(57)【要約】  ＰＣＯＳなどのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２関連障害を治療するための医薬組成物及び方法を提供する。特に、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的なヒト化マウスモノクローナル抗体、及びそれを使用するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物であって、前記抗体又はその抗原結合断片がＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質を特異的に認識しないことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記抗原結合断片がＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片及びこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合断片がアミノ酸配列：ＮＴＩＡＴＰＡＴＬＨＩＬＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号５）に存在する少なくとも１つのエピトープを特異的に認識することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合断片がアミノ酸配列：ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）に存在する少なくとも１つのエピトープを特異的に認識することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列ＮＴＩＡＴＰＡＴＬＨＩＬＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号５）及び／又は配列ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）内の少なくとも４つの連続アミノ酸から成る少なくとも１つのエピトープを特異的に認識することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体又はその抗原結合断片が以下のアミノ酸配列：ＮＴＩＡＴＰＡ；ＴＩＡＴＰＡＴ；ＩＡＴＰＡＴＬ；ＡＴＰＡＴＬＨ；ＴＰＡＴＬＨＩ；ＰＡＴＬＨＩＬ；ＡＴＬＨＩＬＱ；ＴＬＨＩＬＱＫ；ＬＨＩＬＱＫＳ；ＨＩＬＱＫＳＩ；ＩＬＱＫＳＩＴ；ＬＱＫＳＩＴＨ；ＱＫＳＩＴＨＦ；ＫＳＩＴＨＦＡ；ＳＩＴＨＦＡＡ；ＩＴＨＦＡＡＫ；ＴＨＦＡＡＫＦ；ＨＦＡＡＫＦＰ；ＦＡＡＫＦＰＴ；ＡＡＫＦＰＴＲ；ＡＫＦＰＴＲＧ；ＫＦＰＴＲＧＷ；ＦＰＴＲＧＷＴ；ＰＴＲＧＷＴＳ；ＴＲＧＷＴＳＳ；ＲＧＷＴＳＳＳ；及びＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号７〜配列番号３３）の少なくとも１つに存在する少なくとも１つのエピトープを特異的に認識することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗体又はその抗原結合断片が配列番号５３の残基１〜１１６及び１３３〜２４０から成るアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗体又はその抗原結合断片が配列番号６２及び６３の相補性決定領域（ＣＤＲ）から成るアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗体又はその抗原結合断片が配列番号６５のＣＤＲから成るアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸であって、前記抗体又はその抗原結合断片がＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質を特異的に認識しないことを特徴とする核酸。
【請求項１１】
前記核酸が配列番号５６及び／又は配列番号５７で示される配列から成ることを特徴とする請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸が配列番号６０及び／又は配列番号６１で示される配列から成ることを特徴とする請求項１０に記載の核酸。
【請求項１３】
前記核酸が配列番号６４で示される配列から成ることを特徴とする請求項１０に記載の核酸。
【請求項１４】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を治療するための方法であって、前記方法は抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物を治療有効量で、それが必要な被験者に投与する工程を含み、前記抗体又はその抗原結合断片がＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質を特異的に認識しないことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記障害が多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記障害がＰＣＯＳに伴うＩＩ型糖尿病であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞の細胞表面受容体が、対照細胞と比較してＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現を増加させることによってシグナル伝達を変更する方法であって、前記方法は前記細胞と抗体又はその抗原結合断片とを接触させる工程を含み、前記抗体又はその抗原結合断片がＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質を特異的に認識しないことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記細胞が莢膜細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、子宮内膜細胞及び顆粒膜細胞から成る群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞と前記抗体又はその抗原結合断片との接触が、前記細胞におけるアンドロゲン及び／又はプロゲステロン生合成を減少させ、ならびに／あるいは、前記細胞におけるＣＹＰ１７Ａ１及び／又はＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の遺伝子発現を減少させることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
莢膜細胞におけるアンドロゲン及び／又はプロゲステロン生合成の前記減少、ならびに／あるいは前記細胞におけるＣＹＰ１７Ａ１及び／又はＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の遺伝子発現の前記減少が、高アンドロゲン血症に伴う過剰アンドロゲン生成及び／又は無排卵症の症状を抑制あるいは防止することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
過剰アンドロゲン生成の前記症状に多毛症が含まれることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体又はその抗原結合断片が異常なインスリンシグナル伝達、脂肪や骨格筋及び子宮内膜組織におけるインスリン抵抗性、顆粒膜細胞内の異常なＦＳＨシグナル伝達、およびこれらの複合的症状から成る群から選択されるＰＣＯＳを伴う他の表現型を抑制又は予防することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
容器及び容器内の組成物から成る製造物品であって、前記組成物が、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質を特異的に認識しない抗体から成り、更に、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を治療するために前記組成物が使用可能であることを指示する添付文書を備えることを特徴とする製造物品。
【請求項２４】
前記障害がＰＣＯＳであることを特徴とする請求項２３に記載の製造物品。
【請求項２５】
被験者のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を診断する方法であって、
配列番号５３の残基１〜１６６及び１３３〜２４０又は配列番号６２、６３又は６５のうちの少なくとも１つのＣＤＲから成るアミノ酸配列を含む抗体に、前記被験者の生体試料を接触させる工程；ならびに
検出したＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２量を基準値と比較する工程
を含む方法。
【請求項２６】
前記障害がＰＣＯＳであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体試料が血液、血清、尿、血漿もしくは唾液であり、及び／あるいは卵巣、子宮内膜、脂肪組織もしくは骨格筋の生検又は外科的標本であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を治療する方法であって、
ＲＮＡｉを含有する組成物を治療有効量で、それが必要な被験者に投与する工程を含み、前記ＲＮＡｉ組成物がＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の発現を減少させることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は２０１３年１１月１９日付け米国仮出願第６１／９０６，０７８号及び２０１４年８月２８日付け米国仮出願第６２／０４２，８５２号に関連し、それぞれの開示は参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は概括的には、限定するものではないが、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）などの、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２（１Ａ変異体２を含むＤＥＮＮ／ＭＡＤＤドメイン）ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現と相関する障害に関するものであり、より詳細にいうと、これらの障害を予防及び／又は治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）は、最も一般的な内分泌疾患の１つであり、世界的に見て生殖可能年齢の女性の５〜７％が罹患している［１］。それは高アンドロゲン血症／アンドロゲン過剰症、無排卵症、不妊症、及び左右対称卵巣腫大に埋め込まれた複数の小さな皮質下卵胞「嚢胞」からなる特徴的な卵巣形態に関連している［２〜５］。血中テストステロンレベルの上昇は主に卵巣によるアンドロゲン生成増加に起因し、ＰＣＯＳの女性の典型的な内分泌表現型である。ＰＣＯＳの診断基準については議論の余地があるが、他の原因では解明されていない高アンドロゲン血症／アンドロゲン過剰症及び無排卵症はその障害の特質であり、重要な要素として全ての「見解一致」診断スキームに包含されている［６〜１０］。卵巣莢膜細胞はＰＣＯＳの女性における過剰なアンドロゲン生合成の主要な原因であるとの見解で一致している［１１〜１３］。新たに単離した莢膜組織、又は正常女性及びＰＣＯＳ女性由来の莢膜細胞培養の研究によって、ＰＣＯＳ莢膜は正常に排卵する女性の莢膜組織又は細胞より多くの量のアンドロゲンを分泌することが実証されている［１２、１４〜１９］。ＰＣＯＳ莢膜細胞中の莢膜アンドロゲン生合成増加は、アンドロゲン生合成、シトクロムＰ４５０  １７アルファヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１遺伝子にコードされている）及びシトクロムＰ４５０コレステロール側鎖切断部位（ＣＹＰ１１Ａ１遺伝子にコードされている）に関与する主要酵素の発現増加に起因する［１５〜１７、２０］。
【発明の概要】
【０００４】
正常周期の女性及びＰＣＯＳの女性の卵巣由来の個々の大きさが同じ卵胞から単離した莢膜細胞を増殖させる条件が整えば、継代したＰＣＯＳ莢膜細胞は正常な莢膜細胞と比較してアンドロゲン及びプロゲステロンのレベルを上昇させる能力を保持するという第１の証拠が与えられる［１５、１６、２１］。ＰＣＯＳ莢膜細胞中のアンドロゲン及びプロゲステロン生合成のこの増大は、ＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子転写の増加ならびにＲＮＡの安定性に部分的に起因している［１７、２０、２２］。マイクロアレイ分析及び定量的ＰＣＲによって複数の個体から得た正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞の分子特徴化によって、正常細胞及びＰＣＯＳ細胞が特有の分子署名を有していることも確立された［１６、２３、２４］。これらの知見は、屈性刺激に応答してアンドロゲンの過剰分泌を促進するＰＣＯＳ莢膜における内因性異常の概念と一致している。莢膜細胞培養系によって、ＰＣＯＳの女性における遺伝子異常の根底にある生化学的及び分子メカニズムを特定するための固有の構築基盤が与えられる。
【０００５】
本開示では、代替的にスプライシングしたトランケート型のＤＥＮＮＤ１ＡであるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２［２５、２６］は正常莢膜細胞とＰＣＯＳ莢膜細胞とで示差的に発現することを実証するデータが示されている。当該データは、ＰＣＯＳ莢膜細胞によって増加したＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現ならびに増大したアンドロゲン及びプロゲスチン生合成の病態生理学的状態にＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２が寄与していることを実証している［１７、２０、２２］。更に本明細書に提示されたデータは、ｓｈＲＮＡ又は抗体ベースの手法を利用してＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２を標的にすれば、ＰＣＯＳ莢膜細胞によって顕著になったＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現やアンドロゲン生成増加が抑制可能になることを実証している。したがって、ＰＣＯＳの特質であるアンドロゲン発現の増加を阻害することは、ＰＣＯＳ患者、ならびにＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現に確実に関連している他の傷害を持つ個人にも予防及び／又は治療効果があるであろう。
