(57)【要約】【課題】【解決手段】脂溶性栄養素の分子分散を含む組成物と、その方法が、脂溶性栄養素を含む組成物を投与することにより糖尿病の眼関連合併症の進行と成熟を遅延させるために提供される。より詳細には、方法は、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ栄養摂取のための栄養補助食品と健康促進への貢献として特に有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された、ルテインおよびその異性体、ルテインエステル、ゼアキサンチン異性体、ウコン抽出物、クルクミンまたはクルクミノイドを含む組成物を投与することにより、糖尿病の眼関連合併症の進行と成熟を遅延させることに関する。【選択図】図２
2017511380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させる方法であり、
前記方法は、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ栄養摂取のための栄養補助食品および健康促進への貢献として特に有用である脂溶性栄養素を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記糖尿病の眼関連合併症が、白内障および網膜症である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂溶性栄養素は、ルテインおよびその異性体、ルテインエステル、ゼアキサンチン異性体、ウコン抽出物、クルクミン、生姜等ならびにそれらの混合物を含む群から選択される先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記組成物は、血中グルコース値を調節するのに有効である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）値を調節するのに有効である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記組成物は、糖尿病性網膜症における無軸索細胞機能障害を調節するのに有効である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、糖尿病性網膜症における、レチナール層、ロドプシン値およびＮＧＦタンパク質レベルの損失を防ぐのに有効である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記組成物は、糖尿病性網膜症における、糖尿病誘発性ＰＤＧＦ過発現を阻害するのに有効である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記組成物は、糖尿病性白内障における不溶性水晶体タンパク質の蓄積を防ぐのに有効である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物は、糖尿病性白内障における水晶体におけるソルビトール値の蓄積を防ぐのに有効である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物は、タンパク質凝集を減らし、かつ糖尿病性白内障における可溶性タンパク質全体のプロフィールを正規化するのに有効である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、脂溶性栄養素；安定剤；水溶性親水性担体および任意に界面活性剤を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、少なくとも８０重量％の全キサントフィルを含有し、
そのうちトランス−ルテイン含有量は、８０〜９５％ｗ／ｗであり；
（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンは、１４〜２０％ｗ／ｗであり；
（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンは、０．０１〜１％ｗ／ｗであり；または、
トランス−ルテイン含有量は、８０〜９５％ｗ／ｗであり；
（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンは、１４〜２０％ｗ／ｗであり、かつ、
キサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された他のカロチノイドを微量；または、
５〜９５％のクルクミノイドを含むクルクミンを含む、
先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記安定剤は、アスコルビン酸、ＢＨＡ、ＢＨＴ、パルミチン酸アスコルビル、ローズマリー抽出物、混合天然トコフェロール、アルファ酢酸トコフェロール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒマシ油誘導体、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物から選択される先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
使用される前記担体は、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、グルコースシロップ、コーン浸出液、マンニトール、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール１００００、ポリエチレングリコール２００００、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、グルコース、塩化ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、可溶性デンプン、加水分解デンプンおよびこれらの混合物から選択される
先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、レシチン、スクロース脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物からなる群から選択される先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
脂溶性栄養素を含む前記組成物は、粉剤、錠剤、カプセル剤、小袋、ビーズ状剤、マイクロカプセル化粉剤、油懸濁液、分散液、ペレット剤、軟質ゲルカプセル剤、チュアブル錠または液体製剤の形態である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［分野］
本発明は、脂溶性栄養素を含む組成物を投与することにより、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させる方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒトの食物摂取について安全であり、栄養摂取のための栄養補助食品および健康促進への貢献として特に有用である、キサントフィル/キサントフィルエステルを含む植物の抽出物/オレオレジンから誘導された、ルテインおよびその異性体、ルテインエステル、ゼアキサンチン異性体、ウコン抽出物、クルクミンまたはクルクミノイドを単独または組み合わせて含む組成物を投与することにより、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［本発明の背景］
眼は、眼の骨性眼窩により守られている、ヒト身体における最も重要かつ複雑な器官である。眼は、角膜、虹彩、水晶体、毛様体および強膜の前方部分からなる全部に分けられている。後方部は水晶体により前方に結合しており、眼の後方に伸びている。網膜視神経頭は、また、後方部に含まれる。光は、前方部分（角膜、房水、結晶水晶体、瞳孔、硝子体液と呼ばれる）を通り抜けて眼の網膜に到達し、この進路は、眼の視軸と呼ばれる。水晶体は、光線を屈折させ、順応することにより物体の像を網膜(窩)上に焦点を合わせる助けをする。
【０００３】
糖尿病および糖尿病合併症:
糖尿病は、最も発症する、非伝染性の、不均質な、代謝異常の一つであるインスリン生成欠如であり、インスリン作用への抵抗またはその両方から生じる高血糖症により特徴づけられ、２つの型の糖尿病、１型と２型がある。１型真性糖尿病は、膵臓β細胞の自己免疫媒介破壊の結果、インスリン欠乏を引き起こす。
【０００４】
２型真性糖尿病は、完全なインスリン欠乏よりむしろ、相対的なインスリン抵抗性により特徴づけられる。もっとも最新の世界保健機関（ＷＨＯ）評価によれば、約３６６百万人の糖尿病の人々が世界中におり、２０３０年までに５５２百万人に増加することが予想され、インドでは約６２百万人の糖尿病の人がいる。慢性高血糖症に長くさらされると、血管合併症および非血管合併症を含む様々な合併症を引き起こしうる。血管合併症は、大血管の合併症および微細血管の合併症に更に分けられる。網膜、腎臓、末梢神経および水晶体のような組織は、糖尿病の長期の合併症により最も影響を受け、糖尿病性網膜症、腎症、神経障害および白内障の進行をそれぞれ生じる。
【０００５】
糖尿病性白内障: 
白内障は、世界中で、眼水晶体の不透明性により特徴づけられ、失明の原因を引き起こす。糖尿病において白内障の進行は、非糖尿病の人と比較した場合、２〜５倍多い。さらに、真性糖尿病の患者は、白内障手術からの合併症割合が高い。糖尿病と白内障の両方は、特に糖尿病治療が不完全であり、白内障手術はしばしば手の届かないものである発展途上国において、膨大な健康負担および経済的負担をもたらす。多くの臨床的介入が、糖尿病性白内障を含む白内障に反撃することが報告されているが、臨床的診断において完全には成功していない。
【０００６】
糖尿病性網膜症:
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、糖尿病の最も一般的な微小血管合併症の一つである。  ＤＲは、１５年以上糖尿病である患者すべての７０％に起こり、失明の一般的な原因である。ＤＲは、網膜の疾患であり、視覚の喪失、黄斑浮腫、再発性の硝子体液の出血、けん引の、または２次の裂孔原性網膜剥離などになる。最近２０年以来、ＤＲの薬物療法の新たな分野において、著しい進行がある。３０年前にレーザー光凝固術が出現し、ほとんどの場合に失明を制限するのに実に有用であり、ＤＲの治療にとって、いまも．代表的な治療であると考えられている。しかしながら、コルチコステロイドおよび抗ＶＥＧＦ剤は、新血管新生の予防に関して期待できる結果を示したが、短期間の効果のため、限定的なままであった。従って、ＤＲの薬物療法は、いまも、汎網膜の光凝固に付属している。
【０００７】
近年、多くの注意が、ロチノイドの生物学的活動に集中している。カロチノイドは、植物における自然由来のキサントフィルであり、これらは、集光性反応と、一重項酸素誘導損傷に対する植物の保護器官に関与している。食物のカロチノイドは、組織において、抗酸化剤として機能し（Thurnham DL. 「カロチノイド:機能と虚偽」、Proc Nutr Soc 1994; 53: 77-87)、酸化的損傷から身体を守る。
【０００８】
哺乳類種は、カロチノイドを合成せず、従って、これらは、果実および野菜ならびに／または栄養補助食品のような食物源から得る必要がある。多数の疫学調査により、カロチノイド豊富な果実および野菜の消費と、変性疾患の発生率との間に、強力な逆の関係が支持される(Coleman H, Chew E.、「加齢に伴う黄斑変性症における栄養補給」、. Curr Opin Ophthalmol 2007; 18(3): 220-223)。
【０００９】
ルテインは、緑色葉物野菜および卵黄に存在する主なキサントフィルの一つである。ルテインおよびゼアキサンチンは、ヒト網膜の黄斑に選択的に蓄積することが知られている。これらは、抗酸化剤および青色光フィルターとして機能し、喫煙および日光商社のような酸化的ストレス（加齢に伴う黄斑変性症および白内障を引き起こしうる）から眼を保護すると考えられている。
【００１０】
キサントフィルは、光学異性体（Ｒ−およびＳ−立体異性体）と幾何異性体（トランス、Ｅ−およびシス、Ｚ−）の両方を示しうる。Ｒ−およびＳ−立体異性体の配座は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトラムおよびキラル・カラム高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）研究に基づき、一方、シス−およびトランス−異性体の配座は、電子、赤外線、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）およびオンライン分光学研究の高速液体クロマトグラフィー−核磁気共鳴（ＨＰＬＣ−ＮＭＲ）に基づく。有機分子が４つの異なる種類の原子に結合した炭素原子またはそれに結合した基を有する場合、炭素原子は、キラル炭素原子と呼ばれることがよく知られている。そのキラル炭素原子は、光学異性体の生成になる２つの異なる空間的配置の原因であり、一方、ポリエン鎖の二重結合の数とメチル基の存在と、立体障害の不在は、トランス−とシス−異性体の数を決定する。トランス−ゼアキサンチンの場合、２つの末端の環の３位および３’位の炭素原子は、両方ともキラル原子である。
【００１１】
従って、トランス−ゼアキサンチンは、２つの不斉中心が結合している第２級ヒドロキシ基の位置に基づき、２つの不斉中心を炭素原子Ｃ３とＣ３’に有する。従って、トランス−ゼアキサンチンの４つの可能性ある立体異性体、すなわち、（３Ｒ−３'Ｒ）−異性体、（３Ｓ−３'Ｓ）−異性体および（３Ｒ−３'Ｓ）−または（３Ｓ−３'Ｒ）−異性体が存在する。これらの異性体の中で、（３Ｒ−３'Ｓ）−と（３Ｓ−３'Ｒ）−は同一である。従って、トランス−ゼアキサンチンの３つのキラル異性体が存在する。右手方向に偏光の回転を生じる異性体は、Ｒ−立体異性体と呼ばれ、左手方向に偏光の回転を生じる異性体は、Ｓ−立体異性体と呼ばれ、二重の反対効果を有する第３の異性体（Ｒ，Ｓ；光学的に不活性）は、メソ型ゼアキサンチンと呼ばれる。
【００１２】
ルテインおよびゼアキサンチンの共役二重結合は、各色素の独特の色に寄与し、一重項酸素をクエンチするこれらの能力にも影響する。余分な共役二重結合のため、ゼアキサンチンは、ルテインと比較して、より強い抗酸化剤と考えられている。
【００１３】
細胞段階でのキサントフィルの位置に関して、これらは、キサントフィル結合性タンパク質（ＸＢＰ）と呼ばれている特定のタンパク質と結合すると報告されている。ＸＢＰは、血流からのルテインおよびゼアキサンチンの摂取と、網膜におけるそれらの安定化に関与すると示唆されている。フェムト秒過渡吸光分光法によるキサントフィルおよびＸＢＰの研究は、（３Ｒ，３'Ｒ）−ゼアキサンチンと比較して（３Ｒ，３'Ｓ）−ゼアキサンチン豊富なＸＢＰのよりよい安定性を示し、一方、キサントフィル：（３Ｒ，３'Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（３Ｒ，３'Ｓ，メソ）−ゼアキサンチンの物理的特性は、通常、同一である。メソ−ゼアキサンチンは、ＸＢＰとよりよく適合し、タンパク質は、フリーラジカルによる分解からキサントフィルを守るであろう。従って、複合体は、遊離のキサントフィルより、よりよい抗酸化剤であり、眼球組織の酸化的損傷からの優れた保護を容易にする（Billstenら、「ヒト網膜からのカロチノイド・タンパク質におけるキサントフィルの光物理的特性」、 Photochemistry and Photobiology, 78, 138-145, 2003)。
【００１４】
疫学調査により、ルテインおよびゼアキサンチンのより高い食物の摂取量により、白内障および加齢に伴う黄斑変性症のリスクを減じることが示唆された。以前の研究により、インスリンおよびルテインの組み合わせで処理されたラットは、ルテインまたはインスリン単独で処理されたものより、白内障の進行と成熟を遅延させることを示した。ＤＲ患者における血清ルテインおよびゼアキサンチンの濃度は、正常の人におけるものより著しく低いことが見出されており、これらの摂取量は、視力、コントラスト感度および黄斑浮腫を向上させることが証明されており、ルテインおよびゼアキサンチンの補給は、ＤＲ治療における可能性ある治療薬として標的になるかもしれない。
