(57)【要約】本発明は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインと、抗ＩＬ−１７抗体とを含有する二機能性融合タンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターを含有する宿主細胞及び当該タンパク質を含有する医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインと、抗ＩＬ−１７抗体とを含有し、好ましくは、前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ａである二機能性融合タンパク質。
【請求項２】
アミノ酸配列が以下の配列の組み合わせから選ばれるものである請求項１に記載の二機能性融合タンパク質。
ａ）配列番号５と６、配列番号１３と１４、配列番号４と１９、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７で示される配列、
ｂ）配列番号５と６、配列番号１３と１４、配列番号４と１９、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７で示される配列において１個若しくは数個アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、Ｂ７とＩＬ−１７Ａシグナル経路を同時に遮断する活性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号５と６、配列番号１３と１４、配列番号４と１９、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７で示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、Ｂ７とＩＬ−１７Ａシグナル経路を同時に遮断する活性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項１または２に記載の二機能性融合タンパク質をコードすることができるコード遺伝子。
【請求項４】
機能可能なように結合された請求項３に記載のコード遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含有する宿主細胞。
【請求項６】
請求項１または２に記載の二機能性融合タンパク質を製造する方法であって、
（１）請求項３に記載のコード遺伝子を真核発現ベクターに機能可能なように結合し、それを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させる、または請求項４に記載の組換えベクターを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させるステップと、
（２）前記二機能性融合タンパク質を精製するステップと、を含み、
好ましくは、前記真核発現ベクターはＸ０ＧＣであり、前記宿主細胞はＨＥＫ２９３−ＴまたはＣＨＯ細胞である、二機能性融合タンパク質を製造する方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載の二機能性融合タンパク質、または請求項６に記載の方法によって得られる二機能性融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１または２に記載のタンパク質、または請求項６に記載の方法によって得られるタンパク質、または請求項７に記載の医薬組成物の、疾患を予防、治療または改善するための薬物の製造における使用。
【請求項９】
前記疾患が、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のタンパク質、請求項３に記載のコード遺伝子、請求項４に記載の組み換えベクター、または請求項５に記載の宿主細胞を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二機能性融合タンパク質及びその製造方法並びに使用に関し、特に、Ｂ７／ＣＤ２８シグナル経路と、ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７ＲＡシグナル経路を同時に遮断することが可能である二機能性組換え融合タンパク質、当該二機能性融合タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターを含有する宿主細胞及び当該二機能性融合タンパク質を含有する医薬組成物に関わる。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞の機能を調節・制御することは、慢性炎症を治療する有効な方法の一つと見なされている。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４，ＣＴＬＡ４）は、ＣＤ１５２とも称され、白血球分化抗原の一種である。ＣＴＬＡ４とＣＤ２８の配位子はいずれもＢ７分子であり、ＣＴＬＡ４とＢ７分子との結合によって、Ｔ細胞は無反応状態になりつつ免疫反応の負の調節に関与することになる。２００５年から市販されるようになった、関節リウマチの治療用のアバタセプト（ａｂａｔａｃｅｐｔ，商品名：ＯｒｅｎｃｉａＴＭ，ブリストル・マイヤーズ  スクイブ株式会社製）は、単機能性融合タンパク質の一種であり、２つのＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ，ＥＣＤ）とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とが結合してなり、競合的にＢ７とＣＤ２８との結合を遮断して、Ｔ細胞の増殖及び活性化を抑制するものである（Ｇｅｎｏｖｅｓｅ  ＭＣ，  ＢｅｃｋｅｒＪＣ，  ＳｃｈｉｆｆＭ，  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，  ２００５，  ３５３：１１１４−１１２３）。
【０００３】
インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７又はＩＬ−１７Ａ）は、炎症促進性サイトカインの一種であり、主としてＴｈ１７細胞から産生され、ＩＬ−１７ファミリーのうち最も代表的なメンバーである（Ｍｉｏｓｓｅｃ  Ｐ，  Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，  ２０１２，  １１：７６３−７７６）。ＩＬ−１７Ａとそのアクセプター（受容体）（ＩＬ−１７ＲＡ）とが結合すると、多種の細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞及び内皮細胞）における炎症性サイトカイン及びケモカインの発現を誘導することが可能であり、有機体の免疫防御において重要な役割を果たしている（Ｌｉｎ  Ｙ，  Ｒｉｔｃｈｅａ  Ｓ，  Ｌｏｇａｒ  Ａ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ２００９，  ３１：７９９−８１０）。しかしながら、過度に高いレベルで発現するＩＬ−１７Ａは、炎症性疾患を引き起こす可能性がある。関節リウマチ患者の滑膜組織には、ＩＬ−１７Ａが高発現して、重要な炎症性サイトカイン−インターロイキン６が生じるようになるものの、当該作用がＩＬ−１７Ａ中和抗体によって抑制されることが可能である（Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ，  Ｄｕｒａｎｄ  ＪＭ，  Ｂｕｃｈｓ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９９９，  ４２：９６３−７０）。自己免疫疾患の動物モデルを用いた多数の実験によれば、抗体を用いてＩＬ−１７Ａを中和することで、炎症の病態進展を効率的に抑制することが可能である（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ  Ｅ，  Ｋｏｅｎｄｅｒｓ  ＭＩ，  Ｏｐｐｅｒｓ−Ｗａｌｇｒｅｅｎ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，  ２００４，  ５０：６５０−６５９）。販売が許可された市販のＩＬ−１７Ａに関する抗体薬物がないのが現状であるものの、３つの薬物が臨床研究の段階にあり、それぞれ、Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ（ＩＬ−１７Ａ標的抗体）、Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ（ＩＬ−１７Ａ標的抗体）及びＢｒｏｄａｌｕｍａｂ（ＩＬ−１７ＲＡ標的抗体）である。しかしながら、薬物の臨床研究の結果によれば、関節リウマチの如く一部の慢性炎症性疾患に対して、これらの薬物は所期の治療効果を奏しないことが明らかになった（Ｋｅｌｌｎｅｒ  Ｈ，  ＴｈｅｒＡｄｖＭｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｄｉｓ．，  ２０１３，  ５：１４１−１５２）。従って、薬物の併用投与という治療モードを利用することで、関節リウマチの如く一部の慢性炎症性疾患の患者の臨床的利益を向上する可能性がある。
【０００４】
併用投与では、２種若しくは多種の抗体を順次に注射したり、または抗体を同種の剤型とする必要がある。しかしながら、抗体を順次に注射すると患者の治療に対するコンプライアンスを低下させて痛みを増加させる。一方、抗体によって物理化学的性質に差異があるため、異なる抗体を同種の剤型とすることは困難であるか、または可能性が殆どない。
【０００５】
そこで、Ｂ７／ＣＤ２８シグナル経路と、ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７ＲＡシグナル経路を同時に遮断できる新型治療薬を研究する必要性は依然として存在している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ｂ７／ＣＤ２８シグナル経路と、ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７ＲＡシグナル経路を同時に遮断できる二機能性融合タンパク質、当該二機能性融合タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターを含有する宿主細胞及び当該二機能性融合タンパク質を含有する医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明の第１の態様は、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインと、ＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片とを含有する、二機能性融合タンパク質に関わる。一つの実施形態では、前記ＩＬ−１７はＩＬ−１７Ａである。
