されるヒト相同体）ならびに／または本明細書において特定される遺伝子によってコードされるタンパク質の配列、発現、もしくは活性の変化を示すかどうかを判定する工程を含み、この遺伝子またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の配列、発現、もしくは活性の変化は、対象が、ＡｐｏＥ関連疾患、例えば、ＡＤを発症するかまたは有するリスクが上昇した状態にあることを示す。いくつかの実施形態では、この遺伝子は、ＡｐｏＥ関連疾患、または特定のＡｐｏＥ媒介性疾患、例えばＡＤの危険因子としてこれまでに同定されていない、任意の遺伝子であってもよい。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、この遺伝子は、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト遺伝子から選択される。いくつかの実施形態では、この遺伝子（またはそれらのコードされるタンパク質）のうち少なくとも２つが評定される。いくつかの実施形態では、対象における、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強因子として同定されている酵母遺伝子の相同体であるヒト遺伝子の上昇した発現、及び／または、かかるヒト遺伝子によってコードされるタンパク質の上昇した活性は、その対象が、ＡｐｏＥ関連疾患、例えば、ＡＤを発症するかまたは有する可能性が上昇した状態にあることを示す。いくつかの実施形態では、対象における、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子として同定されている酵母遺伝子の相同体であるヒト遺伝子の低下した発現、及び／または、かかる遺伝子によってコードされるタンパク質の低下した活性は、その対象が、ＡｐｏＥ関連疾患、例えば、ＡＤを発症するかまたは有する可能性が上昇した状態にあることを示す。参照配列または参照レベルは、例えば、対照群に典型的に見出される発現または活性の配列またはレベルであり得る。例えば、参照レベルは、対照群内での平均レベルまたはそのレベル周辺の範囲（例えば、対照群の少なくとも８０％、９０％、または９５％が含まれる範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、対照群は、ＡｐｏＥ関連疾患を患っておらず、認知障害に関連する徴候もしくは症状またはＡｐｏＥ関連疾患を発症する著しい可能性を示し得る他の特徴を有しない個体である。対照群は、年齢、性別、全身的健康状態（例えば、循環器疾患の不在）などの多様な特徴について一致していてもよい。歴史的対照を使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、疾患の進行及び／または療法への応答をモニタリングするために使用することができる。いくつかの実施形態では、結果、例えば、参照レベルと比較したときの発現または活性のレベルの差異は、統計的に有意である。例えば、結果は、様々な実施形態において０．０５未満または０．０１未満のＰ値を有し得る。
【０２１０】
遺伝子発現の変化は、例えば、遺伝子のコード領域もしくは非コード領域（例えば、制御領域）における突然変異または多型性、あるいはコピー数の変化（増加もしくは減少）またはエピジェネティック変化（例えば、変更されたＤＮＡメチル化または変更されたヒストン修飾（例えば、変更されたアセチル化またはメチル化）によって引き起こされ得る。突然変異は、例えば、挿入、欠失、または置換であり得る。多型性は、単一のヌクレオチド多型性であってもよい。タンパク質の活性の変化は、遺伝子のコード領域における突然変異によって引き起こされ得、この突然変異が、コードされたタンパク質の配列を変更する。本発明は、対象から（例えば、リンパ球から）得られたＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質を含む試料を分析して、本明細書において特定される遺伝子またはそのコードされるタンパク質の配列（例えば、１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の同一性を判定するため）、発現レベル、及び／または活性を評定することと、任意で、該配列、発現、及び／または活性レベルを、参照配列または発現または活性の参照レベルと比較することとを包含する。本明細書に言及される方法を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法を使用して、遺伝子配列、発現レベル、及び／またはタンパク質の活性を評定することができる。例えば、遺伝子同定は、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ａｇｉｌｅｎｔから入手可能）、リアルタイムＰＣＲ、及び／または配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａの技術またはＳＯＬｉＤ（商標）システムなどの高スループット配列決定）を使用して行うことができる。エピジェネティック変化は、例えば、亜硫酸水素塩配列決定、クロマチン免疫沈降オンチップ（ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ）及び／またはクロマチン免疫沈降配列決定（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）を使用して検出することができる。タンパク質レベルの変化及び／または修飾は、例えば、イムノアッセイまたは質量分析を使用して検出することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性の変化は、タンパク質の翻訳後修飾の変化、例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化、アルキル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化などの変化によって引き起こされ得る。したがって、いくつかの実施形態は、１つ以上のかかる修飾または変化を検出することを含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、遺伝子の低下した発現及び／または本明細書において特定されるタンパク質（例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子である酵母遺伝子のヒト相同体）の低下した発現を示す対象は、タンパク質の発現または活性を上昇させる化合物での治療の候補として治療または選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子の上昇した発現及び／または本明細書において特定されるタンパク質（例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強因子である酵母遺伝子のヒト相同体）の上昇した発現を示す対象は、タンパク質の発現または活性を低下させる化合物での治療の候補として治療または選択される。
【０２１２】
さらに、本明細書において特定される遺伝子及び／または本明細書において特定される遺伝子によってコードされるタンパク質の配列、発現、もしくは活性を検出すること、ならびに／あるいは前述のいずれかの変化を検出することに有用である試薬を含むキットが提供される。かかる試薬は、例えば、遺伝子配列もしくは発現またはそれらの変化を検出するための核酸プローブまたはプライマー（任意で、チップまたはビーズなどの支持体に取り付けられる）、タンパク質のレベル、サイズ、修飾、またはそれらの変化を検出するための抗体を含むことができる。本キットは、対照または参照試料、アッセイを行うため及び／または結果を解釈するための指示書などを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、ＡｐｏＥ媒介性疾患のリスクがあるかもしくはそれを患う対象を同定すること、及び／あるいはＡｐｏＥ媒介性疾患の危険因子である突然変異、多型性、もしくはエピジェネティック変化を潜在的に保有するものと同定されている選択された一式の遺伝子及び／またはタンパク質を評定することのために、特別に適合される。例えば、本キットが複数の遺伝子またはタンパク質の評定を提供する場合、ＡｐｏＥ媒介性疾患の危険因子として関係するもしくは確認されている遺伝子またはタンパク質の割合は、偶然予想されるであろう割合より大きい。いくつかの実施形態では、評定される遺伝子もしくはタンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、ＡｐｏＥ媒介性疾患の危険因子として関係するか確認される。いくつかの実施形態では、キット構成要素は、例えば、本キットが、ＡｐｏＥ媒介性疾患のリスクがあるかもしくはそれを患う対象を同定または評定するために有用であることを示す情報または指示書で標識されているか、あるいはそれと共に包装されている、１つ以上の容器内に封入される。
【０２１３】
本明細書において特定されるヒト遺伝子またはタンパク質の配列、発現、もしくは活性の変化の検出は、対象がＡｐｏＥ関連疾患、例えば、ＡＤを発症するか、またはそれを有する可能性を評定するために、付加的な情報と一緒に使用され得る。そのような情報は、遺伝情報（例えば、リスク上昇に関連する特定の対立遺伝子またはアイソフォームの存在）、撮影情報、生化学的情報（例えば、ＣＳＦ中のアミロイドβまたはタウレベルの測定）、神経心理学的情報、及び／または臨床情報であってもよい。
【０２１４】
哺乳動物モデル系
いくつかの態様では、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する酵母遺伝子の相同体である哺乳動物遺伝子の発現または活性が調節される、例えば、その遺伝子またはその遺伝子によってコードされる遺伝子産物が過剰発現または阻害もしくは無効化される、哺乳動物細胞及び非ヒト哺乳動物が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、ヒト遺伝子である。ヒト遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている酵母遺伝子のいずれかの相同体であってもよい。例えば、ヒト遺伝子は、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト遺伝子のいずれかであってもよい。特定の実施形態では、ヒト遺伝子は、表３に列記されている酵母遺伝子のいずれかの相同体であってもよい。いくつかの実施形態では、ヒト遺伝子は、既知のＡＤ危険因子である。いくつかの実施形態では、ヒト遺伝子は、既知のＡＤ危険因子ではない。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び３のいずれか１つ以上に列記されている酵母遺伝子のいずれかの相同体である非ヒト哺乳動物遺伝子である。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、または２Ａのいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制因子である酵母遺伝子の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、及び２Ａのいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ２媒介性毒性の増強因子である酵母遺伝子の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、及び２Ｂのいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制因子である酵母遺伝子の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、及び２Ｂのいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ３媒介性毒性の増強因子である酵母遺伝子の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ４媒介性毒性の抑制因子である酵母遺伝子の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強因子である酵母遺伝子の相同体である。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、表３に列記されている酵母遺伝子の相同体である。ヒトまたは非ヒト哺乳動物細胞もしくは動物は、様々な実施形態において任意のＡＰＯＥ遺伝子型を有し得る。それらは、任意のＡＰＯＥ対立遺伝子に対してホモ接合性であってもヘテロ接合性であってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子、例えば、ヒト遺伝子は、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制因子または増強因子である酵母遺伝子の相同体であり、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）は、ＡｐｏＥ２を発現する。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子、例えば、ヒト遺伝子は、ＡｐｏＥ３媒介性毒性の抑制因子または増強因子である酵母遺伝子の相同体であり、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）は、ＡｐｏＥ３を発現する。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子、例えば、ヒト遺伝子は、ＡｐｏＥ２媒介性毒性の抑制因子または増強因子である酵母遺伝子の相同体であり、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）は、ＡｐｏＥ４を発現する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、遺伝子を細胞もしくは生物内で過剰発現することは、その遺伝子によってコードされるタンパク質を細胞もしくは生物内で発現することを含み、このタンパク質は、細胞もしくは生物に、または細胞もしくは生物の祖先に導入されている核酸（例えば、発現構築物）によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子を阻害または無効化することは、細胞もしくは生物のゲノム内の遺伝子を阻害または無効化すること、あるいは細胞もしくは生物内の遺伝子の発現産物、例えば、その遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質を阻害または無効化することを含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、神経前駆細胞、神経細胞、グリア前駆細胞、またはグリア細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、皮質神経細胞または海馬神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、グルタミン酸作動性神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、コリン作動性神経細胞である。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、アストロサイトである。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、オリゴデンドロサイトである。いくつかの実施形態では、２つ以上のかかる細胞型を含む組成物、例えば、細胞培養物が提供され、この細胞は、神経細胞及びグリア細胞を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、多能性幹細胞、例えば、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、多能性幹細胞（ｉＰＳまたはＥＳ細胞）、神経前駆細胞、またはグリア前駆細胞からの分化によってインビトロで得られる神経細胞またはグリア細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、異なる細胞型の非多能性体細胞、例えば、非神経性、非グリア性系統の細胞からの分化転換によって得られる神経細胞またはグリア細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、単離された細胞、例えば、単離されたヒト細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒトＡｐｏＥタンパク質を発現する、非ヒト哺乳動物細胞、例えば、齧歯動物細胞（例えば、マウス細胞もしくはラット細胞）または非ヒト霊長類（例えば、サル）細胞である。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する酵母遺伝子の相同体として同定されたヒト遺伝子は、その細胞の少なくとも一部においてヒトＡｐｏＥを発現する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、マウスにおいて発現される。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する酵母遺伝子の相同体であるヒト遺伝子は、ヒトＡｐｏＥを発現する非ヒト哺乳動物細胞において発現される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する酵母遺伝子の非ヒト哺乳動物相同体は、ヒトＡｐｏＥを発現する非ヒト哺乳動物細胞において発現される。