(57)【要約】  治療剤をアッセイするための方法、デバイス、および組成物。１つの側面においては、パクリタキセルの治療薬モニタリングガイド下治療を提供するためにパクリタキセルをアッセイするための方法、デバイス、および組成物。【選択図】  図５Ａ
2017513030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中のパクリタキセルをアッセイするための方法であって、
（ａ）パクリタキセルを含む液体試料をラテラルフローアッセイデバイスに適用することであって、前記デバイスが
（ｉ）前記液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｉｉ）前記試料受容ゾーンと液通し、前記試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、
前記検出試薬ゾーンがその上に堆積した検出試薬を含み、
前記検出試薬が、検出可能なレポート基で標識された、パクリタキセルと結合するパクリタキセル抗体またはその断片もしくは誘導体であり、
前記パクリタキセル抗体またはその断片もしくは誘導体が、約１０4〜約１０7のＫonおよび約１０-3〜約１０-7のＫoffを有する検出試薬ゾーン、および
（ｉｉｉ）前記検出試薬ゾーンと液通し、前記検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーン
を含み、
前記捕捉ゾーンがその上に固定化された第１および第２の捕捉試薬を含み、
前記第１の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料であり（試験ライン）、
前記第２の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能な抗体であり（対照ライン）、
前記第１の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第１の距離に位置し、
前記第２の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第２の距離に位置し、
前記第２の距離が前記第１の距離より大きく、
前記Ｋonが約２．０×１０5より大きく前記Ｋoffが約１．０×１０-3より小さい場合には前記第１の距離対前記第２の距離の比は約０．０〜約０．４であり、
前記Ｋonが約２．０×１０4より大きく前記Ｋoffが約２．０×１０-4より小さい場合には前記第１の距離対前記第２の距離の比は約０．２〜約１．０であること、
（ｂ）前記試料を前記試料受容ゾーンから前記検出試薬ゾーンに流動させて検出試薬にパクリタキセルを供給すること、
（ｃ）前記検出試薬をパクリタキセルとともに前記捕捉ゾーンに流動させることであって、
前記第１の捕捉試薬（試験ライン）が前記検出試薬との結合に関して分析物質（パクリタキセル）と競合し、
前記第２の捕捉試薬（対照ライン）が過剰の検出試薬と結合すること、ならびに
（ｄ）前記第２の捕捉試薬（対照ライン）と比較して前記第１の捕捉試薬（試験ライン）に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む、方法。
【請求項２】
対照ラインおよび試験ラインにおいて結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中のパクリタキセルの量を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することが光学密度の測定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出可能なレポート基が金コロイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記パクリタキセル抗体が３Ｃ６である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記パクリタキセル抗体が８Ａ１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記パクリタキセル材料が前記検出試薬への結合に関してパクリタキセルと競合するパクリタキセル抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記パクリタキセル材料がパクリタキセルタンパク質コンジュゲートである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出試薬と結合可能な抗体がヤギ抗マウス抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料受容ゾーンと前記第１の捕捉試薬との間の距離を変化させて、パクリタキセルの検出感度を最適化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料受容ゾーンと前記第１の捕捉試薬との間の距離を最小化して、パクリタキセルの検出感度を最適化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の捕捉試薬（対照ライン）に結合した過剰の検出試薬の量を観測することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の捕捉試薬に結合した過剰の検出試薬の量を定量することによって前記試料中のパクリタキセルの量を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および第２の捕捉ゾーンの中間の第３の捕捉ゾーンをさらに含み、前記第３の捕捉ゾーンが前記検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第３の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中のパクリタキセルの量を決定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することが光学密度の測定を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ラテラルフローデバイスが、前記捕捉試薬ゾーンと液通し、前記捕捉試薬ゾーンから流れ方向下流にある吸収ゾーンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＬＦＡをＳＰＲまたは他の固相イムノアッセイに置きかえることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
第１および第２の抗体を用い、前記第１の抗体が１０4より大きいＫonを有し、前記第２の抗体が１０-3より小さいＫoffを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
再現性を増大させダイナミックレンジを拡大させるために２本または３本のラインを用いて同一試料について複数の読み取りを生成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
癌と診断された患者におけるパクリタキセル療法の有効性をモニターするための方法であって、
（ａ）第１の時点で癌患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｂ）第１の時点で前記患者におけるパクリタキセルの第１の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが請求項１から２０の何れか一項に記載の方法を含むこと、
（ｃ）第２の時点で前記患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｄ）第２の時点で前記患者におけるパクリタキセル薬の第２の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが請求項１から２０の何れか一項に記載の方法を含むこと、および
（ｅ）癌処置の有効性を決定するために前記患者におけるパクリタキセルの前記第１の濃度と第２の濃度を比較すること
を含む、方法。
【請求項２２】
癌と診断された患者におけるパクリタキセル療法のＰＫガイド下投薬のための方法であって、
（ａ）第１の時点で前記癌患者をパクリタキセルで処置すること、
第１の時点で前記患者におけるパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが請求項１から２０の何れか一項に記載の方法によってパクリタキセルの濃度を測定することを含むこと、
（ｂ）前記第１の投薬からのＰＫ情報を用いて第２の時点で前記患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｃ）第２の時点で前記患者におけるパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが請求項１から２０の何れか一項に記載の方法によってパクリタキセルの濃度を測定することを含むこと、および
（ｄ）適切な投薬が達成されたことを確認するために、前記第１の時点における対象のパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを前記第２の時点におけるレベルと比較すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記薬物動態パラメーターが、最大濃度までの時間（Ｔmax）、濃度最大値（Ｃmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖd）、最終相の間の見かけの分布体積（Ｖz）、定常状態の間の見かけの分布体積（Ｖss）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｂ）前記試料受容ゾーンと液通し、前記試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、
その上に堆積した１つ以上の検出試薬を含む検出試薬ゾーン、
（ｃ）前記検出試薬ゾーンと液通し、前記検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーンであって、
その上に固定化された１つ以上の捕捉試薬を含む捕捉ゾーン、および
（ｄ）前記捕捉ゾーンと液通し、前記捕捉試薬ゾーンから流れ方向下流にある吸収ゾーン
を含む、ラテラルフローデバイス。
【請求項２５】
前記検出試薬が検出可能なレポート基で標識された抗体である、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記検出試薬が治療薬に第１の親和性を有する第１の抗体および前記治療薬に第２の親和性を有する第２の抗体を含み、前記第１の親和性が前記第２の親和性より大きい、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記捕捉試薬が前記検出試薬への結合に関して前記治療薬と競合する抗原である、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能な抗体である、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記捕捉試薬が前記検出試薬への結合に関して前記治療薬と競合する抗原である第１の捕捉試薬と、前記検出試薬と結合可能な抗体である第２の捕捉試薬とを含む、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記第１の捕捉試薬が、前記第２の捕捉試薬から流れ方向上流に固定化されている、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記試料受容ゾーンと前記第１の捕捉試薬との間の距離を変化させて、前記治療薬の検出を最適化する、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記第１および第２の捕捉試薬の中間に固定化された第３の捕捉試薬をさらに含み、前記第３の捕捉試薬が、前記検出試薬への結合に関して前記治療薬と競合する抗原である、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記治療薬がパクリタキセルであり、前記検出試薬が８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体を含み、前記抗体、または断片もしくは誘導体がパクリタキセルに結合する、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項３４】
試料中の治療薬をアッセイするための方法であって、
（ａ）請求項２４から３３の何れか一項に記載のデバイスの試料受容ゾーンに試料を適用すること、および
（ｂ）前記１つ以上の固定化された捕捉試薬に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の固定化された捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中の治療薬の量を決定することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
検出試薬が第１の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
検出試薬が第２の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
検出試薬が第１および第２の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療薬がパクリタキセルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出試薬が８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体を含み、前記抗体、または断片もしくは誘導体がパクリタキセルに結合する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
疾患または状態と診断された患者における治療処置の有効性をモニターするための方法であって、
（ａ）第１の時点で患者を治療剤で処置すること、
（ｂ）第１の時点で前記患者における前記治療剤の第１の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが請求項３４から４０の何れか一項に記載の方法を含むこと、
（ｃ）第２の時点で前記患者を前記治療剤で処置すること、
（ｄ）第２の時点で前記患者における前記治療剤の第２の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが請求項３４から４０の何れか一項に記載の方法を含むこと、および
（ｅ）前記治療処置の有効性を決定するために前記患者における前記第１および第２の濃度を比較すること
を含む、方法。
【請求項４２】
前記疾患または状態の処置が治療薬モニタリングから利益を受ける、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患または状態が癌、炎症、高血圧、心臓血管、または疼痛である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療剤がパクリタキセル、ドセタキセル、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル、および７−Ｌ−アラニルパクリタキセルからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
疾患または状態と診断された患者における治療処置のＰＫガイド下投薬のための方法であって、
（ａ）第１の時点で前記患者を治療剤で処置すること、
第１の時点で前記患者における前記治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが請求項３４から４０の何れか一項に記載の方法によって前記治療剤をアッセイすることを含むこと、
（ｂ）前記第１の投薬から得られたＰＫデータを用いて第２の時点で前記患者を前記治療剤で処置すること、
（ｃ）第２の時点で前記患者における前記治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが請求項３４から４０の何れか一項に記載の方法によって前記治療剤をアッセイすることを含むこと、および
（ｄ）適切な投薬が達成されたことを確認するために、前記第１の時点における前記対象の前記治療薬剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを前記第２の時点におけるレベルと比較すること
を含む方法。
【請求項４６】
前記薬物動態パラメーターが、最大濃度までの時間（Ｔmax）、濃度最大値（Ｃmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖd）、最終相の間の見かけの分布体積（Ｖz）、定常状態の間の見かけの分布体積（Ｖss）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患または状態が癌、炎症、高血圧、心臓血管、または疼痛である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記治療剤がパクリタキセル、ドセタキセル、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル、および７−Ｌ−アラニルパクリタキセルからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
パクリタキセルに結合する、８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体。
【請求項５０】
