(57)【要約】ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗原結合構築物（例えば、抗体）及びその使用方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、抗原結合構築物：
第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカー、及び第一のＶＨを含む第一のｓｃＦｖを含む第一の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第一のｓｃＦｖが、ＣＤ１９抗原に一価で特異的に結合し、前記第一のｓｃＦｖが、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７  ｓｃＦｖ、修飾ＨＤ３７  ｓｃＦｖ、ＨＤ３７遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾ＨＤ３７遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択され、前記ＨＤ３７遮断抗体が、前記ＣＤ１９抗原へのＨＤ３７の結合を５０％以上遮断する、第一の抗原結合ポリペプチド構築物；
第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカー、及び第二のＶＨを含む第二のｓｃＦｖを含む第二の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第二のｓｃＦｖが、ＣＤ３抗原のイプシロンサブユニットに一価で特異的に結合し、前記第二のｓｃＦｖが、ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、修飾ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾ＯＫＴ３遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択され、前記ＯＫＴ３遮断抗体が、前記ＣＤ３抗原の前記イプシロンサブユニットへのＯＫＴ３の結合を５０％以上遮断する、第二の抗原結合ポリペプチド構築物；
二量体化ＣＨ３ドメインを形成することができる修飾ＣＨ３配列をそれぞれ含む第一及び第二のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃであって、各修飾ＣＨ３配列が、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、前記二量体化ＣＨ３ドメインが、約６８℃またはそれより高い融解温度（Ｔｍ）を有し、前記第一のＦｃポリペプチドが、第一のヒンジリンカーにより前記第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、かつ前記第二のＦｃポリペプチドが、第二のヒンジリンカーにより前記第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている、ヘテロ二量体Ｆｃ。
【請求項２】
ｖ１２０４３、ｖ１０１４９、またはｖ１６６１からなる、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項３】
前記第一のｓｃＦｖが、
2017504328.tif 000038
から選択されるＣＤＲ配列のセットに１００％同一であるＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項４】
前記第一のｓｃＦｖが、請求項３に記載のＣＤＲの前記セットに９５％同一であるＣＤＲ配列を含む、請求項３に記載の抗原結合構築物。
【請求項５】
前記第一のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ３７のＶＨのポリペプチド配列、ｈＶＨ２ポリペプチド配列、及びｈＶＨ３ポリペプチド配列から選択され、前記第一のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ３７  ＶＬのポリペプチド配列及びｈＶＬ２ポリペプチド配列から選択される、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項６】
前記第一のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ３７のＶＨのポリペプチド配列、ｈＶＨ２ポリペプチド配列、またはｈＶＨ３ポリペプチド配列に９５％同一であり、前記第一のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ３７  ＶＬのポリペプチド配列またはｈＶＬ２ポリペプチド配列に９５％同一である、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項７】
前記ＨＤ３７遮断抗体が、４Ｇ７、Ｂ４、Ｂ３、ＨＤ２３７、及びＭｏｒ−２０８から選択される、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項８】
前記第二のｓｃＦｖが、
2017504328.tif 000039
から選択されるＣＤＲのセットを含む、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項９】
前記第二のｓｃＦｖが、請求項８に記載のＣＤＲの前記セットに少なくとも９５％同一であるＣＤＲのセットを含む、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項１０】
前記第二のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＯＫＴ３のＶＨのポリペプチド配列であるか、または野生型ＯＫＴ３のＶＨのポリペプチド配列に９５％同一であるポリペプチド配列であり、前記第二のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＯＫＴ３のＶＬのポリペプチド配列であるか、または野生型ＯＫＴ３のＶＬのポリペプチド配列に９５％同一であるポリペプチド配列である、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項１１】
前記ＯＫＴ３遮断抗体が、Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ（商標）、ＵＣＨＴ１、及びビジリズマブから選択される、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項１２】
前記第二のｓｃＦｖが前記ＯＫＴ３のＣＤ３エピトープに結合する、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項１３】
前記第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第一のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１４】
前記第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第一のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１５】
前記第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第二のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１６】
前記第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第二のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１７】
一方または両方のｓｃＦｖが、ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１８】
前記第一または第二のｓｃＦｖリンカーが、表Ｂから選択される、請求項１及び３〜１７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１９】
前記第一または第二のヒンジポリペプチドリンカーが、表Ｅから選択される、請求項１及び３〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２０】
前記第一のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記第一のＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されており、前記第二のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記第二のＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項２１】
前記第一のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されており、前記第二のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項２２】
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、ＦｃγＲまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Ｆｃの能力を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインを含む、請求項２０または２１に記載の抗原結合構築物。
【請求項２３】
ＣＤ１９に対する前記第一のｓｃＦｖの結合親和性が、約０．１ｎＭ〜約５ｎＭであり、ＣＤ３の前記イプシロンサブユニットに対する前記第二のｓｃＦｖの結合親和性が、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２４】
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、
ａ．ヒトＦｃであり；かつ／または
ｂ．ヒトＩｇＧ１  Ｆｃであり；かつ／または
ｃ．表Ａに記載のように前記ＣＨ３ドメインのうち少なくとも１つに１つまたは複数の修飾を含み；かつ／または
ｄ．少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含み；かつ／または
ｅ．１つまたは複数の修飾を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含み；かつ／または
ｆ．表Ｂに記載のように前記ＣＨ２ドメインの少なくとも１つに１つまたは複数の修飾を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含み；かつ／または
ｇ．表Ｃに記載のようにＦｃγＲまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Ｆｃの能力を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含み；かつ／または
ｈ．アミノ酸置換Ｎ２９７Ａ、もしくはＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ、もしくはＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓを含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含む、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２５】
前記二量体化ＣＨ３ドメインが、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２６】
前記抗原結合構築物が、
ａ）ＦＡＣＳ及び／もしくは顕微鏡検査によりアッセイされるようなＣＤ１９＋Ｒａｊｉ  Ｂ細胞及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の間のシナプス形成及び架橋が可能であり；かつ／または
ｂ）ヒト全血またはＰＢＭＣにおけるＣＤ１９発現Ｂ細胞のＴ細胞誘引による殺傷（T-cell directed killing）を媒介し；かつ／または
ｃ）ｖ８７５またはｖ１６６１と比較して改善した生物物理学的特性を示し；かつ／または
ｄ）ｖ８７５またはｖ１６６１と比較して改善したタンパク質発現及び収率、例えば、同様の条件下で発現及び精製された場合にＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）後に４〜１０ｍｇ／Ｌ超での発現を示し；かつ／または
ｅ）例えば９５％を超えるヘテロ二量体純度を示す、
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２７】
薬物にコンジュゲートされている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物及び薬学的担体の医薬組成物。
【請求項２９】
前記担体が、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、糖質、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を含む、医療において使用するための医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を含む、癌の治療において使用するための医薬組成物。
【請求項３２】
対象における癌を治療する方法であって、有効量の請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３３】
前記対象がヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌が、リンパ腫または白血病またはＢ細胞悪性腫瘍、またはＣＤ１９を発現する癌、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）またはリツキシマブもしくはＣＨＯＰ（ｃｙｔｏｘａｎ（商標）／Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（商標）ビンクリスチン／プレドニゾン療法）に耐性のＢ細胞癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
以下の工程を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を製造する方法：請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を前記抗原結合構築物の発現に好適な条件下で培養する工程、及び、前記抗原結合構築物を精製する工程。
【請求項３６】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物の少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセット。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがｃＤＮＡである、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３６に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットの１つまたは複数を含むベクターまたはベクターのセットであって、任意選択的に、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される、前記ベクターまたはベクターのセット。
【請求項３９】
請求項３６に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットまたは請求項３８に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む単離された細胞であって、任意選択的に、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞から選択される、前記単離された細胞。
【請求項４０】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物及び使用説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１月１５日に出願された米国仮出願第６１／９２７，８７７号、及び２０１４年４月１１日に出願された米国仮出願第６１／９７８，７１９号、及び２０１４年７月１７日に出願された米国仮出願第６２／０２５，９３２号の利益を主張する。本出願は、２０１４年７月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４６４３６に対する優先権も主張する。これらの出願のそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年ＸＸ月ＸＸ日に作製され、名称はＸＸＸＸＸ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズはＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
【０００３】
技術分野
本技術分野は、ＣＤ３抗原結合ポリペプチド構築物（例えばＣＤ３結合性ドメイン）及びＣＤ１９抗原結合ポリペプチド構築物（例えばＣＤ１９結合性ドメイン）を含む、二重特異性抗原結合構築物（例えば、抗体）である。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
治療用タンパク質の領域において、その多価標的結合特性を有する抗体は、薬物候補の設計のための優れた足場である。これらの特性をさらに進展させると、設計される二重特異性抗体及びその他の融合多重特異性治療薬は、二重または多重の標的特異性を呈し、新規作用様式を有する薬物を作製する機会を呈する。好ましい薬物動態及び機能活性を有するそのような多価及び多重特異性治療用タンパク質の開発が課題となっている。
【０００５】
Ｔ細胞を腫瘍細胞に誘引することができる二重特異性抗体が同定されており、癌の治療におけるその有効性について試験されている。ブリナツモマブは、再発性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫及び慢性リンパ性白血病などのＢ細胞疾患の治療について同定されているＢｉＴＥ（商標）（二重特異性Ｔ細胞誘導物）と呼ばれる形式の二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗体の例である（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ（２００９）１２：４９４１−４９４４（非特許文献1））。ＢｉＴＥ（商標）形式は、２つの異なる抗体に由来する可変ドメインを連結している二重特異性一本鎖抗体構築物である。しかしながら、ブリナツモマブが有するインビボでの半減期は乏しく、生産性及び安定性の点で製造が難しい。ゆえに、Ｔ細胞を腫瘍細胞に誘引することができ、改善された製造性を有する、改善された二重特異性抗体が必要とされている。
【０００６】
抗原結合構築物は、以下に記載されている：２０１３年７月１３日に出願された"Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ"という名称の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５０４１１（特許文献1）；２０１４年７月１１日に出願された、"Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ３  ａｎｄ  ＣＤ１９  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ"という名称の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４６４３６（特許文献2）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５０４１１
【特許文献２】ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４６４３６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ（２００９）１２：４９４１−４９４４
【発明の概要】
【０００９】
第一の抗原結合ポリペプチド構築物、第二の抗原結合ポリペプチド構築物、及びヘテロ二量体Ｆｃをそれぞれ含む抗原結合構築物を本明細書に記載する。第一のｓｃＦｖは、第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカー、及び第一のＶＨを含む。第一のｓｃＦｖは、ＣＤ１９抗原に一価で特異的に結合する。第一のｓｃＦｖは、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７  ｓｃＦｖ、修飾ＨＤ３７  ｓｃＦｖ、ＨＤ３７遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾ＨＤ３７遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択され、ここでＨＤ３７遮断抗体は、ＣＤ１９抗原へのＨＤ３７の結合を５０％以上遮断する。
【００１０】
第二の抗原結合ポリペプチド構築物は、第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカー、及び第二のＶＨを含む、第二のｓｃＦｖを含む。第二のｓｃＦｖは、ＣＤ３抗原のイプシロンサブユニットに一価で特異的に結合する。第二のｓｃＦｖは、ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、修飾ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾ＯＫＴ３遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択され、ここでＯＫＴ３遮断抗体は、ＣＤ３抗原のイプシロンサブユニットへのＯＫＴ３の結合を５０％以上遮断する。
【００１１】
ヘテロ二量体Ｆｃは、二量体化ＣＨ３ドメインを形成することができる修飾ＣＨ３配列をそれぞれ含む第一及び第二のＦｃポリペプチドを含み、ここで各修飾ＣＨ３配列は、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、二量体化ＣＨ３ドメインは、約６８℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。第一のＦｃポリペプチドは、第一のヒンジリンカーにより第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、第二のＦｃポリペプチドは、第二のヒンジリンカーにより第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている。
【００１２】
抗原結合構築物ポリペプチド配列及びＣＤＲ配列、抗原結合構築物をコードする核酸、及びベクター及び細胞も記載する。抗原結合構築物を含む医薬組成物、及び、本明細書に記載の抗原結合構築物を使用して障害（例えば、癌）を治療する方法も記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】抗原結合構築物の設計の概略図を示す。図１Ａは、エフェクター機能を媒介することができるＦｃを有する例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物を図示する。当該抗原結合構築物の抗原結合ドメインは両方ともｓｃＦｖであり、各ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域はポリペプチドリンカーにより接続されている。各ｓｃＦｖはまた、ヒンジポリペプチドリンカーによりヘテロ二量体Ｆｃの一方のポリペプチド鎖に接続されている。当該抗原結合構築物の当該２つのポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている（破線として示す）。図１Ｂは、Ｆｃがノックアウトされている例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物を図示する。このタイプの抗原結合構築物は、ＦｃγＲ結合を除去するＦｃのＣＨ２領域への修飾（「Ｘ」で示す）を含むことを除き、図１Ａに示すものと類似する。
【図２Ａ】選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図２Ａの上方パネルは、変異体１０１４９についてのプロテインＡ精製後の分取ゲルろ過（ＧＦＣ）プロファイルを示し、下方パネルは、プールしたＧＦＣ画分の分析的ＳＥＣプロファイルを示す。
【図２Ｂ】選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図２Ｂの上方パネルは、変異体１６６１についてのプロテインＡ精製後の分取ゲルろ過（ＧＦＣ）プロファイルを示し、下方パネルは、１６６１についてのプールしたＧＦＣ画分の分析的ＳＥＣプロファイルを示す。
【図２Ｃ】選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図２Ｃは、変異体８７５、１６６１、１６５３、１６６６、１０１４９、及び１２０４３の生物物理学的特徴の概要を提供する。
【図３】Ｂ及びＴ細胞を架橋して仮足の形成させる変異体８７５及び１６６１の能力を示す。左の表は、ＦＡＣＳによる架橋分析及び顕微鏡による架橋分析により測定したこれらの変異体についてのＢ：Ｔ細胞架橋分析の概要を提供し；右の画像は、顕微鏡による架橋分析により測定した、変異体８７５についての仮足の形成を示す。
【図４】３００ｎＭの変異体８７５の、ＩＬ２活性化精製ＣＤ８＋Ｔ細胞における非ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞に対するオフターゲット細胞障害性を示す（４人のドナーの平均）。
【図５】ｖ１６６１のＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する能力の低減または消失を示す。図５Ａは、リツキシマブ対照との比較での変異体１６６１のＲａｊｉ細胞におけるＡＤＣＣを媒介する能力を示す。図５Ｂは、リツキシマブ対照に対する変異体１６６１のＲａｊｉ細胞におけるＣＤＣを媒介する能力を示す。
【図６】選択された変異体の、全血アッセイにおける自己Ｂ細胞枯渇を媒介する能力を示す。ＣＤ２０＋Ｂ細胞の存在は、ＩＬ２活性化ヒト全血における４８時間のインキュベーションの後に決定された（２ドナーの平均、ｎ＝４）。
【図７】１０：１のＥ：Ｔ比率で４８時間後のＩＬ−２活性化ヒト全血における濃度依存様式（０．０１ｎＭ未満のＥＣ５０）でのｖ１６６１による用量依存的な自己Ｂ細胞枯渇を示す。
【図８】静止条件下、用量依存的に全血中の自己Ｂ細胞を枯渇させる変異体１６６１及び１０１４９の能力の比較を示す。
【図９】一次患者ヒト全血におけるｖ１６６１による自己Ｂ細胞枯渇を示す。図９Ａは、ＭＣＬ患者からの血液中でのｖ１６６１の効果を示す。図９Ｂは、２人のＣＬＬ患者からの血液中でのｖ１６６１の効果を示す。残存する悪性Ｂ細胞の数は、培地対照に対して正規化されたＣＤ２０＋／ＣＤ５＋Ｂ細胞の割合（％）として表される。
【図１０】ｖ８７５、１３８０及び対照の、ヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞増殖を刺激する能力を示す（４日間のインキュベーション、４人のドナーの平均）。
【図１１】１００ｎＭの変異体、ヒトＰＢＭＣにおける標的Ｂ細胞依存性Ｔ細胞増殖を示す（４日間のインキュベーション、４人のドナーの平均）。
【図１２】選択された変異体の、ヒトＧ２  ＡＬＬ腫瘍細胞株に結合する能力を示す。
【図１３Ａ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体８７５の有効性を示す。図１３Ａは、腹臥位における全身の生物発光の量を示す。
【図１３Ｂ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体８７５の有効性を示す。図１３Ｂは、仰臥位における全身の生物発光の量を示す。
【図１３Ｃ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体８７５の有効性を示す。図１３Ｃは、１８日目の、単離された脾臓における生物発光の量を示す。
【図１４Ａ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体１６６１（ＦｃγＲノックアウト変異体）の有効性を示す。図１４Ａは、腹臥位における全身の生物発光の量を示す。
【図１４Ｂ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体１６６１（ＦｃγＲノックアウト変異体）の有効性を示す。図１４Ｂは、仰臥位における全身の生物発光の量を示す。
【図１４Ｃ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体１６６１（ＦｃγＲノックアウト変異体）の有効性を示す。図１４Ｃは、全身生物発光の画像である。
【図１４Ｄ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体１６６１（ＦｃγＲノックアウト変異体）の有効性を示す。図１４Ｄは、１８日目に、単離された脾臓で検出された生物発光の量を示す。
【図１５】インビボマウス白血病モデルにおける、３ｍｇ／ｋｇ静脈内注射の２４時間後の二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９変異体の血清濃度の分析を示す。
【図１６】マウスＨＤ３７  ＶＬ及びＶＨ配列をベースとするヒト化ＣＤ１９  ＶＬ及びＶＨ配列を示す。３つのヒト化ＶＬ配列を提供している：ｈＶＬ２、ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）、及びｈＶＬ２（Ｄ−Ｓ）。ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）は、ＣＤＲ  Ｌ１におけるＤからＥへの置換を含有し、ｈＶＬ２（Ｄ−Ｓ）は、ＣＤＲ  Ｌ１におけるＤからＳへの置換を含有する。２つのヒト化ＶＨ配列ｈＶＨ２及びｈＶＨ３を提供している。ＣＤＲ配列は、囲みにより確認される。この図において確認されるＣＤＲは単なる例示である。当該技術分野で知られているように、ＣＤＲの同定は、それらを同定するために使用する方法に応じて変わり得る。抗ＣＤ１９  ＶＬ及びＶＨ配列についての代替のＣＤＲ定義を表Ｓ１に示す。野生型マウスＨＤ３７抗体配列に関してヒト化されたこれらの配列への修飾は、下線で示す。
【図１７−１】抗ＣＤ１９  ＨＤ３７抗体に基づく、抗ＣＤ１９  ＶＬ配列に関するＫａｂａｔに従う番号を示す表を示す。
【図１７−２】抗ＣＤ１９  ＨＤ３７抗体に基づく、抗ＣＤ１９  ＶＨ配列に関するＫａｂａｔに従う番号を示す表を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する二重特異性抗原結合構築物（例えば、抗体）（ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物）を本明細書に記載する。これらのＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物は、ＣＤ３イプシロンサブユニットに一価で結合する抗原結合ドメイン、ＣＤ１９に一価で結合する抗原結合ドメイン、及びヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む。両方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ形式であり、標準的な抗体製造プロトコルを使用して発現及び精製されたときの、抗体の収率、純度及び安定性により評価される製造性を改善するために遺伝子操作されている。
【００１５】
本明細書に記載のように治療用抗体または抗原結合構築物の開発を成功させるためには、構築物は、十分に高い力価を伴って生成されなければならず、発現された生成物は実質的に純粋でなければならない。抗体またはｓｃＦｖ構築物の精製後力価は、凝集物の形成及びタンパク質分解を最小にするために、発現宿主細胞内のタンパク質フォールディング及びプロセシング、及び精製プロセス中の構築物の安定性により、少なくとも部分的に決定される。
【００１６】
本明細書の他の部分に記載するように、抗原結合構築物は、フォールディング、発現、及び安定性の特定の態様を最適化するためにいくつかの修飾を組み込む。これらの修飾には、例えば、タンパク質フォールディング及び発現を改善するためのリンカー及びＶＨＶＬの向きの最適化；発現及び精製中に誤って折りたたまれた凝集物の形成を低減させるためのＶＨＶＬのジスルフィド遺伝子操作；及び、フォールディング、発現、のみならず精製プロセス中の安定性も最適化するための既知の安定したフレームワークへのＣＤＲ移植が含まれる。
【００１７】
本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ３発現Ｔ細胞とＣＤ１９発現Ｂ細胞を架橋することができ、それに伴って免疫シナプスが形成される。これらの抗原結合構築物は、インビトロ及びエキソビボアッセイにより測定され、疾患のインビボモデルにおいて評価される、Ｔ細胞誘引によるＢ細胞枯渇（T cell directed B cell depletion）を媒介することができる。従って、本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物は、患者における血中Ｂ細胞の数を低減させることが有益となる、リンパ腫及び白血病などの疾患の治療において有用である。
【００１８】
抗ＣＤ１９  ＨＤ３７抗体のＶＬ及びＶＨ配列をベースとする、ヒト化抗ＣＤ１９  ＶＬ及びＶＨ（抗ＣＤ１９  ｈｕＶＬＶＨ）配列も本明細書に記載する。これらの抗ＣＤ１９  ｈｕＶＬＶＨ配列は、本明細書に記載の二重特異性ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の抗ＣＤ１９抗原結合ドメインにおいて使用することができる。