【０００６】
本発明の１態様には、予防及び／又は治療の利点が達成されるように効果的量のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２標的薬剤を含む組成物を、それを必要とする被験者に投与する工程が含まれる。標的薬剤の例には、抗体もしくは抗原結合断片及びＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ又は他のヌクレオチド含有組成物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現と確実に相関している障害であればいかなる障害でも、被験者は治療を必要とする。いくつかの実施形態では、障害は、基準値に相対して増加したＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２と相関している。更なる実施形態では、個人はＰＣＯＳのリスクを有しているか、ＰＣＯＳに罹患している疑いがあるか、又はＰＣＯＳと診断されている。
【０００７】
本発明の他の態様は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１（ＤＥＮＮ／ＭＡＤＤドメインを含む１Ａ変異体１）タンパク質を特異的に認識しない抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物に関する。抗原結合断片の例としてはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、明瞭なＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端アミノ酸配列：ＮＴＩＡＴＰＡＴＬＨＩＬＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号５）に存在する少なくとも１つのエピトープを特異的に認識する。
【０００８】
本発明の他の特徴及び利点は以下の発明の説明に記載され、部分的にその説明から明らかになり、あるいは本発明の実施によって知る場合もある。本発明は、特にこの明細書及び特許請求の範囲で指摘した組成物及び方法によって実現し、達成されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−１Ｆ】ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質はＰＣＯＳ莢膜細胞で増加する。２０μＭのフォルスコリンの非存在下（−）および存在下（＋）で処理した正常莢膜細胞及びＰＣＯＳ莢膜細胞から得た全細胞抽出物中での６２ｋＤ以下のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２及び１１２ｋＤ以下のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１の典型的なウエスタン分析。タンパク質の標準化には総ｍＴＯＲを使用した（図１Ａ）。５人の正常周期の被験者及び５人のＰＣＯＳ被験者から単離した莢膜細胞でのウエスタン分析から得た定量的データは平均±ＳＥＭとして示され、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質は、正常莢膜細胞と比較して基本条件及びフォルスコリン刺激条件（＊、Ｐ＜０．０１）の両方のＰＣＯＳ莢膜細胞内において増加した（図１Ｂ）。図１Ｃに示すように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１は正常莢膜細胞内でフォルスコリン処理によって増加した（＊、Ｐ＜０．０１）。フォルスコリンで刺激したＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１は、正常細胞と比較してＰＣＯＳ莢膜細胞内において減少した（＊＊、Ｐ＜０．０１）（図１Ｃ）。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２／Ｖ１の比率は対照条件及びフォルスコリン刺激条件下でＰＣＯＳ莢膜細胞内において増加した（＊、Ｐ＜０．０１）（図１Ｄ）。図１Ｅでは、ウエスタン分析を行い、上述のように処理した正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞から得た全細胞抽出物を使用し、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的な２１アミノ酸ペプチド（ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ）（配列番号：６）に対して生じたウサギポリクローナル抗体の効果を評価した。図１Ｅに示すように、代表的なウエスタンブロット分析から、基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下で処理したＰＣＯＳ莢膜細胞における６２ｋＤのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の増加が実証された。タンパク質の標準化に総ｍＴＯＲを使用した。図１Ｆに示すように、４人の個々の正常女性及び４人の個々のＰＣＯＳ女性から単離した莢膜細胞から採取した全細胞溶解物の累積的分析から、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質は、対照条件及びフォルスコリン刺激条件下両方の正常莢膜細胞と比較してＰＣＯＳ莢膜細胞で優位に増加することが実証された（＊、Ｐ＜０．０１）。フォルスコリン処理が正常又はＰＣＯＳ莢膜細胞中のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質蓄積に影響を与えるとは思われなかった。
【００１０】
【図２Ａ−２Ｂ】正常周期卵巣及びＰＣＯＳ卵巣におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の免疫組織化学的局在。図２Ａでは、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質は卵胞の内卵胞膜に局在し、正常莢膜（上）と比較して、ＰＣＯＳ莢膜（下）でより増加した。図２Ｂでは、ＰＣＯＳ莢膜及び顆粒膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２染色を左パネルに示す（４０Ｘ）。主にＰＣＯＳ莢膜細胞核、細胞質及び細胞膜での染色は右パネルに示す（１００Ｘ、オイル存在下）。
【００１１】
【図３Ａ−３Ｂ】ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ量はＰＣＯＳ莢膜細胞で増加し、アンドロゲン生成の増加と相関する。ｑＲＴ‐ＰＣＲを利用して１６時間、２０μＭのフォルスコリンの非存在下（−）および存在下（＋）で処置した６人の個々の正常女性及び６人の個々のＰＣＯＳ女性から増殖させた莢膜細胞において、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２（図３Ａ）ｍＲＮＡ量を比較した。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡは、正常細胞と比較して、基本条件下（＊、Ｐ＜０．０５）及びフォルスコリン刺激条件下（＊＊、Ｐ＜０．０１）でＰＣＯＳ莢膜細胞において有意に増加した（図３Ｂ）。各々６つの正常及びＰＣＯＳ女性莢膜細胞標本での対照条件（Ｃ）及びフォルスコリン刺激条件（Ｆ）の両方のＤＨＥＡ蓄積を同一条件下でＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡと比較した（図３Ｂ）。
【００１２】
【図４】ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２ｍＲＮＡは、正常女性と比較して、ＰＣＯＳ女性から単離した尿エキソソーム中でより増加する。リアルタイムｑＰＣＲ分析を利用して５人の正常周期女性及び６人のＰＣＯＳ女性（＊、Ｐ＜０．００１）から得た日中の尿から精製し、単離したエキソソームｍＲＮＡにおけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＲＮＡ蓄積の比較。
【００１３】
【図５Ａ−５Ｅ】正常莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の強制的発現はアンドロゲン及びプロゲスチン生成の増強を招く。正常莢膜細胞におけるアンドロゲン生合成に対する強制的発現ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の効果を検討するため、２０μＭのフォルスコリンの非存在下（Ｃ）又は存在下（Ｆ）で７２時間処理した空溶液（Ｎｕｌｌ）又はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルスを０．３、１．０、３．０及び１０ｐｆｕ／細胞で感染させた代表的な正常莢膜細胞によるＤＨＥＡ生成を図５Ａに示す。図のように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス感染及び強制ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現は、対照Ｎｕｌｌアデノウイルスと比較して、正常莢膜細胞におけるフォルスコリン刺激ＤＨＥＡ生成をより増加させる。それに続く研究では、正常な莢膜細胞は３ｐｆｕ／細胞のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２又は対照Ｎｕｌｌアデノウイルスで感染させ、２０μＭのフォルスコリンの非存在下（Ｃ）又は存在下（Ｆ）で７２時間処理した。その後、ＤＨＥＡ（図５Ｂ）、１７ＯＨＰ４（図５Ｃ）、Ｔ（図５Ｄ）及びプロゲステロン（図５Ｅ）を測定し、細胞数によって標準化した。図のように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス感染は、対照Ｎｕｌｌアデノウイルスと比較して、基準の１７ＯＨＰ４（図５Ｃ；＊、Ｐ＜０．０１）、Ｔ（図５Ｄ；＊、Ｐ＜０．０５）及びＰ４（図５Ｅ；＊、Ｐ＜０．０５）の蓄積を有意に増加させた。また、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス感染は、対照Ｎｕｌｌアデノウイルスと比較して、フォルスコリン刺激ＤＨＥＡ（図５Ｂ；＊、Ｐ＜０．００１）、１７ＯＨＰ４（図５Ｃ；＊、Ｐ＜０．００１）及びＰ４（図５Ｅ；＊、Ｐ＜０．００１）を有意に増加させた。従って、正常莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の強制的発現は、アンドロゲン及びプロゲステロン生合成を増大させ、ＰＣＯＳ表現型を促進する。
【００１４】
【図６Ａ−６Ｄ】正常莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の強制的発現はＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１プロモーター調節のみならず、ＣＹＰ１７及びＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡ蓄積の増強を招く。ＣＹＰ１７及びＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ蓄積に対するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の効果を検討するため、正常莢膜細胞を３ｐｆｕ／細胞のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２又は対照Ｎｕｌｌアデノウイルスで感染させ、２０μＭのフォルスコリンの非存在下（Ｃ；対照）又は存在下（Ｆ；フォルスコリン）で１６時間処理した。ＲＮＡ単離に続いて、ＣＹＰ１７及びＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡをｑＲＴ‐ＰＣＲによって定量し、ＴＢＰｍＲＮＡによって標準化した。図のように、正常莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の強制発現によって、フォルスコリン刺激ＣＹＰ１７のｍＲＮＡ（図６Ａ；＊、Ｐ＜０．０１）及びＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡ（図６Ｂ；＊，Ｐ＜０．０５）蓄積が有意に増加した。ＣＹＰ１７Ａ１転写に対するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の効果を検討するため、正常莢膜細胞をＣＹＰ１７Ａ１プロモーター遺伝子プラスミド（−７７０  ＣＹＰ１７Ａ１／ＬＵＣ）でトランスフェクトし、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２又はＮｕｌｌアデノウイルスで感染させた（図６Ｃ）。図６Ｃに示すように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス感染によって、Ｎｕｌｌ対照アデノウイルスと比較して、基準条件（＊、Ｐ＜０．０５）及びフォルスコリン刺激条件（＊＊、Ｐ＜０．０５）の両方の条件下の−７７０ＣＹＰ１７Ａ１プロモーター活性がより増加した。図６Ｄでは、ＣＹＰ１１Ａ１プロモーター構築物（−１６０／−９０ＣＹＰ１１Ａ１／ＬＵＣ）はＰＣＯＳ莢膜細胞でＣＹＰ１１Ａ１発現を増加させ、莢膜細胞でのＣＹＰ１１Ａ１転写に対するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の効果を検討している。正常莢膜細胞は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２／ｐＣＭＶ‐ＸＬ４を含む−１６０／−９０ＣＹＰ１１Ａ１／ＬＵＣプラスミドで、又は対照ｐＣＭＶ‐ＸＬ４プラスミドでトランスフェクトした。図６Ｄに示すように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２は、空のプラスミドと比較して、フォルスコリン刺激（＊、Ｐ＜０．００１）−１６０／−９０ＣＹＰ１１Ａ１／ＬＵＣプロモーター活性を有意に増加させた。これらの結合データから、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２はＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現の転写活性の増加を誘導することが実証されている。