前記抗体、抗体断片、または抗体誘導体が配列番号２、４、６、または８に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）と少なくとも９５％のホモロジーを有する１つ以上のＣＤＲを含む、請求項４９に記載のモノクローナル抗体、抗体断片、または抗体誘導体。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は２０１４年４月４日に出願した米国特許出願第６１／９７５３８６号および２０１４年９月１７日に出願した米国特許出願第６２／０５１７５７号の利益を主張する。これらの出願はそれぞれ参照により全体として明示的にここに組み込まれる。
配列表に関する陳述
本出願に付随する配列表は紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、参照によりここに組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は５３６３４＿ＳＥＱ．ｔｘｔである。テキストファイルは１１ＫＢであり、２０１５年４月６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通して本明細書の出願とともに提出されている。
【０００２】
パクリタキセルはもともとタイヘイヨウイチイの樹皮から分離され、肺癌、卵巣癌、および乳癌等の様々な癌種の最も効果的な化学療法剤の１つとして確立されてきた。パクリタキセルの主な限界はその溶解性が低く、有毒な有機溶媒、典型的にはポリオキシエチル化ひまし油と脱水エタノールの混合物（Ｔａｘｏｌ（登録商標）として知られている）の中で製剤化する必要があることである。溶媒の毒性を防止するために、パクリタキセルは種々の賦形剤を用いて、またパクリタキセル等の疎水性薬剤の溶解性を改善することができるナノ粒子送達システムを用いて製剤化されてきた。
【０００３】
パクリタキセルとアルブミンが結合したナノ粒子製剤であるＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）は２００５年にＦＤＡによって承認され、現在のところ化学療法のためのパクリタキセルの最良の製剤の１つである。その他、たとえばポリマーナノ粒子、脂質系ナノ粒子製剤、ポリマーコンジュゲート、無機ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、またはシクロデキストリンナノ粒子を用いるシステムがパクリタキセルの送達のために研究され、または開発中である（たとえばＰｉｎｇ  Ｍａら、２０１３、Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：４：２を参照）。
【０００４】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）は広く用いられる化学療法剤であり、全ての癌種に実用的に適用可能であるが、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）に対する反応性は２０％と低いことがある。一部の患者において見られるパクリタキセルへの相対的な非感受性は、反応性が低いことに寄与する因子であり得る。しかし、この非感受性は反応性が低いことの一次的な理由ではないこともある。承認された種々の用量（転移乳癌で２６０ｍｇ／ｍ2、膵臓癌で１２５ｍｇ／ｍ2、肺癌で１００ｍｇ／ｍ2）で投与した場合、患者の臨床試料でモニターしたパクリタキセルの血中濃度には１０倍までの変動がある（Ｎｙｍａｎ  ＤＷら、２００５、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３、７７８５−９３）。この変動は、大部分の患者がおそらく不適当な投薬を受けており、パクリタキセルの投与濃度が過大で治療を取りやめなければならなくなったか、または投与量が過小で治療から利益が得られなかったかを示唆している。患者がパクリタキセルに感受性を有していたとしても、薬剤濃度が不十分であれば患者は非反応性になり、治療は無効になる。低用量グループは、彼らがパクリタキセルに非感受性なのか、十分なパクリタキセルの投与を受けなかったのかを判断することが難しいので、最も脆弱な患者集団である。そのような場合において、個別の薬物動態変動に基づいて妥当な薬物用量のための指針を提供するためには、完全な薬物動態（ＰＫ）プロファイルが唯一の手段である。
【０００５】
現在のところ、患者を包括的な臨床試験に登録することなくパクリタキセルの完全な薬物動態定量化を実施する利用可能な方法はなく、そのためには入院が必要である。そのような薬物動態試験の典型的な期間は４８時間を超えることがあり、繰り返して採血する必要がある。現在のところ、パクリタキセルの血中濃度を分析するためには液体クロマトグラフィー／マススペクトル（ＬＣ／ＭＳ）法等の複雑な実験装置を使用する必要がある。これらの方法は極めて高価であり、現在のところ試料あたり１２０ドルを超え、装置のコストは１台あたり１５万ドル〜２０万ドルを超える範囲である。またそれぞれの特定の患者について薬物動態パラメーターを適切に特徴づけるためには、４８〜７２時間にわたって最低４つのデータ点の収集が必要であることも示されている。薬物動態試験のために患者を入院させておくことは、患者あたりのコストを優に約１万ドルに押し上げることになる。ＰＫガイド下投薬の臨床的有効性を証明するための十分に力のある第ＩＩＩ相臨床試験は５００名の患者を必要とするであろう（ＢＳＡの投薬に２５０名、およびＰＫガイド下投薬に２５０名）。生体分析コストだけで１５０万ドルになろう（５００点×化学療法６サイクル×薬物動態解析のための採血４回×試料分析あたり１２０ドル）。その他の試験の要素が患者あたり約１０万ドルとして、合計５千万ドルとなる。これは、最適な腫瘍反応性およびデバイスの規制承認を得るための用量調整をガイドするために必要な意味のある臨床データを得ることに対する顕著な障害となる。したがって、分析および装置のコストが高いことは、比較的狭い治療レンジを有する多くの薬剤の治療薬モニタリング（ＴＤＭ）の確立を不可能にするほどの結果をもたらす。
【０００６】
したがって、患者におけるパクリタキセルの薬物動態をモニターする単純、有効、かつ安価な手段およびそれにより投薬ストラテジーの調節に関する情報を提供することによって個々の患者への治療を適切に個別化することへのニーズが存在する。本発明はこのニーズを満たし、関連する利点をさらに提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は治療剤をアッセイするための方法、デバイス、および組成物を提供する。１つの側面においては、パクリタキセルをアッセイするための方法、デバイス、および組成物が提供される。
【０００８】
１つの側面においては、本発明は液体試料中のパクリタキセルをアッセイするための方法を提供する。１つの態様においては、本方法は、
（ａ）パクリタキセルを含む液体試料をラテラルフローアッセイデバイスに適用することであって、デバイスが
（ｉ）液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｉｉ）試料受容ゾーンと液通し、試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、
検出試薬ゾーンがその上に堆積した検出試薬を含み、
検出試薬が、検出可能なレポート基で標識された、パクリタキセルと結合するパクリタキセル抗体またはその断片もしくは誘導体であり、
パクリタキセル抗体またはその断片もしくは誘導体が、約１０4〜約１０7のＫonおよび約１０-3〜約１０-7のＫoffを有する検出試薬ゾーン、および
（ｉｉｉ）検出試薬ゾーンと液通し、検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーン
を含み、
捕捉ゾーンがその上に固定化された第１および第２の捕捉試薬を含み、
第１の捕捉試薬が検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料であり（試験ライン）、
第２の捕捉試薬が検出試薬と結合可能な抗体であり（対照ライン）、
第１の捕捉試薬が捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第１の距離に位置し、
第２の捕捉試薬が捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第２の距離に位置し、
第２の距離が第１の距離より大きく、
Ｋonが約２．０×１０5より大きくＫoffが約１．０×１０-3より小さい場合には第１の距離対第２の距離の比は約０．０〜約０．４であり、
Ｋonが約２．０×１０4より大きくＫoffが約２．０×１０-4より小さい場合には第１の距離対第２の距離の比は約０．２〜約１．０であること、
（ｂ）試料を試料受容ゾーンから検出試薬ゾーンに流動させて検出試薬にパクリタキセルを供給すること、
（ｃ）検出試薬をパクリタキセルとともに捕捉ゾーンに流動させることであって、
第１の捕捉試薬（試験ライン）が検出試薬との結合に関して分析物質（パクリタキセル）と競合し、
第２の捕捉試薬（対照ライン）が過剰の検出試薬と結合すること、ならびに
（ｄ）第２の捕捉試薬（対照ライン）と比較して第１の捕捉試薬（試験ライン）に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む。
【０００９】
ある態様においては、本方法は第１の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって試料中のパクリタキセルの量を決定することをさらに含む。第１の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することは光学密度の測定を含んでよい。
【００１０】
１つの態様においては、パクリタキセル抗体は３Ｃ６である。別の態様においては、パクリタキセル抗体は８Ａ１０である。ある態様においては、パクリタキセルに結合する２つのパクリタキセル抗体、またはその断片もしくは誘導体が用いられる（たとえば３Ｃ６および８Ａ１０）。
【００１１】
本方法において、パクリタキセル材料は検出試薬への結合に関してパクリタキセルと競合するパクリタキセル抗原である。１つの態様においては、パクリタキセル材料はパクリタキセルタンパク質コンジュゲートである。
【００１２】
本発明の方法において、試料受容ゾーンと第１の捕捉試薬との間の距離を変化させて、パクリタキセルの検出感度を最適化することができる。ある態様においては、試料受容ゾーンと第１の捕捉試薬との間の距離を最小化して、パクリタキセルの検出感度を最適化する。
【００１３】
ある態様においては、本方法は第２の捕捉試薬（対照ライン）に結合した過剰の検出試薬の量を観測することをさらに含む。これらの態様においては、本方法は第２の捕捉試薬に対する検出試薬の量を定量することによって試料中のパクリタキセルの量を決定することをさらに含んでもよい。
【００１４】
感度およびダイナミックレンジを増大させるため、本方法は第１および第２の捕捉ゾーンの中間の第３の捕捉ゾーンをさらに含んでもよく、第３の捕捉ゾーンは検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料を含む。これらの態様においては、パクリタキセルの量の決定は、第３の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって決定することができる。第３の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することは、光学密度の測定を含んでよい。
【００１５】
本発明の方法は、たとえば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを含む他の固相アッセイに応用できることが理解されよう。
【００１６】
上記のように、本方法においては２つ以上の抗体、断片、またはその誘導体を用いることができる。これらの態様においては、第１の抗体は比較的高いＫon（たとえば１×１０4より大きい）を有してよく、第２の抗体は比較的低いＫoff（たとえば１×１０-3より小さい）を有してよい。
【００１７】
さらに、ある態様においては、捕捉ゾーンは再現性を増大させダイナミックレンジを拡大させるために同一試料について複数の読み取りを提供する複数の捕捉位置（たとえば２本または３本のライン、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）を含んでもよい。
【００１８】
別の側面においては、本発明は治療薬モニタリング（ＴＤＭ）ガイド下パクリタキセル療法のための方法を提供する。１つの態様においては、本発明は癌と診断された患者におけるパクリタキセル療法の有効性をモニターするための方法を提供し、本方法は、
（ａ）第１の時点で癌患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｂ）第１の時点で患者におけるパクリタキセルの第１の濃度を決定することであって、濃度を決定することがパクリタキセルをアッセイするための上記の方法を含むこと、
（ｃ）第２の時点で患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｄ）第２の時点で患者におけるパクリタキセル薬の第２の濃度を決定することであって、濃度を決定することがパクリタキセルをアッセイするための上記の方法を含むこと、および
（ｅ）癌処置の有効性を決定するために患者におけるパクリタキセルの第１および第２の濃度を比較すること
を含む。
【００１９】
関連する態様においては、本発明は癌と診断された患者におけるパクリタキセル療法のＰＫガイド下投薬のための方法を提供し、本方法は、
（ａ）第１の時点で癌患者をパクリタキセルで処置すること、
第１の時点で患者におけるパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することがパクリタキセルをアッセイするための上記の方法を含むこと、
（ｂ）第１の投薬からのＰＫ情報を用いて第２の時点で患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｃ）第２の時点で患者におけるパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することがパクリタキセルをアッセイするための上記の方法を含むこと、および
（ｄ）適切な投薬が達成されたことを確認するために、第１の時点における対象のパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを第２の時点におけるレベルと比較すること
を含む。
【００２０】
ある態様においては、薬物動態パラメーターは、最大濃度までの時間（Ｔmax）、濃度最大値（Ｃmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖd）、最終相の間の見かけの分布体積（Ｖz）、定常状態の間の見かけの分布体積（Ｖss）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２１】
さらなる側面においては、本発明はパクリタキセルについて上述したものと同様であるが他の治療剤をアッセイするために有用なデバイスおよび方法を提供する。
【００２２】
１つの態様においては、本発明はラテラルフローデバイスを提供し、ラテラルフローデバイスは、
（ａ）液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｂ）試料受容ゾーンと液通し、試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、その上に堆積した１つ以上の検出試薬を含む検出試薬ゾーン、
（ｃ）検出試薬ゾーンと液通し、検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーンであって、その上に固定化された１つ以上の捕捉試薬を含む捕捉ゾーン、および
（ｄ）捕捉ゾーンと液通し、捕捉試薬ゾーンから流れ方向下流にある吸収ゾーン
を含む。
【００２３】
上記のように、本方法においては２つ以上の抗体、断片、またはその誘導体を用いることができる。これらの態様においては、第１の抗体は比較的高いＫon（たとえば１×１０4より大きい）を有してよく、第２の抗体は比較的低いＫoff（たとえば１×１０-3より小さい）を有してよい。１つの態様においては、検出試薬は治療薬に第１の親和性を有する第１の抗体および治療薬に第２の親和性を有する第２の抗体を含み、第１の親和性は第２の親和性より大きい。さらに、ある態様においては、捕捉ゾーンは再現性を増大させダイナミックレンジを拡大させるために同一試料について複数の読み取りを提供する複数の捕捉位置（たとえば２本または３本のライン、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）を含んでもよい。
【００２４】
本方法において、検出試薬は検出可能なレポート基で標識された抗体であり、捕捉試薬は検出試薬への結合に関して治療薬と競合する抗原であるか、または捕捉試薬は検出試薬と結合可能な抗体である。ある態様においては、捕捉試薬は検出試薬への結合に関して治療薬と競合する抗原である第１の捕捉試薬と、検出試薬と結合可能な抗体である第２の捕捉試薬とを含む。第１の捕捉試薬は、第２の捕捉試薬から流れ方向上流に固定化されている。試料受容ゾーンと第１の捕捉試薬との間の距離は、治療薬の検出を最適化するために変化させることができる。
【００２５】
ある態様においては、デバイスは第１および第２の捕捉試薬の中間に固定化された第３の捕捉試薬をさらに含む。この態様においては、第３の捕捉試薬は、検出試薬への結合に関して治療薬と競合する抗原である。
【００２６】
ある態様においては、治療剤はパクリタキセルであり、検出試薬は８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体を含み、抗体、または断片もしくは誘導体はパクリタキセルに結合する。
【００２７】
別の態様においては、本発明は試料中の治療薬をアッセイするための方法を提供し、本方法は、
（ａ）上記のデバイスの試料受容ゾーンに試料を適用すること、および
（ｂ）１つ以上の固定化された捕捉試薬に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む。
