(57)【要約】ヒドロゲル組成物およびヒドロゲル組成物の使用方法を開示する。ヒドロゲル組成物が、さまざまな細胞の細胞伸長および／または細胞分化を促進する能力を提供することが有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞伸長を促進する方法であって、
ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、および細胞接着ペプチドを含む)を製造すること；
細胞をヒドロゲル組成物に接触させること；および
細胞を培養すること；を含む方法。
【請求項２】
ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールが、8-アーム,20 kDaのノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、循環血管新生細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号：2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号：31)、環状RGD(配列番号：35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号：29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号：30)から選ばれる少なくとも1 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒドロゲル組成物が、約2 kPa〜約12 kPaのせん断弾性率を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヒドロゲル組成物が、約1.8 kPa〜約33 kPaのせん断弾性率を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号：2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号：31)、環状RGD(配列番号：35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号：29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号：30)から選ばれる少なくとも0.25 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、ヒト胚性幹細胞およびヒト誘導多能性幹細胞から選ばれるヒト多能性幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号：2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号：31)、環状RGD(配列番号：35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号：29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号：30)から選ばれる少なくとも0.25 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒドロゲル組成物が、約3 kPa〜約16 kPaのせん断弾性率を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ヒドロゲル組成物が、固定化低分子量ヘパリンをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
細胞分化を促進する方法であって、
ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、および細胞接着ペプチドを包含する)を製造すること；
細胞をヒドロゲル組成物に接触させること；および
細胞を培養すること；を含む方法。
【請求項１４】
ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールが、8-アーム,20 kDaのノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコールを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ヒドロゲル組成物が、約1.8 kPa〜約33 kPaのせん断弾性率を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号：2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号：31)、環状RGD(配列番号：35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号：29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号：30)から選ばれる少なくとも0.25 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、ヒト胚性幹細胞およびヒト誘導多能性幹細胞から選ばれるヒト多能性幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ヒドロゲル組成物が、CRGDS(配列番号：2)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号：31)、環状RGD(配列番号：35)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号：29)、およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号：30)から選ばれる少なくとも0.25 mMの細胞接着ペプチドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒドロゲル組成物が、約3 kPa〜約16 kPaのせん断弾性率を有する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表を提出するための支持的記載
配列表の紙コピーおよびサイズが11,615バイト(MICROSOFT WINDOWS(登録商標)EXPLORER内で測定)である「P150263US01_ST25.txt」と称するファイルを含む配列表のコンピューターに読み込み可能な形式は、本明細書において提供され、参照することによって本明細書に援用される。配列表は、配列番号：1-48からなる。
関連出願の相互参照
本出願は、2014年4月10日出願の米国仮出願第61/978,032号に対する優先権を主張する。上記出願の開示の全体を参照することにより本出願に含める。
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、本発明は、米国政府の支援を受け、国立衛生研究所によって与えられた契約番号HL093282のもとで行われた。米国政府は本発明に関して権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、一般に、生体材料組成物の製造方法および生体材料組成物の使用方法に関する。さらに詳しくは、本開示は、ヒドロゲル組成物およびヒドロゲル組成物を使用して、細胞伸長(cell 伸長)および細胞分化を促進する方法に関する。
【０００３】
大部分の組織のタイプの発達は、成熟した組織特異的な細胞型への制御された前駆細胞の分化をもたらす複数の信号の複雑な相互作用を含む。たとえば、間葉系幹細胞（MSC）は、さまざまな増殖因子に曝露されることによって、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、神経細胞および内皮細胞にインビトロで分化することができる。慣例の細胞伸長および分化のプロトコルは、高濃度の高価な組換え増殖因子に依存する。実質的進歩は、規定培地の開発において行なわれているが、近年、細胞生長における基質および細胞-基質接着の役割が研究されている。
【０００４】
現在、組織培養ポリスチレン(TCPS)は、特に、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)のためのインビトロ細胞培養中の細胞伸長および分化のための「ゴールドスタンダード」である；しかしながら、TCPSは、使用者が基質剛性および増殖因子調節をコントロールするのを許可しない。剛性は、細胞増殖、系統仕様(lineage specification)、拘束および成熟をコントロールすることにおいて重要であることが実証されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、培養物中での細胞の生存および増殖をサポートする生体材料組成物を製造し、特に、細胞伸長、細胞分化を促進し、細胞挙動を調節する特定の分子を提供する方法に対する必要性が存在する。生体材料組成物が、生体材料基質剛性および増殖因子シグナル伝達の両方を制御することを可能にするならば、さらに有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の簡単な記載
