(57)【要約】正常な微生物代謝（同化及び異化）が例えばｐＨ又は温度により制限されている条件で微生物を利用して形成された水素及び他の気体又は液体物質（２，３‐ブタンジオールなど）を生成するための方法及び装置。その後、炭素は、より一般的な微生物反応と同じ速さでは気体相内に遊離することはない。有機廃棄物又は他のバイオマスに向かうように導かれたキャリヤガスは、新たな水素が水からバイオマス内に結合すると同時に、微生物の酵素的又は電気的現象により分子水素が気体相内に遊離することを補助する。燃焼プラントから除去されたガス又は燃焼ガスはいくつかの別のプロセスのバイオプロセスに戻すことが可能であり、それに伴い、これらの手段により総炭素排出量も減少する。生産プラントは居住地域の中心に設けることが可能なように計画する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物学的生成方法であって、前記方法により、実際の細胞増殖代謝の最適化又はその代謝の高レベルな活性化を行うことなく、水素などの気体代謝産物又は２，３‐ブタンジオールなどの液体代謝産物を時間及び容積測定単位に比例して有効に生成することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記方法により、生成する目的を達成するためにプロセスｐＨを最適レベルに調整し、プロセス中の炭素が気体相へと失われていく量をできる限り少量にするように前記レベルで維持することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の細菌酵素又は他のヒドロゲナーゼ型酵素又はヒドラーゼ型酵素の活性を活性化するように試みることを特徴とする請求項１及び２の１項又は両方に記載の方法。
【請求項４】
原材料液又は混合液内に誘導されたガスが存在し、このガスは気体生成物又は液体生成物の生成を最適化する際に役立つことを特徴とする請求項１〜３の１項以上に記載の方法。
【請求項５】
バイオマス原材料又はその同等物に誘導された前記ガスは窒素のように不活性であるか、あるいは二酸化炭素もしくは一酸化炭素又はこれらのガスの混合物のように原材料と反応することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
誘導された前記ガスは全体的にもしくは部分的に燃焼ガスから構成されるか、又は発酵から遊離しているものであり、このガスは微生物学的プロセスに戻すことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
使用のプロセスは好気的、微好気的又は嫌気的なプロセスであることを特徴とする請求項１〜６の１項以上に記載の方法。
【請求項８】
前記プロセスでは、低すぎる又は高すぎるｐＨ又は浸透圧など、自身に有益でない状態を補正するように微生物が自身の環境を制御又は調整しようとする取り組みを利用することを特徴とする請求項１〜７の１項以上に記載の方法。
【請求項９】
前記生成物を蓄積し、又はその遊離を促進するために微生物オーバーフロー代謝を利用することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
液体への液体生成物の蓄積、又は気体相への気体生成物の遊離は、プロセス内に誘導された前記ガスにより迅速化することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結果を最適化するために前記ガスの温度を調整することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロセスから生成物として形成された前記物質を濃縮し、可燃エネルギー源、自動車燃料又は化学産業原材料にすることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
メタノールなどの利用可能な液体生成物を製造するために、水素などの気体生成物を一酸化炭素などの他の物質と反応させることを特徴とする請求項１０〜１２の１項以上に記載の方法。
【請求項１４】
前記形成された気体、液体又は懸濁液を燃料として使用することを特徴とする請求項１０〜１３の１項以上に記載の方法。
【請求項１５】
前記燃焼ガスは再度前記プロセスに誘導することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記２，３‐ブタンジオールは微生物学的反応において形成し、細胞増殖及び二酸化炭素の形成は比較的活性的な異化代謝のレベルに応じて停止又は減弱することを特徴とする請求項９〜１５の１項以上に記載の方法。
【請求項１７】
前記遊離した水素及び他の燃焼可能な気体は、廃棄物又は他のバイオマスの保管貯蔵器又は反応プールから焼却塔（図３）内に誘導することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項以上に記載の方法を実行する装置。
【請求項１８】
起こり得る爆発反応が上方に向かうように導く方式で前記焼却塔を居住区の中心に建設することを特徴とする請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記バイオマスは、表面下でタンク、保管貯蔵器又は反応プール内に収集されることを特徴とする請求項１７及び／又は１８に記載の装置。
【請求項２０】
水素が一酸化炭素と反応して液体メタノールを形成するように、一酸化炭素を燃焼プラントから遊離水素含有気体流内に向かうように導くことを特徴とする請求項１７〜１９の１項以上に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
バイオマス分解中の微生物の利用は公知の廃棄物処理技術である。この作業では、廃棄物材料に含まれる有機物質は、微生物代謝の結果として改変された化学形態に変化する。有機材料に由来する炭素、酸素、窒素、硫黄及び水素の一部は、例えば固体物質から液体に、又は液体から気体へと状態変化する。次いでこれらは更に反応することが可能である。他方、窒素（Ｎ２）は多くの微生物プロセスにおいて、生物学的窒素固定を介して有機材料に結合する。
【背景技術】
【０００２】