【００１５】
クルクミンは、ターメリックの有効成分として同定されており、抗酸化、抗炎症性、抗菌性、および抗発がん性活性を示すことが示されている。クルクミンは、スパイスのターメリックからの天然の抽出物である。ターメリックは、植物ウコン、生姜ファミリーのメンバーから誘導される。クルクミンは、多くの健康利益を本質的に有する抗酸化剤として知られている。クルクミンは、ヒト網膜の内皮細胞におけるアポトーシスを減じ、試験管内で培地中へのＶＥＧＦ放出を減じ、また、ラットにおいて血清ＶＥＧＦレベルの糖尿病誘発性上昇を阻害することを示している。高いグルコースレベルと低酸素症により誘導された血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）発現は、網膜症において主な特徴である。いくつかの研究が、ＶＥＧＦがまた、網膜症の最も初期の段階の進行において、役割を果たすかもしれないことも示している。
【００１６】
クルクミン、ルテイン、ゼアキサンチン等の栄養補助食品は、予備臨床的研究においていくらかの利益を生じるが、転移は非常に乏しく、臨床試験において用いられる用量は、実際に実現するには不可能である。クルクミンでの臨床的成功に欠ける主な理由の一つは、乏しいバイオアベイラビリティを生じる、大規模な腸管および肝臓の代謝の生体内変化に関連づけられる。近年、治療的有効性を向上させるという観点から、栄養補助食品のバイオアベイラビリティ問題に対処することに焦点がある。
【００１７】
クルクミン、ルテイン、ゼアキサンチン、生姜等の脂溶性栄養素は、現在用いられている形態である油懸濁液として、またはビーズ状剤（ｂｅａｄｌｅｔｓ）として投与される場合、吸収されにくい。乏しい吸収性の主な理由は、その水中での乏しい溶解性にある。それらの不溶性のため、これらのバイオアベイラビリティは非常に乏しい。脂溶性栄養素は、消化管において限定された溶解性のため、身体において吸収が限定される。通常、そのような栄養素のバイオアベイラビリティは、４０％より低い。バイオアベイラビリティは、その粒径サイズを減じることにより工場させることができ得、そのかわち、ミセル形成の性能も向上する。栄養製品の分子レベルでの分散は、粒径を低下させる技術として、通常は考えられている。このような分子分散により、水中において栄養素のミセル形成にとってより高い効率を提供し、これにより、バイオアベイラビリティを増加させる。
【００１８】
ゆえに、溶解性脂溶性栄養素を含む組成物の糖尿病ラットにおける効果を、その効果を通常の脂溶性栄養素と比較して、栄養ゲノム情報科学アプローチによる網膜への有益な効果に関して、研究することは、興味深い。
【００１９】
栄養ゲノム情報科学は、栄養素と遺伝子との間の相互作用の科学である。遺伝子発現が、特定の栄養素に対する要求にどのように影響し、人生にわたって最適な健康を維持するようどのように助けるのか研究することである。栄養ゲノム情報科学は、どのように、栄養は、代謝経路およびホメオスタティック・コントロールにどのように影響を与えるのか、この制御が、食物関連疾患の初期のフェーズにおいてどのように分布しているのか、そのような疾患にココの感受性遺伝子タイプがどの程度貢献しているのかを更に理解することを、促進する。我々のゴールは、植物性栄養素が、どのようにして遺伝子発現に影響を与えるのか、さらに理解することである。
【００２０】
糖尿病性眼疾患の予防/治療のために用いられるカロチノイドを含む組成物を提供する多数の引例が、入手可能である。
【００２１】
Ｂｒｏｗｎら（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．１９９９）において、カロチノイドを含む食物の抗酸化剤は、水晶体内のタンパク質または脂質の参加を防ぐことにより、加齢に伴う白内障のリスクを低下させると仮説をたてている。しかし、この現象に関する有望な疫学データは、限定的である。著者は、男性におけるカロチノイドとビタミンＡ摂取量と、白内障抽出の関連を予め研究した。１９８６年に４５〜７５歳の米国男性健康専門家（ｎ＝３６６４４）を、この有望な同世代研究に含めた。他のものは、４５歳になったときに、次いで、含めた。８年の経過観察の間、８４０ケースの老人性白内障抽出を記録した。かれらには、より高い摂取量のルテインおよびゼアキサンチンで、男性における白内障抽出のリスクが多少低くなるのを観察されたが、年齢、喫煙を含む他のリスク因子の後に、他のカロチノイド（アルファ−カロテン、ベータカロテン、リコピンおよびβ−クリプトキサンチン）またはビタミンＡは、調整されなかった。ルテインおよびゼアキサンチン摂取量の最も高い５番目の男性は、最も低い５番目の男性に比べて、白内障のリスクが１９％低かった（相対的リスク：０．８１；９５％ＣＩ：０．６５、１．０１；動向Ｐ＝０．０３）。カロチノイドが多い特定の食物の中で、ブロッコリーとホウレンソウは、最も常に、白内障のより低いリスクと関連していた。ルテインおよびゼアキサンチンは、抽出に必要なだけ十分に厳しい白内障のリスクを低減するかもしれないが、この関係は、強度において緩やかに見える。この研究は、米国男性人口について行われたコホート研究である。この研究は、栄養欠乏と、白内障の発生の間の関連を確立した。
【００２２】
ＥＰ２６１８８３２Ａ２は、ルテインおよび少なくとも１つの立体異性体のゼアキサンチンと関連して、活性酸素分解酵素（ＳＯＤ）およびＳＯＤ模倣体等を含む群から選択された酵素を含む組成物に関する。また、そのような組成物を含む部分のキットも含む。そのキットは前記酵素を含む第１部と、ルテインおよび少なくとも１つのゼアキサンチン異性体を含む第２部とを含む。この引例は、前記組成物または部分のキットは、機能性食品、栄養補給食品組成物、または食物補助食品もしくは栄養補助食品、薬剤、または医薬組成物、または獣医製品に含まれてもよい。薬剤または医薬組成物を必要とする患者に投与することにより、酸化的ストレスに関連した眼の疾患、症状、および／または不調を治療し、予防し、および／または安定化させることにも関連する。しかし、この引例は、ゼアキサンチン異性体の使用には関連しない。
【００２３】
ＷＯ２０１００３２２６７Ａは、糖尿病および関連する合併症の予防および治療のための、選択されたインドの薬草からの抽出物を含む薬草の製剤に関する。この引例は、糖尿病関連合併症のための関連する異なる製剤に関し、臨床的要件（例えば、腎臓の健康を向上させる、腎臓の疾患を予防する、糖尿病性網膜症を予防する、および／または心臓血管および／または血管への酸化的損傷の予防および治療）において、個々に有用である。この製剤は用途が広く、抽出物／濃縮物へ加工されてもよく、さらに、錠剤またはカプセル剤または顆粒剤またはシロップ剤または薬草健康ドリンクまたは吸入可能な医薬製剤または眼球製剤または経皮吸収可能な製剤（例えば、軟膏剤／ゲル剤）または注射可能な薬剤へ医薬的に変更させてもよい。これは、ポリ薬草製剤であり、クレームをサポートする相乗効果的データは存在しない。
【００２４】
ＣＮ１０２１７８９２５Ａは、視力を保護するためのルテイン眼科製剤に関する。この製剤は、以下の原料から製造される：５〜１３部の水溶性ルテイン（Ｃ４ｏＨ５６Ｏ２に基づく）、５０〜８０部のタウリン、０．１〜０．５部のセレン（Ｓｅに基づく）、１０〜２５部の亜鉛（Ｚｎに基づく）、０．５〜１．０部の水溶性ビタミンＡ、および０．８〜２．０部のグルタチオン；希釈材、湿潤剤、等浸透圧調整剤、保存剤、抗酸化剤、および注入のための水からなる補助剤；剤形は、点眼剤、眼ローション剤等である；そのルテイン眼科製剤は、近視、遠視、白内障、緑内障、網膜の色素変性、黄斑変性症等の眼疾患に適する。様々な栄養因子が、合理的に相性がよく、ブランクのルテイン外部製剤が、満たされ、バイオアベイラビリティおよび健康管理効果が、明白に向上し；３００，０００人の人に実際に適用したところ、近視、白内障および糖尿病性眼疾患についての全有効率は、９０％を超え、ルテイン眼科製剤は、有益な促進値を有する。この眼科製剤は、１つの黄斑カロチノイド、すなわち、ルテインのみを含有し、ゼアキサンチン異性体の使用には言及していない。
【００２５】
佐々木らにおいて（IOVS, March 2009, Vol. 50, No. 3）、この研究の目的は、マウスエンドトキシン誘導ブドウ膜炎（ＥＩＵ）モデルを使用して、炎症により生じたルテインの網膜の神経損傷に対する神経護的な効果を調べるものである。ＥＩＵは、リポ多糖類（ＬＰＳ）の腹腔内注射により誘導された。各動物は、ルテインまたは賦形剤を３回、皮下注入した：ＬＰＳ注入と同時に、ＬＰＳ注入の３時間前に、ＬＰＳ注入の後に。分析をＥＩＵ誘導後２４時間行った。ロドプシンタンパク質およびシグナル伝達物質および転写３（ＳＴＡＴ３）活性化の活性剤のレベルを免疫ブロット法により分析した。光受容体細胞の外側部の長さを測定した。暗順応させた全フィールド網膜電図を記録した。網膜における酸化的ストレスを、ジヒドロエチジウムおよび蛍光プローブにより分析した。グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現は、免疫組織化学的に示された。ロドプシン発現におけるＥＩＵ−誘導減少、次いで、外側部の短縮、および波振幅における低減は、ルテイン治療により防止できた。ＳＴＡＴ３活性化、炎症サイトカインシグナルの顆粒、および反応性酸素種（ＲＯＳ）のレベルは、両方ともＥＩＵの間に上部へ調節されるが、ルテインにより低減した。ミュラーグリア細胞の病理学的変化は、ＧＦＡＰ発現により表されるが、ルテインによっても予防される。現在のデータは、抗酸化剤ルテインが、ＥＩＵの間、神経保護的であり、炎症の間の網膜神経損傷を抑制する可能性あるアプローチを示唆することを示している。ルテインは、栄養的補助食品であり、どのような疾患の予防または治療のために日々の用量を摂取するように付してもよい。この研究において、ルテインは、注入により投与された。注入によるルテインの日々の補給は、患者に不快を生じて苦痛である。
【００２６】
ＣＡ２７６０９３２Ａ１は、様々な治療薬を運搬する眼科剤形に関し、長期にわたって患者に投与される、ラパマイシン（シロリムス）、その類似体（ｒａｐａｌｏｇｓ）またはラパマイシンの他の哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤を含むが、これに限定されない。眼科剤形は、眼球内投与もしくは眼周囲の投与、または、患者において疾患の部位または治療されるべき症状の近くの場所を含むがこれに限定されず、患者の水性媒体中に配置される。方法は、患者における加齢に伴う黄斑変性症、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、ドライアイまたは過透過性疾患を治療または予防するのに、治療薬を投与するのに用いてもよい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Thurnham DL. 「カロチノイド:機能と虚偽」、Proc Nutr Soc 1994; 53: 77-87
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
［要約］
眼の特定領域への治療剤／予防薬を運搬する困難さを克服することは、大部分の眼疾患の治療への大きな課題を提起する。脂溶性栄養素の乏しいバイオアベイラビリティのため、多くの重要かもしれない治療薬／予防薬を眼に運搬することが妨げられる。
【００２９】
上記より、糖尿病性眼合併症のための治療薬／予防薬を、たとえ少ない用量レベルでさえも運搬することの困難さを克服しうる技術を提供することが望まれていることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
脂溶性栄養素の分子分散が提供され、これは、糖尿病の眼関連合併症の進行と成熟を遅延させるのに有用であり、これはヒトの食物摂取について安全であり、栄養摂取のための栄養補助食品および健康促進への貢献として、特に有用である。
【００３１】
ある実施形態において、脂溶性栄養素（例えば、クルクミンまたはトランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体、すなわち（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンまたはトランス−ルテインおよび（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチン）の固形または液状の親水性担体中の分子分散が提供され、キサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導され、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させるのに有用である。
【００３２】
ある実施形態において、組成物の分子分散が提供され、それは、少なくとも８０重量％の全キサントフィルを含み、そのうち、トランス−ルテイン含有量が８０〜９５％ｗ／ｗ；（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンが１４〜２０％ｗ／ｗ；（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンが０．０１〜１％ｗ／ｗまたはトランス−ルテイン含有量が８０〜９５％ｗ／ｗ；（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンが１４〜２０％ｗ／ｗであり、キサントフィル／キサントフィルエステルまたは５〜９５％のクルクミノイドを含むクルクミンを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された、少量の他のカロチノイドを含む。
【００３３】
ある実施形態において、固形のまたは液状の親水性担体中に、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体、すなわち、（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチン、またはトランス−ルテインおよび（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンを含むキサントフィル組成物の分子分散が提供され、前記組成物は、遊離型キサントフィルよりさらに強く抗酸化作用を有し、糖尿病の眼関連合併の進行と成熟を遅延させるのに有用である。
【００３４】
ある実施形態において、固形または液状の親水性担体中に含むクルクミン組成物の分子分散が提供され、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させるのに有用である。
【００３５】
ある実施形態において、脂溶性栄養素の分子分散が提供され、脂溶性栄養素の組織中のレベルの増加を生じるバイオアベイラビリティを増強するミセル形成について非常に有効であり、その中でこれらの分子分散は、比較的低い濃度で有効であり、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させるのに有用である。
【００３６】
ある実施形態において、脂溶性栄養素の固形または液状の親水性担体中での分子分散を提供し、それは、より高いバイオアベイラビリティを有する。
【００３７】
ある実施形態において、安全な溶媒（ＧＲＡＳ）を用いて調製された脂溶性栄養素の分子分散は、ヒトの食物摂取に適し、溶媒残留が最小限である。
【００３８】
ここにおいて前記組成物および／または方法の更なる利点は、次の明細書を考慮することにより、明らかになるであろう。
【００３９】
ここに以下に説明する製品、組成物および／または方法の有用性は、実施例において説明され、どのような方法においても本発明の新しい考えの範囲を限定するのに解釈されるべきではない。
【００４０】
ここの方法は、脂溶性栄養素を含む組成物を投与することによる、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させることに関する。より詳細には、ここの方法は、ルテインおよびその異性体、ルテインエステル、ゼアキサンチン異性体、ウコン抽出物、および／またはクルクミンもしくはクルクミノイドを含み、キサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導され、これらは、ヒトの食物摂取について安全であり、栄養摂取のための栄養補助食品および健康促進への貢献として特に有用である組成物を投与することにより、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させることに関する。
