(57)【要約】【課題】本願開示は、ＤＮＡ低メチル化および化学的に修飾された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を作製する方法を提供するものである。【解決手段】この細胞は、心筋組織の再生または心臓の瘢痕組織の交換の促進を必要とする患者の心疾患を治療する方法として有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ低メチル化によって化学的に修飾された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
骨髄細胞、筋芽細胞、臍帯血細胞、小若年性幹細胞、電気的刺激した心臓前駆細胞、成人末梢血細胞、単核細胞、または皮膚線維芽細胞からなる群から選択された親細胞に由来するｉＰＳ細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
１つまたは複数の心臓遺伝子またはマーカーを過剰発現させたｉＰＳ細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
一つ以上の心臓遺伝子またはマーカー、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ａＭＨＣ、サルコメアアクチン、Ｇαｉ、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−７６２、ＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＳ、膜内在性タンパク質２ＡとエフリンＡ３であるｉＰＳ細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
１つまたは複数の多能性遺伝またはマーカーを過剰発現させたｉＰＳ細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
一つ以上の心臓遺伝子またはマーカーで、１つ以上のｍｉＲ−２９０−２９５クラスター、ｌｅｔ−７ファミリー、Ｄｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３ｂないしはＭａｘであるｉＰＳ細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
効果的量でオキサゾールおよびイソキサゾール類似化合物によって修飾された細胞を含むｉＰＳ細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
効果的量は約０．３〜約３０ｕＭ、約０．５ｕＭ〜約２５ｕＭ、約１２ｕＭ〜約２５ｕＭ、約０．５ｕＭ〜約２０ｕＭのグループから選択されたｉＰＳ細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
Ｏｃｔ４を上方制御するために効果的量のＤＮＡメチレーショントランスフェラーゼ阻害剤を親細胞に接触させる方法で作製されたｉＰＳ細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞であって、
親細胞への外来遺伝子の挿入を除外する方法で作製されたｉＰＳ細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のｉＰＳ細胞の細胞集団。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞群であって、実質的に均質である細胞群。
【請求項１３】
請求項１１に記載の細胞集団のクローン細胞集団。
【請求項１４】
化学的修飾細胞は検出可能な標識を含む、請求項１の化学的修飾の細胞。
【請求項１５】
心臓系統細胞を幹細胞から調製する方法であって、有効量のイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物を幹細胞と接触させることから成る方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記幹細胞は、１つ以上のｉＰＳ細胞、骨髄細胞、筋芽細胞、臍帯血、ＳＪＳＣ、成人末梢血、単核細胞、皮膚線維芽細胞または電気的に刺激された心筋前駆細胞である方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、
過剰発現心臓系細胞は１つ以上の心臓遺伝子またはマーカーである方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
１つ以上の心臓遺伝子またはマーカーはＮｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、αＭＨＣ、 サルコメア アクチン、Ｇαｉ、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−７６２、ＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣ５、内在性膜タンパク質２ＡおよびエフリンＡ３である方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、
前記心臓系統細胞は、１つ以上の多能性遺伝子またはマーカーを過剰発現する方法。
【請求項２０】
請求１７に記載の方法であって、
１つ以上の心臓遺伝子またはマーカーで１つ以上のｍｉＲ−２９０−２９５クラスター、ｌｅｔ−７ｆファミリー、Ｄｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｍａｘの方法。
【請求項２１】
請求１５に記載の方法であって、
効果的量は約０．３ｕＭから約３０ｕＭ、約０．５ｕＭから約２５ｕＭ、約１２ｕＭから約２５ｕＭ、と約０．５ｕＭから約２０ｕＭのグループから選択された方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法であって、接触は試験管内（in vitro）または生体内（in vivo）である方法。
【請求項２３】
請求項１５に記載の方法であって、幹細胞がｉＰＳ細胞である方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、
ｉＰＳ細胞はＯｃｔ４をアップレギュレートするＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を接触させることを含む方法によって作製される方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ｉＰＳ細胞が外因性遺伝子の親細胞への挿入を除外する方法によって作製された方法。
【請求項２６】
請求項１５の方法により作製された単離細胞。
【請求項２７】
請求項２６の細胞集団。
【請求項２８】
請求項２６の細胞集団であって、均一同種の細胞集団。
【請求項２９】
請求項２７の細胞集団のクローン集団。
【請求項３０】
請求項２６の細胞集団であって、単離された細胞が検出可能な標識を含む細胞集団。
【請求項３１】
１つ以上の心筋組織再生の方法であって
必要とする患者の心臓病を治療するために心臓瘢痕組織の置き換えを促進するため、患者に１つ以上の有効量の請求項１記載の化学的に修飾された細胞、または有効量の分離した幹細胞と有効量のイソキサゾールまたはイソキサゾール類似した合成物を投与する方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、患者が哺乳類である方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、哺乳動物がマウス・ウマ・ウシ・ネコ・イヌまたはヒト患者である方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、投与は局地的又はシステム的である方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法であって、幹細胞は心臓パッチを介して投与される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１４年４月１７日付にて米国に出願した特許出願番号第１４／２５５，７８９号に対して米国特許法１１９（ｄ）条（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｄ））に基づいて優先権を主張するものであり、そのすべての内容は参考文献として本特許出願に取込まれる。
【背景技術】
【０００２】
様々な技術・特許刊行物は本願発明と関連する技術の現状をより完全に説明するために参照され、いくつかの出版物の完全な文献引用は請求の範囲の直前・明細書の最後に掲載される。
本明細書に記載するすべての刊行物は、その全体を参照することにより本出願に取込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は心臓前駆細胞などの前駆細胞の素として、例えば心筋梗塞の治療などの創薬ないしは疾患治療のために重要である。
ｉＰＳ細胞の固有の特性は奇形腫を形成することに起因するため、腫瘍を生じることなくｉＰＳ細胞を作製することが臨床においては非常に重要となる。
これらの問題の重要性を考え、また再プログラミング効率を改善するための試みとして、いくつかの非ウイルスのｉＰＳ細胞作製が考案された。
種々の成長因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｓ’−アザシチジンおよびＲＧ１０８）などの化学化合物、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えばバルプロ酸）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＢＩＸ−０１２９４）、Ｗｎｔ３Ａ、ＡＬＫＳ阻害剤によりｉＰＳ細胞の誘導効率（１−６）が別の実験操作により改善することが見出されており、ｉＰＳ細胞は移植前の心臓系統の細胞に誘導することができる。
これらの手法では作業量が多く、ＣＶＳの疾患治療に必要な数の細胞を制限なく製造するほどには効率的ではない。したがって臨床用もしくは薬剤開発用の安全なｉＰＳ細胞を生成する方法を確立する必要がある。本発明はこのようなニーズを満たし、関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願においては、ＤＮＡ低メチル化によって化学的に修飾された人口多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を提供する。ある態様では、細胞は効果的量のイソキサゾールまたはイソキサゾール類似化合物と接触することによって修飾されたものを含む。
他の態様においてはｉＰＳ細胞は、骨髄細胞・筋芽細胞・臍帯血細胞・若年の幹細胞・成人の末梢血細胞・単核細胞または皮膚線維芽細胞などの親細胞から誘導される。
また細胞は１つ以上の心臓遺伝子またはマーカーを過剰発現させたことを特徴とするものであり、その非限定的な例としては、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ａＭＨＣ、サルコメアアクチン、Ｇαｉ、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−７６２、ＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＳ、膜内在性蛋白２ＡおよびエフィリンＡ３が挙げられる。
他の様態において当該細胞は、１つ以上の多能遺伝子またはマーカーであるｍｉＲ−２９０−２９Ｓクラスター、ｌｅｔ−７ファミリー、Ｍａｘの発現を抑えたもの、および／または、１つ若しくは複数のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子Ｄｎｍｔｌ、Ｄｎｍｔ３の発現を抑えたものである。
【０００５】
一態様においては化学的に修飾されたｉＰＳ細胞はＯｃｔ４を過剰発現させるため、有効量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を親細胞に接触させることを含む方法により作製した。
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の非限定的な例としては、５’−アザシチジン、５−アザ−２’デオキシシチジン（5-aza-2'deoxycytidine）、ＭＧ９８、ゼブラリン（zebularine）およびＲＧ１０８を含む。
一態様においてはｉＰＳ細胞は、外因性遺伝子の親細胞への挿入を除外する方法によって作製された。
【０００６】
さらに別の実施形態における親細胞は、電気刺激によって前処理がなされた心臓前駆体である。
別の態様において親細胞は、Ｓｃａ１と多能性心臓遺伝子を発現した幹細胞である。
【０００７】
さらに上述のような特性を有する細胞群は、本願の開示によって提供される。一態様における細胞群は、実質的に均質またはクローンである。
【０００８】
またこの提供では幹細胞から心筋細胞系列細胞を作製する方法を含む、あるいは基本的に構成する又はさらに別に構成する、有効量のイソキサゾール化合物またはイソキサゾール類似の化合物と幹細胞を接触させる方法が提供される。
当該の接触は、試験管内（in vitro）または生体内（in vivo）で行うことができる。幹細胞の非限定的な例としては、骨髄細胞、筋芽細胞、臍帯血、電気的に刺激した心臓前駆細胞、ＳＪＳＣ、成人の末梢血単核細胞、および皮膚線維芽細胞から選択される。
本明細書で提供される方法は、一つ以上の心臓遺伝子またはマーカーを過剰発現し、心臓系統の細胞を作製する。１つ以上の心臓遺伝子またはマーカーの非限定的な例としては、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、αＭＨＣ、サルコメア アクチン、Ｇαｉ、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−７６２、ＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣ５、内在性膜タンパク質２ＡとエフィリンＡ３がある。
さらに心筋細胞系列細胞は、１つ以上の多能性遺伝子またはマーカーを発現抑制したものである。１つ以上の多能性遺伝子またはマーカーの非限定的な例は、ｍｉＲ−２９０−２９Ｓクラスター、ｌｅｔ−７ファミリーであり、および／または１つ以上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子Ｄｎｍｔｌ ＤＮＭＴ３Ｂ Ｍａｘを発現抑制したものである。
【０００９】
特定の一態様では、幹細胞はｉＰＳ細胞である。一態様では、ＩＰＳＣを調製する方法は、有効量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を親細胞と接触させＯｃｔ４を過剰発現させることを含む、あるいは基本的に構成する、又はさらに別に構成する。
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の非限定的な例としては、５’−アザシチジン、５−アザ−２’デオキシシチジン（5-aza-2'deoxycytidine）、ＭＧ９８、 zebularine およびＲＧ１０８がある。
一態様においてｉＰＳ細胞は、親細胞への外来遺伝子の挿入を除外する方法によって作製した。
【００１０】
さらに本明細書に記載にあるように、細胞群の調整方法、実質的に均一またはクローン細胞集団を調製する方法を提供する。これらは細胞内に検出可能な標識を挿入することを含む、あるいは基本的に構成する、又はさらに別に構成することによってさらに変更できる。
【００１１】