廃棄物に加え、微生物学的プロセス技術は、原材料として、製造業、農業、林業又はその他の産業から得られる様々な中間留出液、及び自然バイオマス中の有機物を使用することが可能である。植物界では、大部分のバイオマスがセルロースであるが、例えばヘミセルロース、リグニン及びデンプンもかなりの予備分を含んでいる。これらの予備分には大量の束縛化学エネルギーが集中している。植物由来のバイオマス源は例えば、木材、藻類、ピート、収穫廃棄物及び多数の食品産業中間留出液である。
【０００３】
有機化合物はいわゆる炭化水素骨格から構成されている。燃焼に関しては、酸化炭素及び水はこれらから生成される。炭化水素の炭素は結合して酸化炭素になり、水素は水になる。低酸素環境でバイオマスの有機物を変換すると、メタン（ＣＨ４）、水素（Ｈ２）及び二酸化炭素（ＣＯ２）が生成される。また硫化水素（Ｈ２Ｓ）及びアンモニア（ＮＨ４）が形成される。将来的なエネルギー生成及びそれに関連する化学産業は「水素経済」と呼ばれことも多い。電流を利用する水からの水素分離が現在使用されており、水素生成に十分に利用されている。この場合、電気のエネルギー含量が遊離水素より大きいため、全体のエネルギーバランスが負になっている。このことは、損失分を完全に避けられないことによって起こる。また、使用する電気の製造方法は、生成した水素エネルギーの環境に著しく影響を及ぼす。
【０００４】
生化学的及び微生物学的反応では多数の水素が形成されるが、その気体の形態では、通常、二酸化炭素、メタン、気化アンモニア、硫化窒素、気化有機化合物（ＶＯＣ）などの他の気体に混入している。これらのうち気化有機化合物は利用可能な生成物である場合が多い。爆発のリスクも水素（硫化水素）と関連し、また、硫化水素は特に毒性である。製造工場にもたらされた酸やアルカリによる腐食の問題は、硫化水素及びアンモニアの形成に関連している。硫黄の除去は石油掘削及び石油化学産業に関連する公知の技術として順調に行われてきた。
【０００５】
混合気体流からの水素の精製も公知の技術である。従って、収率及び生産性が十分なレベルまで高められれば、水素の生物工学的生成は現在の知識で実施することが工業的に可能である。
【０００６】
問題は、特に人口密集地、都市及び産業隣接地域内又はその近傍における水素の回収、及び特にその安全な生成に関連する。このため、水素の生成設備は注意深く設計する必要がある。このことは具体的には、大量の水素は大量の廃棄物材料又は中間留出液から形成されることが多いため最も注目されている。他方、微生物学的又は生化学的水素生成試験では、生産性レベルは非常に低いままであり、これは製造プロセスの経済的実践に関して複雑な要因となっている。また、廃棄物処理において、炭素排出及び残留バイオマスの更なる処理に起因する気候の負荷は経済的で安全かつ生態学的に実行可能な方法で解決しなければならない。
【０００７】
最近の公開討論では、多くの場合バイオマスベースの廃棄物が価値のある中間留出液に変換されている点、ならびにその充足度及び利用可用性を常時確保する必要がある点が提起されている。従って、有機廃棄物及び他のバイオマスの輸送及び保管コストを削減すると、この中間留出液から得られるエネルギー及び化学物質の価格も下がる。よって、例えば、バイオマスが形成される人口密集地域、工業施設又は農業及び林業施設近傍で水素の生産体制を整えることは重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
多くの微生物学的発酵現象では、脱水素酵素の作用の結果として水素が形成される。この反応は可逆的である。水からバイオマスへの水素の結合では、作用する酵素は、水に含まれる水素を有機分子に結合させる加水分解酵素、すなわちヒドラターゼ又はヒドラーゼ酵素である。水素の生化学的、微生物学的及び生物工学的生産は、水素気体の燃焼又は液化及び可能な他の解放可燃性気体が有利になるように必要となるような生成レベルに達していないことが多い。エネルギー生産に関するこの疑問を解決することは全体的な経済において重要な事項であり、特に、気候の影響により酸化炭素（及び窒素）又はメタンが廃棄物から大気に開放されることが同時に減少又は排除可能になれば、バイオ廃棄物の経済的及び生態学的に意義のある利用を解決することが可能になる（廃乗物処分場）。従って、水素経済的な方向に、又はより広く生物経済的な方向に移行する場合、エネルギー生産は、経済的に、エネルギー的に、かつ生態学的に有益で持続的な基盤で大規模に実施することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に従った方法及び装置の主要かつ中心的な特徴は、実際の有機炭素を含む化合物の代謝が抑制又は減弱されるように全体的に微生物の代謝を制限し、誘導することである。次に細胞レベルで、同化または異化の代わりに、いわゆるオーバーフロー代謝を活用する。この作用の意味は、酵素が気体としての水素を放出して（脱水素酵素）それぞれ水と結合するように（ヒドラーゼ）、またこの水から発生した水素が放出水素と置換するように、微生物の脱水素酵素及びヒドラーゼ型酵素を活用することである。これに応じて、微生物作用の結果として、酸生成に関連する培地に形成されたプロトンを取得し、液体相と気体相との間に形成された電子束と反応し、それによりこの反応でも水素を形成することが可能となる。２，３‐ブタンジオールなどの有機化合物は、多くの場合、オーバーフロー代謝の液体生成物として形成される。
【００１０】
水素を回収又は使用する目的の水素形成及び放出方法を最適化するため、キャリヤガスは連続的に、又は随時バイオマスに導入する。この場合、微生物による生成物に含まれている脱水素酵素の機能的な条件は、例えば最終生成物のｐＨ低下及び阻害を抑制することにより改善することが可能になる。
【００１１】
このガスは例えば、不活性窒素もしくは酸化炭素、又はこれらの混合物であってもよい。必要に応じて、ガス混合物は酸素も含んでいてもよいが、プロセスは完全な嫌気性であってもよい。二酸化炭素としての炭素の代謝及び気化を上記バイオプロセスで同時に抑制するため、ｐＨ制御及び他の環境条件の改変を補助的に利用し、その条件を微生物の通常の同化及び異化代謝に好適ではないものにする。オーバーフロー代謝又は類似の微生物の生化学的活性において放出される水素は有機物中で微生物に含まれる水又はヒドラーゼにより生成された水と置換することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法及び装置に従った有機廃棄物又は他のバイオマスからの水素の遊離についての一般原則を示す。
