(57)【要約】  本開示は、（標的そのものにより、または標的に結合するために用いられる巨大分子化合物のいずれかにより生み出された）立体障害の使用に基づき、（基質に会合した）アンカーオリゴヌクレオチドと、（標的または巨大分子化合物と特異的に結合可能な）シグナルオリゴヌクレオチド、またはシグナルオリゴヌクレオチドの組み合わせとのハイブリダイゼーションを防止または制限する、標的検出及び定量化システム、並びに関連する方法を提供する。【選択図】図１１Ａ
2017513026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の標的を検出するためのシステムであって、前記システムが、
●  それぞれ核酸配列、第１端、及び第２自由端を有する複数のアンカーオリゴヌクレオチドと、
●  複数の異なる位置において、前記複数のアンカーオリゴヌクレオチドの前記第１端のそれぞれと会合している表面を有する第１基質と、
●  複数のシグナルオリゴヌクレオチドであって、前記シグナルオリゴヌクレオチドのそれぞれが、
○  前記アンカーオリゴヌクレオチドのそれぞれの領域に実質的に相補的であり、かつ前記アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能であるコア核酸配列を有し；
○  巨大分子化合物と結合するための部位と会合している第１端を有し；
○  レポーター部位と会合している第２端を有し；そして、
○  前記アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、前記シグナルオリゴヌクレオチドの前記第２端が、前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記第１端近傍に位置するように構成されている、前記複数のシグナルオリゴヌクレオチドとを含み、
前記第１基質上の前記複数のアンカーオリゴヌクレオチドの密度が、前記第１基質上の２つの隣接位置における、少なくとも１つのアンカーオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのシグナルオリゴヌクレオチド、及び前記巨大分子化合物間での複合体の形成を防止または制限することを特徴とする、システム。
【請求項２】
前記標的が、前記巨大分子化合物である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記巨大分子化合物が、ポリペプチドである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、抗体である、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記巨大分子化合物と結合するための前記部位が、前記抗体により特異的に認識されるエピトープを含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記標的と特異的に結合可能な巨大分子化合物を更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記巨大分子化合物と結合するための前記部位が、前記標的である、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記巨大分子化合物が、前記標的を特異的に認識する抗体である、請求項６または７に記載のシステム。
【請求項９】
前記巨大分子化合物と結合するための前記部位が、前記抗体により特異的に認識されるエピトープを含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記巨大分子化合物が、前記標的を特異的に認識するアプタマーである、請求項６に記載のシステム。
【請求項１１】
前記巨大分子化合物と結合するための前記部位が、前記アプタマーとハイブリダイゼーションするための核酸分子を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記アンカーオリゴヌクレオチドのそれぞれの前記第１端が、前記第１基質の前記表面に共有結合している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記第１端が、核酸末端である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記アンカーオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも１０個の核酸塩基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第１基質が、金属電極である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記金属電極が、金電極である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記シグナルオリゴヌクレオチドの前記コア核酸配列が、前記アンカーオリゴヌクレオチドの全長にわたって、前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記核酸配列に相補的である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記シグナルオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも１０個の核酸塩基を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記レポーター部位が、レドックスレポーターである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
前記レドックスレポーターが、メチレンブルーである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
複数の異なる標的を検出するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のシステムであって、前記システムが、
●  複数種のアンカーオリゴヌクレオチドであって、各種アンカーオリゴヌクレオチドが、異なる核酸配列、第１端、及び第２自由端を有する、前記複数種のアンカーオリゴヌクレオチドと、
●  複数の基質であって、前記基質のそれぞれが、複数の異なる位置において、一種類のアンカーオリゴヌクレオチドの前記第１端と会合している表面を有し、前記基質のそれぞれが、異なる種類のアンカーオリゴヌクレオチドを有する、前記複数の基質と、
●  複数種のシグナルオリゴヌクレオチドであって、前記シグナルオリゴヌクレオチドの各種類が、
○  対応するアンカーオリゴヌクレオチドの領域に実質的に相補的なコア核酸配列を有し、かつ前記対応するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションが可能であり、
○  異なる巨大分子化合物と結合するための異なる部位と会合する第１端を有し、
○  レポーター部位と会合している第２端を有し、そして、
○  前記対応するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする際に、前記シグナルオリゴヌクレオチドの前記第２端が、前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記第１端近傍に位置するように構成される、前記複数種のシグナルオリゴヌクレオチドとを更に含み、
前記複数の基質それぞれの上にある前記アンカーオリゴヌクレオチドの密度が、前記複数の基質それぞれの上の２つの隣接位置にて、少なくとも１つのアンカーオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのシグナルオリゴヌクレオチド、及び前記巨大分子化合物間での複合体の形成を防止または制限する、前記システム。
【請求項２２】
●  複数の異なる位置にて、複数のアンカーオリゴヌクレオチドの前記第１端のそれぞれと会合する表面を有する第２基質と、
●  複数の陰性対照オリゴヌクレオチドであって、前記複数の陰性対照オリゴヌクレオチドのそれぞれが、
○  前記アンカーオリゴヌクレオチドの領域に実質的に相補的なコア核酸配列を有し、かつ前記アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能であり、
○  巨大分子化合物と結合するための前記部位を欠く第１端を有し、
○  前記レポーター部位を有する第２端を有し、そして、
○  前記アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、前記シグナルオリゴヌクレオチドの前記第２端が、前記アンカーオリゴヌクレオチドの前記第１端近傍に位置するように構成される、前記複数の陰性対照オリゴヌクレオチドとを更に含み、
前記第２基質上の前記複数のアンカーオリゴヌクレオチドの密度が、前記第１基質上の前記複数のアンカーオリゴヌクレオチドの密度と同等である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２３】
試料内での標的の検出方法であって、前記方法が、
●  前記標的を有することが疑われる前記試料を提供する工程と、
●  請求項１〜２２のいずれか一項に記載のシステムを提供する工程と、
●  前記標的が存在しない前記システム内において、前記複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした前記複数のアンカーオリゴヌクレオチドの対照量を提供または測定する工程と、
●  前記試料を前記システムと接触させる工程と、
●  前記試料が存在するシステム内で、前記複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした前記複数のアンカーオリゴヌクレオチドの試験量を測定する工程と、
●  前記試験量が前記対照量よりも少ないことが測定されれば、前記試料が、前記標的を有すると性質決定され、前記試験量が前記対照量と等しいかまたはそれ以上であることが測定されれば、前記標的を欠いていると性質決定される工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記第１の量と前記第２の量の比較に基づき、前記試料内での前記標的の濃度を定量化する工程を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的を欠くことが分かっている対照試料を、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のシステムと接触させ、前記複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした前記複数のアンカーオリゴヌクレオチドの量を測定すること、または、
前記試料を請求項２２に記載のシステムと接触させ、前記第２基質上の前記複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした前記複数のアンカーオリゴヌクレオチドの量を測定すること
により、前記対照量を測定する工程を更に含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験量及び／または前記対照量を電気化学的に測定する工程を更に含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料が、生物試料である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物試料が、全血である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、食料試料である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的が、細菌またはウイルスである、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願及び書類の相互参照）
本出願は、２０１４年４月４日に出願された米国仮特許出願第６１／９７５，２３１号の優先権を主張し、その内容全体が本明細書に組み込まれている。本出願はまた、電子出願された配列一覧表も含み、その内容全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、アンカーオリゴヌクレオチド、シグナルオリゴヌクレオチド、及び（それ自体が標的であることができるか、または標的に結合可能であるかのいずれかの）巨大分子化合物（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｔｉｔｙ）間で複合体を形成する際に発生する立体障害の使用に基づく、標的の検出及び任意の定量化に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
抗体等の、複数のタンパク質または生体指標の定量的検出における迅速、低コスト、簡易迅速（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ：ＰＯＣ）アプローチの開発は、より頻繁に試験を行うことを可能にすることで、また、発展途上国への分子診断の浸透を向上させることで、地球規模での健康に劇的に影響を与え得る。抗体等のタンパク質の定量的検出における現在最新の方法は、依然として大部分がＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット及び偏光アッセイに依存しており、これらは専用の技術者を必要とし、完了まで数時間を要する、多工程の洗浄及び試薬集約的なプロセスである。免疫化学的ディップスティック等の、代替の簡易迅速アプローチは、使い易さ及び経済的負担能力の観点で、重要な利点を示す。しかし残念なことに、これらは殆ど多重比較することができず、これらの結果は大部分が定性的であるため、主観的解釈となりやすい。
【０００４】
この１０年間で、多重比較可能な定量的簡易迅速（ＰＯＣ）タンパク質検出を実現するために、バイオセンシングの２つの主要カテゴリー：ラブオンチップ装置及び一段階均一アッセイが研究されている。独自の装置に複数工程を組み込み自動化するラブオンチップ装置（例えばマイクロ流体デバイス）は近年、ＰＯＣの多重検出において大きな将来性を示している。しかし、その高コスト、試薬の必要条件、及び比較的複雑な操作が依然として、この装置を実世界に移行させるには手ごわい障害をもたらしている。一方、試料を分離または洗浄工程で処理する必要なく、単に混合し読み取る操作が必要な一段階均一アッセイは、簡易迅速バイオセンシングに対する、見込みのある別の方法を示している。しかし残念なことに、未処理の全血中でタンパク質マーカーを一段階工程で検出可能なほどに選択性のある均一アッセイは殆どない。
【０００５】
タンパク質検出のための多数の一段階均一アッセイが、近年開発されている。これらの方法にはタンパク質ベースのアッセイ、及びＤＮＡベースのアッセイが含まれる。これらの異なるアプローチの中でも、ＤＮＡベースの電気化学センサー（Ｅ−ＤＮＡ）は、実世界への移行に関して大いに見込みを示している。これらのセンサーは通常迅速、無試薬、多重比較可能かつ多機能であり、核酸、タンパク質、及び小検体の検出を可能にする。これらは、血清等の複合体試料において、比較的安価なポテンショスタットを使用して、容易な電気化学測定を直接可能にすることに加えて、ＤＮＡの高い特異性及びプログラミング性を利用する。しかし残念なことに、これらのセンサーには依然として、実世界での用途への移行を不可能にする制限がある。これらは、センサーが全血中に漬けられ、ナノアンペアの低い電気化学シグナルが出力する際の、最初の数分での急速なシグナルの移動を含む。
【０００６】
臨床的に関連のある、ナノ分子濃度の低い全血中において、抗体等の大きな巨大分子を直接、迅速に定量的検出することを支える、多機能性のＤＮＡベース電気化学スイッチが更に開発された（Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかし残念なことに、このＤＮＡスイッチはセンサーヘッド上にて低表面密度でしか十分に機能せず、それぞれの単一スイッチが、多くの場合、最大数十ｎｍ（例えば抗体：１２ｎｍ）にわたる大きな巨大分子により確実に活性化されるためには、ある条件が必要である。それ故、これらの低密度センサーは低い電流密度（ｎＡ／ｃｍ2）しか発生させず、この電流密度は高価な、実験室用ポテンショスタットでしか検出できない。更に、多くの化学部位（例えば電気活性元素、Ｃ６チオール、フレーム反転（ｆｒａｍｅ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、エピトープ）の付加を必要とし、かつ通常は、正確な測定が十分に可能となるように安定する前に、作用培地（例えば全血）中にて長い平衡時間（分）が必要であるため、これらのスイッチ系ＤＮＡセンサーは比較的、合成が難しいままである。
【０００７】
種々の標的を検出するための種々の技術が開発されたが、それらの用途は限定的である。Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅらによる国際出願ＷＯ２０１２／０７１３４４は、巨大分子及び他の検体を検出し定量化するための、単一分子プローブの使用について記載している。その明細書内で記載されている技術は、検出可能なシグナルを引き起こすための、標的結合時の単一分子プローブ構造変化に基づいている。しかし、この技術は、単一分子プローブ上の２つの異なる標的結合部位に同時に結合して構造変化を誘発可能な標的、または標的の組み合わせの検出に限定されている。Ｌａｓｓ−Ｎａｐｉｏｒｋｏｗｓｋａらの出版物（２０１２）は、標的への結合時にＦＲＥＴシグナルを作製する３つのオリゴヌクレオチドの組み合わせについて記載している。しかし、上述のＶａｌｌｅｅ−ＢｅｌｉｓｌｅｓのＰＣＴ出願とほぼ同様に、本技術は、異なるオリゴヌクレオチド上に存在する２つの標的結合部位に結合してＦＲＥＴシグナルを誘発することが可能な標的、または標的の組み合わせの検出に限定されている。Ｘｉａｏらによる国際出願ＷＯ２００７／１２０２９９は、標的検出用のシグナル−オンアーキテクチャの使用について記載している。しかし、本技術は、核酸分子と特異的に結合可能な標的の検出に限定されている。Ｆａｎらの出版物（２００３）は、標的への結合時にその構造を変化させる、単一のステムを含有するオリゴヌクレオチドの使用について記載している。上述のＸｉａｏらのＰＣＴ出願とほぼ同様に、本技術は、核酸分子に結合可能な標的の検出に限定されている。
【０００８】
（２つの異なる標的結合部位、または核酸分子に必ずしも結合可能でなくてよい）種々の標的の検出／定量化用アッセイと共に提供されるのが非常に望ましい。複合体混合物（例えば全血と食物）における標的の検出／定量化のアッセイと共にあることもまた好ましい。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、立体障害を使用して、２つの隣接するオリゴヌクレオチド複合体の会合を防止または制限し、試料中における標的の存在を検出、及び幾つかの実施形態では定量化することに関する。以下に示すように、少なくとも３つの構成成分の組み合わせ：アンカーオリゴヌクレオチドを含む基質、及びアンカーオリゴヌクレオチドに実質的に相補的な単一分子または制御シグナルオリゴヌクレオチドを使用する。幾つかの実施形態においては、本システムは、標的と結合するための巨大分子化合物もまた含むことができる。シグナルオリゴヌクレオチドはまた、（標的と直接結合するため、または標的の直接結合が可能な巨大分子化合物を介して、間接的に標的と結合するための）巨大分子化合物と結合するための部位、並びに（アンカーオリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる際、基質表面と共にシグナル制御が可能な）レポーター部位も含む。アンカーオリゴヌクレオチドは、基質上の２つの隣接位置にある、少なくとも１つのアンカーオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのシグナルオリゴヌクレオチド、及び巨大分子化合物間での複合体の形成を防止または制限する密度で、基質表面に会合する。幾つかの実施形態では、本明細書で記載されたアッセイ及び方法は、多重形態、及び／または全血または食物等の生物学的複合混合物で使用することができる。
【００１０】