【０００８】
一つの実施形態では、前記二機能性融合タンパク質は結合ペプチドをさらに含有する。なお、前記ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインは、結合ペプチドを介してＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片のＮ末端またはＣ末端に結合される。一つの実施形態では、前記結合ペプチドのアミノ酸配列の長さは、１−２５個のアミノ酸であり、例えば、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸である。例えば、前記結合ペプチドは、配列番号３で示されるアミノ酸配列である。
【０００９】
一つの実施形態では、ＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片は、抗ＩＬ−１７抗体またはその機能的断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体である。一つの実施形態では、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインは、結合ペプチドを介して抗ＩＬ−１７抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に結合される。一部の実施形態では、抗ＩＬ−１７抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ抗体またはこれらのハイブリッドである。一部の実施形態では、抗ＩＬ−１７抗体はＩｇＧ抗体である。
【００１０】
一つの実施形態では、前記ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列若しくはその機能的断片、または上記で示される配列において１個若しくは数個（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０個）アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％程度）の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列、を含有する。
【００１１】
一つの実施形態では、前記抗ＩＬ−１７抗体の重鎖配列は、配列番号２８で示されるアミノ酸配列、または上記で示される配列において１個若しくは数個（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０個）アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％程度）の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列、を含有する。前記抗ＩＬ−１７抗体の軽鎖配列は、配列番号２７で示されるアミノ酸配列、または上記で示される配列において１個若しくは数個（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０個）アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％程度）の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列、を含有する。
【００１２】
一つの実施形態では、配列番号２で示されるＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインは、配列番号３で示される結合ペプチドを介して配列番号４若しくは１２で示される抗ＩＬ−１７抗体の重鎖配列のＮ末端、または配列番号５若しくは１３で示される抗ＩＬ−１７抗体の軽鎖配列のＮ末端に結合される。
【００１３】
一つの実施形態では、配列番号２で示されるＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインは、配列番号３で示される結合ペプチドを介して配列番号４若しくは１２で示される抗ＩＬ−１７抗体の重鎖配列のＣ末端、または配列番号５若しくは１３で示される抗ＩＬ−１７抗体の軽鎖配列のＣ末端に結合される。
【００１４】
一つの実施形態では、前記二機能性融合タンパク質を構成するアミノ酸配列は、配列番号５及び６、配列番号１３及び１４、配列番号４及び１９、配列番号２４及び２５、配列番号２６及び２７、または上記で示される配列において１個若しくは数個（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０個）アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％程度）の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列からなる群から選ばれる配列である。
【００１５】
本発明の第２の態様は、前記で示される二機能性融合タンパク質のコード遺伝子に関わる。
【００１６】
一つの実施形態では、前記コード遺伝子は、配列番号７及び８、または配列番号１５及び１６で示されるヌクレオチド配列を含有する。
【００１７】
一部の実施形態では、前記ベクターにおける軽鎖と重鎖をコードするヌクレオチド配列は異なる発現カセットに存在している。
【００１８】
本発明の第３の態様は、機能可能なように結合された上記のコード遺伝子を含有する組換えベクターに関わる。
【００１９】
一部の実施形態では、前記ベクターは真核細胞発現ベクターである。一部の実施形態では、前記ベクターは、改造したことで得られた、２つの表現カセットを有するベクターＸ０ＧＣである。
【００２０】
本発明の第４の態様は、上記の組換えベクターを含有する宿主細胞に関わる。
【００２１】
本発明の第５の態様は、上記の二機能性融合タンパク質を製造する方法に関わる。当該製造方法は、
【００２２】
上記のコード遺伝子を真核発現ベクターに機能可能なように結合し、それを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させる、または上記の組換えベクターを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させるステップと、
前記の二機能性融合タンパク質を精製するステップとを含む。
一つの実施形態では、前記真核発現ベクターはＸ０ＧＣである。一つの実施形態では、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３−ＴまたはＣＨＯ細胞である。
【００２３】
本発明の第６の態様は、上記の宿主細胞を適宜な発現条件下で培養し、発現されたタンパク質を分離・精製することを含む、上記の二機能性融合タンパク質を生産する方法に関わる。
【００２４】
本発明の第７の態様は、上記の二機能性融合タンパク質、または上記の方法によって得られる二機能性融合タンパク質を含む医薬組成物に関わる。
【００２５】
一つの実施形態では、上記の二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植の予防、治療または改善のために用いられる。
【００２６】
別の実施形態では、上記の二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病の予防、治療または改善のために用いられる。
【００２７】
本発明の第８の態様は、上記の二機能性融合タンパク質、上記の方法によって得られる二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物の、疾患の予防、治療または改善のための薬物の製造における使用に関わる。
【００２８】
一つの実施形態では、前記疾患は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である。
【００２９】
本発明の第９の態様は、治療有効量の上記の二機能性融合タンパク質、上記の方法によって得られる二機能性融合タンパク質、または上記の医薬組成物を必要とする被験者に投与するステップを含む、疾患を予防、治療または改善する方法に関わる。
【００３０】
一つの実施形態では、前記疾患は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である。
【００３１】
本発明の第１０の態様は、上記の二機能性融合タンパク質、上記の核酸分子、上記のベクター、または上記の宿主細胞を含むキットに関わる。
【００３２】
本発明によれば、次のような利点を有する。
本発明の実験結果から明らかなように、本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、発現量が高くて、インビトロ実験において炎症性サイトカインの分泌を強く抑制し、動物モデルに対して関節炎症の進展を効果的に抑制できる。当業者に知られているように、作用メカニズムの異なる幾つかの薬物を併用する、または融合して使用することによって、拮抗、無関係、相加または相乗などの異なる効果が現れる可能性がある。二種類以上の薬物を併用する、または融合して使用することによって、どのような相互作用が現れるかについて、具体的な実験研究を通じ、大量な労力を費やしたことだけで確定できる。従来技術では、ＣＴＬＡ４分子と抗ＩＬ−１７抗体を組み合わせて関節リウマチを治療する可能性があるものの、ヒトの有機体が複雑なものであるため、特に、関節リウマチのような病因が極めて複雑で完全に明確になっていない全身性や免疫性疾患に対して、薬物を併用したり、または融合して使用したとしても、作用メカニズムの異なる各薬物による治療効果の完全な相加または相乗効果を実現することが殆どなく、多くの場合は、無関係、さらに拮抗効果が現れる。本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、関節リウマチに対して強化された治療効果を達成するため、関節リウマチの患者、特に中重度の関節リウマチの患者に、治療効果がより一層優れている可能性のある薬物候補を提供する。また、本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、関節リウマチを治療するための２つの異なるターゲットに対して同時に作用し、単一ターゲットの場合での治療失敗または効果不良の確率を低減して、経済的に重要な意味を持ちつつ、社会効果を有する。本発明は、単一機能のタンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ）を使用した場合に較べて、生産コストを低減し、臨床上で投与のボリュームと頻度を減少し、被験者のコンプライアンスを向上させることが可能であり、免疫性疾患の予防及び治療にきわめて広い応用前景がある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Ａ及びＢは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーによる本発明の実施形態にかかる二機能性融合タンパク質Ａ及びＢの精製をそれぞれ示す図である。
