(57)【要約】  本出願は、いくつかの側面において、特定の摂動後に数千のタンパク質の安定性を効率的にモニタリングするために使用され得るプラスミドの開発に関する。該プラスミドは、それぞれがＩＲＥＳの制御下に置かれた２つのレポータータンパク質の共発現を可能にする。本発明の他の側面は、プラスミドライブラリー、目的の化合物によってレベルが調節されるタンパク質を同定するためのスクリーニング方法およびＩＭｉＤ化合物による対象の処置をモニタリングする方法に関する。
2017534270.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作動可能な連結において
（ａ）プロモーター、
（ｂ）第１の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；
（ｃ）第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）第２のＩＲＥＳ；および
（ｅ）第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含むＤＮＡプラスミドであって、
ここでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合されている、前記ＤＮＡプラスミド。
【請求項２】
第１および第２のレポータータンパク質が、識別可能で検出可能なレポーターシグナルを有する、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
第１および第２のレポータータンパク質が、それらの産物から生成された識別可能なシグナルを有する酵素タンパク質である、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項４】
第１および第２のレポータータンパク質が、識別可能な生物発光シグナルを有する生物発光タンパク質である、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項５】
第１および第２のレポータータンパク質が、識別可能な蛍光シグナルを有する蛍光タンパク質である請求項２に記載のプラスミド。
【請求項６】
第１および第２のレポータータンパク質が、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）からなる群から選択される、請求項４に記載のプラスミド。
【請求項７】
第１および第２のレポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項５に記載のプラスミド。
【請求項８】
プロモーターが、真核生物プロモーターまたは合成プロモーターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項９】
プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む、請求項８に記載のプラスミド。
【請求項１０】
オープンリーディングフレームが、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１１】
オープンリーディングフレームが、がんタンパク質をコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１２】
がんタンパク質が、ＭＹＣ、Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質１（ＩＫＺＦ１）、Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質３（ＩＫＺＦ３）、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、変異ｐ５３、Ｎ−Ｒａｓ、ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎからなる群から選択される、請求項１１に記載のプラスミド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプラスミドを含む、単離された形質転換宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
複数のプラスミドを含むＤＮＡプラスミドライブラリーであって、
各前記プラスミドは作動可能な連結において
（ａ）プロモーター、
（ｂ）第１の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；
（ｃ）第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）第２のＩＲＥＳ；および
（ｅ）第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含み、
ここでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合されている、前記ＤＮＡプラスミドライブラリー。
【請求項１６】
各プラスミドのオープンリーディングフレームが異なる、請求項１５に記載のプラスミドライブラリー。
【請求項１７】
各プラスミドのオープンリーディングフレームが、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来する、請求項１５または１６に記載のプラスミドライブラリー。
【請求項１８】
生物が哺乳動物である、請求項１７に記載のプラスミドライブラリー。
【請求項１９】
哺乳類動物がヒトである、請求項１８に記載のプラスミドライブラリー。
【請求項２０】
第１および第２のレポータータンパク質が、識別可能で検出可能なシグナルを有する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項２１】
第１および第２のレポータータンパク質が、識別可能な生物発光シグナルを有する生物発光タンパク質である、請求項２０に記載のプラスミド。
【請求項２２】
第１および第２のレポータータンパク質が、識別可能な蛍光シグナルを有する蛍光タンパク質である、請求項２０に記載のプラスミド。
【請求項２３】
第１および第２のレポータータンパク質が、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）からなる群から選択される、請求項２１に記載のプラスミド。
【請求項２４】
第１および第２のレポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項２２に記載のプラスミド。
【請求項２５】
プロモーターが、真核生物プロモーターまたは合成プロモーターである、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項２６】
プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む、請求項２５に記載のプラスミド。
【請求項２７】
目的の化合物によってレベルが調節されるタンパク質を同定する方法であって、
（ｉ）請求項Ｂ２〜Ｂ１１のいずれか一項に記載のプラスミドライブラリーで形質転換された宿主細胞を目的の化合物と接触させること；
（ｉｉ）化合物の存在下および非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比を決定すること；
（ｉｉｉ）化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較して増加したときに、増加したレベルを有するオープンリーディングフレームを同定すること、および、化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比が、化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較して減少したときに、減少したレベルを有するオープンリーディングフレームを同定することを含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項Ｂ２〜Ｂ１１のいずれか一項に記載のプラスミドライブラリーで形質転換された宿主細胞を目的の化合物と接触させることが、化合物の存在下で形質転換された宿主細胞を適切な時間増殖させることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
目的の化合物が、ＩＭｉＤ（登録商標）である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＩＭｉＤ化合物により対象の処置をモニタリングする方法であって、
ＩＭｉＤ化合物で処置された対象のサンプルにおけるＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定すること；および
ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルが参照レベルと比較して減少したときに対象を処置に応答するものとして同定すること；
を含む方法。
【請求項３１】
参照レベルが、ＩＭｉＤ化合物で処置されていないコントロール対象におけるＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルである、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条の下で、２０１５年４月３０日に出願された米国仮出願番号６２／１５４，８５８および２０１４年１０月１０日に出願された米国仮出願番号６２／０６２，２４５の利益を主張するものであり、これらの各々の内容全体を参照によって本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦支援研究
本発明は、２Ｒ０１ＣＡ０６８４９０−１９および２Ｒ０１ＣＡ０７６１２０−１３のもとで、政府の支援によって行われ、国立衛生研究所によって認められた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
レポーターアッセイは、タンパク質機能に影響するリード化合物を同定するために製薬およびバイオテクノロジー産業において日常的に用いられてきた。過去1０年間に、コンビナトリアルケミストリーなどの技術によって短時間に多数の化学化合物を合成する化学者の能力は大幅に向上し、多くの場合、目的のタンパク質に対して所望の効果を有する化合物を同定するために、数千から数百万の化合物をスクリーニングする必要がある。
【０００４】
典型的には、レポーターアッセイは、サンプル中の１つのレポータータンパク質の活性を測定するが、複数のレポーターを組み合わせてもよい。複数のレポーターの共発現のための１つの戦略は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によカセット（またはバイシストロニック転写産物）として発現されるバイシストロン性構築物の設計を含む（Yen et al., Science. 2008 Nov 7;322(5903):918-23）。介在するＩＲＥＳ配列は、翻訳の効率的なキャップ非依存性内部開始のためのリボソーム結合部位として機能する。かかるデザインは、ＩＲＥＳ指向のキャップ非依存性翻訳を用いて両方の遺伝子の転写を可能にする。
【０００５】
このシステムは、各試験サンプルのコントロールに対してノーマライズされた試験レポーターと一緒に、実験的処置で変化することが予想されないコントロールレポーターの両方の共発現を可能にする。しかしながら、細胞内の多くの摂動は、キャップ非依存性翻訳と比較して、キャップ依存性翻訳に差異的に影響し得る。さらに、いくつかのＩＲＥＳは、下流遺伝子の可変発現を示すことが示されている（Wong et al. Gene Ther.2002 Mar;9(5):337-44）。これは、高い偽陽性および信頼できないレポーターアッセイにつながる。したがって、レポーター活性の非特異的変化を用いて、細胞に基づくタンパク質安定性アッセイにおける固有の変動性を制御する、タンパク質安定性の分析のための効率的なハイスループットアプローチが必要とされている。これにより、ＨＴＳアッセイを効果的かつ効率的に実施するための必要なデータの誤差を低減することが可能になる。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本開示は、いくつかの側面において、特定の摂動後に数千のタンパク質の安定性を効率的にモニタリングするために使用され得るプラスミドの開発に関する。
【０００７】
いくつかの側面によれば、本開示はＤＮＡプラスミドを提供する。プラスミドは、作動可能な連結においてプロモーター；第１の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列；第２のＩＲＥＳ；および第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合されている。
【０００８】
いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、識別可能で検出可能なレポーターシグナルを有する。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、それらの産物から生成される識別可能なシグナルを有する酵素タンパク質である。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、識別可能な生物発光シグナルを有する生物発光タンパク質である。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、識別可能な蛍光シグナルを有する蛍光タンパク質である。
【０００９】
いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）からなる群から選択される。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される。いくつかの態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターまたは合成プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来する。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、がんタンパク質をコードする。がんタンパク質は、ＭＹＣ、Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質１（ＩＫＺＦ１）、Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質３（ＩＫＺＦ３）、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、変異ｐ５３、Ｎ−Ｒａｓ、ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎからなる群から選択される。
【００１０】
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のプラスミドを含む単離された形質転換宿主細胞に関する。いくつかの態様において、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞である。
【００１１】
いくつかの態様によれば、本開示は、複数のプラスミドを含むＤＮＡプラスミドライブラリーを提供し、各前記プラスミドは、作動可能な連結において、プロモーター；第１の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列；第２のＩＲＥＳ；および第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合される。
【００１２】