【００１９】
二重特異性抗原結合構築物
ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する二重特異性抗原結合構築物（例えば、抗体）を本明細書に提供する。二重特異性抗原結合構築物は、それぞれｓｃＦｖでありＣＤ３またはＣＤ１９のいずれかに特異的に結合する、２つの抗原結合ポリペプチド構築物（例えば、抗原結合ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、既知の抗体または抗原結合構築物に由来する。より詳細に下記に記載するように、抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）であり、Ｆｃを含む。
【００２０】
「抗原結合構築物」という用語は、抗原に結合することができる任意の作用物質（例えば、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体）を指す。いくつかの態様では、抗原結合構築物は、対象となる抗原に特異的に結合するポリペプチドである。抗原結合構築物は、単量体、二量体、多量体、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質またはペプチド複合体；抗体、抗体断片、またはその抗原結合断片；ｓｃＦｖ等であることができる。抗原結合構築物は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であるポリペプチド構築物であることができる。いくつかの態様では、抗原結合構築物は、例えば、１つまたは複数のＦｃに連結された１つまたは複数の抗原結合構成要素（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含むことができる。抗原結合構築物のさらなる例は、以下に記載され、実施例にて提供される。
【００２１】
「二重特異性」という用語は、それぞれが特有の結合特異性を有する、２つの抗原結合部分を有する任意の作用物質、例えば、抗原結合構築物（例えば、抗原結合ポリペプチド構築物）を含むことが意図される。例えば、第一の抗原結合部分は、第一の抗原上のエピトープに結合し、第二の抗原結合部分は、第二の抗原上のエピトープに結合し、ここで第一の抗原は第二の抗原と異なる。
【００２２】
例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性薬剤は、（ａ）細胞表面標的分子及び（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し得るまたはそれらと相互作用し得る。別の実施形態では、薬剤は、（ａ）第一の細胞表面標的分子及び（ｂ）第一の細胞表面標的分子と異なる第二の細胞表面標的分子に結合し得るまたはそれらと相互作用し得る。別の実施形態では、薬剤は、２つの細胞に結合してそれらを架橋し得る、すなわち（ａ）第一の細胞上の第一の細胞表面標的分子及び（ｂ）第一の細胞の表面標的分子と異なる、第二の細胞上の第二の細胞表面標的分子と相互作用し得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ３発現Ｔ細胞とＣＤ１９発現Ｂ細胞を架橋して、免疫シナプスを形成させかつ／またはＴ細胞誘引によるＢ細胞枯渇を媒介する。
【００２４】
単一特異性抗原結合構築物は、単一の結合特異性を有する抗原結合構築物を指す。言い換えると、両方の抗原結合部分が同じ抗原上の同じエピトープに結合する。単一特異性抗原結合構築物の例には、例えば、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７及び抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３が含まれる。
【００２５】
抗原結合構築物は、抗体またはその抗原結合部分であることができる。本明細書中で用いるとき、「抗体」または「免疫グロブリン」は、分析物（例えば、抗原）に特異的に結合し、それを認識する、１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチド、またはその断片を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖により所有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、があり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００２６】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端ドメインは、主に抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖ドメインを指す。
【００２７】
ＩｇＧ１重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かってそれぞれＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ及びＣＬドメインからなる。ＩｇＧ１重鎖は、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間にヒンジを含む。
【００２８】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で用いる場合、配列において超可変である及び／または構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般に、天然の４本鎖抗体は６つのＨＶＲ；ＶＨにおいて３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬにおいて３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、一般的に、超可変ループから及び／または相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、配列変化が最も高く、及び／または抗原認識に関与する。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、通常、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、本明細書において互換可能に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）及び  ｂｙ  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７（１９８７）に記載されており、これらの定義は、互いに比較したときのアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。いずれにせよ、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためにいずれの定義を適用しても、本明細書において定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変化するだろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣行的に決定できる。
【００２９】
抗体のＣＤＲ領域を使用して、抗体、ｓｃＦｖ、ダイアボディ等を含むがこれらに限定されない、結合性タンパク質を構築し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、抗体からの少なくとも１つまたは全てのＣＤＲ領域を含むだろう。ＣＤＲ配列は、抗体骨格またはその断片に使用され得、同様にヒト化抗体、またはヒト化配列を含有する抗体を含み得る。抗体のＣＤＲ部分を同定する方法は当該技術分野で周知である。Ｓｈｉｒａｉ，Ｈ．，Ｋｉｄｅｒａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｈ３−ｒｕｌｅｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＲ−Ｈ３  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４５５（１）：１８８−１９７，１９９９；及び  Ａｌｍａｇｒｏ  Ｊ  Ｃ，Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−３３（２００８）を参照されたい。
【００３０】
抗原結合ポリペプチド構築物の形式
二重特異性抗原結合構築物は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物（例えば、抗原結合ドメイン）を含む。抗原結合ポリペプチド構築物の形式は、二重特異性抗原結合構築物の機能的特徴を決定する。一実施形態では、二重特異性抗原結合構築物は、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式を有する、すなわち両方の抗原結合ポリペプチド構築物はｓｃＦｖである。
【００３１】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」形式は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一ポリペプチド鎖で存在する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説には、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００３２】
他の抗原結合ポリペプチド構築物形式は、Ｆａｂ断片またはｓｄＡｂを含む。
【００３３】
「Ｆａｂ断片」（抗原結合断片とも称される）は、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を、それぞれ軽鎖及び重鎖上の可変ドメインＶＬ及びＶＨと共に含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも称される）を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。
【００３４】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」形式は、個々の免疫グロブリンドメインである。Ｓｄａｂは、かなり安定しており、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして容易に発現する（Ｈａｒｍｓｅｎ  ＭＭ，Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ＨＪ（２００７）．"Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｍｅｌｉｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ"．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２）。
【００３５】
ｓｃＦｖ形式
本明細書に記載の抗原結合構築物は、二重特異性であり、例えば、それらはそれぞれが異なる抗原に特異的に結合することができる、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。各抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖ形式である（すなわち、抗原結合ドメインは、ポリペプチドリンカーにより接続される、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成される）。一実施形態では、前記ｓｃＦｖは、ヒトである。別の実施形態では、前記ｓｃＦｖ分子は、ヒト化されている。ｓｃＦｖは、下記の修飾により、タンパク質発現及び収率に最適化される。
【００３６】
ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖにおける可変ドメインＶＬ及びＶＨの順序を変更することにより最適化されることができる。本明細書に記載の抗原結合構築物内のｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、軽鎖可変領域のＣ末端は重鎖可変領域のＮ末端に接続されてよく、または重鎖可変領域のＣ末端は軽鎖可変領域のＮ末端に接続されてよい。
【００３７】
可変領域は、機能的抗原結合部分の形成を可能にする、リンカーペプチド、またはｓｃＦｖリンカーを介して接続され得る。ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖリンカーポリペプチドの組成及び／または長さを変更することによりタンパク質発現及び収率について最適化されることができる。典型的なペプチドリンカーは、約２〜２０個のアミノ酸を含み、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野で公知である。好適な、非免疫原生リンカーペプチドには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、Ｇ４（ＳＧ４）ｎまたはＧ２（ＳＧ２）ｎリンカーペプチドが含まれ、ここでｎは、一般的には、１から１０の間、典型的には２から４の間の数である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、下記の表から選択される。
【００３９】
（表Ｂ）ｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列
2017504328.tif 000002
【００４０】
ｓｃＦｖ分子は、例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４，１２３９−１２４５（１９９６））に記載のように、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間のジスルフィド架橋の安定化を含むことにより、タンパク質発現及び収率について最適化され得る。従って、一実施形態では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ｓｃＦｖ分子を含み、ここで重鎖可変ドメイン内のアミノ酸及び軽鎖可変ドメイン内のアミノ酸は、ジスルフィド架橋が重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間で形成され得るように、システインにより置換されている。特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインの４４位のアミノ酸及び重鎖可変ドメインの１００位のアミノ酸がシステインにより置換されている（Ｋａｂａｔナンバリング）。
【００４１】
当該技術分野で公知であり、［Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１０  Ｊｕｌ；２３（７）：５４９−５７；Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３（３）：２４３−５；Ｐｅｒｃｈｉａｃｃａ  ＆  Ｔｅｓｓｉｅｒ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．２０１２；３：２６３−８６．］に記載されているように、ｓｃＦｖは、ＣＤＲ配列の変異により安定化されることもできる。
【００４２】
ヒト化ＣＤ１９  ＶＨ及びＶＬ
いくつかの実施形態では、及び本明細書に記載の抗原結合構築物をさらに安定化させるためには、ＨＤ３７抗ＣＤ１９抗体の野生型配列は、ヒト化ＶＨ及びＶＬポリペプチド配列を生成するように修飾されることができる。フレームワーク領域及びＣＤＲの両方への修飾は、抗原結合構築物のＣＤ１９結合性ｓｃＦｖにおいて使用されるＶＨ及びＶＬポリペプチド配列を得るために、なされ得る。いくつかの実施形態では、修飾は図１６に示されるそれであり、修飾されたＣＤＲの配列、ＶＨ及びＶＬポリペプチド配列は、表Ｓ２及びＳ３に示されるそれである。
【００４３】
ｓｃＦｖの形式及び配列への上記修飾の１つまたは複数が、抗原結合構築物のｓｃＦｖに適用され得る。
【００４４】
抗原結合ポリペプチド構築物の抗原
本明細書に記載の抗原結合構築物は、ＣＤ３抗原及びＣＤ１９抗原に特異的に結合する。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して、抗原結合部分−抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続した区間または連続していないアミノ酸の異なる領域からなる立体配座立体配置）を指す。エピトープは、典型的に、少なくとも３個、より一般的には少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を、固有の空間立体配座に含む。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドにより有効に遮断されるアミノ酸残基を含み得る；言い換えると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。同じエピトープを認識する抗体は、別の抗体の標的抗原への結合を遮断する１つの抗体の能力を示す簡単なイムノアッセイにおいて確認することができる。
【００４６】
「特異的に結合」、「特異的結合」または「選択的結合」は、結合が抗原に関して選択的であり、望ましくないまたは非特異的な相互作用とは区別されることができることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合構築物の能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）または当業者に周知のその他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７，３２３−３２９（２０００））、及び伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８，２１７−２２９（２００２））により測定されることができる。一実施形態では、非関連タンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定したとき、抗原への抗原結合構築物の結合の約１０％未満である。
【００４７】
ある特定の実施形態では、抗原に結合する抗原結合構築物、またはその抗原結合部分を含む抗原結合分子が有する解離定数（ＫＤ）は、１μΜ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０１ｎＭ未満、または０．００１ｎＭ未満（例えば、１０〜８Ｍ以下、例えば１０〜８Ｍから１０"１３Ｍ、例えば１０"９Ｍから１０"１３Ｍ）である。
【００４８】
「親和性」は、分子（例えば、受容体）とその結合パートナー（例えば、リガンド）の単一結合部位間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書中で用いるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗原結合部分と抗原、または受容体とそのリガンド）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹへの親和性は、一般的に、解離及び会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である、解離定数（ＫＤ）により表すことができる。従って、速度定数の比が同じままである限り、等しい親和性は異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当該技術分野で公知の十分に確立された方法により測定されることができる。親和性を測定するための具体的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、または対象となる抗原を発現する細胞を用いるホールセル結合アッセイである。
【００４９】
「結合減少」、例えばＦｃ受容体への結合減少は、例えばＳＰＲにより測定したとき、それぞれの相互作用に関する親和性における低減を指す。明確にすると、この用語は、親和性のゼロへの（または分析方法の検出限界より下への）減少、すなわち相互作用の完全消失も含む。逆に、「結合増大」は、それぞれの相互作用に関する結合親和性における増大を指す。
【００５０】
「活性化Ｔ細胞抗原」は、本明細書中で用いるとき、抗原結合分子と相互作用するとＴ細胞活性化を誘導し得る、Ｔリンパ球（特に細胞障害性Ｔリンパ球）の表面上で発現される抗原決定基を指す。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原の相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することにより、Ｔ細胞活性化を誘導し得る。特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【００５１】
「Ｔ細胞活性化」は、本明細書中で用いるとき、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞障害性エフェクター分子放出、細胞障害活性及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞障害性Ｔリンパ球の１つまたは複数の細胞性応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための好適なアッセイは、本明細書に記載の当該技術分野で公知である。
【００５２】
「標的細胞抗原」は、本明細書中で用いるとき、標的細胞（例えば、癌細胞または腫瘍間質の細胞などの腫瘍内のＢ細胞）の表面上に提示される抗原決定基を指す。本明細書中で用いるとき、「第一の」及び「第二の」という用語は、抗原結合部分等に関しては、複数の各型の部分が存在する場合、区別を便利にするために用いられる。これらの用語の使用は、明白に記述されない限り、Ｔ細胞を活性化させる二重特異性抗原結合分子の具体的順序または方向を付与するようには意図されない。
【００５３】
「異種間結合」または「種間結合」という用語は、本明細書で用いる場合、ヒト及び他の生物、例えば、これ限定されないが、非チンパンジー霊長類、における同一の標的分子への、本明細書に記載の結合性ドメインの結合を意味する。ゆえに、「異種間結合」または「種間結合」は、異なる種において発現される同一の分子「Ｘ」（すなわち、ホモログ）に対するが、「Ｘ」以外の分子に対するものではない、種間反応性であると理解されたい。例えば、ヒトＣＤ３イプシロンを認識するモノクローナル抗体の、非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロン（例えば、マカクＣＤ３イプシロン）への異種特異性は、例えば、ＦＡＣＳ分析により決定されることができる。ＦＡＣＳ分析は、それぞれのモノクローナル抗体が、それぞれ前記ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３イプシロン抗原を発現するヒト及び非チンパンジー霊長類細胞、例えばマカク細胞への結合について試験される方法で実施される。適切なアッセイを以下の実施例で示す。上記内容は、ＣＤ１９に関して準用される。ＦＡＣＳ分析は、それぞれのモノクローナル抗体が、前記ヒト及び非チンパンジー霊長類ＣＤ３またはＣＤ１９抗原を発現するヒト及び非チンパンジー霊長類細胞（例えば、マカク細胞）への結合について試験される方法で実施される。
【００５４】
ＣＤ３
本明細書に記載の抗原結合構築物は、ＣＤ３抗原に特異的に結合する。
【００５５】
本明細書で記載されるとき「ＣＤ３」または「ＣＤ３複合体」は、成熟Ｔリンパ球中の少なくとも５つの膜結合ポリペプチドの複合体であり、互いに、そしてＴ細胞受容体と非共有結合的に会合している。ＣＤ３複合体は、ガンマ、デルタ、イプシロン、ゼータ鎖（サブユニットとも呼ばれる）を含む。非ヒトモノクローナル抗体は、マウス抗体ＯＫＴ３、ＳＰ３４、ＵＣＨＴ１または６４．１により例示されるように、これらの鎖のいくつかに対して開発されている（例えば、Ｊｕｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３９４５−３９５２（１９８６）；Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００（１９８６）；及びＨａｙｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：８７−９２（１９８８）を参照されたい）。Ｔ細胞上のＣＤ３の、例えば、固定化抗ＣＤ３抗体による、クラスタリングは、Ｔ細胞受容体の係合に類似しているが、そのクローン典型的特異性とは独立したＴ細胞活性化をもたらす。大半の抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３ε鎖を認識する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、既知の抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖであるかまたはそれに由来し、例えば、既知の抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖの修飾体である。本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物において採用される可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を提供するヒトＣＤ３に対して向けられた抗体は、当該技術分野で知られており、ＯＫＴ３（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ−ＯＫＴ３（商標）（ムロモナブＣＤ３）を含む。追加の抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３抗原のイプシロンサブユニットへのＯＫＴ３の結合を５０％以上遮断する「ＯＫＴ３遮断抗体」を含む。例としては、Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ（商標）（ＭＧＡ０３１、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；ＵＣＨＴ１（Ｐｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８７  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３５（１１）：１３２９−３８）；ＮＩ０４０１（ＷＯ２００７／０３３２３０）；及びビジリズマブ（ＵＳ２５８３４５９７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
一実施形態では、二重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ３抗原に一価で特異的に結合するＣＤ３抗原結合ポリペプチド構築物を含み、ここでＣＤ３抗原結合ポリペプチド構築物は、ＯＫＴ３（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ−ＯＫＴ３（商標）（ムロモナブＣＤ３）に由来する。一実施形態では、二重特異性抗原結合構築物は、ＣＤ３抗原に一価で特異的に結合するＣＤ３抗原結合ポリペプチド構築物を含み、前記ＣＤ３抗原結合ポリペプチドのＶＨ及びＶＬ領域は、ＣＤ３イプシロン特異的抗体ＯＫＴ３に由来する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９への第一のｓｃＦｖの結合親和性は、約０．１ｎＭから約５ｎＭの間、または５．０、４．０、３．０、２．０、１．０、０．９、．０９、０．９、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３未満または０．２ｎＭ未満である。
【００５９】
ＯＫＴ３抗体が結合するＣＤ３イプシロンサブユニット上のエピトープは、ＣＤ３イプシロンに結合したＯＫＴ３の結晶構造の分析により同定される（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：７６７５−７６８０）。ＣＤ３イプシロンのポリペプチド配列を下記の表に提供する。
【００６０】
（表Ｆ）ＣＤ３イプシロン配列
2017504328.tif 000003
【００６１】
この構造の分析は、表Ｆの配列に関して、ＯＫＴ３抗体のＣＤＲが、ヒトＣＤ３イプシロンに残基５６−５７（ＳＥ）、６８−７０（ＧＤＥ）、及び１０１−１０７（ＲＧＳＫＰＥＤ）で接触することを示す。これらの残基における結合ホットスポットに下線を引いている。これらの残基は、ＯＫＴ３が結合するエピトープと考えられる。従って、本明細書に記載の抗原結合構築物は、このエピトープに特異的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。
【００６２】
少なくとも１つのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３複合体に結合する少なくとも１つのＣＤ３結合性ポリペプチド構築物を含む抗原結合構築物であって、ＣＤ３発現細胞がＴ細胞である、前記構築物を本明細書に提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３発現細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３発現細胞は、非ヒト、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞障害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００６３】
本明細書に提供する抗原結合構築物のある特定の実施形態では、構築物は、Ｂ細胞などの標的細胞に対するＴ細胞の細胞障害活性の活性化および再動員が可能である。特定の一実施形態では、前記再動員は、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原提示及び／またはＴ細胞の特異性とは独立している。
【００６４】
ＣＤ１９
本明細書に記載の抗原結合構築物は、ＣＤ１９抗原に結合する抗原結合ポリペプチド構築物（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ）を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは、既知の抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖであるかまたはそれに由来し、例えば、既知の抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖの修飾体である。本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物において採用される可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を提供する抗ＣＤ１９に対して向けられた抗体は、当該技術分野で知られており、ＨＤ３７ハイブリドーマにより提供されるＨＤ３７を含む（Ｐｅｚｚｕｔｔｏ（１９９７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８，２７９３−９）。追加の抗ＣＤ１９抗体は、ＣＤ１９抗原へのＨＤ３７の結合を５０％以上遮断する「ＨＤ３７遮断抗体」を含む。例としては、ＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ）（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１９８９；及びＰｅｚｚｕｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８（９）：２７９３−２７９９（１９８７））；４Ｇ７（Ｍｅｅｃｋｅｒ（１９８４）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ３，３０５−２０）；Ｂ４（Ｆｒｅｅｄｍａｎ（１９８７）Ｂｌｏｏｄ  ７０，４１８−２７）；Ｂ４３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５，２３４６−５１）及びＭｏｒ−２０８（Ｈａｍｍｅｒ（２０１２）Ｍａｂｓ４：５，５７１−５７７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
一実施形態では、前記ＶＨ（ＣＤ１９）及びＶＬ（ＣＤ１９）領域（またはＣＤＲのような、その一部）は、ＨＤ３７ハイブリドーマにより提供される、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７に由来する（Ｐｅｚｚｕｔｔｏ（１９９７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８，２７９３−９）。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３のイプシロンサブユニットへの第二のｓｃＦｖの結合親和性は、約１ｎＭから約１００ｎＭの間、または約２０ｎＭから約１００ｎＭの間、または、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０より大きい、または９０ｎＭより大きい。
【００６８】
ある特定の実施形態では、少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｂ細胞上のＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ構築物である。いくつかの実施形態では、前記ｓｃＦｖ構築物は哺乳動物である。一実施形態では、前記ｓｃＦｖ構築物はヒトである。別の実施形態では、前記ｓｃＦｖ構築物はヒト化されている。なおも別の実施形態では、前記ｓｃＦｖ構築物は、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域の少なくとも１つを含む。
【００６９】