【００１５】
【図７Ａ−７Ｆ】ＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のノックダウンは、ＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１発現の有意な減少、ならびにアンドロゲン及びプロゲスチン生合成の減少を招く。サイレンシングＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ２プラスミドをＰＣＯＳ莢膜細胞にトランスフェクトした後の、ＰＣＯＳ莢膜細胞における内因性ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のノックダウンによって、スクランブルプラスミドと比較して、基準条件（Ｐ ＜０．０５）及び２０μＭフォルスコリン（＊、Ｐ＜０．０１）刺激条件の両方の条件下のＣＹＰ１７ｍＲＮＡ蓄積が有意に阻害された。ＰＣＯＳ莢膜にサイレンシングＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｓｈＲＮＡプラスミドをトランスフェクトすると、フォルスコリン刺激下（＊、Ｐ＜０．０５）ＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡ蓄積も有意に阻害された（図７Ｂ）。図７Ｃに示すように、ｐＧＬ３プラスミド（−２３５ＣＹＰ１７Ａ１／ＬＵＣ）とＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ２プラスミドでルシフェラーゼ遺伝子に融合したＣＹＰ１７Ａ１プロモーターの−２３５／＋４４を同時トランスフェクションすることによって、スクランブルｓｈＲＮＡと比較して、ＰＣＯＳ莢膜細胞内のフォルスコリン依存ＣＹＰ１７Ａ１リポーター活性が有意に阻害された（Ｐ＜０．０５）。サイレンシングｓｈＲＮＡ  ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２レンチウイルス粒子の感染によって、対照非サイレンシングレンチウイルスと比較して、フォルスコリン刺激下１７ＯＨＰ４（図７Ｄ；＊、Ｐ＜０．００１）、ＤＨＥＡ（図７Ｅ；＊、Ｐ＜０．００１）及びプロゲステロン生合成（図７Ｆ；＊、Ｐ＜０．００１）が有意に阻害された。従って、ＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のノックダウンはＰＣＯＳ莢膜細胞を正常表現型に変換する。
【００１６】
【図８Ａ−８Ｆ】ウサギポリクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧはＰＣＯＳ莢膜細胞におけるアンドロゲン生合成ならびにＣＹＰ１７及びＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡを有意に減少させる。フォルスコリン非存在下（Ｃ）又は２０μＭのフォルスコリン存在下（Ｆ）で、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の固有のＣ末端２１アミノ酸配列（すなわちＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ）（配列番号６）に対して生成された親和性精製ウサギポリクローナル抗体ＩｇＧ又は非特異的ＩｇＧを高濃度（０．１〜３．０μｇ／ｍＬ）用いてＰＣＯＳ莢膜細胞を処理した。図８Ａでは、ウサギポリクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧは、非特異的ＩｇＧと比較して、約０．２５μｇ／ｍＬのＩＤ５０でフォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ生合成を有意に阻害した。２０μＭのフォルスコリンの非存在下（Ｃ）又は存在下（Ｆ）での、ＣＹＰ１７（図８Ｂ）及びＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡ（図８Ｃ）蓄積に対する０．５μｇ／ｍＬのポリクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ又は０．５μｇ／ｍＬの非特異的ＩｇＧの効果を検討するために実験を行なったところ、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧはＰＣＯＳ莢膜細胞における対照（＊，Ｐ＜０．０１）及びフォルスコリン刺激条件下のＣＹＰ１７ｍＲＮＡ及びＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡ（＊＊、Ｐ＜０．０１）のＣＹＰ１７ＡｍＲＮＡ蓄積を有意に阻害し、正常莢膜細胞には影響を及ぼさないことが実証された。基本条件下、及びフォルスコリン刺激条件下ＤＨＥＡ（図８Ｄ）、１７ＯＨＰ４（図８Ｅ）及びＰ４（図８Ｆ）生合成に対する０．５μｇ／ｍＬのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ又は０．５μｇ／ｍＬの対照ＩｇＧの効果を検討する平行して行う実験によって、ポリクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧは正常莢膜細胞に影響を及ぼすことなく、対照ＩｇＧと比較して、ＰＣＯＳ莢膜細胞でフォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ（図８Ｄ、＊、Ｐ＜０．００１）及び１７ＯＨＰ４（図８Ｅ、＊、Ｐ＜０．００１）を有意に阻害することが同様に実証された。
【００１７】
【図９Ａ−９Ｂ】ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ペプチドによるヒトファージライブラリのファージディスプレイスクリーニングは同一のＳｃＦｖ配列（配列番号５２〜５３）を有する２種のクローンを同定した。ヒト化モノクローナル抗体を得るため、新たに作成したヒトファージライブラリを使用し、ビオチン化Ｃ末端ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の２１アミノ酸ペプチド（すなわちＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ）（配列番号６）でファージディスプレイスクリーニングを行った。２種のＳｃＦｖクローン、クローン１６及び７９はＥＬＩＳＡスクリーニングに従って同定した（表２〜５）。これらのクローンの配列分析によってクローン１６及び７９のヌクレオチド（図９Ａ）（配列番号５２）及びアミノ酸（図９Ｂ）（配列番号５３）配列が同定されることが実証された。図９Ｂに示すように、ＶＨ配列はアミノ酸残基１〜１１６から成る。リンカーは残基１１７〜１３２から成り、ＶＬ配列は残基１３３〜２４０から成る。図９Ａ及び９Ｂでは、重鎖（ＶＨ）の可変領域は大文字であり；リンカーは小文字であり；軽鎖（ＶＬ）の可変領域は下線を引いたイタリック体の大文字である。相補性決定領域（ＣＤＲ）はボックスに囲まれている（図９Ｂ）。
【００１８】
【図１０Ａ−１０Ｄ】ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ペプチド（配列番号５６〜５９）に対するヒト化モノクローナル（組換え）抗体の重鎖及び軽鎖の配列。ファージディスプレイに従って同定したｓｃＦｖのＶＬ及びＨＬ配列を発現プラスミドｐＩｇＧ１‐Ｌ及びｐＩｇＧ１‐Ｌにクローニングした。ヒト化モノクローナル又は組換えＤＥＮＮＤ１．Ｖ２のＩｇＧ１の全長ＩｇＧ１重鎖（図１０Ａ；配列番号５６）及びＩｇＧ１軽鎖（図１０Ｂ；配列番号５７）の配列を決定した。図１０Ａ及び１０Ｂでは、軽鎖及び重鎖両方の分泌シグナルペプチド（ＳＰ）配列はイタリック体で示されている。図１０Ａの重鎖では、重鎖（ＶＨ）の可変領域は頭文字（すなわち大文字）であり、ヒトＩｇＧ１の重鎖の定常領域の残りの部分は小文字である。図１０Ｂの軽鎖では、軽鎖（ＶＬ）の可変領域はイタリック体の下線を引いた大文字であり、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の定常領域の残りの部分は小文字である。重鎖及び軽鎖のタンパク質配列は図１０Ｃ〜Ｄに示している。重鎖及び軽鎖では、分泌シグナルペプチド（ＳＰ）配列はイタリック体の大文字であり、ＣＤＲは下線及び括弧で示している。図１０Ｃの重鎖（配列番号：５８）では、重鎖（ＶＨ）の可変領域は大文字であり、ヒトＩｇＧ１の重鎖の定常領域の残りの部分は大文字である。図１０Ｄの軽鎖（配列番号５９）では、重鎖（ＶＬ）の可変領域はイタリック体の大文字であり、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の定常領域の残りの部分は大文字である。
【００１９】
【図１１Ａ−１１Ｃ】ヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ１発現及び精製。ファージスクリーニングに従って得たヒト化モノクローナル抗体を更に評価するため、組換えヒトＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドベクターを２９３Ｅ細胞にトランスフェクションし、発現させた。トランスフェクションから９６時間後に懸濁培養液を回収した。生成物をＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦで精製し、０．２μｍ孔径で濾過した。図１１Ａに示すように、ヒト化モノクローナル抗体又は組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ１の濃度は計算によって１２６μｇ／ｍｌであった。還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析によって、組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖は適切な寸法であることが分かった（図１１Ｂ）。２１アミノ酸ビオチン化ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２配列（Ｂｉｏ‐ＣＨ‐２２）へのヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１の特異的結合を実証するＥＬＩＳＡの結果を図１１Ｃに示す。
【００２０】
【図１２Ａ−１２Ｂ】組換えヒトＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ１は用量依存的に、ＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＤＨＥＡ生合成を機能的に阻害する。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的な組換えヒトＩｇＧ１が機能的にアンドロゲン生合成を阻害するか否かを検討するため、ＰＣＯＳ莢膜細胞を高濃度（０．０１〜６μｇ／ｍＬ）のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ヒト組み換えモノクローナルＩｇＧ１（Ｖ２ｈｍＡＢ）又は非特異的ＩｇＧ１で処理し、２０μＭのフォルスコリンの非存在下（Ｃ）及び存在下（Ｆ）で７２時間処理した。図１２Ａに示すように、Ｖ２ｈｍＡＢは対照ＩｇＧ１と比較して、約１．８μｇ／ｍＬのＩＤ５０でフォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ生合成を有意に減少させた（＊、Ｐ＜０．０１）。図１２Ｂでは、基本条件下及びフォルスコリン（＊、Ｐ＜０．１）刺激下両方のＤＨＥＡ生合成は、対照ＩｇＧ１と比較して、Ｖ２ｈｍＡＢ処理後に阻害された。
【００２１】
【図１３Ａ−１３Ｂ】正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＤＨＥＡ生合成に対する組換えヒトＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ１の効果。ウサギポリクローナル及びヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２はＰＣＯＳ莢膜細胞においてＤＨＥＡ生合成を減少させる。フォルスコリン非存在下（Ｃ；対照）及び２０μＭのフォルスコリン存在下で処理した正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞における、９μｇ／ｍＬのヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１（Ｖ２ｈｍＡＢ）及び非特異的ＩｇＧ１の効果を比較するために実験を行なった。図１３Ａに示すように、最大量のＶ２ｈｍＡＢは、ＰＣＯＳ莢膜細胞におけるフォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ生合成を有意に（＊、Ｐ＜０．０１）阻害する一方で、正常莢膜細胞に対して影響は非常に低かった。ウサギＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ポリクローナル抗体（Ｖ２ポリクローナル）とヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１（Ｖ２ｈｍＡＢ組換え）とでその効果を比較することによって、両抗体は対照ＩｇＧと比較してＤＨＥＡ生合成を同様に減少させることが実証された（図１３Ｂ）。
【００２２】
【図１４】ＤＥＮＮＤ１Ａペプチドに対するＥＬＩＳＡでの選択されたハイブリドーマのマウスモノクローナル抗体反応性。選択したハイブリドーマについてマウスモノクローナル抗体上清のＥＬＩＳＡスキャンを行った。遊離ペプチド（Ｖ２‐ペプチド、ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ）（配列番号６）、標識化Ｖ２‐ＫＬＨ‐ペプチド及びＶ２‐ＢＳＡ‐ペプチド、ならびに対照ペプチド及びＢＳＡなどのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗原に対する結合反応性について、各ハイブリドーマ上清（１：１０希釈）を試験した。ＨＰＶ１６Ｌ２（Ｌ２ペプチド）配列（ａａ１７〜３６）に対する対照ペプチド及びこのペプチドに反応性を示すモノクローナル（Ｌ２１６．１Ａ）を内部陰性対照モノクローナル抗体として使用した。第２の対照モノクローナル（ＢＳＡ‐１）はＢＳＡに反応性を示した。いくつかのモノクローナル抗体は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２遊離ペプチド、ならびにＰ１Ｂ２、Ｐ１Ｃ５、Ｐ４Ｆ１、Ｐ５Ｆ９及びＰ２Ｆ５などのＶ２‐ＫＬＨ及びＶ２‐ＢＳＡ標識化ペプチドに特異的に反応性を示すことが特定された。