例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する酵母遺伝子のマウス相同体は、ヒトＡｐｏＥを発現するマウス細胞において発現されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＡｐｏＥとヒトＡｐｏＥとの両方を発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞の内因性ＡｐｏＥ遺伝子は、ヒトＡｐｏＥの残基１１２、１５８、またはその両方に対応する位置におけるアルギニンをコードするか、またはそれをコードするように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、その細胞の少なくとも一部、例えば、その神経細胞及び／またはグリア細胞の少なくとも一部において、内因性ＡｐｏＥとヒトＡｐｏＥとの両方を発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物、例えば、マウスの内因性ＡｐｏＥ遺伝子の対立遺伝子のいずれかまたは両方が、ヒトＡｐｏＥの残基１１２、１５８、またはその両方に対応する位置におけるアルギニンを含有するか、またはそれを含有するように遺伝子改変される。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、その修飾が細胞の子孫に受け継がれるように、多能性幹細胞、神経幹細胞、神経もしくはグリア前駆細胞、または他の分裂細胞において遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、修飾を保有する成熟した神経細胞及び／またはグリア細胞が、その細胞から得られる。哺乳動物細胞において遺伝子改変をもたらすための使用法は当該技術分野で既知であり、任意のかかる方法を適用して、遺伝子改変された哺乳動物細胞を作り出すことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ゲノムに対する遺伝性修飾、例えば、ゲノムへの外因性ＤＮＡの挿入、天然ＤＮＡの１個以上のヌクレオチドの欠失もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性毒性の酵母抑制因子または増強因子のヒト相同体によってコードされるタンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーターを含む発現構築物が、哺乳動物細胞に導入される。発現構築物は、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド）内で細胞に送達されてもよい。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、またはマイクロＲＮＡ前駆体分子をコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーター（例えば、Ｐｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター）を含む発現構築物が細胞に導入され、このｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、またはマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＡｐｏＥ媒介性毒性の酵母抑制因子または増強因子のヒト相同体の発現を阻害する。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、もしくはマイクロＲＮＡ分子によって標的化されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現は、少なくとも１０％、２５％、５０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上低下し得る。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト遺伝子（または別の哺乳動物種において見出されるその対応物）によってコードされるタンパク質をコードする、外因性核酸、例えば、外因性ＤＮＡが、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に導入される。例えば、プロモーターに機能的に連結された、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されているヒト遺伝子（または別の哺乳動物種において見出されるその対応物）によってコードされるタンパク質をコードする核酸を含む発現構築物が、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に導入されてもよい。いくつかの実施形態では、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上に列記されている遺伝子は、例えば、プロモーター、他の制御配列、またはコード配列の一部分を欠失させるかまたは改変することによって、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）内で機能障害性にされる。いくつかの実施形態では、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上において特定されるヒト遺伝子（または別の哺乳動物種において見出されるその対応物）は、例えば、それを制御可能プロモーターの制御下に置くことによって、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）において条件付きにされる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部分をリコンビナーゼの認識部位間に置くことによって条件付きにされる。そのような部位間に位置するＤＮＡは、リコンビナーゼを細胞に導入すること、またはその発現を誘導することによって除去することができる。このような系を使用して、例えば、欠失を作ることができ、この欠失は、遺伝子の発現を低減させるか、または変更された（例えば、低減した）機能を有する遺伝子産物をもたらし得、あるいは、コード配列をプロモーターの制御下に置き、それによって発現を誘導し得る。好適な系は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘリコンビナーゼ系が使用され得る。遺伝子は、Ｃｒｅ媒介性組換えによって隣接した（フロックス化（ｆｌｏｘｅｄ））遺伝子セグメントの切除を可能にする２つのｌｏｘＰ部位の挿入によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、Ｃｒｅの発現が制御可能プロモーターの制御下にあってもよく、またはＣｒｅ活性が小分子によって制御されてもよい。例えば、Ｃｒｅは、その活性が受容体リガンドによって制御されるように、ステロイドホルモンリガンド結合ドメインと融合していてもよい。Ｃｒｅ−ＥＲ（Ｔ）またはＣｒｅ−ＥＲ（Ｔ２）リコンビナーゼを使用してもよく、これらは、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）の変異リガンド結合ドメインとＣｒｅリコンビナーゼとの融合タンパク質を含み、その活性は、例えば、４−ヒドロキシ−タモキシフェンによって誘導することができる。誘導性遺伝子変異、例えば、ノックアウトを生成する、当該技術分野で既知の他の方法を使用してもよい。例えば、異なるリコンビナーゼ（例えば、ＤｒｅまたはＦｌｐ／Ｆｒｔ系）を使用してもよく、かつ／またはリコンビナーゼ活性を制御可能にする他の手段を使用してもよい。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）のゲノムへの外因性ＤＮＡの組み込みは、「セーフハーバー（ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ）」遺伝子座において起こる。「セーフハーバー」遺伝子座は、宿主細胞に有害作用を及ぼすことなく新しく組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に順応することができる、哺乳類ゲノム、例えば、ヒトゲノムの遺伝子内または遺伝子外の領域である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳＶ１（染色体１９上の野生型ＡＡＶの天然の組み込み部位）、ＲＯＳＡ２６、またはＣＣＲ５遺伝子座である。これらの遺伝子座の位置は、当該技術分野において周知である。ＡＡＶＳ１部位は、染色体１９内（１９ｑ１３．４２位）にあり、ＡＡＶＳ１遺伝子座における組み込みは、遺伝子ホスファターゼ１制御性サブユニット１２Ｃ（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）を破壊し得る。ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座は、染色体３内（３ｐ２５．３位）にある。ヒトＣＣＲ５遺伝子は、染色体３上（３ｐ２１．３１位）に位置する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、１個以上の選択されたＤＮＡ配列を標的化するヌクレアーゼを使用して、例えば、ゲノム内の目的の規定位置においてＤＮＡを挿入する、置き換える、または除去するために、遺伝子改変されてもよい。例えば、目的の規定位置において、標的化可能なヌクレアーゼを使用して、ＤＮＡを挿入するか、置き換えるか、またはゲノムから除去する遺伝子操作は、「ゲノム編集」と称される場合がある。いくつかの実施形態では、ゲノム編集を使用して、例えば、表１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃのいずれか１つ以上において特定されるヒト遺伝子における改変を操作し、かつ／または哺乳動物細胞における特定のＡＰＯＥ対立遺伝子を生成してもよい。いくつかの実施形態では、目的の特定の遺伝的変異を除いて同質遺伝子的である２個以上の細胞または細胞株。例えば、ＡＰＯＥ遺伝子型に関する以外は同質遺伝子的である細胞または細胞株が生成されてもよい。ゲノム内の特定の位置を標的化する核酸を使用して、内因性ゲノム遺伝子座内の選択された部位における精確な切断を誘導してもよい。切断の位置でゲノムに挿入される配列を含む核酸（例えば、プラスミドまたは線状ＤＮＡ）も、ヌクレアーゼを含有する細胞に導入される。いくつかの実施形態では、２つ以上の切断が作られ、目的の核酸が切断位置間に挿入され、任意で、内因性遺伝子が、突然変異、遺伝的変異、または遺伝子修正を組み込むバージョンで少なくとも部分的に置き換えられる。いくつかの実施形態では、核酸は、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）が刺激されるように、切断部位に隣接する領域と相同性の領域を含む。いくつかの実施形態では、細胞のゲノム内に存在する配列と比較して、標的部位の片側と相同であり、所望の改変を含有する配列を含む核酸が、ポリペプチドに加えて導入され、例えば、相同組換え修復がもたらされる。したがって、細胞のゲノム内の配列を変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナー核酸内に存在する配列に変換することができる。「挿入する」、「置き換える」などの用語は、核酸配列の挿入、または１個のヌクレオチド配列を別のもので置き換えること（すなわち、情報の意味での配列の挿入または置き換え）を表し、導入される核酸のゲノムへの物理的または化学的組み込みを必ずしも必要とせず、例えば、修復は、ドナー配列の少なくとも一部分のコピーを生成することを伴い得ることは理解されよう。好適なヌクレアーゼの例としては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼ、及び、例えば、ＩＩ型細菌性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系から得られる、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼなどのＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）が挙げられる。ＺＦＮ及び／またはＴＡＬＥＮの設計、生成、ならびに使用の方法は、例えば、ＷＯ２０１１０９７０３６、Ｕｒｎｏｖ，ＦＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０），１１：６３６−６４６、Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ���（２０１１）２９（２）：１４３−８、Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２、Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ７，１７１−１９２（２０１２）、及び前述のいずれかにおける参照文献に記載されている。ヒト多能性細胞の遺伝子操作を行うためのＺＦＮの使用は、米国特許公開第２０１１００２７２３５号及び／または米国特許公開第２０１２０１９２３０１号（これはＴＡＬＥＮの使用も記載する）に記載されている。ゲノム操作のためのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの方法は、Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（７）：３９７−４０５に概説されている。ゲノム操作におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用は、例えば、Ｃｏｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３、Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １５３，９１０−９１８（２０１３）、Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５４，１３８０−１３８９（２０１３）、及び米国特許公開第２０１４０１７０７５３号に記載されている。
【０２２４】
トランスジェニック非ヒト動物、例えば、マウス及びラットを生成する方法は、当該技術分野で既知であり、任意のかかる方法を適用して、トランスジェニック非ヒト動物を生成することができる。本明細書で使用される場合、「トランスジェニック動物」という用語は、その細胞の少なくとも一部のゲノムＤＮＡの配列に対する修飾を有する動物を指し、この修飾は、人の手によって生成されたものである。この用語には、元々のトランスジェニック動物ならびに修飾を受け継いだその子孫が含まれることは理解されよう。この修飾は、例えば、非天然ＤＮＡの挿入、天然ＤＮＡの欠失、１個以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。トランスジェニック動物には、その動物に天然でない核酸を発現するように改変されている動物、ならびに内因性遺伝子が少なくとも部分的に欠失しているか、ないしは非機能性にされている「ノックアウト」動物、及び選択された内因性遺伝子が標的化様式で修飾されている「ノックイン」動物が含まれる。その動物に天然でない核酸を発現するように改変されているトランスジェニック動物には、外因性ＤＮＡがゲノムにランダムに挿入されている動物、外因性ＤＮＡがセーフハーバー遺伝子座などの規定位置で挿入されている動物、及び目的の内因性遺伝子が変更されている動物が含まれる。イントロン配列及び／またはポリアデニル化シグナルがまた、例えば、導入遺伝子の発現効率を上昇させるために、導入遺伝子内に含まれ得ることは理解されよう。トランスジェニック創始動物は、そのゲノム内の導入遺伝子の存在及び／あるいは動物の組織もしくは細胞内の導入遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現に基づいて同定され得る。トランスジェニック創始動物は、次に、導入遺伝子を担持するさらなる動物を繁殖させるために使用することができる。特定の導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物と繁殖させて、複数の遺伝子改変を有する動物を生成することができる。
【０２２５】