第１の態様に従うと、本開示は、試料内での標的を検出するためのシステムを提供する。本システムは、（ｉ）核酸配列、第１端及び第２自由端をそれぞれ有する複数のアンカーオリゴヌクレオチド；（ｉｉ）複数の別の位置において、複数個のアンカーオリゴヌクレオチドの第１端のそれぞれに会合する表面を有する第１基質；並びに（ｉｉｉ）複数のシグナルオリゴヌクレオチドを含む。各シグナルオリゴヌクレオチドは、（ｉ）各アンカーオリゴヌクレオチドの一領域に実質的に相補的であり、アンカーオリゴヌクレオチドと共にハイブリダイズ可能なコア核酸配列を有し；（ｉｉ）巨大分子化合物結合用部位と会合している第１端を有し；（ｉｉｉ）レポーター部位と会合している第２端を有し；かつ、（ｉｖ）アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、シグナルオリゴヌクレオチドの第２端がアンカーオリゴヌクレオチドの第１端の近傍に位置するように構成されている。本明細書で記載されるシステムにおいて、第１の基質上にある複数のアンカーオリゴヌクレオチドの密度が、第１基質上の２つの隣接位置にある、少なくとも１つのアンカーオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのシグナルオリゴヌクレオチド、及び巨大分子化合物間での複合体の形成を防止または制限する。一実施形態では、標的はポリペプチド（例えば抗体）等の巨大分子化合物である。かかる実施形態において、巨大分子化合物と結合するための部位は、抗体により特異的に認識されるエピトープを含むことができる。別の実施形態において、システムは、標的と特異的に結合可能な巨大分子化合物（例えば抗体またはアプタマー）を更に含む。かかる実施形態において、巨大分子化合物と結合する部位は標的であることができるか、または巨大分子化合物（例えばアプタマー）とハイブリダイズするための核酸分子を含むことができる。更に他の実施形態では、各アンカーオリゴヌクレオチドの第１端（核酸末端等）は、第１基質の表面に共有結合で会合している。更に別の実施形態において、各アンカーオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個の核酸塩基を含む。更なる実施形態において、第１基質は金属電極（例えば金電極）である。別の実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドのコア核酸配列は、アンカーオリゴヌクレオチドの核酸配列と、アンカーオリゴヌクレオチドの全長にわたって相補的である。また更なる実施形態においては、各シグナルオリゴヌクレオチドは少なくとも１０個の核酸塩基を含む。一実施形態において、レポーター部位はレドックスレポーター（例えばメチレンブルー）である。
【００１１】
第２の態様に従うと、本開示は、２つ以上の標的を、例えば多重フォーマットで検出するためのシステムを提供する。多重システムは本明細書で記載されるシステムを含み、更に（ｉ）複数種のアンカーオリゴヌクレオチドであって、各種のアンカーオリゴヌクレオチドが異なる核酸配列、第１端及び第２自由端を含む、上記アンカーオリゴヌクレオチド；（ｉｉ）複数の基質であって、各基質は、複数の別の位置において、単一種のアンカーオリゴヌクレオチドの第１端と会合する表面を有し、各基質は、異なる種のアンカーオリゴヌクレオチドを有する、上記基質；並びに（ｉｉｉ）複数種のシグナルオリゴヌクレオチドを含む。多重システムにおいて、各種のシグナルオリゴヌクレオチドは、（ｉ）対応するアンカーオリゴヌクレオチドの領域に実質的に相補的であるコア核酸配列を有し、かつ対応するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションが可能であり、（ｉｉ）異なる巨大分子化合物と結合するための異なる部位と会合している第１端を有し；（ｉｉｉ）レポーター部位と会合している第２端を有し；かつ、（ｉｖ）対応するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする際に、シグナルオリゴヌクレオチドの第２端がアンカーオリゴヌクレオチドの第１端の近傍に位置するとなるように構成される。多重システムにおいて、複数の基質それぞれの上にあるアンカーオリゴヌクレオチドの密度が、それぞれの上の２つの隣接位置にある、少なくとも１つのアンカーオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのシグナルオリゴヌクレオチド、及び巨大分子化合物間での複合体の形成を防止または制限する。
【００１２】
第３の態様では、本開示は、任意の対照または参照システムを提供する。対照／参照システムは、本明細書で記載されるシステム（単一または多重フォーマット）を含み、かつまた（ｉ）複数の別の位置において、複数のアンカーオリゴヌクレオチドの各第１端と会合する表面を有する第２基質；及び（ｉｉ）複数の陰性対照オリゴヌクレオチドを含む。対照／参照システムにおいて、複数の陰性対照オリゴヌクレオチドはそれぞれ、（ｉ）アンカーオリゴヌクレオチドの領域に実質的に相補的であるコア核酸配列を有し、アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能であり；（ｉｉ）巨大分子化合物と結合する部位を欠く第１端を有し；（ｉｉｉ）レポーター部位を有する第２端を有し；かつ、（ｉｖ）アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、シグナルオリゴヌクレオチドの第２端がアンカーオリゴヌクレオチドの第１端の近傍に位置するように構成されている。対照／参照システムにおいて、第２基質上の複数のアンカーオリゴヌクレオチドの密度は、第１基質上の複数のアンカーオリゴヌクレオチドの密度に類似している。
【００１３】
第４の態様では、本開示は、試料内での標的（または複数の標的）の検出方法を提供する。概括すると、本方法は、（ｉ）標的（または複数の標的）を有すると考えられる試料を提供すること；（ｉｉ）本明細書で記載されるシステムを提供すること；（ｉｉｉ）標的の不在下で、システム内で複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした、対照量の複数のアンカーオリゴヌクレオチドを提供または測定すること；（ｉｖ）試料をシステムと接触させること；（ｖ）試料の存在下にて、システム内で複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした、試験量の複数のアンカーオリゴヌクレオチドを測定すること；（ｖｉ）試験量が対照量よりも少ないことが測定されれば、試料は標的を有すると性質決定され、試験量が対照量と等しいかまたはそれ以上であることが測定されると、標的を欠いていると性質決定されることを含む。一実施形態において、本方法は更に、１番目の量と２番目の量との比較に基づいた、試料内での標的の濃度の定量化を含む。別の実施形態において、本方法は、（ｉ）標的を欠いていることが分かっている対照試料を本明細書で記載されるシステムと接触させ、複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした複数のアンカーオリゴヌクレオチドの量を測定すること、または試料を本明細書で記載される対照／参照システムと接触させ、第２基質上で、複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした複数のアンカーオリゴヌクレオチドの量を測定することにより、対照量を測定することを含む。一実施形態において、本方法は更に、試験量及び／または対照量を電気化学的に測定することを含む。更に別の実施形態において、試料は生物試料（全血等）である。また別の実施形態において、試料は食料試料である。更に別の実施形態において、標的は細菌またはウイルスである。
【００１４】
このように本発明の性質を記載したので、ここで、添付図面を参照する。これらは本発明の好ましい実施形態を例示として示している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】電気化学的立体障害ハイブリダイゼーションアッセイ（ｅＳＨＨＡ）の略図を提供する。（Ａ）ｅＳＨＨＡは、密充填された、表面に結合しているアンカーＤＮＡオリゴヌクレオチド（太線）、及び遊離した相補シグナルＤＮＡオリゴヌクレオチド（通常線）で構成される。シグナルオリゴヌクレオチドは、小さな認識用成分（□、巨大分子化合物と結合するための部位とも称される）、及びシグナル活性部位（●または○、レポーター部位とも称される）により、２つの末端が標識されている。巨大分子標的巨大分子（上部）の不在下において、シグナルオリゴヌクレオチドは全てのアンカーオリゴヌクレオチドと自由に相互作用するため、電極表面に複数のレドックス標識をもたらすことにより、大きな電気化学的電流（Ｂにおける太い曲線）を生み出す。巨大分子標的の存在下において（下部）、シグナルオリゴヌクレオチドは、認識用成分への結合により標的によって捕捉されるため、立体障害効果によって、電極表面へのハイブリダイゼーション能力が著しく制限される（Ｂにおける通常の曲線）。（Ｂ）巨大分子標的の存在下（通常線）及び不在下（太線）における、ｅＳＳＨＡ（Ａで説明）に関する、電圧の関数としての電流（Ａで測定）の表示。
【図２】抗体及びストレプトアビジンを、ｅＳＨＨＡにて巨大分子化合物（標的）として使用可能であることを示す。Ｄｉｇ標識（上部）またはビオチン標識（下部）シグナルオリゴヌクレオチドを使用して、それぞれの標的（それぞれ、抗Ｄｉｇ抗体及びストレプトアビジン）を検出した。（Ａ〜Ｂ）標的の不在下において、シグナルオリゴヌクレオチドは相補アンカーオリゴヌクレオチドに自由にハイブリダイゼーションするため、金表面近傍に種々のレドックス活性ＭＢをもたらすことにより、高い電気化学的電流を生み出す（太い曲線）。１００ｎＭの抗Ｄｉｇ抗体（Ａ及びＢにおける通常曲線）またはストレプトアビジンの存在下において、立体障害のため、より少量のシグナルオリゴヌクレオチドが金表面に到達するため、より低量の電流が生み出される。（Ｃ〜Ｄ）時間（分）に対する電流（μＡ）の関数の測定を、巨大分子標的の存在下及び不在下における、異なるシステムに関して示す。シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度は、巨大分子標的の存在の影響を受けない（それぞれ、ｔ1/2抗体＝１１．６及び１０．５分；及びｔ1/2ストレプトアビジン＝１１．２及び９．６分）。（Ｅ〜Ｆ）標的濃度（Ｍ）での電流（μＡ）の測定値を示し、抗体（Ｅ）及びストレプトアビジン（Ｆ）の用量反応曲線を表す。５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で実験を行った。値は、三重測定±標準偏差の平均電流を表す。エラーバーは、３つの電極を用いて作動した際に得られる典型的な標準偏差を表し、電極内変動性に支配されている。
【図３】シグナルオリゴヌクレオチドの濃度増加に伴う、ｅＳＨＨＡの用量反応曲線を示す。ｅＳＨＨＡの感度を最適化するために、電極表面の全てのアンカーオリゴヌクレオチドを飽和させるために必要なシグナルＤＮＡオリゴヌクレオチドの最小量を、まず測定した。（Ａ）使用したシステムの略図。使用したシステムは、図２に示すものに類似しているが、巨大分子標的（タンパク質）を含有しない。（Ｂ）３つの異なる自製電極の用量反応曲線（シグナルオリゴヌクレオチド濃度（Ｍ）の関数としての電流（μＡ））は、シグナルオリゴヌクレオチドが約１００ｎＭにて飽和する、類似の協調曲線を示す。これらの電極では、９．５％の再現性が通常得られる。実施例で行った実験は全て、濃度１００ｎＭのシグナルオリゴヌクレオチドを使用して行ったため、標的タンパク質の不在下における、大きくロバストな電気化学シグナルを確保した。このシグナルオリゴヌクレオチド濃度はまた、正確なタンパク質定量化が１ｎＭ〜１００ｎＭ（予想飽和点）の間で観察されることも保障する。理論に束縛されるものではないが、全てのシグナルオリゴヌクレオチドを飽和させるためにより多くのタンパク質が必要であるため、シグナルオリゴヌクレオチド濃度が高ければ、タンパク質の結合曲線が単純に、恣意的により高濃度に移動することが予想される。実施例で得られた結果において、巨大分子標的の不在下では、飽和点で得られた電気化学的電流は一点測定で得られた電流よりも４０％高いことが確認されている。これらの大きい電流は、本実験において、各添加後に、最大３５分待ってからより多くのシグナルＤＮＡを連続して添加することにより、長時間（５時間）にわたりシグナルＤＮＡのハイブリダイゼーションが生じるという事実に起因するようである。直径が小さい電極では、アンカーオリゴヌクレオチドの含有量が少ないため、シグナルＤＮＡオリゴヌクレオチドが低濃度で飽和することが予想される。
【図４】巨大分子標的（本実施形態ではタンパク質）がシグナルオリゴヌクレオチドと結合し、その後シグナルヌクレオチドが電極表面に結合した場合、電流の低下がないことを示す。これは、アンカーオリゴヌクレオチドがシグナルオリゴヌクレオチドにより完全に飽和した後のみにＤｉｇ抗体を添加する（本図においては矢印）ことにより、（図２に示した）Ｄｉｇ抗体システムを用いて示された。これらの抗体は、電極に結合したシグナルオリゴヌクレオチドのリガンドに結合すると予想していたが、１００ｎＭの抗体の添加後には、シグナルの低下は観察されない。時間（分）に対する電流（μＡ）の関数として、結果を示す。本結果は、ｅＳＨＨＡのシグナル機構は、結合により誘発される、個々のメチレンブルーの電子移動速度の低下に関係しないことを示している。本結果はまた、電気化学シグナルの低下は、むしろ、シグナルオリゴヌクレオチドが巨大分子または巨大分子標的に結合した場合に、シグナルオリゴヌクレオチドは電極表面にさほど結合しない、という事実に関係していることを示唆する機構を支持している。
【図５】ｅＳＨＨＡのシグナル機構は、巨大分子化合物がシグナルオリゴヌクレオチドと特異的に結合する際に生じることを示す。結果は、巨大分子標的（本図においては抗体）の存在下（点線）及び不在下（通常の線）における、電圧（Ｖ、Ａ）または時間（分、Ｂ）に対する電流（μＡ）の関数として示す。このことを実証するために、巨大分子化合物と結合するための部位を有しない対照シグナルオリゴヌクレオチドを設計した。この対照は、Ｄｉｇ抗体システムを使用して試験した。Ｄｉｇ  ｅＳＨＨＡセンサー（図２を参照）とは対照的に、電極表面における本対照シグナルＤＮＡのハイブリダイゼーションは、Ｄｉｇ抗体の存在により影響を受けなかった。
【図６】ｅＳＨＨＡの電気化学シグナルは、片対数関係（Ｒ2＝０．９６）に従い、シグナルオリゴヌクレオチドに結合した分子のサイズに逆相関することを示す。結果を、巨大分子化合物と結合するための部位のサイズ（ｋＤａ）に対する電流（μＡ）の関数として示す。本図で用いた分子量は、四価ストレプトアビジン（３つの更なるビオチン結合部位）の場合、３つの更なるシグナルオリゴヌクレオチドを、また二価抗体の場合、１つの更なるシグナルオリゴヌクレオチドを含む。
【図７】シグナルＤＮＡ上の小サイズリガンドに結合することで生み出される立体障害効果を示す。結果は、巨大分子化合物と結合するための部位（本図では認識用成分と称される）：対照（最初の柱）：ＤＮＰ（２番目の柱）、ビオチン（３番目の柱）及びジゴキシゲニン（４番目の柱）に対する電流（μＡ）の関数の程度として示す。２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ、１８４Ｄａ）、ビオチン（２４４Ｄａ）及びジゴキシゲニン（３９０Ｄａ）等の小サイズの分子の、シグナルオリゴヌクレオチドへの結合はそれぞれ、ｅＳＨＨＡの電気化学的電流を３％、８％、及び１３％低下させる。
【図８】最適のｅＳＨＨＡ性能は、高いアンカーオリゴヌクレオチド密度（アンカーオリゴヌクレオチド間の平均距離が短い）にて観察されることを示す。（Ａ）ｅＳＨＨＡシグナル機構は、シグナル伝達が観察されないアンカーオリゴヌクレオチド間の平均距離が増加した際、アンカーオリゴヌクレオチド間の平均距離がタンパク質のサイズ（１０〜１５ｎｍ）よりも大きくなった際に、急速に低下する。結果は、巨大分子標的（本図では抗体）の有無に対する電流（μＡ）の関数として示す。（Ｂ）シグナルゲイン及びアンカーオリゴヌクレオチド間の平均距離間の逆比例関係もまた、標的サイズに依存する。例えば、大きなタンパク質、例えば抗体（≒１２ｎｍ）はより多くの立体障害が生じるため、例えばより小さな標的ストレプトアビジン（≒５ｎｍ）よりも僅かに低いアンカーオリゴヌクレオチド密度で機能することができる。これらの実験は、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０にて室温で実施した。結果は、アンカーオリゴヌクレオチド（捕捉ＤＮＡと称される、ｎＭ）間の平均距離に対するゲイン（巨大分子化合物の存在下における電流の低下（％））として示す。
【図９】ｅＳＨＨＡは全血中で同等に十分に機能し、複数の抗体の刺激の同時検出を可能にすることを示す。（Ａ）ｅＳＨＨＡは緩衝液（１）及び全血（２）内で同等に十分に機能する。結果は、巨大分子標的（本図では抗体）の存在下（●）及び不在下（○）における、時間（分）に対する電流（μＡ）の関数として示す。（Ｂ）ｅＳＨＨＡは、多重フォーマットで十分に機能する。それぞれが特定のアンカーオリゴヌクレオチドと共に機能する３つの電極を使用して、異なる抗体を同時に検出する。対照（Ｃｔｒｌ）電極（０１４）に、巨大分子化合物と結合するための部位を有しないシグナルオリゴヌクレオチド（０３４）をハイブリダイゼーションする。ＤＩＧ電極（０１５）に、抗ＤＩＧ抗体と結合するためのジゴキシゲニン部位を有するシグナルオリゴヌクレオチド（０３５）をハイブリダイゼーションする。ＤＮＰ電極（０１６）に、抗ＤＮＰ抗体と結合するためのＤＮＰ部位を有するシグナルオリゴヌクレオチド（０３６）をハイブリダイゼーションする。全血試料にまず、上述の抗体を添加し（または抗体無しのままとし）、１００ｎＭの３つのシグナルオリゴヌクレオチド全てを、回収の数秒前に加えた。抗ＤＩＧ抗体（１及び３）、または抗ＤＮＰ抗体（２及び３）を添加した全血に関して、電流（μＡ）を測定した。（Ｃ）電圧（Ｖ）に対する電流密度（μＡ／ｃｍ2）の関数を、抗ＤＩＧ抗体をスパイクした全血のインキュベーションの５秒後、６分後、１８分後、及び３０分後に電極で測定した。
【図１０】シグナルオリゴヌクレオチドがモジュラーであり、２つの成分を含む実施形態を示す。本図に示す実施形態において、ＨＩＶのＧＰ４１タンパク質からのペプチドエピトープ（抗ＨＩＶ抗体により認識され、４Ｅ１０と称される）は、標識成分に共有結合される場合、アダプター成分に容易に結合することが可能である。（Ａ）例えば、モジュラーシグナルオリゴヌクレオチド（Ａ３及びＡ４）は、２つのオリゴヌクレオチド：５’末端にメチレンブルーを含有する「アダプター」オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）、及び、巨大分子化合物（ハプテンまたはエピトープ）と結合するための部位を含有し、アダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーション可能な「標識」オリゴヌクレオチド（ＰＮＡまたはＤＮＡ）から構成されることができる。この実施形態では、４つのシグナルオリゴヌクレオチドが示されている：（Ａ１）巨大分子化合物と結合するための「ＤＮＰ」部位を有する、陰性対照単一分子シグナルオリゴヌクレオチド、（Ａ２）巨大分子化合物と結合するためのＧＰ４１ペプチドを有する、陽性対照単一分子シグナルオリゴヌクレオチド、（Ａ３〜Ａ４）アダプター成分及び標識成分を有するモジュラーシグナルオリゴヌクレオチドであって、後者は、巨大分子化合物と結合するためのペプチドと会合している。ＧＰ４１ペプチドは、アダプター成分のレポーター部位に向かって（Ａ３）、または反対方向に（Ａ４）位置することができる。（Ｂ）モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドＡ３（３番目及び４番目の縦列）は、そのサイズがより大きいため、及びその負電荷がより大きいために、元のシグナルシグナルオリゴヌクレオチドＡ１（１番目及び２番目の縦列）と比較して、電極表面上でより非効率的にハイブリダイゼーションする。しかし、Ｍｇ2+を２０ｍＭ添加する（２番目及び４番目の縦列）ことにより、シグナルオリゴヌクレオチド間の電荷反発を低下させることができ、また、電極表面でのモジュラーシグナルオリゴヌクレオチド（Ａ３）のハイブリダイゼーション効率を増加させることができる。結果は、使用したシグナルオリゴヌクレオチド、及びマグネシウムの有無に対する電流（μＡ）の関数として示す。これらの実験は、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０にて室温で実施した。（Ｃ）モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドＡ３（１００ｎＭ）を使用した、４Ｅ１０  ＨＩＶ抗体の存在下または不在下で実施したアッセイに関する、時間（分）に対する電流（μＡ）の関数の測定値。これらの結果は、１０００ｎＭの抗体、及び追加のＭｇＣｌ2（２０ｍＭ）を使用した、スパイクウシ血液にて得た。
