(57)【要約】本発明は、環状ポリヌクレオチドの組成物、並びにその調製、製造及び治療的使用の方法に関する。
2017522028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドであって、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
の配列を含み、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシドを含み；
ｎ及びｏは、独立に、１５〜１０００であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【化１】
2017522028.tif 000106
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり、ここで、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈが０であるとき、Ｒ４は、結合ではなく；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合し；並びに
前記環状ポリヌクレオチドが、コード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’ＵＴＲを含む、環状ポリヌクレオチド。
【請求項２】
［Ａｎ］及び［Ｂｏ］の少なくとも１つが、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩＩ：
【化２】
2017522028.tif 000107
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩である、
請求項１に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項３】
ｈが、０であり；Ｒ１３が、Ｈであり；Ｒ１４が、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルである、請求項２に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルが、メトキシである、請求項３に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項５】
Ｘ３が、ＳＨである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドであって、前記環状ポリヌクレオチドが、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
の配列を含み、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシドを含み；
ｎ及びｏは、独立に、１５〜１０００の整数であり；
Ｌ１は、結合であるか、又は式ＩＩＩ：
【化３】
2017522028.tif 000108
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合し、
ここで、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］の少なくとも１つは、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩＩ：
【化４】
2017522028.tif 000109
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
ここで、式ＩＶについて、Ｘ１、Ｘ２、若しくはＸ４の少なくとも１つは、ＮＨ又はＳであり；並びに
前記環状ポリヌクレオチドが、コード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’ＵＴＲを含む、環状ポリヌクレオチド。
【請求項７】
Ｘ１が、ＮＨである、請求項６に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項８】
Ｘ４が、ＮＨである、請求項６又は７に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項９】
Ｘ２が、Ｓである、請求項６に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１つの５’キャプ構造をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
（ｄ）ポリ−Ａ−テイルをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記コード領域、前記５’ＵＴＲ、前記３’ＵＴＲ、前記５’キャップ構造、又は前記ポリ−Ａ−テイルの１つが、［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］を含む、請求項１０又は１１に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記コード領域、前記５’ＵＴＲ、前記３’ＵＴＲ、前記５’キャップ構造、又は前記ポリ−Ａ−テイルの１つが、［Ａｎ］を含み、前記コード領域、前記５’ＵＴＲ、前記３’ＵＴＲ、前記５’キャップ構造、又は前記ポリ−Ａ−テイルのもう１つが、［Ｂｏ］を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記５’ＵＴＲが、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記環状ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが、表４のヌクレオチドである、請求項１５に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
Ｒ４が、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレンである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリルが、以下の構造：
【化５】
2017522028.tif 000110
を有する、請求項１７に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
Ｌ１が、以下の構造：
【化６】
2017522028.tif 000111
を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
Ｌ１が、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の３’位又は４’位で［Ａｎ］に結合すると共に、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の５’位又は６’位で［Ｂｏ］に結合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ポリ−Ａテイルが、式ＸＸＩ：
【化７】
2017522028.tif 000112
の構造で終結し、
式中、Ｎ３は、核酸塩基であり、
Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、及びＲ３１の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｉは、０又は１であり；
Ｘ５は、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ６は、Ｏ又はＳであり；
Ｘ７は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩である、
請求項６〜２０のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記式ＸＸＩの構造が、
【化８】
2017522028.tif 000113
である、請求項２１に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ポリ−Ａテイルが、４０〜８０個のヌクレオシドを有する、請求項２２に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記式ＸＸＩの構造が、２〜４つの２’−メトキシ−アデノシン及び／又は２’−フルオロ−アデノシンに結合する、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ポリ−Ａテイルが、以下の構造：
【化９】
2017522028.tif 000114
で終結する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記ポリ−Ａテイルが、以下の構造：
【化１０】
2017522028.tif 000115
で終結する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記ポリ−Ａテイルが、以下の構造：
【化１１】
2017522028.tif 000116
を含む、請求項６〜２１のいずれか１項に記載の環状ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂ：
【化１２】
2017522028.tif 000117
の構造を有し、
前記方法が、式ＶＩａ又はＶＩｂ：
【化１３】
2017522028.tif 000118
の構造を有する化合物と、
式ＶＩＩ：
【化１４】
2017522028.tif 000119
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｘ３は、独立に、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ１７及びＲ１９の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ１８は、ハロゲンである）
の構造を有する化合物を反応させて、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂの構造を含む、方法。
【請求項２９】
ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂ：
【化１５】
2017522028.tif 000120
の構造を有し、
前記方法が、式ＩＸａ又はＩＸｂ：
【化１６】
2017522028.tif 000121
の構造を有する化合物と、
式Ｘａ又はＸｂ：
【化１７】
2017522028.tif 000122
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
各Ｘ４は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ１及びＸ２は各々、独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｘ３は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ２０及びＲ２３の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２１及びＲ２２の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシである）
を反応させることにより、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂの構造を含む、方法。
【請求項３０】
ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂ：
【化１８】
2017522028.tif 000123
の構造を含み、
前記方法が、
式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ、又はＸＩＶｂ：
【化１９】
2017522028.tif 000124
の構造を有する化合物と、
式ＸＶａ又はＸＶｂ：
【化２０】
2017522028.tif 000125
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、非存在、Ｏ、ＮＨ、若しくはＳ、又はその塩であり；
Ｒ２４及びＲ２７の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、及びＲ２６’の各々は、独立に、非存在、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであるか、あるいは、Ｒ２６又はＲ２６’とアルキニル基は、一緒に、任意選択で置換されたシクロアルキニルを形成する）
を反応させることにより、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、又はＸＩＩｂの構造を含む、方法。
【請求項３１】
ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
前記方法が、式ＸＶＩ：
［Ａｎ］−（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃ−Ｎ３
式ＸＶＩ
の構造を有する化合物と、式ＸＶ：
Ｒ２７−（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆ−［Ｂｏ］
式ＸＶＩＩ
の構造を有する化合物
（式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシドを含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【化２１】
2017522028.tif 000126
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７は各々、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたトリアゾレンであり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；並びに
Ｒ２７は、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ３アルキニル又は任意選択で置換されたＣ８〜Ｃ１２シクロアルキニルであり、
ここで、Ｌ１は、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合する）
を反応させることにより、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物
を生成するステップを含み、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、式ＩＩの配列を有する、方法。
【請求項３２】
前記任意選択で置換されたトリアゾレンが、以下の構造：
【化２２】
2017522028.tif 000127
を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記環状ポリヌクレオチドが、式ＸＶＩＩＩ：
【化２３】
2017522028.tif 000128
の構造を有し、
前記方法が、式ＸＩＸ：
【化２４】
2017522028.tif 000129
の構造を有する化合物と、
式ＸＸ：
【化２５】
2017522028.tif 000130
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｈは、０又は１であり；並びに
Ｘ４は、Ｏ、ＮＨ、又はＳである）
を反応させることにより、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記環状ポリヌクレオチドが、式ＸＶＩＩＩの構造を含む、方法。
【請求項３４】
式ＸＸＩ：
【化２６】
2017522028.tif 000131
の化合物から式ＸＩＸの化合物を生成するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖環状ポリヌクレオチド（ｃｉｒｃＰ）の設計、調製、製造及び／又は製剤化のための組成物、方法、プロセス、キット及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ＲＮＡは、電子顕微鏡によって１９７９年に初めて発見された（非特許文献１）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。その５’及び３’末端が互いに結合されているため、ｃｉｒｃＲＮＡは、自由端がなく、極めて長い半減期を有する（非特許文献２）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。近年の研究により、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮａｓｅＲエキソヌクレアーゼによる消化に耐性があり、ｉｎ  ｖｉｖｏで、その対応物である線状ＲＮＡよりも代謝回転が遅い（非特許文献３）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ｃｉｒｃＲＮＡ及びそれらの関連した線状ｍＲＮＡの分析から、ｃｉｒｃＲＮＡのアイソフォームは、転写物半減期が４８時間を上回り、高度に安定であるのに対し、関連した線状転写物は２０時間未満の半減期を呈示することが判明した（非特許文献４）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０００３】
ｃｉｒｃＲＮＡは、その最初の発見以来、様々な用途のために開発されている。ザルノー（Ｓａｒｎｏｗ）らの（特許文献１）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）では、ｃｉｒｃＲＮＡは、真核生物リボソームを拘束する内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントと、ＩＲＥＳに作動可能に連結したポリペプチドをコードするＲＮＡ配列エレメントを含む。ザルノー（Ｓａｒｎｏｗ）により記載されるｃｉｒｃＲＮＡは、次に、目的のポリペプチドを生成するために、細胞に挿入することができる。フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）らの（特許文献２）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）は、ポリヌクレオチド配列を記載しており、これは、環状化してもよく、また、タンパク質を生成するために、組織に直接投与してもよい。血管疾患のためのｃｉｒｃＲＮＡは、（特許文献３）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されており、そこで、シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）らは、アテローム動脈硬化性血管疾患に能動的役割を果たす１つ又は複数のアンリル（ＡＮＲＩＬ）エキソンを含むｃｉｒｃＲＮＡを記載した。クール（Ｋｏｏｌ）らの（特許文献４）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）は、一本鎖及び二本鎖標的核酸の両方に結合する一本鎖環状オリゴヌクレオチドを開示する。
【０００４】
自然切断及び自己環状化の能力を有する配列を含むプラスミド中にＤＮＡ断片を挿入することにより、ｃｉｒｃＲＮＡを合成する方法を教示するフェルドシュタイン（Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ）らの（特許文献５）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法などの多様な方法によって、ｃｉｒｃＲＮＡの生成が試みられている。別の方法は、アレス  Ｊｒ．（Ａｒｅｓ  Ｊｒ．）らの（特許文献６）に記載されており、この文献は、ＲＮＡシクラーゼリボザイムをコードするＤＮＡ構築物を作製し、ＤＮＡ構築物をＲＮＡとして発現させた後、ＲＮＡを自己スプライスさせて、イントロンを含まないｃｉｒｃＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生させることにより、ｃｉｒｃＲＮＡを生成することを教示する。ルス（Ｒｕｔｈ）らの（特許文献７）（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）は、線状ポリヌクレオチドを合成し、ハイブリダイゼーション条件下で、線状ヌクレオチドを相補的連結オリゴヌクレオチドと結合させた後、線状ポリヌクレオチドを連結することにより、一本鎖環状核酸を作製する方法を教示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５７６６９０３号明細書
【特許文献２】米国特許第５５８０８５９号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１２０５０９７５号
【特許文献４】米国特許第５４２６１８０号明細書
【特許文献５】米国特許第６２１０９３１号明細書
【特許文献６】米国特許第５７７３２４４号明細書
【特許文献７】国際公開第１９９２００１８１３号
【特許文献８】国際公開第２０１２０１９１６８号
【特許文献９】国際公開第２０１２０４５０７５号
【特許文献１０】国際公開第２０１２１３５８０５号
【特許文献１１】国際公開第２０１２０４５０８２号
【特許文献１２】国際公開第２０１３０５２５２３号
【特許文献１３】国際公開第２０１３０９０６４８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】フスー（Ｈｓｕ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７９年、第２８０巻、ｐ．３３９〜３４０
【非特許文献２】ハーランド及びミシャー（Ｈａｒｌａｎｄ＆Ｍｉｓｈｅｒ）、デベロップメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、１９８８年、第１０２巻、ｐ．８７３〜８５２
【非特許文献３】メムザック（Ｍｅｍｃｚａｋ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１３年、第４９５巻、ｐ．３３３〜３３８
【非特許文献４】ジェック（Ｊｅｃｋ）ら著、ＲＮＡ、２０１３年、第１９巻、ｐ．１４１〜１５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、合成ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、限定はしないが、構造的及び機能的完全性の低下並びに／又は免疫応答及び／若しくは分解経路などの生物応答のトリガーを含む、それらの線状対応物のピットフォールの影響を依然として受けやすい。
【０００８】
いくつかの線状修飾ｍＲＮＡ配列は、治療薬としての能力を有することがこれまでに証明されている。こうした研究は、以下に：２０１１年８月５日に出願された（特許文献８）、２０１１年１０月３日に出願された（特許文献９）、２０１２年４月２日に出願された（特許文献１０）、２０１１年１０月３日に出願された（特許文献１１）、２０１２年１０月３日に出願された（特許文献１２）、及び２０１２年１２月１４日に出願された（特許文献１３）に詳述されており、これら各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００９】
本発明は、以下に挙げる構造的及び／又は化学的特徴を含み得る一本鎖環状ポリヌクレオチド（ｃｉｒｃＰ）を提供する。たとえば、構造的及び／又は化学的特徴としては、限定はしないが、構造的及び機能的完全性を保持しつつ核酸ベースの治療薬の製剤化及び送達を最適化する、発現の閾値を解決する、発現率、半減期及び／又はタンパク質濃度を改善する、タンパク質局在化を最適化する、並びに免疫応答及び／又は分解経路などの有害な生物応答を回避する上で有用な特徴が挙げられる。本明細書に記載する構造的及び／又は化学的特徴を含み得る環状ポリヌクレオチドは、治療薬、診断薬、試薬の分野において、並びに生物学的アッセイのための用途の可能性があり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書には、環状ポリヌクレオチドの設計、調製、製造及び／又は製剤化のための組成物、方法、プロセス、キット及びデバイスが記載される。
一態様では、環状ポリヌクレオチド（ｃｉｒｃＰ）は、第１の連結ヌクレオシド領域、前記第１の連結ヌクレオシド領域に対して５’末端に位置する第１のフランキング領域、及び前記第１の連結ヌクレオシド領域に対して３’末端に位置する第２のフランキング領域を含む。第１及び／又は第２のフランキング領域は、第１の極性領域を含んでもよい。
【００１１】
本発明のｃｉｒｃＰは、本明細書に記載する少なくとも１つの修飾、例えば、限定はしないが、構造的及び／又は化学修飾を含み得る。非制限的例として、化学修飾は、核酸塩基修飾及び／又は糖修飾などのヌクレオチド及び／又はヌクレオシド修飾であってよい。核酸塩基修飾としては、限定はしないが、シトシン、グアニン、アデニン、チミン及びウラシルが挙げられる。別の非制限的例として、本発明のｃｉｒｃＰは、少なくとも２つの修飾を含む。これらの修飾は、１つ又は複数のヌクレオシド及び／又はヌクレオシド同士の骨格結合上に位置してもよい。一態様では、少なくとも１つの骨格結合をホスホロチオエート結合で置換してもよい。
【００１２】
本明細書に記載するｃｉｒｃＰの第１の連結ヌクレオシド領域は、目的のポリペプチドをコードし得る。目的のポリペプチドは、当技術分野で公知のもの、及び／又は本明細書に記載のものであってよい。本明細書に記載するｃｉｒｃＰはまた、目的のポリペプチドをコードすることができる第２の連結ヌクレオシド領域も含み得る。第２の連結ヌクレオシド領域は、第２の連結ヌクレオシド領域に対して５’末端に位置する第３フランキング領域と、第２の連結ヌクレオシド領域に対して３’末端に位置する第４フランキング領域を含んでもよい。第３フランキング領域及び／又は第４フランキング領域は、第２の極性領域を含んでもよい。第２の極性領域は、第１の極性領域と同じであっても、第１の極性領域と少なくとも２０％の同一性を有してもよいし、又は第１の極性領域とは異なっていてもよい。
【００１３】
第２の連結ヌクレオシド領域は、第１の連結ヌクレオシド領域内に位置してもよい。第１の連結ヌクレオシド領域及び第２の連結ヌクレオシド領域は、同じ目的のポリペプチド又は異なる目的のポリペプチドをコードしてもよい。一態様では、第１の連結ヌクレオシド領域の核酸配列は、第２の連結ヌクレオシド領域の核酸配列と少なくとも２０％の同一性を有する。
【００１４】
少なくとも第１の連結ヌクレオシド領域を含む本発明のｃｉｒｃＰは、少なくとも１つのセンサー領域を含んでもよい。センサー領域は、限定はしないが、第１の連結ヌクレオシド領域、第１のフランキング領域及び第２のフランキング領域などの、ｃｉｒｃＰの任意の領域に位置してよい。ｃｉｒｃＰが、第２の連結ヌクレオシド領域を含む場合、センサー領域は、限定はしないが、第１の連結ヌクレオシド領域、第２の連結ヌクレオシド領域、第１のフランキング領域、第２のフランキング領域、第３フランキング領域及び第４フランキング領域などの、ｃｉｒｃＰの任意の領域に位置してよい。第１の連結ヌクレオシド領域内に位置する少なくとも１つのセンサー領域は、第２の連結ヌクレオシド領域の少なくとも１つのセンサー領域と同じでも、及び／又は異なっていてもよい。センサー領域の非制限的例として、ｍｉＲ配列、ｍｉＲシード配列、ｍｉＲ結合部位、及びシードのないｍｉＲ配列が挙げられる。
【００１５】
本発明のｃｉｒｃＰを含む組成物が本明細書に提供される。一態様では、ｃｉｒｃＰを製剤化してもよく、その場合、製剤は、限定はしないが、ナノ粒子、乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）ミクロスフィア、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、
トロンビン、急速に排除される脂質ナノ粒子（ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｌｃｅｓ）（ｒｅＬＮＰ）及びこれらの組み合わせから選択することができる。
【００１６】
本発明のｃｉｒｃＰの組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、限定はしないが、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散液、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘若しくは乳化剤、防腐剤、脂質、リピドイド  リポソーム、脂質ナノ粒子、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物を含んでもよい。本発明のｃｉｒｃＰと一緒に用いることができる脂質の非網羅的リストは、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＡ及びペグ化脂質並びにこれらの混合物を含む。
【００１７】
第１の連結ヌクレオシド領域、第１の連結ヌクレオシド領域に対して５’末端に位置する第１のフランキング領域、及び第１の連結ヌクレオシド領域に対して３’末端に位置する第２のフランキング領域を含む環状ポリヌクレオチドスポンジ（ｃｉｒｃＳＰ）が本明細書に提供される。ｃｉｒｃＳＰは、少なくとも１つのセンサー領域を含み、第１のフランキング領域又は第２のフランキング領域は、第１の極性領域を含む。少なくとも１つのセンサー領域は、限定はしないが、ｍｉＲ配列、ｍｉＲシード配列、ｍｉＲ結合部位、及びシードのないｍｉＲ配列から選択され得る。
【００１８】
一態様では、ｃｉｒｃＳＰの第１の連結ヌクレオシド領域は、目的のポリペプチドをコードしない。
本発明のｃｉｒｃＳＰを含む組成物が本明細書に提供される。一態様では、ｃｉｒｃＳＰを製剤化してもよく、その場合、製剤は、限定はしないが、ナノ粒子、乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）ミクロスフィア、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、トロンビン、急速に排除される脂質ナノ粒子（ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｌｃｅｓ）（ｒｅＬＮＰ）及びこれらの組み合わせから選択することができる。
【００１９】
本発明のｃｉｒｃＳＰの組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、限定はしないが、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散液、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘若しくは乳化剤、防腐剤、脂質、リピドイド  リポソーム、脂質ナノ粒子、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物を含んでもよい。本発明のｃｉｒｃＳＰと一緒に用いることができる脂質の非網羅的リストは、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ｒｅＬＮＰ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＡ及びペグ化脂質並びにこれらの混合物を含む。
【００２０】
本明細書には、細胞、組織及び／又は生物における目的のポリペプチドのレベルを改変する方法が提供され、この方法は、本発明のｃｉｒｃＰを含む組成物を投与するステップを含む。この方法を用いて、細胞、組織及び／又は生物における目的のポリペプチドの所望のレベルを増加、低減及び／又は維持することができる。
【００２１】
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞、組織及び／又は生物における目的のポリペプチドのレベルを低減することを含んでもよく、この方法は、本発明のｃｉｒｃＳ
Ｐを含む組成物を投与するステップを含む。
【００２２】
細胞、組織及び／又は生物への投与としては、限定はしないが、出産前投与、新生児期投与、出産後投与、経口、注射（例えば、静脈内、動脈内、腹膜内、皮内、皮下及び筋肉内）による、眼への投与による、及び鼻内投与によるものが挙げられる。ｃｉｒｃＰは、１ｕｇ〜１５０ｕｇの１日総用量で投与してよく、１回又は複数回用量で投与してよい。
【００２３】
本発明に従い、環状化されて環状ポリヌクレオチドを形成することができるポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドが提供され、キメラポリヌクレオチドは、式Ｉ：
５’［Ａｎ］Ｘ−Ｌ１−［Ｂｏ］ｙ−Ｌ２−［Ｃｐ］ｚ−Ｌ３  ３’
式Ｉ
を含む配列又は構造を有し、
式中、
Ａ及びＢの各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域を含み；
Ｃは、連結ヌクレオシドの任意選択の領域であり；
領域Ａ、Ｂ若しくはＣの少なくとも１つは、位置的に修飾されており、前記位置的に修飾された領域は、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、又はウリジンの１つ又は複数の同じヌクレオシドタイプの少なくとも２つの化学修飾されたヌクレオシドを含み、同じタイプのヌクレオシドの化学修飾の少なくとも２つが、異なる化学修飾であり；
ｎ、ｏ及びｐは、独立に、１５〜１０００の整数であり；
ｘ及びｙは、独立に、１〜２０であり；
ｚは、０〜５であり；
Ｌ１及びＬ２は、独立に、任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベース若しくは非核酸ベースのいずれかであり；
Ｌ３は、任意選択のコンジュゲート又は任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベース若しくは非核酸ベースのいずれかである。
【００２４】
また、研究、診断及び治療薬における環状ポリヌクレオチドを作製及び使用する方法も提供される。
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチド（例えば、環状ポリヌクレオチド）を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【００２５】
【化１】
2017522028.tif 000003
【００２６】
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆが０であるとき、Ｒ４は、結合ではなく；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］（例えば、［Ａｎ］のヌクレオシドの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位、あるいは、［Ａｎ］のヌクレオシドの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位）に結合する。
【００２７】
一部の実施形態では、［Ａｎ］及び［Ｂｏ］の少なくとも１つは、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩＩ：
【００２８】
【化２】
2017522028.tif 000004
【００２９】
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたア
ミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩である。
【００３０】
一部の実施形態では、ｈは、０であり；Ｒ１３は、Ｈであり；Ｒ１４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルである。
他の実施形態では、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルは、メトキシである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、ＳＨである。
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを特徴とし、ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、結合であるか、又は式ＩＩＩ：
【００３２】
【化３】
2017522028.tif 000005
【００３３】
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ，及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］（例えば、［Ａｎ］のヌクレオシドの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位、あるいは、［Ａｎ］のヌクレオシドの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位）に結合する。
【００３４】
ここで、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］の少なくとも１つは、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩＩ：
【００３５】
【化４】
2017522028.tif 000006
【００３６】
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
ここで、式ＩＶについて、Ｘ１、Ｘ２、若しくはＸ４の少なくとも１つは、ＮＨ又はＳである。
【００３７】
一部の実施形態では、Ｘ１は、ＮＨである。他の実施形態では、Ｘ４は、ＮＨである。いくつかの実施形態では、Ｘ２は、Ｓである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ａ）コード領域；（ｂ）５’ＵＴＲ；及び（ｃ）３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに、（ｄ）少なくとも１つの５’キャプ構造を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに、（ｅ）ポリ−Ａ−テイルを含む。
【００３８】
一部の実施形態では、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルの１つは、［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］を含む。
他の実施形態では、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルの１つが、［Ａｎ］を含み、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルのもう１つが、［Ｂｏ］を含む。
【００３９】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド（例えば、表４のヌクレオシド）を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレンであり、例えば、複素環は、以下の構造：
【００４１】
【化５】
2017522028.tif 000007
【００４２】
を有する。
一部の実施形態では、Ｌ１は、以下の構造：
【００４３】
【化６】
2017522028.tif 000008
【００４４】
を有する。
一部の実施形態では、Ｌ１は、上記ヌクレオシドのうちの１つの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位で［Ａｎ］に結合すると共に、上記ヌクレオシドのうちの１つの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位で［Ｂｏ］に結合する。
【００４５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状である。
いくつかの実施形態では、ポリ−Ａテイルは、式ＸＸＩ：
【００４６】
【化７】
2017522028.tif 000009
【００４７】
の構造で終結し、
式中、Ｎ３は、核酸塩基であり
Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、及びＲ３１の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｉは、０又は１であり；
Ｘ５は、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ６は、Ｏ又はＳであり；
Ｘ７は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩である。
【００４８】
一部の実施形態では、式ＸＸＩの構造は、
【００４９】
【化８】
2017522028.tif 000010
【００５０】
である。
他の実施形態では、ポリ−Ａテイルは、４０〜８０個のヌクレオシド（配列番号４８）を有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、式ＸＸＩの構造は、２〜４つの２’−メトキシ−アデノシン及び／又は２’−フルオロ−アデノシンに結合する。
一部の実施形態では、ポリ−Ａテイルは、以下の構造：
【００５２】
【化９】
2017522028.tif 000011
【００５３】
で終結する。
他の実施形態では、ポリ−Ａテイルは、以下の構造：
【００５４】
【化１０】
2017522028.tif 000012
【００５５】
で終結する。
いくつかの実施形態では、ポリ−Ａテイルは、以下の構造：
【００５６】
【化１１】
2017522028.tif 000013
【００５７】
を含む。
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂ：
【００５８】
【化１２】
2017522028.tif 000014
【００５９】
の構造を有する。
この方法は、式ＶＩａ又はＶＩｂ：
【００６０】
【化１３】
2017522028.tif 000015
【００６１】
の構造を有する化合物と、
式ＶＩＩ：
【００６２】
【化１４】
2017522028.tif 000016
【００６３】
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｘ３は、独立に、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ１７及びＲ１９の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ１８は、ハロゲンである）
の構造を有する化合物を（例えば、アルキル化条件下で）反応させて、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂの構造を含む。
【００６４】
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂ：
【００６５】
【化１５】
2017522028.tif 000017
【００６６】
の構造を有する。
この方法は、式ＩＸａ又はＩＸｂ：
【００６７】
【化１６】
2017522028.tif 000018
【００６８】
の構造を有する化合物と、
式Ｘａ又はＸｂ：
【００６９】
【化１７】
2017522028.tif 000019
【００７０】
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ１及びＸ２は各々、独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｘ３は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ２０及びＲ２３の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２１及びＲ２２の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシである）
の構造を有する化合物を（例えば、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）反応条件下で）反応させることにより、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂの構造を含む。
【００７１】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂ：
【００７２】
【化１８】
2017522028.tif 000020
【００７３】
の構造を有する。
この方法は、式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ、又はＸＩＶｂ：
【００７４】
【化１９】
2017522028.tif 000021
【００７５】
の構造を有する化合物と、
式ＸＶａ又はＸＶｂ：
【００７６】
【化２０】
2017522028.tif 000022
【００７７】
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、非存在、Ｏ、ＮＨ、若しくはＳ、又はその塩であり；
Ｒ２４及びＲ２７の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、及びＲ２６’の各々は、非存在であるか、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであるか、あるいは、Ｒ２６又はＲ２６’とアルキニル基は、一緒に、任意選択で置換されたシクロアルキニルを形成する）
を（例えば、銅供給源の存在若しくは非存在下の［３＋２］環状付加条件下で）反応させることにより、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂの構造を含む。
【００７８】
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有する。
【００７９】
この方法は、式ＸＶＩ：
［Ａｎ］−（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃ−Ｎ３
式ＸＶＩ
の構造を有する化合物と、式ＸＶＩＩ：
Ｒ２７−（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆ−［Ｂｏ］
式ＸＶＩＩ
の構造を有する化合物
（式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシドを含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【００８０】
【化２１】
2017522028.tif 000023
【００８１】
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７は各々、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択
され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたトリアゾレンであり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；並びに
Ｒ２７は、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ３アルキニル又は任意選択で置換されたＣ８〜Ｃ１２シクロアルキニルであり、
ここで、Ｌ１は、上記ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合する）
を（例えば、銅供給源の存在若しくは非存在下の［３＋２］環状付加条件下で）反応させることにより、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＩＩの配列を有する。
【００８２】
一部の実施形態では、任意選択で置換されたトリアゾレンは、以下の構造：
【００８３】
【化２２】
2017522028.tif 000024
【００８４】
を有する。
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＸＶＩＩＩ：
【００８５】
【化２３】
2017522028.tif 000025
【００８６】
の構造を有し、
この方法は、式ＸＩＸ：
【００８７】
【化２４】
2017522028.tif 000026
【００８８】
の構造を有する化合物と、
式ＸＸ：
【００８９】
【化２５】
2017522028.tif 000027
【００９０】
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｈは、０又は１であり；
Ｘ４は、Ｏ、ＮＨ、又はＳである）
を（例えば、還元アミド化条件下で）反応させることにより、ポリペプチドをコードする環状ポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＸＶＩＩＩの構造を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、本方法は、式ＸＸＩ：
【００９２】
【化２６】
2017522028.tif 000028
【００９３】
の化合物から式ＸＩＸの化合物を生成するステップを含む。
本発明の様々な実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００９４】
以上及びその他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に図示される通り、本発明の具体的な実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。尚、図面中、類似の参照符号は、様々な図面全体を通して同じ部分を指す。図面は、必ずしも一定の縮尺に従っているわけではなく、本発明の様々な実施形態の原理を説明することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の環状一次構築物の概略図である。
【図２】本発明の環状一次構築物の概略図である。
【図３】少なくとも１つのスペーサ領域を含む本発明の環状一次構築物の概略図である。
【図４】少なくとも１つのセンサー領域を含む本発明の環状一次構築物の概略図である。
【図５】少なくとも１つのセンサー領域と１つのスペーサ領域を含む本発明の環状一次構築物の概略図である。
【図６】本発明の非コード環状一次構築物の概略図である。
【図７】本発明の非コード環状一次構築物の概略図である。
【図８】環状化することができる線状一次構築物の概略図である。
【図９】ＲＮＡ  Ｔ４連結及びポリＡポリメラーゼ処理を示すゲルプロフィールである。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
治療薬、診断薬、試薬の分野で、並びに生物学的アッセイのために、環状ポリヌクレオチド（ｃｉｒｃＰ）を合成、修飾、及び使用することができることは非常に有利である。
本明細書には、環状ポリヌクレオチドの設計、調製、製造及び／又は製剤化のための組成物及び方法が記載される。本明細書で使用されるとき、「環状ポリヌクレオチド」又は「ｃｉｒｃＰ」は、ＲＮＡと実質的に同様に作用すると共に、その特性を有する一本鎖環状ポリヌクレオチドを意味する。「環状」という用語は、ｃｉｒｃＰのあらゆる二次又は三次構造も包含する。
【００９７】
少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする本発明のｃｉｒｃＰは、環状ＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡとして知られている。本明細書で使用されるとき、「環状ＲＮＡ」又は「ｃｉｒｃＲＮＡ」は、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードすることができる環状ポリヌクレオチドを意味する。核酸、例えば、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｅｘ  ｖｉｖｏのいずれにかかわらず、細胞内に送達されて、核酸の細胞内翻訳、並びにコードされた目的のポリペプチドの産生を引き起こし得ることはよく知られている。そのユニークな閉じた環状構造のために、ｃｉｒｃＲＮＡは、エキソヌクレアーゼによる分解に対して耐性が高く、それらの対応する線状同等物より長い半減期を有する。従って、目的のポリペプチドの生成に有用な新規で、改善されたｃｉｒｃＲＮＡを開発することが望ましい。
【００９８】
本明細書には、１つ又は複数の目的のポリペプチドをコードし得るｃｉｒｃＲＮＡの設計、調製、製造及び／又は製剤化のための組成物（医薬組成物を含む）及び方法が記載される。また、ポリペプチドが産生されない細胞プロセスを調節することを目的とした、ｃｉｒｃＲＮＡの選択、設計及び／又は使用のためのシステム、プロセス、デバイス及びキットも提供される。
【００９９】
少なくとも１つのセンサー配列を含み、目的のポリペプチドをコードしない本発明のｃｉｒｃＰは、環状スポンジ又はｃｉｒｃＳＰとして知られている。本明細書で使用されるとき、「環状スポンジ」、「環状ポリヌクレオチドスポンジ」又は「ｃｉｒｃＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列を含み、目的のポリペプチドをコードしない環状ポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるとき、「センサー配列」は、内因性核酸結合分子の受容体又は擬似受容体を意味する。センサー配列の非制限的例として、マイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡシード配列、シード配列のないマイクロＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位、及び擬似受容体として作用するように設計された人工結合部位、並びにこれらの部分及び断片が挙げられる。
【０１００】
少なくとも１つのセンサー配列を含み、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする本発明のｃｉｒｃＰは、環状ＲＮＡスポンジ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰとして知られている。本明細書で使用されるとき、「環状ＲＮＡスポンジ」又は「ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列と、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つの領域を含む環状ポリヌクレオチドを意味する。ｃｉｒｃＲＮＡスポンジは、目的のマイクロＲＮＡ分子を保持するための少なくとも１つの特異的マイクロＲＮＡ結合部位の反復コピーを有する一本鎖非コードポリヌクレオチドと、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの１領域を含む。この人工マイクロＲＮＡ阻害剤は、細胞内で発現させると、目的のマイクロＲＮＡの細胞レベルを低減する。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、目的のマイクロＲＮＡ分子に対する１つ又は複数のマイクロＲＮＡ標的配列又は結合部位を含んでもよい。一態様では、スポンジとして作用するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、マイクロＲＮＡにより調節される遺伝子の発現を調節することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどの本発明の環状ポリヌクレオチドは、記載される及び／又は当技術分野で公知の線状ポリヌクレオチドの欠失の少なくとも１つを回避するために、本明細書に記載する通りに、少なくとも１つの修飾を含む。従って、一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾を含む本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、修飾環状ポリヌクレオチド又は修飾ｃｉｒｃＰ、修飾環状ＲＮＡ又は修飾ｃｉｒｃＲＮＡ、修飾環状スポンジ又は修飾ｃｉｒｃＳＰ、並びに修飾環状ＲＮＡスポンジ又は修飾ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと呼ばれる。
【０１０２】
抗体、ウイルス、獣医学適用、並びに多様なｉｎ  ｖｉｖｏ状況における、修飾ポリヌクレオチド、特に修飾線状ｍＲＮＡの使用は、これまでに研究されており、これらの研究は、以下の文献に開示されている：例えば、２０１１年３月３１日に出願された共同所有米国仮特許出願第６１／４７０，４５１号明細書（ｍｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ適用を教示）、２０１１年４月２６日に出願された同第６１／５１７，７８４号明細書（抗体ポリペプチドの生産のための改変された核酸を教示）；２０１１年５月１７日に出願された同第６１／５１９，１５８号明細書（ｍｍＲＮＡ技術の獣医学適用を教示）；２０１１年９月１２日に出願された同第６１／５３３，５３７号明細書（ｍｍＲＮＡ技術の抗菌適用を教示）；２０１１年９月１２日に出願された同第６１／５３３，５５４明細書（ｍｍＲＮＡ技術のウイルス適用を教示）；２０１１年１０月３日に出願された同第６１／５４２，５３３号明細書（ｍｍＲＮＡ技術で使用するための様々な化学修飾を教示）；２０１１年１２月１４日に出願された同第６１／５７０，６９０号明細書（ｍｍＲＮＡ技術の作製又は使用に用いるための可動デバイスを教示）；２０１１年１２月１４日に出願された同第６１／５７０，７０８号明細書（救急処置の状況下でのｍｍＲＮＡの使用を教示）；２０１１年１２月１６日に出願された同第６１／５７６，６５１号明細書（ｍｍＲＮＡの末端修飾アーキテクチャを教示）；２０１１年１２月１６日に出願された同第６１／５７６，７０５号明細書（ｍｍＲＮＡのためにリピドイドを使用する送達方法を教示）；２０１１
年１２月２１日に出願された同第６１／５７８，２７１号明細書（ｍｍＲＮＡを用いて臓器又は組織の生存性を増大する方法を教示）；２０１１年１２月２９日に出願された同第６１／５８１，３２２号明細書（細胞透過性ペプチドをコードするｍｍＲＮＡを教示）；並びに２０１２年１月１０日に出願された同第６１／６３１，７２９号明細書（血液−脳関門通過のためにｍｍＲＮＡを使用する方法を教示）；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１０３】
本明細書には、一部において、以下：組織中での安定性及び／若しくはクリアランス、受容体取り込み及び／又は動態、組成物による細胞接触、翻訳機構との関与、半減期、翻訳効率、免疫回避、タンパク質産生能力、分泌効率（適用可能であれば）、循環への進入可能性、タンパク質半減期並びに／又は細胞の状態、機能及び／若しくは活性の調節のうち１つ又は複数を改善する特徴を含み得るｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。また、本明細書には、一部において、目的の少なくとも１つのポリペプチドをコードすると共に、翻訳されて、目的のコードされたポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｅｘ  ｖｉｖｏで産生する能力を有し得る、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。
【０１０４】
Ｉ．本発明の組成物（ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）
本発明は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを提供する。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載の修飾及び／又は当技術分野で公知の修飾を含んでもよいが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが修飾を含むことが必要であるわけではない。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として作用し得る。本明細書で使用されるとき、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードすると共に、翻訳されて、目的のコードされたポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｅｘ  ｖｉｖｏで産生することができるポリヌクレオチドを意味する。
【０１０６】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰアーキテクチャ
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書で立証されるように、核酸ベースの方法を用いた効果的なポリペプチド生産の既存の問題を解決する上で役立つ、それらの機能的及び／又は構造的設計特徴で、野生型線状ポリヌクレオチドから識別される。
【０１０７】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つのフランキング領域を含んでもよく、これらの領域は、極性領域及び／又は非翻訳領域を含んでもよい。非制限的例として、極性領域は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）であってもよい。
【０１０８】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む連結ヌクレオシドの少なくとも１領域を含んでもよい。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、極性領域及び／又は非翻訳領域を含んでもよい。
【０１０９】
一実施形態では、本明細書に記載する１つ又は複数の構造的及び／又は化学修飾をｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに組み込んでもよい
。これらの修飾及び／又は改変は、ポリヌクレオチドに有用な特性を付与することができ、一部の実施形態では、これは、ポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む。本明細書で使用されるとき、「構造的」特徴又は修飾は、２つ以上の連結したヌクレオチドが、ヌクレオチド自体に有意な化学修飾をもたらすことなく、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに挿入、欠失、重複、逆転又はランダム化されたものである。構造的修飾を実施するためには、化学結合が必然的に破壊され、再形成されることになるため、構造的修飾は、化学的性質を有し、従って、化学修飾である。しかし、構造的修飾は、ヌクレオチドの異なる配列を生み出すことになる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」へと化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」へと構造的に修飾され得る。この場合、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されて、ポリヌクレオチドに対する構造的修飾をもたらしている。
【０１１０】
一般に、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の最も短い長さは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ナノナペプチド、又はデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであってよい。別の実施形態では、この長さは、２〜３０アミノ酸、例えば、５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、又は１０〜２０アミノ酸のペプチドをコードするのに十分なものであってよい。長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５若しくは３０アミノ酸のペプチド、又は４０アミノ酸以下、例えば、３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１若しくは１０以下のアミノ酸のペプチドをコードするのに十分なものであってよい。ポリヌクレオチド配列がコードすることができるジペプチドの例として、限定はしないが、カルノシン及びアンセリンをコードが挙げられる。
【０１１１】
一般に、本発明の目的のポリペプチドをコードするＯＲＦの長さは、約３０ヌクレオチド長より長い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００ヌクレオチド以上又は１００，０００ヌクレオチド以下）である。本明細書で用いるとき、ＯＲＦは、「コード領域」若しくは「コードする領域」又は単にＯＲＦと呼ぶこともある。
【０１１２】
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、約３０〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１０，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、
１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、及び２，０００〜１００，０００）を含む。
【０１１３】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つのフランキング領域を含み得る。フランキング領域は、独立に、１５〜２０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、約３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００及び１，９００ヌクレオチドより長いか、又は少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００及び１，９００ヌクレオチド）であってよい。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、テイル付加配列（ｔａｉｌｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み得る。テイル付加配列は、１〜５００ヌクレオチド長の範囲（例えば、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００ヌクレオチド）であってよい。テイル付加領域が、ポリＡテイルである場合、長さは、ポリＡ結合タンパク質（ｐｏｌｙＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）結合の単位で、又はその関数として決定することができる。この実施形態では、ポリＡテイルは、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４モノマーに結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質モノマーは、約３８ヌクレオチドの区間に結合する。このように、約８０ヌクレオチド及び１６０ヌクレオチドのポリＡテイルが機能的であることが認められている。
【０１１５】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、第１及び／又は第２作動領域（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み得る。第１及び／又は第２作動領域は、３〜４０、例えば、５〜３０、１０〜２０、１５ヌクレオチド長の範囲、又は少なくとも４、又は３０ヌクレオチド長以下であってよく、出発及び／又は終止コドン以外に、１つ又は複数のシグナル及び／又は制限配列を含んでもよい。
【０１１６】
一部の実施形態では、本発明の環状ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【０１１７】
【化２７】
2017522028.tif 000029
【０１１８】
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆが０であるとき、Ｒ４は、結合ではなく；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、１つのヌクレオシドの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］（例えば、［Ａｎ］のヌクレオシドの糖の３’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの糖の５’位、又は［Ａｎ］のヌクレオシドの糖の５’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの糖の３’位）に結合する。
【０１１９】
他の実施形態では、本発明の環状ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【０１２０】
【化２８】
2017522028.tif 000030
【０１２１】
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、１つのヌクレオシドの糖で［Ａｎ］及び［Ｂｏ］（例えば、［Ａｎ］のヌクレオシドの糖の３’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの糖の５’位、又は［Ａｎ］のヌクレオシドの糖の５’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの糖の３’位）に結合し；
ここで、［Ａｎ］及び［Ｂｏ］の少なくとも１つは、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩ：
【０１２２】
【化２９】
2017522028.tif 000031
【０１２３】
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；並びに
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
ここで、式ＩＶについて、Ｘ１、Ｘ２、若しくはＸ４の少なくとも１つは、ＮＨ又はＳである。
【０１２４】
例えば、一部の実施形態では、本発明の環状ポリヌクレオチドは、以下：
【０１２５】
【化３０−１】
2017522028.tif 000032
【０１２６】
【化３０−２】
2017522028.tif 000033
【０１２７】
の構造を含み、
式中、Ｒ２５は、非存在であるか、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンである。
【０１２８】
一部の実施形態では、糖の２’位のヒドロキシルの存在によって、リボソーム認識の増大が可能になる。
本発明の環状ポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルの１つは、［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］を含む。
【０１２９】
本発明の環状ポリヌクレオチドの他の実施形態では、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルの１つが、［Ａｎ］を含み、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルのもう１つが、［Ｂｏ］を含む。例えば、一部の実施形態では、ポリＡテイルが、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］の一方を含み、３’ＵＴＲが他方を含む。他の実施形態では、５’キャップ構造が、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］の一方を含み、５’ＵＴＲが他方を含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む。
コンジュゲート及び組み合わせ
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、他のポリヌクレオチド、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サプフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放
射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、若しくはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的親和性を有する分子、又は抗体、例えば、癌細胞、上皮細胞若しくは骨細胞などの指定細胞型に結合する抗体、ホルモン及びホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、若しくは薬剤と共役するように設計することができる。一実施形態では、タンパク質生産をさらに増強するために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを他のポリヌクレオチドと共役させてもよい。
【０１３１】
共役は、安定性及び／又は半減期の増大をもたらし得ると共に、細胞、組織若しくは生物における特定の部位にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをターゲティングする上で特に有用となり得る。
【０１３２】
本発明によれば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋の形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー又はベクターなどの１つ又は複数と一緒に投与してもよい。
【０１３３】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋の形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー又はベクターなどの１つ又は複数をコードし得る。
【０１３４】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋の形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー又はベクターなどの１つ又は複数を含み得る。
【０１３５】
二官能性環状ポリヌクレオチド
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、二官能性である。名称が意味するように、二官能性ｃｉｒｃＰ、二官能性ｃｉｒｃＳＰ、二官能性ｃｉｒｃＲＮＡ又は二官能性ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも２つの官能基を有するか、又はその能力を有するものである。これらの分子は、慣例により、多官能性と呼ばれることもある。
【０１３６】
二官能性ｃｉｒｃＰ、二官能性ｃｉｒｃＲＮＡ若しくは二官能性ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの複数の官能性は、ＲＮＡによってコードされ得る（官能基は、コードされた産物が翻訳されるまで、現れない場合がある）か、又はｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ自体の特性であってもよい。これは、構造的又は化学的のいずれであってもよい。二官能性ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと共有結合又は静電気結合した官能基を含んでもよい。さらに、２つの官能基は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと別の分子の複合体として提供してもよい。
【０１３７】
一実施形態では、二官能性ｃｉｒｃＰ、二官能性ｃｉｒｃＳＰ、二官能性ｃｉｒｃＲＮＡ又は二官能性ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つの修飾を有してもよい。
二官能性ｃｉｒｃＰ、二官能性ｃｉｒｃＲＮＡ又は二官能性ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、抗増殖性であるペプチドをコードし得る。これらのペプチドは、線状、環状、拘束、又はランダムコイルであってもよい。これらは、アプタマー、シグナル伝達分子、リガンド又
はそれらの模倣体若しくは擬似物として機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、３〜５０アミノ酸長となり得る。これらのペプチドは、５〜４０、１０〜３０、又は約１５アミノ酸長であってよい。これらは、一本鎖、複鎖若しくは分岐状のいずれであってもよく、また、一旦翻訳されると、複合体、凝集体、若しくはいずれかのマルチユニット構造を形成し得る。
【０１３８】
非コード領域
本明細書に記載するように、部分的又は実質的に翻訳不可能である領域を有し得る、例えば、非コード領域を有するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。こうした非コード領域は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのどの領域に位置してもよく、そのような領域として、限定はしないが、第１の連結ヌクレオシド領域、センサー配列、スペーサ及び／又はフランキング領域が挙げられる。非コード領域は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの２つ以上の領域に位置してもよい。このような分子は、概して、翻訳されないが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの場合、リボソームタンパク質若しくはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの１つ又は複数の翻訳機構成分との結合及びそれらの隔離の１つ又は複数により、タンパク質産生に作用を及ぼし、それによって、細胞でのタンパク質発現を効果的に低減するか、又は細胞中の１つ又は複数の経路若しくはカスケードを調節して、タンパク質レベルを改変することができる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１つ又は複数の長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ、若しくはｌｉｎｃＲＮＡ）、核小体ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はＰｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）及び／又はそれらの部分を含有するか、又はコードし得る。
【０１３９】
目的のポリペプチド
本発明によれば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１つ又は複数の目的のポリペプチド又はその断片をコードするように設計してもよい。目的のポリペプチドとして、限定はしないが、全ポリペプチド、複数のポリペプチド又はポリペプチドの断片が挙げられ、これらは、独立に、１つ又は複数の核酸、複数の核酸、核酸の断片又は前述したもののいずれかの変異体によってコードされ得る。本明細書で使用されるとき、用語「目的のポリペプチド」は、本発明の一次構築物においてコードされるように選択された任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、最も一般的にはペプチド結合により連結されたアミノ酸残基（天然若しくは非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。いくつかの事例では、コードされたポリペプチドは、約５０アミノ酸より小さく、その場合、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドであるとき、それは、少なくとも約２、３、４、又は少なくとも５アミノ酸残基長となる。従って、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片並びにこれらの他の同等物、変異体、及び類似体を含む。ポリペプチドは、単分子であってもよいし、又は二量体、三量体若しくは四量体などの多分子複合体であってもよい。これらはまた、抗体若しくはインスリンなどの一本鎖又は複鎖ポリペプチドを含んでもよいし、結合又は連結していてもよい。最も一般的には、複鎖ポリペプチドにはジスルフィド結合が存在する。また、ポリペプチドという用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学類似体である、アミノ酸ポリマーにも適用され得る。
【０１４０】
「ポリペプチド変異体」という用語は、ネイティブ又は基準配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列は、ネイティブ又は基準配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。通常、変異体は、ネイティブ又
は基準配列に対して少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、ネイティブ又は基準配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％同一（相同）である。
【０１４１】
一部の実施形態では、「変異体模倣体」が提供される。本明細書で用いられるとき、「変異体模倣体」という用語は、活性化配列を模倣する１つ又は複数のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−トレオニン及び／又はホスホロ−セリンの模倣体として役立ち得る。あるいは、変異体模倣体は、脱活性化又は模倣体を含有する不活性化産物をもたらす場合もあり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換物として作用し；又はアラニンは、セリンの不活性化置換物として作用し得る。
【０１４２】
「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、配列をアラインメントし、最大相同率を達成するために、必要であれば、ギャップを導入した後、第２配列中のアミノ酸配列の残基と同一である候補アミノ酸配列中の残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野において公知である。相同性は、同一性（％）の計算に左右されるが、計算に導入されたギャップ及びペナルティによって値が相違し得る。
【０１４３】
「相同体」は、ポリペプチド配列に適用されるとき、第２の種の第２配列と実質的な同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、１つ又は複数のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加若しくは欠失によって異なるが、親若しくは出発ポリペプチドの特性の１つ又は複数を依然として維持するポリペプチド変異体を包含するものとする。
【０１４４】
本発明は、変異体及び誘導体を含む、ポリペプチドベースの数種の組成物を考慮する。これらは、置換、挿入、欠失及び共有結合変異体及び誘導体を含む。用語「誘導体」は、用語「変異体」と類義に用いられるが、一般に、基準分子又は出発分子に対して何らかの方法で修飾及び／又は変更されている分子を指す。
【０１４５】
従って、基準配列、特に、本明細書に開示するポリペプチド配列に対して、置換、挿入、及び／又は付加、欠失及び共有結合修飾を含むポリペプチドをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本発明の範囲に含まれる。例えば、１つ又は複数のリシンなどの配列タグ又はアミノ酸を本発明のペプチド配列に付加することができる（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端で）。配列タグは、ペプチド精製又は局在化に用いることができる。リシンは、ペプチド溶解度を高めるか、又はビオチン化を可能にするために用いることができる。あるいは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、切断型配列を取得することもできる。いくつかのアミノ酸（例えば、Ｃ末端又はＮ末端残基）は、例えば、可溶性であるか、又は固体支持体に結合したより大きな配列の一部として配列の発現など、配列の用途に応じて欠失させてもよい。
【０１４６】
「置換変異体」は、ポリペプチドに関連する場合、ネイティブ又は出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、同じ位置のその場所に挿入された異なるアミノ酸を有するものである。置換は、単一（その場合、分子中のただ１つのアミノ酸が置換されている）であってもよいし、又は複数（その場合、同じ分子中の２つ以上のアミノ酸が置換されている）であってもよい。
【０１４７】
本発明で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似のサイズ、電荷、又は極性を有する別のアミノ酸による、配列に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例として、イソロイシン、バリン及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基に
よる別の非極性残基の置換がある。同様に、保存的置換の例として、アルギニンとリシン同士、グルタミンとアスパラギン同士、並びにグリシンとセリン同士など、ある極性（親水性）残基による別の残基の置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン若しくはヒスチジンなどの塩基性残基による別の残基の置換、又はアスパラギン酸又はグルタミン酸などのある酸性残基による別の酸性残基の置換は、保存的置換の別の例である。非保存的置換の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基による、システイン、グルタミン、グルタミン酸若しくはリシンなどの極性（親水性）残基の置換及び／又は極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。
【０１４８】
ポリペプチドに関連する場合、「挿入変異体」は、ネイティブ又は出発配列における特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入される１つ又は複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接して」とは、アミノ酸のα−カルボキシ又はα−アミノ官能基のいずれかに連結することを意味する。
【０１４９】
ポリペプチドに関連する場合、「欠失変異体」は、ネイティブ又は出発アミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異体は、分子の特定の領域で１つ又は複数のアミノ酸が欠失することになる。
【０１５０】
ポリペプチドに関連する場合、「共有結合誘導体」は、有機タンパク質性若しくは非タンパク質性誘導体化剤によるネイティブ又は出発タンパク質の修飾、及び／又は翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、伝統的に、選択した側鎖若しくは末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と、タンパク質の標的アミノ酸残基を反応させることによって、又は選択した組換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾の機構を抑制することによって導入される。得られる共有結合誘導体は、組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の生物活性、免疫アッセイ、又は調製に重要な残基を見出すことを目的とするプログラムにおいて有用である。こうした修飾は、当業者の通常の技術の範囲内であり、過度の実験を行うことなく実施される。
【０１５１】
いくつかの翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用によって得られる。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、翻訳後、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に、脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明に従って生成されるポリペプチド中に存在し得る。
【０１５２】
その他の翻訳後修飾として、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル若しくはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）著、「タンパク質：構造及び分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．）、サンフランシスコ、ｐｐ．７９〜８６、１９８３年）。
【０１５３】
ポリペプチドに関連する場合、「特徴」は、分子の異なるアミノ配列ベースの成分として定義される。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによってコードされるポリペプチドの特徴としては、表面出現（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）、局所立体構造形状、フォールド、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１５４】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「表面出現」は、最表面上に出現するタンパク質のポリペプチドベースの成分を指す。
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「局所立体構造形状」は、タンパク質の画定可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチドベースの構造出現を意味する。
【０１５５】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「フォールド」は、エネルギー最小化時に得られるアミノ酸配列の立体配座を指す。フォールドは、フォールディングプロセスの二次又は三次レベルで起こり得る。二次レベルの例として、βシート及びαヘリックスがある。三次フォールドの例として、エネルギー力の凝集又は分離によって形成されたドメイン及び領域がある。このようにして形成された領域には、疎水性及び親水性ポケットなどがある。
【０１５６】
本明細書において、タンパク質立体配座に関連して用いられるとき、用語「ターン（ｔｕｒｎ）」は、ペプチド又はポリペプチドの骨格の方向を変更する曲がりを意味し、１、２、３個若しくはそれ以上のアミノ酸残基を伴い得る。
【０１５７】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「ループ」は、ペプチド又はポリペプチドの骨格の方向を逆転するのに役立ち得るポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドに存在し、骨格の方向を変更するだけであれば、これは、４個以上のアミノ酸残基を含み得る。オリバ（Ｏｌｉｖａ）らは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを見出している（分子生物学会誌（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）第２６６巻（４）：ｐ．８１４〜８３０；１９９７年）。ループは、開又は閉のいずれであってもよい。閉ループ又は「環状」ループは、架橋部分の間に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含み得る。こうした架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドに典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含んでもよいし、あるいは、架橋部分は、本明細書で使用するジブロモジリル剤のように、非タンパク質ベースであってもよい。
【０１５８】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「ハーフループ」は、それが由来するループのアミノ酸残基数の少なくとも半分を有する、同定されたループの一部を指す。ループは、必ずしも偶数のアミノ酸残基を含むとは限らないことは理解されたい。従って、ループが、奇数のアミノ酸を含むか、又は含むことが判明した場合には、奇数ループのハーフループは、ループの整数部分又は次の整数部分を含むことになる（ループのアミノ酸の数／２＋／−０．５アミノ酸）。例えば、７アミノ酸ループとして同定されたループは、３アミノ酸又は４アミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５は、３又は４）のハーフループを生成し得る。
【０１５９】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「ドメイン」は、１つ又は複数の同定可能な構造又は機能的特徴若しくは特性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用のための部位として作用する、結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【０１６０】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「ハーフドメイン」は、それが由来するドメインのアミノ酸残基数の少なくとも半分を有する、同定されたドメインの一部を意味する。ドメインは、必ずしも偶数のアミノ酸残基を含むとは限らないことは理解されたい。従って、ドメインが、奇数のアミノ酸を含むか、又は含むことが判明した場合には、奇数ドメインのハーフドメインは、ドメインの整数部分又は次の整数部分を含むことになる（ドメインのアミノ酸の数／２＋／−０．５アミノ酸）。例えば、７アミノ酸ドメインとして同定されたドメインは、３アミノ酸又は４アミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５は、３又は４）のハーフドメインを生成し得る。また、ドメイン又はハーフドメイン内にサブドメインが識別される場合もあり、これらのサブドメインは、それ
らが由来するドメイン又はハーフドメインにおいて同定される全構造若しくは機能的特性の一部を有することも理解されたい。さらに、本明細書のドメインタイプのいずれかを含むアミノ酸が、ポリペプチドの骨格に沿って連続的である必要はない（すなわち、非隣接アミノ酸は、ドメイン、ハーフドメイン又はサブドメインを生成するように構造的にフォールドし得る）ことも理解されたい。
【０１６１】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「部位」は、アミノ酸ベースの実施形態に関する場合、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と類義に使用される。部位は、本発明のポリペプチドベースの分子内で修飾、操作、改変、誘導体化若しくは変異され得る、ペプチド又はポリペプチド内の位置を表す。
【０１６２】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「（複数の）末端」又は「末端」は、ペプチド又はポリペプチドの末端を指す。こうした末端は、ペプチド又はポリペプチドの最初若しくは最後の部位に限定されるわけではなく、末端領域内の別のアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で終結）及びＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終結）の両方を有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、一部の事例で、ジスルフィド結合により、又は非共有結合力によって連結された複数のポリペプチド鎖から構成されている（多量体、オリゴマー）。こうした種類のタンパク質は、複数のＮ及びＣ末端を有することになる。あるいは、場合に応じて、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベースの部分で開始又は終了するように、ポリペプチドの末端を修飾してもよい。
【０１６３】
一旦これらの特徴のいずれかが、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによってコードしようとするポリペプチドの所望の成分として同定又は決定されたら、移動、交換、反転、欠失、ランダム化若しくは複製によって上記の特徴のいくつかの操作及び／又は修飾のいずれかを実施してよい。さらに、特徴の操作によって、本発明の分子に対する修飾と同じ結果が生じ得ることも理解されたい。例えば、ドメインの欠失を含む操作によって、完全長より短い分子をコードするような核酸の修飾と全く同じ分子の長さの改変が起こり得る。
【０１６４】
修飾及び操作は、限定はしないが、部位指定突然変異誘発などの当技術分野では公知の方法により達成することができる。次に、こうして得られた修飾分子は、本明細書に記載するもの又は当技術分野で公知であるいずれか他の好適なスクリーニングアッセイなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて活性について試験してもよい。
【０１６５】
本発明によれば、ポリペプチドは、共通配列を含んでもよく、これは、複数ラウンドの実験によって見出される。本明細書で用いられるとき、「共通」配列は、１つ又は複数の部位での可変性を可能にする配列の集団を代表する１配列である。
【０１６６】
当業者には認識されるように、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、本発明の目的のポリペプチドの範囲内に含まれると考えられる。例えば、本明細書において、基準タンパク質１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又は１００以上のアミノ酸長のいずれかのタンパク質断片（基準ポリペプチド配列より少なくとも１アミノ酸残基短いか、あるいはそれと等しいポリペプチド配列を意味する）が提供される。別の例では、本明細書に記載する配列のいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約１００％同一である約２０、約３０、約４０、約５０、若しくは約１００アミノ酸の区間を含む任意のタンパク質を本発明に従って使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明に従って使用されるポリペプチドは、本明細書で提供又は参照される配列のいずれかに示され
るように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれ以上の突然変異を含む。
【０１６７】
コードされたポリペプチド
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、目的のポリペプチド、例えば、限定はしないが、いくつかの標的カテゴリーのいずれかなどをコードするように設計することができ、こうしたカテゴリーとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質若しくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、形質膜タンパク質、細胞質又は細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒトの疾患に関連するタンパク質、ターゲティング部分、又は治療適用は見出されていないが、それでも研究及び創薬の分野で有用性があるヒトゲノムによってコードされるタンパク質。
【０１６８】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、基準ポリペプチド配列とある程度の同一性を有する変異体ポリペプチドをコードし得る。本明細書で用いられるとき、「基準ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。基準配列は、野生型配列、又は別の配列の設計で参照されるいずれの配列であってもよい。「基準ポリペプチド配列」は、例えば、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、同第２０１３１５１６６７号パンフレット、同第２０１３１５１６６８号パンフレット、同第２０１３１５１６６３号パンフレット、同第２０１３１５１６６９号パンフレット、同第２０１３１５１６７０号パンフレット、同第２０１３１５１６６４号パンフレット、同第２０１３１５１６６５号パンフレット、同第２０１３１５１６７１号パンフレット、同第２０１３１５１６７２号パンフレット、同第２０１３１５１７３６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されている配列のいずれか１つであってもよい。
【０１６９】
用語「同一性」は、当技術分野で知られているように、配列を比較することにより決定される通りの、２つ以上のペプチドの配列同士の関係性を指す。当技術分野では、同一性は、２つ以上のアミノ酸残基の鎖同士の一致の数によって決定される通りの、ペプチド同士の配列関連性の度合も意味する。同一性では、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって処理される、２つ以上の配列の小さい方とギャップアラインメント（もしあれば）の間の完全な一致のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法として、限定はしないが、以下の文献に記載されているものが挙げられる：「分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォ−マティック及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９３年；「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第１部、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）及びグリフィン，Ｈ．Ｇ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州、１９９４年；「分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ハイーネ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）及びデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍ．ストックトン・プレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュー
ヨーク州、１９９１年；カリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら著、ＳＩＡＭ応用数学会誌（ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．）、第４８巻、ｐ．１０７３、１９８８年；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１７０】
一部の実施形態では、ポリペプチド変異体は、基準ポリペプチドと同じか、又は類似の活性を有してもよい。あるいは、変異体は、基準ポリペプチドに対して改変された（例えば、増大又は低減した）活性を有してもよい。概して、本発明の特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、本明細書に記載され、また当業者には周知の配列アラインメントプログラム及びパラメータにより決定される通りに、特定の基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、しかし約１００％未満の配列同一性を有することになる。こうしたアラインメントのツールとして、ＢＬＡＳＴスイート（ステフェン
Ｆ．アルトシェル（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、トーマス  Ｌ．マッデン（Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ）、アレハンドロ  Ａ．シェファー（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）、ジンフィ・チャン（Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ）、チェン・チャン（Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ）、ウェブ・ミラー（Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ）、及びデイビッド  Ｊ．リップマン（Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ）著、１９９７年、「ギャップ付ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代タンパク質データベース検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２）のツールがある。
【０１７１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムのデフォルトパラメータとしては、例えば、期待閾値１０、ワードサイズ２８、マッチ／ミスマッチスコア１、−２、ギャップコストリニア（Ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ  Ｌｉｎｅａｒ）がある。任意のフィルター、並びに例えば、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）などの種特異的反復単位の選択を適用することができる。
【０１７２】
生物製剤
本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種の生物製剤をコードし得る。本明細書で用いられるとき、「生物製剤」は、本明細書に提供される方法で生成され、重症又は命を脅かす疾患若しくは病状を治療、治癒、緩和、予防、又は診断するために使用することができるポリペプチドベースの分子である。生物製剤は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、パラグラフ［０００１０１］及び［０００１０２］に記載されている。
【０１７３】
抗体
本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種の抗体若しくはその断片をコードし得る。用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体）、多エピトープ特異性、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び単鎖分子）、並びに抗体断片を含む。抗体は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、パラグラフ［０００１０３］〜［０００１０９］に記載されている。
【０１７４】
ワクチン
本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種のワクチンをコードし得る。本明細書で用いられるとき、「ワクチン」は、特定
の疾患又は感染因子に対する免疫を向上させる生物学的製剤である。本発明によれば、現在市販されているか、若しくは開発中の１種又は複数種のワクチンが、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによりコードされ得る。特定の理論に拘束される意図はないが、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰへの組み込みは、少なくとも部分的に、構築物設計の特異性、純度及び選択性によって、改善された治療効果をもたらすと考えられる。
【０１７５】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰにコードされるワクチンは、多くの治療分野、例えば、限定はしないが、心血管、ＣＮＳ、皮膚科、内分泌学、腫瘍学、免疫学、呼吸器、及び抗感染症における病状又は疾患を治療するために使用することができる。
【０１７６】
治療用タンパク質又はペプチド
本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種の承認済又は「試験中の」治療用タンパク質又はペプチドをコードし得る。
【０１７７】
本発明によれば、現在市販されているか、若しくは開発中の１種又は複数種の治療用タンパク質又はペプチドは、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによってコードされ得る。特定の理論に拘束される意図はないが、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰへの組み込みは、少なくとも部分的に、構築物設計の特異性、純度及び選択性によって、改善された治療効果をもたらすと考えられる。
【０１７８】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰにコードされる治療用タンパク質又はペプチドは、多くの治療分野、例えば、限定はしないが、血液、心血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚科、内分泌学、遺伝学、泌尿生殖器、胃腸、筋骨格、腫瘍学、及び免疫学、呼吸器、感覚並びに抗感染症における病状又は疾患を治療するために使用することができる。
【０１７９】
細胞透過性ポリペプチド
本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種の細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。本明細書で用いられるとき、「細胞透過性ポリペプチド」又はＣＰＰは、細胞による分子の取り込みを促進することができるポリペプチドを指す。本発明の細胞透過性ポリペプチドは、１種又は複数種の検出可能な標識を含んでもよい。ポリペプチドは、部分的に標識しても、又は全体を完全に標識してもよい。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、検出可能な標識を完全にコードしてもよいし、一部をコードするか、又は全くコードしなくてもよい。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、「シグナル配列」は、タンパク質翻訳中の新生タンパク質のアミノ末端で結合したアミノ残基の配列を指す。シグナル配列は、細胞透過性ポリペプチドの分泌をシグナル伝達するために用いることができる。
【０１８０】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、融合タンパク質もコードし得る。融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に作動可能に連結することによって作製することができる。本明細書で用いられるとき、「作動可能に連結される」は、細胞に導入されると、複合体の発現を可能にするように連結された治療用タンパク質と荷電タンパク質を指す。本明細書で用いられるとき、「荷電タンパク質」は、正、負又は総合中和電荷を帯びたタンパク質を指す。治療用タンパク質は、融合タンパク質の形成中に荷電タンパク質に共有結合させるのが好ましい。表面電荷と総又は表面アミノ酸の比は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７
、０．８又は０．９であってよい。
【０１８１】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによりコードされる細胞透過性ポリペプチドは、翻訳後に、複合体を形成し得る。複合体は、細胞透過性ポリペプチドに連結した、例えば、共有結合した荷電タンパク質を含んでもよい。「治療用タンパク質」は、細胞に投与されると、治療、診断、及び／若しくは予防効果を有し、並びに／又は所望の生物学的及び／若しくは薬理学的効果を有するタンパク質を指す。
【０１８２】
一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第１ドメイン及び第２ドメインを含んでもよい。第１ドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第２ドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で用いられるとき、「タンパク質結合パートナー」は、限定はしないが、抗体及びその機能性断片、スカフォールドタンパク質、又はペプチドを含む。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーに対する細胞内結合パートナーをさらに含んでもよい。細胞透過性ポリペプチドは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが導入され得る細胞から分泌させることができる。細胞透過性ポリペプチドはまた、第１細胞を透過することもできる。
【０１８３】
別の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第２細胞を透過することができる。第２細胞は、第１細胞と同じ部位に由来するものであってもよいし、又は異なる部位に由来するものでもよい。部位として、限定はしないが、組織及び臓器が挙げられる。第２細胞はまた、第１細胞に対し近位又は遠位のいずれでであってもよい。
【０１８４】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、タンパク質結合パートナーを含み得る細胞透過性ポリペプチドをコードすることもできる。タンパク質結合パートナーとして、限定はしないが、抗体、超荷電抗体又は機能性断片が挙げられる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、タンパク質結合パートナーを含む細胞透過性ポリペプチドが導入される細胞に導入してもよい。
【０１８５】
分泌タンパク質
ヒト及び他の真核細胞は、膜によって多数の機能的に異なるコンパートメントに細分されている。膜で仕切られたコンパートメント、すなわち細胞小器官の各々は、細胞小器官の機能に必須の異なるタンパク質を含有する。細胞は、タンパク質を特定の細胞小器官にターゲティングするために、タンパク質内に位置するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用する。
【０１８６】
シグナル配列、シグナルペプチド、又はリーダ配列と呼ばれる１タイプの選別シグナルは、小胞体（ＥＲ）と呼ばれる細胞小器官に１クラスのタンパク質を向ける。
シグナル配列によってＥＲにターゲティングされたタンパク質は、分泌タンパク質として細胞外空間に放出させることができる。同様に、細胞膜上に常在するタンパク質も、タンパク質を膜に保持する「リンカー」のタンパク質分解切断によって、細胞外空間に分泌させることができる。特定の理論に拘束される意図はないが、上記の細胞輸送を利用するために、本発明の分子を用いることができる。従って、本発明の一部の実施形態では、分泌したタンパク質を発現させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。分泌させるタンパク質は、本明細書に記載するもの、又は米国特許出願公開第２０１００２５５５７４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものから選択してもよい。
【０１８７】
一実施形態では、これらは、多量の価値あるヒト遺伝子産物の製造に用いることができる。
形質膜タンパク質
本発明の一部の実施形態では、形質膜タンパク質を発現させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。
【０１８８】
細胞質又は細胞骨格タンパク質
本発明の一部の実施形態では、細胞質又は細胞骨格タンパク質を発現させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。
【０１８９】
細胞内膜結合タンパク質
本発明の一部の実施形態では、細胞内膜結合タンパク質を発現させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。
【０１９０】
核タンパク質
本発明の一部の実施形態では、核タンパク質を発現させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。
【０１９１】
ヒトの疾患に関連するタンパク質
本発明の一部の実施形態では、ヒトの疾患に関連するタンパク質を発現させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。
【０１９２】
その他のタンパク質
本発明の一部の実施形態では、現在未知の治療機能を有するタンパク質を発現させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。
【０１９３】
ターゲティング部分
本発明の一部の実施形態では、ターゲティング部分を発現するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。これらは、タンパク質結合パートナー又は細胞の表面上の受容体を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで細胞を特定の組織空間にターゲティングする、又は特定の部分と相互作用する機能を果たす。好適なタンパク質結合パートナーとして、限定はしないが、抗体及びその機能性断片、スカフォールドタンパク質、又はペプチドがある。さらに、ｃｉｒｃＲＮＡは、脂質、炭水化物、又はその他の生物学的部分若しくは生体分子の合成及び細胞外局在化を指令するために使用することもできる。
【０１９４】
ペプチドライブラリー
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ポリペプチドライブラリーを生成するために用いてもよい。これらのライブラリーは、各々が様々な構造的又は化学修飾設計を含むｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの集団から生じ得る。この実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの集団は、限定はしないが、抗体若しくは抗体断片、タンパク質結合パートナー、スカフォールドタンパク質、並びに本明細書に教示する又は当技術分野で公知の他のポリペプチドを含む、複数のコードされたポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、標的細胞又は培養物への直接導入に好適であると考えられ、これらの標的細胞又は培養物が、コードされたポリペプチドを合成することができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、各々が異なるアミノ酸修飾を含むタンパク質の様々な変異体を生成して、これらを試験することにより、薬物動態、安定性、生体適合性、及び／若しくは生物活性、又は発現レベルなどの生物物理学的特性に関して最良の変異体を決定することができる。このようなライブラリーは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、若しくは１０９超の考えられる変異体（限定はしないが
、１つ又は複数の残基の置換、欠失、及び１つ又は複数の残基の挿入を含む）を含み得る。
【０１９６】
抗菌及び抗ウイルスポリペプチド
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種の抗菌ペプチド（ＡＭＰ）又は抗ウイルスペプチド（ＡＶＰ）をコードするように設計することができる。ＡＭＰ及びＡＶＰは、限定はしないが、微生物、脊椎動物、植物、両性類、鳥類、魚類、及び哺乳動物などの非常に多様な動物から単離され、記載されている（ワング（Ｗａｎｇ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、２００９年、ｐ．３７（データベース特集号）：Ｄ９３３−７）。抗菌及び抗ウイルスポリペプチドは、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットに記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込むものとする。非制限的例として、抗菌ポリペプチドが、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００１８９］〜［０００１９９］に記載されている。別の非制限的例として、抗ウイルスポリペプチドが、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００１８９］〜［０００１９５］及び［０００２００］に記載されている。
【０１９７】
細胞傷害性ヌクレオシド
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種の細胞傷害性ヌクレオシドを組み込んでいてもよい。細胞傷害性ヌクレオシドは、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、パラグラフ［０００１３５］〜［０００１３９］に記載されている。
【０１９８】
フランキング領域：非翻訳領域（ＵＴＲ）
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つのフランキング領域を含み、これらの領域は、少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る。
【０１９９】
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まないのに対して、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳に関してＵＴＲが果たす調節の役割についての証拠量が増えている。ＵＴＲの調節に関する特徴を本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡに組み込むことにより、分子の安定性を増強することができる。さらに、特定の特徴を組み込むことにより、転写物が所望外の器官部位に誤って向けられた場合に、転写物の制御された下方調節を確実にすることもできる。