いくつかの態様において、各プラスミドのオープンリーディングフレームは異なる。いくつかの態様において、プラスミドのオープンリーディングフレームは、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来する。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、識別可能で検出可能なレポーターシグナルを有する。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、識別可能な生物発光シグナルを有する生物発光タンパク質である。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、識別可能な蛍光シグナルを有する蛍光タンパク質である。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）からなる群から選択される。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される。いくつかの態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターまたは合成プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。
【００１３】
いくつかの側面において、本開示は、目的の化合物によってレベルが調節されたタンパク質を同定する方法であって：本明細書に記載のプラスミドライブラリーで形質転換された宿主細胞を目的の化合物と接触させること；化合物の存在下および非存在下で融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比を決定すること；化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較して増加したときに、増加したレベルを有するオープンリーディングフレームを同定すること、および、化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較して減少したときに、減少したレベルを有するオープンリーディングフレームを同定すること、を含む方法を提供する。
【００１４】
いくつかの態様において、本明細書に記載のプラスミドライブラリーで形質転換された宿主細胞を目的の化合物と接触させることは、化合物の存在下で形質転換された宿主細胞を適切な時間、増殖させることを含む。いくつかの態様において、目的の化合物はＩＭｉＤ（登録商標）である。
【００１５】
いくつかの態様によれば、本開示は、ＩＭｉＤ化合物を用いた対象の治療をモニタリングする方法であって：ＩＭｉＤ化合物で処置された対象のサンプルにおけるＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定すること；およびＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルが参照レベルと比較して減少したときに対象を処置に応答するものとして同定することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、参照レベルは、ＩＭｉＤ化合物で処置されていないコントロール対象におけるＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルである。
【００１６】
本発明の態様および側面の各々は、独立してまたは組み合わせて実施することができる。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明のためのものであり、限定的であると見なされるべきではない。本明細書での「含む（including）」、「含む（comprising）」または「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物ならびに追加項目を包含することを意味する。
【００１７】
本発明のこれらのおよび他の態様、ならびに様々な利点および有用性は、詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。本発明の各態様は、理解されるように様々な態様を包含することができる。
本出願で特定された全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な説明
添付の図面は縮尺通りに描かれていない。図面では、様々な図に示されている同一またはほぼ同一の構成要素は、同様の番号で表されている。明確にするために、すべての構成要素がすべての図面でラベル付けされるわけではない。
【００１９】
【図１】図１Ａ〜１Ｅは、レナリドマイドによるＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の下方制御を示す。（図１Ａ）ベクターの模式図。（図１Ｂ）レナリドマイド（ＬＥＮ）（２μＭ）処理後のＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ比の倍率変化の分布。Ｆｌｕｃ（上のパネル）またはＨＡタグ（下のパネル）に融合して示されたＩＫＺＦタンパク質を産生するためにトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞のＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ比（上のパネル）および免疫ブロット（下のパネル）。示されているものは、細胞をレナリドマイド（２μＭ）、ＭＬＮ４９２４（１μＭ）、またはＭＧ１３２（１０μＭ）で１２時間処理したものである。Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃ比を、対応するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理細胞に対してノーマラライズした。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として示される（図１Ｅ）。示されるように、ＬＥＮ（２μＭ）およびＭＬＮ４９２４（１μＭ）で処置したＭＭ１ＳおよびＬ３６３細胞の免疫ブロット分析を１２時間行った。
【００２０】
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、レナリドマイドによるＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の下方制御が、セレブロンを必要とすることを示す。（図２Ａ）示されたＩＫＺＦ−ＨＡタンパク質およびドキシサイクリン誘導性ＣＲＢＮｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを安定的に感染させた２９３ＦＴ細胞のイムノブロット分析。示されているものは、ＬＥＮ（２μＭ）およびドキシサイクリン（Ｄｏｘ）（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ１２時間および６０時間添加したものである。（図２Ｂ）Ｆｌｕｃ（上パネル）またはＨＡタグ（下パネル）に融合したＩＫＺＦ１を産生するようにトランスフェクトされたＣＲＢＮ＋／＋およびＣＲＢＮ−／−２９３ＦＴ細胞のＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ比（上パネル）およびイムノブロット（下パネル）。示された細胞は、ＬＥＮ（２μＭ）で１２時間処理したものである。Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃ比を、対応するＤＭＳＯ処理細胞に対してノーマライズした。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として示される。（図２Ｃおよび２Ｄ）ＣＲＢＮ＋／＋およびＣＲＢＮ−／−ＭＭ１Ｓ骨髄腫細胞のイムノブロット分析。示されているのは、細胞をＬＥＮ（２μＭ）で２４時間（図２Ｃ）または示された時間（図２Ｄ）にシクロヘキサミド（ＣＨＸ）（１００μｇ／ｍＬ）を添加する１時間前に処理したものである。
【００２１】
【図３】図３Ａ〜３Ｆは、レナリドマイドが、セレブロンによるＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３のユビキチン化を促進することを示す。（図３Ａおよび３Ｂ）ＦＬＡＧ−ＩＫＺＦを、安定して感染したＣＲＢＮ−／−２９３ＦＴ細胞から免疫沈降させ、示されたＣＲＢＮ変異体を産生するためにトランスフェクトされたＣＲＢＮ＋／＋２９３ＦＴ細胞（図３Ａ）またはＣＲＢＮ−／−２９３ＦＴ細胞からセレブロンを捕捉するために使用した（図３Ｂ）。示されるように、細胞をＬＥＮ（２μＭ）で溶解前に１２時間処理した。結合したタンパク質をイムノブロット分析により検出した。（図３Ｃ）示されたＦＬＡＧ、ＨｉｓおよびＶ５タグ化タンパク質を産生するようにトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞からのニッケルセファロースで捕捉されたタンパク質のイムノブロット分析。示されているものは、細胞をＭＧ１３２（１０μＭ）およびＬＥＮ（２μＭ）で１２時間処理したものである。（図３Ｄ）ＣＲＢＮ−／−２９３ＦＴ細胞を、ＩＫＺＦ１−ＨＡおよび示されたＭｙｃ−セレブロン変異体を産生させるようにトランスフェクトして溶解した。抽出物を混合し、ＬＥＮ（２μＭ）またはＤＭＳＯで処理し、ＨＡ（抗ＨＡ）または抗Ｍｙｃに対する抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物を、組換えＥ１、Ｅ２およびユビキチン（Ｕｂ）とともにインキュベートし、イムノブロット分析に供した。
【００２２】
【図４】図４は、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の喪失に関連したレナリドマイドの抗骨髄腫活性を示す。（図４Ａおよび４Ｂ）示された期間、ＬＥＮ（２μＭ）で処置した骨髄腫細胞株のイムノブロット分析（図４Ａ）および増殖（図４Ｂ）。（図４Ｂ）において、データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）として示されている。（図４Ｃ）ＲＦＰおよび示されたｓｈＲＮＡをコードするウイルスに感染したＭＭ１Ｓ細胞における経時的な赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）陽性％の変化。各ウイルスの２％ＲＦＰの日を１にノーマライズし、その後の値を、ＲＦＰおよびコントロール（ＣＮＴＬ）ｓｈＲＮＡをコードするウイルスに感染した細胞に対して発現させた。（図４Ｄ）示されたｓｈＲＮＡを７２時間発現するレンチウイルスを一過的に感染させたＭＭ１Ｓ細胞のイムノブロット分析。（図４Ｅ）ＭＭ１Ｓ細胞を、ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターおよび示されたＦＬＡＧタグ付きタンパク質に感染させた。各タンパク質について示されているのは、ＤＭＳＯと比較して示された期間にＬＥＮ（２μＭ）で処理した細胞についてのＧＦＰ陽性率である。（図４Ｅ）において感染させ、ＤＭＳＯまたはＬＥＮ（２μＭ）で２４時間処理したＭＭ１Ｓ細胞のイムノブロット分析（図４Ｆ）。
【００２３】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ比がレポータープラスミド濃度の範囲にわたって安定であることを示す。ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）単独（図５Ａ）またはＨＩＦ１α−Ｆｌｕｃ融合タンパク質（図５Ｂ）をコードする示された量のプラスミドを２９３ＦＴ細胞に一過的にトランスフェクトした。空のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳを加えて全プラスミドＤＮＡを８００ｎｇにした。二重ルシフェラーゼアッセイを４８時間後に実施し、Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃを計算した。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質の薬理学的安定化を示す。２９３ＦＴ細胞を、非融合Ｆｌｕｃ（ｐＩＲＩＦ）または示されたＯＲＦ−ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）融合体をコードするプラスミドで一過的にトランスフェクトし、ＤＭＯＧ（１μＭ）、ＭＧ１３２（１０μＭ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）で２４時間処理した。ＨＩＦ１α−ｄＰＡは、両方のプロリルヒドロキシル化部位を欠くＨＩＦ１α変異体である（３３）。各プラスミドについて、ＤＭＳＯ処理と比較したＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ値（図６Ａ）およびＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃにおける倍数変化（図６Ｂ）が示されている。データは平均±ＳＤ、ｎ＝４である。
【００２４】
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、ポマリドマイドによるＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の下方制御を示す。ホタルルシフェラーゼ（上パネル）または赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグに融合して示されたＩＫＺＦタンパク質を産生するようにトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）／ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）比（図７Ａ）およびイムノブロット（下のパネル）。示された細胞をポマリドマイド（ＰＯＭ）（０．２μＭ）で、１２時間処理したものである。Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃ比を、対応するＤＭＳＯ処理細胞に対してノーマライズした。データは平均±ＳＤ、ｎ＝４である。
【図８】図８は、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３のｍＲＮＡレベルがレナリドマイドによって有意に影響されないことを示す。ＬＥＮ（２μＭ）およびＭＬＮ４９２４（１μＭ）で１２時間処理したＭＭ１ＳおよびＬ３６３細胞のリアルタイムｑＰＣＲ分析が示されている。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝３である。
【００２５】
【図９】図９は、ｐＶＨＬに応答するＨＩＦ２α安定性のモニタリング変化を示す。図９Ａは、ホタルルシフェラーゼを発現するビシストロン性レポーターおよびＮａｎｏＬｕｃと融合したＨＩＦ２αの模式図である。ＮａｎｏＬｕｃは、ＨＡエピトープタグを含み、内部コントロールレポーター（ホタル）の半減期がＮｌｕｃ融合物に匹敵するように、２Ｃ末端デグロン（ＰＥＳＴ）配列の含有によってホタルルシフェラーゼが部分的に不安定化された。このアプローチは、Ｆｌｕｃ融合体として非常に低いＦｌｕｃシグナルを生成する特定の不安定なタンパク質（例えば、ＨＩＦ２α）に必要である。図９Ｂは、野生型ｐＶＨＬをコードするドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性レトロウイルス発現ベクター、腫瘍由来のｐＶＨＬ変異体（Ｙ９８Ｎ）または空のベクターに続いて感染させた（図９Ａ）に示されるレポーターを含む、クローン７８６−Ｏ  ＶＨＬ−／−腎癌細胞についてのＮａｎｏＬｕｃ対ホタルルシフェラーゼ値を示す。留意すべきは、ｐＶＨＬ  Ｙ９８Ｎは、完全に不活性ではないことである。図９Ｄは、ＨＩＦ２α−Ｎｌｕｃ／ホタルルシフェラーゼを安定的に発現し、シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）で処理した７８６−Ｏ腎癌細胞の活性を示す。ＨＩＦ２α−ＮｌｕｃおよびＬｕｃ２ＣＰは、細胞をタンパク質翻訳阻害剤シクロヘキシミドで処理した後、同様の半減期で減衰する。さもなければ、ＮｌｕｃおよびＦｌｕｃの比は、転写、翻訳またはタンパク質分解の非特異的阻害剤に応答して変化し得る。
【００２６】