【００２８】
本方法は、１つ以上の固定化された捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって試料中の治療薬の量を決定することをさらに含んでもよい（たとえば、検出試薬は第１の捕捉位置において捕捉試薬に結合する。検出試薬は第２の捕捉位置において捕捉試薬に結合する。検出試薬は第１および第２の捕捉位置において捕捉試薬に結合する。検出試薬は第１、第２および第３の捕捉位置において捕捉試薬に結合する）。
【００２９】
さらなる態様においては、ＴＤＭガイド下治療法が提供される。
【００３０】
１つの態様においては、本発明は疾患または状態と診断された患者における治療処置の有効性をモニターするための方法を提供し、本方法は、
（ａ）第１の時点で患者を治療剤で処置すること、
（ｂ）第１の時点で患者における治療剤の第１の濃度を決定することであって、濃度を決定することがここに記載した方法を含むこと、
（ｃ）第２の時点で患者を治療剤で処置すること、
（ｄ）第２の時点で患者における治療剤の第２の濃度を決定することであって、濃度を決定することがここに記載した方法を含むこと、および
（ｅ）治療処置の有効性を決定するために患者における第１および第２の濃度を比較すること
を含む。
【００３１】
別の態様においては、本発明は疾患または状態と診断された患者における治療処置のＰＫガイド下投薬のための方法を提供し、本方法は、
（ａ）第１の投薬からの薬物動態情報を用いて第１の時点で患者を治療剤で処置すること、
（ｂ）第１の時点で患者における治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することがここに記載した方法に従って治療剤をアッセイすることを含むこと、
（ｃ）第２の時点で患者を治療剤で処置すること、
（ｄ）第２の時点で患者における治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することがここに記載した方法に従って治療剤をアッセイすることを含むこと、および
（ｅ）適切な投薬が達成されたことを確認するために、第１の時点における対象の治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを第２の時点におけるレベルと比較すること
を含む。
【００３２】
ある態様においては、薬物動態パラメーターは、最大濃度までの時間（Ｔmax）、濃度最大値（Ｃmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖd）、最終相の間の見かけの分布体積（Ｖz）、定常状態の間の見かけの分布体積（Ｖss）およびそれらの組み合わせの１つ以上である。
上記の方法は、治療薬モニタリングから利益を受ける疾患または状態の処置に適用可能である。代表的な疾患または状態としては、癌、炎症、高血圧、心臓血管、および疼痛が挙げられる。代表的な治療剤としては、パクリタキセル、ドセタキセル、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル、および７−Ｌ−アラニルパクリタキセルが挙げられる。
【００３３】
さらなる側面においては、本発明はパクリタキセル抗体を提供する。１つの態様においては、本発明は８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体を提供し、抗体、抗体断片または抗体誘導体はパクリタキセルに結合する。ある態様においては、モノクローナル抗体、抗体断片または抗体誘導体は、配列番号２、４、６、または８に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）と少なくとも９５％のホモロジーを有する１つ以上のＣＤＲを含む。
【００３４】
本発明の上記の側面および付随する利点の多くは、添付した図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解できるとともに、より容易に認識することができよう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明の代表的なシステムおよび方法を用いる薬物動態ガイド下投薬コンセプトおよびプロセスの概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明による治療薬モニタリングデバイスの代表的な作業の流れの説明図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明によるラテラルフローイムノアッセイの代表的なテストストリップの説明図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明によるパクリタキセルのラテラルフローイムノアッセイの代表的なテストストリップの説明図である。
【図３】図３は、本発明によるアッセイ条件に供した代表的なテストストリップの画像であり、代表的な分析物質（パクリタキセル）の量は変動している。このアッセイ構成において、テストストリップは３つの捕捉ゾーンを含んでいる。試験ライン１および試験ライン２は、第１の捕捉材料としての固定化抗原（固定化ＢＳＡ−パクリタキセルの形態のパクリタキセル）を用いる捕捉を示す。対照ラインは第２の捕捉材料としての固定化抗体（ヤギ抗マウス抗体、ＧＡＭ）を用いる捕捉を示す。このアッセイにおいて検出試薬は金コロイドで標識した抗パクリタキセル抗体（８Ａ１０）であった。
【図４】図４は、本発明の未変性ＩｇＧ（８Ａ１０および３Ｃ６）のＢＳＡ−パクリタキセル抗原へのＥＬＩＳＡにおける直接結合を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、図２Ｃに概略図を示し、例３で説明したデバイスを用いて実施した本発明の代表的なラテラルフローアッセイにおいてラインＴ１およびＴ２に結合した８Ａ１０の曲線を示す。図５Ａは標準曲線、即ち対照ラインに対する試験ラインの比（Ｔ／Ｃ）とパクリタキセル濃度の関係を示す。低濃度において８Ａ１０の比がＴ１とＴ２で大きく異なっていることは、分析物質の濃度がより高いと思われる試料ポートに近い位置に置かれたときに、このクラスの抗体の感度がずっと高いことを示している。図５Ｂは、リーダーデバイスによって得られたテストストリップのスキャンにおける出力強度と位置の測定値との関係を示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、図２Ｃに概略図を示し、例３で説明したデバイスを用いて実施した本発明の代表的なラテラルフローアッセイにおいてラインＴ１およびＴ２に結合した８Ａ１０の曲線を示す。図５Ａは標準曲線、即ち対照ラインに対する試験ラインの比（Ｔ／Ｃ）とパクリタキセル濃度の関係を示す。低濃度において８Ａ１０の比がＴ１とＴ２で大きく異なっていることは、分析物質の濃度がより高いと思われる試料ポートに近い位置に置かれたときに、このクラスの抗体の感度がずっと高いことを示している。図５Ｂは、リーダーデバイスによって得られたテストストリップのスキャンにおける出力強度と位置の測定値との関係を示す。
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、図２Ｃに概略図を示し、例３で説明したデバイスを用いて実施した本発明の代表的なラテラルフローアッセイにおいてラインＴ１およびＴ２に結合した３Ｃ６の曲線を示す。図６Ａは標準曲線、即ち対照ラインに対する試験ラインの比（Ｔ／Ｃ）とパクリタキセル濃度の関係を示す。低濃度において３Ｃ６の比がＴ１とＴ２であまり相違していないことは、分析物質の濃度がより高いと思われる試料ポートに近い位置に抗体を置いたときのこのクラスの抗体の感度の改善が比較的少ないことを示している。このクラスの抗体は、シグナルが試料ポートからの位置に影響されないという特徴を有する。図６Ｂは、リーダーデバイスによって得られたテストストリップのスキャンにおける出力強度と位置の測定値との関係を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、図２Ｃに概略図を示し、例３で説明したデバイスを用いて実施した本発明の代表的なラテラルフローアッセイにおいてラインＴ１およびＴ２に結合した３Ｃ６の曲線を示す。図６Ａは標準曲線、即ち対照ラインに対する試験ラインの比（Ｔ／Ｃ）とパクリタキセル濃度の関係を示す。低濃度において３Ｃ６の比がＴ１とＴ２であまり相違していないことは、分析物質の濃度がより高いと思われる試料ポートに近い位置に抗体を置いたときのこのクラスの抗体の感度の改善が比較的少ないことを示している。このクラスの抗体は、シグナルが試料ポートからの位置に影響されないという特徴を有する。図６Ｂは、リーダーデバイスによって得られたテストストリップのスキャンにおける出力強度と位置の測定値との関係を示す。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、図２Ｃに概略図を示し、例３で説明したデバイスを用いて実施した本発明の代表的なラテラルフローアッセイにおいてラインＴ１およびＴ２に結合した８Ａ１０および３Ｃ６の組み合わせの曲線を示す。図７Ａは標準曲線、即ち対照ラインに対する試験ラインの比（Ｔ／Ｃ）とパクリタキセル濃度の関係を示す。コンジュゲートパッドにおいて２つのクラスの抗体（８Ａ１０および３Ｃ６）を組み合わせることによって、Ｔ１およびＴ２の高い感度が得られた。これにより、アッセイのダイナミックレンジが改善された。図７Ｂは、リーダーデバイスによって得られたテストストリップのスキャンにおける出力強度と位置の測定値との関係を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、図２Ｃに概略図を示し、例３で説明したデバイスを用いて実施した本発明の代表的なラテラルフローアッセイにおいてラインＴ１およびＴ２に結合した８Ａ１０および３Ｃ６の組み合わせの曲線を示す。図７Ａは標準曲線、即ち対照ラインに対する試験ラインの比（Ｔ／Ｃ）とパクリタキセル濃度の関係を示す。コンジュゲートパッドにおいて２つのクラスの抗体（８Ａ１０および３Ｃ６）を組み合わせることによって、Ｔ１およびＴ２の高い感度が得られた。これにより、アッセイのダイナミックレンジが改善された。図７Ｂは、リーダーデバイスによって得られたテストストリップのスキャンにおける出力強度と位置の測定値との関係を示す。
【発明の詳細な説明】
【００３６】
今日、臨床使用中または開発中の多くの治療剤がある。困難さは治療のための薬剤の発見にあるのではなく、患者に適合するように治療を調整するところにある。薬物動態（ＰＫ）の変動を考慮しない個人別医療は、投薬量を少なくすれば利益が得られたであろう患者に毒性をもたらす過多の薬剤曝露によって、またはおそらく感受性のある患者集団への過少の薬剤曝露によって、ある患者を誤って分類することにつながる。治療薬モニタリング（ＴＤＭ）による個人別医療によって、薬物動態の変動を除去し、患者のバイオマーカーに従って患者を正しく分類することができる。
【００３７】
本発明は、治療薬の薬物動態（ＰＫ）ガイド下投薬のための、ポイントオブケア（ＰＯＣ）治療薬モニタリング（ＴＤＭ）の方法、デバイス、および関連する組成物を提供する。
【００３８】
図１は、デバイスのシステム特性、利点ならびに病院情報システムおよび／または検査室情報システムと接続してデータを医師に伝達し、究極的に投薬の決定を補助することができるデバイスについて説明している。本発明の方法およびデバイスは、２４〜４８時間にわたって指先穿刺で血液試料を採取することによって、患者の治療薬（たとえばパクリタキセル）の薬物動態データを収集し、医師は薬物動態データにアクセスしてデータを解析し、治療薬用量を改変すべきかを決定することができる。
【００３９】
１つの側面においては、本発明は一般にイムノアッセイのための方法およびデバイス、特にパクリタキセルのイムノアッセイのための方法およびデバイスを提供する。時には、生物学的試料中のパクリタキセル濃度が低いことは対象へのパクリタキセルの用量を増加する必要があることを示し、生物学的試料中のパクリタキセル濃度が高いことは対象へのパクリタキセルの用量を減少する必要があることを示す。本発明の方法およびデバイスは、対象への治療計画を調節するために有用な情報を提供する。
【００４０】
ここに提供するアッセイ方法およびデバイスは、パクリタキセルの検出およびモニタリングのための組成物、方法、およびデバイスに関連して記述している。しかし、記述した組成物、方法、およびデバイスのフォーマットはこれに限定されず、選択した任意の分析物質をモニターするためにより一般的に容易に適用できることが認識される。
【００４１】
代表的なアッセイ方法およびデバイス
本発明は、試料中の分析物質（たとえばパクリタキセル）を検出し、または定量するためのアッセイ方法およびデバイスを提供する。
【００４２】
本方法およびデバイスは、状態の処置のための治療剤（たとえばパクリタキセル）を受けた対象（患者）から得た試料等の生物学的試料をアッセイするために用いることができる。アッセイに用いる試料は、究極的には液体試料（たとえば血液、血漿、尿）である。
【００４３】
本発明の方法は固相アッセイであり、したがって他の固相アッセイ構成への適合化にも適している。本発明を例示するため、本方法およびデバイスを、ラテラルフローアッセイ構成を用いて説明する。当技術分野で既知の他の固相アッセイも、本発明の方法およびデバイスに従って構成可能であることが理解されよう。
【００４４】
ラテラルフローアッセイの方法およびデバイスは、本発明に従って用いることができる。ラテラルフローアッセイの方法およびデバイスのフォーマットにより、アッセイ試薬をある構成に配置することができる。そのような態様において、ある試薬は「検出試薬」として作用し、別の試薬は「捕捉試薬」として作用する。このフォーマットの中では、検出試薬は一般にコンジュゲートパッド上で、試料ポートと捕捉試薬が堆積された場所との間の場所に堆積される。検出試薬は一般に検出可能なラベルを含み、捕捉試薬はパッド上のその場所に固定化される。したがって、操作の間、試料ポートに導入された液体試料はパッドに沿って流れることができる。試料はまず検出試薬と接触し、次いで捕捉試薬の上を流れる。
【００４５】
本発明に従ってラテラルフローアッセイを行なうための代表的なデバイスを図２Ａに示す。図２Ａを参照して、デバイス１００は試料ポート１２０、読み取り窓１３０、およびテストストリップ２００（図２Ｂ参照）を有するハウジング１１０を含むカセットである。操作の際、分析すべき液体試料はポート１２０を通してテストストリップに導入され、流れ方向（試料パッド２１０から吸収パッド２４０へ）に示されるようにテストストリップに沿って流れる。検査結果は、読み取り窓１３０を通してテストストリップを観察することによって見ることができる。
【００４６】
テストストリップは、アッセイを行なうためのいくつかのゾーンおよび試薬を含む。図２Ａおよび図２Ｂを参照して、代表的なテストストリップ２００は試料パッド２１０、コンジュゲートパッド２２０、膜２３０、および吸収パッド２４０を含む。試料パッド２１０、コンジュゲートパッド２２０、膜２３０、および吸収パッド２４０は液通しており、試料パッドに導入された液体試料はコンジュゲートパッドおよび膜を通して、またはこれらを横切って吸収パッドへ流れる。テストストリップ部品の大きさおよび構成は、実施すべき特定のアッセイに適応するように変化させることができる。たとえば、１つの部品から次の部品への最適な流れを可能にするために、部品パッドおよび膜の１つ以上を重ねてもよい（図２Ａに示すように、試料パッド２１０をコンジュゲートパッド２２０と重ねてもよく、コンジュゲートパッド２２０を膜２３０と重ねてもよく、膜２３０を吸収パッド２４０と重ねてもよい）。テストストリップゾーンの性質は特に重要ではなく、これらの部品のための材料は当技術分野で既知である。
【００４７】
代表的なデバイスの操作を以下に述べる。試料パッド２１０は検査すべき液体試料を受容する。試料は試料パッドからコンジュゲートパッド２２０へ流れる。
【００４８】
コンジュゲートパッド２２０は１つ以上の検出試薬（たとえばアッセイすべき試料中の分析物質と親和性を有し、アッセイ中の抗体の検出を容易にするように標識されている抗体）を含む。
【００４９】
ある態様においては、単一の検出試薬がコンジュゲートパッド上に堆積されている。他の態様においては、２つ以上の検出試薬（たとえばアッセイすべき分析物質と異なった親和性、異なったＫon速度、および／または異なったＫoff速度を有する第１の抗体および第２の抗体等の、２つの異なった抗体）が、コンジュゲートパッド上に堆積されている。第１の親和性と第２の親和性は同じではない。１つの態様においては、第１のＫonは第２のＫonより大きい。別の態様においては、第２のＫoffは第１のＫoffより大きい。パクリタキセルのアッセイに関連して以下に述べる抗体の親和性、ＫonおよびＫoffの速度の説明および規格は、一般に治療剤のアッセイに適用可能である。堆積させる第１の抗体および第２の抗体の量は変化させてよく、同一でなくてよい。
【００５０】
コンジュゲートパッド２２０に堆積した検出試薬は液体試料によって流動化し、試料とともに膜２３０へ流れる。試料中に分析物質が存在する場合は、いったん試料が検出試薬と接触すれば、分析物質と検出試薬との結合が起こり始める。いくらかが結合した分析物質を含み、いくらかが含まない検出試薬の捕捉が、膜２３０で起こる。
【００５１】
膜２３０は少なくとも２つの捕捉ゾーン、即ち結合した分析物質を含まない検出試薬を捕捉するための第１の捕捉ゾーン（試験ライン）（図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃにおける２３２を参照）および結合した分析物質を含む過剰の検出試薬を捕捉するための第２の捕捉ゾーン（対照ライン）（図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃにおける２３８を参照）を含む。第１の捕捉ゾーンは、結合した分析物質を含まない検出試薬（即ち遊離検出試薬）を捕捉するために有効な第１の捕捉材料（たとえば固定化抗原）を含む。第２の捕捉ゾーンは、結合した分析物質を含み、または含まない検出試薬を捕捉するために有効な第２の捕捉材料（たとえば固定化抗体）を含む。第１および第２の捕捉材料によって捕捉された検出試薬の量は、それぞれ試料中に存在する分析物質の量に依存する。上記のアッセイは、検出試薬への親和性結合に関して分析物質と第１の捕捉材料が競合する競合アッセイである。試料中に存在する分析物質の量が増加すれば、第１の捕捉材料によって捕捉される検出試薬の量が減少する。捕捉材料の枯渇により、試料中に存在する分析物質の量が減少すれば、より多くの検出試薬が第１の捕捉材料によって捕捉され、したがって第２の捕捉材料によって捕捉される量が減少する。第１および第２の捕捉ラインの強度の比が、分析物質の定量のための最良の値を与える。