【０２００】
５’ＵＴＲ及び翻訳開始
天然の５’ＵＴＲは、転写開始において役割を果たすという特徴を有する。これらは、シグネチャー様コザック配列を有し、これらの配列は、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与していることが一般に知られている。コザック配列は、共通ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）であり、これにもう１つの「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することもわかっている。
【０２０１】
一実施形態では、本発明での使用のために本明細書に記載される５’ＵＴＲは、少なくとも１つのコザック配列を含む。
別の実施形態では、本発明での使用のために本明細書に記載される５’ＵＴＲは、少な
くとも１つのコザック配列を含む。
【０２０２】
特定の標的臓器の豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を操作することにより、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの安定性、並びに本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのタンパク質産生を増強することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トラスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチン、又は因子ＶＩＩＩなどの肝臓発現核酸の５’ＵＴＲの導入を用いて、肝細胞株若しくは肝臓におけるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどのポリヌクレオチド分子の発現を増強することができる。同様に、該当組織における発現の向上を目的とする、他の組織特異的核酸からの５’ＵＴＲの使用は、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、上皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）及び肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）についても可能である。
【０２０３】
他の非ＵＴＲ配列を５’（又は３’ＵＴＲ）ＵＴＲに組み込んでもよい。例えば、イントロン又はイントロン配列の部分を本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのフランキング領域に組み込んでもよい。イントロン配列の組み込みにより、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのタンパク質産生が増加し得る。
【０２０４】
３’ＵＴＲ及びＡＵリッチエレメント
３’ＵＴＲは、アデノシンとウリジンが埋め込まれた区間を有することがわかっている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高速度のターンオーバを有する遺伝子において特に優勢である。それらの配列の特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、次の３つのクラスに分けることができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、１９９５年）：クラスＩ  ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含む。Ｃ−Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩ  ＡＲＥを含む。クラスＩＩ  ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップするＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。このタイプのＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−ａがある。クラスＩＩＩ  ＡＲＥは、それほど明確に定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含んでいない。ｃ−Ｊｕｎ及びミオゲニンは、このクラスの十分に研究された２つの例である。
【０２０５】
線状核酸の場合、ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを脱安定化するのに対し、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増大することが文献に記載されている。ＨｕＲは、３つのクラス全てのＡＲＥに結合する。核酸分子の３’ＵＴＲにＨｕＲ特異的結合部位を操作により導入すれば、ＨｕＲの結合、従って、ｉｎ  ｖｉｖｏでのメッセージの安定化が達成されることになる。
【０２０６】
３’ＵＴＲ  ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去又は修飾を用いて、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの安定性を調節することができる。特定のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを操作する場合、ＡＲＥの１つ又は複数のコピーを導入して、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをより不安定にすることができ、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの場合、ＡＲＥのコピーが、翻訳を短縮し、その結果得られるタンパク質の生産を低減することができる。同様に、ＡＲＥを同定し、除去又は突然変異させて、細胞内安定性を増大し、それにより、翻訳、並びにその結果得られるタンパク質の生産を増大することもできる。
【０２０７】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、トランスフェクション実験を関連細胞株で実施することができ、トランスフェクション後の様々な時点でタンパク質レベルをアッセイすることができる。例えば、異なるＡＲＥ操作分子で細胞をトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対しＥＬＩＳＡキットを用いて、トランスフェクトから６時間、１２時間、２４時間、４８時間、及び７日後に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
【０２０８】
翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのフランキング領域として、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサーエレメント、複数の翻訳エンハンサーエレメント（集合的に「ＴＥＥ」と呼ばれる）が挙げられる。非制限的例として、ＴＥＥは、転写プロモータと開始コドンの間に配置してよい。領域内に少なくとも１つのＴＥＥを有するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、キャップ構造も含んでよい。さらに、少なくとも１つのＴＥＥは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのフランキング領域に配置して、キャップ依存性又はキャップ非依存性翻訳を受けるようにしてもよい。
【０２０９】
「翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）エンハンサーエレメント」又は「翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）エンハンサーエレメント」（集合的に「ＴＥＥ」と呼ばれる）という用語は、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチド又はタンパク質の量を増加する配列を指す。
【０２１０】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのフランキング領域は、国際公開第２０１４０８１５０７号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通り、少なくとも１つのＴＥＥを含んでもよい。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのフランキング領域に組み込むことができるＴＥＥの非制限的例は、国際公開第２０１４０８１５０７号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［００１１６］〜［００１４０］に記載されている。
【０２１１】
マイクロＲＮＡ結合部位の組み込み
マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡであり、これは、核酸分子の３’ＵＴＲに結合して、核酸分子安定性を低減するか、又は翻訳を阻害するかのいずれかにより、遺伝子発現を下方制御する。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１つ又は複数のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、又はマイクロＲＮＡシードを含んでもよい。このような配列は、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書及び同第２００５／００５９００５号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されているものなどのいずれか公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
【０２１２】
マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域の配列を含み、この配列は、マイクロＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位又は２〜７位を含み得る。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、７個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位）を含み得るが、この場合、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補性部位は、マイクロＲＮＡ１位に向き合うアデニン（Ａ）によってフランキングされる。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７位
）を含み得るが、この場合、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補性部位は、マイクロＲＮＡ１位と向き合うアデニン（Ａ）によってフランキングされる。例えば、グリムソン  Ａ（Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ）、ファー  ＫＫ（Ｆａｒｈ  ＫＫ）、ジョンストン  ＷＫ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ）、ギャレット−エンジェレ  Ｐ（Ｇａｒｒｅｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ）、リム  ＬＰ（Ｌｉｍ  ＬＰ）、バーテル  ＤＰ（Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ）ら著、分子細胞（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）、２００７年、７月６日、第２７巻（１）、ｐ．９１〜１０５（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。該当するマイクロＲＮＡが利用可能であれば、マイクロＲＮＡ標的配列を操作により本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに導入することによって、分解又は翻訳低減のために分子をターゲティングすることができる。このプロセスは、核酸分子送達の際のオフターゲット効果の危険性を軽減し得る。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、並びに生物学におけるそれらの発現パターン及び役割が報告されている（ボナウアー（Ｂｏｎａｕｅｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ターゲッツ（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ
Ｔａｒｇｅｔｓ）、２０１０年、第１１巻、ｐ．９４３〜９４９；アナド（Ａｎａｎｄ）及びチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１〜１７６；コントレラス（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ）及びラオ（Ｒａｏ）著、白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２０１２年、第２６号、ｐ．４０４〜４１３（２０１１年、１２月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）著、細胞（Ｃｅｌｌ）、２００９年、第１３６巻、ｐ．２１５〜２３３；ランドグラフ（Ｌａｎｄｇｒａｆ）ら著、細胞（Ｃｅｌｌ）、２００７年、第１２９巻、ｐ．１４０１〜１４１４；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２１３】
例えば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが、肝臓に送達されるのではなく、そこに最後まで留まることが意図される場合、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２の１つ又は複数の標的部位が、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの３’ＵＴＲ中に操作により導入されていれば、目的の遺伝子の発現を阻害することができる。異なるマイクロＲＮＡに対する１つ又は複数の結合部位の導入を操作することにより、ｃｉｒｃＲＮＡの寿命、安定性、及びタンパク質翻訳をさらに低減することができる。
【０２１４】
本明細書で用いられるとき、用語「マイクロＲＮＡ部位」は、マイクロＲＮＡ標的部位又はマイクロＲＮＡ認識部位、又はマイクロＲＮＡが結合又は会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」が、伝統的なワトソン−クリックハイブリダイゼーション法則に従うか、あるいは、マイクロＲＮＡ部位での又はそれに隣接した標的配列とマイクロＲＮＡの何らかの安定な結合を表し得ることは理解すべきである。
【０２１５】
反対に、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの目的で、特定の組織におけるタンパク質発現を増大するために、マイクロＲＮＡ結合部位は、それらが天然に存在する配列から操作により取り出す（すなわち、除去する）ことができる。例えば、肝臓におけるタンパク質発現を改善するために、ｍｉＲ−１２２結合部位を除去することができる。様々な組織における発現の調節は、１つ又はいくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入又は除去によって達成することができる。
【０２１６】
マイクロＲＮＡが、ｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することがわかっている組織の例として、限定はしないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、上皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７
、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられる。マイクロＲＮＡはまた、血管新生などの複雑な生物学的プロセスも調節することができる（ｍｉＲ−１３２）（アナド（Ａｎａｎｄ）及びチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１〜１７６；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰにおいて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの発現を生物学的に関連する細胞型又は関連する生物学的プロセスの状況に合わせて調整するために、こうしたプロセスに関与するマイクロＲＮＡの結合部位を除去又は導入することができる。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ配列及びｍｉＲ結合部位のリストは、２０１３年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７５３，６６１号明細書の表９、２０１３年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５４，１５９号明細書の表９、２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，９２１号明細書の表７に掲載されており、これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む。
【０２１７】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、疾患特異的ｍｉＲ結合部位を含み得る。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳又はｃｉｒｃＳＰのスポンジ活性は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが含まれる細胞が、ｍｉＲ結合部位により活性化される条件を経ない限り、開始されない。非制限的例として、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを細胞、組織又は生物に投与することができる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが配置された細胞が、構築物をアンロックすることにより、翻訳を開始するための特定の条件を経ない限り、翻訳されない。
【０２１８】
最後に、様々な細胞型におけるマイクロＲＮＡの発現パターンを理解することによって、特定の細胞型において、又は特定の生物学的条件下でのみ、より標的化された発現のために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを操作することができる。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入により、ある組織、又は生物学的条件下の状況におけるタンパク質発現のために最適となるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを設計することができる。組織又は疾患特異的遺伝子発現を駆動するためのマイクロＲＮＡの使用の例が列記されている（ゲトナー（Ｇｅｔｎｅｒ）及びナルディニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）著、組織抗原（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ）、２０１２年、第８０巻、ｐ．３９３〜４０３；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。さらに、マイクロＲＮＡシード部位をｍＲＮＡに組み込むことにより、特定の細胞における発現を低減して、生物学的改善をもたらすこともできる。この一例は、ＵＧＴ１Ａ１発現レンチウイルスベクターへのｍｉＲ−１４２部位の組み込みである。ｍｉＲ−１４２シードの存在によって、造血細胞における発現が低減し、その結果、抗原提示細胞での発現が減少し、ウイルス発現ＵＧＴ１Ａ１に対する免疫応答が消失した（シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら著、消化器病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第１３９巻、ｐ．９９９〜１００７；ゴンザレス−アセキノラザ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｑｕｉｎｏｌａｚａ）ら著、消化器病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第１３９巻、ｐ．７２６〜７２９；いずれも、全体として参照により本明細書に組み込む）。ｍｉＲ−１４２部位のｃｉｒｃＲＮＡへの組み込みによって、造血細胞でのコードされたタンパク質の発現を低減することができただけでなく、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰでコードされたタンパク質に対する免疫応答を低減又は無効にすることもできた。ｍｉＲ−１４２シード部位（１つ又
は複数）のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰへの組み込みは、完全なタンパク質欠乏症を有する患者（Ｉ型ＵＧＴ１Ａ１、ＬＤＬＲ欠損患者、ＣＲＩＭ陰性Ｐｏｍｐｅ患者など）を治療する際に重要となり得る。
【０２１９】
操作されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、トランスフェクション後の様々な時点でタンパク質レベルをアッセイすることができる。例えば、種々のマイクロＲＮＡ結合部位操作ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰで細胞をトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対するＥＬＩＳＡキットを用いて、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日の時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。マイクロＲＮＡ結合部位操作分子を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験を実施して、製剤化されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの組織特異的発現の変化を検査することもできる。
【０２２０】
ウイルス配列
別のウイルス配列、例えば、限定はしないが、オオムギ黄萎ウイルス（ｂａｒｌｅｙ  ｙｅｌｌｏｗ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（Ｊａａｇｓｉｅｋｔｅ  ｓｈｅｅｐ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（ＪＳＲＶ）及び／又は動物地方流行性鼻腫瘍ウイルス（ｅｎｚｏｏｔｉｃ  ｎａｓａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）の翻訳エンハンサー配列など（例えば、国際公開第２０１２１２９６４８号パンフレットを参照；全体として参照により本明細書に組み込む）を操作して、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの３’ＵＴＲに挿入することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの構築物の翻訳を刺激することができる。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡによって、トランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日の時点でタンパク質産生をアッセイすることができる。
【０２２１】
ＩＲＥＳ配列
さらに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得るｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。特徴的なピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａ  ｖｉｒｕｓ）として最初に同定され、ＩＲＥＳは、５’キャップ構造の非存在下でタンパク質合成を開始する上で重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用し得るか、又はポリヌクレオチドの複数のリボソーム結合部位の１つとして作用し得る。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を含有するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、リボソームにより独立して翻訳される複数のペプチド又はポリペプチドをコードし得る（マルチシストロン性核酸分子）。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが、ＩＲＥＳと一緒に提供されるとき、任意選択で、第２の翻訳可能な領域もさらに提供される。本発明に従って使用することができるＩＲＥＳ配列の例として、限定はしないが、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａ  ｖｉｒｕｓ）（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＰＶ）、脳脊髄炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＶ）、又はコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）が挙げられる。
【０２２２】
ポリＡテイル
安定性を高めるために、ＲＮＡのプロセシング中に、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテイル）をｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどのポリヌクレオチドに付加することができる。転写直後に、転写物の３’末端を切断して、３’ヒドロキシルを遊離させることができる。そのとき、ポリＡポリメラーゼは、ポリヌクレオチドにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれるプロセスは、ポリＡテイルを付加するが、これは、例えば、約１００〜２５０残基長であってよい。
【０２２３】
独特のポリＡテイルの長さによって、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰにいくつかの利点がもたらされ得ることが判明している。
一般に、本発明のポリＡテイルの長さは、３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ポリＡテイルは、３５ヌクレオチド長より長い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド以上）。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、約３０〜約３，０００個のヌクレオチドを含む（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００）。
【０２２４】
一実施形態では、ポリＡテイルは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ全体の長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴若しくは領域（第１又はフランキング領域など）の長さに基づいて、又はｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰから発現された最終産物の長さに基づいて行ってよい。
【０２２５】
これに関して、ポリＡテイルは、長さが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ又はそれらの特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％長くてもよい。ポリＡテイルはまた、それが属するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの画分として設計してもよい。これに関連して、ポリＡテイルは、構築物の全長又はポリＡテイルを除いた構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、若しくは９０％、又はそれ以上であってもよい。さらに、ポリＡ結合タンパク質に対するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの操作された結合部位及び共役によって、発現を増強することができる。
【０２２６】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ポリＡ−Ｇカルテット（Ｑｕａｒｔｅｔ）を含有するように設計される。Ｇ−カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方でＧリッチ配列によって形成することができる、４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合配列である。この実施形態において、Ｇ
−カルテットは、ポリＡテイルの末端に組み込まれる。得られたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ構築物は、様々な時点で、安定性、タンパク質産生及び／又は半減期などのその他のパラメータについてアッセイする。ポリＡ−Ｇカルテットによって、１２０ヌクレオチドのポリＡテイル（配列番号４９）を単独で用いて認められたものの少なくとも７５％と同等のタンパク質産生が達成されることが判明している。
【０２２７】
開始コドン
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つの開始コドン（ＡＴＧ／ＡＵＧ）を含む。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、２つ以上の開始コドン、例えば、限定はしないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０を超える開始コドンを含んでもよい。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳は、最初の開始コドンで開始するか、又は開始コドンの下流で開始し得る。
【０２２８】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始し得る。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳は、代替開始コドン、例えば、限定はしないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ（トウリオール（Ｔｏｕｒｉｏｌ）ら著、細胞の生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ）」、第９５巻、２００３年、ｐ．１６９〜１７８、並びにマツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）及びマウロ（Ｍａｕｒｏ）著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻、ｐ．１１を参照；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳は、代替開始コドンＡＣＧで開始する。別の非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳は、代替開始コドンＣＴＧ／ＣＵＧで開始する。また別の非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳は、代替開始コドンＧＴＧ／ＧＵＧで開始する。
【０２２９】
翻訳を開始するコドン、例えば、限定はしないが、開始コドン又は代替開始コドンなどにフランキングするヌクレオチドは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳効率、長さ及び／又は構造に影響を与えることがわかっている。（例えば、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）及びマウロ（Ｍａｕｒｏ）著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻、ｐ．１１を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。翻訳を開始するコドンにフランキングするヌクレオチドのいずれかのマスキングを用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳開始、翻訳効率、長さ及び／又は構造を改変することもできる。
【０２３０】
一実施形態では、コドンをマスキング又は隠蔽して、マスキングした開始コドン又は代替開始コドンでの翻訳開始の確率を低下させるために、開始コドン又は代替開始コドン付近でマスキング剤を使用してもよい。マスキング剤の非制限的例として、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）及びマウロ（Ｍａｕｒｏ）が記載するマスキング剤ＬＮＡオリゴヌクレオチド及びＥＪＣ（プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻：ｐ．１１）を参照のこと；これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２３１】
別の実施形態では、翻訳が代替開始コドンで開始する見込みを高めるために、マスキング剤を用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの開始コドンをマスキングすることができる。
【０２３２】
一実施形態では、翻訳が、マスキングした開始コドン又は代替開始コドンの下流で開始する見込みを高めるために、マスキング剤を用いて、第１の開始コドン又は代替開始コドンをマスキングすることができる。
【０２３３】
一実施形態では、開始コドン又は代替開始コドンは、ｍｉＲ結合部位の完全な補体内に位置してもよい。ｍｉＲ結合部位の完全な補体は、マスキング剤と同様に、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳、長さ及び／又は構造を制御する上で役立ち得る。非制限的例として、開始コドン又は代替開始コドンは、ｍｉＲ−１２２結合部位の完全な補体の中央に位置してもよい。開始コドン又は代替開始コドンは、第１ヌクレオチド、第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチド、第４ヌクレオチド、第５ヌクレオチド、第６ヌクレオチド、第７ヌクレオチド、第８ヌクレオチド、第９ヌクレオチド、第１０ヌクレオチド、第１１ヌクレオチド、第１２ヌクレオチド、第１３ヌクレオチド、第１４ヌクレオチド、第１５ヌクレオチド、第１６ヌクレオチド、第１７ヌクレオチド、第１８ヌクレオチド、第１９ヌクレオチド、第２０ヌクレオチド若しくは第２１ヌクレオチドの後に位置してもよい。
【０２３４】
別の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの開始コドンは、開始コドンではないコドンでｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳を開始させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ配列から除去してもよい。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳は、除去された開始コドンの後のコドンで、又は下流の開始コドンで、あるいは代替開始コドンで開始し得る。非制限的例では、下流の開始コドン又は代替開始コドンで翻訳を開始させるために、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ配列の最初の３つのヌクレオチドとして開始コドンＡＴＧ／ＡＵＧを除外する。開始コドンが除去されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ配列は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳開始、長さ及び／若しくはｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの構造を制御する、又は制御を試みるために、下流の開始コドン及び／又は代替開始コドンに対する少なくとも１種のマスキング剤をさらに含んでもよい。
【０２３５】
定量
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種の体液から得られるエキソソームで定量してもよい。本明細書において、「体液」は、血液、血清、血漿、腹水、尿、脳髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、腺液若しくは前射精液、汗、大便、毛髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹膜液、心膜液、リンパ液、キームス、乳糜、胆液、腸液、月経、膿、皮脂、吐しゃ物、膣分泌物、粘液分泌物、水様便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、並びに臍帯血を含む。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される臓器から採取してもよい。
【０２３６】
定量方法では、対象から２ｍＬ以下のサンプルを取得し、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティ精製、マイクロ流体分離、又はこれらの組み合わせによってエキソソームを単離する。分析
において、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのレベル若しくは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、非存在、切断又は改変であってもよい。１つ又は複数の臨床的表現型又はヒトの疾患バイオマーカのアッセイと上記のレベルを相関させることが有利である。アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析法、又はこれらの組み合わせを用いて実施することができ、エキソソームは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学法を用いて単離することができる。エキソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティ精製、マイクロ流体分離、又はこれらの組み合わせによって単離することもできる。
【０２３７】
これらの方法によって、検査者は、残留する、又は送達されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのレベルをリアルタイムでモニターすることができる。これは、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが、構造的又は化学的修飾によって、内因性の形態とは異なるために可能である。
【０２３８】
ＩＩ．環状ポリヌクレオチドの設計及び合成
本発明に従って用いられるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、任意の利用可能などの技術によって調製してもよく、そのような技術として、限定はしないが、化学合成及び酵素的合成がある。一部の実施形態では、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡを環状化、又はコンカテマー化することにより、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを作製することができる。環状化又はコンカテマー化の機構は、限定はしないが、化学、酵素、又はリボザイム触媒方法などの方法によって達成することができる。新たに形成される５’−／３’−結合は、分子内結合又は分子間結合であってよい。
【０２３９】
一実施形態では、化学的方法により線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡを環状化又はコンカテマー化して、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを形成することができる。化学的方法では、核酸（例えば、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡ）の５’末端及び３’末端は、化学的に反応性の基を含有し、これらが、互いに接近すると、分子の５’末端及び３’末端の間に新たな共有結合を形成する。有機溶媒中で、線状ＲＮＡ分子の３’末端上の３’−アミノ末端ヌクレオチドが、５’−ＮＨＳ−エステル部分上の求核攻撃を受けて、新たな５’−／３’−アミド結合を形成するように、５’末端は、ＮＨＳ−エステル反応基を含有し、３’末端は、３’−アミノ末端ヌクレオチドを含有してもよい。
【０２４０】
一実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’−リン酸化核酸分子（例えば、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡ）を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素的に連結することにより、新たなホスホロジエステル連結を形成することができる。例示的反応では、１μｇの核酸分子を１〜１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウイッチ）と、製造者のプロトコルに従い、３７℃で１時間インキュベートする。連結反応は、酵素的連結反応を補助するために、並列する５’−及び３’−領域の両方と塩基対合することができる分断オリゴヌクレオチドの存在下で実施してよい。
【０２４１】
一実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの合成に使用することができる。非制限的例として、リガーゼは、ｃｉｒリガーゼ又は環状リガーゼであってよい。
【０２４２】
別の実施形態では、タンパク質連結を用いて、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡの５’末端に結合した第１タンパク質と、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡの３’末端に結合した第２タンパク質を連結させることができる。一態様では、第１及び第２タンパク質は、同じタンパク質であってよい。別の実施形態では、第１及び第２タンパク質は異なる。非制限的例として、一方又は両方のタンパク質は、ＲＮＡ結合融合酵素であってよい。別の実施形態では、一方又は両方のタンパク質は、ＰＵＦ１タンパク質であってもよく、これは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来するものであってよい。また別の非制限的例として、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡを環状化又はコンカテマー化するために、一方又は両方のタンパク質を他の酵素と融合させてもよい。
【０２４３】
一実施形態では、タンパク質連結を用いて、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡの５’末端に結合した第１融合酵素と、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡの３’末端に結合した第２融合酵素を連結させることができる。
【０２４４】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写中に、得られる核酸分子が、核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端に連結することができる活性リボザイムを含有できるように、ｃＤＮＡ鋳型の５’又は３’末端のいずれかが、リガーゼリボザイム配列をコードすることができる。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｖｉｒｕｓ）、ヘアピン（Ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムに由来するものであってもよいし、又はセレックス（ＳＥＬＥＸ）（試験管内進化法）により選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間を要し得る。
【０２４５】
一実施形態では、少なくとも１つの非核酸部分を用いることによって、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを環状化してもよい。一態様では、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡを環状化又はコンカテマー化するために、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡの５’末端付近及び／又は３’末端付近の領域若しくは特徴と、少なくとも１つの非核酸部分を反応させてもよい。別の態様では、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡの５’末端付近及び／又は３’末端付近に、少なくとも１つの非核酸部分を配置してもよい。本発明で考慮する非核酸部分は、相同性又は異種のいずれであってもよい。非制限的例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能な結合などの結合であってよい。別の非制限的例として、非核酸部分は、連結部分である。また別の非制限的例として、非核酸部分は、オリゴヌクレオチド又はアプタマーなどのペプチド部分であってもよい。
【０２４６】
一実施形態では、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡは、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡの５’及び３’末端における、それらに近接した又は連結した原子同士、分子表面同士の引力を引き起こす非核酸部分によって、環状化又はコンカテマー化され得る。非制限的例として、線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡは、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間力の非制限的例として、双極子−双極子力、双極子−誘起双極子力、誘起双極子−誘起双極子力、ファンデルワールス力、及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非制限的例として、共有結合、金属結合、イオン結合、共振結合、アグノスティック結合、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
【０２４７】
一実施形態では、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、５’末端付近及び３’末端付近にリボザイムＲＮＡを含んでもよい。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残りに曝露されるとき、ペプチドと共有結合する。一態様では、５’末端付近及び３’末端付近でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合したペプチドが互いに結合して、線状一次構築物若
しくは線状ｍＲＮＡを環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態様では、５’末端付近及び３’末端付近でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合したペプチドは、当技術分野で公知の様々な方法、例えば、限定はしないが、タンパク質連結を用いた連結反応に線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを付した後、これらを環状化又はコンカテマー化することができる。本発明の線状一次構築物若しくは線状ｍＲＮＡに使用されるリボザイムの非制限的例、あるいはペプチドを組み込む及び／又は共有結合するための方法の非網羅的例が、米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０２４８】
ｃｉｒｃＰを合成する様々な方法も当技術分野で記載されている（例えば、米国特許第６２１０９３１号明細書、同第５７７３２４４号明細書、同第５７６６９０３号明細書、同第５７１２１２８号明細書、同第５４２６１８０号明細書、同第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット及び国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照されたい；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２４９】
一部の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの設計及び合成の方法は、概して、遺伝子構築、線状ｍＲＮＡ生成（修飾有り又はなしのいずれか）及び精製、並びに線状ｍＲＮＡの環状化のステップを含む。酵素手合成方法では、まず、ベクターへの組み込みのために、目的のポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列を選択してから、ベクターを増幅することにより、ｃＤＮＡ鋳型を生成する。任意選択で、標的ポリヌクレオチド配列及び／又は任意のフランキング配列をコドン最適化してもよい。次に、ｃＤＮＡ鋳型を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によりｍＲＮＡを生成する。生成後、ｍＲＮＡを精製及び環状化プロセスに付してもよい。目的のポリペプチドをコードする線状ポリヌクレオチド（これは、続いて、環状化プロセスに付してもよい）を生成するステップについては、以下にさらに詳しく記載する。
【０２５０】
例えば、式Ｉ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式Ｉ
を含む配列を有する本発明のポリヌクレオチドは、式ＸＶＩ：
［Ａｎ］−（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃ−Ｎ３
式ＸＶＩ
の構造を有する化合物と、式ＸＶＩＩ：
Ｒ２７−（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆ−［Ｂｏ］
式ＸＶＩＩ
の構造を有する化合物を反応させることにより、合成することができ、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、任意のヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【０２５１】
【化３１】
2017522028.tif 000034
【０２５２】
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、各々独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７は各々、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ，及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたトリアゾレンであり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；並びに
Ｒ２７は、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ３アルキニル又は任意選択で置換されたＣ８〜Ｃ１２シクロアルキニルであり、
ここで、Ｌ１は、１つのヌクレオシドの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合する。
【０２５３】
式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂ：
【０２５４】
【化３２】
2017522028.tif 000035
【０２５５】
の構造を含む本発明の環状ポリヌクレオチドは、式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ、又はＸＩＶｂ：
【０２５６】
【化３３】
2017522028.tif 000036
【０２５７】
の構造を有する化合物と、
式ＸＶａ又はＸＶｂ：
【０２５８】
【化３４】
2017522028.tif 000037
【０２５９】
の構造を有する化合物を（例えば、銅供給源の存在若しくは非存在下、［３＋２］環状付加条件下で）反応させることにより、合成することができ、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｒ２４及びＲ２７の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、及びＲ２６’の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであるか、又は、Ｒ２５’若しくはＲ２６’とアルキニル基は一緒に、任意選択で置換されたシクロアルキニルを形成する）。
【０２６０】
例えば、本発明の環状ポリヌクレオチドは、以下に示すように合成することができる：
【０２６１】
【化３５】
2017522028.tif 000038
【０２６２】
一部の実施形態では、この方法で、５’キャップ構造又はポリＡテイルを線状ポリヌクレオチドに結合させてもよく、また、本明細書に記載する方法により線状ポリヌクレオチドを環状化してもよい。
【０２６３】
５’キャップ構造は、以下に示すように、本発明のポリヌクレオチドに結合させることができる：
【０２６４】
【化３６】
2017522028.tif 000039
【０２６５】
５’キャップ構造を結合させた後、ポリヌクレオチドを環状化してもよい。
ポリＡテイルは、以下に示すように、本発明のポリヌクレオチドに結合させることができる：
【０２６６】
【化３７】
2017522028.tif 000040
【０２６７】
ポリＡテイルを結合させた後、ポリヌクレオチドを環状化してもよい。
環状化が可能なポリヌクレオチドは、様々な方法で製造することができる。
例えば、本発明のポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂ：
【０２６８】
【化３８】
2017522028.tif 000041
【０２６９】
の構造を含んでもよい。
本発明の環状ポリヌクレオチドは、式ＶＩａ又はＶＩｂ：
【０２７０】
【化３９】
2017522028.tif 000042
【０２７１】
の構造を有する化合物と、式ＶＩＩ：
【０２７２】
【化４０】
2017522028.tif 000043
【０２７３】
の構造を有する化合物を（例えば、アルキル化条件下で）反応させるステップを含む方法
によって製造される構造を含んでもよく、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ２は各々、独立に、Ｏ又はＳであり；
Ｘ３は各々、独立に、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ１７及びＲ１９の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；並びに
Ｒ１８は、ハロゲンである。
【０２７４】
本発明の環状ポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂ：
【０２７５】
【化４１】
2017522028.tif 000044
【０２７６】
の構造を含んでもよい。
この方法は、式ＩＸａ又はＩＸｂ：
【０２７７】
【化４２】
2017522028.tif 000045
【０２７８】
の構造を有する化合物と、
式Ｘａ又はＸｂ：
【０２７９】
【化４３】
2017522028.tif 000046
【０２８０】
の構造を有する化合物を（例えば、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）反応条件下で）反応させるステップを含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ１及びＸ２は各々、独立に、Ｏ又はＳであり；
Ｘ３は各々、独立に、ＯＨ、ＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ２０及びＲ２３の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２１及びＲ２２の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシである。
【０２８１】
式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂ：
【０２８２】
【化４４】
2017522028.tif 000047
【０２８３】
の構造を含む本発明の環状ポリヌクレオチド。
この方法は、式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ、又はＸＩＶｂ：
【０２８４】
【化４５】
2017522028.tif 000048
【０２８５】
の構造を有する化合物と、
式ＸＶａ又はＸＶｂ：
【０２８６】
【化４６】
2017522028.tif 000049
【０２８７】
の構造を有する化合物を（例えば、銅供給源の存在若しくは非存在下、［３＋２］環状付加条件下で）反応させるステップを含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロア
ルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、非存在、Ｏ、ＮＨ、若しくはＳ又はそれらの塩であり；
Ｒ２４及びＲ２７の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、及びＲ２６’の各々は、独立に、非存在、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであるか、あるいは、Ｒ２５とアルキニル基は一緒に、任意選択で置換されたシクロアルキニレンを形成する。
【０２８８】
本発明の環状ポリヌクレオチドは、以下に示す通りに合成することができる：
【０２８９】
【化４７】
2017522028.tif 000050
【０２９０】
本発明の環状ポリヌクレオチドの他の合成方法を以下に示す：
【０２９１】
【化４８】
2017522028.tif 000051
【０２９２】
（式中、ＣＥＯは、２−シアノエトキシであり、Ｘは、Ｏ又はＳである）。
本発明の環状ポリヌクレオチドの他の合成方法を以下に示す：
【０２９３】
【化４９】
2017522028.tif 000052
【０２９４】
３’（又は、ｇ若しくはｈが１のとき、４’位）及び５’（又は、ｇ若しくはｈが１のとき、６’位）に示される反応基は、逆転可能であることは理解されよう。例えば、ハロゲン、アジド、又はアルキニル基を５’位（又は、ｇ若しくはｈが１のとき、６’位）に結合させることができ、チオホスフェート、（チオ）ホスホリル、又はアジド基を３’（又は、ｇ若しくはｈが１のとき、４’位）に結合させてもよい。
【０２９５】
環状ポリヌクレオチドの遺伝子構築
遺伝子構築のステップは、限定はしないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精
製、プラスミド線状化及びクリーンアップ、及びｃＤＮＡ鋳型合成及びクリーンアップを含み得る。
【０２９６】
遺伝子合成
一実施形態では、環状一次構築物は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰであり、これは、目的のポリペプチドのコード領域を含み得る。環状一次構築物の場合、目的のポリペプチド（標的）を生成のために選択し、環状構築物を設計する。環状一次構築物内で、選択した核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）転写物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を用いて、目的のポリペプチドをコードする第１の連結ヌクレオシド領域を構築することができる。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、それらのアイソフォーム、変異体又は断片を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、目的のポリペプチドをコードすることができる核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指すものとする。ＯＲＦは、多くの場合、開始コドン、ＡＴＧで開始して、ナンセンス若しくは終止コドン又はシグナルで終結する。
【０２９７】
別の実施形態では、環状一次構築物は、ｃｉｒｃＳＰであり、これは、目的のポリペプチドのコード領域を含まない。環状一次構築物内には、少なくとも１つのセンサー領域を含む、第１の連結ヌクレオシド領域がある。第１の連結ヌクレオシド領域は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のセンサー領域を含み得る。
【０２９８】
さらに、第１領域のヌクレオチド配列をコドン最適化してもよい。コドン最適化の方法は、当技術分野で公知であり、いくつかの目標の１つ又は複数を達成する試みにおいて有用となり得る。これらの目標としては、以下のものが挙げられる：適正な折り畳みを確実にするために標的及び宿主生物のコドン使用頻度をマッチさせること、二次構造の安定性の増大又は二次構造の低減のためにＧＣ含量を偏らせること、遺伝子構築若しくは発現を障害し得るタンデム反復コドン若しくは塩基ランを最小限化にすること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入若しくは除去すること、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去若しくはシャッフルすること、制限部位を挿入する、又は欠失させること、リボソーム結合部位及び分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインの適正な折り畳みを可能にするように翻訳速度を調節すること、あるいは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ内で問題となる二次構造を低減又は排除すること。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野において公知であり、非制限的例として、ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンロパーク）及び／又は専有の方法がある。一実施形態では、ＯＲＦ配列、フランキング領域及び／又はセンサー領域は、最適化アルゴリズムを用いて最適化する。各アミノ酸についてのコドンオプションを表１に記載する。
【０２９９】
【表１】
2017522028.tif 000053
【０３００】
本発明の一部の実施形態において有益と考えられ得る特徴は、環状一次構築物によりコードすることができ、フランキング領域として第１の連結ヌクレオシド領域とフランキングしてもよい。フランキング領域は、環状一次構築物の領域、若しくはその部分のいずれかの最適化前及び／又は後に、環状一次構築物に組み込んでもよい。環状一次構築物が、５’及び３’フランキング領域の両方を含有する必要はない。こうした特徴の例として、限定はしないが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ＩＲＥＳ配列又はその断片、オリゴ（ｄＴ）配列、及び検出可能なタグが挙げられ、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローン化部位も含まれ得る。
【０３０１】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲは、フランキング領域として提供される。複数の５’又は３’ＵＴＲがフランキング領域に含まれていてもよく、同じ又は異なる配列であってもよい。フランキング領域のいずれかの部分（ない場合もある）をコドン最適化してもよく、これらは、独立して、コドン最適化の前及び／又は後に、１つ又は複数の異なる構造的若しくは化学修飾を含んでもよい。特徴の組み合わせをフランキング領域に組み込んでもよいし、他の特徴内に含有させてもよい。例えば、第１の連結ヌクレオシド領域は、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲ及び／又はポリＡテイルの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲによってフランキングされていてもよい。米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている５’ＵＴＲのように、５’ＵＴＲは、同じ及び／又は異なる目的のポリペプチドに由来する第１ポリヌクレオチド断片及び第２ポリヌクレオチド断片を含んでもよい。
【０３０２】
表２及び表３に、フランキング領域として本発明の環状一次構築物に使用することができる例示的ＵＴＲの一覧を掲載する。表２には、本発明の５’非翻訳領域の一覧を示す。Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ又はＧなどの１つ又は複数のヌクレオチドが末端に付加されているか又は末端から除去されている、５’ＵＴＲの変異体を使用することもできる。
【０３０３】
【表２】
2017522028.tif 000054
【０３０４】
表３には、本発明の３’非翻訳領域の一覧を示す。Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ又はＧなどの１つ又は複数のヌクレオチドが末端に付加されているか又は末端から除去されている、３’ＵＴＲの変異体を使用することもできる。
【０３０５】
【表３】
2017522028.tif 000055
【０３０６】
前出の表に列記されているものは例であり、任意の遺伝子からの任意のＵＴＲを環状一次構築物のそれぞれのフランキング領域に組み込んでもよいことは理解すべきである。非制限的例として、組み込むことができるＵＴＲ又はその断片は、米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号明細書及び同第６１／８２９，３７２号明細書、又は米国特許出願公開第２０１４／０２１５２２号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に列記されるＵＴＲである。さらに、任意の既知遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを使用してもよい。また、野生型遺伝子の変異体ではない人工ＵＴＲを提供することも本発明の範囲内である。これらのＵＴＲ若しくはその部分は、それらが選択された転写物と同じ配向で配置してもよいし、又は配向若しくは位置を改変してもよい。従って、５’又は３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長してもよいし、１つ又は複数の他の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲと共にキメラ化してもよい。本明細書で用いられるとき、「改変された」という用語は、ＵＴＲ配列に関する場合、ＵＴＲが基準配列に対して何らかの形で変更されていることを意味する。例えば、３’又は５’ＵＴＲは、野生型又はネイティブＵＴＲに対し、上に教示したように配向若しくは位置の変更によって改変してもよいし、追加ヌクレオチドの含有、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換又は転位により改変してもよい。「改変された」ＵＴＲ（３’又は５’のいずれか）を生成するこれらの変更のいずれも、変異体ＵＴＲを構成する。
【０３０７】
一実施形態では、５’又は３’ＵＴＲなどの二重、三重又は四重ＵＴＲを用いてもよい。本明細書で用いられるとき、「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーが、連続して、又は実質的に連続して、コードされるものである。例えば、米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りに、二重β−グロブリン３’ＵＴＲを用いることができる。
【０３０８】
さらに、パターン化ＵＴＲを有することも本発明の範囲に含まれる。本明細書で用いられるとき、「パターン化ＵＴＲ」は、１回、２回、又は３回以上反復されるＡＢＡＢＡＢ若しくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ若しくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ若しくはそれらの変形などの反復又は交互のパターンを表すＵＴＲである。これらのパターンにおいて、Ａ、Ｂ、又はＣの各文字は、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
【０３０９】
一実施形態では、そのタンパク質が、共通の機能、構造、特性の特徴を有する転写物のファミリーから、フランキング領域を選択する。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織又は発生中のある時点で発現されるタンパク質のファミリーに属し得る。これらのいずれかの遺伝子由来のＵＴＲを同じ又は異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新たなキメラ一次転写物を作製することができる。本明細書で用いられるとき、「タンパク質のファミリー」は、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、若しくは発現パターンを共通に有する２つ以上の目的のポリペプチドの群を指して、最も広義に用いられる。
【０３１０】
最適化（所望であれば）の後、環状一次構築物成分を再構成し、例えば、限定はしないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体などのベクターに形質転換してもよい。例えば、最適化構築物を再構成し、ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、アカパンカビ（ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トウモロコシ、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などに形質転換することができ、ここで、本明細書に記載する方法により、多コピープラスミド様又は染色体構造が形成される。
【０３１１】
非翻訳領域はまた、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を含んでもよい。非制限的例として、ＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９０２２６４７０号明細書（これは全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるもの、及び当技術分野で公知のものを含んでもよい。
【０３１２】
終止コドン
一実施形態では、本発明の環状一次構築物は、例えば、限定はしないが、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むフランキング領域などのフランキング領域の前に、少なくとも２つの終止コドンを含んでもよい。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧ（又はＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧ）から選択することができる。一実施形態では、本発明の環状一次構築物は、終止コドンＴＧＡ又はＵＧＡ及び１つの追加終止コドンを含む。さらに別の実施形態では、追加終止コドンは、ＴＡＡ又はＵＡＡであってもよい。別の実施形態では、本発明の環状一次構築物は、３つの終止コドンを含む。
【０３１３】
線状ポリヌクレオチドからの環状ポリヌクレオチドのための遺伝子構築物
一実施形態では、線状構築物は、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、同第２０１３１５１６６７号パンフレット、同第２０１３１５１６６８号パンフレット、同第２０１３１５１６６３号パンフレット、同第２０１３１５１６６９号パンフレット、同第２０１３１５１６７０号パンフレット、同第２０１３１５１６６４号パンフレット、同第２０１３１５１６６５号パンフレット、同第２０１３１５１６７１号パンフレット、同第２０１３１５１６７２号パンフレット、同第２０１３１５１７３６号パンフレット（こ
れらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される方法を用いて製造する。
【０３１４】
次に、線状一次構築物をベクター中に配置してから、増幅した後、プラスミドを単離して、限定はしないが、インビトロジェン・ピュアリンク（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ハイピュア・マキシプレップキット（ＨｉＰｕｒｅ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールスバッド）を用いたマキシプレップなどの当技術分野で公知の方法を用いて精製する。続いて、限定はしないが、制限酵素及びバッファーの使用など、当技術分野で公知の方法を用いて、プラスミドを線状化することができる。線状化反応物は、例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールスバッド）、並びに例えば、限定はしないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）などのＨＰＬＣ精製方法、並びにインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲキット（ＰＣＲ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールスバッド）を含む方法などの当技術分野で公知の方法を用いて、線状化することができる。精製方法は、実施した線状化反応の規模に応じて変更してもよい。線状化プラスミドを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応のためのｃＤＮＡを生成する。次に、当技術野で公知の、及び／又は本明細書に記載する方法を用いて、ｃＤＮＡを環状化することができる。
【０３１５】
ｃＤＮＡ鋳型合成
ｃＤＮＡ鋳型は、線状化プラスミドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付すことによって、合成することができる。国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の表４は、本発明のＰＣＲ反応に有用となり得るプライマー及びプローブの一覧表である。この一覧表は、網羅的ではないこと、いずれの増幅のためのプライマー−プローブ設計も、当業者の技術の範囲内であることを理解すべきである。プローブはまた、標的分子に対する塩基対合忠実度及び対合強度を高めるために化学的に修飾された塩基を含んでもよい。こうした修飾としては、５−メチル−シチジン、２，６−ジ−アミノ−プリン、２’−フルオロ、ホスホロ−チオエート、又はロックド核酸が挙げられる。
【０３１６】
一実施形態では、環状化及び／又は転写に付す前に、ｃＤＮＡを配列解析に供してもよい。
ｍＲＮＡ生成
線状ｍＲＮＡ生成の方法として、限定はしないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、ｃＤＮＡ鋳型除去及びＲＮＡクリーンアップ、並びにｍＲＮＡキャッピング及び／又はテイリング反応が挙げられる。
【０３１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
先行するステップで生成されたｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）システムを用いて、転写することができる。このシステムは、典型的に、転写バッファー、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、所内で製造するか、供給業者から選択するか、又は本明細書に記載する通りに合成してもよい。ＮＴＰは、限定はしないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰなどの本明細書に記載するものから選択することができる。ポリメラーゼは、限定はしないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ並びに修飾核酸を組み込むことができるポリメラーゼなどの突然変異ポリメラーゼから選択することができる。
【０３１８】
ｃＤＮＡ鋳型除去及びクリーンアップ
ｃＤＮＡ鋳型は、例えば、限定はしないが、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）での処理などの当技術分野で公知の方法を用いて、除去することができる。ＲＮＡクリーンアップは、例えば、ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）（マサチューセッツ州デンバー）からのアジェンコート（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ）（登録商標）クリーンＳＥＱ（ＣＬＥＡＮＳＥＱ）（登録商標）システム、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ精製方法（例えば、国際公開第２０１３１０２２０３号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載する方法を参照）、ＨＰＬＣ精製方法、例えば、限定はしないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）などの精製方法も含む。
【０３１９】
環状ポリヌクレオチド生成
本明細書に記載の並びに／又は当技術分野で公知の線状ｍＲＮＡ及び／若しくは線状一次構築物を環状化プロセスに付してもよい。このプロセスは、本明細書に記載する方法の１つ及び／又は当技術分野で公知の方法の１つであってよい。
【０３２０】
合成に有用となり得るＲＮＡポリメラーゼ
本発明の環状一次構築物の設計に、いずれのＲＮＡポリメラーゼ又は変異体を使用してもよい。
【０３２１】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸の挿入又は欠失によって修飾してもよい。非制限的例として、ＲＮＡポリメラーゼは、非修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む増大した能力を呈示するように、修飾してもよい（国際公開第２００８０７８１８０号パンフレット及び米国特許第８，１０１，３８５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０３２２】
変異体は、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸及び／若しくは核酸配列を最適化する、並びに／又は当技術分野で公知の方法を用いることにより、取得することができる。非制限的例として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（２０１１年）第４７２巻（７３４４）、ｐ．４９９〜５０３；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）により記載される持続的定向進化システムを用いて進化させることができ、ここで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、限定はしないが、トレオニン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ又はＬ８６４Ｆが置換された９３位のリシンなどの少なくとも１つの突然変異をコードし得る。別の非制限的例として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、米国特許出願公開第２０１０１２００２４号明細書及び同第２００７０１１７１１２号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りの少なくとも突然変異をコードしてもよい。ＲＮＡポリメラーゼの変異体は、限定はしないが、置換変異体、保存的アミノ酸置換、挿入変異体、欠失変異体、及び／又は共有結合誘導体も含み得る。
【０３２３】
一実施形態では、環状一次構築物は、野生型又は変異型ＲＮＡポリメラーゼによって認
識されるように設計してもよい。それを実施する際に、野生型又は親環状構築物又は線状一次構築物からの配列変化の部位若しくは領域を含有するように、環状一次構築物を修飾することができる。
【０３２４】
ポリヌクレオチド又は核酸合成反応は、ポリメラーゼを用いた酵素的方法により実施することもできる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド又は核酸鎖においてヌクレオチド同士のリン酸ジエステル結合の形成を触媒する。現在既知のＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較及び結晶構造分析に基づいて種々のファミリーに分けることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、並びにＴ７  ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）又はＡポリメラーゼファミリーは、これらのファミリーのうち最もよく研究されているものである。別の大きなファミリーは、ＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌα）又はＢポリメラーゼファミリーであり、全ての真核生物複製ＤＮＡポリメラーゼ及びファージＴ４及びＲＢ６９由来のポリメラーゼが含まれる。これらは、類似した触媒機構を使用するが、これらのポリメラーゼファミリーは、基質特異性、プライマー伸長のための基質類似体組み込み効率、程度及び速度、ＤＮＡ合成の様式、エキソヌクレアーゼ活性、及び阻害剤に対する感受性が異なる。
【０３２５】
ＤＮＡポリメラーゼはまた、それらに必要な最適反応条件、例えば、反応温度、ｐＨ、並びに鋳型及びプライマー濃度に基づいて選択される。場合によっては、所望のＤＮＡ断片サイズ及び合成効率を達成するために、２つ以上のＤＮＡポリメラーゼの組み合わせを使用する。例えば、チェン（Ｃｈｅｎｇ）らは、ｐＨを高め、クローン化挿入片及びヒトゲノムＤＮＡから長い標的を効果的に増幅するために、グリセロール及びジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少させ、伸長時間を増加すると共に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する二次熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら著、ＰＮＡＳ、第９１巻、ｐ．５６９５〜５６９９、１９９４年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６からのＲＮＡポリメラーゼは、生化学及び生物物理学研究のためのＲＮＡを調製するのに広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、及びポリＡポリメラーゼは、同時係属国際公開第２０１４０２８４２９号パンフレットに開示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３２６】
一実施形態では、本明細書に記載する環状ポリヌクレオチドの合成に使用することができるＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼである（チュー（Ｚｈｕ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年を参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼは、チュー（Ｚｈｕ）らによって、海洋シアノファージから近年特性決定されており、そこで、彼らは、プロモータ配列も同定した（チュー（Ｚｈｕ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年を参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。チュー（Ｚｈｕ）らは、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、広い温度範囲及び塩分濃度にわたってＲＮＡ合成を触媒することを見出した。さらに、プロモータでヌクレオチドを開始するための要件は、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼの場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、それほど厳しくないことも判明し、ＲＮＡ合成を目的とするＳｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼが有望となった。
【０３２７】
一実施形態では、本明細書に記載する環状ポリヌクレオチドの合成に、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。非制限的例として、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼは、正確な３’末端を必要とする環状ポリヌクレオチドの合成に用いてもよい。
【０３２８】
一実施形態では、本明細書に記載する環状ポリヌクレオチドの合成に、Ｓｙｎ５プロモータを使用することができる。非制限的例として、Ｓｙｎ５プロモータは、チュー（Ｚｈｕ）ら（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）により記載される通りに、５’−ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ−３’（配列番号２２）であってもよい。
【０３２９】
一実施形態では、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知の少なくとも１つの化学修飾を含む環状ポリヌクレオチドの合成に、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。（例えば、チュー（Ｚｈｕ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年に記載されているプソイド−ＵＴＰ及び５Ｍｅ−ＣＴＰの組み込みを参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０３３０】
一実施形態では、本明細書に記載する環状ポリヌクレオチドは、チュー（Ｚｈｕ）ら（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年を参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）により記載される修正及び改善された精製方法を用いて精製したＳｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼを使用して、合成することもできる。
【０３３１】
一実施形態では、本明細書に記載する環状ポリヌクレオチドは、国際公開第２０１４０６７５５１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通り、２’修飾ヌクレオチドに対する改善された親和性を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いて、合成することもできる。
【０３３２】
遺伝子工学における様々なツールは、鋳型として作用する標的遺伝子の酵素的増幅に基づくものでよい。個々の遺伝子若しくは目的の特定の領域の配列の研究、又は他の研究ニーズのために、ポリヌクレオチド又は核酸の小さなサンプルから標的遺伝子の多数のコピーを作製する必要がある。このような方法は、本発明の環状ポリヌクレオチドの製造に適用することも可能である。一実施形態では、環状一次構築物は、５’ＵＴＲ内、５’ＵＴＲの前及び／又は５’ＵＴＲ後に、環状一次構築物のＲＮＡポリメラーゼ結合若しくは認識部位の上流、ＲＮＡポリメラーゼ結合若しくは認識部位の下流、ＴＡＴＡボックス配列の上流、ＴＡＴＡボックス配列の下流で、環状一次構築物のコード配列の上流に、少なくとも１つの置換及び／又は挿入を含むように設計してもよい。
【０３３３】
一実施形態では、環状一次構築物の５’ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオチドの少なくとも１つの領域及び／又は鎖の挿入によって置換してもよい。ヌクレオチドの領域及び／又は鎖は、限定はしないが、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、若しくは少なくとも８つのヌクレオチドを含んでもよく、ヌクレオチド天然及び／又は非天然のいずれであってもよい。非制限的例として、ヌクレオチドの群は、５〜８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示する他のヌクレオチドのいずれかの鎖及び／又はこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０３３４】
一実施形態では、環状一次構築物の５’ＵＴＲは、２つの異なる塩基、例えば、限定はしないが、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示する他のヌクレオチドのいずれか及び／又はこれらの組み合わせのヌクレオチドの少なくとも２つの領域及び／又は鎖の挿入によって置換してもよい。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８個のアデニン塩基の挿入、続いて５〜８個のシトシン塩基の挿入によって置換することができる。別の例では、５’ＵＴＲは、５〜８個のシトシン塩基の挿入、続いて５〜８個のアデニン塩基の挿入によって置換することができる。
【０３３５】
一実施形態では、環状一次構築物は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換及び／又は挿入を含んでもよい。非制限的例として、少なくとも１つの置換及び／又は挿入は、転写開始部位のすぐ下流（例えば、限定はしないが、＋１〜＋６）の領域における少なくとも１つの核酸を置換することによって、転写開始部位の下流で起こり得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチドの領域に対する変化は、開始速度に影響を与え、見掛けヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数の値を増加すると共に、転写複合体キュアリングからの短い転写物の解離を増大して、初期転写をキュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）し得る（ブリーバ（Ｂｒｉｅｂａ）ら著、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２年、第４１巻、ｐ．５１４４〜５１４９；全体として参照により本明細書に組み込む）。少なくとも１つの核酸の置換及び／又は挿入は、核酸配列のサイレント突然変異を引き起こすか、又はアミノ酸配列に突然変異を引き起こし得る。
【０３３６】
一実施形態では、環状一次構築物は、転写開始部位の下流に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、又は少なくとも１３グアニン個の塩基の置換を含み得る。
【０３３７】
一実施形態では、環状一次構築物は、転写開始部位のすぐ下流の領域に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含み得る。非制限的例として、上記領域中のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４個のアデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非制限的例では、上記領域中のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４個のシトシン塩基によって置換され得る。別の非制限的例では、上記領域中のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、若しくは少なくとも４個のチミン、及び／又は本明細書に記載するヌクレオチドのいずれかによって置換され得る。
【０３３８】
一実施形態では、環状一次構築物は、開始コドンの上流に少なくとも１つの置換及び／又は挿入を含んでもよい。明瞭化の目的で、開始コドンが、タンパク質コード領域の最初のコドンであり、また、転写開始部位は、転写が開始する部位であることを当業者は理解されよう。環状一次構築物は、限定はしないが、ヌクレオチド塩基の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８つの置換及び／又は挿入を含み得る。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の１、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、若しくは少なくとも５つの位置で挿入又は置換されていてもよい。挿入及び／又は置換されたヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、全てＡ若しくは全てＣ若しくは全てＴ若しくは全てＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡとＣ、ＡとＴ、若しくはＣとＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ及びＴ若しくはＡ、Ｃ及びＴ）又は少なくとも４つの異なる塩基であってもよい。非制限的例として、環状一次構築物のコード領域上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、又は本明細書に記載するヌクレオチドのいずれかで置換してもよい。別の非制限的例では、環状一次構築物中のグアニン塩基の置換は、転写開始の下流の領域で、且つ開始コドンの前に１つのグアニン塩基を残すように設計してもよい（エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７２巻（７３４４）、ｐ．４９９〜５０３を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、転写開始部位の下流で、開始コドンの上流の１位置に少なくとも５個のヌクレオチドを挿入することができ、これら少なくとも５個のヌクレオチドは同じ塩基タイプであってもよい。
【０３３９】
キャッピング及び／又はテイル付加反応
環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、キャッピング及び／又はテイル付加反応に付してもよい。キャッピング反応は、当技術分野で公知の方法により実施することにより、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの５’末端に５’キャップを添加することができる。キャッピングの方法として、限定はしないが、ワクシニアキャッピング酵素を使用するもの（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウイッチ）がある。
【０３４０】
ポリ−Ａテイル付加反応は、当技術分野で公知の方法、例えば、限定はしないが、２’Ｏ−メチルトランスフェラーゼにより、及び本明細書に記載の方法により実施することができる。環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰがポリ−Ｔを含まない場合には、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをクリーニングする前に、ポリ−Ａテイル付加反応を実施するのが有益となり得る。
【０３４１】
精製
環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの精製は、限定はしないが、クリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得る。環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰクリーンアップは、当技術分野で公知の方法、例えば、限定はしないが、アジェンコート（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ）（登録商標）ビーズ（ベックマン・コールター・ゲノミクス（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、マサチューセッツ州デンバー）、ポリ−Ｔビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（エキシコン社（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ）、デンマーク、ベドビーク（Ｖｅｄｂａｅｋ））、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ処理（例えば、国際公開第２０１３１０２２０３号パンフレットを参照；全体として参照により本明細書に組み込む）又は例えば、限定はしないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）などのＨＰＬＣ精製方法によって、実施することができる。用語「精製（された）」は、「精製ｃｉｒｃＰ」、「精製ｃｉｒｃＳＰ」、「精製ｃｉｒｃＲＮＡ」、「精製ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ」又は「精製環状一次構築物」などの環状ポリヌクレオチドに関して用いられるとき、少なくとも１つの混入物から分離されたものを指す。本明細書で用いられるとき、「混入物」は、他の物質を不適合、不純又は劣等にするいずれかの物質である。従って、精製された環状ポリヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）は、天然に見出されるものとは異なる形態若しくは状況、又はそれを処理若しくは精製方法に付す前に存在した形態とは異なる形態若しくは環境で存在する。
【０３４２】
品質保証及び／又は品質管理検査は、限定はしないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、又は分析ＨＰＬＣなどの方法を用いて実施することができる。
別の実施形態では、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、逆転写酵素−ＰＣＲなどの方法によって配列決定することができる。
【０３４３】
一実施形態では、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、紫外・可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法によって定量することができる。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非制限的例は、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（登録商標）分光計（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マサチューセッツ州ウォルサム）である。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ中のポリヌクレオチドが、適切なサイズであるか否かを決定し、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ
、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの分解が起こっていないことを調べるために、定量したｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを分析してもよい。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの分解は、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣ精製方法（例えば、限定はしないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）並びにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって調べることができる。
【０３４４】
シグナル配列
環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはさらに、治療に関連する部位へのポリペプチドの輸送を促進する追加の特徴も含む、及び／又はコードし得る。タンパク質輸送を補助するこのような特徴の１つは、シグナル配列である。本明細書で用いられるとき、「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、それぞれ、コード領域又はコードされたポリペプチドの５’（若しくはＮ末端）に組み込まれる約９〜２００ヌクレオチド（３〜６０アミノ酸）長の、ポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰでは、これらの配列の付加によって、１つ又は複数の分泌経路を介した小胞体への、コードされたポリペプチドの輸送が達成される。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０３４５】
一実施形態では、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の表５に示される核酸配列（配列番号３２〜９３）のいずれかなどのタンパク質シグナル配列を含んでもよい。これらの配列は、第１の連結ヌクレオシド領域の始め、中央又は末端、あるいはフランキング領域中に含まれてもよい。さらに、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのいずれかは、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の表５に示される核酸配列の１つ又は複数を含んでもよい。これらは、第１の連結ヌクレオシド領域又はフランキング領域のいずれにあってもよい。
【０３４６】
一実施形態では、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、タンパク質シグナル配列、例えば、限定はしないが、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の表５に示されるタンパク質配列（配列番号９４〜１５５）のいずれかを含み得る。これらの配列は、第１の連結ヌクレオシド領域の始め、中央又は末端、あるいはフランキング領域中に含まれてもよい。さらに、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのいずれかは、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の表５に列記されるタンパク質配列をコードする核酸配列の１つ又は複数を含んでもよい。これらは、第１領域連結ヌクレオシド又はフランキング領域のいずれにあってもよい。本明細書で使用することができる追加のシグナル配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／又はｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／に見出されるものなどのデータベースに教示されているものを含む。米国特許第８，１２４，３７９号明細書；同第７，４１３，８７５号明細書及び同第７，３８５，０３４号明細書に記載されているものもまた、本発明の範囲に含まれ、これらの文献の各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３４７】
標的選択
本発明によれば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする、連結ヌクレオシドの少なくとも第１領域を含む。本発明の目的のポリペプチド又は「標的」の非制限的例は、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、同第２０１３１５１６６８号パンフレット、同第２０１３１５１６６３号パンフレット、同第２０１３１５１６６９号パンフレット、同第２０１３１５１６７０号パンフレット、同第２０１３１５１６６４号パンフレット、同第２０１３１５１６６５号パンフレット、同第２０１３１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレットの表６及び７；国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレットの表６、１７８及び１７９；国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレットの表６、１８５及び１８６に列記されており、これら文献の各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３４８】
タンパク質切断シグナル及び部位
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによりコードされるポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を含有する少なくとも１つのタンパク質切断シグナルを含んでもよい。タンパク質切断部位は、Ｎ末端、Ｃ末端、Ｎ末端とＣ末端の間の任意の空間、例えば、限定はしないが、Ｎ末端とＣ末端との中間、Ｎ末端と中間地点の間、中間地点とＣ末端の間、並びにこれらの組み合わせに位置してよい。
【０３４９】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによりコードされるポリペプチドは、限定はしないが、プロタンパク質コンベルターゼ（若しくはプロホルモンコンベルターゼ）、トロンビン又は因子Ｘａタンパク質切断シグナルを含み得る。プロタンパク質コンベルターゼは、９つのプロテイナーゼのファミリーであり、これは、酵母ケキシンに関連する７つの塩基性アミノ酸特異的スブチリシン様セリンプロテイナーゼ（プロホルモンコンベルターゼ１／３（ＰＣ１／３）、ＰＣ２、フリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、対合塩基性アミノ酸切断酵素４（ＰＡＣＥ４）及びＰＣ７として知られる）と、非塩基性残基を切断する他の２つのスブチラーゼ（スブチリシンケキシンイソザイム１（ＳＫＩ−１）及びプロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケキシン８（ＰＣＳＫ９）と呼ばれる）を含む。タンパク質切断シグナルアミノ酸配列の非制限的例は、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の表７に列記されている。一実施形態では、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが、少なくとも１つのコードされたタンパク質切断シグナルを含有するように操作することもできる。コードされたタンパク質切断シグナルは、開始コドンの前、開始コドンの後、コード領域の前、コード領域内、例えば、限定はしないが、コード領域内の中間、開始コドンと中間地点の間、中間地点と終止コドンの間、コード領域の後、終止コドンの前、２つの終止コドンの間、終止コドンの後、並びにこれらの組み合わせに位置してよい。
【０３５０】
一実施形態では、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を含有する少なくとも１つのコードされたタンパク質切断シグナルを含んでもよい。コードされたタンパク質切断シグナルとして、限定はしないが、プロタンパク質コンベルターゼ（若しくはプロホルモンコンベルターゼ）、トロンビン及び／又は因子Ｘａタンパク質切断シグナルが挙げられる。当業者は、前出の表１又は他の公知の方法を用いて、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに含有させる、適切なコードされたタンパク質切断シグナルを決定することができる。例えば、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に
組み込む）の表７のシグナルで出発し、表１のコドンを考慮して、得られるポリペプチド中にタンパク質シグナルを生成することができる環状一次構築物のシグナルを設計することができる。
【０３５１】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによってコードされるポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質切断シグナル及び／又は部位を含んでもよい。
【０３５２】
非制限的例として、米国特許第７，３７３，９３０号明細書及び米国特許出願公開第２００９０２２７６６０号明細書は、フリン切断部位を使用して、細胞のゴルジ装置からの発現産物におけるＧＬＰ−１のＮ末端メチオニンを切断する。一実施形態では、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによってコードされるポリペプチドは、ポリペプチドがＧＬＰ−１ではないという条件で、少なくとも１つのタンパク質切断シグナル及び／又は部位を含む。
【０３５３】
一実施形態では、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つのコードされたタンパク質切断シグナル及び／又は部位を含む。
【０３５４】
一実施形態では、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが、ＧＬＰ−１をコードしないという条件で、少なくとも１つのコードされたタンパク質切断シグナル及び／又は部位を含む。
【０３５５】
一実施形態では、本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、２つ以上のコード領域を含んでもよい。本発明の環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに複数のコード領域が存在する場合、複数のコード領域は、コードされたタンパク質切断部位によって隔てられ得る。非制限的例として、環状一次構築物、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、規則正しいパターンでサインされ得る。こうしたパターンは、ＡＸＢＹ形態に従い、ここで、Ａ及びＢは、コード領域であり、これらは、同じ、若しくは異なるコード領域であってよく、及び／又は同じ、若しくは異なるポリペプチドをコードし得るものであり、また、Ｘ及びＹは、コードされたタンパク質切断シグナルであり、これらは、同じ、又は異なるタンパク質切断シグナルをコードし得る。第２のこうしたパターンは、形態ＡＸＹＢＺに従い、ここで、Ａ及びＢは、コード領域であり、これらは、同じ、若しくは異なるコード領域であってよく、及び／又は同じ、若しくは異なるポリペプチドをコードし得るものであり、また、Ｘ、Ｙ及びＺは、コードされたタンパク質切断シグナルであり、これらは、同じ、又は異なるタンパク質切断シグナルをコードし得る。第３のパターンは、形態ＡＢＸＣＹに従い、ここで、Ａ、Ｂ及びＣは、コード領域であり、これらは、同じ、若しくは異なるコード領域であってよく、及び／又は同じ、若しくは異なるポリペプチドをコードし得るものであり、また、Ｘ及びＹは、コードされたタンパク質切断シグナルであり、これらは、同じ、又は異なるタンパク質切断シグナルをコードし得る。
【０３５６】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、タンパク質切断部位をコードする配列を含んでもよく、これによって、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、前記タンパク質切断部位について特異的なプロテアーゼでの処理により、キャリア領域又は融合パートナーから放出され得る。
【０３５７】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲ
ＮＡ−ＳＰは、２Ａペプチドをコードする配列を含んでもよい。一実施形態では、２Ａペプチドをコードする配列を用いて、２つ以上の目的のポリペプチドのコード領域を隔てることができる。別の実施形態では、この配列を用いて、コード配列とセンサー領域を隔てることができる。また別の実施形態では、この配列を用いて、２つのセンサー領域を隔てることができる。非制限的例として、２Ａペプチドをコードする配列は、領域Ａと領域Ｂの間に位置してもよい（Ａ−２Ａｐｅｐ−Ｂ）。２Ａペプチドの存在によって、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ及び２Ａペプチド中に１つの長いタンパク質の切断が生じる。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂは、同じ、又は異なる目的のポリペプチドであってよい。別の実施形態では、２Ａペプチドを本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰで用いて、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０以上のタンパク質を生成することもできる。
【０３５８】
転写後制御モジュレータの組み込み
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つの転写後制御モジュレータを含んでもよい。これらの翻訳後制御モジュレータは、限定はしないが、小分子、化合物及び調節配列であってよい。非制限的例として、翻訳後制御モジュレータは、ＰＴＣセラピューティクス社（ＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）（ニュージャージー州サウスプレインフィールド）によって、そのＧＥＭＳ（商標）（小分子による遺伝子発現調節（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）スクリーニング技術を用いて同定される小分子を使用して達成することができる。
【０３５９】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている少なくとも１つの転写後制御モジュレータを含んでもよい。転写後制御モジュレータの非制限的例は、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットのパラグラフ［０００２９９］〜［０００３０４］に記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３６０】
線状ポリヌクレオチドの環状化
線状ポリヌクレオチド及び／又は線状一次構築物を環状化することによって、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを作製することができ、これは、限定はしないが、１）化学、２）酵素、及び３）リボザイムによる触媒といった３つの異なる経路を含む。これらの経路の非制限的例を以下に概説する。新しく形成される５’−／３’−結合は、分子内又は分子間のいずれでもよい。
【０３６１】
非制限的例として、環状化することができる線状ポリヌクレオチド及び線状一次構築物は、以下：国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、同第２０１３１５１６６７号パンフレット、同第２０１３１５１６６８号パンフレット、同第２０１３１５１６６３号パンフレット、同第２０１３１５１６６９号パンフレット、同第２０１３１５１６７０号パンフレット、同第２０１３１５１６６４号パンフレット、同第２０１３１５１６６５号パンフレット、同第２０１３１５１６７１号パンフレット、同第２０１３１５１６７２号パンフレット、同第２０１３１５１７３６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されているものから選択することができる。
【０３６２】
第１の経路では、核酸の５’末端及び３’末端は、１つ又は複数の化学反応基を含有し、これらは、互いに近接しているとき、分子の５’末端と３’末端の間に新たな共有結合を形成する。５’末端は、限定はしないが、ＮＨＳ−エステル反応基を含有し、また、３’末端は、限定はしないが、３’−アミノ末端ヌクレオチドを含有し、これによって、有
機溶媒中で、合成ｍＲＮＡ分子の３’末端上の３’−アミノ末端ヌクレオチドが、５’−ＮＨＳ−エステル部分上で求核攻撃を受けて、新たな５’−／３’−アミド結合を形成し、その結果、ｃｉｒｃＲＮＡが得られる。
【０３６３】
第２の経路では、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて、５’−リン酸化核酸分子を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素的に連結することによって、新たなホスホロジエステル結合を形成する。非制限的例の反応では、１μｇの核酸を１〜１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウイッチ）と、製造者のプロトコルに従い、３７℃で１時間インキュベートする。連結反応は、酵素連結反応を補助するために、並列する５’−及び３’−領域の両方と塩基対合することができる分断オリゴヌクレオチドの存在下で実施することができる。この反応によって、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが形成される。
【０３６４】
第３の経路では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写中に、得られる核酸分子が、核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含有することができるように、ｃＤＮＡ鋳型の５’末端又は３’末端のいずれかが、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、グループＩイントロン、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｖｉｒｕｓ）、ヘアピン（Ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムに由来するものであってもよいし、又はセレックス（ＳＥＬＥＸ）（試験管内進化法）により選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間を要し得る。
【０３６５】
本発明の環状ポリヌクレオチドは、以下に示すように合成することができる：
【０３６６】
【化５０】
2017522028.tif 000056
【０３６７】
あるいは、本明細書に記載する他の反応基、例えば、ハロゲン及びチオホスフェート又
はアジド及び（チオ）ホスホリルで、アルキル及びアジド基を置換してもよい。
ＩＩＩ．修飾
本明細書では、環状ポリヌクレオチド（例えば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）において、用語「修飾」又は必要に応じて、「修飾（された）」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｕ若しくはＣリボヌクレオチドに対する修飾を指す。概して、本明細書では、これらの用語は、天然に存在する５’−末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図しない。ポリペプチドの場合、「修飾」という用語は、２０アミノ酸の標準的なセットと比較した修飾を指す。
【０３６８】
修飾は、様々な異なる修飾であってもよい。一部の実施形態では、コード領域、フランキング領域及び／又は末端領域は、１つ、２つ、又はそれ以上の（任意選択で異なる）ヌクレオシド又はヌクレオチド修飾を含み得る。一部の実施形態では、導入された修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、非修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと比較して、細胞中での分解の低減を呈示し得る。
【０３６９】
本発明で有用な修飾として、限定はしないが、表４に示すものが挙げられる。この表には、修飾の符号、核酸塩基のタイプ、及び／又は修飾が天然に存在するか否かを表示している。