【図１０】図１０において、ＵＢＣプロモーターの制御下でＩＲＥＳ−ＥＲ−ＦＬｕｃ−ＩＲＥＳ−ＲＬｕｃレポーターを発現するプラスミドで安定的にトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ウェルあたり２０，０００細胞の濃度で不透明な９６ウェルプレートのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。翌日、細胞を３７℃、１０％ＣＯ２で６時間、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で示された薬物で処理した。ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケシグナルは、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）および９６ウェルプレートリーダー（Berthold）を用いて定量した。３つの複製物を薬物濃度ごとにプロットした。エラーバーは、ＳＤを指す。シクロヘキシミド（CHX）とは対照的に、ＥＲリガンドはＲＬｕｃに影響を与えずにＦＬｕｃに影響する。
【００２７】
発明の詳細な説明
本出願は、いくつかの側面において、特定の摂動後に数千のタンパク質の安定性を効率的にモニタリングするために使用され得るプラスミドの開発に関する。このプラスミドは、それぞれがＩＲＥＳの制御下に置かれた２つのレポータータンパク質の共発現を可能にする。このようにして、両方のレポーターが一緒に転写され（すなわち、同じｍＲＮＡによってコードされ）、両方がＩＲＥＳを用いて翻訳される。これは、ＩＲＥＳ依存性対ＩＲＥＳ非依存性の翻訳に差異的に影響する摂動（例えば、化合物）によって引き起こされる２つのレポーターの比の偽の変化の問題を最小限にし、したがって偽陽性を最小化する。
【００２８】
本発明の他の態様は、プラスミドライブラリー、目的の化合物によってレベルが調節されるタンパク質を同定するためのスクリーニング法およびＩＭｉＤ化合物による対象の処置をモニタリングする方法に関する。
本発明の一態様によれば、ＤＮＡプラスミドが提供される。プラスミドは、作動可能な連結において（ａ）プロモーター；（ｂ）第１の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；（ｃ）第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）第２のＩＲＥＳ；および（ｅ）第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「作動可能な連結」は、転写制御エレメント（例えば、プロモーター）および連結された転写配列などの２つの核酸配列間の機能的連結を指す。したがって、プロモーターが遺伝子の転写を媒介することができるならば、プロモーターは遺伝子と作動可能に連結している。
【００３０】
本明細書で使用される「プロモーター」は、通常、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位および転写が生じるための転写因子を提供する特異的ＤＮＡ配列（応答エレメント）を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターまたは合成プロモーターである。プロモーターの例には、ＴＡＴＡボックス、シミアンウイルス４０由来のＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣプロモーター）およびＴ７プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。これらおよび他のプロモーター配列は、当技術分野において周知である。本発明の一例では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。本発明の一例において、プロモーターはＵｂＣプロモーターである。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＲＮＡ分子上のリボソームの内部侵入を媒介し、それによって真核生物系における翻訳を調節するシス作用性核酸エレメントである。本発明の方法および組成物では、第１および第２のＩＲＥＳエレメントがプラスミドに含まれる。第１および第２のＩＲＥＳエレメントは、レポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列および単一のメッセンジャーＲＮＡ由来の別のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合されたオープンリーディングフレームの独立した翻訳を可能にする。いくつかの態様において、第１および第２のＩＲＥＳは同一である（すなわち、それらは同一の配列を有する）。いくつかの態様において、第１および第２のＩＲＥＳは同一ではない（すなわち、それらは同一の配列を有さない）。
【００３２】
多くのＩＲＥＳエレメントが、ウイルスゲノムおよび真核ゲノムの両方で同定されている。さらに、合成ＩＲＥＳエレメントも開発されている。例えば、ＩＲＥＳエレメントは、エンテロウイルス属のメンバーを含む種々のウイルスに見出されている（例えばヒトパピローマウイルス１（Ishii et al. (1998) J Virol. 72:2398- 405 and Shiroki et al. (1997) J. Virol. 77:1-8）、ヒトコクサッキーウイルスＢ）；ライノウイルス（例えばヒトライノウイルス）；へパトウイルス（Ａ型肝炎ウイルス）；カーディオウイルス（脳心筋炎ウイルスＥＣＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０４１９２７のヌクレオチド２１３７−２７５２およびKim et al. (1992) Mol Cell Biology 72:3636-43）およびタイラー（Etheirler's）脳脊髄炎ウイルス）；アフトウイルス（口蹄疫ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３０８１５７のヌクレオチド６００−１０５８；Belsham et al. (1990) EMBO 77:1105-10；Poyry et al. (2001) RNA 7:647-60；およびStoneley et al. (2000) Nucleic Acid Research 25:687-94）、ウマ鼻炎Ａウイルス、ウマ（Ewuine）鼻炎Ｂ）；ぺスティウイルス（例えばウシウイルス性下痢ウイルス（Poole et al. (1995) Virology 206:150-154）およびブタコレラウイルス（Rijnbrand et al. (1997) J. Virol 77:451-7）；ヘパシウイルス（例えばＣ型肝炎ウイルス(Tsukiyama-Kohara et al. (1992) J. Virol. 66:1476-1483, Lemon et al. (1997) Semin. Virol. 5:274-288、およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２４２６５４のヌクレオチド１２０１−１８１２）およびＧＢウイルスＢ）。これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
ＩＲＥＳエレメントは、レンチウイルスファミリーのメンバー（例えば、シミアン免疫不全ウイルス（Ohlmann et al. (2000) Journal of Biological Chemistry 275:11899-906）およびヒト免疫不全ウイルス１（Buck et s/. (2001) J Virol. 75:181-91）；ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス（例えば、ヒトＴ−リンホトロピックウイルス１型（Attal et al. (1996) EEES Letters 392:220-4）;および哺乳動物Ｃ型レトロウイルスファミリー（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Vagner et al. (1995) J. Biol. Chem 270:20316-83）、フレンドマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス（Lopez-Lastra et al. (1997) Hum. Gene Ther 5:1855-65）、マウス白血病ウイルス（envRNA）（Deffaud et al. (2000) J. Virol. 74:846-50）、ラウス肉腫ウイルス（Deffaud et al. (2000) J. Virol. 74:11581-8）を含む、レトロウイルス科のウイルスにも見出されている。これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
真核生物のｍＲＮＡはまた、例えばＢｉＰを含むＩＲＥＳエレメントを含む（Macejak et al. (1991) Nature 355:91）；ショウジョウバエのアンテナペディア（エクソンｄおよびｅ）(Oh et al. (1992) Genes and Development 6:1643-1653；ｃ−ｍｙｃ；およびアポトーシスのＸ連結阻害剤（ＸＩＡＰ）遺伝子（米国特許第６，１７１，８２１号）を含むＩＲＥＳエレメントを含有する。
様々な合成ＩＲＥＳエレメントは、生成されている。例えば、De Gregorio et al. (1999) EMBO J. 75:4865-74; Owens et al. (2001) PNAS 4:1471-6；およびVenkatesan et al. (2001) Molecular and Cellular Biology 21:2826-37を参照。当技術分野で知られている追加のＩＲＥＳエレメントについては、例えばrangueil.inserm.fr/IRESdatabaseを参照。
【００３５】
特定の態様において、ＩＲＥＳ配列は、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）に由来する。
本明細書中で使用される場合、レポータータンパク質は、例えば、その蛍光または酵素活性を介して発現された場合（すなわち、発現された場合に検出可能なシグナルを有する）、特異的に検出され得る任意のタンパク質である。プラスミドは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列および第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。オープンリーディングフレームは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチドコード配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれかに融合される。
【００３６】
いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配置に融合される。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合される。これは、異なる刺激に応答して、連結されたオープンリーディングフレームの発現を研究することを可能にする。本明細書中で使用される場合、「融合された」とは、ＯＲＦおよびレポータータンパク質によってコードされるアミノ酸がペプチド結合によって接続されて、連続したタンパク質配列を生成することを意味することを意図する。
【００３７】
したがって、オープンリーディングフレームに融合したレポータータンパク質は、融合オープンリーディングフレームの安定性のマーカーとして働く。オープンリーディングフレームに融合していない（したがって、ＯＲＦによってコードされたアミノ酸と連続したタンパク質配列を生成しない）他のレポータータンパク質は、細胞数および発現の変動性についてノーマライズするための内部コントロールとして働く。
【００３８】
典型的には、第１および第２のレポータータンパク質は識別可能で検出可能なレポーターシグナルを有する。例えば、第１および第２のレポータータンパク質は、それらの産物から生成される識別可能なシグナルを有する酵素タンパク質である。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、異なる波長で光を放出する、および／または、異なる基質を使用する生物発光タンパク質である。あるいは、第１および第２の蛍光タンパク質は、異なる波長で蛍光を発する蛍光タンパク質である。
【００３９】
生物発光タンパク質、蛍光レポータータンパク質、ベータガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの特異的な検出可能な産物を産生する酵素タンパク質を含む、当技術分野で公知の多くのレポータータンパク質を使用してもよいが、これらに限定されない。蛍光発光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ならびに、その改変形態、例えば、強化されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化されたＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化されたＲＦＰ（ＥＲＦＰ）、ｍＣＨＥＲＲＹ、および強化されたＹＥＰ（ＥＹＥＰ）である。
【００４０】
生物発光タンパク質の例は、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）およびＮａｎｏＬｕｃを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知である。（例えばFan, F. and Wood, K., Assay and drug development technologies V5 #1 (2007); Gupta, R. et al Nature Methods V8 #10 (2011); Nano-Glo（登録商標）Luciferase Assay System (Promega) およびen.wikipedia.org/wiki/Bioluminescenceを参照）。レポータータンパク質の他の非限定的な例を以下に示す：
【００４１】
【表１】
2017534270.tif 000003
【００４２】
いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）およびＮａｎｏＬｕｃからなる群から選択される。いくつかの態様において、第１および第２のレポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される。
【００４３】
オープンリーディングフレームは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチドコード配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれかに融合される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に融合される。本明細書において、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦは、アミノ酸の連続した配列をコードするヌクレオチドの配列を指す。翻訳されたオープンリーディングフレームは、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部であり得る。ＯＲＦは、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来し得る。完全なＯＲＦｅｏｍｅは、所定の生物のすべてのタンパク質をコードする核酸を含む。完全ＯＲＦｅｏｍｅの代表的な部分は、生物によって発現される全タンパク質の少なくとも６０％である。いくつかの態様において、生物は哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。
【００４４】