【図１１】小分子標的の検出（例えば競合アッセイ）のために設計したシステムの実施形態を示す。（Ａ）小さいターゲット分子の存在下において（上面）、後に、試料に添加された巨大分子化合物（例えば小分子標的を特異的に認識する抗体）に結合する。標的を巨大分子化合物に結合することで、巨大分子化合物のシグナルオリゴヌクレオチドへの結合を防止する。したがって、シグナルオリゴヌクレオチドは、センサー表面にてアンカーオリゴヌクレオチドの大部分に結合し、それにより、センサーヘッド（左面の太線）付近に多くのシグナル部位をもたらすことで、大きなシグナルを生み出す。小さな標的分子の不在下にて（下面）、巨大分子化合物（例えば抗体）は複合体を形成するシグナルオリゴヌクレオチドに結合するが、立体障害により、電極表面に結合するシグナルオリゴヌクレオチド（左面の通常の線）の数は減少する。（Ｂ〜Ｃ）抗ジゴキシン抗体（５０ｎＭ）、及びジゴキシゲニン標識したシグナルオリゴヌクレオチド１００ｎＭを使用して、ジゴキシンの検出のために全血中で直接、本実施形態を試験した。結果は、時間（Ｂ）またはジゴキシゲニンの濃度（Ｃ）に対する電流（μＡ）の関数の測定値について示す。
【図１２】図１１に類似しているが、標的細菌を検出するためのシステムの実施形態を示す。本実施形態では、細菌が対応する抗抗体を隔離し、これらはその後、シグナルオリゴヌクレオチドと結合するのに利用できなくなるように、システムが設計される。特定の細菌株の存在はそれ故、大きい電気化学的電流を生み出すことにより検出することができる。
【図１３】アプタマーを巨大分子化合物として使用し、（構造変換メカニズム、または競合アッセイにより）小分子を検出するためのシステムの実施形態を示す。本実施形態では、分子標的（通常は小分子またはタンパク質）に対して高親和性及び高特異性を示すアプタマーが、シグナルオリゴヌクレオチド上に位置する、短い相補配列（巨大分子化合物と結合するための部位と考えられる）を介してシグナルオリゴヌクレオチドに結合する。（Ａ）標的の存在下において（上面）、アプタマーはその結合可能な構造を好み、それは相補シグナルオリゴヌクレオチドに対して低い親和性を示す。遊離シグナルオリゴヌクレオチドはそれ故、センサー表面付近でさほど立体障害を生み出さず、結果として、シグナルヌクレオチドとアンカーオリゴヌクレオチドとの間でのハイブリダイゼーション効率を増加させ、最終的にセンサーからのシグナルの増加をもたらす。標的の不在下において（下面）、比較的大きなアプタマーと複合体を形成したシグナルオリゴヌクレオチドは、センサー表面で立体障害を生み出すため、電気化学シグナルは少なくなる。（Ｂ）アプタマーを巨大分子化合物として使用した場合の、時間に対する、標的の存在下または不在下で測定した電流の関数の表示。
【図１４】標的が巨大分子（例えば抗体）である場合の、電流低下の増加に関する本開示の実施形態を示す。本実施形態では、巨大分子と結合するための部位はまた、電極表面における、アンカーオリゴヌクレオチドのある種の（特定の）部分の自由端に付加することができる。（Ａ）標的巨大分子の存在下において（下面）、後に、立体障害の向上に役立つ巨大分子薄膜をセンサー表面に（アンカーオリゴヌクレオチドへの結合を介して）作製するため、巨大分子が結合したシグナルオリゴヌクレオチドとアンカーオリゴヌクレオチドとの間でのハイブリダイゼーション効率を更に一層低下させる。（Ｂ）巨大分子化合物と結合するための部位がアンカーオリゴヌクレオチドの自由端に付加された場合の、時間に対する、標的の存在下または不在下において測定した電流の関数の表示。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（詳細な説明）
本開示に従い、巨大分子化合物の、本明細書で記載された異なる少なくとも２つの一連のオリゴヌクレオチド（例えばアンカーシグナルオリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチド）との結合により作られる立体障害の使用に基づく、試料内での標的の検出、及び所望により半定量化または定量化のためのシステム、並びに関連する方法を提供する。本明細書で示すように、このシステムは、アンカー／シグナルオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイゼーションされた際にシグナルを生成し、標的の存在下または不在下においてかかるシグナルを調節することを可能にするように設計されている。幾つかの実施形態では、このシステムはまた、かかるシグナル調節の定量化により、試料内での標的の量を評価することも可能にすることができる。
【００１７】
幾つかの実施形態では、本システム及び方法は、例えば、単一の標的、または異なる標的の組み合わせの検出を可能にするように設計することができる。本明細書で示すように、本システム及び方法は、標的が核酸分子と結合して、または少なくとも２つの標的結合部位に同時に結合して、これらの検出／定量化を同時に可能にする能力に必ずしも依存しない。実施形態において、本システム及び方法は、標的の検出／定量化の前に標的を増幅する必要がない。幾つかの実施形態では、本システム及び方法は、全血または食物等、複合体の未処理混合物中での検出／定量化を可能にするように設計するされることができる。
【００１８】
検出システム及び関連するキット
本明細書で記載される検出システムは、少なくとも３つの構成要素：アンカーオリゴヌクレオチド（捕捉オリゴヌクレオチドとも称される）、（アンカーオリゴヌクレオチドが会合する）基質、及び（アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション／塩基対形成可能な）単一分子またはモジュラーシグナルオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、標的が巨大分子化合物でない、またはシグナルオリゴヌクレオチドへの結合ができない場合、検出システムはまた、（シグナルオリゴヌクレオチドに結合可能な）巨大分子化合物を含むことができる。検出システムは、巨大分子化合物の存在下及び不在下において、並びに、標的の存在下及び不在下において、互いに会合可能な、少なくとも２つの別のオリゴヌクレオチドを含む。アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチド間での塩基対形成またはハイブリダイゼーション効率は、定量化可能なシグナルの生成を可能にする。しかし、アンカーオリゴヌクレオチドはその末端の１つにおいて、基質表面に特定の密度で会合するため、巨大分子化合物のシグナルオリゴヌクレオチドとの会合が立体障害を生み、他のシグナルオリゴヌクレオチドの、隣接したアンカーオリゴヌクレオチドと会合する能力を調節する。最終的に、アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関係するシグナルが調節される。この調節は、試料内での標的の検出、及び幾つかの実施形態においては、定量化を可能にする。
【００１９】
本明細書で記載されるシステムは、試料内での１つ以上の標的の検出用、及び所望により定量化用である。本開示との関係においては、試料は、対象の標的、または対象の標的の組み合わせを含有することが疑われる、（既に液体であるか、または液体形態で提供することが可能である）混合物である。試料は溶液または懸濁液とすることができる。試料は溶液または懸濁液に処理することができる。試料は生物試料とすることができる。代表的な生物試料としては、体液（例えば血液、尿、胃腸液、間質液、涙液、汗、唾液、大便、痰、膿、脳脊髄液、精液、前立腺液、母乳、乳頭吸引液、涙液、汗）、組織（スワブ（例えば口腔粘膜検体採取物）、組織生検）、分画体液（血清、血漿等）、細胞抽出物（例えば細胞質膜、ミトコンドリア抽出物、核抽出物等）、細胞懸濁液、分泌物、及びかかる生物試料の培養液が挙げられるが、これらに限定されない。試料は環境的試料、例えば水、気体試料または土壌試料等とすることができる。試料はまた、食品試料とすることができる。
【００２０】
検出システムは、少なくとも２つの取り外し可能かつ塩基対形成可能／ハイブリダイゼーション可能な構成要素：（シグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な）アンカーオリゴヌクレオチドと会合する基質、及び（アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な）シグナルオリゴヌクレオチドに構成されている。基質は、２つの（及び、ある実施形態では複数の）別の隣接した位置において、少なくとも２つの（及び、ある実施形態においては複数の）アンカーオリゴヌクレオチドと会合する。本システムは、少なくとも２つの（及び、ある実施形態においては複数の）シグナルオリゴヌクレオチドを含む。アンカーオリゴヌクレオチドは、その末端の１つにおいてアンカーオリゴヌクレオチドが基質表面に会合し、もう一端において、（例えば基質表面と直接会合しない）遊離端を有するとなるように構成されている。シグナルオリゴヌクレオチドが単一分子である場合、シグナルオリゴヌクレオチドは、一端において巨大分子化合物と結合するための部位を有し、もう一端にてレポーター部位を有するように設計されている。シグナルオリゴヌクレオチドがモジュラーである場合、第１構成成分として、巨大分子化合物と結合するための部位（標識成分）、及び第２構成成分としてレポーター部位（アダプター成分）を含むように設計されている。アンカーオリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイゼーションし、シグナルオリゴヌクレオチドのレポーター部位を基質表面の近傍に配置するように構成される。巨大分子化合物が（標的が試料内に存在しないか、または巨大分子化合物が標的と複合体を形成するかのいずれかの理由により）シグナルオリゴヌクレオチドと複合体を形成できない場合、アンカー及びシグナルオリゴヌクレオチドは、アンカーオリゴヌクレオチドが位置する基質上の、２つの（及び、ある実施形態においては複数の）別の隣接した位置において共にハイブリダイゼーションされる。本実施形態では、結合シグナルオリゴヌクレオチドのそれぞれにおけるレポーター部位は、基質表面と共に、検出及び定量化可能なシグナルの生成を調節する（ある実施形態では、シグナルを生成する）。巨大分子化合物が、（標的が試料に存在しないために）シグナルオリゴヌクレオチドと共に複合体を形成する場合、複合体が少なくとも１つのアンカーオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのシグナルオリゴヌクレオチド、及び巨大分子化合物間で形成され、かかる複合体の存在が基質上のある位置において立体障害を生み出し、これにより、別の隣接するアンカーオリゴヌクレオチド、及び（巨大分子化合物と会合するかまたは会合しない）更なるシグナルオリゴヌクレオチド間でのハイブリダイゼーションを制限または防止する。隣接位置においてかかるハイブリダイゼーションが行われないことで、基質表面にもたらされるレポーター部位の数が調節される（例えば減少する）。かかるシグナルは検出及び定量化可能である。
【００２１】
本明細書で提示されるシステムは、標的の検出のために使用される。本開示との関係で用いられる場合、「標的」は、分析される試料内に存在することが疑われ、（ある実施形態では特異的に）巨大分子化合物またはシグナルオリゴヌクレオチドに結合することが可能な、任意の対象の分子であってよい。本開示との関係においては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という表現とは、核酸、タンパク質、及び他の生体分子を含み得る分子の不均一集団の存在下または不在下における、構成要素の存在を決定するような方法での２つの構成要素の相互作用を意味する。例えば、指定条件下において、標的は特定巨大分子化合物に結合し、試料内の他の分子には有意に結合しない。幾つかの実施形態では（標的が巨大分子化合物と考えられる場合）、標的のシグナルオリゴヌクレオチドへの「特異的結合」は、基質表面での立体障害をもたらし、最終的に検出可能なシグナル、またはシグナル中での検出可能な変化を生み出す。他の実施形態では、巨大分子化合物の標的への「特異的結合」は、基質表面での立体障害を抑制し、最終的に検出可能なシグナル、またはシグナル中での検出可能な変化を生み出す。
【００２２】
本システムの一実施形態を図１Ａに示す。本実施形態では、本システムは標的抗体の存在を検出し、最終的には定量化するように設計された。本実施形態では、標的は巨大分子化合物であり、シグナルオリゴヌクレオチドと結合することが可能である（なぜなら、シグナルオリゴヌクレオチドは、抗体により、巨大分子化合物と結合するための部位として認識されるエピトープを含有するからである）。当業者は、巨大分子化合物であり、（同一または異なる部位を介して）シグナルオリゴヌクレオチドに結合可能な他の標的が、本システムの本実施形態により検出可能であることを理解するであろう。図１Ａに示すシステムにおいて、基質（例えば金電極）０１０が提供され、これは表面に複数のアンカーオリゴヌクレオチド０２０を有する。アンカーオリゴヌクレオチド０２０は全て同一の核酸配列を有し、基質０１０上の複数の別の位置に配置される。アンカーオリゴヌクレオチド０２０は、その末端の一方（幾つかの実施形態において、その第１端）を介して基質０１０の表面に会合しているが、他端は基質０１０の表面に直接会合していない（例えば、「遊離」端と考えられる）。本システムのシグナルオリゴヌクレオチド０３０は、３つの異なるセグメント：アンカーオリゴヌクレオチド０２０とハイブリダイゼーション可能な核酸分子０３２、巨大分子と結合するための部位０３１（□、小さな認識用成分または巨大分子化合物と結合するための部位とも称される）、及びレポーターとして作用する部位０３３（●、幾つかの実施形態ではレドックス標識またはレポーター部位と称される）を有する（本実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドは単一分子であり、そのセグメントは互いに便利に共通結合している）。シグナルオリゴヌクレオチド０３０の核酸分子０３２は全て同一の核酸配列を有し、アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能である。抗体標識０４０の不在下において（上面）、シグナルオリゴヌクレオチド０３０はアンカーオリゴヌクレオチド０２０と自由に相互作用し、基質０１０の表面に複数の核酸二重鎖０５０を生成する。シグナルオリゴヌクレオチドは、二本鎖０５０の形成時に、レポーター部位０３３が基質表面０１０の近傍に位置するように設計される。そのために、シグナル（例えば電気化学シグナル（例えば電流））が二本鎖０５０の形成時に生成される。他方、抗体標識０４０の存在下において（下面）、シグナルオリゴヌクレオチド０３０は標的と複合体０５５を形成し、アンカーオリゴヌクレオチド０２０と相互作用して、基質０１０の表面に複数の複合体０６０を形成する。複合体０６０は、アンカーオリゴヌクレオチド０２０、（アンカーオリゴヌクレオチドと塩基対形成している）シグナルオリゴヌクレオチド０３０、及び標的巨大分子抗体０４０を含有する。基質０１０の表面に複合体０６０が存在することでシグナル（例えば電気化学シグナル（例えば電流））の生成が可能となるが、基質０１０の表面において、隣接位置０１１において別の複合体０６０の形成を防止する。そのために、かかる実施形態において、標的抗体の存在下において、より少量のシグナルが基質から生成され、このシグナルの低下が、試験される試料における標的抗体の検出、及び所望により定量化を可能にする（図１Ｂを参照）。
【００２３】
図１に示す実施形態において、標的は、アンカーオリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドと複合体を形成する場合、基質表面の隣接位置において立体障害を生み出すことが可能であり、シグナルオリゴヌクレオチドの一端に位置する部位と特異的に結合することもまた可能である。一実施形態において、標的は、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａ、または少なくとも１００ｋＤａの平均分子量を有することができる。標的は抗体（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ）、一本鎖抗体、または抗体断片（例えばＦａｂ’断片）であることができる。標的は、細胞（例えば真核細胞（例えば免疫細胞）、もしくは原核細胞（例えば細菌））、または細胞断片（例えば赤血球もしくは血小板等）とすることができる。標的は、病原菌、例えば原核細胞（例えば細菌）、真菌細胞（例えば酵母菌もしくはカビ）、ウイルスまたはプリオン等とすることができる。標的はまた、ポリマー分子（例えばポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ（ｃＤＮＡ及びＤＮＡ断片を含む）ベース、並びにＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む）ベース、ポリペプチド分子、もしくは炭水化物（例えばレクチン））であることもできるし、またはモノマー分子（例えば脂質）であることができる。巨大分子がポリヌクレオチド分子である場合、巨大分子は少なくとも２０、３０、４０、５０、または少なくとも１００個の核酸塩基を含む。代表的なポリペプチド／タンパク質としては、抗体、細胞受容体、分泌ポリペプチド、免疫調節ポリペプチド（インターロイキン、インターフェロン）、ホルモン（例えば成長因子）、凝固因子、ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば転写因子）等が挙げられるが、これらに限定されない。標的は、単一分子、２つ以上の分子の組み合わせ（例えばグリコシル化抗体）、または２つ以上の分子の凝集とすることができる。標的は、天然分子または合成（例えば人工）分子とすることができる。
【００２４】
別の実施形態（例えば図１１〜１３で示したもの）では、標的そのものは、シグナルオリゴヌクレオチドの末端の一方に位置する部位と特異的に結合できないため、基質表面の隣接位置にて立体障害を生み出さない。かかる実施形態において、システムは、標的、及びシグナルオリゴヌクレオチドに結合可能な巨大分子化合物を更に含む。一実施形態において、巨大分子化合物は、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａ、または少なくとも１００ｋＤａの平均分子量を有する。巨大分子化合物は、抗体（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ）、一本鎖抗体、または抗体断片（例えばＦａｂ’断片）とすることができる。巨大分子化合物は、細胞（例えば真核細胞（例えば免疫細胞））、または細胞断片（例えば赤血球もしくは血小板等）とすることができる。巨大分子化合物は、病原菌、例えば原核細胞（例えば細菌）、真菌細胞（例えば酵母菌もしくはカビ）、ウイルスまたはプリオン等とすることができる。巨大分子化合物はまた、ポリマー分子（例えばポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ（ｃＤＮＡ及びＤＮＡ断片を含む）ベース、及びＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む）ベース、ポリペプチド分子もしくは炭水化物（例えばレクチン））であることもできるし、またはモノマー分子（例えば脂質）であることができる。巨大分子化合物がポリヌクレオチド分子である場合、巨大分子化合物は少なくとも２０、３０、４０、５０、または少なくとも１００個の核酸塩基を含む。代表的なポリペプチドとしては、抗体、細胞受容体、分泌ポリペプチド、免疫調節ポリペプチド（インターロイキン、インターフェロン）、ホルモン（例えば成長因子）、凝固因子、ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば転写因子）等が挙げられるが、これらに限定されない。巨大分子化合物は、単一分子、２つ以上の分子の組み合わせ（例えばグリコシル化抗体）、または２つ以上の分子の凝集とすることができる。標的は、天然分子または合成（例えば人工）分子とすることができる。
