(57)【要約】ＰＥＧまたはＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１２７などの親水性ポリマーを用いて高密度にコーティングされている、生分解性ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などのマトリックス中に、リン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）などのグルココルチコイドをカプセル封入している粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最大７日間のＤＳＰの持続放出を示す。これらのナノ粒子は、角膜移植片拒絶または角膜新血管形成を予防するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーで高密度にコーティングされ、かつナノ粒子を形成するポリマーと、ホスフェート基またはカルボキシル基と金属イオンのキレート化によって錯体形成しているグルココルチコイド、前記ポリマーの末端のカルボキシ末端基と錯体形成しているグルココルチコイド、および前記グルココルチコイドの水溶性塩からなる群より選択されるグルココルチコイドをカプセル封入している生分解性ポリマー粒子であって、前記粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最大７日間のグルココルチコイドの持続放出を提供し、結膜下（ＳＣ）注射によって投与され得、かつ眼の結膜組織中に２週間保持される、生分解性ポリマー粒子。
【請求項２】
前記グルココルチコイドが、リン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）である、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記分解性ポリマーが、ポリヒドロキシ酸、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリ酸無水物およびそのカルボキシル基末端型ポリマーからなる群より選択される、請求項１に記載の粒子。
【請求項４】
１００から最大１ミクロンの間の平均直径を有するナノ粒子を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項５】
ＰＥＧ、ポリオキシエチレン−ポリエチレンオキシドブロックコポリマーまたはそれらの組み合わせで高密度にコーティングされている、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項６】
前記グルココルチコイドが、前記ナノ粒子を形成する前記ポリマーと、ホスフェート基またはカルボキシル基と金属イオンのキレート化によって錯体形成している、請求項１に記載の粒子。
【請求項７】
前記グルココルチコイドが、エステルまたは他の加水分解性部分を介して前記ポリマーの末端のカルボキシ末端基と錯体形成している、請求項１に記載の粒子。
【請求項８】
前記グルココルチコイドが、水溶性塩に誘導体化され、次いで、前記ポリマーナノ粒子中に組み込まれる、請求項１に記載の粒子。
【請求項９】
眼へ投与するための薬学的に受容可能な賦形剤中の請求項１に記載の粒子。
【請求項１０】
炎症、移植片拒絶または新血管形成を予防するための方法であって、有効量の請求項１から９のいずれか一項に記載の粒子を、それを必要とする部位に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記粒子が、前部、中央もしくは後部硝子体注射、結膜下注射、前房内注射、耳側輪部を介する前眼房への注射、基質内注射、脈絡膜下腔への注射、角膜内注射、網膜下注射または眼内注射によって眼に局所投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子が、血管形成を予防または減少させるために、硝子体内注射によって投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記粒子が、結膜下（ＳＣ）注射によって投与され、結膜組織中に保持される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記粒子が、新血管形成を予防または減少させるために投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記粒子が、移植片拒絶を予防するために投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記粒子が、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、月に１回、２カ月に１回または３カ月に１回以下の頻度で投与される、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記粒子が、直径１ミクロン未満のナノ粒子である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記粒子が、直径最大１００ミクロンのマイクロ粒子である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表への参照
「ＪＨＵ＿Ｃ１２６０４＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」との名称のテキストファイルとして２０１５年８月３日に提出された配列表（２０１５年７月３１日に作成され、２，７６２バイトのサイズである）は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、眼への有効量の１種または複数種のグルココルチコイドの送達のためのポリマー徐放性製剤、ならびに疾患の処置および予防のための、特に、移植片拒絶の処置または予防のためのその使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
角膜は、眼の屈折面および保護障壁として働く、無血管性の透明な結合組織である。角膜新血管形成（ＮＶ）は、血管新生および血管新生抑制因子間のバランスが崩れることによって引き起こされる。感染、炎症、外傷および変性障害などの病状は、縁から通常は、無血管性角膜への新血管の浸潤を誘導し得る。角膜ＮＶは、脂質滲出、持続性炎症および角膜瘢痕を引き起こし、最終的に、角膜の透明度の喪失および視力の低下につながり得る。角膜ＮＶは、角膜移植術において角膜移植失敗の１つのハイリスク因子と見なされた。
【０００４】
角膜新血管形成の処置として、アルゴンレーザー光凝固、光ダイナミック療法、ジアテルミーおよび焼灼、非ステロイド系抗炎症薬、抗血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）剤、メタロマトリックスプロテアーゼ（「ＭＭＰ」）阻害剤およびコルチコステロイドが挙げられる。角膜新血管形成処置の頼みの綱は、依然として、局所コルチコステロイドである。コルチコステロイドは、眼を含む種々の免疫疾患および炎症性疾患を処置するために使用される強力な抗炎症薬である。コルチコステロイドは、強力な抗血管新生機能を有すると示されており、種々のコルチコステロイドは、眼の新血管形成を処置するために広く使用されている。ステロイドは炎症を低減し、また血管新生抑制特性を示し、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の上方制御を遮断するので、患者において血管新生加齢黄斑変性症および糖尿病性網膜症を処置するために硝子体内コルチコステロイドまたはステロイド移植物が適用されてきた（Ａｕｇｕｓｔｉｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、Ｃｌｉｎ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．第３巻（２００９年）１７５〜１８２頁；Ｐａｉら、Ｓａｕｄｉ  Ｊ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．第２４巻（２０１０年）１４３〜１４９頁）。角膜ＮＶの抗血管新生効果は、種々の動物モデルにおいて、また診療において確認された。焼灼誘導性角膜新血管形成は、局所デキサメタゾンによって有効に阻害された（Ｐｒｏｉａら  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ．  Ｒｅｓ．第５７巻（１９９３年）６９３〜６９８頁）。ＩＬ−１ベータ誘導性角膜血管新生は、角膜新血管形成を阻害するデキサメタゾンの有効性のために、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達の遮断によって部分的に阻害されると考えられた。
【０００５】
局所コルチコステロイド点眼薬は、最も広く使用され、患者にとって好都合である。しかし、コルチコステロイドを含めた局所適用された薬物の吸収および保持は、まばたき、流涙、涙液交換およびドレナージによる眼表面からの迅速なクリアランスのため極めて不十分である。さらに、無傷の角膜構造は、薬物分子の浸透および透過を損なう。したがって、点眼薬は、極めて低い眼のバイオアベイラビリティを示し、通常、適用された用量の５％未満しか角膜を通って透過して、眼内組織に到達しない。したがって、眼内薬物レベルを維持し、治療効果を達成するには、点眼薬の頻繁な点眼が必要である。患者コンプライアンスおよび眼表面に対する毒性を含めた他の可能性ある問題を生じさせ得る。前眼房における最大４時間の高い薬物レベルは、リン酸デキサメタゾンナトリウムの結膜下注射によって達成され得る。眼用薬物送達を改善するためにナノテクノロジーが適用されてきた（Ｖａｎｄｅｒｖｏｏｒｔ、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  第２巻（２００７年）１１〜２１頁；Ｒｅｉｍｏｎｄｅｚ−Ｔｒｏｉｔｉｎｏら、Ｅｕ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｐｈａｒｍ、２０１５年３月６日）。ナノテクノロジーはまた、角膜ＮＶの処置のために使用された（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｊ．  Ｏｃｕｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  第２９巻（２０１３年）１２４〜１３４頁）。ナノテクノロジーは、標的化の利点を提供し、眼障壁を克服し、眼のバイオアベイラビリティ、放出の制御、副作用の低減などを改善し得る。
【０００６】
角膜の移植は、固体組織移植の最も古く、最も一般的な形態であり、角膜不全を処置するために広く使用されている。米国では、毎年、角膜移植術の約３６，０００症例が実施されている。無血管性および非炎症性「低リスク」角膜ベッドでの２年の移植生着率は、最大９０％であり得るが、生着率は、以前の移植片拒絶を有するか、または新血管形成または炎症を示し得る「ハイリスク」角膜ベッドでは、５０％にまで低くなり得る。角膜移植失敗は、移植に適した角膜組織の制限のためにアイバンクの負担を大幅に増大し得る。
【０００７】
免疫学的拒絶は、ヒト角膜の移植失敗の主な原因の１つである。「通常リスク」無血管性および非炎症性ベッドでの初年度拒絶率は、２０％近くであり、「ハイリスク」血管新生、炎症レシピエントベッドの拒絶率は、５０％にまで高くなり得る。免疫抑制剤を用いる処置は、角膜移植後の角膜の移植生着率を改善するための通常の戦略である。グルココルチコイドは、臨床において最も広く使用されている免疫抑制剤であり、その有効性は、広く受け入れられている。
【０００８】
グルココルチコイドは、全身にまたは局所点眼によって投与され得る。しかし、長期の全身ステロイドは、白内障、緑内障、グルコース異常、成長遅延、日和見感染症および骨粗鬆症などの重度の副作用を引き起こし得る。迅速な前角膜クリアランスおよび角膜障壁は、局所点眼による点眼薬の有効性を大きく損ない得る。したがって、許容される結果を達成するにはステロイドの頻繁な局所適用が必要であり、眼内圧の上昇および白内障のさらなる確立されたリスクを伴い得る。
【０００９】
免疫学的角膜の拒絶は、移植失敗の主な原因となる。グルココルチコイド、代謝拮抗物質（すなわち、ミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｌｏｎａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ））、Ｔ細胞阻害剤（すなわち、シクロスポリンＡ、タクロリムス、ＦＫ５０６）を用いる免疫抑制療法が、全身または点眼薬のいずれかによって、角膜移植を受けた患者に適用されてきた。通常、点眼薬は、眼が、薬物に容易に到達できる器官であり、免疫抑制剤の全身投与と関連する全身性副作用を低減するので、数週間から数カ月の範囲の長期の術後の全身投与にわたって好ましい。しかし、点眼薬は、依然として、前眼球（ｐｒｅ−ｏｃｕｌａｒ）表面からの迅速なクリアランスおよび前眼房におけるより低い薬物濃度、短時間の治療ウィンドウおよび頻繁な投与などの問題を抱えている。
【００１０】
グルココルチコイドは、「ローリスク」および「ハイリスク」角膜移植の両方で角膜移植片拒絶の制御で広く使用されてきた。局所グルココルチコイドは、角膜移植片拒絶の制御のための「代表的な基準」のままであるが、白内障、眼内圧の増大、創傷離開ならびに細菌および真菌感染などの副作用のリスクを伴う。リン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）溶液の結膜下（ＳＣ）注射は、前眼房で高レベルのステロイドＤＳＰを送達するのに、点眼薬と比較してより有効であると示されている。２４時間後でさえ、前側眼房水（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｈｕｍｏｒ）中のＤＳＰレベルは依然として検出可能であり、ＳＣ投与からの貯蔵効果に起因して眼組織において長期間薬物保持した。ステロイドの結膜下注射は、局所投与および全身投与に対して多数の利点を提供するが、眼組織における薬物は、依然として、短すぎて単回投与では良好な治療効果を達成しない。
【００１１】
眼の慢性疾患を処置するために、グルココルチコイドを眼に送達するための長時間作用する方法が必要である。送達の延長を提供する製剤は、多数のグルココルチコイドの投与と関連する毒性の可能性を最小化する。さらに、頻繁な注射の必要性を低減することは、眼内炎のリスクを低減し、頻繁な通院、患者およびその家族にとっての多大な苦難の負担を低減することとなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖａｎｄｅｒｖｏｏｒｔ、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００７年）第２巻、１１〜２１頁
【非特許文献２】Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｊ．Ｏｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１３年）第２９巻、１２４〜１３４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、有効性の改善されたグルココルチコイドの製剤を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
グルココルチコイドは、角膜拒絶の制御で最も広く使用される免疫抑制剤である。迅速な眼のクリアランスのために、グルココルチコイド点眼薬の頻繁な局所点眼が必要である。それが、不十分な患者コンプライアンスおよび重度の副作用に関する問題を引き起こし得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最大７日間のグルココルチコイドの持続性放出を提供する、親水性ポリマーで高密度にコーティングされ、ナノ粒子を形成するポリマーと、ホスフェート基またはカルボキシル基と金属イオンのキレート化によって錯体形成しているグルココルチコイド、ポリマーの末端のカルボキシ末端基と錯体形成しているグルココルチコイド（ｇｌｕｒｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）などのグルココルチコイドおよびグルココルチコイドの水溶性塩をカプセル封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）している生分解性ポリマー粒子が開発され、これは、結膜下（ＳＣ）注射によって投与され得、眼の結膜組織中に２週間保持されることが発見された。実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最大７日のＤＳＰの持続放出を示す、リン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）などのグルココルチコイドを、ＰＥＧまたはＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１２７などの親水性ポリマーで高密度にコーティングされている生分解性ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などのマトリックス中にカプセル封入しているナノ粒子の利点を実証する。ＤＳＰが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子（ＤＳＰ−ＮＰ）は、結膜下（ＳＣ）注射によって容易に投与され得、最大２週間の長期間結膜組織中に保持される。ＳＣ注射後の遊離ＤＳＰ溶液は、通常、最初の２時間以内に排除され、２４時間後には眼組織中に検出可能なＤＳＰはほとんどない。比較では、ＤＳＰ−ＮＰは、７日の研究期間にわたって、前眼房および硝子体を含めた眼組織において持続されたレベルのＤＳＰを提供し得る。好ましい実施形態では、グルココルチコイドは、ナノ粒子中のグルココルチコイドおよび生分解性ポリマー中のホスフェート基またはカルボキシル基と金属イオンのキレート化によって錯体形成される。複数のカルボキシル基を含有するポリマーを使用し、薬物負荷を大幅に増大し、放出速度を減速するとわかっているＤＳＰが負荷されたミクロスフェア（水中油型エマルジョン中の固体の方法（ｓｏｌｉｄ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ））を調製することで、高い薬物負荷、遅い放出などが得られる。一実施形態では、粒子は、最大１００ミクロンの直径を有するマイクロ粒子である。別の実施形態では、粒子は、ナノ粒子である。