さらに別の提供は、本明細書に記載されるように、必要とする患者に心臓の瘢痕組織の交換を促進するまたは心筋組織を再生するために、１つ以上の有効量のイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似の化合物および/または有効量の単離された細胞または細胞群を投与する方法である。
【００１２】
さらに必要とする患者の心疾患を治療するための方法で、本明細書に記載のように有効量のイソオキサゾール、イソキサゾール類似化合物および/または有効量の単離された細胞、または細胞群を投与する方法を提供する。
【００１３】
開示された方法によって治療された患者には、哺乳動物の患者も含む。その非限定的な例として、マウス・ウマ・ウシ・ネコ・イヌまたはヒト患者が含まれる。
細胞は、患者の自己の細胞または同種異系のものである。
【００１４】
本明細書に記載するように、細胞の調整および療法を投与のため使用する薬剤と組成物および使用説明書が含まれるキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。
カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁により提供される。
【００１６】
【図１】図１は、多能性マーカーの発現のｉＰＳ細胞の特性評価を示す。  代表的な顕微鏡写真は、ＩＰＳクローンが胚性幹細胞（ESC）特定マーカーのＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ（赤色蛍光）および内因性のＯｃｔ４（緑色蛍光）の発現することを示している。核はＤＡＰＩ（青色蛍光）で染色した。
【００１７】
【図２】図２は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性測定の結果を示す（DNMT）。小分子で処理したｉＰＳ細胞は、非処理ｉＰＳ細胞に比べてＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性の有意な（９５％）阻害を示す。
【００１８】
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、小分子処理が試験管内（in vitro）で細胞保護（サイトプロテクション）を誘導し、その小分子処理が酸化を防止およびアポトーシスおよび増殖を増加させることを示している。  図３Ａに示すように、アポトーシスはＴＵＮＥＬアッセイによって検出した。陽性細胞／顕微鏡視野では小分子で処理したｉＰＳ細胞は非処理ｉＰＳ細胞の対照と比較してより少なく観察された。小分子処理ｉＰＳ細胞の分裂促進応答は非処理ＩＰＳ細胞と比較して著しく増加した。  すべての値は、平均±ＳＥＭ、* p<0.05 0対コントロールとして発現した。
【００１９】
【図４】図４は、細胞質へのシトクロムｃ転座（細胞傷害の記号）を示す。非処理および小分子処理されたＩＰＳ細胞はＨ２０２（１００ ｆ.ｔｍｏｌ）で暴露後、（ＤＡＰＩで画像を合併）、（元倍率;２００倍）シトクロムｃ（赤）の免疫染色した。  非処理ＩＰＳ細胞と比較して、小分子処置したｉＰＳ細胞は細胞質へのシトクロムｃの転位の有意な減少を示す。
【００２０】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、小分子が試験管内（in vitro）でｉＰＳ細胞の心筋分化を媒介していることを示す。  図５Ａは、小分子処理ｉＰＳ細胞中の心臓特異的遺伝子ＮＫｘ２．５とαサルコメアアクチンの免疫染色を示す（ＤＡＰＩで画像を拡大）、（元倍率; ４００倍）。  図５Ｂは、小分子処理ＩＰＳ内の心筋細胞特異的マーカー、Ｎｋｘ２．５の非処理ＩＰＳとの比較をＲＴ−ＰＣＲ分析で行ったものである。小分子処理ＩＰＳは、非処理ＩＰＳと比較して有意な上方制御（upregulation：アップレギュレーション）を示した。
【００２１】
【図６】図６は、Ｇタンパク質共役受容体（GPCR）シグナル伝達を標的とすることによって小分子処理がグローバルなＤＮＡ低メチル化を誘導することを示す。
【００２２】
【図７】図７Ａ−７Ｄは、非処理のＩＰＳ細胞対小分子処理ＩＰＳ細胞のｍｉＲ−マイクロアレイ解析を示す。ｍｉＲ発現プロファイルが非処理ＩＰＳ細胞と小分子処理されたｉＰＳ細胞とでは全く異なっていたことがマイクロアレイ分析で示された。（図７Ａ−７Ｄ）  ｍｉＲｓは分化およびリプログラミングのために極めて重要であることが知られており、非処理ｉＰＳ細胞および小分子処理ｉＰＳ細胞内で観察される。  ｍｉＲマイクロアレイ解析で、小分子処理ｉＰＳ細胞内の心臓特異的ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−７６２のアップレギュレーション、およびを多能性関連ｍｉＲ−２９０−２９５クラスターおよびｌｅｔ−７ファミリーのダウンレギュレーションを示した。
【００２３】
【図８】図８は、小分子処理ＳＩＰｓ細胞におけるＧＰＣＲシグナル伝達を示す。  ウェスタンブロット分析では小分子で処理したｉＰＳ細胞とＧＰＣＲブロッカーおよび百日咳毒素でブロックした非処理ＩＰＳ細胞を比較した場合、小分子で処理したｉＰＳ細胞でＧａ（ｐａｎ）の有意なアップレギュレーションを示す。
【００２４】
【図９】図９Ａ−９Ｉは実験２で記述された若年および老年のマウスの異種の骨髄由来の幹細胞（BMSCs）から得られた小さな幼若幹細胞（SJSCs）の特性評価を示す。  図９Ａおよび９Ｂは若年および老年両方のＳＪＳＣｓが、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９およびＣＤ９０ Ｃ陽性で、ＣＤ４５およびＣＤ１１７ Ｂ陰性であることを示す。  図９Ｃの細胞増殖曲線では、細胞増殖速度がBMSCsよりもSJSCsが高かったことを示す。老年ＢＭＳＣｓと老年ＳＪＳＣｓを比較すると、オクタマー結合転写因子４（Oct-4）、Ｎａｎｏｇ、性別決定領域Ｙボックス２（Sox-2）、Kruppel様ファクター４（Klf-4）およびＲｅｘ−１のような多能性マーカーの高い発現を示した。  図９Ｄは、ＧＡＴＡ−４および筋細胞特異的エンハンサー因子２Ｃ（MEF2C）などの心原性分化マーカーを示す。  図９Ｅは、sirtuin 1 (Sirtl) のようなアンチエイジングマーカーとテロメラーゼ逆転写酵素（Tert）の発現を示す。  図９Ｆは、ＲＴ−ＰＣＲ検査でのマーカー発現である。  図９Ｇで老いた骨髄からのＳＪＳＣｓが、老いたＢＭ中の他の細胞と比較して少ない老化関連ガラクトシダーゼ（β-gal）発現を示した。  図９Ｈで示される共焦点顕微鏡では、老年ＳＪＳＣｓは老年ＢＭＳＣｓと比較しテロメアの高い密度を持っていたことを示している。  図９Ｉは、in situハイブリダイゼーション（FISH）分析の定量蛍光であり、ＳＪＳＣｓはＢＭＳＣと比較してより長いテロメアを維持することを実証している。老年ＢＭＳＣと比較すると、老年ＳＪＳＣｓはテロメアの短縮が遅れている。
【００２５】
【図１０】図１０Ａ−１０Ｄは、Sea-l+ CSCsの特性を示す。  図ｌ０Ａは、ＣＳＣｓの単離手順の簡単な説明である。  図１０Ｂは、単離したCSCs中のSea-l+ の発現が発現免疫細胞化学およびフローサイトメトリーにより検証されたことを示す、(赤=Sca-1+; 青=DAPI)。  図１０Ｃでは、ジスコイジンドメイン受容体2（DDR2）とプロリル−４−ヒドロキシラーゼβ（P4HB）抗体がＣＳＣ培養においてまれに陽性であった。  図１０Ｄは分離したSea-l+ 細胞コロニーに造血前駆マーカー（c-kit）、多能性マーカー（Oct-4、Sox2、Nanog）、幹細胞側集団マーカー（Bcrp1）、早期の心臓系統マーカーの発現（NKx2.5、GATA4、MEF2C）、および血管前駆細胞マーカー(Flk1）が発現していることがＲＴ−ＰＣＲで分析されたことを示す。  「Ｃ」は、培養コロニーとその識別番号である。  それらは、フローサイトメトリーによって測定され、継代５から３０、Sea-l+ 80&#12316;90％の陽性細胞に維持した。全ての実験はこの継代内で行った。バー= L00 f.tmである。
【００２６】
【図１１】図１１Ａ−１１Ｄは、ＣＴＧＦがＥｌｅＳ誘発性ＦＡＫ／ＡＫＴ経路の主要な下流因子であることを示している。ＣＴＧＦはEleS誘発性FAK/ AKT経路のための主要な下流因子である。  図１１Ａは、ECMおよび細胞接着分子の遺伝子発現プロファイリングをリアルタイムPCRベースで行ったことを示す。４つの各アップレギュレート遺伝子ならびにダウンレギュレート遺伝子は倍率変化に基づいて選択した。  図１１Ｂ・図１１Ｃは、従来のＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ（N=5）である。  図１１ＤはＣＴＧＦ陽性を免疫細胞化学法により、非EleSCSCsと比較した場合にEleSCSCsが高かったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
特に断りのない限り本発明の実施は、当該技術分野の技術の範囲内である組織培養・免疫学・分子生物学・微生物学・細胞生物学・ＤＮＡ組換の従来における技術を採用する。
Sambrook, Frisch and Maniatis (1989) Molecular Cloneng: A Laboratory Manual, 2nd edition; F. M. Ausubel, et al. eds. (1987) Current Protocols In Molecula Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995) (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Tayloreds.); Ausubel, et al. eds. (1987) Current Protocols In Molecula Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995) (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Tayloreds.)を参照する。
【００２８】
すべての数の呼称、例えばｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量を含む範囲は、（+）または（−）が1.0または0.1の単位で近似値とする。またすべての数字に対して「約」という用語を常用してはいないものの、その数字も近似値を適応している。
また常に明確に本明細書に記載した試薬は単に例示したものであり、その対等のものは当技術分野で知られていることを述べていないが理解されるべきである。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形"a"、"an"、および"the"は、文脈から明らかにそうでないと指定されない限り、複数の指示対象を含んでいる。
【００３０】
自家細胞置換、自家移植または自家移植片様の治療の条件は、細胞ドナーが細胞置換受容者となる。
同種細胞置換、同種移植または同種移植片様の治療条件は細胞ドナーが細胞置換受容者と同じ種となるが、細胞ドナーが受容者になるとは限らない。細胞置換での条件は、細胞ドナーと受容者がヒストコンパティビリティが適合している場合、同系置換である。
「異種移植」（xenogeneic transfer）、「ゼノ移植」（xenogeneic transplantation）、「異種移植片」（xenograft）などの用語は治療法を意図したものであり、前記細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエント（提供者）と異なる種のものである。
【００３１】
「生体適合性足場」とは、所望の組織を作製するための適切な細胞活動をサポートし、分子および機械的シグナル伝達系の促進を含め、任意の望ましくない細胞内または局所で任意の望ましくない効果を誘発または誘導せず、最終的にホスト内または全身応答する適切な細胞活性を支持する基板として実行する能力をもつ、組織工学のための足場またはマトリックスを指す。
他の実施形態では、生体適合性の足場は、宿主における局所的にまたは全身的に望ましくない効果を誘発することなく、宿主へ望ましい程度の組込で、その意図した機能を実行する能力を有する埋込型装置の前駆体である。
生体適合性足場は、米国特許第６６３８３６９に記載されている。
【００３２】
本明細書で使用される「心臓パッチ」は生体工学によって作られたものであり、ｉＰＳ細胞からなる及びｉＰＳ細胞含む材料で作られた２次元または３次元（3D）の組織パッチである。
【００３３】
「心筋細胞」または「心筋の細胞」とは、主に心臓の心筋を形成する特殊な筋細胞で、５つの主要な構成要素を持つ。
１．細胞膜（筋細胞膜）とＴ細管
２．筋小胞体
３．収縮のために必要なカルシウムイオンチャンネルを持つ収縮要素
４．ミトコンドリア
５．核
心筋細胞はサブタイプに細分でき、心房心筋細胞、心室心筋細胞、ＳＡ結節心筋細胞、末梢ＳＡ結節心筋細胞、または中央ＳＡ結節心筋細胞が含まれるものの、これらには限定されない。
幹細胞はインパルス伝導のため心筋細胞の生理機能を模倣し作用するか、ないしは代わりに心筋細胞に分化することができる。
これらの分化は、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、アクチン、トロポニン、トロポミオシン、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２ＣおよびＮｋｘ２．５から選択されるマーカーから検出される。
【００３４】
心筋細胞マーカーの「ミオシン重鎖」と「ミオシン軽鎖」は、筋細胞に見られる収縮力を生成するモータータンパク質の大きなファミリーである。
これらのタンパク質は、配列決定と同定がなされている。GenBank Accession Nos. AAD29948, CAC70714, CAC70712, CAA29119, P12883, NP 000248, P13533, CAA37068, ABR18779, AAA59895, AAA59891, AAA59855, AAB91993, AAH31006, NP_000423, および ABC84220が参照例である.
これらのタンパク質の遺伝子も、配列決定と同定がなされている。GenBankAccession Nos. NM_002472 および NM_000432 が参照例である。
【００３５】
心筋細胞マーカー「アクチニン」は、全ての真核細胞の細胞質に見出される細胞骨格の最も細いフィラメントであるマイクロフィラメントタンパク質である。
アクチンの重合体はアクトミオシン駆動型の収縮過程における役割を果たし、筋収縮中のミオシンのＡＴＰ加水分解に依存し収縮のプラットフォームとして機能する。
当該のタンパク質は、配列決定と同定がなされている。GenBank Accession Nos. NP_001093, NP_001095, NP_001094, NP_004915, P35609, NP_598917, NP_112267, AAI07534, および NP_001029807. を参照する。
このタンパク質の遺伝子もまた配列決定と同定がなされている。GenBank GenBank Accession Nos. NM_001102, NM_004924, および NM_001103が参照例である。
【００３６】
心筋マーカー「トロポニン」は、骨格筋および心筋における筋収縮に不可欠である３つのタンパク質の複合体である。
トロポニンはプロテイン「トロポミオシン」に結合し、筋肉組織におけるアクチンフィラメントの間の溝内に位置する。
トロポミオシンは、心筋細胞マーカーとして使われる。これらのタンパク質の遺伝子は、配列決定と解析がなされている。GenBank Accession Nos. NM_000363, NM_152263, and NM_001018007 が参照例である.