【００４１】
ここでの分子分散は、粉剤、錠剤、カプセル剤、小袋、ビーズ状剤、マイクロカプセル化粉剤、油懸濁液、分散液（Liquid dispersions）、ペレット剤、軟質ゲルカプセル剤、チュアブル錠または液体製剤の形態である。
【００４２】
ここでのトランス−ルテインおよびゼアキサンチンの異性体、すなわち、（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチン、またはトランス−ルテインおよび（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチン、ならびに／またはクルクミノイドを含むクルクミンの固形または液状の親水性担体中の分子分散は、向上した水溶解性とバイオアベイラビリティを有し、この分子を有効に運搬するのを促進し、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延する可能性を示す。糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させるために向上したバイオアベイラビリティを有する高度に水溶性な形態で、より高い抗酸化可能性を有するカロチノイド、すなわち、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体の使用は、以前の文献には報告されていない。
【００４３】
ある実施形態において、ここの組成物は、親水性の液体および固体の担体の分子分散である。ある実施形態において、ここの組成物を製造する方法は、それらを親水性の液体および固体の担体の分子分散に入れることを含み、これにより、その特徴は、飲料または柔ゼラチンカプセル剤またはリキャップ（ｌｉｃａｐｓ）として、さらに製剤化されるのに有益である栄養素の水溶解性を向上させる。
【００４４】
いくつかの実施形態におけるここでの組成物は、
（ａ）安定剤，
（ｂ）水溶性親水性担体、および
（ｃ）任意に界面活性剤
を含む脂溶性栄養素の水溶性、分子分散を含み、
油性栄養素を粉剤、錠剤、カプセル剤、軟膏剤、ペースト剤、ローション剤、塗布薬、口内洗浄液、小袋、うがい液へ変換するのに有用であり、かつ、飲料へ取り込ませるのに適する。
【００４５】
ある実施形態において、ここの組成物は、脂溶性栄養素（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、ベータカロテンおよびリコピン）の水溶性の液体または固体の親水性担体中でのさらさらな水溶性分子分散であり、これは、飲料もしくは柔ゼラチンカプセル剤として、またはリキャップとして、製剤化することができる。
【００４６】
ある実施形態において、飲料もしくは柔ゼラチンカプセル剤として、またはリキャップとして、製剤化することができる、脂溶性栄養素（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、ベータカロテンおよびリコピン）の水溶性の液体または固体の親水性担体中でのさらさらな水溶性分子分散の製造方法が提供される。
【００４７】
ある実施形態において、極性または非極性の有機溶媒中の脂溶性栄養素の溶液は、特定の水溶性親水性の液体または  固体の担体システム中に分散しうる。真空下で溶媒を除去し、生じた分散は、軟質ゲルカプセル剤へまたは、リキャップへ充填するのに適する均質の液体または固体分散として、維持される。そのような液体または固体の分散は、カプセル剤へ充填するのに、または、顆粒剤、錠剤を製造するのに、小袋へ充填するのに、または飲料を製造するのに適する。
【００４８】
ある実施形態において、ここの組成物は、脂溶性栄養素（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、ベータカロテンおよびリコピン）の水溶性親水性の液体または固体の担体中のさらさらな水溶性分子分散であり、これらは、柔ゼラチンカプセル剤、リキャップ、軟膏剤、ペースト剤、ローション剤、塗布薬、口内洗浄液、うがい液等に変換するのに有用であり、飲料に取り込まれるのにも適している。
【００４９】
ある実施形態において、方法が、水溶性親水性の液体または  固体の担体中の脂溶性栄養素のさらさらの水溶性分子分散の製造のために提供される。これらは、柔ゼラチンカプセル剤、リキャップ、軟膏剤、ペースト剤、ローション剤、塗布薬、口内洗浄液、うがい液等に変換するのに有用であり、飲料に取り込まれるのにも適している。
前記方法は、以下を含む：
（ｉ）脂溶性栄養素を非極性または極性の溶媒またはその混合物に溶解させて溶液を形成し；
（ｉｉ）前記生じた溶液をろ過して、不溶性不純物を除去し；
（ｉｉｉ）別に、前記水溶性親水性の液体または固体の担体、安定剤および任意に界面活性剤を、極性溶媒中に溶解させ、透明溶液を形成し；
（ｉｖ）工程（ｉ）で得られた溶液を、工程（ｉｉｉ）で得られた溶液と混合させ；
（ｖ）生じた混合物を５００〜７６０ｍｍＨｇの範囲の圧力で２０〜４５℃で加熱して溶媒を除去し；
（ｖｉ）生じた分子分散を室温まで冷却し；および
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られた冷却された分子分散を、適切なメッシュサイズの篩に通して、凝集体または塊を除去して、脂溶性栄養素のさらさらな水溶性または固体分散を製造する。
【００５０】
用語「脂溶性」は、脂質様を指すが、通常、水溶性に乏しい化合物すべてをカバーする。従って、この用語の範囲には、水溶性に乏しいアミノ酸、タンパク質、  無機物、ハーブ抽出物（例えばクルクミン）、炭化水素、アルカロイドフラボノイドおよび配糖体を含む。
【００５１】
用いられ得る脂溶性栄養素には、ルテイン、ルテインエステル、ゼアキサンチン異性体、リコピン、ベータカロテン、トコフェロール、アスタキサンチン、オメガ−３  脂肪酸、ユビキノン、植物ステロール、レシチンおよびその混合物を含むが、これに限定されない。
【００５２】
分散溶液を形成するのに用いられる水溶性親水性の液体または  固体の担体には、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、グルコースシロップ、コーン浸出液、マンニトール、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール１００００、ポリエチレングリコール２００００、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、グルコース、塩化ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、可溶性デンプン、加水分解デンプンおよびその混合物を含んでもよい。
【００５３】
ある実施形態において、脂溶性栄養素の溶液を製造するのに用いられる溶媒は、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、エタノール、ジクロロメタン、メタノール等から選択されてもよく、より好ましくはアセトン、エタノール、ジクロロメタン、イソプロピルアルコールから選択され、より好ましくはジクロロメタンおよびイソプロピルアルコールである。
【００５４】
本方法において用いることができる安定剤は、アスコルビン酸、ＢＨＡ、ＢＨＴ、パルミチン酸アスコルビル、ローズマリー抽出物、混合天然トコフェロール、アルファ酢酸トコフェロール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒマシ油誘導体、ラウリル硫酸ナトリウムおよびその混合物から選択してもよい。
【００５５】
本方法において用いることができる界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウムおよびその混合物から選択してもよい。
【００５６】
栄養素分散中に存在する溶媒を蒸発させるための真空下での加熱工程は、３５〜４５℃の範囲で行われるのが好ましい。
【００５７】
ある実施形態において、前記脂溶性栄養素は、水溶性親水性の液体または固体の担体中に分子レベルで分散され、その結果、その溶解性と、その結果、そのバイオアベイラビリティは、数倍にも増強される。親水性の液体または固体の担体中の分散する親水性栄養素中で、前記栄養素の生じた分散は、著しく高い溶解性とバイオアベイラビリティを有する。さらに、前記脂溶性栄養素を親水性の液体または  固体の担体中に分散させることにより、脂溶性栄養素を例えば硬ゼラチンカプセル剤および柔ゼラチンカプセル剤の形態に形成するのに役立つ。
【００５８】
分子分散を達成するために、前記脂溶性栄養素は、極性または非極性の溶媒に溶解される必要がある。前記脂溶性栄養素の化学的性質に応じて、極性溶媒もしくは非極性溶媒または極性溶媒と非極性溶媒の混合物を用いてもよい。必要であれば、前記脂溶性栄養素と前記溶媒の混合物を、温めて、溶解の速度を増強させてもよい。非常にしばしば、前記脂溶性栄養素は、さらなる期間の間、溶解を完全にするために攪拌が必要とされる。完全に溶解させるために、生じた溶液をろ材に通して、ろ液のみを分子分散に用いる必要がある。もし溶液の粘度が高い場合、溶解に持ちる溶媒でさらに希釈してもよい、その結果、ろ過工程をより速く行うことができる。
【００５９】
前記親水性（水溶性）担体は、適切な極性溶媒（例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メタノール、プロピレングリコールおよび／または水）中に溶解させ、透明な溶液を形成する。分散に用いられる前記親水性水溶性担体は、安定剤と混合してもよく、任意に界面活性剤と混合してもよい。必要であれば、前記安定剤は、前記親水性担体と混合する前に、溶媒中に溶解させる必要がある。生じた混合物が、透明な溶液ではない場合、その溶液はろ過して、残渣を廃棄してもよい。
【００６０】
前記脂溶性栄養素の分散は、その後、前記親水性の液体または固体の担体と混合して、均質の塊を得てもよい。この目的のため、単純な磁性攪拌機または電気的に操作される攪拌機を用いてもよい。混合は、液体−液体のホモジナイザーまたは乳化剤を用いて行ってもよい。生じた混合物の粘度に応じて、均質塊を得るのに必要な時間は、１５分から１時間の範囲であってもよい。大気酸化に敏感な栄養素については、混合工程は、不活性雰囲気下または、抗酸化安定剤の存在したに行ってもよい。
【００６１】
消化管中でより速い溶解が要求される栄養素について、任意に食品等級の界面活性剤を取り込んで、前記脂溶性栄養素の溶解性と、そのバイオアベイラビリティを増強してもよい。
【００６２】
前記のようにして得られた均質の塊は、その後、減圧したで加熱する工程に付される。大部分の前記脂溶性栄養素は、熱、光、酸素に敏感であるため、そのような低温での加熱、好ましくは４５℃を超えない温度での加熱を行う必要があるかもしれない。窒素またはアルゴンのような不活性ガスを用いた不活性雰囲気中で加熱することも好ましい。加熱方法は、生じた分散が前記溶媒の２５ｐｐｍより少なくなるまで続けられる。
【００６３】
２５ｐｐｍ未満に溶媒残渣が減ったことを確認した後、生じた分子分散は、室温まで冷却し、その後、１００メッシュ篩に通して、凝集体または塊を除去する。均質の物は、その後、ろ過して、適切な容器中に詰める。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、ＳＴＺ−誘導糖尿病ラットにおける血漿グルコースを絶食することに対する治療効果のグラフを示す。
【図２】図２は、治療によるラットにおける糖尿病性白内障の遅延に関するグラフを示す。
【図３】図３は、水晶体タンパク質の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。
【図４】図４は、水晶体タンパク質可溶性画分のサイズ排除クロマトグラフィーに関するグラフを示す。
【図５】図５は、水晶体ソルビトールの蛍光分光（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｅｍｅｔｒｉｃ）測定に関するグラフを示す。
【図６】図６は、血漿ルテインレベルのＨＰＬＣ測定に関するグラフを示す。
【図７】図７は、異なる群と全振幅からの律動様小波（ＯＰｓ）の代表的な波形を示す。
【図８】図８は、網膜の代表的な組織構造を示す。
【図９】図９は、リアルタイムＰＣＲ（Ａ）によるロドプシンの発現および免疫組織化学（Ｂ）を示す。
【図１０】図１０は、リアルタイムＰＣＲ（Ａ）によるＮＧＦの発現および免疫組織化学（Ｂ）を示す。
【図１１】図１１は、免疫ブロット法によるＶＥＧＦの発現を示す。
【図１２】図１２は、免疫組織化学によるＰＤＧＦの発現を示す。
【図１３】図１３は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された血清ルテインレベルを示す。
【図１４】図１４は、異なる群と全振幅の個々の動物からのＯＰｓの代表的な波形を示す。
【図１５】図１５は、網膜の代表的な組織構造を示す。
【図１６】図１６は、リアルタイムＰＣＲ（Ａ）によるロドプシンの発現および免疫組織化学（Ｂ）を示す。
【図１７】図１７は、リアルタイムＰＣＲ（Ａ）によるＮＧＦの発現および免疫組織化学（Ｂ）を示す。
【図１８】図１８は、免疫ブロット法によるＶＥＧＦの発現を示す。
【図１９】図１９は、免疫組織化学化学（histochemistochemistry）によるＰＤＧＦの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
［詳細な説明］
真性糖尿病は、さまざまな眼の問題を引き起こし、最も一般的なものは糖尿病性網膜症（ＤＲ）および糖尿病性白内障であり、これらは、失明の最も一般的な原因である。抗酸化剤化合物は、多くのヒトの病気（例えば、加齢に伴う黄斑変性症、白内障、糖尿病性眼合併症および様々な他の疾患）の予防において高い抗酸化能を有すると考えられる。
【００６６】
ルテインは、ホウレンソウのような緑色葉野菜において見出された自然由来の抗酸化剤である。ルテインは、また、黄斑に主に存在し眼においても見られる。ルテインはカロチノイドであり、強力な抗酸化剤であることがよく知られている。それは、白内障および、加齢に伴う変性疾患である黄斑変性症を治療するのに用いられてきた。ルテインは、ヒトＨｅｐＧ２細胞株において、保護的な抗酸化活性も示している。
【００６７】
ゼアキサンチンは、天然において最も一般的に見られるカロチノイドアルコールの一つである。ルテインおよびゼアキサンチンは、同一の化学式を有し、異性体であるが、これらは、立体異性体ではない。これらの唯一の相違は、末端の環の一つにおける二重結合の位置にある。この相違点により、ルテインには３つの不斉中心を生じるが、ゼアキサンチンは２つしかない。対称性のため、（３Ｒ，３'Ｓ）および（３Ｓ，３'Ｒ）の立体異性体のゼアキサンチンは同一である。従って、ゼアキサンチンは３つのみの立体異性体を有する。（３Ｒ，３'Ｓ）立体異性体は、ｍｅｓｏ−ゼアキサンチンと呼ばれる。
【００６８】
ルテインおよびゼアキサンチンの共役二重結合は、各色素の独特の色に寄与し、一重項酸素をクエンチするこれらの能力にも影響がある。余分な共役二重結合のため、ゼアキサンチンは、ルテインと比べてより強い抗酸化剤であると考えられている。ルテインとゼアキサンチン異性体の複合体は、遊離のキサントフィルより良い抗酸化剤として作用し、酸化的損傷からの保護を向上させることが、示されている。
【００６９】
クルクミン、ウコンからの黄色色素は、ターメリックの主成分であり、スパイスおよび食品着色料として通常用いられる。これはまた、化粧品として、かつある医薬製品においても用いられる。クルクミンの所望な防止または推測の治療的特性も、その抗酸化特性および抗炎症性特性とも関連がある。クルクミンは、様々な慢性病理学的合併症（例えば、癌、アテローム性動脈硬化、および神経変性病）に対する極めて重要な役割を果たしていると考えられる。
【００７０】
脂溶性栄養素は、（現在用いられている形態である）油懸濁液またはビーズ状剤として投与された際、吸収されにくい。低吸収性の主な理由は、水中の低い溶解性である。これらの不溶性のため、これらのバイオアベイラビリティは非常に乏しい。分子レベルでの栄養製品の分散により、水中での栄養素のミセル形成により高い性能が得られ、そのため、バイオアベイラビリティが増加する。
