(57)【要約】  本発明は、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対する患者の応答性を予測するための方法に関し、該方法は、該患者から得られたＢ細胞におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルを測定する工程を含む。
2017510261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対する患者の応答性を予測するための方法であって、該方法は、該患者から得られたＢ細胞におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルを測定する工程を含み、ＧＡＰＤＨの高い発現レベルは、抗ＣＤ２０抗体による処置に対する応答を予測する、方法。
【請求項２】
抗ＣＤ２０抗体を用いての処置を受けている患者の抗ＣＤ２０抗体に対する抵抗性を検出するための方法であって、該方法は、該患者から得られたＢ細胞におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルを測定する工程を含み、ＧＡＰＤＨの低い発現レベルは、抗ＣＤ２０抗体による処置に対する無応答を予測する、方法。
【請求項３】
前記抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ベルツズマブ、ＡＭＥ−１３３ｖ、トシツモマブ、及びＧＡ−１０１からなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記患者が、Ｂ細胞の増殖又は過剰活性化を伴う疾病に罹患している、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記疾病が、非ホジキンＢ細胞リンパ腫、例えば濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、バーキットリンパ腫、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、白血病、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；及び自己免疫性疾患、例えば関節リウマチ、特発性自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、多発性硬化症、水疱性皮膚症（例えば天疱瘡、類天疱瘡）、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記疾病が、非ホジキンＢ細胞リンパ腫又は白血病である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記疾病が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
必要とする患者を処置するための方法において使用するための抗ＣＤ２０抗体であって、該方法は、以下の工程：
ａ）請求項１において定義されたような応答性を予測するための方法を用いて、患者が、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対して応答性であるかどうかを同定する工程；及び
ｂ）抗ＣＤ２０抗体を用いて、同定された応答患者を処置する工程
を含む、抗ＣＤ２０抗体。
【請求項１１】
必要とする患者を処置するための方法において使用するための抗ＣＤ２０抗体であって、該患者は、請求項１に定義されたような応答性を予測するための方法を用いて、応答性であると同定されている、抗ＣＤ２０抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対する患者の応答性を予測するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
モノクローナル試薬をインビボで投与することによりヒトの疾病を軽減することができるという仮説がＣＤ２０抗体により確認された。リツキシマブによる、正常Ｂリンパ球、悪性Ｂリンパ球、及び自己免疫性Ｂリンパ球上のＣＤ２０の標的化は、様々なＢ細胞リンパ腫患者、並びに、幾人かの自己免疫疾患患者に対して実質的な利点を実証した。抗ＣＤ２０抗体療法が導入されて以来、過去十年間においてＢ細胞リンパ腫の生存率の顕著な増加が認められた。
【０００３】
抗ＣＤ２０ｍＡｂのリツキシマブを用いてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法は、過去３０年間においてリンパ増殖性疾患の処置における最も重要な進歩の１つを示す。その導入前には、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）などの疾病の処置の転帰においてわずかな改善しか見られなかった。しかしながら、特に様々な化学療法／放射線療法治療計画と組み合わせての、リツキシマブの使用は、これらの患者の生存率の統計値の全ての様相を有意に改善させた。さらに、リツキシマブは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの他の悪性疾患から、免疫性及び血栓性の血小板減少性紫斑病並びに関節リウマチなどの自己免疫疾患におよぶ、多くの他の血液疾患の処置に認可されているか、又は検討中である（Lim et al. Haematologica. 2010; 95(1): 135-143）。
【０００４】
抗ＣＤ２０抗体療法の成功にも関わらず、約半数の患者に抵抗性が生じ、結果として、処置に対して無応答であるか、又は、元来の疾病が早期に再発する。
【０００５】
ＣＤ２０の細胞表面密度に加えて、ＣＤ２０を発現している細胞の数も、初期の段階における抗ＣＤ２０ｍＡｂの感受性を決定することが明らかに示された（Tsai et al., 2012）。それ故、ＣＤ２０発現の調節の研究は、非常に関心がもたれる。
【０００６】
抗ＣＤ２０抗体に対する応答者対非応答者の分子識別は大きな臨床的関心事となり、抗ＣＤ２０抗体を用いての患者に最適化された治療管理を提供する際に医師を支援することのできる、予後予測バイオマーカーが、当技術分野において不変的に必要とされている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対する患者の応答性を予測するための方法に関し、該方法は、該患者から得られたＢ細胞におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルを測定する工程を含む。
【０００８】
ＧＡＰＤＨの高い発現レベルは、抗ＣＤ２０抗体による処置に対する応答を予測する。
【０００９】
ＧＡＰＤＨの高い発現を有する患者は、より高いＣＤ２０の発現、及び、抗ＣＤ２０抗体に基づいた療法に対するより良好な応答を示す。
【００１０】
発明の詳細な説明
「抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対する患者の応答性を予測する」という表現は広義に理解されるべきであり、それは、抗ＣＤ２０抗体を用いてのあらゆる処置を開始する前になされた予測、及び、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置の最中になされた予測を包含する。
【００１１】
本発明の方法は、抗ＣＤ２０抗体療法に対する抵抗性の検出を可能とする。
【００１２】
したがって、本発明はまた、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置を受けている患者の抗ＣＤ２０抗体に対する抵抗性を検出するための方法に関し、該方法は、該患者から得られたＢ細胞におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルを測定する工程を含む。ＧＡＰＤＨの低い発現レベルは、抗ＣＤ２０抗体による処置に対する無応答を予測する。
【００１３】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）＋ＮＡＤ＋＋Ｐｉから１，３−ジホスホグリセリン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋への反応を触媒する。ＧＡＰＤＨは解糖系の重要な酵素である。
【００１４】