【００３７】
「クローン増殖」は、２つの同一の娘細胞および／または同一の細胞群で、単一細胞の連続的な分裂による細胞群の増殖を指す。
【００３８】
本明細書で使用される「含む」（comprising）なる用語は、引用された要素を含む組成物および方法を指すものの、それ以外のものを除外する意図ではない。
「基本的に〜なる」（Consisting essentially of）は組成物および方法を定義するものであり、意図された目的のために使用した場合、任意の本質的に重要な他の要素を除外する組合せとは、意図された目的のために使用した場合である。したがって本明細書で定義される基本的に要素となる組成物は、微量汚染物質および不活性な担体を除外しない。
「からなる」（Consisting of）は、他の成分の微量元素以上と実質的な方法ステップを除外したものを意図している。実施形態はこれらの各移行用語はこの発明の範囲内で定義されるものである。
【００３９】
「組成物」は活性剤や他の担体の組合せを包含することを意図したものであり、アジュバント・希釈剤・結合剤・安定剤・緩衝液・塩・親油性溶媒・保存剤・アジュバントなどが例として挙げられる。
担体は、生体適合性の足場、医薬賦形剤および添加剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖を含む糖、ジ−、トリ−、テトラ−、およびオリゴ糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖；および多糖類または糖ポリマー）であって、単体もしくは組合せで存在し、重量や体積の組合せが１から99.99パーセントである。
典型的なタンパク質賦形剤には、血清、ヒト血清アルブミン（HSA）などのアルブミン、組換ヒトアルブミン（rHA）、ゼラチン、カゼイン等がある。
緩衝能として機能することができる代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。
本発明の範囲内では炭水化物賦形剤も意図されており、限定されない例としてはフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類;ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類;ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖類;およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールなどのアルジトールなどが挙げられる。
【００４０】
「コントロール」は、比較のために実験に使用される代替の対象または試料である。コントロールは、「正」または「負」とすることができる。
例えば実験目的が特定の表現型と遺伝子の変化した発現レベルの相関関係を決定することである場合、一般にポジティブコントロール（対象からのサンプル、望ましい表現型に変質するまたは示すもの）およびネガティブコントロール（変更された発現または表現型を欠いている対象からのサンプル）を使用することが好ましい。
さらに実験目的として薬剤が幹細胞の分化に影響を与えるかどうかを決定する場合、ポジティブコントロール（分化に影響を与えることが知られている相のサンプル）ならびにネガティブコントロール（影響のないことが知られている薬剤および薬剤が追加されていないサンプル）を使用することが好ましい。
【００４１】
「培養」という用語は、様々な種類培地中または培地上で細胞または生物の試験管内（in vitro）での増殖を指す。培養で増殖させた細胞の子孫は、親細胞と完全に同一（例えば形態的、遺伝的または表現型）でなくてもよい。
「拡張した」（expanded）とは、細胞の任意の増殖または分裂を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する用語「検出可能な標識」とは、検出されるべき組成物に直接または間接的に結合されて、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物であり、例えばＮ末端ヒスチジンタグ（N-His）、磁気活性同位体、１３Ｃ、１５Ｎ、ポリヌクレオチド、タンパク質のような非放射性同位体、抗体のような標識された組成物である。
また同用語は例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの挿入配列の発現の際にシグナルを発するポリヌクレオチドにコンジュゲート配列（挿入配列）を含む。
標識はそれ自身によって検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒し得るものである。標識は、小規模の検出に適しているか、またはハイスループットスクリーニングのためにより適切であり得る。
このような適切な標識としては、酵素を含む磁気活性同位体・非放射性同位体・放射性同位体・蛍光色素・発光化合物・色素およびタンパク質があるものの、これらに限定されない。
標識は、単に検出できるか、定量化可能である。定量化される応答は、一般に、強度、偏光および／または他の特性のように定量化（例えば、数値で報告可能な）の値を有する応答を含む一方、単に一般に検出される応答は、その存在を単に確認する応答を含む。
発光または蛍光アッセイでは、検出可能な応答は発光体を直接使用する、蛍光物はアッセイ組成物と結合があり実際結合に関与している、間接的に発光体を使用する、または蛍光物が他のもの（例えばレポーターまたはインジケータ）に結合して発生される。
【００４３】
発光標識の例にはシグナルを発するものを含まれ、生物発光ならびに化学発光があるものの、これに限定されない。
検出可能な発光応答は、一般に発光シグナルの発生および変化を含む。ルミネセンス標識アッセイを構成する適切な方法および発光群は当該分野で公知であり、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6'h ed.)に記載されている。蛍光プローブの例にはエクオリンおよびルシフェラーゼを含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
適切な蛍光標識の例としてはフルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル - クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＴＭ、およびテキサスレッドなどが含まれるもののこれらに限定されるものではなく、また他の適切な光学色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6'h ed.)に記載されている。
【００４５】
本明細書で使用される用語「検出可能な標識」とは、検出される組成物に直接または間接的に結合されて、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物を指し、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（N-His）、磁気活性同位体（例えば１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ）、非放射性同位体１３Ｃおよび１５Ｎ、ポリヌクレオチド、タンパク質抗体のような「標識された」組成物などである。
また同用語は、挿入された配列の発現の際にシグナルを提供するポリヌクレオチドにコンジュゲート配列、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）などを含む。標識はそれ自身によって検出可能（例えば、放射性同位体標識および蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物および組成物の化学変化を触媒してもよい。
ラベルは、小規模検出に適切およびハイスループットスクリーニングにもっと適切でありえる。
例えば適切な標識として、酵素を含む磁気活性同位体、非放射性同位体、放射性同位体、蛍光色素、発光化合物、色素、およびタンパク質などがあるが、これに限定されるものではない。
定量化される応答は一般に、強度、偏光および／または他の特性のように定量化できる（例えば、数値で報告可能な）値を有する応答を含む一方、単に一般に検出される応答では、その存在を単に確認する応答を含む。
発光または蛍光アッセイでは、検出可能な応答はアッセイ成分が発光物質または蛍光物質と実際の結合に関与し発生する、または間接的に発光物質または蛍光物質が結合して別の（例えばレポーターまたはインジケータ）成分により発生する。
【００４６】
シグナルを発生する発光標識の例としては、生物発光と化学ルミネセンスがあるが、これに限定されない。検出可能な発光応答は、発光シグナルの一般的変化ないしは発光シグナルの発生を含む。
標識アッセイ成分のための適切な方法および発光物質は、当該分野において公知なものの例としてHaugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6'h ed.)がある。
蛍光プローブの例としてはエクオリン・ルシフェラーゼが含まれるが、これらに限られない。
【００４７】
適切な蛍光標識の例には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル - クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＴＭおよびテキサスレッドを含まれるものの、これらに限定されない。
他の適切な光学色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals （6'h ed.）に記載されている。
【００４８】
対照と比較して「発現量が異なる」とは遺伝子またはマーカーの発現が増加または減少することを意図する。
【００４９】
「分化」とは、未分化細胞が心臓・肝臓または筋肉細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。
「分化誘導」は、特定の細胞型への分化を誘導するための幹細胞培養条件の操作をいう。
「脱分化」は、分化前の細胞系統に戻ることである。本明細書において「分化する」または「分化した」なる用語は、細胞系統内でより確実に（「分化した」）位置をとる細胞と定義する。
本明細書で使用される「中胚葉（または外胚葉または内胚葉）に分化する細胞系譜」のように、それぞれ特定の中胚葉、外胚葉または内胚葉系統に分化する細胞と定義する。
中胚葉系統に分化する細胞または特定の中胚葉細胞を生じる細胞には、脂肪生成・骨形成・軟骨形成・心原性・皮膚・造血・ヘム血管新生・筋原性・腎性・尿生殖器原性・骨形成・心膜原性または間質細胞などがあるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で使用する用語「分化する」または「分化した」は、細胞系統内でさらに確約の「分化」した細胞を定義する。
「脱分化」とは、細胞系統内でより分化前の状態に戻った細胞のことを指す。
【００５１】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、高メチル化を阻害する能力をもつ小分子または薬剤であり、抑制遺伝子をもとに戻し、試験管内（in vitro）および生体内（in vivo）での実験モデルにおいて抗腫瘍効果を発揮する。
Goffin and Eisenhauer (2002) Ann. Oneal. November 13(11): 1699-16716.阻害剤の一例としては N-phthalyl-L-tryptopha (C19H14N204、 商品名 RG108、 Sigma-Aldrich)があるが、これに限られない。
追加の例としては、５’−アザシチジン、５−アザシチジン、メチルトランスフェラーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むもの、例えば
MG98 (see Amato (2007) Clin. Gentourin Cancer, December, 5(7):422-426ならびに1-( D-Ribofuranosyl)-2(1H)-pyrimidinone (シチジンのヌクレオシドアナログ、 商品名(Abeam（登録商標）)がある。
【００５２】
ＤＮＡ低メチル化とは、ＤＮＡメチル化が正常なレベルよりも低いことをいう。
ＤＮＡメチル化のレベルを決定する方法は、本明細書に記載されているいくつかの当該技術分野で周知である。
【００５３】
本明細書に記載される用語の有効量とは、試薬または組成物の濃度または量を指し、本明細書に記載される組成物、または細胞群および他の試薬、目的とした結果を得るために有効な、生体内（in vivo）または試験管内（in vitro）の細胞増殖および/または 分化を含み、あるいは本明細書に記載の神経変性状態の処理も含む。
当然のことながら投与される細胞数は治療される個々の障害に特に依拠しており、それだけに限定されないが処置されるサイズまたは総体積/表面積を含んでおり、さらに投与部位の付近など治療される領域の位置は医薬生物学者によく知られている他の要因によっても変化する。
【００５４】
用語の有効期間（または時間）と有効な条件とは期間または制御条件（例えば、試験管内（in vitro）における温度・湿度条件）を意図し、薬剤または組成物を活性化させ目的の結果を得るために必要または好適なものである。
例としては、予定された細胞型への分化などである。
【００５５】
「胚様体またはＥＢ」は、その後の分化を促進する培養中に形成された胚性幹細胞の３次元（3D）凝集体である。
懸濁培養で増殖させたとき、ＥＢ細胞は内臓内胚葉の外層に囲まれた細胞の小さな凝集体を形成する。増殖および分化の際に、ＥＢは液体で満たされた空洞および外胚葉様細胞の内側層と嚢胞性胚様体へと発達する。
【００５６】
本明細書で使用される 「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡおよび／またに転写され、続いてペプチド、ポリペプチドならびにタンパク質に翻訳されるプロセスを意図する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
遺伝子ならびにマーカーに適応される「発現量が異なる」とは、遺伝子または遺伝子によってコードされたタンパク質産物から転写されたｍＲＮＡの生産量の差異を意味する。通常、非処理または対照細胞の発現レベルと比較して（別名 阻害）過剰発現また発現抑制される。
一態様では１．５倍あるいは、２倍あるいは、少なくとも２．５倍または、少なくとも３倍または、３．５倍あるいは、少なくとも４倍あるいは、少なくとも５倍あるいは１０倍高く発現する（すなわち過剰発現）、または対照試料において検出される発現レベルよりも低い。
さらに「発現量が異なる」なる用語は、細胞内または組織中に発現したヌクレオチド配列が対照細胞のどこにおいてサイレントとして発現し、どこで発現されず又はどこで発現しなかったのかということも指す。
【００５７】
「人工多能性細胞」とは、成体細胞から未成熟表現型に再プログラムされた胚様細胞のことを指す。
様々な方法が当技術分野において知られており、参照例として"A simple new way to induce pluripotency: Acid." Nature, 29 Jan. 2014 および available at sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445, last accessed on Feb. 5, 2014 および米国特許出願公開 No. 2010/0041054 がある。
ヒトｉＰＳ細胞はさらに幹細胞マーカー発現し、３つ全ての胚葉に特徴的な細胞を生成することが可能である。
【００５８】
「イソキサゾール」は天然に存在する化合物の種類であり、イボテン酸のような多数の薬品があり、ＣＯＸ−２阻害剤、フロキサン（furoxan）を含む一酸化窒素供与体である。
イソオキサゾールはピリジンの有用等価体であり、電位依存性ナトリウムチャネルを阻害するために疼痛をコントロールでき、またテトラサイクリン抗生物質の誘導体の構築を可能にする。そして、うつ病の治療にも使われる。
この種類の化合物はSigma-Aldrichから入手可能であり、合成方法は当技術分野において知られている。例として、米国特許Nos. 5,059,614 and 8,318,951 および PCT Publication No. WO 1999/002507 がある。
【００５９】
本明細書で使われる「イソオキサゾール様化合物」または「類似化合物」なる用語は、本明細書に開示されるようなイソオキサゾールと同様の機能特性を有する薬剤または小分子のことを指す。
これらの非限定的な例としてはCardionogenを含む,CDNG1/vuc230, CDNG2/vuc198, and CDNG3/vuc247 (参照 Terri et al., (2011) Chem Biol., December 23 18(12):1658-1668)
【００６０】
本明細書で使用される「単離された」なる用語は、分子、生物学的および細胞物質が他の物質を実質的に含まないことを意味し、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および９８％より大きい。
一態様において、「単離された」なる用語は、核酸・ＤＮＡ・ＲＮＡ・タンパク質・ポリペプチド・細胞・細胞小器官・組織、および他のものから分離されたＤＮＡないしはタンパク質・ポリペプチド・細胞・細胞小器官・組織・器官のことを指しており、またそれらは天然源に存在し、材料の操作が可能、または材料の操作の結果その天然または自然の状態では存在できないものの存在を可能にするもの、例えば組換え複製または操作による突然変異を示す。
用語「単離」はさらに、実質的に細胞物質、ウイルス物質および培養培地を含まない核酸およびペプチドが、組替ＤＮＡ技術・化学的前駆体および化学的に合成された化学品によって作製されたものも意味する。
さらに、「単離された核酸」には、天然のフラグメントとして発生されず、天然状態で見出されない核酸断片も含む。
本明細書に使用される「単離された」なる用語は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチド、または精製された組換ポリペプチドの両方を意味しており、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および９８％を超える純度を有することを意味する。本願明細書にて使用される「単離された」なる用語はまた、他の細胞および組織から単離されたもの、培養および操作された細胞、ないしはその両方を含むものである。
【００６１】
本明細書中で使用される細胞の「系統」は、細胞の遺伝、すなわち、その祖先と子孫を定義する。
細胞の系統は、発生および分化の遺伝スキーム内の細胞である。
【００６２】
「多分化性幹細胞」または「多能性幹細胞」は、それ自身と、異なる発達系列からの少なくとも２つの更なる分化した子孫細胞を再生する幹細胞を指す。
細胞系統は同じ胚葉（すなわち中胚葉、外胚葉または内胚葉）、または異なる胚葉から由来する。
２つの子孫細胞の多系統幹細胞の分化が異なる発達系列を有する例として、筋原細胞および脂肪生成細胞（両方が中胚葉起源であり、まだ異なる組織を生じる）がある。別の例として、（外胚葉起源の）神経性細胞と（中胚葉起源の）脂肪生成細胞がある。
【００６３】
「単為生殖性幹細胞」は、卵の単為生殖活性化から生じる幹細胞を示す。単為生殖性幹細胞を作製する方法は当技術分野において公知である。
Cibelli et al., (2002) Science 295(5556):819 および Vrana et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA lOO (Suppl.1)11911-6 (2003) が参照例である。