ある特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｂ細胞の表面上に発現された少なくとも１つの抗原への異種間結合を呈する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物の抗原結合ポリペプチド構築物は、哺乳動物ＣＤ１９の少なくとも１つに結合する。ある特定の実施形態では、ＣＤ１９抗原結合ポリペプチド構築物は、ヒトＣＤ１９に結合する。
【００７０】
抗原結合構築物のＦｃ
本明細書に記載の抗原結合構築物は、Ｆｃ、例えば、二量体Ｆｃを含む。Ｆｃは、それぞれが修飾ＣＨ３配列を含む第一及び第二のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃであり、ここで各修飾ＣＨ３配列は、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、二量体化ＣＨ３ドメインは、約６８℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ここで第一のＦｃポリペプチドは第一のヒンジリンカーにより第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、第二のＦｃポリペプチドは第二のヒンジリンカーにより第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている。
【００７１】
「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。本明細書で別段の指定がない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。本明細書で用いる場合、二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定的に自己会合できる、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体ＩｇＧ  ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。
【００７２】
Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ３及びＣＨ２ドメインのいずれかを含む。ＣＨ３ドメインは、２つのＣＨ３配列を含み、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドからそれぞれ１つである。ＣＨ２ドメインは、２つのＣＨ２配列を含み、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドからそれぞれ１つである。
【００７３】
いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つまたは２つのＣＨ３配列を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、１つまたは複数のリンカーを伴ってまたは伴わずに、第一の抗原結合構築物及び／または第二の抗原結合構築物と結合する。いくつかの態様では、Ｆｃは、ヒトＦｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは、ヘテロ二量体Ｆｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つまたは２つのＣＨ２配列を含む。
【００７４】
いくつかの態様では、Ｆｃは、ＣＨ３配列の少なくとも１つにおいて１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、ＣＨ２配列の少なくとも１つにおいて１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、単一ポリペプチドである。いくつかの態様では、Ｆｃは、複数のペプチド、例えば、２つのポリペプチドである。
【００７５】
いくつかの態様では、Ｆｃは、２０１１年１１月４日に出願された特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８、または２０１２年１１月２日に出願された特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０に記載されるＦｃであり、これらの各々の開示全体は全ての対象となるために参照によって本明細書に組み込まれている。
【００７６】
修飾ＣＨ３ドメイン
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、非対称的に修飾されている修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む。ヘテロ二量体Ｆｃは、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド：第一のＦｃポリペプチド及び第二のＦｃポリペプチドを含むことができ、これは、Ｆｃが１つの第一のＦｃポリペプチド及び１つの第二のＦｃポリペプチドを含むならば、互換可能に使用することができる。一般に、第一のＦｃポリペプチドは、第一のＣＨ３配列を含み、第二のＦｃポリペプチドは、第二のＣＨ３配列を含む。
【００７７】
非対称様式で導入される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む２つのＣＨ３配列は、概して、２つのＣＨ３配列が二量体化するときに、ホモ二量体よりもむしろ、ヘテロ二量体Ｆｃをもたらす。本明細書で用いる場合、「非対称性アミノ酸修飾」とは、第一のＣＨ３配列上の特定の位置のアミノ酸が、同じ位置の第二のＣＨ３配列上のアミノ酸とは異なり、第一及び第二のＣＨ３配列が、ホモ二量体ではなくヘテロ二量体を形成するために優先的に対合する、任意の修飾を指す。このヘテロ二量体化は、各配列上の同じそれぞれのアミノ酸位置の２つのアミノ酸のうちの１つのみの修飾；または第一及び第二の各々のＣＨ３配列上の同じそれぞれの位置での各配列上の両方のアミノ酸の修飾の結果であり得る。ヘテロ二量体Ｆｃの第一及び第二のＣＨ３配列は、１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾を含むことができる。
【００７８】
表Ａは、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に対応する、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列のアミノ酸配列を提供する。アミノ酸２３１〜２３８は下方ヒンジとも呼ばれる。ＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。
【００７９】
典型的には、Ｆｃは、二量体化することができる２つの連続した重鎖配列（Ａ及びＢ）を含むことができる。本明細書に記載の抗原結合構築物に関して、いくつかの実施形態では、第一のｓｃＦｖは、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａに連結されており、第二のｓｃＦｖは、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂに連結されている。いくつかの実施形態では、第二のｓｃＦｖは、ヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ａに連結されており、第一のｓｃＦｖはヘテロ二量体Ｆｃの鎖Ｂに連結されている。
【００８０】
いくつかの態様では、Ｆｃのうちの一方または両方の配列は、ＥＵナンバリングを用いた、Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００、及び／またはＮ３９０の位置で、１つまたは複数の変異または修飾を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、表Ｘに示される変異配列を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体１Ａ-Ｂの変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体２Ａ-Ｂの変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体３Ａ-Ｂの変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体４Ａ-Ｂの変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体５Ａ-Ｂの変異を含む。
【００８１】
（表Ａ）ＩｇＧ１  Ｆｃ配列及び変異体
2017504328.tif 000004
【００８２】
第一及び第二のＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に関して本明細書に記載のアミノ酸変異を含むことができる。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｆ４０５及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含む。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列、及びＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗから選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含む。
【００８３】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、第一または第二のＣＨ３配列のうちの１つは、Ｑ３４７の位置でアミノ酸修飾をさらに含み、他方のＣＨ３配列は、Ｋ３６０の位置でアミノ酸修飾をさらに含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、第一または第二のＣＨ３配列のうちの１つは、Ｑ３４７の位置でアミノ酸修飾をさらに含み、他方のＣＨ３配列は、Ｋ３６０の位置でアミノ酸修飾をさらに含み、前記ＣＨ３配列の１つまたは両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む。
【００８４】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、前記第一及び第二のＣＨ３配列のうちの１つは、Ｄ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾をさらに含み、他方のＣＨ３配列は、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、及びＫ３９２Ｄのうちの１つまたは複数を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、前記第一及び第二のＣＨ３配列のうちの１つは、Ｄ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾をさらに含み、他方のＣＨ３配列は、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、及びＫ３９２Ｄのうちの１つまたは複数を含み、前記ＣＨ３配列のうちの１つまたは両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む。
【００８５】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５、及びＹ４０７の位置でアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列と、Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４の位置でアミノ酸修飾を有する第二のＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、前記ＣＨ３配列のうちの１つまたは両方は、Ｔ３５０Ｖのアミノ酸修飾をさらに含む。
【００８６】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、以下のアミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを含み、「Ａ」は、第一のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表し、「Ｂ」は、第二のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表す：Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び／またはＢ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。
【００８７】
１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが野生型ホモ二量体ＣＨ３ドメインに匹敵する安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進することができる。一実施形態では、１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが野生型ホモ二量体Ｆｃドメインに匹敵する安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する。一実施形態では、１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが示差走査熱量測定試験における融解温度（Ｔｍ）を介して観察された安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進し、ここで融解温度は、対応する対称性の野生型ホモ二量体Ｆｃドメインに関して観察されたものの４℃以内である。いくつかの態様では、Ｆｃは、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する、ＣＨ３配列のうちの少なくとも１つにおける１つまたは複数の修飾を含む。
【００８８】
一実施形態では、ＣＨ３ドメインの安定性は、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によりＣＨ３ドメインの融解温度を測定することにより評価することができる。従って、さらなる実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約６８℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７２℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７３℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７５℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７８℃以上の融解温度を有する。いくつかの態様では、二量体化ＣＨ３配列は、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃、またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、修飾ＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃは、発現生成物におけるホモ二量体Ｆｃと比較して少なくとも約７５％の純度で形成されることができる。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８０％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８５％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９０％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９５％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９７％超の純度で形成される。いくつかの態様では、Ｆｃは、発現されるとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％超の純度で形成されるヘテロ二量体である。いくつかの態様では、Ｆｃは、単一細胞により発現されるとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％超の純度で形成されるヘテロ二量体である。
【００９０】
ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するために単量体Ｆｃポリペプチドを修飾するためのさらなる方法は、国際特許公開番号ＷＯ９６／０２７０１１（ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ））に、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７−４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）に，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄａｖｉｓ，ＪＨ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ；２３（４）：１９５−２０２，ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に、及びＬａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ１  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦ，Ｍｅｅｓｔｅｒｓ  ＪＩ，ｄｅ  Ｇｏｅｉｊ  ＢＥ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｅｍｅｒ  ＥＴ，Ｎｅｉｊｓｓｅｎ  Ｊ，ｖａｎ  Ｋａｍｐｅｎ  ＭＤ，Ｓｔｒｕｍａｎｅ  Ｋ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ  Ｓ，Ｋｕｎｄｕ  Ａ，Ｇｒａｍｅｒ  ＭＪ，ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ  ＰＨ，ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  ＪＧ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ，Ｐａｒｒｅｎ  ＰＷ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ｍａｒ  ２６；１１０（１３）：５１４５−５０に記載されている。
【００９１】
ＣＨ２ドメイン
上に示すように、いくつかの実施形態では、抗原結合構築物のＦｃは、ＣＨ３ドメインに加えてＣＨ２ドメインを含む。一例として、ＩｇＧ１  ＦｃのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列は、表Ａに示す配列のアミノ酸２３９−３４０として同定される。ＦｃのＣＨ２ドメインは、Ｆｃ受容体及び補体に結合し、ゆえに、エフェクター細胞機能の媒介に関与する。
【００９２】
「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用され、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）及び新生児受容体ＦｃＲｎを含む。
【００９３】
一般に、ＦｃγＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ヒトにおけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、対立遺伝子の変異体及びこれらの受容体の選択的スプライス型（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｆｏｒｍ）を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、それらの細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。他のアイソタイプの免疫グロブリンもまた、ある特定のＦｃＲによって結合されることができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ  ｅｄ．，１９９９）を参照されたい）。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をその細胞質ドメイン内に含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）をその細胞質ドメイン内に含有する（Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７））．ＦｃＲｓ  ａｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及び  ｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において概説される）。将来的に同定されるものを含む他のＦｃγＲは、本明細書において「ＦｃＲ」という用語に包含される。ＦｃγＲはまた、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含むがこれらに限定されない、他の生物においても見いだされる。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）が含まれるがこれらに限定されない。ＦｃγＲはＮＫ細胞またはＢ細胞などのエフェクター細胞によって発現される。
【００９４】
補体活性化は、抗原−抗体複合体への補体タンパク質Ｃ１ｑの結合を要する。ＦｃのＣＨ２ドメイン内の残基は、Ｃ１ｑとＦｃ間の相互作用に関与する。
【００９５】
本明細書に記載の抗原結合構築物は、ＦｃＲｎと結合することができる。当該技術分野で知られているように、ＦｃＲｎへの結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流へと戻して再利用する（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６）。このプロセスは、完全長分子のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と合わさって、１〜３週間の範囲の好ましい抗体血清半減期をもたらす。ＦｃＲｎへのＦｃの結合はまた、抗体輸送において重要な役割を果たす。ＦｃＲｎは、胎児への母体ＩｇＧの移送を担う（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。ＩｇＧへのＦｃＲｎの結合は、ＦｃのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン内の残基を必然的に含む。
【００９６】
ＣＨ２ドメインにおける修飾は、ＦｃへのＦｃＲの結合に影響を与えることができる。上に示すように、ＦｃのＣＨ２ドメインは、２つのＣＨ２配列を含み、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチド上にそれぞれ１つずつある。典型的には、ＣＨ２ドメインへの修飾は対称的であり、ゆえに、Ｆｃポリペプチドの両方のＣＨ２配列上で同一である。しかしながら、非対称性の変異は、ヘテロ二量体化を増強するＣＨ３ドメインへの変異の存在下においても可能である。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲもしくはＣ１ｑ結合及び／またはエフェクター機能を低減させる修飾を含む。
【００９７】
エフェクター機能を低減させる修飾：
ＦｃγＲ及び／もしくは補体結合及び／またはエフェクター機能を低減させるＦｃ修飾は、当該技術分野で知られている。近年の刊行物には、エフェクター活性を低減または沈黙させた抗体を遺伝子操作するために使用されている戦略が記載されている（Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ（２００９），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０：６８５−６９１、及びＳｔｒｏｈｌ，ＷＲ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｈｌ  ＬＭ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ"Ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ  ２２５−２４９を参照されたい）。これらの戦略には、グリコシル化の修飾、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４骨格の使用、またはＦｃのヒンジまたはＣＨ２領域における変異の導入を介したエフェクター機能の低減が含まれる。例えば、米国特許公開第２０１１／０２１２０８７号（Ｓｔｒｏｈｌ）、国際特許公開番号ＷＯ２００６／１０５３３８（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２２５０５８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２５１５３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＳｔｒｏｐら（（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９）には、ＦｃへのＦｃγＲまたは補体結合を低減させる具体的な修飾が記載されている。
【００９８】
ＦｃへのＦｃγＲまたは補体結合を減少させる、公知の対称的なアミノ酸修飾の具体的で非限定的な例には、以下の表で同定されたものが挙げられる。
【００９９】
（表Ｃ）Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体の結合を減少させる修飾
2017504328.tif 000005
【０１００】
一実施形態では、Ｆｃは、上記の表において同定される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、またはＤ２６５のうちの少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５でアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ｓを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、Ｆｃは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５０５０７に記載のように、１つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾をＦｃの下方ヒンジ領域において含む。ＦｃγＲ結合を減少させるそのような非対称性アミノ酸修飾の例を、表Ｄに示す。
【０１０２】
（表Ｄ）ＦｃγＲ結合を減少させる非対称性変異
2017504328.tif 000006
【０１０３】
ヒンジリンカー
本明細書に記載の抗原結合構築物では、第一のＦｃポリペプチドは第一のヒンジリンカーにより第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、第二のＦｃポリペプチドは第二のヒンジリンカーにより第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている。ヒンジリンカー配列の例は、当業者に周知であり、本明細書に記載の抗原結合構築物において使用されることができる。あるいは、既知のヒンジリンカーの修飾体を使用することができる。
【０１０４】
ヒンジリンカーポリペプチドは、それらが抗原結合構築物の機能活性を維持するまたは最適化するように選択される。好適なリンカーポリペプチドには、上方のヒンジ配列及びコアヒンジ配列を含む、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４からのものなどのＩｇＧヒンジ領域を含む。上方及びコアヒンジ配列に対応するアミノ酸残基は、ＩｇＧ型に応じて変わり、当該技術分野で知られているように、当業者は所与のＩｇＧ型に関してそのような配列を容易に同定することができるだろう。これらの例示的なリンカーの修飾体も使用することができる。例えば、ＩｇＧ４ヒンジの安定性を改善するための修飾が当該技術分野で公知である（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７，７６７−７７１を参照されたい）。ヒンジリンカー配列の例は、以下の表に見いだされる。
【０１０５】
（表Ｅ）ヒンジリンカーポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５１−３６０）
2017504328.tif 000007
【０１０６】
解離定数（ＫＤ）及び最大結合（Ｂｍａｘ）
いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、解離定数及び最大結合を含むがこれらに限定されない機能的特徴によって説明される。
【０１０７】
本明細書で用いる場合、「解離定数（ＫＤ）」という用語は、特定のリガンド−タンパク質相互作用の平衡解離定数を指すと意図される。本明細書で用いる場合、リガンド−タンパク質相互作用とは、これらに限定されないが、タンパク質−タンパク質相互作用または抗体−抗原相互作用を指す。ＫＤは、より小さい成分（Ａ＋Ｂ）へと可逆的に解離するために２つのタンパク質（例えば、ＡＢ）の傾向を測定し、「オフ速度（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度の会合速度すなわち「オン速度（ｋｏｎ）」に対する比として定義される。従って、ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤが小さくなるほど、結合の親和性は強くなることが分かる。従って、１ｍＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比較して弱い結合親和性を示す。抗原結合構築物のＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗原結合構築物のＫＤを決定する１つの方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いること、典型的には、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、決定に使用することができる別の方法である。
【０１０８】
「Ｂｍａｘ」、または最大結合という用語は、抗原結合構築物の飽和濃度での細胞上の最大抗原結合構築物結合レベルを指す。このパラメーターは、相対比較のために任意単位ＭＦＩで報告することができ、または標準曲線を利用して細胞に結合した抗原結合構築物の数に対応する絶対値に変換することができる。
【０１０９】
抗原結合構築物の結合特徴は、種々の技術で決定することができる。そのうちの１つは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、蛍光活性化セルソーティング）による抗原を発現する標的細胞への結合の測定である。典型的に、そのような実験では、対象となる抗原を発現する標的細胞を、異なる濃度で抗原結合構築物とインキュベートし、洗浄し、抗原結合構築物を検出するための二次剤とインキュベートし、洗浄し、フローサイトメーターで分析して、細胞上の検出シグナルの強度を表す中央蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、これが今度は細胞に結合した抗原結合構築物の数に関連する。次いで、抗原結合構築物濃度対ＭＦＩデータを飽和結合式に当てはめて、２つの重要な結合パラメーターであるＢｍａｘと見かけのＫＤとを得る。
【０１１０】
見かけのＫＤ、すなわち見かけの平衡解離定数は、最大半量細胞結合が観察される抗原結合構築物濃度を表す。明らかに、ＫＤ値が小さいほど、より少ない抗原結合構築物濃度が最大細胞結合に到達するのに必要とされ、ゆえに抗原結合構築物の親和性はより高くなる。見かけのＫＤは、細胞上に発現される異なる受容体レベル及びインキュベーション条件などの、細胞結合実験の条件に依存しており、ゆえに見かけのＫＤは、ＳＰＲ及びＩＴＣなどの無細胞分子実験から決定されたＫＤ値とは一般的に異なる。しかしながら、異なる方法の間で良好な一致が一般に得られる。
【０１１１】
抗原結合構築物の調製方法
本明細書に記載の抗原結合構築物は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて生成され得る。
【０１１２】
一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物をコードする単離された核酸を提供する。そのような核酸は、抗原結合構築物のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗原結合構築物の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。一実施形態では、核酸は、マルチシストロン性ベクターで提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞を提供する。そのような一実施形態では、宿主細胞は：（１）抗原結合構築物のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗原結合ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗原結合ポリペプチド構築物のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター及び抗原結合ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクター、を含む（例えば、それらで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は、真核性であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗原結合構築物を作製する方法を提供し、前記方法は、抗原結合構築物の発現に好適な条件下で、上記に提供されるように抗原結合構築物をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び任意選択的に宿主細胞（また宿主細胞培養培地）から抗原結合構築物を回収することを含む。