本発明によると、「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において同等に使用される。本明細書において使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、及び、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子をいう。したがって、抗体という用語は、完全抗体分子だけでなく、抗体断片又は抗体誘導体も包含する。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びディアボディが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１５】
好ましくは、前記抗ＣＤ２０抗体はモノクローナル抗体である。
【００１６】
ＣＤ２０標的化療法は周知であり、例えば、概説についてはvan Meerten et al. Neth J Med. 2009 Jul-Aug;67(7):251-9, Lim et al. Haematologica. 2010; 95(1): 135-143及び Cang et al. Journal of Hematology & Oncology 2012, 5:64を参照されたい。
【００１７】
「抗ＣＤ２０抗体」という用語は、ＣＤ２０抗原に対して指向される抗体をいう。ＣＤ２０抗原は、Ｂリンパ球上に発現されている。
【００１８】
抗ＣＤ２０抗体の例としては、リツキシマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ベルツズマブ、ＡＭＥ−１３３ｖ、トシツモマブ、ＧＡ−１０１が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
好ましくは、前記抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブである。
【００２０】
「患者」という用語は、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置から恩恵を受けそうな疾病に罹患しているあらゆる被験体（好ましくはヒト）をいう。
【００２１】
前記疾病は、好ましくは、Ｂ細胞の増殖又は過剰活性化を伴う疾病から選択される。該疾病は、非ホジキンＢ細胞リンパ腫、例えば濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、バーキットリンパ腫、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、白血病、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；及び自己免疫性疾患、例えば関節リウマチ、特発性自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、多発性硬化症、水疱性皮膚症（例えば天疱瘡、類天疱瘡）、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択され得る。
【００２２】
好ましくは、患者はＢ細胞リンパ腫患者、より好ましくはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者である。
【００２３】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、成人の非ホジキン（ＮＨ）リンパ腫の最も一般的なタイプである（Alizadeh et al., 2000）。ＤＬＢＣＬを、標準的な多剤アントラサイクリンを含有する化学療法であるシクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、オンコビン、プレドニゾン（ＣＨＯＰ）に加えて、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のリツキシマブ（Ｒ）を用いて処置した場合の、明白な延命効果にも関わらず、かなりの比率の患者（４０％）が依然として不十分な臨床転帰を示す。なぜなら、彼らは、第一選択のリツキシマブ併用化学療法に対する無応答、又は、初回化学療法後の部分的応答若しくは再発として定義される、処置の失敗を経験しているからである（Thieblemont and Gisselbrecht, 2009）。ＣＤ２０の細胞表面密度に加えてＣＤ２０を発現している細胞の数も、初期段階でのリツキシマブの感受性を決定することが明瞭に示された（Tsai et al., 2012）。
【００２４】
患者から得られたＢ細胞におけるＧＡＰＤＨの発現レベルは、細胞内のＧＡＰＤＨレベルを検出するのに適した任意の技術を使用して決定され得る。
【００２５】
典型的には、ＧＡＰＤＨの発現レベルは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）若しくは免疫組織化学的検査によって、又はＧＡＰＤＨ酵素活性を測定することによって決定され得る。
【００２６】
典型的には、Ｂ細胞は、生検材料から、好ましくはリンパ節生検材料から、又は血液試料から得られる。
【００２７】
Ｂ細胞を得るためにフローサイトメトリーが使用されてもよい。
【００２８】
Ｂ細胞内のＧＡＰＤＨの発現レベルを測定するための方法の一例は以下である：細胞を透過処理し、ＢＤサイトフィックス／サイトパーム溶液（BD Biosciences）を使用して固定し、４℃で２０分間インキュベートする。次いで、細胞をサポニン含有緩衝液（BD Perm/Wash）で洗浄し、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Abcam ab9485；希釈度１／１００）を含有する同緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートする。細胞を、サポニン含有緩衝液で２回洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合させた抗ウサギ抗体（希釈度１／１００）と共に４℃で３０分間同じ緩衝液中でインキュベートする。サポニン含有緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析する。
【００２９】
本発明の方法はさらに、ＧＡＰＤＨの発現レベルを、応答者群及び無応答者群の患者から得られた基準値と比較する工程を含み得、ＧＡＰＤＨ発現レベルの基準値との差の検出は、患者が、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対して応答者であるかそうでないかを示す。
【００３０】
「応答」患者は、抗ＣＤ２０抗体を用いて処置された場合に、臨床学的に有意な疾病の軽減を示す患者をいう。
【００３１】
抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対する応答性について試験した後に、患者は抗ＣＤ２０抗体を処方され得るか、又は、抗ＣＤ２０抗体による処置がすでに開始されている場合には、抗ＣＤ２０抗体による処置は継続され得る。
【００３２】
本発明の実施態様は、必要とする患者を抗ＣＤ２０抗体を用いて処置するための方法に関し、該方法は、以下の工程：
ａ）本発明に記載の応答性を予測するための方法を用いて、患者が、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対して応答性であるかどうかを同定する工程；及び
ｂ）抗ＣＤ２０抗体を用いて、同定された応答患者を処置する工程
を含む。
【００３３】
本発明はまた、必要とする患者を処置するための方法において使用するための抗ＣＤ２０抗体に関し、該方法は、以下の工程：
ａ）本発明に記載の応答性を予測するための方法を用いて、患者が、抗ＣＤ２０抗体を用いての処置に対して応答性であるかどうかを同定する工程；及び
ｂ）抗ＣＤ２０抗体を用いて、同定された応答患者を処置する工程
を含む。
【００３４】
したがって、本発明は、必要とする患者を処置するための方法において使用するための抗ＣＤ２０抗体に関し、該患者は、本発明に記載の応答性を予測するための方法を用いて応答性であると同定されている。
【００３５】
該方法は、あらゆる抗ＣＤ２０抗体による処置を開始する前に患者に対して実施されてもよく、該方法は、抗ＣＤ２０抗体による処置に対して応答性であろう患者の同定を可能とする。
【００３６】
あるいは、該方法は、抗ＣＤ２０抗体による処置をすでに受けている患者に対して実施されてもよく、該方法は、抗ＣＤ２０抗体による処置に対して依然として応答性である患者の同定を可能とする。
【００３７】
患者が抵抗性であると同定された場合、すなわち、抗ＣＤ２０抗体による処置に対してもはや応答性ではないと同定された場合、抗ＣＤ２０抗体による処置は中止するか、又は、Ｂ細胞におけるＣＤ２０発現を増加させるために適応させる。
【００３８】