本開示は、一般に、生体材料組成物および生体材料組成物の使用方法に関する。さらに詳しくは、本開示は、ヒドロゲル組成物ならびにヒドロゲル組成物を用いて細胞伸長および細胞分化を促進する方法に関する。
【０００７】
本開示にしたがって、培養物中での細胞の生存および増殖をサポートするヒドロゲル組成物の製造方法が見い出されている。本開示のヒドロゲル組成物は、二次元(2D)および三次元(3D)細胞培養のために用いることもできる。本開示のヒドロゲル組成物は、さらに、たとえば、可溶性因子結合剤を用いる細胞表面への生体分子の富化などの、生体分子の二次元および三次元富化のために用いることもできる。本開示のヒドロゲル組成物は、さらに、ヒドロゲル基質剛性および増殖因子シグナル伝達の両方にわたる設計コントロールを提供し、従来のマトリゲル(MATRIGEL(登録商標))によって提供されるものと一致する表現型での接着および増殖因子調節を可能にする。
【０００８】
1つの態様において、本開示は、細胞伸長を促進する方法に関する。方法は、ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、および細胞接着ペプチドを包含する)を製造すること；細胞をヒドロゲル組成物に接触させること；および細胞を培養すること；を含む。
【０００９】
もう1つの態様において、本開示は、細胞分化を促進する方法に関する。方法は、ヒドロゲル組成物(ここで、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール、架橋ペプチド、および細胞接着ペプチドを包含する)を製造すること；細胞をヒドロゲル組成物に接触させること；および細胞を培養すること；を含む。
【００１０】
後述の詳細な記載を考慮することにより、本開示はより十分に理解され、かつ上記以外の特徴、態様および利点が明らかとなるであろう。このような詳細な記載は、以下の図面に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−１Ｂ】を製造するためのステップ本開示のヒドロゲルアレイを製造するためのステップの模式図である。
【図２Ａ】本開示のヒドロゲルアレイの製造方法で用いられる金属コーティングされた基質の模式図である。
【図２Ｂ】図2Aに示す金属コーティングされた基質をパターニングするためのステップ中の金属コーティングされた基質の端面図である。
【図３】本開示の方法を用いて製造された64個の個々のヒドロゲルスポットを有するヒドロゲルアレイの写真である。
【図４】原子間力顕微鏡法によって決定されたヒドロゲルアレイの表面粗さを描くグラフである。
【図５】異なる形状の個々のヒドロゲルスポットを示す高倍率の上面画像である。
【図６】異なる高さを有する個々のヒドロゲルスポットを示す側面画像である。
【図７】実施例2で検討される、蛍光タグ付きペプチドの密度を増加させること、およびカプセル化された蛍光マイクロスフェアの密度を増加させることによる、個々のヒドロゲルスポットのパターニングを示すヒドロゲルアレイである。
【図８】本開示の方法を用いるヒドロゲル前駆体溶液中のPEG-NB(w/w%)の総濃度を変化させることによる、ヒドロゲルアレイの個々のヒドロゲルスポットの圧縮率の制御を描くグラフである。
【図９】本開示の方法を用いて、ヒドロゲルアレイを製造し、さらに、マイクロウェルアドオン(add-on)とともにヒドロゲルアレイを組み立てるためのステップを描く模式図である。
【図１０Ａ−１０Ｃ】実施例2で検討される、4重量%(図10A)、6重量%(図10B)および8重量%(図10C)のポリエチレングリコールを用い、線形RGDペプチドを提供して製造された、ヒドロゲルアレイ上で培養されたhMSCの写真である。スケール・バー＝100 μm。
【図１１Ａ−１１Ｃ】実施例2で検討される、4重量%(図11A)、6重量%(図11B)および8重量%(図11C)のポリエチレングリコールを用い、ペプチドアイデンティティを変化させて製造された、ヒドロゲルアレイ上で培養されたhMSCの写真である。スケール・バー＝100 μm。
【図１２−１４】実施例3で分析される、hMSC細胞接着、拡散および増殖を示す。
【図１５−１６】実施例4で分析される、hESC細胞拡散および増殖率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、さまざまな修正および代替形態が可能であるが、その特定の実施態様は、図面において例示を目的として示されるものであり、本明細書で詳細に説明される。しかしながら、特定の実施態様の記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲に入るすべての変更、等価物および代替物をカバーする本開示を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【００１３】
本開示の詳細な記載
他に特記しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、本開示が属する当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。本命最初に記載の方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料は、以下に記載される。
【００１４】
本開示にしたがって、細胞伸長および分化を促進する生体材料組成物の製造方法が見い出されている。さらに詳しくは、本開示は、ヒドロゲル組成物に関する。1つの態様において、ヒドロゲル組成物は、個別に制御されたヒドロゲルスポット弾性率、ヒドロゲルスポットポリマー密度、ヒドロゲルスポットリガンドアイデンティティおよびヒドロゲルスポットリガンド密度を有するヒドロゲルアレイとして製造されうる。本開示は、ヒドロゲルアレイの製造方法に関する。もう1つの態様において、ヒドロゲル組成物を、細胞培養プレートの表面上で使用するためなどのコーティングとして製造することができる。さらにもう1つの態様において、ヒドロゲル組成物を、懸濁培養におけるマイクロキャリアとして製造することができる。本開示のヒドロゲル組成物は、生体分子で機能化することができ、細胞培養に適合し、生体適合性がある。本開示のヒドロゲル組成物を、細胞機能、特に、細胞伸長、成熟および分化を変更する(たとえば、増強する、抑制する、および変化させる)、ために用いることができる。
【００１５】
当業者に公知のように、ヒドロゲル組成物は、ポリマー材料および水が平衡状態にある親水性のポリマー鎖のネットワークである。ヒドロゲル組成物は、非重合の出発物質を用いて形成される。ポリマー材料は、たとえば、天然ポリマー材料、合成ポリマー材料およびその組合せでありうる。
【００１６】
有利なことに、本開示のヒドロゲル組成物の製造方法は、合成中にアミノ酸配列にシステインを含むことにより、重合中にヒドロゲルネットワークにペプチドを直接組み込むことを可能にし、合成後修飾の必要性を排除することを可能にする。この方法では、ペプチを、両端にシステインを含むことによって架橋剤として用いるか、またはペンダント基として組み込むことができ、ポリマー主鎖に予めカップリングさせ、さまざまな組合せで混合するか、または簡単にするために重合中に組み込むことができる。
【００１７】
ヒドロゲル組成物およびヒドロゲル組成物の製造方法
本開示は、ヒドロゲル組成物の製造方法および得られる組成物の使用に関する。ヒドロゲルアレイを製造するために用いられる場合、製造方法は、一般に、基質にヒドロゲル前駆体溶液を接触させること(ここで、基質は疎水性領域と親水性領域を含む)；ヒドロゲル前駆体溶液が基質と表面修飾基質との間に位置するように、表面修飾基質をヒドロゲル前駆体溶液上に置くこと；ヒドロゲル前駆体溶液を重合させること；および基質から表面修飾基質を分離して、ヒドロゲルアレイを得ること；を含む(図1A-1B参照)。このように、ポリマーヒドロゲル前駆体溶液を基質と表面修飾基質との間で重合させ、得られるヒドロゲルを表面修飾基質がヒドロゲルアレイを含むように表面修飾基質とともに移す。1つの実施態様において、以下に詳述するように、ヒドロゲルを含まないバックグラウンドによって囲まれるヒドロゲルスポットのアレイを含むように、ヒドロゲルアレイをパターニングすることができる。もう1つの実施態様において、以下に詳述するように、ヒドロゲルバックグラウンド内にヒドロゲルを含まないスポット(またはプール)のアレイが形成されるように、ヒドロゲルアレイをパターニングすることができる。
【００１８】