哺乳動物（例えば、ヒト）の多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）、神経前駆細胞、神経細胞、グリア前駆細胞、及びグリア細胞を生成または単離するための使用法は当該技術分野で既知であり、任意のかかる方法を使用して、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、及び／もしくはグリア細胞を生成または単離することができる。多能性細胞は、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の細胞を生じさせることができる未分化細胞であり、典型的に、長期または不定の期間にわたって自己再生する能力を有する。概して、多能性細胞は、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１としても知られる）、ＳＯＸ２、及び／またはＮＡＮＯＧなどの、少なくとも１つの支配的な多能性転写因子、例えば、これらの因子の３つ全てに対して陽性である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。ＥＳ細胞は、初期胚、例えば、胚盤胞から、または初期胚から単離された卵割球から得られる、多能性幹細胞である。本明細書で使用される場合、「初期胚」という用語は、第１の細胞分裂から胚盤胞期、例えば、４細胞胚、８細胞胚、桑実胚、または胚盤胞までの（及びこれらを含む）着床前胚を包含する。ＥＳ細胞は、典型的には、インビトロ受精を使用して作り出された初期胚から、またはそのような胚から単離された卵割球から、インビトロで得られる。当該技術分野で既知の多様な方法のいずれを使用して、ＥＳ細胞を得、同定し、かつ／または特性化してもよい。例えば、Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｋ．（ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３１  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＨ（２００６年）、Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｋ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８７３  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒのブランド）（２０１２年）（例えば、ヒトＥＳ細胞を得る方法について具体的には第１〜６章）を参照されたい。また、米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号、同第７，０２９，９１３号、米国特許公開第２００９０１８６４０７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００８５０（ＷＯ／２０１１／１４２８３２）も参照されたい。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、多能性細胞は、誘導多能性幹細胞である。本明細書で使用される場合、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、体細胞を多能性状態にリプログラミングすることによって体細胞から得られる細胞である。ｉＰＳ細胞は、細胞形態、コロニー形態、長期自己再生、多能性関連マーカーの発現、同様の全ゲノム発現プロファイル、免疫低下マウスにおける奇形腫を形成する能力、及び適切な条件下においてインビトロで複数の細胞系統の細胞を生じさせる能力を含む、ＥＳ細胞のある特定の主要な特徴を有する。「ｉＰＳ細胞」という用語には、最初に得られた多能性細胞、及び多能性幹細胞特性を保持するその子孫が含まれることは理解されよう。「リプログラミング」は、本明細書で使用される場合、細胞（例えば、その細胞型）の分化状態もしくは同一性、またはそれが起こるプロセスを変更することを指す。概して、第１の細胞のリプログラミングは、第１の細胞または対応する細胞がインビボで通常は従うであろう分化プログラムから生じるであろうものとは明確に異なる分化状態もしくは同一性を有する第２の細胞を生成し、第１の細胞または対応する細胞がインビボで生じさせるであろうものとは明確に異なる１つ以上の型の細胞をもたらす。「対応する細胞」は、同じ型の細胞、または当業者が同じもしくは実質的に同じ細胞型の細胞であると合理的に見なすような十分に類似した特徴を有する細胞である。細胞型は、「神経細胞」もしくは「グリア細胞」などの細胞の分類、またはより広い分類におけるサブタイプを指す場合がある。サブタイプは、特徴的な特徴、特徴的な細胞マーカー（例えば、細胞によって産生されるか、または細胞を刺激する神経伝達物質）、そのサブタイプの細胞が見出され得る体内の特徴的な位置、機能的特性などに基づいて定義されてもよい。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、リプログラミングは、体細胞から多能性細胞を生成する。いくつかの実施形態では、体細胞は、成熟分化細胞である。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、細胞を、対応する細胞が成長してなる細胞、または通常の条件下においてインビボで生じさせる細胞とは異なる細胞系統のものに変更する。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、第２の細胞系統または第１の細胞型とは異なる第１の細胞系統または第１の細胞型の体細胞から、第２の細胞系統または第２の細胞型の体細胞を生成する。いくつかの実施形態では、この形質転換は、検出可能な多能性細胞を中間体として生成することなく起こり得、その場合、それは「分化転換」と称される場合がある。特定の細胞型、細胞系統、または細胞状態への細胞のリプログラミングは、１つ以上の細胞周期の過程にわたって起こり得る。例えば、多能性幹細胞を体細胞から生成するため、または第１の細胞型の分化細胞を異なる細胞型の分化細胞から生成するためには、複数回の細胞分裂を要する場合がある。
【０２２８】
概して、リプログラミングは、少なくとも１個の体細胞を、１つ以上のリプログラミング剤と、細胞がリプログラミングされるのに好適な条件下にて、かつ好適な時間にわたって接触させる工程を含む方法によって、行われ得る。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、リプログラミング因子もしくはリプログラミング因子をコードする核酸を細胞に導入する工程、または外因性核酸によってコードされるリプログラミング因子の細胞における発現を誘導する工程を含む方法によって行われる。「リプログラミング因子」という用語は、細胞のリプログラミングを引き起こすことまたはそれに寄与することができるタンパク質を包含する。有用なリプログラミング因子の多くは、生成される型もしくは状態の哺乳動物細胞によって自然に発現されるか、またはその中に存在する、転写因子である。これらのタンパク質は、遺伝子発現に影響を及ぼすことによって、細胞の同一性または状態を誘導または維持することに通常は寄与し得る。「リプログラミング剤」という用語には、リプログラミング因子、ならびに（ｉ）リプログラミング法においてリプログラミング因子の代わりとなること、（ｉｉ）さもなければリプログラミングを阻害し得る内因性ＲＮＡもしくはタンパク質の発現を阻害すること、及び／または（ｉｉｉ）リプログラミング効率もしくは速度を、リプログラミング剤の不在下で達成されるであろう効率もしくは速度と比較して検出可能に上昇させることができる薬剤も包含される。いくつかの実施形態では、リプログラミング剤は、内因性リプログラミング因子の発現または活性化をもたらすシグナル伝達経路の刺激、リプログラミングの内因性阻害因子の発現または活性化をもたらすシグナル伝達経路の阻害、あるいはＤＮＡもしくはヒストンアセチラーゼ、デアセチラーゼ、メチラーゼ、またはデメチラーゼなどのクロマチン構造を修飾する酵素の活性化または阻害を行い得る。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、細胞に１つ以上の操作を行うこと、例えば、特定のタンパク質もしくはＲＮＡをコードする核酸（例えば、ベクター）を細胞に導入すること、及び／あるいは、細胞に進入するかまたは細胞表面受容体に作用してリプログラミングを誘導し、かつ／またはその効率もしくは速度を上昇させ得る、特定の化合物を含有する培地中で、それらを培養することなどを含む。使用される具体的な操作及び／またはプロトコルは、例えば、所望の細胞型または状態、リプログラミングされる細胞の型または状態などに応じて、適切に選択されてよい。概して、リプログラミングは、インビトロで行われる。いくつかの態様では、リプログラミングは、核移植もしくは細胞質移植、あるいは、例えば、卵母細胞、胚、胚細胞、または多能性細胞との細胞融合を含まない。
【０２２９】
リプログラミング法は、多くの場合、複数の細胞を培養液中でリプログラミング剤またはその組み合わせに曝露し、所望の細胞型もしくは状態の特徴を有する１個以上の細胞または細胞コロニーを同定あるいは選択することを含む。１個以上の細胞または細胞コロニーの少なくとも一部分は、単離し、培養液中で拡大させてもよく、その新しい細胞同一性または状態を維持するのに適切な条件下にて、明確に異なる細胞株として繁殖させてもよい。いくつかの実施形態では、かかる条件は、その型の細胞に典型的な培養条件である。いくつかの実施形態では、外因性リプログラミング剤のうちの少なくとも１つ、一部、または全てに対する継続的な曝露は、リプログラミングされた細胞の同一性または状態を維持するために必要ではない。例えば、リプログラミングされた細胞の同一性または状態は、かかる薬剤の不在下で安定である。
【０２３０】
体細胞は、多様な方法によってｉＰＳ細胞にリプログラミングされ得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、１つ以上のリプログラミング因子もしくはかかる因子をコードする核酸を体細胞に導入すること、及び／またはかかる因子をコードする１つ以上の外因性核酸の細胞における発現を誘導する工程を含む方法によって生成される。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４（ＯＳＫ因子）、そして任意にｃ−ＭＹＣ（ＯＳＫＭ因子）のうちの少なくとも１つ、２つ、または全てを含む。ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８などの他のリプログラミング因子も用いられる。例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８の組み合わせ（ＯＳＮＬ因子）は、多能性を誘導することができる。多くの変形形態または代替的な組み合わせが可能である。例えば、ＫＬＦ４及び／もしくはｃ−ＭＹＣの代わりに、またはそれらに加えて、異なるＫＬＦ及び／もしくはＭＹＣファミリーメンバーを使用してもよい。例えば、ＫＬＦ２またはＫＬＦ５は、ＫＬＦ４に代わることができ、Ｎ−ＭＹＣまたはＬ−Ｍｙｃは、ｃ−ＭＹＣに代わることができる。当業者であれば、ＯＫＳＭまたはＯＳＮＬ因子のうちの１つ以上に代わることができる様々なリプログラミング剤を把握しているであろう。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くのリプログラミング因子が使用される。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子は、少なくともＯＣＴ４を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、十分な時間にわたって適切なレベルで好適な培養条件下にて導入または発現された適切な一式のリプログラミング因子は、内因性多能性遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧの活性化を引き起こし、これは、細胞の一部における自続的な多能性状態をもたらし得る。いくつかの実施形態では、細胞に導入された外因性ＤＮＡ（例えば、リプログラミング因子をコードするＤＮＡ）は、多能性の誘導後、例えば、自続的な多能性状態が達成された後、または多能性細胞、誘導神経幹細胞、もしくは誘導神経前駆細胞が所望の細胞型に分化された後に、自然に発現停止し、かつ／あるいは、少なくとも部分的に除去されるか、または失われる。挿入ＤＮＡは、リコンビナーゼの標的部位を含んでもよく、その結果、これらの部位間の領域の除去がリコンビナーゼ媒介性切除によって行われ得る。かかる切除は、リコンビナーゼ標的部位の一部を含む短い残留配列のみを残し得る。細胞をリプログラミングするために使用されたエピソームプラスミドは、その後、失われ得る。導入された遺伝子材料を含まない、もしくは外因性遺伝子材料を本質的に含まない（例えば、残留リコンビナーゼ標的部位またはその一部のみを含有する）ｉＰＳ細胞及び／または誘導神経系細胞は、かかる方法によって産生することができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、１つ以上のリプログラミング因子が、その因子をコードする１個以上の核酸配列を導入することによって、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、１個以上の核酸配列は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１個以上の核酸配列は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１個以上の核酸配列は、核酸構築物を含む。いくつかの実施形態では、１個以上の核酸配列は、リプログラミング因子を標的細胞（例えば、哺乳動物体細胞、例えば、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、または血液細胞）に送達するためのベクターを含む。例えば、ｉＰＳ細胞は、好適な一式のリプログラミング因子をコードする遺伝子を、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスによる感染によって体細胞に導入することにより、生成することができる。任意の好適なベクターが使用され得る。好適なベクターの例は、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ及びＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒにより説明されている（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２４：２２３９−２２６３、２０１０年、参照により本明細書に組み込まれる）。他の好適なベクターは、当業者にとって明らかである。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くの因子が、核酸の単一カセット内でコードされる。例えば、リプログラミング因子は、単一のプロモーターからの効率的な多シストロン性発現を支持する２Ａ「自己切断」ペプチドを使用して、単一のウイルス内で送達され得る。ある特定の実施形態では、リプログラミング因子または他のリプログラミング剤の生物活性バリアントが使用され得る。こうした因子のうちの１つ以上をコードする遺伝子をゲノムに挿入することの代わりに、またはそれに加えて、多様な技法をｉＰＳ細胞の生成に用いることができる。かかる方法は、小分子の使用、一過性トランスフェクション、非組込型ウイルス（例えば、アデノウイルス、センダイウイルス）もしくは環状エピソームとして染色体外で複製可能なプラスミド（例えば、ＥＢＮＡ１遺伝子及びＯｒｉＰ  ＤＮＡなどのエプスタイン−バーウイルスの要素を含む）を使用した感染、タンパク質形質導入、１つ以上のリプログラミング因子をコードする翻訳可能なｍＲＮＡの導入、及び／または選択された遺伝子（例えば、ｐ５３−ｐ２１経路遺伝子）の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉を伴い得る。ＴＧＦβ及び／またはＭＥＫ経路などの、ＥＳ細胞の自己再生及び多能性に関与するシグナル伝達経路に作用する分子を使用してもよい。リプログラミング因子の代わりに、かつ／または１つ以上のリプログラミング因子と組み合わせて、リプログラミングを増強するために使用され得るリプログラミング剤の非限定的な例としては、とりわけ、キナーゼ阻害因子、例えば、オーロラＡキナーゼ阻害因子（Ｌｉ  Ｚ，Ｒａｎａ  ＴＭ  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２；３：１０８５）、ＴＧＦ−β／アクチビン／Ｎｏｄａｌ受容体阻害因子（例えば、Ａ−８３−０１）などのＴＧＦβ経路阻害因子、ＭＥＫ阻害因子（例えば、ＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫ３β阻害因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）、ＲＯＣＫ阻害因子（例えば、ＨＡ−１００）、Ｏｃｔ４活性化化合物１などのＯｃｔ−４を活性化させる化合物１及びその構造類似体（Ｌｉ，Ｔ，���ｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１２；１０９（５１）：２０８５３−８）、レチノイン酸受容体作動薬が挙げられ、ある特定の実施形態において使用され得る。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害因子（例えば、バルプロ酸、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害因子（例えば、ＢＩＸ−０１２９４）、及び内因性クロマチン修飾酵素の他の調節因子は、リプログラミング効率を改善することができる。これらの化合物は、リプログラミングへのエピジェネティック障壁を低減させることによって作用し得る。いくつかの実施形態では、リプログラミング剤は、ＥＳＣ特異的細胞周期（ＥＳＣＣ）制御ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、またはかかるｍｉＲＮＡの標的遺伝子を阻害するアンチセンス分子などの、リプログラミングを増強する１つ以上のマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体を含む。いくつかの実施形態では、ある特定のマイクロＲＮＡ（例えば、ｌｅｔ−７）の発現の阻害は、リプログラミングを増強する。いくつかの実施形態では、リプログラミング剤は、アンタゴミルまたはアンチセンス分子などの、かかるｍｉＲＮＡの阻害因子を含む。いくつかの実施形態では、１個以上の遺伝子、例えば、ｐ５３、ＤＯＴ１、４Ｅ−ＢＰの発現の（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスの使用による）阻害は、リプログラミングを増強する。