【０１１３】
抗原結合構築物の組換え生成に関して、例えば、上記のように、抗原結合構築物をコードする核酸は、単離され、宿主細胞における更なるクローニング及び／または発現のために１つまたは複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗原結合構築物の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０１１４】
抗原結合構築物をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核または真核細胞を含む。
【０１１５】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に用いられる方法、例えば、直接取込み、形質導入、ｆ交配、または当該技術分野で知られている組換え宿主細胞を作製するための他の方法にかかわらず、外来性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター、例えばプラスミドとして維持されてもよく、または代替として、宿主ゲノムに統合されてもよい。
【０１１６】
本明細書で用いる場合、「真核生物」という用語は、動物（哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類等を含むが、これらに限定されない）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類等を含むが、これらに限定されない）、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等の系統学的ドメイン（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）の真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物を指す。
【０１１７】
本明細書で用いる場合、「原核生物」という用語は、原核の生物を指す。例えば、非真核の生物は、真正細菌（大腸菌、サーマス・サーモフィラス、バチルス・ステアロサーモフィルス、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・プチダ等を含むが、これらに限定されない）系統学的ドメイン、または古細菌（メタノコッカス・ジャナスキー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロバクテリウム種（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＲＣ−１等のハロバクテリウム属、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロピラム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）等を含むが、これらに限定されない）系統学的ドメインに属することができる。
【０１１８】
例えば、抗原結合構築物は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において生成されてもよい。細菌における抗原結合構築物断片及びポリペプチドの発現に関しては、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい（また、大腸菌における抗体断片の発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい）。発現後、抗原結合構築物は、可溶性画分における細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製されることができる。
【０１１９】
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母などの真核微生物は、抗原結合構築物をコードするベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主であり、それには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗原結合構築物の生成をもたらす真菌株及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
【０１２０】
グリコシル化抗原結合構築物の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と合わせて使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０１２１】
植物細胞培養物は、宿主としても活用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗原結合構築物を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
【０１２２】
脊椎動物細胞も宿主として使用してよい。例えば、懸濁液内での増殖に順化した哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ-７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３または２９３細胞）；幼ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ-７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されるようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０）；及びＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗原結合構築物の生成に好適な、ある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０１２３】
一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、少なくとも１つの安定した哺乳動物細胞に、抗原結合構築物をコードする核酸を所定の比率でトランスフェクトすることと；少なくとも１つの哺乳動物細胞内で核酸を発現させることとを含む方法によって、安定した哺乳動物細胞内で生成される。いくつかの実施形態では、核酸の所定の比率は、発現産物中で最も高い割合（％）の抗原結合構築物をもたらす入力核酸の相対比を決定するための一過的なトランスフェクション実験で決定する。
【０１２４】
必要とされる場合、抗原結合構築物は、発現後に精製または単離されることができる。タンパク質は、当業者に公知の様々な方法で単離または精製され得る。標準的な精製方法には、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、及び逆相を含むクロマトグラフィー技術が含まれ、大気圧または高圧でＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して実施される。精製方法には、電気泳動、免疫学、沈殿、透析、及びクロマトフォーカシングの技術も含まれる。タンパク質濃縮と合わせて限外濾過及びダイアフィルトレーション技術も有用である。当該技術分野で周知のように、様々な天然タンパク質が、Ｆｃ及び抗体と結合し、これらのタンパク質は、抗原結合構築物の精製について本発明において用途を見出し得る。例えば、細菌のプロテインＡ及びＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌のプロテインＬは、いくつかの抗体のＦａｂ領域に結合する。精製は、しばしば、特定の融合パートナーにより可能にすることができる。例えば、抗体は、ＧＳＴ融合体が採用されている場合にはグルタチオン樹脂を、Ｈｉｓ−タグが採用されている場合にはＮｉ＋２親和性クロマトグラフィーを、ｆｌａｇ−タグが使用されている場合には固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して、精製され得る。好適な精製技術における一般的な手引きには、例えば、参照によりその全体が組み込まれるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄＥｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。必要な精製度は、抗原結合構築物の用途に応じて異なるだろう。いくつかの例では、精製は必要ない。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、抗原結合構築物は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製され、陰イオン交換クロマトグラフィーには、Ｑ−セファロースカラム、ＤＥＡＥセファロースカラム、ポロスＨＱカラム、ポロスＤＥＡＥカラム、トーヨーパールＱカラム、トーヨーパールＱＡＥカラム、トーヨーパールＤＥＡＥカラム、リソース／ソースＱカラム及びＤＥＡＥカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｑカラム及びＤＥＡＥカラムでのクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
特定の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製され、陽イオン交換クロマトグラフィーには、ＳＰ−セファロースカラム、ＣＭセファロースカラム、ポロスＨＳカラム、ポロスＣＭカラム、トーヨーパールＳＰカラム、トーヨーパールＣＭカラム、リソース／ソースＳカラム及びＣＭカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｓカラム及びＣＭカラム、及びこれらの等価物及び同等物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
さらに、本明細書に記載の抗原結合構築物は、当該技術分野で公知の技術を用いて化学合成されることができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照されたい）。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成されることができる。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入されることができる。非古典的アミノ酸には、通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、−メチルアミノ酸）、Ｃ−メチルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、及び一般のアミノ酸類似体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、実質的に精製されている。「実質的に精製されている」という用語は、本明細書に記載の構築物またはその変異体が、その天然の環境（すなわち体内に生じた細胞）または組換え生産された抗原結合構築物の場合の宿主細胞において見いだされるタンパク質に通常は付随するかまたはそれと相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まないことを指し、特定の実施形態においては、（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む細胞物質を実質的に含まないことを指す。抗原結合構築物またはその変異体が宿主細胞によって組換え生産される場合、タンパク質は、ある特定の実施形態では、細胞の乾燥重量の、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下で存在する。抗原結合構築物またはその変異体が宿主細胞によって組換え生産される場合、タンパク質は、ある特定の実施形態では、培養培地内に、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ以下で存在する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で生成された「実質的に精製された」抗原結合構築物は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％またはそれ以上の純度レベルを有し、これは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、及びキャピラリー電気泳動などの適当な方法によって決定される。
【０１２９】
翻訳後修飾：
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、翻訳中または翻訳後に特異的に修飾される。
【０１３０】
本明細書で用いる場合、「修飾」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造への変化、ポリペプチドの共翻訳時修飾（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、または翻訳後修飾などの、所与のポリペプチドに対してなされる任意の変更を指す。書式「（修飾）」という用語は、議論されているポリペプチドが任意選択的に修飾される、つまり、議論下にあるポリペプチドが修飾または非修飾であることができることを意味する。
【０１３１】
「翻訳後修飾」という用語は、天然または非天然アミノ酸の、ポリペプチド鎖内にそれが組み込まれた後にそのようなアミノ酸に生じる、任意の修飾を指す。この用語は、単に例として、インビボにおける共翻訳時修飾、インビトロにおける共翻訳時修飾（例えば、無細胞翻訳系）、インビボにおける翻訳後修飾、及びインビトロにおける翻訳後修飾を包含する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、修飾は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または抗原結合構築物または他の細胞性リガンドへの結合のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成を含むがこれらに限定されない既知の技術によって化学的に修飾される。
【０１３３】
本明細書の抗原結合構築物のさらなる翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の付着、Ｎ結合型またはＯ結合型の糖鎖の化学修飾、及び原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。本明細書に記載の抗原結合構築物は、タンパク質の検出及び単離を可能にするために、検出可能な標識、例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識、または親和性標識を用いて修飾される。ある特定の実施形態では、好適な酵素標識の例として、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；好適な放射活性物質の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、放射性金属イオンと会合する大環状のキレーターに付着する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって、修飾することができる。ある特定の実施形態では、同じタイプの修飾が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で同じ程度または様々な程度で存在し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物からのポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝鎖状であり、いくつかの実施形態では、分枝鎖を含むかまたは含まない環状である。環状、分枝鎖状、及び分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的付着、ヘム部分の共有結合的付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的付着、脂質または脂質誘導体の共有結合的付着、ホスファチジルイノシトールの共有結合的付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的付着架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化が含まれる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２））を参照されたい）。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、固体支持体に付着し、これは、本明細書に記載のタンパク質よって結合されるか、それに結合するか、またはそれと会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製に特に有用である。そのような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
抗原結合構築物の機能活性のアッセイ
本明細書に記載の抗原結合構築物を、当該技術分野で公知のアッセイを用いて、またはそれを慣例的に修飾して、ならびに本明細書に記載のアッセイを用いて、機能活性（例えば、生物活性）に関してアッセイすることができる。
【０１３８】
本明細書に記載の抗原結合構築物の生物活性を試験する方法は、実施例に記載のような様々なアッセイにより測定されることができる。そのような方法には、ヒト全血、またはＰＢＭＣを含む際の標的ＣＤ１９＋Ｂ細胞のＴ細胞媒介殺傷を測定するインビトロアッセイを含む。そのようなアッセイはまた、精製されたＴ細胞培養物及び自己標的Ｂ細胞または腫瘍Ｂ細胞を用いて実施され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ  Ｂ細胞とＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞との間でシナプスを形成させかつ架橋することが可能であり、これはＦＡＣＳ及び／または顕微鏡検査によりアッセイされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、ヒト全血におけるＣＤ２０＋Ｂ細胞のＴ細胞誘引による殺傷（T-cell directed killing）を媒介する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、ｖ８７５及び／またはｖ１６６１と比較して改善された生物物理学的特性を示し；かつ／またはｖ８７５及び／またはｖ１６６１と比較して、例えば、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）後に１０ｍｇ／Ｌ超で発現される、改善された収率を示し；かつ／または、例えば、９５％を超えるヘテロ二量体純度を示す。一実施形態では、アッセイは以下の例に記載するものである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物の機能的特徴は、基準の抗原結合構築物のそれと比較される。基準の抗原結合構築物の同一性は、測定される機能的特徴または作製される差異に依存する。例えば、例示的な二重特異性抗原結合構築物の機能的特徴を比較するとき、基準の抗原結合構築物は、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７及び／または抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３であり得る。他の実施形態では、基準の抗原結合構築物は本明細書に記載の構築物、例えば、ｖ８７５及びｖ１６６１である。
【０１４１】
ＯＫＴ３またはＨＤ３７への結合を抗体が遮断する程度は、試験抗体が、その標的抗原へのＯＫＴ３またはＨＤ３７抗体（基準抗体）の特異的結合を阻害または遮断することができる競合アッセイを使用して評価することができる（アッセイの例については、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０；Ｆｅｎｄｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８；ＵＳ  ６，９４９，２４５を参照されたい）。競合結合アッセイにおいて測定されて、過剰量の試験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍）が、基準抗体の結合を、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害するまたは遮断する場合に、試験抗体は、基準抗体と競合する。競合アッセイにより同定される試験抗体（遮断抗体）は、基準抗体と同一のエピトープに結合するもの、及び基準抗体により結合されるエピトープに立体障害を生じるのに十分に近位である隣接エピトープに結合する抗体を含む。
【０１４２】
例えば、抗原と結合する、または抗原との結合に関して別のポリペプチドと競合するか、またはＦｃ受容体及び／または抗アルブミン抗体と結合する本明細書に記載の抗原結合構築物の能力に関してアッセイする一実施形態では、当該技術分野で公知の種々のイムノアッセイ、例えば、これらに限定されないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射能測定アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を使用）、ウェスタン・ブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いる競合及び非競合アッセイ系を用いることができる。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識の検出により検出される。別の実施形態では、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。さらなる一実施形態では、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多数の手段が当該技術分野で公知であり、それらは本発明の範囲内である。
【０１４３】
結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）が、本明細書に記載の抗原結合構築物により含まれる抗原結合ドメインに対して同定される、ある実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物によるその結合パートナーへの結合は、例えば、当該技術分野で周知の手段、例えば、還元及び非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、及びアフィニティーブロッティングによりアッセイされる。概して、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照されたい。別の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物の抗原結合ポリペプチド構築物の基質に結合する抗原結合構築物タンパク質の生理学的相関物の能力は、当該技術分野で公知の技術を用いて慣例的にアッセイすることができる。
【０１４４】
抗原結合構築物及び抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、薬物、例えば、毒素、化学療法剤、免疫モジュレーター、または放射性同位体にコンジュゲートされている。ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲートまたは抗原結合構築物薬物コンジュゲート）を調製するいくつかの方法が、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，６２４，００３号（ポット方法）、同第８，１６３，８８８号（一段階）、及び同第５，２０８，０２０号（二段階方法）に記載されている。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、薬物は、マイタンシン、アウリスタチン、カリチェアミシン、またはそれらの誘導体から選択される。他の実施形態では、薬物は、ＤＭ１及びＤＭ４から選択されるマイタンシンである。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、薬物は、ＳＭＣＣリンカー（ＤＭ１）またはＳＰＤＢリンカー（ＤＭ４）で抗原結合構築物にコンジュゲートされている。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、細胞障害剤にコンジュゲートされている。本明細書で用いる場合、「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害するかまたは妨害する、及び／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕ１７７）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素、その断片及び／またはその変異体を含むと意図される。
【０１４８】
コンジュゲートリンカー
いくつかの実施形態では、薬物は、リンカーによって抗原結合構築物（例えば、抗体）に結合される。抗体へのリンカーの付着は、表面リジンを介して、酸化炭水化物への還元カップリング、鎖間ジスルフィド結合を還元することで遊離されるシステイン残基を介してなど様々な方法で達成することができる。ヒドラゾン系、ジスルフィド系、及びペプチド系結合を含む、様々なＡＤＣ結合系が、当該技術分野で公知である。
【０１４９】
好適なリンカーには、例えば、切断可能なリンカー及び切断不可能なリンカーが含まれる。切断可能なリンカーは、典型的には、細胞内条件下で切断を受けやすい。好適な切断可能なリンカーには、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーが含まれる。リンカーは、薬物が放出されるために抗体が細胞内で分解されなければならない程度まで、抗体に共有結合され得る、それは例えば、ＭＣリンカーなどである。
【０１５０】
医薬組成物
本明細書に記載の抗原結合構築物を含む医薬組成物も本明細書に提供する。医薬組成物は、当該構築物及び薬学的に許容され得る担体を含む。
【０１５１】
「薬学的に許容され得る」という用語は、動物における、より具体的にはヒトにおける使用のために、連邦規制当局または米国政府により承認を受けたか、または米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。「担体」という用語は、治療剤とともに投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、水及び油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）などの滅菌された液体であり得る。いくつかの態様では、担体は、天然では見られない人工の担体である。水は、医薬組成物を静脈内投与する場合に、担体として使用することができる。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための、液体担体としても使用され得る。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望の場合、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤等の形態を取り得る。組成物は、従来の結合剤及び担体、例えばトリグリセリドとともに、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準担体を含み得る。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、好適な量の担体とともに含有するだろう。製剤は、投与の様式に適するべきである。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、構築物を含む組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために適用された医薬組成物として、製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤及び注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔も含み得る。一般に、成分は、別々にまたは単位投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋などの密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、中性のまたは塩の形態として製剤化される。薬学的に許容され得る塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどのアニオンとともに形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどのカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０１５４】
治療方法
かかる治療、予防または回復が望まれる対象に、本明細書に記載の抗原結合構築物を、疾患または障害を治療する、予防する、回復させるのに有効な量で投与することを含む疾患または障害を治療する方法も本明細書に記載する。
【０１５５】
障害及び疾患は、互換可能に使用され、本明細書に記載の抗原結合構築物または方法を用いる治療から利益を得るだろう任意の状態を指す。これは、哺乳動物を問題の障害に罹らせる病理学的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害は癌である。
【０１５６】
「対象」という用語は、治療、観察、または実験の対象である動物を指す。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ペット（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）であり得る。
【０１５７】
本明細書で用いる場合、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタを含むがこれらに限定されない。
【０１５８】
「治療」は、治療される個体または細胞の自然経過を変化させることを試みる臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理の経過中のいずれかで実施することができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾患進行の速度の低減、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、疾患または障害の発症を遅らせるために使用される。一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物及び方法は、腫瘍退縮に効果を与える。一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物及び方法は、腫瘍／癌増殖の阻害に効果を与える。
【０１５９】
治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾患進行の速度の低減、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築構築物は、疾患の発症を遅らせるためまたは疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１６０】
本明細書で用いる場合、「有効量」という用語は、投与される構築物の量であり、列挙する方法の目的を達成するだろう量、例えば、治療される疾患、状態、または障害の症状のうちの１つまたは複数をある程度軽減し得る量を指す。治療用タンパク質の異常な発現及び／または活性と関連する疾患または障害の治療、阻害及び予防において効果的であるだろう本明細書に記載の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。さらに、インビトロアッセイは、任意選択的に採用されて、最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。製剤において使用されるべき正確な用量は、投与の経路、及び疾患または障害の重篤さにも依存し、専門家の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿される。
【０１６１】
治療用途
一態様では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、抗原結合構築物、または抗原結合構築物をコードする核酸を、１つまたは複数の疾患、障害、または状態を治療するために患者に投与することを必然的に含む、抗体に基づく治療法において使用される。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、癌の予防、治療または回復のための方法であって、そのような予防、治療または回復を必要とする対象に本明細書に記載の抗原結合構築物を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、それを必要とする哺乳動物において癌を治療する方法であって、哺乳動物に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を含む組成物を、任意選択的に他の薬学的に活性な分子と組み合わせて投与することを含む、前記方法である。ある特定の実施形態では、癌は、リンパ腫または白血病である。