【００２５】
図１１に示す実施形態において、標的は小分子とすることができる。本開示との関係においては、小分子は、シグナルオリゴヌクレオチドに結合して隣接位置において立体障害を生み出すことができなくなった巨大分子化合物（及び例えば抗体、レクチン、またはアプタマー）に結合する。本システムのかかる実施形態において、小分子はシグナルオリゴヌクレオチドの末端の一方に結合することができる。本システムの別の実施形態において、巨大分子化合物と結合するための部位は標的そのものではないが、標的そのものよりも親和性が低いが巨大分子化合物に結合可能な、別の部位である。かかる実施形態では、その部位は、１０ｋＤａ未満、５ｋＤａ未満、４ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、２ｋＤａ未満、または１ｋＤａ未満の平均分子量を有する。部位はまた、ポリマー分子（例えばポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ（ｃＤＮＡ及びＤＮＡ断片を含む）並びにＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む）ベース、ペプチド分子、もしくは炭水化物）であることもできるし、またはモノマー分子（例えば脂質）であることができる。部位がポリヌクレオチドである場合、５０個以下の核酸塩基を含む。部位がペプチドである場合、７０個以下のアミノ酸残基を含む。部位が小分子標的である場合、例えば、天然分子または合成（例えば人工）分子、例えば薬剤、代謝産物、汚染物質、金属等とすることができる。  
【００２６】
上で示した通り、標的が巨大分子化合物ではないか、またはシグナルオリゴヌクレオチドに結合不可能であり、かつ検出される場合、本システムは更に、分析される試料に付加された巨大分子化合物を含む。この巨大分子化合物（例えば抗体）は、標的に特異的に結合することができる。シグナルオリゴヌクレオチドは、標的の不在下においてのみ、巨大分子化合物と特異的に結合することができるように構成される。したがって、標的の存在下において、巨大分子化合物は好ましくは標的に結合し、シグナルオリゴヌクレオチドに結合せず、後者はアンカーオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのために利用可能である。しかし、標的の不在下において、巨大分子化合物はシグナルオリゴヌクレオチドと結合し、基質表面にて立体障害を生み出す。幾つかの実施形態では、アッセイの検出の限界を改善するために、巨大分子化合物が、巨大分子化合物と結合するための部位よりも遊離小分子標的に一層親和性を示すことが重要であり得る。
【００２７】
本システムの別の実施形態を図１２に示す。本実施形態では、本システムは、（１種以上の抗生物質に耐性を有することができるか、または食物もしくは水中に存在することができる）標的細菌の存在を検出し、最終的に定量化するように設計された。標的細菌は巨大分子であると考えられてはいるものの、シグナルオリゴヌクレオチドに結合可能でないため、更なる巨大分子化合物（細菌に対して特異的な抗体）を使用する。図１２に示す実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドは、抗体により巨大分子化合物と結合するための部位として認識されるエピトープを有する。当業者は、巨大分子と考えられ得る、または考えられ得ない他の標的（例えばウイルス、代謝産物、薬剤等）を、本システムの本実施形態により検出することができることを理解するであろう。図１２に示すシステムにおいて、基質（例えば金電極）０１０が提供され、これは表面に複数のアンカーオリゴヌクレオチド０２０を有する。アンカーオリゴヌクレオチド０２０は全て同一の核酸配列を有し、基質０１０上の複数の別の位置に配置される。アンカーオリゴヌクレオチド０２０は、その末端の一方（幾つかの実施形態では、第１端）を介して基質０１０の表面に結合するが、他端は基質０１０の表面に直接会合していない（例えば、「遊離」端と考えられる）。シグナルオリゴヌクレオチド０３０は３つの異なる部位：アンカーオリゴヌクレオチド０２０とハイブリダイゼーション可能な核酸分子０３２、抗体と結合するための部位０３１（Ｘは、本実施形態において、抗体により特異的に認識され、標的細菌上に存在するエピトープである）、及びレポーターとして作用する部位０３３（●、幾つかの実施形態ではレドックス標識と称される）を有する（本実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドは単一分子であり、その元素は互いに便利に共有結合している）。シグナルオリゴヌクレオチド０３０の核酸分子０３２は全て、同一の核酸配列を有する。標的細菌０７０の存在下において（上面）、抗体０４０は細菌０７０と特異的に結合し、抗体細菌複合体０８０を形成する。抗体細菌複合体の形成は、シグナルオリゴヌクレオチド０３０が、基質０１０の個々の位置においてアンカーオリゴヌクレオチド０２０と自由に相互作用し、基質０１０の表面に複数の二本鎖０５０を生成することを可能にする。シグナルオリゴヌクレオチドは、二本鎖０５０の形成時に、レポーター部位０３３が基質表面０１０の近傍に位置するように設計される。そのために、シグナル（例えば電気化学シグナル（例えば電流））が二本鎖０５０の形成時に生成される。標的細菌０７０の不在下において（下面）、シグナルオリゴヌクレオチド０３０が抗体０４０と会合して複合体０５５を形成し、アンカーオリゴヌクレオチド０２０と相互作用して、基質０１０の表面に複数の複合体０６０を生成する。複合体０６０は、アンカーオリゴヌクレオチド０２０、（アンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションされた）シグナルオリゴヌクレオチド０３０、及び抗体０４０を含有する。基質０１０の表面に複合体０６０が存在することで、シグナル（例えば電気化学シグナル（例えば電流））の生成が可能となるが、基質０１０の表面の隣接位置０１１において、別の核酸複合体０６０の形成を防止する。そのため、かかる実施形態において、標的細菌の不在下において、より少ないシグナルが生成され、このシグナルの低下が、試験される試料における標的細菌の検出及び所望により定量化を可能にする（図の下面左のパネルを参照）。図１２に図示した実施形態において、システムは、ポテンショスタット１１０を介してコンピュータ１００に取り付けられた、安価なポータブルセンサー０９０（多重センサーとすることができる）として設計されることができる。図１２に示す実施形態において、システムはセンサー０９０内に位置することができる。食品試料、または食品試料の細菌培養液１２０をセンサー０９０と接触させて配置し、標的細菌の有無を測定することができる。センサー０９０を、ポテンショスタット１１０を介してコンピュータ１００に結合することができる。
【００２８】
本明細書においては、シグナルオリゴヌクレオチドに結合できない標的を検出するための、アプタマーの巨大分子化合物としての使用もまた企図する。かかる実施形態の図を図１３に提供する。この図において、シグナルオリゴヌクレオチドは、巨大分子化合物と結合するための部位０３３としての核酸配列（アプタマー結合配列）を有する。図１３に示す実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドはＤＮＡから作製される。アプタマー結合配列は、アプタマーに特異的に結合するのには十分に長く（少なくとも５、６、７、８、または９ヌクレオチド長）、かつ、シグナルオリゴヌクレオチドがその標的に結合する際、アプタマーがこのシグナルオリゴヌクレオチドから解離することを可能にするために十分に短い（最大２０、１９、１８、１７、１６、または１５ヌクレオチド長）。標的の存在下において（図１３Ａ、上）、アプタマーは標的に優先的に結合し、これにより、シグナルオリゴヌクレオチドを分離し、シグナルオリゴヌクレオチドは次いで、種々の隣接する位置においてアンカーオリゴヌクレオチドと自由に相互作用し、シグナルを生成する（図１３Ｂ、破線）。標的の不在下において（図１３Ａ、下）、基質表面において、アプタマーの存在により引き起こされる立体障害のために、標的の存在下よりも密度が低いにも関わらず、アプタマーは、アンカーオリゴヌクレオチドとも会合可能であるシグナルオリゴヌクレオチドと会合したままである。このことは、標的が存在する場合よりも大幅に低いシグナルを生成する（図１３Ｂ、通常線）。
【００２９】
本開示との関係においては、アプタマーは、シグナルオリゴヌクレオチドを介してアンカーオリゴヌクレオチドと会合する場合、基質表面にて立体障害を生み出すことができなくてはならない。アプタマーは通常、２０〜９０核酸長である。アプタマーの長さ、または三次元構造が基質表面に十分な立体障害を生み出さない場合、これに加えて、アプタマーを改変して、シグナルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関与しない、または標的への結合に関与しない、追加の核酸塩基を含むことが企図される。例えば、ポリＴ尾部を、アプタマーの３’末端または５’末端のいずれかに付加し、アプタマーのサイズを増加させる（そして、最終的に基質表面にて障害を生み出すことができるアプタマーの能力を増加させる）ことができる。
【００３０】
依然として、本開示との関係においては、アプタマーはシグナルオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーション可能でなければならない。アプタマーがシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションできない場合、これに加えて、アプタマーを改変して、標的への結合によるハイブリダイゼーションに関与しない追加の核酸塩基（３’末端または５’末端のいずれかにおいて）を含むことが企図される。
【００３１】
ある種の実施形態において、本明細書で記載される検出システムは、試料内における標的のナノモルまたはピコモル濃度を特異的に識別することができる。幾つかの実施形態では、本システムは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、または８０のダイナミックレンジを有する。例えば、シグナルオリゴヌクレオチドが単一分子であり、１００ｎＭの濃度で用いられる実施形態において、本システムは、１ｎＭ〜１μＭ、例えば、１ｎＭ〜５００ｎＭを含む１ｎＭ〜７５０ｎＭ、または１ｎＭ〜２５０ｎＭ、例えば１ｎＭ〜１００ｎＭまたは２ｎＭ〜１６０ｎＭの範囲の濃度を有する標的を検出することができる。
【００３２】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度、及び密度、並びに特にアンカーオリゴヌクレオチドの密度を動的に調節して、標的／巨大分子化合物のサイズ、及び基質のサイズを考慮に入れて標的を検出することができる。例えば、（１０〜１５ｎｍ、例えば１２ｎｍの平均サイズを有する）抗体を、標的または巨大分子化合物として使用する場合、アンカーオリゴヌクレオチドは、約３〜５ｎｍまたは４〜５ｎｍ離れた、約２〜５ｎｍで離間した別の位置にアンカリングされることができる。一実施形態において、抗体を標的または巨大分子化合物として使用する場合、アンカーオリゴヌクレオチドは、約４ｎｍ離間した別の位置にてアンカリングされることができる。一実施形態において、（巨大分子化合物の不在下において）ハイブリダイゼーションされたシグナリングとアンカーオリゴヌクレオチドとの複合体は、約２ｎｍの平均直径を有する複合体を形成する。かかる実施形態において、アンカーオリゴヌクレオチドの間隔は少なくとも２ｎｍであり、幾つかの実施形態においては少なくとも約３ｎｍである。幾つかの実施形態では、基質表面でのアンカーオリゴヌクレオチドの間隔は、約２ｎｍ〜約３ｎｍである。
【００３３】
ある種の実施形態において、アンカーオリゴヌクレオチドの表面密度（即ち、基質表面の単位面積あたりの、アンカーオリゴヌクレオチドのモル数、Ｎtot）は、以前に確立された、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）及びＩｄｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に記載されている、ピーク電流との関係：
2017513026.tif 000003
を用いて決定することができる。ここで、Ｉpeak（Ｅ0）はボルタモグラムにおける平均ＡＣピーク電流、ｎはレドックスの実施あたりで移動する電子の数（我々のＭＢ標識ではｎ＝２）、Ｆはファラデー電流、Ｒは一般気体定数、Ｔは温度、Ｅacは振幅、及び、ｆは印加電圧摂動の頻度である。一実施形態において、各アンカーオリゴヌクレオチドはシグナルオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーション可能であり、かつ、電子移動は、（オリゴヌクレオチドが結合した各レポーター部位にて完全な電子移動を仮定すれば）シグナルオリゴヌクレオチドの結合の際にレポーター部位と基質表面との間のみで発生すると推定された。Ｎtotを基質の幾何表面積で除することにより、アンカーオリゴヌクレオチドの表面密度（モル／ｃｍ2）が得られた。基質表面に会合した各オリゴヌクレオチド周辺の円面積を考慮すると、この面積は、密度（オリゴヌクレオチド／ｃｍ2）の値の逆数を取ることで推定され、結果的に、距離はその後、この円面積の直径から計算された。
【００３４】
本明細書で記載される検出システムの構成要素の１つは、アンカーオリゴヌクレオチドである。本明細書で記載される検出システムにおいて、アンカーオリゴヌクレオチドは、基質上の少なくとも２つの隣接位置において、基質表面付近にシグナルオリゴヌクレオチドを配置することができる。依然として、本明細書で記載される検出システムにおいて、アンカーオリゴヌクレオチドは溶液中で自由に拡散せず、基質表面に会合する（かつ、ある実施形態においては共有結合する）。
【００３５】
本開示との関係においては、アンカーオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドであり、好ましくは単一オリゴヌクレオチド化して線状であり、末端の一方（「第１」端と称される）にて基質表面に会合している。アンカーオリゴヌクレオチドは、アンカーヌクレオチドの５’または３’核酸末端に隣接する５つの核酸塩基内に好ましくは位置する、末端核酸塩基（例えば核酸の５’もしくは３’核酸末端）または内部核酸塩基のいずれかを介して基質表面に会合していることが企図される。一実施形態において、アンカーオリゴヌクレオチドはその第１端を介して、基質表面に共有結合している。アンカーオリゴヌクレオチドは基質表面に直接会合することができるか、あるいはリンカーの使用によって基質表面に会合することができる。アンカーオリゴヌクレオチドの他端（「第２」端と称される）は、基質表面に直接結合していないため「遊離」していると考えられる。アンカーオリゴヌクレオチドは、領域（「相補領域」と称される）が露出し、シグナルオリゴヌクレオチドと自由にハイブリダイゼーションするように構成される。
【００３６】
本システムの一実施形態において（図１４に示すもの等）、アンカーオリゴヌクレオチドの一部が、巨大分子化合物と結合するための部位に（その「自由」端を介して）会合することができる。標的が巨大分子化合物であり、標的の不在下／存在下において、ゲインを増幅する必要がある場合に、本実施形態は特に有用である。図１４に示す実施形態において、本システムのアンカーオリゴヌクレオチドの５０％が、その「自由」端にて巨大分子化合物と結合するための部位（Ｘ）を有するが、アンカーオリゴヌクレオチドの他の５０％はこの部位を有しない。標的の不在下において（上）、センサー表面に生み出される立体障害が存在しないため、アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドは、複数の隣接位置にて相互作用することができる。標的の存在下において（下）、巨大分子化合物の幾つかはアンカーオリゴヌクレオチドと会合し、センサー表面に立体障害の「膜」を生成する。他の分子化合物はシグナルオリゴヌクレオチドと会合し、結果的にセンサー表面に複合体を形成し、シグナルを提供することができる。本システムの本実施形態では、アンカーオリゴヌクレオチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％が、巨大分子化合物と結合するための部位を有することができる。また、本システムの別の実施形態において、アンカーオリゴヌクレオチドの９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０％以下が巨大分子化合物と結合するための部位を有することができる。
【００３７】
アンカーオリゴヌクレオチドがリンカーを介して基質表面に間接的に会合している、本システムの実施形態においては、リンカーは、アンカーオリゴヌクレオチドのシグナルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、基質表面に近いシグナルオリゴヌクレオチドのレポーター部位の位置決定を可能にする任意のリンカーであることができることが企図されている。一実施形態において、リンカー部位は１〜２５個の炭素原子、例えば５〜１５個の炭素原子を含む２〜２０個の炭素原子を含んでよい。リンカーの代表的実施形態としては、アルキル、好ましくは低級直鎖アルキル（例えばＣ1〜Ｃ10）、及び更により好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキルが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、リンカーはＣ6直鎖アルキルである。
【００３８】
アンカーオリゴヌクレオチドは、既知の天然または合成核酸塩基の任意の組み合わせで構成され、その骨格は天然骨格から改変することができる。天然オリゴヌクレオチドはリン酸ジエステル結合を含有し、核酸類似体を含む合成オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホラミド、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホラミダイト結合、並びにペプチド核酸骨格及び結合を含む代替の骨格を有してもよい。他の類似体核酸類似体としては、正骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）、非イオン性骨格、及び非リボース骨格を有するものが挙げられる。１種以上の炭素環式糖類を含有する核酸塩基もまた、企図される核酸塩基の定義に含まれる。
【００３９】
アンカーオリゴヌクレオチドは通常、１０〜３０個の核酸塩基の全長を有する。アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドとの十分良好な親和性（例えば少なくとも１０ｎＭのＫD）を達成するために、アンカーオリゴヌクレオチドの長さ並びに組成（ＧＣ及びＡＴ含量）を設計する。アンカーオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の核酸塩基の全長、及び／または３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０個以下の核酸塩基の全長を有する。アンカーオリゴヌクレオチドはまた、シグナルオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションするように設計された領域（相補領域と称される）も含む。相補領域は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７個の連続核酸塩基長、及び／または１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０個以下の連続核酸塩基長である。アンカーオリゴヌクレオチドの相補領域、及び対応するシグナルオリゴヌクレオチドの相補領域の同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一実施形態では、アンカーオリゴヌクレオチドの全長が、対応するシグナルオリゴヌクレオチドの相補領域に相補的である。別の実施形態において、アンカーオリゴヌクレオチドは、シグナルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関与しない追加の核酸塩基を含む（相補領域に対して３’及び／または５’に位置する）。