【００７１】
ここに脂溶性栄養素の組成物は、少なくとも８０重量％の全キサントフィルを含み、そのうち、トランス−ルテイン含有量は、８０〜９５％ｗ／ｗであり；（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンは、１４〜２０％ｗ／ｗであり；（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンは、０．０１〜１％ｗ／ｗであり、またはトランス−ルテイン含有量は、８０〜９５％ｗ／ｗであり；（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンは、１４〜２０％ｗ／ｗであり、キサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された他のカロチノイドを微量；または高度に水溶性形態の５〜９５％のクルクミノイドを含むクルクミンを含み、糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させるのに向上したバイオアベイラビリティを有する。
【００７２】
ここに組成物は、脂溶性栄養素；安定剤；水溶性親水性担体；および任意に界面活性剤を含む。
【００７３】
ここに組成物は、少なくとも８０重量％の全キサントフィルをふくみ、そのうち、トランス−ルテイン含有量は、８０〜９５％ｗ／ｗであり；（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンは、１４〜２０％ｗ／ｗであり；（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンは、０．０１〜１％ｗ／ｗであり、または、トランス−ルテイン含有量は、８０〜９５％ｗ／ｗであり；（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンは、１４〜２０％ｗ／ｗであり、キサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された他のカロチノイドを微量、または５〜９５％のクルクミノイドを含むクルクミンを含む。
【００７４】
用いられる安定剤は、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、パルミチン酸アスコルビル、ローズマリー抽出物、混合天然トコフェロール、アルファ酢酸トコフェロール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒマシ油誘導体、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物から選択される。
【００７５】
用いられる担体は、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、グルコースシロップ、コーン浸出液、マンニトール、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール１００００、ポリエチレングリコール２００００、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、グルコース、塩化ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、可溶性デンプン、加水分解デンプン、およびこれらの混合物から選択される。
【００７６】
界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、レシチン、スクロース脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物から選択される。
【００７７】
ラットでの研究を行って、糖尿病性眼合併症における脂溶性栄養素の活性を４つのサンプル、すなわち（ｖｉｚ）、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体（ＵｌｔｒａＳｏｌ  Ｌｕｔｅｍａｘ２０２０（登録商標）の商標名で販売されている）の水溶性組成物；トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体（Ｌｕｔｅｍａｘ２０２０（登録商標）の商標名で販売されている）を含む濃縮物；およびクルクミン（ＵｌｔｒａＳｏｌ  ＣｕｒｃｕＷｉｎ（登録商標）の商標名で販売されている）およびクルクミン粉剤を含む水溶性組成物で試験した。
【００７８】
ある実施形態において、ここの前記組成物は、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンを含む、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体の黄斑色素を含むキサントフィル組成物を含む。
【００７９】
ある実施形態において、キサントフィル組成物は、少なくとも８０重量％の全キサントフィルを含み、そのうちトランス−ルテイン含有量は、少なくとも８０重量％であり、残りは、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンを含む、ゼアキサンチン異性体である。
【００８０】
ある実施形態において、キサントフィル組成物は、少なくとも８５重量％の全キサントフィルを含み、そのうちトランス−ルテイン含有量は、少なくとも８５重量％であり、残りは、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンを含む、ゼアキサンチン異性体である。
【００８１】
ある実施形態において、キサントフィル組成物は、少なくとも８５重量％の全キサントフィルをふくみ、そのうち少なくとも８０重量％は、トランス−ルテインであり、少なくとも６重量％は、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンであり、少なくとも６重量％は、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンである。
【００８２】
ある実施形態において、キサントフィル組成物は、少なくとも８５重量％のトランス−ルテインと、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された少なくとも４重量％（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンと、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された少なくとも５重量％の（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンを含む。
【００８３】
ある実施形態において、キサントフィル組成物は、少なくとも８５重量％の全キサントフィルをふくみ、そのうち、少なくとも８０重量％は、トランス−ルテインであり、残り１５重量％は、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンを含む、ゼアキサンチン異性体である。
【００８４】
ある実施形態において、トランス−ルテイン、ゼアキサンチン異性体、すなわちヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンからなる黄斑色素を含むキサントフィル組成物の製造方法であり、
その方法において、
ａ）植物の抽出物／オレオレジン中に存在するキサントフィルエステルを、脱エステル化形態へ変換するケン化工程は、ルテインの限定された異性化と組み合わせて、より大量のトランス−ルテインを含み、残りはヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンを含むゼアキサンチン異性体であるキサントフィル組成物を製造してもよい。；
ｂ）ケン化工程において、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムは、水の添加無しで１−プロパノール中に溶解することができる；
ｃ）前記ケン化／異性化の温度は、７０〜１００℃の間であり、好ましくは９５℃付近であり、ケン化の長さは１〜２時間であってもよい；および
ｄ）この方法において用いる酢酸エチルは、回収され、必要ならば利用される。これにより、この方法は安価である。
【００８５】
ある実施形態において、キサントフィル組成物は、トランス−ルテインの黄斑色素、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンを含む、ゼアキサンチン異性体を含み、少なくとも８０重量％は、全キサントフィルであり、そのトランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体の比は、４：１から６：１の範囲であり、ゼアキサンチンの異性体の比は、８０：２０から２０：８０の範囲である。ある実施形態において、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体の比は、約５：１である。
【００８６】
ある実施形態において、キサントフィル組成物は、少なくとも８５重量％の全キサントフィルを含み、そのうち、トランス−ルテイン含有量は、少なくとも８５％であり、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体の比は、４：１から６：１の範囲であり、ゼアキサンチンの異性体の比は、８０〜２０：２０〜８０の範囲である。
【００８７】
ある実施形態において、トランス−ルテインおよび、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ、栄養摂取および健康管理のために有用なキサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンおよび（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンを含む、ゼアキサンチン異性体の黄斑色素を含むキサントフィル組成物の製造方法は、以下の工程を含む：
（ａ）キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジン中に存在するキサントフィルエステルを、前記抽出物／オレオレジンを１−プロパノールのアルカリ溶液（アルカリと１−プロパノールの比は、１：０．５〜１：１重量／容量の範囲）と混合し、生じた物を７０〜１００℃の範囲の温度で、好ましくは９５℃で、１〜５時間の間、加熱し、ケン化／異性化された粗濃縮物を得ることにより、ケン化および同時に部分的に異性化する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた生じたケン化／異性化された粗濃縮物を水と混合し（前記濃縮物と用いた水の比は、１：２から１：３容量／容量の比）、希釈された油性混合物を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた前記希釈された油性混合物を酢酸エチルで抽出し（希釈された油性混合物と用いた酢酸エチルの比は、１：１．５から１：２容量／容量の範囲）、キサントフィル  組成物を含む抽出物を得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記組成物を蒸発させて酢酸エチルを除去する工程；
（ｅ）工程（ｄ）から生じた前記組成物を、まず非極性溶媒で、次いで極性溶媒で洗浄し、ろ過することにより精製する工程；
（ｆ）生じた組成物を４０から４５℃の温度で４８〜７２時間の間、真空下で乾燥する工程；
（ｇ）所望であれば、工程（ｃ）で用いた酢酸エチルを、通常の方法により回収し、必要であれば再利用する工程；および
（ｈ）所望であれば、生じた組成物を不活性雰囲気中で−２０℃で保管する工程。
【００８８】
温度、時間、行程（ａ）におけるアルカリの量、工程（ｂ）と（ｃ）における比を調節することにより、所望の組成物を得ることができる。
【００８９】
葉物野菜および青野菜、トウモロコシ、果実ならびに/またはマリーゴールドは、キサントフィルオレオレジンの供給源として用いてもよいことに注意すべきである。しかしながら、大部分の果実において大量のクロロフィルおよび他の望ましくないカロチノイドと関連して遊離型ゼアキサンチンと共に存在することを考慮すると、本発明によれば、葉物野菜および青野菜、トウモロコシ、果実の使用が可能であり、上記材料においてはルテインおよびゼアキサンチンの濃度が低いことを考慮し、経済的ではない複雑な精製工程が必要であるため、マリーゴールドは、本発明の前記組成物の製造について、出発原料として好ましい選択肢である。
【００９０】
詳細には、ヘキサン 抽出により製造された市販の食品等級マリーゴールドオレオレジンは、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体を含むキサントフィル 組成物の製造について、出発物質として用いることができる、(Kumarら、キサントフィル結晶の製造方法、米国特許第6,743,953号、2004 ;Kumar 米国特許第6,737,535号、2004)。
【００９１】
マリーゴールド花(Tagetes erecta、テーゲィテス・エレクタ)は、ルテインモノエステルおよびジエステルを主なカロチノイド構成成分として含むため、トランス−ルテインについて、最も可能な市販の入手源と考えられている。
【００９２】
工程（ａ）において用いられるアルカリは、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムから選択されてもよい。
【００９３】
工程（ｄ）において用いられる非極性溶媒は、ペンタン、ヘキサンおよびヘプタン等から選択されてもよく、ヘキサンが好ましい炭化水素溶媒であってもよい。工程（ｅ）で用いられる極性溶媒は、低級脂肪族アルコールから選択されてもよい。
【００９４】
生じた組成物を保管するのに用いられる不活性雰囲気は、窒素等の維持された不活性ガスであってもよい。
【００９５】
ある実施形態において、キサントフィルエステルを含む抽出物は、すでにアルカリが溶解された1-プロパノールと混合される。アルカリの1-プロパノールおよび前記植物の抽出物への割合は、それぞれ0.5〜1:0.5〜1.0および1.0である。前記混合物を９０℃の温度まで加熱し、攪拌しながら１〜５時間維持する。前記反応混合物中の前記全キサントフィルは、分光光度分析(AOAC-16版方法970.64)により決定し、同じサンプルのHPLC分析によりトランス−ルテインおよびゼアキサンチンの割合を決定した(Haddenら, J.Agric.Food.Chem, 47, 4189-494, 1999)。
【００９６】
抽出物/オレオレジンのケン化により、脂肪酸のアルカリ塩と共に、遊離型のキサントフィルの遊離が生じる。異性化反応により、マリーゴールドからのルテインの一部は、（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンへ変換される。ルテインのゼアキサンチン異性体への異性化は、アルカリ：溶媒比、温度、期間のような方法パラメータを変えることにより、変化させることができる。反応混合物中のキサントフィルの前記組成物は、ヘキサン：アセトン：エタノール：トルエン（１０：７：６：７  ｖ／ｖ）へ抽出し、ヘキサンおよび１０％の硫酸ナトリウム溶液を次いで添加し、ＨＰＬＣにより上層を分析することにより、分析する。
【００９７】
所望の程度の異性化と、典型的には約８５％のトランス−ルテイン含有量を有するキサントフィル組成物を得た後、その反応混合物を水で希釈し、室温でよく攪拌して脂肪酸、石鹸および不純物と関連して遊離型キサントフィルを含む黄色油性層を得る。
【００９８】
この油性層を分液漏斗へ移し、酢酸エチルを添加して、キサントフィルを抽出する。酢酸エチル層を二度、等容量の脱イオン水で洗浄する。従って、脂肪酸と石鹸様材料を水へ除去し、これは廃棄する。酢酸エチル抽出物は、減圧下に前記溶媒を蒸発除去することにより濃縮して、粗キサントフィル濃縮物を得る。
【００９９】
前記キサントフィル濃縮物組成物は、室温で１時間、ヘキサンを用いて激しく攪拌することにより精製に付し、次いでろ過する。このキサントフィル塊は、さらにエタノールで洗浄し、生じた橙色結晶を真空下室温で７２時間乾燥する。