【図２】水素になり、更に処理される有機廃棄物又は他のバイオマス原材料の段階的な利用を示す。
【図３】現代の都市環境内の水素生成の解決策を示す。
【図４】好気条件（曲線ａ及びｃ）ならびに低酸素条件（曲線ｂ及びｄ）におけるＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎ（登録商標）装置での大腸菌（曲線ａ及びｂ）ならびにクレブシエラモビリス（曲線ｃ及びｄ）の増殖を示すグラフ。
【図５】タンクから給水され、洗浄水と混合された製糖プロセス由来の糖水をＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎ装置中、ＢＨＩ培地上で細菌培養した際の細菌増殖を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
水素を形成するために必要なバイオプロセスの全容を図１に示す。
【００１４】
低ｐＨ（５未満又は４．５未満）では、炭素循環に直接関係する二酸化炭素及びメタンなどの気体の放出がバイオマスから減少するにもかかわらず、脱水素酵素の機能は活発に継続する。従って水素の生成は、混合される微生物割合の観点からは比較的好ましい条件と同様の気体割合で炭素が放出されないような条件に維持することが可能である。微生物の観点から、水素の放出は、微生物がｐＨ低下を抑制しようとする作用に関連している可能性がある。
【００１５】
例えばクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種及びエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、他の多種の微生物、多くの場合、腸由来の細菌が活発に行う２，３‐ブタンジオールの生成は、微生物オーバーフロー代謝の作用によりｐＨ低下の抑制と部分的に関連している。本発明者らの研究によれば、この生成は、基質液の糖含有量が増加すると、このいわゆるオーバーフロー代謝で促進される。グルコースを２，３‐ブタンジオール、エタノール及び気体に変えることにより、細菌のブタンジオール発酵は、細菌生息場所のｐＨのみならず浸透圧の均衡を保つ。
【００１６】
廃棄物材料（ジャガイモ廃棄物、大量生産廃棄物材料及び中間留出液、食品産業、肥料、わら、木材から得る廃棄物、ピート、廃スラッジ、集落廃棄物等）中の、天然もしくは添加細菌又は他の微生物混合培養物を利用することにより、脱水素酵素の作用に基づく気化水素のフラックスを生成することが可能になる。水素が気体形態で気化すると、新たな水素は水から、例えばｐＨ制御により炭素放出が抑制される有機物へと結合する。実践では、有機廃棄物又はバイオマスを受け入れる設備は原則的にバッチで稼働し、それにより例えば１日で生成されるような廃棄物又は他の受容可能なバイオマスが、処理施設において例えば５日間かけて１部門から他部門へ移送される１バッチとして処理される（図２）。次いで、水素の形成、及びキャリヤガス中への水素放出は例えばガス流量、ｐＨ及び温度を利用して促進及び制御する。
【００１７】
生物工学的に、達成される利点としては、当該プロセス（バイオマス原材料）では正味炭素含有量は高いままであり、この含有量は、乾燥廃棄物もしくは他のバイオマス、又は発酵プロセスから得た排気をそのまま又は精製して燃焼させることに伴って放出される二酸化炭素及び一酸化炭素に原材料を導入することによっても維持することが可能である。このような進行により、基質としてのバイオマス原材料の価値は持続し、そこから例えば燃料、化学物質及び肥料を製造することが可能となる。
【００１８】
バイオプロセスから放出される一酸化炭素と水素とが反応するときに、液体燃料として利用可能なメタノールが得られ、あるいは水素が液化して例えば輸送燃料になることが可能である。水素を保存するための様々な方法が研究され、発表されている（Ｈｉｒｓｃｈｅｒ 、２０１０年）。この場合、微生物培養液及びその脱水素酵素が使用されるとき、一般的に水素の工業生産に関連する電気エネルギーの必要性が高まることが回避される。この目的のために構築された施設では、必要に応じて燃焼ガスの一酸化炭素及び微生物に生成された水素が同時に導入可能になり、形成されたメタノールを回収することが可能になる。水素気体も、両側は強力に保護されているが上方が開口した燃焼チャンバ内で燃焼することが可能であり、そうすることで、起こり得る強力な燃焼反応又は爆発が上方に抜ける。こうして構築された施設は都市の中心部でさえ安全に建設することが可能であり、この場合、下水廃棄物及び発生し得る他の廃棄物は精製所及び発電プラント塔の下、例えばタンク、プロセス機器又は類似物の地下で回収することが可能である（図３）。必要であれば、放出水素（Ｈ２）を形成し、異なる燃焼ガス中の一酸化炭素と反応させることが可能である。この場合、メタノールを形成する。バイオプロセス及びキャリヤガスとして作用する窒素から放出される「残留」二酸化炭素又は一酸化炭素の混合物は、液体中に、すなわちプロセス中に再度導入することが可能である。
【００１９】
代謝中の微生物による水素生成が集団の増殖及びエネルギー代謝から部分的又は全体的に断ち切れているということは、この気体形成が、微生物の生存条件をより有利に修正することを目的とするオーバーフロー代謝の一部であることの指標となる。それぞれ、高い２，３‐ブタンジオール濃度は、有機酸の中和、具体的には酢酸の反応の結果である。この現象は、例えばクレブシエラモビリス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の混合培養、又は純粋なクレブシエラ培養で注目されている（Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２００８年、Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２０１０年）。このように、食品産業廃棄物から記録的な生産レベルの２，３‐ブタンジオールが得られた（Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２０１３年）。これらの同様の反応においても水素が形成され、水素の形成は常に二酸化炭素の放出に直接関連している訳ではない。水素気体は培養液に戻すことも可能であり、この場合、それは例えば大腸菌、クレブシエラ及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種の細胞増殖を刺激する（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１１年ａ、Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１３年、Ｈａｋａｌｅｈｔｏ 、２０１４年）。クロストリジウム菌は１００％ＣＯ２流量でも増殖可能であることが分かっている（Ｈｅｌｌら、２０１０年）。それらを利用して例えばブタノール、エタノール及び水素を生成することが可能になる。