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、リプログラミングは、少なくとも部分的に、ｍＲＮＡを細胞に導入することによって行われ得、この導入されたｍＲＮＡは、少なくとも１つのリプログラミング因子をコードする。ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡであってもよい。インビトロ転写ｍＲＮＡ産生の非限定的な例は、Ｗａｒｒｅｎらによって説明されている（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７（５）：６１８−３０，２０１０，Ｍａｎｄａｌ  ＰＫ，Ｒｏｓｓｉ  ＤＪ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  ８（３）：５６８−８２、及び／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２６７９（ＷＯ／２０１１／１３０６２４）、これらの各々の教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。記載されているプロトコルは、１つ以上の本明細書における目的のｍＲＮＡを産生するように適合されてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡの安定性または翻訳可能性を上昇させる１つ以上の修飾（例えば、修飾リボヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、この修飾は、シチジンの５−メチルシチジン（５ｍＣ）での置換、ウリジンのシュードウリジン（ｐｓｉ）での置換、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、シチジン、ウリジン、またはその両方の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または全てが、それぞれ、５ｍＣまたはｐｓｉで置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ホスファターゼ処置に供される。いくつかの実施形態では、修飾は、インターフェロンシグナル伝達を減衰させる。いくつかの実施形態では、培地には、インターフェロンシグナル伝達の阻害因子が補充される。いくつかの実施形態では、阻害因子は、インターフェロンに結合する。いくつかの実施形態では、阻害因子は、Ｂ１８Ｒタンパク質、Ｉ型インターフェロンのワクシニアウイルスデコイ受容体などのデコイ受容体を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ｍＲＮＡは、５’キャップを含む。このキャップは、野生型であっても修飾されていてもよい。好適なキャップ及びかかるキャップを含有するｍＲＮＡを合成する方法の例は、当業者にとって明らかである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ｍＲＮＡは、読み取り枠を含み、これには、該読み取り枠の翻訳を増強する５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域、例えば、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含む５’非翻訳領域が隣接しており、かつ／または３’非翻訳領域は、α−グロビン３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ｍＲＮＡは、ポリＡ尾部を含む。ポリＡ尾部をｍＲＮＡに付加する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、ポリＡポリメラーゼによる酵素添加、または好適なリガーゼを用いた連結）。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、体細胞の細胞リプログラミングが起こるまで、該ｍＲＮＡによってコードされるリプログラミング因子または他のリプログラミング剤の発現を維持するのに十分な量で、かつ十分な期間にわたり、該体細胞に導入される。この十分な期間は、例えば、用いられる体細胞及びリプログラミング因子の種類に応じて、様々であってよい。当業者であれば、日常的な実験によって適切な期間を決定することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、リプログラミングの過程中、様々な間隔で体細胞に導入される。
【０２３５】
ある特定の実施形態で使用され得る、リプログラミング、ある特定のリプログラミング法、リプログラミングされた細胞を特性化する方法、及び／またはｉＰＳ細胞から分化細胞を生成する方法に関するさらなる考察ならびに説明は、例えば、米国特許公開第２０１１００７６６７８号、同第２０１１００８８１０７号、同第２０１００３１０５２５号、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ，ＣＡ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．，１０６（２２）：８９１２−７，２００９、Ｃａｒｅｙ  ＢＷ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ；１０６（１）：１５７−６２，２００９、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００８；３（３）：３４６−５３、及び／またはＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ，Ｕ．ａｎｄ  Ｖｅｍｕｒｉ，ＭＣ（ｅｄｓ．），Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９９７（２０１３）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒのブランド）、ならびに前述のいずれかに引用される参照文献で確認することができる。様々なリプログラミング法の非包括的、非限定的な考察は、Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎ  ＴＷ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．（２０１４），１４（６）：７２０−３４で確認される。
【０２３６】
本開示は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に導入して、例えば、リプログラミング及び／または遺伝子改変を行うための、任意の好適な方法を想定している。いくつかの実施形態では、核酸は、電気穿孔によって体細胞に導入される。いくつかの実施形態では、核酸は、トランスフェクションによって体細胞に導入される。好適なトランスフェクション試薬が使用され得、その多くが当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、核酸は、ビヒクル、例えば、カチオン性ビヒクル、例えば、カチオン性リポソームまたはナノ粒子と複合されてもよい。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、エンドサイトーシスによる核酸の取り込みを促進し、かつ／またはエンドソームからの核酸の放出を促進する。いくつかの実施形態では、核酸は、ベクターに組み込まれるか、またはそれによって担持されてもよい。
【０２３７】
概して、ヒトｉＰＳ細胞は、いずれの型の体細胞から生成されてもよい。いくつかの実施形態では、ヒトｉＰＳ細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪組織細胞、間葉系幹細胞（これは脂肪組織から得ることができる）、末梢血単核細胞（ＰＭＮＣ）、または尿から回収される上皮細胞から生成される。これらの細胞型は、生きているヒト対象から非侵襲的に、または最小もしくは低度の侵襲性で容易に得られ得るため、ヒトｉＰＳ細胞を得るために特に簡便であり得る。いくつかの実施形態では、ヒトｉＰＳ細胞は、精製されたヒトＣＤ３４＋細胞（これは末梢血から単離され得る）から得られる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、リプログラミングされた細胞は、分化して１つ以上の異なる細胞系統または細胞型の細胞を産生するように誘導され得る。例えば、リプログラミングによって生成された多能性細胞が、多分化能前駆細胞、例えば、神経前駆細胞に分化することを許容または誘導してもよく、これが様々な型の成熟分化細胞を生じるようにさらに分化することを許容または誘導してもよい。１つ以上の所望の細胞系統または細胞型への分化は、細胞を適切な１つ以上の操作一式に供すること、または分化を許容する条件下に細胞を置くことによって誘導され得る。分化が１つまたは複数の細胞周期の過程にわたって起こり得ることは理解されよう。分化を引き起こすために使用されるべき具体的な操作及び／またはプロトコルは、例えば、所望の細胞型及び／または開始細胞型に応じて、適切に選択されてよい。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、神経幹細胞は、多能性ヒト細胞から得られる。「神経幹細胞」という用語は、多分化能、自己再生、神経球形成能、及び神経幹細胞に特徴的な細胞マーカーの発現などの、神経幹細胞に特徴的な特徴を示す神経系細胞を指す。神経幹細胞は多分化能性であり、成熟した神経細胞、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトを生じさせる能力を有する。いくつかの実施形態では、神経前駆細胞は、多能性ヒト細胞からインビトロで得られる。「神経前駆細胞」という用語は、神経幹細胞よりも特定の細胞運命に向かって分化または特異化しており、成熟神経細胞よりも分化しておらず、成熟神経細胞の特徴を有する細胞を生じさせることができる、神経系細胞を指す。いくつかの実施形態では、誘導神経前駆細胞は、神経細胞とグリア細胞との両方（例えば、アストロサイト及び／またはオリゴデンドロサイトを生じさせることができる。成熟した神経細胞及びグリア細胞を生じさせるプロセスが、進行する分化を伴う１つ以上の細胞分裂周期を伴い得ることは理解されよう。
【０２４０】
神経幹細胞及び神経前駆細胞は、培養液中で分化して、成熟神経細胞、そしていくつかの実施形態ではグリア細胞を生じさせ得る。いくつかの実施形態では、成熟神経細胞は、分裂終了細胞である。そのような分化を誘導するための方法は、当該技術分野で既知である。概して、かかる方法は、所望の細胞型を生成するのに適切な時間にわたって神経幹細胞または神経前駆細胞を好適な培養培地中で培養する工程を含む。培養培地は、神経分化を促進する１つ以上の薬剤を含んでもよく、かつ／または、神経分化を阻害するか、もしくは非神経細胞系統経路に沿った分化を促進し得る１つ以上の薬剤を欠いていてもよい。ｉＰＳまたはＥＳ細胞、神経幹細胞、及び神経前駆細胞などのヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）から培養液中で神経細胞を生成するための方法は、当該技術分野で既知である。具体的な方法、培養培地は、所望の細胞型またはサブタイプの細胞を生成するために適切に選択されてよい。いくつかの実施形態では、神経細胞とグリア細胞との両方を含む細胞培養物が生成され得る。例えば、いくつかの実施形態では、神経細胞は、米国特許公開第２０１０００２１４３７号及び／またはＣｈｕｎｇ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１３）；３４２（６１６１）：９８３−７に記載されているように、ｉＰＳ細胞から生成され得る。
【０２４１】
多能性ヒト細胞からグリア前駆細胞を生成するための方法が利用可能である。グリア前駆細胞は、オリゴデンドロサイト細胞及びアストロサイト細胞に分化することができる。アストロサイトとオリゴデンドロサイトとの両方が、ヒトｉＰＳＣ由来のヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）から効率的に得られる（Ｗａｎｇ．，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２，２５２−２６４）。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）の神経系細胞は、例えば、インビトロの分化転換によって生成され得る。いくつかの実施形態では、神経幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞は、体細胞、例えば、線維芽細胞またはケラチノサイトからの分化転換によって生成される。かかる細胞を分化転換によって生成するための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｒｉｎｇ，ＫＬ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １１，１００−１０９及び／またはＰａｎｇ，ＺＰ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｎａｔｕｒｅ，４７６：２２０−２２４を参照されたい）。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、特定の型の神経細胞またはグリア細胞が、本明細書に記載されている方法において生成、単離、及び／または使用される。当業者であれば、脳または脳の特定の領域もしくは小領域、例えば前脳、中脳、皮質、海馬、線条体、または脳の特定の核、例えば、神経変性疾患において影響を受ける頻度が高い領域、小領域、または核内に典型的に見出され、かつ／あるいはこれらの場所にある、神経細胞及び／もしくはグリア細胞に発達するように運命づけられている細胞を示す、特徴及び細胞マーカーを把握しているであろう。当業者であれば、目的の神経系細胞を同定するために適切なマーカーを把握しているであろう。好適なマーカーは、例えば、転写因子、神経伝達物質の合成または神経伝達物質前駆体として機能する分子の取り込みに関与する酵素、神経伝達物質の受容体、中間径フィラメントタンパク質、イオンチャネルサブユニット、細胞接着分子などであってもよい。当業者であれば、目的の組織または細胞において、目的の核酸またはタンパク質、例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性の修飾遺伝子である酵母遺伝子のヒト相同体を発現するために使用され得る好適な制御要素、例えば、プロモーターを把握しているであろう。例えば、前述のマーカーをコードする遺伝子の制御要素、例えば、プロモーターが使用され得る。いくつかの実施形態では、神経細胞特異的プロモーターシナプシンが使用され得る。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、細胞は、Ａβを過剰発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、Ａβの変異体型、例えば、ＡＤに関連する変異体型を発現し得る。
【０２４５】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する酵母遺伝子の哺乳動物相同体が過剰発現または阻害もしくは無効化されている哺乳動物細胞及び／あるいは非ヒトトランスジェニック動物が、多様な目的のために使用され得る。例えば、かかる細胞及び／または動物は、本明細書に記載されている酵母系もしくは他の系で同定されている候補薬剤を試験するためのモデル系として使用されてもよく、または新規の候補薬剤を同定するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性疾患、例えば、ＡＤの遺伝的危険因子である酵母遺伝子の哺乳動物相同体を保有する哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）は、遺伝的危険因子を保有する罹患対象を治療するのに特に役立つ候補薬剤を同定するための個別化されたモデルとして機能し得る。いくつかの実施形態では、かかる細胞は、ヒトＡｐｏＥ、例えば、ヒトＡｐｏＥ４、または特定のＡｐｏＥアイソフォームを模倣するＡｐｏＥを保有する。例えば、ヒトＡｐｏＥ４を模倣するＡｐｏＥは、ヒトＡｐｏＥの残基１１２及び１５８に対応する位置にアルギニンを有する。いくつかの実施形態では、細胞は、いずれのＡＰＯＥ遺伝子型を有してもよい。
【０２４６】
前出の哺乳動物モデル系のいずれが、本明細書に記載されているヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーを同定する方法において使用されてもよい。
【０２４７】
薬学的組成物及び治療方法
細胞内のＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制することが分かっている化合物は、例えば、ＡｐｏＥ関連疾患、例えば、アルツハイマー病などのＡｐｏＥ関連神経変性疾患を治療するための対象への投与のために、薬学的組成物として製剤化することができる。
【０２４８】
薬学的組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。本組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９，１９７７を参照されたい）を含むことができる。
【０２４９】