いくつかの態様において、ＯＲＦは、がんタンパク質の全部または一部をコードするがん遺伝子である。がん遺伝子の例として、ＲＡＳ、ＭＹＣ、ＳＲＣ、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＢ、ＡＢＬ、ＢＣＬ２、ＨＯＸ１１、ＨＯＸ１１Ｌ２、ＴＡＬ１／ＳＣＬ、ＬＭＯｌ、ＬＭ０２、ＥＧＦＲ、ＭＹＣＮ、ＭＤＭ２、ＣＤＫ４、ＧＬＩ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＰ５３、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＨＥＲ２  ＮＥＵ、ＦＬＴ３Ｒ、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＡＮ１、Ｂ−ＲＡＦ、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、ならびにＰＡＸおよびＦＫＨＲ遺伝子ファミリーのメンバーの融合、ＷＮＴ、ＭＹＣ、ＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ３、ＣＤＨ５、ＫＩＴ、ＲＥＴ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）およびＴＲＫを含むが、これらに限定されない。他の例示的ながん遺伝子は、当該技術分野で周知であり、いくつかのかかる例は、例えば、The Genetic Basis of Human Cancer（Vogelstein, B. and Kinzler, K. W. eds. McGraw-Hill, New York, N.Y., 1998）に記載されている。
【００４５】
いくつかの態様において、ＯＲＦは転写因子である。かかる転写因子のいくつかの例には、ＳＴＡＴファミリー（ＳＴＡＴ１，２，３，４，５Ａ、および６）、ＦＯＳ／ＪＵＮ、ＮＦκＢ、ＨＩＶ−ＴＡＴおよびＥ２Ｆファミリーが含まれる（しかし、これらに限定されない）。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガータンパク質である。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ４、またはＩＫＺＦ５である。いくつかの態様において、目的のタンパク質はＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３である。
【００４６】
レポータータンパク質および融合ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は、「インフレーム」、すなわちレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単一ポリヌクレオチドの連続トリプレットコドンであり、融合オープンリーディングフレームは単一の連続アミノ酸配列をコードする。
【００４７】
本発明の他の態様は、本明細書に記載のプラスミドを含む単離された形質転換宿主細胞を提供する。プラスミドは、当該技術分野で公知の利用可能な技術を用いて宿主細胞に導入することができる。例えば、プラスミドは、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ソノポレーション、感染および光学トランスフェクションによって宿主細胞に導入することができる。適切な宿主細胞には、細菌細胞（例えば、E.coli、Bacillus subtilisおよびSalmonella typhimurium）、酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiaeおよびSchizosaccharomyces pombe）、植物細胞（例えば、Nicotiana tabacumおよびGossypium hirsutum）および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞および３Ｔ３線維芽細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ−２ＯＳ細胞）が挙げられる。
【００４８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の複数のプラスミド（すなわち、１つ以上のプラスミドのコレクション）を含むＤＮＡプラスミドライブラリーを提供する。いくつかの態様において、ライブラリー中の各プラスミドのオープンリーディングフレームは異なる。いくつかの態様において、ライブラリー中の各プラスミドのオープンリーディングフレームは、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来する。いくつかの態様において、生物は哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。
【００４９】
本発明の別の態様は、目的の化合物によってレベルが調節されたタンパク質を同定する方法を提供する。該方法は、ｉ）本明細書に記載のプラスミドライブラリーで形質転換された宿主細胞を目的の化合物と接触させること；（ｉｉ）化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比を決定すること；（ｉｉｉ）化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較して増加したときに、増加したレベルを有するオープンリーディングフレームを同定すること、および、化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較して減少したときに、減少したレベルを有するオープンリーディングフレームを同定することを含む。
【００５０】
宿主細胞は、当技術分野で公知の利用可能な技術を用いてプラスミドライブラリーのプラスミドで形質転換することができる。例えば、プラスミドは、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ソノポレーション、光学トランスフェクションまたはインジェクションによって宿主細胞に導入することができる。
【００５１】
本明細書において、「融合レポータータンパク質シグナル」とは、ＯＲＦに融合されたヌクレオチド配列によってコードされるレポータータンパク質の検出可能なシグナルをいう。本明細書中で使用される場合、「非融合レポータータンパク質シグナル」とは、ＯＲＦに融合していないヌクレオチド配列によってコードされるレポータータンパク質の検出可能なシグナルをいう。
【００５２】
いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合される。かかる態様において、第１のレポータータンパク質シグナル対第２のレポータータンパク質シグナルの比は、化合物の存在下および非存在下において決定される。化合物の存在下における第１のレポータータンパク質シグナル対第２のレポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における第１のレポータータンパク質シグナル対第２のレポータータンパク質シグナルの比と比較して増加したときに、増加したレベルを有するオープンリーディングフレームが同定され、化合物の存在下における第１のレポータータンパク質シグナル対第２のレポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における第１のレポータータンパク質シグナル対第２のレポータータンパク質シグナルの比と比較して減少したときに、減少したレベルを有するオープンリーディングフレームが同定される。
【００５３】
いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合される。かかる態様において、第２のレポータータンパク質シグナル対第１のレポータータンパク質シグナルの比は、化合物の存在下および非存在下において決定される。化合物の存在下における第２のレポータータンパク質シグナル対第１のレポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における第２のレポータータンパク質シグナル対第１のレポータータンパク質シグナルの比と比較して増加したときに、増加したレベルを有するオープンリーディングフレームが同定され、化合物の存在下における第２のレポータータンパク質シグナル対第１のレポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における第２のレポータータンパク質シグナル対第１のレポータータンパク質シグナルの比と比較して減少したときに、減少したレベルを有するオープンリーディングフレームが同定される。
【００５４】
目的の化合物は、所望の疾患改変活性（例えば、抗新生物活性、抗アポトーシス活性および抗炎症活性）を有するか、または有すると疑われるいずれかの化合物であり得る。これらは、とりわけ、小有機分子、マクロ化合物、ヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを含む）、核酸（遺伝子編集を誘導するベクター（ＣＲＩＳＰＲを含む）、ペプチド、タンパク質および炭水化物を含む。目的の化合物によってレベルが調節されたタンパク質を同定することにより、本明細書に記載の方法は、化合物の薬理学的活性の根底にあるメカニズムを評価し、理解することを可能にする。さらに、本明細書に記載の方法は、化合物の薬力学的効果をモニタリングおよび／または画像化するために使用することができるタンパク質の発見を可能にする。
【００５５】
いくつかの態様において、目的の化合物はＩＭｉＤ（登録商標）(Celegene)である。ＩＭｉＤ（登録商標）化合物は、複数の作用機序を介して免疫系や他の生物学的標的を調節する、小分子の経口利用可能な化合物である。ＩＭｉＤ化合物の例には、レナリドマイドおよびＣＣ−４０４７（ポマリドマイド）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、目的の化合物は、ＣＤＫ４阻害剤（例えば、ＷＯ２００２／０５１８４９、ＷＯ２０００／０１２４９６、ＷＯ２０１１／１０１４１７）、ＮＥＤＤ８阻害剤（例えばＷＯ２０１３／０２８８３２参照）またはプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２である。
【００５６】
いくつかの態様において、本明細書に記載のプラスミドライブラリーで形質転換された宿主細胞を目的の化合物と接触させることは、適切な培養条件下で化合物の存在下で形質転換された宿主細胞を適切な時間増殖させることを含む。培養期間を含む適切な培養条件は、培養される細胞に依存して変化するであろう。しかしながら、当業者は、一連のMethods in Microbiology、Academic Press Inc.に記載されているような標準的なプロトコールにしたがって、培養条件を容易に決定することができる。
【００５７】
典型的には、細胞培養培地は、塩（単数または複数）、緩衝液（単数または複数）、アミノ酸、グルコースまたは他の糖（単数または複数）、抗生物質、血清または血清代替物、およびペプチド増殖因子、補因子および微量元素などの他の成分が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、トランスフェクションされた宿主細胞を、化合物の存在下で、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２０時間、２４時間、３０時間、４８時間または７２時間増殖させる。
【００５８】
化合物の存在下および非存在下における融合および非融合レポータータンパク質シグナルは、当該分野で公知の方法を用いて決定される。ルミノメーター、分光光度計および蛍光光度計などの検出器またはレポータータンパク質活性の変化を検出し得る任意の他の装置を使用することができる。単一サンプル中の２つのレポーター遺伝子からの安定なレポーターシグナルの定量を可能にする当技術分野で公知のアッセイ系を使用することができる。例としては、単一のサンプルからホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を連続的に測定するDual-Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を含むが、これに限定されない。
【００５９】
レポータータンパク質によって生成されたシグナルを検出すると、目的の化合物が、レポータータンパク質に融合したＯＲＦの発現を増減するかどうかが決定される。かかる決定は、化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比を、化合物の非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較することによって行うことができる。化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較して増加する場合、ＯＲＦは目的の化合物の存在下で増加したレベル（すなわち、より大きな安定性）を有すると決定される。
【００６０】
対照的に、化合物の存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比が、化合物の非存在下における融合レポータータンパク質シグナル対非融合レポータータンパク質シグナルの比と比較して減少する場合、ＯＲＦは目的の化合物の存在下においてが減少したレベル（すなわち、安定性が低い）を有すると同定される。
【００６１】
本発明の別の態様は、ＩＭｉＤ化合物により対象の処置をモニタリングする方法に関する。方法は、ＩＭｉＤ化合物で処置された対象のサンプルにおけるＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定すること；ならびにＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルが参照レベルと比較して減少したときに対象を処置に応答するものとして同定することを、含む。
【００６２】
本明細書で使用する用語「対象」は、ＩＭｉＤ化合物で処置されている状態または障害を有する哺乳動物をいう。ＩＭｉＤで処置することができる状態または障害の例には、多発性骨髄腫などのがんおよび骨髄線維症、輸血依存性貧血および骨髄異形成疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象はヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコまたはイヌである。ＩＭｉＤ化合物の例には、レナリドマイドおよびＣＣ−４０４７（ポマリドマイド）が含まれるが、これらに限定されない。「ＩＭｉＤ化合物による対象の処置のモニタリング」は、ＩＭｉＤ化合物で処置されている状態または障害の進行または寛解を確認することを指す。いくつかの態様において、「ＩＭｉＤ化合物による対象の処置のモニタリング」は、ＩＭｉＤ化合物が、その予測された、所望の薬学的効果を有するかどうかを確認することを指す。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「対象から採取されたサンプル」は、対象から単離された組織または体液のサンプルを指し、例えば、血液、血漿、血清、糞便物質、尿、骨髄、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚の外分泌物、呼吸器系、腸系および尿生殖路、涙、唾液、乳、血液細胞、臓器および生検を含む。いくつかの態様において、サンプルは、血液、血漿または腫瘍組織である。
【００６５】
対象のサンプルを得ることは、対象のサンプルを採取することを意味する。対象からサンプルを得ることは、対象からサンプルを除去することを意味する。したがって、対象のサンプルを得て、サンプル中のＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定する者は、必ずしも対象から生体サンプルを得る必要はない。いくつかの態様において、サンプルは、医師（例えば、医師、看護師、または臨床検査医師）によって対象から除去され、次いでＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定する者に提供されてよい。
【００６６】