【００１５】
実施例によって実証されるように、ラット角膜同種移植片拒絶モデルに毎週ＳＣ注射されたＤＳＰ−ＮＰ製剤は、生理食塩水対照、空の粒子および遊離ＤＳＰ溶液と比較して有意に大きな有効性を示した。生理食塩水または空のナノ粒子を用いて処置された場合には、ほとんどの移植片は２週間以内に拒絶された。ＤＳＰ処置された群の場合には、移植片は術後４週間後にすべて拒絶された。ＤＳＰ−ＮＰを用いて処置された場合には、すべての角膜移植片は澄明なままであり、９週間の研究期間全体を通じて拒絶されなかった。これらの結果は、グルココルチコイドが持続放出されるナノ粒子が、角膜拒絶のためのＳＣ投与、ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子の毎月の注射によって角膜同種移植片拒絶を有効に予防し得ることを実証する。
【００１６】
実施例によって実証されるように、コルチコステロイドであるリン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）の持続放出を提供するこの生分解性ナノ粒子製剤は、角膜新血管形成、ブドウ膜炎の有効な阻害を提供し得、緑内障の処置に役立ち得る。粒子は、手術の時点で、また、その後、定期的に眼に注射され得る。角膜新血管形成の予防に好ましい実施形態では、粒子は、結膜下に注射される。ブドウ膜炎（汎ブドウ膜炎または中間部／後部ブドウ膜炎）の処置に好ましい実施形態では、粒子は、眼周囲注射で注射され、硝子体中の高い薬物レベルを可能にする。ＤＳＰ−ＮＰ結膜下注射は、網膜炎症性サイトカインレベル測定によってＬＰＳ誘導性ブドウ膜炎を予防し得る。中間部および後部ブドウ膜炎は、局所点眼薬を用いて処置されることが困難であり、あまり侵襲性ではない眼周囲注射（結膜下注射を含む）が、より侵襲性の硝子体内注射に対して有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、時間（日数）をわたって累積放出（％）をプロットするＤＳＰ／ＰＬＧＡナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出プロファイルのグラフである。
【００１８】
【図２】図２は、ラットへの皮下投与後の蛍光のＺｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングによって定量された、時間（日数）をわたってのラットへの結膜下（「ＳＣ」）注射後の、ＰＳ−ＰＥＧコーティングを有する非分解性ポリスチレン粒子（１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１ミクロン、５ミクロン）の保持パーセントのグラフである。
【００１９】
【図３】図３は、ラットにＳＣ注射されたＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子の時間（日数）をわたっての眼における保持パーセントのグラフである。この値は、ポリマー鎖からの色素の切断によって影響を受け得る。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、ラットへの皮下投与後の遊離ＤＳＰ溶液およびＤＳＰ−ＮＰの薬物動態のグラフである（時間（日数）をわたってのＤＳＰ／ｍｌ）。図４Ａは、注射部位で；図４Ｂは、眼房水中；図４Ｃは、硝子体液中；および図４Ｄは、血液中である。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄは、ラットへの皮下投与後の遊離ＤＳＰ溶液およびＤＳＰ−ＮＰの薬物動態のグラフである（時間（日数）をわたってのＤＳＰ／ｍｌ）。図４Ａは、注射部位で；図４Ｂは、眼房水中；図４Ｃは、硝子体液中；および図４Ｄは、血液中である。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄは、ラットへの皮下投与後の遊離ＤＳＰ溶液およびＤＳＰ−ＮＰの薬物動態のグラフである（時間（日数）をわたってのＤＳＰ／ｍｌ）。図４Ａは、注射部位で；図４Ｂは、眼房水中；図４Ｃは、硝子体液中；および図４Ｄは、血液中である。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、ラットへの皮下投与後の遊離ＤＳＰ溶液およびＤＳＰ−ＮＰの薬物動態のグラフである（時間（日数）をわたってのＤＳＰ／ｍｌ）。図４Ａは、注射部位で；図４Ｂは、眼房水中；図４Ｃは、硝子体液中；および図４Ｄは、血液中である。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【００２１】
【図５】図５は、すべての組織において３Ｈ−ＤＳＰの放射能を測定することによって定量された、眼球外組織（網膜、角膜、硝子体および眼房水の除去後の眼組織）における、単独でまたはＮＰ中にカプセル封入されて注射された保持されたＤＳＰ用量のグラフである。いくつかのデータ点で値がないことは、レベルが検出可能ではないことを意味する。
【００２２】
【図６】図６は、角膜透明度、浮腫および新規血管に関して終了時点での生理食塩水、ＮＰ、ＤＳＰまたはＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射を用いて処置された移植片の臨床評価の棒グラフである。ＤＳＰ−ＮＰについて透明度および浮腫でバーが示されないことは、移植片が完全に透明であり、浮腫がないことを意味する。
【００２３】
【図７】図７は、生理食塩水対照、空のＮＰ、遊離ＤＳＰまたはＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射を用いて処置された移植された角膜移植片の生存曲線を示す図である。
【００２４】
【図８】図８は、時間（日数または週数）をわたっての眼内圧（ＩＯＰ）のグラフである。ＩＯＰは、角膜移植片を移植され、続いて、生理食塩水、空のＮＰ、遊離ＤＳＰまたはＤＳＰ−ＮＰを用いて処置された眼で測定された。正常な眼を対照として使用した。
【００２５】
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、生理食塩水、ＤＳＰおよびＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射を用いる処置後のＮＶ領域（図９Ａ）および血管の長さ（図９Ｂ）についての角膜新血管形成の定量的解析のグラフである。
【００２６】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＤＳＰ−ＮＰ、遊離ＤＳＰ、生理食塩水および健常について、ＲＴ−ＰＣＲによって測定された、（図１０Ａ）ＰＯ７日および（図１０Ｂ）ＰＯ１４日での角膜新血管形成と関連するサイトカインレベルのグラフである。
【００２７】
【図１１】図１１は、生理食塩水、遊離ＤＳＰおよびＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射の処置後のＩＯＰ（ｍｍＨｇ）のグラフである。
【００２８】
【図１２】図１２は、２００±８ｎｍの大きさ、８重量％薬物負荷を示したＤＳＰ−ＮＰのｓｉｎｋ条件下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの１５日にわたる持続性薬物放出のグラフである。
【００２９】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、前眼房（図１３Ａ）および硝子体（図１３Ｂ）の両方において高い薬物レベルを示す、ラットにおけるＤＳＰ−ＮＰのＳＣ投与後の少なくとも７日間の持続性高眼用薬物レベルのグラフである。
【００３０】
【図１４】図１４は、ＬＰＳのＩＰ注射後３時間および２４時間でイメージングおよびスコア化された前眼部の炎症スコアのグラフである。ＤＳＰ−ＮＰ予防群は、対照群よりも有意に少ない炎症を有することを示す。
【００３１】
【図１５】図１５は、２４時間の免疫化のＥＩＵモデルの３群における網膜におけるＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６およびＴＮＦのｍＲＮＡ発現のグラフである。プラセボ−ＮＰおよびＰＢＳ群と比較してＤＳＰ−ＮＰ群において有意に低下した発現を示す。
【００３２】
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ラットへのＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子の結膜下注射の薬物動態（時間（日数）をわたってのｎｇ  ＤＳＰ／ｍｌ）グラフである。図１６Ａ、眼房水；図１６Ｂ、硝子体；図１６Ｃ、血液；および図１６Ｄ、注射部位対照。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ラットへのＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子の結膜下注射の薬物動態（時間（日数）をわたってのｎｇ  ＤＳＰ／ｍｌ）グラフである。図１６Ａ、眼房水；図１６Ｂ、硝子体；図１６Ｃ、血液；および図１６Ｄ、注射部位対照。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ラットへのＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子の結膜下注射の薬物動態（時間（日数）をわたってのｎｇ  ＤＳＰ／ｍｌ）グラフである。図１６Ａ、眼房水；図１６Ｂ、硝子体；図１６Ｃ、血液；および図１６Ｄ、注射部位対照。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ラットへのＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子の結膜下注射の薬物動態（時間（日数）をわたってのｎｇ  ＤＳＰ／ｍｌ）グラフである。図１６Ａ、眼房水；図１６Ｂ、硝子体；図１６Ｃ、血液；および図１６Ｄ、注射部位対照。
【００３３】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｅは、（１７Ａ〜１７Ｃ）ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群および（１７Ｄ〜１７Ｆ）生理食塩水対照群の全１２週間のフォローアップの間の時間（日数）をわたっての移植片の臨床観察のグラフである。矢印は、処置注射時点を示す。図１７Ａ、１７Ｄは、透明度スコアであり、図１７Ｂ、１７Ｅは、浮腫スコアであり、１７Ｃ、１７Ｆは、新血管形成である。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｅは、（１７Ａ〜１７Ｃ）ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群および（１７Ｄ〜１７Ｆ）生理食塩水対照群の全１２週間のフォローアップの間の時間（日数）をわたっての移植片の臨床観察のグラフである。矢印は、処置注射時点を示す。図１７Ａ、１７Ｄは、透明度スコアであり、図１７Ｂ、１７Ｅは、浮腫スコアであり、１７Ｃ、１７Ｆは、新血管形成である。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｅは、（１７Ａ〜１７Ｃ）ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群および（１７Ｄ〜１７Ｆ）生理食塩水対照群の全１２週間のフォローアップの間の時間（日数）をわたっての移植片の臨床観察のグラフである。矢印は、処置注射時点を示す。図１７Ａ、１７Ｄは、透明度スコアであり、図１７Ｂ、１７Ｅは、浮腫スコアであり、１７Ｃ、１７Ｆは、新血管形成である。
【図１７Ｄ】図１７Ａ〜１７Ｅは、（１７Ａ〜１７Ｃ）ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群および（１７Ｄ〜１７Ｆ）生理食塩水対照群の全１２週間のフォローアップの間の時間（日数）をわたっての移植片の臨床観察のグラフである。矢印は、処置注射時点を示す。図１７Ａ、１７Ｄは、透明度スコアであり、図１７Ｂ、１７Ｅは、浮腫スコアであり、１７Ｃ、１７Ｆは、新血管形成である。
【図１７Ｅ】図１７Ａ〜１７Ｅは、（１７Ａ〜１７Ｃ）ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群および（１７Ｄ〜１７Ｆ）生理食塩水対照群の全１２週間のフォローアップの間の時間（日数）をわたっての移植片の臨床観察のグラフである。矢印は、処置注射時点を示す。図１７Ａ、１７Ｄは、透明度スコアであり、図１７Ｂ、１７Ｅは、浮腫スコアであり、１７Ｃ、１７Ｆは、新血管形成である。
【図１７Ｆ】図１７Ａ〜１７Ｅは、（１７Ａ〜１７Ｃ）ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群および（１７Ｄ〜１７Ｆ）生理食塩水対照群の全１２週間のフォローアップの間の時間（日数）をわたっての移植片の臨床観察のグラフである。矢印は、処置注射時点を示す。図１７Ａ、１７Ｄは、透明度スコアであり、図１７Ｂ、１７Ｅは、浮腫スコアであり、１７Ｃ、１７Ｆは、新血管形成である。
【００３４】
【図１８】図１８は、生理食塩水対照群およびＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群両方の生存曲線（時間（日数）をわたっての生存パーセント）を示す図である。
【００３５】
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、対照（１９Ｂ）と比較した、毎月の間隔でＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子を用いて処置された動物の（１９Ａ）、時間（日数）をわたっての眼内圧のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
Ｉ．定義
本明細書において「活性剤」とは、身体において局所的におよび／または全身に作用する生理学的にまたは薬理学的に活性な物質を指す。活性剤は、疾患または障害の処置（例えば、治療剤）、予防（例えば、予防剤）または診断（例えば、診断剤）のために患者に投与される物質である。「眼用薬物」または「眼用活性剤」とは、本明細書において、眼の疾患または障害の１種または複数種の症状を軽減し、その発症を遅延し、もしくは予防するために患者に投与される薬剤または眼をイメージングする、もしくは他の方法で評価するのに有用な診断剤を指す。
【００３７】
「有効な量」または「治療上有効な量」とは、本明細書において、特に、眼の疾患または障害の１種または複数種の症状を軽減し、その発症を遅延し、もしくは予防するのに有効なポリマーナノ粒子の量を指す。加齢黄斑変性症の場合には、ポリマーナノ粒子の有効な量は、患者において視力喪失を遅延、低減または予防する。
【００３８】
「生体適合性」および「生物学的に適合する」とは、本明細書において、全般的に、任意の代謝産物またはその分解生成物とともに、全般的にレシピエントにとって非毒性であり、レシピエントに任意の有意な有害作用を引き起こさない材料を指す。一般的に言えば、生体適合性材料は、患者に投与された場合に有意な炎症性応答または免疫応答を誘発しない材料である。
【００３９】
「生分解性ポリマー」とは、本明細書において、全般的に、生理学的条件下で酵素作用および／または加水分解によって分解するか、または侵食され、被験体によって代謝、排除または排出されることが可能であるより小さい単位または化学種になるポリマーを指す。分解時間は、ポリマー組成、多孔度、粒子寸法などの形態学および環境の関数である。
【００４０】
「親水性の」とは、本明細書において、水に対して親和性を有するという特性を指す。例えば、親水性ポリマー（または親水性ポリマーセグメント）は、主に水溶液に可溶性である、および／または水を吸収する傾向を有するポリマー（またはポリマーセグメント）である。一般に、ポリマーが親水性であるほど、ポリマーが水に溶解し、水と混合するか、または水によって湿潤化される傾向が大きい。
【００４１】
「疎水性の」とは、本明細書において、水に対する親和性を欠く、またはさらに水をはじく特性を指す。例えば、ポリマー（またはポリマーセグメント）が疎水性であるほど、ポリマー（またはポリマーセグメント）が水に溶解されない、水と混合されない、または水によって湿潤化されない傾向が大きい。
【００４２】
親水性および疎水性は、それだけには限らないがポリマーまたはポリマーセグメントの群内の親水性／疎水性の範囲など、相対的に語られ得る。２種またはそれ超のポリマーが論じられている一部の実施形態では、用語「疎水性ポリマー」は、別のより親水性のポリマーと比較した場合のポリマーの相対的疎水性に基づいて定義され得る。
【００４３】
「ナノ粒子」とは、本明細書において、全般的に、平均直径、約１０ｎｍから約１ミクロン未満、好ましくは、１００ｎｍ〜約１ミクロンなどの直径を有する粒子を指す。粒子は、任意の形状を有し得る。球状の形状を有するナノ粒子は、全般的に「ナノスフェア」と呼ばれる。
【００４４】