【００２３】
【図１５】アンドロゲン生合成に対するマウスモノクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１の阻害効果。ＥＬＩＳＡスクリーン（図１４）においてＰＣＯＳ莢膜細胞中アンドロゲン生合成に反応性があることが分かっているＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２マウスモノクローナル抗体Ｐ１Ｂ２及びＰ１Ｃ５の機能的効果を試験するため、実験を行なった。２０μＭのフォルスコリンの存在下及び非存在下でＰ１Ｂ２（ｍＶ２．Ａ）及びＰ１Ｃ５（ｍＶ２．Ｂ）マウスＩｇＧ１か、又は陰性対照マウスＩｇＧ１いずれかの４０μＬの組織培養上清でＰＣＯＳ莢膜細胞を７２時間処理した。図１５に示すように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的Ｐ１Ｂ２及びＰ１Ｃ５マウスＩｇＧ１は陰性対照マウスＩｇＧ１と比較して、ＰＣＯＳの莢膜細胞におけるフォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ蓄積を阻害した（＊、Ｐ＜０．０５）。
【００２４】
【図１６Ａ−１６Ｆ】ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的マウスモノクローナル抗体Ｐ１Ｂ２及びＰ１Ｃ５の配列（配列番号６０〜６５）。マウスモノクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ１、Ｐ１Ｂ２重鎖（図１６Ａ）（配列番号６０）、Ｐ１Ｂ２軽鎖（図１６Ｂ）（配列番号６１）、及びＰ１Ｃ５重鎖（図１６Ｅ）（ 配列番号６４）ヌクレオチド配列を決定した。Ｐ１Ｂ２の重鎖のＤＮＡ配列は大文字であり、Ｐ１Ｂ２の軽鎖は下線を引き、イタリック体の大文字である。タンパク質では、Ｐ１Ｂ２の重鎖（図１６Ｃ）（配列番号６２）及びＰ１Ｃ５の重鎖（図１６Ｆ）（配列番号６５）の配列は大文字であり、Ｐ１Ｂ２の軽鎖はイタリック体である（図１６Ｄ）（配列番号６３）。ＣＤＲ残基は下線及び括弧で示している。不確実なアミノ酸配列はイタリック体で示している。
【発明の詳細な説明】
【００２５】
本発明の実施形態は抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物に関するものであり、当該抗体又はその抗原結合断片はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質を特異的に認識しない。本発明の更なる実施形態は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現と確実に相関している障害の予防及び／又は治療のための方法に関するものであり、当該方法は、抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物を治療有効量で、それが必要な被験者に投与する工程を含み、ここでは抗体又はその抗原結合断片はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質を特異的に認識しない。
【００２６】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｃＤＮＡ配列は：
2017501979.tif 000002
2017501979.tif 000003
である。
【００２７】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のアミノ酸配列は：
2017501979.tif 000004
である。
【００２８】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１のｃＤＮＡ配列は：
2017501979.tif 000005
2017501979.tif 000006
2017501979.tif 000007
である。
【００２９】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１アミノ酸配列は：
2017501979.tif 000008
である。
【００３０】
本明細書で提示した各ｃＤＮＡ配列に関し、本発明はｃＤＮＡと同等のｍＲＮＡを包含し、このことは各ＴがＵに置換されている各ｃＤＮＡ配列が本発明に包含されていることを意味する。
【００３１】
一態様では、本開示は１つ以上の単離した、更に／又は、組み換え技術もしくは合成（例えば化学合成）を行った結合パートナーを含み、これはＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するが、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質は特異的に認識しない。
【００３２】
このような結合パートナーには、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、アプタマー、二重特異性抗体及びこれらの組み合わせなどのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質の固有のＣ末端に特異的に結合可能な抗体及びその抗原結合断片が挙げられる。単鎖Ｆｖ又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインから成り、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含み、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。抗体及びその抗原結合断片はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質の固有の３３アミノ酸Ｃ末端にある１つ以上のエピトープを対象としている。ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体１と２との間に固有に存在する３３アミノ酸ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２配列は：ＮＴＩＡＴＰＡＴＬＨＩＬＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号５）である。
【００３３】
本開示はこの固有のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端アミノ酸配列の断片に対する抗体を作製する実演を包含する。この点で、以下の固有な２１アミノ酸配列断片：ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）を標的とするＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ポリクローナル抗体（ウサギ）を作製した。この配列は、配列が適切に抗原性を有し、他のタンパク質に非特異的な交差反応性がある抗体を生成する可能性が無いと予測する分析に基づいて選択した。
【００３４】
本開示では、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質の２１アミノ酸Ｃ末端を標的とする抗体はＰＣＯＳ莢膜細胞におけるアンドロゲン生合成ならびにＣＹＰ１７及びＣＹＰ１１Ａ１ｍＲＮＡを有意に減少させることが実証されている（例えば、図８Ａ〜Ｂを参照）。
【００３５】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、少量存在する自然発生的突然変異を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は単一の抗原部位に対して高度に特異的である。更に、様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体標本とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を対象としている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成することができるという点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得る抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体生成を必要とするものであると解釈すべきではない。
【００３６】
抗体の調製のための抗体及び方法は、当技術分野において周知である。抗体生成法、及び抗原へ実質上特異的に結合するため生成された抗体のスクリーニングの詳細は標準的な参照文献に記載されており、例えばＥ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ著、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年；Ｆ．Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ及びＳ．Ｄｕｂｅｌ著、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク、１９９９年；Ｈ．Ｚｏｌａ著、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０００年；ならびにＢ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ著、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００３年が挙げられる。
【００３７】
例示的な１手法では、モノクローナル抗体はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端に位置するポリペプチドＮＴＩＡＴＰＡＴＬＨＩＬＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号５）、又はその任意の免疫原性断片を使用する標準的な手法によって作製可能である。１実施形態では、配列ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）から成る配列番号５の２１アミノ酸配列セグメントに対して、又は配列番号６内の１つ以上の決定基に対してモノクローナル抗体を作製する。
【００３８】
本開示の抗体は、ＮＴＩＡＴＰＡＴＬＨＩＬＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号５）配列又はＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）に存在する立体構造エピトープ（単数又は複数）及び／又は直鎖エピトープ（単数又は複数）のうちいずれかを認識することが可能である。
【００３９】
実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、３３アミノ酸配列以内の任意の位置で開始及び終了する３３アミノ酸ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端配列の少なくとも約４個の連続したアミノ酸中に存在する少なくとも１つのエピトープを特異的に認識する。実施形態では、エピトープは、３３アミノ酸ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端配列（配列番号５）中に存在する少なくとも約４、５、６又は７個の連続アミノ酸を有する。エピトープは、例えば約１２アミノ酸以下の長めの配列（例えば８、９、１０、１１又は１２アミノ酸）で定義することも可能である。従ってエピトープは、３３アミノ酸ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端配列の任意の約１２アミノ酸までのセグメント、もしくはそれ以上に長いセグメントを含むか、又はそれのみから構成することが可能である。実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、３３アミノ酸ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端配列の以下に示す例示的なセグメント：ＮＴＩＡＴＰＡ（配列番号：７）；ＴＩＡＴＰＡＴ（配列番号：８）；ＩＡＴＰＡＴＬ（配列番号：９）；ＡＴＰＡＴＬＨ（配列番号：１０）； ＴＰＡＴＬＨＩ（配列番号：１１）；ＰＡＴＬＨＩＬ（配列番号：１２）；ＡＴＬＨＩＬＱ（配列番号：１３）；ＴＬＨＩＬＱＫ（配列番号：１４）；ＬＨＩＬＱＫＳ（配列番号：１５）；ＨＩＬＱＫＳＩ（配列番号：１６）；ＩＬＱＫＳＩＴ（配列番号：１７）； ＬＱＫＳＩＴＨ（配列番号：１８）；ＱＫＳＩＴＨＦ（配列番号：１９）；ＫＳＩＴＨＦＡ（配列番号：２０）；ＳＩＴＨＦＡＡ（配列番号：２１）；ＩＴＨＦＡＡＫ（配列番号：２２）；ＴＨＦＡＡＫＦ（配列番号：２３）；ＨＦＡＡＫＦＰ（配列番号：２４）；ＦＡＡＫＦＰＴ（配列番号：２５）；ＡＡＫＦＰＴＲ（配列番号：２６）；ＡＫＦＰＴＲＧ（配列番号：２７）；ＫＦＰＴＲＧＷ（配列番号：２８）；ＦＰＴＲＧＷＴ（配列番号：２９）；ＰＴＲＧＷＴＳ（配列番号：３０）；ＴＲＧＷＴＳＳ（配列番号：３１）；ＲＧＷＴＳＳＳ（配列番号：３２）；ＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号：３３）及びこれらの組み合わせ：のうちのいずれかに一部又は全体が存在するエピトープに特異的である。実施形態では、本開示の抗体は、２１アミノ酸配列：ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）（例えば、上記で開示した７アミノ酸配列の群に含まれるか、又はそれらを含む約４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２連続アミノ酸から成るセグメント）のうちの少なくとも約４つの連続したアミノ酸に存在するエピトープを特異的に認識する。例えば、配列番号７から開始して、以下の４つの連続したアミノ酸： ＮＴＩＡ（配列番号：６６）、ＴＩＡＴ（配列番号：６７）、ＩＡＴＰ（配列番号６８）及びＡＴＰＡ（配列番号６９）は、抗体に認識されるエピトープから構成されてもよい。また、これらのエピトープは比較的長い配列の一部であってもよい。例えば、配列番号６６から開始して、配列ＸＸＮＴＩＡＸ（配列番号７０）は、抗体に認識されるエピトープから構成されてもよく、ここではＸは、本明細書に記載されているように任意のアミノ酸である。実施形態では、抗体は、配列番号５に一部又は全体が存在する配列に対して少なくとも約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するエピトープを認識する。本開示は、上記アミノ酸セグメントの少なくとも１つを認識する少なくとも１つのパラトープ、又は上記セグメントの少なくとも１つを認識する少なくとも２つのパラトープを有する構造（例えば、本明細書に記載された抗体又はその断片などの結合分子）を含む。