【００６４】
「表現型」なる用語は、集団内で個々のサブセットに発現される測定可能な個体の形質または特徴を意図する。
本発明の一態様では、個体の表現型は、単一の細胞の表現型、細胞の実質的に均質な集団、分化した細胞の集団、または細胞の集団からなる組織を含む。
【００６５】
本明細書で使用される、「多能性細胞」とは、少なくとも２つの別個の（遺伝子型および／または表現型）にさらに分化した子孫細胞を生じさせることができる、より少なく分化した細胞を定義する。
別の態様においては「多能性細胞」は、非多能性細胞から人工的に誘導された幹細胞である人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）が含まれ、通常、成人の体細胞で、歴史的に１つ以上の幹細胞特異的遺伝子の発現を誘導することによって作製されている。
幹細胞特異的遺伝子には、これだけに限定されないが、八量体転写因子のファミリー、転写因子 例えばＯｃｔ−３／４; Ｓｏｘ遺伝子ファミリー（例としてＳｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８）; Ｋｌｆ遺伝子ファミリー（例としてＫｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５）; Ｍｙｃ遺伝子ファミリー（例としてｃ−ｍｙｃとＬ−ｍｙｃ）; Ｎａｎｏｇ遺伝子ファミリー、例. ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧとＲＥＸ１またはＬＩＮ２８が含まれる。
ｉＰＳＣの例は Takahashi et al.、 (2007) Cell advance online publication 20 Nov. 2007; Takahashi & Yamanaka (2006) Cell126: 663-76; Okita et al., (2007) Nature448:260-262; Yu et al., (2007) Science advance online publication 20 Nov. 2007; and Nakagawa et al., (2007) Nat. Biotechnol. Advance online publication 30 Nov. 2007. に記載されている。
【００６６】
「前駆体」または「前駆細胞」は、特定の型に分化する能力を有する細胞のことを指す。前駆細胞は幹細胞であってもよく、また前駆細胞は幹細胞よりも特異的であってもよい。
前駆細胞は、単能性または多能のいずれでもよい。成体幹細胞に比べて、前駆細胞は細胞分化の後期であってもよい。
前駆細胞の例としては前駆神経細胞が含まれるが、これに限定されない。
【００６７】
用語、生物学的に適合性の担体（または媒体）とは、薬学的に許容される担体または媒体と言い換えることができ、治療に投与される細胞および他の薬剤と互換性があるだけでなく、試薬・細胞・化合物・材料・組成物および／または剤形を意味し、しかし過度の毒性・刺激・アレルギー応答または合理的な利益／リスク比に見合った他の合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、健全な医学的判断の範囲内のものである。
本発明での使用に適した薬学的に許容される担体は、半固体（例えばゲル）と固体材料（例えば、当技術分野において公知である細胞骨格やマトリックス・チューブシートその他のこのような物質）液体を含む。これらの半固体および固体物質（非生分解性）は体内での分解に抵抗するように設計されているか、または生体内（生分解性、生体侵食）に分解するように設計されている。
生分解性材料はさらに、それが溶解することができると（例えば水溶インプラント）体液中に吸収または減成し、最終的に体内から除去され、いずれかの他の材料または自然経路を介して分解および変換され排除される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「多能性細胞」とは、少なくとも２つの（表現型および/または表現型）の別個の分化した子孫細胞を生じさせることができる、より低分化細胞を定義する。
【００６９】
細胞の集団は同じ（クローン）、もしくは表現型および／または遺伝子型で非同一である１つ以上の細胞群を意図する。
【００７０】
用語「繁殖」は成長および細胞または細胞集団の表現型を変更することを意味する。
「成長」なる用語は、細胞または細胞型の所望の数を得るために必要な支持媒体、栄養素、成長因子、支持細胞、または任意の化学的および生物学的化合物の存在下での細胞の増殖を意図する。一実施形態では、組織の再生における細胞の結果の成長である。さらに別の実施形態では、組織は心臓前駆細胞または心臓細胞を含む。
【００７１】
「骨格筋芽細胞（SM）」は、基底膜と筋細胞膜の間から単離することができる未成熟細胞である。骨格筋芽細胞は成熟した骨格筋のサブ層状核の2〜5パーセントを占める。骨格筋芽細胞は、筋肉の損傷または疾患誘発性筋変性に応答して活性化される。
骨格筋芽細胞はdesmin、CD56、PAX3、PAX7、c-Met、筋細胞核因子、Mカドヘリン、VCAM1、N-CAM、CD3、CD4を発現する。
活性化骨格筋芽細胞は最初ＭＹＦ−５および／またはＭｙｏＤを発現し、最終的にミオゲニンとＭＲＦ４細胞は多核筋管に分化する。
【００７２】
本明細書で使用する用語「小幼若幹細胞（SJSCs）」とは、高増殖および分化能力を有する高齢骨髄由来幹細胞（BMSCs）から単離された幹細胞を意図する。
参照例 Iqura et al., (2013) 305(8):81354-62 SJSCsは、間葉系幹細胞マーカーＣＤ２９（＋）／ＣＤ４４（＋）／ＣＤ５９（＋）／ＣＤ９０（＋）を発現するが、ＣＤ４５（−）／ＣＤ１１７（−）陰性であり、フローサイトメトリー分析による解析ではSJSUは骨髄幹細胞と比較して高い増殖、コロニー形成、および分化能力を示す。
ＳＪＳＣｓはまた、有意な心臓系統マーカー（ＧＡＴＡ−４と筋細胞特異的エンハンサー因子2C）、および多能性マーカー（オクタマー結合転写因子４、性別決定regionY box 2、段階特異的胚抗原１、およびＮａｎｏｇ）、さらにテロメラーゼ逆転写酵素とsirtuin 1のようなアンチエイジングファクターを発現することが報告されている。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」は培養で無期限に分裂し特殊化した細胞を生じる能力を有する細胞を定義する。この時点では便宜上、幹細胞は、体細胞（成人）、胚または人工多能性幹細胞に分類される。体性幹細胞は分化組織に見られる未分化細胞であり、自家更新するもの（クローン）と（一定の制限あり）それが由来する組織のすべての特殊化した細胞型を生じるように分化する。
胚性幹細胞は、特殊化した細胞型の多種多様となる可能性を有する胚からプリミティブ（未分化）細胞である。
胚性幹細胞の非限定的な例としては、HES2 ( ES02として既知) 細胞株がESI、Singapore 、 H1 または H9 (WA01として既知) 細胞株が WiCell, Madison, Wisより入手可能である。
多能性胚性幹細胞は、マーカーを用いて細胞の他の型から区別することができる、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＣＤ３０、ＴＤＧＦ−１、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、 生殖細胞核因子、SSEA1、SSEA3および SSEA4などがあるが、これに限定されない。
ｉＰＳＣは非多能性細胞から人工的に誘導された幹細胞であり、通常成人の体細胞で、１つ以上の幹細胞特異的遺伝子の発現から誘導から作製され、本明細書に記載の培養条件の操作により胚様表現型を樹立する。
【００７４】
「対象」、「個体」ならびに「患者」は本明細書において相互交換可能で使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意図する。
哺乳動物にはマウス・ラット・サル・ウシ・イヌ・ネコ・ヒト・家畜・競技用動物およびペットを含むものの、これらに限定されるものではない。
【００７５】
「実質的に均質な」とは、細胞の集団が約５０％以上、または６０％以上、または７０％以上、または７５％以上、または８０％以上、または８５％以上、または９０％以上、あるいは９５％以上同一または類似の表現型である。
表現型は、予め選択された細胞表面マーカーまたは他のマーカーによって判定できる。
【００７６】
本明細書で使用する「治療する」、「治療」などの用語は、期待する薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。
効果は完全にまたは部分的に疾患、徴候またはその症状を予防することができ、および/または障害および/または疾患に起因する悪影響の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であってもよい。
「治療」の例としては限定するものではないものの、疾患にかかりやすいが、まだそれを有すると診断されていない対象において発生する障害を防止することが含まれる。障害を阻害する、すなわち、その進行を停止させること;および/または緩和または障害の症状（心不整脈など）を改善する。
当業者に理解されているように、「治療」とは、病理および/またはそのような胸の痛みなどの症状の発症の遅延に関連する症状の全身的改善を含みうる。
「治療」の臨床的および副次的な臨床的エビデンスは、病理学、個人および治療に応じて異なる。
記述的実施形態
化学的修飾幹細胞
【００７７】
この開示は、ＤＮＡ低メチル化を特徴とする化学的に修飾された人工多能性幹細胞(ｉＰＳＣ)を提供する。
一態様において細胞は、１つ以上の心臓の遺伝子またはマーカー群から選択されたＧαｉ、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−７６２、ＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＳ、内在性膜タンパク質２ＡおよびエフィリンＡ３を過剰発現することをさらに特徴とする。
別の態様における非限定的な例としてはこれに限定しないものの１つ以上の多能性遺伝子またはマーカーｍｉＲ−２９０−２９５クラスター、ｌｅｔ−７ファミリー、Ｍａｘの発現を抑え、また１つ以上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子Ｄｎｍｔ１、ＤＮＭＴ３Ｂの発現を抑えたものである。一態様では、１つ以上の心臓遺伝子またはマーカーはＧαｉである。
一態様では、一つ以上の心臓遺伝子またはマーカーは、対照細胞のそれよりも、少なくとも1.5倍、あるいは少なくとも2倍、あるいは少なくとも3倍過剰発現される。遺伝子マーカーを同定および定量する方法は当技術分野で公知であり、公知の方法を補うために、本明細書中に記載されている。
【００７８】
Ｇαｉは、ＡＴＰからｃＡＭＰの生成物を阻害するヘテロ三量体Ｇタンパク質のサブユニットである。典型的な配列は、GenBankの下で提供されている、Ref.: NM_002069 and UnProt P63096. このマーカーを認識する抗体は、商業的にSanta Cruz Biotechnologyから入手可能である。
【００７９】
Ｍｉｒ−１３３は、未成熟または未分化表現型にリンクされているマイクロＲＮＡである。
検出方法はマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡ−配列を含む。Ｍｉｒ−１３３用市販のキットはEMD Millipore (SmartFlare&#8482; Detection Probes)から入手可能で、生細胞におけるｍｉＲＮＡの検出が可能である。
【００８０】
ｍｉＲ−７６２は、多細胞生物における遺伝子発現の転写後調節に関連している非コードＲＮＡである。
miR-762ヒト配列はNR_030428.1 で報告されている（ncbi.nlm.nih.gov/gene/79103, last accessed on Apr. 16, 2014 を参照）。
検出方法は当技術分野において知られていて、キットは市販で入手可能であり、例えばOrigene (Mir762, 参照 origene.com, last accessed on Apr. 16, 2014)がある。
【００８１】
本明細書で使用する用語「多能性遺伝子またはマーカー」は、未成熟または未分化の表現型と相関している発現遺伝子またはタンパク質である。例えば、Oct 3/4、 Sox2、 Nanog、 c-Myc およびLIN-28 がある。
識別する方法は該当分野では公知であり、識別するシステムは市販されている。例えばEMD Millipore (MILLIPLEX（登録商標） Map Kit)がある。
【００８２】
miR-290-295クラスターは、初期胚発生時にde novo発現し、マウス胚性幹細胞（ESC）および胚性癌細胞（ECC）に特異のマイクロＲＮＡ（miRNAs）ファミリーの多能性クラスターコードである。
これらは当技術分野で知られており、例として Lichner et aｌ. (2011) Differentiation, January 81(1):11-24がある。
【００８３】
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド７（CCL7）は小さなサイトカインで単球に特異的なケモカイン３（MCP3）として知られている。
タンパク質配列は、Accession番号NP_006264下で利用可能であり、またマウスの配列は、NP_038682下で利用可能である（ncbi.nlm. nih.gov/gene/6354, last accessed on Apr. 16, 2014を参照）。
ＣＣＬ７を検出するための抗体およびキットは、Sino Biological Incから入手できる。
【００８４】
ＣＸＣＲ２ケモカイン受容体２（CXCR2）は、Gタンパク質共役受容体ファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質の１つである。
このタンパク質はインターロイキン（IL8）の受容体である。この受容体は、高い親和性でIL8に結合し、Gタンパク質活性化されたセカンドメッセンジャーを介して信号を伝達する。
またこの受容体は、ケモカイン（C-X--- Cモチーフ）リガンド１（CXCLl/ MGSA）に結合する。タンパク質およびその遺伝子に関する情報はnchbi.nlm.nih.gov/gene/3579 (last accessed on Apr. 16, 2014)に記載されている。
【００８５】
内在性膜タンパク質2Aは幹細胞マーカーである。
ヒト遺伝子の配列は、UniProtKB（043736）、マウス配列はQ61500（uniprot.org/uiprot, last accessed on Apr. 16, 2014)で報告されている。
【００８６】
ＤＮＡ（シトシン-５）-メチルトランスフェラーゼ１は、ＤＮＭＴｌ遺伝子によってコードされる酵素である。
タンパク質およびその遺伝子の完全な配列はgenecards. org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DNMTl, last accessed on Apr.16, 2014。
例としてCell Signaling Technologies で (DNMTl (D63A6) XP（登録商標） Rabbit mAb #5032)にて市販で利用可能である。
ＤＮＡ（シトシン-5）-メチルトランスフェラーゼ３ は、DNMT3遺伝子によってコードされる酵素である 。
【００８７】
EFNA3またはエフリンA3はタンパク質受容体である。
ヒトタンパク質配列はncbi.nlm.nih.gov/ gene/1944で報告されている。タンパク質の検出および分析に有用な抗体は、R&D Systems and Santa Cruz Biotechnologyから入手可能である。
【００８８】
Ｌｅｔ−７はマイクロＲＮＡｓである。
配列はmiRBase mirbase.org/cgibin/mirna_summary.pl?fam=MIPF000002, last accessed on Apr. 16, 2014.で報告されている。検出方法は該当技術で知られており、例として米国特許出願第2014/0005251がある。
【００８９】
Ｍａｘは、ＭＹＣに結合する多能性マーカーである。
Chappell et al. (2013) Genes & Dev. 27:725-7を参照する。
【００９０】
細胞は、哺乳動物、例えばウマ・マウス・ウシ・イヌ・ネコまたはヒト患者などの任意の動物種に由来し得える。
【００９１】
ｉＰＳ細胞は任意の適する親細胞に由来する。
非限定的な例としては、骨髄細胞からなる群から選択される細胞、筋芽細胞、皮膚線維芽細胞、臍帯血細胞、成体の末梢血、小幼若幹細胞（SJST）または単核細胞が含まれる。
【００９２】
それぞれの親細胞タイプからのｉＰＳＣへの導入または調整方法は、当技術分野で知られている。
一態様においてはＩＰＳＣは、有効量のＤＮＡメチル化酵素阻害剤と親細胞を接触することにより、Oct4を過剰発現させる方法によって作製された。
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の非限定的な例は、５’−アザシチジン、５−アザ−２’デオキシシチジン（5-aza-2'-deoxycytidine）、ＭＧ９８、ゼブラリン（zebularine）とＲＧ１０８を含む。
別の態様においてはｉＰＳ細胞は、親細胞への外来遺伝子の挿入を除外する方法によって作製された。
【００９３】
さらに別の実施形態では、心臓前駆細胞は親細胞を電気刺激で細胞を前処理することにより調製された。
一態様において本明細書に記載の親細胞は、Ｓｃａ１と多能性および心臓遺伝子を発現する幹細胞である。細胞は本明細書に記載の通り、その後イソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物と接触させる。
【００９４】
一態様において、親細胞は、ｉＰＳＣに修飾されていないまたは プログラムされていない小幼若幹細胞である。
この態様では、ＳＪＳＴはイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物で処理され、研究や治療において診断用途で使用される。
別の態様において本願開示は未成熟または前駆細胞を誘導する方法を提供し（例えば、ＳＪＳＴ細胞、循環血液や心臓由来幹細胞）、本明細書に記載されるようイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類の化合物の有効量と細胞を接触させることにより、心臓前駆表現型へ誘導する方法である。
【００９５】
本明細書に記載の化学的に修飾されたｉＰＳ細胞は、有効量のイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物を接触されることによって調整され、調製量の例としては約0.3から約30 uM、0.5から25 uM、12から25uMおよび約0.5 uMから20 uMである。
【００９６】
ｉＰＳ細胞を作製する方法は当技術分野で知られているが、出願人が決定した有効量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば５’−アザシチジン（5'-azacytidine）およびＲＧ１０８ (Sigma-Aldrich)と親細胞を接触させてＯｃｔ４を過剰発現させるｉＰＳ細胞を作製する方法は特に有用である。
一態様では、ｉＰＳ細胞は、さらに臨床使用のための細胞の安全性を高める親細胞への外来遺伝子の挿入を除外する方法によって調製された。
【００９７】