【０１００】
ある実施形態において、前記組成物は、向上したバイオアベイラビリティを有する水溶性組成物であり、クルクミン、少なくとも抗酸化剤、親水性担体および脂質の相乗的な組み合わせを含む。
【０１０１】
ある実施形態において、前記クルクミン組成物の製造方法は、クルクミン、少なくとも１つの抗酸化剤、親水性担体および脂質を溶媒中に溶解させて均質のものを製造する工程;生じたものを２５℃から６０℃の範囲の温度で４〜８時間温め、乾湿物を得る工程;蒸発により溶媒を除去し、乾燥物を形成し、前記乾燥物を粉砕して細粉剤を形成する工程を含む。
【０１０２】
ある実施形態において、水溶性組成物は、向上したバイオアベイラビリティを有し、経口的に投与可能なクルクミンを含む。
【０１０３】
ある実施形態において、水溶性組成物は、向上したバイオアベイラビリティを有し、著しい副作用無にヒトの食物摂取により安全なクルクミンを含む。
【０１０４】
ある実施形態において、向上したバイオアベイラビリティを有する水溶性組成物の製造のため、方法を説明する。
【０１０５】
ある実施形態において、水溶性組成物は、向上したバイオアベイラビリティを有し、クルクミン、少なくとも抗酸化剤、親水性担体および脂質の相乗的な組み合わせを含む。
【０１０６】
ある実施形態において、向上したバイオアベイラビリティを有する新規水溶性組成物の製造方法は、
(i)クルクミン、少なくとも１つの抗酸化剤、親水性担体および脂質を溶媒中に溶解させ、均質のものを形成する工程;
(ii）生じたものを２５℃から６０℃の範囲の温度で４時間から８時間の間、温め、乾湿物を得る工程;
(iii)前記溶媒を蒸発により除去して乾燥物を形成する工程、および
(iv)前記乾燥物を粉砕して細粉剤を形成する工程を含む。
【０１０７】
工程(i)で用いるクルクミンは、８５〜９６％の範囲の分析を有する市販のものであってもよい。クルクミンにおけるターメリック豊富な抽出物であってもよい。添加するクルクミンの量は、１〜５５％のクルクミンの分析を有する水溶性クルクミンを製造するのに十分な量であってもよい。
【０１０８】
工程（ｉ）で用いる抗酸化剤は、天然のトコフェロール、パルミチン酸アスコルビル、ローズマリー抽出物、エピガロカテキン没食子酸塩、カテキン、アスコルビン酸およびこれらの混合物から選択してもよい。用いられる抗酸化剤の量は、１~１０％の範囲であってもよい。
【０１０９】
工程(i)で用いられる親水性担体は、可溶性デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール200-20000、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、グルコース、糖およびこれらの混合物から選択してもよい。添加する親水性担体の量は、１０~９０％の範囲であってもよい。
【０１１０】
工程(i)で用いられる脂質は、ミルク脂質、中鎖脂肪酸トリグリセリド、長鎖脂肪酸トリグリセリド、硬化植物油およびこれらの混合物から選択してもよい。用いる脂質の量は、１~２５％の範囲であってもよい。
【０１１１】
工程（ｉ）において用いられる溶媒は、イソプロピルアルコール、アセトン、メタノール、アルコールおよびこれらの混合物から選択してもよい。均質のものを得るために維持された温度は、室温から７０℃の範囲、好ましくは２５℃から６０℃の範囲であってもよい。
【０１１２】
工程（ｉｉ）における溶媒の除去は、真空蒸留もしくは蒸発技術において、または噴霧乾燥法によって行われてもよい。生じた乾燥物は、臼と杵、ミキサー-グラインダー、マルチ-ミル、ボールミル、ジェット・ミル等を用いて粉砕される。
【０１１３】
クルクミンの有益な効果は、よく知られている。しかしながら、経口形態で投与される場合、クルクミンのバイオアベイラビリティに関連する多くの問題が存在する。摂取されたクルクミンの大部分は、糞便により排泄され、非代謝され、吸収された少量の部分は、他の代謝産物に変換され、排泄される。クルクミンは、消化管に容易には浸透せず、肝臓および他の腸管の酵素に付される。これらの酵素のため、身体内のクルクミンは、すばやく代謝され、従って身体におけるバイオアベイラビリティを減じる。血流に入った少量のクルクミンは、肝臓および腎臓により迅速に代謝される。したがって、クルクミンは非常に脂溶性であるものの(そして、非常に容易に血液脳関門を超える)、経口投与されたクルクミンの非常に少量のみが、血清中および脳組織中に検知される。
【０１１４】
チトクローム P450は、発癌現象を引き起こすＤＮＡ付加物を誘導する複素環アミンのような、代謝毒性化学物質に対して必要な、フェーズI代謝アイソザイムである。身体中に摂取されたクルクミンは、消化管へ入り、チトクロームP450を阻害することが知られている。上記に述べたように、ピペリンと共に用いられたとき、クルクミンのバイオアベイラビリティが増加するよう、研究が行われている。ピペリンは、チトクロームP450を阻害するバイオエンハンサー（bioenhancer）であり、これにより、身体中のクルクミンの代謝を阻害する。この組成物は、更なるバイオエンハンサーの存在無しにバイオアベイラビリティを向上されているようである。
【０１１５】
クルクミンの水溶性組成物は、抗酸化剤、親水性担体および脂質を含む。クルクミンと共に前記抗酸化剤は、チトクロームP450を阻害する。一方、前記組成物上を被覆する脂質の存在により、前記組成物が肝臓ミクロソームまたは他の腸管酵素から攻撃されるのを防ぐ。というのも、これらの酵素は、水性化合物のみを攻撃するからである。従って、前記抗酸化剤および前記脂質は、クルクミンのバイオアベイラビリティを向上させるのにおいて、極めて重要な役割を果たしている。
【０１１６】
初期の研究は、Lutemax2020（登録商標）が、食物において１％でラットにおける糖尿病性白内障を遅延させ、０．１％では遅延させなかったことを示した。さらに、 Lutemax2020（登録商標）(1%) は、遅延させたが、糖尿病性白内障を完全には阻害せず、ゆえに、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体の水溶性組成物(UltraSol Lutemax2020（登録商標）)が、糖尿病性眼合併症（例えば、糖尿病性白内障および糖尿病性網膜症）の予防/治療において、前記組成物の効果をさらに試験するのに用いられた。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明を説明するために示すものであり、したがって、本発明の範囲を限定するのに用いられるべきものではない。
【０１１８】
糖尿病性白内障および糖尿病性網膜症を予防または遅延させるのにおいて、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体を含む水溶性組成物と、クルクミンを含む水溶性組成物の効果を、トランス−ルテインおよびゼアキサンチン異性体を含む通常の組成物ならびに、クルクミンを含む通像の組成物と比較して決定するために、ラットは、ストレプトゾトシン(STZ)を用いて糖尿病をさせた。
【０１１９】
［実施例１］
UltraSol Lutemax2020（登録商標）およびUltraSol CurcuWin（登録商標）の糖尿病性白内障における効果
＜実験計画＞
実験動物科学の国立センター、国立栄養研究所、ハイデラーバード、インド（ＮＣＬＡＳ，ＮＩＮ）から入手したオスのウィスター系（ＷＮＩＮ）ラット（２か月齢；２１３±１４ｇの平均ＢＷ）。動物は、ＮＣＬＡＳ，ＮＩＮにおいて維持し、順応のため２週間、実験室で保管した。糖尿病を、０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４．５中のＳＴＺ（３０ｍｇ／ｋｇ）の１回の腹腔内注射により、一晩絶食動物に誘導させた。賦形剤のみを投与され、コントロールとして用いられる一群のラット（群Ｉ；ｎ＝１２）。絶食血中グルコース値は、ＳＴＺ注射後、７２時間で測定した。＞１５０ｍｇ／ｄＬの血中グルコース値を有する動物は、糖尿病と考え、これらを５つの群に分割した（群ＩＩ〜ＶＩ）。コントロールのラット（ｎ＝６）の群には、０．０１％の溶解性クルクミン（群ＶＩＩ）および溶解性０．５％ルテインのみ（群ＶＩＩＩ）を供給した。
【０１２０】
すべての動物は、１２週間、それぞれの食物が保たれた個々のケージ内で飼育され、飲料水は研究機関の間、自由裁量で供給された。
【０１２１】
【表１】
2017511380.tif 000003
【０１２２】
動物の世話:動物の世話および使用のための組織および国立のガイドラインに従って、生きている動物に関与する全ての実験手順は、国立栄養研究所のIAEC (institutional animal ethical committee)により承認された。
【０１２３】
動物は、１２時間の明／暗サイクルで温度（２２℃）および湿度コントロールされた部屋における個々のケージに収容された。すべての動物は、水へのアクセスは自由にした。
【０１２４】
食物摂取量（１日の）および体重（週の）をモニターした。
【０１２５】
細隙灯検査および白内障等級付け：横に広がった瞳孔に対して細隙灯生物顕微鏡を用いて毎週、目を検査した。水晶体不透明性の開始および向上は、５つのカテゴリー（０〜４）に分かれた。
【０１２６】
死亡率：
研究の間、群ＩＩにおいて３頭の動物が、群ＩＩＩ〜ＶＩのそれぞれについて２頭の動物が、予想したように高血糖症になり死亡した。
【０１２７】
血液／水晶体の採取および処理：グルコースおよびインスリンの評価のため、後眼窩の網状組織から毎週１回血液を引き抜いた。１２週が終わった後、動物をＣＯ2窒息状態により犠牲にし、水晶体を後方アプローチにより切断し、−７０℃でさらなる分析まで保管した。１０％ホモジネートを５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に３〜５の溜まった水晶体から調製した。水晶体マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を除くすべての生化学的パラメータを、水晶体ホモジネートの可溶性画分（４℃で１５，０００ｘｇ）中で分析し、全ホモジネート中で決定した。
【０１２８】
生化学的評価: 
チオバルビツール酸反応物質(TBARS)として、水晶体MDA、タンパク質カルボニル含有量を、Suryanarayana Pらにより研究論文「ラットにおけるクルクミンおよびターメリックの遅延ストレプトゾトシン-誘導糖尿病性白内障」Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46(6):2092-9において説明されたタンパク質カルボニル含有量を評価する方法に従い、測定した。全ての溶解性および不溶性のタンパク質を、ウシ血清アルブミン(BSA)をスタンダートとして用いるローリー（Lowry）法により、分析した。
【０１２９】
血漿ルテインレベル:
血漿ルテインレベルを、Dionex UltiMate3000迅速分離液体クロマトグラフィー（ＲＳＬＣ）に接続した４．６×１５０ｍｍ、５μｍ、ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂウォーターズＣ１８カラムを用いてＨＰＬＣで測定した。このカラムは、アセトニトリル：ジクロロエタン：メタノールの７０：２０：１０（ｖ／ｖ）比の等張溶媒混合物で、２５℃で０．５ｍｌ／分の流速で移動相で平衡化された。２μｌの血漿サンプル（ヘキサンで抽出された）をこのカラムに載せ、ルテインを３００〜６００ｎｍで検出した。
【０１３０】
水晶体タンパク質のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除クロマトグラフィー：可溶性タンパク質のサブユニット・プロフィールおよび架橋を、還元性条件下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で１０％ポリアクリルアミド上で分析した。可溶性タンパク質画分における結晶配分を、６００ｘ７．５ｍｍのＴＳＫ−Ｇ４０００  ＳＷカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｃｏ．，  Ｊａｐａｎ）上でＨＰＬＣシステムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより行った。このカラムを、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．７で、１ｍｌ／分の流速で平衡化させた。
【０１３１】
統計的分析:一元配置分散分析(ANOVA)を、データ群間の統計的有意性を試験するために用い、個々の対の相違は、Duncanの多重範囲検定を用いて試験した。分散の不均一性は、p<0.05は有意と考えられる非母数のMann Whitney検定を用いて試験した。
【０１３２】
＜結果＞
絶食血中グルコース：
図１は、処理期間にわたって異なる群の動物における絶食血漿グルコースの結果をようやくした。糖尿病コントロール・ラットの血漿グルコース濃度は、実験を通して、非糖尿病コントロール・ラットのものより著しく高かった。  ＳＣおよびＳＬで処理された群において観察された、より低い平均絶食血漿グルコース・レベルが存在するものの、糖尿病ラットにおいて血漿グルコースに対する治療の著しい効果は観察されなかった。
【０１３３】
図１：
ＳＴＺ−誘導糖尿病ラットにおける絶食血漿グルコースに対する治療の効果（図１は、明細書に添付した図面に示す）。データは、平均±測定の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。コントロール（非糖尿病コントロール）；  Ｄ（糖尿病コントロール）；Ｄ＋ＲＬ（糖尿病＋通常のルテイン）；Ｄ＋ＳＬ（糖尿病＋通常のルテイン）；Ｄ＋ＲＣ（糖尿病＋通常のクルクミン）；Ｄ＋ＳＣ（糖尿病＋溶解性クルクミン）＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【０１３４】
白内障進行および向上：
白内障の発病および向上を、以下に説明するように、細隙灯生物顕微鏡試験によりモニターした。眼は、細隙灯生物顕微鏡（興和ＳＬ１５、ポータブル、日本）を用いて横に広がった瞳孔について毎週検査した。水晶体混濁の開始および向上は、以下のように５つのカテゴリーに格付けした：「透明」、透明な水晶体ｅで、液胞が存在しない；「ステージ１」、液胞が前極の表面の約半分をカバーし、嚢下白内障を形成する；「ステージ２」、幾つかの液胞が消失し、皮質が霞んだ不透明性を示す；「ステージ３」、霞んだ皮質のままであり、濃い核の不透明性が存在する；「ステージ４」、成熟した白内障が、皮質と核の両方において、濃い不透明性として観察される（図２）。
【０１３５】
図２：
治療によるラットにおける糖尿病性白内障の遅延（図２は、  明細書に添付した図面中に示す）。データは、平均±ＳＥＭとして表した。コントロール（非糖尿病コントロール）；Ｄ（糖尿病コントロール）；Ｄ＋ＲＬ（糖尿病＋通常のルテイン）；Ｄ＋ＳＬ（糖尿病＋溶解性ルテイン）；Ｄ＋ＲＣ（糖尿病＋通常のクルクミン）；Ｄ＋ＳＣ（糖尿病＋溶解性クルクミン）。
【０１３６】
高血糖症による白内障の発症は、ＳＴＺ注入の３週間後に糖尿病どうぶつにおいて観察された。白内障の平均発生率を計算し、図２に示した。発症において遅延は存在しないものの、群Ｄと比較した際、すべての治療群において白内障の向上と成熟において、明白な遅延が存在した。群Ｄ動物は、１０週が終わるまでに、水晶体混濁（ステージＩＶ）を示したが、治療群は、ステージ略２．５〜３を示した。このデータは、白内障介入群の向上と成熟において、群Ｄと比較した際、６週以降に著しい遅延が存在することを明確に示している。１０週の終わりに、白内障の重症度は、群Ｄ＋ＲＬ（ステージ３．１）、群Ｄ＋ＳＬ（ステージ２．７）、群Ｄ＋ＲＣ（ステージ３．０）および群Ｄ＋ＳＣ（ステージ３．２）において、群Ｄ（ステージ４）においてより、著しく低い。このことは、遅い向上のため、糖尿病性白内障の成熟を、どのような剤をもって介入しても遅延させることを示す。さらに、ＳＬは、ＲＬよりより有効なようであるが、ＳＣは、白内障の向上において、ＲＣに対する有効性において、優位性を示さなかった。実験期間全体にわたって群Ｃにおける全ての水晶体は、正常、透明および混濁性が無いように見える。