本化合物は、標準的方法に従って製剤化することができる。製剤処方は、十分に確立された技術であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）、及びＫｉｂｂｅ（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）にさらに記載されている。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、細胞内のＡｐｏＥ媒介性毒性を予防または抑制する化合物は、塩化ナトリウム、リン酸二塩基ナトリウム七水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｈｅｐｔａｈｙｄｒａｔｅ）、リン酸一ナトリウムなどの賦形剤材料、及び安定剤を用いて製剤化することができる。これは例えば、好適な濃度にて緩衝液中で準備することができ、２〜８℃で保管することができる。
【０２５１】
本薬学的組成物は、多様な形態であってよい。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射用液及び輸注用液）、分散液または懸濁液、錠剤、カプセル剤、ピル、粉剤、リポソーム、及び坐剤などの、液体、半固体、及び固体剤形が含まれる。好ましい形態は、意図される投与方法及び治療用途によって決めることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている１つ以上の薬剤を含む組成物は、注射用液または輸注用液の形態である。このような組成物は、非経口方法（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）によって投与することができる。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という表現は、通常は注射による経腸及び局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内、及び胸骨内注射ならびに輸注を含むが、これらに限定されない。
【０２５２】
本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度での安定な保管に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。無菌注射用液は、本明細書に記載されている薬剤を、必要に応じて、上に列挙された成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要量で組み込み、その後、濾過滅菌することによって、調製することができる。概して、分散液は、化合物を、塩基性分散媒及び上に列挙されたもののうち必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌注射用液の調製用の無菌粉体の場合、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これは、化合物に加え、任意のさらなる所望の成分の粉体を、以前に滅菌濾過されたその溶液からもたらすものである。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアレート塩及びゼラチンを組成物に含めることによって引き起こすことができる。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、本化合物は、インプラントを含む徐放性製剤、及びマイクロカプセル化送達系などの、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法が、特許取得されているか、または一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０２５４】
細胞内のＡｐｏＥ誘導性毒性を予防または抑制するものと同定された化合物は、例えば、循環、例えば、血液、血清、もしくは他の組織におけるその安定化及び／または保持を、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、または５０倍改善する部分で修飾することができる。当該修飾された化合物を、それが目的の治療部位に到達できるかどうか、例えばアルツハイマー病などの神経変性疾患を有する対象の細胞において見出され得るかどうかを（例えば、標識された形態の当該化合物を使用することによって）評定するために評価することができる。
【０２５５】
例えば、本化合物は、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなどのポリマー、例えば、実質的に非抗原性のポリマーと会合することができる。好適なポリマーは、重量によって実質的に異なる。約２００〜約３５，０００ダルトン（または約１，０００〜約１５，０００、及び２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマーを使用することができる。例えば、化合物は、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンに抱合され得る。かかるポリマーの非限定的な一覧には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマー、及びそれらのブロックコポリマー（ただし、ブロックコポリマーの水溶性が維持されることを条件とする）が含まれる。さらなる有用なポリマーとしては、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））などのポリオキシアルキレン；ポリメタクリレート；カルボマー；ならびに分岐または非分岐状の多糖類が挙げられる。
【０２５６】
本化合物が第２の薬剤（例えば、アルツハイマー病または他のＡｐｏＥ関連疾患のための任意のさらなる治療薬と組み合わせて使用される場合、この２つの薬剤は、別々に製剤化されても一緒に製剤化されてもよい。例えば、それぞれの薬学的組成物を、例えば投与の直前に混合し、一緒に投与することもでき、または、例えば同時もしくは異なる時間に、別々に投与することもできる。別々に投与される化合物は、例えば具体的な薬剤に応じて、同じ経路で投与されても異なる経路で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、第１及び第２の化合物は、互いから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日以内、または互いから２週間、３週間、４週間、もしくは６週間に、１回以上投与される。
【０２５７】
本明細書に記載されている化合物、及び本明細書に記載されているように同定された化合物は、ＡｐｏＥ媒介性毒性、アミロイドβ媒介性毒性、及び／またはアミロイドβ凝集体、例えば、アミロイドβオリゴマー及び／もしくは二量体の形成、沈着、蓄積、もしくは存続性に関連する障害のリスクがあるか、あるいはそれを有する対象（例えば、ヒト対象）を治療するために使用することができる。特定の実施形態では、この障害はアルツハイマー病である。このような障害のリスクがあるかまたはそれを有する個体を同定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、ＡＤは、例えば、患者病歴（例えば、記憶喪失）臨床的観察、特徴的な神経学的及び神経心理学的特徴の存在、ならびに前述のものの原因であり得る他の病態の検出の欠如に基づいて診断することができる。コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）などの撮影技法を用いることができる。診断は、脳物質の死後検査によって確認することができる。ＡＤの例示的な診断基準は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＤＳＭ）−ＩＶ（２０００年編集）またはＤＳＭ−Ｖ、及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ（ＮＩＮＣＤＳ）−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＤＲＤＡ）の基準（ＭｃＫｈａｎｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４（７）：９３９−４４）、例えば更新版（Ｄｕｂｏｉｓ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６（８）：７３４−４６）で確認される。様々なバイオマーカー、例えば、アミロイドβもしくはタウタンパク質（例えば、全タウタンパク質及びリン酸化タウ）についての脳脊髄液（ＣＳＦ）の分析、及び／またはアミロイドβ沈着物に結合する標識化合物（例えば、１１Ｃ標識ピッツバーグ化合物Ｂ（１１Ｃ−ＰＩＢ）もしくは１８Ｆ−ＡＶ−４５（フロベタピル（ｆｌｏｂｅｔａｐｉｒ）Ｆ１８））を用いた撮影法（例えば、ＰＥＴ撮影法）は、ＡＤの発症を予測するために、例えば、将来（例えば、今後２年以内）にＡＤに進行する著しい可能性を有する個体を同定するために使用することができる。そのような撮影法はまた、本明細書において特定され、かつ／または本発明のスクリーニングアッセイを使用して同定された化合物のインビボでの作用を評定するために、本発明において用いられてもよい。いくつかの実施形態では、対象は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン１、またはプレセニリン２をコードする遺伝子内に突然変異を有する。いくつかの実施形態では、突然変異は、Ａβ４２の産生を増加させるか、またはＡβ４２対Ａβ４０の比を変更する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、ＡＰＯＥ遺伝子に関する対象の遺伝子型は既知である。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＰＯＥ遺伝子のε４対立遺伝子を少なくとも１コピー有する。一般的なＡｐｏＥアイソフォームは、ＡｐｏＥポリペプチドの１１２位及び１５８位にあるアミノ酸をコードするコドンにおけるＣ／Ｔ多型によって決定される。可能性のある６つの遺伝子型のうち、３つはホモ接合性であり（ε２／ε２、ε３／ε３、ε４／ε４）、３つはヘテロ接合性である（ε２／ε３、ε２／ε４、ε３／ε４）。いくつかの実施形態では、対象は、ε４対立遺伝子に対してヘテロ接合性である（対象の遺伝子型は、ε２／ε４またはε３／ε４である）。いくつかの実施形態では、対象は、ε４対立遺伝子に対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、対象は、ε３対立遺伝子に対してヘテロ接合性である（対象の遺伝子型は、ε２／ε３またはε３／ε４である）。いくつかの実施形態では、対象は、ε３対立遺伝子に対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、対象は、ε２対立遺伝子に対してヘテロ接合性である（対象の遺伝子型は、ε２／ε３またはε２／ε４である）。いくつかの実施形態では、対象は、ε２対立遺伝子に対してホモ接合性である。ＡＰＯＥ遺伝子座における遺伝子型は、当該技術分野で既知の遺伝子検査に有用な多様な方法のいずれか、例えば、配列決定（例えば、ＰＣＲによる増幅後）、対立遺伝子特異性プローブのハイブリダイゼーション後の検出、対立遺伝子特異性プライマーのハイブリダイゼーション後のリアルタイムＰＣＲ（Ｃａｌｅｒｏ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１８３（２）：２３８−４０）、ＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）ミニシークエンシング（Ｂｅｎ−Ａｖｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．２００４  Ｏｃｔ；６（５）：４９７−５０１）、及び多重テトラプライマー増幅不応性突然変異系（Ｔ−ＡＲＭＳ）ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎアッセイ（Ｋｏｃｈ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．４０（１１）：１１２３−３１）、ＦＲＥＴベース法（Ｒｉｈｎ，ＢＨ（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；９（１）：６１−５．）、ＰＣＲ後の制限断片長多型性評価（Ｚｉｖｅｌｉｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４３：１６５７−９）などを使用して、決定することができる。
【０２５９】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、患者に治療用化合物を適用もしくは投与すること、すなわち、疾患（または他の医学的に認識される障害もしくは症候群）、疾患の症状、または疾患に向かう素因（例えば、疾患に関連する１つ以上の危険因子（例えば、遺伝的危険因子））を有する対象（例えば、「患者」とも称され得るヒト対象）に、疾患、疾患の症状、または疾患に向かう素因を、癒やすか、治癒するか、軽減するか、和らげるか、変更するか、是正するか、緩和するか、改善するか、または（対象に有益な様式で）それに影響を及ぼす目的で、治療用化合物を適用もしくは投与することとして定義される。いくつかの実施形態では、治療は予防的である。すなわち、治療は、疾患を発症していない（そして疾患を発症する素因を有する場合も有しない場合もある）対象に、対象が疾患を発症することを遅延させること、予防すること、もしくはその可能性を低減させること、または対象が疾患を発症した場合はその重症度を低減させることを目的として施される。化合物は、同様にまたは代替的に、試験、研究、もしくは診断の目的で対象に投与されてもよく、かつ／あるいは、例えば、試験、研究、診断の目的で、または単離された組織、細胞、もしくは細胞株を後に治療のために対象に投与することを目的として、患者から単離された組織、細胞、もしくは細胞株と接触させられてもよい。
【０２６０】
いくつかの態様では、対象（例えば、ヒト）において、標的タンパク質、または標的タンパク質の発現もしくは少なくとも１つの標的タンパク質の活性を調節する化合物を対象に投与することによって、ＡｐｏＥ媒介性疾患を予防するための方法が、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、例えば、本発明の方法によって同定されたヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーであり得る。異常または不要な標的タンパク質の発現または活性によって引き起こされるか、またはそれらが寄与する疾患のリスクがある対象は、例えば、本明細書に記載されている診断アッセイもしくは予後アッセイのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせによって同定することができる。予防的化合物の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいは、その進行が遅延されるように、疾患に特徴的な症状の顕在化の前に行うことができる。当該技術分野で既知の方法を使用して、治療の有効性を判定することができる。対象を治療するために使用される適切な化合物は、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。ＡＤ（または他のＡｐｏＥ媒介性疾患）の一部の症例は、少なくとも部分的に、異常なレベルの標的遺伝子産物によって、または異常な活性を示す標的タンパク質の存在によって引き起こされ得る。本発明のいくつかの態様では、そのような遺伝子産物のレベル及び／または活性を変更することで、障害の症状の緩和がもたらされる。例えば、異常に高いレベルの標的遺伝子産物、もしくは標的タンパク質の異常に高いレベルの活性は、低減することができ、かつ／または、異常に高いレベルの標的遺伝子産物、もしくは標的タンパク質の異常に高いレベルの活性は、上昇することができる。したがって、かかる遺伝子産物のレベル及び／または活性の調節により、障害の症状の緩和がもたらされる。故に、いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性またはアミロイドβ媒介性障害の治療は、選択された標的遺伝子産物（例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性の増強因子）の発現または活性を阻害する技法によって達成することができる。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ媒介性またはアミロイドβ媒介性障害の治療は、選択された標的遺伝子産物（例えば、ＡｐｏＥ媒介性毒性の抑制因子）の発現または活性を増強する技法によって達成することができる。例えば、負の調節活性を示す（例えば、遺伝子発現またはタンパク質活性を阻害する）化合物、例えば、上述のアッセイのうちの１つ以上を使用して同定された薬剤は、本明細書に記載されているように、ＡｐｏＥ媒介性またはアミロイドβ媒介性障害の症状を予防及び／または緩和するために使用することができる。かかる分子としては、ペプチド、有機もしくは無機小分子、抗体、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、リボザイム、または三重らせん分子を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本化合物は、１つ以上の標的タンパク質活性を増強する。かかる化合物の例としては、活性標的タンパク質（またはその生物活性断片もしくはバリアント）、標的タンパク質をコードするか、またはその生物活性断片もしくはバリアントをコードする核酸分子、さもなければ遺伝子の発現を阻害するであろうｍｉＲＮＡを阻害するアンタゴミル、ペプチド、有機もしくは無機小分子、及び抗体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２６１】