サンプルは、対象または医師（例えば、医師、看護師、または臨床検査医師）によってＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定する者に提供され得る。いくつかの態様において、ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定する者は、対象からサンプルを除去することによって、対象から生物学的サンプルを得る。サンプルは、ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルの測定を容易にするために任意の適切な様式で処理され得ることが理解されるべきである。例えば、生物学的サンプルから目的の生体分子を単離するために、生化学的、機械的および／または熱的処理方法を適切に使用することができる。ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルは、またサンプル中で直接決定されてもよい。
【００６７】
ＩＫＺＦ１（ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー１（Ｉｋａｒｏｓ）；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１０３２０）は、クロマチンリモデリングに関連するジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質のファミリーに属する転写因子をコードする。それは造血系において、重要な機能を示し、その機能喪失はリンパ性白血病の発症と関連している。特に、Ｉｋａｒｏｓは、近年、ヒトＢ細胞急性リンパ芽球性白血病に関与する主要な腫瘍抑制因子であることが見出されている。
【００６８】
ＩＫＺＦ３（Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質３；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２２８０６）は、Ｂリンパ球の増殖および分化の調節において重要な転写因子である。ＩＬ−２依存性の様式でＴ細胞におけるＢＣＬ２発現の調節およびアポトーシスの制御に関与する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定する」とは、サンプル中のＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３の量または濃度を決定することを指す。「決定する」とは、ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを測定するアッセイを実施することを指す。いくつかの態様において、「決定する」は、例えば、サンプル中のＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３の発現レベルまたは活性レベルを決定することを含む。いくつかの態様において、ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３タンパク質の発現レベルが決定される。
【００７０】
ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルは、アッセイを実施することによって測定してもよい。「アッセイを実施する」とは、サンプルを試験してＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを定量することを意味する。使用されるアッセイの例としては、質量分析、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）、ＨＰＬＣ液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）およびイムノアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルは、ＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３に融合されたレポータータンパク質のレベルを測定することによって決定される（Zhang et al. Nature Medicine 10, 643 - 648 (2004) and Safran et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Jan 3;103(1):105-10参照）。ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルを決定するための他の適切な方法は、当業者には明らかであろう。
【００７１】
対象は、ＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルが参照レベルと比較して減少した場合に、治療に応答していると同定される。参照レベルは、ＩＭｉＤ化合物で処置されていないコントロール対象におけるＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３のレベルである。
【００７２】
いくつかの側面によれば、本開示は、目的のタンパク質の機能を特徴付ける方法を提供する。この方法は、ＩＫＺ１またはＩＫＺ３またはその断片に融合された目的のタンパク質を有する細胞を提供すること；細胞をＩＭｉＤ化合物と接触させること；目的のタンパク質を下方制御する効果をモニタリングすることを含む。いくつかの態様において、細胞はインビボである。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「目的のタンパク質」は、研究さもなければ特徴付けのためなどの目的となり得るポリペプチドまたはタンパク質である。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、ＲＡＳ、ＭＹＣ、ＳＲＣ、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＢ、ＡＢＬ、ＢＣＬ２、ＨＯＸ１１、ＨＯＸ１１Ｌ２、ＴＡＬ１／ＳＣＬ、ＬＭＯｌ、ＬＭ０２、ＥＧＦＲ、ＭＹＣＮ、ＭＤＭ２、ＣＤＫ４、ＧＬＩ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＰ５３、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＨＥＲ２  ＮＥＵ、ＦＬＴ３Ｒ、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＡＮ１、Ｂ−ＲＡＦ、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１およびＮＰＭ−ＡＬＫならびにＰＡＸおよびＦＫＨＲ遺伝子ファミリーのメンバーの融合、ＷＮＴ、ＭＹＣ、ＥＲＫ  ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ３、ＣＤＨ５、ＫＩＴ、ＲＥＴおよびＴＲＫなどのがんタンパク質も含まれるが、これらに限定されない。他の例示的ながん遺伝子は、当該分野で周知であり、かかるいくつかの例は、例えば、The Genetic Basis of Human Cancerに記載されている（Vogelstein, B. and Kinzler, K. W. eds. McGraw-Hill, New York, N.Y., 1998）。
【００７４】
いくつかの態様において、目的のタンパク質は転写因子である。かかる転写因子のいくつかの例には、ＳＴＡＴファミリー（ＳＴＡＴ１、２、３、４、５Ａおよび６）、ＦＯＳ／ＪＵＮ、ＮＦκＢ、ＨＩＶ−ＴＡＴおよびＥ２Ｆファミリーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガータンパク質である。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、ＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３の「断片」は、対応する全長タンパク質より小さいＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３の任意の部分をいう。断片は、ＩＭｉＤの存在下でセレブロンに結合するのに十分なアミノ酸を含む。いくつかの態様において、目的のタンパク質を下方制御する効果をモニタリングすることは、当技術分野で公知の任意の方法を用いて細胞の生存率をモニタリングすることを指す。
【００７６】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これは決してさらなる限定として解釈すべきではない。本出願を通して引用された全ての参考文献（参考文献、発行された特許、出願公開公報、および同時継続出願）の全内容は、参照により明示的に援用される。
【実施例】
【００７７】
例
材料および方法
細胞培養
ＨＥＫ２９３ＦＴ（Invitrogen）細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で維持した。Ｕ９３７、ＭＭ１Ｓ、ＫＭＳ３４、ＫＭＳ１１、Ｌ３６３、ＲＰＭＩ８２２６およびＯＣＩｍｙ５細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地で培養した。レンチウイルス感染の後、蛍光活性化セルソーティングまたは０．５または２μｇ／ｍｌのプロマイシン、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンまたは２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する培地における増殖により安定な細胞株を樹立した。
【００７８】
ルシフェラーゼORF融合ライブラリー構築
目的ベクターｐＣＭＶ−ＩＲＥＳ−ウミシイイタケルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ゲートウェイ−ホタルルシフェラーゼ（ｐＩＲＩＧＦ）をオーバーラップＰＣＲにより構築した。ヒトＯＲＦｅｏｍｅライブラリーＶ５．１を、ＬＲゲートウェイ組換え（Invitrogen）を介してｐＩＲＩＧＦ中にシャトルした。２５℃で一晩の組換え後、１μＬの反応混合物を、９６ウェルプレート中の１０μＬのＯｍｎｉＭＡＸ  ２Ｔ１コンピテント細胞（Invitrogen）に、４２℃で１分間の熱ショックにより形質転換した。１００μＬのＳＯＣ培地を各ウェルに加え、形質転換混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【００７９】
次に、９６ウェルディープウェルプレート（Qiagen）を用いて１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１ｍＬの２×ＹＴ培地に各混合物を移した。３７℃で一晩振盪した後、形質転換体を遠心分離によって収集し、プラスミドをDirectPrep 96 BioRobot Kit（Qiagen）を用いて抽出した。
【００８０】
３８４ウェルDual-gloルシフェラーゼスクリーニング
３８４ウェルプレートに播種した２９３ＦＴ細胞にＯＲＦルシフェラーゼ融合ライブラリーをトランスフェクトするために、７０００個の細胞を含む２５μｌの培地を、ＤＮＡ／トランスフェクション混合物を添加する約１０分前にプレートに播種した。９６−使い捨てチップのBeckman FX pod headを用いて、元のＯＲＦｅｏｍｅ  Ｖ５．１マップ（１６９個のライブラリープレート）にしたがって配列された個々のＤＮＡプラスミド溶液（５μｌ）を２０μｌのOpti-MEM還元血清培地に希釈した。次いで、２０μｌの希釈プラスミドを、２０μｌの希釈Lipofectamine 2000（Invitrogen）［１：１５、Opti-MEM還元血清培地で希釈］と混合した。
【００８１】
室温で５分後、３μｌのこのＤＮＡ／リポフェクタミン溶液を単一の９６ウェルのソース溶液に対応する２つの同一の３８４ウェルプレートの４ウェル（合計８ウェル）に加えた。次いで、細胞を標準的な増殖条件下で２６〜２８時間増殖させた。８チャンネルのマルチドロップディスペンサーを用いて、レナリドマイド（最終２μＭ；Selleck Chemicals＃S1029）の１３．３μＭ溶液５μｌを一方のプレートに添加し、０．１３％ＤＭＳＯを他方のプレートに添加し、細胞をさらに１７〜２０時間増殖させた。ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現を製造元の説明書（Promega＃E2940）にしたがってDual-gloアッセイを用いて定量した。
【００８２】
データ分析のために、ホタルＣＰＳをウミシイタケＣＰＳ（Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃ）で割ることにより、最初の１秒あたりの生カウント（ＣＰＳ）を全トランスフェクション効率でノーマライズした。次いで、各プレート上の４つの複製ウェル比を平均し、標準偏差を決定した。ＤＭＳＯ対照プレートによるＬＥＮプレートからの平均Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃの比を割ることによって（Ｆｌｕｃ／Ｒｌｕｃの変化）、レナリドマイド（ＬＥＮ）誘発変化を各ＯＲＦについて決定した。
【００８３】
比における全ての有意な変化に関連するデータは、バックグラウンドシグナルより有意に高い生データから生じたことが確認された。５０％を超える標準偏差を有する四重複データは、低発現プラスミドおよび他の点でエラーが発生しやすいデータから大部分のデータを迅速に除去するために、さらなる解析から排除された。除外されたデータのほとんどは低発現クローン由来であった。
【００８４】
残りのデータ（１５，４８３のＯＲＦのうち１３，３７２）は、平均ＬＥＮ／ＤＭＳＯ比が１．０２±０．１８の対数正規分布に適合し、フォローアップテストのために、比が３標準偏差の増加（６１）または減少（４６）したＯＲＦのリストを生成した。
【００８５】
９６ウェルDual-gloルシフェラーゼアッセイ
３８４ウェルハイスループットスクリーニングから得られたＯＲＦのＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃの変化を検証するために、各クローンを９６ウェルフォーマットでさらに試験した。トランスフェクションの前日に、ウェル当たり１００μｌのＤＭＥＭ培地中に２０，０００個の細胞を有する固体不透明９６ウェルプレート（BD biosciences）に２９３ＦＴ細胞を播種した。トランスフェクションの当日、９６ウェルポリプロピレンプレート（Greiner）を用いてトランスフェクション混合物を調製した。最初に、２４０ｎｇのＯＲＦルシフェラーゼ融合クローンおよび４８０ｎｇのｐｃＤＮＡ３を含むプラスミド混合物を１２０μｌのOpti-MEM還元血清に希釈した。
【００８６】
次に、１４．４μＬのLipofectamine 2000を１２０μｌのOpti-MEM還元血清に希釈した。５分後、マルチチャネルピペットを用いてプラスミド溶液を希釈したLipofectamine 2000と混合した。３０分後、２８μｌのＤＮＡ／リポフェクタミン混合物を、２９３ＦＴ細胞（各ＯＲＦについて８ウェル）を播種した９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＬＥＮ（２μＭ）またはＤＭＳＯで４回処理した。トランスフェクションの３６時間後、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼシグナルを、製造元の説明書に従ってDual-gloアッセイを用いて定量した。
【００８７】
各ウェルについてＦＬｕｃ／Ｒｌｕｃの比を計算した。各ＯＲＦのＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃの変化を測定するために、ＬＥＮ処理したウェルの平均Ｆｌｕｃ／ＲｌｕｃをＤＭＳＯ処理ウェルのＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃで割った。両側スチューデントｔ検定を行って、統計的有意性を決定した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【００８８】