【０１６４】
一実施形態では、癌は、リンパ腫または白血病またはＢ細胞悪性腫瘍、またはＣＤ１９を発現する癌、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）またはリツキシマブ−またはＣＨＯＰ（ｃｙｔｏｘａｎ（商標）／Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（商標）ビンクリスチン／プレドニゾン療法）-耐性Ｂ細胞癌である。
【０１６５】
さらなる態様では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、医薬の製造または調製において使用するためのものである。一実施形態では、医薬は、癌を治療するためのものである。ある特定の実施形態では、医薬は、リンパ腫または白血病を治療するためのものである。他の実施形態では、医薬は、上記の癌を治療するためのものである。別の実施形態では、医薬は、癌を有する患者に有効量の医薬を投与することを含む、癌を治療する方法において使用するためのものである。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び使用は、患者に有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、細胞障害剤、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生薬、心保護剤、免疫賦活剤、免疫抑制剤、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤、他の抗体、Ｆｃ融合体または免疫グロブリン、または他の治療剤を投与することをさらに含む。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、癌を予防及び／または治療するためのものである。そのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別の製剤に含まれている）、及び別々の投与、この場合は、本明細書に記載の抗原結合構築物の投与は、追加の治療剤及び／または補助剤の投与の前、同時、及び／または後に生じることができる、を包含する。
【０１６８】
本明細書に記載の抗原結合構築物は、単独またはほかのタイプの治療（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法及び抗腫瘍剤）と組み合わせて投与され得る。
【０１６９】
治療活性または予防活性の実証：
本明細書に記載の抗原結合構築物または医薬組成物は、ヒトに用いる前に、所望の治療活性または予防活性に関して、インビトロで、次いでインビボで試験される。例えば、化合物または医薬組成物の治療的または予防的有用性を実証するためのインビトロアッセイは、細胞株または患者組織試料に及ぼす化合物の効果を含む。細胞株及び／または組織試料に及ぼす化合物または組成物の効果は、ロゼット形成アッセイ及び細胞溶解アッセイを含むがこれらに限定されない当業者に公知の技術を利用して決定することができる。
【０１７０】
治療的／予防的投与及び組成物：
有効量の本明細書に記載の抗原結合構築物または医薬組成物の対象への投与による治療、抑制及び予防の方法を提供する。一実施形態では、抗原結合構築物は、実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。ある実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含むがこれらに限定されない動物であり、ある特定の実施形態では、哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【０１７１】
様々な送達系が知られており、本明細書に記載の抗原結合構築物製剤を投与するために使用することができ、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、抗原結合構築物を発現することができる組換え細胞中のカプセル化、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照されたい）、レトロウィルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築等である。導入方法としては、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合構築物は、任意の好都合な経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び小腸粘膜等）を通した吸収により投与されてよく、他の治療剤と一緒に投与されてよい。投与は、全身的または局所的であることができる。投与の好適な経路には、脳室内及び髄腔内注射が含まれる；脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けられる脳室内カテーテルにより容易になり得る。例えば、吸入器またはネブライザーの使用、及びエアロゾル化剤を用いた製剤化により、肺内投与も採用することができる。
【０１７２】
特定の実施形態では、治療を必要とする区域に局所的に本明細書に記載の抗原結合構築物または組成物を投与することが望ましい；これは、限定しないが、例えば手術中の局所注入、例えば、術後の創傷用包帯と合わせた局所適用、注射により、カテーテルにより、坐剤により、または移植により達成され得、前記移植片は、多孔性、非多孔性、またはゼラチン性物質であり、シラスティック膜などの膜または繊維を含む。好ましくは、本発明の、抗体を含む、タンパク質を投与するとき、タンパク質が吸収しない物質を用いるよう注意しなければならない。
【０１７３】
別の実施形態では、抗原結合構築物または組成物は、小胞、具体的にはリポソーム中へ送達されることができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書、ｐｐ．３１７−３２７を参照されたい；一般的に同書を参照されたい）。
【０１７４】
なおも別の実施形態では、抗原結合構築物または組成物は、制御放出系において送達されることができる。一実施形態では、ポンプを用いてよい（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照されたい）。別の実施形態では、高分子物質を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照されたい；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照されたい）。なおも別の実施形態では、制御放出系が、治療標的、例えば脳の近位に配置されることができるため、全身用量の一部のみを要する（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。
【０１７５】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による概説にて考察されている。
【０１７６】
キット及び製品
１つまたは複数の本明細書に記載の抗原結合構築物を含むキットも記載する。キットの個々の構成要素は、個別の容器に入れられ、かかる容器に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形式の通知を伴うことができ、この通知は、製造、使用または販売の機関による承認を反映する。キットは、任意選択的に、抗原結合構築物に関する使用の方法または投与レジメンの概要を述べる使用説明書または指示書を含有し得る。
【０１７７】
キットの１つまたは複数の構成要素が、溶液、例えば水溶液、または滅菌水溶液として提供されるとき、容器手段はそれ自体が、吸入器、シリンジ、ピペット、点眼びん、またはその他の類似の器具であり得、それから溶液が対象に投与され得るまたはキットの他の構成要素に適用され得る及びキットの他の構成要素と混合され得る。
【０１７８】
キットの構成要素はまた、乾燥または凍結乾燥した形態において提供されてよく、キットは、凍結乾燥した構成要素を再構成するための好適な溶媒を追加で含有することができる。容器の数またはタイプにかかわらず、本明細書に記載のキットは、患者への組成物の投与を援助するための器具も含んでよい。そのような器具は、吸入器、鼻内噴霧デバイス、シリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーン、点眼びん、または類似の医学的に承認された送達ビヒクルであり得る。
【０１７９】
本明細書に記載の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／または診断に有用な物質を含有する製品を提供する。製品は、容器、及び容器上にまたは容器に伴うラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、単独の組成物、または状態を治療、予防、及び／または診断するために有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により刺し貫かれ得る栓を有する静脈内溶液袋またはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載のＴ細胞活性化抗原結合構築物である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するために使用されるということを示す。さらに、製品は、（ａ）本明細書に記載の抗原結合構築物を含む組成物を含有する第一容器；及び（ｂ）さらなる細胞障害剤またはそうでなければ治療剤を含む組成物を含有する第二容器を含み得る。本明細書に記載のこの実施形態における製品は、組成物が特定の状態を治療するために使用されることができるということを示す添付文書をさらに含み得る。あるいはまたは加えて、製品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの見地から望ましい他の物質をさらに含み得る。
【０１８０】
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書に記載の抗原結合構築物は、少なくとも１つのポリペプチドを含む。本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、典型的には単離されている。
【０１８１】
本明細書で用いる場合、「単離された」は、その天然細胞培養環境の構成成分から同定され、分離され、及び／または回収されている薬剤（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を意味する。その天然環境の夾雑構成成分は、抗原結合構築物に関する診断的または治療的使用を妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン及びその他のタンパク様または非タンパク様溶質を含み得る。単離は、例えば、ヒト介入を介して、合成的に生成されている薬剤も指す。
【０１８２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。つまり、ポリペプチドに対する記述は、ペプチドの記述及びタンパク質の記述に等しく適用され、その逆もまた同様である。これらの用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマー、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が非天然にコードされるアミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書で用いる場合、これらの用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結される。
【０１８３】
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされたアミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）及びピロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）、または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸への言及には、例えば、天然に生じるタンパク新生Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸、例えば、アミノ酸変異体及び誘導体；天然に生じる非タンパク新生アミノ酸、例えば、βアラニン、オルニチン等；及びアミノ酸の特徴であると当該技術分野において知られている性質を有する化学的に合成された化合物を含む。非天然に生じるアミノ酸の例としては、αメチルアミノ酸（例えば、αメチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、余分なメチレンを側鎖に有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（例えばシステイン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。合成の非天然アミノ酸、置換されたアミノ酸、または１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含む、非天然アミノ酸を本発明のタンパク質に組み込むことは、多くの異なる意味において有利であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ−アミノ酸含有対応物と比較して、インビトロまたはインビボにおいて増加した安定性を呈する。ゆえに、Ｄ−アミノ酸を組み込んだ、ペプチドの構築等は、細胞内でのより高い安定性が望まれるか必要とされる場合、特に有用であることができる。より具体的には、Ｄ−ペプチド等は、内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性を示し、それにより、このような特性が望ましいときに、分子のバイオアベイラビリティを改善し、インビボにおける寿命を延長する。加えて、Ｄ−ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞への、主要組織適合性複合体クラスＩＩの拘束性提示のために効率良く処理されることができず、従って、全生物において体液性免疫応答を誘導する可能性が低い。
【０１８４】
本明細書においてアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会が推薦する、それらの一般的に知られた３文字表記または１文字表記のどちらかによって示され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に許容されている１文字コードによって示され得る。
【０１８５】
抗原結合構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本明細書に記載する。「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続した区間を示すと意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成または合成起源のもの、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１８６】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、及び一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途具体的に限定されない限り、この用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含むオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術に使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミダート等）も指す。別途指示されない限り、特定の核酸配列は、それらの保存的に修飾された変異体（縮重コドン置換体を含むが、これに限定されない）、及び相補的配列、ならびに明確に示された配列も、潜在的に包含する。具体的には、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３位が、混合された塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、縮重コドン置換体が達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１８７】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵのコドンは全て、アミノ酸アラニンをコードする。ゆえに、コドンによってアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンのいずれかへコドンを変化させることができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能性のあるサイレント変異を表している。当業者は、機能的に同一の分子が得られるように、核酸における各コドンが修飾され得ることを理解するだろう（メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ、及びトリプトファンに対する通常唯一のコドンであるＴＧＧは除く）。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
【０１８８】
アミノ酸配列に関しては、コードされた配列内の単一アミノ酸または数％のアミノ酸を変更、付加、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、その変更が、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似するアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを当業者は理解するだろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当業者に公知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本明細書に記載の多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子に加えられるものであり、それらを排除するものではない。
【０１８９】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当業者に公知である。以下の８群は、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３）を参照されたい。
【０１９０】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して測定するか、または手動で整列させて目視検査により測定して、配列を比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大限に対応するように比較及び整列させるときに、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドのある割合（％）を配列が有する（すなわち、特定の領域にわたって約６０％同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一性）場合、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補性にも言及する。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、または７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、または、指定されない場合は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列全体にわたって存在することができる。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングする工程と、前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離する工程とを含むプロセスによって、ヒト以外の種からのホモログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得られ得る。そのようなハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知である。
【０１９１】
配列比較については、典型的に、一方の配列を基準配列として、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び基準配列をコンピューターに入力し、サブ配列の座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。プログラムのデフォルトのパラメーターを使用することができ、または代替のパラメーターを指定することができる。そして、配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメーターに基づいて基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【０１９２】
本明細書で用いる場合、「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、一般的に約５０〜約２００、より一般的に約１００〜約１５０からなる群より選択される、いくつかの連続する位置のいずれか１つの区分への参照を含み、ここにおいて配列は、２つの配列が最適に整列された後に、連続する位置の同数の基準配列と比較され得る。比較のための配列整列の方法は、当業者に公知である。比較のための最適な配列整列は、これに限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性探索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．の中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、または手動での整列及び目視の検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照されたい）により、行うことができる。
【０１９３】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて利用可能である全米バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。（ヌクレオチド配列用の）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、１１の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を、規定値として使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３の語長、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）の５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を、規定値として使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的に「低複雑性」フィルタをオフにして実施される。
【０１９４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間に偶然に一致が生じ得る確率の指標を提供する。例えば、基準核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満であるとき、核酸は基準配列に類似するとみなされる。
【０１９５】
「に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（細胞全体、ライブラリーＤＮＡ、またはＲＮＡを含むが、これらに限定されない）内に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列に対してのみ分子が結合すること、二重鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることを指す。
【０１９６】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、当該技術分野において知られているような低イオン強度及び高温の条件下における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸の配列、またはそれらの組合せのハイブリダイゼーションを指す。典型的には、ストリンジェントな条件下において、プローブは、核酸の複合混合物（細胞全体、ライブラリーＤＮＡ、またはＲＮＡを含むが、これらに限定されない）中のその標的サブ配列とハイブリダイズし得るが、この複合混合物中の他の配列とはハイブリダイゼーションしない。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境においては異なるだろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，"Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ"（１９９３）に見られる。
【０１９７】
本明細書で用いる場合、「遺伝子操作する、遺伝子操作された、遺伝子操作すること」という用語は、ペプチド骨格の任意の操作、または天然に生じるポリペプチドまたは組換えポリペプチドまたはその断片の翻訳後修飾を含むとみなされる。遺伝子操作することは、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、ならびにこれらのアプローチの組合せを含む。遺伝子操作されたタンパク質は、標準的な分子生物学技術により発現及び生成される。
【０１９８】
「単離された核酸分子またはポリヌクレオチド」とは、その天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、単離されたと見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞中に保持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞中に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、インビボまたはインビトロＲＮＡ転写体、ならびにプラス鎖及びマイナス鎖の形態、及び二本鎖形態を含む。本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、例えばＰＣＲまたは化学合成を介して合成的に生成されるこのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ある実施形態では、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントを含む。
【０１９９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、一般的に、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているように、インビトロでの所望のヌクレオチド配列を増幅するための方法を指す。概して、ＰＣＲ法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマー伸長合成の反復周期を必然的に含む。
【０２００】
本発明の基準ヌクレオチド配列と、少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、当該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が基準配列と同一である、ということを意図する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを獲得するためには、基準配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されるか、または別のヌクレオチドで置換されるか、または基準配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが基準配列中に挿入されてよい。基準配列のこれらの変更は、基準ヌクレオチド配列の５'または３'末端位置で、またはそれらの末端位置間のどこかで起こり得、基準配列中の残基中に個別に散在するかまたは基準配列内の１つまたは複数の連続群内に散在する。実際には、任意の特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラム、例えばポリペプチドに関して上記されたもの（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）を用いて慣用的に決定することができる。
【０２０１】
ポリペプチドの誘導体または変異体は、誘導体または変異体のアミノ酸配列が元のペプチドからの１００アミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する場合、そのペプチドと「相同性」を有する、または「相同である」と言われる。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかのものと少なくとも７５％同一である。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかのものと少なくとも８５％同一である。ある特定の実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも９５％同一である。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかのものと少なくとも９９％同一である。
【０２０２】
本明細書で用いる場合、「修飾」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造への変化、ポリペプチドの共翻訳時修飾、または翻訳後修飾などの、所与のポリペプチドに対してなされる任意の変更を指す。書式「（修飾）」という用語は、議論されているポリペプチドが任意選択的に修飾される、つまり、議論下にあるポリペプチドが修飾または非修飾であることができることを意味する。
【０２０３】
いくつかの態様では、抗原結合構築物は、本明細書に開示の表またはアクセッションナンバーに記載した関連するアミノ酸配列またはその断片と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、単離された抗原結合構築物は、本明細書に開示の表またはアクセッションナンバーに記載した関連するヌクレオチド配列またはその断片に少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む。
【０２０４】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、特許請求対象物が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書中の用語に関して複数の定義が存在する事象では、本節における定義が優勢である。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変化し得、インターネット上の特定情報は移り変わり得るが、インターネット検索により等価の情報が見出され得ることが理解されたい。それを参照することは、このような情報の利用可能性及び公的普及を立証する。本明細書において明らかに異なるように定義されない限り、抗体技術分野の当業者により理解される用語は、当該技術分野で獲得された意味をそれぞれ与えられる。
【０２０５】
一般的記述及び以下の詳細な記述は、単に例示的及び解説的なものであって、特許請求されるいかなる対象物をも限定するものではないことを理解されたい。
【０２０６】
この出願において、単数形の使用は、特に別段の記載がない限り、複数形を含む。
【０２０７】
本発明の記述において、任意の濃度範囲、割合（％）範囲、比率範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を、そして適切な場合には、その分数（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１）を含むことを理解されたい。本明細書で用いる場合、「約」は、別段の指示がない限り、指示される範囲、値、配列または構造の±１０％を意味する。「ａ」及び「ａｎ」という用語は、本明細書で用いる場合、別段の指示がない限り、またはその文脈により指図されない限り、列挙された構成成分のうちの「１つまたは複数」を指すことを理解されたい。選択肢（例えば「または」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはその任意の組合せを意味することが理解されたい。本明細書で用いる場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義的に用いられる。加えて、本明細書に記載される構造及び置換基の種々の組合せに由来する個々の一本鎖ポリペプチドまたは免疫グロブリン構築物は、各一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体が個別に記述されるのと同程度に、本出願により開示されることが理解されたい。従って、個々の一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体を形成するための特定の構成成分の選択は、本発明の開示の範囲内である。
【０２０８】
本明細書で用いられる節の見出しは、系統化を目的とするに過ぎず、記載される対象物を限定すると意図されるべきでない。
