(57)【要約】本発明は、キメラポリヌクレオチド分子の組成物、並びにその調製、製造及び治療的使用の方法に関し、これらは、化学修飾の配置、位置及びロード率のカスタマイズを可能にすることによって、ポリヌクレオチドの特定の物理化学的及び薬学的特性を改善、改変又は最適化する。１つの非制限的実施形態では、こうしたキメラポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡとしての形態をしているか、又は目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡとして機能する。一実施形態では、上記のキメラポリヌクレオチドは、実質的に非コードである。
2017524357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドであって、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシドを含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００であり；ここで、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］は、独立に、ｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ及びコード領域を含み；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【化１】
2017524357.tif 000108
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆが０であるとき、Ｒ４は、結合ではなく；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合されている、キメラポリヌクレオチド。
【請求項２】
［Ａｎ］及び［Ｂｏ］の少なくとも１つが、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩＩ：
【化２】
2017524357.tif 000109
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩である、
請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項３】
ｈが、０であり；Ｒ１３が、Ｈであり；Ｒ１４が、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルである、請求項２に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルが、メトキシである、請求項３に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項５】
Ｘ３が、ＳＨである、請求項２〜４のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドであって、前記キメラポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシドを含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００であり、ここで、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］は、独立にｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ及びコード領域を含み；
Ｌ１は、結合であるか、又は式ＩＩＩ：
【化３】
2017524357.tif 000110
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合され；
ここで、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］の少なくとも１つは、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩＩ：
【化４】
2017524357.tif 000111
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
ここで、式ＩＶについて、Ｘ１、Ｘ２、若しくはＸ４の少なくとも１つは、ＮＨ又はＳである、キメラポリヌクレオチド。
【請求項７】
Ｘ１が、ＮＨである、請求項６に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項８】
Ｘ４が、ＮＨである、請求項６又は７に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項９】
Ｘ２が、Ｓである、請求項６に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１つの５’キャプ構造をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリ−Ａ−テイルをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記コード領域、前記５’ＵＴＲ、前記３’ＵＴＲ、前記５’キャップ構造、又は前記ポリ−Ａ−テイルの１つが、式ＩＩ：［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］を含む、請求項１又は１１のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記コード領域、前記５’ＵＴＲ、前記３’ＵＴＲ、前記５’キャップ構造、又は前記ポリ−Ａ−テイルの１つが、［Ａｎ］を含み、前記コード領域、前記５’ＵＴＲ、前記３’ＵＴＲ、前記５’キャップ構造、又は前記ポリ−Ａ−テイルのもう１つが、［Ｂｏ］を含む、請求項１又は１１のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記５’ＵＴＲが、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記キメラポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが、表２のヌクレオチドである、請求項１５に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１７】
Ｒ４が、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレンである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレンが、以下の構造：
【化５】
2017524357.tif 000112
を有する、請求項１７に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１９】
Ｌ１が、以下の構造：
【化６】
2017524357.tif 000113
を含む、請求項１８に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２０】
Ｌ１が、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の３’位又は４’位で［Ａｎ］に結合すると共に、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の５’位又は６’位で［Ｂｏ］に結合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ポリ−Ａテイルが、式ＸＸＩ：
【化７】
2017524357.tif 000114
の構造で終結し、
式中、Ｎ３は、核酸塩基であり
Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、及びＲ３１の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｉは、０又は１であり；
Ｘ５は、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ６は、Ｏ又はＳであり；
Ｘ７は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩である、
請求項８〜２０のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記式ＸＸＩの構造が、
【化８】
2017524357.tif 000115
である、請求項２１に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ポリ−Ａテイルが、４０〜８０個のヌクレオシドを有する、請求項２２に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記式ＸＸＩの構造が、２〜４つの２’−メトキシ−アデノシン及び／又は２’−フルオロ−アデノシンに結合する、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ポリ−Ａテイルが、以下の構造：
【化９】
2017524357.tif 000116
で終結する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記ポリ−Ａテイルが、以下の構造：
【化１０】
2017524357.tif 000117
で終結する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記ポリ−Ａテイルが、以下の構造：
【化１１】
2017524357.tif 000118
を含む、請求項８〜２１のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂ：
【化１２】
2017524357.tif 000119
の構造を有し、
前記方法が、式ＶＩａ又はＶＩｂ：
【化１３】
2017524357.tif 000120
の構造を有する化合物と、
式ＶＩＩ：
【化１４】
2017524357.tif 000121
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｘ３は、独立に、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ１７及びＲ１９の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ１８は、ハロゲンである）
の構造を有する化合物を反応させて、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂの構造を含む、方法。
【請求項２９】
ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂ：
【化１５】
2017524357.tif 000122
の構造を有し、
前記方法が、式ＩＸａ又はＩＸｂ：
【化１６】
2017524357.tif 000123
の構造を有する化合物と、
式Ｘａ又はＸｂ：
【化１７】
2017524357.tif 000124
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
各Ｘ４は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ１及びＸ２は各々、独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｘ３は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ２０及びＲ２３の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２１及びＲ２２の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシである）
を反応させることにより、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂの構造を含む、方法。
【請求項３０】
ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂ：
【化１８】
2017524357.tif 000125
の構造を含み、
前記方法が、
式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ、又はＸＩＶｂ：
【化１９】
2017524357.tif 000126
の構造を有する化合物と、
式ＸＶａ又はＸＶｂ：
【化２０】
2017524357.tif 000127
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、非存在、Ｏ、ＮＨ、若しくはＳ、又はその塩であり；
Ｒ２４及びＲ２７の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、及びＲ２６’の各々は、独立に、非存在、任意選択で置換
されたＣ１〜Ｃ６アルキレン又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであるか、あるいは、Ｒ２６又はＲ２６’とアルキニル基は、一緒に、任意選択で置換されたシクロアルキニルを形成する）
を反応させることにより、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、又はＸＩＩｂの構造を含む、方法。
【請求項３１】
ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
前記方法が、式ＸＶＩ：
［Ａｎ］−（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃ−Ｎ３
式ＸＶＩ
の構造を有する化合物と、式ＸＶ：
Ｒ２７−（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆ−［Ｂｏ］
式ＸＶＩＩ
の構造を有する化合物
（式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシドを含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【化２１】
2017524357.tif 000128
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７は各々、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたトリアゾレンであり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；並びに
Ｒ２７は、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ３アルキニル又は任意選択で置換されたＣ８〜Ｃ１２シクロアルキニルであり、
ここで、Ｌ１は、前記ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合する）
を反応させることにより、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記キメラポリヌクレオチドは、式ＩＩの配列を有する、方法。
【請求項３２】
前記任意選択で置換されたトリアゾレンが、以下の構造：
【化２２】
2017524357.tif 000129
を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法であって、ここで、前記キメラポリヌクレオチドが、式ＸＶＩＩＩ：
【化２３】
2017524357.tif 000130
の構造を有し、
前記方法が、式ＸＩＸ：
【化２４】
2017524357.tif 000131
の構造を有する化合物と、
式ＸＸ：
【化２５】
2017524357.tif 000132
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオ
ール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｈは、０又は１であり；並びに
Ｘ４は、Ｏ、ＮＨ、又はＳである）
を反応させることにより、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、前記キメラポリヌクレオチドが、式ＸＶＩＩＩの構造を含む、方法。
【請求項３４】
式ＸＸＩ：
【化２６】
2017524357.tif 000133
の化合物から式ＸＩＸの化合物を生成するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラポリヌクレオチドの設計、調製、製造及び／又は製剤化のための組成物、方法、製法、キット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９０年代初めに、ブルーム（Ｂｌｏｏｍ）及び共同研究者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写バソプレシンｍＲＮＡを視床下部に注入することによってバソプレシン欠乏ラットをレスキューすることに成功した（非特許文献１）。しかしながら、翻訳レベルの低さ及び分子の免疫原性のために、治療薬としてのｍＲＮＡの開発が阻まれ、それ以来、逆にこれらの落とし穴を利用し得る代替的用途、すなわち、癌抗原をコードするｍＲＮＡによる免疫化に向けて努力が注がれている。
【０００３】
さらに近年では、他の研究者らによって、ｍＲＮＡを用いた目的のポリペプチドをコードする構築物の送達が研究され、ｍＲＮＡ分子の特定の化学修飾、特に、プソイドウリジン及び５−メチル−シトシンが免疫刺激作用を低下させたことが明らかにされている。
【０００４】
これらの研究は、例えば、リボステム社（Ｒｉｂｏｓｔｅｍ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）の２００３年７月９日に出願され、現在は放棄されている英国特許出願（特許文献１）、（特許文献２）として公開されている２００４年７月９日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２９８１号、（特許文献３）として公開され、現在は放棄されている２００６年６月８日出願の米国特許出願国内段階１０／５６３，８９７号、及び（特許文献４）として公開され、現在撤回されている２００４年７月９日出願の欧州特許出願国内段階第ＥＰ２００４７４３３２２号；ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｉｎｃ．）の（特許文献５）として公開された２００７年１２月１９日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／８８０６０号）、（特許文献６）として公開された２００９年７月２日出願の米国特許出願国内段階第１２／５２０，０７２号、及び（特許文献７）として公開された２００９年７月７日出願の欧州特許出願国内段階第ＥＰ２００７８７４３７６号；ロチェスター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）の（特許文献８）として公開された２００６年１２月４日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４６１２０号、及び（特許文献９）として公開された２００６年１２月１日出願の米国特許出願第１１／６０６，９９５号；バイオＮテックＡＧ（ＢｉｏＮＴｅｃｈ  ＡＧ）の２００７年１２月１４日に出願され、現在は放棄されている欧州特許出願（特許文献１０）、（特許文献１１）として公開された２００８年１２月１２日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０５９、（特許文献１２）として公開された２０１０年６月２日出願の欧州特許出願国内段階第ＥＰ２００８８６１４２３号、（特許文献１３）として公開された２０１０年１１月２４日出願の米国特許出願国内段階第１２／，７３５，０６０号、２００５年９月２８日出願のドイツ国特許出願（特許文献１４）、（特許文献１５）として公開された２００６年９月２８日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０４４８号、２０１２年３月２１日公開の国内段階欧州特許（特許文献１６）、及び（特許文献１７）として公開された２００９年８月１４日出願の米国特許出願第１１／９９２，６３８号；イミューン・ディジーズ・インスティテュート社（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）の（特許文献１８）として公開された２０１１年４月１５日出願の米国特許出願第１３／０８８，００９号及び（特許文献１９）として公開された２０１１年４月１５日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３２６７９号；シャイア・ヒューマンジェネティック・セラピューティクス（Ｓｈｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の（特許文献２０）として公開された２０１０年１１月２０日出願の米国特許出願第１２／９５７，３４０号；セクイター社（Ｓｅｑｕｉｔｕｒ  Ｉｎｃ．）の
（特許文献２１）として公開された１９９８年９月１８日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１９９８／０１９４９２号；スクリップス研究所（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の（特許文献２２）として公開された２０１０年２月２４日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００５６７号、及び（特許文献２３）として公開された２０１１年１１月３日出願の米国特許出願国内段階第１３／２０３，２２９号；ルートヴィヒ・マクシミリアン大学（Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｌｉａｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の（特許文献２４）として公開された２０１０年７月３０日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００４６８１号；セルスクリプト社（Ｃｅｌｌｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．）の２００８年６月３０日に出願され、２０１１年１０月１８日に付与された米国特許（特許文献２５）、（特許文献２６）として公開された２０１０年１２月７日出願の米国特許出願第１２／９６２，４９８号、（特許文献２７）として公開された２０１０年１２月７日出願の米国特許出願第１２／９６２，４６８号、（特許文献２８）として公開された２０１１年９月２０日出願の米国特許出願１３／２３７，４５１号、並びに（特許文献２９）として公開された２０１０年１２月７日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５９３０５号、及び（特許文献３０）として公開された２０１０年１２月７日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５９３１７号；ペンシルベニア大学理事会（Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）の（特許文献３１）として公開された２００６年８月２１日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／３２３７２号、及び（特許文献３２）として公開された２００９年３月２７日出願の米国特許出願国内段階第１１／９９０，６４６号；キュアバック社（Ｃｕｒｅｖａｃ  ＧＭＢＨ）の２００１年６月５日出願のドイツ国特許出願（特許文献３３）、２００１年１２月１９日出願の（特許文献３４）、及び２００６年１０月３１日出願の（特許文献３５）（これらは全て放棄されている）、２００５年３月３０日に付与された欧州特許（特許文献３６）、及び２００８年１月２日に付与された（特許文献３７）、（特許文献３８）として公開された２００２年６月５日出願のＰＣＴ／ＥＰ２００２／０６１８０号、（特許文献３９）として公開された２００２年１２月１９日出願のＰＣＴ／ＥＰ２００２／１４５７７号、（特許文献４０）として公開された２００７年１２月３１日出願のＰＣＴ／ＥＰ２００７／０９４６９号、（特許文献４１）として公開された２００８年４月１６日出願のＰＣＴ／ＥＰ２００８／０３０３３号、（特許文献４２）として公開された２００５年５月１９日出願のＰＣＴ／ＥＰ２００６／００４７８４号、（特許文献４３）として公開された２００７年１月９日出願のＰＣＴ／ＥＰ２００８／０００８１号、並びに（特許文献４４）として公開された２００３年１２月５日出願の米国特許出願第１０／７２９，８３０号、（特許文献４５）として公開された２００４年６月１８日出願の米国特許出願第１０／８７０，１１０号）、（特許文献４６）として公開された２００８年７月７日出願の米国特許出願第１��／９１４，９４５号、（特許文献４７）として公開され、現在は放棄されている２００９年１０月２７日出願の米国特許出願第１２／４４６，９１２号、（特許文献４８）として公開された２０１０年１月４日出願の米国特許出願第１２／５２２，２１４号、（特許文献４９）として公開された２０１０年５月２６日出願の米国特許出願第１２／７８７，５６６号、（特許文献５０）として公開された２０１０年５月２６日出願の米国特許出願第１２／７８７，７５５号、（特許文献５１）として公開された２０１１年７月１８日出願の米国特許出願第１３／１８５，１１９号、及び（特許文献５２）として公開された２０１１年５月１２日出願の米国特許出願第１３／１０６，５４８号に記載されており、これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】英国特許出願第０３１６０８９．２号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５００５６２２号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６０２４７１９５号明細書
【特許文献４】欧州特許第１６４６７１４号明細書
【特許文献５】国際公開第２００８１４０６１５号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１０００２８９４３号明細書
【特許文献７】欧州特許第２１０４７３９号明細書
【特許文献８】国際公開第２００７０６４９５２号
【特許文献９】米国特許出願公開第２００７０１４１０３０号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願第２００７０２４３１２号明細書
【特許文献１１】国際公開第２００９０７７１３４号
【特許文献１２】欧州特許第２２４０５７２号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１１００６５１０３号明細書
【特許文献１４】ＤＥ１０  ２００５  ０４６  ４９０号明細書
【特許文献１５】国際公開第２００７０３６３６６号
【特許文献１６】欧州特許第１９３４３４５号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１２００４６３４６号明細書
【特許文献１９】国際公開第２０１１０１３０６２４号
【特許文献２０】米国特許出願公開第２０１１０２４４０２６号明細書
【特許文献２１】国際公開第１９９９０１４３４６号
【特許文献２２】国際公開第２０１００９８８６１号
【特許文献２３】米国特許出願公開第２０１２００５３３３３号明細書
【特許文献２４】国際公開第２０１１０１２３１６号
【特許文献２５】米国特許第８，０３９，２１４号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２０１１０１４３４３６号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１１０１４３３９７号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２０１２０００９６４９号明細書
【特許文献２９】国際公開第２０１１０７１９３１号
【特許文献３０】国際公開第２０１１０７１９３６号明細書
【特許文献３１】国際公開第２００７０２４７０８号
【特許文献３２】米国特許出願公開第２００９０２８６８５２号明細書
【特許文献３３】ＤＥ１０  ２００１  ０２７  ２８３．９号明細書
【特許文献３４】ＤＥ１０  ２００１  ０６２  ４８０．８号明細書
【特許文献３５】ＤＥ２０  ２００６  ０５１  ５１６号明細書
【特許文献３６】欧州特許第１３９２３４１号明細書
【特許文献３７】欧州特許第１４５８４１０号明細書
【特許文献３８】国際公開第２００２０９８４４３号
【特許文献３９】国際公開第２００３０５１４０１号
【特許文献４０】国際公開第２００８０５２７７０号明細書
【特許文献４１】国際公開第２００９１２７２３０号
【特許文献４２】国際公開第２００６１２２８２８号
【特許文献４３】国際公開第２００８０８３９４９号
【特許文献４４】米国特許出願公開第２００５００３２７３０号明細書
【特許文献４５】米国特許出願公開第２００５００５９６２４号明細書
【特許文献４６】米国特許出願公開第２００８０２６７８７３号明細書
【特許文献４７】米国特許出願公開第２０１００４７２６１号明細書
【特許文献４８】米国特許出願公開第２０１００１８９７２９号明細書
【特許文献４９】米国特許出願公開第２０１１００７７２８７号明細書
【特許文献５０】米国特許出願公開第２０１００２３９６０８号明細書
【特許文献５１】米国特許出願公開第２０１１０２６９９５０号明細書
【特許文献５２】米国特許出願公開第２０１１０３１１４７２号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５５巻、ｐ．９９６〜９９８、１９９２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの報告はあるものの、それらは、修飾がｍＲＮＡ中に均質に存在する化学修飾（プソイドウリジン及び５−メチル−シトシンを含む）の選択に限定されており、当技術分野では、生理学的反応及び転帰を微調整し、又は個別に合わせて調整すべく、種々の化学修飾の選択的組込みを阻む障壁を含む、ポリペプチドをコードする核酸の細胞内翻訳及びプロセシングの有効な調節を取り巻く無数の障壁に対処する治療モダリティが依然として必要とされている。
【０００８】
今日まで、位置的に修飾されたポリヌクレオチド、例えば、修飾の選択的組み込みを有するものに関する研究は報告されていない。本発明は、当技術分野における課題のうちの１つ又は複数を回避する構造的及び／又は化学的特徴、例えば、核酸ベースの治療薬を最適化すると共に、構造的及び機能的完全性を維持し、発現の閾値を克服し、発現率、半減期及び／又はタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、且つ免疫応答及び／又は分解経路などの有害な生物学的反応を回避するのに有用な特徴を有する核酸ベースの化合物又はキメラポリヌクレオチド（コード及び非コードの両方並びにそれらの組み合わせ）を提供することにより、この必要に対処する。これらの障壁の各々が、本発明を用いて軽減され又は解消され得る。
【０００９】
このために、本発明者らは、化学修飾の配置、位置及びロード率のカスタマイズを可能にすることによって、ポリヌクレオチドの特定の物理化学的及び薬学的特性を改善し、改変し又は最適化するキメラポリヌクレオチド及びそれらのポリヌクレオチドの合成方法を開発してきた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書には、キメラポリヌクレオチドの設計、調製、製造及び／又は製剤化のための組成物、方法、製法、キット及び装置が記載される。非制限的実施形態では、こうしたキメラポリヌクレオチドは、目的のポリヌクレオチドをコードする修飾ｍＲＮＡ分子の形態をしているか、又はそのような修飾ｍＲＮＡとして機能する。一実施形態では、こうしたキメラポリヌクレオチドは、実質的に非コードである。
【００１１】
本発明に従い、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドが提供され、キメラポリヌクレオチドは、式Ｉ：
５’［Ａｎ］Ｘ−Ｌ１−［Ｂｏ］ｙ−Ｌ２−［Ｃｐ］ｚ−Ｌ３  ３’
式Ｉ
を含む配列又は構造を有し、
式中、
Ａ及びＢの各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域を含み；
Ｃは、連結ヌクレオシドの任意選択の領域であり；
領域Ａ、Ｂ若しくはＣの少なくとも１つは、位置的に修飾されており、前記位置的に修飾された領域は、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、又はウリジンの１つ又は複数の同じヌクレオシドタイプの少なくとも２つの化学修飾されたヌクレオシドを含み、同じタイプのヌクレオシドの化学修飾の少なくとも２つが、異なる化学修飾であり；
ｎ、ｏ及びｐは、独立に、１５〜１０００の整数であり；
ｘ及びｙは、独立に、１〜２０であり；
ｚは、０〜５であり；
Ｌ１及びＬ２は、独立に、任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベース若しくは非核酸ベースのいずれかであり；
Ｌ３は、任意選択のコンジュゲート又は任意選択のリンカー部分であり、前記リンカー部分は、核酸ベース若しくは非核酸ベースのいずれかである。
【００１２】
また、研究、診断及び治療薬におけるキメラポリヌクレオチドを作製及び使用する方法も提供される。
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【００１３】
【化１】
2017524357.tif 000003
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆが０であるとき、Ｒ４は、結合ではなく；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］（例えば、［Ａｎ］のヌクレオシドの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位、あるいは、［Ａｎ］のヌクレオシドの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位）に結合する。
【００１４】
一部の実施形態では、［Ａｎ］及び［Ｂｏ］の少なくとも１つは、式ＩＶ又は式ＸＶＩ
ＩＩ：
【００１５】
【化２】
2017524357.tif 000004
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩である。
【００１６】
一部の実施形態では、ｈは、０であり；Ｒ１３は、Ｈであり；Ｒ１４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルである。
他の実施形態では、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキルは、メトキシである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、ＳＨである。
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを特徴とし、ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、結合であるか、又は式ＩＩＩ：
【００１８】
【化３】
2017524357.tif 000005
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ，及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］（例えば、［Ａｎ］のヌクレオシドの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位、あるいは、［Ａｎ］のヌクレオシドの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位）に結合する。
【００１９】
ここで、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］の少なくとも１つは、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩＩ：
【００２０】
【化４】
2017524357.tif 000006
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
ここで、式ＩＶについて、Ｘ１、Ｘ２、若しくはＸ４の少なくとも１つは、ＮＨ又はＳである。
【００２１】
一部の実施形態では、Ｘ１は、ＮＨである。他の実施形態では、Ｘ４は、ＮＨである。いくつかの実施形態では、Ｘ２は、Ｓである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ａ）コード領域；（ｂ）５’ＵＴＲ；及び（ｃ）３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに、（ｄ）少なくとも１つの５’キャプ構造を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに、（ｅ）ポリ−Ａ−テイルを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルの１つは、［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］を含む。
他の実施形態では、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルの１つが、［Ａｎ］を含み、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルのもう１つが、［Ｂｏ］を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド（例えば、表２のヌクレオシド）を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレンであり、例えば、複素環は、以下の構造：
【００２５】
【化５】
2017524357.tif 000007
を有する。
【００２６】
一部の実施形態では、Ｌ１は、以下の構造：
【００２７】
【化６】
2017524357.tif 000008
を有する。
【００２８】
一部の実施形態では、Ｌ１は、上記ヌクレオシドのうちの１つの５員糖環の３’位又は６員糖環の４’位で［Ａｎ］に結合すると共に、上記ヌクレオシドのうちの１つの５員糖環の５’位又は６員糖環の６’位で［Ｂｏ］に結合する。
【００２９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状である。
いくつかの実施形態では、ポリ−Ａテイルは、式ＸＸＩ：
【００３０】
【化７】
2017524357.tif 000009
の構造で終結し、
式中、Ｎ３は、核酸塩基であり
Ｒ２８、Ｒ２９、Ｒ３０、及びＲ３１の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｉは、０又は１であり；
Ｘ５は、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ６は、Ｏ又はＳであり；
Ｘ７は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩である。
【００３１】
一部の実施形態では、式ＸＸＩの構造は、
【００３２】
【化８】
2017524357.tif 000010
である。
【００３３】
他の実施形態では、ポリ−Ａテイルは、４０〜８０個のヌクレオシド（配列番号２３）を有する。
いくつかの実施形態では、式ＸＸＩの構造は、２〜４つの２’−メトキシ−アデノシン及び／又は２’−フルオロ−アデノシンに結合する。
【００３４】
一部の実施形態では、ポリ−Ａテイルは、以下の構造：
【００３５】
【化９】
2017524357.tif 000011
で終結する。
【００３６】
他の実施形態では、ポリ−Ａテイルは、以下の構造：
【００３７】
【化１０】
2017524357.tif 000012
で終結する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ポリ−Ａテイルは、以下の構造：
【００３９】
【化１１】
2017524357.tif 000013
を含む。
【００４０】
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂ：
【００４１】
【化１２】
2017524357.tif 000014
の構造を有する。
【００４２】
この方法は、式ＶＩａ又はＶＩｂ：
【００４３】
【化１３】
2017524357.tif 000015
の構造を有する化合物と、
式ＶＩＩ：
【００４４】
【化１４】
2017524357.tif 000016
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたア
ミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｘ３は、独立に、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ１７及びＲ１９の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ１８は、ハロゲンである）
の構造を有する化合物を（例えば、アルキル化条件下で）反応させて、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂの構造を含む。
【００４５】
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂ：
【００４６】
【化１５】
2017524357.tif 000017
の構造を有する。
【００４７】
この方法は、式ＩＸａ又はＩＸｂ：
【００４８】
【化１６】
2017524357.tif 000018
の構造を有する化合物と、
式Ｘａ又はＸｂ：
【００４９】
【化１７】
2017524357.tif 000019
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ１及びＸ２は各々、独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｘ３は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ２０及びＲ２３の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２１及びＲ２２の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシである）
の構造を有する化合物を（例えば、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）反応条件下で）反応させることにより、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂの構造を含む。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂ：
【００５１】
【化１８】
2017524357.tif 000020
の構造を有する。
【００５２】
この方法は、式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ、又はＸＩＶｂ：
【００５３】
【化１９】
2017524357.tif 000021
の構造を有する化合物と、
式ＸＶａ又はＸＶｂ：
【００５４】
【化２０】
2017524357.tif 000022
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、非存在、Ｏ、ＮＨ、若しくはＳ、又はその塩であり；
Ｒ２４及びＲ２７の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、及びＲ２６’の各々は、非存在であるか、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであるか、あるいは、Ｒ２６又はＲ２６’とアルキニル基は、一緒に、任意選択で置換されたシクロアルキニルを形成する）
を（例えば、銅供給源の存在若しくは非存在下の［３＋２］環状付加条件下で）反応させることにより、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂの構造を含む。
【００５５】
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有する。
【００５６】
この方法は、式ＸＶＩ：
［Ａｎ］−（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃ−Ｎ３
式ＸＶＩ
の構造を有する化合物と、式ＸＶＩＩ：
Ｒ２７−（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆ−［Ｂｏ］
式ＸＶＩＩ
の構造を有する化合物
（式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシドを含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【００５７】
【化２１】
2017524357.tif 000023
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７は各々、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたトリアゾレンであり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；並びに
Ｒ２７は、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ３アルキニル又は任意選択で置換されたＣ８〜Ｃ１２シクロアルキニルであり、
ここで、Ｌ１は、上記ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合する）
を（例えば、銅供給源の存在若しくは非存在下の［３＋２］環状付加条件下で）反応させ
ることにより、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＩＩの配列を有する。
【００５８】
一部の実施形態では、任意選択で置換されたトリアゾレンは、以下の構造：
【００５９】
【化２２】
2017524357.tif 000024
を有する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を特徴とし、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＸＶＩＩＩ：
【００６１】
【化２３】
2017524357.tif 000025
の構造を有し、
この方法は、式ＸＩＸ：
【００６２】
【化２４】
2017524357.tif 000026
の構造を有する化合物と、
式ＸＸ：
【００６３】
【化２５】
2017524357.tif 000027
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｈは、０又は１であり；
Ｘ４は、Ｏ、ＮＨ、又はＳである）
を（例えば、還元アミド化条件下で）反応させることにより、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む組成物を生成するステップを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式ＸＶＩＩＩの構造を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、本方法は、式ＸＸＩ：
【００６５】
【化２６】
2017524357.tif 000028
の化合物から式ＸＩＸの化合物を生成するステップを含む。
【００６６】
本発明の様々な実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
以上及びその他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に図示される通り、本発明の具体的な実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。尚、図面中、類似の参照符号は、様々な図面全体を通して同じ部分を指す。図面は、必ずしも一定の縮尺に従っているわけではなく、本発明の様々な実施形態の原理を説明することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ポリヌクレオチド構築物の概略図である。図１Ａは、２０１３年３月９日に出願された共同所有の同時係属米国特許出願第１３／７９１，９２２号明細書（その内容は、参照により本明細書に組み込む）に教示されるポリヌクレオチド構築物の概略図である。図１Ｂは、線状ポリヌクレオチドの概略図である。
【図２】本発明の一連のキメラポリヌクレオチドの概略図である。
【図３】位置修飾の様々なパターンを例示し、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの領域に類似する領域を示す一連のキメラポリヌクレオチドの概略図である。
【図４】式Ｉに基づく位置修飾の様々なパターンを例示する一連のキメラポリヌクレオチドの概略図である。
【図５】式Ｉに基づく位置修飾の様々なパターンを例示し、さらに、遮断又は構造化３’末端を示す一連のキメラポリヌクレオチドの概略図である。
【図６】本発明の環状構築物の概略図である。
【図７】本発明の環状構築物の概略図である。
【図８】少なくとも１つのスペーサ領域を含む本発明の環状一次構築物の概略図である。
【図９】少なくとも１つのセンサー領域を含む本発明の環状一次構築物の概略図である。
【図１０】少なくとも１つのセンサー領域と１つのスペーサ領域を含む本発明の環状一次構築物の概略図である。
【図１１】本発明の非コード環状一次構築物の概略図である。
【図１２】本発明の非コード環状一次構築物の概略図である。
【図１３】３’−アジドｄｄＡＴＰ組み込み前及び後のＲＮＡ１〜３のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）生成ゲルを示すイメージである。レーン１は、ラダー、レーン２は、ＲＮＡ１、レーン３は、３’−アジドｄｄＡＴＰ組み込み後のＲＮＡ１、レーン４は、ＲＮＡ２、レーン５は、３’−アジドｄｄＡＴＰ組み込み後のＲＮＡ２、レーン６は、ＲＮＡ３、レーン７は、３’−アジドｄｄＡＴＰ組み込み後のＲＮＡ３である。
【図１４】ＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートの形成のＣＥ生成ゲルを示すイメージである。レーン１は、ラダー、レーン２は、３’−アジドｄｄＡＴＰ組み込み後のＲＮＡ１、レーン３は、テイル１との反応後の３’−アジドＲＮＡ１、レーン４は、３’−アジドｄｄＡＴＰ組み込み後のＲＮＡ２、レーン５は、テイル１との反応後の３’−アジドＲＮＡ２、レーン６は、３’−アジドｄｄＡＴＰ組み込み後のＲＮＡ３、並びにレーン７は、テイル１との反応後の３’−アジドＲＮＡ３である。レーン２、４、及び６のＲＮＡは、非修飾及び３’−アジドＲＮＡの混合物である。レーン３、５、及び７において、最短から最長へと移る３つの明瞭なバンドは、非反応テイル１、非修飾ＲＮＡと非反応３’−アジドＲＮＡとの推定混合物、及びＲＮＡ−テイル１コンジュゲートである。
【図１５】ＲＮＡ−テイル１コンジュゲートを賦与するＲＮＡ１及びテイル１のＤＮＡスプリント鋳型共役、続くオリゴ（Ｔ）ダイナビーズによる精製のＣＥ生成ゲルを示すイメージである。レーン１は、ラダー、レーン２は、非修飾ＲＮＡ１、レーン３は、限外濾過による脱塩後のＤＮＡスプリント鋳型反応混合物、レーン４は、ＤＮａｓｅでの消化後の反応混合物、レーン５は、オリゴ（Ｔ）ダイナビーズに結合しなかった反応混合物、レーン６は、オリゴ（Ｔ）ダイナビーズからの溶離後の精製済ＲＮＡ−テイル１コンジュゲートである。
【図１６】オリゴ（Ｔ）ダイナビーズにより精製されたテイル１〜６を含むＲＮＡ−テイル１コンジュゲートのＣＥ生成ゲルを示すイメージである。レーン１は、ラダー、レーン２は、３’−アジドＲＮＡ１、レーン３は、ＲＮＡ１−テイル１コンジュゲート、レーン４は、ＲＮＡ１−テイル４コンジュゲート、レーン５は、ＲＮＡ１−テイル２コンジュゲート、レーン６は、ＲＮＡ１−テイル５コンジュゲート、レーン７は、ＲＮＡ−テイル３コンジュゲート、レーン８は、ＲＮＡ１−テイル６コンジュゲート、レーン９は、３’−アジドＲＮＡ２、レーン１０は、ＲＮＡ２−テイル１コンジュゲート、レーン１１は、ＲＮＡ２−テイル４コンジュゲート、レーン１２は、３’−アジドＲＮＡ３、レーン１３は、ＲＮＡ３−テイル１コンジュゲート、レーン１４は、ＲＮＡ３−テイル４コンジュゲートである。
【図１７】キャップ付加ＴＰオリゴ１及び２のＰＡＧＥ分析を示すイメージである。レーン１は、ＴＰオリゴ１、レーン２は、キャップ付加ＴＰオリゴ１、レーン３は、ＴＰオリゴ２、レーン４は、キャップ付加ＴＰオリゴ２である。
【図１８】キャップオリゴ−ＲＮＡ５コンジュゲートのＣＥ分析を示すイメージである。レーン１は、ラダー、レーン２は、５’−アジドＲＮＡ５、レーン３は、非キャップ付加ＴＰオリゴ１−ＲＮＡ５コンジュゲート、レーン４は、キャップ付加ＴＰオリゴ１−ＲＮＡ５コンジュゲート、レーン５は、非キャップ付加ＴＰオリゴ２−ＲＮＡ５コンジュゲート、レーン６は、キャップ付加ＴＰオリゴ１−ＲＮＡ５コンジュゲートである。レーン７〜１１は、５’−ＢＣＮテイルとのＳＰＡＡＣ反応後の前述のサンプルである。
【図１９】３’−アジドＲＮＡ３のＳＰＡＡＣ反応後のＲＮＡとポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）処理前及び後のテイル１の混合物のＣＥ電気泳動図を示すイメージである。この例では、３’−アジドｄｄＡＴＰ組み込みは、４６％であると算出された。
【図２０】ポリ（Ａ）ポリメラーゼでのＳＰＡＡＣ反応物の処理によるＲＮＡ１〜３への３’−アジドｄｄＡＴＰのＣＥ生成ゲルを示すイメージである。レーン１は、ラダーである。レーン２及び３は、それぞれ、ＰＡＰでの処理前及び後のテイル１を含む非修飾ＲＮＡ１である。レーン４及び５は、それぞれＰＡＰでの処理前及び後のテイル１を含む３’−アジドＲＮＡ１である。レーン６〜９及びレーン１０〜１３は、それぞれ、ＲＮＡ２及びＲＮＡ３との同じ反応物である。文字は、各レーンのＲＮＡの一般名称を示し、ａは、非処理テイル１に、ｂは、非共役ＲＮＡに、ｃは、ＲＮＡ−テイル１コンジュゲートに、また、ｄは、ＰＡＰでの反応により付加されたポリ（Ａ）テイルを有するＲＮＡに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
治療薬、診断薬、試薬の分野で、並びに生物学的アッセイにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｅｘ  ｖｉｖｏのいずれにかかわらず、細胞内で核酸、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）を設計、合成、及び送達を可能にすること、例えば、細胞、組織若しくは臓器、最終的に生物にとって有益な生理学的帰結をもたらすことは非常に重要である。１つの有益な帰結は、核酸の細胞内翻訳及びコードされた目的のポリペプチドの産生を引き起こすことである。同様に、非コードＲＮＡが、多くの研究の焦点となっており；非コードポリヌクレオチドは、単独で、及びコードポリヌクレオチドと併せて使用すると、治療シナリオに有益な帰結をもたらすことができる。
【００６９】
本明細書には、ポリヌクレオチド、特にキメラポリヌクレオチドの設計、調製、製造及び／又は製剤化のための組成物（医薬組成物を含む）及び方法が記載される。
また、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドの選択、設計及び／又は使用のためのシステム、プロセス、デバイス及びキットも提供される。
【００７０】
本発明によれば、当技術分野の他の分子の欠損を回避するように、キメラポリヌクレオチドを修飾するのが好ましい。
ヒトの疾患、抗体、ウイルス、獣医学適用、並びに多様なｉｎ  ｖｉｖｏでの状況における、ポリペプチドをコードする修飾ポリヌクレオチド（すなわち、修飾ｍＲＮＡ）の使用は、本発明者らにより研究されており、これらの研究は、例えば、以下の文献に開示されている：国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、同第２０１３１５１６６８号パンフレット、同第２０１３１５１６６３号パンフレット、同第２０１３１５１６６９号パンフレット、同第２０１３１５１６７０号パンフレット、同第２０１３１５１６６４号パンフレット、同第２０１３１５１６６５号パンフレット、同第２０１３１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレットの表６及び７；国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレットの表６、１７８及び１７９；国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレットの表６、１８５及び１８６（これら各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。上記のいずれも、キメラポリヌクレオチドとして合成することができ、こうした実施形態は、本発明によって考慮される。
【００７１】
従って、本明細書には、キメラポリヌクレオチドが提供され、これらは、そのキメラ性のために、以下：組織中での安定性及び／若しくはクリアランス、受容体取り込み及び／若しくは動態、細胞接触、翻訳機構との関与、ｍＲＮＡ半減期、翻訳効率、免疫回避、免
疫誘導（例えば、ワクチンの場合）、タンパク質産生能力、分泌効率（該当する場合）、循環への進入可能性、タンパク質半減期並びに／又は細胞の状態、機能及び／若しくは活性の調節のうちの１つ又は複数を改善するように設計されている。
【００７２】
Ｉ．本発明の組成物
本発明は、キメラであり、一部の実施形態では、１つ又は複数の目的のポリペプチドをコードする核酸分子、具体的には、ポリヌクレオチドを提供する。用語「核酸」は、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと称される。
【００７３】
本発明の例示的核酸又はポリヌクレオチドとして、限定はしないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキシル核酸（ＣｅＮＡ）、又はこれらのハイブリッド若しくは組み合わせが挙げられる。
【００７４】
好ましい実施形態では、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で使用されるとき、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、目的のポリペプチドをコードし、且つ翻訳されてｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｅｘ  ｖｉｖｏで、コードされた目的のポリペプチドを産生することができる任意のポリヌクレオチドを指す。
【００７５】
伝統的に、ｍＲＮＡ分子の基本構成要素には、少なくともコード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡテイルが含まれる。図１は、本発明の代表的なポリヌクレオチド１００を示し、これは、ポリペプチドをコードする本発明のキメラポリヌクレオチドを設計するための出発、親又はスカフォールド分子として役立ち得る。
【００７６】
図１Ａ及びＢを参照すると、ここでポリヌクレオチド１００は、第１の連結ヌクレオチド領域１０２を含み、これは、第１のフランキング領域１０４及び第２のフランキング領域１０６によってフランキングされている。このポリヌクレオチドは、その５’末端で、シグナル領域１０３の１つ又は複数のシグナル配列をコードし得る。フランキング領域１０４は、１つ又は複数の完全若しくは不完全な５’ＵＴＲ配列（完全にコドン最適化されていても、又は部分的にコドン最適化されていてもよい）を含む連結ヌクレオシド領域を含んでもよい。フランキング領域１０４は、限定はしないが、ｍｉＲ配列、テルザック（ＴＥＲＺＡＫ）（商標）配列及び翻訳制御配列などの少なくとも１つの核酸配列を含んでもよい。フランキング領域１０４はまた、５’末端キャップ１０８を含んでもよい。５’末端キャップ領域１０８は、天然に存在するキャップ、合成キャップ又は最適化キャップなどのキャップを含んでもよい。最適化キャップの非制限的例として、ローズ（Ｒｈｏａｄｓ）により、米国特許第７０７４５９６号明細書並びに国際公開第２００８１５７６６８号パンフレット、同第２００９１４９２５３号パンフレット及び同第２０１３１０３６５９号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されているキャップが挙げられる。第２のフランキング領域１０６は、１つ又は複数の完全若しくは不完全な３’ＵＴＲ配列を含む連結ヌクレオシド領域を含んでもよい。第２のフランキング領域１０６は、完全にコドン最適化されていても、又は一部がコドン最適化されていてもよい。フランキング領域１０６は、限定はしないが、ｍｉＲ配列及び翻訳制御配列などの少なくとも１つの核酸配列を含んでもよい。フランキング領域１０６はまた、３’テイル付加配列１１０を含んでもよい。３’テイル付加配列１１０は、合成テイル付加領域１１２及び／又は鎖終結ヌクレオシド１１４を含み得る。合成テイル付
加領域の非制限的例として、ポリＡ配列、ポリＣ配列、ポリＡ−Ｇカルテットが挙げられる。鎖終結ヌクレオシドの非制限的例として、２’−Ｏメチル、Ｆ及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。
【００７７】
第１領域１０２の５’末端と第１フランキング領域１０４とを架橋するのが、第１の作動領域１０５である。伝統的に、この作動領域は、開始コドンを含む。あるいは、作動領域は、開始コドンなどの任意の翻訳開始配列又はシグナルを含んでもよい。
【００７８】
第１領域１０２の３’末端と第２フランキング領域１０６とを架橋するのは、第２の作動領域１０７である。伝統的に、この作動領域は、終止コドンを含む。あるいは、作動領域は、終止コドンなどの任意の翻訳開始配列又はシグナルを含んでもよい。本発明によれば、複数の連続した終止コドンを用いてもよい。
【００７９】
野生型モジュール構造に基づいて、本発明は、モジュール構成を維持しながらも、ポリヌクレオチドに有用な特性を付与する１つ又は複数の構造及び／若しくは化学修飾又は改変を含むキメラポリヌクレオチド又はＲＮＡ構築物を提供することにより、当技術分野における従来のｍＲＮＡ分子並びにＩＶＴにより産生されたｍＲＮＡの機能性の範囲を広げる。従って、本発明のｍＲＮＡ分子であるキメラポリヌクレオチドは、「キメラ修飾ｍＲＮＡ」又は「キメラｍＲＮＡ」と呼ばれる。
【００８０】
キメラポリヌクレオチドのアーキテクチャ
本発明の「キメラ」は、２つ以上の不調和な若しくは異質の部分又は領域を有する実体である。本明細書で使用されるとき、「キメラポリヌクレオチド」又は「キメラポリヌクレオチド」は、サイズ及び／又は化学修飾パターン、化学修飾位置、化学修飾率（％）若しくは化学修飾集団並びにこれらの組み合わせが異なる部分又は領域を有する核酸ポリマーである。本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドの「部分」又は「領域」は、ポリヌクレオチドの完全長より短いポリヌクレオチドの任意の部分として定義される。
【００８１】
キメラポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡとして機能し、且つ目的のポリペプチドをコードする部分又は領域の例として、限定はしないが、非翻訳領域（ＵＴＲ、例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）、コード領域、キャップ領域、ポリＡテイル領域、出発領域、終止領域、シグナル配列領域、及びこれらの組み合わせが挙げられる。図２は、ｍＲＮＡとして使用することができる本発明の特定のキメラポリヌクレオチドを示す。図３は、一連のキメラポリヌクレオチドの概略図を示し、位置修飾の様々なパターンを特定すると共に、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのそれらの領域に類似する領域を示す。他の領域をつなぎ合わせるか、又はそれらの間にある領域若しくは部分もまた、サブ領域を有するように設計することもできる。それらは、図に示す。
【００８２】
一部の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、式Ｉ：
５’［Ａｎ］Ｘ−Ｌ１−［Ｂｏ］ｙ−Ｌ２−［Ｃｐ］ｚ−Ｌ３  ３’
式Ｉ
を含む構造を有し、
式中、
Ａ及びＢの各々は、独立に、連結ヌクレオシド領域を含み；
Ｃは、連結ヌクレオシドの任意選択の領域であり；
領域Ａ、Ｂ若しくはＣの少なくとも１つは、位置的に修飾されており、位置的に修飾された領域は、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、又はウリジンの１つ又は複数の同じヌクレオシドタイプの少なくとも２つの化学修飾されたヌクレオシドを含み、同じタイプのヌクレオシドの化学修飾の少なくとも２つが、異なる化学修飾であり；
ｎ、ｏ及びｐは、独立に、１５〜１０００の整数であり；
ｘ及びｙは、独立に、１〜２０であり；
ｚは、０〜５であり；
Ｌ１及びＬ２は、独立に、任意選択のリンカー部分であり、リンカー部分は、核酸ベース若しくは非核酸ベースのいずれかであり；
Ｌ３は、任意選択のコンジュゲート又は任意選択のリンカー部分であり、リンカー部分は、核酸ベース若しくは非核酸ベースのいずれかである。
【００８３】
一部の実施形態では、式Ｉのキメラポリヌクレオチドは、１つ又は複数の目的のペプチド又はポリペプチドをコードする。このようなコードされた分子は、２つ以上の領域にわたってコードされてもよい。
【００８４】
図４及び図５は、式Ｉに基づく位置修飾の様々なパターン、並びにブロック化又は構造化された３’末端を有するものを示す一連のキメラポリヌクレオチドの概略図を提供する。
【００８５】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分又は領域を含め、ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）、ウィングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）、又はブロックマー（ｂｌｏｃｋｍｅｒ）に分類され得る。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「ヘミマー」は、あるパターン、割合（％）、位置若しくは集団の化学修飾の半分と、第２のパターン、割合（％）、位置若しくは集団の化学修飾の半分とを含む領域又は部分を含むキメラポリヌクレオチドである。本発明のキメラポリヌクレオチドはまた、ヘミマーサブ領域も含み得る。一実施形態では、部分又は領域は、５０％の一方と５０％の他方である。
【００８７】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチド全体が、５０％の一方と５０％の他方であってもよい。本発明の任意のキメラポリヌクレオチドの任意の領域又は部分は、ヘミマーであってもよい。ヘミマーのタイプには、パターンヘミマー、集団ヘミマー又は位置ヘミマーが含まれる。定義上、ヘミマーは、５０：５０パーセントヘミマーである。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「ギャップマー」は、少なくとも３つの部分又は領域を有し、それらの部分又は領域の間にギャップを含むキメラポリヌクレオチドである。「ギャップ」は、それにフランキングする２つの部分又は領域のキメラの性質とは異なる連結ヌクレオシド領域又は単一のヌクレオシドを含み得る。ギャップマーの２つの部分又は領域は、互いに同じであっても、又は異なってもよい。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、「ウィングマー」は、少なくとも３つの部分又は領域を有し、それらの部分又は領域の間にギャップを含むキメラポリヌクレオチドである。ギャップマーと異なり、ウィングマーでは、ギャップを取り囲む２つのフランキング部分又は領域が同じ程度又は種類である。このような類似性は、種々の修飾の単位数の長さ又は修飾数に関するものであってよい。ウィングマーのウィングは、ギャップより長くても、又は短くてもよい。ウィング部分又は領域は、ギャップを含む領域と比べて長さが２０、３０、４０、５０、６０  ７０、８０、９０若しくは９５％長くても、又は短くてもよい。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「ブロックマー」は、部分又は領域が同等のサイズ若しくは数及びタイプの修飾である、パターン化したポリヌクレオチドである。ブロックマー内の領域又はサブ領域は、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１  ６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９
、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０又は５００ヌクレオシド長であってよい。
【００９１】
化学修飾パターンを有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分又は領域を含め、「パターンキメラ」と称される。パターンキメラはまた、ブロックマーと呼ばれることもある。パターンキメラは、領域又は部分の範囲内に、それらにわたって又はそれらの間に修飾パターンを有するポリヌクレオチドである。
【００９２】
部分又は領域の範囲内の修飾パターンは、画定された領域内で開始し、終止する。部分又は領域にわたる修飾パターンは、ある部分又は領域で開始し、別の隣接する部分又は領域で終止するパターンである。部分又は領域間での修飾パターンは、ある部分又は領域内で開始及び終止し、必ずしもその第１の領域又は部分に隣接しているとは限らない異なる部分又は領域内で繰り返されるものである。
【００９３】
パターンキメラ又はブロックマーの領域若しくはサブ領域は、ＡＢＡＢ［ＡＢ］ｎ（各「Ａ」及び各「Ｂ」は、異なる化学修飾（塩基、糖又は主鎖リンカーの少なくとも１つにおける）、異なるタイプの化学修飾（例えば、天然に存在する、及び天然に存在しない）、異なる割合（％）の修飾又は異なる集団の修飾を表す）などの単純な交互のパターンを有してもよい。パターンは、ｎ回（ｎ＝３〜３００）繰り返され得る。さらに、各Ａ又はＢが、パターン中の１〜２５００単位（例えば、ヌクレオシド）を表し得る。パターンはまた、ＡＡＢＢＡＡＢＢ［ＡＡＢＢ］ｎ（交互の２個組）又はＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ［ＡＡＡＢＢＢ］ｎ（交互の３個組）パターンなどの交互の複数個組であってもよい。パターンは、ｎ回（ｎ＝３〜３００）繰り返され得る。
【００９４】
また異なるパターンが一緒に混合されて、二次パターンを形成してもよい。例えば、単一の交互パターンが３個組の交互パターンと組み合わされて、二次交互パターンＡ’Ｂ’を形成し得る。一例を挙げると、［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］［ＡＢＡＢＡＢ］［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］（［ＡＢＡＢＡＢ］はＡ’であり、［ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ］はＢ’である）とな
る。同様に、これらのパターンは、ｎ回（ｎ＝３〜３００）繰り返され得る。
【００９５】
パターンは３個又はそれ以上の異なる修飾を含み、ＡＢＣＡＢＣ［ＡＢＣ］ｎパターンを形成し得る。これらの３成分パターンもまた、ＡＡＢＢＣＣＡＡＢＢＣＣ［ＡＡＢＢＣＣ］ｎなど複数個組であってもよいし、ＡＢＣＡＢＣＡＡＢＢＣＣＡＢＣＡＢＣＡＡＢＢＣＣなど他のパターンとの組み合わせとして設計されてもよく、さらには、より高次のパターンであってもよい。
【００９６】
位置、割合（％）、及び集団修飾の領域又はサブ領域が、各修飾タイプからの等しい寄与を反映する必要はない。それらは「１−２−３−４」、「１−２−４−８」（各整数は特定の修飾タイプの単位数を表す）などの系列を形成し得る。あるいは、それらは、「１−３−３−１−３−１−５」など奇数個のみであっても、又は偶数個のみの「２−４−２−４−６−４−８」であっても、あるいは「１−３−４−２−５−７−３−３−４」など奇数個の単位数と偶数個の単位数との混合であってもよい。
【００９７】
パターンキメラは、その化学修飾の点で程度（上記に記載されるものなど）又は種類（例えば、異なる修飾）が異なっていてもよい。
同じヌクレオシドタイプ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ）の２つ以上のヌクレオシドメンバーの２つ以上の異なる化学修飾を含む少なくとも１つの領域を有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分又は領域を含め、「位置的に修飾された」キメラと称される。位置的に修飾されたキメラは、本明細書では、「選択的配置」キメラ又は「選択的配置ポリヌクレオチド」とも称される。その名称が示す通り、選択的配置とは、任意のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はＵに対する修飾が合成方法に起因して同じである当技術分野のポリヌクレオチドとは異なり、ポリヌクレオチド又はその領域内の個々のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はＵに異なる修飾を有し得るポリヌクレオチドの設計を指す。例えば、位置的に修飾されたキメラポリヌクレオチドでは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵのヌクレオシドタイプのいずれかに対して２つ以上の異なる化学修飾があり得る。また、同じヌクレオシドタイプの任意の２つ以上に対する２つ以上の組み合わせもあり得る。例えば、位置的に修飾されている又は選択的配置のキメラポリヌクレオチドは、分子中のアデニンの集団に対して３つの異なる修飾を含むことができ、また、構築物中のシトシンの集団に対しても３つの異なる修飾を有し得る−これらは全て、ユニークで非ランダムな配置を有し得る。
【００９８】
化学修飾パーセントを有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分又は領域を含め、「パーセントキメラ」と称される。パーセントキメラは、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の位置、パターン又は集団修飾を含む領域若しくは部分を有し得る。あるいは、パーセントキメラは、修飾位置、パターン、又は集団に関して完全に修飾されていてもよい。パーセントキメラの修飾のパーセントは、天然に存在する修飾と天然に存在しない修飾とに分けることができる。
【００９９】
化学修飾集団を有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、その部分又は領域を含め、「集団キメラ」と称される。集団キメラは、ヌクレオシド（その塩基、糖又は主鎖連結、又はそれらの組み合わせ）が選択修飾集団を有する領域又は部分を含み得る。こうした修飾は、表現型の帰結を誘導、改変又は調節する修飾などの機能的集団から選択され得る。例えば、機能的集団は、サイトカインのレベルを増加させる化学修飾の集団又は選択であってもよい。他の機能的集団は、個々に、又は集合的に、１つ以上のサイトカインのレベルを低下させるように機能し得る。従って、キメラポリヌクレオチドにおいてこれらの同様の機能的修飾の選択を用いれば、「機能的集団キメラ」を構成し得る。本明細書で使用
されるとき、「機能的集団キメラ」とは、そのユニークな機能的特徴が、上記に記載した通りの修飾の集団によって定義されるものであってもよく、又はこの用語は、キメラポリヌクレオチドそれ自体の全体的な機能に適用することもできる。例えば、全体としてキメラポリヌクレオチドが、非修飾若しくは非キメラポリヌクレオチドと比較して、異なる、又はより優れた形で機能し得る。
【０１００】
同じヌクレオシドタイプのいずれかの全ての均一な化学修飾を有するか、又は同じヌクレオシドタイプのいずれかの全てにおいて、若しくは同じヌクレオシドタイプのいずれか全ての一定パーセントにおいて、しかしランダムな組み込みで、同じ出発修飾の単なる漸減（ｄｏｗｎｗａｒｄ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって生じる修飾の集団を有するポリヌクレオチド、例えば、全てのウリジンがウリジン類似体、例えばプソイドウリジンにより置換される場合などは、キメラとみなされないことに留意すべきである。同様に、ポリヌクレオチド全体にわたり同じヌクレオシドタイプの２つ、３つ、又は４つの均一な化学修飾を有する（全てのウリジン及び全てのシトシン等が同じように修飾されているなどの）ポリヌクレオチドも、キメラポリヌクレオチドとはみなされない。キメラでないポリヌクレオチドの一例は、先行技術の標準プソイドウリジン／５−メチルシトシン修飾ポリヌクレオチドである。これらの先行技術のポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）酵素合成によって完全に取得され；また、合成酵素の制約上、ポリヌクレオチドに見出される同じヌクレオシドタイプ、すなわち、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）又はウリジン（Ｕ）の各々の存在毎に１種類の修飾のみを含む。
【０１０１】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、構造的に修飾されても、又は化学的に修飾されてもよい。本明細書で使用されるとき、「構造的」修飾は、ヌクレオチドそれ自体に対する顕著な化学修飾なしに、キメラポリヌクレオチドにおいて２つ以上の連結ヌクレオシドが挿入され、欠失し、重複し、反転又はランダム化されるものである。構造的修飾が生じるには、必然的に化学結合が破壊され、再編成されることになるため、構造的修飾は化学的性質を帯びることから、化学修飾である。しかしながら、構造的修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらすことになる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、化学的に修飾されて「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」になり得る。同じポリヌクレオチドが、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」へと構造的に修飾され得る。ここでは、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、これによりポリヌクレオチドの構造的修飾がもたらされる。
【０１０２】
本発明の一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、２つ以上のタンパク質又はペプチドをコードし得る。こうしたタンパク質又はペプチドは、抗体の重鎖及び軽鎖、酵素及びその基質、標識及びその結合分子、二次メッセンジャー及びその酵素又は多量体タンパク質若しくは複合体の成分を含む。
【０１０３】
本発明のキメラポリヌクレオチドの領域又は部分は、リンカー又はスペーサ部分によって分離され得る。こうしたリンカー又はスペーサは、核酸ベースであっても、又は非ヌクレオシドであってもよい。
【０１０４】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、自己開裂ペプチドをコードする配列を含んでもよい。自己開裂ペプチドは、限定はしないが、２Ａペプチドであってもよい。非制限的例として、２Ａペプチドは、タンパク質配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１）、その断片又は変異体を有し得る。一実施形態では、２Ａペプチドは、最後のグリシンと最後のプロリンとの間で開裂する。別の非制限的例として、本発明のキメラポリヌクレオチドは、タンパク質配列ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１）、その断片又は変異体を有する２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０５】
２Ａペプチドをコードするこうしたポリヌクレオチド配列の１つは、ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ（配列番号２）である。ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載する方法及び／又は当技術分野において公知の方法によって修飾され、又はコドン最適化されてもよい。
【０１０６】
一実施形態では、この配列を用いて、２つ以上の目的ポリペプチドのコード領域を分離することもできる。非制限的例として、２Ａペプチドをコードする配列は、第１のコード領域Ａと第２のコード領域Ｂとの間にあってもよい（Ａ−２Ａｐｅｐ−Ｂ）。２Ａペプチドの存在により、１つの長いタンパク質が開裂してタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ及び２Ａペプチドになり得る。タンパク質Ａとタンパク質Ｂは、同じ又は異なる目的ポリペプチドであってよい。別の実施形態では、２Ａペプチドを本発明のキメラポリヌクレオチドに用いて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のタンパク質を産生させることができる。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【０１０８】
【化２７】
2017524357.tif 000029
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり、ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆが０であるとき、Ｒ４は、結合ではなく；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、１つのヌクレオシドの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］（例えば、［Ａｎ］のヌクレオシドの糖の３’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの糖の５’位、又は［Ａｎ］のヌクレオシドの糖の５’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの糖の３’位）に結合する。
【０１０９】
他の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、式ＩＩ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式ＩＩ
を含む配列を有し、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【０１１０】
【化２８】
2017524357.tif 000030
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、又は（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃを（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆに連結する結合であり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｌ１は、１つのヌクレオシドの糖で［Ａｎ］及び［Ｂｏ］（例えば、［Ａｎ］のヌクレオシドの糖の３’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの糖の５’位、又は［Ａｎ］のヌクレオシドの糖の５’位及び［Ｂｏ］のヌクレオシドの糖の３’位）に結合し；
ここで、［Ａｎ］及び［Ｂｏ］の少なくとも１つは、式ＩＶ又は式ＸＶＩＩ：
【０１１１】
【化２９】
2017524357.tif 000031
の構造を含み、
式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
各Ｘ２は、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；並びに
各Ｘ３は、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
ここで、式ＩＶについて、Ｘ１、Ｘ２、若しくはＸ４の少なくとも１つは、ＮＨ又はＳである。
【０１１２】
例えば、一部の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、以下：
【０１１３】
【化３０−１】
2017524357.tif 000032
【０１１４】
【化３０−２】
2017524357.tif 000033
の構造を含み、
式中、Ｒ２５は、非存在であるか、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンである。
【０１１５】
一部の実施形態では、糖の２’位のヒドロキシルの存在によって、リボソーム認識の増大が可能になる。
本発明のキメラポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルの１つは、［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］を含む。
【０１１６】
本発明のキメラポリヌクレオチドの他の実施形態では、コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルの１つが、［Ａｎ］を含み、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ構造、又はポリ−Ａ−テイルのもう１つが、［Ｂｏ］を含む。例えば、一部の実施形態では、ポリＡテイルが、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］の一方を含み、３’ＵＴＲが他方を含む。他の実施形態では、５’キャップ構造が、［Ａｎ］又は［Ｂｏ］の一方を含み、５’ＵＴＲが他方を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む。
前述に関わらず、本発明のキメラポリヌクレオチドは、位置的に修飾されないか、又は本明細書に定義するキメラではない領域若しくは部分を含み得る。
【０１１８】
例えば、キメラポリヌクレオチドの領域又は部分は、１つ又は複数のＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、若しくはＵで均一に修飾されてもよいが、本発明によれば、ポリヌクレオチドが全領域又は部分にわたって均一に修飾されることはない。
【０１１９】
キメラポリヌクレオチドの領域又は部分は、１５〜１０００ヌクレオシド長さであってもよく、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する通りの２〜１００個の異なる領域又は領域のパターンを有し得る。
【０１２０】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、１つ又は複数の目的のポリペプチドをコードする。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、実質的に非コードである。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、コード及び非コードの両方の領域及び部分を有する。
【０１２１】
図２は、図１のポリヌクレオチドのスカフォールドに基づいたときの本発明の特定のキメラポリヌクレオチドの設計を示す。この図には、キメラポリヌクレオチドの領域又は部分が示され、ここで模様付きの領域は、位置的に修飾されている領域を表し、白抜きの領域は、修飾されていることも又は修飾されていないこともあるが、修飾されている場合には均一に修飾されている領域を示す。本発明のキメラポリヌクレオチドは、完全に位置修飾されていてもよいし、又は部分的に位置修飾されていてもよい。キメラポリヌクレオチドはまた、サブ領域も有し得るが、これらは、任意のパターン又は設計であってよい。この図には、キメラサブ領域及びヘミマーサブ領域が示されている。
【０１２２】
一実施形態では、ペプチドをコードする本発明のキメラポリヌクレオチドの領域のうち最も短い長さは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、又はデカペプチドをコードするのに十分な長さであり得る。別の実施形態では、この長さは、２〜３０アミノ酸、例えば、５〜３０、１０〜３０、２〜２５、５〜２５、１０〜２５、又は１０〜２０アミノ酸のペプチドをコードするのに十分であってもよい。この長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５又は３０アミノ酸のペプチド、又は４０アミノ酸以下、例えば、３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１又は１０アミノ酸以下のペプチドをコードするのに十分であってもよい。ポリヌクレオチド配列がコードすることのできるジペプチドの例として、限定はしないが、カルノシン及びアンセリンが挙げられる。
【０１２３】
一実施形態では、本発明の目的のポリペプチドをコードする領域の長さは、約３０ヌクレオチド長より長い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００以上、又は１００，０００ヌクレオチド以下）。本明細書で使用されるとき、こうした領域は「コード領域」又は「領域コーディング」と呼ばれることがある。
【０１２４】
一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、約３０〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３
，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、及び２，０００〜１００，０００）を含む。
【０１２５】
本発明によれば、キメラポリヌクレオチドの領域又はサブ領域はまた、独立に、１５〜１，０００ヌクレオチド長の範囲（例えば、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、及び９００ヌクレオチド超、又は少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、及び１，０００ヌクレオチド）であってよい。
【０１２６】
本発明によれば、キメラポリヌクレオチドの領域又はサブ領域は、非存在から５００ヌクレオチド長の範囲（例えば、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００ヌクレオチド）であってもよい。領域がポリＡテイルである場合、長さは、ポリＡ結合タンパク質の結合の単位で、又はその関数として決定され得る。この実施形態では、ポリＡテイルは、ポリＡ結合タンパク質の少なくとも４個のモノマーと結合するのに十分な長さである。ポリＡ結合タンパク質モノマーは、約３８ヌクレオチドの区間に結合する。このように、約８０ヌクレオチド及び１６０ヌクレオチドのポリＡテイルが機能性であることが認められている。ｍＲＮＡとして機能する本発明のキメラポリヌクレオチドは、ポリＡテイルを含まなくてもよい。
【０１２７】
本発明によれば、ｍＲＮＡとして機能するキメラポリヌクレオチドは、キャッピング領域を有し得る。キャッピング領域は、単一のキャップ、又はキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態では、キャッピング領域は、１〜１０、例えば、２〜９、３〜８、４〜７、１〜５、５〜１０、若しくは少なくとも２、又は１０以下のヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、キャップは存在しない。
【０１２８】
環状キメラポリヌクレオチドのアーキテクチャ
本発明は、環状又は環式のキメラポリヌクレオチドを考慮する。その名称が示すように、環状ポリヌクレオチドは本質的に環状であり、つまり、連結、共有結合、同じタンパク質又は他の分子若しくは複合体との共通の会合によるか、あるいは、ハイブリダイゼーションによるかに関わらず、末端が何らかの方法で結合されていることを意味する。例えば、同時係属国際公開第２０１５０３４９２５号パンフレット（この内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示される通りの任意の環状ポリヌクレオチドは、本発明に従って、キメラにすることができる。
【０１２９】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、図６〜図１２に示す環状ＲＮＡ構築物スカフォー
ルドに従って設計することができる。こうしたポリヌクレオチドは、環状キメラポリヌクレオチド又は環状構築物である。
【０１３０】
本明細書で使用されるとき、「環状ポリヌクレオチド」又は「ｃｉｒｃＰ」は、実質的にＲＮＡのように作用し、且つＲＮＡの特性を有する一本鎖環状ポリヌクレオチドを意味する。用語「環状」はまた、ｃｉｒｃＰの二次又は三次構造を包含することも意図される。
【０１３１】
少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする本発明のｃｉｒｃＰは、環状ＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡとして知られている。本明細書で使用されるとき、「環状ＲＮＡ」又は「ｃｉｒｃＲＮＡ」は、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードすることができる環状ポリヌクレオチドを意味する。少なくとも１つのセンサー配列を含み、且つ目的ポリペプチドをコードしない本発明のｃｉｒｃＰは、環状スポンジ又はｃｉｒｃＳＰとして知られる。本明細書で使用されるとき、「環状スポンジ」、「環状ポリヌクレオチドスポンジ」又は「ｃｉｒｃＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列を含み、且つ目的ポリペプチドをコードしない環状ポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるとき、「センサー配列」は、内因性核酸結合分子の受容体又は擬似受容体を意味する。センサー配列の非制限的例としては、マイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡシード配列、シード配列のないマイクロＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位、及び擬似受容体として作用するように操作された人工結合部位並びにこれらの一部分及び断片が挙げられる。
【０１３２】
少なくとも１つのセンサー配列を含み、且つ少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする本発明のｃｉｒｃＰは、環状ＲＮＡスポンジ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰとして知られる。本明細書で使用されるとき、「環状ＲＮＡスポンジ」又は「ｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ」は、少なくとも１つのセンサー配列と、少なくとも１つの目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つの領域とを含む環状ポリヌクレオチドを意味する。
【０１３３】
図６は、本発明の代表的な環状構築物２００を示す。本明細書で使用されるとき、用語「環状構築物」は、ＲＮＡ分子と実質的に同様に作用し、且つその特性を有し得る環状ポリヌクレオチド転写物を指す。一実施形態では、環状構築物は、ｍＲＮＡとして作用する。環状構築物が、１つ又は複数の目的のポリペプチドをコードする場合（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰ）、ポリヌクレオチド転写物は、そこでコードされる目的のポリペプチドの翻訳を可能にするのに十分な構造的及び／又は化学的特徴を保持している。環状構築物は、本発明のポリヌクレオチドであってもよい。構造的又は化学的に修飾されているとき、構築物は、修飾ｃｉｒｃＰ、ｃｉｒｃＳＰ、ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡ−ＳＰと呼ばれることもある。
【０１３４】
図６に戻ると、ここで環状コンストラクト２００は、第１のフランキング領域２０４と第２のフランキング領域２０６とがフランキングする第１の連結ヌクレオチド領域２０２を含む。本明細書で使用されるとき、「第１の領域」は、「コード領域」、「非コード領域」又は「領域コーディング」又は単に「第１領域」と呼ばれることもある。一実施形態では、この第１の領域は、限定はしないが、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド及び／又はセンサー領域をコードするか、若しくはそれを含むヌクレオチドなどを含み得る。ポリヌクレオチドは、その５’末端で、シグナル配列領域２０３内の１つ又は複数のシグナルペプチド配列をコードし得る。第１のフランキング領域２０４は、ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡ配列内の非翻訳領域（ＵＴＲ）と同様に作用し得る連結ヌクレオシド領域又はその一部分を含み得る。第１のフランキング領域はまた、極性領域２０８を含んでもよい。極性領域２０８は、ＩＲＥＳ配列又はその一部分を含み得る。非制限的例として、線状化されたとき、この領域が分断して、第１の部分が第１領域２０２の５’末端上になり、第２の部分が第１領域２０２の３’末端上になり得る。第２のフランキング領域２０
６は、テイル付加配列領域２１０を含むことができ、ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡのＵＴＲと同様に作用し得る連結ヌクレオチドの領域又はその部分２１２を含むことができる。
【０１３５】
第１領域２０２の５’末端と第１フランキング領域２０４とを架橋するのが、第１の作動領域２０５である。一実施形態では、この作動領域は、開始コドンを含んでもよい。あるいは、この作動領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列又はシグナルを含んでもよい。
【０１３６】
第１領域２０２の３’末端と第２フランキング領域２０６とを架橋するのが、第２の作動領域２０７である。伝統的に、この作動領域は、終止コドンを含む。あるいは、この作動領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列又はシグナルを含み得る。本発明によれば、複数の連続する終止コドンを用いてもよい。一実施形態では、本発明の作動領域は２つの終止コドンを含み得る。第１の終止コドンは「ＴＧＡ」又は「ＵＧＡ」であってもよく、第２の終止コドンは、「ＴＡＡ」、「ＴＧＡ」、「ＴＡＧ」、「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」又は「ＵＡＧ」からなる群から選択されてもよい。
【０１３７】
図７を参照すると、環状ポリヌクレオチド２００の調製に少なくとも１つの非核酸部分２０１が使用されてもよく、その場合、非核酸部分２０１を用いて、第１フランキング領域２０４を第２フランキング領域２０６に近付ける。本発明で使用することができる非核酸部分の非制限的例は、本明細書に記載する。環状ポリヌクレオチド２００は、２つ以上の非核酸部分を含むことができ、これらのさらなる非核酸部分は、第１の非核酸部分に対して異種であっても、又は同種であってもよい。
【０１３８】
図８を参照すると、第１の連結ヌクレオシド領域２０２は、スペーサ領域２１４を含み得る。このスペーサ領域２１４を使用することにより、第１の連結ヌクレオシド領域２０２を分離して、環状構築物が、２つ以上のオープンリーディングフレーム、非コード領域又はオープンリーディングフレーム及び非コード領域を含むことができるようにしてもよい。
【０１３９】
図９を参照すると、第２のフランキング領域２０６は、３’ＵＴＲ２１２に１つ又は複数のセンサー領域２１６を含み得る。本明細書で論述する通りのこれらのセンサー配列は、環状構築物又は環状ポリヌクレオチドの局所微小環境のリガンドに対する擬似受容体（又は結合部位）として動作する。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位又はｍｉＲＮＡシードは、これらが、環状ポリヌクレオチドの環境に存在する任意のマイクロＲＮＡに対する擬似受容体として機能するように、センサーとして用いることができる。図９に示すように、１つ又は複数のセンサー領域２１６は、スペーサ領域２１４によって分離することができる。
【０１４０】
図１０に示すように、１つ又は複数のセンサー領域２１６を含む環状構築物２００は、第１の連結ヌクレオシド領域２０２内にスペーサ領域２１４を含んでもよい。図７について上で述べたように、このスペーサ領域２１４を使用することにより、第１の連結ヌクレオシド領域２０２を分離して、環状構築物が、２つ以上のオープンリーディングフレーム及び／又は２つ以上の非コード領域を含むことができるようにしてもよい。
【０１４１】
図１１を参照すると、環状構築物２００は、少なくとも１つの非コード領域、例えば、限定はしないが、センサー領域２１６を含むｃｉｒｃＳＰとして知られる非コード構築物であってもよい。センサー領域２１６の各々は、限定はしないが、ｍｉＲ配列、ｍｉＲシード、ｍｉＲ結合部位及び／又はシードのないｍｉＲ配列を含み得る。
【０１４２】
図１２を参照すると、少なくとも１つの核酸部分２０１を用いて、非コード構築物であ
る環状ポリヌクレオチド２００を調製することができる。非コード構築物である環状ポリヌクレオチド２００は、２つ以上の非核酸部分を含んでもよく、ここで、追加の非核酸部分は、第１の非核酸部分に対して異種又は同種のいずれであってもよい。
【０１４３】
キメラポリヌクレオチドの多量体
本発明によれば、３’末端で修飾されているヌクレオチドを用い、３’末端を介して複数の異なるキメラポリヌクレオチドを互いに連結することができる。細胞への送達の化学量論を制御するために化学的コンジュゲーションを用いることができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素であるイソクエン酸リアーゼ及びリンゴ酸シンターゼを１：１比で細胞に供給すると、細胞脂肪酸代謝が改変され得る。この比は、一方のキメラポリヌクレオチド種の３’−アジド末端ヌクレオチドと、反対側のキメラポリヌクレオチド種のＣ５−エチニル又はアルキニル含有ヌクレオチドを使用して、キメラポリヌクレオチドを化学的に連結することにより制御することができる。修飾ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用し、製造者のプロトコルに従って、転写後に付加する。３’−修飾ヌクレオチドの付加後、銅の存在又は非存在下、２つのキメラポリヌクレオチド種を水溶液中で結合させて、文献に記載される通りのクリックケミストリー機構により新規の共有結合性の連結を形成することができる。
【０１４４】
別の例では、官能化されたリンカー分子を用いて、３つ以上のポリヌクレオチドを互いに連結させてもよい。例えば、官能化サッカリド分子が複数の化学反応基（ＳＨ−、ＮＨ２−、Ｎ３など）を含有するように化学的に修飾することにより、３’−官能化ｍＲＮＡ分子（すなわち、３’−マレイミドエステル、３’−ＮＨＳ−エステル、アルキニル）のコグネイト部分と反応させることができる。修飾されたサッカリドの反応基の数を化学量論的に制御することにより、共役させるキメラポリヌクレオチドの化学量論比を直接制御することができる。
【０１４５】
キメラポリヌクレオチドのコンジュゲート及び組み合わせ
タンパク質産生をさらに促進するために、本発明のキメラポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチド、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン（Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ））、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質類、又はペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的親和性を有する分子、又は抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞などの指定の細胞型に結合する抗体、ホルモン及びホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、又は薬物と共役するように設計することができる。
【０１４６】
共役は、安定性及び／又は半減期の増大をもたらすことができ、キメラポリヌクレオチドを細胞、組織又は生物中の特定の部位にターゲティングする上で特に有用となり得る。
本発明によれば、キメラポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、トリプルヘリックス形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー又はベクターなどの１つ又は複数と一緒に投与してもよいし、それと共役させるか、又はそれをさらにコードし得る。
【０１４７】
二官能性キメラポリヌクレオチド
本発明の一実施形態では、二官能性ポリヌクレオチド（例えば、二官能性キメラポリヌクレオチド）がある。名称が意味するように、二官能性ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの官能基を有するか、又はその能力を有するものである。これらの分子は、慣例により、多官能性と呼ばれることもある。
【０１４８】
二官能性ポリヌクレオチドの複数の官能性は、ＲＮＡによってコードされ得る（官能基は、コードされた産物が翻訳されるまで、現れない場合がある）か、又はポリヌクレオチド自体の特性であってもよい。これは、構造的又は化学的のいずれであってもよい。二官能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合又は静電気結合した官能基を含んでもよい。さらに、２つの官能基は、キメラポリヌクレオチドと別の分子との複合体として提供されてもよい。
【０１４９】
二官能性ポリヌクレオチドは、抗増殖性であるペプチドをコードし得る。これらのペプチドは、線状、環状、拘束、又はランダムコイルであってもよい。これらは、アプタマー、シグナル伝達分子、リガンド又はそれらの模倣体若しくは擬似物として機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、３〜５０アミノ酸長となり得る。これらのペプチドは、５〜４０、１０〜３０、又は約１５アミノ酸長であってよい。これらは、単鎖、複鎖若しくは分岐状のいずれであってもよく、また、一旦翻訳されると、複合体、凝集体、又はいずれかのマルチユニット構造を形成し得る。
【０１５０】
非コードキメラポリヌクレオチド
本明細書に記載するように、部分的又は実質的に翻訳不可能な領域を有し得る、例えば、非コード領域を有するキメラポリヌクレオチドが提供される。こうした非コード領域は、キメラポリヌクレオチドの「第１の領域」であってもよい。あるいは、非コード領域は、第１の領域以外の領域であってもよい。このような分子は、概して、翻訳されないが、リボソームタンパク質若しくは輸送ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの１つ又は複数の翻訳機構成分との結合及びそれらの隔離の１つ又は複数により、タンパク質産生に作用を及ぼし、それによって、細胞でのタンパク質発現を効果的に低減するか、又は細胞中の１つ又は複数の経路若しくはカスケードを調節して、タンパク質レベルを改変することができる。キメラポリヌクレオチドは、１つ又は複数の長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ、若しくはｌｉｎｃＲＮＡ）若しくはその部分、核小体ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はＰｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含有するか、又はコードし得る。上記のｌｎｃＲＮＡ分子及びこうしたｌｎｃＲＮＡをターゲティングするように設計されたＲＮＡｉ構築物（そのいずれもキメラポリヌクレオチドにおいてコードされ得る）の例は、国際公開第２０１２／０１８８８１  Ａ２号パンフレット（この内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されている。
【０１５１】
目的のポリペプチド
本発明のキメラポリヌクレオチドは、１つ又は複数の目的のペプチド又はポリペプチドをコードし得る。本発明のキメラポリヌクレオチドはまた、１つ又は複数のポリペプチドのレベル、シグナル伝達又は機能に影響を及ぼし得る。本発明によれば、目的のポリペプチドには、以下の文献に教示されるもの、例えば、そこに掲載されているもののいずれかを含む：国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、同第２０１３１５１６６８号パンフレット、同第２０１３１５１６６３号パンフレット、同第２０１３１５１６６９号パンフレット、同第２０１３１５１６７０号パンフレット、同第２０１３１５１６６４号パンフレット、同第２０１３１５１６６５号パンフレット、同第２０１３１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレットの表６及び７；国際公開第２０１３１５１６７１号パンフレットの表６、１７８及び１７９；国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレットの表６、１８５及び１８６（これら各々の内容は、全
体として参照により本明細書に組み込む）。
【０１５２】
本発明によれば、キメラポリヌクレオチドは、１つ又は複数の目的のポリペプチド又はその断片をコードするように設計することができる。こうした目的のポリペプチドとしては、限定はしないが、全ポリペプチド、複数のポリペプチド又はポリペプチドの断片を挙げることができ、これらは、独立に、キメラポリヌクレオチドの１つ又は複数の領域若しくは部分又はその全体によってコードされ得る。本明細書で使用されるとき、用語「目的のポリペプチド」は、本発明のキメラポリヌクレオチド内でコードされるように選択されるか、又はそれによって機能が影響を受ける任意のポリペプチドを指す。
【０１５３】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、最も一般的にはペプチド結合により連結されたアミノ酸残基（天然若しくは非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。いくつかの事例では、コードされたポリペプチドは、約５０アミノ酸より小さく、その場合、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドであるとき、それは、少なくとも約２、３、４、又は少なくとも５アミノ酸残基長となる。従って、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片並びにこれらの他の同等物、変異体、及び類似体を含む。ポリペプチドは、単分子であってもよいし、又は二量体、三量体若しくは四量体などの多分子複合体であってもよい。これらはまた、抗体若しくはインスリンなどの一本鎖又は複鎖ポリペプチドを含んでもよいし、結合又は連結していてもよい。最も一般的には、複鎖ポリペプチドにはジスルフィド結合が存在する。また、ポリペプチドという用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学類似体である、アミノ酸ポリマーにも適用され得る。
【０１５４】
「ポリペプチド変異体」という用語は、ネイティブ又は基準配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列は、ネイティブ又は基準配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。通常、変異体は、ネイティブ又は基準配列に対して少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、ネイティブ又は基準配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％同一（相同）である。
【０１５５】
一部の実施形態では、「変異体模倣体」が提供される。本明細書で用いられるとき、「変異体模倣体」という用語は、活性化配列を模倣する１つ又は複数のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−トレオニン及び／又はホスホロ−セリンの模倣体として役立ち得る。あるいは、変異体模倣体は、脱活性化又は模倣体を含有する不活性化産物をもたらす場合もあり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換物として作用し；又はアラニンは、セリンの不活性化置換物として作用し得る。
【０１５６】
「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、配列をアラインメントし、最大相同率を達成するために、必要であれば、ギャップを導入した後、第２配列中のアミノ酸配列の残基と同一である候補アミノ酸配列中の残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野において公知である。相同性は、同一性（％）の計算に左右されるが、計算に導入されたギャップ及びペナルティによって値が相違し得る。
【０１５７】
「相同体」は、ポリペプチド配列に適用されるとき、第２の種の第２配列と実質的な同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、１つ又は複数のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加若しくは欠失によって異なるが、親若しくは出発ポリペプチドの特性の１つ又は複数を依然と
して維持するポリペプチド変異体を包含するものとする。
【０１５８】
本発明は、変異体及び誘導体を含む、ポリペプチドベースの数種の組成物を考慮する。これらは、置換、挿入、欠失及び共有結合変異体及び誘導体を含む。用語「誘導体」は、用語「変異体」と類義に用いられるが、一般に、基準分子又は出発分子に対して何らかの方法で修飾及び／又は変更されている分子を指す。
【０１５９】
従って、基準配列、特に、本明細書に開示するポリペプチド配列に対して、置換、挿入、及び／又は付加、欠失及び共有結合修飾を含むポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドは、本発明の範囲に含まれる。例えば、１つ又は複数のリシンなどの配列タグ又はアミノ酸を本発明のペプチド配列に付加することができる（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端で）。配列タグは、ペプチド精製又は局在化に用いることができる。リシンは、ペプチド溶解度を高めるか、又はビオチン化を可能にするために用いることができる。あるいは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、切断型配列を取得することもできる。いくつかのアミノ酸（例えば、Ｃ末端又はＮ末端残基）は、例えば、可溶性であるか、又は固体支持体に結合したより大きな配列の一部として配列の発現など、配列の用途に応じて欠失させてもよい。
【０１６０】
「置換変異体」は、ポリペプチドに関連する場合、ネイティブ又は出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、同じ位置のその場所に挿入された異なるアミノ酸を有するものである。置換は、単一（その場合、分子中のただ１つのアミノ酸が置換されている）であってもよいし、又は多数（その場合、同じ分子中の２つ以上のアミノ酸が置換されている）であってもよい。
【０１６１】
本発明で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似のサイズ、電荷、又は極性を有する別のアミノ酸による、配列に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例として、イソロイシン、バリン及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基による別の非極性残基の置換がある。同様に、保存的置換の例として、アルギニンとリシン同士、グルタミンとアスパラギン同士、並びにグリシンとセリン同市など、ある極性（親水性）残基による別の残基の置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン若しくはヒスチジンなどの塩基性残基による別の残基の置換、又はアスパラギン酸又はグルタミン酸などのある酸性残基による別の酸性残基の置換は、保存的置換の別の例である。非保存的置換の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基による、システイン、グルタミン、グルタミン酸若しくはリシンなどの極性（親水性）残基の置換及び／又は極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。