【０３７０】
【表４−１】
2017522028.tif 000057
【０３７１】
【表４−２】
2017522028.tif 000058
【０３７２】
【表４−３】
2017522028.tif 000059
【０３７３】
【表４−４】
2017522028.tif 000060
【０３７４】
【表４−５】
2017522028.tif 000061
【０３７５】
【表４−６】
2017522028.tif 000062
【０３７６】
【表４−７】
2017522028.tif 000063
【０３７７】
【表４−８】
2017522028.tif 000064
【０３７８】
【表４−９】
2017522028.tif 000065
【０３７９】
【表４−１０】
2017522028.tif 000066
【０３８０】
【表４−１１】
2017522028.tif 000067
【０３８１】
【表４−１２】
2017522028.tif 000068
【０３８２】
【表４−１３】
2017522028.tif 000069
【０３８３】
【表４−１４】
2017522028.tif 000070
【０３８４】
【表４−１５】
2017522028.tif 000071
【０３８５】
【表４−１６】
2017522028.tif 000072
【０３８６】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに有用となり得る他の修飾を表５に列記する。
【０３８７】
【表５−１】
2017522028.tif 000073
【０３８８】
【表５−２】
2017522028.tif 000074
【０３８９】
【表５−３】
2017522028.tif 000075
【０３９０】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格に対する）任意の有用な修飾を含んでもよい。ピリミジン核酸塩基の１つ又は複数の原子は、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたチオール、任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）、又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置換してもよい。いくつかの実施形態では、修飾（例えば、１つ又は複数の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合の各々に存在する。本発明の修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（Ｔ
ＮＡ）、グリオール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はこれらのハイブリッド）への修飾であってもよい。別の修飾も本明細書に記載する。
【０３９１】
本明細書に記載するように、一部の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが導入された細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導される免疫応答の特徴としては、１）炎症促進性サイトカインの発現増大、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ４などの活性化、及び／又は３）タンパク質翻訳の終結又は短縮が挙げられる。他の実施形態では、免疫応答が誘導される。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、細胞に導入される修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを細胞内で分解することが望ましい。例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合には、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ分子の分解が好ましいであろう。従って、一部の実施形態において、本発明は、細胞内で指令された様式で作用させることができる分解ドメインを含有する修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ分子を提供する。
【０３９３】
環状ポリヌクレオチドアーキテクチャ
本発明の環状ポリヌクレオチドは、核酸ベースの治療薬で用いることができる機能及び／又は構造設計の特徴において、野生型から識別される。
【０３９４】
図１は、本発明の代表的な環状一次構築物１００を示す。本明細書で用いられるとき、用語「環状一次構築物」は、ＲＮＡ分子と実質的に同様に作用し、その特性を有し得る環状ポリヌクレオチド転写物を指す。環状一次構築物が、１つ又は複数の目的のポリペプチド（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）をコードする場合、ポリヌクレオチド転写物は、そこにコードされた目的のポリペプチドが翻訳され得るのに十分な構造的及び／又は化学的特徴を保持する。環状一次構築物は、本発明のポリヌクレオチドであってもよい。構造的に、又は化学的に修飾されている場合、環状一次構築物は、修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと呼ぶことができる。
【０３９５】
図１を参照すると、環状一次構築物１００は、ここで、第１の連結ヌクレオシド領域１０２を含み、これは、第１のフランキング領域１０４及び第２のフランキング領域１０６によってフランキングされている。本明細書で用いられるとき、「第１領域」は、「コード領域」、「非コード領域」若しくは「コードする領域」又は単純に「第１領域」と呼ばれることがある。一実施形態では、この第１領域は、限定はしないが、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチドなどのヌクレオチドを含んでもよく、及び／又はヌクレオチドは、センサー領域をコードするか、若しくは含む。目的のポリペプチドは、その５’末端に、シグナル領域１０３によってコードされる１つ又は複数のシグナルペプチド配列を含んでもよい。第１のフランキング領域１０４は、連結ヌクレオシドの１領域又はその一部を含んでもよく、それらは、ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡ配列中の非翻訳領域（ＵＴＲ）と同様に作用し得る。第１のフランキング領域はまた、極性領域１０８を含んでもよい。極性領域１０８は、ＩＲＥＳ配列又はその一部分を含み得る。非制限的例として、線状化されたとき、この領域が分断されて、第１の部分が、第１領域１０２の５’末端上になり、第２の部分が、第１領域１０２上の３’末端上になり得る。第２のフランキング領域１０６は、テイル付加配列領域１１０を含んでもよく、それらは、ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡ配列中の非翻訳領域（ＵＴＲ）と同様に作用し得る。第２のフランキング領域１０６は、ＩＲＥＳ配列又はその一部を含んでもよい。非制限的例として、ＩＲＥＳ配列は、第１の部分と第２の部分に分断することができ、その場合、第１部分が、第１領域１０２内に位置し得ると共に、第２部分が、第２のフランキング領域１０６内に位置し得る。
【０３９６】
第１領域１０２の５’末端と第１のフランキング領域１０４の架橋は、第１作動領域１０５である。一実施形態では、この作動領域は、開始コドンを含み得る。これに代わり、作動領域は、開始コドンを含む任意の転写開始配列又はシグナルを含んでもよい。
【０３９７】
第１領域１０２の３’末端と第２のフランキング領域１０６の架橋は、第２作動領域１０７である。伝統的に、この作動領域は、終止コドンを含む。あるいは、作動領域は、終止コドンを含む任意の転写開始配列又はシグナルを含んでもよい。本発明によれば、複数の連続した終止コドンを使用してもよい。一実施形態では、本発明の作動領域は、２つの終止コドンを含んでもよい。第１終止コドンは、「ＴＧＡ」又は「ＵＧＡ」であってよく、第２終止コドンは、「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」、「ＴＡＧ」、「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」又は「ＵＡＧ」からなる群から選択することができる。
【０３９８】
図２を参照すると、少なくとも１つの非核酸部分１０１を用いて、環状ポリヌクレオチド１００を調製することができ、ここでは、非核酸部分１０１を用いて、第１のフランキング領域１０４を第２のフランキング領域１０６近傍に位置させる。本発明で用いることができる非核酸部分の非制限的例を本明細書に記載する。環状一次構築物１００は、２つ以上の非核酸部分を含み、ここで、追加の非核酸部分は、第１非核酸部分に対して異種又は同種のいずれであってもよい。
【０３９９】
図３を参照すると、第１の連結ヌクレオシド領域１０２は、スペーサ領域１１４を含み得る。このスペーサ領域１１４を使用することにより、第１の連結ヌクレオシド領域１０２を分離して、環状一次構築物が、２つ以上のオープンリーディングフレーム、非コード領域又はオープンリーディングフレーム及び非コード領域を含むことができるようにしてもよい。
【０４００】
図４を参照すると、第２のフランキング領域１０６は、３’ＵＴＲ１１２の１つ又は複数のセンサー領域１１６を含んでもよい。本明細書で論述するこれらのセンサー配列は、環状一次構築物又は環状ポリヌクレオチドの局所微小環境のリガンドに対する擬似受容体（又は結合部位）として作動する。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位又はｍｉＲＮＡシードは、これらが、環状ポリヌクレオチドの環境に存在する任意のマイクロＲＮＡに対する擬似受容体として機能するように、センサーとして用いることができる。図４に示すように、１つ又は複数のセンサー領域１１６は、スペーサ領域１１４によって分離することができる。
【０４０１】
図５に示すように、１つ又は複数のセンサー領域１１６を含む環状一次構築物１００は、第１の連結ヌクレオシド領域１０２内にスペーサ領域１１４を含んでもよい。図３について上で述べたように、このスペーサ領域１１４を使用することにより、第１の連結ヌクレオシド領域１０２を分離して、環状一次構築物が、２つ以上のオープンリーディングフレーム及び／又は２つ以上の非コード領域を含むことができるようにしてもよい。
【０４０２】
図６を参照すると、環状一次構築物１００は、少なくとも１つの非コード領域、例えば、限定はしないが、センサー領域１１６を含むｃｉｒｃＳＰとして知られる非コード構築物であってもよい。センサー領域１１６の各々は、限定はしないが、ｍｉＲ配列、ｍｉＲシード、ｍｉＲ結合部位及び／又はシードのないｍｉＲ配列を含み得る。
【０４０３】
図７を参照すると、少なくとも１つの核酸部分１０１を用いて、非コード構築物である環状一次構築物１００を調製することができる。非コード構築物である環状一次構築物１００は、２つ以上の非核酸部分を含んでもよく、ここで、追加の非核酸部分は、第１非核酸部分に対して異種又は同種のいずれであってもよい。
【０４０４】
図８を参照すると、環状一次構築物１００を調製するために、本明細書に記載する方法のいずれかを用いて、線状一次構築物２００を環状化することができる。再度図８を参照して、線状一次構築物２００は、第１の連結ヌクレオシド領域２０２を含み、これは、第１のフランキング領域２０４と第２のフランキング領域２０６によってフランキングされている。本明細書で用いられるとき、「第１領域」は、「コード領域」若しくは「コードする領域」又は単に「第１領域」と呼ばれることもある。この第１領域は、限定はしないが、目的のコードされたポリペプチドを含み得る。一態様では、第１領域２０２は、限定はしないが、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み得る。オープンリーディングフレームは、全体又は一部がコドン最適化されていてもよい。フランキング領域２０４は、１つ又は複数の完全又は不完全な５’ＵＴＲ配列を含む連結ヌクレオシドの１領域を含んでもよく、これらは、完全にコドン最適化されていても、又は一部がコドン最適化されていてもよい。フランキング領域２０４は、限定はしないが、ｍｉＲ配列、テルザック（ＴＥＲＺＡＫ）（商標）配列及び翻訳制御配列などの少なくとも１つの核酸配列を含んでもよい。フランキング領域２０４はまた、５’末端キャップ２０８を含んでもよい。５’末端キャッピング領域２０８は、限定はしないが、天然に存在するキャップ、合成キャップ又は最適化キャップなどのキャップを含んでもよい。最適化キャップの非制限的例として、ローズ（Ｒｈｏａｄｓ）により、米国特許第７０７４５９６号明細書並びに国際公開第２００８１５７６６８号パンフレット、同第２００９１４９２５３号パンフレット及び同第２０１３１０３６５９号パンフレット（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されているキャップが挙げられる。第２のフランキング領域２０６は、１つ又は複数の完全又は不完全な３’ＵＴＲ配列を含む連結ヌクレオシドの１領域を含んでもよい。第２のフランキング領域２０６は、完全にコドン最適化されていても、又は一部がコドン最適化されていてもよい。フランキング領域２０６は、限定はしないが、ｍｉＲ配列及び翻訳制御配列などの少なくとも１つの核酸配列を含んでもよい。第２のフランキング領域２０６の後、一次構築物２００は、３’テイル付加配列２１０を含んでもよい。３’テイル付加配列２１０は、合成テイリング領域２１２及び／又は鎖終結ヌクレオシド２１４を含み得る。合成テイリング領域の非制限的例として、ポリＡ配列、ポリＣ配列、ポリＡ−Ｇカルテットが挙げられる。鎖終結ヌクレオシドの非制限的例として、２’−Ｏメチル、Ｆ及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。
【０４０５】
第１領域２０２の５’末端と第１のフランキング領域２０４の架橋は、第１作動領域２１６である。伝統的に、この作動領域は、開始コドンを含む。あるいは、作動領域は、開始コドンなどの任意の翻訳開始配列又はシグナルを含んでもよい。
【０４０６】
第１領域２０２の３’末端と第２のフランキング領域２０６の架橋は、第２作動領域２１８である。伝統的に、この作動領域は、終止コドンを含む。あるいは、作動領域は、終止コドンなどの任意の翻訳開始配列又はシグナルを含んでもよい。本発明によれば、複数の連続した終止コドンを用いてもよい。
【０４０７】
概して、本発明の環状一次構築物の第１領域の最短の長さは、これが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどの目的のポリペプチドをコードする場合、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、又はデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであってよい。別の実施形態では、この長さは、２〜３０アミノ酸、５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、又は１０〜２０アミノ酸のペプチドをコードするのに十分なものであってよい。上記の長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５若しくは３０アミノ酸のペプチド、又は４０アミノ酸以下のペプチド、例えば、３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１若
しくは１０アミノ酸以下のペプチドをコードするのに十分なものであってよい。環状ポリヌクレオチド配列がコードするか、又は含有することができるジペプチドの非制限的例として、限定はしないが、カルノシン及びアンセリンが挙げられる。
【０４０８】
概して、本発明の第１の連結ヌクレオシド領域の長さは、約３０ヌクレオチド長より長い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００以上、又は１００，０００ヌクレオチド以下）。本明細書で用いるとき、「第１領域」は、「コード領域」、「非コード領域」、「コードする領域」又は単に「第１領域」と呼ぶこともある。
【０４０９】
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、約３０〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、及び２，０００〜１００，０００）を含む。
【０４１０】
本発明によれば、フランキング領域は、独立に、１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、及び９００超のヌクレオチド、又は少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、及び１，０００ヌクレオチド）であってよい。
【０４１１】
本発明によれば、テイル付加配列は、非存在から５００ヌクレオチド長の範囲（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００ヌクレオチド）であってよい。テイル付加領域が、ポリＡテイルである場合、その長さは、ポリＡ結合タンパク質結合の単位で、又はその関数として決定することができる。この実施形態では、ポリＡテイルは、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４モノマーに結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合
タンパク質モノマーは、約３８ヌクレオチドの区間に結合する。このように、約８０ヌクレオチド及び１６０ヌクレオチドのポリＡテイルが機能的であることが認められている。
【０４１２】
本発明によれば、キャッピング領域は、単一キャップ、又はキャップを形成する一続きのヌクレオチドを含み得る。この実施形態では、キャッピング領域は、１〜１０、例えば、２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０、若しくはは少なくとも２、又は１０以下のヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、キャップは存在しない。
【０４１３】
本発明によれば、第１及び第２作動領域は、３〜４０、例えば、５〜３０、１０〜２０、１５の範囲、若しくは少なくとも４、又は３０ヌクレオチド長以下であってよく、出発及び／若しくは終止コドン以外に、１つ又は複数のシグナル及び／若しくは制限配列を含んでもよい。
【０４１４】
一実施形態では、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、コザック配列を含まない。
別の実施形態では、環状一次構築物、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つのコザック配列を含む。
【０４１５】
別の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドと主溝相互作用（例えば、結合）パートナーの結合を破壊することができるヌクレオシド又はヌクレオチドを含むｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを提供する（例えば、修飾ヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドと比較して、主溝相互作用パートナーに対する結合親和性が低減している）。
【０４１６】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、任意選択で、他の物質（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋の形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなど）を含むことができる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１つ又は複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及び１つ又は複数の修飾ヌクレオシド若しくはヌクレオチド（例えば、修飾ｃｉｒｃＲＮＡ分子）を含んでもよい。
【０４１７】
修飾ｃｉｒｃＲＮＡ分子
本発明は、修飾環状ポリヌクレオチド分子のビルディングブロック、例えば、修飾ヌクレオチドを含む。例えば、これらのビルディングブロックは、本発明の修飾ｃｉｒｃＰ、修飾ｃｉｒｃＳＰ、修飾ｃｉｒｃＲＮＡ又は修飾ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを調製する上で有用となり得る。こうしたビルディングブロックは、２０１２年１０月３日に出願された同時係属国際出願：国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されている。
【０４１８】
核酸塩基での修飾
本開示は、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。本明細書に記載されるとき、「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリン若しくはピリミジン）又はその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて、糖分子（例えば、ペントース若しくはリボース）又はその誘導体を含有する化合物として定義される。本明細書に記載されるとき、「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドとして定義される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるヌクレオシド及びヌクレオチドは、概して、主溝面で化学的に修飾されている。例示的な非制限的修飾として、アミノ基、チオール基、アルキル基、ハロ基、又は本明細書に記載されるいずれかが挙げられる。修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載するいずれかの有用な方法（例えば、化学的、酵素的、又は組換え
により、１つ又は複数の修飾若しくは非天然ヌクレオシドを含有させる方法）によって合成することができる。
【０４１９】
修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むことができる。ＲＮＡに見出される核酸塩基の例として、限定はしないが、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが挙げられる。ＤＮＡに見出される核酸塩基の例として、限定はしないが、アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンが挙げられる。これらの核酸塩基を修飾又は完全に置換することによって、増強された特性を有するｃｉｒｃＲＮＡ分子を得ることができる。例えば、本明細書に記載するヌクレオシド及びヌクレオチドは、化学的に修飾することができる。一部の実施形態では、化学修飾物は、アミノ基、チオール基、アルキル基、又はハロ基を含み得る。
【０４２０】
ヌクレオシド間結合での修飾
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸骨格）で修飾することができる。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格に関連して、語句「リン酸（塩）」及び「リン酸ジエステル」は、置き換え可能に用いられる。骨格リン酸基は、１つ又は複数の酸素原子を異なる置換基で置換することによって修飾することができる。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載する通りの別のヌクレオシド間結合による非修飾リン酸部分の大規模な置換を含んでもよい。修飾リン酸基の例として、限定はしないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、リン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、リン酸アルキル若しくはアリール、及びリン酸トリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非連結酸素がイオウによって置換されている。リン酸リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン−ホスホン酸塩）による連結酸素の置換によって修飾することもできる。
【０４２１】
非天然ホスホロチオエート骨格結合によってＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定性を付与するために、α−チオ置換リン酸部分が提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、増大したヌクレアーゼ耐性、ひいては細胞環境内でより長い半減期を有する。ホスホロチオエート結合ｃｉｒｃＲＮＡ分子はまた、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化によって、自然免疫応答を低減すると予想される。
【０４２２】
特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、α−チオ−ヌクレオシド（例えば、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン（α−チオ−シチジン）、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−プソイドウリジン）を含む。
【０４２３】
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合など、本発明に従って使用することができる他のヌクレオシド間結合を以下に記載する。
修飾された糖、核酸塩基、及びヌクレオシド間結合の組み合わせ
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、糖、核酸塩基、及びヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせとして、本明細書又は２０１２年１０月３日に出願された国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている１つ又は複数の修飾が挙げられる。
【０４２４】
環状ポリヌクレオチドの合成
本発明に従い用いられるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮ
Ａ−ＳＰは、本明細書に記載する通りに、いずれかの有用な技術に従って調製することができる。本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの合成に用いられる修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、以下の一般的方法及び手順を用いて、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的又は好ましいプロセス条件（例えば、反応温度、時間、反応体のモル比、溶媒、圧力など）が提供されれば、当業者は、追加のプロセス条件を最適化及び展開することができるであろう。最適反応条件は、使用する具体的な反応体又は溶媒に応じて変動し得るが、こうした条件は、常用の最適化手順によって当業者が決定することができる。
【０４２５】
本明細書に記載するプロセスは、当技術分野で公知のいずれかの好適な方法に従ってモニターすることができる。例えば、産物形成は、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈ若しくは１３Ｃ）、赤外分光法、分光測光法（例えば、紫外−可視）、若しくは質量分析法などの分光法、又は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）若しくは薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによってモニターすることができる。
【０４２６】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの調製は、様々な化学基の保護及び脱保護を含んでよい。適切な基の保護及び脱保護、並びに選択の必要性は、当業者が容易に決定することができる。保護基の化学は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら著、有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第２版、ウィリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９９１年（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に見出すことができる。
【０４２７】
本明細書に記載するプロセスの反応は、好適な溶媒中で実施することができ、こうした溶媒は、有機合成の分野の技術者が容易に選択することができる。好適な溶媒は、反応が実施される温度、すなわち、溶媒の凍結温度から溶媒の沸騰温度の範囲の温度で、出発材料（反応体）、中間体、又は産物と実質的に非反応性であってよい。所与の反応は、１種の溶媒又は２種以上の溶媒の混合物中で実施することができる。特定の反応ステップに応じて、具体的な反応ステップに好適な溶媒を選択することができる。
【０４２８】
当技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）のラセミ混合物の分割を実施することができる。例示的方法は、光学的に活性の、塩形成有機酸である「キラル分割酸」を用いた分別再結晶を含む。分別再結晶法に好適な分割剤は、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、又は様々な光学活性カンファースルホン酸のＤ及びＬ形態などの光学活性酸である。ラセミ混合物の分割は、光学活性分割剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラムでの溶離によっても実施することができる。好適な溶離溶媒組成物は、当業者が決定することができる。
【０４２９】
修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ビルディングブロック分子）は、以下の文献に記載されている合成方法に従って調製することができる：オガタ（Ｏｇａｔａ）ら著、有機化学会誌（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、第７４巻、ｐ．２５８５〜２５８８、２００９年；パーマル（Ｐｕｒｍａｌ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２２巻（１）、ｐ．７２〜７８、１９９４年；フクハラ（Ｆｕｋｕｈａｒａ）ら著、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１巻（４）、ｐ．５６３〜５６８、１９６２年；及びシュー（Ｘｕ）ら著、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第４８巻（９）、ｐ．１７２９〜１７４０、１９９２年；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０４３０】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、分子の全長に沿って均質に修飾されていてもよいし、そうでなくてもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドにおいて、又はその所与の予め定めた配列領域（例えば、図１に示す配列領域の１つ又は複数）において、１つ又は複数、又は全タイプのヌクレオチド（例えば、プリン若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃの１つ又は複数又は全部）が均質に修飾されていてもよいし、そうでなくてもよい。一部の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ中の全てのヌクレオチドＸが修飾され、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、又は組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ若しくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであってよい。
【０４３１】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの様々な位置に、異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）が存在し得る。当業者であれば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの機能が実質的に低下しないように、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの任意の位置にヌクレオチド類似体若しくは他の修飾を配置してもよいことは理解されよう。修飾はまた、非コード領域修飾であってもよい。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（総ヌクレオチド含量に対して、若しくは１種又は複数種のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ又は複数に関して）又は中間の任意のパーセンテージ（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）を含有してもよい。
【０４３２】
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシル／ウリジン／Ｕ又は修飾シトシン／シチジン／Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ分子中のウラシル又はウリジン（一般に：Ｕ）は、約１％〜約１００％の修飾ウラシル又は修飾ウリジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％の修飾ウラシル又はウリジン）で置換してもよい。修飾ウラシル又はウリジンは、単一のユニークな構造を有する化合物によって、又は様々な構造を有する複数の化合物（例えば、本明細書に記載するように、２、３、４若しくはそれ以上のユニークな構造）によって、置換することができる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ分子中のシトシン又はシチジン（一般に：Ｃ）は、約１％〜約１００％の修飾シトシン又はシチジン（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、
１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％の修飾シトシン又はシチジン）で置換してもよい。修飾シトシン又はシチジンは、単一のユニークな構造を有する化合物によって、又は様々な構造を有する複数の化合物（例えば、本明細書に記載するように、２、３、４若しくはそれ以上のユニークな構造）によって、置換することができる。
【０４３３】
ヌクレオチドの組み合わせ
修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド組み合わせのさらなる例が、２０１２年１０月３日に出願された国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０４３４】
一部の実施形態では、シトシンの少なくとも２５％が置換されている（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％）。
【０４３５】
一部の実施形態では、ウラシルの少なくとも２５％が置換されている（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％）。
【０４３６】
一部の実施形態では、シトシンの少なくとも２５％が置換され、且つウラシルの少なくとも２５％が置換されている（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％）。
【０４３７】
修飾された糖、核酸塩基、及びヌクレオシド間結合の組み合わせ
本発明のｃｉｒｃＰキメラポリヌクレオチドは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含んでもよい。これらの組み合わせは、本明細書に記載するいずれか１つ又は複数の修飾を含み得る。
【０４３８】
修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド組み合わせの例を表６及び表７に列記する。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせは、本発明のキメラポリヌクレオチドを形成するために使用することができる。別に記載のない限り、修飾ヌクレオチドで、本発明のキメラポリヌクレオチドの天然ヌクレオチドを完全に置換してもよい。非制限的例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載する修飾ヌクレオチドで置換することができる。別の非制限的例では、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つで、一部（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９．９％）を置換することができる。塩基／糖又はリンカーの任意の組み合わせを本発明のキメラポリヌクレオチドに組み
込んでもよく、こうした修飾は、以下の文献に教示されている：国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ９）；国際公開第２０１４０９３９２４号パンフレット（代理人整理番号Ｍ３６）；国際公開第２０１５０５１１７３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ７１）；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０４３９】
【表６−１】
2017522028.tif 000076
【０４４０】
【表６−２】
2017522028.tif 000077
【０４４１】
【表７−１】
2017522028.tif 000078
【０４４２】
【表７−２】
2017522028.tif 000079
【０４４３】
【表７−３】
2017522028.tif 000080
【０４４４】
【表７−４】
2017522028.tif 000081
【０４４５】
【表７−５】
2017522028.tif 000082
【０４４６】
本発明によれば、本発明のポリヌクレオチドは、表７の組み合わせ又は単一の修飾を含むように合成することができる。
単一の修飾が記載されている場合、記載されるヌクレオシド又はヌクレオチドは、そのＡ、Ｕ、Ｇ、若しくはＣヌクレオチド又はヌクレオシドの１００％が修飾されていることを示す。パーセンテージが記載されている場合には、これらは、存在するＡ、Ｕ、Ｇ、又はＣ三リン酸の総量の特定のＡ、Ｕ、Ｇ、又はＣのパーセンテージを表す。例えば、組み合わせ：２５％５−アミノアリル−ＣＴＰ＋７５％ＣＴＰ／２５％５−アミノアリル−ＵＴＰ＋７５％ＵＴＰは、２５％のシトシン三リン酸が、５−アミノアリル−ＣＴＰであり、且つ７５％のシトシンがＣＴＰであると共に；２５％のウラシルが、５−メトキシＵＴＰであり、且つ７５％のウラシルが、ＵＴＰであるポリヌクレオチドを指す。修飾ＵＴＰが記載されていない場合には、ポリヌクレオチドに見出されるヌクレオチドの部位の１００％に、天然に存在するＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ及び／又はＣＴＰが使用されている。この例では、ＧＴＰ及びＡＴＰヌクレオチドの全てが、非修飾のままである。
【０４４７】
ＩＶ．医薬組成物
製剤化、投与、送達及び用量決定
本発明は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物、並びに１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を提供する。医薬組成物は、任意選択で、１種又は複数種の追加の活性物質、例えば、治療及び／又は予防に活性の物質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、滅菌であっても、及び／又は発熱物質除去されていてもよい。薬剤の製剤化及び／又は製造に際しての一般的な考慮事項は、例えば、「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により本明細書に組み込む）に見出すことができる。
【０４４８】
一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者又は対象に投与される。本開示の目的のために、語句「活性成分」は、概して、本明細書に記載するように送達しようとするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを指す。
【０４４９】
一実施形態では、本明細書に記載する組成物は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの少なくとも１つを含む。
一実施形態では、本明細書に記載する組成物は、少なくとも１つのｃｉｒｃＳＰ及び／又は少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを含み得る。別の実施形態では、本明細書に記載する組成物は、少なくとも１つのｃｉｒｃＳＰ及び／又は少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含み得る。また別の実施形態では、本明細書に記載する組成物は、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含み得る。
【０４５０】
本明細書に提供する医薬組成物の説明は、主として、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するものであるが、当業者には、こうした組成物が、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物などの他の動物への投与に一般に好適であることは理解されよう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾は十分に理解されており、通常の獣医薬理学者であれば、必要であるとしても、常用の実験だけで、こうした修飾を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が考慮される対象として、限定はしないが、ヒト及び／又は他の霊長類；畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラットなどの商業関連の哺乳動物を含む哺乳動物；及び／又は家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／又はシチメンチョウなどの商業関連の鳥類を含む鳥類が挙げられる。
【０４５１】
本明細書に記載する医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知であるか、又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、こうした調製方法は、賦形剤及び／又は１つ又は複数の他の補助成分と活性成分を結合させるステップ、並びにその後、必要な及び／若しくは望ましい場合には、生成物を所望の１回若しくは複数回用量単位に分割、造形及び／又はパッケージングするステップを含む。
【０４５２】
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／又は任意の追加成分の相対量は、治療対象の種、大きさ、及び／又は状態に応じて、さらには、組成物を投与しようとする経路に応じて変動し得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０４５３】
製剤
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、（
１）安定性を高める；（２）細胞トランスフェクションを増大する；（３）持続的若しくは遅延放出（例えば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのデポー剤から）を可能にする；（４）生体分布を改変する（例えば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを特定の組織若しくは細胞型にターゲティングする）；（５）コードされたタンパク質の翻訳をｉｎ  ｖｉｖｏで増大する；並びに／又は（６）コードされたタンパク質の放出プロフィールをｉｎ  ｖｉｖｏで改変するために、１種又は複数種の賦形剤を用いて製剤化することができる。溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散若しくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘若しくは乳化剤、防腐剤のいずれか若しくは全てなどの伝統的賦形剤以外にも、本発明の賦形剤は、限定はしないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植のために）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体並びにこれらの組み合わせを含んでもよい。従って、本発明の製剤は、１種又は複数種の賦形剤を含んでもよく、これらは各々が、一緒にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの安定性を高め、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによる細胞トランスフェクションを増大し、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰにコードされたタンパク質の発現を増大し、並びに／又はｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰにコードされたタンパク質の放出プロフィールを改変する量で含まれる。さらに、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、自己集合核酸ナノ粒子を用いて製剤化することもできる。
【０４５４】
本明細書に記載する医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知であるか、又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、こうした調製方法は、賦形剤及び／又は１つ又は複数の他の補助成分と活性成分を結合させるステップを含む。
【０４５５】
本開示の医薬組成物は、１単位用量として、及び／若しくは複数の１単位用量として、調製、パッケージング、並びに／又は大量販売することができる。本明細書で用いられるとき、「単位用量」は、予定量の活性成分を含む医薬組成物の個別量を指す。活性成分の量は、概して、対象に投与される活性成分の投与量、及び／又はそうした投与量の好適な部分（限定はしないが、上記投与量の２分の１又は３分の１など）に等しいものでよい。
【０４５６】
本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／又は任意の追加成分の相対量は、治療対象の種、大きさ、及び／又は状態に応じて、さらには、組成物を投与しようとする経路に応じて変動し得る。例として、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０４５７】
一部の実施形態では、本明細書に記載する製剤は、少なくとも１つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有し得る。非制限的例として、製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有し得る。一実施形態では、製剤は、限定はしないが、以下：ヒトタンパク質、家畜タンパク質、細菌タンパク質、生物学的タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療用ペプチド及びタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質及び細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質及び／又は非ヒト疾患に関連するタンパク質などのカテゴリーから選択されるタンパク質をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有し得る。一実施形態では、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも３つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する。一実施形態では、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも５つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃ
ＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する。
【０４５８】
別の非制限的例として、製剤は、環状ポリヌクレオチドスポンジと考えられる１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのｃｉｒｃＰ又はｃｉｒｃＳＰを含有し得る。本明細書で用いられるとき、「環状ポリヌクレオチドスポンジ」、「スポンジ」、「ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ」又は「ｃｉｒｃＳＰ」は、目的のマイクロＲＮＡに対する少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含み得る競合的阻害剤を意味する。ｃｉｒｃＳＰは、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位、少なくとも３つのｍｉＲ結合部位、少なくとも４つのｍｉＲ結合部位、少なくとも５つのｍｉＲ結合部位、少なくとも６つのｍｉＲ結合部位、少なくとも７つのｍｉＲ結合部位、少なくとも８つのｍｉＲ結合部位、少なくとも９つのｍｉＲ結合部位、少なくとも１０のｍｉＲ結合部位、少なくとも１５のｍｉＲ結合部位、少なくとも２０のｍｉＲ結合部位、少なくとも２５のｍｉＲ結合部位、少なくとも３０のｍｉＲ結合部位、少なくとも３５のｍｉＲ結合部位、少なくとも４０のｍｉＲ結合部位、少なくとも４５のｍｉＲ結合部位、少なくとも５０のｍｉＲ結合部位、少なくとも５５のｍｉＲ結合部位、少なくとも６０のｍｉＲ結合部位、少なくとも６５のｍｉＲ結合部位、少なくとも７０のｍｉＲ結合部位、少なくとも７５のｍｉＲ結合部位、少なくとも８０のｍｉＲ結合部位、少なくとも８５のｍｉＲ結合部位、少なくとも９０のｍｉＲ結合部位、少なくとも１００のｍｉＲ結合部位、少なくとも１５０のｍｉＲ結合部位、又は少なくとも２００のｍｉＲ結合部位を含み得る。一実施形態では、製剤は、少なくとも３つのｃｉｒｃＳＰスポンジを含有する。一実施形態では、製剤は、少なくとも５つのｃｉｒｃＳＰスポンジを含有する。
【０４５９】
一実施形態では、ｃｉｒｃＳＰは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも２つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも３つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも４つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも５つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも６つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも７つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも８つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも９つのｍｉＲ−１２２配列、少なくとも１０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも１５のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも２０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも２５のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも３０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも３５のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも４０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも４５のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも５０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも５５のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも６０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも６５のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも７０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも７５のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも８０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも８５のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも９０のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも１００のｍｉＲ−１２２配列、少なくとも１５０のｍｉＲ−１２２配列、又は少なくとも２００のｍｉＲ−１２２配列を含み得る。ｃｉｒｃＳＰ中のｍｉＲ−１２２配列は、ｍｉＲ結合部位、ｍｉＲシード配列、シードのないｍｉＲ結合部位配列又はこれらの組み合わせであってもよい。
【０４６０】
一実施形態では、ｃｉｒｃＳＰは、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位及び少なくとも１つのスペーサを含み得る。スペーサは、１ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒ、４ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ、８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１４ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２１ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、２３ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、３０ｍｅｒ、３５ｍｅｒ、４０ｍｅｒ、５０ｍｅｒ、又は５０ｍｅｒ超の長さであってよい。
【０４６１】
一実施形態では、ｃｉｒｃＳＰは、出発又は終止コドンを含まず、非翻訳領域を含まない。非制限的例として、ｃｉｒｃＳＰは、少なくとも５０のｍｉＲ−１２２結合部位を含み、各々のｍｉＲ−１２２結合部位の間に２０ｍｅｒスペーサを有する。非制限的例とし
て、５０のｍｉＲ−１２２結合部位と、各ｍｉＲ−１２２結合部位の間の２０ｍｅｒスペーサとを含むｃｉｒｃＳＰは、一次肝細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトしてもよく、当技術分野において公知の方法及び本明細書に記載する方法を用いて、遊離ｍｉＲ−１２２を測定してもよい。さらに、ｃｉｒｃＳＰは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含んでもよい。別の非制限的例として、５０のｍｉＲ−１２２結合部位と、各ｍｉＲ−１２２結合部位の間の２０ｍｅｒスペーサとを含むｃｉｒｃＳＰは、様々な用量で液体ナノ粒子に製剤化して、マウスＨＣＶモデルを用いて、マウスに投与することもできる。さらに、ｃｉｒｃＳＰは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
【０４６２】
一実施形態では、ｃｉｒｃＳＰの分解は、ＥＮＤＯヌクレアーゼモチーフを覆い隠すタンパク質モチーフを用いることによって、制御することができる。非制限的例として、ＥＮＤＯヌクレアーゼモチーフを覆い隠す結合タンパク質モチーフを用いることによって、ｃｉｒｃＳＰを分解に対して安定化することができる。安定化したｃｉｒｃＳＰは、結合タンパク質をターゲティングすることができるｓｉＲＮＡ又は別のｃｉｒｃＳＰを投与することによって、不安定化することができる。別の非制限的例として、ＥＮＤＯヌクレアーゼモチーフを覆い隠す結合タンパク質モチーフＰＵＦ１を用いることによって、ｃｉｒｃＳＰを分解に対して安定化することができる。
【０４６３】
別の実施形態では、製剤は、少なくとも１つのｃｉｒｃＳＰと、目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つのｃｉｒｃＰ（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）を含んでもよい。
【０４６４】
医薬組成物は、さらに、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよく、これらは、本明細書で使用する通り、限定はしないが、所望される特定の剤形に合わせて、溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散若しくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘若しくは乳化剤、防腐剤などのいずれか若しくは全てを含む。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤、及び組成物を調製するための技術は、当技術分野において公知である（「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルティモア、２００６年を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。従来の賦形剤媒体の使用は、従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生み出すか、又はそうでなければ、医薬組成物のいずれかの他の成分と有害な形で相互作用するなどによって、物質若しくはその誘導体と不適合性となり得る場合を除いて、本開示の範囲内で考慮され得る。
【０４６５】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の粒度は、増加及び／又は減少し得る。粒度の変化は、限定はしないが、炎症などの生物学的反応に対抗するのを助けることができるか、又は哺乳動物に送達されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの生物学的効果を増大し得る。
【０４６６】
医薬組成物の製造に用いられる薬学的に許容される賦形剤として、限定はしないが、不活性希釈剤、界面活性剤及び／若しくは乳化剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、並びに／又は油が挙げられる。こうした賦形剤は、任意選択で、本発明の医薬製剤に含有させることができる。
【０４６７】
リピドイド
リピドイドの合成は、広く記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達に特に適している
（マホン（Ｍａｈｏｎ）ら著、バイオコンジュゲート化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．）、２０１０年、第２１巻、ｐ．１４４８〜１４５４；シュローダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、内科学会誌（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．）、２０１０年、第２６７巻、Ｐ．９〜２１；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ
Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９；シーグワルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ
Ｓ  Ａ．）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６〜３００１を参照のこと；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４６８】
これらのリピドイドは、げっ歯類及び非ヒト霊長類における二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子を有効に送達するために使用されている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９；フランク−カメネトスキー（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００８年、第１０５巻、ｐ．１１９１５〜１１９２０；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ
Ｓ  Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜１０１０を参照のこと；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）が、本開示は、それらの製剤化、並びにｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達におけるそれらの使用を記載する。
【０４６９】
これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム又は粒子を調製することができ、従って、局所及び／又は全身投与経路を介したリピドイド製剤の注射後に、コードされるタンパク質の産生により判断される通りのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの有効な送達を達成することができる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのリピドイド複合体は、限定はしないが、静脈内、筋肉内、又は皮下経路などの様々な手段により投与することができる。
【０４７０】
核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、限定はしないが、製剤組成物、粒子ペグ化の性質、ローディングの程度、オリゴヌクレオチドと脂質の比、並びに限定はしないが、粒度などの生物物理学的パラメータを含む多種のパラメータにより影響され得る（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９を参照のこと；全体として参照により本明細書に組み込む）。一例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長さのわずかな変化によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ効力に有意な影響が及ぼされ得る。限定はしないが、以下：ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ；別名９８Ｎ１２−５、ムルガイアー（Ｍｕｒｕｇａｉａｈ）ら著、分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０１巻、ｐ．６１、２０１０年を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）、Ｃ１２−２００（誘導体及び変異体を含む）、並びにＭＤＩなど、種々のリピドイドを含む製剤をｉｎ  ｖｉｖｏ活性について試験することができる。
【０４７１】
本明細書で「９８Ｎ１２−５」と呼ばれるリピドイドは、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９に開示されており、これは、全体として参照により本明細書に組み込む。
【０４７２】
本明細書で「Ｃ１２−２００」と呼ばれるリピドイドは、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９並びにリュウ（Ｌｉｕ）及びフアン（Ｈｕａｎｇ）ら著、分子療法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２０１０年、ｐ．６６９〜６７０に開示されており、これらのいずれも、全体として参照により本明細書に組み込む。リピドイド製剤は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ以外に、３つ又は４つ以上の成分を含む粒子を含んでもよい。一例として、いくつかのリピドイドを含む製剤は、限定はしないが、９８Ｎ１２−５を含んでおり、これは、４２％のリピドイド、４８％のコレステロール及び１０％のＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有してもよい。別の例として、いくつかのリピドイドを含む製剤は、限定はしないが、Ｃ１２−２００を含んでおり、これは、５０％のリピドイド、１０％のジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含有してもよい。
【０４７３】
一実施形態では、全身性静脈内投与のために、リピドイドと一緒に製剤化されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、肝臓をターゲティングすることができる。例えば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを使用し、４２％の９８Ｎ１２−５、４８％のコレステロール及び１０％のＰＥＧ−脂質の脂質モル組成物を含み、総脂質：ｃｉｒｃＲＮＡの最終重量比が約７．５：１であり、且つＰＥＧ脂質上でＣ１４アルキル鎖長を有し、平均粒度が約５０〜６０ｎｍの最終最適化静脈内製剤は、肝臓に対して９０％超の製剤の分布をもたらすことができる。（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の例では、Ｃ１２−２００（米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書及び国際公開第２０１０１２９７０９号パンフレットを参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）リピドイドを使用する静脈内製剤は、Ｃ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比５０／１０／３８．５／１．５を有し、総脂質：ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの重量比が７：１で、平均粒度が８０ｎｍであってよく、これは、肝細胞にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達するのに有効であり得る（ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９を参照のこと；全体として参照により本明細書に組み込む）。別の実施形態では、ＭＤ１リピドイド含有製剤を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝細胞にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを有効に送達することができる。筋肉内又は皮下経路用の最適化リピドイド製剤の特徴は、標的細胞型及び製剤が細胞外マトリックスを介して血流中に拡散する能力に応じて、有意に変動し得る。内皮透過窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）のサイズのために、有効な肝細胞送達には１５０ｎｍ未満の粒度が望ましいと思われる（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９を参照のこと；全体として参照により本明細書に組み込む）が、限定はしないが、内皮細胞、骨髄細胞、及び筋肉細胞などの他の細胞型に製剤を送達するためのリピドイド製剤化ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの使用は、それと同様にサイズ制限しなくてもよい。
【０４７４】
骨髄細胞及び内皮細胞などの他の非肝細胞にｉｎ  ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜
１０１０；チョー（Ｃｈｏ）ら著、アドバンスト・ファンクショナル・マテリアルズ（Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．）、２００９年、第１９巻、ｐ．３１１２〜３１１８；第８回国際ユダ・フォークマン会議（８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｕｄａｈ
Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ、２０１０年１０月８日〜９日を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。単球、リピドイド製剤などの骨髄性細胞への有効な送達は、同様の構成成分モル比を有し得る。異なる比のリピドイド及び他の構成成分、例えば限定はしないが、ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＭＧを用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの製剤を、限定はしないが、肝細胞、骨髄性細胞、筋肉細胞などの種々の細胞型への送達のために最適化することができる。例えば、構成成分モル比は、限定はしないが、５０％のＣ１２−２００、１０％のジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含み得る（ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜１０１０を参照；全体として参照により本明細書に組み込む）。核酸を皮下送達又は筋肉内送達のいずれかによって、細胞（限定はしないが、脂肪細胞及び筋肉細胞など）に局所送達するためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に望ましい製剤構成成分を全て必要とするわけではなく、従って、リピドイド及びｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのみを含む場合もある。
【０４７５】
リピドイドは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによる細胞トランスフェクションを増大し得る；及び／又はコードされたタンパク質の翻訳を増加し得るため、種々のリピドイドの組み合わせを用いることにより、ｃｉｒｃＲＮＡ誘導によるタンパク質産生の効力を改善することができる（ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．１６８８〜１６９４を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４７６】
リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主として脂質二重層で構成され得る人工的に調製された小胞であり、栄養素及び医薬製剤の投与のための送達ビヒクルとして用いることができる。リポソームは、限定はしないが、直径が数百ナノメートルであり、狭い水性コンパートメントによって分離された一続きの同心二重層を含み得る多重膜小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍ未満であり得る小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、及び直径５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ）など、様々なサイズであってよい。非健常組織に対するリポソームの付着を改善する、又は限定はしないがエンドサイトーシスなどのイベントを活性化するために、リポソーム設計は、限定はしないが、オプソニン又はリガンドを含んでもよい。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低い又は高いｐＨを含有してよい。
【０４７７】
リポソームの形成は、限定はしないが、封入される医薬製剤及びリポソーム成分、脂質小胞を分散させる媒体の性質、封入物質の有効濃度及びその潜在的毒性、小胞の適用中及び／又は送達中に関与する任意の追加プロセス、意図する用途に対する小胞の最適サイズ、多分散性及び貯蔵寿命、並びに安全且つ効率的なリポソーム産物のバッチ間再現性及び大量生産の可能性などの、物理化学的特性に左右され得る。
【０４７８】
非制限的例として、合成膜小胞などのリポソームは、以下の文献に記載されている方法、装置及びデバイスによって調製することができる：米国特許出願公開第２０１３０１７
７６３８号明細書、同第２０１３０１７７６３７号明細書、同第２０１３０１７７６３６号明細書、同第２０１３０１７７６３５号明細書、同第２０１３０１７７６３４号明細書、同第２０１３０１７７６３３号明細書、同第２０１３０１８３３７５号明細書、同第２０１３０１８３３７３号明細書、及び同第２０１３０１８３３７２号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む。
【０４７９】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、限定なしに、以下：１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ワシントン州ボセル）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、及びＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）から形成されるリポソーム、並びに、限定はしないが、ヤンセン・バイオテック社（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（ペンシルベニア州ホーシャム）のＤＯＸＩＬ（登録商標）などの小分子薬物を送達し得るリポソームなどのリポソームを含み得る。
【０４８０】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、限定なしに、以前記載されており、且つｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが証明されている安定化プラスミド脂質粒子（ＳＰＬＰ）又は安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるリポソームなどのリポソームを含み得る（ホイーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．２７１〜２８１；チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．１４３８〜１４４７；ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）ら著、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．）、２００５年、第２２巻、ｐ．３６２〜３７２；モリッシー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２巻、ｐ．１００２〜１００７；ツィンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４１巻、ｐ．１１１〜１１４；ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００５年、第１０７巻、ｐ．２７６〜２８７；センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２〜１７６；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１〜６７３；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２；米国特許出願公開第２０１３０１２２１０４号明細書を参照のこと；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。ホイーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）らによる最初の製造方法は、デタージェント透析法であったが、これは、後にジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより改良されており、自発的小胞形成法と呼ばれる。リポソーム製剤は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに加えて、３〜４つの脂質構成成分から構成されてもよい。一例として、リポソームは、限定はしないが、ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより記載される通り、５５％のコレステロール、２０％のジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、及び１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有することができる。別の例として、いくつかのリポソーム製剤は、限定はしないが、ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）らにより記載される通り、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、及び３０％のカチオン性脂質を含有してもよく、ここで、カチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、又は１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であってもよい。
【０４８１】
一部の実施形態では、リポソーム製剤は、約２５．０％〜約４０．０％のコレステロール、約３０．０％〜約４５．０％のコレステロール、約３５．０％〜約５０．０％のコレステロール、及び／又は約４８．５％〜約６０％のコレステロールを含んでもよい。好ましい実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％及び４３．５％からなる群から選択されるパーセンテージのコレステロールを含み得る。一部の実施形態では、製剤は、約５．０％〜約１０．０％のＤＳＰＣ及び／又は約７．０％〜約１５．０％のＤＳＰＣを含み得る。
【０４８２】
一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫原又は別の目的のポリペプチドをコードし得るｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達するように形成することができるリポソームを含み得る。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、リポソームによって封入してもよいし、及び／又は水性コアに含有させた後、これをリポソームによって封入してもよい（国際公開第２０１２０３１０４６号パンフレット、同第２０１２０３１０４３号パンフレット、同第２０１２０３０９０１号パンフレット、同第２０１２００６３７８号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３０１８９３５１号明細書、同第２０１３０１９５９６９号明細書、同第２０１３０２０２６８４号明細書を参照；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４８３】
別の実施形態では、リポソームを標的送達のために製剤化することができる。非制限的例として、リポソームは、肝臓への標的送達のために製剤化することができる。標的送達のために用いられるリポソームとして、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１９５９６７号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているリポソーム、及びリポソームの製造方法が挙げられる。
【０４８４】
別の実施形態では、免疫原をコードし得るｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、カチオン性水中油形エマルション中に製剤化することができ、ここで、エマルション粒子は、オイルコア、及びｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと相互作用して、その分子をエマルション粒子に係留することができるカチオン性脂質を含む（国際公開第２０１２００６３８０号パンフレットを参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４８５】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、親水相が分散している連続的疎水相を含む油中水形エマルション中に製剤化することもできる。非制限的例として、エマルションは、国際公開第２０１０８７７９１号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製造することができる。
【０４８６】
別の実施形態では、脂質製剤は、少なくともカチオン性脂質、トランスフェクションを増強する脂質、及び脂質部分に連結した親水性ヘッドグループを含有する少なくとも１つの脂質を含み得る（国際公開第２０１１０７６８０７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１１０２００５８２号明細書；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の実施形態では、免疫原をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞に製剤化することができる（米国特許出願公開第２０１２０１７７７２４号明細書を参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４８７】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１３０８６５２６号パンフレット（全体として参照により本明細書
に組み込む）に記載のリポソーム中に製剤化することができる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１３０８６５２６号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、逆転ｐＨ勾配及び／又は最適化内部バッファー組成物を用いて、リポソーム中に封入することができる。
【０４８８】
一実施形態では、カチオン性脂質は、米国特許出願公開第２０１３００９０３７２号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどの、低分子量カチオン性脂質であってもよい。
【０４８９】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化することができる。
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、カチオン性脂質を含むリポソーム中に製剤化することができる。リポソームは、国際公開第２０１３００６８２５号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、１：１〜２０：１のカチオン性脂質中の窒素対ＲＮＡ中のリン酸のモル比（Ｎ：Ｐ比）を有していてよい。別の実施形態では、リポソームは、２０：１超又は１：１未満のＮ：Ｐ比を有し得る。
【０４９０】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化することができる。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって達成することができる。非制限的例として、ポリカチオンは、限定はしないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び／又はポリアルギニン、並びに国際公開第２０１２０１３３２６号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０１４２８１８号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているカチオン性ペプチドなどのカチオン性ペプチド又はポリペプチドを含み得る。別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、コレステロール又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの中性脂質をさらに含み得る脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化してもよい。
【０４９１】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、アミノアルコールリピドイド中に製剤化することができる。本発明で用いられ得るアミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって調製することができる。
【０４９２】
リポソーム製剤は、限定はしないが、カチオン性脂質構成成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ペグ化の性質、全構成成分の比及びサイズなどの生物物理学的パラメータによって影響され得る。センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら（センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２〜１７６；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）による一例では、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、及び１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変えると、様々な抗原提示細胞にｓｉＲＮＡをより効果的に送達することができた（バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６〜２２００；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。一部の実施形態では、リポソーム製剤は、約３５〜約４５％のカチオン性脂質、約４０〜約５０％のカチオン性脂質、約５０〜約６０％
のカチオン性脂質、及び／又は約５５〜約６５％のカチオン性脂質を含み得る。一部の実施形態では、リポソーム中の脂質対ｍＲＮＡの比は、約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、及び／又は少なくとも３０：１であってよい。
【０４９３】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＰＥＧの比を増減する、及び／又はＰＥＧ脂質の炭素鎖長さをＣ１４からＣ１８に変更することにより、ＬＮＰ製剤の薬物動態及び／又は生体分布を改変することができる。非制限的例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ及びコレステロールと比較して、約０．５％〜約３．０％、約１．０％〜約３．５％、約１．５％〜約４．０％、約２．０％〜約４．５％、約２．５％〜約５．０％、及び／又は約３．０％〜約６．０％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有し得る。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、限定はしないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール））、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロール）及び／又はＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質で置換してもよい。カチオン性脂質は、当技術分野で公知の任意の脂質、例えば、限定はしないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００及び／又はＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどから選択することができる。
【０４９４】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１２１７０９３０号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどの脂質ナノ粒子中に製剤化することができる。
【０４９５】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子である。脂質は、限定はしないが、以下：ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ペグ化脂質及びアミノアルコール脂質から選択することができる。別の態様では、脂質は、限定はしないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であってもよい。アミノアルコールカチオン性脂質は、本明細書に記載の脂質及び／又は米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造される脂質であってもよい。非制限的例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物３）；及び２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物４）；又はこれらの任意の薬学的に許容される塩若しくは立体異性体であってもよい。
【０４９６】
一実施形態では、カチオン性脂質は、限定はしないが、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００３７０］に記載のカチオン性脂質から選択することができる。
【０４９７】
一実施形態では、脂質は、国際公開第２０１２１７０８８９号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものなどの切断可能な脂質であってもよい。
別の実施形態では、脂質は、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３００６４８９４号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）の式（Ｉ）などのカチオン性脂質であってもよい。
【０４９８】
一実施形態では、カチオン性脂質は、当技術分野で公知の方法及び／又は以下の文献に記載の方法により合成することができる：国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、同第２０１１１５３１２０号パンフレット、同第２０１１１４９７３３号パンフレット、同第２０１１０９０９６５号パンフレット、同第２０１１０４３９１３号パンフレット、同第２０１１０２２４６０号パンフレット、同第２０１２０６１２５９号パンフレット、同第２０１２０５４３６５号パンフレット、同第２０１２０４４６３８号パンフレット、同第２０１００８０７２４号パンフレット、同第２０１０２１８６５号パンフレット、同第２０１３０８６３７３号パンフレット、及び同第２０１３０８６３５４号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４９９】
別の実施形態では、カチオン性脂質は、トリアルキルカチオン性脂質であってもよい。トリアルキルカチオン性脂質並びにトリアルキルカチオン性脂質の製造及び使用方法の非制限的例は、国際公開第２０１３１２６８０３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０５００】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのＬＮＰ製剤は、３％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有し得る。別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのＬＮＰ製剤は、１．５％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有し得る。
【０５０１】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの医薬組成物は、国際公開第２０１２０９９７５５号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているペグ化脂質の少なくとも１つを含んでもよい。
【０５０２】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有してもよい。一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当技術分野で公知のカチオン性脂質及び少なくとも１つの他の成分を含有してもよい。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当技術分野で公知のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ及びコレステロールを含有してもよい。非制限的例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ及びコレステロールを含有してもよい。別の非制限的例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモル比で含有してもよい（例えば、ギール（Ｇｅａｌｌ）ら著、「自己増幅ＲＮＡワクチンの非ウイルス送達（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、ＰＮＡＳ、２０１２年、ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照；全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５０３】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレット又は同第２００８１０３２７６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって製剤化することができる。非制限的例として、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレット又は同第２００８１０３２７
６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、ＬＮＰ製剤に封入することができる。
【０５０４】
一実施形態では、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許出願公開第２０１２０２０７８４５号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、非経口経路によって送達するためにナノ粒子に製剤化することができる。
【０５０５】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許出願公開第２０１３０１５６８４５号明細書又は国際公開第２０１３０９３６４８号パンフレット若しくは同第２０１２０２４５２６号パンフレット（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造される脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５０６】
本明細書に記載する脂質ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１６４４００号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のシステム及び／又は方法により、滅菌環境において製造することができる。
【０５０７】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、米国特許第８，４９２，３５９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている核酸−脂質粒子などのナノ粒子に製剤化することができる。非制限的例として、脂質粒子は、以下のものを含む：１種又は複数種の活性剤若しくは治療薬；粒子中に存在する総脂質の約５０モル％〜約８５モル％を占める１種又は複数種のカチオン性脂質；粒子中に存在する総脂質の約１３モル％〜約４９．５モル％を占める１種又は複数種の非カチオン性脂質；粒子中に存在する総脂質の約０．５モル％〜約２モル％を占め、粒子の凝集を阻害する１種又は複数種の共役脂質。ナノ粒子中の核酸は、本明細書に記載する、及び／又は当技術分野で公知のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰであってよい。
【０５０８】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレット又は同第２００８１０３２７６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製剤化することができる。非制限的例として、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレット及び／又は同第２００８１０３２７６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、ＬＮＰ製剤に封入することができる。
【０５０９】
一実施形態では、本明細書に記載するＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでもよい。非制限的例として、ポリカチオン性組成物は、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の式１〜６０から選択することができる。別の実施形態では、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの送達に使用することができる。
【０５１０】
一実施形態では、本明細書に記載するＬＮＰ製剤は、さらに、透過性促進剤分子を含んでもよい。透過性促進剤分子の非制限的例は、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０５１１】
一実施形態では、医薬組成物は、限定はしないが、ＤｉＬａ２リポソーム（マリナ・バ
イオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ワシントン州ボセル）、スマーティクレス（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ワシントン州ボセル）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣癌へのｓｉＲＮＡ送達（ランデン（Ｌａｎｄｅｎ）ら著、癌生物学及び療法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００６年、第５巻（１２）、ｐ．１７０８〜１７１３）；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）及びヒアルロナン被覆リポソーム（クワイエット・セラピューティクス（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、イスラエル）などのリポソームに製剤化することができる。
【０５１２】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許出願公開第２０１２０６０２９３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、凍結乾燥ゲル相リポソーム組成物に製剤化することができる。
【０５１３】
ナノ粒子製剤は、リン酸コンジュゲートを含んでもよい。リン酸コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏ循環時間を増加し、及び／又はナノ粒子の標的送達を増大し得る。本発明で使用するリン酸コンジュゲートは、国際公開第２０１３０３３４３８号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。非制限的例として、リン酸コンジュゲートは、国際公開第２０１３０３３４３８号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている式のいずれか１つの化合物を含んでもよい。
【０５１４】
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含んでもよい。ポリマーコンジュゲートは、水溶性コンジュゲートであってもよい。ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている構造を有し得る。一態様では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰとのポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３００７２７０９号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法及び／又はセグメント化ポリマー試薬を用いて、製造することができる。別の態様では、ポリマーコンジュゲートは、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているポリマーコンジュゲートなどの環部分を含むペンダント側基を有していてもよい。
【０５１５】
ナノ粒子製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を促進するためのコンジュゲートを含んでもよい。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の貪食細胞によるクリアランスを阻害し得る。一態様では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計される「自己」ペプチドであってもよい（例えば、ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）らにより記載される「自己」粒子（“ｓｅｌｆ”ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３３９巻、ｐ．９７１〜９７５）を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）らにより示される通り、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介のクリアランスを遅延させ、これによって、ナノ粒子の送達が促進された。別の態様では、コンジュゲートは、膜タンパク質ＣＤ４７であってもよい（例えば、ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３３９巻、ｐ．９７１〜９７５を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）らは、「自己」ペプチドと同様に、ＣＤ４７は、スクランブルペプチド及びＰＥＧ被覆ナノ粒子と比較して、対象における循環粒子比率を増大することができること
を示した。
【０５１６】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、対象における本発明のナノ粒子の送達を促進するためのコンジュゲートを含むナノ粒子に製剤化する。コンジュゲートは、ＣＤ４７膜であってもよいし、又はコンジュゲートは、前述した「自己」ペプチドなどのＣＤ４７膜タンパク質に由来するものであってもよい。別の態様では、ナノ粒子は、ＰＥＧ及びＣＤ４７のコンジュゲート又はその誘導体を含んでもよい。また別の態様では、ナノ粒子は、前述した「自己」ペプチド及び膜タンパク質ＣＤ４７の両方を含んでもよい。
【０５１７】
別の態様では、「自己」ペプチド及び／又はＣＤ４７タンパク質は、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達のために、本明細書に記載するように、ウイルス様粒子又は偽ビリオン（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）に共役させてもよい。
【０５１８】
別の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと、分解可能な結合を有し得るコンジュゲートを含む医薬組成物。コンジュゲートの非制限的例は、イオン化水素原子含有の芳香族部分、スペーサ部分、及び水溶性ポリマーを含む。非制限的例として、分解可能な結合を有するコンジュゲートを含む医薬組成物、及びこのような医薬組成物の送達方法が、米国特許出願公開第２０１３０１８４４４３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０５１９】
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体と、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む炭水化物ナノ粒子であってもよい。非制限的例として、炭水化物担体は、限定はしないが、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲンタイプの材料、フィトグリコーゲンオクテニルコハク酸塩、フィトグリコーゲンβ−デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ−デキストリンを含み得る。（例えば、国際公開第２０１２１０９１２１号パンフレットを参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５２０】
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤又はポリマーで被覆してもよい。一実施形態では、ナノ粒子は、限定はしないが、ＰＥＧコーティング及び／又は中性表面電荷を有するコーティングなどの親水性コーティングで被覆してもよい。親水性コーティングは、より大きなペイロード、例えば、限定はしないが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどを有するナノ粒子を中枢神経系内に送達する上で役立ち得る。非制限的例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及びそうしたナノ粒子を製造する方法が、米国特許出願公開第２０１３０１８３２４４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０５２１】
一実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であってもよい。親水性ポリマー粒子及び親水性ポリマー粒子の製造方法の非制限的例は、米国特許出願公開第２０１３０２１０９９１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０５２２】
別の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であってもよい。
脂質ナノ粒子製剤は、急速に排除される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られる生分解性カチオン性脂質で、カチオン性脂質を置換することにより改善することができる。限定はしないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン化カチオン性脂質は、時間の経過とともに血漿及び組織中に蓄積するこ
とがわかっており、潜在的な毒性源となり得る。急速に排除される脂質の急速な代謝は、ラットにおいて、脂質ナノ粒子の耐容性及び治療指数を１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量へと一桁分改善することができる。酵素により分解されるエステル結合の含有によって、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持しながら、カチオン性成分の分解及び代謝プロフィールを改善することができる。エステル結合は、脂質鎖の内部に配置してもよいし、又は脂質鎖の末端に配置してもよい。内部エステル結合で、脂質鎖内の任意の炭素を置換してもよい。
【０５２３】
一実施形態では、内部エステル結合は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００３９８］に記載されるｒｅＬＮＰなどの飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。
【０５２４】
一実施形態では、ナノ種、ポリマー及び免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって、免疫応答を誘発することができる。（米国特許出願公開第２０１２０１８９７００号明細書及び国際公開第２０１２０９９８０５号パンフレット；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ポリマーでナノ種を封入してもよいし、又はナノ種を部分的に封入してもよい。免疫原は、本明細書に記載する組換えタンパク質、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰであってもよい。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、ワクチン、例えば、限定はしないが、病原体に対するワクチンなどに使用するために製剤化することもできる。
【０５２５】
脂質ナノ粒子は、粒子の表面特性を改変するように操作してもよく、これによって、脂質ナノ粒子は、粘膜障壁を透過することができるようにしてもよい。粘液は、限定はしないが、口腔（例えば、頬及び食道膜並びに扁桃腺組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管及び気管支膜）、生殖器（例えば、膣、子宮頸及び尿道膜）などの粘膜組織に位置している。より高い薬物封入効率及び多種多様な薬物の持続的送達をもたらす能力のために好ましい１０〜２００ｎｍ超のナノ粒子は、粘膜障壁を通過して急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、連続的に分泌、放出、廃棄又は消化及び再利用されているため、捕捉された粒子のほとんどが数十秒以内若しくは数時間以内に粘膜組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で密にコーティングされた大きなポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中に拡散する同じ粒子よりわずか４〜６倍低速で粘膜を介して拡散した（ライ（Ｌａｉ）ら著、ＰＮＡＳ、２００７年、第１０４巻（５）、ｐ．１４８２〜４８７；ライ（Ｌａｉ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビュー（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．）、２００９年、第６１巻（２）、ｐ．１５８〜１７１；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ナノ粒子の輸送は、透過速度、及び／又は限定はしないが、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）法及び高解像度多粒子追跡（ＭＰＴ）法などの蛍光顕微鏡検査法を用いて、決定することができる。非制限的例として、米国特許第８，２４１，６７０号明細書、又は国際公開第２０１３１１００２８号パンフレット（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、粘膜障壁を透過することができる組成物を製造することができる。
【０５２６】
粘膜を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）及び／又はポリマー−ビタミンコンジュゲート及び／又はトリブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマー材料として、限定はしないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートが挙げられる。ポリマー材料は、生分解性及び／
又は生体適合性であってもよい。生体適合性ポリマーの非制限的例が、国際公開第２０１３１１６８０４号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。さらに、ポリマー材料は照射してもよい。非制限的例として、ポリマー材料にγ線照射してもよい（例えば、国際公開第２０１２８２１６５号パンフレットを参照のこと；全体として参照により本明細書に組み込む）。具体的なポリマーの非制限的例として、以下のものが挙げられる：ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＰＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などのポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メト）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メト）アクリレート）、ポリ（ブチル（メト）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メト）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メト）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メト）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メト）アクリレート）、ポリ（フェニル（メト）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）並びにこれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ及びトリメチレンカルボネート、ポリビニルピロリドン。脂質ナノ粒子は、限定���しないが、ブロックコポリマー（国際公開第２０１３０１２４７６号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている分岐状ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマーなど）、及び（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（プロピレンオキシド））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２１７１８号明細書及び同第２０１００００３３３７号明細書及び米国特許第８，２６３，６６５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）などのコポリマーで被覆するか、又はコポリマーと結合させてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ポリマーであってよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学的実体が生成されないように行ってよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学的実体を形成することなく、ＰＬＧＡナノ粒子を被覆するポロキサマーを含んでもよく、こうした粒子は、依然として急速にヒト粘膜を透過することができる（ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー国際版（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２０１１年、第５０巻、ｐ．２５９７〜２６００；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ヒト粘膜を透過することができるナノ粒子を生成する非制限的なスケーラブルな方法が、シュー（Ｘｕ）らにより記載されている（例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２０１３年、第１７０巻（２）、ｐ．２７９〜８６を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５２７】
ポリマー−ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンＥであってよい。コンジュゲートのビタミン部分は、限定はしないが、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分、又は他の界面活性剤の疎水性成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖及びアルキレンオキシド鎖）などの他の好適な成分で置換してもよい。
【０５２８】
粘液を透過するように操作される脂質ナノ粒子は、表面改変剤を含んでもよく、そのようなものとして、限定はしないが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル−臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性剤）、糖若しくは糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、モグサ（ｍｕｇｗｏｒｔ）、ブロメライン、パパイン、クレロデンドロン（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ）、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アムブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼα、ネルテネキシン、エルドステイン）並びにｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅがある。表面改変剤は、粒子の表面に埋め込むか、若しくはメッシュに絡ませてもよいし、又は脂質ナノ粒子の表面上に付着させてもよい（例えば、コーティング、吸着、共有結合、若しくは他のプロセスにより）。（例えば、米国特許出願公開第２０１００２１５５８０号明細書、同第２００８０１６６４１４号明細書及び米国特許出願公開第２０１３０１６４３４３号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５２９】
粘膜透過性脂質ナノ粒子は、本明細書に記載する少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを含んでもよい。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、脂質ナノ粒子に封入してもよいし、及び／又は粒子の表面に付着させてもよい。脂質ナノ粒子の表面にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを共有結合させてもよい。粘膜透過性脂質ナノ粒子の製剤は、複数種のナノ粒子を含んでもよい。さらに、製剤は、粘液と相互作用して、周囲の粘液の構造的及び／又は付着特性を改変することにより粘液付着を低減する粒子を含有してもよく、これにより、粘膜組織に対する粘液透過性脂質ナノ粒子の送達が増大し得る。
【０５３０】
別の実施形態では、粘膜透過性脂質ナノ粒子は、粘膜透過促進コーティングを含む、低張性製剤であってもよい。製剤は、それが送達される上皮に対して低張性であってよい。低張性製剤の非制限的例は、国際公開第２０１３１１００２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に見出すことができる。
【０５３１】
