(57)【要約】本発明は、新規のアミノ脂質及びこれらの化合物を合成する方法を提供する。本発明によれば、上記アミノ脂質は、以下の式の構造（Ｉ）を有する：2017522305.tif 000130式中、Ｚは、水素または−Ｘ１Ｒ１のいずれかであり、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、Ｙは、（ＩＩ）2017522305.tif 000131または式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のヘテロサイクル2017522305.tif 000132のいずれかであり、式中、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、任意に、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成し、またはＲ３及びＲ４は同一かもしくは異なるアルキルアミンであり；Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで好ましくは、ｐが２または３の場合にＹはＮである。
2017522305.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の構造を含むアミノ脂質。
【化１】
2017522305.tif 000095
式中、Ｚは、水素または−Ｘ１Ｒ１のいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、
【化２】
2017522305.tif 000096
または
次式のヘテロサイクル
【化３】
2017522305.tif 000097
のいずれかであり、
式中、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、任意に、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成し、またはＲ３及びＲ４は同一かもしくは異なるアルキルアミンであり；
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで好ましくは、ｐが２または３の場合にＹはＮであり；
そしてＹは、ｐ＝２の場合に、
【化４】
2017522305.tif 000098
であることもできる。
【請求項２】
式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有する請求項１に記載のアミノ脂質。
【化５】
2017522305.tif 000099
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、
【化６】
2017522305.tif 000100
または
次式のヘテロサイクル
【化７】
2017522305.tif 000101
のいずれかであり、
式中、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、任意に、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成し、またはＲ３及びＲ４は同一かもしくは異なるアルキルアミンであり；
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで好ましくは、ｐが２または３の場合にＹはＮであり；
そしてＹは、ｐ＝２の場合に、
【化８】
2017522305.tif 000102
であることもできる。
【請求項３】
次式（Ｉｃ）の構造を含むアミノ脂質。
【化９】
2017522305.tif 000103
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして互いに独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、
【化１０】
2017522305.tif 000104
であり、
ここで、Ｚは、
【化１１】
2017522305.tif 000105
であり、
ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
ｍは、１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数である。
【請求項４】
Ｘ１及びＸ２が、同一かまたは異なりそして独立して、Ｓ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかである、請求項１または２に記載のアミノ脂質。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２が、同一かまたは異なりそして独立してＣ６〜Ｃ２４アルキルであり、これは任意にＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されている、請求項１〜４のいずれか一つに記載のアミノ脂質。
【請求項６】
式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の構造を有する、請求項１または５に記載のアミノ脂質。
【化１２】
2017522305.tif 000106
式中、Ｒ１及びＲ２は同じＣ６〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｙは、
【化１３】
2017522305.tif 000107
または
次式のヘテロサイクル
【化１４】
2017522305.tif 000108
のいずれかであり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであり、ここでアルキルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されており、またはＲ３及びＲ４は、任意に、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成し、またはＲ３及びＲ４は同一かもしくは異なるアルキルアミンであり；
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで好ましくは、ｐが２または３の場合にＹはＮであり；
そしてＹは、ｐ＝２の場合に、
【化１５】
2017522305.tif 000109
であることもできる。
【請求項７】
式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＩＩｅ）、（ＩＩＩｆ）、（ＩＩＩｇ）、（ＩＩＩｈ）、（ＩＩＩｉ）、（ＩＩＩｊ）、（ＩＩＩｋ）、（ＩＩＩｌ）、（ＩＩＩｍ）、（ＩＩＩｎ）、（ＩＩＩｏ）、（ＩＩＩｐ）、（ＩＩＩｒ）、（ＩＩＩｓ）、（ＩＩＩｔ）、（ＩＩＩｕ）、（ＩＩＩｖ）、または（ＩＩＩｗ）の構造を有する、請求項１、５または６に記載のアミノ脂質。
【化１６】
2017522305.tif 000110
式中、Ｒ１及びＲ２は同じＣ１１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ３及びＲ４は同じＣ１〜Ｃ２アルキルであり、
ｍは、１〜２の整数であり、ｎは１〜３の整数である。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一つに記載のアミノ脂質を含む脂質粒子。
【請求項９】
リポソームである、請求項８に記載の脂質粒子。
【請求項１０】
非カチオン性脂質、ステロール及び／または生物活性剤を更に含み、ここで前記生物活性剤が、特に、核酸、抗腫瘍薬、抗生薬、免疫調節薬、抗炎症薬、中枢神経系に作用する薬、ポリペプチドまたはポリペプトイドからなる群から選択される、請求項８または９に記載の脂質粒子。
【請求項１１】
細胞中に生物活性剤を送達するための、請求項８〜１０のいずれか一つに記載の脂質粒子の使用。
【請求項１２】
医薬品としての、特にウイルス感染、肝臓病もしくは肝疾患、または癌の処置における医薬品としての、請求項８〜１０のいずれか一つに記載の脂質粒子の使用。
【請求項１３】
次のステップ：
一般式（ＶＩ）のアルキンまたはアルケン
【化１７】
2017522305.tif 000111
［式中、Ｅは、ＣＨ＝ＣＨ２またはＣ≡ＣＨのいずれかである］
と、一般式ＨＳ−Ｒ１及びＨＳ−Ｒ２の化合物との反応を実施して、一般式（ＶＩＩ）の化合物を生成するステップを含む、請求項１及び４〜７のいずれか一つに記載のアミノ脂質を合成する方法。
【化１８】
2017522305.tif 000112
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されており、
Ｙは、
【化１９】
2017522305.tif 000113
または
次式のヘテロサイクル
【化２０】
2017522305.tif 000114
のいずれかであり、
式中、ｋ及びｌは０からの整数であるか、またはｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されており、またはＲ３及びＲ４は、任意に、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成し、またはＲ３及びＲ４は同一かもしくは異なるアルキルアミンであり；
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで好ましくは、ｐが２または３の場合にＹはＮであり；
そしてＹは、ｐ＝２の場合に、
【化２１】
2017522305.tif 000115
であることもできる。
【請求項１４】
一般式（ＶＩ）のアルキンまたはアルケンと、一般式ＨＳ−Ｒ１及びＨＳ−Ｒ２の化合物との反応を、ＵＶ照射下にまたはラジカル開始剤を用いて実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
反応生成物が、式（ＶＩＩｂ）に従う化合物である、請求項１２または１４に記載の方法。
【請求項１６】
一般式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）のチオエーテルを酸化剤を使用してスルホキシド（Ｓ＝Ｏ）及び／またはスルホン（Ｓ（＝Ｏ）２）に酸化して、請求項１または２に記載のスルホキシドまたはスルホン基含有アミノ脂質を合成するステップを更に含む、請求項１３〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
次のステップ
ａ）一般式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）または（ＩＶｄ）のアルキンまたはアルケン
【化２２】
2017522305.tif 000116
［式中、ｎは１〜１２の整数である］
と、次の化合物
【化２３】
2017522305.tif 000117
との反応を実施して、以下の一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）または（Ｖｄ）の化合物を生成するステップ；
【化２４】
2017522305.tif 000118
及び／または