【図２】Ａ及びＢは、イオン交換クロマトグラフィーによる本発明の実施形態にかかる二機能性融合タンパク質Ａ及びＢの精製をそれぞれ示す図である。
【図３】Ａ及びＢは、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーによる本発明の実施形態にかかる二機能性融合タンパク質Ａ及びＢの単量体の純度の分析をそれぞれ示す図である。
【図４】二機能性融合タンパク質Ａ、Ｃと、ヒトＩＬ−１７Ａとの結合力を示す図である。
【図５】二機能性融合タンパク質Ａ、Ｃと、マウスＩＬ−１７Ａとの結合力を示す図である。
【図６】二機能性融合タンパク質Ａによって、ＩＬ−１７Ａで誘導されるＨＴ−２９細胞からのＧＲＯα分泌が抑制される図である。
【図７】混合リンパ球反応により二機能性融合タンパク質Ｂの免疫抑制活性を測定する図である。
【図８】二機能性融合タンパク質Ａヒト化類似体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎａｌｏｇｕｅ）によるラットＣＩＡ関節炎指数の低下作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインと、ＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片とを含有する、二機能性融合タンパク質を提供することを目的の一つとする。ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインと、ＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片とが有効的に結合され、各々の空間構造が保たれつつ各々の生理活性が発揮されている。前記ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインとＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片を、各々の機能に影響を及ぼさずに直接に融合することが可能である。且つ、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインがＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片のＮ末端またはＣ末端に結合される。それらの間に他のインターバル配列、例えば結合ペプチドを付加してもよい。
【００３５】
当業者に知られているように、本発明において前記二機能性融合タンパク質を限定する時に使用する用語は「含む」であるが、前記二機能性融合タンパク質にはその機能と関係のない他の配列を任意に追加可能であることを意味するものでもない。前記二機能性融合タンパク質の如く、複雑な構成を持つ融合タンパク質を製造する場合、融合タンパク質の各構成成分の空間構造、生物活性、細胞発現レベルを保証し、さらに前記各種の構成成分を適切に融合したり、または前記融合タンパク質の耐加水分解性を増強させるために、当業者は、前記融合タンパク質を製造する時に、必要に応じて各構成成分間にまたは前記融合タンパク質の両端に一つまたは複数の余分のアミノ酸残基を追加する。従って、閉鎖式の表現を用いて前記二機能性融合タンパク質を限定することは、これらの状況を忠実にカバーすることができないようになる。
【００３６】
本発明に用いられる技術用語である「ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメイン」とは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４，ＣＴＬＡ４）の細胞外ドメインを意味する。ある実施形態では、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列は、配列番号２で示されるものであり、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質の第３７−１６１位アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録号ＮＭ＿００５２１４．４）である。
【００３７】
一部の実施形態では、本発明に用いられる技術用語「ＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片」とは、ＩＬ−１７を標的とする免疫グロブリンまたはその修飾物、機能的等価物、機能的断片または変異体を意味する。ある実施形態では、ＩＬ−１７の活性を中和する機能的断片は、ＩＬ−１７を標的とするＩｇＧ抗体である。ある実施形態では、ＩｇＧはキメラＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧまたは完全ヒトＩｇＧである。ある実施形態では、前記修飾物は、ＩＬ−１７を標的とする性能が維持される限り、アシル化、アルキル化、ＰＥＧ化産物の如く化学修飾物であることは可能である。ある実施形態では、前記機能的等価物とは、ＩＬ−１７を標的とする前記免疫グロブリンの能力を実現できるその他のポリペプチド断片を意味する。ある実施形態では、前記機能的断片は、ＩＬ−１７を標的とする能力を維持しているタンパク質断片であり、例えば、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である。ある実施形態では、前記変異体は、一つまたは複数（幾つか）の位置において１つまたは複数の改変、即ち、置換、挿入及び／又は欠失によって親タンパク質に由来するポリペプチドである。
【００３８】
ある実施形態では、前記結合断片の長さは５−３０個のアミノ酸である。ある実施形態では、前記結合断片の長さは２５個のアミノ酸である。ある実施形態では、前記結合断片の配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。本発明に用いられる結合断片は、融合タンパク質の２つの構成成分の間隔として機能し、各構成成分がそれぞれ空間構造を的確に形成して、生物活性、細胞発現レベルを維持できる限り、特に制限されるものではない。
【００３９】
ある実施形態では、前記二機能性融合タンパク質を構成するアミノ酸配列は、配列番号５及び６、配列番号１３及び１４、配列番号４及び１９、配列番号２４及び２５、配列番号２６及び２７、または上記で示される配列において１個若しくは数個（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０個）アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％程度）の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列からなる群から選ばれる配列である。アミノ酸の保守アミノ酸は、本分野で公知のものである。
【００４０】
本発明に用いられる技術用語である「同一性」は、本分野での一般的に知られている意味を有する。異なる配列間の同一性を測定する規則、標準は当業者にもよく知られているものである。本発明において異なる程度の同一性で限定された配列は、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインやＩＬ−１７の活性を中和することを同時に有する必要がある。如何に上記した活性を用いて変異体配列を選別する方法及び手段は当業者に知られているものである。当業者は、本願の開示内容中の示唆によりこのような変異体配列を容易に取得することが可能である。
【００４１】
一つの実施形態では、本発明は、上記の二機能性融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するコード遺伝子に関わる。
【００４２】
当業者に知られているように、本発明において、前記コード遺伝子を限定する時に使用する用語は「含有する」であるが、前記コード遺伝子の両端にはその機能と関係のない他の配列を任意に追加可能であることを意味するものでもない。当業者に知られているように、組換えの操作に対する要求を満たすために、前記コード遺伝子の両端に適切な制限エンドヌクレアーゼの切断部位を追加したり、または開始コドン、終止コドンなどを余分に増加する必要がある。従って、閉鎖式の表現を用いて前記コード遺伝子を限定することは、これらの状況を忠実にカバーすることができないようになる。
【００４３】
当業者に知られているように、コードされるアミノ酸を変更しない場合、前記コード遺伝子配列における一つまたは複数のコドン（例えば、一つまたは幾つかのコドン、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個のコドン）を同義コドンで置換することが可能である。コドン使用表は本分野で公知のものである。
【００４４】
一つの実施形態では、本発明は、機能可能なように結合された上記のコード遺伝子を含有する組換えベクターに関わる。前記組換えベクターは、組換え発現ベクターであり、原核発現ベクターでもよいし、真核発現ベクターでもよいが、好ましくは、真核発現ベクターであり、より好ましくは、哺乳動物における真核発現に用いられる組換え発現ベクターである。
【００４５】
本発明に用いられる技術用語である「機能可能なように結合」とは、前記コード遺伝子の複製、転写または発現が的確かつ順調にできるように、前記コード遺伝子をベクターの適切な部位に結合させる、というような結合方式を意味する。
【００４６】
一つの実施形態では、本発明は、上記の組換えベクターによってトランスフォーメーションされ、またはトランスフェクションされた宿主細胞に関わる。前記宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞を含む。
【００４７】
一つの好適な実施形態では、前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞及びＳＰ２／０細胞を含む。
【００４８】
一つの実施形態では、本発明は、前記二機能性融合タンパク質を生産する方法に関わる。当該生産方法は、適宜なポリペプチド発現条件下で上記の宿主細胞を培養して、細胞培地から発現したポリペプチドを分離・精製することを含む。好ましくは、前記精製後のポリペプチドの純度は５０％より大きい。より好ましくは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％より大きい。
【００４９】
