(57)【要約】  本発明は、治療的に有効な切断されたサバイビンおよびリポソーム製剤中のワクチンとしてのその治療的使用に関し、ここで該サバイビン断片は、好ましくはグルコノイル化され、該リポソーム製剤は、インビボ抗腫瘍活性を誘発する。より詳細には、本発明は、脂質アジュバントと共に特異的に有効であるヒトサバイビンの断片を含む癌ワクチンに関する。より詳細には、本発明は、腫瘍抗原としての活性な切断されたサバイビン分子、およびリポソーム製剤の一部である、アジュバントとして作用するキラルカチオン性脂質、例えばR-DOTAPを含む、リポソームワクチン送達系に関し、ここで該リポソーム薬物送達系は、その脂質およびアジュバント成分、物理的または物理化学的パラメーター、ならびに放出される切断されたサバイビン分子の最終的な治療有効性に関し最適化される。最終的に、本発明は、前記の切断され、好ましくはグルコノイル化されたサバイビンを含むリポソーム製剤を提供することにより、インビボのCD4+CD8+ T細胞応答を増加させ、増加した抗腫瘍活性を生じる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1で表される全長ヒトサバイビン(survivin)の最初の118〜133のN末端アミノ酸、またはC末端で切断されたサバイビンに対して＞90%の相同性を有する配列からなるC末端で切断されたサバイビンであって、該切断されたサバイビンが、1つ以上の位置でグルコノイル化(gluconoylated)される、C末端で切断されたサバイビン。
【請求項２】
存在するリジン残基の少なくとも1つがグルコノイル化される、請求項１記載のC末端で切断されたサバイビン。
【請求項３】
全長ヒトサバイビン(surviving)の最初の120のN末端アミノ酸からなる、C末端で切断されたサバイビンであって、該切断されたサバイビンが、アミノ酸配列(配列番号:2):
【化１】
2017501172.tif 000008
で表される、請求項１または２記載のC末端で切断されたサバイビン。
【請求項４】
N末端の1位のメチオニン残基が除去される、請求項１または２記載のC末端で切断されたサバイビン。
【請求項５】
全長ヒトサバイビン(surviving)の最初の120のN末端アミノ酸からなる、C末端で切断されたサバイビンであって、該切断されたサバイビンが、アミノ酸配列(配列番号：3)：
【化２】
2017501172.tif 000009
で表される、請求項４記載のC末端で切断されたサバイビン。
【請求項６】
1位のグリシン残基がグルコノイル化される、請求項４記載のC末端で切断されたサバイビン。
【請求項７】
1位のグリシン残基ならびに22位および/または102位のリジン残基がグルコノイル化される、請求項６記載の切断されたサバイビン。
【請求項８】
グルコノイル化が、グルコノ-1,5-ラクトンにより合成的に達成される、請求項１〜７いずれか記載の切断されたサバイビン。
【請求項９】
グリコシル化されない、請求項１〜８いずれか記載の切断されたサバイビン。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか記載の切断されたサバイビン、およびそれぞれ切断され、グルコノイル化されないサバイビンを含むサバイビン組成物であって、前記組成物中、切断されたサバイビン分子の10〜80%がグルコノイル化される、サバイビン組成物。
【請求項１１】
切断されたサバイビン分子の35〜45%がグルコノイル化される、請求項１０記載のサバイビン組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９いずれか記載の切断されたサバイビン、または請求項１０または１１記載のサバイビン組成物、および少なくとも1つのアジュバントを含むリポソーム製剤であって、該少なくとも1つのアジュバントが、免疫調節剤として作用するキラルカチオン性リン脂質である、リポソーム製剤。
【請求項１３】
該キラルカチオン性リン脂質がDOTAPである、請求項１２記載のリポソーム製剤。
【請求項１４】
該リポソーム製剤中のDOTAPの濃度が2〜8mMである、請求項１３記載のリポソーム製剤。
【請求項１５】
該キラルカチオン性脂質がR-DOTAPである、請求項１３または１４記載のリポソーム製剤。
【請求項１６】
コレステロール、ならびにホスファチジルコリン(PC)、ホスホエタノールアミン(PE)およびホスホグリセロール(PG)からなる群より選択される少なくとも1つのリン脂質を含む、請求項１２〜１５いずれか記載のリポソーム製剤。
【請求項１７】
該リン脂質が、DLPC、DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、EPCおよびEPC3からなる群より選択されるホスファチジルコリン(PC)である、請求項１６記載のリポソーム製剤。
【請求項１８】
該ホスファチジルコリンが、卵ホスファチジルコリン(egg phosphatidylcholine)(EPC)である、請求項１７記載のリポソーム製剤。
【請求項１９】
該キラルカチオン性リン脂質アジュバントが、R-DOTAPであり、脂質製剤中のその含有量が、15〜30%(mol/mol)で変化する、請求項１２〜１８いずれか記載のリポソーム製剤。
【請求項２０】
25〜55%(mol/mol)の含有量のコレステロールを含む、請求項１２〜１９いずれか記載のリポソーム製剤。
【請求項２１】
30〜80%(mol/mol)の含有量のホスファチジルコリン(PC)を含む、請求項１２〜２０いずれか記載のリポソーム製剤。
【請求項２２】
該製剤のリポソーム粒子が、≧17mVの粒子表面電荷を有する、請求項１２〜２１いずれか記載のリポソーム製剤。
【請求項２３】
抗原荷重(antigen payload)が0.5〜1.5mg/mLである、請求項１２〜２２いずれか記載のリポソーム製剤。
【請求項２４】
該製剤のリポソーム粒子の少なくとも70%が、50〜500nmの粒子径を有する、請求項１２〜２３いずれか記載のリポソーム製剤。
【請求項２５】
(i) 請求項１０記載のサバイビン組成物、
(ii) 脂質成分R-DOTAP、コレステロールおよびEPC、
(iii) 該製剤中3〜5mMの濃度のR-DOTAP、
(iv) 脂質粒子、ここで該粒子の少なくとも70%の粒子径が、50〜250nmである、ならびに
(v) 0.5mg/mL(±0.1mg/mL)の抗原荷重
を含む、請求項１２〜２４いずれか記載のリポソーム製剤。
【請求項２６】
(i) 該切断されたサバイビンが、配列番号：3で表され、かつグリコシル化されず、該切断されたサバイビンの40%(±5%)が、グルコノイル化され、
(ii) 該脂質組成物の含有量が：
10〜30% R-DOTAP、
25〜55%コレステロール、および
30〜60% EPC(mol/mol)
である、請求項２５記載のリポソーム製剤。
【請求項２７】
請求項１２〜２６いずれか記載のリポソーム製剤を含み、任意にさらなる薬学的に許容され得る担体、賦形剤、添加剤または希釈剤を含む、免疫刺激性ワクチン。
【請求項２８】
予防接種によるヒト個体の予防または治療における使用のための免疫刺激性ワクチンであって、該個体が、癌もしくは癌関連疾患に苦しむか、または癌もしくは癌関連疾患の素因を有し、該癌またはは癌関連疾患が、サバイビン特異的腫瘍細胞の存在に基づくものである、請求項２７記載の免疫刺激性ワクチン。
【請求項２９】
予防接種により、ヒト個体においてサバイビン特異的免疫応答が誘発される、ヒト個体の治療のための、請求項２８記載の使用のための免疫刺激性ワクチン。
【請求項３０】
CD4+および/またはCD8+ T細胞応答が誘発される、請求項２９記載の使用のための免疫刺激性ワクチン。
【請求項３１】
該ワクチンを用いた予防接種により腫瘍増殖が阻害または予防される、請求項２８〜３０いずれか記載の使用のための免疫刺激性ワクチン。
【請求項３２】
請求項１２〜２６いずれか記載のリポソーム製剤、または請求項２７記載の免疫刺激性ワクチン、ならびにシクロホスファミド、カルボプラチン、パクリタキセルおよびNHS-IL12からなる群より選択される抗腫瘍剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療的に有効な切断されたサバイビン(survivin)およびリポソーム製剤中のワクチンとしてのその治療的使用に関し、ここでサバイビン断片は好ましくはグルコノイル化(gluconoylated)され、前記リポソーム製剤は、インビボ抗腫瘍活性を誘発する。より詳細には、本発明は、特異的に有効なヒトサバイビンの断片を脂質アジュバントと共に含む癌ワクチンに関する。より詳細に、本発明は、腫瘍抗原としての切断されたサバイビン分子、およびリポソーム製剤の一部である、アジュバントとして作用するキラルカチオン性脂質、例えばR-DOTAPを含むリポソームワクチン送達系に関し、ここでリポソーム薬物送達系は、その脂質およびアジュバント成分、物理的または物理化学的パラメーター、ならびに放出される切断されたサバイビン分子の最終的な治療有効性に関して最適化される。最終的に、本発明は、前記の切断され、好ましくはグルコノイル化されたサバイビンを含むリポソーム製剤を提供することにより、インビボでCD4+/CD8+ T細胞応答を増加させ、増加したインビボ抗腫瘍活性を生じる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の技術的背景
アポトーシスは細胞の自殺の遺伝子的なプログラムであり、アポトーシスの阻害は、形質転換性変異の蓄積を好んで保持する(favor)細胞の寿命を延長することによる、癌形成に関連する重要な機構であることが示唆されている。
【０００３】
細胞のアポトーシスを阻害し、アポトーシスタンパク質の阻害剤(IPA)のファミリーに属するタンパク質サバイビンは、1997年にAltieriおよび共同発明者により発見および特徴付けがなされた(例えば、WO 98/22589; Ambrosini et al., Nature Medicine. 917-921, 1997; Adida et al., American Journal of Pathology, 152, 43-49, 1998; Cirino et al., J Clinical Investigations, 99, 2446-2451, 1997; Adida et al., The Lancet, 351, 882-883, 1998、参照)。
【０００４】
サバイビンは、単一のBIR、およびRINGフィンガーの代わりに高度に荷電したカルボキシ末端コイル領域を含む16.5kDaの細胞質タンパク質であり、B細胞前駆体に移動される際に、成長因子(IL-3)の回収(withdrawal)により誘導されるアポトーシスを阻害する。サバイビンは、広い範囲の固形腫瘍および血液学的悪性疾患において過剰発現されるが、最終的に分化した成体組織においては限定された発現を示す。全ての癌において過剰発現されるが隣接する正常組織では過剰発現しないヒトトランスクリプトームにおいて約40個の遺伝子が同定された。これらの40個の遺伝子のうち、サバイビン遺伝子(BIRC5)は、ヒトの癌において共通して4番目に多く過剰発現される腫瘍関連抗原として同定された(Velculescu et al., Nat Genet 23(4): 387-8, 1999)。
【０００５】
サバイビンは、Birc5遺伝子(アポトーシス遺伝子ファミリーの阻害剤の構成メンバー)によりコードされる142アミノ酸(aa)タンパク質である。ヒトサバイビンのアミノ酸配列を、配列番号：1
【化１】
2017501172.tif 000002
により示す。
【０００６】
ほとんどのヒトの癌におけるサバイビンの過剰発現は、腫瘍進行におけるアポトーシス阻害の一般的な役割、結腸直腸癌および膀胱癌、ならびに神経芽細胞腫の場合、サバイビンの発現が好ましくない予後に関連したという観察により実証される概念を示唆する。対照的に、サバイビンは、正常成体組織では検出できない。これらの特徴は、診断目的および治療目的の両方についての適切なTAAとしてサバイビンを性格付ける。
【０００７】
サバイビンは、結腸直腸癌(67%)、非小細胞肺癌(96%)、乳癌(90%)、前立腺癌(83%)、腎細胞癌(79%)、卵巣癌(87%)、膀胱癌(88%)、子宮内膜癌(83%)などを含むほとんどのヒトの癌において高度に過剰発現される。サバイビンの発現の増加は、上述の全てのこれらの腫瘍における乏しい臨床結果と相関する。
【０００８】
癌におけるサバイビンタンパク質の発現は、乏しい予後、診断時の進行した疾患、高い悪性度分類、治療への耐性、および再発の高い割合と関連する。サバイビンは、細胞分裂とアポトーシスの間のバランスの決定において複数の機能を有する。第1に、サバイビンは、細胞周期依存性の様式(G2-Mチェックポイント)で発現し、細胞周期の進行を促進するために有糸分裂紡錘体装置と相互作用することが示される。第2に、サバイビンは、カスパーゼ-9のプロセッシングおよび下流のエフェクターカスパーゼ(例えばカスパーゼ-3)の活性化を妨害して、ミトコンドリアアポトーシス経路の阻害をもたらすことによりアポトーシスを阻害する。第3に、細胞ストレス応答の際に、サバイビンは分子シャペロン熱ショックタンパク質90と相互作用して細胞生存を促進する。癌におけるサバイビンの過剰発現の程度、ならびに癌細胞の生存および継続的な増殖を促進する細胞内のサバイビンの役割は、サバイビンを免疫療法の魅力的な標的にする。さらに、サバイビンの発現は、治療的予防接種のさらなる標的を提示する、腫瘍微小環境内の増殖している内皮細胞中で同定されている。