ｂ）一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）または（Ｖｄ）のアルキンまたはアルケン
【化２５】
2017522305.tif 000119
と、一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺのアミン（式中、ｍは１〜１２の整数であり、Ｚは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ、または次式の第二級ヘテロ環式アミンである）
【化２６】
2017522305.tif 000120
［式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である］
との反応を実施して、一般式（ＶＩ’ａ）または（ＶＩ’ｂ）の化合物を生成するステップ；
を更に含む、請求項１３または１６に記載の方法。
【化２７】
2017522305.tif 000121
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されており、
Ｙは、
【化２８】
2017522305.tif 000122
または次式のヘテロサイクル
【化２９】
2017522305.tif 000123
のいずれかであり、
または、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されており、またはＲ３及びＲ４は、任意に、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成し、またはＲ３及びＲ４は同一かもしくは異なるアルキルアミンであり；
Ｒ５は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで好ましくは、ｐが２または３の場合にＹはＮである。
【請求項１８】
一般式（ＩＶｅ）、（ＩＶｆ）、（ＩＶｇ）または（ＩＶｈ）のアルキンまたはアルケン
【化３０】
2017522305.tif 000124
［式中、ｎは１〜１２の整数である］
と、一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺのアミン（式中、ｍは１〜１２の整数であり、そしてＺは、ＮＨ２、ＮＨ、Ｎまたは次式の第二級ヘテロ環式アミンである）
【化３１】
2017522305.tif 000125
［式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である］
との反応を実施し、
一般式（ＶＩ’’ａ）または（ＶＩ’’ｂ）の化合物を生成するステップを更に含む、請求項１３または１６に記載の方法。
【化３２】
2017522305.tif 000126
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されており、
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ７、
【化３３】
2017522305.tif 000127
または次式のヘテロサイクル
【化３４】
2017522305.tif 000128
［式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である］
のいずれかであり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されており、またはＲ３及びＲ４は、任意に、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成し、
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで好ましくは、ｐが２または３の場合にＹはＮであり；
そしてＹは、ｐ＝２の場合に、
【化３５】
2017522305.tif 000129
であることもできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ脂質及びそれらの合成法に関する。このような（カチオン性）アミノ脂質は、トランスフェクション剤として良好な性質を有する。これらは、脂質粒子、特にリポソームの製造に使用でき、生物活性剤を細胞中に送達することを可能にする。合成の簡素さは、キット式での（カチオン性）アミノ脂質のコンビナトリアルライブリーの開発を可能にする。このライブラリーに含まれる化合物は、特定の性質に関して、特に様々な細胞株のトランスフェクションに関してスクリーニングすることができる。本発明は、中性またはカチオン性アミノ脂質を含む脂質粒子の医薬品としての使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸等の生物活性剤で細胞をトランスフェクションするために使用される様々な試薬のうちで、リポソーム仲介送達に基づいたものが、最も効果的であることは広く認知されている。これは、殆どはそれらの効率及び使用の簡単さによるものである。リポソームは、脂質二重層でできた人工的に調製された球形の小胞である。分子を作用部位に送達させるために、脂質二重層は細胞膜などの他の二重層と融合し、そうしてリポソームの中身を細胞内に送達することができる。
【０００３】
リポソームは、それらのユニークな性質の故に薬物送達に使用される。リポソームは、水溶液の領域を疎水性膜内に封入し；溶解された親水性溶質は、脂質を簡単には通り抜けることができない。疎水性化学品は膜内に溶解することができ、このようにしてリポソームは、疎水性分子と親水性分子の両方を運ぶことができる。リポソームは、薬物、核酸、ペプチドなどの生物活性剤と組み合わせることができ、そしてこれらの剤を、細胞生化学的経路の調整のために送達するのに使用できる。これは、病気の新しい治療法の可能性を開くものである。
【０００４】
負に荷電した核酸の送達のためには、カチオン性脂質が最も効果の高いトランスフェクション剤である。カチオン性脂質は、ＤＮＡ送達のための有望な部類の合成材料である。現在まで、幾つかの商業化されたカチオン性脂質があるものの、遺伝子の安全で効果的な送達のためのカチオン性脂質の数はまだ限られている。
【０００５】
「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．１９９８，３７：１７６８−１７８５）（非特許文献１）には、一般的に使用されている商業的に入手可能な多くのトランスフェクション剤が記載されている。しかし、慣用の脂質合成法は、典型的には、個別に最適化された多段階の合成を必要とし、化学的な保護及び解保護、触媒の使用及び除去、溶剤の交換及び精製などの時間集約的な作業を含んでいる。
【０００６】
細胞膜内により効果的に導入できるリポソームを形成するためには、カチオン性脂質を天然のリン脂質（ヘルパー脂質と称する）と組み合わせる必要がある。単独では標的細胞の細胞膜を通って拡散できないＤＮＡや薬物をリポソームと組み合わせることによって、これらは、脂質二重層を（無差別に）通り過ぎて送達され得るようになる。ホスト細胞中へのＤＮＡの形質転換またはトランスフェクションのためのリポソームの使用はリポフェクションとして知られている。
【０００７】
リポソーム試薬は、細胞トランスフェクション剤に関して技術水準となるが、これらは以下の欠点を持つ：先ず、多くの細胞株（例えば初代細胞）は、リポソーム試薬を用いた場合でも、現在は効果的にトランスフェクションできない。第二に、これは、合成するのが比較的困難、費用高であり、しばしば高い価格となる。
【０００８】
上記の第二の点の結果として、多くの実験室が、トランスフェクションのために効果が低い、より安価な代替物（例えばリン酸カルシウム）を使用している。合成するのが簡単で、かつ広い種類の細胞タイプに良好なトランスフェクション収率を有する新しいトランスフェクション剤への具体的な要望がある。代替法として、種々様々な化合物の製造を可能にするトランスフェクション剤の簡単なコンビナトリアル合成を配置することは有用であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．１９９８，３７：１７６８−１７８５）
【非特許文献２】Ｈｕｌｅａ  Ｖ，Ｍｏｒｅａｕ  Ｐ，Ｒｅｎｚｏ  ＦＤ．Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｉｔａｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｚｅｏｌｉｔｅｓ  ａｓ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｃｈｅｍｃｉａｌ．１９９６，１１１：３２５−３３２
【非特許文献３】Ｂｕｔｔｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＢ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＢＬＰ２５  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩＢ  ａｎｄ  ＩＶ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００５，２３：６６７４−６６８１
【非特許文献４】Ｕ’Ｒｅｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６，１３：１０３３−１０４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故、本発明の課題の一つは、新規の（カチオン性）アミノ脂質及びそれらの合成方法を提供することであった。この方法は、汎用で、経済的でかつ実施が容易であるべきである。この汎用方法は、カチオン性アミノ脂質のライブラリーの開発を可能にする。（数百の異なる脂質分子を含む）このような脂質ライブラリーの汎用化は、最適なトランスフェクション試薬特性を持つ脂質の特定を大きく促進する。
【００１１】
本発明の更に別の課題の一つは、上記の（カチオン性）アミノ脂質を含む脂質粒子、特にリポソームを提供することであった。特に、これらの脂質粒子またはリポソームは、細胞膜を通って生物活性剤を送達することを可能にするべきである。
【００１２】
更に別の課題の一つは、病気の治療のための上記の脂質粒子またはリポソームの使用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、次の一般式（Ｉ）を持つ新規のアミノ脂質を提供する：
【００１４】
【化１】
2017522305.tif 000003
式中、Ｚは、水素または−Ｘ１Ｒ１のいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして互いに独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、
【００１５】
【化２】
2017522305.tif 000004
または
次式のヘテロサイクル
【００１６】
【化３】
2017522305.tif 000005
のいずれかであり、
ここでｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子（Ｒ３及びＲ４が結合している窒素原子も含む）を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成してよく、
