(57)【要約】哺乳動物において、Ａ群レンサ球菌の細菌に対する免疫反応を引き起こす方法及び組成物であって、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進するために、ＳｐｙＣＥＰタンパク質またはペプチドフラグメント、或いはＳｐｙＣＥＰタンパク質またはフラグメントに対する抗体と、を哺乳動物に投与することを含む、方法及び組成物が提供される。また、ＳｐｙＣＥＰの免疫優勢ペプチドフラグメントも提供される。
2017513849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、Ａ群レンサ球菌の細菌に対する免疫反応を引き起こす方法であって、前記方法は、前記哺乳動物に、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を投与して、それにより前記哺乳動物においてＡ群レンサ球菌の細菌に対する免疫反応を引き起こす工程を含む、方法。
【請求項２】
Ａ群レンサ球菌の細菌に対して哺乳動物に免疫性を与える方法であって、前記方法は、前記哺乳動物に、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を投与して、それにより前記哺乳動物にＡ群レンサ球菌の細菌に対する免疫性を与える工程を含む、方法。
【請求項３】
哺乳動物におけるＡ群レンサ球菌の細菌感染を治療または予防する方法であって、前記方法は、前記哺乳動物に、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体、或いはその抗体若しくは抗体フラグメントと、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を投与して、それにより前記哺乳動物におけるＡ群レンサ球菌の細菌感染を治療または予防する工程を含む、方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法であって、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体をコードする、そして好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質をコードする１つまたは複数の単離された核酸、あるいはそれらを含む組成物の投与を含む、方法。
【請求項５】
哺乳動物への投与に適した組成物であって、前記組成物は、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体、或いはその抗体若しくは抗体フラグメントと、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を含む、組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物は、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体及び好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質をコードする１つまたは複数の単離された核酸を含むか、或いはそれらを含む組成物を含む、組成物。
【請求項７】
前記好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質は、好中球または好中球活性を通常は直接的に若しくは間接的に、阻害若しくは抑制するタンパク質またはそのフラグメントである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法、或いは請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質は、好中球または好中球活性を通常は直接的に若しくは間接的に、阻害若しくは抑制するタンパク質またはそのフラグメントと結合する抗体若しくは抗体フラグメントである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法、或いは請求項５または６に記載の組成物。
【請求項９】
前記好中球活性は、好中球走化性である、請求項７または８に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質は、インターロイキン８をタンパク質分解的に不活性化するプロテアーゼまたはそのフラグメントである、請求項９に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１１】
前記プロテアーゼはＳｐｙＣＥＰである、請求項１０に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１２】
ＳｐｙＣＥＰのフラグメントは、アミノ酸配列ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）或いは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントを含むか、アミノ酸配列ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）或いは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントから本質的に構成されているか、若しくはアミノ酸配列ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）或いは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントのみからなる、請求項１１に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１３】
前記Ｍタンパクフラグメントは、Ｍタンパクの保存されたＣ−末端領域である、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１４】
前記Ｍタンパクフラグメントは、ｐ１４５アミノ酸配列であるか、ｐ１４５アミノ酸配列を含むか、或いはｐ１４５アミノ酸配列内に包含されている、請求項１３に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１５】
前記Ｍタンパクフラグメントは、Ｊ８ペプチドのアミノ酸配列中に存在している、請求項１４に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１６】
前記Ｍタンパクのフラグメントは、Ｊ８バリアントペプチドであるか、Ｊ８バリアントペプチドを含むか、或いはＪ８バリアントペプチド内に包含されている、請求項１３に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１７】
前記Ｊ８バリアントペプチドは、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号５９）、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＣ（配列番号６０）、ＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６１）及びＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、同アミノ酸配列から本質的に構成されるか、或いは同アミノ酸配列のみからなる、請求項１６に記載の方法、或いは組成物。
【請求項１８】
前記バリアントまたは誘導体は、そのＮ−末端及びＣ−末端の少なくとも一方に、１つまたは複数のリジン残基を含む、請求項１乃至４及び７乃至１７のいずれか一項に記載の方法、或いは請求項５乃至１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の方法、或いは組成物。
【請求項２０】
ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号５９）、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＣ（配列番号６０）、ＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６１）及びＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６２）、並びに配列番号１８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１或いは配列番号６２のいずれか１つのフラグメント、そのバリアント若しくは誘導体、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、同アミノ酸配列から本質的に構成されるか、或いは同アミノ酸配列のみからなる単離されたペプチド。
【請求項２１】
前記バリアント若しくは前記誘導体は、そのＮ−末端及びＣ−末端の少なくとも一方に、１つまたは複数のリジン残基を含む、請求項２０に記載の単離されたペプチド。
【請求項２２】
請求項２０または請求項２１に記載の単離されたペプチドと結合するか、或いは同ペプチドに対して産生された抗体、または抗体フラグメント。
【請求項２３】
請求項２０または請求項２１に記載の単離されたペプチド、フラグメント、バリアント、若しくは誘導体をコードする、単離された核酸。
【請求項２４】
請求項２３の単離された核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項２５】
請求項２４の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２０または請求項２１に記載の単離されたペプチド、フラグメント、バリアント、若しくは誘導体の１つまたは複数を含むか、請求項２２に記載の抗体または抗体フラグメントの１つまたは複数を含むか、請求項２３の単離された核酸を含むか、請求項２４の遺伝子構築物を含むか、及び請求項２５の宿主細胞を含むか、のうちの少なくとも１つである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症の予防及び治療に関する。より詳細には、本発明は、Ａ群レンサ球菌、レンサ球菌に関連した疾患及び症状を治療または予防するためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａ群レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ランスフィールドＡ群レンサ球菌：ＧＡＳ）に対するワクチンは、細菌に起因する衰弱する疾患、特にリウマチ熱及びリウマチ性心疾患の原因となることから長年にわたり探求されてきた。リウマチ熱は、今日では大部分の先進国では稀な疾患ではあるが、発展途上国では依然として、小児、青少年及び若年成人における後天的な心疾患の主たる原因である。加えて、侵襲性のＧＡＳ疾患は、小児及び成人での敗血症の常習的な原因であり、高い致死率を有する。更にはＧＡＳの負荷が加わると、レンサ球菌感染後糸球体腎炎となり、それは多くのＧＡＳ流行地域では、高い割合での末期腎不全の一因となりうる。ＧＡＳ咽頭炎及び膿痂疹は、毎年、最も絶対数の多いＧＡＳ感染に関係している。ＧＡＳ咽頭炎は、毎年学童期の小児のおおよそ８％〜１５％が罹患し、ＧＡＳ膿痂疹は、小児での有病割合が１０〜５０％である最もありふれた感染である。発展途上国における深刻なＧＡＳ関連疾患の問題のみならず、先進国においてさえも、特に毒性のＧＡＳ菌株が出現してきており、それは標準的な抗生物質療法に抵抗性を示し、重篤な壊疽性筋膜炎のような衰弱する疾患を引き起こす。
【０００３】
ＧＡＳの重要な病原性因子は、Ｍタンパクであり、それは強力な抗食作用性であり、血清因子Ｈと結合し、Ｃ３−転化酵素を破壊し、Ｃ３ｂによるオプソニン化を阻止する。Ｃ−リピート領域からのＴ及びＢ細胞エピトープのようなＭタンパクの保存されたＣ−リピート部分からの免疫原性ペプチド、或いはこのＣ−リピート領域からの単一の最小Ｂ細胞エピトープを含むＪ８及びＪ１４ペプチドワクチン、を含むワクチンが開発されてきている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
驚くべきことに、本願の発明者らは、Ａ群レンサ球菌へのＪ８−ペプチド誘導性免疫における重要な因子が好中球活性であることを発見した。インビトロのオプソニン化アッセイは好中球及び補体源として全血を使用しているが、好中球がインビボでの防御のために必要であることは知られていなかった。更に、同オプソニン化アッセイはＣＦＵにおいて比較的わずかな低減（典型的には１０倍未満）を示しているが、インビボにおけるＪ８で誘導された防御は、細菌のバイオバーデンにおいて数桁のオーダーで低減を生じた。具体的に述べると、本願の発明者らは、好中球走性化物質インターロイキン８を不活性化するＳｐｙＣＥＰのような好中球阻害剤が、Ａ群レンサ球菌に対する誘導免疫において、Ｊ８に対して作用することをここに示す。
【０００５】
従って、広い形態において、本発明は、好中球活性を回復または向上させることによって、Ａ群レンサ球菌に対するＭタンパク−誘導免疫を支援することに関する。
本発明の一態様は、哺乳動物においてＡ群レンサ球菌の細菌に対する免疫反応を引き起こす方法であって、哺乳動物にＭタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質（ａｇｅｎｔ）と、を投与して、それにより哺乳動物においてＡ群レンサ球菌の細菌に対する免疫反応を引き起こす工程を含む方法を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様は、Ａ群レンサ球菌の細菌に対して哺乳動物に免疫性を与える方法であって、哺乳動物にＭタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を投与して、それにより哺乳動物にＡ群レンサ球菌の細菌に対する免疫性を与える工程を含む方法を提供する。
【０００７】