【０００９】
癌の治療における予防接種の使用の概念の利益は、免疫系が癌の生物学的な挙動および発達にける主要な役者であるという役割の理解が増加することに伴い増大している。癌ワクチン開発への経路は、標的抗原(1つまたは複数)の選択、製剤化、および免疫の計画から、その効果の評価へと進行する。一般的に高いレベルの保護抗体を生じることを目指す予防ワクチンとは対照的に、治療ワクチンは、腫瘍細胞の破壊または少なくとも腫瘍細胞成長の停止を媒介し得る潜在的なT細胞応答の誘発を目指す。治療ワクチン開発経路に下される第1の主要な決定は、使用される抗原の種類に関する。数百のT細胞限定(T cell defined)腫瘍抗原がこれまでに同定されている。第2の決定は、抗原を免疫系に送達するためのビヒクルの選択に関する。ネイキッドDNA、mRNA、組み換えタンパク質、合成ペプチド、組み換えウイルスもしくは細菌のベクター、またはエクソビボで抗原を負荷された樹状細胞を含む比較的多様な可能性が存在する。現在の発明は、一般的にタンパク質系治療的癌ワクチン、詳細にはサバイビン指向性癌ワクチンに関連する。
【００１０】
多くの治療タンパク質またはペプチド系癌ワクチンの戦略は、適応免疫系の主要組織適合性複合体(MHC)クラスI機構へと腫瘍抗原を優先的に送達し、続いて抗原特異的様式で腫瘍細胞を認識および溶解する能力を有する抗原特異的CD8+ T細胞の誘導を生じることである。これは、CD4+ヘルパーT細胞からの不十分なサイトカインを誘発するという潜在的な制限を有するMHCクラスIペプチドに対する抗原のレパートリーを限定することによりペプチド系ワクチンにおいて達成される。最近10年間で、サバイビン由来のかなりの数のMHCクラスI/IIペプチドが発見された(例えば、US 6,245,523; EP 2 092 938; およびEP 2 359 841参照)。これらの所見は、サバイビンが、細胞によりTRA機能を有するペプチドにプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体TRAPとして作用することを強く示唆する。しかしながら、それぞれのサバイビン由来9〜15マーのペプチドは、通常、全長サバイビンと比較して、免疫原性がより低い。
【００１１】
治療的癌ワクチンにおいて全長腫瘍抗原を免疫系に提示することの利点の1つは、予防接種された宿主において体液性ならびにCD4+およびCD8+ T細胞の強壮な応答を誘導する能力である(Davis et al., PNAS 101(29): 10697-702, 2004)。CD4+およびCD8+ T細胞エピトープの両方を標的化することの治療的な利点は、脳神経膠腫の前臨床モデルにおけるサバイビンペプチド系DCワクチンを使用して以前に報告されている(Ciesielski et al., Cancer Immunol Immunother 57 (12): 1827-35, 2008)。
【００１２】
ペプチドおよび組み換えタンパク質はしばしば、それ自身では乏しい免疫原性であり、そのためそれらをアジュバントとともに投与する必要がある。アジュバントの役割は少なくとも二通りある(two-fold)。一方では、アジュバントは、T細胞応答の有効な誘導を可能にするのに十分な長時間、抗原を免疫系に送達する。もう一方では、アジュバントは、樹状細胞の活性化および成熟を誘発する。結果的に、抗原とともに負荷されたDCは、近位リンパ節に移動し、デノボでのT細胞応答を開始するために抗原を最適に提示する能力を獲得する。前者のアジュバントの機能は、エマルジョン形成のための鉱物油(不完全フロイントアジュバント)、リポソームまたは生分解性マイクロスフィアなどの薬剤により満足される。現在、比較的少数のアジュバントがヒト用途のために利用可能である。これらには、ミョウバンおよびMF59が含まれる。しかしながら、分子的に規定された増加する数のアジュバントは、臨床開発段階にあり、癌予防接種の臨床試験に使用される。これらには、種々の合成または組み換えTLRリガンド、モンタニド(montanide)などの鉱物油、サポニンおよびさらにリポソームが含まれる。
【００１３】
癌予防接種に使用され、カチオン性脂質およびワクチンアジュバントR,S DOTAP(1,2-ジオレイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン)で構成されるリポソームナノ粒子は、DNA、ペプチドおよびタンパク質のための有効な送達系として確立されている。脂質成分およびアジュバントの両方として適用される他のカチオン性脂質は、DSTAP、DMTAP、DODAP、DDAB、R,S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、R,S DOEPC、R-DOEPCおよびS-DOEPCである。リポソーム製剤におけるDOTAPの使用は、ナノ粒子とAPCの間の相互作用を容易にすることが報告される(Foged et al., Int J Pharm 298(2): 315-22, 2005)正味の表面正電荷を付与する。さらに、DOTAPは、樹状細胞成熟を促進し、それにより反応性酸素種(ROS)媒介性の機構を介した抗原の交差提示を高める(Yan et al., J Control Release 130(1): 22-8. 2008参照)。
【００１４】
最近、R-DOTAPおよびS-DOTAPなどのそれらの別々のエナンチオマー形態において使用される、脂質成分およびアジュバントとしてキラルカチオン性脂質を含むリポソーム製剤は、抗原の免疫応答の増加、ならびに免疫応答の誘導、活性化および直接調節においてもきわめて有効であることが示された(例えばWO 2009/129227およびWO 2013/039989参照)。
【００１５】
リポソームは十分に認識された薬物送達ビヒクルである。それらは微細な、ナノ粒子サイズの、細胞膜を形成するリン脂質区分と好ましくは同一であるリン脂質で構成される二重層膜により外部媒体から分離された内部の水性空間を封入する閉じた小胞である。リポソームの構造は、細胞の基本構造と非常に類似している。リポソームはまた、比較的に生体適合性である。リポソームは、薬物を体内の所望の標的に送達し、全身性の毒性を低減する能力を示す。したがって、向上された製剤およびより良い標的化戦略により、より良い治療の方法をもたらすという増大している利益がある。リポソームは、サイズ、形態、組成、調製方法および機能に基づいて大きく分類され得る。簡潔に、リポソームは、サイズの観点から、小単層小胞(Small Unilamellar Vesicle)(SUV)および大単層小胞(Large Unilamellar Vesicle)(LUV)の2つの一般的な種類で存在する。SUVは、典型的に20nm〜100nmの範囲のサイズを有する。100nm〜200nmの範囲のサイズを有する中間単層小胞(Intermediate Unilamellar Vesicle)(IUV)は、SUVの内にあると考えられる。SUVは、好ましくは高強度超音波処理の結果として作製される単一の外被を有する(single-shelled)小胞である。内部の水性コア内に親水性の薬物が封入され、二重層膜内に疎水性の薬物が封入される。
【００１６】
上述のように、リポソーム製剤は、薬物送達ビヒクルとして複数の利点を示している。しかしながら、リポソーム製剤は、低い封入負荷のために、非常に強力な薬物を保有するように使用されなければならない。脂質系の小胞は、血流中での不安定性、脂質/界面活性剤溶液中の多くの薬物の乏しい溶解性、乏しい貯蔵安定性および薬物の迅速なバースト放出(burst release)などのいくつかの他の難点を有する。リポソーム製剤はまた、皮膚組織中でのそれらの蓄積のために重度の副作用と関連する。したがって、2012年現在、リポソーム送達系を用いたわずかに12の薬物しか承認されておらず、さらに5つのリポソーム薬物が臨床試験中であった。
【００１７】
そのため、高度に有効なアジュバントの存在により増大されるインビボでの所望の高められた免疫応答を開始させる必要のある選択した抗原を放出する、高度に有効でかつ安定なリポソーム抗原送達系を提供することが現在強く必要とされている。
【００１８】
サバイビンは、以下：
- 最終的に分化した正常組織における低い発現、
- 種々の癌の種類において高度に発現する、
- 進行した病期、悪性度分類および治療への耐性に関連する発現、
- アポトーシスの阻害剤、
- 細胞分裂および移動/転移を促進する、
- 腫瘍微細環境における脈管形成を促進する、
- 細胞ストレス応答に関連する
という理由のために、持続性腫瘍特異的免疫応答および好ましい安全性プロフィールについての能力を有する癌ワクチンのための好ましい候補である。
【００１９】
そのため、少なくとも強力なアジュバントDOTAPまたは構造的に同様のキラルカチオン性脂質の存在下で、インビボにおいて安定かつ十分に有効なサバイビン指向性癌治療のためのリポソーム製剤を提供することが本発明の目的である。
【００２０】
解決すべき課題の1つは、安定性の消失を引き起こす恒久的な異なる正味の電荷(R-DOTAPの正の正味の電荷およびサバイビンの負の正味の電荷)に関する、抗原およびアジュバントの固有の不適合性により見られるはずである。別の課題は、それぞれの製剤におけるサバイビンの不十分なインビボでの免疫原性において見ることができる。
【００２１】
リポソーム製剤の脂質成分の本発明の選択、サバイビン構造/配列の修飾、ならびに粒子径、抗原荷重(antigen payload)、脂質成分およびDOTAPの濃度および含有量などの多くの物理化学的なパラメーターの最適化により、課題を解決し得る。
【発明の概要】
【００２２】
発明の概要
リポソーム製剤中の全長サバイビンによる試みは、これらの粒子が満足のいかない生物物理学的タンパク質特性を誘発したことを示した。特に、本発明の好ましいアジュバントであるDOTAPと混合した場合にサバイビンの安定性の消失を観察することができた(図1、図2)。
【００２３】
驚くべきことに、C末端で切断されたサバイビンを使用することにより、安定性の課題を解決し得ることが見出された。サバイビンのC末端を切断することにより、溶液中でタンパク質の沈澱を誘導する疎水性パッチが除去されて、溶液中のタンパク質が安定化される。ペプチドにプロセッシングされ、免疫系に提示されるタンパク質の能力は、タンパク質の一部における生物学的な活性を必要とせず、抗原提示細胞のプロテオソーム複合体との接触前に構造完全性(structural integrity)のみを必要とする。本発明の一局面において、C末端で切断されたサバイビンは、依然として生物学的に活性であり有効である。
【００２４】
そのため、N末端から計算して、全長サバイビン(配列番号：1)の1〜119、1〜120、1〜121、1〜122、1〜123、1〜124、1〜125、1〜126、1〜127、1〜128、1〜129、1〜130、1〜131、1〜132、1〜133アミノ酸残基からなるC末端が切断された形態を提供することが本発明の目的である。
【００２５】
バイオ遺伝子工学戦略のために、配列番号：1の以下の切断されたサバイビン：2〜119、2〜120、2〜121、2〜122、2〜123、2〜124、2〜125、2〜126、2〜127、2〜128、2〜129、2〜130、2〜131、2〜132または2〜133を提供する本発明の好ましい態様において、最初のメチオニン残基を切断し得る。
【００２６】
上述で特定されるサバイビンの全てのこれらの短いトラック(track)配列は、例えばDOTAP、好ましくはR-DOTAPを脂質アジュバントとして含むリポソーム製剤中で、全長サバイビンと比較して、向上した生物物理学的特性を示し、それぞれ、142アミノ酸残基配列で表される全長サバイビン(配列番号：1)と比較して、同様の薬理学的特性を誘発する。
【００２７】
したがって、本発明は、以下の切断されたサバイビンアミノ酸配列：
【化２】
2017501172.tif 000003
(配列番号：2)に関する。この配列のGly2〜K120配列トラックは、本発明に従って、本発明の薬物物質(drug substance)または「dC-サバイビン薬物物質」と指定され、配列番号：3
【化３】
2017501172.tif 000004
(配列番号：3)の配列トラック1〜119と同一である。この配列のGly1〜K119配列トラックは、本発明に従って本発明の薬物物質またはdC-サバイビンと指定され、配列番号：2の配列トラック2〜120と同一である。
【００２８】
本発明は、好ましくは全長サバイビンの最初の120のN末端アミノ酸残基からなる切断されたサバイビンに関し、ここで、好ましくは1位のメチオニン残基は欠損される(配列番号：2および配列番号：3)。
【００２９】
さらに驚くべきことに、上述で特定される切断されたサバイビンであるが、ある程度までグルコノイル化される切断されたサバイビンが、切断されてグルコノイル化されないサバイビンと比較して、有意に向上されたインビボ薬理学的特性を誘発することが見出された。
【００３０】