一実施形態では、粘膜障壁を通過する送達を促進するために、製剤は、低張性溶液を含むか、又は低張性溶液であってもよい。低張性溶液は、粘液不活性粒子、例えば、限定はしないが、粘膜透過性粒子などが、膣上皮表面に到達することができる速度を高めることが判明している（例えば、エンサイン（Ｅｎｓｉｇｎ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１３年、第３４巻（２８）、ｐ．６９２２〜９を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５３２】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定なしに、サイレンス・セラピューティクス（Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（英国、ロンドン）のアトゥプレックス（ＡＴＵＰＬＥＸ）（商標）システ
ム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム及び他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ステムジェント（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のステムフェクト（ＳＴＥＭＦＥＣＴ）（商標）、並びにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はプロタミンベースの標的及び非標的核酸送達などの、リポプレックスとして製剤化してもよい（アレク（Ａｌｅｋｕ）ら著、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２００８年、第６８巻、ｐ．９７８８〜９７９８；ストランバーグ（Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ）ら著、臨床薬理学及び治療薬国際ジャーナル（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第５０巻、ｐ．７６〜７８；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２〜１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０〜１３７０；グートビア（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、肺薬理学及び治療薬（Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４〜３４４；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、微小管研究（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６〜２９３；ワイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、免疫療法学会誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００９年、第３２巻、ｐ．４９８〜５０７；ワイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、免疫療法学会誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００８年、第３１巻、ｐ．１８０〜１８８；パスコロ（Ｐａｓｃｏｌｏ）著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第４巻、ｐ．１２８５〜１２９４；フォティン−ムレチェク（Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ）ら著、２０１１年、免疫療法学会誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、第３４巻、ｐ．１〜１５；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年６月、第１０４巻、ｐ．４０９５〜４１００；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５３３】
一実施形態では、こうした製剤はまた、限定はしないが、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、及び白血球など、種々の細胞型にｉｎ  ｖｉｖｏで受動的又は能動的に向かわせるように構築するか、又は組成物を改変させてもよい（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１〜６７３；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、微小管研究（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６〜２９３；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２〜１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０〜１３７０；グートビア（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、肺薬理学及び治療薬（Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４〜３４４；バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６〜２２００；フェンスケ（Ｆｅｎｓｋｅ）及びカリス（Ｃｕｌｌｉｓ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ．２５〜４４；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７〜６３０；ピア（Ｐｅｅｒ）及びリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７〜１１３３；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。肝細胞に対する製剤の受動的ターゲティングの一例として、ＤＬｉｎ−Ｄ
ＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、これらは、アポリポタンパク質Ｅに結合し、これらの製剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの肝細胞への結合及び取込みを促進することが明らかにされている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。製剤はまた、限定はしないが、葉酸塩、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、及び抗体標的化手法により例示されるように、その表面上での種々のリガンドの発現を介して選択的にターゲティングさせることもできる（コールハトカー（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ディスカバリー・テクノロジー（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第８巻、ｐ．１９７〜２０６；ムサッチオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）及びトーチリン（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ）著、フロンティア・イン・バイオサイエンス（Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．）、２０１１年、第１６巻、ｐ．１３８８〜１４１２；ユー（Ｙｕ）ら著、分子膜生物学（Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、第２７巻、ｐ．２８６〜２９８；パティル（Ｐａｔｉｌ）ら著、クリティカル・レビュー・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリア・システム（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．）、２００８年、第２５巻、ｐ．１〜６１；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８〜２７１４；チャオ（Ｚｈａｏ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ．３０９〜３１９；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４；スリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）ら著、分子生物学による方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第８２０巻、ｐ．１０５〜１１６；ベン−アリー（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ）ら著、分子生物学による方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第７５７巻、ｐ．４９７〜５０７；ピア（Ｐｅｅｒ）著、２０１０年、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、第２０巻、ｐ．６３〜６８；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．４０９５〜４１００；キム（Ｋｉｍ）ら著、分子生物学による方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１１年、第７２１巻、ｐ．３３９〜３５３；スブラマニヤ（Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．２０２８〜２０３７；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７〜６３０；ピア（Ｐｅｅｒ���及びリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７〜１１３３；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５３４】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、固体脂質ナノ粒子として製剤化する。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球形であってもよい。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することのできる固体脂質コアマトリックスを有し、界面活性剤及び／又は乳化剤と共に安定化し得る。別の実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己集合脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）、２００８年、第２巻（８）、ｐ．１６９６〜１７０２を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、ＳＬＮは、国際公開第２０１３１０５１０１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているＳＬＮであってもよい。別の非制限的例として、ＳＬＮは、国際公開第２０１３１０５１０１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法により製造することができる。
【０５３５】
リポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用すると、これらの製剤は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによる細胞トランスフェクションを増大することができ；且つ／又はコードされたタンパク質の翻訳を増大することができるため、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに誘導されるタンパク質産生の効力を向上させ得る。１つのこうした例は、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にする脂質封入の使用を伴う（ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００７年、第１５巻、ｐ．７１３〜７２０；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。また、リポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用することにより、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの安定性を高めることもできる。
【０５３６】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、制御放出及び／又は標的送達のために製剤化することができる。本明細書で用いられるとき、「制御放出」は、治療成果を実施する特定の放出パターンに適合する医薬組成物又は化合物放出プロフィールを指す。一実施形態では、制御放出及び／又は標的送達のために本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知の送達剤に、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを封入することができる。本明細書で用いられるとき、「封入する」という用語は、包み込む、取り囲む、又は包むことを意味する。本発明の化合物の製剤に関する場合、封入は、実質的、完全又は部分的のいずれであってもよい。用語「実質的に封入された」は、本発明の医薬組成物又は化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９超若しくは９９．９９９％超が、送達剤内に包み込まれる、取り囲まれる、又は包まれることを意味する。「部分的封入」とは、本発明の医薬組成物又は化合物の１０、１０、２０、３０、４０、５０以下が送達剤内に包み込まれる、取り囲まれる、又は包まれることを意味する。有利には、封入は、蛍光及び／又は電子顕微鏡写真を用いて、本発明の医薬組成物又は化合物のエスケープ又は活性を測定することによって、決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物又は化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９若しくは９９．９９％超が、送達剤内に封入される。
【０５３７】
一実施形態では、制御放出製剤は、限定はしないが、トリブロックコポリマーを含んでもよい。非制限的例として、製剤は、２つの異なる種類のトリブロックコポリマーを含み得る（国際公開第２０１２１３１１０４号パンフレット及び同第２０１２１３１１０６号パンフレット；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５３８】
別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、脂質ナノ粒子又は急速排除脂質ナノ粒子に封入した後、本明細書に記載の及び／若しくは当技術分野で公知のポリマー、ハイドロゲル並びに／又は外科密閉剤に、この脂質ナノ粒子又は急速排除脂質ナノ粒子を封入してもよい。非制限的例として、ポリマー、ハイドロゲル及び／又は外科密閉剤は、以下に挙げるものであってよい：ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス社（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、フロリダ州アラチュア）、ヒレネクス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）、外科密閉剤、例えば、フィブリノーゲンポリマー（エチコン社（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）、ジョージア州コーネリア）、ティッセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースの密閉剤、並びにコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ  
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）。
【０５３９】
別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象に注入すると、ゲルを形成し得る当技術分野で公知の任意のポリマーに封入してもよい。別の非制限的例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックスに封入してもよい。
【０５４０】
一実施形態では、制御放出及び／又は標的送達のためのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ製剤はまた、少なくとも１つの制御放出コーティングを含んでもよい。制御放出コーティングとして、限定はしないが、オパドライ（ＯＰＡＤＲＹ）（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ユードラギット  ＲＬ（ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＬ）（登録商標）、ユードラギット  ＲＳ（ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＳ）（登録商標）並びにエチルセルロース水性分散液（アクアコート（ＡＱＵＡＣＯＡＴ）（登録商標）及びシュアリース（ＳＵＲＥＬＥＡＳＥ）（登録商標））などのセルロース誘導体が挙げられる。
【０５４１】
一実施形態では、制御放出及び／又は標的送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１種の生分解性ポリエステルを含んでもよい。生分解性ポリエステルとして、限定はしないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、生分解性ポリエステルは、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧ共役を含んでもよい。
【０５４２】
一実施形態では、少なくとも１つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む制御放出及び／又は標的送達製剤は、米国特許第８，４０４，２２２号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のように、少なくとも１種のＰＥＧ及び／又はＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含んでもよい。
【０５４３】
別の実施形態では、少なくとも１つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む制御放出送達製剤は、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の制御放出ポリマー系であってもよい。
【０５４４】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、治療用ナノ粒子に封入してもよい。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載の、並びに限定はしないが、以下：国際公開第２０１０００５７４０号パンフレット、同第２０１００３０７６３号パンフレット、同第２０１０００５７２１号パンフレット、同第２０１０００５７２３号パンフレット、同第２０１２０５４９２３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、同第２０１００１０４６４５号明細書、同第２０１０００８７３３７号明細書、同第２０１０００６８２８５号明細書、同第２０１１０２７４７５９号明細書、同第２０１０００６８２８６号明細書、同第２０１２０２８８５４１号明細書、同第２０１３０１２３３５１号明細書及び同第２０１３０２３０５６７号明細書、並びに米国特許第８，２０６，７４７号明細書、同第８，２９３，２７６号明細書、同第８，３１８，２０８号明細書及び同第８，３１８，２１１号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）など、当技術分野で公知の方法によって製剤化することができる。別の実施形態では、治療用ポリマーナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２０１４０７９０号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって同定することができる。
【０５４５】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、持続放出のために製剤化することができる。本明
細書で用いられるとき、「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物又は化合物を指す。期間は、限定はしないが、数時間、数日、数週間、数ヵ月及び数年を含み得る。非制限的例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー、及び限定はしないが、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどの治療薬を含んでもよい（国際公開第２０１００７５０７２号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号明細書、同第２０１１０２１７３７７号明細書及び同第２０１２０２０１８５９号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の非制限的例では、持続放出製剤は、持続的な生体利用可能性を可能にする物質、例えば、限定はしないが、結晶、高分子ゲル及び／又は粒子状懸濁物を含んでもよい（米国特許出願公開第２０１３０１５０２９５号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５４６】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、標的特異的となるように製剤化することができる。非制限的例として、治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含んでもよい（国際公開第２０１１０８４５１８号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。一実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌特異的となるように製剤化することができる。非制限的例として、治療用ナノ粒子は、国際公開第２００８１２１９４９号パンフレット、同第２０１０００５７２６号パンフレット、同第２０１０００５７２５号パンフレット、同第２０１１０８４５２１号パンフレット、並びに米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号明細書、同第２０１２０００４２９３号明細書及び同第２０１００１０４６５５号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているナノ粒子に製剤化してもよい。
【０５４７】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでもよい。非制限的例として、ナノ粒子は、限定はしないが、以下：ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）又はこれらの組み合わせなどの２種以上のポリマーを含み得る。
【０５４８】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。一実施形態では、ジブロックコポリマーは、限定はしないが、以下：ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）又はこれらの組み合わせなどのポリマーと組み合わせてＰＥＧを含んでもよい。別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、欧州特許出願公開第（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているジブロックコポリマーを含んでもよい。また別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、国際公開第２０１３１２００５２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのハイＸ（ｈｉｇｈ  Ｘ）ジブロックコポリマーであってもよい。
【０５４９】
非制限的例として、治療用ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書及び米国特許第８，２３６，３３０号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）を含む。別の非制限的例では、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧ及びＰＬＡ又はＰＥＧ及びＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（米国特許第８，２４６，９６８号明細書及び国際公開第２０１２１６６９２３号パンフレットを参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。また別の非制限的例では、治療用ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているステルスナノ粒子又は標的特異的ステルスナノ粒子である。
【０５５０】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含んでもよい（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号明細書及び同第８，２８７，９１０号明細書並びに米国特許出願公開第２０１３０１９５９８７号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５５１】
また別の非制限的例では、脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む（例えば、以下を参照：感熱性ハイドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）は、リー（Ｌｅｅ）ら著、「Ｔｇｆ−β１遺伝子送達ビヒクルとしての感熱性ハイドロゲルは、糖尿病性損傷治癒を促進する（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ
ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ）」、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻（１２）、ｐ．１９９５〜２０００では、ＴＦＧ−β１遺伝子送達ビヒクルとして；リー（Ｌｉ）ら著、「感熱性生分解性ハイドロゲルを基材とする制御遺伝子送達系（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）」、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻（６）、ｐ．８８４〜８８８；及びチャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、「ノニオン性両親媒性生分解性ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーは、ラット骨格筋において遺伝子送達効率を高める（Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）」、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２００７年、第１１８巻、ｐ．２４５〜２５３では、制御遺伝子送達系として、使用された；これらの文献の各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５５２】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含んでもよい（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号明細書及び同第８，２８７，９１０号明細書並びに米国特許出願公開第２０１３０１９５９８７号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５５３】
一実施形態では、本明細書に記載するブロックコポリマーは、非ポリマーミセル及びブロックコポリマーを含むポリイオン複合体に含有させてもよい。（例えば、米国特許出願公開第２０１２００７６８３６号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５５４】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のアクリル酸ポリマーを含んでも
よい。アクリル酸ポリマーとして、限定はしないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリル酸コポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
【０５５５】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のポリ（ビニルエステル）ポリマーを含んでもよい。ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、ランダムコポリマーなどのコポリマーであってもよい。非制限的例として、ランダムコポリマーは、国際公開第２０１３０３２８２９号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０１２１９５４号明細書（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどの構造を有し得る。一態様では、ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに共役させてもよい。別の態様では、本発明で使用することができるポリ（ビニルエステル）ポリマーは、（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものであってもよい。
【０５５６】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のジブロックコポリマーを含んでもよい。ジブロックコポリマーは、限定はしないが、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーであってよい（例えば、国際公開第２０１３０４４２１９号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、治療用ナノ粒子は、癌を治療するために使用することができる（国際公開第２０１３０４４２１９号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５５７】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、本明細書に記載の、及び／又は当技術分野で公知の少なくとも１種のカチオン性ポリマーを含んでもよい。
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のアミン含有ポリマー、例えば、限定はしないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（β−アミノエステル）（例えば、米国特許第８，２８７，８４９号明細書を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）及びこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０５５８】
別の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、国際公開第２０１３０５９４９６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのアミンカチオン性脂質を含んでもよい。一態様では、カチオン性脂質は、アミノ−アミン又はアミノ−アミド部分を有し得る。
【０５５９】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１種の分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性ポリエステルとして、限定はしないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧ共役を含んでもよい。
【０５６０】
別の実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのターゲティングリガンドの共役を含んでもよい。ターゲティングリガンドは、限定はしないが、モノクローナル抗体などの当技術分野で公知の任意のリガンドであってよい。（キルポチン（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ）ら著、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、２００６年、第６６巻、ｐ．６７３２〜６７４０；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５６１】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌をターゲティングするのに用いることができる
水溶液中に製剤化することができる（国際公開第２０１１０８４５１３号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１１０２９４７１７号明細書を参照；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５６２】
一実施形態では、少なくとも１つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む治療用ナノ粒子は、ポドビンスキー（Ｐｏｄｏｂｉｎｓｋｉ）らにより、米国特許第８，４０４，７９９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法を用いて製剤化することができる。
【０５６３】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、合成ナノキャリアに封入する、これと連結させる、及び／又は結合させることができる。合成ナノキャリアとして、限定はしないが、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレットのパラグラフ［０００４４０］〜［０００４４９］に記載のものがあり、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０５６４】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、双性イオン性脂質に封入する、これと連結させる、及び／又は結合させることができる。双性イオン性脂質及び双性イオン性脂質の使用方法の非制限的例は、米国特許出願公開第２０１３０２１６６０７号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。一態様では、双性イオン性脂質は、本明細書に記載のリポソーム及び脂質ナノ粒子に使用することができる。
【０５６５】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許出願公開第２０１３０１９７１００号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、コロイドナノキャリアに製剤化することができる。
【０５６６】
一実施形態では、ナノ粒子は、経口投与のために最適化することができる。ナノ粒子は、限定はしないが、キトサン又はその誘導体などの少なくとも１種のカチオン性バイオポリマーを含んでもよい。非制限的例として、ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２０２８２３４３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製剤化することができる。
【０５６７】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、脂質ＫＬ５２（参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２９５８３２号明細書に開示されているアミノ−脂質）を含む。ＬＮＰ投与の活性及び／又は安全性（１つ又は複数のＡＬＴ／ＡＳＴ、白血球数並びにサイトカイン誘導を検査することにより測定される）は、こうした脂質の組み込みによって改善され得る。ＫＬ５２を含むＬＮＰは、静脈内及び／又は１つ又は複数の用量で投与することができる。一部の実施形態では、ＫＬ５２を含むＬＮＰの投与によって、ＭＣ３を含むＬＮＰと比較して、同等若しくは改善されたｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現が達成される。
【０５６８】
一部の実施形態では、より小さいＬＮＰを用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することができる。こうした粒子は、直径が０．１ｕｍ未満から１００ｎｍ以下、例えば、限定はしないが、０．１ｕｍ未満、１．０ｕｍ未満、５ｕｍ未満、１０ｕｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕ
ｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、９７５ｕｍ未満であってよい。
【０５６９】
別の実施形態では、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ及び／又は約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの直径を含み得る、より小さいＬＮＰを用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することができる。
【０５７０】
一部の実施形態では、こうしたＬＮＰは、マイクロ流体力学ミキサーを含む方法を用いて合成する。例示的マイクロ流体力学スミキサーとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：限定なしに、マイクロイノバ（Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ）（アラーハイリゲン・バイ・ヴィルドン（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ  ｂｅｉ  Ｗｉｌｄｏｎ）、オーストリア）などのスリット型インターデジタルマイクロミキサー、及び／又はスタガー・ヘリンボーン（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ）マイクロミキサー（ＳＨＭ）（チガルツェフ，Ｉ．Ｖ（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ）ら著、ミリ秒のマイクロ流体混合を用いた、水性及びトリグリセリドコアを備える制限サイズ脂質ナノ粒子のボトムアップ設計及び合成が公開されている（ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）著、２０１２年、第２８巻、ｐ．３６３３〜４０；ベリボー，Ｎ．Ｍ．（Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．）ら著、「ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達のための極めて強力な制限サイズ脂質ナノ粒子のマイクロ流体合成（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ）」、分子療法−核酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、２０１２年、第１巻、ｅ３７；チェン，Ｄ．（Ｃｈｅｎ，Ｄ．）ら著、「制御マイクロ流体製剤により達成される強力なｓｉＲＮＡ含有脂質ナノ粒子の迅速な発見（Ｒａｐｉｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」、米国化学会誌、（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．）、２０１２年、第１３４巻（１６）、ｐ．６９４８〜５１；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。一部の実施形態では、ＳＨＭを含むＬＮＰ作製方法は、少なくとも２つの入力ストリームの混合をさらに含み、その場合、混合は、ミクロ構造誘導のカオス的移流（ＭＩＣＡ）によって起こる。本方法によれば、流体ストリームは、ヘリンボーンパターンに存在する流路を通って流れ、これが旋回流を引き起こして、互いの周囲に流体を折り重ねる。この方法はまた、流体混合のための表面も含み得るが、その場合、上記の表面は、流体の循環中に方向を変更する。ＳＨＭを用いてＬＮＰ
を作製する方法としては、米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号明細書及び同第２０１２／０２７６２０９号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されているものがある。
【０５７１】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、インスティチュート・フュア・ミクロテクニーク・マインツ社（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ  Ｍａｉｎｚ  ＧｍｂＨ）、ドイツ、マインツ）製のスリット・インターデジタル・マイクロストラクチャード・ミキサー（Ｓｌｉｔ  Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｍｉｘｅｒ）（ＳＩＭＭ−Ｖ２）又はスタンダード・スリット・インターデジタル・マイクロミキサー（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｌｉｔ  Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｉｘｅｒ）（ＳＳＩＭＭ）又はキャタピラー（Ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）（ＣＰＭＭ）若しくはインピンギング−ジェット（Ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ−ｊｅｔ）（ＩＪＭＭ）などのマイクロミキサーを用いて、作製される脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５７２】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、マイクロ流体技術を用いて、作製された脂質ナノ粒子に製剤化することができる（ホワイトサイズ，ジョージ  Ｍ．（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ
Ｍ．）著、「マイクロフルイディックスの起源及び未来（Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４２巻、ｐ．３６８〜３７３；及びアブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら著、「マイクロ流路のためのカオスミキサー（Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ
ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年、第２９５巻、ｐ．６４７〜６５１を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、制御マイクロ流体製剤化は、低いレイノルズ数（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｎｕｍｂｅｒ）で、マイクロ流路中の定常圧力駆動流のストリームを混合するための受動的方法を含む（例えば、アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら著、「マイクロ流路のためのカオスミキサー（Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年、第２９５巻、ｐ．６４７〜６５１を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５７３】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、ハーバード・アパラタス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）（マサチューセッツ州ホリストン）又はドロマイト・マイクロフルイディックス（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）（英国、ロイストン）製のものなどのマイクロミキサーチップを用いて作製された脂質ナノ粒子に製剤化することができる。マイクロミキサーチップは、分割及び再結合機構による２つ以上の流体ストリームの高速混合のために使用することができる。
【０５７４】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレット又は米国特許第８，４４０，６１４号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている薬剤封入マイクロスフィアを用いて、送達のために製剤化することができる。マイクロスフィアは、国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）の化合物を含み得る。別の態様では、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）は、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを細胞に送達する上で有用である（国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照
により本明細書に組み込む）。
【０５７５】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、限定はしないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、及び／又は約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５７６】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約５００ｎｍの直径を有し得る。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超又は１０００ｎｍ超の直径を有し得る。
【０５７７】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、国際公開第２０１３０５９９２２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている制限サイズ脂質ナノ粒子であってもよい。制限サイズ脂質ナノ粒子は、水性コア又は疎水性コアを取り囲む脂質二重層を含んでよく；ここで、脂質二重層は、リン脂質、例えば、限定はしないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリン、及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を含み得る。別の態様では、制限サイズ脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール−脂質、例えば、限定はしないが、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧを含んでもよい。
【０５７８】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１３０６３５３０号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている送達方法を用いて、特定の位置に送達、局在化及び／又は濃縮することができる。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達前、送達と同時に、又は送達後に、中空ポリマー粒子を対象に投与することができる。中空ポリマー粒子は、一旦対象と接触すると、体積が変化し、対象の特定の位置に留まる、埋め込まれる、固定化されるか、又は捕捉される。
【０５７９】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、活性物質放出系に製剤化することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１０２５４５号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。活性物質放出系は、１）触媒活性核酸とハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド阻害剤ストランドに結合した少なくとも１つのナノ粒子、及び２）治療活性物質に結合する少なくとも１つの基質分子に結合する化合物（例えば、本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）を含んでもよく
、その場合、治療活性物質は、触媒活性核酸による基質分子の切断によって放出される。
【０５８０】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、非細胞材料を含む内部コアと、細胞膜を含む外側表面とを含む、ナノ粒子に製剤化することができる。細胞膜は、細胞に由来してもよいし、又はウイルス由来の膜であってもよい。非制限的例として、ナノ粒子は、国際公開第２０１３０５２１６７号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製造することができる。別の非制限的例として、国際公開第２０１３０５２１６７号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のナノ粒子を用いて、本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することもできる。
【０５８１】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、多孔質ナノ粒子支持脂質二重層（プロトセル）に製剤化してもよい。プロトセルは、国際公開第２０１３０５６１３２号パンフレットに記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０５８２】
一実施形態では、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許第８，４２０，１２３号明細書及び同第８，５１８，９６３号明細書並びに欧州特許第２０７３８４８Ｂ１号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている又はそれに記載されている方法により作製されるポリマーナノ粒子に製剤化することができる。非制限的例として、ポリマーナノ粒子は、米国特許第８，５１８，９６３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のナノ粒子、又は記載の方法によって製造されるナノ粒子のように、高いガラス転移温度を有し得る。別の非制限的例として、経口、非経口及び局所製剤のためのポリマーナノ粒子は、欧州特許第２０７３８４８Ｂ１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製造することができる。
【０５８３】
別の実施形態では、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、イメージングに用いられるナノ粒子に製剤化することができる。ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１２９６３６号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのリポソームナノ粒子であってもよい。非制限的例として、リポソームは、ガドリニウム（ＩＩＩ）２−｛４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリルアミドメチル−Ｎ’−アミド−メチル］−１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデク−ｌ−イル｝−酢酸及び中性の完全飽和リン脂質成分を含み得る（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１２９６３６号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５８４】
一実施形態では、本発明で使用することができるナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法により形成される。
【０５８５】
本発明のナノ粒子は、限定はしないが、その欠乏によって、貧血から神経管欠損までの健康障害を引き起こし得るものなどの栄養素をさらに含んでもよい（例えば、国際公開第２０１３０７２９２９号パンフレットに記載のナノ粒子を参照のこと；これらの各々の内容は、その全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、栄養素は、第一鉄塩、第二鉄塩若しくは元素鉄の形態の鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミン又は微量栄養素であってもよい。
【０５８６】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、膨潤性ナノ粒子に製剤化することができる。膨潤性ナノ粒子は、限定はしないが、米国特許第８，４４０，２３１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってもよい。非制限的例として、膨潤性ナノ粒子は、呼吸器系に対する本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達に用いることができる（例えば、米国特許第８，４４０，２３１号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５８７】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、米国特許第８，４４９，９１６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのポリ無水物ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５８８】
本発明のナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び／又は免疫応答を調節するように幾何学的に操作してもよい。一態様では、幾何学的に操作した粒子は、例えば、限定はしないが、肺への送達などの標的送達のための本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを組み込む目的で、様々な形状、サイズ及び／又は表面変化を有し得る（例えば、国際公開第２０１３０８２１１１号パンフレットを参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。幾何学的操作粒子が有し得る他の物理的特徴として、限定はしないが、開窓、角のあるアーム、非対称及び粗い表面、細胞及び組織との相互作用を改変し得る電荷が挙げられる。非制限的例として、本発明のナノ粒子は、国際公開第２０１３０８２１１１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０５８９】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定はしないが、国際公開第２０１３０９０６０１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどの水溶性ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、優れた水溶性を呈示するために、小型の双性イオン性リガンドを有する無機ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子はまた、小さい流体学的径（ＨＤ）、時間、ｐＨ、及び塩分濃度に対する安定性、並びに低レベルの非特異的タンパク質結合を有し得る。
【０５９０】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により作製することができる。
【０５９１】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのステルスナノ粒子又は標的特異的ステルスナノ粒子である。本発明のナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０５９２】
別の実施形態では、ステルスナノ粒子又は標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでもよい。ポリマーマトリックスは、限定はしないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリ
レート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート又はこれらの組み合わせなどの２種以上のポリマーを含み得る。
【０５９３】
一実施形態では、ナノ粒子は、高密度核酸層を有するナノ粒子−核酸ハイブリッド構造を有し得る。非制限的例として、ナノ粒子−核酸ハイブリッド構造は、米国特許出願公開第２０１３０１７１６４６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。ナノ粒子は、限定はしないが、本明細書に記載の、並びに／又は当技術分野で公知のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどの核酸を含んでもよい。
【０５９４】
本発明のナノ粒子の少なくとも１つは、ナノ構造のコアに埋め込むか、あるいは、ナノ構造内若しくは表面上の少なくとも１つのペイロードを担持するか若しくはそれと結合することができる低密度多孔質３Ｄ構造又はコーティングで被覆してもよい。少なくとも１種のナノ粒子を含むナノ構造の非制限的例が、国際公開第２０１３１２３５２３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０５９５】
ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコア−シェルナノ粒子
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、天然及び／若しくは合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に用いることができるポリマーの非制限的例として、限定はしないが、ミラス（ＭＩＲＵＳ）（登録商標）バイオ（Ｂｉｏ）（ウィスコンシン州マディソン）及びロシュ・マディソン（Ｒｏｃｈｅ
Ｍａｄｉｓｏｎ）（ウィスコンシン州マディソン）のダイナミック・ポリコンジュゲート（ＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ）（登録商標）（アローヘッド・リサーチ社（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、カリフォルニア州パサデナ）製剤、フェーズＲＸ（ＰＨＡＳＥＲＸ）（商標）ポリマー製剤、例えば、限定なしに、スマート・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（商標）（フェーズＲＸ（ＰＨＡＳＥＲＸ）（登録商標）、ワシントン州シアトル）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、バイカル（Ｖｉｃａｌ）（カリフォルニア州サンディエゴ）のバクスフェクチン（ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）アジュバント、キトサン、カランド・ファーマシューティカルズ（Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（カリフォルニア州パサデナ）のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ロンデル（ＲＯＮＤＥＬ）（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（アローヘッド・リサーチ社（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州パサデナ）及びｐＨ反応性コブロックポリマー、例えば、限定はしないが、フェーズＲＸ（ＰＨＡＳＥＲＸ）（登録商標）（ワシントン州シアトル）が挙げられる。
【０５９６】
キトサン製剤の非制限的例は、正荷電キトサンのコアと、負荷電基質の外側部分を含む（米国特許出願公開第２０１２０２５８１７６号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。キトサンとしては、限定はしないが、Ｎ−トリメチルキトサン、モノ−Ｎ−カルボキシメチルキトサン（ＭＣＣ）、Ｎ−パルミトイルキトサン（ＮＰＣＳ）、ＥＤＴＡ−キトサン、低分子量キトサン、キトサン誘導体、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【０５９７】
一実施形態では、本発明で用いられるポリマーは、不要な物質、例えば、限定はしないが、細菌がポリマーの表面に付着するのを低減及び／又は阻害するための処理に付してある。ポリマーは、当技術分野で公知の、及び／若しくは当技術分野に記載の方法、並びに／又は国際公開第２０１２１５０４６７号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により処理することができる。
【０５９８】
ＰＬＧＡ製剤の非制限的例として、限定はしないが、ＰＬＧＡ注射デポー剤（例えば、６６％Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、並びに水性溶媒及びロイプロリド中にＰＬＧＡを溶解させて形成されるＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）。一旦注射されると、ＰＬＧＡ及びロイプロリドペプチドは、皮下空間中に沈降する）がある。
【０５９９】
これらのポリマー手法の多くは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドの細胞質への送達における効力が実証されている（ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２に論じられている；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。核酸の頑健なｉｎ  ｖｉｖｏ送達をもたらした（この場合、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて）２つのポリマー手法は、動的ポリコンジュゲート及びシクロデキストリンベースのナノ粒子である（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１５６７２１号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。これらの送達手法のうちの最初のものは、動的ポリコンジュゲートを使用するもので、マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを有効に送達し、肝細胞における内因性の標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ１２９８２〜１２８８７；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。この特定の手法は多成分ポリマー系であり、その重要な特徴としては、核酸、この場合、ｓｉＲＮＡが、ジスルフィド結合を介して共有結合される膜活性ポリマーが挙げられ、そこにＰＥＧ基（電荷マスキング用）及びＮ−アセチルガラクトサミン基（肝細胞ターゲティング用）の両方がｐＨ感受性結合を介して連結される（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２〜１２８８７；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ポリマー複合体は、肝細胞に結合してエンドソームに侵入すると、低ｐＨ環境で分解し、ポリマーがその正電荷を露出することによって、ポリマーからのエンドソームエスケープ及びｓｉＲＮＡの細胞質放出が起こる。Ｎ−アセチルガラクトサミン基をマンノース基で置換することにより、アシアロ糖タンパク質受容体発現肝細胞から、類洞内皮細胞及びクッパー細胞へとターゲティングを変更できることが判明した。別のポリマー手法は、トランスフェリン標的シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子の使用を含む。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現ユーイング肉腫腫瘍細胞におけるＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の標的サイレンシングを実証しており（フー−リースコバン（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ）ら著、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２００５年、第６５巻、ｐ．８９８４〜８９８２；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）、これらのナノ粒子に製剤化されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において良好な耐容性を示した（ハイデル（Ｈｅｉｄｅｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．５７１５〜２１；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。これらの送達戦略はいずれも、標的送達及びエンドソームエスケープ機構の両者を用いた合理的な手法を取り入れている。
【０６００】
ポリマー製剤は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの持続的若しくは遅延放出を可能にし得る（例えば、筋肉内若しくは皮下注射の後）。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの放出プロフィールを改変することにより、例えば、長期間にわたって、コードされたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。また、ポリマー製剤を用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの安定性を高めることもできる。生分解性ポリマーは、これまで、ｃｉｒｃＲＮＡ以外の核酸を分解から保護するために用いられており、ｉｎ  ｖｉｖｏでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ
Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２〜１２８８７；サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１０年、第７巻、ｐ．１４３３〜１４４６；コンバーチン（Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１０年１０月１日；チュー（Ｃｈｕ）ら著、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．）、２０１２年１月１３日；マンガニエロ（Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１２年、第３３巻、ｐ．２３０１〜２３０９；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８〜２７１４；シンハ（Ｓｉｎｇｈａ）ら著、核酸治療薬（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第２巻、ｐ．１３３〜１４７；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２；シャファート（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ）及びワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１６巻、ｐ．１１３１〜１１３８；チャツルベディ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１１年、第８巻、ｐ．１４５５〜１４６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、分子薬剤学（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．）、２００９年、第６巻、ｐ．６５９〜６６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ．１０６７〜１０７０；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６０１】
一実施形態では、医薬組成物は、持続放出製剤であってもよい。別の実施形態では、持続放出製剤は、皮下送達用であってよい。持続放出製剤として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ＰＬＧＡマイクロスフィア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス社（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、フロリダ州アラチュア）、ヒレネクス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）、外科密閉剤、例えば、フィブリノーゲンポリマー（エチコン社（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）、ジョージア州コーネリア）、ティッセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースの密閉剤、並びにコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）。
【０６０２】
非制限的例として、調整可能な放出速度（例えば、数日及び数週間）のＰＬＧＡマイクロスフィアを調製し、封入工程中にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの完全性を維持しながら、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをＰＬＧＡマイクロスフィアに封入することによって、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをＰＬＧＡマイクロスフィアに製剤化することができる。ＥＶＡｃは、前臨床持続放出インプラント用途（例えば、徐放剤オキュサート（Ｏｃｕｓｅｒｔ）（緑内障用のピロカルピン眼球インサート）又はプロゲスタサート（ｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ）（持続放出プロゲステロン子宮内デバイス；経皮送達系テストダーム（Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ）、デュラゲシック（Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ）及びセレギリン（Ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）；カテーテル）に広く使用されている非生分解性、生分解性ポリマーである。ポロキサマーＦ−４０７ＮＦは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンからなる親水性のノニオン性界面活性剤トリブロックコポリマーであり、５℃未満の温度で低粘度を有し、１５℃を超える温度で固体ゲルを形成する。ペグ化外科密閉剤は、送達デバイス中で混合される２種の合成ＰＥＧ成分を含み、このデバイスは、１分で調製することができ、３分で密閉し、３０日以
内に再吸収される。ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）及び天然ポリマーは、投与部位でのｉｎ  ｓｉｔｕゲル化が可能である。これらは、イオン相互作用によって、タンパク質及びペプチド治療薬候補と相互作用して、安定化効果をもたらすことが判明している。
【０６０３】
ポリマー製剤はまた、限定はしないが、葉酸塩、トランスフェリン、及びＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により例示される通りの、種々のリガンドの発現により、選択的にターゲティングすることもできる（ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８〜２７１４；ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２〜１２８８７；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、分子薬剤学（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．）、２００９年、第６巻、ｐ．６５９〜６６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ．１０６７〜１０７０；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６０４】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ポリマー化合物と一緒に、又はポリマー化合物に製剤化することができる。ポリマーは、限定はしないが、以下に挙げるものなどの少なくとも１種のポリマーを含み得る：ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフト処理したＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐状ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、マルチブロックコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アクリル酸ポリマー、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体又はこれらの組み合わせ。
【０６０５】
非制限的例として、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許第６，１７７，２７４号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、ＰＬＬでグラフト処理したＰＥＧのポリマー化合物と一緒に製剤化することができる。製剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞のトランスフェクション、又はｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために用いることができる。別の実施例では、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書及び同第２００９００４２８２５号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、乾燥医薬組成物、又は乾燥させることができる溶液中で、カチオン性ポリマーと一緒にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを溶液若しくは媒質中に懸濁させてもよい。
【０６０６】
別の非制限的例として、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉ
ｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書及び米国特許第８，２３６，３３０号明細書を参照のこと；これらは、全体として参照により本明細書に組み込む）又はＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロックコポリマー（米国特許第６，００４，５７３号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）と一緒に製剤化することができる。非制限的例として、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ＰＥＧ及びＰＬＡ又はＰＥＧ及びＰＬＧＡのジブロックコポリマーと一緒に製剤化することができる（米国特許第８，２４６，９６８号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６０７】
ポリアミン誘導体を用いて、核酸を送達する、又は疾患を治療する及び／又は予防する、又は移植可能若しくは注射可能なデバイスに含有させることができる（例えば、米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書（現在、米国特許第８，４６０，６９６号明細書）；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、医薬組成物は、修飾核酸及びｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ並びに米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書（現在、米国特許第８，４６０，６９６号明細書；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のポリアミン誘導体を含んでもよい。非制限的例として、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ポリアミドポリマー、例えば、限定はしないが、オリゴアミンを含むジルキン単位と炭水化物ジアジドモノマーを組み合わせることにより調製される１，３−双極性付加ポリマーを含むポリマー（米国特許第８，２３６，２８０号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）を用いて送達することができる。
【０６０８】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１種のアクリル酸ポリマーと一緒に製剤化することができる。アクリル酸ポリマーとして、限定はしないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０６０９】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレット、同第２０１２０８２５７４号パンフレット及び同第２０１２０６８１８７号パンフレット、並びに米国特許出願公開第２０１２０２８３４２７号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている少なくとも１種のポリマー及び／又はその誘導体と一緒に製剤化することができる。別の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りの、式Ｚのポリマーと一緒に製剤化することができる。また別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレット又は同第２０１２０６８１８７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０２８３４２号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りの、式Ｚ、Ｚ’若しくはＺ’’のポリマーと一緒に製剤化することができる。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと一緒に製剤化されるポリマーは、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレット又は同第２０１２０６８１８７号パンフレット（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって合成することができる。
【０６１０】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少
なくとも１種のアクリル酸ポリマーと一緒に製剤化することができる。アクリル酸ポリマーとして、限定はしないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０６１１】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの製剤は、少なくとも１種のアミン含有ポリマー、例えば、限定はしないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン−コ−エステル）又はこれらの組み合わせを含んでもよい。非制限的例として、ポリ（アミン−コ−エステル）は、国際公開第２０１３０８２５２９号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のポリマーであってもよいし、及び／又はそこに記載されている方法によって製造することができる。
【０６１２】
例えば、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、又は生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー又はこれらの組み合わせを含む医薬化合物に製剤化することができる。生分解性カチオン性リポポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，６９６，０３８号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３６１９号明細書及び同第２００４０１４２４７４号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって製造することができる。ポリ（アルキレンイミン）は、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて製造することができる。生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、又は生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，５１７，８６９号明細書及び同第６，２６７，９８７号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて製造することができる。線状生分解性コポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，６５２，８８６号明細書に記載の方法を用いて製造することができる。ＰＡＧＡポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，２１７，９１２号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて製造することができる。限定はしないが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルチニン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）などのポリマーとＰＡＧＡポリマーを共重合して、コポリマー又はブロックコポリマーを形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第８，０５７，８２１号明細書、同第８，４４４，９９２号明細書又は米国特許出願公開第２０１２００９１４５号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。例えば、マルチブロックコポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンと比較して、異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを用いて合成することができる。さらに、組成物又は医薬組成物は、当技術分野で公知の方法、本明細書に記載する方法、又は米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書若しくは米国特許第６，２６７，９８７号明細書及び同第６，２１７，９１２号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０６１３】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ポ
リカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１種の分解性ポリエステルと一緒に製剤化することができる。分解性ポリエステルとして、限定はしないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧ共役を含んでもよい。
【０６１４】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つの架橋可能なポリエステルと一緒に製剤化することができる。架橋可能なポリエステルとしては、当技術分野で公知のもの及び米国特許出願公開第２０１２０２６９７６１号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０６１５】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１種のシクロデキストリンポリマー中に、又はそれと一緒に製剤化することができる。シクロデキストリンポリマー及びシクロデキストリンポリマーを製造する方法としては、当技術分野で公知のもの及び米国特許出願公開第２０１３０１８４４５３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０６１６】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１種の架橋カチオン結合ポリマー中に、又はそれと一緒に製剤化することができる。架橋カチオン結合ポリマー及び架橋カチオン結合ポリマーを製造する方法としては、当技術分野で公知のもの及び国際公開第２０１３１０６０７２号パンフレット、同第２０１３１０６０７３号パンフレット及び同第２０１３１０６０８６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０６１７】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１種の分岐状ポリマー中に、又はそれと一緒に製剤化することができる。分岐状ポリマー及び分岐状ポリマーを製造する方法としては、当技術分野で公知のもの及び国際公開第２０１３１１３０７１号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０６１８】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１種のペグ化アルブミンポリマー中に、又はそれと一緒に製剤化することができる。ペグ化アルブミンポリマー及びペグ化アルブミンポリマーを製造する方法としては、当技術分野で公知のもの及び米国特許出願公開第２０１３０２３１２８７号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０６１９】
一実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、リピド−末端ＰＥＧと共役させてもよい。非制限的例として、ＰＬＧＡをリピド−末端ＰＥＧと共役させて、ＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成することができる。別の非制限的例として、本発明で使用するＰＥＧコンジュゲートが、国際公開第２００８１０３２７６号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。ポリマーは、限定はしないが、米国特許第８，２７３，３６３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているコンジュゲートなどのリガンドコンジュゲートを用いて共役させてもよい。
【０６２０】
一実施形態では、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、投与の前にＰＥＧ又はリン酸ナトリウム及び／若しくは炭酸ナトリウム溶液と混合させることができる。別の実施形態では、目的のタンパク質をコード
するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをＰＥＧと混合し、さらに、リン酸ナトリウム及び／若しくは炭酸ナトリウム溶液とも混合することができる。また別の実施形態では、目的のタンパク質をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをＰＥＧと混合し、第２の目的のタンパク質をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをリン酸ナトリウム及び／若しくは炭酸ナトリウム溶液と混合してもよい。
【０６２１】
一実施形態では、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを別の化合物と共役させてもよい。コンジュゲートの非制限的例が、米国特許第７，９６４，５７８号明細書及び同第７，８３３，９９２号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。別の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許第７，９６４，５７８号明細書及び同第７，８３３，９９２号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りの式１〜１２２のコンジュゲートと共役させてもよい。本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、金などの金属と共役させてもよい。（例えば、ギルヨハン（Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ）ら著、米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００９年、第１３１巻（６）、ｐ．２０７２〜２０７３を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の実施形態では、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、金−ナノ粒子と共役させてもよいし、及び／又は金−ナノ粒子に封入してもよい。（国際公開第２０１２１６２６９号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１２０３０２９４０号明細書及び同第２０１３０１７７５２３号明細書；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６２２】
米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列及びポロキサマーを含んでもよい。例えば、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書に記載のポロキサマーを含む遺伝子送達組成物に用いることができる。
【０６２３】
一実施形態では、本発明のポリマー製剤は、コレステロール及びポリエチレングリコール基に共有結合させることができるカチオン性リポポリマーと、ポリマー製剤（カチオン性担体を含み得る）を接触させることにより、安定化することができる。ポリマー製剤は、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いてカチオン性リポポリマーと接触させてもよい。カチオン性担体として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム塩化物（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリ
スチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物ＤＯＤＡＣ）及びこれらの組み合わせ。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許出願公開第２０１３００６５９４２号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのカチオン性リポポリマーと一緒に製剤化してもよい。
【０６２４】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種のポリマーのポリプレックスに製剤化することができる（例えば、米国特許第８，５０１，４７８号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２３７５６５号明細書及び同第２０１２０２７０９２７号明細書及び同第２０１３０１４９７８３号明細書並びに国際公開第２０１３０９０８６１号パンフレットを参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、ポリプレックスは、国際公開第２０１３０９０８６１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている新規のαアミノアミジンポリマーを用いて形成してもよい。別の非制限的例として、ポリプレックスは、米国特許第８，５０１，４７８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のクリックポリマーを用いて形成することもできる。
【０６２５】
一実施形態では、ポリプレックスは、２種以上のカチオン性ポリマーを含む。カチオン性ポリマーは、線状ＰＥＩなどのポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を含んでもよい。別の実施形態では、ポリプレックスは、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）、そのペグ化類似体ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ及びこれらの混合物を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１４９７８３号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６２６】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、ポリマー、脂質、及び／又は他の生分解性薬剤、例えば限定はしないが、リン酸カルシウムなどの組み合わせを用い、ナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分は、コア−シェル、ハイブリッド、及び／又は多層構造に組み合わせてもよく、これによって、ナノ粒子の微調整が可能になり、ひいてはｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達を促進することができる（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．）、２００６年、第５巻、ｐ．７９１〜７９６；フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２００８年、第２９巻、ｐ．１５２６〜１５３２；デコカー（ＤｅＫｏｋｅｒ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．）、２０１１年、第６３巻、ｐ．７４８〜７６１；エンドレス（Ｅｎｄｒｅｓ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、ｐ．７７２１〜７７３１；スー（Ｓｕ）ら著、分子薬剤学（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．）、２０１１年６月６日、第８巻（３）、ｐ．７７４〜８７；これらは、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、ナノ粒子は、限定はしないが、親水性−疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）及び／又は親水性ポリマー（国際公開第２０１２０２２５１２９号パンフレット；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）などの複数のポリマーを含み得る。
【０６２７】
別の非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡのための親水性ポリマーを含むナノ粒子は、国際公開第２０１３１１９９３６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってもよいし、又はそこに記載の方法によって製造してもよい。
【０６２８】
一実施形態では、本発明で用いることができる生分解性ポリマーは、ポリ（エーテル−無水物）ブロックコポリマーである。非制限的例として、本明細書で用いる生分解性ポリマーは、国際公開第２００６０６３２４９号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているブロックコポリマーであってもよいし、又は国際公開第２００６０６３２４９号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって製造してもよい。
【０６２９】
別の実施形態では、本発明で用いることができる生分解性ポリマーは、アルキル及びシクロアルキル末端生分解性脂質である。非制限的例として、アルキル及びシクロアルキル末端生分解性脂質は、国際公開第２０１３０８６３２２号パンフレットに記載されているものであってもよいし、及び／又は国際公開第２０１３０８６３２２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって製造してもよい。
【０６３０】
また別の実施形態では、本発明で用いることができる生分解性ポリマーは、脂質部分に位置する１つ又は複数の生分解性基を有するカチオン性脂質である。非制限的例として、生分解性脂質は、米国特許出願公開第２０１３０１９５９２０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってもよい。
【０６３１】
脂質及び／又はポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することが明らかにされている。一実施形態では、脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子（これはまたアニスアミドなどのターゲティングリガンドも含有し得る）を使用して、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達してもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてｓｉＲＮＡを有効に送達するために、脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子が使用されている（リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２０１０年、第１４２巻、ｐ．４１６〜４２１；リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２０１２年、第１５８巻、ｐ．１０８〜１１４；ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第２０巻、ｐ．６０９〜６１５；これらは、全体として参照により本明細書に組み込む）。この送達系は、ｓｉＲＮＡの送達を改善するために、標的化ナノ粒子と、エンドソームエスケープを増強する構成成分であるリン酸カルシウムの両方を組み合わせる。
【０６３２】
一実施形態では、リン酸カルシウムをＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーと一緒に使用して、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達してもよい（カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００４年、第９７巻、ｐ．３４５〜３５６；カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００６年、第１１１巻、ｐ．３６８〜３７０；これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６３３】
一実施形態では、ＰＥＧ−電荷変換型ポリマー（ピテラ（Ｐｉｔｅｌｌａ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、ｐ．３１０６〜３１１４；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）を用いて、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達するナノ粒子を形成してもよい。ＰＥＧ−電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンに切断され、これにより、エンドソームエスケープを増強することによって、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
【０６３４】
一実施形態では、本発明で用いることができるポリマーは、限定はしないが、国際公開第２０１３０５５３３１号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のペンタブロックポリマーなどのペンタブロックポリマーであってもよい。非制限的例として、ペンタブロックポリマーは、ＰＧＡ−ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＧＡを含み、ここで、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、ＰＣＬは、ポリ（Ｅ−カプロラクトン）であり、ＰＧＡは、ポリ（グリコール酸）であり、またＰＬＡは、ポリ（乳酸）である。別の非制限的例として、ペンタブロックポリマーは、ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＬＡ−ＰＣＬ−ＰＥＧを含み、ここで、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、ＰＣＬは、ポリ（Ｅ−カプロラクトン）であり、ＰＧＡは、ポリ（グリコール酸）であり、またＰＬＡは、ポリ（乳酸）である。
【０６３５】
一実施形態では、本発明で使用することができるポリマーは、少なくとも１つのジエポキシド及び少なくとも１つのアミノグルコシドを含む（例えば、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレットを参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ジエポキシドは、限定はしないが、１，４ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４Ｂ）、１，４−シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテル（１，４Ｃ）、４−ビニルシクロヘキセンジエポキシド（４ＶＣＤ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＤＧＥ）、グリセロールジクリシジルエーテル（ＧＤＥ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ＮＰＤＧＥ）、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）、ポリ（プロピレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＰＧＤＥ）及びレゾルシノールジグリシジルエーテル（ＲＤＥ）から選択することができる。アミノグリコシドは、限定はしないが、ストレプトマイシン、ネオマイシン、フラマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、カナマイシン、アミカシン、アルベカシン、ベカナマイシン、ジベカシン、トブラマイシン、スペクチノマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、シソマイシン、イセパマイシン、ベルダマイシン、アストロマイシン、及びアプラマイシンから選択することができる。非制限的例として、ポリマーは、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。別の非制限的例として、少なくとも１つのジエポキシド及び少なくとも１つのアミノグルコシドを含有するポリマーのいずれかを含む組成物は、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０６３６】
一実施形態では、本発明で使用することができるポリマーは、架橋ポリマーであってもよい。非制限的例として、架橋ポリマーを用いて、米国特許第８，４１４，９２７号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの粒子を形成することができる。別の非制限的例として、架橋ポリマーは、米国特許出願公開第２０１３０１７２６００号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により取得することもできる。
【０６３７】
一実施形態では、本発明で使用することができるポリマーは、米国特許第８，４６１，１３２号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるものなどの架橋ポリマーであってもよい。非制限的例として、架橋ポリマーは、身体組織の治療のための治療組成物に用いることができる。治療組成物は、注射若しくはカテーテル法などの当技術分野で公知の及び／又は本明細書に記載の様々な方法を用いて、損傷組織に投与することができる。
【０６３８】
一実施形態では、本発明で使用することができるポリマーは、限定はしないが、国際公開第２０１３０４９３２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものなどの二脂肪族置換ペグ化脂質であってもよい。
【０６３９】
一実施形態では、ブロックコポリマーは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧである（例えば、以下を参照：感熱性ハイドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）は、リー（Ｌｅｅ）ら著、「Ｔｇｆ−β１遺伝子送達ビヒクルとしての感熱性ハイドロゲルは、糖尿病性損傷治癒を促進する（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ）」、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻（１２）、ｐ．１９９５〜２０００では、ＴＦＧ−β遺伝子送達ビヒクルとして；リー（Ｌｉ）ら著、「感熱性生分解性ハイドロゲルを基材とする制御遺伝子送達系（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）」、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻（６）、ｐ．８８４〜８８８；及びチャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、「ノニオン性両親媒性生分解性ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーは、ラット骨格筋において遺伝子送達効率を高める（Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ
ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）」、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２００７年、第１１８巻、ｐ．２４５〜２５３では、制御遺伝子送達系として、使用された；これら文献の各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）が本発明において使用され得る。本発明は、限定はしないが、筋肉内及び皮下投与などの投与のために、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧと一緒に製剤化することができる。
【０６４０】
別の実施形態では、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーは、本発明において、生分解性持続放出系を作製するために使用される。一態様では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、投与の前に、ブロックコポリマーと混合する。別の態様では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ブロックコポリマーと共投与する。
【０６４１】
一実施形態では、本発明で用いられるポリマーは、多機能性ポリマー誘導体、例えば、限定はしないが、米国特許第８４５４９４６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの多機能性Ｎ−マレイミジルポリマー誘導体であってもよい。
【０６４２】
コア−シェルナノ粒子の使用はさらに、カチオン性架橋ナノゲルコア及び様々なシェルを合成するハイスループット手法に焦点が置かれてきた（ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６〜１３００１；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ナノ粒子のコア及びシェル構成成分の両方で化学組成を改変することにより、ポリマーナノ粒子の複合体化、送達、及びインターナリゼーションを正確に制御することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後、マウス肝細胞にｓｉＲＮＡを効率的に送達することができる。
【０６４３】
一実施形態では、中央のＰＬＧＡ層と、ＰＥＧを含有する外側の中性脂質層とを含む中空脂質コアを用いて、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することができる。非限定的な例として、ルシフェラーゼ発現腫瘍を有するマウスでは、従来のリポプレックスと比較して、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子がルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが判明した（シャイ（Ｓｈｉ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅ
ｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ）、２０１１年、第５０巻、ｐ．７０２７〜７０３１；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６４４】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのコアと、ポリマーシェルとを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載するポリマーのいずれであってもよく、これらは、当技術分野において公知である。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを保護することができる。
【０６４５】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと一緒に使用されるコア−シェルナノ粒子は、米国特許第８，３１３，７７７号明細書又は国際公開第２０１３１２４８６７号パンフレット（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されており、そこに記載される方法により形成することができる。
【０６４６】
一実施形態では、コア−シェルナノ粒子は、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのコアと、ポリマーシェルとを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載するポリマーのいずれであってもよく、これらは、当技術分野において公知である。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを保護することができる。
【０６４７】
一実施形態では、本明細書に記載する製剤と共に用いられるポリマーは、国際公開第２０１１１２００５３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの修飾ポリマー（例えば、限定はしないが、修飾ポリアセタールなど）であってもよい。
【０６４８】
一実施形態では、製剤は、ポリマー担体と、少なくとも１つの核酸分子とを含むポリマー担体カーゴ複合体であってもよい。ポリマー担体カーゴ複合体の非制限的例は、国際公開第２０１３１１３３２６号パンフレット、同第２０１３１１３５０１号パンフレット、同第２０１３１１３３２５号パンフレット、同第２０１３１１３５０２号パンフレット及び同第２０１３１１３７３６号パンフレット並びに欧州特許第２６２３１２１号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。一態様では、ポリマー担体カーゴ複合体は、負荷電核酸分子、例えば、限定はしないが、国際公開第２０１３１１３３２５号パンフレット及び同第２０１３１１３５０２号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどを含んでもよい。
【０６４９】
一実施形態では、医薬組成物は、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと、ポリマー担体カーゴ複合体を含んでもよい。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、目的のタンパク質、例えば、限定はしないが、感染症に関連する病原体に由来する抗原、アレルギー若しくはアレルギー性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、又は癌若しくは腫瘍疾患に関連する抗原などをコードし得る（例えば、国際公開第２０１３１１３３２６号パンフレット、同第２０１３１１３５０１号パンフレット、同第２０１３１１３３２５号パンフレット、同第２０１３１１３５０２号パンフレット、及び同第２０１３１１３７３６号パンフレット並びに欧州特許第２６２３１２１号明細書に記載されている抗原を参照のこと；これらの文献の各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６５０】
非制限的例として、コア−シェルナノ粒子を用いて、眼病又は障害を治療することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１２０３２１７１９号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６５１】
一実施形態では、本明細書に記載する製剤で用いられるポリマーは、国際公開第２０１１１２００５３号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの修飾ポリマー（例えば、限定はしないが、修飾ポリアセタールなど）であってもよい。
【０６５２】
ペプチド及びタンパク質
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによる細胞のトランスフェクションを増大するために、ペプチド及び／又はタンパク質と一緒に製剤化することができる。本発明で用いることができるペプチド及び／又はタンパク質は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５４０］〜［０００５４３］に記載されている。
【０６５３】
細胞
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトすることができ、続いて、その細胞を対象に移植する。非制限的例として、医薬組成物は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを肝臓及び骨髄性細胞に送達するための赤血球、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）中でｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達するためビロソーム、並びに電気穿孔細胞、例えば、限定はしないが、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５４４］〜［０００５４６］に記載されているものなどを含んでもよい。
【０６５４】
細胞への導入
細胞への核酸の導入のためには、ウイルス媒介性及び非ウイルス媒介性の技術を含め、様々な方法が当技術分野において公知であり、且つ好適である。本発明で用いることができる導入方法の例は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５４７］〜［０００５４９］に記載されている。
【０６５５】
微小器官（Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎ）
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、微小器官に含有させてもよく、これが、その後、持続的な治療製剤において目的のコードされたポリペプチドを発現することができる。本発明で用いることができる微小器官は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５５０］〜［０００５５４］に記載されている。
【０６５６】
ヒアルロニダーゼ
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの筋肉内又は皮下局所注射は、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含有することができる。ヒアルロニダーゼは、間質バリアの構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロナンの粘度を低下させ、これにより組織透過性を高める（フロスト（Ｆｒｏｓｔ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２００７年、第４巻、ｐ．４２７〜４４０；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ヒアルロニダー
ゼは、その分散及びトランスフェクト細胞により産生される、コードされたタンパク質の全身分布を速めるのに有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内投与又は皮下投与された本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−Ｓに曝露される細胞の数を増加させることができる。
【０６５７】
ナノ粒子模倣体