本開示はまた本明細書に記載される培養細胞群を、本明細書に記載のように化学的に修飾された細胞を培養することにより細胞を拡大することを提供する。
一態様では細胞群は表現型が例えば少なくとも７０％同一、または少なくとも表現型が７５％同一、または少なくとも表現型が８０％同一、または少なくとも表現型が８５％同一、または実質的に均質で表現型が同一、または少なくとも表現型が９５％同一、または少なくとも表現型が９８％同一の細胞のクローン群である。
一態様における細胞群は、クローン群である。
一態様において細胞は、特定の細胞型、例えば、心臓細胞への分化に有利な条件下で培養される。これらの培養条件は当技術分野で知られている。
【００９８】
細胞および細胞群は治療または研究用途のためにさらなる修飾をすることができ、例としてさらに、検出可能な標識または外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。
治療的使用のための方法は Durrani at el (2010) Skeletal myoblasts for cardiac repair, Regen. Med. 5(6):919-932.に記載されている。
細胞の準備方法
【００９９】
この開示は、有効量のイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物を幹細胞に接触させることを含む、幹細胞から心筋細胞系列細胞を調製する方法を提供する。
方法中の有用な幹細胞としては、１つ以上のｉＰＳ細胞で、骨髄細胞・筋芽細胞・皮膚線維芽細胞・臍帯血細胞・成体の末血液・ＳＪＳＣまたは単核細胞の由来のものが含まれるが、これに限定されるものではない。
これらの親細胞型からｉＰＳＣを誘導または調製する方法は当技術分野で既知である。この方法により調製された細胞は、1つ以上の心臓遺伝子またはマーカーの過剰発現、例えば、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、αＭＨＣ、サルコメア アクチン、Ｇαｉ、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−７６２、ＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＳ、内在性膜２ＡまたはエフリンＡ３および／または１つ以上の心臓遺伝子またはマーカー、例としてｍｉＲ−２９０−２９５クラスター、ｌｅｔ−７ファミリー、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂおよびＭａｘを発現抑制することを特徴とし、これらをそれぞれイソオサゾールまたはイソオサゾール類似化合物と接触またはさらされていない対照細胞と比較した。
一態様では、過剰発現または発現減少はその対照細胞の少なくとも１．５倍であった。
【０１００】
一態様において細胞は小幼若幹細胞であり、ｉＰＳＣに修飾またはプログラムされていない細胞である。この態様では、イソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物で処理されたＳＪＳＴは研究および治療の診断に使用される。
別の態様においては本願開示は未成熟または前駆細胞を誘導する方法を提供し、例えば、本明細書に記載のＳＪＳＴ細胞を心臓前駆表現型（血液や心臓由来幹細胞を循環の細胞群を含む）へ誘導するため有効量のイソオキサゾールまたはイソキサゾール類似化合物と細胞を接触させる方法を提供する。
【０１０１】
特定の態様において細胞は、有効量のイソキサゾールまたはイソキサゾール類似化合物と細胞を少なくとも3日、4日、5日、6日、7日接触させ、約10％〜約30％DMEM F12を追加、もしくは代わりに20％ノックアウト血清代替（KSR; Invitrogen、USA）を約0.05 mMから約0.2mMまでの間で、または約0.1mM のMEM非必須アミノ酸溶液（Invitroge、CA、USA）、約0.1 mM から 約0.3 mM または約 0.2 mMのL-グルタミン（Invitrogen、USA）、約0.05 mM から約 0.2 mM、または約0.1 mM のβメルカプトエタノール（Invitrogen、USA）、約750 U/ml から約 1250 U/ml または1000 U/ml LIF (Millipore); ０．５％の有効量のペニシリンおよびストレプトマイシンで培養する方法を含む、あるいは基本的に構成する、又はさらに別に構成する方法である。
その後、細胞を薬剤なしの培地で５日間培養する。
培地中の細胞数の増加が培地のｐＨ増加に起因し細胞生存および遺伝子発現に影響を受けるため、培地は毎日交換する。イソキサゾールまたは類似のイソキサゾール化合物の有効量は、約0.3 から約30 uM; 約0.5 から25 uM; 約 12 から約 25 Um; 約 0.5 uM から約２５uMを含む、あるいは基本的に構成する、又はさらに別に構成する。
本明細書においてイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物とは、化合物のクラスのことを指す。
【０１０２】
遺伝子とマーカーの定量と識別の方法は当技術分野において公知であり、公知の方法を補うために本明細書中に記載されている。
【０１０３】
細胞は、哺乳動物、例えばウマ・マウス・ウシ・イヌ・ネコまたはヒト患者などの任意の動物種に由来し得る。
【０１０４】
薬剤との接触は試験管内（in vitro）で行うことができる、例えば、有効量のイソキサゾールまたはイソキサゾール類似の化合物を、本明細書記述の組織培養ディッシュまたはプレート中の細胞または生体内（in vivo）にて投与する、または治療を必要とする患者および被験体への有効量の化合物または化合物ならびにｉＰＳ細胞を生体内（in vivo）にて投与する。全身または局所的な投与の方法は以下に説明する。
化合物および/または細胞は、使用に容易なように、薬学的に許容される担体と組合わせることができる。
【０１０５】
一態様では、化合物と接触させた幹細胞はｉＰＳ細胞である。
分化細胞からｉＰＳ細胞を作製する方法は当技術分野で知られており、例としてOct4を過剰発現させるため有効量のRG108（Sigma-Aldrich社）のようなＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を親細胞に接触させる方法を含む。
別の態様では、ｉＰＳ細胞は親細胞への外来遺伝子の挿入を除外する方法で作製される。
【０１０６】
本開示はさらに本明細書に記載の方法によって細胞を単離した細胞を提供し、さらに単離方法も含む。さらに細胞群を調製するために細胞を培養する他の方法も含む。
一態様においては細胞群は実質的に均一に調製する条件下で培養され、例として表現型が少なくとも70％同一、または少なくとも表現型が75％同一、または少なくとも表現型が80％同一、または少なくとも表現型が85％同一、または、実質的に均質で表現型が同一、または少なくとも表現型が95％同一、または少なくとも表現型が98％同一の細胞の細胞群である。
一態様においては、方法はさらにクローン集団の細胞のクローン性増殖に有利な条件下で細胞を培養することを含む。一態様では、細胞は特定の細胞型、例えば、心臓細胞への分化に有利な条件下で培養される。このような培養条件は当技術分野で知られている。
【０１０７】
この方法はさらに、細胞と細胞群に検出可能な標識または外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの集団に挿入することにより変更できる。
治療のための使用方法および適切なポリヌクレオチドはDurrani et al. (2010) Skeletal myoblasts for cardiac repair, Regen. Med. 5(6):919-932.に記載されている
組成物
【０１０８】
本発明はまた、生体適合性の足場またはその薬学的に許容される担体として細胞または細胞群および/または分化した細胞と担体と組合せたものを含む組成物を提供する。
一実施形態では従って組成物は治療的使用のためと意図され、有効量の修飾された細胞は細胞群または分化細胞は単独またはイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物と組合せたものの組成物として提供される。
細胞および細胞集団の使用
【０１０９】
本発明のさらに別の実施形態は、心機能の回復を必要とする患者または組織のための方法である。この方法または他の治療用途については、本明細書に記載されている。
【０１１０】
一実施形態において本発明は１つまたは複数の方法を提供し、一態様では、損傷及び疾患心臓中の瘢痕組織の心筋組織を再生させること、心臓機能の改善を必要とする患者に対して、心疾患または疾患状態を治療することである。
方法は必要とされる対象に投与するため、組織の再生のため有効量のイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物を接触させること、および/または上記の有効量の化学的に修飾された細胞集団または細胞を投与することを含む。
さらなる態様では、単離された細胞（例えば、ｉＰＳ細胞または他の前駆細胞）は局地的に有効量以内のイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物が投与される。一態様においては、処理されたｉＰＳ細胞は心臓の瘢痕組織における筋線維を形成する筋細胞に分化する。
細胞は、ホストまたは患者の、自己または同種異系である。本明細書に記載されるように、細胞は任意の種であってもよい。
【０１１１】
さらに本発明の別の実施形態は上述したように、適切なホストの心筋組織を再生するため化学的に修飾された細胞または細胞群を投与することである。
細胞は、宿主または患者に自己または同種異系であってもよい。上記のように対象とする細胞は任意の種であってもよい。
【０１１２】
別の態様では、有効量のｉＰＳ細胞の および有効量のイソオキサゾールまたはイソオキサゾール類似化合物を、必要とする患者に投与することを含む、あるいは基本的に構成する、又はさらに別に構成する方法である。
投与は、損傷部位に局所的に患者の心臓へ細胞またはイソキサゾールおよびイソキサゾール類似化合物を直接注入することを含む。
【０１１３】
一態様において幹細胞またはｉＰＳ細胞は、幹細胞由来の心筋パッチの形態で投与される（例えば、成体骨髄細胞または骨髄由来前駆細胞、ｉＰＳ細胞、小幼若幹細胞 および/または心疾患における心臓修復のための組織心臓パッチ移植）。
したがって一態様では、幹細胞は骨髄中に存在する非常に小さな幼若幹細胞（骨髄幹細胞内のものも含まれる）および／または末梢血細胞（循環血液および心臓由来幹細胞内のものも含まれる）を含む。
これらの細胞は有意に高い増殖性と分化性があり、また容易に再プログラムでき、および／またイソキサゾールまたはイソキサゾール類似化合物により心臓前駆体に変換できる。したがって、この方法は安全な細胞移植のためにｉＰＳ細胞を誘導する必要がない。
【０１１４】
適切にこの方法で治療を受けた患者は心臓機能不全に関連する疾患または障害で苦しむ人々を含み、うっ血性心不全・単離した拡張期心不全・心筋梗塞および心臓不整脈などが含まれるが、これに限定されるものではない。
治療可能な心臓不整脈のいくつかは、洞不全症候群・徐脈性不整脈・異常な洞結節機能・房室ブロックおよび心房と心室頻脈性不整脈などが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１１５】
細胞または組成物のカテーテルまたは心臓パッチの使用による局所または全身投与は、治療過程全体を通して連続的、断続的または単回で投与できる。投与の最も有効な手段および用量を決定する方法は当業者に知られており、治療の目的・治療する対象に応じて治療のために使用される組成物及び/又は細胞は変化する。
単一または複数の投与は、用量レベルおよびパターンで行われ、処置する医師によって選択される。
適切な投与製剤と細胞および薬剤投与する方法は、当技術分野で既知である。さらなる態様において、本発明の細胞および組成物は他の治療と組合せて投与することもできる
【０１１６】
細胞および細胞集団は当該分野で公知の方法により宿主に投与され、例えば米国特許. No. 6,638,369に記載されている。
本発明の細胞ならびに組成物の投与は、本明細書に記載のような疾患を治療するため、期待される疾患をもつ動物モデルの作製のため、障害を持つ患者のため、実験の条件設定およびスクリーニングアッセイのために行うことができる。
スクリーニングアッセイ
【０１１７】
本発明は、心臓機能を調節する種々の薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。
本発明の目的での「薬剤」は、単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば抗体）、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）またはリボザイムを含む生物学的または化学的化合物であるものの、これに限定されるものではない。
化合物の膨大な合成アレイは、例えばポリマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび合成有機化合物を様々なコア構造に基づいて合成でき、これらもまた当該の「薬剤」に含まれる。
さらに、例えば植物または動物抽出物などの様々な天然のものもスクリーニングの化合物として提供される。
理解されるべきことは、必ずしも明示されていなくとも薬剤は単独または他の薬剤と組合せて使用されものであり、本発明のスクリーニングによって同薬剤は同一または異なる生物学的活性を有することが同定された。
【０１１８】
試験管内（in vitro）でのスクリーニング方法を実施するために、適切な修飾された細胞（単数または複数）を含む組織培養物および培養組織が最初に提供される。薬剤が上記のような小分子のようなＤＮＡまたはＲＮＡ以外の組成物である場合、薬剤は培養細胞または培養液に直接添加することができる。
当業者にとって自明の経験的に決定することができる「有効」量を追加する必要がある。
薬剤がポリヌクレオチドである場合、それは直接遺伝子銃またはエレクトロポレーションを使用する。あるいは遺伝子送達ビヒクル（ベクター）または上記のように他の方法を用いて細胞に挿入する。
陽性対照および陰性対照は、薬物または他の薬剤の固有の活性を確認するためにアッセイできる。
典型的な実施形態
【０１１９】
出願人はｉＰＳｃが、ＤＮＡ低メチル化により化学的に誘導でき、心臓遺伝子をアップレギュレーションし、疾患のある心臓で極めて低い造腫瘍性または造腫瘍性をもたないことを発見した。
【０１２０】
若い雄の骨格筋芽細胞(SMs)はSMS Oct3/4 GFP+トランスジェニックマウスから精製し、ノックアウトDMEMに0.5％DMSOにＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤50004 RG-108を添加したもので5日間処理した。
２週間後、ＧＦＰおよびマウス胚性幹細胞の形態学的特徴を発現した SMのGFP+コロニー由来のｉＰＳ 細胞（ＳｉＰＳ）は、単離して試験管内（in vitro）で増殖させた。
ＳＩＰは、アルカリホスファターゼ活性が陽性でSSEAlを発現およびES細胞に類似した多能性マーカーのパネル（図1）を表示し、ヌードマウスにおいて奇形腫を発症した。
本明細書に記載する研究ではマウスモデルにおいて行ったが、同じマーカーおよび薬剤の使用は、ヒト細胞や組織でない場合には類似の結果を提供する。
【０１２１】
心臓系統細胞にＳｉＰＳを直接処理するために、小分子（イソオキサゾール、20μM Sigma-Aldrich）を５日間で処理し、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（DNMT）活性、細胞増殖、および心臓遺伝子発現について分析した。DNMT活性は、小分子処理ＳｉＰＳ (FIG. 2)中のグローバルＤＮＡメチル化が95％の減少して完全に消失した。ＳｉＰＳは細胞増殖アッセイによって評価 （対未処理ＳＩＰＳ p<0.01）し、増殖活性の増加およびアポトーシス耐性を示し、虚血性環境における細胞死を防止するための重要な考慮事項となることを示した。
未処理のｉＰＳ細胞（図４）と比較して、小分子処置したｉＰＳ細胞は細胞質へのシトクロムｃのトランスロケーションの有意な減少を示している。
【０１２２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析では、心筋細胞様の遺伝子発現プロファイルを用いてNkx2.5の有意なアップレギュレーション(対非処理ＩＰＳ p<0.01; 図５参照)を示した。
処理されたｉＰＳ細胞は約60％NKX2.5陽性であった。ポスト転写調節が重要であることを考え、遺伝子発現および細胞生存のための分子表現型分析を行った; AF：tymetrixのアレイベースの遺伝子発現プロファイルではDnmtl、DNMT3BとグローバルなＤＮＡ低メチル化およびｍｙｃ依存的な細胞の形質転換（表1を参照）に関連のあるＭＡＸ遺伝子の２−３倍のダウンレギュレーションが確認された。
さらにＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ５、内在性膜２ＡとエフィリンＡ３の２〜３倍の付随アップレギュレーションがあった（図６）。
これらは、ＤＮＡ合成、細胞増殖、細胞マトリックス相互作用および化学誘引と関連していた。ｍｉＲマイクロアレイ解析では心臓特異的のｍｉＲ−１３３、７６２のアップレギュレーションおよび多能性関連のｍｉＲ−２９０クラスター、ｍｉＲ−５７４−５ｐおよびｌｅｔ−７ファミリーのダウンレギュレーションを示した（図７参照）。
ウェスタンブロット分析は、未処理のｉＰＳ細胞と比較してＧαｉタンパク質レベルの有意なアップレギュレーションを示した（図８参照）。
【０１２３】
小分子で処理されたＳｉＰＳは心臓での場所を特定するためPKH26で染色し、６週間冠状動脈結紮した心筋に３０分後に移植した。
心臓を採取する前に移植したＳｉＰＳのゆくえを可視化するため、心機能は心エコー検査でモニターした。
処理されたＳｉＰＳは、瘢痕組織内の筋線維を形成する筋細胞へと分化した。これらの重要な知見は、今まで報告されていない。
【０１２４】
また出願人は、イソオキサゾールがｉＰＳ細胞におけるＤＮＡの低メチル化およびｍｙｃ依存性細胞形質転換を誘導し、ＤＮＡ合成・細胞増殖・細胞マトリックス相互作用およびケモタキシスに関連していたことを発見した。
イソオキサゾール化合物は、ＣＸＣケモカイン受容体・内在性膜タンパク質・エフリンファミリーおよび関連受容体を過剰発現し、特に赤血球生成の発症に関与する。
【０１２５】
申請者は、小分子処理がいくつかの心臓遺伝子、マイクロＲＮＡと生物活性分子の過剰発現を誘導することを報告した。これらの梗塞した心臓への処理は、梗塞した心臓の広範な再生および生存率の向上をもたらした。
出願人の骨髄由来幹細胞に関する以前の研究（Circ Res 98：1414-1421; 2006;）に基づいて細胞が多数のパラクリン因子（サイトカインおよび成長因子）を放出することが知られているものの理論に縛られることなく、出願人は小分子処置された多能性幹細胞は細胞生存および血管新生に重要な生物活性因子も放出するものと考察する。
【０１２６】
出願人はさらにｉＰＳ細胞ならびに未処理のｉＰＳ細胞を比較して、イソオキサゾールは心臓特異のｍｉＲ−１３３およびｍｉＲ−７６２を過剰発現し、また多能性の調節に関連したｍｉＲ−２９０クラスターおよびｌｅｔ−７ファミリーを発現抑制することを発見した。
【０１２７】
したがって上記のｉＰＳ細胞の小分子媒介修飾は、梗塞心臓中で成長することが可能であり瘢痕組織を置換えることができ、筋細胞が電気的接続（ギャップジャンクション）で結合され働くことが上記で報告されている。
小分子のスルホニルヒドラゾン（sulfonylhydrazone）ファミリーは、筋芽細胞に由来するｉＰＳ細胞の心臓遺伝子を誘導することができる。これらの小分子は、ノッチ活性化された心外膜由来の前駆体（７）の筋肉分化を誘導することが知られている。