したがって、配列番号：1で表される全長ヒトサバイビンの最初の118〜122のN末端アミノ酸からなる、C末端が切断されたサバイビン、または前記切断されたサバイビンに対して、＞90%、好ましくは＞91%、＞92%、＞93%、＞94%、＞95%、＞96%、＞97%、＞98または＞99%の相同性を有し、同じまたはほぼ同じ生物学的活性を誘発する配列を提供することが本発明の目的であり、ここで該切断されたサバイビンは、1つ以上の位置でグルコノイル化される。
【００３１】
特定の一局面において、本発明は、配列番号：1で表される全長ヒトサバイビンの最初の118〜133のN末端アミノ酸からなる、C末端が切断されたサバイビン、または前記切断されたサバイビンと＞90%の相同性を有する配列に関し、該切断されたサバイビンは、1つ以上の位置でグルコノイル化される。好ましい局面において、前記C末端が切断されたサバイビンは、同じ生物学的活性を誘発する。
【００３２】
本発明は特に、全長ヒトサバイビンの最初の120のN末端アミノ酸からなる、それぞれのC末端が切断されたサバイビンに関し、前記切断されたサバイビンは、アミノ酸配列(配列番号：2)：
【化４】
2017501172.tif 000005
で表され、ここで該切断されたサバイビンは、1つ以上の位置でグルコノイル化される。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、少なくとも配列番号：2の2位のグリシン残基または上述のそれぞれの118〜122アミノ酸残基配列がグルコノイル化される。
【００３４】
具体的に、本発明は、それぞれの切断されたサバイビンに関し、ここでN末端1位のメチオニン残基が除去され(通常タンパク質発現工程の後)、前記切断されたサバイビンは、アミノ酸配列(配列番号：3)：
【化５】
2017501172.tif 000006
で表され、該切断されたサバイビンは1つ以上の位置でグルコノイル化される。
【００３５】
本発明の好ましい態様において、少なくとも配列番号：3の1位のグリシン残基、またはそれぞれの118〜122アミノ酸残基配列がグルコノイル化される。
【００３６】
発明者により、好ましい特性はさらに、本発明の切断されたサバイビンのリジン残基でグルコノイル化が行われた場合に向上され得ることが示された。好ましくは、配列番号：2の23位および103位ならびに配列番号：3の22位および103位のリジン残基がそれぞれ、好ましくはグルコノ-1,5-ラクトンによりグルコノイル化され得るが、主に他のグルコノイル化剤が使用され得る。したがって、それぞれの切断されたグルコノイル化サバイビンを提供することが本発明の目的であり、ここでグルコノイル化は、リジン残基、好ましくは配列番号：2の23位および/または103位、または配列番号：3の22位および/または102位のリジン残基でさらに行われる。
【００３７】
驚くべきことに、特に本発明のリポソーム製剤により引き起こされる活性化CD4+および/またはCD8+ T細胞応答に関するインビボ薬理学データは、それぞれの組成物中の全ての切断されたサバイビン分子がグルコノイル化されなかった場合、特に好ましいものであることが見出された。具体的に、40%のグルコノイル化は、最もバランスのとれたサバイビン特異的CD4+およびCD8+ T細胞応答を誘発した。より高いレベルのグルコノイル化は優先的に、CD4+ヘルパーT細胞支持を犠牲にしてCD8+ T細胞応答に従事した。したがって、上述に特定されるような切断されたサバイビンおよびそれぞれの切断された非グルコノイル化サバイビンを含むサバイビン組成物を提供することが本発明の目的であり、ここで前記組成物において、10〜80%、好ましくは10〜60%、より好ましくは35〜45%、最も好ましくは切断されたサバイビンの前記組成物中約40%の切断されたサバイビン分子がグルコノイル化される。
【００３８】
本発明の切断されたサバイビンのグルコノイル化は、以下の利点を提供する：
- 合成的グルコノイル化は、広い修飾範囲に対する入手手段を与え、その薬理学的利益の体系的な評価を可能にする。
- 確立されたプロトコルは、効率的で経済的な方法を設計するための基準を提供する。
- (切断された)サバイビンのグルコノイル化は、腫瘍ワクチンとしての本発明の治療的な切断されたサバイビンの抗原性および有効性を増加させる。
- 本発明の切断されたサバイビンの合成的グルコノイル化は、宿主細胞グルコノイル化に関連する主要な不利益を回避する能力を有して最適であると考えられる。
【００３９】
本発明のサバイビンは、グリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよい。好ましくは、グリコシル化されず、大腸菌などの細菌系により製造される。
【００４０】
上述のように、予防接種後、インビボでサバイビンまたはサバイビン様の活性を誘発するリポソーム製剤を提供することが本発明の主な目的であり、ここで該リポソーム製剤は、異なる物理的および薬理学的パラメーターに関して最適化され、かつ非常に効果的な免疫刺激剤およびアジュバントDOTAP、好ましくはそのキラル成分R-DOTAPまたは同様のキラル脂質アジュバント、例えばR-もしくはS-DOTMAまたはR,S DOEPCを含む。したがって、
(i)配列番号：2の配列を含む120アミノ酸残基もしくは配列番号：3の配列を含む119アミノ酸残基、または＞90%、好ましくは＞95%の配列相同性を有するそれぞれの修飾された配列などの、切断され、好ましくはグルコノイル化された上述に特定されるようなサバイビン、あるいはそれぞれ切断されたサバイビンのサバイビン組成物、ここで上述のように10〜60%、好ましくは35〜45%の切断サバイビン分子がグルコノイル化される、および
(ii)少なくとも1つのアジュバント、ここで該少なくとも1つのアジュバントは、免疫調節剤として作用するキラルカチオン性リン脂質であり、好ましくはR,S DOTAP、R-DOTAP、S-DOTAP、R,S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、R,S DOEPC、R-DOEPCおよびS-DOEPCからなる群より選択される、
を含むリポソーム製剤を提供することが本発明の目的である。
【００４１】
発明者により、上述の特定のキラルカチオン性アジュバント脂質は、これは特にリポソーム製剤中でのR-DOTAPと関連して、2〜8mM、好ましくは3〜5mM、最も好ましくは約4mMの濃度で適用され、これは排他的ではない場合に、特に効果的であることが見出された。リポソーム製剤中の脂質アジュバントの含有量は変更してもよいが、興味深いことに、15〜30%(mol/mol)の含有量が薬理学的有効性に関して最良の結果を誘発する。
【００４２】
発明者により、キラルカチオン性脂質の存在とは別に、脂質組成物の品質および量は、本発明のリポソーム製剤の好ましい特性に関して重要な役割を果たすことがさらに示された。
【００４３】
したがって、切断されたサバイビン、ならびにコレステロール、およびホスファチジルコリン(PC)、ホスホエタノールアミン(PE)およびホスホグリセロール(PG)からなる群より選択される少なくとも1つのリン脂質を含む上述のようなDOTAPなどの少なくとも1つのキラルカチオン性脂質アジュバントに基づくリポソーム製剤を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、リン脂質は、DLPC、DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、EPCおよびEPC3からなる群より選択されるホスファチジルコリン(PC)である。以下に示されるように、異なるPCの粗製混合物である卵ホスファチジルコリン(egg phosphatidylcholine)(EPC)は、DMPCなどの他のホスファチジルコリンと比較して、例えばインビボにおけるCD8+誘発応答に対して最も有意な効果を示すので、最も好ましい。しかしながら他の公知のリン脂質を使用することができ、本発明のリポソーム製剤を調製するために試験し得る。
【００４５】
本発明のリポソーム製剤は、10〜60%(mol/mol)、好ましくは20〜45%、より好ましくは30〜45%、最も好ましくは45%の含有量のコレステロールおよび30〜80%(mol/mol)、好ましくは30〜50%の含有量の上述のようなホスファチジルコリン(PC)、最も好ましくは約35%の含有量のEPCを含み得る。
【００４６】
本発明のリポソーム製剤は、40nm〜500nmの変化するサイズのナノ粒子を含む。好ましいリポソーム組成物はリポソーム粒子を含み、ここで物理的および生物学的な特性に関して最も好ましい結果を誘発するので、少なくとも70%の粒子、好ましくは少なくとも80%の粒子が、50〜500nm、好ましくは100〜300nm、最も好ましくは150〜250nmのサイズを有する。
【００４７】
さらに、粒子の表面電荷が、本発明に従って0.5〜1.5mg/mL、好ましくは0.75〜1.0mg/mLである抗原荷重に依存して、≧17mVである場合に特に好ましい結果が得られ得ることが示された。正の表面電荷(ゼータ電位)は、DOTAP含有リポソームナノ粒子の免疫および抗腫瘍活性を高める。
【００４８】
上述から、リポソームナノ粒子の全ての関連のあるパラメーターおよび成分を変更して、部分的に驚くべき特性を誘発し、本発明に従って、本発明の薬物製品または「dc-サバイビン薬物製品」として指定される最適なリポソーム製剤を生じることが見出され得る。
【００４９】
したがって、
(i)切断された(グルコノイル化された)サバイビンおよび上述および特許請求の範囲において特定される切断されたサバイビン、好ましくは配列番号：2または3の配列の組成物、
(ii)脂質成分R-DOTAP、コレステロールおよびEPC、
(iii)前記製剤中R-DOTAP濃度が3〜5mMである、
(iv)リポソーム粒子、ここで少なくとも70%が150〜250nmの粒子径を有する、ならびに
(v)0.5mg/mL(±0.1mg/mL)の抗原荷重
を含む、それぞれのリポソーム製剤を提供することが本発明の具体的な目的である。
【００５０】
好ましい態様において、薬物製品は、以下のパラメーター：
(i)配列番号：3で表される切断されたグルコノイル化、非グリコシル化サバイビン、ここで約40%(±2〜5%、好ましくは±5%)の前記切断されたサバイビンがグルコノイル化される、および
(ii)脂質組成物の含有量が、10〜30%、好ましくは約20%(±1%)のR-DOTAP、25〜55%、好ましくは約45%(±1%)のコレステロール、および30〜60%、好ましくは約35%(±1%)のEPC(mol/mol)である、
を特徴とする。
【００５１】
本発明のリポソーム粒子、好ましくは本発明のリポソーム製剤のリン脂質成分は、標準的な方法に従ってペグ化され得る。これらの本発明のペグ化脂質粒子は、塩濃度の低下に対する製剤の感受性の低減に関して、高められた安定性および強い傾向を示し、それにより、タンパク質または製剤の沈澱に有意に影響を及ぼしかつ向上させる。しかしながら、本発明のペグ化リポソーム製剤は、驚くべきことに、非ペグ化粒子と比較して、より低いインビボ有効性(CD4+/CD8+ T細胞応答および抗腫瘍活性)を誘発する。しかしながら、脂質粒子のペグ化は、必要とされる場合は患者において、特に過剰反応免疫応答を有する個体において、免疫応答を調節するために、本発明に従って使用され得る。そのため、上述および下記で特定されるリポソーム製剤またはワクチン組成物を提供することが本発明の目的であり、ここで該リポソーム粒子は、好ましくは0.5%〜5%(mol/全脂質含有量mol)でペグ化される。
【００５２】
本発明はさらに、貯蔵の理由のために凍結乾燥される本発明のリポソーム製剤およびワクチン製剤に関する。2.0〜2.5%(w/v)の低濃度のスクロースの存在により、凍結乾燥製剤の薬理学的有効性を損なうことなく十分に製剤を安定化する。本発明の製剤はまた、酸化的損傷からの保護のために、酸化防止剤、好ましくはモノチオグリセロール(MTG)を含み得る。
【００５３】
上述および下記に記載されるように、該リポソームおよびワクチン製剤は、予防接種治療を意図するワクチン組成物を調製するために、本発明に従って使用される。
【００５４】
したがって、担体、賦形剤、添加剤、希釈剤、さらなる免疫エンハンサーまたは免疫エフェクター分子をさらに含み得る、上述および下記に特定されるようなリポソーム製剤で構成される免疫刺激性ワクチンを提供することが本発明の目的である。
【００５５】
本発明のワクチン組成物は、抗腫瘍剤などの他の治療効果的な薬物および/または放射線などの他の治療形態と一緒にまたは別々に(同時または逐次投与)組み合わされ得る。
【００５６】
好ましい態様において、リポソームワクチン製剤は、下記のように、シクロホスファミド、カルボプラチンもしくはパクリタキセルなどの化学療法剤、または抗腫瘍抗体もしくはNHS-IL12などの抗体-サイトカイン融合タンパク質と組み合される。これらの組合せは、高められたインビボ有効性を示す(図21〜24)。したがって、より詳細に、本明細書に記載されるそれぞれの場合において、シクロホスファミド、カルボプラチン、パクリタキセルおよびNHS-IL12からなる群より選択される抗腫瘍剤と一緒にリポソーム製剤または免疫刺激性ワクチン組成物を含む、医薬組成物を提供することが本発明のさらなる目的である。好ましい一態様において、本発明は、ヒト個体の予防または治療における使用のための前記医薬組成物に関し、ここで該個体は癌または癌関連疾患に苦しむ。
【００５７】
