(57)【要約】  本発明は、対象からの血漿、血清または血液の患者試料を本明細書中で同定されるタンパク質マーカーについてアッセイすることを含む、対象における実質臓器移植片拒絶のスクリーニングおよび検出のための方法を提供する。対照試料と比較した患者試料中に存在するマーカー量の上昇または減少は、拒絶を示し、生検または修飾性治療（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の必要な患者を同定する。本方法は、より費用が嵩み、リスクがあり、侵襲性である生検手順を受ける必要なく、移植片拒絶の危険性において患者についてスクリーニングするために使用することができる。【選択図】図１Ｂ
2017513009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法であって、
（ａ）前記患者から得られる試料中の補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５キロダルトン（ｋＤａ）断片の量を測定するステップと；
（ｂ）前記Ｃ４Ａの５ｋＤａ断片の量を対照試料中の量と比較するステップと；
（ｃ）（ｂ）での比較が、前記対照試料と比較して前記患者試料中の前記Ｃ４Ａの５ｋＤａ断片の量の増加を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出するステップと
含む、方法。
【請求項２】
前記測定が、前記患者から得られる試料を、前記Ｃ４Ａの５ｋＤａ断片と特異的に結合する試薬と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定が、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）および／またはα−１抗キモトリプシンＣ末端断片（ＡＡＣＴ）の量を測定することをさらに含み、前記検出が、前記比較が前記対照試料と比較した前記患者試料中のＡｐｏＡｌおよび／またはＡＡＣＴの前記量の減少を示す場合に、移植片拒絶の起こり易さを検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｂ）および（ｃ）の接触および比較が、前記患者試料を、ＡｐｏＡ１およびＡＡＣＴと結合する試薬と接触させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記接触が、前記患者試料を、表１で列挙される２以上のマーカーを含む一連のマーカーと特異的に結合する試薬と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記一連のマーカーが、表１で列挙される８以下のマーカーからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
次のマーカー：Ｃ１プロテアーゼ阻害剤、血清アミロイドＡ、Ｃ−反応性タンパク質、アポリポタンパク質Ｅ、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）が、対照と比較して増加しており、および／または次のマーカー：ＡＡＣＴ、ＡｐｏＡ１、翻訳後修飾ＡｐｏＡ１、インター−アルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４、アルファ−２−マクログロブリンが、対照と比較して減少している、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
差異が、対照に対する少なくとも１０％の減少である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
差異が、対照に対する少なくとも１０％の増加である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定が免疫アッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定が質量スペクトルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬が、抗体、核酸プローブまたは合成プローブである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記実質臓器移植片拒絶が、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記拒絶の検出が、少なくとも９０％の感度および少なくとも９０％の特異性を呈する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法であって、
（ａ）前記患者から得られる試料を、補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５１９１ダルトン断片、α−１抗キモトリプシンＣ末端断片（ＡＡＣＴ）およびアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）からなり；場合によってはさらに補体Ｃ１阻害剤（Ｃ−ｉｎｈ）、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、インター−アルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）および／またはアルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）からなる一連のマーカーと特異的に結合する試薬と接触させるステップと；
（ｂ）前記試薬と前記試料との間の特異的結合の量を測定するステップと；
（ｃ）前記（ｂ）における特異的結合の量を対照試料と比較するステップと；
（ｄ）前記（ｃ）での比較が、前記対照試料と比較してＣ４Ａの５１９１ダルトン断片の増加またはＡＡＣＴおよび／またはＡｐｏＡｌの減少を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
Ｃ４Ａの５ｋＤａ断片、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴおよび、場合によってはＣ−ｉｎｈ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４およびＡ２Ｍから選択される１以上のさらなるマーカーと特異的に結合する抗体を含む、キット。
【請求項１７】
前記抗体が固定化される固形支持体をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記固形支持体がマイクロタイタープレートである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記抗体が、前記固形支持体に固定化される抗原への結合を介して固定化される、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体が、ビーズまたは粒子への結合を介して固定化される、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
発色性基質をさらにを含む、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体の内容が参照により本明細書中に組み込まれる、２０１４年４月９日に出願された米国特許仮出願第６１／９７７，５６７号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、全般的に、腎臓同種移植片拒絶を含む移植片拒絶の検出、予測および監視に関する。本発明は、より具体的には、同種移植片拒絶の早期検出のための、血清中で検出することができるタンパク質マーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
損傷がある組織を、同じ種の生体または減少した個体（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）の何れかからの健康な組織と入れ替えるための移植は、同種移植と呼ばれる。別の個体からの組織および細胞は通常、哺乳動物免疫系により外来物として認識される。これは、宿主防御の反応を刺激して、外来組織を拒絶する。免疫系は、時折、分子構造の非常に小さな相違を認識し、同種免疫反応を発現し得る。一部の細胞型は、血液細胞など、個体間で非常に類似している。血液型が適合する場合、免疫反応なく赤血球および血漿などの血液製剤を投与することができる。実質的には、哺乳動物細胞は全て、赤血球細胞を除き、それらの細胞表面上で主要組織適合分子を発現する。これらの分子は、免疫系が自己を外来細胞から区別することができる重要な機序である。
【０００４】
臓器移植は、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓および腸の多くの形態の末期疾患に対する根治治療である。ランゲルハンス島および神経細胞などの特殊化した細胞の移植、ならびに四肢または顔面などの複合組織移植がより一般的になりつつある。しかし、これらの手順の成功の長期間の持続は、免疫反応により限定される。ドナーが同一である双生児でない限り、殆どの受容者は免疫抑制薬治療を受けなければならない。最新の免疫抑制療法は、全ての場合において拒絶を防ぐことが可能ではなく、複数の重大な副作用がある。これらの薬物は、生命を脅かす感染、循環器疾患、糖尿病および癌につながり得る。
【０００５】
現在、移植された臓器および組織の機能を監視するために多くの方法が使用されている：腎臓に対する血清クレアチニン、肝臓に対する血清トランスアミナーゼ、心臓に対する駆出率、肺に対する酸素飽和度および膵臓移植に対する血清グルコース。残念ながら、これらの試験は、拒絶に対する感度または特異性に乏しい。多くの場合において、臓器拒絶に対する決定的な試験は、侵襲性があり高価な生検である。
【０００６】
拒絶の組織学的パターンは各臓器に対して異なり、組織損傷の特徴的パターンは、「細胞性」対「液性」拒絶について同定することができる。「細胞性」拒絶に対する最良の処置は、Ｔリンパ球のさらなる増殖を防ぐために標的化される免疫抑制薬の投与であり得、一方で「液性」拒絶は、Ｂリンパ球を抑制し、移植片を外来物として認識する抗体の血漿をなくす投薬によって処置し得るので、この区別は重要である。一般に、軽度の細胞性拒絶は食い止めることができることが多く、長期間の損傷を引き起こし得ない。液性拒絶は食い止めることがより困難であり、移植片機能が不十分になることにつながるリスクがより高い。移植片拒絶の多くの場合において、細胞性および液性免疫反応の両方の要素が組み合わさっている。移植片拒絶の分類に対する黄金律は同種移植片生検である。
【０００７】
現在の免疫抑制ストラテジーでの１年同種移植片機能における顕著な改善にもかかわらず、移植片機能の長期維持における進歩は少ない。薬物毒性または高血圧などの免疫性および非免疫性因子の両方がこの疾患に寄与するという仮説が立てられる。慢性移植片機能不全は、移植片生検での特徴的な組織学的特性に付随して機能が徐々に悪化する、実質臓器移植における現象である。腎臓移植において、これは、慢性拒絶、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）または尿細管萎縮（ＩＦＴＡ）を伴う間質性線維症として知られる。心臓移植においては、急性進行型アテローム性動脈硬化症があり、肝臓移植においては、胆管萎縮がある。慢性移植片損傷は、移植片の内部の血管の線維症を特徴とし、無症候性ＡＭＲに関連し得る。早期でのこの問題の検出は、プロトコール生検でさえも困難である。
【０００８】
腎臓同種移植片拒絶の最新の診断方法は、高感度でもなく、特異的でもない。針生検は侵襲性が高く、患者死亡を伴う。したがって、拒絶を予測し、診断するための非侵襲性の試験を開発することが望まれる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、一連のタンパク質マーカーおよび、患者の免疫状況の評価のために、および臓器移植片の拒絶を予測するために、これらのマーカーを使用する方法を提供する。本マーカーは、補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）、α−１抗キモトリプシンＣ末端断片（ＡＡＣＴ）、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（Ｃ−ｉｎｈ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、翻訳後修飾ＡｐｏＡ１、インター−アルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）およびアルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、その上、これらのタンパク質の断片も含む（表１および４および配列番号１から１８参照）。
【００１０】
本発明は、高い感度および特異性で達成され得る、患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、少なくとも９０％の感度および少なくとも９０％の特異性で拒絶を検出する。ある実施形態において、本方法は、（ａ）患者から得られる試料中の補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５キロダルトン（ｋＤａ）断片の量を測定し；（ｂ）患者試料中のＣ４Ａの５ｋＤａ断片の量を対照試料中の量と比較し；（ｃ）比較が、対照試料と比較した患者試料中のＣ４Ａの５ｋＤａ断片の増加を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出する、段階を含む。別の実施形態において、本方法は、（ａ）患者から得られる試料を、補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５キロダルトン（ｋＤａ）断片と特異的に結合する試薬と接触させ；（ｂ）試薬と患者試料との間の特異的結合の量を測定し；（ｃ）（ｂ）での特異的結合の量を、対照試料に対する試薬の特異的結合の量と比較し；（ｄ）（ｃ）での比較が、対照試料と比較した患者試料中のＣ４Ａの５ｋＤａ断片への特異的結合の増加を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出する、段階を含む。ある実施形態において、接触は、患者試料をアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）および／またはα−１抗キモトリプシンＣ末端断片（ＡＡＣＴ）に結合する試薬と接触させることをさらに含み、検出は、比較が対照試料と比較した患者試料中のＡｐｏＡｌおよび／またはＡＡＣＴの量の減少を示す場合に移植片拒絶の起こり易さを検出することをさらに含む。ある実施形態において、（ｂ）および（ｃ）の接触および比較は、患者試料をＡｐｏＡ１およびＡＡＣＴに結合する試薬と接触させることを含む。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、（ａ）患者から得られる試料を表１で列挙される２以上のマーカーを含む一連のバイオマーカーと特異的に結合する試薬と接触させ；（ｂ）試薬と患者試料との間の特異的結合の量を測定し；（ｃ）（ｂ）での特異的結合の量を対照試料に対する試薬の特異的結合の量と比較し；（ｄ）（ｃ）での比較が、対照試料と比較した患者試料中のバイオマーカーへの特異的結合の有意な増加または減少を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出する、段階を含む。いくつかの実施形態において、段階（ａ）から（ｃ）は、表１で列挙されるマーカーのうち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５から１９種類までに対して行われる。ある実施形態において、一連のマーカーは、表１で列挙される８以下のマーカーからなる。別の実施形態において、一連のマーカーは、表１で列挙される６以下のマーカーからなる。さらに別の実施形態において、一連のマーカーは、表１で列挙される４以下のマーカーからなる。