【０１６２】
ポリペプチドに関連する場合、「挿入変異体」は、ネイティブ又は出発配列における特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入される１つ又は複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接して」とは、アミノ酸のα−カルボキシ又はα−アミノ官能基のいずれかに連結することを意味する。
【０１６３】
ポリペプチドに関連する場合、「欠失変異体」は、ネイティブ又は出発アミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異体は、分子の特定の領域で１つ又は複数のアミノ酸が欠失することになる。
【０１６４】
ポリペプチドに関連する場合、「共有結合誘導体」は、有機タンパク質性若しくは非タンパク質性誘導体化剤によるネイティブ又は出発タンパク質の修飾、及び／又は翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、伝統的に、選択した側鎖若しくは末端残基と反応することが
できる有機誘導体化剤と、タンパク質の標的アミノ酸残基を反応させることによって、又は選択した組換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾の機構を抑制することによって導入される。得られる共有結合誘導体は、組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の生物活性、免疫アッセイ、又は調製に重要な残基を見出すことを目的とするプログラムにおいて有用である。こうした修飾は、当業者の通常の技術の範囲内であり、過度の実験を行うことなく実施される。
【０１６５】
いくつかの翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用によって得られる。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、翻訳後、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に、脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明に従って生成されるポリペプチド中に存在し得る。
【０１６６】
その他の翻訳後修飾として、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル若しくはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）著、「タンパク質：構造及び分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．）、サンフランシスコ、ｐｐ．７９〜８６、１９８３年）。
【０１６７】
ポリペプチドに関連する場合、「特徴」は、分子の異なるアミノ配列ベースの成分として定義される。本発明のキメラポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴としては、表面出現、局所立体構造形状、フォールド、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１６８】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「表面出現」は、最表面上に出現するタンパク質のポリペプチドベースの成分を指す。
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「局所立体構造形状」は、タンパク質の画定可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチドベースの構造出現を意味する。
【０１６９】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「フォールド」は、エネルギー最小化時に得られるアミノ酸配列の立体配座を指す。フォールドは、フォールディングプロセスの二次又は三次レベルで起こり得る。二次レベルの例として、βシート及びαヘリックスがある。三次フォールドの例として、エネルギー力の凝集又は分離によって形成されたドメイン及び領域がある。このようにして形成された領域には、疎水性及び親水性ポケットなどがある。
【０１７０】
本明細書において、タンパク質立体配座に関連して用いられるとき、用語「ターン（ｔｕｒｎ）」は、ペプチド又はポリペプチドの骨格の方向を変更する曲がりを意味し、１、２、３個若しくはそれ以上のアミノ酸残基を伴い得る。
【０１７１】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「ループ」は、ペプチド又はポリペプチドの骨格の方向を逆転するのに役立ち得るポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドに存在し、骨格の方向を変更するだけであれば、これは、４個以上のアミノ酸残基を含み得る。オリバ（Ｏｌｉｖａ）らは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを見出している（分子生物学会誌（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）第２６６巻（４）：ｐ．８１４〜８３０；１９９７年）。ループは、開又は閉のいずれであってもよい。閉ループ又は「環状」ループは、架橋部分の間に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含み得る。こうした架橋部分は、ジスルフィド架
橋を有するポリペプチドに典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含んでもよいし、あるいは、架橋部分は、本明細書で使用するジブロモジリル剤のように、非タンパク質ベースであってもよい。
【０１７２】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「ハーフループ」は、それが由来するループのアミノ酸残基数の少なくとも半分を有する、同定されたループの一部を指す。ループは、必ずしも偶数のアミノ酸残基を含むとは限らないことは理解されたい。従って、ループが、奇数のアミノ酸を含むか、又は含むことが判明した場合には、奇数ループのハーフループは、ループの整数部分又は次の整数部分を含むことになる（ループのアミノ酸の数／２＋／−０．５アミノ酸）。例えば、７アミノ酸ループとして同定されたループは、３アミノ酸又は４アミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５は、３又は４）のハーフループを生成し得る。
【０１７３】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「ドメイン」は、１つ又は複数の同定可能な構造又は機能的特徴若しくは特性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用のための部位として作用する、結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【０１７４】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「ハーフドメイン」は、それが由来するドメインのアミノ酸残基数の少なくとも半分を有する、同定されたドメインの一部を意味する。ドメインは、必ずしも偶数のアミノ酸残基を含むとは限らないことは理解されたい。従って、ドメインが、奇数のアミノ酸を含むか、又は含むことが判明した場合には、奇数ドメインのハーフドメインは、ドメインの整数部分又は次の整数部分を含むことになる（ドメインのアミノ酸の数／２＋／−０．５アミノ酸）。例えば、７アミノ酸ドメインとして同定されたドメインは、３アミノ酸又は４アミノ酸（７／２＝３．５＋／−０．５は、３又は４）のハーフドメインを生成し得る。また、ドメイン又はハーフドメイン内にサブドメインが識別される場合もあり、これらのサブドメインは、それらが由来するドメイン又はハーフドメインにおいて同定される全構造若しくは機能的特性の一部を有することも理解されたい。さらに、本明細書のドメインタイプのいずれかを含むアミノ酸が、ポリペプチドの骨格に沿って連続的である必要はない（すなわち、非隣接アミノ酸は、ドメイン、ハーフドメイン又はサブドメインを生成するように構造的にフォールドし得る）ことも理解されたい。
【０１７５】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「部位」は、アミノ酸ベースの実施形態に関する場合、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と類義に使用される。部位は、本発明のポリペプチドベースの分子内で修飾、操作、改変、誘導体化若しくは変異され得る、ペプチド又はポリペプチド内の位置を表す。
【０１７６】
本明細書において、ポリペプチドに関連して用いられるとき、用語「（複数の）末端」又は「末端」は、ペプチド又はポリペプチドの末端を指す。こうした末端は、ペプチド又はポリペプチドの最初若しくは最後の部位に限定されるわけではなく、末端領域内の別のアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で終結）及びＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終結）の両方を有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、一部の事例で、ジスルフィド結合により、又は非共有結合力によって連結された複数のポリペプチド鎖から構成されている（多量体、オリゴマー）。こうした種類のタンパク質は、複数のＮ及びＣ末端を有することになる。あるいは、場合に応じて、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベースの部分で開始又は終了するように、ポリペプチドの末端を修飾してもよい。
【０１７７】
一旦これらの特徴のいずれかが、本発明の環状一次構築物、キメラポリヌクレオチドによってコードしようとするポリペプチドの所望の成分として同定又は決定されたら、移動、交換、反転、欠失、ランダム化若しくは複製によって上記の特徴のいくつかの操作及び／又は修飾のいずれかを実施してよい。さらに、特徴の操作によって、本発明の分子に対する修飾と同じ結果が生じ得ることも理解されたい。例えば、ドメインの欠失を含む操作によって、完全長より短い分子をコードするような核酸の修飾と全く同じ分子の長さの改変が起こり得る。
【０１７８】
修飾及び操作は、限定はしないが、部位指定突然変異誘発、又は化学合成の間の事前組み込みなどの当技術分野では公知の方法により達成することができる。次に、こうして得られた修飾分子は、本明細書に記載するもの又は当技術分野で公知であるいずれか他の好適なスクリーニングアッセイなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて活性について試験してもよい。
【０１７９】
本発明によれば、ポリペプチドは、共通配列を含んでもよく、これは、複数ラウンドの実験によって見出される。本明細書で用いられるとき、「共通」配列は、１つ又は複数の部位での可変性を可能にする配列の集団を代表する１配列である。
【０１８０】
当業者には認識されるように、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、本発明の目的のポリペプチドの範囲内に含まれると考えられる。例えば、本明細書において、基準タンパク質１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又は１００以上のアミノ酸長のいずれかのタンパク質断片（基準ポリペプチド配列より少なくとも１アミノ酸残基短いか、あるいはそれと等しいポリペプチド配列を意味する）が提供される。別の例では、本明細書に記載する配列のいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約１００％同一である約２０、約３０、約４０、約５０、若しくは約１００アミノ酸の区間を含む任意のタンパク質を本発明に従って使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明に従って使用されるポリペプチドは、本明細書で提供又は参照される配列のいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれ以上の突然変異を含む。
【０１８１】
目的のポリペプチドのタイプ
本発明のキメラポリヌクレオチドは、いくつかの標的カテゴリーのいずれかから選択される目的ポリペプチドをコードするように設計することができ、こうしたカテゴリーとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：生物学的製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質又はペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質又は細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質、ターゲティング部分、又は治療適用は見出されていないが、それにも関わらず研究及び創薬の分野で有用性があるヒトゲノムによってコードされるタンパク質。
【０１８２】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、基準ポリペプチド配列とある程度の同一性を有する変異体ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用されるとき、「基準ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。基準配列は、野生型配列、又は別の配列の設計で参照されるいずれの配列であってもよい。「基準ポリペプチド配列」は、例えば、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット、同第２０１３１５１６６８号パンフレット、同第２０１３１５１６６３号パンフレット、同第２０１３１５１６６９号パンフレット、同第２０１３１５１６７０号パンフレット、同第２０１３１５１６６４号パンフレット、同第２０１３１５１６６５号パンフレット、同第２０１３１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３１５１６７２号パンフレットの表６及び７；国際公
開第２０１３１５１６７１号パンフレットの表６、１７８及び１７９；国際公開第２０１３１５１６６７号パンフレットの表６、１８５及び１８６（これら各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されているポリペプチドのいずれであってもよい。
【０１８３】
基準分子（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）は、設計された分子（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）とある程度の同一性を共有する。用語「同一性」は、当技術分野で公知のように、配列を比較することにより決定される通りの、２つ以上のペプチド、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列同士の関係性を指す。当技術分野では、同一性は、２つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオシドの鎖同士の一致の数によって決定される通りの、ペプチド同士の配列関連性の度合も意味する。同一性では、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって処理される、２つ以上の配列の小さい方とギャップアラインメント（もしあれば）の間の完全な一致のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法として、限定はしないが、以下の文献に記載されているものが挙げられる：「分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォ−マティック及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９３年；「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第１部、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）及びグリフィン，Ｈ．Ｇ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州、１９９４年；「分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ハイーネ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）及びデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍ．ストックトン・プレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９１年；カリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら著、ＳＩＡＭ応用数学会誌（ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．）、第４８巻、ｐ．１０７３、１９８８年。
【０１８４】
一部の実施形態では、ポリペプチド変異体は、基準ポリペプチドと同じか、又は類似の活性を有してもよい。あるいは、変異体は、基準ポリペプチドに対して改変された（例えば、増大又は低減した）活性を有してもよい。概して、本発明の特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、本明細書に記載され、また当業者には周知の配列アラインメントプログラム及びパラメータにより決定される通りに、特定の基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、しかし約１００％未満の配列同一性を有することになる。こうしたアラインメントのツールとして、ＢＬＡＳＴスイート（ステフェン
Ｆ．アルトシェル（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、トーマス  Ｌ．マッデン（Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ）、アレハンドロ  Ａ．シェファー（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）、ジンフィ・チャン（Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ）、チェン・チャン（Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ）、ウェブ・ミラー（Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ）、及びデイビッド  Ｊ．リップマン（Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ）著、１９９７年、「ギャップ付ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代タンパク質データベース検
索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２）のツールがある。
【０１８５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムのデフォルトパラメータとしては、例えば、期待閾値１０、ワードサイズ２８、マッチ／ミスマッチスコア１、−２、ギャップコストリニア（Ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ  Ｌｉｎｅａｒ）がある。任意のフィルター、並びに例えば、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）などの種特異的反復単位の選択を適用することができる。
【０１８６】
生物製剤
本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種の生物製剤をコードし得る。本明細書で用いられるとき、「生物製剤」は、本明細書に提供される方法で生成され、重症又は命を脅かす疾患若しくは病状を治療、治癒、緩和、予防、又は診断するために使用することができるポリペプチドベースの分子である。生物製剤は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、パラグラフ［０００１５９］及び［０００１６０］に記載されている。
【０１８７】
抗体
本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種の抗体若しくはその断片をコードし得る。用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体）、多エピトープ特異性、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び単鎖分子）、並びに抗体断片を含む。抗体は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、パラグラフ［０００１６１］〜［０００１６７］に記載されている。
【０１８８】
ワクチン
本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種のワクチンをコードし得る。本明細書で用いられるとき、「ワクチン」は、特定の疾患又は感染因子に対する免疫を向上させる生物学的製剤である。本発明によれば、現在市販されているか、若しくは開発中の１種又は複数種のワクチンが、本発明のキメラポリヌクレオチドによりコードされ得る。特定の理論に拘束される意図はないが、本発明のキメラポリヌクレオチドへの組み込みは、少なくとも部分的に、構築物設計の特異性、純度及び選択性によって、改善された治療効果をもたらすと考えられる。
【０１８９】
本発明のキメラポリヌクレオチドにコードされるワクチンは、多くの治療分野、例えば、限定はしないが、心血管、ＣＮＳ、皮膚科、内分泌学、腫瘍学、免疫学、呼吸器、及び抗感染症における病状又は疾患を治療するために使用することができる。
【０１９０】
治療用タンパク質又はペプチド
本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種の承認済又は「試験中の」治療用タンパク質又はペプチドをコードし得る。
【０１９１】
本発明によれば、現在市販されているか、若しくは開発中の１種又は複数種の治療用タンパク質又はペプチドは、本発明のキメラポリヌクレオチドによってコードされ得る。特定の理論に拘束される意図はないが、本発明のキメラポリヌクレオチドへの組み込みは、少なくとも部分的に、構築物設計の特異性、純度及び選択性によって、改善された治療効果をもたらすと考えられる。
【０１９２】
本発明のキメラポリヌクレオチドにコードされる治療用タンパク質又はペプチドは、多くの治療分野、例えば、限定はしないが、血液、心血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚科、内分泌学、遺伝学、泌尿生殖器、胃腸、筋骨格、腫瘍学、及び免疫学、呼吸器、感覚並びに抗感染症における病状又は疾患を治療するために使用することができる。
【０１９３】
細胞透過性ポリペプチド
本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種の細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。本明細書で用いられるとき、「細胞透過性ポリペプチド」又はＣＰＰは、細胞による分子の取り込みを促進することができるポリペプチドを指す。本発明の細胞透過性ポリペプチドは、１種又は複数種の検出可能な標識を含んでもよい。ポリペプチドは、部分的に標識しても、又は全体を完全に標識してもよい。キメラポリヌクレオチドは、検出可能な標識を完全にコードしてもよいし、一部をコードするか、又は全くコードしなくてもよい。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、「シグナル配列」は、タンパク質翻訳中の新生タンパク質のアミノ末端で結合したアミノ残基の配列を指す。シグナル配列は、細胞透過性ポリペプチドの分泌をシグナル伝達するために用いることができる。
【０１９４】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドはまた、融合タンパク質もコードし得る。融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に作動可能に連結することによって作製することができる。本明細書で用いられるとき、「作動可能に連結される」は、細胞に導入されると、複合体の発現を可能にするように連結された治療用タンパク質と荷電タンパク質を指す。本明細書で用いられるとき、「荷電タンパク質」は、正、負又は総合中和電荷を帯びたタンパク質を指す。治療用タンパク質は、融合タンパク質の形成中に荷電タンパク質に共有結合させるのが好ましい。表面電荷と総又は表面アミノ酸の比は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８又は０．９であってよい。
【０１９５】
キメラポリヌクレオチドによりコードされる細胞透過性ポリペプチドは、翻訳後に、複合体を形成し得る。複合体は、細胞透過性ポリペプチドに連結した、例えば、共有結合した荷電タンパク質を含んでもよい。「治療用タンパク質」は、細胞に投与されると、治療、診断、及び／若しくは予防効果を有し、並びに／又は所望の生物学的及び／若しくは薬理学的効果を有するタンパク質を指す。
【０１９６】
一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第１ドメイン及び第２ドメインを含んでもよい。第１ドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第２ドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で用いられるとき、「タンパク質結合パートナー」は、限定はしないが、抗体及びその機能性断片、スカフォールドタンパク質、又はペプチドを含む。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーに対する細胞内結合パートナーをさらに含んでもよい。細胞透過性ポリペプチドは、キメラポリヌクレオチドが導入され得る細胞から分泌させることができる。細胞透過性ポリペプチドはまた、第１細胞を透過することもできる。
【０１９７】
別の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第２細胞を透過することができる。第２細胞は、第１細胞と同じ部位に由来するものであってもよいし、又は異なる部位に由来するものでもよい。部位として、限定はしないが、組織及び臓器が挙げられる。第２細胞はまた、第１細胞に対し近位又は遠位のいずれでであってもよい。
【０１９８】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、タンパク質結合パートナーを含み得る細胞透過性ポリペプチドをコードすることもできる。タンパク質結合パートナーとして、限
定はしないが、抗体、超荷電抗体又は機能性断片が挙げられる。キメラポリヌクレオチドは、タンパク質結合パートナーを含む細胞透過性ポリペプチドが導入される細胞に導入してもよい。
【０１９９】
分泌タンパク質
ヒト及び他の真核細胞は、膜によって多数の機能的に異なるコンパートメントに細分されている。膜で仕切られたコンパートメント、すなわち細胞小器官の各々は、細胞小器官の機能に必須の異なるタンパク質を含有する。細胞は、タンパク質を特定の細胞小器官にターゲティングするために、タンパク質内に位置するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用する。
【０２００】
シグナル配列、シグナルペプチド、又はリーダ配列と呼ばれる１タイプの選別シグナルは、小胞体（ＥＲ）と呼ばれる細胞小器官に１クラスのタンパク質を向ける。
シグナル配列によってＥＲにターゲティングされたタンパク質は、分泌タンパク質として細胞外空間に放出させることができる。同様に、細胞膜上に常在するタンパク質も、タンパク質を膜に保持する「リンカー」のタンパク質分解切断によって、細胞外空間に分泌させることができる。特定の理論に拘束される意図はないが、上記の細胞輸送を利用するために、本発明の分子を用いることができる。従って、本発明の一部の実施形態では、分泌したタンパク質を発現させるために、キメラポリヌクレオチドが提供される。分泌させるタンパク質は、本明細書に記載するもの、又は米国特許出願公開第２０１００２５５５７４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものから選択してもよい。
【０２０１】
一実施形態では、これらは、多量のヒト遺伝子産物の製造に用いることができる。
形質膜タンパク質
本発明の一部の実施形態では、形質膜タンパク質を発現させるために、キメラポリヌクレオチドが提供される。
【０２０２】
細胞質又は細胞骨格タンパク質
本発明の一部の実施形態では、細胞質又は細胞骨格タンパク質を発現させるために、キメラポリヌクレオチドが提供される。
【０２０３】
細胞内膜結合タンパク質
本発明の一部の実施形態では、細胞内膜結合タンパク質を発現させるために、キメラポリヌクレオチドが提供される。
【０２０４】
核タンパク質
本発明の一部の実施形態では、核タンパク質を発現させるために、キメラポリヌクレオチドが提供される。
【０２０５】
ヒトの疾患に関連するタンパク質
本発明の一部の実施形態では、ヒトの疾患に関連するタンパク質を発現させるために、キメラポリヌクレオチドが提供される。
【０２０６】
その他のタンパク質
本発明の一部の実施形態では、現在未知の治療機能を有するタンパク質を発現させるために、キメラポリヌクレオチドが提供される。
【０２０７】
ターゲティング部分
本発明の一部の実施形態では、ターゲティング部分を発現するキメラポリヌクレオチド
が提供される。これらは、タンパク質結合パートナー又は細胞の表面上の受容体を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで細胞を特定の組織空間にターゲティングする、又は特定の部分と相互作用する機能を果たす。好適なタンパク質結合パートナーとして、限定はしないが、抗体及びその機能性断片、スカフォールドタンパク質、又はペプチドがある。さらに、ｃｉｒｃＲＮＡは、脂質、炭水化物、又はその他の生物学的部分若しくは生体分子の合成及び細胞外局在化を指令するために使用することもできる。
【０２０８】
ペプチドライブラリー
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、ポリペプチドライブラリーを生成するために用いてもよい。これらのライブラリーは、各々が様々な構造的又は化学修飾設計を含むキメラポリヌクレオチドの集団から生じ得る。この実施形態では、キメラポリヌクレオチドの集団は、限定はしないが、抗体若しくは抗体断片、タンパク質結合パートナー、スカフォールドタンパク質、並びに本明細書に教示する又は当技術分野で公知の他のポリペプチドを含む、複数のコードされたポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、標的細胞又は培養物への直接導入に好適であると考えられ、これらの標的細胞又は培養物が、コードされたポリペプチドを合成することができる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、各々が異なるアミノ酸修飾を含むタンパク質の様々な変異体を生成して、これらを試験することにより、薬物動態、安定性、生体適合性、及び／若しくは生物活性、又は発現レベルなどの生物物理学的特性に関して最良の変異体を決定することができる。このようなライブラリーは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、若しくは１０９超の考えられる変異体（限定はしないが、１つ又は複数の残基の置換、欠失、及び１つ又は複数の残基の挿入を含む）を含み得る。
【０２１０】
抗菌及び抗ウイルスポリペプチド
本発明のキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種の抗菌ペプチド（ＡＭＰ）又は抗ウイルスペプチド（ＡＶＰ）をコードするように設計することができる。ＡＭＰ及びＡＶＰは、限定はしないが、微生物、脊椎動物、植物、両性類、鳥類、魚類、及び哺乳動物などの非常に多様な動物から単離され、記載されている（ワング（Ｗａｎｇ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、２００９年、ｐ．３７（データベース特集号）：Ｄ９３３−７）。抗菌及び抗ウイルスポリペプチドは、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットに記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込むものとする。非制限的例として、抗菌ポリペプチドが、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００１８９］〜［０００１９９］に記載されている。別の非制限的例として、抗ウイルスポリペプチドが、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００１８９］〜［０００１９５］及び［０００２００］に記載されている。
【０２１１】
キメラポリヌクレオチド領域
一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、他の核酸ベースの分子の既知の領域又は部分と同様に機能する領域、サブ領域若しくは部分を含むように設計することができる。こうした領域には、本明細書で述べるｍＲＮＡ領域並びに非コード領域が含まれる。非コード領域は、領域が１つ又は複数の細胞傷害性ヌクレオシドであるか又はそれを組み込む場合のように、単一ヌクレオシドのレベルであってもよい。
【０２１２】
細胞傷害性ヌクレオシド
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種の細胞傷害性ヌクレオシドを組み込んでいてもよい。細胞傷害性ヌクレオシドは、同時係属国際公開第２
０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、パラグラフ［０００１９４］〜［０００１９８］に記載されている。
【０２１３】
非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するキメラポリヌクレオチド
本発明のキメラポリヌクレオチドは、非翻訳領域として作用又は機能する１つ又は複数の領域又は部分を含み得る。キメラポリヌクレオチドが目的のポリペプチドをコードするように設計される場合、キメラポリヌクレオチドは、これらの非翻訳領域のうちの１つ以上を含み得る。
【０２１４】
定義上、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンは含まないのに対して、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳に関してＵＴＲが果たす調節の役割についての一連の証拠が増えている。ＵＴＲの調節に関する特徴を本発明のキメラポリヌクレオチドに組み込むことにより、分子の安定性を増強することができる。さらに、特定の特徴を組み込むことにより、転写物が所望外の器官部位に誤って向けられた場合に、転写物の制御された下方調節を確実にすることもできる。
【０２１５】
５’ＵＴＲ及び翻訳開始
天然の５’ＵＴＲは、転写開始において役割を果たすという特徴を有する。これらは、シグネチャー様コザック（Ｋｏｚａｋ）配列を有し、これらの配列は、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与していることが一般に知られている。コザック（Ｋｏｚａｋ）配列は、共通ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）であり、これにもう１つの「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することもわかっている。
【０２１６】
特定の標的臓器の豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を操作することによって、本発明のキメラポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を増強することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トラスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチン、又は因子ＶＩＩＩなどの肝臓に発現するｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入を用いて、肝細胞株若しくは肝臓におけるキメラポリヌクレオチドなどの核酸分子の発現を増強することができる。同様に、該当組織における発現の向上を目的とする、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲの使用は、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、上皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）及び肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）についても可能である。キメラポリヌクレオチドの設計及び製造に有用な非翻訳領域として、限定はしないが、同時係属中で、共同所有の米国特許出願（ＵＳＳＮ）第６１／８２９３７２号明細書（代理人整理番号Ｍ４２）（この内容は全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されるものが挙げられる。
【０２１７】
キメラポリヌクレオチド内の領域又はサブ領域として他の非ＵＴＲ配列を使用してもよい。例えば、イントロン又はイントロン配列の部分を本発明のキメラポリヌクレオチドの領域に組み込んでもよい。イントロン配列の組み込みにより、タンパク質産生並びにポリヌクレオチドレベルが増加し得る。
【０２１８】
特徴の組み合わせをフランキング領域に含ませてもよいし、他の特徴内に含有させても
よい。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５’ＵＴＲ及び／又はポリＡテイルの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３’ＵＴＲによってフランキングされてもよい。５’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号明細書（本明細書において全体として参照により組み込む）に記載される５’ＵＴＲなどの、同じ及び／又は異なる遺伝子由来の第１のポリヌクレオチド断片と第２のポリヌクレオチド断片とを含んでもよい。
【０２１９】
同時係属中で、共同所有の国際公開第２０１４１６４５３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ４２）は、本発明のキメラポリヌクレオチドでフランキング領域として使用することができる例示的ＵＴＲの一覧を提供している。５’又は３’ＵＴＲの変異体を使用してもよく、この場合、末端に対し、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧを含めた１つ又は複数のヌクレオチドが付加又は除去されている。
【０２２０】
キメラポリヌクレオチドの領域に、任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲが組み込まれ得ることは理解すべきである。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを使用してもよい。また、野生型領域の変異体でない人工ＵＴＲを提供することも、本発明の範囲に含まれる。これらのＵＴＲ又はその部分は、それらが選択された元の転写物と同じ配向で配置してもよいし、又は配向若しくは位置が改変されてもよい。従って、５’又は３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長してもよいし、１つ又は複数の他の５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲと共にキメラ化してもよい。本明細書で使用されるとき、用語「改変される」は、ＵＴＲ配列に関する場合、ＵＴＲが基準配列に対して何らかの形で変更されていることを意味する。例えば、３’又は５’ＵＴＲは、野生型又は天然ＵＴＲに対し、上記に教示したように配向若しくは位置の変更によって改変してもよいし、又は追加ヌクレオチドの含有、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換若しくは転位によって改変してもよい。「改変された」ＵＴＲ（３’又は５’のいずれであるかに関わらず）を生成するこれらの変更のいずれも、変異ＵＴＲを構成する。
【０２２１】
一実施形態では、５’又は３’ＵＴＲなどの二重、三重又は四重ＵＴＲを用いてもよい。本明細書で用いられるとき、「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーが、連続して、又は実質的に連続して、コードされるものである。例えば、米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りに、二重β−グロブリン３’ＵＴＲを用いることができる。
【０２２２】
さらに、パターン化ＵＴＲを有することも本発明の範囲に含まれる。本明細書で用いられるとき、「パターン化ＵＴＲ」は、１回、２回、又は３回以上反復されるＡＢＡＢＡＢ若しくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ若しくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ若しくはそれらの変形などの反復又は交互のパターンを表すＵＴＲである。これらのパターンにおいて、Ａ、Ｂ、又はＣの各文字は、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
【０２２３】
一実施形態では、そのタンパク質が、共通の機能、構造、特性の特徴を有する転写物のファミリーから、フランキング領域を選択する。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織又は発生中のある時点で発現されるタンパク質のファミリーに属し得る。これらの遺伝子のいずれかに由来するＵＴＲを同じ又は異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新たなキメラポリヌクレオチドを作製することができる。本明細書で用いられるとき、「タンパク質のファミリー」は、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、若しくは発現パターンを共通に有する２つ以上の目的のポリペプチドの群を指して、最も広義に用いられる。
【０２２４】
非翻訳領域はまた、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を含んでもよい。非制限的例として、ＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９０２２６４７０号明細書（これは全体
として参照により本明細書に組み込む）に記載されるもの、及び当技術分野で公知のものを含んでもよい。
【０２２５】
３’ＵＴＲ及びＡＵリッチエレメント
天然又は野生型３’ＵＴＲは、アデノシンとウリジンが埋め込まれた区間を有することがわかっている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高速度のターンオーバを有する遺伝子において特に優勢である。それらの配列の特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、次の３つのクラスに分けることができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、１９９５年）：クラスＩ  ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含む。Ｃ−Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩ  ＡＲＥを含む。クラスＩＩ  ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップするＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。このタイプのＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−ａがある。クラスＩＩＩ  ＡＲＥは、それほど明確に定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含んでいない。ｃ−Ｊｕｎ及びミオゲニンは、このクラスの十分に研究された２つの例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを脱安定化するのに対し、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増大することが文献に記載されている。ＨｕＲは、３つのクラス全てのＡＲＥに結合する。核酸分子の３’ＵＴＲにＨｕＲ特異的結合部位を操作により導入すれば、ＨｕＲの結合、従って、ｉｎ  ｖｉｖｏでのメッセージの安定化が達成されることになる。
【０２２６】
３’ＵＴＲ  ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去又は修飾を用いて、本発明のキメラポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特定のキメラポリヌクレオチドを操作する場合、ＡＲＥの１つ又は複数のコピーを導入して、本発明のキメラポリヌクレオチドをより不安定にすることができ、それにより翻訳を短縮し、その結果得られるタンパク質の生産を低減する。同様に、ＡＲＥを同定し、除去又は突然変異させて、細胞内安定性を増大し、それにより、翻訳、並びにその結果得られるタンパク質の生産を増大することもできる。本発明のキメラポリヌクレオチドを用いて、トランスフェクション実験を関連細胞株で実施することができ、トランスフェクション後の様々な時点でタンパク質の生産をアッセイすることができる。例えば、異なるＡＲＥ操作分子で細胞をトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対しＥＬＩＳＡキットを用いて、トランスフェクトから６時間、１２時間、２４時間、４８時間、及び７日後に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
【０２２７】
マイクロＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡであり、これは、核酸分子の３’ＵＴＲに結合して、核酸分子安定性を低減するか、又は翻訳を阻害するかのいずれかにより、遺伝子発現を下方制御する。本発明のキメラポリヌクレオチドは、１つ又は複数のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、又はマイクロＲＮＡシードを含んでもよい。このような配列は、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書及び同第２００５／００５９００５号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されているものなどのいずれか公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
【０２２８】
マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域の配列を含み、この配列は、マイクロＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位又は２〜７位を含み得る。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、７個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位）を含み得るが、この場合、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補性部位は、マイクロＲＮＡ１位に向
き合うアデニン（Ａ）によってフランキングされる。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７位）を含み得るが、この場合、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補性部位は、マイクロＲＮＡ１位と向き合うアデニン（Ａ）によってフランキングされる。例えば、グリムソン  Ａ（Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ）、ファー  ＫＫ（Ｆａｒｈ  ＫＫ）、ジョンストン  ＷＫ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ）、ギャレット−エンジェレ  Ｐ（Ｇａｒｒｅｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ）、リム  ＬＰ（Ｌｉｍ  ＬＰ）、バーテル  ＤＰ（Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ）ら著、分子細胞（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）、２００７年、７月６日、第２７巻（１）、ｐ．９１〜１０５（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。該当するマイクロＲＮＡが利用可能であれば、マイクロＲＮＡ標的配列の操作により本発明のキメラポリヌクレオチド（例えば、３’ＵＴＲ様領域又は他の領域）に導入することによって、分解又は翻訳低減のために分子をターゲティングすることができる。このプロセスは、核酸分子送達の際のオフターゲット効果の危険性を軽減し得る。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、並びに生物学におけるそれらの発現パターン及び役割が報告されている（ボナウアー（Ｂｏｎａｕｅｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ターゲッツ（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ）、２０１０年、第１１巻、ｐ．９４３〜９４９；アナド（Ａｎａｎｄ）及びチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１〜１７６；コントレラス（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ）及びラオ（Ｒａｏ）著、白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２０１２年、第２６号、ｐ．４０４〜４１３（２０１１年、１２月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）著、細胞（Ｃｅｌｌ）、２００９年、第１３６巻、ｐ．２１５〜２３３；ランドグラフ（Ｌａｎｄｇｒａｆ）ら著、細胞（Ｃｅｌｌ）、２００７年、第１２９巻、ｐ．１４０１〜１４１４；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２２９】
例えば、核酸分子が、ｍＲＮＡであり、肝臓に送達されるのではなく、そこに最後まで留まることが意図される場合、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２の１つ又は複数の標的部位が、操作によりキメラポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ領域中に導入されていれば、目的の遺伝子の発現を阻害することができる。異なるマイクロＲＮＡに対する１つ又は複数の結合部位の導入を操作することによって、キメラポリヌクレオチドの寿命、安定性、及びタンパク質翻訳をさらに低減することができる。
【０２３０】
本明細書で用いられるとき、用語「マイクロＲＮＡ部位」は、マイクロＲＮＡ標的部位又はマイクロＲＮＡ認識部位、又はマイクロＲＮＡが結合又は会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」が、伝統的なワトソン−クリックハイブリダイゼーション法則に従うか、あるいは、マイクロＲＮＡ部位での又はそれに隣接した標的配列とマイクロＲＮＡの何らかの安定な結合を表し得ることは理解すべきである。
【０２３１】
反対に、本発明のキメラポリヌクレオチドの目的で、例えば、特定の組織におけるタンパク質発現を増大するために、マイクロＲＮＡ結合部位は、それらが存在する配列から操作により取り出す（すなわち、除去する）ことができる。例えば、肝臓におけるタンパク質発現を改善するために、ｍｉＲ−１２２結合部位を除去することができる。様々な組織における発現の調節は、１つ又はいくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入又は除去によって達成することができる。
【０２３２】
マイクロＲＮＡが、ｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することがわかっている組織の例として、限定はしないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、上皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、
ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられる。マイクロＲＮＡはまた、血管新生などの複雑な生物学的プロセスも調節することができる（ｍｉＲ−１３２）（アナド（Ａｎａｎｄ）及びチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１〜１７６；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２３３】
本発明において有用な発現プロフィール、マイクロＲＮＡ及び細胞株として、例えば、米国仮特許出願第６１／８５７，４３６号明細書（代理人整理番号Ｍ３９）及び同第６１／８５７，３０７号明細書（代理人整理番号Ｍ３７）（いずれも２０１３年６月２３日出願）に教示されるものがあり、これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０２３４】
本発明のキメラポリヌクレオチドにおいて、キメラポリヌクレオチドの発現を生物学的に関連する細胞型又は関連する生物学的プロセスの状況に合わせて調整するために、こうしたプロセスに関与するマイクロＲＮＡの結合部位を除去又は導入することができる。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ配列及びｍｉＲ結合部位のリストは、２０１３年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７５３，６６１号明細書の表９、２０１３年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５４，１５９号明細書の表９、２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，９２１号明細書の表７に掲載されており、これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む。
【０２３５】
組織又は疾患特異的遺伝子発現を駆動するためのマイクロＲＮＡの使用の例が列記されている（ゲトナー（Ｇｅｔｎｅｒ）及びナルディニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）著、組織抗原（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ）、２０１２年、第８０巻、ｐ．３９３〜４０３；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。さらに、マイクロＲＮＡシード部位をｍＲＮＡに組み込むことにより、特定の細胞における発現を低減して、生物学的改善をもたらすこともできる。この一例は、ＵＧＴ１Ａ１発現レンチウイルスベクターへのｍｉＲ−１４２部位の組み込みである。ｍｉＲ−１４２シードの存在によって、造血細胞における発現が低減し、その結果、抗原提示細胞での発現が減少し、ウイルス発現ＵＧＴ１Ａ１に対する免疫応答が消失した（シュミット（Ｓｃｈｍｉｔｔ）ら著、消化器病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第１３９巻、ｐ．９９９〜１００７；ゴンザレス−アセキノラザ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｑｕｉｎｏｌａｚａ）ら著、消化器病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第１３９巻、ｐ．７２６〜７２９；いずれも、全体として参照により本明細書に組み込む）。ｍｉＲ−１４２部位の修飾ｍＲＮＡへの組み込みによって、造血細胞でのコードされたタンパク質の発現を低減することができただけでなく、ｍＲＮＡでコードされたタンパク質に対する免疫応答を低減又は無効にすることもできた。ｍｉＲ−１４２シード部位（１つ又は複数）のｍＲＮＡへの組み込みは、完全なタンパク質欠乏症を有する患者（Ｉ型ＵＧＴ１Ａ１、ＬＤＬＲ欠損患者、ＣＲＩＭ陰性Ｐｏｍｐｅ患者など）を治療する際に重要となり得る。
【０２３６】
最後に、様々な細胞型におけるマイクロＲＮＡの発現パターンを理解することによって、特定の細胞型において、又は特定の生物学的条件下でのみ、より標的化された発現のために、キメラポリヌクレオチドを操作することができる。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入により、ある組織、又は生物学的条件の状況におけるタンパク質発現のために最適となるキメラポリヌクレオチドを設計することができる。
【０２３７】
操作されたキメラポリヌクレオチドを用いて、トランスフェクション実験を関連細胞株
において行うことができ、トランスフェクション後の様々な時点でタンパク質産生をアッセイすることができる。例えば、種々のマイクロＲＮＡ結合部位操作キメラポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対しＥＬＩＳＡキットを用いて、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日の時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。マイクロＲＮＡ結合部位操作分子を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験を実施して、製剤化されたキメラポリヌクレオチドの組織特異的発現の変化を検査することもできる。
【０２３８】
５’キャップを有する領域
天然のｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核の輸出に関与し、ｍＲＮＡ安定を増大し、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合するが、これは、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質の会合を通じて、細胞内のｍＲＮＡの安定性並びに翻訳能力を担い、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシングの間、５’近位イントロンの除去も促進する。
【０２３９】
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端でキャップ付加されて、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合が生じる。次に、この５’−グアニル酸塩キャップをメチル化して、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成することができる。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／又は末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）の転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意選択で２’−Ｏ−メチル化してよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’キャップ除去は、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を分解のためにターゲティングすることができる。
【０２４０】
一部の実施形態では、キャップ部分を組み込むように、キメラポリヌクレオチドを設計することができる。本発明のキメラポリヌクレオチドに対する修飾は、キャップ除去を阻止する加水分解抵抗性のキャップ構造を生成することができるため、ｍＲＮＡの半減期を延長し得る。キャップ構造の加水分解には、５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断が必要であることから、キャッピング反応中に修飾ヌクレオチドを使用することができる。例えば、ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州イプスウィッチ）のワクチニアキャッピング酵素をα−チオ−グアノシンヌクレオチドと一緒に、製造者の指示に従い使用して、５’−ｐｐｐ−５’キャップ内にホスホロチオエート結合を形成してもよい。α−メチル−ホスホネート及びセレノ−リン酸ヌクレオチドなどの追加の修飾グアノシンヌクレオチドを使用してもよい。
【０２４１】
追加の修飾には、限定はしないが、糖環の２’−ヒドロキシル基のキメラポリヌクレオチドの５’末端及び／又は５’末端前のヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化（前述の通り）が含まれる。複数の異なる５’キャップ構造を用いて、ｍＲＮＡ分子として機能するキメラポリヌクレオチドなどの核酸分子の５’キャップを生成することができる。
【０２４２】
キャップ類似体は、本明細書では合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、又は構造的若しくは機能的キャップ類似体とも呼ばれ、キャップ機能を保持しながら、その化学構造は天然の（すなわち内因性、野生型又は生理学的）５’−キャップとは異なる。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）又は酵素的に合成してもよいし、及び／又は本発明のキメラポリヌクレオチドに連結させてもよい。
【０２４３】
例えば、アンチリバースキャップ類似体（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−三リン酸基で連結された２つのグアニンを含み、一方のグアニンは、３’−Ｏ−メチル基のほかにもＮ７メチル基を含む（すなわ
ち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ；同じく３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとも呼ばれる）。他方の非修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、キャップ付加されたキメラポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７−及び３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャップ付加されたキメラポリヌクレオチドの末端部分をもたらす。
【０２４４】
別の例示的キャップは、ｍＣＡＰであり、ＡＲＣＡに類似しているが、２’−Ｏ−メチル基をグアノシン上に有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０２４５】
キャップ類似体は、インビトロ転写反応においてキメラポリヌクレオチド又はその領域の同時キャッピングを可能にするが、転写物の最大２０％がキャッピングされていないままであってもよい。このことと、内因性の細胞転写機構により産生された核酸の内因性５’キャップ構造とのキャップ類似体の構造的相違は、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下を招き得る。
【０２４６】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、より真正な５’キャップ構造を生成するために、製造後（ＩＶＴ又は化学合成のいずれにかかわらず）にも酵素を用いてキャッピングすることができる。本明細書で使用されるとき、語句「より真正」は、構造的若しくは機能的に内因性又は野生型の特徴を非常によく反映又は模倣した特徴を指す。つまり、「より真正」な特徴は、従来技術の合成の特徴又は類似体などと比較して、内因性、野生型、天然若しくは生理学的な細胞機能及び／又は構造をよりよく表すか、あるいは、１つ又は複数の点において、対応する内因性、野生型、天然若しくは生理学的な特徴よりも性能がよい特徴である。本発明のより真正な５’キャップ構造の非制限的例は、とりわけ、当技術分野で知られる合成の５’キャップ構造（又は野生型、天然若しくは生理学的５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合の増強、半減期の延長、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性の低下及び／又は５’キャップ除去の抑制を有するものである。例えば、組換えワクチニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）キャッピング酵素及び組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、キメラポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチとドの間に標準的な５’−５’−三リン酸結合を生成することができ、ここで、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含み、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含んでいる。このような構造は、キャップ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当技術分野で公知の他の５’キャップ類似体と比較して、高度な翻訳能力と細胞安定性及び細胞の炎症促進性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造は、限定はしないが、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）を含む。
【０２４７】
キメラポリヌクレオチドは、製造後にキャップ付加してもよく、また、このプロセスは、より高効率であるため、ほぼ１００％のキメラポリヌクレオチドがキャップ付加され得る。これは、キャップ類似体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の過程でキメラポリヌクレオチドに連結される場合の約８０％と対照的である。
【０２４８】
本発明によれば、５’末端キャップは、内因性キャップ又はキャップ類似体を含んでもよい。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニン類似体を含んでもよい。有用なグアニン類似体として、限定はしないが、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンが挙げられる。
【０２４９】
ウイルス配列
別のウイルス配列、例えば、限定はしないが、オオムギ黄萎ウイルス（ｂａｒｌｅｙ  ｙｅｌｌｏｗ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（Ｊａａｇｓｉｅｋｔｅ  ｓｈｅｅｐ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（ＪＳＲＶ）及び／又は動物地方流行性鼻腫瘍ウイルス（ｅｎｚｏｏｔｉｃ  ｎａｓａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）の翻訳エンハンサー配列など（例えば、国際公開第２０１２１２９６４８号パンフレットを参照；全体として参照により本明細書に組み込む）を操作して、本発明のキメラポリヌクレオチドに挿入することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの構築物の翻訳を刺激することができる。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡによって、トランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日の時点でタンパク質産生をアッセイすることができる。
【０２５０】
ＩＲＥＳ配列
さらに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得るキメラポリヌクレオチドが提供される。特徴的なピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａ  ｖｉｒｕｓ）として最初に同定され、ＩＲＥＳは、５’キャップ構造の非存在下でタンパク質合成を開始する上で重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用し得るか、又はｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして作用し得る。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を含有するキメラポリヌクレオチドは、リボソームにより独立して翻訳される複数のペプチド又はポリペプチドをコードし得る（マルチシストロン性核酸分子）。キメラポリヌクレオチドが、ＩＲＥＳと一緒に提供されるとき、任意選択で、第２の翻訳可能な領域もさらに提供される。本発明に従って使用することができるＩＲＥＳ配列の例として、限定はしないが、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａ  ｖｉｒｕｓ）（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＰＶ）、脳脊髄炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＶ）、又はコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）が挙げられる。
【０２５１】
ポリＡテイル
安定性を高めるために、ＲＮＡのプロセシング中に、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテイル）をｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加することができる。転写直後に、転写物の３’末端を切断して、３’ヒドロキシルを遊離させることができる。そのとき、ポリＡポリメラーゼは、ＲＮＡにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれるプロセスは、ポリＡテイルを付加するが、これは、例えば、約１００〜２５０残基長であってよい。
【０２５２】
また、ポリＡテイルは、構築物が核から輸出された後に付加することもできる。
本発明によれば、ポリＡテイル上の末端基を安定化のために組み込んでもよい。本発明のキメラポリヌクレオチドは、ｄｅｓ−３’ヒドロキシルテイルを含んでもよい。これらはまた、ジュンジエ・リー（Ｊｕｎｊｉｅ  Ｌｉ）ら（カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１５巻、ｐ．１５０１〜１５０７、２００５年８月２３日）（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）により教示される通りの構造部分又は２’−Ｏメチル修飾を含んでもよい。
【０２５３】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む別のポリＡテイルを含む
転写物をコードするように設計することができる。ノーベリー（Ｎｏｒｂｕｒｙ）によれば、「末端ウリジン化もヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡに検出されている。これらのｍＲＮＡのターンオーバは、染色体ＤＮＡ複製の完了又は阻害後の潜在的に毒性のヒストン蓄積を阻止する上で重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テイルの欠如により識別され、その機能は、それよりもむしろ、安定したステム−ループ構造及びそのコグネイトステム−ループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）により想定され；後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡ上のＰＡＢＰのそれと同じ機能を果たす」（ノーベリー（Ｎｏｒｂｕｒｙ）著、「細胞質ＲＮＡ：本末転倒の事例（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｗａｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｇ）」、ネイチャー・レビューズ  分子細胞生物学（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ、２０１３年８月２９日にオンラインで公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２５４】
ユニークなポリＡテイルの長さが、本発明のキメラポリヌクレオチドにいくつかの利点をもたらす。
一般に、本発明のポリＡテイルの長さは、３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ポリＡテイルは、３５ヌクレオチド長より長い（例えば、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド以上）。一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチド又はその領域は、約３０〜約３，０００ヌクレオチドを含む（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００）。
【０２５５】
一実施形態では、ポリＡテイルは、キメラポリヌクレオチド全体の長さ又はキメラポリヌクレオチドの特定の領域の長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴若しくは領域の長さに基づいて、又はキメラポリヌクレオチドから発現された最終産物の長さに基づいて行ってよい。
【０２５６】
これに関して、ポリＡテイルは、長さが、キメラポリヌクレオチド又はそれらの特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％長くてもよい。ポリＡテイルはまた、それが属するキメラポリヌクレオチドの画分として設計してもよい。これに関連して、ポリＡテイルは、構築物の全長、構築物領域又はポリＡテイルを除いた構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、若しくは９０％、又はそれ以上であってもよい。さらに、ポリＡ結合タンパク質に対するキメラポリヌクレオチドの操作された結合部位及び共役によって、発現を増強することができる。
【０２５７】
さらに、ポリＡテイルの３’末端での修飾ヌクレオチドを用いたＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して、複数の異なるキメラポリヌクレオチドを互いに連結することがで
きる。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ＥＬＩＳＡにより、トランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日の時点でタンパク質産生をアッセイすることができる。
【０２５８】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、ポリＡ−Ｇカルテット（Ｑｕａｒｔｅｔ）領域を含有するように設計される。Ｇ−カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方でＧリッチ配列によって形成することができる、４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合配列である。この実施形態において、Ｇ−カルテットは、ポリＡテイルの末端に組み込まれる。得られたポリヌクレオチドは、様々な時点で、安定性、タンパク質産生及び半減期などのその他のパラメータについてアッセイする。ポリＡ−Ｇカルテットによって、１２０ヌクレオチドのポリＡテイル（配列番号２１）を単独で用いて認められたものの少なくとも７５％と同等のｍＲＮＡからのタンパク質産生が達成されることが判明している。
【０２５９】
開始コドン
一部の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似するか、又はそれと同様に機能する領域を有し得る。
【０２６０】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始し得る。キメラポリヌクレオチドの翻訳は、例えば、限定はしないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ（トウリオール（Ｔｏｕｒｉｏｌ）ら著、細胞の生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ）、第９５巻、２００３年、ｐ．１６９〜１７８、並びにマツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）及びマウロ（Ｍａｕｒｏ）著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻、ｐ．１１を参照；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）などの代替開始コドンで開始し得る。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンＡＣＧで開始する。別の非制限的例として、キメラポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンＣＴＧ／ＣＵＧで開始する。また別の非制限的例として、キメラポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンＧＴＧ／ＧＵＧで開始する。
【０２６１】
翻訳を開始するコドン、例えば、限定はしないが、開始コドン又は代替開始コドンなどにフランキングするヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／又は構造に影響を与えることがわかっている。（例えば、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）及びマウロ（Ｍａｕｒｏ）著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻、ｐ．１１を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。翻訳を開始するコドンにフランキングするヌクレオチドのいずれかのマスキングを用いて、ポリヌクレオチドの翻訳開始、翻訳効率、長さ及び／又は構造を改変することもできる。
【０２６２】
一実施形態では、コドンをマスキング又は隠蔽して、マスキングした開始コドン又は代替開始コドンでの翻訳開始の確率を低下させるために、開始コドン又は代替開始コドン付近でマスキング剤を使用してもよい。マスキング剤の非制限的例として、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）及びマウロ（Ｍａｕｒｏ）が記載するマスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣ（プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１０年、第５巻：ｐ．１１）を参照のこと；これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２６３】
別の実施形態では、翻訳が代替開始コドンで開始する見込みを高めるために、マスキング剤を用いて、キメラポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングすることができる。
一実施形態では、翻訳が、マスキングした開始コドン又は代替開始コドンの下流で開始する見込みを高めるために、マスキング剤を用いて、第１の開始コドン又は代替開始コドンをマスキングすることができる。
【０２６４】
一実施形態では、開始コドン又は代替開始コドンは、ｍｉＲ結合部位の完全な補体内に位置してもよい。ｍｉＲ結合部位の完全な補体は、マスキング剤と同様に、キメラポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び／又は構造を制御する上で役立ち得る。非制限的例として、開始コドン又は代替開始コドンは、ｍｉＲ−１２２結合部位の完全な補体の中央に位置してもよい。開始コドン又は代替開始コドンは、第１ヌクレオチド、第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチド、第４ヌクレオチド、第５ヌクレオチド、第６ヌクレオチド、第７ヌクレオチド、第８ヌクレオチド、第９ヌクレオチド、第１０ヌクレオチド、第１１ヌクレオチド、第１２ヌクレオチド、第１３ヌクレオチド、第１４ヌクレオチド、第１５ヌクレオチド、第１６ヌクレオチド、第１７ヌクレオチド、第１８ヌクレオチド、第１９ヌクレオチド、第２０ヌクレオチド若しくは第２１ヌクレオチドの後に位置してもよい。
【０２６５】
別の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドの開始コドンは、開始コドンではないコドンでキメラポリヌクレオチドの翻訳を開始させるために、キメラポリヌクレオチド配列から除去してもよい。キメラポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの後のコドンで、又は下流の開始コドンで、あるいは代替開始コドンで開始し得る。非制限的例では、下流の開始コドン又は代替開始コドンで翻訳を開始させるために、キメラポリヌクレオチド配列の最初の３つのヌクレオチドとして開始コドンＡＴＧ／ＡＵＧを除外する。開始コドンが除去されたキメラポリヌクレオチド配列は、キメラポリヌクレオチドの翻訳開始、長さ及び／若しくはキメラポリヌクレオチドの構造を制御する、又は制御を試みるために、下流の開始コドン及び／又は代替開始コドンに対する少なくとも１種のマスキング剤をさらに含んでもよい。
【０２６６】
終止コドン
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に、少なくとも２つの終止コドンを含んでもよい。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから選択することができる。一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、終止コドンＴＧＡと追加の終止コドンを含む。さらに別の実施形態では、追加の終止コドンは、ＴＡＡであってもよい。別の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、３つの終止コドンを含む。
【０２６７】
シグナル配列
キメラポリヌクレオチドはまた、治療に関連する部位へのポリペプチドの輸送を促進する追加の特徴もコードし得る。タンパク質輸送を補助するこのような特徴の１つは、シグナル配列である。本明細書で用いられるとき、「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、それぞれ、コード領域又はコードされたポリペプチドの５’側（若しくはＮ末端）に組み込まれる約９〜２００ヌクレオチド（３〜６０アミノ酸）長の、ポリヌクレオチド又はポリペプチドである。これらの配列の付加によって、１つ又は複数の分泌経路を介した小胞体への、コードされたポリペプチドの輸送が達成される。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０２６８】
本明細書で使用することができる追加のシグナル配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／又はｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／に見出されるものなどのデータベースに教示されているものを含む。米国特許第８，１２４，３７９号明細書；同第７，４１３，８７５号明細書及び同第７，３８５，０３４号明細書に記載されているものもまた、本発明の範囲に含
まれ、これらの文献の各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０２６９】
タンパク質切断シグナル及び部位
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を含有する少なくとも１つのタンパク質切断シグナルを含んでもよい。タンパク質切断部位は、Ｎ末端、Ｃ末端、Ｎ末端とＣ末端の間の任意の空間、例えば、限定はしないが、Ｎ末端とＣ末端との中間、Ｎ末端と中間地点の間、中間地点とＣ末端の間、並びにこれらの組み合わせに位置してよい。
【０２７０】
本発明のポリペプチドは、限定はしないが、プロタンパク質コンベルターゼ（若しくはプロホルモンコンベルターゼ）、トロンビン又は因子Ｘａタンパク質切断シグナルを含み得る。プロタンパク質コンベルターゼは、９つのプロテイナーゼのファミリーであり、これは、酵母ケキシンに関連する７つの塩基性アミノ酸特異的スブチリシン様セリンプロテイナーゼ（プロホルモンコンベルターゼ１／３（ＰＣ１／３）、ＰＣ２、フリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、対合塩基性アミノ酸切断酵素４（ＰＡＣＥ４）及びＰＣ７として知られる）と、非塩基性残基を切断する他の２つのスブチラーゼ（スブチリシンケキシンイソザイム１（ＳＫＩ−１）及びプロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケキシン８（ＰＣＳＫ９）と呼ばれる）を含む。
【０２７１】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、キメラポリヌクレオチドが、少なくとも１つのコードされたタンパク質切断シグナルを含有するように操作することもできる。コードされたタンパク質切断シグナルは、開始コドンの前、開始コドンの後、コード領域の前、コード領域内、例えば、限定はしないが、コード領域内の中間、開始コドンと中間地点の間、中間地点と終止コドンの間、コード領域の後、終止コドンの前、２つの終止コドンの間、終止コドンの後、並びにこれらの組み合わせに位置してよい。
【０２７２】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つのタンパク質切断部位を含有する少なくとも１つのコードされたタンパク質切断シグナルを含んでもよい。コードされたタンパク質切断シグナルとして、限定はしないが、プロタンパク質コンベルターゼ（若しくはプロホルモンコンベルターゼ）、トロンビン及び／又は因子Ｘａタンパク質切断シグナルが挙げられる。
【０２７３】
非制限的例として、米国特許第７，３７３，９３０号明細書及び米国特許出願公開第２００９０２２７６６０号明細書では、フリン切断部位を使用して、細胞のゴルジ装置からの発現産物におけるＧＬＰ−１のＮ末端メチオニンを切断する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドがＧＬＰ−１ではないという条件で、少なくとも１つのタンパク質切断シグナル及び／又は部位を含む。
【０２７４】
挿入及び置換
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域及び／又はストリングの挿入によって置換してもよい。ヌクレオチド領域及び／又はストリングは、限定はしないが、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７又は少なくとも８個のヌクレオチドを含んでもよく、ヌクレオチドは、天然及び／又は非天然のいずれであってもよい。非制限的例として、ヌクレオチドの群は、５〜８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示する他のヌクレオチドのいずれかの鎖及び／又はこれらの組み合わせを含み得る。
【０２７５】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、２つの異なる塩基、例えば、限定はしないが、アデニン、シトシン、チミン、並びに本明細書に開示する他のヌクレ
オチドのいずれか及び／又はこれらの組み合わせのヌクレオチドの少なくとも２つの領域及び／又は鎖の挿入によって置換してもよい。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８個のアデニン塩基の挿入、続いて５〜８個のシトシン塩基の挿入により置換することができる。別の例では、５’ＵＴＲは、５〜８個のシトシン塩基の挿入、続いて５〜８個のアデニン塩基の挿入により置換することができる。
【０２７６】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換及び／又は挿入を含んでもよい。非制限的例として、少なくとも１つの置換及び／又は挿入は、転写開始部位のすぐ下流（例えば、限定はしないが、＋１〜＋６）の領域における少なくとも１つの核酸を置換することによって、転写開始部位の下流で起こり得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域に対する変化は、開始速度に影響を与え、見掛けヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数の値を増加すると共に、転写複合体からの短い転写物の解離を増大して、初期転写をキュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）し得る（ブリーバ（Ｂｒｉｅｂａ）ら著、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２年、第４１巻、ｐ．５１４４〜５１４９；全体として参照により本明細書に組み込む）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換及び／又は挿入は、当該配列のサイレント突然変異を引き起こすか、又はアミノ酸配列に突然変異を引き起こし得る。
【０２７７】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、又は少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含み得る。
【０２７８】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流の領域に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含み得る。非制限的例として、上記領域中のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４個のアデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非制限的例では、上記領域中のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４個のシトシン塩基によって置換され得る。別の非制限的例では、上記領域中のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡであるとき、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、若しくは少なくとも４個のチミン、及び／又は本明細書に記載するヌクレオチドのいずれかによって置換され得る。
【０２７９】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、開始コドンの上流に少なくとも１つの置換及び／又は挿入を含んでもよい。明瞭化の目的で、開始コドンが、タンパク質コード領域の最初のコドンであり、また、転写開始部位は、転写が開始する部位であることを当業者は理解されよう。キメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、ヌクレオチド塩基の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８つの置換及び／又は挿入を含み得る。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の１、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、若しくは少なくとも５つの位置で挿入又は置換されていてもよい。挿入及び／又は置換されたヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、全てＡ若しくは全てＣ若しくは全てＴ若しくは全てＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡとＣ、ＡとＴ、若しくはＣとＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ及びＴ若しくはＡ、Ｃ及びＴ）又は少なくとも４つの異なる塩基であってもよい。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドのコード領域上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、又は本明細書に記載するヌクレオチドのいずれかで置換してもよい。別の非制限的例では、キメラポリヌクレオチド中のグアニ
ン塩基の置換は、転写開始の下流の領域で、且つ開始コドンの前に１つのグアニン塩基を残すように設計してもよい（エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７２巻（７３４４）、ｐ．４９９〜５０３を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、転写開始部位の下流で、しかも開始コドンの上流の１位置に少なくとも５個のヌクレオチドを挿入することができ、これら少なくとも５個のヌクレオチドは同じ塩基タイプであってもよい。
【０２８０】
転写後制御モジュレータの組み込み
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写後制御モジュレータを含んでもよい。これらの転写後制御モジュレータは、限定はしないが、小分子、化合物及び調節配列であってよい。非制限的例として、転写後制御は、ＰＴＣセラピューティクス社（ＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）（ニュージャージー州サウスプレインフィールド）によって、そのＧＥＭＳ（商標）（小分子による遺伝子発現調節（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）スクリーニング技術を用いて同定される小分子を使用して達成することができる。
【０２８１】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている少なくとも１つの転写後制御モジュレータを含んでもよい。転写後制御モジュレータの非制限的例は、国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットのパラグラフ［０００２９９］〜［０００３０４］に記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０２８２】
ＩＩ．キメラポリヌクレオチドの設計、合成及び定量
設計−コドン最適化
キメラポリヌクレオチド、その領域又は部分若しくはサブ領域は、コドン最適化してもよい。コドン最適化の方法は、当技術分野で公知であり、いくつかの目標の１つ又は複数を達成する試みにおいて有用となり得る。これらの目標としては、以下のものが挙げられる：適正な折り畳みを確実にするために標的及び宿主生物のコドン使用頻度をマッチさせること、ｍＲＮＡの安定性の増大若しくは二次構造の低減のためにＧＣ含量を偏らせること、遺伝子構築若しくは発現を障害し得るタンデム反復コドン若しくは塩基ランを最小限化にすること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入若しくは除去すること、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去若しくはシャッフルすること、制限部位を挿入する、又は欠失させること、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインの適正な折り畳みを可能にするように翻訳速度を調節すること、あるいは、ポリヌクレオチド内で問題となる二次構造を低減又は排除すること。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野において公知であり、非制限的例として、ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンロパーク）及び／又は専有の方法がある。一実施形態では、最適化アルゴリズムを用いて、ＯＲＦ配列を最適化する。各アミノ酸についてのコドンオプションを表１に記載する。
【０２８３】
【表１】
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本発明の一部の実施形態において有益と考えられ得る特徴は、キメラポリヌクレオチドの領域によりコードすることができ、こうした領域は、ポリペプチドをコードする領域に対して上流（５’）又は下流（３’）のいずれであってもよい。これらの領域は、タンパク質コード領域若しくはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のコドン最適化前及び／又は後に、キメラポリヌクレオチドに組み込んでもよい。キメラポリヌクレオチドが、５’及び３’フランキング領域の両方を含む必要はない。こうした特徴の例として、限定はしないが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列、オリゴ（ｄＴ）配列、及び検出可能なタグが挙げられ、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローン化部位も含まれ得る。
【０２８４】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲは、フランキング領域として提供される。複数の５’又は３’ＵＴＲがフランキング領域に含まれていてもよく、同じ又は異なる配列であってもよい。フランキング領域のいずれかの部分（ない場合もある）をコドン最適化してもよく、これらは、独立して、コドン最適化の前及び／又は後に、１つ又は複数の異なる構造的若しくは化学修飾を含んでもよい。
【０２８５】
最適化の後（所望であれば）、キメラポリヌクレオチド成分を再構成して、ベクター、
例えば、限定はしないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体に形質転換する。例えば、最適化ポリヌクレオチドを再構成した後、ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、アカパンカビ（ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トウモロコシ、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などに形質転換することができ、ここで、本明細書に記載する方法により、多コピープラスミド様又は染色体構造が形成される。
【０２８６】
合成ポリヌクレオチド及びその核酸類似体は、生化学プロセスの研究及び試験において重要な役割を果たす。ポリヌクレオチド及び核酸を合成するために、様々な酵素補助及び化学的方法が開発されている。
【０２８７】
酵素的方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−酵素的合成
キメラポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）システムを用いて、転写することができる。このシステムは、典型的に、転写バッファー、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、所内で製造するか、供給業者から選択するか、又は本明細書に記載する通りに合成してもよい。ＮＴＰは、限定はしないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰなどの本明細書に記載するものから選択することができる。ポリメラーゼは、限定はしないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、並びに限定はしないが、キメラポリヌクレオチド（例えば、修飾核酸）を組み込むことができるポリメラーゼなどの突然変異ポリメラーゼから選択することができる。
【０２８８】
合成に有用なＲＮＡポリメラーゼ
本発明のキメラポリヌクレオチドの合成には、任意の数のＲＮＡポリメラーゼ又は変異体を使用してよい。
【０２８９】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸の挿入又は欠失によって修飾してもよい。非制限的例として、ＲＮＡポリメラーゼは、非修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む能力の増大を呈示するように、修飾してもよい（国際公開第２００８０７８１８０号パンフレット及び米国特許第８，１０１，３８５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２９０】
変異体は、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸及び／若しくは核酸配列を最適化する、並びに／又は当分野で公知の方法を用いることにより、取得することができる。非制限的例として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（２０１１年）第４７２巻（７３４４）、ｐ．４９９〜５０３；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）により記載される持続的定向進化システムを用いて進化させることができ、ここで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、限定はしないが、トレオニン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ又はＬ８６４Ｆが置換された９３位のリシンなどの少なくとも１つの突然変異をコードし得る。別の非制限的例として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、米国特許出願公開第２０１００１２００２４
号明細書及び同第２００７０１１７１１２号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りの少なくとも突然変異をコードしてもよい。ＲＮＡポリメラーゼの変異体は、限定はしないが、置換変異体、保存的アミノ酸置換、挿入変異体、欠失変異体、及び／又は共有結合誘導体も含み得る。
【０２９１】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、野生型又は変異型ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計してもよい。それを実施する際に、野生型又は親キメラポリヌクレオチドからの配列変化の部位若しくは領域を含有するように、キメラポリヌクレオチドを修飾することができる。
【０２９２】
ポリヌクレオチド又は核酸合成反応は、ポリメラーゼを用いた酵素的方法により実施することもできる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド又は核酸鎖においてヌクレオチド同士のリン酸ジエステル結合の形成を触媒する。現在既知のＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較及び結晶構造分析に基づいて種々のファミリーに分けることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、並びにＴ７ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）又はＡポリメラーゼファミリーは、これらのファミリーのうち最もよく研究されているものである。別の大きなファミリーは、ＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌα）又はＢポリメラーゼファミリーであり、全ての真核生物複製ＤＮＡポリメラーゼ及びファージＴ４及びＲＢ６９由来のポリメラーゼが含まれる。これらは、類似した触媒機構を使用するが、これらのポリメラーゼファミリーは、基質特異性、プライマー伸長のための基質類似体組み込み効率、程度及び速度、ＤＮＡ合成の様式、エキソヌクレアーゼ活性、及び阻害剤に対する感受性が異なる。
【０２９３】
ＤＮＡポリメラーゼはまた、それらに必要な最適反応条件、例えば、反応温度、ｐＨ、並びに鋳型及びプライマー濃度に基づいて選択される。場合によっては、所望のＤＮＡ断片サイズ及び合成効率を達成するために、２つ以上のＤＮＡポリメラーゼの組み合わせを使用する。例えば、チェン（Ｃｈｅｎｇ）らは、クローン化挿入片及びヒトゲノムＤＮＡ由来の長い標的を効果的に増幅するために、ｐＨを高め、グリセロール及びジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少させ、伸長時間を増加すると共に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する二次熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、ＰＮＡＳ，第９１巻、ｐ．５６９５〜５６９９、１９９４年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６ポリメラーゼからのＲＮＡポリメラーゼは、生化学及び生物物理学研究のためのＲＮＡを調製するのに広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、及びポリＡポリメラーゼは、同時係属国際公開第２０１４０２８４２９号パンフレットに開示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０２９４】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドの合成に使用することができるＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼである（チュー（Ｚｈｕ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年を参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼは、近年、チュー（Ｚｈｕ）らにより海洋シアノファージから特性決定されており、その際、彼らは、プロモータ配列も同定した（チュー（Ｚｈｕ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年を参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。チュー（Ｚｈｕ）らは、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、広い温度範囲及び塩分濃度にわたってＲＮＡ合成を触媒することを見出した。さらに、プロモータでヌクレオチドを開始するための要件は、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼの場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、それほど厳
しくないことも判明し、ＲＮＡ合成を目的とするＳｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼが有望となった。
【０２９５】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドの合成に、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。非制限的例として、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼは、正確な３’末端を必要とするキメラポリヌクレオチドの合成に用いてもよい。
【０２９６】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの合成に、Ｓｙｎ５プロモータを使用することができる。非制限的例として、Ｓｙｎ５プロモータは、チュー（Ｚｈｕ）ら（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）により記載される通りに、５’−ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ−３’（配列番号３）であってもよい。
【０２９７】
一実施形態では、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知の少なくとも１つの化学修飾を含むキメラポリヌクレオチドの合成に、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。（例えば、チュー（Ｚｈｕ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年に記載されているプソイド−ＵＴＰ及び５Ｍｅ−ＣＴＰの組み込みを参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０２９８】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、チュー（Ｚｈｕ）ら（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年を参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）により記載される修正及び改善された精製方法を用いて精製したＳｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼを使用して、合成することもできる。
【０２９９】
遺伝子工学における様々なツールは、鋳型として作用する標的遺伝子の酵素的増幅に基づく。個々の遺伝子又は目的とする特定の領域の配列の研究、及び他の研究ニーズのために、ポリヌクレオチド又は核酸の小さなサンプルから標的遺伝子の多数のコピーを作製する必要がある。このような方法は、本発明のキメラポリヌクレオチドの製造に適用することも可能である。
【０３００】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的遺伝子の高速増幅、並びにゲノムマッピング及び配列決定において広い用途を有する。ＤＮＡを合成する重要な構成要素には、鋳型としての標的ＤＮＡ分子、標的ＤＮＡ鎖の末端と相補的なプライマー、ビルディングブロックとしてのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＤＮＡポリメラーゼが含まれる。ＰＣＲは、変性、アニーリング及び伸長ステップを通して進行するため、新たに生成されるＤＮＡ分子が、次の複製の環の鋳型として働くことができ、標的ＤＮＡの指数関数的増幅を達成する。ＰＣＲは、変性及びアニーリングの加熱及び冷却サイクルを必要とする。基本的なＰＣＲの変形として、以下のものが挙げられる：非対称ＰＣＲ［イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら著、ＰＮＡＳ、第８５巻、ｐ．９４３６〜９４４０、１９８８年］、インバースＰＣＲ［オフマン（Ｏｃｈｍａｎ）ら著、遺伝子学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１２０巻（３）、ｐ．６１２〜６２３、１９８８年］、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら著、バイオテクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２６巻（１）、ｐ．１１２〜２２、ｐ．１２４〜５（１９９９）；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ＲＴ−ＰＣＲでは、一本鎖ＲＮＡが所望の標的であり、最初に逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに変換される。
【０３０１】
ＰＣＲに代わり、又はその補完物として多様な等温ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅技術が開発されている。例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、制限酵素がニックを形成する能力に基づく。（ウォーカ（Ｗａｌｋｅｒ）ら著、ＰＮＡＳ、第８９巻、ｐ．３９２〜３９６、１
９９２年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。アニーリングしたプライマー配列に制限酵素認識配列を挿入する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰにより伸長されて、二重螺旋を形成する。次に、制限酵素により二重螺旋の一方の鎖のみを切断する。このとき、各一本鎖は、後の合成のための鋳型として利用可能である。ＳＤＡは、ＰＣＲの複雑な温度制御サイクルを必要としない。
【０３０２】
核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）とも呼ばれ、これもまた、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ  Ｈ、及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する等温増幅である。［コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５０巻、ｐ．９１〜９２、１９９１年］（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。標的ＲＮＡを鋳型として使用すると、逆転写酵素は、その相補的ＤＮＡ鎖を合成する。ＲＮＡｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ鋳型とハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ標的と相補的な第１のＤＮＡ鎖と相補的なＤＮＡ鎖を合成するための空間を作り、これによってＤＮＡ二重螺旋を形成する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、このＤＮＡ二重螺旋の相補的ＲＮＡ鎖を連続的に生成する。これらのＲＮＡ鎖は、ＤＮＡ合成の新たなサイクルの鋳型として働き、標的遺伝子の増幅をもたらす。