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ナノ粒子模倣体に封入してもよいし、及び／又はナノ粒子模倣体に吸収させてもよい。ナノ粒子模倣体は、送達機能生物又は粒子、例えば、限定はしないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生体、プリオン及び細胞を模倣することができる。非制限的例として、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非ビリオン粒子に封入してもよい（国際公開第２０１２００６３７６号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１７１２４１号明細書及び同第２０１３０１９５９６８号明細書を参照のこと；これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６５８】
ナノチューブ
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つのナノチューブ、例えば、限定はしないが、ロゼットナノチューブ、リンカーを含むツインベースを有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ及び／又は単層カーボンナノチューブに付着、あるいは、結合させることができる。本発明で用いることができるナノチューブは、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５５６］〜［０００５６０］に記載されている。
【０６５９】
コンジュゲート
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、コンジュゲート、例えば、担体若しくはターゲティング基に共有結合したｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ、あるいは一緒に融合タンパク質（例えば、ターゲティング基と治療用タンパク質若しくはペプチドを有する）を生成する２つのコード領域を含むコンジュゲートを含む。
【０６６０】
本発明のコンジュゲートとしては、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）；又は脂質などの、天然に存在する物質が挙げられる。リガンドはまた、組換え分子又は合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンなどの、ポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、以下のものが挙げられる：ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はαヘリックスペプチド。
【０６６１】
特にＲＮＡとの、ポリヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はしないが、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書及び同第５，６８８，９４１号明細書；同第６，２９４，６６４号明細書；同第６，３２０，０１７号明細書；同第６，５７６，７５２号明細書；同第６，７８３，９３１号明細書；同第６，９００，２９７号明細書；同第７，０３７，６４６号明細書が挙げられ；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０６６２】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの担体として機能し得る。コンジュゲートは、カチオン性ポリマー、例えば、限定はしないが、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミンを含んでもよく、これは、ポリ（エチレングリコール）でグラフト処理してもよい。非制限的例として、コンジュゲートは、米国特許第６，５８６，５２４号明細書（これは、全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されているポリマーコンジュゲート及びポリマーコンジュゲートの合成方法と類似していてもよい。
【０６６３】
基質との共役の方法の非制限的例が、米国特許出願公開第２０１３０２１１２４９号明細書（この内容は、全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている。この方法を用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む共役ポリマー粒子を製造することができる。
【０６６４】
コンジュゲートはまた、ターゲティング基、例えば、細胞若しくは組織ターゲティング剤、例えば、腎細胞などの指定細胞型に結合する、レクチン、糖タンパク質、脂質、又はタンパク質、例えば抗体も含むことができる。ターゲティング基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、Ｒ
ＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体又はアプタマーであってもよい。
【０６６５】
ターゲティング基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的な親和性を有する分子、又は抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞などの指定細胞型に結合する抗体であってもよい。ターゲティング基はまた、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。ターゲティング基はさらに、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、又はアプタマーなどの非ペプチド種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、又はｐ３８  ＭＡＰキナーゼのアクチベータであってもよい。
【０６６６】
ターゲティング基は、特定の受容体をターゲティングすることができる任意のリガンドであってもよい。例としては、限定なしに、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、及びＨＤＬリガンドが挙げられる。具体的な実施形態において、ターゲティング基はアプタマーである。アプタマーは修飾されていなくてもよいし、又は本明細書に開示する修飾の任意の組み合わせを有していてもよい。
【０６６７】
非制限的例として、ターゲティング基は、血液−中枢神経系関門を介した標的送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）結合コンジュゲートであってもよい（例えば、米国特許出願公開第２０１３０２１６６１０１２号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６６８】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、相乗作用生体分子−ポリマーコンジュゲートであってもよい。相乗作用生体分子−ポリマーコンジュゲートは、より大きな治療効果をもたらすように、長時間作用型の連続放出系であってもよい。相乗作用生体分子−ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３０１９５７９９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってもよい。
【０６６９】
別の実施形態では、本発明で用いることができるコンジュゲートは、アプタマーコンジュゲートであってもよい。アプタマーコンジュゲートの非制限的例は、国際公開第２０１２０４０５２４号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。アプタマーコンジュゲートを用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡを含む製剤の標的送達を達成することができる。
【０６７０】
一実施形態では、本発明で用いることができるコンジュゲートは、アミン含有ポリマーコンジュゲートであってもよい。アミン含有ポリマーコンジュゲートの非制限的例は、米国特許第８，５０７，６５３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。因子ＩＸ部分ポリマーコンジュゲートは、対象への送達時及び／又は送達後に、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及びｃｉｒｃＲＮＡを放出するように、解離性結合を含んでもよい。
【０６７１】
一部の実施形態では、製剤は、修飾アミノ酸を介して連結されるポリペプチドコンジュゲートを含んでもよい。非制限的例では、コンジュゲートは、国際公開第２０１４０７４２１８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の請求項１及び従属請求項に記載の化合物を含んでもよい。
【０６７２】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、限定はしないが、ロックド核酸に類似する修飾などの化学修飾を含んでもよい。
サンタリス（Ｓａｎｔａｒｉｓ）のものなどの、ロックド核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する代表的な米国特許として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；及び同第７，３９９，８４５号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０６７３】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、限定はしないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込むものとする。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５４巻、ｐ．１４９７〜１５００に見出すことができる。
【０６７４】
本発明で取り上げる一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ、並びに他の修飾骨格、特に、前文で参照される米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで、ネイティブリン酸ジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、並びに前文で参照される米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、前文で参照される米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
【０６７５】
２’位の修飾もまた、送達を補助し得る。２’位の修飾は、ポリペプチドコード配列に位置せず、すなわち翻訳可能領域に位置しないのが好ましい。２’位の修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／又はテイル付加領域に位置してもよい。２’位の修飾は、以下のうちの１つを２’位に含むことができる：Ｈ（すなわち、２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってよい。好適な例示的修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中、ｎ及びｍは、１〜約１０である。他の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、以下のうちの１つを２’位に含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、リポータ基、インターカレータ、薬物動態学的特性を改善する基、又は薬力学的特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基。一部の実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる）（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルベチカ・キミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻、ｐ
．４８６〜５０４）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下の例に記載する通りの、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、同様に本明細書において以下の例に記載する通りの、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）がある。さらに、他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位又は２’−５’連結ｄｓＲＮＡ及び５’末端ヌクレオチドの５’位に、同様の修飾を実施してもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。こうした修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許として、限定はしないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０６７６】
さらに他の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを細胞透過性ポリペプチドと共有結合により共役させる。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列を含んでもよい。本発明のコンジュゲートは、高い安定性；高い細胞トランスフェクション；及び／又は改変された生体分布（例えば、特定の組織若しくは細胞型にターゲティングされる）を有するように設計することができる。
【０６７７】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及びｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、送達を促進する薬剤と共役させてもよい。非制限的例として、この薬剤は、モノマー又はポリマー、例えば、国際公開第２０１１０６２９６５号パンフレット（これは、全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りのターゲティングモノマー又はターゲティングブロックを有するポリマーであってもよい。別の非制限的例では、上記薬剤は、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと共有結合によりカップリングされた輸送剤であってもよい（例えば、米国特許第６，８３５，３９３号明細書及び同第７，３７４，７７８号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体を参照により本明細書に組み込む）。また別の非制限的例では、上記薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号明細書及び同第８，００３，１２９号明細書（これらの各々は、全体を参照により本明細書に組み込む）に記載のものなどの膜障壁輸送促進剤であってもよい。
【０６７８】
別の非制限的例では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、スマート・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（登録商標）（フェーズＲＸ（登録商標）社（ＰＨＡＳＥＲＸ  Ｉｎｃ．）、ワシントン州シアトル）共役させてもよい。
【０６７９】
別の態様では、コンジュゲートは、ナノ粒子を組織又は臓器内でニューロンに選択的に誘導するペプチドであってもよい。非制限的例として、用いられるペプチドは、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１２９６２７号明細書（これは、全体として参照
により本明細書に組み込む）に記載されているペプチドであってもよい。
【０６８０】
また別の態様では、コンジュゲートは、血液脳関門を通過するのを補助することができるペプチドであってもよい。
一実施形態では、製剤は、米国特許出願公開第２０１４０１３５３８１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の請求項１の式及び従属請求項に記載の小分子コンジュゲートを含み得る。
【０６８１】
一実施形態では、製剤は、米国特許出願公開第２０１４０１３５３８０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の請求項１の式及び従属請求項に記載の１種又は複数種のポリマー化合物を含有し得る。
【０６８２】
自己集合ナノ粒子
本発明で用いることができる自己集合ナノ粒子（核酸自己集合ナノ粒子、及びポリマーベースの自己集合ナノ粒子など）は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５８６］〜［０００５９４］に記載されている。
【０６８３】
自己集合高分子
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、送達のために両親媒性高分子（ＡＭ）に製剤化することができる。ＡＭは、ポリ（エチレングリコール）に共有結合したアルキル化糖骨格を有する生分解性両親媒性ポリマーを含む。水溶液中で、ＡＭは自己集合して、ミセルを形成する。ＡＭを形成する方法及びＡＭの非制限的例は、米国特許出願公開第２０１３０２１７７５３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６８４】
無機ナノ粒子
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、無機ナノ粒子に製剤化することができる（米国特許第８，２５７，７４５号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。無機ナノ粒子には、限定はしないが、水膨潤性の粘土物質がある。非制限的例として、無機ナノ粒子は、単純なケイ酸塩から製造される合成スメクタイト粘土を含んでもよい（例えば、米国特許第５，５８５，１０８号明細書及び同第８，２５７，７４５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６８５】
一実施形態では、無機ナノ粒子は、本明細書に開示する修飾核酸のコアとポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載するポリマーのいずれであってもよく、これらは、当技術分野において公知である。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア中の修飾核酸を保護することができる。
【０６８６】
半導電性及び金属ナノ粒子
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、半導電性若しくは金属材料を含む水分散性ナノ粒子に製剤化しても（米国特許出願公開第２０１２０２２８５６５号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）、又は磁気ナノ粒子に形成してもよい（米国特許出願公開第２０１２０２６５００１号明細書及び同第２０１２０２８３５０３号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子又は親水性ナノ粒子のいずれであってもよい。
【０６８７】
一実施形態では、半導電性及び／又は金属ナノ粒子は、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ
、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのコアと、ポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載するポリマーのいずれであってもよく、これらは、当技術分野において公知である。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア中のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを保護することができる。
【０６８８】
外科密閉剤：ゲル及びハイドロゲル
一実施形態では、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、当技術分野で公知の任意のハイドロゲルに封入してもよく、ハイドロゲルは、対象に注射するとゲルを形成し得る。ハイドロゲルは、親水性であるポリマー鎖のネットワークであり、水が分散媒であるコロイドゲルとして存在することもある。ハイドロゲルは、高度に吸収性（９９％超の水を含有し得る）の天然又は合成ポリマーである。ハイドロゲルはまた、大きな含水率のために、天然の組織に極めて類似する柔軟度も有する。本明細書に記載するハイドロゲルを用いて、生体適合性、生分解性及び／又は多孔質である脂質ナノ粒子を封入することができる。ハイドロゲルは、注射液からｉｎ
ｓｉｔｕで製造することもできるし、又は移植することもできる。本発明で用いることができるゲル及びハイドロゲルは、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００６００］〜［０００６３９］に記載されている。
【０６８９】
懸濁液製剤
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及び／若しくはｃｉｒｃＲＮＡ、不水溶性油デポー剤、界面活性剤及び／若しくは補助界面活性剤並びに／又は共溶剤を含む懸濁液製剤が提供される。油及び界面活性剤の組み合わせは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む懸濁液製剤を可能にし得る。不水溶性デポー剤中でのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡの送達を用いて、デポー剤から周囲の生理学的環境へのｍＲＮＡの持続放出により生体利用可能性を改善すると共に、ヌクレアーゼによるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ分解を阻止することができる。本発明に用いることができる懸濁液製剤は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００６４０］〜［０００６４６］に記載されている。
【０６９０】
カチオン及びアニオン
本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの製剤は、カチオン又はアニオンを含んでもよい。一実施形態では、製剤は、限定はしないが、金属カチオン、例えば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋及びこれらの組み合わせなどを含む。非制限的例として、製剤は、金属カチオンと複合体化したポリマー及びｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含んでもよい（例えば、米国特許第６，２６５，３８９号明細書及び同第６，５５５，５２５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６９１】
一部の実施形態では、二価及び一価カチオンの組み合わせを有するカチオン性ナノ粒子をｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡと一緒に製剤化することができる。こうしたナノ粒子は、所与の期間（例えば、数時間、数日など）にわたって溶液中に自然に形成され得る。こうしたナノ粒子は、二価カチオンのみの存在下、又は一価カチオンのみの存在下では形成されない。カチオン性ナノ粒子中での、又はカチオン性ナノ粒子を含む１種又は複数のデポー剤中でのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及び／若しくはｃｉｒｃＲＮＡの送達は、長時間作用デポー剤として作用する、及び／又はヌクレアーゼによる分解の速度を低下させることにより、ｃｉｒ
ｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの生体利用可能性を改善することができる。
【０６９２】
成形ナノ粒子及びマイクロ粒子
本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ナノ粒子及び／又はマイクロ粒子に製剤化することができる。これらのナノ粒子及び／又はマイクロ粒子は、任意のサイズ形状及び化学に成形することができる。一例として、ナノ粒子及び／又はマイクロ粒子は、リクィダ・テクノロジーズ（ＬＩＵＩＤＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）（登録商標）（ノースカロライナ州モリスビル）によるプリント（ＰＲＩＮＴ）（登録商標）技術を用いて製造することができる（例えば、国際公開第２００７０２４３２３号パンフレットを参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６９３】
一実施形態では、成形ナノ粒子は、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのコアと、ポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に開示の、及び当技術分野で公知のポリマーのいずれであってもよい。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア中のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを保護することができる。
【０６９４】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、マイクロ粒子に製剤化することができる。マイクロ粒子は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのコアと、生体適合性及び／若しくは生分解性ポリマーの皮質を含有し得る。非制限的例として、本発明で用いることができるマイクロ粒子は、米国特許第８，４６０，７０９号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１２９８３０号明細書及び国際公開第２０１３０７５０６８号パンフレット（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってよい。別の非制限的例として、マイクロ粒子は、所望の時間にわたって本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの放出を持続するように設計してもよい（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１２９８３０号明細書の「治療用タンパク質の徐放（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」を参照のこと；この文献は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６９５】
本発明で使用されるマイクロ粒子は、少なくとも１ミクロン〜少なくとも１００ミクロン（例えば、少なくとも１ミクロン、少なくとも５ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロン、少なくとも４０ミクロン、少なくとも４５ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも５５ミクロン、少なくとも６０ミクロン、少なくとも６５ミクロン、少なくとも７０ミクロン、少なくとも７５ミクロン、少なくとも８０ミクロン、少なくとも８５ミクロン、少なくとも９０ミクロン、少なくとも９５ミクロン、少なくとも９７ミクロン、少なくとも９９ミクロン、及び少なくとも１００ミクロン）の直径を有し得る。
【０６９６】
ナノジャケット（ＮａｎｏＪａｃｋｅｔ）及びナノリポソーム（ＮａｎｏＬｉｐｏｓｏｍｅ）
本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、キーストーンナノ（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｎａｎｏ）（ペンシルベニア州ステートカレッジ）により、ナノジャケット及びナノリポソームに製剤化することができる。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩など、体内に自然に存在する化合物から構成されるが、少量のケイ酸塩を含む場合もある。ナノジャケットは、５〜５０ｎｍの粒度であって
よく、これを用いて、親水性及び疎水性化合物、例えば、限定はしないが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することができる。
【０６９７】
ナノリポソームは、限定はしないが、体内に自然に存在する脂質などの脂質から構成される。ナノリポソームは、６０〜８０ｎｍの粒度であってよく、これを用いて、親水性及び疎水性化合物、例えば、限定はしないが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することができる。一態様では、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、セラミド・ナノリポソーム（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ＮａｎｏＬｉｐｏｓｏｍｅ）などのナノリポソームに製剤化される。
【０６９８】
プソイドビリオン（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）
一実施形態では、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、プソイドビリオン（例えば、偽ビリオン）に製剤化することができる。本発明で用いることができるプソイドビリオンは、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００６５５］〜［０００６６０］に記載されている。
【０６９９】
ミニ細胞
一態様では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを細菌ミニ細胞に製剤化することができる。非制限的例として、細菌ミニ細胞は、国際公開第２０１３０８８２５０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１７７４９９号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってよい。本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどの治療薬を含む細菌ミニ細胞を用いて、治療薬を脳腫瘍に送達することができる。
【０７００】
半固体組成物
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、疎水性マトリックスと一緒に製剤化して、半固体組成物を形成することができる。非制限的例として、半固体組成物又はペースト様組成物は、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。半固体組成物は、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの持続放出製剤であってもよい。
【０７０１】
別の実施形態では、半固体組成物は、組成物の周囲に形成される微細孔膜又は生分解性ポリマーをさらに有し得る（例えば、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０７０２】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いる半固体組成物は、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの半固体混合物の特徴（例えば、少なくとも１０−４Ｎ・ｍｍ−２の弾性率、及び／又は少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度）を有し得る。
【０７０３】
エキソソーム
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをエキソソームに製剤化してもよい。エキソソームに、少なくとも１つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰをロードして、これを細
胞、組織及び／又は生物に送達することができる。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、国際公開第２０１３０８４０００号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のエキソソームにロードしてもよい。
【０７０４】
絹を用いた送達
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、絹ベースの持続放出送達系に製剤化することができる。絹ベースの送達系は、絹フィブロイン溶液と、治療薬、例えば、限定はしないが、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを接触させることにより、形成することができる。非制限的例として、本発明で用いることができる絹ベースの持続放出送達系及びこうした系を製造する方法は、米国特許出願公開第２０１３０１７７６１１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７０５】
マイクロ粒子
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む製剤は、マイクロ粒子を含んでもよい。マイクロ粒子は、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知のポリマー、例えば、限定はしないが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸塩、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル及びポリ無水物を含んでもよい。マイクロ粒子は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどの生物活性分子を吸着する吸着性表面を有し得る。本発明で用いられるマイクロ粒子及びマイクロ粒子の製造方法の非制限的例は、米国特許出願公開第２０１３１９５９２３号明細書及び同第２０１３０１９５８９８号明細書並びに米国特許第８，３０９，１３９号明細書及び同第８，２０６，７４９号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７０６】
別の実施形態では、製剤は、マイクロ粒子とｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含むマイクロエマルションであってもよい。非制限的例として、マイクロ粒子を含むマイクロエマルションは、米国特許出願公開第２０１３１９５９２３号明細書及び同第２０１３０１９５８９８号明細書並びに米国特許第８，３０９，１３９号明細書及び同第８，２０６，７４９号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７０７】
アミノ酸脂質
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、アミノ酸脂質に製剤化することができる。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基と、１つ又は複数の親油性テイルを含む親油性化合物である。アミノ酸脂質及びアミノ酸脂質の製造方法の非制限的例は、米国特許第８，５０１，８２４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７０８】
一実施形態では、アミノ酸脂質は、親水性部分と親油性部分を有する。親水性部分は、アミノ酸残基であってよく、親油性部分は、少なくとも１つの親油性テイルを含んでよい。
【０７０９】
一実施形態では、アミノ酸脂質製剤を用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを対象に送達することができる。
別の実施形態では、アミノ酸脂質製剤は、放出可能な形態で、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することができ、この形態は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに結合して、これを放
出するアミノ酸脂質を含む。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの放出は、酸不安定性リンカー、例えば、限定はしないが、米国特許第７，０９８，０３２号明細書、同第６，８９７，１９６号明細書、同第６，４２６，０８６号明細書、同第７，１３８，３８２号明細書、同第５，５６３，２５０号明細書、及び同第５，５０５，９３１号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものなどによって提供され得る。
【０７１０】
微小小胞体
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを微小小胞体に製剤化することができる。微小小胞体の非制限的例としては、米国特許出願公開第２０１３０２０９５４４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものがある。
【０７１１】
一実施形態では、微小小胞体は、ＡＲＲＤＣ１媒介性微小小胞体（ＡＲＭＭ）である。ＡＲＭＭ及びＡＲＭＭの製造方法の非制限的例は、国際公開第２０１３１１９６０２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７１２】
高分子電解質間錯体
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを高分子電解質間錯体（ｉｎｔｅｒｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に製剤化することができる。高分子電解質間錯体は、電荷−動力学的ポリマーを１つ又は複数のアニオン分子と複合体化するとき、形成される。電荷−動力学的ポリマー及び高分子電解質間錯体並びに高分子電解質間錯体の製造方法の非制限的例は、米国特許第８，５２４，３６８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７１３】
結晶性ポリマー系
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを結晶性ポリマー系に製剤化することができる。結晶性ポリマー系は、結晶性部分及び／又は結晶性部分を含有する末端単位を含むポリマーである。結晶性部分及び／又は結晶性部分を含む末端単位を有するポリマー（「ＣＹＣポリマー」と呼ばれる）、結晶性ポリマー系及びこうしたポリマー及びポリマー系の製造方法の非制限的例は、米国特許第８，５２４，２５９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７１４】
賦形剤
医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよく、賦形剤は、本明細書で用いられるとき、所望される特定の剤形に適合するように、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤、香味剤、安定剤、抗酸化剤、容量オスモル濃度調節剤、ｐＨ調節剤などを含む。医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤及び組成物の調製方法は、当技術分野で公知である（レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著、「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）（リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルティモア、２００６年を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的作用を生み出すか、又はそうでなければ、医薬組成物のいずれかの他の成分と有害な形で相互作用するなどによって、物質若しくはその誘導体と不適合性となる場合を除いて
、従来の賦形剤媒体の使用は本開示の範囲内で考慮され得る。
【０７１５】
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％純粋であり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用及び獣医学用途について承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものであってよい。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）（ＵＳＰ）、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）（ＥＰ）、英国薬局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、及び／又は国際薬局方（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の基準を満たすものであってよい。
【０７１６】
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤としては、限定はしないが、不活性希釈剤、分散剤及び／又は造粒剤、界面活性剤及び／又は乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、バッファー、潤滑剤、及び／又は油が挙げられる。こうした賦形剤は、任意選択で、医薬組成物中に含有させることができる。組成物はさらに、カカオ脂及び座薬用ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、及び／又は芳香剤などの賦形剤を含んでもよい。
【０７１７】
例示的な希釈剤、造粒剤及び／又は分散剤、界面活性剤及び／又は乳化剤、結合剤、防腐剤、バッファー、潤滑剤、油、添加剤、カカオ脂及び座薬用ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、及び／又は芳香剤は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８２８］〜［０００８３８］に記載されている。
【０７１８】
ｍＲＮＡの凍結防止剤
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ製剤は、凍結防止剤を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、用語「凍結防止剤」は、所与の物質と組み合わせると、凍結時に起こる物質への損傷を軽減するのを助けるか、又は損傷を排除する１種又は複数種の薬剤を指す。一部の実施形態では、凍結防止剤をｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと組み合わせることにより、凍結時にこれらを安定化させる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの長期（例えば、３６ヵ月）安定性のためには、−２０℃〜−８０℃のｍＲＮＡの凍結保存が有利であると考えられる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ製剤に凍結防止剤を含有させることにより、凍結／解凍サイクルから、並びに凍結保存条件下でｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを安定化させる。本発明の凍結防止剤として、限定はしないが、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース及び／又はマンニトールが挙げられる。トレハロースは、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ものとして列記されており、商業的医薬製剤で一般的に使用されている。
【０７１９】
充填剤
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ製剤は、充填剤を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、用語「充填剤」は、製剤に所望の粘稠性を、及び／又は製剤成分の安定性を付与するために、製剤に含有させ
る１種又は複数種の薬剤を指す。一部の実施形態では、凍結乾燥したｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ製剤に充填剤を含有させることにより、「薬学的に洗練された（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｌｅｇａｎｔ）」ケークを取得し、長期（例えば、３６ヵ月）保存の間、凍結乾燥したｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを安定化させる。本発明の充填剤は、限定はしないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース及び／又はラフィノースを含んでもよい。一部の実施形態では、凍結防止剤及び充填剤の組み合わせ（例えば、スクロース／グリシン又はトレハロース／マンニトール）を含有させることにより、凍結中のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを安定化すると同時に、凍結乾燥用の充填剤を提供することができる。
【０７２０】
本発明の製剤及びｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを製剤化するための方法の非制限的例は、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３０９０６４８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７２１】
不活性成分
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ製剤は、不活性成分である少なくとも１種の賦形剤を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、用語「不活性成分」は、製剤に含有させる１種又は複数種の不活性剤を指す。一部の実施形態では、本発明の製剤に用いることができる不活性成分の全部又は一部は、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により承認されていてもよいし、いずれも承認されていなくてもよい。製剤化することができる不活性成分の非網羅的リスト及び不活性成分の投与経路は、同時係属国際公開第２０１４１５２２１１号パンフレット（代理人整理番号Ｍ０３０）の表４に記載されている。
【０７２２】
送達
本開示は、薬物送達の科学において起こり得る進歩を考慮して、任意の適切な経路による治療、製薬、診断又はイメージングのいずれかの用途のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達を包含する。送達は、裸の（ｎａｋｅｄ）送達又は製剤化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）送達であってよい。
【０７２３】
裸の送達
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、細胞に裸で送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「裸の」は、トランスフェクションを促進する薬剤を含まないｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、修飾を含まなくてもよい。裸のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、当技術分野において公知の、及び本明細書に記載される投与経路を用いて細胞に送達することができる。
【０７２４】
製剤化された送達
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載する方法を用いて製剤化してもよい。製剤は、修飾されていても及び／又は修飾されていなくてもよいｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有し得る。製剤は、限定はしないが、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体侵食性又は生体適合性ポリマー、溶媒、及び持続放出送達デポー剤をさらに含み得る。製剤化されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、当技術分野において公知の、及び本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に
送達することができる。
【０７２５】
組成物はまた、限定はしないが、直接浸漬若しくは浴（ｂａｔｈｉｎｇ）、カテーテルの使用、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／又は液滴剤、組成物を被覆若しくは含浸させた布又は生分解性材料等の支持体の使用など、当技術分野で公知の複数の方法のいずれかで臓器又は組織への直接送達のために製剤化することもできる。
【０７２６】
投与
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、治療に有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与することもできる。これらには、限定はしないが、以下に挙げるものが含まれる：腸内（腸の中へ）、胃腸、硬膜外（硬膜の中へ）、経口（口を介して）、経皮、硬膜外、脳内（脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、皮膚上（皮膚への塗布）、内皮（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚深部）、鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈の中へ）、静脈内ボーラス、静脈内持続注入、動脈内（動脈の中へ）、筋肉内（筋肉の中へ）、心臓内（心臓の中へ）、骨髄内輸液（骨髄の中へ）、髄腔内（脊柱管の中へ）、腹腔内（腹腔中への注入若しくは注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を介して）、空洞内注射（患部空洞の中へ）、腔内（陰茎基部の中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためにインタクトな皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、経膣、通気（鼻で吸う）、舌下、口唇下、浣腸、点眼剤（結膜上に）、点耳剤、耳介（耳内若しくは耳を介して）、頬（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯（１つ又は複数の歯に対して）、電気浸透、子宮頸管内、静脈洞内（ｅｎｄｏｓｉｎｕｓｉａｌ）、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質、腹部内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、滑液嚢内、軟骨内（軟骨内）、尾側内（馬尾内）、槽内（後小脳延髄槽内）、角膜内（角膜内）、歯科イントラコルナル（ｄｅｎｔａｌ  ｉｎｔｒａｃｏｒｎａｌ）、冠動脈内（冠動脈内）、体内（ｉｎｔｒａｃｏｒｐｏｒｕｓ）海綿体（陰茎海綿体の膨張性空間）、椎間板内（椎間板内）、腺管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内若しくは硬膜下）、表皮内（表皮に向けて）、食道内（食道に向けて）、胃内（胃内）、歯肉内（歯肉内）、回腸内（小腸の末端部）、病巣内（局所病巣内若しくは病巣への直接導入）、管腔内（管腔内）、リンパ管内（リンパ管内）、髄質内（骨の髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、眼球内（眼内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺若しくはその気管支内）、洞内（鼻内若しくは眼窩部副鼻腔内）、脊髄内（脊椎内）、髄液嚢内（関節の髄液腔内）、腱内（腱内）、精巣内（精巣内）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルの脳脊髄液内）、胸郭内（胸郭内）、細管内（臓器の細管内）、腫瘍内（腫瘍内）、鼓室内（中耳（ａｕｒｕｓ）内）、脈管内（１つ又は複数の脈管内）、心室内（心室内）、イオン導入（電流を用いて、可溶性塩のイオンを身体組織中に移動させる）、灌注（開放性損傷又は体腔を浸すか、若しくは洗い流す）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻を介して胃の中へ）、密封包帯法（包帯で覆い、患部を密封する局所投与）、経眼（外眼部へ）、経口咽頭（口腔及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所若しくは全身効果のために口若しくは鼻からの吸入により気道内に）、球後（橋の後ろ若しくは眼球の後ろ）、柔組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所的、経胎盤（胎盤を介して、若しくは胎盤全体に）、経気管（気管の壁を介して）、経鼓室（鼓室を介して、若しくは鼓室全体に）、尿管（尿管に向���て）、尿道（尿道に向けて）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、循環光療法又は脊髄。具体的実施形態では、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、又は他の上皮関門を通過することを可能にする方法で投与してもよい。
【０７２７】
一実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも１種の不活性成分を含んでもよい。投与経路並びに特定の投与経路のための製剤に含有させることができる不活性成分の非制限的例は、同時従属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、
全体として参照により本明細書に組み込む）の表９に示されている。
【０７２８】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの非制限的投与経路を以下に記載する。
非経口及び注射投与
非経口投与の液体剤形として、限定はしないが、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、及び／又はエリキシルが挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用されている不活性希釈剤、例えば、水若しくは他の溶媒、可溶化剤、並びに乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実、ピーナッツ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含んでもよい。不活性希釈剤以外に、経口投与組成物は、補助薬、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、香味料、及び／又は香料を含み得る。非経口投与のためのいくつかの実施形態では、クレモフォア（ＣＲＥＭＯＰＨＲ）（登録商標）などの可溶化剤、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／又はこれらの組み合わせと組成物を混合する。
【０７２９】
非経口投与用の医薬組成物は、少なくとも１種の不活性成分を含んでもよい。使用される不活性成分のいずれかは、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により承認されていてもよいし、いずれも承認されていなくてもよい。非経口投与用の医薬組成物に使用される不活性成分の非網羅的リストには、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及び水酸化ナトリウムが含まれる。
【０７３０】
注射製剤、例えば、滅菌注射水性又は油性懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤、及び／又は懸濁剤を用いて、公知の技術に従い製剤化することができる。滅菌注射製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液など、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤及び／又は溶媒中の滅菌注射液、懸濁液、及び／又はエマルションであってよい。使用することができる許容されるビヒクル及び溶媒として、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張食塩溶液がある。滅菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒として一般的に使用されている。この目的で、合成モノ−又はジグリセリドなど、任意の低刺激性不揮発性油を使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸を注射製剤の調製に使用することができる。滅菌製剤はさらに、局部麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤などの補助薬を含んでもよい。
【０７３１】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介した濾過により、及び／又は使用前に滅菌水若しくは他の滅菌注射媒体中に溶解若しくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を含有させることにより、滅菌することができる。
【０７３２】
活性成分の効果を持続させるためには、多くの場合、皮下若しくは筋肉内注射からの活性成分の吸収を緩徐にすることが望ましい。これは、難水溶性の結晶性若しくは非晶質材料の液体懸濁物の使用により、達成することができる。その場合、薬物の吸収速度は、溶解速度に応じて変動するが、溶解速度は、結晶サイズ及び結晶形態に左右され得る。あるいは、非経口投与剤形の吸収遅延は、油性ビヒクル中に薬物を溶解又は懸濁させることにより、達成される。注射デポー剤形態は、ポリアクチド−ポリグリコシドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造される。薬物とポリマーの比、及び使用する具体的ポリマーの性質によって、薬物の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）及びポ
リ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤は、身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルション中に薬物を封じ込めることにより調製される。
【０７３３】
直腸及び膣投与
直腸及び膣投与並びに対応する剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８５６］〜［０００８５９］に記載されている。
【０７３４】
経口投与
経口投与及び対応する剤形（例えば、液体剤形）は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８６０］〜［０００８６９］に記載されている。
【０７３５】
局所又は経皮投与
本明細書に記載するように、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する組成物は、局所投与及び／又は経皮投与のために製剤化することができる。皮膚は、容易に接触可能であるため、送達には理想的な部位である。遺伝子発現は、恐らく非特異的毒性を回避しながら、皮膚だけではなく、皮膚内の特定の層及び細胞型にも限定することができる。
【０７３６】
送達される組成物の皮膚発現の部位は、核酸の投与経路に左右され得る。ｃｉｒｃＲＮＡを皮膚に投与するために、一般に、次の３つの経路が考えられる：（ｉ）局所適用（例えば、局所／領域治療及び／又は美容適用）のため；（ｉｉ）皮内注射（例えば、局所／領域治療及び／又は美容適用）のため；並びに（ｉｉｉ）全身投与（例えば、皮膚及び皮膚外領域の両方に及ぶ皮膚科疾患の治療のため）。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、当技術分野で公知の複数の様々な手法で皮膚に送達することができる。ほとんどの局所送達の手法が、ＤＮＡ送達について機能することが証明されており、こうした手法として、限定はしないが、非カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体の局所適用、粒子媒介（遺伝子ガン）、穿孔媒介遺伝子トランスフェクション、並びにウイルス送達手法が挙げられる。核酸の送達後、遺伝子産物が、いくつかの異なる皮膚細胞型に検出されており、細胞型として、限定はしないが、基底角化細胞、汗腺細胞、皮膚線維芽細胞及び皮膚マクロファージが挙げられる。
【０７３７】
局所適用のための軟膏、クリーム及びゲルは、例えば、好適な増粘剤及び／又はゲル化剤及び／又は溶媒を添加した水性若しくは油性基材を用いて製剤化することができる。従って、こうした基材の非制限的例は、例えば、水及び／又は液体パラフィンなどの油、又は落花生油若しくはヒマシ油などの植物油、又はポリエチレングリコールなどの溶媒を含み得る。基材の性質に応じて、様々な増粘剤及びゲル化剤を使用することができる。こうした薬剤の非制限的例として、ワセリン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、蜜蝋、カルボキシポリメチレン及びセルロース誘導体、並びに／又はモノステアリン酸塩並びに／又は非イオン性乳化剤が挙げられる。
【０７３８】
局所投与用のローションは、水性若しくは油性基材を用いて製剤化することができ、これはまた、一般に、１種又は複数種の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤若しくは増粘剤も含有し得る。
【０７３９】
一実施形態では、本発明は、本発明の方法を好都合に及び／又は効果的に実施するため
の各種包帯（例えば、創傷包帯）又は帯具（例えば、絆創膏）を提供する。典型的には、包帯又は帯具は、ユーザが対象の様々な処置の実施を可能にするのに十分な量で、本明細書に記載する医薬組成物及び／又はｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含み得る。
【０７４０】
一実施形態では、本発明は、２回以上の注射で送達されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物を提供する。
一実施形態では、局所及び／又は経皮投与の前に、透過性を高め得る装置及び／又は溶液に、少なくとも組織、例えば、皮膚の１部を付してもよい。一実施形態では、皮膚の透過性を高めるために、剥離装置に組織を付してもよい（米国特許出願公開第２００８０２７５４６８号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の実施形態では、超音波強化装置に組織を付してもよい。超音波強化装置として、限定はしないが、米国特許出願公開第２００４０２３６２６８号明細書並びに米国特許第６，４９１，６５７号明細書及び同第６，２３４，９９０号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の装置が挙げられ得る。組織の透過性を高める方法は、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号明細書及び同第２００４０２３６２６８号明細書並びに米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７４１】
一実施形態では、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの製剤を送達する前に、組織の透過性を高めるために、装置を使用することができる。皮膚の透過性は、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって測定することができる。非制限的例として、修飾ｍＲＮＡ製剤は、米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の薬物送達方法によって送達することができる。
【０７４２】
別の非制限的例では、透過性を高め得る装置に組織を付す前、その間及び／又はその後に、局所麻酔（ＥＭＬＡ）クリームの共晶混合物で組織を処置してもよい。カッツ（Ｋａｔｚ）ら（麻酔法及び無痛法（Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ）、２００４年、第９８巻、ｐ．３７１〜７６；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）は、低エネルギーと組み合わせたＥＭＬＡクリームを使用すると、表皮の鎮痛の開始が、低エネルギー超音波による前処理から５分後という速さで認められたことを示している。
【０７４３】
一実施形態では、組織の透過性を高めるために組織を処置する前、その間及び／又はその後に、促進剤を適用してもよい。促進剤として、限定はしないが、輸送促進剤、物理的吸収促進剤、及び空洞化促進剤などがある。促進剤の非制限的例は、米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７４４】
一実施形態では、組織の透過性を高めるための特定の装置を使用した後、本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの製剤を送達することができ、この製剤は、免疫応答を誘発する物質をさらに含有してもよい。別の非制限的例では、免疫応答を誘発する物質を含有する製剤は、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号明細書及び同第２００４０２３６２６８号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により送達することができる。
【０７４５】
組成物の局所及び／又は経皮投与用の剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤及び／又はパッチが挙げられ得る。概して、活性成分は、必要に応じて薬学的に許容される賦形剤及び／又は必要な防腐剤及び／又
は緩衝剤と滅菌条件下で混合する。
【０７４６】
さらに、本発明は、経皮パッチの使用も考慮し、これは、多くの場合、身体に対する化合物の制御送達をもたらすというさらなる利点を有する。こうした剤形は、例えば、適切な媒体中に化合物を溶解及び／又は分散させることによって調製することができる。上記に代わり又はこれに加えて、律速膜の付与並びに／又はポリマーマトリックス及び／若しくはゲル中への化合物の分散のいずれかによって、速度を制御することもできる。
【０７４７】
局所投与に好適な製剤は、限定はしないが、塗布薬、ローション、水中油形及び／若しくは油中水形エマルション、例えば、クリーム、軟膏、及び／若しくはペースト、並びに／又は溶液及び／若しくは懸濁剤などの液体及び／若しくは半液体調製物を含む。
【０７４８】
局所投与可能な製剤は、例えば、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｗ）活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の固溶限界と同じくらい高くてもよい。局所投与用の製剤は、本明細書に記載する追加成分の１つ又は複数をさらに含んでもよい。
【０７４９】
局所、経真皮及び経皮投与及び対応する剤形は、例えば、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８７０］〜［０００８８８］に記載されている。
【０７５０】
デポー剤投与
本明細書に記載するように、一部の実施形態では、組成物は、持続放出のためのデポー剤に製剤化される。一般に、特定の臓器又は組織（「標的組織」）が投与のためにターゲティングされる。
【０７５１】
本発明の一部の態様では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、標的組織内又はその近傍に空間的に保持される。組成物、特に組成物の核酸成分が、標的組織内に実質的に維持される、すなわち、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９又は９９．９９％超が、標的組織内に保持される条件下で、標的組織（１つ又は複数の標的細胞を含む）と組成物を接触させることにより、哺乳動物対象の標的組織に組成物を供給する方法が提供される。１つ又は複数の標的細胞に侵入した、組成物中に存在する核酸の量を測定することにより、保持を定量するのが有利である。例えば、対象に投与した核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９又は９９．９９％超が、投与から一定期間にわたって細胞内に存在する。例えば、リボ核酸及びトランスフェクション試薬を含有する水性組成物を用いて、哺乳動物対象に対する筋肉内注射を実施した後、筋肉細胞中に存在するリボ核酸の量を測定することによって組成物の保持を定量する。
【０７５２】
本発明の態様は、組成物が、標的組織内に実質的に保持される条件下で、標的組織（１つ又は複数の標的細胞を含む）と組成物を接触させることにより、哺乳動物対象の標的組織に組成物を供給する方法に関する。組成物は、目的のポリペプチドが、少なくとも１つの標的組織内で産生されるように、有効量のｃｉｒｃＲＮＡを含有する。組成物は、一般に、細胞透過剤及び薬学的に許容される担体を含有するが、「裸」の核酸（細胞透過剤若しくは他の薬剤を含まない核酸）も考慮される。
【０７５３】
特定の状況では、組織内で細胞により産生されるタンパク質の量は増加するのが望ましい。タンパク質産生の増加は、標的組織内の細胞に空間的に限定されるのが好ましい。従
って、哺乳動物対象の組織内で目的のタンパク質の産生を増加する方法が提供される。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する組成物であって、予め決定した量の標的組織内に含まれる実質的割合の細胞において目的のポリペプチドを産生するように、組成物の単位量が決定されていることを特徴とする組成物が提供される。
【０７５４】
一部の実施形態では、組成物は、複数の異なるｃｉｒｃＲＮＡを含み、ここで、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの１つ又は２つ以上が、目的のポリペプチドをコードする。任意選択で、組成物はまた、組成物の細胞内送達を補助するための細胞透過剤も含有する。予め決定した量の標的組織内に含まれる実質的割合の細胞において目的のポリペプチドを産生する（一般に、予め決定した量に隣接するか、又は標的組織から離れた組織内で目的のポリペプチドの有意な産生を誘導することなく）のに必要な組成物の用量の決定を実施する。この決定の後、決定された用量を哺乳動物対象の組織に直接導入する。
【０７５５】
一実施形態では、本発明は、２回以上の注射又は分割用量の注射で投与されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを提供する。
一実施形態では、本発明は、小型の使い捨て薬物リザーバ、パッチポンプ又は浸透圧ポンプを用いて、標的組織付近に保持することができる。パッチポンプの非制限的例として、ＢＤ（登録商標）（ニュージャージー州フランクリンレイクス）、インスレット社（Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（マサチューセッツ州ベッドフォード）、ステディメド・セラピューティクス（ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（カリフォルニア州サンフランシスコ）、メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）（ミネソタ州ミネアポリス）（例えば、ミニメド（ＭｉｎｉＭｅｄ））、ユニライフ（ＵｎｉＬｉｆｅ）（ペンシルベニア州ヨーク）、バレリタス（Ｖａｌｅｒｉｔａｓ）（ニュージャージー州ブリッジウォータ）、並びにスプリングリーフ・セラピューティクス（ＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（マサチューセッツ州ボストン）により製造及び／又は販売されているものが挙げられる。浸透圧ポンプの非制限的例としては、デュレクト（ＤＵＲＥＣＴ）（登録商標）（カリフォルニア州クパーチノ）（例えば、デュロス（ＤＵＲＯＳ）（登録商標）及びアルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標））が挙げられる。
【０７５６】
肺内投与
医薬組成物は、口腔を介した肺内投与に好適な製剤として調製、パッケージング、及び／又は販売することができる。肺内投与及び対応する剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８９６］〜［０００９０１］に記載されている。
【０７５７】
鼻内、鼻及び口腔内投与
肺内投与に有用なものとして本明細書に記載する製剤は、医薬組成物の鼻内送達に有用である。鼻内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含む、平均粒度が約０．２μｍ〜５００μｍの粗い粉末である。こうした製剤は、鼻から吸い込む方法、すなわち、鼻の近傍に保持した粉末の容器から鼻腔を通した急速な吸入により、投与される。鼻内、鼻及び口腔内投与並びに対応する剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９０２］〜［０００９０５］に記載されている。
【０７５８】
眼及び耳介（耳性）投与
医薬組成物は、眼への及び／若しくは眼周辺の送達並びに／又は耳への送達（例えば、耳介（耳性）投与）に好適な製剤として調製、パッケージング、及び／又は販売すること
ができる。眼への及び／又は眼周辺の送達のための投与経路の非制限的例として、眼球後方、結膜、角膜内、眼球内、硝子体内、眼及び結膜下が挙げられる。眼及び耳介投与並びに対応する剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９０６］〜［０００９１２］に記載されている。
【０７５９】
ペイロード投与：検出可能な薬剤及び治療薬
本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、生物学標的に対する物質（「ペイロード」）の送達、例えば、標的の検出を目的とした検出可能な物質の送達、又は治療薬の送達が所望されるいくつかの異なるシナリオで用いることができる。検出方法は、限定はしないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ双方でのイメージング方法、例えば、免疫組織化学、生物発光イメージング（ＢＬＩ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、電子顕微鏡、Ｘ線コンピュータ断層法、ラマンイメージング、光干渉断層法、吸収イメージング、サーマルイメージング、蛍光反射イメージング、蛍光顕微鏡検査、蛍光分子トモグラフィーイメージング、核磁気共鳴イメージング、Ｘ線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、実験室アッセイ、あるいは、タグ付け／染色／イメージングが必要なあらゆる状況におけるものを含み得る。
【０７６０】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、リンカー及びペイロードの両方を任意の有用な配向で含有するように設計することができる。例えば、２つの末端を有するリンカーを用いて、一端をペイロードに、他端を核酸塩基に（例えば、デアザ−アデノシン若しくはデアザ−グアノシンのＣ−７若しくはＣ−８位又はシトシン若しくはウラシルのＮ−３若しくはＣ−５位に）結合させる。本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上のペイロード（例えば、標識及び転写阻害剤）、並びに切断可能なリンカーを含んでもよい。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸であり、ここで、切断可能なリンカーの一端は、７−デアザ−アデニンのＣ７位に結合され、リンカーの他端は、阻害剤に（例えば、シチジンの核酸塩基のＣ５位に）結合され、標識（例えば、Ｃｙ５）が、リンカーの中心に結合されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９９４，３０４号明細書の図５並びに第９及び１０列におけるＡ＊ｐＣｐ  Ｃ５  Ｐａｒｇ  Ｃａｐｌｅｓｓの化合物１を参照のこと）。コード領域への修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸の組み込み後、標識及び阻害剤（例えば、ポリメラーゼ阻害剤）に結合した切断可能なリンカーを有するポリヌクレオチドが得られる。リンカーが切断されると（例えば、切断可能なジスルフィド部分を有するリンカーを還元する還元条件により）、標識及び阻害剤が放出される。上記以外のリンカー及びペイロード（例えば、治療薬、検出可能な標識、及び細胞透過ペイロード）は、本明細書、並びに国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（代理人整理番号Ｍ３００）（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７６１】
例えば、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の再プログラミングに使用することができ、これは、クラスター中の全細胞と比較して、トランスフェクトされた細胞を直接追跡することができる。別の事例では、リンカーを介してｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに結合させることができ、しかも蛍光標識することができる薬物を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、細胞内で薬物を追跡することができる。他の例として、限定はしないが、細胞への可逆的薬物送達におけるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの使用がある。
【０７６２】
本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、特定の細胞小器官に対するペイロード（例えば、検出可能な薬剤若しくは治療薬
）の細胞内ターゲティングに使用することができる。例示的細胞内標的は、限定はしないが、進化したｍＲＮＡプロセシングのための核局在化、又は阻害剤を含有するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに連結した核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。
【０７６３】
さらに、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、例えば、生存動物における細胞若しくは組織に治療薬を送達することができる。例えば、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、癌細胞を殺傷するために高極性の化学療法薬を送達することができる。リンカーを介して治療薬に結合したｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、膜透過を促進することができ、これにより、治療薬を細胞中に移動させて、細胞内標的に到達させることができる。
【０７６４】
一例では、リンカーをリボース環の２’位並びに／又はｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの３’及び／若しくは５’位に結合させる（例えば、国際公開第２０１２０３０６８３号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。リンカーは、本明細書に開示するリンカー、当技術分野で公知のリンカー及び／又は国際公開第２０１２０３０６８３号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されるリンカーのいずれであってもよい。
【０７６５】
別の例では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、切断可能なリンカーを介してウイルス阻害ペプチド（ＶＩＰ）に結合することができる。切断可能なリンカーは、ＶＩＰ及び色素を細胞中に放出することができる。別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、リンカーを介してＡＤＰ−リボシレートに結合することができ、これは、いくつかの細菌毒素、例えば、コレラ毒素、ジフテリア毒素、及び百日咳毒素などの作用の原因となるものである。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞における標的タンパク質を改変するＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ＡＤＰ−リボシレートＧタンパク質は、小腸の内膜から大量の体液分泌を引き起こすことによりヒト細胞を改変し、これによって生命を脅かす下痢が起こる。
【０７６６】
一部の実施形態では、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法薬、又はその他の治療薬などの治療薬であってもよい。細胞毒又は細胞傷害薬は、細胞に対して有害となり得る任意の物質を含む。例として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、プロマイシン、メイタンシノイド、例えば、メイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照のこと；これは、全体として本明細書に組み込む）、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第５，５８５，４９９号明細書、及び同第５，８４６，５４５号明細書を参照のこと；これらの全ては、参照により本明細書に組み込む）、並びにそれらの類似体又は相同体。放射性イオンとして、限定はしないが、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、及びプラセオジムが挙げられる。その他の治療薬として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：抗代謝物（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロ
レタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに抗菌剤（例えば、ビスクリスチン、ビンブラスチン、タキソール及びメイタンシノイド）。
【０７６７】
一部の実施形態では、ペイロードは、検出可能な薬剤、例えば、各種有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素若しくは酵素基質、蛍光材料、発光材料（例えば、ルミノール）、生物発光材料（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン）、化学発光材料、放射性材料（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、若しくは９９ｍＴｃ（例えば、過テクネシウム酸塩（例えば、テクネシウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４−））、並びに造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、及び極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ化造影剤（イオヘキソール）、微小気泡、又はパーフルオロカーボン）であってよい。こうした任意選択で検出可能な標識として、例えば、以下のものが挙げられる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン及び誘導体（例えば、アクリジン及びアクリジンイソチオシアネート）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ）；クマリン及び誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）１２０）、及び７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）１５１））；シアニン染料；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニリンドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニル塩化物（ＤＮＳ、ダンシル塩化物）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナト（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体（例えば、エオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体（例えば、エリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体（例えば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（及び−６−）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣ又はＸＲＩＴＣ）、及びフルオレスカミン）；２−［２−［��−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール−２−イリデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホルプロピル）−１Ｈ−ベンズ［ｅ］インドリウム水酸化物、分子内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタナミン（１：１）を含む化合物（ＩＲ１４４）；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−
イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体（例えば、ピレン、酪酸ピレン、及びスクシニミジル１−ピレン）；酪酸塩量子ドット；リアクティブ・レッド（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ）４（シバクロン（ＣＩＢＡＣＲＯＮ）（商標）ブリリアント・レッド（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ）３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リッサミンローダミンＢ塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＩＣ））；リボフラビン；ロソール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）−３（Ｃｙ３）；シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；アレキサ（Ａｌｅｘａ）６４７；ラ・ホルタ・ブルー（Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；及びナフタロシアニン。
【０７６８】
一部の実施形態では、検出可能な薬剤は、検出不能の前駆物質であってもよく、これは、活性化すると、検出可能になる（例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン−ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）ＦＬ、テトラジン−オレゴン・グリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）４８８、若しくはテトラジン−ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）ＴＭＲ−Ｘ）又は酵素活性化蛍光発生剤（例えば、プロセンス（ＰＲＯＳＥＮＳＥ）（登録商標）（ビスエン・メディカル（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）））。酵素標識組成物を使用することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとして、限定はしないが、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及びウエスタンブロット分析が挙げられる。
【０７６９】
組み合わせ
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種の他の治療薬、予防薬、診断薬、又はイメージング剤と組み合わせて使用することができる。「〜と組み合わせて」によって、薬剤を同じ時間に投与すべき、及び／又は送達のために一緒に製剤化すべきであることを意味するわけではないが、こうした送達方法は本開示の範囲に含まれる。組成物は、１種又は複数種の所望の治療薬若しくは医療手順と一緒に、その前若しくはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、当該薬剤について決定された用量及び／又は時間スケジュールで投与される。一部の実施形態では、本開示は、医薬、予防薬、診断薬、又はイメージング組成物の送達であって、その生体利用可能性を改善し、その代謝を低減及び／若しくは改変し、その排出を阻害し、並びに／又はその体内分布を改変し得る薬剤と組み合わせた送達を包含する。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、癌治療又は過剰増殖性細胞の制御のための医薬剤と組み合わせて使用することができる。米国特許第７，９６４，５７１号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）では、リポポリマーと共にインターロイキン１２をコードするＤＮＡプラスミドを含む医薬組成物を使用すると共に、さらに少なくとも１種の抗癌剤又は化学療法薬も投与する、固形原発腫瘍又は転移性腫瘍の治療のための併用療法が記載されている。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、リポポリマーを含む医薬組成物の形態をしていてもよく（例えば、全体として参照により
本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１０２１８２３１号明細書を参照のこと；これは、抗増殖性分子をコードするＤＮＡプラスミドと、リポポリマーを含む医薬組成物を請求する）、この組成物は、少なくとも１種の化学療法薬又は抗癌剤と一緒に投与してもよい。（例えば、米国特許第８，５１８，９０７号明細書及び国際公開第２０１２１８７５４号パンフレットにおける「組み合わせ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」のセクションを参照のこと；これら文献の各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０７７０】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及びその医薬製剤は、単独で対象に投与してもよいし、１種又は複数種の他の治療薬、例えば、抗癌剤と併用するか、又はこれらを含有してもよい。従って、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと他の抗癌剤若しくは化学療法薬との組み合わせは、本発明の範囲内にある。こうした薬剤の例は、Ｖ．Ｔ．デビタ（Ｖ．Ｔ．Ｄｅｖｉｔａ）及びＳ．ヘルマン（Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ）（編者）による「癌の原理と腫瘍学の実践（Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、第６版、２００１年２月１５日、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）に見出すことができる。当業者は、関連する薬物及び癌の具体的な特徴に基づき、どの薬剤の組み合わせが有用であるかを認識することができよう。こうした抗癌剤として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤、レチノイド受容体調節剤、細胞傷害剤／細胞分裂抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤及び他の血管新生阻害剤、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、アポトーシス促進剤及び細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、ＨＣＣの治療に用いられる任意の治療薬、例えば、限定はしないが、ソラフェニブと組み合わせても有用となり得る。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、放射性療法と組み合わせて共投与すれば、特に有用となり得る。
【０７７１】
特定の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、以下に挙げるものなどの公知の抗癌剤と組み合わせると有用となり得る：エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤、レチノイド受容体調節剤、細胞傷害剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、及び他の血管新生阻害剤。
【０７７２】
以下：エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤、レチノイド受容体調節剤、細胞傷害剤、低酸素活性化剤、プロテアソーム阻害剤、微小管阻害剤／微小管安定化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞分裂キネシンの阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、細胞分裂進行に関与するキナーゼの阻害剤、抗増殖剤、モノクローナル抗体標的治療薬、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、血管新生を調節若しくは阻害する治療薬、細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤、細胞増殖及び生存シグナル伝達経路の阻害剤、アポトーシス促進剤、選択的ＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤ、ＣＯＸ−２の阻害剤、ＣＯＸ−２の特異的阻害剤として記載されている化合物、血管新生阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗癌化合物以外の化合物、内因性多剤耐性（ＭＤＲ）の阻害剤、吐き気若しくは嘔吐を治療する制吐薬、並びにニューロキニン−１受容体アンタゴニストの例は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９２５］〜［０００９５７］に記載されている。
【０７７３】
本発明の別の実施形態は、癌の治療のための遺伝子療法と組み合わせたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの使用である。癌治療に関する遺伝子戦略の概略については、ホール（Ｈａｌｌ）ら著（米国ヒト遺伝子療法学会誌（Ａｍ
Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ）、第６１巻、ｐ．７８５〜７８９、１９９７年）及びクフェ（Ｋｕｆｅ）ら著（癌医療（Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第５版、ｐ．８７６〜８８９、ＢＣ  デッカー（ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ）、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、２０００年）を参照されたい。遺伝子療法を用いて、任意の腫瘍抑制遺伝子を送達することができる。こうした遺伝子の例として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：組換えウイルス媒介遺伝子輸送を介して送達することができるｐ５３（例えば、米国特許第６，０６９，１３４号明細書を参照）、ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニスト（「ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニストのアデノウイルス媒介送達により、マウスにおける血管新生依存性腫瘍増殖及び播種を抑制する（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｕＰＡ／ｕＰＡＲ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ）」、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９８年８月、第５巻（８）、ｐ．１１０５〜１３）、並びにインターフェロンγ（免疫学会誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１６４巻、ｐ．２１７〜２２２、２０００年）。
【０７７４】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、ビスホスホネート（ビスホスホネート、ジホスホネート、ビスホスホン酸及びジホスホン酸を含むと理解される）と併用して、骨癌などの癌の治療又は予防にも有用であり得る。ビスホスホネートの例として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：エチドロネート（ジドロネル（Ｄｉｄｒｏｎｅｌ））、パミドロネート（アレジア（Ａｒｅｄｉａ））、アレンドロネート（フォサマックス（Ｆｏｓａｍａｘ））、リセドロネート（アクトネル（Ａｃｔｏｎｅｌ））、ゾレドロネート（ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ））、イバンドロネート（ボニバ（Ｂｏｎｉｖａ））、インカドロネート若しくはシマドロネート、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、ミノドロネート、ネリドロネート、ピリドロネート及びチルドロネート、並びにこれらのあらゆる薬学的に許容される塩、誘導体、水和物及び混合物。
【０７７５】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、貧血の治療に有用な薬剤と一緒に投与してもよい。こうした貧血治療薬は、例えば、持続性エリスロポエチン受容体活性化剤（エポエチンαなど）である。
【０７７６】
さらに、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、好中球減少症の治療に有用な薬剤と一緒に投与してもよい。こうした好中球減少症の治療薬は、例えば好中球の産生及び機能を制御する造血増殖因子、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、（Ｇ−ＣＳＦ）などである。Ｇ−ＣＳＦの例として、フィルグラスティム及びＰＥＧ−フィルグラスティムが挙げられる。
【０７７７】
さらに、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、免疫増強薬、例えば、レバミソール、イソプリノシン及びザダキシンと一緒に投与してもよい。
【０７７８】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、アロマターゼ阻害剤と併用して、乳癌の治療又は予防にも有用となり得る。アロマターゼ阻害剤の例として、限定はしないが、アナストロゾール、レトロゾール及びエキセメスタンが挙げられる。
【０７７９】
また、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、他の核酸治療薬と併用して、癌の治療又は予防にも有用となり得る。
さらに、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、γセクレターゼ阻害剤及び／又はＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤と組み合わせて、投与してもよい。こうした阻害剤として、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９６４］に記載されている化合物を含む。
【０７８０】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、ＰＡＲＰ阻害剤と併用して、癌の治療又は予防にも有用となり得る。
さらに、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９６６］に記載の治療薬と併用して、癌の治療にも有用となり得る。
【０７８１】
前述した組み合わせは、医薬製剤の形態での使用のために好都合に提供することができ、従って、薬学的に許容される希釈剤若しくは担体と一緒に前述の組み合わせを含む医薬組成物は、本発明のさらなる態様を呈示する。
【０７８２】
こうした組み合わせの個々の化合物は、個別の製剤又は併用医薬製剤として、順次又は同時に投与することができる。一実施形態では、個々の化合物は、併用医薬製剤として同時に投与される。
【０７８３】
さらに、組み合わせて使用される治療、予防、診断、若しくはイメージング活性剤が、単一組成物として一緒に投与してもよいし、又は別々の組成物として個別に投与してもよいことは理解されよう。一般に、組み合わせて使用される薬剤は、それらが個別に使用されるレベルを超えないレベルで使用されることが予想される。一部の実施形態では、組み合わせて使用されるレベルは、個別に使用されるレベルより低くなる。一実施形態では、組み合わせは、各々又は一緒に、本明細書に記載する分割投与計画に従って投与することができる。
【０７８４】
用量決定
本発明は、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及びそれらのコードされたタンパク質又は複合体をそれらが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質若しくは複合体、又はそれらの医薬、イメージング、診断、若しくは予防組成物は、疾患、障害、及び／又は病状（例えば、ワーキングメモリ障害に関する疾患、障害、及び／又は病状）を予防、治療、診断、若しくはイメージングするのに有効な任意の量及び任意の投与経路を用いて、対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢及び健康状態、疾患の重症度、具体的組成物、その投与方法、その活性様式などに応じて、対象間で変動し得る。本発明の組成物は、投与しやすさ及び投与量の均一性のために、典型的に単位用量形態で製剤化される。しかし、本発明の組成物の１日総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で担当医により決定され得ることは理解されよう。いかなる特定の患者についての具体的な治療有効用量、予防有効用量、又は適切なイメージング用量は、以下のものを含む様々な要因にも応じて変動し得る：治療対象の障害及び障害の重症度；使用する具体的な化合物の活性；使用する具体的な組成物；患者の年齢、体重、健康状態、性別及び食事；使用する具体的な化合物の投与時間、投与経路及び排出速度；治療の期間；使用する具体的な化合物と組み合わせて、若しくは同時に使用する薬物；並びに医学分野で周知の同様の要因。
【０７８５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、所望治療効果、診断効果、予防効果、又
はイメージング効果を得るために、１日に１又は複数回、１日につき対象の体重ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．００１ｍｇ〜約０．０５ｍｇ、約０．００５ｍｇ〜約０．０５ｍｇ、約０．００１ｍｇ〜約０．００５ｍｇ、約０．０５ｍｇ〜約０．５ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２５ｍｇを送達するのに十分な投与レベルで投与することができる（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３０７８１９９号パンフレットに記載される単位用量の範囲を参照のこと）。所望の用量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日置き、２日置き、毎週、２週間毎、３週間毎、又は４週間毎に投与することができる。いくつかの実施形態では、所望の用量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、又は１５回以上の投与）を用いて送達することができる。複数回投与を用いる場合、本明細書に記載のものなどの分割投与レジメンを使用することができる。
【０７８６】
本発明によれば、分割用量レジメンでのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの投与によって、哺乳動物対象において、より高レベルのタンパク質が産生されることが見出されている。本明細書で用いられるとき、「分割用量」は、１単位用量又は１日総用量の２つ以上の用量への分割、例えば、１単位用量の２回以上の投与を意味する。本明細書で用いられるとき、「１単位用量」は、１用量／１回／１経路／１接触点、すなわち１回の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。本明細書で用いられるとき、「１日総用量」は、２４時間内に投与又は処方される量である。これは、１単位用量として投与され得る。一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、分割用量で対象に投与される。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、緩衝剤のみで製剤化してもよいし、又は本明細書に記載の製剤として製剤化してもよい。
【０７８７】
剤形
本明細書に記載する医薬組成物は、本明細書に記載の剤形、例えば、局所、鼻内、気管内、又は注射可能な（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、及び皮下）剤形に製剤化することができる。
【０７８８】
液体剤形
非経口投与用の液体剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０３７］に記載されている。
【０７８９】
注射可能な剤形
注射製剤、例えば、注射用滅菌水性又は油性懸濁液は、公知の技術に従って製剤化することができ、好適な分散剤、湿潤剤、及び／又は懸濁剤を含み得る。滅菌注射製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液など、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤及び／又は溶媒中の滅菌注射溶液、懸濁液、及び／又はエマルションであってよい。使用することができる許容可能なビヒクル及び溶媒として、限定はしないが、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張食塩溶液がある。滅菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒として一般的に使用されている。この目的で、合成モノ−又はジグリセリドなど、任意の低刺激性不揮発性油を使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸を注射製剤の調製に使用することができる。
【０７９０】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介した濾過により、及び／又は使用前に滅菌水若しくは他の滅菌注射媒体中に溶解若しくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を含有させることにより、滅菌することができる。
【０７９１】
活性成分の効果を持続させるためには、皮下若しくは筋肉内注射からの活性成分の吸収を緩徐にすることが望ましいと考えられる。これは、難水溶性の結晶性若しくは非晶質材料の液体懸濁物の使用により、達成することができる。その場合、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの吸収速度は、溶解速度に応じて変動するが、溶解速度は、結晶サイズ及び結晶形態に左右され得る。あるいは、非経口投与されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの吸収遅延は、油性ビヒクル中にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを溶解若しくは懸濁させることにより、達成され得る。注射デポー剤形態は、ポリアクチド−ポリグリコシドなどの生分解性ポリマー中にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造される。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰとポリマーの比、及び使用する具体的ポリマーの性質によって、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、限定はしないが、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤は、身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルション中にｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを封じ込めることにより調製され得る。
【０７９２】
肺
送達及び投与のための肺及び鼻内製剤は、同時係属国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００７６６］〜［０００７８１］に記載されている。
【０７９３】
コーティング又はシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、及び顆粒などの固体剤形は、腸溶コーティング及び医薬製剤化の分野で公知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて、調製することができる。これらは、任意選択で、乳白剤を含んでもよく、腸管の特定の部分だけに、若しくはそこに選択的に、任意選択で遅延して、活性成分を放出する組成物から成るものでもよい。使用することができる埋没組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスがある。同様のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖、並びに高分子ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いた軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。
【０７９４】
複数回用量及び反復用量投与
一部の実施形態では、本発明の化合物及び／又は組成物は、２回以上の用量で投与することができる（本明細書では、複数回用量投与と呼ぶ）。こうした用量は、同じ成分を含んでもよいし、又は以前の用量には含有されない成分を含んでもよい。こうした用量は、以前の用量と比較して、同じ質量及び／若しくは体積の成分又は変更された質量及び／若しくは体積の成分を含んでもよい。一部の実施形態では、複数回用量投与は、反復用量投与を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、用語「反復用量投与」は、連続的に、又は実質的に同じ質量及び／若しくは体積で供給される実質的に同じ成分を含む反復用量のレジメンにおいて、投与される２回以上の用量を指す。一部の実施形態では、対象は、反復用量応答を示し得る。本明細書で用いられるとき、用語「反復用量応答」は、反復用量投与レジメンにおいて投与される別の用量とは異なる反復用量に対する対象の応答を指す。一部の実施形態では、こうした応答は、ｍＲＮＡを含む反復用量に応答するタンパク質の発現であってもよい。上記の実施形態では、タンパク質発現は、反復用量投与レジメンにおいて投与される別の用量と比較して増大し得るか、又はタンパク質発現は、反復用量投与レジメンにおいて投与される別の用量と比較して低減し得る。タンパク質発現の変化
は、約１％〜約２０％、約５％〜約５０％、約１０％〜約６０％、約２５％〜約７５％、約４０％〜約１００％及び／又は少なくとも１００％であり得る。反復用量レジメンの一環として投与されるｍＲＮＡの発現の低減で、投与ＲＮＡから翻訳されたタンパク質のレベルが、反復用量レジメンにおいて投与される別の用量と比較して４０％超の低減である場合、本明細書ではこれを「反復用量抵抗」と呼ぶ。
【０７９５】
医薬組成物の特性
本明細書に記載の医薬組成物は、以下の特性の１つ又は複数を特徴とし得る：
生体利用可能性
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載の送達剤を含む組成物に製剤化されると、本明細書に記載の送達剤がない組成物と比較して、生体利用可能性に増加を示し得る。本明細書で用いられるとき、用語「生体利用可能性」は、哺乳動物に投与される所与の量のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの全身利用可能性を指す。生体利用可能性は、哺乳動物への化合物の投与後の非変化形態の化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）又は最大血清若しくは血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定することにより、評価することができる。ＡＵＣは、横座標（Ｘ軸）に沿う時間に対して、縦座標（Ｙ軸）に沿う化合物の血清又は血漿濃度をプロットする曲線下の面積を決定したものである。一般に、特定の化合物のＡＵＣは、当業者には周知の方法、並びにＧ．Ｓ．バンカー（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ）著、現代製剤、薬物及び薬学（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第７２巻、マーセル・デッカー，ニューヨーク社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．）、１９９６年（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの方法を用いて、計算することができる。
【０７９６】
Ｃｍａｘ値は、哺乳動物への化合物の投与後に哺乳動物の血清又は血漿中で達成される化合物の最大濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者には周知の方法を用いて測定することができる。語句「生体利用可能性を増大する」、「薬物動態を改善する」は、本明細書で用いられるとき、哺乳動物におけるＡＵＣ、Ｃｍａｘ、若しくはＣｍｉｎとして測定された最初のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの全身利用可能性が、本明細書に記載の送達剤と一緒に共投与したとき、こうした共投与を実施しない場合より高いことを意味する。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの生体利用可能性は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％増大し得る。
【０７９７】
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの液体製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期がまちまちである場合があり、治療効果を達成するために用量の調節が必要となる。これに対処するため、本発明の一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ製剤は、反復投与の間に、生体利用可能性及び／又は治療効果を改善するように設計することができる。こうした製剤は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの持続放出を可能にする、並びに／又はヌクレアーゼによるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの分解率を低減することができる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ、不水溶性油性デポー剤、界面活性剤及び／又は共界面活性剤及び／又は共溶
媒を含む懸濁液が提供される。油と界面活性剤の組み合わせは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む懸濁液製剤化を可能にし得る。不水溶性デポー剤中のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達を用いて、デポー剤から周辺の生理環境へのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの持続放出により生体利用可能性を改善し、及び／又はヌクレアーゼによるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの分解を阻止することができる。
【０７９８】
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと一緒に、二価及び一価カチオンの組み合わせを含むカチオン性ナノ粒子を製剤化することができる。こうしたナノ粒子は、所与の期間（例えば、数時間、数日など）にわたって溶液中に自然に形成され得る。上記のナノ粒子は、二価カチオンのみの存在下で、又は一価カチオンのみの存在下では形成されない。カチオン性ナノ粒子中の又はカチオン性ナノ粒子を含む１種又は複数のデポー剤中でのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達は、長時間作用デポー剤として作用する、及び／又はヌクレアーゼによる分解の速度を低下させることにより、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの生体利用可能性を改善することができる。
【０７９９】
治療濃度域
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載の送達剤を含む組成物に製剤化すると、本明細書に記載の送達剤なしで投与されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物の治療濃度域と比較して、投与されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物の治療濃度域の増加を呈示し得る。本明細書で用いられるとき、「治療濃度域」は、治療効果を誘発する高い確率を有する血漿濃度の範囲、又は作用部位での治療活性物質レベルの範囲を指す。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの治療濃度域は、本明細書に記載の送達剤と一緒に共投与した場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％増加し得る。
【０８００】
分布容積
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載の送達剤を含む組成物に製剤化すると、本明細書に記載の送達剤のない組成物と比較して、改善された、例えば、減少又は標的化された分布容積（Ｖｄｉｓｔ）を呈示し得る。分布容積（Ｖｄｉｓｔ）は、体内の薬物の量を血液又は血漿中の薬物の濃度に関連させる。本明細書で用いられるとき、「分布容積」という用語は、血液又は血漿中と同じ濃度で、体内に薬物の総量を含有するのに必要な液量を指す。すなわち、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物の量／血液又は血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、１０ｍｇの容量及び１０ｍｇ／Ｌの血漿濃度の場合、分布容積は、１リットルである。分布容積は、薬物が血管外組織中に存在する度合いを表す。大きな分布容積は、血漿タンパク質結合と比較して、化合物が組織成分に結合する傾向を示している。臨床の状況では、Ｖｄｉｓｔを用いて、定常濃度を達成するためのロード用量を決定することができる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの分布容積は、本明細書に記載の送達剤と一緒に共投与した場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なく