【００１２】
次のマーカーに対して、マーカー：Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（Ｃ１−ｉｎｈ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）への試薬の特異的結合が対照と比較して患者試料で増加する場合、および／または次のマーカー：ＡＡＣＴ、ＡｐｏＡ１、翻訳後修飾ＡｐｏＡ１、インター−アルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、アルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）への試薬の特異的結合が対照と比較して減少する場合、移植片拒絶の起こり易さが検出される。典型的な実施形態において、差異は、対照と比較して少なくとも１０％の減少または増加である。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法であって、（ａ）患者から得られる試料を、補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５１９１ダルトン断片、α−１抗キモトリプシンＣ末端断片（ＡＡＣＴ）およびＡｐｏＡ１からなり；場合によってはさらに補体Ｃ１阻害剤および／または表１で列挙されるマーカーからなる一連のマーカーと特異的に結合する試薬と接触させ；（ｂ）この試薬と試料との間の特異的結合の量を測定し；（ｃ）（ｂ）での特異的結合の量を対照試料と比較し；（ｄ）（ｃ）での比較が、対照試料と比較したＣ４Ａの５１９１ダルトン断片の増加またはＡＡＣＴおよび／またはＡｐｏＡｌの減少を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出する、段階を含む方法を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、前記測定は免疫アッセイを含む。他の実施形態において、測定は質量スペクトルを含む。試薬の代表例としては、抗体、核酸プローブまたは合成プローブが挙げられるが限定されない。プローブまたは抗体は、場合によっては検出可能マーカーで標識し得る。
【００１５】
実質臓器移植の例としては、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、腸および胸腺が挙げられるが限定されない。ある実施形態において、実質臓器移植片拒絶は、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶である。実質臓器移植片拒絶の他のタイプとしては、慢性拒絶、例えば慢性同種移植片腎症または尿細管萎縮を伴う間質性線維症などが挙げられる。
【００１６】
本発明は、Ｃ４Ａの５ｋＤａ断片、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴおよび、場合によっては表１で列挙される１以上のさらなるマーカーと特異的に結合する抗体を含むキットをさらに提供する。ある実施形態において、本キットは、Ｃ４Ａ（またはその５ｋＤａ断片）およびＡｐｏＡ１（またはアミノ酸１４８から１８３のその断片）および／またはＡＡＣＴ（またはアミノ酸３８５から４２２のその断片）に結合する試薬を含む。ある実施形態において、本キットは、ＡＡＣＴの５１９１Ｄａ断片およびＡｐｏＡ１と特異的に結合する試薬を含む。ある実施形態において、本キットは、抗体が固定化される固形支持体をさらに含む。固形支持体の例としては、マイクロタイタープレート、ビーズ、膜または当業者にとって公知の他の支持体が挙げられるが限定されない。ある実施形態において、抗体は、固形支持体に固定化される抗原への結合を介して固定化される。ある実施形態において、抗体は、ビーズまたは粒子、例えばルミネックスなどへの結合を介して固定化される。ある実施形態において、本キットは、発色性基質をさらに含む。
【００１７】
患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法であって、（ａ）患者から得られる試料を、補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）と特異的に結合する試薬と接触させ；（ｂ）この試薬と試料との間の特異的結合の量を測定し；（ｃ）（ｂ）での特異的結合の量を対照試料と比較し；（ｂ）での結合の量が対照と比較してより多いことが実質臓器移植片拒絶の起こり易さを示す、段階を含む方法がさらに提供される。
【００１８】
本発明の別の例示的な実施形態は、血漿または血清または他の体液中で、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤および／または表１における他の１６種類のタンパク質のうち１つを検出することによる、実質臓器同種移植片拒絶に関連がある患者においてペプチドおよび／またはタンパク質プロファイルを同定するための質量スペクトルアッセイであり、このアッセイは、（ａ）血漿、血清または他の体液中で質量スペクトルにより特異的なペプチドの特異的な量を測定し；（ｂ）（ａ）でのタンパク質／ペプチドの特異的な量を対照試料と比較し；対照と比較した特異的なペプチドの量がより多いかまたはより少ないことが、実質臓器移植片拒絶の起こり易さを示す、段階を含む。
【００１９】
本発明の別の例示的な実施形態は、血漿または血清中でα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤を検出することによる、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶に関連がある患者における血漿分子プロファイルについてスクリーニングするためのＥＬＩＳＡキットであり、本キットは、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体で被覆されたマイクロタイタープレート；（ｂ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性がある、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体−アルカリホスファターゼ複合物；（ｃ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート；および（ｄ）抗原標準物質としての、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤を含む。
【００２０】
患者における急性細胞性腎臓同種移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法であって、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤に対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を提供し；（ｂ）この抗体で被覆されたマイクロタイタープレートを提供し；（ｃ）このマイクロタイタープレートに血清または血漿を添加し；（ｄ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性があるアルカリホスファターゼ−抗体複合物をこのマイクロタイタープレートに提供し；（ｅ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェートをこのマイクロタイタープレートに提供し；（ｆ）段階（ａ）から（ｅ）の結果として起こる反応を標準曲線と比較して、正常個体と比較したα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤のレベルを決定する、段階を含む方法も提供される。
【００２１】
本発明の別の例示的な実施形態は、血漿または血清中でα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤を検出することにより急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある患者における血漿分子プロファイルについてスクリーニングするためのＥＬＩＳＡキットであり、このキットは、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体により被覆されたマイクロタイタープレート；（ｂ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性があるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体−アルカリホスファターゼ複合物；（ｃ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート；および（ｄ）抗原標準物質としての、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤を含む。
【００２２】
本発明の別の例示的な実施形態は、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤および／または表１に記載のタンパク質を検出することにより、実質臓器同種移植片拒絶と関連がある患者における分子プロファイルについて血漿、血清および／または体液中でスクリーニングするためのＬｕｍｉｎｅｘキットであり、このキットは、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤および／または表１で列挙される他のタンパク質に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体で被覆されたマイクロビーズアレイ；（ｂ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤および／または表１で列挙される他のタンパク質と反応性があるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体蛍光色素複合物；（ｃ）および抗原標準物質としての、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤または表１の他のタンパク質を含む。
【００２３】
本発明の実施形態は、ＡＡＣＴおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／またはＳＡＡおよび／またはＣＲＰおよび／またはＡ２Ｍおよび／またはＡｐｏＥおよび／またはＩＴＩＨ４および／またはＡ１ＡＴおよび／またはＣ−ｉｎｈおよび／またはこれらのポリペプチドの断片の試料中での検出および／または定量のための、アッセイおよび方法を提供する。本発明の典型的な実施形態は、哺乳動物、特にヒトの、血液、血漿、血清または他の体液などの、生体液試料との使用に適切であるタイプのＥＬＩＳＡ型のアッセイを利用する。方法論的実施形態は、生体液試料中のＡＡＣＴおよび／またはＣ４Ａおよび／またはＡｐｏＡ１ポリペプチド、これらのマーカーの断片および／または本明細書中に記載のマーカーの組み合わせの量について試験することを含む。ある一定の実施形態は、例えば急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある患者における血漿分子プロファイルを同定するために、α−１抗キモトリプシン、ＡｐｏＡ１、補体Ｃ１阻害剤およびＣ４Ａの５１９１Ｄａペプチドを一緒に試験する。ある一定の実施形態は、１（例えば５１９１Ｄａ  Ｃ４Ａペプチド）または２（例えばＣ４Ａペプチド＋α−１抗キモトリプシンまたはＡｐｏＡ１）または３（例えばα−１抗キモトリプシン、ＡｐｏＡ１および５１９１Ｄａ  Ｃ４Ａペプチド）またはこれらのバイオマーカー４種類全てを試験する。
【００２４】
本発明のある一定の実施形態において、５１９１Ｄａ  Ｃ４Ａペプチドを精製し、次いで、ＥＬＩＳＡテストなどで使用することができる５１９１Ｄａペプチドに特異的なポリクローナル抗体を産生させるために、この精製ペプチドをウサギなどの動物に注射する。同様に、タンパク質に対するモノクローナル抗体標品は、精製５１９１Ｄａペプチドをマウスに注射し、脾臓およびリンパ節細胞を回収し、これらの細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生させるために得られたハイブリドーマ細胞を使用することによって調製され得る。
【００２５】