「マイクロ粒子」とは、本明細書において、全般的に、平均直径、約１ミクロン〜約１００ミクロン、好ましくは、約１ミクロン〜約５０ミクロン、より好ましくは、約１〜約３０ミクロンなどの直径を有する粒子を指す。マイクロ粒子は、任意の形状を有し得る。球状の形状を有するマイクロ粒子は、全般的に、「ミクロスフェア」と呼ばれる。
【００４５】
「分子量」とは、本明細書において、全般的に、特に断りのない限り、バルクのポリマーの相対的平均鎖長を指す。実際には、分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）またはキャピラリービスコメトリーを含めた種々の方法を使用して推定され、特徴付けられ得る。ＧＰＣ分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）とは対照的に重量平均分子量（Ｍｗ）として報告される。キャピラリービスコメトリーは、濃度、温度および溶媒条件の特定のセットを使用して希釈ポリマー溶液から決定される固有の粘度として分子量の推定値を提供する。
【００４６】
「平均粒径」とは、本明細書において、全般的に粒子の集団中の粒子の統計的平均粒径（直径）を指す。本質的に球状の粒子の直径は、物理的または流体力学直径を指し得る。非球状の粒子の直径は、好ましくは、流体力学直径を指す。本明細書において、非球状粒子の直径は、粒子の表面上の２点間の最大直線距離を指し得る。平均粒径は、動的光散乱などの当技術分野で公知の方法を使用して測定され得る。
【００４７】
「単分散」および「均一なサイズ分布」は、本明細書において交換可能に使用され、粒子のすべてが同一またはほぼ同一の大きさであるナノ粒子またはマイクロ粒子の集団を説明する。本明細書において、単分散分布とは、分布の９０％またはそれ超が、中央値粒径の１５％内、より好ましくは、中央値粒径の１０％内、最も好ましくは、中央値粒径の５％内にある粒子分布を指す。
【００４８】
「薬学的に受容可能な」とは、本明細書において、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応もしくはその他の問題または合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した正当な医学的判断の範囲内にある化合物、担体、賦形剤、組成物および／または剤形を指す。
【００４９】
「分岐点」とは、本明細書において、複数の親水性ポリマーセグメントを疎水性ポリマーセグメントの一方の末端と、または複数の疎水性ポリマーセグメントを親水性セグメントの一方の末端と接続するように働くポリマーナノ粒子の部分を指す。
【００５０】
「グルココルチコイド」とは、本明細書において、ＨＩＦ−１のレベルをおよび／またはそのプロモーター領域中に低酸素応答エレメントを含有する遺伝子の転写を刺激する能力を低減させる薬物を指す。
【００５１】
本明細書において一般的に使用される「移植物」とは、移植の部位で長期間にわたって１種または複数種のグルココルチコイドを放出することによって治療的利益を提供するように、好ましくは、身体の特定の領域に注射または外科的移植によって、移植されるように構築されるか、大きさにされるか、または他の方法で構成されるポリマーデバイスまたはエレメントを指す。例えば、眼内移植物は、好ましくは、注射または外科的移植によって、眼の中に置かれるように、および１種または複数種のグルココルチコイドを長期間にわたって放出することによって１種または複数種の眼の疾患または障害を処置するために、構築されるか、大きさにされるか、または他の方法で構成されるポリマーデバイスまたはエレメントである。眼内移植物は、一般に、眼の生理学的条件と生体適合性であり、有害な副作用を引き起こさない。一般に、眼内移植物は、眼の視力を乱すことなく眼の中に置かれ得る。
【００５２】
本明細書において定義される値の範囲は、範囲内のすべての値ならびに範囲内のすべての部分範囲を含む。例えば、範囲が０〜１０の整数として定義される場合には、範囲は、範囲内のすべての整数および範囲内のありとあらゆる部分範囲、例えば、１〜１０、１〜６、２〜８、３〜７、３〜９などを包含する。
【００５３】
ＩＩ．ポリマー−グルココルチコイド（Ｇｌｕｃｏｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）粒子
一部の実施形態では、１種または複数種のグルココルチコイドは、眼への送達のためにポリマーマトリックス中に分散されるか、またはカプセル封入される。ポリマーマトリックスは、非生分解性または生分解性ポリマーから形成され得る；しかし、ポリマーマトリックスは、好ましくは、生分解性である。ポリマーマトリックスは、眼への送達のために移植物、マイクロ粒子、ナノ粒子またはそれらの組み合わせに形成され得る。投与すると、１種または複数種のグルココルチコイドが、ポリマーマトリックスの分解、ポリマーマトリックスからの１種もしくは複数種の阻害剤の拡散のいずれか、またはそれらの組み合わせの際に長期間にわたって放出される。ポリマーナノ粒子を用いることによって、より制御された薬物負荷および薬物放出プロファイルを有する粒子が形成され得る。
【００５４】
一部の実施形態では、徐放性製剤は、１種または複数種のポリマーナノ粒子から形成された粒子を含有する。ポリマーナノ粒子は、１種または複数種のグルココルチコイドを含有するブロックコポリマーである。通常、ブロックコポリマーは、グルココルチコイド、１種または複数種の疎水性ポリマーセグメントおよび１種または複数種の親水性ポリマーセグメントを含有する。特定の場合には、１種または複数種の親水性ポリマーセグメントは、分岐点によって１種または複数種の疎水性ポリマーセグメントと結合している。ポリマーナノ粒子を用いることによって、より制御された薬物負荷および薬物放出プロファイルを有する粒子が形成され得る。さらに、コンジュゲートの溶解度は、可溶性薬物濃度、したがって、毒性を最小にするように制御され得る。
【００５５】
ポリマーナノ粒子は、好ましくは、ホスフェート基またはカルボキシル基、最も好ましくは、エステルまたは他の加水分解性部分を含有するポリマーなどの生分解性ポリマーの末端のカルボキシ末端基と金属イオンのキレート化によって錯体形成している１種または複数種のグルココルチコイドを含有する。グルココルチコイドは、水溶性塩に誘導体化され、次いで、ポリマーナノ粒子中に組み込まれ得る。
【００５６】
Ａ．グルココルチコイド
グルココルチコイドは、副腎皮質によって産生され、炭水化物、タンパク質および脂肪代謝に関与し、抗炎症剤として使用される、ヒドロコルチゾンなどの抗炎症性ステロイド様化合物の群である。以下は、相対効力の順の一般的なグルココルチコイドの一覧である。入手可能なグルココルチコイドは、種々の効力を有し、例えば、１ｍｇのデキサメタゾンは、２５ｍｇのヒドロコルチゾンと同程度に有効である。以下の表は、主な製品の相対効力を示す：
【化１】
2017524712.tif 000002
【００５７】
アクロメタゾン（ａｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）、ブデソニド、クロベタゾール、クロベタゾン、デソニド、フルオシノロン、フルオコルトロンフルニソリド、フルチカゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、パラメタゾン、リメキソロンおよびチキソコルトールを含め、多数のその他のグルココルチコイドがある。移植片拒絶が絡むほとんどの状況は、デキサメタゾンまたはベタメタゾンなどのより強力な化合物を利用する。
【００５８】
水溶性グルココルチコイド塩は、商業的に得ることもでき、または従来化学を使用して合成することもできる。好ましい塩として、リン酸デキサメタゾンナトリウムおよびリン酸ヒドロコルチゾンナトリウムなどのリン酸塩ならびにコハク酸ヒドロコルチゾンナトリウムおよびコハク酸メチルプレドニゾロンナトリウムなどのカルボン酸塩が挙げられる。
【００５９】
Ｂ．ナノ粒子を形成するポリマー
ポリマーナノ粒子は、１種または複数種のポリマー、ホモポリマーまたはコポリマーを含有し得る。好ましい実施形態では、ポリマーは、生分解性ポリマーである。疎水性ポリマーが生分解性である場合には、ポリマー分解プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性剤の放出速度に影響を及ぼすように選択され得る。例えば、ポリマーは、７日から２年、より好ましくは、７日から５６週間、より好ましくは、４週間から５６週間、最も好ましくは、８週間から２８週間の期間にわたって分解するように選択され得る。
【００６０】
適した疎水性ポリマーの例として、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）などのポリヒドロキシ酸；ポリ３−ヒドロキシブチレートまたはポリ４−ヒドロキシブチレートなどのポリヒドロキシアルカノエート；ポリカプロラクトン；ポリ（オルトエステル）；ポリ酸無水物；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（ヒドロキシアルカノエート）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）；チロシンポリカーボネートなどのポリカーボネート；ポリアミド（合成および天然ポリアミドを含む）、ポリペプチドおよびポリ（アミノ酸）；ポリエステルアミド；ポリエステル；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（アルキレンアルキレート）；疎水性ポリエーテル；ポリウレタン；ポリエーテルエステル；ポリアセタール；ポリシアノアクリレート；ポリアクリレート；ポリメチルメタクリレート；ポリシロキサン；ポリ（オキシエチレン）／ポリ（オキシプロピレン）コポリマー；ポリケタール；ポリホスフェート；ポリヒドロキシバレレート；ポリアルキレノキサレート；ポリアルキレンスクシネート；ポリ（マレイン酸）、ならびにそのコポリマーが挙げられる。
【００６１】
好ましい実施形態では、ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリヒドロキシエステルまたはそれらのコポリマーである。グリコール酸対乳酸の比は、分解の速度を制御するために最適化され得る。
【００６２】
ポリマーは、ポリ酸無水物であり得る。ポリ酸無水物は、脂肪族ポリ酸無水物、不飽和ポリ酸無水物または芳香族ポリ酸無水物であり得る。代表的なポリ酸無水物として、ポリアジピン酸無水物、ポリフマル酸無水物、ポリセバシン酸無水物、ポリマレイン酸無水物、ポリリンゴ酸無水物、ポリフタル酸無水物、ポリイソフタル酸無水物、ポリアスパラギン酸無水物、ポリテレフタル酸無水物、ポリイソフタル酸無水物、ポリカルボキシフェノキシプロパン無水物、ポリカルボキシフェノキシヘキサン無水物ならびに種々のモル比でのこれらのポリ酸無水物とその他のポリ酸無水物とのコポリマーのコポリマーが挙げられる。その他の適したポリ酸無水物は、米国特許第４，７５７，１２８号、同第４，８５７，３１１号、同第４，８８８，１７６号および同第４，７８９，７２４号に開示されている。ポリ酸無水物はまた、ポリ酸無水物ブロックを含有するコポリマーであり得る。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリセバシン酸無水物である。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリ（１，６−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン−ｃｏ−セバシン酸）（ポリ（ＣＰＨ−ＳＡ）である。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリ（１，３−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン−ｃｏ−セバシン酸）（ポリ（ＣＰＰ−ＳＡ）である。
【００６３】
疎水性ポリマーの分子量は、特定の適用にとって最適な薬物放出速度などの特性を有する粒子を形成するポリマーナノ粒子を調製するために変更され得る。ポリマーは、約１５０Ｄａ〜１ＭＤａの分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、ポリマーは、約１ｋＤａから約１００ｋＤａの間、より好ましくは、約１ｋＤａから約５０ｋＤａの間、最も好ましくは、約１ｋＤａから約２５ｋＤａの間の分子量を有する。
【００６４】
Ｃ．親水性ポリマー
ナノ粒子は、親水性ポリマーでコーティングされる。これらは、親水性で、生体適合性で（すなわち、顕著な炎症性応答または免疫応答を誘導しない）、非毒性のポリマーまたはコポリマーでなくてはならない。適したポリマーの例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）などのポリ（アルキレングリコール）ならびにエチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルアルコール）およびコポリマー、ターポリマーおよびそれらの混合物を挙げることができる。
【００６５】
好ましい実施形態では、１種または複数種の親水性ポリマーセグメントは、ポリ（アルキレングリコール）鎖を含有する。ポリ（アルキレングリコール）鎖は、８から５００反復単位の間、より好ましくは、４０から５００反復単位の間を含有し得る。適したポリ（アルキレングリコール）として、ポリエチレングリコール）、ポリプロピレン１，２−グリコール、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリプロピレン１，３−グリコールおよびそれらのコポリマーが挙げられる。ある特定の実施形態では、１種または複数種の親水性ポリマーセグメントは、ＰＥＧ鎖である。このような場合には、ＰＥＧ鎖は、米国特許第５，９３２，４６２号に記載されるものなど、直鎖である場合も、分岐鎖である場合もある。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ鎖は、直鎖である。
【００６６】
１種または複数種の親水性ポリマーセグメントの各々は、約３００Ｄａ〜１ＭＤａの分子量を独立に有し得る。親水性ポリマーセグメントは、上記の分子量のいずれかの間の範囲の分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、１種または複数種の親水性ポリマーセグメントの各々は、約１ｋＤａから約２０ｋＤａの間、より好ましくは、約１ｋＤａから約１５ｋＤａの間、最も好ましくは、約１ｋＤａから約１０ｋＤａの間の分子量を有する。好ましい実施形態では、１種または複数種の親水性ポリマーセグメントの各々は、約５ｋＤａの分子量を有する。
【００６７】
すべての親水性ポリマーが有効であるわけではない。実施例によって実証されるように、好ましいポリマーとして、ＢＡＳＦによって販売されるＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１２７がある。ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）は、２つのポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）ブロックと接続している１つのポリプロピレンオキシド（「ＰＰＯ」）ブロックから構成されるトリブロックコポリマーである。ＰＥＯブロックは、大部分は親水性であるので水性媒体中に十分に溶解するが、ＰＰＯブロックは、周囲温度で大部分は疎水性であるので溶解しない。
【００６８】
ＩＩＩ．ポリマーナノ粒子の合成
ポリマーナノ粒子は、当技術分野で公知の合成法を使用して調製され得る。ポリマーナノ粒子を調製するための代表的な方法論は、以下に論じられる。所与のポリマーナノ粒子を合成するための適当な経路は、ポリマーナノ粒子の構造、コンジュゲートを作り上げるポリマーの正体、活性剤の正体ならびに官能基の適合性と関連するので全体としての化合物の構造、保護基戦略および不安定な結合の存在などのいくつかの因子を考慮して決定され得る。
【００６９】
１種または複数種のグルココルチコイドの制御された送達のためのポリマー移植物（例えば、ロッド、ディスク、ウェハーなど）、マイクロ粒子およびナノ粒子が提供され、マトリックス中に分散されるか、またはカプセル封入される。一部の実施形態では、粒子または移植物は、ポリマーマトリックス中に分散されるか、またはカプセル封入された１種または複数種のグルココルチコイドを含有する。
【００７０】
粒子は、２種またはそれ超の異なるポリマーナノ粒子の混合物として提供され得る。例えば、粒子は、異なるグルココルチコイドを含有する２種またはそれ超のポリマーナノ粒子から形成され得る。その他の場合には、粒子は、グルココルチコイドの放出速度を変更するために、同一グルココルチコイドを含有する２種またはそれ超のポリマーナノ粒子から形成される。
【００７１】
１０ｎｍから１０００ミクロンの間の平均粒径を有する粒子は、本明細書において記載される組成物において有用である。好ましい実施形態では、粒子は、１０ｎｍから１００ミクロンの間、より好ましくは、約１００ｎｍから約５０ミクロンの間、より好ましくは、約２００ｎｍから約５０ミクロンの間の平均粒径を有する。ある特定の実施形態では、粒子は、５００から７００ｎｍの間の直径を有するナノ粒子である。粒子は、任意の形状を有し得るが、一般的には、球状の形状である。
【００７２】
一部の実施形態では、１種または複数種のポリマーナノ粒子から形成される粒子の集団は、粒子の単分散集団である。他の実施形態では、１種または複数種のポリマーナノ粒子から形成される粒子の集団は、粒子の多分散集団である。１種または複数種のポリマーナノ粒子から形成される粒子の集団が粒子の多分散集団であるいくつかの場合には、粒径分布の５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％超が、中央値粒径の１０％内にある。
【００７３】