最終的に、本発明は、予防接種によるヒト個体の予防または治療のための使用について記載される免疫刺激性ワクチンまたはリポソーム製剤に関し、ここで該個体は、癌もしくは癌関連疾患に苦しむかまたはその素因を有する。本発明は特に、癌に苦しむかまたはその素因を有する患者を、予防接種により治療するそれぞれの方法に関し、該予防接種は、例えば患者の攻撃された免疫系によるCD4+および/またはCD8+ T細胞応答を調節、好ましくは高めることにより前記個体においてサバイビン特異的免疫応答を誘発し、該患者における腫瘍増殖の阻害または予防をもたらす。
【００５８】
該発明によると、ワクチンの以下のパラメーターは、全長サバイビンと比較して、製剤化および免疫応答の増加について最適化された。
- サバイビンタンパク質修飾：10〜80%、好ましくは10〜60%の制御された合成的グルコノイル化は、サバイビン特異的CD4+およびCD8+ T細胞応答の最適な誘導に影響を及ぼす。
- R-DOTAP濃度：3.5〜4.5mM DOTAPは、サバイビン特異的CD4+およびCD8+ T細胞応答の最適なバランスを含む。
- 粒子表面電荷：＞17mV、好ましくは約18mVのゼータ電位は、サバイビン特異的CD4+およびCD8+ T細胞応答の最適なバランスを誘導する。
- 粒子径：より大きなナノ粒子、好ましくは＞200nmは、サバイビン特異的CD8+ T細胞IFNγ産生を高める。
- 液体組成物：EPCヘルパー(helper)脂質は一貫して、細胞性免疫応答の発生においてDMPCなどの合成ヘルパー脂質より優れる。
- 低温保存のための賦形剤：2〜3%スクロースは、安定で活性な凍結乾燥ワクチン製剤を支持する。
【００５９】
本発明の製剤は、切断されたサバイビンの水性安定性(aqueous stability)を高め、特定されるように切断されたサバイビンに切り替えることにより、R-DOTAPおよび全長サバイビンの本来の非適合性を克服する。記載されるように切断されたグルコノイル化サバイビンを適用することにより、薬理学的活性は、全長のネイティブのサバイビンに対して維持され、切断された非グルコノイル化サバイビンと比較して増加した(図2〜図14参照)。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図1A：サバイビンの量を増加した、8mM脂質濃度のDOTAPリポソーム。左から右へ、0μg/mLタンパク質、41μg/mLタンパク質、3.1mg/mLタンパク質。DOTAP-タンパク質複合体の沈澱は増加したタンパク質濃度で誘導される。図2B：pHおよび塩の条件のマトリックスにおける全長 対 C末端が切断されたサバイビンの安定性評価。緑は好ましい条件を示し、赤は好ましくない条件を示す。低い塩およびより低いpHへのタンパク質適合性条件の関連のある伸長は、1〜120アミノ酸のサバイビンについて観察されている。
【図２】図2：DOTAP/CHO/DMPCまたはDOTAP/CHO/DPPCのいずれかを含む三元混合物についての96w形式における脂質組成物の滴定および粒子径分布の影響、試料は、t0および2〜8℃で1週間貯蔵後に測定した。3つの製剤をプールおよび測定した後に値を得る。
【図３】図3：96w形式における異なるPC組合せ：DMPC+DPPC、DOPC+DPPC、DOPC+DSPCに関するリポソーム組成物の滴定、DOPC+DPPCまたはDPPC+DMPCの組合せを使用する際に適切な粒子径分布が得られる。値は3つそれぞれのバイアルのプールを表す。
【図４】図4： DOTAP(20%mol/mol)およびコレステロール(45%mol/mol)の固定した含有量でのDPPCおよびDOPCの異なる割合に関する96w形式におけるリポソーム組成物の滴定、適切な粒子径分布は広い範囲の割合で得られる。値は、3つそれぞれのバイアルのプールを表す。
【図５】図5：100mM KClの低減した塩含有量での96w形式における異なるPC組合せに関するリポソーム組成物の滴定。DMPCは、DPPCおよびDSPCと比較して、サバイビン(surviving)負荷リポソームを安定化することに優れていることが明らかになる。DOTAP含有量の低減も、リポソームを安定化することを示す。値は、3つそれぞれのウェルのプールを表す。
【図６】図6：低減されたKCl含有量(50mM)の存在下での96w形式におけるリポソーム組成物の滴定。異なる割合のDSPE-PEG2000(1〜5%mol/mol)および異なるヘルパー脂質を、4℃で1週間の間の、製剤化可能性および短期間安定性に関して調べた。リン脂質としてDMPC、DPPCおよびDOPCを適用した。値は、3つそれぞれのウェルのプールを表す。
【図７Ａ】図7：アジュバントの濃度の影響。C57BL/6マウスにおける2回の予防接種後のCD4およびCD8の読み出し、ワクチン組成物：100nm DOTAPリポソーム、0.5mg/mL抗原荷重、脂質：20% DOTAP、35% EPC、45%コレステロール。A：T細胞記憶応答は、約2mM DOTAPで増殖最大値をほのめかす(insinuate)。
【図７Ｂ】B：対照的に、SVN特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の最も高い頻度は、製剤中、最も高い濃度のDOTAPで観察された。対照：非特異的免疫活性化は、MHCクラスI限定オボアルブミンペプチド(SIINFEKL)で予防接種されたマウスから単離されたCD8+ T細胞を刺激することによって定量した。
【図８】図8： DOTAP濃度、2mM 対 4mM R-DOTAPの影響。A：CD4+ T細胞増殖、およびB：C57BL/6マウスにおける2回の予防接種の後のCD8+ IFN-γ産生、ワクチン組成物：100nm DOTAPリポソーム、0.5mg/mL抗原荷重、脂質：20% DOTAP、35% EPC、45%コレステロール。対照：非特異的免疫活性化は、MHCクラスI限定オボアルブミンペプチド(SIINFEKL)で予防接種されたマウスから単離されたCD8+ T細胞を刺激することによって、定量した。4mM DOTAPは、サバイビン特異的CD4+およびCD8+ T細胞応答の最適なバランスを誘導した。
【図９】図9：サバイビン特異的CD4+およびCD8+ T細胞応答に対するゼータ電位およびワクチン荷重の効果。C57BL/6マウスにおける2回の予防接種後のCD4およびCD8の読み出し、ワクチン組成物：10mM脂質濃度、脂質：20% DOTAP、35% EPC、45%コレステロール。A：精製した全長サバイビンタンパク質を適用した(pulse)抗原提示細胞で刺激した、単離されたCD4+ T細胞における3H-チミジン取り込みにより測定した際のSVN特異的CD4+ T細胞増殖。B：MHCクラスI限定SVNペプチドを適用した抗原提示細胞で刺激した、単離されたCD8+T細胞を用いたELISPOTアッセイにより測定した際のSVN特異的CD8+ T細胞IFN-γ産生。粒子表面電荷：-6mV〜+33mV。ワクチン荷重により、粒子表面電荷の変化がもたらされる。+18.3mVのゼータ電位により、サバイビン特異的CD4+およびCD8+ T細胞の応答の最適なバランスが誘導される。
【図１０】図10：細胞傷害性免疫応答に対する粒子径の影響。製剤は、10mMの全脂質濃度、薬物負荷0.5mg/mLのそれぞれで20% R-DOTAP/35% EPC/45%コレステロール(mol/mol)からなった。より大きなナノ粒子(200nm)により、サバイビン特異的CD8+ T細胞IFN-γ産生が高められた。EPCヘルパー脂質は一貫して、細胞性免疫応答の発生において、合成ヘルパー脂質(例えばDMPC)より優れた。
【図１１】図11：リン脂質成分としてのDMPC 対 EPCの比較。リポソームは、20% DOTAP/25% EPC/45%コレステロール(mol/mol)または20% DOTAP/50% DMPC/30%コレステロールからなった、脂質濃度：10mM、薬物負荷：0.5mg/mL、サイズ：105nm (EPC) 対 129nm (DMPC)、2週間の予防接種の後に得られたデータ、1群当たりN=10のマウス。
【図１２】図12：A：2回の予防接種、B：4回の予防接種で負荷されたペグ化リポソームの細胞傷害性免疫応答、脂質濃度：10mM、サイズ：50〜60nm、抗原荷重：0.5mg/mL、1群当たりn=10のマウス。3および5%のペグ化。
【図１３】図13：ペグ化サバイビンリポソーム(3%、5%) 対 非ペグ化製剤(0%)の比較、リポソーム組成物：20mM脂質濃度、約200nmのサイズ、抗原負荷0.5mg/mL、データは、非ペグ化製剤のより優れた細胞傷害効果を示す。
【図１４】図14：再構成後の液体(EPC液)および凍結乾燥(EPC lyo)のリポソームの比較、リポソーム組成物：20mM、20% DOTAP/35% EPC/45%コレステロール、サイズ：200nm、抗原負荷：0.5mg/mL、EPC lyoはさらに、100mg/mLのスクロースを含む。
【図１５Ａ】図15A：グルコノイル化スキーム。
【図１５Ｂ−Ｃ】図15B：グルコノ-1,5-ラクトン試薬を利用して達成されるサバイビングルコノイル化の範囲。図15C：反応パラメーターおよびサバイビングルコノイル化に対する該反応パラメーターの影響の評価。
【図１６】図16：サバイビン特異的CD4+およびCD8+ T細胞応答に対するサバイビングルコノイル化の効果。
【図１７】図17：皮下MC38/SVN腫瘍モデルにおけるdC-サバイビンの抗腫瘍効力に対するサバイビングルコノイル化の効果。
【図１８】図18：該発明の1〜120aaの切断されたサバイビンの合成遺伝子。発現プラスミドAL37は、切断されたサバイビン(配列番号：2；1〜120aa)をコードするDNA配列を含む。発現後、配列番号：3の切断されたサバイビン(第1メチオニン残基を除いた配列番号：2の2〜120に対応する)を培地中に放出した。
【図１９】図19：pAL37中の制限部位。
【図２０−１】図20：配列番号：2/3をコードする切断されたサバイビンDNAを含む発現プラスミドpAL37(配列番号：4)上のDNA配列および特徴。
【図２０−２】図20：配列番号：2/3をコードする切断されたサバイビンDNAを含む発現プラスミドpAL37(配列番号：4)上のDNA配列および特徴。
【図２１】図21：本発明の切断されたサバイビン(配列番号：3の2〜120aa)とシクロホスファミド(CPA)の組合せ。
【図２２】図22：本発明の切断されたサバイビン(配列番号：3の2〜120aa)と抗体-サイトカイン融合タンパク質NHS-IL12の組合せ。
【図２３】図23：卵巣腫瘍を有するSVN.Tgマウスにおける本発明の切断されたサバイビン(配列番号：3の2〜120aa)とパクリタキセルの組合せ。
【図２４】図24： 卵巣腫瘍を有するSVN.Tgマウスにおける本発明の切断されたサバイビン(配列番号：3の2〜120aa)とカルボプラチンの組合せ。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明の定義によると、用語「薬物物質(drug substance)」は、簡単に、配列番号：3に基づく本発明の切断されたサバイビンで指定される「dC-サバイビン」(C末端で切断された2〜120aa二量体サバイビン構築物)をいい、ここで該切断されたサバイビンは、具体的に、少なくとも配列番号：3のGly1でグルコノイル化される。
【００６２】
本発明の定義によると、用語「薬物製品(drug product)」は、上述で特定され、上記または下記のように最適化される「薬物物質」を含むリポソーム製剤をいう。より詳細に、本発明の「薬物製品」は、(i)配列番号：3で示された、グリコシル化されていない切断されたサバイビンであり、ここで前記切断されたサバイビンの40%(±0.5%)がグルコノイル化され、(ii)脂質組成物の含有量は10〜30%、好ましくは約20%(±1%)R-DOTAP、25〜55%、好ましくは約45%(±1%)コレステロール、および30〜60%、好ましくは約35%(±1%)EPC(mol/mol)である。
【００６３】
発現系の選択
小さいサイズおよび翻訳後修飾を欠いた(void)ポリペプチドを生成する目的は、切断されたサバイビンを、大腸菌などの原核生物発現系における産生について特に適した候補にする。天然の細胞質局在のために、サバイビンは、還元(reducing)環境に適合される。開発の過程で、サバイビンタンパク質は、構造完全性を維持するために、継続的な抗酸化保護を必要とすることが明らかとなった。この必要性は、組み換え産生のための細胞内標的化を明らかに好むものであった。また、ピキア(Pichia)系における可能性試験により、サバイビンの効果的でない分泌特性が明らかになった。これらの考察により、大腸菌が、細胞内にタンパク質産物を保持するとはいえ、産生宿主に選択された。誘導性プロモーター系(lacIq/T7)とエピソームベクターを併用することがさらに決定された。プラスミドに基づく系は、計画の進行の過程で発現カセットに対する改変のための良好な利用可能性の利点を有する。誘導により発現を制御することで、転写産物レベルの調整および最適化が可能になる。これは、細胞貯蔵(banking)プロセスおよび発酵培養の増殖段階中に、負の選択の圧力をさらに回避する。
【００６４】