一つの実施形態では、本発明は、上記の二機能性融合タンパク質と、薬学的に受容可能なベクターとを含有する医薬組成物に関わる。前記二機能性融合タンパク質は、前記医薬組成物の唯一の有効成分であってもよく、有効成分の一つであってもよい。その他の有効成分は、前記二機能性融合タンパク質と組み合わて使用可能な他の治療剤である。
【００５０】
一つの好適な実施形態では、本発明の医薬組成物は、単回投与剤型、局所投与剤型及び全身投与剤型を含む。
【００５１】
一つの実施形態では、本発明にかかる前記の二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植の予防、治療または改善のために用いられる。一部の実施形態では、前記の二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病の予防、治療または改善のために用いられる。
【００５２】
一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の上記の二機能性融合タンパク質、上記の方法によって生産される二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物を必要とする被験者に投与するステップを含む、疾患を予防、治療または改善する方法に関わる。
【００５３】
一つの実施形態では、前記疾患は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である。
【００５４】
本発明に用いられる技術用語である「治療有効量」とは、投与時に被験者の体内に薬理作用を奏することができる剤量を意味する。「治療有効量」は、患者の年齢、体重、疾患状態などに応じて当業者によって容易に決定されるものである。
【００５５】
一つの実施形態では、本発明は、上記の二機能性融合タンパク質、上記の方法によって得られる二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物の、疾患の予防、治療または改善のための薬物の製造における使用に関わる。
【００５６】
一つの実施形態では、前記疾患は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である。
【００５７】
当業者に知られているように、上述した内容において本発明にかかる二機能性融合タンパク質によって予防、治療または改善可能な病状が挙げられているものの、本発明にかかる二機能性融合タンパク質によって対応可能な病状は上述した具体的な病状のみに限定されるものでもなく、Ｂ７／ＣＤ２８シグナル経路とＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７ＲＡシグナル経路を同時に遮断することで予防、治療または改善のメリットが得られる病状はいずれも本発明の保護範囲内に含まれる。
【００５８】
本発明の上記の技術案によれば、本発明は下記のような優れた効果を有する。
１）ＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外ドメインと抗ＩＬ−１７抗体をそれぞれ生産するのに対して、Ｂ７とＩＬ−１７Ａとの二つのシグナル経路を遮断する分子（ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインと抗ＩＬ−１７抗体）を一つの分子に融合して発現・生産することで、操作方法及び生産コストを大幅に軽減した。
２）ヒトＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外ドメインと抗ＩＬ−１７抗体とを結合してなる目標タンパク質は、４量体構造であり、よって、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが活性を発揮するのに２量体構造が必要であるという要求を満たすばかりでなく、抗ＩＬ−１７Ａ抗体の力価を依然として２価に維持する。従って、目標タンパク質の総力価は３価である。なお、結合様式のスクリーニング比較及びインビトロの結合実験により、本発明における有効な結合様式は、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインとその配位子Ｂ７との結合、及び抗ＩＬ−１７抗体とＩＬ−１７との結合には影響を及ぼさないことが示された。
３）本発明にかかる二機能性タンパク質は、更なる改造によって、キメラ体またはヒト化類似体を形成し、その結合活性を保ちつつ免疫原性をさらに低下させた。
４）疾患モデル実験結果から明らかなように、二機能性融合タンパク質は疾患動物モデルの炎症反応を効果的に軽減することができた。
【００５９】
以下、本発明を制限的ではない実施例により、さらに具体的に説明する。当業者に知られているように、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な形態に変形して実施することができる。このような変形も本発明の範囲内に入る。
特に断らない限り、下記の実験方法は通常のものであり、実験で使用される実験材料は販売会社から容易に購入できるものである。
【００６０】
実施例
実施例１：二機能性融合タンパク質Ａ発現ベクターの構築
（１）二機能性融合タンパク質Ａのアミノ酸及びコードヌクレオチド配列
二機能性融合タンパク質Ａを発現させるために用いられるシグナルペプチド配列は、配列番号１で示されるものである。ヒトＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列は、配列番号２で示されるものであり、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質における第３７−１６１位のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録番号ＮＭ＿００５２１４．４）である。結合ペプチドは（Ｇ４Ｓ）５であり、配列は配列番号３で示されるものである。二機能性融合タンパク質Ａにおける抗ＩＬ−１７Ａ（コントロール抗体Ａ）の可変部配列はＵＳ７８４６４４３（ラット１Ｄ１０）に由来するものであり、その定常部配列はマウスＩｇＧ２ａの定常部配列である。即ち、抗ＩＬ−１７Ａ抗体の重鎖（ｈｃ）配列は配列番号４で示されるものであり、軽鎖（ｌｃ）配列は配列番号５で示されるものである。ヒトＣＴＬＡ４ＥＣＤ−結合ペプチド−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ａのアミノ酸配列は、配列番号６で示されるものである。
【００６１】
配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して哺乳動物細胞コドンバイアスの最適化が施され、その配列は配列番号７で示されるものである。配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して哺乳動物細胞コドンバイアスの最適化が施され、その配列は配列番号８で示されるものである。配列番号７及び配列番号８は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（南京金斯瑞生物科技有限公司）によって合成され、ＴＡクローニング法によってｐＵＣ５７ベクターに挿入された。得られた陽性クローンをシーケンシング法により検証し、それぞれｐＵＣ５７−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ａ、ｐＵＣ５７−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａと称す。
【００６２】
（２）二機能性融合タンパク質Ａ発現ベクターの構築及びトランスフェクションプラスミドの準備
ｐＵＣ５７−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ａプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を鋳型として用いて、通常のＰＣＲ法により、シグナルペプチド−ヒトＣＴＬＡ４ＥＣＤ−結合ペプチド−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ａをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ切断部位を有し、その配列がＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧ（配列番号９）である。下流プライマーはＥｃｏＲ  Ｉ切断部位を有し、その配列がＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴＴＣＴ（配列番号１０）である。
ｐＵＣ５７−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を鋳型として用いて、通常のＰＣＲ法によりａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ切断部位を有し、その配列が配列番号９である。下流プライマーはＥｃｏＲ  Ｉ切断部位を有し、その配列が  ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＧ（配列番号１１）。
【００６３】
増幅したことで得られたシグナルペプチド−ヒトＣＴＬＡ４  ＥＣＤ−結合ペプチド−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ａ、及びａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａをコードする配列（長さはそれぞれ１８８１ｂｐ及び７１７ｂｐ）を、１％濃度のアガロースゲル電気泳動によって、対応する断片を回収した。回収して得られた遺伝子断片と本社製の真核発現ベクターＸ０ＧＣ（特許ＵＳ２０１００１２００８９）とを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏＲ  Ｉによって切断した後、結合して、組換えプラスミドＸ０ＧＣ−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−ＡとＸ０ＧＣ−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａが得られ、それぞれ大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、組換え菌ＤＨ５α／Ｘ０ＧＣ−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−ＡとＤＨ５α／Ｘ０ＧＣ−−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａが得られた。ＰＣＲにより陽性クローンのスクリーニングを行い、ＤＮＡシーケンシング解析により組換えプラスミドの正確な構築を検証した。