好ましくは、１種または複数種のポリマーナノ粒子から形成される粒子は、その表面に、相当な量のＰＥＧなどの親水性ポリマーを含有する。
【００７４】
マイクロ粒子およびナノ粒子は、当技術分野で公知のポリマーマイクロ粒子またはナノ粒子を形成する任意の適した方法を使用して形成され得る。粒子形成に用いられる方法は、ポリマーナノ粒子またはポリマーマトリックス中に存在するポリマーの特徴ならびに所望の粒径およびサイズ分布を含めた種々の因子に依存する。いくつかのグルココルチコイドが、特定の溶媒の存在下で、特定の温度範囲において、および／または特定のｐＨ範囲において不安定であるので、粒子中に組み込まれているグルココルチコイドの種類も、因子であり得る。
【００７５】
粒子の単分散集団が望ましい状況では、粒子は、ナノ粒子の単分散集団を製造する方法を使用して形成され得る。あるいは、多分散ナノ粒子分布を製造する方法が使用され得、粒子は、所望の平均粒径および粒径分布を有する粒子の集団を提供するように、粒子形成後のふるい分けなどの当技術分野で公知の方法を使用して分離され得る。
【００７６】
マイクロ粒子およびナノ粒子を調製するための一般的な技術として、それだけには限らないが、溶媒蒸発、ホットメルト粒子形成、溶媒除去、噴霧乾燥、相反転、コアセルベーションおよび低温注型が挙げられる。粒子形成の適した方法は、手短に以下に記載される。ｐＨ改変剤、崩壊剤、保存料および抗酸化剤を含めた薬学的に受容可能な賦形剤は、任意選択で、粒子形成の際に粒子中に組み込まれ得る。
【００７７】
ポリマーナノ粒子は、好ましくは、ホスフェート基またはカルボキシル基、最も好ましくは、実施例に記載されるような、エステルまたは他の加水分解性部分を含有するポリマーなどの生分解性ポリマーの末端のカルボキシ末端基と金属イオンのキレート化によって錯体形成している１種または複数種のグルココルチコイドを含有する。グルココルチコイドは、水溶性塩に誘導体化され、次いで、ポリマーナノ粒子中に組み込まれ得る。
【００７８】
眼内移植物は、球状または非球状の形状であり得る。球状形状の移植物については、移植物は、ニードルを用いる投与のためには約５μｍから約２ｍｍの間または約１０μｍから約１ｍｍの間の最大寸法（例えば、直径）、外科的移植による投与のためには、１ｍｍ超または３ｍｍもしくは最大１０ｍｍなどの２ｍｍ超を有し得る。移植物が非球状である場合には、移植物は、最大寸法を有し得、または最小寸法は、ニードルを用いる投与のためには約５μｍから約２ｍｍ、または約１０μｍから約１ｍｍの間、外科的移植による投与のためには１ｍｍ超または３ｍｍもしくは最大１０ｍｍなどの２ｍｍ超であり得る。
【００７９】
ヒトにおける硝子体眼房は、例えば、１〜１０ｍｍの長さを有する変動する幾何の相対的に大きな移植物を収容できる。移植物は、約２ｍｍ×０．７５ｍｍ直径の寸法の円柱状ペレット（例えば、ロッド）であり得る。移植物は、約７ｍｍ〜約１０ｍｍの長さおよび約０．７５ｍｍ〜約１．５ｍｍの直径を有する円柱状ペレットであり得る。ある特定の実施形態では、移植物は、約０．５ｍｍの直径、約６ｍｍの長さおよびおよそ１ｍｇの重量を有する押出フィラメントの形態である。一部の実施形態では、寸法は、ニードルによる眼内注射用にすでに認可された移植物であるか、またはそれと同様である：４６０ミクロンの直径および６ｍｍの長さならびに３７０ミクロンの直径および３．５ｍｍの長さ。
【００８０】
眼内移植物はまた、硝子体中へなど、眼中への移植物の挿入および移植物のその後の適応の両方を容易にするために、少なくとも幾分か可撓性であるように設計され得る。移植物の総重量は、通常、約２５０〜５０００μｇ、より好ましくは、約５００〜１０００μｇである。ある特定の実施形態では、眼内移植物は、約５００μｇ、７５０μｇまたは１０００μｇの質量を有する。
【００８１】
移植物は、当技術分野で公知の任意の適した技術を使用して製造され得る。移植物を調製するための適した技術の例として、溶媒蒸発法、相分離法、界面法、成形法、射出成形法、押出法、共押出（ｃｏｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）法、カーバープレス（ｃａｒｖｅｒ  ｐｒｅｓｓ）法、打ち抜き法、熱圧縮およびそれらの組み合わせが挙げられる。移植物を製造するための適した方法は、移植物中に存在するポリマー／ポリマーセグメントの特性、移植物中に存在する１種または複数種のグルココルチコイドの特性ならびに移植物の所望の形状および大きさを含めた多数の因子を考慮して選択され得る。移植物を調製するための適した方法は、例えば、米国特許第４，９９７，６５２号および米国特許出願公開ＵＳ２０１０／０１２４５６５に記載されている。
【００８２】
特定の場合には、移植物製造の間の溶媒の必要性を避けるために、押出法が使用され得る。押出法を使用する場合には、ポリマー／ポリマーセグメントおよびグルココルチコイドは、製造するために必要な温度、通常、少なくとも約８５℃で安定であるように選択される。しかし、ポリマー成分および１種または複数種のグルココルチコイドの性質に応じて、押出法は、約２５℃〜約１５０℃、より好ましくは、約６５℃〜約１３０℃の温度を用い得る。移植物は、移植物の表面のすべてまたは一部を覆うコーティングを提供するために共押し出しされ得る。
【００８３】
ＩＶ．医薬製剤
医薬製剤は、１種または複数種の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて１種または複数種のポリマーナノ粒子を含有する。代表的賦形剤として、溶媒、希釈剤、ｐＨ改変剤、保存料、抗酸化剤、懸濁剤、湿潤剤、粘度調整剤、張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）、安定化剤およびそれらの組み合わせが挙げられる。適した薬学的に受容可能な賦形剤は、好ましくは、一般的に安全と認識される（ＧＲＡＳ）材料から選択され、望ましくない生物学的副作用または不要な相互作用を引き起こさずに個体に投与され得る。
【００８４】
Ａ．さらなる活性剤
ポリマー粒子中に存在する１種または複数種のグルココルチコイドに加えて、製剤は、１種または複数種のさらなる治療剤、診断剤および／または予防剤を含有し得る。活性剤は、小分子活性剤または酵素もしくはタンパク質、ポリペプチドもしくは核酸などの生体分子であり得る。適した小分子活性剤として、有機および有機金属化合物が挙げられる。いくつかの場合には、小分子活性剤は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、より好ましくは、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、最も好ましくは、約１２００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。小分子活性剤は、親水性、疎水性または両親媒性の化合物であり得る。
【００８５】
一部の場合では、１種または複数種のさらなる活性剤は、１種または複数種のポリマーナノ粒子から形成される粒子中にカプセル封入され得るか、分散され得るか、またはその他の方法で会合され得る。ある特定の実施形態では、１種または複数種のさらなる活性剤は、薬学的に受容可能な担体中に溶解または懸濁され得る。
【００８６】
眼の疾患の処置のための医薬組成物の場合には、製剤は、１種または複数種の眼用薬物を含有し得る。特定の実施形態では、眼用薬物は、後眼部の疾患または障害を処置、予防または診断するために使用される薬物である。眼用薬物の限定されない例として、抗緑内障剤（ａｎｔｉ−ｇｌａｕｃｏｍａ  ａｇｅｎｔ）、抗血管新生剤、抗感染剤、抗炎症剤、増殖因子、免疫抑制剤、抗アレルギー剤およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８７】
代表的な抗緑内障剤として、プロスタグランジン類似体（トラボプロスト、ビマトプロストおよびラタノプロストなど）、ベータ−アドレナリン（ａｎｄｒｅｎｅｒｇｉｃ）受容体アンタゴニスト（チモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール（ｌｅｖｏｂｅｔａｘｏｌｏｌ）およびカルテオロールなど）、アルファ−２アドレナリン受容体アゴニスト（ブリモニジンおよびアプラクロニジンなど）、炭酸脱水酵素阻害剤（ブリンゾラミド、アセタゾラミン（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｎｅ）およびドルゾラミドなど）、縮瞳薬（すなわち、副交感神経刺激薬、ピロカルピンおよびエコチオパートなど）、セロトニン作動薬、ムスカリン作動薬、ドーパミン作動性アゴニスト、およびアドレナリン作動性アゴニスト（アプラクロニジンおよびブリモニジンなど）が挙げられる。
【００８８】
代表的な抗血管新生剤として、それだけには限らないが、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））およびｒｈｕＦＡｂ  Ｖ２（ラニビズマブ、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））などの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体ならびにアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））を含めた他の抗ＶＥＧＦ化合物；ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニムナトリウム（ｐｅｇａｐｔａｎｉｍ  ｓｏｄｉｕｍ）、抗ＶＥＧＦアプタマーまたはＥＹＥ００１）（Ｅｙｅｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））およびロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（登録商標））などのＣＯＸ−２阻害剤；インターフェロンアルファ；インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）；サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））およびレナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））などのその誘導体；スクアラミン；エンドスタチン；アンギオスタチン；ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）（Ｓｉｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）などのリボザイム阻害剤；ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＡＥ−９４１）（Ａｅｔｅｒｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｑｕｅｂｅｃ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｎａｄａ）などの多機能血管新生抑制剤；スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））などの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））およびエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））などのチロシンキナーゼ阻害剤；パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））およびセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））などの上皮増殖因子受容体に対する抗体、ならびに他の当技術分野で公知の抗血管新生剤が挙げられる。
【００８９】
抗感染剤として、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗寄生生物剤および抗真菌剤が挙げられる。代表的な抗ウイルス剤として、ガンシクロビルおよびアシクロビルが挙げられる。代表的な抗生物質剤として、ストレプトマイシン、アミカシン、ゲンタマイシンおよびトブラマイシンなどのアミノグリコシド、ゲルダナマイシンおよびハービマイシンなどのアンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、バンコマイシン、テイコプラニンおよびテラバンシンなどのグリコペプチド、リンコサミド、ダプトマイシンなどのリポペプチド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシンおよびエリスロマイシンなどのマクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、ペニシリン、バシトラシン、コリスチンおよびポリミキシンＢなどのポリペプチド、キノロン、スルホンアミドおよびテトラサイクリンが挙げられる。
【００９０】
一部の場合では、活性剤は、オロパタジンおよびエピナスチンなどの抗アレルギー剤である。
【００９１】
抗炎症剤は、非ステロイド系およびステロイド系抗炎症剤の両方を含む。適したステロイド系活性剤として、グルココルチコイド、プロゲスチン、ミネラルコルチコイドおよびグルココルチコイドが挙げられる。
【００９２】
眼用薬物は、その中性形態で、または薬学的に受容可能な塩の形態で存在し得る。一部の場合では、安定性の増強または望ましい溶解度または溶解プロファイルなどの塩の有利な物理的特性のうち１種または複数種のために、活性剤の塩を含有する製剤を調製するのに望ましいものであり得る。
【００９３】
一般に、薬学的に受容可能な塩は、水中または有機溶媒中または２種の混合物中で、活性剤の遊離酸または塩基の形態を、化学量論的量の適当な塩基または酸と反応させることによって調製され得、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。薬学的に受容可能な塩として、無機酸、有機酸、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩に由来する活性剤の塩、ならびに薬物の、適した有機リガンド（例えば、第四級アンモニウム塩）との反応によって形成される塩が挙げられる。適した塩の一覧が、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２０００年、７０４頁に見いだされる。薬学的に受容可能な塩の形態で投与されることもある眼用薬物の例として、マレイン酸チモロール、酒石酸ブリモニジンおよびナトリウムジクロフェナクが挙げられる。
【００９４】
一部の場合では、活性剤は、眼をイメージングするか、その他の方法で評価する診断剤である。例示的診断剤として、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子および放射性核種、Ｘ線イメージング剤および造影剤が挙げられる。
【００９５】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１種または複数種の局所麻酔剤を含有する。代表的な局所麻酔剤として、テトラカイン、リドカイン、アメトカイン（ａｍｅｔｈｏｃａｉｎｅ）、プロパラカイン、リグノカインおよびブピバカインが挙げられる。一部の場合では、局所麻酔剤の分散を促進および改善するために、製剤にヒアルロニダーゼ酵素などの１種または複数種のさらなる薬剤も添加される。
【００９６】
Ｂ．眼投与のための製剤
ポリマーナノ粒子は、好ましくは、眼への注射のための懸濁物として製剤化される。眼投与用医薬製剤は、好ましくは、１種または複数種のポリマーナノ粒子から形成される粒子の滅菌水性懸濁物の形態である。受容可能な溶媒として、例えば、水、リンガー溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。製剤はまた、１，３−ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌溶液、懸濁物またはエマルジョンであり得る。
【００９７】
いくつかの場合には、製剤は、液体形態中に分配またはパッケージングされる。あるいは、眼投与用製剤は、例えば、適した液体製剤の凍結乾燥によって得られる固体としてパッケージングされ得る。固体は、投与の前に適当な担体または希釈剤を用いて再構成され得る。
【００９８】
眼投与用溶液、懸濁物またはエマルジョンは、眼投与に適したｐＨを維持するのに必要な有効量のバッファーを用いて緩衝され得る。適したバッファーは、当業者に周知であり、有用なバッファーのいくつかの例として、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩バッファーがある。
【００９９】
眼投与用の溶液、懸濁物またはエマルジョンはまた、製剤の等張性範囲を調整するために１種または複数種の張度剤も含有し得る。適した張度剤は、当技術分野で周知であり、いくつかの例として、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムおよび他の電解質が挙げられる。
【０１００】
眼投与用の溶液、懸濁物またはエマルジョンはまた、眼用調製物の細菌汚染を予防するために１種または複数種の保存料を含有し得る。適した保存料は、当技術分野で公知であり、ポリヘキサメチレンビグアニジン（ＰＨＭＢ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、安定化されたオキシクロロ複合体（別名Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標）としても知られる）、酢酸フェニル水銀、クロロブタノール、ソルビン酸、クロルヘキシジン、ベンジルアルコール、パラベン、チメロサールおよびそれらの混合物が挙げられる。