【００４０】
本発明の抗体又は抗原結合断片は、標的エピトープが他のエピトープに５％以下の結合を示す場合に、好ましくは、例えば酵素結合免疫吸着検定法で測定したときに他のエピトープに測定可能な結合を示さない場合に、標的エピトープを特異的に認識又は結合する。抗体又は抗原結合断片は、標的エピトープが他のエピトープに５％を超える結合を示す場合、標的エピトープを特異的に認識又は結合することはない。非特異的に結合する抗体又は抗原結合断片は依然として選択的に結合することも可能であり、例えば抗体は標的エピトープに結合し、更にいくつかの他のエピトープへの非特異的な結合を示す場合もある。
【００４１】
抗体は、化学的ペプチド合成などの当技術分野で公知の様々な方法によって製造してもよい。1つの手法では、モノクローナル抗体を作製するために、本明細書に記載されたＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端ポリペプチドをマウスなどの実験動物に導入し、数週間に及ぶ期間、続けて投与する。通常、脾細胞をマウス脾臓から単離し、単離されたＢ細胞を取得し、電気融合などの任意の好適な手法によって不死化された骨髄腫細胞と融合する。骨髄腫細胞はヒポキサンチン‐グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）遺伝子を十分持っていないことが特徴的であり、その結果としてＨＡＴ培地（ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン培地）に対して感受性を持つ。融合物は通常、１０〜１４日などの期間、ＨＡＴ培地に曝露し、この間、アミノプテリンなどの化合物を使用してヌクレオチド合成を阻害する。その結果として、非融合細胞は死滅し、不死化して抗体を生成するＢ細胞‐骨髄腫ハイブリッド（ハイブリドーマ）は生存する。細胞を希釈し、例えばマルチウェルプレートの１つ１つのウェルで単一のハイブリドーマを単離する。その後、ハイブリドーマをスクリーニングし、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端を特異的に認識し、それによってＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質とは交差反応しない抗体を生成するハイブリドーマを同定する。適切なハイブリドーマを単離すると、分泌された免疫グロブリン（Ｉｇ）をコードするＤＮＡを配列することが可能になるので、Ｉｇのアミノ酸配列を決定することができる。ハイブリドーマによって作製した抗体の合成版を作製するために、又は本明細書で更に説明する抗原結合部分を作製するために、Ｉｇ重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定し、使用することが可能である。あるいは、抗体を生成する細胞をクローニングし、モノクローナル抗体の継続的な供給源を提供する同一の娘クローンを生成することが可能である。大量の抗血清が必要な場合、比較的大型の動物、例えばヤギ又はヒツジを抗体産生用宿主種として使用してもよい。
【００４２】
非ヒト哺乳動物由来のハイブリドーマによって生成された抗体はいかなる抗体でも修飾してキメラ型又は部分的もしくは完全なヒト化形態にすることが可能であり；本開示はこのような修飾体も包含している。一般に、非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は基本的に、レシピエントの超可変領域由来の残基を、所望の抗体特異性、親和性及び性能を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域由来の残基（「ドナー」抗体とも称する）で置換しているヒト免疫グロブリン（「レシピエント」抗体とも称する）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能を更に改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの全てを実質的に含むことが知られており、ここでは超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列の領域である。ヒト化抗体は場合によって、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンの領域の少なくとも一部を含むことも可能である。詳細については、Ｊｏｎｅｓら、［２７］；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、［２８］；及びＰｒｅｓｔａ、［２９］を参照されたい。
【００４３】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野で周知である。本開示に従って生成された抗体のヒト化は基本的に、ヒト抗体の対応する配列にマウスＣＤＲ配列を置き換えることによってＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って行うことが可能である（Ｊｏｎｅｓら［２７］；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、［２８］、及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、［３０］）。
【００４４】
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載した抗体の抗原結合領域断片又は可変領域断片を含む。好適な抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片が挙げられる。抗体断片を生成するために様々な技術が開発されている。従来、これらの断片は無傷の抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導されていた。しかし、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接生成することが可能である。以下に説明するように、例えば抗体断片は抗体ファージライブラリーから単離することが可能である。あるいは、Ｆａｂ’‐ＳＨ断片を細菌発現系から直接回収し、化学的に結合し、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することが可能である。
【００４５】
１実施形態では、抗原結合領域を有するタンパク質のライブラリをスクリーニングし、本開示に従った治療目的のために修飾できる候補を同定することが可能である。例えば、ファージディスプレイ又は他の抗体ライブラリは、本明細書に記載のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端ポリペプチドに対してスクリーニングすることが可能であり、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端特異的結合タンパク質を同定することが可能である。当業者に公知の技術によって、ファージＤＮＡ又は抗原結合領域をコードする任意の他のＤＮＡにコードされる軽鎖及び重鎖のＣＤＲ配列を決定することが可能である。その後、上述の様にＣＤＲ配列を発現ベクターにクローニングし、上記のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端特異的抗体、又はそのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端特異的断片を生成することが可能である。従って、実施形態では、上記のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端特異的抗体、又はそのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端特異的断片は、ライブラリ内のポリペプチドとは区別されている。１実施形態では、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端特異的抗体、又はそのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＣ末端特異的断片は、必ずしも限定するものではないがバクテリオファージ被覆タンパク質（単数又は複数）などのファージ／ファージミドタンパク質は含まない。本明細書では、非限定的な例としてラクダのナノボディなどの抗体又は抗原結合断片を生成するための新たな手法が考えられている。
【００４６】
本発明はまた、抗ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗体をコードする単離核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、ならびに抗体生成のための組換え技術を提供する。単離した核酸は異種プロモーターに操作可能に結合することも可能である。本発明は更に、本明細書に開示したタンパク質／ポリペプチド配列と少なくとも約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子配列（遺伝子）を含む単離核酸分子及びその補体を提供する。コード化ヌクレオチド配列の例が提供されているが、遺伝子コードが重複しているので他のヌクレオチド配列も同一のタンパク質／ポリペプチドをコードする可能性があることは当業者に認識されている。抗体の組換え体を生成するため、抗体をコードする核酸を単離し、更なるクローニング（例えばＤＮＡの増幅）又は発現のための複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の手技によって（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定される。例えばｐＩｇＧ１‐Ｈ及びＰＩｇＧ１‐Ｌ等、多くのベクターが当技術分野で利用可能であり、公知である。ベクター成分は一般的に以下の１種以上：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列：を含むがこれらに限定されるものではない。
【００４７】
ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されればＤＮＡは発現ベクターに挿入することも可能であり、その後、抗体タンパク質を他に生成しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞内にモノクローナル抗体を合成する。発現ベクターの例としては、ＣＭＶ又はβ‐アクチン作動型プラスミド（すなわち、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＭ６、ｐＤＲＩＶＥ‐β‐ａｃｔ等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本明細書に記載の抗ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗体のアミノ酸配列修飾（単数又は複数）を検討する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合もある。抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体のアミノ酸配列変異体は、抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体核酸に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製する。このような修飾には、例えば抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体のアミノ酸配列内の残基における欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換が挙げられる。置換は保存的又は非保存的であってもよい。最終構築物を得るために欠失、挿入及び置換を任意に組み合わせ、所望の特徴を有する最終構築物がもたらされる。グリコシル化部位の数又は位置の変化など、アミノ酸を変化させれば、抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体の翻訳後プロセシングも変化し得る。一般に、このような変異体のアミノ酸配列は、それらが由来する配列に対して、又は断片ではその配列の連続部分に対して、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である。
【００４９】
変異誘発の好ましい場所である抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体の特定の残基又は領域を同定する有用な方法は「アラニンスキャニング変異誘発」と称する。ここでは、残基、又は標的残基の群を同定し（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性又は負の電荷を帯びたアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置換し、アミノ酸とＤＥＮＮＤ１Ａ抗原との相互作用に影響を与える。その後、置換部位上に、又はその部位に対して更なる変異体又は他の変異体を導入することによって、置換に対する機能的感受性を実証するこれらのアミノ酸位置を改良する。従って、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定するが、変異自体の性質は予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するためにアラニンスキャニング又はランダム変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現した抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体変異体を、所望の活性についてスクリーニングする。
【００５０】