【００５２】
ある態様においては、捕捉ゾーンは結合した分析物質を含まない検出試薬を捕捉するための２つ以上の第１の捕捉ゾーン（たとえば図２Ｂおよび図２Ｃにおける２３２および２３４）を含む。ある態様においては、捕捉ゾーンは検出試薬を捕捉するための２つ以上の第２の捕捉ゾーン（たとえば図２Ｂにおける２３６および２３８）を含む。
【００５３】
ラテラルフローカセットの説明した手段には、フローカセットからのシグナルの検出のための適切な感度およびそのようなシグナルを較正し、定量する能力を有する任意の適応したリーダーを用いることができる。いずれのリーダーの有益な特色としても、タッチスクリーン、統合ＲＦＩＤまたは統合バーコードリーダー等の使いやすい特色、ならびに結果をメモリーカードまたはＵＳＢスティック等へ簡単にエクスポートできる能力が挙げられる。リーダーは、好ましくは言語の選択においてインターフェースを容易にするプレインストールされたソフトウェアを有する。リーダーは、好ましくは多重（１０００を超える等）の結果を保存できる大きなメモリー容量を有し、１００を超える異なった検査方法のプロトコルを保存することができる。リーダーは、ＬＡＮまたはＷＬＡＮ接続を通したＬＩＳへの統合、またはクラウド系データ保存およびマネジメントシステムへの統合など、より大きなシステムへの統合を容易にするための接続を含んでもよい。最後に、外部プリンター等への接続を容易にするため等の追加的な接続容量のために、多重ＵＳＢポートが望ましい。
【００５４】
代表的なリーダーとしてはＱｉａｇｅｎ’ｓ  Ｒｅａｄｅｒ  ＥＳＥＱｕａｎｔ  ＬＦＲ（ドイツＱｉａｇｅｎ社から市販）が挙げられ、これはここに記載したラテラルフローカセットを納めるための適応性のある有効なリーダーであることが示されている。このリーダーは小型で携帯型のデバイスで、充電可能なバッテリーを内蔵しており、戸外で操作でき、ポイントオブケア（ＰＯＣ）デバイスの要求事項を満たしている。ラテラルフローカセットは、リーダーに埋め込まれた共焦点カメラシステムを用いて走査される。搭載された画像解析システムはラテラルフローカセットのバーコードリーダーとともに完全に機能し、分析方法は容易にデバイスにアップロードできる。
【００５５】
検出試薬
ある態様においては、検出試薬は、ここに述べたように少なくとも１つの抗体、抗体断片、または抗体誘導体である。検出試薬は試料中の分析物質（たとえばパクリタキセル）と結合することができ、検出試薬が試料中のパクリタキセルと結合しない場合には、検出試薬は捕捉試薬に結合する。
【００５６】
検出試薬は信頼性のある定量が可能な検出可能なシグナルを提供することができる部分または標識を含む。好適な部分としては、イムノアッセイ技術で既知の、比色法、蛍光法、化学発光法、酵素法、または放射性シグナルを提供する部分が挙げられる。代表的な部分としては、目視可能で読み取りに装置を必要としない検出可能なシグナルを提供するもの（たとえば着色部分、または、着色部分もしくは酵素を発生する酵素）が挙げられる。定量は典型的には検出可能なシグナルの機器分析によって達成される。１つの態様においては、検出試薬は金コロイドで標識した抗体であり、これは目視観察できる。
【００５７】
金コロイドは単分散性の塩化金の還元によって生成し、これは４０ｎｍ等の制御された均一な直径を有する単分散コロイドである。抗体は受動的吸収によって金コロイドにコンジュゲートされる。
【００５８】
上記のように、好ましい態様においては、多種（即ち２種以上）の抗体、抗体断片、または抗体誘導体が用いられる。ある態様においては、多種の（異なった）抗体、抗体断片、または抗体誘導体が組み合わされ、テストストリップの同じ場所（即ちコンジュゲートパッド）に堆積される。
【００５９】
ここで、２つの異なった抗パクリタキセル抗体、３Ｃ６および８Ａ１０について述べる。３Ｃ６抗体はパクリタキセル特異性が高い抗体であるが、８Ａ１０抗体はパクリタキセル特異性が比較的低く、概してタキサン類に広い親和性を有する。従来の競合ＥＬＩＳＡにおいては２つの抗体は同様の挙動を示すが、固相ラテラルフローアッセイにおいては驚くべきことに、８Ａ１０が提供するシグナルは、場所（Ｔ１またはＴ２）に依存しない３Ｃ６と比較して、第１の捕捉試薬（たとえばＴ１の場所）を試料ポートに近い場所に移すことによって改善されることが分かった。試料の適用位置に近いＴ１はより高い濃度の分析物質に曝露され、試料の適用位置から遠いＴ２はより低い濃度の分析物質に曝露される。捕捉ラインの最適配置が本方法で用いる抗体のＫonおよびＫoffの値に関連することは驚くべき発見である。３Ｃ６は入手しやすいので、Ｋonが大きい抗体（たとえば８Ａ１０）をできるだけ試料開始位置の近くに堆積させ、Ｋoffが小さい抗体（たとえば３Ｃ６）をパッドに沿って堆積させて第２／第３／第４等の読み取りをする多重のラインデバイスを構築することができる。
【００６０】
したがって、ラテラルフローカセットデバイスに種々の改変を加えて、種々の検出特性を容易にし、または与えることができる。たとえば、デバイスのダイナミックレンジを拡張するため、多重親和性を有する抗体を用いた多重試験ライン（Ｔ１、Ｔ２等）、ダイナミックレンジおよび／またはアッセイの再現性を拡張することができる。代表的なパクリタキセルのアッセイに関連して以下に述べるテストストリップの上での捕捉試薬の位置決め（Ｔ／Ｃ）についての説明および規格は、一般に本発明のアッセイにおける捕捉試薬の位置決めに適用可能である。
【００６１】
本発明のアッセイに有用な代表的な検出試薬（たとえばパクリタキセル抗体−金コロイドコンジュゲート）の調製については、例１で述べる。
【００６２】
捕捉試薬
捕捉試薬は検出試薬を捕捉してアッセイ中の検出可能なシグナルの観察および定量を可能にするために作用する。上記のように、アッセイ方法およびデバイスは、それぞれ第１および第２の捕捉ゾーンに固定化された第１および第２の捕捉材料を含む。
【００６３】
１つの態様においては、検出試薬が抗体である場合には、捕捉試薬は結合した分析物質を含まない検出試薬を捕捉する固定化抗原である固定化分析物質（たとえばパクリタキセル複合体）である。固定化分析物質はテストストリップに直接固定化してよい。あるいは、固定化分析物質はリンカーまたはキャリア材料を介して固定化してもよい（たとえばアルブミン等のキャリアタンパク質にコンジュゲートした分析物質）。そのような態様においては、捕捉試薬は上述のように第１の捕捉材料である。
【００６４】
１つの態様においては、捕捉試薬は結合した分析物質を含み、または含まない検出試薬を捕捉する固定化抗体である。検出試薬がマウスモノクローナル抗体である態様においては、捕捉試薬は抗マウス抗体（たとえばヤギ抗マウス抗体、ＧＡＭ抗体）である。そのような態様においては、捕捉試薬は上述のように第２の捕捉材料である。
【００６５】
本発明のアッセイに有用な代表的な捕捉試薬（たとえばＢＳＡ−パクリタキセル）の調製については、例１で述べる。
【００６６】
代替のアッセイ構成
ここに記載した発明のラテラルフローアッセイは固相イムノアッセイである。アッセイのフォーマットおよびデバイスを上述のフォーマットと逆にして、検出試薬を標識抗原（たとえば検出可能な標識を有するＢＳＡ−パクリタキセル）とし、捕捉試薬を１つ以上の抗体、抗体断片、または抗体誘導体（即ち、捕捉ゾーンに固定化された）としてもよいことは認識されよう。そのようなフォーマットの操作においては、試料は堆積された標識抗原を通して／横切って流れ、その後、固定化抗体、抗体断片、または抗体誘導体と接触する。その点において、試料中に当初存在していた遊離分析物質（たとえばパクリタキセル）は、固定化抗体、抗体断片、または抗体誘導体への結合に関して標識抗原と競合する。上記のように、デバイスは同一または異なった場所に固定化された複数の異なった抗体、抗体断片、または抗体誘導体を含み得る。捕捉試薬は同一または異なった場所にあってよい。テストストリップの複数の場所に捕捉試薬が固定化された全ての態様においては、それらの場所におけるシグナルを検出できる好適なリーダーが用いられる。
【００６７】
ここでは本発明のデバイス、システム、組成物、および方法はラテラルフローアッセイに関して一般的に述べていることに注意されたい。しかしここに述べたように、選択した抗原をモニターするための一般的な戦略はラテラルフローアッセイフォーマットに限定する必要はなく、当技術分野において一般に周知の他の固相イムノアッセイ（表面プラスモン共鳴アッセイ）等の他のアッセイフォーマットに適用できる。したがって、ラテラルフローフォーマットについて述べた説明に関わらず、本開示は任意の既知のアッセイフォーマットを組み込んだデバイス、システム、組成物、および方法をも包含する。ある態様においては、アッセイフォーマットは抗原コンジュゲート（たとえばパクリタキセルコンジュゲート）または抗原結合試薬（たとえば抗パクリタキセル抗体、断片、誘導体）等の捕捉試薬の基材への固定化を含む。基材はニトロセルロースまたはガラス等の、アッセイフォーマットのための任意の既知の好適な基材でよい。ある態様においては、基材はナノ構造である。ある態様においては、基材は捕捉試薬を固定化できるカーボンナノチューブ等のカーボンナノ構造を含み、またはこれからなっていてよい。
【００６８】
代表的なパクリタキセルアッセイ
図２Ｃは、本発明によるパクリタキセルのラテラルフローイムノアッセイのための代表的なテストストリップの説明図である。図２Ｃを参照して、代表的なテストストリップ２００は試料パッド２１０、コンジュゲートパッド２２０、第１の捕捉ゾーン２３２および２３４（Ｔ１およびＴ２）と第２の捕捉ゾーン２３８（Ｃ）を有する膜２３０、ならびに吸収パッド２４０を含む。図２Ａおよび図２Ｂに関して上記したように、試料パッド２１０、コンジュゲートパッド２２０、膜２３０、および吸収パッド２４０は液通しており、それにより試料パッドに導入された液体試料はコンジュゲートパッドおよび膜を通して、またはこれらを横切って吸収パッドへ流れる。テストストリップ部品の大きさおよび構成は、実施すべきパクリタキセルのアッセイに適応するように変化させることができる（たとえば図２Ａに示すように、１つの部品から次の部品への最適な流れを可能にするために、部品パッドおよび膜の１つ以上を重ねてもよい）。
【００６９】
１つの態様においては、本発明は液体試料中のパクリタキセルをアッセイするための方法を提供し、本方法は、
（ａ）パクリタキセルを含む液体試料をラテラルフローアッセイデバイスに適用することであって、デバイスが
（ｉ）液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｉｉ）試料受容ゾーンと液通し、試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、
検出試薬ゾーンがその上に堆積した検出試薬を含み、
検出試薬が、検出可能なレポート基で標識された、パクリタキセルと結合するパクリタキセル抗体またはその断片もしくは誘導体である、検出試薬ゾーン、および
（ｉｉｉ）検出試薬ゾーンと液通し、検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーン
を有し、
捕捉ゾーンがその上に固定化された第１および第２の捕捉試薬を含み、
第１の捕捉試薬が第２の捕捉試薬から流れ方向上流に位置し、
第１の捕捉試薬が検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料であり、
第２の捕捉試薬が検出試薬と結合可能な抗体であること、
（ｂ）試料を試料受容ゾーンから検出試薬ゾーンに流動させて検出試薬にパクリタキセル（たとえば検出試薬と結合したパクリタキセルの組み合わせ、任意に遊離検出試薬、および任意に遊離パクリタキセル）を供給すること、
（ｃ）検出試薬をパクリタキセルとともに捕捉ゾーンに流動させることであって、
第１の捕捉試薬が遊離検出試薬と結合して第１の捕捉試薬に結合した検出試薬を提供し、
第２の捕捉試薬が結合したパクリタキセルを含み、または含まない検出試薬と結合すること、ならびに
（ｄ）第２の捕捉試薬に結合した検出試薬の量に対する第１の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む。
【００７０】
ある態様においては、本方法は第１の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって試料中のパクリタキセルの量を決定することをさらに含む。第１の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することは、中でも光学密度の測定を含む。
【００７１】
好適な検出可能なレポート基については上述した。１つの態様において、検出可能なレポート基は金コロイドである。
【００７２】
本方法において有用なパクリタキセル抗体、またはその断片もしくは誘導体は、約１×１０4より大きいＫonを有する。代表的なＫonの値は約２×１０4、４×１０4、８×１０4、１×１０5、１×１０6、および１×１０7より大きい。好ましい範囲は約１×１０4〜約１×１０7である。
【００７３】
本方法において有用なパクリタキセル抗体、またはその断片もしくは誘導体は、約１×１０-3より小さいＫoffを有する。代表的なＫoffの値は約１×１０-3、１×１０-4、１×１０-5、および１×１０-7より小さい。好ましいＫoff値の範囲は約１×１０-3〜１×１０-7である。
【００７４】
ある態様においては、パクリタキセル抗体、またはその断片もしくは誘導体は約１×１０4〜約１×１０6のＫonおよび約１×１０-3〜約１×１０-4のＫoffを有する。
【００７５】
Ｋonの値およびＫoffの値を決定する方法については例４で述べる。
【００７６】
１つの態様においては、抗体は高いＫonおよび低いＫoffを有する（たとえば、最小のＫonは２．０×１０5であり、最大のＫoffは１．０×１０-3である）。この態様においては、捕捉ラインは０．０〜０．４Ｔ／Ｃに置かれる。このクラスについて、モノクローナル抗体の工学ではＫoffを一定に保ち、Ｋonをできるだけ大きくすることが重視される。Ｋonが大きければ、抗体検出がより良くなる。
【００７７】
別の態様においては、抗体は低いＫonおよび高いＫoffを有する（たとえば、最小のＫonは２．０×１０4であり、最大のＫoffは２．０×１０-4である）。この態様においては、捕捉ラインは０．２〜１．０Ｔ／Ｃに置かれる。このクラスについて、モノクローナル抗体の工学ではＫonを一定に保ち、Ｋoffをできるだけ小さくすることが重視される。オフレートが小さければ、抗体検出がより良くなる。
【００７８】
ある態様においては、パクリタキセル抗体は３Ｃ６である。他の態様においては、パクリタキセル抗体は８Ａ１０である。さらなる態様においては、パクリタキセル抗体の組み合わせを用いることができる（たとえば３Ｃ６および８Ａ１０）。これらの抗体については以下に詳細に述べる。
【００７９】
アッセイにおいて、第１の捕捉ゾーンは検出試薬への結合に関してパクリタキセルと競合するパクリタキセル抗原として作用する固定化パクリタキセル材料を含む。第１の捕捉ゾーンは、結合したパクリタキセルを含まない検出試薬（即ち、遊離検出試薬）を捕捉する。ある態様においては、パクリタキセル材料はパクリタキセルタンパク質コンジュゲートである。好適なタンパク質コンジュゲートは、ＢＳＡ−パクリタキセル等の血清アルブミンコンジュゲートを含む。
【００８０】
アッセイにおいて、第２の捕捉ゾーンは検出試薬と結合可能な固定化抗体を含む。ある態様においては、抗体はヤギ抗マウス抗体である。
【００８１】
上記のように、アッセイにおけるパクリタキセル検出の感度は、ラテラルフローデバイスに試料を導入する点（たとえば試料受容ゾーン）と第１の捕捉試薬との間の距離を変化させることによって最適化できる。ある態様においては、試料受容ゾーンと第１の捕捉試薬との間の距離を最小化して、パクリタキセル検出の感度を最適化する。ある態様においては、その距離は２０ｍｍ未満、１０ｍｍ未満、５ｍｍ未満、３ｍｍ未満、２ｍｍ未満、または１ｍｍ未満である。ある態様においては、その距離は２０〜１ｍｍ、１０〜１ｍｍ、５〜１ｍｍ、３〜１ｍｍ、または２〜１ｍｍである。
【００８２】
最適化はＴ（試験ライン）とＣ（対照ライン）の相対位置、即ちＴ／Ｃによって記述することができ、Ｔ／Ｃは比（始点からＴまでの距離／始点からＣまでの距離）として定義され、ここで始点は捕捉ゾーンの上流端（図２Ａ〜図２Ｃにおける膜２３０の上流端）として定義される。Ｔ／Ｃは約０．０（即ち、第１の捕捉試薬が捕捉ゾーンの上流端に位置する）、もしくは約０．０１、約０．０２、約０．０４、約０．０８、約０．１０、約０．２０、約０．４０、約０．８０より大きく、または約１．０未満（即ち、第１の捕捉試薬が捕捉ゾーンの下流端に位置し、第２の捕捉試薬が第１の捕捉試薬と捕捉ゾーンの下流端との中間に位置する）であってよい。好ましくは、Ｔ／Ｃは約０．２〜約０．７である。
【００８３】
ある態様においては、第１の距離対第２の距離の比は、約０．０〜約０．４０である。他の態様においては、第１の距離対第２の距離の比は、約０．２０〜約１．０である。
【００８４】
ある態様においては、第２の捕捉試薬に結合した過剰の検出試薬の量が観測および測定される。ある態様においては、試料中のパクリタキセルの量の決定は、最終の捕捉試薬（試験ライン）を第２の捕捉試薬（対照ライン）に関連付けることによって決定される。
【００８５】