【０１０１】
眼投与用の溶液、懸濁物またはエマルジョンはまた、分散剤、湿潤剤および懸濁剤などの当業者において公知の１種または複数種の賦形剤を含有し得る。
【０１０２】
Ｖ．使用方法
１種または複数種のグルココルチコイドの送達のための徐放性投与製剤は、急性黄斑変性症などの血管形成、角膜移植片拒絶などの炎症または網膜炎と関連している患者において疾患または障害を処置するために使用され得る。投与すると、１種または複数種のグルココルチコイドは、治療的利益をもたらすのに十分に高いが、細胞毒性を避けるように十分に低い濃度で長期間にわたって放出される。
【０１０３】
１つの好ましい実施形態では、医薬組成物は、眼の新血管形成と関連している患者において疾患または障害を処置または予防するために投与される。
【０１０４】
別の好ましい実施形態では、製剤は、角膜移植片拒絶を処置または予防するために、結膜下（ＳＣ）注射によって投与され、結膜組織中に保持される。
【０１０５】
眼に投与される場合には、粒子は、低用量の１種または複数種のグルコステロイドおよび／または他の活性剤を長期間にわたって、好ましくは、３、７、１０、１５、２１、２５、３０または４５日よりも長く放出する。ポリマーナノ粒子の構造またはポリマーマトリックスの構成、粒子形態学および投与される粒子の投与量は、暗所視ＥＲＧ  ｂ−波振幅の低減および／または網膜変性などの副作用を最小にしながら、眼に治療上有効な量の１種または複数種の活性剤を長期間にわたって投与するように調整され得る。
【０１０６】
製剤は、硝子体内注射（例えば、前部、中央または後部硝子体注射）、結膜下注射、前房内注射、耳側輪部（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｉｍｂｕｓ）を介する前眼房への注射、基質内注射、脈絡膜下腔への注射、角膜内注射、網膜下注射および眼内注射によって眼に局所投与され得る。好ましい実施形態では、医薬組成物は、硝子体内注射によって投与される。
【０１０７】
移植物は、当技術分野で公知の移植のための適した方法を使用して眼に投与され得る。ある特定の実施形態では、移植物は、２２−ゲージニードルなどのニードルを使用して硝子体内に注射される。移植物を硝子体内に配置することは、移植物の大きさ、移植物の形状および処置されるべき疾患または障害を考慮して変更され得る。
【０１０８】
好ましい実施形態では、ナノ粒子は、硝子体内注射（例えば、前部、中央または後部硝子体注射）、結膜下注射、前房内注射、耳側輪部を介する前眼房への注射、基質内注射、脈絡膜下腔への注射、角膜内注射、網膜下注射および眼内注射によって眼に局所投与される。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ナノ粒子は、新血管形成、移植片拒絶またはブドウ膜炎などの炎症を予防または減少させるのに有効な量で投与される。
【０１１０】
好ましい実施形態では、ナノ粒子は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、月に１回、２カ月に１回または３カ月に１回以下の頻度で投与される。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書において記載される医薬組成物および／または移植物は、１種または複数種のさらなる活性剤と同時投与される。「同時投与」とは、本明細書において、１種または複数種のグルココルチコイドの徐放性製剤と、同一剤形内の１種または複数種のさらなる活性剤との投与ならびに同時にまたは本質的に同時の異なる剤形を使用する投与を指す。「本質的に同時」とは、本明細書において、一般に、１０分以内、好ましくは、５分以内、より好ましくは、２分以内、最も好ましくは、１分以内を意味する。
【０１１２】
一部の実施形態では、本明細書において記載される医薬組成物および／または移植物は、眼の血管新生疾患または障害のための１種または複数種のさらなる処置と同時投与される。一部の実施形態では、本明細書において記載される医薬組成物および／または移植物は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）またはアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））のような１種または複数種の抗血管新生剤と同時投与される。
【０１１３】
好ましくは、粒子は、炎症を予防または低減するために有効量の１種または複数種のグルココルチコイドを長期間にわたって放出する。好ましい実施形態では、粒子は、有効量の１種または複数種のグルココルチコイドを少なくとも２週間の期間にわたって、より好ましくは、少なくとも４週間の期間にわたって、より好ましくは、少なくとも６〜８週間の期間にわたって放出する。一部の実施形態では、粒子は、有効量の１種または複数種のグルココルチコイドを３カ月またはそれ超の期間にわたって放出する。
【０１１４】
本発明は、以下の限定されない実施例の参照によってさらに理解される。
【実施例】
【０１１５】
（実施例１：グルココルチコイドの送達のためのＰＬＧＡナノ粒子の調製）
材料および方法
ＰＬＧＡナノ粒子の調製
【０１１６】
蛍光マーカーとしてここで使用したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５（ＡＦ５５５）カダベリンおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）カダベリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、ＰＬＧＡ（ＭＷ３．２ｋＤａ、ＬＡ：ＧＡ＝５０：５０）（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）に化学的にコンジュゲートさせた。標識された、または標識されていないＰＬＧＡポリマーから構成されるナノ粒子は、溶媒拡散（またはナノ沈殿）法によって調製した。手短には２０ｍｇのポリマーを１ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、７００ｒｐｍで磁気撹拌下で４０ｍｌの超純水に滴下添加した。約１時間撹拌した後、溶液を３０分間回転蒸発させて、残存するＴＨＦを除去した。１０，０００ｇで２５分間遠心分離することによって粒子を回収し、０．２ｍＬの超純水に再懸濁した。ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）Ｆ１２７コーティングされた粒子のために、ナノ沈殿の間に超純水を５％  Ｆ１２７水溶液と置換した。Ｆ１２７（ＰＬＧＡ／Ｆ１２７）を用いてコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子を、１０，０００ｇで２５分間の遠心分離によって１％  Ｆ１２７を用いて洗浄し、０．２ｍＬの超純水に再懸濁した。ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ＮＡＮＯ（登録商標）ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して、それぞれ動的光散乱およびレーザードップラー流量測定（ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ａｎｅｍｏｍｅｔｒｙ）によって大きさおよびゼータ電位（表面電荷）を測定した。
【０１１７】
モデルナノ粒子の調製
大きさ１００、２００、５００、１０００ｎｍの赤色蛍光ＣＯＯＨ修飾ＰＳ粒子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）および５μｍ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒｉｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を、ＣＯＯＨ−アミン反応によってメトキシ（ＭｅＯ）−ＰＥＧ−アミン（ＮＨ２）（ＭＷ５ｋＤ；Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ）を用いて共有結合によって修飾した。ＰＥＧ化ＰＳ粒子（ＰＳ−ＰＥＧ）を徹底的に洗浄し、水に再懸濁し、使用の準備ができた状態で＋４℃で保存した。表面電荷および流体力学直径に関してＰＳ−ＰＥＧ粒子を特徴付け、その物理化学的特徴を表３において報告した。
【０１１８】
ＤＳＰが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子の調製
デキサメタゾン２１−リン酸ナトリウム塩（ＤＳＰ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、修飾溶媒拡散法にしたがったＦ１２７コーティングを有するＰＬＧＡナノ粒子中にカプセル封入した。手短には、０．５ｍＬの、１０ｍｇのＤＳＰを含有する水溶液に１ｍＬの０．５Ｍの酢酸亜鉛水溶液を添加することによって、ＤＳＰ−亜鉛錯体を形成した。１０，０００ｇで５分間の遠心分離後、沈殿した錯体および５０ｍｇのＰＬＧＡ（ＭＷ３．２ｋＤａ、ＬＡ：ＧＡ＝５０：５０）を２．５ｍＬのＴＨＦに溶解し、続いて、２０μＬのトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した。撹拌しながら、１００ｍＬの５％  Ｆ１２７溶液中に混合物を滴下添加して、Ｆ１２７でコーティングした、ＤＳＰが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子を形成した（ＤＳＰ／ＰＬＧＡ／Ｆ１２７またはＤＳＰ−ＮＰ）。溶媒蒸発および回転蒸発によってＴＨＦを完全に除去した後、ナノ粒子懸濁物に１ｍＬの０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）水溶液（ｐＨ７．５）を添加して、亜鉛をキレート化し、カプセル封入されていないあらゆるＤＳＰ−亜鉛錯体を可溶化した。１０，０００ｇで２５分間の遠心分離によってナノ粒子を回収し、１％  Ｆ１２７を用いて２回洗浄し、０．２ｍＬの超純水に再懸濁した。ナノ粒子の水力学的大きさおよび表面電荷を、上記のように特徴付けた。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７６００透過型電子顕微鏡（株式会社  日立製作所、東京、日本）を使用して粒子形態学を可視化した。
【０１１９】
薬物負荷およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出研究
ＤＳＰ／ＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子中のＤＳＰ含量を測定するために、およそ５０μＬのＰＬＧＡナノ粒子を凍結乾燥させ、秤量し、０．５ｍＬのアセトニトリルに溶解した。その後、１ｍＬの５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して、亜鉛をキレート化し、カプセル封入されたＤＳＰを可溶化し、逆相ＨＰＬＣによって溶液中のＤＳＰ濃度を測定した。均一濃度（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）分離を、Ｐｕｒｓｕｉｔ  ５  Ｃ１８カラム（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＣＡ）および０．１％トリフルオロ酢酸（流量＝１ｍＬ／分）を含有するアセトニトリル／水（３５／６５  ｖ／ｖ）からなる移動相を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＬＣシステム（京都、日本）で実施した。カラム流出液を、２４１ｎｍでＵＶ検出によってモニタリングした。以下の方程式にしたがって、薬物負荷（ＬＤ）およびカプセル封入効率（ＥＥ）を算出した：
ＤＬ（％）＝（ナノ粒子中のＤＳＰの量／ナノ粒子の重量）×１００
ＥＥ（％）＝（実測された薬物負荷／理論上の薬物負荷）×１００
【０１２０】
ＤＳＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイルを測定するために、４００μＬのナノ粒子懸濁物を、透析チューブセルロースメンブレン（ＭＷカットオフ：１０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に密閉した。１２ｍＬの放出媒体（ｒｅｌｅａｓｅ  ｍｅｄｉａ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を含有する  ５０ｍＬのコニカルチューブ中に、密閉された透析メンブレンを配置し、プラットフォームシェーカー（１４０ｒｐｍ）上３７℃でインキュベートした。所定の間隔で全放出媒体を回収し、１２ｍＬの新鮮ＰＢＳで置換した。回収された放出媒体中のＤＳＰ濃度を、上記のようにＨＰＬＣによって測定した。
【０１２１】
動物
８週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、ＬｅｗｉｓおよびＢｒｏｗｎ  ＮｏｒｗａｙラットをＨａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および保持研究にはＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。Ｌｅｗｉｓラットは、レセプター動物として使用し、Ｂｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙラットは、ドナー動物として使用した。すべてのラットは、眼科学的研究における動物の使用に関して、視覚と眼科学に関する研究学会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）にしたがってケアした。試験手順の前に動物に麻酔した。すべての実験プロトコールは、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０１２２】
結膜下投与後のナノ粒子の保持
ＳＣ注射後のナノ粒子の保持を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）での眼全体のイメージングによって調べた。ラットを、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉内注射を用いて麻酔した。非分解性モデル粒子、赤色蛍光を有するＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰ（動的直径およそ１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍおよび５μｍ）を、２６ゲージニードルを使用してＳＣ注射（５０μＬ）によってＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに注射した。眼瞼を、イメージングの間に４５Ｇ開瞼器（Ｆｏｃｕｓ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｏｎｔａｒｉｏ、ＣＡ）を用いて広げた。注射部位における総蛍光カウントを、５５０ｎｍの励起波長および５７０ｎｍの発光波長で記録した。イメージは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアによって分析し、０時間でナノ粒子をＳＣ注射した眼と比較することによってナノ粒子の保持を定量化した。処置を施さなかったラットの眼をベースラインとして使用した。
【０１２３】
ＳＣ注射後の生分解性ＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子の保持は、上記と同一の方法で実施し、分析した。化学的にコンジュゲートされたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ  ６４７（ＡＦ６４７）色素を有するＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子を使用し、６４０ｎｍの励起波長および６８０ｎｍの発光波長を用いて眼全体をイメージングした。
【０１２４】
負荷されていないＰＬＧＡナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性プロファイル
Ｆ１２７コーティングされた、およびコーティングされていない両方の空のＰＬＧＡナノ粒子を、眼あたり１ｍｇの用量で  ＳＣ注射によって生理食塩水（５０μＬ）中で投与した（ｎ＝９）。対照眼は、生理食塩水を用いて処置した（ｎ＝９）。２日、７日および１４日の時点で、動物を屠殺し、眼全体を結膜組織と一緒に、固定化およびＨ＆Ｅを用いる染色後に組織学研究のために回収した。
【０１２５】
ＳＣ注射後のｉｎ  ｖｉｖｏでの眼のＤＳＰレベル
ラットにおいてＳＣ注射後に眼のＤＳＰレベルを検出するために、Ｆ１２７コーティングされたＤＳＰが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子（ＤＳＰ−ＮＰ）の調製の間に、［３Ｈ］標識されたＤＳＰをＤＳＰでスパイクした（１０μＣｉ：１ｍｇ  ＤＳＰ）。ナノ粒子を、２０μＣｉ／ｍＬで生理食塩水に懸濁した。２０μＣｉ／ｍＬの遊離ＤＳＰ溶液を、同一ブレンド比で調製した。４０μＬ（眼あたり約０．８μＣｉ）の同一製剤を、同一動物（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット）の両眼に注射した。示された時間間隔、注射後２時間、１日、３日、５日および７日で、ラットをケタミン／キシラジン溶液の筋肉内注射によって麻酔した。尾静脈から２滴の血液を回収した後、動物を屠殺した。
【０１２６】