とも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％減少し得る。
【０８０１】
生物学的効果
一実施形態では、動物に送達されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することによって分類することができる。タンパク質発現は、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを投与された動物から採取した生体サンプルの分析から定量することができる。一実施形態では、動物に投与したｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによりコードされた発現タンパク質は、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌが好ましいと考えられる。例えば、哺乳動物に送達したｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによりコードされたタンパク質の場合、５０〜２００ｐｇ／ｍｌのタンパク質発現が、動物におけるタンパク質の治療有効量とみなすことができる。
【０８０２】
質量分析法による環状ポリヌクレオチドの検出
質量分析法（ＭＳ）は、イオンへの変換後、分子に関する構造及び分子質量／濃度の情報を提供することができる分析技術である。分子をまずイオン化して、正及び負電荷を取得すると、それらは、質量分析装置を通過して、その質量／電荷（ｍ／ｚ）比に応じて、検出器の異なる箇所に到達する。ポリヌクレオチドを検出する方法は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０５５］〜［０００１０６７］に記載されている。
【０８０３】
Ｖ．本発明の環状ポリヌクレオチドの使用
好ましい実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、免疫応答及び／若しくは分解経路などの有害な生体応答の回避若しくは忌避、発現の閾値の達成及び／若しくはタンパク質産生能力の改善、発現率若しくは翻訳効率の改善、薬物若しくはタンパク質半減期及び／又はタンパク質濃度の改善、タンパク質局在化の最適化をもたらすように、また、以下：組織中での安定性及び／若しくはクリアランス、受容体取り込み及び／若しくは動態、組成物による細胞接触、翻訳機構への関与、分泌効率（適用可能であれば）、循環への進入可能性、並びに／又は細胞の状態、機能及び／若しくは活性の調節の１つ又は複数を改善するように設計される。
【０８０４】
治療薬
治療薬
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと、それらから翻訳された本明細書に記載のタンパク質は、治療薬又は予防薬として使用することができる。これらは、医療での使用のために提供される。例えば、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを対象に投与することができ、ここで、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳されて、対象において治療又は予防用ポリペプチドを産生する。ヒト及び他の哺乳動物における疾患又は病状の診断、治療若しくは予防のための組成物、方法、キット及び試薬が提供される。本発明の活性治療薬は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する細胞、又はｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰから翻訳されたポリペプチドを含む。
【０８０５】
いくつかの実施形態では、抗体依存性細胞傷害性を誘導するタンパク質と一緒に、哺乳
動物対象の免疫を増強する１種又は複数種のタンパク質をコードする翻訳可能な領域を含む１つ又は複数のｃｉｒｃＲＮＡを含有する併用治療薬が本明細書に提供される。例えば、トラスツズマブをコードする１つ又は複数の核酸と、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）とを含有する治療薬が本明細書に提供される。特に、こうした併用治療薬は、トラスツズマブに対し誘導された耐性を形成するＨｅｒ２＋乳癌患者において有用である。（例えば、アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）著、免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、第２巻（６）、ｐ．７９５〜８、２０１０年を参照のこと）。
【０８０６】
本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、細胞集団における組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が本明細書に提供される。こうした翻訳は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾を有し得るｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する有効量の組成物と接触させる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの翻訳可能な領域を含んでもよい。集団は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが、細胞集団の１つ又は複数に局在化されるような条件下で接触させる。組換えポリペプチドは、細胞においてｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰから翻訳される。
【０８０７】
組成物の「有効量」は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ（例えば、修飾ヌクレオシドのサイズ、及び範囲）の物理的特徴、並びに他の決定因子に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、細胞において効率的なタンパク質産生、好ましくは対応する非修飾核酸を含有する組成物よりも効率的な産生をもたらす。効率の増加は、細胞トランスフェクション（すなわち、核酸でトランスフェクトした細胞のパーセンテージ）の増加、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の低減（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の持続増加によって示される通りの）、又は宿主細胞の自然免疫応答の低減によって明らかにすることができる。
【０８０８】
本発明の態様は、必要とする哺乳動物対象において組換えポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳を誘導する方法に関する。この方法では、本明細書に記載する送達方法を用いて、少なくとも１つの構造的修飾又は化学修飾と、組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する組成物を有効量で対象に投与する。核酸は、核酸が、対象の細胞に局在化すると共に、組換えポリペプチドが、核酸から細胞内で翻訳されるような量及びその他の条件下で提供される。核酸が局在化される細胞、又はその細胞が存在する組織は、１ラウンド又は複数ラウンドの核酸投与によってターゲティングすることができる。
【０８０９】
一部の実施形態では、投与されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞、組織若しくは生物において実質的に存在しない機能活性を付与する１つ又は複数の組換えポリペプチドの産生を指令する。例えば、欠落している機能活性は、天然の酵素、構造、又は遺伝子調節機能であってよい。関連する実施形態では、投与されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞に存在するが、実質的に欠失している機能活性を増大する（例えば、相乗的に）１つ又は複数の組換えポリペプチドの産生を指令する。
【０８１０】
別の実施形態では、投与されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞において実質的に存在しないポリペプチド（若しくは複数のポリペプチド）に代わる１つ又は複数の組換えポリペプチドの産生を指令す
る。こうした非存在は、コード遺伝子又はその調節経路の遺伝子突然変異に起因し得る。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞内での内因性タンパク質のレベルを望ましいレベルまで増加し；このような増加は、内因性タンパク質のレベルを通常以下のレベルから通常レベルへ又は通常レベルから通常を超えるレベルに上昇させ得る。
【０８１１】
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内、細胞の表面に存在する、又は細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗する機能を果たす。通常、内因性タンパク質の活性は、例えば、改変された活性又は局在化を引き起こす内因性タンパク質の突然変異のために対象にとって有害である。さらに、組換えポリペプチドは、細胞内、細胞の表面に存在する、又は細胞から分泌される生物学的部分の活性を直接若しくは間接的に拮抗する。拮抗対象となる生物学的部分の例として、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀毒素及び破傷風毒素などのタンパク質毒素、又はボツリヌス毒素、コレラ毒素及びジフテリア毒素などの小分子毒素が挙げられる。これらに加えて、拮抗対象の生物学的部分は、細胞傷害性又は細胞増殖抑制活性などの望ましくない活性を呈示する内因性タンパク質であり得る。
【０８１２】
本明細書に記載する組換えタンパク質は、細胞内、恐らく核などの特定のコンパートメント内に局在化するように操作してもよいし、又は細胞からの分泌若しくは細胞の細胞膜への転位のために操作してもよい。
【０８１３】
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、限定はしないが、以下に挙げるうちの１つ又は複数を含む様々な疾患、障害、及び／又は病状のいずれかの治療のために使用することができる：自己免疫障害（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、慢性関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染症（例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染、真菌感染、敗血症）；神経障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性などの血管新生障害）；増殖性障害（例えば、癌、良性新生物）；呼吸器障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛、関節炎）；内分泌腺、代謝、及び栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例えば、腎臓病）；精神障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液及びリンパ系障害（例えば、貧血、血友病）など。
【０８１４】
機能不全又は異常タンパク質活性を特徴とする疾患としては、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、表皮水疱症、筋萎縮性側索硬化症、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症が挙げられる。本発明は、本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する核酸又は細胞ベースの治療薬を導入することによって対象におけるこうした病状若しくは疾患を治療する方法を提供し、ここで、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、対象の細胞に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、あるいは克服するタンパク質をコードする。機能不全タンパク質の具体的な例は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス変異体であり、これが、ＣＦＴＲタンパク質の機能不全タンパク質変異体を産生して、嚢胞性線維症を引き起こす。
【０８１５】
タンパク質活性の欠落（又は実質的に減少した、例えば、適正な（正常若しくは生理的なタンパク質機能が存在しない）を特徴とする疾患は、嚢胞性線維症、ニーマンピック病Ｃ型、βサラセミア・メジャー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ハンター症候群、及び血友病が挙げられる。こうしたタンパク質は、存在しないこともあるし、又はほぼ非機能性である。本発明は、本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、
ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する核酸又は細胞ベースの治療薬を導入することによって対象におけるこうした病状若しくは疾患を治療する方法を提供し、ここで、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、対象の標的細胞から欠落しているタンパク質活性に代わるタンパク質をコードする。機能不全タンパク質の具体的な例は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のナンセンス変異体であり、これが、ＣＦＴＲタンパク質の非機能性タンパク質変異体を産生して、嚢胞性線維症を引き起こす。
【０８１６】
このように、細胞内に有効量のＣＴＦＲポリペプチドが存在するような条件下で、機能性ＣＦＴＲポリペプチドをコードする翻訳可能な領域を有するｃｉｒｃＲＮＡと対象の細胞を接触させることにより、哺乳動物対象の嚢胞性線維症を治療する方法が提供される。好ましい標的細胞は、肺などの上皮、内皮及び中皮細胞であり、投与方法は、標的組織を考慮して決定する：すなわち、肺送達の場合には、吸入による投与のためにＲＮＡ分子を製剤化する。
【０８１７】
別の実施形態では、本発明は、対象の細胞集団に、ゲノム研究により近年特性決定されたタンパク質のソーティリン（Ｓｏｒｔｉｌｉｎ）をコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子を導入し、これによって対象の高脂血症を改善することにより、対象の高脂血症を治療する方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）膜貫通タンパク質（ソーティリンと呼ばれる）をコードする。遺伝子研究から、５人の個体のうち１人は、ＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３遺伝子座に単一のヌクレオチド多型、ｒｓ１２７４０３７４を有し、これによって個体は低レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を有する傾向が高くなることが判明した。約３０％の人に存在するマイナー対立遺伝子の各コピーは、ＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬ改変するのに対し、人口の約５％に存在するマイナー対立遺伝子の２つのコピーは、ＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ減少させる。マイナー対立遺伝子の保有者は、心筋梗塞のリスクが４０％低いこともわかっている。マウスでの機能性ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、マウス肝臓組織におけるＳＯＲＴ１の過剰発現によって、８０％減という有意に低いＬＤＬコレステロールレベルが得られたこと、並びにサイレンシングＳＯＲＴ１によって、ＬＤＬコレステロールが約２００％増加したことが記載されている（ムスヌル  Ｋ（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ  Ｋ）ら著、「１ｐ１３コレステロール遺伝子座でのＳＯＲＴ１により、非コード変異体から表現型へ（Ｆｒｏｍ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ  ｔｏ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｖｉａ  ＳＯＲＴ１  ａｔ  ｔｈｅ  １ｐ１３  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ
ｌｏｃｕｓ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６６巻、ｐ．７１４〜７２１）。
【０８１８】
別の実施形態では、本発明は、造血障害、心血管疾患、腫瘍、糖尿病、嚢胞性線維症、神経疾患、先天性代謝異常、皮膚及び全身性障害、及び盲を治療する方法を提供する。これらの特定の疾患を治療するための分子標的のアイデンティティーが、記載されている（テンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）編、遺伝子及び細胞療法：治療機序及び戦略（Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）、第３版、フロリダ州ボタ・ラトン（Ｂｏｔａ  Ｒａｔｏｎ）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８１９】
本明細書には、感染症及び／又は敗血症を発症するリスクがある対象において感染症及び／又は敗血症を予防する方法が提供され、この方法は、そうした予防が必要な対象に、感染症及び／又は敗血症を予防するのに十分な量で、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌感染ポリペプチド）をコードするｃｉｒｃＲＮＡ前駆体、又はその部分的若しくは完全にプロセシングされた形態を含む組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形
態では、感染症及び／又は敗血症を発症するリスクがある対象は、癌患者であってもよい。いくつかの実施形態では、癌患者は、前処置レジメンを受けている。一部の実施形態では、前処置レジメンは、限定はしないが、化学療法、放射線療法、又はその両方を含み得る。非制限的例として、ｃｉｒｃＲＮＡは、プロテインＣ、そのチモーゲン若しくはプレプロタンパク質、プロテインＣの活性化形態（ＡＰＣ）又は当技術分野において公知のプロテインＣの変異体をコードすることができる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、化学的に修飾した後、細胞に送達してもよい。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰによりコードされ得るポリペプチドの非制限的例は、米国特許第７，２２６，９９９号明細書；同第７，４９８，３０５号明細書；同第６，６３０，１３８号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されているものを含む。上記の特許は、プロテインＣ様分子、変異体及び誘導体を教示しており、そのいずれも、本発明の化学修飾分子内でコードされ得る。
【０８２０】
本明細書には、対象の感染症及び／又は敗血症を治療する方法がさらに提供され、この方法は、そうした治療が必要な対象に、感染症及び／又は敗血症を治療するのに十分な量で、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌感染ポリペプチド）、例えば、本明細書に記載の抗微生物ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ前駆体、又はその部分的若しくは完全にプロセシングされた形態を含む組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、治療が必要な対象は、癌患者である。いくつかの実施形態では、癌患者は、前処置レジメンを受けている。一部の実施形態では、前処置レジメンは、限定はしないが、化学療法、放射線療法、又はその両方を含み得る。
【０８２１】
いくつかの実施形態では、対象は、急性又は慢性微生物感染症（例えば、細菌感染症）を呈示し得る。いくつかの実施形態では、対象は、１つの療法を受けたことがあるか、又は受けていてもよい。いくつかの実施形態では、上記の療法は、限定はしないが、放射線療法、化学療法、ステロイド、紫外線照射、又はこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、患者は、微小血管障害に罹患していてもよい。一部の実施形態では、微小血管障害は、糖尿病であってもよい。いくつかの実施形態では、患者は、損傷を有し得る。一部の実施形態では、損傷は潰瘍であってもよい。特定の実施形態では、損傷は、糖尿病性足部潰瘍であってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、１つ又は複数の熱創傷を有し得る。いくつかの実施形態では、投与は、局所又は全身のいずれでもよい。いくつかの実施形態では、投与は、皮下であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、経口であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、局投与所であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、吸入によるものであってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、直腸投与であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、膣投与であってもよい。
【０８２２】
本開示の他の態様は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する細胞の哺乳動物対象への移植に関する。哺乳動物対象への細胞の投与は、当業者には周知であり、限定はしないが、局所移植（例えば、局所若しくは皮下投与）、臓器送達又は全身注射（例えば、静脈内注射若しくは吸入）、並びに薬学的に許容される担体への細胞の製剤化が挙げられる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有するこうした組成物は、筋肉内、経動脈、腹腔内、静脈内、鼻内、皮下、内視鏡、経皮、又は髄腔内投与のために製剤化することができる。一部の実施形態では、組成物は、持続放出のために製剤化することができる。
【０８２３】
治療薬を投与することができる対象は、疾患、障害、又は有害な病状に罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある者でよい。これらに基づき、対象を識別、診断、及び
分類する方法が提供され、こうした方法として、臨床診断、バイオマーカレベル、ゲノムレベルの結合試験（ＧＷＡＳ）、及び当技術分野で公知のその他の方法が挙げられる。
【０８２４】
創傷管理
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、創傷治療、例えば、治癒の遅延を呈示する創傷の治療に使用することができる。創傷の治療を管理するためにｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの投与を含む方法は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０８９］〜［０００１０９２］に記載されている。
【０８２５】
抗体の産生
本発明の一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０９３］〜［０００１０９５］に記載されているものなど、抗体及びそのような抗体をコードすることができる。
【０８２６】
感染症の管理
一実施形態では、抗微生物ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを投与することにより、対象において微生物感染症（例えば、細菌感染症）及び／又は微生物若しくはウイルス感染に関連する疾患、障害、若しくは病状、又はそれらの症状を治療又は予防する方法が提供される。前記の投与は、抗微生物剤（例えば、抗細菌剤）、例えば、本明細書に記載する抗微生物ポリペプチド又は小分子抗微生物化合物と組み合わせて行ってもよい。抗微生物剤として、限定はしないが、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原生動物剤、抗寄生体剤、抗プリオン剤が挙げられ、さらには、本明細書に記載のポリヌクレオチドの組成物、その送達及び使用方法は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０９６］〜［０００１１１６］に記載されている。
【０８２７】
免疫応答の調節
免疫応答の回避
本明細書に記載するように、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの有用な特徴は、細胞の自然免疫応答を低下させ、忌避又は回避する能力である。一態様では、基準化合物、例えば、本発明のｃｉｒｃＲＮＡ若しくは本発明の異なるｃｉｒｃＲＮＡに対応する線状ポリヌクレオチドによりトリガーされる応答と比較して、細胞に投与されると、宿主から低下した免疫応答をもたらすｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが本明細書で提供される。本明細書で用いられるとき、「基準化合物」は、哺乳動物に投与されると、既知の程度、レベル若しくは量の免疫刺激を有する自然免疫応答を生じる任意の分子又は物質である。基準化合物は、核酸分子である必要はないし、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰである必要もない。従って、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの免疫応答トリガーの回避、忌避又は不履行の測定は、そうした応答をトリガーすることがわかっている任意の化合物若しくは物質と比較して表すことができる。
【０８２８】
用語「自然免疫応答」は、一般にウイルス起源又は細菌起源の、外因性一本鎖核酸に対する細胞性応答を含み、これは、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出の誘導、並びに細胞死を伴う。本明細書で用いられるとき、自然免疫応答又はインターフェ
ロン応答は、１細胞レベルで作動し、サイトカイン発現、サイトカイン放出、タンパク質合成の全体的阻害、細胞ＲＮＡの全体的破壊、主要組織適合性分子の上方制御、及び／又はアポトーシス細胞死の誘導、アポトーシスに関与する遺伝子の遺伝子転写の誘導、抗増殖、並びに自然及び適応免疫細胞活性化を引き起こす。Ｉ型ＩＦＮにより誘導される遺伝子のいくつかは、ＰＫＲ、ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）、ＯＡＳ（２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ）、ＲＮａｓｅＬ、及びＭｘタンパク質を含む。ＰＫＲ及びＡＤＡＲは、それぞれ翻訳開始の阻害及びＲＮＡ編集を引き起こす。ＯＡＳは、ｄｓＲＮＡ依存性シンセターゼであり、エンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅＬを活性化して、ｓｓＲＮＡを分解させる。
【０８２９】
一部の実施形態では、自然免疫応答は、Ｉ型又はＩＩ型インターフェロンを含み、Ｉ型又はＩＩ型インターフェロンの発現は、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと接触させていない細胞からの基準と比較して、最大２倍しか増大されない。
【０８３０】
一部の実施形態では、自然免疫応答は、１つ又は複数のＩＦＮシグネチャー遺伝子の発現を含み、ここで、１つ又は複数のＩＦＮシグネチャー遺伝子の発現は、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと接触させていない細胞からの標準と比較して、最大３倍しか増大されない。
【０８３１】
特定の状況では、細胞の自然免疫応答を排除することが有利となる場合もあるが、本発明は、インターフェロンシグナル伝達を含む免疫応答を完全には排除することなく、こうした応答を実質的に低下させる（実質的に減少させる）ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ又はｃｉｒｃＲＮＡを提供する。
【０８３２】
一部の実施形態では、免疫応答は、基準化合物により誘導される免疫応答と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、又は９９．９％超低下する。免疫応答自体は、１型インターフェロンの発現若しくは活性レベル又はインターフェロンが調節する遺伝子、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）などの発現により測定することができる。自然免疫応答の低下はまた、細胞集団に１回又は複数回投与した後の細胞死減少のレベルによって測定することもでき；例えば、細胞死は、基準化合物で観察される細胞死頻度と比べて、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超少ない。さらに、細胞死が影響を及ぼし得るのは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ又はｃｉｒｃＲＮＡと接触させた細胞の５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％又は０．０１％未満である。
【０８３３】
別の実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、同じ配列を有する線状ＲＮＡ又は基準化合物よりも有意に低免疫原性である。本明細書で用いられるとき、「有意に低免疫原性である」とは、免疫原性の検出可能な減少を指す。別の実施形態では、この用語は、免疫原性の倍率減少を指す。別の実施形態では、この用語は、検出可能な免疫応答をトリガーすることなく、有効量のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを投与することができるような減少を指す。別の実施形態では、この用語は、組換えタンパク質の発現を検出可能に低減するほどの免疫応答を誘発することなく、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを繰り返し投与することを可能にするような減少を指す。別の実施形態では、この減少は、組換えタンパク質の検出可能な発現を排除するほどの免疫応答を誘発することなく、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを繰り返し投与することを可能にするような減少である。
【０８３４】
別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、その非修飾線状対応物又は標準化合物に比して２倍低免疫原性である。別の実施形態では、免疫原性は、３倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、５倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、７倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１０倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１５倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、５０倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、２００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、５００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１０００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、２０００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、別の倍率で減少する。
【０８３５】
免疫原性を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α若しくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、又はＩＬ−８）の分泌の測定、ＤＣ活性化マーカ（例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現の測定、又は適応免疫応答のアジュバントとして作用する能力の測定などがある。
【０８３６】
本明細書に教示する修飾の組み合わせを含む本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、これらを治療法としてさらに好適にする優れた特性を有し得る。
【０８３７】
当技術分野における「全か無（ａｌｌ  ｏｒ  ｎｏｎｅ）」のモデルは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの治療有用性に関連する生物学的現象を説明する上で非常に不十分であることが判明している。本発明者らは、タンパク質産生を改善するために、修飾、又は修飾の組み合わせの性質、修飾率（％）を考慮して、２つ以上のサイトカイン若しくは測定基準を調べることにより、特定のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの効力及びリスクプロフィールを決定し得ると結論付けた。
【０８３８】
本発明の一態様では、非修飾線状対応物と比較したｃｉｒｃＲＮＡの効果を決定する方法は、本発明の外性核酸の投与により発現がトリガーされる１つ又は複数のサイトカインの測定及び分析を含む。これらの値を非修飾核酸又は標準的測定基準、例えば、サイトカイン応答、ＰｏｌｙＩＣ、Ｒ−８４８若しくは当技術分野で公知の他の標準と比較する。
【０８３９】
本発明で開発される標準的測定基準の一例は、細胞、組織若しくは生物に産生されたコードされたポリペプチド（タンパク質）のレベル若しくは量と、修飾核酸（例えば、修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）の投与若しくは接触によって細胞、組織若しくは生物での発現がトリガーされたサイトカインの１つ又は複数（若しくは集団）のレベル若しくは量の比を測定することである。こうした比は、タンパク質：サイトカイン比又は「ＰＣ」比と呼ぶ。ＰＣ比が高いほど、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ（測定したタンパク質をコードするポリヌクレオチド）は有効である。本発明の好ましいＰＣ比（サイトカインによる）は、１超、１０超、１００超、１０００超、１０，０００超であってよい。
【０８４０】
ＰＣ比は、ポリヌクレオチドに存在する修飾の割合（％）によってさらに定量することができる。例えば、１００％修飾核酸に正規化して、サイトカイン（若しくはリスク）又はサイトカインプロフィールの関数としてのタンパク質産生を決定することができる。
【０８４１】
一実施形態では、本発明は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのＰＣ比を比較することにより、化学、サイトカイン又は修飾率に関して、
いずれか特定のｃｉｒｃＲＮＡの相対効力を決定する方法を提供する。
【０８４２】
様々なレベルの核酸塩基置換を含む修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを生成することができ、これらは、高いタンパク質産生と低い免疫刺激能力を維持している。天然に存在するヌクレオチド対応物に対する任意の修飾ヌクレオチドの相対的割合（％）は、ＩＶＴ反応中に変動し得る（例えば、シチジンに対して１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％の５メチルシチジン使用頻度；ウリジンに対して１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％のプソイドウリジン若しくはＮ１−メチル−プソイドウリジン使用頻度）。同じ塩基に対して２つ以上の別のヌクレオチドを用いる異なる比（例えば、異なる比のプソイドウリジンとＮ１−メチル−プソイドウリジン）を使用する修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを作製することもできる。５メチルシチジン／シチジン及びプソイドウリジン／Ｎ１−メチル−プソイドウリジン／ウリジンの比など、２以上の「塩基」位置での混合比を用いて修飾ｃｉｒｃＲＮＡを作製することもできる。改変された比の修飾ヌクレオチドを有する修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの使用は、化学修飾ヌクレオチドに対する曝露の可能性を低減する上で有益となり得る。最後に、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰへの修飾ヌクレオチドの位置的導入も可能であり、これは、タンパク質産生若しくは免疫刺激能力のいずれか又はその両方を調節する。こうしたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが、これらの改善された特性を示す能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することができ（本明細書に記載するＰＢＭＣアッセイなどのアッセイを用いて）、また、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰにコードされたタンパク質産生及び自然免疫認識のメディエータ（サイトカインなど）双方の測定によってもｉｎ  ｖｉｖｏで評価することもできる。
【０８４３】
別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと、その線状対応物の相対免疫原性は、所与の量の非修飾ヌクレオチド又は基準化合物と同じ程度まで前述の応答の１つを誘発するのに必要なｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの量を測定することにより、決定することができる。例えば、同じ応答を誘発するのに２倍のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが必要であれば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、非修飾ヌクレオチド又は基準化合物より２倍低免疫原性である。
【０８４４】
別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと、その線状対応物の相対免疫原性は、同じ量の非修飾ヌクレオチド又は基準化合物と比較して、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの投与に応答して分泌されたサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α若しくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、又はＩＬ−８）の量を測定することにより、決定される。例えば、半分の量のサイトカインが分泌されれば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、非修飾ヌクレオチド又は標準化合物より２倍低免疫原性である。別の実施形態では、前述の方法で免疫原性を計算する前に、刺激のバックグラウンドレベルを差し引く。
【０８４５】
本明細書には、さらに、細胞又は細胞集団における免疫応答のタイトレーション、低減又は排除を実施する方法も提供される。一部の実施形態では、様々な用量の同じｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと細胞を接触させた後、用量応答を評価する。一部の実施形態では、同じ若しくは異なる用量のいくつかの様々なｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと細胞を接触させて、所望の効果を生み出す最適濃度を決定する。免疫応答に関しては、所望の効果は、細胞
の免疫応答を回避、忌避又は低減することであってよい。所望の効果はまた、タンパク質産生の効率を改変することであってもよい。
【０８４６】
国際公開第２０１３００３４７５号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて免疫応答を低減するために、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを使用することができる。
【０８４７】
免疫応答の活性化：ワクチン
本発明によれば、本明細書に開示するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、１種又は複数種のワクチンをコードすることができる。本明細書で用いられるとき、「ワクチン」は、特定の疾患又は感染因子に対する免疫を改善する生物製剤である。ワクチンは、対象の組織又は細胞中に抗原を導入して、免疫応答を誘発することにより、特定の疾患又は病原体感染から対象を保護する。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、抗原をコードすることができ、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが細胞に発現されたら、所望の免疫応答が達成される。
【０８４８】
ＲＮＡをワクチンとして使用することにより、安全、実現可能性、適応可能性、及び免疫応答を生じる有効性に関して、細胞へのＤＮＡの組み込みを含む従来の遺伝子ワクチン接種の問題が解決される。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡがより容易に分解されることから、ＤＮＡワクチンより有意に安全であると考えられる。ＲＮＡ分子は、生物から迅速に排除されるため、ゲノムに組み込まれて、細胞の遺伝子発現に制御不能な様式で影響を及ぼすことはできない。また、ＲＮＡワクチンは、自己免疫疾患又は抗ＤＮＡ抗体の発生などの重度の副作用を引き起こし難い（ブリングマン  Ａ．（Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ａ．）ら著、生物医学及びバイオテクノロジー学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ
ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第２０１０巻、論文ＩＤ６２３６８７）。ＲＮＡでのトランスフェクションは、細胞の細胞質に挿入するだけでよく、これは、核への挿入よりも達成するのが容易である。しかし、ＲＮＡは、細胞の細胞質においてＲＮａｓｅ分解及びその他の自然の分解を被りやすい。ＲＮＡワクチンの安定性及び貯蔵寿命を増加するための様々な試み。フォン・デア・ムルベ（Ｖｏｎ  Ｄｅｒ  Ｍｕｌｂｅ）らは、ｍＲＮＡ分子のＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を増加することにより、ｍＲＮＡワクチン組成物の安定性を改善することを開示している。フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）らの米国特許第５５８０８５９号明細書は、ｍＲＮＡに結合して、その安定性を調節する調節タンパク質をコードするポリヌクレオチドの組み込みを教示している。特定の理論に拘束されることを意図しないが、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰワクチンは、少なくとも部分的に、構築物設計の特異性、純度及び選択性によって、安定性及び治療効果の改善を達成する。
【０８４９】
さらに、特定の修飾ヌクレオチド、若しくはその組み合わせは、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰに導入されると、自然免疫応答を活性化する。こうした活性化分子は、ポリペプチド及び／又は他のワクチンと組み合わせたとき、アジュバントとして有用である。いくつかの実施形態では、活性化分子は、ワクチンとして有用なポリペプチド配列をコードする翻訳可能な領域を含有するため、自己アジュバントとなる能力を付与する。
【０８５０】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、抗原又は感染因子に起因する疾患及び身体的障害の予防、治療及び診断に使用することができる。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも１つの目的のポリペプチド（例えば、抗体又は抗原）をコードすることができるため、これを個体に供給することにより、免疫系を刺激して病因物質から防御することができる。非制限的例として、抗原又は感染因子に結合してこれらを中和する能力を有する
１つ又は複数のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡを供給することにより、抗原又は感染因子からの生物活性及び／若しくは作用を阻害並びに／又は無効化することができる。
【０８５１】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、免疫原をコードすることができる。免疫原をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの送達により、免疫応答を活性化することができる。非制限的例として、免疫原をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを細胞に送達して、複数の自然免疫応答経路をトリガーすることができる（国際公開第２０１２００６３７７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１７７６３９号明細書を参照のこと；これらは、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の非制限的例として、本発明の免疫原をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、脊椎動物に対して免疫原性となるのに十分な用量で脊椎動物に送達することができる（国際公開第２０１２００６３７２号パンフレット及び同第２０１２００６３６９号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１３０１４９３７５号明細書及び同第２０１３０１７７６４０号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰワクチンで治療することができる感染症の非制限的リストは、以下のものを含む：ウイルス感染症、例えば、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ、Ｂ若しくはＣ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹（水痘）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱、デング熱など（フラビ（ｆｌａｖｉ）ウイルス、インフルエンザ（インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス）、出血性感染症（マールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）若しくはエボラ（Ｅｂｏｌａ）ウイルス）、細菌感染症、例えば、レジオネラ症（レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ））、胃潰瘍（ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ））、コレラ（ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染症、ブドウ球菌感染症、サルモネラ菌感染症若しくはレンサ球菌感染症、破傷風（破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、又は原生動物感染症（マラリア、睡眠病、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、すなわち、マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）及びトキソプラズマ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）を原因とする感染症）。
【０８５２】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、腫瘍抗原をコードして、癌を治療することができる。腫瘍抗原の非制限的リストは、以下に挙げるものを含む：７０７−ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、．β．−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ．α．、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１又はＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１又はＳＡＲＴ−３、ＴＥＵＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２及びＷＴ１。
【０８５３】
本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ワクチンのポリペプチド配列をコードすることができ、さらに阻害剤を含んでもよい。阻害剤は、抗原提示を低減し、及び／又は当技術分野で既知の様々な経路を阻害することができる。非制限的例として、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、抗原提示を低減することができる阻害剤と組み合わせてワクチンに使用することができる（国際公
開第２０１２０８９２２５号パンフレット及び同第２０１２０８９３３８号パンフレットを参照のこと；これの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８５４】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、自己複製ＲＮＡであってもよい。自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ送達の効率及び封入された遺伝子産物の発現を増強することができる。一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知の少なくとも１つの修飾を含んでもよい。一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡが、感染性ウイルス粒子の産生を誘導しないように設計することができる。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１１０３００２０５号明細書並びに国際公開第２０１１００５７９９号パンフレット及び同第２０１３０５５９０５号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により設計してもよい。
【０８５５】
一実施形態では、本発明の自己複製ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、免疫応答を増大し得るタンパク質をコードすることができる。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つの抗原をコードすることができる自己複製ＲＮＡであってよい（米国特許出願公開第２０１１０３００２０５号明細書、同第２０１３０１７１２４１号明細書、同２０１３０１７７６４０号明細書及び同第２０１３１７７６３９号明細書並びに国際公開第２０１１００５７９９号パンフレット、同第２０１２００６３７２号パンフレット、同第２０１２００６３７７号パンフレット、同第２０１３００６８３８号パンフレット、同第２０１３００６８４２号パンフレット、同第２０１２００６３６９号パンフレット及び同第２０１３０５５９０５号パンフレットを参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。一態様では、自己複製ＲＮＡは、大型哺乳動物において免疫応答を増大するのに十分な量で、哺乳動物に投与することができる（例えば、国際公開第２０１２００６３６９号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８５６】
一実施形態では、本発明の自己複製ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載の方法、又は当技術分野で公知の方法を用いて、製剤化することができる。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、ギール（Ｇｅａｌｌ）ら（自己増幅ＲＮＡワクチンの非ウイルス送達（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）、ＰＮＡＳ、２０１２年；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法による送達のために製剤化することができる。
【０８５７】
別の非制限的例では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ（例えば、自己複製ＲＮＡなどの免疫原をコードする核酸分子）は、ペグ化リポソーム中に実質的にカプセル化してもよい（国際公開第２０１３０３３５６３号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。また別の非制限的例では、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１３０５５９０５号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに製剤化してもよい。１つの非制限的例では、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１２００６３５９号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０１８３３５５号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、生分解性ポリマーを用いて製剤化することもできる。
【０８５８】
一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ビリオン様粒子中に製剤化してもよい。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１２００６３７６号パンフレット（これは
、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、ビリオン様粒子中に製剤化される。
【０８５９】
別の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、リポソーム中に製剤化してもよい。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１２００６７３７８号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、リポソーム中に製剤化される。一態様では、リポソームは、限定はしないが、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ、例えば、ｍＲＮＡの送達に有利となり得るｐＫａ値を有する脂質を含んでもよい。別の態様では、リポソームは、生理学的ｐＨでほぼ中性の表面電荷を有し得ることから、免疫に有効となり得る（例えば、国際公開第２０１２００６７３７８号パンフレットに記載のリポソームを参照のこと；この文献は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８６０】
また別の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、カチオン性水中油形エマルションに製剤化してもよい。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１２００６３８０号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、カチオン性水中油形エマルションに製剤化される。本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）と一緒に使用することができるカチオン性水中油形エマルションは、国際公開第２０１２００６３８０号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０８６１】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、両親媒性及び／又は免疫原性両親媒性ペプチドをコードすることができる。
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの製剤は、両親媒性及び／又は免疫原性両親媒性ペプチドをさらに含んでもよい。非制限的例として、両親媒性及び／又は免疫原性両親媒性ペプチドを含むｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、米国特許出願公開第２０１１０２５０２３７号明細書並びに国際公開第２０１０００９２７７号パンフレット及び同第２０１０００９０６５号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに製剤化することができる。
【０８６２】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、免疫刺激性であってもよい。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、プラス−センス鎖又はマイナス−センス鎖ＲＮＡウイルスゲノムの全部若しくは一部をコードすることができる（国際公開第２０１２０９２５６９号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０１７７７０１号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の非制限的例では、本発明の免疫刺激性ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知の投与用賦形剤と一緒に製剤化することができる（国際公開第２０１２０６８２９５号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０２１３８１２号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはさらに、免疫応答を促進するサイトカイン、例えば、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン若しくはケモカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６，ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＬＴ−α）、又はｈＧＨなどの増殖因子を含んでもよい。
【０８６３】
一実施形態では、本明細書に記載の方法により製剤化されるワクチンの応答は、治療効果を誘導する様々な化合物の添加により増強することができる。非制限的例として、ワク
チン製剤は、ＭＨＣＩＩ結合ペプチド又はＭＨＣＩＩ結合ペプチドと類似の配列を有するペプチドを含んでもよい（国際公開第２０１２０２７３６５号パンフレット、同第２０１１０３１２９８号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１２００７０４９３号明細書、同第２０１１０１１０９６５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の例として、ワクチン製剤は、対象におけるニコチン残基に対する抗体応答を生み出し得る修飾ニコチン化合物を含んでもよい（国際公開第２０１２０６１７１７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０１１４６７７号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８６４】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つの抗体又はその断片若しくは部分をコードすることができる。抗体は、多種多様な感染因子を阻害し、それらから防御することができる広域中和抗体であってよい。非制限的例として、感染症から対象を防御する、及び／又は疾患を治療するために、少なくとも１つの抗体又はその断片若しくは部分をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。別の非制限的例として、感染症から対象を防御する、及び／又は疾患を治療するために、広範囲の感染因子を中和することができる２種以上の抗体又はその断片若しくは部分をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。
【０８６５】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、抗体重鎖又は抗体軽鎖をコードすることができる。抗体重鎖又は抗体軽鎖をコードすることができるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの最適な割合を評価することにより、最大量の機能性抗体及び／又は所望の応答を生み出す割合を決定することができる。ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰはまた、抗体の単一ｓｃＦｖ鎖もコードすることができる。
【０８６６】
本発明によれば、１つ又は複数の広域中和抗体をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、感染ウイルスへの曝露の前に対象に投与してもよい。
一実施形態では、細胞、組織又は対象に供給される有効量のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、免疫予防に十分な量であってよい。
【０８６７】
一部の実施形態では、癌細胞特異的タンパク質をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを癌ワクチンとして製剤化することができる。非制限的例として、少なくとも１つの本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む癌ワクチンは、癌を予防するために予防的に用いることができる。ワクチンは、アジュバント及び／又は防腐剤を含んでもよい。非制限的例として、アジュバントは、スクアレンであってもよい。別の非制限的例として、防腐剤はチメロザールであってもよい。
【０８６８】
一実施形態では、本発明は、１種又は複数種の抗体、及び／又は他の抗感染試薬をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する免疫原性組成物を提供する。これらの免疫原性組成物は、アジュバント及び／又は防腐剤を含んでもよい。非制限的例として、抗体は、広域中和抗体であってもよい。
【０８６９】
別の実施形態では、本発明は、１種又は複数種の抗体、及び／又は他の抗感染試薬をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含有する抗体治療薬を提供する。
【０８７０】
一実施形態では、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物は、他の予防又は治療化合物と一緒に投与することができる。非制限的例として、予防又は治療化合物は、アジュバント又はブースタであってもよい。ワクチンなどの予防組成
物に関して、本明細書で用いられるとき、用語「ブースタ」は、予防組成物の追加投与を指す。ブースタ（又はブースタワクチン）は、これより早期の予防組成物の投与後に投与することができる。予防組成物の最初の投与からブースタ投与までの時間は、限定はしないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１年、１８ヵ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、又は９９年超であってよい。
【０８７１】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、生ワクチンの投与と同様に鼻内に投与してもよい。別の態様では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、当技術分野では公知の不活性化ワクチンの投与と同様に筋肉内又は皮内に投与してもよい。
【０８７２】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、既知若しくは未知の新興の脅威又は操作による脅威の伝染から防御する及び／又は保護することができる。
【０８７３】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、本明細書に記載の方法により製剤化することができる。製剤は、２種以上の抗体又はワクチン用のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含んでもよい。一態様では、製剤は、２種以上の疾患、障害若しくは病状に対して治療及び／又は予防効果を有し得るｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含んでもよい。非制限的例として、製剤は、抗原、抗体又はウイルスタンパク質をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含んでもよい。
【０８７４】
さらに、本発明の組成物は、様々な分野、例えば、限定はしないが、細胞内及び細胞外タンパク質、タンパク質相互作用、シグナル経路及び細胞生物学などでの研究に用いることができる。
【０８７５】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ワクチン、例えば、限定はしないが、国際公開第２０１３０９３６２９号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のモジュラーワクチンに使用することができる。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つ細胞内局在性エレメント及び少なくとも１つのＣＤヘルパーエレメントをコードする。一態様では、細胞内局在性エレメントは、細胞質ゾルからの抗原の輸出をもたらすタンパク質配列のシグナルペプチドであってもよい。別の態様では、ＣＤ４ヘルパーエレメントは、限定はしないが、Ｐ３０、ＮＥＦ、Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、ＰｆＴ３、Ｐ２ＴＴ、ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、ＨＢｓＡｇ及びＭＴであってよい（国際公開第２０１３０９３６２９号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８７６】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ＲＳＶ感染の予防若しくは治療又はＲＳＶ感染のリスクの軽減に使用することができる。バイシュ
ナウ（Ｖａｉｓｈｎａｗ）らは、米国特許出願公開第２０１３１０６５４９９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、ＲＳＶ感染を治療及び／又は予防するために、ｓｉＲＮＡを含む組成物の使用を記載している。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ＲＳＶの予防及び／又は治療を目的とする鼻内投与のために製剤化することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１６５４９９号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８７７】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、インフルエンザウイルスの感染、例えば、限定はしないが、病原性の高いトリインフルエンザウイルス（限定はしないが、Ｈ５Ｎ１サブタイプなど）感染、及びヒトインフルエンザウイルス（限定はしないが、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ３Ｎ２サブタイプなど）感染のリスクを軽減するか、又はその感染を阻害するために使用することができる。米国特許第８４７０７７１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるタンパク質配列のいずれかをコードし得る本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、インフルエンザ感染症の治療又はそのリスクの軽減に用いることができる。
【０８７８】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、寄生体に対するワクチンとして、又は寄生体により産生されるタンパク質に対する免疫応答を調節するために用いることができる。バーグマン−ライトナー（Ｂｅｒｇｍａｎｎ−Ｌｅｉｔｎｅｒ）らは、米国特許第８４７０５６０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、マラリア原虫のスポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ）に対するＤＮＡワクチンを記載している。非制限的例として、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、Ｃ３ｄのＣＲ２結合モチーフをコードすることができ、マラリア原虫のＣＳＰに対して免疫系を調節するためのワクチン又は治療薬として用いることができる。
【０８７９】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、例えば、限定はしないが、国際公開第２０１３１１２７７８号パンフレット及び同第２０１３１１２７８０号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるものなど、アルキン修飾生体分子で標識することができるウイルスを産生するために使用することができる。標識ウイルスは、ウイルスの感染力を増大させることができるため、ワクチンの製造に有益となり得る。標識ウイルスは、国際公開第２０１３１１２７７８号パンフレット及び同第２０１３１１２７８０号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるものを含む様々な方法によって生産することができる。
【０８８０】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ワクチンとして使用することができ、これはさらに、ワクチンがより高い免疫応答を誘発するのを可能にし得るアジュバントを含んでもよい。非制限的例として、アジュバントは、ヒト小児集団においてより高い免疫応答を誘発することができるサブミクロン水中油形エマルションであってよい（例えば、全体として参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２０１２００２７８１３号明細書及び米国特許第８５０６９６６号明細書に記載のアジュバント添加ワクチンを参照されたい）。
【０８８１】
別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ワクチンとして使用することができ、これはさらに、ワクチンの安定性を改善すると共に、その発現を高める５’キャップ類似体を含んでもよい。５’キャップ類似体の非制限的例は、米国特許出願公開第２０１２０１９５９１７号明細書に記載されており、その内容は、全
体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０８８２】
天然に存在する突然変異体
別の実施形態では、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１１７４］〜［０００１１７５］に記載される通りに、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを使用して、増大した生物活性、改善された患者の転帰、又は防御機能など、改善された疾患改変活性を有する天然に存在するタンパク質の変異体を発現することができる。
【０８８３】
主溝相互作用パートナー
本明細書で用いられるとき、語句「主溝相互作用パートナー」は、ヌクレオチド又は核酸の主溝面との相互作用、例えば、結合を介してＲＮＡリガンドを検出し、これに応答するＲＮＡ認識受容体を指す。従って、本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどの修飾ヌクレオチド又は核酸を含むＲＮＡリガンドは、主溝パートナーとの相互作用を低減し、これによって自然免疫応答を低減する。
【０８８４】
主溝相互作用、例えば、結合パートナーの例として、限定はしないが、以下のヌクレアーゼ及びヘリカーゼが挙げられる。膜内では、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）３、７、及び８は、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡに応答することができる。細胞質内では、ＤＥＸ（Ｄ／Ｈ）ヘリカーゼのスーパーファミリー２クラスのメンバー及びＡＴＰａｓｅが、ＲＮＡを感知して、抗ウイルス応答を開始する。これらのヘリカーゼは、ＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ）及びＭＤＡ５（メラノーマ分化関連遺伝子５）を含む。その他の例として、ラボラトリー・オブ・ジェネティクス・アンド・フィジオロジー（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）２（ＬＧＰ２）、ＨＩＮ−２００ドメイン含有タンパク質、又はヘリカーゼドメイン含有タンパク質がある。
【０８８５】
病原生物又は疾患細胞のターゲティング
本明細書には、細胞分裂抑制若しくは細胞傷害性ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、例えば、細菌、酵母、原生動物、蠕虫などの病原微生物、又は癌細胞などの疾患細胞をターゲティングする方法が提供される。一実施形態では、導入されるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、修飾ヌクレオシド又は他の核酸配列修飾を含有してもよく、これらは、標的病原生物において排他的又は優先的に翻訳されて、治療薬の起こり得るオフターゲット効果を低減する。こうした方法は、血液、精液、卵などの生体材料、並びに肺、組織、及び臓器などの移植材料に見出される病原生物を除去する、又は疾患細胞を殺傷する上で有用である。
【０８８６】
バイオプロセシング
本明細書に提供する方法は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１１７６］〜［０００１１８７］に記載される通りに、細胞培養プロセスでのタンパク質産物収率を高める上で有用となり得る。
【０８８７】
細胞
一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物、微生物、藻類及び真菌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、例えば、限定はしないが、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター又はウシ細胞などの哺乳動物細胞である。別の実施形態では、細胞は、限定はしないが、ヒーラ（ＨｅＬａ）、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＫＥＫ２９３Ｔ、ベロ（Ｖｅｒｏ）、Ｃａｃｏ、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ、Ｃ
ＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｋ５６２、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＫ、ＣＨＯ−Ｓ、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ−１、Ｈｕｈ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ−９０、ＭＣＦ−７、Ｕ−２０Ｓ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＳＦ９、ＳＦ２１又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など、樹立細胞株に由来するものでもよい。
【０８８８】
特定の実施形態では、細胞は、例えば、限定はしないが、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）細胞、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、ジクチオステリウム属（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）細胞、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）細胞、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）細胞などの真菌細胞である。
【０８８９】
特定の実施形態では、細胞は、例えば、限定はしないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はＢＬ２１細胞などの細菌細胞である。本発明の方法によりトランスフェクトされる一次及び二次細胞は、様々な組織から得ることができ、限定はしないが、培地中に維持することができるあらゆる細胞型を含む。例えば、本発明の方法によりトランスフェクトすることができる一次及び二次細胞として、限定はしないが、線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞（例えば、哺乳動物上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞及びこれらの体細胞型の前駆体が挙げられる。一次細胞はまた、同じ種又は別の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、鳥類、ヒツジ、ヤギ、ウマ）のドナーから取得することもできる。
【０８９０】
精製及び単離
当業者であれば、培養細胞から目的のタンパク質を精製又は単離するのに使用する方法を決定することができる。一般に、これは、親和性結合又は非親和性結合を用いた捕捉方法によって実施される。目的のタンパク質が培養細胞によって分泌されない場合には、精製又は単離の前に、培養細胞の溶解を実施すべきである。細胞培養基成分、並びに本明細書に記載する消泡剤及びその他の栄養素及び補充物などの細胞培養添加剤、細胞、細胞残屑、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルスなどと一緒に、目的のタンパク質を含有する非清澄化細胞培養液を使用することができる。このプロセスは、バイオリアクター自体において実施してもよい。培養液は、ｐＨ、温度若しくはその他の刺激特性などの所望の刺激に対して前処置するか、又はポリマーの添加の際に順化させてもよく、あるいは、培養液にポリマーを溶解させるのに必要な刺激条件について要求されるパラメータに対して適正に順化させた担体液体に、ポリマーを添加することができる。培養液と一緒にポリマーを完全に循環させた後、刺激（ｐＨ、温度、塩濃度などの変化）を加えてから、所望のタンパク質及びポリマー沈殿物を溶液から取り出すことができる。ポリマー及び所望のタンパク質を残りの培養液から分離した後、任意選択で１回又は複数回洗浄することにより、捕捉された混入物、又は緩く結合した混入物を除去することができる。次に、例えば、溶離などによって、所望のタンパク質をポリマーから回収することができる。溶離は、ポリマーが、その沈殿した形態を保持すると共に、所望のタンパク質の選択された溶離の工程中にその不純物を全て保持するような一連の条件下で実施するのが好ましい。ポリマー及びタンパク質並びにいずれかの不純物は、水又は緩衝溶液などの新しい液体に溶解させてもよく、ポリマー又は不純物に対してタンパク質への優先及び選択性を有するアフィニティ、イオン交換、疎水性、又は他のタイプのクロマトグラフィーなどの手段によりポリマーを回収することができる。溶離されたタンパク質を回収した後、必要に応じて、バッチ様ステップ又は連続フロースルーステップいずれかの追加処理ステップに付してもよい。
【０８９１】
別の実施形態では、細胞株又は候補細胞株の集団における特定のポリペプチド、特に、既知の活性を有する標準タンパク質のタンパク質変異体などのポリペプチドの発現を最適化するのが有用となり得る。一実施形態では、複数の標的細胞型を用意し、複数の標的細胞型の各々と、ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡを独立に接触させることにより、標的細胞において目的のポリペプチドの発現を最適化する方法が提供される。さらに、タンパク質産生効率を高めるために、培養条件を改変してもよい。続いて、複数の標的細胞型中の目的のポリペプチドの存在及び／又はレベルを検出及び／又は定量することによって、効率的な標的細胞及びそれに関する細胞培養条件の選択により、目的とするポリペプチドの発現の最適化を可能にする。こうした方法は、目的のポリペプチドが、１つ又は複数の翻訳後修飾を含むか、又は実質的な三次構造（往々にして効率的なタンパク質産生を困難にする）を有する場合に有用となり得る。
【０８９２】
タンパク質回収
目的のタンパク質は、好ましくは分泌ポリペプチドとして培地から回収するか、又は分泌シグナルなしで発現される場合には、宿主細胞溶解物から回収することができる。目的のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られるように、他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質から目的のタンパク質を精製することが必要な場合もある。培地又は溶解物から細胞及び／若しくは粒状細胞残屑を除去してもよい。次に、例えば、免疫アフィニティ若しくはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＬＰＣ）、セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）（登録商標）クロマトグラフィー、シリカ若しくはカチオン交換樹脂（ＤＥＡＥなど）でのクロマトグラフィーによって、混入物の可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から目的の産物を精製することができる。宿主細胞により発現された異種タンパク質を精製する方法は、当技術分野において公知である。
【０８９３】
本明細書に記載する方法及び組成物を用いて、内因性アゴニスト生体応答を減弱又は阻止する、及び／又は哺乳動物対象における受容体若しくはシグナル伝達分子に拮抗することができるタンパク質を生産することができる。例えば、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−２３受容体シグナル伝達は、例えば、多発性硬化症などの慢性自己免疫障害並びに慢性関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、強直性脊椎炎及びクローン病などの炎症性疾患において増強され得る（キクリー  Ｋ（Ｋｉｋｌｙ  Ｋ）、リュウ  Ｌ（Ｌｉｕ  Ｌ）、ナ  Ｓ（Ｎａ  Ｓ）、セジウィック  ＪＤ（Ｓｅｄｇｗｉｃｈ  ＪＤ）著、２００６年、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１８巻（６）、ｐ．６７０〜５）。別の実施形態では、核酸は、ケモカイン受容体のアンタゴニストをコードする。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４及びＣＣＲ−５は、宿主細胞へのＨＩＶ侵入に必要である（アレンザナ−セイスデドス  Ｆ（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｄｅｄｏｓ  Ｆ）ら著、１９９６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１０月３日、第３８３巻（６５９９）、ｐ．４００）。
【０８９４】
遺伝子サイレンシング
本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、細胞集団における１つ又は複数の標的遺伝子の発現をサイレンシングする（すなわち、阻止又は実質的に低減する）上で有用である。配列特異的ヒストンＨ３メチル化を指令することができる目的のポリペプチドをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、ポリペプチドが翻訳されるような条件下で集団中の細胞に導入されると、ヒストンＨ３メチル化及び続くヘテロクロマチン形成によって標的遺伝子の遺伝子転写を低減する。一部の実施形態では、サイレンシング機構は、哺乳動物対象に存在する細胞集団に対して実施する。非制限的例として、有用な標的遺伝子は、突然変異したヤヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ  Ｋｉｎａｓｅ）２ファミリーメンバーであり、この場合、哺乳動物対象は、突然変異標的遺伝子を発現すると、異常なキナーゼ活性によって骨髄増殖性疾患に罹患する。
【０８９５】
ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰとＲＮＡｉ薬剤の共投与もまた本明細書に提供される。
生物学的経路の調節
細胞に導入されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの急速な翻訳は、標的生物学的経路を調節する望ましい機構をもたらす。こうした方法調節は、所与の経路の拮抗作用及び活性化作用を含む。一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが細胞中に局在化され、ポリペプチドが、細胞においてｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰから翻訳され得るような条件下で、目的のポリペプチドをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む有効量の組成物と、細胞を接触させることにより、細胞における生物学的経路に拮抗する方法が提供され、ここで、ポリペプチドは、生物学的経路で機能性のポリペプチドの活性を阻害する。生物学的経路の例として、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、強直性脊椎炎、若しくはクローン病などの自己免疫障害又は炎症性障害において欠損するものがあり；とりわけ、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３シグナル伝達経路の拮抗作用は、特に有用である。（キクリー  Ｋ（Ｋｉｋｌｙ  Ｋ）、リュウ  Ｌ（Ｌｉｕ  Ｌ）、ナ  Ｓ（Ｎａ  Ｓ）、セジウィック  ＪＤ（Ｓｅｄｇｗｉｃｈ  ＪＤ）著、２００６年、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１８巻（６）、ｐ．６７０〜５を参照のこと）。
【０８９６】
さらに、ケモカイン受容体に対するアンタゴニストをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供され；ケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４及びＣＣＲ−５は、例えば、宿主細胞へのＨＩＶ侵入に必要である。（アレンザナ−セイスデドス  Ｆ（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｄｅｄｏｓ  Ｆ）ら著、１９９６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１０月３日、第３８３巻（６５９９）、ｐ．４００）。
【０８９７】
あるいは、核酸が細胞中に局在化され、組換えポリペプチドが、組換えポリペプチドが細胞において核酸から翻訳され得ると共に、組換えポリペプチドが、生物学的経路において機能性のポリペプチドの活性を誘導するような条件下で、組換えポリペプチドをコードする有効量のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと、細胞を接触させることにより、細胞における生物学的経路を活性化する方法が提供される。活性化される生物学的経路の例として、細胞運命決定を調節する経路がある。こうした活性化は、可逆的、又はそうでなければ、不可逆的である。
【０８９８】
細胞表面でのリガンド又は受容体の発現
本明細書に記載する態様の一部の態様及び実施形態では、本明細書に記載のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、細胞の表面にリガンド又はリガンド受容体（例えば、ホーミング部分）を発現させることができる。細胞表面に結合したリガンド又はリガンド受容体部分は、細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織又は物質との所望の生物学的相互作用を達成することを可能にする。リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質若しくはポリペプチド、受容体、例えば、細胞表面受容体、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療薬、薬物、グリコサミノグリカン、又はこれらの任意の組み合わせであってよい。例えば、リガンドは、抗体であってよく、これは、癌細胞特異的抗原を認識して、細胞が腫瘍細胞と優先的に相互作用できるようにし、これによって修飾細胞の腫瘍特異的局在化を可能にする。好ましいリガンドは、治療対象の組織の外側面上の標的分子と相互作用することができるため、リガンドは、細胞組成物が治療対象の組織に蓄積する能力を付与し得る。他の組織に対して限定された架橋反応性を有するリガンドが一般に好ましい。
【０８９９】
ある事例では、リガンドは、細胞が、特定の組織をターゲティングする、又は特定のリ
ガンドと相互作用することを可能にするホーミング部分として作用することができる。こうしたホーミング部分として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：特異的結合ペアの任意のメンバー、抗体、モノクローナル抗体、又はその誘導体若しくは類似体、例えば、限定なしで、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体及び抗体断片、ヒト化抗体及び抗体断片、並びに上記の多価形態；多価結合試薬、例えば、限定なしで、単一特異的若しくは二重特異的抗体断片、例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ＳＣＦＶ）２断片）、ダイアボディ、トリボディ若しくはテトラボディ（これらは、典型的に、共有結合した、あるいは、安定化した（すなわち、ロイシンジッパー若しくはヘリックス安定化）ｓｃＦＶ断片；並びに他のホーミング部分として、例えば、アプタマー、受容体、及び融合タンパク質がある。
【０９００】
一部の実施形態では、ホーミング部分は、表面結合抗体であってもよく、これは、細胞ターゲティング特異性の調整を可能にする。高度に特異的な抗体は、所望のターゲティング部位の目的のエピトープに対して増強され得ることから、ホーミング部分は、特に有用である。一部の実施形態では、複数の抗体を細胞の表面に発現させると、各抗体は、所望の標的に対して異なる特異性を持つことができる。こうした手法は、ホーミング相互作用の結合活性及び特異性を高めることができる。
【０９０１】
当業者は、細胞の要望される局在化又は機能に基づいて、任意のホーミング部分を選択することができ、例えば、タモキシフェンなどのエストロゲン受容体は、細胞表面に多数のエストロゲン受容体を有するエストロゲン依存性乳癌細胞に対して細胞をターゲティングすることができる。リガンド／受容体相互作用の他の非制限的例として、以下のものが挙げられる：ＣＣＲＩ（例えば、慢性関節リウマチにおける炎症関節組織若しくは脳、及び／又は多発性硬化症の治療のため）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織へのターゲティング）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸組織にターゲティングするため）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚にターゲティングするため）、ＣＸＣＲ４（例えば、遊出の全般的増強のため）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症及び／又は炎症性障害、骨髄の治療のため）、α４β７（例えば、腸粘膜ターゲティングのため）、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１（例えば、内皮へのターゲティング）。一般に、本明細書に記載する方法及び組成物で使用するために、ターゲティング（例えば、癌転移）に関与する任意の受容体を利用することができる。
【０９０２】
幹細胞
本発明の一部の実施形態では、細胞運命の改変に関連する因子、例えば、限定はしないが、細胞表現型改変因子、分化転換因子、分化因子及び脱分化因子をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを使用して、細胞表現型を改変することができ、これは、パーソナル再生医療、細胞療法及び他の疾患の療法の分野において有用である。
【０９０３】
目的のタンパク質を発現させる、又は細胞を異なる細胞表現型に変えるための細胞の表現型の改変は、様々な臨床、治療及び研究環境において使用されている。細胞の表現型の改変は、現在、ＤＮＡ又はウイルスベクターからタンパク質を発現させることによって達成される。
【０９０４】
現在、パーキンソン病及び糖尿病並びに脊髄損傷などの傷害などの様々な疾患の治療の選択肢として、ヒト胚幹細胞の使用を評価する研究がなされている。胚幹細胞は、多能性を維持しながら無期限に成長する能力を有する。しかし、ヒト胚の使用に関しては、患者へのヒト胚幹細胞の移植後に起こる組織拒絶の問題に加えて、倫理的問題が存在する。
【０９０５】
これらの倫理的課題及び拒絶の課題を回避するために、患者自身の細胞を用いて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製することができる。ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２（あるいは、集合的にＫＭＯＳ）とも呼ばれる）を発現するウイルスベクターを用いて、タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）及びヤマナカ（Ｙａｍａｎａｋａ）（細胞（Ｃｅｌｌ）、２００６年、第１２６巻（４）、ｐ．６６３〜７６；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）によりｉＰＳＣの誘導が達成された。また、切除可能なレンチウイルス及びトランスポゾンベクター、一過性プラスミド、エピソーム及びアデノウイルスベクターの反復適用を用いて、ｉＰＳＣを誘導することとも試みられている（チャン，Ｃ．−Ｗ．（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．−Ｗ．）ら著、幹細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）、２００９年、第２７巻（５）、ｐ．１０４２〜１０４９；カジ，Ｋ．（Ｋａｊｉ，Ｋ．）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００９年、第４５８巻（７２３９）、ｐ．７７１〜５；オキタ，Ｋ．（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３２２巻（５９０３）、ｐ．９４９〜５３；スタッドフェルド，Ｍ．（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３２２巻（５９０３）、ｐ．９４５〜９；ウォルトジェン，Ｋ．）ら著、（Ｗｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００９年；ユー，Ｊ．（Ｙｕ，Ｊ．）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００９年：１１７２４８２；フサキ，Ｎ．（Ｆｕｓａｋｉ，Ｎ．）ら著、日本学士院Ｓｅｒ．Ｂ．物理及び生物学科学（Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ）、２００９年、第８５巻（８）、ｐ．３４８〜６２；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ヒトｉＰＳＣを作製するためのＤＮＡを用いない方法もまた、細胞透過性ペプチド部分を組み込む組換えタンパク質での連続的タンパク質導入を用いて（キム，Ｄ．（Ｋｉｍ，Ｄ．）ら著、セル・ステム・セル（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）、２００９年、第４巻（６）、ｐ．４７２〜４７６；チョウ，Ｈ．（Ｚｈｏｕ，Ｈ．）ら著、セル・ステム・セル（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）、２００９年、第４巻（５）、ｐ．３８１〜４；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）、並びに、センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスを用いた感染性トランスジーン送達により（フサキ，Ｎ．（Ｆｕｓａｋｉ，Ｎ．）ら著、日本学士院Ｓｅｒ．Ｂ．物理及び生物学科学（Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ）、２００９年、第８５巻（８）、ｐ．３４８〜６２；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）見出されている。
【０９０６】
しかし、ｉＰＳＣの臨床適用は、ｉＰＳＣを誘導する効率の低さ及び細胞の細胞表現型の改変のために、ゲノムを修飾する必要があることによって制限される。本発明は、以下：組織中での安定性及び／若しくはクリアランス、受容体取り込み及び／又は動態、組成物による細胞接触、翻訳機構への関与、ｍＲＮＡ半減期、翻訳効率、免疫回避、タンパク質生産能力、分泌効率（適用可能であれば）、循環への進入可能性、タンパク質半減期並びに／又は細胞の状態、機能及び／若しくは活性の調節のうち１つ又は複数を改善するように設計された目的の細胞表現型改変タンパク質をコードする細胞表現型改変ｃｉｒｃＲＮＡを提供する。
【０９０７】
本発明によれば、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、当技術分野の他のポリペプチドコード分子の欠失を回避するように修飾することもできる。
別の態様では、本開示は、ヌクレオチドの糖部分に位置する化学修飾を提供する。
【０９０８】
別の態様では、本開示は、細胞表現型改変ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのリン酸骨格に位置する化学修飾を提供する。
別の態様では、本開示は、化学修飾を含有し得る細胞表現型改変ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを提供し、ここで、細胞表現型改変ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、対応する非修飾核酸により誘導された細胞自然免疫と比較して、細胞自然免疫応答を低減する。
【０９０９】
別の態様では、本開示は、本発明に記載する通りの化合物を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、反応混合物である。一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物である。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養物である。一部の実施形態では、組成物はさらに、ＲＮＡポリメラーゼ及びｃＤＮＡ鋳型を含む。一部の実施形態では、組成物はさらに、アデノシン、シトシン、グアノシン、及びウラシルからなる群から選択されるヌクレオチドを含む。
【０９１０】
さらに別の態様では、本開示は、生理的に活性の分泌タンパク質を含む医薬製剤を製造する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の方法により製造した医薬核酸で、第１集団のヒト細胞をトランスフェクトするステップを含み、ここで、分泌タンパク質は、第２集団のヒト細胞に対して活性である。
【０９１１】
一部の実施形態では、分泌タンパク質は、第２集団に存在する少なくとも１つの細胞の表面上の受容体と相互作用することができる。分泌タンパク質の非制限的例として、ＯＣＴ４などのＯＣＴ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５及びＳＯＸ１８などのＳＯＸ、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４及びＫＬＦ５などのＫＬＦ、ＮＲ５Ａ２、ｃ−ＭＹＣ及びｎ−ＭＹＣなどのＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ及びＬＩＮ２８が挙げられる。
【０９１２】
一部の実施形態では、第２集団は、分泌タンパク質の受容体を発現する骨髄芽球を含有する。
いくつかの実施形態では、体細胞から人工多能性幹細胞を生産するのに用いることができる、１つ又は複数の細胞表現型改変タンパク質をコードする翻訳可能な領域を含有する１つ又は複数の細胞表現型改変細胞表現型改変ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む併用治療薬が提供される。
【０９１３】
細胞株の修飾
標的哺乳動物細胞の細胞運命に改変を導入する方法が提供される。標的哺乳動物細胞は、前駆細胞であってもよく、改変は、細胞株中への分化の駆動、又はこうした分化の阻止を含み得る。あるいは、標的哺乳動物細胞は、分化細胞であってもよく、細胞運命改変は、多能性前駆細胞中への脱分化の駆動、又はこうした脱分化の阻止、例えば、癌幹細胞中への癌細胞の脱分化などを含む。細胞運命の変化が要望される状況では、細胞運命の改変が誘導される条件下で、細胞運命誘導性ポリペプチドをコードする有効量のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを標的細胞に導入する。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、細胞の亜集団を第１表現型から第２表現型へと再プログラムする上で有用である。こうした再プログラムは、一過性又は永久的のいずれであってもよい。任意選択で、再プログラムは、標的細胞を誘導して、中間表現型を採用させる。
【０９１４】
さらに、本発明の方法は、高い効率のトランスフェクション、細胞を再トランスフェクトする能力、及び標的細胞に産生される組換えポリペプチドの量の維持可能性によって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製する上で特に有用である。さらに、本明細書に記載の方法を用いて作製したｉＰＳＣの使用は、奇形腫形成の発生率を低下させると予想される。
【０９１５】
また、標的細胞集団における細胞分化を抑制する方法も提供される。例えば、ポリペプチドが翻訳されて、前駆細胞の分化を抑制するような条件下で、ポリペプチドをコードする有効量のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む組成物と、１つ又は複数の前駆細胞型を含有する標的細胞集団を接触させる。非制限的実施形態では、標
的細胞集団は、哺乳動物対象の損傷組織又は外科手術の影響を受けた組織を含有する。前駆細胞は、例えば、間質前駆細胞、神経前駆細胞、又は間葉系前駆細胞である。
【０９１６】
特定の実施形態では、１つ又は複数の分化因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ４をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが提供される。これらのｃｉｒｃＲＮＡ生成因子は、線維芽細胞に導入されて、心筋細胞への再プログラムを駆動する。こうした再プログラムは、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ含有パッチ又は他の材料と損傷心臓組織を接触させて、心臓の再生を促進することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。こうしたプロセスは、線維症とは反対に、心筋発生を促進する。
【０９１７】
細胞死の媒介
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、細胞（例えば、癌細胞）にアポトーシスを誘導することができる。一態様では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを用いて、細胞死受容体、細胞死受容体リガンド又はその組み合わせの発現を誘導することができる。この方法を使用して、任意の所望する細胞に細胞死を誘導することができ、この方法は、細胞が、自然のアポトーシスシグナルから逃避する癌の治療に特に有用性がある。
【０９１８】
アポトーシスは、複数の独立したシグナル伝達経路により誘導され得るが、これらの経路は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体／リガンドスーパーファミリーに属するいくつかの「細胞死受容体」とそれらのリガンドとの様々な相互作用からなる最終エフェクター機構に集中する。最もよく特性決定されている細胞死受容体は、ＣＤ９５（「Ｆａｓ」）、ＴＮＦＲＩ（ｐ５５）、細胞死受容体３（ＤＲ３又はＡｐｏ３／ＴＲＡＭＯ）、ＤＲ４及びＤＲ５（ａｐｏ２−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）である。アポトーシスの最終エフェクター機構は、カスパーゼと称される一連のプロテイナーゼの活性化であると考えられる。これらのカスパーゼの活性化によって、一連の重要な細胞タンパク質の切断及び細胞死が起こる。細胞死受容体／リガンド誘導細胞死の分子機構は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介アポトーシスは、３つのＦａｓＬ分子が結合して、Ｃ末端細胞死ドメイン（ＤＤ）を介したＦａｓ受容体の三量体化を誘導し、次にこれが、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（細胞死ドメインを含むＦａｓ結合タンパク質）及びカスパーゼ−８をリクルートすることによって、誘導される。この３分子複合体、Ｆａｓ／ＦＡＩＤＤ／カスパーゼ−８のオリゴマー化によって、プロ酵素カスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８へのタンパク質分解切断が起こり、これが今度は、タンパク質分解により他の下流カスパーゼ（カスパーゼ−３など）を活性化することにより、アポトーシスプロセスを開始する。細胞死リガンドは概して、三量体又はより高次の構造に形成されると、アポトーシス促進性となる。単量体の場合、これらは、細胞死受容体との結合について、三量体と競合することにより、抗アポトーシス因子として役立ち得る。
【０９１９】
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物は、細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＭＯ、ＴＮＦＲ、ＴＬＲなど）をコードする。ｃｉｒｃＲＮＡのトランスフェクションによる細胞死受容体を発現させるようにした細胞は、この受容体を活性化するリガンドにより誘導される細胞死に対して感受性になる。同様に、例えば、細胞表面で、細胞死リガンドを発現させるようにした細胞は、トランスフェクトした細胞が標的細胞に接触すると、受容体を有する細胞の死を誘導することになる。別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物は、細胞死受容体（例えば、ＦａｓＬ、ＴＮＦなど）をコードする。別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物は、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ９など）をコードする。癌細胞が、非増殖性又は制御された増殖形態へと適正な分化の不履行を往々にして呈示する場合、別の実施
形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物は、細胞死受容体及びその適切な活性化リガンドの両方をコードする。別の実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ組成物は、分化因子をコードし、これは、癌幹細胞などの癌細胞で発現されると、その細胞を誘導して、非病原性若しくは非自己再生表現型（例えば、低下した細胞増殖速度、抑制された細胞分裂など）に分化させるか、又は細胞を誘導して、休眠細胞期（例えば、Ｇ０静止期）に入らせる。
【０９２０】
当業者であれば、アポトーシス誘導技術の使用には、不要な広範囲の細胞死を防ぐために、例えば、腫瘍細胞に対してｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを適正にターゲティングすることが要求され得る。そのため、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰが、癌細胞だけに見出されるように、癌抗原を認識する送達機構（例えば、結合リガンド又は抗体、標的リポソームなど）を使用することができる。
【０９２１】
美容用途
一実施形態では、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、美容に関する状態の治療、改善又は予防に使用することができる。こうした状態として、ざ瘡（ニキビ）、酒さ、瘢痕、シワ、湿疹、帯状疱疹、乾癬、年齢によるシミ、母斑、乾燥肌、皮膚硬結、発疹（例えば、おむつかぶれ、あせも）、疥癬、蕁麻疹、疣贅、虫刺され、白斑、ふけ、そばかす、及び加齢の一般的徴候が挙げられる。
【０９２２】
ＶＩ．キット及びデバイス
キット
本発明は、本発明の方法を好都合に及び／又は効果的に実施するための様々なキットを提供する。典型的に、キットは、ユーザが、対象の複数の治療を実施する、及び／又は複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量及び／又は数の成分を含む。
【０９２３】
一態様では、本発明は、本発明の分子（ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）を含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、１つ又は複数の機能性抗体又はその機能断片を含む。
【０９２４】
前記キットは、翻訳可能な領域を含む第１ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを含む、タンパク質生産用であってよい。このキットは、さらに、パッケージング並びに製剤組成物を形成するための指示書及び／又は送達剤を含んでもよい。送達剤は、塩水、緩衝液、リピドイド又は本明細書に開示する任意の送達剤を含んでもよい。
【０９２５】
一実施形態では、バッファー溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩及び／又はＥＤＴＡを含んでもよい。別の実施形態では、緩衝溶液は、限定はしないが、塩水、２ｍＭカルシウムを含む塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含む５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムを含む塩化ナトリウム及びマンノースを含んでもよい（例えば、米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。また別の実施形態では、緩衝溶液を沈殿させてもよいし、又は凍結乾燥させてもよい。各成分の量は、一貫した再生可能な高濃度塩水又は単純なバッファー製剤を可能にするように、変動し得る。また、所定の期間にわたって及び／又は様々な条件下で、バッファー溶液中のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの安定性を高めるために、成分を変更してもよい。一態様では、本発明は、タンパク質生産のためのキットを提供し、キットは、以下を含む：標的細胞に導入されると翻訳可能な領域によりコードされる所望の量のタンパク質を産生す
るのに有効な量で提供される、翻訳可能な領域を含むｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ；細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害核酸を含む第２ポリヌクレオチド；並びにパッケージング及び指示書。
【０９２６】
一態様では、本発明は、タンパク質生産のためのキットを提供し、キットは、翻訳可能な領域を含むｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ（ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す）、並びにパッケージング及び指示書を含む。
【０９２７】
一態様では、本発明は、タンパク質生産のためのキットを提供し、キットは、翻訳可能な領域を含むｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ（ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す）、並びに第１核酸の翻訳可能領域の翻訳に好適な哺乳動物細胞を含む。
【０９２８】
一実施形態では、プロテインＣのレベルは、免疫アッセイにより測定することができる。アッセイは、購入してもよいし、以下を含むいずれの供給業者からでも入手が可能である：ビオメリュー社（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．）（ノースカロライナ州ダーラム）、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（イリノイ州アボット・パーク）、シーメンス・メディカル・ソリューションズ  ＵＳＡ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）（ペンシルベニア州マルバーン）、バイオポート（ＢＩＯＰＯＲＴＯ）（登録商標）ダイアグノスティックス（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）Ａ／Ｓ（デンマーク、ゲントフテ）、ＵＳＣＮ（登録商標）ライフ・サイエンス社（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）（テキサス州ヒューストン）、又はロシュ・ダイアグノスティック社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（インディアナ州インディアナポリス）。この実施形態では、アッセイを用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ分子の投与時の、又はそれに応答するプロテインＣ若しくはその活性化形態又は送達された変異体のレベルを評価することができる。
【０９２９】
デバイス
本発明は、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、それを必要とする対象、例えば、ヒト対象に直ちに送達するために利用可能な製剤にポリヌクレオチドを合成するための試薬を安定な製剤中に含有する。デバイスを用いて、目的のポリペプチドをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することができる。こうした目的のポリペプチドの非制限的例として、創傷治癒のための増殖因子及び／又は血管新生刺激因子、感染防止を促進するためのペプチド抗生物質、並びに新たに同定されたウイルスに対する免疫応答を急速に刺激するための抗原が挙げられる。
【０９３０】
デバイスはまた、本発明と一緒に使用してもよい。一実施形態では、デバイスを用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの形態で投与されたタンパク質のレベルを評価する。デバイスは、血液、尿又はその他の体液試薬を含んでもよい。キットは、自動化中央検査室プラットフォームを含むほど大型であってもよいし、又は小型の非集中卓上デバイスであってもよい。これは、ポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）又は携帯用デバイスであってもよい。この実施形態では、例えば、プロテインＣ（そのチモーゲン）、ＡＰＣ若しくはその任意の変異体をコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰでの処置前、処置中若しくは処置後に、プロテインＣ又はＡＰＣを定量することができる。オートプロトロンビンＩＩＡ及び血液凝固因子ＸＩＶとしても知られるプロテインＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏで血液凝固及び／又は線維素溶解活
性の生成の調節に重要な役割を果たすセリンプロテアーゼのチモーゲン、若しくは前駆体である。これは、肝臓において単鎖ポリペプチドとして合成されるが、翻訳後プロセシングを経て、２本鎖中間体をもたらす。プロテインＣの中間体は、１２残基ペプチドのトロンビン媒介切断により、分子の重鎖のアミノ末端から「活性化プロテインＣ」（ＡＰＣ）として知られる活性形態へと変換される。デバイスは、敗血又は重篤な敗血症などのプロテインＣ、又はＡＰＣ治療に関連するコンパニオン診断検査として、薬物発見の取り組みに有用となり得る。早期の研究では、ＡＰＣは、重篤な敗血症の死亡率を低下させる能力を有することが示された。この研究の方向に従って、臨床試験により、１つの化合物、すなわち活性化ドロトレコギンアルファ（組換えプロテインＣ）のＦＤＡ承認を得るに到った。しかし、２０１１年後半、この薬物は、プロウェス−ショック（ＰＲＯＷＥＳＳ−ＳＨＯＣＫ）研究の結果に従って全ての市場での販売から回収された。この研究は、試験が、敗血性ショック患者の２８日全死因死亡率において満足に有意な減少の主要評価項目を満たさなかったことを明らかにした。本発明は、敗血、重篤な敗血症及び敗血症の診断及び治療に使用することができ、哺乳動物におけるタンパク質発現効率増加に関連する課題若しくは問題を解決するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを提供する。
【０９３１】
一部の実施形態では、デバイスは、内蔵式であり、任意選択で、作製されるｃｉｒｃＲＮＡの合成及び／又は分析のための指示を得るために無線のリモートアクセスが可能である。デバイスは、少なくとも１つのｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ、好ましくは無制限の数の異なるｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの流動的な合成が可能である。いくつかの実施形態では、デバイスは、一人又は少人数の個体によって運搬が可能である。他の実施形態では、デバイスは、台又はデスクに合わせて設計される。別の実施形態では、デバイスは、スーツケース、バックパック又は同様の大きさの物体に入るように設計される。別の実施形態では、デバイスは、ポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）又は携帯用デバイスであってもよい。さらに別の実施形態では、デバイスは、車両、例えば、乗用車、トラック若しくは救急車、又は戦車若しくは人員運搬車などの軍事車両に合わせて設計される。目的のポリペプチドをコードするｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを作製するのに必要な情報は、デバイス内に存在するコンピュータ読み取り可能な媒体に存在する。
【０９３２】
一実施形態では、デバイスを用いて、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの形態で投与されたタンパク質のレベルを評価することができる。デバイスは、血液、尿又はその他の体液試薬を含んでもよい。