【０３０３】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、一本鎖環状ポリヌクレオチドを増幅するが、複数ラウンドの等温酵素的合成を必要とし、その際、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ポリヌクレオチド環の周囲を連続的に進み、その配列を繰り返し複製することにより、プライマーを伸長する。従って、環状鋳型の線状コピーが達成される。次に、この線状コピーにプライマーをアニーリングして、その相補的鎖を合成することができる。［リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１９巻、ｐ．２２５〜２３２、１９９８年］（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。一本鎖環状ＤＮＡもまた、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でのＲＮＡ合成の鋳型として使用することができる。（ダウベンディーク（Ｄａｕｂｅｎｄｉｅｋ）ら著、ＪＡＣＳ、第１１７巻、ｐ．７８１７〜７８１９、１９９５年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ｃＤＮＡ末端のインバース高速増幅（ＲＡＣＥ）ＲＣＡが、ポリドロス（Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓ）らにより記載されている。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をｃＤＮＡに逆転写した後、ＲＮＡｓｅＨ処理に付すことにより、ｃＤＮＡを分離する。次に、サークリガーゼ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ）によりｃＤＮＡを環状ＤＮＡに環状化する。得られた環状ＤＮＡの増幅は、ＲＣＡを用いて達成される。（ポリドロス（Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓ）ら著、バイオテクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第４１巻、ｐ．３５〜４２（２００６）；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０３０４】
本発明のキメラポリヌクレオチドの１つ又は複数の領域の製造に前述の方法のいずれを使用してもよい。
リガーゼによるポリヌクレオチド又は核酸のアセンブリングもまた広く使用されている。ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、リン酸ジエステル結合の形成を介してポリヌクレオチド鎖の５’及び３’末端の分子内連結を促進する。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、２つの隣接するポリヌクレオチドプローブが、標的遺伝子の一方の鎖とハイブリダイズして、リガーゼにより互いに結合するという原理に基づく有望な診断技術である。標的遺伝子が存在しない場合、又は標的遺伝子にミスマッチ、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する場合には、プローブは、リガーゼとして働くことができない。（ウィードマン（Ｗｉｅｄｍａｎｎ）ら著、ＰＣＲ法及び適用（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、第３巻（４）、ｐ．ｓ５１〜ｓ６４、１９９４年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ＬＣＲは、検出の感度を高める、又はポリヌクレオチド及び核酸の合成に使用される場合には、産物の量を増加するために、様々な増幅技術と組み合わせてもよい。
【０３０５】
核酸のためのいくつかのライブラリー調製キットが現在市販されている。これらは、少量の核酸サンプルを下流適用のための指示ライブラリーに変換する酵素及びバッファーを含む。例えば、ＤＮＡ断片は、最終調製、連結、サイズ選択、クリーンアップ、ＰＣＲ増幅及び最終クリーンアップのために、ニュー・イングランド・バイオラボ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）（登録商標）によるネブネクスト（ＮＥＢＮＥＸＴ）（登録商標）ウルトラ（ＵＬＴＲＡ）（商標）ＤＮＡライブラリープレップキット（ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）内に配置する。
【０３０６】
増幅技術を改善するために、継続的な開発が進行中である。例えば、アサダ（Ａｓａｄａ）らの米国特許第８，３６７，３２８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の効率を増大するために反応促進剤の使用を教示している。反応促進剤は、酸性物質又は酸性物質のカチオン性複合体を含む。キタバヤシ（Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ）らの米国特許第７．３８４，７４９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、酵素的ＤＮＡ合成を促進するカルボン酸イオン補充物質を教示しており、ここで、カルボン酸イオン補充物質は、シュウ酸、マロン酸、シュウ酸のエステル、マロン酸のエステル、マロン酸の塩、及びマレイン酸のエステルから選択される。ソベク（Ｓｏｂｅｋ）らの米国特許第７，３７８，２６２号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、ＤＮＡ増幅の忠実性を増大する酵素組成物を開示している。この組成物は、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、ポリメラーゼ活性のない１つの酵素と、ポリメラーゼである別の酵素を含む。いずれの酵素も熱安定性であり、より低温で不活性となるように可逆的に修飾される。
【０３０７】
ゲッツ（Ｇｅｔｔｓ）らの米国特許第７，５５０，２６４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、オリゴデオキシヌクレオチドテイルをｃＤＮＡ分子の３’末端に結合させた後、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ転写を開始することにより、センスＲＮＡ分子の合成を複数回ラウンド実施することを教示している。ロハイェム（Ｒｏｈａｙｅｍ）の米国特許出願公開第２０１３／０１８３７１８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、一本鎖ＤＮＡ鋳型にＲＮＡポリメラーゼ活性を展示するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）によるＲＮＡ合成を教示している。非標準ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、酵素的重合を用い、ベナー（Ｂｅｎｎｅｒ）の米国特許第６，６１７，１０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示される通りに、非標準ヌクレオチドを含む鋳型をその鋳型のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの混合物と接触させることによって合成することができる。
【０３０８】
固相化学合成
本発明の化学ポリヌクレオチドは、固相技術を用いて全部又は一部を製造することができる。
【０３０９】
ポリヌクレオチド又は核酸の固相化学合成は、自動化された方法であり、この方法では、分子を固体支持体上で固定化してから、反応体溶液中で段階的に合成する。不純物及び余剰の反応体は洗い流すため、各ステップ後に精製は必要ない。工程の自動化は、コンピュータ制御固相合成装置で実施しやすい。固相合成によって、比較的大きな規模でのポリヌクレオチド又は核酸の高速生産が可能になり、これにより、一部のポリヌクレオチド又は核酸が市場で入手可能となる。さらに、これは、ポリヌクレオチド又は核酸配列への化学修飾の部位特異的導入にも有用である。これは、天然の核酸の修飾誘導体を設計する上で不可欠なツールである。
【０３１０】
自動化固相合成において、鎖は３’から５’方向に合成される。ヌクレオシドの３’末端のヒドロキシル基は、化学的に切断可能な、又は光分解リンカーを介して固体支持体に係留される。活性化ヌクレオシドモノマー、例えば、２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ及びＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ）、又は化学修飾ヌクレオシドを順次支持体結合ヌクレオシドに付加する。現在最も広く使用されているモノマーは、ヌクレオシドビルディングブロックの３’−ホスホロアミダイト誘導体である。活性化モノマーの３’リン原子は、支持体結合ヌクレオシドの５’酸素原子とカップリングして、リン酸トリエステルを形成する。副反応を防止するために、カップリング反応に関与しないあらゆる官能基、例えば、５’ヒドロキシル基、３’リン原子上のヒドロキシル基、リボヌクレオシド分子中の２’ヒドロキシル基、及びプリン若しくはピリミジン塩基上のアミノ基などは全て、保護基で遮断する。次のステップは、リン酸トリエステルを酸化して、リン酸トリエステル又はホスホトリエステルを形成するものであり、ここで、リン原子は、五価である。続いて、成長する鎖の末端の５’ヒドロキシル基上の保護基を除去すると、新来の活性化モノマービルディングブロックとのカップリングが可能になる。合成の終了時に、アンモニア又は水酸化アンモニウムなどの切断剤を添加して、保護基を全て除去することにより、固体支持体からポリヌクレオチド鎖を放出させる。また、光を当てて、ポリヌクレオチド鎖を切断してもよい。次に、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は電気泳動を用いて、産物を精製することができる。
【０３１１】
固相合成では、３’ヒドロキシル基を介してポリヌクレオチド鎖を固体支持体に共有結合させる。固体支持体は、典型的には直径５０〜２００μｍの不溶性粒子であり、樹脂とも呼ばれる。ギュザイブ（Ｇｕｚａｅｖ）による「ポリヌクレオチド合成のための固相支持体（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）［ギュザイブ（Ｇｕｚａｅｖ）著、核酸化学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３．１．１〜３．１．６０、２０１３年］（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に論じられている通り、多種の樹脂が現在入手可能である。樹脂に最も一般的な材料としては、高度架橋ポリスチレンビーズ及び多孔性ガラス（ＣＰＧ）ビーズが挙げられる。ビーズの表面は、官能基、例えば、ヌクレオシドを係留するリンカーのための係留点として用いることができるアミノ又はアミノメチル基を有するように処理してもよい。こうした処理は、カラム、マルチウェルプレート、マイクロアレイ又はマイクロチップにおいて実施することができる。カラムを用いたフォーマットは、ポリヌクレオチド又は核酸の比較的大きな規模の合成を可能にする。カラム内のフィルターの間に樹脂を保持して、全ての試薬及び溶媒を自由に通過させることができる。マルチウェルプレート、マイクロアレイ、又はマイクロチップは、特に費用効果的小規模合成のために設計されている。単一のマイクロアレイチップで最大百万個のヌクレオチドを生成することができる。しかしながら、マイクロチップを用いた合成の誤り率は、伝統的なカラム法より高い。［ボロフコフ（Ｂｏｒｏｖｋｏｖ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３８巻（１９）、ｅ１８０、２０１０年］（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。マルチウェルプレートは、種々の配列と同時にポリヌクレオチド又は核酸の並行合成を可能にする。［シンドラー（Ｓｉｎｄｅｌａｒ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２３巻、ｐ．９８２〜９８７、１９９５年］（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。固体支持体へのローディングは限定される。その上、伸長が進むと、固体支持体への成長する鎖の形態及び嵩高性によって、新来モノマーと成長鎖の末端基との反応が妨害される。そのため、成長鎖に付加することができるモノマーの数も限定される。
【０３１２】
鎖のさらなる伸長のためにリンカーを固体支持体に結合させる。リンカーは、鎖が固体支持体から脱離する合成の終了時を除いて、合成工程で使用される全ての試薬に対して安定している。特定のヌクレオシドリンカー、すなわち、Ａ、Ｃ、ｄＴ、Ｇ、又はＵを有す
る固体支持体を用いて、配列中の最初のヌクレオチドとして、それぞれＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、又はＵを有するポリヌクレオチドを調製することができる。非ヌクレオシドリンカーを有するユニバーサル固体支持体は、全てのポリヌクレオチド配列に使用することができる。（ギュザイブ（Ｇｕｚａｅｖ）らの米国特許第６，６５３，４６８号明細書；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ユニバーサル支持体のために様々な非ヌクレオシドリンカーが開発されているが、それらの多くは、２つのビシナルヒドロキシル基を有する。例えば、スクシニル基は、よく使用されているリンカーである。
【０３１３】
本明細書で使用されるとき、リンカーは、例えば、１０〜１，０００原子といった原子団を指し、例えば、限定はしないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、イオウ、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどの原子又は原子団から構成され得る。リンカーは、核酸塩基又は糖部分上の修飾ヌクレオシド若しくはヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、核酸ベース又は非ヌクレオシドであってもよい。リンカーは、核酸配列への組み込みを妨害しない、十分な長さのものであってよい。リンカーは、本明細書に記載する通り、任意の有用な目的、例えば、多量体（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子の連結による）若しくはコンジュゲートの形成、並びに治療分子の投与又は標識の組み込みのために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例として、限定はしないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、又はヘテロシクリルが挙げられ、これらの各々は、本明細書に記載する通り、任意選択で置換することができる。リンカーの例として、限定はしないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレン又はプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、又はテトラエチレングリコール）、並びにデキストランポリマー及びその誘導体が挙げられる。他の例として、限定はしないが、リンカー内で切断可能な部分、例えば、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）又はアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）があり、これらは、還元剤又は光分解を用いて切断することができる。選択的に切断可能な結合の非制限的例として、アミノ結合があり、これは、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、又は他の還元剤、及び／若しくは光分解の使用により切断することができ、さらには、エステル結合は、例えば、酸性又は塩基性加水分解によって切断することができる）。
【０３１４】
鎖を伸長するためのカップリング反応に必要な、活性化モノマー及び成長鎖上の官能基を除いて、他の全ての官能基は、副反応の回避のために保護する必要がある。保護及び脱保護の条件、及び適切な保護基の選択は、当業者が容易に決定することができる。保護基の化学は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら著、有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第２版、ウィリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９９１年（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に見出すことができる。例えば、活性化ヌクレオシドホスホロアミダイト上の５’ヒドロキシル基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護することができ、リン原子上のヒドロキシル基は、２−シアノエチルで保護することができる。Ａ、Ｃ、Ｇ塩基上の環外アミノ基は、アシル基で保護することができる。
【０３１５】
固相合成系では、媒質が不均質であることから、活性化モノマーの反応性が重要である。固相合成の大部分は、ホスホロアミダイトヌクレオシドを使用するが、その機構については上で述べている。別の活性化モノマーの例は、ヌクレオシドＨ−リン酸である。［アブラモバ（Ａｂｒａｍｏｖａ）、分子（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、第１８巻、ｐ．１０６３〜１０７５、２０１３年］。固相合成系での高い収率を確実にするために、大量の試薬、例えば、モノマー、酸化剤、及び脱保護剤が必要である。
【０３１６】
固相合成法をさらに改良するために、科学的調査及び研究が進められている。例えば、十分に確立された３’から５’への合成ではなく、スリバスタバ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）らの米国特許第８，３０９，７０７号明細書及び米国特許出願公開第２０１３／００７２６７０号明細書は、新規のホスホロアミダイト及び新規のヌクレオシド誘導体を用いたＲＮＡの５’から３’への合成を開示しており、これによって、３’末端での合成ＲＮＡの容易な修飾が可能になった。チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）らの国際公開第２０１３１２３１２５号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、複数の配列からの標的核酸配列のアセンブリを記載しており、ここで、サブ配列を含む樹脂がエマルション小滴に導入される。サブ配列は、樹脂から切断されて、エマルション小滴内でアセンブリする。固体支持体のコストを削減するために、ハイドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸リンカー（Ｑ−リンカー）を用いて、再利用可能なＣＰＧ固体支持体が開発された（ポン（Ｐｏｎ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２７巻、ｐ．１５３１〜１５３８、１９９９年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０３１７】
固相合成のための新たな保護基が開発されている。ナガト（Ｎａｇａｔ）らは、２’−ヒドロキシ保護基として２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）を用いることにより、候補前駆体マイクロＲＮＡの配列を含む１１０−ｎｔ長ＲＮＡの合成に成功した。（シバ（Ｓｈｉｂａ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３５巻、ｐ．３２８７〜３２９６、２００７年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。また、２’−Ｏ−保護基を用いて、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の配列を含む３３アミノ酸ペプチドをコードする１３０−ｎｔｍＲＮＡも合成されている。人工的１３０−ｎｔｍＲＮＡの生物活性は、無細胞タンパク質合成系及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてＧＬＰ−１を産生することによって証明されている。（ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３８巻、ｐ．７８４５〜７８５７、２０１０年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。固相合成モノマーの新規の保護基として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：デリンジャー（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ）らの米国特許第８，３０９，７０６号明細書に開示される炭酸塩保護基、デリンジャー（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ）らの米国特許第８，２４２，２５８号明細書に開示されるオルトエステルタイプ２’ヒドロキシ保護基及び炭酸アシルタイプヒドロキシル保護基、デリンジャー（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ）らの米国特許第８，２０２，９８３号明細書に開示される２’−ヒドロキシルチオ炭素保護基、デリンジャー（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ）らの米国特許第７，９９９，０８７号明細書に開示される２’−シリル含有チオ炭酸塩保護基、アルバラド（Ａｌｖａｒａｄｏ）の米国特許第７，６６７，０３３号明細書に開示されるアミノ保護基としての９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＳ）誘導体、スカリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）らの米国特許第５，８８９，１３６号明細書に開示されるフッ化物不安定性５’シリル保護基、並びにグリフェイ（Ｇｒｉｆｆｅｙ）らの米国特許出願公開第２００８／０１１９６４５号明細書に開示されるピキシル保護基（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。デバート（Ｄｅｂａｒｔ）らの米国特許出願公開第２０１１／０２７５７９３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、リボースの２’位のヒドロキシルの保護基を用いたＲＮＡ合成を教示しており、この保護基は、塩基により除去することができる。新規の固体支持体は、ムーディ（Ｍｏｏｄｙ）らの米国特許第７，４７６，７０９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示される重合性単位に結合した保護ヒドロキシポリＣ２〜４アルキレンオキシ鎖を含むモノマーから構成されるポリマーを含む。
【０３１８】
液相化学合成
モノマービルディングブロックの連続的付加によるキメラポリヌクレオチドの合成は、液相で実施することもできる。モノマー同士、又は成長鎖の末端官能基と新来モノマーと
の間に、共有結合が形成される。反応に関与しない官能基は、一時的に保護しなければならない。各モノマービルディングブロックの付加後、次のモノマービルディングブロックを付加する前に、反応混合物を精製する必要がある。鎖の一方の末端の官能基は、次のモノマービルディングブロックと反応することができるように、脱保護しなければならない。液相合成は、労力及び時間がかかるため、自動化することができない。こうした制約にもかかわらず、液相合成は、短いポリヌクレオチドを大規模に調製する上でいまだに有用である。この系は均質であるため、大量の試薬を必要とせず、この点では費用効果的である。
【０３１９】
様々な合成方法の組み合わせ
前述した合成方法は各々、独自の利点及び制約を有する。制約を解決するために、これらの方法を組み合わせる試みが行われている。こうした方法の組み合わせは、本発明の範囲内である。
【０３２０】
２〜４ヌクレオチドの短いポリヌクレオチド鎖を液相で調製した後、固相合成による伸長反応のために、固体支持体に結合させることができる。モノマービルディングブロックの支持体としてポリエチレングリコールのモノメチルエーテル（ＭＰＥＧ）ビーズを使用する高効率液相（ＨＥＬＰ）合成が開発されている。ＭＰＥＧは、塩化メチレン及びピリジン溶媒に可溶性であるが、ジエチルエーテル溶媒中では沈殿する。適切な溶媒を選択することにより、モノマー同士、又は成長鎖と、ＭＰＥＧに結合した新来モノマーとのカップリング反応は、均質な液相系で実施することができる。次に、混合物をジエチルエーテル溶媒で洗浄することにより、産物を容易に沈殿させると共に精製することができる。［ボノラ（Ｂｏｎｏｒａ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、ｐ．３１５５〜３１５９、１９９０年］（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。アダモ（Ａｄａｍｏ）らの米国特許第８，３０４，５３２号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、試薬の少なくとも一部が固体支持される溶液相オリゴヌクレオチド合成を教示している。
【０３２１】
酵素的連結と組み合わせた固相又は液相化学合成を使用すると、化学合成単独では得ることができない長鎖ポリヌクレオチドを産生する効率的方法が提供される。ムーア（Ｍｏｏｒｅ）及びシャープ（Ｓｈａｒｐ）は、化学合成によりＲＮＡ断片１０〜２０ｎｔ長（これに、部位特異的修飾を導入してもよい）を調製し、これらの断片をｃＤＮＡ架橋にアニーリングした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む断片をアセンブリすることを記載している。（ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５６巻、ｐ．９９９〜９９７（１９９２）；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０３２２】
固相合成装置は、ＰＣＲ及びその他の増幅技術を実施する上で十分な優れた純度のポリヌクレオチド又は核酸を生産することができる。アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、マイクロアレイを開発し、これらは市販されている。マイクロアレイ支持体上でポリヌクレオチドを合成し、強塩基又は光により切断した後、ＰＣＲ増幅により、ポリヌクレオチドのライブラリーを作製することができる。［クリアリー（Ｃｌｅａｒｙ）ら著、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１巻（３）、ｐ．２４１〜２４７、２００４年］（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０３２３】
小領域合成
本発明のキメラポリヌクレオチドの領域又はサブ領域は、ｓｉＲＮＡなどの小ＲＮＡ分子を含み得ることから、同じように合成することができる。適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイト、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、及びＰＣＲ発現カセットを用いて、化学合成などのｓｉＲＮＡを調製するいくつかの方法がある。
シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（登録商標）は、ｓｉＲＮＡ供給業者の１つであり、ｔ−ブチルメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で、２’位が保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトモノマーを用いて、それらのｓｉＲＮＡを合成する。高いカップリング効率及び高速脱保護を達成するために、固相化学合成は、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（登録商標）のウルトラ・ファスト・パラレル・シンセシス（Ｕｌｔｒａ  Ｆａｓｔ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＵＦＰＳ）及びウルトラ・ファスト・パラレル・デプロテクション（Ｕｌｔｒａ  Ｆａｓｔ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）（ＵＦＰＤ）を用いて実施する。最終ｓｉＲＮＡ産物は、ＨＰＬＣ又はＰＡＧＥで精製することができる。こうした方法を用いて、キメラポリヌクレオチドの領域又はサブ領域を合成することができる。
【０３２４】
ベクター又はＰＣＲ生成ｓｉＲＮＡカセットからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び発現は、ｓｉＲＮＡを生成するための適切な鋳型が必要である。市販のアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）（登録商標）サイレンサー（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ）（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットは、ＤＮＡ鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によりｓｉＲＮＡを生成するが、これは、必要な酵素、バッファー、プライマーを含む。こうした方法を用いて、キメラポリヌクレオチドの領域又はサブ領域を合成することができる。
【０３２５】
キメラポリヌクレオチドの領域又はサブ領域の連結
連結は、ポリヌクレオチド又は核酸断片をより大きな構築物にアセンブリする上で不可欠なツールである。リガーゼ触媒反応により、ＤＮＡ断片を結合させることによって、様々な機能を備えた組換えＤＮＡを作製することができる。２つのオリゴデオキシヌクレオチド（１つは５’ホスホリル基を含み、もう１つは、遊離３’ヒドロキシル基を有する）が、ＤＮＡリガーゼの基質として役立つ。蛍光又は化学発光標識を有するオリゴデオキシヌクレオチドもまた、ＤＮＡリガーゼ基質として用いられ得る。（マーチネリ（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ）ら著、臨床化学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４２巻、ｐ．１４〜１８、１９９６年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。Ｔ４ＲＮＡリガーゼなどのＲＮＡリガーゼは、２つの一本鎖オリゴリボヌクレオチド又はＲＮＡ断片同士のリン酸ジエステル結合の形成を触媒する。大きなＤＮＡ構築物のコピーは、ポリヌクレオチド断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼの組み合わせで合成されている。イグナトフ（Ｉｇｎａｔｏｖ）らの米国特許出願公開第２００９／０１７００９０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、ＤＮＡポリメラーゼに加えてＤＮＡリガーゼを用いることにより、ＰＣＴを改善する、特に、長距離ＰＣＲ及び／又はローコピーＤＮＡ鋳型ＰＣＲ増幅の収率を増大することを開示している。
【０３２６】
リガーゼを他の酵素と一緒に用いることにより、キメラポリヌクレオチド又は核酸分子を調製し、ゲノム分析を実施することもできる。例えば、連結媒介選択性ＰＣＲ増幅が、カトウ（Ｋａｔｏ）の欧州特許第０７３５１４４号明細書に開示されている。組織若しくは細胞由来ＲＮＡ又はＤＮＡから逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＩＩＳ型制限酵素で断片に消化する（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼにより、上記の断片にビオチン化アダプター配列を結合させる。次に、ビオチン標識ＤＮＡ断片を下流での分析のためにストレプトアビジン被覆ビーズ上に固定化する。
【０３２７】
連結スプリント又は連結スプリントオリゴは、リガーゼ又はリガーゼ活性を有する別の酵素を用いて、１つの核酸の２つの末端（すなわち、分子内結合）、又は２つの核酸の２つの末端（すなわち、分子間結合）を結合するためのアニーリング部位又は連結鋳型を提供するために用いられるオリゴヌクレオチドである。連結スプリントは、互いに隣接した末端を保持して、連結しようとする５’−リン酸化及び３’−ヒドロキシル化末端の間に
連結点を形成する。
【０３２８】
一実施形態では、スプリント媒介連結又はスプリント連結法を用いて、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドを合成することができる。キメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１２１３８４５３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法など、制限エンドヌクレアーゼ切断部位の存在を利用しない方法を用いてアセンブリしてもよい。スプリント媒介連結は、制御されたコンカテマー化を用い、しかも領域の結合に制限部位の導入を必要としないか、又は必要な場合も限定的なもので、構築物の高速合成を可能にする。非制限的例として、スプリント連結を用いることにより、少なくとも１つの非翻訳領域をキメラポリヌクレオチドのコード領域に付加することもできる。一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドの合成に、他の合成方法と組み合わせてスプリント連結を用いてもよい。
【０３２９】
核酸の５’−リン酸化及び３’−ヒドロキシル末端を連結する場合、末端同士が隣接するように、末端を連結スプリントにアニーリングするとき、例えば、限定はしないが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（登録商標）ＤＮＡリガーゼ（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）（登録商標）テクノロジーズ（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｔｈＤＮＡリガーゼ、ＴｆｌＤＮＡリガーゼ、又はＴｓｃＤＮＡリガーゼ（プロカリア（Ｐｒｏｋａｒｉａ）を用いることができる。ファルグイ（Ｆａｒｕｇｕｉ）の米国特許第６，３６８，８０１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼがＲＮＡ分子の末端を効率的に連結できることを開示しており、これらは、ＲＮＡスプリントとハイブリダイズすると、互いに隣接する。従って、Ｔ４ＲＮＡリガーゼは、ＤＮＡ末端と、ＲＮＡ又は修飾ＲＮＡを含む連結スプリントオリゴを結合するために好適なリガーゼである。ＲＮＡスプリントの例として、ダール（Ｄａｈｌ）らの米国特許第８，１３７，９１１号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／０１５６６７９号明細書に開示される、デュラスクライブ（ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ）（登録商標）Ｔ７転写キット（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）（登録商標）テクノロジーズ（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造される、２’−フルオリン−ＣＴＰ（２’−Ｆ−ｄＣＴＰ）及び２’−フルオリン−ＵＴＰ（２’−Ｆ−ｄＵＴＰ）を含有する修飾ＲＮＡが挙げられる。デュラスクライブ（ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ）（登録商標）Ｔ７転写キットから生成される修飾ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ  Ａ消化に対して完全に耐性である。ＤＮＡスプリント及びＤＮＡリガーゼを用いて、スゾスタク（Ｓｚｏｓｔａｋ）らの米国特許第６，２５８，５５８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されるＲＮＡ−タンパク質融合物を作製することができる。
【０３３０】
線状ｓｓＤＮＡの分子間連結のためには、クール（Ｋｏｏｌ）らの米国特許第７，９０６，４９０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）は、ＤＮＡ合成装置で線状オリゴデオキシヌクレオチド断片を製造した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと２つの３０ヌクレオチドスプリントオリゴヌクレオチドの連結により８３ヌクレオチド環を構築することを教示している。線状センスプロモータ含有ｃＤＮＡの環状化は、ダール（Ｄａｈｌ）らの米国特許出願公開第２０１２／０１５６６７９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されている。サーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）に感染するファージＴＳ２１２６に由来するサーモファージ（ＴｈｅｒｍｏＰｈａｇｅ）（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（プロカザイム）は、ＤＮＡ及びＲＮＡのＡＴＰ依存性分子内及び分子間連結を触媒する。
【０３３１】
ホスホロアミダイトモノマーを使用する固相化学合成法は、短鎖のＤＮＡ分子の生成に限定される。長さが１５０塩基を超えると、ＤＮＡ産物の純度及び反応物の収率が低くなる。高収率で長いポリヌクレオチドを合成するために、化学合成と並行して酵素的連結法を使用すれば、より好都合である。例えば、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）及びシャープ（Ｓｈａ
ｒｐ）は、化学合成によりＲＮＡ断片１０〜２０ｎｔ長（これに、部位特異的修飾を導入してもよい）を調製し、この断片をｃＤＮＡスプリントにアニーリングした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む断片をアセンブリすることを記載している。（ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５６巻、ｐ．９９２〜９９７（１９９２）；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。Ｔ４ＲＮＡリガーゼを含むオリゴリボヌクレオチドとＤＮＡスプリント又はポリリボヌクレオチドの連結反応は、ベイン（Ｂａｉｎ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻（１６）、ｐ．４３７２、１９９２年、スターク（Ｓｔａｒｋ）ら著、ＲＮＡ、第１２巻、ｐ．２０１４〜２０１９、２００６年、及びデラス（Ｄｅｒａｓ）らの米国特許出願第２００５／０１３０２０１号明細書に記載されており、これらの文献の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。固相法で合成されたオリゴヌクレオチドには、酵素的付加により５’−キャップ及び３’−ポリＡテイルが付加されることが多い。非制限的例として、イワセ（Ｉｗａｓｅ）ら（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻、ｐ．１６４３〜１６４８、１９９２年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）により記載される通り、酵素的に連結された３つの断片として合成キャップ付加４２−ｍｅｒ  ｍＲＮＡが合成されている。１６．３−キロベースマウスミトコンドリアゲノムが、６００の重複６０−ｍｅｒポリヌクレオチドを産生している。この方法は、所望の長さに達するまで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えから増幅までが反復される。（ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら著、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第７巻、ｐ．９０１〜９０３、２０１０年（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。１．０８メガベースのマイコプラズマ・ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）ＪＣＶＩ−ｓｙｎ１．０ゲノムのアセンブリが報告されている。ポリヌクレオチド合成装置から化学的に作製されたポリヌクレオチド断片をアセンブリすることにより、１０８０ｂｐカセットを生成する。次に、酵母内での形質転換及び相同組換えにより３段階でゲノムをアセンブリする。（ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３２９巻、ｐ．５２〜５６、２０１０年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０３３２】
短いＤＮＡ断片を化学リンカーと結合させるために、研究がおこなわれている。「クリック」ケミストリー又は「クリック」連結、すなわちアジ化物とアルキンとの間の環状付加反応は、穏やかな反応条件、高い収率、及び無害な副産物といったその利点によって、多くの関心を集めている。「クリック」ケミストリーは、ヌウェ（Ｎｗｅ）ら著、癌生物療法及び放射性医薬品（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、第２４（３）、ｐ．２８９〜３０２、２００９年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。クリック連結により、最大３００塩基長のＤＮＡ構築物が生成されており、それより長い配列も実現可能である。環状付加反応によって生じる断片間のトリアゾールリンカーにもかかわらず、様々なＤＮＡポリメラーゼが、クリック連結により製造された合成ＤＮＡ構築物を増幅できることがＰＣＲデータで実証されている。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及びローリングサークル増幅も合成ＤＮＡ構築物に対し実施することができる。最大１００ヌクレオチド長のヘアピンリボザイム及び環状ミニＤＮＡ二重螺旋もまた、クリック連結で調製されている。（エル−サグヘア（Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒ）ら著、アカウンツ・オブ・ケミカルリサーチ（Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第４５巻（８）、ｐ．１２５８〜１２６７、２０１２年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０３３３】
例えば、式Ｉ：
［Ａｎ］−Ｌ１−［Ｂｏ］
式Ｉ
を含む配列を有する本発明のポリヌクレオチドは、
式ＸＶＩ：
［Ａｎ］−（Ｒ１）ａ−（Ｒ２）ｂ−（Ｒ３）ｃ−Ｎ３
式ＸＶＩ
の構造を有する化合物と、式ＸＶＩＩ：
Ｒ２７−（Ｒ５）ｄ−（Ｒ６）ｅ−（Ｒ７）ｆ−［Ｂｏ］
式ＸＶＩＩ
の構造を有する化合物を反応させることによって合成することができ、
式中、Ａ及びＢは各々、独立に、いずれかのヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド）を含み；
ｎ及びｏは、独立に、１０〜１０，０００、例えば、１０〜１０００又は１０〜２０００の整数であり；
Ｌ１は、式ＩＩＩ：
【０３３４】
【化３１】
2017524357.tif 000035
の構造を有し、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは各々、独立に、０又は１であり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ７の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、及びＮＲ８から選択され；
Ｒ２及びＲ６は各々、独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、又はホスホリルから選択され；
Ｒ４は、任意選択で置換されたトリアゾレンであり；
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ４アルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１２アリール、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルであり；
Ｒ２７は、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ３アルキニル又は任意選択で置換されたＣ８〜Ｃ１２シクロアルキニルであり、
Ｌ１は、ヌクレオシドのうちの１つの糖の［Ａｎ］及び［Ｂｏ］に結合する。
【０３３５】
式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩｂ：
【０３３６】
【化３２】
2017524357.tif 000036
の構造を有する本発明のキメラポリヌクレオチドは、式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ、又はＸＩＶｂ：
【０３３７】
【化３３】
2017524357.tif 000037
の構造を有する化合物と、
式ＸＶａ又はＸＶｂ：
【０３３８】
【化３４】
2017524357.tif 000038
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、若しくはＳであり；
Ｒ２４及びＲ２７の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、及びＲ２６’の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであるか、あるいは、Ｒ２５’又はＲ２６’とアルキニル基は、一緒に、任意選択で置換されたシクロアルキニルを形成する）
を（例えば、銅供給源の存在若しくは非存在下の［３＋２］環状付加条件下で）反応させることにより合成することができる。
【０３３９】
例えば、本発明のキメラポリヌクレオチドは、以下：
【０３４０】
【化３５】
2017524357.tif 000039
に示すように合成することができる。一部の実施形態では、この方法で、５’キャップ構造又はポリ−Ａテイルを本発明のキメラポリヌクレオチドに結合させることができる。
【０３４１】
５’キャップ構造は、以下に示すように、本発明のキメラポリヌクレオチドに結合させることができる：
【０３４２】
【化３６】
2017524357.tif 000040
ポリ−Ａテイルは、以下に示すように、本発明のキメラポリヌクレオチドに結合させることができる：
【０３４３】
【化３７】
2017524357.tif 000041
固体支持体上で連続的連結を実施することができる。例えば、ビオチンで末端を修飾した最初のリンカーＤＮＡ分子をストレプトアビジン被覆ビーズに結合させる。リンカーＤＮＡ分子の３’末端は、新来のＤＮＡ断片の５’末端と相補的である。各連結ステップ後
、ビーズを洗浄してから、回収し、メガヌクレアーゼにより最終線状産物を放出させる。この方法によって、最適化された順序及び方向で、遺伝子の高速且つ効率的なアセンブリが可能になる。（タキタ（Ｔａｋｉｔａ）、ＤＮＡ研究（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻（４）、ｐ．１〜１０、２０１３年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。固体支持体で合成された標識ポリヌクレオチドは、ソロベイチク（Ｓｏｌｏｖｅｉｃｈｉｋ）らの米国特許出願公開第２００１／００１４７５３号明細書及びビナヤク（Ｖｉｎａｙａｋ）らの同第２００３／０１９１３０３号明細書に開示されており、これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３４４】
修飾及び結合キメラポリヌクレオチド
所望の機能又は特性を達成するために、鎖の合成中又は合成後に、キメラポリヌクレオチド又は核酸に非天然の修飾ヌクレオチドを導入してもよい。修飾は、ヌクレオチド間系統、プリン若しくはピリミジン塩基、又は糖に行ってよい。修飾は、化学合成又はポリメラーゼ酵素を用いて、鎖の末端又は鎖のいずれか他の箇所に導入することができる。例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）は、ヌクレアーゼ耐性であり、ＲＮＡとの強力なハイブリダイゼーションをもたらす。２つのコドンにヘキシトール残基を有する短いメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が構築されている。（ラブリック（Ｌａｖｒｉｋ）ら著、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０巻、ｐ．１１７７７〜１１７８４、２００１年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。５’及び３’ＨＮＡ配列によりフランキングされるホスホロチオエート中央配列を含むキメラＨＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果も研究されている。（カン（Ｋａｎｇ）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３２巻（４）、ｐ．４４１１〜４４１９、２００４年；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ＲＮＡ妨害、アンチセンス療法又は他の用途における６員環を有する修飾ヌクレオチドの調製及び使用は、ヘルデウィジン（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｉｎ）らの米国特許出願第２００８／０２６１９０５号明細書、同第２０１０／０００９８６５号明細書、及び国際公開第９７／３００６４号パンフレットに開示されている。修飾核酸及びその合成は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号明細書（代理人整理番号Ｍ０９）（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されている。修飾ポリヌクレオチドの合成及び戦略は、フェルマ（Ｖｅｒｍａ）及びエクシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）により、アニュアルレビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７６巻、ｐ．９９〜１３４、１９９８年（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に論じられている。
【０３４５】
キメラポリヌクレオチド又は核酸を種々の機能性ブロック、例えば、蛍光標識、液体、ナノ粒子、送達剤などと共役させるために、酵素的又は化学的連結方法のいずれを用いてもよい。ポリヌクレオチド及び修飾ポリヌクレオチドのコンジュゲートは、グッドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）により、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１巻（３）、ｐ．１６５〜１８７、１９９０年（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）により論じられている。ビナヤク（Ｖｉｎａｙａｋ）らの米国特許第６，８３５，８２７号明細書及び同第６，５２５，１８３号明細書は、標識固体支持体を用いた標識オリゴヌクレオチドの合成を教示している。
【０３４６】
例えば、本発明のキメラポリヌクレオチドは、式Ｖａ又はＶｂ：
【０３４７】
【化３８】
2017524357.tif 000042
の構造を含んでもよい。
【０３４８】
キメラポリヌクレオチドは、式ＶＩａ又はＶＩｂ：
【０３４９】
【化３９】
2017524357.tif 000043
の構造を有する化合物と、
式ＶＩＩ：
【０３５０】
【化４０】
2017524357.tif 000044
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ２は各々、独立に、Ｏ又はＳであり；
Ｘ３は各々、独立に、ＯＨ若しくはＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ１７及びＲ１９の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ１８は、ハロゲンである）
の構造を有する化合物を（例えば、アルキル化条件下で）反応させるステップを含む方法により製造された構造を含んでもよい。
【０３５１】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、式ＶＩＩＩａ又はＶＩＩＩｂ：
【０３５２】
【化４１】
2017524357.tif 000045
の構造を有し得る。
【０３５３】
この方法は、式ＩＸａ又はＩＸｂ：
【０３５４】
【化４２】
2017524357.tif 000046
の構造を有する化合物と、
式Ｘａ又はＸｂ：
【０３５５】
【化４３】
2017524357.tif 000047
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ４は各々、独立に、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ１及びＸ２は各々、独立に、Ｏ又はＳであり；
Ｘ３は各々、独立に、ＯＨ、ＳＨ、又はその塩であり；
Ｒ２０及びＲ２３の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２１及びＲ２２の各々は、独立に、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルコキシである）
を（例えば、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）反応条件下で）反応させるステップを含む。
【０３５６】
式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ又はＸＩＩａ：
【０３５７】
【化４４】
2017524357.tif 000048
の構造を含む、本発明のキメラポリヌクレオチド。
【０３５８】
この方法は、式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ、又はＸＩＶｂ：
【０３５９】
【化４５】
2017524357.tif 000049
の構造を有する化合物と、
式ＸＶａ又はＸＶｂ：
【０３６０】
【化４６】
2017524357.tif 000050
の構造を有する化合物
（式中、Ｎ１及びＮ２の各々は、独立に、核酸塩基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６の各々は、独立に、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されたＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されたアミノ、アジド、又は任意選択で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｇ及びｈの各々は、独立に、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ４は各々、独立に、非存在、Ｏ、ＮＨ、若しくはＳ、又はその塩であり；
Ｒ２４及びＲ２７の各々は、独立に、連結ヌクレオシドの１領域であり；
Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、及びＲ２６’の各々は、非存在であるか、又は任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキレン若しくは任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであるか、あるいは、Ｒ２５とアルキニル基は、一緒に、任意選択で置換されたシクロアルキニレンを形成する）
を（例えば、銅供給源の存在若しくは非存在下の［３＋２］環状付加条件下で）反応させるステップを含む。
【０３６１】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、以下：
【０３６２】
【化４７】
2017524357.tif 000051
に示すように合成することができる。
【０３６３】
本発明のキメラポリヌクレオチドの他の合成方法を以下に示す：
【０３６４】
【化４８】
2017524357.tif 000052
式中、ＣＥＯは、２−シアノエトキシであり、Ｘは、Ｏ又はＳである。
【０３６５】
本発明のキメラポリヌクレオチドの他の合成方法を以下に示す：
【０３６６】
【化４９】
2017524357.tif 000053
３’（又は、ｇ若しくはｈが１のとき、４’位）及び５’（又は、ｇ若しくはｈが１のとき、６’位）を逆転することができることは理解されよう。例えば、ハロゲン、アジド、又はアルキニル基を５’位（又は、ｇ若しくはｈが１のとき、６’位）に結合させてもよいし、あるいは、チオリン酸、（チオ）ホスホリル、又はアジド基を３’位（又は、ｇ若しくはｈが１のとき、４’位）に結合させてもよい。
【０３６７】
定量
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、エキソソームで又は１種又は複数種の体液から得られる場合に定量してもよい。本明細書において、「体液」は、血液、血清、血漿、腹水、尿、脳髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、腺液若しくは前射精液、汗、大便、毛髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹膜液、心膜液、リンパ液、キームス、乳糜、胆液、腸液、月経、膿、皮脂、吐しゃ物、膣分泌物、粘液分泌物、水様便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、並びに臍帯血を含む。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される臓器から採取してもよい。
【０３６８】
エキソソーム定量方法では、対象から２ｍＬ以下のサンプルを取得し、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティ精製、マイクロ流体分離、又はこれらの組み合わせによってエキソソームを単離する。分析において、キメラポリヌクレオチドのレベル若しくは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、非存在、切断又は改変であってもよい。１つ又は複数の臨床的表現型又はヒトの疾患バイオマーカのアッセイと上記のレベルを相関させることが有利である。アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析法、又はこれらの組み合わせを用いて実施することができ、エキソソームは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学法を用いて単離することができる。エキソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティ精製、マイクロ流体分離、又はこれらの組み合わせによって単離することもできる。
【０３６９】
これらの方法によって、検査者は、残留する、又は送達されたキメラポリヌクレオチドのレベルをリアルタイムでモニターすることができる。これは、本発明のキメラポリヌクレオチドが、構造的又は化学的修飾によって、内因性の形態とは異なるために可能である。
【０３７０】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、紫外・可視分光法（Ｕ
Ｖ／Ｖｉｓ）などの方法を用いて定量することができる。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非制限的例は、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（登録商標）分光計（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マサチューセッツ州ウォルサム）である。キメラポリヌクレオチドが、適切なサイズであるか否かを決定し、キメラポリヌクレオチドの分解が起こっていないことを調べるために、定量したキメラポリヌクレオチドを分析してもよい。キメラポリヌクレオチドの分解は、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣ精製方法（例えば、限定はしないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）並びにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって調べることができる。
【０３７１】
精製
キメラポリヌクレオチドの精製は、限定はしないが、クリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得る。クリーンアップは、当技術分野で公知の方法、例えば、限定はしないが、アジェンコート（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ）（登録商標）ビーズ（ベックマン・コールター・ゲノミクス（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、マサチューセッツ州デンバー）、ポリ−Ｔビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（エキシコン社（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ）、デンマーク、ベドビーク（Ｖｅｄｂａｅｋ））、又は例えば、限定はしないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）などのＨＰＬＣ精製方法によって、実施することができる。用語「精製（された）」は、「精製キメラポリヌクレオチド」などのポリヌクレオチドに関して用いられるとき、少なくとも１つの混入物から分離されたものを指す。本明細書で用いられるとき、「混入物」は、他の物質を不適合、不純又は劣等にするいずれかの物質である。従って、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、天然に見出されるものとは異なる形態若しくは状況、又はそれを処理若しくは精製方法に付す前に存在した形態とは異なる形態若しくは環境で存在する。
【０３７２】
品質保証及び／又は品質管理検査は、限定はしないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、又は分析ＨＰＬＣなどの方法を用いて実施することができる。
別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、逆転写酵素−ＰＣＲなどの方法によって配列決定することができる。
【０３７３】
ＩＩＩ．修飾
本明細書で、ポリヌクレオチド（例えば、コード又は非コードにかかわらず、キメラポリヌクレオチド）に使用されるとき、用語「化学修飾」、又は必要に応じて「化学的に修飾された」は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）又はシチジン（Ｃ）リボ−若しくはデオキシリボヌクレオシドに対し、それらの位置、パターン、割合（％）若しくは集団の１つ又は複数において為される修飾を指す。概して、本明細書では、これらの用語は、天然に存在する５’−末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図しない。
【０３７４】
ポリペプチドの場合、「修飾」という用語は、２０アミノ酸の標準的なセットと比較した修飾を指す。
修飾は、様々な異なる修飾であってもよい。一部の実施形態では、領域は、１つ、２つ、又はそれ以上の（任意選択で異なる）ヌクレオシド又はヌクレオチド修飾を含み得る。一部の実施形態では、導入された修飾キメラポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、細胞中での分解の低減を呈示し得る。
【０３７５】
本発明で有用な修飾として、限定はしないが、表２に示すものが挙げられる。この表に
は、修飾の符号、核酸塩基のタイプ、及び／又は修飾が天然に存在するか否かを表示している。
【０３７６】
【表２−１】
2017524357.tif 000054
【０３７７】
【表２−２】
2017524357.tif 000055
【０３７８】
【表２−３】
2017524357.tif 000056
【０３７９】
【表２−４】
2017524357.tif 000057
【０３８０】
【表２−５】
2017524357.tif 000058
【０３８１】
【表２−６】
2017524357.tif 000059
【０３８２】
【表２−７】
2017524357.tif 000060
【０３８３】
【表２−８】
2017524357.tif 000061
【０３８４】
【表２−９】
2017524357.tif 000062
【０３８５】
【表２−１０】
2017524357.tif 000063
【０３８６】
【表２−１１】
2017524357.tif 000064
【０３８７】
【表２−１２】
2017524357.tif 000065
【０３８８】
【表２−１３】
2017524357.tif 000066
【０３８９】
【表２−１４】
2017524357.tif 000067
【０３９０】
【表２−１５】
2017524357.tif 000068
【０３９１】
【表２−１６】
2017524357.tif 000069
本発明のキメラポリヌクレオチドに有用となり得る他の修飾を表３に記載する。
【０３９２】
【表３−１】
2017524357.tif 000070
【０３９３】
【表３−２】
2017524357.tif 000071
【０３９４】
【表３−３】
2017524357.tif 000072
キメラポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間に任意の有用なリンカーを含んでもよい。骨格修飾を含め、こうしたリンカーを表４に記載する。
【０３９５】
【表４】
2017524357.tif 000073
キメラポリヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格に対する）任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ又は複数の原子は、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたチオール、任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）、又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置換してもよい。いくつかの実施形態では、修飾（例えば、１つ又は複数の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合の各々に存在する。本発明の修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はこれらのハイブリッド）への修飾であってもよ
い。別の修飾も本明細書に記載する。
【０３９６】
一部の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡが導入された細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導される免疫応答の特徴としては、１）炎症促進性サイトカインの発現増大、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５などの活性化、及び／又は３）タンパク質翻訳の終結又は短縮が挙げられる。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、細胞に導入されるキメラポリヌクレオチドを細胞内で分解することが望ましい。例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合には、キメラポリヌクレオチドの分解が好ましいであろう。従って、一部の実施形態において、本発明は、細胞内で指令された様式で作用させることができる分解ドメインを含有するキメラポリヌクレオチドを提供する。
【０３９８】
キメラポリヌクレオチドの領域のいずれも、本明細書に教示する通りに、又は２０１２年１０月３日に出願された国際出願ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９号明細書（代理人整理番号Ｍ９）及び２０１３年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８３７２９７号明細書（代理人整理番号Ｍ３６）（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示される通りに化学的に修飾することができる。
【０３９９】
修飾キメラポリヌクレオチド分子
本発明はまた、キメラポリヌクレオチド分子のビルディングブロック、例えば、修飾リボヌクレオシド、及び修飾リボヌクレオチドも含む。例えば、これらのビルディングブロックは、本発明のキメラポリヌクレオチドを調製する上で有用となり得る。こうしたビルディングブロックは、２０１２年１０月３日に出願された国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット及び２０１３年１２月１３日に出願された国際公開第２０１４０９３９２４号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されている。
【０４００】
糖での修飾
キメラポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載する通りのＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ）に組み込むことができる修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ビルディングブロック分子）は、リボ核酸の糖で修飾することができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を修飾するか、又はいくつかの異なる置換基で置換することができる。２’位の例示的置換として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル；任意選択で置換されたＣ１〜６アルコキシ；任意選択で置換されたＣ６〜１０アリールオキシ；任意選択で置換されたＣ３〜８シクロアルキル；任意選択で置換されたＣ３〜８シクロアルコキシ；任意選択で置換されたＣ６〜１０アリールオキシ；任意選択で置換されたＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；任意選択で置換されたＣ１〜１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、又は本明細書に記載のいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたアルキルであり、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、及び４〜２０）の整数である）；「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（ここで、２’−ヒドロキシルは、Ｃ１〜６アルキレン又はＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋により、同じリボース糖の４’−炭素に連結しており、例示的架橋として、メチレン、プロピレン、エーテル、若しくはアミノ架橋がある）；本明細書に記載のアミノアルキル；本明細書に記載のアミノアルコキシ；本明細書に記載のアミノ；並びに本明細書に記載のアミノ酸。
【０４０１】
概して、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。非制限的な修飾ヌ
クレオチドの例として、以下のものが挙げられる：リボースにおける酸素の置換（例えば、Ｓ、Ｓｅ、又はメチレン若しくはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（これにより、例えば、シクロペンテニル若しくはシクロヘキセニルでリボースを置換する）；リボースの環縮小（これにより、例えば、シクロブタン又はオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡張（これにより、例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホロアミダイト骨格も有するモルホリノなどのように、追加の炭素又はヘテロ原子を有する６−若しくは７員環を形成する）；多環式形態（例えば、トリシクロ；並びに、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡ若しくはＳ−ＧＮＡ、ここで、リボースは、リン酸ジエステル結合に結合したグリコール単位で置換される）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ここで、リボースは、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ、ここで、２−アミノ−エチル−グリシン結合でリボース及びリン酸ジエステル骨格を置換する）。さらに、糖基は、リボース内の対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する１つ又は複数の炭素も含有し得る。従って、キメラポリヌクレオチド分子は、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。こうした糖修飾は、２０１２年１０月３日に出願された国際出願ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９号明細書（代理人整理番号Ｍ９）及び国際公開第２０１４０９３９２４号パンフレット（代理人整理番号Ｍ３６）（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されている。
【０４０２】
核酸塩基での修飾
本開示は、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。本明細書に記載されるとき、「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリン若しくはピリミジン）又はその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて、糖分子（例えば、ペントース若しくはリボース）又はその誘導体を含有する化合物として定義される。本明細書に記載されるとき、「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドとして定義される。修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載するいずれかの有用な方法（例えば、化学的、酵素的、又は組換えにより、１つ又は複数の修飾若しくは非天然ヌクレオシドを含有させる方法）によって合成することができる。キメラポリヌクレオチドは、１つ又は複数の連結ヌクレオチド領域を含み得る。こうした領域は、多様な骨格連結を有し得る。連結は、標準的リン酸エステル結合であってもよく、その場合、キメラポリヌクレオチドは、複数のヌクレオチド領域を含むことになる。
【０４０３】
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、又はグアノシン−シトシン塩基対だけではなく、ヌクレオチド及び／又は非標準若しくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチドの間に形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合ドナーと水素結合アクセプターの構成が、非標準塩基と標準塩基、又は２つの相補的非標準塩基構造同士の水素結合を可能にする。こうした非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン又はウラシルとの塩基対合である。
【０４０４】
修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むことができる。ＲＮＡに見出される核酸塩基の例として、限定はしないが、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが挙げられる。ＤＮＡに見出される核酸塩基の例として、限定はしないが、アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンが挙げられる。こうした修飾核酸塩基（天然及び非天然の識別を含む）は、２０１２年１０月３日に出願された国際出願ＰＣＴ／２０１２／０５８５１９号明細書（代理人整理番号Ｍ９）及び国際公開第２０１４０９３９２４号パンフレット（代理人整理番号Ｍ３６）（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されている。
【０４０５】
修飾糖、核酸塩基、及びヌクレオシド間連結の組み合わせ
本発明のキメラポリヌクレオチドは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間連結に対する修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載するいずれか１つ又は複数の修飾を含み得る。
【０４０６】
修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド組み合わせの例を表５及び表６に列記する。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせは、本発明のキメラポリヌクレオチドを形成するために使用することができる。別に記載のない限り、修飾ヌクレオチドで、本発明のキメラポリヌクレオチドの天然ヌクレオチドを完全に置換してもよい。非制限的例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載する修飾ヌクレオチドで置換することができる。別の非制限的例では、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つで、一部（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９．９％）を置換することができる。
【０４０７】
塩基／糖又はリンカーの任意の組み合わせを本発明のキメラポリヌクレオチドに組み込んでもよく、こうした修飾は、以下の文献に教示されている：国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ９）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／７５１７７号明細書（代理人整理番号Ｍ３６）；国際公開第２０１５０５１１７３号パンフレット（代理人整理番号Ｍ７１）；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０４０８】
【表５−１】
2017524357.tif 000074
【０４０９】
【表５−２】
2017524357.tif 000075
【０４１０】
【表６−１】
2017524357.tif 000076
【０４１１】
【表６−２】
2017524357.tif 000077
【０４１２】
【表６−３】
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【０４１３】
【表６−４】
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【０４１４】
【表６−５】
2017524357.tif 000080
本発明によれば、本発明のポリヌクレオチドは、表６の組み合わせ又は単一の修飾を含むように合成することができる。
【０４１５】
単一の修飾が記載されている場合、記載されるヌクレオシド又はヌクレオチドは、そのＡ、Ｕ、Ｇ、若しくはＣヌクレオチド又はヌクレオシドの１００％が修飾されていることを示す。パーセンテージが記載されている場合には、これらは、存在するＡ、Ｕ、Ｇ、又はＣ三リン酸の総量の特定のＡ、Ｕ、Ｇ、又はＣのパーセンテージを表す。例えば、組み合わせ：２５％５−アミノアリル−ＣＴＰ＋７５％ＣＴＰ／２５％５−アミノアリル−ＵＴＰ＋７５％ＵＴＰは、２５％のシトシン三リン酸が、５−アミノアリル−ＣＴＰであり、且つ７５％のシトシンがＣＴＰであると共に；２５％のウラシルが、５−メトキシＵＴＰであり、且つ７５％のウラシルが、ＵＴＰであるポリヌクレオチドを指す。修飾ＵＴＰが記載されていない場合には、ポリヌクレオチドに見出されるヌクレオチドの部位の１００％に、天然に存在するＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ及び／又はＣＴＰが使用されている。この例では、ＧＴＰ及びＡＴＰヌクレオチドの全てが、非修飾のままである。
【０４１６】
ＩＶ．医薬組成物
製剤化、投与、送達及び用量決定
本発明は、キメラポリヌクレオチド組成物、並びに１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を提供する。医薬組成物は、任意選択で、１種又は複数種の追加の活性物質、例えば、治療及び／又は予防に活性の物質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、滅菌であっても、及び／又は発熱物質除去されていてもよい。薬剤の製剤化及び／又は製造に際しての一般的な考慮事項は、例えば、「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照によりその全体を本明細書に組み込む）に見出すことができる。
【０４１７】
一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者又は対象に投与される。本開示の目的のために、語句「活性成分」は、概して、本明細書に記載するように送達しようとするキメラポリヌクレオチドを指す。
【０４１８】
本明細書に提供する医薬組成物の説明は、主として、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するものであるが、当業者には、こうした組成物が、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物などの他の動物への投与に一般に好適であることは理解されよう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾は十分に理解されており、通常の獣医薬理学者であれば、必要であるとしても、常用の実験だけで、こうした修飾を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が考慮される対象として、限定はしないが、ヒト及び／又は他の霊長類；畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラットなどの商業関連の哺乳動物を含む哺乳動物；及び／又は家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／又はシチメンチョウなどの商業関連の鳥類を含む鳥類が挙げられる。
【０４１９】
本明細書に記載する医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知であるか、又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、こうした調製方法は、賦形剤及び／又は１つ又は複数の他の補助成分と活性成分を結合させるステップ、並びにその後、必要な及び／若しくは望ましい場合には、生成物を所望の１回若しくは複数回用量単位に分割、造形及び／又はパッケージングするステップを含む。
【０４２０】
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／又は任意の追加成分の相対量は、治療対象の種、大きさ、及び／又は状態に応じて、さらには、組成物を投与しようとする経路に応じて変動し得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０４２１】
製剤
本発明のキメラポリヌクレオチドは、（１）安定性を高める；（２）細胞トランスフェクションを増大する；（３）持続的若しくは遅延放出（例えば、キメラポリヌクレオチドのデポー剤から）を可能にする；（４）生体分布を改変する（例えば、キメラポリヌクレオチドを特定の組織若しくは細胞型にターゲティングする）；（５）コードされたタンパク質の翻訳をｉｎ  ｖｉｖｏで増大する；並びに／又は（６）コードされたタンパク質の放出プロフィールをｉｎ  ｖｉｖｏで改変するために、１種又は複数種の賦形剤を用いて製剤化することができる。溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散若しくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘若しくは乳化剤、防腐剤のいずれか若しくは全てなどの伝統的賦形剤以外にも、本発明の賦形剤は、限定はしないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、キメラポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植
のために）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体並びにこれらの組み合わせを含んでもよい。従って、本発明の製剤は、１種又は複数種の賦形剤を含んでもよく、これらは各々が、一緒にキメラポリヌクレオチドの安定性を高め、キメラポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増大しキメラポリヌクレオチドにコードされたタンパク質の発現を増大し、並びに／又はキメラポリヌクレオチドにコードされたタンパク質の放出プロフィールを改変する量で含まれる。さらに、本発明のキメラポリヌクレオチドは、自己集合核酸ナノ粒子を用いて製剤化することもできる。
【０４２２】
本明細書に記載する医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知であるか、又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、こうした調製方法は、賦形剤及び／又は１つ又は複数の他の補助成分と活性成分を結合させるステップを含む。
【０４２３】
本開示の医薬組成物は、１単位用量として、及び／若しくは複数の１単位用量として、調製、パッケージング、並びに／又は大量販売することができる。本明細書で用いられるとき、「単位用量」は、予定量の活性成分を含む医薬組成物の個別量を指す。活性成分の量は、概して、対象に投与される活性成分の投与量、及び／又はそうした投与量の好適な部分（例えば、上記投与量の２分の１又は３分の１など）に等しい。
【０４２４】
本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／又は任意の追加成分の相対量は、治療対象の種、大きさ、及び／又は状態に応じて、さらには、組成物を投与しようとする経路に応じて変動し得る。例として、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０４２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載する製剤は、少なくとも１つのキメラポリヌクレオチドを含有し得る。非制限的例として、製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのキメラポリヌクレオチドを含有し得る。一実施形態では、製剤は、限定はしないが、以下：ヒトタンパク質、家畜タンパク質、細菌タンパク質、生物学的タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療用ペプチド及びタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質及び細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質及び／又は非ヒト疾患に関連するタンパク質などのカテゴリーから選択されるタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドを含有し得る。一実施形態では、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも３つのキメラポリヌクレオチドを含有する。一実施形態では、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも５つのキメラポリヌクレオチドを含有する。
【０４２６】
医薬組成物は、さらに、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよく、これらは、本明細書で使用する通り、限定はしないが、所望される特定の剤形に合わせて、溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散若しくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘若しくは乳化剤、防腐剤などのいずれか若しくは全てを含む。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤、及び組成物を調製するための技術は、当技術分野において公知である（「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルティモア、２００６年を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。従来の賦形剤媒体の使用は、従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生み出すか、又はそうでなければ、医薬組成物のいずれかの他の成分と有害な形で相互作用するなどによって、物質若しくはその誘導体と不適合性となり得る場合を除いて、
本開示の範囲内で考慮され得る。
【０４２７】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の粒度は、増加及び／又は減少し得る。粒度の変化は、限定はしないが、炎症などの生物学的反応に対抗するのを助けることができるか、又は哺乳動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を増大し得る。
【０４２８】
医薬組成物の製造に用いられる薬学的に許容される賦形剤として、限定はしないが、不活性希釈剤、界面活性剤及び／若しくは乳化剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、並びに／又は油が挙げられる。こうした賦形剤は、任意選択で、本発明の医薬製剤に含有させることができる。
【０４２９】
リピドイド
リピドイドの合成は、広く記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、キメラポリヌクレオチドの送達に特に適している（マホン（Ｍａｈｏｎ）ら著、バイオコンジュゲート化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．）、２０１０年、第２１巻、ｐ．１４４８〜１４５４；シュローダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、内科学会誌（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ
Ｍｅｄ．）、２０１０年、第２６７巻、Ｐ．９〜２１；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９；シーグワルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６〜３００１を参照のこと；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４３０】
これらのリピドイドは、げっ歯類及び非ヒト霊長類における二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子を有効に送達するために使用されている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９；フランク−カメネトスキー（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００８年、第１０５巻、ｐ．１１９１５〜１１９２０；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ
Ｓ  Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜１０１０を参照のこと；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）が、本開示は、それらの製剤化、並びにキメラポリヌクレオチドの送達におけるそれらの使用を記載する。
【０４３１】
これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム又は粒子を調製することができ、従って、局所及び／又は全身投与経路を介したリピドイド製剤の注射後に、コードされるタンパク質の産生により判断される通りのキメラポリヌクレオチドの有効な送達を達成することができる。キメラポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、限定はしないが、静脈内、筋肉内、又は皮下経路などの様々な手段により投与することができる。
【０４３２】
核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、限定はしないが、製剤組成物、粒子ペグ化の性質、ローディングの程度、ポリヌクレオチドと脂質の比、並びに限定はしないが、粒度などの生物物理学的パラメータを含む多種のパラメータにより影響され得る（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９を参照のこと；全体として参照により本明細書に組み込む）。一例として、ポリ（エチレ
ングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長さのわずかな変化によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ効力に有意な影響が及ぼされ得る。限定はしないが、以下：ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ；別名９８Ｎ１２−５、ムルガイアー（Ｍｕｒｕｇａｉａｈ）ら著、分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０１巻、ｐ．６１、２０１０年を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）、Ｃ１２−２００（誘導体及び変異体を含む）、並びにＭＤＩなど、種々のリピドイドを含む製剤をｉｎ  ｖｉｖｏ活性について試験することができる。
【０４３３】
本明細書で「９８Ｎ１２−５」と呼ばれるリピドイドは、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９に開示されており、これは、全体として参照により本明細書に組み込む。
【０４３４】
本明細書で「Ｃ１２−２００」と呼ばれるリピドイドは、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９並びにリュウ（Ｌｉｕ）及びフアン（Ｈｕａｎｇ）ら著、分子療法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２０１０年、ｐ．６６９〜６７０に開示されており、これらのいずれも、全体として参照により本明細書に組み込む。リピドイド製剤は、キメラポリヌクレオチド以外に、３つ又は４つ以上の成分を含む粒子を含んでもよい。一例として、いくつかのリピドイドを含む製剤は、限定はしないが、９８Ｎ１２−５を含んでおり、これは、４２％のリピドイド、４８％のコレステロール及び１０％のＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有してもよい。別の例として、いくつかのリピドイドを含む製剤は、限定はしないが、Ｃ１２−２００を含んでおり、これは、５０％のリピドイド、１０％のジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含有してもよい。
【０４３５】
一実施形態では、全身性静脈内投与のために、リピドイドと一緒に製剤化されるキメラポリヌクレオチドは、肝臓をターゲティングすることができる。例えば、キメラポリヌクレオチドを使用し、４２％の９８Ｎ１２−５、４８％のコレステロール及び１０％のＰＥＧ−脂質の脂質モル組成物を含み、総脂質：ｃｉｒｃＲＮＡの最終重量比が約７．５：１であり、且つＰＥＧ脂質上でＣ１４アルキル鎖長を有し、平均粒度が約５０〜６０ｎｍの最終最適化静脈内製剤は、肝臓に対して９０％超の製剤の分布をもたらすことができる。（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の例では、Ｃ１２−２００（米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書及び国際公開第２０１０１２９７０９号パンフレットを参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）リピドイドを使用する静脈内製剤は、Ｃ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比５０／１０／３８．５／１．５を有し、総脂質：キメラポリヌクレオチドの重量比が７：１で、平均粒度が８０ｎｍであってよく、これは、肝細胞にキメラポリヌクレオチドを送達するのに有効であり得る（ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９を参照のこと；全体として参照により本明細書に組み込む）。別の実施形態では、ＭＤ１リピドイド含有製剤を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝細胞にキメラポリヌクレオチドを有効に送達することができる。
【０４３６】
筋肉内又は皮下経路用の最適化リピドイド製剤の特徴は、標的細胞型及び製剤が細胞外マトリックスを介して血流中に拡散する能力に応じて、有意に変動し得る。内皮透過窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）のサイズのために、有効な肝細胞送達には１５０ｎｍ未満の粒度が望ましいと思われる（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、
２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９を参照のこと；全体として参照により本明細書に組み込む）が、限定はしないが、内皮細胞、骨髄細胞、及び筋肉細胞などの他の細胞型に製剤を送達するためのリピドイド製剤化キメラポリヌクレオチドの使用は、それと同様にサイズ制限しなくてもよい。
【０４３７】
骨髄細胞及び内皮細胞などの他の非肝細胞にｉｎ  ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜１０１０；チョー（Ｃｈｏ）ら著、アドバンスト・ファンクショナル・マテリアルズ（Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．）、２００９年、第１９巻、ｐ．３１１２〜３１１８；第８回国際ユダ・フォークマン会議（８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｕｄａｈ
Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ、２０１０年１０月８日〜９日を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。単球、リピドイド製剤などの骨髄性細胞への有効な送達は、同様の構成成分モル比を有し得る。異なる比のリピドイド及び他の構成成分、例えば限定はしないが、ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＭＧを用いて、キメラポリヌクレオチドの製剤を、限定はしないが、肝細胞、骨髄性細胞、筋肉細胞などの種々の細胞型への送達のために最適化することができる。例えば、構成成分モル比は、限定はしないが、５０％のＣ１２−２００、１０％のジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含み得る（ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜１０１０を参照；全体として参照により本明細書に組み込む）。核酸を皮下送達又は筋肉内送達のいずれかによって、細胞（限定はしないが、脂肪細胞及び筋肉細胞など）に局所送達するためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に望ましい製剤構成成分を全て必要とするわけではなく、従って、リピドイド及びキメラポリヌクレオチドのみを含む場合もある。
【０４３８】
リピドイドは、キメラポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増大し得る；及び／又はコードされたタンパク質の翻訳を増加し得るため、種々のリピドイドの組み合わせを用いることにより、ｃｉｒｃＲＮＡ誘導によるタンパク質産生の効力を改善することができる（ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．１６８８〜１６９４を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４３９】
リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
本発明のキメラポリヌクレオチドは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主として脂質二重層で構成され得る人工的に調製された小胞であり、栄養素及び医薬製剤の投与のための送達ビヒクルとして用いることができる。リポソームは、限定はしないが、直径が数百ナノメートルであり、狭い水性コンパートメントによって分離された一続きの同心二重層を含み得る多重膜小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍ未満であり得る小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、及び直径５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ）など、様々なサイズであってよい。非健常組織に対するリポソームの付着を改善する、又は限定はしないがエンドサイトーシスなどのイベントを活性化するために、リポソーム設計は、限定はしないが、オプソニン又はリガンドを含んでもよい。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低い又は高いｐＨを含有してよい。
【０４４０】
リポソームの形成は、限定はしないが、封入される医薬製剤及びリポソーム成分、脂質小胞を分散させる媒体の性質、封入物質の有効濃度及びその潜在的毒性、小胞の適用中及び／又は送達中に関与する任意の追加プロセス、意図する用途に対する小胞の最適サイズ、多分散性及び貯蔵寿命、並びに安全且つ効率的なリポソーム産物のバッチ間再現性及び大量生産の可能性などの、物理化学的特性に左右され得る。
【０４４１】
非制限的例として、合成膜小胞などのリポソームは、以下の文献に記載されている方法、装置及びデバイスによって調製することができる：米国特許出願公開第２０１３０１７７６３８号明細書、同第２０１３０１７７６３７号明細書、同第２０１３０１７７６３６号明細書、同第２０１３０１７７６３５号明細書、同第２０１３０１７７６３４号明細書、同第２０１３０１７７６３３号明細書、同第２０１３０１８３３７５号明細書、同第２０１３０１８３３７３号明細書、及び同第２０１３０１８３３７２号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む。
【０４４２】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、限定なしに、以下：１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ワシントン州ボセル）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、及びＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）から形成されるリポソーム、並びに、限定はしないが、ヤンセン・バイオテック社（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（ペンシルベニア州ホーシャム）のＤＯＸＩＬ（登録商標）などの小分子薬物を送達し得るリポソームなどのリポソームを含み得る。
【０４４３】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、限定なしに、以前記載されており、且つｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが証明されている安定化プラスミド脂質粒子（ＳＰＬＰ）又は安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるリポソームなどのリポソームを含み得る（ホイーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．２７１〜２８１；チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．１４３８〜１４４７；ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）ら著、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．）、２００５年、第２２巻、ｐ．３６２〜３７２；モリッシー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２巻、ｐ．１００２〜１００７；ツィンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４１巻、ｐ．１１１〜１１４；ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００５年、第１０７巻、ｐ．２７６〜２８７；センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２〜１７６；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１〜６７３；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２；米国特許出願公開第２０１３０１２２１０４号明細書を参照のこと；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。ホイーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）らによる最初の製造方法は、デタージェント透析法であったが、これは、後にジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより改良されており、自発的小胞形成法と呼ばれる。リポソーム製剤は、キメラポリヌクレオチドに加えて、３〜４つの脂質構成成分から構成される。一例として、リポソームは、限定はしないが、ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより記載される通り、５５％のコレステロール、２０％のジステロイルホスファチジ
ルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、及び１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有することができる。別の例として、いくつかのリポソーム製剤は、限定はしないが、ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）らにより記載される通り、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、及び３０％のカチオン性脂質を含有してもよく、ここで、カチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、又は１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であってもよい。
【０４４４】
一部の実施形態では、リポソーム製剤は、約２５．０％〜約４０．０％のコレステロール、約３０．０％〜約４５．０％のコレステロール、約３５．０％〜約５０．０％のコレステロール、及び／又は約４８．５％〜約６０％のコレステロールを含んでもよい。好ましい実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％及び４３．５％からなる群から選択されるパーセンテージのコレステロールを含み得る。一部の実施形態では、製剤は、約５．０％〜約１０．０％のＤＳＰＣ及び／又は約７．０％〜約１５．０％のＤＳＰＣを含み得る。
【０４４５】
一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫原又は別の目的のポリペプチドをコードし得るキメラポリヌクレオチドを送達するように形成することができるリポソームを含み得る。キメラポリヌクレオチドは、リポソームによって封入してもよいし、及び／又は水性コアに含有させた後、これをリポソームによって封入してもよい（国際公開第２０１２０３１０４６号パンフレット、同第２０１２０３１０４３号パンフレット、同第２０１２０３０９０１号パンフレット、同第２０１２００６３７８号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３０１８９３５１号明細書、同第２０１３０１９５９６９号明細書、同第２０１３０２０２６８４号明細書を参照；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４４６】
別の実施形態では、リポソームを標的送達のために製剤化することができる。非制限的例として、リポソームは、肝臓への標的送達のために製剤化することができる。標的送達のために用いられるリポソームとして、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１９５９６７号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているリポソーム、及びリポソームの製造方法が挙げられる。
【０４４７】
別の実施形態では、免疫原をコードし得るキメラポリヌクレオチドは、カチオン性水中油形エマルション中に製剤化することができ、ここで、エマルション粒子は、オイルコア、及びキメラポリヌクレオチドと相互作用して、その分子をエマルション粒子に係留することができるカチオン性脂質を含む（国際公開第２０１２００６３８０号パンフレットを参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４４８】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、親水相が分散している連続的疎水相を含む油中水形エマルション中に製剤化することもできる。非制限的例として、エマルションは、国際公開第２０１０８７７９１号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製造することができる。
【０４４９】
別の実施形態では、脂質製剤は、少なくともカチオン性脂質、トランスフェクションを増強する脂質、及び脂質部分に連結した親水性ヘッドグループを含有する少なくとも１つの脂質を含み得る（国際公開第２０１１０７６８０７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１１０２００５８２号明細書；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の実施形態では、免疫原をコードするキメラポリヌクレオチドは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞に製剤化することができる（米国特許
出願公開第２０１２０１７７７２４号明細書を参照；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４５０】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１３０８６５２６号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のリポソーム中に製剤化することができる。キメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１３０８６５２６号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、逆転ｐＨ勾配及び／又は最適化内部バッファー組成物を用いて、リポソーム中に封入することができる。
【０４５１】
一実施形態では、医薬組成物は、限定はしないが、ＤｉＬａ２リポソーム（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ワシントン州ボセル）、スマーティクレス（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ    Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ワシントン州ボセル）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣癌へのｓｉＲＮＡ送達（ランデン（Ｌａｎｄｅｎ）ら著、癌生物学及び療法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００６年、第５巻（１２）、ｐ．１７０８〜１７１３）；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）及びヒアルロナン被覆リポソーム（クイテット・セラピューティクス（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、イスラエル）などのリポソームに製剤化することができる。
【０４５２】
一実施形態では、カチオン性脂質は、米国特許出願公開第２０１３００９０３７２号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどの、低分子量カチオン性脂質であってもよい。
【０４５３】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化することができる。
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、カチオン性脂質を含むリポソーム中に製剤化することができる。リポソームは、国際公開第２０１３００６８２５号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、１：１〜２０：１のカチオン性脂質中の窒素対ＲＮＡ中のリン酸のモル比（Ｎ：Ｐ比）を有していてよい。別の実施形態では、リポソームは、２０：１超又は１：１未満のＮ：Ｐ比を有し得る。