ラットから結膜組織とともに眼球を注意深く採取し、ＰＢＳを用いてすすぎ、Ｋｉｍｗｉｐｅティッシュによって乾燥させた。前眼房液（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｈｕｍｏｒ）、角膜、硝子体、網膜および残存する眼球組織を注意深く解剖し、回収した。角膜および網膜組織の両方を、ＰＢＳを用いてすすぎ、Ｋｉｍｗｉｐｅティッシュを用いて乾燥させた。すべてのサンプルを秤量し、２ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅを用い、５０℃で終夜インキュベートすることによって溶解した。０．２ｍｌのＨ２Ｏ２および２０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを用いて血液サンプルを漂白した。１０ｍｌのＵｌｔｉｍｏｌｄ  ｇｏｌｄシンチレーション媒体を添加し、その後、シンチレーションカウンターで放射能をカウントした。結果は、注射された用量のパーセンテージとして表し、データ点あたりの４個の眼（２匹の動物）の平均±ｓｄである。血液中のＤＳＰのレベルは、時点あたりの２匹の動物の平均とした。眼周囲組織の注射された用量の総パーセンテージおよび１ｍｇ（または１ｍＬ）の組織あたりの放射能を算出した。
【０１２７】
角膜移植術
ラットを用いて実施したすべての手順は、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。Ｂｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙドナーラットは、屠殺し、４．０ｍｍトレフィンを用いて両眼の中心角膜ボタンを採取し、使用の準備ができた状態で生理学的溶液中で維持した。手術は、手術用顕微鏡下で角膜外科医（ＱＰ）によって実施した。角膜レシピエントＬｅｗｉｓラットを、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉内注射を用いて麻酔した。手術前に総瞳孔散大のためにＬｅｗｉｓラットで０．５％トロピカミド点眼薬の反復点眼を使用した。穿刺術を実施し、その後、穿頭術（ｔｒｅｐｈｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を実施し、前眼房をヒアルロン酸で満たした。３．５ｍｍトレフィンを用いてレセプターＬｅｗｉｓラットから角膜ボタンを採取した。ドナー角膜ボタンを、８縫合点を用いてレセプター角膜に縫合した。
【０１２８】
全層角膜移植術（ＰＫ）後の手術後処置
全層角膜移植術の直後に、動物を無作為に５群に分けた：群１（４匹のラット）は、５０μＬの生理食塩水の結膜下注射を受け、群２（５匹のラット）は、５０μｌの空のＮＰのＳＣ注射を受け、群３（５匹のラット）は、１ｍｇ／ｍＬの濃度の５０μＬのＤＳＰ溶液のＳＣ注射を受け、群４（６匹のラット）は、１ｍｇ  ＤＳＰ／ｍＬの濃度の５０μＬのＤＳＰが負荷されたナノ粒子（ＤＳＰ−ＮＰ）のＳＣ注射を受けた。すべての群の動物が、移植片の不全または研究のエンドポイント（９週間）まで、週に１回、同一処置を受けた。
【０１２９】
群１および群２について術後（ＰＯ）２週間で、群３についてＰＯ４週でおよび群４についてＰＯ９週で２人の眼科医（ＱＰおよびＬＴ）によって、細隙灯顕微鏡を用いて臨床観察を実施した。角膜移植片の検査のために３種のパラメータを評価した（角膜透明度、浮腫および新血管形成）。パラメータのスコアリングは、以下に示されている。
【０１３０】
眼内圧は、ＰＯ２日、術後１週間、２週間、４週間、６週間、８週間および９週間でモニタリングした。各眼について記録されたＩＯＰは、成功裏の３つの測定値の平均である。終了時点で動物をＣＯ２によって屠殺し、ＰＫ術を施した眼を眼球摘出した。眼組織を、１０％ホルマリンを用いて２４時間固定し、その後、パラフィン中に包理した。切片（５μｍ）を視神経および角膜の方向に切り出し、Ｈ＆Ｅを用いて染色した。
【０１３１】
統計分析
データの統計分析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くチューキー検定によって実施した。差は、Ｐ＜０．０５のレベルで統計的に有意であると考えられた。
【０１３２】
結果
ＤＳＰが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子の調製および特徴付け
疎水性デキサメタゾンをＰＬＧＡナノ粒子中にカプセル封入することは、デキサメタゾンおよびＰＬＧＡの不適合性のために困難である。水溶性プロドラッグ、デキサメタゾン２１−リン酸二ナトリウム（ＤＳＰ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで親薬物デキサメタゾンに変換され得、主に、眼組織を含めたすべての臓器中に存在するホスファターゼによって促進される。水溶性ＤＳＰは、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）Ｆ１２７の存在下でＰＬＧＡナノ粒子中に亜鉛とともに効率的に同時カプセル封入される。ＤＳＰが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子（ＤＳＰ−ＮＰ）の物理化学的特性は、表３に示されている。ＤＳＰ−ＮＰは、−５ｍＶの表面電荷を示し、これは、高密度なＰＥＧコーティングを示し、疎水性ナノ粒子上のＰＬＵＲＯＮＩＣＳ  Ｆ１２７の強力な結合によるものである。ＤＳＰ−ＮＰは、ＴＥＭ観察によって確認される球状の形態であった。ＤＳＰ−ＮＰは、約７２％のカプセル封入効率に相当する約１２％  ｗ／ｗの高薬物負荷を示した。ＤＳＰ−ＮＰからのＤＳＰの放出は、最大１５日持続的であり、負荷されたＤＳＰのほぼ８０％が、最初の７日以内に放出された（図１）。亜鉛が、ＰＬＧＡ上の末端カルボキシル基と薬物分子上のホスフェート基の間とのイオン橋の形成のために、カプセル封入効率を高め、ＰＬＧＡナノ粒子からの水溶性グルココルチコイドの持続放出も促進すると考えられた。
【表１】
2017524712.tif 000003
【０１３３】
ＳＣ投与後のナノ粒子の眼の保持
蛍光色素標識されたナノ粒子のＳＣ注射を施した正常なラット眼の蛍光イメージは、ラットへのＳＣ注射後の生体不活性ＰＥＧコーティング（ＰＳ−ＰＥＧ）を有する非分解性ポリスチレン粒子の保持を示した。ＰＳ−ＰＥＧ粒子の保持は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングによって定量化した。ライブイメージングを使用して、ラットにおけるＳＣ投与後のナノ粒子の保持を定量化した。第１に、ナノ粒子の保持に対するサイズ効果を調べるために、非分解性ＰＳ−ＰＥＧ粒子を適用した。１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍ  および５μｍのサイズを有するＰＳ−ＰＥＧ粒子はすべて、高密度のＰＥＧコーティングを示すほぼ中性の表面電荷を示した。ＰＳ−ＰＥＧ粒子を、ＳＣ注射によってラットに投与し、ライブイメージングを用いて蛍光シグナルを定量化した。１００ｎｍ、２００ｎｍおよび５００ｎｍのサイズを有するＰＳ−ＰＥＧ粒子はすべて、ＳＣ注射後最初の６時間の間に、蛍光シグナルのおよそ６０％の減少を示した。後に、残りの２カ月の保持研究について一定レベルの蛍光が観察され、これは、１００ｎｍほどの小さい粒子についてＳＣ注射後にこれらの非分解性粒子の一定の保持を示した。大きな粒子（１μｍおよび５μｍ）については、全保持研究によって粒子のほぼ１００％の保持が観察された（図２）。しかし、２６ゲージのニードルを通して大きな粒子を注射することはより困難であった。これらの粒子がＰＥＧ化され、注射前に十分に懸濁されても、ナノ粒子のある程度の沈降および凝集が観察された。
【０１３４】
ＡＦ−６４７で標識されたＰＬＧＡ／Ｆ１２７  ＮＰのＳＣ注射後の種々の時点での代表的な蛍光イメージおよびラット眼の保持曲線を使用して、ＳＣ注射後の生分解性ＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子（１８６ｎｍ）の保持を算出した。蛍光色素を、ＰＬＧＡに化学的にコンジュゲートさせ、その後、ＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子を調製した。蛍光シグナルは、ＰＯ３０日後であっても検出された。全３０日の保持研究の間にシグナルの段階的減少が観察された。蛍光シグナルの１０％未満が、ＰＯ８日に保持されていた。
【０１３５】
ＳＣ注射後のＰＬＧＡナノ粒子の眼の安全性
生理食塩水、ＰＬＧＡ／Ｆ１２７およびコーティングされていないＰＬＧＡナノ粒子のＳＣ注射を用いて処置されたラット角膜および結膜組織の代表的なイメージのＰＯ２日、７日および１４日でのサンプル角膜組織学は、ＰＬＧＡ／Ｆ１２７  ＮＰおよびＰＬＧＡ  ＮＰについてＰＯ２日に注射領域に密接する結膜組織が、慢性炎症を有すること（グレード１）および慢性炎症が、ＰＯ７日およびＰＯ１４日で段階的に消失した（グレード０〜１）ことを示した。生理食塩水対照群について同様の炎症反応が観察された。生理食塩水注射は、ＰＯ２日に軽度の慢性炎症（グレード１）を示し、ＰＯ７日およびＰＯ１４日に回復した（グレード０〜１）。（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ  Ｄｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｅｂｅｒｈａｒｔによって観察され、グレード付けされ、炎症の全グレードは、０〜３、炎症なし〜重度の炎症である）。
【０１３６】
空のナノ粒子担体のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を決定するために、健常なＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにＳＣ注射によって、生理食塩水に懸濁された、ＰＬＧＡ（ＰＥＧコーティングなし）、ＰＬＧＡ／Ｆ１２７（高密度のＰＥＧコーティング）ナノ粒子を投与した。組織学的検査を適用して眼組織における炎症反応を決定した。生理食塩水対照群を含めたすべての注射群について、２日目の結膜組織において軽度の炎症のみが観察された。７日目および１４日目に、Ｆ１２７コーティングを有するおよび有さないすべてのナノ粒子は、結膜、角膜および網膜を含めたすべての眼組織において炎症を示さなかった。生理食塩水対照と同様に、ＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子は、良好な安全性プロファイルを示し、２日目、７日目および１４日目に、ラット眼へのＳＣ注射後に極めて軽度の炎症を有する〜炎症なしであった。すべての群について、網膜、前眼房および角膜を含めたその他の眼組織において炎症なしが観察された。結果は、図３に示されている。
【０１３７】
ＳＣ投与後のＤＳＰ−ＮＰは、眼組織におけるＤＳＰレベルを持続させた
ＤＳＰ不含薬物またはＤＳＰが負荷されたＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子（ＤＳＰ−ＮＰ）（両方とも、約０．０８ｍｇのＤＳＰを含有する）のいずれかの単回ＳＣ注射後に、ＤＳＰの眼組織レベルを比較した。図４Ａ〜４Ｄは、ラットへの皮下投与後の遊離ＤＳＰ溶液およびＤＳＰ−ＮＰの薬物動態学（時間（日数）をわたってのＤＳＰ／ｍｌ）のグラフである。図４Ａは、注射部位であり；図４Ｂは、眼房水中であり；図４Ｃは、硝子体液中であり；図４Ｄは、血液中である。
【０１３８】
ＰＯ２時間で結膜組織で、遊離ＤＳＰ溶液の総用量のおよそ０．４％が保持され、ＰＯ１日でＤＳＰはほとんど検出できなかった。比較すると、ＤＳＰ−ＮＰ群は、ＰＯ２時間で結膜組織に保持された総用量のほぼ６５％を示し、結膜組織での保持されたＤＳＰレベルは、ＰＯ７日で５％に段階的に低下した。眼組織、眼房水、硝子体、網膜および角膜を分析することによって、眼組織のＤＳＰレベルは、極めて迅速に減少し、ＤＳＰ遊離薬物のＳＣ注射のベースラインに達することがわかった。ＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射は、眼房水および硝子体でのＤＳＰの高レベルを最大ＰＯ７日に大幅に延長した。網膜および角膜のＤＳＰレベルは、ＤＳＰおよびＤＳＰ−ＮＰ群の両方について極めて低かった。ＤＳＰレベルはまた、種々の時点で採取された血液サンプルにおいて測定された。ＤＳＰ−ＮＰ群は、ＰＯ２時間からＰＯ７日で一貫して低レベルのＤＳＰ（１ｍｌあたり約５０ｎｇのＤＳＰ）を示した。比較すると、ＤＳＰ群は、ＰＯ２時間で血液１ｍｌあたり３５０ｎｇほどの高いＤＳＰを示し、次いで、ベースラインまで迅速に減少した。すべての組織において３Ｈ−ＤＳＰの放射能を測定することによってＤＳＰレベルを定量化した。いくつかのデータ点で値がないことは、レベルが検出可能ではないことを意味する。これは、図５に示されている。
【０１３９】
ＳＣ投与後のＤＳＰ−ＮＰは、角膜移植片拒絶を予防した
ナノ粒子のＳＣ注射を施した移植された角膜の手術後細隙検査を実施した。生理食塩水のＳＣ注射およびＰＬＧＡ／Ｆ１２７（ＮＰ）のＳＣ注射を施した群について、ＰＯ２週間ですべての移植片が拒絶された。ＤＳＰ（Ｄ）のＳＣ注射を施した群について、ＰＯ４週間ですべての移植片が拒絶され、ＤＳＰ／ＰＬＧＡ／Ｆ１２７（ＤＳＰ−ＮＰ）のＳＣ注射を施した場合、ＰＯ９週間の研究終了時点でさえすべての移植片が澄明でとどまった（Ｅ）。
【０１４０】
角膜透明性、浮腫および新規血管に関して終了時点で、生理食塩水、ＮＰ、ＤＳＰおよびＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射を用いて処置された移植片を臨床的に評価した。結果は、図６および７に示されている。ＤＳＰ−ＮＰについて、透明度および浮腫に関して図６にバーが示されていないことは、移植片が完全に透明であり、浮腫を有さないことを意味する。ＳＣ注射後のＰＯ２週での生理食塩水、ＰＯ２週での空のＮＰ、ＰＯ４週での遊離ＤＳＰおよびＰＯ９週でのＤＳＰ−ＮＰの処置後の移植された角膜の組織学的イメージを実施した。外科的手順は、経験を積んだ眼科医によってすべて成功裏に実施され、手術合併症は起こらなかった。ＰＫの直後に、動物を無作為に４群に分け、各群への処置を、生理食塩水、ＮＰ、ＤＳＰおよびＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射によって開始した。臨床観察で移植片をスコア化するために、角膜透明度、浮腫および新血管形成を含めた３種のパラメータを使用した。手術後（ＰＯ）２週で、生理食塩水対照およびＮＰ対照群は、重度浮腫を示し、角膜移植片は、不透明であり、多量の新規血管が、縫合の周囲だけでなく、角膜移植片中にも形成された。しかし、ＤＳＰの毎週の注射を用いて処置された移植片は、有意に少ない浮腫（ｐ＜０．０００１）および少ない新血管形成（ｐ＜０．００１）を示した。ＤＳＰ群における角膜移植片は、生理食塩水対照およびＮＰ対照群と同程度に不透明であった。ＤＳＰ−ＮＰ処置群は、角膜の透明度、浮腫および新血管形成に関して有意により良好な結果を示した。ＤＳＰ−ＮＰ処置群について浮腫はなく、６匹のラットにおいてすべての角膜移植片は、全９週間の研究を通じて澄明であった。
【０１４１】
縫合の周囲に２、３の新血管が生じたが、ＤＳＰ−ＮＰ群における新血管形成は、その他の３群すべてよりも有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。重度浮腫および角膜透明度で重度の不透明によって示される完全な角膜移植片の不全が観察された場合には、動物を屠殺した。
【０１４２】
生理食塩水対照、空のＮＰ、遊離ＤＳＰおよびＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射を用いて処置された移植された角膜移植片の生存曲線は、図７に示されている。９週間にわたる同一サンプルの眼内圧が、図８に示されている。完全移植片拒絶は、生理食塩水対照およびＮＰ対照群についてＰＯ２週で起こった。ＤＳＰ遊離薬物の毎週のＳＣ注射によってわずかな改善が達成され、角膜移植片の生存率は、ＰＯ２週およびＰＯ３週でそれぞれ１００％および８０％であった。しかし、ＤＳＰ群のすべての角膜は、ＰＯ４週では依然として拒絶された。ＤＳＰ−ＮＰ処置群について有意により高い生存率が観察され、研究の最後（ＰＯ９週）に１００％の生存率であった。ＰＯ９週で、ＤＳＰ−ＮＰ群の角膜移植片は、すべて澄明、透明で、角膜の拒絶エピソードのなんの手がかりもなかった。
【０１４３】
終了点（生理食塩水およびＮＰ群についてはＰＯ２週、ＤＳＰ群についてはＰＯ４週およびＤＳＰ−ＮＰ群についてはＰＯ９週）で獲得された角膜組織の組織学的検査は、生理食塩水、ＮＰおよびＤＳＰ群の角膜組織は、すべて腫大しており、正常な健常角膜よりも厚かったことを示した。３群すべてについて角膜組織において好中球およびマクロファージが観察された。３種の対照群すべての移植片の明らかな内皮細胞死が観察され、角膜移植片の上皮層は、３種の対照群すべてでその完全性を失った。比較すると、ＤＳＰ−ＮＰ処置群の角膜は、無傷の上皮層、間質および内皮層を有する完全角膜構造を示し、角膜組織の腫大は存在しなかった。最も重要なことに、ＤＳＰ−ＮＰ処置角膜において炎症性細胞は見られず、移植された角膜が、研究全体の間にＳＣ注射によって、全機能を有して、ＤＳＰ−ＮＰ処置後に生存したことを示し、移植片は、正常として機能し始めた。
【０１４４】
同一群について１４日にわたる角膜新血管形成は、図９Ａおよび９Ｂに示されている。
【０１４５】
結果の要約