ヒドロゲルスポットを有するヒドロゲルアレイにおいては、各ヒドロゲルスポットの表面形状を定義してアレイの各ヒドロゲルスポットの含量を限定するため、ならびに、近隣のスポットとの関連におけるアレイ内の各ヒドロゲルスポットの空間パターンを定義するための、差動湿潤(differential wettability)が得られるように、得られるヒドロゲルアレイをパターニングすることができる。これは、一般的マルチウェルプレートのサイズおよび寸法(たとえば、96ウェルプレート、384ウェルプレートなど)に適合する、さまざまなサイズおよび寸法の一般的なマイクロアレイアドオンとともに用いるためのヒドロゲルアレイを製造するために特に有用である。これは、強化スループット細胞培養、培地交換などのためのマルチチャンネルピペットでの使用にも有用である。アレイの個々のヒドロゲルスポットは、所望の形状を有することができる(たとえば、図5を参照)。たとえば、形状は、円形(circular)、円形(round)、楕円形、四つ葉、長方形、三角形、星形、菱形、その組合せなどでありうる。ヒドロゲルスポットのパターンは、列、渦巻き、円、正方形、長方形、その組合せなどに作られてもよい。個々のヒドロゲルスポットの形状は、パターニングされる基質のパターニング中のエッチングのために用いられるステンシルのパターンを変えることによって変えることができる。
【００１９】
ヒドロゲルを含まないスポットを有するヒドロゲルアレイにおいては、個々のヒドロゲルを含まないスポットは、所望の形状を有することができる(たとえば、図5を参照)。たとえば、形状は、円形(circular)、円形(round)、楕円形、四つ葉、長方形、三角形、星形、菱形、その組合せなどでありうる。ヒドロゲルを含まないスポットのパターンは、列、渦巻き、円、正方形、長方形、その組合せなどに作られてもよい。個々のヒドロゲルを含まないスポットの形状は、パターニングされる基質のパターニング中のエッチングのために用いられるステンシルのパターンを変えることによって変えることができる。
【００２０】
ヒドロゲルアレイのサイズの上限は、パターニングされた基質の寸法および／または表面修飾基質の寸法に応じて変化する。得られるヒドロゲルアレイをパターニングして、所望のサイズを有すうる個々のヒドロゲルスポットおよびヒドロゲルを含まないスポットを得ることもできる。個々のヒドロゲルスポットおよびヒドロゲルを含まないスポットのサイズおよび形状は、パターニングされる基質のパターニング中のエッチングのために用いられるステンシルのパターンを変えることによって変えることができる。ヒドロゲルアレイの適当な個々のヒドロゲルスポットサイズは、単一の細胞を適応させるのに十分小さくありうるが、たとえば、多くの細胞を適応させるのに十分大きくもありうる。このように、ヒドロゲルアレイの個々のヒドロゲルスポットサイズは、任意の所望の直径でありうる。ヒドロゲルアレイの特に適当な個々のヒドロゲルスポットサイズは、約10 μmおよびそれ以上でありうる。
【００２１】
2014年7月24日出願の米国特許出願第14/339,938号(参照することによって本明細書に援用される)などに記載の自己組織化単分子膜(SAM)によって形成される疎水性領域および親水性領域を作成することによって、パターニングされた基質を製造することができる。自己組織化単分子膜を形成するための適当な基質は、当業者に公知であり、たとえば、Love et al.、Chem. Rev. 2005、105:1103-1169(参照することによって本明細書に援用される)に記載のような、金属コーティングされた基質、シリコン基質、ダイアモンド基質、ポリジメチルシロキサン(PDMS)基質などでありうる。たとえば、基質を過フッ素化アルカンチオール溶液に浸漬して、過フッ素化アルカンチオール自己組織化単分子膜(フッ素SAM)が形成されうるようにすることにより、基質上に差動湿潤を伴う領域を形成することによって、パターニングされた基質を製造することができる。親水性領域を形成するために、フッ素SAM金属コーティングされた基質領域をプラズマエッチングから保護するために、フッ素SAM金属コーティングされた基質上にステンシルを置くことができる。次いで、フッ素SAM基質の露出領域を、酸素プラズマ処理によってエッチングして、基質中にエッチングされたフッ素SAMを形成することができる。次いで、基質を水酸基末端アルカンチオール溶液に浸漬して、基質のエッチングされた領域中に、親水性アルカンチオールSAM(EG3SAM)を形成する。得られるパターニングされた基質は、疎水性SAMおよび親水性SAMに基づく差動湿潤を有する。
【００２２】
方法は、さらに、パターニングされた基質と表面修飾基質との間にスペーサーを置くことを包含する。方法の実行中にパターニングされた基質上に置かれたスペーサーは、ヒドロゲルアレイを形成するヒドロゲルの高さ(または厚さ)を定義するように機能する。より高い(すなわち、より厚い)ヒドロゲルアレイを製造する場合に、スペーサーは特に望ましい。このように、ヒドロゲルアレイは、任意の所望の高さを有することができる(たとえば、図6を参照)。しかしながら、ヒドロゲルアレイの適当な高さは、約20マイクロメーター(μm)〜約1ミリメーターであり、ヒドロゲルアレイは、必要に応じて、より高くされうる。スペーサーは、ヒドロゲルの形成中の、パターニングされた基質および表面修飾基質の表面間の直接接触を予防するようにも機能する。本発明方法に用いるスペーサーは、当業者に公知の任意の適当な材料でありうる。特に適当なスペーサーは、たとえば、ポリジメチルシロキサン(PDMS)である。ヒドロゲルアレイの高さは、たとえば、ヒドロゲルの頂点から基質に到るまで焦点を合わせるための顕微鏡を用い、基質からヒドロゲルの頂点に至るまで焦点を合わせるための顕微鏡を用い、そして、原子間力顕微鏡法によって決定されるヒドロゲルアレイの表面粗さを測定することによって決定されうる(たとえば、図4を参照)。
【００２３】
製造方法はさらに、パターニングされた基質に、ヒドロゲル前駆体溶液を接触させることを包含する。さらに詳しくは、パターニングされた基質の親水性領域に、ヒドロゲル前駆体溶液を接触させる。パターニングされた基質の疎水性領域は、隣接する親水性領の間のバリヤーとして働き、各親水性領域の単離を可能にする。ヒドロゲル前駆体溶液は、たとえば、ポリマーと多官能性ポリマー架橋剤の組合せでありうる。
【００２４】
ヒドロゲルコーティング組成物として用いられる場合、製造方法は、一般に、コーティングされるべき基質(たとえば、細胞培養プレートの表面)に、ヒドロゲル前駆体溶液を接触させることを包含する。
【００２５】
ヒドロゲル前駆体溶液における使用のための適当なポリマーは、当業者には公知であり、たとえば、ポリ(エチレングリコール)、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル(MATRIGEL(登録商標))、ジチオールポリマー(たとえば、アクリルアミド）、クリックベースの複合ヒドロゲル(Polizzotti et al. Biomacromolecules 2008、9:1084-1087(参照することによって本明細書に援用される)で論じられたもの)、ポリ(エチレングリコール)−ジアクリレート、ポリ(エチレングリコール)ビニルスルホンなどが挙げられる。特に適当なポリマーは、たとえば、ポリ(エチレングリコール)でありうる。特に適当なポリマーは、たとえば、機能性ポリマーでありうる。ポリマーの機能化は、たとえば、1H核磁気共鳴分光学、質量分析、エルマン試薬、紫外可視分光法、赤外分光法およびその他の当業者に既知の方法で確認されうる。
【００２６】
特に適当な機能性ポリマーは、たとえば、ノルボルネンで官能化されている末端ヒドロキシル(-OH)基を有する8-アームポリ(エチレングリコール)(JenKem Technology USA、テキサス州、アレンから市販されている)でありうる。Fairbanks et al.(Adv. Mater. 2009、21:5005-5010)に記載のように、8-アームポリ(エチレングリコール)は、ノルボルネンで官能化されうる。
【００２７】
他の特に適当なポリマーは、クリックケミストリーを用いて機能化されてもよいポリ(エチレングリコール)である。「クリック」ケミストリーは、化学的に生体分子を結合させるための非常に多彩な方法であり、アルキンとアジド官能基間の[3+2]型の付加環化を述べるために用いられる。アジドとアルキンは、生体分子および水性環境に対して非常に不活性であり、フイスゲン1,3-双極性付加環化を用いて、酸化または還元することが非常に困難である安定なトリアゾールを得ることを可能にする。銅(I)触媒および銅を含まないひずみアルキン変異体反応は両者とも、穏やかで、非常に効率的である。これらの反応は、少量の水溶液中で行うこともでき、酸素および水に対して非感受性であり、ペプチド上の官能基に対して強固である。クリックケミストリーは、たとえば、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質などの生体サンプル中の抱合反応における選択性を可能にする。クリックケミストリーに特に適した試薬は、Laysan Bio Inc.(アラバマ州、アラブ)から市販されている。
【００２８】
一般に、ヒドロゲル前駆体溶液は、200 mg/mL以下、たとえば、約36 mg/mL〜約160 mg/mL、およびたとえば、約36 mg/mL〜約70 mg/mLのポリマーの濃度を含有する。