【０４５４】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化することができる。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって達成することができる。非制限的例として、ポリカチオンは、限定はしないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び／又はポリアルギニン、並びに国際公開第２０１２０１３３２６号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０１４２８１８号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているカチオン性ペプチドなどのカチオン性ペプチド又はポリペプチドを含み得る。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、コレステロール又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの中性脂質をさらに含み得る脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化してもよい。
【０４５５】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイド中に製剤化することができる。本発明で用いられ得るアミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって調製することができる。
【０４５６】
リポソーム製剤は、限定はしないが、カチオン性脂質構成成分の選択、カチオン性脂質
の飽和度、ペグ化の性質、全構成成分の比及びサイズなどの生物物理学的パラメータによって影響され得る。センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら（センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２〜１７６；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）による一例では、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、及び１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変えると、様々な抗原提示細胞にｓｉＲＮＡをより効果的に送達することができた（バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６〜２２００；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。一部の実施形態では、リポソーム製剤は、約３５〜約４５％のカチオン性脂質、約４０〜約５０％のカチオン性脂質、約５０〜約６０％のカチオン性脂質、及び／又は約５５〜約６５％のカチオン性脂質を含み得る。一部の実施形態では、リポソーム中の脂質対ｍＲＮＡの比は、約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、及び／又は少なくとも３０：１であってよい。
【０４５７】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＰＥＧの比を増減する、及び／又はＰＥＧ脂質の炭素鎖長さをＣ１４からＣ１８に変更することにより、ＬＮＰ製剤の薬物動態及び／又は生体分布を改変することができる。非制限的例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ及びコレステロールと比較して、約０．５％〜約３．０％、約１．０％〜約３．５％、約１．５％〜約４．０％、約２．０％〜約４．５％、約２．５％〜約５．０％、及び／又は約３．０％〜約６．０％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有し得る。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、限定はしないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロール）及び／又はＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質で置換してもよい。カチオン性脂質は、当技術分野で公知の任意の脂質、例えば、限定はしないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００及び／又はＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどから選択することができる。
【０４５８】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１２１７０９３０号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどの脂質ナノ粒子中に製剤化することができる。
【０４５９】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドを含む製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子である。脂質は、限定はしないが、以下：ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ペグ化脂質及びアミノアルコール脂質から選択することができる。別の態様では、脂質は、限定はしないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であってもよい。アミノアルコールカチオン性脂質は、本明細書に記載の脂質及び／又は米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造される脂質であってもよい。非制限的例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチル
オキシ）メチル］プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物３）；及び２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号明細書の化合物４）；又はこれらの任意の薬学的に許容される塩若しくは立体異性体であってもよい。
【０４６０】
一実施形態では、カチオン性脂質は、限定はしないが、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００３９８］に記載のカチオン性脂質から選択することができる。
【０４６１】
一実施形態では、脂質は、国際公開第２０１２１７０８８９号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものなどの切断可能な脂質であってもよい。
別の実施形態では、脂質は、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３００６４８９４号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）の式（Ｉ）などのカチオン性脂質であってもよい。
【０４６２】
一実施形態では、カチオン性脂質は、当技術分野で公知の方法及び／又は以下の文献に記載の方法により合成することができる：国際公開第２０１２０４０１８４号パンフレット、同第２０１１１５３１２０号パンフレット、同第２０１１１４９７３３号パンフレット、同第２０１１０９０９６５号パンフレット、同第２０１１０４３９１３号パンフレット、同第２０１１０２２４６０号パンフレット、同第２０１２０６１２５９号パンフレット、同第２０１２０５４３６５号パンフレット、同第２０１２０４４６３８号パンフレット、同第２０１００８０７２４号パンフレット、同第２０１０２１８６５号パンフレット、同第２０１３０８６３７３号パンフレット、及び同第２０１３０８６３５４号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４６３】
別の実施形態では、カチオン性脂質は、トリアルキルカチオン性脂質であってもよい。トリアルキルカチオン性脂質並びにトリアルキルカチオン性脂質の製造及び使用方法の非制限的例は、国際公開第２０１３１２６８０３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０４６４】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドのＬＮＰ製剤は、３％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有し得る。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドのＬＮＰ製剤は、１．５％の脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有し得る。
【０４６５】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドの医薬組成物は、国際公開第２０１２０９９７５５号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているペグ化脂質の少なくとも１つを含んでもよい。
【０４６６】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有してもよい。一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当技術分野で公知のカチオン性脂質及び少なくとも１つの他の成分を含有してもよい。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当技術分野で公知のカチオン性脂質、ＤＳＰＣ及びコレステロールを含有してもよい。非制限的例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ及びコレステロールを含有してもよい。別の非制限的例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモル比で含有してもよい（例えば、ギール（Ｇｅａｌｌ）ら著、「自己増幅ＲＮＡワクチンの非ウイルス送
達（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、ＰＮＡＳ、２０１２年、ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照；全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４６７】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレット又は同第２００８１０３２７６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって製剤化することができる。非制限的例として、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレット又は同第２００８１０３２７６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、ＬＮＰ製剤に封入することができる。
【０４６８】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１２０２０７８４５号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、非経口経路によって送達するためにナノ粒子に製剤化することができる。
【０４６９】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１３０１５６８４５号明細書又は国際公開第２０１３０９３６４８号パンフレット若しくは同第２０１２０２４５２６号パンフレット（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造される脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
【０４７０】
本明細書に記載する脂質ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１６４４００号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のシステム及び／又は方法により、滅菌環境において製造することができる。
【０４７１】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、米国特許第８，４９２，３５９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている核酸−脂質粒子などのナノ粒子に製剤化することができる。非制限的例として、脂質粒子は、以下のものを含む：１種又は複数種の活性剤若しくは治療薬；粒子中に存在する総脂質の約５０モル％〜約８５モル％を占める１種又は複数種のカチオン性脂質；粒子中に存在する総脂質の約１３モル％〜約４９．５モル％を占める１種又は複数種の非カチオン性脂質；粒子中に存在する総脂質の約０．５モル％〜約２モル％を占め、粒子の凝集を阻害する１種又は複数種の共役脂質。ナノ粒子中の核酸は、本明細書に記載する、及び／又は当技術分野で公知のキメラポリヌクレオチドであってよい。
【０４７２】
一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレット又は同第２００８１０３２７６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製剤化することができる。非制限的例として、本明細書に記載するｍＲＮＡは、国際公開第２０１１１２７２５５号パンフレット及び／又は同第２００８１０３２７６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、ＬＮＰ製剤に封入することができる。
【０４７３】
一実施形態では、本明細書に記載するＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでもよい。非制限的例として、ポリカチオン性組成物は、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の式１〜６０から選択することができる。別の実施形態では、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載するｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの送達に使用することができる。
【０４７４】
一実施形態では、本明細書に記載するＬＮＰ製剤は、さらに、透過性促進剤分子を含んでもよい。透過性促進剤分子の非制限的例は、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０４７５】
一実施形態では、医薬組成物は、限定はしないが、ＤｉＬａ２リポソーム（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ワシントン州ボセル）、スマーティクレス（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）（マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ワシントン州ボセル）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣癌へのｓｉＲＮＡ送達（ランデン（Ｌａｎｄｅｎ）ら著、癌生物学及び療法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００６年、第５巻（１２）、ｐ．１７０８〜１７１３）；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）及びヒアルロナン被覆リポソーム（クワイエット・セラピューティクス（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、イスラエル）などのリポソームに製剤化することができる。
【０４７６】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１２０６０２９３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、凍結乾燥ゲル相リポソーム組成物に製剤化することができる。
【０４７７】
ナノ粒子製剤は、リン酸コンジュゲートを含んでもよい。リン酸コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏ循環時間を増加し、及び／又はナノ粒子の標的送達を増大し得る。本発明で使用するリン酸コンジュゲートは、国際公開第２０１３０３３４３８号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。非制限的例として、リン酸コンジュゲートは、国際公開第２０１３０３３４３８号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている式のいずれか１つの化合物を含んでもよい。
【０４７８】
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含んでもよい。ポリマーコンジュゲートは、水溶性コンジュゲートであってもよい。ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている構造を有し得る。一態様では、本発明のキメラポリヌクレオチドとのポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３００７２７０９号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法及び／又はセグメント化ポリマー試薬を用いて、製造することができる。別の態様では、ポリマーコンジュゲートは、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているポリマーコンジュゲートなどの環部分を含むペンダント側基を有していてもよい。
【０４７９】
ナノ粒子製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を促進するためのコンジュゲートを含んでもよい。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の貪食細胞によるクリアランスを阻害し得る。一態様では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計される「自己」ペプチドであってもよい（例えば、ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）らにより記載される「自己」粒子（“ｓｅｌｆ”ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３３９巻、ｐ．９７１〜９７５）を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）らにより示される通り、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介のクリアランスを遅延させ、これによって、ナノ粒子の送達が促進された。別の態様では、コンジュゲートは
、膜タンパク質ＣＤ４７であってもよい（例えば、ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３３９巻、ｐ．９７１〜９７５を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）らは、「自己」ペプチドと同様に、ＣＤ４７は、スクランブルペプチド及びＰＥＧ被覆ナノ粒子と比較して、対象における循環粒子比率を増大することができることを示した。
【０４８０】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、対象における本発明のナノ粒子の送達を促進するためのコンジュゲートを含むナノ粒子に製剤化する。コンジュゲートは、ＣＤ４７膜であってもよいし、又はコンジュゲートは、前述した「自己」ペプチドなどのＣＤ４７膜タンパク質に由来するものであってもよい。別の態様では、ナノ粒子は、ＰＥＧ及びＣＤ４７のコンジュゲート又はその誘導体を含んでもよい。また別の態様では、ナノ粒子は、前述した「自己」ペプチド及び膜タンパク質ＣＤ４７の両方を含んでもよい。
【０４８１】
別の態様では、「自己」ペプチド及び／又はＣＤ４７タンパク質は、本発明のキメラポリヌクレオチドの送達のために、本明細書に記載するように、ウイルス様粒子又は偽ビリオン（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）に共役させてもよい。
【０４８２】
別の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドと、分解可能な結合を有し得るコンジュゲートを含む医薬組成物。コンジュゲートの非制限的例は、イオン化水素原子含有の芳香族部分、スペーサ部分、及び水溶性ポリマーを含む。非制限的例として、分解可能な結合を有するコンジュゲートを含む医薬組成物、及びこのような医薬組成物の送達方法が、米国特許出願公開第２０１３０１８４４４３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０４８３】
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体と、キメラポリヌクレオチドを含む炭水化物ナノ粒子であってもよい。非制限的例として、炭水化物担体は、限定はしないが、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲンタイプの材料、フィトグリコーゲンオクテニルコハク酸塩、フィトグリコーゲンβ−デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ−デキストリンを含み得る。（例えば、国際公開第２０１２１０９１２１号パンフレットを参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４８４】
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤又はポリマーで被覆してもよい。一実施形態では、ナノ粒子は、限定はしないが、ＰＥＧコーティング及び／又は中性表面電荷を有するコーティングなどの親水性コーティングで被覆してもよい。親水性コーティングは、より大きなペイロード、例えば、限定はしないが、キメラポリヌクレオチドなどを有するナノ粒子を中枢神経系内に送達する上で役立ち得る。非制限的例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及びそうしたナノ粒子を製造する方法が、米国特許出願公開第２０１３０１８３２４４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０４８５】
一実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であってもよい。親水性ポリマー粒子及び親水性ポリマー粒子の製造方法の非制限的例は、米国特許出願公開第２０１３０２１０９９１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０４８６】
別の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であってもよい。
脂質ナノ粒子製剤は、急速に排除される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られる生分解性カチオン性脂質で、カチオン性脂質を置換することにより改善することができる。
限定はしないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン化カチオン性脂質は、時間の経過とともに血漿及び組織中に蓄積することがわかっており、潜在的な毒性源となり得る。急速に排除される脂質の急速な代謝は、ラットにおいて、脂質ナノ粒子の耐容性及び治療指数を１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量へと一桁分改善することができる。酵素により分解されるエステル結合の含有によって、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持しながら、カチオン性成分の分解及び代謝プロフィールを改善することができる。エステル結合は、脂質鎖の内部に配置してもよいし、又は脂質鎖の末端に配置してもよい。内部エステル結合で、脂質鎖内の任意の炭素を置換してもよい。
【０４８７】
一実施形態では、内部エステル結合は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００４２６］に記載されるｒｅＬＮＰなどの飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。
【０４８８】
一実施形態では、ナノ種、ポリマー及び免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって、免疫応答を誘発することができる。（米国特許出願公開第２０１２０１８９７００号明細書及び国際公開第２０１２０９９８０５号パンフレット；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ポリマーでナノ種を封入してもよいし、又はナノ種を部分的に封入してもよい。免疫原は、本明細書に記載する組換えタンパク質、ｍＲＮＡ及び／又はキメラポリヌクレオチドであってもよい。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、ワクチン、例えば、限定はしないが、病原体に対するワクチンなどに使用するために製剤化することもできる。
【０４８９】
脂質ナノ粒子は、粒子の表面特性を改変するように操作してもよく、これによって、脂質ナノ粒子は、粘膜障壁を透過することができるようにしてもよい。粘液は、限定はしないが、口腔（例えば、頬及び食道膜並びに扁桃腺組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管及び気管支膜）、生殖器（例えば、膣、子宮頸及び尿道膜）などの粘膜組織に位置している。より高い薬物封入効率及び多種多様な薬物の持続的送達をもたらす能力のために好ましい１０〜２００ｎｍ超のナノ粒子は、粘膜障壁を通過して急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、連続的に分泌、放出、廃棄又は消化及び再利用されているため、捕捉された粒子のほとんどが数十秒以内若しくは数時間以内に粘膜組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で密にコーティングされた大きなポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中に拡散する同じ粒子よりわずか４〜６倍低速で粘膜を介して拡散した（ライ（Ｌａｉ）ら著、ＰＮＡＳ、２００７年、第１０４巻（５）、ｐ．１４８２〜４８７；ライ（Ｌａｉ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビュー（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．）、２００９年、第６１巻（２）、ｐ．１５８〜１７１；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ナノ粒子の輸送は、透過速度、及び／又は限定はしないが、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）法及び高解像度多粒子追跡（ＭＰＴ）法などの蛍光顕微鏡検査法を用いて、決定することができる。非制限的例として、米国特許第８，２４１，６７０号明細書、又は国際公開第２０１３１１００２８号パンフレット（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、粘膜障壁を透過することができる組成物を製造することができる。
【０４９０】
粘膜を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）及び／又はポリマー−ビタミンコンジュゲート及び／又はトリブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマー材料として、限定はしないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポ
リエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートが挙げられる。ポリマー材料は、生分解性及び／又は生体適合性であってもよい。生体適合性ポリマーの非制限的例が、国際公開第２０１３１１６８０４号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。さらに、ポリマー材料は照射してもよい。非制限的例として、ポリマー材料にγ線照射してもよい（例えば、国際公開第２０１２８２１６５号パンフレットを参照のこと；全体として参照により本明細書に組み込む）。具体的なポリマーの非制限的例として、以下のものが挙げられる：ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＰＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などのポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メト）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メト）アクリレート）、ポリ（ブチル（メト）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メト）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メト）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メト）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メト）アクリレート）、ポリ（フェニル（メト）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）並びにこれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ���酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ及びトリメチレンカルボネート、ポリビニルピロリドン。脂質ナノ粒子は、限定はしないが、ブロックコポリマー（国際公開第２０１３０１２４７６号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている分岐状ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマーなど）、及び（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（プロピレンオキシド））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２１７１８号明細書及び同第２０１００００３３３７号明細書及び米国特許第８，２６３，６６５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）などのコポリマーで被覆するか、又はコポリマーと結合させてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ポリマーであってよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学的実体が生成されないように行ってよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学的実体を形成することなく、ＰＬＧＡナノ粒子を被覆するポロキサマーを含んでもよく、こうした粒子は、依然として急速にヒト粘膜を透過することができる（ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー国際版（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２０１１年、第５０巻、ｐ．２５９７〜２６００；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ヒト粘膜を透
過することができるナノ粒子を生成する非制限的なスケーラブルな方法が、シュー（Ｘｕ）らにより記載されている（例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２０１３年、第１７０巻（２）、ｐ．２７９〜８６を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４９１】
ポリマー−ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンＥであってよい。コンジュゲートのビタミン部分は、限定はしないが、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分、又は他の界面活性剤の疎水性成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖及びアルキレンオキシド鎖）などの他の好適な成分で置換してもよい。
【０４９２】
粘液を透過するように操作される脂質ナノ粒子は、表面改変剤を含んでもよく、そのようなものとして、限定はしないが、キメラポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル−臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性剤）、糖若しくは糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、モグサ（ｍｕｇｗｏｒｔ）、ブロメライン、パパイン、クレロデンドロン（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ）、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アムブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼα、ネルテネキシン、エルドステイン）並びにｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅがある。表面改変剤は、粒子の表面に埋め込むか、若しくはメッシュに絡ませてもよいし、又は脂質ナノ粒子の表面上に付着させてもよい（例えば、コーティング、吸着、共有結合、若しくは他のプロセスにより）。（例えば、米国特許出願公開第２０１００２１５５８０号明細書、同第２００８０１６６４１４号明細書及び米国特許出願公開第２０１３０１６４３４３号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４９３】
粘膜透過性脂質ナノ粒子は、本明細書に記載する少なくとも１つのキメラポリヌクレオチドを含んでもよい。キメラポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に封入してもよいし、及び／又は粒子の表面に付着させてもよい。脂質ナノ粒子の表面にキメラポリヌクレオチドを共有結合させてもよい。粘膜透過性脂質ナノ粒子の製剤は、複数種のナノ粒子を含んでもよい。さらに、製剤は、粘液と相互作用して、周囲の粘液の構造的及び／又は付着特性を改変することにより粘液付着を低減する粒子を含有してもよく、これにより、粘膜組織に対する粘液透過性脂質ナノ粒子の送達が増大し得る。
【０４９４】
別の実施形態では、粘膜透過性脂質ナノ粒子は、粘膜透過促進コーティングを含む、低張性製剤であってもよい。製剤は、それが送達される上皮に対して低張性であってよい。低張性製剤の非制限的例は、国際公開第２０１３１１００２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に見出すことができる。
【０４９５】
一実施形態では、粘膜障壁を通過する送達を促進するために、製剤は、低張性溶液を含むか、又は低張性溶液であってもよい。低張性溶液は、粘液不活性粒子、例えば、限定はしないが、粘膜透過性粒子などが、膣上皮表面に到達することができる速度を高めることが判明している（例えば、エンサイン（Ｅｎｓｉｇｎ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１３年、第３４巻（２８）、ｐ．６９２２〜９を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４９６】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、限定なしに、サイレンス・セラピューティクス（Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（英国、ロンドン）のアトゥプレ
ックス（ＡＴＵＰＬＥＸ）（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム及び他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ステムジェント（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のステムフェクト（ＳＴＥＭＦＥＣＴ）（商標）、並びにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はプロタミンベースの標的及び非標的核酸送達などの、リポプレックスとして製剤化してもよい（アレク（Ａｌｅｋｕ）ら著、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２００８年、第６８巻、ｐ．９７８８〜９７９８；ストランバーグ（Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ）ら著、臨床薬理学及び治療薬国際ジャーナル（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第５０巻、ｐ．７６〜７８；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２〜１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０〜１３７０；グートビア（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、肺薬理学及び治療薬（Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４〜３４４；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、微小管研究（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６〜２９３；ワイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、免疫療法学会誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００９年、第３２巻、ｐ．４９８〜５０７；ワイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、免疫療法学会誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００８年、第３１巻、ｐ．１８０〜１８８；パスコロ（Ｐａｓｃｏｌｏ）著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第４巻、ｐ．１２８５〜１２９４；フォティン−ムレチェク（Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ）ら著、２０１１年、免疫療法学会誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、第３４巻、ｐ．１〜１５；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年６月、第１０４巻、ｐ．４０９５〜４１００；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４９７】
一実施形態では、こうした製剤はまた、限定はしないが、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、及び白血球など、種々の細胞型にｉｎ  ｖｉｖｏで受動的又は能動的に向かわせるように構築するか、又は組成物を改変させてもよい（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１〜６７３；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、微小管研究（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６〜２９３；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２〜１２３４；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０〜１３７０；グートビア（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、肺薬理学及び治療薬（Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４〜３４４；バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６〜２２００；フェンスケ（Ｆｅｎｓｋｅ）及びカリス（Ｃｕｌｌｉｓ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ．２５〜４４；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７〜６３０；ピア（Ｐｅｅｒ）及びリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７〜１１３３；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。肝細胞に対する製剤の受動的ターゲティングの一例として、ＤＬｉｎ−Ｄ
ＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、これらは、アポリポタンパク質Ｅに結合し、これらの製剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの肝細胞への結合及び取込みを促進することが明らかにされている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。製剤はまた、限定はしないが、葉酸塩、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、及び抗体標的化手法により例示されるように、その表面上での種々のリガンドの発現を介して選択的にターゲティングさせることもできる（コールハトカー（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ディスカバリー・テクノロジー（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第８巻、ｐ．１９７〜２０６；ムサッチオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）及びトーチリン（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ）著、フロンティア・イン・バイオサイエンス（Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．）、２０１１年、第１６巻、ｐ．１３８８〜１４１２；ユー（Ｙｕ）ら著、分子膜生物学（Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、第２７巻、ｐ．２８６〜２９８；パティル（Ｐａｔｉｌ）ら著、クリティカル・レビュー・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリア・システム（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．）、２００８年、第２５巻、ｐ．１〜６１；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８〜２７１４；チャオ（Ｚｈａｏ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ．３０９〜３１９；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４；スリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）ら著、分子生物学による方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第８２０巻、ｐ．１０５〜１１６；ベン−アリー（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ）ら著、分子生物学による方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第７５７巻、ｐ．４９７〜５０７；ピア（Ｐｅｅｒ）著、２０１０年、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、第２０巻、ｐ．６３〜６８；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．４０９５〜４１００；キム（Ｋｉｍ）ら著、分子生物学による方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）、２０１１年、第７２１巻、ｐ．３３９〜３５３；スブラマニヤ（Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．２０２８〜２０３７；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７〜６３０；ピア（Ｐｅｅｒ���及びリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７〜１１３３；これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０４９８】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、固体脂質ナノ粒子として製剤化する。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球形であってもよい。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することのできる固体脂質コアマトリックスを有し、界面活性剤及び／又は乳化剤と共に安定化し得る。別の実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己集合脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）、２００８年、第２巻（８）、ｐ．１６９６〜１７０２を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、ＳＬＮは、国際公開第２０１３１０５１０１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているＳＬＮであってもよい。別の非制限的例として、ＳＬＮは、国際公開第２０１３１０５１０１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法により製造することができる。
【０４９９】
リポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用すると、これらの製剤は、キメラポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増大することができ；且つ／又はコードされたタンパク質の翻訳を増大することができるため、キメラポリヌクレオチドに誘導されるタンパク質産生の効力を向上させ得る。１つのこうした例は、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にする脂質封入の使用を伴う（ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２００７年、第１５巻、ｐ．７１３〜７２０；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。また、リポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用することにより、キメラポリヌクレオチドの安定性を高めることもできる。
【０５００】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、制御放出及び／又は標的送達のために製剤化することができる。本明細書で用いられるとき、「制御放出」は、治療成果を実施する特定の放出パターンに適合する医薬組成物又は化合物放出プロフィールを指す。一実施形態では、制御放出及び／又は標的送達のために本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知の送達剤に、キメラポリヌクレオチドを封入することができる。本明細書で用いられるとき、「封入する」という用語は、包み込む、取り囲む、又は包むことを意味する。本発明の化合物の製剤に関する場合、封入は、実質的、完全又は部分的のいずれであってもよい。用語「実質的に封入された」は、本発明の医薬組成物又は化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９超若しくは９９．９９９％超が、送達剤内に包み込まれる、取り囲まれる、又は包まれることを意味する。「部分的封入」とは、本発明の医薬組成物又は化合物の１０、１０、２０、３０、４０、５０以下が送達剤内に包み込まれる、取り囲まれる、又は包まれることを意味する。有利には、封入は、蛍光及び／又は電子顕微鏡写真を用いて、本発明の医薬組成物又は化合物のエスケープ又は活性を測定することによって、決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物又は化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９若しくは９９．９９％超が、送達剤内に封入される。
【０５０１】
一実施形態では、制御放出製剤は、限定はしないが、トリブロックコポリマーを含んでもよい。非制限的例として、製剤は、２つの異なる種類のトリブロックコポリマーを含み得る（国際公開第２０１２１３１１０４号パンフレット及び同第２０１２１３１１０６号パンフレット；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５０２】
別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子又は急速排除脂質ナノ粒子に封入した後、本明細書に記載の及び／若しくは当技術分野で公知のポリマー、ハイドロゲル並びに／又は外科密閉剤に、この脂質ナノ粒子又は急速排除脂質ナノ粒子を封入してもよい。非制限的例として、ポリマー、ハイドロゲル及び／又は外科密閉剤は、以下に挙げるものであってよい：ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス社（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、フロリダ州アラチュア）、ヒレネクス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）、外科密閉剤、例えば、フィブリノーゲンポリマー（エチコン社（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）、ジョージア州コーネリア）、ティッセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースの密閉剤、並びにコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）。
【０５０３】
別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象に注入すると、ゲルを形成し得る当技術分野
で公知の任意のポリマーに封入してもよい。別の非制限的例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックスに封入してもよい。
【０５０４】
一実施形態では、制御放出及び／又は標的送達のためのキメラポリヌクレオチド製剤はまた、少なくとも１つの制御放出コーティングを含んでもよい。制御放出コーティングとして、限定はしないが、オパドライ（ＯＰＡＤＲＹ）（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ユードラギット  ＲＬ（ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＬ）（登録商標）、ユードラギット  ＲＳ（ＥＵＤＲＡＧＩＴ
ＲＳ）（登録商標）並びにエチルセルロース水性分散液（アクアコート（ＡＱＵＡＣＯＡＴ）（登録商標）及びシュアリース（ＳＵＲＥＬＥＡＳＥ）（登録商標））などのセルロース誘導体が挙げられる。
【０５０５】
一実施形態では、制御放出及び／又は標的送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１種の生分解性ポリエステルを含んでもよい。生分解性ポリエステルとして、限定はしないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、生分解性ポリエステルは、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧ共役を含んでもよい。
【０５０６】
一実施形態では、少なくとも１つのキメラポリヌクレオチドを含む制御放出及び／又は標的送達製剤は、米国特許第８，４０４，２２２号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のように、少なくとも１種のＰＥＧ及び／又はＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含んでもよい。
【０５０７】
別の実施形態では、少なくとも１つのキメラポリヌクレオチドを含む制御放出送達製剤は、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の制御放出ポリマー系であってもよい。
【０５０８】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、治療用ナノ粒子に封入してもよい。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載の、並びに限定はしないが、以下：国際公開第２０１０００５７４０号パンフレット、同第２０１００３０７６３号パンフレット、同第２０１０００５７２１号パンフレット、同第２０１０００５７２３号パンフレット、同第２０１２０５４９２３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、同第２０１００１０４６４５号明細書、同第２０１０００８７３３７号明細書、同第２０１０００６８２８５号明細書、同第２０１１０２７４７５９号明細書、同第２０１０００６８２８６号明細書、同第２０１２０２８８５４１号明細書、同第２０１３０１２３３５１号明細書及び同第２０１３０２３０５６７号明細書、並びに米国特許第８，２０６，７４７号明細書、同第８，２９３，２７６号明細書、同第８，３１８，２０８号明細書及び同第８，３１８，２１１号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）など、当技術分野で公知の方法によって製剤化することができる。別の実施形態では、治療用ポリマーナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２０１４０７９０号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって同定することができる。
【０５０９】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、持続放出のために製剤化することができる。本明細書で用いられるとき、「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物又は化合物を指す。期間は、限定はしないが、数時間、数日、数週間、数ヵ月及び数年を含み得る。非制限的例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー、及び限定はしないが、本発明のキメラポリヌクレオチドなどの治療薬を含んでもよい（国際公開第２０１００
７５０７２号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号明細書、同第２０１１０２１７３７７号明細書及び同第２０１２０２０１８５９号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の非制限的例では、持続放出製剤は、持続的な生体利用可能性を可能にする物質、例えば、限定はしないが、結晶、高分子ゲル及び／又は粒子状懸濁物を含んでもよい（米国特許出願公開第２０１３０１５０２９５号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５１０】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、標的特異的となるように製剤化することができる。非制限的例として、治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含んでもよい（国際公開第２０１１０８４５１８号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。一実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌特異的となるように製剤化することができる。非制限的例として、治療用ナノ粒子は、国際公開第２００８１２１９４９号パンフレット、同第２０１０００５７２６号パンフレット、同第２０１０００５７２５号パンフレット、同第２０１１０８４５２１号パンフレット、並びに米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号明細書、同第２０１２０００４２９３号明細書及び同第２０１００１０４６５５号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているナノ粒子に製剤化してもよい。
【０５１１】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでもよい。非制限的例として、ナノ粒子は、限定はしないが、以下：ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）又はこれらの組み合わせなどの２種以上のポリマーを含み得る。
【０５１２】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。一実施形態では、ジブロックコポリマーは、限定はしないが、以下：ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）又はこれらの組み合わせなどのポリマーと組み合わせてＰＥＧを含んでもよい。別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、欧州特許出願公開第（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているジブロックコポリマーを含んでもよい。また別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、国際公開第２０１３１２００５２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのハイＸ（ｈｉｇｈ  Ｘ）ジブロックコポリマーであってもよい。
【０５１３】
非制限的例として、治療用ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書及び米国特許第８，２３６，３３０号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）を含む。別の非制限的例では、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧ及びＰＬＡ又はＰＥＧ及びＰＬＧＡのジ
ブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（米国特許第８，２４６，９６８号明細書及び国際公開第２０１２１６６９２３号パンフレットを参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。また別の非制限的例では、治療用ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているステルスナノ粒子又は標的特異的ステルスナノ粒子である。
【０５１４】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含んでもよい（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号明細書及び同第８，２８７，９１０号明細書並びに米国特許出願公開第２０１３０１９５９８７号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５１５】
また別の非制限的例では、脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む（例えば、以下を参照：感熱性ハイドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）は、リー（Ｌｅｅ）ら著、「Ｔｇｆ−β１遺伝子送達ビヒクルとしての感熱性ハイドロゲルは、糖尿病性損傷治癒を促進する（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ
ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ）」、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻（１２）、ｐ．１９９５〜２０００では、ＴＦＧ−β１遺伝子送達ビヒクルとして；リー（Ｌｉ）ら著、「感熱性生分解性ハイドロゲルを基材とする制御遺伝子送達系（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）」、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻（６）、ｐ．８８４〜８８８；及びチャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、「ノニオン性両親媒性生分解性ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーは、ラット骨格筋において遺伝子送達効率を高める（Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）」、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２００７年、第１１８巻、ｐ．２４５〜２５３では、制御遺伝子送達系として、使用された；これらの文献の各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。本発明のキメラポリヌクレオチドは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５１６】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含んでもよい（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号明細書及び同第８，２８７，９１０号明細書並びに米国特許出願公開第２０１３０１９５９８７号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５１７】
一実施形態では、本明細書に記載するブロックコポリマーは、非ポリマーミセル及びブロックコポリマーを含むポリイオン複合体に含有させてもよい。（例えば、米国特許出願公開第２０１２００７６８３６号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５１８】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のアクリル酸ポリマーを含んでもよい。アクリル酸ポリマーとして、限定はしないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリル酸コポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート並びにこれらの組
み合わせが挙げられる。
【０５１９】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のポリ（ビニルエステル）ポリマーを含んでもよい。ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、ランダムコポリマーなどのコポリマーであってもよい。非制限的例として、ランダムコポリマーは、国際公開第２０１３０３２８２９号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０１２１９５４号明細書（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどの構造を有し得る。一態様では、ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドに共役させてもよい。別の態様では、本発明で使用することができるポリ（ビニルエステル）ポリマーは、（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものであってもよい。
【０５２０】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のジブロックコポリマーを含んでもよい。ジブロックコポリマーは、限定はしないが、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーであってよい（例えば、国際公開第２０１３０４４２１９号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、治療用ナノ粒子は、癌を治療するために使用することができる（国際公開第２０１３０４４２１９号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５２１】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、本明細書に記載の、及び／又は当技術分野で公知の少なくとも１種のカチオン性ポリマーを含んでもよい。
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のアミン含有ポリマー、例えば、限定はしないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（β−アミノエステル）（例えば、米国特許第８，２８７，８４９号明細書を参照；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）及びこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０５２２】
別の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、国際公開第２０１３０５９４９６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのアミンカチオン性脂質を含んでもよい。一態様では、カチオン性脂質は、アミノ−アミン又はアミノ−アミド部分を有し得る。
【０５２３】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１種の分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性ポリエステルとして、限定はしないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧ共役を含んでもよい。
【０５２４】
別の実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのターゲティングリガンドの共役を含んでもよい。ターゲティングリガンドは、限定はしないが、モノクローナル抗体などの当技術分野で公知の任意のリガンドであってよい。（キルポチン（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ）ら著、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、２００６年、第６６巻、ｐ．６７３２〜６７４０；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５２５】
一実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌をターゲティングするのに用いることができる水溶液中に製剤化することができる（国際公開第２０１１０８４５１３号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１１０２９４７１７号明細書を参照；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５２６】
一実施形態では、少なくとも１つのキメラポリヌクレオチドを含む治療用ナノ粒子は、ポドビンスキー（Ｐｏｄｏｂｉｎｓｋｉ）らにより、米国特許第８，４０４，７９９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法を用いて製剤化することができる。
【０５２７】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、合成ナノキャリアに封入する、これと連結させる、及び／又は結合させることができる。合成ナノキャリアとして、限定はしないが、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレットのパラグラフ［０００４６８］〜［０００４７７］に記載のものがあり、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０５２８】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、双性イオン性脂質に封入する、これと連結させる、及び／又は結合させることができる。双性イオン性脂質及び双性イオン性脂質の使用方法の非制限的例は、米国特許出願公開第２０１３０２１６６０７号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。一態様では、双性イオン性脂質は、本明細書に記載のリポソーム及び脂質ナノ粒子に使用することができる。
【０５２９】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１３０１９７１００号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通り、コロイドナノキャリアに製剤化することができる。
【０５３０】
一実施形態では、ナノ粒子は、経口投与のために最適化することができる。ナノ粒子は、限定はしないが、キトサン又はその誘導体などの少なくとも１種のカチオン性バイオポリマーを含んでもよい。非制限的例として、ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２０２８２３４３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製剤化することができる。
【０５３１】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、脂質ＫＬ５２（参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２９５８３２号明細書に開示されているアミノ−脂質）を含む。ＬＮＰ投与の活性及び／又は安全性（１つ又は複数のＡＬＴ／ＡＳＴ、白血球数並びにサイトカイン誘導を検査することにより測定される）は、こうした脂質の組み込みによって改善され得る。ＫＬ５２を含むＬＮＰは、静脈内及び／又は１つ又は複数の用量で投与することができる。一部の実施形態では、ＫＬ５２を含むＬＮＰの投与によって、ＭＣ３を含むＬＮＰと比較して、同等若しくは改善されたｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現が達成される。
【０５３２】
一部の実施形態では、より小さいＬＮＰを用いて、キメラポリヌクレオチドを送達することができる。こうした粒子は、直径が０．１ｕｍ未満から１００ｎｍ以下、例えば、限定はしないが、０．１ｕｍ未満、１．０ｕｍ未満、５ｕｍ未満、１０ｕｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、９７５ｕｍ未満であってよ
い。
【０５３３】
別の実施形態では、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ及び／又は約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの直径を含み得る、より小さいＬＮＰを用いて、キメラポリヌクレオチドを送達することができる。
【０５３４】
一部の実施形態では、こうしたＬＮＰは、マイクロ流体力学ミキサーを含む方法を用いて合成する。例示的マイクロ流体力学スミキサーとして、限定はしないが、以下のものが挙げられる：限定なしに、マイクロイノバ（Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ）（アラーハイリゲン・バイ・ヴィルドン（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ  ｂｅｉ  Ｗｉｌｄｏｎ）、オーストリア）などのスリット型インターデジタルマイクロミキサー、及び／又はスタガー・ヘリンボーン（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ）マイクロミキサー（ＳＨＭ）（チガルツェフ，Ｉ．Ｖ（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ）ら著、ミリ秒のマイクロ流体混合を用いた、水性及びトリグリセリドコアを備える制限サイズ脂質ナノ粒子のボトムアップ設計及び合成が公開されている（ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）著、２０１２年、第２８巻、ｐ．３６３３〜４０；ベリボー，Ｎ．Ｍ．（Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．）ら著、「ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達のための極めて強力な制限サイズ脂質ナノ粒子のマイクロ流体合成（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ）」、分子療法−核酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、２０１２年、第１巻、ｅ３７；チェン，Ｄ．（Ｃｈｅｎ，Ｄ．）ら著、「制御マイクロ流体製剤により達成される強力なｓｉＲＮＡ含有脂質ナノ粒子の迅速な発見（Ｒａｐｉｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」、米国化学会誌、（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．）、２０１２年、第１３４巻（１６）、ｐ．６９４８〜５１；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。一部の実施形態では、ＳＨＭを含むＬＮＰ作製方法は、少なくとも２つの入力ストリームの混合をさらに含み、その場合、混合は、ミクロ構造誘導のカオス的移流（ＭＩＣＡ）によって起こる。本方法によれば、流体ストリームは、ヘリンボーンパターンに存在する流路を通って流れ、これが旋回流を引き起こして、互いの周囲に流体を折り重ねる。この方法はまた、流体混合のための表面も含み得るが、その場合、上記の表面は、流体の循環中に方向を変更する。ＳＨＭを用いてＬＮＰを作製する方法としては、米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号明細書及び同第２０１２／０２７６２０９号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されているものがある。
【０５３５】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、インスティチュート・フュア・ミクロテクニーク・マインツ社（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋ
ｒｏｔｅｃｈｎｉｋ  Ｍａｉｎｚ  ＧｍｂＨ）、ドイツ、マインツ）製のスリット・インターデジタル・マイクロストラクチャード・ミキサー（Ｓｌｉｔ  Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｍｉｘｅｒ）（ＳＩＭＭ−Ｖ２）又はスタンダード・スリット・インターデジタル・マイクロミキサー（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｌｉｔ  Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｉｘｅｒ）（ＳＳＩＭＭ）又はキャタピラー（Ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）（ＣＰＭＭ）若しくはインピンギング−ジェット（Ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ−ｊｅｔ）（ＩＪＭＭ）などのマイクロミキサーを用いて、作製される脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５３６】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を用いて、作製された脂質ナノ粒子に製剤化することができる（ホワイトサイズ，ジョージ  Ｍ．（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｍ．）著、「マイクロフルイディックスの起源及び未来（Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４２巻、ｐ．３６８〜３７３；及びアブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら著、「マイクロ流路のためのカオスミキサー（Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年、第２９５巻、ｐ．６４７〜６５１を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、制御マイクロ流体製剤化は、低いレイノルズ数（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｎｕｍｂｅｒ）で、マイクロ流路中の定常圧力駆動流のストリームを混合するための受動的方法を含む（例えば、アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら著、「マイクロ流路のためのカオスミキサー（Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年、第２９５巻、ｐ．６４７〜６５１を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５３７】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、ハーバード・アパラタス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）（マサチューセッツ州ホリストン）又はドロマイト・マイクロフルイディックス（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）（英国、ロイストン）製のものなどのマイクロミキサーチップを用いて作製された脂質ナノ粒子に製剤化することができる。マイクロミキサーチップは、分割及び再結合機構による２つ以上の流体ストリームの高速混合のために使用することができる。
【０５３８】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレット又は米国特許第８，４４０，６１４号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている薬剤封入マイクロスフィアを用いて、送達のために製剤化することができる。マイクロスフィアは、国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）の化合物を含み得る。別の態様では、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）は、本発明のキメラポリヌクレオチドを細胞に送達する上で有用である（国際公開第２０１３０６３４６８号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５３９】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、限定はしないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ
、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、及び／又は約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５４０】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約５００ｎｍの直径を有し得る。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超又は１０００ｎｍ超の直径を有し得る。
【０５４１】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、国際公開第２０１３０５９９２２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている制限サイズ脂質ナノ粒子であってもよい。制限サイズ脂質ナノ粒子は、水性コア又は疎水性コアを取り囲む脂質二重層を含んでよく；ここで、脂質二重層は、リン脂質、例えば、限定はしないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリン、及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を含み得る。別の態様では、制限サイズ脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール−脂質、例えば、限定はしないが、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧを含んでもよい。
【０５４２】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１３０６３５３０号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている送達方法を用いて、特定の位置に送達、局在化及び／又は濃縮することができる。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドの送達前、送達と同時に、又は送達後に、中空ポリマー粒子を対象に投与することができる。中空ポリマー粒子は、一旦対象と接触すると、体積の変化を被り、対象の特定の位置に留まる、埋め込まれる、固定化されるか、又は捕捉される。
【０５４３】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、活性物質放出系に製剤化することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１０２５４５号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。活性物質放出系は、１）触媒活性核酸とハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド阻害剤ストランドに結合した少なくとも１つのナノ粒子、及び２）治療活性物質に結合する少なくとも１つの基質分子に結合する化合物（例えば、本明細書に記載のキメラポリヌクレオチド）を含んでもよく、その場合、治療活性物質は、触媒活性核酸による基質分子の切断によって放出される。
【０５４４】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、非細胞材料を含む内部コアと、細胞膜を含む外側表面とを含む、ナノ粒子に製剤化することができる。細胞膜は、細胞に由来してもよいし、又はウイルス由来の膜であってもよい。非制限的例として、ナノ粒子は、国際公開第２０１３０５２１６７号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製造することができる。別の非制限的例として、国際公開第２０１３０５２１６７号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のナノ粒子を用いて、本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドを送達することもできる。
【０５４５】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、多孔質ナノ粒子支持脂質二重層（プロトセル）に製剤化してもよい。プロトセルは、国際公開第２０１３０５６１３２号パンフレットに記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０５４６】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、米国特許第８，４２０，１２３号明細書及び同第８，５１８，９６３号明細書並びに欧州特許第２０７３８４８Ｂ１号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている又はそれに記載されている方法により作製されるポリマーナノ粒子に製剤化することができる。非制限的例として、ポリマーナノ粒子は、米国特許第８，５１８，９６３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のナノ粒子、又は記載の方法によって製造されるナノ粒子のように、高いガラス転移温度を有し得る。別の非制限的例として、経口、非経口及び局所製剤のためのポリマーナノ粒子は、欧州特許第２０７３８４８Ｂ１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって製造することができる。
【０５４７】
別の実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、イメージングに用いられるナノ粒子に製剤化することができる。ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１２９６３６号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのリポソームナノ粒子であってもよい。非制限的例として、リポソームは、ガドリニウム（ＩＩＩ）２−｛４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリルアミドメチル−Ｎ’−アミド−メチル］−１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデク−ｌ−イル｝−酢酸及び中性の完全飽和リン脂質成分を含み得る（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１２９６３６号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５４８】
一実施形態では、本発明で使用することができるナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法により形成される。
【０５４９】
本発明のナノ粒子は、限定はしないが、その欠乏によって、貧血から神経管欠損までの健康障害を引き起こし得るものなどの栄養素をさらに含んでもよい（例えば、国際公開第２０１３０７２９２９号パンフレットに記載のナノ粒子を参照のこと；これらの各々の内容は、その全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、栄養素は、第一鉄塩、第二鉄塩若しくは元素鉄の形態の鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミン又は微量栄養素であってもよい。
【０５５０】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、膨潤性ナノ粒子に製剤化することができる。膨潤性ナノ粒子は、限定はしないが、米国特許第８，４４０，２３１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってもよい。非制限的例として、膨潤性ナノ粒子は、呼吸器系に対する本発明のキメラポリヌクレオチドの送達に用いることができる（例えば、米国特許第８，４４０，２３１号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５５１】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、米国特許第８，４４９，９１６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのポリ無水物ナノ粒子に製剤化することができる。
【０５５２】
本発明のナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び／又は免疫応答を調節するように幾何学的に操作してもよい。一態様では、幾何学的に操作した粒子は、例えば、限
定はしないが、肺への送達などの標的送達のための本発明のキメラポリヌクレオチドを組み込む目的で、様々な形状、サイズ及び／又は表面変化を有し得る（例えば、国際公開第２０１３０８２１１１号パンフレットを参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。幾何学的操作粒子が有し得る他の物理的特徴として、限定はしないが、開窓、角のあるアーム、非対称及び粗い表面、細胞及び組織との相互作用を改変し得る電荷が挙げられる。非制限的例として、本発明のナノ粒子は、国際公開第２０１３０８２１１１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０５５３】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定はしないが、国際公開第２０１３０９０６０１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどの水溶性ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、優れた水溶性を呈示するために、小型の双性イオン性リガンドを有する無機ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子はまた、小さい流体学的径（ＨＤ）、時間、ｐＨ、及び塩分濃度に対する安定性、並びに低レベルの非特異的タンパク質結合を有し得る。
【０５５４】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により作製することができる。
【０５５５】
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのステルスナノ粒子又は標的特異的ステルスナノ粒子である。本発明のナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０５５６】
別の実施形態では、ステルスナノ粒子又は標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでもよい。ポリマーマトリックスは、限定はしないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート又はこれらの組み合わせなどの２種以上のポリマーを含み得る。
【０５５７】
一実施形態では、ナノ粒子は、高密度核酸層を有するナノ粒子−核酸ハイブリッド構造を有し得る。非制限的例として、ナノ粒子−核酸ハイブリッド構造は、米国特許出願公開第２０１３０１７１６４６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。ナノ粒子は、限定はしないが、本明細書に記載の、並びに／又は当技術分野で公知のキメラポリヌクレオチドなどの核酸を含んでもよい。
【０５５８】
本発明のナノ粒子の少なくとも１つは、ナノ構造のコアに埋め込むか、あるいは、ナノ構造内若しくは表面上の少なくとも１つのペイロードを担持するか若しくはそれと結合することができる低密度多孔質３Ｄ構造又はコーティングで被覆してもよい。少なくとも１種のナノ粒子を含むナノ構造の非制限的例が、国際公開第２０１３１２３５２３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０５５９】
ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコア−シェルナノ粒子
本発明のキメラポリヌクレオチドは、天然及び／若しくは合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に用いることができるポリマーの非制限的例として、限定はしないが、ミラス（ＭＩＲＵＳ）（登録商標）バイオ（Ｂｉｏ）（ウィスコンシン州マディソン）及びロシュ・マディソン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ）（ウィスコンシン州マディソン）のダイナミック・ポリコンジュゲート（ＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ）（登録商標）（アローヘッド・リサーチ社（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、カリフォルニア州パサデナ）製剤、フェーズＲＸ（ＰＨＡＳＥＲＸ）（商標）ポリマー製剤、例えば、限定なしに、スマート・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（商標）（フェーズＲＸ（ＰＨＡＳＥＲＸ）（登録商標）、ワシントン州シアトル）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、バイカル（Ｖｉｃａｌ）（カリフォルニア州サンディエゴ）のバクスフェクチン（ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）アジュバント、キトサン、カランド・ファーマシューティカルズ（Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（カリフォルニア州パサデナ）のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ロンデル（ＲＯＮＤＥＬ）（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（アローヘッド・リサーチ社（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州パサデナ）及びｐＨ反応性コブロックポリマー、例えば、限定はしないが、フェーズＲＸ（ＰＨＡＳＥＲＸ）（登録商標）（ワシントン州シアトル）が挙げられる。
【０５６０】
キトサン製剤の非制限的例は、正荷電キトサンのコアと、負荷電基質の外側部分を含む（米国特許出願公開第２０１２０２５８１７６号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。キトサンとしては、限定はしないが、Ｎ−トリメチルキトサン、モノ−Ｎ−カルボキシメチルキトサン（ＭＣＣ）、Ｎ−パルミトイルキトサン（ＮＰＣＳ）、ＥＤＴＡ−キトサン、低分子量キトサン、キトサン誘導体、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【０５６１】
一実施形態では、本発明で用いられるポリマーは、不要な物質、例えば、限定はしないが、細菌がポリマーの表面に付着するのを低減及び／又は阻害するための処理に付してある。ポリマーは、当技術分野で公知の、及び／若しくは当技術分野に記載の方法、並びに／又は国際公開第２０１２１５０４６７号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により処理することができる。
【０５６２】
ＰＬＧＡ製剤の非制限的例として、限定はしないが、ＰＬＧＡ注射デポー剤（例えば、６６％Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、並びに水性溶媒及びロイプロリド中にＰＬＧＡを溶解させて形成されるＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）。一旦注射されると、ＰＬＧＡ及びロイプロリドペプチドは、皮下空間中に沈降する）がある。
【０５６３】
これらのポリマー手法の多くは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドの細胞質への送達における効力が実証されている（ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２に論じられている；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。核酸の頑健なｉｎ  ｖｉｖｏ送達をもたらした（この場合、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて）２つのポリマー手法は、動的ポリコンジュゲート及びシクロデキストリンベースのナノ粒子である（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１５６７２１号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。これらの送達手法のうちの最初のものは、動的ポリコンジュゲートを使用するもので、マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを有効に送達し、肝細胞における内因性の標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００７年、第１０４巻、
ｐ１２９８２〜１２８８７；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。この特定の手法は多成分ポリマー系であり、その重要な特徴としては、核酸、この場合、ｓｉＲＮＡが、ジスルフィド結合を介して共有結合される膜活性ポリマーが挙げられ、そこにＰＥＧ基（電荷マスキング用）及びＮ−アセチルガラクトサミン基（肝細胞ターゲティング用）の両方がｐＨ感受性結合を介して連結される（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２〜１２８８７；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。ポリマー複合体は、肝細胞に結合してエンドソームに侵入すると、低ｐＨ環境で分解し、ポリマーがその正電荷を露出することによって、ポリマーからのエンドソームエスケープ及びｓｉＲＮＡの細胞質放出が起こる。Ｎ−アセチルガラクトサミン基をマンノース基で置換することにより、アシアロ糖タンパク質受容体発現肝細胞から、類洞内皮細胞及びクッパー細胞へとターゲティングを変更できることが判明した。別のポリマー手法は、トランスフェリン標的シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子の使用を含む。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現ユーイング肉腫腫瘍細胞におけるＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の標的サイレンシングを実証しており（フー−リースコバン（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ）ら著、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２００５年、第６５巻、ｐ．８９８４〜８９８２；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）、これらのナノ粒子に製剤化されたｓｉＲＮＡは、非ヒト霊長類において良好な耐容性を示した（ハイデル（Ｈｅｉｄｅｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．５７１５〜２１；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。これらの送達戦略はいずれも、標的送達及びエンドソームエスケープ機構の両者を用いた合理的な手法を取り入れている。
【０５６４】
ポリマー製剤は、キメラポリヌクレオチドの持続的若しくは遅延放出を可能にし得る（例えば、筋肉内若しくは皮下注射の後）。キメラポリヌクレオチドの放出プロフィールを改変することにより、例えば、長期間にわたって、コードされたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。また、ポリマー製剤を用いて、キメラポリヌクレオチドの安定性を高めることもできる。生分解性ポリマーは、これまで、キメラポリヌクレオチド以外の核酸を分解から保護するために用いられており、ｉｎ  ｖｉｖｏでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２〜１２８８７；サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１０年、第７巻、ｐ．１４３３〜１４４６；コンバーチン（Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１０年１０月１日；チュー（Ｃｈｕ）ら著、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．）、２０１２年１月１３日；マンガニエロ（Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１２年、第３３巻、ｐ．２３０１〜２３０９；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８〜２７１４；シンハ（Ｓｉｎｇｈａ）ら著、核酸治療薬（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第２巻、ｐ．１３３〜１４７；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２；シャファート（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ）及びワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）著、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、２００８年、第１６巻、ｐ．１１３１〜１１３８；チャツルベディ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２０１１年、第８巻、ｐ．１４５５〜１４６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、分子薬剤学（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．）、２００９年、第６巻、ｐ．６５９〜６６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ．１０６７〜１０７０；これらの各々は、全体とし
て参照により本明細書に組み込む）。
【０５６５】
一実施形態では、医薬組成物は、持続放出製剤であってもよい。別の実施形態では、持続放出製剤は、皮下送達用であってよい。持続放出製剤として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ＰＬＧＡマイクロスフィア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス社（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、フロリダ州アラチュア）、ヒレネクス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）、外科密閉剤、例えば、フィブリノーゲンポリマー（エチコン社（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）、ジョージア州コーネリア）、ティッセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースの密閉剤、並びにコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナショナル社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）。
【０５６６】
非制限的例として、調整可能な放出速度（例えば、数日及び数週間）のＰＬＧＡマイクロスフィアを調製し、封入工程中に修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、修飾ｍＲＮＡをＰＬＧＡマイクロスフィアに封入することによって、修飾ｍＲＮＡをＰＬＧＡマイクロスフィアに製剤化することができる。ＥＶＡｃは、前臨床持続放出インプラント用途（例えば、徐放剤オキュサート（Ｏｃｕｓｅｒｔ）（緑内障用のピロカルピン眼球インサート）又はプロゲスタサート（ｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ）（持続放出プロゲステロン子宮内デバイス；経皮送達系テストダーム（Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ）、デュラゲシック（Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ）及びセレギリン（Ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）；カテーテル）に広く使用されている非生分解性、生分解性ポリマーである。ポロキサマーＦ−４０７ＮＦは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンからなる親水性のノニオン性界面活性剤トリブロックコポリマーであり、５℃未満の温度で低粘度を有し、１５℃を超える温度で固体ゲルを形成する。ペグ化外科密閉剤は、送達デバイス中で混合される２種の合成ＰＥＧ成分を含み、このデバイスは、１分で調製することができ、３分で密閉し、３０日以内に再吸収される。ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）及び天然ポリマーは、投与部位でのｉｎ  ｓｉｔｕゲル化が可能である。これらは、イオン相互作用によって、タンパク質及びペプチド治療薬候補と相互作用して、安定化効果をもたらすことが判明している。
【０５６７】
ポリマー製剤はまた、限定はしないが、葉酸塩、トランスフェリン、及びＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により例示される通りの、種々のリガンドの発現により、選択的にターゲティングすることもできる（ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、生体高分子（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８〜２７１４；ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１２９８２〜１２８８７；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、分子薬剤学（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．）、２００９年、第６巻、ｐ．６５９〜６６８；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、ｐ．１０６７〜１０７０；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５６８】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、ポリマー化合物と一緒に、又はポリマー化合物に製剤化することができる。ポリマーは、限定はしないが、以下に挙げるものなどの少なくとも１種のポリマーを含み得る：ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフト処理したＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐状ポリ
（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、マルチブロックコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アクリル酸ポリマー、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体又はこれらの組み合わせ。
【０５６９】
非制限的例として、本発明のキメラポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、ＰＬＬでグラフト処理したＰＥＧのポリマー化合物と一緒に製剤化することができる。製剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞のトランスフェクション、又はキメラポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために用いることができる。別の実施例では、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書及び同第２００９００４２８２５号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、乾燥医薬組成物、又は乾燥させることができる溶液中で、カチオン性ポリマーと一緒にキメラポリヌクレオチドを溶液若しくは媒質中に懸濁させてもよい。
【０５７０】
別の非制限的例として、本発明のキメラポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書及び米国特許第８，２３６，３３０号明細書を参照のこと；これらは、全体として参照により本明細書に組み込む）又はＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロックコポリマー（米国特許第６，００４，５７３号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）と一緒に製剤化することができる。非制限的例として、本発明のキメラポリヌクレオチドは、ＰＥＧ及びＰＬＡ又はＰＥＧ及びＰＬＧＡのジブロックコポリマーと一緒に製剤化することができる（米国特許第８，２４６，９６８号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５７１】
ポリアミン誘導体を用いて、核酸を送達する、又は疾患を治療する及び／又は予防する、又は移植可能若しくは注射可能なデバイスに含有させることができる（例えば、米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書（現在、米国特許第８，４６０，６９６号明細書）；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、医薬組成物は、修飾核酸及びキメラポリヌクレオチド並びに米国特許出願公開第２０１００２６０８１７号明細書（現在、米国特許第８，４６０，６９６号明細書；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のポリアミン誘導体を含んでもよい。非制限的例として、本発明のキメラポリヌクレオチドは、ポリアミドポリマー、例えば、限定はしないが、オリゴアミンを含むジルキン単位と炭水化物ジアジドモノマーを組み合わせることにより調製される１，３−双極性付加ポリマーを含むポリマー（米国特許第８，２３６，２８０号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）を用いて送達することができる。
【０５７２】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１種のアクリル酸ポリマーと一緒に製剤化することができる。アクリル酸ポリマーとして、限定はしないが、アクリル酸、メタ
クリル酸、アクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０５７３】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレット、同第２０１２０８２５７４号パンフレット及び同第２０１２０６８１８７号パンフレット、並びに米国特許出願公開第２０１２０２８３４２７号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている少なくとも１種のポリマー及び／又はその誘導体と一緒に製剤化することができる。別の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１１１１５８６２号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りの、式Ｚのポリマーと一緒に製剤化することができる。また別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレット又は同第２０１２０６８１８７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０２８３４２号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りの、式Ｚ、Ｚ’若しくはＺ’’のポリマーと一緒に製剤化することができる。本発明の修飾ＲＮＡと一緒に製剤化されるポリマーは、国際公開第２０１２０８２５７４号パンフレット又は同第２０１２０６８１８７号パンフレット（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法によって合成することができる。
【０５７４】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１種のアクリル酸ポリマーと一緒に製剤化することができる。アクリル酸ポリマーとして、限定はしないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０５７５】
本発明のキメラポリヌクレオチドの製剤は、少なくとも１種のアミン含有ポリマー、例えば、限定はしないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン−コ−エステル）又はこれらの組み合わせを含んでもよい。非制限的例として、ポリ（アミン−コ−エステル）は、国際公開第２０１３０８２５２９号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のポリマーであってもよいし、及び／又はそこに記載されている方法によって製造することができる。
【０５７６】