【００４０】
本明細書で記載される検出システムの別の構成要素は基質である。本開示との関係においては、基質は、少なくとも２個のアンカーオリゴヌクレオチドと会合するための表面を提供し、アンカーオリゴヌクレオチドが溶液／懸濁液中に自由に拡散することを防止する。シグナルオリゴヌクレオチドのレポーター部位に極めて接近しているため、基質表面はまた、シグナルオリゴヌクレオチドのアンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、シグナルを生成、調節または実行可能でもある。例えば、基質表面は蛍光性のものであることができ、シグナルオリゴヌクレオチドのレポーター部位は、基質表面に関係する蛍光を制限可能な消光部位であることができる。かかる実施形態において、アンカーオリゴヌクレオチドのシグナルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、消光部位は蛍光性基質表面に近接近し、検出及び定量化可能な蛍光制御（例えば減少）を生成する。別の例において、基質は金属電極（金電極等）であり、レポーター部位はレドックスレポーター（例えばメチレンブルー）である。かかる例において、アンカーオリゴヌクレオチドのシグナルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、レドックス部位は金電極と近接近し、検出及び所望により定量化される電流の制御を行う。
【００４１】
アンカーオリゴヌクレオチドは種々の別の位置において、基質表面で会合する。第１の隣接位置において、アンカーオリゴヌクレオチド、シグナルオリゴヌクレオチド、及び（標的であることができる）巨大分子化合物間で複合体が形成される場合、アンカーオリゴヌクレオチドは、基質上の２つの隣接位置間でのハイブリダイゼーションを防止する密度で基質表面に構成される。アンカーオリゴヌクレオチドの最適密度は、検出される標的のサイズ、巨大分子化合物のサイズ、及び／またはシグナルオリゴヌクレオチド上の巨大分子化合物と結合するための部位のサイズに合わせることができることが理解されよう。アンカーオリゴヌクレオチドの最適密度は、例えば、アンカーオリゴヌクレオチドの殆どまたは全てが、シグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能となるのに十分なだけの間隔を提供しなければならない。幾つかの実施形態で用いられるアンカーオリゴヌクレオチドの密度は例えば、１０11個の分子／ｃｍ2より大きいことが可能である（または、１０ｎｍより小さい平均間隔を示すことができる）。更に別の実施形態において、基質表面におけるアンカーオリゴヌクレオチドの密度は、１０12個の分子／ｃｍ2以上（例えば、５ｎｍの平均間隔を作る１．４×１０12個の分子／ｃｍ2）である。この最適密度は、用いられる巨大分子結合部位が大きくなる（例えば最大５ｋＤａとなる）と、低下し得る。アッセイで満足のいく結果を得るために、アンカーオリゴヌクレオチド間の平均は、巨大分子の平均分子サイズよりも小さいまま（全血中に存在する抗体の場合、１２ｎｍ未満）でなくてはならない。別の実施形態において、標的が小分子である場合、基質表面のアンカーオリゴヌクレオチドの密度は、シグナルオリゴヌクレオチドが依然としてアンカーオリゴヌクレオチドの大部分とハイブリダイゼーション可能である限り、より高くする（５ｎｍ未満の間隔とする）ことができる。
【００４２】
本明細書で記載される基質は「アレイ」であることができ、この用語は、会合するアンカーオリゴヌクレオチドを有する指定可能な領域の、任意の一次、二次または実質的に二次（及び三次）配置を含む。幾つかの実施形態では、アレイは三次的、例えばナノ粒子等（金ナノ粒子または蛍光ナノ粒子等）であることができる。基質は略平面状であるか、または球状をとることができる。「指定可能なアレイ」には、会合した特定のアンカーオリゴヌクレオチドを有し、基質上の特定の所定の位置に配置される個々の領域の、任意の一次配置または二次配置を含む（かかる各位置は既知の「アドレス」にある）。これらの領域は介在空間によって分離されても、またはされていなくてもよい。任意の所与の基質は、基質の前面に配置された１つ、２つ、４つまたはそれ以上のアレイを有してよい。その使用に応じて、アレイのいずれかまたは全ては互いに同一でも、または異なっていてもよく、それぞれが複数のスポットまたはフィーチャーを含んでよい。典型的なアレイは、２０ｃｍ2未満、例えば１０ｃｍ2未満の面積に、１０を超える、１００を超える、１０００を超える、１万を超えるフィーチャー、あるいは１０万を超えるフィーチャーを含有してよい。例えば、フィーチャーは１０μｍ〜１．０ｃｍの範囲の幅（即ち、円形スポットの直径）を有してよい。他の実施形態では、各フィーチャーは、１．０μｍ〜１．０ｍｍ、例えば１０μｍ〜２００μｍを含む、５．０μｍ〜５００μｍの範囲の幅を有してよい。非円形のフィーチャーは、前述の幅（直径）範囲を有する円形フィーチャーの範囲に等しい面積範囲を有してよい。
【００４３】
システムの第３の構成要素は、シグナルオリゴヌクレオチドである。本明細書で記載される検出システムにおいて、シグナルオリゴヌクレオチドは、シグナルオリゴヌクレオチドのレポーター部位が基質表面近傍に位置する場合、標的または巨大分子化合物への特異的結合が可能であり、かつシグナルを調節可能であるという２つの役割を有する。
【００４４】
一実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドは、（互いに共有結合可能な）標的結合部位及びレポーター部位の両方を含む単一の線状オリゴヌクレオチドである。かかる実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドは３つの下位構成要素：（アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのための相補領域を含む）コアオリゴヌクレオチド、巨大分子化合物と結合するための部位、及びレポーター部位を含む。上記の標的／巨大分子化合物への特異的結合は、巨大分子化合物と結合するための部位をシグナルオリゴヌクレオチドの一端にて（好ましくは共有結合により）会合させることにより、達成される。上記シグナルを調節する能力は、レポーター部位をシグナルオリゴヌクレオチドの他端にて（好ましくは共有結合により）会合することで得られる。シグナルオリゴヌクレオチドは、一本鎖及び線状オリゴヌクレオチドであるのが好ましい。依然として、本明細書で記載される検出システムとの関係においては、シグナルオリゴヌクレオチドは溶液中で拡散する能力を有し、必ずしも基質表面に会合する必要はないが、それでもアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能である。
【００４５】
別の実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドはモジュラーであり、少なくとも２つの異なる成分：（巨大分子化合物と結合するための部位を含む）第１のシグナルオリゴヌクレオチド成分、並びに（（上述した、アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのための相補領域を含む）コア領域、及びレポーター部位を含む）第２のシグナルオリゴヌクレオチドの組み合わせを含む。本実施形態は便利なことに、レポーター部位、及び巨大分子化合物と結合するための部位を単一のオリゴヌクレオチドに会合させる必要なく、種々のシグナルオリゴヌクレオチドの設計を可能にする。
【００４６】
かかるモジュラーシグナルオリゴヌクレオチドの実施形態は、図１０Ａ３及びＡ４に示されている。上で示した通り、モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドは、アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのための第１の相補領域１５０を含む第１のオリゴヌクレオチド（アダプター成分）、及び、モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドの第２成分とのハイブリダイゼーションのための第２の相補領域１６０を含む。図１０に示す実施形態において、アダプター成分はＤＮＡから作製される。アダプター成分は、その末端の一方または一方付近において、レポーター部位０３３（本実施形態ではＭＢ、即ちメチレンブルー）と会合する。アダプター成分は、アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、アダプター成分のレポーター部位が基質表面近傍（アンカーオリゴヌクレオチドの第１端付近）に位置するように配置されるように構成される。モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドはまた、標識成分１７０も含む。図１０に示す実施形態において、標識成分はＰＮＡで作製される。シグナル成分１７０はまた、モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドの第１のアダプター成分とのハイブリダイゼーションのための、第３の相補領域も有する。シグナル成分はまた、巨大分子化合物と結合するための部位（例えば、本実施形態においては４Ｅ１０ペプチド）も含む。巨大分子化合物と結合するための部位は、内部（図１０Ａ３に示すように、第１のアダプター成分のコア領域１５０と相補領域１６０との接点付近）に位置するか、または外部（図１０Ａ４に示すように、第１成分の自由末端付近）に位置するかのいずれかであることができる。一実施形態において、巨大分子化合物と結合するための部位は内部に位置している。
【００４７】
モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドのアダプター成分は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個の核酸塩基の全長、及び／または４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１もしくは２０個以下の核酸塩基の全長を有することができる。アダプター成分は、アンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションするために設計された領域（第１の相補領域と称される）も含む。第１の相補領域は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個、及び／または２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０個以下の連続した核酸塩基長である。アダプター成分の第１の相補領域とアンカーオリゴヌクレオチドの対応する相補領域の同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一実施形態では、第１の相補領域の全長が、アンカーオリゴヌクレオチドの対応する相補領域とハイブリダイゼーションする。アダプター成分は、標識成分にハイブリダイゼーションするように設計された領域（第２の相補領域と称される）も含む。第２の相補領域は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個、及び／または２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０個以下の連続した核酸塩基長である。アダプター成分の第２の相補領域と標識成分の対応する相補領域の同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一実施形態では、第２の相補領域の全長が、標識オリゴヌクレオチドの対応する相補領域とハイブリダイゼーションする。別の実施形態において、アダプター成分オリゴヌクレオチドは、アンカーオリゴヌクレオチドと、または第２の標識成分とのハイブリダイゼーションに関与しない、更なる核酸塩基を含む（第１の相補領域に対して３’及び／または５’に位置する）。
【００４８】
モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドの標識成分は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の核酸塩基の全長、及び／または３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９もしくは８個以下の核酸塩基の全長を有することができる。標識成分は、アダプター成分オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションするように設計された領域（第３の相補領域と称される）も含む。第３の相補領域は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個、及び／または２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０個以下の連続した核酸塩基長である。アダプター成分の第３の相補領域と第２の相補領域の同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一実施形態では、第３の相補領域の全長が、アダプター成分の第２の相補領域とハイブリダイゼーションする。別の実施形態において、標識成分は、アダプター成分の第２の相補領域とのハイブリダイゼーションに関与しない、更なる核酸塩基を含む（第３の相補領域に対して３’及び／または５’に位置する）。
【００４９】
本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドのコア及び相補領域は、既知の天然または合成核酸塩基の任意の組み合わせで構成され、その骨格は天然骨格から改変することができる。天然オリゴヌクレオチドはリン酸ジエステル結合を含有し、核酸類似体を含む合成オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホラミド、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホラミダイト結合、並びにペプチド核酸骨格及び結合を含む代替の骨格を有してもよい。他の類似体核酸類似体としては、正骨格、非イオン性骨格、及び非リボース骨格を有するものが挙げられる。１種以上の炭素環式糖類を含有する核酸塩基もまた、企図される核酸塩基の定義に含まれる。
【００５０】
シグナルオリゴヌクレオチドのコア及び相補領域は通常、１０〜４０個の核酸塩基の全長を有する。アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドとの、または第１シグナルオリゴヌクレオチドと第２シグナルオリゴヌクレオチドとの十分に良好な親和性（例えば、少なくとも１０ｎＭのＫD）を達成するために、シグナルオリゴヌクレオチドのコア領域の長さ及び組成（ＧＣ及びＡＴ含量）を設計する。シグナルオリゴヌクレオチドが単一分子である場合、シグナルオリゴヌクレオチドのコア／相補領域は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の核酸塩基の全長、及び／または３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０個以下の核酸塩基の全長を有することができる。シグナルオリゴヌクレオチドのコアオリゴヌクレオチド領域はまた、アンカーオリゴヌクレオチド、または第１のシグナルオリゴヌクレオチド（相補領域と称される）にハイブリダイゼーションするように設計された小領域も含む。シグナルオリゴヌクレオチドの相補領域は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７個の連続核酸塩基長、及び／または１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０個以下の連続核酸塩基長である。シグナルオリゴヌクレオチドとアンカーオリゴヌクレオチドの相補領域の同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一実施形態では、シグナルオリゴヌクレオチドのコアオリゴヌクレオチド領域の全長は、アンカーオリゴヌクレオチドの対応する相補領域に相補的である。別の実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドのコア領域は、アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関与しない、更なる核酸塩基を含む（相補領域に関して３’及び／または５’に位置する）。
【００５１】
シグナルオリゴヌクレオチドの一端にて会合する巨大分子化合物と結合するための部位は、標的そのものまたは巨大分子化合物に結合可能な任意の化合物とすることができる。一実施形態において、各シグナルオリゴヌクレオチドは最大で１つ（例えば単一）の標的部位領域を有する。巨大分子化合物と結合するための部位としては、タンパク質、ペプチド（抗原及びエピトープを含む）、炭水化物、核酸、脂質、小分子等が挙げられるが、これらに限定されない。標的が抗体またはレクチンである実施形態においては、部位は、かかる抗体またはレクチンに特異的なエピトープであることができるか、これを含むことができる。部位はまた、アプタマー（例えば、ポリペプチドに結合可能な核酸ベースの配列）、更なるオリゴヌクレオチド部位（例えば、標的が相補的核酸ベースの分子である場合）、脂質（例えば、標的が脂質結合化合物である場合）等であることもできる。一実施形態において、部位は８〜２０個の核酸残基を有する核酸部位であることができる。別の実施形態において、部位は、２〜６０個のアミノ酸残基を有するグリコシル化または非グリコシル化ペプチドである。更に別の実施形態において、部位は、２〜３０個の炭水化物単位を有する多糖類とすることができる。
【００５２】
シグナルオリゴヌクレオチドは、末端核酸塩基（例えば、シグナルオリゴヌクレオチドの５’もしくは３’核酸末端）、または内部核酸塩基（好ましくは、シグナルオリゴヌクレオチドの５’もしくは３’核酸末端に隣接する５つの核酸塩基内に位置する）のいずれかにより巨大分子化合物と結合するための部位と会合していることが企図される。一実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドはその第１端を介して、巨大分子化合物と結合するための部位に共有結合している。シグナルオリゴヌクレオチドは部位に直接会合することができるか、あるいはリンカーの使用によって部位に会合することができる。シグナルオリゴヌクレオチドがリンカーを介して間接的に標的結合部位に会合している本システムの実施形態において、リンカーは、シグナルオリゴヌクレオチドが標的及びアンカーオリゴヌクレオチドに結合する際に、基質表面にて立体障害を生み出すことが可能な任意のリンカーとすることができることが企図される。一実施形態において、リンカー部位は１〜２５個の炭素原子、例えば５〜１５個の炭素原子を含む２〜２０個の炭素原子を含んでよい。一実施形態において、リンカーはアルキル、例えば直鎖低級アルキル（例えばＣ1〜Ｃ10低級アルキル）、及び好ましくはＣ3〜Ｃ6アルキルである。幾つかの実施形態では、リンカーはＣ6直鎖アルキルである。
【００５３】
シグナルオリゴヌクレオチドの他端に会合するレポーター部位領域（例えば、「第２」端とも称される、巨大分子化合物と結合するための部位に会合しないシグナルオリゴヌクレオチドの末端）は、基質表面と近くで会合する場合、シグナルを調節する任意の化合物であることができる。シグナルオリゴヌクレオチドは、アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの際に、レポーター部位が巨大分子化合物と結合するための部位よりも基質表面の近くに位置するように構成されることが重要である。例えば、アンカーヌクレオチドがその３’末端を介して基質表面に会合している場合、レポーター部位はシグナルオリゴヌクレオチドの５’末端に位置しなければならない（そして、その逆もまた同様である）。レポーター部位としては、フルオロフォア、消光剤、酵素、酵素活性剤、酵素阻害剤、レドックスレポーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