【００２９】
ヒドロゲル前駆体溶液中にて用いるための適当な多官能性ポリマー架橋剤は、当業者には公知である。特に、多官能性架橋剤は、たとえば、二官能性ポリマー架橋剤および多官能性ポリマー架橋剤(n＞=2)であり、末端は、ヒドロゲル前駆体溶液のポリマーとの共有結合を形成しうる官能基でありうる。特に、適当な二官能性ポリマー架橋剤および多官能性ポリマー架橋剤は、たとえば、ポリエチレングリコールジチオール(PEG-DT)、プロテアーゼ分解性架橋剤およびチオール末端マルチアームポリ(エチレングリコール)(たとえば、チオール末端4-アームPEG)でありうる。適当なプロテアーゼ分解性架橋剤は、たとえば、Nagase and Fields(Biopolymers 1996、40:399-416；参照することによって本明細書に援用される)に記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)分解性架橋剤でありうる。さらに詳しくは、ヒドロゲル前駆体溶液中にて用いるための適当なMMP分解性架橋ペプチドとして、KCGGPQGIWGQGCK(配列番号：27)およびKCGGPQGIAGQGCK(配列番号：28)が挙げられる。
【００３０】
ヒドロゲル前駆体溶液は、さらに、開始剤を含むことができる。当業者には公知であるように、ヒドロゲル重合は、開始剤の不在下でも起こりうる。しかしながら、開始剤は、重合を誘発し、および／または、重合速度を低下させる。適当な開始剤は、当業者に公知であり、たとえば、化学開始剤および光開始剤でありうる。特に適当な光開始剤は、たとえば、IRGACURE 2959 光開始剤(Ciba/BASF、ドイツ、ルートウィヒスハーフェンから市販されている)であり得、ヒドロゲルを形成するためのエオシンY重合は、温度変化によっても行われうる。
【００３１】
もう1つの態様において、ヒドロゲル前駆体溶液は、細胞接着ペプチドを含みうる。本明細書で用いる「細胞接着ペプチド」は、細胞が受容体−リガンド相互作用を介して結合する接着タンパク質から得られるアミノ酸配列を意味する。溶液中の細胞接着ペプチドおよびその濃度を変化させることは、得られるヒドロゲル組成物への細胞接着の安定性を制御する能力を可能にする。適当な細胞接着ペプチドとして、たとえば、RGD、RGDS(配列番号：1)、CRGDS(配列番号：2)、CRGDSP(配列番号：3)、PHSRN(配列番号：4)、GWGGRGDSP(配列番号：5)、SIDQVEPYSSTAQ(配列番号：6)、GRNIAEIIKDI(配列番号：7)、DITYVRLKF(配列番号：8)、DITVTLNRL(配列番号：9)、GRYVVLPR(配列番号：10)、GNRWHSIYITRFG(配列番号：11)、GASIKVAVSADR(配列番号：12)、GTTVKYIFR(配列番号：13)、GSIKIRGTYS(配列番号：14)、GSINNNR(配列番号：15)、SDPGYIGSR(配列番号：16)、YIGSR(配列番号：17)、GTPGPQGIAGQGVV(配列番号：18)、GTPGPQGIAGQRVV(配列番号：19)、MNYYSNS(配列番号：20)、KKQRFRHRNRKG(配列番号：21)、CRGDGGGGGGGGGGGGGPHSRN(配列番号：29)、CPHSRNSGSGSGSGSGRGD(配列番号：30)、アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号：31)、CRDGS(配列番号：32)、環状RGD[Fd]C(配列番号：33)、RKRLQVQLSIRT(配列番号：37)、IKVAV(配列番号：38)、YIGSR(配列番号：39)、KRTGQYKL(配列番号：40)、TYRSRKY(配列番号：41)、KRTGQYKLGSKTGPGQK(配列番号：42)、QAKHKQRKRLKSSC(配列番号：43)、SPKHHSQRARKKKNKNC(配列番号：44)、XBBXBX(ここで、B＝塩基性残基であり、X＝疎水性親水性残基である)(配列番号：45)、XBBBXXBX(ここで、B＝塩基性残基であり、X＝疎水性親水性残基である)(配列番号：46)、およびRGDSP(配列番号：47)が挙げられる。
【００３２】
ヒドロゲル前駆体溶液中の細胞接着ペプチドの濃度は、用いられる特定の細胞接着ペプチドならびにヒドロゲル前駆体溶液中のその他の成分に応じて変わる。しかしながら、典型的には、ヒドロゲル前駆体溶液は、約0.25 mM〜約2 mMの細胞接着ペプチドなどの約0.125 mM〜約4 mMの細胞接着ペプチドを含む。1つの適当な実施態様において、細胞接着ペプチドは、CRGDS(配列番号：2)であり、ヒドロゲル前駆体溶液は、約0.25 mM〜約4 mMのCRGDS(配列番号：2)を含む。もう1つの適当な実施態様において、細胞接着ペプチドは、環状RGDであり、ヒドロゲル前駆体溶液は、約0.125 mM〜約2 mMの環状RGD、特に、環状RGD[Fd]C(配列番号：33)を含む。
【００３３】
もう1つの態様において、ヒドロゲル前駆体溶液は、可溶性因子結合剤を含みうる。1つの態様においては、細胞培養培地に含まれる可溶性因子を結合するためのペプチドが、ヒドロゲル前駆体溶液に含まれる。ヒドロゲル組成物中の可溶性因子結合剤の密度(濃度)は、ヒドロゲル前駆体溶液中の可溶性因子結合剤の濃度を変えることによって制御されうる。特に適当な可溶性因子結合剤の例を下記第1表において提供する。
【００３４】
第1表：ヒドロゲル組成物のための可溶性因子結合剤ペプチド配列
【表１】
2017513474.tif 000002
【００３５】
ヒドロゲル前駆体溶液中の可溶性因子結合剤の濃度は、用いられる特定の可溶性因子結合剤ならびにヒドロゲル前駆体溶液中のその他の成分に応じて変わる。
【００３６】
もう1つの態様において、ヒドロゲル前駆体溶液は、さらに、細胞を包含する。適当な細胞は、当業者に公知であり、たとえば、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の神経細胞、胚性幹細胞由来の神経前駆細胞、胚性幹細胞由来の星状膠細胞、胚性幹細胞由来の小膠細胞、胚性幹細胞由来の内皮細胞、胚性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、誘導多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞由来の神経前駆細胞、誘導多能性幹細胞由来の星状膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の小膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞、間葉系幹細胞、臍帯静脈内皮細胞、NIH3T3線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、線維肉腫細胞、弁間質細胞、心筋細胞、誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞、内皮前駆細胞、循環脈管形成細胞、神経細胞、周皮細胞、癌細胞、肝細胞、膵臓β細胞、膵島細胞、およびその組合せなどが挙げられる。
【００３７】
もう1つの態様において、ヒドロゲル前駆体溶液は、マイクロスフェア担体(すなわち、マイクロ担体)を含みうる。マイクロスフェア担体は、たとえば、細胞、生体分子、染料および当業者に公知のその他の分子などの分子を含みうる。マイクロスフェアは、溶解または分解してマイクロスフェアの内容物を放出する分解性マイクロスフェアでありうる。
【００３８】
調製後、基質(たとえば、パターニングされた表面修飾基質、細胞培養プレートの表面など)に、ヒドロゲル前駆体溶液を接触させる。
【００３９】
パターニングされた表面修飾基質上で用いられる場合、表面修飾基質は、たとえば、雲母、ガラス、シリコン、ダイヤモンドおよび金属酸化物表面でありうる。表面修飾基質は、たとえば、シラン単層を有するガラスカバースリップなどの表面を官能化することによって製造されうる。特に適当な表面修飾基質は、たとえば、ガラススライドでありうる。基質を官能化するための特に適当な方法は、たとえば、シラン処理でありうる。基質は、酸素プラズマ処理中に表面の両側を活性化することによって表面修飾されうる。酸素プラズマ処理は、基質の表面上の活性化ヒドロキシル基の数を増加させうる。当業者には公知のように、シラン単層は、たとえば、トルエンなどの無水有機溶媒に溶解されるアルコキシシランで製造されうる。他の適当なアルコキシシランは、たとえば、アミノシラン、グリシドキシシランおよびメルカプトシランでありうる。特に適当なアミノシランは、たとえば、(3-アミノプロピル)-トリエトキシシラン、(3-アミノプロピル)-ジエトキシ-メチルシラン、(3-アミノプロピル)ジメチルエトキシシランおよび(3-アミノプロピル)-トリメトキシシランでありうる。特に適当なグリシドキシシランは、たとえば、(3-グリシドキシプロピル)ジメチル-エトキシシランでありうる。特に適当なメルカプトシランは、たとえば、(3-メルカプトプロピル)-トリメトキシシランおよび(3-メルカプトプロピル)-メチル-ジメトキシシランでありうる。他の適当なシランは、市販されている(Sigma Aldrich、ミズーリ州、セントルイス)。表面修飾シラン基質の製造は、本明細書に記載のとおり、クリックケミストリーに参加しうる末端官能基を有する任意のシランを用いて行なわれうる。たとえば、メルカプトシランは、PEG-ノルボルネンのノルボルネンと反応しうる末端チオールを含む。他の適当な官能性表面修飾シラン基質は、たとえば、アクリレートおよびメタクリレートでありうる。基質の表面修飾に続いて、表面修飾基質上に、非接着自己組織化単分子膜が形成される。