本発明はさらに、以下の実施例及び図面によって説明されるだろう。しかしながら、この実施例及び図面は、いずれもしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＧＡＰＤＨの発現はＣＤ２０の発現を増加させ、抗ＣＤ２０抗体に基づいた療法を用いて処置されたＤＬＢＣＬ患者に対する好ましい予後予測因子である。Ａ．ｇａｐｄｈ ｍＲＮＡ発現レベルに従って分類されたＤＬＢＣＬ患者の全生存率のためのカプランマイヤー生存時間分析。
【図２】Ａ．正常酸素圧（２１％Ｏ２）又は低酸素圧（１％Ｏ２）中で２４時間インキュベートしたバーキットリンパ腫細胞株（Rａｊｉ細胞）におけるＧＡＰＤＨの発現。Ｂ．左：正常酸素圧（Ｎ）又は低酸素圧１％Ｏ２（Ｈｘ）で生バーキットリンパ腫Rａｊｉ細胞を４８時間インキュベートした後の、ＣＤ２０細胞表面発現上で得られた効果の代表的なヒストグラムの重ね合わせ。右：ＧＡＰＤＨ阻害剤のＫＡ（０．１μg/ml）で処置された（ＫＡ）又は処置されていない（−；ＤＭＳＯ）、正常酸素圧又は低酸素圧に４８時間曝された、生Rａｊｉ細胞上の蛍光強度（ＣＤ２０）の平均値の定量。
【図３】ヒト濾胞性リンパ腫ＲＬ細胞株においてＦＡＣＳ（平均蛍光強度）によって決定されたＣＤ２０の細胞表面発現及びＧＡＰＤＨの細胞内発現。
【図４】Ａ．Ｂ．処置及びｇａｐｄｈ ｍＲＮＡレベルに応じた、全生存率（ＯＳ）のカプランマイヤー曲線。（Ｒ−ＣＨＯＰ群（Ａ．）においてｇａｐｄｈ低い患者についてはｎ＝１１７、ｇａｐｄｈ高い患者についてはｎ＝１１６；ＣＨＯＰ群（Ｂ．）においてｇａｐｄｈ低い患者についてはｎ＝９１、ｇａｐｄｈ高い患者についてはｎ＝９０）。
【００４０】
実施例
実施例１
概要
代謝におけるその機能にも関わらず、癌における解糖酵素の役割は依然として解明されていない。ここで本発明者らは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＨＤ）はリンパ腫の悪性度及び血管新生を増加させたが、試験された他のどの解糖酵素も増加させなかったことを示す。機構的には、ＧＡＰＤＨは、ＴＮＦ受容体関連因子２（ＴＲＡＦ２）への結合を介してＮＦ−κＢを活性化し、その結果、ｈｉｆ−１αの転写の増加、及び、ＣＤ２０発現のアップレギュレーションが起こる。試験されたびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者の中で、より高いＧＡＰＤＨレベルを有する患者は、より多くのＣＤ２０発現を呈し、リツキシマブによる処置時により良好な転帰を示した。したがって、ＧＡＰＤＨは、ＣＤ２０の発現を支持するＮＦ−κＢ／ＨＩＦ−１の活性化を促進する正のフィードバックループに関与し、それ故、抗ＣＤ２０抗体療法を用いて処置されたＤＬＢＣＬ患者に対する好ましい予後予測因子となる。
【００４１】
序論
本研究は、特定の解糖酵素が、癌の発生及び化学療法に対する応答において役割を有し得るかどうかを調べるために行なわれた。それは主に、Ｅμ−Ｍｙｃトランスジェニックマウスモデルを使用して行なわれ、ここで、全ての動物は、解糖が非常に活発で悪性度の高いタイプの腫瘍であるヒト非ホジキンＢリンパ腫（Harris et al., 1988）に似ているクローン性プレＢ細胞リンパ腫又はＢ細胞リンパ腫を自然発生的に発達させている。本発明者らは、ＧＡＰＤＨが、リンパ腫増殖及び血管新生の増加に寄与するが、試験された他のどの解糖酵素も寄与しないと決定した。機構の研究により、ＧＡＰＤＨによるＨＩＦ−１αの調節は、ＮＦ−κＢ活性化によって媒介され、このプロセスは、ＴＲＡＦ２とＧＡＰＤＨの相互作用によって駆動されることが判明した。重要なことには、低酸素圧におけるＧＡＰＤＨにより媒介されるＮＦ−κＢ／ＨＩＦ−１α系の制御によりＣＤ２０の発現は増加し、その結果、ＧＡＰＤＨを高度に発現しているＤＬＢＣＬ患者は、リツキシマブに基づいた処置時により良好な生存率を呈することが可能となる。
【００４２】
結果
ＧＡＰＤＨの発現の増加は、ｃＭｙｃにより駆動されるリンパ腫形成を加速する
Ｅμ−Ｍｙｃマウスは、非常に悪性度の高いリンパ腫を発達させ、生誕から数か月後に死滅する。Ｅμ−Ｍｙｃマウスの全寿命をモニタリングすることによって、本発明者らは、それらのマウスの大半を、２つの群に再分類することができることを観察した：非常に悪性度の高いリンパ腫を発達しているマウス（「高い」、１１週未満の生存期間中央値、ｎ＝１５）に対して、より悪性度の低いリンパ腫を発達しているマウス（「低い」、２０週間を超える生存期間中央値、ｎ＝１０）。ワールブルク効果と一致して、本発明者らは、非常に悪性度の高いリンパ腫は、より悪性度の低いリンパ腫よりも、より解糖が活発であることを観察した。なぜなら、それらはインビボでより多くの乳酸を産生しているからである。驚くべきことに、本発明者らがいくつかの解糖酵素の発現をモニタリングした場合、本発明者らは、唯一ＧＡＰＤＨのみが、「低い」群と比較して「高い」悪性度の群において有意に過剰発現されている（２倍）ことを観察した。ＧＡＰＤＨタンパク質レベルのこのような増加は、「高い」群のリンパ節におけるＧＡＰＤＨ比活性の増加と密接に相関していた。
【００４３】
リンパ腫の悪性度におけるＧＡＰＤＨの役割を評価するために、Ｅμ−Ｍｙｃマウスから単離された一次Ｂリンパ腫細胞を、内因性ＧＡＰＤＨについて安定的にサイレンス状態とさせたか（ｓｈｇａｐｄｈ）又はさせなかった（ｓｈｃｔｌ）（実験手順を参照）。ＧＡＰＤＨ発現の部分的な減少は、インビトロでのＥμ−Ｍｙｃ細胞の増殖に影響を及ぼさなかったが、Ｅμ−Ｍｙｃ−ｓｈｇａｐｄｈ細胞を注射されたマウスは対照よりも長く生き延び、腋窩リンパ節の総重量の減少を呈した。本発明者らは、屠殺時に、Ｅμ−Ｍｙｃ−ｓｈｇａｐｄｈ細胞から得られたリンパ節腫瘍が、実際に、対照と比較して、ＧＡＰＤＨ発現及びＧＡＰＤＨ比活性の減少を呈していたことを確認した。本発明者らはまた、リンパ節腫瘍から収集された細胞が、各群において同程度のＣＤ１９＋／ＧＦＰ＋細胞を有していたことを確認した。
【００４４】
リンパ腫の進行に対するＧＡＰＤＨの発現の具体的な役割をさらに確認するために、本発明者らは、一次Ｅμ−Ｍｙｃリンパ腫細胞においてＧＡＰＤＨを過剰発現させた。ＧＡＰＤＨの過剰発現は、リンパ腫の増殖を有意に加速させ、それ故、対照群（ｐＭＩＧ）と比較してマウスの寿命を縮める。ＧＡＰＤＨ−Ｖ５とは対照的に、Ｖ５でタグ化されたエノラーゼ―１（ＥＮＯ１−Ｖ５、別の律速ではない解糖酵素）又はピルビン酸キナーゼＭ２（ＰＫＭ２−Ｖ５、解糖の最後の律速酵素）の過剰発現は、対照細胞を用いて得られた寿命と比較して、マウスの寿命を改変させなかった。ＧＡＰＤＨ過剰発現時における生存期間の減少は、インビトロでの基礎（正常酸素圧）条件での同じ増殖速度にも関わらず、他の群と比較して、リンパ節のサイズの増加と密接に相関していた。屠殺時に、本発明者らは、各群からリンパ腫細胞を単離し、ＧＡＰＤＨ−Ｖ５発現細胞は、他の群と比較して、ＧＡＰＤＨ比活性の増加を実際に呈していることを確認した。特に、類似の結果が、独立したＥμ−Ｍｙｃクローンを使用して得られた。
【００４５】
分析時に、本発明者らは、ＧＡＰＤＨ−Ｖ５を発現しているリンパ腫細胞を注射されたマウスが、より大きなリンパ節を有することを観察しただけでなく、さらに、それらは、対照よりも多くの血管新生を起こし、これは、ｉ）ヘモグロビン含量の増加、ｉｉ）リンパ節内の内皮ＣＤ３１マーカーについて染色された血管新生化構造の増加、及びｉｉｉ）血管新生因子ｖｅｇｆ−αのｍＲＮＡの増加によって示される。興味深いことに、低酸素誘導転写因子ｈｉｆ−１αのαサブユニットのｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨを過剰発現しているリンパ腫細胞においてはより高かったが、ＥＮＯ又はＰＫＭ２を過剰発現しているリンパ腫細胞においてはそうではなかった。本発明者らの観察をさらに一般化するために、本発明者らは、リアルタイムｑＰＣＲによってＤＬＢＣＬ患者のそうした遺伝子の発現を分析した。分析された１３個のＤＬＢＣＬ患者試料の中で、６つがｇａｐｄｈ ｍＲＮＡの「低い」発現体であり、７つが「高い」発現体であった（実験手順を参照）。インビボにおいてＥμ−Ｍｙｃモデルを使用して観察されたように、最も高いレベルのＧＡＰＤＨを発現している患者は、ｇａｐｄｈの「低い」発現者と比較して、高いレベルのｈｉｆ−１α及びｖｅｇｆ−α ｍＲＮＡを呈しているが、ｈｉｆ−２α ｍＲＮＡは呈していない。
【００４６】
要するに、本発明者らの結果は、ＧＡＰＤＨの過剰発現は、リンパ腫の悪性度の増加に関与するが、試験された他のどの解糖酵素も関与しないことを示唆する。
【００４７】
ＧＡＰＤＨは、ＴＲＡＦ２への結合を通してＮＦ−κＢの活性化を調節し、ＨＩＦ−１αの誘導をもたらす