長期間にわたり免疫抑制剤を提供し得る持続放出プラットフォームは、臨床適用に都合がよく、患者コンプライアンスを改善し、副作用を低減する。ナノ粒子は、薬物の放出を持続させ得、硝子体内注射、局所投与および結膜下注射を含めた種々の経路によって治療剤を眼に送達するために広く使用されている。結膜下ナノ粒子は、治療剤を、適用に応じて数日間から数カ月間放出を持続させると示された。放出速度は、異なるポリマーの選択または製剤化における変化によって修飾され得る。角膜拒絶を予防するためのグルココルチコイドの持続放出のための、高密度ＰＥＧコーティングを有する生分解性ナノ粒子プラットフォームが開発された。Ｆ１２７などの特定のＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）は、ＰＬＧＡナノ粒子上に容易に吸着されて、高密度ＰＥＧコーティングを形成し得、これが粒子を生体不活性にする。眼は極めて感受性の臓器であり、投与された眼科学的製剤によって刺激、炎症反応が誘導され得、これは、患者の不快感を引き起こし、さらには重篤な眼障害をもたらし得る。したがって、免疫抑制剤の送達を持続させるための安全なプラットフォームおよび経路は有利であり得る。
【０１４６】
ＰＬＧＡ／Ｆ１２７の薬物送達プラットフォームは、両方とも、ＦＤＡによって一般的に安全と認識される（ＧＲＡＳ）材料として分類され、眼科学的製剤を含め、種々の医薬製剤における長い使用歴を有するＰＬＧＡおよびＦ１２７を含む。しかし、ナノ粒子の眼科使用に関する安全性問題は、依然として大きな懸念事項のままである。現在の研究では、ＰＬＧＡ／Ｆ１２７群の炎症反応は、すべての調べた時点（ＰＯ２日、７日および１４日）を通じて生理食塩水対照群のＳＣ注射に匹敵した。健常なラットは、ＳＣ注射後最初の２日の間に、ＳＣ注射後の軽度の眼の炎症を誘発したが、これは、７日内に減少する。炎症を低下するためのナノ粒子上へのＦ１２７からの高密度コーティングの効果が、ＢＡＬＢ／Ｃマウス肺への吸引およびＣＦ−１マウスへの膣投与で報告されている。Ｆ１２７を用いてコーティングされたおよびコーティングされていないＰＬＧＡナノ粒子のＳＣ投与では、肺および膣管における研究とは異なり重度炎症は観察されなかった。ＳＣ投与の眼周囲結膜組織（主に、筋組織および結合組織から構成される）は、肺気道および膣管に関与する上皮と同程度に感受性ではない場合がある。異なるコーティングを有するＰＬＧＡが他の眼部分に適用される場合には、安全性特性は変わり得る。Ｆ１２７コーティングは、ＳＣ投与用のＰＬＧＡナノ粒子により多くの安全性の利益を加えない場合もあるが、Ｆ１２７の使用は、コーティングされていないＰＬＧＡ  ＮＰと比較して、ＤＳＰ−ＮＰの収量を大いに増強する。ナノ粒子収集の際にＦ１２７コーティングを有さないＰＬＧＡ  ＮＰについて大きな凝集が起こった。
【０１４７】
非分解性モデルＰＳ−ＰＥＧナノ粒子は、ＳＣ注射後に最大２カ月間保持され得る。１００ｎｍ、２００ｎｍおよび５００ｎｍのＰＳ−ＰＥＧは、ＳＣ注射後、最初の６時間で４０〜６０％の低下を示し、これは注射後の漏出に起因し得る。５０μＬの容量の単回注射は、ラット結膜下腔には多すぎる可能性がある。ナノ粒子上の親水性ＰＥＧコーティングは、組織との接着がないために注射部位を通る粒子の漏出またはトランスロケーションをさらに助け得る。２００ｎｍおよび２μｍの大きさを有する非ＰＥＧ化疎水性ＰＳ粒子（カルボキシレート修飾）は、２０〜３０μＬの容量でのＳＣ注射後に結膜下組織において永久に保持されることが報告されている。より小さい注射容量および疎水性粒子の性質は、ナノ粒子のより少ない漏出または漏出がないことをもたらし得る。大きな粒子（１μｍおよび５μｍ）について極めて同様の結果が観察され、眼の保持の極めてわずかな減少がモニタリングされた。大きな粒子は沈降が容易であり、それらは、注射された水溶液が漏出した場合に結膜組織内で遮断され得、表面特性はその保持には多すぎて変化しない。生分解性ＰＬＧＡナノ粒子は、ＳＣ注射後最初の６時間で同様の傾向を示し、用量のほぼ４０％が減少したが、蛍光シグナルは、シグナルが完全に完全に消滅するまで１５日間減少し続け、これは非分解性の２００ｎｍのＰＳ−ＰＥＧナノ粒子とは異なっていた。蛍光シグナルの段階的減少は、ポリマーの分解およびまた化学的にコンジュゲートされた蛍光色素の放出に起因し得る。注射条件の最適化を通して、治療薬の持続放出のために、適した量のナノ粒子／マイクロ粒子がＳＣ腔中に成功裏に投与され得る。
【０１４８】
ＤＳＰが、前眼房に、さらに硝子体に長期間効率的に送達されることを確認するために、健常ラットにおいてトリチウム標識されたＤＳＰを有するＤＳＰ−ＮＰを用いて眼の薬物動態研究を実施した。遊離ＤＳＰを対照として使用した。Ｗｅｉｊｔｅｎｓおよび共同研究者は、ＳＣ注射は、眼球周囲注射または経口用量のいずれかと比較して、患者の眼の前眼部および後眼部の両方にＤＳＰを送達する最も有効な方法であることを見いだした。これまでの報告は、ＤＳＰのＳＣ注射が、ＰＯ２〜３時間でピーク硝子体デキサメタゾン濃度をもたらすことを示した。現在の研究では、ラット眼における眼房水および硝子体のＤＳＰのピーク濃度は、遊離ＤＳＰおよびＤＳＰ−ＮＰの両方について注射の２時間後に観察された。極めて明確な傾向が、この研究に基づいて正確なＴｍａｘは明らかではないが、高濃度のＤＳＰが、注射後最初の２時間内に極めて迅速に達成されたことを示した。ＤＳＰの結膜下注射は、点眼薬と比較して前眼房および硝子体中に残存するＤＳＰをもたらす。点眼薬を用いる頻繁な投薬を用いた場合、ＤＳＰの硝子体中への透過は、無視できるものであり、前眼房におけるＤＳＰ濃度は、ＳＣ注射よりもかなり低い。しかし、ＤＳＰ遊離薬物のＳＣ投与は、６時間未満の前眼房における有効なＤＳＰ濃度しか提供し得ない。前眼房および硝子体におけるＤＳＰレベルは、ＳＣ注射後ＰＯ１日でほぼベースラインに大きく低下した。ＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射後ＰＯ１日での前眼房および硝子体両方におけるＤＳＰの濃度は、それぞれ５１５７±３９５２ｎｇ／ｍＬおよび１２８６±８５１ｎｇ／ｍＬであった。前眼房および硝子体両方における高濃度のＤＳＰは、ＳＣ投与後ＰＯ７日でＤＳＰ−ＮＰについて依然として検出可能であったが、ＤＳＰのＳＣ投与のレベルは、検出可能ではなかった。
【０１４９】
血行性経路、経強膜経路および経角膜経路は、ＳＣ注射後の前眼房およびさらには硝子体へのＤＳＰの透過に寄与し得る。一部は、最初の６時間の間のＳＣ注射後のナノ粒子の漏出の可能性によるものであり得る。親水性ＤＳＰの水溶液は、注射部位から同様に漏出し得、これは、注射されたＤＳＰの保持時間を低減するが、ＳＣ注射後最初の数時間での涙液膜でのＤＳＰレベルを増大し、これは、眼への経角膜経路の薬物送達を増強し得る。ＳＣ注射は、血管に対する薬物の曝露領域を増大し、これは、薬物の血液循環への全身性取り込み（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｕｐｄａｔｅ）を増強した。ＤＳＰのＳＣ注射の血液ＤＳＰレベルは、前角膜表面での漏出した高ＤＳＰ濃度と一緒に、ＰＯ２時間で極めて高く、これは、ＤＳＰ−ＮＰ注射よりも８倍超高かった。ＤＳＰ−ＮＰは、ＳＣ注射後に遊離ＤＳＰ溶液よりも良好な保持を示し、ＤＳＰ−ＮＰからＤＳＰ薬物は持続的に放出された。
【０１５０】
要約すると、ＳＣ注射後のＤＳＰ−ＮＰについて、眼内組織においてだけでなく血液中でも一定レベルのＤＳＰが達成されている（ＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射については、一貫して低レベルの血液ＤＳＰレベル）。高い血中濃度を避けることは、ステロイドの全身性副作用の機会を低減するのに役立ちうる。
【０１５１】
注射された空のＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子の約２０％が、ＰＯ７日で結膜組織中に保持され、ナノ粒子からの蛍光レベルの段階的低減は、ナノ粒子の分解およびナノ粒子中のＰＬＧＡからの蛍光色素の切断に起因し得る。１００％から６０％への第１の大きな低下は、主に注射されたナノ粒子の漏出に起因し得るが、この低下は、眼組織における所望の一定の高レベルのＤＳＰには影響を及ぼさなかった。注意深い投与および注射容量の低減によって、ＳＣ注射からのナノ粒子の漏出は、最小化され得る。角膜、眼房水、硝子体および網膜の解剖後の眼球外組織での同様のＤＳＰレベルの段階的低下も観察された。これは結膜組織中のＤＳＰ−ＮＰの保持後のナノ粒子からのＤＳＰの持続放出に起因し得る。
【０１５２】
ＤＳＰは、眼房水および涙液膜からの物理的に吸収されるＤＳＰではなく、経角膜ＤＳＰによって表されるように、においてのみ検出した。角膜は、上皮、間質および内皮層を含む堅固な組織である。適した低分子量および親水性を有する薬物のみが、角膜を透過できる。ＤＳＰは、経角膜透過に適していない。したがって、涙液膜でのＤＳＰ濃度が極めて高い場合に、最初のほんの数時間でのみ、角膜組織内で低レベルのＤＳＰを検出できる。経角膜透過以外の経路が、ＳＣ注射後の眼内組織におけるＤＳＰの高レベルに寄与し得る。
【０１５３】
ＤＳＰの網膜への透過は無視できる。グルココルチコイドが、ほとんどのサイトカインの発現および作用を有効に阻害し得ることは周知であり、またＴ細胞アポトーシスを誘導するとわかっている。通常のＰＫ後に角膜拒絶を予防するために、長期間のグルココルチコイド点眼薬が必要である。グルココルチコイド点眼薬の長期間の使用は、安全性の問題を生じさせ得、また患者コンプライアンスの課題であり得る。本明細書において記載される研究は、週に１回の、ＳＣ注射用のＤＳＰ−ＮＰ製剤が、角膜同種移植片拒絶の有効な予防を達成するのに有効であることを示す。ＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射を用いる局所処置について観察された高い有効性が、ＡＣ液において見られた高レベルのＤＳＰと一致していた。対照、ＤＳＰおよびＰＬＧＡ／Ｆ１２７  ＮＰ群と比較すると、ＤＳＰ−ＮＰ処置群１は、組織学的研究において炎症性細胞を欠いていた。炎症性細胞は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−ａ、ＶＥＧＦを含めた種々のサイトカインを産生し得る。ＩＬ−２、ＴＮＦ−ａは、主要組織適合性複合体ＩＩ抗原発現を増大し、マクロファージおよびＴリンパ球を活性化して、より多くのサイトカイン放出につながり、免疫拒絶を引き起こし得る。ＳＣ注射後のＤＳＰ−ＮＰからの高レベルのＤＳＰの持続放出は、対照群と比較して、炎症の大きな阻害および角膜への新規血管成長の遅延に寄与した。角膜の無血管性は、角膜移植でその免疫特権を有する状態を維持するために重大であり、新血管形成は、角膜拒絶の駆動力であると考えられた。ＤＳＰのＳＣ注射は、角膜同種移植片の新血管形成の阻害で幾分かの効果を有していたが、週に１回の頻度でのＤＳＰのＳＣ注射からのＤＳＰレベルは、新規血管の成長を完全に抑制するには十分ではない。デキサメタゾンは、より高い抗炎症性効力を示すが（プレドニゾンと比較して７：１）、ＳＣ注射後の高ＤＳＰレベルのより短い保持が、その治療効力を依然として大きく損なった。
【０１５４】
眼内圧増大は、ＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射について全９週間の研究の間観察されなかった。カプセル封入されたＤＳＰの大部分、約８０％は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出研究において最初の１週間で放出され、注射後１週間で残存するＤＳＰは、およそ５％に低下した。したがって、何らかの副作用が観察されるまたはＩＯＰが増大する場合には、ＤＳＰは、ＤＳＰ−ＮＰのさらなるＳＣ投与をなくすことによって容易に停止され得る。他のデポーデバイスと比較すると、薬物送達デバイスを除去するためにさらなる手術が必要ではない。１週間間隔は、新血管形成を低減し、移植片角膜を澄明に維持するのに有効であった。これを臨床上実現可能な治療選択肢にするためには、この間隔を例えば１カ月に延長する必要があり得る。
【０１５５】
水溶性グルココルチコイドであるリン酸デキサメタゾンナトリウムが負荷された生分解性ＰＬＧＡ／Ｆ１２７ナノ粒子（ＤＳＰ−ＮＰ）を成功裏に構築し、ＤＳＰ−ＮＰは、最大７日間持続的にＤＳＰを放出し得る。結膜組織でのナノ粒子の長期の保持は、ラットでのＳＣ注射によって達成され、眼組織で一定に高いＤＳＰレベルが測定された。ＤＳＰ−ＮＰのＳＣ注射は、全９週間の研究によって角膜同種移植片拒絶を有効に予防したが、遊離ＤＳＰを用いる対照群は、ほんの４週間で移植片の不全をもたらした。この戦略は、投与頻度を低減し、グルココルチコイドの全身性副作用の可能性を回避し、これは、患者コンプライアンスを改善する可能性があり得る。
【０１５６】
（実施例２：ＤＳＰ−ＮＰを用いる新血管形成の予防）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびその後のラットにおけるＳＣ注射の両方で、コルチコステロイドであるリン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）の持続放出を提供し得る生分解性ナノ粒子製剤は、ラットにおいて角膜同種移植片拒絶を予防することを実証し、また角膜新血管形成の有効な阻害を提供することを示した。
【０１５７】
材料および方法
材料
ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸；５０：５０、Ｍｗ約３．４ｋＤａ、酸末端型）（ＰＬＧＡ）は、Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  （Ｅｖｏｎｉｋ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から購入した。リン酸デキサメタゾンナトリウム塩（ＤＳＰ）は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）から購入した。［３Ｈ］標識されたＤＳＰは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドトリブロックコポリマー、またはＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（０．５Ｍ）、酢酸亜鉛二水和物およびすべての他の有機溶媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ６４７）カダベリンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。
【０１５８】
蛍光標識されたＤＳＰ−ＮＰの調製
蛍光マーカーとしてのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ６４７）カダベリンを、Ｘｕら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｉｅａｓｅ  第１７０巻（２０１３年）２７９〜２８６頁によって記載された方法を使用してＰＬＧＡに化学的にコンジュゲートした。溶媒拡散（またはナノ沈殿）法によってＡＦ６４７−ＰＬＧＡから構成されるナノ粒子を調製した。手短には、１０ｍｇのＤＳＰを含有する０．５ｍＬの水溶液に、１ｍＬの０．５Ｍ酢酸亜鉛水溶液を添加することによって、ＤＳＰ−亜鉛錯体を形成した。１０，０００ｇで５分間遠心分離した後、沈殿した錯体および５０ｍｇのＰＬＧＡ（１：３ｗ／ｗのＡＦ６４７−ＰＬＧＡ：ＰＬＧＡ）を１．２５ｍＬのＴＨＦに懸濁し、溶解し、続いて、２０μＬのＴＥＯＡを添加した。撹拌しながら、混合物を１００ｍＬの５％  Ｆ１２７水溶液中に滴下添加して、ＤＳＰが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子（ＤＳＰ−ＮＰ）を形成した。溶媒蒸発によってＴＨＦを完全に除去した後、ナノ粒子懸濁物に１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ７．５）を添加して、過剰の亜鉛をキレート化し、カプセル封入されていないあらゆるＤＳＰ−亜鉛錯体を可溶化した。８，０００ｇで２５分間の遠心分離によって、蛍光標識されたＤＳＰ−ＮＰを回収し、５％  Ｆ１２７を用いて洗浄し、０．２ｍＬの超純水に再懸濁した。蛍光標識を有さないＤＳＰ−ＮＰは、ＰＬＧＡのみを使用して同様の方法で調製した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用して、動的光散乱およびレーザードップラー流量測定によって、粒径およびζ電位を決定した。サンプルは１０ｍＭの、ｐＨ７．２のＮａＣｌ溶液に希釈した。
【０１５９】
結膜下投与後のＤＳＰ−ＮＰの保持
Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いて、眼全体をイメージングすることによってＳＣ投与後のＤＳＰ−ＮＰの保持を調べた。ラットを、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉内注射によって麻酔した。ＡＦ６４７で蛍光標識されたＤＳＰ−ＮＰを、２７ゲージニードルを使用するＳＣ投与（５０μＬ）によってＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに注射した。注射手順は、Ｓ８１手術用眼科用顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）下で実施した。イメージングの間は、眼瞼を４５Ｇ開瞼器（Ｆｏｃｕｓ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）を用いて後退させた。注射部位での総蛍光カウントを６４０／６８０ｎｍで記録した。イメージは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ３．０ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して解析し、ナノ粒子の保持は、粒子の注射の直後の同一眼の蛍光カウントと比較することによって定量化した。粒子注射を施していないラットの眼をベースラインとして使用した。
【０１６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの眼のＤＳＰレベル