本発明の更に別の態様は、哺乳動物におけるＡ群レンサ球菌の細菌感染を治療または予防する方法であって、哺乳動物にＭタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体、或いはその抗体若しくは抗体フラグメントと、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を投与して、それにより哺乳動物におけるＡ群レンサ球菌の細菌感染を治療または予防する工程を含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の更なる態様は、哺乳動物への投与に適した組成物であって、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体、或いはその抗体若しくは抗体フラグメントと、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を含む組成物を提供する。
【０００９】
本発明に関連した態様は、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質とをコードする１つまたは複数の単離された核酸、あるいはこれらを含む組成物の投与を提供する。
【００１０】
特定の実施形態において、Ｍタンパクフラグメントは、Ｍタンパクの保存された領域であるか、Ｍタンパクの保存された領域を含む。一実施形態において、フラグメントは、ｐ１４５ペプチドを含むか、或いはｐ１４５ペプチド内に包含された免疫原性フラグメントである。特定の実施形態において、免疫原性フラグメントは、Ｊ８ペプチド若しくはそのバリアント内にあるか、或いはＪ８ペプチド若しくはそのバリアントを含む。ある実施形態において、バリアントは、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号５９）、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＣ（配列番号６０）、ＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６１）及びＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６２）、或いはそのフラグメント若しくはそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、同アミノ酸配列から本質的に構成されるか、或いは同アミノ酸配列のみからなる。
【００１１】
１つの広い実施形態において、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質は、通常は、好中球または好中球活性を直接的に若しくは間接的に、阻害若しくは抑制するタンパク質またはそのフラグメントである。適切には、タンパク質またはそのフラグメントの投与は、タンパク質及び／またはＡ群レンサ球菌に対する免疫反応を引き起こす。
【００１２】
別の広い実施形態において、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質は、通常は、好中球または好中球活性を直接的に若しくは間接的に、阻害若しくは抑制するタンパク質またはそのフラグメントと結合する抗体若しくは抗体フラグメントである。
【００１３】
特定の実施形態において、タンパク質は、ＳｐｙＣＥＰ若しくはそのフラグメントである。
好ましい実施形態において、フラグメントは、アミノ酸配列ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）を含む。
【００１４】
本発明の別の更なる態様は、単離されたペプチドであって、ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号５９）、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＣ（配列番号６０）、ＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６１）及びＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６２）、或いはそのフラグメント若しくはそのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、同アミノ酸配列から本質的に構成されるか、或いは同アミノ酸配列のみからなる単離されたペプチドを提供する。
【００１５】
関連した態様は、上述の態様の単離されたペプチドをコードする単離された核酸、同単離された核酸を含む遺伝子構築物及び／または同遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００１６】
更なる関連した態様は、上述の態様の単離されたペプチドを結合するか、或いは単離されたペプチドに対して産生される抗体若しくは抗体フラグメントを提供する。
本発明のまた更なる態様は、単離されたペプチド、単離された核酸、遺伝子構築物、宿主細胞及び／またはこれまでの態様の抗体若しくは抗体フラグメントを含む組成物を提供する。
【００１７】
本明細書において使用されるように、不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数の要素または特徴を指すかまたは包含し、「１つの（ｏｎｅ）」または「単一の（ｓｉｎｇｌｅ）」要素または特徴を意味するまたは定義するものと解釈されるべきではない。
【００１８】
本明細書全体にわたって、文脈がそうでないことを必要としないかぎり、単語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、単語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「〜を含み（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」或いは同様の用語は、引用された要素または特徴の列記が、記載されたまたは列記された要素のみを含むのではなく、列記されていないまたは記載されていないその他の要素または特徴を含み得るように、包括的な包含を意味するように意図されている。
【００１９】
アミノ酸配列の文脈において、「〜から本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、引用されたアミノ酸配列が、そのＮ−またはＣ−末端に、１つ、２つ或いは３つのアミノ酸を一緒に備えることを意味するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｊ８−ＤＴ／Ａｌｕｍワクチン接種の防御効率（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）。
【図２】Ｊ８−ＤＴ介在型免疫における好中球。Ｅ：表皮、Ｄ：真皮、ＳＣ：皮下層（Ｓｕｂ−ｃｕｔ  ｌａｙｅｒ）。
【図３】Ｊ８−ＤＴワクチン接種の好中球枯渇及び有効性。
【図４】ＣｏｖＲ／Ｓ変異体ＧＡＳ  ａｎ  Ｍ１Ｔ１分離株における遺伝子発現の上昇の概略図。
【図５】５４４８ＡＰに対する防御（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）におけるＪ８−ＤＴの有効性。
【図６】種々のＧＡＳ菌株によるＩＬ−８の分解。
【図７】種々のＧＡＳ菌株によるＭＩＰ−２の分解。
【図８】種々のＧＡＳ菌株によるＫＣの分解。
【図９】ケモカインの遊走能における種々のＧＡＳ分離株の効果。
【図１０】Ｊ８−ＤＴ−ｒＳｐｙＣＥＰ／Ａｌｕｍを用いた免疫付与によるＧＡＳ５４４８ＡＰに対する防御。
【図１１】抗原特異的なＩｇＧ産生により測定されるＪ８−ＤＴ−ＳｐｙＣＥＰの免疫原性。
【図１２】ｒＳｐｙＣＥＰ抗血清によるＳｐｙＣＥＰのＩＬ−８分解活性の阻害。
【図１３Ａ】ＳｐｙＣＥＰの残基３５−５８７にわたる重複する２０ｍｅｒペプチド（１０個のアミノ酸が重複する）のエピトープマッピング（降順にて配列番号１〜５５）。太字の（ｂｏｌｄｅｄ）ペプチドは、エピトープマッピングにより選択されたペプチドである。
【図１３Ｂ】ＳｐｙＣＥＰの残基３５−５８７にわたる重複する２０ｍｅｒペプチド（１０個のアミノ酸が重複する）のエピトープマッピング（降順にて配列番号１〜５５）。太字の（ｂｏｌｄｅｄ）ペプチドは、エピトープマッピングにより選択されたペプチドである。
【図１４】個々のペプチドエピトープでの抗組換えＳｐｙＣＥＰ抗血清活性。ＳｐｙＣＥＰ（５５３個のアミノ酸）のＢ細胞エピトープマッピングは、ペプチドアレイを用いて実施した。図１３に示されるように、１０個のアミノ酸により重複している２０ｍｅｒペプチドは、ｒＳｐｙＣＥＰ抗血清を用いて調べた。
【図１５】抗組換えＳｐｙＣＥＰ抗血清と強い反応性を示す６つのエピトープの同定。Ｓ１＝配列番号１５、Ｓ２＝配列番号１８、Ｓ３＝配列番号１９、Ｓ４＝配列番号２４、Ｓ５＝配列番号３０及びＳ６＝配列番号５４。
【図１６】ＳｐｙＣＥＰエピトープ抗血清による免疫原性及び親ペプチド認識。
【図１７】ＳｐｙＣＥＰエピトープ抗血清によるＩＬ−８分解の阻害。
【図１８】自己ペプチドに対するマウスα−ｐ１４５−ＤＴ及びα−Ｊ８−ＤＴ力価及び交叉認識（ｃｒｏｓｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）ＥＬＩＳＡ。
【図１９】自己ペプチドに対するマウスα−Ｊ８ｉバリアント−ＤＴ力価。
【図２０】交叉認識ＥＬＩＳＡ。
【図２１】ｒｅｃＳｐｙＣＥＰにおける免疫優勢エピトープの同定。ｒｅｃＳｐｙＣＥＰにおける免疫優勢エピトープを同定するために、ペプチド阻害ＥＬＩＳＡを実施した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）のコホートに、０日、２１日、及び２８日にＳｐｙＣＥＰエピトープ−ＤＴコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）またはＳｐｙＣＥＰを皮下に接種した。最後のブーストの１週間後に、顎下腺出血によってマウスを出血させて、抗血清を採取した。エピトープ抗血清は、５μｇ／ｍｌ若しくは０．５μｇ／ｍｌの濃度の自己ペプチドとともにインキュベートして、自己ペプチド認識の阻害を評価した（Ａ）。ペプチド抗血清も５μｇ／ｍｌ若しくは０．５μｇ／ｍｌの濃度のＳｐｙＣＥＰとともに培養した。次に、血清を固定化ペプチドに対するＥＬＩＳＡに使用した（Ｂ）。最後に、ＳｐｙＣＥＰ抗血清を各々が５μｇ／ｍｌ若しくは０．５μｇ／ｍｌの濃度のペプチド（Ｓ１−Ｓ６）或いはｒｅｃＳｐｙＣＥＰとともに培養して、各個の対応するペプチド或いはＳｐｙＣＥＰへの結合を評価した（Ｃ）。各バーに対するデータは、平均±ＳＥＭである。統計学的解析は、グループ間の有意性を決定するために、ボンフェローニの多重比較試験を用いた２要因の分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して実施した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓはＰ＜０．０５である。
【図２２】ＳｐｙＣＥＰ及びＳｐｙＣＥＰエピトープ抗血清の種々のＧＡＳ菌株に対する結合効率。ｒｅｃＳｐｙＣＥＰ若しくはＳｐｙＣＥＰエピトープ抗血清の種々のＧＡＳ菌株に対する特異性を決定するために、フローサイトメトリーを実施した。アッセイは、ＳｐｙＣＥＰ抗血清と比較した、ＦＩＴＣがコンジュゲートされたＩｇＧを介するエピトープ抗血清（Ｓ１−Ｓ６）の結合を測定した。５４４８及びその動物継代培養（ａｎｉｍａｌ  ｐａｓｓａｇｅｄ）誘導体（Ａ）、ＢＳＡ１０及びその動物継代培養誘導体（Ｂ）及び咽喉（ｔｈｒｏａｔ）分離株（ｐＭ１）及び皮膚分離株（８８／３０）の結合を示す（Ｃ）。各バーに対するデータは、平均±ＳＥＭである。統計学的解析は、ＰＢＳ対照と比較した有意性を決定するために、両側ｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）を使用して実施した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２３】ＧＡＳに対する防御におけるＪ８−ＤＴ＋Ｓ２−ＤＴの防御効率。ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）のコホートに、０日、２１日、及び２８日にＪ８−ＤＴ、Ｊ８−ＤＴ＋ＳｐｙＣＥＰ、Ｊ８−ＤＴ＋Ｓ２−ＤＴ、ＳｐｙＣＥＰ若しくはＰＢＳの処方物を皮下に接種した。最後のブーストの２週間後に、ＧＡＳ５４４８ＡＰを皮膚からの感染経路を介してマウスに感染させた（Ａ及びＢ）。感染後６日目に、５匹／群のマウスをと殺して、皮膚（Ａ）及び血液（Ｂ）におけるＧＡＳのバイオバーデンを決定するためにサンプルを採取した。データは２つ以上の独立した実験を代表するものであり、各群４〜５匹のマウスに対して結果を平均±ＳＥＭとして示した。ワクチン接種されたコホートと対照コホートとの間の有意性を決定するために、２要因の分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓはｐ＜０．０５である。
【図２４】ＧＡＳに対する防御におけるＪ８−ＤＴ＋Ｓ２−ＤＴの防御効率。ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）のコホートに、０日、２１日、及び２８日にＪ８−ＤＴ、Ｊ８−ＤＴ＋ＳｐｙＣＥＰ、Ｊ８−ＤＴ＋Ｓ２−ＤＴ、ＳｐｙＣＥＰ若しくはＰＢＳの処方物を皮下に接種した。最後のブーストの２週間後に、ＧＡＳ  ＮＳ２２．８を皮膚からの感染経路を介してマウスに感染させた（Ａ、Ｂ及びＣ）。感染後３日目及び６日目に、５匹／群のマウスをと殺して、皮膚（Ａ）、血液（Ｂ）及び膵臓（Ｃ）におけるＧＡＳのバイオバーデンを決定するためにサンプルを採取した。各群４〜５匹のマウスに対して結果を平均±ＳＥＭとして示した。ワクチン接種されたコホートと対照コホートとの間の有意性を決定するために、２要因の分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓはｐ＜０．０５である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、好中球活性がＡ群レンサ球菌に対するＪ８ペプチドでの免疫付与の成功にとって重要であるという発見において少なくとも部分的に述べられている。より詳細には、ＳｐｙＣＥＰのようなＡ群レンサ球菌のある種のプロテアーゼが、好中球走性化物質インターロイキン８をタンパク質分解活性により不活性化することにより好中球における有害な効果或いは抑制効果を与えることが明らかにされた。従って、Ｊ８ペプチド、或いはその他のＭタンパクフラグメントと、またＳｐｙＣＥＰとを用いて免疫を与えることによって、インターロイキン８を不活性化して、好中球反応を抑制するＳｐｙＣＥＰの能力を少なくとも部分的に低減するＳｐｙＣＥＰに対する免疫反応が引き起こされることが提唱される。従って、これは、Ｊ８免疫付与の免疫学的効果を相乗的に高めるものであろう。関連した実施形態において、抗ＳｐｙＣＥＰ抗体を治療的に投与して、Ｊ８ペプチドに対する増強された免疫反応を引き起こしてもよい。更に、ＳｐｙＣＥＰの免疫優勢エピトープが同定された。特定の形態において、本発明は、Ａ群レンサ球菌感染に対して使用される典型的な抗生物質での治療に抵抗力のあるＡ群レンサ球菌の特に毒性の強い菌株または分離株による感染を治療或いは予防するのに適している。これらの菌株または分離株は、典型的には皮膚への重篤な感染（例えば、壊疽性筋膜炎）を引き起こし、幾らかの場合には、ＣｏｖＲ／ＳＣｏｖＲ／Ｓ変異体を寄生させ得る。