大腸菌により産生されたサバイビンの質量分析により、主要な形態と比較して+178および+258Daの質量増加を有する2つの種が明らかになった。このパターンは、いわゆるホスホ-グルコノイル化を生じる、反応性糖誘導体によるタンパク質修飾を示す。これは、糖分解とペントースホスフェート経路の接点(interface)での代謝中間体であるホスホ-グルコノラクトンとタンパク質中の一級アミノ基の自発的な反応から生じる。最初のホスホ-グルコノイルタンパク質付加物(+258Da)が形成された後、グルコノイル形態に部分的な加水分解が生じる(+178Da)(Geoghegan et al., Anal Biochem 267(1): 169-84, 1999参照)。サバイビンの場合、この反応はGly2でのαアミノ基に限られた。試験した発現条件の範囲下で、サバイビンタンパク質の12%までが、この機構に基づいて修飾された。該修飾は意図されたものではなく、製造制御に関するリスクとして評価された。制御の関心が潜在的に高まることがさらに見られた。しかしながら、精製プロセスにおいて修飾された種を除去するかまたは適切な発酵設定によりこれらの生成を回避するかのいずれかの強い努力は不首尾であった。
【００６５】
制御されないホスホ-グルコノイル化は、宿主細胞が代謝産物ホスホ-グルコノラクトンを蓄積する際に生じる。そのため、グルコノイル化が起こらない大腸菌株を提供することが本発明の目的であったが、驚くべきことに、これらの研究により、本発明のグルコノイル化され、切断されたサバイビンは、グルコノイル化されないサバイビンと比べて薬理学的により有効であることが見出された。
【００６６】
したがって、発明者らは、発現された切断されたサバイビンを自然に(ホスホ)-グルコノイル化しない発現宿主を開発した。代わりに、(ホスホ)-グルコノイル化は、合成的手段により制御された様式で、発現の後に実施されるべきである。しかしながら、グルコノイル化が自然に得られる切断されたグルコノイル化サバイビンまたは生物工学的に作り変えられた発現宿主系が本発明に含まれることに注意すべきである。
【００６７】
本発明の切断されたサバイビンの発現について本発明に従って使用され得る適切かつ好ましい大腸菌株は、大腸菌BL21(DE3) (Novagen)である。しかしながら、この株は、天然に不十分なラクトナーゼ活性を欠点としており、この反応性中間体を不活性なグルコン酸に加水分解する。この購入可能な株は、(ホスホ)-グルコノラクトナーゼ遺伝子のコピーをこの発現株のゲノムに導入することにより本発明に従って、生物工学的に作り変えられた。この戦略は、ホスホ-グルコノイル化サバイビン種およびグルコノイル化サバイビン種の出現を完全に廃止し、主に当該分野において公知である合成手段により、制御された様式でグルコノイル化を導入する道を開く。主に、不十分なラクトナーゼ活性を有する他の細菌株もそのように作り変えられ得、そのため本発明の切断されたサバイビンを産生するために使用され得る。
【００６８】
上述の生物工学的に作り変えられた大腸菌株から生じる株、好ましくは大腸菌BL21(DE3)は、本発明の切断されたサバイビンを含む発現プラスミドで形質転換するために、本発明に従って採用される。本発明の特定の株は、大腸菌T7E2(#1)と指定される。
【００６９】
本発明のグリコシル化されず元々はグルコノイル化されていない切断されたサバイビンを製造するために、大腸菌T7E2を形質転換したプラスミドを構築した。該プラスミドはpAL37と指定され、配列および特徴を図19および20に示す。当然、該プラスミド構築物の変形物および改変物、特にリーディング配列、プロモーター配列、制限部位、抗生物質耐性などを有するものは、原則的に本発明に含まれる。(サバイビンの生物物理学的特性を改変するために)(合成により)グリコシル化された切断されたサバイビンの使用も、本発明の要旨にカバーされることが指摘されるべきである。
【００７０】
修飾反応(グルコノイル化)
本発明の切断されたサバイビンは、細菌発現宿主により発現された際に好ましくはグルコノイル化されていない。生物工学的に作り変えられた切断されたサバイビンの制御された所望のグルコノイル化速度を達成するために、標準的な方法により、グルコノイル残基の導入が合成的に実施される。該グルコノイル化は、遊離アミノ基と、グルコノ-1,5-ラクトンなどの標準的なグルコノイル化試薬を反応させることにより達成される(図15A)。本発明の切断されたサバイビン中の可能性のある遊離アミノ残基は、メチオニン残基の切断後の配列番号：2の(or)2位のグリシンおよび配列番号：3の1位のグリシンである。さらに、グルコノイル化の候補は切断された分子内の全てのリジン残基であるが、リジン23およびリジン103(配列番号：2)またはリジン22およびリジン102(配列番号：3)のグルコノイル化は、最良の薬理学的特性を有するサバイビンを誘発するために、これらの位置のリジンが好ましいリジン残基である。
【００７１】
本発明によると、本発明のグルコノイル化され、切断されたサバイビンを有するワクチンは、同じであるが修飾されていないサバイビンを有するそれぞれのワクチンよりも強いインビボ免疫応答を誘発する。
【００７２】
宿主細胞が媒介するサバイビンのグルコノイル化は、BL21(DE3)などの使用される大腸菌株における最適ではない代謝状況の意図されない結果として生じた。低い達成可能な修飾の程度(12%まで)およびこの事象に対しての制限された制御は、この機構を利用するには好ましくないように思われた。より広い修飾範囲でのサバイビングルコノイル化の潜在的な薬理学的な利点の体系的な評価を可能にするために、代わりの合成アプローチが設計された。発現株T7E2#1に由来する修飾されないサバイビンDSバルク(bulk)を、グルコノ-1,5-ラクトンと反応させる。修飾の程度は、グルコノ-1,5-ラクトンの量が提供されるにつれて増加する。80%まで、好ましくは65%〜80%の修飾レベルが達成された(図15B)。
【００７３】
反応は、Gly2(配列番号：2)またはGly1(配列番号：3)で、おそらくその特有のpKa特性のために、αアミノ基について顕著に選択的であり続ける。しかしながら、高いラクトン濃度で、低いレベルでの2つのリジン残基の修飾が観察された。直交する検出原理での2つの方法は、サバイビンのグルコノイル化レベルを定量するために利用可能である(電荷によりcIEF、質量によりESI-MS、静止相相互作用特性によりRP-HPLC)。水溶液中のラクトンの自発的な加水分解のために、粉末として、タンパク質成分に対して有意にモル過剰で、ラクトンを添加する必要がある。グルコノイル化試薬の量に加えて温度、反応時間およびpHなどの重要な反応パラメーターの影響を評価した(図15C)。
【００７４】
使用するバッファ系、含まれる酸化防止剤の製剤化可能性
本発明の切断されたサバイビンの開発の枠組みにおいて、バッファ培体への適合がなされた。最適化された特性を有する1つの適切な製剤化バッファは、50mM Na-P、150mM NaCl、1mM DTT、pH 7.5で構成される。衛生局によりDTTが承認されないので、該バッファ組成物は、受諾された酸化防止剤に関して作製し直す必要がある。サバイビン構築物の最適な安定性範囲を画定するために、さらなる種類のバッファ塩の系、pHおよび一価の塩濃度を調査した。結果は以下のように要約され得る：
エタノールおよびt-ブタノールは5〜20%の範囲で試験した。25℃で5日後に、溶媒濃度の増加に伴って酸化二量体化の増加が観察される。5% t-ブタノールで、最低の有害効果が検出された。
【００７５】
切断されたサバイビンは、6.1でpIを示す。4〜9の範囲でpH滴定を行った場合、5.0＜pH＜6.0で安定性の最低値が検出され、これらのpH値での正味の分子電荷に対応する沈殿が生じた。顕著に、酸化防止剤を添加せずに試験した場合、化学安定性(酸化)は、≧7.0のより高いpH値で低減した。pH6でのpH安定性は、150mM NaClを製剤に導入することにより劇的に高まり得た。最適塩濃度で、APIは、6〜8のpH範囲内で安定化し得、pH 6〜6-5で最適な安定性を有する。NaClは、該分子のpIに近いpH値でdC-サバイビンを安定化することを示した。さらに、NaClは薬物負荷R-DOTAP含有リポソームの処理の際に、必須の成分であることが明らかになった。NaClを含まないかまたはNaCl濃度が不十分である(＜150mM)場合、カチオン性リポソームの存在下でタンパク質は沈殿する。
【００７６】
最終的な好ましいバッファ組成物は、以下の賦形剤：20mM K2HPO4、150mM KCl、10mM MTG、pH 7からなるように画定されたが、組成および含有量の変更も本発明にカバーされる。
【００７７】
酸化的損傷からの該発明の切断されたサバイビンの保存に関して以下の酸化防止剤：アスコルビン酸、K-亜硫酸、Na-亜硫酸、Na-チオ硫酸、システイン、メチオニン、モノチオグリセロール、Na-ホルムアルデヒドスルホキサート(sulfoxate)および没触子酸プロピルを試験した。FDA成分リストに従って、全てのこれらの賦形剤を、市販の非経口製品中で使用する。25℃で5日間のインキュベーション後、酸化防止剤の性能を試験した。結果は、他の酸化防止剤と比較して、モノチオグリセロール(MTG)が優れることを示した。MTG、メチオニンおよびNa-チオ硫酸のみが、試験プロトコルにおいて酸化を防止した。没触子酸プロピルおよびアスコルビン酸は、望ましくない反応を引き起こし、試験試料の変色を生じた。20mM K2HPO4、150mM KCl、pH 7.0中MTGの濃度を0〜10mMで滴定した。酸化の防止(25℃で5日)はMTG濃度に依存した。
【００７８】
本発明のリポソーム製剤に使用される脂質およびリン脂質
本発明のリポソーム粒子の脂質成分を調製するために使用し得る多くの脂質化合物および誘導体がある。リポソーム製剤は通常、コレステロールまたはαトコフェロール、カチオン性リン脂質および中性リン脂質などの脂質化合物を含む。本発明のリポソーム製剤に使用されるサバイビン断片の負の電荷を補償するために、本発明に従って、カチオン性成分が必要である。
【００７９】
(A)キラルカチオン性リン脂質
分離したエナンチオマー形態は、増加した生物学的かつ薬学的有効性を示すので、カチオン性リン脂質成分は好ましくはキラル性質のものである。該カチオン性リン脂質成分は、好ましくはR,S DOTAP、R-DOTAP、S-DOTAP、R,S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、R,S DOEPC、R-DOEPCおよびS-DOEPCからなる群より選択され得るが、これらの薬剤に限定される必要はない。
【００８０】
切断されたサバイビンリポソームの製剤化可能性は、切断されたサバイビンおよびアジュバント成分、好ましくはR-DOTAPの固有の不適合性により導かれる。図1は、生理学的条件でのDOTAPの恒久的な正電荷およびサバイビンの正味の負電荷の間の制御されない相互作用のためのこの現象の影響を示している。製剤開発の過程で、1つの主要な目標は、リポソーム当たりのDOTAP含有量を最大にしながら望ましくない静電相互作用を抑制することであった。DOTAPは、リポソーム二重層の一部として、脂質成分として作用しているだけでなく、(本明細書の切断されたサバイビンを用いる背景において)予防接種アプローチおよび設定においてアジュバントとして強く作用する。
【００８１】
0〜50%(mol/mol)の範囲でDOTAPを滴定することにより、電荷相互作用が、0〜30%(mol/mol)DOTAPの範囲で制御され得ることが示され得る。さらに、DOTAPおよび1つの中性脂質成分の混合物が、構想される標的サイズの粒子を生じなかったことが示され得た。DOTAP、コレステロールおよび1つのPCを異なる割合、例えば10〜30%、好ましくは約20%(±1%) R-DOTAP、25〜55%、好ましくは約45%(±1%)コレステロールおよび30〜60%、好ましくは約35%(±1%) EPC(mol/mol)で組み合わせた場合に好ましい結果が得られた。
【００８２】
(B)他の脂質およびリン脂質
電荷相互作用の制御は、中性脂質成分(卵PC(EPC)を含むホスファチジルコリン(phosphadityl cholines)(PC)、コレステロールおよびトコフェロール)をリポソーム二重層に導入することにより達成され得ることが見出された。適切な中性リン脂質の例は、ホスファチジン酸(ホスファチデート)(PA)、ホスファチジルエタノールアミン(ケファリン)(PE)、ホスファチジルコリン(レシチン)(PC)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルイノシトールホスフェート(PIP)、ホスファチジルイノシトールビスホスフェート(PIP2)、およびホスファチジルイノシトールトリホスフェート(PIP3)である。
【００８３】
本発明に従って、さらなる合成リン脂質誘導体：
- ホスファチジン酸(DMPA、DPPA、DSPA)
- ホスファチジルコリン(DHPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC)
- ホスファチジルグリセロール(DMPG、DPPG、DSPG、POPG)
- ホスファチジルエタノールアミン(DMPE、DPPE、DSPE DOPE)
- ホスファチジルセリン(DOPS)
を使用し得る。
【００８４】
【表１】
2017501172.tif 000007
【００８５】