本発明のある例示的な実施形態は、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある患者における血漿分子プロファイルについてスクリーニングするために、血漿中でα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤を検出するための方法であって、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤に対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を提供し；（ｂ）この抗体で被覆されたマイクロタイタープレートを提供し；（ｃ）このマイクロタイタープレートに血清または血漿を添加し；（ｄ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性があるアルカリホスファターゼ−抗体複合物をこのマイクロタイタープレートに提供し；（ｅ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェートをこのマイクロタイタープレートに提供し；（ｆ）段階（ａ）から（ｅ）の結果として起こる反応を標準曲線と比較して、正常個体と比較したα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤のレベルを決定する段階を含む方法である。
【００２６】
本発明の別の例示的な実施形態は、血漿または血清中でα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤を検出することによる、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある患者における血漿分子プロファイルについてスクリーニングするためのＥＬＩＳＡキットであり、このキットは、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体で被覆されたマイクロタイタープレート；（ｂ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性があるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体−アルカリホスファターゼ複合物；（ｃ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート；および（ｄ）抗原標準物質としての、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】腎臓同種移植片拒絶を検出する候補血漿タンパク質。（１Ａ）拒絶対拒絶後試料を検出するためのバイオマーカー候補を評価する分類および回帰木（ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎおよびＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ、ＣＡＲＴ）分析。（１Ｂ）拒絶（群Ａ、ｎ＝１７）、拒絶後（群Ｂ、ｎ＝１７）および非拒絶（群Ｃ、ｎ＝４８）血漿試料における、４４６７Ｄａおよび５１９１Ｄａバイオマーカー候補の修正強度の箱ひげ図。（１Ｃ）生検により非拒絶と証明された患者（ｎ＝１９）と比較した、拒絶時および拒絶後（ｎ＝１６）の拒絶患者に対して生検時に測定した血清クレアチニンレベルの箱ひげ図。
【図１Ｂ】腎臓同種移植片拒絶を検出する候補血漿タンパク質。（１Ａ）拒絶対拒絶後試料を検出するためのバイオマーカー候補を評価する分類および回帰木（ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎおよびＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ、ＣＡＲＴ）分析。（１Ｂ）拒絶（群Ａ、ｎ＝１７）、拒絶後（群Ｂ、ｎ＝１７）および非拒絶（群Ｃ、ｎ＝４８）血漿試料における、４４６７Ｄａおよび５１９１Ｄａバイオマーカー候補の修正強度の箱ひげ図。（１Ｃ）生検により非拒絶と証明された患者（ｎ＝１９）と比較した、拒絶時および拒絶後（ｎ＝１６）の拒絶患者に対して生検時に測定した血清クレアチニンレベルの箱ひげ図。
【図１Ｃ】腎臓同種移植片拒絶を検出する候補血漿タンパク質。（１Ａ）拒絶対拒絶後試料を検出するためのバイオマーカー候補を評価する分類および回帰木（ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎおよびＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ、ＣＡＲＴ）分析。（１Ｂ）拒絶（群Ａ、ｎ＝１７）、拒絶後（群Ｂ、ｎ＝１７）および非拒絶（群Ｃ、ｎ＝４８）血漿試料における、４４６７Ｄａおよび５１９１Ｄａバイオマーカー候補の修正強度の箱ひげ図。（１Ｃ）生検により非拒絶と証明された患者（ｎ＝１９）と比較した、拒絶時および拒絶後（ｎ＝１６）の拒絶患者に対して生検時に測定した血清クレアチニンレベルの箱ひげ図。
【図２Ａ】α−１抗キモトリプシンおよびアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）のＣ末端断片の同定。（２Ａ）４４６７Ｄａバイオマーカー（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより測定した場合の平均質量）候補ペプチドを含有するＣ８高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製分画の、高解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。モノアイソトピック質量差はＳＡＬＶ（Ｓ、セリン；Ａ、アラニン；Ｌ、ロイシン；およびＶ、バリン）の配列ラダーを示す。（２Ｂ）α−１−抗キモトリプシンに対するモノクローナル抗体を用いた血漿試料の免疫沈降。平均質量（Ｄａ）とともに番号付けしたペプチドを与える。（２Ｃ）ヒトＡｐｏＡ１に対するモノクローナル抗体を用いた血漿試料の免疫沈降。（２Ｄ）拒絶（群Ａ、ｎ＝１７）、拒絶後（群Ｂ、ｎ＝１７）および非拒絶（群Ｃ、ｎ＝４８）血漿試料におけるＡｐｏＡ１のＳＥＬＤＩ修正ピーク強度の箱ひげ図。
【図２Ｂ】α−１抗キモトリプシンおよびアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）のＣ末端断片の同定。（２Ａ）４４６７Ｄａバイオマーカー（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより測定した場合の平均質量）候補ペプチドを含有するＣ８高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製分画の、高解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。モノアイソトピック質量差はＳＡＬＶ（Ｓ、セリン；Ａ、アラニン；Ｌ、ロイシン；およびＶ、バリン）の配列ラダーを示す。（２Ｂ）α−１−抗キモトリプシンに対するモノクローナル抗体を用いた血漿試料の免疫沈降。平均質量（Ｄａ）とともに番号付けしたペプチドを与える。（２Ｃ）ヒトＡｐｏＡ１に対するモノクローナル抗体を用いた血漿試料の免疫沈降。（２Ｄ）拒絶（群Ａ、ｎ＝１７）、拒絶後（群Ｂ、ｎ＝１７）および非拒絶（群Ｃ、ｎ＝４８）血漿試料におけるＡｐｏＡ１のＳＥＬＤＩ修正ピーク強度の箱ひげ図。
【図２Ｃ】α−１抗キモトリプシンおよびアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）のＣ末端断片の同定。（２Ａ）４４６７Ｄａバイオマーカー（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより測定した場合の平均質量）候補ペプチドを含有するＣ８高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製分画の、高解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。モノアイソトピック質量差はＳＡＬＶ（Ｓ、セリン；Ａ、アラニン；Ｌ、ロイシン；およびＶ、バリン）の配列ラダーを示す。（２Ｂ）α−１−抗キモトリプシンに対するモノクローナル抗体を用いた血漿試料の免疫沈降。平均質量（Ｄａ）とともに番号付けしたペプチドを与える。（２Ｃ）ヒトＡｐｏＡ１に対するモノクローナル抗体を用いた血漿試料の免疫沈降。（２Ｄ）拒絶（群Ａ、ｎ＝１７）、拒絶後（群Ｂ、ｎ＝１７）および非拒絶（群Ｃ、ｎ＝４８）血漿試料におけるＡｐｏＡ１のＳＥＬＤＩ修正ピーク強度の箱ひげ図。
【図２Ｄ】α−１抗キモトリプシンおよびアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）のＣ末端断片の同定。（２Ａ）４４６７Ｄａバイオマーカー（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより測定した場合の平均質量）候補ペプチドを含有するＣ８高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製分画の、高解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。モノアイソトピック質量差はＳＡＬＶ（Ｓ、セリン；Ａ、アラニン；Ｌ、ロイシン；およびＶ、バリン）の配列ラダーを示す。（２Ｂ）α−１−抗キモトリプシンに対するモノクローナル抗体を用いた血漿試料の免疫沈降。平均質量（Ｄａ）とともに番号付けしたペプチドを与える。（２Ｃ）ヒトＡｐｏＡ１に対するモノクローナル抗体を用いた血漿試料の免疫沈降。（２Ｄ）拒絶（群Ａ、ｎ＝１７）、拒絶後（群Ｂ、ｎ＝１７）および非拒絶（群Ｃ、ｎ＝４８）血漿試料におけるＡｐｏＡ１のＳＥＬＤＩ修正ピーク強度の箱ひげ図。
【図３Ａ】急性細胞性拒絶との関連についての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）の検証。（３Ａ）オリジナルコホートのサブセットの血漿試料のＥＬＩＳＡ結果の箱ひげ図。（３Ｂ）第二の独立コホートの血漿試料のＥＬＩＳＡ結果の箱ひげ図。（３Ｃ）腎臓生検の前−３から０日内に回収された試料を有した受容者におけるＡｐｏＡ１レベルの箱ひげ図。２５検体の拒絶および２２検体の非拒絶試料を比較した。非拒絶での平均ＡｐｏＡ１レベルは０．２２ＳＤ±０．０６であり、拒絶では０．１３ＳＤ±０．０４であった。ＡｐｏＡ１のレベルは、生検で非拒絶が証明された受容者と比較して、拒絶時に有意に低かった（Ｐ値＜０．０００１）。（３Ｄ）全３期間（拒絶前、拒絶および拒絶後）からの血漿試料を有した１４名の患者に対する個々のＡｐｏＡ１の結果を示す線グラフ。（Ｅ）０．１６７ｍｇ／ｄＬのカットポイントおよび７６％の感度および８６％の特異性を示す、オリジナルコホートおよび第二コホート両方を合わせたものからの非拒絶試料と拒絶試料を比較するＲＯＣ分析。
【図３Ｂ】急性細胞性拒絶との関連についての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）の検証。（３Ａ）オリジナルコホートのサブセットの血漿試料のＥＬＩＳＡ結果の箱ひげ図。（３Ｂ）第二の独立コホートの血漿試料のＥＬＩＳＡ結果の箱ひげ図。（３Ｃ）腎臓生検の前−３から０日内に回収された試料を有した受容者におけるＡｐｏＡ１レベルの箱ひげ図。２５検体の拒絶および２２検体の非拒絶試料を比較した。非拒絶での平均ＡｐｏＡ１レベルは０．２２ＳＤ±０．０６であり、拒絶では０．１３ＳＤ±０．０４であった。ＡｐｏＡ１のレベルは、生検で非拒絶が証明された受容者と比較して、拒絶時に有意に低かった（Ｐ値＜０．０００１）。（３Ｄ）全３期間（拒絶前、拒絶および拒絶後）からの血漿試料を有した１４名の患者に対する個々のＡｐｏＡ１の結果を示す線グラフ。（Ｅ）０．１６７ｍｇ／ｄＬのカットポイントおよび７６％の感度および８６％の特異性を示す、オリジナルコホートおよび第二コホート両方を合わせたものからの非拒絶試料と拒絶試料を比較するＲＯＣ分析。
【図３Ｃ】急性細胞性拒絶との関連についての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）の検証。（３Ａ）オリジナルコホートのサブセットの血漿試料のＥＬＩＳＡ結果の箱ひげ図。（３Ｂ）第二の独立コホートの血漿試料のＥＬＩＳＡ結果の箱ひげ図。（３Ｃ）腎臓生検の前−３から０日内に回収された試料を有した受容者におけるＡｐｏＡ１レベルの箱ひげ図。２５検体の拒絶および２２検体の非拒絶試料を比較した。非拒絶での平均ＡｐｏＡ１レベルは０．２２ＳＤ±０．０６であり、拒絶では０．１３ＳＤ±０．０４であった。ＡｐｏＡ１のレベルは、生検で非拒絶が証明された受容者と比較して、拒絶時に有意に低かった（Ｐ値＜０．０００１）。（３Ｄ）全３期間（拒絶前、拒絶および拒絶後）からの血漿試料を有した１４名の患者に対する個々のＡｐｏＡ１の結果を示す線グラフ。（Ｅ）０．１６７ｍｇ／ｄＬのカットポイントおよび７６％の感度および８６％の特異性を示す、オリジナルコホートおよび第二コホート両方を合わせたものからの非拒絶試料と拒絶試料を比較するＲＯＣ分析。
【図３Ｄ】急性細胞性拒絶との関連についての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）の検証。（３Ａ）オリジナルコホートのサブセットの血漿試料のＥＬＩＳＡ結果の箱ひげ図。（３Ｂ）第二の独立コホートの血漿試料のＥＬＩＳＡ結果の箱ひげ図。（３Ｃ）腎臓生検の前−３から０日内に回収された試料を有した受容者におけるＡｐｏＡ１レベルの箱ひげ図。２５検体の拒絶および２２検体の非拒絶試料を比較した。非拒絶での平均ＡｐｏＡ１レベルは０．２２ＳＤ±０．０６であり、拒絶では０．１３ＳＤ±０．０４であった。ＡｐｏＡ１のレベルは、生検で非拒絶が証明された受容者と比較して、拒絶時に有意に低かった（Ｐ値＜０．０００１）。（３Ｄ）全３期間（拒絶前、拒絶および拒絶後）からの血漿試料を有した１４名の患者に対する個々のＡｐｏＡ１の結果を示す線グラフ。（Ｅ）０．１６７ｍｇ／ｄＬのカットポイントおよび７６％の感度および８６％の特異性を示す、オリジナルコホートおよび第二コホート両方を合わせたものからの非拒絶試料と拒絶試料を比較するＲＯＣ分析。
【図４】腎臓同種移植片拒絶と診断された患者のＡｐｏＡ１レベル（平均０．１５６＋／−０．７７）が、非拒絶（平均０．２３９＋／−０．１６）と比較して有意に低かったことを示す、生検で非拒絶者と証明された者と生検で拒絶者と証明された者との間のＡｐｏＡ１比較。（Ｐ＜０．００２４）。
【図５】生検で非拒絶者と証明された者と生検で拒絶者と証明された者との間のＡｐｏＡ１比較の感度および特異性。０．１９５のカットポイントを用いて、ＡｐｏＡ１レベルは、７５％の感度および８２％の特異性で、７９％の確率で拒絶患者を的確に分類した。
【図６】抗体に基づくＥＬＩＳＡを用いたアルファ−２−マクログロブリンの検証。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書中に記載の発明は、移植片拒絶を、検出し、予測し、監視するために、ヒト血漿中に存在する特異的なタンパク質マーカーを使用することができるという発見に基づく。これらのタンパク質のレベルの変化の評価によって、拒絶のリスクがある患者を判定する。
【００２９】
定義