【００２２】
従って、本発明のある態様は、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質とを投与して、それにより哺乳動物において免疫反応を引き起こすことに関する。
【００２３】
本発明のこれらの目的のために、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」によって意味されるのは、その天然の状態から取り出されたか、そうでなければ人為操作に供された物質である。単離された物質は、その天然の状態においては同物質に通常伴っている構成要素を実質的に含まないか若しくは本質的に含まない場合もあれば、その天然の状態においては同物質に通常伴っている構成要素と一緒に人工的な状態にあるように操作される場合もある。単離された物質には、天然型、化学的に合成された型、或いは組換え型が含まれる。
【００２４】
用語「たんぱく質」によって意味されるのは、アミノ酸ポリマーである。アミノ酸は、天然の、或いは非天然のアミノ酸であり得、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸が当該技術分野において十分に理解される。
【００２５】
用語「タンパク質」は、「ペプチド」を含み、かつ包含し、同ペプチドは、典型的には、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質を記載するように使用され、「ポリペプチド」は、典型的には５０個超のアミノ酸を有するタンパク質を記載するように使用される。
【００２６】
「フラグメント」は、タンパク質（Ｍタンパク、ｐ１４５、Ｊ１４またはＪ８またはＳｐｙＣＥＰまたはＳｐｙＣＥＰのペプチドまたはＳｐｙＣＥＰのエピトープなど）のセグメント、ドメイン、部分または領域であり、同タンパク質のアミノ酸配列の１００％以下を構成するものである。フラグメントは、単一のフラグメントであってもよく、或いは単独で、若しくは他のフラグメントとともに繰り返えされるものであってもよい。
【００２７】
一般に、フラグメントは、完全長のタンパク質の５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０または１６００個までのアミノ酸を含み得るか、同アミノ酸から本質的に構成されるか、或いは同アミノ酸のみからなる。
【００２８】
適切には、フラグメントは免疫原性フラグメントである。本発明の文脈において、用語「免疫原性」は、本明細書において使用されるように、哺乳動物への免疫原性フラグメントの投与によって、Ａ群レンサ球菌またはＭタンパクのようなその分子成分に対して免疫反応を生成するまたは引き起こす能力または可能性を示す。好ましくは、免疫原性フラグメントによって引き起こされる免疫反応は防御である。
【００２９】
「免疫反応を引き起こす」によって意味されるのは、細胞免疫系、抗体、及び／または天然の免疫系を含めて、免疫系の１つまたは複数の要素の生産または活性を生成すること、または刺激することである。適切には、免疫系の１つまたは複数の要素は、Ｂリンパ球、抗体及び好中球を含む。
【００３０】
本明細書において一般的に使用されるように、用語「免疫を与える（ｉｍｍｕｎｉｚｅ）」、「ワクチン接種する（ｖａｃｃｉｎａｔｅ）」及び「ワクチン」は、Ａ群レンサ球菌に対して防御免疫反応を引き起こし、それにより、その後のＡ群レンサ球菌による感染が少なくとも部分的に回避されるか、或いは最小限にされる、方法及び／または組成物を参照する。
【００３１】
本明細書において使用されるように、用語「Ａ群レンサ球菌（ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）」、「Ａ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）」、「Ａ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）」、「Ａ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐ）」及びその省略形「ＧＡＳ」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ種のグラム陽性β−溶血性細菌である、ランスフィールドＡ血清型群のレンサ球菌を参照する。ＧＡＳの重要な病原性因子はＭタンパクであり、それは強力な抗食作用性であり、血清因子Ｈと結合し、Ｃ３−転化酵素を破壊し、Ｃ３ｂによるオプソニン化を阻止する。これらはまた、Ｇｒａｈａｍ他、２００２、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９９  １３８５５に記載されているような、ＣｏｖＲ／ＳまたはＣｏｖＲＳ変異体のような毒性の強い「変異体」を含むが、それらに限定されるものではない。
【００３２】
Ａ群レンサ球菌によって引き起こされる疾患及び症状は、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、猩紅熱、急性咽頭炎（レンサ球菌性咽頭炎）のような咽頭感染症、菌血症、毒素性ショック症候群、壊疽性筋膜炎、急性リウマチ熱及び急性糸球体腎炎を含むが、それらに限定されるものではない。
【００３３】
本明細書において使用されるように、「好中球」または好中性顆粒球は、好塩基球及び好酸球とともに多形核細胞ファミリー（ＰＭＮｓ）の一部を形成する細胞である。好中球は、骨髄幹細胞から形成される比較的短命の食細胞であり、典型的には哺乳動物の白血球の４０乃至７５％を構成する。食作用を有するのみならず、好中球は可溶性の抗菌剤（例えば、顆粒タンパク質）を放出し、好中球細胞外トラップを産生する。好中球は、損傷部位及び／または急性炎症部位への好中球の走化性を促進するインターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｃ５ａ、ｆＭＬＰ及びロイコトリエンＢ４のような分子に対して反応性を有する。
【００３４】
本明細書において使用されるように、「好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質」は、好中球の産生、移動及び／または走化性、及び／または好中球の１つ以上の免疫学的活性を、直接的に或いは間接的に、少なくとも部分的に増大する、向上する、或いは回復する分子である。一実施形態において、作用物質は、好中球阻害剤（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する免疫反応を引き起こす。別の実施形態において、作用物質は、好中球阻害剤に結合するか、或いは少なくとも部分的に不活性化する。好中球阻害剤は、Ａ群レンサ球菌の細菌に由来するか或いは起源とする分子であり得る。１つの特定の形態において、好中球阻害剤はセリンプロテアーゼまたはそのフラグメントであり、インターロイキン８をタンパク質分解的に開裂する。１つの特定の実施形態において、好中球阻害剤は、ＳｐｙＣＥＰ或いはそのフラグメントである。ＳｐｙＣＥＰは、ヒト病原菌である溶血性レンサ球菌の表面に発現される１７０ｋＤａの多ドメインセリンプロテアーゼであり、好中球化学誘引物質であるインターロイキン−８の触媒作用による開裂及び不活性化により感染における重要な役割を果たしている。ＳｐｙＣＥＰアミノ酸配列の非限定的な例は、受託番号ＹＰ５９７９４９．１及び（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０２７０）及びＹＰ５９６０７６．１（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ９４２９）において見出され得る。従って、１つの特定の実施形態において、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質は、ＳｐｙＣＥＰまたはその免疫原性フラグメントである。別の実施形態において、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質は、ＳｐｙＣＥＰと結合する抗体または抗体フラグメントである。ＳｐｙＣＥＰフラグメントの特定の実施形態は、図１３に記載されている（配列番号１〜５５）。好ましいＳｐｙＣＥＰフラグメントは、配列番号１８（ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ）に記載されているアミノ酸配列であるか、同アミノ酸配列を含む。以下により詳細に記載されるように、抗−配列番号１８ペプチド抗血清は、抗−ｒＳｐｙＣＥＰ抗体と同程度に効果的にＩＬ８の分解を阻止する。従って、配列番号１８は、機能的な抗体を誘導することが可能なＳｐｙＣＥＰに対する優性遺伝子エピトープであるか、同優性遺伝子エピトープを含む。
【００３５】
本明細書において使用されるように、「Ｍタンパクフラグメント」は、免疫原性である、及び／または抗体若しくは抗体フラグメントによって結合されることか可能なＧＡＳのＭタンパクの任意のフラグメントである。典型的には、フラグメントは、ＧＡＳのＭタンパクまたはそのフラグメントの、Ｃ−リピート領域のアミノ酸配列であるか、同アミノ酸配列を含むか、或いは同アミノ酸配列に包含される。非限定的な例はｐ１４５を含み、同ｐ１４５は、アミノ酸配列ＬＲＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥ（配列番号５６）を有するアミノ酸配列を備えた２０ｍｅｒである。この点に関し、ｐ１４５アミノ酸配列のフラグメントは、Ｊ１４ペプチドまたはＪ８ペプチドにおいて存在し得る。
【００３６】
本明細書において使用されるように、「Ｊ１４ペプチド」は、アミノ酸配列ＫＱＡＥＤＫＶＫＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥＱＬＥＤＲＶＫ（配列番号５７）、またはそのフラグメント若しくはそのバリアントを含み、ｐ１４５内の最小Ｂ細胞及びＴ細胞エピトープを備えたペプチドは、有毒になる可能性のあるＴ細胞オートエピトープを欠くが、オプソニンＢ細胞エピトープを含有したＧＡＳのＭタンパクＣ領域ペプチドとして同定された。Ｊ１４は、ＭタンパクＣ領域（太字で示されているＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥ）からの１４個のアミノ酸を含み、かつペプチドの正確な螺旋状の折り畳みと立体的な構造を維持するために必要であった酵母由来のＧＣＮ４配列が隣接したキメラペプチドである。
【００３７】
本明細書において使用されるように、「Ｊ８ペプチド」は、ＧＡＳのＭタンパクＣ領域ペプチドに少なくとも部分的に由来するか、或いは同ペプチドに対応するアミノ酸配列を含むペプチドである。Ｊ８ペプチドは適切には、立体構造Ｂ細胞エピトープを含み、かつ有毒になる可能性のあるＴ細胞オートエピトープを欠いている。好ましいＪ８ペプチドのアミノ酸配列は、ＱＡＥＤＫＶＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＬＥＤＫＶＱ（配列番号５８）またはそのフラグメント若しくはそのバリアントを含み、太字で示された残基（ＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬ）は、ＧＡＳのＭタンパクの３４４〜３５５番目の残基に対応する。この実施形態において、Ｊ８は、Ｊ８ペプチドの正確な螺旋状の折り畳みと立体的な構造を維持することを支援するＧＣＮ４  ＤＮＡ結合タンパク質フランキング配列を更に含む。
【００３８】
本明細書において使用されるように、タンパク質の「バリアント」は、基準アミノ酸配列と、定義可能なヌクレオチドまたはアミノ酸配列の関係を共有する。基準アミノ酸配列は、本明細書において上記されたように、Ｍタンパク、ＳｐｙＣＥＰまたはそれらいずれかのフラグメントのアミノ酸配列であってもよい。「バリアント」タンパク質は、基準アミノ酸配列から１つまたは複数のアミノ酸が欠失されているか、異なるアミノ酸によって置換されている同１つまたは複数のアミノ酸を有し得る。幾らかのアミノ酸は、免疫原性フラグメント及び／またはタンパク質の活性を変化させることなく置換または欠失され得る（保存的置換）。好ましくは、タンパク質のバリアントは、基準アミノ酸配列に対して、少なくとも７０％若しくは７５％、好ましくは少なくとも８０％若しくは８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。
【００３９】
１つの特定の実施形態において、バリアントタンパク質またはペプチドは、そのＮ末端及び／またはＣ末端に１つまたは複数のリジン残基を含み得る。複数のリジン残基（例えば、ポリリジン）は、リジン残基の直鎖の配列であってもよいし、或いはリジン残基の分岐鎖の配列であってもよい。これらの更なるリジン残基は、ペプチドの可溶性の増大を促進し得る。
【００４０】
Ｊ８ペプチドバリアントの非限定的な例は、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号５９）、ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＣ（配列番号６０）ＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６１）ＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ（配列番号６２）を含む。