【００４０】
ヒドロゲル前駆体溶液に基質を接触させた後、方法は、重合ヒドロゲルが基質に接着する(すなわち、結合する)ようにヒドロゲル前駆体溶液を重合することを含む。
【００４１】
1つの実施態様において、方法は、実質的にヒドロゲルを含まないか、または完全に含まない(「ヒドロゲルを含まない」)バックグラウンドによって囲まれるヒドロゲルの「スポット」または「島」(本明細書において、「ヒドロゲルスポット」と称する)を有するアレイを形成するために用いられうる。この実施態様において、ヒドロゲルを含まないバックグラウンドは、パターニングされた基質の疎水性領域に対応し、ヒドロゲルスポットは、パターニングされた基質の親水性領域に対応する。図1に関して、本実施態様では、円形は、ヒドロゲルを含まない領域によって囲まれるヒドロゲルスポットを表す。
【００４２】
もう1つの実施態様において、方法は、ヒドロゲルのバックグラウンド(本明細書において、「ヒドロゲルバックグラウンド」と称する)によって囲まれたヒドロゲルを含まないプールを有するアレイを形成するために用いられうる。図1に関して、本実施態様では、円形は、ヒドロゲルを含まないバックグラウンドによって囲まれるヒドロゲルを含まないプールを表す。
【００４３】
もう1つの態様において、本開示は、可変弾性率、可変せん断弾性率、可変リガンドアイデンティティ、可変リガンド密度およびその組合せを有するヒドロゲルスポットを含むヒドロゲル組成物に関する。可変弾性率、可変せん断弾性率、可変リガンドアイデンティティ、可変リガンド密度およびその組合せを有するヒドロゲル組成物は、上述の本発明方法にしたがって製造されうる。
【００４４】
適当なリガンドは、当業者に公知であり、たとえば、任意のシステインを含む、および/または、チオールで官能化された生体分子でありうる。リガンドのチオール官能化は、市販のキット(たとえば、トラウト試薬(2-イミノチオラン・HCl)、Thermo Fischer Scientific、イリノイ州、ロックフォード)を用いて行われうる。適当なリガンドは、たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖類、脂質、生体機能模倣材料およびその他の分子、ならびにその組合せでありうる。特に適当なタンパク質は、たとえば、接着タンパク質でありうる。特に適当な接着タンパク質は、たとえば、フィブロネクチン、カドヘリンおよびその組合せでありうる。特に適当なペプチドは、たとえば、上述の細胞接着ペプチドおよび／または可溶性因子結合剤でありうる。
【００４５】
本開示のヒドロゲル組成物が、細胞と結合または相互作用して、細胞接着、拡散、移動、成熟、増殖、分化および細胞構造(たとえば、細管など)の形成に影響を及ぼすと思われる細胞接着ペプチドおよび可溶性因子結合剤の組合せを含むのが適当である。
【００４６】
ヒドロゲル組成物は、さらに、可変弾性率を含んでもよい。ヒドロゲル組成物は、広範な剛性(本明細書において基質弾性率と称する)を有しうる。たとえば、異なる弾性率を有するヒドロゲルは、ヒドロゲル前駆体溶液中のポリマーの濃度を変化させること、および／または、多官能性ポリマー(たとえば、チオール-ポリエチレングリコール-チオール(SH-PEG-SH))：ポリマー比の理論混合比を変化させることによって製造されうる(たとえば、図8参照)。適当な比は、約1:1〜約4:1(モル比)でありうる。
【００４７】
もう1つの態様において、パターニングされたヒドロゲルアレイは、さらに、それによってパターニングされたヒドロゲルアレイが、任意のサイズのアドオンを適合させるための寸法で製造される、マイクロアレイアドオンとともに組み立てられうる。適当なマイクロアレイアドオンは、市販されている(Grace Bio Labs、オレゴン州、ベンド)。マイクロアレイアドオンは、可溶性因子のプレゼンテーションが制御されうるように、ヒドロゲルアレイの個々のヒドロゲルスポットおよびヒドロゲルを含まないプールを単離することを可能にする。マイクロアレイアドオンは、各ヒドロゲルスポットおよびヒドロゲルを含まないプールが、可溶性因子プレゼンテーションで独立して調べられうるように、ヒドロゲルアレイの個々のヒドロゲルスポットおよびヒドロゲルを含まないプールとの数と同じ数の開口を含みうる。あるいは、マイクロアレイアドオンは、1つ以上の個々のヒドロゲルスポットおよび1つ以上の個々のヒドロゲルを含まないプールを適合させうる、より大きい開口を有しうる。たとえば、は、単一のヒドロゲルスポットまたは単一のヒドロゲルを含まないプールを適合させるのに十分に大きい開口を有しうる。
【００４８】
ヒドロゲル組成物の使用方法
【００４９】
もう1つの態様において、本開示は、細胞伸長、成熟および細胞分化を促進するためのヒドロゲル組成物の使用方法に関する。一般に、方法は、ヒドロゲル組成物を製造すること；細胞をヒドロゲル組成物に接触させること；および細胞を培養することを包含する。ヒドロゲル組成物は、上述のように製造され、典型的には、より十分に上述したように、ポリマー（たとえば、ノルボルネンで官能化されたポリエチレングリコール）、多官能性ポリマー架橋剤（たとえば、MMP分解性架橋ペプチド、非分解性PEG-ジチオール架橋剤）および細胞接着ペプチドを包含する。
【００５０】
方法は、さらに、ヒドロゲル組成物に、細胞を接触させることを含む。本明細書で用いる「細胞を接触させる」は、細胞を培養することを目的として、細胞を播種することを意味する。当業者には公知のように、細胞懸濁液を基質に移し、細胞が基質に接着するのに十分な時間を付与するのが一般的である。
【００５１】
もう1つの実施態様において、細胞は、ポリマー、架橋剤、細胞接着ペプチドおよび細胞を含むヒドロゲル前駆体溶液を用いて、ヒドロゲル組成物のヒドロゲルに組み込まれうる。
【００５２】
次いで、細胞は、たとえば、約1時間〜約30日間などの所望の期間培養される。所望の期間の後、細胞は、たとえば、免疫蛍光顕微鏡法、位相差顕微鏡法、光学顕微鏡法、電子顕微鏡法およびその組合せなどの顕微鏡法によって分析されうる。細胞は、細胞接着、細胞拡散、細胞形態、細胞増殖、細胞移動、細胞伸長、細胞分化、タンパク質発現、細胞-細胞接触形成、出芽、細管形成、構造の形成およびその組合せについて分析されうる。
【００５３】
適当な細胞は、当業者に公知の任意の細胞でありうる。特に適当な細胞は、たとえば、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の神経細胞、胚性幹細胞由来の神経前駆細胞、胚性幹細胞由来の星状膠細胞、胚性幹細胞由来の小膠細胞、胚性幹細胞由来の内皮細胞、胚性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、誘導多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞由来の神経前駆細胞、誘導多能性幹細胞由来の星状膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の小膠細胞、誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来の網膜色素上皮細胞、間葉系幹細胞、臍帯静脈内皮細胞、NIH 3T3線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、線維肉腫細胞、弁間質細胞、心筋細胞、誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞、内皮前駆細胞、循環脈管形成細胞、神経細胞、周皮細胞、癌細胞、肝細胞、膵臓β細胞、膵島細胞およびその組合せを包含しうる。
【００５４】
1つの特定の態様において、細胞は、循環血管新生細胞(CAC)である。CACは、治癒中の新たな血管の形成などの、血管生物学において多くの役割を果たす血管新生促進細胞集団である。CACは、末梢虚血および損傷または機能不全の内皮の修復などの、複数の心臓血管障害の治療のための有望なツールであるが、CACを採取することは、血流中でのそれらの希少性により困難であり、どの時点においても少数のCACしか単離することができない。補充されたCACの増殖を促すヒドロゲル前駆体溶液を用いて製造された本開示のヒドロゲル組成物中でCACを培養することによって、補充されたCACの初期数が少ないこと、およびCACの伸長が限定されるという上記問題に対処する。
【００５５】