本発明者らはｉ）ＧＡＰＤＨを過剰発現しているリンパ腫の腫瘍増殖及び血管新生の増加、ｉｉ）ｈｉｆ−１α及びＨＩＦ−１により誘導されたｖｅｇｆ−αのｍＲＮＡレベルのＧＡＰＤＨ依存性増加を観察したので、本発明者らは、低酸素圧におけるＨＩＦ−１α発現及びＨＩＦ−１活性に対するＧＡＰＤＨ発現の結果を調べた。本発明者らは、一次Ｅμ−Ｍｙｃ細胞及びＨｅＬａ細胞において、ＧＡＰＤＨの過剰発現が、２４時間の低酸素圧後に、ＨＩＦ−１αの発現及びＨＩＦ−１の転写活性を増加させることができたことを観察した。過剰発現時に得られたＧＡＰＤＨの発現／活性のレベルが、２４時間の低酸素圧後に観察されたＧＡＰＤＨの生理学的過剰発現と一致することは注目に値する。Ｅμ−Ｍｙｃ細胞においてインビボで観察されたｈｉｆ−１αの転写のアップレギュレーションが、ＧＡＰＤＨを過剰発現しているＨｅＬａ細胞において確認された。
【００４８】
さらに、ＧＡＰＤＨ発現時に観察されたＨＩＦ−１α発現の増加は、ＰＫＭ２又はＥＮＯ１の発現時には得られず、このことは、効果の特異性を示す。近年実証されたように（Luo et al., 2011）、本発明者らは、ＰＫＭ２の過剰発現は、ＨＩＦ−１αの発現を安定化させることができないが、ＨｅＬａ細胞においてその活性を増加させることを確認した。本発明者らは、ＧＡＰＤＨの過剰発現は正常酸素圧では細胞増殖に影響を及ぼすことができなかったが、細胞が低酸素圧において解糖及び増殖速度を３０％増加させることを可能とすることをインビトロで確立した。これらの結果は、ＧＡＰＤＨが低酸素圧においてＨＩＦ−１を活性化する能力と矛盾しない。
【００４９】
次いで、本発明者らは、Ｅμ−Ｍｙｃ細胞及びＨｅＬａ細胞において、ｓｈＲＮＡを使用したＧＡＰＤＨレベルの低減が、低酸素圧においてｈｉｆ−１α ｍＲＮＡレベルの減少、ＨＩＦ−１αタンパク質発現の減少、及びＨＩＦ−１標的化遺伝子の発現の減少をもたらしたことを確認した。結果として、解糖及び増殖は、低酸素圧において有意に減少した。興味深いことに、ＧＡＰＤＨの特異的阻害剤であるコニンギン酸（ＫＡ）の無毒性用量の使用は、ＧＡＰＤＨの活性を５０〜６０％減少させ、ＧＡＰＤＨを標的化するｓｈＲＮＡを用いて観察されたＨＩＦ−１活性及びＨＩＦ−１αの発現の減少を模倣することができた。
【００５０】
ｈｉｆ−１α転写の重要な調節因子であるＮＦ−κＢは、Ａｋｔによって一部制御されているので、そして本発明者らは近年、ＧＡＰＤＨが活性形のＡｋｔを安定化させることができることを確立したので（Jacquin et al., 2013）、本発明者らは、ＧＡＰＤＨ発現時のＮＦ−κＢの活性化を調べた。そのことについては、ＧＡＰＤＨを安定に発現している（ＧＡＰＤＨ−Ｖ５）又は発現していない（ｐＭＩＧ）Ｅμ−Ｍｙｃ細胞又はＨｅＬａ細胞を、正常酸素圧又は低酸素圧において２４時間培養した。本発明者らは、低酸素圧においてＧＡＰＤＨは、Ａｋｔのリン酸化を増加させることができるだけでなく、正常酸素圧及び低酸素圧でもＩκＢαのＳｅｒ３２−３６のリン酸化を増加させることができることを確認した。結果として、ＮＦ−κＢの転写活性は、ＧＡＰＤＨを過剰発現させた場合には増加するか、又は、ＧＡＰＤＨをサイレンス状態にした場合には減少した。ＧＡＰＤＨの発現は、リン酸化Ａｋｔを安定化させるが、Ａｋｔの特異的阻害剤を使用したＡｋｔ活性化の阻害は、ＩκＢαのリン酸化を妨げなかった。それ故、ＧＡＰＤＨは、Ａｋｔ非依存的な様式でＮＦ−κＢ経路の活性化を誘導することができる。
【００５１】
ＧＡＰＤＨによるＨＩＦ−１αの調節におけるＮＦ−κＢの寄与をさらに調べるために、本発明者らは、ドミナントネガティブ型のＩκＢα（ＩκＢαＳ３２−３６Ａ）を使用した。ＩκＢαＳ３２−３６Ａの発現は、ＮＦ−κＢの活性及びＨＩＦ−１αタンパク質の発現を崩壊させ、このことは、ＧＡＰＤＨ依存的なＮＦ−κＢの活性化が、ＧＡＰＤＨにより媒介されるＨＩＦ−１αの調節に必要とされることを示す。興味深いことに、この観察は、ＤＬＢＣＬ患者の試料において確認された。なぜなら、ｇａｐｄｈの「高い」発現者は、ＮＦ−κＢの特異的標的であるｎｆｋｂｉａ ｍＲＮＡの増加した発現を呈し、これは、ＮＦκＢの活性化を反映している（Bottero et al., 2003）。
【００５２】
古典的ＮＦ−κＢ経路が実際にＧＡＰＤＨによって活性化されたことを実証するために、ｇａｐｄｈをサイレンス状態としたＨｅＬａ細胞を、低酸素圧においてＴＮＦαを用いて刺激した。結果として、ｇａｐｄｈをサイレンス状態とした細胞は、ＴＮＦαを用いて刺激した対照細胞と比較して、ＮＦ−κＢ活性を完全に増強させることができなかった。本発明者らはさらに、電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）アッセイを使用してバーキット細胞株Rａｊｉを使用してＮＦ−κＢ活性化に対するＧＡＰＤＨの役割を確認した。ＴＮＦαによる刺激又は低酸素圧でのインキュベーションは、ＮＦ−κＢのその共通配列への結合を増強させるが、ＫＡを使用したＧＡＰＤＨの阻害は、低酸素圧におけるその結合を減少させ、低酸素圧のＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢの転写活性を妨げた。
【００５３】
細菌感染時に、宿主細胞の炎症応答が抑制され、このプロセスにはＧＡＰＤＨ−ＴＲＡＦ２の相互作用の破壊が関与していることが近年実証された（Gao et al., 2013）。結果として、本発明者らはＥμ−Ｍｙｃ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるＧＡＰＤＨ−ＴＲＡＦ２の結合を調べ、細胞を低酸素圧において培養すると、ＧＡＰＤＨはＴＲＡＦ２と共免疫沈降することができたことを証明した。低酸素圧におけるＫＡを用いてのＧＡＰＤＨの特異的阻害及び部分的阻害は、ＧＡＰＤＨ−ＴＲＡＦ２の相互作用の消失の結果として、ＮＦ−κＢの活性を減少させる。本発明者らはさらに、インビボにおいてこの相互作用を試験した。そのことについては、Ｅμ−Ｍｙｃを有するマウスを、ＰＢＳを用いて又は共有結合性の阻害剤であるコニンギン酸を用いて１回処置（腹腔内）し、ＧＡＰＤＨ／ＴＲＡＦ２相互作用を、処置から２４時間後に組織における共免疫沈降によって調べた。非常に興味深いことに、本発明者らは、ＧＡＰＤＨはインビボにおいてＴＲＡＦ２に結合することができ、有効量のＫＡ（５mg/kg）はそのような内因性タンパク質間に観察された相互作用を低減させたが、無効量のＫＡ（０．５mg/kg）では低減させなかったことを確認することができた。次いで、本発明者らは、インビボにおいて、ＧＡＰＤＨの阻害（ＫＡ ５mg/kgを使用して）が、インビボにおいて、ＧＡＰＤＨとＮＦ−κＢとＨＩＦ−１αの発現間の連鎖の基礎をなすｈｉｆ−１α ｍＲＮＡを低減させたことを確認した。
【００５４】
ＧＡＰＤＨ−ＮＦ−κＢとリンパ腫悪性度との間の基礎をなす連鎖をさらに解明するために、本発明者らは、酵素の解糖機能を維持することができない、ＧＡＰＤＨ二重突然変異体（ＤＭ、ＧＡＰＤＨ Ｃ１５２Ｓ、及びＨ１７９Ｆ）を使用した（Colell et al., 2007）。本発明者らは、ＤＭは、野生型ＧＡＰＤＨと比較して、ＴＲＡＦ２に結合することができず、ＮＦ−κＢを活性化することができず、低酸素圧Ｅμ−ＭｙｃにおいてＨＩＦ−１αの発現を上昇させることができなかったことを確認し、このことは、酵素の触媒部位が、効果に役割を果たしていることを示唆する。
【００５５】
結果として、ＤＭを過剰発現しているＥμ−Ｍｙｃ細胞は、ＧＡＰＤＨの過剰発現とは対照的に、インビボにおいてリンパ腫の進行を増加させることができなかった。特に、ＧＡＰＤＨを発現しているＥμ−Ｍｙｃ細胞とＢｃｌ−ｘＬを発現しているＥμ−Ｍｙｃ細胞との間に有意な差は全く観察できなかった（Ｂｃｌ−ｘＬは、非常に悪性度の高いリンパ腫の誘導因子と考えられている）。最後に、ＧＡＰＤＨは、ＮＦ−κＢ及びＨＩＦ−１の活性化の結果として、ＶＥＧＦ総分泌量の増加をもたらしたが、ＤＭの発現もＢｃｌ−ｘＬの発現も増加をもたらさなかった。本発明者らは、マウスの屠殺時に、ＧＡＰＤＨを発現しているＥμ−Ｍｙｃ細胞のみが、より多くのＧＡＰＤＨ活性を呈し、示されたタンパク質の発現は、注射されたマウスのリンパ節において観察することができたことを確認した。
【００５６】
本発明者らの所見は、ＧＡＰＤＨが、試験された他の解糖酵素とは対照的に、インビボにおいてリンパ腫の増殖及び血管新生を増加させることができ、この効果は、少なくとも部分的には、ＧＡＰＤＨがＴＲＡＦ２に結合する能力によって媒介され、これは次いでＮＦ−κＢの活性化、続いてＨＩＦ−１の活性化に寄与する。
【００５７】
ＧＡＰＤＨ依存性のＮＦ−κＢ／ＨＩＦ−１αの活性化により、リンパ腫細胞においてＣＤ２０の過剰発現がもたらされる