【００４１】
その他のバリアントは、Ｃｏｏｐｅｒ他、１９９７に記載されているようなヘプタッド（ｈｅｐｔａｄ）に基づいていてもよい。
例として、仮にエピトープがα−ヘリックスタンパク質立体構造内に存在していることが知られている場合、モデルペプチドは、この立体構造に折り畳んで合成され得る。本発明者らは、ＧＣＮ４ロイシン・ジッパーの構造（Ｏ’Ｓｈｅａ他、１９９１）に基づいて、α−螺旋に巻かれたコイルペプチドのモデルを設計した。最初のヘプタッドは、配列ＭＫＱＬＥＤＫ（配列番号６３）を含んでおり、安定した巻かれたコイルのヘプタッド繰り返しモチーフ（ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ）ｎに見出される幾つかの特徴を含んでいる（Ｃｏｈｅｎ及びＰａｒｒｙ，１９９０）。これらは、位置ａ及びｄに、大きな無極性残基を含んでおり、位置ｅ及びｇに酸／塩基対（Ｇｌｙ／Ｌｙｓ）（通常は、好都合な鎖間イオン性相互作用）を含んでおり、位置ｂ、ｃ、ｆに極性基を含んでいる（Ｌｕｐａｓ他，１９９１の予測と一致する）。ＧＣＮ４ペプチドはまた、位置ａにコンセンサスバリンを含んでいる。位置ａ及びｄがＶ及びＬによって占められている場合、巻かれたコイルのダイマーが好ましいことも明記したい（Ｈａｒｂｕｒｙ他、１９９４）。ヘプタッドリピートのモデルは、α−螺旋に巻かれたコイルを形成する可能性を備えたＧＣＮ４ロイシン・ジッパーペプチド（ＶＫＱＬＥＤＫ；配列番号６４）のこれらのコンセンサスな特徴に由来した。このペプチドはフレークワークペプチドになる。研究中の立体構造エピトープの重複するフラグメントは、キメラペプチドを得るために巻かれたコイルペプチドのモデル内に埋め込まれた。正確な螺旋状に巻かれたコイルの立体構造（Ｃｏｈｅｎ及びＰａｒｒｙ，１９９０）を確実にするように設計されたアミノ酸置換は、同じ残基が螺旋状モデルペプチドとエピトープ配列の両方において見出されるたびにキメラペプチドに組み込まれ得る。以下の置換が典型的に使用された：位置ａではＶがＩに、位置ｂではＫがＲに、位置ｃではＱがＮに、位置ｄではＬがＡに、位置ｅでは、ＥがＱに、位置ｆではＤがＥに、位置ｇではＫがＲに置換された。これらの置換残基の全ては、巻かれたコイルタンパク質のそれぞれの対応する位置にて通常見られる（Ｌｕｐａｓ他，１９９１）。
【００４２】
対応するタンパク質と核酸との間の配列関係を記載するために本明細書において一般的に使用される用語は、「比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」及び「実質的な同一性」を含む。対応する核酸／タンパク質はそれぞれ（１）核酸／タンパク質によって共有される完全な核酸／タンパク質配列の１つ以上の部分のみを含み、かつ（２）核酸／タンパク質間で相違する１つ以上の部分を含むので、配列の比較は、典型的には、配列類似性の特定の位置の領域を同定し比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって配列を比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、典型的には、基準配列と比較される、６個、９個または１２個の連続する残基の概念的なセグメントを参照する。比較ウィンドウは、それぞれの配列の最良のアライメントのために基準配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（即ち、相違）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最良のアライメントは、コンピュータによるアルゴリズムの実施（インテリジェネティクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）によるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ・リリース（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ）７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５に所在のジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、参照によって本明細書中に援用される）によって実行され得るか、或いは検査及び選択された様々な方法のうち任意のものによって生成された最良のアライメント（即ち、比較ウィンドウ上の最も高い相同性（％）をもたらすもの）によって、実行され得る。例えばアルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７年、第２５巻、ｐ．３３８９（参照によって本明細書中に援用される）に開示されているようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムが照会されてもよい。配列解析の詳細な議論については、Ａｕｓｕｂｅｌ他編の「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」（１９９５−１９９９年、米国ニューヨークのＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）のユニット１９．３に見出すことが可能である。
【００４３】
用語「配列同一性」は、比較のウィンドウについて配列が同一である範囲を考慮して標準的なアルゴリズムを使用する適切なアラインメントを考慮した正確なヌクレオチド一致またはアミノ酸一致の数を含むようにその最も広い意味で本明細書では使用される。従って、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較のウィンドウにわたって比較し、一致した位置の数を得るために、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配列に存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算して、配列同一性のパーセンテージを得るためにその結果を１００倍することによって計算される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウインドウス（登録商標）用バージョン２．５；Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ））から入手可能）により計算される「一致パーセンテージ」を意味することが理解され得る。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」は、当技術分野において理解されるように、例えば、他の化学的成分とのコンジュゲート化または複合体化によって、あるいは翻訳後修飾技術（例えば、リン酸化、アセチル化など）、グリコシル化修飾（例えば、グリコシル化を付加、除去、或いは改変）、脂質化、及び／または更なるアミノ酸配列の包含によって変化しているタンパク質、そのフラグメント若しくはそのバリアントのような分子である。１つの特定の実施形態において、更なるアミノ酸配列は、そのＮ末端及び／またはＣ末端に１つまたは複数のリジン残基を含んでいてもよい。複数のリジン残基（例えば、ポリリジン）はリジン残基の直鎖の配列であってもよいし、或いはリジン残基の分岐鎖の配列であってもよい。これらの更なるリジン残基は、ペプチドの可溶性の増大を促進し得る。
【００４５】
Ｏｌｉｖｅｒ他、「Ｉｎｆｅｃｔ＆Ｉｍｍｕｎ．」、２００２年、第７０巻、２７３４頁に記載されている１つの特定のＪ８ペプチド誘導体は、「脂質コアペプチド」である。一実施形態において、脂質コアペプチドは複数のＪ８ペプチド（例えば、４つのＪ８ペプチド）を含み得、同複数のＪ８ペプチドは、親油性アンカーに結合された分岐鎖ポリリジンコアの各リジンの２つのアミノ基上に直接合成されている。
【００４６】
更なるアミノ酸配列は、融合タンパク質を作製する融合パートナーアミノ酸配列を含んでいてもよい。例として、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出及び／または精製を助ける。非限定的な例は、金属結合（例えば、ポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（例えば、ＧＦＰ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンタグのようなエピトープタグを含む。
【００４７】
本発明によって考慮されるその他の誘導体は、限定するものではないが、側鎖の修飾、ペプチド或いはタンパク質合成時の非天然アミノ酸及び／またはその誘導体の組み込み、及び架橋剤の使用及び本発明の免疫原性タンパク質、フラグメント及びバリアントにおいて立体構造的な制約を与えるその他の方法の使用を含む。
【００４８】
この点について、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な方法のために、Ｃｏｌｉｇａｎ他編、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ」の第１５章（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９５−２００８）を参照されたい。
【００４９】
本発明の単離された免疫原性タンパク質、フラグメント及び／または誘導体は、限定されるものではないが、ペプチドフラグメントを生成するための化学合成、組換えＤＮＡ技術、及び加水分解的開裂を含む当業者に周知の手段によって生成され得る。
【００５０】
化学合成は、固相と液相の合成を含む。そのような方法は当業者には周知であるが、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ編、「ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ」の第９章（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）及びＣｏｌｉｇａｎ他編、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ」の第１５章（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９５−２００８）に提供される化学合成技術の例を参照されたい。この点について、国際公開第ＷＯ９９／０２５５０号パンフレット及び国際公開第ＷＯ９７／４５４４４号パンフレットも参照されたい。
【００５１】
組換えタンパク質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）（特に第１６節および第１７節）、Ａｕｓｕｂｅｌら他編、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、アメリカ合衆国ニューヨーク、１９９５〜２００８）（特に第１０章および第１６章）、及びＣｏｌｉｇａｎ他編、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、アメリカ合衆国ニューヨーク、１９９５−２００８）（特に第１章、第５章および第６章）に記載されるような標準的なプロトコルを使用して当業者によって簡便に調製することができる。典型的には、組換えタンパク質の調製は、適切な宿主細胞内でのタンパク質をコードする核酸の発現を含む。
【００５２】
ある態様及び実施形態は、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、をコードする１つまたは複数の単離された核酸、あるいはこれらを含む組成物を投与して、それによりＧＡＳに対する免疫反応を引き起こす、及び／またはＧＡＳ感染に対して免疫を与えることに関する。
【００５３】
本明細書において使用されるように、用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを指す。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを含む。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ及び自己触媒ＲＮＡを含む。核酸はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。核酸は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ塩基を含むヌクレオチドを典型的には含んでいるヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、その他の塩基、例えば、修飾されたプリン（例えば、イノシン、メチルイノシン及びメチルアデノシン）及び修飾されたピリミジン（例えば、チオウリジン及びメチルシトシン）を含んでいてもよい。
【００５４】
好ましい形態において、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、をコードする１つまたは複数の単離された核酸は、ヒトのような哺乳動物への投与に適した遺伝子構築物の形態にある。そのために好ましいものにおいて、遺伝子構築物は、ヒトのような哺乳動物のＤＮＡワクチン接種に適している。
【００５５】
適切には、遺伝子構築物は、当業者によく理解されるように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母または細菌人工染色体の形態であるか、あるいはプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母または細菌人工染色体の遺伝子成分を含む。遺伝子構築物はまた、組換えＤＮＡ技術による操作のために、細菌またはその他の宿主細胞内での単離された核酸の維持及び増殖に適している。
【００５６】
タンパク質発現の目的のために、遺伝子構築物は発現構築物である。適切には発現構築物は、発現ベクター中の１つまたは複数の更なる配列に作動的に結合された１つまたは複数の核酸を含む。「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００５７】
「作動的に結合された」により意味されるのは、更なるヌクレオチド配列（１つまたは複数）が、転写を開始または調節またはそうでなければ制御するように本発明の核酸に対して配置されていることである。