虚血モデルに移植した小分子で誘導したｉＰＳ細胞は非処理のｉＰＳ細胞に比べグローバル心臓機能を向上した。
心機能の回復は、ｉＰＳ細胞由来の前駆細胞の生存に依存していた。
小分子は組織分化に向かうｉＰＳ細胞における組織特異的遺伝子発現を誘導するだけでなく、発生の時間的および空間パターンを決定する中で革新的である。
【０１２８】
出願人は人工多能性幹細胞を適切な小分子で処理した場合、薬理学的にＤＮＡのメチル化を阻害し、したがって心臓の発生遺伝子の調節に重要な担い手となることを発見した。
理論に束縛されることなく、小分子のエフリンファミリーへの効果は造血前駆細胞の生成のプロセスを操作し、および臨床造血器腫瘍のために有益である可能性がある。
【０１２９】
出願人はさらに、小分子処理によって誘導された多能幹細胞が筋形成に関連する内在性膜タンパク質２Ａの有意なアップレギュレーションを引起こしたことを観察した。
【０１３０】
出願人はまた、未処理のｉＰＳ細胞に比べてイソキサゾールで処理したｉＰＳ細胞は心臓特異的のｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−７６２を過剰発現し、多能性関連のｍｉＲ−２９０クラスターおよびｌｅｔ−７ファミリーを発現抑制することを発見した。
【０１３１】
エリック・オスロン（Eric Oslon）は米国特許 No. 8,318,951 ('951 特許)の中で、神経発生および心外膜前駆細胞におけるこれらの化合物の使用を報告している。
これらの研究にかかわらず、本明細書で報告の所見は、小分子がエピジェネティックな変化を誘導し、梗塞心臓におけるレンダリングｉＰＳ細胞を増殖するために操作することできるこの発見は、ユニークで革新的であると示される。この研究では、ｉＰＳ細胞は患者の細胞（この場合には、骨格筋）から作られ、小分子で前処理した後に同じ患者に再導入することができることを強調している。
本開示のｉＰＳ細胞がオスロンの研究とは異なることは、冠動脈結紮または心臓発作後のマウスの心臓の瘢痕組織における増殖のため、治療のために予め設計（または前処理）していることである。ｉＰＳ細胞によって瘢痕組織は大幅に再生した。
一方、オスロンは心臓内の心臓前駆細胞に作用するように生きたマウスに薬剤を注入した。薬は心臓の異なる細胞に取込まれたものと出願人は考える。
ここでは組成物および方法はｉＰＳ細胞を予めディッシュの中で心臓前駆体にした後、損傷した心臓に再導入する。
【０１３２】
出願人はまた新規知見として、小分子とＩＰＳとの前処理がアポトーシスを減少させることを発見した。
例えば非誘導ｉＰＳ細胞と比較してより少ないアポトーシスが小分子誘導されたｉＰＳ細胞で観察された。
'951特許における報告結果では、虚血状態下での細胞の生存に重要であるトリパンブルー排除アッセイは細胞生存率確認のためだけに使用され、細胞アポトーシスには使用されなかった。
【０１３３】
また出願人は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（DNMT）活性が完全に化学的に修飾されたｉＰＳ細胞で消失したことを見出した。
小分子誘導されたｉＰＳ細胞でＤＮＡ低メチル化および細胞形質転換に関連しているDnmtl、DNMT3BとMax遺伝子関連タンパク質の２〜３倍のダウンレギュレーションが誘導されている。
細胞動員・走化性・癌および赤血球にも関連性のあるＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ５、内在性膜タンパク質２ＡおよびエフリンＡ３の２〜３倍のアップレギュレーションも観察された。
出願人はさらに多能性遺伝子のダウンレギュレーションにより心臓の調節遺伝子を誘導して心原特定のmiR-133のアップレギュレーションおよび多能性関連のｍｉＲ−２９０−２９５クラスター およびｌｅｔ−７ ファミリーがダウンレギュレーションすることをマイクロＲＮＡで確認した。
【０１３４】
加えて「951 特許」はＧａタンパクレベルを確認しておらず、本願で報告された研究と比較するとＧＰＣＲブロッカーで処理した化学的修飾ｉＰＳ細胞ではＧａタンパクレベルのアップレギュレーションは阻害され、小分子誘導されたｉＰＳ細胞内でのすべての試験管内（in vitro）で効果を消失するのを認めた。
オスロン（OSLON）は、以前にもこれらの神経発生における化合物ならびに心外膜前駆細胞の使用を報告している。
これまでの研究に関わらず、出願人は現在の発見はユニークかつ革新的であり、小分子は梗塞心臓内での増殖に適したｉＰＳ細胞をレンダリングするために操作することができるエピジェネティックな変化を誘導したと考える。
【０１３５】
出願人の知る限り、実施例２で報告された結果は以下の通りであり、イソオキサゾールおよび他の同様な小分子は身体の他の部分からの幹細胞にも機能する。
例えば骨髄由来の幹細胞と心臓は、イソオキサゾールのような小分子薬を使って直接内皮細胞または筋細胞にリプログラミングできる。したがってイソキサゾールおよび同様の小分子を直接投与することができ、例えば、心臓発作患者、瘢痕組織を置換えるために、心臓細胞の虚血性部位の炎症細胞と幹細胞に進める。正味の効果は、心臓発作後の損傷した心臓の再成長を支援することである。
開示された方法は非ウイルス性ベースであるという利点を有しｙろち、以前に承認された化合物を使用して臨床での適応を簡素化する。
また開示された方法ではイソオキサゾールまたは CDNG1/ vuc230、CDNG2/ vuc198、およびCDNG3/ vuc247のような他の類似の小分子で処理した後、ほんの数週間以内に劇的に心臓前駆体を増加させると出願人は推測する。
【０１３６】
出願人の方法、アプローチと技術に対して、ｉＰＳ細胞を使用しての現在のアプローチは遺伝子突然変異およびまたは腫瘍（すなわち、癌）の成長などの制限を含む。
本願の方法では遺伝子突然変異の必要がなく有益であり、臨床使用のための安全性が向上する。
【０１３７】
出願人の推測と彼の知る限り、現在報告されている研究では、心臓遺伝子のアップレギュレーションのためにクロマチン構造を変化させることによってｉＰＳ細胞を安全に治療に使用することができるという最初のエビデンスを提供する。
これらのいわゆる心臓前駆体が増殖し瀕死の心筋の再生と限られた細胞死が可能である。化学的再プログラミングｉＰＳ細胞から求められるような心臓系統の作製は、心臓治療でスマートな戦略となりうる。
実施例
実施例１
マウスＳｉＰＳの維持
【０１３８】
ＳｉＰＳはマイトマイシンＣ処理したマウス胚線維芽細胞(MEFs)ディッシュを20% ノックアウト血清代替(KSR; Invitrogen, USA)、 0.1 mM MEM 非必須アミノ酸溶液 (Invitrogen, CA, USA)、0.2 mM L-グルタミン (Invitrogen, USA)、 0.1 mM βメルカプトエタノール (Invitrogen, CA, USA) および 1 000 U/ml LIF (Millipore) 0.5% ペニシリンおよびスレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ノックアウト-DMEM、Invitrogen、CA、USA）で維持した。
コロニーは、このようにして3&#12316;4日の間隔で定期的に 0.2％コラゲナーゼ-1V（Invitrogen、CA、USA）で剥がし0.025％トリプシン(Sigma Aldrich, MO, USA) を用いて単一細胞懸濁液に解離し、増殖のためのMEF上に再プレート播種した。
細胞増殖アッセイ
【０１３９】
細胞増殖アッセイはＭＴＳ［3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム］を用いて、アッセイを製造元（Promega）が推奨する方法で行った。
プレートは、培養中の生細胞の数に直接比例するホルマザンを定量するために、自動ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて490nmで読取った。
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（DNMT）活性アッセイ
【０１４０】
核抽出物を、NE-PER核および細胞質抽出キット（Thermo Scientific, IL USA）を用いて単離した。
総DNMT活性は、EpiQuik ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性アッセイキット（Epigentek, Brooklyn, N.Y.）で製造業者のプロトコールを用いて同定した。サンプルおよびコントロールの酵素活性は、450 nmおよびDNMT活性（OD/時間/ ml）でマイクロプレートリーダー（Hidex Chameleon, Finland）を用い測定し、次式（サンプルのOD-ブランクOD）/（サンプルボリューム）×１０００に従って計算した。
RT-PCRおよび定量RT-PCR
【０１４１】
小分子処理および未処理ＳＩＰＳ細胞は RNeasy mini キット (Qiagen, Maryland, USA)を用いて全ＲＮＡを単離し、Onmiscript逆転写キット(Qiagen, Maryland, USA) を用い製造者の指示に従ってeＤＮＡの合成に使用した。
逆転写反応からのＰＣＲ増幅は、逆転写反応で得られた1μg のｅＤＮＡを推奨量のPCR バッファー、Q液、dNTPミックス、リバースおよびフォワードプライマー、Taq ＤＮＡポリメラーゼと蒸留水が添加されたPCR mixに添加した。
ＰＣＲ条件は１分間72℃で4分、1分、延長55℃で1分間、アニーリング95℃で変性の32サイクルの95℃での初期変性を含み7分間72o℃で、最終延長した。
ＰＣＲ産物は1.5％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色してから可視化してUV transluminator（Bio-Rad、USA）上で撮影した。
心筋梗塞動物モデル
【０１４２】
動物は（ketamine/xylazine 0.05 ml intra-peritonealy）で麻酔した。正中子宮頸部皮膚切開し挿管を行った。
動物は機械的に齧歯類の人工呼吸器（Model 683, Harvard Apparatus, MA, USA）を用いて、酸素（1.5 L /分）を補充した室内空気で換気した。体温は慎重にプローブ（Cole-Parmer Instrument, IL, USA）を用いてモニターし、外科的処置により３７℃に維持した。左側のみ開胸し左前下行（LAD）冠状動脈をプロレン＃9-0縫合糸で結紮し心臓を露出させた。心筋虚血は左心室壁の色の変化によって確認した。
細胞は直視下左心室の自由壁に（各心臓あたり3-4サイト）複数の部位での冠状動脈結紮し10分後注入した。
ポスト移植の移植細胞の生存の追跡と確認のため、細胞は製造業者の説明書に従ってＰＫＨ２６（Sigma、Product# PKH26-GL）で標識した。胸部を閉じ、動物を回復させた。痛みを軽減するために、Buprinex (0.05 ml)を手術の最初の24時間に皮下注射した。
動物は７日、４週間心機能評価のための経胸壁心エコー検査をし、そののち６〜８週間で安楽死させた。
心臓を凍結および10％のホルマリン溶液で固定し、免疫組織学的研究のためにパラフィン固定で処理した。
免疫細胞化学
【０１４３】
ＳｉＰＳを免疫細胞化学的分化させたコロニーは、それぞれの特異的一次抗体（anti-Oct3/4, anti-Sox2, anti Nanog、c1:100 concentration; Cell Signaling, Danvers, USA）で免疫染色した。
小分子で処理したＳｉＰＳは免疫染色のため0.1％ゼラチンコートしたチャンバースライド上に播種した。細胞を4％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで10分間、室温で固定した。
ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＣＡＳブロック（Invitrogen CA、USA）により室温で45分間ブロックし、抗原特異的な一次抗体Ｎｋｘ２．５、サルコメア アクチン(Santa Cruz, Calif., USA)で免疫染色した。
一次抗体抗原反応は、蛍光共役特異的二次抗体を用いて検出した。核は5 f.tg/ml 4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI; Invitrogen、CA、USA）で染色し、蛍光シグナルを染色観察し、写真は、蛍光顕微鏡（Olympus; Tokyo, Japan）を使用してグラフ化した。
遺伝子発現プロファイリング
【０１４４】
アフィメトリックス社（Affymetrix）のアレイベースの遺伝子発現プロファイリングにて、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂ と 、グローバルなＤＮＡの低メチル化およびｍｙｃ依存性細胞形質転換に関連したＭａｘ遺伝子関連タンパク質の２〜３倍のダウンレギュレーションがさらに確認された。
また、これに付随してＣＣＬ７・ＣＣＲ２・ＣＣＲ５・内在性膜タンパク質２ＡおよびエフリンＡ３の２〜３倍のアップレギュレーションが確認された。
2017513482.tif 000003
実施例２
【０１４５】
出願人は、多能性および心臓マーカーを発現老齢マウスからの骨髄幹細胞集団という小さな幼若幹細胞（SJSCs）を同定した。
イソオキサゾール化合物で処理されたこれらの細胞が心臓分化のためにより適切であり、ｉＰＳ細胞への代替（８）として使用することができるものと出願人は予想している。
実施例３
【０１４６】
この実験は、心原性小分子と電気刺激の前処理により心臓前駆細胞を生成する代替の方法を開示する。
出願人は、造血前駆細胞マーカー(c-kit)、多能性マーカー（Oct-4、Sox2、Nanog）、幹細胞側集団マーカー（Bcrpl）、初期の心臓系統マーカー（Nkx2. 5、 GATA4、 MEF2C）、および血管前駆細胞マーカー（Flkl）を発現する他の細胞群（９）を認識した。幹細胞のプレコンディショニング（PC）は虚血/無酸素または治療の短い期間を経るか、代替擬態改善でポスト生着生存および分化特性を向上するかのいずれかを介する。
しかし幹細胞の生存における電気刺激（EleS）を加えたＰＣの役割に関する報告書は存在しない。心臓は一定の電界を発生させるものの、移植前の幹細胞におけるその影響は探求されていない。
この研究は EleSが心臓幹細胞（Sea-l+ CSCs）の生存においてPCの影響があり、焦点接着キナーゼ（FAK）の活性化を介して細胞接着の増加、ならびにｍｉＲ−３７８のダウンレギュレーションにより、結合組織増殖因子（CTGF）を放出することを実証した。
これにより結合組織増殖因子（CTGF）は、EleS誘導 CSC（EiesCSCs）の生存との密着性を担当していることが判明した。
重要なことは、CTGFのノックダウンはEleS誘発性の細胞保護効果や心機能の回復を消失したことである。
また、ｍｉＲ−３７８はElescscsの潜在的なCTGFレギュレータとして同定された。これは、多能性および心臓遺伝子の両方を発現する他の幹細胞型であり、これらの細胞はさらにイソキサゾール処理の心臓前駆体で検討することができる。
Sea-l+ CSCsの単離
【０１４７】
Ｃ５７ＢＬ６マウス（ハーラン）はＣＳＣを単離するために使用した。
１２週齢のＣ５７ＢＬ６マウスをケタミン/キシラジン（それぞれ87-100ミリグラムおよび13-15ミリグラム/キログラム）の腹腔内注射によって麻酔した。麻酔の深さは、正のつま先ピンチおよび筋弛緩によってモニターした。
心臓を摘出し、血液細胞を除去するために氷冷ＰＢＳで洗浄した。大動脈・肺動脈および心膜を除去したのちに心臓全体をミンチし、0.1％II型コラゲナーゼ（Invitrogen）および0.01％のＤＮａｓｅＩ（Worthington Biochemical Corporation）を用いて37℃で20分間消化した。
得られた細胞を70％パーコール（Fluka）で分画し破片を除去するために40 f.tmフィルタで透過し、B27（Invitrogen）、20 ng/ ml EGF（Sigma） を添加した無血清DMEM / FL2、40 ng/ ml bFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子、Peprotech）を含む維持培地（Invitrogen）中で培養した。
１週間後、コロニー形成を開始するため、細胞は100個／ｃｍ２の密度で無血清維持培地の新しいディッシュに移した、各コロニーは２４穴ディッシュに2％FBS、B27サプリメント、20 ng/ ml EGF、40 ng/ ml bFGFおよび10ng / mL LIF（白血病阻害因子、Millipore）を添加したDMEM/ F12で培養したサブカルチャーから機械的にピックアップした。
コロニー由来の細胞は90％コンフルエンスで新しいディッシュに再播種して、維持した。
CSCs のEleS
【０１４８】
２４時間の細胞密度で播種した後３×１０５細胞／３５ｍｍ ディッシュの細胞は、血清飢餓状態で１５時間ＥｌｅＳ（Eiescscs）細胞ペーサーシステム（IonOptix）を使用して培養した。
細胞は、ＥｌｅＳにて二相性方形パルス（5ミリ秒） 1.5 V/1.8全角で0、1、3時間、5 Hzの周波数で 照射した。
ＥｌｅＳなし（非ElesCSC）の細胞は、ベースライン対照として用いた。細胞は後に採取し種々の分子および細胞研究に使用した。
【０１４９】
特に明示しない限り本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、一般的に本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されるものと同一の意味を有する。
本明細書で提供される全てのヌクレオチド配列は、5'から3'の方向に示されている。
【０１５０】
本発明は 例示的に本明細書に記載され、本明細書に具体的に開示されていなくとも、適切任意の要素または限定で実施されてもよい。
従って、例えば、「含んでいる」（comprising)、 「含んでいる」（including）、「含まれる」（containing）などの用語は、拡張的にかつ限定なしに解釈されるものとする。
さらに用語および本明細書中で使用される表現は説明の用語として使用され、限定ではなく、このような用語および示された特徴の任意の等価物を排除する表現の使用には意図はなく、本発明の範囲の説明またはその一部は特許請求の範囲内の種々の改変が可能である。
【０１５１】
したがって本発明は特に好ましい実施形態および任意の特徴により開示されているが、本明細書に開示された発明の変更、改良およびバリエーションの具体化は当業者によって行われ、そしてこのような変更、改良およびバリエーションは本発明の範囲内であると考えることと理解される。
ここで提供される材料、方法、および実施例は、好ましい実施形態を代表するものであって例示であり本発明の範囲を限定するものではない。
【０１５２】
本発明は、広く一般的に明細書に記載されている。一般的な開示内に入るより狭い種および亜属分類のそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。
本発明の一般的な記述を含み、但し書き、負の制限付きまたは種から任意の主題を除去すること、摘出材料は本明細書に具体的に列挙されている。
【０１５３】
加えて本発明の記述または態様がマーカッシュグループの用語で記載してある場合、当業者には本発明はまたマーカッシュグループの任意または個々のメンバーまたはサブグループの用語によって記載されていることが理解される。
【０１５４】