反直感的に、ＨＩＦ−１α発現の増加は、Ｒ−ＣＨＯＰを用いて処置されたＤＬＢＣＬ患者における好ましい予後予測因子であることが近年示唆された（Evens et al., 2010）。本発明者らは、ＧＡＰＤＨが低酸素圧においてＨＩＦ−１αの発現を増加させることを観察したので、本発明者らは、本発明者らが以前にｑＰＣＲによってｇａｐｄｈのｍＲＮＡレベルを分析し、かつ診断時にリツキシマブに基づいた化学療法を用いて全てのヒトが処置された、ＤＬＢＣＬ患者の全生存率を調べた。顕著なことには、「高い」レベルのｇａｐｄｈ ｍＲＮＡを有するＤＬＢＣＬを呈する患者の１００％が、診断から３５０日後にも依然として生存していたが、ｇａｐｄｈの「低い」群においては僅か３３％であった。このＨＩＦ−１α依存性の好ましい予後が、ＣＨＯＰ処置患者ではなく、Ｒ−ＣＨＯＰ処置患者において観察されたことが分かっているので（Evens et al., 2010）、本発明者らは、ｍｓ４ａ１（ＣＤ２０をコードする遺伝子）の発現を調べ、ｇａｐｄｈの「高い」ＤＬＢＣＬ試料は、ｇａｐｄｈの「低い」群よりも多くのｍｓ４ａ１発現を呈することを明らかにした。ＧＡＰＤＨ及びＣＤ２０の発現の免疫組織化学的分析は、ＤＬＢＣＬ生検材料（患者１番及び２番）におけるＧＡＰＤＨの弱い発現（陽性細胞の低い比率によって示される）が、ＣＤ２０の皆無の発現／低い発現に相関することを確認した。対照的に、高いＧＡＰＤＨの発現（患者３番及び４番）はＣＤ２０の強力な発現を伴い、これはさらに、患者試料におけるＧＡＰＤＨの発現とＣＤ２０の発現との間の相関の基礎をなす。
【００５８】
ＣＤ２０発現の機構を深く研究するために、本発明者らは、２４時間の低酸素圧時に、一次Ｅμ−Ｍｙｃ細胞は、正常酸素圧と比較して、ｍｓ４ａ１のｍＲＮＡレベルの２倍の増加を示すことを観察した。本発明者らはまた、ＫＡを使用したＧＡＰＤＨのインビボでの阻害により、ＧＡＰＤＨがＴＲＡＦ２に結合できなくなり、ｈｉｆ−１αの発現の減少がもたらされ、結果として、リンパ腫を有するマウスにおいてｍｓ４ａ１の発現が減少したことを確立した。次いで、本発明者らは、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Rａｊｉを使用したＣＤ２０細胞表面発現に対する低酸素圧の効果を確認した。
【００５９】
追加の結果
この観察を伸展させるために、本発明者らは、４１４人の患者の大規模な一次ＤＬＢＣＬ発現プロファイルデータセットを使用した（Lenz et al, N Engl J Med 2008; 359:2313-2323）。上記のように、本発明者らは、Ｒ−ＣＨＯＰ処置患者を、各解糖遺伝子の「高い」発現者及び「低い」発現者として分類した。最初の観察と同じように、９個の解糖酵素の中で（ｇａｐｄｈ、ヘキソキナーゼ−２（ｈｋ２）、ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｇｉ）、筋ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋｍ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ｐｇｋ−１）、ホスホグリセリン酸ムターゼ−１（ｐｇａｍ１）、エノラーゼ−１（ｅｎｏ１）、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋ）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ−ａ（ｌｄｈ−ａ））、ｇａｐｄｈ発現レベルのみが、上昇した場合に、Ｒ−ＣＨＯＰ処置時に好ましい転帰を規定した（図４Ａ、ｐ＝０．０３）。興味深いことに、ｇａｐｄｈの発現は、ＣＨＯＰ処置患者において全生存率の差を全く示さなかった（図４Ｂ）。
【００６０】
考察
代謝の差が、正常細胞と癌細胞との間に同定された最初の変化であった。実際に、癌細胞は、様々な方法を発達させて、代謝に適応して、不適切な細胞増殖を支持し、そして異常な組織環境において生存を維持しなければならない。全てではなくても大半の解糖酵素が、大半の癌において過剰発現されていることが判明しているが（Altenberg and Greulich, 2004）、発癌におけるその役割は、解明には程遠い。解糖酵素の過剰発現は、癌細胞のエネルギー需要を満たすためにだけ必要とされると長く考えられていた。しかしながら、近年、そうした酵素の解糖以外の役割が、いくつかの状況において出現し始めているが、癌の環境においては稀である（Chang et al., 2013; Colell et al., 2007; Jacquin et al., 2013; Luo et al., 2011; Majewski et al., 2004; Yang et al., 2011）。
【００６１】
ここで、本発明者らは、ＧＡＰＤＨが、ｃ−ｍｙｃ依存性リンパ腫形成の重要な調節因子であるが、試験された他のどの解糖酵素もそうではないというエビデンスを提供する。本発明者らは、低酸素圧条件では、ＧＡＰＤＨはＴＲＡＦ２に結合し、その結果、ＩκＢのリン酸化及びＮＦ−κＢの活性化が起こることを確立した。一連のエビデンスは、ＧＡＰＤＨが、ＮＦ−κＢシグナル伝達の調節に関与している可能性があるが（Bouwmeester et al., 2004; Gao et al., 2013; Mookherjee et al., 2009）、低酸素圧条件下及び／又は癌の環境においては決して関与しないと示唆した。本発明者らは初めて、ＧＡＰＤＨ依存性のＮＦ−κＢの活性化が、正常酸素圧及び低酸素圧の両方においてｈｉｆ−１αの転写の増加、及び、低酸素圧におけるＨＩＦ−１αタンパク質発現の増加をもたらすことを確立した。実際に、ＨＩＦは、αサブユニット（ＨＩＦα）及びβサブユニット（ＡＲＮＴとしても知られる）から構成される二量体である。低酸素圧条件下では、その分解は阻害され、これによりＨＩＦαの蓄積、ＨＩＦβとの二量体化が可能となり、核に移動し、ＨＩＦ−１αの標的遺伝子の転写を活性化する。本発明者らは、低酸素圧時に、ＧＡＰＤＨが、ＨＩＦ−１αの誘導、及びその転写活性のアップレギュレーションをもたらすことを実証した。ＧＡＰＤＨはＨＩＦ−１α標的化遺伝子の１つであることが分かっているので、ＧＡＰＤＨは、それらのタンパク質間の既存の正のフィードバックループの基礎をなす。
【００６２】
ＴＲＡＦ２−ＧＡＰＤＨの結合は、ＧＡＰＤＨ活性に関与する重要なアミノ酸（Ｃ１５２）の突然変異時に、又は、共有結合性のＧＡＰＤＨ阻害剤であるコニンギン酸の使用のいずれかによって破壊される。これらの条件において、ＧＡＰＤＨがＴＲＡＦ２に結合できないことにより、ＮＦ−κＢの活性は減少し、ＨＩＦ−１αの発現は減少し、そして野生型のＧＡＰＤＨとは対照的に、この突然変異型がインビボにおいてリンパ腫形成を増加させることができないことに密接に相関していた。ＴＮＦα刺激時にすでに示唆されていたように（Gao et al., 2013）、本発明者らは、酵素の解糖機能に必要とされるシステインであるＣ１５２が、ＧＡＰＤＨ−ＴＲＡＦ２の結合、及びＮＦ−κＢ／ＨＩＦの誘導にとって必須であることを確認した。解糖機能それ自体が必要とされるかどうかは、依然として不明である。なぜなら、Ｃ１５２突然変異はまた、ＧＡＰＤＨの解糖以外の機能に対しても影響を及ぼすであろうからである（Colell et al., 2007; Gao et al., 2013; Hara et al., 2005）。
【００６３】
ＧＡＰＤＨが核酸と相互作用することができることは十分に確立されている。概説については（Colell et al., 2009）。ＧＡＰＤＨは、ＡＵリッチ配列に対する選択性を有する、ＲＮＡ結合タンパク質としてさらに特徴付けられ、酵素のロスマンフォールドに結合活性を局在させていた（Nagy et al., 2000）。ＧＡＰＤＨはｍＲＮＡの安定性を調節し、結果として、エンドセリン−１（Rodriguez-Pascual et al., 2008）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）（Zhou et al., 2008）、又はインターフェロン−γ（Chang et al., 2013）などのタンパク質の発現を制御する。それ故、本発明者らは、低酸素圧時にＧＡＰＤＨがＮＦ−κＢ／ＨＩＦ経路を活性化できることに加えて、ＧＡＰＤＨのＲＮＡ結合能もまた、ｈｉｆ−１ａ及び／又はｖｅｇｆ−α ｍＲＮＡの安定化に一部寄与し得ることを排除することはできない。
【００６４】
低酸素圧時におけるＧＡＰＤＨ発現はさらに、ｖｅｇｆ−αの発現及びＶＥＧＦの分泌総量をインビボで刺激し、このことは、ＧＡＰＤＨによるＮＦ−κＢ／ＨＩＦ経路の誘導能を通して、ＧＡＰＤＨは、癌進行において以前に認識されていたよりもより広範な役割を果たしている可能性があることを示唆する。いくつかの腫瘍は、増殖するためだけでなく、その生存を容易にするために、解糖代謝を採用する可能性があると推測することは興味をそそる。