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで一つの態様では、ｐが２または３の場合にＹはＮであり；
及びＹは、一つの態様では、ｐ＝２の場合に、
【００１７】
【化４】
2017522305.tif 000006
でもある。
【００１８】
本発明の一つの態様では、Ｒ３及びＲ４は同一かまたは異なるアルキルアミンである。
【００１９】
本発明の好ましい態様の一つでは、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立してＣ６〜Ｃ２４アルキルであり、より好ましくはＲ１及びＲ２は同じＣ６〜Ｃ１８アルキルである。
【００２０】
一つの態様では、本発明は、式（Ｉｂ）のアミノ脂質に関する。
【００２１】
【化５】
2017522305.tif 000007
【００２２】
式中、可変部は上に定義した通りである。
【００２３】
他の態様の一つでは、Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、Ｓ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかである。
【００２４】
一つの態様では、本発明は以下の一般式（ＩＩ）のアミノ脂質を提供する：
【００２５】
【化６】
2017522305.tif 000008
Ｒ１及びＲ２は同じＣ６〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｙは、
【００２６】
【化７】
2017522305.tif 000009
または
次式のヘテロサイクル
【００２７】
【化８】
2017522305.tif 000010
のいずれかであり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なるＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、ここでアルキルは任意にＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合する窒素原子と一緒になって合同して１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成してよく、
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで一つの態様では、ｐが２または３の場合にＹはＮであり；
そしてＹは、ｐ＝２の場合に、
【００２８】
【化９】
2017522305.tif 000011
であることもできる。
【００２９】
式（Ｉ）または（ＩＩ）に従う化合物の好ましい態様の一つでは、ｎ及びｍは互いに独立して１、２または３の整数でありそしてｐは独立して１または２の整数である。
【００３０】
特に好ましい態様は、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＩＩｅ）、（ＩＩＩｆ）、（ＩＩＩｇ）、（ＩＩＩｈ）、（ＩＩＩｉ）、（ＩＩＩｊ）、（ＩＩＩｋ）、（ＩＩＩｌ）、（ＩＩＩｍ）、（ＩＩＩｎ）、（ＩＩＩｏ）、（ＩＩＩｐ）、（ＩＩＩｑ）、（ＩＩＩｒ）、（ＩＩＩｓ）、（ＩＩＩｔ）、（ＩＩＩｕ）、（ＩＩＩｖ）、または（ＩＩＩｗ）の構造に相当し：
【００３１】
【化１０】
2017522305.tif 000012
ここで、Ｒ１及びＲ２は同じＣ１１〜Ｃ１２アルキルであり、
Ｒ３及びＲ４は同じＣ１〜Ｃ２アルキルであり、
ｍは、１〜２の整数であり、ｎは１〜３の整数である。
【００３２】
本発明の特に好ましい態様の一つでは、式Ｉ及びＩＩにおいて、Ｙは、
【００３３】
【化１１】
2017522305.tif 000013
または次式のヘテロサイクル
【００３４】
【化１２】
2017522305.tif 000014
のいずれかであり、
ここで、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
特に好ましくは、Ｙは、
【００３５】
【化１３】
2017522305.tif 000015
または次式のヘテロサイクル
【００３６】
【化１４】
2017522305.tif 000016
のいずれかであり、
最も好ましくは、本発明によるアミノ脂質は、ＩＩＩａ〜ＩＩＩｌに従う構造を含む：
【００３７】
【化１５】
2017522305.tif 000017
他の特に好ましい態様の一つでは、式Ｉ及びＩＩにおいて、Ｙは、ＮＨ、ＮＲ７、＋ＮＲ６Ｒ７、
【００３８】
【化１６】
2017522305.tif 000018
または
次式のヘテロサイクル
【００３９】
【化１７】
2017522305.tif 000019
のいずれかであり、
ここで、ｋ及びｌは、０〜２の整数であり、Ｒ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
特に好ましくは、Ｙは、ＮＨ、ＮＲ７、＋ＮＲ６Ｒ７、
【００４０】
【化１８】
2017522305.tif 000020
または次式のヘテロサイクル
【００４１】
【化１９】
2017522305.tif 000021
のいずれかであり、
最も好ましくは、本発明によるアミノ脂質は、ＩＩＩｍ〜ＩＩＩｗに従う構造を含む：
【００４２】
【化２０】
2017522305.tif 000022
本発明は、次の一般式（Ｉｃ）を持つ新規のアミノ脂質も提供する：
【００４３】
【化２１】
2017522305.tif 000023
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして互いに独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、
【００４４】
【化２２】
2017522305.tif 000024
のいずれかであり、
ここで、Ｚは、
【００４５】
【化２３】
2017522305.tif 000025
であり、
ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
ｍは、１〜１２の整数であり、そしてｎは１〜１２の整数である。
合成法
本発明は、式Ｉ及びＩｃ、好ましくはＩｂに従うアミノ脂質を合成する方法も提供する。該方法は、クロマトグラフィ精製無しの液相コンビナトリアル合成におけるチオール−インケミストリーをベースとしたイオン化可能な（カチオン性）アミノ脂質の大きなライブラリーの第一のパラレル合成である。
【００４６】
本発明による方法は、次の一般式（ＶＩ）のアルキンまたはアルケン：
【００４７】
【化２４】
2017522305.tif 000026
と、一般式ＨＳ−Ｒ１及びＨＳ−Ｒ２の化合物とを、
ＵＶ照射下またはラジカル開始剤を用いて反応させて、次の一般式（ＶＩＩ）の化合物を生成するステップを含む：
【００４８】
【化２５】
2017522305.tif 000027
式中、Ｅは、ＣＨ＝ＣＨ２またはＣ≡ＣＨのいずれかであり、
Ｚは、水素または−Ｓ−Ｒ１のいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｙは、
【００４９】
【化２６】
2017522305.tif 000028
または次式のヘテロサイクル
【００５０】
【化２７】
2017522305.tif 000029
のいずれかであり、
ここで、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成してよく、
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで一つの態様では、ｐが２または３の場合にＹはＮであり；
及びＹは、一つの態様では、ｐ＝２の場合に、
【００５１】
【化２８】
2017522305.tif 000030
でもある。
【００５２】
一つの態様では、Ｒ３及びＲ４は同一であり；他の態様では、Ｒ３及びＲ４は異なるアルキルアミンである。
【００５３】
この反応は、ラジカル機構を介して行われる。化学的ラジカル源を反応の開始のために添加できるか、または単に太陽光の下に行うことができる。好ましい態様の一つでは、反応はＵＶ照射によって開始される。
【００５４】
本発明の特に好ましい態様の一つでは、該方法は、一般式（ＶＩＩ）のチオエーテルを酸化剤を使用してスルホキシド（Ｓ＝Ｏ）及び／またはスルホン（Ｓ（＝Ｏ）２）に酸化して、スルホキシドまたはスルホン基含有アミノ脂質を合成するステップを更に含む。
【００５５】
チオエーテルの酸化は、好ましくは、メタノールなどの溶媒中で水性過酸化水素を用いて室温で行われる。本発明の他の態様では、チオエーテルのこの酸化は、チタン含有ゼオライトなどの触媒によって触媒することができる。この反応は、Ｈｅｌｅａら（Ｈｕｌｅａ  Ｖ，Ｍｏｒｅａｕ  Ｐ，Ｒｅｎｚｏ  ＦＤ．Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｉｔａｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｚｅｏｌｉｔｅｓ  ａｓ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｃｈｅｍｃｉａｌ．１９９６，１１１：３２５−３３２（非特許文献２））によって既に提案されている。
【００５６】
好ましい態様の一つでは、本発明による方法は、次の二つのステップを更に含む：
ａ）一般式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）または（ＩＶｄ）のアルキンまたはアルケン
【００５７】
【化２９】
2017522305.tif 000031
［式中、ｎは１〜１２の整数である］
を、次の化合物
【００５８】
【化３０】
2017522305.tif 000032
と反応させて、以下の一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）または（Ｖｄ）の化合物を生成するステップ；
【００５９】
【化３１】
2017522305.tif 000033
ｂ）一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）または（Ｖｄ）のアルキンまたはアルケン
【００６０】
【化３２】
2017522305.tif 000034
を、一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺ（式中、ｍは１〜１２の整数であり、Ｚは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ、または次式の第二級ヘテロ環式アミン；
【００６１】
【化３３】
2017522305.tif 000035
（ここで、ｋ及びｌは０〜２の整数である）である）のアミン、
と反応させて、以下の一般式（ＶＩ’）の化合物を生成するステップ；
【００６２】
【化３４】
2017522305.tif 000036
式中、Ｅは、ＣＨ＝ＣＨ２またはＣ≡ＣＨのいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｙは、