実施例１は、ＳＣ注射後１週間以内のｉｎ  ｖｉｖｏでの眼のＤＳＰレベルを記載する。同じ方法を使用して、ＰＯＤ１４でのラットにおけるＳＣ投与後の眼のＤＳＰレベルを検出した。［３Ｈ］標識されたＤＳＰを標識されていないＤＳＰとブレンドし（１０μＣｉ：１ｍｇ  ＤＳＰ）、ＤＳＰ−ＮＰの調製において使用した。同一製剤の５０μＬ（眼あたり約０．８μＣｉ）を、ＳＣ注射によって同一動物（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット）の両眼に投与した。ＰＯＤ１４で、麻酔下のラットを、尾静脈から２滴の血液を採取した後、屠殺した。眼房水、硝子体および注射部位を含有する残りの眼組織を注意深く解剖し、回収した。すべてのサンプルを秤量し、次いで、２ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用い、５０℃で終夜インキュベートすることによって溶解した。０．２ｍＬのＨ２Ｏ２および２０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを用いて血液サンプルを漂白した。１０ミリリットルのＵｌｔｉｍａ  ｇｏｌｄシンチレーション媒体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を添加し、その後、シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）において放射能をカウントした。結果は、注射された用量のパーセンテージとして表し、データ点あたりの４個の眼の平均±標準偏差（ＳＤ）である。血液中のＤＳＰのレベルは、時点あたりの２匹の動物の平均とした。注射部位の注射された用量の総パーセンテージおよび１ｍｇの組織または１ｍＬの血液あたりの放射能を算出した。
【０１６１】
動物
すべての実験プロトコールは、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。６〜８週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇの体重）を、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。すべてのラットを、眼科学的研究における動物の使用に関して、視覚と眼科学に関する研究学会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（ＡＲＶＯ）ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）にしたがってケアし、処置した。動物は、試験手順の間、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉内注射を用いて麻酔した。局所麻酔は、眼で０．５％プロパラカイン点眼薬の点眼を用いて達成した。
【０１６２】
縫合による角膜ＮＶモデル
角膜中において縫合糸を配置することによって角膜ＮＶモデルを誘導した。手短には、ラットを、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉内注射を用いて麻酔した。それぞれ、手術前に総瞳孔散大および局所麻酔のために、０．５％トロピカミド点眼薬の反復点眼および０．５％プロパラカインを使用した。角膜ＮＶは、手術用顕微鏡下で１０−０ナイロン（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）を用いて上部角膜中に２つの縫合糸の縫合部（ｓｔｉｔｃｈ）を置くことによって誘導した。縫合部と縁との間の距離は、およそ２ｍｍであり、２つの縫合部間には１ｍｍの距離がある。縫合糸を配置した後、動物に、ａ）６ｍｇのＤＳＰ／ｍＬの濃度の５０μＬのＤＳＰ−ＮＰ、ｂ）５０μＬのＤＳＰ溶液（６ｍｇのＤＳＰ／ｍＬ）およびｃ）生理食塩水対照の結膜下注射を用いて直ちに投与した。エリスロマイシン抗生物質軟膏を角膜に塗布して、角膜の炎症および角膜の乾燥を予防した。
【０１６３】
角膜ＮＶ定量化
角膜ＮＶは、デジタルカメラおよび細隙灯顕微鏡（ＳＬ１２０；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）の両方によって観察した。ラットを、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉内注射を用いて麻酔した。イメージングの前に、０．５％トロピカミド点眼薬の反復点眼を使用して、瞳孔を十分に散大した。１２×倍率で細隙灯写真を撮った。角膜の細隙灯写真を使用し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ５（Ａｄｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）を使用して角膜新血管形成を定量化した。血管形成された領域の縁に沿って弧を描き、血管形成された領域のピクセルを測定した。血管形成された領域のピクセル／１ｍｍ２領域のピクセルを使用して、角膜ＮＶ領域を算出した。血管形成された領域を６つの部分に分け、弧の５つの交点で血管の先端と縁との間の距離を、血管長として測定し、各角膜の最終新規血管長として平均血管長を算出した。すべてのパラメータは、処置割り当てについて盲検にされた調査者によって測定された。
【０１６４】
眼内圧測定
非侵襲性眼内圧（ＩＯＰ）測定は、Ｉｃａｒｅ（登録商標）Ｔｏｎｏｌａｂ（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、フィンランド）を使用して手術の後、毎週実施した。各眼について記録されたＩＯＰは、３つの連続測定値の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）とした。
【０１６５】
角膜組織病理学研究
術後７日目および１４日目、すべての動物を屠殺し、縫合手順を受けた眼を眼球摘出した。１０％ホルマリンを用いて２４時間、眼組織を固定化し、その後、パラフィン中に包埋した。前後軸配向（ａｎｔｅｒｏ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）（角膜から視神経に）を有する横断面（５μｍ厚）を切断し、Ｈ＆Ｅを用いて染色した。
【０１６６】
リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
角膜における、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＮＦ−アルファを含めたいくつかの血管新生サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。それぞれ、術後７および１４日目に処置された眼から角膜を解剖し、一緒にプールした（ｎ＝３）。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）を製造業者の指示にしたがって用いて総リボ核酸（ＲＮＡ）を単離した。次いで、ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（４３６８８１４番、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を、製造業者の指示にしたがって使用して相補的ＤＮＡに転写させた。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い、７１００  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。使用したプライマーは、表２に列挙されている。すべての発現レベルは、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、互いに比較した。結果を、３回の反復の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示した。
【表２】
2017524712.tif 000004
【０１６７】
統計解析
収集したすべてのデータは、ｔ検定および多重比較検定（一元配置分散分析、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定）を使用して群の間で比較した。差は、Ｐ＜０．０５のレベルで統計的に有意であると考えた。
【０１６８】
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＳＰ−ＮＰの特徴付け
水溶性コルチコステロイドであるリン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）は、亜鉛キレート剤を使用してＰＬＧＡナノ粒子（ＤＳＰ−ＮＰ）中に成功裏にカプセル封入した。結膜下投与後の生分解性ＤＳＰ−ＮＰの保持を定量化するために、ＡＦ−６４７色素をＰＬＧＡにコンジュゲートすることによってＰＬＧＡを蛍光標識し、その後、ＤＳＰ−ＮＰを調製した。ＡＦ−６４７のＰＬＧＡへのコンジュゲーションは、８％薬物負荷およびおよそ２００ｎｍの粒径を有するＤＳＰ−ＮＰの生理化学的特性に影響を及ぼした（表３）。ＡＦ−６４７で標識したＤＳＰ−ＮＰのＳＣ投与後、生存動物イメージングを使用して、眼における蛍光シグナルを３週間の保持研究にわたって定量化した（図３）。最初の２日間に、元のシグナルの２０％への蛍光シグナルの迅速な低下が観察された。
【表３】
2017524712.tif 000005
ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｂＦＧＦおよびＴＮＦ−αのレベルは、図１０Ａ（７日目の）および１０Ｂ（１４日目の）に示されている。眼内圧は、図１１に示されている。
【０１６９】
（実施例３：ブドウ膜炎の予防）
ブドウ膜炎は、失明の危険がある（ｓｉｇｈｔ−ｔｈｒｅａｔｅｎｉｎｇ）炎症性眼疾患である。コルチコステロイドは、ブドウ膜炎の最も有効な処置である。しかし、中間部および後部ブドウ膜炎は、硝子体および網膜に影響を及ぼし、これは、局所ステロイドを用いて処置することが困難である。結膜下に注射された水溶性ステロイド溶液は、極めて迅速に排除され、治療レベルを長期間維持するには反復注射の必要がある。リン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）が負荷されたナノ粒子（ＮＰ）は、高薬物負荷および長い薬物放出を提供する。これらを、ラット汎ブドウ膜炎モデルにおいて有効性について試験した。
【０１７０】
方法：
ＤＳＰを含有する生分解性ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子を、修飾溶媒拡散法を使用して調製した。エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｃｉｎ）誘発性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）モデルは、６週齢のＬｅｗｉｓラットへのリポ多糖（ｌｉｐｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＬＰＳ）のＩＰ注射を使用する２４時間試験を開始した。ＤＳＰが負荷されたナノ粒子の、ＬＰＳによって免疫化されたラットにおいて炎症を低減する能力を、臨床評価、網膜における炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現およびタンパク質レベルならびに組織病理学によって試験した。
【０１７１】
結果：
ナノ粒子は、２００ｎｍの平均直径、８重量％の高い薬物負荷および制御された薬物放出プロファイルを１５日間にわたって示した。図１２は、ＤＳＰ−ＮＰのｓｉｎｋ条件下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの１５日にわたる持続した薬物放出のグラフである。
【０１７２】
これらのＤＳＰが負荷されたナノ粒子は、ラット眼への結膜下投与後に持続した眼用薬物レベルを提供した。図１３Ａおよび１３Ｂは、ラットにおけるＤＳＰ−ＮＰのＳＣ投与後少なくとも７日間の持続した高い眼用薬物レベルのグラフであり、前眼房（図１３Ａ）および硝子体（図１３Ｂ）の両方において高い薬物レベルを示す。
【０１７３】
プラセボ粒子、生理食塩水または遊離薬物溶液の対照処置群との比較は、ブドウ膜炎ラットモデルのＤＳＰが負荷されたＮＰ処置が、有意により低下した炎症スコア、ｍＲＮＡ発現および炎症性サイトカインタンパク質レベルを示すことを示した。図１４は、ＬＰＳのＩＰ注射の３時間後および２４時間後にイメージングされ、スコア化された前眼部の炎症スコアのグラフであり、ＤＳＰ−ＮＰ予防群は、対照群よりも有意に少ない炎症を有することを示す。図１５は、２４時間免疫化後のＥＩＵモデルの３群における、網膜におけるＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６およびＴＮＦのｍＲＮＡ発現のグラフであり、プラセボ−ＮＰおよびＰＢＳ群と比較してＤＳＰ−ＮＰ群において有意に低下した発現を示す。
【０１７４】
結論：
リン酸デキサメタゾンナトリウムが負荷されたＰＬＧＡナノ粒子は、コルチコステロイドの持続放出を提供し、ラットにおいてブドウ膜炎と関連している炎症を有効に減少させる。ブドウ膜炎は、再発することが多いので、この処置は、投与頻度を低減し、コルチコステロイドの全身性副作用の可能性を回避し、患者コンプライアンスを改善するはずであり、有望な臨床適用を有する。
【０１７５】
（実施例４：ラットにおいて角膜同種移植片拒絶および緑内障を処置するためのコルチコステロイドナノ粒子の毎月の結膜下投与）
材料および方法
実施例１に記載されるように、ＤＳＰのカプセル封入のためにＣＯＯＨ基を有するポリ乳酸を使用してナノ粒子を調製した。
【０１７６】
毎月の結膜下注射を使用して角膜新血管形成の予防のために、実施例２に記載されたようにラットにナノ粒子を投与した。
【０１７７】
ナノ粒子はまた、緑内障のモデルにも投与した。
【０１７８】
結果
ナノ粒子は、３３８±１１ｎｍの直径、０．０９±０．０３８のＰＤＩ、−３±１のζ−電位（ｍＶ）および９．４±０．８のＤＬ％を有する。
【０１７９】
時間をわたってＤＳＰレベルを示す薬物動態研究の結果が、図１６Ａ〜１６Ｄに示されている。図１６Ａ〜１６Ｄは、ラットへのＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子の結膜下注射の薬物動態（時間（日数）をわたってのｎｇ  ＤＳＰ／ｍｌ）のグラフである。図１６Ａ、眼房水；図１６Ｂ、硝子体；図１６Ｃ、血液；および図１６Ｄ、注射部位対照。
【０１８０】
図１７Ａ〜１７Ｅは、（１７Ａ〜１７Ｃ）ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群および（１７Ｄ〜１７Ｆ）生理食塩水対照群についての全１２週間のフォローアップの間の時間（日数）をわたっての移植片の臨床観察のグラフである。矢印は、処置注射時点を示す。図１７Ａ、１７Ｄは、透明度スコア；図１７Ｂ、１７Ｅは、浮腫スコア、１７Ｃ、１７Ｆは、新血管形成である。
【０１８１】
図１８は、生理食塩水対照群およびＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子処置群両方についての生存曲線である（時間（日数）をわたっての生存パーセント）。
【０１８２】
図１９Ａおよび１９Ｂは、対照（１９Ｂ）と比較した、毎月間隔でＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子を用いて処置された動物（１９Ａ）についての、時間（日数）をわたっての眼内圧のグラフである。
【０１８３】
結果は、ＤＳＰ−ＰＬＡ２ＣＯＯＨナノ粒子を使用する、移植片拒絶の予防ならびに緑内障の処置両方のための毎月注射を用いて、同等の結果が得られることを実証する。
【図１】
2017524712.tif 000006
【図２】
2017524712.tif 000007
【図３】
2017524712.tif 000008
【図４Ａ】
2017524712.tif 000009
【図４Ｂ】
2017524712.tif 000010
【図４Ｃ】
2017524712.tif 000011
【図４Ｄ】
2017524712.tif 000012
【図５】
2017524712.tif 000013
【図６】
2017524712.tif 000014
【図７】
2017524712.tif 000015
【図８】
2017524712.tif 000016
【図９】
2017524712.tif 000017
【図１０】
2017524712.tif 000018
【図１１】
2017524712.tif 000019
【図１２】
2017524712.tif 000020
【図１３】
2017524712.tif 000021
【図１４】
2017524712.tif 000022
【図１５】
2017524712.tif 000023
【図１６Ａ】
2017524712.tif 000024
【図１６Ｂ】
2017524712.tif 000025
【図１６Ｃ】
2017524712.tif 000026
【図１６Ｄ】
2017524712.tif 000027
【図１７Ａ】
2017524712.tif 000028
【図１７Ｂ】
2017524712.tif 000029
【図１７Ｃ】
2017524712.tif 000030
【図１７Ｄ】
2017524712.tif 000031
【図１７Ｅ】
2017524712.tif 000032
【図１７Ｆ】
2017524712.tif 000033
【図１８】
2017524712.tif 000034
【図１９】
2017524712.tif 000035
【配列表】
2017524712000001.app
【国際調査報告】
2017524712.tif 000036
2017524712.tif 000037
2017524712.tif 000038