【０２０９】
本明細書に記載の方法及び組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、構築物及び試薬に限定されず、それ自体変化し得ることが理解されたい。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載することを目的とするに過ぎず、本明細書に記載の方法及び組成物の範囲を限定することを意図せず、これは、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるということも理解されたい。
【０２１０】
本出願中で引用される全ての文書または文書の一部には、これらに限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル及び学術論文が含まれ、任意の目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。本出願において言及される全ての刊行物及び特許は、例えば、本明細書に記載の方法、組成物及び化合物とともに使用され得る刊行物中に記載の構築物及び方法論を記載及び開示する目的のために、それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書において何事も、本明細書に記載の発明人が先行発明のために、または任意の他の理由のために、かかる開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２１１】
以下の具体的及び非限定的な例は、単なる例証として解釈されるものであって、いかなる点においても本発明の開示を限定するものではない。さらなる詳細な検討の必要もなく、本明細書中の記載に基づいて、当業者は本発明の開示を最大限利用することができると考えられる。本明細書で引用される刊行物はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変化し得、インターネット上の特定情報は移り変わり得るが、等価情報はインターネット検索により見出され得ることが理解されたい。それを参照することは、このような情報の利用可能性及び公的普及を立証する。
【０２１２】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示を目的とするに過ぎず、それに鑑みて、種々の修正または変更が当業者に示唆され得、本出願の精神及び範囲内に、及び添付の特許請求の範囲内に含まれるべきものであることが理解されたい。
【０２１３】
実施例１．抗原結合構築物及び対照の設計、発現及び精製
図１は、抗原結合構築物の設計の概略図を示す。図１Ａは、エフェクター機能を媒介することができるＦｃを有する例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物を図示する。当該抗原結合構築物の抗原結合ドメインは両方ともｓｃＦｖであり、各ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域はポリペプチドリンカーにより接続されている。各ｓｃＦｖはまた、ヒンジポリペプチドによりヘテロ二量体Ｆｃの一方のポリペプチド鎖に接続されている。当該抗原結合構築物の当該２つのポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている（破線として示す）。図１Ｂは、Ｆｃがノックアウトされている例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物を図示する。このタイプの抗原結合構築物は、ＦｃγＲ結合を除去するＦｃのＣＨ２領域への修飾を含むことを除き、図１Ａに示すものと類似する。ゆえに、これらの構築物は、治療上妥当な濃度でＦｃエフェクター機能を媒介することができない。
【０２１４】
いくつかの二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９抗体を、表１に記載するように調製した。抗ＣＤ３または抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖの説明がＢｉＴＥへの参照を含む場合、これは、抗ＣＤ３または抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖが、下記に示すように、可変重鎖及び軽鎖の向き（例えばＶＨ−ＶＬ）への修飾を伴ってまたは伴わずに、抗ＣＤ３抗ＣＤ１９ＢｉＴＥ（商標）分子（ブリナツモマブ）のＶＨ及びＶＬの配列と同一のアミノ酸配列を有することを示す。別段の指示がない限り、αＣＤ１９＿ＨＤ３７  ｓｃＦｖ及びαＣＤ３＿ＯＫＴ３  ｓｃＦｖについては、Ｎ末端からＣ末端へのＶＬ及びＶＨ領域の順序はＶＬＶＨである。
【０２１５】
（表１）変異体、鎖Ａ、鎖Ｂ、Ｆｃ
2017504328.tif 000008
2017504328.tif 000009
−Ｈｅｔ  Ｆｃ１＝鎖Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；鎖Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（ＩｇＧ１  Ｆｃに対するＥＵナンバリングシステム）
−Ｈｅｔ  Ｆｃ２＝鎖Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；鎖Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ
−ＦｃγＲ  ＫＯ１＝鎖Ａ：Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ；鎖Ｂ：Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ
−ＦｃγＲ  ＫＯ２＝鎖Ａ：Ｄ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ；鎖Ｂ：Ｄ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ
−αＣＤ１９＿ＨＤ３７  ｓｃＦｖ−別段の指示がない限り、可変領域のＮからＣ末端への順序はＶＬ／ＶＨである。
−αＣＤ３＿ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ−別段の指示がない限り、可変領域のＮからＣ末端への順序はＶＬ／ＶＨである。ＶＬＶＨは、（ＧＧＧＧＳ）３リンカーにより接続されている。
−αＣＤ３＿ＢｉＴＥ  ｓｃＦｖ−可変領域のＮからＣ末端への順序はＶＨ／ＶＬであり、リンカー及び組成はブリナツモマブと同一である。
−（ＶＬＶＨ  ＳＳ）または（ＶＨＶＬ  ＳＳ）は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬ間にジスルフィド連結を導入するために、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに準じ、公表されたＶＨ４４位及びＶＬ１００位を活用するジスルフィド安定化ｓｃＦｖを示す［Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２３９−１２４５（１９９６）］。
−（ＣＤＲＣ→Ｓ）−下記に参照されるようにＯＫＴ３のＨ３  ＣＤＲにおける変異を示す。
−（ＶＨＶＬリンカー）−リンカー
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により接続されるＶＨ及びＶＬを示す。
【０２１６】
Ｆｃナンバリングは、ＥＵ抗体のナンバリングを参照するＫａｂａｔのように、ＥＵインデックスに準じる（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５）；Ｆａｂまたは可変ドメインナンバリングは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９１；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ−ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，ｐ  ６４７（１９９１）））に準じる。
【０２１７】
表１に記載の変異体は、初期設計である変異体８７５を含み、これは改善された収率及び生物物理学的特性を有する抗原結合構築物を生成するための開始点として使用した。修飾は、ＶＬＶＨジスルフィド遺伝子操作及び／または安定化ＣＤＲ変異の付加によるｓｃＦｖの安定化を含む。全ての変異体は、ヘテロ二量体Ｆｃ（Ｈｅｔ  Ｆｃ１またはＨｅｔ  Ｆｃ２）を含み、Ｆｃエフェクター活性を消すためのＣＨ２ドメインにおける変異（ＦｃγＲ  ＫＯ１またはＦｃγＲ  ＫＯ２）を有するまたは有さずに発現されることができる。Ｆｃへのこの修飾を含む変異体は、ＦｃノックアウトまたはＦｃ  ＫＯを有すると称される。
【０２１８】
変異体８７５、１６６１、１６５３、１６６２、１６６０、１６６６、１８０１、及び１３８０は、開発されたＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の初期設計であり、一方で変異体６７４７、１０１４９、及び１２０４３は、ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の収率及び生物物理学的特性をさらに改善するように設計された修飾を含む設計を例示する。変異体Ｎ１、Ｎ３及びＮ１０も設計されており、これらの変異体の生物物理学的及び機能的特徴は本明細書に提供するデータから予測することができる。
【０２１９】
ＣＤ３及びＣＤ１９  ｓｃＦｖの両方についてのＶＨＶＬジスルフィド遺伝子操作戦略は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間にジスルフィド連結を導入するために、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに準じて、公表されたＶＨ４４位及びＶＬ１００位を活用した［Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２３９−１２４５（１９９６）］。αＣＤ３  ＯＫＴ３  ｓｃＦｖのＨ３  ＣＤＲにおけるＣからＳへの変異は、Ｋｉｐｒｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：４４５−４５３（１９９７）に記載されるように生成された。
【０２２０】
表１から選択された変異体を調製し、これらの変異体の対応する配列組成を表２に示す。
【０２２１】
（表２）二重特異性ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物及び対照の配列組成
2017504328.tif 000011
【０２２２】
クローニング及び発現
抗体及び抗体対照を、以下のようにクローニングし、発現した。抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、ヒト／哺乳動物発現に最適化されたコドンを使用する遺伝子合成を介して構築された。ｓｃＦｖ−Ｆｃ配列は、既知の抗ＣＤ３及びＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＢｉＴＥ（商標）抗体（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ．ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ：７７，７６３−７７２）、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｄｒｕｇ  Ｂａｎｋ参照番号：ＤＢ０００７５）から生成された。
【０２２３】
最終遺伝子産物を哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，カナダ）へとサブクローニングし、ＣＨＯ細胞において発現した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．＆  Ｋａｍｅｎ，Ａ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，Ｅ９（２００２））。
【０２２４】
ＣＨＯ細胞を、対数増殖期（１．５から２百万細胞／ｍＬ）に水溶性の１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比率でトランスフェクトした（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ヘテロ二量体を形成するための最適濃度範囲を決定するために、ＤＮＡを、ヘテロ二量体形成を可能にする最適ＤＮＡ比率の重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）と重鎖Ｂ（ＨＣ−Ｂ）でトランスフェクトした（例えば、ＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂ／比率＝５０：５０％）。トランスフェクトした細胞を、４０００ｒｐｍでの遠心分離後に収集された培養培地と共に５〜６日後に回収し、０．４５μｍフィルタを使用して清澄化した。
【０２２５】
清澄化培養培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに充填し、１０カラム体積のＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２で洗浄した。抗体を１０カラム体積のクエン酸緩衝液、ｐＨ３．６で溶出し、抗体を含有するプール画分をｐＨ１１のＴＲＩＳで中和した。次いで、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質を脱塩した。
【０２２６】
いくつかの場合では、タンパク質をゲル濾過によってさらに精製し、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮し、１ｍＬ／分の流速でＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣを介してＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を１ｍＬ／分の流速で用いた。精製抗体に対応する画分を収集し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２２７】
プロテインＡによる精製後に、プロテインＬクロマトグラフィーを使用する追加の精製工程が以下のような方法によって実施され得る。Ｃａｐｔｏ  Ｌ樹脂をＰＢＳで平衡化し、変異体を該樹脂に添加して室温で３０分間インキュベートした。樹脂をＰＢＳで洗浄し、結合タンパク質を０．５ｍｌの０．１Ｍグリシン、ｐＨ３で溶出した。この追加の工程は、図２Ｃの結果を得るために使用された製造方法には含まれなかった。
【０２２８】
最終産物の純度及び収率は、下記のようにＬＣ／ＭＳ及びＵＰＬＣ−ＳＥＣにより推測された。
【０２２９】
ヘテロ二量体純度のＬＣ−ＭＳ分析
精製試料を、３７℃で６時間、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで脱グリコシル化した。ＭＳ分析の前に、試料をＰｏｒｏｓ  Ｒ２カラム上に注射して、２０〜９０％ＡＣＮ、０．１％ＦＡを用いた勾配にて３分間溶出して、１つの単一ピークを結果得た。
【０２３０】
ＬＣカラムのピークを、以下の設定を用いてＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分光計で分析した：Ｃｏｎｅ電圧：５０Ｖ'Ｔｕｂｅレンズ：２１５Ｖ；ＦＴ解像度：７，５００。質量スペクトルを、ソフトウェアＰｒｏｍａｓｓまたはＭａｘ  Ｅｎｔ．で積分して、分子量プロファイルを作成した。
【０２３１】
ＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析
０．４ｍｌ／分で３０℃に設定したＷａｔｅｒｓ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣカラム（２．５ｍＬ、４．６×１５０ｍｍ、ステンレススチール、１．７μｍ粒子）を使用して、ＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析を行った。実行時間は７分で構成され、１回注入当たりの総体積は２．８ｍＬで、実行緩衝液は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．１；及び１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．４〜７．１であった。吸光度による検出を１９０〜４００ｎｍで行い、蛍光による検出は２８０ｎｍで励起し３００〜３６０ｎｍから発光を収集して行った。ピーク積分を、Ｅｍｐｏｗｅｒ  ３ソフトウェアにより分析した。
【０２３２】
全ての変異体は発現され、ホモ二量体を汚染することなく、９５％超のヘテロ二量体純度まで精製された。
【０２３３】
変異体８７５、１６６１、１６５３、１６６６、１０１４９、及び１２０４３の収率及びヘテロ二量体純度を図２Ｃに示す。
【０２３４】
変異体１０１４９についてのプロテインＡ精製後のゲルろ過（ＧＦＣ）プロファイルを図２Ａの上方パネルに示し、一方で下方パネルは、プールしたＧＦＣ画分のＳＥＣプロファイルを示す。図２Ｂの上方パネルは、変異体１６６１についてのプロテインＡ精製後のゲルろ過（ＧＦＣ）プロファイルを示し、一方で、下方パネルは１６６１についてのプールしたＧＦＣ画分のＳＥＣプロファイルを示す。図２Ｃは、１６６１と比較して１０１４９の改善された収率及びヘテロ二量体純度を示す。
【０２３５】
示差走査熱量測定による安定性の評価
ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により融解温度（Ｔｍ）を決定することにより評価した。全てのＤＳＣ実験は、ＧＥ  ＶＰ−毛細管計器を用いて実施された。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に緩衝液交換して０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．１３７ｍＬを試料細胞中に充填し、１℃／分の走査速度にて２０〜１００℃で測定した。ＰＢＳ緩衝液バックグラウンドを差し引いて、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してデータを分析した。
【０２３６】
変異体８７５、１６６１、１６６６、１０１４９、及び１２０４３についての結果を図２Ｃに示す。
【０２３７】
初期変異体１６６１は、ｐＡ後のＧＦＣプロファイルにおいて明らかなように、低い発現及びプロテインＡ後収率、及び大量の高分子量凝集物示した（図２Ｂ及び２Ｃ）。より低い発現及び高分子量凝集物の傾向は、種々の方法を使用するｓｃＦｖ安定性遺伝子操作により最適化され、その方法はリンカーの最適化、ＶＨＶＬの向き、ジスルフィド遺伝子操作及びＣＤＲ移植によるｓｃＦｖ安定化を含み、それはｓｃＦｖ発現及び安定性の異なる態様を扱う。
【０２３８】
変異体１６６６及び１３８０に例示されるようなｓｃＦｖリンカー及びＶＨＶＬの向きの違いは、発現及び収率における有意な改善をもたらさなかった。ジスルフィド遺伝子操作によるｓｃＦｖの安定化は、発現及びプロテインＡ後収率を改善しなかったが、変異体１０１４９についてのＧＦＣプロファイルに示すように（図２Ｂ及び２Ｃ）高分子量凝集物の量を有意に減少させ、最終収率を増加させた。
【０２３９】
ＣＤ１９  ｓｃＦｖのヒト化及びＣＤＲ移植による安定化は、全体的に改善された発現及びプロテインＡ後力価及びｓｃＦｖ熱安定性をもたらし、これは図２Ｃに示される変異体１２０４３についてのデータにより示される。
【０２４０】
初期変異体１６６１は、ｐＡ後のＧＦＣプロファイルにおいて明らかなように、低い発現及びプロテインＡ後収率、及び大量の高分子量凝集物を示した（図２Ｂ及び２Ｃ）。より低い発現及び高分子量凝集物の傾向は、種々の方法を使用するｓｃＦｖ安定性遺伝子操作により最適化され、その方法はリンカーの最適化、ＶＨＶＬの向き、ジスルフィド遺伝子操作及びＣＤＲ移植によるｓｃＦｖ安定化を含み、それはｓｃＦｖ発現及び安定性の異なる態様を扱う。
【０２４１】
変異体１６６６及び１３８０に例示されるようなｓｃＦｖリンカー及びＶＨＶＬの向きの違いは、発現及び収率における有意な改善をもたらさなかった。ジスルフィド遺伝子操作によるｓｃＦｖの安定化は、発現及びプロテインＡ後収率を改善しなかったが、変異体１０１４９についてのＧＦＣプロファイルに示すように（図２Ｂ及び２Ｃ）高分子量凝集物の量を有意に減少させ、最終収率を増加させた。
【０２４２】
ＣＤ１９  ｓｃＦｖのヒト化及びＣＤＲ移植による安定化は、全体的に改善された発現及びプロテインＡ後力価及びｓｃＦｖ熱安定性をもたらし、これは図２Ｃに示される変異体１２０４３についてのデータにより示される。
【０２４３】
図２Ｃにまとめられているように、ｓｃＦｖの精製後収率、ヘテロ二量体純度及び熱安定性の分析は、ジスルフィド遺伝子操作（ｖ１０１４９）、及びＣＤ１９  ｓｃＦｖのヒト化及び安定化（ｖ１２０４３）による安定化は、収率及び熱安定性における有意な改善をもたらし、一方でＶＬ−ＶＨの向き及びリンカー組成の変更は効果がなかったことを示す。
【０２４４】
実施例２：Ｒａｊｉ及びＪｕｒｋａｔ細胞へのＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の結合
ＣＤ１９−及びＣＤ３−発現細胞に結合する二重特異性変異体８７５及び１６６１の能力を、下記のようにＦＡＣＳにより評価した。
【０２４５】
ＦＡＣＳプロトコルによるホールセル結合：
２×１０６細胞／ｍｌの細胞（８０％超の生存力）を、Ｌ１０＋ＧＳ１培地中に再懸濁して、抗体希釈液と混合し、氷上で１時間インキュベートした。１０ｍｌの冷却Ｒ−２緩衝液を添加することにより細胞を洗浄し、４℃で１０分間、２３３×ｇで遠心分離した。細胞ペレットを１００μｌ（Ｌ１０＋ＧＳ１培地中の１／１００希釈液）の蛍光標識化抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧとともに再懸濁して、室温で１時間インキュベートした。次いで、上記のように１０ｍｌの冷却Ｒ−２を添加することにより細胞を洗浄し、細胞ペレットを４００μｌの冷却Ｌ−２と再懸濁し、試料を、Ｎｉｔｅｘを通して濾過し、４μｌのヨウ化プロピジウムを含有する試験管に添加した。
【０２４６】
試料を、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２４７】
表３は、このアッセイにおいて試験された全ての変異体が同等の親和性でＣＤ１９＋Ｒａｊｉ  Ｂ細胞に結合すること、及び同等の親和性でＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合することを示す、結果の概要を提供する。全ての変異体は、高い親和性でＲａｊｉ  Ｂ細胞に結合し、より低い親和性でＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合した。低いＴ細胞親和性は、１つのＴ細胞が複数の標的細胞を殺傷することを可能にする一連のＴＣＲ誘発プロセスにとって重要である可能性が非常に高い。
【０２４８】
実施例３：ＦＡＣＳ及び顕微鏡検査によるＴ細胞及びＢ細胞の架橋及びシナプス（仮足）形成の分析
Ｔ細胞シナプス及び仮足の形成を媒介する例示的な変異体の能力を以下のように評価した。このアッセイにおいて試験された変異体は、８７５及び１６６１を含んだ。
【０２４９】
ＦＡＣＳによるホールセル架橋：
ＲＰＭＩ中に懸濁された１×１０６細胞／ｍｌを、０．３μＭの適切なＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識で標識して、混合し、３７℃で２５分間、水浴中でインキュベートした。
【０２５０】
ペレットを２ｍｌのＬ１０＋ＧＳ１＋ＮａＮ３中に再懸濁して、最終濃度を５×１０６細胞／ｍｌとした。細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析して（１／５希釈液）、適切な細胞標識及びレーザー設定を確認した。Ｆｌｏｗ−ｃｈｅｃｋ及びｆｌｏｗ−ｓｅｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓを使用して、計器標準化、光学的アラインメント及び流体工学を確認した。フローサイトメトリー確認後、及び架橋前に、各細胞株を所望の比率で、最終濃度１×１０６細胞／ｍｌで混合した。Ｊｕｒｋａｔ−バイオレット＋ＲＡＪＩ−ＦａｒＲｅｄによりＴ：Ｂ架橋を評価した。
【０２５１】
抗体を室温でＬ１０＋ＧＳ１＋ＮａＮ３中で二倍に希釈し、次いで、細胞に添加し、その後、静かに混合して、３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーションの後、２μｌのヨウ化プロピジウムを添加し、ゆっくり混合して、フローサイトメトリーにより直ちに分析した。Ｂ：Ｔ架橋率（％）は、バイオレット及びＦａｒ−Ｒｅｄの同時標識事象の割合（％）として算出され、バックグラウンドに対する倍率は、培地のみの場合の架橋率（％）に対する変異体による架橋率（％）の割合として算出された。
【０２５２】
顕微鏡検査によるシナプス（仮足）形成の分析：
標識したＲａｊｉ  Ｂ細胞及び標識したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、室温で３０分間、３ｎＭのヒトＩｇＧまたは変異体とともにインキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離により濃縮し、その後１８０μｌの上清を除去した。細胞を残りの体積中に再懸濁して、２００倍及び４００倍で撮像した。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを使用して、顕微鏡検査画像（２００倍）を獲得し、疑似色付けし、オーバーレイし、ＴＩＦＦに変換した。次いで、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアのセルカウンターを使用して細胞を計数し、５つの異なる集団に分類した。
１．Ｔ単独（Ｔ：Ｔも含む）
２．Ｂと会合するＴ（仮足無し）
３．Ｂと会合するＴ（仮足有り、すなわち三日月のような構造を示すＴ細胞）
４．Ｂ単独（Ｂ：Ｂも含む）
５．Ｔと会合するＢ
【０２５３】
いくつかの細胞について、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアにおける元画像及び位相画像の見直しが適切な分類に必要だった。次いで、Ｂ細胞と会合する総Ｔ細胞の割合（％）、仮足を有するＢ細胞と会合する総Ｔ細胞の割合（％）、仮足を有するＢ細胞と会合するＴ細胞の割合（％）、Ｔ細胞と会合するＢ細胞の割合（％）及び全体的なＢ：Ｔ率（％）が決定され得る。
【０２５４】
結果は図３に示され、３ｎＭで、変異体８７５及び１６６１が、１：１の化学量論でＣＤ１９＋Ｒａｊｉ  Ｂ細胞及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を架橋してＴ細胞シナプス（仮足）を形成させることができたことを実証した。架橋されたＴ：Ｂ細胞の８０％超が、シナプス形成を示す仮足を呈した。このデータは、変異体８７５及び１６６１がＲａｊｉリンパ腫Ｂ細胞及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を架橋し、Ｔ細胞媒介性標的細胞溶解の前提条件及び指標としてＴ：Ｂ細胞シナプスを誘発することができることを示す。
【０２５５】
実施例４：ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の存在下での活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のオフターゲット細胞障害性の決定
ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の存在下での活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の潜在的なオフターゲット細胞障害性を、ＣＤ１９またはＣＤ３を発現しない標的細胞株であるＫ５６２に対して測定した。この場合は変異体８７５を試験し、アッセイを以下のように実施した。
【０２５６】
個々の試験のために、選択されたドナーからヒト血液（１２０〜１４０ｍＬ）を採取した。ＰＢＭＣを、リンパ球勾配分離（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，カタログ番号ＣＬ５０２０）を使用してドナーから新たに単離した。ＩＬ２活性化のために、ＰＢＭＣを１０００〜３０００単位／ｍＬのＩＬ−２とともに一晩インキュベーションして活性化した。静止及びＩＬ−２活性化ＰＢＭＣをＣＤ４＋及びＣＤ８＋の濃縮のために、ＥａｓｙＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）カラムに通した。ＩＬ−２活性化ＣＤ８＋をエフェクター細胞として、及びＫ５６２赤白血病細胞を標的細胞として、１５：１のＥ：Ｔ比率で使用した。試験品と細胞を２０〜２６時間インキュベートした後、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＬＤＨ酵素キットを使用したＬＤＨ分析のために５０μＬの細胞培養上清を収集した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｅｍａｘを使用して各ウェルの４９０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定した。データ分析はＬｉｂｒｅＯｆｆｉｃｅ  Ｃａｌｃソフトウェアを使用して行った。
【０２５７】
結果を表３及び図４に示す。表３は、０日目の精製ＣＤ８＋Ｔ細胞中の活性化Ｔ細胞の割合（％）を示す。図４は、３００ｎＭ及び１５：１のＥ：Ｔ比率において、ＩＬ−２活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた場合のＫ５６２赤白血病細胞の枯渇が観察されなかったことを示す。このように、飽和濃度及び高い標的対エフェクター細胞比率でＩＬ−２活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた場合のＫ５６２赤白血病細胞のオフターゲットバイスタンダー細胞障害が観察されなかった。
【０２５８】
（表３）０日目の精製ＣＤ８＋Ｔ細胞中の活性化Ｔ細胞の割合（％）
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【０２５９】
実施例５：Ｒａｊｉ細胞において用量依存性ＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介する変異体１６６１の能力
実施例１に記載したように、変異体１６６１は、Ｆｃ媒介性エフェクター活性を無効にするＣＨ２変異を有するＦｃ（Ｆｃ  ＫＯ）を含む。この変異体に関するエフェクター機能の欠如を確認するために、それを下記のようにＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイにおいて試験した。
【０２６０】
用量反応性試験を１０００〜０．０１ｎＭの抗体濃度範囲で行った。リツキシマブを陽性対照として使用した。ＡＤＣＣアッセイは以下のように実施した。標的Ｒａｊｉ細胞を試験抗体と３０分間プレインキュベーションし、その後、５：１のＮＫエフェクター細胞対標的細胞比率でエフェクター細胞を添加し、インキュベーションを５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で６時間継続した。ＬＤＨ放出及び標的溶解率（％）を、ＬＤＨアッセイキットを使用して測定した。ＣＤＣアッセイについては、最終濃度１０％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）を、Ｒａｊｉ標的細胞及びそれぞれの抗体と、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２時間インキュベートした。ＬＤＨ放出及び標的溶解率（％）を、ＬＤＨアッセイキットを使用して測定した。
【０２６１】
結果を図５に示す。図５Ａは、変異体１６６１が、予測通り、１０μＭまでの濃度でＡＤＣＣを媒介することができなかったことを示す。それに比べて、陽性対照リツキシマブはＡＤＣＣを媒介した。図５Ｂは、変異体１６６１が、５００ｎＭを超えるＥＣ５０の観察を伴って、これも予想通り、ＣＤＣの誘発における効力がリツキシマブより１０倍超弱かったことを示す。これらの結果は、１６６１が、最大標的Ｂ細胞殺傷媒介濃度（配列例を参照されたい）でＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介しそうにないことを示す。
【０２６２】
実施例６：ヒト全血における自己Ｂ細胞枯渇
二重特異性抗ＣＤ１９−ＣＤ３抗原結合構築物を、ＩＬ２活性化下のヒト全血初代細胞培養物において自己Ｂ細胞を枯渇させるそれらの能力について分析した。このアッセイにおいて試験された変異体は、８７５、１６６１、及び１０１４９であった。非特異性対照として、Ｆａｂ結合性アームを有さないホモ二量体Ｆｃ（Ｆｃ遮断）を使用した。
【０２６３】
簡潔には、変異体を、ヘパリン処置したヒト全血内、ＩＬ２の存在下で２日間インキュベートした。各対照及び実験条件について四連のウェルにプレーティングされ、培養物を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートし、４８時間で停止した。培養物を回収した後に赤血球細胞を溶解し、収集した初代細胞をＣＤ４５、ＣＤ２０及び７−ＡＡＤ  ＦＡＣＳ検出のために染色した。ＣＤ４５＋、ＣＤ４５＋／ＣＤ２０＋及びＣＤ４５＋／ＣＤ２０＋／７ＡＡＤ＋／−集団のＦＡＣＳ分析を、ＩｎＣｙｔｅ／ＦｌｏｗＪｏにより以下のように実施した：ＦＳＣ／ＳＳＣ及び補正ウェルについての５，０００事象から実験ウェルについての３０，０００事象をサイトメトリーにより分析した。デブリとＲＢＣをスキップするように閾値を設定した。リンパ球、ＣＤ４５＋、ＣＤ２０＋、及び７ＡＡＤ＋細胞についてゲーティングを実施した。
【０２６４】
図６は、ＩＬ２活性化下のヒト全血内の自己Ｂ細胞濃度に及ぼす変異体８７５及び１６６１の細胞障害効果を示す。両変異体は、このアッセイにおいてＣＤ２０＋Ｂ細胞を枯渇させることができた。最大インビトロ有効性は、０．１ｎＭ未満で観察され、強い濃度依存性効果があり、ＥＣ５０は約０．００１ｎＭであった。