上記のように、本発明の代表的なアッセイは２つ以上の第１の捕捉ゾーンの中の２つ以上の第１の捕捉試薬を含む。これらのある態様においては、本方法は第１（図２ＣのＴ１、２３２）および第２（図２ＣのＣ、２３８）の捕捉ゾーンの中間の第３の捕捉ゾーン（図２ＣのＴ２、２３４を参照）をさらに含み、ここで第３の捕捉ゾーンは検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料を含む。第１および第３のゾーン中のパクリタキセル材料は同じでも異なっていてもよい。これらのある態様においては、試料中のパクリタキセルの量は、第１および第２の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって決定される。第１および第２の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することは、光学密度の測定を含んでよい。
【００８６】
本方法のある態様においては、ラテラルフローデバイスは、捕捉試薬ゾーンと液通し、捕捉試薬ゾーンから流れ方向下流にある吸収ゾーンをさらに含む。
【００８７】
図３は、代表的な分析物質（パクリタキセル）の量を変化させたアッセイ条件に供した代表的なテストストリップの画像である。これらのアッセイ構成において、膜２３０は３つの捕捉ゾーンを含む。試験ライン１および試験ライン２は第１の捕捉材料として固定化抗原（固定化ＢＳＡ−パクリタキセルの形態のパクリタキセル）を用いた捕捉を示す。対照ラインは第２の捕捉材料として固定化抗体（ヤギ抗マウス抗体）を用いた捕捉を示す。このアッセイにおいて、検出試薬は金コロイドで標識した抗パクリタキセル抗体（８Ａ１０）であった。
【００８８】
本発明の方法およびデバイスは、生物学的試料中のパクリタキセルまたはパクリタキセルプロドラッグの任意の製剤を含むパクリタキセルの濃度を検出するために有用であることが注目される。パクリタキセルの製剤としては、ポリマーナノ粒子、脂質系ナノ粒子製剤、ポリマーコンジュゲート、無機ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、およびシクロデキストリンナノ粒子等の、パクリタキセルの送達を促進する任意の既知の薬剤が挙げられる。
【００８９】
本発明の方法およびデバイスによる代表的なラテラルフローイムノアッセイの説明については例３で述べる。
【００９０】
パクリタキセル抗体
別の側面においては、本発明はパクリタキセルと結合する抗体（たとえばモノクローナル抗体またはｍＡｂ）を提供する。８Ａ１０および３Ｃ６と称されるｍＡｂは、抗体に富む回収培地からＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて精製した。ｍＡｂは、Ｊ−Ｇ．Ｌｅｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３：１３８８−１３９１に記載されているようにして調製したＢＳＡ−パクリタキセルへの結合に基づいて選択した。
【００９１】
１つの側面において、本発明は８Ａ１０、３Ｃ６、およびその断片または誘導体から選択したモノクローナル抗体を提供し、ここで抗体、抗体断片、または抗体誘導体はパクリタキセルと結合する。
【００９２】
ここで用いる「抗体」という用語は、任意の抗体産生哺乳類（たとえばマウス、ラット、ウサギ、ラクダ類、およびヒトを含む霊長類）から誘導された、または合成もしくは組み換えによって製造された、対象のターゲット（たとえばパクリタキセル）またはその部分に特異的に結合する、抗体およびその抗体断片を包含する。例示的な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、および組み換え抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、および抗イディオタイプ抗体が挙げられ、任意の未変性分子またはその抗原結合断片等の断片であってよい。ここに記載したように、治療薬（たとえばパクリタキセル）等の選択した抗原の結合における特異性が増大することから、モノクローナル抗体が好ましい。
【００９３】
ここで用いる「抗原結合断片」という用語は、完全長抗体からの、もしくはそれに関連する、抗原結合領域または可変領域を意味する。抗体断片の説明の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片、二重特異性抗体、ナノ抗体、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００９４】
ここで用いる「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶHおよびＶLドメインを含み、これらのドメインは一本鎖ポリペプチド中に存在している。一般に、ＦｖポリペプチドはＶHおよびＶLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦｖが抗原と結合するための所望の構造を形成することができる。
【００９５】
ここで用いる「キメラ抗体」は、非ヒト種（たとえば齧歯類）抗体から誘導された可変ドメインと相補性決定領域を含む組み換えタンパク質であり、抗体分子の残りの部分はヒト抗体から誘導されている。
【００９６】
ここで用いる「ヒト化抗体」は、非ヒトイムノグロブリンから誘導された特定の相補性決定領域に一致し、ヒト抗体フレームワークに移植される最小の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は典型的には抗体の相補性決定領域のみが非ヒト起源である組み換えタンパク質である。
【００９７】
ここで用いる「誘導体」という用語は、抗体または抗体断片がリファレンス抗体から作成されたことを示す。たとえば、時としてリファレンス抗体の結合特性を改変または増強することが望ましい場合がある。したがって、結合特性を変化させるために、エンコードするＤＮＡに施す変異などの種々の改変を抗体に施すことができる。それによって得られる特性が変化した抗体は、リファレンス抗体の「誘導体」と称される。たとえば、抗体誘導体はリファレンス抗体（またはリファレンス抗体をエンコードする核酸）に適用した親和性成熟プロセスに起因する変異を含む抗体であり得る。そのような変異によって、抗体の結合親和性、選択性等を変化させる（たとえば改善する）ことができる。
【００９８】
ある態様においては、抗体、抗体断片、または抗体誘導体は、配列番号２、４、６、または８に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）と少なくとも９５％のホモロジーを有する１つ以上のＣＤＲを含む。配列番号２および４は、以下に詳細に述べるが、それぞれ８Ａ１０の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列である。配列番号６および８は、これも以下に詳細に述べるが、それぞれ３Ｃ６の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列である。それぞれの可変領域は、以下に示す３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ある態様においては、抗体、抗体断片、または抗体誘導体は、配列番号２、４、６、または８の何れかに含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ、２つまたは３つ全てと少なくとも９５％のホモロジーを有するＣＤＲの１つ、２つまたは３つ全てを含む。ある態様においては、抗体、抗体断片、または抗体誘導体は、８Ａ１０の可変軽鎖領域および重鎖領域（配列番号２および４）によって提供されるＣＤＲ領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ全てを含む重鎖および軽鎖を有する。ある態様においては、抗体、抗体断片、または抗体誘導体は、３Ｃ６の可変軽鎖領域および重鎖領域（配列番号６および８）によって提供されるＣＤＲ領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ全てを含む重鎖および軽鎖を有する。
【００９９】
ある態様においては、１つ以上のＣＤＲは配列番号２、４、６、または８の何れかにおける１つ以上のＣＤＲと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のホモロジーを有する配列同一性を有する。ここで用いる「％ホモロジー」または「％相同」という用語は、本発明の実施において用いるポリペプチドに関連して用いる場合には、最大の％ホモロジーが得られるように配列を配列させた後の、特定したポリペプチドのアミノ酸配列と相同であるポリペプチド配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。比較する際には、最良の配列を得るためにバイオマーカー配列の間にはギャップを導入しない。アミノ酸配列のホモロジーは、たとえば以下のようにして決定することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列を用いて、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いるＧｅｎＢａｎｋデータベース等のタンパク質配列データベースを検索する。プログラムはギャップのない様式で用いる。デフォルトフィルタリングを用いて、複雑度の低い領域による配列ホモロジーを除去する。ＢＬＡＳＴＰのデフォルトパラメーターを用いる。
【０１００】
本発明のアッセイ方法に有用な代表的なパクリタキセル抗体（３Ｃ６および８Ａ１０）の産生、プロセシング、精製、特性解析、および最適化については例２に述べる。本発明の抗体はＫＬＨにコンジュゲートしたＴａｘｏｌ（登録商標）またはバッカチンでマウスを免疫することによって産生された。抗体は以下のように要約される。３Ｃ６抗Ｔａｘｏｌ（登録商標）ＩｇＧ2a,k、３Ｈ５抗バッカチンＩＩＩ  ＩｇＧ1、８Ａ１０抗タキサンＩｇＧ2a。３Ｃ６、３Ｈ５，および８Ａ１０抗体の交差反応性を、種々のタキサンに対するＩＣ50値によって表１に示す。
【０１０１】
表１．パクリタキセル抗体の交差反応性
【０１０２】
【表１】
2017513030.tif 000003
【０１０３】
診断用途において抗体を効果的に利用し、ダイナミック検出レンジを達成するため、最適化を成功させることが必要な２つの重要な要素は、抗体の特異性および目標の抗原に対する親和性である。３Ｃ６および８Ａ１０モノクローナル抗体はパクリタキセルに対して高い特異性と親和性を有し、これらが高度に均一な様式で目標のパクリタキセル抗原の単一のエピトープに特異的に結合することを示している。この特異性は、検出アッセイにおける交差反応の問題を除去することにも役立っている。特異性と相まって、モノクローナル抗体は、親和性成熟の過程によって達成される診断テストにおけるダイナミック検出レンジを達成するための、抗原に対する最適化され、改善された親和性をも有することができる。さらに、迅速なＫonを迅速なフローアッセイに適合させるようにｍＡｂを選択することができる。
【０１０４】
図４に示すように、３Ｃ６および８Ａ１０の両方のモノクローナル抗体は、約１０ｎＭの見掛けＫd値および約１００〜２００ｎｇ／ｍＬの感度限界を有する。
【０１０５】
以下の例は説明のために提供され、本発明を限定するためではない。
【０１０６】
［実施例］
例１
アッセイ試薬
本例においては、本発明のアッセイ方法およびデバイスに有用な代表的な検出試薬および捕捉試薬の調製について述べる。
【０１０７】
検出試薬：抗体−金コロイドコンジュゲート
簡略には、抗体（例２参照）を０．５倍ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈して、以下の工程を実施した。（１）沈降した金を再懸濁するために金を振盪または渦流状に撹拌し、０．５ｍＬのネイキッドゴールドゾルを１０本の清潔な個別の試験管に入れる。（２）準備したｐＨチャートからそれぞれの試験管にｐＨ値（または１〜１０）をラベルした。（３）ｐＨチャートを用いてそれぞれの試験管に種々の量の緩衝液をμＬ単位で加え、振盪して混合した。（４）それぞれの試験管を低速ボルテクサーに入れ、抗体溶液を加え、十分に撹拌する（約２〜３秒）。２０ｎｍの金に対しては抗体またはタンパク質の２ｍｇ／ｍＬ溶液１４μＬが最適である。（５）数本の試験管における紫色の濃色化および／または黒色の沈殿は、抗体またはタンパク質がその等電点以下であり、個別の金溶液が架橋することになることを示す（架橋した溶液は免疫アッセイに使用できず、廃棄する。濃紫色の溶液も大部分不活性である。淡紫色または色の変化がない試験管のみが免疫アッセイに有用である）。（６）反応を全部で３０分間、継続させる。（７）５０μＬのブロッキング溶液を加えることによって反応を停止させる。
【０１０８】
捕捉試薬：パクリタキセル−アルブミンコンジュゲート
パクリタキセル−アルブミンコンジュゲート（たとえば、ＢＳＡ−パクリタキセル）は、Ｊ−Ｇ  Ｌｅｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３：１３８８〜１３９１の記載された常法に従って調製した。２’−ヘミスクシニルタキソールの合成については、結晶がキャリアタンパク質へのタキソールのコンジュゲート化のための出発物質である。タキソール（２０ｍｇ）および無水コハク酸（３６ｍｇ）を室温、真空下にＰ2Ｏ5上で４時間乾燥し、乾燥ピリジン４８０μＬに溶解した。室温で一夜放置した後、真空下にピリジンを除去し、残渣を蒸留水２ｍＬで１回洗浄した。アセトン（１ｍＬ）を加え、いくらかの結晶（２’−ヘミスクシニルタキソール）が出現するまでアセトン溶液に蒸留水を滴下した。混合物を４℃に３時間保持し、濾過により結晶を回収し、真空下に乾燥した。生成物の収率は７０％であった。
【０１０９】
透析工程によりコンジュゲートしていないタキソールを除去する。２’−ヘミスクシニルタキソール（１０ｍｇ）をＤＭＳＯ１ｍＬとアセトニトリル３００μＬに溶解し、５０μＬ（３５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のｎ−トリブチルアミンを加えた。混合物を氷浴中で４℃に冷却し、２５μＬ（２５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）のイソブチルクロロフォーメートを混合物に加え、混合物を氷上に３０分保持した。溶液をＢＳＡ溶液（蒸留水３ｍＬ中２５ｍｇ（３．７３×１０-4ｍｍｏｌ）、ｐＨ９．５、４℃）中に滴下した。直ちに１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを７．５に調整し、混合物を４℃で一夜保持し、ＰＢＳに対して４℃で一夜透析した。
【０１１０】
ある例示的な態様において、ラテラルフローシステムを評価した。０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−パクリタキセル（試験ライン）および０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス抗体（対照ライン）を、システムの膜の上に縞状に載せた。パクリタキセル抗体−金コロイドコンジュゲートをシステムに流した。ＢＳＡ−パクリタキセルに結合した抗体−金コロイドコンジュゲートは膜に固定化され、強いシグナルを生成した。試料にパクリタキセルをスパイクして加えるとシグナルの減少が見られたので、シグナルはパクリタキセルに特異的であった。
【０１１１】
例２
パクリタキセル抗体
本例においては、本発明の方法およびデバイスに有用な代表的なパクリタキセル抗体の産生、プロセシング、精製、特製解析、および最適化について述べる。
【０１１２】
抗体産生およびプロセシング
５〜１０％のＦＢＳおよび１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加えたＣＣＭ１（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で細胞を培養した。細胞の密度が１×１０6個／ｍＬを超えれば、細胞を１：４に分割した。次いで細胞を凍結し、予備として２つの別々の液体窒素低温容器に保存した。細胞密度が１×１０6個／ｍＬに達するまで、ローラーボトルで細胞を培養した。この時点で、培養液の補給を止め、細胞の生存率を毎日モニターした。細胞の生存率が５０％未満に減少すれば、細胞を除去して抗体に富む培地を回収した。
【０１１３】
抗体のアフィニティ精製
ｐＨ７．４のＰＢＳを用いて濾過透析を行ない、回収した抗体を、５０Ｋｄカットオフ膜を用いて１０倍に濃縮した。アフィニティ精製にはＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いた。容量およびスループットの両方について最適化された親水性、高流量のアガロースビーズと、ｒプロテインＡリガンドの配向されたカップリングにより、純度および収率の高い生成物のプールが得られる。
【０１１４】
精製実行のプログラム
カラム：ＸＫ１６／４０（内径１６ｍｍ、ベッド高さ２０ｃｍ）
試料：澄明化したハイブリドーマの使用済み培地
装填緩衝液Ａ：２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２
溶出緩衝液Ｂ：０．１Ｍ  Ｎａ3−クエン酸塩、ｐＨ３．６
抗体親和性
未変性ＩｇＧ（８Ａ１０および３Ｃ６）のＢＳＡ−パクリタキセル抗原への直接結合の結果のプロットを図４に示す。１倍ＰＢＳ中の濃度３．５μｇ／ｍＬのＢＳＡ−パクリタキセル抗原５０μＬをプレートに結合させ、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の１％ＢＳＡで、室温で２時間、ブロックした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。抗体試料（８Ａ１０および３Ｃ６）５０μＬを結合させた（３００ｎＭで開始し、タイターを３ｓで低下させる）。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ヤギ抗ｍＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（５０００倍希釈）５０μＬを結合させ、次いで基質溶液ＴＭＢ５０μＬを加え、放置して発色させた。５０μＬの１Ｍ  ＨＣｌで反応を停止し、４５０ｎｍで光学密度を測定した。未変性ＩｇＧ（８Ａ１０および３Ｃ６）のＢＳＡ−パクリタキセル抗原への直接結合の結果を図４に示す。