本願において使用される科学および技術用語は全て、別段の指定がない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本願で使用される場合、次の語または句は、指定される意味を有する。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、対象からの「試料」は、血漿、血液、血清、唾液、尿，または他の体液を含有する対象から得られる検体を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、何らかのヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、ニワトリ、両生類、爬虫類、げっ歯類などを含む。典型的な実施形態において、対象または患者はヒトである。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「対照」試料は、個々のマーカーの正常測定値または比較のために使用しようとするマーカーのベースライン量の代表である試料を意味する。一般的には、ベースラインは同じ対象または患者から得られる測定値である。試料は、試験のために使用される実際の試料、または対応するマーカーの既知の正常測定値に基づく、参照レベルまたは範囲であり得る。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５キロダルトン（ｋＤａ）断片」は、分子量がおよそ５ｋＤａであるＣ４Ａの断片を指し、配列番号３に対応する５，０５１ＤａのＣ４Ａ断片および配列番号２に対応する５，１９１ＤａのＣ４Ａ断片を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ４Ａの５ｋＤａ断片は５，１９１Ｄａ断片である。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、明らかな別段の断りがない限り、少なくとも１つを意味する。
【００３５】
マーカーおよび方法
本発明は、一連のタンパク質マーカーおよび患者の免疫状況の評価のために、および臓器移植の拒絶を予測するために、これらのマーカーを使用する方法を提供する。マーカーとしては、補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）、α−１抗キモトリプシンＣ末端断片（ＡＡＣＴ）、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（Ｃ−ｉｎｈ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、翻訳後修飾ＡｐｏＡ１、インター−アルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）およびアルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）ならびにこれらのタンパク質の断片（表１および４および配列番号１から１８参照）が挙げられる。患者の血漿または他の体液中でのこれらのマーカーのレベルの変化は、同種移植片拒絶を予測する。
【表１】
2017513009.tif 000003
【００３６】
本発明は、患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、８０％を超える感度および特異性で拒絶の起こり易さを検出し、典型的な実施形態においては、少なくとも９０％の感度および少なくとも９０％の特異性で検出する。ある実施形態において、本方法は、（ａ）患者から得られる試料中で補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５キロダルトン（ｋＤａ）断片の量を測定し；（ｂ）患者試料中のＣ４Ａの５ｋＤａ断片の量を対照試料中の量と比較し；（ｃ）比較が、対照試料と比較した患者試料中のＣ４Ａの５ｋＤａ断片の増加を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出する、段階を含む。別の実施形態において、本方法は、（ａ）患者から得られる試料を補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５キロダルトン（ｋＤａ）断片と特異的に結合する試薬と接触させ；（ｂ）試薬と患者試料との間の特異的結合の量を測定し；（ｃ）（ｂ）での特異的結合の量を対照試料中の試薬の特異的結合の量と比較し；（ｄ）（ｃ）での比較が、対照試料と比較した患者試料中のＣ４Ａの５ｋＤａ断片への特異的結合の増加を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出する、段階を含む。ある実施形態において、接触は、患者試料をアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）および／またはα−１抗キモトリプシンＣ末端断片（ＡＡＣＴ）に結合する試薬と接触させることをさらに含み、検出は、比較が、対照試料と比較した患者試料中のＡｐｏＡｌおよび／またはＡＡＣＴの量の減少を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出することをさらに含む。ある実施形態において、接触および比較は、患者試料をＡｐｏＡ１およびＡＡＣＴに結合する試薬と接触させることを含む。
【００３７】
別の実施形態において、本発明は、患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、（ａ）患者から得られる試料を、表１で列挙される２以上マーカーを含む一連のバイオマーカーと特異的に結合する試薬と接触させ；（ｂ）試薬と患者試料との間の特異的結合の量を測定し；（ｃ）（ｂ）での特異的結合の量を対照試料中の試薬の特異的結合の量と比較し；（ｄ）（ｃ）での比較が、対照試料と比較した患者試料中でのバイオマーカーへの特異的結合の増加または減少を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出する段階を含む。いくつかの実施形態において、段階（ａ）から（ｃ）は、表１で列挙されるマーカーのうち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５から１９種類以下に対して行われる。ある実施形態において、一連のマーカーは、表１で列挙される８以下のマーカーからなる。別の実施形態において、一連のマーカーは、表１で列挙される６以下のマーカーからなる。さらに別の実施形態において、一連のマーカーは、表１で列挙される４以下のマーカーからなる。
【００３８】
次のマーカー：断片を含め、Ｃ４Ａ、Ｃ１プロテアーゼ阻害剤（Ｃ１−ｉｎｈ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、に対して、マーカーへの試薬の特異的結合が対照と比較して増加する場合、および／または次のマーカー：断片を含め、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＡ１、翻訳後修飾ＡｐｏＡ１、インター−アルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、アルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）への試薬の特異的結合が対照と比較して減少する場合、移植片拒絶の起こり易さが検出される。典型的な実施形態において、差異は、対照と比較して少なくとも１０％の減少または増加である。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法であって、（ａ）患者から得られる試料を、補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）の５１９１ダルトン断片、α−１抗キモトリプシンＣ末端断片（ＡＡＣＴ）およびＡｐｏＡ１からなる；および場合によってはさらに補体Ｃ１阻害剤および／または表１で列挙されるマーカーからなる一連のマーカーと特異的に結合する試薬と接触させ；（ｂ）この試薬と試料との間の特異的結合の量を測定し；（ｃ）（ｂ）での特異的結合の量を対照試料への試薬の特異的結合の量と比較し；および（ｄ）（ｃ）での比較が、対照試料と比較したＣ４Ａの５１９１ダルトン断片の増加またはＡＡＣＴおよび／またはＡｐｏＡＩの減少を示す場合、移植片拒絶の起こり易さを検出する、段階を含む方法を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、測定は免疫アッセイを含む。他の実施形態において、測定は質量スペクトルを含む。他のアッセイ方法としては、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、ウエスタンブロッティングおよびサロゲートＤＮＡ鋳型の増幅が挙げられる。試薬の代表例としては、抗体、核酸プローブまたは合成プローブが挙げられるが限定されない。プローブまたは抗体は、場合によっては検出可能マーカーで標識し得る。いくつかの実施形態において、試薬は検出可能マーカーで標識され、および／または発色または蛍光発生基質を用いて観察される。
【００４１】
実質臓器移植の例としては、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、腸および胸腺が挙げられるが限定されない。ある実施形態において、実質臓器移植片拒絶は、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶である。他のタイプの実質臓器移植片拒絶としては、慢性拒絶、例えば慢性同種移植片腎症または尿細管萎縮を伴う間質性線維症が挙げられる。
【００４２】
患者における実質臓器移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法であって、（ａ）患者から得られる試料を、補体Ｃ４アナフィラトキシン（Ｃ４Ａ）と特異的に結合する試薬と接触させ；（ｂ）この試薬と試料との間の特異的結合の量を測定し；（ｃ）（ｂ）での特異的結合の量を対照試料と比較し；（ｂ）での結合の量が対照と比較してより多いことが実質臓器移植片拒絶の起こり易さを示す、段階を含む方法がさらに提供される。
【００４３】
本発明の別の例示的な実施形態は、血漿または血清または他の体液中でα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤および／または表１における他の１６種類のタンパク質のうち１つを検出することによって、実質臓器同種移植片拒絶と関連がある患者におけるペプチドおよび／またはタンパク質プロファイルを同定するための質量スペクトルアッセイであり、このアッセイは、（ａ）血漿、血清または他の体液中で質量スペクトルにより特異的なペプチドの特異的な量を測定し；（ｂ）（ａ）でのタンパク質／ペプチドの特異的な量を対照試料と比較し；対照と比較して特異的なペプチドの量がより多いかまたはより少ないことが実質臓器移植片拒絶の起こり易さを示す、段階を含む。
【００４４】
患者における急性細胞性腎臓同種移植片拒絶の起こり易さを検出するための方法であって、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤に対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を提供し；（ｂ）この抗体で被覆されたマイクロタイタープレートを提供し；（ｃ）このマイクロタイタープレートに血清または血漿を添加し；（ｄ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性があるアルカリホスファターゼ−抗体複合物をマイクロタイタープレートに提供し；（ｅ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェートをこのマイクロタイタープレートに提供し；（ｆ）段階（ａ）から（ｅ）の結果として起こる反応を標準曲線と比較して、正常個体と比較したα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤のレベルを決定する、段階を含む方法も提供される。
【００４５】
本発明の実施形態は、ＡＡＣＴおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／またはＳＡＡおよび／またはＣＲＰおよび／またはＡ２Ｍおよび／またはＡｐｏＥおよび／またはＩＴＩＨ４および／またはＡ１ＡＴおよび／またはＣ−ｉｎｈおよび／またはこれらのポリペプチドの断片の、試料中での検出および／または定量のためのアッセイおよび方法を提供する。本発明の典型的な実施形態は、哺乳動物、特にヒトの、血液、血漿、血清または他の体液などの、生体液試料との使用に適切であるタイプのＥＬＩＳＡ型のアッセイを利用する。方法論的実施形態は、生体液試料中のＡＡＣＴおよび／またはＣ４Ａおよび／またはＡｐｏＡ１ポリペプチド、これらのマーカーの断片および／または本明細書中に記載のマーカーの組み合わせの量について試験することを含む。ある一定の実施形態は、例えば急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある患者における血漿分子プロファイルを同定するために、α−１抗キモトリプシン、ＡｐｏＡ１、補体Ｃ１阻害剤およびＣ４Ａの５１９１Ｄａペプチドを一緒に試験する。ある一定の実施形態は、１（例えば５１９１Ｄａ  Ｃ４Ａペプチド）または２（例えばＣ４Ａペプチド＋α−１抗キモトリプシンまたはＡｐｏＡ１）または３（例えばα−１抗キモトリプシン、ＡｐｏＡ１および５１９１Ｄａ  Ｃ４Ａペプチド）またはこれらのバイオマーカー全４種類を試験する。
【００４６】
本発明のある一定の実施形態において、５１９１Ｄａ  Ｃ４Ａペプチドを精製し、次いで、ＥＬＩＳＡテストなどで使用することができる５１９１Ｄａペプチドに特異的なポリクローナル抗体を産生させるために、この精製ペプチドをウサギなどの動物に注射する。同様に、タンパク質に対するモノクローナル抗体標品は、精製５１９１Ｄａペプチドをマウスに注射し、脾臓およびリンパ節細胞を回収し、これらの細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生させるために得られたハイブリドーマ細胞を使用することによって調製され得る。
【００４７】