プラスミド
ヒトＩＫＺＦ４  ｃＤＮＡクローンをＥＴＳクローンＨｓＣＤ００２９５５３０（PlasmID、DF/HCC DNA Resource Core）からＰＣＲ増幅し、ＢＰゲートウェイ組換えを介してｐＤＯＮＲ２２３にクローニングした。ヒトORFeome Collection（DF / HCC DNA Resource Core）から、ヒトＣＲＢＮ、ヒトＩＫＺＦ１スプライシング変異体２（ＩＫＺＦ１−Ｖ２）、ヒトＩＫＺＦ２スプライシング変異体２（ＩＫＺＦ２−Ｖ２）、ヒトＩＫＺＦ５およびヒトＩＲＦ４をｐＤＯＮＲ２２３エントリーベクターで得た。ＩＫＺＦ１スプライシング変異体１（ＩＫＺＦ１−Ｖ１）ｃＤＮＡおよびヒトＩＫＺＦ２スプライシング変異体１（ＩＫＺＦ２−Ｖ１）ｃＤＮＡをオーバーラップＰＣＲによって作製し、ＢＰゲートウェイ組換えを介してｐＤＯＮＲ２２３にクローニングした。
【００８９】
ＩＫＺＦ４、ＩＫＺＦ１−Ｖ１およびＩＫＺＦ２−Ｖ１を、ＬＲゲートウェイ組換えを介してｐＩＲＩＧＦにクローニングした。ＩＫＺＦ１／２キメラ（ＩＫＺＦ１２  Ｈ１、Ｈ２  ＩＫＺＦ１２、ＩＫＺＦ１２  Ｈ３、Ｈ４  ＩＫＺＦ１２、ＩＫＺＦ２１  Ｈ５、Ｈ６  ＩＫＺＦ２１、ＩＫＺＦ２１  Ｈ７、Ｈ８  ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ１２１およびＩＫＺＦ２１２）、ＩＫＺＦ１−Ｖ２−Ｑ１４６Ｈ、ＩＫＺＦ１−Ｖ２−  Ｈ１７６Ｐ／Ｌ１７７Ｆ、ＩＫＺＦ２−Ｖ１−Ｈ１４１Ｑ、ＩＫＺＦ２−Ｖ１−Ｐ１７１Ｈ／Ｆ１７２Ｌ、ＩＫＺＦ１−Ｖ１−Ｑ１４６Ｈ、ＩＫＺＦ３−Ｑ１４７Ｈ変異はオーバーラップＰＣＲを介して生成し、ＬＲゲートウェイ組換えを介してｐＩＲＩＧＦにクローニングした。
【００９０】
ＩＫＺＦ１−Ｖ２、ＩＫＺＦ２−Ｖ２、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ４、ＩＫＺＦ５およびＩＲＦ４を、ＬＲゲートウェイ組換えを介してｐｌｅｎｔｉ−ＵＢＣ−ｇａｔｅ−３ｘＨＡ−ｐＧＫ−ＰＵＲにクローニングした。ＩＫＺＦ１−Ｖ２、ＩＫＺＦ１２１、ＩＫＺＦ１−Ｖ２−Ｑ１４６Ｈ、ＩＫＺＦ１−Ｖ２−Ｈ１７６Ｐ／Ｌ１７７Ｆ、ＩＫＺＦ２−Ｖ１−Ｈ１４１Ｑ、ＩＫＺＦ２−Ｖ１−Ｐ１７１Ｈ／Ｆ１７２Ｌ、ＩＫＺＦ２１２、ＩＫＺＦ１−Ｖ１、ＩＫＺＦ１−Ｖ１−Ｑ１４６Ｈ、ＩＫＺＦ３およびＩＫＺＦ３−Ｑ１４７Ｈをｐｌｅｎｔｉ−ＵＢＣ−ｇａｔｅ−３ｘＨＡ−ｐＧＫ−ＨＹＧにクローニングした。ＩＫＺＦ１−Ｖ２およびＩＫＺＦ２−Ｖ２を、ＬＲゲートウェイ組換えを介してｐｃＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴ（Invitrogen）およびｐｌｅｎｔｉ−ＵＢＣ−ｇａｔｅ−ＦＬＡＧ−ｐＧＫ−ＨＹＧにクローニングした。ＩＫＺＦ１−Ｖ１、ＩＫＺＦ１−Ｖ１−Ｑ１４６Ｈ、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ３−Ｑ１４７Ｈ、ＩＫＺＦ２−Ｖ２およびＩＲＦ４をＬＲ組換えを介してｐｌｅｎｔｉ−ＣＡＧ−ｇａｔｅ−ＦＬＡＧ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにクローニングした。
【００９１】
オーバーラップＰＣＲにより、ＣＲＢＮ−Ｙ３８３Ａ／Ｗ３８５Ａ（ＹＷＡＡ）変異を生成させ、ＢＰ組換えを介してｐＤＯＮ２２３にクローニングした。ＣＲＰＮおよびＹＷＡＡをＬＲ組換えを介してｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｇａｔｅ−ｐＧＫ−ＨＹＧ、ｐｌｅｎｔｉ−ＵＢＣ−ＦＬＡＧ−ｇａｔｅ−ｐＧＫ−ＨＹＧ、ｐｌｅｎｔｉ−ＵＢＣ−ＨＡ−ｇａｔｅ−ｐＧＫ−ＨＹＧおよびｐｌｅｎｔｉ−ＵＢＣ−Ｍｙｃ−ｇａｔｅ−ｐＧＫにクローニングした。レンチウイルス発現ベクター内のｃＤＮＡをＤＮＡ配列決定により確認した。
【００９２】
ＣＲＩＳＰＲゲノム編集
ＣＲＢＮ遺伝子編集ベクターは、アニーリングされたオリゴヌクレオチド対を、ＢｂｓＩ（１６）で消化したｐＸ３３０にクローニングすることにより、ＣＲＢＮ遺伝子編集ベクターを作製した。（ＣＲＢＮ  Ｔ１フォワード５’−ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＧＣ−３’（配列番号１）、ＣＲＢＮ  Ｔ１リバース５’−ＡＡＡＣＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣ−３’（配列番号２）、ＣＲＢＮ  Ｔ２フォワード５’−ＣＡＣＣＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡ−３’（配列番号３）、ＣＲＢＮ  Ｔ２リバース５’−ＡＡＡＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＴＣ−３’（配列番号４）。１２穴プレートに播種した２９３ＦＴ細胞に１μｇのＣＲＢＮ  ｐＸ３３０編集ベクターをLipofectamine 2000を用いて一過的にトランスフェクトした。
【００９３】
トランスフェクションの３日後、細胞をトリプシン処理し、新鮮な増殖培地に入れ、連続希釈により９６ウェルプレートに播種して単一のクローンを得た。２週間後、イムノブロット分析によるＣＲＢＮの編集を検証するために、単一のクローンを選択して展開した。ＭＭ１Ｓ細胞を標的とするために、ＣＲＢＮ  ｐＸ３３０編集ベクターを、ｐＧＫ−Ｐｕｒカセットを含むレンチウイルスのバックボーンにシャトルした。ＭＭ１Ｓ細胞を、次いでｐｌｅｎｔｉ−ＣＲＢＮ  ＣＲＩＳＰＲ  ｐＧＫ−ｐｕｒに感染させ、０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンで３日間選択した。安定な細胞を限界希釈によって、９６ウェルプレートに播種した。４週間後、単一クローンを拡大し、免疫ブロット分析によりＣＲＢＮ−／−クローンを同定した。
【００９４】
イムノブロッティング
細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、緩衝液Ａ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭβ−グリセロホスフェート、２．５ｍＭナトリウムピロリン酸、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  ＮａＦ、および１ｘプロテアーゼ阻害剤（Roche）］で回収した。全細胞抽出物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜上に移し、示された一次抗体でプローブした。結合抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Pierce）および増強化学発光（ＥＣＬ）ウェスタンブロッティング検出試薬（Pierce）またはイモビロン（Immobilon）化学発光西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（Millipore）で検出した。
【００９５】
抗体
以下の抗体を使用した：ＨＲＰ結合抗ＦＬＡＧ  Ｍ２マウスモノクローナル抗体（Sigma）、ＨＲＰ共役抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（Cell signaling）、ＨＲＰ結合抗Ｍｙｃマウスモノクローナル抗体(Cell Signaling)、ＦＬＡＧ  Ｍ２マウスモノクローナル抗体（Sigma）、ＣＲＢＮウサギポリクローナル抗体（Novus Biologicals）、ＩＫＺＦ１ウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling、イムノブロット用）、ＩＫＺＦ１ウサギポリクローナル抗体（Bethyl、クロマチン免疫沈降用）、ＩＫＺＦ２ウサギポリクローナル抗体（Bethyl）、ＩＫＺＦ３ウサギポリクローナル抗体（Imginex）、ＨＡ．１１マウスモノクローナル抗体（Covance）、Ｖｉｎｃｕｌｉｎマウスモノクローナル抗体（Sigma）、ＤＤＢ１ウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling）、ＩＲＦ４ウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling）、Ｃｕｌ４Ａウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling）、ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（Thermo Scientific）、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体（Thermo Scientific）。
【００９６】
免疫沈降
細胞を緩衝液Ｂ中で溶解した［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０，１ｍＭβ−グリセロリン酸、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  ＮａＦ、および１ｘプロテアーゼ阻害剤（Roche）］。溶解物を遠心分離によって清澄化し、次いで一次抗体と４℃で１２時間混合した。示されているものは、細胞溶解の前に細胞を処理するためにＬＥＮ（２μＭ）（Ｐｒｅ）またはＤＭＳＯを使用し、細胞溶解後に全細胞抽出物に添加したものである（Ｐｏｓｔ）。
【００９７】
免疫複合体をプロテインＧアガロースビーズ（Roche）４℃で１時間捕捉し、次いで緩衝液Ｂで６回洗浄した。抗ＦＬＡＧ免疫沈降のために、細胞抽出物をプロテインＧアガロースビーズで４℃で１時間インキュベートし、次いで抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズとともに４℃で６時間インキュベートし、続いて緩衝液Ｂで６回洗浄した。結合したタンパク質を、ＳＤＳローディング緩衝液中で煮沸することによって溶出させ、イムノブロット分析により検出した。
【００９８】
ポストライシス結合アッセイ（混合実験）
ＦＬＡＧタグ化ＩＫＺＦ１またはＦＬＡＧタグ化ＩＫＺＦ２を発現するレンチウイルスベクターまたは空のレンチウイルスベクターを感染させた２９３ＦＴ  ＣＲＢＮ  Ｔ１１（ＣＲＩＰＳＲ  Ｔ１クローン１）細胞をＤＭＳＯまたはＬＥＮ（２μＭ）で１２時間処理した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、緩衝液Ｂで溶解した。遠心分離後に全細胞抽出物を集め、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズと共に４℃で一晩インキュベートした。次に、ビーズを緩衝液Ｂで４回洗浄した。次に、ＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ２をロードしたビーズを、細胞溶解（Ｐｒｅ）前にＤＭＳＯまたはＬＥＮ（２μＭ）で処理した２９３ＦＴ  ＣＲＢＮ＋／＋細胞から調製した全細胞溶解物と１２時間混合した。
【００９９】
４℃で一晩結合させた後、アガロースを緩衝液Ｂで６回洗浄した。結合したタンパク質をＳＤＳローディングバッファーで煮沸して溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、イムノブロット分析で検出した。ＦＬＡＧタグ化ＩＫＺＦ１の内在性セレブロンとの結合もまた、ＬＥＮ（２μＭ）またはＤＭＳＯポスト細胞溶解（Ｐｏｓｔ）で処理した２９３ＦＴ細胞抽出物を用いてアッセイした。
【０１００】
ＦＬＡＧタグ付きＩＫＺＦ１の外因性セレブロンへの結合をアッセイするために、ＩＫＺＦ１積載抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズを緩衝液Ｂで４回洗浄し、次いで２９３ＦＴ  ＣＲＢＮヌルＴ１１細胞から調製した全細胞抽出物と混合した（ＨＡタグ付きセレブロン（ＣＲＢＮ）またはセレブロン変異（ＹＷＡＡ）で一過的にトランスフェクトし、溶解前にＤＭＳＯまたはＬＥＮ（２μＭ）で１２時間処理する。）。４℃で一晩結合させた後、アガロースを緩衝液Ｂで６回洗浄した。次いで、結合したタンパク質をＳＤＳローディングバッファー中で煮沸して溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、イムノブロット分析により検出した。
【０１０１】
内在性ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３との組換えセレブロンの結合をアッセイするために、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズを用いて２９３ＦＴ  ＣＲＢＮ−／−Ｔ１１細胞に一過的に発現されるＦＬＡＧタグ付きＣＲＢＮまたはＹＷＡＡ変種を免疫沈降させた。セレブロンローディングビーズを緩衝液Ｂで４回洗浄し、次いで細胞溶解後にＬＥＮ（１０μＭ）またはＤＭＳＯで処理したＭＭ１Ｓ  ＣＲＢＮ−／−Ｔ１１細胞抽出物と混合した。４℃で一晩結合させた後、アガロースを緩衝液Ｂで６回洗浄した。次いで、結合したタンパク質をＳＤＳローディングバッファー中で煮沸して溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、イムノブロット分析により検出した。
【０１０２】
インビトロ結合およびユビキチン化アッセイ
２９３ＦＴ  ＣＲＢＮヌルＴ１１細胞を、Ｍｙｃタグ付きセレブロン（ＣＲＢＮ）またはセレブロン変異（ＹＷＡＡ）、ＨＡタグ付きＩＫＺＦ１または空ベクター（ＥＶ）をコードするプラスミドで一過的にトランスフェクトした。４８時間後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、緩衝液Ｂ中で溶解したＬＥＮ（２μＭ）またはＤＭＳＯの存在下で、Ｍｙｃ−ＣＲＢＮまたはＭｙｃ−ＹＷＡＡ細胞抽出物をＨＡ−ＩＫＺＦ１抽出物と混合した。次いで、抗Ｍｙｃ抗体結合アガロースビーズ（Sigma）を混合抽出物に添加し、続いて４℃で１２時間インキュベートした。
【０１０３】
ネガティブコントロールとして、ＣＲＢＮ抽出物と混合するのに用いたＨＡ−ＩＫＺＦ１抽出物の５％を空のベクター細胞からの抽出物と混合し、次いで抗ＨＡ抗体結合ビーズ（Sigma）と共にインキュベートした。次に、ビーズを緩衝液Ｂで４回、１ｘＵＲＢ緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ］で２回洗浄し、次いで、２００ｎｇ組換えＥ１（Boston Biochem）、２５０ｎｇ組換えＵｂｃＨ５ａ（Boston Biochem）、２５０ｎｇ組換えＵｂｃＨ５ｂ（Boston Biochem）、０．４μＭユビキチンアルデヒド（Boston Biochem）、１０μｇＦＬＡＧ  ユビキチン（Boston Biochem）、１×ＥＲＳ（２０ｍＭクレアチンリン酸、０．２μｇ／μｌクレアチンホスホキナーゼ、５ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ）、１×プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Roche）、１０ｎＭ  ＬＬＮＬ（Boston Biochem）、１０ｎＭ  ＭＧ１３２（EMD Bioscience）、０．５ｍＭ  ＡＴＰを含む１×ＵＲＢ緩衝液の２０μＬに再懸濁した。反応を３０℃で１時間行った後、ＳＤＳローディングバッファーで沸騰させて終了させた。ユビキチン化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、イムノブロット分析により検出した。
【０１０４】
インビボユビキチン化アッセイ
ユビキチン化アッセイは、以前に記載されたように実施した（３０）。要約すると、６ウェルプレートに播種した２９３ＦＴ細胞に、図３Ｃに示すように、以下のプラスミド：ｐｃＤＮＡ３−ＩＫＺＦ１−Ｖ２−Ｖ５（１μｇ）、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＣＲＢＮ（１μｇ）、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ＹＷＡＡ（１μｇ）およびｐＣＭＶ−８×Ｈｉｓ−Ｕｂ（０．５μｇ）を一過性にトランスフェクトした。各トランスフェクションのための全プラスミドＤＮＡを空ベクターｐｃＤＮＡ３を用いて４μｇにした。３６時間後、細胞をＬＥＮ（２μＭ）またはＤＭＳＯならびに１０μＭのＭＧ１３２でさらに１２時間処理した。