1つの特定の態様において、CACとともに用いる場合、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化された8-アーム,20 kDaのポリ(エチレングリコール)(PEG)、MMP分解性架橋ペプチドおよび細胞接着ペプチドを包含する。特に適当な細胞接着ペプチドとして、CRGDS(配列番号：2)；アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号：31)；環状[RGD(Fd)C](配列番号：33)；CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号：29)；およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号：30)などの固定化RGD含有ペプチドが挙げられる。ヒドロゲル組成物が、少なくとも約1 mMの細胞接着ペプチド、たとえば、約1 mM〜約4 mMの細胞接着ペプチドを包含するのが適当である。さらに、ヒドロゲル組成物は、約20 mg/mL〜約100 mg/mLのPEG濃度を有してもよい。
【００５６】
いくつかの態様において、ヒドロゲル組成物は、少なくとも35%、たとえば少なくとも45%、たとえば約35%〜約75%、およびたとえば約45%〜約50%の架橋を有するするように製造される。
【００５７】
CACとともに用いるためのヒドロゲル組成物が、約1.8 kPa〜約12 kPa、たとえば約2 kPa〜約12 kPaの範囲のせん断弾性率を有するのが適当である。
【００５８】
もう1つの態様において、細胞は、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)である。PEG-ヒドロゲル組成物が、hMSC接着および伸長をサポートすることが見い出されている。さらに、これらのヒドロゲル組成物は、基質剛性、細胞接着および増殖因子調節に対する組み合わせによる調節を提供する。
【００５９】
1つの特定の態様において、hMSCとともに用いる場合、ヒドロゲル組成物は、ノルボルネンで官能化された8-アーム,20 kDaのポリ(エチレングリコール)(PEG)、MMP分解性架橋ペプチドおよび細胞接着ペプチドを包含する。特に適当な細胞接着ペプチドとして、CRGDS(配列番号：2)；アセチル化GCYGRGDSPG(配列番号：31)；環状[RGD(Fd)C](配列番号：33)；CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号：29)；およびCPHSRN-(SG)5-RGD(配列番号：30)などの固定化RGD含有ペプチドが挙げられる。ヒドロゲル組成物が、少なくとも約0.25 mMの細胞接着ペプチド、たとえば、約0.25 mM〜約4 mMの細胞接着ペプチド、およびたとえば約1 mM〜約4 mMの細胞接着ペプチドを包含するのが適当である。さらに、ヒドロゲル組成物は、約40 mg/mL〜約160 mg/mLのPEG濃度を有してもよい。
【００６０】
さらに、hMSCとともに用いるためのヒドロゲル組成物は、少なくとも1.8 kPaのせん断弾性率、たとえば約1.8 kPa〜約33 kPaのせん断弾性率、およびたとえば約1.8 kPa〜約10.9 kPaのせん断弾性率を有する。
【００６１】
もう1つの態様において、細胞は、たとえば、ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト誘導多能性幹細胞などのヒト多能性幹細胞(hPSC)を包含する。hMSCと同様に、PEG-ヒドロゲル組成物、特にノルボルネンで官能化された(PEG)、MMP分解性架橋ペプチドおよび細胞接着ペプチド(たとえば、環状[RGD(Fd)C](配列番号：33))を含むヒドロゲル組成物が、基質剛性コントロール、細胞接着コントロール、および増殖因子調節を提供し、それによってhPSC接着および伸長をサポートすることが見い出されている。ヒドロゲル組成物が、少なくとも約0.25 mMの細胞接着ペプチド、たとえば、約0.25 mM〜約4 mMの細胞接着ペプチド、およびたとえば約1 mM〜約4 mMの細胞接着ペプチドを包含するのが適当である。
【００６２】
さらに、hPSCとともに用いるためのヒドロゲル組成物は、少なくとも3 kPaのせん断弾性率、たとえば約3 kPa〜約16 kPaのせん断弾性率、およびたとえば約3 kPa〜約10 kPaのせん断弾性率を有する。
【００６３】
さらなる態様において、ヒドロゲル組成物は、さらに、固定化低分子量ヘパリンを包含する。存在する場合、ヒドロゲル組成物が、約0.1 mM〜約2 mMの量の低分子量ヘパリンを包含するのが適当である。
【００６４】
方法は、さらに、細胞を培養する培養培地中に可溶性分子を包含することによって、細胞を可溶性分子と接触させることを包含してもよい。特に適当な可溶性分子は、増殖因子およびプロテオグリカンでありうる。適当な増殖因子は、たとえば、形質転換増殖因子βスーパーファミリー、増殖因子の線維芽細胞増殖因子ファミリー、増殖因子の血小板由来増殖因子ファミリー、およびその組合せでありうる。特に適当な増殖因子は、たとえば、血管内皮増殖因子、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、およびその組み合わせでありうる。適当なプロテオグリカンは、たとえば、ヘパリンを有するプロテオグリカン、硫酸ヘパリン、および／またはコンドロイチングリコサミノグリカン側鎖である。
【００６５】
本開示は、以下の非限定的実施例を考慮することにより、より完全に理解されるであろう。
【００６６】
実施例
材料および方法
PEG-ノルボルネン合成
末端ヒドロキシル基(-OH)を有し、分子量20 kDaである8-アームポリ(エチレングリコール)(PEG)をJenKem Technology USA(テキサス州、アレン)から購入した。無水ピリジン、4-(ジメチルアミノ）ピリジン（DMAP）、5-ノルボルネン-2-カルボン酸、ジエチルエーテル、および0.03 % v/v テトラメチルシラン(TMS)を含む重水素化クロロホルム(CDCl3、99.8%)をSigma Aldrich(ミズーリ州、セントルイス)から購入した。N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、無水ジクロロメタン(DCM)をACROS Organics(ベルギー、ヘール)から購入した。3.5K分子量カットオフのスネークスキン(SNAKESKIN)透析チューブをThermo Fisher Scientific(マサチューセッツ州、ウォルサム)から購入した。
【００６７】
8-アームPEG-OHをでノルボルネン官能化して、生物活性リガンドの光重合および固定のためにチオール-エン化学を利用した(Fairbanks et al. Adv. Mater. 2009、21:5005-5010；Impellitteri et al. Biomaterials 2012、33:3475-84；Belair and Murphy Acta Biomater. 2013；およびGould et al. Acta Biomater 2012、8:3201-3209に記載)。官能化反応のPEG-ノルボルネン(PEG-NB)生成物を、中型のフリット付きブフナー漏斗を通してろ過し、反応中に形成された塩を除去した。ろ液を900 mL冷ジエチルエーテルおよび100 mLヘキサンで沈殿させた。固体を定性ろ紙で集め、一夜風乾した。残留ノルボルネン酸を除去するために、水で戻したスネークスキン透析チューブを用い、4℃にて72時間、4LのdH2Oに対して透析することによってPEG-NB生成物を精製し、次いで、凍結乾燥した。
【００６８】
1H核磁気共鳴分光法で、＞90%のノルボルネン官能化が確認された。TMS内部標準を含む CDCl3中、6 mg/mLにてサンプルを調製した。マディソン国立磁気共鳴施設によって提供される分光分析サービスを用いて、Bruker Instruments Avance III 500iで、400 MHzおよび27℃にて、自由誘導減衰(FID)スペクトルを得た。
【００６９】
ヒドロゲルアレイ形成
これらの実験に用いたヒドロゲルアレイは、シラン化ガラス基質に固定されたヒドロゲルスポットから構成された。ヒドロゲルスポットは、金の、異なる湿潤性をもつことにより、エラストマーステンシルによってパターンが定義される領域を有するようにパターニングされた表面を用いて形成された。ヒドロゲルアレイの製造方法を、以下にさらに記載する。
【００７０】
ガラスシラン化
ガラスカバースリップおよび塩酸(HCl)溶液をThermo Fisher Scientific(マサチューセッツ州、ウォルサム)から購入した。トルエン、メタノール、エタノール、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(3-MPTS)およびジチオスレイトール（DTT)をSigma Aldrich(ミズーリ州、セントルイス)から購入した。低圧プラズマシステムをDiener Electronic(ドイツ、エブハウゼン)から購入した。
【００７１】