【００５８】
調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現が必要とされる宿主細胞または組織に適している。多数のタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が様々な宿主細胞について当技術分野では知られている。
【００５９】
典型的には、同１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列は、これらに限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列または活性化因子配列を含むことができる。当技術分野において知られている構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが本発明により考慮される。発現構築物は、（典型的には発現ベクターによって提供される）融合パートナーをコードする更なる核酸配列を含んでいてもよく、それにより本発明の組換えタンパク質は、上記したように、融合タンパク質として発現される。
【００６０】
Ｍタンパク、そのフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体及び好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質（例えば、ＳｐｙＣＥＰまたはその免疫原性フラグメント）をコードする単離された核酸は、別々の発現構築物によって投与され得るか、或いは同一の発現構築物（例えば、マルチシストロン発現構築物）に存在し得る。
【００６１】
適切には、ＤＮＡワクチン接種は、１つまたは複数のプラスミドＤＮＡ発現構築物を手段としている。プラスミドは、典型的にはウイルスプロモータ（ＳＶ４０、ＲＳＶまたはＣＭＶプロモーターなど）を含む。ｍＲＮＡの安定性を改善し、それによりタンパク質の発現が増大するようにイントロンＡが含められてもよい。プラスミドは更に、多重クローニング部位、ウシ成長ホルモンのような強力なポリアデニル化／転写終結信号、またはウサギβ−グロブリンポリアデニル化配列を含み得る。プラスミドは更に、ＨＩＶｒｅｖの増大したエンベロープ発現を伴うか、或いは伴わないメイソンファイザーサルウイルスシス転写エレメント（ＭＰＶ−ＣＴＥ）を含み得る。発現を向上させる更なる修飾は、エンハンサー配列、合成イントロン、アデノウイルス３分節系リーダー（ＴＰＬ）配列の挿入、及び／またはポリアデニル化への修飾、及び／または転写終結信号を含む。ＤＮＡワクチンプラスミドの非限定的な例は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから市販されているｐＶＡＣである。
【００６２】
ＤＮＡワクチン技術を記載する有用な参考文献は、「ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｓｅｒｉｅｓ、第１２７巻）である。
【００６３】
既に述べたように、本発明は、哺乳動物において、Ａ群レンサ球菌に関連した疾患、病気、または状態を予防する、或いは治療する組成物及び／または方法を提供する。
本明細書において使用されるように、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、Ａ群レンサ球菌に関連した疾患、病気、または状態の、兆候又は症状を、同兆候又は症状が生じ始めた後に、少なくとも部分的に改善する、排除する、或いは軽減する治療的介入を指している。治療は、対象にとって有益であるべく絶対的なものである必要はない。有益な効果は、当業者に既知の任意の方法又は基準を使用して決定可能である。
【００６４】
本明細書において使用されるように、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」又は「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、Ａ群レンサ球菌による感染の前に先立って、Ａ群レンサ球菌への暴露の前に先立って、Ａ群レンサ球菌に関連した疾患、病気、または状態の、兆候又は症状を、同兆候又は症状の発症の前に先立って、感染を予防するため、及び／または同兆候又は同症状を軽減するように、開始される一連の行動を指している。そのような予防は、対象にとって有益であるべく絶対的なものである必要はない。「予防の（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）」治療は、Ａ群レンサ球菌に関連した疾患、病気、または状態の兆候又は症状を進行させるリスクを低減する目的のために、Ａ群レンサ球菌に関連した疾患、病気、または状態の兆候を示さないか、或いはほんの初期の兆候を示す対象に投与される治療である。
【００６５】
本発明の文脈において、「Ａ群レンサ球菌に関連した疾患、病気、または状態」によって意味されるのは、Ａ群レンサ球菌による感染を原因とする任意の臨床学的病状であり、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、猩紅熱、急性咽頭炎（レンサ球菌性咽頭炎）のような咽頭感染症、菌血症、毒素性ショック症候群、壊疽性筋膜炎、急性リウマチ熱及び急性糸球体腎炎を含むが、それらに限定されるものではない。
【００６６】
既に記載したように、本明細書に開示される治療方法及び／または免疫法は、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を別々に、或いは組み合わせて哺乳動物に投与し、それにより同哺乳動物による免疫反応を引き起こすことを含む。代替的に、上記したように、治療方法及び／または免疫法は、Ｍタンパクフラグメント、そのバリアント若しくはその誘導体をコードする１つまたは複数の単離された核酸と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、を別々に、或いは組み合わせて哺乳動物に投与し、それにより同哺乳動物による免疫反応を引き起こすことを含む。
【００６７】
本明細書において開示されるように、本発明のその他の特別な態様及び実施形態は、ＳｐｙＣＥＰを感染部位（例えば、皮膚）へ標的化することによるような、ＧＡＳ感染を治療的に処置する抗体または抗体フラグメントの使用に関する。これは、Ｍタンパクフラグメントの免疫接種及び／またはＭタンパクフラグメント抗体または抗体フラグメントの投与と組み合わせて実施され得る。
【００６８】
抗体及び抗体フラグメントは、ポリクローナルまたはモノクローナルの、天然型または組換え型であり得る。抗体フラグメントは、Ｆｃ，ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２フラグメントを含む、及び／または単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を含み得る。そのようなｓｃＦｖは、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、欧州特許第２３９，４００号明細書、またはＷｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ  ３４９：２９３（１９９１）なる論文にそれぞれ記載される方法に従って調製することができる。抗体はまた、複数のｓｃＦｖ並びに二量化活性デミボディ（ｄｅｍｉｂｏｄｉｅｓ）を含む二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体のような多価組換え抗体フラグメントも含み得る（例えば、国際公開第ＷＯ／２００７／０６２４６６号パンフレット）。例として、そのような抗体は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０、６４４４（１９９３）、またはＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、５６２、１７７（２００９）に記載された方法に従って調製可能である。抗体形成、精製及び使用に適用可能な周知のプロトコルは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ他編、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」の第２章（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１−１９９４）、及びＨａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に見られる。
【００６９】
ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者には十分に知られている。使用され得る例示的なプロトコルが、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ他、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」（前掲）及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８、前掲）に記載されている。特定の実施形態において、抗−ＳｐｙＣＥＰポリクローナル抗体はＡ群レンサ球菌に暴露された個人或いはＡ群レンサ球菌に感染された個人からのヒト血清から取得されるか、或いは精製される。代替的に、ポリクローナル抗体は、ウマのような生産種において、精製され或いは組換えられたＳｐｙＣＥＰまたはその免疫原性フラグメントに対して産生され、引き続き投与前に精製されてもよい。
【００７０】
モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ  ２５６、４９５（１９７５）なる論文に最初に記載された標準的な方法を使用して、または、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ他、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」（前掲）に記載されるそのより最近の改変法により、本発明の単離されたタンパク質、フラグメント、バリアントまたは誘導体の１つまたは複数が接種された産生種に由来する脾臓または他の抗体産生細胞を不死化することによって製造することができる。従って、モノクローナル抗体は、本発明に従う使用のために、Ｍタンパクフラグメント、バリアント若しくは誘導体、及び／または、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質（ＳｐｙＣＥＰ）に対して産生され得る。ある実施形態において、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、組換え型であってもよい。これは、仮にモノクローナル抗体が最初に非ヒト哺乳動物の脾臓細胞によって生成される場合、同モノクローナル抗体またはそのフラグメントを「ヒト化する（ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ）」ために特に有利である。
【００７１】
治療用抗体に関する実施形態のために、好ましいＭタンパクフラグメントは、ｐ１４５ペプチドであってもよい。
ＳｐｙＣＥＰの好ましいフラグメントは、アミノ酸配列ＮＳＤＮＩＫＥＮＱＦＥＤＦＤＥＤＷＥＮＦ（配列番号１８）を含むか、或いは同アミノ酸配列のみから構成され得る。
【００７２】
ある態様及び実施形態において、本明細書において開示されているように、抗体または抗体フラグメントを含む、Ｍタンパクフラグメント、バリアント若しくは誘導体と、好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質は、哺乳動物に、組成物の形態で、別々に或いは組み合わせて投与され得る。
【００７３】
好ましい形態において、組成物は許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
「許容される担体、希釈剤又は賦形剤」によって意味されるのは、全身投与で安全に使用され得る固体又は液体の増量剤、希釈剤又はカプセル封入物質である。特定の投与経路に応じて、当分野で良く知られた様々な担体、希釈剤又は賦形剤が使用され得る。これらは、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、多価アルコール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張生理食塩水並びに塩であって例えば塩酸塩、臭化物及び硫酸塩を含む鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩及びマロン酸塩のような有機酸、並びに発熱性物質除去水、を含む群から選択され得る。
【００７４】
許容される担体、希釈剤及び賦形剤について述べている有用な参照文献は、「レミングトンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（１９９１年、アメリカ合衆国ニュージャージー州のＭａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）であり、参照により本明細書中に援用される。
【００７５】
好ましくは、免疫反応を引き起こす目的のために、ある種の免疫剤が、Ｊ８ペプチド、フラグメント、バリアント若しくは誘導体と好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質と、或いはこれらをコードする１つまたは複数の遺伝子構築物と、組み合わせて、使用され得る。
【００７６】