三元混合物、また、DOTAP、コレステロールおよび1つのリン脂質の混合物に加えて、より複雑な系を調査し、特に製剤成分類脂質EPC中の脂肪酸組成の模倣および置き換えに焦点を当てた。主要なPCとして、この混合物は、DSPC、DPPC、POPCおよびDOPCを含む。2つの極限複雑性(limit complexity)EPCを、これらの製剤成分のうちの2つの混合物で置き換えた。図2、3および4は、リポソームの製剤化可能性および安定性についてのヘルパー脂質組成物の影響を例示する。DSPCは製剤特長に関しての限定された適切さを示し、DOPCおよびDPPCの混合物またはDMPCおよびDPPCの混合物は、良好な製剤安定性を示す。DPPCおよびDOPCを関連のある濃度範囲で滴定し、2〜32%(mol/mol)でDOPCおよび3〜32%でDPPCをそれぞれ滴定した場合に、PSDにおいてわずかな変動しか示さなかった。
【００８６】
PEG化リポソームおよび塩濃度の低減
一価のイオンの濃度は、予備試験において分散安定性に関して重大であることが明らかとなった。液体製剤では重大ではないが、凍結乾燥製剤または凍結した製剤は、150mM KClの塩含有量で凝固点低下の欠点をもつ。標準的なPCとは対照的に、リポソーム二重層中のペグ化リン脂質の存在は、低い塩含有量に対する製剤の感受性を低下したことが見出された。図5は、100mM KCl(標準的には150mM)での製剤化試験およびこの条件下でのタンパク質/製剤沈殿に対する劇的な影響を示している。対照的に、図6は、50mM KClの塩含有量での製剤選択肢の概観を示している。製剤中3%(mol/mol)ほどに低いDSPE-PEG2000の導入は、サバイビン負荷リポソームの産生を可能にすることが見られ得る。1〜2% DSPE-PEG2Kで、製剤は、沈殿および粒子径分布(PSD)の顕著な増加を示す。
【００８７】
既に上述したように、これらの結果(図6)は、リン脂質またはリポソーム粒子のペグ化は、本発明の切断されたサバイビンの可能性のある沈殿に関して、リポソーム製剤の安定性に寄与することを示す。しかしながら、不運にも、サバイビンを含むペグ化されたリポソーム粒子は、同じ成分および組成の非ペグ化粒子と比較して、抗腫瘍効力の低下およびCD4+/CD8+ T細胞活性の低下を示す。
【００８８】
リポソームの凍結および凍結乾燥
-70℃での凍結および凍結乾燥について3つの異なる製剤：
DOTAP/EPC/CHO      20/35/45(%割合)
DOTAP/CHO/DOPC/DSPE-PEG2K      20/45/32/3(%割合)
DOTAP/CHO/DOPC/DSPE-PEG2K      20/45/30/5(%割合)
を試験した。
【００８９】
異なる凍結防止剤(例えば、トレハロースまたはスクロース)の可能性試験は、凍結乾燥後のリポソームサイズ分布の保存において、スクロースが優れることを示した。結果的に、最適なサイズ保存の範囲を画定するために、異なるスクロース濃度を滴定した。濃度は、0%、2.5%、5%、7.5%および10%スクロース(w/v)に設定した。
【００９０】
約10%のスクロースは最適であることが見出されたが、インビボの有効性に干渉した。そのため、脂質成分DOTAP/CHO/EPCおよび2〜3%スクロース(w/w)、好ましくは約2.5%スクロースに基づく凍結分散リポソームは、最適な物理化学的かつインビボ薬学的活性を示す。
【００９１】
さらに、PEG2Kを含む製剤は、免疫学的応答に関して、非ペグ化形態よりも劣ることが見出された。
【００９２】
インビボ実験
(i)DOTAP濃度の影響
予防接種ボーラス当たりのDOTAP濃度の影響を調べるために、リポソームの数、したがってDOTAPの濃度を、0.7mM〜7mM DOTAPの範囲で変えた。図7は、プラシーボリポソーム(P.L.)またはサバイビンタンパク質を封入するリポソームのいずれかで予防接種したマウス由来のそれぞれのCD4+およびCD8+ T細胞応答を示す。アジュバント含有量とCD8+ T細胞応答の間で用量依存的な関係が観察された(図7A)が、最高のDOTAP濃度でSVN特異的CD4+ T細胞増殖の消失が示された。結果は、2〜7mM R-DOTAPの間のDOTAP濃度の最適値を示し、最高のDOTAP濃度(7mM)で免疫応答がSVN特異的CD8+ T細胞に対して選択的にに偏っている。さらに、図7のデータは、ワクチン製剤におけるDOTAPの中間濃度(例えば2mM)でのCD4+およびCD8+の両方のSVN特異的T細胞応答の関与を示す。関連のある濃度範囲をさらに解明するために、2mMと4mMのR-DOTAPを比較する第2の試験を設定した(図8)。結果は、SVN特異的CD4+ T細胞増殖(図8A)およびIFN-γ産生CD8+ T細胞(図8B)の誘導において、4mMのDOTAP濃度は、2mMよりも優れることを示す。
【００９３】
(ii)抗原荷重の影響
本発明のリポソーム(例えば、100nmリポソーム、10mM脂質、20% DOTAP、35% EPC、45%コレステロール)に、ΔC(切断された)サバイビン(配列番号：3)を用いて、サバイビン(surviving)を異なる程度(0、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mLおよび1.5mg/mL)まで負荷した。CD4/CD8応答は、0.5〜10.0mg/mLの荷重最適値を示唆し(図9A)、細胞傷害性効果において0.1〜0.5mg/mL抗原でプラトーに達するように思われる(図9B)。注意すべきことに、プラシーボリポソームも純粋なタンパク質もいずれも有意な免疫学的効果を何ら示さなかった。
【００９４】
(iii)粒子径の影響
本発明のリポソーム(例えば、100nm 対 200nmのリポソーム)を、ワクチン生体活性における異なる粒子径の影響に関して比較した。図10は、2回の予防接種後のCD8+活性化における差を示す。180〜350nm、好ましくは200〜250nmの粒子径を有するリポソームは、試験設定内で免疫応答を有意に増加する。結果は、約200nmの粒子径が、ワクチン適用に非常に適切であることを示唆する。
【００９５】
(iv)脂質組成物の影響
計画の変遷のために、全ての初期の試験は、20% DOTAP/35% EPC/45%コレステロール(mol/mol)で構成されるリポソームを使用して行った。EPCは、主にC16、C18およびC18:1脂肪酸を有するPCからなる異なるホスファチジルコリンのかなり粗製の混合物である。リポソームの優れた物理化学的安定性を可能にし、製剤の複雑さを低減する他の製剤組成物を画定することに大きな努力をした。EPCは、リン脂質成分としてDMPCで効率的に置き換えることができたが、サイズ、表面電荷および抗原荷重などの他の製剤パラメーターの全てを維持することが可能であった。提唱される製剤は、20mMの20% DOTAP/50% DMPC/30%コレステロール(mol/mol)からなり、免疫学的動物試験に供した。データは、EPCを合成ヘルパー脂質で置き換えた場合に免疫学的活性が完全に消失したことを示した(図11)。
【００９６】
実験の第2のセットにおいて、ペグ化リポソームの免疫原性を評価した。リポソームは、20% DOTAP/45%コレステロール/32% DOPC/3% DSPE-PEG2000または20% DOTAP/45%コレステロール/30% DOPC/5% DSPE-PEG2000のいずれかからなり、これらを標準的なEPC含有リポソームに対して試験した(図12)。CD8応答は、2および4回の予防接種後に記録した。データは、1) 3%のペグ化は、特異的細胞傷害性応答の誘発において優れること、および2) 免疫応答は、4回の予防接種後にさらに増加されることを示唆する。DMPC含有リポソームと同様に、CD8+ T細胞の頻度は、EPC含有リポソームを用いた予防接種後よりもかなり低かった。少量のDSPE-PEG2000を導入した場合、リポソームはかなり小さい。活性の消失が、免疫系認識から逃れることをもたらし得る粒子表面上のPEG保護体または低減された粒子径により優先的に媒介されるかどうかは不明確であった。そのため、最適化された粒子径(約200nm)およびDOTAP濃度(4mM R-DOTAP)を有する別の実験セットを行った(図13参照)。再度、ペグ化製剤において中程度の免疫活性化のみが検出され得、ペグ化が0%のカチオン性EPC系製剤について強い応答が観察される。
【００９７】
(v)凍結乾燥製剤の性能
水性環境でのサバイビン(surviving)タンパク質の本来の不安定性のために、長期間貯蔵製品のための代替物を画定する必要がある。リポソームの物理化学的性質を保存するための凍結乾燥プロトコルが開発された。該プロトコルは、製剤に凍結防止剤を添加することを含んだ。製剤バッファ中の約25〜150mg/mL、好ましくは100〜150mg/mLのスクロース濃度は、ワクチンの関連のあるパラメーター(粒子径、電荷、薬物荷重)を効果的に保存することを示した。図14は、予防接種プロトコルおよび同等の脂質組成物の液体製剤と比較した再構成された凍結乾燥(lyo)製剤のそれぞれのCD8+読み出しを示している。凍結乾燥製剤中では細胞傷害性が損なわれることが見られ得る。
【００９８】
先に示された結果は、カチオン性リポソーム中の120aa(配列番号：1由来)の切断されたサバイビンバリアントを製剤化することが可能であることを明確に示す。該製剤は、DOTAP、好ましくはR-DOTAPを使用する場合に、脂質粒子のサイズおよび組成に依存して、強くかつ再現可能なアジュバント力を可能にする。製剤化試験は、リポソームの安定性および特性は、製剤成分の注意深い選択に依存することを明らかにした。純粋なR-DOTAPは感受性の抗原を製剤化することに適さないが、DOTAP、コレステロールおよびホスファチジルコリン成分の混合物は、標的プロフィールに従って安定なリポソームの産生を可能にした。ペグ化脂質はサバイビンとR-DOTAPの間の望ましくない静電的反応を有意に低減し、一価のイオンの含有量を低減して産生および貯蔵を可能にしたので、リポソームマトリックス中のペグ化脂質の導入は、特別な適切性のあるものであった。
【００９９】
インビボの結果により、ワクチンのアジュバントの性能についての製剤パラメーターの重要性が強調された。3〜5mM、好ましくは3.5〜4.5mM、より好ましくは4mMのR-DOTAPは、約200nm(150〜300nm)の粒子径での最適なアジュバント濃度であると同定された。また、脂質組成は、ワクチンにとって最も(outmost)重要であることが明らかになった。製剤成分としてDMPCを導入することによりワクチンが不活性化されたが、DOTAP、EPCおよびコレステロールの混合物により、強くかつ強壮な効果が検出され得た。ペグ化脂質およびスクロースの添加により、ワクチンの有効性が損なわれた。さらに、100mg/mLのスクロースでも、細胞傷害効果が記録され得た。スクロースの濃度を50〜25mg/mLに低減することでインビボの性能が高められる。
【０１００】
併用療法
さらなる局面において、免疫療法剤の投与は、本発明のリポソーム予防接種組成物と同時または逐次的に組み合わせることが好ましい。本発明の適切な免疫療法剤は、例えばWO 2013/079174に開示されるものなどの、抗VEGF(R)抗体、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブなどの抗EGFR抗体、または抗PDL1抗体などの抗癌抗体である。該抗体は、好ましくはC末端重鎖を介して、IL-2、TNFa、IFNbおよびIL12などのサイトカインに融合され得る。
【０１０１】
本発明の好ましい態様において、公知の融合タンパク質NHS-IL12およびNHS-IL2 (Selectikine)、好ましくはNHS-IL12は、本発明のリポソーム製剤と合わされる。NHS-IL12は、核細胞(nuclear cells)を介して腫瘍の壊死コアに結合する公知のヒト抗体NHS76の重鎖からなる融合タンパク質(「TNT」抗体、WO 2000/001822参照)であり、ここで前記抗体は、そのC末端で、(修飾された)IL-12のp40および/またはp30サブユニットに共有結合により融合され、潜在的な免疫刺激活性および抗新生物活性を備える。投与時、免疫サイトカインNHS-IL12の抗体部分は、壊死固形腫瘍のコアに主に位置する壊死腫瘍細胞から放出されるDNAに結合し、それによりIL-12部分を送達する。次いで、この薬剤のIL-12部分は、宿主免疫系を刺激して、腫瘍細胞に対して免疫応答を開始させ(mount)、それにより腫瘍増殖を阻害する。IL-12は多くの免疫調節機能を有する前炎症性サイトカインであり、腫瘍細胞に対する宿主の免疫応答を増大させ得る。腫瘍細胞を標的化することにより、NHS-IL-12は、組み換えヒトIL-12の全身投与に関連する毒性を低減し得る。
【０１０２】
多様な癌、好ましくは卵巣癌の治療のための本発明の切断されたサバイビンに基づく好ましい組合せ療法としては以下のものが挙げられる(図21〜24)。
- 低用量シクロホスファミド(CPA)との組合せ：低用量CPAは、免疫応答を高めことが見出され、これはCD4_25-Treg細胞の枯渇を介して媒介されることが公知である。CPAの活性は、いくつかの癌ワクチン臨床試験においても観察された。DPX-Survivac第I相試験において、規則正しい低用量CPAは、DPX-Survivacの免疫原性を直接高め得ることも示された。