全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は本明細書で言及され、それらのその全体が参考として参照され、同程度にそれぞれの場合と同じように個々に参照により組込まれている。
矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
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【図１】
2017513482.tif 000004
【図２】
2017513482.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
2017513482.tif 000008
【図６】
2017513482.tif 000009
【図７Ａ−Ｂ】
2017513482.tif 000010
【図７Ｃ−Ｄ】
2017513482.tif 000011
【図８】
2017513482.tif 000012
【図９Ａ−Ｃ】
2017513482.tif 000013
【図９Ｄ−Ｉ】
2017513482.tif 000014
【図１０Ａ−Ｂ】
2017513482.tif 000015
【図１０Ｃ−Ｄ】
2017513482.tif 000016
【図１１Ａ−Ｂ】
2017513482.tif 000017
【図１１Ｃ】
2017513482.tif 000018
【図１１Ｄ】
2017513482.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月24日(2017.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓系統細胞、心臓前駆細胞、前駆細胞、心筋の細胞、心筋細胞、内皮細胞、筋細胞または筋繊維を幹細胞から調製する方法であって、
約０．５μＭから約３０μＭの有効量の化合物群（ＣＤＮＧ１／ｖｕｃ２３０、ＣＤＮＧ２／ｖｕｃ１９８およびＣＤＮＧ３／ｖｕｃ２４７またはイソオキサゾール類似化合物）を幹細胞（試験管内（in vitro）および生体内（in vivo）のもの）と接触させることにより、
心臓系統細胞、心臓前駆細胞、前駆細胞、心臓細胞、心筋細胞、内皮細胞、筋細胞、筋線維を幹細胞から作製する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記幹細胞は、１つ以上のｉＰＳ細胞、骨髄細胞、臍帯血細胞、ＳＪＳＣ（成熟幹細胞）、成人末梢血細胞、皮膚線維芽細胞または電気刺激された心臓前駆細胞である方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記心臓系細胞は、１つ以上の心臓遺伝子またはマーカー、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、αＭＨＣ、サルコメア  アクチン、Ｇαｉ、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−７６２、ＣＣＬ７、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣ５、内在性膜タンパク質２ＡおよびエフリンＡ３などを過剰発現し、
前記幹細胞は、好ましくは細胞表面マーカーＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ５９（＋）、ＣＤ９０（＋）を発現する方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記心臓系統細胞は、１つ以上の多能性遺伝子またはマーカー（１つ以上のｍｉＲ−２９０−２９５クラスター、ｌｅｔ−７ファミリー、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ｂおよびＭａｘなど）を発現抑制する方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、
前記ｉＰＳ細胞は親細胞を有効量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させてＯｃｔ４をアップレギュレートすることを含む方法によって作製され、
同ｉＰＳ細胞は好ましくは外来遺伝子の親細胞への挿入を排除する方法によって作製される方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記幹細胞は、細胞表面マーカーc-Kitおよび/またはＦｌｋ１を発現する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
イソキサゾール化合物が次式を有してなり、
2017513482.tif 000020
前記Ｒ１およびＲ２がともに水素基であるか、
もしくはＲ１が水素基であり、Ｒ２が置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニルおよびベンジル基からなる群から選択されるか、
Ｒ１およびＲ２は一緒になって、アゼチジニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基またはモルホリニル基から選択される環を形成してもよく、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素基、ハロゲン基、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、置換または非置換芳香族または複素芳香環、シアノ基、ニトロ基およびアシル基からなる群から独立して選択され、
Ｘは０、ＮＨまたはＳであり
Ｙは０、ＮＨまたはＳである方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
イソキサゾール化合物が次式を有してなり、
2017513482.tif 000021
Ｒ１およびＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル、フェニル、ペンシル、トリフルオロメチルまたはハロゲンからそれぞれ選択され、
Ｒ３は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアルコキシから選択され、
Ｒ４は３位または５位において水素Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｒ５は水素またはＣ４−Ｃ４アルキルから選択されるか、またはＲ４およびＲ５は結合してテトラメチレン基を形成し、
複素環上の３位または５位のＺは  −Ｎ（Ｒ６）−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ６）−、−Ｎ（Ｒ６）−ＣＯ−Ｎ（Ｒ６）−、−ＣＨ（Ｒ６）−ＮＨ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ６）から選択され、
Ｒ６は水素基またはＣ１−Ｃ４アルキルから選択される方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記イソキサゾール化合物は以下の群
5-(トリフルオロメチル)-3-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、5-(トリフルオロメチル)-3-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、5-(チオフェン-2-yl -)イソオキサゾール-3-カルボキシアルデヒド,5,6,7,8-テトラヒドロ-4h-シクロヘプタ[d]イソオキサゾール-3-カルボン酸, 4,5,6,7-テトラヒドロ - ベンゾ[d]イソオキサゾール-3-カルボン酸, 3-アミノ-5-メチルイソオキサゾール, 4-アミノ-n-(5-メチル-3-イソキサゾリル)ベンゼンスルホンアミド, 3-フェニル - イソオキサゾール-5-ボロン酸ピナコールエステル, 5-フェニルイソオキサゾール, 1-フェニル-1-シクロペンタンカルボン酸, 3-フェニル - ベンゾ[c]イソオキサゾール-5-カルボン酸, 5-メチル-3-フェニルイソオキサゾール-4-カルボン酸, 3a,4,5,6,7,8,9,9a-オクタヒドロ - シクロオクタ[d]イソオキサゾール-3-カルボン酸 、5-(3-ニトロフェニル)イソオキサゾール, 3-(4-ニトロフェニル)イソオキサゾール, 3-ヒドロキシ-5-アミノメチル - イソオキサゾール, 5-(モルホリノメチル)イソオキサゾール-3-カルボン酸塩酸塩, 5-(モルホリノメチル)イソオキサゾール-3-カルバルデヒド、3-メチル-5-(トリフルオロメチル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、5-(チオフェン-2-yl)イソオキサゾール-3-カルボン酸メチル, 3-(メチルスルホニル)-5-(2-チエニル)イソオキサゾール-4-カルボニトリル、5-メチル-3-(2-ピロリジニル)イソオキサゾール、3-メチル-5-(2-ピロリジニル)イソオキサゾール、3-(1-メチル-1h-ピラゾール-4- yl) - イソオキサゾール-5-カルボン酸、3-(1-メチル-1h-ピラゾール-4- yl)-4,5-ジヒドロ - イソオキサゾール-5-カルボン酸、5-(4-メチルフェニル)イソオキサゾール-3-カルボン酸、5-メチル-3-フェニルイソオキサゾール-4-カルボン酸、5-(4-メチルフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシアルデヒド、5-メチル-3-(4-フェノキシフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、3-メチル-5-(4-メチル-1,2,3-チアジアゾール-5-yl)イソオキサゾール-4-カルボン酸 、3-メチル-5-(5-メチルイソオキサゾール-3-yl)イソオキサゾール-4-カルボン酸 、5-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸メチル、5-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール-3-カルボン酸メチル、5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸メチル 、メチル5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸メチル、5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸メチル、5-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール-3-カルボン酸、5-(3-メトキシ - フェニル) - イソオキサゾール-3-カルボン酸、3-(2-メトキシフェニル)イソオキサゾール-5-カルボン酸、5-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシアルデヒド、3-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール-5-カルバルデヒド、3-(2-メトキシフェニル)イソオキサゾール-5-カルバルデヒド、5-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール、3-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール、3-(2-メトキシ - フェニル)-4,5-ジヒドロ - イソオキサゾール-5-カルボン酸、3-メトキシ - イソオキサゾール-5-カルボン酸、3-メトキシ - イソオキサゾール-5-カルボン酸、イソオキサゾール-5-カルボン酸、イソオキサゾール-4-カルボン酸、イソオキサゾール-5-カルボチオアミド、イソオキサゾール-5-カルボニルクロライド、イソオキサゾール-3-カルボニトリル、イソオキサゾール-3-���ルバルデヒド、イソオキサゾール-4-ボロン酸、イソオキサゾール、5-シクロプロピル-4- [2-(メチルスルホニル)-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]イソオキサゾール、6-(5-(チオフェン-2- yl)イソオキサゾール-3-カルボキサミド)ヘキシル5 - ((3as、4s、6ar)-2-ジオキソヘキサヒドロ-1h-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4- )ペンタノエート、イソカルボキサミド5-メチル-3-イソオキサゾール - カルボン酸2-ベンジルヒドラジド、5-イソブチル - イソオキサゾール-3-カルボン酸、3,3'-イミノビス(n、n-ジメチルプロピルアミン)、3-(3-ヒドロキシ - フェニル) - イソオキサゾール-5-カルボン酸メチルエステル、5-(4-ヒドロキシ - フェニル) - イソオキサゾール-3-カルボン酸、5-(3-ヒドロキシ - フェニル) - イソオキサゾール-3-カルボン酸、5-(ヒドロキシメチル)-3-メチルイソオキサゾール、3-ヒドロキシ-5-メチルイソオキサゾール、5-(1-ヒドロキシエチル)-3-(4-トリフルオロメチルフェニル)イソオキサゾール、3a,4,5,6,7,7a-ヘキサヒドロ - ベンゾ[d]イソオキサゾール-3-カルボン酸、5-(2-フリル)イソオキサゾール-3-カルバルデヒド、5-フラン-2-yl - イソオキサゾール-3-カルボン酸、6-フルオロ-3-(4-ピペリジニル)ベンズイソオキサゾール、5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール-3-メタノール、3-(2-フルオロ - フェニル) - イソオキサゾール-5-カルボン酸、5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシアルデヒド、3-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール-5-カルバルデヒド、3-(3-フルオロフェニル)イソオキサゾール-5-カルバルデヒド、3-(2-フルオロフェニル)イソオキサゾール-5-カルバルデヒド、5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール、3-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール、5-(3-フルオロ-4-メトキシ - フェニル) - イソオキサゾール-3-カルボン酸、エチル5-(トリフルオロメチル)-3-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール-4-カルボキシレート、エチル-5-(トリブチルスタニル)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、エチル5-(チオフェン-2- yl)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、5-エチル - イソオキサゾール-4-カルボン酸、、5-エチル - イソオキサゾール-3-カルボン酸、エチル5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール-4-カルボキシレート、エチル5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、エチル5-(2,3-ジヒドロベンゾ[b] [1,4]ジオキシン-7- yl)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、エチル3-(4-クロロフェニル)-5-(トリフルオロメチル)イソオキサゾール-4-カルボキシレート、エチル5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、エチル5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、エチル3-(4-ブロモフェニル)-5-(トリフルオロメチル)イソオキサゾール-4-カルボキシレート、エチル5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、エチル5-アミノ-4-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、エチル5-アミノ-4-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシレート、エチル6b-アセチル-2-(アセチルオキシ)-4a、6a-ジメチル-2,3,4,4a,4b,5,6,6a,6b,9a,10,10a,10b,11-テトラデカヒドロ-1h-ナフト [2 ',1'：4,5]インデノ[2,1-d]イソオキサゾール-9-カルボキシレート、3,5-ジメチル-4-(トリブチルスタンニル)イソオキサゾール、5-(1,5-ジメチル-1h-ピラゾール-4-yl) - イソオキサゾール-3-カルボン酸、5-(1,3-ジメチル-1 h -ピラゾール-4- yl) - イソオキサゾール-3-カルボン酸、5-(1,5-ジメチル-1 h -ピラゾール-4- yl) - イソオキサゾール、3,5-ジメチルイソオキサゾール-4-ボロン酸ピナコールエステル、3,5-ジメチルイソオキサゾール、3-(ジメチルアミノ)-1-(2-ピリジル)-2-プロペン-1-オン、5-(3,5-ジフルオロフェニル)イソオキサゾール、[2,6-ジクロロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル]ヒドラジン、5-(2,5-ジクロロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボン酸、ダナゾール、3-(4-クロロフェニル)-5-(トリフルオロメチル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-3-プロピオン酸、5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボン酸、3-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-5-カルボン酸、3-(3-クロロフェニル)イソオキサゾール-5-カルボン酸、5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-3-カルボキシアルデヒド、3-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール-5-カルバルデヒド、3-(3-クロロフェニル)イソオキサゾール-5-カルバルデヒド、3-(2-クロロフェニル)イソオキサゾール-5-カルバルデヒド、5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール、3-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール、5-(クロロメチル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、3-(クロロメチル)-5-(2-フリル)イソオキサゾール、4-クロロメチル-3,5-ジメチルイソオキサゾール、5-(クロロメチル)-3-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール、5-(3-クロロ-4-メトキシ - フェニル) - イソオキサゾール-3-カルボン酸、3-クロロ-4-フルオロベンズアルデヒド、3-(5-クロロ-2,4-ジメトキシ - フェニル)-4,5-ジヒドロ - イソオキサゾール-5-カルボン酸、5-tert-ブチル-4,5,6,7-テトラヒドロ - ベンゾ[d]イソオキサゾール-3-カルボン酸、3-(4-ブロモフェニル)-5-(ト