用語「免疫剤（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）」は、その範囲において、当業者によく知られているように、担体、送達剤、免疫刺激剤及び／またはアジュバンドを含む。当業者に理解されるように、免疫刺激剤及びアジュバンドは、免疫原性及び／または組成物の有効性を高める１つまたは複数の物質を指しているか、或いは含んでいる。適切な免疫刺激剤及びアジュバンドの非限定的な例は、スクワラン及びスクワレン（或いはその他の植物または動物由来の油）、ブロックコポリマー、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｑｕｉｌ（登録商標）Ａのような洗剤、Ｄｒａｋｅｏｌ（登録商標）またはＭａｒｃｏｌのような鉱油、落花生油のような植物油、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのようなＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のアジュバンド、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅようなＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のアジュバンド、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）（カルメット−ゲラン桿菌、即ちＢＣＧ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジコクタデシル−Ｎ’、Ｎ’ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、及びプルロニックポリオールのような界面活性物質、ピラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣカーボポールのようなポリアミン、ムラミルジペプチド及び誘導体、ジメチルグリシン、タフトシンのようなペプチド、油乳剤、及びリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのような鉱物ゲル、インターロイキン２及びインターロイキン１２のようなインターロイキン、インターロイキン１のようなモノカイン、腫瘍壊死因子、γ−インターフェロンのようなインターフェロン、ＣｐＧ  ＤＮＡのような免疫刺激性ＤＮＡ、サポニン−水酸化アルミニウム若しくはＱｕｉｌ−Ａ水酸化アルミニウムのような組み合わせ、リポソーム、ＩＳＣＯＭ（登録商標）及びＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバンド、抗酸菌細胞壁抽出物、ムラミルジペプチド若しくはその他の誘導体のような合成グリコペプチド、アブリジン、リピドＡ誘導体、硫酸デキストラン、ＤＥＡＥデキストラン単独若しくはリン酸アルミニウムとの組み合わせ、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）ＥＭＡのようなカルボキシポリメチレン、Ｎｅｏｃｒｙｌ（登録商標）Ａ６４０（例えば、米国特許第５，０４７，２３８号明細書）のようなアクリル酸コポリマー乳剤、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ７２０のような油中水型乳化剤、ポリオウイルス、ワクシニアウイルスタンパク質または動物ポックスウイルスタンパク質、或いはそれらの混合物を含む。
【００７７】
免疫剤は、チログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス、大腸菌、ブドウ球菌および連鎖球菌に由来するトキシン、トキソイドもしくはトキシンの任意の変異交差反応性物質（ＣＲＭ）、ポリ（リシン：アルギン酸）などのポリアミノ酸、インフルエンザ、ロタウイルスＶＰ６、パルボウイルスのＶＰ１およびＶＰ２、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えワクチンなどのような担体が含まれる。代替的に、担体タンパク質またはその他の免疫原性タンパク質のフラグメントまたはエピトープも使用され得る。例えば、細菌のトキシン、トキソイドまたはＣＲＭのＴ細胞エピトープが使用され得る。この点に関し、米国特許第５，７８５，９７３号明細書を参照することができる。これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【００７８】
任意の適切な手法がワクチン組成物を製造するために考慮される。例示的な手法には、例えば、Ｌｅｖｉｎｅ他「Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」（１９９７、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、バーゼル、香港）に記載される手法が含まれ、これは引用により本明細書に組み込むものとする。
【００７９】
幾らかの実施形態において、組成物及びワクチンは、Ｊ８ペプチド、フラグメント、バリアント若しくは誘導体、及び／または好中球活性を回復させること或いは向上させることを促進する作用物質を発現するように遺伝的に改変された弱毒化された、または不活化された細菌の形態にて、哺乳動物に投与され得る。弱毒化された細菌の非限定的な例は、例えば、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｖａｒ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）或いはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ．）のようなサルモネラ種を含む。代替的に、赤痢菌または大腸菌のようなその他の腸内病原菌を弱毒化した形で使用することもできる。弱毒化されたサルモネラ菌株は、芳香族アミノ酸生合成経路における遺伝子を不活性化することにより（Ａｌｄｅｒｔｏｎ他、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３５、４３５）、芳香族アミノ酸生合成経路における２つの遺伝子に変異を導入することによって（例えば、米国特許第５，７７０，２１４号明細書に記載されているような）、或いは、ｈｔｒＡのようなその他の遺伝子において（例えば、米国特許第５，９８０，９０７号明細書に記載されているような）、或いはｏｍｐＲのような外膜タンパク質をコードする遺伝子において（例えば、米国特許第５，８５１，５１９号明細書に記載されているような）構築されてきた。
【００８０】
任意の安全な投与経路を使用することができ、それらは、経口的、直腸的、非経口的、舌下、口内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、局所、粘膜及び経皮的投与を含むが、それらに限定されるものではない。
【００８１】
剤形は、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ、トローチ、カプセル、点鼻用スプレー、坐薬、エアロゾル剤、経皮パッチなどが含まれる。これらの剤形はまた、この目的のために特に設計された注射用または埋め込み用の徐放性デバイス、またはこの様式でさらに作用するように改変された他の形態のインプラントを含み得る。制御された放出は、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにある種のセルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）を含む疎水性ポリマーで被覆することによって達成することができる。さらに、制御された放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを使用することによって達成することができる。
【００８２】
組成物は、各々が予め定められた量の本発明の１つまたは複数の治療剤を、粉末若しくは顆粒として、溶液または水性の液体、非水性の液体、水中油型乳剤若しくは油中水型乳剤の懸濁剤として含む、カプセル、サシェ、機能食品／機能供給物、或いは錠剤のような別個のユニットとして存在し得る。そのような組成物は、薬学の方法の任意のものによって調製され得るが、全ての方法は、１つまたは複数の必要な成分を構成する担体と、上記した１つまたは封数の作用物質とを合わせる工程を含む。一般に、組成物は、本発明の作用物質を液体の担体、微粉化した固体の担体、或いは両方と均一かつ密に混合し、その後必要であれば生成物を所望の外観に成形することによって調製される。
【００８３】
上述の組成物は、投与量の製剤と適合する方式にて、かつ効果的である量にて投与され得る。本発明の文脈において、患者に投与される用量は、適切な期間にわたり患者に有効な反応を与えるのに十分であるべきである。投与されるべき作用物質（１つまたは複数）の量は、年齢、性別、体重、及び通常の健康状態、医師の判断に依存する因子を含む、治療される対象に基づいていてもよい。
【００８４】
本明細書において一般的に使用されるように、「患者」、「個人」及び「対象」なる用語は、本明細書に開示されている治療または組成物の任意の哺乳動物のレシピエントの文脈において使用される。従って、本明細書に開示されている方法及び組成物は、医療用途及び／または獣医用途を有し得る。好ましい形態において、哺乳動物はヒトである。
【００８５】
本発明が容易に理解され、かつ実用的に具体化されうるように、以降の非限定的な実施例が提供される。
【実施例】
【００８６】
材料及び方法
動物：ＢＡＬＢ／ｃ．マウス（雌：４〜６週齢）をアニマル・リソース・センター（ウエストオーストラリア、パース、ＡＲＣ）から求めた。全てのプロトコルは、オーストラリア連邦ガイドラインである国立保健医療研究委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＨＭＲＣ））に従い、グリフィス大学の動物倫理委員会によって承認された。
【００８７】
細菌の菌株及び培地：種々のソースから得られた多数のＧＡＳ分離株が研究において使用された。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１（ｅｍｍ１）、８８／３０（ｅｍｍ  ９７）、ＢＳＡ１０（ｅｍｍ  １２４）及びＮＳ２７（ｅｍｍ  ９１），ＮＳ１（ｅｍｍ  １００）及び９０／３１（ｅｍｍ  ５７）はオーストラリア連邦ダーウィンに所在のメンジーズ学校保健研究（Ｍｅｎｚｉｅｓ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手した。５４４８ＡＰ（ｅｍｍ１）菌株はオーストラリア連邦ブリスベーン所在のクイーンズランド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）のＭａｒｋ  Ｗａｌｋｅｒ教授の研究室から入手した。全ての菌株はマウスにて継代培養させ、濃度を増加させたストレプトマイシン上にそれらを連続的に再播種することによりストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）耐性とした。抗原投与接種材料（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を調製するために、ＧＡＳ菌株を、１％のネオペプトン（Ｄｉｆｃｏ）が補充されたトッドヒューイットブロス（ＴＨＢ；Ｏｘｏｉｄ、オーストラリア連邦）を含む液体培地中で３７℃にて培養した。感染後の細菌のバイオバーデンの決定のために、サンプルを、２％寒天、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２％ウマ血液を含む上述の液体培地から構成される血液寒天培地中に播種した。
【００８８】
ペプチド合成及びワクチン処方物：ペプチドＪ８を合成し、他の箇所（Ｂａｔｚｌｏｆｆ他、２００３）に記載されているように、Ａｕｓｐｅｐ株式会社（オーストラリア連邦）によってＤＴにコンジュゲートさせた。組換えＳｐｙＣＥＰは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ社によって発現及び精製された。全てのペプチドは、−８０℃にて、凍結乾燥させて、或いは溶液にて保存した。マウスに、Ｊ８−ＤＴまたは組換えＳｐｙＣＥＰをマウス当り３０ｕｇの用量にて接種した。組み合わせたタンパク質−ペプチドコンジュゲートワクチンを接種するために、マウス１匹当り３０ｕｇのペプチドコンジュゲートＪ８−ＤＴ及び３０ｕｇの組換えＳｐｙＣＥＰを混合して、１：１（ｖ／ｖ）の比率にて水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）：ａｌｕｍ）に吸収させた。
【００８９】
表面皮膚感染モデルの確立：ＧＡＳに対する表面皮膚感染モデルを生成するために、同系交配の雌ＢＡＬＢ／ｃ及び非近交系のスイスマウス（４〜６週齢）を使用した。マウスは、ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌストック）／キシラジル−２０（２０ｍｇ／ｍｌストック）／水（１：１：１０の比率）の腹腔内注射（ＩＰ）（１００μｇ／１０ｍｇマウス）で麻酔した。クリッパーとカミソリを使用してマウスの背臀部の毛を除去した。皮膚をエタノール綿棒を使用して清潔にして、金属用ヤスリを使用して機械的に皮膚表面に傷をつけた。皮膚を傷つけた後に、マウスにＧＡＳを感染させた。ＣＦＵ数が周知のＧＡＳを含有する接種材料（２０μｌ）を傷ついた皮膚上に局所的に適用した。接種材料が皮膚に完全に吸収された後に、創傷部位に一時的なカバーを適用し、マウスを個々のケージに収容した。表面的に感染したコホートに加えて、陽性対照として、空気嚢（ａｉｒ  ｓａｃ）感染マウスのコホートを使用した。これらのマウスは、Ｒａｅｄｅｒ及びＢｏｙｌｅ（１９９３）の方法に従って感染させた。マウスは、承認されたスコアシートのとおりに感染病変及び疾病の兆候について毎日監視した。創傷部位は、感染の状態を評価するために詳しく監視した。
【００９０】
組織構造切片：感染後３日目に、ＧＡＳ皮膚感染を伴う、或いは伴わない傷つけられたマウス（ｎ＝３／群）をと殺した。感染部位からの組織の皮膚サンプルを採取して、緩衝ホルマリンで固定して、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色のためにパラフィンに包埋した。次に、厚さ５μｍの組織切片にスライスして、グラム陽性微生物を可視化するために、Ｈ＆Ｅ並びにギムサ及びグラム染色を用いて染色した。切片は、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（商標）ソフトウェアを使用して、スキャンして、高倍率で読み取った。免疫組織化学の為に、サンプルをＯＣＴ中に凍結した。好中球及びマクロファージ枯渇後の種々の時点での組織検査を実施した。陽性細胞は、スキャンされたスライドの５つの領域にてカウントして、ＩｍａｇｅＪ（アメリカ合衆国メリーランド州ベセスダ所在のアメリカ国立衛生研究所）を用いて１０，０００ｕｍ２当りの陽性細胞の平均数として表した。