【０１３７】
水晶体生化学的分析：
個々の水晶体の重量を量り、プールのため４つの水晶体へ溜め、このような４〜５のプールを群ごとに形成した。１０％ホモジネートを、組織ホモジナイザーを用いて過剰な熱の発生を避けるために断続的な時間間隔をおいて、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４，中に調製した。全ホモジネート（ＴＨ）の別々のアリコートをＴＢＡＲＳ分析のために２５０μｌ、ソルビトール評価のために１５０μｌ、タンパク質評価のために２０μｌに調製した。残りのホモジネートを、１０，０００ＲＰＭで３０分間４℃で遠心分離機にかけた。上澄み液を可溶性タンパク質全体（ＴＳＰ）として、ラベルを付けたバイアルに分けた。
【０１３８】
水晶体ホモジネート中のタンパク質の溶解性割合の決定: タンパク質評価は、水晶体ホモジネートおよび可溶性画分中でローリーの方法により行った。水晶体のグラム重量あたりに存在するタンパク質の量を計算した。可溶性タンパク質の割合は、可溶性タンパク質の画分を１００と掛けることにより、計算した。
【０１３９】
全ての実験群の水晶体における全タンパク質含有量と可溶性タンパク質含有量を分析した。コントロール群と比較して、群Ｄにおいて、全タンパク質含有量と可溶性タンパク質含有量の両方における著しい減少が存在した。これは、房水へのタンパク質の部分的漏れ、またはタンパク質の凝集および不溶化に起因するであろう。治療群の中で、ＳＬおよびＲＣは、群Ｄと比較して、可溶性タンパク質の損失は著しく防止された一方、ＳＬのみは、可溶性タンパク質の割合において、群Ｄに対して著しい相違を示した。ＳＣおよびＲＬは、水晶体タンパク質の不溶化を防止するのに部分的に有益な効果を示したが、それは、統計的に比較的著しくなかった。
【０１４０】
表２:
水晶体ホモジネートの全画分および可溶性画分におけるタンパク質含有量。このデータは、平均±ＳＥＭとして表した。ｎ＝６；コントロール（非糖尿病コントロール）；Ｄ（糖尿病コントロール）；Ｄ＋ＲＬ（糖尿病＋通常のルテイン）；Ｄ＋ＳＬ（糖尿病＋溶解性ルテイン）；Ｄ＋ＲＣ（糖尿病＋通常のクルクミン）；Ｄ＋ＳＣ（糖尿病＋溶解性クルクミン）；***=p<0.001、**=P<0.01および*=P<0.05 Vs C; ##= P<0.01 and #= P<0.05 Vs D
【０１４１】
【表２】
2017511380.tif 000004
【０１４２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質プロファイリング：タンパク質分布パターンにおける相違が、水晶体タンパク質サンプルを１２％ポリアクリルアミドゲル上で展開することにより観察された。３０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の分子量マーカー（広範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥマーカー、ＢｉｏＲａｄ）と共にウェルごとにロードした。可溶性タンパク質画分のＳＤＳ−電気泳動パターンは、群Ｃに関して群Ｄにおける５０ｋＤａの位置に凝集したタンパク質に対応するバンドを、治療群ＲＬ、ＳＬ、ＲＣおよびＳＣにおいて、減じたバンドを示した。図３は、明細書に添付する図面中に示すように、水晶体タンパク質の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。
【０１４３】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー: 
ＴＳＫ−３０００  ＨＰＬＣカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより、結晶水晶体タンパク質の分解を生じた。ＨＰＬＣプロフィールは、群Ｃ（黒線）と比べて、群Ｄ（赤線）ＴＳＰにおいて、低分子量領域において、減じたピークエリアを示し、高分子量タンパク質領域においては増加したピークエリアを示した。このことは、糖尿病症状においてタンパク質凝集の減少が存在することを示唆している。ＲＬを除くすべて、すなわち、ＳＬ、ＲＣおよびＳＣでの介入は、ＴＳＰのプロフィールを正規化した。ＲＬを除いて、すべての他の組成物、ＳＬ、ＲＣおよびＳＣは、ＴＳＰと共に介入し、プロフィールを正規化させ、一方、ＲＬは、ＴＳＰレベルに影響を全く示さず、糖尿病症状のような非正常のままであった。
【０１４４】
図４は、明細書に添付する図面に示すように、水晶体タンパク質可溶性画分のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【０１４５】
ソルビトール値：
すべての実験動物の水晶体におけるソルビトールの蓄積を評価し、そのデータを図８に示した。群Ｄは、群Ｃ（０．３０１±０．０４  ｕモル／ｇｍソルビトールの水晶体）と比較した場合、著しく向上したソルビトールのレベル（５．８７７±０．２７）を示した。ｓｃを除く介入群のうち、残りの治療は、群Ｄと比較して、ソルビトール蓄積を低下させなかった。群ＳＣは、群Ｆと比較して、ソルビトール値を著しく低下させ、群Ｃと比較して、ソルビトール値を著しく高くさせた。これは、アルドース・レダクターゼ阻害剤としてのクルクミンの更なる薬理学的作用のためかもしれない。
【０１４６】
図５：
水晶体ソルビトールの蛍光分光測定（図５は、明細書に添付した図に示すとおり）。このデータは、平均±ＳＥＭで表した。ｎ＝６；コントロール（非糖尿病コントロール）；Ｄ（糖尿病コントロール）；Ｄ＋ＲＬ（糖尿病＋通常のルテイン）；Ｄ＋ＳＬ（糖尿病＋溶解性ルテイン）；Ｄ＋ＲＣ（糖尿病＋通常のクルクミン）；Ｄ＋ＳＣ（糖尿病＋溶解性クルクミン）； *=P<0.05 Vs C; # = P<0.05 Vs D.
血漿ルテインレベル：血漿ルテインレベルをＨＰＬＣにより測定した。齧歯動物が食べる食物は、カロチノイドを含まないため、ルテインはコントロールおよび糖尿病ラットにおいて検出されなかった。しかし、ルテインは、ルテインを補完した群において検出されうる。糖尿病ラットに通常のルテインを食べさせることにより、０．０１マイクロモル／Ｌの血漿ルテインが生じた（図６）。溶解性ルテインを食べさせることにより、血漿ルテイン０．０７マイクロモルにおいて７倍に増加させ（図６）、溶解性ルテインは、ルテインのバイオアベイラビリティを著しく増加させ、このことは、通常のルテインに比べて、溶解性ルテインでより有益な効果が得られる理由かもしれないことを示唆している。
【０１４７】
図６：
血漿ルテインレベルのｈｐｌｃ測定（図６は、明細書に添付した図面中に示す）。このデータは、平均±ｓｅｍとして表す。Ｎ＝６；コントロール（非糖尿病コントロール）；ｄ（糖尿病コントロール）；ｄ＋ｒｌ（糖尿病＋通常のルテイン）；ｄ＋ｓｌ（糖尿病＋溶解性ルテイン）。
【０１４８】
＜結論＞
クルクミンの補給により、Ｐ２３Ｈロドプシン変異を有する遺伝子組み換えラットにおいて、光受容体変性を救出した。食事の抗酸化剤クルクミンを食べさせることは、主にその抗酸化剤特性によりラットにおけるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病性白内障を遅延させるのに有効であった。さらに、クルクミンは、ラットの網膜および水晶体アルドース・レダクターゼ（ＡＲ）において、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の糖尿病誘発性発現を阻害した。
【０１４９】
溶解性ルテインは、白内障起源に関連する分子分析において反映された食物における０．５％の用量の通常のルテインと比較して、糖尿病性白内障を遅延させるのにより有効である。溶解性ルテインの向上したバイオアベイラビリティは、通常のルテインと比較して、溶解性ルテインの観察された生物学的効果を説明するかもしれない。溶解性クルクミンの有効性は、通常のクルクミンとほとんど匹敵した。
【０１５０】
［実施例2］
栄養ゲノム情報科学アプローチによる糖尿病性網膜症におけるUltraSol Lutemax2020（登録商標）の効果
溶解性ルテイン(UltraSol Lutemax2020（登録商標）)の効果を、栄養ゲノム情報科学アプローチにより網膜に対するその有益な効果に関し、糖尿病ラットにおいて調べ、その効果を通常のルテイン(Lutemax2020（登録商標）)と比較した。
【０１５１】
＜方法論＞
動物モデル：
糖尿病のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）ラットモデルは、糖尿病に関してヒトの疾患の最も一般的に用いられるモデルの一つである。これは、ヒト糖尿病において観察される多くの急性合併症および幾つかの慢性合併症を模倣することが知られている。このモデルは、高度に再生可能であるという利点を有し、開発させるべき様々な合併症についての予定表は、よく知られており、再生可能である。ヒト疾患の構造的、機能的、および生化学的な異常な事態のいくつかの確立した類似性を前提として、糖尿病のメカニズムを評価し、可能性ある治療を評価するのに適切なモデルであると考えられる。
【０１５２】
実験計画：
１２０ｇｍｓの平均体重を有するオスのウィスター−ＮＩＮラットを、実験動物科学についての国立センター、ハイデラーバードから入手した（ＮＣＬＡＳ，ＮＩＮ）。動物はＮＣＬＡＳ、ＮＩＮにおいて維持し、２週間の間、実験室において順応のため保持した。糖尿病を、０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４．５中のＳＴＺ（３０ｍｇ／ｋｇ）の１回の腹腔内注射により、絶食動物に一晩で誘導させた。賦形剤のみを投与された別のセットのラットをコントロールとして用いた（群Ｃ；ｎ＝６）。絶食血中グルコース値をＳＴＺ注入から７２時間で測定した。血中グルコース値＞１５０ｍｇ／ｄＬを有する動物を、糖尿病と考え、すべての動物を以下の表３に示すように４つの群に分けた。
【０１５３】
【表３】
2017511380.tif 000005
【０１５４】
すべての動物は、１２週間、それぞれの食物が保たれた個々のケージ内で飼育され、飲料水は研究機関の間、自由裁量で供給された。日々の食物摂取量および毎週の体重、絶食グルコース・レベルを記録した。犠牲にする前に、網膜電図を行い、グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１Ｃ）を見積もった。１２週の後、ラットを安楽死させ、網膜を組織学的分析および分子解析（遺伝子およびタンパク質の発現）のため、採取した。
【０１５５】
網膜電図（ＥＲＧ）分析：
糖尿病網膜症（retinoapthy）は、網膜機能における擾乱により特徴づけた。その網膜機能は、網膜電図により評価することができる。糖尿病により、異なる網膜細胞層における局所貧血およびアポトーシスを生じ、これにより、網膜の機能における変化を生じた。律動様小波（ＯＰｓ、ＯＰが波を表す場合、振動波と呼ばれ、これはＥＲＧの主な成分である）が、ａ−またはｂ−波より糖尿病においてより影響されることをよく報告している。ＯＰｓは、内側のレチナール層、神経節細胞層と内側網状層の機能的観点を表す。
【０１５６】
動物を一晩、暗順応させ、ＥＲＧ手順のため、ぼんやりとした赤色照明したで、準備させた。ラットの瞳孔は、アトロピン目薬により、横に広がらせた。接地電極は尾における皮下注射針であり、参照電極は、耳クリップ電極であった。活性なコンタクト水晶体電極を、角膜上に配置した。記録を、ＵＴＡＳ  視覚診断システムにより行った。応答は、交流電流結合ＵＢＡ−４２０４増幅器を用いて、１，０００のゲインに別個に増幅させた。−２から８ｄＢの閃光刺激を、BigShot（登録商標） Ganzfeld システム（ＬＫＣテクノロジーズ；ゲイサーズバーグ、ＭＤ、米国）により届けた。律動様小波を波形から抽出し、すべてのＯＰｓの合計を計算した。
【０１５７】
量のリアルタイムＰＣＲ：
全ＲＮＡを、Ｔｒｉ試薬を用いてラットの網膜から抽出した。分離したＲＮＡは、RNeasy Mini キット（Ｑｉａｇｅｎ）により更に精製し、ＮＤ１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐテクノロジーズ、デラウェア、米国）により２６０ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、定量した。ＲＮＡ調製品の質を、変性アガロースゲル上で電気泳動することにより、評価した。２μｇの全ＲＮＡを、大容量ｃＤＮＡ逆転写キットを用いて逆転写させた。逆転写反応は、サーモサイクラー（thermocycler （ＡＢＩ  ９７００））を用いて行った。リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＡＢＩ−７５００）を、遺伝子特異的なプライマーを有するＳＹＢＲ緑マスターミックスを用いて、２５ｎｇのｃＤＮＡテンプレートと３セットで行った。データの正規化および検証を、β−アクチンを内部コントロールとして用いて行い、データは、比較閾値サイクル（２-△ct）方法に従い、サンプル間を比較した。
【０１５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法：網膜を、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌのアプロチニン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、および１μｇ／ｍｌのペプスタチンを含む、２０ｍＭトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）（ＴＮＥ緩衝液；ｐＨ７．５）を含む緩衝液中で均質化した。ホモジネートを、１２，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。その上澄み液を集め、免疫ブロット法分析のために用いた。前記上澄み液からの等量のタンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に移した。非特異的結合は、トゥイーン（ＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝液塩水中で５％のＢＬＯＴ−ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒ試薬（ＷＢ５７，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によりブロックされ、リン酸緩衝液塩水（ＰＢＳ）中に希釈された一次抗体と共に一晩４℃でインキュベートされた。ＰＢＳＴで洗浄したのち、その膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗ウサギＩｇＧ（１：３５００）二次抗体と共にインキュベートした。免疫ブロット法は、改良化学発光検出試薬（ＲＰＮ２２３２、ＧＥ  健康管理、バッキンガムシャー、ＵＫ）により改良され、デジタル画像は、画像分析機（Ｓｙｎｇｅｎｅ，  Ｇ−ｂｏｘ）により記録された。バンド強度の定量化は、イメージＪソフトウェアにより行った。
【０１５９】
組織病理学:
選んだ動物からの眼球を、別々にラベルを付けたバイアル中の固定剤4 %パラホルムアルデヒド溶液中に収集した。組織にはいくつかの切り傷を付け、深組織へ固定剤が浸透するのを助けるようにした。これらは室温で２４〜４８時間保管し、次いで、その固定剤を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液と置き換えた。緩衝液を病理組織学の処理まで毎週一回、新鮮な緩衝液で置き換えるように予定をたてた。組織をパラフィンに埋め込み、切片をミクロトーム中にとった。コートされたスライドを免疫組織化学および免疫蛍光のために用い、一方、コートされていないスライドをヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシン(H & E)染色のために用いた。
【０１６０】
統計的分析:
データは、平均±ＳＥＭとして表した。ｎ＝６；Ｃ（非糖尿病コントロール）；Ｄ（糖尿病コントロール）；Ｄ＋ＲＬ（糖尿病＋通常のルテイン）；Ｄ＋ＳＬ（糖尿病＋溶解性ルテイン）; *** =p<0.001, ** =P<0.01および*=P<0.05 Vs C; ## = P<0.01および# = P<0.05 Vs D.