ある例示的な本発明の実施形態は、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある患者における血漿分子プロファイルについてスクリーニングするために、血漿中でα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤を検出するための方法であって、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤に対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を提供し；（ｂ）この抗体で被覆されたマイクロタイタープレートを提供し；（ｃ）このマイクロタイタープレートに血清または血漿を添加し；（ｄ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性があるアルカリホスファターゼ−抗体複合物をこのマイクロタイタープレートに提供し；（ｅ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェートをこのマイクロタイタープレートに提供し；（ｆ）段階（ａ）から（ｅ）の結果として起こる反応を標準曲線と比較して、正常個体と比較したα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤のレベルを決定する、段階を含む方法である。
【００４８】
マーカーの量は、これが、対照中に存在する量と統計学的に有意な量、異なる場合、増加または減少しているとみなされる。いくつかの実施形態において、差異は少なくとも１０％の増加または減少であり；他の実施形態において、差異は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上である。他の実施形態において、参照範囲は、正常、対照試料中に存在するマーカーの量に対して特定され、試験試料のマーカー量がそのマーカーに対する参照範囲の外側である場合、拒絶が起こり易い。典型的な実施形態において、試料は血漿試料である。血清、尿および唾液を含め、他の体液を試料のために使用し得る。
【００４９】
マーカーの次の組み合わせが本発明の方法での使用のために企図される：Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ；ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ；ＡＡＣＴ、ＣＲＰ；ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ；Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＣＲＰ；ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡｌ、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＡ１、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡＡＣＴ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ４Ａ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ４Ａ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４：ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡ
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；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＡ１、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡＡＣＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；；；１ｓｔ３ｐｌｕｓ：；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ；Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＣＲＰ；ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、Ｃ１−ｉｎｈ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ａ１ＡＴ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＳＡＡ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；Ｃ１−ｉｎｈ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ；ＳＡＡ、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ、ＩＴＩＨ４、Ａ２Ｍ。
【００５０】
対照と比較した増加が拒絶を示すマーカーの例としては、Ｃ４Ａ、ＣＲＰ、ＳＡＡ、Ｃ１−ｉｎｈ、Ａ１ＡＴおよびＡｐｏＥが挙げられる。対照と比較した減少が拒絶を示すマーカーとしては、ＡＡＣＴ、ＡｐｏＡ１、ＩＴＩＨ４およびＡ２Ｍが挙げられる。
【００５１】
ある実施形態において、測定はクロマトグラフィーまたは分光法を含む。クロマトグラフィーは、ガスまたは液体クロマトグラフィーであり得る。分光法は質量スペクトルであり得る。マーカー検出の他の既知の方法も企図され、関心のある個々のマーカーの特徴に基づいて選択し得る。使用し得る他のアッセイの例としては、免疫アッセイおよび電気化学検出が挙げられる。試験試料の測定値は、試験試料中に存在するマーカーの量を対照試料中のマーカーの量と、またはマーカーの既知の正常レベルと比較するなど、対照と直接比較し得る。あるいは、いくつかの実施形態において、マーカー量を同じ対象に対するベースライン量と比較する。
【００５２】
次の特許文書：米国特許第７，６６６，５９６号明細書、米国特許出願公開第２００９／０３０４７０５号明細書；米国特許第７，６９１，５６９号明細書；米国特許第７，６４５，５７５号明細書；国際公開第２００９／１０１０８３号パンフレット；国際公開第２００９／０４５１０４号パンフレット；米国特許出願公開第２００９／００２２７３０号明細書；国際公開第２００７／１０４５３７号パンフレット；国際公開第２００８／０２７４２８号パンフレット；米国特許出願公開第２００８／００３８７４６号明細書；国際公開第２００７／１３８０１１号パンフレット；国際公開第２００７／１２１９２２号パンフレット；米国特許出願公開第２００７／０２０２０８５号明細書；米国特許第７，２３５，３５８号明細書；米国特許出願公開第２００７／００３７１６６号明細書；米国特許出願公開第２００６／００８８８３６号明細書；米国特許第７，０２６，１２１号明細書；国際公開第２００４／０４２３４６号；米国特許第７，１９２，７１６号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１０４３７１号明細書；および国際公開第０１／８１９１６号は、移植片拒絶の分子診断に関する。次の特許公開は、移植片拒絶に対する遺伝子型および表現型試験に関する：米国特許出願公開第２００７７２３５３５８号明細書；国際公開第２００６０２９１８４号パンフレット；米国特許出願公開第２００７００８２３５６号明細書；欧州特許第０００２５３５１４号明細書；欧州特許第０００９５３２２０号明細書；米国特許出願公開第２００４０００５８４７２８号明細書；国際公開第２００５０７７９８０号パンフレット；米国特許出願公開第２００４０００５５７２３４号明細書；国際公開第０２０７５３０６号パンフレット；米国特許出願公開第２００６０００６４１６２５号明細書；および米国特許出願公開第２００５０１５２８９３号明細書。
【００５３】
キット
本明細書中に記載の方法での使用に対して、キットもまた本発明の範囲内である。このようなキットは、各容器が本方法で使用しようとする個別の要素のうち１つを含む、バイアル、チューブなどの１以上の容器を受け入れるために区画化される、担体、包装または容器を含み得る。本キットの、プローブ、抗体および他の試薬は、凍結、凍結乾燥を含む何らかの適切な形態で、またはＴＢＳまたはＰＢＳなどの医薬的に許容可能な緩衝液中で、提供され得る。本キットはまた、緩衝液（すなわち、ＴＢＳ、ＰＢＳ）、ブロッキング剤（脱脂乳、正常血清、Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤、ＢＳＡまたはカゼインを含む溶液）および／または検出試薬（すなわち、ヤギ抗マウスＩｇＧビオチン、ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合物、アロフィコシアニン、Ｂ−フィコエリスリン、Ｒ−フィコエリスリン、ペルオキシダーゼ、蛍光（すなわちＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）および／または染色キット（すなわち、ＡＢＣ染色キット、Ｐｉｅｒｃｅ））などでの、インビトロまたはインビボでの試薬の利用に必要とされる他の試薬も含み得る。本キットは、例えば液体またはガスクロマトグラフィー、分光法、電気化学アッセイ、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（すなわちウエスタンブロット）、免疫細胞化学、免疫組織化学など、上述の一般に利用されるアッセイにおいて、抗体、プローブおよび他の試薬を使用するための、他の試薬および／または説明書も含み得る。
【００５４】
ある実施形態において、本キットは、精製型で試薬を提供する。別の実施形態において、試薬は、単独で、またはアビジン複合検出試薬（すなわち抗体）と一緒に、の何れかで、ビオチン化型で提供される免疫試薬である。別の実施形態において、本キットは、抗原を直接検出するために使用され得る蛍光標識された免疫試薬を含む。これらの系の何れかを使用するために必要とされる緩衝液などは当技術分野で周知であり、エンドユーザーにより調製され得るか、またはキットの構成成分として提供され得る。本キットは、陽性および陰性対照タンパク質および／または組織試料を含有する固形支持体も含み得る。例えば、スポッティングまたはウエスタンブロット型アッセイを行うためのキットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは実験試料用のさらなるスペースとともに予め固定した対照試料を含有するナイロンもしくは他のメンブレンでの使用のための対照細胞または組織溶解液を含み得る。
【００５５】
本発明のキットは、一般的には、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用のための説明がある添付文書を含め、上述の容器および商業的および使用者の立場から所望される材料を含む１以上の他の容器を含む。さらに、ラベルは、具体的な適用について組成物が使用されることを示すために容器上で提供され得、上述のものなど、使用のための指示も示し得る。指示およびまたは他の情報もまた、キットとともに含まれる添付文書に含まれ得る。
【００５６】
本発明は、Ｃ４Ａの５ｋＤａ断片、ＡｐｏＡ１、ＡＡＣＴおよび、場合によっては、表１で列挙される１以上のさらなるマーカーと特異的に結合する抗体を含むキットをさらに提供する。ある実施形態において、本キットは、Ｃ４Ａ（またはその５ｋＤａ断片）およびＡｐｏＡ１（またはアミノ酸１４８から１８３でのその断片）および／またはＡＡＣＴ（またはアミノ酸３８５から４２２でのその断片）に結合する試薬を含む。ある実施形態において、本キットは、ＡＡＣＴおよびＡｐｏＡ１の５１９１Ｄａ断片と特異的に結合する試薬を含む。ある実施形態において、本キットは、抗体が固定化される固形支持体をさらに含む。固形支持体の例としては、マイクロタイタープレート、ビーズ、膜または当業者にとって公知の他の支持体が挙げられるが限定されない。ある実施形態において、抗体は、固形支持体に固定化される抗原への結合を介して固定化される。ある実施形態において、抗体は、ルミネックスなどのビーズまたは粒子への結合を介して固定化される。ある実施形態において、本キットは発色性基質をさらに含む。
【００５７】
本発明の別の例示的な実施形態は、血漿または血清中でα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤を検出することによって、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある患者における血漿分子プロファイルについてスクリーニングするためのＥＬＩＳＡキットであり、このキットは、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体で被覆されたマイクロタイタープレート；（ｂ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性があるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体−アルカリホスファターゼ複合物；（ｃ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート；および（ｄ）抗原標準物質としての、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／または本明細書中で開示される５１９１ペプチドおよび／または補体Ｃ１阻害剤を含む。
【００５８】
本発明の別の例示的な実施形態は、血漿または血清中でα−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤を検出することによって、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある患者における血漿分子プロファイルについてスクリーニングするためのＥＬＩＳＡキットであり、このキットは、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体で被覆されたマイクロタイタープレート；（ｂ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤と反応性があるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体−アルカリホスファターゼ複合物；（ｃ）ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート；および（ｄ）抗原標準物質としての、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤を含む。
【００５９】