【０９３３】
別の実施形態では、デバイスは、核酸及びポリペプチド配列のデータベースとの通信（例えば、無線通信）が可能である。デバイスは、１つ又は複数のサンプル容器の挿入用の少なくとも１つのサンプルブロックを含む。こうしたサンプル容器は、鋳型ＤＮＡ、ヌクレオチド、酵素、バッファー、及び他の試薬などの任意の数の材料を液体又は他の形態で収容することができる。サンプル容器はまた、サンプルブロックとの接触により、加熱及び冷却することもできる。サンプルブロックは、一般に、少なくとも１つのサンプルブロック用の１つ又は複数の電子制御ユニットでデバイス基部と連絡している。サンプルブロックは、加熱モジュール、例えば、サンプル容器及びその内容物を約−２０℃〜約＋１００℃の温度範囲に加熱及び／又は冷却することができる加熱モジュールを備えているのが好ましい。デバイス基部は、電池又は外部電圧源などの電圧源と連絡している。デバイスはまた、ＲＮＡ合成用の材料を保存及び分配するための手段も含む。
【０９３４】
任意選択で、サンプルブロックは、合成された核酸を分離するためのモジュールを含む。あるいは、デバイスは、サンプルブロックに作動可能に連結した分離モジュールを含む
。デバイスは、合成された核酸の分析のための手段を含むのが好ましい。こうした分析手段として、以下のものが挙げられる：配列番号（ハイブリダイゼーションなどにより明らかにされる）、不要な配列が存在しないこと、合成されたｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの完全性の測定（例えば、分光法と組み合わせたマイクロ流体粘土測定などにより）、並びにｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの濃度及び／又は効力（例えば、分光法などにより）。
【０９３５】
いくつかの実施形態では、デバイスは、対象から取得した生体物質中に存在する病原体の検出手段（例えば、細菌同定のためのＩＢＩＳ  ＰＬＥＸ−ＩＤシステム（アボット（Ａｂｏｔｔ）、イリノイ州アボットパーク）と組み合わせる。
【０９３６】
本明細書に記載する皮内医薬組成物の送達に用いるのに好適なデバイスは、以下に記載されているものなどの、ショートニードルデバイスが挙げられる：米国特許第４，８８６，４９９号明細書；同第５，１９０，５２１号明細書；同第５，３２８，４８３号明細書；同第５，５２７，２８８号明細書；同第４，２７０，５３７号明細書；同第５，０１５，２３５号明細書；同第５，１４１，４９６号明細書；及び同第５，４１７，６６２号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。皮内組成物は、国際公開第９９／３４８５０号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものなど、皮膚への針の有効貫入長さを限定するデバイス、及びその機能的同等物によって投与することができる。液体ジェット注射器及び／又は角質層に貫入して、真皮に達するジェットを生成する針を介して、真皮に液体組成物を送達するジェット注射デバイスが好適である。ジェット注射デバイスは、例えば、以下の文献に記載されている：米国特許第５，４８０，３８１号明細書；同第５，５９９，３０２号明細書；同第５，３３４，１４４号明細書；同第５，９９３，４１２号明細書；同第５，６４９，９１２号明細書；同第５，５６９，１８９号明細書；同第５，７０４，９１１号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；同第５，８９３，３９７号明細書；同第５，４６６，２２０号明細書；同第５，３３９，１６３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，５０３，６２７号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，５２０，６３９号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第４，９４０，４６０号明細書；並びに国際公開第９７／３７７０５号パンフレット及び同第９７／１３５３７号パンフレット（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。圧縮ガスを用いて、皮膚の外層から真皮への粉末状のワクチンを加速させる弾道粉末／粒子送達デバイスが好適である。これに代わり、又は加えて、皮内投与の古典的マントウー（ｍａｎｔｏｕｘ）法に従来の注射器を使用してもよい。
【０９３７】
一部の実施形態では、デバイスは、血液脳関門を介した本発明の化合物又は組成物の投与のためのポンプであってもよいし、そのためのカテーテルを含んでもよい。こうしたデバイスとして、限定はしないが、加圧嗅覚器官送達デバイス、イオン泳動デバイス、多層マイクロ流体デバイスなどがある。こうしたデバイスは、携帯可能又は据え置き型のいずれであってもよい。これらは、移植可能であってもよいし、又は外部から身体に係留してもよく、あるいは、これらの組み合わせであってもよい。
【０９３８】
投与のためのデバイスを使用して、本明細書に教示する単回、複数回若しくは分割投与レジメンに従い、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを送達することもできる。このようなデバイスは、以下に記載される。
【０９３９】
細胞、臓器及び組織に対する複数回投与について当技術分野で公知の方法及びデバイスは、本発明の実施形態として本明細書に開示される方法及び組成物と併用することが考慮される。これらの方法として、例えば、マルチプルニードル、例えば、管腔又はカテーテ
ルを使用するハイブリッドデバイス、並びに熱、電流若しくは放射線駆動機構を使用する方法及びデバイスがある。
【０９４０】
本発明によれば、複数回投与デバイスを使用して、本明細書で考慮する単回、複数回若しくは分割用量を送達することができる。こうした装置は、例えば、２０１３年３月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に教示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０９４１】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも３本の針で、３つの異なる、任意選択で隣接した部位に、同時に、又は６０分以内に皮下若しくは筋肉内投与する（例えば、４、５、６、７、８、９、若しくは１０の部位への同時又は６０分以内の投与）。
【０９４２】
固体生分解性マイクロニードルを用いて治療薬を送達する方法は、オヘイガン（Ｏ’ｈａｉｇａｎ）らにより、米国特許出願公開第２０１３０２８７８３２号明細書により記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。マイクロニードルは、少なくとも１つの固体賦形剤と組み合わせた治療薬（例えば、インフルエンザワクチン）から製造される。皮膚に貫入した後、マイクロニードルは、ｉｎ  ｓｉｔｕで溶解し、治療薬を対象に放出する。非制限的例として、マイクロニードルの製造に使用される治療薬は、本明細書に記載のポリヌクレオチドである。
【０９４３】
経皮薬物送達用のマイクロニードルアセンブリは、ロス（Ｒｏｓｓ）らにより、米国特許第８６３６６９６号明細書に記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。このアセンブリは、第１面と第２面を有し、支持体の第２面から外側に向かってマイクロニードルが突出している。アセンブリは、流路と開口部を含み、これらが交差を形成して、液体（例えば、治療薬又は薬物）の通過を可能にする。
【０９４４】
カテーテル及び／又は管腔を用いる方法及びデバイス
カテーテル及び管腔を用いる方法及びデバイスを使用して、単回、複数回若しくは分割投与スケジュールで、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを投与することができる。こうした方法及び装置は、２０１３年３月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に教示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０９４５】
電流を用いる方法及びデバイス
電流を用いる方法及びデバイスを使用して、単回、複数回若しくは分割投与スケジュールで、本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰを投与することができる。こうした方法及び装置は、２０１３年３月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に教示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０９４６】
ＶＩＩ．定義
本明細書の様々な箇所で、本開示の化合物の置換基は、群又は範囲で開示される。本開示は、こうした群及び範囲のメンバーの各々及びあらゆる個別の部分組み合わせを包含する。例えば、用語「Ｃ１〜６アルキル」は、具体的に、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、及びＣ６アルキルを個別に開示することが意図される。本明細書において、「任意選択で置換されたＸ」（例えば、任意選択で置換されたアルキル）という形態の語句は、「Ｘ（ここで、Ｘは、任意選択で置換されている」（例えば、「アルキル（ここで、アルキルは、任意選択で置換されている」）と同等であることが意図
される。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意であると意味することは意図しない。
【０９４７】
約：本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記載される値の±１０％を意味する。
組み合わせて投与される：本明細書で使用されるとき、用語「組み合わせて投与される」又は「併用投与」は、２種以上の薬剤が対象に同時に、又は対象に対する各薬剤の効果の重複が生じ得るような間隔内で投与されることを意味する。一部の実施形態では、これらの薬剤は、互いの約６０分、３０分、１５分、１０分、５分、又は１分以内に投与される。一部の実施形態では、薬剤の投与は、併用効果（例えば、相乗効果）が達成されるように、互いに十分に近い間隔が空けられる。
【０９４８】
アジュバント：本明細書で使用されるとき、用語「アジュバント」は、抗原に対する対象の免疫応答を増強する物質を意味する。
動物：本明細書で使用されるとき、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発達段階にあるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、畜牛、霊長類、又はブタ）である。一部の実施形態では、動物として、限定はしないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び蠕虫が挙げられる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、又はクローンである。
【０９４９】
抗体断片：本明細書で使用されるとき、用語「抗体断片」は、インタクトな抗体、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域及び／又は可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；ナノボディ；単鎖抗体分子、並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【０９５０】
抗原：本明細書で使用されるとき、用語「抗原」は、それぞれの抗体に特異的に結合する物質を指す。抗原は、本明細書で使用する癌抗原などの身体、又は外部環境、例えば、感染因子のいずれを起源とするものでもよい。
【０９５１】
目的の抗原又は所望の抗原：本明細書で使用されるとき、用語「目的の抗原」又は「所望の抗原」には、明細書に記載の抗体並びにその断片、突然変異体、変異体、及び改変物が免疫特異的に結合した、本明細書に提供するタンパク質及び他の生体分子が含まれる。目的の抗原の例として、限定はしないが、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω又はＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦα及びＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦが挙げられる。
【０９５２】
近似的に（約）：本明細書で使用されるとき、用語「近似的に」又は「約」は、目的とする１つ以上の値に適用される場合、記載される基準値と同程度である値を指す。特定の実施形態では、用語「近似的に」又は「約」は、特に記載のない限り、又はその他文脈上明らかでない限り、記載される基準値のいずれの（より大きい又はより小さい）方向にも２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満の範囲内に含まれる値の範囲を指す（こうした数が、考えられる値の１００％を超える場合を除く）。
【０９５３】
〜と会合（結合）した：本明細書で使用されるとき、用語「〜と会合（結合）した」、「コンジュゲートした」、「連結した」、「付着した」、及び「係留された」は、２つ以上の部分に関して用いられるとき、それらの部分が、直接、若しくは連結剤として働く１つ又は複数の追加部分を介して、互いに物理的に結合される、又はつながることにより、十分に安定した構造を形成し、これによってその構造が用いられる条件下、例えば、生理学的条件下で、それらの部分が物理的に結合したまま保持されることを意味する。「会合」は、厳密に直接共有化学結合によるものである必要はない。これは、イオン若しくは水素結合、又は「会合した」実体が物理的に結合したまま保持されるように十分安定したハイブリダイゼーションに基づく連結性も示し得る。
【０９５４】
二官能性：本明細書で使用されるとき、用語「二官能性」は、少なくとも２つの官能基の能力を有するか、又はそれらを維持することができる任意の物質、分子又は部分を指す。これらの官能基は、同じ結果又は異なる結果のいずれをもたらすものでもよい。官能基をもたらす構造は、同じでも異なっていてもよい。例えば、本発明の二官能性ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰは、細胞傷害性ペプチド（第１機能）をコードするが、コードＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自体として細胞傷害性である（第２機能）。この例では、二官能性ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの癌細胞への送達は、癌を緩和又は治療し得るペプチド若しくはタンパク質分子をもたらすだけではなく、万一ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの翻訳ではなく、分解が必要な場合には、細胞に対するヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードの送達も達成し得る。
【０９５５】
生体適合性：本明細書で使用されるとき、用語「生体適合性」とは、損傷、毒性又は免疫系による拒絶のリスクをほとんど若しくは全くもたらすことなく、生存細胞、組織、臓器若しくは系統と適合性であることを意味する。
【０９５６】
生分解性：本明細書で使用されるとき、用語「生分解性」とは、生物の作用により無害の産物に分解できることを意味する。
生物活性：本明細書で使用されるとき、語句「生物活性」は、生体系及び／又は生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されたとき、当該生物に対して生物学的作用を有する物質は、生物活性であるとみなされる。具体的な実施形態において、ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの一部であっても、それが生物活性であるか、又は生物学的に関連するとみなされる活性を模倣する場合には、本発明のｃｉｒｃＲＮＡは生物活性であるとみなされる。
【０９５７】
癌幹細胞：本明細書で使用されるとき、「癌幹細胞」は、自己再生並びに／又は異常な増殖及び分化を経て、腫瘍を形成することができる細胞である。
化学用語：以下に、「アシル」から「チオール」まで、様々な化学用語の定義を記載する。
【０９５８】
本明細書で使用されるとき、用語「アシル」は、本明細書で定義する通りの水素又はアルキル基（例えば、ハロアルキル基）を表し、これは、本明細書で定義する通りのカルボニル基を介して親分子基に結合し、例として、ホルミル（すなわち、カルボキシアルデヒド基）、アセチル、トリフルオロアセチル、プロピオニル、ブタノイルなどが挙げられる。例示的非置換アシル基は、１〜７、１〜１１、又は１〜２１個の炭素を含む。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換される。
【０９５９】
任意選択で置換されたアシル基の非制限的例として、以下のものが挙げられる：アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アリールアルコキシカルボニル、アリー
ロイル、カルバモイル、カルボキシアルデヒド、（ヘテロシクリル）イミノ、及び（ヘテロシクリル）オイル：
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニル」基は、カルボニル原子を介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのアルコキシ（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、若しくはＣ１〜２０アルキル基である）を表す。例示的非置換アルコキシカルボニルは、１〜２１個の炭素（例えば、１〜１１又は１〜７個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルコキシ基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換される。
【０９６０】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアシル」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアシル基を表す（例えば、−Ｃ（Ｏ）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜２０アルキル基である）。例示的非置換アルコキシカルボニルアシルは、３〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アシル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アシル、Ｃ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アシルなどのように、例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、又は３〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルコキシ及びアルキル基は、各々の基について、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９６１】
本明細書で使用されるとき、「アリールアルコキシカルボニル」基は、カルボニルを介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのアリールアルコキシ基を表す（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル−アリール）。例示的非置換アリールアルコキシ基は、８〜３１個の炭素（例えば、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ−カルボニル、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜１０アルコキシ−カルボニル、又はＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜２０アルコキシ−カルボニルなどのように、例えば、８〜１７又は８〜２１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アリールアルコキシカルボニル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９６２】
本明細書で使用されるとき、「アリーロイル」基は、カルボニル基を介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのアリール基を表す。例示的非置換アリーロイルは、炭素数７〜１１である。一部の実施形態では、アリール基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９６３】
本明細書で使用されるとき、「カルバモイル」基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、ここで、各ＲＮ１の意味は、本明細書に記載する「アミノ」の定義に見出される。
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルデヒド」基は、構造−ＣＨＯを有するアシル基を表す。
【０９６４】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）イミノ」基は、イミノ基を介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのヘテロシクリル基を表す。一部の実施形態では、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９６５】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）オイル」基は、カルボニル基を介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのヘテロシクリル基を表す。一部の実施形態では、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９６６】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は、別に記載のない限り、炭素数１〜２
０（例えば、１〜１０若しくは１〜６）の直鎖及び分岐鎖飽和基の両方を包含する。アルキル基の例として、メチル、エチル、ｎ−及びイソ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、イソ−及びｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチルなどが挙げられ、これは、任意選択で、以下のものからなる群から独立に選択される１、２、３、又は炭素数２以上のアルキル基の場合には、４つの置換基で置換することができる：（１）Ｃ１〜６アルコキシ；（２）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（３）本明細書で定義する通りのアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）又は置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２、ここで、ＲＮ１は、アミノについて定義する通りである）；（４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２〜９ヘテロシクリル）オキシ；（８）任意選択で、Ｏ−保護基で置換されるヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒド又はアシル）；（１１）Ｃ１〜７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）任意選択で、Ｏ−保護基で置換される−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ＲＢ’及びＲＣ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’、ここで、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）ヒドロキシ；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’、ここで、ＲＧ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’、ここで、ＲＨ’は、以下：（ａ１）水素及び（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、以下：（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整
数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＲＫ’、ここで、ＲＪ’は、以下：（ａ１）水素及び（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、以下：（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；並びに（２１）アミジン。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通り、さらに置換することができる。例えば、Ｃ１アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換することにより、それぞれのアリーロイル置換基を付与することができる。
【０９６７】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキレン」は、直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素から２つの水素原子を除去することにより得られる飽和二価炭化水素を表し、例として、メチレン、エチレン、イソプロピレンなどが挙げられる。用語「Ｃｘ〜ｙアルキレン」及び接頭辞「Ｃｘ〜ｙアルク」は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキレン基を表す。ｘの例示的値は、１、２、３、４、５、及び６であり、ｙの例示的値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０である（例えば、Ｃ１〜６、Ｃ１〜１０、Ｃ２〜２０、Ｃ２〜６、Ｃ２〜１０、又はＣ２〜２０アルキレン）。一部の実施形態では、アルキレンは、アルキル基について本明細書に記載する通り、１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。同様に、任意の基に付いた接尾辞「−エン」は、該当する基が二価の基であることを示している。
【０９６８】
任意選択で置換されたアルキル及びアルキレン基の非制限的例として、アシルアミノアルキル、アシルオキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アルキルスルフィニル、アルキルスルフィニルアルキル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアミノアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、ペルフルオロアルキル、及びスルホアルキルが挙げられる：
本明細書で使用されるとき、「アシルアミノアルキル」基は、アミノ基に結合されて、これが今度は、本明細書で定義する通りのアルキレン基を介して親分子に結合された、本明細書で定義する通りのアシル基であり（すなわち、−アルキル−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、若しくはＣ１〜２０アルキル基（例えば、ハロアルキル）、ＲＮ１は、本明細書で定義する通りである）である。例示的非置換アシルアミノアルキル基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、又は２〜４１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキレン基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換され、及び／又はアミノ基は、−ＮＨ２又は−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、Ｓ
Ｏ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載するその他）、又はアルコキシカルボニルアルキルであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、又はアリールであってよい。
【０９６９】
本明細書で使用されるとき、「アシルオキシアルキル」基は、酸素原子に結合されて、これが今度は、アルキレン基を介して親分子に結合された、本明細書で定義する通りのアシル基である（すなわち、−アルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜２０アルキル基である）。例示的非置換アシルアミノアルキル基は、１〜２１個の炭素（例えば、１〜７又は１〜１１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキレン基は、独立に、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換される。
【０９７０】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシアルキル」基は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を表す。例示的非置換アルコキシアルキル基は、２〜４０個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜１０アルコキシ−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜２０アルコキシ−Ｃ１〜２０アルキルなどのように、例えば、２〜１２、又は２〜２０個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキル及びアルコキシは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９７１】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す（例えば、−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜６アルキル基である）。例示的非置換アルコキシカルボニルアルキルは、３〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アルキルなどのように、例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、又は３〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルキル及びアルコキシ基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９７２】
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニルアルキル」基は、アルキルスルフィニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。例示的非置換アルキルスルフィニルアルキル基は、炭素数２〜１２、２〜２０、又は２〜４０である。一部の実施形態では、各アルキル基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９７３】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。各アルキル及びアミノ基は、それぞれの基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシ、及び／又はＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９７４】
本明細書で使用されるとき、「カルバモイルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのカルバモイル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９７５】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルキル」基は、本明細書で定義する通りのカルボキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができ、カルボキシ基は、任意選択で、１つ又は複数のＯ−保護基で置換することができる。
【０９７６】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルキルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのカルボキシで置換された、本明細書で定義する通りのアミノアルキル基を表す。カルボキシ、アルキル、及びアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシ、及び／又はＮ−保護基、及び／又はＯ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９７７】
本明細書で使用されるとき、「ハロアルキル」基は、本明細書で定義する通りのハロゲン基（すなわちＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。ハロアルキルは、１つ、２つ、３つ、又は、炭素数２以上のアルキル基の場合には、４つのハロゲンで置換してもよい。ハロアルキル基は、ペルフルオロアルキル（例えば、−ＣＦ３）、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＣｌ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、及び−ＣＨＩＣＨ３を含む。一部の実施形態では、ハロアルキル基は、アルキル基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９７８】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルキル」基は、わずか１つのヒドロキシ基がアルキル基の１炭素原子に結合し得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表し、例として、ヒドロキシメチル、ジヒドロキシプロピルなどが挙げられる。一部の実施形態では、ヒドロキシアルキル基は、アルキルについて本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換することができる。
【０９７９】
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルキル」基は、アルキル基に結合した各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルで置換されている、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。ペルフルオロアルキル基の例として、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどが挙げられる。
【０９８０】
本明細書で使用されるとき、「スルホアルキル」基は、−ＳＯ３Ｈのスルホ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができ、スルホ基は、１つ又は複数のＯ−保護基（例えば、本明細書に記載する通りの）で置換することができる。
【０９８１】
本明細書で使用されるとき、用語「アルケニル」は、１つ又は複数の炭素−炭素二重結合を含有する、炭素数２〜２０（例えば、２〜６若しくは２〜１０）の１価直鎖又は分岐鎖の基を表し、例として、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルなどが挙げられる。アルケニルは、シス及びトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、任意選択で、本明細書で定義する通りのアミノ、アリール、シクロアルキル、若しくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又は本明細書に記載する例示的アルキル置換基のいずれかから独立に選択される１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９８２】
任意選択で置換されたアルケニル基の非制限的例として、アルコキシカルボニルアルケ
ニル、アミノアルケニル、及びヒドロキシアルケニルが挙げられる：
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルケニル」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルケニル基を表す（例えば、−アルケニル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜６アルキル基である）。例示的非置換アルコキシカルボニルアルケニルは、４〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜２０アルケニルなどのように、例えば、４〜１０、４〜１３、４〜１７、４〜２１、又は４〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルキル、アルケニル、及びアルコキシ基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９８３】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルケニル」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルケニル基を表す。アルケニル及びアミノ基は各々、それぞれの基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシ、及び／又はＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９８４】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルケニル」基は、わずか１つのヒドロキシ基がアルキル基の１炭素原子に結合し得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルケニル基を表し、例として、ヒドロキシプロペニル、ヒドロキシイソペンテニルなどが挙げられる。一部の実施形態では、ヒドロキシアルケニル基は、アルキルについて本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換することができる。
【０９８５】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキニル」は、１つの炭素−炭素三重結合を含有する、炭素数２〜２０（例えば、２〜４、２〜６、若しくは２〜１０）の１価直鎖又は分岐鎖の基を表し、例として、エチニル、１−プロピニルなどが挙げられる。アルキニル基は、任意選択で、本明細書で定義する通りのアリール、シクロアルキル、若しくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又は本明細書に記載する例示的アルキル置換基のいずれかから独立に選択される１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９８６】
任意選択で置換されたアルキニル基の非制限的例として、アルコキシカルボニルアルキニル、アミノアルキニル、及びヒドロキシアルキニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルキニル」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキニル基を表す（例えば、−アルキニル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜６アルキル基である）。例示的非置換アルコキシカルボニルアルキニルは、４〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜１０アルキニル、又はＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜２０アルキニルなどのように、例えば、４〜１０、４〜１３、４〜１７、４〜２１、又は４〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルキル、アルキニル、及びアルコキシ基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９８７】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルキニル」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキニル基を表す。アルキニル及びアミノ基は各々、それぞれの基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの
置換基（例えば、−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシ、及び／又はＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９８８】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルキニル」基は、わずか１つのヒドロキシ基がアルキル基の１炭素原子に結合し得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキニル基を表す。一部の実施形態では、ヒドロキシアルキニル基は、アルキルについて本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換することができる。
【０９８９】
本明細書で使用されるとき、「アミノ」は、−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、ここで、各ＲＮ１は、独立に、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル（例えば、任意選択で、Ｏ−保護基で置換されたもの、例えば、任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基若しくは本明細書に記載するいずれかなど）、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載するその他）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、任意選択でＯ−保護基で置換されたもの、例えば、任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基若しくは本明細書に記載するいずれかなど）、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又はアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）であり、これらの記載するＲＮ１基の各々は、各々の基について本明細書で定義する通り、任意選択で置換することができ；又は、２つのＲＮ１は、結合して、ヘテロシクリル若しくはＮ−保護基を形成し、並びに、各ＲＮ２は、独立に、Ｈ、アルキル、又はアリールである。本発明のアミノ基は、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）又は置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２）であってよい。好ましい実施形態では、アミノは、−ＮＨ２又は−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載するその他）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、ｔ−ブトキシカルボニルアルキル）又はアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、又はＣ６〜１０アリールであってよい。
【０９９０】
任意選択で置換されたアミノ基の非制限的例は、アシルアミノ及びカルバミルである：
本明細書で使用されるとき、「アシルアミノ」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基を介して親分子基に結合した、本明細書で定義する通りのアシル基を表す（すなわち−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、若しくはＣ１〜２０アルキル基（例えば、ハロアルキル）あり、ＲＮ１は、本明細書で定義する通りである）。例示的非置換アシルアミノ基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、又は２〜４１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換され、及び／又はアミノ基は、−ＮＨ２又は−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載するその他）、又はアルコキシカルボニルアルキルであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、又はアリールである。
【０９９１】
本明細書で使用されるとき、「カルバミル」基は、構造−ＮＲＮ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ又は−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＮ１）２を有するカルバメート基を指し、ここで、各ＲＮ１は、本
明細書に記載する「アミノ」の定義に見出され、Ｒは、本明細書で定義する通りのアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又はアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）である。
【０９９２】
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、側鎖、アミノ基、及び酸基（例えば、−ＣＯ２Ｈのカルボキシ基又は−ＳＯ３Ｈのスルホ基）を有する分子を指し、ここで、アミノ酸は、側鎖、アミノ基、若しくは酸基（例えば、側鎖）によって親分子基に結合されている。一部の実施形態では、アミノ酸は、カルボニル基によって親分子基に結合されており、ここで、側鎖又はアミノ基は、カルボニル基に結合されている。例示的側鎖としては、任意選択で置換されたアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリール、アルクヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、及びカルボキシアルキルが挙げられる。例示的アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イロソイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリシン、セレノシステイン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが挙げられる。アミノ酸基は、任意選択で、以下のものからなる群から独立に選択される１、２、３つの置換基、又は炭素数２以上のアルキル基の場合には、４つの置換基で置換してもよい：（１）Ｃ１〜６アルコキシ；（２）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（３）本明細書で定義する通りのアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）又は非置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２、ここで、ＲＮ１は、アミノについて定義する通りである）；（４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２〜９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒド又はアシル）；（１１）Ｃ１〜７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ＲＢ’及びＲＣ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’、ここで、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）ヒドロキシ；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’、ここで、ＲＧ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（
例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’、ここで、ＲＨ’は、以下：（ａ１）水素及び（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、以下：（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＲＫ’、ここで、ＲＪ’は、以下：（ａ１）水素及び（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、以下：（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；並びに（２１）アミジン。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通りに、さらに置換することができる。
【０９９３】
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は、１つ又は２つの芳香環を有する単環、二環、又は多環式炭素環系を表し、例として、フェニル、ナフチル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどが挙げられ、これは、以下のものからなる群から独立に選択される１、２、３、４、若しくは５つの置換基で置換してもよい：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、又はＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシなどのＣ１〜６アルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ１〜６アルク−Ｃ３
〜８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１５）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’及びＲＣ’は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２１）チオール；（２２）Ｃ６〜１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（２５）Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（２６）Ｃ２〜２０アルケニル；並びに（２７）Ｃ２〜２０アルキニル。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通り、さらに置換することができる。例えば、Ｃ１−アルカリール又はＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換することにより、それぞれのアリーロイル及び（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与することができる。
【０９９４】
本明細書で使用されるとき、用語「アリールアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアルキレン基を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのアリール基を表す。例示的非置換アリールアルキル基は、炭素数７〜３０（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜１０アルク−Ｃ６〜１０アリール、若しくはＣ１〜２０アルク−Ｃ６〜１０アリールなどのように、炭素数７〜１６又は７〜２０）である。一部の実施形態では、アルキレン及びアリールは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。接頭辞「アルク−」が前に置かれた他の基も同様に定義され、「アルク」は、別に注記のない限り、Ｃ１〜６アルキレンを指し、結合される化学構造は、本明細書に定義する通りである。
【０９９５】
用語「アジド」は、−Ｎ３基を表し、これは、Ｎ＝Ｎ＝Ｎと表示することもできる。
本明細書で使用されるとき、用語「二環式」は、２つの環を有する構造を指し、これらの環は、芳香族又は非芳香族のいずれであってもよい。二環式構造は、本明細書で定義する通りのスピロシクリル基と、１つ又は複数の架橋を共有する２つの環を含み、こうした架橋は、１個の原子か、又は２、３個若しくはそれ以上の原子を含む鎖を含み得る。例示的二環式基としては、以下のものが挙げられる：第１及び第２環が、本明細書で定義する通りのカルボシクリル基である二環式カルボシクリル基；第１及び第２環が、本明細書で定義する通りのアリール基である、二環式アリール基；第１環がヘテロシクリル基であり、第２環がカルボシクリル（例えば、アリール）若しくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である二環式ヘテロシクリル基；並びに第１環が、ヘテロアリール基であり、第２環が、カルボシクリル（例えば、アリール）若しくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である二環式ヘテロアリール基。一部の実施形態では、二環式基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリール基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９９６】
本明細書で使用されるとき、用語「ボラニル」は、−Ｂ（ＲＢ１）３を表し、ここで、各ＲＢ１は、独立に、Ｈ及び任意選択で置換されたアルキルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ボラニル基は、アルキルについて本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９９７】
本明細書で使用されるとき、用語「炭素環式」及び「カルボシクリル」は、任意選択で置換されたＣ３〜１２単環式、二環式、又は三環式構造を指し、ここで、環は、芳香族又は非芳香族のいずれであってもよく、これらの環は炭素原子により形成されている。炭素環式構造には、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、及びアリール基が含まれる。
【０９９８】
本明細書で使用されるとき、用語「カルボニル」は、Ｃ（Ｏ）基を表し、これは、Ｃ＝Ｏとしても表示することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「カルボキシ」は、−ＣＯ２Ｈを意味する。
【０９９９】
本明細書で使用されるとき、用語「シアノ」は、−ＣＮ基を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「シクロアルキル」は、別に記載のない限り、炭素数３〜８の一価飽和又は不飽和非芳香族環式炭化水素基を表し、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、二環式ヘプチルなどが挙げられる。上記以外に、シクロアルキル基と考えられるものが、１つ又は複数の炭素−炭素二重結合を含む場合、その基は、「シクロアルケニル」基と呼ばれる。本発明の目的のために、シクロアルケニルは、アリール基を除外する。上記以外に、シクロアルキル基と考えられるものが、１つ又は複数の炭素−炭素三重結合を含む場合、その基は、「シクロアルキニル」基と呼ばれる。例示的シクロアルケニル基として、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどがある。本発明のシクロアルキル基は、任意選択で、以下に挙げるもので置換することができる：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、又はＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシなどのＣ１〜６アルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ１〜６アルク−Ｃ３〜８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１５）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’及びＲＣ’は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ６〜１０アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６〜１０アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２１）チオール；（２２）Ｃ１〜６アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（２５）Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；
（２６）オキソ；（２７）Ｃ２〜２０アルケニル；並びに（２８）Ｃ２〜２０アルキニル。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通り、さらに置換することができる。例えば、Ｃ１−アルカリール又はＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換することにより、それぞれのアリーロイル及び（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与することができる。
【１０００】
本明細書で使用されるとき、用語「シクロアルキルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアルキレン基（例えば、炭素数１〜４、１〜６、１〜１０、又は１〜２０のアルキレン基）を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのシクロアルキル基表す。一部の実施形態では、アルキレン及びシクロアルキルは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１００１】
本明細書で使用されるとき、用語「ジアステレオマー」は、互いに鏡像ではなく、且つ、互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「鏡像体」は各々、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像体の少なくとも９０％と他方の鏡像体の最大１０％）、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９８％の光学純度又は鏡像体過剰率（当技術分野で標準的方法により決定される通り）を有する本発明の化合物の個別の光学活性形態を意味する。
【１００２】
本明細書で使用されるとき、用語「ハロ」は、臭素、塩素、ヨウ素、又はフッ素から選択されるハロゲンを表す。
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアルキル」は、構成炭素原子の１つ又は２つが各々、窒素、酸素、又はイオウで置換されている、本明細書で定義する通りのアルキル基を指す。一部の実施形態では、ヘテロアルキル基は、アルキル基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアルケニル」及び「ヘテロアルキニル」は、それぞれ、構成炭素原子の１つ又は２つが各々、窒素、酸素、又はイオウで置換されている、本明細書で定義する通りのアルケニル及びアルキニル基を指す。一部の実施形態では、ヘテロアルケニル及びヘテロアルキニル基は、アルキル基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１００３】
任意選択で置換されたヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、及びヘテロアルキニル基の非制限的例として、アシルオキシ、アルケニルオキシ、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルコキシカルボニルアルコキシ、アルキニルオキシ、アミノアルコキシ、アリールアルコキシ、カルボキシアルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルコキシ、（ヘテロシクリル）オキシ、ペルフルオロアルコキシ、チオアルコキシ、及びチオヘテロシクリルアルキルが挙げられる：
本明細書で使用されるとき、「アシルオキシ」基は、酸素原子を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのアシル基を表す（すなわち、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜２０アルキル基である）。例示的非置換アシルオキシ基は、１〜２１個の炭素（例えば、１〜７又は１〜１１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換される。
【１００４】
本明細書で使用されるとき、「アルケニルオキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ２〜２０アルケニル基（例えば、Ｃ２〜６又はＣ２〜１０アルケニル）である）の化学置換基を表す。例示的アルケニルオキシ基としては、エテニルオキシ、プロペニルオキシなどがある。一部の実施形態では、アルケニル基は、本明細書に定義する通り
の１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換することができる。
【１００５】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ１〜２０アルキル基（例えば、Ｃ１〜６又はＣ１〜１０アルキル）である）の化学置換基を表す。例示的アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、ｎ−プロポキシ及びイソプロポキシ）、ｔ−ブトキシなどがある。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ又はアルコキシ）でさらに置換することができる。
【１００６】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシアルコキシ」基は、アルコキシ基で置換されたアルコキシ基を表す。例示的非置換アルコキシアルコキシ基は、２〜４０個の炭素（Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜１０アルコキシ−Ｃ１〜１０アルコキシ、若しくはＣ１〜２０アルコキシ−Ｃ１〜２０アルコキシなどのように、例えば、２〜１２又は２〜２０個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルコキシ基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１００７】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルコキシ」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換されたアルコキシ基を表す（例えば、−Ｏ−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜２０アルキル基である）。例示的非置換アリコキシカルボニルアルコキシ基は、３〜４１個の炭素（Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アルコキシ、又はＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アルコキシなどのように、例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、又は３〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルコキシ基は、独立して、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【１００８】
本明細書で使用されるとき、「アルキニルオキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ２〜２０アルキニル基（例えば、Ｃ２〜６又はＣ２〜１０アルキル基）である）の化学置換基を表す。例示的アルキニルオキシ基としては、エチニルオキシ、プロピニルオキシなどがある。一部の実施形態では、アルキニル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換することができる。
【１００９】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルコキシ」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基で置換されたアルコキシ基を表す。アルキル及びアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載する１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【１０１０】
本明細書で使用されるとき、「アリールアルコキシ」基は、酸素原子を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのアルカリール基を表す。例示的非置換アリールアルコキシ基は、７〜３０個の炭素（Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜１０アルコキシ、若しくはＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜２０アルコキシなどのように、例えば、７〜１６又は７〜２０個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アリールアルコキシ基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【１０１１】
本明細書で使用されるとき、「アリールオキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ’（Ｒ’は、炭素数６〜１８のアリール基である）の化学置換基を表す。一部の実施形態では、アリール基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【１０１２】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルコキシ」基は、本明細書で定義する通りのカルボキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルコキシ基を表す。アルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができ、カルボキシ基は、任意選択で、１つ又は複数のＯ−保護基で置換することができる。
【１０１３】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルコキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ３〜８シクロアルキル基である）の化学置換基を表す。シクロアルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。例示的非置換シクロアルコキシ基は、炭素数３〜８である。一部の実施形態では、シクロアルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１０１４】
本明細書で使用されるとき、「ハロアルコキシ」基は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）で置換された、本明細書で定義する通りのアルコキシ基を表す。ハロアルコキシは、１つ、２つ、３つ、又は、炭素数２以上のアルキル基の場合、４つのハロゲンで置換してもよい。ハロアルコキシ基は、ペルフルオロアルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、及び−ＯＣＨＩＣＨ３を含む。一部の実施形態では、ハロアルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１０１５】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）オキシ」基は、酸素原子を介して親分子基に結合した、本明細書で定義する通りのヘテロシクリル基を表す。一部の実施形態では、ヘテロシクリル基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【１０１６】
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルコキシ」基は、アルコキシ基に結合した各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルで置換されている、アルコキシ基を表す。ペルフルオロアルコキシ基の例としては、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシなどが挙げられる。
【１０１７】
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニル」基は、−Ｓ（Ｏ）−基を介して親分子基に結合したアルキル基を表す。例示的非置換アルキルスルフィニル基は、炭素数１〜６、１〜１０、又は１〜２０である。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１０１８】
本明細書で使用されるとき、「チオアリールアルキル」基は、式−ＳＲ（Ｒは、アリールアルキル基である）の化学置換基を表す。一部の実施形態では、アリールアルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１０１９】
本明細書で使用されるとき、「チオアルコキシ」基は、式−ＳＲ（Ｒは、アルキル基である）の化学置換基を表す。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１０２０】
本明細書で使用されるとき、「チオヘテロシクリルアルキル」基は、式−ＳＲ（Ｒは、ヘテロシクリルアルキル基である）の化学置換基を表す。一部の実施形態では、ヘテロシクリルアルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１０２１】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリール」は、芳香族である（すなわち、単環又は多環式環系内に４ｎ＋２ｐｉ電子を含有する）ヘテロシクリルのサブセットを表す。例示的非置換ヘテロアリール基は、炭素数１〜１２（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、又は２〜９）である。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、ヘテロシクリル基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換される。
【１０２２】
用語「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書で定義する通りのアルキレン基を介して親分子基に結合した、本明細書で定義する通りのヘテロアリール基を指す。例示的非置換ヘテロアリール基は、炭素数２〜３２（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール、Ｃ１〜１０アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール、若しくはＣ１〜２０アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリールのように、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、又は２〜１２）である。一部の実施形態では、アルキレン及びヘテロアリールは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。ヘテロアリールアルキル基は、ヘテロシクリルアルキル基のサブセットである。
【１０２３】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロシクリル」は、別に記載のない限り、窒素、酸素、及びイオウからなる群から独立に選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含有する、５−、６−若しくは７員環を表す。５員環は、０〜２つの二重結合を有し、６−及び７員環は、０〜３つの二重結合を有する。例示的非置換ヘテロシクリル基は、炭素数１〜１２（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、又は２〜９）である。用語「ヘテロシクリル」はまた、架橋した多環式構造を有する複素環式化合物を表し、ここで、１個又は複数個の炭素及び／又はヘテロ原子が、単環、例えば、キヌクリジニル基の２つの非隣接メンバーを架橋する。用語「ヘテロシクリル」は、二環式、三環式、及び四環式基を含み、ここで、前述した複素環のいずれかは、１つ、２つ、又は３つの炭素環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、又は別の単環、例えば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニルなどに融合する。融合ヘテロシクリルの例として、トロパン及び１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環式基としては、以下：ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソキサゾリル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル（例えば、１，２，３−オキサジアゾリル）、プリニル、チアジアゾリル（例えば、１，２，３−チアジアゾリル）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエ
ニルなどが挙げられ、１つ又は複数の二重結合が還元又は水素で置換されたジヒドロ及びテトラヒドロ形態を含む。また別の例示的ヘテロシクリルとしては、以下のものが挙げられる：２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−オキサゾリル；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−イミダゾリル；２，３，４，５−テトラヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−フェニル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル）；２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１Ｈ−イミダゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−５−メチル−５−フェニル−１Ｈ−イミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１，３，４−オキサジアゾリル（例えば、２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−５−フェニル−１，３，４−オキサジアゾリル）；４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル（例えば、４，５−ジヒドロ−３−メチル−４−アミノ５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３，３−ジエチルピリジニル）；２，６−ジオキソ−ピペリジニル（例えば、２，６−ジオキソ−３−エチル−３−フェニルピペリジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソピリジミニル、１，６−ジヒドロ−４−オキソピリミジニル（例えば、２−（メチルチオ）−１，６−ジヒドロ−４−オキソ−５−メチルピリミジン−１−イル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリミジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３−エチルピリミジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−ピリダジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−６−オキソ−３−エチルピリダジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−５−イソプロピル−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル（例えば、３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル及び２，３−ジヒドロ−３，３’−スピロプロパン−１Ｈ−インドール−１−イル）；１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１，３−ジヒドロ−１，３−２Ｈ−イソ−インドリル；１Ｈ−ベンゾピラゾリル（例えば、１−（エトキシカルボニル）−１Ｈ−ベンゾピラゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル（例えば、３−エチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル（例えば、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル；２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラニル；１，４−ベンゾジオキサニル；１，３−ベンゾジオキサニル；２，３−ジヒドロ−３−オキソ，４Ｈ−１，３−ベンゾチアジニル；３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル（例えば、２−メチル−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル（例えば、１−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−１，３−ジメチル−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−３，７−ジメチル−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル）；２−オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル；１，１−ジオキソ−２Ｈ−ナフト［１，８−ｃ，ｄ］イソチアゾリル；並びに１，８−ナフチレンジカルボキサミド。さらなる複素環式基として、３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−ピロロ［３，４−ｂ］ピロル−（２Ｈ）−イル、並びに２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル、ホモピペラジニル（又はジアゼパニル）、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、及びチオカニルが挙げられる。複素環式基はまた、下記の式の基も含む：
【１０２４】
【化５１】
2017522028.tif 000083
【１０２５】
式中、
Ｅ’は、−Ｎ−及び−ＣＨ−からなる群から選択され；Ｆ’は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−Ｏ−、及び−Ｓ−からなる群から選択され；Ｇ’は、−ＣＨ−及び−Ｎ−からなる群から選択される。本明細書に挙げたヘテロシクリル基のいずれも、任意選択で、以下のものからなる群から独立に選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの置換基で置換してもよい：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、又はＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシなどのＣ１〜６アルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ１〜６アルク−Ｃ３〜８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ２〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’及びＲＣ’は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２１）チオール；（２２）Ｃ１〜６アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）アリールアルコキシ；（２５）Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）イミノ；（２８）Ｃ２〜２０アルケニル；並びに（２９）Ｃ２〜２０アルキニル。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通り、さらに置換することができる。例えば、Ｃ１−アルカリール又はＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換することにより、それぞれのアリーロイル及び（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与することができる。
【１０２６】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロシクリルアルキル」基は、本明細書で定義す
る通りのアルキレン基を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのヘテロシクリル基を表す。例示的非置換ヘテロシクリルアルキル基は、炭素数２〜３２（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル、Ｃ１〜１０アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル、若しくはＣ１〜２０アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリルなどのように、例えば、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、又は２〜１２個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキレン及びヘテロシクリルは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【１０２７】
本明細書で使用されるとき、用語「炭化水素」は、炭素及び水素原子のみから構成される基を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を表す。
【１０２８】
本明細書で使用されるとき、用語「異性体」は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像体、又はジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ又は複数のキラル中心及び／又は二重結合を有し得るため、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）又はジアステレオマー（例えば、鏡像体（すなわち、（＋）若しくは（−））又はシス／トランス異性体）として存在し得ることが認識される。本発明によれば、本明細書で描かれる化学構造、従って、本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち、立体異性体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋、鏡像体的に純粋、又はジアステレオマー的に純粋な）形態及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体の両方を包含する。本発明の化合物の鏡像体及び立体異性体の混合物は、典型的に、公知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体として化合物を結晶化する方法、又はキラル溶媒中で化合物を結晶化する方法により、それらの成分鏡像体又は立体異性体に分割することができる。鏡像体及び立体異性体はまた、公知の非対称合成方法により、立体異性体的に又は鏡像体的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から取得することもできる。
【１０２９】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｎ−保護アミノ」は、本明細書で定義する通りの１つ又は２つのＮ−保護基が結合した、本明細書で定義する通りのアミノ基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｎ−保護基」は、合成工程中に不要な反応からアミノ基を保護することが意図される基を表す。一般的に使用されているＮ−保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９９年（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されている。Ｎ−保護基としては、以下のものが挙げられる：アシル、アリーロイル、又はカルバミル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル、並びにキラル補助剤、例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンなどの保護若しくは非保護Ｄ、Ｌ若しくはＤ、Ｌ−アミノ酸；スルホニル含有基、例えば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなど；カルバメート形成基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α
，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドロキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど、アルカリール基、例えば、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなど、並びにシリル基、例えば、トリメチルシリルなど。好ましいＮ保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、及びベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
【１０３０】
本明細書で使用されるとき、用語「ニトロ」は、−ＮＯ２基を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｏ−保護基」は、合成工程中に不要な反応から酸素含有（例えば、フェノール、ヒドロキシル、若しくはカルボニル）基を保護することが意図される基を表す。一般的に使用されているＯ−保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９９年（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されている。Ｏ−保護基としては、以下のものが挙げられる：アシル、アリーロイル、又はカルバミル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル、４，４’−ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジノ、及び４−ニトロベンゾイル；アルキルカルボニル基、例えば、アシル、アセチル、プロピオニル、ピバロイルなど；任意選択で置換されたアリールカルボニル基、例えば、ベンゾイル；シリル基、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）など；ヒドロキシルを含むエーテル形成基、例えば、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなど；アルコキシカルボニル、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ−イソプロポキシカルボニル、ｎ−ブチルオキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、ｓｅｃ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、２−エチルヘキシルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、メチルオキシカルボニルなど；アルコキシアルコキシカルボニル基、例えば、メトキシメトキシカルボニル、エトキシメトキシカルボニル、２−メトキシエトキシカルボニル、２−エトキシエトキシカルボニル、２−ブトキシエトキシカルボニル、２−メトキシエトキシメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、プロパルギルオキシカルボニル、２−ブテノキシカルボニル、３−メチル−２−ブテノキシカルボニルなど；ハロアルコキシカルボニル、例えば、２−クロロエトキシカルボニル、２−クロロエトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルなど；任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メチルベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジニトロベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメチルベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシ−カルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルなど；並びに任意選択で置換されたアリールオキシカルボニル基、例えば、フェノキシカルボニル、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル、ｏ−ニトロフェノキシカルボニル、２，４−ジニトロフェノキシカルボニル、ｐ−メ
チル−フェノキシカルボニル、ｍ−メチルフェノキシカルボニル、ｏ−ブロモフェノキシカルボニル、３，５−ジメチルフェノキシカルボニル、ｐ−クロロフェノキシカルボニル、２−クロロ−４−ニトロフェノキシ−カルボニルなど）；置換されたアルキル、アリール、及びアルカリールエーテル（例えば、トリチル；メチルチオメチル；メトキシメチル；ベンジルオキシメチル；シロキシメチル；２，２，２−トリクロロエトキシメチル；テトラヒドロピラニル；テトラヒドロフラニル；エトキシエチル；１−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］エチル；２−トリメチルシリルエチル；ｔ−ブチルエーテル；ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、及びニトロベンジル）；シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル；トリエチルシリル；トリイソプロピルシリル；ジメチルイソプロピルシリル；ｔ−ブチルジメチルシリル；ｔ−ブチルジフェニルシリル；トリベンジルシリル；トリフェニルシリル；及びジフェニルメチルシリル）；カルボン酸塩（例えば、メチル、メトキシメチル、９−フルオレニルメチル；エチル；２，２，２−トリクロロエチル；２−（トリメチルシリル）エチル；ビニル、アリル、ニトロフェニル；ベンジル；メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；及びニトロベンジル）；カルボニル−保護基（例えば、アセタール及びケタール基、例えば、ジメチルアセタール、１，３−ジオキソランなど；アシラル基；並びにジチアン基、例えば、１，３−ジチアン、１，３−ジチオランなど）；カルボン酸−保護基（例えば、エステル基、例えば、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔ−ブチルエステル、オルトエステルなど；並びにオキサゾリン基。
【１０３１】
本明細書で使用されるとき、用語「オキソ」は、＝Ｏを表す。
本明細書で使用されるとき、接頭辞「ペルフルオロ」は、アルキル基に結合した各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルによって置換されている、本明細書で定義する通りのアニル基を指す。例えば、ペルフルオロ基の例としては、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどが挙げられる。
【１０３２】
本明細書で使用されるとき、用語「ホスホリル」は、
【１０３３】
【化５２】
2017522028.tif 000084
【１０３４】
を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「保護（された）ヒドロキシル」は、Ｏ−保護基に結合した酸素原子を指す。
【１０３５】
本明細書で使用されるとき、用語「スピロシクリル」は、両端が、親基の同じ炭素原子に結合して、スピロ環状基を形成する、Ｃ２〜７アルキレンジラジカル、並びに両端が、同じ原子に結合された、Ｃ１〜６ヘテロアルキレンジラジカルを表す。スピロシクリル基を形成するヘテロアルキレンラジカルは、窒素、酸素、及びイオウからなる群から独立に選択される、１つ、２つ、３つ、又は４つのヘテロ原子を含有してよい。一部の実施形態では、スピロシクリル基は、ジラジカルが結合する炭素原子を除いて、１〜７個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、任意選択で、シクロアルキル及び／又はヘテロシクリル基についての任意選択の置換基として本明細書に提供される１、２、３、若しくは４つの置換基で置換してもよい。
【１０３６】
本明細書で使用されるとき、用語「立体異性体」は、化合物（例えば、本明細書に記載する任意の式の化合物）が有し得る、考えられる全ての様々な異性体形態、並びに配座形態、特に、考えられる全ての立体化学及び配座異性体形態、基本的分子構造のあらゆるジアステレオマー、鏡像体及び／又は配座異性体を指す。本発明の一部の化合物は、様々な互変異性体で存在してもよく、その全てが、本発明の範囲に含まれる。
【１０３７】
本明細書で使用されるとき、用語「スルホニル」は、−Ｓ（Ｏ）２−基を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「チオール」は、−ＳＨ基を表す。
環状：本明細書で使用されるとき、用語「環状」、「環式」、又は「環状化」は、連続的ループの存在を指す。環状は、分子の具体的な形状又は構造を示すものではない。環状分子は、サブユニットの非開裂鎖を有する。本発明のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰなどの環状分子は、単一ユニット若しくは多量体であってもよいし、又は複合体又はさらに高次構造の１つ又は複数の成分を含んでもよい。
【１０３８】
環状ポリヌクレオチド：本明細書で使用されるとき、用語「環状ポリヌクレオチド」又は「ｃｉｒｃＰ」は、あるＲＮＡと実質的に同様に作用すると共に、ＲＮＡの特性を有する一本鎖環状ポリヌクレオチドを意味する。
【１０３９】
環状ＲＮＡ：本明細書で使用されるとき、用語「環状ＲＮＡ」又は「ｃｉｒｃＲＮＡ」は、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードすることができる環状ポリヌクレオチドを意味する。
【１０４０】
環状ＲＮＡスポンジ：本明細書で使用されるとき、用語「環状ＲＮＡスポンジ」又は「環状ＲＮＡ−ＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列と、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つの領域とを含む、環状ポリヌクレオチドを意味する。
【１０４１】
環状スポンジ：本明細書で使用されるとき、用語「環状スポンジ」、「環状ポリヌクレオチドスポンジ」、又は「ｃｉｒｃＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列を含むが、目的のポリペプチドをコードしない環状ポリヌクレオチドを意味する。
【１０４２】
化合物：本明細書で使用されるとき、用語「化合物」は、記載する構造の立体異性体、幾何異性体、互変異性体、及びアイソトープの全てを包含することを意味する。
本明細書に記載する化合物は、非対称であってよい（例えば、１つ又は複数のキラル中心を有する）。別に記載のない限り、あらゆる鏡像体及びジアステレオマーなどの立体異性体が意図される。非対称に置換された炭素原子を含む本開示の化合物は、光学活性又はラセミ形態で単離することができる。光学活性出発材料から光学活性形態を調製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ラセミ混合物の分割又は立体選択的合成によるものがある。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合などの多くの幾何異性体も、本明細書に記載の化合物に存在する可能性があり、こうした安定異性体は全て本開示において考慮される。本開示の化合物のシス及びトランス異性体が記載され、これらは、異性体の混合物又は分離された異性体形態として単離することができる。
【１０４３】
本開示の化合物はまた、互変異性体形態も含む。互変異性体形態は、隣接する二重結合による単結合のスワッピングと、それに付随するプロトンの移動により生じる。互変異性体形態は、同じ実験式及び総電荷を有する異性体のプロトン化状態である、プロトン放出互変異性体を含む。プロトン放出互変異性体の例として、ケトン−エノールペア、アミド−イミド酸ペア、ラクタム−ラクチムペア、アミド−イミド酸ペア、エナミン−イミンペア、及び環状形態があり、ここで、プロトンは、１Ｈ−及び３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−
、２Ｈ−及び４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−及び２Ｈ−イソインドール、及び１Ｈ−及び２Ｈ−ピラゾールなどの複素環系の２つ以上の位置を占め得る。互変異性体形態は、平衡状態であってもよいし、又は適切な置換によって１つの形態に立体的に固定されていてもよい。
【１０４４】
本開示の化合物はまた、中間又は最終化合物に存在する原子のアイソトープの全てを含む。「アイソトープ」は、同じ原子数を有するが、核内の中性子数が異なるために、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素のアイソトープとしては、トリチウム及び重水素がある。
【１０４５】
本開示の化合物及び塩は、常用の方法により、溶媒又は水分子と組み合わせて調製することにより、溶媒和化合物及び水和物を形成することができる。
拘束（された）（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）：本明細書で使用されるとき、用語「拘束（された）（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」は、細胞に関して述べる場合、細胞が、分化経路中に十分な程度まで進行している時点を意味し、その際、細胞は、正常な状況下で、別の細胞型にではなく、又はより低い分化細胞型に戻るのではなく、特定の細胞型若しくは細胞型のサブセットに分化し続けることになる。
【１０４６】
保存された：本明細書で使用されるとき、用語「保存された」は、比較される２つ以上の配列の同じ位置に非改変状態で存在するものである、それぞれポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基を指す。比較的保存されたヌクレオチド又はアミノ酸は、当該配列の他所に出現するヌクレオチド又はアミノ酸より関連性の高い配列の間で保存されているものである。
【１０４７】
一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一であれば、「完全に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一であれば、「高度に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、又は約９９％同一であれば、「高度に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一であれば、「保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、又は約９９％同一であれば、「保存されている」と言う。配列の保存は、オリゴヌクレオチド又はポリペプチドの全長に適用してもよいし、又はその一部、領域若しくは特徴に適用することもできる。
【１０４８】
制御放出：本明細書で使用されるとき、用語「制御放出」は、治療成果をもたらすように特定のパターンの放出に適合する医薬組成物又は化合物放出を指す。
環式又は環状化：「環状」を参照されたい。
【１０４９】
細胞増殖抑制：本明細書で使用されるとき、「細胞増殖抑制」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、プリオン、又はこれらの組み合わせの成長、分裂、若しくは増殖を阻害、低減、抑制することを指す。
【１０５０】
細胞傷害性：本明細書で使用されるとき、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、プリオン、又
はこれらの組み合わせを殺傷するか、又はこれらに傷害性、毒性、又は致命的な作用を引き起こすことを指す。
【１０５１】
送達：本明細書で使用されるとき、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴ若しくはペイロードを送達する作用又は方法を指す。
送達剤：本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、標的細胞に対するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのｉｎ  ｖｉｖｏ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
【１０５２】
不安定化された：本明細書で使用されるとき、「不安定な」、「不安定化する」、又は「不安定化領域」は、同じ領域又は分子の出発、野生型若しくはネイティブ形態よりも不安定な領域又は分子を意味する。
【１０５３】
検出可能な標識：本明細書で使用されるとき、「検出可能な標識」は、Ｘ線撮影、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む当技術分野で公知の方法により容易に検出される別の実体と結合した、それに組み込まれた、若しくはそれと会合した、１つ又は複数のマーカ、シグナル、又は部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位体、発蛍光団、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びハプテン、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は、本明細書に開示するペプチド又はタンパク質中の任意の位置に配置してよい。これらは、アミノ酸、ペプチド、若しくはタンパク質内にあってもよいし、又はＮ−若しくはＣ末端に位置してもよい。
【１０５４】
発生能：本明細書で使用されるとき、「発生能」又は「発生能力」は、分化の際に細胞により達成することができるあらゆる発生細胞運命又は細胞型の全体を指す。
発生能改変因子：本明細書で使用されるとき、「発生能改変因子」は、細胞の発生能を改変することができるタンパク質若しくはＲＮＡを指す。
【１０５５】
消化する：本明細書で使用されるとき、用語「消化する」は、より小さい断片又は成分に分解することを意味する。ポリペプチド又はタンパク質に関する場合、消化によって、ペプチドの産生が起こる。
【１０５６】
分化細胞：本明細書で使用されるとき、用語「分化細胞」は、そのネイティブ形態では多能性ではない任意の体細胞を指す。分化細胞はまた、部分的に分化した細胞も包含する。
【１０５７】
分化：本明細書で使用されるとき、用語「分化因子」は、所望の細胞型に分化するように、細胞を誘導することができるタンパク質、ＲＮＡ又は小分子などの発生能改変因子を指す。
【１０５８】
分化する：本明細書で使用されるとき、用語「分化する」は、非拘束又は低拘束細胞が、拘束細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。
遠位：本明細書で使用されるとき、用語「遠位」は、中心から離れて、又は目的の地点若しくは領域から離れて位置することを意味する。
【１０５９】
投与レジメン：本明細書で使用されるとき、用語「投与レジメン」は、治療、予防、若しくは緩和医療の投与スケジュール又は医師が決定したレジメンである。
用量分割係数（ＤＳＦ）−１日総用量又は１単位用量のＰＵＤで割った用量分割治療のＰＵＤの比。この値は、投与レジメン群の比較から得られる。
【１０６０】
胚性幹細胞：本明細書で使用されるとき、用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。
封入する：本明細書で使用されるとき、用語「封入する」は、包み込む、取り囲む、又は包むことを意味する。
【１０６１】
コードされたタンパク質切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「コードされたタンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【１０６２】
操作された：本明細書で使用されるとき、本発明の実施形態は、それらが、出発点、野生型若しくはネイティブ分子から変化した特徴又は特性（構造的若しくは化学的にかかわらず）を有するように設計されているとき、「操作されている」。
【１０６３】
エキソソーム：本明細書で使用されるとき、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞により分泌される小胞又はＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、下記のイベントの１つ又は複数を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）；（３）ポリペプチド又はタンパク質へのＲＮＡの翻訳；並びに（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。
【１０６４】
特徴：本明細書で使用されるとき、「特徴」は、特徴、特性、又は特有の要素を指す。
製剤：本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくともｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ及び送達剤を含む。
【１０６５】
断片：本明細書で使用されるとき、「断片」は、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離した完全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含み得る。
【１０６６】
機能性：本明細書で使用されるとき、「機能性」生体分子は、それが特徴とする特性及び／又は活性を呈示する形態の生体分子である。
相同性：本明細書で使用されるとき、「相同性」は、ポリマー分子同士、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／若しくはＲＮＡ分子）同士並びに／又はポリペプチド分子同士の全体的関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一であるか、又は類似していれば、互いに「相同的」であるとみなされる。用語「相同的」は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列）同士の比較を指す。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの区間にわたって、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％であれば、相同的であるとみなされる。一部の実施形態では、相同的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の独自に指定したアミノ酸の区間をコードする能力を特徴とする。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４〜５個の独自に指定したアミノ酸の区間をコードする能力によって決定される。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの区間にわたって、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％同一であれば、相同的であるとみなされる。
【１０６７】
同一性：本明細書で使用されるとき、用語「同一性」は、ポリマー分子同士、例えば、
オリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／若しくはＲＮＡ分子）同士並びに／又はポリペプチド分子同士の全体的関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性（％）の計算は、例えば、最適な比較の目的のために２つの配列をアラインメントすることによって実施することができる（例えば、最適アラインメントのために、第１及び第２核酸配列の一方若しくは両方にギャップを導入することができ、非同一配列は、比較目的のために無視することができる）。いくつかの実施形態では、比較目的のためにアラインメントした配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１配列のある位置が、第２配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているとき、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列同士の同一性（％）は、２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列が共通に有する同じ位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列同士の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、ヌクレオチド配列同士の同一性（％）は、以下の文献に記載されているものなどの方法を用いて決定することができる：「分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォーマティック及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９３年；「分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ハイーネ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第１部、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）及びグリフィン，Ｈ．Ｇ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州、１９９４年；並びに「配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）及びデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍ．ストックトン・プレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９１年；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。例えば、２つのヌクレオチド配列同士の同一性（％）は、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用い、アライン（ＡＬＩＧＮ）プログラム（バージョン２．０）に組み込まれているメイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）及びミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（カビオス（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年、第４巻：ｐ．１１〜１７）を使用して決定することができる。あるいは、２つのヌクレオチド配列同士の同一性（％）は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを用いて、決定することもできる。配列同士の同一性（％）を決定するために一般的に使用されている方法として、限定はしないが、カリロ，Ｈ（Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ）及びリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）著、ＳＩＡＭ応用数学会誌（ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８）、第１０７３巻、１９８８年（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法がある。同一性を決定する技術は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列同士の相同性を決定する例示的コンピュータソフトウェアとして、限定しないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、デベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻（１）、ｐ．３８７、１９８４年）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ、アルトシェル，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、分子生
物学会誌（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、ｐ．４０３、１９９０年）が挙げられる。
【１０６８】
免疫グロビン：本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロビン」（Ｉｇ）は、「抗体」と置き換え可能に使用することができる。
感染因子：本明細書で使用されるとき、用語「感染因子」は、感染症を引き起こすことができる因子を意味する。
【１０６９】
遺伝子の発現を阻止する：本明細書で使用されるとき、語句「遺伝子の発現を阻止する」は、遺伝子の発現産物の量の減少を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであってよい。典型的に、ｍＲＮＡのレベルの減少によって、そこから翻訳されるポリペプチドのレベルの減少が起こる。発現のレベルは、ｍＲＮＡ又はタンパク質を測定する標準的技術を用いて決定することができる。
【１０７０】
感染因子：本明細書で使用されるとき、「感染因子」は、いずれかの微生物、ウイルス、感染物質、若しくは生物工学の結果として操作され得るバイオ製品、又はこうした微生物、ウイルス、感染物質、若しくはバイオ製品のいずれかの天然に存在する若しくは生物工学で作製された成分を指し、これらは、ヒト、動物、植物若しくは別の生物において、新興感染症及び接触伝染病、死亡若しくは他の生物学的機能不全を引き起こし得る。
【１０７１】
インフルエンザ：本明細書で使用されるとき、「インフルエンザ」又は「フルー（インフルエンザ）」は、インフルエンザウイルスである、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のＲＮＡウイルスを原因とする鳥類及び哺乳動物の感染症である。
【１０７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用されるとき、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、生物（例えば、動物、植物、若しくは微生物）ではなく、人工環境、例えば、試験管若しくは反応槽内、細胞培養下、ペトリ皿内などで起こるイベントを指す。
【１０７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用されるとき、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、生物（例えば、動物、植物、若しくは微生物）において起こるイベントを指す。
単離された：本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、（天然であれ、又は実験状況であれ）それが結合していた構成成分の少なくとも一部から分離されている物質又は実体を指す。単離された物質は、それらが結合していた物質に対して変化したレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／又は実体は、それらが当初結合していた他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離されていてもよい。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、それが実質的に他の構成成分を含まない場合、「純粋」である。
【１０７４】
実質的に単離された：本明細書で使用されるとき、用語「実質的に単離された」は、それが形成又は検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的分離は、例えば、本開示の化合物が濃縮された組成物を含む。実質的分離は、本開示の化合物、又はその塩の重量当たり少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％を含有する組成物を含み得る。組成物及びその塩を単離する方法は当技術分野で常用的である。
【１０７５】
リンカー：本明細書で使用されるとき、リンカーは、原子、例えば、１０〜１，０００原子の１団を指し、限定はしないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、イオウ、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどの原子又は原子団を含み得る。リンカーは、第１端で、核酸塩基又は糖部分上の修飾ヌクレオシド若しくはヌクレオチドに結合させると共に、第２端で、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤又は治療薬に結合させることができる。リンカーは、核酸配列への組み込みを妨害しないように、十分な長さのものであってよい。リンカーは、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ多量体（例えば、２つ以上のｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ若しくはｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰの連結を介して）又は環状ポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するため、並びに本明細書に記載する通りのペイロードを投与するためなどの、あらゆる有用な目的のために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例として、限定はしないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、又はヘテロシクリルが挙げられ、これらの各々は、本明細書に記載する通り、任意選択で置換することができる。リンカーの例として、限定はしないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレン又はプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、又はテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマー及びこれらの誘導体が挙げられる。その他の例として、限定はしないが、リンカー内で切断可能な部分、例えば、還元剤又は光分解を用いて切断することができるジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）又はアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）が挙げられる。選択的に切断可能な結合の非制限的例として、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、若しくはその他の還元剤、及び／又は光分解の使用により切断することができるアミド結合、並びに例えば、酸性若しくは塩基性加水分解により切断することができるエステル結合が挙げられる。