【０２６５】
図７は、変異体１６６１が、１０：１のＥ：Ｔ比率で４８時間後に濃度依存性様式（０．０１ｎＭ未満のＥＣ５０）で、ＩＬ−２活性化ヒト全血内で用量依存性自己Ｂ細胞枯渇を媒介することができたことを示す。結果は、培地対照に対して正規化されたＣＤ２０＋Ｂ細胞の割合（％）として示す。図８は、静止条件下（すなわちＩＬ２刺激の不存在下）での変異体１６６１と１０１４９の間の比較を示し、これは両方の変異体が用量依存的様式でＢ細胞を枯渇させることができたことを示す。ジスルフィド安定化変異体１０１４９は、静止全血において親変異体ｖ１６６１と同等の効力を示した。
【０２６６】
実施例７：例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の、一次ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）及びＭＣＬ（マントル細胞リンパ腫）患者試料における自己Ｂ細胞を枯渇させる能力
一次ＣＬＬ及びＭＣＬ患者全血試料において自己Ｂ細胞を枯渇させる変異体１６６１の能力を以下のように決定した。
【０２６７】
３人の患者から一次患者血液試料を採取した。血液試料を血液採取の当日に以下のように処理した：ヘパリン処置した患者全血内で変異体を直接インキュベートした。各対照及び実験条件について四連のウェルにプレーティングされ、培養物を５％  ＣＯ２中、３７℃でインキュベートし、４日目で停止した。培養物を回収した後に赤血球細胞を溶解し、収集した初代細胞をＣＤ４５、ＣＤ２０、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ１９及び７−ＡＡＤ  ＦＡＣＳ検出のために染色した。ＦＡＣＳ分析を、ＩｎＣｙｔｅ／ＦｌｏｗＪｏにて実施した。アッセイを実施する前に、各患者のベースのリンパ球数も、ＣＤ４５、ＣＤ２０、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ１９及び７−ＡＡＤについて染色することにより決定した。ベースのリンパ球数は下記表４に示す。図９Ａ及びＢは、枯渇アッセイの結果を示す。結果は、培地対照に対して正規化されたＣＤ２０＋／ＣＤ５＋Ｂ細胞の割合（％）として示す。
【０２６８】
（表４）ベースのリンパ球数：Ｚ３４  ＫＯインキュベーション前の患者全血におけるＴ細胞及びＢ細胞の割合（％）
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＊ 患者は、試料採取時に標準リツキサン＋プレドニゾン処置を受けている
＄ ＲＡＩ：ＣＬＬの病期分類及び診断のための国際ＲＡＩシステム
【０２６９】
ＭＣＬ患者全血におけるＥ：Ｔ比率は、Ｔ細胞対Ｂ細胞が１：１．３であった。ＣＣＬ患者全血におけるＥ：Ｔ比率は、Ｔ細胞対Ｂ細胞が１：１〜１：５であった。変異体１６６１は、ＣＬＬ一次患者全血においてＴ細胞を活性化させることができ、これは４日間のインキュベーションの後のＣＤ６９＋Ｔ細胞のレベルの上昇により示される（データは図示されず）。図９Ｂは、変異体１６６１が、未処置及びリツキサン前処置一次患者全血試料において同等の程度まで濃度依存的にＣＬＬ  Ｂ細胞を枯渇させたことを示す。図９Ａは、変異体１６６１が未処置一次患者全血試料において濃度依存的なＭＣＬ  Ｂ細胞枯渇を示したことを示す。
【０２７０】
実施例８：例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の存在下でのヒトＰＢＭＣにおける自己Ｔ細胞増殖の評価
例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の、ヒトＰＢＭＣにおいて自己Ｔ細胞増殖を刺激する能力を評価した。試験変異体は８７５及び１３８０（変異体１６６１と同様にＦｃ  ＫＯを有する）であった。試験対照は、野生型ＯＫＴ３抗体、ヒトＩｇＧ、及びブリナツモマブ（変異体８９１）であった。アッセイは下記のように実施した。
【０２７１】
細胞増殖アッセイ：１日目に、４人の各ドナーから血液を採取し、ＰＢＭＣを新たに単離した。ドナーリンパ球プロファイルを実施例６に記載するようにＦＡＣＳにより決定した。４人のドナーのドナープロファイルを下記表５に示す。
【０２７２】
（表５）ドナーＰＢＭＣプロファイル
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【０２７３】
増殖アッセイについては、試験物を最終濃度０．３ｎＭ及び１００ｎＭにて調製し、ＰＢＭＣと混合して、２５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。混合物を３日間インキュベートし、その後、トリチウムで標識したチミジンを細胞含有ウェルに添加して最終濃度０．５μＣｉチミジン／ウェルとした。プレートをさらに１８時間インキュベートし、その後、プレートを凍結した。総インキュベーション時間は４日間であった。プレートを濾過して、β計数器を使用して計数した（ＣＰＭ）。平均値から、刺激指数（ＳＩ）を以下のように算出し、データを表にした：試験物の平均ＣＰＭ／培地のみの平均ＣＰＭ。アッセイの結果を図１０に示す。図１０は、ＯＫＴ３が０．３ｎＭにてｖ８９１（ブリナツモマブ）＞ｖ８７５及びｖ１３８０のランク降順で最大Ｔ細胞増殖を媒介したことを示す。患者の血清中０．３ｎＭの濃度で、ＯＫＴ３及びブリナツモマブは有害作用と関連する［Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；Ｋｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２０１０）］。ｖ１３８０は、ＯＫＴ３及びブリナツモマブより有意に低い程度にＴ細胞増殖を誘導した。変異体１６６１のようにＦｃエフェクター機能を媒介しない変異体であるＶ１３８０は、最大Ｂ細胞枯渇のために十分なＴ細胞増殖（しかし、ベンチマークよりもはるかに低いレベル）を誘導することができた（実施例５及び６を参照されたい）。
【０２７４】
実施例９：例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物により媒介されるヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞増殖に関する標的Ｂ細胞依存性の決定
ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物により媒介されるＴ細胞増殖が標的Ｂ細胞の存在に依存していることの確認は、Ｂ細胞及び／またはＮＫエフェクター細胞の不在下または存在下でのＰＢＭＣにおけるＴ細胞増殖を刺激するＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の能力を評価することにより得られた。アッセイは、変異体１３８０、対照ブリナツモマブ（ｖ８９１）、及びヒトＩｇＧを使用して下記のように実施された。
【０２７５】
細胞増殖アッセイ：ＰＢＭＣ由来のサブ集団は、ＰＢＭＣ、Ｂ細胞を有さないＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ−Ｂ）、ＮＫ細胞を有さないＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ−ＮＫ）、ＮＫ及びＢ細胞を有さないＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ−ＮＫ−Ｂ）を含む。１日目に、４人の各ドナーから約１３５ｍＬの血液を採取した。ＰＢＭＣを新たに単離し、当該ＰＢＭＣを、正の選択によるＣＤ１９及び／またはＣＤ５６枯渇用のＥａｓｙＳｅｐカラム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に通した（１日目）。ＰＢＭＣの白血球プロファイルを実施例６に記載するようにＦＡＣＳにより決定した。ＰＢＭＣプロファイルを表６に示す。
【０２７６】
（表６）ＰＢＭＣプロファイル
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【０２７７】
Ｔ細胞増殖アッセイを以下のように実施した。試験物を最終濃度１００ｎＭにて調製し、ＰＢＭＣと混合し、２５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。混合物を３日間インキュベートし、その後、トリチウム標識したチミジンを細胞含有ウェルに添加して最終的に０．５μＣｉチミジン／ウェルとした；プレートをさらに１８時間インキュベートし、その後プレートを凍結した。総インキュベーション時間は４日間であった。プレートを濾過して、β計数器を使用して計数した（ＣＰＭ）。平均値から、刺激指数（ＳＩ）を以下のように算出し、データを表にした：試験物の平均ＣＰＭ／培地のみの平均ＣＰＭ。
【０２７８】
結果を図１１に示す。健常ドナーから採取されたヒトＰＢＭＣにおける平均Ｅ：Ｔ比率は、ＣＤ３＋Ｔ細胞対ＣＤ１９＋Ｂ細胞が約１０：１であった（データは図示されず）。
【０２７９】
図１１は、変異体１３８０が、ＰＢＭＣ及びＰＢＭＣ−ＮＫ細胞（ＰＢＭＣマイナスＮＫ細胞）においてはＴ細胞増殖を示したが、Ｂ細胞を欠くＰＢＭＣ及びＢ細胞及びＮＫ細胞を欠くＰＢＭＣにおいてはほとんどから全くＴ細胞増殖を示さなかったことを示し、これは、標的Ｂ細胞への依存性を示す。ブリナツモマブは、Ｔ細胞活性化について同様の標的Ｂ細胞依存性を示したが、１３８０より高いＴ細胞増殖を誘導した。
【０２８０】
これらの結果は、変異体１３８０が、最大Ｂ細胞枯渇を媒介する濃度で厳密に標的依存性のＴ細胞増殖を呈することを示す（実施例５及び６を参照されたい）。これらの結果はまた、変異体１３８０及びエフェクター機能を媒介することができないＦｃを有する他のＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物がブリナツモマブより高い治療指数を有する可能性が高いことも示す。１３８０は、１６６１と同一のＣＤＲ配列及び等しいＴ及びＢ細胞親和性を有し、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ＶＨ−ＶＬの向き及びｓｃＦｖリンカーにおいてのみ１６６１と異なる（表１を参照されたい）。
【０２８１】
実施例１０：ＩＬ２活性化ヒトＰＢＭＣ及びＧ２白血病細胞を移植されたＮＳＧマウスにおけるＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物のインビボ有効性
インビボマウス白血病モデルにおける例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物の有効性を決定した。このモデルでは、ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧ（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ）マウスに化学療法抵抗性のＧ２  ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）細胞を移植し、ＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物８７５及び１６６１がＧ２白血病細胞の生着レベルに及ぼす効果を観察した。このモデルは、Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ９（１）：１７５−８４（１９９５）、及びＮｅｒｖｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３５：１８２３−１８３８（２００７）に記載されている。
【０２８２】
予備実験として、選択された変異体のＧ２白血病細胞株への結合能を試験した。
【０２８３】
ヒトＧ２  ＡＬＬ腫瘍細胞株へのインビトロＦＡＣＳ結合：
前もって冷却したＧ２細胞（１×１０６生存細胞／管）を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清及び１％ヤギ血清（Ｌ−１０＋ＧＳ１）を最終容量２００μＬ／管で含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ１５緩衝液中、０、０．１、０．３、１、３、１０、３０、及び１００ｎＭの濃度の氷冷した二重特異性試薬ｈｕＣＤ３×ｈｕＣＤ１９と、３連で、氷上で２時間、ＣＯ２不在下でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を４ｍｌの氷冷Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ１５中で洗浄し、ペレットを、Ｌ−１０＋ＧＳ１中１／１００に希釈した１００μＬの氷冷Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８タグ付き抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）に再懸濁した。１５分以上暗所に置いた後、４ｍｌのＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ１５を添加し、細胞をペレット状にし、次いでフローサイトメトリーによる分析の前に２μｇ／ｍｌの７ＡＡＤを含有する２００μＬの氷冷フローサイトメトリーランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁した。平均蛍光強度を使用して、結合曲線を確立し、そこから各細胞株に関する各二重特異性試薬についてのＫｄを決定した。
【０２８４】
図１２は、例示的な変異体である８７５及び１６６１が、８７５では１．９ｎＭのＫｄで、１６６１では２．６ｎＭのＫｄで、Ｇ２  ＡＬＬ細胞に結合できたことを示す。
【０２８５】
ＩＬ２活性化ヒトＰＢＭＣ及びＧ２白血病細胞を移植されたＮＳＧマウスにおけるインビボ有効性：
３×１０６個の活性化（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８［１ビーズ／ＣＤ３＋細胞］＋５０ＵのＩＬ２／ｍｌ（５ｄにつき））ヒトＰＢＭＣと混合した１×１０５個のＧ２−ＣＢＲｌｕｃ／ｅＧＦＰ細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／  ｃｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（ｎ＝５／群）の静脈内に移植した。全マウス群の細胞源として単一のドナーを使用した。ヒトＴ細胞：Ｇ２  Ｂ細胞の比率は１０：１であった。フローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞の活性化状態（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＣＲ７）及び生存力（７ＡＡＤ）を評価した。
【０２８６】
マウスは、ＰＢＭＣ及びＧ２の移植の１時間後に二重特異性変異体の最初の投与を受容した（ｎ＝５／群）：３ｍｇ／ｋｇで０、２、及び４日目に投薬され、５日目に終了した。Ｄ−ルシフェリン（１５０μｇ／体重（ｇ））をマウスに注射し、ベースラインで１０分後及び移植の９、１４、１８日後の全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）により腫瘍進行を追跡した。１８日目に動物を屠殺し、脾臓をエキソビボＢＬＩ（生物発光イメージング）のために回収した。結果を図１３及び１４に示す。「ブランク」は、Ｇ２を移植されていない対照群を示す。
【０２８７】
さらに、平均血清濃度（１ｍＬあたりのマイクログラム）を決定するために、最初の３ｍｇ／ｋｇ静脈内投薬の２４時間後に１コホートあたり２動物について血液試料を採取した。結果を図１５に示す。
【０２８８】
図１３Ａは、１８日間にわたる、腹臥位で測定したときの変異体８７５の全身ＢＬＩを示し、図１３Ｂは、仰臥位での同じ変異体の全身ＢＬＩを示す。図１３Ｃは、１８日目における変異体８７５及び対照の脾臓ＢＬＩを示す。
【０２８９】
図１４Ａは、１８日間にわたる、腹臥位で測定したときの変異体１６６１の全身ＢＬＩを示し、図１４Ｂは、仰臥位での同じ変異体の全身ＢＬＩを示す。図１４Ｃは、ＩｇＧで処置された対照群及びｖ１６６１で処置された群からの２匹の代表的なマウスの全身走査画像を示す。図は、ｖ１６６１で処置された動物ではＧ２生着を示さず、ＩｇＧで処置された群においては高度な生着及びＡＬＬ疾患の進行を示す。図１４Ｄは、１８日目における変異体１６６１及び対照の脾臓ＢＬＩを示す。
【０２９０】
図１５は、３ｍｇ／ｋｇ静脈内投薬の２４時間後に達成された、変異体８７５及び１６６１の平均血清濃度を示す。
【０２９１】
これらの結果は、Ｆｃノックアウト変異体１６６１が、Ｇ２  ＡＬＬ細胞の完全な枯渇を示し、有意なＧ２生着を示さないことを示す。これらの条件下で、活性なＦｃを含有する変異体８７５は、類似するが、変異体１６６１と比較すると低減したレベルのＧ２枯渇を示す。
【０２９２】
（表Ｓ１）ＣＤ３及びＣＤ１９抗原結合構築物のＣＤＲ配列（２８９〜３８６）
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【０２９３】
（表Ｓ２）ＣＤ１９ヒト化ＶＬ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７、３３８）
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【０２９４】
（表Ｓ３）ＣＤ１９ヒト化ＶＨ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３９〜３４２）
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【０２９５】
（表Ｓ４）変異体及びクローン
2017504328.tif 000020
【０２９６】
（表Ｓ５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ（１〜２８８）ごとのクローンの配列
2017504328.tif 000021
2017504328.tif 000022
2017504328.tif 000023
2017504328.tif 000024
2017504328.tif 000025
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2017504328.tif 000037
【図１】
2017504328.tif 000040
【図２Ａ】
2017504328.tif 000041
【図２Ｂ】
2017504328.tif 000042
【図２Ｃ】
2017504328.tif 000043
【図３】
2017504328.tif 000044
【図４】
2017504328.tif 000045
【図５】
2017504328.tif 000046
【図６】
2017504328.tif 000047
【図７】
2017504328.tif 000048
【図８】
2017504328.tif 000049
【図９】
2017504328.tif 000050
【図１０】
2017504328.tif 000051
【図１１】
2017504328.tif 000052
【図１２】
2017504328.tif 000053
【図１３Ａ】
2017504328.tif 000054
【図１３Ｂ】
2017504328.tif 000055
【図１３Ｃ】
2017504328.tif 000056
【図１４Ａ】
2017504328.tif 000057
【図１４Ｂ】
2017504328.tif 000058
【図１４Ｃ】
2017504328.tif 000059
【図１４Ｄ】
2017504328.tif 000060
【図１５】
2017504328.tif 000061
【図１６】
2017504328.tif 000062
【図１７−１】
2017504328.tif 000063
【図１７−２】
2017504328.tif 000064
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月25日(2016.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年１月３０日に作製され、名称は２８５１５＿ＰＣＴ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズは３３２，１４４バイトである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
抗原結合構築物ポリペプチド配列及びＣＤＲ配列、抗原結合構築物をコードする核酸、及びベクター及び細胞も記載する。抗原結合構築物を含む医薬組成物、及び、本明細書に記載の抗原結合構築物を使用して障害（例えば、癌）を治療する方法も記載する。
[本発明1001]
以下を含む、抗原結合構築物：
第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカー、及び第一のＶＨを含む第一のｓｃＦｖを含む第一の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第一のｓｃＦｖが、ＣＤ19抗原に一価で特異的に結合し、前記第一のｓｃＦｖが、抗ＣＤ19抗体ＨＤ37  ｓｃＦｖ、修飾ＨＤ37  ｓｃＦｖ、ＨＤ37遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾ＨＤ37遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択され、前記ＨＤ37遮断抗体が、前記ＣＤ19抗原へのＨＤ37の結合を50％以上遮断する、第一の抗原結合ポリペプチド構築物；
第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカー、及び第二のＶＨを含む第二のｓｃＦｖを含む第二の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第二のｓｃＦｖが、ＣＤ3抗原のイプシロンサブユニットに一価で特異的に結合し、前記第二のｓｃＦｖが、ＯＫＴ3  ｓｃＦｖ、修飾ＯＫＴ3  ｓｃＦｖ、ＯＫＴ3遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾ＯＫＴ3遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択され、前記ＯＫＴ3遮断抗体が、前記ＣＤ3抗原の前記イプシロンサブユニットへのＯＫＴ3の結合を50％以上遮断する、第二の抗原結合ポリペプチド構築物；
二量体化ＣＨ3ドメインを形成することができる修飾ＣＨ3配列をそれぞれ含む第一及び第二のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃであって、各修飾ＣＨ3配列が、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、前記二量体化ＣＨ3ドメインが、約68℃またはそれより高い融解温度（Ｔｍ）を有し、前記第一のＦｃポリペプチドが、第一のヒンジリンカーにより前記第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、かつ前記第二のＦｃポリペプチドが、第二のヒンジリンカーにより前記第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている、ヘテロ二量体Ｆｃ。
[本発明1002]
ｖ12043、ｖ10149、またはｖ1661からなる、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1003]
前記第一のｓｃＦｖが、
2017504328.tif 000065
から選択されるＣＤＲ配列のセットに100％同一であるＣＤＲ配列を含む、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1004]
前記第一のｓｃＦｖが、本発明1003のＣＤＲの前記セットに95％同一であるＣＤＲ配列を含む、本発明1003の抗原結合構築物。
[本発明1005]
前記第一のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ37のＶＨのポリペプチド配列、ｈＶＨ2ポリペプチド配列、及びｈＶＨ3ポリペプチド配列から選択され、前記第一のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ37  ＶＬのポリペプチド配列及びｈＶＬ2ポリペプチド配列から選択される、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1006]
前記第一のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ37のＶＨのポリペプチド配列、ｈＶＨ2ポリペプチド配列、またはｈＶＨ3ポリペプチド配列に95％同一であり、前記第一のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ37  ＶＬのポリペプチド配列またはｈＶＬ2ポリペプチド配列に95％同一である、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1007]
前記ＨＤ37遮断抗体が、4Ｇ7、Ｂ4、Ｂ3、ＨＤ237、及びＭｏｒ−208から選択される、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1008]
前記第二のｓｃＦｖが、
2017504328.tif 000066
から選択されるＣＤＲのセットを含む、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1009]
前記第二のｓｃＦｖが、本発明1008のＣＤＲの前記セットに少なくとも95％同一であるＣＤＲのセットを含む、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1010]
前記第二のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＯＫＴ3のＶＨのポリペプチド配列であるか、または野生型ＯＫＴ3のＶＨのポリペプチド配列に95％同一であるポリペプチド配列であり、前記第二のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＯＫＴ3のＶＬのポリペプチド配列であるか、または野生型ＯＫＴ3のＶＬのポリペプチド配列に95％同一であるポリペプチド配列である、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1011]
前記ＯＫＴ3遮断抗体が、Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ（商標）、ＵＣＨＴ1、及びビジリズマブから選択される、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1012]
前記第二のｓｃＦｖが前記ＯＫＴ3のＣＤ3エピトープに結合する、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1013]
前記第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第一のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、本発明1001〜1012のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1014]
前記第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第一のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、本発明1001〜1012のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1015]
前記第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第二のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、本発明1001〜1014のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1016]
前記第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第二のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、本発明1001〜1014のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1017]
一方または両方のｓｃＦｖが、ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含む、本発明1001〜1016のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1018]
前記第一または第二のｓｃＦｖリンカーが、表Ｂから選択される、本発明1001及び1003〜1017のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1019]
前記第一または第二のヒンジポリペプチドリンカーが、表Ｅから選択される、本発明1001及び1003〜1018のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1020]
前記第一のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記第一のＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されており、前記第二のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記第二のＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1021]
前記第一のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されており、前記第二のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1022]
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、ＦｃγＲまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Ｆｃの能力を低減させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つのＣＨ2ドメインを含む、本発明1020または1021の抗原結合構築物。
[本発明1023]
ＣＤ19に対する前記第一のｓｃＦｖの結合親和性が、約0．1ｎＭ〜約5ｎＭであり、ＣＤ3の前記イプシロンサブユニットに対する前記第二のｓｃＦｖの結合親和性が、約1ｎＭ〜約100ｎＭである、本発明1001〜1022のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1024]
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、
ａ．ヒトＦｃであり；かつ／または
ｂ．ヒトＩｇＧ1  Ｆｃであり；かつ／または
ｃ．表Ａに記載のように前記ＣＨ3ドメインのうち少なくとも1つに1つまたは複数の修飾を含み；かつ／または
ｄ．少なくとも1つのＣＨ2ドメインをさらに含み；かつ／または
ｅ．1つまたは複数の修飾を含む少なくとも1つのＣＨ2ドメインをさらに含み；かつ／または
ｆ．表Ｂに記載のように前記ＣＨ2ドメインの少なくとも1つに1つまたは複数の修飾を含む少なくとも1つのＣＨ2ドメインをさらに含み；かつ／または
ｇ．表Ｃに記載のようにＦｃγＲまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Ｆｃの能力を低減させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つのＣＨ2ドメインをさらに含み；かつ／または
ｈ．アミノ酸置換Ｎ297Ａ、もしくはＬ234Ａ＿Ｌ235Ａ、もしくはＬ234Ａ＿Ｌ235Ａ＿Ｄ265Ｓを含む少なくとも1つのＣＨ2ドメインをさらに含む、
本発明1001〜1023のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1025]
前記二量体化ＣＨ3ドメインが、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77．5、78、79、80、81、82、83、84、または85℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する、本発明1001〜1024のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1026]
前記抗原結合構築物が、
ａ）ＦＡＣＳ及び／もしくは顕微鏡検査によりアッセイされるようなＣＤ19＋Ｒａｊｉ  Ｂ細胞及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の間のシナプス形成及び架橋が可能であり；かつ／または
ｂ）ヒト全血またはＰＢＭＣにおけるＣＤ19発現Ｂ細胞のＴ細胞誘引による殺傷（T-cell directed killing）を媒介し；かつ／または
ｃ）ｖ875またはｖ1661と比較して改善した生物物理学的特性を示し；かつ／または
ｄ）ｖ875またはｖ1661と比較して改善したタンパク質発現及び収率、例えば、同様の条件下で発現及び精製された場合にＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）後に4〜10ｍｇ／Ｌ超での発現を示し；かつ／または
ｅ）例えば95％を超えるヘテロ二量体純度を示す、
本発明1001〜1025のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1027]