シグナルオリゴヌクレオチドは、末端核酸塩基（例えば、シグナルオリゴヌクレオチドの５’もしくは３’核酸末端）、または内部核酸塩基（好ましくは、シグナルオリゴヌクレオチドの５’もしくは３’核酸末端に隣接する５つの核酸塩基内に位置する）のいずれかによりレポーター部位に会合していると考えられている。一実施形態において、シグナルオリゴヌクレオチドはその第２端を介してレポーター部位に共有結合している。シグナルオリゴヌクレオチドはレポーター部位に直接会合することができるか、あるいはリンカーの使用によってレポーター部位に会合することができる。シグナルオリゴヌクレオチドがリンカーを介して間接的にレポーター部位に会合している本システムの実施形態において、アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションされる場合、リンカーは、基質表面近傍でのレポーター部位の配置を可能にする任意のリンカーとすることができることが企図される。一実施形態において、リンカー部位は１〜２５個の炭素原子、例えば５〜１５個の炭素原子を含む２〜２０個の炭素原子を含んでよい。一実施形態において、リンカーはアルキル、例えば直鎖低級アルキル（例えばＣ1〜Ｃ10低級アルキル）、及び好ましくはＣ3〜Ｃ6アルキルである。幾つかの実施形態では、リンカーはＣ6直鎖アルキルである。
【００５５】
基質は（例えば、単一のフルオロフォアまたは複数のフルオロフォアを含む）蛍光性基質であってよく、かつ、レポーター部位は対応する消光部位（または消光部位の組み合わせ）とすることができる。あるいは、レポーター部位は単一のフルオロフォア（またはフルオロフォアの組み合わせ）とすることができ、かつ、基質は（例えば、単一の消光剤または複数の消光剤を含む）対応する消光剤であってよい。これらの例において、標的の不在下において、シグナルオリゴヌクレオチドの大部分はアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションし、フルオロフォアが消光剤から保持される距離は、フルオロフォアから検出可能なシグナルを放出することを最小限に抑える、抑制する、または防止するのに十分である。あるいは、標的または巨大分子化合物の存在下において、より少量のシグナルオリゴヌクレオチドが基質表面に配置可能であり、フルオロフォアが検出可能なシグナルを放出することができる。「フルオロフォア」という用語とは、第１の波長のエネルギーを吸収し、異なる第２の波長にてエネルギーを再放出することができる任意の分子化合物を意味する。フルオロフォアは、当業者に既知であるように、合成されてもよいし、または天然の生物学的なものであってもよい。更に一般的には、アッセイ条件下にて安定しており、消光剤に極めて接近している場合に、フルオロフォアの蛍光強度の著しい変化が、プローブを特異的に結合する標的に対応して検出可能であるような、十分に抑制することが可能な任意のフルオロフォアを使用することができる。好適なフルオロフォアの例としては、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（ＦＲ６１０；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ローダミン及びローダミン誘導体、クマリン及びクマリン誘導体、シアニン及びシアニン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
「消光剤」という用語とは、フルオロフォアからの励起エネルギーを吸収し、そのエネルギーを熱として放散する物質を意味してよい。消光剤はまた、フルオロフォアからの励起エネルギーを吸収し、そのエネルギーを異なる波長で再放出される光として放散することもできる。消光剤は、消光剤がフルオロフォアに隣接して配置されるか、またはフルオロフォアに十分近い位置で配置される場合に、フルオロフォアの発光が抑制されるようにフルオロフォアと共に使用される。しかし、消光剤がフルオロフォアから離れて位置しているか、またはフルオロフォアから十分遠くの距離に位置している場合、フルオロフォアの発光は、フルオロフォアのシグナルが検出可能なように、抑制されない。あるいは、消光剤は、光電子の移動、共鳴エネルギーの移動、または他の消光メカニズムにより、フルオロフォアの発光を減少させる部位を含んでよい。消光剤は、共鳴エネルギーの移動が可能な第２のフルオロフォアにより、エキシマーもしくはエキシプレックスを形成可能な第２のフルオロフォアにより、または通常、第１のフルオロフォアの蛍光を調節する任意の他の基により置き換えられてもよい。消光剤は、当業者に既知であるように、合成されてもよいし、または天然の生物学的なものであってもよい。更に一般的には、アッセイ条件下にて安定しており、フルオロフォアに極めて接近している場合に、フルオロフォアの蛍光強度の著しい変化が、シグナルオリゴヌクレオチドを特異的に結合する標的／巨大分子化合物に対応して検出可能であるような、フルオロフォアの蛍光を十分に抑制することが可能な任意の消光剤を使用することができる。消光剤の例としては、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）、Ｄａｂｓｙｌ（ジメチルアミノアゾスルホン酸）、Ｑｘｌ消光剤（ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＦＱ、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＲＱ等が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、消光剤はまた蛍光性であり、第１のフルオロフォアに近接している場合に第２の波長にて発光をもたらしてもよい。かかるフルオロフォア／消光剤のペアの例としては、Ａｌｅｘａ４８８（商標）−Ａｌｅｘａ５５５（商標）、Ａｌｅｘａ４８８（商標）−Ｃｙ３（商標）、Ｃｙ３（商標）−Ｃｙ５（商標）が挙げられる。他の実施形態において、消光剤は第１のフルオロフォアとエキシマーまたはエキシプレックスを形成する第２のフルオロフォアであり、これらの分離の際に蛍光の変化をもたらす。例としては、フルオロフォアと消光剤が共にピレンである実施形態が挙げられる。
【００５７】
ある種の実施形態において、本開示の基質及びレポーター部位は、触媒活性を有する巨大分子を含む第１のシグナル伝達部位、及び触媒活性の阻害剤または活性剤を含む第２のシグナル伝達部位を含む。ある種の実施形態において、触媒巨大分子は、アンカーオリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドの相補ハイブリダイゼーションにより、阻害剤に極めて接近した（例えば阻害剤に隣接した）距離で保持される。
【００５８】
更に別の実施形態において、基質は金属電極（例えば金、銀、白金）または非金属電極（例えば炭素もしくはケイ素等）である。導電性物質及び半導体物質は金属または非金属であることができ、レポーター部位はレドックスレポーター（例えば、ビオロゲン、アントラキノン、エチジウムブロマイド、ダウノマイシン、メチレンブルー等の有機レドックス部位、及びこれらの誘導体、有機金属レドックス部位、例えばフェロセン、ルテニウム、ビスピリジン、トリスピリジン、ビスイミダゾール、及びこれらの誘導体、並びに生物学的レドックス部位、例えばシトクロムｃ、プラストシアニン、及びシトクロムｃ’）である。アンカーオリゴヌクレオチド、シグナルオリゴヌクレオチド及び巨大分子化合物間で複合体が形成されない場合、シグナルオリゴヌクレオチドはアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションし、レポーター部位は基質表面近くに配置されることで、電流を生み出す。アンカーオリゴヌクレオチド、シグナルオリゴヌクレオチド及び巨大分子化合物間で複合体が形成される場合、より少量のシグナルオリゴヌクレオチドがアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能となり、より少量のレポーター部位が基質表面に配置され、より少量の電流が生み出される。
【００５９】
多重検出（例えば２つ以上の種類の標的）が保証される実施形態においては、本システムは、検出される各種類の標的に関して、標的のそれぞれに特異的であるか、または標的の１つにも特異的に結合する巨大分子化合物と結合可能であるかのいずれかの部位を有するアンカーオリゴヌクレオチドと、対応するシグナルオリゴヌクレオチドとの特定の組み合わせを含むことができる。それぞれの組み合わせにおけるアンカー／シグナルオリゴヌクレオチドの核酸配列を変更して、それぞれの異なる標的に関して、アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドとの特異的結合を可能に／制限する。本多重システムの各組み合わせにおけるアンカーオリゴヌクレオチドは、異なる基質表面に、または基質表面の異なる既知の位置にて会合可能である。更に、基質表面にて立体障害を可能にするために、基質上におけるアンカーオリゴヌクレオチドの密度が、基質上の２つの隣接位置における、少なくとも１つのアンカーオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのシグナルオリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つの標的間での複合体の形成を防止または制限する。
【００６０】
多重システムの一実施形態を図９Ｂに示す。この図において、全血は１種または２種の異なる抗体でスパイクされ、３つのシステムが使用される。当業者は、血液以外の他の種類の試料をこの多重検出にかけることが可能であり、２つを超える異なる標的を多重検出により検出可能であることを理解するであろう。図９Ｂに示す実施形態において、複数のセンサー０９０が提供される。電極センサー０９０のそれぞれは、異なる種類のアンカーオリゴヌクレオチド（それぞれ０２３、０２５または０２６）とそれぞれ会合する、異なる基質（０１４、０１５または０１６）を含む。本開示との関係においては、「異なる」という用語とは、アンカーオリゴヌクレオチドの核酸配列が各センサーで異なっていることを意味する。単一のセンサーに存在するアンカーオリゴヌクレオチドは、同一の核酸配列を有する。言い換えれば、アンカーオリゴヌクレオチド０２４、０２５及び０２６（それぞれ基質０１４、０１５及び０１６と会合している）は異なる核酸配列を有し、これらはアンカーオリゴヌクレオチドが（それぞれ）シグナルオリゴヌクレオチド０３４、０３５及び０３６に特異的に結合することを可能にする。当然、シグナルオリゴヌクレオチド０３４、０３５及び０３６のそれぞれもまた、異なる核酸配列を有するということになる。シグナルオリゴヌクレオチド０３４、基質０１４及びアンカーオリゴヌクレオチド０２４は参照または対照電極センサーの一部であり、これらの存在は多重システム内では任意的である。シグナルオリゴヌクレオチド０３４はレポーター部位と一端にて会合しているが、巨大分子化合物／標的と結合するための任意の部位を欠いている。シグナルオリゴヌクレオチド０３５、基質０１５及びアンカーオリゴヌクレオチド０２５（合わせて「Ｄｉｇ電極」と称する）は、図９の実施形態において、第１の標的である抗ジゴキシゲニン抗体を検出する（及び所望により定量化する）ように設計されている。そのために、シグナルオリゴヌクレオチド０３５は、一端にシグナルオリゴヌクレオチドに結合したジゴキシゲニン部位を有し、他端にレポーター部位を有する。シグナルオリゴヌクレオチド０３６、基質０１６及びアンカーオリゴヌクレオチド０２６（合わせて「ＤＮＰ電極」と称する）は、第２の標的、即ち抗ＤＮＰ抗体を検出する（及び所望により定量化する）ように設計される。そのために、シグナルオリゴヌクレオチド０３６は、一端にシグナルオリゴヌクレオチドに結合したＤＮＰを有し、他端にレポーター部位を有する。
【００６１】
図９Ｂの上面に示すように、血液を抗ジゴキシゲニン抗体でスパイクした場合、参照電極（対照）及びＤＮＰ電極から強力なシグナルが提供される。これは、かかる電極では、抗ジゴキシゲニン抗体との複合体が基質表面に形成されないためである。しかし、Ｄｉｇ電極からのシグナルの低下が観察される。これは、抗ジゴキシゲニン抗体、シグナルオリゴヌクレオチド０３５、及びアンカーオリゴヌクレオチド０２５間で複合体が形成されることで、基質表面上に立体障害を引き起こすためである。
【００６２】
図９Ｂの中央のパネルに示すように、血液を抗ＤＮＰ抗体でスパイクした場合、参照電極（対照）及びＤｉｇ電極から強力なシグナルが提供される。これは、かかる電極では、基質表面にて抗ＤＮＰ抗体との複合体が形成されないためである。しかし、ＤＮＰ電極からのシグナルの低下が観察される。これは、抗ＤＮＰ抗体、シグナルオリゴヌクレオチド０３６及びアンカーオリゴヌクレオチド０２６間で複合体が形成されることで、基質表面上に立体障害を引き起こすためである。
【００６３】
下面にて示すように、血液が抗ジゴキシゲニン抗体及び抗ＤＮＰ抗体とスパイクされる場合、参照電極（対照）から強力なシグナルが提供される。これは、かかる電極において、基質表面にて抗ジゴキシゲニン抗体、または抗ＤＮＰ抗体との複合体が形成されないためである。しかし、Ｄｉｇ電極及びＤＮＰ電極からのシグナルの低下が観察される。これは、抗ジゴキシゲニン抗体、シグナルオリゴヌクレオチド０３５、及びアンカーオリゴヌクレオチド０２５間で、または抗ＤＮＰ抗体、シグナルオリゴヌクレオチド０３６及びアンカーオリゴヌクレオチド０２６間で複合体が形成されることで、基質表面で立体障害を引き起こすためである。
【００６４】
更なる実施形態において、対照システムを提供することが便利となり得る。本対照システムもまた、基質表面に適切な密度（本明細書で記載される検出または本明細書で記載される検出または多重システムに類似）にて会合したアンカーオリゴヌクレオチドを含むことができる。しかし、対照シグナルオリゴヌクレオチドは巨大分子化合物または標的と結合するための部位を含まない。しかし、対照シグナルオリゴヌクレオチドはその一端にレポーター部位を有する。かかる実施形態において、標的／巨大分子化合物により引き起こされる立体障害は生み出されないため、アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの量は、標的の存在下または不在下で異ならない。
【００６５】
本開示はまた、本明細書で記載される検出システム、多重システムまたは対照システムを含む、キット及び商用パッケージを提供する。キットは、提供される各基質用の反応容器（電極等）、検出を目的とする標的（複数可）を欠く既知の対照試料、検出を目的とする既知量の標的（複数可）を含有する対照試料、既知量の標的（複数可）の欠乏または存在と関係する対照値または一連の対照値、基質またはシグナルオリゴヌクレオチドを含有する溶液または懸濁液、及び、提供されるシステムに基づき、標的（複数可）の存在／量を測定する方法に関する取扱説明書、のいずれをも含むことができる。取扱説明書は種々の形態でキットに存在してよく、１種以上の取扱説明書がキットに存在してよい。これらの取扱説明書が存在し得る一形態は、好適な媒体または基質に印刷された情報（例えば、情報が印刷される一片または数片の紙）、キット内のパッケージ、添付文書等である。別の手段は、コンピュータで読取り可能な媒体、例えばフロッピーディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標）、コンピュータで読取り可能なメモリ等があり、これらでは情報が記録または保存される。存在し得る更に別の方法は、インターネットにより使用可能で、離れた場所にあるサイトの情報にアクセスするためのウェブアドレスである。
【００６６】
方法及び関連する用途
本開示はまた、試料内の１つの標的、または複数の標的を検出するための方法を提供する。本明細書記載の方法は、１つの標的または複数の標的の「シグナルオン」または「シグナルオフ」検出のために構成することが可能である。本方法はまた、１つの標的または複数の標的の量を定量化するためにも構成可能である。
【００６７】
本明細書に記載の方法はまず、１つの標的または複数の標的を有することが疑われる試料を提供することを含む。試料の実施形態は上述されており、ここで適用される。幾つかの実施形態においては、試料は、先に行う分画または増幅に通さずに使用する。他の実施形態において、試料を分画、希釈または増幅して、検出を目的とする１つの標的または複数の標的に関する試料を濃縮する。
【００６８】
試料（またはその希釈もしくは濃縮分画）が得られると、少なくとも１つのアンカーオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのシグナルオリゴヌクレオチド及び巨大分子化合物間での複合体の形成を可能にするための条件下にて本明細書で記載される検出システム（単一または多重）と接触させる。本明細書で開示される方法は、本明細書に規定されるアンカーオリゴヌクレオチド、シグナルオリゴヌクレオチド及び巨大分子化合物間での特異的結合を可能にする任意の反応媒体で実施してよい。試料が、シグナルオリゴヌクレオチドの標的結合部位に特異的に結合する巨大分子標的を含有する場合、アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションは、巨大分子標的により引き起こされる立体障害のために、制限または防止され得る。試料が標的を含有し、システムがシグナルオリゴヌクレオチドの部位に特異的に結合する更なる巨大分子化合物を含む場合、アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションは、（好ましくは認識標的と相互作用する）巨大分子化合物により引き起こされる立体障害により、制限または防止されない。
【００６９】
試料がシステム（または複数のシステム）と接触すると、本方法は、シグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたアンカーオリゴヌクレオチドの量を測定して、試験値または試験量を得ることを含む。シグナルオリゴヌクレオチドに対する標的／巨大分子化合物の結合の有無が、ハイブリダイゼーションしたアンカー／シグナルオリゴヌクレオチドの量を調節し、最終的に、基質表面近傍のレポーター部位の量を調節する。かかる調節が、ハイブリダイゼーションしたアンカー／シグナルオリゴヌクレオチドの量、及び最終的に試料内の標的の量を示す。そのために、本方法は、複数のシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした複数のアンカーオリゴヌクレオチドの量を（直接また間接的に）測定する工程を含む。
【００７０】
標的の適切な検出を行うために、標的の不在下でシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたアンカーオリゴヌクレオチドの量を（予め測定した値として）得ることができるか、または測定することができる（以下の、対照値の測定方法を参照）。
【００７１】
試料の存在下にてシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたアンカーオリゴヌクレオチドの量を測定すると、次に試料の性質決定を行うことができる。試料の存在下にてシグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたアンカーオリゴヌクレオチドの試験量と、対照量の比較を行うために、この性質決定は可能である。試験量が陰性対照よりも少ないことが測定されれば、試料は標的を有すると性質決定される。試験量が陰性対照よりも少なければ、標的の定量化の任意工程を実施することができる。試験量が陰性対照と同じであるか、またはそれ以上であることが測定される場合、試料は標的を欠いていると性質決定される。
【００７２】
別の実施形態において、陽性対照量が使用される場合、性質決定工程は、試験量の複数の陽性対照量との比較、及びどの陽性対照量が検出する試験量に最も近いかの測定、及び所望により、標的の定量化を含むことができる。
【００７３】
標的の存在を確認するため、または標的の量を定量化するために、本方法はまた、試験量との比較のために対照量を提供することも含む。一実施形態において、対照値は、対照試料（例えば、標的を欠いていることが知られている試料）を、本明細書で記載される（単一または多重）検出システムと接触させ、シグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたアンカーオリゴヌクレオチドの量を測定することにより得ることができる。本実施形態では、対照またはバックグラウンドシグナルを得て、対照量として使用することができる。別の実施形態において、対照システムで検出されている同一試料を接触させることにより、対照量を得ることができる。上で示した通り、かかる対照システムは、検出されている任意の巨大分子化合物、または巨大分子化合物の組み合わせに結合するための部位を欠いている。更に他の実施形態では、対照値は、既知の量の標的（例えば陽性対照）を含む検出システムからもたらすことができる。多数の代替の対照を、当業者に既知の通りに、個別に、または組み合わせて実施してよい。