【００６３】
【化３５】
2017522305.tif 000037
または次式のヘテロサイクル
【００６４】
【化３６】
2017522305.tif 000038
のいずれかであり、
または、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成してよく、
Ｒ５は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで一つの態様では、ｐが２または３の場合にＹはＮである。
【００６５】
一つの態様では、Ｒ３及びＲ４は同一であり；他の態様では、Ｒ３及びＲ４は異なるアルキルアミンである。
【００６６】
代替的な好ましい態様の一つでは、本発明による方法は、次のステップを含む：
一般式（ＩＶｅ）、（ＩＶｆ）、（ＩＶｇ）または（ＩＶｈ）のアルキンまたはアルケン
【００６７】
【化３７】
2017522305.tif 000039
［式中、ｋ及びｌは１〜１２の整数である］
を、一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺ（式中、ｍは１〜１２の整数であり、Ｚは、ＮＨ２、ＮＨ、Ｎまたは次式の第二級ヘテロ環式アミン；
【００６８】
【化３８】
2017522305.tif 000040
（ここで、ｋ及びｌは０〜２の整数である）である）のアミン
と反応させて、以下の一般式（ＶＩ’’）の化合物を生成するステップ；
【００６９】
【化３９】
2017522305.tif 000041
式中、Ｅは、ＣＨ＝ＣＨ２またはＣ≡ＣＨのいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ７、
【００７０】
【化４０】
2017522305.tif 000042
または次式のヘテロサイクル
【００７１】
【化４１】
2017522305.tif 000043
のいずれかであり、
ここで、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成してよく、
Ｒ５及びＲ６は、存在しないかまたは水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで一つの態様では、ｐが２または３の場合にＹはＮであり：
及びＹは、一つの態様では、ｐ＝２の場合に、
【００７２】
【化４２】
2017522305.tif 000044
でもある。
【００７３】
一つの態様では、Ｒ３及びＲ４は同一であり；他の態様では、Ｒ３及びＲ４は異なるアルキルアミンである。
【００７４】
特に、化合物６７〜７６の合成は、上記及びここに記載のように一般式ＩＶｇ及びＩＶｈの化合物との反応をベースとして行われる。
【００７５】
一つの態様では、本発明は、式Ｉに従うアミノ脂質を合成する方法に関する：
【００７６】
【化４３】
2017522305.tif 000045
式中、Ｚは、水素または−Ｘ１−Ｒ１のいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、
【００７７】
【化４４】
2017522305.tif 000046
または次式のヘテロサイクル
【００７８】
【化４５】
2017522305.tif 000047
のいずれかであり、
または、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成してよく、
Ｒ５は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
ｍは１〜１２の整数であり、ｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数である。
【００７９】
一つの態様では、Ｒ３及びＲ４は同一であり；他の態様では、Ｒ３及びＲ４は異なるアルキルアミンである。
【００８０】
該方法は、次のステップを含む、（クロマトグラフィ精製無しの）液相コンビナトリアル合成におけるチオール−インケミストリーをベースとしたイオン化可能なカチオン性アミノ脂質の大きなライブラリーの第一のパラレル合成である。
【００８１】
第一のステップは、一般式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）または（ＩＶｄ）のアルキンまたはアルケン
【００８２】
【化４６】
2017522305.tif 000048
［式中、ｎは１〜１２の整数である］
を、次の化合物
【００８３】
【化４７】
2017522305.tif 000049
と反応させて、以下の一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）または（Ｖｄ）；
【００８４】
【化４８】
2017522305.tif 000050
の化合物を生成する反応である。
【００８５】
第二のステップは、一般式（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）、または（Ｖｄ）のアルキンまたはアルケン
【００８６】
【化４９】
2017522305.tif 000051
を、一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺのアミン（式中、ｍは１〜１２の整数であり、Ｚは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ、または次式の第二級ヘテロ環式アミンである）
【００８７】
【化５０】
2017522305.tif 000052
［ここで、ｋ及びｌは０〜２の整数である］
と反応させて、以下の一般式（ＶＩ’）の化合物を生成する反応である：
【００８８】
【化５１】
2017522305.tif 000053
式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｙ、Ｅ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上に定義した通りである。
【００８９】
第三の反応は、一般式（ＶＩ）のアルキンを、一般式ＨＳ−Ｒ１及びＨＳ−Ｒ２［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができる］の化合物と、好ましくはＵＶ照射下にまたはラジカル開始剤を使用して、一般式（ＶＩＩ’）の化合物を生成する反応である：
【００９０】
【化５２】
2017522305.tif 000054
式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上に定義した通りである。
【００９１】
この反応は、好ましくはラジカル機構を介して行われる。化学的ラジカル源を反応の開始のために添加できるか、または単に太陽光の下に行うことができる。好ましい態様の一つでは、反応はＵＶ照射によって開始される。
【００９２】
任意の第四ステップは、第二のステップの生成物のチオエーテル基を酸化剤を用いて酸化して、一般式（Ｉ）中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が上に定義した通りであり、そしてＸ１、Ｘ２が同一かまたは異なりＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかである同式の化合物を生成する酸化反応である。この第四ステップは、好ましくは、メタノールなどの溶媒中で水性過酸化水素を用いて室温で行われる。
【００９３】
第四ステップは、更に、チタン含有ゼオライトなどの触媒によって触媒することができる。この反応は、Ｈｕｌｅａら（Ｈｕｌｅａ  Ｖ，Ｍｏｒｅａｕ  Ｐ，Ｒｅｎｚｏ  ＦＤ．Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｉｔａｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｚｅｏｌｉｔｅｓ  ａｓ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｃｈｅｍｃｉａｌ．１９９６，１１１：３２５−３３２（非特許文献２））によって既に提案されている。驚くべきことに、この反応は、第二のステップのアミノ脂質の他の官能性基に影響しない。
【００９４】
本発明の一つの態様では、この第四ステップは必須である。
【００９５】
他の態様の一つでは、本発明は、式（Ｉ）に従うアミノ脂質を合成する方法に関する：
【００９６】
【化５３】
2017522305.tif 000055
式中、Ｚは、水素または−Ｘ１−Ｒ１のいずれかであり、
Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ７、＋ＮＲ６Ｒ７、
【００９７】
【化５４】
2017522305.tif 000056
または次式のヘテロサイクル
【００９８】
【化５５】
2017522305.tif 000057
のいずれかであり、
ここで、ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１〜Ｃ１２アルキニルのいずれかであり、ここでアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって合同して、１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成してよく、
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、そしてｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数であり、ここで一つの態様では、ｐが２または３の場合にＹはＮであり：
及びＹは、一つの態様では、ｐ＝２の場合に、
【００９９】
【化５６】
2017522305.tif 000058
でもある。
【０１００】
一つの態様では、Ｒ３及びＲ４は同一であり；他の態様では、Ｒ３及びＲ４は異なるアルキルアミンである。
【０１０１】
該方法は、次のステップを含む、クロマトグラフィ精製無しの液相コンビナトリアル合成におけるチオール−インケミストリーをベースとしたイオン化可能なカチオン性アミノ脂質の大きなライブラリーの第一のパラレル合成である。
【０１０２】
第一のステップは、一般式（ＩＶｅ）、（ＩＶｆ）、（ＩＶｇ）または（ＩＶｈ）のアルキンまたはアルケン
【０１０３】
【化５７】
2017522305.tif 000059
［式中、ｎは１〜１２の整数である］
を、一般式（Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｎ）（ＣＨ２）ｍＺのアミン（式中、ｍは１〜１２の整数であり、Ｚは、ＮＨ２、ＮＨ、Ｎまたは次式の第二級ヘテロ環式アミンである）
【０１０４】
【化５８】
2017522305.tif 000060
［式中、ｋ及びｌは０〜２の整数である］
と反応させて、以下の一般式（ＶＩ’’）の化合物を生成する反応である：
【０１０５】
【化５９】
2017522305.tif 000061
式中、Ｅは、ＣＨ＝ＣＨ２またはＣ≡ＣＨのいずれかであり、
Ｙは、ＮＨ、ＮＲ７、＋ＮＲ６Ｒ７、
【０１０６】
【化６０】
2017522305.tif 000062