本発明の別の例示的な実施形態は、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤および／または表１に記載のタンパク質を検出することによって、実質臓器同種移植片拒絶と関連がある患者における分子プロファイルについて血漿、血清および／または生体液中でスクリーニングするためのＬｕｍｉｎｅｘキットであり、このキットは、（ａ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤および／または表１で列挙される他のタンパク質に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体で被覆されたマイクロビーズアレイ；（ｂ）α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤および／または表１で列挙される他のタンパク質と反応性があるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体蛍光色素複合物；（ｃ）および抗原標準物質としての、α−１抗キモトリプシンおよび／またはＡｐｏＡ１および／またはＣ４Ａおよび／または補体Ｃ１阻害剤または表１の他のタンパク質を含む。
【００６０】
実施例
次の実施例は、本発明を例示し、これをなし、使用することにおいて当業者を支援するために与えられる。この実施例は、何ら本発明の範囲を限定するものではない。
【００６１】
実施例１：アポリポタンパク質Ａ１およびα−１抗キモトリプシンのＣ末端断片は急性腎臓同種移植片拒絶と関連がある血漿バイオマーカーである。
この実施例は、ケース対照アプローチおよびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用して、腎臓同種移植片拒絶と関連がある血漿タンパク質の同定を明らかにする。各拒絶患者から、２検体の血漿試料（一方は生検日に近く、他方は生検後）を比較した。生検によって確認済みの非拒絶患者を対照としてさらに分析した。生検により拒絶（ｎ＝４０）および非拒絶（ｎ＝７０）が確認された患者のオリジナルおよび第二コホートのサブセットにおいて候補バイオマーカーアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）を検証するために、抗体に基づく定量的ＥＬＩＳＡを行った。２２個のタンパク質／ペプチドが、拒絶と拒絶後試料との間で有意差を示した。ペプチド５１９１Ｄａおよび４４６７Ｄａは、１００％の感度および９４％の特異性で拒絶を検出した。４４６７Ｄａペプチドは、α−１抗キモトリプシンのＣ末端断片として同定され、２８ｋＤａタンパク質はＡｐｏＡ１として判定された。両タンパク質レベルは、拒絶後と比較して、拒絶時に有意に低かった。非拒絶患者のタンパク質レベルは、拒絶後試料と同様であった。ＡｐｏＡ１  ＥＬＩＳＡの結果から、非拒絶と比較して、拒絶時に有意に低いＡｐｏＡ１レベル（オリジナルコホートに対してｐ＝０．００１および第二コホートに対してｐ＝４．１４Ｅ−１１）が示され、これはＳＥＬＤＩ知見と一致する。α−１抗キモトリプシンと一緒に、ＡｐｏＡ１および５１９１Ｄａペプチド（Ｃ４Ａの断片）は、血漿分子プロファイルを提供し、これは、急性細胞性腎臓同種移植片拒絶と関連がある。
【００６２】
方法
試験計画および患者集団。書面での同意を得て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認された免疫モニタリング研究に腎臓移植患者を登録した。１６名の腎臓移植片受容者は、生検により確認されたＡＣＲの１７例の「独立」エピソードが付随する、３４検体の血液検体を提供した。１名の受容者には十分に間隔があいた（４か月）２回の拒絶エピソードがあり、中間血清クレアチニンは正常であったので、発明者らは、２回目の拒絶を独立した事象とみなした。生検により非拒絶と証明された患者も選択した（ｎ＝４８）。生検は全て正当な理由により行われ、血清クレアチニン上昇または遅延型移植片機能後に採取した。６５６日で起こった１例を除き、拒絶生検は移植後最初の１００日以内に起こった（中央値＝移植後２７日）。急性拒絶をスコア化するために、バンフ分類を使用した（３５、３６）。ＡＣＲがある２例の生検もＡＭＲのエビデンスを示し、Ｃ４ｄ陽性であった。２回の時点で拒絶患者を調べた：陽性生検の日に一番近い時点で拒絶検体（群Ａ）を選択し（中央値＝−１日、範囲：−１６から＋８日）；および拒絶後試料（群Ｂ）は、生検日後１４日に一番近い時点で選択した（中央値＝２８日、範囲：１４から１８０日）。１７検体の拒絶試料（群Ａ）のうち１２検体を生検前８日以内に回収し、生検後８日以内に１７検体のうち５検体を得た。拒絶後試料（群Ｂ）の場合、生検後６０日以内に１７検体のうち１６検体を回収し、生検後１８０日で１７検体のうちの１検体を回収した。陰性生検（中央値＝１日、範囲：−３５から＋４４日）に一番近い時点で１回、非拒絶血漿試料（対照として定義、群Ｃ）を選択した。表２は、試験集団の人口統計学データを例示し、年齢、性別、人種、移植数またはヒト白血球抗原不一致の度合いに関して有意差がないことを示す。死亡および生存ドナーのパーセンテージは、Ｕ．Ｓ．Ｏｒｇａｎ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｎｅｔｗｏｒｋの全国データと同様であった。
【表２】
2017513009.tif 000004
【００６３】
生検により腎臓同種移植片拒絶が証明されている受容者の第二コホート（ｎ＝２７）を選択し、再び２検体の血漿試料を試験した（拒絶および拒絶後時点）。生検は全て正当な理由により行われ、血清クレアチニン上昇または遅延型移植片機能後に採取した。ＡＣＲ陽性生検のうち２検体はＡＭＲのエビデンスもあり、一方で生検のうち４検体が、ＡＭＲのみのエビデンスしかなかった。生検−７日以内の時点で拒絶検体（ｎ＝２７）を選択した（中央値＝−１日、範囲＝−７から０日）。平均拒絶エピソードは、移植後１２２日であった。２７例の生検のうち２０例が最初の３か月以内であり、２７例のうち５例が最初の９か月以内であり、２７例のうち２例が１年超経過後であった。
【００６４】
生検後８日超で拒絶後試料を選択した（中央値＝３２日、範囲＝８から５７３日）。拒絶後試料に対して、２７例のうち２０例を生検後３か月以内に回収し、２７例のうち３例を６か月以内に回収し、２７例のうち１例を９か月で回収し、２７例のうち３例を生検後１年で回収した。さらに、生検により非拒絶が証明されている試料５１例のコホートを陰性生検に最も近い時間に選択した（中央値＝８日、範囲＝−２２から５８１日）。生検により証明されている非拒絶試料の場合、５１例のうち３８例を生検後３か月以内に回収し、５１例のうち５例を６か月以内に回収し、５１例のうち４例を生検後９か月以内に回収し、５１例のうち４例を１年後に回収した。非拒絶者のこの群からの生検は全て、正当な理由で行われ、血清クレアチニン上昇または遅延型移植片機能の後に採取した。
【００６５】
両コホートに対して、維持免疫抑制には、カルシニューリン阻害剤（タクロリムスまたはシクロスポリン）、抗増殖剤（ミコフェノール酸モフェチルまたはシロリムス）およびプレドニゾンが含まれた。移植前感作の証拠がない一部のケースにおいて、ステロイドを取り除いた。
【００６６】
血漿アルブミンおよび免疫グロブリン−Ｇ枯渇および陰イオン交換分画化
ＢＤバキュテナーＡＣＤ溶液Ａチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で血液試料を回収した。血漿を分離し、保存した。抗体スピンカラム（Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ヒト血清アルブミンおよび免疫グロブリン−Ｇを枯渇させた。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ（エチレンジアミンテトラ酢酸）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を添加した。ＡｃｒｏＰｒｅｐ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ（親水性ポリエーテルスルホン膜）陰イオン交換樹脂９６−ウェルプレート（Ｐａｌｌ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）を使用して、枯渇化血漿をｐＨ９、ｐＨ６およびｐＨ４分画に分離した。
【００６７】
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ調製
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ（ＣＭ１０およびＱ１０）を結合のために予め平衡化した。ｐＨ分画をアレイに結合させ、３つ組で分析した。６検体のプールヒト血清（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）試料を各アレイセット上で内部対照として使用した。試料アレイ処理後、マトリックスを適用した：飽和シナピン酸（ＳＰＡ，ＬａｓｅｒＢｉｏ  Ｌａｂｓ，Ｓｏｐｈｉａ−Ａｎｔｉｐｏｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）または２０％飽和アルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ，ＬａｓｅｒＢｉｏ  Ｌａｂｓ）の何れか。Ｂｉｏｍｅｋ２０００液体操作ロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）をマトリックススポッティングのために使用した。
【００６８】
質量スペクトルデータ分析
ＳＰＡ−スポットを行ったアレイ（１５０および１７０のレーザーエネルギー）を読み取る前に、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐソフトウェア３．２を用いたＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＢＳ  ＩＩｃ）質量分析計を高質量範囲で較正した。ＣＨＣＡ−スポットアレイ（１２０および１３５のレーザーエネルギー）の較正のために、ペプチド混合物を使用した。各スポットからの質量スペクトルは、２４０のレーザーショットの平均であった。ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓ  Ｃｌｉｅｎｔソフトウェア３．０において全スペクトルを予備的に分析して、発現差マッピング分析によってクラスターを作成した。クラスターは、同じ質量／電荷（ｍ／ｚ）比を有するピークの群であり、複数のスペクトルにまたがり同じタンパク質またはペプチドとして処理される。各スペクトルからのピーク強度を使用して、相対的タンパク質／ペプチド量を測定した。総イオン電流を使用して、シグナルを正規化した。ピーク高の再現性は、既に公開されたもの（３７）と同様であり、１５％から３０％のＣＶを示した。
【００６９】
タンパク質同定
ｐｒＯＴＯＦ２０００オルトガノル（ｏｒｔｈｏｇａｎｏｌ）−ＴＯＦ質量分析計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行った。高速液体クロマトグラフィー系はＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ２０００（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）であった。全プロトコールおよび試薬は製造者の示唆に従った。
【００７０】
４４６７Ｄａペプチド
このペプチドがあるＱ分画を逆相Ｃ８カラム（Ａｘｘｉｏｍ，Ｍｏｏｒｐａｒｋ，ＣＡ）に載せた。Ｃ８分画をＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ−ＦＴエレクトロスプレー質量分析計（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において衝突誘発解離ＭＳ／ＭＳ分画化に供した。ＮＣＢＩ  ＢｌａｓｔによってＭＳ／ＭＳデータを検索した。α−１−抗キモトリプシンに対するポリクローナル抗体（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて免疫沈降を行い、続いてＭＡＬＤＩ分析を行った。
【００７１】
２８ｋＤａタンパク質
ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥにより高レベルのタンパク質があるプール試料分画を分離した。ＰｒｏｔｅｏＳｉｌｖｅｒ  Ｐｌｕｓキット（Ｓｉｇｍａ）を用いてゲルを染色した。２８ｋＤａ付近のバンドを切り出し、ゲル中でトリプシン消化を行った。ＭＡＬＤＩによってペプチドを分析した。オンラインタンパク質断片データベース検索を用いて、インタクトなトリプシン質量をＭＡＳＣＯＴで検索した。ヒトＡｐｏＡ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に対するモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行い、続いてＭＡＬＤＩ分析を行った。
【００７２】
統計学的分析
ノンパラメトリック（２項）およびパラメトリック（混合効果および線形回帰）モデルを使用して、重要なピークを同定した。０．０５未満の両側Ｐ値を有意とみなし、ボンフェローニ補正を必要に応じて使用した。ＣＡＲＴ分析を行って、候補バイオマーカーのサブセットを選択し、拒絶を正しく分類するそれらの能力を決定した。選択したタンパク質／ペプチドピークの修正強度をＣＡＲＴトレーニング（ｔｒａｉｎｉｎｇ）において予測因子変数として使用した。統計学的計算のために、Ｒソフトウェアパッケージ（バージョン３．１、ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用した。従来のロジスティック回帰分析を行い、ＳＴＡＴＡデータ分析および統計ソフトウェアを用いてＲＯＣプロットを作成した。正しく分類された最大値によってカットポイントを選択した。統計学的分析の詳細を補足資料で与える（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  １，ｌｉｎｋｓ．ｌｗｗ．ｃｏｍ／ＴＰ／Ａ４６５参照；この資料のオンラインバージョンとともにＺｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．ら、２０１１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９２（４）：１０．１０９７として公開）。
【００７３】
血漿ＡｐｏＡ１レベルの定量のためのＥＬＩＳＡ