【００７４】
本明細書に記載の方法はまた、得られた試験量を得られた対照値と比較し、試料内での標的の存在、及び所望によりその量を測定することを含む。この比較は、例えば、検量線により決定される見かけの解離定数（ＫD）を使用して、人により、またはコンピュータで実施する方法により行うことができる。
【００７５】
本明細書にて開示したオリゴヌクレオチドが関与する結合反応は、所望の特異的結合を促進するか、非特異的なバックグラウンド相互作用を減らすか、微生物の増殖を阻害するか、またはプローブ及び／もしくは標的の安定性を増加させる試薬及び添加剤の存在下で実施してよい。本開示の結合反応は周囲温度にて実施することができるが、特異的結合を可能にする範囲の任意の温度を用いてよい。例えば、幾つかの実施形態では、温度範囲は５℃〜４５℃、例えば１０℃〜４０℃、または２０℃〜３０℃である。更に、幾つかの実施形態では、標的が生物学システムからのものである場合、結合反応媒体のｐＨは、およそ生理的ｐＨである。例えば、ｐＨは、４〜１０、例えば５〜９（６〜８を含む）の範囲であってよい。ある特定の場合において、ｐＨは７であってよい。便宜上、反応条件は、特異的結合ができる限り急速に生じることを可能にするように選択され得る。数秒（例えば１〜６０秒）、または数分（例えば１〜３０分）のようにできるだけ短い結合時間を使用してよい。例として、１〜６０秒、例えば１０〜６０秒（２０〜６０秒を含む）を使用してよい。他の実施形態において、１〜３０分、例えば５〜２０分（１０〜２０分を含む）を使用してよい。幾つかの特定の実施形態において、特に核酸分子（ＤＮＡ等）を巨大分子化合物と結合するための部位として使用する場合、カチオン（例えばマグネシウムカチオン等の二価カチオン）含有緩衝液を使用して、電荷反発を制限／防止することができる。
【００７６】
上で示した通り、基質表面上のアンカーオリゴヌクレオチドの密度は、複合体形成により立体障害を生み出すために重要である。そのために、本方法は、所望により複合体の存在下で立体障害が実際に生み出されたのかを測定する対照工程を含むことができる。更に、本方法は、所望により最初に、標的／巨大分子化合物のそれぞれの分子量に基づいて、アンカーオリゴヌクレオチドの密度を測定する工程を含むことができる。
【００７７】
全血または他の複合体混合物を試料として使用する場合、電気化学の生成に依存する方法を使用して試験値及び対照値をもたらすことが有利である。かかる実施形態において、基質が電極となるように構成することができ、シグナルオリゴヌクレオチド上のレポーター部位はレドックスレポーター部位とすることができる。アンカーオリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションされる際（そして、部分的にはレポーター部位が、基質表面と会合するアンカーオリゴヌクレオチドの末端に位置するために）、電極から保持される電気化学的レポーター間の距離は、検出可能なシグナルを生成するのに十分である。しかしシグナルオリゴヌクレオチドが試料内で自由に拡散するか、または、（隣接する複合体からの立体障害のために）アンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが不可能である場合、電気化学的レポーターは、電極から更に遠くに移動し、シグナルの検出可能な低下を生み出すことが可能である。
【００７８】
本明細書記載の方法は、試料内の１種以上の標的の有無の測定、及び／または定量化が望まれる、各種の異なった用途にて使用法を見出す。
【００７９】
例えば、試料内での標的の有無もしくは残存、または時間の経過による、標的の濃度の著しい変化を用いて、病気のリスク、個体内での病気の存在を診断／評価することができるか、または個々の病気に対する治療を調整することができる。例えば、特定の標的または標的の集合の存在が、個体に与えられる薬剤治療または投与レジメンの選択に影響を与え得る。潜在的な薬剤療法を評価するために、標的の有無または濃度を、生残または非可逆的罹患等の自然のエンドポイントに対する代用物として使用してよい。治療が標的を変え、これが健康の改善に直接関係する場合、標的は、特定の治療または投与レジメンの臨床効果を評価するための代用エンドポイントとして機能することができる。したがって、個体内で検出される特定の標的または標的の集合に基づく個別使用の診断及び治療が、対象のシステム及び方法により容易となる。更に、病気に関連する標的の初期検出は、前述の通り、対象のシステム及び方法の高い感度により促進される。単一アッセイにおいて複数の標的を検出する多重能力のために、選択性、感度及び使用の容易性と組み合わさって、本明細書にて開示するシステム及び方法は、定量的、簡易迅速またはニアペイシェント生体分子アッセイでの使用が見出されている。
【００８０】
更なる例において、病原菌（例えば、幾つかの実施形態にて１種以上の抗生物質に耐性を有することができる細菌）の有無を、生物試料、食料または水中で検出することができる。
【００８１】
更に別の例において、試料内での標的の有無もしくは残存、または時間の経過による、標的の濃度の著しい変化を使用して、食料中における汚染リスク、汚染の存在を測定することができる。
【００８２】
対象システム及び方法は、例えば以下のように、上述の標的の検出及び／または定量化；試料が無症候性の対象に対して定期的な間隔で試験されるスクリーニングアッセイ；標的の存在及び／または量を使用して、可能性のある病気の経過を予測する予後アッセイ；異なる薬剤治療に対する対象の反応を予測できる階層アッセイ（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）；薬剤治療の有効性を監視する有効性アッセイ等が挙げられるが、これらに限定されない診断アッセイにて用途が見出される。
【００８３】
対象システム及び方法はまた、検証アッセイでも用途を見出される。例えば、検証アッセイを使用して、潜在的な病気の生体指標が、種々の個体における病気の有無に関する、信頼できる指標であることを検証、または確認することができる。対象システム及び方法の短いアッセイ時間は、最小量の時間内で、複数の試料のスループットの増加を促進し得る。
【００８４】
ある種の実施形態において、対象システム及び方法は、試料内での抗体の検出に用途を見出される。場合によっては、対象システム及び方法は、特定の抗体の有無、及び試料内での特定の抗体の濃度の増減を検出するために使用され得る。
【００８５】
別の実施形態において、対象システムは、２つの生物学的化合物の結合を調節可能な作用物質のスクリーニングに使用可能である。例えば、本システムを使用して、薬剤ライブラリーをスクリーニングして、２つの生物学的化合物の結合を増減可能なアンタゴニストまたはアゴニストを識別することができ、ここで、少なくとも１つの生物学的化合物（またはその断片）がシグナルオリゴヌクレオチドと会合する。作用物質が２つの生物学的化合物間での相互作用を妨げることが可能である場合、より多くのオリゴヌクレオチドがアンカーオリゴヌクレオチドを介して基質表面にハイブリダイゼーションする。作用物質が２つの生物学的化合物間での相互作用を促進することが可能である場合、より少量のシグナルオリゴヌクレオチドがアンカーオリゴヌクレオチドを介して基質表面にハイブリダイゼーションする。かかる実施形態において、スクリーニング可能な試料は、例えば、細胞抽出物、核抽出物、全血、作用物質の実質的に純粋な形態等とすることができる。
【００８６】
本発明は以下の実施例を参照することにより一層速やかに理解され、これらは本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するために与えられる。
【実施例】
【００８７】
既存技術の制限（全血でのシグナル変化、弱い電気化学的電流）に対応して、「立体障害ハイブリダイゼーションアッセイ」（ＳＨＨＡ）と呼ばれる多機能のシグナル伝達メカニズムをここに提示する。ＳＨＨＡは新規のメカニズムに依拠し、このメカニズムはナノスケールにて立体障害効果を利用する。より具体的には、このメカニズムは、ＤＮＡハイブリダイゼーションの高特異性及び選択性、並びに、比較的半径の小さいＤＮＡヘリックス（＜２ｎｍ）と比較して、タンパク質（＞５ｎｍ）等の巨大分子間でのサイズの違いの両方を利用する（図１Ａ）。電気化学的フォーマットで、本アッセイは、末端に、特異的認識用成分、及び金電極の表面に高表面密度で予め結合した相補アンカーＤＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーション可能な、シグナル電気活性部位（ここではメチレンブルー）を有する遊離シグナルＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる。アンカーオリゴヌクレオチドへの結合の際に、シグナルオリゴヌクレオチドは、メチレンブルー（ＭＢ）レドックス標識を電極表面付近にもたらすことで、大きな電気化学シグナルを生成する（図１Ｂ、実線の曲線）。シグナルオリゴヌクレオチドの認識用成分に結合する大型の巨大分子の存在下にて、ナノスケールの立体障害がより少量の電気化学的電流を生成するため、より少量のこのオリゴヌクレオチドのコピーしか、表面に結合したアンカーオリゴヌクレオチドに到達してハイブリダイゼーションできない（図１Ｂ、点線の曲線）。
【００８８】
ｅＳＨＨＡは、タンパク質検出のための、ワンステップの他のＤＮＡベース電気化学アッセイに対して主に２つの利点を提供する。まず、シグナル部位は電極表面に結合しておらず、このことは、センサーを血液に浸漬した最初の数分で発生する、潜在的な干渉成分（例えば血液タンパク質）の非特異的吸着を、センサーが殆ど感知しないままであるはずである。２つ目に、電極表面の高密度のアンカーオリゴヌクレオチドは、より多くの量のシグナルオリゴヌクレオチドを表面にもたらすことに寄与し、それによって、上述のアッセイよりも多くの量の電気化学的電流を確保する。
【００８９】
試薬。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、６−メルカプト−１−ヘキサノール（ＭＣＨ；Ｆｌｕｋａ）及び硫酸（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を全て、受け取ったままの状態で使用した。ポリクロナール抗Ｄｉｇ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）及びストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に溶解させた。抗ＤＮＰ（全抗血清）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び他のタンパク質の在庫を分取し、即時使用のための４℃で保管するか、長期間保存のために−２０℃で保存した。新生子ウシ全血を分取し、使用前に−２０℃で冷凍した。
【００９０】
ＤＮＡ配列。本原稿で使用したＤＮＡオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣで精製し、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡにより合成した。チオール化アンカーオリゴヌクレオチドを受け取ったままの状態で、更に精製することなく使用した。ジゴキシゲニン／メチレンブルー標識シグナルオリゴヌクレオチド、ビオチン／メチレンブルー標識シグナルオリゴヌクレオチド、及びＤＮＰ／メチレンブルー標識シグナルオリゴヌクレオチドを、受け取ったままの状態で使用した。本作業で使用した種々のオリゴヌクレオチドの配列を、表１に示す。
【００９１】
表１  異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列：シグナル及びアンカーＤＮＡオリゴヌクレオチド
2017513026.tif 000004
【００９２】
電極の洗浄及びセンサーの調製。手短に言えば、多結晶質金ディスク電極（直径２ｍｍ；ＢＡＳ，Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を、その表面をダイヤモンド及びアルミナ（ＢＡＳ，Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）で研磨し、各工程後にエタノールまたは水で音波処理することにより調製した。研磨後、電気化学洗浄（０．５ＭのＨ2ＳＯ4、０．０１ＭのＫＣｌ／０．１ＭのＨ2ＳＯ4、及び０．０５ＭのＨ2ＳＯ4の、一連の酸化及び還元サイクル）、並びに面積測定（最終洗浄工程での、金酸化還元ピークの面積に基づく）（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を行った。
【００９３】
アンカーＤＮＡオリゴヌクレオチド（０．１ｍＭ）をＴＣＥＰ（１μｍ）で１時間インキュベーションし、ジスルフィド結合を還元させた。本溶液を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で１００ｎＭ（または、より低いＤＮＡ充填密度で電極を作製する場合は他の濃度）まで希釈した。（ＤＩ水で完全に洗い流した）電極を、アンカーオリゴヌクレオチドの１００ｎＭ溶液（１５０μＬ）内で２時間インキュベーションした。次いで、電極をＤＩ水で洗い流し、緩衝液（ＭＣＨが３ｍＭ）中で更に３時間インキュベーションし、非特異的に吸着したＤＮＡを置き換えて、残りの電極領域を不動態化した。ＤＩ水で完全に洗い流した後、電極を緩衝液中で保存した。予め確立したピーク電流との関係（補足情報を参照）を使用することにより、これらの条件に対して測定したアンカーオリゴヌクレオチドの表面密度（即ち、電極表面の単位面積あたりにおける電気的活性ＤＮＡモル数）は、約１．４×１０12オリゴヌクレオチド／ｃｍ2（平均のアンカーオリゴヌクレオチド≦５ｎｍについて）である。
【００９４】
モジュラーシグナルオリゴヌクレオチド。モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドを使用した実験（図１０Ｃ）は、試料中に２０ｍＭのＭｇＣｌ2を添加したことを除き、元のシグナルオリゴヌクレオチドを使用する場合と同様のプロトコールを用いて実施した。使用したオリゴヌクレオチドの核酸配列を表２に示す。濃度が１００ｎＭのモジュラーシグナルオリゴヌクレオチドを全ての実験で使用した。緩衝液中で実施した実験では５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を使用したが、全血中での実験ではウシ全血試料を使用した。
【００９５】
表２モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドの実験の異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列（図１０を参照）
2017513026.tif 000005
【００９６】
電気化学的測定。ＥｍＳｔａｔＭＵＸポテンショスタットマルチプレクサ（Ｐａｌｍｓｅｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）、並びに白金対極（ガーゼ−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＡｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＮａＣｌ）参照電極（ＣＨＩ）を含有する標準的な３電極電池を使用して、室温で電気化学的測定を実施した。生物電気化学インターフェースを、高アンカーオリゴヌクレオチド密度（１．４×１０12オリゴヌクレオチド／ｃｍ2）を使用して上述の通りに作製した。次いで、ＭＣＨ自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を使用して金表面を被覆した。振幅５０ｍＶ及び周波数６０Ｈｚで、Ａｇ／ＡｇＣｌに対する、−０．０５Ｖから−０．４５Ｖまで０．００１Ｖずつ変化する方形波ボルタンメトリーを使用して実験データを収集した。（Ｐａｌｍｓｅｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの）ＰＳＴｒａｃｅソフトウェアのマニュアル一致モードでピーク電流を一致させた。シグナルオリゴヌクレオチド１００ｎＭを、標的タンパク質を含有する試料に添加した直後に、全ての測定を行った（即ち、シグナルオリゴヌクレオチドと標的とのプレインキュベーションは必要とされなかった）。電流の観点で結果を示す（電極面積は０．０３ｃｍ2であることが分かっている）。ゲインは、初期ピーク電流により除した、標的添加前後で得られるピーク電流の差を表す。
【００９７】
個々のセンサーに対する用量反応曲線（図２Ｅ及び２Ｆ）を、標的タンパク質の濃度を逐次的に増加させることにより、シグナルＤＮＡ  １００ｎＭを使用して得た。３つの電極を使用して、各１ｍＬの試料を同時に分析した。個々の用量反応曲線を単一結合部位メカニズムに当てはめた（［Ｔ］＝標的濃度；Ａｍｐ＝電流の振幅；Ｃ0＝バックグラウンド電流；Ｃ50%は、センサーのシグナル振幅の５０％に到達した時点でのタンパク質濃度である）：
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アンカーＤＮＡオリゴヌクレオチドの表面密度（つまりアンカーＤＮＡオリゴヌクレオチド間の平均距離）の測定。アンカーＤＮＡの表面密度（即ち、電極表面の単位面積あたりにおける電気的活性ＤＮＡモル数、Ｎtot）を、（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｉｄｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に記載されているように、予め確立されたピーク電流との関係を用いて測定した。
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ここで、Ｉpeak（Ｅ0）はボルタモグラムにおける平均ＡＣピーク電流、ｎはレドックスの実施あたりで移動する電子の数（我々のＭＢ標識ではｎ＝２）、Ｆはファラデー電流、Ｒは一般気体定数、Ｔは温度、Ｅacは振幅、及び、ｆは印加電圧摂動の頻度である。本手順に関し、各アンカーオリゴヌクレオチドがシグナルオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーション可能であり、電子移動は、シグナルＤＮＡオリゴヌクレオチドの結合時にメチレンブルーと電極表面との間でのみ発生すると推定された（ＤＮＡに結合した各メチレンブルーに関して完全な電子移動が推定される）。センサーを、１００ｎＭのシグナルオリゴヌクレオチドを含有する溶液中に３５分間浸漬して飽和させた後で、電気化学的測定を実施した。次いで、メチレンブルーの電子移動に対応するピーク応答を上記式に使用し、アンカーＤＮＡのモル数を計算した。この数字を電極表面積で除し、モル／ｃｍ2でアンカーＤＮＡの表面密度を得た。各アンカーＤＮＡ周辺の円面積を考慮すると、この面積は、密度（オリゴヌクレオチド／ｃｍ2）の値の逆数を取ることで推定され、結果的に、距離はその後、この円面積の直径から計算された。
【００９８】
我々は、センサー製作中に使用したチオール化オリゴヌクレオチドの濃度を変化させることにより、アンカーＤＮＡオリゴヌクレオチドが電極表面に充填された密度を調節した（図５）。１００ｎＭの製作濃度を用いる際に、我々は再現性良く約１．４×１０12オリゴヌクレオチド／ｃｍ2のプローブ密度を達成する。
【００９９】