アミノ酸配列の挿入には、１残基〜１００残基以上のポリペプチドの長さのアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、ならびに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニルを有する抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体が挙げられる。抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体分子の他の挿入変異には、抗体の血清半減期を増加させる酵素又はポリペプチドに対する抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体のＮ又はＣ末端への融合が挙げられる。
【００５１】
別のタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基で置換した抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体分子中に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発について最も関心ある部位には超可変領域が挙げられるが、ＦＲ変化も考えられる。
【００５２】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシート形態又はらせん形態のような置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の量、の維持に対するその効果に有意差を示す置換を選択することによって達成される。
【００５３】
抗ＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２抗体の適切な形態の維持に関与しないシステイン残基であればいかなる残基も通常、セリンと置換し、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することがあり得る。例えば、配列番号５８のＶＨ内の２つのシステインは以下のようにセリンと置換することが可能である：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＳＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＩＩＧＴＤＧＤＤＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＳＡＫＡＥＡＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：７１）。逆に、ジスルフィド結合（単数又は複数）を形成することが可能な残基を抗体に付加し、（抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合は特に）その安定性を改善することがあり得る。
【００５４】
特に好ましいタイプの置換変異体としては、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換&#8203;&#8203;が挙げられる。一般的に、更なる開発のために選択されて得られた変異体（単数又は複数）は、それらが生成される親抗体と比較して改善された生物学的特性を有している。このような置換変異体を生成するための利便性のある方法には、ファージディスプレイを利用する親和性成熟が含まれる。すなわち、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を変異させ、各部位で全ての可能なアミノ酸置換を生じさせる。ファージディスプレイ変異体はその後、生物学的活性（例えば、結合親和性、細胞機能に対する適当な効果）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するため、アラニンスキャニング変異誘発を行い、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することが可能となる。あるいは、又はそれに加えて、抗体とヒトＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２との間の接触点を同定するために抗原‐抗体複合体の結晶構造を分析することが有益である場合もある。このような接触残基及び隣接残基が本明細書で詳述する技術に従った置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルを本明細書に記載したスクリーニングに供し、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を更なる開発のために選択することも可能である。別のタイプ抗体のアミノ酸変異体は、グリコシル化可能な１つ以上の残基の欠失を意味する「改変」によって、典型的にグリコシル化される１つ以上の残基もしくはグリコシル化に感受性の無い残基の置換によって、及び／又はグリコシル化部位である１つ以上のアミノ酸の添加によって、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。例えば、Ｎ結合型グリコシル化モチーフは、以下のように配列番号５８のＶＨに添加することが可能である：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＳＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＩＩＧＴＤＧＤＤＴＮＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＳＡＫＡＥＡＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：７２）。
【００５５】
本発明の実施形態は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２関連障害の治療に関する。用語「治療」は、治療的処置及び予防又は防止的手段の両方を意味する。治療を必要とする対象には、障害をすでに持つ被験体、障害が予防されるべき被験体も含まれる。従って本明細書で治療対象となる哺乳動物は、障害を有すると診断されている場合、あるいは障害に対してその素因又は感受性を有している（例えば遺伝的素因）場合があり得る。
【００５６】
治療目的の用語「哺乳動物」は、ヒト、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の飼育動物及び家畜、動物園の動物、競技動物又はペットを含む哺乳動物に分類される全ての動物を意味する。当該哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体及び／又は抗原結合断片は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、安定剤等の成分を含むことが可能な医薬製剤の形態で提供される。抗体及び／又は抗原結合断片はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現と相関する障害を治療するために他の薬物又は療法と組み合わせてもよい。例えば、ホルモン療法と組み合わせるＰＣＯＳの治療にＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に対するモノクローナル抗体を投与してもよい。
【００５８】
ＰＣＯＳ、ＰＣＯＳに関連するＩＩ型糖尿病、ならびに過剰なステロイド生合成を招くＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の発現の直接的結果である女性及び男性の他の障害は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現と確実に相関している疾患又は障害の例である。罹患する組織には：卵巣、血管平滑筋、骨格筋、脂肪組織及び子宮内膜が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
用語「治療有効量」は、被検体における疾患又は障害を治療するのに有効とする薬剤又は医薬組成物の量を意味する。ＰＣＯＳ又は他のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２関連障害の場合、治療的有効量の抗体は、その障害に関連する１つ以上の症状をある程度は低減及び／又は予防することも可能である。例えば、本明細書の記載どおりに治療した被験者から得た生体試料（例えば血液試料）中の測定可能なテストステロン（総テストステロン及び遊離テストステロン）、アンドロステンジオン及びデヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（ＤＨＥＡＳ）の量は、例えば少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％以上減少させることが可能であり；及び／あるいは他の症状を改善することも可能であり、例えば、排卵周期は回復し、複数の卵胞嚢胞が消失するなど卵巣の形態は正常化し、高インスリン血症及びインスリン抵抗性が軽減し得る。
【００６０】
更なる実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は任意の好適な手段で投与してもよく、当該手段には皮下、非経口、膣内、腹腔内、肺内及び鼻腔内投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。非経口注射には、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、リンパ内又は皮下投与が挙げられる。また、モノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片は、例えば減量しながらパルス注入によって投与してもよい。経口投与の方法も検討されている。徐放製剤はペグ化などの修飾と併用して、医薬組成物の半減期を延長してもよい。
【００６１】
疾患の予防又は治療では、抗体の適切な用量は、治療する疾患の種類、疾患の重症度及び経過、抗体投与が予防目的であるか治療目的であるか、又はその両方であるか、治療歴、患者の既往歴及び抗体への反応性、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は一度で、又は一連の処置に渡って適切に患者に投与する。疾患の種類及び重症度によって、例えば１回以上の分割投与又は連続的注入のいずれかで、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者に対する初回の投与量の候補である。典型的な１日用量は、上述の要因に依存して約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与では、症状に依存して、疾患症状の目的の抑制が生じるまで治療を続ける。抗体の好ましい用量は約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量を患者に投与してもよい。このような用量は例えば、毎週又は３週間毎に間欠的に投与してもよい。初回の高めの負荷投与量の後は、低用量を１回、又はそれ以上投与する。投与計画の例としては、約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷投与量の後、毎週約２ｍｇ／ｋｇの抗ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗体量を維持する。しかし他の投薬計画も有用である。この治療の進行は従来の技術及び検定によって容易に観察される。患者への抗体タンパク質投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体投与も検討している。抗体をコードする核酸のこのような投与は「治療的有効量の抗体を投与する」という表現に包含されている。
【００６２】
本発明の実施形態は、抗体及びその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドから成る発現ベクター、細胞が前記発現ベクターを含んで抗体又はその抗原結合断片を発現するインビトロ細胞培養、ならびに抗体及びその抗原結合断片を作製するためのこのような発現ベクター及び細胞培養を利用する方法を包含する。他の実施形態は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の発現と確実に相関している障害を治療するためのＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ又は他のヌクレオチドを含有する組成物を包含する。
【００６３】
核酸（場合によってはベクター内に含有されている）を患者の細胞に送達するために、インビボ及びエクスビボの２つの主要な手法がある。インビボ送達では、核酸は患者に、例えば血流に、又は抗体を必要とする部位に直接注射する。エクスビボ治療では、患者の細胞を取り出し、前記単離した細胞に核酸を導入し、修飾した細胞を患者に直接投与するか、又は例えば多孔性膜内にカプセル封入して患者に再移植する。生細胞への核酸の導入に利用可能な技術は多様に存在する。核酸をインビトロで培養細胞に移入するか、又はインビボで目的の宿主細胞に移入するかによって技術は多様に変化する。インビトロでの核酸の哺乳動物細胞への移入に適した技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ‐デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。遺伝子のエクスビボ送達のために一般的に使用されるベクターはレトロウイルスである。
【００６４】