【１０７６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書で使用されるとき、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位は、ｍｉＲＮＡの少なくとも「シード」領域が結合する核酸転写物のヌクレオチド位置又は領域を表す。
【１０７７】
修飾された：本明細書で使用されるとき「修飾された」は、本発明の分子の変化した状態又は構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的方法を含め、様々な方法で修飾され得る。一実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、それが天然のリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関連するとき、非天然のヌクレオシド及び／又はヌクレオチドの導入により修飾される。キャップ構造などの非標準のヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるものの、「修飾された」ものとはみなされない。
【１０７８】
モノクローナル抗体：本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、自然に起こり得る突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性体化、アミド化）（わずかな量で存在し得る）を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して指令され、高度に特異的である。
【１０７９】
粘液：本明細書で使用されるとき、「粘液」は、粘性であり、且つムチン糖タンパク質を含む天然の物質を指す。
多分化能：本明細書で使用されるとき、「多分化能」又は「部分的に分化した細胞」は、細胞に関する場合、３種の胚葉全てではなく、１種又は複数種の胚葉の細胞に分化する発生能を有する細胞を指す。
【１０８０】
天然に存在する：本明細書で使用されるとき、「天然に存在する」は、人工的な補助なしに自然中に存在することを意味する。
中和抗体：本明細書で使用されるとき、「中和抗体」は、その抗原に結合して、抗原若しくは感染因子が有するいずれかの生体活性を中和又は無効化することによって、抗原若しくは感染因子から細胞を防御する抗体を指す。
【１０８１】
非ヒト脊椎動物：本明細書に記載されるとき、「非ヒト脊椎動物」には、野生種及び家畜化された種を含め、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を除くあらゆる脊椎動物が含まれる。非ヒト脊椎動物の例として、限定はしないが、哺乳類、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、畜牛、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、及びヤクが挙げられる。
【１０８２】
オフターゲット：本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、いずれか１つ又は複数の標的、遺伝子、又は細胞転写物に対する何らかの意図しない効果を指す。
少能性：本明細書で使用されるとき、「少能性」は、細胞に関する場合、多分化能幹細胞よりも限定されたサブセットの細胞株を生成することを意味する。
【１０８３】
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレームに終止コドンを含まない配列を指す。
【１０８４】
作動可能に連結された：本明細書で使用されるとき、語句「作動可能に連結された」は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能性連結を指す。
任意選択で置換された：本明細書において、「任意選択で置換されたＸ」（例えば、任意選択で置換されたアルキル）という形態の語句は、「Ｘ（ここで、Ｘは任意選択で置換される）」（例えば、「アルキル（ここで、アルキルは、任意選択で置換される）」と同等であるものとする。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択であることを意味するわけではない。
【１０８５】
ペプチド：本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長である。
【１０８６】
パラトープ：本明細書で使用されるとき、「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位を指す。
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を求める若しくは必要とし得る、治療を必要とする、治療を受けている、治療を受けようとする対象、又は特定の疾患又は条件について専門家によるケアを受けている対象を指す。
【１０８７】
薬学的に許容される：語句「薬学的に許容される」は、本明細書において、信頼できる医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を起こすことなく、妥当なベネフィット／リスク比に相応する、ヒト及び動物の組織との接触での使用に好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指して用いられる。
【１０８８】
薬学的に許容される賦形剤：語句「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載する化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁又は溶解可能なビヒクル）であって、患者において実質的に非毒性且つ非炎症性の特性を有する任意の成分を指す。賦形剤としては、例えば、以下のものが挙げられる：抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、皮膚軟化剤、乳
化剤、充填剤（希釈剤）、塗膜形成剤又はコーティング剤、香味料、芳香剤、滑剤（流動促進剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤又は分散剤、甘味料、及び水和水。例示的な賦形剤として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトール。
【１０８９】
薬学的に許容される塩：本開示はまた、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」は、開示する化合物の誘導体を指し、ここで、親化合物は、既存の酸部分又は塩基部分をその塩形態に（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させて）変換することによって修飾されている。薬学的に許容される塩の例としては、限定はしないが、アミンなどの塩基性残基の無機塩又は有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ塩又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、並びに非毒性アンモニウム、第４級アンモニウム、及びアミンカチオン、例えば、限定はしないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性の無機酸又は有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩がある。本開示の薬学的に許容可能な塩は、塩基部分又は酸部分を含む親化合物から従来の化学的方法によって合成することができる。概して、こうした塩は、これらの化合物の遊離酸又は塩基形態と、水中若しくは有機溶媒中、又は両者の混合物中の適切な塩基若しくは酸の化学量論量とを反応させることによって調製することができ；一般に、非水性媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルが好ましい。好適な塩のリストは、「レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン、１９８５年、ｐ．１４１８、「製薬用塩：特性、選択、及び使用」、Ｐ．Ｈ．シュタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）及びＣ．Ｇ．ウェルムート（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（編）、ワイリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、���００８年、及びベルゲ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、薬剤科学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、ｐ．１〜１
９、１９７７年に見出され、これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【１０９０】
薬学的に許容される溶媒和物：用語「薬学的に許容される溶媒和物」は、本明細書で使用されるとき、好適な溶媒の分子が結晶格子に取り込まれている本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される用量で生理学的に許容可能である。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、又はその混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、又は沈殿により調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と称される。
【１０９１】
薬物動態：本明細書で使用されるとき、「薬物動態」は、それが、生存生物に投与される物質の運命の決定に関する場合、分子又は化合物のいずれか１つ又は複数の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝及び排出の程度及び速度を含む、いくつかの分野に分けられる。これは、一般にＡＤＭＥと呼ばれ、ここで、（Ａ）吸収（Ａｂｓｏｒｔｉｏｎ）は、血液循環に侵入する物質のプロセスであり；（Ｄ）分布（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、体液及び身体の組織全体にわたる物質の分散又は播種であり；（Ｍ）代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）（若しくは生体内変化）は、親化合物から娘代謝物への不可逆的変化であり；並びに（Ｅ）排出（若しくは排除）は、身体からの物質の排除を指す。稀に、一部の薬物は、身体組織内に不可逆的に蓄積する場合がある。
【１０９２】
物理化学的：本明細書で使用されるとき、「物理化学的」は、物理的及び／又は化学的特性、又はそれに関するものを意味する。
多能性の：本明細書で使用されるとき、「多能性の」は、様々な条件下で、３種の胚葉の全てに特有の細胞型に分化する発生能を有する細胞を指す。
【１０９３】
多能性：本明細書で使用されるとき、「多能性」又は「多能性状態」は、細胞の発生能を指し、ここで、細胞は、３種の胚葉（内胚葉、中内胚葉及び外胚葉）の全てに分化する能力を有する。
【１０９４】
単位薬物当たりのポリペプチド（ＰＵＤ）：本明細書で使用されるとき、ＰＵＤ又は単位薬物当たりの産物は、体液若しくは組織中で測定される産物（例えば、ポリペプチド）の総１日量（通常、１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇなど）の細分された部分として定義され、通常、体液中の測定基準で割った濃度、例えば、ｐモル／ｍＬ、ｍモル／ｍＬなどで決定される。
【１０９５】
予防する：本明細書で使用されるとき、用語「予防する」は、感染、疾患、障害及び／若しくは病状の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／若しくは病状の１つ又は複数の症状、特徴、若しくは臨床徴候の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／若しくは病状の１つ又は複数の症状、特徴、若しくは徴候の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の疾患、障害及び／若しくは病状からの進行を部分的又は完全に遅延させること；並びに／又は感染、疾患、障害、及び／若しくは病状に関連する疾病が発生するリスクを低下させることを指す。
【１０９６】
プロドラッグ：本開示はまた、本明細書に記載する化合物のプロドラッグも含む。本明細書で使用されるとき、「プロドラッグ」は、物質、分子又は実体が、化学的若しくは物
理的改変時に治療薬として作用することを示す形態である任意の物質、分子又は実体を指す。プロドラッグは、何らの方法で共有結合又は隔離してもよく、これは、哺乳動物対象への投与前、投与時若しくは投与後に放出されるか、又は活性薬物部分に変換される。プロドラッグは、親化合物に対して、常用の操作又はｉｎ  ｖｉｖｏで、修飾が切断されるように、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、又はカルボキシル基が、任意の基に結合し、これが、哺乳動物対象に投与されると、切断して、それぞれ、遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、又はカルボキシル基を形成する化合物を含む。プロドラッグの調製及び使用は、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）及びＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）著、「新規送達系としてのプロドラッグ（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、第１４巻、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ）、及び「薬物設計における生物可逆性担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）」エドワードＢ．ロッシュ（Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）編、米国製剤協会及びパーガモン・プレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年に論述されており、これらはいずれも、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【１０９７】
増殖する：本明細書で使用されるとき、用語「増殖する」は、成長、拡張若しくは増加する、又は急速に成長、拡張若しくは増加することを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に対抗するか、又はそれに不適切な特性を有することを意味する。
【１０９８】
前駆細胞：本明細書で使用されるとき、用語「前駆細胞」は、それが分化によってもたらし得る細胞に関して、より大きな発生能を有する細胞を指す。
予防的：本明細書で使用されるとき、「予防的」は、疾患の広がりを予防するために使用される治療又は処置の過程を指す。
【１０９９】
予防：本明細書で使用されるとき、「予防」は、健康を維持し、疾患の広がりを予防するために取られる措置を指す。「免疫予防」は、疾患の広がりを予防するために能動又は受動免疫を生成させる処置を指す。
【１１００】
タンパク質切断部位：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断部位」は、アミノ酸鎖の制御された切断が、化学的、酵素的、又は光化学的手段によって達成され得る部位を指す。
【１１０１】
タンパク質切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断シグナル」は、切断のためのポリペプチドを示す又はマークする少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質：本明細書で使用されるとき、「目的のタンパク質」又は「所望のタンパク質」には、本明細書に提供されるもの並びにその断片、突然変異体、変異体、及び改変物が含まれる。
【１１０２】
近位：本明細書で使用されるとき、用語「近位」は、中心又は目的の地点若しくは領域に対し、より近傍に位置することを意味する。
プソイドウリジン：本明細書で使用されるとき、プソイドウリジンは、ヌクレオシドウリジンのＣ−グリコシド異性体を指す。「プソイドウリジン類似体」は、プソイドウリジンの任意の修飾物、変異体、アイソフォーム又は誘導体である。例えば、プソイドウリジン類似体として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、１−プロピル−プソイドウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン
（ｍ１ψ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、及び２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）。
【１１０３】
精製された：本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製された」、「精製」は、不要な成分、材料不純物、混合物若しくは不完全物から実質的に純粋に、又は清浄にすることを意味する。
【１１０４】
反復トランスフェクション：本明細書で使用されるとき、用語「反復トランスフェクション」は、ポリヌクレオチド、一次構築物又はｍｍＲＮＡによる同じ細胞培養物の複数回のトランスフェクションを指す。細胞培養物は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回以上トランスフェクトすることができる。
【１１０５】
再プログラミング：本明細書で使用されるとき、「再プログラミング」は、細胞又は細胞の集団の発生能を逆転するプロセスを指す。
再プログラミング因子：本明細書で使用されるとき、用語「再プログラミング因子」は、タンパク質、ＲＮＡ若しくは小分子などの発生能改変因子を指し、それらの発現は、低分化又は未分化状態への細胞の再プログラミングに寄与する。
【１１０６】
サンプル：本明細書で使用されるとき、用語「サンプル」又は「生体サンプル」は、その組織、細胞又は構成部分（例えば、限定はしないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液及び精液を含む体液）のサブセットを指す。サンプルには、全生物、又はその組織、細胞若しくは構成部分のサブセット、あるいは、その画分若しくは部分、限定はしないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側切片、気道、腸管、及び尿生殖路、涙液、唾液、乳汁、血球、腫瘍、臓器から調製されるホモジネート、ライセート又は抽出物がさらに含まれ得る。サンプルはさらに、タンパク質又は核酸分子などの細胞成分を含有し得る栄養ブイヨン又はゲルなどの媒体を指す。
【１１０７】
センサー配列：本明細書で使用されるとき、語句「センサー配列」は、内因性核酸結合分子の受容体又は擬似受容体を意味する。
シグナル配列：本明細書で使用されるとき、語句「シグナル配列」は、タンパク質の輸送又は局在化を指令することができる配列を指す。
【１１０８】
１単位用量：本明細書で使用されるとき、「１単位用量」は、１用量／１回／１経路／１接触点、すなわち１回の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。
類似性：本明細書で使用されるとき、用語「類似性」は、ポリマー分子同士、例えば、核酸分子同士（例えばＤＮＡ分子及び／若しくはＲＮＡ分子間）並びに／又はポリペプチド分子同士の全体的な関連性を指す。ポリマー分子同士の類似性（％）の計算は、同一性（％）の計算と同様に実施することができるが、但し、類似性（％）の計算は、当技術分
野において理解される通り、保存的置換を考慮する。
【１１０９】
体細胞：本明細書で使用されるとき、「体細胞」は、生殖細胞以外の任意の細胞、着床前胚に存在する、若しくは着床前胚から得られる細胞、又はそうした細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖から得られる細胞を指す。
【１１１０】
体性幹細胞：本明細書で使用されるとき、「体性幹細胞」は、胎児、若年及び成体組織などの非胚性組織から得られる任意の多能性又は多分化能幹細胞を指す。
体性多能性細胞：本明細書で使用されるとき、「体性多能性細胞」は、多能性状態のものに改変された発生能を有する体細胞を指す。
【１１１１】
分割用量：本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、１単位用量又は１日総用量の２つ以上の用量への分割である。
安定した：本明細書で使用されるとき、「安定した」は、反応混合物から有用な純度までの単離に耐えるほど十分に頑健な化合物を指し、これは、有効な治療薬への製剤化が可能であることが好ましい。
【１１１２】
安定化された：本明細書で使用されるとき、「安定化する」、「安定化された」、「安定化領域」は、安定にする、又は安定になることを意味する。
幹細胞：本明細書で使用されるとき、用語「幹細胞」は、自己再生の特性を有し、特定の発生能を持つことなく、様々な細胞型に分化する発生能を有する、未分化又は部分的分化状態にある細胞を指す。幹細胞は、その発生能を維持しながら、増殖すると共に、さらに多くのそうした幹細胞を生み出す能力を有し得る。
【１１１３】
対象：本明細書で使用されるとき、用語「対象」又は「患者」は、本発明の組成物が、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療目的で投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類などの哺乳動物）及び／又は植物が挙げられる。
【１１１４】
実質的に：本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性の全て若しくはほぼ全ての範囲又は程度を示す定性的条件を指す。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が完結する、及び／又は完全性に至る又は絶対的な結果を達成若しくは回避することは、あるにしても、稀であることを理解するであろう。従って、用語「実質的に」は、本明細書では、多くの生物学的及び化学的現象に特有の、完全性の欠如の可能性を捕捉するために使用される。
【１１１５】
実質的に等しい：用量間の時間差に関して本明細書で使用されるとき、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：複数の用量に関して本明細書で使用されるとき、この用語は、２秒以内を意味する。
【１１１６】
〜に罹患している：疾患、障害、及び／又は病状「に罹患している」個体は、疾患、障害、及び／又は病状を有すると診断されているか、又はその１つ又は複数の症状を呈示する。
【１１１７】
〜に罹患しやすい：疾患、障害、及び／又は病状「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、及び／又は病状を有すると診断されていない、並びに／又はその症状を呈示しないこともあるが、疾患若しくはその症状を発生する傾向を有する。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、以下の１つ又は複数を特徴とし得る：（１）疾患、障害、及び／又は病状の発生に関連する遺伝子突然変異；（２
）疾患、障害、及び／又は病状の発生に関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、及び／又は病状に関連するタンパク質及び／又は核酸の発現及び／又は活性の増大及び／又は低減；（４）疾患、障害、及び／又は病状の発生に関連する習慣及び／又は生活様式；（５）疾患、障害、及び／又は病状の家族歴；並びに（６）疾患、障害、及び／又は病状の発生に関連する微生物への曝露及び／又は感染。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／又は病状を発生することになる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／又は病状を発生しない。
【１１１８】
持続放出：本明細書で使用されるとき、用語「持続放出」は、特定の期間にわたって特定の放出速度に従う医薬組成物又は化合物放出プロフィールを指す。
合成：用語「合成」は、人の手で生成、調製、及び／又は製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチド若しくはポリペプチド又は他の分子の合成は、化学又は酵素的であってよい。
【１１１９】
標的細胞：本明細書で使用されるとき、「標的細胞」は、目的の１つ又は複数の細胞を指す。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕで又は生物の組織若しくは臓器中に見出され得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であってよい。
【１１２０】
治療薬：用語「治療薬」は、対象に投与されると、治療的、診断的、及び／若しくは予防的効果を及ぼし、並びに／又は所望の生物学的及び／若しくは薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
【１１２１】
治療有効量：本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、感染、疾患、障害、及び／若しくは病状に罹患しているか、又はそれに罹患しやすい対象に投与されたとき、感染、疾患、障害、及び／若しくは病状を治療し、その症状を改善し、それを診断し、予防し、並びに／又はその発症を遅延させるのに十分な、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
【１１２２】
治療上有効な転帰：本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な転帰」は、感染、疾患、障害、及び／若しくは病状に罹患しているか、又はそれに罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、及び／若しくは病状を治療し、その症状を改善し、それを診断し、予防し、並びに／又はその発症を遅延させるのに十分である転帰を意味する。
【１１２３】
１日総用量：本明細書で使用されるとき、「１日総用量」は、２４時間で投与される、又は処方される量である。これは、１単位用量として投与してもよい。
分化全能性：本明細書で使用されるとき、「分化全能性」は、成人身体に見出される細胞の全て、並びに胎盤を含む胚外組織を生成する発生能を備えた細胞を指す。
【１１２４】
転写因子：本明細書で使用されるとき、用語「転写因子」は、例えば、転写の活性化又は抑制により、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を指す。ある転写因子は、転写だけの調節を実施するが、他の転写因子は、他のタンパク質と共同して作用する。ある転写因子は、特定の条件下で、転写の活性化及び抑制の両方が可能である。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定の共通配列に酷似する１つ又は複数の特定の標的配列に結合する。転写因子は、単独で、又は他の分子との複合体として、標的遺伝子の転写を調節し得る。
【１１２５】
転写：本明細書で使用されるとき、用語「転写」は、外性核酸を細胞中に導入する方法を指す。トランスフェクションの方法として、限定はしないが、化学的方法、物理的処理
及びカチオン性脂質又は混合物などが挙げられる。
【１１２６】
分化転換：本明細書で使用されるとき、「分化転換」は、１細胞型の分化細胞が、固有の特徴を喪失して、その表現型を他の完全に分化した細胞のものに変化させる能力を指す。
【１１２７】
治療する：本明細書で使用されるとき、用語「治療する」は、特定の感染症、疾患、障害、及び／若しくは病状の１つ又は複数の症状又は特徴を部分的若しくは完全に軽減し、寛解させ、改善し、緩和し、その発症を遅延させ、その進行を阻止し、その重症度を低下させ、並びに／又はその発生率を低下させることを指す。例えば、癌を「治療する」とは、腫瘍の生存、成長、及び／又は広がりを阻止することを指し得る。治療は、疾患、障害、及び／若しくは病状に関連する疾病が発生するリスクを低減することを目的として、疾患、障害、及び／若しくは病状の徴候を呈していない対象、並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは病状の初期徴候のみを呈する対象に投与することができる。
【１１２８】
非修飾：本明細書で使用されるとき、「非修飾」は、何らかの方法で変更される前のあらゆる物質、化合物又は分子を指す。非修飾は、常にではないが、生体分子の野生型若しくはネイティブ形態を指す場合もある。分子は、一連の修飾を受けることができ、その際、各修飾分子は、次の修飾のための「非修飾」出発分子として役立ち得る。
【１１２９】
単能性：本明細書で使用されるとき、「単能性」は、細胞に関して述べる場合、単一の細胞株を生み出す細胞を意味する。
ワクチン：本明細書で使用されるとき、語句「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫を向上させる生物製剤を指す。
【１１３０】
ウイルスタンパク質：本明細書で使用されるとき、語句「ウイルスタンパク質」は、ウイルスを起源とするあらゆるタンパク質を意味する。
同等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態の様々な同等物を認識するか、又は常用の実験を用いるだけでそれらを確認することができるだろう。本発明の範囲は、以上の説明に限定することは意図されず、添付の特許請求の範囲に示される通りである。
【１１３１】
特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、文脈から反対又はその他の解釈が明らかでない限り、１つ又は複数を意味し得る。ある群の１つ又は複数のメンバー間に「又は」を含むクレーム若しくは記載は、文脈から反対又はその他の解釈が明らかでない限り、群メンバーの１つ、２つ以上、若しくは全てが、所与の製品又は方法に存在する、そこで使用される、あるいは、それに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、その群の厳密に１つのメンバーが所与の製品又は方法に存在する、そこで使用される、あるいは、それに関連する実施形態を含む。本発明は、群メンバーの２つ以上、又は全てが所与の製品又は方法に存在する、そこで使用される、あるいは、それに関連する実施形態を含む。
【１１３２】
また、用語「含む」は、開放型であることが意図され、さらなる要素又はステップの包含を可能にする（しかし要求するわけではない）ことも注記される。従って、用語「含む」が本明細書で使用されるとき、用語「〜から構成される」も包含され、開示される。
【１１３３】
別に定義されない限り、本明細書で使用する技術及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示で使用する方法及び材料は、本明細書に記載されており；当技術分野で公知の他の好適な方法及び材料を使
用することもできる。
【１１３４】
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、特に指示のない限り、又はその他の解釈が文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値が、文脈から明らかに指示されるのでない限り、その範囲の下限値の単位の１０分の１までの、本発明の種々の実施形態記載する範囲内のいずれかの具体的な値又は部分範囲を想定し得ることは理解されるべきである。
【１１３５】
加えて、先行技術の範囲に含まれる本発明のいずれかの具体的な実施形態は、クレームのいずれか１つ又は複数から明示的に除外され得ることは理解されるべきである。こうした実施形態は、当業者に公知であるとみなされることから、それらは、その除外が本明細書に明示的に記載されない場合であっても除外され得る。本発明の組成物のいずれかの具体的な実施形態（例えば、任意の核酸又はそれによりコードされるタンパク質；任意の生成方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在と関連するか否かにかかわらず、何らかの理由でいずれか１つ又は複数のクレームから除外され得る。
【１１３６】
引用出典、例えば、本明細書に引用される参照文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び技術は、引用が明示的に記載されていない場合であっても、参照により本願に組み込むものとする。引用出典と本願との記載の間に矛盾が生じた場合、本願の記載が優先されるものとする。
【１１３７】
セクション及び表の見出しは、限定的であることを意図しない。
（実施例）
実施例１．線状修飾ｍＲＮＡの生成
本発明の環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を生成するために環状化することができる線状修飾核酸（ｍｍＲＮＡ）は、標準的な実験室的方法及び材料を用いて作製することができる。修飾ｍＲＮＡを作製する本明細書に記載の方法は、長い分子を含むあらゆるサイズの分子を生成するために使用することができる。目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、強力なコザック（Ｋｏｚａｋ）翻訳開始シグナルを含み得る５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、及び／又は、鋳型によるポリＡテイル付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得るα−グロビン３’ＵＴＲにより、フランキングされていてもよい。修飾ｍＲＮＡは、細胞の自然免疫応答を低減するように修飾してもよい。細胞性応答を低減する修飾としては、プソイドウリジン（ψ）及び５−メチル−シチジン（５ｍｅＣ、５ｍｃ又はｍ５Ｃ）が挙げられる（カリコ  Ｋ（Ｋａｒｉｋｏ  Ｋ）ら著、免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第２３巻、ｐ．１６５〜７５、２００５年、カリコ  Ｋ（Ｋａｒｉｋｏ  Ｋ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、第１６巻、ｐ．１８３３〜４０、２００８年、アンダーソン  ＢＲ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＢＲ）ら著、ＮＡＲ、２０１０年を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【１１３８】
ＯＲＦはまた、様々な上流又は下流付加（例えば限定はしないが、β−グロビン、タグなど）を含んでもよく、限定はしないが、ＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンロパーク）などの最適化サービスから注文することができ、ＸｂａＩ認識を有し得る多重クローニング部位を含んでもよい。構築物を受け取った後、それを再構成して、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換することができる。
【１１３９】
本発明では、ＮＥＢ  ＤＨ５−αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用する。形質転換は、１００ｎｇのプラスミドを使用してＮＥＢの指示に従い実施する。プロトコルは以下の通りである：
１  ＮＥＢ  ５−αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の試験管を氷上で１０分間解凍する。
【１１４０】
２  １ｐｇ〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有する１〜５μｌを細胞混合物に添加する。試験管を４〜５回慎重に軽く振り、細胞とＤＮＡとを混合する。ボルテックスはしない。
【１１４１】
３  混合物を氷上に３０分間置く。混合はしない。
４  正確に３０秒間、４２℃での熱ショック。混合はしない。
５  氷上に５分間置く。混合はしない。
【１１４２】
６  ピペット操作により９５０μｌの室温ＳＯＣを混合物に導入する。
７  ３７℃で６０分間置く。激しく振盪（２５０ｒｐｍ）するか、又は旋回する。
８  選択プレートを３７℃に加温する。
【１１４３】
９  試験管を軽く振り、反転させることにより、細胞を完全に混合する。
５０〜１００μｌの各希釈物を選択プレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートする。あるいは、３０℃で２４〜３６時間又は２５℃で４８時間インキュベートする。
【１１４４】
次に、単一コロニーを使用することにより、適切な抗生物質を用いた５ｍｌのＬＢ増殖培地に接種した後、５時間増殖させる（２５０ＲＰＭ、３７℃）。続いて、これを使用して２００ｍｌの培養培地に接種し、同じ条件下で一晩増殖させる。
【１１４５】
プラスミド（最大８５０μｇ）を単離するために、製造者の指示に従いインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ハイピュア・マキシプレップ・キット（ＨｉＰｕｒｅ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド）を使用して、マキシプレップを実施する。
【１１４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）用のｃＤＮＡを作製するために、まずＸｂａＩなどの制限酵素を用いてプラスミドを線状化する。典型的なＸｂａＩによる制限消化は、以下：プラスミド１．０μｇ；１０×バッファー１．０μｌ；ＸｂａＩ  １．５μｌ；ｄＨ２Ｏ最大１０μｌを含み；３７℃で１時間インキュベートする。実験室規模（＜５μｇ）で実施する場合、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド）を製造者の指示に従い使用して、反応物をクリーンアップする。より規模の大きい精製は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲキット（ＰＣＲ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド）などのより大きい負荷容量を備える製品で行う必要があり得る。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて、線状化ベクターを定量し、アガロースゲル電気泳動を用いた分析により、線状化を確認する。
【１１４７】
実施例２．ｃＤＮＡ生成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡ調製のためのＰＣＲ手順は、カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（マサチューセッツ州ウォバーン）による２×カパ・ハイファイ（ＫＡＰＡ
ＨＩＦＩ）（商標）ホットスタート・レディミックス（ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）を使用して実施する。このシステムは、２×カパ・レディミックス（ＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；リバースプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇ；及び２５．０μｌに希釈されたｄＨ２Ｏを含む。反応条件は、９５℃で５分間、９８℃で２０秒間を２５サイクル、次いで５８℃で１５秒間、続いて７２℃で４５秒間、続いて７２℃で５分間、次に終了まで４℃である。
【１１４８】
本発明のリバースプライマーは、ｍＲＮＡのポリＡ１２０（配列番号４９）のためのポリＴ１２０（配列番号５０）を組み込んでいる。より長い又はより短いポリ（Ｔ）トラクトを含む他のリバースプライマーを用いて、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルの長さを調節することができる。
【１１４９】
インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド）を製造者の指示に従い使用して（最大５μｇ）、反応物をクリーンアップする。より規模の大きい精製は、より大きな容量を備える製品を用いたクリーンアップが必要になるだろう。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）を用いて、ｃＤＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動を用いた分析により、ｃＤＮＡが予想されたサイズであることを確認する。次に、ｃＤＮＡを配列解析に供してから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応に進む。
【１１５０】
実施例３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応によって、均質に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが産生される。こうした均質に修飾されたポリヌクレオチドは、本発明のキメラポリヌクレオチドの１領域又は部分を含み得る。投入されるヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、天然及び非天然のＮＴＰを用いて、所内で作製する。
【１１５１】
典型的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応は、以下のものを含む：
１  鋳型ｃＤＮＡ  １．０μｇ
２  １０×転写バッファー（４００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ））２．０μｌ
３  カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）７．２μｌ
４  ＲＮａｓｅ阻害剤  ２０Ｕ
５  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  ３０００Ｕ
６  ｄＨ２Ｏ最大２０．０μｌ、及び
７  ３７℃で３時間〜５時間のインキュベーション。
【１１５２】
翌日にクリーンアップするために、粗ＩＶＴ混合物を４℃で一晩保存してもよい。次に１ＵのＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを用いて元の鋳型を消化する。３７℃で１５分間インキュベートした後、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースティン）を製造者の指示に従い使用して、ｍＲＮＡを精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適切なサイズであること、並びにＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。
【１１５３】
実施例４．ｍＲＮＡの酵素的キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングを以下の通りに実施し、その際、混合物は、ＩＶＴ  ＲＮＡ６０μｇ〜１８０μｇ及びｄＨ２Ｏ最大７２μｌを含む。混合物を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させた後、直ちに氷に移す。
【１１５４】
次に、プロトコルは、１０×キャッピングバッファー（０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭ  ＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）；２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（２８μ
ｌまで）の混合；及び６０μｇのＲＮＡに対して３０分間又は１８０μｇのＲＮＡに対して最大２時間の３７℃でのインキュベーションを含む。
【１１５５】
続いて、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースティン）を製造者の指示に従い使用して、ポリヌクレオチドを精製する。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適切なサイズであること、並びにＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。ＲＮＡ産物はまた、配列決定用のｃＤＮＡを作製する逆転写ＰＣＲを実行することにより、配列決定してもよい。
【１１５６】
実施例５．ポリＡテイル付加反応
ｃＤＮＡにポリＴがない場合、最終産物をクリーニングする前にポリＡテイル付加反応を実施しなければならない。これは、キャップ付きＩＶＴ  ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テイル付加バッファー（０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭ  ＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ最大１２３．５μｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより実施される。ポリＡテイルが既に転写物にある場合には、テイル付加反応は省いて、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースティン）（最大５００μｇ）によるクリーンアップに直接進んでもよい。ポリＡポリメラーゼは、酵母に発現する組換え酵素であるのが好ましい。
【１１５７】
ポリＡテイル付加反応の処理能力又は完全性から必ずしも正確なサイズのポリＡテイルが得られない場合もあることは理解すべきである。従って、約４０〜２００ヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４又は１６５ヌクレオチドのポリＡテイルは本発明の範囲内にある。
【１１５８】
実施例６．天然５’キャップ及び５’キャップ類似体
ポリヌクレオチドの５’−キャッピングは、製造者のプロトコルに従い、５’−グアノシンキャップ構造を生成する以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応中に同時に完了することができる：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウィッチ）。修飾ＲＮＡの５’−キャッピングは、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成するワクシニアウイルスキャッピング酵素（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、転写後に完了することもできる。ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼの両方を用いて、キャップ１構造を生成してもよく、これによって、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルが得られる。キャップ１構造と、これに続く２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いた５’側の終わりから３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化から、キャップ２構造を生成することもできる。キャップ２構造と、これに続く２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いた５’側の終わりから４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化から、キャップ３構造を生成することもできる。酵素は、組換え供給源に由来するのが好ましい。
【１１５９】
哺乳動物細胞にトランスフェクトされると、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間又は１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間若しくは７２時間超の安定性を有する。
【１１６０】
実施例７．キャッピング
Ａ．タンパク質発現アッセイ
ＡＲＣＡ（３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）キャップ類似体又はキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（配列中には示されない約１６０ヌクレオチド長のポリＡテイルを有する配列番号２３に示す、各シトシンを５−メチルシトシンで、また各ウリジン部位をプソイドウリジン置換で完全に修飾したｍＲＮＡ配列）は、同じ濃度でヒト一次角化細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後６、１２、２４及び３６時間の時点で、培地中に分泌されたＧ−ＣＳＦの量をＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。より高レベルのＧ−ＣＳＦを培地中に分泌する合成ｍＲＮＡは、より高度の翻訳コンピテントキャップ（Ｃａｐ）構造を有する合成ｍＲＮＡに対応すると考えられる。
【１１６１】
Ｂ．純度分析合成
ＡＲＣＡキャップ類似体又はＣａｐ１構造粗合成産物を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（配列中には示されない約１６０ヌクレオチド長のポリＡテイルを有する配列番号２３に示す、各シトシンを５−メチルシトシンで、また各ウリジン部位をプソイドウリジン置換で完全に修飾したｍＲＮＡ配列）は、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動又はＨＰＬＣ分析を用いて、純度について比較することができる。電気泳動による単一の連結バンドを有する合成ｍＲＮＡは、複数のバンド又は線状のバンドを有する合成ｍＲＮＡと比較して、より高純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ｍＲＮＡもまた、より高純度の産物に対応する。より高い効率のキャッピング反応は、より高純度のｍＲＮＡ集団を提供すると考えられる。
【１１６２】
Ｃ．サイトカイン分析
ＡＲＣＡキャップ類似体又はキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（配列中には示されない約１６０ヌクレオチド長のポリＡテイルを有する配列番号２３に示す、各シトシンを５−メチルシトシンで、また各ウリジン部位をプソイドウリジン置換で完全に修飾したｍＲＮＡ配列）は、様々な濃度でヒト一次角化細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後６、１２、２４及び３６時間の時点で、培地中に分泌されたＴＮＦ−α及びＩＦＮ−βなどの炎症促進性サイトカインの量をＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。より高レベルの炎症促進性サイトカインを培地中に分泌する合成ｍＲＮＡは、免疫活性化キャップ構造を含有する合成ｍＲＮＡに対応すると考えられる。
【１１６３】
Ｄ．キャッピング反応効率
ＡＲＣＡキャップ類似体又はキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする合成ｍＲＮＡ（配列中には示されない約１６０ヌクレオチド長のポリＡテイルを有する配列番号２３に示す、各シトシンを５−メチルシトシンで、また各ウリジン部位をプソイドウリジン置換で完全に修飾したｍＲＮＡ配列）は、キャップ付加ｍＲＮＡヌクレアーゼ処理後、ＬＣ−ＭＳによりキャッピング反応効率について分析することができる。キャップ付加ｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理によって、遊離ヌクレオチドと、ＬＣ−ＭＳにより検出可能なキャップ付加５’−５−三リン酸キャップ構造との混合物が得られる。ＬＣ−ＭＳスペクトルによるキャップ付加産物の量は、反応からの全ｍＲＮＡの割合（％）として表すことができ、キャッピング反応効率に対応すると考えられる。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳによるより多量のキャップ付加産物を有する
と考えられる。
【１１６４】
実施例８．修飾ＲＮＡ又はＲＴ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々の修飾ＲＮＡ（２０μｌの体積中２００〜４００ｎｇ）又は逆転写ＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）をウェル中の非変性１．２％アガロースＥ−ゲル（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド）上にロードし、製造者のプロトコルに従い１２〜１５分泳動させた。
【１１６５】
実施例９．ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）修飾ＲＮＡの定量及びＵＶスペクトルデータ
ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）ＵＶ吸光度読み取りのためにＴＥバッファー（１μｌ）中の修飾ＲＮＡを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応からの各修飾ＲＮＡの収率を定量した。
【１１６６】
実施例１０．タンパク質発現についてのスクリーニング方法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与された修飾ＲＮＡによりコードされたタンパク質を含有し得る生体サンプルを調製し、１、２、３又は４台の質量分析計を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）についての製造者のプロトコルに従い分析する。生体サンプルは、タンデムＥＳＩ質量分析システムを用いて分析してもよい。
【１１６７】
タンパク質断片、又は全タンパク質のパターンを所与のタンパク質の既知の対照と比較し、比較により同一性を決定する。
Ｂ．マトリックス支援レーザ脱離／イオン化
対象に投与された修飾ＲＮＡによりコードされたタンパク質を含有し得る生体サンプルを調製し、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）についての製造者のプロトコルに従い分析する。
【１１６８】
タンパク質断片、又は全タンパク質のパターンを所与のタンパク質の既知の対照と比較し、比較により同一性を決定する。
Ｃ．液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析
修飾ＲＮＡによりコードされたタンパク質を含有し得る生体サンプルは、トリプシン酵素で処理して、そこに含まれるタンパク質を消化してもよい。得られるペプチドは、液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により分析する。ペプチドを質量分析計で断片化して、コンピュータアルゴリズムによりタンパク質配列データベースとマッチし得る診断パターンを取得する。所与のタンパク質について１ｎｇ以下の出発材料を取得するために、消化されたサンプルを希釈してもよい。単純なバッファーバックグラウンド（例えば、水又は揮発性塩）を含有する生体サンプルは、直接的溶液中消化を被りやすい；より複雑なバックグラウンド（例えば、洗剤、非揮発性塩、グリセロール）は、サンプル分析を促進するために、追加のクリーンアップステップが必要である。
【１１６９】
タンパク質断片、又は全タンパク質のパターンを所与のタンパク質の既知の対照と比較し、比較により同一性を決定する。
実施例１１．ＣｉｒｃＲＮＡ構築物
本明細書に記載するｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰのいずれかは、本明細書に記載の方法及び／又は当技術分野で公知の方法により本明細書に記載する線状ポリヌクレオチドから合成することができる。
【１１７０】
ｃｉｒｃＲＮＡに作製することができる、Ｇ−ＣＳＦをコードする線状ｃＤＮＡ配列の非制限的例を表８に掲載する。この構築物は、表８に太字の斜体で示す分断ＩＲＥＳ配列
、３’ＵＴＲ中のＡＳＣ１部位及び８０ヌクレオチドのポリＡテイルを含み、コザック配列は含まない。配列の開始コドンは下線で示す。
【１１７１】
【表８−１】
2017522028.tif 000085
【１１７２】
【表８−２】
2017522028.tif 000086
【１１７３】
さらに、本発明のｃｉｒｃＲＮＡは、表９に掲載する線状構築物を用いて、作製することもできる。表９において、配列の開始コドンを下線で示し、ＩＲＥＳ配列が構築物に含まれていれば、これは太字の斜体で示す。
【１１７４】
【表９−１】
2017522028.tif 000087
【１１７５】
【表９−２】
2017522028.tif 000088
【１１７６】
【表９−３】
2017522028.tif 000089
【１１７７】
【表９−４】
2017522028.tif 000090
【１１７８】
【表９−５】
2017522028.tif 000091
【１１７９】
【表９−６】
2017522028.tif 000092
【１１８０】
【表９−７】
2017522028.tif 000093
【１１８１】
【表９−８】
2017522028.tif 000094
【１１８２】
【表９−９】
2017522028.tif 000095
【１１８３】
【表９−１０】
2017522028.tif 000096
【１１８４】
【表９−１１】
2017522028.tif 000097
【１１８５】
【表９−１２】
2017522028.tif 000098
【１１８６】
実施例１２．修飾核酸の発現に対するコザック配列の作用
１００ｕｌの細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中にウェル当たり１７，０００の密度でヒーラ細胞を接種した。ＩＲＥＳ配列及びコザック配列を有するＧ−ＣＳＦｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ＩＲＥＳ  Ｋｏｚａｋ；配列番号２５に示すｍＲＮＡ配列；配列には示されない約１４０ヌクレオチドのポリＡテイル；５’キャップ、Ｃａｐ１）；ＩＲＥＳ配列を有するが、コザック配列は含まないＧ−ＣＳＦｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ＩＲＥＳ；配列番号２７に示すｍＲＮＡ配列；配列には示されない約１４０ヌクレオチドのポリＡテイル；５’キャップ、Ｃａｐ１）；ＩＲＥＳ配列若しくはコザック配列を含まないＧ−ＣＳＦｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  ｎｏ  Ｋｏｚａｋ；配列番号２９に示すｍＲＮＡ配列；配列には示されない約１４０ヌクレオチドのポリＡテイル；５’キャップ、Ｃａｐ１）；又はコザック配列を有するＧ−ＣＳＦｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｋｏｚａｋ；配列番号３１に示すｍＲＮＡ配列；配列には示されない約１４０ヌクレオチドのポリＡテイル；５’キャップ、Ｃａｐ１）は、５−メチルシトシン及び１−メチルプソイドウリジンで完全に修飾した後、２４ウェルプレート中に７５ｎｇの濃度で試験した。トランスフェクションから２４時間後、Ｇ−ＣＳＦの発現をＥＬＩＳＡにより測定し、結果を表１０に示す。
【１１８７】
【表１０】
2017522028.tif 000099
【１１８８】
実施例１３．環状化及び／又はコンカテマー化
本発明によれば、ポリＡ結合タンパク質及び５’末端結合タンパク質同士の相互作用を補助するために、キメラポリヌクレオチドを環状化、又はコンカテマー化して、翻訳コンピテント分子を作製してもよい。環状化又はコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの
異なる経路：１）化学的、２）酵素的、及び３）リボザイム触媒によって起こり得る。新しく形成した５’／３’結合は、分子内又は分子間のいずれであってもよい。
【１１８９】
第１の経路では、核酸の５’末端及び３’末端は、化学的に反応性の基を含有し、これらは、互いに接近すると、分子の５’末端と３’末端との間に新たな共有結合を形成する。有機溶媒中で、合成ｍＲＮＡの３’末端の３’アミノ末端ヌクレオチドが、５’−ＮＨＳ−エステル部分で求核攻撃を受けて、新たな５’／３’アミド結合を形成するように、５’末端は、ＮＨＳ−エステル反応性基を含有し、３’末端は、３’アミノ末端ヌクレオチドを含有し得る。
【１１９０】
第２の経路では、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて、５’−リン酸化核酸分子を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素的に連結することにより、新たなホスホロジエステル結合を形成することができる。一例の反応では、製造者のプロトコルに従い、１〜１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウィッチ）と１μｇの核酸分子を３７℃で１時間インキュベートする。酵素的連結反応を補助するために、連結反応は、並列の５’−及び３’−領域の両方と塩基対合が可能な分断ポリヌクレオチドの存在下で行ってもよい。
【１１９１】
第３の経路では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写中に、得られる核酸分子が、核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含有できるように、ｃＤＮＡ鋳型の５’末端又は３’末端のいずれかが、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、グループＩイントロン、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ｖｉｒｕｓ）、ヘアピン（Ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムに由来するものでもよいし、又はセレックス（ＳＥＬＥＸ）（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ
ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）により選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間を要し得る。
【１１９２】
実施例１４．ＲＮＡのキメラ合成
キメラＲＮＡ分子は、環状化の前に設計及び／又は合成することができる。
Ａ．キャッピング
ＩＶＴステップから溶離したＲＮＡ（２２０μＬ）は、１５分間で６５℃に加熱した後、少なくとも２分間氷上で冷却することにより変性させる。キャッピング反応は、変性ＲＮＡ（２２０μＬ）、ＧＴＰ（１ｍＭ）、ＳＡＭ（０．５ｍＭ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１Ｕ／μＬ）、１×キャッピングバッファー、及びワクシニアキャッピング複合体（０．４Ｕ／μＬ）（ＮＥＢ）を含む３００μＬ中で実施する。これらの反応物は、サーモミキサ上で３７℃にて２時間インキュベートする。メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）スピンカラム（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて反応物を精製した後、２５０μＬの水に溶離させる。溶離したｍＲＮＡは、ＣＥ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析し、ＵＶ吸光度により定量した。
【１１９３】
Ｂ．３’−アジド−２’、３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸（３’−アジド−ｄｄＡＴＰ）の組み込み
３’−アジド−ｄｄＡＴＰは、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いたＲＮＡの３’末端への３’−アジド−ｄｄＡＴＰの組み込みによる３’−アジドＲＮＡの一般的合成を示す以下のスキーム（スキーム１）に描く通りに、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、テイルなしＲＮＡの３’末端に組み込む。
【１１９４】
【化５３】
2017522028.tif 000100
【１１９５】
１００μＬの反応物中で、ＲＮＡ転写物（０．２μＭ）、３’−アジド−ｄｄＡＴＰ（５００μＭ）、マウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）（１Ｕ／μＬ）、１×反応バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２０μＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、１０％グリセロール）、及び酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（２４００Ｕ、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））を３７℃で１時間インキュベートした後、エタノール沈殿を実施する。ＲＮＡを１００μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解させてから、イルストラ・ニック（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＩＣＫ）カラム又はイルストラ・マイクロスピン（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ）Ｇ−２５カラム（ＧＥ  ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いたゲル濾過によりさらに精製する。
【１１９６】
必要であれば、アミコン・ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−０．５遠心分離装置（１００Ｋ  ＮＭＷＬ）を用いた限外濾過によりＲＮＡを濃縮し、ＵＶ吸光度により定量して、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析する。この時点で得られたＲＮＡは、ＣＥにより識別することができない非修飾及び３’−アジドＲＮＡの混合物であり、この混合物は、これ以上精製せずに、後の反応に使用する。
【１１９７】
Ｃ．５’−ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）ポリ（Ａ）テイル１〜６の合成
歪促進アジド−アルキン環状付加（ＳＰＡＡＣ）ケミストリーを用いて、ＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートを作製するために、５’−ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）ポリ（Ａ）テイル１〜６を合成する。以下のスキーム（スキーム２）は、５’−ＢＣＮポリ（Ａ）テイル１〜６の構造を示す。テイル１〜３は、２つの２’−ＯＭｅＡと逆転Ｔを含む３’末端で安定化される。テイル４〜６は、Ａのみを含む。
【１１９８】
【化５４】
2017522028.tif 000101
【１１９９】
テイル１及び４は、固相ホスホロアミダイトオリゴマー化技術により直接合成することができるが、テイル２、３、５、及び６は、まず５’−アミノ誘導体（テイル２ａ、３ａ、５ａ、及び６ａ）として合成し、次に、これらをＮＨＳケミストリーによって反応性ＢＣＮ基とカップリングさせる。以下のスキーム（スキーム３）は、対応する５’−アミノオリゴヌクレオチドをＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩとカップリングすることによるテイル２、３、５、及び６の合成を示す。
【１２００】
【化５５】
2017522028.tif 000102
【１２０１】
テイル１、２ａ、３ａ、４、５ａ、６ａ、７及び８は、固相ホスホロアミダイトオリゴマー化技術を用いて、エクスペダイト（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）８９０９ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（パースペクティブ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ））上に集合させる。合成は、制御多孔質ガラス（ＣＰＧ、１０００Å）製の固体支持体上で、３’末端に３’−３’−結合を生成する３１μモル／ｇのロード量の固定化３’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン（プライム・シンセシス（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｓｉｓ）、米国、ペンシルベニア州アストンから入手）か、又は３２μモル／ｇでロードされる固定化５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−アデノシン（ケムジーンズ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）、マサチューセッツ州ウィルミントン；米国）のいずれかで開始する。
【１２０２】
５’末端にアミノ−リンカーを導入するために、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）−保護アミノヘキシルホスホロアミダイト（ＳＡＦＣプロリゴ（ＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ）、ドイツ、ハンブルク）又はグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（米国、バージニア州スターリング）からの対応するプロピル誘導体を使用する。アミダイトは全て無水アセトニトリル（１００ｍＭ）に溶解させ、分子篩（３Å）を添加する。５−エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中５００ｍＭ）を活性化剤溶液として使用する。カップリング時間は、ヌクレオシドホスホロアミダイトの場合５分で、リンカーアミダイトの場合は１２分である。ＲＮＡ合成のためのアンシラリー（Ａｎｃｉｌｌａｒｙ）試薬は、ＳＡＦＣプロリゴ（ＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ）（ドイツ、ハンブルク）から購入する。固相合成の完結後、乾燥させた固体支持体を１５ｍＬのポリプロピレンチューブに移し、ＲＮＡを固体支持体から切断した後、当技術分野で公知の方法（ウィンコット
Ｆ．（Ｗｉｎｃｏｔｔ  Ｆ．）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．
）、１９９５年、第２３巻、ｐ．２６７７〜８４）により脱保護する。
【１２０３】
ＡＫＴＡエクスプローラ（ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）システム（ＧＥ  ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ、フライブルク）上で、Ｘブリッジ（ＸＢｒｉｄｇｅ）Ｃ１８  １９×５０ｍｍカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、ドイツ、エシュボルン）を用いたＲＰ  ＨＰＬＣにより、粗オリゴマーを精製する。バッファーＡは、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（バイオソールブ（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ）、オランダ、ファルケンスワールト）であり、バッファーＢは、バッファーＡ中に９５％アセトニトリルを含有した。１５ｍＬ／分の流量を使用する。２６０及び２８０でのＵＶトレースを記録した。５７カラム容量内で５％Ｂから４５％Ｂへの勾配を使用した。適切な画分をプールし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ＝５．２及び７０％エタノールで沈殿させる。ペレットを遠心分離により単離し、水に溶解させた後、ＵＶ光度計（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ドイツ）を用いた２６０ｎｍでの吸光度測定により、溶液の濃度を決定する。
【１２０４】
上記のスキーム３に描く通りのＮＨＳケミストリーによりテイル２、３、５、及び６を生成するカップリングステップのために、それぞれのアミン修飾オリゴリボヌクレオチドは、５００μＭの濃度をもたらすように、１００ｍＭホウ酸ナトリウム／ＫＣｌバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させる。クリック−イージー（Ｃｌｉｃｋ−ｅａｓｙ）（登録商標）ＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩ（５ｍｇ、ベリー・アンド・アソシエイツ社（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、米国、ミシガン州デクスター）を５０μＬのＤＭＳＯに溶解させる。３当量のＢＣＮ誘導体をＲＮＡ溶液に添加することにより、反応を開始する。反応の進行は、アニオン交換ＨＰＬＣカラム（ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＤＮＡ  Ｐａｃ  ＰＡ２００、４×２５０ｍｍ、ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）、ドイツ、イトシュタイン）上の保持時間の変化によりモニターする。反応の完了後、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）／ＥｔＯＨを用いて、オリゴリボヌクレオチドコンジュゲートを沈殿させてから、Ｃ１８  Ｘブリッジ（ＸＢｒｉｄｇｅ）逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、ドイツ、エシュボルン）上で精製する。
【１２０５】
Ｄ．歪促進アジド−アルキン環状付加（ＳＰＡＡＣ）を用いたポリ（Ａ）テイル共役
歪促進アジド−アルキン環状付加（ＳＰＡＡＣ）を用いて、３’末端が３’−アジド−ｄｄＡＴＰで修飾されたＲＮＡ転写物を８０ｎｔ５’−ＢＣＮポリ（Ａ）テイルに連結することにより、以下のスキーム（スキーム４）に示す一般的形態のＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートを取得する。スキームは、３’−アジド−ＲＮＡ及び５’−ＢＣＮポリ（Ａ）テイルを用いたＳＰＡＡＣによるＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートの一般的合成を示す。
【１２０６】
【化５６】
2017522028.tif 000103
【１２０７】
３’−アジドＲＮＡ及びテイル１をそれぞれ少なくとも１：５０モル比で水中に混合してから、７０％エタノールの最終濃度に達するまで、エタノールで希釈する。一般に、３’−アジドＲＮＡの濃度は、反応混合物中１５０〜４００ｎＭである。反応物を室温で１時間振盪させ、必要であれば２００μＬまで水で希釈し、エタノール沈殿させた後、ＤＥＰＣ処理水に溶解させる。
【１２０８】
あるいは、反応物は、メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））により精製した後、水中に溶離させる。ＲＮＡ反応混合物は、ＣＥ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析する。
【１２０９】
また、コンジュゲートは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写を介したポリ（Ａ）テイルを既に含むＲＮＡと、テイル１及び４を用いて同様に作製することもできる。
余剰の非反応５’−ＢＣＮテイルを除去するために、室温で１時間の振盪により、反応混合物を１０％ＤＭＳＯ中アジ化ビオチン（５００μＭ）と反応させた後、メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）精製を実施する。
【１２１０】
次に、Ｍ−２８０ストレプトアビジン・ダイナビーズ（Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるストレプトアビジン捕捉に付す。ビーズ（２００μＬ、２ｍｇ）は、高塩濃度バッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で３回洗浄した後、２００μＬの高塩濃度バッファーに懸濁させる。約１．３ｎモルの５’−ＢＣＮテイルを含む反応混合物を２００μＬまで希釈して最終濃度１×高塩濃度バッファーにした後、ビーズに添加する。サンプル及びビーズを室温で１５分間混合する。この上清を保存し、エタノール沈殿させる。
【１２１１】
ＣＥを用いて、５’−ビオチン−テイルが反応混合物から除去されたことを確認した。この手順後のクリック構築物の純度は、８０％超である。
Ｅ．ＳＰＡＡＣを用いたＤＮＡスプリント鋳型ポリ（Ａ）テイル共役
ＲＮＡの３’末端及びポリ（Ａ）テイルと相同的なＤＮＡスプリントを用いて、ＳＰＡＡＣ反応物を鋳型化する。ＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートは、１Ｍ  ＮａＣｌ
を含有する１００μＬの反応物中に、３’−アジドＲＮＡ、５’−ＢＣＮポリ（Ａ）テイル、及びスプリントを１：３：３のモル比で混合することにより合成し、それぞれ１００ｎＭ：３００ｎＭ：３００ｎＭの最終濃度とする。ＲＮＡ及びＤＮＡスプリント混合物を７０℃で５分間加熱し、２５℃に達するまで１℃／分で冷却した後、２５℃で一晩維持する。限外濾過（アミコン・ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−０．５遠心分離装置１００Ｋ  ＮＭＷＬ）により塩類を除去する。
【１２１２】
ＤＮＡスプリントは、わずか２００ｎｇ／μＬ以下の反応混合物、１×反応バッファー、及びＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（２Ｕ）を含有する５０μＬの反応物中のＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いた消化により除去する。これらの反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、２μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加により停止させる。バッファー成分を限外濾過により再度除去する。オリゴ（Ｔ）ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて、非修飾及び非反応３’−アジドＲＮＡからＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートを精製する。オリゴ（Ｔ）精製は、製造者のプロトコルにより指示される通りに実施するが、但し、ビーズを洗浄し、ＲＮＡサンプルは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する高塩濃度バッファー中で調製し、結合後に、ビーズは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する低塩濃度バッファーで洗浄し、ＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶離させる。
【１２１３】
クリック反応及び精製の全ステップは、ＣＥ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析する。
Ｆ．３’−アジド−ｄｄＡＴＰ組み込みの分析
３’−アジドＲＮＡ及びＲＮＡ−テイルコンジュゲートは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによるポリ（Ａ）伸長のために３’末端でブロックされていることから、非修飾ＲＮＡだけが酵素的テイル付加のための基質である。非修飾ＲＮＡ、従って、３’−アジドＲＮＡの割合（％）は、非修飾ＲＮＡの除去及びＲＮＡ−テイル１コンジュゲートピークの面積への正規化後の非修飾ＲＮＡ及び３’−アジドＲＮＡ混合物に対応するピークの面積の差（％）を計算することによって決定することができる。
【１２１４】
多くの事例で、クリック反応は、記載する条件下で完了に到達するため、単純にＲＮＡ−テイルコンジュゲートの収率（％）を決定するだけでアジ化物組み込みの定量が可能である。
【１２１５】
１０μＬにおいて、７０％エタノール中でのＳＰＡＡＣ反応後のＲＮＡ混合物は、ＲＮＡ反応混合物（３００〜４００ｎｇ／μＬ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、及び１×反応バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を含有する反応物中、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）（５Ｕ）で処理する。酵素を一切含まない反応物も、比較対照のために使用する。非修飾ＲＮＡをテイルと混合した後、ポリ（Ａ）ポリメラーゼで処理する対照を実施することにより、全ての非修飾ＲＮＡがテイル付加されていることを確認することもできる。限外濾過により反応物から塩類を除去した後、ＣＥにより反応物を分析する。
【１２１６】
対照反応物では、ＰＡＰでの処理により、全ての非修飾ＲＮＡを延伸する。これらの全事例で、ＳＰＡＡＣ反応及びＰＡＰでの処理後、非修飾ＲＮＡ及び３’−アジドＲＮＡの推定混合物を示すピーク中にＲＮＡは一切残っておらず、これは、クリック反応が完了し、アジ化物組み込みがＲＮＡ−テイルコンジュゲートの収率（％）から決定することができることを示している。
【１２１７】
Ｇ．ｍチェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）蛍光の曲線下総面積
作製したｍＲＮＡ（５０ｎｇ）は、リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）２０００（商標）を用いて、ヒーラ細胞にトランスフェクトする。細胞をインキュサイト（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）キネティックイメージングシステム（エッセン・バイオサイエンス（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）内に配置し、そこで、１４２時間にわたって２時間毎にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を測定した。各トランスフェクションは３回反復して実施する。グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて、曲線下総面積を統合する。
【１２１８】
Ｈ．ヒーラ細胞における活性
作製したｍＲＮＡ（２５ｎｇ）は、リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）２０００（商標）を用いて、ヒーラ細胞に３回反復してトランスフェクトする。一晩のインキュベーション後、ＧＬＯ溶解バッファー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中に細胞を溶解させる。ＮａｎｏＧｌｏ基質を添加し、シナジー・マイクロプレート・リーダ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（バイオテク（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、発光シグナルを定量する。
【１２１９】
Ｉ．ヒーラ細胞における発現
作製したｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）は、リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）２０００（商標）を用いて、ヒーラ細胞に３回反復してトランスフェクトする。一晩のインキュベーション後、上清を回収し、これを用いて、タンパク質のレベルを測定する（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【１２２０】
Ｊ．ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＢＪ線維芽細胞の上清中のＩＦＮβレベル
作製したｍＲＮＡ（５００ｎｇ）は、リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）２０００（商標）を用いて、ＢＪ線維芽細胞に３回反復してトランスフェクトする。４８時間のインキュベーション後、上清を回収し、これを用いて、ヒトインターフェロンβのレベルを測定する（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【１２２１】
実施例１５．環状化のためのＲＮＡ転写物の作製
Ａ．ＲＮＡの転写
一般に、当技術分野で公知の方法並びに／又は実施例１及び実施例３に記載の方法を用いて、線状ＲＮＡ分子を転写する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応によって、修飾ヌクレオチドを含有し得るポリヌクレオチドを作製する。こうしたポリヌクレオチドは、均質に修飾されるか、又は修飾ヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドの１領域若しくは部分を含む。投入するヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、所内で製造するか、又は天然及び非天然ＮＴＰを用いた市販の試薬から構築することができる。
【１２２２】
Ｂ．ＲＮＡ転写物５’末端官能基の作製
環状化のために、線状ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ転写物）の５’末端及び３’末端を修飾して、環状化のための好適な官能基を付与する。５’末端では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、修飾グアノシン（例えば、５’−アミノグアノシン、５’アジ化物グアノシン（５’アジドグアノシンとしても知られる）など）（集合的に「５’Ｇｍｏｄ」）又は５’グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）をＲＮＡの５’末端に組み込む。ＩＶＴ反応において、５’−アミノグアノシン、５’アジ化物グアノシン又はＧＭＰを指定の（例えば、１０：１）比でグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）に組み込む。ＧＭＰの組み込みにより、例えば、Ｔ４ＲＮＡ（又はＤＮＡ）リガーゼを用いた線状ＲＮＡの末端の酵素的結合が促進される。修飾グアノシンの組み込みは、例えば、特定のクリックケミストリーリガンドなどを促進する。
【１２２３】
どのようにしてＧＭＰを転写物に十分に組み込むかを決定する予備試験では、ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡをグアノシン一リン酸（ＧＰＭ）及びヌクレオチド三リン酸で転写することにより、５’−一リン酸ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡを形成する。ＧＭＰとＧＴＰの比を１：１、４：１又は１０：１としたところ、５’−一リン酸ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡは、１−メチルプソイドウリジンで完全に修飾された。ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡを転写した後、キャッピング反応を実施した。ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＡＴＰ及び修飾ＵＴＰ（Ｎ１−メチル−プソイドウリジンを含むｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡの場合、９８％のキャッピングが達成された。ＣＴＰ、ＡＴＰ、修飾ＵＴＰ、及び２：１比のＧＭＰ：ＧＴＰを含むｍＣｈｅｒｒｙの場合、１６．７１％のキャッピングが観察されたが、これは、＞８０％の分子が、５’末端にＧＭＰを有しており、従って、Ｔ４リガーゼの基質となることを示している。ＣＴＰ、ＡＴＰ、修飾ＵＴＰ、及び４：１比のＧＭＰ：ＧＴＰで転写したｍＣｈｅｒｒｙの場合、１１％のキャッピングが観察され、これは、最大９０％の分子が、５’末端にＧＭＰを有しており、従って、Ｔ４リガーゼの基質となることを示している。ＣＴＰ、ＡＴＰ、修飾ＵＴＰ、及び４：１比のＧＭＰ：ＧＴＰで転写したｍＣｈｅｒｒｙの場合、５．５％のキャッピングは、最大９４％の分子が、５’末端にＧＭＰを有しており、従って、Ｔ４リガーゼの基質となることを示している。
【１２２４】
５’ＧＭＰ転写産物を作製する別の方法は、精製後に、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＡＴＰ転写産物を５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＮＥＢ）で処理することにより、転写ＲＮＡの５’末端からガンマ型及びベータ型リン酸塩を除去し、５’末端に一リン酸塩を残すものである。反応は、１×反応バッファー（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中、３７℃で２時間実施した後、ミルバナ（ＭｉｒＶａｎａ）（商標）又はメガクリア（ＭｅｇａＣｌｅａｒ）（商標）クリーンアップキットを用いて精製する。
【１２２５】
Ｃ．ＲＮＡ転写物３’末端官能基の作製
３’末端官能基を作製するために、以下の通りに３’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸（３’−アジド−ｄｄＡＴＰ）を組み込んだ。１００μＬの反応物中で、ＲＮＡ転写物（０．２μＭ）、３’−アジド−ｄｄＡＴＰ（５００μＭ）、マウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）（１Ｕ／μＬ）、１×反応バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２０μＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ
ＤＴＴ、１００μｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、１０％グリセロール）、及び酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（２４００Ｕ、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））を３７℃で１時間インキュベートした後、エタノール沈殿を実施する。ＲＮＡを１００μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解させてから、イルストラ・ニック（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＩＣＫ）カラム又はイルストラ・マイクロスピン（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ）Ｇ−２５カラム（ＧＥ  ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いたゲル濾過によりさらに精製する。必要であれば、アミコン・ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−０．５遠心分離装置（１００Ｋ  ＮＭＷＬ）を用いた限外濾過によりＲＮＡを濃縮し、ＵＶ吸光度により定量して、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析する。この時点で得られたＲＮＡは、ＣＥにより識別することができない非修飾及び３’−アジドＲＮＡの混合物であり、この混合物は、これ以上精製せずに後の反応に使用することができる。
【１２２６】
【化５７】
2017522028.tif 000104
【１２２７】
スキーム１．ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いたＲＮＡの３’末端への３’−アジド−ｄｄＡＴＰの組み込みによる３’−アジドＲＮＡの一般的合成
３’アジ化物組み込みの程度を決定するために、診断クリック反応を用いて、転写物３’末端を特性決定することができる。手短には、歪促進アジ化物−アルキン環状付加（ＳＰＡＡＣ）を用いて、３’末端が３’−アジド−ｄｄＡＴＰで修飾されたＲＮＡのアリコートを短い（例えば、８０ｎｔ）５’−ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）ポリ（Ａ）テイルに連結させることによって、ＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートを取得する。７０％エタノール中でのＳＰＡＡＣ反応後、ＲＮＡ種の混合物が生成されるが、これは、恐らく、非修飾ＲＮＡ、非処理３’−アジドＲＮＡ、及び所望のＲＮＡ−テイルコンジュゲートを含有している。しかし、非修飾ＲＮＡと３’−アジドＲＮＡは識別不能であるため、これは、ＣＥ電気泳動図の２つの明瞭なピークに対応するに過ぎない。３’−アジドＲＮＡ及びＲＮＡ−テイルコンジュゲートは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによるポリ（Ａ）伸長のために３’−末端でブロックされることから、非修飾ＲＮＡだけが酵素的テイル付加のための基質である。非修飾ＲＮＡ、従って、３’−アジドＲＮＡの割合（％）は、非修飾ＲＮＡの除去及びＲＮＡ−テイルコンジュゲートピークの面積への正規化後の非修飾ＲＮＡ及び３’−アジドＲＮＡ混合物に対応するピークの面積の差（％）を計算することによって決定することができる。多くの事例で、クリック反応は、記載する条件下で完了するため、単純にＲＮＡ−テイルコンジュゲートの収率（％）を決定するだけでアジ化物組み込みの定量が可能である。
【１２２８】
１０μＬにおいて、７０％エタノール中でのＳＰＡＡＣ反応後のＲＮＡ混合物は、ＲＮＡ反応混合物（３００〜４００ｎｇ／μＬ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、及び１×反応バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を含有する反応物中、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）（５Ｕ）で処理する。酵素を一切含まない反応物も、比較対照のために使用する。全ての非修飾ＲＮＡがテイル付加されていることを確認するために、非修飾ＲＮＡを５’−ＢＣＮテイルと混合した後、ポリ（Ａ）ポリメラーゼで処理した対照も実施した。限外濾過により反応物から塩類を除去した後、ＣＥにより反応物を分析した。対照反応物では、ＰＡＰでの処理により、全ての非修飾ＲＮＡが延伸される。これらの全事例で、ＳＰＡＡＣ反応及びＰＡＰによる処理後、非修飾ＲＮＡ及び３’−アジドＲＮＡの推定混合物を示すピーク中にＲＮＡは一切残っておらず、これは、診断クリック反応が完了に達し、アジ化物の組み込みが、ＲＮＡ−テイルコンジュゲートの収率（％）から決定することができることを示している。
【１２２９】
Ｄ．製剤化
本明細書に記載する線状ポリヌクレオチド又は環状ポリヌクレオチドのいずれかを本明細書に記載する通りに製剤化することができる。ポリヌクレオチドを製剤化するための非
制限的例及び方法は、国際公開第２０１３０９０６４８号パンフレット及び同第２０１４１５２２１１号パンフレットに記載されており、これらの各々の内容は、全体として本明細書に組み込むものとする。
【１２３０】
実施例１６．線状ＲＮＡの環状化
Ａ．ＤＮＡｚｙｍｅを用いた環状化
一方法では、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及びヌクレオチド三リン酸混合物で線状ＲＮＡを転写することにより、５’−三リン酸ＲＮＡを形成する。連結は、当技術分野で公知の方法及び／又は本明細書に記載の方法を用いて実施する（ホィットニー（Ｗｈｉｔｎｅｙ）ら著、米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、２００５年、第１２７巻、ｐ．１３１２４〜１３１２５）。ＤＮＡｚｙｍｅは、以下に示す線状ＲＮＡＤＮＡｚｙｍｅ（ＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＧＴＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣＣ；配列番号４１）の５’及び３’末端にアニーリングするように設計される。２つのオリゴは、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７．５及びＮａＣｌを含有する反応バッファー中で、５分以下の短い時間高温（＞６５℃）に曝露した後、室温まで冷却させる。一旦反応物が冷却したら、塩化亜鉛を添加して、反応を触媒する。ＲＮＡの環状化は、ＤＮＡｚｙｍｅ消化を用いて明らかにされる。
【１２３１】
ＤＮＡｚｙｍｅは、本明細書に記載する通りの配列、例えば、配列番号４１に示す配列を有し得る。こうしたＤＮＡｚｙｍｅ配列は、次のような構造組成を有する：分子（例えば、環状化しようとするＲＮＡ分子）の５’末端と相補的なヌクレオチド−ＤＮＡｚｙｍｅのコア−分子（例えば、環状化しようとするＲＮＡ分子）の３’末端と相補的なヌクレオチド。
【１２３２】
例示的構築物では、ＤＮＡｚｙｍｅは、コアにフランキングする、分子（例えば、環状化しようとするＲＮＡ分子）の５’末端と相補的な約１５ヌクレオチド及び分子（例えば、環状化しようとするＲＮＡ分子）の３’末端と相補的な約１５ヌクレオチドを含む。例示的構築物では、ＤＮＡｚｙｍｅコアにフランキングする、分子（例えば、環状化しようとするＲＮＡ分子）の５’末端と相補的な約１０〜約２０又は約１２〜約２５ヌクレオチド及び分子（例えば、環状化しようとするＲＮＡ分子）の３’末端と相補的な約１０〜約２０又は約１２〜約２５ヌクレオチドを含む。例示的ＤＮＡｚｙｍｅ（配列番号４１）では、ヌクレオチド１〜１５が分子の５’末端と相補的であり、ヌクレオチド１６〜５５がコアを含み、ヌクレオチド５６〜７２が分子の３’末端と相補的である。
【１２３３】
例示的コア配列のさらに詳細な説明は、例えば、ホィットニー（Ｗｈｉｔｎｅｙ）ら著、２００５年、第１２７巻、ｐ．１３１２４〜１３１２５に見出すことができる。
コアを維持するが、相補的配列の塩基組成が異なる遺伝子ＤＮＡｚｙｍｅ配列を構築することができる。相補的フランキング領域については、目的のＲＮＡ間の塩基対合が維持される限り、長さ及び塩基組成は変わってもよい。
【１２３４】
別の方法では、ＧＭＰ：ＧＴＰの比による転写により設置されるか、又はＧＭＰを生成するためのピロホスホヒドロラーゼを用いたＧＴＰ転写ＲＮＡの処理により作製された５’ＧＭＰ末端を有する線状ＲＮＡは、スプリントで促進されるＴ４ＤＮＡリガーゼ又はＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて連結することによって、３’及び５’末端を連結する。スプリント連結反応は、当技術分野で公知の方法及び／又は本明細書に記載の方法を用いて実施する（ムーア（Ｍｏｏｒｅ）及びシャープ（Ｓｈａｒｐ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９２年、第２５６巻、第５０５９号、ｐ．９９２〜９９７、並びにスターク（Ｓｔａｒｋ）ら著、ＲＮＡ、２００６年１１月、第１２巻（１１）、ｐ．２０１４〜２０１９）。一例として、スプリント１（ＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴ
ＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣ；配列番号３９）又はスプリント２（ＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣＣＡＣＴＣ；配列番号４０）を線状ＲＮＡの５’及び３’末端にアニーリングする。アニーリングの前に、ＲＮＡは、水中で、高温（＞６５℃）にて短時間（＞１０分）変性させる。一旦ＲＮＡが変性したら、緩衝溶液中にスプリントを過剰量添加し、この混合物を高温に加熱することによりアニーリングを促進した後、室温まで冷却させる。アニーリングした混合物が室温に達した後、反応物を反応バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０％ＰＥＧ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に移してから、室温まで冷却させる。冷却した混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼを添加した後、反応を２５℃で４時間〜一晩進行させる。続いて、ミルバナ（ＭＩＲＶＡＮＡ）（商標）全ＲＮＡ単離プロトコルを用いて、連結反応物を精製する。次に、ＤＮＡｓｅ  Ｉを用いて、精製済反応物を処理することにより、ＤＮＡスプリントを消化した後、再度精製する。ＲＮＡの環状化は、ＤＮＡｚｙｍｅ消化を用いて明らかにされる。
【１２３５】
スプリント配列（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼの場合、本明細書に記載するＴ４ＤＮＡリガーゼ又はケミカルダンベル（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｕｍｂｂｅｌｌ）手法）は、本明細書に記載する通りの配列、例えば、配列番号３９及び４０を有し得る。こうしたスプリント配列は、次のような構造組成を有する：環状化しようとするＲＮＡの最も５’側のヌクレオチドと相補的なヌクレオチド−環状化しようとするＲＮＡの最も３’側のヌクレオチドと相補的なヌクレオチド。
【１２３６】
例示的構築物では、スプリントは、環状化しようとするＲＮＡの最も５’側の約１５〜２５ヌクレオチドと相補的なヌクレオチド、及び環状化しようとするＲＮＡの最も３’側の約１５〜２５ヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む。
【１２３７】
スプリント１（配列番号３９）は、例えば、環状化しようとするＲＮＡの最も５’側の１６塩基に相補的な１６のヌクレオチド（例えば、配列番号３９のヌクレオチド１〜１６）、及び環状化しようとするＲＮＡの最も３’側の１７ヌクレオチドに相補的な１７のヌクレオチド（例えば、配列番号３９のヌクレオチド１７〜３３）を含む。スプリント２（配列番号４０）は、例えば、環状化しようとするＲＮＡの最も５’側の２０ヌクレオチドに相補的な２０のヌクレオチド（例えば、配列番号４０のヌクレオチド１〜２０）、及び環状化しようとするＲＮＡの最も３’側の２２ヌクレオチドに相補的な２２のヌクレオチド（例えば、配列番号４０のヌクレオチド２１〜４２）を含む。目的とする任意のＲＮＡ／ｍＲＮＡの遺伝子スプリントは、同じ方法で設計することができる。任意のＲＮＡ／ｍＲＮＡのスプリントの塩基組成は、環状化しようとするＲＮＡ／ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に応じて、様々な塩基組成を有し得る。
【１２３８】
別の方法では、ＧＭＰ：ＧＴＰの比による転写により設置されるか、又はＧＭＰを生成するためのピロホスホヒドロラーゼを用いたＧＴＰ転写ＲＮＡの処理により作製された５’ＧＭＰ末端を有する線状ＲＮＡは、スプリントを使用せずに、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて連結する。１０ｕｇのＲＮＡは、サーモサイクラーにおいて６５℃で１０分間加熱することにより、変性させる。反応物を１０分間室温まで冷却させる。１×Ｔ４ＲＮＡ連結バッファーの連結マスターミックス（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）、５０μＭ  ＡＴＰ、１０％ＰＥＧ８０００、２０単位のＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）を添加する。１μｌ（１０単位）のＴ４ＲＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を添加する。反応物を２５℃で２時間、又は１６℃で一晩インキュベートする。５０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により反応を停止させる。反応物への１．５容量の１００％エタノールの添加、それに続くミルバナ（ｍｉｒＶａｎａ）（商標）全ＲＮＡ単離プロトコルにより、連結物を精製する。連結生成物をカラムから５０μｌの９５℃の水中に溶離させる。ＲＮＡの環状化は、ポリＡポリメラーゼ伸長（実施例１８Ａ）ＤＮＡｚｙｍｅ消化（
実施例１８Ｂ）を用いて明らかにされる。
【１２３９】
上記の方法のいずれにおいても、得られるＲＮＡは、キャップを含み得ることから、ＤＮＡｚｙｍｅ消化アッセイ（以下に詳しく説明する）を用いて、転写物末端の連結を確認することができる。
【１２４０】
Ｂ．ケミカルダンベル及びクリックを用いた環状化
一方法では、グアノシン−５’−（６−アミノヘキシル）−一リン酸で線状ＲＮＡを転写する。ＲＮＡの３’末端でＰＡＰ反応（ポリＡポリメラーゼ反応）を実施した後、精製して、前述した通りに３’末端にアジ化物を付加する。次に、ｐＨ７以上の重炭酸ナトリウム溶液中でのＮＨＳ共役反応により、５’アミンをケミカルダンベルで官能化する。ケミカルダンベルは、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−スルホ−ＮＨＳエステル又はＤＢＣＯ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであってよい。この反応を少なくとも２時間進行させる。ＮＨＳエステル共役反応が完了したら、反応混合物をバッファー交換してから、非反応ケミカルダンベルを全て除去する。二官能化ＲＮＡは、３’及び５’末端と相補的なスプリントとの混合物であり、シクロオクチン（５’末端とアジ化物（３’末端）官能基を連結し得る。スプリント１（ＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣ；配列番号３９）又はスプリント２（ＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣＣＡＣＴＣ；配列番号４０）を濃縮溶液中でＲＮＡとアニーリングし、銅フリーのクリックケミストリー反応を進行させる。環状化は、ＤＮＡｚｙｍｅ消化を用いて明らかにすることができる。
【１２４１】
Ｃ．オリゴダンベル及びクリックを用いた環状化
一実施形態では、線状ＲＮＡは、５’アジドグアノシンで転写する。ＲＮＡの３’末端でＰＡＰ反応（ポリＡポリメラーゼ反応）を実施することにより、前述した通りに３’アジ化物を設置する。ＵＰＬＣ（登録商標）を用いて、官能化線状ＲＮＡを評価する。線状の官能化ＲＮＡは、オリゴＤＢＣＯｄＴ  ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ  ｄＴＤＢＣＯ（配列番号４３）及びスプリント３（ＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣＣＡＣＴＣ；配列番号４４）又はスプリント４（ＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣ；配列番号４５）を用いて、クリック方法により環状化する。
【１２４２】
実施例１７．環状化のためのＲＮＡ
表１１に示す線状ＲＮＡは、当技術分野で公知の方法及び／又は本明細書に記載する方法を用いて環状化される。表１１において、構築物１及び構築物２の最初の「Ｇ」は、ＧＭＰ、５’−アジドグアノシン、５’−アミノグアノシンなどの修飾Ｇが位置し得る箇所である。構築物１の場合、最初の４７個の太字で示すヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列であり、５’ＵＴＲ中の太字且つ斜体で示すヌクレオチドは、診断用切断アッセイに用いられ得るＤＮＡｚｙｍｅの結合部位であり、５’ＵＴＲ中の下線を引いた太字且つ斜体のＧは、切断の実際部位である。構築物１のヌクレオチド４８〜５１３の太字は、ｍｉＲ−１２２−５ｐ配列である。太字で示すヌクレオチド５１４〜５６９は、３’ＵＴＲ配列であり、斜体で示すヌクレオチドは、ＤＮＡｚｙｍｅの結合部位であり、下線を引いた太字且つ斜体のヌクレオチドは、切断の実際部位である。構築物１の末端で、ヌクレオチド５７０〜５７５（ＵＣＵＡＧＡ配列）は、プラスミド鋳型から転写されたＸｂａＩ部位配列であり、この配列の末端のＡＡＡＡは、ＰＡＰ反応を促進することを目的とする。構築物２は、構築物１と同じ特徴を有し、５’ＵＴＲの５’末端に「ＮＨ」を有する。構築物２の「ＮＨ」は、ＲＮＡの５’末端のアミノ−修飾官能基を表す。あるいは、Ｎ３でＮＨを置換してもよく、これは、ＲＮＡの５’末端のアジ化物−修飾官能基を表す。
【１２４３】
【表１１】
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【１２４４】
一実施形態では、表１１の構築物は、酵素的連結、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（若しくはＤＮＡリガーゼ）連結又はＤＮＡｚｙｍｅ連結を用いて環状化する。非制限的例として、構築物１は、ＧＭＰ官能化ＲＮＡ及び酵素的連結、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、又
はＧＴＰ含有ＲＮＡ及びＤＮＡｚｙｍｅ連結（特殊ＤＮＡｚｙｍｅでの）を用いて環状化する。
【１２４５】
別の方法では、表１１の構築物は、クリックベースのケミカルダンベル５’−３’連結を用いて環状化する。非制限的例として、構築物２の５’及び３’末端を連結するためのトリアゾール連結を用いて、構築物２の５’及び３’末端を環状化する（Ｃｕフリークリックケミストリーにより、トリアゾール連結反応が起こる）。
【１２４６】
また別の方法では、表１１の構築物は、二重シクロオクチンで官能化されたクリックベースのオリゴヌクレオチドダンベルを用いて環状化する。非制限的例として、各末端がシクロオクチン基で官能化されているオリゴヌクレオチドダンベル（ＮＨ３ＵＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＵＮＨ３；配列番号４２）を用いて、構築物１の５’及び３’末端を環状化し、５’及び３’アジ化物を含有するＲＮＡ転写物とのトリアゾール連結を生成する。
【１２４７】
また別の方法では、表１１の構築物は、クリックベースのオリゴヌクレオチドダンベルを用いて環状化する。非制限的例として、５’及び３’末端にトリアゾール連結を有するオリゴヌクレオチドダンベル（ＤＢＣＯｄｔ  ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ  ＤＢＣＯ
ｄＴ；配列番号４３）を用いて、構築物１の５’及び３’末端を環状化する。
【１２４８】
実施例１８．環状化の実証
Ａ．ＲＮＡＴ４連結及びポリＡポリメラーゼ
環状化の範囲を決定するために、以下のように反応生成物を診断用ＰＡＰ反応に付すことができる。ＣＴＰ、ＡＴＰ、修飾ＵＴＰ及び１０：１ＧＭＰ：ＧＴＰで転写されたＩＶＴ生成材料（線状ＲＮＡ構築物、表１１）を前述した通りにＴ４ＲＮＡリガーゼと連結させた）。図９において、レーン１（ラダーレーンの後）は、ＣＴＰ、ＡＴＰ、修飾ＵＴＰ及び１０：１ＧＭＰ：ＧＴＰで転写されたＩＶＴ生成材料を示し、レーン２は、クリーンアップ後ポリＡポリメラーゼに暴露されたＩＶＴ生成材料を示し、レーン３は、ポリＡポリメラーゼに暴露された２時間Ｔ４ＲＮＡ連結材料を示し、レーン４は、ポリＡポリメラーゼに曝露された一晩Ｔ４ＲＮＡ連結材料を示し、レーン５は、クリーンアップ後２時間連結材料（ＰＡＰなし）を示し、レーン６は、クリーンアップ後一晩連結材料（ＰＡＰなし）を示す。ポリＡポリメラーゼは、生成物が線状（より高度の分子バンドスピアリング（ｓｐｅａｒｉｎｇ）により図９に示す）である場合、分子の露出された３’末端にテイルを付加し、分子が環状化されると、３’末端が露出されず胣鎾臣ꚁ胣鶃菣ꆼ菣ꪃ菣ꦃ菣벂迥鲿臣략臣覂臣蒁胣것菣뎃볯誏臣钼臣膀볯ꆼ볯趏뿥銂룤螈ꓧ閁臣膀菣벃菣銼臣膀껥ꢅ臣낼볯낼迥鲿苣몤臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꊼ볯꒼볯ꆼ뷯馽뷯薽뛦隌戼㹲 銼볯閽볯꺁뷯늼볯ꆼ뫦늶볯蒴볯螽뷯込뷯겼볯銂볯閽볯꺁郥꒼볯ꆼ뷯馽뷯薽볯뒰룤꺁볯邼뷯궼뫦늶볯誏臣颼뷯겼臣醼볯邼뷯궼†菣ꪃ苣銈볯貽†뷯ꢼ볯膀볯邼뷯궼†볯꒼볯ꆼ胣銼볯邼뷯궼†볯膽볯貽뫦늶臣랷郥馁苣芀菣ꪃ볯蚃苣ꮃ臣螈雦꺁臣膂臣膀볯꺼볯骽뷯趽뷯₅뢼볯閼볯醼볯袼菣Ꚃ苣鎼胢銈볯뒼볯覼迥꾁볯邼볯鞼볯銼볯銃菣鎼胢銈볯뒼볯覼苣뾽铧馁苣芀苣ꎃ菣鞃裥궖臣龁苣ꮁ臣膀볯꺼볯骽뷯趽뷯₅뢼볯閼볯邼볯銂뷤ꢔ臣讂胣랷郥ꦉ苣隼볯莄臣ꞁ볯邼裥鎖諥놆臣龁뻥膀껥ꦸ臣ꞁ蛥뒍臣鮁苣芀臣꺁苣蚃菣鞃臣膀볯꺼볯骽뷯趽뷯銂뷯늼볯ꆼ臣ꊂ菣벃菣뎃苣閁臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣讂胣랷郥ꦉ苣꒮룦뺁臣랆跥閁臣龁뻥膀볯閽볯꺁볯閼볯趽볯₭궼뷯莽뷯銼뫦늶胣銼뷯겼臣钻觧뢅菣릂菣ꆂ苣벃苣袼뿤颭菣莃菣ꆂ菣궸볯떼볯閽볯覼胣醼뷯겼臣ꎼ볯낼뷯鎽뷯袼뿤颭菣莃菣ꆂ菣궸볯躼볯閼뷯螽볯趽뷯覼迥뎁볯閽볯꺁냦Ꞁ볯邼볯趽볯₭꒼볯뒼뫦늶苣뮷諥馁苣芀볯邈裥銂뫤趉臣麃苣뾂菣龃菣꾂苣ꮁ럦袐臣龁뻥膀볯릂菣莃菣ꞁ럦ꂊ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂볯芀럦袐觧銂볯鞼蓢ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣銼볯邼뷯궼†볯꒼볯ꆼ苣ꮐ鳦馁苣醼볯袃菣ꢂ菣ꮃ苣뎃菣讃苣ꂃ藩뢅ꇥ뚺뛦閼뷯겼臣뮷諥ꮁ苣誂胣㲁牢ਾ苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣趏뿥銂臥ꊭ臣鮁苣芀뗧鲞苣떼볯낼볯ꎼ臣袂苣ꎧ黦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯馼볯꺿ꏩꆃ菣뮂菣뢂菣벃볯꺼볯ꊻ蛥ꦉ臣袂苣뎂菣覃臣貂臣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂臣몙迧ꮁ꿥馁苣趽뷯늼苣鶃菣뢂臣鲽铧㲨牢ਾ†볯邼볯閽뷯꺁듧麃鿥난볯꒼볯ꖼ볯讼볯邼볯ꚼ볯뎼볯궸臣Ꚃ苣ꮃ뷥龁苣醼볯貼볯邼볯꺁꿥ꚺ臣銃菣ꦃ듧麃苣ꖎ꣧馁苣芀볯邼볯閽뷯꺁鿥난볯ꒂ菣鎃菣궃볯늼볯袼볯躽뷯覽뷯銽뷯Ꞽ볯꾼볯ꎼ볯讼볯躼볯薼菣ꮃ菣覃볯뒼뷯銽뷯薽뷯辽볯鞊铧ꦉ돨랷郥ꦉ볯궸臣Ꚃ苣ꮃ뷥龁苣钼볯貼볯邼볯꺁꿥ꚺ臣肸곦鶂듧麃苣ꖎ꣧鞁胣ꢼ볯릟鳥袼苣뎃菣袃菣Ꞽ볯꾼볯ꦼ뷯隽뷯钽뷯辽볯늼볯覼볯ꦼ볯銼볯銼볯袃菣骃菣袼볯辽뷯邽뷯蒽뷯覼諦龔觧ꪳ럦袐觧覼룤ꮁ뛧膌臣讂胣내菨꾁胣趽뷯銽裢醼볯銼诨鞁臣꾁뷯覽뷯銈볯銼볯뢛ꏨ蒚菩趽苣ꮐ臣ꪁ臣鞼볯躽뷯꺁菣랂菣Ꞃ菣벃苣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ胣鎼胢떼볯늼臣趽뷯銽裢醼볯銼鯧鲣髧ꢃ뷤銂郥肂菣랂菣Ꞃ菣벃苣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ胣袏臣鎼胢떼볯늼臣趽뷯銽裢醼볯銼鯧鲣髧ꢃ뷤銂郥肂菣랂菣Ꞃ菣벃苣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣膀뷯覽볯銈苣鶃菣뢂볯鞼볯躽뷯ꖋ臣辁臣醼볯邼뷯螽볯꺁귥ꢜ诨鞁臣꾁鷩颭鳥许胣ꪃ菣閃苣꾂苣龃菣袼볯覽뷯辽뷯薽뷯钽뷯趽뷯躽뷯覼볯邼볯邼苣ꢔ臣ꚁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣讂胣ꊂ菣躃苣뎃룤ꪃ菣뢅胣낂苣躃苣뎃룤ꪃ菣뢅胣랂菣랂菣覸菣뎃藩誏臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢鞃苣ꒂ菣Ꚃ菣뢂菣覸菣뎃藩貃苣것苣膃菣銂铧蒁臣膀볯鞼菣ꪃ菣ꦃ菣벂苣뎃菣袃菣ꊻ蛥趏뿥ꦉ菣랂菣Ꞃ菣벃苣趽볯꺼볯ꊻ蛥ꦉ苣ꊻ蛥馁苣芀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣覂볯钼駦鎖뻥ꮁ胣鞃菣벃菣ꪃ菣肃苣ꢔ臣ꚁ胣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂駧覅苣겸껥馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 鶁臣隻臣龮雦ꊽ藦㲋牢ਾ†뷤ꢔ臣ꚁ臣龁ꫨꖏ臣膀駩骮臣꾁臣辁ꫨ躘臣麪迥ꞁ臣讂臣ꢁ胣鶁臣莺꿧ꪁ藦颧臣誁臣ꚁ胣겜駧躘臣蒯鯥誏臣뺲ꗧ銂胩놄臣讂臣ꢁ臣辁럦颻臣릉꣨讫뇦꺁꿧늛臣蒯鯥薆臣覤鯦貁苧閁苣鞾苣鎁臣꾁郧ꎧ臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦꾁胣蒁臣ꒁ臣꺁꣨覼臣龁껥붖뷥讅臣ꊖ臣ꚁ臣讂꣧ꚺ臣랕臣ꞁ胣芁苣讨뫥꺁藥鎽胦銂苣ꎁ臣겪飦鞁臣趁臣貁胣蒁臣貂臣꺁臣蚁臣龁藥鎽髧论ꃩꖋ臣辁臣龮雦ꊽ藦膀迥꾁臣骁苣讁臣랅뷤蒚껥붖뷥讅臣겜駧躘苣邙껥馁苣鎁臣銂蓦뎛臣讂苣꺁臣꾁臣辁胣鎾鷦꺁諦鎡苣莀藦鞁臣膀觧놨ꯨ花臣蒯鯥꺁胨袁苣貂苣肜苣莺뻧꺁꟨袇苣节臣覂臣袂臣ꮁ胣鎾臣ꚁ胣겜駧躘臣辄鯥閁苣讂꿧늛苣龮돨蒚臣薌郥馁苣袂臣ꮁ胣뮷믤꺁觧놨ꯨ花臣蒯鯥銂迥ꞅ臣ꚁ꟨袇臣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣馌臣讂藥ꚁ臣誈ꇨꦉ胣릉꣨몇ꇩ膀觧놨胣誏臣隻臣芏藧螖賧꾁胣ꢅ뷤ꢁ臣ꚁ迥ꞅ臣袂苣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨肂苣꺁臣馁苣芀鿧뺛臣龔臣讂ꃥ袐臣꾁胣骮뻧銂郥肂鳦躘듧뢛臣ꪄ藥閁苣讂胣ꂊ臣ꚁ胣뮂苣랂菣뎃臣讦蟥鞁胣邝雦膀雦閳胣誏臣龮雦设臣膀뻤몤髧ꞁ臣讂臣躁臣骁胣邙껥蒚臣芁苣鎁臣銂蓦뎛臣讂苣꺁臣꾁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔷㈲㈰⸸楴≦㈾㄰㔷㈲㈰⸸楴쉦゠〰㌱㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㜱㈵〲㠲琮晩㸢〲㜱㈵〲㠲琮晩ꃂ〰㄰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔷㈲㈰⸸楴≦㈾㄰㔷㈲㈰⸸楴쉦゠〰㌱㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㜱㈵〲㠲琮晩㸢〲㜱㈵〲㠲琮晩ꃂ〰㄰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔷㈲㈰⸸楴≦㈾㄰㔷㈲㈰⸸楴쉦゠〰㌱㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㜱㈵〲㠲琮晩㸢〲㜱㈵〲㠲琮晩ꃂ〰㄰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔷㈲㈰⸸楴≦㈾㄰㔷㈲㈰⸸楴쉦゠〰㌱㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㜱㈵〲㠲琮晩㸢〲㜱㈵〲㠲琮晩ꃂ〰㄰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔷㈲㈰⸸楴≦㈾㄰㔷㈲㈰⸸楴쉦゠〰㐱㰰愯㰾䐯噉ਾ††††⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀藩鞈ꇨ醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦⸢㈯㄰㔷㈲㈰⼸⸲㄰㔷㈲㈰䔸〫㔱㈯㄰㔷㈲㈰〸〰〰⸱灡≰㈾㄰㔷㈲㈰〸〰〰⸱灡㱰愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣붛髩뾪鿦놠釥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔷㈲㈰⸸楴≦㈾㄰㔷㈲㈰⸸楴쉦゠〰㐱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㜱㈵〲㠲琮晩㸢〲㜱㈵〲㠲琮晩ꃂ〰㄰㈴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔷㈲㈰⸸楴≦㈾㄰㔷㈲㈰⸸楴쉦゠〰㐱㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㜱㈵〲㠲琮晩㸢〲㜱㈵〲㠲琮晩ꃂ〰㄰㐴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔷㈲㈰⸸楴≦㈾㄰㔷㈲㈰⸸楴쉦゠〰㐱㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㜱㈵〲㠲琮晩㸢〲㜱㈵〲㠲琮晩ꃂ〰㄰㘴⼼㹡⼼䥄㹖㰊戯摯㹹㰊栯浴㹬