【００２０】
ブタンジオールは、合成ゴム、プラスチック、氷結防止剤、繊維、化粧品の生成、又は薬剤製造の原材料として使用することが可能である。精製すると、ブタノールは自動車燃料に適している。液体水素はＦＣＶ型車両に適した燃料である。
【００２１】
スラッジ、プロセスブロス、バイオマス懸濁液又は他の原材料中に形成される気体の拡散が緩徐であるため、生化学的な水素生成試験では、生産性レベルはこれまで一般的に非常に低いものであった。生化学反応の生成物は、最終生成物阻害、又は水素もしくは他の生成物を形成する反応に関連する類似の他の代謝制御メカニズムを介して、その生成物自体の形成を容易に抑制又は防止する。従来の発酵では、水素生成は炭素の排出量に、ひいては培養液中の適当な炭素源に直接比例し、また最適レベルのｐＨ条件に近い。
【００２２】
しかし、本発明に従った驚嘆すべき方法では、微生物の同化及び異化に関し不都合な条件において高レベルで水素などの気体材料及び２，３‐ブタンジオールなどの液体材料の生成を維持し、継続することが可能である。その後、例えば低すぎる又は高すぎるｐＨレベルで、水素は依然として放出可能であり、あるいは高すぎるグルコース濃度（浸透圧）は２，３‐ブタンジオール生成に利用可能である。水素生成では、たとえ強力な同化又は異化代謝を可能にしなくとも、プロセス中に活性的なヒドロゲナーゼに対して使用のｐＨが可能になるような状態にすることが要件である。温度を都合よく制御することが可能なキャリヤガスに導入することにより上述のバイオマスに対して行うガスによるすすぎは、炭素の排出が基本的に加速しない上述の条件で、気体状水素を放出する。従って、ある方法では、キャリヤガスを使用して有機性廃棄物又は他のバイオマスから水素を抽出する。
【００２３】
水素は様々な微生物学的発酵反応に伴って形成される。これらの反応は例えば：
‐２，３‐ブタンジオール発酵
‐アセトン‐ブタノール発酵
‐グリセロール又は他の多価アルコールの微生物分解
‐ギ酸の形成、及びその後のギ酸が崩壊して水素及び二酸化炭素を形成する反応
である。
【００２４】
水素の形成は、同時に代謝反応連鎖の一部であり、これにより微生物生息場所の酸性化が減少する。自身の作用又は他の微生物の作用の結果として酢酸、乳酸、酪酸、プロピオン酸及び他の多数の有機酸は初めに微生物の培地中に形成される（Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２００８年）。次に培地のプロトン濃度が増加する。同時にプロトン及び電子フラックスを形成し、それにより水素気体を形成する目的で、プロトン及び電子両方が同じ方向に移動するために明確な勾配が必要である。このことは、窒素又は窒素と酸化炭素との混合物などの好適なガスで、液体又は懸濁液形態の培地にガス供給することにより有利に達成される。当該キャリヤガスは、自発的な方法で培地とは異なる温度になり得る。この場合、プロトン及び電子両方の方向は流動ガスに向かい、それらは界面上で水素気体（Ｈ２）に融合する。この結果として、一般的な発酵反応の場合より高い割合の水素も放出される。本発明に従った方法を利用することにより、例えば、基本的に水素生成を減少させずにｐＨを正常レベルから上下させてこれらの発酵反応を抑制することが可能である。これにより、炭素が、例えばどちらかと言えば二酸化炭素として漏れることなく、バイオマス及び有機廃棄物からの大量のエネルギー生産が可能になる。水素はまた、二酸化炭素などの他の放出気体から分離し、キャリヤガスにより培地に戻すことが可能である。それぞれバイオマスもしくは有機廃棄物又は他の燃料の燃焼中に放出される他の気体も、キャリヤガスに融合することが可能である。この場合、基本的に水素気体の放出を低下させることなく、高温又は低温でほとんどの発酵反応を停止又は抑制することが可能である。更に、微生物の酵素活性の結果として、厳しい条件下でこの気体は形成され、新たな水素はそれぞれ、水から更に酵素的に有機物へと結合する。
【００２５】
細菌の細胞内脱水素酵素は、細胞が低ｐＨ又は高ｐＨの条件にある場合に最も活発に作用することが多く（Ｔａｇｕｃｈｉら、１９８２年、Ｈｏｈｎ‐Ｂｅｎｔｚ及びＲａｄｌｅｒ、１９７８年）、このことはその活性が細胞の生息条件の均衡を保ち、保護するように方向付けられていることを実証している。例えば、好熱性サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種の細菌Ｌ‐乳酸脱水素酵素は、８０℃、ｐＨ４．５の最適な培養液中でこのように活動する（Ｔａｇｕｃｈｉら、１９８２年）。従って、本発明に従ってバイオリアクター（発酵槽）の厳しい条件を利用し、廃棄物又は他のバイオマスから水素を生成することが可能である。低ｐＨ又は高ｐＨレベルで炭素化合物に基づいた代謝が減衰するが、水素の気化は、酸又はアルカリが形成された後の培地中の変化したｐＨの均衡を保つ。従って、バイオリアクターのｐＨは例えばｐＨ４．５〜５又は４．０〜４．５まで低下させることが可能であり、この場合通常、細菌増殖が減衰するが、水素の生成は依然として高レベルである。従って、細菌の増殖及び発酵は高温又は低温のどちらかで抑制することが可能である。
【００２６】