【０１１５】
抗体の最適化
親和性成熟を含む抗体の最適化を行なった。この手法には、（１）ハイブリドーマ細胞株から産生された抗体を配列決定することによって抗体の特性を解析すること、（２）ＣＤＲ領域に着目して抗体ライブラリーを構築すること、（３）良性変異をスクリーニングすること、および（４）良性変異を組み合わせることが含まれる。
【０１１６】
工程１：抗パクリタキセルｍＡｂのＦａｂとしてのクローニングおよび発現
Ａ．ハイブリドーマ細胞から産生された抗体（８Ａ１０および３Ｃ６）の可変領域の配列決定
ｉ．全ＲＮＡ抽出およびｍＲＮＡ変性
ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、２つのハイブリドーマ細胞（８Ａ１０および３Ｃ６）から全ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ混合物（以下に述べる）を７２℃で３分間インキュベートし、次いで４２℃に２分間冷却した。冷却後、チューブを１０秒間１４，０００×ｇで簡略に遠心し、内容物を底に集めた。
【０１１７】
ｍＲＮＡ混合物
ＲＮＡテンプレート（０．２〜０．４μｇ）  １〜２．７５μＬ
５’−ＲＡＧＥプライマーＡ                １μＬ
ＲＮａｓｅを含まない水                    ３．７５μＬまで
ｉｉ．ｃＤＮＡ合成および５’ＲＡＧＥ反応
ｃＤＮＡ合成および５’ＲＡＧＥ反応は以下に示すように行なった。
【０１１８】
【表２】
2017513030.tif 000004
【０１１９】
ｉｉｉ．アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ反応の解析
８Ａ１０および３Ｃ６  ｍＭＡｂの軽鎖および重鎖可変領域に対応するアンプリコンの存在を確認するため、ＰＣＲ増幅の生成物をアガロースゲル上で電気泳動した。
【０１２０】
ｉｖ．クローニング、配列決定およびＣＤＲの解析
ＰＣＲ陽性バンドをベクターにクローン化し、配列決定を行なった。抗体配列解析により、８Ａ１０および３Ｃ６について１つの軽鎖および１つの重鎖が同定された。３Ｃ６については当初、ただ１つの軽鎖が同定され、重鎖は同定されなかった（異常配列）。このため、Ｎ−末端配列決定結果から得られた配列によって設計された特異的プライマーを用いて、重鎖を再ＰＣＲした。その結果、３Ｃ６の重鎖の同定が達成された。
【０１２１】
８Ａ１０ハイブリドーマ
８Ａ１０ハイブリドーマの配列決定の結果を以下に説明する。
【０１２２】
８Ａ１０の可変軽鎖核酸配列は配列番号１である。
ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＣＣＧ  ＴＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧ（配列番号１）。
【０１２３】
ＣＤＲ領域をエンコードする配列には下線を付している。
【０１２４】
対応する８Ａ１０可変軽鎖アミノ酸配列は配列番号２である。
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＩＴＬＧＥＲＶＳＩＴＣＫＰＳＱＮＶＧＳＡＶＴＷＷＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＤＹＦＣＱＱＹＳＳＹＰＹＴＦＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号２）。
【０１２５】
３つのＣＤＲ領域に下線を付している（即ちＣＤＲＬ１はＫＰＳＱＮＶＧＳＡＶＴ、ＣＤＲＬ２はＳＡＳＮＲＹＴ、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＳＳＹＰＹＴである）。
【０１２６】
８Ａ１０の可変重鎖核酸配列は配列番号３である。
ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＴＡＴ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＡ（配列番号３）。
【０１２７】
ＣＤＲ領域をエンコードする配列には下線を付している。
【０１２８】
対応する８Ａ１０可変重鎖アミノ酸配列は配列番号４である。
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＳＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＥＩＤＰＮＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＶＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号４）。
【０１２９】
３つのＣＤＲ領域に下線を付している（即ちＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＤＳＴＭＮ、ＣＤＲＨ２はＥＩＤＰＮＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧ、ＣＤＲＨ３はＧＶである）。
【０１３０】
３Ｃ６ハイブリドーマ
３Ｃ６ハイブリドーマの配列決定の結果を以下に説明する。
【０１３１】
３Ｃ６の可変軽鎖核酸配列は配列番号５である。
ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  Ｃ（配列番号５）。
【０１３２】
ＣＤＲ領域をエンコードする配列には下線を付している。
【０１３３】
対応する３Ｃ６可変軽鎖アミノ酸配列は配列番号６である。
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＲＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＥＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６）。
【０１３４】
３つのＣＤＲ領域に下線を付している（即ちＣＤＲＬ１はＲＳＲＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ、ＣＤＲＬ２はＫＶＳＮＲＦＳ、ＣＤＲＬ３はＳＱＳＴＨＶＰＰＴである）。
【０１３５】
３Ｃ６の可変重鎖核酸配列は配列番号７である。
ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＡＴＡ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＣＧＡ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＴＡＣ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＡ（配列番号７）。
【０１３６】
ＣＤＲ領域をエンコードする配列には下線を付している。
【０１３７】
対応する３Ｃ６可変重鎖アミノ酸配列は配列番号８である。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＳＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＴＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＰＧＮＲＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＨＬＴＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＱＧＤＧＡＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号８）。
【０１３８】
３つのＣＤＲ領域に下線を付している（即ちＣＤＲＨ１はＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮ、ＣＤＲＨ２はＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳ、ＣＤＲＨ３はＧＤＧＡＹである）。
【０１３９】
表２．８Ａ１０および３Ｃ６ｍＡｂについてのＮ−末端配列決定の結果とハイブリドーマ配列決定の結果の比較
【０１４０】
【表３】
2017513030.tif 000005
【０１４１】
Ｂ．ｍＡｂの可変領域のＭ１３エンジニアリングベクターへのクローニング
ＰＣＲを用いて配列特異的プライマーにより、ｍＡｂ（即ち８Ａ１０および３Ｃ６）のＶＬ、Ｃカッパ、およびＶＨ領域をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ生成物をゲルにより精製し、ｌａｃＺプロモーターの制御の下にＭ−１３系ファージベクター内の特異的部位について制限消化した。８Ａ１０および３Ｃ６  ｍＡｂのＶＬ、Ｃカッパ、およびＶＨ領域をコードする二本鎖ＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域の定常領域の遺伝子を含むファージ系ベクターに連結した。ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入し、得られたファージ含有プラークを詳細に検討した。プラークを無作為に取り出し、そのＤＮＡを分離して配列を決定した。クローン８Ａ１０＿１はｍＡｂ  ８Ａ１０（示していない）と同じＶＬ、Ｃカッパ、およびＶＨ領域の配列を有していることが決定された。３Ｃ６のクローニングプロセスも同じプロトコルに従って行なうことができる。
【０１４２】
Ｃ．Ｍ１３エンジニアリングベクターから生成したＦａｂのパクリタキセル結合活性の証明
クローン８Ａ１０＿１のＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（グラム陰性）のファージ感染培養物をＩＰＴＧで誘導しながら増殖させて遠心により回収し、浸透圧ショックによってペリプラズム内容物を放出させた（ペリプレップ）。放出されたＦａｂ生成物を培養液から分離した。ＥＬＩＳＡによってＦａｂ濃度を定量し、未変性のＩｇＧ（示していない）とともにパクリタキセルＥＬＩＳＡを用いてＦａｂの抗原特異的結合を行なった。２つの未変性ＩｇＧのＫd値（両方の抗体について約１０ｎＭ）は以前報告した値と同程度であった（図３参照）。Ｆａｂ  ８Ａ１０のＫd値も１０ｎＭと決定され、これは未変性のＩｇＧ  ８Ａ１０の値と同じである。これらの結果より、このＦａｂ  ８Ａ１０には親抗体８Ａ１０の可変領域配列が正しく存在しており、Ｍ１３エンジニアリングベクターからのＦａｂフォーマットにおいて正しく折り畳まれ、発現していることが示唆される。
【０１４３】
Ｆａｂはペリプラズム調製物中で十分に発現し、ＢＳＡ−パクリタキセルコンジュゲートで被覆されたウェルに濃度依存的に結合することが示された。
【０１４４】
例３
代表的な固相競合アッセイ
本例においては、固相競合アッセイの有効性を示す代表的なアッセイについて述べる。このアッセイは、試料中のパクリタキセルの存在に関する情報を含むシグナルを提供するためのこのような検出フォーマットにおいてここに記載した抗パクリタキセル抗体を用いることの有用性を証明する。その結果から、抗体の位置の変化によってアッセイ性能を向上させられることが証明される。
【０１４５】
パクリタキセルラテラルフローシステム
１．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ−パクリタキセル（試験ライン、Ｔ）および０．２ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス抗体（対照ライン、Ｃ）を膜カード（高流量プラスＨＦ１８０膜カード、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上に縞状に塗布した。抗パクリタキセル抗体−金コロイドコンジュゲートをコンジュゲートパッド（ガラス繊維パッド、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に吸収させ、乾燥した。パクリタキセル（１０μＬ）を加えたウシ胎児血清（ＦＢＳ）に８０μＬのＰＢＳＴｗｅｅｎを追加し、アッセイに流した。
【０１４６】
タンデム抗体アッセイ
蒸留水を用いて抗体−金コンジュゲートを再構成し、相互に添加して適当な濃度とする。このタンデム抗体溶液をアッセイコンジュゲートパッドに塗布して乾燥する。
【０１４７】
リーダーアウトプット：強度対位置
テストストリップの走査結果の読み取り。ストリップはＱｉａｇｅｎリーダー（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて読み取る。
【０１４８】
パクリタキセル標準曲線
試験ラインと対照ラインとの比と、パクリタキセル濃度との関係の標準曲線を作成した。
【０１４９】
図５Ａおよび図５Ｂに、ラインＴ１およびＴ２に結合した８Ａ１０の曲線を示す。図５Ａは標準曲線、即ち試験ラインと対照ラインとの比（Ｔ／Ｃ）と、パクリタキセル濃度との関係を示す。８Ａ１０について低濃度における比がＴ１とＴ２で大きく相違することは、分析物質の濃度が比較的高いと思われる試料ポートに近い場所に置かれた場合に抗体の感度がずっと高いことを示している。図５Ｂは、リーダーデバイスによって得られた、走査したテストストリップの出力強度と位置の読み取りとの関係を示す。
【０１５０】
図６Ａおよび図６Ｂに、ラインＴ１およびＴ２に結合した３Ｃ６の曲線を示す。図６Ａは標準曲線、即ち試験ラインと対照ラインとの比（Ｔ／Ｃ）と、パクリタキセル濃度との関係を示す。３Ｃ６について低濃度における比がＴ１とＴ２であまり大きく相違しないことは、分析物質の濃度が比較的高いと思われる試料ポートに近い場所に抗体が置かれた場合に得られる感度の改善が比較的少ないことを示している。しかし、Ｔ２においてシグナル強度の改善が見られた。図６Ｂは、リーダーデバイスによって得られた、走査したテストストリップの出力強度と位置の読み取りとの関係を示す。
【０１５１】
図７Ａおよび図７Ｂに、ラインＴ１およびＴ２に結合した８Ａ１０と３Ｃ６の組み合わせの曲線を示す。図７Ａは標準曲線、即ち試験ラインと対照ラインとの比（Ｔ／Ｃ）と、パクリタキセル濃度との関係を示す。高感度の８Ａ１０を試料ポートの近くに置き、より感度が高く位置に依存しない３Ｃ６をＴ２に置く組み合わせによって、アッセイをより確実にすることができた。図７Ｂは、リーダーデバイスによって得られた、走査したテストストリップの出力強度と位置の読み取りとの関係を示す。
【０１５２】
上記の分析（および図５〜図７）において、図５Ｂ、図６Ｂ、および図７ＢにおけるＴ１、Ｔ２、およびＣの位置（Ｐｏｓ［ｍｍ］）の測定はテストストリップの流れ方向下流端から行なった（たとえば試料は５５ｍｍ点に導入、Ｔ２は約４５ｍｍ、Ｔ１は約４０ｍｍ、Ｃは約３５ｍｍ）。
【０１５３】
例４
抗体結合特性の決定方法
本例においては、抗体特性の決定方法について述べる。方法はＢｉａｃｏｒｅ  Ａｓｓａｙを用いてＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）によって行なった。本例はまた、本発明のＬＦＡアッセイ（ラテラルフローアッセイ）が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ等の他の固相アッセイにいかに適合できるかを示す。
【０１５４】
結合実験はＢｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（ＧＥ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）によって２５℃で行なった。約１３，０００ＲＵの抗ＢＳＡ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１１３３、ｌｏｔ  １６３７２７０）をアミンカップリング（ＥＤＣ／ＮＨＳ）によりＣＭ５チップのフローセル２に直接固定化した。１１０〜１２０ＲＵのＢＳＡ−パクリタキセル（ＢＳＡ−Ａｇ）が捕捉された。フローセル１を同様に、しかしリガンドなしで処理し、参照を差し引くためのブランク表面として用いた。占拠されていない部位を１Ｍのエタノールアミンでブロックした。分析物質Ａｂ１（８Ａ１０）およびＡｂ２（３Ｃ６）を種々の濃度でチップの上に流した。リアルタイムで抗原の抗体への結合をモニターしてオン（ｋa）およびオフ（ｋd）の速度を求めた。観察されたｋaおよびｋdから平衡定数（ＫD）を計算した。
【０１５５】
２倍の連続希釈で示される分析物質濃度を用いて完全な動力学解析を行なった。出発濃度を２００ｎＭとし、続いて１００、５０、２５、１２．５、および０ｎＭとした。アッセイの再現性を確認するため、１００ｎＭ濃度を２回実験した。完全な動力学解析の結果を表３に示す。
【０１５６】
アッセイ用緩衝液は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｐ２０（ポリオキシエチレンソルビタン）であった。再生用緩衝液は１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．０）であった。コンジュゲーション用緩衝液は１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）であった。リガンドを捕捉するために用いた流量は１μＬ／分であった。動力学解析のための流量は５０μＬ／分であった。
【０１５７】
分析の精度を決定するため、実際のセンサグラムとＢＩＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアから生成したセンサグラムとの間でカイ二乗（χ2）解析を行なった。１〜２以内のχ2値は有意（正確）と考えられ、１未満は高度に有意（高度に正確）である。
【０１５８】
３回の独立のＳＰＲ実験の概要を表４に示す。
【０１５９】
表３．完全な動力学解析
【０１６０】
【表４】
2017513030.tif 000006
【０１６１】
表４．ＳＰＲの概要
【０１６２】
【表５】
2017513030.tif 000007
【０１６３】
説明のための態様を図示し記述してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明において種々の変更が可能であることが理解されよう。