インビボの核酸移入技術の例には、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型ウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど）でのトランスフェクション、及び脂質ベース系（遺伝子の脂質媒介移入の有用な脂質は例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ‐Ｃｈｏｉである）が挙げられる。いくつかの状況では、標的細胞を標的とする薬剤、例えば標的細胞の細胞表面膜タンパク質、標的細胞上の受容体のリガンド等に特異的な抗体などと共に核酸源を提供することが望ましい。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を使用して；例えば特定の細胞タイプに指向性を持つキャプシドタンパク質又はその断片、周期中に内部移行するタンパク質の抗体、及び細胞内局在を標的として細胞内半減期を促進するタンパク質；を標的にし、ならびに／あるいはこれらの取り込みを容易にすることが可能となる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、標的細胞は莢膜細胞であり、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片を莢膜細胞に接触させると、莢膜細胞内のアンドロゲン及び／又はプロゲステロン生合成が減少し、ならびに／あるいは細胞内でＣＹＰ１７Ａ１及び／又はＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現、ならびにＣＹＰ１７及びＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が減少する。これらの減少によって、ＣＹＰ１７Ａ１及び／又はＣＹＰ１１Ａ１遺伝子調節ならびにＣＹＰ１７及び／又はＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の過剰発現；例えば過剰アンドロゲン生成に関連する症状が軽減又は予防される。軽減又は解消される可能性のある過剰アンドロゲン生成の症状の例としては：高アンドロゲン血症に伴う無排卵、多毛症、卵巣形態、不妊が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片は、ＰＣＯＳに伴う他の表現型、例えば、異常なインスリンシグナル伝達、脂肪、骨格筋及び子宮内膜組織におけるインスリン抵抗性、顆粒膜細胞内の異常なＦＳＨシグナル伝達、及びこれらの複合的症状を抑制又は予防する。
【００６６】
本発明の実施形態はまた、対照細胞と比較してＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現が増加している細胞内で細胞表面受容体によってシグナル伝達を変化させる方法も提供する。当該方法は、このような細胞を本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片に接触させる工程を含み、この工程では、抗体又は抗原結合断片はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質を特異的に認識するとともに、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質を特異的に認識しない。
【００６７】
本明細書に記載した障害の治療に有用な材料を含む製造物品も提供する。本製造物品は、容器、及び容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては例えば、ボトル、バイアル、注射器等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成できる。容器は症状の治療に効果的な組成物を保持し、滅菌アクセスポート（例えば、容器は静脈注射用液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）を備えてもよい。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本明細書に記載の抗ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗体又は抗体断片である。ラベル又は添付文書は、適応症を治療するために組成物を使用することを指示し、組成物を使用するための指針を提供する場合もある。
【００６８】
抗ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗体は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質の診断アッセイ、例えば特定の細胞、組織又は血清中のその発現の検出に有用である。本発明の態様は、被験者のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を診断する方法を提供するものであり、当該方法は、前記被験者から得た生体試料を、配列番号５３、５８、５９、６２、６３又は６５のアミノ酸配列を含む１種以上の抗体に接触させる工程、及び検出したＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の量を基準陰性対照と比較する工程を含む。障害はＰＣＯＳであってもよい。基準値は、罹患していない健康かつ正常な患者から得た試料から取得してもよい。測定値が正常基準値より高い場合、被験者は罹患していると判断し、また測定値が正常基準値と同等か又はそれより低い場合、被験者は罹患していないと判断することが可能である。特定の実施形態では、基準と比較して、試料中のＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡでは少なくとも１．５倍、ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のタンパク質では２〜３倍統計学的に有意な増加が測定されることは、ＰＣＯＳの診断又はＰＣＯＳ診断の支援となる。特定の実施形態では、基準に対するその増加は少なくとも２．０、３．０又は４．０倍であり、この数値は包括的なものであり、小数点第１位までのこれらの間にある数値も含まれる。基準値は、既に疾患又は障害と診断された患者から得た陽性対照の数値であってもよい。この場合、測定値が陽性基準値と同等か又はそれより高いと、被験者は罹患していると判断することが可能である。測定値が、例えば少なくとも統計的に有意な１．５倍の減少と、低い場合、被験者は罹患していないと結論付けることが可能である。いくつかの実施形態では、診断には陽性及び陰性両方の基準値を使用している。被験者が罹患していると判断されれば、本明細書に記載の治療工程又は方法を継続することが可能である。
【００６９】
生体試料の例としては、尿、血液、血漿、血清及び唾液が挙げられるがこれらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、生体試料は、卵巣、子宮内膜、脂肪組織又は骨格筋の生検あるいは外科的標本である。診断用途では、通常、抗体は検出可能な部分で標識する。多数の標識が利用可能であり、当技術分野で公知である（例えば、様々な蛍光又は比色タグ）。本発明の別の実施形態では、抗ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗体は標識する必要がなく、その存在はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗体に結合する標識抗体を用いて検出することが可能である。本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接的サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ法で使用することが可能である。
【００７０】
ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡが検出されれば、このことは当該技術分野で公知の様々な技術によって達成される可能性もある。ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡの存否を判定するか、又はそれを定量するのに適した技術には；ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡに対するプローブもしくはプライマーのハイブリダイゼーション、又は、種々のチップ技術を利用するポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドアレイ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、様々な実施形態では、ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡ又はそのＤＮＡ等価物に対するプローブは固体支持体上に配列及び／又は固定することが可能である。
【００７１】
ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡは直接的に試験してもよく、あるいは例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や定量的リアルタイム（ｑＲＴ‐ＰＣＲ）ＰＣＲ分析などのリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ、又は他のインビトロ増幅法の利用によってインビトロで酵素的に増幅してもよい。増幅反応では、プライマーは、ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２との複合体を形成するように設計し、核酸増幅生成物（すなわちアンプリコン）を得るために使用することが可能である。本発明の方法の様々な実施形態を実行するために当業者は、好適なプライマーを設計し、増幅及び／又はハイブリダイゼーション反応を実行する方法を理解するであろう。一般的に、プライマーは増幅反応に有用であるよう十分な長さを有する必要があり、また一般的に、長さが少なくとも１２塩基であるプライマーはこのような目的に適していると考えられる；しかし、８塩基もの短いプライマーも反応条件によっては使用することが可能である。ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のＲＮＡを検出するために使用するプライマー／プローブは、リアルタイム（ＲＴ）‐ＰＣＲなどの反応で使用するためのリポーター色素形態の蛍光体及び／又は消光部分などの１種以上の検出可能標識と共役させるなど、修飾部分を含むことが可能であり、このことはＲＮＡから増幅したＤＮＡの定量を可能にし、定量は経時的に増幅と同時に行うことが可能となる。１実施形態において、増幅反応にはＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡに特異的な少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブが用いられ、当該プローブでは一方の末端ヌクレオチドは蛍光タグを含むように修飾され、他方の末端ヌクレオチドは蛍光タグから蛍光を消す部分を含むように修飾されている。例えばｑＲＴ‐ＰＣＲにおける使用ではこのようなプローブは、２つのＲＴ‐ＰＣＲプライマーがハイブリダイズする配列の間に存在してその配列に重ならないＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２部分又はその相補体に特異的に結合するよう設計可能である。この設計を利用し、増幅中にポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を介してプローブが分解されるまで蛍光タグからのシグナルを消光させ、この時点で、蛍光ヌクレオチドを消光部分から分離し、そのシグナルは検出可能となる。
【００７２】
必要であれば、ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の測定値を基準値と比較することが可能である。個体から得られた変異体２のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルと比較できる基準値が好適な基準値となり得る。この例としては、ＰＣＯＳなどの診断が求められる特定の状態にない個体から得られる試料が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような基準値には、対応対象（例えば、年齢、性別又は他の人口統計について対応させている）、標準化曲線（単数又は複数）、及び／又は質量、モル濃度、濃度等の、試料から得たＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２の定性又は定量的測定値の実験データを標準化するために使用する公知のＲＮＡ又はタンパク質インプット量などの実験的に設計された対照値が挙げられる。基準レベルはまた、グラフ上の面積として図示してもよい。特定の実施形態では、試料中の変異体２のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が基準を上回る量で測定されたということは、ＰＣＯＳと診断されたということであり、言い換えれば医師によるＰＣＯＳの診断を支援したことになる。特定の実施形態では、基準はＰＣＯＳ莢膜細胞と比較する正常莢膜細胞である。別の実施形態では、基準はＰＣＯＳに罹患していない個人から得たエキソソームを含む試料である。
【００７３】
本発明の例示的な実施形態を更に詳細に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、当然ながら多様に変更可能であることは理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の請求項でのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、限定することを意図していないことも理解すべきである。
【００７４】
数値の範囲が提供されている場合、特段明確に指示の無い限り、前記範囲の上限及び下限の間にあって下限の単位の１０分の１までの各介在数値、及び他の所定の数値又はその所定の範囲の中にある介在数値は本発明に包含されることは理解されているものとする。所定の範囲で限界値が特異的に除外されることを仮定して、これらの比較的狭い範囲の上限及び下限はそれぞれ更に狭い範囲に納めることも可能であり、また本発明に包含もされる。所定の範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、これらの包含される限界値の一方又は両方を排除する範囲もまた本発明に包含される。
【００７５】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用することが可能であるが、代表的な例示的方法及び材料を以下に記載する。
【００７６】
各個別の刊行物又は特許が具体的かつ個別に参照により援用されていることが示すように、本明細書で引用した全ての刊行物及び特許は参照により本明細書に援用され、また、刊行物が引用されている事柄に関する方法及び／又は材料を開示及び説明するために参照により本明細書に援用される。あらゆる刊行物の引用は出願日前にそれが開示されていることを示すためであり、先行発明によるこのような刊行物に本発明が先行する権利はないという承認であると解釈すべきではない。更に、示された刊行物の日付は、実際の公開日とは異なっており、個別に確認する必要がある場合もある。
【００７７】