【００６４】
陽性ＤＨ５α／Ｘ０ＧＣ−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−ＡとＤＨ５α／Ｘ０ＧＣ−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａをそれぞれ１ＬのＬＢ／Ａｍｐ液体培地（１％ペプトン（ＢＤ社）、０．５％酵母抽出物（ＢＤ社）、１％ＮａＣｌ（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ株式会社（国薬集団化学試剤有限公司）））に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍにて一晩振盪培養した。翌日にエンドトキシンフリープラスミドマキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ，１２３８１）を用いてプラスミドを抽出して、ＨＥＫ２９３−Ｔ（中国科学院上海生命科学研究院細胞資源センター）のトランスフェクションのために用いた。
【００６５】
実施例２：二機能性融合タンパク質Ｂ発現ベクターの構築
（１）二機能性融合タンパク質Ｂのアミノ酸及びコードヌクレオチド配列
二機能性融合タンパク質Ｂを発現させるために用いるシグナルペプチド配列は配列番号１で示されるものである。ヒトＣＴＬＡ４タンパク質のＥＣＤ配列は、配列番号２で示されるものであり、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質における第３７−１６１位のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録番号ＮＭ＿００５２１４．４）である。結合ペプチドは（Ｇ４Ｓ）５であり、その配列は配列番号３で示されるものである。二機能性融合タンパク質Ｂにおける抗ＩＬ−１７Ａ抗体の配列は、特許ＵＳ７８４６４４３（ヒト化１６１０）に由来のものであり、その重鎖（ｈｃ）配列は配列番号１２で示されるものであり、軽鎖（ｌｃ）配列は配列番号１３で示されるものである。ヒトＣＴＬＡ４  ＥＣＤ−結合ペプチド−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ｂのアミノ酸配列は、配列番号１４で示されるものである。
【００６６】
配列番号１４で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して哺乳動物細胞コドンバイアスの最適化が施され、その配列は配列番号１５で示されるものである。配列番号１３で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して哺乳動物細胞コドンバイアスの最適化が施され、その配列は配列番号１６で示されるものである。配列番号１５及び配列番号１６は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって合成され、ＴＡクローニング法によってｐＵＣ５７ベクターに挿入された。得られた陽性クローンをシーケンシング法により検証し、それぞれ、ｐＵＣ５７−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ｂ、ｐＵＣ５７−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ｂと称す。
【００６７】
（２）二機能性融合タンパク質Ｂ発現ベクターの構築及びトランスフェクションプラスミドの準備
ｐＵＣ５７−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ｂプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を鋳型として用いて、通常のＰＣＲ法によりシグナルペプチド−ヒトＣＴＬＡ４  ＥＣＤ−結合ペプチド−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ｂをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ切断部位を有し、その配列が配列番号９である。下流プライマーはＥｃｏＲ  Ｉ切断部位を有し、その配列がＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＣＴＣＡ（配列番号１７）である。
【００６８】
ｐＵＣ５７−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ｂプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を鋳型として用いて、通常のＰＣＲ法によりａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ｂをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ切断部位を有し、その配列が配列番号９である。下流プライマーは、ＥｃｏＲ  Ｉ切断部位を有し、その配列がＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＡＣＴＣＧＣＣＣＣＧＧＴＴＧ（配列番号１８）。
【００６９】
増幅して得られたシグナルペプチド−ヒトＣＴＬＡ４  ＥＣＤ−結合ペプチド−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ｂ、及びａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ｂをコードする配列（長さはそれぞれ１８８７ｂｐ及び７３５ｂｐ）に対して、１％濃度のアガロースゲル電気泳動によって、対応する断片を回収した。回収して得られた遺伝子断片と本社製の真核発現ベクターＸ０ＧＣ（特許ＵＳ２０１００１２００８９）とを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏＲ  Ｉによって切断した後、結合して、組換えプラスミドＸ０ＧＣ−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−ＢとＸ０ＧＣ−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ｂが得られ、それぞれ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、組換え菌ＤＨ５α／Ｘ０ＧＣ−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−ＢとＤＨ５α／Ｘ０ＧＣ−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ｂが得られた。ＰＣＲにより陽性クローンのスクリーニングを行い、ＤＮＡシーケンシング解析により組換えプラスミドの正確な構築を検証した。
【００７０】
陽性ＤＨ５α／Ｘ０ＧＣ−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−ＢとＤＨ５α／Ｘ０ＧＣ−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ｂをそれぞれ１ＬのＬＢ／Ａｍｐ液体培地（１％ペプトン（ＢＤ社）、０．５％酵母抽出物（ＢＤ社）、１％ＮａＣｌ（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ株式会社））に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍにて一晩振盪培養した。翌日にエンドトキシンフリープラスミドマキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ，１２３８１）を用いてプラスミドを抽出して、ＨＥＫ２９３−Ｔ（中国科学院上海生命科学研究院細胞資源センター）のトランスフェクションのために用いた。
【００７１】
実施例３：二機能性融合タンパク質Ａ及びＢの発現
成長状態が良好で、生存力（活細胞の比率、「生存率」とも記述される）が９５％以上に達したＨＥＫ２９３−Ｔ細胞を、１．８×１０７個の細胞の接種量で１０層の細胞工場（ＮＵＮＣ社製、カタログ番号：１４０４００）に接種し、１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）含有ＤＭＥＭ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いて培養した。細胞工場を繰り返して転倒混和させて均一にした後、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で４８時間培養した。細胞は完全に接着し、密度が８０％に達して、瞬時トランスフェクションに用いる。
【００７２】
プラスミドＸ０ＧＣ−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−ＡとＸ０ＧＣ−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａを同時に細胞にトランスフェクションして、二機能性融合タンパク質Ａを発現させるために用いる。プラスミドＸ０ＧＣ−ＣＴＬＡ４−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−ＢとＸ０ＧＣ−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ｂを同時に細胞にトランスフェクションして、二機能性融合タンパク質Ｂを発現させるために用いる。０．２２μｍの濾過膜を用いて濾過し、それぞれに対して１３３０μｇ吸引して、６６ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に加えた。２６６０μｇのトランスフェクション試薬ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ社）を吸引して、６６ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に添加して、それぞれ均一に混合した後、得られたＰＥＩ混合液をプラスミド含有ＤＭＥＭに添加して均一に混合した。室温で１５分間静置した後、プラスミドとＰＥＩとを含有する混合物を、１．３Ｌの無血清ＤＭＥＭ培地に添加して充分に混合した後、細胞工場内に徐々に加えた。細胞工場を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に放置して培養した。４時間後、２６６ｍｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ５（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を加え、均一に混合してから引き続いて６日培養した。７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を収集してタンパク質の精製に用いた。ＥＬＩＳＡ法により上清の濃度測定を行った結果、二機能性融合タンパク質ＡとＢは各バッチでタンパク質発現量が４−８ｍｇ／Ｌである。