製造者のプロトコールに従い、総ヒトアポリポタンパク質Ａ１  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ａｌｅｒｃｈｅｋ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）を使用した。対照血漿試料とともに試料を２つ組で試験した。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ５．４ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２プレートリーダー上で分析を行った。
【００７４】
結果
拒絶と拒絶後試料との間の血漿タンパク質／ペプチドレベルの変動
拒絶と拒絶後群との間のスペクトルにわたるピーク強度差を分析した。全部で６５３ピーククラスターを検出したが、これには、ｐＨ４分画の２３５ピーク、ｐＨ６分画の１８６ピークおよびｐＨ９分画の２３２ピークが含まれた。
【００７５】
二項モデルを用いて同じ患者からの拒絶および拒絶後試料のピーク強度を分析した。拒絶試料において、８１ピーク強度（表Ｓ１Ａ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  １、ｌｉｎｋｓ．ｌｗｗ．ｃｏｍ／ＴＰ／Ａ４６５参照）が有意に上昇し、一方で６３ピーク（表Ｓ１Ｂ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  １参照）が有意に低下した。各条件における総ピーク数に対するボンフェローニ補正後、線形混合モデルにより、２４ピーク（表Ｓ２、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  １、ｌｉｎｋｓ．ｌｗｗ．ｃｏｍ／ＴＰ／Ａ４６５）において拒絶と拒絶後試料との間で有意差があった。二項モデルおよび線形混合モデルの両方によって、２２個の有意なタンパク質ピークが検出された（表３）。
【表３】
2017513009.tif 000005
【００７６】
１７例の独立した拒絶事象を分類および回帰木（ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎおよびＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ、ＣＡＲＴ）分析に適用し、拒絶と拒絶後試料とを最良に区別する、２つのピーク（４４６７Ｄａおよび５１９１Ｄａ）の組み合わせを生成させた（図１Ａ）。拒絶試料全てが正しく検出され、一方で不正に検出されたのは１例の拒絶後試料のみであり；これは、１００％の感度および９４％の特異性を示す。５１９１Ｄａピークの強度が拒絶中に有意に上昇し（Ｐ＜０．００１）、一方で４４６７Ｄａピークは拒絶中に有意に低下した（Ｐ＜０．００４）（図１Ｂ）。ＲＯＣプロットから、カットポイントが生成され、これらはＣＡＲＴ分析により見出されたものと同様であった。
【００７７】
非拒絶群（群Ｃ）とこれらの２つのタンパク質のピーク強度を比較した（図１Ｂ）。群ＢとＣとの間で５１９１Ｄａピーク強度の有意な差はなかった（Ｐ＝０．３３）。しかし、拒絶（群Ａ）において、非拒絶（群Ｃ）を超えて５１９１Ｄａピークが上昇した（Ｐ＜０．００１）。４４６７Ｄａピーク強度は、非拒絶（群Ｃ）と比較して、拒絶（群Ａ）中で低く（Ｐ＜０．００１）、非拒絶（群Ｃ）は、拒絶後試料よりも僅かに高いだけだった（群Ｂ、Ｐ＝０．０４）。
【００７８】
５１９１Ｄａおよび４４６７Ｄａタンパク質ピークのレベルが拒絶の診断に顕著に関連したにもかかわらず、それらの強度は、拒絶のバンフグレードを区別することができなかったと思われる。数が限定されるため、拒絶は軽度（≦バンフ１Ａ、ｎ＝１０）または重度（≧バンフ１Ｂ、ｎ＝７）の何れかとして分類した。この２つの群は、個々に、拒絶の複合ケースに対して先に挙げられるものと同じ強度パターン（対非拒絶）を示した（データは示さない）。
【００７９】
タンパク質プロファイリングのために使用した血漿試料のうち、血液試料血清クレアチニンレベルは、１７例の拒絶試料のうち１６例および４８例の対照のうち１９例で利用可能であった。拒絶後と拒絶中回収試料との間の血清クレアチニンレベルに有意差はなかった。拒絶後試料におけるクレアチニンレベル（中央値＝１．９）が全患者において拒絶時と比較して実際に低かったにもかかわらず（中央値＝２．２）、この差は統計学的に有意ではなかった。クレアチニン回復は、拒絶のタイプ、拒絶治療およびドナーの状態を含む多くの要因ゆえに、よりゆっくりであり得る。
【００８０】
バイオマーカー候補の同定
ｐＨ４分画において４４６７Ｄａペプチドを検出し、さらなる精製から、ＳＡＬＶ（Ｓ、セリン；Ａ、アラニン；Ｌ、ロイシン；およびＶ、バリン）の末端配列を与える、バリン、ロイシン、アラニンおよびセリンのモノアイソトピック質量と合致する質量差があるピークのクラスター（図２Ａ）が明らかになったが、これはヒトα−１−抗キモトリプシン（ＡＡＣＴ）のＣ末端断片に対応する。免疫沈降血漿ペプチドの高分解能ＭＡＬＤＩ分析によって、ＡＡＣＴとしての同一性が確認された（図２Ｂ）。
【００８１】
腎臓同種移植片拒絶に関連するプロファイルをさらに発展させるために、２２個の有意のタンパク質のリスト中で見出した〜２８ｋＤａのピークのクラスターを分析した（表３）。ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥによる２８ｋＤａピークの分離とそれに続くゲル中でのトリプシン消化によって、ペプチドが生成し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析し、ＭＡＳＣＯＴ上で検索して、ＡｐｏＡ１としてタンパク質を同定した。モノクローナル抗体を用いた免疫沈降によって同一性が確認された（図２Ｃ）。ＡｐｏＡ１ピーク強度は、拒絶後において、拒絶および非拒絶患者と比較して有意に高く、拒絶試料（Ｐ＝０．００１）よりも拒絶後（Ｐ＝０．０３５）に近かった（図２Ｄ）。ＡｐｏＡ１タンパク質レベルは急性拒絶の診断と有意に関連があったにもかかわらず、これらは、個々の拒絶のバンフグレードと関連がなかった。４４６７Ｄａおよび２８ｋＤａピークのロジスティック回帰およびＣＡＲＴ分析から、これらが５９％の感度および１００％の特異性で、拒絶を拒絶後と区別することが示された。
【００８２】
ＡｐｏＡ１の検証
ＳＥＬＤＩの結果を検証するために、オリジナルの拒絶／拒絶後試料（ｎ＝１３）および非拒絶試料（ｎ＝１９）のサブセット上で定量的ＡｐｏＡ１  ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡにより測定されたＡｐｏＡ１レベルのパターン（図３Ａ）は、ＳＥＬＤＩ強度ピークレベルと一致する（図２Ｄ）。これらの知見をさらに立証するために、対応する拒絶後試料がある生検により急性細胞性拒絶（ＡＣＲ）が確認された患者からの２７検体の血漿試料および生検により非拒絶が証明された５１名の患者からなる独立コホートにおいて、ＡｐｏＡ１  ＥＬＩＳＡを行った。第二コホートにおいて、ＥＬＩＳＡによるＡｐｏＡ１レベルは、拒絶後（平均＝０．２２±０．０９）および非拒絶試料（平均＝０．２３±０．０７、Ｐ＝４、１４Ｅ−１１）と比較して、拒絶中に有意に低く（平均＝０．１４±０．０４）（図３Ｂ）、これはオリジナルコホートと一致する知見である。
【００８３】
両コホートの間で、腎臓生検前−３から０日に回収した試料を調べた。２５例の拒絶および２２例の非拒絶試料を比較し、生検により非拒絶が証明されている受容者と比較して、ＡｐｏＡ１レベルが拒絶の時点で有意に低かった（Ｐ値＜０．０００１）（図３Ｃ）。
【００８４】
新しいコホートのサブセット（ｎ＝１４）も、拒絶エピソード前の時点で回収した血漿試料が利用可能であった（中央値＝−５０日、範囲＝−１８０から−１１日）。拒絶前試料から、ＡｐｏＡ１レベルが拒絶後試料の平均レベルとほぼ同一であることが明らかになった（図３Ｄ）。
【００８５】
患者のオリジナルおよび第二コホートの両方からの拒絶および非拒絶試料のＡｐｏＡ１レベルを使用して、ＲＯＣ分析を行った（図３Ｅ）。結果から、０．１６７ｇ／ｄＬのカットポイントが、７６％の感度および８６％の特異性を提供し、患者の８０％を正しく検出することが示される。２７名の拒絶患者のうち２６名のバンフ分類データは次のとおりであった：ボーダーライン変化＝２、バンフ１Ａ＝１３、バンフ２Ａ＝６、バンフ３血管＝１およびバンフ抗体介在性拒絶（ＡＭＲ）＝４。軽度ＡＣＲ（ボーダーラインおよびバンフ１Ａ＝１５）、重度ＡＣＲ（バンフ２Ａおよびバンフ３血管＝７）またはＡＣＲがないＡＭＲ（ｎ＝４）に基づいて、患者をカテゴリーに分けた。ＡｐｏＡ１中央値レベルは、全３群に対して０．１４であり、このことから、拒絶の重症度がＡｐｏＡ１レベルによって区別されなかったことが示される。
【００８６】
考察
表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量スペクトルにより発見された２２種類のペプチド／タンパク質は、急性同種移植片拒絶の診断と有意に関連があった。これらのタンパク質のうち２つ、ＡＡＣＴおよびＡｐｏＡ１の同一性を解明した。ＡＡＣＴのＣ末端断片は、拒絶後および非拒絶と比較して、拒絶中に有意に低い。ＡＡＣＴ断片（４３５４Ｄａ）の様々なバリエーションは、安定な移植片があるもの（１４）と比較して、急性拒絶がある患者の尿中でより高レベルで見出される。Ｐｉｍｅｎｔａら（１７）は、高速液体クロマトグラフィー単離およびＭＡＤＬＩを使用して、カテプシンＤによってＡＡＣＴの加水分解を調べ、３個のペプチド：４３５４Ｄａ、４４６８Ｄａおよび４６２５Ｄａを見出した。これらの切断生成物は、配列データに基づき、血漿中で同定された４４６７Ｄａピークおよび尿中で見出された４３５４Ｄａと同一であり、このことから、両方がカテプシンＤにより生成され得ることが示唆される。
【００８７】
Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら（１４）は、免疫組織化学によって腎臓における総ＡＡＣＴのレベルを調べ、拒絶と対照との間で差がないことを見出し、レベルが変動したペプチドＡＡＣＴの発見は、標的プロテアーゼ相互作用後の切断の結果であり、したがって、患者間のペプチドレベル変動はＡＡＣＴ標的プロテアーゼの活性の反映であることを示唆した。発明者らは、ペプチドレベルの変動が、総ＡＡＣＴが阻止されるかまたはシスタチンＣまたはキニノゲンなど、カテプシンＤに対する他の基質に結合される結果であり得るという仮説を立てる（１８）。あるいは拒絶中、総ＡＡＣＴが、代わりに、同種移植片機能に関連付けられているその主要な標的、カテプシンＧ（１９）、炎症関連好中球プロテアーゼを阻害し得る（２０、２１）。
【００８８】
２８ｋＤａピークはＡｐｏＡ１として同定された。ＡｐｏＡ１およびＡｐｏＡ１活性を模倣する合成ペプチドは、強力な抗炎症および抗酸化特性を有する（２２、２３）。ＡｐｏＡ１模倣ペプチド、Ｄ−４Ｆは、マウスモデルにおいて慢性拒絶により引き起こされる内膜損傷を減少させる。この効果の機序は、移植片における抗酸化剤遺伝子ヘムオキシゲナーゼ−１の誘導および／またはＴ−リンパ球増殖およびエフェクターサイトカイン産生における直接的効果を含む（２４）。
【００８９】
オリジナルおよび独立コホートの両方においてＥＬＩＳＡによってＡｐｏＡ１を検証した。両コホートにおける、拒絶、拒絶後および非拒絶試料の比較は、ＡｐｏＡ１のレベルが低いほど拒絶と関連があることを示すＳＥＬＤＩの知見と一致した。独立コホートにおける拒絶前の時点は、拒絶エピソードの発症を予測し得ず、このことから、ＡｐｏＡ１低下が拒絶の時間と密接に関連することが示唆される。さらに、全患者のＡｐｏＡ１  ＲＯＣ分析から、ＡｐｏＡ１が拒絶を説明するために使用される痕跡の一部となる可能性があり得ることが示唆される。ＡｐｏＡ１はまた、肺動脈高血圧、結直腸癌および卵巣癌（２５〜２７）において候補バイオマーカーとして同定され、より最近、シャーガス病、多嚢胞性卵巣症候群および慢性閉塞性肺疾患（２８〜３０）とも関連付けられた。これらの全ての試験において、ＡｐｏＡ１レベルは、非疾患と比較して、疾患状態でより低かった。
【００９０】
感染は血清脂質プロファイルの変化につながり得、ＡｐｏＡ１の低下は、慢性炎症を伴う感染と結びつくと仮定されている（３１）。長期免疫抑制療法の使用によって、移植患者は感染しやすい状態が続く（３２）。発明者らは、第二コホートからの５１名の非拒絶患者を試験し、この試験のために使用した血漿試料が回収された時点で細菌感染のエビデンスがある５名の患者が見付かった。ＡｐｏＡ１レベルは、感染がある非拒絶患者において、このごく一部の患者なしの場合と比較して有意差がなかった。これは、腎臓移植患者にとって、ＡｐｏＡ１が低レベルであることが拒絶エピソードと関連があるという仮説に寄与するが、これを確認するためにはより多くの試験が必要である。
【００９１】
５１９１Ｄａペプチドの単離および同定は、血漿中でその存在量が低いこと、他のより多量のペプチドとの同時精製および直接それを断片化できないことのために、妨げられている。未知の理由のために、一部のペプチド断片が乏しく、得られるＭＳ／ＭＳスペクトルを解読することができない（３３、３４）。５１９１および４４６７Ｄａピークの組み合わせは拒絶対非拒絶を確実に評価し、一方で４４６７および２８ｋＤａピークの組み合わせは価値があるものというほどではなく、したがって、５１９１Ｄａピークの同定が重要である。発明者らは、現在、同定のためにこのペプチドをより良好に単離し、断片化するための代替法を探っている。
【００９２】
発明者らの試験計画の制限は、所定の患者来院時に血漿を回収したことであり、これは、腎臓生検が行われた日と同日とは限らなかった。また、発明者らの試験集団の臨床パラメーターは、免疫抑制に関して均一ではなかった。さらに、ＡＭＲがあったのはオリジナルコホート中の２名の患者のみであり、したがってＡＭＲに対する痕跡を決定できなかった。患者の大部分は、最初の１００日以内に拒絶があり、したがって発明者らは、早期拒絶を探索するのみに制限された。将来、遅発型腎臓同種移植片拒絶が起こっている患者においてこれらのマーカーを探索することも価値あるものとなろう。さらに、発明者らは、バンフ分類に基づく拒絶の重症度とＡｐｏＡ１レベルとの間の関連を見出さなかった。より大きな対象のコホートにおいて再びこの比較を試行することは興味深い。最後に、発明者らは、これらのマーカーをより良好に評価するため、臨床背景においてそれらの真の値を決定するために前向き研究が必要であることを認める。前向き研究の可能性を示すために、発明者らは、患者の両コホートを試験し、腎臓生検前−３から０日に回収された２５検体の拒絶および２２検体の非拒絶試料を発見した。発明者らが、これらの群間のＡｐｏＡ１レベルを比較したとき、拒絶レベルは有意に低く（Ｐ＜０．０００１）、このことから、前向き研究が生検時にこれらの患者を区別したと思われることが示唆される。