ＡｐｏＥ媒介性毒性を阻害し、かつ／または標的遺伝子の発現、合成、及び／もしくは活性を調節する（阻害または増強する）化合物は、ＡｐｏＥ媒介性もしくはアミロイドβ媒介性障害を予防、治療、または緩和するために、治療有効用量で患者に投与することができる。治療有効用量は、疾患の１つ以上の症状もしくは徴候の緩和、及び／または疾患の１つ以上の症状もしくは徴候の重症度が高まる速度の（例えば、療法の不在下で予想されるであろう速度と比較したときの）低減をもたらすのに十分な化合物の量とすることができる。ＡＤにおける有効性を評定するための基準は、当該技術分野で既知である。かかる化合物の毒性及び治療有効性は、標準的な薬理学的手段によって判定することができる。いくつかの実施形態では、Ｖｅｌｌａｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００８）７（５）：４３６−４５０に記載されている１つ以上のエンドポイントまたはエンドポイントセットが使用され得る。いくつかの実施形態では、Ａｉｓｅｎ，ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１；７６（３）：２８０−６に記載されている１つ以上のエンドポイントまたはエンドポイントセットが、早期（前認知症（ｐｒｅｄｅｍｅｎｔｉａ））ＡＤにおける有効性を評価するために使用される。有効用量は典型的に、例えば、その半減期などの様々な要因に応じて複数回、例えば、毎日、毎週、毎月などに１回またはより多くの回数で投与されることは理解されよう。例示的な実施形態では、治療有効量は、体重１ｋｇ当たり約０．００１〜１００ｍｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜２５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．１〜２０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約１〜１０ｍｇの範囲である。疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全身的健康及び／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる薬用量及びタイミングに影響し得ることは、当業者であれば理解するであろう。さらに、治療有効量の薬剤、例えば、小分子、タンパク質、ポリペプチド、核酸、または抗体を用いた対象の治療は、単回治療を含むことができ、または一連の治療を含むことができる。
【０２６２】
いくつかの態様では、標的タンパク質または核酸分子の異常または不要な発現または活性によって特徴付けられる疾患または障害を患う個体を治療する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、当該方法は、化合物（例えば、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイによって同定された化合物）、または標的タンパク質の発現または活性を調節する（例えば、上方制御または下方制御する）化合物の組み合わせを投与する工程を伴う。標的タンパク質活性の刺激は、標的タンパク質が異常に下方制御されており、かつ／または上昇した標的タンパク質活性が有益な効果を有する可能性が高い状況において望ましい場合がある。標的タンパク質活性の阻害は、標的タンパク質が異常に上方制御されており、かつ／または低下した標的タンパク質活性が有益な効果を有する可能性が高い状況において望ましい場合がある。ある特定の実施形態では、１種以上の化合物（例えば、異なる遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する化合物）を一緒に（同時に）投与することも、または異なる時間に（逐次）投与することもできる。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、例えば、本発明の方法によって同定されたヒトＡｐｏＥタンパク質の結合パートナーであり得る。
【０２６３】
以下は、本発明の実施の例である。これらは、本発明の範囲をいかようにも限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２６４】
実施例１：ＡｐｏＥ毒性の酵母モデル
ヒトＡｐｏＥのガラクトース誘導性発現を可能にするいくつかの酵母菌株を生成した。これらの研究で使用した発現構築物は、アミノ末端に酵母Ｋａｒ２ｐシグナル配列、続いてヒトＡｐｏＥタンパク質、続いてカルボキシ末端にＥＧＦＰタンパク質を含有する融合ポリペプチドをコードする。ヒトＡｐｏＥタンパク質を細胞内で小胞体に輸送させ、それによってこれが分泌経路に進入するように、シグナル配列を融合ポリペプチド内に含めた。ＧＡＬ１プロモーターの制御下でヒトＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４アイソフォームをコードする構築物を生成した。
【０２６５】
以下の配列を、Ｇａｔｅｗａｙクローニング技術ＬＲ反応を使用して、ｐＡＧ３０４  Ｇａｌ  ｃｃＤＢ  ＥＧＦＰベクター（https://www.addgene.org/14207/；Alberti, S., et al., (2007) Yeast. 24(10):913-9）に挿入した。これらの配列において、下線が引かれたイタリック体の大文字は、酵母Ｋａｒ２シグナル配列
2017534255.tif 000067
をコードし、大文字の配列の残部は、対応するヒトＡｐｏＥアイソフォームをコードするヒトＡｐｏＥε２、ε３、またはε４ヌクレオチド配列であり、イタリック体の小文字（ｔｇｃｃｃ）は、Ｇａｔｅｗａｙクローニングのために使用されたＡＴＴＢ２組換え配列の一部である）。ＡｐｏＥアイソフォームをコードする配列内の下線が引かれた太字は、タンパク質のＡｐｏＥ部分において１１２位及び１５８位にあるアミノ酸をコードする。
【０２６６】
2017534255.tif 000068
2017534255.tif 000069
【０２６７】
ＡｐｏＥ融合ポリペプチドを酵母内で発現させ、酵母細胞生存能力に対するその作用を次のように評定した：酵母細胞を、空ベクター、またはＡｐｏＥ融合ポリペプチドのうちの１つをコードするガラクトース誘導性発現プラスミドのいずれかで形質転換した。形質転換体の段階希釈物を、グルコースまたはガラクトース培地を含むプレート上にスポッティングし、増殖を評定した。ＡｐｏＥタンパク質の発現（すなわち、ガラクトースプレート上で増殖した形質転換体におけるもの）は、酵母細胞に対して毒性であることが分かった（図２（Ｂ）；各写真中、示されているように、対照ベクターは一番上にあり、実験用発現ベクター（ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４融合ポリペプチドをコードする）は下３つの横列にある。３つ全てのアイソフォームが毒性を誘導したが、その度合いは異なった。各対立遺伝子によって誘導された毒性の度合いは、当該対立遺伝子がヒトにもたらすＡＤリスクの度合いと相関した。Ｅ４アイソフォームは、酵母において最も高い毒性を有し、ヒトにおいて最も高いＡＤリスクをもたらし、Ｅ３アイソフォームは、酵母において中等量の毒性を示し、ヒトにおいて中等度のＡＤリスクに関連し、Ｅ２アイソフォームは、酵母において最小量の毒性を示し、ヒトにおいて最も低いＡＤリスクをもたらす。
【０２６８】
ガラクトースを含有する液体培地中で形質転換体を培養し、ＯＤ６００を経時的にモニタリングすることによって増殖を評定したとき、同様のパターンが観察された（図２Ｃ）。増殖曲線の各々については、菌株を、２％ラフィノースを含有するトリプトファン不含培地中で飽和状態まで振盪しながら、３０℃で一晩増殖させた。次いで、これらの培養物を０．１の光学密度（６００ｎｍのＯＤ）まで希釈し、ＯＤ（６００ｎｍ）が約０．４〜０．８になるまで７〜８時間放置し、増殖させた。次いで、これらの細胞を、２％ガラクトースを含むトリプトファン不含培地中で０．１のＯＤまで希釈して、ＡｐｏＥの産生を誘導した。その増殖を、最大７２時間にわたって１５分毎に、時間の関数としてのＯＤを追跡することによって測定した。
【０２６９】
これらの形質転換体は、ｑＰＣＲによって評定したとき、ＡｐｏＥ２構築物を４コピー、ＡｐｏＥ３構築物を３〜４コピー、またはＡｐｏＥ４構築物を３〜４コピー保有しており、したがって、毒性レベルの違いは構築物のコピー数の差によるものではなかったことが実証された。
【０２７０】
それぞれの形質転換体におけるＡｐｏＥタンパク質のレベルを、ウェスタンブロットによって決定し、次のようにＰＧＫ１のレベルと比較した：ウェスタンブロットのために、誘導の２４時間後に細胞を採取し、ＯＤによって細胞数を正規化した。ＴＣＡ沈降プロトコルを使用して、細胞を溶解し、タンパク質を採取した。それらを、４〜１２％のビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、約１時間にわたり１５０Ｖで泳動した。このゲルを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｂｌｏｔ装置を使用してニトロセルロースの０．２ｕｍ孔径膜上に移した。次いで、このブロットを、５％脱脂乳中で一晩ブロッキングし、５％乳中で抗ＧＦＰ抗体（１：１０００希釈、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号１１８１４４６０００１）を用いてプローブし、ＰＢＳ  １％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、二次抗体抗マウスＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ、１：１００００）を使用して再プローブした。このブロットを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｆｅｍｔｏ基質を使用して現像し、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ−Ｄｏｃデバイスを使用して撮影した。ローディング対照は、抗ウサギＰＧＫ１抗体（１：１０００）及び抗ウサギＨＲＰ二次抗体（１：１００００）を使用して行った。
【０２７１】
上述のように、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２−ＥＧＦＰ、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３−ＥＧＦＰ、またはＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ＥＧＦＰ（図２Ａ参照）の４つの遺伝子コピーを有する細胞を、ガラクトースを含有する液体培地中で培養し、ＯＤ６００を経時的にモニタリングすることによって増殖を評定した（図３Ａ）。図３Ｂは、これらの菌株において発現したＡｐｏＥアイソフォームのタンパク質レベルをローディング対照（ＰＧＫ１）と比較して評定するために、抗ＧＦＰ一次抗体を使用したウェスタンブロットの結果を示す。
【０２７２】
上述の結果がポリペプチドのＥＧＦＰではなくＡｐｏＥ部分に起因したことを確認するため、上述の構築物と同様であるが融合ポリペプチドのＥＧＦＰ部分を欠いた構築物を生成し、酵母に形質転換した。これらの実験は、２ミクロン発現プラスミド内のＡｐｏＥ構築物を用いて行った。上述のように、形質転換体の段階希釈物を、グルコースまたはガラクトース培地を含むプレート上にスポッティングし、増殖を評定した。その結果は、上述の結果と同様であり、ＥＧＦＰの存在は観察される表現型に影響しないことが確認された（図４）。
【０２７３】
実施例２：中レベルまたは高レベルの毒性を有するＡｐｏＥ発現菌株の生成
ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４融合ポリペプチドをコードする発現構築物を様々なコピー数保有するさらなる酵母菌株を生成した。中レベルの毒性を示す菌株（「中等度毒性」菌株と称される）または高レベルの毒性を示す菌株（「高毒性」菌株と称される）を、各アイソフォームについて単離した。上述のように、ガラクトースを含有する液体培地中の様々な菌株の増殖を、ＯＤ６００を経時的にモニタリングすることによって評定した（図５Ａ）。上述のように、ＰＧＫ発現に対する、各菌株におけるそれぞれのＡｐｏＥタンパク質の発現レベルを、ウェスタンブロットによって判定した（図５Ｂ）。
【０２７４】
様々な中等度毒性及び高毒性菌株における関連性のあるコード配列のコピー数を、ｑＰＣＲを使用して決定した。結果を表４に提示する。
【０２７５】
（表４）中等度毒性及び高毒性菌株におけるＡｐｏＥをコードする構築物のコピー数
2017534255.tif 000070
【０２７６】
実施例３：Ｒ６１Ｔ突然変異はＡｐｏＥ３様表現型を回復する
２ミクロン発現プラスミド内のＧＡＬ１プロモーターの制御下の発現を有する、Ｒ６１Ｔ突然変異を保有するＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ−ｅＧＦＰ融合タンパク質をコードする酵母発現構築物を生成した。上述のように、Ｒ６１Ｔ突然変異は、ＡｐｏＥ４の構造をＡｐｏＥ３の構造のようにする。発現構築物のＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ−ｅＧＦＰ配列は、Ｒ６１Ｔ突然変異の存在を除いては上述のものと同一であった。Ｒ６１Ｔ突然変異を保有するＡｐｏＥ融合ポリペプチドをコードする構築物を、２ミクロン発現プラスミド内で酵母に導入し、各タンパク質の酵母細胞生存能力に対する作用を、形質転換体の段階希釈物をガラクトース含有培地上にスポッティングして融合ポリペプチドの発現を誘導することによって評定した（図７）。ＡｐｏＥ４  Ｒ６１Ｔ融合ポリペプチドは、ＡｐｏＥ３融合ポリペプチドによって示される毒性に酷似した、ＡｐｏＥ４野生型融合ポリペプチドと比較して低減した毒性を示した。これらの結果は、酵母モデル系においてＡｐｏＥによって誘導される毒性の根底にある機序が、ＡｐｏＥがヒトにおいてその効果を発揮する機序に直接関連していることをさらに裏付ける。
【０２７７】
実施例４：ＡｐｏＥ毒性の修飾遺伝子についてのスクリーニング
ＡｐｏＥ毒性の修飾遺伝子を同定するためにスクリーニングを行った。このスクリーニングは、プール形式で行った。上述の高毒性菌株（ＡｐｏＥ２高毒性、ＡｐｏＥ３高毒性、及びＡｐｏＥ４高毒性）ならびにｅＧＦＰ発現対照菌株の各々を、ＦＬＥＸＧＥＮＥライブラリ（Ｈｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１７：５３６−４３）における約５７００個のプラスミドのプールライブラリを用いて形質転換した（各々がその酵母ゲノムにおいて１つのＧＡＬ誘導性ＯＲＦにより形質転換された）。各菌株（各々が概ね１つのプラスミドを保有する）から得られたクローンを採取してプールし、（毒性タンパク質ＡｐｏＥまたは対照ＧＦＰが目的のＯＲＦと共に発現されるように）ガラクトースを用いた誘導下で増殖させた。同時に、ライブラリ適用範囲の知るために、これらの菌株の別のアリコートをグルコース含有培地中で増殖させた。プラスミドを抽出し、ＰＣＲを使用してＯＲＦを増幅させた。ＤＮＡを超音波処理し、遺伝子の配列を決定した。ヒットは、それらの効果サイズに基づいて（ＡｐｏＥ対ＧＦＰ対照とグルコース対ガラクトースとの両方を比較して）閾値決定した（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｅｄ）。
【０２７８】
ヒットの多くについて、ＦＬＥＸＧＥＮＥライブラリ（非プール）からの個別のプラスミドを、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４を発現する酵母菌株に個別に形質転換し、ガラクトース培地中の（すなわち、プラスミド内のＡｐｏＥとＯＲＦとの両方の発現が誘導される条件下にての）それらの増殖を追跡することによって、再試験した。各菌株において増殖を空ベクターと比べて増強または抑制したヒットを同定した。この検証に使用したＡｐｏＥ２菌株は、ＡｐｏＥ２をコードする発現構築物を約１１〜１５コピー含有していた。検証に使用したＡｐｏＥ３菌株は、ＡｐｏＥ３をコードする発現構築物を７コピー含有していた。検証に使用したＡｐｏＥ４菌株は、ＡｐｏＥ４をコードする発現構築物を４コピー含有していた。
【０２７９】
表１Ａは、ヒットが初めに同定されたスクリーニングに使用した菌株と同じＡｐｏＥアイソフォームを発現する検証用菌株においてＡｐｏＥ毒性の抑制因子または増強因子として認証されたこれらのヒットを列記している。こうしたヒットのうちいくつかは、他のアイソフォームを発現する検証用菌株のいずれかまたは両方におけるＡｐｏＥ毒性も調節した。表１Ｂは、ヒットが初めに同定されたスクリーニングに使用した菌株によって発現されるものとは異なるＡｐｏＥアイソフォームを発現する１つ（または２つ）の検証用菌株においてＡｐｏＥ毒性を調節するものとして認証されたこれらのヒットを列記している。表２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、よりストリンジェントなカットオフ基準を使用して、少なくとも１つのＡｐｏＥアイソフォームの抑制因子または増強因子として同定された、同じスクリーニングからのヒットを列記している。各菌株の増殖に対する各酵母遺伝子の作用は、各表（効果サイズを示す縦列）に示されている。数字は、対照菌株（同じ菌株だが酵母遺伝子が挿入されていないベクターで形質転換されているもの）と比較した、示されている酵母遺伝子を発現する菌株の相対的な増殖を表す。したがって、１．０超の数字は、その遺伝子が過剰発現されるとＡｐｏＥ媒介性毒性が抑制されたことを示す。１．０未満の数字は、その遺伝子が過剰発現されるとＡｐｏＥ媒介性毒性が増強されたことを示す。表１Ａ及び１Ｂ中、毒性の抑制因子は「Ｓ」の文字で示され、毒性の増強因子は「Ｅ」の文字で示されている。この値が０．５以下または１．５以上である遺伝子は特に大きな効果を有した。