例えば、本発明のキメラポリヌクレオチドは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、又は生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー又はこれらの組み合わせを含む医薬化合物に製剤化することができる。生分解性カチオン性リポポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，６９６，０３８号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３６１９号明細書及び同第２００４０１４２４７４号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって製造することができる。ポリ（アルキレンイミン）は、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて製造することができる。生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、又は生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，５１７，８６９号明細書及び同第６，２６７
，９８７号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて製造することができる。線状生分解性コポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，６５２，８８６号明細書に記載の方法を用いて製造することができる。ＰＡＧＡポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，２１７，９１２号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて製造することができる。限定はしないが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルチニン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド及びポリ（ラクチド−コ−グリコリド）などのポリマーとＰＡＧＡポリマーを共重合して、コポリマー又はブロックコポリマーを形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第８，０５７，８２１号明細書、同第８，４４４，９９２号明細書又は米国特許出願公開第２０１２００９１４５号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。例えば、マルチブロックコポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンと比較して、異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを用いて合成することができる。さらに、組成物又は医薬組成物は、当技術分野で公知の方法、本明細書に記載する方法、又は米国特許出願公開第２０１００００４３１５号明細書若しくは米国特許第６，２６７，９８７号明細書及び同第６，２１７，９１２号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０５７７】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１種の分解性ポリエステルと一緒に製剤化することができる。分解性ポリエステルとして、限定はしないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧ共役を含んでもよい。
【０５７８】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つの架橋可能なポリエステルと一緒に製剤化することができる。架橋可能なポリエステルとしては、当技術分野で公知のもの及び米国特許出願公開第２０１２０２６９７６１号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０５７９】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１種のシクロデキストリンポリマー中に、又はそれと一緒に製剤化することができる。シクロデキストリンポリマー及びシクロデキストリンポリマーを製造する方法としては、当技術分野で公知のもの及び米国特許出願公開第２０１３０１８４４５３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０５８０】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１種の架橋カチオン結合ポリマー中に、又はそれと一緒に製剤化することができる。架橋カチオン結合ポリマー及び架橋カチオン結合ポリマーを製造する方法としては、当技術分野で公知のもの及び国際公開第２０１３１０６０７２号パンフレット、同第２０１３１０６０７３号パンフレット及び同第２０１３１０６０８６号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０５８１】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１種の分岐状ポリマー中に、又はそれと一緒に製剤化することができる。分岐状ポリマー及び分岐状ポリマーを製造する方法としては、当技術分野で公知のもの及び国際公開第２０１３１１３０７１号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０５８２】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１種のペグ化アルブミンポリマー中に、又はそれと一緒に製剤化することができる。ペグ化アルブミンポリマー及びペグ化アルブミンポリマーを製造する方法としては、当技術分野で公知のもの及び米国特許出願公開第２０１３０２３１２８７号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものがある。
【０５８３】
一実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、リピド−末端ＰＥＧと共役させてもよい。非制限的例として、ＰＬＧＡをリピド−末端ＰＥＧと共役させて、ＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成することができる。別の非制限的例として、本発明で使用するＰＥＧコンジュゲートが、国際公開第２００８１０３２７６号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。ポリマーは、限定はしないが、米国特許第８，２７３，３６３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているコンジュゲートなどのリガンドコンジュゲートを用いて共役させてもよい。
【０５８４】
一実施形態では、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、投与の前にＰＥＧ又はリン酸ナトリウム及び／若しくは炭酸ナトリウム溶液と混合させることができる。別の実施形態では、目的のタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドをＰＥＧと混合し、さらに、リン酸ナトリウム及び／若しくは炭酸ナトリウム溶液とも混合することができる。また別の実施形態では、目的のタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドをＰＥＧと混合し、第２の目的のタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドをリン酸ナトリウム及び／若しくは炭酸ナトリウム溶液と混合してもよい。
【０５８５】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドを別の化合物と共役させてもよい。コンジュゲートの非制限的例が、米国特許第７，９６４，５７８号明細書及び同第７，８３３，９９２号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。別の実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡは、米国特許第７，９６４，５７８号明細書及び同第７，８３３，９９２号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りの式１〜１２２のコンジュゲートと共役させてもよい。本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、金などの金属と共役させてもよい。（例えば、ギルヨハン（Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ）ら著、米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００９年、第１３１巻（６）、ｐ．２０７２〜２０７３を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、金−ナノ粒子と共役させてもよいし、及び／又は金−ナノ粒子に封入してもよい。（国際公開第２０１２１６２６９号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１２０３０２９４０号明細書及び同第２０１３０１７７５２３号明細書；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５８６】
米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列及びポロキサマーを含んでもよい。例えば、本発明のキメラポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１００００４３１３号明細書に記載のポロキサマーを含む遺伝子送達組成物に用いることができる。
【０５８７】
一実施形態では、本発明のポリマー製剤は、コレステロール及びポリエチレングリコール基に共有結合させることができるカチオン性リポポリマーと、ポリマー製剤（カチオン性担体を含み得る）を接触させることにより、安定化することができる。ポリマー製剤は、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号明細書（これは、全体として参照により
本明細書に組み込む）に記載の方法を用いてカチオン性リポポリマーと接触させてもよい。カチオン性担体として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム塩化物（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物ＤＯＤＡＣ）及びこれらの組み合わせ。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１３００６５９４２号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのカチオン性リポポリマーと一緒に製剤化してもよい。
【０５８８】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種のポリマーのポリプレックスに製剤化することができる（例えば、米国特許第８，５０１，４７８号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２３７５６５号明細書及び同第２０１２０２７０９２７号明細書及び同第２０１３０１４９７８３号明細書並びに国際公開第２０１３０９０８６１号パンフレットを参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、ポリプレックスは、国際公開第２０１３０９０８６１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている新規のαアミノアミジンポリマーを用いて形成してもよい。別の非制限的例として、ポリプレックスは、米国特許第８，５０１，４７８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のクリックポリマーを用いて形成することもできる。
【０５８９】
一実施形態では、ポリプレックスは、２種以上のカチオン性ポリマーを含む。カチオン性ポリマーは、線状ＰＥＩなどのポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を含んでもよい。別の実施形態では、ポリプレックスは、ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）、そのペグ化類似体ｐ（ＴＥＴＡ／ＣＢＡ）−ｇ−ＰＥＧ２ｋ及びこれらの混合物を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１４９７８３号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５９０】
本発明のキメラポリヌクレオチドはまた、ポリマー、脂質、及び／又は他の生分解性薬剤、例えば限定はしないが、リン酸カルシウムなどの組み合わせを用い、ナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分は、コア−シェル、ハイブリッド、及び／又は多層構造に組み合わせてもよく、これによって、ナノ粒子の微調整が可能になり、ひいてはキメラポリヌクレオチドの送達を促進することができる（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．）、２００６年、第５巻、ｐ．７９１〜７９６；フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２００８年、第２９巻、ｐ．１５２６〜１５３２；デコカー（ＤｅＫｏｋｅｒ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．）、２０１１年、第６３巻、ｐ．７４８〜７６１；エンドレス（Ｅｎｄｒｅｓ）ら著、バ
イオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、ｐ．７７２１〜７７３１；スー（Ｓｕ）ら著、分子薬剤学（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．）、２０１１年６月６日、第８巻（３）、ｐ．７７４〜８７；これらは、全体として参照により本明細書に組み込む）。非制限的例として、ナノ粒子は、限定はしないが、親水性−疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）及び／又は親水性ポリマー（国際公開第２０１２０２２５１２９号パンフレット；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）などの複数のポリマーを含み得る。
【０５９１】
別の非制限的例として、キメラポリヌクレオチドのための親水性ポリマーを含むナノ粒子は、国際公開第２０１３１１９９３６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってもよいし、又はそこに記載の方法によって製造してもよい。
【０５９２】
一実施形態では、本発明で用いることができる生分解性ポリマーは、ポリ（エーテル−無水物）ブロックコポリマーである。非制限的例として、本明細書で用いる生分解性ポリマーは、国際公開第２００６０６３２４９号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているブロックコポリマーであってもよいし、又は国際公開第２００６０６３２４９号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって製造してもよい。
【０５９３】
別の実施形態では、本発明で用いることができる生分解性ポリマーは、アルキル及びシクロアルキル末端生分解性脂質である。非制限的例として、アルキル及びシクロアルキル末端生分解性脂質は、国際公開第２０１３０８６３２２号パンフレットに記載されているものであってもよいし、及び／又は国際公開第２０１３０８６３２２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって製造してもよい。
【０５９４】
また別の実施形態では、本発明で用いることができる生分解性ポリマーは、脂質部分に位置する１つ又は複数の生分解性基を有するカチオン性脂質である。非制限的例として、生分解性脂質は、米国特許出願公開第２０１３０１９５９２０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってもよい。
【０５９５】
脂質及び／又はポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでキメラポリヌクレオチドを送達することが明らかにされている。一実施形態では、脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子（これはまたアニスアミドなどのターゲティングリガンドも含有し得る）を使用して、本発明のキメラポリヌクレオチドを送達してもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてｓｉＲＮＡを有効に送達するために、脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子が使用されている（リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２０１０年、第１４２巻、ｐ．４１６〜４２１；リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２０１２年、第１５８巻、ｐ．１０８〜１１４；ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、分子療法（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１２年、第２０巻、ｐ．６０９〜６１５；これらは、全体として参照により本明細書に組み込む）。この送達系は、ｓｉＲＮＡの送達を改善するために、標的化ナノ粒子と、エンドソームエスケープを増強する構成成分であるリン酸カルシウムの両方を組み合わせる。
【０５９６】
一実施形態では、リン酸カルシウムをＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーと一緒に使用して、キメラポリヌクレオチドを送達してもよい（カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００４年、第９７巻、ｐ．３４５〜３５６；カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャー
ナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．）、２００６年、第１１１巻、ｐ．３６８〜３７０；これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０５９７】
一実施形態では、ＰＥＧ−電荷変換型ポリマー（ピテラ（Ｐｉｔｅｌｌａ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、ｐ．３１０６〜３１１４；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）を用いて、本発明のキメラポリヌクレオチドを送達するナノ粒子を形成してもよい。ＰＥＧ−電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンに切断され、これにより、エンドソームエスケープを増強することによって、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
【０５９８】
一実施形態では、本発明で用いることができるポリマーは、限定はしないが、国際公開第２０１３０５５３３１号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のペンタブロックポリマーなどのペンタブロックポリマーであってもよい。非制限的例として、ペンタブロックポリマーは、ＰＧＡ−ＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＧＡを含み、ここで、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、ＰＣＬは、ポリ（Ｅ−カプロラクトン）であり、ＰＧＡは、ポリ（グリコール酸）であり、またＰＬＡは、ポリ（乳酸）である。別の非制限的例として、ペンタブロックポリマーは、ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＬＡ−ＰＣＬ−ＰＥＧを含み、ここで、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、ＰＣＬは、ポリ（Ｅ−カプロラクトン）であり、ＰＧＡは、ポリ（グリコール酸）であり、またＰＬＡは、ポリ（乳酸）である。
【０５９９】
一実施形態では、本発明で使用することができるポリマーは、少なくとも１つのジエポキシド及び少なくとも１つのアミノグルコシドを含む（例えば、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレットを参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ジエポキシドは、限定はしないが、１，４ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４Ｂ）、１，４−シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテル（１，４Ｃ）、４−ビニルシクロヘキセンジエポキシド（４ＶＣＤ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＤＧＥ）、グリセロールジクリシジルエーテル（ＧＤＥ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ＮＰＤＧＥ）、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）、ポリ（プロピレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＰＧＤＥ）及びレゾルシノールジグリシジルエーテル（ＲＤＥ）から選択することができる。アミノグリコシドは、限定はしないが、ストレプトマイシン、ネオマイシン、フラマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、カナマイシン、アミカシン、アルベカシン、ベカナマイシン、ジベカシン、トブラマイシン、スペクチノマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、シソマイシン、イセパマイシン、ベルダマイシン、アストロマイシン、及びアプラマイシンから選択することができる。非制限的例として、ポリマーは、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。別の非制限的例として、少なくとも１つのジエポキシド及び少なくとも１つのアミノグルコシドを含有するポリマーのいずれかを含む組成物は、国際公開第２０１３０５５９７１号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０６００】
一実施形態では、本発明で使用することができるポリマーは、架橋ポリマーであってもよい。非制限的例として、架橋ポリマーを用いて、米国特許第８，４１４，９２７号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの粒子を形成することができる。別の非制限的例として、架橋ポリマーは、米国特許出願公開第２０１３０１７２６００号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により取得することもできる。
【０６０１】
一実施形態では、本発明で使用することができるポリマーは、米国特許第８，４６１，１３２号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるものなどの架橋ポリマーであってもよい。非制限的例として、架橋ポリマーは、身体組織の治療のための治療組成物に用いることができる。治療組成物は、注射若しくはカテーテル法などの当技術分野で公知の及び／又は本明細書に記載の様々な方法を用いて、損傷組織に投与することができる。
【０６０２】
一実施形態では、本発明で使用することができるポリマーは、限定はしないが、国際公開第２０１３０４９３２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものなどの二脂肪置換ペグ化脂質であってもよい。
【０６０３】
一実施形態では、ブロックコポリマーは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧである（例えば、以下を参照：感熱性ハイドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）は、リー（Ｌｅｅ）ら著、「Ｔｇｆ−β１遺伝子送達ビヒクルとしての感熱性ハイドロゲルは、糖尿病性損傷治癒を促進する（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｓ  ａ  Ｔｇｆ−β１  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ）」、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻（１２）、ｐ．１９９５〜２０００では、ＴＦＧ−β遺伝子送達ビヒクルとして；リー（Ｌｉ）ら著、「感熱性生分解性ハイドロゲルを基材とする制御遺伝子送達系（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）」、薬剤学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第２０巻（６）、ｐ．８８４〜８８８；及びチャン（Ｃｈａｎｇ）ら著、「ノニオン性両親媒性生分解性ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーは、ラット骨格筋において遺伝子送達効率を高める（Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ
ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）」、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２００７年、第１１８巻、ｐ．２４５〜２５３では、制御遺伝子送達系として、使用された；これら文献の各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）が本発明において使用され得る。本発明は、限定はしないが、筋肉内及び皮下投与などの投与のために、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧと一緒に製剤化することができる。
【０６０４】
別の実施形態では、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーは、本発明において、生分解性持続放出系を作製するために使用される。一態様では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、投与の前に、ブロックコポリマーと混合する。別の態様では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、ブロックコポリマーと共投与する。
【０６０５】
一実施形態では、本発明で用いられるポリマーは、多機能性ポリマー誘導体、例えば、限定はしないが、米国特許第８４５４９４６号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの多機能性Ｎ−マレイミジルポリマー誘導体であってもよい。
【０６０６】
コア−シェルナノ粒子の使用はさらに、カチオン性架橋ナノゲルコア及び様々なシェルを合成するハイスループット手法に焦点が置かれてきた（ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６〜１３００１；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。ナノ粒子のコア及びシェル構成成分の両方で化学組成を改
変することにより、ポリマーナノ粒子の複合体化、送達、及びインターナリゼーションを正確に制御することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後、マウス肝細胞にｓｉＲＮＡを効率的に送達することができる。
【０６０７】
一実施形態では、中央のＰＬＧＡ層と、ＰＥＧを含有する外側の中性脂質層とを含む中空脂質コアを用いて、本発明のキメラポリヌクレオチドを送達することができる。非限定的な例として、ルシフェラーゼ発現腫瘍を有するマウスでは、従来のリポプレックスと比較して、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子がルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが判明した（シャイ（Ｓｈｉ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ）、２０１１年、第５０巻、ｐ．７０２７〜７０３１；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６０８】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドのコアと、ポリマーシェルとを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載するポリマーのいずれであってもよく、これらは、当技術分野において公知である。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内のキメラポリヌクレオチドを保護することができる。
【０６０９】
本発明のキメラポリヌクレオチドと一緒に使用されるコア−シェルナノ粒子は、米国特許第８，３１３，７７７号明細書又は国際公開第２０１３１２４８６７号パンフレット（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されており、そこに記載される方法により形成することができる。
【０６１０】
一実施形態では、コア−シェルナノ粒子は、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドのコアと、ポリマーシェルとを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載するポリマーのいずれであってもよく、これらは、当技術分野において公知である。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内のキメラポリヌクレオチドを保護することができる。
【０６１１】
一実施形態では、本明細書に記載する製剤と共に用いられるポリマーは、国際公開第２０１１１２００５３号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの修飾ポリマー（例えば、限定はしないが、修飾ポリアセタールなど）であってもよい。
【０６１２】
一実施形態では、製剤は、ポリマー担体と、少なくとも１つの核酸分子とを含むポリマー担体カーゴ複合体であってもよい。ポリマー担体カーゴ複合体の非制限的例は、国際公開第２０１３１１３３２６号パンフレット、同第２０１３１１３５０１号パンフレット、同第２０１３１１３３２５号パンフレット、同第２０１３１１３５０２号パンフレット及び同第２０１３１１３７３６号パンフレット並びに欧州特許第２６２３１２１号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。一態様では、ポリマー担体カーゴ複合体は、負荷電核酸分子、例えば、限定はしないが、国際公開第２０１３１１３３２５号パンフレット及び同第２０１３１１３５０２号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどを含んでもよい。
【０６１３】
一実施形態では、医薬組成物は、本発明のキメラポリヌクレオチドと、ポリマー担体カーゴ複合体を含んでもよい。キメラポリヌクレオチドは、目的のタンパク質、例えば、限定はしないが、感染症に関連する病原体に由来する抗原、アレルギー若しくはアレルギー性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、又は癌若しくは腫瘍疾患に関連する抗原などをコードし得る（例えば、国際公開第２０１３１１３３２６号パンフレット、同第２０１３１１３５０１号パンフレット、同第２０１３１１３３２５号パンフレット、
同第２０１３１１３５０２号パンフレット、及び同第２０１３１１３７３６号パンフレット並びに欧州特許第２６２３１２１号明細書に記載されている抗原を参照のこと；これらの文献の各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６１４】
非制限的例として、コア−シェルナノ粒子を用いて、眼病又は障害を治療することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１２０３２１７１９号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６１５】
一実施形態では、本明細書に記載する製剤で用いられるポリマーは、国際公開第２０１１１２００５３号パンフレット（これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの修飾ポリマー（例えば、限定はしないが、修飾ポリアセタールなど）であってもよい。
【０６１６】
ペプチド及びタンパク質
本発明のキメラポリヌクレオチドは、キメラポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増大するために、ペプチド及び／又はタンパク質と一緒に製剤化することができる。本発明で用いることができるペプチド及び／又はタンパク質は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５６７］〜［０００５７０］に記載されている。
【０６１７】
細胞
本発明のキメラポリヌクレオチドは、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトすることができ、続いて、その細胞を対象に移植する。非制限的例として、医薬組成物は、修飾ＲＮＡを肝臓及び骨髄性細胞に送達するための赤血球、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）中で修飾ＲＮＡを送達するためビロソーム、並びに電気穿孔細胞、例えば、限定はしないが、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５７１］〜［０００５７３］に記載されているものなどを含んでもよい。
【０６１８】
細胞への導入
細胞への核酸の導入のためには、ウイルス媒介性及び非ウイルス媒介性の技術を含め、様々な方法が当技術分野において公知であり、且つ好適である。本発明で用いることができる導入方法の例は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５７４］〜［０００５７６］に記載されている。
【０６１９】
微小器官（Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎ）
キメラポリヌクレオチドは、微小器官に含有させてもよく、これが、その後、持続的な治療製剤において目的のコードされたポリペプチドを発現することができる。本発明で用いることができる微小器官は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５７７］〜［０００５８０］に記載されている。
【０６２０】
ヒアルロニダーゼ
本発明のキメラポリヌクレオチドの筋肉内又は皮下局所注射は、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含有することができる。ヒアルロニダーゼは、間質バリアの構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロナンの粘度を低下させ、これにより組織透過性を高める（フロスト（Ｆｒｏｓｔ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．）、２００７年、第４巻、ｐ．４２７〜４４０；これは、全体として参照によ
り本明細書に組み込む）。ヒアルロニダーゼは、その分散及びトランスフェクト細胞により産生される、コードされたタンパク質の全身分布を速めるのに有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内投与又は皮下投与された本発明のキメラポリヌクレオチドに曝露される細胞の数を増加させることができる。
【０６２１】
ナノ粒子模倣体
本発明のキメラポリヌクレオチドは、ナノ粒子模倣体に封入してもよいし、及び／又はナノ粒子模倣体に吸収させてもよい。ナノ粒子模倣体は、送達機能生物又は粒子、例えば、限定はしないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生体、プリオン及び細胞を模倣することができる。非制限的例として、本発明のキメラポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非ビリオン粒子に封入してもよい（国際公開第２０１２００６３７６号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１７１２４１号明細書及び同第２０１３０１９５９６８号明細書を参照のこと；これらの内容は、それぞれ全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６２２】
ナノチューブ
本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つのナノチューブ、例えば、限定はしないが、ロゼットナノチューブ、リンカーを含むツインベースを有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ及び／又は単層カーボンナノチューブに付着、あるいは、結合させることができる。本発明で用いることができるナノチューブは、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００５８３］〜［０００５８７］に記載されている。
【０６２３】
コンジュゲート
本発明のキメラポリヌクレオチドは、コンジュゲート、例えば、担体若しくはターゲティング基に共有結合したキメラポリヌクレオチド、あるいは一緒に融合タンパク質（例えば、ターゲティング基と治療用タンパク質若しくはペプチドを有する）を生成する２つのコード領域を含むコンジュゲートを含む。
【０６２４】
本発明のコンジュゲートとしては、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）；又は脂質などの、天然に存在する物質が挙げられる。リガンドはまた、組換え分子又は合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンなどの、ポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、以下のものが挙げられる：ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はαヘリックスペプチド。
【０６２５】
特にＲＮＡとの、ポリヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はしないが、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；
同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書及び同第５，６８８，９４１号明細書；同第６，２９４，６６４号明細書；同第６，３２０，０１７号明細書；同第６，５７６，７５２号明細書；同第６，７８３，９３１号明細書；同第６，９００，２９７号明細書；同第７，０３７，６４６号明細書が挙げられ；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０６２６】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、本発明のキメラポリヌクレオチドの担体として機能し得る。コンジュゲートは、カチオン性ポリマー、例えば、限定はしないが、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミンを含んでもよく、これは、ポリ（エチレングリコール）でグラフト処理してもよい。非制限的例として、コンジュゲートは、米国特許第６，５８６，５２４号明細書（これは、全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されているポリマーコンジュゲート及びポリマーコンジュゲートの合成方法と類似していてもよい。
【０６２７】
基質との共役の方法の非制限的例が、米国特許出願公開第２０１３０２１１２４９号明細書（この内容は、全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている。この方法を用いて、キメラポリヌクレオチドを含む共役ポリマー粒子を製造することができる。
【０６２８】
コンジュゲートはまた、ターゲティング基、例えば、細胞若しくは組織ターゲティング剤、例えば、腎細胞などの指定細胞型に結合する、レクチン、糖タンパク質、脂質、又はタンパク質、例えば抗体も含むことができる。ターゲティング基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体又はアプタマーであってもよい。
【０６２９】
ターゲティング基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的な親和性を有する分子、又は抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、
若しくは骨細胞などの指定細胞型に結合する抗体であってもよい。ターゲティング基はまた、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。ターゲティング基はさらに、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、又はアプタマーなどの非ペプチド種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、又はｐ３８  ＭＡＰキナーゼのアクチベータであってもよい。
【０６３０】
ターゲティング基は、特定の受容体をターゲティングすることができる任意のリガンドであってもよい。例としては、限定なしに、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、及びＨＤＬリガンドが挙げられる。具体的な実施形態において、ターゲティング基はアプタマーである。アプタマーは修飾されていなくてもよいし、又は本明細書に開示する修飾の任意の組み合わせを有していてもよい。
【０６３１】
非制限的例として、ターゲティング基は、血液−中枢神経系関門を介した標的送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）結合コンジュゲートであってもよい（例えば、米国特許出願公開第２０１３０２１６６１０１２号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６３２】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、相乗作用生体分子−ポリマーコンジュゲートであってもよい。相乗作用生体分子−ポリマーコンジュゲートは、より大きな治療効果をもたらすように、長時間作用型の連続放出系であってもよい。相乗作用生体分子−ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３０１９５７９９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってもよい。
【０６３３】
別の実施形態では、本発明で用いることができるコンジュゲートは、アプタマーコンジュゲートであってもよい。アプタマーコンジュゲートの非制限的例は、国際公開第２０１２０４０５２４号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。アプタマーコンジュゲートを用いて、キメラポリヌクレオチドを含む製剤の標的送達を達成することができる。
【０６３４】
一実施形態では、本発明で用いることができるコンジュゲートは、アミン含有ポリマーコンジュゲートであってもよい。アミン含有ポリマーコンジュゲートの非制限的例は、米国特許第８，５０７，６５３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。因子ＩＸ部分ポリマーコンジュゲートは、対象への送達時及び／又は送達後に、キメラポリヌクレオチドを放出するように、解離性結合を含んでもよい。
【０６３５】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、限定はしないが、ロックド核酸に類似する修飾などの化学修飾を含んでもよい。
サンタリス（Ｓａｎｔａｒｉｓ）のものなどの、ロックド核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する代表的な米国特許として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；及び同第７，３９９，８４５号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０６３６】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、限定はしないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込むものとする。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５４巻、ｐ．１４９７〜１５００に見出すことができる。
【０６３７】
本発明で取り上げる一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するキメラポリヌクレオチド、並びに他の修飾骨格、特に、前文で参照される米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで、ネイティブリン酸ジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、並びに前文で参照される米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げるキメラポリヌクレオチドは、前文で参照される米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
【０６３８】
２’位の修飾もまた、送達を補助し得る。２’位の修飾は、ポリペプチドコード配列に位置せず、すなわち翻訳可能領域に位置しないのが好ましい。２’位の修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／又はテイル付加領域に位置してもよい。２’位の修飾は、以下のうちの１つを２’位に含むことができる：Ｈ（すなわち、２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってよい。好適な例示的修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中、ｎ及びｍは、１〜約１０である。他の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、以下のうちの１つを２’位に含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、リポータ基、インターカレータ、薬物動態学的特性を改善する基、又は薬力学的特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基。一部の実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる）（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルベチカ・キミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻、ｐ．４８６〜５０４）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下の例に記載する通りの、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、同様に本明細書において以下の例に記載する通りの、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）がある。さらに、他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位又は２’−５’連結ｄｓＲＮＡ及び５’末端ヌクレオチドの５’位に、同様の修飾を実施してもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。こうした修飾糖構造の調製を教示する代表的
な米国特許として、限定はしないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０６３９】
さらに他の実施形態では、キメラポリヌクレオチドを細胞透過性ポリペプチドと共有結合により共役させる。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列を含んでもよい。本発明のコンジュゲートは、高い安定性；高い細胞トランスフェクション；及び／又は改変された生体分布（例えば、特定の組織若しくは細胞型にターゲティングされる）を有するように設計することができる。
【０６４０】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、送達を促進する薬剤と共役させてもよい。非制限的例として、この薬剤は、モノマー又はポリマー、例えば、国際公開第２０１１０６２９６５号パンフレット（これは、全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている通りのターゲティングモノマー又はターゲティングブロックを有するポリマーであってもよい。別の非制限的例では、上記薬剤は、本発明のキメラポリヌクレオチドと共有結合によりカップリングされた輸送剤であってもよい（例えば、米国特許第６，８３５，３９３号明細書及び同第７，３７４，７７８号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体を参照により本明細書に組み込む）。また別の非制限的例では、上記薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号明細書及び同第８，００３，１２９号明細書（これらの各々は、全体を参照により本明細書に組み込む）に記載のものなどの膜障壁輸送促進剤であってもよい。
【０６４１】
別の非制限的例では、キメラポリヌクレオチドは、スマート・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（登録商標）（フェーズＲＸ（登録商標）社（ＰＨＡＳＥＲＸ  Ｉｎｃ．）、ワシントン州シアトル）共役させてもよい。
【０６４２】
別の態様では、コンジュゲートは、ナノ粒子を組織又は臓器内でニューロンに選択的に誘導するペプチドであってもよい。非制限的例として、用いられるペプチドは、限定はしないが、米国特許出願公開第２０１３０１２９６２７号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているペプチドであってもよい。
【０６４３】
また別の態様では、コンジュゲートは、血液脳関門を通過するのを補助することができるペプチドであってもよい。
自己集合ナノ粒子
本発明で用いることができる自己集合ナノ粒子（核酸自己集合ナノ粒子、及びポリマーベースの自己集合ナノ粒子など）は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００６１０］〜［０００６１９］に記載されている。
【０６４４】
自己集合高分子
キメラポリヌクレオチドは、送達のために両親媒性高分子（ＡＭ）に製剤化することができる。ＡＭは、ポリ（エチレングリコール）に共有結合したアルキル化糖骨格を有する
生分解性両親媒性ポリマーを含む。水溶液中で、ＡＭは自己集合して、ミセルを形成する。ＡＭを形成する方法及びＡＭの非制限的例は、米国特許出願公開第２０１３０２１７７５３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６４５】
無機ナノ粒子
本発明のキメラポリヌクレオチドは、無機ナノ粒子に製剤化することができる（米国特許第８，２５７，７４５号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。無機ナノ粒子には、限定はしないが、水膨潤性の粘土物質がある。非制限的例として、無機ナノ粒子は、単純なケイ酸塩から製造される合成スメクタイト粘土を含んでもよい（例えば、米国特許第５，５８５，１０８号明細書及び同第８，２５７，７４５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６４６】
一実施形態では、無機ナノ粒子は、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドのコアとポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載するポリマーのいずれであってもよく、これらは、当技術分野において公知である。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア中のキメラポリヌクレオチドを保護することができる。
【０６４７】
半導電性及び金属ナノ粒子
本発明のキメラポリヌクレオチドは、半導電性若しくは金属材料を含む水分散性ナノ粒子に製剤化しても（米国特許出願公開第２０１２０２２８５６５号明細書；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）、又は磁気ナノ粒子に形成してもよい（米国特許出願公開第２０１２０２６５００１号明細書及び同第２０１２０２８３５０３号明細書；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子又は親水性ナノ粒子のいずれであってもよい。
【０６４８】
一実施形態では、半導電性及び／又は金属ナノ粒子は、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドのコアと、ポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載するポリマーのいずれであってもよく、これらは、当技術分野において公知である。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア中のキメラポリヌクレオチドを保護することができる。
【０６４９】
外科密閉剤：ゲル及びハイドロゲル
一実施形態では、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意のハイドロゲルに封入してもよく、ハイドロゲルは、対象に注射するとゲルを形成し得る。ハイドロゲルは、親水性であるポリマー鎖のネットワークであり、水が分散媒であるコロイドゲルとして存在することもある。ハイドロゲルは、高度に吸収性（９９％超の水を含有し得る）の天然又は合成ポリマーである。ハイドロゲルはまた、大きな含水率のために、天然の組織に極めて類似する柔軟度も有する。本明細書に記載するハイドロゲルを用いて、生体適合性、生分解性及び／又は多孔質である脂質ナノ粒子を封入することができる。ハイドロゲルは、注射液からｉｎ  ｓｉｔｕで製造することもできるし、又は移植することもできる。本発明で用いることができるゲル及びハイドロゲルは、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００６２４］〜［０００６６３］に記載されている。
【０６５０】
懸濁液製剤
一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチド、不水溶性油デポー剤、界面活性剤及び／若しくは補助界面活性剤並びに／又は共溶剤を含む懸濁液製剤が提供される。油及び界面活性剤の組み合わせは、キメラポリヌクレオチドを含む懸濁液製剤を可能にし得る。不水溶性デポー剤中でのキメラポリヌクレオチドの送達を用いて、デポー剤から周囲の生理
学的環境へのｍＲＮＡの持続放出により生体利用可能性を改善すると共に、ヌクレアーゼによるキメラポリヌクレオチド分解を阻止することができる。本発明に用いることができる懸濁液製剤は、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００６６４］〜［０００６７０］に記載されている。
【０６５１】
カチオン及びアニオン
本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドの製剤は、カチオン又はアニオンを含んでもよい。一実施形態では、製剤は、限定はしないが、金属カチオン、例えば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋及びこれらの組み合わせなどを含む。非制限的例として、製剤は、金属カチオンと複合体化したポリマー及びキメラポリヌクレオチドを含んでもよい（例えば、米国特許第６，２６５，３８９号明細書及び同第６，５５５，５２５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６５２】
一部の実施形態では、二価及び一価カチオンの組み合わせを有するカチオン性ナノ粒子をキメラポリヌクレオチドと一緒に製剤化することができる。こうしたナノ粒子は、所与の期間（例えば、数時間、数日など）にわたって溶液中に自然に形成され得る。こうしたナノ粒子は、二価カチオンのみの存在下、又は一価カチオンのみの存在下では形成されない。カチオン性ナノ粒子中での、又はカチオン性ナノ粒子を含む１種又は複数のデポー剤中でのキメラポリヌクレオチドの送達は、長時間作用デポー剤として作用する、及び／又はヌクレアーゼによる分解の速度を低下させることにより、キメラポリヌクレオチドの生体利用可能性を改善することができる。
【０６５３】
成形ナノ粒子及びマイクロ粒子
本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、ナノ粒子及び／又はマイクロ粒子に製剤化することができる。これらのナノ粒子及び／又はマイクロ粒子は、任意のサイズ形状及び化学に成形することができる。一例として、ナノ粒子及び／又はマイクロ粒子は、リクィダ・テクノロジーズ（ＬＩＵＩＤＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）（登録商標）（ノースカロライナ州モリスビル）によるプリント（ＰＲＩＮＴ）（登録商標）技術を用いて製造することができる（例えば、国際公開第２００７０２４３２３号パンフレットを参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６５４】
一実施形態では、成形ナノ粒子は、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドのコアと、ポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に開示の、及び当技術分野で公知のポリマーのいずれであってもよい。別の実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア中のキメラポリヌクレオチドを保護することができる。
【０６５５】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、マイクロ粒子に製剤化することができる。マイクロ粒子は、キメラポリヌクレオチドのコアと、生体適合性及び／若しくは生分解性ポリマーの皮質を含有し得る。非制限的例として、本発明で用いることができるマイクロ粒子は、米国特許第８，４６０，７０９号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１２９８３０号明細書及び国際公開第２０１３０７５０６８号パンフレット（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってよい。別の非制限的例として、マイクロ粒子は、所望の時間にわたって本発明のキメラポリヌクレオチドの放出を持続するように設計してもよい（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１２９８３０号明細書の「治療用タンパク質の徐放（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」を参照のこと；この文献は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６５６】
本発明で使用されるマイクロ粒子は、少なくとも１ミクロン〜少なくとも１００ミクロ
ン（例えば、少なくとも１ミクロン、少なくとも５ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロン、少なくとも４０ミクロン、少なくとも４５ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも５５ミクロン、少なくとも６０ミクロン、少なくとも６５ミクロン、少なくとも７０ミクロン、少なくとも７５ミクロン、少なくとも８０ミクロン、少なくとも８５ミクロン、少なくとも９０ミクロン、少なくとも９５ミクロン、少なくとも９７ミクロン、少なくとも９９ミクロン、及び少なくとも１００ミクロン）の直径を有し得る。
【０６５７】
ナノジャケット（ＮａｎｏＪａｃｋｅｔ）及びナノリポソーム（ＮａｎｏＬｉｐｏｓｏｍｅ）
本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、キーストーンナノ（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ
Ｎａｎｏ）（ペンシルベニア州ステートカレッジ）により、ナノジャケット及びナノリポソームに製剤化することができる。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩など、体内に自然に存在する化合物から構成されるが、少量のケイ酸塩を含む場合もある。ナノジャケットは、５〜５０ｎｍの粒度であってよく、これを用いて、親水性及び疎水性化合物、例えば、限定はしないが、キメラポリヌクレオチドを送達することができる。
【０６５８】
ナノリポソームは、限定はしないが、体内に自然に存在する脂質などの脂質から構成される。ナノリポソームは、６０〜８０ｎｍの粒度であってよく、これを用いて、親水性及び疎水性化合物、例えば、限定はしないが、キメラポリヌクレオチドを送達することができる。一態様では、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、限定はしないが、セラミド・ナノリポソーム（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ＮａｎｏＬｉｐｏｓｏｍｅ）などのナノリポソームに製剤化される。
【０６５９】
プソイドビリオン（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）
一実施形態では、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、プソイドビリオン（例えば、偽ビリオン）に製剤化することができる。本発明で用いることができるプソイドビリオンは、同時係属国際公開第２０１５０３４９２８号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）のパラグラフ［０００６７９］〜［０００６８４］に記載されている。
【０６６０】
ミニ細胞
一態様では、キメラポリヌクレオチドを細菌ミニ細胞に製剤化することができる。非制限的例として、細菌ミニ細胞は、国際公開第２０１３０８８２５０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１７７４９９号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものであってよい。本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドなどの治療薬を含む細菌ミニ細胞を用いて、治療薬を脳腫瘍に送達することができる。
【０６６１】
半固体組成物
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、疎水性マトリックスと一緒に製剤化して、半固体組成物を形成することができる。非制限的例として、半固体組成物又はペースト様組成物は、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。半固体組成物は、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの持続放出製剤であってもよい。
【０６６２】
別の実施形態では、半固体組成物は、組成物の周囲に形成される微細孔膜又は生分解性ポリマーをさらに有し得る（例えば、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレットを参
照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０６６３】
本発明のキメラポリヌクレオチドを用いる半固体組成物は、国際公開第２０１３０７６０４号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの半固体混合物の特徴（例えば、少なくとも１０−４Ｎ・ｍｍ−２の弾性率、及び／又は少なくとも１００ｍＰａ・ｓの粘度）を有し得る。
【０６６４】
エキソソーム
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドをエキソソームに製剤化してもよい。エキソソームに、少なくとも１つのキメラポリヌクレオチドをロードして、これを細胞、組織及び／又は生物に送達することができる。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、国際公開第２０１３０８４０００号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のエキソソームにロードしてもよい。
【０６６５】
絹を用いた送達
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、絹ベースの持続放出送達系に製剤化することができる。絹ベースの送達系は、絹フィブロイン溶液と、治療薬、例えば、限定はしないが、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知のキメラポリヌクレオチドを接触させることにより、形成することができる。非制限的例として、本発明で用いることができる絹ベースの持続放出送達系及びこうした系を製造する方法は、米国特許出願公開第２０１３０１７７６１１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６６６】
マイクロ粒子
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドを含む製剤は、マイクロ粒子を含んでもよい。マイクロ粒子は、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知のポリマー、例えば、限定はしないが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸塩、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル及びポリ無水物を含んでもよい。マイクロ粒子は、キメラポリヌクレオチドなどの生物活性分子を吸着する吸着性表面を有し得る。本発明で用いられるマイクロ粒子及びマイクロ粒子の製造方法の非制限的例は、米国特許出願公開第２０１３１９５９２３号明細書及び同第２０１３０１９５８９８号明細書並びに米国特許第８，３０９，１３９号明細書及び同第８，２０６，７４９号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６６７】
別の実施形態では、製剤は、マイクロ粒子とキメラポリヌクレオチドを含むマイクロエマルションであってもよい。非制限的例として、マイクロ粒子を含むマイクロエマルションは、米国特許出願公開第２０１３１９５９２３号明細書及び同第２０１３０１９５８９８号明細書並びに米国特許第８，３０９，１３９号明細書及び同第８，２０６，７４９号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６６８】
アミノ酸脂質
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、アミノ酸脂質に製剤化することができる。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基と、１つ又は複数の親油性テイルを含む親油性化合物である。アミノ酸脂質及びアミノ酸脂質の製造方法の非制限的例は、米国特許第８，５０１，８２４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６６９】
一実施形態では、アミノ酸脂質は、親水性部分と親油性部分を有する。親水性部分は、アミノ酸残基であってよく、親油性部分は、少なくとも１つの親油性テイルを含んでよい
。
【０６７０】
一実施形態では、アミノ酸脂質製剤を用いて、キメラポリヌクレオチドを対象に送達することができる。
別の実施形態では、アミノ酸脂質製剤は、放出可能な形態で、キメラポリヌクレオチドを送達することができ、この形態は、キメラポリヌクレオチドに結合して、これを放出するアミノ酸脂質を含む。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドの放出は、酸不安定性リンカー、例えば、限定はしないが、米国特許第７，０９８，０３２号明細書、同第６，８９７，１９６号明細書、同第６，４２６，０８６号明細書、同第７，１３８，３８２号明細書、同第５，５６３，２５０号明細書、及び同第５，５０５，９３１号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のものなどによって提供され得る。
【０６７１】
微小小胞体
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドを微小小胞体に製剤化することができる。微小小胞体の非制限的例としては、米国特許出願公開第２０１３０２０９５４４号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されているものがある。
【０６７２】
一実施形態では、微小小胞体は、ＡＲＲＤＣ１媒介性微小小胞体（ＡＲＭＭ）である。ＡＲＭＭ及びＡＲＭＭの製造方法の非制限的例は、国際公開第２０１３１１９６０２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６７３】
高分子電解質間錯体
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドを高分子電解質間錯体（ｉｎｔｅｒｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に製剤化することができる。高分子電解質間錯体は、電荷−動力学的ポリマーを１つ又は複数のアニオン分子と複合体化するとき、形成される。電荷−動力学的ポリマー及び高分子電解質間錯体並びに高分子電解質間錯体の製造方法の非制限的例は、米国特許第８，５２４，３６８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６７４】
結晶性ポリマー系
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドを結晶性ポリマー系に製剤化することができる。結晶性ポリマー系は、結晶性部分及び／又は結晶性部分を含有する末端単位を含むポリマーである。結晶性部分及び／又は結晶性部分を含む末端単位を有するポリマー（「ＣＹＣポリマー」と呼ばれる）、結晶性ポリマー系及びこうしたポリマー及びポリマー系の製造方法の非制限的例は、米国特許第８，５２４，２５９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６７５】
賦形剤
医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよく、賦形剤は、本明細書で用いられるとき、所望される特定の剤形に適合するように、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤、香味剤、安定剤、抗酸化剤、容量オスモル濃度調節剤、ｐＨ調節剤などを含む。医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤及び組成物の調製方法は、当技術分野で公知である（レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著、「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）（リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルティモア、２００６年を参照；これは、全体として参照
により本明細書に組み込む）。従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的作用を生み出すか、又はそうでなければ、医薬組成物のいずれかの他の成分と有害な形で相互作用するなどによって、物質若しくはその誘導体と不適合性となる場合を除いて、従来の賦形剤媒体の使用は本開示の範囲内で考慮され得る。
【０６７６】
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％純粋であり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用及び獣医学用途について承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものであってよい。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）（ＵＳＰ）、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）（ＥＰ）、英国薬局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、及び／又は国際薬局方（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の基準を満たすものであってよい。
【０６７７】
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤としては、限定はしないが、不活性希釈剤、分散剤及び／又は造粒剤、界面活性剤及び／又は乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、バッファー、潤滑剤、及び／又は油が挙げられる。こうした賦形剤は、任意選択で、医薬組成物中に含有させることができる。組成物はさらに、カカオ脂及び座薬用ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、及び／又は芳香剤などの賦形剤を含んでもよい。
【０６７８】
例示的な希釈剤、造粒剤及び／又は分散剤、界面活性剤及び／又は乳化剤、結合剤、防腐剤、バッファー、潤滑剤、油、添加剤、カカオ脂及び座薬用ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、及び／又は芳香剤は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８２８］〜［０００８３８］に記載されている。
【０６７９】
ｍＲＮＡの凍結防止剤
一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチド製剤は、凍結防止剤を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、用語「凍結防止剤」は、所与の物質と組み合わせると、凍結時に起こる物質への損傷を軽減するのを助けるか、又は損傷を排除する１種又は複数種の薬剤を指す。一部の実施形態では、凍結防止剤をキメラポリヌクレオチドと組み合わせることにより、凍結時にこれらを安定化させる。キメラポリヌクレオチドの長期（例えば、３６ヵ月）安定性のためには、−２０℃〜−８０℃のｍＲＮＡの凍結保存が有利であると考えられる。一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチド製剤に凍結防止剤を含有させることにより、凍結／解凍サイクルから、並びに凍結保存条件下でキメラポリヌクレオチドを安定化させる。本発明の凍結防止剤として、限定はしないが、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース及び／又はマンニトールが挙げられる。トレハロースは、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ものとして列記されており、商業的医薬製剤で一般的に使用されている。
【０６８０】
充填剤
一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチド製剤は、充填剤を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、用語「充填剤」は、製剤に所望の粘稠性を、及び／又は製剤成分の安定性を付与するために、製剤に含有させる１種又は複数種の薬剤を指す。一部の実施形
態では、凍結乾燥したキメラポリヌクレオチド製剤に充填剤を含有させることにより、「薬学的に洗練された（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｌｅｇａｎｔ）」ケークを取得し、長期（例えば、３６ヵ月）保存の間、凍結乾燥したキメラポリヌクレオチドを安定化させる。本発明の充填剤は、限定はしないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース及び／又はラフィノースを含んでもよい。一部の実施形態では、凍結防止剤及び充填剤の組み合わせ（例えば、スクロース／グリシン又はトレハロース／マンニトール）を含有させることにより、凍結中のキメラポリヌクレオチドを安定化すると同時に、凍結乾燥用の充填剤を提供することができる。
【０６８１】
本発明の製剤及びキメラポリヌクレオチドを製剤化するための方法の非制限的例は、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第第２０１３０９０６４８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０６８２】
不活性成分
一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチド製剤は、不活性成分である少なくとも１種の賦形剤を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、用語「不活性成分」は、製剤に含有させる１種又は複数種の不活性剤を指す。一部の実施形態では、本発明の製剤に用いることができる不活性成分の全部又は一部は、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により承認されていてもよいし、いずれも承認されていなくてもよい。
【０６８３】
製剤化することができる不活性成分の非網羅的リスト及び不活性成分の投与経路は、同時係属国際公開第２０１４１５２２１１号パンフレット（代理人整理番号Ｍ０３０）の表４に記載されている。
【０６８４】
送達
本開示は、薬物送達の科学において起こり得る進歩を考慮して、任意の適切な経路による治療、製薬、診断又はイメージングのいずれかの用途のキメラポリヌクレオチドの送達を包含する。送達は、裸の（ｎａｋｅｄ）送達又は製剤化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）送達であってよい。
【０６８５】
裸の送達
本発明のキメラポリヌクレオチドは、細胞に裸で送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「裸の」は、トランスフェクションを促進する薬剤を含まないキメラポリヌクレオチドを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるキメラポリヌクレオチドは、修飾を含まなくてもよい。裸のキメラポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の、及び本明細書に記載される投与経路を用いて細胞に送達することができる。
【０６８６】
製剤化された送達
本発明のキメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載する方法を用いて製剤化してもよい。製剤は、修飾されていても及び／又は修飾されていなくてもよいキメラポリヌクレオチドを含有し得る。製剤は、限定はしないが、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体侵食性又は生体適合性ポリマー、溶媒、及び持続放出送達デポー剤をさらに含み得る。製剤化されたキメラポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の、及び本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達することができる。
【０６８７】
組成物はまた、限定はしないが、直接浸漬若しくは浴（ｂａｔｈｉｎｇ）、カテーテルの使用、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／又は液滴剤、組成物を被覆若しくは含浸させた布又は生分解性材料等の支持体の使用など、当技術分野で公知の複数の方法のいずれかで臓器又は組織への直接送達のために製剤化することもできる。
【０６８８】
投与
本発明のキメラポリヌクレオチドは、治療に有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与することもできる。これらには、限定はしないが、以下に挙げるものが含まれる：腸内（腸の中へ）、胃腸、硬膜外（硬膜の中へ）、経口（口を介して）、経皮、硬膜外、脳内（脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、皮膚上（皮膚への塗布）、内皮（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚深部）、鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈の中へ）、静脈内ボーラス、静脈内持続注入、動脈内（動脈の中へ）、筋肉内（筋肉の中へ）、心臓内（心臓の中へ）、骨髄内輸液（骨髄の中へ）、髄腔内（脊柱管の中へ）、腹腔内（腹腔中への注入若しくは注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を介して）、空洞内注射（患部空洞の中へ）、腔内（陰茎基部の中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためにインタクトな皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、経膣、通気（鼻で吸う）、舌下、口唇下、浣腸、点眼剤（結膜上に）、点耳剤、耳介（耳内若しくは耳を介して）、頬（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯（１つ又は複数の歯に対して）、電気浸透、子宮頸管内、静脈洞内（ｅｎｄｏｓｉｎｕｓｉａｌ）、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質、腹部内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、滑液嚢内、軟骨内（軟骨内）、尾側内（馬尾内）、槽内（後小脳延髄槽内）、角膜内（角膜内）、歯科イントラコルナル（ｄｅｎｔａｌ  ｉｎｔｒａｃｏｒｎａｌ）、冠動脈内（冠動脈内）、体内（ｉｎｔｒａｃｏｒｐｏｒｕｓ）海綿体（陰茎海綿体の膨張性空間）、椎間板内（椎間板内）、腺管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内若しくは硬膜下）、表皮内（表皮に向けて）、食道内（食道に向けて）、胃内（胃内）、歯肉内（歯肉内）、回腸内（小腸の末端部）、病巣内（局所病巣内若しくは病巣への直接導入）、管腔内（管腔内）、リンパ管内（リンパ管内）、髄質内（骨の髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、眼球内（眼内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺若しくはその気管支内）、洞内（鼻内若しくは眼窩部副鼻腔内）、脊髄内（脊椎内）、髄液嚢内（関節の髄液腔内）、腱内（腱内）、精巣内（精巣内）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルの脳脊髄液内）、胸郭内（胸郭内）、細管内（臓器の細管内）、腫瘍内（腫瘍内）、鼓室内（中耳（ａｕｒｕｓ）内）、脈管内（１つ又は複数の脈管内）、心室内（心室内）、イオン導入（電流を用いて、可溶性塩のイオンを身体組織中に移動させる）、灌注（開放性損傷又は体腔を浸すか、若しくは洗い流す）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻を介して胃の中へ）、密封包帯法（包帯で覆い、患部を密封する局所投与）、経眼（外眼部へ）、経口咽頭（口腔及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所若しくは全身効果のために口若しくは鼻からの吸入により気道内に）、球後（橋の後ろ若しくは眼球の後ろ）、柔組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所的、経胎盤（胎盤を介して、若しくは胎盤全体に）、経気管（気管の壁を介して）、経鼓室（鼓室を介して、若しくは鼓室全体に）、尿管（尿管に向けて）、尿道（尿道に向けて）、膣、仙骨ブロ���ク、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、循環光療法又は脊髄。具体的実施形態では、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、又は他の上皮関門を通過することを可能にする方法で投与してもよい。一実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも１種の不活性成分を含んでもよい。投与経路並びに特定の投与経路のための製剤に含有させることができる不活性成分の非制限的例は、同時従属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）の表９に示されている。
【０６８９】
本発明のキメラポリヌクレオチドの非制限的投与経路を以下に記載する。
非経口及び注射投与
非経口投与の液体剤形として、限定はしないが、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、及び／又はエリキシルが挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用されている不活性希釈剤、例えば、水若しくは他の溶媒、可溶化剤、並びに乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロ
ピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実、ピーナッツ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含んでもよい。不活性希釈剤以外に、経口投与組成物は、補助薬、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、香味料、及び／又は香料を含み得る。非経口投与のためのいくつかの実施形態では、クレモフォア（ＣＲＥＭＯＰＨＲ）（登録商標）などの可溶化剤、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／又はこれらの組み合わせと組成物を混合する。
【０６９０】
非経口投与用の医薬組成物は、少なくとも１種の不活性成分を含んでもよい。使用される不活性成分のいずれかは、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により承認されていてもよいし、いずれも承認されていなくてもよい。非経口投与用の医薬組成物に使用される不活性成分の非網羅的リストには、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及び水酸化ナトリウムが含まれる。
【０６９１】
注射製剤、例えば、滅菌注射水性又は油性懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤、及び／又は懸濁剤を用いて、公知の技術に従い製剤化することができる。滅菌注射製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液など、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤及び／又は溶媒中の滅菌注射液、懸濁液、及び／又はエマルションであってよい。使用することができる許容されるビヒクル及び溶媒として、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張食塩溶液がある。滅菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒として一般的に使用されている。この目的で、合成モノ−又はジグリセリドなど、任意の低刺激性不揮発性油を使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸を注射製剤の調製に使用することができる。滅菌製剤はさらに、局部麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤などの補助薬を含んでもよい。
【０６９２】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介した濾過により、及び／又は使用前に滅菌水若しくは他の滅菌注射媒体中に溶解若しくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を含有させることにより、滅菌することができる。
【０６９３】
活性成分の効果を持続させるためには、多くの場合、皮下若しくは筋肉内注射からの活性成分の吸収を緩徐にすることが望ましい。これは、難水溶性の結晶性若しくは非晶質材料の液体懸濁物の使用により、達成することができる。その場合、薬物の吸収速度は、溶解速度に応じて変動するが、溶解速度は、結晶サイズ及び結晶形態に左右され得る。あるいは、非経口投与剤形の吸収遅延は、油性ビヒクル中に薬物を溶解又は懸濁させることにより、達成される。注射デポー剤形態は、ポリアクチド−ポリグリコシドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造される。薬物とポリマーの比、及び使用する具体的ポリマーの性質によって、薬物の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤は、身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルション中に薬物を封じ込めることにより調製される。
【０６９４】
直腸及び膣投与
直腸及び膣投与並びに対応する剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８５６］〜［０００８５９］に記載されている。
【０６９５】
経口投与
経口投与及び対応する剤形（例えば、液体剤形）は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８６０］〜［０００８６９］に記載されている。
【０６９６】
局所又は経皮投与
本明細書に記載するように、本発明のキメラポリヌクレオチドを含有する組成物は、局所投与及び／又は経皮投与のために製剤化することができる。皮膚は、容易に接触可能であるため、送達には理想的な部位である。遺伝子発現は、恐らく非特異的毒性を回避しながら、皮膚だけではなく、皮膚内の特定の層及び細胞型にも限定することができる。
【０６９７】
送達される組成物の皮膚発現の部位は、核酸の投与経路に左右され得る。キメラポリヌクレオチドを皮膚に投与するために、一般に、次の３つの経路が考えられる：（ｉ）局所適用（例えば、局所／領域治療及び／又は美容適用）のため；（ｉｉ）皮内注射（例えば、局所／領域治療及び／又は美容適用）のため；並びに（ｉｉｉ）全身投与（例えば、皮膚及び皮膚外領域の両方に及ぶ皮膚科疾患の治療のため）。キメラポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の複数の様々な手法で皮膚に送達することができる。ほとんどの局所送達の手法が、ＤＮＡ送達について機能することが証明されており、こうした手法として、限定はしないが、非カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体の局所適用、粒子媒介（遺伝子ガン）、穿孔媒介遺伝子トランスフェクション、並びにウイルス送達手法が挙げられる。核酸の送達後、遺伝子産物が、いくつかの異なる皮膚細胞型に検出されており、細胞型として、限定はしないが、基底角化細胞、汗腺細胞、皮膚線維芽細胞及び皮膚マクロファージが挙げられる。
【０６９８】
局所適用のための軟膏、クリーム及びゲルは、例えば、好適な増粘剤及び／又はゲル化剤及び／又は溶媒を添加した水性若しくは油性基材を用いて製剤化することができる。従って、こうした基材の非制限的例は、例えば、水及び／又は液体パラフィンなどの油、又は落花生油若しくはヒマシ油などの植物油、又はポリエチレングリコールなどの溶媒を含み得る。基材の性質に応じて、様々な増粘剤及びゲル化剤を使用することができる。こうした薬剤の非制限的例として、ワセリン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、蜜蝋、カルボキシポリメチレン及びセルロース誘導体、並びに／又はモノステアリン酸塩並びに／又は非イオン性乳化剤が挙げられる。
【０６９９】
局所投与用のローションは、水性若しくは油性基材を用いて製剤化することができ、これはまた、一般に、１種又は複数種の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤若しくは増粘剤も含有し得る。
【０７００】
一実施形態では、本発明は、本発明の方法を好都合に及び／又は効果的に実施するための各種包帯（例えば、創傷包帯）又は帯具（例えば、絆創膏）を提供する。典型的には、包帯又は帯具は、ユーザが対象の様々な処置の実施を可能にするのに十分な量で、本明細書に記載する医薬組成物及び／又はキメラポリヌクレオチドを含み得る。
【０７０１】
一実施形態では、本発明は、２回以上の注射で送達されるキメラポリヌクレオチド組成物を提供する。
一実施形態では、局所及び／又は経皮投与の前に、透過性を高め得る装置及び／又は溶液に、少なくとも組織、例えば、皮膚の１部を付してもよい。一実施形態では、皮膚の透過性を高めるために、剥離装置に組織を付してもよい（米国特許出願公開第２００８０２７５４６８号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の実施形態では、超音波強化装置に組織を付してもよい。超音波強化装置として、限
定はしないが、米国特許出願公開第２００４０２３６２６８号明細書並びに米国特許第６，４９１，６５７号明細書及び同第６，２３４，９９０号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の装置が挙げられ得る。組織の透過性を高める方法は、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号明細書及び同第２００４０２３６２６８号明細書並びに米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７０２】
一実施形態では、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドの製剤を送達する前に、組織の透過性を高めるために、装置を使用することができる。皮膚の透過性は、当技術分野で公知の方法及び／又は米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって測定することができる。非制限的例として、修飾ｍＲＮＡ製剤は、米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の薬物送達方法によって送達することができる。
【０７０３】
別の非制限的例では、透過性を高め得る装置に組織を付す前、その間及び／又はその後に、局所麻酔（ＥＭＬＡ）クリームの共晶混合物で組織を処置してもよい。カッツ（Ｋａｔｚ）ら（麻酔法及び無痛法（Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ）、２００４年、第９８巻、ｐ．３７１〜７６；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）は、低エネルギーと組み合わせたＥＭＬＡクリームを使用すると、表皮の鎮痛の開始が、低エネルギー超音波による前処理から５分後という速さで認められたことを示している。
【０７０４】
一実施形態では、組織の透過性を高めるために組織を処置する前、その間及び／又はその後に、促進剤を適用してもよい。促進剤として、限定はしないが、輸送促進剤、物理的吸収促進剤、及び空洞化促進剤などがある。促進剤の非制限的例は、米国特許第６，１９０，３１５号明細書（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７０５】
一実施形態では、組織の透過性を高めるための特定の装置を使用した後、本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドの製剤を送達することができ、この製剤は、免疫応答を誘発する物質をさらに含有してもよい。別の非制限的例では、免疫応答を誘発する物質を含有する製剤は、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号明細書及び同第２００４０２３６２６８号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により送達することができる。
【０７０６】
組成物の局所及び／又は経皮投与用の剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤及び／又はパッチが挙げられ得る。概して、活性成分は、必要に応じて薬学的に許容される賦形剤及び／又は必要な防腐剤及び／又は緩衝剤と滅菌条件下で混合する。
【０７０７】
さらに、本発明は、経皮パッチの使用も考慮し、これは、多くの場合、身体に対する化合物の制御送達をもたらすというさらなる利点を有する。こうした剤形は、例えば、適切な媒体中に化合物を溶解及び／又は分散させることによって調製することができる。上記に代わり又はこれに加えて、律速膜の付与並びに／又はポリマーマトリックス及び／若しくはゲル中への化合物の分散のいずれかによって、速度を制御することもできる。
【０７０８】
局所投与に好適な製剤は、限定はしないが、塗布薬、ローション、水中油形及び／若しくは油中水形エマルション、例えば、クリーム、軟膏、及び／若しくはペースト、並びに／又は溶液及び／若しくは懸濁剤などの液体及び／若しくは半液体調製物を含む。
【０７０９】
局所投与可能な製剤は、例えば、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｗ）活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の固溶限界と同じくらい高くてもよい。局所投与用の製剤は、本明細書に記載する追加成分の１つ又は複数をさらに含んでもよい。
【０７１０】
局所、経真皮及び経皮投与及び対応する剤形は、例えば、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８７０］〜［０００８８８］に記載されている。
【０７１１】
デポー剤投与
本明細書に記載するように、一部の実施形態では、組成物は、持続放出のためのデポー剤に製剤化される。一般に、特定の臓器又は組織（「標的組織」）が投与のためにターゲティングされる。
【０７１２】
本発明の一部の態様では、キメラポリヌクレオチドは、標的組織内又はその近傍に空間的に保持される。組成物、特に組成物の核酸成分が、標的組織内に実質的に維持される、すなわち、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９又は９９．９９％超が、標的組織内に保持される条件下で、標的組織（１つ又は複数の標的細胞を含む）と組成物を接触させることにより、哺乳動物対象の標的組織に組成物を供給する方法が提供される。１つ又は複数の標的細胞に侵入した、組成物中に存在する核酸の量を測定することにより、保持を定量するのが有利である。例えば、対象に投与した核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９又は９９．９９％超が、投与から一定期間にわたって細胞内に存在する。例えば、リボ核酸及びトランスフェクション試薬を含有する水性組成物を用いて、哺乳動物対象に対する筋肉内注射を実施した後、筋肉細胞中に存在するリボ核酸の量を測定することによって組成物の保持を定量する。
【０７１３】
本発明の態様は、組成物が、標的組織内に実質的に保持される条件下で、標的組織（１つ又は複数の標的細胞を含む）と組成物を接触させることにより、哺乳動物対象の標的組織に組成物を供給する方法に関する。組成物は、目的のポリペプチドが、少なくとも１つの標的組織内で産生されるように、有効量のキメラポリヌクレオチドを含有する。組成物は、一般に、細胞透過剤及び薬学的に許容される担体を含有するが、「裸」の核酸（細胞透過剤若しくは他の薬剤を含まない核酸）も考慮される。
【０７１４】
特定の状況では、組織内で細胞により産生されるタンパク質の量は増加するのが望ましい。タンパク質産生の増加は、標的組織内の細胞に空間的に限定されるのが好ましい。従って、哺乳動物対象の組織内で目的のタンパク質の産生を増加する方法が提供される。キメラポリヌクレオチドを含有する組成物であって、予め決定した量の標的組織内に含まれる実質的割合の細胞において目的のポリペプチドを産生するように、組成物の単位量が決定されていることを特徴とする組成物が提供される。
【０７１５】
一部の実施形態では、組成物は、複数の異なるキメラポリヌクレオチドを含み、ここで、キメラポリヌクレオチドの１つ又は２つ以上が、目的のポリペプチドをコードする。任意選択で、組成物はまた、組成物の細胞内送達を補助するための細胞透過剤も含有する。予め決定した量の標的組織内に含まれる実質的割合の細胞において目的のポリペプチドを産生する（一般に、予め決定した量に隣接するか、又は標的組織から離れた組織内で目的のポリペプチドの有意な産生を誘導することなく）のに必要な組成物の用量の決定を実施する。この決定の後、決定された用量を哺乳動物対象の組織に直接導入する。
【０７１６】
一実施形態では、本発明は、２回以上の注射又は分割用量の注射で投与されるキメラポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態では、本発明は、小型の使い捨て薬物リザーバ、パッチポンプ又は浸透圧ポンプを用いて、標的組織付近に保持することができる。パッチポンプの非制限的例として、ＢＤ（登録商標）（ニュージャージー州フランクリンレイクス）、インスレット社（Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（マサチューセッツ州ベッドフォード）、ステディメド・セラピューティクス（ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（カリフォルニア州サンフランシスコ）、メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）（ミネソタ州ミネアポリス）（例えば、ミニメド（ＭｉｎｉＭｅｄ））、ユニライフ（ＵｎｉＬｉｆｅ）（ペンシルベニア州ヨーク）、バレリタス（Ｖａｌｅｒｉｔａｓ）（ニュージャージー州ブリッジウォータ）、並びにスプリングリーフ・セラピューティクス（ＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（マサチューセッツ州ボストン）により製造及び／又は販売されているものが挙げられる。浸透圧ポンプの非制限的例としては、デュレクト（ＤＵＲＥＣＴ）（登録商標）（カリフォルニア州クパーチノ）（例えば、デュロス（ＤＵＲＯＳ）（登録商標）及びアルゼット（ＡＬＺＥＴ）（登録商標））が挙げられる。
【０７１７】
肺内投与
医薬組成物は、口腔を介した肺内投与に好適な製剤として調製、パッケージング、及び／又は販売することができる。肺内投与及び対応する剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００８９６］〜［０００９０１］に記載されている。
【０７１８】
鼻内、鼻及び口腔内投与
肺内投与に有用なものとして本明細書に記載する製剤は、医薬組成物の鼻内送達に有用である。鼻内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含む、平均粒度が約０．２μｍ〜５００μｍの粗い粉末である。こうした製剤は、鼻から吸い込む方法、すなわち、鼻の近傍に保持した粉末の容器から鼻腔を通した急速な吸入により、投与される。鼻内、鼻及び口腔内投与並びに対応する剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９０２］〜［０００９０５］に記載されている。
【０７１９】
眼及び耳介（耳性）投与
医薬組成物は、眼への及び／若しくは眼周辺の送達並びに／又は耳への送達（例えば、耳介（耳性）投与）に好適な製剤として調製、パッケージング、及び／又は販売することができる。眼への及び／又は眼周辺の送達のための投与経路の非制限的例として、眼球後方、結膜、角膜内、眼球内、硝子体内、眼及び結膜下が挙げられる。眼及び耳介投与並びに対応する剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９０６］〜［０００９１２］に記載されている。
【０７２０】
ペイロード投与：検出可能な薬剤及び治療薬
本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、生物学標的に対する物質（「ペイロード」）の送達、例えば、標的の検出を目的とした検出可能な物質の送達、又は治療薬の送達が所望されるいくつかの異なるシナリオで用いることができる。検出方法は、限定はしないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ双方でのイメージング方法、例えば、免疫組織化学、生物発光イメージング（ＢＬＩ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、電子顕微鏡、Ｘ線コンピュータ断層法、ラマンイメージング、光干渉断層法、吸収イメージング、サーマルイメージング、蛍光反射イメージング、蛍光顕微鏡検査、蛍光分子トモグラフィーイメージング、核磁気共鳴イメージング、Ｘ線イメー
ジング、超音波イメージング、光音響イメージング、実験室アッセイ、あるいは、タグ付け／染色／イメージングが必要なあらゆる状況におけるものを含み得る。
【０７２１】
キメラポリヌクレオチドは、リンカー及びペイロードの両方を任意の有用な配向で含有するように設計することができる。例えば、２つの末端を有するリンカーを用いて、一端をペイロードに、他端を核酸塩基に（例えば、デアザ−アデノシン若しくはデアザ−グアノシンのＣ−７若しくはＣ−８位又はシトシン若しくはウラシルのＮ−３若しくはＣ−５位に）結合させる。本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上のペイロード（例えば、標識及び転写阻害剤）、並びに切断可能なリンカーを含んでもよい。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸であり、ここで、切断可能なリンカーの一端は、７−デアザ−アデニンのＣ７位に結合され、リンカーの他端は、阻害剤に（例えば、シチジンの核酸塩基のＣ５位に）結合され、標識（例えば、Ｃｙ５）が、リンカーの中心に結合されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９９４，３０４号明細書の図５並びに第９及び１０列におけるＡ＊ｐＣｐ  Ｃ５  Ｐａｒｇ  Ｃａｐｌｅｓｓの化合物１を参照のこと）。コード領域への修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸の組み込み後、標識及び阻害剤（例えば、ポリメラーゼ阻害剤）に結合した切断可能なリンカーを有するポリヌクレオチドが得られる。リンカーが切断されると（例えば、切断可能なジスルフィド部分を有するリンカーを還元する還元条件により）、標識及び阻害剤が放出される。上記以外のリンカー及びペイロード（例えば、治療薬、検出可能な標識、及び細胞透過ペイロード）は、本明細書、並びに２０１３年３月９日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０７２２】
例えば、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の再プログラミングに使用することができ、これは、クラスター中の全細胞と比較して、トランスフェクトされた細胞を直接追跡することができる。別の事例では、リンカーを介してキメラポリヌクレオチドに結合させることができ、しかも蛍光標識することができる薬物を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、細胞内で薬物を追跡することができる。他の例として、限定はしないが、細胞への可逆的薬物送達におけるキメラポリヌクレオチドの使用がある。
【０７２３】
本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、特定の細胞小器官に対するペイロード（例えば、検出可能な薬剤若しくは治療薬）の細胞内ターゲティングに使用することができる。例示的細胞内標的は、限定はしないが、進化したｍＲＮＡプロセシングのための核局在化、又は阻害剤を含有するｍＲＮＡに連結した核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。
【０７２４】
さらに、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドを用いて、例えば、生存動物における細胞若しくは組織に治療薬を送達することができる。例えば、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドを用いて、癌細胞を殺傷するために高極性の化学療法薬を送達することができる。リンカーを介して治療薬に結合したキメラポリヌクレオチドは、膜透過を促進することができ、これにより、治療薬を細胞中に移動させて、細胞内標的に到達させることができる。
【０７２５】
一例では、リンカーをリボース環の２’位並びに／又はキメラポリヌクレオチドの３’及び／若しくは５’位に結合させる（例えば、国際公開第２０１２０３０６８３号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。リンカーは、本明細書に開示するリンカー、当技術分野で公知のリンカー及び／又は国際公開第２０１２０３０６８３号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されるリンカーのいずれであってもよい。
【０７２６】
別の例では、キメラポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーを介してキメラポリヌクレオチドウイルス阻害ペプチド（ＶＩＰ）に結合することができる。切断可能なリンカーは、ＶＩＰ及び色素を細胞中に放出することができる。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、リンカーを介してＡＤＰ−リボシレートに結合することができ、これは、いくつかの細菌毒素、例えば、コレラ毒素、ジフテリア毒素、及び百日咳毒素などの作用の原因となるものである。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞における標的タンパク質を改変するＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ＡＤＰ−リボシレートＧタンパク質は、小腸の内膜から大量の体液分泌を引き起こすことによりヒト細胞を改変し、これによって生命を脅かす下痢が起こる。
【０７２７】
一部の実施形態では、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法薬、又はその他の治療薬などの治療薬であってもよい。細胞毒又は細胞傷害薬は、細胞に対して有害となり得る任意の物質を含む。例として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、プロマイシン、メイタンシノイド、例えば、メイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照のこと；これは、全体として本明細書に組み込む）、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第５，５８５，４９９号明細書、及び同第５，８４６，５４５号明細書を参照のこと；これらの全ては、参照により本明細書に組み込む）、並びにそれらの類似体又は相同体。放射性イオンとして、限定はしないが、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、及びプラセオジムが挙げられる。その他の治療薬として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：抗代謝物（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに抗菌剤（例えば、ビスクリスチン、ビンブラスチン、タキソール及びメイタンシノイド）。
【０７２８】
一部の実施形態では、ペイロードは、検出可能な薬剤、例えば、各種有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素若しくは酵素基質、蛍光材料、発光材料（例えば、ルミノール）、生物発光材料（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン）、化学発光材料、放射性材料（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、若しくは９９ｍＴｃ（例えば、過テクネシウム酸塩（例えば、テクネシウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４−））、並びに造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、及び極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ化造影剤（イオヘキソール）、微小気泡、又はパーフルオロカーボン）であってよい。こうした任意選択で検出可能な標識として、例えば、以下のものが挙げられる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン及び誘導体（例えば、アクリジン及びアクリジンイソチオシ