【００６５】
近年、ＨＩＦ−１α発現の増加は、ＣＤ２０の発現を増強させ得、ＣＨＯＰではなくＲ−ＣＨＯＰを用いて処置されたＤＬＢＣＬ患者に対する好ましいマーカーとなることが示唆された（Evens et al., 2010）。大半の報告は、ＨＩＦ−１αの発現増加は、転移リスクの増加及び／又は劣る生存率に関連すると記載していたが、ＨＩＦ−１αと、改善された転帰との相関には、前例がある（Beasley et al., 2002; Lidgren et al., 2005）。これらの所見は、ＧＡＰＤＨ発現はＮＦ−κＢ／ＨＩＦシグナル伝達を制御することによって、ＣＤ２０発現の中心的な調節因子であるという興味深い意見を示唆する。実際に、本発明者らは、ＧＡＰＤＨの発現増加は、患者の生検材料におけるＣＤ２０の発現増加と相関し、ＧＡＰＤＨの阻害は、ＴＲＡＦ２へのＧＡＰＤＨの結合を妨げ、低酸素圧時にｍｓ４ａ１（ＣＤ２０遺伝子）の発現及びＣＤ２０の細胞表面発現を減少させることを確立した。さらに、本発明者らは、Ｒ−ＣＨＯＰを用いて処置されたＤＬＢＣＬ患者は、ＧＡＰＤＨが高度に発現されていた場合には優れた転帰を示したことを発見した。最後に、本発明者らは、ＣＤ２０が、ＧＡＰＤＨ及びＨＩＦ−１α依存的に、低酸素圧時に過剰発現されたことを確立した。興味深いことに、ＣＤ２０の正の調節に関与する同定された調節因子の中に、ＩＲＦ４／ＰＵ．１があり（Himmelmann et al., 1997）、これはＮＦ−κＢの２つの特徴付けられた標的である（Bonadies et al., 2010; Grumont and Gerondakis, 2000）。結果として、文献の複合エビデンスにより、ＧＡＰＤＨを通したＮＦ−κＢの活性化は、ＣＤ２０の転写制御に関与している可能性があることが示唆される。
【００６６】
ＣＤ２０のダウンレギュレーションは、リツキシマブに基づいた療法に対して不応答性となった再発／難治性Ｂ細胞リンパ腫患者の多くの症例報告において観察され、リツキシマブ抵抗性に寄与する最も重要な原因の１つであると推測されている（Haidar et al., 2003; Jilani et al., 2003）。本発明者らは、処置中の腫瘍細胞の代謝の改変を伴うＧＡＰＤＨ発現の改変が、ＣＤ２０の発現のダウンレギュレーションに関与している可能性があると推測することができた。
【００６７】
非ホジキンリンパ腫の前臨床モデル及び臨床試料を使用して、本発明者らは、ＧＡＰＤＨが、ｍｙｃにより誘導されるリンパ腫形成において２つの役割を有し、腫瘍の悪性度及び血管新生を増加させるが、それは、ＣＤ２０の発現を増強させ、抗ＣＤ２０抗体に基づいた処置に対する患者の応答を増加させることを確立した。ｃ−Ｍｙｃは全てのヒト腫瘍の約７０％未満においてアップレギュレーションされていることが判明し、ＧＡＰＤＨは大半の種類の腫瘍において広く過剰発現されているので、本発明者らの観察は、他の種類の癌にもより広く関連している。
【００６８】
実験手順
安定なトランスジェニック細胞
ＧＡＰＤＨを過剰発現しているＨｅＬａ細胞を、以前に記載のように感染させた（Colell et al., 2007）。一次Ｅμ−Ｍｙｃ細胞の形質導入は以前に記載のように行なわれた（Beneteau et al., 2012）。形質導入から１週間後、感染させた細胞集団を、ＧＦＰ陽性細胞についてフローサイトメーターBD Ariaによって選別し、関心対象のタンパク質の発現をイムノブロットによって評価した。
【００６９】
共免疫沈降
プロテインＧセファロース４Ｂビーズ（Invitrogen, CA, USA）をまず、ウサギ抗ＴＲＡＦ２抗体又はマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体又はＩｇＧ対照（Santacruz, CA, USA）と共に４℃で４時間インキュベートした。次いで、ビーズを、２０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１．５mM ＭｇＣｌ２、１μg/μl ＰＭＳＦ、プロテアーゼ、及びホスファターゼ阻害剤混液（Thermo Scientific）に溶解した予め清澄化されたタンパク質１mgと共に一晩インキュベートした。次いで、試料を５回洗浄し、Laemmli緩衝液中で煮沸し、示された抗体を用いてのイムノブロットによって分析した。
【００７０】
ＣＤ２０の発現についての染色
細胞（０．５×１０６個の細胞）（３回繰り返し）を１×ＰＢＳで洗浄し、２．５μg/mlの濃度のモノクローナル抗ＣＤ２０抗体（Affymetrix eBioscience）と共に４℃で４５分間インキュベートした。ＩｇＧアイソタイプ対照を含めた。次いで、細胞を２×ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８抗マウス抗体（１μg/ml）と共に暗所で４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．５μg/mlのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を含有しているＰＢＳ １００μlに再懸濁した。１万回のイベントを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析機器（Miltenyi Biotec）を使用したフローサイトメトリーによって直ちに分析した。生（ＤＡＰＩ陽性）ＣＤ２０陽性細胞について得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）を報告した。ヒストグラムは、３回の独立した実験の平均を示す。
【００７１】
トランスジェニックマウス、リンパ腫の移植、及びリンパ節の分析
全てのマウスを、特定病原体フリーの条件で維持し、実験手順は、動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって、及び地域倫理委員会（regional ethics committee）（Comite Institutionnel d’Ethique Pour l’Animal de Laboratoire - AZURのＮＣＥ／２０１１−３５）によって承認された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｅμ−Ｍｙｃトランスジェニックマウスは、ジャクソン研究所から購入した。リンパ腫を有する動物は、苦しんでいる兆候を呈するとすぐに頸椎脱臼によって屠殺した。Ｅμ−Ｍｙｃ細胞を得て、以前に記載されているように（Beneteau et al., 2012）使用した。病気の最初の兆候は、鼠径リンパ節の触診、及びHemavet 950FS（Drew Scientific, INC, France）を用いての血液試料の分析によって決定された。屠殺時に全てのリンパ節腫瘍を直ちに回収し、秤量し、その後、凍結させるか、又は生存ＣＤ１９陽性細胞及びＧＦＰ陽性細胞についてＦＡＣＳによって分析した。ＯＣＴ（Thermoelectron Corp）に包埋した凍結リンパ節腫瘍を、ＣＤ３１の発現について免疫蛍光法に供された。凍結させた腫瘍組織を、細胞抽出緩衝液（Promega）に溶解した。腫瘍内ヘモグロビン含量を、Drabkin reagentキット５２５（Sigma）を使用することによって測定した。マウス又はヒトのＶＥＧＦの総量を、製造業者の推奨に従ってPepro Tech ＥＬＩＳＡキットを使用することによって測定した。
【００７２】
患者及び組織試料の調製
サンルイ病院（サンルイ病院、血液・腫瘍内科、パリ、フランス）で２００７年５月から２０１１年５月までにＤＬＢＣＬについて生検を受けた１３人の患者が選択された。患者は、治験に関して必要な情報を受け、同意が得られた。腫瘍の形態学的分類は、世界保健機構（ＷＨＯ）の基準に従って割り当てられた（Campo et al., 2011）。腫瘍の広がりは、アナーバーステージに従ってステージ分類され、全ての患者はＩＰＩａａによってスコアが付された（プロジェクト、１９９３）。全ての患者についての経過観察データを定期的に集めた。これらの患者の中で、８人が再発し（６１．５％）、６人（４６％）が死亡した。
【００７３】
免疫組織化学的検査
ホルマリンで固定されパラフィンに包埋されたＤＬＢＣＬ生検材料の切片（３μm）を標準的な手順を使用して処理し、ＧＡＰＤＨ（Prestige, Sigma, 1/400）、ＣＤ２０（１／８００クローンＬ２６ ＤＡＫＯ）、及びＣＤ７９Ａ（１／１００クローンＪＣＢ１１７Ｄａｋｏ）の発現について自動的に（Ventana）免疫染色した。
【００７４】
統計分析
データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表現される。各群間の計算された平均値の差異を、フィッシャー検定を使用して分析した（量的変数）。生存関数はカプランマイヤー法によって推定され、ログランク検定によって比較された。０．０５以下のＰ値が、統計学的有意を示すと判断された。カプランマイヤー生存曲線及びボックスプロット表示は、「Ｒ」ソフトウェアを使用して行なわれた。
【００７５】
無憎悪生存期間（ＰＦＳ）は、診断日から任意の原因で死亡した日又は中止した日まで測定された。後者の日に達しない場合には、データは、最後の経過観察評価の日に打ち切られた。生物学的連続変数を、標準的な分割検体アプローチを適用することによって二分した。得られた閾値は、コックスモデルのリスク関数にキュービック平滑化スプラインを含めることによって確認された。スプライン曲線を使用して、最善のカットオフ点を決定し、ｇａｐｄｈの「低い」及び「高い」ＤＢＣＬ発現者を識別した。
【００７６】
細胞培養及び低酸素圧への曝露
ＨｅＬａ細胞及びRａｊｉ細胞はＡＴＣＣから入手し、推奨された通りに培養した。マウス一次Ｅμ−Ｍｙｃリンパ腫（Ｂリンパ腫細胞）を、以前に記載されているように単離し（Lindemann et al., 2007）、１０％ＦＣＳ、２−メルカプトエタノール（５０μM）、Ｌ−アスパラギン（０．３７mM）及びＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、１０mM）の補充されたＤＭＥＭ中に維持した。１％Ｏ２の低酸素圧でのインキュベーションを、密封した嫌気的なワークステーション（Whitley hypoxystation H3）において３７℃で９５％の湿度及び５％ＣＯ２／９４％Ｎ２中で行なった。
【００７７】
試薬及び抗体
マウス抗Ｖ５抗体はInvitrogen（Carlsbad, CA, USA）から購入し、ウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体は（Abcam）から購入し、マウス抗Ｅｒｋ２抗体はSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）から購入した。免疫組織化学的検査のために使用されたウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体はSigmaから購入した「Prestige抗体」であった。免疫沈降法のために使用されたマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。ウサギ抗ＨＩＦ−１α抗体は調製され、J. Pouyssegur博士の研究所において確認された。抗ＣＤ１９−ＰＥ抗体はBD Bioscienceから購入した。モノクローナル抗ＣＤ２０抗体はAffymetrix eBioscienceから購入した。抗ＣＤ３１抗体はBD Pharmigenから購入した。他の抗体は、Cell Signaling Technology（Beverly, MA, USA）から購入した。ＧＡＰＤＨ特異的阻害剤であるコニンギン酸（ＫＡ）はEuromedexから購入した。
【００７８】
ＧＡＰＤＨ活性の測定
細胞を、１０mmol/LのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０mmol/LのＮａＣｌ、５mmol/LのＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、１０μg/mLのアプロチニン、１mmol/Lのフェニルメチルスルホニルフルオライド、及び１０μmol/Lのロイペプチンを含有している緩衝液（緩衝液Ａ）に溶解した。溶解液をタンパク質含量について標準化し、０．２５mmol/LのＮＡＤ、３．３mmol/LのＤＴＴ、１３mmol/LのＮａ４Ｐ２Ｏ７（ｐＨ８．５）、２６mmol/Lのヒ酸ナトリウム、及び２５mmol/LのＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸と共に黒色の９６穴プレート（Cellstar）中でインキュベートした。ＧＡＰＤＨ活性を、４４５nmでフルオロスキャンで測定した。なぜなら、蛍光の増加は、ＮＡＤＨの蓄積に関連していたからである。活性は、タンパク質１mgあたりの吸光度の変化として表現される。
【００７９】
プラスミド
完全長ヒトｇａｐｄｈ（ＧＡＰＤＨ−Ｖ５）及びｇａｐｄｈ二重突然変異体ＧＡＰＤＨＣ１５２Ｓ／Ｈ１７９Ｆ−Ｖ５（ＤＭ−Ｖ５）ｃＤＮＡを得、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ発現プラスミド（Invitrogen）に以前に記載されているように（Colell et al., 2007）挿入した。ｃＤＮＡライブラリー及び以下の古典的な方法を使用して、エノラーゼ１（ＮＰ＿００１４１９）、ＰＫＭ２（ＮＰ＿８７２２７０）をＰＣＲによってｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ発現プラスミド（Invitrogen）にクローニングし、Ｂｃｌ−ｘＬ（ＮＰ＿００１１８２）をｐｃＤＮＡ３にクローニングした。次いで、ＧＡＰＤＨ、ＤＭ、ＥＮＯ１、ＰＫＭ２、Ｂｃｌ−ｘＬをレトロウイルス感染のためにｐＭＩＧ−ＧＦＰウイルスベクターにサブクローニングした。
【００８０】
相補的なセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＳＵＰＥＲ ｒｅｔｒｏ．Ｎｅｏ＋ＧＦＰベクター（oligoengine）に挿入した。ルシフェラーゼを標的化するｓｈＲＮＡを、ルシフェラーゼアッセイ（空のｐＳＵＰＥＲ ｒｅｔｒｏ．Ｎｅｏ＋ＧＦＰベクターを使用した）以外は、対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈｃｔｌ）として使用した（Beneteau et al., 2012）。
【００８１】
ＲＮＡ抽出及びリアルタイム定量ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮＡ抽出キット（Qiagen）を使用して製造業者の説明書に従って細胞から抽出した。全ＲＮＡ（２μg）を、Omniscriptキット（Qiagen）を使用して逆転写ＰＣＲ ２０μlに加えた。ｇａｐｄｈ、ｈｉｆ−１α、ｃａ９、ｖｅｇｆ−α、ｌｄｈ−ａ（マウス及びヒト）の相対的ｍＲＮＡ発現レベルは、7500 Fast及びStep One（Applied Biosystems）で製造業者の説明書に従ってＴａｑＭａｎ ＰＣＲマスターミックス（Eurogentec）及びＴａｑＭａｎアッセイプライマーセット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用してリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって得られた（配列はリクエスト時に提供される）。インビトロでの実験のために、全ての試料をｒｐｌｐ０に対して正規化した。ヒト腫瘍組織からの全てのｍＲＮＡ試料をｐｐｉａ（シクロフィリン−ａ）によって正規化した。
【００８２】
ウェスタンブロット分析
簡潔に言えば、正常酸素圧又は低酸素圧に曝した後、細胞を洗浄し、laemmli緩衝液に溶解した。低酸素圧に曝された細胞は、低酸素圧チャンバーにおいて溶解された。タンパク質（４０μg）を８％〜１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜（Millipore）上に転写した。次いで、膜を、示されたタンパク質に対応する抗体を用いてブロットした。免疫反応性バンドを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗マウス抗体（Dako）又は抗ウサギ抗体（Cell Signaling）を用いて高感度ケミルミネッセンス法（Pierce）によって検出した。指定されている場合には、ウェスタンブロットによる定量を、ImageJソフトウェアを使用して行なった。
【００８３】
解糖速度の決定
インビトロ。ピルビン酸を含まないＤＭＥＭ中で１、３、６、９時間、正常酸素圧（Ｎ）又は１％Ｏ２の低酸素圧（Ｈｘ）のいずれかにおいてインキュベートされた細胞の上清中に報告された乳酸を、ｐＨ１０に調整された炭酸ナトリウム（６２０mM）−Ｌ−グルタミン酸（７９mM）緩衝液中に希釈された、９００μMのβ−ＮＡＤ（BioChemika）、１７５μg/mLのＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（BioChemika）、及び１００μg/mLのグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（Roche）を使用して、酵素に基づいたアッセイによって決定した。乳酸リチウムを標準物質として使用した。