リフルオロメチル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-3-プロピオン酸、5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-3-カルボン酸ヒドラジド、5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-4-カルボン酸、5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-3-カルボン酸、3-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-5-カルボン酸、3-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール-5-カルボキシアルデヒド、5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール、5-(3-ブロモフェニル)イソオキサゾール、3-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール、5-(ブロモメチル)-3-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール、4-(ブロモメチル)イソオキサゾール、5-(ブロモメチル)-3-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール、5-(ブロモメチル)-3-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール、5-(ブロモメチル)-3-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール、6-ブロモ-3-メチルベンゾ[d]イソオキサゾール、5-ブロモ-3-メチルベンゾ[d]イソオキサゾール、4-ブロモ-5-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール、3-ブロモ - イソオキサゾール、3-ブロモ-5-(2-ヒドロキシエチル)イソオキサゾール、4-ブロモ-5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール、3-ブロモ-5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール、4-ブロモ-5-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール、4-ブロモ-5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール、6-ブロモ - ベンゾ[d]イソオキサゾール-3-カルボン酸、ベンゾ[d]イソオキサゾール-3-カルボン酸、3-アミノ-5-メチルイソオキサゾール、5-アミノ-3-(4-メトキシフェニル)イソオキサゾール、3-アミノイソオキサゾール、3-アミノ-5-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール、5-アミノ-3-(4-クロロフェニル)イソオキサゾール、5-アミノ-4-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール、3-アミノ-5-(4-ブロモフェニル)イソオキサゾール、5-アセチル-3-(4-フルオロフェニル)イソオキサゾール、5-アセチル-3-(3-フルオロフェニル)イソオキサゾール、3-メチル-5 - [(2S)-1-メチル-2-ピロリジニル]イソオキサゾール塩酸塩、7-メトキシ-5-メチル-4,5-ジヒドロナフト[2,1-d]イソオキサゾール、5-メチル-3-フェニル - イソオキサゾール-4-カルボン酸メチルアミド、5-メチル-3-フェニル - イソオキサゾール-4-カルボチオ酸メチルアミド、5-メチル-3-フェニル-4-(1 h -ピラゾール-5-yl)イソオキサゾール、5-ベンジル-3-フラン-2-yl-2-フェニル - テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、5-ベンジル-3- [4-(ジメチルアミノ)フェニル] -2-フェニルジヒドロ-2 h -ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン、5-ベンジル-3-(5-br-2-ho-フェニル)-2-ph-テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、5-ベンジル-3-(4-ニトロ-ph)-2-ph-ジヒドロ-2 h -ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン、5-ベンジル-3-(4-メトキシ - フェニル)-2-ph-テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、5-ベンジル-3-(4-フルオロフェニル)-2-(2-メチルフェニル)ジヒドロ-2 h -ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン、5-ベンジル-3-(3-ニトロ-ph)-2-フェニル - テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、5-ベンジル-ph-3-(2-ピリジニル)ジヒドロ-2 h -ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-ベンジル-2-ph-3-(2-ph-ビニル)ジヒドロ-2h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-ベンジル-2-(4-クロロフェニル)-3-(2-チエニル)ジヒドロ-2 h -ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-ベンジル-2,3-ジフェニルジヒドロ-2h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-ベンジル-2(4-cl-ph)3-(2-フリル)ジヒドロ-2ｈ-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,5-ジオン、6(3h,5h)ジオン、5-ベンジル-2(4-cl-ph)-3-(4-f-ph)ジヒドロ-2 h -ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h)ジオン、5-(p-トリル)イソオキサゾール、5-(4-メチルフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2ｈ-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-メトキシフェニル)-2-フェニル-3-(4-ピリジニル)ジヒドロ-2 h -ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-メトキシフェニル)-2-フェニル-3-(3-ピリジニル)ジヒドロ-2ｈ-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-メトキシ-ph)-2,3-ジフェニルジヒドロ-2 h -ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-フルオロフェニル)-3-(4-メトキシフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2 h -ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-フルオロフェニル)-2-(2-メチルフェニル)-3-(4-ピリジニル)ジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-エトキシフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-エトキシフェニル)-3-(4-フルオロフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-エトキシフェニル)-2-メチル-3-(4-ニトロフェニル)ジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-エトキシ-ph)-2-ph-3-チオフェン-2- yl -4h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、5-(4-Cl-ph)-3-(3-ニトロ-ph)-2-フェニル - テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、5-(4-ブロモフェニル)-3-(4-メトキシフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-ブロモフェニル)-3-(2-フリル)-2-(2-メチルフェニル)ジヒドロ-2H-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-ブロモフェニル)-2-フェニル-3-(2-ピリジニル)ジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、5-(4-br-ph)2-ph-3-(2phビニル)ジヒドロ-2h-ピロロ(3,4d)イソオキサゾール-4、6(3h、5h)ジオン、5-(2-cl-ph)-3-(4-ジメチルアミノ-ph)2-o-トリル-4h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、5-(2-クロロフェニル)-3- [4-(ジメチルアミノ)フェニル] -2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン、5-(2-クロロフェニル)-3-(4-メトキシフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン、4 - ((3-(2-cl-ph)-5-メチル - イソオキサゾール-4-カルボニル) - アミノ) - 安息香酸エチルエステル、4,5,6,6a-テトラヒドロ-3ah-シクロペンタ[d]イソオキサゾール-3-カルボン酸、3-フェニル-3a、6a-ジヒドロチエノ[2,3-d]イソオキサゾール4,4-ジオキシド、3-メチル-5-(3-フェニルプロピル)イソオキサゾール、3-メチル-4-ニトロ-5 - [(e)-2-フェニルエテニル]イソオキサゾール、3-メチル-4,5,8,9-テトラヒドロシクロオクタ(d)イソオキサゾール、3-メチル-4、5、5a、6a、7、8-ヘキサヒドロキレノ(2'、3'：5、6)シクロオクタ(1、2d)イソオキサゾール、3-メチル-3a、4,5,8,9,9a-ヘキサヒドロシクロオクタ(d)イソオキサゾール、3-フラン-2- yl -2-フェニル-5-p-トリル - テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、3-クロロ-4,5-ジヒドロ(1) - ベンゾチエピノ(5,4-c)イソオキサゾール、3-(4-ジメチルアミノ)フェ��ル] -5-(4-メトキシフェニル)-2-(2-メチルフェニル)ジヒドロ-2H-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン 、、3-(5-ブロモ-2- ho-フェニル)-2,5-ジフェニル - テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、3-(5-ブロモ-2-ho-ph)-5-(2-cl-ph)-2-ph-テトラヒドロ-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、3-(4-メオ-シフェニル)-5-フェニル-2-o-トリル - テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、(4-フルオロフェニル)-5-(4-ニトロフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン、(4-フルオロフェニル)-5-(4-メチルフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、(3,4-ジメチルアミノ-ph)-5-ph-2-o-トリル-4h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4、6ジオン、(4-フルオロフェネチル)-5-(4-メトキシフェニール)-2-フェニールジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d] イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、3-(4-br-ph)-2-ph-5-(2-トリフルオロメチル-ph)-4h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、3-(3-ニトロ - フェニル)-2,5-ジフェニル - テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-(3h、5h)ジオン、3-(3-br-フェニル)-2.5
-テトラヒドロ-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-(3h,5h)ジオン、3-(3-br-ph)-5-(2-メオ-ph)-2-o-トリル-テトラヒドロ-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン, 3-(2-フリル)-5- [4-(4-モルホリニル)フェニル] -2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、3-(2-フリル)-2-(2-me-ph)-5-ph-ジヒドロ-2h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、3-(2-フリル)-2,5-ジフェニルジヒドロ-2h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、3-(2-cl - フェニル)-5-メチル - イソオキサゾール-4-カルボン酸(2,5-ジクロロ - フェニル) - アミド、3-(2-cl-ph)-5-me-イソオキサゾール-4-カルボン酸(4,5-ジヒドロ - チアゾール-2-yl) - アミド、3-(2-クロロ - フェニル)-5-メチル - イソオキサゾール-4-カルボン酸シアノメチル - アミド、3-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メトキシフェニル)-2-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、3-(2,4-ジ-cl-ph)-2,5-ジフェニルジヒドロ-2h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、3-(2,2-ジクロロ - ビニル)-5-フェニル - イソオキサゾール、3,5-ジフェニル - イソオキサゾール、3,5-ジメチル-4-(1-ピロリジニルスルホニル)イソオキサゾール、(3,4-ジメチルアミノ-ph)-5-(4-eto-ph)2-o-トリル-4h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン, 2-(4-cl-ph)5-ph-3-(2-チエニル)ジヒドロ-2h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン, 2-(4-cl-ph)-5-(3-メオ-ph)-3-(3-ニトロ-ph)-4h-ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン, 、2-(4-cl-ph)-3-(4-メオ-ph)-5-p-トリル - テトラヒドロ - ピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6-ジオン、2-(4-クロロフェニル)-5-(4-メチルフェニル)-3-(2-チエニル)ジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン、2-(4-クロロフェニル)-3- [4-(ジメチルアミノ)フェニル] -5-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン、2-(4-クロロフェニル)-3-(4-フルオロフェニル)-5-(4-ニトロフェニル)ジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン, 2-(4-クロロフェニル)-3-(2-チエニル)-5- [3-(トリフルオロメチル)フェニル]ジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h、5h) - ジオン 、2-(4-クロロフェニル)-3-(2,4-ジクロロフェニル)-5-フェニルジヒドロ-2h-ピロロ[3,4-d]イソオキサゾール-4,6(3h,5h) - ジオン, 2,3-di-ph-5-(3-(トリ-f-me)ph)ジヒドロ-2h-pピロロ(3,4-d)イソオキサゾール-4,6(3h,5h)-ジオン、ダナゾールおよびn-シクロプロピル-5-(チオフェン-2-yl)イソオキサゾール-3-カルボキサミド
より選択される方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、
前記イソキサゾール化合物はダナゾールであり、および／または前記イソキサゾールはｎ-cyclopropyl-5-(thiophen-2-yl)isoxazole-3-carboxamideである方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記イソキサゾール化合物は一般式（１）を有してなり、
2017513482.tif 000022
前記Ａは、Ｇで置換されていてもよい複素環基ないしはＧで置換されていてもよいフェニルであり、
Ｇは、ハロゲノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換されていてもよいフェニルなどであり、複素環基はチアゾリルなどを含んでおり、
Ｂは、ハロゲノなどで置換されたフェニル、ハロゲノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル等で置換された複素環基であり、
Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルなどである方法。
【請求項１２】
化学的に修飾された多能性幹（ｉＰＳ）細胞であって、
ＤＮＡ低メチル化を特徴とし、
前記細胞は有効量のイソキサゾールまたはイソキサゾール類似化合物と接触することによって修飾されるｉＰＳ細胞。
【請求項１３】
実質的に純粋な心臓前駆細胞および／または心筋細胞群の少なくとも８０％以上が請求項１２由来のものから単離された細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞群であって、実質的に均質である細胞群。
【請求項１５】
好ましくは治療的使用のための薬学的に許容される担体を含む、請求項１３に記載の細胞のクローン群。
【国際調査報告】
2017513482.tif 000023