または次式のヘテロサイクル
【０１０７】
【化６１】
2017522305.tif 000063
のいずれかであり、
及びＹは、一つの態様では、ｐ＝２の場合に、
【０１０８】
【化６２】
2017522305.tif 000064
でもある。
【０１０９】
Ｒ３及びＲ４は、同一かまたは異なるＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、ここでアルキルは任意にＣ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていてよく、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合する窒素原子と一緒になって合同して１〜７個の窒素原子を含む３〜１０個の原子の任意に置換されたＮ−ヘテロ環式リングを形成してよく、
Ｒ５及びＲ６は、存在しないか、または水素もしくはＣ１〜Ｃ１２アルキルとなり第四級アミンを供し、
Ｒ７は、水素またはＣ１〜Ｃ１２アルキルのいずれかであり、
ｍは１〜１２の整数であり、そしてｎは１〜１２の整数であり、そしてｐは１〜３の整数である。好ましい態様の一つでは、ｎ及びｍは独立して１、２または３の整数であり、そしてｐは独立して１または２の整数である。
【０１１０】
一つの態様では、Ｒ３及びＲ４は同一であり；他の態様では、Ｒ３及びＲ４は異なるアルキルアミンである。
【０１１１】
特に、化合物６７〜７６の合成は、上記及びここに記載のように一般式ＩＶｇ及びＩＶｈの化合物との反応をベースとして行われる。
【０１１２】
第二のステップは、一般式（ＶＩ’’）のアルキンまたはアルケンを、一般式ＨＳ−Ｒ１及びＨＳ−Ｒ２（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができる）の化合物と、ＵＶ照射下にまたはラジカル開始剤を使用して、一般式（ＶＩＩ’’）の化合物を生成する反応である：
【０１１３】
【化６３】
2017522305.tif 000065
式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は式ＶＩＩ’’について上に定義した通りである。
【０１１４】
この反応は、ラジカル機構を介して行われる。化学的ラジカル源を反応の開始のために添加できるか、または単に太陽光の下に行うことができる。好ましい態様の一つでは、反応はＵＶ照射によって開始される。
【０１１５】
任意の第三ステップは、第二のステップの生成物のチオエーテル基を酸化剤を用いて酸化して、一般式（Ｉ）中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が上に定義した通りであり、そしてＸ１、Ｘ２が同一かまたは異なりＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかである同式の化合物を生成する酸化反応である。この第三ステップは、好ましくは、メタノールなどの溶媒中で水性過酸化水素を用いて室温で行われる。
【０１１６】
第三ステップは、更に、チタン含有ゼオライトなどの触媒によって触媒することができる。この反応は、Ｈｕｌｅａら（Ｈｕｌｅａ  Ｖ，Ｍｏｒｅａｕ  Ｐ，Ｒｅｎｚｏ  ＦＤ．Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｉｔａｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｚｅｏｌｉｔｅｓ  ａｓ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｃｈｅｍｃｉａｌ．１９９６，１１１：３２５−３３２（非特許文献２））によって既に提案されている。驚くべきことに、この反応は、第二のステップのアミノ脂質の他の官能性基に影響しない。
【０１１７】
一つの態様では、この第三ステップは必須である。
【０１１８】
一つの態様では、本発明は、一般式（ＶＩＩＩ）のアルキンまたはアルケン：
【０１１９】
【化６４】
2017522305.tif 000066
と、一般式ＨＳ−Ｒ１及びＨＳ−Ｒ２の化合物とを、
ＵＶ照射下にまたはラジカル開始剤を用いて反応させて、次の一般式（Ｉｃ）の化合物を生成する反応を含む：
【０１２０】
【化６５】
2017522305.tif 000067
式中、Ｒ１及びＲ２は、同一かまたは異なりそして互いに独立して、Ｃ６〜Ｃ２４アルキル、Ｃ６〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ６〜Ｃ２４アルキニル、またはＣ６〜Ｃ２４アシルであり、これらは、任意に、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロカルビル基で置換されていることができ、
Ｘ１及びＸ２は、同一かまたは異なり、ＳまたはＳ＝ＯまたはＳ（＝Ｏ）２のいずれかであり、
Ｙは、
【０１２１】
【化６６】
2017522305.tif 000068
のいずれかであり、
ここで、Ｚは、
【０１２２】
【化６７】
2017522305.tif 000069
であり、
ｋ及びｌは０〜２の整数であり、
ｍは、１〜１２の整数であり、そしてｎは１〜１２の整数である。
【０１２３】
本発明の特に好ましい態様の一つでは、該方法は、一般式（Ｉｃ）のチオエーテルを酸化剤を使用してスルホキシド（Ｓ＝Ｏ）及び／またはスルホン（Ｓ（＝Ｏ）２）に酸化して、スルホキシドまたはスルホン基含有アミノ脂質を合成するステップを更に含む。
【０１２４】
チオエーテルの酸化は、好ましくは、メタノールなどの溶媒中で水性過酸化水素を用いて室温で行われる。本発明の他の態様の一つでは、チオエーテルのこの酸化は、チタン含有ゼオライトなどの触媒によって触媒することができる。この反応は、Ｈｕｌｅａら（Ｈｕｌｅａ  Ｖ，Ｍｏｒｅａｕ  Ｐ，Ｒｅｎｚｏ  ＦＤ．Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｉｔａｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｚｅｏｌｉｔｅｓ  ａｓ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｃｈｅｍｃｉａｌ．１９９６，１１１：３２５−３３２（非特許文献２））によって既に提案されている。
【０１２５】
本発明によるこれらの方法は非常に多用途であり；これらは、非常に低廉な方法で、高速なセルベーススクリーニングアッセイのための（カチオン性）アミノ脂質の大きなライブラリーの合成のために使用できる。生じる化合物は全て、それらの長い非極性残基の故の疎水性の特性と、それらのアミノ基の故の親水性の特性の両方を有する。この両親倍性の特性は、脂質粒子、例えば脂質二重層、ミセル、リポソームなどの生成に使用できる。更に、これらの化合物のアミノ基は、トランスフェクション剤に有用なカチオン性の電荷を与える。新しい特性を持った様々な化合物のこのライブラリーは、幅広い細胞種についてのそれらのトランスフェクション能力に関して簡単に試験できる。
脂質粒子
本発明の他の態様の一つは、式Ｉ〜ＩＩＩに従うアミノ脂質を含む脂質粒子に関する。本発明の範囲内において、「脂質粒子」という用語は、水性溶液中に置かれたアミノ脂質でできたナノサイズの物を意味する。これらの粒子は、とりわけ、脂質二重層小胞（リポソーム）、多層状小胞またはミセルである。
【０１２６】
本発明の好ましい態様の一つでは、上記のナノ粒子は、式Ｉ〜ＩＩＩに従うアミノ脂質を含むリポソームである。本発明の範囲内において、リポソームは、水性区画を封入している脂質両親媒性分子の二重層から構成された微小胞である。
【０１２７】
リポソーム形成は、自発的なプロセスではない。脂質小胞は、リン脂質などの脂質が水中に置かれ、その結果、一つの二重層、またはそれぞれ水分子で隔離された一連の二重層を形成して初めて形成される。リポソームは、脂質小胞を水中で超音波処理することによって生成することができる。
【０１２８】
本発明の範囲内において、「脂質二重層」という用語は、脂質分子の二つの層でできた薄膜を意味する。
【０１２９】
「ミセル」という用語は、液体コロイド中に分散された界面活性剤分子の集合体を意味する。水溶液中の典型的なミセルは、水と接触し、ミセル中央に疎水性のシングルテール領域を封鎖する親水性ヘッド領域を持つ集合体を形成する。
【０１３０】
本発明の範囲内において、「細胞」という用語は、一般名称を意味し、そして各々の細胞、組織、器官、昆虫細胞、鳥細胞、魚細胞、両生類細胞、哺乳類細胞、初代細胞、連続細胞株、幹細胞及び／または遺伝子操作細胞、例えば異種ポリペプチドもしくはタンパク質を発現する組み替え細胞の培養液を包含する。組み替え細胞には、例えば、異種ポリペプチドまたはタンパク質、例えば成長因子または血液因子を発現する細胞などが挙げられる。
【０１３１】
一つの態様では、上記の脂質粒子またはリポソームは更にヘルパー脂質を含む。このようなヘルパー脂質は、非カチオン性脂質、好ましくは非カチオン性リン脂質である。カチオン性アミノ脂質と非カチオン性（中性）リン脂質との混合物からなるリポソームは、細胞内への核酸送達に最も効果的である。更により好ましい態様の一つでは、上記の非カチオン性脂質はＤＯＰＥである。最も好ましい態様の一つでは、ヘルパー脂質及び請求項１〜４のアミノ脂質は１：１の比率で加えられてリポソームを形成する。
【０１３２】
更に別の態様の一つでは、脂質粒子またはリポソームは更にステロールを含む。コレストロールのようなステロールは、細胞膜中の中性成分である。これは、粒子の安定化に使用でき、そして細胞膜中への組み込みを助けることができる。
【０１３３】
本発明の他の態様の一つでは、脂質粒子またはリポソームは更に生物活性剤を含む。本発明の範囲内では、生物活性剤は、細胞またはホスト中に導入された時に、例えば免疫反応または炎症反応を刺激する、酵素活性を発揮するまたは変異を補うことなどによって生物学的効果を有する剤であり、生物活性剤には、とりわけ、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体及び小分子などが挙げられる。
【０１３４】
薬剤物質を脂質二重層内にまたはリポソームの内部水性空間中にカプセル化するためにリポソームが使用される場合に、「リポソーム薬」という用語を使用できる。
【０１３５】
最も好ましい態様の一つでは、生物活性剤は核酸である。他の好ましい態様の一つでは、上記の生物活性剤は、抗腫瘍薬、抗生薬、免疫調節薬、抗炎症薬、中枢神経系に作用する薬、ポリペプチドまたはポリペプトイドからなる群から任意に選択された剤である。
【０１３６】
更に別の態様の一つでは、脂質粒子またはリポソームは、更に、少なくとも一種のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含む。ＰＥＧ脂質は、粒子及びそれらの積み荷を、インビボで崩壊から保護する助けをする。更に、ＰＥＧは、リポソーム表面上に保護層を形成し、インビボでの循環時間を長くする。これは、リポソーム薬送達に使用できる（ＰＥＧ−リポソーム）。
【０１３７】
生物活性剤を含む脂質粒子またはリポソームは、様々な治療薬の任意のものを細胞内に送達するために使用できる。本発明は、細胞内に生物活性剤を送達するための上述のような脂質粒子、特にリポソームの使用を含む。