【００７３】
実施例４：二機能性融合タンパク質ＡとＢの精製
細胞工場からの上清を０．２μｍの濾過膜で濾過した後、限外濾過膜で限外濾過を行い濃縮させ（公称分画分子量１０ｋＤａ）、溶液を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのリン酸塩溶液（ｐＨ７．４）に置換した。カラムクロマトグラフィーによる精製の前に、０．２μｍの濾過膜でろ過して沈殿物を除去した。このステップは４℃で行われた。
タンパク質精製システムＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びアフィニティークロマトグラフィー  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，２２ｍｌ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて４℃で精製を行った。先ず、ベースラインが安定するまで、移動相Ａ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。その後、前記のように処理された細胞上清のサンプルを注入し、流速を５ｍｌ／ｍｉｎとする。その後、移動相Ａで溶出した。その後、移動相Ｂ１（０．５Ｍのアルギニンを含有する移動相Ａ）で５つのカラム体積を送液した後、移動相Ｂ２（１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．０）で５つのカラム体積を送液し、溶出ピークを目標タンパク質ピークとした。上記の溶出ステップにおける流速は何れも５ｍｌ／ｍｉｎである。クロマトグラムは図１Ａ及びＢで示されるものである。標識された溶出ピーク（図１ＡとＢの灰色領域）を集め、１Ｍの酢酸ナトリウム溶液を滴下することでｐＨ５．０に調整した。
【００７４】
タンパク質精製システムＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び強陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（５ｍＬ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、４℃で精製を行った。先ず、ベースラインが安定するまで、移動相Ａ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）でクロマトグラフィーカラムを平衡化した。その後、前実験で収集してｐＨ調整された溶出液サンプルを注入し、流速を５ｍＬ／ｍｉｎとし、フロースルーピークを収集して目標タンパク質ピークとした。サンプルの注入終了後、移動相Ｂ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）を用いて定組成溶離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ  ｅｌｕｔｉｏｎ）を行い、流速を５ｍｌ／ｍｉｎとした。クロマトグラムは図２Ａ及びＢで示されるものである。標識された成分（図２ＡとＢの灰色領域）を集め、限外濾過管（公称分画分子量３０ｋＤａ）による濃縮を行い、クリーンベンチにて０．２μｍの濾過膜で無菌濾過した後、紫外分光光度計（２８０ｎｍ）により定量し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により純度分析を行った。その結果、図３ＡとＢに示すように、二機能性融合タンパク質Ａ及びＢの単量体の純度はそれぞれ９６．６％、９７．４である。
【００７５】
実施例５：二機能性融合タンパク質の安定細胞株の構築
ＣＨＯ／ＤＧ４４（ｄｈｆｒ−）細胞を蘇生させた後、２−３回継代培養した。その生存率が９５％になった時に、トランスフェクション実験に用いることが可能である。トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１６６８０１９）を用いて、マニュアルに従ってＣＨＯ／ＤＧ４４細胞のトランスフェクションを行った。詳しくは、一つの遠心チューブに、５μｇのプラスミドと３ｍｌのα−ＭＥＭ培地（ＳＡＦＣ，５１４５１Ｃ）とを混合する同時に、別の遠心チューブにおいて２０μＬのトランスフェクション剤と３ｍＬのα−ＭＥＭ培地とを混合した。クリーンベンチにおいて、室温で５分間静置した後、上記の希釈されたプラスミドとトランスフェクションとを混合して、引き続いて３０分間静置した。そして、６ｍＬの混合物を７５ｃｍ２の細胞培養角瓶（細胞コンフルエンスが７０〜８０％であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を含む）に徐々に加えた。そして、角瓶を細胞インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）に設置した。一晩培養した後、トランスフェクション試薬混合物を除去し、新鮮なα−ＭＥＭ培地を加え、１０％透析ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，３００６７−３３４）を添加した。そして、角瓶を細胞インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）に設置し、１〜２日培養した。その後、１ｍｇ／ｍＬＧ４１８（Ｃｅｌｌｇｒｏ，６１−２３４ＲＧ）添加の新鮮な培地で細胞を２週間持続して培養した。
【００７６】
モノクローナル細胞株を得られるために、限界希釈実験を行う必要がある。詳しくは、１０％透析ウシ胎児血清及び１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８添加のα−ＭＥＭ培地を用いて細胞懸濁液を希釈して、細胞濃度を５個細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液を９６ウェルのマイクロプレートに接種した。単一の細胞が独立した群落に成長するまで、細胞をインキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。トリプシン消化法により、単一の細胞から成長した群落を選択して、２４ウェルのマイクロプレートに継代した。そして、細胞を１２ウェルのマイクロプレート、６ウェルのマイクロプレートに順次に継代した。６ウェルのマイクロプレートにおけるモノクローナル細胞株の細胞コンフルエンスが９０％に達した時に、ＥＬＩＳＡ法により目標タンパク質の発現レベルを測定し、発現レベルの高いクローンが得たことを鑑定し、その結果、それぞれクローン５２号（１４ｍｇ／Ｌ）、クローン８５号（５６ｍｇ／Ｌ）、クローン１０３号（５９ｍｇ／Ｌ）である。
【００７７】
実施例６：二機能性融合タンパク質の小規模発酵
クローン１０３号を選択し、５Ｌの生物反応器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｂｐｌｕｓ  ｔｗｉｎ  ５Ｌ）において生産させた。５×１０５の細胞密度でＨｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（４ｇ／Ｌのグルコース、０．３ｇ／Ｌのグルタミン）に接種した。生物反応器の作業ボリュームは２．４Ｌであり、プロセスの開始条件として３７℃、ｐＨ７．１、溶存酸素４０％−６０％、攪拌速度４０ｒｐｍである。その後、１日あたり攪拌速度を５ｒｐｍ上げて、５日後、温度を０．５℃／時間の速度で３４℃まで下げて、０．３ｍＭの酪酸ナトリウムを加えた。二週間後、反応器の発酵液を収集して、７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を収集して保存した。ＥＬＩＳＡ法により測定した結果、濃度は２４０ｍｇ／Ｌである。
【００７８】
実施例７：二機能性融合タンパク質Ａ、Ｃと、ヒト及びマウスＩＬ−１７Ａとの結合親和力
結合親和力実験では、二機能性融合タンパク質Ａと類似した二機能性融合タンパク質Ｃを構築した。二機能性融合タンパク質Ｃのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９（ＣＴＬＡ４  ＥＣＤ−結合ペプチド−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ）と配列番号４で示されるものであり、即ち、そのＣＴＬＡ４  ＥＣＤは結合ペプチドを介してａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂの軽鎖に結合され（即ち、配列番号５に結合される）、二機能性融合タンパク質ＡのＣＴＬＡ４  ＥＣＤが結合ペプチドを介してａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂの重鎖に結合される（即ち、配列番号４に結合される）ことに相違する。なお、コントロール抗体Ａは、二機能性融合タンパク質ＡとＣのコントロール抗体とし、そのアミノ酸配列が配列番号４（コントロール抗体Ａの重鎖）と配列番号５（コントロール抗体Ａの軽鎖）で示されるものであり、即ち、コントロール抗体Ａは、二機能性融合タンパク質Ａ及びＣにおける抗ＩＬ−１７Ａ抗体の部分に対応している。
【００７９】
該方法は、以下のように具体的に実施される。炭酸ナトリウム溶液（１５ｍＭの炭酸ナトリウム、３５ｍＭの炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．６）を１μｇ／ｍＬの濃度で、９６ウェルの高吸着ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５９２）にヒトＩＬ−１７Ａ（シノバイオロジカル社（北京義［堯羽］神州生物技術有限公司）、カタログ番号：１２０４７−ＨＮＡＥ）またはマウスＩＬ−１７Ａ（シノバイオロジカル社、カタログ番号：５１０６５−ＭＮＡＥ）をコーティングし、各ウェルに１００μＬずつ注入して、４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号：Ｐ−３５６３）で該プレートを５回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで該プレートをブロッキングし、各ウェルに３００μＬずつ注入し、２５℃で少なくとも１時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで希釈された特定濃度の検体を、各ウェルに１００μＬずつ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで該プレートを５回洗浄した。そして、１：１００００となるように１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで希釈された、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ，カタログ番号：Ａｂ７０６８）を、各ウェルに１００μＬずつ注入し、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで該プレートを５回洗浄した。比色基質ＴＭＢ（ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ，カタログ番号：５５５２１４）を各ウェルに１００μＬずつ注入し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ２ＳＯ４を各ウェルに１００μＬずつ注入して、発色反応を終了させた。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍのでの吸光度を読み取った。