【０１６４】
排他的な権利または特権を請求する本発明の態様は以下のように定義される。
【図１】
2017513030.tif 000008
【図２Ａ】
2017513030.tif 000009
【図２Ｂ】
2017513030.tif 000010
【図２Ｃ】
2017513030.tif 000011
【図３】
2017513030.tif 000012
【図４】
2017513030.tif 000013
【図５Ａ】
2017513030.tif 000014
【図５Ｂ】
2017513030.tif 000015
【図６Ａ】
2017513030.tif 000016
【図６Ｂ】
2017513030.tif 000017
【図７Ａ】
2017513030.tif 000018
【図７Ｂ】
2017513030.tif 000019
【配列表】
2017513030000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月6日(2016.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中のパクリタキセルをアッセイするための方法であって、
（ａ）パクリタキセルを含む液体試料をラテラルフローアッセイデバイスに適用することであって、前記デバイスが
（ｉ）前記液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｉｉ）前記試料受容ゾーンと液通し、前記試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、
前記検出試薬ゾーンがその上に堆積した検出試薬を含み、
前記検出試薬がパクリタキセルと結合するパクリタキセル抗体、その機能的断片または機能的誘導体であり、前記パクリタキセル抗体、その機能的断片または機能的誘導体は検出可能なレポート基で標識され、
前記パクリタキセル抗体、その機能的断片または機能的誘導体が、約１０4〜約１０7の会合速度定数（Ｋon）および約１０-3〜約１０-7の解離速度定数（Ｋoff）を有する検出試薬ゾーン、および
（ｉｉｉ）前記検出試薬ゾーンと液通し、前記検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーンであって、
前記捕捉ゾーンがその上に固定化された第１、第２および第３の捕捉試薬を含み、
前記第１の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料であり（第１の試験ライン）、
前記第２の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料であり（第２の試験ライン）、
前記第３の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能な抗体であり（対照ライン）、
前記第１の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第１の距離に位置し、
前記第２の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第２の距離に位置し、
前記第３の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第３の距離に位置し、
前記第２の距離が前記第１の距離より大きく、
前記第３の距離が前記第１の距離および第２の距離より大きく、
前記検出試薬のＫonが約２．０×１０5より大きく前記検出試薬のＫoffが約１．０×１０-3より小さい場合には前記第１の距離対前記第２の距離の比は約０．０超〜約０．４であり、または
前記Ｋonが約２．０×１０4より大きく前記Ｋoffが約２．０×１０-4より小さい場合には前記第１の距離対前記第２の距離の比は約０．２〜約１．０である、上記捕捉ゾーン、
を含み、
（ｂ）前記試料を前記試料受容ゾーンから前記検出試薬ゾーンに流動させて検出試薬にパクリタキセルを供給すること、
（ｃ）前記検出試薬をパクリタキセルとともに前記捕捉ゾーンに流動させることであって、
前記第１及び第２の捕捉試薬（第１及び第２の試験ライン）が前記検出試薬との結合に関してパクリタキセルと競合し、
前記第３の捕捉試薬（対照ライン）が過剰の検出試薬と結合すること、ならびに
（ｄ）前記第３の捕捉試薬（対照ライン）と比較して前記第１及び第２の捕捉試薬（第１及び第２の試験ライン）に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む、方法。
【請求項２】
対照ラインおよび試験ラインにおいて結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中のパクリタキセルの量を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することが光学密度の測定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出可能なレポート基が金コロイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記パクリタキセル抗体が３Ｃ６である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記パクリタキセル抗体が８Ａ１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記パクリタキセル材料が前記検出試薬への結合に関してパクリタキセルと競合するパクリタキセル抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記パクリタキセル材料がパクリタキセルタンパク質コンジュゲートである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出試薬と結合可能な抗体がヤギ抗マウス抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料受容ゾーンと前記第１及び第２の捕捉試薬との間の距離を変化させて、パクリタキセルの検出感度を最適化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料受容ゾーンと前記第１及び第２の捕捉試薬との間の距離を最小化して、パクリタキセルの検出感度を最適化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第３の捕捉試薬（対照ライン）に結合した過剰の検出試薬の量を観測することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第３の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中のパクリタキセルの量を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第３の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することが光学密度の測定を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ラテラルフローデバイスが、前記捕捉試薬ゾーンと液通し、前記捕捉試薬ゾーンから流れ方向下流にある吸収ゾーンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＬＦＡをＳＰＲまたは他の固相イムノアッセイに置きかえることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２の抗体を用い、前記第１の抗体が１０4より大きいＫonを有し、前記第２の抗体が１０-3より小さいＫoffを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
再現性を増大させダイナミックレンジを拡大させるために２本または３本のラインを用いて同一試料について複数の読み取りを生成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
癌と診断された患者におけるパクリタキセル療法の有効性をモニターするための方法であって、
（ａ）第１の時点で癌患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｂ）第１の時点で治療薬の投与後の前記患者におけるパクリタキセルの第１の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが請求項１から１８の何れか一項に記載の方法を含むこと、
（ｃ）第２の時点で前記患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｄ）第２の時点で治療薬の投与後の前記患者におけるパクリタキセル薬の第２の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが請求項１から１８の何れか一項に記載の方法を含むこと、および
（ｅ）癌処置の有効性を決定するために前記患者におけるパクリタキセルの前記第１の濃度と第２の濃度を比較すること
を含む、方法。
【請求項２０】
癌と診断された患者におけるパクリタキセル療法のＰＫガイド下投薬のための方法であって、
（ａ）第１の時点で前記癌患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｂ）第１の時点で治療薬の投与後の前記患者におけるパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが請求項１から１８の何れか一項に記載の方法によってパクリタキセルの濃度を測定することを含むこと、
（ｃ）前記第１の投薬からのＰＫ情報を用いて第２の時点で前記患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｄ）第２の時点で治療薬の投与後の前記患者におけるパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが請求項１から１８の何れか一項に記載の方法によってパクリタキセルの濃度を測定することを含むこと、および
（ｅ）適切な投薬が達成されたことを確認するために、前記第１の時点における治療薬の投与後の対象のパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを前記第２の時点における治療薬の投与後のレベルと比較すること
を含む、方法。
【請求項２１】
前記薬物動態パラメーターが、最大濃度までの時間（Ｔmax）、濃度最大値（Ｃmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖd）、最終相の間の見かけの分布体積（Ｖz）、定常状態の間の見かけの分布体積（Ｖss）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｂ）前記試料受容ゾーンと液通し、前記試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、
前記検出試薬ゾーンがその上に堆積した１つ以上の検出試薬を含み、
前記検出試薬がパクリタキセルと結合するパクリタキセル抗体、その機能的断片または機能的誘導体であり、前記パクリタキセル抗体、その機能的断片または機能的誘導体は検出可能なレポート基で標識され、
前記パクリタキセル抗体、その機能的断片または機能的誘導体が、約１０4〜約１０7の会合速度定数（Ｋon）および約１０-3〜約１０-7の乖離速度定数（Ｋoff）を有する検出試薬ゾーン；
（ｃ）前記検出試薬ゾーンと液通し、前記検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーンであって、
前記捕捉ゾーンがその上に固定化された第１、第２および第３の捕捉試薬を含み、
前記第１の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料であり（第１の試験ライン）、
前記第２の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料であり（第２の試験ライン）、
前記第３の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能な抗体であり（対照ライン）、
前記第１の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第１の距離に位置し、
前記第２の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第２の距離に位置し、
前記第３の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第３の距離に位置し、
前記第２の距離が前記第１の距離より大きく、
前記第３の距離が前記第１の距離および第２の距離より大きく、
前記検出試薬のＫonが約２．０×１０5より大きく前記検出試薬のＫoffが約１．０×１０-3より小さい場合には前記第１の距離対前記第２の距離の比は約０．０超〜約０．４であり、または
前記Ｋonが約２．０×１０4より大きく前記Ｋoffが約２．０×１０-4より小さい場合には前記第１の距離対前記第２の距離の比は約０．２〜約１．０である、上記捕捉ゾーン
および
（ｄ）前記捕捉ゾーンと液通し、前記捕捉試薬ゾーンから流れ方向下流にある吸収ゾーン
を含む、ラテラルフローデバイス。
【請求項２３】
前記検出試薬が治療薬に第１の親和性を有する第１の抗体および前記治療薬に第２の親和性を有する第２の抗体を含み、前記第１の親和性が前記第２の親和性より大きい、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記試料受容ゾーンと前記第１の捕捉試薬との間の距離を変化させて、前記治療薬の検出を最適化する、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記治療薬がパクリタキセルであり、前記検出試薬が８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体を含み、前記抗体、または断片もしくは誘導体がパクリタキセルに結合する、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２６】
試料中の治療薬をアッセイするための方法であって、
（ａ）請求項２２から２５の何れか一項に記載のデバイスの試料受容ゾーンに試料を適用すること、および
（ｂ）前記１つ以上の固定化された捕捉試薬に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む方法。
【請求項２７】
前記１つ以上の固定化された捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中の治療薬の量を決定することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
検出試薬が第１の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
検出試薬が第２の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
検出試薬が第１および第２の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療薬がパクリタキセルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出試薬が８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体を含み、前記抗体、または断片もしくは誘導体がパクリタキセルに結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
疾患または状態と診断された患者における治療処置の有効性をモニターするための方法であって、
（ａ）第１の時点で患者を治療剤で処置すること、
（ｂ）第１の時点で治療薬の投与後の前記患者における前記治療剤の第１の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが請求項２６から３２の何れか一項に記載の方法を含むこと、
（ｃ）第２の時点で前記患者を前記治療剤で処置すること、
（ｄ）第２の時点で治療薬の投与後の前記患者における前記治療剤の第２の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが請求項２６から３２の何れか一項に記載の方法を含むこと、および
（ｅ）前記治療処置の有効性を決定するために前記患者における前記第１および第２の濃度を比較すること
を含む、方法。
【請求項３４】
前記疾患または状態の処置が治療薬モニタリングから利益を受ける、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患または状態が癌、炎症、高血圧、心臓血管、または疼痛である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療剤がパクリタキセル、ドセタキセル、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル、および７−Ｌ−アラニルパクリタキセルからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
疾患または状態と診断された患者における治療処置のＰＫガイド下投薬のための方法であって、
（ａ）第１の時点で前記患者を治療剤で処置すること、
第１の時点で治療薬の投与後の前記患者における前記治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが請求項２６から３２の何れか一項に記載の方法によって前記治療剤をアッセイすることを含むこと、
（ｂ）前記第１の投薬から得られたＰＫデータを用いて第２の時点で前記患者を前記治療剤で処置すること、