【０１３８】
好ましくは、上記生物活性剤は、以下に限定されないがＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、阻害的小分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）などをはじめとした核酸である。生物活性剤は、抗腫瘍薬、抗生薬、免疫調節薬、抗炎症薬、中枢神経系に作用する薬、抗原もしくはそれの断片、タンパク質、ペプチド、ポリペプトイド、ワクチン、及び小分子、またはこれらの混合物であることもできる。
【０１３９】
上述の通り、本発明で定義されるアミノ脂質を含む脂質粒子またはリポソームは、細胞内に生物活性剤を送達するのに適している。上記の多用途の合成方法によって合成できる多種多様なアミノ脂質は、リポソームに付与される特定の特性についてスクリーニングすることができる。重要な特性は、例えばトランスフェクション効率、細胞毒性、細胞中に送達すべき剤の接着、リポソームの安定性、リポソームの大きさなどである。本方法は、特定の用途のために特別に適応されたリポソームの生成を可能にする。
【０１４０】
例えば、脂質粒子（リポソーム）は、多細胞組織または器管のトランスフェクションのために使用できる。これは、患者の新規治療処置の可能性を提供する。
【０１４１】
本発明によれば、患者は、任意の哺乳類、好ましくはヒト、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギ、ウシ、及びサル及び／または他の哺乳類からなる群から選択される任意の哺乳類であることができる。最も好ましくは、患者はヒトである。
【０１４２】
本発明の重要な態様の一つは、医薬品としての使用のための、式（Ｉ〜ＩＩＩ）のうちの一つに従うアミノ脂質を含む上記の脂質粒子またはリポソームの使用である。
【０１４３】
特に、上記脂質粒子またはリポソームは、遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種、アンチセンス治療、またはＲＮＡ干渉による治療に使用するために患者に投与することができる。本発明の脂質粒子は、核酸移送で使用するための薬剤の製造ためにも、例えばヒトまたは動物体の治療による処置、特に遺伝的欠陥または遺伝的修飾によるまたはこれらに関連した状態の処置における核酸移送で使用するための薬剤の製造ためにも使用することができる。
【０１４４】
遺伝子治療のための標的は周知であり、単一遺伝子疾患、例えば嚢胞性繊維症、様々な癌、及び感染、例えばウイルス感染、例えばＨＩＶのウイルス感染などが挙げられる。例えば、ｐ５３遺伝子のトランスフェクションは、癌の処置に大きな可能性を提供する。遺伝子ワクチン接種のための標的も周知であり、天然の源から誘導されたワクチンがヒトでの使用には危険すぎ、他方で組み替えワクチンは必ずしも効果的ではない病原体、例えばＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及び単純性ヘルペスウイルスに対するワクチン接種などが挙げられる。
【０１４５】
アンチセンス治療の標的も既知である。遺伝子治療及びアンチセンス治療の更に別の標的が、病気の遺伝的原因の知識が増えるにつれて提案されつつあり、遺伝子ワクチン接種の更に別の標的も同様である。
【０１４６】
本発明の脂質粒子はワクチン接種に使用し得る。それ故、本発明の脂質粒子またはリポソームは、抗原の送達または抗原をコードする核酸の送達のために使用し得る。これらの技術は、当業者にはよく知られたものである。リポソームワクチンの例は、Ｂｕｔｔｓ  Ｃら、Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＢ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＢＬＰ２５  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩＢ  ａｎｄ  ＩＶ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００５，２３：６６７４−６６８１（非特許文献３）及びＵ’Ｒｅｎ  Ｌ，ら、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６，１３：１０３３−１０４４（非特許文献４）に記載されている。
【０１４７】
本発明の脂質粒子は、以下に限定されないが、癌、アレルギー、毒性並びにウイルス、細菌、真菌及び他の病原性有機体などの病原体による感染などの数多くの状態の治療及び／または予防のための幅広い種々の抗原に対する免疫応答を誘発するために使用し得る。
【０１４８】
本発明の更に別の態様の一つでは、上記の脂質粒子またはリポソームは、ウイルス感染、肝臓病もしくは肝疾患、または癌の処置における医薬品として使用することができる。肝臓病では、リポソームは、主として肝臓中に位置する細網内皮系の細胞によって捕獲され得る。リポソームはそこに蓄積される。
【０１４９】
以下の図面は、本発明の手順及び概念的見地の記載がより理解し易いように提示するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】アミノリポソーム試薬＃３０及び一つの商業的に入手可能なトランスフェクション剤の使用によるリポフェクションの結果を示す比較顕微鏡写真である。
【図２】アミノリポソーム試薬＃６０及び一つの商業的に入手可能なトランスフェクション剤の使用によるリポフェクションの結果を示す比較顕微鏡写真である。
【図３】商業的に入手可能な試薬と比較した例化合物１〜４４のトランスフェクション試薬のライブラリーのトランスフェクション効率の図示的全容である。
【図４】商業的に入手可能な試薬と比較した例化合物４７〜７６のトランスフェクション試薬のライブラリーのトランスフェクション効率の図示的全容である。
【図５】脂質試薬＃２４を用いたＭＥＦ細胞中でのｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングである
【図６】脂質試薬＃６４を用いたＭＥＦ細胞中でのｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングである。
【実施例】
【０１５１】
以下の８１個の例は、本発明の手順及び概念的見地の記載がより理解し易いように提示するものである。
【０１５２】
例１：２，３−ビス（ドデシルチオ）プロピル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメートの合成及び特徴付け
【０１５３】
【化６８】
2017522305.tif 000070
このアミノ脂質を二つのステップで合成した。第一のステップは、２−プロピン−１−イル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメートの合成である。０．１ｍｍｏｌのカルボニイイミダゾール及び０．１ｍｍｏｌのプロパルギルアルコールを２ｍｌのＤＣＭ中に溶解し、そしてアルミニウム箔で覆った２０ｍｌガラスバイアル中に加えた。この溶液を１時間振盪し、次いで０．１ｍｍｏｌのジメチルエタン−１，２−ジアミン及び０．０１ｍｍｏｌのＤＭＡＰを加え、そしてこの溶液を一晩振盪した。
【０１５４】
第二のステップは、２−プロピン−１−イル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメートへのドデカンチオールの光付加である。これを行うために、０．２ｍｍｏｌのドデカンチオール及び３ｍｇのＤＭＰＡを、第一のステップからの溶液に加え、そしてバイアルをアルゴンで脱気しそして３６５ｎｍＵＶ下に２時間照射した。次いでこのバイアルを乾燥し、そして４℃で保管した。
【０１５５】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって分析した。分子イオンは、５７４．４６Ｗ／ｚとして明らかに同定された。
【０１５６】
例２〜２２の化合物の合成を例１に類似して行った。ステップ１は使用したアミンが異なり、例１７〜２２では化学理論量比が異なる。ステップ２は反応体が異なるが、化学理論量比は維持した。生じた化合物及び対応するＭＷ／ｚ値を表１に纏める：
【０１５７】
【表１】
2017522305.tif 000071
2017522305.tif 000072
2017522305.tif 000073
【０１５８】
例２３：１−（２，３−ビス（ドデシルチオ）プロピル）−３−（２−（ジメチルアミノ）エチル）尿素の合成及び特徴付け
【０１５９】
【化６９】
2017522305.tif 000074
１−（２，３−ビス（ドデシルチオ）プロピル）−３−（２−イメチルアミノ）エチル）尿素の合成手順は上記の例と類似する。
【０１６０】
第一のステップは、１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−３−（２−プロピン−１−イル）尿素の合成である。０．１ｍｍｏｌのカルボニイイミダゾール及び０．１ｍｍｏｌのプロパルギルアミンを２ｍｌのＤＣＭ中に溶解し、そしてアルミニウム箔で覆った２０ｍｌガラスバイアルに加えた。この溶液を１時間振盪し、次いで０．１ｍｍｏｌのジメチルエタン−１，２−ジアミン及び０．０１ｍｍｏｌのＤＭＡＰを加え、この溶液を一晩振盪した。
【０１６１】
第二のステップは、１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−３−（２−プロピン−１−イル）尿素へのチオールの光付加である。これを行うために、０．２ｍｍｏｌのドデカンチオール及び３ｍｇのＤＭＰＡを、第一のステップからの溶液に加え、そしてバイアルをアルゴンで脱気しそして３６５ｎｍＵＶ下に２時間照射した。次いでこのバイアルを乾燥し、そして４℃で保管した。
【０１６２】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって分析した。分子イオンは、５７３．４７ＭＷ／ｚとして明確に同定された。
【０１６３】
例２４〜４４による合成を例２３に類似して行った。ステップ１は使用したアミンが異なり、並びに例３９〜４４では化学理論量比も異なる。ステップ２は反応体が異なるが、化学理論量比は維持した。生じた化合物及び対応する分子イオンを表２に要約する：
【０１６４】
【表２】
2017522305.tif 000075
2017522305.tif 000076
2017522305.tif 000077
【０１６５】
例４５：３−（ドデシルスルフィニル）−２−（ドデシルチオ）プロピル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメートの合成及び特徴付け
【０１６６】
【化７０】
2017522305.tif 000078
このアミノ脂質は一つのステップで合成される。１ｍｍｏｌの２，３−ビス（ドデシルチオ）プロピル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメート（例１の生成物）を１０ｍｍｏｌの水性過酸化水素（３０％）と１０ｍｌのメタノール中で混合し、そして１時間室温で攪拌した。次いで、この混合物を５０ｍｌフラスコに移し、そして濃縮した。