本発明に従った方法は、例えば有機下水スラッジもしくは埋立廃棄物、農業廃棄物又は様々な産業廃棄物をエネルギーや化学物質に変換する際に利用可能である。従って、本発明者らの測定によれば、数パーセントの固体を含む有機廃棄物から、液体及びバイオマスを流れるキャリヤガスに水素を放出することで、数パーセントの水素が得られる。通常利用される農業廃棄物は肥料及び様々な収穫廃棄物である。産業廃棄物の中では、例えば乳業、ジャガイモ及びトウモロコシ、糖ならびに利便性のある食品産業の中間留出液及び廃棄物、更に林業中間留出液及び廃棄物が利用可能である。
【００２７】
２００７年から２，３‐ブタンジオールについて本発明者らが行ってきた生成の研究において、ブタンジオールがマス又はジャガイモ産業廃棄物から生成されると、この発酵では気体生成が減少する一方で、ブタンジオール生成は増加することに注目している。これらの研究の結果は部分的に、例えば国際特許出願（ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０００００１、ＰＣＴ／ＦＩ２０１１／０００１６）及びそれ以降の文献（Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２００８年、Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２０１３年）で発表されている。
【００２８】
上記気体生成の減少は特に、発酵中に（特に部分的に細胞呼吸中に）放出される二酸化炭素の形成の減少に関連する。これに応じて、低２，３‐ブタンジオール生成レベルの場合と比較して、より多くの水素が２，３‐ブタンジオール発酵の副産物として形成されている。にもかかわらず、このことは必ずしも目視観察で確認されている訳ではない。何故なら、水素は気化しながらバイオマスに拡散し、バイオマスに再度結合し、一部がバイオマスに拡散するのであり、その放出が気泡の形成増加として目視可能にならないからである。本発明者らの初期の研究では、気泡形成の減少は２，３‐ブタンジオール形成の増加と関連していた（ＰＣＴ／ＦＩ２０１１／０００１６）。従ってこのことは恐らく、少なくとも二酸化炭素生成の減少として説明できる可能性があり、必ずしも生成された水素の量を示している訳ではない。
【００２９】
本発明に従った方法及び装置を使用すれば、微生物及びその酵素を利用してバイオマスから形成された水素を、バイオマスに流れるガス流及び気泡に移送することが可能になる。気泡とバイオマス間で電子及びプロトン濃度に差があると、対応する電子及びプロトンの流れが加速され、これにより、例えば相界面で電気現象が起こり易くなり、よって水素形成が促進される。
【００３０】
上記の方法で２，３‐ブタンジオールが形成され、それを形成する細菌の濃度が著しく増加することがなければ、この代謝は明らかにオーバーフロー型である（表１及び７）。
【００３１】
表１．時点２５．５時間での培養液のＫ及びＫＳの細菌含有量。大腸菌及びＫ．モビリスの細菌含有量は驚くほど類似していた。これらの平板培地の結果はまた、大量の２，３‐ブタンジオール形成に関連するＫＳ培養で促進した反応は、決して同化経路の一部ではないことも示しており、この場合、現在の理論と矛盾している（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９７５年、Ｙｕ及びＳａｄｄｌｅｒ、１９８３年）。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
この場合、細菌細胞は代謝反応を行い、代謝を利用してｐＨ低下や浸透圧増加などの細胞周辺の他の不都合な進行を補正する（Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２００８年；Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２０１０年）。次に他の細菌に形成された酢酸はクレブシエラの作用により２，３‐ブタンジオールに組み込まれ、水素が放出する。炭素‐１３で標識し、培地に添加したグルコースを細菌に付与したところ、グルコースの２‐炭素については標識はアセテートのカルボニル炭素内に見られ、その一方で、グルコースの３‐炭素については標識はアセテートのカルボニル及びメチル炭素の両方に見られた。このことは、２つの異なる代謝経路における作用の結果としてアセテートが形成されることを示している。
【００３４】
過去の知識（Ｋｌｕｙｖｅｒ、１９５６年）に基づき、このことはアセテートが２，３‐ブタンジオールに結合することを示している。従って、グルコースをブタンジオールに変換すると、浸透圧が低下し、ｐＨ低下が減速する。クレブシエラ種、及びブタンジオール発酵が可能な他の細菌が上記発酵を行うには、代謝力を低下させる必要がある。このことは、ポリヒドロキシブチレートなどの細胞のエネルギー貯蔵から、また、水から放出されて有機物質に酵素的に結合した水素から達成される。水素からの２，３‐ブタンジオールの形成は、以下の仮説に基づいた反応を経て起こり得る：
過去の研究によると、ピルビン酸塩からの２，３‐ブタンジオールの合成経路は、アセト乳酸及びアセトンを経てブタンジオールになるように合成される。この作用には、２つの酵素系経路：ｐＨ８同化及びｐＨ６異化経路が存在する。その周囲で酸性度が高まるにつれ、微生物細胞は過剰な酸形成を回避するよう努める。この場合、異化経路が作用し始め、アセト乳酸が分岐鎖アミノ酸（ロイシン、バリン）に変換される代わりに、異化アセトインが低ｐＨでアセト乳酸から形成され始める。ここからブタンジオールが形成され、ｐＨが増加する。従ってクレブシエラ、腸内細菌（＝好気性細菌）等は、腸内ｐＨに関する自身の条件及び環境を調節する。大腸菌及び他の酸発生菌もこの作用から利益を得る。また、酸形成からブタンジオールへの交換及びその逆の交換が可能な種類も存在する（例えばセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）種）。前述のこれらの種は通常、腸管の支配的フローラではないが、大腸菌及びクレブシエラは腸管の支配的フローラである。
【００３５】
仮説：すべてのブタンジオールが必ず３つの炭素ピルビン酸塩を経て形成されるのか？微生物がエネルギー的により都合よく６つの炭素グルコースをブタンジオール（アセトインを経て）及びエタノールに分割出来なかったのは何故か？この種の代謝経路は恐らく可能になるが、どのように？ピルビン酸塩から始まる経路に並行する代謝経路が存在する可能性はあるか？重要な問題は：全てのブタンジオールが常に、分岐鎖アミノ酸合成に関連する上述の経路を介して形成されるのか、又は他の既存の経路がいくつか存在するのか？以下の表では、過去の研究に基づいて、混合酸発酵及び２，３‐ブタンジオール発酵における物質の形成についての所見を提示している。