- 抗PD-L1との組合せ：ワクチンのための一般的な原理は、APCの活性化および抗原特異的CTL媒介性免疫応答の刺激である。しかしながら、慢性腫瘍抗原刺激の設定において、CD8 T細胞は、枯渇され、機能不全になる。枯渇のプロセスには多数の機構が貢献するが、PD-L1は、最も良好に特徴付けられた上方制御される阻害分子であり、疾患進行および免疫機能不全に関係する。PD-L1の遮断により、臨床試験において腫瘍クリアランスの増加に対する有効性が示された。そのため、抗PD-L1と本発明の組合せは、CTL応答を向上することが推定される。さらに、抗PD-L1は、少なくとも1つのラインの化学療法で不首尾であった卵巣癌患者において研究されている。卵巣癌患者(n=17)の18%は、安定な疾患を少なくとも6か月達成し得た。
- NHS-IL12との組合せ：NHS-IL12は、IL-12サイトカインをより安全でより効果的な癌治療にすることが想定されるIL-12の標的化送達である。IL-12は、ナイーブT細胞の、T細胞の増殖および機能を刺激し得るTh1細胞への分化に関与する。IL-12は、T細胞およびNK細胞からのIFN-γおよびTNF-αの産生を刺激し、IL-4媒介性のIFN-γの抑制を低減する。IL-12はまた、抗脈管形成活性を有し、これはIL-12が新規の血管の形成を阻害し得ることを意味する。そのため、本発明の切断されたサバイビンと、上記の特定の薬物または他の抗癌薬物との組合せは、全体的な抗腫瘍活性を高めることが推定される。
【０１０３】
本発明のワクチン組成物はまたさらに、CpGsまたはシクロホスファミドなどの免疫を刺激することが知られるさらなる化合物を含み得る。CpG核酸は、好ましくは少なくとも1つ以上の(分裂促進性)シトシン/グアニンジヌクレオチド配列(1つまたは複数)(CpGモチーフ(1つまたは複数))を含む。ある態様において、本発明のリポソーム製剤またはワクチン組成物は、免疫応答に寄与するエフェクター分子と協力して機能する。例えば、かかるエフェクター分子は、限定されないがIL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、GM-CSFまたは任意の他のサイトカイン、特にThI免疫応答を活性化し得るものを含むサイトカイン部分であり得る。かかるエフェクター分子はまた、免疫系を抑制するサイトカインのインヒビター、例えばSTAT3インヒビターであり得る。
【０１０４】
治療的使用
一局面において、本発明は、癌または癌関連疾患の予防または治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載されるリポソーム製剤または本明細書に記載される免疫刺激性ワクチンの使用に関し、ここで該癌または癌関連疾患は、サバイビン特異的腫瘍細胞の存在に基づく。好ましい局面において、前記リポソーム製剤は、シクロホスファミド、カルボプラチン、パクリタキセルおよびNHS-IL12からなる群より選択される抗癌剤と併用される。
【０１０５】
一局面において、本発明は、癌または癌関連疾患の予防または治療を必要とする個体における、前記個体に本明細書に記載される免疫刺激性ワクチンの治療有効量を投与することによる、癌または癌関連疾患を予防または治療する方法に関し、ここで該癌または癌関連疾患は、前記個体におけるサバイビン特異的腫瘍細胞の存在に基づく。好ましい局面において、本発明は、シクロホスファミド、カルボプラチン、パクリタキセルおよびNHS-IL12からなる群より選択される抗腫瘍剤をさらに投与することによる前記治療方法に関する。
【０１０６】
サバイビンは、ほとんどの癌形態において発現されるようであるという事実のために、本発明のワクチン組成物またはリポソーム製剤が、サバイビンが発現される任意の型の癌疾患を制御するように提供され得る可能性が非常に高い。
【０１０７】
したがって、例として、本発明の組成物および製剤は、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血悪性疾患、黒色腫、乳癌、頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌および前立腺癌に対して免疫学的に活性である。該治療的使用は、該疾患に苦しむ患者に、本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【０１０８】
本発明によると、本発明のワクチン組成物またはリポソーム製剤は、薬学的に許容され得る担体および/またはさらなる補助物質ならびに添加剤およびアジュバントをさらに含み得る。
【０１０９】
本発明の製剤は典型的に、安全かつ有効な量の上述の切断されたサバイビンポリペプチドを含む。本明細書で使用する場合、「安全かつ有効な量」は、癌、例えば肺癌または卵巣癌の正の改変を有意に誘導するのに十分な、本発明の切断されたサバイビンの量を意味する。しかしながら同時に、「安全かつ有効な量」は、重度の副作用を回避するため、すなわち利益とリスクの間の実際的な(sensible)関係を許容するほど十分に少ない。これらの制限の決定は典型的に、実際的な医学的判断の範囲内にある。本発明の薬物物質に関連して、表現「安全かつ有効な量」は、好ましくは、過剰なまたは損傷を与える免疫反応に達しないが、好ましくはかかる免疫反応が測定可能なレベル未満でもないような様式で、適合免疫系を刺激するのに適した、本発明の切断されたサバイビンの量を意味する。「安全かつ有効な量」はさらに、治療対象の特定の状態、ならびに治療対象の患者の年齢および身体的な条件、範囲内の状態の重症度、治療の持続時間、付随する治療の性質、使用される特定の薬学的に許容され得る担体の性質、ならびに同様の要因に関連して同行医師の知識および経験の範囲内で、変化する。本発明のリポソーム製剤またはワクチン製剤は、予防接種のための医薬組成物として、ヒトのためおよび獣医学的目的のためにも、本発明に従って使用され得る。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、表現「薬学的に許容され得る担体」は、好ましくは本発明のリポソーム製剤またはワクチン製剤の液体または非液体基剤を含む。本発明のリポソーム製剤またはワクチン組成物が液体形態で提供される場合、該担体は典型的に、発熱原非含有水、等張食塩水または緩衝化(水性)溶液、例えばリン酸またはクエン酸の緩衝化溶液である。
【０１１１】
本発明の免疫原性ワクチン組成物の量は、特定の適用に応じて変化し得る。しかしながら、単一用量のワクチンは、好ましくは概して約10μg〜約5000μg、より好ましくは約100μg〜約1000μgなどの約50μg〜約2500μgである。本発明の好ましい態様において、1つの単一用量のリポソーム製剤は、本発明に従って、500〜1200μgの前記リポペプチド(lipopeptide)、より好ましくは700〜900μgを含むものべきである。本発明の好ましい態様において、本発明のリポソーム製剤による予防接種は、100〜400mg/m2、好ましくは250mg/m2のシクロホスファミドの投与を伴い、それにより患者の免疫系が活性化または高められ得る。通常、予防接種の開始前、普通は1〜5日、好ましくは2〜5日において、単一用量は有効であるのに十分であるはずであるが、他の異なる計画が適用可能である。
【０１１２】
投与の形態としては、皮内投与、皮下投与および静脈内投与、持続放出製剤の形態の埋め込み等が挙げられる。当該技術分野で公知の任意のおよび全ての投与形態が本発明に包含される。必要な場合、従来の薬学的に許容され得る担体、希釈剤、保存剤、アジュバント、バッファ成分等を含む凍結乾燥形態および溶液、懸濁液またはエマルジョン形態などの注射可能免疫原性ペプチド組成物を調製するのに適切である、当該技術分野で公知の任意および全ての従来の剤型も、包含される。
【０１１３】
本発明のさらなる局面において、本発明のワクチン組成物およびリポソーム製剤は、他の薬学的に有効な薬剤および以下により詳細に述べられる薬物と合わされ得る。
【０１１４】
化学/放射線療法
本発明の予防接種アプローチはまた、「化学放射線療法」を含む。本発明の化学放射線療法は、「化学療法」を含む。化学放射線療法はまた、標準的な方法に従った放射線または放射性同位元素標識化合物の投与により実施される「放射線療法」を含む。本発明によると放射線が好ましい。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞の破壊を引き起こすことにより、細胞の機能を阻害または妨害する物質をいう。該用語は、放射性同位体、化学療法剤、免疫療法剤および細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素、またはそれらの断片を含むことを意図する。該用語はまたサイトカインファミリーの構成メンバー、好ましくはIFNγ、および細胞傷害活性も有する抗新生物剤を含み得る。
【０１１６】
用語「抗癌剤」または「抗腫瘍剤」は、癌/腫瘍治療において有効な全ての薬剤を記載する。該用語は、細胞傷害性薬剤、化学療法剤および免疫療法剤を含む。
【０１１７】
本発明の化学放射線療法は、通常化学療法で始まり、その後放射線療法が続く。しかしながら、放射線療法で始まる治療も適用可能である。化学療法は、少なくとも1つの「化学療法剤」、好ましくはシスプラチンまたはカルボプラチンなどの白金系薬物の投与により実施される。本発明によると、化学療法剤は、用量持続時間および投与回数に依存して毎日、毎週または2〜5週毎に投与される。
【０１１８】
本発明の化学療法は、この発明の理解に従うと、細胞傷害性薬剤のクラスの構成メンバーであり、腫瘍細胞に直接であり生物学的応答改変などの機構を介した間接的なものではない抗新生物効果を発揮する、すなわち新生物細胞の発達、成熟または拡散を防ぐ化学剤を含む、化学療法剤の投与を含む。
【０１１９】
本発明の化学放射線療法設定において投与される本発明の好ましい化学療法剤は、シスプラチンまたはカルボプラチンなどの白金系薬剤である。しかしながら、以下に特定されるような他の化学療法剤も使用し得る。
【０１２０】
また、さらなる化学療法剤または他の抗癌剤が、特許請求される治療の有効性を向上するために投与され得る。商業的使用、臨床評価および前臨床開発において利用可能な多くの抗新生物剤があり、これらは併用療法による腫瘍/新生物の治療のための本発明に含まれ得る。化学療法剤は任意に、前記のリポソーム製剤とともに投与され得るということが指摘されるべきである。化学療法剤または薬剤の例としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネートならびにニトロソ尿素(nitrosourea)、シスプラチンおよびダカルバジンなどのアルキル化作用を有する他の化合物；代謝拮抗物質、例えば葉酸、プリンまたはピリミジンアンタゴニスト；有糸分裂阻害剤、例えばビンカアルカロイドおよびポドフィロトキシンの誘導体；細胞傷害性抗生物質およびカプトテシン誘導体が挙げられる。好ましい化学療法剤または化学療法としては、アミフォスチン(エチヨル(ethyol))、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン(carrnustine)(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ドキソルビシンリポ(doxorubicin lipo)(ドキシル)、ゲムシタビン(ジェムザール)、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ(daunorubicin lipo)(ダウノキソーム(daunoxome))、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル(5-FU)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテール)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン(cladribine)、カンプトテシン、CPT-11、10-ヒドロキシ-7-エチル-カンプトテシン(SN38)、ダカルバジン、フロクスウリジン(floxuridine)、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、メスナ(mesna)、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン(plicamycin)、ミトタン、ペグアスパラガーゼ(pegaspargase)、ペントスタチン(pentostatin)、ピポブロマン(pipobroman)、プリカマイシン(plicamycin)、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド(teniposide)、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルおよびそれらの組合せが挙げられる。
【０１２１】
本発明の好ましい態様において、リポソーム製剤が提供され、ここで化学療法剤はシスプラチンまたはカルボプラチンからなる群より選択され、非白金系化学療法剤は、ビノレルビン、エトポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンデシン、ゲムシタビン、イホスファミドおよびペメトレキセドからなる群より選択され、好ましくはパクリタキセルである。
【０１２２】