アネート）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ）；クマリン及び誘導体（例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）１２０）、及び７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）１５１））；シアニン染料；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニリンドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニル塩化物（ＤＮＳ、ダンシル塩化物）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナト（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体（例えば、エオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体（例えば、エリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体（例えば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（及び−６−）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣ又はＸＲＩＴＣ）、及びフルオレスカミン）；２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール−２−イリデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホルプロピル）−１Ｈ−ベンズ［ｅ］インドリウム水酸化物、分子内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタナミン（１：１）を含む化合物（ＩＲ１４４）；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体（例えば、ピレン、酪酸ピレン、及びスクシニミジル１−ピレン）；酪酸塩量子ドット；リアクティブ・レッド（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ）４（シバクロン（ＣＩＢＡＣＲ��Ｎ）（商標）ブリリアント・レッド（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ）３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体（例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リッサミンローダミンＢ塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＩＣ））；リボフラビン；ロソール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）−３（Ｃｙ３）；シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；アレキサ（Ａｌｅｘａ）６４７；ラ・ホルタ・ブルー（Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；及びナフタロシアニン。
【０７２９】
一部の実施形態では、検出可能な薬剤は、検出不能の前駆物質であってもよく、これは、活性化すると、検出可能になる（例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物
（例えば、テトラジン−ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）ＦＬ、テトラジン−オレゴン・グリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）４８８、若しくはテトラジン−ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）ＴＭＲ−Ｘ）又は酵素活性化蛍光発生剤（例えば、プロセンス（ＰＲＯＳＥＮＳＥ）（登録商標）（ビスエン・メディカル（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）））。酵素標識組成物を使用することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとして、限定はしないが、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及びウエスタンブロット分析が挙げられる。
【０７３０】
組み合わせ
キメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種の他の治療薬、予防薬、診断薬、又はイメージング剤と組み合わせて使用することができる。「〜と組み合わせて」によって、薬剤を同じ時間に投与すべき、及び／又は送達のために一緒に製剤化すべきであることを意味するわけではないが、こうした送達方法は本開示の範囲に含まれる。組成物は、１種又は複数種の所望の治療薬若しくは医療手順と一緒に、その前若しくはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、当該薬剤について決定された用量及び／又は時間スケジュールで投与される。一部の実施形態では、本開示は、医薬、予防薬、診断薬、又はイメージング組成物の送達であって、その生体利用可能性を改善し、その代謝を低減及び／若しくは改変し、その排出を阻害し、並びに／又はその体内分布を改変し得る薬剤と組み合わせた送達を包含する。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、癌治療又は過剰増殖性細胞の制御のための医薬剤と組み合わせて使用することができる。米国特許第７，９６４，５７１号明細書（全体として参照により本明細書に組み込む）では、リポポリマーと共にインターロイキン１２をコードするＤＮＡプラスミドを含む医薬組成物を使用すると共に、さらに少なくとも１種の抗癌剤又は化学療法薬も投与する、固形原発腫瘍又は転移性腫瘍の治療のための併用療法が記載されている。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明のキメラポリヌクレオチドは、リポポリマーを含む医薬組成物の形態をしていてもよく（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１０２１８２３１号明細書を参照のこと；これは、抗増殖性分子をコードするＤＮＡプラスミドと、リポポリマーを含む医薬組成物を請求する）、この組成物は、少なくとも１種の化学療法薬又は抗癌剤と一緒に投与してもよい。（例えば、米国特許第８，５１８，９０７号明細書及び国際公開第２０１２１８７５４号パンフレットにおける「組み合わせ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」のセクションを参照のこと；これら文献の各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０７３１】
キメラポリヌクレオチド及びその医薬製剤は、単独で対象に投与してもよいし、１種又は複数種の他の治療薬、例えば、抗癌剤と併用するか、又はこれらを含有してもよい。従って、キメラポリヌクレオチドと他の抗癌剤若しくは化学療法薬との組み合わせは、本発明の範囲内にある。こうした薬剤の例は、Ｖ．Ｔ．デビタ（Ｖ．Ｔ．Ｄｅｖｉｔａ）及びＳ．ヘルマン（Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ）（編者）による「癌の原理と腫瘍学の実践（Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、第６版、２００１年２月１５日、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）に見出すことができる。当業者は、関連する薬物及び癌の具体的な特徴に基づき、どの薬剤の組み合わせが有用であるかを認識することができよう。こうした抗癌剤として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤、レチノイド受容体調節剤、細胞傷害剤／細胞分裂抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤及び他の血管新生阻害剤、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、アポトーシス促進剤及び細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤。キメラポリヌクレオチドはまた、ＨＣＣの治療に用いられる任意の治療薬、例えば、限定はしないが、ソラフェニブと組み合わせても有用となり得る。キメラポリ
ヌクレオチドは、放射性療法と組み合わせて共投与すれば、特に有用となり得る。
【０７３２】
特定の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、以下に挙げるものなどの公知の抗癌剤と組み合わせると有用となり得る：エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤、レチノイド受容体調節剤、細胞傷害剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、及び他の血管新生阻害剤。
【０７３３】
以下：エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤、レチノイド受容体調節剤、細胞傷害剤、低酸素活性化剤、プロテアソーム阻害剤、微小管阻害剤／微小管安定化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞分裂キネシンの阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、細胞分裂進行に関与するキナーゼの阻害剤、抗増殖剤、モノクローナル抗体標的治療薬、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、血管新生を調節若しくは阻害する治療薬、細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤、細胞増殖及び生存シグナル伝達経路の阻害剤、アポトーシス促進剤、選択的ＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤ、ＣＯＸ−２の阻害剤、ＣＯＸ−２の特異的阻害剤として記載されている化合物、血管新生阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗癌化合物以外の化合物、内因性多剤耐性（ＭＤＲ）の阻害剤、吐き気若しくは嘔吐を治療する制吐薬、並びにニューロキニン−１受容体アンタゴニストの例は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９２５］〜［０００９５７］に記載されている。
【０７３４】
本発明の別の実施形態は、癌の治療のための遺伝子療法と組み合わせたキメラポリヌクレオチドの使用である。癌治療に関する遺伝子戦略の概略については、ホール（Ｈａｌｌ）ら著（米国ヒト遺伝子療法学会誌（Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ）、第６１巻、ｐ．７８５〜７８９、１９９７年）及びクフェ（Ｋｕｆｅ）ら著（癌医療（Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第５版、ｐ．８７６〜８８９、ＢＣ  デッカー（ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ）、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、２０００年）を参照されたい。遺伝子療法を用いて、任意の腫瘍抑制遺伝子を送達することができる。こうした遺伝子の例として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：組換えウイルス媒介遺伝子輸送を介して送達することができるｐ５３（例えば、米国特許第６，０６９，１３４号明細書を参照）、ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニスト（「ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニストのアデノウイルス媒介送達により、マウスにおける血管新生依存性腫瘍増殖及び播種を抑制する（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｕＰＡ／ｕＰＡＲ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ）」、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９８年８月、第５巻（８）、ｐ．１１０５〜１３）、並びにインターフェロンγ（免疫学会誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１６４巻、ｐ．２１７〜２２２、２０００年）。
【０７３５】
キメラポリヌクレオチドはまた、ビスホスホネート（ビスホスホネート、ジホスホネート、ビスホスホン酸及びジホスホン酸を含むと理解される）と併用して、骨癌などの癌の治療又は予防にも有用であり得る。ビスホスホネートの例として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：エチドロネート（ジドロネル（Ｄｉｄｒｏｎｅｌ））、パミドロネート（アレジア（Ａｒｅｄｉａ））、アレンドロネート（フォサマックス（Ｆｏｓａｍａｘ））、リセドロネート（アクトネル（Ａｃｔｏｎｅｌ））、ゾレドロネート（ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ））、イバンドロネート（ボニバ（Ｂｏｎｉｖａ））、インカドロネート若しくはシマドロネート、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、ミノドロネート、ネリドロネート、ピリドロネート及びチルドロネート、並びにこれらのあらゆる薬学的に許容される
塩、誘導体、水和物及び混合物。
【０７３６】
キメラポリヌクレオチドはまた、貧血の治療に有用な薬剤と一緒に投与してもよい。こうした貧血治療薬は、例えば、持続性エリスロポエチン受容体活性化剤（エポエチンαなど）である。
【０７３７】
さらに、キメラポリヌクレオチドは、好中球減少症の治療に有用な薬剤と一緒に投与してもよい。こうした好中球減少症の治療薬は、例えば好中球の産生及び機能を制御する造血増殖因子、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、（Ｇ−ＣＳＦ）などである。Ｇ−ＣＳＦの例として、フィルグラスティム及びＰＥＧ−フィルグラスティムが挙げられる。
【０７３８】
さらに、キメラポリヌクレオチドは、免疫増強薬、例えば、レバミソール、イソプリノシン及びザダキシンと一緒に投与してもよい。
キメラポリヌクレオチドはまた、アロマターゼ阻害剤と併用して、乳癌の治療又は予防にも有用となり得る。アロマターゼ阻害剤の例として、限定はしないが、アナストロゾール、レトロゾール及びエキセメスタンが挙げられる。
【０７３９】
また、キメラポリヌクレオチドは、他の核酸治療薬と併用して、癌の治療又は予防にも有用となり得る。
さらに、キメラポリヌクレオチドは、γセクレターゼ阻害剤及び／又はＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤と組み合わせて、投与してもよい。こうした阻害剤として、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９６４］に記載されている化合物を含む。
【０７４０】
キメラポリヌクレオチドはまた、ＰＡＲＰ阻害剤と併用して、癌の治療又は予防にも有用となり得る。
さらに、キメラポリヌクレオチドは、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００９６６］に記載の治療薬と併用して、癌の治療にも有用となり得る。
【０７４１】
前述した組み合わせは、医薬製剤の形態での使用のために好都合に提供することができ、従って、薬学的に許容される希釈剤若しくは担体と一緒に前述の組み合わせを含む医薬組成物は、本発明のさらなる態様を呈示する。
【０７４２】
こうした組み合わせの個々の化合物は、個別の製剤又は併用医薬製剤として、順次又は同時に投与することができる。一実施形態では、個々の化合物は、併用医薬製剤として同時に投与される。
【０７４３】
さらに、組み合わせて使用される治療、予防、診断、若しくはイメージング活性剤が、単一組成物として一緒に投与してもよいし、又は別々の組成物として個別に投与してもよいことは理解されよう。一般に、組み合わせて使用される薬剤は、それらが個別に使用されるレベルを超えないレベルで使用されることが予想される。一部の実施形態では、組み合わせて使用されるレベルは、個別に使用されるレベルより低くなる。一実施形態では、組み合わせは、各々又は一緒に、本明細書に記載する分割投与計画に従って投与することができる。
【０７４４】
用量決定
本発明は、本発明の修飾ｍＲＮＡ及びそれらのコードされたタンパク質又は複合体をそ
れらが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質若しくは複合体、又はそれらの医薬、イメージング、診断、若しくは予防組成物は、疾患、障害、及び／又は病状（例えば、ワーキングメモリ障害に関する疾患、障害、及び／又は病状）を予防、治療、診断、若しくはイメージングするのに有効な任意の量及び任意の投与経路を用いて、対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢及び健康状態、疾患の重症度、具体的組成物、その投与方法、その活性様式などに応じて、対象間で変動し得る。本発明の組成物は、投与しやすさ及び投与量の均一性のために、典型的に単位用量形態で製剤化される。しかし、本発明の組成物の１日総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で担当医により決定され得ることは理解されよう。いかなる特定の患者についての具体的な治療有効用量、予防有効用量、又は適切なイメージング用量は、以下のものを含む様々な要因にも応じて変動し得る：治療対象の障害及び障害の重症度；使用する具体的な化合物の活性；使用する具体的な組成物；患者の年齢、体重、健康状態、性別及び食事；使用する具体的な化合物の投与時間、投与経路及び排出速度；治療の期間；使用する具体的な化合物と組み合わせて、若しくは同時に使用する薬物；並びに医学分野で周知の同様の要因。
【０７４５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、所望治療効果、診断効果、予防効果、又はイメージング効果を得るために、１日に１又は複数回、１日につき対象の体重ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．００１ｍｇ〜約０．０５ｍｇ、約０．００５ｍｇ〜約０．０５ｍｇ、約０．００１ｍｇ〜約０．００５ｍｇ、約０．０５ｍｇ〜約０．５ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２５ｍｇを送達するのに十分な投与レベルで投与することができる（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３０７８１９９号パンフレットに記載される単位用量の範囲を参照のこと）。所望の用量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日置き、２日置き、毎週、２週間毎、３週間毎、又は４週間毎に投与することができる。いくつかの実施形態では、所望の用量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、又は１５回以上の投与）を用いて送達することができる。複数回投与を用いる場合、本明細書に記載のものなどの分割投与レジメンを使用することができる。
【０７４６】
本発明によれば、分割用量レジメンでのキメラポリヌクレオチドの投与によって、哺乳動物対象において、より高レベルのタンパク質が産生されることが見出されている。本明細書で用いられるとき、「分割用量」は、１単位用量又は１日総用量の２つ以上の用量への分割、例えば、１単位用量の２回以上の投与を意味する。本明細書で用いられるとき、「１単位用量」は、１用量／１回／１経路／１接触点、すなわち１回の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。本明細書で用いられるとき、「１日総用量」は、２４時間内に投与又は処方される量である。これは、１単位用量として投与され得る。一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、分割用量で対象に投与される。キメラポリヌクレオチドは、緩衝剤のみで製剤化してもよいし、又は本明細書に記載の製剤として製剤化してもよい。
【０７４７】
剤形
本明細書に記載する医薬組成物は、本明細書に記載の剤形、例えば、局所、鼻内、気管内、又は注射可能な（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、及び皮下）剤形に製剤化することができる。
【０７４８】
液体剤形
非経口投与用の液体剤形は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はし
ないが、パラグラフ［０００１０３７］に記載されている。
【０７４９】
注射可能な剤形
注射製剤、例えば、注射用滅菌水性又は油性懸濁液は、公知の技術に従って製剤化することができ、好適な分散剤、湿潤剤、及び／又は懸濁剤を含み得る。滅菌注射製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液など、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤及び／又は溶媒中の滅菌注射溶液、懸濁液、及び／又はエマルションであってよい。使用することができる許容可能なビヒクル及び溶媒として、限定はしないが、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張食塩溶液がある。滅菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒として一般的に使用されている。この目的で、合成モノ−又はジグリセリドなど、任意の低刺激性不揮発性油を使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸を注射製剤の調製に使用することができる。
【０７５０】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介した濾過により、及び／又は使用前に滅菌水若しくは他の滅菌注射媒体中に溶解若しくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を含有させることにより、滅菌することができる。
【０７５１】
活性成分の効果を持続させるためには、皮下若しくは筋肉内注射からの活性成分の吸収を緩徐にすることが望ましいと考えられる。これは、難水溶性の結晶性若しくは非晶質材料の液体懸濁物の使用により、達成することができる。その場合、キメラポリヌクレオチドの吸収速度は、溶解速度に応じて変動するが、溶解速度は、結晶サイズ及び結晶形態に左右され得る。あるいは、非経口投与されたキメラポリヌクレオチドの吸収遅延は、油性ビヒクル中にキメラポリヌクレオチドを溶解若しくは懸濁させることにより、達成され得る。注射デポー剤形態は、ポリアクチド−ポリグリコシドなどの生分解性ポリマー中にキメラポリヌクレオチドのマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造される。キメラポリヌクレオチドとポリマーの比、及び使用する具体的ポリマーの性質によって、キメラポリヌクレオチドの放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、限定はしないが、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤は、身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルション中にキメラポリヌクレオチドを封じ込めることにより調製され得る。
【０７５２】
肺
送達及び投与のための肺及び鼻内製剤は、同時係属国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００７６６］〜［０００７８１］に記載されている。
【０７５３】
コーティング又はシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、及び顆粒などの固体剤形は、腸溶コーティング及び医薬製剤化の分野で公知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて、調製することができる。これらは、任意選択で、乳白剤を含んでもよく、腸管の特定の部分だけに、若しくはそこに選択的に、任意選択で遅延して、活性成分を放出する組成物から成るものでもよい。使用することができる埋没組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスがある。同様のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖、並びに高分子ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いた軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。
【０７５４】
複数回用量及び反復用量投与
一部の実施形態では、本発明の化合物及び／又は組成物は、２回以上の用量で投与することができる（本明細書では、複数回用量投与と呼ぶ）。こうした用量は、同じ成分を含
んでもよいし、又は以前の用量には含有されない成分を含んでもよい。こうした用量は、以前の用量と比較して、同じ質量及び／若しくは体積の成分又は変更された質量及び／若しくは体積の成分を含んでもよい。一部の実施形態では、複数回用量投与は、反復用量投与を含んでもよい。本明細書で用いられるとき、用語「反復用量投与」は、連続的に、又は実質的に同じ質量及び／若しくは体積で供給される実質的に同じ成分を含む反復用量のレジメンにおいて、投与される２回以上の用量を指す。一部の実施形態では、対象は、反復用量応答を示し得る。本明細書で用いられるとき、用語「反復用量応答」は、反復用量投与レジメンにおいて投与される別の用量とは異なる反復用量に対する対象の応答を指す。一部の実施形態では、こうした応答は、ｍＲＮＡを含む反復用量に応答するタンパク質の発現であってもよい。上記の実施形態では、タンパク質発現は、反復用量投与レジメンにおいて投与される別の用量と比較して増大し得るか、又はタンパク質発現は、反復用量投与レジメンにおいて投与される別の用量と比較して低減し得る。タンパク質発現の変化は、約１％〜約２０％、約５％〜約５０％、約１０％〜約６０％、約２５％〜約７５％、約４０％〜約１００％及び／又は少なくとも１００％であり得る。反復用量レジメンの一環として投与されるｍＲＮＡの発現の低減で、投与ＲＮＡから翻訳されたタンパク質のレベルが、反復用量レジメンにおいて投与される別の用量と比較して４０％超の低減である場合、本明細書ではこれを「反復用量抵抗」と呼ぶ。
【０７５５】
医薬組成物の特性
本明細書に記載の医薬組成物は、以下の特性の１つ又は複数を特徴とし得る：
生体利用可能性
キメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載の送達剤を含む組成物に製剤化されると、本明細書に記載の送達剤がない組成物と比較して、生体利用可能性に増加を示し得る。本明細書で用いられるとき、用語「生体利用可能性」は、哺乳動物に投与される所与の量のキメラポリヌクレオチドの全身利用可能性を指す。生体利用可能性は、哺乳動物への化合物の投与後の非変化形態の化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）又は最大血清若しくは血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定することにより、評価することができる。ＡＵＣは、横座標（Ｘ軸）に沿う時間に対して、縦座標（Ｙ軸）に沿う化合物の血清又は血漿濃度をプロットする曲線下の面積を決定したものである。一般に、特定の化合物のＡＵＣは、当業者には周知の方法、並びにＧ．Ｓ．バンカー（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ）著、現代製剤、薬物及び薬学（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第７２巻、マーセル・デッカー，ニューヨーク社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．）、１９９６年（全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの方法を用いて、計算することができる。
【０７５６】
Ｃｍａｘ値は、哺乳動物への化合物の投与後に哺乳動物の血清又は血漿中で達成される化合物の最大濃度である。特定の化合物のＣｍａｘ値は、当業者には周知の方法を用いて測定することができる。語句「生体利用可能性を増大する」、「薬物動態を改善する」は、本明細書で用いられるとき、哺乳動物におけるＡＵＣ、Ｃｍａｘ、若しくはＣｍｉｎとして測定された最初のキメラポリヌクレオチドの全身利用可能性が、本明細書に記載の送達剤と一緒に共投与したとき、こうした共投与を実施しない場合より高いことを意味する。一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドの生体利用可能性は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％増大し得る。
【０７５７】
一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドの液体製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期がまちまちである場合があり、治療効果を達成するために用量の調節が必要となる。これに対処するため、本発明の一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチド製剤は、反復投与の間に、生体利用可能性及び／又は治療効果を改善するように設計することができる。こうした製剤は、キメラポリヌクレオチドの持続放出を可能にする、並びに／又はヌクレアーゼによるキメラポリヌクレオチドの分解率を低減することができる。一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチド、不水溶性油性デポー剤、界面活性剤及び／又は共界面活性剤及び／又は共溶媒を含む懸濁液が提供される。油と界面活性剤の組み合わせは、キメラポリヌクレオチドを含む懸濁液製剤化を可能にし得る。不水溶性デポー剤中のキメラポリヌクレオチドの送達を用いて、デポー剤から周辺の生理環境へのキメラポリヌクレオチドの持続放出により生体利用可能性を改善し、及び／又はヌクレアーゼによるキメラポリヌクレオチドの分解を阻止することができる。
【０７５８】
一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドと一緒に、二価及び一価カチオンの組み合わせを含むカチオン性ナノ粒子を製剤化することができる。こうしたナノ粒子は、所与の期間（例えば、数時間、数日など）にわたって溶液中に自然に形成され得る。上記のナノ粒子は、二価カチオンのみの存在下で、又は一価カチオンのみの存在下では形成されない。カチオン性ナノ粒子中の又はカチオン性ナノ粒子を含む１種又は複数のデポー剤中でのキメラポリヌクレオチドの送達は、長時間作用デポー剤として作用する、及び／又はヌクレアーゼによる分解の速度を低下させることにより、キメラポリヌクレオチドの生体利用可能性を改善することができる。
【０７５９】
治療濃度域
キメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載の送達剤を含む組成物に製剤化すると、本明細書に記載の送達剤なしで投与されるキメラポリヌクレオチド組成物の治療濃度域と比較して、投与されるキメラポリヌクレオチド組成物の治療濃度域の増加を呈示し得る。本明細書で用いられるとき、「治療濃度域」は、治療効果を誘発する高い確率を有する血漿濃度の範囲、又は作用部位での治療活性物質レベルの範囲を指す。一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドの治療濃度域は、本明細書に記載の送達剤と一緒に共投与した場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％増加し得る。
【０７６０】
分布容積
キメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載の送達剤を含む組成物に製剤化すると、本明細書に記載の送達剤のない組成物と比較して、改善された、例えば、減少又は標的化された分布容積（Ｖｄｉｓｔ）を呈示し得る。分布容積（Ｖｄｉｓｔ）は、体内の薬物の量を血液又は血漿中の薬物の濃度に関連させる。本明細書で用いられるとき、「分布容積」という用語は、血液又は血漿中と同じ濃度で、体内に薬物の総量を含有するのに必要な液量を指す。すなわち、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物の量／血液又は血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、１０ｍｇの容量及び１０ｍｇ／Ｌの血漿濃度の場合、分布容積は、１リットルである。分布容積は、薬物が血管外組織中に存在する度合いを表す。大きな分布容積は、血漿タンパク質結合と比較して、化合物が組織成分に結合する傾向を示している。臨床の状況では、Ｖｄｉｓｔを用いて、定常濃度を達成するためのロード用量を決定することができる。一部の実施形態では、キメラポリヌクレオチドの分布容積は、本明細書に記載の送達剤と一緒に共投与した場合、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも
約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％減少し得る。
【０７６１】
生物学的効果
一実施形態では、動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することによって分類することができる。タンパク質発現は、本発明の修飾ｍＲＮＡを投与された動物から採取した生体サンプルの分析から定量することができる。一実施形態では、動物に投与した修飾ｍＲＮＡによりコードされた発現タンパク質は、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌが好ましいと考えられる。例えば、哺乳動物に送達した修飾ｍＲＮＡによりコードされたタンパク質の場合、５０〜２００ｐｇ／ｍｌのタンパク質発現が、動物におけるタンパク質の治療有効量とみなすことができる。
【０７６２】
質量分析法によるキメラポリヌクレオチド酸の検出
質量分析法（ＭＳ）は、イオンへの変換後、分子に関する構造及び分子質量／濃度の情報を提供することができる分析技術である。分子をまずイオン化して、正及び負電荷を取得すると、それらは、質量分析装置を通過して、その質量／電荷（ｍ／ｚ）比に応じて、検出器の異なる箇所に到達する。ポリヌクレオチドを検出する方法は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０５５］〜［０００１０６７］に記載されている。
【０７６３】
Ｖ．本発明のキメラポリヌクレオチドの使用
好ましい実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、免疫応答及び／若しくは分解経路などの有害な生体応答の回避若しくは忌避、発現の閾値の達成及び／若しくはタンパク質産生能力の改善、発現速度若しくは翻訳効率の改善、薬物若しくはタンパク質半減期及び／又はタンパク質濃度の改善、タンパク質局在化の最適化をもたらすように、また、以下：組織中での安定性及び／若しくはクリアランス、受容体取り込み及び／若しくは動態、組成物による細胞接触、翻訳機構への関与、分泌効率（適用可能であれば）、循環への進入可能性、並びに／又は細胞の状態、機能及び／若しくは活性の調節の１つ又は複数を改善するように設計される。
【０７６４】
治療薬
治療薬
修飾核酸及び修飾ＲＮＡなどの、本発明のキメラポリヌクレオチドと、それらから翻訳された本明細書に記載のタンパク質は、治療薬又は予防薬として使用することができる。これらは、医療での使用のために提供される。例えば、本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドを対象に投与することができ、ここで、キメラポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳されて、対象において治療又は予防用ポリペプチドを産生する。ヒト及び他の哺乳動物における疾患又は病状の診断、治療若しくは予防のための組成物、方法、キット及び試薬が提供される。本発明の活性治療薬は、キメラポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドを含有する細胞、又はキメラポリヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドを含む。
【０７６５】
いくつかの実施形態では、抗体依存性細胞傷害性を誘導するタンパク質と一緒に、哺乳動物対象の免疫を増強する１種又は複数種のタンパク質をコードする翻訳可能な領域を含む１つ又は複数のキメラポリヌクレオチドを含有する併用治療薬が本明細書に提供される。例えば、トラスツズマブをコードする１つ又は複数の核酸と、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）とを含有する治療薬が本明細書に提供される。特に、こうした併用治療薬は、トラスツズマブに対し誘導された耐性を形成するＨｅｒ２＋乳癌患者において有用で
ある。（例えば、アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）著、免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、第２巻（６）、ｐ．７９５〜８、２０１０年を参照のこと）。
【０７６６】
本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドを用いて、細胞集団における組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が本明細書に提供される。こうした翻訳は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾及び組換えポリペプチドをコードする翻訳可能な領域を有する核酸を含有する有効量の組成物と接触させる。集団は、核酸が、細胞集団の１つ又は複数に局在化されるような条件下で接触させる。組換えポリペプチドは、細胞において核酸から翻訳される。
【０７６７】
組成物の「有効量」は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸（例えば、修飾ヌクレオシドのサイズ、及び範囲）の物理的特徴、並びに他の決定因子に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、細胞において効率的なタンパク質産生、好ましくは対応する非修飾核酸を含有する組成物よりも効率的な産生をもたらす。効率の増加は、細胞トランスフェクション（すなわち、核酸でトランスフェクトした細胞のパーセンテージ）の増加、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の低減（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の持続増加によって示される通りの）、又は宿主細胞の自然免疫応答の低減によって明らかにすることができる。
【０７６８】
本発明の態様は、必要とする哺乳動物対象において組換えポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳を誘導する方法に関する。この方法では、本明細書に記載する送達方法を用いて、少なくとも１つの構造的修飾又は化学修飾と、組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する組成物を有効量で対象に投与する。核酸は、核酸が、対象の細胞に局在化すると共に、組換えポリペプチドが、核酸から細胞に翻訳されるような量及びその他の条件下で実施される。核酸が局在化される細胞、又はその細胞が存在する組織は、１ラウンド又は複数ラウンドの核酸投与によってターゲティングすることができる。
【０７６９】
一部の実施形態では、投与されたキメラポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞、組織若しくは生物において実質的に存在しない機能活性を付与する１つ又は複数の組換えポリペプチドの産生を指令する。例えば、欠落している機能活性は、天然の酵素、構造、又は遺伝子調節機能であってよい。関連する実施形態では、投与されたキメラポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞に存在するが、実質的に欠失している機能活性を増大する（例えば、相乗的に）１つ又は複数の組換えポリペプチドの産生を指令する。
【０７７０】
別の実施形態では、投与されたキメラポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞において実質的に存在しないポリペプチド（若しくは複数のポリペプチド）に代わる１つ又は複数の組換えポリペプチドの産生を指令する。こうした非存在は、コード遺伝子又はその調節経路の遺伝子突然変異に起因し得る。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞内での内因性タンパク質のレベルを望ましいレベルまで増加し；このような増加は、内因性タンパク質のレベルを通常以下のレベルから通常レベルへ又は通常レベルから通常を超えるレベルに上昇させ得る。
【０７７１】
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内、細胞の表面に存在する、又は細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗する機能を果たす。通常、内因性タンパク質の活性は、例えば、改変された活性又は局在化を引き起こす内因性タンパク質の突然変異のために対象にとって有害である。さらに、組換えポリペプチドは、細胞内、細胞の表面に存在する、又は細胞から分泌される生物学的部分の活性を直接若しくは間接的に拮抗する。拮抗対象となる生物学的部分の例として、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク
質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀毒素及び破傷風毒素などのタンパク質毒素、又はボツリヌス毒素、コレラ毒素及びジフテリア毒素などの小分子毒素が挙げられる。これらに加えて、拮抗対象の生物学的部分は、細胞傷害性又は細胞増殖抑制活性などの望ましくない活性を呈示する内因性タンパク質であり得る。
【０７７２】
本明細書に記載する組換えタンパク質は、細胞内、恐らく核などの特定のコンパートメント内に局在化するように操作してもよいし、又は細胞からの分泌若しくは細胞の細胞膜への転位のために操作してもよい。
【０７７３】
一部の実施形態では、修飾ｍＲＮＡ及び本発明によるそれらのコードされたポリペプチドは、限定はしないが、以下に挙げるうちの１つ又は複数を含む様々な疾患、障害、及び／又は病状のいずれかの治療のために使用することができる：自己免疫障害（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、慢性関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染症（例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染、真菌感染、敗血症）；神経障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性などの血管新生障害）；増殖性障害（例えば、癌、良性新生物）；呼吸器障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛、関節炎）；内分泌腺、代謝、及び栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例えば、腎臓病）；精神障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液及びリンパ系障害（例えば、貧血、血友病）など。
【０７７４】
機能不全又は異常タンパク質活性を特徴とする疾患としては、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、表皮水疱症、筋萎縮性側索硬化症、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症が挙げられる。本発明は、本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドを含有する核酸又は細胞ベースの治療薬を導入することによって対象におけるこうした病状若しくは疾患を治療する方法を提供し、ここで、キメラポリヌクレオチドは、対象の細胞に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、あるいは克服するタンパク質をコードする。機能不全タンパク質の具体的な例は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス変異体であり、これが、ＣＦＴＲタンパク質の機能不全タンパク質変異体を産生して、嚢胞性線維症を引き起こす。
【０７７５】
タンパク質活性の欠落（又は実質的に減少した、例えば、適正な（正常若しくは生理的なタンパク質機能が存在しない）を特徴とする疾患は、嚢胞性線維症、ニーマンピック病Ｃ型、βサラセミア・メジャー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ハンター症候群、及び血友病が挙げられる。こうしたタンパク質は、存在しないこともあるし、又はほぼ非機能性である。本発明は、本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドを含有する核酸又は細胞ベースの治療薬を導入することによって対象におけるこうした病状若しくは疾患を治療する方法を提供し、ここで、キメラポリヌクレオチドは、対象の標的細胞から欠落しているタンパク質活性に代わるタンパク質をコードする。機能不全タンパク質の具体的な例は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のナンセンス変異体であり、これが、ＣＦＴＲタンパク質の非機能性タンパク質変異体を産生して、嚢胞性線維症を引き起こす。
【０７７６】
このように、細胞内に有効量のＣＴＦＲポリペプチドが存在するような条件下で、機能性ＣＦＴＲポリペプチドをコードする翻訳可能な領域を有するキメラポリヌクレオチドと対象の細胞を接触させることにより、哺乳動物対象の嚢胞性線維症を治療する方法が提供される。好ましい標的細胞は、肺などの上皮、内皮及び中皮細胞であり、投与方法は、標的組織を考慮して決定する：すなわち、肺送達の場合には、吸入による投与のためにＲＮ
Ａ分子を製剤化する。
【０７７７】
別の実施形態では、本発明は、対象の細胞集団に、ゲノム研究により近年特性決定されたタンパク質のソーティリン（Ｓｏｒｔｉｌｉｎ）をコードする修飾ｍＲＮＡ分子を導入し、これによって対象の高脂血症を改善することにより、対象の高脂血症を治療する方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）膜貫通タンパク質（ソーティリンと呼ばれる）をコードする。遺伝子研究から、５人の個体のうち１人は、ＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３遺伝子座に単一のヌクレオチド多型、ｒｓ１２７４０３７４を有し、これによって個体は低レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を有する傾向が高くなることが判明した。約３０％の人に存在するマイナー対立遺伝子の各コピーは、ＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬ改変するのに対し、人口の約５％に存在するマイナー対立遺伝子の２つのコピーは、ＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ減少させる。マイナー対立遺伝子の保有者は、心筋梗塞のリスクが４０％低いこともわかっている。マウスでの機能性ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、マウス肝臓組織におけるＳＯＲＴ１の過剰発現によって、８０％減という有意に低いＬＤＬコレステロールレベルが得られたこと、並びにサイレンシングＳＯＲＴ１によって、ＬＤＬコレステロールが約２００％増加したことが記載されている（ムスヌル  Ｋ（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ  Ｋ）ら著、「１ｐ１３コレステロール遺伝子座でのＳＯＲＴ１により、非コード変異体から表現型へ（Ｆｒｏｍ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ  ｔｏ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｖｉａ  ＳＯＲＴ１  ａｔ  ｔｈｅ  １ｐ１３  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｏｃｕｓ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６６巻、ｐ．７１４〜７２１）。
【０７７８】
別の実施形態では、本発明は、造血障害、心血管疾患、腫瘍、糖尿病、嚢胞性線維症、神経疾患、先天性代謝異常、皮膚及び全身性障害、及び盲を治療する方法を提供する。これらの特定の疾患を治療するための分子標的のアイデンティティーが、記載されている（テンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）編、遺伝子及び細胞療法：治療機序及び戦略（Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）、第３版、フロリダ州ボタ・ラトン（Ｂｏｔａ  Ｒａｔｏｎ）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０７７９】
本明細書には、感染症及び／又は敗血症を発症するリスクがある対象において感染症及び／又は敗血症を予防する方法が提供され、この方法は、そうした予防が必要な対象に、感染症及び／又は敗血症を予防するのに十分な量で、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌感染ポリペプチド）をコードするキメラポリヌクレオチド前駆体、又はその部分的若しくは完全にプロセシングされた形態を含む組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、感染症及び／又は敗血症を発症するリスクがある対象は、癌患者であってもよい。いくつかの実施形態では、癌患者は、前処置レジメンを受けている。一部の実施形態では、前処置レジメンは、限定はしないが、化学療法、放射線療法、又はその両方を含み得る。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、プロテインＣ、そのチモーゲン若しくはプレプロタンパク質、プロテインＣの活性化形態（ＡＰＣ）又は当技術分野において公知のプロテインＣの変異体をコードすることができる。キメラポリヌクレオチドは、化学的に修飾した後、細胞に送達してもよい。本発明のキメラ修飾ｍＲＮＡによりコードされ得るポリペプチドの非制限的例は、米国特許第７，２２６，９９９号明細書；同第７，４９８，３０５号明細書；同第６，６３０，１３８号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されているものを含む。上記の特許は、プロテインＣ様分子、変異体及び誘導体を教示しており、そのいずれも、本発明の化学修飾分子内でコードされ得る。
【０７８０】
本明細書には、対象の感染症及び／又は敗血症を治療する方法がさらに提供され、この方法は、そうした治療が必要な対象に、感染症及び／又は敗血症を治療するのに十分な量で、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌感染ポリペプチド）、例えば、本明細書に記載の抗微生物ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチド前駆体、又はその部分的若しくは完全にプロセシングされた形態を含む組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、治療が必要な対象は、癌患者である。いくつかの実施形態では、癌患者は、前処置レジメンを受けている。一部の実施形態では、前処置レジメンは、限定はしないが、化学療法、放射線療法、又はその両方を含み得る。
【０７８１】
いくつかの実施形態では、対象は、急性又は慢性微生物感染症（例えば、細菌感染症）を呈示し得る。いくつかの実施形態では、対象は、１つの療法を受けたことがあるか、又は受けていてもよい。いくつかの実施形態では、上記の療法は、限定はしないが、放射線療法、化学療法、ステロイド、紫外線照射、又はこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、患者は、微小血管障害に罹患していてもよい。一部の実施形態では、微小血管障害は、糖尿病であってもよい。いくつかの実施形態では、患者は、損傷を有し得る。一部の実施形態では、損傷は潰瘍であってもよい。特定の実施形態では、損傷は、糖尿病性足部潰瘍であってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、１つ又は複数の熱創傷を有し得る。いくつかの実施形態では、投与は、局所又は全身のいずれでもよい。いくつかの実施形態では、投与は、皮下であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、経口であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、局投与所であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、吸入によるものであってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、直腸投与であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、膣投与であってもよい。
【０７８２】
本開示の他の態様は、キメラポリヌクレオチドを含有する細胞の哺乳動物対象への移植に関する。哺乳動物対象への細胞の投与は、当業者には周知であり、限定はしないが、局所移植（例えば、局所若しくは皮下投与）、臓器送達又は全身注射（例えば、静脈内注射若しくは吸入）、並びに薬学的に許容される担体への細胞の製剤化が挙げられる。キメラポリヌクレオチドを含有するこうした組成物は、筋肉内、経動脈、腹腔内、静脈内、鼻内、皮下、内視鏡、経皮、又は髄腔内投与のために製剤化することができる。一部の実施形態では、組成物は、持続放出のために製剤化することができる。
【０７８３】
治療薬を投与することができる対象は、疾患、障害、又は有害な病状に罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある者でよい。これらに基づき、対象を識別、診断、及び分類する方法が提供され、こうした方法として、臨床診断、バイオマーカレベル、ゲノムレベルの結合試験（ＧＷＡＳ）、及び当技術分野で公知のその他の方法が挙げられる。
【０７８４】
創傷管理
本発明のキメラポリヌクレオチドは、創傷治療、例えば、治癒の遅延を呈示する創傷の治療に使用することができる。創傷の治療を管理するためにキメラポリヌクレオチドの投与を含む方法が本明細書において提供され、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０８９］〜［０００１０９２］に記載されている。
【０７８５】
抗体の産生
本発明の一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０９３］〜［０００１０９５］に記載されているものなど、抗体及びそのような抗体をコードすることができる。
【０７８６】
感染症の管理
一実施形態では、抗微生物ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを投与することにより、対象において微生物感染症（例えば、細菌感染症）及び／又は微生物若しくはウイルス感染に関連する疾患、障害、若しくは病状、又はそれらの症状を治療又は予防する方法が提供される。この投与は、抗微生物剤（例えば、抗細菌剤）、例えば、本明細書に記載する抗微生物ポリペプチド又は小分子抗微生物化合物と組み合わせて行ってもよい。抗微生物剤として、限定はしないが、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原生動物剤、抗寄生体剤、抗プリオン剤が挙げられ、さらには、本明細書に記載のポリヌクレオチドの組成物、その送達及び使用方法は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１０９６］〜［０００１１１６］に記載されている。
【０７８７】
免疫応答の調節
免疫応答の回避
本明細書に記載するように、本発明のキメラポリヌクレオチドの有用な特徴は、細胞の自然免疫応答を低下させ、忌避又は回避する能力である。一態様では、基準化合物、例えば、本発明のキメラポリヌクレオチド若しくは本発明の異なるキメラポリヌクレオチドに対応する非修飾ポリヌクレオチドによりトリガーされる応答と比較して、細胞に投与されると、宿主から低下した免疫応答をもたらす、目的のポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドが本明細書で提供される。本明細書で用いられるとき、「基準化合物」は、哺乳動物に投与されると、既知の程度、レベル若しくは量の免疫刺激を有する自然免疫応答を生じる任意の分子又は物質である。基準化合物は、核酸分子である必要はないし、本発明のキメラポリヌクレオチドである必要もない。従って、キメラポリヌクレオチドの免疫応答トリガーの回避、忌避又は不履行の測定は、そうした応答をトリガーすることがわかっている任意の化合物若しくは物質と比較して表すことができる。
【０７８８】
用語「自然免疫応答」は、一般にウイルス起源又は細菌起源の、外因性一本鎖核酸に対する細胞性応答を含み、これは、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出の誘導、並びに細胞死を伴う。本明細書で用いられるとき、自然免疫応答又はインターフェロン応答は、１細胞レベルで作動し、サイトカイン発現、サイトカイン放出、タンパク質合成の全体的阻害、細胞ＲＮＡの全体的破壊、主要組織適合性分子の上方制御、及び／又はアポトーシス細胞死の誘導、アポトーシスに関与する遺伝子の遺伝子転写の誘導、抗増殖、並びに自然及び適応免疫細胞活性化を引き起こす。Ｉ型ＩＦＮにより誘導される遺伝子のいくつかは、ＰＫＲ、ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）、ＯＡＳ（２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ）、ＲＮａｓｅＬ、及びＭｘタンパク質を含む。ＰＫＲ及びＡＤＡＲは、それぞれ翻訳開始の阻害及びＲＮＡ編集を引き起こす。ＯＡＳは、ｄｓＲＮＡ依存性シンセターゼであり、エンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅＬを活性化して、ｓｓＲＮＡを分解させる。
【０７８９】
一部の実施形態では、自然免疫応答は、Ｉ型又はＩＩ型インターフェロンを含み、Ｉ型又はＩＩ型インターフェロンの発現は、本発明のキメラポリヌクレオチドと接触させていない細胞からの基準と比較して、最大２倍しか増大されない。
【０７９０】
一部の実施形態では、自然免疫応答は、１つ又は複数のＩＦＮシグネチャー遺伝子の発現を含み、ここで、１つ又は複数のＩＦＮシグネチャー遺伝子の発現は、本発明のキメラポリヌクレオチドと接触させていない細胞からの標準と比較して、最大３倍しか増大されない。
【０７９１】
特定の状況では、細胞の自然免疫応答を排除するが有利となる場合もあるが、本発明は、インターフェロンシグナル伝達を含む免疫応答を完全には排除することなく、こうした応答を実質的に低下させる（実質的に減少させる）キメラポリヌクレオチドを提供する。
【０７９２】
一部の実施形態では、免疫応答は、基準化合物により誘導される免疫応答と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、又は９９．９％超低下する。免疫応答自体は、１型インターフェロンの発現若しくは活性レベル又はインターフェロンが調節する遺伝子、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）などの発現により測定することができる。自然免疫応答の低下はまた、細胞集団に１回又は複数回投与した後の細胞死減少のレベルによって測定することもでき；例えば、細胞死は、基準化合物で観察される細胞死頻度と比べて、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超少ない。さらに、細胞死が影響を及ぼし得るのは、キメラポリヌクレオチドと接触させた細胞の５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％又は０．０１％未満である。
【０７９３】
別の実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、同じ配列を有するキメラポリヌクレオチド又は基準化合物よりも有意に低免疫原性である。本明細書で用いられるとき、「有意に低免疫原性である」とは、免疫原性の検出可能な減少を指す。別の実施形態では、この用語は、免疫原性の倍率減少を指す。別の実施形態では、この用語は、検出可能な免疫応答をトリガーすることなく、有効量のキメラポリヌクレオチドを投与することができるような減少を指す。別の実施形態では、この用語は、組換えタンパク質の発現を検出可能に低減するのに十分な免疫応答を誘発することなく、キメラポリヌクレオチドを繰り返し投与することを可能にするような減少を指す。別の実施形態では、この減少は、組換えタンパク質の検出可能な発現を排除するほどの免疫応答を誘発することなく、キメラポリヌクレオチドを繰り返し投与することを可能にするような減少である。
【０７９４】
別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、その非修飾対応物又は標準化合物に比して２倍低免疫原性である。別の実施形態では、免疫原性は、３倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、５倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、７倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１０倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１５倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、５０倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、２００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、５００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、１０００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、２０００倍減少する。別の実施形態では、免疫原性は、別の倍率で減少する。
【０７９５】
免疫原性を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α若しくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、又はＩＬ−８）の分泌の測定、ＤＣ活性化マーカ（例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現の測定、又は適応免疫応答のアジュバントとして作用する能力の測定などがある。
【０７９６】
本明細書に教示する修飾の組み合わせを含む本発明のキメラポリヌクレオチドは、これらを治療法としてさらに好適にする優れた特性を有し得る。
当技術分野における「全か無（ａｌｌ  ｏｒ  ｎｏｎｅ）」のモデルは、修飾ｍＲＮＡの治療有用性に関連する生物学的現象を説明する上で非常に不十分であることが判明している。本発明者らは、タンパク質産生を改善するために、修飾、又は修飾の組み合わせの性質、修飾率（％）を考慮して、２つ以上のサイトカイン若しくは測定基準を調べることにより、特定の修飾ｍＲＮＡの効力及びリスクプロフィールを決定し得ると結論付けた。
【０７９７】
本発明の一態様では、非修飾と比較した修飾ｍＲＮＡの効果を決定する方法は、本発明の外性核酸の投与により発現がトリガーされる１つ又は複数のサイトカインの測定及び分析を含む。これらの値を非修飾核酸又は標準的測定基準、例えば、サイトカイン応答、ＰｏｌｙＩＣ、Ｒ−８４８若しくは当技術分野で公知の他の標準と比較する。
【０７９８】
本発明で開発される標準的測定基準の一例は、細胞、組織若しくは生物に産生されたコードされたポリペプチド（タンパク質）のレベル若しくは量と、修飾核酸の投与若しくは接触によって細胞、組織若しくは生物での発現がトリガーされたサイトカインの１つ又は複数（若しくは集団）のレベル若しくは量の比を測定することである。こうした比は、タンパク質：サイトカイン比又は「ＰＣ」比と呼ぶ。ＰＣ比が高いほど、修飾核酸（測定したタンパク質をコードするポリヌクレオチド）は有効である。本発明の好ましいＰＣ比（サイトカインによる）は、１超、１０超、１００超、１０００超、１０，０００超であってよい。異なる又は非修飾構築物の修飾核酸よりも高いＰＣ比を有する修飾核酸が好ましい。
【０７９９】
ＰＣ比は、ポリヌクレオチドに存在する修飾の割合（％）によってさらに定量することができる。例えば、１００％修飾核酸に正規化して、サイトカイン（若しくはリスク）又はサイトカインプロフィールの関数としてのタンパク質産生を決定することができる。
【０８００】
一実施形態では、本発明は、修飾核酸（キメラポリヌクレオチド）のＰＣ比を比較することにより、化学、サイトカイン又は修飾率に関して、いずれか特定の修飾ｃｉｒｃＲＮＡの相対効力を決定する方法を提供する。
【０８０１】
様々なレベルの核酸塩基置換を含むキメラポリヌクレオチドを生成することができ、これらは、高いタンパク質産生と低い免疫刺激能力を維持している。天然に存在するヌクレオチド対応物に対する任意の修飾ヌクレオチドの相対的割合（％）は、ＩＶＴ反応中に変動し得る（例えば、シチジンに対して１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％の５メチルシチジン使用頻度；ウリジンに対して１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％のプソイドウリジン若しくはＮ１−メチル−プソイドウリジン使用頻度）。同じ塩基に対して２つ以上の別のヌクレオチドを用いる異なる比（例えば、異なる比のプソイドウリジンとＮ１−メチル−プソイドウリジン）を使用するキメラポリヌクレオチドを作製することもできる。５メチルシチジン／シチジン及びプソイドウリジン／Ｎ１−メチル−プソイドウリジン／ウリジンの比など、２以上の「塩基」位置での混合比を用いてキメラポリヌクレオチドを作製することもできる。改変された比の修飾ヌクレオチドを有する修飾ｍＲＮＡの使用は、化学修飾ヌクレオチドに対する曝露の可能性を低減する上で有益となり得る。最後に、キメラポリヌクレオチドへの修飾ヌクレオチドの位置的導入も可能であり、これは、タンパク質産生若しくは免疫刺激能力のいずれか又はその両方を調節する。こうしたキメラポリヌクレオチドが、これらの改善された特性を示す能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することができ（本明細書に記載するＰＢＭＣアッセイなどのアッセイを用いて）、また、キメラポリヌクレオチドにコードされたタンパク質産生及び自然免疫認識のメディエータ（サイトカインなど）双方の測定によってもｉｎ  ｖｉｖｏで評価することもできる。
【０８０２】
別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドと、その線状対応物の相対免疫原性は、所与の量の非修飾ヌクレオチド又は基準化合物と同じ程度まで前述の応答の１つを誘発するのに必要なキメラポリヌクレオチドの量を測定することにより、決定することができる。例えば、同じ応答を誘発するのに２倍のキメラポリヌクレオチドが必要であれば、キメラポリヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチド又は基準化合物より２倍低免疫原性である。
【０８０３】
別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドと、その線状対応物の相対免疫原性は、同じ量の非修飾ヌクレオチド又は基準化合物と比較して、キメラポリヌクレオチドの投与に応答して分泌されたサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α若しくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、又はＩＬ−８）の量を測定することにより、決定される。例えば、半分の量のサイトカインが分泌されれば、キメラポリヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチド又は標準化合物より２倍低免疫原性である。別の実施形態では、前述の方法で免疫原性を計算する前に、刺激のバックグラウンドレベルを差し引く。
【０８０４】
本明細書には、さらに、細胞又は細胞集団における免疫応答のタイトレーション、低減又は排除を実施する方法も提供される。一部の実施形態では、様々な用量の同じキメラポリヌクレオチドと細胞を接触させた後、用量応答を評価する。一部の実施形態では、同じ若しくは異なる用量のいくつかの様々なキメラポリヌクレオチドと細胞を接触させて、所望の効果を生み出す最適濃度を決定する。免疫応答に関しては、所望の効果は、細胞の免疫応答を回避、忌避又は低減することであってよい。所望の効果はまた、タンパク質産生の効率を改変することであってもよい。
【０８０５】
国際公開第２０１３００３４７５号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法を用いて免疫応答を低減するために、本発明のキメラポリヌクレオチドを使用することができる。
【０８０６】
免疫応答の活性化：ワクチン
本発明によれば、本明細書に開示するキメラポリヌクレオチドは、１種又は複数種のワクチンをコードすることができる。本明細書で用いられるとき、「ワクチン」は、特定の疾患又は感染因子に対する免疫を改善する生物製剤である。ワクチンは、対象の組織又は細胞中に抗原を導入して、免疫応答を誘発することにより、特定の疾患又は病原体感染から対象を保護する。本発明のキメラポリヌクレオチドは、抗原をコードすることができ、キメラポリヌクレオチドが細胞に発現されたら、所望の免疫応答が達成される。
【０８０７】
ＲＮＡをワクチンとして使用することにより、安全、実現可能性、適応可能性、及び免疫応答を生じる有効性に関して、細胞へのＤＮＡの組み込みを含む従来の遺伝子ワクチン接種の問題が解決される。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡがより容易に分解されることから、ＤＮＡワクチンより有意に安全であると考えられる。ＲＮＡ分子は、生物から迅速に排除されるため、ゲノムに組み込まれて、細胞の遺伝子発現に制御不能な様式で影響を及ぼすことはできない。また、ＲＮＡワクチンは、自己免疫疾患又は抗ＤＮＡ抗体の発生などの重度の副作用を引き起こし難い（ブリングマン  Ａ．（Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ａ．）ら著、生物医学及びバイオテクノロジー学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ
ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第２０１０巻、論文ＩＤ６２３６８７）。ＲＮＡでのトランスフェクションは、細胞の細胞質に挿入するだけでよく、これは、核への挿入よりも達成するのが容易である。しかし、ＲＮＡは、細胞の細胞質においてＲＮａｓｅ分解及びその他の自然の分解を被りやすい。ＲＮＡワクチンの安定性及び貯蔵寿命を増加するための様々な試み。フォン・デア・ムルベ（Ｖｏｎ  Ｄｅｒ  Ｍｕｌｂｅ）らは、ｍＲＮＡ分子のＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を増加することにより、ｍＲＮＡワクチン組成物の安定性を改善することを開示している。フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）らの米国特許第５５８０８５９号明細書は、ｍＲＮＡに結合して、その安定性を調節する調節タンパク質をコードするポリヌクレオチドの組み込みを教示している。特定の理論に拘束されることを意図しないが、本発明のキメラポリヌクレオチドワクチンは、少なくとも部分的に、構築物設計の特異性、純度及び選択性によって、安定性及び治療効果の改善を達成する。
【０８０８】
さらに、特定の修飾ヌクレオチド、若しくはその組み合わせは、本発明のキメラポリヌクレオチドに導入されると、自然免疫応答を活性化する。こうした活性化分子は、ポリペプチド及び／又は他のワクチンと組み合わせたとき、アジュバントとして有用である。いくつかの実施形態では、活性化分子は、ワクチンとして有用なポリペプチド配列をコードする翻訳可能な領域を含有するため、自己アジュバントとなる能力を付与する。
【０８０９】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、抗原又は感染因子に起因する疾患及び身体的障害の予防、治療及び診断に使用することができる。本発明のキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つの目的のポリペプチド（例えば、抗体又は抗原）をコードすることができるため、これを個体に供給することにより、免疫系を刺激して病因物質から防御することができる。非制限的例として、抗原又は感染因子に結合してこれらを中和する能力を有する１つ又は複数のキメラポリヌクレオチドを供給することにより、抗原又は感染因子からの生物活性及び／若しくは作用を阻害並びに／又は無効化することができる。
【０８１０】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、免疫原をコードすることができる。免疫原をコードするキメラポリヌクレオチドの送達により、免疫応答を活性化することができる。非制限的例として、免疫原をコードするキメラポリヌクレオチドを細胞に送達して、複数の自然免疫応答経路をトリガーすることができる（国際公開第２０１２００６３７７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０１７７６３９号明細書を参照のこと；これらは、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の非制限的例として、本発明の免疫原をコードするキメラポリヌクレオチドは、脊椎動物に対して免疫原性となるのに十分な用量で脊椎動物に送達することができる（国際公開第２０１２００６３７２号パンフレット及び同第２０１２００６３６９号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１３０１４９３７５号明細書及び同第２０１３０１７７６４０号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。キメラポリヌクレオチドワクチンで治療することができる感染症の非制限的リストは、以下のものを含む：ウイルス感染症、例えば、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ、Ｂ若しくはＣ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹（水痘）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱、デング熱など（フラビ（ｆｌａｖｉ）ウイルス、インフルエンザ（インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス）、出血性感染症（マールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）若しくはエボラ（Ｅｂｏｌａ）ウイルス）、細菌感染症、例えば、レジオネラ症（レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ））、胃潰瘍（ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ））、コレラ（ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染症、ブドウ球菌感染症、サルモネラ菌感染症若しくはレンサ球菌感染症、破傷風（破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、又は原生動物感染症（マラリア、睡眠病、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、すなわち、マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）及びトキソプラズマ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）を原因とする感染症）。
【０８１１】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、腫瘍抗原をコードして、癌を治療することができる。腫瘍抗原の非制限的リストは、以下に挙げるものを含む：７０７−ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、．β．−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ．α．、ＰＲＡＭＥ、ＰＳ
Ａ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１又はＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１又はＳＡＲＴ−３、ＴＥＵＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２及びＷＴ１。
【０８１２】
本発明のキメラポリヌクレオチドは、ワクチンのポリペプチド配列をコードすることができ、さらに阻害剤を含んでもよい。阻害剤は、抗原提示を低減し、及び／又は当技術分野で既知の様々な経路を阻害することができる。非制限的例として、本発明のキメラポリヌクレオチドは、抗原提示を低減することができる阻害剤と組み合わせてワクチンに使用することができる（国際公開第２０１２０８９２２５号パンフレット及び同第２０１２０８９３３８号パンフレットを参照のこと；これの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８１３】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、自己複製ＲＮＡであってもよい。自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ送達の効率及び封入された遺伝子産物の発現を増強することができる。一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知の少なくとも１つの修飾を含んでもよい。一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡが、感染性ウイルス粒子の産生を誘導しないように設計することができる。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１１０３００２０５号明細書並びに国際公開第２０１１００５７９９号パンフレット及び同第２０１３０５５９０５号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により設計してもよい。
【０８１４】
一実施形態では、本発明の自己複製キメラポリヌクレオチドは、免疫応答を増大し得るタンパク質をコードすることができる。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つの抗原をコードすることができる自己複製ＲＮＡであってよい（米国特許出願公開第２０１１０３００２０５号明細書、同第２０１３０１７１２４１号明細書、同２０１３０１７７６４０号明細書及び同第２０１３０１７７６３９号明細書並びに国際公開第２０１１００５７９９号パンフレット、同第２０１２００６３７２号パンフレット、同第２０１２００６３７７号パンフレット、同第２０１３００６８３８号パンフレット、同第２０１３００６８４２号パンフレット、同第２０１２００６３６９号パンフレット及び同第２０１３０５５９０５号パンフレットを参照のこと；これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。一態様では、自己複製ＲＮＡは、大型哺乳動物において免疫応答を増大するのに十分な量で、哺乳動物に投与することができる（例えば、国際公開第２０１２００６３６９号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８１５】
一実施形態では、本発明の自己複製キメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法、又は当技術分野で公知の方法を用いて、製剤化することができる。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、ギール（Ｇｅａｌｌ）ら（自己増幅ＲＮＡワクチンの非ウイルス送達（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）、ＰＮＡＳ、２０１２年；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている方法による送達のために製剤化することができる。
【０８１６】
別の非制限的例では、本発明のキメラポリヌクレオチド（例えば、自己複製ＲＮＡなどの免疫原をコードする核酸分子）は、ペグ化リポソーム中に実質的にカプセル化してもよい（国際公開第２０１３０３３５６３号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。また別の非制限的例では、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１３０５５９０５号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに製剤化してもよい。１つの非制限的例では、自己複製ＲＮＡ
は、国際公開第２０１２００６３５９号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０１８３３５５号明細書（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、生分解性ポリマーを用いて製剤化することもできる。
【０８１７】
一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ビリオン様粒子中に製剤化してもよい。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１２００６３７６号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、ビリオン様粒子中に製剤化される。
【０８１８】
別の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、リポソーム中に製剤化してもよい。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１２００６７３７８号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、リポソーム中に製剤化される。一態様では、リポソームは、限定はしないが、キメラポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの送達に有利となり得るｐＫａ値を有する脂質を含んでもよい。別の態様では、リポソームは、生理学的ｐＨでほぼ中性の表面電荷を有し得ることから、免疫に有効となり得る（例えば、国際公開第２０１２００６７３７８号パンフレットに記載のリポソームを参照のこと；この文献は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８１９】
また別の実施形態では、自己複製ＲＮＡは、カチオン性水中油形エマルションに製剤化してもよい。非制限的例として、自己複製ＲＮＡは、国際公開第２０１２００６３８０号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに、カチオン性水中油形エマルションに製剤化される。本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ（例えば、キメラポリヌクレオチド）と一緒に使用することができるカチオン性水中油形エマルションは、国際公開第２０１２００６３８０号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法により製造することができる。
【０８２０】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、両親媒性及び／又は免疫原性両親媒性ペプチドをコードすることができる。
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドの製剤は、両親媒性及び／又は免疫原性両親媒性ペプチドをさらに含んでもよい。非制限的例として、両親媒性及び／又は免疫原性両親媒性ペプチドを含むキメラポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１１０２５０２３７号明細書並びに国際公開第２０１０００９２７７号パンフレット及び同第２０１０００９０６５号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載される通りに製剤化することができる。
【０８２１】
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチドは、免疫刺激性であってもよい。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、プラス−センス鎖又はマイナス−センス鎖ＲＮＡウイルスゲノムの全部若しくは一部をコードすることができる（国際公開第２０１２０９２５６９号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０１７７７０１号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の非制限的例では、本発明の免疫刺激性キメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載の及び／又は当技術分野で公知の投与用賦形剤と一緒に製剤化することができる（国際公開第２０１２０６８２９５号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０２１３８１２号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。キメラポリヌクレオチドはさらに、免疫応答を促進するサイトカイン、例えば、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン若しくはケモカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６，ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＬＴ−α）、又はｈＧＨなどの増殖因子を含んでもよい。
【０８２２】
一実施形態では、本明細書に記載の方法により製剤化されるワクチンの応答は、治療効果を誘導する様々な化合物の添加により増強することができる。非制限的例として、ワクチン製剤は、ＭＨＣＩＩ結合ペプチド又はＭＨＣＩＩ結合ペプチドと類似の配列を有するペプチドを含んでもよい（国際公開第２０１２０２７３６５号パンフレット、同第２０１１０３１２９８号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１２００７０４９３号明細書、同第２０１１０１１０９６５号明細書を参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。別の例として、ワクチン製剤は、対象におけるニコチン残基に対する抗体応答を生み出し得る修飾ニコチン化合物を含んでもよい（国際公開第２０１２０６１７１７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０１１４６７７号パンフレットを参照のこと；これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８２３】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つの抗体又はその断片若しくは部分をコードすることができる。抗体は、多種多様な感染因子を阻害し、それらから防御することができる広域中和抗体であってよい。非制限的例として、感染症から対象を防御する、及び／又は疾患を治療するために、少なくとも１つの抗体又はその断片若しくは部分をコードするキメラポリヌクレオチドが提供される。別の非制限的例として、感染症から対象を防御する、及び／又は疾患を治療するために、広範囲の感染因子を中和することができる２種以上の抗体又はその断片若しくは部分をコードするキメラポリヌクレオチドが提供される。
【０８２４】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、抗体重鎖又は抗体軽鎖をコードすることができる。抗体重鎖又は抗体軽鎖をコードすることができるキメラポリヌクレオチドの最適な割合を評価することにより、最大量の機能性抗体及び／又は所望の応答を生み出す割合を決定することができる。キメラポリヌクレオチドはまた、抗体の単一ｓｃＦｖ鎖もコードすることができる。
【０８２５】
本発明によれば、１つ又は複数の広域中和抗体をコードするキメラポリヌクレオチドは、感染ウイルスへの曝露の前に対象に投与してもよい。
一実施形態では、細胞、組織又は対象に供給される有効量のキメラポリヌクレオチドは、免疫予防に十分な量であってよい。
【０８２６】
一部の実施形態では、癌細胞特異的タンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドを癌ワクチンとして製剤化することができる。非制限的例として、少なくとも１つの本発明のキメラポリヌクレオチドを含む癌ワクチンは、癌を予防するために予防的に用いることができる。ワクチンは、アジュバント及び／又は防腐剤を含んでもよい。非制限的例として、アジュバントは、スクアレンであってもよい。別の非制限的例として、防腐剤はチメロザールであってもよい。
【０８２７】
一実施形態では、本発明は、１種又は複数種の抗体、及び／又は他の抗感染試薬をコードするキメラポリヌクレオチドを含有する免疫原性組成物を提供する。これらの免疫原性組成物は、アジュバント及び／又は防腐剤を含んでもよい。非制限的例として、抗体は、広域中和抗体であってもよい。
【０８２８】
別の実施形態では、本発明は、１種又は複数種の抗体、及び／又は他の抗感染試薬をコードするキメラポリヌクレオチドを含有する抗体治療薬を提供する。
一実施形態では、本発明のキメラポリヌクレオチド組成物は、他の予防又は治療化合物と一緒に投与することができる。非制限的例として、予防又は治療化合物は、アジュバント又はブースタであってもよい。ワクチンなどの予防組成物に関して、本明細書で用いられるとき、用語「ブースタ」は、組成物の追加投与を指す。ブースタ（又はブースタワク
チン）は、これより早期の予防組成物の投与後に投与することができる。予防組成物の最初の投与からブースタ投与までの時間は、限定はしないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１年、１８ヵ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、又は９９年超であってよい。
【０８２９】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、生ワクチンの投与と同様に鼻内に投与してもよい。別の態様では、キメラポリヌクレオチドは、当技術分野では公知の不活性化ワクチンの投与と同様に筋肉内又は皮内に投与してもよい。
【０８３０】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドを用いて、既知若しくは未知の新興の脅威又は操作による脅威の伝染から防御する及び／又は保護することができる。
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法により製剤化することができる。製剤は、２種以上の抗体又はワクチン用のキメラポリヌクレオチドを含んでもよい。一態様では、製剤は、２種以上の疾患、障害若しくは病状に対して治療及び／又は予防効果を有し得るキメラポリヌクレオチドを含んでもよい。非制限的例として、製剤は、抗原、抗体又はウイルスタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０８３１】
さらに、本発明の組成物は、様々な分野、例えば、限定はしないが、細胞内及び細胞外タンパク質、タンパク質相互作用、シグナル経路及び細胞生物学などでの研究に用いることができる。
【０８３２】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、ワクチン、例えば、限定はしないが、国際公開第２０１３０９３６２９号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載のモジュラーワクチンに使用することができる。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つ細胞内局在性エレメント及び少なくとも１つのＣＤヘルパーエレメントをコードする。一態様では、細胞内局在性エレメントは、細胞質ゾルからの抗原の輸出をもたらすタンパク質配列のシグナルペプチドであってもよい。別の態様では、ＣＤ４ヘルパーエレメントは、限定はしないが、Ｐ３０、ＮＥＦ、Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、ＰｆＴ３、Ｐ２ＴＴ、ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、ＨＢｓＡｇ及びＭＴであってよい（国際公開第２０１３０９３６２９号パンフレットを参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８３３】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、ＲＳＶ感染の予防若しくは治療又はＲＳＶ感染のリスクの軽減に使用することができる。バイシュナウ（Ｖａｉｓｈｎａｗ）らは、米国特許出願公開第２０１３１０６５４９９号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、ＲＳＶ感染を治療及び／又は予防するために、ｓｉＲＮＡを含む組成物の使用を記載している。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、ＲＳＶの予防及び／又は治療を目的とする鼻内投与のために製剤化することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１３０１６５４９９号明細書を参照のこと；その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）。
【０８３４】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、インフルエンザウイルスの感染、例えば、限定はしないが、病原性の高いトリインフルエンザウイルス（限定はしないが、Ｈ５Ｎ１サブタイプなど）感染、及びヒトインフルエンザウイルス（限定はしないが、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ３Ｎ２サブタイプなど）感染のリスクを軽減するか、又はその感染を阻害するために使用することができる。米国特許第８４７０７７１号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるタンパク質配列のいずれかをコードし得る本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドは、インフルエンザ感染症の治療又はそのリスクの軽減に用いることができる。
【０８３５】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、寄生体に対するワクチンとして、又は寄生体により産生されるタンパク質に対する免疫応答を調節するために用いることができる。バーグマン−ライトナー（Ｂｅｒｇｍａｎｎ−Ｌｅｉｔｎｅｒ）らは、米国特許第８４７０５６０号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、マラリア原虫のスポロゾイト表面タンパク質（ＣＳＰ）に対するＤＮＡワクチンを記載している。非制限的例として、キメラポリヌクレオチドは、Ｃ３ｄのＣＲ２結合モチーフをコードすることができ、マラリア原虫のＣＳＰに対して免疫系を調節するためのワクチン又は治療薬として用いることができる。
【０８３６】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、例えば、限定はしないが、国際公開第２０１３１１２７７８号パンフレット及び同第２０１３１１２７８０号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるものなど、アルキン修飾生体分子で標識することができるウイルスを産生するために使用することができる。標識ウイルスは、ウイルスの感染力を増大させることができるため、ワクチンの製造に有益となり得る。標識ウイルスは、国際公開第２０１３１１２７７８号パンフレット及び同第２０１３１１２７８０号パンフレット（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されるものを含む様々な方法によって生産することができる。
【０８３７】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、ワクチンとして使用することができ、これはさらに、ワクチンがより高い免疫応答を誘発するのを可能にし得るアジュバントを含んでもよい。非制限的例として、アジュバントは、ヒト小児集団においてより高い免疫応答を誘発することができるサブミクロン水中油形エマルションであってよい（例えば、全体として参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２０１２００２７８１３号明細書及び米国特許第８５０６９６６号明細書に記載のアジュバント添加ワクチンを参照されたい）。
【０８３８】
別の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、ワクチンとして使用することができ、これはさらに、ワクチンの安定性を改善すると共に、その発現を高める５’キャップ類似体を含んでもよい。５’キャップ類似体の非制限的例は、米国特許出願公開第２０１２０１９５９１７号明細書に記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０８３９】
天然に存在する突然変異体
別の実施形態では、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１１７４］〜［０００１１７５］に記載される通りに、キメラポリヌクレオチドを使用して、増大した生物活性、改善された患者の転帰、又は防御機能など、改善された疾患改変活性を有する天然に存在するタンパク質の変異体を発現することができる。
【０８４０】
病原生物又は疾患細胞のターゲティング
本明細書には、細胞分裂抑制若しくは細胞傷害性ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを用いて、例えば、細菌、酵母、原生動物、蠕虫などの病原微生物、又は癌細胞などの疾患細胞をターゲティングする方法が提供される。好ましくは、導入されるｍＲＮＡは、修飾ヌクレオシド又は他の核酸配列修飾を含有し、これらは、標的病原生物において排他的又は優先的に翻訳されて、治療薬の起こり得るオフターゲット効果を低減する。こうした方法は、血液、精液、卵などの生体材料、並びに肺、組織、及び臓器などの移植材料に見出される病原生物を除去する、又は疾患細胞を殺傷する上で有用である。
【０８４１】
バイオプロセシング
本明細書に提供する方法は、同時係属国際公開第２０１５０３８８９２号パンフレット（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）において、例えば、限定はしないが、パラグラフ［０００１１７６］〜［０００１１８７］に記載される通りに、細胞培養プロセスでのタンパク質産物収率を高める上で有用となり得る。
【０８４２】
細胞
一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物、微生物、藻類及び真菌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、例えば、限定はしないが、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター又はウシ細胞などの哺乳動物細胞である。別の実施形態では、細胞は、限定はしないが、ヒーラ（ＨｅＬａ）、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＫＥＫ２９３Ｔ、ベロ（Ｖｅｒｏ）、Ｃａｃｏ、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｋ５６２、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＫ、ＣＨＯ−Ｓ、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ−１、Ｈｕｈ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ−９０、ＭＣＦ−７、Ｕ−２０Ｓ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＳＦ９、ＳＦ２１又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など、樹立細胞株に由来するものでもよい。
【０８４３】
特定の実施形態では、細胞は、例えば、限定はしないが、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）細胞、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、ジクチオステリウム属（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）細胞、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）細胞、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）細胞などの真菌細胞である。
【０８４４】
特定の実施形態では、細胞は、例えば、限定はしないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はＢＬ２１細胞などの細菌細胞である。本発明の方法によりトランスフェクトされる一次及び二次細胞は、様々な組織から得ることができ、限定はしないが、培地中に維持することができるあらゆる細胞型を含む。例えば、本発明の方法によりトランスフェクトすることができる一次及び二次細胞として、限定はしないが、線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞（例えば、哺乳動物上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞及びこれらの体細胞型の前駆体が挙げられる。一次細胞はまた、同じ種又は別の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、鳥類、ヒツジ、ヤギ、ウマ）のドナーから取得することもできる。
【０８４５】
精製及び単離
当業者であれば、培養細胞から目的のタンパク質を精製又は単離するのに使用する方法を決定することができる。一般に、これは、親和性結合又は非親和性結合を用いた捕捉方法によって実施される。目的のタンパク質が培養細胞によって分泌されない場合には、精
製又は単離の前に、培養細胞の溶解を実施すべきである。細胞培養基成分、並びに本明細書に記載する消泡剤及びその他の栄養素及び補充物などの細胞培養添加剤、細胞、細胞残屑、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルスなどと一緒に、目的のタンパク質を含有する非清澄化細胞培養液を使用することができる。このプロセスは、バイオリアクター自体において実施してもよい。培養液は、ｐＨ、温度若しくはその他の刺激特性などの所望の刺激に対して前処置するか、又はポリマーの添加の際に順化させてもよく、あるいは、培養液にポリマーを溶解させるのに必要な刺激条件について要求されるパラメータに対して適正に順化させた担体液体に、ポリマーを添加することができる。培養液と一緒にポリマーを完全に循環させた後、刺激（ｐＨ、温度、塩濃度などの変化）を加えてから、所望のタンパク質及びポリマー沈殿物を溶液から取り出すことができる。ポリマー及び所望のタンパク質を残りの培養液から分離した後、任意選択で１回又は複数回洗浄することにより、捕捉された混入物、又は緩く結合した混入物を除去することができる。次に、例えば、溶離などによって、所望のタンパク質をポリマーから回収することができる。溶離は、ポリマーが、その沈殿した形態を保持すると共に、所望のタンパク質の選択された溶離の工程中にその不純物を全て保持するような一連の条件下で実施するのが好ましい。ポリマー及びタンパク質並びにいずれかの不純物は、水又は緩衝溶液などの新しい液体に溶解させてもよく、ポリマー又は不純物に対してタンパク質への優先及び選択性を有するアフィニティ、イオン交換、疎水性、又は他のタイプのクロマトグラフィーなどの手段によりポリマーを回収することができる。溶離されたタンパク質を回収した後、必要に応じて、バッチ様ステップ又は連続フロースルーステップいずれかの追加処理ステップに付してもよい。
【０８４６】
別の実施形態では、細胞株又は候補細胞株の集団における特定のポリペプチド、特に、既知の活性を有する標準タンパク質のタンパク質変異体などのポリペプチドの発現を最適化するのが有用となり得る。一実施形態では、複数の標的細胞型を用意し、複数の標的細胞型の各々と、ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを独立に接触させることにより、標的細胞において目的のポリペプチドの発現を最適化する方法が提供される。さらに、タンパク質産生効率を高めるために、培養条件を改変してもよい。続いて、複数の標的細胞型中の目的のポリペプチドの存在及び／又はレベルを検出及び／又は定量することによって、効率的な標的細胞及びそれに関する細胞培養条件の選択により、目的とするポリペプチドの発現の最適化を可能にする。こうした方法は、目的のポリペプチドが、１つ又は複数の翻訳後修飾を含むか、又は実質的な三次構造（往々にして効率的なタンパク質産生を困難にする）を有する場合に有用となり得る。
【０８４７】
タンパク質回収
目的のタンパク質は、好ましくは分泌ポリペプチドとして培地から回収するか、又は分泌シグナルなしで発現される場合には、宿主細胞溶解物から回収することができる。目的のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られるように、他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質から目的のタンパク質を精製することが必要な場合もある。培地又は溶解物から細胞及び／若しくは粒状細胞残屑を除去してもよい。次に、例えば、免疫アフィニティ若しくはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＬＰＣ）、セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）（登録商標）クロマトグラフィー、シリカ若しくはカチオン交換樹脂（ＤＥＡＥなど）でのクロマトグラフィーによって、混入物の可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から目的の産物を精製することができる。宿主細胞により発現された異種タンパク質を精製する方法は、当技術分野において公知である。
【０８４８】
本明細書に記載する方法及び組成物を用いて、内因性アゴニスト生体応答を減弱又は阻止する、及び／又は哺乳動物対象における受容体若しくはシグナル伝達分子に拮抗することができるタンパク質を生産することができる。例えば、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−２３受容体シグナル伝達は、例えば、多発性硬化症などの慢性自己免疫障害並びに慢性関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、強直性脊椎炎及びクローン病などの炎症性疾患にお
いて増強され得る（キクリー  Ｋ（Ｋｉｋｌｙ  Ｋ）、リュウ  Ｌ（Ｌｉｕ  Ｌ）、ナ  Ｓ（Ｎａ  Ｓ）、セジウィック  ＪＤ（Ｓｅｄｇｗｉｃｈ  ＪＤ）著、２００６年、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１８巻（６）、ｐ．６７０〜５）。別の実施形態では、核酸は、ケモカイン受容体のアンタゴニストをコードする。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４及びＣＣＲ−５は、宿主細胞へのＨＩＶ侵入に必要である（アレンザナ−セイスデドス  Ｆ（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｄｅｄｏｓ  Ｆ）ら著、１９９６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１０月３日、第３８３巻（６５９９）、ｐ．４００）。
【０８４９】
遺伝子サイレンシング
本明細書に記載するキメラポリヌクレオチドは、細胞集団における１つ又は複数の標的遺伝子の発現をサイレンシングする（すなわち、阻止又は実質的に低減する）上で有用である。配列特異的ヒストンＨ３メチル化を指令することができる目的のポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドは、ポリペプチドが翻訳されるような条件下で集団中の細胞に導入されると、ヒストンＨ３メチル化及び続くヘテロクロマチン形成によって標的遺伝子の遺伝子転写を低減する。一部の実施形態では、サイレンシング機構は、哺乳動物対象に存在する細胞集団に対して実施する。非制限的例として、有用な標的遺伝子は、突然変異したヤヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ  Ｋｉｎａｓｅ）２ファミリーメンバーであり、この場合、哺乳動物対象は、突然変異標的遺伝子を発現すると、異常なキナーゼ活性によって骨髄増殖性疾患に罹患する。
【０８５０】
キメラポリヌクレオチドとＲＮＡｉ薬剤の共投与もまた本明細書に提供される。
生物学的経路の調節
細胞に導入されたキメラポリヌクレオチドの急速な翻訳は、標的生物学的経路を調節する望ましい機構をもたらす。こうした方法調節は、所与の経路の拮抗作用及び活性化作用を含む。一実施形態では、キメラポリヌクレオチドが細胞中に局在化され、ポリペプチドが、細胞においてキメラポリヌクレオチドから翻訳され得るような条件下で、目的のポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを含む有効量の組成物と、細胞を接触させることにより、細胞における生物学的経路に拮抗する方法が提供され、ここで、ポリペプチドは、生物学的経路で機能性のポリペプチドの活性を阻害する。生物学的経路の例として、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、強直性脊椎炎、若しくはクローン病などの自己免疫障害又は炎症性障害において欠損するものがあり；とりわけ、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３シグナル伝達経路の拮抗作用は、特に有用である。（キクリー  Ｋ（Ｋｉｋｌｙ  Ｋ）、リュウ  Ｌ（Ｌｉｕ  Ｌ）、ナ  Ｓ（Ｎａ  Ｓ）、セジウィック  ＪＤ（Ｓｅｄｇｗｉｃｈ  ＪＤ）著、２００６年、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１８巻（６）、ｐ．６７０〜５を参照のこと）。
【０８５１】
さらに、ケモカイン受容体に対するアンタゴニストをコードするキメラポリヌクレオチドが提供され；ケモカイン受容体ＣＸＣＲ−４及びＣＣＲ−５は、例えば、宿主細胞へのＨＩＶ侵入に必要である。（アレンザナ−セイスデドス  Ｆ（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｄｅｄｏｓ  Ｆ）ら著、１９９６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１０月３日、第３８３巻（６５９９）、ｐ．４００）。
【０８５２】
あるいは、核酸が細胞中に局在化され、組換えポリペプチドが、組換えポリペプチドが細胞において核酸から翻訳され得ると共に、組換えポリペプチドが、生物学的経路において機能性のポリペプチドの活性を誘導するような条件下で、組換えポリペプチドをコードする有効量のキメラポリヌクレオチドと、細胞を接触させることにより、細胞における生物学的経路を活性化する方法が提供される。活性化される生物学的経路の例として、細胞運命決定を調節する経路がある。こうした活性化は、可逆的、又はそうでなければ、不可
逆的である。
【０８５３】
細胞表面でのリガンド又は受容体の発現
本明細書に記載する態様の一部の態様及び実施形態では、本明細書に記載のキメラポリヌクレオチドを用いて、細胞の表面にリガンド又はリガンド受容体（例えば、ホーミング部分）を発現させることができる。細胞表面に結合したリガンド又はリガンド受容体部分は、細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織又は物質との所望の生物学的相互作用を達成することを可能にする。リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質若しくはポリペプチド、受容体、例えば、細胞表面受容体、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療薬、薬物、グリコサミノグリカン、又はこれらの任意の組み合わせであってよい。例えば、リガンドは、抗体であってよく、これは、癌細胞特異的抗原を認識して、細胞が腫瘍細胞と優先的に相互作用できるようにし、これによって修飾細胞の腫瘍特異的局在化を可能にする。好ましいリガンドは、治療対象の組織の外側面上の標的分子と相互作用することができるため、リガンドは、細胞組成物が治療対象の組織に蓄積する能力を付与し得る。他の組織に対して限定された架橋反応性を有するリガンドが一般に好ましい。
【０８５４】
ある事例では、リガンドは、細胞が、特定の組織をターゲティングする、又は特定のリガンドと相互作用することを可能にするホーミング部分として作用することができる。こうしたホーミング部分として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：特異的結合ペアの任意のメンバー、抗体、モノクローナル抗体、又はその誘導体若しくは類似体、例えば、限定なしで、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体及び抗体断片、ヒト化抗体及び抗体断片、並びに上記の多価形態；多価結合試薬、例えば、限定なしで、単一特異的若しくは二重特異的抗体断片、例えば、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ＳＣＦＶ）２断片）、ダイアボディ、トリボディ若しくはテトラボディ（これらは、典型的に、共有結合した、あるいは、安定化した（すなわち、ロイシンジッパー若しくはヘリックス安定化）ｓｃＦＶ断片；並びに他のホーミング部分として、例えば、アプタマー、受容体、及び融合タンパク質がある。
【０８５５】
一部の実施形態では、ホーミング部分は、表面結合抗体であってもよく、これは、細胞ターゲティング特異性の調整を可能にする。高度に特異的な抗体は、所望のターゲティング部位の目的のエピトープに対して増強され得ることから、ホーミング部分は、特に有用である。一部の実施形態では、複数の抗体を細胞の表面に発現させると、各抗体は、所望の標的に対して異なる特異性を持つことができる。こうした手法は、ホーミング相互作用の結合活性及び特異性を高めることができる。
【０８５６】