結果は、一方向ＡＮＯＶＡにより、次いでＤｕｎｎｅｔｔｆｓ多重比較試験により、すべての群をコントロール群と比較するため、統計的有意性を分析した。群間有意性は両側不対ｔ−試験によりチェックした。
【０１６１】
＜結果＞
網膜電位図：
糖尿病ラット（Ｄ）において、Ｏｐｓの振幅は、正常コントロール（Ｃ）動物（４９８．４μＶ）と比較して、低下した（３３４．２μＶ）。Ｏｐｓについての陰的時間は、群Ｄにおいて増加したことも着目される。抗酸化剤ルテインの摂取により、ＯＰ振幅において低下が低くなり、このことは、ＯＰｓの合計により示唆された；ＲＬ（４４２．６）およびＳＬ（５６１．９）。群ＳＬは、群Ｄと比較して、ＯＰｓの合計において著しい相違を示した。実際、正常コントロールラットより良かった。
【０１６２】
図７：
代表的な波形のＯｐｓは、異なる群と全振幅から示される（図７は、明細書に添付した図面中に示す）。  Ｃ、非糖尿病コントロール；Ｄ、糖尿病コントロール；Ｄ＋ＲＬ、糖尿病＋通常のルテイン；Ｄ＋ＳＬ、糖尿病＋溶解性ルテイン。
【０１６３】
網膜の形態学:
コントロールラットＣにおいて、網膜のすべての層は、無傷であり、網膜の最大厚みを有し、また、濃いＩＮＬに着目され、ＩＮＬおよびＯＮＬ間に識別可能な分離（ＯＰＬ）であった。対照的に、糖尿病網膜（Ｄ）は、全網膜厚みの著しい減少を示し、また、濃さが低いＯＮＬにより印をつけられ、ＩＮＬおよびＯＮＬｓをほとんど混合した。ルテインを用いた治療は、糖尿病網膜において著しい程度に粗雑な形態学的変化を防いだ。ルテインの溶解性剤形は、通常のルテインより良いことを示しており、これは、濃いＯＮＬｓにより示された（図８）。図８は、明細書に添付した図面に示すように、網膜の組織構造を表している。
【０１６４】
【表４】
2017511380.tif 000006
【０１６５】
Ｌｉｅｃａ適用スーツ、Ｌｅｉｃａ、スイスの使用により測定されたレチナール層厚み（μｍで）の代表的な表。Ｃ、非糖尿病コントロール；Ｄ、糖尿病コントロール；Ｄ＋ＲＬ、糖尿病＋通常のルテイン；Ｄ＋ＳＬ、糖尿病＋溶解性ルテイン；ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内部網状層；ＩＮＬ、内部核層；ＯＰＬ、外部網状層；ＯＮＬ、外部核層；ＰＲＬ、光受容体層。
【０１６６】
リアルタイムＰＣＲ、免疫組織化学および免疫ブロット法による網膜マーカー（遺伝子）の発現：
ロドプシン（Ｒｈｏ）：
ロドプシン（Ｒｈｏ）は、網膜の光受容体細胞における生物学的色素であり、光の知覚において、最初の出来事に重要である。リアルタイムＰＣＲにより定量化されたＲｈｏ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、糖尿病動物の網膜において低下レベルを示した。ＲＬおよびＳＬによる治療は、その減少を防ぎ、しかしながら、ＳＬの供給は、ＲＣと比較して著しいい効果を示し、通常のラットより良いものであった（図９Ａ、明細書に添付の図面に示すように）。さらに、免疫蛍光によりＲｈｏのタンパク質レベルも定量化した。これは、ｍＲＮＡレベルと合致する。Ｒｈｏタンパク質の免疫蛍光イメージングは、通常のコントロール・ラット網膜と比較して、糖尿病ラット網膜において低下した発現を示した。ＲＬおよびＳＬによる治療は、糖尿病網膜におけるＲｈｏタンパク質発現の損失を防いだ。これは、非常に強いＲｈｏプラスの蛍光により示される。さらに、ＳＬは、糖尿病動物におけるラット網膜中でのＲｈｏタンパク質発現の損失を防ぐのに、ＲＬより明瞭により効果的であることがそれぞれ見出された（図９Ｂ、明細書に添付の図面に示すように）。
【０１６７】
神経成長因子（ＮＧＦ）：
ＮＧＦは、最も特徴づけられたニューロトロフィンであり、生存かつ末梢神経系および中枢神経系において、ニューロンを選択する分化において重要な役割を果たすことが知られている。１９５０年代に発見されて以来、ＮＧＦは、進行性の神経変性疾患の治療において、有望さを示していた。動物において、ＮＧＦは、神経末端派生物を促進し、虚血性傷害、外傷および毒性傷害後の神経単位回復を促進することが知られていた。リアルタイムＰＣＲによりＮＧＦ遺伝子発現の状態をチェックし、糖尿病動物の網膜における下方調整を見出した。ＲＬを用いた治療では、その減少を防止することはできなかったが、ＳＬは、その下方調整を防止した（図１０Ａ、明細書に添付した図面に示すとおり）。免疫蛍光により見積もられたＮＧＦのタンパク質レベルは、同様の結果であった。ＮＧＦタンパク質の免疫蛍光イメージは、通常のコントロール・ラット網膜に比べて、糖尿病ラット網膜において低下した発現を示した（図１０Ｂ、明細書に添付した図に示したとおり）。ＳＬを用いた治療により、糖尿病網膜におけるＮＧＦタンパク質の損失を防いだ。これは、非常に強いＮＧＦプラスの蛍光により示される。ＲＬは、糖尿病ラット網膜において、有効にＮＧＦタンパク質の損失を防ぐことが不可能であった。
【０１６８】
血管内皮細胞増殖因子ＶＥＧＦ）：
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成および血管形成を刺激する細胞により産生されるシグナル・タンパク質である。これは、血液循環が不十分なとき、組織への酸素供給を回復させるシステムの一部である。ＶＥＧＦが過剰に発現されたとき、これは疾患に寄与しうる。ＶＥＧＦは、幅広い網膜の血管拡張を生じ、血液−網膜のバリアの破壊を生じ、眼球新血管形成に関与する。ＶＥＧＦについてウエスタンブロット法は、糖尿病網膜におけるＶＥＧＦ発現の上昇調整を示した（図１１、明細書に添付の図面に示すように）。ＲＬおよびＳＬを用いた治療は、糖尿病誘発性ＶＥＧＦの過発現を阻害した。
【０１６９】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）：
ＰＤＧＦは、血液管形成（血管形成）、既に存在する血管組織からの血管の成長において、著しく重要な役針を果たす成長因子である。幾つかの研究が、糖尿病性網膜症を有する患者からの硝子体液サンプル中に、高いＰＤＧＦ集中を示す。ＶＥＧＦのように、ＰＤＧＦは、血管新生促進の成長因子であり、糖尿病性網膜症において、異常な新血管形成を促進するかもしれない。さらに、ＰＤＧＦは、糖尿病性網膜症を有する患者における網膜上膜の形成とけん引を刺激し、けん引の網膜の分離を引き起こすかもしれない。実際、阻害剤の開発は、病理学網膜の新血管形成におけるＰＤＧＦシグナルに拮抗し、依然として眼科薬物開発の活性化領域である。ＰＤＧＦについての免疫組織化学は、糖尿病網膜におけるタンパク質の上昇調整を示している（図１２、明細書に添付した図面中に示すとおり）。ＲＬおよびＳＬの両方を用いた治療は、糖尿病誘発性ＰＤＧＦの過発現を阻害する。
【０１７０】
血漿ルテイン：
バイオアベイラビリティに対する溶解性ルテイン投与の効果を理解するため、カロチノイドの血漿レベルをＨＰＬＣ方法により測定した。データにより、通常の食物（ＡＩＮ−９３）を供給したラットの血漿中で、検出不能なルテインレベルが示された。血漿ルテインレベルは、通常のルテインおよび溶解性ルテインと混合したＡＩＮ−９３食物を供給されたラットにおいて、検出可能な範囲であった。より興味深いことに、ＳＬ食物を供給されたラットは、ＲＬ食物を供給されたラットと比較して、数倍高いルテインレベルを含んでいることが見出された。このことにより、ルテインのバイオアベイラビリティを向上させるのに、この形成が成功していることを特に確認した。
【０１７１】
図１３は、明細書に添付した図面中に示すように、逆フェーズ（ＲＰ）−ＨＰＬＣにより測定した血清ルテインレベルを示す。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表した。$$$<0.001 D+SL Vs. D+RL。
【０１７２】
＜結論＞
ラットへのルテイン投与により、網膜における糖尿病誘発性異常事態を防いだ。ルテインは、ＥＲＧによりチェックされたように、糖尿病ラットにおいて失われた、ラットの網膜の機能性を保持していた。また、これは、Ｈ＆Ｅ染色により行われたように、網膜の形態学的研究により、明らかである。ルテインは、網膜の健康を維持するのに極めて重要な役割を有する、ロドプシンおよび神経成長因子（ＮＧＦ）の発現における減少を防いだ。ルテインは、ストレスおよび血管形成に関与するＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの過発現を防いだ。興味深いことに、溶解性ルテインで処理したラットは、通常のルテインと比較した際に完全な利益を示し、増加したバイオアベイラビリティは、増加した血漿レベルにより示された。さらに、ルテインの抗酸化剤能力および抗炎症性能力は、その有益な効果について寄与しているかもしれない。ゆえに、溶解性ルテインは、糖尿病性網膜症を治療するか、または予防するのに、用いることができる。
【０１７３】
［実施例3］
栄養ゲノム情報科学アプローチによる糖尿病性網膜症におけるUltraSol CurcuWin（登録商標）の効果
溶解性クルクミン(UltraSol CurcuWin（登録商標）)の効果を、栄養ゲノム情報科学アプローチにより網膜に対する有益な効果について、糖尿病ラットにおいて調べ、その効果を通常のクルクミンと比較した。
【０１７４】
＜方法論＞
実施例２において説明したのと同一である。すべての動物を以下に示すように４つの群に分けた。
【０１７５】
【表５】
2017511380.tif 000007
【０１７６】
網膜電位図：
糖尿病ラット（Ｄ）において、ＯＰｓの振幅は、正常コントロール動物（Ｃ）と比較して、低下した（３３４．２μＶ）。ＯＰｓについての陰的時間は、群Ｄにおいて増加したことも着目される。抗酸化剤クルクミンの摂取により、振幅において低下が低くなり、このことは、ＯＰｓの合計により示唆された；ＲＣ（４４５．７）、ＳＣ（４５５．３）。ＳＣは、ＯＰｓの合計において低下が低くなったのみならず、陰的時間を正規化した。
【０１７７】
図１４は、明細書に添付した図面中に示すように、異なる群と全振幅の個々の動物からのＯＰｓの波形を示す。Ｃ、非糖尿病コントロール；Ｄ、糖尿病コントロール；Ｄ＋ＲＣ、糖尿病＋通常のクルクミン；Ｄ＋ＳＣ、糖尿病＋溶解性クルクミン。
【０１７８】
網膜の形態学：
コントロールラットＣにおいて、網膜のすべての層は無傷であり、網膜の最大厚みを有し、また、濃いＩＮＬに着目され、ＩＮＬおよびＯＮＬ間に識別可能な分離（ＯＰＬ）であった。対照的に、糖尿病ラット網膜（Ｄ）は、全網膜厚みの著しい減少を示し、また、濃さが低いＯＮＬにより印をつけられ、ＩＮＬおよびＯＮＬｓをほとんど混合した。クルクミンを用いた治療は、糖尿病網膜において著しい程度に粗雑な形態学的変化を防いだ。この有効成分の溶解性剤形は、通常の有効成分より良いことを示しており、これは、濃いＯＮＬｓにより示された。
【０１７９】
図15は、明細書に添付した図面に示すように、網膜の代表的な組織構造を表している。
【０１８０】
【表６】
2017511380.tif 000008
【０１８１】
Ｌｉｅｃａ適用スーツ、Ｌｅｉｃａ、スイスの使用により測定されたレチナール層厚さ（μｍで）の代表的な表。Ｃ、非糖尿病コントロール；Ｄ、糖尿病コントロール；Ｄ＋ＲＣ、糖尿病＋通常のクルクミン；Ｄ＋ＳＣ、糖尿病＋溶解性クルクミン。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＰＬ、内部網状層；ＩＮＬ、内部核層；ＯＰＬ、外部網状層；ＯＮＬ、外部核層；ＰＲＬ、光受容体層。
【０１８２】
リアルタイムＰＣＲ、免疫組織化学および免疫ブロット法による網膜のマーカー（遺伝子）の発現:
ロドプシン(Rho):
ロドプシンは、網膜の光受容体細胞における生物学的色素であり、光の知覚において、最初の出来事に重要である。リアルタイムＰＣＲにより定量化されたＲｈｏ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、糖尿病動物の網膜において低下レベルを示した。ＲＣおよびＳＣによる治療は、その減少を防ぎ、しかしながら、ＳＣ治療は、ＲＣと比較して著しいい効果を示し、通常のラットより良いものであった（図１６Ａ、明細書に添付の図面に示すように）。免疫蛍光によりＲｈｏのタンパク質レベルを定量化した。これは、ｍＲＮＡレベルと合致する。Ｒｈｏタンパク質の免疫蛍光イメージングは、通常のコントロール・ラット網膜と比較して、糖尿病ラット網膜において低下した発現を示した。ＲＣおよびＳＣによる治療は、糖尿病網膜におけるＲｈｏタンパク質発現の損失を防いだ。これは、非常に強いＲｈｏプラスの蛍光により示される。さらに、ＳＣは、糖尿病動物におけるラット網膜中でのＲｈｏタンパク質発現の損失を防ぐのに、ＲＣより明瞭により効果的であることがそれぞれ見出された（図１６Ｂ、明細書に添付の図面に示すように）。