3-MPTSでガラスカバースリップをシラン化して、PEG-NBとのチオール-エン反応に酸化することができ、次いで、PEG-NBヒドロゲルの共有固定化を可能にするチオール基を提供する基質を作成した(Seo et al. Colloids Surf B Biointerfaces 2012、98:1-6)。既述されたように、液相シラン化を行なった(Seo et al. Colloids Surf B Biointerfaces 2012、98:1-6；Halliwell et al. Anal Chem 2001、73:2476-2483；and Cras et al. Biosens Bioelectron 1999、14:683-688)。1:1のメタノール：HCl中で45分間、カバースリップを超音波処理して、大量汚染物質を除去した。シラン化の直前に、それぞれの側に5分間、40 sccmおよび50 Wにて酸素プラズマ処理することによって、カバースリップを反応させて、表面上の活性化ヒドロキシル基の数を増加させた。2.5% v/v 3-MPTSを含むコプリンジャー内に活性化されたカバースリップを4時間置いた。トルエン、1：1のエタノール/トルエン、およびエタノールで濯ぐことによって、カバースリップの表面から過剰のシランを除去し、N2ガスで乾燥した。シラン化カバースリップを気密室に置き、N2ガスでパージし、次いで、100℃にて1時間養生して、表面に結合したシランを架橋させ、それらの加水分解に対する感受性を低下させた。使用まで、N2ガスでパージされ、光から保護されたチャンバー内でシラン化カバースリップを保管した。使用前に、37℃にて30分間、PBS中の10 mM DTTでシラン化ガラスカバースリップを処理して、表面上に形成されたジスルフィドを減少させ、表面で利用可能な遊離チオールを増加させた(Vistas et al. Appl Surf Sci 2013、286:314-318)。
【００７２】
エラストマーステンシルの製作
シリコンウェハーをWRS Materials(カリフォルニア州、サンノゼ)から購入した。SU-8 100フォトレジストをMicroChem(マサチューセッツ州、ニュートン)から購入した。Sylgard 184シリコンエラストマーキットをDow Corning Corporation(ミシガン州、ミッドランド)から購入した。
【００７３】
既述されたように、ソフトリソグラフィーを用いて、ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーステンシルを製造した(Jo et al. J Microelectromechanical Syst 2000、9:76-81)。アドビイラストレーターを用いてステンシルのためのレイアウトおよび形状を描き、ImageSetter(ウィスコンシン州、マディソン)によって提供される高解像度の市販のレーザープリントサービスを用いて透明フィルム上に印刷した。従来のフォトリソグラフィー技術と組み合わせた光マスクとして透明フィルムを用いて、シリコンウェハー上にスピンコートしたSU-8ネガ型UVフォトレジストをもつマスターモールドを製造した。PDMSステンシルを製造するために、Sylgardエラストマーキットからの硬化剤およびPDMSプレポリマー溶液を、1:10 重量比で完全に混合し、マスターモールド上に広げ、80℃にて6時間硬化させた。硬化後、マスターモールドからステンシルをはがし、エタノールで簡単に洗浄し、N2ガスで乾燥した。
【００７４】
疎水性／親水性パターニング
金コートテストスライド(25 mm x 75 mm x 1 mmのガラス上の50 Åのチタン金属薄膜上に1,000 Åの金)をEvaporated Metal Films(ニューヨーク州、イサカ)から購入した。過フッ素化アルカンチオール(HS-(CH2)11-O-(CH2)2-(CF2)5-CF3)をProChimia Surfaces(ポーランド、ソポト)から購入した。既述されたように、ヒドロキシル末端アルカンチオール(HS-C11-(O-CH2-CH2)3-OH)を合成した(Prime and Whitesides J. Am. Chem. Soc. 1993、115:10714-10721)。
【００７５】
金コートスライドを、アルカンチオレートの疎水性および親水性自己組織化単分子膜(SAM)でパターニングして、差動湿潤を有する領域を形成した。差動湿潤パターニングは、2つの目的を同時に果たした：1)ヒドロゲルスポットの形状を定義した；および2)アレイ内の各ヒドロゲルスポットの含量を限定した。金コートスライドをエタノールに浸漬し、〜2分間超音波処理し、エタノールで濯ぎ、N2ガスで乾燥して、汚染物質および酸化金層を除去した。金コートスライドを、過フッ素化アルカンチオールの1 mMエタノール溶液に≧2時間浸漬して、フッ素化アルカンチオレートSAM(フッ素SAM)を形成させた。フッ素SAM形成後、フッ素SAM金コートスライドをエタノールで洗浄し、N2ガスで乾燥した。基質上の親水性領域を定義するために、PDMSステンシルをフッ素SAM金コートスライド上に置いて、プラズマエッチングからスライドの領域を選択的に保護した。PDMSステンシルのパターンによって、フッ素SAM金コートスライド上の露出領域の空間的および形状的パターニングが決定され、次いで、アレイが含みうるヒドロゲルスポットの形状および空間的パターニングが決定された。1分間、40 sccmおよび50 Wでの酸素プラズマ処理によって、フッ素SAM金コートスライドの露出領域をエッチングした。エッチングされた金コートスライドを、エタノールで洗浄し、N2ガスで乾燥し、金コートスライドの選択的にエッチングされた領域に、親水性アルカンチオレートSAM(EG3SAM)が形成されるように、ヒドロキシル末端アルカンチオールの0.1 mMエタノール溶液に≧2時間浸漬した。エタノールで得られる金コートスライドを洗浄し、ヒドロゲル形成前にN2ガスで乾燥した。
【００７６】
接触角測定によって、金コートスライド上の疎水性および親水性SAM形成を確認した(図2B参照)。接触角ゴニオメーター(DataPhysics Contact Angle System OCA、カリフォルニア州、サンノゼ)を用い、室温にて静的接触角を測定した。表面上に蒸留水の液滴(3 μL)を置き、3つの異なるサンプル上の異なる5つの部位において、各サンプルについて静的接触角を測定した。
【００７７】
ヒドロゲルスポット重合および固定化
上述のように、PEG-NBを官能化した。二官能性PEGジチオール(PEG-DT)架橋剤(3.4 kDa)をLaysan Bio(アラバマ州、アラブ)から購入した。IRGACURE 2959光開始剤をCiba/BASF(ドイツ、ルートヴィヒスハーフェン)から購入した。システイン末端ペプチドをGenScript USA(ニュージャージー州、ピスカタウェイ、NJ)から購入した。オムニキュアシリーズ1000 UVスポット硬化ランプ(波長365 nm)、ライトガイドおよびコリメートアダプタをLumen Dynamics Group(カナダ、オンタリオ)から購入した。上記と同じ手順を用い、所望のヒドロゲルスポット高さに対応する厚さ寸法をもつPDMSスペーサーを製造した。
【００７８】
PEG-NB、PEG-DT、ペプチドおよび光開始剤を組み合わせることによってヒドロゲル前駆体溶液を製造し、ヒドロゲルスポット形成の直前に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で所望の濃度に希釈した。各ヒドロゲルアレイを形成するために、パターニングされた金コートスライドをエタノールで濯ぎ、N2ガスで乾燥し、PDMSスペーサーをスライドの疎水性領域に置き、ヒドロゲル前駆体溶液を親水性領域に配置した。DTT処理シラン化ガラスカバースリップを用いて、カバースリップとスライドの間にヒドロゲル前駆体溶液を挟んだ。ガラスカバースリップを貫通する光を用いる90 mW/cm2にて2秒間のUV開始光架橋によってヒドロゲル前駆体溶液を重合させた。得られる重合ヒドロゲルスポットをカバースリップ上に共有的に結合させ、固定した。シラン化手順が、ヒドロゲル前駆体溶液重合に用いるチオール-エン反応に参加する能力があるチオール末端シランで官能化されるガラスカバースリップを製造し、ヒドロゲルネットワークを表面結合シランに効率的に架橋することを想起されたい。カバースリップから金コートスライドを分離し、ガラス固定化ヒドロゲルスポットが、金コートスライドから容易に切り離されるのを可能にした。「ヒドロゲルアレイ」と総称される、得られるガラス固定化ヒドロゲルスポットを、70%エタノール中で１時間滅菌し、PBSで洗浄して、残留未反応成分を除去した。
【００７９】