当業者は、細胞の要望される局在化又は機能に基づいて、任意のホーミング部分を選択することができ、例えば、タモキシフェンなどのエストロゲン受容体は、細胞表面に多数のエストロゲン受容体を有するエストロゲン依存性乳癌細胞に対して細胞をターゲティングすることができる。リガンド／受容体相互作用の他の非制限的例として、以下のものが挙げられる：ＣＣＲＩ（例えば、慢性関節リウマチにおける炎症関節組織若しくは脳、及び／又は多発性硬化症の治療のため）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織へのターゲティング）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸組織にターゲティングするため）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚にターゲティングするため）、ＣＸＣＲ４（例えば、遊出の全般的増強のため）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症及び／又は炎症性障害、骨髄の治療のため）、α４β７（例えば、腸粘膜ターゲティングのため）、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１（例えば、内皮へのターゲティング）。一般に、本明細書に記載する方法及び組成物で使用するために、ターゲティング（例えば、癌転移）に関与する任意の受容体を利用することができる。
【０８５７】
細胞株の修飾
標的哺乳動物細胞の細胞運命に改変を導入する方法が提供される。標的哺乳動物細胞は、前駆細胞であってもよく、改変は、細胞株中への分化の駆動、又はこうした分化の阻止を含み得る。あるいは、標的哺乳動物細胞は、分化細胞であってもよく、細胞運命改変は、多能性前駆細胞中への脱分化の駆動、又はこうした脱分化の阻止、例えば、癌幹細胞中への癌細胞の脱分化などを含む。細胞運命の変化が要望される状況では、細胞運命の改変が誘導される条件下で、細胞運命誘導性ポリペプチドをコードする有効量のｍＲＮＡを標的細胞に導入する。一部の実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、細胞の亜集団を第１表現型から第２表現型へと再プログラムする上で有用である。こうした再プログラムは、一過性又は永久的のいずれであってもよい。任意選択で、再プログラムは、標的細胞を誘導して、中間表現型を採用させる。
【０８５８】
さらに、本発明の方法は、高い効率のトランスフェクション、細胞を再トランスフェクトする能力、及び標的細胞に産生される組換えポリペプチドの量の維持可能性によって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製する上で特に有用である。さらに、本明細書に記載の方法を用いて作製したｉＰＳＣの使用は、奇形腫形成の発生率を低下させると予想される。
【０８５９】
また、標的細胞集団における細胞分化を抑制する方法も提供される。例えば、ポリペプチドが翻訳されて、前駆細胞の分化を抑制するような条件下で、ポリペプチドをコードする有効量のキメラポリヌクレオチドを含む組成物と、１つ又は複数の前駆細胞型を含有する標的細胞集団を接触させる。非制限的実施形態では、標的細胞集団は、哺乳動物対象の損傷組織又は外科手術の影響を受けた組織を含有する。前駆細胞は、例えば、間質前駆細胞、神経前駆細胞、又は間葉系前駆細胞である。
【０８６０】
特定の実施形態では、１つ又は複数の分化因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ４をコードするキメラポリヌクレオチドが提供される。これらのｍＲＮＡ生成因子は、線維芽細胞に導入されて、心筋細胞への再プログラムを駆動する。こうした再プログラムは、ｍＲＮＡ含有パッチ又は他の材料と損傷心臓組織を接触させて、心臓の再生を促進することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。こうしたプロセスは、線維症とは反対に、心筋発生を促進する。
【０８６１】
細胞死の媒介
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドを用いて、細胞死受容体、細胞死受容体リガンド又はその組み合わせの発現を増加させることにより、細胞（例えば、癌細胞）にアポトーシスを誘導することができる。この方法を使用して、任意の所望する細胞に細胞死を誘導することができ、この方法は、細胞が、自然のアポトーシスシグナルから逃避する癌の治療に特に有用性がある。
【０８６２】
アポトーシスは、複数の独立したシグナル伝達経路により誘導され得るが、これらの経路は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体／リガンドスーパーファミリーに属するいくつかの「細胞死受容体」とそれらのリガンドとの様々な相互作用からなる最終エフェクター機構に集中する。最もよく特性決定されている細胞死受容体は、ＣＤ９５（「Ｆａｓ」）、ＴＮＦＲＩ（ｐ５５）、細胞死受容体３（ＤＲ３又はＡｐｏ３／ＴＲＡＭＯ）、ＤＲ４及びＤＲ５（ａｐｏ２−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）である。アポトーシスの最終エフェクター機構は、カスパーゼと称される一連のプロテイナーゼの活性化であると考えられる。これらのカスパーゼの活性化によって、一連の重要な細胞タンパク質の切断及び細胞死が起こる。細胞死受容体／リガンド誘導細胞死の分子機構は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介アポトーシスは、３つのＦａｓＬ分子が結合して、Ｃ末端細胞死
ドメイン（ＤＤ）を介したＦａｓ受容体の三量体化を誘導し、次にこれが、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（細胞死ドメインを含むＦａｓ結合タンパク質）及びカスパーゼ−８をリクルートすることによって、誘導される。この３分子複合体、Ｆａｓ／ＦＡＩＤＤ／カスパーゼ−８のオリゴマー化によって、プロ酵素カスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８へのタンパク質分解切断が起こり、これが今度は、タンパク質分解により他の下流カスパーゼ（カスパーゼ−３など）を活性化することにより、アポトーシスプロセスを開始する。細胞死リガンドは概して、三量体又はより高次の構造に形成されると、アポトーシス促進性となる。単量体の場合、これらは、細胞死受容体との結合について、三量体と競合することにより、抗アポトーシス因子として役立ち得る。
【０８６３】
一実施形態では、キメラポリヌクレオチド組成物は、細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＭＯ、ＴＮＦＲ、ＴＬＲなど）をコードする。キメラポリヌクレオチドのトランスフェクションによる細胞死受容体を発現させるようにした細胞は、この受容体を活性化するリガンドにより誘導される細胞死に対して感受性になる。同様に、例えば、細胞表面で、細胞死リガンドを発現させるようにした細胞は、トランスフェクトした細胞が標的細胞に接触すると、受容体を有する細胞の死を誘導することになる。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチド組成物は、細胞死受容体（例えば、ＦａｓＬ、ＴＮＦなど）をコードする。別の実施形態では、キメラポリヌクレオチド組成物は、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ９など）をコードする。癌細胞が、非増殖性又は制御された増殖形態へと適正な分化の不履行を往々にして呈示する場合、別の実施形態では、合成キメラポリヌクレオチド組成物は、細胞死受容体及びその適切な活性化リガンドの両方をコードする。別の実施形態では、合成キメラポリヌクレオチド組成物は、分化因子をコードし、これは、癌幹細胞などの癌細胞で発現されると、その細胞を誘導して、非病原性若しくは非自己再生表現型（例えば、低下した細胞増殖速度、抑制された細胞分裂など）に分化させるか、又は細胞を誘導して、休眠細胞期（例えば、Ｇ０静止期）に入らせる。
【０８６４】
当業者であれば、アポトーシス誘導技術の使用には、不要な広範囲の細胞死を防ぐために、例えば、腫瘍細胞に対してキメラポリヌクレオチドを適正にターゲティングすることが要求され得る。そのため、キメラポリヌクレオチドが、癌細胞だけに発現されるように、癌抗原を認識する送達機構（例えば、結合リガンド又は抗体、標的リポソームなど）を使用することができる。
【０８６５】
美容用途
一実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、美容に関する状態の治療、改善又は予防に使用することができる。こうした状態として、ざ瘡（ニキビ）、酒さ、瘢痕、シワ、湿疹、帯状疱疹、乾癬、年齢によるシミ、母斑、乾燥肌、皮膚硬結、発疹（例えば、おむつかぶれ、あせも）、疥癬、蕁麻疹、疣贅、虫刺され、白斑、ふけ、そばかす、及び加齢の一般的徴候が挙げられる。
【０８６６】
ＶＩ．キット及びデバイス
キット
本発明は、本発明の方法を好都合に及び／又は効果的に実施するための様々なキットを提供する。典型的に、キットは、ユーザが、対象の複数の治療を実施する、及び／又は複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量及び／又は数の成分を含む。
【０８６７】
一態様では、本発明は、本発明の分子（キメラポリヌクレオチド）を含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、１つ又は複数の機能性抗体又はその機能断片を含む。
キットは、翻訳可能な領域を含む第１キメラポリヌクレオチドを含む、タンパク質生産用であってよい。このキットは、さらに、パッケージング並びに製剤組成物を形成するた
めの指示書及び／又は送達剤を含んでもよい。送達剤は、塩水、緩衝液、リピドイド又は本明細書に開示する任意の送達剤を含んでもよい。
【０８６８】
一実施形態では、バッファー溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩及び／又はＥＤＴＡを含んでもよい。別の実施形態では、緩衝溶液は、限定はしないが、塩水、２ｍＭカルシウムを含む塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含む５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムを含む塩化ナトリウム及びマンノースを含んでもよい（例えば、米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号明細書を参照のこと；これは、全体として参照により本明細書に組み込む）。また別の実施形態では、緩衝溶液を沈殿させてもよいし、又は凍結乾燥させてもよい。各成分の量は、一貫した再生可能な高濃度塩水又は単純なバッファー製剤を可能にするように、変動し得る。また、所定の期間にわたって及び／又は様々な条件下で、バッファー溶液中の修飾ＲＮＡの安定性を高めるために、成分を変更してもよい。一態様では、本発明は、タンパク質生産のためのキットを提供し、キットは、以下を含む：標的細胞に導入されると翻訳可能な領域によりコードされる所望の量のタンパク質を産生するのに有効な量で提供される、翻訳可能な領域を含むキメラポリヌクレオチド；細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害核酸を含む第２ポリヌクレオチド；並びにパッケージング及び指示書。
【０８６９】
一態様では、本発明は、タンパク質生産のためのキットを提供し、キットは、翻訳可能な領域を含むキメラポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す）、並びにパッケージング及び指示書を含む。
【０８７０】
一態様では、本発明は、タンパク質生産のためのキットを提供し、キットは、翻訳可能な領域を含むキメラポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す）、並びに第１核酸の翻訳可能領域の翻訳に好適な哺乳動物細胞を含む。
【０８７１】
デバイス
本発明は、目的のポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、それを必要とする対象、例えば、ヒト対象に直ちに送達するために利用可能な製剤にポリヌクレオチドを合成するための試薬を安定な製剤中に含有する。
【０８７２】
投与用のデバイスを使用して、本明細書に記載する単回、複数回若しくは分割投与レジメンに従って、本発明のキメラポリヌクレオチドを送達することができる。こうしたデバイスは、例えば、２０１３年３月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）（これらの各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されている。
【０８７３】
細胞、臓器及び組織に対する複数回投与について当技術分野で公知の方法及びデバイスは、本発明の実施形態として本明細書に開示される方法及び組成物と併用することが考慮される。これらの方法として、例えば、マルチプルニードル、例えば、管腔又はカテーテルを使用するハイブリッドデバイス、並びに熱、電流若しくは放射線駆動機構を使用する方法及びデバイスがある。
【０８７４】
本発明によれば、複数回投与デバイスを使用して、本明細書で考慮する単回、複数回若しくは分割用量を送達することができる。こうした装置は、例えば、２０１３年３月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に教示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０８７５】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも３本の針で、３つの異なる、任意選択で隣接した部位に、同時に、又は６０分以内に皮下若しくは筋肉内投与する（例えば、４、５、６、７、８、９、若しくは１０の部位への同時又は６０分以内の投与）。
【０８７６】
固体生分解性マイクロニードルを用いて治療薬を送達する方法は、オヘイガン（Ｏ’ｈａｉｇａｎ）らにより、米国特許出願公開第２０１３０２８７８３２号明細書により記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。マイクロニードルは、少なくとも１つの固体賦形剤と組み合わせた治療薬（例えば、インフルエンザワクチン）から製造される。皮膚に貫入した後、マイクロニードルは、ｉｎ  ｓｉｔｕで溶解し、治療薬を対象に放出する。非制限的例として、マイクロニードルの製造に使用される治療薬は、本明細書に記載のポリヌクレオチドである。
【０８７７】
経皮薬物送達用のマイクロニードルアセンブリは、ロス（Ｒｏｓｓ）らにより、米国特許第８６３６６９６号明細書に記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。このアセンブリは、第１面と第２面を有し、支持体の第２面から外側に向かってマイクロニードルが突出している。アセンブリは、流路と開口部を含み、これらが交差を形成して、液体（例えば、治療薬又は薬物）の通過を可能にする。
【０８７８】
カテーテル及び／又は管腔を用いる方法及びデバイス
カテーテル及び管腔を用いる方法及びデバイスを使用して、単回、複数回若しくは分割投与スケジュールで、本発明のキメラポリヌクレオチドを投与することができる。こうした方法及び装置は、２０１３年３月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に教示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０８７９】
電流を用いる方法及びデバイス
電流を用いる方法及びデバイスを使用して、単回、複数回若しくは分割投与スケジュールで、本発明のキメラポリヌクレオチドを投与することができる。こうした方法及び装置は、２０１３年３月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号明細書（代理人整理番号Ｍ３００）に教示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【０８８０】
ＶＩＩ．定義
本明細書の様々な箇所で、本開示の化合物の置換基は、群又は範囲で開示される。本開示は、こうした群及び範囲のメンバーの各々及びあらゆる個別の部分組み合わせを包含する。例えば、用語「Ｃ１〜６アルキル」は、具体的に、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、及びＣ６アルキルを個別に開示することが意図される。本明細書において、「任意選択で置換されたＸ」（例えば、任意選択で置換されたアルキル）という形態の語句は、「Ｘ（ここで、Ｘは、任意選択で置換されている」（例えば、「アルキル（ここで、アルキルは、任意選択で置換されている」）と同等であることが意図される。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意であると意味することは意図しない。
【０８８１】
約：本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記載される値の±１０％を意味する。
組み合わせて投与される：本明細書で使用されるとき、用語「組み合わせて投与される」又は「併用投与」は、２種以上の薬剤が対象に同時に、又は対象に対する各薬剤の効果の重複が生じ得るような間隔内で投与されることを意味する。一部の実施形態では、これらの薬剤は、互いの約６０分、３０分、１５分、１０分、５分、又は１分以内に投与される。一部の実施形態では、薬剤の投与は、併用効果（例えば、相乗効果）が達成されるよ
うに、互いに十分に近い間隔が空けられる。
【０８８２】
アジュバント：本明細書で使用されるとき、用語「アジュバント」は、抗原に対する対象の免疫応答を増強する物質を意味する。
動物：本明細書で使用されるとき、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発達段階にあるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、畜牛、霊長類、又はブタ）である。一部の実施形態では、動物として、限定はしないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び蠕虫が挙げられる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、又はクローンである。
【０８８３】
抗体断片：本明細書で使用されるとき、用語「抗体断片」は、インタクトな抗体、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域及び／又は可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；ナノボディ；単鎖抗体分子、並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【０８８４】
抗原：本明細書で使用されるとき、用語「抗原」は、それぞれの抗体に特異的に結合する物質を指す。抗原は、本明細書で使用する癌抗原などの身体、又は外部環境、例えば、感染因子のいずれを起源とするものでもよい。
【０８８５】
目的の抗原又は所望の抗原：本明細書で使用されるとき、用語「目的の抗原」又は「所望の抗原」には、明細書に記載の抗体並びにその断片、突然変異体、変異体、及び改変物が免疫特異的に結合した、本明細書に提供するタンパク質及び他の生体分子が含まれる。目的の抗原の例として、限定はしないが、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω又はＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦα及びＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦが挙げられる。
【０８８６】
近似的に（約）：本明細書で使用されるとき、用語「近似的に」又は「約」は、目的とする１つ以上の値に適用される場合、記載される基準値と同程度である値を指す。特定の実施形態では、用語「近似的に」又は「約」は、特に記載のない限り、又はその他文脈上明らかでない限り、記載される基準値のいずれの（より大きい又はより小さい）方向にも２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満の範囲内に含まれる値の範囲を指す（こうした数が、考えられる値の１００％を超える場合を除く）。
【０８８７】
〜と会合（結合）した：本明細書で使用されるとき、用語「〜と会合（結合）した」、「コンジュゲートした」、「連結した」、「付着した」、及び「係留された」は、２つ以上の部分に関して用いられるとき、それらの部分が、直接、若しくは連結剤として働く１つ又は複数の追加部分を介して、互いに物理的に結合される、又はつながることにより、十分に安定した構造を形成し、これによってその構造が用いられる条件下、例えば、生理学的条件下で、それらの部分が物理的に結合したまま保持されることを意味する。「会合」は、厳密に直接共有化学結合によるものである必要はない。これは、イオン若しくは水素結合、又は「会合した」実体が物理的に結合したまま保持されるように十分安定したハイブリダイゼーションに基づく連結性も示し得る。
【０８８８】
二官能性：本明細書で使用されるとき、用語「二官能性」は、少なくとも２つの官能基の能力を有するか、又はそれらを維持することができる任意の物質、分子又は部分を指す。これらの官能基は、同じ結果又は異なる結果のいずれをもたらすものでもよい。官能基をもたらす構造は、同じでも異なっていてもよい。例えば、本発明の二官能性修飾ＲＮＡは、細胞傷害性ペプチド（第１機能）をコードするが、コードＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自体として細胞傷害性である（第２機能）。この例では、二官能性修飾ＲＮＡの癌細胞への送達は、癌を緩和又は治療し得るペプチド若しくはタンパク質分子をもたらすだけではなく、万一修飾ＲＮＡの翻訳ではなく、分解が必要な場合には、細胞に対するヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードの送達も達成し得る。
【０８８９】
生体適合性：本明細書で使用されるとき、用語「生体適合性」とは、損傷、毒性又は免疫系による拒絶のリスクをほとんど若しくは全くもたらすことなく、生存細胞、組織、臓器若しくは系統と適合性であることを意味する。
【０８９０】
生分解性：本明細書で使用されるとき、用語「生分解性」とは、生物の作用により無害の産物に分解できることを意味する。
生物活性：本明細書で使用されるとき、語句「生物活性」は、生体系及び／又は生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されたとき、当該生物に対して生物学的作用を有する物質は、生物活性であるとみなされる。具体的な実施形態において、キメラポリヌクレオチドの一部であっても、それが生物活性であるか、又は生物学的に関連するとみなされる活性を模倣する場合には、本発明のキメラポリヌクレオチドは生物活性であるとみなされる。
【０８９１】
癌幹細胞：本明細書で使用されるとき、「癌幹細胞」は、自己再生並びに／又は異常な増殖及び分化を経て、腫瘍を形成することができる細胞である。
化学用語：以下に、「アシル」から「チオール」まで、様々な化学用語の定義を記載する。
【０８９２】
本明細書で使用されるとき、用語「アシル」は、本明細書で定義する通りの水素又はアルキル基（例えば、ハロアルキル基）を表し、これは、本明細書で定義する通りのカルボニル基を介して親分子基に結合し、例として、ホルミル（すなわち、カルボキシアルデヒド基）、アセチル、トリフルオロアセチル、プロピオニル、ブタノイルなどが挙げられる。例示的非置換アシル基は、１〜７、１〜１１、又は１〜２１個の炭素を含む。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換される。
【０８９３】
任意選択で置換されたアシル基の非制限的例として、以下のものが挙げられる：アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アリールアルコキシカルボニル、アリーロイル、カルバモイル、カルボキシアルデヒド、（ヘテロシクリル）イミノ、及び（ヘテロシクリル）オイル：
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニル」基は、カルボニル原子を介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのアルコキシ（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、若しくはＣ１〜２０アルキル基である）を表す。例示的非置換アルコキシカルボニルは、１〜２１個の炭素（例えば、１〜１１又は１〜７個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルコキシ基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換される。
【０８９４】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアシル」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアシル基を表
す（例えば、−Ｃ（Ｏ）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜２０アルキル基である）。例示的非置換アルコキシカルボニルアシルは、３〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アシル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アシル、Ｃ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アシルなどのように、例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、又は３〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルコキシ及びアルキル基は、各々の基について、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０８９５】
本明細書で使用されるとき、「アリールアルコキシカルボニル」基は、カルボニルを介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのアリールアルコキシ基を表す（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル−アリール）。例示的非置換アリールアルコキシ基は、８〜３１個の炭素（例えば、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ−カルボニル、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜１０アルコキシ−カルボニル、又はＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜２０アルコキシ−カルボニルなどのように、例えば、８〜１７又は８〜２１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アリールアルコキシカルボニル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０８９６】
本明細書で使用されるとき、「アリーロイル」基は、カルボニル基を介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのアリール基を表す。例示的非置換アリーロイルは、炭素数７〜１１である。一部の実施形態では、アリール基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０８９７】
本明細書で使用されるとき、「カルバモイル」基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、ここで、各ＲＮ１の意味は、本明細書に記載する「アミノ」の定義に見出される。
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルデヒド」基は、構造−ＣＨＯを有するアシル基を表す。
【０８９８】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）イミノ」基は、イミノ基を介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのヘテロシクリル基を表す。一部の実施形態では、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０８９９】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）オイル」基は、カルボニル基を介して親分子に結合した、本明細書で定義する通りのヘテロシクリル基を表す。一部の実施形態では、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９００】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は、別に記載のない限り、炭素数１〜２０（例えば、１〜１０若しくは１〜６）の直鎖及び分岐鎖飽和基の両方を包含する。アルキル基の例として、メチル、エチル、ｎ−及びイソ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、イソ−及びｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチルなどが挙げられ、これは、任意選択で、以下のものからなる群から独立に選択される１、２、３、又は炭素数２以上のアルキル基の場合には、４つの置換基で置換することができる：（１）Ｃ１〜６アルコキシ；（２）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（３）本明細書で定義する通りのアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）又は置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２、ここで、ＲＮ１は、アミノについて定義する通りである）；（４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２〜９ヘテロシクリル）オキシ；（８）任意選択で、Ｏ−保護基で置換されるヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒド又はアシル）；（１１）Ｃ１〜７スピロシクリル；（１２）チオア
ルコキシ；（１３）チオール；（１４）任意選択で、Ｏ−保護基で置換される−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ＲＢ’及びＲＣ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’、ここで、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）ヒドロキシ；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’、ここで、ＲＧ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’、ここで、ＲＨ’は、以下：（ａ１）水素及び（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、以下：（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＲＫ’、ここで、ＲＪ’は、以下：（ａ１）水素及び（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、以下：（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２
０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；並びに（２１）アミジン。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通り、さらに置換することができる。例えば、Ｃ１アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換することにより、それぞれのアリーロイル置換基を付与することができる。
【０９０１】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキレン」は、直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素から２つの水素原子を除去することにより得られる飽和二価炭化水素を表し、例として、メチレン、エチレン、イソプロピレンなどが挙げられる。用語「Ｃｘ〜ｙアルキレン」及び接頭辞「Ｃｘ〜ｙアルク」は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキレン基を表す。ｘの例示的値は、１、２、３、４、５、及び６であり、ｙの例示的値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０である（例えば、Ｃ１〜６、Ｃ１〜１０、Ｃ２〜２０、Ｃ２〜６、Ｃ２〜１０、又はＣ２〜２０アルキレン）。一部の実施形態では、アルキレンは、アルキル基について本明細書に記載する通り、１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。同様に、任意の基に付いた接尾辞「−エン」は、該当する基が二価の基であることを示している。
【０９０２】
任意選択で置換されたアルキル及びアルキレン基の非制限的例として、アシルアミノアルキル、アシルオキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アルキルスルフィニル、アルキルスルフィニルアルキル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアミノアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、ペルフルオロアルキル、及びスルホアルキルが挙げられる：
本明細書で使用されるとき、「アシルアミノアルキル」基は、アミノ基に結合されて、これが今度は、本明細書で定義する通りのアルキレン基を介して親分子に結合された、本明細書で定義する通りのアシル基であり（すなわち、−アルキル−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、若しくはＣ１〜２０アルキル基（例えば、ハロアルキル）、ＲＮ１は、本明細書で定義する通りである）である。例示的非置換アシルアミノアルキル基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、又は２〜４１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキレン基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換され、及び／又はアミノ基は、−ＮＨ２又は−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載するその他）、又はアルコキシカルボニルアルキルであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、又はアリールであってよい。
【０９０３】
本明細書で使用されるとき、「アシルオキシアルキル」基は、酸素原子に結合されて、これが今度は、アルキレン基を介して親分子に結合された、本明細書で定義する通りのアシル基である（すなわち、−アルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜２０アルキル基である）。例示的非置換アシルアミノアルキル基は、１〜２１個の炭素（例えば、１〜７又は１〜１１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキレン基は、独立に、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換される。
【０９０４】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシアルキル」基は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を表す。例示的非置換アルコキシアルキル基は、２〜４０個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜１０アルコキシ−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜２０アルコキシ−Ｃ１〜２０アルキルなどのように、例えば、２〜１２、又は２〜２０個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキル及びアルコキシは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９０５】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す（例えば、−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜６アルキル基である）。例示的非置換アルコキシカルボニルアルキルは、３〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アルキルなどのように、例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、又は３〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルキル及びアルコキシ基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９０６】
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニルアルキル」基は、アルキルスルフィニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。例示的非置換アルキルスルフィニルアルキル基は、炭素数２〜１２、２〜２０、又は２〜４０である。一部の実施形態では、各アルキル基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９０７】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。各アルキル及びアミノ基は、それぞれの基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシ、及び／又はＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９０８】
本明細書で使用されるとき、「カルバモイルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのカルバモイル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９０９】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルキル」基は、本明細書で定義する通りのカルボキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができ、カルボキシ基は、任意選択で、１つ又は複数のＯ−保護基で置換することができる。
【０９１０】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルキルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのカルボキシで置換された、本明細書で定義する通りのアミノアルキル基を表す。カルボキシ、アルキル、及びアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシ、及び／又はＮ−保護基、及び／又は
Ｏ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９１１】
本明細書で使用されるとき、「ハロアルキル」基は、本明細書で定義する通りのハロゲン基（すなわちＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。ハロアルキルは、１つ、２つ、３つ、又は、炭素数２以上のアルキル基の場合には、４つのハロゲンで置換してもよい。ハロアルキル基は、ペルフルオロアルキル（例えば、−ＣＦ３）、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＣｌ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、及び−ＣＨＩＣＨ３を含む。一部の実施形態では、ハロアルキル基は、アルキル基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９１２】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルキル」基は、わずか１つのヒドロキシ基がアルキル基の１炭素原子に結合し得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表し、例として、ヒドロキシメチル、ジヒドロキシプロピルなどが挙げられる。一部の実施形態では、ヒドロキシアルキル基は、アルキルについて本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換することができる。
【０９１３】
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルキル」基は、アルキル基に結合した各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルで置換されている、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。ペルフルオロアルキル基の例として、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどが挙げられる。
【０９１４】
本明細書で使用されるとき、「スルホアルキル」基は、−ＳＯ３Ｈのスルホ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキル基を表す。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができ、スルホ基は、１つ又は複数のＯ−保護基（例えば、本明細書に記載する通りの）で置換することができる。
【０９１５】
本明細書で使用されるとき、用語「アルケニル」は、１つ又は複数の炭素−炭素二重結合を含有する、炭素数２〜２０（例えば、２〜６若しくは２〜１０）の１価直鎖又は分岐鎖の基を表し、例として、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルなどが挙げられる。アルケニルは、シス及びトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、任意選択で、本明細書で定義する通りのアミノ、アリール、シクロアルキル、若しくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又は本明細書に記載する例示的アルキル置換基のいずれかから独立に選択される１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９１６】
任意選択で置換されたアルケニル基の非制限的例として、アルコキシカルボニルアルケニル、アミノアルケニル、及びヒドロキシアルケニルが挙げられる：
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルケニル」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルケニル基を表す（例えば、−アルケニル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜６アルキル基である）。例示的非置換アルコキシカルボニルアルケニルは、４〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜２０アルケニルなどのように、例えば、４〜１０、４〜１３、４〜１７、４〜２１、又は４〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルキル、アルケニル、及びアルコキシ基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９１７】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルケニル」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルケニル基を表す。アルケニル及びアミノ基は各々、それぞれの基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシ、及び／又はＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９１８】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルケニル」基は、わずか１つのヒドロキシ基がアルキル基の１炭素原子に結合し得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルケニル基を表し、例として、ヒドロキシプロペニル、ヒドロキシイソペンテニルなどが挙げられる。一部の実施形態では、ヒドロキシアルケニル基は、アルキルについて本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換することができる。
【０９１９】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキニル」は、１つの炭素−炭素三重結合を含有する、炭素数２〜２０（例えば、２〜４、２〜６、若しくは２〜１０）の１価直鎖又は分岐鎖の基を表し、例として、エチニル、１−プロピニルなどが挙げられる。アルキニル基は、任意選択で、本明細書で定義する通りのアリール、シクロアルキル、若しくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又は本明細書に記載する例示的アルキル置換基のいずれかから独立に選択される１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９２０】
任意選択で置換されたアルキニル基の非制限的例として、アルコキシカルボニルアルキニル、アミノアルキニル、及びヒドロキシアルキニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルキニル」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキニル基を表す（例えば、−アルキニル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜６アルキル基である）。例示的非置換アルコキシカルボニルアルキニルは、４〜４１個の炭素（例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜１０アルキニル、又はＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜２０アルキニルなどのように、例えば、４〜１０、４〜１３、４〜１７、４〜２１、又は４〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルキル、アルキニル、及びアルコキシ基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９２１】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルキニル」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキニル基を表す。アルキニル及びアミノ基は各々、それぞれの基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシ、及び／又はＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９２２】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルキニル」基は、わずか１つのヒドロキシ基がアルキル基の１炭素原子に結合し得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルキニル基を表す。一部の実施形態では、ヒドロキシアルキニル基は、アルキルについて本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換することができる。
【０９２３】
本明細書で使用されるとき、「アミノ」は、−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、ここで、各ＲＮ１は、独立に、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル（例えば、任意選択で、Ｏ−保護基で置換されたもの、例えば、任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基若しくは本明細書に記載するいずれかなど）、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載するその他）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、任意選択でＯ−保護基で置換されたもの、例えば、任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基若しくは本明細書に記載するいずれかなど）、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又はアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）であり、これらの記載するＲＮ１基の各々は、各々の基について本明細書で定義する通り、任意選択で置換することができ；又は、２つのＲＮ１は、結合して、ヘテロシクリル若しくはＮ−保護基を形成し、並びに、各ＲＮ２は、独立に、Ｈ、アルキル、又はアリールである。本発明のアミノ基は、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）又は置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２）であってよい。好ましい実施形態では、アミノは、−ＮＨ２又は−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載するその他）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、ｔ−ブトキシカルボニルアルキル）又はアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、又はＣ６〜１０アリールであってよい。
【０９２４】
任意選択で置換されたアミノ基の非制限的例は、アシルアミノ及びカルバミルである：
本明細書で使用されるとき、「アシルアミノ」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基を介して親分子基に結合した、本明細書で定義する通りのアシル基を表す（すなわち−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、若しくはＣ１〜２０アルキル基（例えば、ハロアルキル）あり、ＲＮ１は、本明細書で定義する通りである）。例示的非置換アシルアミノ基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、又は２〜４１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換され、及び／又はアミノ基は、−ＮＨ２又は−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立に、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、若しくは本明細書に記載するその他）、又はアルコキシカルボニルアルキルであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、又はアリールである。
【０９２５】
本明細書で使用されるとき、「カルバミル」基は、構造−ＮＲＮ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ又は−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＮ１）２を有するカルバメート基を指し、ここで、各ＲＮ１は、本明細書に記載する「アミノ」の定義に見出され、Ｒは、本明細書で定義する通りのアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、又はアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）である。
【０９２６】
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、側鎖、アミノ基、及び酸基（例えば、−ＣＯ２Ｈのカルボキシ基又は−ＳＯ３Ｈのスルホ基）を有する分子を指し、ここで、アミノ酸は、側鎖、アミノ基、若しくは酸基（例えば、側鎖）によって親分子基に結合されている。一部の実施形態では、アミノ酸は、カルボニル基によって親分子基に結合されており、ここで、側鎖又はアミノ基は、カルボニル基に結合されている。例示的側鎖としては、任意選択で置換されたアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリール、アル
クヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、及びカルボキシアルキルが挙げられる。例示的アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イロソイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリシン、セレノシステイン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが挙げられる。アミノ酸基は、任意選択で、以下のものからなる群から独立に選択される１、２、３つの置換基、又は炭素数２以上のアルキル基の場合には、４つの置換基で置換してもよい：（１）Ｃ１〜６アルコキシ；（２）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（３）本明細書で定義する通りのアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）又は非置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２、ここで、ＲＮ１は、アミノについて定義する通りである）；（４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２〜９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒド又はアシル）；（１１）Ｃ１〜７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ＲＢ’及びＲＣ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’、ここで、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）ヒドロキシ；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’、ここで、ＲＧ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’、ここで、ＲＨ’は、以下：（ａ１）水素及び（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、以下：（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０ア
リール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＲＫ’、ここで、ＲＪ’は、以下：（ａ１）水素及び（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、以下：（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜２０アルキルである、及び（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコール、ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６又は１〜４）の整数であり、ｓ２及びｓ３の各々は、独立に、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、又は１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立に、水素又は任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである；並びに（２１）アミジン。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通りに、さらに置換することができる。
【０９２７】
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は、１つ又は２つの芳香環を有する単環、二環、又は多環式炭素環系を表し、例として、フェニル、ナフチル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどが挙げられ、これは、以下のものからなる群から独立に選択される１、２、３、４、若しくは５つの置換基で置換してもよい：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、又はＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシなどのＣ１〜６アルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ１〜６アルク−Ｃ３〜８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１５）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’及びＲＣ’は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｃ
）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２１）チオール；（２２）Ｃ６〜１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（２５）Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（２６）Ｃ２〜２０アルケニル；並びに（２７）Ｃ２〜２０アルキニル。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通り、さらに置換することができる。例えば、Ｃ１−アルカリール又はＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換することにより、それぞれのアリーロイル及び（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与することができる。
【０９２８】
本明細書で使用されるとき、用語「アリールアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアルキレン基を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのアリール基を表す。例示的非置換アリールアルキル基は、炭素数７〜３０（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜１０アルク−Ｃ６〜１０アリール、若しくはＣ１〜２０アルク−Ｃ６〜１０アリールなどのように、炭素数７〜１６又は７〜２０）である。一部の実施形態では、アルキレン及びアリールは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。接頭辞「アルク−」が前に置かれた他の基も同様に定義され、「アルク」は、別に注記のない限り、Ｃ１〜６アルキレンを指し、結合される化学構造は、本明細書に定義する通りである。
【０９２９】
用語「アジド」は、−Ｎ３基を表し、これは、Ｎ＝Ｎ＝Ｎと表示することもできる。
本明細書で使用されるとき、用語「二環式」は、２つの環を有する構造を指し、これらの環は、芳香族又は非芳香族のいずれであってもよい。二環式構造は、本明細書で定義する通りのスピロシクリル基と、１つ又は複数の架橋を共有する２つの環を含み、こうした架橋は、１個の原子か、又は２、３個若しくはそれ以上の原子を含む鎖を含み得る。例示的二環式基としては、以下のものが挙げられる：第１及び第２環が、本明細書で定義する通りのカルボシクリル基である二環式カルボシクリル基；第１及び第２環が、本明細書で定義する通りのアリール基である、二環式アリール基；第１環がヘテロシクリル基であり、第２環がカルボシクリル（例えば、アリール）若しくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である二環式ヘテロシクリル基；並びに第１環が、ヘテロアリール基であり、第２環が、カルボシクリル（例えば、アリール）若しくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である二環式ヘテロアリール基。一部の実施形態では、二環式基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリール基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９３０】
本明細書で使用されるとき、用語「ボラニル」は、−Ｂ（ＲＢ１）３を表し、ここで、各ＲＢ１は、独立に、Ｈ及び任意選択で置換されたアルキルからなる群から選択される。一部の実施形態では、ボラニル基は、アルキルについて本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９３１】
本明細書で使用されるとき、用語「炭素環式」及び「カルボシクリル」は、任意選択で置換されたＣ３〜１２単環式、二環式、又は三環式構造を指し、ここで、環は、芳香族又は非芳香族のいずれであってもよく、これらの環は炭素原子により形成されている。炭素環式構造には、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、及びアリール基が含まれる。
【０９３２】
本明細書で使用されるとき、用語「カルボニル」は、Ｃ（Ｏ）基を表し、これは、Ｃ＝Ｏとしても表示することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「カルボキシ」は、−ＣＯ２Ｈを意味する。
【０９３３】
本明細書で使用されるとき、用語「シアノ」は、−ＣＮ基を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「シクロアルキル」は、別に記載のない限り、炭素数３〜８の一価飽和又は不飽和非芳香族環式炭化水素基を表し、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、二環式ヘプチルなどが挙げられる。上記以外に、シクロアルキル基と考えられるものが、１つ又は複数の炭素−炭素二重結合を含む場合、その基は、「シクロアルケニル」基と呼ばれる。本発明の目的のために、シクロアルケニルは、アリール基を除外する。上記以外に、シクロアルキル基と考えられるものが、１つ又は複数の炭素−炭素三重結合を含む場合、その基は、「シクロアルキニル」基と呼ばれる。例示的シクロアルケニル基として、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどがある。本発明のシクロアルキル基は、任意選択で、以下に挙げるもので置換することができる：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、又はＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシなどのＣ１〜６アルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ１〜６アルク−Ｃ３〜８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１５）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’及びＲＣ’は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ６〜１０アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６〜１０アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２１）チオール；（２２）Ｃ１〜６アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（２５）Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）Ｃ２〜２０アルケニル；並びに（２８）Ｃ２〜２０アルキニル。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通り、さらに置換することができる。例えば、Ｃ１−アルカリール又はＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換することにより、それぞれのアリーロイル及び（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与することができる。
【０９３４】
本明細書で使用されるとき、用語「シクロアルキルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアルキレン基（例えば、炭素数１〜４、１〜６、１〜１０、又は１〜２０のアルキレン基）を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのシクロアルキル基表す。一部の実施形態では、アルキレン及びシクロアルキルは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができ
る。
【０９３５】
本明細書で使用されるとき、用語「ジアステレオマー」は、互いに鏡像ではなく、且つ、互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「鏡像体」は各々、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像体の少なくとも９０％と他方の鏡像体の最大１０％）、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９８％の光学純度又は鏡像体過剰率（当技術分野で標準的方法により決定される通り）を有する本発明の化合物の個別の光学活性形態を意味する。
【０９３６】
本明細書で使用されるとき、用語「ハロ」は、臭素、塩素、ヨウ素、又はフッ素から選択されるハロゲンを表す。
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアルキル」は、構成炭素原子の１つ又は２つが各々、窒素、酸素、又はイオウで置換されている、本明細書で定義する通りのアルキル基を指す。一部の実施形態では、ヘテロアルキル基は、アルキル基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアルケニル」及び「ヘテロアルキニル」は、それぞれ、構成炭素原子の１つ又は２つが各々、窒素、酸素、又はイオウで置換されている、本明細書で定義する通りのアルケニル及びアルキニル基を指す。一部の実施形態では、ヘテロアルケニル及びヘテロアルキニル基は、アルキル基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９３７】
任意選択で置換されたヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、及びヘテロアルキニル基の非制限的例として、アシルオキシ、アルケニルオキシ、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルコキシカルボニルアルコキシ、アルキニルオキシ、アミノアルコキシ、アリールアルコキシ、カルボキシアルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルコキシ、（ヘテロシクリル）オキシ、ペルフルオロアルコキシ、チオアルコキシ、及びチオヘテロシクリルアルキルが挙げられる：
本明細書で使用されるとき、「アシルオキシ」基は、酸素原子を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのアシル基を表す（すなわち、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈ又は任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜２０アルキル基である）。例示的非置換アシルオキシ基は、１〜２１個の炭素（例えば、１〜７又は１〜１１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換される。
【０９３８】
本明細書で使用されるとき、「アルケニルオキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ２〜２０アルケニル基（例えば、Ｃ２〜６又はＣ２〜１０アルケニル）である）の化学置換基を表す。例示的アルケニルオキシ基としては、エテニルオキシ、プロペニルオキシなどがある。一部の実施形態では、アルケニル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換することができる。
【０９３９】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ１〜２０アルキル基（例えば、Ｃ１〜６又はＣ１〜１０アルキル）である）の化学置換基を表す。例示的アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、ｎ−プロポキシ及びイソプロポキシ）、ｔ−ブトキシなどがある。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ又はアルコキシ）でさらに置換することができる。
【０９４０】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシアルコキシ」基は、アルコキシ基で置換され
たアルコキシ基を表す。例示的非置換アルコキシアルコキシ基は、２〜４０個の炭素（Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜１０アルコキシ−Ｃ１〜１０アルコキシ、若しくはＣ１〜２０アルコキシ−Ｃ１〜２０アルコキシなどのように、例えば、２〜１２又は２〜２０個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルコキシ基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９４１】
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルコキシ」基は、本明細書で定義する通りのアルコキシカルボニル基で置換されたアルコキシ基を表す（例えば、−Ｏ−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６、Ｃ１〜１０、又はＣ１〜２０アルキル基である）。例示的非置換アリコキシカルボニルアルコキシ基は、３〜４１個の炭素（Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アルコキシ、又はＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アルコキシなどのように、例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、又は３〜３１個の炭素）を含む。一部の実施形態では、各アルコキシ基は、独立して、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０９４２】
本明細書で使用されるとき、「アルキニルオキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ２〜２０アルキニル基（例えば、Ｃ２〜６又はＣ２〜１０アルキル基）である）の化学置換基を表す。例示的アルキニルオキシ基としては、エチニルオキシ、プロピニルオキシなどがある。一部の実施形態では、アルキニル基は、本明細書に定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換することができる。
【０９４３】
本明細書で使用されるとき、「アミノアルコキシ」基は、本明細書で定義する通りのアミノ基で置換されたアルコキシ基を表す。アルキル及びアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載する１、２、３、又は４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、以下：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される）でさらに置換することができる。
【０９４４】
本明細書で使用されるとき、「アリールアルコキシ」基は、酸素原子を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのアルカリール基を表す。例示的非置換アリールアルコキシ基は、７〜３０個の炭素（Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜１０アルコキシ、若しくはＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜２０アルコキシなどのように、例えば、７〜１６又は７〜２０個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アリールアルコキシ基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９４５】
本明細書で使用されるとき、「アリールオキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ’（Ｒ’は、炭素数６〜１８のアリール基である）の化学置換基を表す。一部の実施形態では、アリール基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９４６】
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルコキシ」基は、本明細書で定義する通りのカルボキシ基で置換された、本明細書で定義する通りのアルコキシ基を表す。アルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができ、カルボキシ基は、任意選択で、１つ又は複数のＯ−保護基で置換することができる。
【０９４７】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルコキシ」基は、別に記載のない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ３〜８シクロアルキル基である）の化学置換基を表す。シクロアルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。例示的非置換シクロアルコキシ基は、炭素数３〜８である。一部の実施形態では、シクロアルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９４８】
本明細書で使用されるとき、「ハロアルコキシ」基は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）で置換された、本明細書で定義する通りのアルコキシ基を表す。ハロアルコキシは、１つ、２つ、３つ、又は、炭素数２以上のアルキル基の場合、４つのハロゲンで置換してもよい。ハロアルコキシ基は、ペルフルオロアルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、及び−ＯＣＨＩＣＨ３を含む。一部の実施形態では、ハロアルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９４９】
本明細書で使用されるとき、「（ヘテロシクリル）オキシ」基は、酸素原子を介して親分子基に結合した、本明細書で定義する通りのヘテロシクリル基を表す。一部の実施形態では、ヘテロシクリル基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基で置換することができる。
【０９５０】
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルコキシ」基は、アルコキシ基に結合した各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルで置換されている、アルコキシ基を表す。ペルフルオロアルコキシ基の例としては、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシなどが挙げられる。
【０９５１】
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニル」基は、−Ｓ（Ｏ）−基を介して親分子基に結合したアルキル基を表す。例示的非置換アルキルスルフィニル基は、炭素数１〜６、１〜１０、又は１〜２０である。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９５２】
本明細書で使用されるとき、「チオアリールアルキル」基は、式−ＳＲ（Ｒは、アリールアルキル基である）の化学置換基を表す。一部の実施形態では、アリールアルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９５３】
本明細書で使用されるとき、「チオアルコキシ」基は、式−ＳＲ（Ｒは、アルキル基である）の化学置換基を表す。一部の実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９５４】
本明細書で使用されるとき、「チオヘテロシクリルアルキル」基は、式−ＳＲ（Ｒは、ヘテロシクリルアルキル基である）の化学置換基を表す。一部の実施形態では、ヘテロシクリルアルキル基は、本明細書に記載する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９５５】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリール」は、芳香族である（すなわち、単環又は多環式環系内に４ｎ＋２ｐｉ電子を含有する）ヘテロシクリルのサブセットを表す。例示的非置換ヘテロアリール基は、炭素数１〜１２（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、又は２〜９）である。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、ヘテロシクリル基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は
４つの置換基で置換される。
【０９５６】
用語「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書で定義する通りのアルキレン基を介して親分子基に結合した、本明細書で定義する通りのヘテロアリール基を指す。例示的非置換ヘテロアリール基は、炭素数２〜３２（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール、Ｃ１〜１０アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール、若しくはＣ１〜２０アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリールのように、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、又は２〜１２）である。一部の実施形態では、アルキレン及びヘテロアリールは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。ヘテロアリールアルキル基は、ヘテロシクリルアルキル基のサブセットである。
【０９５７】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロシクリル」は、別に記載のない限り、窒素、酸素、及びイオウからなる群から独立に選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含有する、５−、６−若しくは７員環を表す。５員環は、０〜２つの二重結合を有し、６−及び７員環は、０〜３つの二重結合を有する。例示的非置換ヘテロシクリル基は、炭素数１〜１２（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、又は２〜９）である。用語「ヘテロシクリル」はまた、架橋した多環式構造を有する複素環式化合物を表し、ここで、１個又は複数個の炭素及び／又はヘテロ原子が、単環、例えば、キヌクリジニル基の２つの非隣接メンバーを架橋する。用語「ヘテロシクリル」は、二環式、三環式、及び四環式基を含み、ここで、前述した複素環のいずれかは、１つ、２つ、又は３つの炭素環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、又は別の単環、例えば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニルなどに融合する。融合ヘテロシクリルの例として、トロパン及び１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環式基としては、以下：ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソキサゾリル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル（例えば、１，２，３−オキサジアゾリル）、プリニル、チアジアゾリル（例えば、１，２，３−チアジアゾリル）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニルなどが挙げられ、１つ又は複数の二重結合が還元又は水素で置換されたジヒドロ及びテトラヒドロ形態を含む。また別の例示的ヘテロシクリルとしては、以下のものが挙げられる：２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−オキサゾリル；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−イミダゾリル；２，３，４，５−テトラヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−フェニル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル）；２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１Ｈ−イミダゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−５−メチル−５−フェニル−１Ｈ−イミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１，３，４−オキサジアゾリル（例えば、２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−５−フェニル−１，３，４−オキサジアゾリル）；４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル（例えば、４，５−ジヒドロ−３−メチル−４−アミノ５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル）；１，２，３，
４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３，３−ジエチルピリジニル）；２，６−ジオキソ−ピペリジニル（例えば、２，６−ジオキソ−３−エチル−３−フェニルピペリジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソピリジミニル、１，６−ジヒドロ−４−オキソピリミジニル（例えば、２−（メチルチオ）−１，６−ジヒドロ−４−オキソ−５−メチルピリミジン−１−イル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリミジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３−エチルピリミジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−ピリダジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−６−オキソ−３−エチルピリダジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−５−イソプロピル−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル（例えば、３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル及び２，３−ジヒドロ−３，３’−スピロプロパン−１Ｈ−インドール−１−イル）；１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１，３−ジヒドロ−１，３−２Ｈ−イソ−インドリル；１Ｈ−ベンゾピラゾリル（例えば、１−（エトキシカルボニル）−１Ｈ−ベンゾピラゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル（例えば、３−エチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル（例えば、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル；２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラニル；１，４−ベンゾジオキサニル；１，３−ベンゾジオキサニル；２，３−ジヒドロ−３−オキソ，４Ｈ−１，３−ベンゾチアジニル；３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル（例えば、２−メチル−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル（例えば、１−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−１，３−ジメチル−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−３，７−ジメチル−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル）；２−オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル；１，１−ジオキソ−２Ｈ−ナフト［１，８−ｃ，ｄ］イソチアゾリル；並びに１，８−ナフチレンジカルボキサミド。さらなる複素環式基として、３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−ピロロ［３，４−ｂ］ピロル−（２Ｈ）−イル、並びに２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル、ホモピペラジニル（又はジアゼパニル）、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、及びチオカニルが挙げられる。複素環式基はまた、下記の式の基も含む：
【０９５８】
【化５０】
2017524357.tif 000081
式中、
Ｅ’は、−Ｎ−及び−ＣＨ−からなる群から選択され；Ｆ’は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−Ｏ−、及び−Ｓ−からなる群から選択され；Ｇ’は、−ＣＨ−及び−Ｎ−からなる群から選択される。本明細書に挙げたヘテロシクリル基のいずれも、任意選択で、以下のものからなる群から独立に選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの置換基で置換してもよい：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ
１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、又はＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシなどのＣ１〜６アルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ１〜６アルク−Ｃ３〜８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ２〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’及びＲＣ’は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、以下からなる群から選択される：（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｃ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’及びＲＦ’の各々は、独立に、以下からなる群から選択される：（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１〜６アルク−Ｃ６〜１０アリール；（２１）チオール；（２２）Ｃ１〜６アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）アリールアルコキシ；（２５）Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）イミノ；（２８）Ｃ２〜２０アルケニル；並びに（２９）Ｃ２〜２０アルキニル。一部の実施形態では、これらの基の各々は、本明細書に記載する通り、さらに置換することができる。例えば、Ｃ１−アルカリール又はＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換することにより、それぞれのアリーロイル及び（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与することができる。
【０９５９】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロシクリルアルキル」基は、本明細書で定義する通りのアルキレン基を介して親分子基に結合された、本明細書で定義する通りのヘテロシクリル基を表す。例示的非置換ヘテロシクリルアルキル基は、炭素数２〜３２（例えば、Ｃ１〜６アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル、Ｃ１〜１０アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリル、若しくはＣ１〜２０アルク−Ｃ１〜１２ヘテロシクリルなどのように、例えば、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、又は２〜１２個の炭素）を含む。一部の実施形態では、アルキレン及びヘテロシクリルは各々、それぞれの基について本明細書で定義する通りの１、２、３、又は４つの置換基でさらに置換することができる。
【０９６０】
本明細書で使用されるとき、用語「炭化水素」は、炭素及び水素原子のみから構成される基を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を表す。
【０９６１】
本明細書で使用されるとき、用語「異性体」は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像体、又はジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ又は複数のキラル中心及び／又は二重結合を有し得るため、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）又はジアステレオマー（例えば、鏡像体（すなわち、（＋）若しくは
（−））又はシス／トランス異性体）として存在し得ることが認識される。本発明によれば、本明細書で描かれる化学構造、従って、本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち、立体異性体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋、鏡像体的に純粋、又はジアステレオマー的に純粋な）形態及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体の両方を包含する。本発明の化合物の鏡像体及び立体異性体の混合物は、典型的に、公知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体として化合物を結晶化する方法、又はキラル溶媒中で化合物を結晶化する方法により、それらの成分鏡像体又は立体異性体に分割することができる。鏡像体及び立体異性体はまた、公知の非対称合成方法により、立体異性体的に又は鏡像体的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から取得することもできる。
【０９６２】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｎ−保護アミノ」は、本明細書で定義する通りの１つ又は２つのＮ−保護基が結合した、本明細書で定義する通りのアミノ基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｎ−保護基」は、合成工程中に不要な反応からアミノ基を保護することが意図される基を表す。一般的に使用されているＮ−保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９９年（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されている。Ｎ−保護基としては、以下のものが挙げられる：アシル、アリーロイル、又はカルバミル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル、並びにキラル補助剤、例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンなどの保護若しくは非保護Ｄ、Ｌ若しくはＤ、Ｌ−アミノ酸；スルホニル含有基、例えば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなど；カルバメート形成基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドロキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど、アルカリール基、例えば、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなど、並びにシリル基、例えば、トリメチルシリルなど。好ましいＮ保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、及びベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
【０９６３】
本明細書で使用されるとき、用語「ニトロ」は、−ＮＯ２基を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｏ−保護基」は、合成工程中に不要な反応から酸素含有（例えば、フェノール、ヒドロキシル、若しくはカルボニル）基を保護することが意図される基を表す。一般的に使用されているＯ−保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎ
ｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９９年（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に開示されている。Ｏ−保護基としては、以下のものが挙げられる：アシル、アリーロイル、又はカルバミル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル、４，４’−ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジノ、及び４−ニトロベンゾイル；アルキルカルボニル基、例えば、アシル、アセチル、プロピオニル、ピバロイルなど；任意選択で置換されたアリールカルボニル基、例えば、ベンゾイル；シリル基、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）など；ヒドロキシルを含むエーテル形成基、例えば、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなど；アルコキシカルボニル、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ−イソプロポキシカルボニル、ｎ−ブチルオキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、ｓｅｃ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、２−エチルヘキシルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、メチルオキシカルボニルなど；アルコキシアルコキシカルボニル基、例えば、メトキシメトキシカルボニル、エトキシメトキシカルボニル、２−メトキシエトキシカルボニル、２−エトキシエトキシカルボニル、２−ブトキシエトキシカルボニル、２−メトキシエトキシメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、プロパルギルオキシカルボニル、２−ブテノキシカルボニル、３−メチル−２−ブテノキシカルボニルなど；ハロアルコキシカルボニル、例えば、２−クロロエトキシカルボニル、２−クロロエトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルなど；任意選択で置換されたアリールアルコキシカルボニル基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メチルベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジニトロベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメチルベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシ−カルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルなど；並びに任意選択で置換されたアリールオキシカルボニル基、例えば、フェノキシカルボニル、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル、ｏ−ニトロフェノキシカルボニル、２，４−ジニトロフェノキシカルボニル、ｐ−メチル−フェノキシカルボニル、ｍ−メチルフェノキシカルボニル、ｏ−ブロモフェノキシカルボニル、３，５−ジメチルフェノキシカルボニル、ｐ−クロロフェノキシカルボニル、２−クロロ���４−ニトロフェノキシ−カルボニルなど）；置換されたアルキル、アリール、及びアルカリールエーテル（例えば、トリチル；メチルチオメチル；メトキシメチル；ベンジルオキシメチル；シロキシメチル；２，２，２−トリクロロエトキシメチル；テトラヒドロピラニル；テトラヒドロフラニル；エトキシエチル；１−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］エチル；２−トリメチルシリルエチル；ｔ−ブチルエーテル；ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、及びニトロベンジル）；シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル；トリエチルシリル；トリイソプロピルシリル；ジメチルイソプロピルシリル；ｔ−ブチルジメチルシリル；ｔ−ブチルジフェニルシリル；トリベンジルシリル；トリフェニルシリル；及びジフェニルメチルシリル）；カルボン酸塩（例えば、メチル、メトキシメチル、９−フルオレニルメチル；エチル；２，２，２−トリクロロエチル；２−（トリメチルシリル）エチル；ビニル、アリル、ニトロフェニル；ベンジル；メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；及びニトロベンジル）；カルボニル−保護基（例えば、アセタール及びケタール基、例えば、ジメチルアセタール、１，３−ジオキソランなど；アシラル基；並びにジチアン基、例えば、１，３−ジチアン、１，３−ジチオランなど）；カルボン酸−保
護基（例えば、エステル基、例えば、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔ−ブチルエステル、オルトエステルなど；並びにオキサゾリン基。
【０９６４】
本明細書で使用されるとき、用語「オキソ」は、＝Ｏを表す。
本明細書で使用されるとき、接頭辞「ペルフルオロ」は、アルキル基に結合した各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルによって置換されている、本明細書で定義する通りのアニル基を指す。例えば、ペルフルオロ基の例としては、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどが挙げられる。
【０９６５】
本明細書で使用されるとき、用語「ホスホリル」は、
【０９６６】
【化５１】
2017524357.tif 000082
を指す。
【０９６７】
本明細書で使用されるとき、用語「保護（された）ヒドロキシル」は、Ｏ−保護基に結合した酸素原子を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「スピロシクリル」は、両端が、親基の同じ炭素原子に結合して、スピロ環状基を形成する、Ｃ２〜７アルキレンジラジカル、並びに両端が、同じ原子に結合された、Ｃ１〜６ヘテロアルキレンジラジカルを表す。スピロシクリル基を形成するヘテロアルキレンラジカルは、窒素、酸素、及びイオウからなる群から独立に選択される、１つ、２つ、３つ、又は４つのヘテロ原子を含有してよい。一部の実施形態では、スピロシクリル基は、ジラジカルが結合する炭素原子を除いて、１〜７個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、任意選択で、シクロアルキル及び／又はヘテロシクリル基についての任意選択の置換基として本明細書に提供される１、２、３、若しくは４つの置換基で置換してもよい。
【０９６８】
本明細書で使用されるとき、用語「立体異性体」は、化合物（例えば、本明細書に記載する任意の式の化合物）が有し得る、考えられる全ての様々な異性体形態、並びに配座形態、特に、考えられる全ての立体化学及び配座異性体形態、基本的分子構造のあらゆるジアステレオマー、鏡像体及び／又は配座異性体を指す。本発明の一部の化合物は、様々な互変異性体で存在してもよく、その全てが、本発明の範囲に含まれる。
【０９６９】
本明細書で使用されるとき、用語「スルホニル」は、−Ｓ（Ｏ）２−基を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「チオール」は、−ＳＨ基を表す。
化合物：本明細書で使用されるとき、用語「化合物」は、記載する構造の立体異性体、幾何異性体、互変異性体、及びアイソトープの全てを包含することを意味する。
【０９７０】
本明細書に記載する化合物は、非対称であってよい（例えば、１つ又は複数のキラル中心を有する）。別に記載のない限り、あらゆる鏡像体及びジアステレオマーなどの立体異性体が意図される。非対称に置換された炭素原子を含む本開示の化合物は、光学活性又はラセミ形態で単離することができる。光学活性出発材料から光学活性形態を調製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ラセミ混合物の分割又は立体選択的合成によるものがある。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合などの多くの幾何異性体も、本明細書に記載の化合物に存在する可能性があり、こうした安定異性体は全て本開示において考慮される。本開示の化合物のシス及びトランス異性体が記載され、これらは、異性体の混合物又は分離
された異性体形態として単離することができる。
【０９７１】
本開示の化合物はまた、互変異性体形態も含む。互変異性体形態は、隣接する二重結合による単結合のスワッピングと、それに付随するプロトンの移動により生じる。互変異性体形態は、同じ実験式及び総電荷を有する異性体のプロトン化状態である、プロトン放出互変異性体を含む。プロトン放出互変異性体の例として、ケトン−エノールペア、アミド−イミド酸ペア、ラクタム−ラクチムペア、アミド−イミド酸ペア、エナミン−イミンペア、及び環状形態があり、ここで、プロトンは、１Ｈ−及び３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−及び４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−及び２Ｈ−イソインドール、及び１Ｈ−及び２Ｈ−ピラゾールなどの複素環系の２つ以上の位置を占め得る。互変異性体形態は、平衡状態であってもよいし、又は適切な置換によって１つの形態に立体的に固定されていてもよい。
【０９７２】
本開示の化合物はまた、中間又は最終化合物に存在する原子のアイソトープの全てを含む。「アイソトープ」は、同じ原子数を有するが、核内の中性子数が異なるために、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素のアイソトープとしては、トリチウム及び重水素がある。
【０９７３】
本開示の化合物及び塩は、常用の方法により、溶媒又は水分子と組み合わせて調製することにより、溶媒和化合物及び水和物を形成することができる。
拘束（された）（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）：本明細書で使用されるとき、用語「拘束（された）（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」は、細胞に関して述べる場合、細胞が、分化経路中に十分な程度まで進行している時点を意味し、その際、細胞は、正常な状況下で、別の細胞型にではなく、又はより低い分化細胞型に戻るのではなく、特定の細胞型若しくは細胞型のサブセットに分化し続けることになる。
【０９７４】
保存された：本明細書で使用されるとき、用語「保存された」は、比較される２つ以上の配列の同じ位置に非改変状態で存在するものである、それぞれポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基を指す。比較的保存されたヌクレオチド又はアミノ酸は、当該配列の他所に出現するヌクレオチド又はアミノ酸より関連性の高い配列の間で保存されているものである。
【０９７５】
一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一であれば、「完全に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一であれば、「高度に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、又は約９９％同一であれば、「高度に保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一であれば、「保存されている」と言う。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、又は約９９％同一であれば、「保存されている」と言う。配列の保存は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長に適用してもよいし、又はその一部、領域若しくは特徴に適用することもできる。
【０９７６】
制御放出：本明細書で使用されるとき、用語「制御放出」は、治療成果をもたらすように特定のパターンの放出に適合する医薬組成物又は化合物放出を指す。
環式又は環状化：本明細書で使用されるとき、用語「環状」は、連続的ループの存在を
指す。環状分子は、環状でなくてもよく、連結されて、サブユニットの非開裂鎖を有するだけでよい。本発明の操作ＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの環状分子は、単一ユニット若しくは多量体であってもよいし、又は複合体又はさらに高次構造の１つ又は複数の成分を含んでもよい。
【０９７７】
細胞増殖抑制：本明細書で使用されるとき、「細胞増殖抑制」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、プリオン、又はこれらの組み合わせの成長、分裂、若しくは増殖を阻害、低減、抑制することを指す。
【０９７８】
細胞傷害性：本明細書で使用されるとき、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、プリオン、又はこれらの組み合わせを殺傷するか、又はこれらに傷害性、毒性、又は致命的な作用を引き起こすことを指す。
【０９７９】
送達：本明細書で使用されるとき、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴ若しくはペイロードを送達する作用又は方法を指す。
送達剤：本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、標的細胞に対するキメラポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
【０９８０】
不安定化された：本明細書で使用されるとき、「不安定な」、「不安定化する」、又は「不安定化領域」は、同じ領域又は分子の出発、野生型若しくはネイティブ形態よりも不安定な領域又は分子を意味する。
【０９８１】
検出可能な標識：本明細書で使用されるとき、「検出可能な標識」は、Ｘ線撮影、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む当技術分野で公知の方法により容易に検出される別の実体と結合した、それに組み込まれた、若しくはそれと会合した、１つ又は複数のマーカ、シグナル、又は部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位体、発蛍光団、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びハプテン、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は、本明細書に開示するペプチド又はタンパク質中の任意の位置に配置してよい。これらは、アミノ酸、ペプチド、若しくはタンパク質内にあってもよいし、又はＮ−若しくはＣ末端に位置してもよい。
【０９８２】
ジアステレオマー：本明細書で使用されるとき、用語「ジアステレオマー」は、互いの鏡像ではなく、且つ、互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
消化する：本明細書で使用されるとき、用語「消化する」は、より小さい断片又は成分に分解することを意味する。ポリペプチド又はタンパク質に関する場合、消化によって、ペプチドの産生が起こる。
【０９８３】
分化細胞：本明細書で使用されるとき、用語「分化細胞」は、そのネイティブ形態では多能性ではない任意の体細胞を指す。分化細胞はまた、部分的に分化した細胞も包含する。
【０９８４】
分化：本明細書で使用されるとき、用語「分化因子」は、所望の細胞型に分化するように、細胞を誘導することができるタンパク質、ＲＮＡ又は小分子などの発生能改変因子を指す。
【０９８５】
分化する：本明細書で使用されるとき、用語「分化する」は、非拘束又は低拘束細胞が、拘束細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。
遠位：本明細書で使用されるとき、用語「遠位」は、中心から離れて、又は目的の地点若しくは領域から離れて位置することを意味する。
【０９８６】
投与レジメン：本明細書で使用されるとき、用語「投与レジメン」は、治療、予防、若しくは緩和医療の投与スケジュール又は医師が決定したレジメンである。
用量分割係数（ＤＳＦ）−１日総用量又は１単位用量のＰＵＤで割った用量分割治療のＰＵＤの比。この値は、投与レジメン群の比較から得られる。
【０９８７】
鏡像体：本明細書で使用されるとき、用語「鏡像体」は各々、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像体の少なくとも９０％と他方の鏡像体の最大１０％）、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９８％の光学純度又は鏡像体過剰率（当技術分野で標準的方法により決定される通り）を有する本発明の化合物の個別の光学活性形態を意味する。
【０９８８】
封入する：本明細書で使用されるとき、用語「封入する」は、包み込む、取り囲む、又は包むことを意味する。
コードされたタンパク質切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「コードされたタンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【０９８９】
操作された：本明細書で使用されるとき、本発明の実施形態は、それらが、出発点、野生型若しくはネイティブ分子から変化した特徴又は特性（構造的若しくは化学的にかかわらず）を有するように設計されているとき、「操作されている」。
【０９９０】
有効量：本明細書で使用されるとき、ある薬剤の「有効量」という用語は、有益又は所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、従って、「有効量」は、適用される状況に応じて変動する。例えば、癌を治療する薬剤を投与する状況において、薬剤の有効量は、例えば、その薬剤を投与せずに得られた応答と比較して、癌の治療（本明細書で定義する通り）を達成する上で十分な量である。
【０９９１】
エキソソーム：本明細書で使用されるとき、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞により分泌される小胞又はＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、下記のイベントの１つ又は複数を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）；（３）ポリペプチド又はタンパク質へのＲＮＡの翻訳；並びに（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。
【０９９２】
特徴：本明細書で使用されるとき、「特徴」は、特徴、特性、又は特有の要素を指す。
製剤：本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくともキメラポリヌクレオチド及び送達剤を含む。
【０９９３】
断片：本明細書で使用されるとき、「断片」は、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離した完全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含み得る。
【０９９４】
機能性：本明細書で使用されるとき、「機能性」生体分子は、それが特徴とする特性及び／又は活性を呈示する形態の生体分子である。