【００８４】
インビボ。インタクトなリンパ節を、溶解緩衝液Ａ中で解離した。乳酸の濃度は記載の通りに決定され、タンパク質総量によって正規化された。
【００８５】
増殖アッセイ
ＨｅＬａ細胞（１×１０５個）を１００mmの皿に播種した。細胞を剥がし、播種から２４時間後及び３日間の間２４時間毎に計数した。Ｅμ−Ｍｙｃ細胞（４×１０５個の細胞／ml）をＴ−２５cm２フラスコに播種し、３日間毎日計数した。増殖指数を、それぞれの日に得られた細胞数を、播種から２４時間後に得られた細胞数で割ることによって計算した。
【００８６】
ルシフェラーゼアッセイ
ＨＩＦ−１活性。エリスロポエチン遺伝子由来の３コピーの低酸素圧応答性領域（ＨＲＥ）を含有している（Dayan et al., 2006）、ｐ３ＨＲＥ−Ｄｐｔｋ−ＬＵＣベクターを安定に発現しているＨｅＬａ細胞に、対照ベクター（ｐＭＩＧ又は空のｐＳＵＰＥＲベクター）又はＧＡＰＤＨを過剰発現させるか若しくはサイレンス状態とさせるためのベクター（２μg）を一過性にトランスフェクト（リン酸カルシウム）した。翌日、トランスフェクトされた細胞を正常酸素圧又は低酸素圧１％Ｏ２に２４時間曝し、その後、レポーター溶解緩衝液（Promega）中に細胞を溶解した。低酸素圧におけるＨＩＦ−１活性の決定のために、細胞を、低酸素圧チャンバーに直接溶解したことは注記するに値する。ルシフェラーゼアッセイを以前に記載されているように（Jacquin et al., 2013）行なった。
【００８７】
ＮＦ−κＢ活性
ＧＡＰＤＨ−Ｖ５又はＧＡＰＤＨ二重突然変異体（ＤＭ−Ｖ５）対照（ｐＭＩＧ）を安定に発現しているＨｅＬａ細胞に、古典的なリン酸カルシウム法によって、ｃＦＰをコードしているベクター ０．５μg及び最小ｔｋプロモーターと６回反復κＢ部位によって制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子 ２μg（κＢ×６ ｔｋ ｌｕｃ）を一過性に共トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を正常酸素圧又は低酸素圧１％Ｏ２のいずれかに２４時間曝し、その後、収集し、以前に記載されているように（Bottero et al., 2003）分析した。
【００８８】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
０．２μg/mlのＫＡで処理された又は処理されていない、正常酸素圧又は低酸素圧１％Ｏ２に２４時間曝されたRａｊｉ細胞からの全細胞抽出物を、以前に記載されているように（Bottero et al., 2003）調製した。移動度シフトアッセイのために、ＩｇκプロモーターのκＢ結合部位を含有している合成二本鎖オリゴヌクレオチドからなるＮＦ−κＢプローブを使用した。末端標識されたプローブ（Ｔ４キナーゼ）を、抽出物試料と共に３０℃で２０分間インキュベートした。複合体を、０．５×ＴＢＥ中５％非変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離した。乾燥させたゲルをオートラジオフィーにかけた。
【００８９】
ＣＤ３１の免疫蛍光
ＯＣＴ（Thermoelectron Corp）に包埋された凍結リンパ節腫瘍を、ＣＤ３１発現についての免疫蛍光法にかけた（補足資料を参照）。−２０℃で切断し（クリオスタット、Leica）、次いで、５μmのスライドをアセトン中−２０℃で２０分間かけて固定し、洗浄し、飽和させ、そして加湿チャンバー中で４℃でラット抗ＣＤ３１抗体（２．５μg/ml）を用いて一晩かけて染色した。インキュベーション後、カバーガラスを洗浄し、暗所でＤＡＰＩ（１μg/ml）及びＡｌｅｘａ４８８抗ラット抗体（２μg/ml）と共に室温で１時間インキュベートした。腫瘍スライドにフルオロマウントＧを載せ、共焦点顕微鏡（LSM 510 Meta Zeiss）を用いて分析した。
【００９０】
実施例２
方法及び材料
試薬
ＦＡＣＳ染色のために：抗ＧＡＰＤＨ抗体（Abcam）、抗ＣＤ２０抗体−ＦＩＴＣ（クローンＬ２６、eBioscience）を使用した。コニンギン酸（ＫＡ）はEuromedexから購入した。
【００９１】
細胞培養及び低酸素圧への曝露
Rａｊｉ細胞（ヒトバーキット非ホジキンＢリンパ腫細胞株）をＡＴＣＣから入手し、推奨されているように培養した。ＲＬ細胞（ヒト濾胞性非ホジキンＢリンパ腫細胞株）をPr. Charles Dumontetから入手し、記載のように（Dalle S et al, Clin Cancer Res, 2009, 15(3):851-7）培養した。低酸素圧でのインキュベーションを、密封した嫌気的なワークステーション（Whitley hypoxystation H35）において、１％Ｏ２で（正常酸素圧の２１％Ｏ２でのインキュベーションとは対照的に）、３７℃で、９５％の湿度及び５％ＣＯ２／９４％Ｎ２中で行なった。
【００９２】
ＣＤ２０及びＧＡＰＤＨの発現についての染色
全部で１×１０６個の細胞をＰＢＳで洗浄し、モノクローナル抗ＣＤ２０抗体（２．５μg/ml）（Affymetrix eBioscience）と共に４℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗マウス抗体（１μg/ml）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を透過処理し、ＢＤサイトフィックス／サイトパーム溶液（BD Biosciences）を使用して固定し、４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞をサポニン含有緩衝液（BD Perm/Wash）で洗浄し、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Abcam ab9485；希釈度１／１００）を含有している同緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をサポニン含有緩衝液で２回洗浄し、ＡＰＣに結合させた抗ウサギ抗体（希釈度１／１００）と共に同緩衝液中で４℃で３０分間インキュベートした。サポニン含有緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。その直後に、１０，０００回のイベントを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析機器（Miltenyi Biotec）を使用したフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ２０−低い、ＣＤ２０−高い、ＧＡＰＤＨ−低い、ＧＡＰＤＨ−高い細胞について得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）が報告された。
【００９３】
マイクロアレイデータ分析
生データ（ＧＳＥ１０８４６）を正規化し、ｊｕｓｔＲＭＡ関数（ａｆｆｙパッケージ）を使用してｌｏｇ２変換した。遺伝子がいくつかのプローブセットによって示された場合、強度の中央値が使用された。生存曲線を、カプランマイヤー法に従って、カットオフ点として中央値を使用してプロットし、ハザード比をコックス回帰を使用して得た。
【００９４】
結果
本発明者らはまた、バーキットリンパ腫及び濾胞性リンパ腫などの２つの他の非ホジキンＢリンパ腫におけるＣＤ２０の発現とＧＡＰＤＨの発現との間の関係を実証した（図２及び３）。ヒトバーキットリンパ腫では、Rａｊｉ細胞株を低酸素圧下でインキュベートして、ＧＡＰＤＨ発現を生理学的に増加させた（図２Ａ）。ＣＤ２０細胞表面発現は、低酸素圧に曝露されたRａｊｉ細胞において増加し（図３Ｂ）、このプロセスはＧＡＰＤＨ活性を通して媒介された。なぜなら、無毒性量のコニンギン酸を使用した特異的なＧＡＰＤＨの阻害は、この低酸素圧に依存的なＣＤ２０発現の増加を妨げたからである。ヒト濾胞性リンパ腫では、細胞表面でのＣＤ２０の低い発現レベルは、ＲＬ細胞株における細胞内ＧＡＰＤＨの低い発現と相関する。対照的に、高いレベルのＣＤ２０は、このモデルにおけるＧＡＰＤＨの高い発現レベルと関連している。
【００９５】
参考文献
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９６】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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