【００９３】
この試験から、血漿中の腎臓同種移植片拒絶の候補バイオマーカーに対する探索が有望な臨床的利点を有することが明らかになる。これらの血漿試料が回収された時点で、候補バイオマーカーは、血清クレアチニンレベル変化よりも有益であった変動を示した。したがって、さらなる試験は、ＡｐｏＡ１を調べるだけでなく、腎臓同種移植片拒絶を正確に検出できるようにするために他のマーカーも調べるべきである。最後に、同定された２つの候補マーカーは抗炎症性タンパク質であり、それらの機能的特徴を探るべきである。
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１３．Ｊａｈｎｕｋａｉｎｅｎ  Ｔら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００６；１７：３２４８．
１４．Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ  Ｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００７；７：９３０．
１５．Ｌｉｎｇ  ＸＢら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１０；２１：６４６．
１６．Ｆｒｅｕｅ  ＧＶら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１０；９：１９５４．
１７．Ｐｉｍｅｎｔａ  ＤＣら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０００；１９：４１１．
１８．Ｌｅｎａｒｃｉｃ  Ｂら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９１；２８０：２１１．
１９．Ｚｈａｎｇ  Ｓ，Ｊａｎｃｉａｕｓｋｉｅｎｅ  Ｓ．Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．２００２；４：１１５．
２０．Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＬ  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ  ＩＧＦ  Ｒｅｓ．１９９９；９：２４１．
２１．Ｋｏｏ  ＤＤら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９８；１５３：５５７．
２２．Ｎａｖａｂ  Ｍら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２；１０５：２９０．
２３．Ｎａｖａｂ  Ｍら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ．２００５；２５：１３２５．
２４．Ｈｓｉｅｈ  ＧＲら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００７：８４：２３８．
２５．Ｙｕｄｉｔｓｋａｙａ  Ｓら、Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１３：１１２２．
２６．Ｅｎｇｗｅｇｅｎ  ＪＹら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００６；１２：１５３６．
２７．Ｋｏｚａｋ  ＫＲら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００５；５：４５８９．
２８．Ｎｄａｏ  Ｍら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０；４８：１１３９．
２９．Ｃｈｏｉ  ＤＨら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１０：９：４３２９．
３０．Ｎｉｃｈｏｌａｓ  ＢＬら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２０１０：１８１：１０４９．
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３２．Ｆｉｓｈｍａｎ  ＪＡ，Ｒｕｂｉｎ  ＲＨ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９８：３３８：１７４１．
３３．Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０００：１４６：１．
３４．Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９７；１１：１０１５．
３５．Ｒａｃｕｓｅｎ  ＬＣら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００３：３：７０８．
３６．Ｒａｃｕｓｅｎ  ＬＣら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９９；５５：７１３．
３７．Ａｌｂｒｅｔｈｓｅｎ  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００７；５３：８５２．
【００９４】
実施例２：急性腎臓同種移植片拒絶と関連する血漿バイオマーカーとしてのアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）の検証
Ａｐｏ−Ａ１として実施例１で同定された２８ｋＤａタンパク質は、一貫して、生検で腎臓同種移植片拒絶と証明された患者においてより低いレベルを示した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および生検で拒絶と証明された患者からの２７検体の血漿試料の独立コホートおよび拒絶がない５１名の患者を用いて、発明者らは、質量スペクトル試験を確認し、より低レベルであることが腎臓同種移植片拒絶の診断と関連することを示した。
【００９５】
現在の試験の目的は、２０１０から２０１３年の間にＵＣＬＡで移植を受けた７３名の腎臓同種移植片受容者の独立コホートを用いて、腎臓同種移植片拒絶に対するマーカーの的中率を検証することであった。７１名中４５名の患者で拒絶が起こり、一方で２８名の患者が生検で非拒絶と証明された。
【００９６】
ＥＬＩＳＡによってＡｐｏ−Ａ１タンパク質レベルについて、７３名の腎臓受容者からの血漿試料をアッセイした。４５名の患者において少なくとも１回、生検で拒絶と証明されたエピソードが起こり、一方で２８名の患者が生検で非拒絶と証明された。拒絶の診断前７日以内または拒絶の診断後２日以内に得られた血漿試料のＡｐｏＡ１レベルをＥＬＩＳＡによって定量した。腎臓同種移植片拒絶は、バンフ基準を用いて診断した。表３および図４で示されるように、腎臓同種移植片拒絶と診断された患者のＡｐｏＡ１レベル（平均０．１５６＋／−０．７７）は、非拒絶（平均０．２３９＋／−０．１６）と比較して有意に低かった（Ｐ＜０．００２４）。０．１９５のカットポイントを用いて、ＡｐｏＡ１レベルによって、７５％の感度および８２％の特異性で、７９％の確率で拒絶がある患者が正しく分類された（図５）。
【表４】
2017513009.tif 000006
【００９７】
結論：腎臓同種移植片拒絶の診断の１週間以内で有意に低いＡｐｏＡ１タンパク質レベルが見出される。この試験は、腎臓同種移植片拒絶のバイオマーカーとしてのＡｐｏＡ１の使用をさらに裏付け、腎臓同種移植片拒絶の診断において支援となるよう使用することができるだけでなく、拒絶リスクを判定するために移植片受容者を監視するためにも使用し得る。
【００９８】
実施例３：抗体に基づくＥＬＩＳＡアッセイを用いたアルファ−２−マクログロブリンの検証
図６は、質量スペクトルを用いて明らかにされた場合と同じアルファ−２−マクログロブリンの検出パターンを示すＥＬＩＳＡデータを与える。拒絶と診断された７名の腎臓同種移植片受容者から、一対の血漿試料を拒絶時および拒絶後に回収した。これらは、上記実施例１で使用した同じ対の血清試料である。このデータから、ＥＬＩＳＡにより検出した場合のアルファ−２−マクログロブリンのレベルが拒絶診断時に低下することが示される。
【００９９】
実施例４：質量スペクトルに同定されたバイオマーカーのアミノ酸配列
次の表に記載のように、上記実施例１で同定されたタンパク質断片のアミノ酸配列を決定した。
表４：バイオマーカーペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列
【０１００】
アルファ−１−アンチトリプシンＣ末端断片（２５０５Ｄａ、Ａ１ＡＴ３９７−４１８；配列番号１１）ＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＶＶＮＰＴＱＫ
【０１０１】
アポリポタンパク質Ａ１断片（４１２５Ｄａ、ＡｐｏＡ１  １４８−１８３；配列番号５）
ＡＥＬＱＥＧＡＲＱＫＬＨＥＬＱＥＫＬＳＰＬＧＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＶＤＡＬ
【０１０２】
血漿プロテアーゼＣ１阻害剤断片（４１８７Ｄａ、Ｃ１  ｉｎｈ  ４４５−４７８；配列番号１３）
ＡＲＴＬＬＶＦＥＶＱＱＰＦＬＦＶＬＷＤＱＱＨＫＦＰＶＦＭＧＲＶＹＤＰＲＡ（＋２  Ｏｘ）
【０１０３】
アルファ−１−抗キモトリプシンＣ末端断片（４４６７Ｄａ、ＡＡＣＴ３８５−４２２；配列番号８）
【０１０４】
ＡＬＶＥＴＲＴＩＶＲＦＮＲＰＦＬＭＩＩＶＰＴＤＴＱＮＩＦＦＭＳＫＶＴＮＰＫＱ
【０１０５】
補体Ｃ４アナフィラトキシン（５０５１Ｄａ、Ｃ４アルファ６９８−７４２；配列番号３）
ＴＡＫＲＣＣＱＤＧＶＴＲＬＰＭＭＲＳＣＥＱＲＡＡＲＶＱＱＰＤＣＲＥＰＦＬＳＣＣＱＦＡＥＳＬ
【０１０６】
補体Ｃ４アナフィラトキシン（５１９１Ｄａ、Ｃ４アルファ  ７０２−７４６；配列番号２）
ＣＣＱＤＧＶＴＲＬＰＭＭＲＳＣＥＱＲＡＡＲＶＱＱＰＤＣＲＥＰＦＬＳＣＣＱＦＡＥＳＬＲＫＫＳ
【０１０７】
血清アミロイドＡ−４（１１６９４Ｄａ、ＳＡＡ４  ２１−１２２；配列番号１４）
ＷＲＳＦＦＫＥＡＬＱＧＶＧＤＭＧＲＡＹＷＤＩＭＩＳＮＨＱＮＳＮＲＹＬＹＡＲＧＮＹＤＡＡＱＲＧＰＧＧＶＷＡＡＫＬＩＳＲＳＲＶＹＬＱＧＬＩＤＣＹＬＦＧＮＳＳＴＶＬＥＤＳＫＳＮＥＫＡＥＥＷＧＲＳＧＫＤＰＤＲＦＲ
【０１０８】
Ｃ−反応性タンパク質（１９４０９Ｄａ、ＣＲＰ  １０−１８５；配列番号１５）
ＶＦＰＫＥＳＤＴＳＹＶＳＬＫＡＰＬＴＫＰＬＫＡＦＴＶＣＬＨＦＹＴＥＬＳＳＴＲＧＹＳＩＦＳＹＡＴＫＲＱＤＮＥＩＬＩＦＷＳＫＤＩＧＹＳＦＴＶＧＧＳＥＩＬＦＥＶＰＥＶＴＶＡＰＶＨＩＣＴＳＷＥＳＡＳＧＩＶＥＦＷＶＤＧＫＰＲＶＲＫＳＬＫＫＧＹＴＶＧＡＥＡＳＩＩＬＧＱＥＱＤＳＦＧＧＮＦＥＧＳＱＳＬＶＧＤＩＧＮＶＮＭＷＤＦＶＬＳＰＤＥＩＮＴＩＹＬＧＧＰＦＳＰＮＶＬ
【０１０９】
アポリポタンパク質Ａ１（２８０７７Ｄａ、ＡｐｏＡ１  ５６−２６７；配列番号６）
ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲ  ＶＫＤＬＡＴＶＹＶＤＶＬＫＤＳＧＲＤＹＶＳＱＦＥＧＳＡＬＧＫＱＬＮＬＫＬＬＤＮＷＤＳＶＴＳＴＦＳＫＬＲＥＱＬＧＰＶＴＱＥＦＷＤＮＬＥＫＥＴＥＧＬＲＱＥＭＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥＬＱＥＧＡＲＱＫＬＨＥＬＱＥＫＬＳＰＬＧＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＶＤＡＬＲＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫＥＮＧＧＡＲＬＡＥＹＨＡＫＡＴＥＨＬＳＴＬＳＥＫＡＫＰＡＬＥＤＬＲＱＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴＱ
【０１１０】
アポリポタンパク質Ｅ（３６７４７Ｄａ、ＡｐｏＥ  １９−３１７、グリコシル化；配列番号１６）
ＫＶＥＱＡＶＥＴＥＰＥＰＥＬＲＱＱＴＥＷＱＳＧＱＲＷＥＬＡＬＧＲＦＷＤＹＬＲＷＶＱＴＬＳＥＱＶＱＥＥＬＬＳＳＱＶＴＱＥＬＲＡＬＭＤＥＴＭＫＥＬＫＡＹＫＳＥＬＥＥＱＬＴＰＶＡＥＥＴＲＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤＶＣＧＲＬＶＱＹＲＧＥＶＱＡＭＬＧＱＳＴＥＥＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡＶＹＱＡＧＡＲＥＧＡ
ＥＲＧＬＳＡＩＲＥＲＬＧＰＬＶＥＱＧＲＶＲＡＡＴＶＧＳＬＡＧＱＰＬＱＥＲＡＱＡＷＧＥＲＬＲＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥ
ＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ
【０１１１】
本願を通じて、様々な刊行物を参照する。これらの刊行物のそれらの全体における開示は、本発明が属する技術分野の最先端をより詳細に記載するために、参照により本明細書によって本願に組み込まれる。
【０１１２】
前述のものから、本発明の具体的な実施形態が例示目的で本明細書中に記載されるものの、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更をなし得ることが認められよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2017513009.tif 000007
【図１Ｂ】
2017513009.tif 000008
【図１Ｃ】
2017513009.tif 000009
【図２Ａ】
2017513009.tif 000010
【図２Ｂ】
2017513009.tif 000011
【図２Ｃ】
2017513009.tif 000012
【図２Ｄ】
2017513009.tif 000013
【図３Ａ】
2017513009.tif 000014
【図３Ｂ】
2017513009.tif 000015
【図３Ｃ】
2017513009.tif 000016
【図３Ｄ】
2017513009.tif 000017
【図４】
2017513009.tif 000018
【図５】
2017513009.tif 000019
【図６】
2017513009.tif 000020
【国際調査報告】
2017513009.tif 000021
2017513009.tif 000022
2017513009.tif 000023
2017513009.tif 000024