【０１８３】
神経成長因子（ＮＧＦ）：
ＮＧＦは、最も特徴づけられたニューロトロフィンであり、生存かつ末梢神経系および中枢神経系において、ニューロンを選択する分化において重要な役割を果たすことが知られている。１９５０年代に発見されて以来、ＮＧＦは、進行性の神経変性疾患の治療において、有望さを示していた。動物において、ＮＧＦは、神経末端派生物を促進し、虚血性傷害、外傷および毒性傷害後の神経単位回復を促進することが知られていた。リアルタイムＰＣＲによりＮＧＦ遺伝子発現の状態をチェックし、糖尿病動物の網膜における規則を見出した。通常のクルクミンおよび溶解性クルクミンの両方を用いた治療では、糖尿病下のＮＧＦ遺伝子の下方調整を防ぐのに同じくらいに有利な効果を示した（図１７Ａ、明細書に添付した図面に示すとおり）。免疫蛍光により見積もられたＮＧＦのタンパク質レベルは、同様の結果であった。ＮＧＦタンパク質の免疫蛍光イメージは、通常のコントロール・ラット網膜に比べて、糖尿病ラット網膜において低下した発現を示した（図１７Ｂ、明細書に添付した図に示したとおり）。ＲＣおよびＳＣを用いた治療により、糖尿病網膜におけるＮＧＦタンパク質の損失を防いだ。これは、非常に強いＮＧＦプラスの蛍光により示される。
【０１８４】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）：
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)は、脈管形成および血管形成を刺激する細胞により産生されるシグナル・タンパク質である。これは、血液循環が不十分なとき、組織への酸素供給を回復させるシステムの一部である。ＶＥＧＦが過剰に発現されたとき、これは疾患に寄与しうる。ＶＥＧＦは、幅広い網膜の血管拡張を生じ、血液−網膜のバリアの破壊を生じ、眼球新血管形成に関与する。ＶＥＧＦについてウエスタンブロット法は、糖尿病網膜におけるＶＥＧＦ発現の上昇調整を示した（図１８、明細書に添付の図面に示すように）。ＲＬおよびＳＬを用いた治療は、糖尿病誘発性ＶＥＧＦの過発現を阻害した。
【０１８５】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）：
ＰＤＧＦは、細胞成長と細胞分裂を調節する成長因子である。特に、ＰＤＧＦは、
血液管形成（血管形成）、既に存在する血管組織からの血管の成長において、著しく重要な役針を果たす。幾つかの研究が、糖尿病性網膜症を有する患者からの硝子体液サンプル中に、高いＰＤＧＦ集中を示す。ＶＥＧＦのように、ＰＤＧＦは、血管新生促進の成長因子であり、糖尿病性網膜症において、異常な新血管形成を促進するかもしれない。さらに、ＰＤＧＦは、糖尿病性網膜症を有する患者における網膜上膜の形成とけん引を刺激し、けん引の網膜の分離を引き起こすかもしれない。実際、阻害剤の開発は、病理学網膜の新血管形成におけるＰＤＧＦシグナルに拮抗し、依然として眼科薬物開発の活性化領域である。ＰＤＧＦについての免疫組織化学は、糖尿病網膜におけるタンパク質の上昇調整を示している（図１９、明細書に添付した図面中に示すとおり）。ＲＣおよびＳＣの両方を用いた治療は、糖尿病誘発性ＰＤＧＦの過発現を阻害する。溶解性クルクミンは、通常のクルクミンよりより有効であった（図１９、明細書に添付する図面に示すように）。
【０１８６】
＜結論＞
ラットへのクルクミン投与により、網膜における糖尿病誘発性異常事態を防いだ。クルクミンは、ＥＲＧによりチェックされたように、糖尿病ラットにおいて失われた、ラットの網膜の機能性を保持していた。また、これは、網膜の様々な層の厚みが測定されたＨ＆Ｅ染色により行われたように、網膜の形態学的研究により、明らかである。クルクミンは、極めて重要な役割を有するロドプシンおよび神経成長因子の発現における低下を防いだ。クルクミンは、ストレスおよび血管形成に関与するＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの過発現を防いだ。興味深いことに、溶解性クルクミンで処理したラットは、通常のクルクミンと比較した際に完全な利益を示し、これは、増加したバイオアベイラビリティのためかもしれない。ゆえに、溶解性クルクミンは、糖尿病性網膜症を治療するか、または予防するのに用いることができる。
【０１８７】
＜利点＞
１．脂溶性栄養素の乾燥したさらさらの、水溶性／混和性形態を提供する。
【０１８８】
２．貧弱な水溶性、油性、脂溶性の栄養素を、顆粒剤、粉剤、錠剤、軟膏剤、ペースト剤、口内洗浄液、うがい液、小袋、カプセル剤の形態で、または飲料に含めて、運搬する適切な方法を提供する。
【０１８９】
３．貧弱な水溶性、油性、脂溶性の高いバイオアベイラビリティを有する栄養素の剤形を提供する。
【０１９０】
４．ここの前記組成物は、血中グルコース値を調節するのに有効である。
【０１９１】
５．脂溶性栄養素を含むここの前記組成物および方法は、糖尿病性網膜症における無軸索細胞機能障害を調節するのに有効である。
【０１９２】
６．ここの前記組成物は、糖尿病性網膜症におけるレチナール層、ロドプシン値およびＮＧＦタンパク質レベルの損失を防ぐのに有効である。
【０１９３】
７．ここの前記組成物は、糖尿病性網膜症における糖尿病誘発性ＰＤＧＦの過発現を阻害するのに有効である。
【０１９４】
８．ここの前記組成物は、糖尿病性白内障における不溶性水晶体タンパク質の蓄積を防ぐのに有効である。
【０１９５】
９．ここの前記組成物は、糖尿病性白内障における水晶体におけるソルビトール値の蓄積を防ぐのに有効である。
【０１９６】
１０．ここの前記組成物は、糖尿病性白内障におけるタンパク質凝集を減じ、かつ可溶性タンパク質全体のプロフィールを正規化するのに有効である。
【図１】
2017511380.tif 000009
【図２】
2017511380.tif 000010
【図３】
2017511380.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2017511380.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2017511380.tif 000023
【図１６】
2017511380.tif 000024
【図１７】
2017511380.tif 000025
【図１８】
2017511380.tif 000026
【図１９】
2017511380.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月13日(2016.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の眼関連合併症の進行および成熟を遅延させる方法であり、
前記方法は、組成物を動物へ投与する工程を含み、
前記組成物は、ヒトの食物摂取について安全であり、かつ栄養摂取のための栄養補助食品および健康促進への貢献として有用であり、
前記組成物は、脂溶性栄養素、安定剤および水溶性親水性担体を含む分子分散であり、
前記組成物は、糖尿病の眼関連合併症を遅延させるのに有効な量で投与される方法。
【請求項２】
前記糖尿病の眼関連合併症が、白内障および網膜症である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂溶性栄養素は、ルテイン、ルテイン異性体、ルテインエステル、ゼアキサンチン異性体、ウコン抽出物、クルクミン、生姜ならびにそれらの混合物を含む群から選択される先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記投与する工程は、血中グルコース値を調節するのに有効な量で前記組成物を投与する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記投与する工程は、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）値を調節するのに有効な量で前記組成物を投与する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記投与する工程は、糖尿病性網膜症における無軸索細胞機能障害を調節するのに有効な量で前記組成物を投与する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記投与する工程は、糖尿病性網膜症における、レチナール層、ロドプシン値およびＮＧＦタンパク質レベルの損失を防ぐのに有効な量で前記組成物を投与する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記投与する工程は、糖尿病性網膜症における、糖尿病誘発性ＰＤＧＦ過発現を阻害するのに有効な量で前記組成物を投与する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記投与する工程は、糖尿病性白内障における不溶性水晶体タンパク質の蓄積を防ぐのに有効な量で前記組成物を投与する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記投与する工程は、糖尿病性白内障における水晶体におけるソルビトール値の蓄積を防ぐのに有効な量で前記組成物を投与する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記投与する工程は、タンパク質凝集を減らし、かつ糖尿病性白内障における可溶性タンパク質全体のプロフィールを正規化するのに有効な量で前記組成物を投与する工程を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、界面活性剤を含む先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、少なくとも８０重量％の全キサントフィルを含有し、
そのうちトランス−ルテイン含有量は、８０〜９５％ｗ／ｗであり；
（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンは、１４〜２０％ｗ／ｗであり；
（Ｒ，Ｓ）−ゼアキサンチンは、０．０１〜１％ｗ／ｗであり；または、
トランス−ルテイン含有量は、８０〜９５％ｗ／ｗであり；
（Ｒ，Ｒ）−ゼアキサンチンは、１４〜２０％ｗ／ｗであり、かつ、
キサントフィル／キサントフィルエステルを含む植物の抽出物／オレオレジンから誘導された他のカロチノイドを微量；または、
５〜９５％のクルクミノイドを含むクルクミンを含む、
先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記安定剤は、アスコルビン酸、ＢＨＡ、ＢＨＴ、パルミチン酸アスコルビル、ローズマリー抽出物、混合天然トコフェロール、アルファ酢酸トコフェロール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒマシ油誘導体、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物から選択される先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
使用される前記水溶性親水性担体は、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、グルコースシロップ、コーン浸出液、マンニトール、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール１００００、ポリエチレングリコール２００００、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、グルコース、塩化ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、可溶性デンプン、加水分解デンプンおよびこれらの混合物から選択される
先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、レシチン、スクロース脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、粉剤、錠剤、カプセル剤、小袋、ビーズ状剤、マイクロカプセル化粉剤、油懸濁液、分散液、ペレット剤、軟質ゲルカプセル剤、チュアブル錠または液体製剤の形態である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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