化学療法は、通常少なくとも2サイクル、好ましくは2〜8サイクル、より好ましくは2〜5サイクルにより、本発明に従って適用される。1サイクルは、21〜35日、好ましくは21〜28日である。化学療法剤の投与計画(dose regimen)は、種々の可能性のある患者および薬物に関連のある状態および特性に依存する。通常、シスプラチンは、50〜120mg/m2で1サイクルごとに変化する用量で適用される。カルボプラチンまたはパクリタキセルは、本発明に従って、1用量当たりおよび1サイクル当たり100〜1500mgの用量で適用され得る。
【０１２３】
放射線療法は、標準的な放射線により、本発明に従って実施され、ここで合計40〜120Gy、好ましくは少なくとも50Gy、より好ましくは50〜75Gyが適用される。通常、放射線療法は、細分化され、少なくとも4日間、好ましくは5〜7日間連続して1日当たり1.5〜3.5Gyが適用される。合計放射線量は、本発明に従って、21〜35日、好ましくは28日以内に適用される。必要であるかまたは好ましい場合、3.5〜15Gy、好ましくは5〜10Geeの増加線量が、放射線の開始時または中間のインターバルに適用され得る。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【０１２５】
実施例1：材料
本発明において適用されるリン脂質種を表1に列挙する。DOTAPはMerck Milliporeにより入手し、コレステロールはSigma Aldrichから購入した。全ての他の脂質は、Lipoid AG, Germanyから入手した。dC-サバイビンは、以下に記載されるように製造し、より好ましい安定性特性およびより良い製造可能性を達成するようにC末端で短くされたヒトサバイビンのアミノ酸配列からなった。dC-サバイビンはヒトサバイビンのアミノ酸2〜120(配列番号：3)を含み、以下の特性：分子量13.8kDa、等電点6.0および融点48℃を有した。
【０１２６】
実施例2：供給源株大腸菌BL21(DE3)の遺伝子工学的作り変えおよび本発明の切断されたサバイビンのための発現株としての大腸菌T7E2株の調製
供給源株大腸菌BL21(DE3)(Novagen)は以下：
- 大腸菌BL21(DE3)の入来分析(incoming analysis)
- ストレプトマイシン耐性表現型を達成するための大腸菌BL21(DE3)ゲノム性rpsL遺伝子の改変
- 大腸菌BL21(DE3)STRゲノム性バックグラウンドにおける必ずしも必要でない(dispensable)DE3プロファージ領域のloxP-cmR-loxPカセットによる置換 
- 大腸菌BL21(DE3)STR L'1DE3:loxP-cmR-loxP遺伝的バックグラウンドにおけるRacプロファージの合成pgl遺伝子による置換
- loxPが隣接するクロラムフェニコールマーカーの除去
の通りに遺伝子工学的に作り変えた。
【０１２７】
インシリコの株の遺伝子工学的作り変えのために大腸菌BL21(DE3) [gb#CPOO 1509 .3]のゲノム配列およびArtemisソフトウェア(Rutherford et al.,Bioinformatics 16(10): 944-5, 2000)を使用した。大腸菌BL21(DE3)をL-ロイシン(0.04mg/mL)を補充したLB Vegitone培養液および寒天またはマルトースM9-Minimalplate(0.4%)上で好気的に増殖させた。必要に応じて、それぞれ50flg/mL、15flg/mL、15flg/mL、50flg/mLおよび3flg/mLの終濃度までアンピシリン(Ap)、クロラムフェニコール(Cm)、カナマイシン(Km)、ストレプトマイシン(Str)およびテトラサイクリン(Tc)を添加した。
【０１２８】
供給源株大腸菌BL21(DE3)(Novagenから購入)がグルコノイル化を行わないことを確実にするために、株ゲノムDNAを生物工学により作り変えた。BL21(DE3)ゲノムは、いくつかのプロファージを含む。特定の生理学的条件下で、これらのプロファージのいくつかが活性になり、感染性のファージ粒子を生じ得る潜在的な危険性がある。Lambda DE3ファージの存在を、T7ポリメラーゼ(T7-RNAP)の細菌性ゲノムへの導入まで戻す(goes back to)。移動(mobilization)の機会をさらに低減するために、T7-RNAP遺伝子の上流の38.3キロベースのDE3プロファージ配列を発現株内で欠失させた。さらにこれに、ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子コピーの導入の過程において、Racプロファージ座を欠失させた。本発明により得られた株は大腸菌T7E2 (#1)であり、以下：(i) Lys43Arg置換を生じるゲノムrpsL内の点変異のためにストレプトマイシン耐性(その後のrpsLに基づく逆選別(couterselection)に欠くことのできないものである)、(ii) T7 RNA-ポリメラーゼ遺伝子および機能を損傷することがないDE3プロファージの89.1%のマーカーなしでの(markerless)除去および(iii) 大腸菌MG 1655ゲノム配列由来の合成pgl遺伝子によるRacプロファージの置換、の遺伝的特性を特徴とする。
【０１２９】
実施例3：大腸菌T7Eの発現プラスミドpAL37での形質転換
供給源プラスミドは、pAL28を介して最終的な発現プラスミドpAL37へと最終的に設計されたpET42 (Novagen)であった。pLA37のプラスミドDNAを十分に図20に示し、配列番号：4で表される。それぞれの制限酵素についての制限部位を図19に示す。プラスミドAL37は、切断されたサバイビン配列、配列番号：2(配列番号：1の1〜120aa)をコードするDNAを含み、発現および培地への放出後、該切断されたサバイビンの配列から第1メチオニン残基を切断し、これを切断されたサバイビン配列番号：3(配列番号：1の2〜120aa)と表す。
【０１３０】
形質転換のために大腸菌T7E2#1細胞を氷上で解凍し、1μlのプラスミドal37を添加して氷上で30分間インキュベートして、42℃で30秒間インキュベートし、再度氷上で2分間インキュベートした。次いで、250μlの抗生物質非含有LB vegitone培養液を添加して、450rpmで浸透しながら37℃で60分間インキュベートした。培養物をカナマイシンおよびストレプトマイシンを補充したLB vegitone寒天プレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。
【０１３１】
このプレート由来の細胞を使用して、三回のストリーキング(streaking)により単一コロニーを有する寒天プレートを生成した。28℃で2日間のインキュベーション後、小さな単一コロニーを使用して、第1の培養物のための28℃、160rpm、一晩において、バッフルを有する1Lの浸透フラスコ中の200mLの化学的に規定された培地に接種した。第2の前培養物に、OD 578nm=0.001の光学密度について、1.44mLの第1の培養物を接種した。培養物を、28℃、160rpmで約20時間インキュベートした。17%グリセロールおよび2mMベタインを添加して、細胞懸濁物を10x1mLの低温バイアルに配し、フタを閉じ、該バイアルを液体窒素中でショック凍結させ(shockfrosted)、上述の液体窒素中で保存した。
【０１３２】
研究作業用細胞バンクの生成のため、それぞれの場合において、第1の細胞ストックの1つのバイアルを解凍した。ストックのうち175μlを使用して、28℃、160rpmにおいて、バッフルを有する1L浸透フラスコ中の200mLの化学的に規定された培地に、接種し、一晩インキュベートした。17%グリセロールおよび2mMベタインを添加して、培養物を、第1のものについて50x1mL低温バイアルに配し、第2のRWCBについて100x1mLバイアルに配した。フタを閉じて、バイアルを細胞凍結デバイスPlaner Kryo 10に配置して、凍結した。凍結処理を完了した後、バイアルを注意深く低温タンク(cryotank)に配置した。得られた物質を、同一性、純度、生存性、グラム染色および汚染ファージについて分析した。全ての容認基準を満たした。
【０１３３】
実施例4：本発明による切断されたサバイビンのグルコノイル化のプロトコル
- 実施例3から得られた切断されたサバイビンのバッファへのゲルろ過
- 125mgサバイビン(5mg/mL)を25℃の水浴中で撹拌する
- 固体グルコノ-1,5-ラクトン、200mM最終の添加
- 時間経過0〜20時間、45分後に主要な反応を回収した(withdrawn)
- ゲルろ過
- 濃縮
- cIEF、ESI-MS、SE+RP-HPLCによる分析
- 約65%の総グルコノイル化部分を有して約100mg(80%)の収率
- 約60分後に反応を停止させる(seize)(pHは、GLの完全な加水分解を示す)
- この分解能において一修飾速度と二修飾速度の間に差はない
【０１３４】
実施例5：リポソーム製造法
220μlのバッファまたはタンパク質溶液を96ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。最初に脂質をエタノールに溶解して、次いで33μl/ウェルでバッファ含有ウェルに注入した。それぞれの製剤化は3回繰り返した。それぞれのウェルをピペッティングにより混合した。水溶液について約0.5mL/分に対応する分配モードおよびスピードレベル5で、Eppendorf Multipette Streamにより脂質注入を行った。最終混合工程は、約30mL/分であるPモードおよびスピードレベル1で、Biohit Proline 12-Channelピペットにより行った。混合について1回のピペッティング当たりの体積は100μlであり、それぞれのウェルに1回ピペッティングした。そうではないと記されなければ、最終脂質濃度は1mMであり、サバイビン濃度は0.1mg/mLであった。それぞれの製剤化は3回繰り返した。
【０１３５】
実施例6：連続エタノール注入リポソーム製造法
内径2mmのシリコンチューブを使用して、80mL/分の流速で、バッファまたはタンパク質溶液を試料容器にポンプ注入した(pumped)。最初に脂質をエタノールに溶解し、次いでバッファ流に12mL/分の流速で注入した。最終リポソーム溶液を試料容器に回収した。そうではないと記載されなければ、最終製剤は、10mMの脂質濃度および1mg/mLの合計タンパク質含有量を示した。それぞれの製剤化は3回繰り返した。
【０１３６】
実施例7：粒子径およびゼータ電位測定
リポソームは、Malvern Zetasizer Nano-ZSを使用して動的光散乱によりサイズを測った。固定した173°の後方散乱角度で、25℃で、測定を行った。リポソームのゼータ電位は、同じMalvern Zetasizer Nano-ZS装置により測定した。リポソーム溶液は、水中1:100で希釈した。Smoluchowskiモデルを使用して25℃で測定を行った。
【０１３７】
実施例8：本発明の薬物製品を生じる薬物物質の形成
バッファ培体に分散されたリポソームは、以下の構成要素：
- 脂質組成物：20% R-DOTAP、35%高純度卵PC(EPC)、45%コレステロール(全て% mol/mol)
- 分散液中の全脂質組成物：20mM
- 分散培体：20mM K-リン酸塩pH7、150mM KCl、10mMモノチオグリセロール(MTG)
- dC-サバイビン含有量：0.8〜1.0mg/mLの全含有量、薬物負荷0.6mg/mL
からなる。
【０１３８】
107.6mg DOTAP、207.1mg EPCおよび134.0mgコレステロールを適切なガラスビーカーに計量し、10mLのエタノール(ad 10 mL with ethanol)(＞99%純度)を添加して、77mMの脂質を含むリン脂質のエタノール溶液を調製した。APIを、20mM K2HPO4、150mM KCl、10mM MTGを含むバッファに希釈した。
【０１３９】
t型混合デバイス中、エタノール性かつバッファ溶液の制御された混合によりリポソームを調製した。流速は、エタノール相について12mL/分およびバッファ相について80mL/分であった。得られたリポソーム分散液をSlide-A-Lyzer透析カセット(MWCO 10kDa、PES)中24時間、バッファを5回交換する透析により精製した。最後の工程において、リポソームは、2回のダイアフィルトレーション(diafiltration)により濃縮した。得られたリポソームはDLSにより測定し、約120nmの平均粒子径および＜0.15のPDIを示す。さらなる処理のために、リポソームは、2.5%(w/v)スクロースの存在下で凍結または凍結乾燥のいずれかを行った。得られた粒子は、PDI＞0.15を有し200〜300nmの平均粒子径を示した。薬物負荷分析により、0.6mg/mLの抗原がリポソーム粒子に結合したことが明らかになった。
【０１４０】
試料の凍結乾燥を可能にするために、バッファ組成物を、20mM K2HPO4に変えた。一価の塩中のカリウムにカチオンを適合させることも必要であった。20mM K2HPO4、10mM MTG、pH 7.0からなるバッファ中、0〜150mMでKClの滴定を行った。DSバッファ中にタンパク質を保存するために30mM KClの最小値が必要であった。リポソームの存在下での処理可能性を確実にするために、濃度を150mM KClに上げた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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