【０１０５】
次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中でプレートをこすり落とし、次いで遠心分離によって回収した。少量の細胞を緩衝液Ａで溶解し、残りを緩衝液Ｃ（６Ｍグアニジン−ＨＣＬ、０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で溶解した。超音波処理後、全細胞抽出物を２５μＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズと室温で３時間混合した。次に、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを緩衝液Ｃで２回、緩衝液Ｄ（緩衝液Ｃの１容量：緩衝液Ｅの３容量）で２回、緩衝液Ｅ（２５ｍＭＴｒｉｓ  ＣＬ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．８）。次いで、結合したタンパク質を、３００ｍＭイミダゾールを含有する１×ＳＤＳローディングバッファー中で煮沸することによって溶出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、イムノブロット分析によって検出した。
【０１０６】
インビボタンパク質分解アッセイ
１２ウェルプレートに播種した２９３ＦＴ細胞に、指示されたＯＲＦを発現する５０ｎｇのｐｌｅｎｔｉ−ＵＢＣ−ｐＧＫ−ＨＹＧまたはｐｌｅｎｔｉ−ＵＢＣ−ｐＧＫ−Ｐｕｒレンチウイルスベクターおよび９５０ｎｇの対応する空のレンチウイルスベクターを一過的にトランスフェクトした。３６時間後、細胞をＤＭＳＯ、ＬＥＮ（２μＭ）またはＰＯＭ（０．２μＭ）で１２時間処理した。細胞抽出物の緩衝液Ａを用いて採取し、イムノブロット分析に供した。
【０１０７】
タンパク質半減期分析
シクロヘキシミドアッセイのために、細胞をＤＭＳＯまたはＬＥＮ（２μＭ）で１時間前処理し、次いで１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（Sigma）をＤＭＥＭ増殖培地に添加した。その後様々な時点で、細胞抽出物を緩衝液Ａを用いて回収し、イムノブロット分析に供した。
【０１０８】
リアルタイムRT-PCR
全ＲＮＡを、オンカラムＤＮａｓｅ分解によるQiagen RNeasy Mini Kitを用いて抽出した。ランダムプライマーを用いたAffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit（Agilent）を使用して、全ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲは、RT2 SYBR Green/ROX qPCRマスターミックス（Qiagen）およびMx3000P QPCRシステム（Stratagene）を用いて２重で行った。値を平均して発現レベルを計算し、ＲＰＳ１８のレベルに対してノーマライズした。ＰＣＲプライマーは以下の通りである：
【０１０９】
ＲＰＳ１８フォワード５’−ＴＴＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＧＣＣＡＴＧＡＴ−３’（配列番号５）
ＲＰＳ１８リバース５’−ＴＴＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＣＴＴＧ−３’（配列番号６）
ＩＫＺＦ１フォワード５’−ＣＣＣＣＴＧＴＡＡＧＣＧＡＴＡＣＴＣＣＡ−３’（配列番号７）
ＩＫＺＦ１リバース５’−ＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号８）
ＩＫＺＦ３フォワード５’−ＴＣＧＧＡＧＡＴＧＧＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＣＡ−３’（配列番号９）
ＩＫＺＦ３リバース５’−ＡＴＴＣＴＧＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＴ−３’（配列番号１０）
ＩＲＦ４フォワード５’−ＧＣＧＧＴＧＣＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号１１）
ＩＲＦ４リバース５’−ＡＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＧＧＧＴＣＴＧＡＧＡ−３’（配列番号１２）。
【０１１０】
レンチウイルスｓｈＲＮＡベクター
目的のｍＲＮＡを標的とする合成相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングし、以下のようにサブクローニングした：ＣＲＢＮを標的とするオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチド対（ｓｈＣＮＴＬ）をｐＬＫＯ−ｔｅｔ−ｏｎ−ｐｕｒｏ（３１）にライゲーションした。ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３を標的とするオリゴヌクレオチドおよびｓｈＣＮＴＬを、ｐＬＫＯ−ＲＦＰ（Julie Losman博士からの贈呈品）にライゲーションした。ターゲティングシーケンスは次のとおりである：
【０１１１】
ｓｈＣＮＴＬ、５’−ＣＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡ−３’  （配列番号１３）；
ｓｈＣＲＢＮ−１、５’−ＧＣＣＣＡＣＧＡＡＴＡＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴ−３’（配列番号１４）；
ｓｈＣＲＢＮ−２、５’−ＧＣＴＴＧＣＡＡＣＴＴＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡ−３’（配列番号１５）；
ｓｈＩＫＺＦ１−１、５’−ＧＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡＡＴＡＡＡ−３’（配列番号１６）；
ｓｈＩＫＺＦ１−２、５’−ＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＴ−３’（配列番号１７）；
ｓｈＩＫＺＦ１−３、５’−ＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＧＣＴＡＡＡＧ−３’（配列番号１８）；
ｓｈＩＫＺＦ３−１、５’−ＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＡ−３’（配列番号１９）；
ｓｈＩＫＺＦ３−２、５’−ＧＴＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＡＴＴＡ−３’（配列番号２０）；
ｓｈＩＫＺＦ３−３、５’−ＧＡＣＡＧＴＣＴＡＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＡＡ−３’（配列番号２１）。
【０１１２】
ｃＤＮＡ枯渇または富化アッセイ
ＭＭ１Ｓ細胞に、ＩＫＺＦ１−Ｖ１−Ｑ１４６Ｈ、ＩＫＺＦ３−Ｑ１４７Ｈ、ＩＫＺＦ２−Ｖ２またはＩＲＦ４を発現するｐｌｅｎｔｉ−ＣＡＧ−ＦＬＡＧ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ空ベクターまたはｐｌｅｎｔｉ−ＣＡＧ−ＦＬＡＧ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを感染させた。感染の４８時間後、２μＭのＬＥＮまたはＤＭＳＯを培地に添加した。培地は、１日おきにＬＥＮまたはＤＭＳＯを含む新鮮な培地と交換した。示された時点における、ＧＦＰ＋細胞の割合を、フローサイトメトリー分析によって決定した。ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージの倍数変化は、ＬＥＮ処理細胞のパーセンテージをＤＭＳＯ処理細胞のパーセンテージで割ることによって計算した。
【０１１３】
スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）枯渇または富化アッセイ
スモールヘアピンＲＭＭ１ＳまたはＫＭＳ３４細胞を、コントロールｓｈＲＮＡまたはＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３に対するｓｈＲＮＡを発現するｐＬＫＯ−ＲＦＰレンチウイルスベクターで感染させた。２日後、ＲＦＰ＋細胞の割合を、フローサイトメーターを用いてモニタリングした。最初に、各ｓｈＲＮＡについてＲＦＰ＋パーセンテージの変化を２日目に対してノーマライズした。次いで、示したように、ＲＦＰ＋細胞の相対パーセンテージを各時点についてｓｈＲＮＡ対照に対してノーマライズした。
【０１１４】
クロマチン免疫沈降
ＣｈＩＰ研究は、以前に記載されたように、ヒトＩＲＦ４遺伝子座（３２）のための特異的プライマーを用いていくつかの改変を行った。簡単に言えば、４×１０７個のＭＭ１．Ｓ細胞を２μＭのＬＥＮまたはＤＭＳＯで２４時間処理し、増殖培地に１１％ホルムアルデヒド溶液（１１％ホルムアルデヒド、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．３、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．０）の１／１０の体積の添加により１０分間室温で架橋し、続いて０．１２５Ｍグリシンでクエンチし、ＰＢＳで２回洗浄した。５０μｌのＤｙｎａｌタンパク質６磁気ビーズ（Sigma）をＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）でブロックした。
【０１１５】
磁気ビーズを１０μｇの抗ＩＫＺＦ１抗体（Bethyl Labs＃A303-516A）と結合させた。架橋した細胞を溶解緩衝液１（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ−４０、および０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解し、溶解バッファー２（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、および０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．０）で洗浄した。細胞を再懸濁し、４×１０分間、Bioruptorソニケーターを使用して３０秒のオン／オフサイクルをハイパワーに設定して溶解緩衝液３（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．５、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．０、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％Ｎａ−デオキシコレートおよび１％ＳＤＳ）において超音波処理をした。
【０１１６】
超音波処理した溶解物を清澄化し、希釈緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．５、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．０、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％Ｎａ−デオキシコール酸塩）で１：１０に希釈し、抗体と結合した磁気ビーズで４℃で一晩インキュベートした。ビーズを溶解緩衝液３で２回、高塩洗浄液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．５，５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．０，１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．１％Ｎａ−デオキシコール酸塩および０．１％ＳＤＳ）で１回、ＬｉＣｌ洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、０．５％ＮＰ−４０，０．５％Ｎａ−デオキシコレート）で１回、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）で１回洗浄した。プロテアーゼ阻害剤（Roche Complete）をすべての溶解緩衝液および洗浄緩衝液に添加した。結合した複合体を、時々ボルテックスしながら６５℃で１５分間溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１％ＳＤＳ）で２回溶出した。
【０１１７】
架橋を６５℃で一晩かけて戻した。ＲＮａｓｅＡおよびプロテイナーゼＫをそれぞれ用いてＲＮＡおよびタンパク質を消化し、ＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。プロモーター領域内の２つの部位、および転写された領域の3'側の負の制御領域を増幅するようにプライマーを設計した。
【０１１８】
プロモーター部位１（フォワード）５’−ＡＧＴＴＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号２２）および（リバース）５’−ＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＣＧＴＴＧＡＧＣＴＴ−３’（配列番号２３）；プロモーター部位２（フォワード）５’−ＡＣＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＣＧ−３’（配列番号２４）および（リバース）５’−ＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＡＴＡＴ−３’（配列番号２５）；ネガティブコントロール領域１（フォワード）５’−ＣＧＴＧＧＣＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＧＧＧ−３’（配列番号２６）および（リバース）５’−ＡＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴ−３’（配列番号２７）；（フォワード）５’−ＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＡＴＣＴ−３’（配列番号２８）および（リバース）５’−ＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＡＧ−３’（配列番号２９）。各サンプルについて、入力ＤＮＡの免疫沈降ＤＮＡパーセンテージを計算することにより、濃縮データを分析した。
【０１１９】
細胞増殖アッセイ
１．５×１０６個の生存可能な骨髄腫細胞を、ＬＥＮ（２μＭ）またはＤＭＳＯビヒクルコントロールを含むＲＰＭＩ１６４０増殖培地中の１０ｃｍプレートに３重で播種した。２日おきに、穏やかな掻き取りによって細胞を剥がし、連続培養のために各薬剤（ＬＥＮまたはＤＭＳＯ）を含む新鮮なＲＰＭＩ増殖培地で全細胞の半分を再度プレーティングした。２日目、４日目および８日目に、ViaCell細胞生存カウンター（Beckman Coulter）を用いて細胞を計数した。
【０１２０】
結果
５０年前、サリドマイドは、不眠症と悪阻のために使われたが、催奇形性のために後に禁止された。サリドマイドに関連する薬剤であるレナリドマイドとポマリドマイド（ＩＭｉＤ）は、特に多発性骨髄腫や他のＢ細胞悪性腫瘍（１−３）の免疫調節剤や抗腫瘍剤として関心を集めている。それにもかかわらず、それらの催奇性および治療活性の根底にある生化学的メカニズム、およびそれらが関連しているかどうかは不明である。
【０１２１】