【００９１】
マウス免疫付与及び抗原投与プロトコル：ＢＡＬＢ／ｃマウス尾根部に、０日目に、３０μｇのＪ８−ＤＴ、３０ｕｇのｒＳｐｙＣＥＰ、または３０ｕｇのＪ８−ＤＴと３０ｕｇのｒＳｐｙＣＥＰとを含有する６０ｕｇの処方物を、皮下接種した。ＰＢＳ中の全ての抗原調製物は、アジュバンドとしてＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）中に製剤化した。マウスは、２１日目と２８日目に追加接種（ｂｏｏｓｔ）した。対照マウスはアジュバンドのみを受けた。最後の接種から２週間後に、皮膚感染経路を使用して、マウスにＧＡＳを抗原投与した。感染後、マウスを詳しく監視し、（ＧＵ動物倫理委員会によって承認されたスコアシートに基づいて）疾病の兆候の認められるマウスをと殺した。
【００９２】
サンプル採取及びＣＦＵの決定：既定された時点において、各群から感染後（３日目、６日目及び９日目）の５匹のマウスを選び出した。血液サンプルを心穿刺にて採取し、皮膚組織は、感染マウスの背臀部の感染病変から切除した。皮膚サンプルは秤量して、生理食塩水中でホモジナイズした。その後、適切な希釈液をストレプトマイシン−血液−寒天プレート上に繰り返しにて（ｉｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）播種し、感染領域の細菌量を決定した。血液サンプルはＰＢＳにて希釈し、適切な希釈液をストレプトマイシン−血液−寒天プレート上に繰り返しにて播種し、血液中の細菌量を決定した。
【００９３】
細胞枯渇試験：これまでに記載されているように（Ｇｏｌｄｍａｎｎ他、２００４）、カラギーナン（ＣＧＮ）のＩＰ投与によりマクロファージを枯渇させた。皮膚マクロファージの枯渇については、ＣＧＮを７２時間毎に皮下注射し、皮膚常在マクロファージを９５％超、枯渇させた。ＣＧＮ注射の用量と経時変化は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＭａｃ−１及びＡＰＣコンジュゲートＦ４／８０（アメリカ合衆国ニュージャージー州所在のＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識化した後に脾臓細胞のフローサイトメトリー分析を用いて最適化した。好中球を枯渇するために、これまでに記載されているように（Ｅｙｌｅｓ他、２００８）、抗−Ｌｙ６Ｇ  ｍＡｂ（クローン１Ａ８）を使用した。好中球の枯渇は、ＣＤ１１ｂ−ｐｅｒＣｐ−ｃｙ５．５及びＧｒ−１−ＡＰＣ  ｍＡｂｓを用いて、血液細胞、骨髄細胞及び脾臓細胞のフローサイトメトリー分析を用いて確認した。
【００９４】
インビトロにおけるケモカイン分解のアッセイ：ＩＬ−８、ＭＩＰ−２及びＫＣの分解を実施し、これまでに記載されているように（Ｈｉｄａｌｇｏ−Ｇｒａｓｓ他、２００４）、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）キット（アメリカ合衆国ミネソタ州ミネアポリス所在のＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＥＬＩＳＡにより定量化した。この方法を用いて、ＧＡＳ培養上清（Ｓ／Ｎ）を接種後の未分解のケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−２及びＫＣ）の量を測定した。簡潔に述べると、培養物Ｓ／Ｎを採取するために、種々のＧＡＳ菌株を対数増殖期中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６００  ０．５）まで増殖させ、新たなＴＨＢに再接種して、３７℃にて一晩培養した。その後、各菌株からの細胞フリーのＧＡＳ培養物Ｓ／Ｎを既知の濃度の組換えケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−２及びＫＣ）とともに３７℃にて培養した。サンプルを２時間、４時間、８時間または２４時間にて採取し、上記したように、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって未分解のケモカイン量を決定した。
【００９５】
好中球の単離及びｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞遊走アッセイ：好中球単離キット（ドイツ連邦共和国、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてマウス骨髄から好中球を単離した。好中球（１００ｕｌ培地に２．５×１０５）をｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）システム（ニューヨーク州コーニング、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）２４−ウェルトランスウェル）の上側チャンバに加え、次いで、それを培地のみ、または完全なままの（ｉｎｔａｃｔ）、または分解したケモカインを含有する下側チャンバに配置した。陽性対照として、既知の濃度の各組換えケモカインを含有するウェルも使用した。３７℃にて２時間培養後、上側チャンバ及び下側チャンバの両方から細胞を採取し、移動した生存好中球数を、トリパンブルー色素排除法を用いて決定した。移動している好中球の割合（％）は、移動している好中球数を存在している全好中球数によって除算することによって計算した。
【００９６】
ＳｐｙＣＥＰ中和アッセイ：ｒＳｐｙＣＥＰ抗血清のＳｐｙＣＥＰ中和能力を評価するために、ｒＳｐｙＣＥＰに対する高度免疫血清をＢＡＬＢ／Ｃマウス中にて産生した。９０／３１、ＢＳＡ１０及び５４４８ＡＰを含む一団のＧＡＳ菌株を静止期まで成長させた。細胞フリーのＧＡＳ培養上清を組換えケモカインと、５０％のノルマルまたは抗ＳｐｙＣＥＰ血清のいずれかと、ともに３７℃にて１６時間培養した。非開裂ＩＬ−８を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
【００９７】
ＳｐｙＣＥＰエピトープマッピング：ＳｐｙＣＥＰのＮ−末端領域から５５３のアミノ酸を包含するペプチドアレイを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ社）を用いて合成した。５５個の全ペプチド（配列番号１〜５５）において、１０により重複している２０−ｍｅｒの各々を、膜上にブロットした。ＥＬＩＳＡプロトコルに続いて、３０ｕｇ／用量のｒＳｐｙＣＥＰ／Ａｌｕｍ調製物で３回接種したマウスからの抗血清を用いて膜を精査した。ＳｐｙＣＥＰ抗血清で最も強く認識された６つのペプチドを更に試験した（配列番号１５、１８、１９、２４、３０及び５４）。
【００９８】
ペプチド合成及びワクチン処方物：（上記したように）エピトープマッピングにより同定された６つのペプチド（各々が２０−ｍｅｒ）を、フリーのペプチドとして、或いはＣ−末端に更なるシステイン残基を有するものとして、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにて合成した。次いで、Ｃ−末端を有するペプチドをＤＴとコンジュゲートさせ、インビボ免疫原性試験のためにマウスにて使用した。全てのペプチドは、−２０℃にて、凍結乾燥させて、或いは溶液にて保存した。マウスは、マウス当り３０ｕｇの用量にて、ｒＳｐｙＣＥＰまたはＳｐｙＣＥＰペプチド（Ｓ１−Ｓ６）−ＤＴコンジュゲートを３回接種した。
【００９９】
個々のペプチドの免疫原性の決定：血清サンプルを、免疫化ペプチド並びに親タンパク質（ｒＳｐｙＣＥＰ）に対する抗体価を決定するために、各ブーストの前と後に採取した。ペプチド特異的ＩｇＧ力価を決定するために、６つのペプチド（Ｓ１−Ｓ６）の各々の５ｕｇ／ｍｌでプレートをコートした。各ペプチドに対して産生された２倍段階希釈の抗血清を用いてＥＬＩＳＡを実施した。ｒＳｐｙＣＥＰによるＳｐｙＣＥＰペプチド認識を決定するために、２倍段階希釈のｒＳｐｙＣＥＰ抗血清を使用した。最終的に、ペプチド抗血清の親ペプチド認識を決定するために、プレートをｒＳｐｙＣＥＰでコートして、ｒＳｐｙＣＥＰの結合／認識を評価するために、ペプチド抗血清を使用した。
【０１００】
インビトロにおけるＩＬ−８防御についてのアッセイ：ＩＬ−８分解を阻害するペプチド抗血清の能力を評価するために、インビトロＩＬ−８防御アッセイを実施した。ＧＡＳ培養上清（Ｓ／Ｎ）を既知の濃度の組換えＩＬ−８及び１：２希釈のペプチド抗血清（Ｓ１−Ｓ６）と共に培養した。反応混合物中の未分解ＩＬ−８の量を、これまでに記載されているように（Ｈｉｄａｌｇｏ−Ｇｒａｓｓ他、２００４）、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）キット（アメリカ合衆国ミネソタ州ミネアポリス所在のＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＥＬＩＳＡにより定量化した。簡潔に述べると、培養物Ｓ／Ｎを採取するために、種々のＧＡＳ菌株を対数増殖期中期（ＯＤ６００  ０．５）まで増殖させ、新たなＴＨＢに再接種して、３７℃にて一晩培養した。その後、各菌株からの細胞フリーのＧＡＳ培養物Ｓ／Ｎを、既知の濃度の組換えケモカイン（ＩＬ−８）と各ペプチドからの抗血清とともに、或いは既知の濃度の組換えケモカイン（ＩＬ−８）に抗血清を伴わないで、３７℃にて培養した。サンプルを接種後１６時間にて採取し、上記したように、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって未分解のケモカイン量を決定した。
【０１０１】
ペプチド阻害ＥＬＩＳＡ：ペプチド阻害ＥＬＩＳＡアッセイのために、ｐＨ９．６の７５ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液中の最終濃度が５μｇ／ｍｌである、１００μｌのペプチドＳ１〜Ｓ６、或いは、ｒｅｃＳｐｙＣＥｐを用いてマイクロタイタープレートを４℃にて一晩コートした。プレートを緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）を用いて洗浄し、５％スキムミルクを補充した緩衝液（ブロッキングバッファー）を用いて３７℃にて９０分間ブロッキングした。抗ペプチドまたはｒｅｃＳｐｙＣＥＰ血清は、５μｇ／ｍｌまたは２．５μｇ／ｍｌの自己ペプチドの各々またはｒｅｃＳｐｙＣＥＰとともに、３７℃にて３０分間前培養した。その後、試験用抗血清をブロッキングされたプレートに加え、３７℃にて９０分間培養した。プレートを４回洗浄し、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ（オーストラリア連邦、Ｂｉｏｒａｄ）を加え、３７℃にてさらに９０分間培養した。更なる洗浄の後に、プレートを上記したように展開させて、ＯＤ４５０を測定した。
【０１０２】
フローサイトメトリーアッセイ：ｒｅｃＳｐｙＣＥＰエピトープ抗体またはＳｐｙＣＥＰエピトープ抗体のＧＡＳ細胞表面への結合を、フローサイトメトリーによって分析した。細菌を１％ネオペプトンを含むＴＨＢにて一晩培養し、ＰＢＳ中にて洗浄した。その後、細菌（１×１０７コロニー形成単位，ｃｆｕ）を室温にて１５分間１００μｌのＦｃブロッカーとともに前培養して、非特異的結合部位をブロックした。これに続いて、ペプチド抗血清を２０分の１の希釈にて添加した。室温にて１時間培養後、細菌をＰＢＳ中にて２回洗浄し、ＦＩＴＣがコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に５０分の１で希釈）とともに培養した。最終的に、細菌を洗浄し、（ＰＢＳ中の）１％ホルムアルデヒド中にて室温で１５分間培養した。サンプルは、ＣｙＡｎ（登録商標）ＡＤＰアナライザ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）にて分析した。ＦＩＴＣがコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧを分析される各菌株に対する陰性対照として別々に加え、更には、非特異的マウスＩｇＧを対照として含めた。
【０１０３】
ワクチンの有効性を評価するための抗原投与モデル：同系交配の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）をケタミン（１００ｍｇ／ｍｌストック）／キシラジル−２０（２０ｍｇ／ｍｌストック）／水（１：１：１０の比率）の腹腔内注射（ＩＰ）（１００μｇ／１０ｍｇマウス）で麻酔した。クリッパーとカミソリを使用してマウスの首筋の毛を除去した。皮膚の傷付処理の後、１×１０６ＣＦＵ数を含むＧＡＳの接種材料（２０μｌ）を局所的に適用した。接種材料が皮膚に完全に吸収された後に、創傷部位に一時的なカバーを適用し、マウスを個々のケージに収容した。感染の２４時間前にストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）水をマウスに与え、試験期間中、そこに留めた。マウスは、グリフィス大学ＩＢＣによって承認されたスコアシートのとおりに感染病変及び疾病の兆候について毎日監視した。創傷部位は、感染の状態を評価するために詳しく監視した。
【０１０４】
臓器の採取及びＣＦＵの決定：感染後の種々の時点（３日目、６日目及び９日目）において、各群から規定数のマウスをと殺した。血液サンプルを心穿刺にて採取し、脾臓を除去し、首筋の感染病変から皮膚バイオプシーサンプルを得た。皮膚サンプル及び膵臓サンプルをホモジナイズし、適切な希釈液をストレプトマイシン−血液−寒天プレート上に繰り返しにて播種した。感染後、マウスを詳しく監視し、（スコアシートに基づいて）疾病の兆候を示すマウスをと殺した。
【０１０５】
結果
図１において、Ｊ８−ＤＴ／Ａｌｕｍワクチン接種の防御効率を、異なるＧＡＳ菌株Ｍ１（咽頭分離株）及び皮膚分離株８８／３０及びＢＳＡ１０を比較することによって示す。Ｊ８−ＤＴ／Ａｌｕｍワクチン接種は、Ｍ１と比較して、皮膚分離株のいずれにおいても効果が低かった。Ｊ８免疫の効果は、図２に示されるように、ＧＡＳ感染マウスの皮膚における好中球（ＰＭＮ）の存在と関係している。
【０１０６】