それに組み込まれたペプチドのアイデンティティおよび濃度によって、アレイ中の各ヒドロゲルスポットの生物活性を決定した。この検討に用いたペプチドは、CRGDS(配列番号：2)、CRGD-(G)13-PHSRN(配列番号：29)、CRGD-(SG)5-PHSRN(配列番号：30)、アセチル化CRGDSP(配列番号：31)、環状(RGD{Fd]C)(配列番号：33)、および非生物活性スクランブルペプチド CRDGS(配列番号：32)であった。各ヒドロゲルスポットの生物活性を調節するために、ヒドロゲル前駆体溶液に異なるペプチドを加え、UV開始架橋を行った後、得られる重合ヒドロゲルネットワークは、それぞれ、異なる固定ペプチドを現した。すべてのアレイに対して、ヒドロゲルネットワークに合計4 mMのペプチドを組み込んだ。ペプチドアイデンティティおよび濃度の制御を介してヒドロゲルスポットの生物活性を同時に変化させるために、選択された生物活性ペプチドの所望の濃度を決定し、CRDGS(配列番号：32)ペプチドを補足して、ヒドロゲル前駆体溶液中の総ペプチド濃度4 mMを維持した。
【００８０】
架橋ヒドロゲルネットワーク中のPEGの総濃度によって、ヒドロゲルアレイ中の各ヒドロゲルスポットの弾性率を決定した。ヒドロゲル前駆体溶液中のPEG-NBの濃度の増加により、ネットワーク重合に、より多量のPEG架橋がもたらされ、圧縮弾性率が増加した(図8参照)。
【実施例１】
【００８１】
本実施例では、ガラス基質上に固定されたヒドロゲルアレイを調製した。
パターニングされたアルカンチオレート自己組織化単分子膜(SAM)で、金基質を修飾して、周囲の疎水性領域によって分離される単離された親水性領域を提供した (図1A-1Bに示す)。図2A(図1Aにも)に示すように、金コートスライド上の疎水性および親水性SAM形成を、接触角測定によって確認した。図2Bは、疎水性パターニング前のステップにおける金基質 100；フッ素SAMを有する基質 110；エッチング後の基質 120；および親水性パターニング後の基質 130；のパターニング中の端面図を提供する。
【００８２】
重合反応に必要なすべての成分を含むヒドロゲル前駆体溶液を、パターニングされた基質の親水性SAM領域上に沈着させた(図1B参照)。親水性領域は、各領域上に沈着した溶液の含量を限定するように、および得られる重合ヒドロゲルの形状を定義するように機能した。パターニングされたスライドの疎水性領域上に、エラストマースペーサー(所望のヒドロゲルアレイ高さに相当する厚さ寸法をもつ)を置いた。重合反応に参加する能力がある末端官能基をもつSAMを有するようにシラン化によって修飾されたガラス基質を用いて、ヒドロゲル前駆体溶液を挟んだ。UV重合中に、ヒドロゲル前駆体溶液の成分は、架橋ネットワークを形成し、ガラス基質上の末端官能基との共有結合を形成した。重合ヒドロゲルを、パターニングされた金基質からきれいに除去して、ガラス基質上に固定されたヒドロゲルアレイを製造した(図3参照)。
【実施例２】
【００８３】
本実施例では、ヒドロゲルアレイを用いて、初期の幹細胞接着における基質特性の効果を決定した。
上述のように(図1A-1B参照)、金基質上のパターニングされた疎水性／親水性自己組織化単分子膜を用いて、アレイにおける各ヒドロゲルスポットの形状を定義し、含量を限定するように、ポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルアレイを形成した。UV開始チオール-エン架橋は、同時にヒドロゲルを重合させ、ヒドロゲルスポットをガラス上に固定して、ヒドロゲルアレイをもたらした。図9に示すように、ヒドロゲルアレイを、64ウェルマイクロアレイアドオン(オーランド州、ベンドのGrace Bio-Labsから市販)に適合する寸法で製造することができた。
【００８４】
フィブロネクチン由来ペプチド、蛍光マイクロスフェアおよびジチオール架橋剤を含むヒドロゲル溶液をSAMに沈着させ、シラン化ガラススライドで挟んだ。図7に示すように、ヒドロゲルアレイの個々のヒドロゲルスポットを、さまざまな量の蛍光タグ付きペプチドならびにさまざまな量の蛍光マイクロスフェアを含むように製造することができた。また、架橋前に、さまざまなPEGまたは架橋剤濃度をもつヒドロゲル溶液を製造して、剛性、ペプチドアイデンティティまたはペプチド濃度を変化させた(図8)。得られるアレイ(図3参照)は、直径2.4 mm、高さ150 umの柱(post)を含んだ。ヒト間葉幹細胞(hMSC)を、さまさまなPEG濃度(4重量%、6重量% and 8重量%)をもつ柱上で培養して剛性を変化させ、初期細胞接着および拡散における変化をモニターした。ヒト胚性幹細胞(hESC)を、さまざまなペプチドアイデンティティ(ブランク、RDGS、RGDS(配列番号：1)、RGD-PHSRN(配列番号：34)、RGDSP(配列番号：47)および環状RGD)をもつ柱上で培養し、初期細胞接着および拡散における変化をモニターした。
【００８５】
図10A-10Cに示すように、hMSCの2D培養は、公開された見解(Engler et al.細胞126:677(2006)を参照)と一致した、弾性率の変化に応答した細胞拡散依存性を実証した。化学的に規定され、アルブミンを含まない培地でのhMSCの2D培養は、細胞接着が、ペプチド提示スポットに非常に特異的であることを実証した。hESC細胞接着と拡散との両方が、固定ペプチドへのインテグリン受容体の結合親和性に依存性であった(図11参照)。アレイは、ヒドロゲルスポット形状、ヒドロゲルスポット高さ(パターニングされたヒドロゲルスポット形状を変更すること、またはスペーサーを付加することによる)、ヒドロゲルスポット剛性およびヒドロゲルスポットペプチド濃度における変更を可能にし、2Dおよび3D細胞培養に対して適合可能であった。
【００８６】
これらの結果は、本明細書に記載のヒドロゲルアレイの製造方法が、剛性、固定リガンドアイデンティティおよびリガンド濃度、ならびに可溶性増殖因子提示を制御する能力を提供することを実証する。本開示のヒドロゲルアレイは、細胞接着および生存をサポートすることができ、複雑な細胞-環境相互作用をスクリーニングすることを可能にする。
【実施例３】
【００８７】
本実施例では、本開示のヒドロゲル組成物を製造し、その上でヒト間葉系幹細胞(hMSC)を培養し、細胞特性を分析した。
【００８８】
本明細書に記載のとおり、1.8〜10.9 kPaの範囲の剛性値を有するヒドロゲルスポットを含み、0〜4 mMの範囲で固定化CRGDS(配列番号：2)ペプチド濃度を変化させるヒドロゲルアレイを製造した。「スクランブル」非生物活性CRDGSペプチド(配列番号：32)を含むヒドロゲル前駆体溶液を補足することによって、総ペプチド濃度が4 mMに維持されたことに留意。このスクリーニングのために選ばれた剛性範囲は、脂肪および筋組織などのさまざまな軟組織の報告された剛性値を反映するように選択された。ヒドロゲルアレイ形成に続いて、ヒドロゲルスポット上にhMSCを播種し、最大8日間培養した。
【００８９】
ヒドロゲルスポット剛性とは無関係に、hMSC初期細胞接着、拡散および増殖は、固定化CRGDS(配列番号：2)濃度に線形相関した。培養の1日後、最小のhMSCは、CRGDS(配列番号：2)(4 mMの「スクランブル」CRDGS(配列番号：32))を含まないヒドロゲルスポットに接着したhMSCであり、このことは、初期細胞接着が、固定化ペプチドの生物活性によって媒介されることを示す。CRGDS(配列番号：2)の濃度を増加させると、4 mMのCRGDS(配列番号：2)を提供するヒドロゲルスポット上に、最大値のhMSC細胞接着、拡散および増殖の増加がもたらされた。
【００９０】
ヒドロゲルスポット剛性を増加させると(1.8〜10.9 kPa)、hMSC初期細胞接着、拡散および増殖の増加がもたらされた。最大のhMSC初期細胞接着は、8.2 kPaの剛性を有するヒドロゲルスポット上で見られ、最大の細胞拡散および増殖の両方が、5.4 kPaの剛性を有するヒドロゲルスポット上で見られた。結果を図12-14に示す。
【実施例４】
【００９１】
本実施例では、本開示のヒドロゲル組成物を製造し、その上でヒト胚幹細胞(hESC)を培養し、細胞伸長を分析した。
【００９２】
ヒドロゲルアレイは、1.8〜10 kPaの範囲の剛性値を有し、環状RGD[Fd]Cペプチド(配列番号：33)濃度を0〜4 mMで変化させるヒドロゲルスポットを含む。「スクランブル」非生物活性環状RAD[d-Phe]ペプチド(配列番号：48)を含むヒドロゲル前駆体溶液を補足することによって、総ペプチド濃度が4 mMに維持されたことに留意。ヒドロゲルアレイ形成に続いて、ヒドロゲルスポット上にH1 hESCを播種し、最大5日間培養した。3-10 kPaの剛性を有し、2〜4 mMの環状RGD[d-Phe]ペプチドを含むヒドロゲル上で培養されたH1 hESCは、マトリゲル(登録商標)コーティング組織培養ポリスチレン上で培養された細胞と同様の細胞拡散および増殖率を示した。結果を図15および16に示す。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｃ】
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【図１１Ａ−１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年11月21日(2016.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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