【０１６７】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって分析した。分子イオンは、５９０．５ＭＷ／ｚとして明確に同定された。
【０１６８】
例４６：２，３−ビス（ドデシルスルホニル）プロピル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメートの合成及び特徴付け
【０１６９】
【化７１】
2017522305.tif 000079
このアミノ脂質は一つのステップで合成される。１ｍｍｏｌの２，３−ビス（ドデシルチオ）プロピル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメート（例１の生成物）を１０ｍｍｏｌの水性過酸化水素（３０％）と１０ｍｌのメタノール中で混合し、そして二日間室温で攪拌した。次いで、この混合物を５０ｍｌフラスコに移し、そして濃縮した。
【０１７０】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって分析した。分子イオンは、６３８．４ＭＷ／ｚとして明確に同定された。
【０１７１】
例４７：Ｎ１，Ｎ１−ビス（３−（ドデシルチオ）プロピル−Ｎ２，Ｎ２−ジメチルエタン−１，２−ジアミンの合成及び特徴付け
【０１７２】
【化７２】
2017522305.tif 000080
Ｎ１，Ｎ１−ビス（３−（ドデシルチオ）プロピル−Ｎ２，Ｎ２−ジメチルエタン−１，２−ジアミンの合成手順は前述の例と類似する。
【０１７３】
１ｍｍｏｌのＮ１，Ｎ１−ジメチルエタン−１，２−ジアミン、及び２ｍｍｏｌの３−ブロモプロパン−１−エンを、２ｍｌのＴＨＦ及び１重量％のＣｓ２ＣＯ３を含む２０ｍｌガラスバイアルに加えた。この溶液を４０℃で一晩振盪した。次いで、この溶液バイアルを振盪器から取り出し、遠心分離し、そして上澄み液を新しい２０ｍｌバイアルに移した。２ｍｍｏｌのドデカン−１−チオール及びＴＨＦ中の５〜７重量％の２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトンフェノン（ＤＭＰＡ）溶液を上記の２０ｍｌガラスバイアルに加えた。この混合物をＵＶ３６５ｎｍ下に２時間照射し、次いでＴＨＦを蒸発して除去した。
【０１７４】
このステップは、前述の例と類似して行った。化学理論量比は維持した。
【０１７５】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって試験した（ｍ／ｚ  ５７２．５１）。
【０１７６】
例４８〜５９による合成を例４７に類似して行った。ステップ１は使用したアミンが異なるが、化学理論量比は維持した。生じた化合物及び対応する分子イオンを表３に要約する：
【０１７７】
【表３】
2017522305.tif 000081
2017522305.tif 000082
【０１７８】
例５７：１１−（ドデシルチオ）−２−メチル−９−オキサ−１３−チア−２，５−ジアザペンタコサン−７−オールの合成及び特徴付け
【０１７９】
【化７３】
2017522305.tif 000083
この脂質は次のように合成した：１ｍｍｏｌのＮ１，Ｎ１−ジメチルエタン−１，２−ジアミン、及び１ｍｍｏｌの２−（（２−プロピン−１−イルオキシ）メチル）オキシランを、セプタムで覆った２０ｍｌガラスバイアル中で２ｍｌのエタノール中に溶解した。この溶液を４０℃で一晩振盪した。次いで、この溶液バイアルを振盪器から取り出し、エタノールを蒸発し、そして２ｍｌの新鮮なＴＨＦを加えそしてよく混合し、次いで溶液を５分間脱気し、そして３分間アルゴン（Ａｒ）を充填し、次いで蓋で覆った。２ｍｍｏｌのドデカン−１−チオール及びＴＨＦ中の５〜７重量％の２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトンフェノン（ＤＭＰＡ）溶液を上記の２０ｍｌガラスバイアルに加えた。この混合物をＵＶ３６５ｎｍ下に２時間照射し、次いでＴＨＦを蒸発して除去した。
【０１８０】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって分析した。分子イオンは、６０５．０８ＭＷ／ｚとして明確に同定された。
【０１８１】
例５８〜６６の化合物の合成を例５７に類似して行った。生じた化合物及び対応するＭＷ／ｚ値を表４に纏める：
【０１８２】
【表４】
2017522305.tif 000084
2017522305.tif 000085
【０１８３】
例６７：２１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−１７，２５−ジオキサ−１３，２９−ジチア−２１−アザヘンテトラコンタン−１９，２３−ジオール
【０１８４】
【化７４】
2017522305.tif 000086
２１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−１７，２５−ジオキサ−１３，２９−ジチア−２１−アザヘンテトラコンタン−１９，２３−ジオールの合成手順は前述の例に類似する。１ｍｍｏｌのＮ１，Ｎ１−ジメチルエタン−１，２−ジアミン、及び２ｍｍｏｌの２−（（アリルオキシ）メチル）オキシランを、セプタムで覆った２０ｍｌガラスバイアル中で２ｍｌのエタノール中に溶解した。この溶液を４０℃で一晩振盪した。次いで、この溶液バイアルを振盪器から取り出し、エタノールを蒸発し、そして２ｍｌの新鮮なＴＨＦを加えそしてよく混合し、次いで溶液を５分間脱気し、そして３分間アルゴン（Ａｒ）を充填し、次いで蓋で覆った。２ｍｍｏｌのドデカン−１−チオール及びＴＨＦ中の５〜７重量％の２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトンフェノン（ＤＭＰＡ）溶液を上記の２０ｍｌガラスバイアルに加えた。この混合物をＵＶ３６５ｎｍ下に２時間照射し、次いでＴＨＦを蒸発して除去した。
【０１８５】
このステップは、前述の例と類似して行った。化学理論量比は維持した。
【０１８６】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって試験した（ｍ／ｚ  ７２１．２４）。
【０１８７】
例６８〜７６による合成を例６７に類似して行った。生じた化合物及び対応する分子イオンを表５に要約する：
【０１８８】
【表５】
2017522305.tif 000087
2017522305.tif 000088
【０１８９】
例７７：Ｎ１−（３−（ドデシルスルフィニル）−２−（ドデシルチオ）プロピル−Ｎ２，Ｎ２−ジメチルエタン−１，２−ジアミンの合成及び特徴付け
【０１９０】
【化７５】
2017522305.tif 000089
このアミノ脂質は一つのステップで合成される。１ｍｍｏｌのＮ１−（２，３−ビス（ドデシルチオ）プロピル）−Ｎ２，Ｎ２−ジメチルエタン−１，２−ジアミン（例５０の生成物）を１０ｍｍｏｌの水性過酸化水素（３０％）と１０ｍｌのメタノール中で混合し、そして１時間室温で攪拌した。次いで、この混合物を５０ｍｌフラスコに移し、そして濃縮した。
【０１９１】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって分析した。分子イオンは、５４６．５ＭＷ／ｚとして明確に同定された。
【０１９２】
例７８：Ｎ１−（２，３−ビス（ドデシルスルホニル）プロピル）−Ｎ２，Ｎ２−ジメチルエタン−１，２−ジアミンの合成及び特徴付け
【０１９３】
【化７６】
2017522305.tif 000090
このアミノ脂質は一つのステップで合成される。１ｍｍｏｌのＮ１−（２，３−ビス（ドデシルチオ）プロピル）−Ｎ２，Ｎ２−ジメチルエタン−１，２−ジアミン（例５０の生成物）を１０ｍｍｏｌの水性過酸化水素（３０％）と１０ｍｌのメタノール中で混合し、そして二日間室温で攪拌した。次いで、この混合物を５０ｍｌフラスコに移し、そして濃縮した。
【０１９４】
分子の同定のために、粗製生成物を質量分析によって分析した。分子イオンは、５９４．４ＭＷ／ｚとして明確に同定された。
【０１９５】
細胞トランスフェクションのためのカチオン性脂質のスクリーニング
例７９：細胞トランスフェクションのための最適な脂質比の初期決定
十分に証明されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を例７９及び８０に使用する。
【０１９６】
天然のリン脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ−構造を以下に示す）を、必要な共脂質（ヘルパー脂質とも称する）として選択した。これは、リポソーム自体の安定性には必要ではないが、細胞の細胞内区画（エンドソーム）中の脂質膜を破壊して、生物活性剤を細胞質ゾル及び／または核に放出するために必要である。基本的に、これは、本カチオン性アミノ脂質（ＤＰＤＥＣ）と組み合わせた安定なリポソーム形成のための望ましい効果のために必要である。ＤＯＰＥを、代表的なカチオン性アミノ脂質（構造を以下に示す）と様々な比率で混合した。両脂質を５０ｍｇ／ｍｌでエタノール中に溶解して組み合わせて最終体積を３０μｌとした。
【０１９７】
ＤＯＰＥ（共脂質）：
【０１９８】
【化７７】
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代表的な新規カチオン性アミノ脂質としての２，３−ビス（ドデシルチオ）プロピル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメート（ＤＰＤＥＣ）：
【０１９９】
ＤＰＤＥＣ：
【０２００】
【化７８】
2017522305.tif 000092
【０２０１】
【表６】
2017522305.tif 000093
【０２０２】
次いで、これらの３０μｌのエタノール混合物を、一定の渦流下に３０秒間で０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）７０μｌに加え、その後、５分間超音波処理してリポソームを生成した。最終脂質含有率は２ｍｇ／ｍｌである。この最終の２ｍｇ／ｍｌリポソームサンプルを「脂質試薬」と称する。
【０２０３】
０．１μｌ、０．２μｌ、０．３μｌ、０．４μｌ及び０．５μｌの上記の脂質試薬を、５０ｎｇまたは１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（それぞれ５：１の比率でｐＣＳ−ＬａｃＺ及びｐＨ２Ｂ−ＹＦＰプラスミドを含む）のいずれかと組みあわせ、そして以下に記載されるように細胞と混合した：
（記載の量は、９６ウェル培養プレートの一つのウェルについての量である）
１．０．１μｌ〜０．５μｌの脂質試薬を、１０μｌの５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）中に希釈した。
２．２〜５分のインキュベーションの後に、（１）からの希釈脂質試薬を、５０ｎｇまたは１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウムバッファー１０μｌ中に溶解したＤＮＡ、ｐＨ５．０）のいずれかに添加した。