従って、Ｊ８−ＤＴ／Ａｌｕｍに反応した、好中球枯渇の効果を測定するための実験を行い、その結果を図３に示す。好中球枯渇は、Ｊ８−ＤＴ／Ａｌｕｍワクチン接種の有効性に有害な影響を与える。
【０１０７】
図１乃至３のデータは、ＧＡＳ感染に対してＪ８免疫の有効性を決定する上で好中球が役割を果たしていることを示唆するものである。図４はＣｏｖＲ／Ｓ変異を有する５４４８ＡＰ（Ｍ１Ｔ１分離株）のようなＧＡＳ分離株においてアップレギュレートされて発現された細菌遺伝子の概略図を提供する。図５に示されるように、ＧＡＳ分離株５４４８ＡＰに対するＪ８−ＤＴ／Ａｌｕｍ防御の有効性は比較的劣っていた。好中球がＪ８ペプチドに対する免疫反応を支援しているかもしれないとすれば、ＧＡＳ分離株５４４８ＡＰにて強く発現される候補細菌遺伝子は、好中球化学誘引物質であるインターロイキン−８を開裂し、不活性化する、７０ｋＤａのセリンプロテアーゼであるＳｐｙＣＥＰであった（図４を参照）。図６は５４４８ＡＰが特に強いＩＬ−８分解を示した実験結果を示す。５４４８ＡＰ分離株はまたＩＬ−８のマウス機能的ホモログ：ＣＸＣＬ１／ＭＩＰ−２（図７）及びＣＸＣＬ１／ＫＣ（図８）に対する強い分解活性も示した。機能的に、この分解は、図９に示されるように、好中球走化性の阻害と相関していた。
【０１０８】
図１乃至９に示すデータは、セリンプロテアーゼであるＳｐｙＣＥＰは、タンパク質分解によりＩＬ−８をマイナスにレギュレートするＣｏｖＲ／ＳＣｏｖＲ／Ｓ変異ＧＡＳ細菌により高度に発現され、それにより好中球の走化性を阻害するか或いは抑制することを示唆している。従って、ＳｐｙＣＥＰの標的化がＪ８ペプチドに対する免疫反応を改善する、回復する、或いは増強するかどうかを決定するための実験を行った。図１０に示した結果は、Ｊ８−ＤＴ−組換えＳｐｙＣＥＰ／Ａｌｕｍでの免疫付与は、Ｊ８−ＤＴペプチドコンジュゲート、或いは組換えＳｐｙＣＥＰ単独での免疫付与よりも遥かに効果的であり、Ｊ８ペプチドと組換えＳｐｙＣＥＰとの組み合わせは５４４８ＡＰＧＡＳ細菌による感染に対する防御のために相乗的に作用することを、示した。これに続き、図１１は、Ｊ８−ＤＴ−ｒＳｐｙＣＥＰでの免疫付与は、Ｊ８−ＤＴまたはＳｐｙＣＥＰ単独よりも遥かに強いＩｇＧ抗体反応を生ずることを示している。これらのデータは、ＳｐｙＣＥＰに対する抗体が、ＧＡＳ感染部位（皮膚）に直接投与できる有用な治療剤となり、それにより感染を治療する可能性を引き上げるものである。図１２に示されるように、抗ＳｐｙＣＥＰ抗体（組換えＳｐｙＣＥＰが接種されたマウスからの抗血清の形態）は、ＳｐｙＣＥＰのＩＬ−８分解活性を阻害した。
【０１０９】
本発明者らは、ＳｐｙＣＥＰの残基３５−５８７からの一連の重複する２０ｍｅｒペプチド（ニトロセルロース膜上のペプチドアレイ）（図１３の配列番号１〜５５）をｒｅｃＳｐｙＣＥＰ抗血清によって認識されたものとして決定した。図１４におけるデータから、本発明者らは、図１５に記載されるアミノ酸配列を有する６つの推定ペプチドエピトープを同定した（Ｓ１〜Ｓ６、配列番号１５、１８、１９、２４、３０及び５４）。次いで、本発明者らは、これらの個々の合成ペプチドを作製し、それぞれをＤＴとコンジュゲートさせた。マウスに接種し、本発明者らは抗血清がｒｅｃＳｐｙＣＥＰを認識し得ることを示した。とはいえ、幾らかのものは他のものと比較してより強力であった（図１６）。次に、本発明者らはＩＬ−８防御アッセイを実施して、抗ペプチド抗体がＳｐｙＣＥＰによるＩＬ−８の分解を程度の差こそあれブロックすることを示した。しかしながら、１つのペプチド（Ｓ２：配列番号１８）抗血清は、抗ｒｅｃＳｐｙＣＥＰと同程度に効果的にＩＬ−８の分解をブロックする（図１７）。従って、本発明者らは、機能的抗体を誘導できるＳｐｙＣＥＰにおける優勢エピトープ（配列番号１８）を同定した。
【０１１０】
図１８乃至２０に示されるデータは、以下に示されるｐ１４５、Ｊ８及びＪ８ペプチドバリアントの免疫原性を試験したものである：
・ｐ１４５    ＬＲＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥ  （配列番号５６）
・Ｊ８    ＱＡＥＤＫＶＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＬＥＤＫＶＱ（配列番号５８）
・Ｊ８ｉ  Ｖ１    ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＶＥＫＡＬＣ  （配列番号５９）
・Ｊ８ｉ  Ｖ２    ＳＲＥＡＫＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＣ  （配列番号６０）
・Ｊ８ｉ  Ｖ３    ＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ  （配列番号６１）
・Ｊ８ｉ  Ｖ４    ＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＣ  （配列番号６２）。
【０１１１】
高度免疫血清は、４〜６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにて、２８日の免疫付与プロトコルの後に生成された。ＰＢＳ及びＡｌｕｍ中の３０μｇのＤＴがコンジュゲートされたペプチド（Ｊ８、ｐ１４５、Ｊ８ｉＶ１、Ｊ８ｉＶ２、Ｊ８ｉＶ３、またはＪ８ｉＶ４）をマウスに皮下接種した。免疫付与は、０日、２１日、２８日に行った。血液／血清を採取するために、３５日目、４２日目及び４９日目に顎下腺出血を実施した。
【０１１２】
本発明者らはＪ８−ＤＴのワクチン接種により誘導される抗体が、天然の配列ｐ１４５のみを不十分に認識することを、マウス及びヒトの両方においてこれまでに観察してきた。従って、本発明者らは１２ｍｅｒのＪ８挿入配列に基づいて４つのバリアントペプチドを設計し、ペプチドのα−Ｊ８ｉＶ３−ＤＴ螺旋構造を保存するべく、疎水性及び親水性アミノ酸のヘプタッド周期性を維持するように設計した。これらは、上記したＪ８ｉＶ１、Ｊ８ｉＶ２、Ｊ８ｉＶ３、及びＪ８ｉＶ４ペプチドである。図１８（右側のパネル）は、Ｊ８−ＤＴワクチン接種により誘導されたｐ１４５特異的抗体の力価が非常に低い（平均約２０００、幾らかのマウスでは２００未満）ことを示している。これに対し、Ｊ８特異的抗体の力価は、Ｊ８−ＤＴワクチン接種後、約６００，０００である。Ｊ８に対する高い力価は、大部分の抗体が、Ｊ８のアミノ末端セグメント及びカルボキシル末端セグメントにて非レンサ球菌のフランキング配列を認識していることを意味しているに違いない。とはいえ、これは正式には証明されてはいない。
【０１１３】
図１９は、Ｊ８ｉＶ１、Ｊ８ｉＶ２、Ｊ８ｉＶ３、及びＪ８ｉＶ４の全てが、自身に対する高い力価の抗体を誘導することを示す（おおよそ１００，０００）。重要なことは、全てがｐ１４５に対して高い力価を誘導している（＞１０，０００）ことであり、Ｊ８ｉＶ３−ＤＴはおおよそ３０，０００の力価を誘導している（図２０の右側のパネル）。新規なペプチドの自身に対する力価は、ｐ１４５に対する力価よりも高い可能性がある。その理由は、ｐ１４５が新たなペプチドには認められない更なるアミノ酸配列を含んでおり、これらの幾らかが、新たなバリアントに対する抗血清により認識されるエピトープをマスクするからである。しかしながら、バリアントＪ８ペプチドの自身に対する高い力価（おおよそ１００，０００）は、それらがレンサ球菌配列にのみ由来していることから重要である。従って、新たなバリアントは、レンサ球菌配列を認識する全ての抗体で１００，０００の力価を誘導するのに対して、Ｊ８は、おおよそ２，０００のレンサ球菌力価を誘導する。
【０１１４】
Ｓ２の免疫優勢を、ペプチド阻害アッセイを使用して更に評価した。ｒｅｃＳｐｙＣＥＰに対する抗血清及び個々のエピトープを、免疫抗原の各々とともに前培養して、その後、抗原に対する結合性を分析した。エピトープ抗血清の固定化自己ペプチドに対する結合は、自己ペプチドとの前培養後に大いに低減された（４０〜８０％の阻害）（図２１Ａ）。エピトープ抗血清のｒｅｃＳｐｙＣＥＰとの前培養はまた、Ｓ２−ＤＴに対する抗血清をｒｅｃＳｐｙＣＥＰと培養した場合に観察された最も高い阻害にて固体化された自己ペプチドによる認識の阻害を引き起こすものであり（図２１Ｂ）、Ｓ２−ＤＴ免疫付与により認識されたエピトープがｒｅｃＳｐｙＣＥＰの表面上にて示されることを示している。更に、ＳｐｙＣＥＰに対する抗血清が６個のペプチドの各々とともに培養された場合、本発明者らは、ペプチドＳ２（配列番号１８）が最大の程度にて結合を阻害し、そしてｒｅｃＳｐｙＣＥＰにより誘発される阻害に匹敵することを観察した（図２１Ｃ）。これらのデータは、ＥＬＩＳＡに関して、ＳｐｙＣＥＰに対する免疫反応がＳ２（配列番号１８）の抗体認識により優勢的に定義され、かつそのＳ２（配列番号１８）は全ｒｅｃＳｐｙＣＥＰに対する同様の免疫反応を誘導し得ることを示している。従って、Ｓ２（配列番号１８）はＳｐｙＣＥＰの免疫優勢エピトープである。
【０１１５】
次に、本発明者らは、ＳｐｙＣＥＰ及びエピトープ抗血清の、種々のＧＡＳ菌株に対する結合効率を試験した。ＳｐｙＣＥＰは、ＧＡＳ表面上にて発現され、かつ排出される（ｓｈｅｄ）。生来の抗原の認識を評価する為に、異なるエピトープ特異的抗体の種々のＧＡＳ菌株に対する結合を、ＦＡＣＳアッセイを使用して比較した。ＧＡＳ菌株５４４８は、その動物継代培養された誘導体５４４８ＡＰ（高レベルのＳｐｙＣＥＰを発現することが知られているＣｏｖＲ／Ｓ変異菌株）とともに使用した。同様に、野生型のＢＳＡ１０を、その動物継代培養された誘導体ｐＢＳＡ１０（これもまたＣｏｖＲ／Ｓ変異体である）と同時に使用した。参照菌株２０３１（ｅｍｍ１）及びオーストラリア北部準州の皮膚単離株８８／３０もまた培養した。本発明者らのデータは、全ての場合において、ｒｅｃＳｐｙＣＥＰでのワクチン接種により誘導された抗体のＧＡＳ単離株への結合が、Ｓ２−ＤＴ免疫付与により誘導された抗体に匹敵することを示している。その他のエピトープに対する抗体は、ＧＡＳに対する種々のレベルでの結合を示した（図２２Ａ、Ｂ及びＣ）。加えて、ＳｐｙＣＥＰ並びにＳ２の表面発現は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）のデータ（データは示さない）により測定された場合、試験された菌株の全てにおいて、最も高い値であることが認められた。これらのデータは、天然のＳｐｙＣＥＰに対するＳ２エピトープの免疫優勢を示す。しかしながら、データは、Ｓ２エピトープに対する抗体がＳｐｙＣＥＰのＣＸＣケモカインプロテアーゼを機能的に損ねるであろうということを示していない。
【０１１６】
次に、本発明者らはＳ２−ＤＴがＪ８−ＤＴワクチンの有効性を強化するかどうかを求めた。本発明者らは、Ｊ８−ＤＴと組み合わせたｒｅｃＳｐｙＣＥＰがＪ８−ＤＴ単独またはＳｐｙＣＥＰ単独のいずれの場合よりもＧＡＳのＣｏｖＲ／Ｓ変異菌株での侵襲性感染に対して有意に優れた防御が得られることをこれまでに示してきた（提出された原稿）。Ｊ８−ＤＴと、ｒｅｃＳｐｙＣＥＰ若しくはＳ２−ＤＴと、を１：１の重量比にて混合し、本発明者らが最近開発した皮膚抗原投与モデルにて試験した（提出された原稿）。対照マウスは、個々の抗原、或いはＰＢＳを接種した。接種後のマウスは５４４８ＡＰ  ＧＡＳを抗原投与した。Ｊ８−ＤＴ＋Ｓ２−ＤＴの接種は、５４４８ＡＰ感染マウスの皮膚及び血液中において、細菌のバイオバーデンを有意に低減した（図２３Ａ及びＢ）。Ｊ８−ＤＴ＋Ｓ２−ＤＴワクチン接種により提供される防御のレベルはまた、Ｊ８−ＤＴ＋ＳｐｙＣＥＰワクチン接種のそれに匹敵することが明らかとなった。これらの知見を確認するために、抗原投与実験は、別のＣｏｖＲ／Ｓ変異菌株ＮＳ８８．２を用いて繰り返した（図２４Ａ及びＢ）。ここでもまた、本発明者らは、Ｊ８−ＤＴ＋ＳｐｙＣＥＰまたはＪ８−ＤＴ＋Ｓ２−ＤＴのワクチン接種が、Ｊ８−ＤＴのみの場合と比較して防御効率が有意に向上するという結果と見出した。Ｊ８−ＤＴまたはＳｐｙＣＥＰ単独でのワクチン接種は、ＰＢＳ対照と比較していかなる防御をも提供するものではなかった。
【０１１７】
結論
好中球活性は、Ｊ８ペプチドのワクチン接種の有効性における重要な要因であるように思われる。ＳｐｙＣＥＰは、ＣｏｖＲ／Ｓ変異を有するような毒性の強いＧＡＳ細菌によって高度に発現されるＩＬ−８分解プロテアーゼである。Ｊ８ペプチドとｒＳｐｙＣＥＰの組み合わせでの免疫付与は、Ｊ８ペプチドまたはＳｐｙＣＥＰ単独の場合と比較して、ＣｏｖＲ／Ｓ変異体５４４８ＡＰによるＧＡＳ感染に対して相乗効果を有する。抗ＳｐｙＣＥＰ抗体が、ＳｐｙＣＥＰのＩＬ−８分解活性を効果的に中和し、それにより既存のＧＡＳ感染に対して治療的介入を提供することも明らかである。更に、本発明者らは、機能的な抗体を誘導可能なＳｐｙＣＥＰに対する優勢エピトープ（配列番号１８）を同定した。本発明者らは、現在、ＧＡＳ抗原投与を用いて、能動的及び受動的ワクチン試験を計画している。このエピトープの利点は、ワクチンにおいてＳｐｙＣＥＰ組換えタンパク全体の使用を回避可能である点にあり、それによって安全性の側面を改善することができる。本発明者らは、最適なワクチンは、Ｊ８とこのエピトープとの混合物であろうと考えている。この予測の確認において、Ｊ８−ＤＴ＋ＳｐｙＣＥＰまたはＪ８−ＤＴ＋Ｓ２−ＤＴのワクチン接種が、Ｊ８−ＤＴ単独の場合と比較して防御効率を有意に向上させた。更に、バリアントＪ８ペプチドを開発したが、これは自身に対して、そして、レンサ球菌ペプチドｐ１４５に対して高い力価を誘導した。その理由はおそらくは、それらが、レンサ球菌ｐ１４５アミノ酸配列にもっぱら由来していることによるものである。
【０１１８】
本明細書全体にわたって、その目的は、本発明をいかなる１つの実施形態にも具体的な特徴の集まりにも限定することなく、本発明の好ましい実施形態について述べることであった。本発明の広い精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載され、かつ例示された実施形態に様々な改変及び変更をなすことが可能である。
【０１１９】
本明細書中で参照した全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許文献及び科学文献は参照により本願に組込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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