薬物にコンジュゲートされている、本発明1001〜1026のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1028]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物及び薬学的担体の医薬組成物。
[本発明1029]
前記担体が、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、糖質、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む、本発明1028の医薬組成物。
[本発明1030]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物を含む、医療において使用するための医薬組成物。
[本発明1031]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物を含む、癌の治療において使用するための医薬組成物。
[本発明1032]
対象における癌を治療する方法であって、有効量の本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1033]
前記対象がヒトである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記癌が、リンパ腫または白血病またはＢ細胞悪性腫瘍、またはＣＤ19を発現する癌、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）またはリツキシマブもしくはＣＨＯＰ（ｃｙｔｏｘａｎ（商標）／Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（商標）ビンクリスチン／プレドニゾン療法）に耐性のＢ細胞癌である、本発明1032の方法。
[本発明1035]
以下の工程を含む、本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物を製造する方法：本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を前記抗原結合構築物の発現に好適な条件下で培養する工程、及び、前記抗原結合構築物を精製する工程。
[本発明1036]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物の少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセット。
[本発明1037]
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがｃＤＮＡである、本発明1036の単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1038]
本発明1036のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットの1つまたは複数を含むベクターまたはベクターのセットであって、任意選択的に、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される、前記ベクターまたはベクターのセット。
[本発明1039]
本発明1036のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットまたは本発明1038のベクターもしくはベクターのセットを含む単離された細胞であって、任意選択的に、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ293細胞から選択される、前記単離された細胞。
[本発明1040]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物及び使用説明書を含む、キット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図１】抗原結合構築物の設計の概略図を示す。図１Ａは、エフェクター機能を媒介することができるＦｃを有する例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物を図示する。当該抗原結合構築物の抗原結合ドメインは両方ともｓｃＦｖであり、各ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域はポリペプチドリンカーにより接続されている。各ｓｃＦｖはまた、ヒンジポリペプチドリンカーによりヘテロ二量体Ｆｃの一方のポリペプチド鎖に接続されている。当該抗原結合構築物の当該２つのポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている（破線として示す）。図１Ｂは、Ｆｃがノックアウトされている例示的なＣＤ３−ＣＤ１９抗原結合構築物を図示する。このタイプの抗原結合構築物は、ＦｃγＲ結合を除去するＦｃのＣＨ２領域への修飾（「Ｘ」で示す）を含むことを除き、図１Ａに示すものと類似する。
【図２Ａ】選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図２Ａの上方パネルは、変異体１０１４９についてのプロテインＡ精製後の分取ゲルろ過（ＧＦＣ）プロファイルを示し、下方パネルは、プールしたＧＦＣ画分の分析的ＳＥＣプロファイルを示す。
【図２Ｂ】選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図２Ｂの上方パネルは、変異体１６６１についてのプロテインＡ精製後の分取ゲルろ過（ＧＦＣ）プロファイルを示し、下方パネルは、１６６１についてのプールしたＧＦＣ画分の分析的ＳＥＣプロファイルを示す。
【図２Ｃ】選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図２Ｃは、変異体８７５、１６６１、１６５３、１６６６、１０１４９、及び１２０４３の生物物理学的特徴の概要を提供する。
【図３】Ｂ及びＴ細胞を架橋して仮足の形成させる変異体８７５及び１６６１の能力を示す。左の表は、ＦＡＣＳによる架橋分析及び顕微鏡による架橋分析により測定したこれらの変異体についてのＢ：Ｔ細胞架橋分析の概要を提供し；右の画像は、顕微鏡による架橋分析により測定した、変異体８７５についての仮足の形成を示す。
【図４】３００ｎＭの変異体８７５の、ＩＬ２活性化精製ＣＤ８＋Ｔ細胞における非ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞に対するオフターゲット細胞障害性を示す（４人のドナーの平均）。
【図５】ｖ１６６１のＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する能力の低減または消失を示す。図５Ａは、リツキシマブ対照との比較での変異体１６６１のＲａｊｉ細胞におけるＡＤＣＣを媒介する能力を示す。図５Ｂは、リツキシマブ対照に対する変異体１６６１のＲａｊｉ細胞におけるＣＤＣを媒介する能力を示す。
【図６】選択された変異体の、全血アッセイにおける自己Ｂ細胞枯渇を媒介する能力を示す。ＣＤ２０＋Ｂ細胞の存在は、ＩＬ２活性化ヒト全血における４８時間のインキュベーションの後に決定された（２ドナーの平均、ｎ＝４）。
【図７】１０：１のＥ：Ｔ比率で４８時間後のＩＬ−２活性化ヒト全血における濃度依存様式（０．０１ｎＭ未満のＥＣ５０）でのｖ１６６１による用量依存的な自己Ｂ細胞枯渇を示す。
【図８】静止条件下、用量依存的に全血中の自己Ｂ細胞を枯渇させる変異体１６６１及び１０１４９の能力の比較を示す。
【図９】一次患者ヒト全血におけるｖ１６６１による自己Ｂ細胞枯渇を示す。図９Ａは、ＭＣＬ患者からの血液中でのｖ１６６１の効果を示す。図９Ｂは、２人のＣＬＬ患者からの血液中でのｖ１６６１の効果を示す。残存する悪性Ｂ細胞の数は、培地対照に対して正規化されたＣＤ２０＋／ＣＤ５＋Ｂ細胞の割合（％）として表される。
【図１０】ｖ８７５、１３８０及び対照の、ヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞増殖を刺激する能力を示す（４日間のインキュベーション、４人のドナーの平均）。
【図１１】１００ｎＭの変異体、ヒトＰＢＭＣにおける標的Ｂ細胞依存性Ｔ細胞増殖を示す（４日間のインキュベーション、４人のドナーの平均）。
【図１２】選択された変異体の、ヒトＧ２  ＡＬＬ腫瘍細胞株に結合する能力を示す。
【図１３Ａ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体８７５の有効性を示す。図１３Ａは、腹臥位における全身の生物発光の量を示す。
【図１３Ｂ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体８７５の有効性を示す。図１３Ｂは、仰臥位における全身の生物発光の量を示す。
【図１３Ｃ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体８７５の有効性を示す。図１３Ｃは、１８日目の、単離された脾臓における生物発光の量を示す。
【図１４Ａ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体１６６１（ＦｃγＲノックアウト変異体）の有効性を示す。図１４Ａは、腹臥位における全身の生物発光の量を示す。
【図１４Ｂ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体１６６１（ＦｃγＲノックアウト変異体）の有効性を示す。図１４Ｂは、仰臥位における全身の生物発光の量を示す。
【図１４Ｃ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体１６６１（ＦｃγＲノックアウト変異体）の有効性を示す。図１４Ｃは、全身生物発光の画像である。
【図１４Ｄ】インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体１６６１（ＦｃγＲノックアウト変異体）の有効性を示す。図１４Ｄは、１８日目に、単離された脾臓で検出された生物発光の量を示す。
【図１５】インビボマウス白血病モデルにおける、３ｍｇ／ｋｇ静脈内注射の２４時間後の二重特異性抗ＣＤ３−ＣＤ１９変異体の血清濃度の分析を示す。
【図１６】マウスＨＤ３７  ＶＬ及びＶＨ配列をベースとするヒト化ＣＤ１９  ＶＬ及びＶＨ配列（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６７及び３７１）を示す。３つのヒト化ＶＬ配列を提供している：ｈＶＬ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６８）、ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６９）、及びｈＶＬ２（Ｄ−Ｓ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７０）。ｈＶＬ２（Ｄ−Ｅ）は、ＣＤＲ  Ｌ１におけるＤからＥへの置換を含有し、ｈＶＬ２（Ｄ−Ｓ）は、ＣＤＲ  Ｌ１におけるＤからＳへの置換を含有する。２つのヒト化ＶＨ配列ｈＶＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）及びｈＶＨ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３）を提供している。ＣＤＲ配列は、囲みにより確認される。この図において確認されるＣＤＲは単なる例示である。当該技術分野で知られているように、ＣＤＲの同定は、それらを同定するために使用する方法に応じて変わり得る。抗ＣＤ１９  ＶＬ及びＶＨ配列についての代替のＣＤＲ定義を表Ｓ１に示す。野生型マウスＨＤ３７抗体配列に関してヒト化されたこれらの配列への修飾は、下線で示す。
【図１７−１】抗ＣＤ１９  ＨＤ３７抗体に基づく、抗ＣＤ１９  ＶＬ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６７）に関するＫａｂａｔに従う番号を示す表を示す。
【図１７−２】抗ＣＤ１９  ＨＤ３７抗体に基づく、抗ＣＤ１９  ＶＨ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７１）に関するＫａｂａｔに従う番号を示す表を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
可変領域は、機能的抗原結合部分の形成を可能にする、リンカーペプチド、またはｓｃＦｖリンカーを介して接続され得る。ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖリンカーポリペプチドの組成及び／または長さを変更することによりタンパク質発現及び収率について最適化されることができる。典型的なペプチドリンカーは、約２〜２０個のアミノ酸を含み、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野で公知である。好適な、非免疫原生リンカーペプチドには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６３）、（ＳＧ４）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６４）、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６３）、Ｇ４（ＳＧ４）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６５）またはＧ２（ＳＧ２）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６６）リンカーペプチドが含まれ、ここでｎは、一般的には、１から１０の間、典型的には２から４の間の数である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
（表Ｂ）ｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列
2017504328.tif 000067
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
この構造の分析は、表Ｆの配列に関して、ＯＫＴ３抗体のＣＤＲが、ヒトＣＤ３イプシロンにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５０の残基５６−５７（ＳＥ）、６８−７０（ＧＤＥ）、及び１０１−１０７（ＲＧＳＫＰＥＤ）で接触することを示す。これらの残基における結合ホットスポットに下線を引いている。これらの残基は、ＯＫＴ３が結合するエピトープと考えられる。従って、本明細書に記載の抗原結合構築物は、このエピトープに特異的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
（表１）変異体、鎖Ａ、鎖Ｂ、Ｆｃ
2017504328.tif 000068
2017504328.tif 000069
−Ｈｅｔ  Ｆｃ１＝鎖Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；鎖Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（ＩｇＧ１  Ｆｃに対するＥＵナンバリングシステム）
−Ｈｅｔ  Ｆｃ２＝鎖Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ；鎖Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ
−ＦｃγＲ  ＫＯ１＝鎖Ａ：Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ；鎖Ｂ：Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ
−ＦｃγＲ  ＫＯ２＝鎖Ａ：Ｄ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ；鎖Ｂ：Ｄ２６５Ｓ＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ
−αＣＤ１９＿ＨＤ３７  ｓｃＦｖ−別段の指示がない限り、可変領域のＮからＣ末端への順序はＶＬ／ＶＨである。
−αＣＤ３＿ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ−別段の指示がない限り、可変領域のＮからＣ末端への順序はＶＬ／ＶＨである。ＶＬＶＨは、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）により接続されている。
−αＣＤ３＿ＢｉＴＥ  ｓｃＦｖ−可変領域のＮからＣ末端への順序はＶＨ／ＶＬであり、リンカー及び組成はブリナツモマブと同一である。
−（ＶＬＶＨ  ＳＳ）または（ＶＨＶＬ  ＳＳ）は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬ間にジスルフィド連結を導入するために、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに準じ、公表されたＶＨ４４位及びＶＬ１００位を活用するジスルフィド安定化ｓｃＦｖを示す［Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２３９−１２４５（１９９６）］。
−（ＣＤＲＣ→Ｓ）−下記に参照されるようにＯＫＴ３のＨ３  ＣＤＲにおける変異を示す。
−（ＶＨＶＬリンカー）−リンカー
2017504328.tif 000070
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４４）により接続されるＶＨ及びＶＬを示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、抗原結合構築物：
第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカー、及び第一のＶＨを含む第一のｓｃＦｖを含む第一の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第一のｓｃＦｖが、ＣＤ１９抗原に一価で特異的に結合し、前記第一のｓｃＦｖが、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７  ｓｃＦｖ、修飾ＨＤ３７  ｓｃＦｖ、ＨＤ３７遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾ＨＤ３７遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択され、前記ＨＤ３７遮断抗体が、前記ＣＤ１９抗原へのＨＤ３７の結合を５０％以上遮断する、第一の抗原結合ポリペプチド構築物；
第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカー、及び第二のＶＨを含む第二のｓｃＦｖを含む第二の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第二のｓｃＦｖが、ＣＤ３抗原のイプシロンサブユニットに一価で特異的に結合し、前記第二のｓｃＦｖが、ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、修飾ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ、ＯＫＴ３遮断抗体ｓｃＦｖ、及び修飾ＯＫＴ３遮断抗体ｓｃＦｖからなる群より選択され、前記ＯＫＴ３遮断抗体が、前記ＣＤ３抗原の前記イプシロンサブユニットへのＯＫＴ３の結合を５０％以上遮断する、第二の抗原結合ポリペプチド構築物；
二量体化ＣＨ３ドメインを形成することができる修飾ＣＨ３配列をそれぞれ含む第一及び第二のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃであって、各修飾ＣＨ３配列が、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、前記二量体化ＣＨ３ドメインが、約６８℃またはそれより高い融解温度（Ｔｍ）を有し、前記第一のＦｃポリペプチドが、第一のヒンジリンカーにより前記第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、かつ前記第二のＦｃポリペプチドが、第二のヒンジリンカーにより前記第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている、ヘテロ二量体Ｆｃ。
【請求項２】
ｖ１２０４３、ｖ１０１４９、またはｖ１６６１からなる、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項３】
前記第一のｓｃＦｖが、
2017504328.tif 000071
から選択されるＣＤＲ配列のセットに１００％同一であるＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項４】
前記第一のｓｃＦｖが、請求項３に記載のＣＤＲの前記セットに９５％同一であるＣＤＲ配列を含む、請求項３に記載の抗原結合構築物。
【請求項５】
前記第一のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ３７のＶＨのポリペプチド配列、ｈＶＨ２ポリペプチド配列、及びｈＶＨ３ポリペプチド配列から選択され、前記第一のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ３７  ＶＬのポリペプチド配列及びｈＶＬ２ポリペプチド配列から選択される、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項６】
前記第一のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ３７のＶＨのポリペプチド配列、ｈＶＨ２ポリペプチド配列、またはｈＶＨ３ポリペプチド配列に９５％同一であり、前記第一のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＨＤ３７  ＶＬのポリペプチド配列またはｈＶＬ２ポリペプチド配列に９５％同一である、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項７】
前記ＨＤ３７遮断抗体が、４Ｇ７、Ｂ４、Ｂ３、ＨＤ２３７、及びＭｏｒ−２０８から選択される、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項８】
前記第二のｓｃＦｖが、
2017504328.tif 000072
から選択されるＣＤＲのセットを含む、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項９】
前記第二のｓｃＦｖが、請求項８に記載のＣＤＲの前記セットに少なくとも９５％同一であるＣＤＲのセットを含む、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項１０】
前記第二のＶＨのポリペプチド配列が、野生型ＯＫＴ３のＶＨのポリペプチド配列であるか、または野生型ＯＫＴ３のＶＨのポリペプチド配列に９５％同一であるポリペプチド配列であり、前記第二のＶＬのポリペプチド配列が、野生型ＯＫＴ３のＶＬのポリペプチド配列であるか、または野生型ＯＫＴ３のＶＬのポリペプチド配列に９５％同一であるポリペプチド配列である、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項１１】
前記ＯＫＴ３遮断抗体が、Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ（商標）、ＵＣＨＴ１、及びビジリズマブから選択される、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項１２】
前記第二のｓｃＦｖが前記ＯＫＴ３のＣＤ３エピトープに結合する、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項１３】
前記第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第一のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１４】
前記第一のＶＬ、第一のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第一のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１５】
前記第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第二のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１６】
前記第二のＶＬ、第二のｓｃＦｖリンカーポリペプチド配列、及び第二のＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１７】
一方または両方のｓｃＦｖが、ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１８】
前記第一または第二のｓｃＦｖリンカーが、表Ｂから選択される、請求項１及び３〜１７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項１９】
前記第一または第二のヒンジポリペプチドリンカーが、表Ｅから選択される、請求項１及び３〜１８のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２０】
前記第一のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記第一のＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されており、前記第二のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記第二のＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＨ−リンカー−ＶＬとして配列されている、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項２１】
前記第一のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されており、前記第二のＶＬ、ｓｃＦｖリンカー、及びＶＨのポリペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記ＶＬ及びＶＨのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むＶＬ−リンカー−ＶＨとして配列されている、請求項１に記載の抗原結合構築物。
【請求項２２】
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、ＦｃγＲまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Ｆｃの能力を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインを含む、請求項２０または２１に記載の抗原結合構築物。
【請求項２３】
ＣＤ１９に対する前記第一のｓｃＦｖの結合親和性が、約０．１ｎＭ〜約５ｎＭであり、ＣＤ３の前記イプシロンサブユニットに対する前記第二のｓｃＦｖの結合親和性が、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２４】
前記ヘテロ二量体Ｆｃが、
ａ．ヒトＦｃであり；かつ／または
ｂ．ヒトＩｇＧ１  Ｆｃであり；かつ／または
ｃ．表Ａに記載のように前記ＣＨ３ドメインのうち少なくとも１つに１つまたは複数の修飾を含み；かつ／または
ｄ．少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含み；かつ／または
ｅ．１つまたは複数の修飾を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含み；かつ／または
ｆ．表Ｂに記載のように前記ＣＨ２ドメインの少なくとも１つに１つまたは複数の修飾を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含み；かつ／または
ｇ．表Ｃに記載のようにＦｃγＲまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Ｆｃの能力を低減させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含み；かつ／または
ｈ．アミノ酸置換Ｎ２９７Ａ、もしくはＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ、もしくはＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓを含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインをさらに含む、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２５】
前記二量体化ＣＨ３ドメインが、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２６】
前記抗原結合構築物が、
ａ）ＦＡＣＳ及び／もしくは顕微鏡検査によりアッセイされるようなＣＤ１９＋Ｒａｊｉ  Ｂ細胞及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の間のシナプス形成及び架橋が可能であり；かつ／または
ｂ）ヒト全血またはＰＢＭＣにおけるＣＤ１９発現Ｂ細胞のＴ細胞誘引による殺傷（T-cell directed killing）を媒介し；かつ／または
ｃ）ｖ８７５またはｖ１６６１と比較して改善した生物物理学的特性を示し；かつ／または
ｄ）ｖ８７５またはｖ１６６１と比較して改善したタンパク質発現及び収率、例えば、同様の条件下で発現及び精製された場合にＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）後に４〜１０ｍｇ／Ｌ超での発現を示し；かつ／または
ｅ）例えば９５％を超えるヘテロ二量体純度を示す、
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２７】
薬物にコンジュゲートされている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物及び薬学的担体の医薬組成物。
【請求項２９】
前記担体が、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、糖質、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を含む、医療において使用するための医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を含む、癌の治療において使用するための医薬組成物。
【請求項３２】
対象における癌を治療する方法であって、有効量の請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３３】
前記対象がヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌が、リンパ腫または白血病またはＢ細胞悪性腫瘍、またはＣＤ１９を発現する癌、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）またはリツキシマブもしくはＣＨＯＰ（ｃｙｔｏｘａｎ（商標）／Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（商標）ビンクリスチン／プレドニゾン療法）に耐性のＢ細胞癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
以下の工程を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を製造する方法：請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を前記抗原結合構築物の発現に好適な条件下で培養する工程、及び、前記抗原結合構築物を精製する工程。
【請求項３６】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物の少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセット。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがｃＤＮＡである、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３６に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットの１つまたは複数を含むベクターまたはベクターのセットであって、任意選択的に、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される、前記ベクターまたはベクターのセット。
【請求項３９】
請求項３６に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットまたは請求項３８に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む単離された細胞であって、任意選択的に、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＨＥＫ２９３細胞から選択される、前記単離された細胞。
【請求項４０】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗原結合構築物及び使用説明書を含む、キット。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017504328000001.app
【国際調査報告】
2017504328.tif 000073
2017504328.tif 000074
2017504328.tif 000075
2017504328.tif 000076
2017504328.tif 000077