【０２８０】
表２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、ＡｐｏＥ誘導性毒性の酵母抑制因子及び増強因子のうちの特定のもののヒト相同体を列記している。アルツハイマー病の既知の遺伝的危険因子であるヒト相同体は、別個の縦列に列記されている。ヒト相同体は、配列及び構造に基づく相同性検索ツールを使用して同定された。ＡＤ危険因子である相同体のうちの特定のものの同定においては、この配列及び構造に基づく基準に加えて、同様の配列の長さならびに文献データに基づくさらなる基準を考慮した。
【０２８１】
実施例５：ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する能力についての化合物の試験
Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ｅＧＦＰをコードする構築物を保有するＡｐｏＥ４発現酵母細胞をスクリーニングアッセイに使用して、治療候補化合物のスクリーニングにおける組換え細胞の有用性を評定した。ＡｐｏＥ４構築物を３〜４コピー保有し、薬物ポンプ転写因子ＰＤＲ１及びＰＤＲ３が欠失したＡｐｏＥ４高毒性菌株を、この実験に使用した。細胞をラフィノース中で増殖させ、細胞を（発現構築物の発現を開始させるために）ガラクトース培地中に希釈した。被験化合物を０．２５μＭ〜３２．０μＭの範囲の様々な濃度で培養物に添加し、この化合物の添加後、細胞を２４時間増殖させ、次いで光学密度をＡ６００で読み取った。被験化合物は、アルツハイマー病の治療のための既知の候補化合物であるクリオキノール、ならびに、酵母及び哺乳動物の神経細胞を含む多様な細胞型をα−シヌクレイン毒性から選択的に保護する小分子であるＮＡＢ２（Ｔａｒｄｉｆｆ，ＤＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）；３４２（６１６１）：９７９−８３）であった。クリオキノール自体が高濃度で酵母に対して毒性になることが、他の実験から知られている。結果（図１０）は、約１．５μＭ未満の濃度でクリオキノールは酵母モデル系におけるＡｐｏＥ４媒介性毒性を低減させることができたが、ＮＡＢ２にはそれができなかったことを実証した。これらの結果は、ＡｐｏＥ誘導性細胞毒性のモデル系として酵母が使用可能であること、及びこの毒性を軽減する治療候補化合物が特定可能であることを裏付ける。
【０２８２】
実施例６：ＡｐｏＥを発現する酵母細胞はエンドサイトーシスの欠陥を示す
Ｓ．セレビシエのＭＵＰ１は、通常の条件下では細胞膜において発現され、メチオニンの存在下でエンドサイトーシスを受ける、高親和性メチオニンパーミアーゼである。ＭＵＰ１局在化は、エンドサイトーシスのマーカーとして使用することができる。ＭＵＰ１局在化に基づくエンドサイトーシスアッセイを行って、酵母におけるエンドサイトーシスに対するＡｐｏＥの作用を評定した。
【０２８３】
上述のＡｐｏＥ高毒性菌株（ＡｐｏＥ２高毒性、ＡｐｏＥ３高毒性、及びＡｐｏＥ４高毒性）ならびにｅＧＦＰ発現対照菌株の各々を、ＭＵＰ１レポーター構築物（蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２に融合しているＭＵＰ１を含有する融合タンパク質の発現を駆動するＳ．セレビシエメチオニンパーミアーゼＭＵＰ１のプロモーターを含有する発現構築物）を用いて形質転換した。加えて、さらなるヒト神経変性疾患関連タンパク質であるα−シヌクレインをコードする発現構築物を保有する酵母菌株（α−ｓｙｎ中等度毒性、α−ｓｙｎ高毒性菌株）またはＡβをコードする発現構築物を保有する酵母菌株（Ｔｒｅｕｓｃｈ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１１），３３４：１２４１−５に記載されているＫａｒ２ｓｓ−Ａβ菌株）を、ＭＵＰ１レポーター構築物で形質転換した。（図１１（Ａ））。
【０２８４】
各菌株の細胞を、ガラクトースを含有し、かつ標準レベルのメチオニンを含有するか、またはメチオニンを欠いているかのいずれかの培地中で、６時間（ヒト神経変性疾患タンパク質の発現を誘導するために）培養した。次いで細胞を蛍光顕微鏡法によって検査した。ヒト神経変性疾患関連タンパク質を発現する酵母菌株は、ＧＦＰのみの対照と比較して（特にＡｐｏＥ菌株及びα−ｓｙｎ菌株において）重度に撹乱されたエンドサイトーシスを示した（図１１（Ｂ）、上パネル）。
【０２８５】
ＡｐｏＥ４、Ａβ、及びα−シヌクレインは、ＭＵＰ１のエンドソーム輸送の妨害において明確に異なる表現型をもたらす（図１１（Ｃ））。ＡｐｏＥ４「高毒性」、Ａβスクリーニング菌株２．８（ＡＤＥ２＋）、及びα−シヌクレイン「中等度毒性」菌株を、図１１（Ｃ）に示されている画像を得る前に８時間にわたって、上述のＡｐｏＥ４、Ａβ、またはα−シヌクレイン構築物を発現するように誘導した。理論に束縛されることを望むものではないが、これらのタンパク質によって引き起こされるエンドソーム輸送欠陥の性質は明確に異なる場合がある。
【０２８６】
実施例７：ＡｐｏＥ毒性の修飾遺伝子スクリーニングからのトップヒットの再検証
実施例４に記載されているＡｐｏＥ毒性についての修飾遺伝子スクリーニングからのトップヒットのうちおよそ５００個の再検証を行った（図１２）。これらのヒットは、濃縮／欠乏カットオフの３シグマ倍率変化を使用して選択した。これらのヒットを、上述のＦＬＥＸＧＥＮＥライブラリ動原体プラスミドを使用した３８４ウェルプレート形式の増殖アッセイを使用して再検証した。これらをまた、α−シヌクレイン及びアミロイド−β発現酵母モデルにおいて交差検証した。
【０２８７】
表３は、ＡｐｏＥ４媒介性毒性の増強因子及び抑制因子に関する再検証されたヒットの概要を示す。図１２には、各ＡｐｏＥアイソフォームについて再検証されたヒットの数、ならびに交差試験実験において観察されたレスキューの重複を要約するベン図が含まれる。理論に束縛されることを望むものではないが、ＡｐｏＥ４スクリーニングにおける再検証されたヒット間の重複の欠如は、毒性の差に起因するものであり得る。
【０２８８】
再検証分析によって確認されたヒットは、小胞輸送（例えば、ＡＴＧ２０、ＵＢＰ３、ＴＲＳ６５、ＢＲＥ５、ＭＵＫ１、及びＧＹＰ５）、エンドサイトーシス（例えば、ＲＶＳ１６１、ＯＳＨ２、ＲＶＳ１６７、ＹＡＰ１８０２、及びＯＳＨ３）、ユビキチン化／脱ユビキチン化（例えば、ＡＰＣ１１、ＵＢＰ３、ＵＢＰ７、ＣＤＣ７３、ＢＲＥ５、及びＲＲＩ２）、脂質代謝（例えば、ＰＥＲ１、ＭＤＨ３、ＧＰＩ８、ＳＭＰ３、及びＳＵＲ１）、ＤＮＡ修復（例えば、ＭＧＴ１、ＰＣＤ１、ＣＤＣ７３、及びＲＡＤ１４）、ならびにミトコンドリア機構（例えば、ＡＴＧ２０、ＭＨＲ１、ＭＲＰ４、ＲＲＭ３、ＩＬＭ１、ＭＳＴ１，ＹＴＡ１２、ＰＯＲ１、及びＭＲＰＬ１０）を含む、いくつかの生物学的経路におけるＡｐｏＥ媒介性撹乱を示唆した。
【０２８９】
実施例８：ＡｐｏＥ媒介性毒性を調節する化合物の化学的スクリーニング
神経変性疾患に関連するタンパク質の発現に関連する毒性を抑制する化合物を同定するために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｐｒｏｂｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＭＬＰＣＮ）ライブラリ（ＮＩＨ−ＮＣＡＴＳプログラム）を、α−シヌクレインの酵母モデル（ＴＲＰ及びＵＲＡ遺伝子座にα−シヌクレインのコピーが組み込まれており、転写因子ＰＤＲ１及びＰＤＲ３が欠失している、「高毒性」菌株）ならびにＴＤＰ−４３の酵母モデル（Ｔａｒｄｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：４１０７−４１２０，２０１２に記載されているＴＤＰ−４３モデル）の毒性をレスキューする化合物について、７つの用量でスクリーニングした。これらのアッセイは、ＢＡＣＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）発光を増殖の代理として使用し、１５３６ウェルプレートにて行った。これら２つのスクリーニングから、α−シヌクレインモデル、ＴＤＰ−４３モデル、またはその両方に対してレスキュー活性を示した１６４種の化合物を選択し、さらなる分析のために得た。
【０２９０】
これらの化合物について、α−シヌクレイン酵母モデル及びＴＤＰ−４３酵母モデルに対する再スクリーニングを実施し、当該化合物の活性を３８４ウェルプレートにて増殖測定用に６００ｎｍの光学密度で検証した。また、これらの化合物について、ＡｐｏＥ４を発現する酵母細胞、アミロイド−β（１−４２）を発現する酵母細胞、及びＦＵＳタンパク質を発現する酵母細胞を含む、他の酵母モデル系に対する交差スクリーニングも実施した。当該ＡｐｏＥ４細胞は、転写因子ＰＤＲ１及びＰＤＲ３をコードする遺伝子が欠失している、実施例５に記載されている高毒性菌株であった。当該アミロイド−β（１−４２）細胞は、Ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１：４０１３−４０１８，２０１４に記載されたものであった。これらの交差スクリーニングは、細胞からの薬物排出を最小限に抑えるために、２つの転写因子ＰＤＲ１及びＰＤＲ３が欠失している菌株を使用して実施した。この例示的な分析の目的では、細胞の増殖を、未処理の細胞の増殖の１．１５倍に上昇させた化合物を、「レスキュー」化合物と見なした。
【０２９１】
これらのスクリーニングから、化合物の４９％（８０）がα−シヌクレイン酵母モデルをレスキューし、試験した化合物の２１％（３５）がＴＤＰ−４３酵母モデルをレスキューし、５７％（９４）がＡｐｏＥ４酵母モデルをレスキューし、１８％（２９）がＦＵＳタンパク質酵母モデル（Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（４）：ｅ１００１０５２に記載されている通りだがＰＤＲ１及びＰＤＲ３をコードする遺伝子が欠失しているもの）をレスキューし、３３％（５４）がアミロイド−β酵母モデルをレスキューした。
【０２９２】
３種の化合物が、試験した５つ全ての酵母モデルをレスキューした。１９種の化合物が、ＦＵＳタンパク質モデルとＡｐｏＥ４酵母モデルの両方をレスキューした。１８種の化合物が、ＴＤＰ−４３酵母モデルとＡｐｏＥ４酵母モデルの両方をレスキューした。４３種の化合物が、アミロイド−β酵母モデルとＡｐｏＥ４酵母モデルの両方をレスキューした。同じ４３種の化合物は、α−シヌクレイン酵母モデルとＡｐｏＥ４酵母モデルの両方もレスキューした。２６種の化合物は、ＡｐｏＥ４酵母モデルを明確にレスキューし、試験した他のモデルはレスキューしなかった。
【０２９３】
前述の結果はさらに、本明細書に記載されているＡｐｏＥ誘導性細胞毒性の酵母モデル系が、ＡｐｏＥ媒介性毒性を軽減する治療候補化合物（これは、アルツハイマー病を含むＡｐｏＥ関連疾患の治療のための治療候補化合物でもあり得る）の同定のための確固たるスクリーニングプラットフォームであることを実証している。
【０２９４】
実施例９：ＡｐｏＥを発現する酵母細胞はＳｔｅ３エンドサイトーシスの欠陥を示す
Ｓｔｅ３−ｍＫａｔｅ２アッセイを使用して、酵母におけるエンドサイトーシスに対するＡｐｏＥの作用をさらに分析した。Ｓｔｅ３は、細胞表面から液胞へのエンドサイトーシスを自然に受ける酵母Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。クラスリン媒介性エンドサイトーシスが妨害されると、Ｓｔｅ３輸送もまた妨害され得る。
【０２９５】
ｐＡＧ４２３ガラクトース誘導性プラスミドから蛍光タグ（ｍＫａｔｅ２）付きのＳｔｅ３を過剰発現させることによって、蛍光顕微鏡法を使用してＳｔｅ３の輸送を観察した。上述のＡｐｏＥ４高毒性菌株を、ｐＡＧ４２３−Ｓｔｅ３−ｍＫａｔｅ２プラスミドで形質転換した。加えて、実施例４に記載されている、ヒト神経変性疾患関連タンパク質であるα−シヌクレインをコードする発現構築物を保有する酵母菌株（α−ｓｙｎ中等度毒性）またはＡβをコードする発現構築物を保有する酵母菌株（Ｔｒｅｕｓｃｈ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１１），３３４：１２４１−５に記載されているＫａｒ２ｓｓ−Ａβ菌株）も、ｐＡＧ４２３−Ｓｔｅ３−ｍＫａｔｅ２プラスミドで形質転換した。Ｇａｌ−ＧＦＰプラスミドで形質転換した菌株は、陰性対照として機能した。ガラクトースを用いた６〜８時間の誘導の後、ＡｐｏＥ４の産生は、液胞へのＳｔｅ３エンドサイトーシスの重度の妨害をもたらした。（図１３）。α−シヌクレイン及びＡβの発現もまた、Ｓｔｅ３エンドサイトーシスの妨害をもたらした（図１３）。
【０２９６】
実施例１０：治療標的候補であるＡｐｏＥ結合パートナーの同定
ＡｐｏＥ結合パートナーの同定は、相互作用、及び潜在的な治療標的として機能する相互作用タンパク質を明らかにし得る。ＡｐｏＥタンパク質を発現する細胞は、ＡｐｏＥタンパク質の単離または精製、続いてＡｐｏＥタンパク質と同時に精製される結合パートナーの同定によって分析される。
【０２９７】
例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端にＴＡＰタグ（タンデムアフィニティー精製タグ）またはＧＦＰタグが付いたＡｐｏＥアイソフォームをコードする発現構築物を保有する酵母菌株を生成する。ＴＡＰタグは、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位によって分離されるＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ及びカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）の２つのＩｇＧ結合ドメインを含む（例えば、Ｐｕｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：２１８−２２９，２００１を参照されたい）。例えば、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下で、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ２−ＴＡＰ、Ｋａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ３−ＴＡＰ、またはＫａｒ２ｓｓ−ＡｐｏＥ４−ＴＡＰのいずれかをコードする組込み型発現構築物を保有する酵母菌株を、本明細書に記載されている方法を使用して生成する。これらの酵母菌株は、異なるＡｐｏＥアイソフォームを複数の菌株にわたって均等なレベルで発現するために、異なるコピー数の発現構築物を保有する。細胞がＡｐｏＥアイソフォームを均等なレベルで発現することを確実にする別の手法は、ガラクトース誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターのタイトレーションである。タグ付きＡｐｏＥを欠いている対照菌株も生成される。抗ＴＡＰタグ抗体（例えば、抗ＴＡＰタグ抗体［２２Ｆ１２−１Ｅ３］、Ａｂｃａｍ）を用いて行われるウェスタンブロットは、菌株が均等なレベルの異なるＡｐｏＥアイソフォームを発現することを確認するために使用される。中レベルの毒性を有する細胞（例えば、中等度毒性菌株）は、結合パートナーの同定に適合性がある。一部の例では、誘導の長さは、十分なタンパク質の発現と毒性とを均衡させるように変更（例えば、短縮）してもよい。
【０２９８】
ＴＡＰタグ付きＡｐｏＥアイソフォームを発現する酵母菌株または対照細胞を、並行して、例えば、２リットルの培養液中で早期対数期まで増殖させ、増殖培地へのガラクトースの添加によってＡｐｏＥアイソフォーム融合タンパク質の産生を誘導する。誘導時間は、過度の毒性をもたらすことなく十分なＡｐｏＥタンパク質を産生するために変更してもよい。これらの培養物を、溶解用に細胞をペレット化するために遠心処理する。
【０２９９】
次に、酵母細胞を並行して溶解して、例えば、Ｐｕｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されている抽出物を調製する。手短に述べると、ペレットを水で１回洗浄し、５０ｍｌのポリプロピレン管において再度ペレット化する。このペレットを液体窒素で凍結させる。溶解物を調製するため、血中血球容積（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）が１の緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐｈ７．０）、１０ｍＭ  Ｋｃｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及びプロテアーゼ阻害因子）を、解凍し４℃に保ったペレットに添加する。細胞を８．２７ＭＰａの圧力でフレンチプレス（Ｓｉｍ−Ａｍｉｎｃｏ）に３回通すことによって、細胞を溶解する。２Ｍ  ＫＣｌの添加によってＫＣＬを０．２Ｍに調整する。典型的にはこの溶解物を遠心処理して、デブリを除去して抽出物を得る。他の酵母溶解方法、例えば、ビーズ叩解、アルカリ溶解、酵素溶解（例えば、ザイモリアーゼを用いるもの）、または液体窒素で冷やした乳鉢及び乳棒を用いた凍結酵母の粉砕を用いてもよい。
【０３００】