タンパク質のワンステップ検出用のｅＳＨＨＡ。ｅＳＨＨＡの最初の原理証明の確認のため、アッセイを２つの大型巨大分子である抗体及びストレプトアビジンの検出のために適合させた（図２）。このようにするために、最初の１６塩基のシグナルオリゴヌクレオチドを２つ設計し、３’末端をメチレンブルーで標識して（電気化学シグナル読み出し情報を生成し）、５’末端を、それぞれ抗Ｄｉｇ抗体（図２、上列）及びストレプトアビジン（図２、下列）で認識される小ハプテンジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）またはビオチンで標識した。相補性の１６塩基ＤＮＡアンカーオリゴヌクレオチドを、まず硫黄−金結合の形成により容易な結合を可能にする５’−Ｃ６−チオール基を介して、高い表面被覆率にて金電極に不動化し、次いで６−メルカプトヘキサノールを使用して表面を覆った。ｅＳＨＨＡの感度を最適化するために、電極表面において全てのアンカーオリゴヌクレオチドを飽和するために必要なシグナルオリゴヌクレオチドの最小濃度を測定した。これらの電極の用量反応曲線は、電極表面が、約１００ｎＭの濃度のシグナルオリゴヌクレオチドで飽和されており（図３を参照）、マイクロアンペアの電流を発生することを示している。それ故、このシグナルオリゴヌクレオチドの濃度は、低いｎＭにおける検出限界を確保しながら、高くて堅強な電気化学シグナルを確保するため、１００ｎＭのシグナルオリゴヌクレオチドの濃度を全てのｅＳＨＨＡ実験で用いた（１００ｎＭの標的タンパク質は、１００ｎＭのシグナルオリゴヌクレオチドを隔離するため、センサーを飽和させることが予想される）。
【０１００】
次いで、我々の２つのモデルの標的タンパク質を検出するためのｅＳＨＨＡ応答を試験した。異なる濃度で種々のタンパク質の試料を調製した。ここでは、１００ｎＭのシグナルオリゴヌクレオチドを収集前に添加した。標的タンパク質の不在下において（図２Ａ及び２Ｂ、黒色の曲線）、センサーは共に、数分にわたり１μＡを超える大きなファラデー電流を生み出した（図２Ｃ及び２Ｄ、黒色の曲線−ｔ1/2抗体＝１１．６分、及びｔ1/2ストレプトアビジン＝１１．２分）。タンパク質（１００ｎＭ）の存在下において、ＭＢレドックス電流はそれぞれ、６８％、５２％減少した（図２Ａ及び２Ｂ、破線の曲線）。注釈として、シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度は巨大分子の存在により影響を受けなかった（図２Ｃ及び２Ｄ、青色の曲線−それぞれ、ｔ1/2抗体＝１０．５分、及びｔ1/2ストレプトアビジン＝９．７分）。ｅＳＨＨＡは、１００ｎＭよりわずかに少ない標的濃度の１００倍のダイナミックレンジで、定量的検出を達成した（図２Ｅ及び２Ｆ）。Ｄｉｇ抗体のセンサー（図２Ｅ）は２７±３ｎＭのＣ50%（センサーシグナルの５０％が到達した際の標的タンパク質の濃度）を示し、このことは、各抗体が２つの結合部位を含有するためにシグナルオリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）の半分が２５ｎＭの抗体と結合することが予測されるという事実に一致する。ストレプトアビジンセンサーに関し（図２Ｆ）、１４±２ｎＭのＣ50%が得られ、これもまた、これは後でビオチン用の４つの結合部位を含有するために、シグナルオリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）の半分が１２．５ｎＭのストレプトアビジンと結合しなければならないという事実と一致した。
【０１０１】
提示した新規の「立体障害」メカニズムを支持し、ｅＳＨＨＡの選択性を強調するために、２つの主要な対照を設計した。まず、標的巨大分子の存在下にて得られた、より低い電気化学シグナルは、シグナルオリゴヌクレオチドに結合する抗体から生じる電子移動効率の低下ではなく、金表面により少量のシグナルオリゴヌクレオチドが到達してハイブリダイゼーションしたためであることを確認した。第１の仮説を支持するものとして、シグナルオリゴヌクレオチドで予め飽和した電極表面に飽和濃度の巨大分子標的を付加した後に、電気化学シグナルの低下が観察されなかった（図４）。標的巨大分子の存在下におけるこのシグナルの低下は、巨大分子のシグナルオリゴヌクレオチドへの特異的結合により生み出されたことが更に確認された。このようにするために、特異的な認識用成分を含有しないシグナルオリゴヌクレオチドを使用して、標的巨大分子の存在下または不在下に関わらず、類似強度の電気化学シグナルを提供した（図５）。この結果は、ｅＳＨＨＡで観察されたシグナル低下は、電極表面に結合している非特異的なタンパク質とは関係していないことを確認した。
【０１０２】
ｅＳＨＨＡは標的巨大分子のサイズの影響を受ける。ｅＳＨＨＡの電気化学シグナル伝達は標的巨大分子のサイズに比例する。大きな巨大分子は、電極表面付近のシグナルヌクレオチドとアンカーオリゴヌクレオチドとの間でより多くの立体障害を生み出すために、これらがより大きなシグナルの低下を生み出す。これは、分子量が増大する（即ち、１８４Ｄａ〜最大１８０，０００Ｄａ）分子に結合したシグナルオリゴヌクレオチドにより生み出された電気化学シグナルを比較することにより示された（図６）。例えば、シグナルオリゴヌクレオチドに２，４−ジニトロフェノール（１８４Ｄａ）、ビオチン（２４４Ｄａ）、及びジゴキシゲニン（３９０Ｄａ）等の小サイズの分子が結合することにより、それぞれ電気化学的電流が３％、８％及び１３％低下した（図７もまた参照のこと）。１６塩基ＤＮＡ配列（５，０００Ｄａ）の結合は電流を３０％低下させたが、Ｆａｂ断片（５０，０００Ｄａ）、ストレプトアビジン（７５，０００Ｄａ：この分子量は、３つの追加のビオチン結合部位に結合する、３つの追加のビオチン含有シグナルオリゴヌクレオチドの重量を含む）、及び抗体（例えばＩｇＧ及びＩｇＥ、約１５０ｋＤａ）等の大型の巨大分子の（認識用成分を介した）結合は、それぞれ電流を４０％、５０％、及び６０％低下した（図Ｓ５もまた参照のこと）。したがって、ｅＳＨＨＡにより生み出された、（電極表面でハイブリダイゼーションしているシグナルオリゴヌクレオチドの数に結合した）電気化学シグナルは、片対数関係に従い、標的巨大分子のサイズに逆相関していることが見出された（図６）。この結果は、認識用成分と標的巨大分子との分子量差が最大となったときに、ｅＳＨＨＡは最適のシグナルゲイン低下が可能であることを示している。
【０１０３】
ｅＳＨＨＡは、電極表面の高密度のアンカーオリゴヌクレオチドで最適に作用する。ｅＳＨＨＡの立体障害メカニズムを支持する追加の証拠はまた、ｅＳＨＨＡはアンカーオリゴヌクレオチドの密充填層のみと良好に機能するという立証に由来した。したがって、結合または遊離シグナルオリゴヌクレオチドは、大型サイズの分子への結合に関係なくアンカーオリゴヌクレオチドと等しくハイブリダイゼーションしなければならないため、被覆が少ない表面では、より低い性能が予測される。このことを確かめるため、被覆密度を変更するために、アンカーオリゴヌクレオチドの濃度を変えることで幾つかの電極を官能化した（図８）。シグナルゲインは、アンカーオリゴヌクレオチド間の平均距離の増加に伴い急速に（線形に）低下した（図８Ｂ）ことが見出された。例えば、表面に密充填層のアンカーオリゴヌクレオチドを有する電極（オリゴヌクレオチド間の平均距離が５ｎｍ）は、標的抗体の存在下において、高い電気化学的電流（１．１μＡ）及び−６０％のシグナルゲインの低下をもたらした（図８Ａ、上）。対照的に、低充填層のアンカーオリゴヌクレオチドを有する電極（オリゴヌクレオチド間の平均距離が１１ｎｍ）は低い電気化学シグナル（０．２μＡ）をもたらし、したがって、抗体の存在下においては限定的なシグナルゲインの低下が得られた（−１０％）（図８Ａ、下）。これらの結果は、アンカーオリゴヌクレオチドを高い表面被覆率で使用した際に急速にシグナルが低下したことがわかった、先に報告したｅＤＮＡセンサーとは対照的である。予想通り、シグナルゲイン間の逆線形関係、及びアンカーオリゴヌクレオチド間の平均距離もまた、標的サイズに依存することがわかった（図８Ｂ）。実際、電極表面のアンカーオリゴヌクレオチド密度を低下させる（即ち、アンカーオリゴヌクレオチド間の平均距離を増加させる）と、比較的小さなサイズの標的（即ちストレプトアビジン）とのｅＳＨＨＡの性能は、比較的大きなサイズの標的（即ち抗体）と比較してより急速に低下した。このことは、より小さなタンパク質は電極表面でより少ない立体障害を生み出すために、アンカーオリゴヌクレオチド間の平均距離がタンパク質サイズよりも大きくなると、検出不可能となるという事実と一致する。
【０１０４】
ｅＳＨＨＡは全血中で直接的に作用する。ｅＳＨＨＡは全血中で直接的に作用し、複数のタンパク質の１０分未満での同時検出を可能にする。ｅＳＨＨＡの最も重要な利点の１つは、前述の、巨大分子検出のための一段階工程法とは異なり、  全血中で直接用いるには十分に選択的である、ということである（図９）。まず、ｅＳＨＨＡの性能は、全血中で直接用いた場合、または緩衝溶液（１００ｎＭの抗体）中で単に用いた場合、ゲイン及び速度論の観点ではほぼ同一であることが示された（図９Ａ）。先に公表された抗体検出用の電気化学的ＤＮＡベースアッセイと比較した、ｅＳＨＨＡの別の相当な利点は、センサーが最初に全血中に挿入される際に、急速な（電流の）移動（または変化）が検出されないことである。これは、メチレンブルーレドックス標識が電極表面には存在せず、シグナルオリゴヌクレオチド上に存在するという事実によるものである。したがって、シグナルオリゴヌクレオチドが移動して表面に結合したアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする前に、電気化学シグナルは生成されない。
【０１０５】
ｅＳＨＨＡはまた、全血等の複合体マトリックス中における、複数のタンパク質の同時検出に適合することもできる。このことは、同一の血液試料中で、異なるアンカーオリゴヌクレオチド配列を含有する複数の電極を同時に用いることにより示された。これらの異なる電極はそれぞれ、特異的な認識用成分に結合した相補性特異的シグナルオリゴヌクレオチドと会合した。我々は、全血試料中の２つの抗体（抗Ｄｉｇ及び抗ＤＮＰ）の測定を実施することにより、この多検出の特徴を実証した（図９Ｂ）。抗Ｄｉｇスパイク血液試料（図９Ｂ−１）において、対応する青色電極の電気化学的電流のみが低下した（−６０％のゲイン低下）が、他の２つの電極（抗ＤＮＰ及び対照）のシグナルは変化しないままだった（対照シグナルオリゴヌクレオチドは認識用成分を含有しない）。同様に、抗ＤＮＰスパイク血液（図９Ｂ−２）において、対応する緑色電極の電気化学的電流のみが低下した（−５０％のゲイン低下）。抗Ｄｉｇ及び抗ＤＮＰ抗体の両方でスパイクした第３の血液試料はｅＳＨＨＡ応答を生み出し、ここで、青色及び緑色電極は共に、著しい電気化学シグナルゲインをもたらしたが、対照の「黒色」電極は無変化のままだった。電気化学シグナルは５０分のインキュベーション後に平衡に達したが、最適ゲイン低下は最初の１０分で既に達成されている（図９Ｂ、中央）。電圧に対する電流密度の運動の関数は、全血中では、異なるシグナルを得るのに最少６分が必要であり得ることを示す（図９Ｃ）。合わせると、これらの結果は明確に、複合体マトリックス中での複数のタンパク質の急速検出のための、一段階工程で使用が簡単なアッセイとしての、ｅＳＨＨＡメカニズムの可能性の高さを実証している。
【０１０６】
ペプチドを認識用成分として使用するセンサーには、（例えば、アダプター成分及び標識成分を含有する）モジュラーシグナルオリゴヌクレオチドを使用した（図１０）。その大きなサイズ及び電荷密度の高さのために、より少量のモジュラーシグナルオリゴヌクレオチド（３３％）を電極表面でハイブリダイゼーションすることができる（立体障害及び電荷反発のために）（図１０Ｂ）。しかし、試料内に２０ｍＭのＭｇ２+（ＭｇＣｌ）を添加することで電荷反発を低下させ、かかるモジュラーシグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率を最大２５％増大させることができる。（Ｃ）認識用成分として、ＨＩＶ  ＧＰ４１タンパク質のペプチド（ＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＫＫＫＫＧＳ（配列番号：１０、Ｂｒｕｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を用いた抗ＨＩＶ抗体（４Ｅ１０、１０００ｎＭ）の検出。これらの実験は、１００ｎＭのモジュラーシグナルオリゴヌクレオチド、ウシ全血中に直接スパイクした２０ｍＭのＭｇＣｌを使用して実施した。
【０１０７】
ナノスケールでの立体障害効果に基づく、タンパク質の一段階工程検出のための、新規の一般化可能な、高選択性シグナル伝達メカニズムを本明細書で記載した。ＤＮＡハイブリダイゼーションの高特異性及び選択性を利用する本シグナルメカニズムは原則として、ＤＮＡに結合可能な小さな認識用成分を有する任意のタンパク質の検出のために適合可能である。ここで我々は、ｅＳＨＨＡは、−６５％までシグナルゲインの低下を生み出す大きなタンパク質を用いて、全血中で５つの異なる巨大分子（＞５０ｋＤＡ）の単一工程での検出を可能にすることを示す（図６）。ｅＳＨＨＡはまた、ペプチド及び他の小リガンドを認識用成分として使用することを支持するように適合可能であると考えられている。ｅＳＨＨＡは低ナノ分子濃度において、標的に対して速やかに（＜１０分）、かつ高感度で応答する。ＤＮＡは、多数の特異的アンカー−シグナル対を作製可能であること示すという独自の能力のために、ｅＳＨＨＡは、独自の試料中で多数の標的タンパク質を同時に多重検出することもできる。
【０１０８】
ｅＳＨＨＡは、比較可能な既存のタンパク質検出技術よりも著しい利点を示す。例えば、ｅＳＨＨＡは、最近開発されたＥ−Ａｂセンサー及び電気化学スイッチよりも１０倍大きな電気化学シグナルを生み出す。電気化学シグナルはシグナルオリゴヌクレオチドの電極への特異的ハイブリダイゼーションにより促進されるため、本明細書では、全血中で直接用いられる場合は、シグナル移動がないことが示されている。ｅＳＨＨＡはまた、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット及び蛍光偏光アッセイ等の、抗体を定量的に検出するための他の現在の方法と比較をすると、多くの有利な特徴を示す。ｅＳＨＨＡは多工程の洗浄及び試薬集約的なプロセスを必要とせず、専門の技術者を必要とせず、かつ、実施には数分、そして大変安価で持ち運び可能なポテンショスタットを必要とするのみである。ｅＳＨＨＡはまた、その定量的特徴、及び単一試料での多重検出支持能力を考慮すると、免疫化学ディップスティックよりも便利なことが明らかである。これら全ての利点を考慮すると、ｅＳＨＨＡは簡易迅速診察への適合に十分な状況にあることが明らかである。
【０１０９】
本発明はその特定の実施形態と共に記載されているが、特許請求の範囲は実施例で説明されている好ましい実施形態により制限されず、明細書全体に一致して最も広範な解釈が行われるべきと理解されよう。
【０１１０】
参照文献
Ｂｒｕｎｅｌ，Ｆ．Ｍ．；Ｚｗｉｃｋ，Ｍ．Ｂ．；Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｒ．Ｍ．Ｆ．；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６，８０，１６８０−１６８７
Ｃａｓｈ，Ｋ．Ｊ．；Ｒｉｃｃｉ，Ｆ．；Ｐｌａｘｃｏ，Ｋ．Ｗ．  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２００９ａ，４１，６２２２−４．
Ｃａｓｈ，Ｋ．Ｊ．；Ｒｉｃｃｉ，Ｆ．；Ｐｌａｘｃｏ，Ｋ．Ｗ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００９ｂ，１３１，６９５５−７．
Ｆａｎ  Ｃ，Ｐｌａｘｃｏ  ＫＷ，Ｈｅｅｇｅｒ  ＡＪ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓ  ａ  ｒｅａｇｅｎｔｌｅｓｓ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３  Ａｕｇ  ５；１００（１６）：９１３４−７．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｊｕｌ  １６．
Ｌａｓｓ−Ｎａｐｉｏｒｋｏｗｓｋａ  Ａ，Ｈｅｙｄｕｋ  Ｅ，Ｔｉａｎ  Ｌ，Ｈｅｙｄｕｋ  Ｔ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ａｐｒ  ３；８４（７）：３３８２−９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ３００１０３４．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｍａｒ  ２２．
Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｓ．Ｄ．；Ｏｌｓｅｎ，Ｇ．Ｔ．；Ｃｒｅａｇｅｒ，Ｓ．Ｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９９，４６６，１９７．
Ｉｄｉｌｉ，Ａ．；Ａｍｏｄｉｏ，Ａ．；Ｖｉｄｏｎｉｓ，Ｍ．；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ−Ｓｏｍｅｒｓｏｎ，Ｊ．；Ｃａｓｔｒｏｎｏｖｏ，Ｍ．；Ｒｉｃｃｉ，Ｆ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４，８６，９０１３．
Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ，Ａ．；Ｒｉｃｃｉ，Ｆ．；Ｕｚａｗａ，Ｔ．；Ｘｉａ，Ｆ．；Ｐｌａｘｃｏ，Ｋ．Ｗ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２０１２，１３４，１５１９７−２００．
Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｊ．；Ｐｈａｒｅｓ，Ｎ．；Ｌｕｂｉｎ，Ａ．Ａ．；Ｘｉａｏ，Ｙ．；Ｐｌａｘｃｏ，Ｋ．Ｗ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００８，２４，１０５１３−８．
Ｘｉａｏ，Ｙ．；Ｌａｉ，Ｒ．Ｙ．；Ｐｌａｘｃｏ，Ｋ．Ｗ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ，Ｒｅｄｏｘ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ａｐｔａｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｎｓｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２００７，２，２８７５−２８８０．
Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ  ｅｔ  ａｌ．による国際出願ＷＯ２０１２／０７１３４４
Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．による国際出願ＷＯ２００７／１２０２９９
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2017513026.tif 000009
【図２】
2017513026.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2017513026.tif 000014
【図６】
2017513026.tif 000015
【図７】
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【図８Ａ】
2017513026.tif 000017
【図８Ｂ】
2017513026.tif 000018
【図９Ａ１】
2017513026.tif 000019
【図９Ａ２】
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【図９Ｂ】
2017513026.tif 000021
【図９Ｃ】
2017513026.tif 000022
【図１０Ａ】
2017513026.tif 000023
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
2017513026.tif 000026
【図１１Ｂ】
2017513026.tif 000027
【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
2017513026.tif 000030
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
2017513026.tif 000032
【図１４Ｂ】
2017513026.tif 000033
【配列表】
2017513026000001.app
【国際調査報告】
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