（ｃ）第２の時点で治療薬の投与後の前記患者における前記治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが請求項２６から３２の何れか一項に記載の方法によって前記治療剤をアッセイすることを含むこと、および
（ｄ）適切な投薬が達成されたことを確認するために、前記第１の時点における前記対象の前記治療薬剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを前記第２の時点におけるレベルと比較すること
を含む方法。
【請求項３８】
前記薬物動態パラメーターが、最大濃度までの時間（Ｔmax）、濃度最大値（Ｃmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖd）、最終相の間の見かけの分布体積（Ｖz）、定常状態の間の見かけの分布体積（Ｖss）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患または状態が癌、炎症、高血圧、心臓血管、または疼痛である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療剤がパクリタキセル、ドセタキセル、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル、および７−Ｌ−アラニルパクリタキセルからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体であって、配列番号２、４、６、または８に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）と少なくとも９５％のホモロジーを有する１つ以上のＣＤＲを含む、上記抗体、抗体断片、または抗体誘導体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
排他的な権利または特権を請求する本発明の態様は以下のように定義される。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
液体試料中のパクリタキセルをアッセイするための方法であって、
（ａ）パクリタキセルを含む液体試料をラテラルフローアッセイデバイスに適用することであって、前記デバイスが
（ｉ）前記液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｉｉ）前記試料受容ゾーンと液通し、前記試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、
前記検出試薬ゾーンがその上に堆積した検出試薬を含み、
前記検出試薬が、検出可能なレポート基で標識された、パクリタキセルと結合するパクリタキセル抗体またはその断片もしくは誘導体であり、
前記パクリタキセル抗体またはその断片もしくは誘導体が、約１０4〜約１０7のＫonおよび約１０-3〜約１０-7のＫoffを有する検出試薬ゾーン、および
（ｉｉｉ）前記検出試薬ゾーンと液通し、前記検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーン
を含み、
前記捕捉ゾーンがその上に固定化された第１および第２の捕捉試薬を含み、
前記第１の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料であり（試験ライン）、
前記第２の捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能な抗体であり（対照ライン）、
前記第１の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第１の距離に位置し、
前記第２の捕捉試薬が前記捕捉ゾーンの上流端から流れ方向下流の第２の距離に位置し、
前記第２の距離が前記第１の距離より大きく、
前記Ｋonが約２．０×１０5より大きく前記Ｋoffが約１．０×１０-3より小さい場合には前記第１の距離対前記第２の距離の比は約０．０〜約０．４であり、
前記Ｋonが約２．０×１０4より大きく前記Ｋoffが約２．０×１０-4より小さい場合には前記第１の距離対前記第２の距離の比は約０．２〜約１．０であること、
（ｂ）前記試料を前記試料受容ゾーンから前記検出試薬ゾーンに流動させて検出試薬にパクリタキセルを供給すること、
（ｃ）前記検出試薬をパクリタキセルとともに前記捕捉ゾーンに流動させることであって、
前記第１の捕捉試薬（試験ライン）が前記検出試薬との結合に関して分析物質（パクリタキセル）と競合し、
前記第２の捕捉試薬（対照ライン）が過剰の検出試薬と結合すること、ならびに
（ｄ）前記第２の捕捉試薬（対照ライン）と比較して前記第１の捕捉試薬（試験ライン）に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む、方法。
［２］
対照ラインおよび試験ラインにおいて結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中のパクリタキセルの量を決定することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することが光学密度の測定を含む、［２］に記載の方法。
［４］
前記検出可能なレポート基が金コロイドである、［１］に記載の方法。
［５］
前記パクリタキセル抗体が３Ｃ６である、［１］に記載の方法。
［６］
前記パクリタキセル抗体が８Ａ１０である、［１］に記載の方法。
［７］
前記パクリタキセル材料が前記検出試薬への結合に関してパクリタキセルと競合するパクリタキセル抗原である、［１］に記載の方法。
［８］
前記パクリタキセル材料がパクリタキセルタンパク質コンジュゲートである、［１］に記載の方法。
［９］
前記検出試薬と結合可能な抗体がヤギ抗マウス抗体である、［１］に記載の方法。
［１０］
前記試料受容ゾーンと前記第１の捕捉試薬との間の距離を変化させて、パクリタキセルの検出感度を最適化する、［１］に記載の方法。
［１１］
前記試料受容ゾーンと前記第１の捕捉試薬との間の距離を最小化して、パクリタキセルの検出感度を最適化する、［１］に記載の方法。
［１２］
前記第２の捕捉試薬（対照ライン）に結合した過剰の検出試薬の量を観測することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［１３］
前記第２の捕捉試薬に結合した過剰の検出試薬の量を定量することによって前記試料中のパクリタキセルの量を決定することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［１４］
前記第１および第２の捕捉ゾーンの中間の第３の捕捉ゾーンをさらに含み、前記第３の捕捉ゾーンが前記検出試薬と結合可能なパクリタキセル材料を含む、［１］に記載の方法。
［１５］
前記第３の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中のパクリタキセルの量を決定することを含む、［１４］に記載の方法。
［１６］
前記第３の捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することが光学密度の測定を含む、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記ラテラルフローデバイスが、前記捕捉試薬ゾーンと液通し、前記捕捉試薬ゾーンから流れ方向下流にある吸収ゾーンをさらに含む、［１］に記載の方法。
［１８］
ＬＦＡをＳＰＲまたは他の固相イムノアッセイに置きかえることができる、［１］に記載の方法。
［１９］
第１および第２の抗体を用い、前記第１の抗体が１０4より大きいＫonを有し、前記第２の抗体が１０-3より小さいＫoffを有する、［１］に記載の方法。
［２０］
再現性を増大させダイナミックレンジを拡大させるために２本または３本のラインを用いて同一試料について複数の読み取りを生成することができる、［１］に記載の方法。
［２１］
癌と診断された患者におけるパクリタキセル療法の有効性をモニターするための方法であって、
（ａ）第１の時点で癌患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｂ）第１の時点で前記患者におけるパクリタキセルの第１の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが［１］から［２０］の何れか一に記載の方法を含むこと、
（ｃ）第２の時点で前記患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｄ）第２の時点で前記患者におけるパクリタキセル薬の第２の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが［１］から［２０］の何れ一に記載の方法を含むこと、および
（ｅ）癌処置の有効性を決定するために前記患者におけるパクリタキセルの前記第１の濃度と第２の濃度を比較すること
を含む、方法。
［２２］
癌と診断された患者におけるパクリタキセル療法のＰＫガイド下投薬のための方法であって、
（ａ）第１の時点で前記癌患者をパクリタキセルで処置すること、
第１の時点で前記患者におけるパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが［１］から［２０］の何れか一に記載の方法によってパクリタキセルの濃度を測定することを含むこと、
（ｂ）前記第１の投薬からのＰＫ情報を用いて第２の時点で前記患者をパクリタキセルで処置すること、
（ｃ）第２の時点で前記患者におけるパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが［１］から［２０］の何れか一に記載の方法によってパクリタキセルの濃度を測定することを含むこと、および
（ｄ）適切な投薬が達成されたことを確認するために、前記第１の時点における対象のパクリタキセルの１つ以上の薬物動態パラメーターを前記第２の時点におけるレベルと比較すること
を含む、方法。
［２３］
前記薬物動態パラメーターが、最大濃度までの時間（Ｔmax）、濃度最大値（Ｃmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖd）、最終相の間の見かけの分布体積（Ｖz）、定常状態の間の見かけの分布体積（Ｖss）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、［２２］に記載の方法。
［２４］
（ａ）液体試料を受容するための試料受容ゾーン、
（ｂ）前記試料受容ゾーンと液通し、前記試料受容ゾーンから流れ方向下流にある検出試薬ゾーンであって、
その上に堆積した１つ以上の検出試薬を含む検出試薬ゾーン、
（ｃ）前記検出試薬ゾーンと液通し、前記検出試薬ゾーンから流れ方向下流にある捕捉ゾーンであって、
その上に固定化された１つ以上の捕捉試薬を含む捕捉ゾーン、および
（ｄ）前記捕捉ゾーンと液通し、前記捕捉試薬ゾーンから流れ方向下流にある吸収ゾーン
を含む、ラテラルフローデバイス。
［２５］
前記検出試薬が検出可能なレポート基で標識された抗体である、［２４］に記載のデバイス。
［２６］
前記検出試薬が治療薬に第１の親和性を有する第１の抗体および前記治療薬に第２の親和性を有する第２の抗体を含み、前記第１の親和性が前記第２の親和性より大きい、［２４］に記載のデバイス。
［２７］
前記捕捉試薬が前記検出試薬への結合に関して前記治療薬と競合する抗原である、［２４］に記載のデバイス。
［２８］
前記捕捉試薬が前記検出試薬と結合可能な抗体である、［２４］に記載のデバイス。
［２９］
前記捕捉試薬が前記検出試薬への結合に関して前記治療薬と競合する抗原である第１の捕捉試薬と、前記検出試薬と結合可能な抗体である第２の捕捉試薬とを含む、［２４］に記載のデバイス。
［３０］
前記第１の捕捉試薬が、前記第２の捕捉試薬から流れ方向上流に固定化されている、［２４］に記載のデバイス。
［３１］
前記試料受容ゾーンと前記第１の捕捉試薬との間の距離を変化させて、前記治療薬の検出を最適化する、［３０］に記載のデバイス。
［３２］
前記第１および第２の捕捉試薬の中間に固定化された第３の捕捉試薬をさらに含み、前記第３の捕捉試薬が、前記検出試薬への結合に関して前記治療薬と競合する抗原である、［３０］に記載のデバイス。
［３３］
前記治療薬がパクリタキセルであり、前記検出試薬が８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体を含み、前記抗体、または断片もしくは誘導体がパクリタキセルに結合する、［２４］に記載のデバイス。
［３４］
試料中の治療薬をアッセイするための方法であって、
（ａ）［２４］から［３３］の何れか一に記載のデバイスの試料受容ゾーンに試料を適用すること、および
（ｂ）前記１つ以上の固定化された捕捉試薬に結合した検出試薬の量を観測すること
を含む方法。
［３５］
前記１つ以上の固定化された捕捉試薬に結合した検出試薬の量を定量することによって前記試料中の治療薬の量を決定することをさらに含む、［３４］に記載の方法。
［３６］
検出試薬が第１の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、［３４］に記載の方法。
［３７］
検出試薬が第２の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、［３４］に記載の方法。
［３８］
検出試薬が第１および第２の捕捉位置において捕捉試薬に結合する、［３４］に記載の方法。
［３９］
前記治療薬がパクリタキセルである、［３４］に記載の方法。
［４０］
前記検出試薬が８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体を含み、前記抗体、または断片もしくは誘導体がパクリタキセルに結合する、［３４］に記載の方法。
［４１］
疾患または状態と診断された患者における治療処置の有効性をモニターするための方法であって、
（ａ）第１の時点で患者を治療剤で処置すること、
（ｂ）第１の時点で前記患者における前記治療剤の第１の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが［３４］から［４０］の何れか一に記載の方法を含むこと、
（ｃ）第２の時点で前記患者を前記治療剤で処置すること、
（ｄ）第２の時点で前記患者における前記治療剤の第２の濃度を決定することであって、前記濃度を決定することが［３４］から［４０］の何れか一に記載の方法を含むこと、および
（ｅ）前記治療処置の有効性を決定するために前記患者における前記第１および第２の濃度を比較すること
を含む、方法。
［４２］
前記疾患または状態の処置が治療薬モニタリングから利益を受ける、［４１］に記載の方法。
［４３］
前記疾患または状態が癌、炎症、高血圧、心臓血管、または疼痛である、［４１］に記載の方法。
［４４］
前記治療剤がパクリタキセル、ドセタキセル、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル、および７−Ｌ−アラニルパクリタキセルからなる群から選択される、［４１］に記載の方法。
［４５］
疾患または状態と診断された患者における治療処置のＰＫガイド下投薬のための方法であって、
（ａ）第１の時点で前記患者を治療剤で処置すること、
第１の時点で前記患者における前記治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが［３４］から［４０］の何れか一に記載の方法によって前記治療剤をアッセイすることを含むこと、
（ｂ）前記第１の投薬から得られたＰＫデータを用いて第２の時点で前記患者を前記治療剤で処置すること、
（ｃ）第２の時点で前記患者における前記治療剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することであって、前記１つ以上の薬物動態パラメーターを決定することが［３４］から［４０］の何れか一に記載の方法によって前記治療剤をアッセイすることを含むこと、および
（ｄ）適切な投薬が達成されたことを確認するために、前記第１の時点における前記対象の前記治療薬剤の１つ以上の薬物動態パラメーターを前記第２の時点におけるレベルと比較すること
を含む方法。
［４６］
前記薬物動態パラメーターが、最大濃度までの時間（Ｔmax）、濃度最大値（Ｃmax）、曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、分布体積（Ｖd）、最終相の間の見かけの分布体積（Ｖz）、定常状態の間の見かけの分布体積（Ｖss）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、［４５］に記載の方法。
［４７］
前記疾患または状態が癌、炎症、高血圧、心臓血管、または疼痛である、［４５］に記載の方法。
［４８］
前記治療剤がパクリタキセル、ドセタキセル、７−エピパクリタキセル、ｔ−アセチルパクリタキセル、１０−デスアセチル−パクリタキセル、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル、７−キシロシルパクリタキセル、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル、および７−Ｌ−アラニルパクリタキセルからなる群から選択される、［４５］に記載の方法。
［４９］
パクリタキセルに結合する、８Ａ１０および３Ｃ６から選択されるモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体。
［５０］
前記抗体、抗体断片、または抗体誘導体が配列番号２、４、６、または８に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）と少なくとも９５％のホモロジーを有する１つ以上のＣＤＲを含む、［４９］に記載のモノクローナル抗体、抗体断片、または抗体誘導体。
【国際調査報告】
2017513030.tif 000020
2017513030.tif 000021
2017513030.tif 000022
2017513030.tif 000023
2017513030.tif 000024