【００３６】
表２。（ブチレングリコール＝２，３‐ブタンジオール）混合酸発酵及びブチレングリコール発酵、すなわち例えばそれぞれ大腸菌及びクレブシエラ種において発酵したグルコースの１００モル当たりの生成物の総モル数で示した混合酸対ブチレングリコール発酵生成物。Ｓｔａｎｉｅｒ，Ｒ．Ｙ．，Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ，Ｍ．，及びＡｄｅｌｂｅｒｇ，Ｅ．Ａ．，Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｗｏｒｌｄ，ｐ．５８２．Ｐｒｅｎｔｉｓｅ  Ｈａｌｌ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ，Ｎ．Ｊ．，１９７０年（Ｓｏｎｎｅｎｗｉｒｔｈ、１９７３年に準拠する）からのデータに基づく。
【００３７】
【表２】
2017513468.tif 000003
【００３８】
代謝反応：
１．ピルビン酸ＣＨ３ＣＯＣＯＯＨ＋ＴＰＰ→「活性アセトアルデヒド」［ＣＨ３ＣＨＯ］＊ＴＰＰ＋ギ酸ＨＣＯＯＨ
２．ギ酸塩は、水素１分子及び二酸化炭素１分子になる。
３．理論によれば、活性アセトアルデヒドは別のピルビン酸塩と反応し、アセト乳酸が形成される（従ってこの反応は同化分枝鎖アミノ酸の形成反応と競合する）。
４．アセト乳酸はアセトイン＋Ｃ０２になる（２分子存在する！）。
５．２Ｈは、アセト乳酸からブタンジオールを得るために必要である。
【００３９】
コメント：
‐（表に従って）ブタンジオールと同量形成されるエタノールはどこから生じるのか？
‐以下の表に従って、物質は以下の割合で次のようになる：
【００４０】
【表３】
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【００４１】
‐従って、１０ＣＯ２から、２水素、４ブタンジオール、４エタノール及び１ギ酸が得られる。
‐「式によれば」、形成された１ブタンジオールから、１ギ酸が得られる。
‐理論によれば、１ギ酸は１水素になるから、このことは３／４のギ酸（４×１７＝６８）は水素及び二酸化炭素に変換され、１／４は測定時まで反応している時間はなく、代わりに、ギ酸として測定されるようになる（この場合、理論値と等しくブタンジオールと同量のギ酸が存在する）ことを意味する。
‐約８７（測定量の半量）の水素の７／３倍のブタンジオールが存在しているはずであり、このことからＣＯ２の割合が１０ではなく８であることが分かる。
‐このことは、従来の理論に従えば、上記から、アセトラクトン、２ブタンジオール及び４二酸化炭素を経て、グルコースが形成されるはずであることを意味する。
‐上記の計算に基づいて、形成される二酸化炭素の半分以下のブタンジオールが存在するはずであり、これは２を意味する（４存在する！）。
‐上記の理論によればブタンジオールと同量のグルコースからエタノールは形成されないため、２倍量のエタノールが存在する。これはブタンジオール４−２＝２、エタノール４、二酸化炭素８−２×２＝４を意味する。
【００４２】
【表４】
2017513468.tif 000005
【００４３】
ここから残っているのは４二酸化炭素、４エタノール及び２ブタンジオールである。
‐よって、グルコースからブタンジオール、エタノール及び二酸化炭素が２：４：４、すなわち１：２：２の割合で形成される反応とはどのようなものか？
‐グルコース（Ｇｌｕ）、ブタンジオール（ＢＤ）、エタノール（ＥｔＯＨ）及び二酸化炭素（ＣＯ２）中の異なる原子の割合の表である。
【００４４】
【表５】
2017513468.tif 000006
【００４５】
‐ここから、以下のように続く：
【００４６】
【表６】
2017513468.tif 000007
【００４７】
‐余剰分は４Ｃ、２Ｏ及び８Ｈであり、化合物としてはＣ４Ｈ８Ｏ２であり、この化合物は何か？  回答：酪酸塩（酪酸）
‐上記から、以下の反応式が続く：Ｇｌｕ＋酪酸塩→ＢＤ＋２ＥｔＯＨ＋２ＣＯ２、この式はこの例では妥当である。
‐全ての例で、物質はこのように「等価である」。
‐従って、下記表から、開始時の理論により説明された方法では、２グルコースから、１グルコースは初めに従来式に従って２×ピルビン酸塩へと分解され、他方は酪酸と反応し、これにより２ブタンジオール、２エタノール及び４二酸化炭素が形成されるという考えが導かれ、―このことは、ブタンジオールの半分は従来の経路を介して形成され、他の半分は、２エタノール及び２二酸化炭素も含むいくつかの他の経路を介して形成されることを意味する。
‐従って酪酸塩はどこから生じるのか？
‐ほぼ全ての細菌のエネルギー貯蔵材料はポリヒドロキシ酪酸塩（ＰＨＢ）である。それは酪酸のポリマーであり、細菌は自らの細胞に保存する。
‐従って特定の細菌（ブタンジオール発酵を行うもの）は、酸性度が増加すると、特にｐＨ及び浸透圧に関する環境の生育力を維持するため、言い換えれば環境及びその細胞内環境を中和し、均衡を保つため、そのエネルギー貯蔵を利用する。
‐次に、ｐＨが増加すると、細菌は再度ＰＨＢ貯蔵を充填する。
‐４グルコース及び２ＰＨＢ酪酸部から、クレブシエラ、腸内細菌等のブタンジオール発酵細菌は４ブタンジオール、４エタノール、８ＣＯ２及び２水素（それに加えて、１ギ酸があるが、これは反応して水素及び二酸化炭素になる時間がなかったと考えられる）を生成することは化学量論的に整合性がある。
‐（２，３‐ブタンジオールの形成に）必要な酪酸塩は恐らく他の細菌の代謝からも生じることが可能であるが、細胞内供給源としてはＰＨＢが可能性が高い。
【００４８】
ウシ反芻胃内の微生物は、消化物自体が高濃度の遊離単糖又はオリゴ糖等を含んでいなくとも、反芻胃消化物中の単純な有機化合物を利用しており、これにより反応が迅速になり、生産性が高まる。それにもかかわらず、消化物中の加水分解性ポリマーの緩徐な循環により、連続的な高レベルの小分子化合物を維持することが可能になり、バイオ反応の生産性を高めることが可能になる。
【００４９】