【００８０】
その結果、図４及び５に示すように、本発明にかかる二機能性融合タンパク質Ａと二機能性タンパク質Ｃは、その抗原であるヒトＩＬ−１７Ａ（図４）及びマウスＩＬ−１７Ａ（図５）と結合する高親和力を有し、且つその親和力がコントロール抗体Ａと類似した。上記の結果から明らかなように、結合ペプチドを介してコントロール抗体Ａの重鎖または軽鎖のＮ末端に結合されたＣＴＬＡ４  ＥＣＤは、コントロール抗体Ａそのものと抗原との親和力に大きい影響を及ぼさない。
【００８１】
なお、本発明にかかる二機能性融合タンパク質Ｂは、マウスＩＬ−１７Ａに結合することができなく、ヒトＩＬ−１７Ａに結合する高親和力を有するものであり（本発明では、ＥＬＩＳＡ法により測定した数値は、ＥＣ５０＝１０３ｐＭ）、特許（ＵＳ７８４６４４３）に記載の数値に接近する。
【００８２】
実施例８：ＣＴＬＡ４の異なる結合様式による二機能性融合タンパク質とＢ７との親和力への影響
二機能性融合タンパク質とＢ７との親和力に対して、ＣＴＬＡ４の異なる結合様式による影響を比較するために、異なるＣＴＬＡ４結合様式を有する二機能性融合タンパク質の類似体を構築した。
（１）二機能性融合タンパク質Ｃ：その配列は、前記で示されるものであり、即ち、配列番号１９（ＣＴＬＡ４  ＥＣＤ−結合ペプチド−ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ）及び配列番号４である。即ち、そのＣＴＬＡ４  ＥＣＤは、結合ペプチドを介してａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂの軽鎖のＮ末端に結合され（即ち、配列番号５に結合される）、二機能性融合タンパク質ＡのＣＴＬＡ４  ＥＣＤが結合ペプチドを介してａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂの重鎖のＮ末端に結合される（即ち、配列番号４に結合される）ことに相違する。
（２）二機能性融合タンパク質Ｄ：使用したシグナルペプチド配列は配列番号１で示されるものである。ヒトＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列は配列番号２で示されるものである。結合ペプチドは（Ｇ４Ｓ）５であり、その配列は配列番号３で示されるものである。抗体ＩＬ−１７Ａ抗体は、重鎖（ｈｃ）の配列が配列番号４で示されるものであり、軽鎖（ｌｃ）の配列が配列番号５で示されるものである。ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｈｃ−Ａ−結合ペプチド−ＣＴＬＡ４  ＥＣＤのアミノ酸配列は配列番号２０で示されるものであり、即ち、二機能性融合タンパク質ＤのＣＴＬＡ４は結合ペプチドを介してコントロール抗体Ａの重鎖のＣ末端に結合される。
（３）二機能性融合タンパク質Ｅ：使用したシグナルペプチド配列は配列番号１で示されるものである。ヒトＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列は配列番号２で示されるものである。結合ペプチドは（Ｇ４Ｓ）５であり、その配列は配列番号３で示されるものである。抗体ＩＬ−１７Ａ抗体は、重鎖（ｈｃ）の配列が配列番号４で示されるものであり、軽鎖（ｌｃ）の配列が配列番号５で示されるものである。ａｎｔｉ−ＩＬ−１７Ａ  ｍＡｂ  ｌｃ−Ａ−結合ペプチド−ＣＴＬＡ４  ＥＣＤのアミノ酸配列は配列番号２１で示されるものであり、即ち、二機能性融合タンパク質ＥのＣＴＬＡ４は結合ペプチドを介してコントロール抗体Ａの軽鎖のＣ末端に結合される。
【００８３】
ＣＴＬＡ４  ＥＣＤは、その配位子であるＢ７分子と結合することができる。Ｂ７との結合親和力を測定する実験では、フローサイトメトリー法により、Ｂ７分子の発現レベルの高いＲａｊｉ細胞において、二機能性融合タンパク質Ａ、Ｃ、及びＤ、Ｅと、Ｂ７分子との結合能力を測定した。該方法は、以下のようなプロセスにより実施された。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離してＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ，カタログ番号：ＣＣＬ−８６）を収集した。２％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ，カタログ番号：１００９９１４１）含有ＰＢＳ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，カタログ番号：Ｃ−４０２３２）を用いて１回洗浄した。ＥＰ管においてＲａｊｉ細胞を再懸濁させ、各管に、１×１０６個細胞を、２％ＦＢＳ且つ最終濃度を０．５ｎＭとした検体を含有する２００μＬの冷たいＰＢＳに再懸濁させた。ＥＰ管を氷上で３０分間インキュベートした。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した。そして、２％ＦＢＳ且つＦＩＴＣによって標記された抗マウスＩｇＧ抗体（１：５０に希釈）を含有する２００μＬの冷たいＰＢＳに再懸濁させた。遮光して氷上で３０分間インキュベートした。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄し、２％ＦＢＳを含有する５００μＬの冷たいＰＢＳに再懸濁させた。該細胞懸濁液をフローサイトメトリーで測定・分析した。
【００８４】
その結果、表１に示すように、二機能性融合タンパク質Ａは、その配位子Ｂ７分子の発現の高いＲａｊｉ細胞に結合する能力を有し、且つその結合力が二機能性融合タンパク質Ｃ、二機能性融合タンパク質Ｄ及び二機能性融合タンパク質Ｅに較べて明らかに大きい。上記の結果から明らかなように、ＣＴＬＡ４  ＥＣＤと抗ＩＬ−１７Ａ抗体との異なる結合様式は、それとＢ７分子との結合能力に大きく影響した。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
実施例９：二機能性融合タンパク質ＡによるＩＬ−１７Ａで誘導されるＨＴ−２９細胞からのＧＲＯα分泌の抑制
ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＴ−２９はＡＴＣＣに由来するものである。ＨＴ−２９細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１００９９）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：２２４００）に培養し、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに設置して、毎週２回継代培養した。
ＩＬ−１７Ａによって誘導されるＧＲＯα分泌を抑制する実験は、具体的に以下のように実施される。検体を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０完全培地で勾配希釈し、細胞培養プレート（Ｃｏｒｉｎｇ，カタログ番号：３５９９）の各ウェルに５０μＬずつ注入した。さらに、細胞培養プレートに、同一の完全培地で希釈された、濃度が２４０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１７Ａを各ウェルに５０μＬずつ注入した。３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに設置して、１時間インキュベートした。そして、ＨＴ−２９細胞を完全培地に再懸濁させて、９６ウェルの細胞培養プレート内に接種し、各ウェルに１００μＬ（約２００００個の細胞）注入した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに設置して４８時間インキュベートした。１０００ｒｐｍで細胞培養プレートを５分間遠心分離して、上清を取り出した。マニュアルに従って、ＧＲＯα  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ，カタログ番号：ＤＹ２７５）を用いてＧＲＯαのレベルを測定した。
【００８７】
その結果、図６に示すように、コントロール抗体Ａと二機能性融合タンパク質Ａのいずれも、ＩＬ−１７Ａによって誘導されるＨＴ−２９細胞からのＧＲＯα分泌を抑制することが可能であり、ＩＣ５０はそれぞれ５３２ｐＭと９１１ｐＭである。
【００８８】
実施例１０：二機能性融合タンパク質Ｂによるヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−２の分泌の抑制
混合リンパ細胞反応により、本発明にかかる二機能性融合タンパク質Ｂの免疫抑制活性、即ち、Ｔリンパ球活性化を抑制する活性を測定した。簡単に言えば、二つの異なる個体からのヒト末梢血単核細胞を取り（ＰＢＭＣ）、一つのＰＢＭＣを不活性化させて刺激細胞とし、もう一つのＰＢＭＣを反応細胞とした。この２つのＰＢＭＣを混合すると、刺激細胞は反応細胞の免疫反応を活性化させて、サイトカインＩＬ−２を大量分泌させる。この混合ＰＢＭＣ系と共に、サンプルをインキュベートして、ＩＬ−２分泌への影響を測定した。
【００８９】