３．サンプルを室温で３０分間置いて、脂質／ＤＮＡトランスフェクション複合体を形成した。ＤＮＡが負に荷電されるので、これは、リポソーム中のカチオン性脂質の正に荷電したヘッド基と非特異的に結びつく。
４．３０分後、新たに懸濁させた５０μｌのＨＥＫ２９３細胞（１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中の約５０，０００個の細胞）を脂質／ＤＮＡ複合体に加え、ピペットアクションで混合し、そして細胞＋脂質／ＤＮＡ複合体の６５μｌを、一枚の９６ウェルに加えた。
【０２０４】
脂質混合物がプラスミドＤＮＡを細胞内に送達する能力を評価するために、顕微鏡を使用して、初期トランスフェクションをしてから２０〜２４時間後に黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）によって発せられる蛍光を可視化した。ＹＦＰタンパク質がｐＨ２Ｂ−ＹＦＰプラスミドでコードされ、そして効率よく合成され、首尾良くトランスフェクションされた細胞の核内に見つかる。
【０２０５】
結果：
脂質の非常に明確な最適比：ＤＯＰＥは２：１と特定され、そして最適な脂質試薬：ＤＮＡ比は、７５ｎｇのＤＮＡ当たり０．４μｌの脂質試薬であった。それ故、以下の例８０に記載のように、これらの条件を、最高の細胞トランスフェクション効率及び最低の細胞毒性を持つ脂質試薬を特定するための一次スクリーニングに使用した。
【０２０６】
例８０：新規の脂質試薬を用いた一次スクリーニング
細胞株：ＨＥＫ２９３細胞
スクリーニングフォーマット：９６ウェル
検出（読み出し）：全細胞数（核染料（ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｙｅ）、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて評価した全細胞数−図１及び２参照）に対するＹＦＰ蛍光
商業的に入手可能なリポソームトランスフェクション試薬を、製造業者の指示に従い参考品（参考試薬）として使用した。図１及び２参照。
【０２０７】
方法：
全てのステップは、８もしくは１２チャンネルマルチピペットを用いて９６チューブ／プレートフォーマットで行った。記載の量は、９６ウェルプレートの対の（２×）ウェル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｗｅｌｌｓ）についての量である。
１．０．８μｌの脂質試薬を、２０μｌの５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＯＡｃバッファー中に希釈した（ｐＨ５．０）。
２．（１）からの希釈した脂質試薬を、２０μｌのＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ５．０）中で１５０ｎｇのＤＮＡ（２５ｎｇのｐＨ２Ｂ−ＹＦＰ＋１２５ｎｇのｐＣＳ−ＬａｃＺプラスミド）に加え、そしてピペットアクションで混合した。
３．室温で３０分間インキュベーションした後、１００μｌの新たに懸濁した細胞（１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中の５×１０４個の細胞／ウェル）を加え、ピペットで混合した。
４．細胞＋脂質／ＤＮＡ複合体の二つの６５μｌアリコート部を直ぐに、９６ウェル培養プレートの別々のウェルに移し、そして５％ＣＯ２の３７℃インキュベータ中に置いた。
５．細胞の初期トランスフェクションから２０〜２４時間後、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８染料を０．２μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に加え、そして細胞を更に３０分間、３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を、倒立顕微鏡上に置き、そして図１及び２に示すように、２セットの独立した細胞画像を各々のウェルからキャプチャーした。
【０２０８】
各々のサンプルについて、三枚の画像をキャプチャーした：細胞の明視野像（図１及び２の上部パネル）、全細胞核のＨｏｅｃｈｓｔ染料で着色した画像（図１及び２の中間パネル）、及び細胞が首尾良くプラスミドＤＮＡでトランスフェクションされそしてＹＦＰタンパク質を発現していることを示すＹＦＰ画像（図１及び２の下部パネル）。トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の顕微鏡画像は、通常使用される市販のトランスフェクション試薬（参考試薬）と比較して、二つの本脂質分子（＃３０及び＃６０）のトランスフェクション効率及び毒性レベルの両方を示す。脂質試薬＃３０及び＃６０はおおよそ９０％のトランスフェクション効率を有し、かつ低い細胞毒性を有する（非常に少数の明るく着色されたアポトーシス核）。
【０２０９】
例８０に記載のプロトコルに従い、請求項１に従う新たに合成された化合物のライブラリーを、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションするそれらの能力について試験した。図３及び４のグラフは、商業的に入手可能な参考用トランスフェクション剤と比べてこれらの脂質化合物のトランスフェクション効率を示す。脂質分子の１は、実線で示される広く使用されている商業的なトランスフェクション試薬と比べた場合に、ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドＤＮＡ（ＹＦＰ遺伝子）の送達で効果がある。特に二つの試薬が、非常に低い毒性を持つことが確認され、細胞にｓｉＲＮＡ分子を非常に効率よく送達する能力を持つ（＃２４、図５参照、及び＃６４、図６参照）。
【０２１０】
例８１：ｓｉＲＮＡをトランスフェクションする能力についてのライブラリー「ｈｉｔｓ」のスクリーニング
細胞及び全生物中での遺伝子機能の操作のためのキーテクノロジーの一つは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した遺伝子サイレンシングである。哺乳類細胞中への低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の送達は、この技術には極めて重要であり、大きな臨床的／治療的意味を持つ。
【０２１１】
それ故、プラスミドＤＮＡ（遺伝子）の送達に関しての本脂質のスクリーニングに加えて、ｓｉＲＮＡ分子（遺伝子サイレンサー）を効率よく送達する能力に関しても本発明によるアミノ脂質をスクリーニングした。
【０２１２】
これのスクリーニングのために、二つの異なる種類の細胞を使用して、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）を標的とするｓｉＲＮＡを送達する本脂質試薬の能力を試験した。これは、Ｗｎｔリガンドの２００ｋＤの１回膜貫通型受容体であり、Ｗｎｔ／ｂ−カテニンシグナル伝達経路を活性化する。これは、ＭＥＦ細胞中で比較的高いレベルで発現される。
【０２１３】
アッセイ：マウス胚繊維芽（ＭＥＦ）細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクション
方法：
全てのステップは、０．２ｍｌＰＣＲチューブ及び９６ウェルプレートフォーマットで行った。記載の量は、９６ウェルプレートの一つのウェルについての量である。
１．０．２５μｌの脂質試薬を、８μｌの５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ５．０）に希釈した。
２．（１）からの希釈した脂質試薬を、８μｌのＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ５．０）中でｓｉＲＮＡ分子１ｐｍｏｌ（５μｍｏｌ／ｌの０．２μｌ）に加え、そしてピペットアクションで混合した。使用したｓｉＲＮＡ分子は、どの既知の遺伝子に対しても特異的でないスクランブルされた配列（Ｃｏｎ  ｓｉＲＮＡ）か、またはＬＲＰ６遺伝子からの内在性ｍＲＮＡを特異的に標的にする配列（ＬＲＰ６  ｓｉＲＮＡ）のいずれかを有した。
３．室温で３０分のインキュベーション後、５０μｌの新たに再懸濁した細胞（１０％ウシ胎仔血清が補充されたＤＭＥＭ培地中、２×１０４個の細胞／ウェル）を９６ウェルプレートの一つのウェルに加え、そして５％ＣＯ２の３７℃インキュベーター内に置いた。
４．最初のトランスフェクションから２４時間後に、細胞を２５μｌのデタージェントバッファー（プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含有する５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で溶解させ、遠心させて不溶性細胞破片を除去し、そして３０μｌの清澄溶解物を１０μｌの４×ＳＤＳローディングバッファー（２５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、４０％のグリセロール、８％のＳＤＳ、０．０１％のブロモフェノールブルー、５％の２−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）に添加した。
５．試料を９６℃で２分間加熱して変性させ、１２μｌを、分子量に従ってタンパク質を分離するために９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。分離されたタンパク質をウェスタン・ブロット（ＷＢ）分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜に移した。
６．ＷＢを、ＬＲＰ６及びα−チューブリンタンパク質に対する抗体を用いた自動ＢｉｏＬａｎｅ  ＨＴＩ装置を使用して実行した。ＨＲＰ結合二次抗体及び化学発光法を使用して膜上のタンパク質を検出した。
【０２１４】
結果
図５及び６は、示したｓｉＲＮＡ分子でトランスフェクションされそして２４時間培養されたＭＥＦ（マウス胚繊維芽）細胞の全溶解物からのＬＲＰ６タンパク質のウエスタン・ブロット（ＷＢ）分先を示す。脂質試薬＃２４及び＃６４は、ｓｉＲＮＡ仲介遺伝子サイレンシングにおいて市販試薬Ａと比べて極めて効果的である。これは、関連するトランスフェクション試薬の特性における著しい相違を実証し、かつ、最適な特性（例えば非常に効率的なＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの送達並びに低い細胞毒性）を有するものを特定するためにスクリーニングできる数百の関連脂質を容易に合成するために本新規方法を使用することの重要性を強調するものである。
【０２１５】
【表７】
2017522305.tif 000094
【図１】
2017522305.tif 000133
【図２】
2017522305.tif 000134
【図３】
2017522305.tif 000135
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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