相同性：本明細書で使用されるとき、「相同性」は、ポリマー分子同士、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／若しくはＲＮＡ分子）同士並びに／又はポリペプチド分
子同士の全体的関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一であるか、又は類似していれば、互いに「相同的」であるとみなされる。用語「相同的」は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列）同士の比較を指す。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの区間にわたって、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％であれば、相同的であるとみなされる。一部の実施形態では、相同的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の独自に指定したアミノ酸の区間をコードする能力を特徴とする。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４〜５個の独自に指定したアミノ酸の区間をコードする能力によって決定される。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの区間にわたって、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％同一であれば、相同的であるとみなされる。
【０９９５】
同一性：本明細書で使用されるとき、用語「同一性」は、ポリマー分子同士、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／若しくはＲＮＡ分子）同士並びに／又はポリペプチド分子同士の全体的関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性（％）の計算は、例えば、最適な比較の目的のために２つの配列をアラインメントすることによって実施することができる（例えば、最適アラインメントのために、第１及び第２核酸配列の一方若しくは両方にギャップを導入することができ、非同一配列は、比較目的のために無視することができる）。いくつかの実施形態では、比較目的のためにアラインメントした配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１配列のある位置が、第２配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているとき、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列同士の同一性（％）は、２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列が共通に有する同じ位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列同士の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、ヌクレオチド配列同士の同一性（％）は、以下の文献に記載されているものなどの方法を用いて決定することができる：「分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォーマティック及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９３年；「分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ハイーネ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第１部、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）及びグリフィン，Ｈ．Ｇ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州、１９９４年；並びに「配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）及びデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍ．ストックトン・プレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９１年；これらの各々は、全体として参照により本
明細書に組み込むものとする。例えば、２つのヌクレオチド配列同士の同一性（％）は、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用い、アライン（ＡＬＩＧＮ）プログラム（バージョン２．０）に組み込まれているメイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）及びミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（カビオス（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年、第４巻：ｐ．１１〜１７）を使用して決定することができる。あるいは、２つのヌクレオチド配列同士の同一性（％）は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを用いて、決定することもできる。配列同士の同一性（％）を決定するために一般的に使用されている方法として、限定はしないが、カリロ，Ｈ（Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ）及びリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）著、ＳＩＡＭ応用数学会誌（ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８）、第１０７３巻、１９８８年（これは、全体として参照により本明細書に組み込む）に記載の方法がある。同一性を決定する技術は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列同士の相同性を決定する例示的コンピュータソフトウェアとして、限定しないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、デベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻（１）、ｐ．３８７、１９８４年）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ、アルトシェル，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、分子生物学会誌（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、ｐ．４０３、１９９０年）が挙げられる。
【０９９６】
免疫グロビン：本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロビン」（Ｉｇ）は、「抗体」と置き換え可能に使用することができる。
感染因子：本明細書で使用されるとき、用語「感染因子」は、感染症を引き起こすことができる因子を意味する。
【０９９７】
遺伝子の発現を阻止する：本明細書で使用されるとき、語句「遺伝子の発現を阻止する」は、遺伝子の発現産物の量の減少を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであってよい。典型的に、ｍＲＮＡのレベルの減少によって、そこから翻訳されるポリペプチドのレベルの減少が起こる。発現のレベルは、ｍＲＮＡ又はタンパク質を測定する標準的技術を用いて決定することができる。
【０９９８】
感染因子：本明細書で使用されるとき、「感染因子」は、いずれかの微生物、ウイルス、感染物質、若しくは生物工学の結果として操作され得るバイオ製品、又はこうした微生物、ウイルス、感染物質、若しくはバイオ製品のいずれかの天然に存在する若しくは生物工学で作製された成分を指し、これらは、ヒト、動物、植物若しくは別の生物において、新興感染症及び接触伝染病、死亡若しくは他の生物学的機能不全を引き起こし得る。
【０９９９】
インフルエンザ：本明細書で使用されるとき、「インフルエンザ」又は「フルー（インフルエンザ）」は、インフルエンザウイルスである、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のＲＮＡウイルスを原因とする鳥類及び哺乳動物の感染症である。
【１０００】
異性体：本明細書で使用されるとき、用語「異性体」は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像体、又はジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ又は複数のキラル中心及び／又は二重結合を有し得るため、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）又はジアステレオマー（例えば、鏡像体（すなわち、（＋）若しくは（−））又はシス／トランス異性体）として存在し得ることが認識される。本発明によれば、本明細書で描かれる化学構造、従って、本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち、立体異性体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋、鏡像体的に純
粋、又はジアステレオマー的に純粋な）形態並びに鏡像体及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体の両方を包含する。本発明の化合物の鏡像体及び立体異性体の混合物は、典型的に、公知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体として化合物を結晶化する方法、又はキラル溶媒中で化合物を結晶化する方法により、それらの成分鏡像体又は立体異性体に分割することができる。鏡像体及び立体異性体はまた、公知の非対称合成方法により、立体異性体的に又は鏡像体的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から取得することもできる。
【１００１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用されるとき、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、生物（例えば、動物、植物、若しくは微生物）ではなく、人工環境、例えば、試験管若しくは反応槽内、細胞培養下、ペトリ皿内などで起こるイベントを指す。
【１００２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用されるとき、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、生物（例えば、動物、植物、若しくは微生物）において起こるイベントを指す。
単離された：本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、（天然であれ、又は実験状況であれ）それが結合していた構成成分の少なくとも一部から分離されている物質又は実体を指す。単離された物質は、それらが結合していた物質に対して変化したレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／又は実体は、それらが当初結合していた他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離されていてもよい。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、それが実質的に他の構成成分を含まない場合、「純粋」である。
【１００３】
実質的に単離された：本明細書で使用されるとき、用語「実質的に単離された」は、それが形成又は検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的分離は、例えば、本開示の化合物が濃縮された組成物を含む。実質的分離は、本開示の化合物、又はその塩の重量当たり少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％を含有する組成物を含み得る。組成物及びその塩を単離する方法は当技術分野で常用的である。
【１００４】
リンカー：本明細書で使用されるとき、リンカーは、原子、例えば、１０〜１，０００原子の１団を指し、限定はしないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、イオウ、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどの原子又は原子団を含み得る。リンカーは、第１端で、核酸塩基又は糖部分上の修飾ヌクレオシド若しくはヌクレオチドに結合させると共に、第２端で、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤又は治療薬に結合させることができる。リンカーは、核酸配列への組み込みを妨害しないように、十分な長さのものであってよい。リンカーは、例えばキメラポリヌクレオチド多量体（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子の連結を介して）又はキメラポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するため、並びに本明細書に記載する通りのペイロードを投与するためなどの、あらゆる有用な目的のために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例として、限定はしないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、又はヘテロシクリルが挙げられ、これらの各々は、本明細書に記載する通り、任意選択で置換することができる。リンカーの例として、限定はしないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレン又はプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、又はテトラエチレングリコール）、及び
デキストランポリマー及びこれらの誘導体が挙げられる。その他の例として、限定はしないが、リンカー内で切断可能な部分、例えば、還元剤又は光分解を用いて切断することができるジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）又はアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）が挙げられる。選択的に切断可能な結合の非制限的例として、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、若しくはその他の還元剤、及び／又は光分解の使用により切断することができるアミド結合、並びに例えば、酸性若しくは塩基性加水分解により切断することができるエステル結合が挙げられる。
【１００５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書で使用されるとき、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位は、ｍｉＲＮＡの少なくとも「シード」領域が結合する核酸転写物のヌクレオチド位置又は領域を表す。
【１００６】
修飾された：本明細書で使用されるとき「修飾された」は、本発明の分子の変化した状態又は構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的方法を含め、様々な方法で修飾され得る。一実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、それが天然のリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関連するとき、非天然のヌクレオシド及び／又はヌクレオチドの導入により修飾される。キャップ構造などの非標準のヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるものの、「修飾された」ものとはみなされない。
【１００７】
モノクローナル抗体：本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、自然に起こり得る突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性体化、アミド化）（わずかな量で存在し得る）を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して指令され、高度に特異的である。
【１００８】
粘液：本明細書で使用されるとき、「粘液」は、粘性であり、且つムチン糖タンパク質を含む天然の物質を指す。
天然に存在する：本明細書で使用されるとき、「天然に存在する」は、人工的な補助なしに自然中に存在することを意味する。
【１００９】
中和抗体：本明細書で使用されるとき、「中和抗体」は、その抗原に結合して、抗原若しくは感染因子が有するいずれかの生体活性を中和又は無効化することによって、抗原若しくは感染因子から細胞を防御する抗体を指す。
【１０１０】
非ヒト脊椎動物：本明細書に記載されるとき、「非ヒト脊椎動物」には、野生種及び家畜化された種を含め、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を除くあらゆる脊椎動物が含まれる。非ヒト脊椎動物の例として、限定はしないが、哺乳類、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、畜牛、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、及びヤクが挙げられる。
【１０１１】
オフターゲット：本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、いずれか１つ又は複数の標的、遺伝子、又は細胞転写物に対する何らかの意図しない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレームに終止コドンを含まない配列を指す。
【１０１２】
作動可能に連結された：本明細書で使用されるとき、語句「作動可能に連結された」は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能性連結を指す。
任意選択で置換された：本明細書において、「任意選択で置換されたＸ」（例えば、任
意選択で置換されたアルキル）という形態の語句は、「Ｘ（ここで、Ｘは任意選択で置換される）」（例えば、「アルキル（ここで、アルキルは、任意選択で置換される）」と同等であるものとする。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択であることを意味するわけではない。
【１０１３】
ペプチド：本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長である。
【１０１４】
パラトープ：本明細書で使用されるとき、「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位を指す。
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を求める若しくは必要とし得る、治療を必要とする、治療を受けている、治療を受けようとする対象、又は特定の疾患又は条件について専門家によるケアを受けている対象を指す。
【１０１５】
薬学的に許容される：語句「薬学的に許容される」は、本明細書において、信頼できる医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を起こすことなく、妥当なベネフィット／リスク比に相応する、ヒト及び動物の組織との接触での使用に好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指して用いられる。
【１０１６】
薬学的に許容される賦形剤：語句「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載する化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁又は溶解可能なビヒクル）であって、患者において実質的に非毒性且つ非炎症性の特性を有する任意の成分を指す。賦形剤としては、例えば、以下のものが挙げられる：抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、塗膜形成剤又はコーティング剤、香味料、芳香剤、滑剤（流動促進剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤又は分散剤、甘味料、及び水和水。例示的な賦形剤として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトール。
【１０１７】
薬学的に許容される塩：本開示はまた、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」は、開示する化合物の誘導体を指し、ここで、親化合物は、既存の酸部分又は塩基部分をその塩形態に（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させて）変換することによって修飾されている。薬学的に許容される塩の例としては、限定はしないが、アミンなどの塩基性残基の無機塩又は有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フ
マル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ塩又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、並びに非毒性アンモニウム、第４級アンモニウム、及びアミンカチオン、例えば、限定はしないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性の無機酸又は有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩がある。本開示の薬学的に許容可能な塩は、塩基部分又は酸部分を含む親化合物から従来の化学的方法によって合成することができる。概して、こうした塩は、これらの化合物の遊離酸又は塩基形態と、水中若しくは有機溶媒中、又は両者の混合物中の適切な塩基若しくは酸の化学量論量とを反応させることによって調製することができ；一般に、非水性媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルが好ましい。好適な塩のリストは、「レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン、１９８５年、ｐ．１４１８、「製薬用塩：特性、選択、及び使用」、Ｐ．Ｈ．シュタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）及びＣ．Ｇ．ウェルムート（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（編）、ワイリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、及びベルゲ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、薬剤科学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、ｐ．１〜１９、１９７７年に見出され、これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【１０１８】
薬学的に許容される溶媒和物：用語「薬学的に許容される溶媒和物」は、本明細書で使用されるとき、好適な溶媒の分子が結晶格子に取り込まれている本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される用量で生理学的に許容可能である。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、又はその混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、又は沈殿により調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と称される。
【１０１９】
薬物動態：本明細書で使用されるとき、「薬物動態」は、それが、生存生物に投与される物質の運命の決定に関する場合、分子又は化合物のいずれか１つ又は複数の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝及び排出の程度及び速度を含む、いくつかの分野に分けられる。これは、一般にＡＤＭＥと呼ばれ、ここで、（Ａ）吸収（Ａｂｓｏｒｔｉｏｎ）は、血液循環に侵入する物質のプロセスであり；（Ｄ）分布（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、体液及び身体の組織全体にわたる物質の分散又は播種であり；（Ｍ）代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）（若しくは生体内変化）は、親化合物から娘代謝物への不可逆的変化であり；並びに（Ｅ）排出（若しくは排除）は、身体からの物質の排除を指す。稀に、一部の薬物は、身体組織内に不可逆的に蓄積する場合がある。
【１０２０】
物理化学的：本明細書で使用されるとき、「物理化学的」は、物理的及び／又は化学的特性、又はそれに関するものを意味する。
単位薬物当たりのポリペプチド（ＰＵＤ）：本明細書で使用されるとき、ＰＵＤ又は単位薬物当たりの産物は、体液若しくは組織中で測定される産物（例えば、ポリペプチド）の総１日量（通常、１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇなど）の細分された部分として定義され、通常、体液中の測定基準で割った濃度、例えば、ｐモル／ｍＬ、ｍモル／ｍＬなどで決定される。
【１０２１】
予防する：本明細書で使用されるとき、用語「予防する」は、感染、疾患、障害及び／若しくは病状の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／若しくは病状の１つ又は複数の症状、特徴、若しくは臨床徴候の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／若しくは病状の１つ又は複数の症状、特徴、若しくは徴候の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の疾患、障害及び／若しくは病状からの進行を部分的又は完全に遅延させること；並びに／又は感染、疾患、障害、及び／若しくは病状に関連する疾病が発生するリスクを低下させることを指す。
【１０２２】
プロドラッグ：本開示はまた、本明細書に記載する化合物のプロドラッグも含む。本明細書で使用されるとき、「プロドラッグ」は、物質、分子又は実体が、化学的若しくは物理的改変時に治療薬として作用することを示す形態である任意の物質、分子又は実体を指す。プロドラッグは、何らの方法で共有結合又は隔離してもよく、これは、哺乳動物対象への投与前、投与時若しくは投与後に放出されるか、又は活性薬物部分に変換される。プロドラッグは、親化合物に対して、常用の操作又はｉｎ  ｖｉｖｏで、修飾が切断されるように、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、又はカルボキシル基が、任意の基に結合し、これが、哺乳動物対象に投与されると、切断して、それぞれ、遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、又はカルボキシル基を形成する化合物を含む。プロドラッグの調製及び使用は、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）及びＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）著、「新規送達系としてのプロドラッグ（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、第１４巻、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ）、及び「薬物設計における生物可逆性担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）」エドワードＢ．ロッシュ（Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）編、米国製剤協会及びパーガモン・プレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年に論述されており、これらはいずれも、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。
【１０２３】
増殖する：本明細書で使用されるとき、用語「増殖する」は、成長、拡張若しくは増加する、又は急速に成長、拡張若しくは増加することを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に対抗するか、又はそれに不適切な特性を有することを意味する。
【１０２４】
前駆細胞：本明細書で使用されるとき、用語「前駆細胞」は、それが分化によってもたらし得る細胞に関して、より大きな発生能を有する細胞を指す。
予防的：本明細書で使用されるとき、「予防的」は、疾患の広がりを予防するために使用される治療又は処置の過程を指す。
【１０２５】
予防：本明細書で使用されるとき、「予防」は、健康を維持し、疾患の広がりを予防するために取られる措置を指す。「免疫予防」は、疾患の広がりを予防するために能動又は受動免疫を生成させる処置を指す。
【１０２６】
タンパク質切断部位：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断部位」は、アミノ酸鎖の制御された切断が、化学的、酵素的、又は光化学的手段によって達成され得る部位を指す。
【１０２７】
タンパク質切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断シグナル」は、切断のためのポリペプチドを示す又はマークする少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質：本明細書で使用されるとき、「目的のタンパク質」又は「所望のタンパク質」には、本明細書に提供されるもの並びにその断片、突然変異体、変異体、及び改変物が含まれる。
【１０２８】
近位：本明細書で使用されるとき、用語「近位」は、中心又は目的の地点若しくは領域に対し、より近傍に位置することを意味する。
プソイドウリジン：本明細書で使用されるとき、プソイドウリジンは、ヌクレオシドウリジンのＣ−グリコシド異性体を指す。「プソイドウリジン類似体」は、プソイドウリジンの任意の修飾物、変異体、アイソフォーム又は誘導体である。例えば、プソイドウリジン類似体として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、１−プロピル−プソイドウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、及び２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）。
【１０２９】
精製された：本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製された」、「精製」は、不要な成分、材料不純物、混合物若しくは不完全物から実質的に純粋に、又は清浄にすることを意味する。
【１０３０】
反復トランスフェクション：本明細書で使用されるとき、用語「反復トランスフェクション」は、キメラポリヌクレオチドによる同じ細胞培養物の複数回のトランスフェクションを指す。細胞培養物は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回以上トランスフェクトすることができる。
【１０３１】
サンプル：本明細書で使用されるとき、用語「サンプル」又は「生体サンプル」は、その組織、細胞又は構成部分（例えば、限定はしないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液及び精液を含む体液）のサブセットを指す。サンプルには、全生物、又はその組織、細胞若しくは構成部分のサブセット、あるいは、その画分若しくは部分、限定はしないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側切片、気道、腸管、及び尿生殖路、涙液、唾液、乳汁、血球、腫瘍、臓器から調製されるホモジネート、ライセート又は抽出物がさらに含まれ得る。サンプルはさらに、タンパク質又は核酸分子などの細胞成分を含有し得る栄養ブイヨン又はゲルなどの媒体を指す
。
【１０３２】
シグナル配列：本明細書で使用されるとき、語句「シグナル配列」は、タンパク質の輸送又は局在化を指令することができる配列を指す。
１単位用量：本明細書で使用されるとき、「１単位用量」は、１用量／１回／１経路／１接触点、すなわち１回の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。
【１０３３】
類似性：本明細書で使用されるとき、用語「類似性」は、ポリマー分子同士、例えば、核酸分子同士（例えばＤＮＡ分子及び／若しくはＲＮＡ分子間）並びに／又はポリペプチド分子同士の全体的な関連性を指す。ポリマー分子同士の類似性（％）の計算は、同一性（％）の計算と同様に実施することができるが、但し、類似性（％）の計算は、当技術分野において理解される通り、保存的置換を考慮する。
【１０３４】
分割用量：本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、１単位用量又は１日総用量の２つ以上の用量への分割である。
安定した：本明細書で使用されるとき、「安定した」は、反応混合物から有用な純度までの単離に耐えるほど十分に頑健な化合物を指し、これは、有効な治療薬への製剤化が可能であることが好ましい。
【１０３５】
安定化された：本明細書で使用されるとき、「安定化する」、「安定化された」、「安定化領域」は、安定にする、又は安定になることを意味する。
立体異性体：本明細書で使用されるとき、用語「立体異性体」は、化合物（例えば、本明細書に記載する任意の式の化合物）が有し得る、考えられる全ての様々な異性体形態、並びに配座形態、特に、考えられる全ての立体化学及び配座異性体形態、基本的分子構造のあらゆるジアステレオマー、鏡像体及び／又は配座異性体を指す。本発明の一部の化合物は、様々な互変異性体で存在してもよく、その全てが、本発明の範囲に含まれる。
【１０３６】
対象：本明細書で使用されるとき、用語「対象」又は「患者」は、本発明の組成物が、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療目的で投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類などの哺乳動物）及び／又は植物が挙げられる。
【１０３７】
実質的に：本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性の全て若しくはほぼ全ての範囲又は程度を示す定性的条件を指す。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が完結する、及び／又は完全性に至る又は絶対的な結果を達成若しくは回避することは、あるにしても、稀であることを理解するであろう。従って、用語「実質的に」は、本明細書では、多くの生物学的及び化学的現象に特有の、完全性の欠如の可能性を捕捉するために使用される。
【１０３８】
実質的に等しい：用量間の時間差に関して本明細書で使用されるとき、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：複数の用量に関して本明細書で使用されるとき、この用語は、２秒以内を意味する。
【１０３９】
〜に罹患している：疾患、障害、及び／又は病状「に罹患している」個体は、疾患、障害、及び／又は病状を有すると診断されているか、又はその１つ又は複数の症状を呈示する。
【１０４０】
〜に罹患しやすい：疾患、障害、及び／又は病状「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、及び／又は病状を有すると診断されていない、並びに／又はその症状を呈示しないこ
ともあるが、疾患若しくはその症状を発生する傾向を有する。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、以下の１つ又は複数を特徴とし得る：（１）疾患、障害、及び／又は病状の発生に関連する遺伝子突然変異；（２）疾患、障害、及び／又は病状の発生に関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、及び／又は病状に関連するタンパク質及び／又は核酸の発現及び／又は活性の増大及び／又は低減；（４）疾患、障害、及び／又は病状の発生に関連する習慣及び／又は生活様式；（５）疾患、障害、及び／又は病状の家族歴；並びに（６）疾患、障害、及び／又は病状の発生に関連する微生物への曝露及び／又は感染。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／又は病状を発生することになる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／又は病状を発生しない。
【１０４１】
持続放出：本明細書で使用されるとき、用語「持続放出」は、特定の期間にわたって特定の放出速度に従う医薬組成物又は化合物放出プロフィールを指す。
合成：用語「合成」は、人の手で生成、調製、及び／又は製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチド若しくはポリペプチド又は他の分子の合成は、化学又は酵素的であってよい。
【１０４２】
標的細胞：本明細書で使用されるとき、「標的細胞」は、目的の１つ又は複数の細胞を指す。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕで又は生物の組織若しくは臓器中に見出され得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であってよい。
【１０４３】
治療薬：用語「治療薬」は、対象に投与されると、治療的、診断的、及び／若しくは予防的効果を及ぼし、並びに／又は所望の生物学的及び／若しくは薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
【１０４４】
治療有効量：本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、感染、疾患、障害、及び／若しくは病状に罹患しているか、又はそれに罹患しやすい対象に投与されたとき、感染、疾患、障害、及び／若しくは病状を治療し、その症状を改善し、それを診断し、予防し、並びに／又はその発症を遅延させるのに十分な、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
【１０４５】
治療上有効な転帰：本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な転帰」は、感染、疾患、障害、及び／若しくは病状に罹患しているか、又はそれに罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、及び／若しくは病状を治療し、その症状を改善し、それを診断し、予防し、並びに／又はその発症を遅延させるのに十分である転帰を意味する。
【１０４６】
１日総用量：本明細書で使用されるとき、「１日総用量」は、２４時間で投与される、又は処方される量である。これは、１単位用量として投与してもよい。
分化全能性：本明細書で使用されるとき、「分化全能性」は、成人身体に見出される細胞の全て、並びに胎盤を含む胚外組織を生成する発生能を備えた細胞を指す。
【１０４７】
転写因子：本明細書で使用されるとき、用語「転写因子」は、例えば、転写の活性化又は抑制により、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を指す。ある転写因子は、転写だけの調節を実施するが、他の転写因子は、他のタンパク質と共同して作用する。ある転写因子は、特定の条件下で、転写の活性化及び抑制の両方が可能である。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定の共通配列に酷似する１つ又は複数の特定の標的配列に結合する。転写因子は、単独で、又は他の分子との複合体として、標的遺伝子の転写を調節し得る。
【１０４８】
転写：本明細書で使用されるとき、用語「転写」は、外性核酸を細胞中に導入する方法を指す。トランスフェクションの方法として、限定はしないが、化学的方法、物理的処理及びカチオン性脂質又は混合物などが挙げられる。
【１０４９】
分化転換：本明細書で使用されるとき、「分化転換」は、１細胞型の分化細胞が、固有の特徴を喪失して、その表現型を他の完全に分化した細胞のものに変化させる能力を指す。
【１０５０】
治療する：本明細書で使用されるとき、用語「治療する」は、特定の感染症、疾患、障害、及び／若しくは病状の１つ又は複数の症状又は特徴を部分的若しくは完全に軽減し、寛解させ、改善し、緩和し、その発症を遅延させ、その進行を阻止し、その重症度を低下させ、並びに／又はその発生率を低下させることを指す。例えば、癌を「治療する」とは、腫瘍の生存、成長、及び／又は広がりを阻止することを指し得る。治療は、疾患、障害、及び／若しくは病状に関連する疾病が発生するリスクを低減することを目的として、疾患、障害、及び／若しくは病状の徴候を呈していない対象、並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは病状の初期徴候のみを呈する対象に投与することができる。
【１０５１】
非修飾：本明細書で使用されるとき、「非修飾」は、何らかの方法で変更される前のあらゆる物質、化合物又は分子を指す。非修飾は、常にではないが、生体分子の野生型若しくはネイティブ形態を指す場合もある。分子は、一連の修飾を受けることができ、その際、各修飾分子は、次の修飾のための「非修飾」出発分子として役立ち得る。
【１０５２】
単能性：本明細書で使用されるとき、「単能性」は、細胞に関して述べる場合、単一の細胞株を生み出す細胞を意味する。
ワクチン：本明細書で使用されるとき、語句「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫を向上させる生物製剤を指す。
【１０５３】
ウイルスタンパク質：本明細書で使用されるとき、語句「ウイルスタンパク質」は、ウイルスを起源とするあらゆるタンパク質を意味する。
同等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態の様々な同等物を認識するか、又は常用の実験を用いるだけでそれらを確認することができるだろう。本発明の範囲は、以上の説明に限定することは意図されず、添付の特許請求の範囲に示される通りである。
【１０５４】
特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、文脈から反対又はその他の解釈が明らかでない限り、１つ又は複数を意味し得る。ある群の１つ又は複数のメンバー間に「又は」を含むクレーム若しくは記載は、文脈から反対又はその他の解釈が明らかでない限り、群メンバーの１つ、２つ以上、若しくは全てが、所与の製品又は方法に存在する、そこで使用される、あるいは、それに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、その群の厳密に１つのメンバーが所与の製品又は方法に存在する、そこで使用される、あるいは、それに関連する実施形態を含む。本発明は、群メンバーの２つ以上、又は全てが所与の製品又は方法に存在する、そこで使用される、あるいは、それに関連する実施形態を含む。
【１０５５】
また、用語「含む」は、開放型であることが意図され、さらなる要素又はステップの包含を可能にする（しかし要求するわけではない）ことも注記される。従って、用語「含む」が本明細書で使用されるとき、用語「〜から構成される」も包含され、開示される。
【１０５６】
別に定義されない限り、本明細書で使用する技術及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示で使用する方法及び材料は、本明細書に記載されており；当技術分野で公知の他の好適な方法及び材料を使用することもできる。
【１０５７】
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、特に指示のない限り、又はその他の解釈が文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値が、文脈から明らかに指示されるのでない限り、その範囲の下限値の単位の１０分の１までの、本発明の種々の実施形態記載する範囲内のいずれかの具体的な値又は部分範囲を想定し得ることは理解されるべきである。
【１０５８】
加えて、先行技術の範囲に含まれる本発明のいずれかの具体的な実施形態は、クレームのいずれか１つ又は複数から明示的に除外され得ることは理解されるべきである。こうした実施形態は、当業者に公知であるとみなされることから、それらは、その除外が本明細書に明示的に記載されない場合であっても除外され得る。本発明の組成物のいずれかの具体的な実施形態（例えば、任意の核酸又はそれによりコードされるタンパク質；任意の生成方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在と関連するか否かにかかわらず、何らかの理由でいずれか１つ又は複数のクレームから除外され得る。
【１０５９】
引用出典、例えば、本明細書に引用される参照文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び技術は、引用が明示的に記載されていない場合であっても、参照により本願に組み込むものとする。引用出典と本願との記載の間に矛盾が生じた場合、本願の記載が優先されるものとする。
【１０６０】
セクション及び表の見出しは、限定的であることを意図しない。
（実施例）
実施例１．キメラポリヌクレオチドの製造
本発明によれば、キメラポリヌクレオチド及び又はその部分若しくは領域の製造は、「ＲＮＡ転写物生成のための製造方法（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）」と題する国際公開第２０１４１５２０２７号パンフレット（代理人整理番号Ｍ５００）（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されている方法を使用して達成することができる。
【１０６１】
精製方法として、「ｍＲＮＡ生成におけるＤＮＡ断片の除去方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」と題する国際公開第２０１４１５２０３０号パンフレット（代理人整理番号Ｍ５０１）；「リボ核酸精製（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」と題する国際公開第２０１４１５２０３１号パンフレット（代理人整理番号Ｍ５０２）（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示されているものがある。
【１０６２】
ポリヌクレオチドの検出及び特性決定方法は、「ｍＲＮＡ分子の特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」と題する国際公開第２０１４１４４０３９号パンフレット（代理人整理番号Ｍ５０５）（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示される通りに実施することができる。
【１０６３】
本発明のキメラポリヌクレオチドの特性決定は、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素配列決定、電荷分布分析、及びＲＮＡ不純物の検出からなる群から選択される方法を用いて達成することができ、ここで、特性決定は、ＲＮＡ転写物配列の決定、ＲＮＡ転写
物の純度の決定、又はＲＮＡ転写物の電荷不均質性の決定を含む。こうした方法は、例えば、「ｍＲＮＡ不均質性及び安定性の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」と題する国際公開第２０１４１４４０３９号パンフレット（代理人整理番号Ｍ５０６）及び「ｍＲＮＡのイオン交換精製（Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ）」と題する国際公開第２０１４１４４７６７号パンフレット（代理人整理番号Ｍ５０７）（これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み込む）に教示される通りに実施することができる。
【１０６４】
実施例２．キメラポリヌクレオチド合成：三リン酸経路
概論
本発明によれば、三リン酸ケミストリーを用いて、キメラポリヌクレオチドの２つの領域若しくは部分を結合又は連結することができる。
【１０６５】
本発明によれば、１００ヌクレオチド以下の第１の領域は、５’一リン酸及び末端３’ｄｅｓＯＨ又は遮断ＯＨと化学的に合成される。この領域が、８０ヌクレオチドより長ければ、２つの鎖として合成し、連結してもよい。
【１０６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を用いて、非位置的に修飾された領域又は部分として第１の領域又は部分を合成する場合、次に、５’一リン酸の変換、続いて３’末端のキャッピングを実施してもよい。
【１０６７】
一リン酸保護基は、当技術分野で公知の保護基のいずれかから選択してよい。
キメラポリヌクレオチドの第２の領域又は部分は、化学的合成又はＩＶＴ法のいずれを用いて実施してもよい。ＩＶＴ法は、ＲＮＡポリメラーゼを含んでもよく、その場合、修飾キャップを含むプライマーを使用することができる。あるいは、最大１３０ヌクレオチドのキャップを化学的に合成した後、ＩＶＴ領域又は部分にカップリングしてもよい。
【１０６８】
連結方法の場合、ＤＮＡｓｅでの処理後にＤＮＡ  Ｔ４リガーゼと連結すれば、コンカテマー化が容易に回避されることに留意されたい。
キメラポリヌクレオチド全体をリン酸−糖骨格で製造する必要はない。領域又は部分の１つが、ポリペプチドをコードする場合、こうした領域又は部分は、リン酸−糖骨格を含むことが好ましい。
【１０６９】
次に、いずれか公知のクリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、又は当業者には周知の他のバイオコンジュゲートケミストリーを用いて、連結を実施する。
【１０７０】
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを用いて作製する。こうしたセグメントとして、以下のものが挙げられる：
（ａ）通常の３’ＯＨを含む、キャップ付加且つ保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含み得ると共に、通常の３’ＯＨを含む５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）
（ｃ）コルジセピンを含むか、又は３’ＯＨを含まないキメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、テイル）の５’一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）
合成（化学的又はＩＶＴ）の後、セグメント３（ＳＥＧ．３）をコルジセピン、次にピロホスファターゼで処理することにより、５’一リン酸を形成する。
【１０７１】
次に、ＲＮＡリガーゼを用いて、セグメント２（ＳＥＧ．２）をＳＥＧ．３と連結させる。続いて、連結したポリヌクレオチドを精製してから、ピロホスファターゼで処理することにより、二リン酸を切断する。その後、処理済ＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３構築物を精製した後、ＳＥＧ．１を５’末端に連結させる。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを実施してもよい。
【１０７２】
キメラポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする場合、リガンド又は結合セグメントは、次のように表わされる：５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレーム又はＯＲＦ（ＳＥＧ．２）及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）。
【１０７３】
各ステップの収率は、９０〜９５％にもなり得る。
実施例３：ｃＤＮＡ生成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡ調製のためのＰＣＲ手順は、カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（マサチューセッツ州ウォバーン）による２×カパ・ハイファイ（ＫＡＰＡ
ＨＩＦＩ）（商標）ホットスタート・レディミックス（ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）を使用して実施する。このシステムは、２×カパ・レディミックス（ＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；リバースプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇ；及び２５．０μｌに希釈されたｄＨ２Ｏを含む。反応条件は、９５℃で５分間、９８℃で２０秒間を２５サイクル、次いで５８℃で１５秒間、続いて７２℃で４５秒間、続いて７２℃で５分間、次に終了まで４℃である。
【１０７４】
本発明のリバースプライマーは、ｍＲＮＡのポリＡ１２０（配列番号２１）のためのポリＴ１２０（配列番号２４）を組み込んでいる。より長い又はより短いポリ（Ｔ）トラクトを含む他のリバースプライマーを用いて、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルの長さを調節することができる。
【１０７５】
インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールズバッド）を製造者の指示に従い使用して（最大５μｇ）、反応物をクリーンアップする。より規模の大きい精製は、より大きな容量を備える製品を用いたクリーンアップが必要になるだろう。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）を用いて、ｃＤＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動を用いた分析により、ｃＤＮＡが予想されたサイズであることを確認する。次に、ｃＤＮＡを配列解析に供してから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応に進む。
【１０７６】
実施例４．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応によって、均質に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが産生される。こうした均質に修飾されたポリヌクレオチドは、本発明のキメラポリヌクレオチドの１領域又は部分を含み得る。投入されるヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、天然及び非天然のＮＴＰを用いて、所内で作製する。
【１０７７】
典型的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応は、以下のものを含む：
１  鋳型ｃＤＮＡ  １．０μｇ
２  １０×転写バッファー（４００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ））２．０μｌ
３  カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）７．２μｌ
４  ＲＮａｓｅ阻害剤  ２０Ｕ
５  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  ３０００Ｕ
６  ｄＨ２Ｏ最大２０．０μｌ、及び
７  ３７℃で３時間〜５時間のインキュベーション。
【１０７８】
翌日にクリーンアップするために、粗ＩＶＴ混合物を４℃で一晩保存してもよい。次に１ＵのＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを用いて元の鋳型を消化する。３７℃で１５分間インキュベートした後、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースティン）を製造者の指示に従い使用して、ｍＲＮＡを精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適切なサイズであること、並びにＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。
【１０７９】
実施例５．酵素的キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングを以下の通りに実施し、その際、混合物は、ＩＶＴ  ＲＮＡ６０μｇ〜１８０μｇ及びｄＨ２Ｏ最大７２μｌを含む。混合物を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させた後、直ちに氷に移す。
【１０８０】
次に、プロトコルは、１０×キャッピングバッファー（０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭ  ＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）；２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（２８μｌまで）の混合；及び６０μｇのＲＮＡに対して３０分間又は１８０μｇのＲＮＡに対して最大２時間の３７℃でのインキュベーションを含む。
【１０８１】
続いて、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースティン）を製造者の指示に従い使用して、ポリヌクレオチドを精製する。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適切なサイズであること、並びにＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。ＲＮＡ産物はまた、配列決定用のｃＤＮＡを作製する逆転写ＰＣＲを実行することにより、配列決定してもよい。
【１０８２】
実施例６．ポリＡテイル付加反応
ｃＤＮＡにポリＴがない場合、最終産物をクリーニングする前にポリＡテイル付加反応を実施しなければならない。これは、キャップ付きＩＶＴ  ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テイル付加バッファー（０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭ  ＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ最大１２３．５μｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより実施される。ポリＡテイルが既に転写物にある場合には、テイル付加反応は省いて、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースティン）（最大５００μｇ）によるクリーンアップに直接進んでもよい。ポリＡポリメラーゼは、酵母に発現する組換え酵素であるのが好ましい。
【１０８３】
ポリＡテイル付加反応の処理能力又は完全性から必ずしも正確なサイズのポリＡテイルが得られない場合もあることは理解すべきである。従って、約４０〜２００ヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１
５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４又は１６５ヌクレオチドのポリＡテイルは本発明の範囲内にある。
【１０８４】
実施例７．天然５’キャップ及び５’キャップ類似体
ポリヌクレオチドの５’−キャッピングは、製造者のプロトコルに従い、５’−グアノシンキャップ構造を生成する以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応中に同時に完了することができる：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウィッチ）。修飾ＲＮＡの５’−キャッピングは、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成するワクシニアウイルスキャッピング酵素（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、転写後に完了することもできる。ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼの両方を用いて、キャップ１構造を生成してもよく、これによって、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルが得られる。キャップ１構造と、これに続く２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いた５’側の終わりから３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化から、キャップ２構造を生成することもできる。キャップ２構造と、これに続く２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いた５’側の終わりから４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化から、キャップ３構造を生成することもできる。酵素は、組換え供給源に由来するのが好ましい。
【１０８５】
哺乳動物細胞にトランスフェクトされると、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間又は１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間若しくは７２時間超の安定性を有する。
【１０８６】
実施例８．キャッピングアッセイ
Ａ．タンパク質発現アッセイ
本明細書に教示するキャップのいずれかを含み、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドは、同じ濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後６、１２、２４及び３６時間の時点で、培地中に分泌されたタンパク質の量をＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。より高レベルのタンパク質を培地中に分泌する合成キメラポリヌクレオチドは、より高度の翻訳コンピテントキャップ（Ｃａｐ）構造を有する合成キメラポリヌクレオチドに対応すると考えられる。
【１０８７】
Ｂ．純度分析合成
本明細書に教示するキャップのいずれかを含み、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドは、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動又はＨＰＬＣ分析を用いて、純度について比較することができる。電気泳動による単一の連結バンドを有するキメラポリヌクレオチドは、複数のバンド又は線状のバンドを有するキメラポリヌクレオチドと比較して、より高純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成キメラポリヌクレオチドもまた、より高純度の産物に対応する。より高い効率のキャッピング反応は、より高純度のポリヌクレオチド集団を提供すると考えられる。
【１０８８】
Ｃ．サイトカイン分析
本明細書に教示するキャップのいずれかを含み、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドは、様々な濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後６、１２、２４及び３６時間の時点で、培地中に分泌されたＴＮＦ−α及びＩＦＮ−βなどの炎症促進性サイトカインの量をＥＬＩＳＡによりアッセイすることができ
る。より高レベルの炎症促進性サイトカインを培地中に分泌するキメラポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するキメラポリヌクレオチドに対応すると考えられる。
【１０８９】
Ｄ．キャッピング反応効率
本明細書に教示するキャップのいずれかを含み、ポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理後、ＬＣ−ＭＳによりキャッピング反応効率について分析することができる。キャップ付加キメラポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理によって、遊離ヌクレオチドと、ＬＣ−ＭＳにより検出可能なキャップ付加５’−５−三リン酸キャップ構造との混合物が得られる。ＬＣ−ＭＳスペクトルによるキャップ付加産物の量は、反応からの全キメラポリヌクレオチドの割合（％）として表すことができ、キャッピング反応効率に対応すると考えられる。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳによるより多量のキャップ付加産物を有すると考えられる。
【１０９０】
実施例９．修飾ＲＮＡ又はＲＴ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個別のキメラポリヌクレオチド（２０μｌの体積中２００〜４００ｎｇ）又は逆転写ＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）をウェル中の非変性１．２％アガロースＥ−ゲル（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド）上にロードし、製造者のプロトコルに従い１２〜１５分泳動させた。
【１０９１】
実施例１０．ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）修飾ＲＮＡの定量及びＵＶスペクトルデータ
ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）ＵＶ吸光度読み取りのためにＴＥバッファー（１μｌ）中の修飾キメラポリヌクレオチドを使用して、化学的合成又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応からの各キメラポリヌクレオチドの収率を定量した。
【１０９２】
実施例１１．リピドイドを用いた修飾ｍＲＮＡの製剤化
細胞への添加の前に、キメラポリヌクレオチドをリピドイドと設定比で混合することにより、キメラポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のために製剤化する。ｉｎ  ｖｉｖｏ製剤化は、全身にわたる循環を促進するために、さらに別の成分の添加が必要となる場合がある。これらのリピドイドが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの作用に好適な粒子を形成する能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ−リピドイド製剤化に用いられる標準的製剤化プロセスを出発点として使用してもよい。粒子の形成後、キメラポリヌクレオチドを添加して、複合体と一体化させる。標準的色素排除アッセイを用いて、カプセル化効率を決定する。
【１０９３】
実施例１２．タンパク質発現についてのスクリーニング方法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与したキメラポリペプチドによりコードされたタンパク質を含有し得る生体サンプルを調製し、１、２、３又は４台の質量分析計を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）についての製造者のプロトコルに従い分析する。生体サンプルは、タンデムＥＳＩ質量分析システムを用いて分析してもよい。
【１０９４】
タンパク質断片、又は全タンパク質のパターンを所与のタンパク質の既知の対照と比較し、比較により同一性を決定する。
Ｂ．マトリックス支援レーザ脱離／イオン化
対象に投与した１つ又は複数のキメラポリペプチドによりコードされたタンパク質を含有し得る生体サンプルを調製し、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）についての製造者のプロトコルに従い分析する。
【１０９５】
タンパク質断片、又は全タンパク質のパターンを所与のタンパク質の既知の対照と比較
し、比較により同一性を決定する。
Ｃ．液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析
１つ又は複数のキメラポリペプチドによりコードされたタンパク質を含有し得る生体サンプルは、トリプシン酵素で処理して、そこに含まれるタンパク質を消化してもよい。得られるペプチドは、液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により分析する。ペプチドを質量分析計で断片化して、コンピュータアルゴリズムによりタンパク質配列データベースとマッチし得る診断パターンを取得する。所与のタンパク質について１ｎｇ以下の出発材料を取得するために、消化されたサンプルを希釈してもよい。単純なバッファーバックグラウンド（例えば、水又は揮発性塩）を含有する生体サンプルは、直接的溶液中消化を被りやすい；より複雑なバックグラウンド（例えば、洗剤、非揮発性塩、グリセロール）は、サンプル分析を促進するために、追加のクリーンアップステップが必要である。
【１０９６】
タンパク質断片、又は全タンパク質のパターンを所与のタンパク質の既知の対照と比較し、比較により同一性を決定する。
実施例１３．環状化及び／又はコンカテマー化
本発明によれば、ポリＡ結合タンパク質及び５’末端結合タンパク質同士の相互作用を補助するために、キメラポリヌクレオチドを環状化、又はコンカテマー化して、翻訳コンピテント分子を作製してもよい。環状化又はコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路：１）化学的、２）酵素的、及び３）リボザイム触媒によって起こり得る。新しく形成した５’／３’結合は、分子内又は分子間のいずれであってもよい。
【１０９７】
第１の経路では、核酸の５’末端及び３’末端は、化学的に反応性の基を含有し、これらは、互いに接近すると、分子の５’末端と３’末端との間に新たな共有結合を形成する。有機溶媒中で、合成ｍＲＮＡの３’末端の３’アミノ末端ヌクレオチドが、５’−ＮＨＳ−エステル部分で求核攻撃を受けて、新たな５’／３’アミド結合を形成するように、５’末端は、ＮＨＳ−エステル反応性基を含有し、３’末端は、３’アミノ末端ヌクレオチドを含有し得る。
【１０９８】
第２の経路では、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて、５’−リン酸化核酸分子を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素的に連結することにより、新たなホスホロジエステル結合を形成することができる。一例の反応では、製造者のプロトコルに従い、１〜１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州イプスウィッチ）と１μｇの核酸分子を３７℃で１時間インキュベートする。酵素的連結反応を補助するために、連結反応は、並列の５’−及び３’−領域の両方と塩基対合が可能な分断ポリヌクレオチドの存在下で行ってもよい。
【１０９９】
第３の経路では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写中に、得られる核酸分子が、核酸分子の５’末端を核酸分子の３’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含有できるように、ｃＤＮＡ鋳型の５’末端又は３’末端のいずれかが、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、グループＩイントロン、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ｖｉｒｕｓ）、ヘアピン（Ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムに由来するものでもよいし、又はセレックス（ＳＥＬＥＸ）（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ
ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）により選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間を要し得る。
【１１００】
実施例１４．ｍＲＮＡ構築物の合成
プラスミドの制限消化
ＤＮＡプラスミド（５０ｎｇ／μＬ）、ＢＳＡ（１×）、１×ＮＥバッファー（ＮＥＢ
ｕｆｆｅｒ）４（５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．９）、及びＸｂａＩ（４００Ｕ／ｍＬ）（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する５０μＬの反応物において、３７℃で２時間のインキュベーションによりＤＮＡプラスミドを消化した。１％アガロースゲルにより制限消化物を分析し、ＰＣＲに直接使用した。
【１１０１】
ＤＮＡ鋳型増幅
線状化プラスミド（２０ｎｇ）、ｄＮＴＰ（各０．２μＭ）、フォワードプライマー（０．２μＭ）、リバースプライマー（０．２μＭ）、１×Ｑ５反応バッファー、及びＱ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（２０Ｕ／ｍＬ）（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた１００ｕＬ反応物中でのＰＣＲにより、所望のＤＮＡ鋳型を増幅した。全ての成分は、サーモサイクラーに添加するまで氷上に保持した。表７に示す以下のサーモサイクラー法を実施した。
【１１０２】
【表７】
2017524357.tif 000083
線状化プラスミドのＤＮＡ配列を表８に掲載し、プライマー配列を表９に掲載する。
【１１０３】
【表８−１】
2017524357.tif 000084
【１１０４】
【表８−２】
2017524357.tif 000085
【１１０５】
【表９】
2017524357.tif 000086
ＰＣＲ産物は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析し、限外濾過（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））により脱塩した。
【１１０６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応は、ＤＮＡ鋳型（２５ｎｇ／μＬ）、ＮＴＰ（各７．６ｍＭ）、１×Ｔ７  ＩＶＴ反応バッファー、ＲＮａｓｅ阻害剤（１Ｕ／μＬ）、ピロリン酸塩（１Ｕ／μＬ）、及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（７Ｕ／μＬ）（ＮＥＢ）を含有する５０ｕＬ中で実施した。一般に、構築物当たり２４の５０ｕＬ反応物を使用した。５−メチル−ＣＴＰ及び１−メチル−プソイドＵＴＰを用いて、修飾ｍＲＮＡを作製した。ＩＶＴ反応物を３７℃で４時間インキュベートした後、２．５μＬのＤＮａｓｅＩ（２０００Ｕ／ｍＬ）（ＮＥＢ）を添加して、反応物をさらに４５分間インキュベートした。反応物を一緒にした後、メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）スピンカラム（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて精製し、２５０μＬの水中に溶離させた。ＩＶＴ産物をＣＥ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析した。表１０は、ＲＮＡ転写物の配列を示す。５’−アジ化物を含有するｍＲＮＡについては、１：１６比のＧＴＰ：５’−アジド−５’−デオキシグアノシン（ＤＭＳＯに溶解させたカーボシンス（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）をそれぞれ０．４５ｍＭ及び７．１５ｍＭの最終濃度で使用して、転写を実施した。この性質の構築物は、酵素的キャッピングには付さなかった。
【１１０７】
【表１０−１】
2017524357.tif 000087
【１１０８】
【表１０−２】
2017524357.tif 000088
【１１０９】
【表１０−３】
2017524357.tif 000089
【１１１０】
【表１０−４】
2017524357.tif 000090
【１１１１】
【表１０−５】
2017524357.tif 000091
キャッピング
最後のＩＶＴステップから溶離したＲＮＡ（２２０μＬ）は、６５℃まで１５分間加熱した後、少なくとも２分間冷却することにより、変性させた。キャッピング反応は、変性ＲＮＡ（２２０μＬ）、ＧＴＰ（１ｍＭ）、ＳＡＭ（０．５ｍＭ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１Ｕ／μＬ）、１×キャッピングバッファー、及びワクシニアキャッピング複合体（０．４Ｕ／μＬ）（ＮＥＢ）を含む３００μＬ中で実施した。これらの反応物はサーモミキサ上で、３７℃で２時間インキュベートした。メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）スピンカラム（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて反応物を精製した後、２５０μＬ中に溶離させた。溶離したｍＲＮＡをＣＥ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析し、ＵＶ吸光度により定量した。
【１１１２】
実施例１５．３’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸（３’−アジド−ｄｄＡＴＰ）の組み込み
スキーム１に描く通りに、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、３’−アジド−ｄｄＡＴＰをテイルなしのＲＮＡ１〜３（表１０）の３’末端に組み込んだ。１００μＬの反応物中で、ＲＮＡ転写物（０．２μＭ）、３’−アジド−ｄｄＡＴＰ（５００μＭ）、マウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）（１Ｕ／μＬ）、１×反応バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２０μＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、１０％グリセロール）、及び酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（２４００Ｕ、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））を３７℃で１時間インキュベートした後、エタノール沈殿を実施した。ＲＮＡを１００μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解させてから、イルストラ・ニック（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＩＣＫ）カラム又はイルストラ・マイクロスピン（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ）Ｇ−２５カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いたゲル濾過によりさらに精製した。必要であれば、アミコン・ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−０．５遠心分離装置（１００Ｋ  ＮＭＷＬ）を用いた限外濾過によりＲＮＡを濃縮し、ＵＶ吸光度により定量して、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）
２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析した（図１３）。この時点で得られたＲＮＡは、ＣＥにより識別することができない非修飾及び３’−アジドＲＮＡの混合物であり、この混合物は、これ以上精製せずに、後の反応に使用した。
【１１１３】
【化５２】
2017524357.tif 000092
スキーム１．酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いたＲＮＡの３’末端への３’−アジドｄｄＡＴＰの組み込みによる３’−アジドＲＮＡの一般的合成
歪促進アジド−アルキン環状付加（ＳＰＡＡＣ）ケミストリーを用いて、ＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートを作製するために、５’−ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）ポリ（Ａ）テイル１〜６を合成した。テイル１及び４は、固相ホスホロアミダイトオリゴマー化技術により直接合成することができたが、テイル２、３、５、及び６は、まず５’−アミノ誘導体（テイル２ａ、３ａ、５ａ、及び６ａ）として合成した後、これらをＮＨＳケミストリーによって反応性ＢＣＮ基とカップリングさせた（スキーム２）。
【１１１４】
【化５３−１】
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【１１１５】
【化５３−２】
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スキーム２．テイル２、３、５、及び６の合成は、対応する５’−アミノオリゴリボヌクレオチドをＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩにカップリングすることにより達成した。
【１１１６】
テイル１、２ａ、３ａ、４、５ａ、６ａ、７及び８は、固相ホスホロアミダイトオリゴマー化技術を用いて、エクスペダイト（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）８９０９ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（パースペクティブ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ））上にアセンブリした。合成は、多孔性ガラス（ＣＰＧ、１０００Å）製の固体支持体上で、３’末端に３’−３’−結合を生成する３１μモル／ｇのロード量の固定化３’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン（プライム・シンセシス（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｓｉｓ）、米国、ペンシルベニア州アストンから入手）か、又は３２μモル／ｇでロードされる固定化５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−アデノシン（ケムジーンズ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）、マサチューセッツ州ウィルミントン；米国）のいずれかで開始した。意図する配列の合成のために、以下のホスホロアミダイトを使用した：（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト（ＳＡＦＣプロリゴ（ＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ）、ドイツ、ハンブルク）及び５’−クリック−イージー（５’−Ｃｌｉｃｋ−ｅａｓｙ）（登録商標）ＢＣＮ  ＣＥＰ  ＩＩ（ベリー・アンド・アソシエイツ社（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、米国ミシガン州デクスター）。５’末端にアミノ−リンカーを導入するために、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）保護アミノヘキシルホスホロアミダイト（ＳＡＦＣプロリゴ（ＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ）、ドイツ、ハンブルク）のいずれかを使用した。３’−アミノリンカーは、プライム・シンセシス（Ｐｒｉｍｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）から入手可能なフタルイミジル保護アミノヘキシル誘導体化ＣＰＧ又はグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（米国バージニア州スターリング）から入手可能なフタルイミジル保護アミノプロピル誘導体化ＣＰＧを用いて作製した。アミダイトを全て無水アセトニトリル（１００ｍＭ）に溶解させ、分子篩（３Å）を添加した。５−エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中５００ｍＭ）を活性化剤溶液として使用した。カップリング時間は、ヌクレオシドホスホロアミダイトの場合５分、リンカーアミダイトの場合１２分であった。ホスホロチオエート結合を導入するために、無水アセトニトリル／ピリジン（１：１ｖ／ｖ）中の５０ｍＭ溶液
の３−（（ジメチルアミノ−メチルイデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、ケムジーンズ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）から入手）を使用した。ＲＮＡ合成のためのアンシラリー（Ａｎｃｉｌｌａｒｙ）試薬（デブロック（Ｄｅｂｌｏｃｋ）、オキシダイザー（Ｏｘｉｄｉｚｅｒ）、キャップ（Ｃａｐ）Ａ及びキャップ（Ｃａｐ）Ｂ）は、ＳＡＦＣプロリゴ（ＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ）（ドイツ、ハンブルク）から購入した。固相合成の完結後、乾燥させた固体支持体を１５ｍＬのポリプロピレンチューブに移し、ＲＮＡを固体支持体から切断した後、当技術分野で公知の方法（ウィンコット  Ｆ．（Ｗｉｎｃｏｔｔ  Ｆ．）ら著、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．）、１９９５年、第２３巻、ｐ．２６７７〜８４）により脱保護した。
【１１１７】
ＡＫＴＡエクスプローラ（ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）システム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ、フライブルク）上で、Ｘブリッジ（ＸＢｒｉｄｇｅ）Ｃ１８  １９×５０ｍｍカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、ドイツ、エシュボルン）を用いたＲＰ  ＨＰＬＣにより、粗オリゴマーを精製した。バッファーＡは、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（バイオソールブ（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ）、オランダ、ファルケンスワールト）であり、バッファーＢは、バッファーＡ中に９５％アセトニトリルを含有した。１５ｍＬ／分の流量を使用した。２６０及び２８０でのＵＶトレースを記録した。５７カラム容量内の５％Ｂから４５％Ｂへの勾配を使用した。適切な画分をプールし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ＝５．２及び７０％エタノールで沈殿させた。ペレットを遠心分離により単離し、水に溶解させた後、溶液の濃度をＵＶ光度計（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ドイツ）を用いた２６０ｎｍでの吸光度測定により決定した。あるいは、オートサンプラＡ９０５及びＦｒａｃ９５０（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ、フライブルク）を備えたＡＫＴＡピュリファイア（ＡＫＴＡ
Ｐｕｒｉｆｉｅｒ）上で、ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＤＮＡ  ＰＡＣ  ＰＡ２００カラム（９×２５０ｍｍ）を用いたアニオン交換ＨＰＬＣにより粗オリゴマーを精製した。１０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、２０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％アセトニトリルを含有するバッファーＡと、バッファーＡ中に５００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４を含有するバッファーＢから構成されるバッファー系を用いて、修飾ＲＮＡ配列を溶離した。１５カラム容量（ＣＶ）内で５ｍＬ／分の流量及び５％バッファーＢから９５％バッファーＢへの勾配を使用した。溶離を２８０ｎｍで記録し、適切なサイズの画分を採取した。所望の配列を含む画分をプールし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ＝５．２及び７０％エタノールで沈殿させた。ペレットを遠心分離により単離し、８５％エタノールで洗浄してから、水に溶解させた後、ＵＶ光度計（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ドイツ）を用いた２６０ｎｍでの吸光度測定により、溶液の濃度を決定した。
【１１１８】
上記のスキーム２に描く通りのＮＨＳケミストリーによりテイル２、３、５、及び６を生成するカップリングステップのために、それぞれのアミン修飾オリゴリボヌクレオチドは、５００μＭの濃度をもたらすように、１００ｍＭホウ酸ナトリウム／ＫＣｌバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させた。クリック−イージー（Ｃｌｉｃｋ−ｅａｓｙ）（登録商標）ＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩ（５ｍｇ、ベリー・アンド・アソシエイツ社（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、米国ミシガン州デクスター）を５０μＬのＤＭＳＯに溶解させた。３当量のＢＣＮ誘導体をＲＮＡ溶液に添加することにより、反応を開始した。反応の進行は、アニオン交換ＨＰＬＣカラム（ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＤＮＡ  Ｐａｃ  ＰＡ２００、４×２５０ｍｍ、ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）、ドイツ、イトシュタイン）上の保持時間の変化によりモニターした。反応の完了後、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）／ＥｔＯＨを用いて、オリゴリボヌクレオチドコンジュゲートを沈殿させてから、Ｃ１８  Ｘブリッジ（ＸＢｒｉｄｇｅ）逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、ドイツ、エシュボルン）上で精製した。オリゴリボヌクレオチドの分析を表１１に示す。表１１において、「ａ」は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した純度を指し、「ｂ」は、ＡＥＸ−ＨＰＬＣにより決定した純度を指す。
【１１１９】
【表１１】
2017524357.tif 000095
実施例１６．５’−三リン酸、３’−シクロオクチンオリゴ合成
５’−三リン酸及び３’−シクロオクチンを含むＴＰオリゴ１及び２の構造及び配列を以下に示す。５’−三リン酸は、エクシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）（有機化学会誌（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ）、１９８９年、第５４巻、ｐ．６３１〜６３５）により考案された手法から改変されたブラウンリー（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）ら（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ）、１９９５年、第１４巻、ｐ．２６４１〜２６４７）により公開された方法に従い、若干の変更を加えて合成した。手短には、前述の方法に従って、最終ＤＭＴ基の除去（「ＤＭＴオフ」合成）を備えたフタルイミジル保護アミノプロピル誘導体化多孔性ガラス（ＣＰＧ）により、１μモルスケールで対応するＲＮＡ配列を合成した。自動化合成の完了後、合成カラムを５ｍＬアセトニトリルで洗浄し、アルゴンフラッシュで洗浄した。続いて、２つの注射器を用いて、アセトニトリル中の１２５ｍＭ  ２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン（サリチルホスホロクロリダイト、ＴＣＩヨーロッパ（ＴＣＩ  Ｅｕｒｏｐｅ）、ドイツ、エシュボルンから入手）及びアセトニトリル中の５０％２，６−ルチジンの１：１混合物２ｍＬで、合成カラム内のＣＰＧ結合ＲＮＡを室温で５分間処理した。次に、試薬混合物を除去し、アセトニトリル（１０ｍＬ）でＣＰＧを入念に洗浄した後、アセトニトリル中の１２５ｍＭトリブチルアンモニウムピロリン酸塩２ｍＬと一緒に室温で１５分のインキュベーションを実施した。ピロリン酸塩は、公開された手順（核酸化学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１．２８．１〜１．２８．１６）に従って調製した。アセトニトリル（１０ｍＬ）でこの試薬を洗い流した後、固相ＲＮＡ合成で使用されている酸化剤溶液（水／ピリジン１０／９０ｖ／ｖ中１００ｍＭヨウ素）を用いて、酸化（５分）を達成した。最後に、再度アセトニトリルで酸化剤溶液を洗い流した後、４０％アセトニトリル中の１００ｍＭトリエチルアンモニウム重炭酸塩２ｍＬで、ＣＰＧを室温で２時間処理した。ＣＰＧをアセトニトリルで洗浄し、真空を適用して１５分間乾燥させた後、前述の標準的ＲＮＡ脱保護に従って脱保護した。
【１１２０】
オートサンプラＡ９０５及びＦｒａｃ９５０（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ、フライブルク）を備えたＡＫＴＡピュリファイア（ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ）上で、ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＤＮＡ  ＰＡＣ  ＰＡ２００カラム（９×２５０ｍｍ）を用いたアニオン交換ＨＰＬＣにより、粗５’−三リン酸ＲＮＡ配列を精製した。１０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、２０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％アセトニトリルを含有するバッファーＡと、バッファーＡ中に５００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４を含有するバッファーＢから構成されるバッファー系を用いて、修飾ＲＮＡ配列を溶離した
。１５カラム容量（ＣＶ）内での５ｍＬ／分の流量及び５％バッファーＢから７５％バッファーＢへの勾配を使用した。溶離を２８０ｎｍで記録し、適切なサイズの画分を採取した。所望の配列を含む画分をプールし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ＝５．２及び７０％エタノールで沈殿させた。
【１１２１】
３’−アミノプロピル誘導体化三リン酸ＲＮＡを含有するペレットを１００ｍＭホウ酸ナトリウム／ＫＣｌバッファー（ｐＨ８．５）に溶解させて、約５００μＭの濃度を得た。以下の表に示す配列を生成するために、クリック−イージー（ＣＬＩＣＫ−ＥＡＳＹ）（登録商標）ＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩ又はクリック−イージー（ＣＬＩＣＫ−ＥＡＳＹ）（登録商標）ＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩＩ（いずれも、ベリー・アンド・アソシエイツ社（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、米国ミシガン州デクスターから入手可能である）のいずれかと、前述の手順に従い反応させた。
【１１２２】
【化５４】
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ＴＰオリゴ１及びＴＰオリゴ２の配列を表１２に示す。表１２において、Ａは、ＲＮＡ−Ａを表し；Ｃは、ＲＮＡ−Ｃを表し；Ｇは、ＲＮＡ−Ｇを表し；（Ｃ３ＮＨ）は、アミノプロピルであり；（ＢＣＮ１）は、クリック−イージー（ＣＬＩＣＫ−ＥＡＳＹ）（登録商標）ＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩであり；（ＣＯＭ−ＮＨＳ）は、クリック−イージー（ＣＬＩＣＫ−ＥＡＳＹ）（登録商標）ＢＣＮ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩＩであり；（ｐｐｐ）は、三リン酸を表す。
【１１２３】
【表１２】
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表１３は、ＥＭＩ−ＭＳ並びにＴＰオリゴ１及び２の純度分析を示す。
【１１２４】
【表１３】
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実施例１７．歪促進アジド−アルキン環状付加（ＳＰＡＡＣ）を用いたポリ（Ａ）テイル共役
歪促進アジド−アルキン環状付加（ＳＰＡＡＣ）を用いて、３’末端が３’−アジド−ｄｄＡＴＰで修飾されたＲＮＡ転写物を８０ｎｔ５’−ＢＣＮポリ（Ａ）テイルに連結することにより、スキーム３に示す一般的形態のＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートを取得した。３’−アジドＲＮＡ１〜３とテイル１を少なくとも１：５０モル比で水中に混合してから、７０％エタノールの最終濃度に達するまで、エタノールで希釈した。一般に、３’−アジドＲＮＡの濃度は、反応混合物中１５０〜４００ｎＭであった。反応物を室温で１時間振盪させ、必要であれば２００μＬまで水で希釈し、エタノール沈殿させた後、ＤＥＰＣ処理水に溶解させる。あるいは、メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））により反応物を精製した後、水中に溶離させた。ＲＮＡ反応混合物は、図１４に示すように、ＣＥ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析した。レーン３、５、及び７のシフトしたバンドは、それぞれ、スキーム３に描く形態のコンジュゲートＲＮＡ１−テイル１、ＲＮＡ２−テイル１、及びＲＮＡ３−テイル１を表す。ＣＥから決定されたＲＮＡ−テイル１コンジュゲートの変換収率は、ＲＮＡ１が７１％、ＲＮＡ２が８０％、ＲＮＡ３が７５％であった。
【１１２５】
また、上記と同様に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写を介したポリ（Ａ）テイルを既に含むＲＮＡ４及びＲＮＡ５と、テイル１及び４とを用いてコンジュゲートを作製した。これらの反応（ＣＥ）からの変換収率は、全て約９５％であった。６Ｍ塩酸グアニジンの存在下での変性限外濾過を使用して、余剰の非反応５’−ＢＣＮテイルを除去した。水によるＵＦバッファー交換により塩類を除去した後、テイルの除去をＣＥにより確認した。
【１１２６】
【化５５】
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スキーム３．３’−アジドＲＮＡ及び５’−ＢＣＮポリ（Ａ）テイルとのＳＰＡＡＣによるＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルの一般的合成
実施例１８．ＳＰＡＡＣを用いたＤＮＡスプリント鋳型ポリ（Ａ）テイル共役
ＲＮＡ１〜３の３’末端及びポリ（Ａ）テイルと相同的なＤＮＡスプリント（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＣＡＣＴＣＡＧＡＣＴＴＴＡＴ−３’；配列番号２０）を用いて、ＳＰＡＡＣ反応物を鋳型化した。ＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートは、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１００μＬの反応物中に、３’−アジドＲＮＡ、５’−ＢＣＮポリ（Ａ）テイル、及びスプリントを１：３：３のモル比で混合することにより合成し、それぞれ１００ｎＭ：３００ｎＭ：３００ｎＭの最終濃度とする。ＲＮＡ及びＤＮＡスプリント混合物を７０℃で５分間加熱し、２５℃に達するまで１℃／分で冷却した後、２５℃で一晩維持した。限外濾過（アミコン・ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−０．５遠心分離装置１００Ｋ  ＮＭＷＬ）により塩類を除去した。ＤＮＡスプリントは、わずか２００ｎｇ／μＬの反応混合物、１×反応バッファー、及びＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（２Ｕ）を含有する５０μＬの反応物中のＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いた消化により除去した。これらの反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、２μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加により停止させた。バッファー成分を限外濾過により再度除去した。オリゴ（Ｔ）ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて、非修飾及び非反応３’−アジドＲＮＡからＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートを精製した。ビーズを洗浄し、ＲＮＡサンプルは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する高塩濃度バッファー中で調製した以外は、製造者のプロトコルにより指示される通りにオリゴ（Ｔ）精製を実施し、結合後に、ビーズは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する低塩濃度バッファーで洗浄し、ＲＮＡ−ポリ（Ａ）テイルコンジュゲートは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶離させた。クリック反応及び精製の全ステップは、ＣＥ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））により分析したが、その一例は、ＲＮＡ１の反応及び精製によってＲＮＡ１−テイル１コンジュゲートを得る図１５に示される。図１６は、テイル１〜６を有するＲＮＡ１、並びにテイル１及び４を有するＲＮＡ２及びＲＮＡ３のオリゴ（Ｔ）精製後のコンジュゲートを示す。これらのコンジュゲートの収率及び純度（％）を表１４に記載する。
【１１２７】
【表１４】
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実施例１９．ＳＰＡＡＣを用いたＤＮＡスプリント鋳型化５’−オリゴ共役
ワクシニアキャッピング複合体（ＮＥＢ）を用いて、ＴＰオリゴ１及び２を酵素的にキャッピングした。反応の前に、６５℃で１０分間加熱することにより、ＲＮＡオリゴを変性させた後、氷上で冷却した。キャッピング反応は、変性ＲＮＡ（１５μＬ）、ＧＴＰ（１ｍＭ）、ＳＡＭ（０．５ｍＭ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１Ｕ／μＬ）、１×キャッピングバッファー、及びワクシニアキャッピング複合体（０．４Ｕ／μＬ）を含む１００μＬ中で実施する。これらの反応物は、サーモミキサ上で３７℃にて１時間加熱し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出した後、エタノールで沈殿させた。キャップ付加したオリゴは、図１７に示すように、変性ＰＡＧＥにより分析した。図１７において、レーン１は、ＴＰオリゴ１、レーン２は、キャップ付加ＴＰオリゴ１、レーン３は、ＴＰオリゴ２、レーン４は、キャップ付加ＴＰオリゴ２である。
【１１２８】
配列５’−ＡＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＣＣ−３’（配列番号２２）を有するスプリントを用いた以外は、前述と同様に、キャップ付加ＴＰオリゴ１及び２、並びに５’−アジドＲＮＡ５を用いて、ＤＮＡスプリント鋳型環状付加を実施した。非キャップ付加ＴＰオリゴ１及び２とのクリック反応も対照として実施した。５’−アジドＲＮＡ５は、ｍＲＮＡ構築物の合成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）のセクションに記載する通りに作製した。前述したように、７０％エタノール中の５’−ＢＣＮテイルとのＳＰＡＡ
Ｃ反応を実施することにより、５’−アジドＲＮＡ５及びキャップ付加ＴＰオリゴ−ＲＮＡ５コンジュゲートを分析した。図１８に示すように、クリック及び非クリック５’−アジドＲＮＡ５の比を決定し、５’−アジ化物の完全反応を仮定することにより、ＲＮＡ５への５’−アジドＧの組み込みが７５％であることが判明した。図１８において、レーン１はラダー、レーン２は５’−アジドＲＮＡ５、レーン３は、非キャップ付加ＴＰオリゴ１−ＲＮＡ５コンジュゲート、レーン４は、キャップ付加ＴＰオリゴ１−ＲＮＡ５コンジュゲート、レーン５は、非キャップ付加ＴＰオリゴ２−ＲＮＡ５コンジュゲート、レーン６は、キャップ付加ＴＰオリゴ１−ＲＮＡ５コンジュゲートである。レーン７〜１１は、５’−ＢＣＮテイルとのＳＰＡＡＣ反応後の前述のサンプルである。
【１１２９】
しかしながら、キャップ付加ＴＰオリゴ−ＲＮＡ５コンジュゲートは、５’−ＢＣＮテイルとの反応を示さなかったが、これは、５’−アジドＲＮＡ５が全て反応したことを示している。キャップ付加ＴＰオリゴ−ＲＮＡ５コンジュゲート反応混合物の約２５％が５’−三リン酸ＲＮＡ５を含有するものの、これらのコンジュゲートは、それ以上精製せずに、トランスフェクション実験に進めた。
【１１３０】
実施例２０．３’−アジド−ｄｄＡＴＰ組み込みの分析
７０％エタノール中でのＳＰＡＡＣ反応後、ＲＮＡ種の混合物が生成されるが、これは、恐らく、非修飾ＲＮＡ、非処理３’−アジドＲＮＡ、及び所望のＲＮＡ−テイル１コンジュゲートを含有している。しかし、非修飾ＲＮＡと３’−アジドＲＮＡは識別不能であるため、これは、ＣＥ電気泳動図の２つの明瞭なピークに対応するに過ぎない。３’−アジドＲＮＡ及びＲＮＡ−テイル１コンジュゲートは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによるポリ（Ａ）伸長のために３’−末端でブロックされることから、非修飾ＲＮＡだけが酵素的テイル付加のための基質である。図１９に示すように、非修飾ＲＮＡ、従って、３’−アジドＲＮＡの割合（％）は、非修飾ＲＮＡの除去及びＲＮＡ−テイル１コンジュゲートピークの面積への正規化後の非修飾ＲＮＡ及び３’−アジドＲＮＡ混合物に対応するピークの面積の差（％）を計算することによって決定することができる。多くの事例で、クリック反応は、記載の条件下で完了まで進行するため、単純にＲＮＡ−テイル１コンジュゲートの収率（％）を決定するだけでアジ化物組み込みの定量が可能である。
【１１３１】
１０μＬにおいて、７０％エタノール中でのＳＰＡＡＣ反応後のＲＮＡ混合物は、ＲＮＡ反応混合物（３００〜４００ｎｇ／μＬ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、及び１×反応バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を含有する反応物において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）（５Ｕ）で処理した。酵素を一切含まない反応物も、比較対照のために使用した。全ての非修飾ＲＮＡがテイル付加されていることを確認するために、非修飾ＲＮＡをテイル１と混合した後、ポリ（Ａ）ポリメラーゼで処理した対照も実施した。限外濾過により反応物から塩類を除去した後、ＣＥにより反応物を分析した。図２０は、このようにして分析したＲＮＡ１、２、及び３のＣＥゲルイメージを示す。対照反応物では、ＰＡＰでの処理により、全ての非修飾ＲＮＡが延伸された。これらの全事例で、ＳＰＡＡＣ反応及びＰＡＰによる処理後、非修飾ＲＮＡ及び３’−アジドＲＮＡの推定混合物を示すピーク中にＲＮＡは一切残っておらず、これは、クリック反応が完了に達し、アジ化物の組み込みが、ＲＮＡ−テイルコンジュゲートの収率（％）から決定することができることを示している。これらの実施例の場合、アジ化物の組み込みは、ＲＮＡ１が６０％、ＲＮＡ２が６０％、及びＲＮＡ３が７５％であった。
【１１３２】
実施例２１．ｍチェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）蛍光の曲線下総面積
リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（商標）を用いて、表示のｍＲＮＡ（５０ｎｇ）をヒーラ細胞にトランスフェクトした。細胞をインキュサイト（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）動態イメージングシステム（エッセン・バイオサイエンス（Ｅｓｓｅｎ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））内に配置し、そこで、１４２時間にわたって２時間毎にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を測定した。各トランスフェクションは３回反復して実施した。グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて、曲線下総面積を統合した。表１５及び１６は、ＲＮＡ１−テイルコンジュゲート及び適切な対照のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のＡＵＣを示し、ここで、ＲＮＡ４及びＲＮＡ５は、それぞれ、８０−ｍｅｒ及び１４０−ｍｅｒポリ（Ａ）テイルを含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写構築物である。表１７は、ＲＮＡ４−テイルコンジュゲート及びＲＮＡ５−テイルコンジュゲートのＡＵＣを示す。表１８は、キャップ付加ＴＰオリゴ−ＲＮＡ５コンジュゲートのＡＵＣを示す。
【１１３３】
【表１５】
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【１１３４】
【表１６】
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【１１３５】
【表１７】
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【１１３６】
【表１８】
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実施例２２．ヒーラ細胞におけるナノルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性
表示のｍＲＮＡ（２５ｎｇ）は、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（商標）を用いて、ヒーラ細胞に３回反復してトランスフェクトした。一晩のインキュベーション後、ＧＬＯ溶解バッファー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中に細胞を溶解させた。ＮａｎｏＧｌｏ基質を添加し、シナジー・マイクロプレート・リーダ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（バイオテク（ＢｉｏＴｅｋ））を用いて、発光シグナルを定量した。表１９は、ＲＮＡ２−テイルコンジュゲート及び適切な対照のナノルシフェラーゼ（ｎａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性を示し、ここで、ＲＮＡ６は、１４０−ｍｅｒポリ（Ａ）テイルを含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写構築物である。
【１１３７】
【表１９】
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実施例２３．ヒーラ細胞におけるヒトＧＣＳＦ発現
表示のｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）は、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（商標）を用いて、ヒーラ細胞に３回反復してトランスフェクトした。一晩のインキュベーション後、上清を回収し、これを用いて、ヒトＧＣＳＦのレベルを測定した（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））。表２０は、ＲＮＡ３−テイルコンジュゲート及び適切な対照の発現レベルを示し、ここで、ＲＮＡ７は、１４０−ｍｅｒポリ（Ａ）テイルを含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写構築物である。
【１１３８】
【表２０】
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実施例２４．ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＢＪ線維芽細胞の上清中のＩＦＮβレベル
表示のｍＲＮＡ（５００ｎｇ）は、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（商標）を用いて、ＢＪ線維芽細胞に３回反復してトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、上清を回収し、これを用いて、ヒトインターフェロンβのレベルを測定した（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））。表２１は、ＲＮＡ２−テイルコンジュゲート及び適切な対照について検出されたＩＦＮβの量を示し、ここで、ＲＮＡ６は、１４０−ｍｅｒポリ（Ａ）テイルを含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写構築物であり、野生型ＲＮＡ６は、修飾ヌクレオチドなしで転写される。
【１１３９】
【表２１】
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その他の実施形態
使用してきた語句は、限定ではなく説明の語句であること、その広範な態様において、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく添付の特許請求の範囲の範囲内で変更が為され得ることは理解すべきである。
【１１４０】
本発明は、いくつかの記載した実施形態に関してある程度の長さで、ある程度の具体性をもって説明してきたが、いずれかのこうした具体的事項若しくは実施形態、又はいずれかの具体的実施形態に本発明を限定することを意図するものではなく、従来の技術を考慮して、特許請求の範囲の考えられる最も広義の解釈をもたらすように、従って、本発明の意図される範囲を実質的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈すべきである。
【１１４１】
本明細書に挙げる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、全体として参照により本明細書に組み込むものとする。矛盾が生じる場合には、定義を含む本明細書が優先される。加えて、セクションの見出し、材料、方法、及び実施例は、例示的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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