リンパ球混合反応は、以下のような方法により実施される。２つの異なる個体から、異なるロット番号のＰＢＭＣ（Ｌｏｎｚａ，カタログ番号：ＣＣ−２７０２）を蘇生させて１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：１００９９）含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：２２４００）完全培地に再懸濁させた。一つのＰＢＭＣを刺激細胞とし、もう一つを反応細胞とした。刺激細胞と共に、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｗａｋｏ，カタログ番号：５０−０７−７）を３７℃で４５分間インキュベートした。その後、細胞をＤＰＢＳ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，カタログ番号：Ｃ−４０２３２）で２回洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０完全培地に再懸濁させた。刺激細胞と反応細胞の何れに対しても、細胞数のカウント（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  Ｃｅｄｅｘ）と細胞生存率測定（トリパンブルー色素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号：１５２５０−０６１）を行った。そして、反応細胞を９６ウェルの細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号：３７９９）に接種し、各ウェルに５０μＬ（１×１０５個の細胞）注入し、さらに各ウェルに１００μＬの既定濃度の二機能性融合タンパク質Ｂ、市販されている陽性対照試薬アバタセプト（ＯｒｅｎｃｉａＴＭ，ブリストル・マイヤーズスクイブ社）またはエタネルセプト（商品名：エンブレル（益賽普），上海中信国健薬業株式会社製）を加えた。そして、各サンプルに対して３つのウェルを設定した。１ウェル当たり５０μＬの刺激細胞（１×１０５個の細胞）を加えた。細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに設置してインキュベートした。７２時間後、１ウェルあたり１００μＬの上清を取り出して、−７０℃に保存した。マニュアルに従って、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，カタログ番号：ＥＬＨ−ＩＬ２−００１）を用いてＩＬ−２のレベルを測定した。
【００９０】
その結果、図７に示すように、ヒトＰＢＭＣとを混合する反応において、二機能性融合タンパク質Ｂ、アバタセプト及びエタネルセプトについて、ＩＬ−２分泌を抑制するＥＣ５０は、それぞれ３ｎＭ、１２ｎＭ及び２１ｎＭである。二機能性融合タンパク質Ｂは、市販されている陽性対照物質であるアバタセプト及びエタネルセプトに較べて、より強いＩＬ−２分泌抑制活性を示した。追加した実験により明らかなように、二機能性融合タンパク質Ａも、アバタセプトに近い、比較的強いＩＬ−２分泌抑制活性を示した。
【００９１】
実施例１１：二機能性融合タンパク質Ａのキメラ体及びヒト化類似体
二機能性融合タンパク質Ａの定常部アミノ酸配列、即ち、コントロール抗体Ａの定常部アミノ酸配列を、ヒトＩｇＧ１定常部配列に置換した。ヒトＩｇＧ１の重鎖の定常部配列は配列番号２２で示されるものであり、軽鎖の定常部配列は配列番号２３で示されるものである。これにより二機能性融合タンパク質Ａキメラ体類似体を得た。そのアミノ酸配列は配列番号２４と配列番号２５で示されるものである。当該キメラ体類似体はねずみ（鼠）由来成分を減少し、タンパク質の免疫原性を効率的に減少することが可能である。
【００９２】
なお、配列番号２４及び配列番号２５の部分配列に対してさらに改造し、その可変部におけるフレームワーク領域のアミノ酸の置換及び変異を行って、ねずみ（鼠）由来成分をさらに減少した。これにより得られた二機能性融合タンパク質Ａヒト化類似体のアミノ酸配列は配列番号２６及び配列番号２７で示されるものである。
二機能性融合タンパク質Ａ、キメラ体及びそのヒト化類似体に対して抗原親和力測定を行った。その結果、表２に示すように、キメラ体及びヒト化類似体は母体の抗原結合活性を良好的に保留した。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
実施例１２：二機能性融合タンパク質Ａヒト化類似体のＩＩ型コラーゲンに誘導されるラット関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける薬効の研究
ラットＣＩＡモデルは、関節リウマチの病因の研究及び治療薬剤のスクリーニングに広く用いられている動物モデルである。実験動物として、７週齢のＷｉｓｔａｒ系雌ラット（ＨＦＫ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（北京華阜康生物科技株式会社）から購入）を選択した。一週間かけて環境に適応させた後、ランダムに５匹のラットを選んで正常対照ラットとし、その他のラットをラットＣＩＡモデルの構築のために用いた。ラットに対して初回免疫と追加免疫を行うことによりＣＩＡモデルが得られた。初回免疫では、２００μｇのＩＩ型ウシコラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，カタログ番号：２００２２）と不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号：Ｆ５５０６）とを混合して乳剤を形成し、皮内注射によりラットの尾根部に注射した。一週間後、追加免疫を行った。追加免疫では、１００μｇのＩＩ型ウシコラーゲンと不完全フロイントアジュバントとを混合して乳剤を形成し、皮内注射によりラットの尾根部に注射した。追加免疫後、ラットの四肢の腫れなどの臨床的関節炎症を観察した後、ランダムに１群を６匹として分けた。
【００９５】
ＣＩＡモデルのラットの各群に対してそれぞれ投与した。薬物溶媒（ＰＢＳ）、アバタセプト（２７２ｎｍｏｌ／ｋｇ，第１、５、８、１１日にそれぞれ投与した）、二機能性融合タンパク質Ａヒト化類似体（３３ｎｍｏｌ／ｋｇ，２日毎に１回腹腔内注射し、計７回）。投与後、前後四肢の病変状態を観察し、関節炎症に関してインデックスの採点を行った。０＝赤腫なし；１＝足首関節または足根関節に紅斑や軽度の腫脹あり；２＝足首関節から足根関節にかけて紅斑や軽度の腫脹あり；３＝足首関節から中足骨関節にかけて紅斑や中程度の腫脹；４＝足首関節、足、足趾関節を含めて腫脹紅斑や重度の腫脹または四肢関節強直である。ラットの四肢に対し炎症採点を行い、各ラットの最多得点は１６点である。
【００９６】
実験結果は図８に示すように、正常コントロール群のラットでは炎症反応がみられなく、溶媒群のＣＩＡモデルラットでは顕著な炎症反応がみられた。二機能性融合タンパク質Ａヒト化類似体投与群のＣＩＡモデルラットの関節炎インデックスが顕著に抑制され、アバタセプト投与群に較べて優れた炎症緩解効果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月22日(2016.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインと、抗ＩＬ−１７抗体とを含有する二機能性融合タンパク質。
【請求項２】
前記抗ＩＬ−１７抗体が抗ＩＬ−１７Ａ抗体である請求項１に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項３】
以下の配列の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１または請求項２に記載の二機能性融合タンパク質。
ａ）配列番号５と配列番号６との組み合わせ、配列番号１３と配列番号１４との組み合わせ、配列番号４と配列番号１９との組み合わせ、配列番号２４と配列番号２５との組み合わせ、もしくは配列番号２６と配列番号２７との組み合わせで示される配列、
ｂ）配列番号５と配列番号６との組み合わせ、配列番号１３と配列番号１４との組み合わせ、配列番号４と配列番号１９との組み合わせ、配列番号２４と配列番号２５との組み合わせ、もしくは配列番号２６と配列番号２７との組み合わせで示される配列において１個若しくは数個アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、Ｂ７とＩＬ−１７Ａシグナル経路を同時に遮断する活性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号５と配列番号６との組み合わせ、配列番号１３と配列番号１４との組み合わせ、配列番号４と配列番号１９との組み合わせ、配列番号２４と配列番号２５との組み合わせ、もしくは配列番号２６と配列番号２７との組み合わせで示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、Ｂ７とＩＬ−１７Ａシグナル経路を同時に遮断する活性を有するアミノ酸配列。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の二機能性融合タンパク質をコードするコード遺伝子。
【請求項５】
機能可能なように結合された請求項４に記載のコード遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含有する宿主細胞。
【請求項７】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の二機能性融合タンパク質を製造する方法であって、
（１）請求項４に記載のコード遺伝子を機能可能なように結合した真核発現ベクターを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させるステップ、または請求項５に記載の組換えベクターを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させるステップと、
（２）前記二機能性融合タンパク質を精製するステップと、
を含む、二機能性融合タンパク質を製造する方法。
【請求項８】
前記真核発現ベクターはＸ０ＧＣである、請求項７に記載の二機能性融合タンパク質を製造する方法。
【請求項９】
前記宿主細胞はＨＥＫ２９３−ＴまたはＣＨＯ細胞である、請求項７または請求項８に記載の二機能性融合タンパク質を製造する方法。
【請求項１０】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の二機能性融合タンパク質、または請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の方法によって得られる二機能性融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の方法によって得られるタンパク質、または請求項１０に記載の医薬組成物の、疾患を予防、治療または改善するための薬物の製造における使用。
【請求項１２】
前記疾患が、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項４に記載のコード遺伝子、請求項５に記載の組み換えベクター、または請求項６に記載の宿主細胞を含むキット。
【国際調査報告】
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