これに関して、サリドマイドは、最近、カリン依存性ユビキチンリガーゼの基質認識成分であるセレブロンに結合し、その自己ユビキチン化活性を阻害することが示された（４）。ゼブラフィッシュのセレブロンモリフォルノまたはサリドマイドによる処理はヒレの欠損を引き起こし（４）、これはＩＭｉＤがセレブロン化することによって作用することを示唆した。しかしながら、ＩＭｉＤ耐性とされた骨髄腫細胞はしばしばセレブロンを下方制御している（５−８）。逆に、骨髄腫細胞における高いセレブロン濃度は、ＩＭｉＤに対する応答性の増加と関連している（９、１０）。まとめると、これらの所見は、ＩＭｉＤが、単にセレブロンアンタゴニストではなく、代わりにセレブロンの基質特異性を変化させて骨髄腫において重要なタンパク質を含むことを示唆している。
【０１２２】
このようなタンパク質を探すために、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）に融合された１５，４８３個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするプラスミドライブラリーを、かかる融合物の安定性が、対応する非融合ＯＲＦのユビキチンリガーゼ（単数または複数）によって通常影響されること（１１−１３）を知りながら作成した。ウミシイタケシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）レポーターをノーマライズの目的のために各ＯＲＦ−ルシフェラーゼｃＤＮＡに挿入し、両方のレポーターを内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）対照（図１Ａ）の下に置いた。
【０１２３】
パイロット実験において、マルチウェルプレートで増殖させた２９３ＦＴ胚性腎臓細胞をＯＲＦ−ルシフェラーゼライブラリー（１ウェル当たり１つのＯＲＦ）でトランスフェクトし、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２、ヒドロキシラーゼ阻害剤ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）またはビヒクルで処理した。３６〜４８時間後に測定されたＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ値は、広範囲の含有プラスミド濃度にわたって安定していた（図５）。予期されるように、ＭＧ１３２は、多くのプロテアソーム基質およびＤＭＯＧ安定化ＨＩＦ１αを安定化したが、これはプロリルヒドロキシル化時に急速に分解された（図６）。
【０１２４】
次に、このアプローチを用いて、レナリドマイドで処理した２９３ＦＴ細胞におけるタンパク質安定性の変化を同定した（図１Ａ）。全部で２１１３個のＯＲＦ−ルシフェラーゼ融合物が、検出不能または非常に可変性（＞５０％ＳＤ）のルシフェラーゼシグナルを生成し、分析のために１３，３７０を残した。予想通り、ほとんどのＯＲＦはレナリドマイドの影響を受けなかった（図１Ｂ）。平均から３ＳＤ以上の１０７のＯＲＦ（４６のＯＲＦ＋レナリドマイド処理後のＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ比の減少または増加を示す６１のＯＲＦ）を、二次アッセイで再試験した。１つの下方制御されたＯＲＦ（ＩＫＺＦ３）および１つの上方制御されたＯＲＦ（Ｃ１１またはＦ６５）が、陽性で再試験した。
【０１２５】
Ｃ１１またはｆ６５は、Ｆｌｕｃの代わりにヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグに融合した場合、レナリドマイドの影響を受けなかったので、これ以上研究されなかった。対照的に、１次スクリーニングの３−ＳＤカットオフのすぐ外側に落ちたレナリドマイドのＩＫＺＦ３およびそのパラログＩＫＺＦ１は、ＦｌｕｃまたはＨＡのいずれかに融合した（図１Ｂおよび１Ｃ）。レナリドマイドは、外因性ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ４、ＩＫＺＦ５、またはＢ細胞転写因子ＩＲＦ４に影響を与えなかったので、これらの効果は特異的であった（図１Ｃ）。
【０１２６】
同様の結果が、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ２（図１Ｃ）およびポマリドマイド（図７）の２つの共通のスプライス変異体（Ｖ１およびＶ２）で得られた。外因性ＩＫＺＦ１の下方制御は、ＭＧ１３２およびカリン依存性ユビキチンリガーゼを阻害するＭＬＮ４９２４によってブロックされた（図１Ｄ）（１４，１５）。これらの発見と一致して、レナリドマイドは、ＭＧ１３２またはＭＬＮ４９２４で前処理しない限り、ＭＭ１ＳおよびＬ３６３骨髄腫細胞（図１Ｅ）においてＩＫＺＦ３を発現しないＵ９３７白血病細胞およびＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の内在性ＩＫＺＦ１を下方制御した（図１Ｅ）。複数のＩＫＺＦ１バンドが、おそらく選択的スプライシングのために、イムノブロット分析によって検出された。レナリドマイドは、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３  ｍＲＮＡレベルを変化させず、転写後に作用することと一致していた（図８）。
【０１２７】
ドキシサイクリン誘導性の短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を有する２９３ＦＴ細胞におけるセレブロンの下方制御は、レナリドマイドによる外因性ＨＡタグ化ＩＫＺＦ１の不安定化を防止した（図２Ａ）。同様に、セレブロンｓｈＲＮＡは、Ｕ９３７白血病細胞（Ｕ９３７）および骨髄腫細胞（Ｌ３６３およびＫＭＳ３４）におけるレナリドマイドによる内因性ＩＫＺＦ１の下方制御をブロックした。Ｆｌｕｃに融合されたＩＫＺＦ１（図２Ｂ、最上部パネル）またはＨＡ（図２Ｂ、下のパネル）を産生するためにトランスフェクトされたＣＲＢＮ−／−２９３ＦＴ細胞を産生するために、定期的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）に基づく遺伝子編集（１６、１７）を用いた。外因性ＩＫＺＦ１は、ＣＲＢＮ−／−２９３ＦＴ細胞では下方制御されなかった（図２Ｂ）。
【０１２８】
この欠損は、野生型セレブロンによってレスキューされたが、レナリドマイド抵抗性セレブロン変異（ＹＷＡＡ）（４）ではレスキューされなかった（図２Ｂ）。同様の結果が、第２のＣＲＢＮ−／−２９３ＦＴサブクローンで得られたが、検出可能な量のセレブロンを有するサブクローンでは得られなかった。さらに、内因性ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３は、ＣＲＩＳＰＲで作製した２つの独立したＣＲＢＮ−／−ＭＭ１Ｓ骨髄腫細胞株においてレナリドマイドによって分解されなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。
【０１２９】
レナリドマイドは、ＭＧ１３２で処理した２９３ＦＴ細胞を用いた同時トランスフェクション実験において、ＩＺＫＦ１およびＩＫＺＦ３（ＩＫＺＦ２およびＩＫＺＦ５ではなく）の結合をセレブロンユビキチンリガーゼに増強した。次に、ＦＬＡＧ標識ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ２を、レナリドマイドで処理または処理しなかったＣＲＢＮ−／−細胞から免疫沈降させた。次いで、固定化免疫沈降物を用いて、野生型セレブロンまたはＹＷＡＡ変異体を産生するようにトランスフェクトされたＣＲＢＮ−／−細胞からのＣＲＢＮ＋／＋細胞（図３Ａ）または外因性セレブロンから内因性セレブロンを捕捉した（図３Ｂ）。
【０１３０】
両方の場合において、セレブロンを産生する細胞は、溶解前にレナリドマイドで処理されたか、または処理されなかった。野生型セレブロンは、レナリドマイドに曝露されていればＩＫＺＦ１に特異的に結合し、ＩＫＺＦ１ではなくセレブロンに直接結合するレナリドマイドと一致していれば、ＹＷＡＡ変異体ではなく、ＩＫＺＦ１に特異的に結合した（図３Ａおよび３Ｂ）。レナリドマイドはまた、セレブロンの外因性ＩＫＺＦ１への結合および内因性ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３への結合を、細胞抽出物を用いて行われた結合アッセイに直接添加すると促進した。さらに、野生型セレブロンは、ＹＷＡＡ変異体ではなく、レナリドマイドに曝露した後のインビボ（図３Ｃ）およびインビトロ（図３Ｄ）におけるＩＫＺＦ１のユビキチン化を促進した。
【０１３１】
一連のＩＫＺＦ１／２キメラを解析し、ＩＫＺＦ１（Ｖ２）の残基１０８〜１９７に対応するＩＫＺＦ１の領域がセレブロンへのレナリドマイド依存性の結合を媒介することを確認した。この領域内には、ＩＫＺＦ１とＩＫＺＦ２との間にわずか７つのアミノ酸の違いがある。ＩＫＺＦ１残基Ｑ１４６（またはＩＫＺＦ３  Ｑ１４７）をＩＫＺＦ２（ヒスチジン）中の対応する残基に変化させると、セレブロン結合およびレナリドマイド誘導分解が無効になった。逆に、ＩＫＺＦ２の相反する変化は、レナリドマイドを部分的に感受性にした。
【０１３２】
次に、６つの骨髄腫細胞株をインビトロでのレナリドマイドに対する感受性について試験した（図４Ａおよび４Ｂ）。これまでの研究では、レナリドマイドが少なくとも間接的にＩＲＦ４を下方制御し、これを抗骨髄腫活性（５−８）に関連付けることが示された。ＭＭ１Ｓ、ＫＭＳ３４およびＬ３６３細胞はインビトロでレナリドマイドに対して感受性であったが、ＫＭＳ１１、ＲＰＭＩ８２２６およびＯＣＩｍｙ５細胞は比較的抵抗性であった（図４Ｂ）。３つの感受性系統において、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３はレナリドマイドによって下方制御されていた（図４Ａ）。これらの系統の２つ（ＭＭ１ＳおよびＫＭＳ３４）では、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の喪失の後に、これらの細胞におけるＩＫＺＦ１および／またはＩＫＺＦ３の下流で働くＩＲＦ４と一致するＩＲＦ４の減少が見られた（図４Ａ）。
【０１３３】
レナリドマイドで処置したＭＭ１Ｓ細胞において、ＩＲＦ４  ｍＲＮＡの減少およびＩＫＺＦ１の結合の減少が、ＩＲＦ４遺伝子座へのクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって確認された。第３の感受性細胞株Ｌ３６３は、レナリドマイドによって影響を受けなかったＩＲＦ４の高い基礎量を発現し、この薬物の抗増殖効果がＩＲＦ４以外の少なくとも１つの標的を含むという証拠を提供した（図４Ａ）。
【０１３４】
耐性株の２つは、感受性株と比較してＩＫＺＦ１（ＯＣＩｍｙ５）またはＩＫＺＦ３（ＫＭＳ１１）および対応する少量のセレブロンの比較的高い基礎量を有し、レナリドマイドによるＩＫＺＦ１（ＯＣＩｍｙ５）およびＩＫＺＦ３の下方制御は、３番目に減弱した（ＲＰＭＩ８２２６）（図４Ａ）。ＩＲＦ４は、３つの耐性株においてレナリドマイドによって下方制御されなかった。
【０１３５】
次に、ＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３が、ｓｈＲＮＡで抑制された細胞またはＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３のレナリドマイド耐性の発現により増強された細胞で競合実験を行った。レナリドマイド感受性細胞株ＭＭ１ＳおよびＫＭＳ３４におけるＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３の下方制御は、対照ｓｈＲＮＡを発現する細胞と比較して細胞適合性を著しく低下させ、ＩＲＦ４の下方制御に関連した（図４Ｃおよび４Ｄ）。注目すべきことに、いずれかのＩＫＺＦタンパク質の下方制御により、他のタンパク質の損失が引き起こされた。逆に、ＩＫＺＦ１（Ｑ１４６Ｈ）またはＩＫＺＦ３（Ｑ１４７Ｈ）の安定化バージョンの発現は、ＭＭ１Ｓ細胞（図４Ｅおよび４Ｆ）およびＫＭＳ３４細胞に対するレナリドマイド耐性を付与した。
【０１３６】
当然、レナリドマイド耐性であるＴ細胞特異的ＩｋａｒｏｓファミリーメンバーＩＫＺＦ２（図１Ｃ）の異所性発現も同様の効果を示した。ＩＲＦ４自体の発現の効果ははるかに少なく、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３がレナリドマイドの抗骨髄腫活性に関連するさらなる標的を有することを再び示唆している（図４Ｅ）。ＩＫＺＦファミリーメンバーによって付与されたレナリドマイド耐性が、主として、それらの標的遺伝子の転写活性化または非標準機能によるものであるかどうかはまだ分かっていない。
【０１３７】
この発見は、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の下方制御に対するレナリドマイドの抗骨髄腫活性、Ｂ細胞発生に重要な役割を果たし、骨髄腫を含むＢ細胞悪性腫瘍（１８−２１）において高度に発現する２つの転写因子にリンクしている。細胞系統を特定する転写因子に中毒になるがんの多くの他の例がある（２２、２３）。ＩＫＺＦ１はいくつかの他のＢ細胞悪性腫瘍における腫瘍抑制因子であるが（２４）、異なる状況において腫瘍抑制因子またはがん遺伝子のいずれかとして作用する同じ遺伝子が優先される。
【０１３８】
Ｉｋａｒｏｓファミリーのメンバーは、異なる設定で転写活性化因子または抑制因子として機能することができる。例えば、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３は、Ｔ細胞におけるインターロイキン２（ＩＬ−２）発現を抑制し、ＩＭｉＤがインビボでどのようにＩＬ−２産生を誘導するかを説明する（１９、２５、２６）。
【０１３９】
プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブは、関連するプロテアソーム基質について議論されているが、単独でおよびレナリドマイドと組み合わせて、抗骨髄腫活性を有する（２７、２８）。これは、プロテアソームの封鎖がレナリドマイドによる、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の破壊を防止するため、パラドックスを作り出す。ボルテゾミブによるプロテアソームの封鎖は、治療的投与では不完全であるが、しかしながら、それは、ボルテゾミブの他の有益な効果を保持しつつ、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の十分なクリアランスを可能にする。これらの２つのタンパク質は、いったんポリユビキチン化されると、不活性またはドミナントネガティブとなる可能性がある。
【０１４０】
以前の研究は、サリドマイドの催奇形作用は脳梗塞の不活性化を反映していたが、これらの知見はＩＭｉＤの治療効果がセレブロンの機能獲得を反映していることを示している。注目すべきことに、セレブロンは、融合ライブラリーには存在せず、ルシフェラーゼ融合として認識され得ないか、または２９３ＦＴ細胞に存在しないアクセサリータンパク質またはシグナルを必要とするさらなる基質を有し得る。いずれにせよ、この知見は、ＩＭｉＤの治療的および催奇形性の活動を分離するための道筋を作り出している。レナリドマイドがセレブロンにおよぼす影響がハイパーモルフィック（hypermorphic）であるかまたネオモルフィック（neomorfic）であるかはまだ明らかではない。
【０１４１】
後者の優先順位は、ＦＫＢＰ１２をＴＯＲＣ１キナーゼ阻害剤に変換するラパマイシン、および、シクロフィリンをカルシニューリンアンタゴニストに変換するシクロスポリン（２９）によってもたらされる。現在、レナリドマイドのように、ユビキチンリガーゼを再利用する薬剤によって、ｃ−Ｍｙｃまたはβ−カテニンのような不可抗力であると考えられるがんタンパク質が破壊される可能性がある。
【０１４２】
【表２−１】
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【０１４３】
【表２−２】
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【０１４４】
【表２−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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