タンデムアフィニティー精製は、例えば、Ｐｕｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されているように、ＡｐｏＥ含有タンパク質複合体を単離する（またはそれを濃縮する）ために行われる。手短に述べると、ＩｇＧ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ビーズをカラムに加え、ＩＰＰ１５０緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）で洗浄し、このビーズに抽出物を加え、４℃でインキュベートする。重力流により溶出を行い、ビーズをＩＰＰ１５０緩衝液で３回、そしてＴＥＶ切断緩衝液（０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴに調整したＩＰＰ１５０）で１回洗浄する。ＴＥＶ切断緩衝液及びＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｉｂｃｏ）を添加することによって、同じカラム内で切断を行う。このビーズを１６℃で２時間回転させ、その溶出液を重力流によって回収する。次に、カルモジュリンビーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含むカラムにこの溶出液を加え、１０ｍＬのＩＰＰ１５０カルモジュリン結合緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐｈ８）、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１５０ｍＭのＮａＣＬ、１ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのイミダゾール、２ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．１％のＮＰ−４０）で洗浄する。次に、このビーズをＩＰＰ１５０カルモジュリン結合緩衝液で１回洗浄し、結合タンパク質をカラムから溶出させる。
【０３０１】
次に、質量分析（ＭＳ）によって、例えば、Ｇａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１４１−１４７，２００２に記載されているように、種々のＡｐｏＥアイソフォームの結合パートナーを同定する。ＴＡＰ精製からの溶出物を濃縮し、ＳＤＳ−ｐａｇｅによって分離し、クマシーブルー染色または銀染色を実施する。バンドを切り取り、トリプシンで消化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに供してもよい。ＡｐｏＥ結合パートナーを自動ペプチド質量フィンガープリンティングによって同定し、酵母タンパク質の配列データベース（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＳＧＤ）、ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）と比較してもよい。あるいは、データベース検索と自動ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの組み合わせによってＡｐｏＥ結合パートナーを同定してもよい。ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４と相互作用するタンパク質は、複数のアイソフォームと相互作用する結合パートナー、ならびに特定のアイソフォームと相互作用する結合パートナーを決定するために比較され得る。
【０３０２】
前述の手法によって同定された結合パートナーがＡｐｏＥに特異的に結合することを確認するために、異なるアフィニティータグ（例えば、ＧＦＰ）を使用する任意の並行スクリーニングが行われる。この分析のために、例えば、本明細書に記載されている中等度毒性ＡｐｏＥ−ＧＦＰ酵母菌株を使用するかまたは適合させてもよい。質量分析の前にＡｐｏＥ含有タンパク質複合体を免疫沈降するために抗ＧＦＰ抗体が使用されることを除いて、同様の手法が使用される。
【０３０３】
ＡｐｏＥ結合パートナーのヒト相同体は、本明細書に記載されているように、例えば、Ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅ、ＢｉｏＭａｒｔ−Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＢＬＡＳＴ検索、構造的相同性を使用して、かつ／または相同性機能に基づいて、同定される。後続の研究には、高スループットランダム変異誘発手法、例えば、結合パートナータンパク質における、ＡｐｏＥと結合パートナータンパク質の相互作用を媒介する領域をプローブするためのバリオミクス（ｖａｒｉｏｍｉｃｓ）ライブラリ（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．３（２）：５７７−５８５，２０１３）の使用が含まれ得る。
【０３０４】
例えば、本実施例に記載されている例示的な非限定的手法を使用して、ＡｐｏＥ結合パートナーを同定すると、ＡｐｏＥ関連疾患の治療のための治療標的候補が同定される。
【０３０５】
実施例１１：ＡｐｏＥタンパク質と相互作用する脂質の分析
ＡｐｏＥタンパク質と相互作用する脂質の分析を行う。細胞、例えば、酵母細胞から（例えば、アフィニティー精製または免疫沈降によって）ＡｐｏＥアイソフォームを単離し、相互作用している脂質を質量分析によって同定する。
【０３０６】
例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端にＴＡＰタグ（タンデムアフィニティー精製タグ）またはＧＦＰタグが付いているＡｐｏＥアイソフォームをコードする発現構築物を保有する酵母菌株を、例えば、実施例１０に記載されているように生成する。ＡｐｏＥアイソフォームを、例えば、実施例１０に記載されているように、酵母内で発現させ、精製する。あるいは、タグ無しＡｐｏＥアイソフォームを本明細書に記載されている酵母において発現させ、適切な抗ＡｐｏＥ抗体を使用して免疫沈降してもよい。
【０３０７】
精製されたＡｐｏＥアイソフォームと相互作用している脂質を、質量分析によって同定する。ＡｐｏＥタンパク質と相互作用する脂質の同定には、任意の好適な手法が使用される。例えば、液体クロマトグラフィＭＳ（ＬＣ／ＭＳ）、多次元質量分析に基づくショットガンリピドミクス（ＭＤＭＳ−ＳＬ）、ＭＡＬＤＩに基づく質量分析、ガスクロマトグラフィ−ＭＳ（ＧＣ０ＭＳ）、及び／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行って、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及び／またはＡｐｏＥ４と相互作用する脂質を同定する。
【０３０８】
各ＡｐｏＥアイソフォームと相互作用する脂質を比較して、複数のアイソフォームと相互作用する脂質、ならびに特定のＡｐｏＥアイソフォームと特異的に相互作用する脂質を同定する。同定された脂質は、ＡｐｏＥ関連疾患の治療のための治療標的候補を示し得る。
【０３０９】
実施例１２：ＡｐｏＥタンパク質を発現する細胞のリピドミック解析及びメタボロミック解析
ＡｐｏＥタンパク質を発現する細胞を、リピドミック解析及びメタボロミック解析を使用して分析し、ＡｐｏＥ発現によって撹乱される生物学的経路、ならびにＡｐｏＥ関連疾患を含む神経変性疾患の治療のための治療標的候補を同定する。
【０３１０】
例えば、ＡｐｏＥアイソフォームを発現する酵母細胞（例えば、実施例２に記載されている中等度毒性ならびに／または高毒性のＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４菌株）を網羅的リピドミック解析に供して、細胞脂質含有量に対するＡｐｏＥの発現の作用を決定する。脂質組成は、任意の好適な手法によって測定される。例えば、ショットガンリピドミクスを、Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７０：３６９−３９１，２０１０、Ｔａｒａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔ．１０：１３６４−１３７６，２０１４、またはｄａ  Ｓｉｌｖｅｉｒａ  ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２５（２０）３２３４−３２４６，２０１４に記載されている手法と同様の手法を使用して行ってもよい。
【０３１１】
種々のＡｐｏＥアイソフォームをコードする発現構築物を保有する酵母菌株を、適切な期間にわたってＡｐｏＥを発現するように誘導する。一部の事例では、試料を異なる時点で採取して、脂質組成に対するＡｐｏＥアイソフォーム発現の経時的な作用を決定する。ＡｐｏＥ発現酵母を採取し、例えば、ビーズ叩解、続いて脂質抽出（例えば、クロロホルム／メタノールの抽出溶媒、またはエタノール、水、ジエチルエーテル、ピリジン、及び４．２Ｎ水酸化アンモニウム［１５：１５：５：１：０．０１８、ｖｏｌ／ｖｏｌ］の抽出溶媒を使用する）によって溶解する。有機相を収集し、真空蒸発に供する。次いでこの脂質を、質量分析によって分析する。任意の好適な質量分析法、例えば、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）質量分析、及びガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）が使用される。グリセロリン脂質及びスフィンゴ脂質は、例えば、ＥＳＩ−ＭＳまたは高解像度質量分析によって分析及び数量化され得る。ステロールは、例えば、ＧＣ−ＭＳを使用して分析及び数量化され得る。全体的な脂質組成に対する各ＡｐｏＥアイソフォームの作用を決定して、ＡｐｏＥタンパク質発現によって撹乱される生物学的経路を同定する。脂質組成の変化もまた、ＡｐｏＥ関連疾患を含む神経変性疾患の治療のための治療標的候補を示し得る。
【０３１２】
別の例において、ＡｐｏＥアイソフォームを発現する酵母細胞（例えば、実施例２に記載されている中等度毒性ならびに／または高毒性のＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４菌株）を網羅的メタボロミック解析に供して、代謝物に対するＡｐｏＥの発現の作用を決定する。種々のＡｐｏＥアイソフォームをコードする発現構築物を保有する酵母菌株を、適切な期間にわたってＡｐｏＥを発現するように誘導する。一部の事例では、試料を異なる時点で採取して、代謝物組成に対するＡｐｏＥアイソフォーム発現の経時的な作用を決定する。代謝物組成は、任意の好適な手法によって測定される。細胞外代謝物と細胞内代謝物の両方がアッセイされ得る。
【０３１３】
ＬＣ−ＭＳを行って、種々のＡｐｏＥアイソフォームを発現する酵母細胞から得られる試料中の代謝物の濃度を決定する。ＬＣ−ＭＳは、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．８（２）：４７０−４８１，２０１２、Ｔｈｅｏｄｏｒｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．７１１：７−１６，２０１２、またはＧｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ．８７：１２−２５，２０１４に記載されているように実施される。代謝物組成の変化は、ＡｐｏＥタンパク質発現によって撹乱される生物学的経路を同定し得る。代謝物濃度の変化もまた、ＡｐｏＥ関連疾患を含む神経変性疾患の治療のための治療標的候補を示し得る。
【０３１４】
様々な実施形態
本発明がその詳細な説明と併せて説明されてきたが、前記説明は例示を意図し、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。一群の１つ以上の構成要素間に「または」を含む特許請求の範囲または前記説明は、別段の指示がある場合または文脈から明白である場合を除き、その群の構成要素のうちの１つ、２つ以上、または全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、または別様に関連性がある場合に満たされると見なされることも理解されたい。本発明には、厳密に１つの群構成要素が所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、または別様に関連性がある実施形態が含まれる。本発明には、群構成要素のうちの２つ以上もしくは全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、または別様に関連性がある実施形態も含まれる。さらに、別段の記載がある場合または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者にとって明らかである場合を除き、本発明には、列記されている請求項のうちの１つ以上における１つ以上の制約、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項（または関連する任意の他の請求項）に従属する別の請求項に導入されている全ての実施形態が包含され、かかる実施形態が、提出される本出願の追加項目を構成することも、その内容の範囲を超えることもないことを理解されたい。要素が一覧として提示される場合、その要素の各部分群も開示されること、また、任意の１つ以上の要素がその群から除外され得ること、また、かかる部分群または結果として得られる一覧が本明細書に明示的に開示され、提出される本出願の追加項目を構成することも、その内容の範囲を超えることもないことを理解されたい。概して、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むものと称される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、かかる要素、特徴などからなるか、またはそれらから本質的になるものと理解されるべきである。本発明の任意の実施形態が、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。
【０３１５】
特許請求の範囲または前記説明が生成物（例えば、物質の組成物）に関する場合、本明細書に開示される方法のうちのいずれかに従った該生成物の作製方法または使用方法、及び本明細書に開示される目的のいずれか１つ以上のために該生成物を使用する方法が、別段の記載がある場合または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者にとって明らかである場合を除き、該当する場合は本開示に包含されることが理解されるべきである。特許請求の範囲または前記説明が方法に関する場合、その方法の１つ以上の工程を行うために有用な生成物、例えば、物質の組成物、デバイス、またはシステムが、別段の記載がある場合または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者にとって明らかである場合を除き、該当する場合は本開示に包含されることが理解されるべきである。
【０３１６】
本明細書において範囲が与えられる場合、エンドポイントが含まれる実施形態、両方のエンドポイントが除外される実施形態、及び一方のエンドポイントが含まれ、他方が除外される実施形態が提供される。別段の記載がない限り、両方のエンドポイントが含まれると見なされるべきである。さらに、別段の記載がある場合または文脈及び当業者の理解から明白である場合を除き、範囲として表わされる値は、本発明の異なる実施形態では、文脈による明確な別段の規定がない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、記載された範囲内のいかなる特定の値または部分的範囲をとることもできると理解されるべきである。一連の数値が本明細書に記載されている場合、その一連における任意の介在値、または任意の２つの値によって定義される範囲に類似して関連する実施形態が提供されること、及び最も低い値が最小値と見なされ得、最も大きい値が最大値と見なされ得ることも理解される。本明細書において、「少なくとも」、「最大」、「以下」などの表現、または同様の表現が、一連の数字に先行する場合、その表現は、文脈による明確な別段の規定がない限り、様々な実施形態において一覧内の各数字に適用されることを理解されたい（ただし、文脈に応じて、ある値、例えば、百分率として表される値の１００％は、上限であり得ると理解されるものとする）。例えば、「少なくとも１、２、または３」は、様々な実施形態において「少なくとも１、少なくとも２、または少なくとも３」を意味すると理解されるべきである。該当する場合、ありとあらゆる合理的な下限及び上限が明示的に想定されることも理解されよう。合理的な下限または上限は、当業者により、例えば便宜、コスト、時間、労力、（例えば、試料、薬剤、または試薬の）利用能、統計的考慮事項などの要因に基づいて、選択または決定され得る。いくつかの実施形態では、上限または下限は、特定の値と２倍、３倍、５倍、または１０倍異なる。本明細書で使用される数値は、百分率として表される値を含む。数値の前に「約」または「およそ」が置かれる各実施形態については、その厳密値が記載される実施形態が提供される。数値の前に「約」または「およそ」が置かれない各実施形態については、その数値の前に「約」または「およそ」が置かれる実施形態が提供される。
【０３１７】
本明細書で使用される節の見出しは、いかようにも限定するものと解釈されるべきではない。いかなる節の見出しの下に提示される主題も、本明細書に記載されているいずれの態様または実施形態に適用可能であり得ることが明示的に想定される。本明細書における実施形態または態様は、本明細書に記載されているいかなる薬剤、組成物、物品、キット、及び／または方法をも対象とし得る。適切であればいつでも、いずれか１つ以上の実施形態または態様が、いずれか１つ以上の他の実施形態または態様と自由に組み合わせ可能であることが想定される。
【０３１８】
本発明の他の態様、利点、及び改変形態は、以下に記載されている特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月11日(2017.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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