微生物によりバイオマスから排出する水素は脱水素酵素によって形成され、その酵素は、水からの新たな水素を有機化合物に結合させる。このように連続作用が生じる：排出水素気体の流動、この中への細胞膜バリア層からのプロトンの流動、及び気体液体相のバリア層上で結合が起こる反応。例えば食肉処理場の廃棄物中の反芻胃消化物、又は家畜肥料又は他のバイオマス廃棄物からの水素形成のこの流れ／連続作用は、それと同時に細胞内の一般的な代謝レベルが減少するため、驚くべき現象である。
【００５０】
様々な調査研究が示唆しているように（Ｋｌｕｙｖｅｒ、１９５６年、Ｈａｋａｌｅｈｔｏ及びＨａｎｎｉｎｅｎ、２０１２年）、ＣＯ２は従属栄養的にバイオマスに結合し、細胞レベルで反応連鎖を作用させる。二酸化炭素のこの結合は微生物の代謝を促進する。
【００５１】
ＰＭＥＵ機器を適用して行う細菌学研究（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２００６年、Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２００９年、Ｐｅｓｏｌａ及びＨａｋａｌｅｈｔｏ、２０１１、Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１１年ａ）から、ガスを発酵ブロスに導入又は誘導すると、微生物の増殖及び代謝が促進されることが分かっている。好気性細菌の場合、このことは、制限要因になることが最も多い溶存酸素が細胞の使用において迅速に拡散するという点で、部分的に説明できる。
【００５２】
しかし、嫌気性発酵反応では、代謝産物―水素（Ｈ２）など―を細胞から離して誘導することがより重要である。その結果、培養物から還元能が消失し、従って水がミネラル基質と反応するときに新たな能力が発生する必要がある。脱水素酵素は水素の排出において決定的な地位を担っている。ヒドラーゼ酵素機能の結果として、水はバイオマスに結合し、この方式で有機分子の水素貯蔵は補充される。
【００５３】
ＰＭＥＵ技術（ポータブル微生物濃縮ユニット）は、微生物の増殖、増殖の開始及び代謝を促進するために開発された（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ及びＨｅｉｔｔｏ、２０１２年、Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１３年）。その目的は、従来のものより高感度で信頼性のある微生物研究方法を開発すること、ならびに従来のものより速く結果を得ることである。それと同時に、衛生モニタリング方法の範囲を多様化することが可能である。ＰＭＥＵは、例えば細菌胞子の通常栄養細胞への形質転換も促進する（Ｍｅｎｔｕら、２００９年）。
【００５４】
ＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎ（登録商標）は、オンライン検出器及び相対濁度測定用遠隔追跡機能が装備された携帯用の微生物濃縮ユニットである。装置の内部温度は摂氏温度の１／１０の精度で非常に正確に調整することが可能であり、微生物の最適な増殖は、試料中に空気又はガスを供給して栄養素の混和性を補助し、代謝を促進することによって確認する。このように、濃縮ユニットの使用者は、使用者が選択する特定の微生物を検出するために様々な「プロトコル」を作成することが可能である。
【００５５】
一般的な培地を使用する場合、培養の初めに、できる限り多くの細菌で増殖を急激に最大にすることが可能である。この場合、ＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎ培養の増殖をオンラインで―分刻みで―追跡できることは非常に重要であり、増殖の図表が装置のメモリに保存される。その図表は、例えばインターネットを介する遠隔使用機能／特性を利用して検討することが可能であり、装置は遠隔制御を利用して調整することも可能である（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１０年、Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１１年ａ／ｃ）。ＰＭＥＵ装置の使用が研究されており、環境及び水資源に関する様々な研究プロジェクトにおいて検証されている（Ｈｅｉｔｔｏら、２００９年、Ｐｉｔｋａｎｅｎら、２００９年、Ｗｉｒｔａｎｅｎ及びＳａｌｏ、２０１０年）。
【実施例１】
【００５６】
大腸菌及びクレブシエラモビリス菌を＋３７℃でＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎ内の培養シリンジ中で培養した。ＴＨＧブロス（トリプトン‐酵母エキス‐グルコース）を栄養培地として使用した。培養シリンジ１及び６では大腸菌が存在し、シリンジ２及び７ではクレブシエラが存在した。シリンジ１及び２は好気条件下で培養し、シリンジ６及び７は酸素量を減少させたガス混合物（Ｎ２、ＣＯ ２、Ｏ２）で培養した。実行１（図４）の例では、グルコースが消耗したとき、減少した酸素条件下で大腸菌の代謝は低下したが（４ｂ．）、一方、キャリヤガスを使用したとき、好気培養（４ｃ．）と類似の速度で減少した酸素条件下（４ｄ．）でクレブシエラ菌の機能は阻害され続けることはなかった。ＰＭＥＵでは、選択に応じて好気性および嫌気性細菌を同時に試験することも可能であり、このことはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌の培養に関する過去の研究でも確認／実証されている（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ  ｙｍ、２００７年）。
【実施例２】
【００５７】
本研究ではＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎを使用し、様々な製糖所のプロセス試料からの中温細菌の増殖率を調べた。その目的は、微生物リスクの制御についての新たな情報を取得し、プロセスの衛生管理を促進する手段／方法を見出すことであった。
【００５８】
ＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎ培養用の試料を糖製造プロセスの様々な段階の自己監視試料から採取した。試料は、温かい水道水貯蔵タンク（ＶＬ）から、タンクの洗浄水から得た水も混入している希釈プロセスの糖水（ＶＭ）から、フィルターを通過した糖溶液（ｃｐ１‐ｃｃｐ６）から、精糖及びシロップの原材料から、煮沸果汁（１Ｋ  ｊａ  ２Ｋ）から、エバポレーター用フィーダー貯蔵器（４０  ｇａ  １４）から、エバポレーター用フィーダー貯蔵器のポンプ（４３  ｄａ  ６）から、加熱前後の容器１２の液体シロップ（ｇａ１２）から、標準化／調節容器の液体シロップ（ラウンド１、ｇａ１）から、排出される液体シロップ（バルクｇａ１）から、ならびに、留分、例えば洗浄水やシロップの原材料として使用したシロップ廃棄物を含む「回収タンク６」（４３  ｇａ  ６）から採取した。
【００５９】
ＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎ及びＴＨＧ又はＢＨＩ栄養ブロスを使用して検体を＋３０℃で培養し、培養温度が＋５０℃になったとき、１試料以外採取した。
【００６０】
製糖所の微生物学研究室で、対応する試料を用いて皿培養（平板計数皿中の中温細菌）を行った。
【００６１】
Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎ培養の結果は、試料の相対濁度を表す図表として示した（図５の例を参照）。
【００６２】
研究から、ＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎは製糖所工場から得られたプロセス試料中の中温細菌の存在を判定するのに非常に適したツールであることが明らかになっている。Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎを使用し、温度を＋３０℃にすると、全ての試料で２４時間後に微生物の増殖が検出され、平板計数法によると微生物密度は２〜６００ｃｆｕ／ｍｌ（２日間）であった。また１試料では、平板計数は０ｃｆｕ／ｍｌであった。試験データによれば、ＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎにおいて２４時間以内に増殖が観察されなければ、中温細菌が試験試料体積内に存在していないということが示唆できる。
【００６３】
ＰＭＥＵ  Ｓｐｅｃｔｒｉｏｎは、糖の製造プロセスで発生する胞子形成細菌の培養にも適している（Ｍｅｎｔｕら、２００９年）。高温を使用すると、増殖ペースが促進され、それにより試料中の多数の胞子の存在に関する情報が同じ作業日中に早期に得られるようになる。
【００６４】
ＰＭＥＵ法は、バイオテクノロジー産業において糖及びグルコース含有試料の微生物学的研究に適している。
【００６５】
過去の結果に基づいて、ＰＭＥＵ法を使用して受け入れられた培養結果は、多くの例で、従来の平板計数法より格段に信頼性の高い定量的培養結果をもたらしている（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１０年、Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１１年ａ）。
【００６６】
ＰＭＥＵ技術に基づいて、時間及び労力を節約する手法及び方法を開発することが可能である。必要に応じて、表面の衛生管理を強化することも当該方法に加えることが可能である（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２００６年；Ｈａｋａｌｅｈｔｏ、２０１０年）。有効性、及び個々の細菌細胞の検出時間を数時間に短縮することが目的であるなら、細菌培養において気体検出を利用することが可能である（Ｈａｋａｌｅｈｔｏら、２００９年）。
【実施例３】
【００６７】
クレブシエラ菌をグルコース濃縮した培地上で培養する場合、本発明者らは、一方で、アセテート及び２，３‐ブタンジオールならびに他の化合物、例えばエタノールによる炭素‐１３マーカーの取り込みを検討し、更に他方で、嫌気的条件下でのアセテート、２，３‐ブタンジオール及びエタノール形成の割合を検討した。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ社のＡｖａｎｃｅ  ＤＲＸ５００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ社、ドイツ）で記録し、その動作周波数は５００．１３ＭＨｚである。ＮＭＲ測定のために、５０μｌ（マイクロリットル）の調整剤を４５０μｌのエキス（１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｄ２Ｏ、ｐＨ７．４、２ｍＭのＮａＮ３、０．１％のＴＳＰ）に添加して試料を調製した。Ｂｒｕｋｅｒ社のｐｕｌｓｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＮＯＥＳＹＧＰＰＲ１Ｄを使用してプロトンＮＭＲスペクトルを取得し、これは廃水のプレサチュレーション試験であり、０．１５Ｈｚのデジタル分解能が得られるスペクトル幅１０ｋＨｚ、６４ｋデータポイント、及び６４走査型でＮＯＥＳＹパルスシーケンスを複合的に初めに追加する。マーカー試験から得た試料の炭素‐１３スペクトルは、０．２３Ｈｚのデジタル分解能が得られるスペクトル幅３０ｋＨｚ、１２８ｋデータポイント、及び９６走査型で測定した。内部基準としてＴＳＰを使用した。試料の温度は３００Ｋとした。
【００６８】
表７．嫌気的なクレブシエラ培養にグルコースを高濃度で添加する試験における、アセテート、エタノール及び２，３‐ブタンジオールの割合。また、これらの培養液のｐＨは培養中に制御した。なお、これらの数値は絶対値を表すものではなく、相対値であることに留意されたい。アセテートが（培養液Ｋ中で）消耗した場合、このことは栄養培地中の利用可能な糖の量も欠乏／不足していることの指標である。２１．５時間の時点で、糖はやや増加している。これは明らかに酵素的加水分解が原因である。
【００６９】
【表７】
2017513468.tif 000008
【００７０】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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