なお、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されているように、単数形は、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特段の指示が無い限り、複数の対象を含むことを留意されたい。更に、特許請求の範囲は任意の要素を除外するように起草してもよいことを留意されたい。このように、この記述は、請求項の要素の詳述又は「消極的な」限定の使用に関連する「単に」、「のみ」等の排他的用語を使用するための事前説明として役立つように意図している。
【００７８】
本開示を読めば当業者に明らかな通り、本明細書に記載及び説明された個々の実施形態の各々はそれぞれの成分及び特徴を有し、これらは、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態の特長から容易に分離するか、又はそれらと組み合わせることが可能である。引用された方法はどれも、引用されたイベントの順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実施することが可能である。
【００７９】
以下の実施例によって本発明を更に説明する。しかしこれらの実施例及び図面はいかなる場合でも、本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
実施例１．ＰＣＯＳ莢膜表現型を生成するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現
材料及び方法
【００８０】
正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞。ペンシルベニア州立大学医学部の治験審査委員会に承認されたプロトコルの下でインフォームドコンセントを行った後、子宮摘出術を受けた女性の卵胞からヒト内莢膜組織を得た。先行文献に記載の通り［３１］、個々の卵胞を卵巣支質から切除し、０．０５％のコラゲナーゼＩ、０．０５％のコラゲナーゼＩＡ及び０．０１％のデオキシリボヌクレアーゼと共に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地中に分散させた。正常及びＰＣＯＳ被験者の比較的小さい卵胞由来莢膜細胞を比較できるように、単離した卵胞の中から直径３〜５ｍｍのものをサイズ選択した。莢膜細胞は、先行文献に記載された増殖培地（５％のＦＢＳ、５％のウマ血清（ＨＳ）、２％のＵｌｔｒｏＳｅｒ  Ｇ（商標）、２０ｎＭのインスリン、２０ｎＭのセレン、１μＭのビタミンＥ及び抗生物質を含む、ダルベッコイーグル培地（ＤＭＥ）とＨａｍｓ  Ｆ‐１２培地との１：１混合物）を使用しているフィブロネクチンを被覆した皿上で培養した。血清及び成長因子は以下の供給源：ＦＢＳ及びＤＭＥ／Ｆ１２（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、Ｉｒｖｉｎｅ社、カリフォルニア州）；ウマ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ニューヨーク州）；ＵｌｔｒｏＳｅｒ  Ｇ（商標）（Ｒｅａｃｔｉｆｓ  ＩＢＦ社、Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ‐ｌａ‐Ｇａｒｅｎｎｅ、フランス）から取得し；他の化合物はＳｉｇｍａ（登録商標）（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。酸化的損傷を防止するため、酸素分圧を低下させ（５％のＯ２、９０％のＮ２及び５％のＣＯ２）、酸化防止剤（ビタミンＥ及びセレン）を補って細胞を培養した。
【００８１】
これらの研究で使用された莢膜細胞培養物は先行技術で記載され、機能的に特徴付けされている［１５、１７、３２］。ＰＣＯＳ莢膜と正常莢膜との比較実験は、適合した年齢の被験者の適合したサイズの卵胞から単離した第４継代（３１〜３８細胞数倍加）莢膜細胞を使用して行った。上記の培地中、第２継代細胞の凍結ストックから増殖させた第４継代細胞を使用すると、同一の患者集団から複数の実験が行えるようになった。全ての研究で、少なくとも５人の独立した正常患者及び５人の独立したＰＣＯＳ患者から得た莢膜細胞培養物を試験した。全ての正常及びＰＣＯＳ細胞の継代条件及び分割比は同一であった。
【００８２】
ＰＣＯＳ及び正常卵巣組織は３８〜４０歳の年齢が適合した女性から得た。ＰＣＯＳの診断はＮＩＨコンセンサスガイドライン［１０］に従って行った。これには高アンドロゲン血症、乏排卵症、多嚢胞性卵巣が含まれており、２１‐ヒドロキシラーゼ欠損症、クッシング症候群及び高プロラクチン血症は含まれていない。先行技術で記載しているように［１５、３３］、試験したＰＣＯＳ莢膜細胞標本は全て、年間６回未満の月経の女性、及び血清中総テストステロン又は生物学上利用可能なテストステロンレベルが上昇している女性の卵巣から得た。ＰＣＯＳ卵巣の各々には直径１０ｍｍ未満の複数の皮質下卵胞が含まれていた。対照（正常）莢膜細胞標本は、正常な月経履歴として２１〜３５日の月経周期を有し、高アンドロゲン症の臨床兆候の無い生殖可能な女性の卵巣から取得した。ＰＣＯＳ被験者も正常被験者も手術時にホルモン剤を投与されていなかった。手術の適応症は機能障害性子宮出血、子宮内膜癌及び／又は骨盤痛であった。
【００８３】
ウエスタンブロット分析。第４継代の正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞を半コンフルエント状態になるまで培養し、無血清培地に移し、フォルスコリン存在下及び非存在下で２４時間置いた。処置後に莢膜細胞を、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、０．１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭのジチオスレイトール、０．２ｍＭのベンズアミジン、１μＭのミクロシスチン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡを含む氷冷した改変ＲＩＰＡ緩衝液（３０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＦ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のデオキシコール酸、１．０％のノニデットＰ‐４０、０．１％のＳＤＳ）に回収した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いて測定した。１０％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥで全細胞溶解物（３５μｇ／Ｉｎ）を分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、先行技術で記載しているように［３２］［３４］、ウエスタン分析を実施した。
【００８４】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の免疫組織化学的局在。ＤＥＮＮＤ１Ａの免疫組織化学的分析は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的であることが見出されたＳｉｇｍａ社のＤＥＮＮＤ１Ａ抗体を使用し、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ  Ｓｔａｉｎｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、トゥーソン、アリゾナ州）によって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織の厚さ４〜５μｍの切片上で実施した。染色プロトコルは簡単に、１：３００希釈した一次抗体中での３０分間のインキュベーション、その後のＶｅｎｔａｎａ  ＯｍｎｉＭａｐ  ＤＡＢ抗ウサギ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、トゥーソン、アリゾナ州）での検出及び可視化から構成されている。副腎皮質のＦＦＰＥ試料を陽性組織対照として使用した［３４］。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２免疫組織化学のカラー画像は、ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒらによって公開されている［３４］。
【００８５】
定量的ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２、ＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１の１工程超高速ｑＲＴ‐ＰＣＲ。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１及びＶ２、ＣＹＰ１７Ａ１ならびにＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ量の定量は、５０〜１００ｎｇの総ＲＮＡ／チューブ及び２００ｎＭの終濃度のフォワード及びリバースプライマーならびに１００ｎＭのプローブを使用し、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｅｐ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）ＩＩＩ  Ｕｌｔｒａ  Ｆａｓｔ  ｑＲＴ‐ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）によって測定した。使用した特定のプライマー及びプローブ配列は以下に詳細に提供する。「ＺＥＮ」部分は、例示的なの位置にあるプローブとして示されているが、必要であればプローブ内の他の位置に配置することも可能である。遺伝子特異的な１工程ＰＣＲは、Ｍｘ３０００ｐＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒシステム（ストラタジーン社）で、この装置の取扱説明書に従って、各ｍＲＮＡ試料及び一連の希釈物について二重に実施した。莢膜ＲＮＡテンプレートの任意の数値は各連続的希釈物（すなわち、１０００、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１ｎｇ）に割り当て、Ｃｔ値（ｙ軸＝Ｃｔ、ｘ軸＝数値、対数スケール）に対してプロットし、標準曲線を作成した。標準曲線の傾き及びｙ切片に基づいて、各未知数値を任意の数値に割り当てた。各反応の標準化にＴＢＰ値を使用するために、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）に対して同じプロセスを実施した。各未知数値の平均目標値を、各未知数値の平均ＴＢＰ値で割り、各試料の目標の基準値を求めた［３４］。
【００８６】
プライマー及びプローブのセット
ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２に特異的なｍＲＮＡプライマー及びプローブのセット［２５］は、３’ＵＴＲ、フォワードプライマー（５’ＧＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＡＧＴＧＴＧＴ３’）（配列番号３４）、リバースプライマー（５’ＧＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＧＧＡＧＴＧＴＧＴ３’）（配列番号３５）、プローブ（５’／５６‐ＦＡＭ／ＣＣＡＡＡＧＡＧＣ／ＺＥＮ／ＣＧＧＴＧＴＣＴＧＡＴＡＡＴＣＣＣＡ／３ｉＡ３ＡｂｋＦＱ／‐３’）（配列番号３６）に特異的である。
第２の確認用ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２に特異的なｍＲＮＡプライマー及びプローブのセットは、３３ａａ３’ＣＤＳフォワードプライマー（５’ＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧ３’）（配列番号３７）、リバースプライマー（５’ＣＣＧＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＴＧＣＴＴ３’）（配列番号３８）、プローブ（５’／５６‐ＦＡＭ／ＡＧＣＣＣＴＧＡＧ／ＺＥＮ／ＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡ／３ｉＡ３ＡｂｋＦＱ／‐３’）（配列番号３９）に特異的である。
ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体１に特異的なｍＲＮＡプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー（５’ＧＧＡＴＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＡＡＡＣＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧ３’）（配列番号４０）、リバースプライマー（５’ＣＡＣＡＡＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＡ３’）（配列番号４１）、プローブ（５’／５６‐ＦＡＭ／ＡＴＧＧＣＣＣＧＡ／ＺＥＮＣＣＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＡ／＃ＩＡ３ＢｋＦＱ／‐３）（配列番号４２）
ＣＹＰ１７のｍＲＮＡプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー（５’‐ＧＧＣＣＴＣＡＡＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＴＡＧＡ‐３’）（配列番号４３）、リバースプライマー（５’‐ＣＴＴＣＴＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡ‐３’）（配列番号４４）、プローブ（５’６‐ＦＡＭ‐ＴＣＧＣＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＡＡ ＧＧＧＴＡＴＣ‐３’ＢＨＱ‐１）（配列番号４５）
ＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー（５’ＧＡＧＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＡＣＡＣＡ‐３’）（配列番号４６）、リバースプライマー（５’‐ＴＧＡＣＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＣＧＴＴ‐３’）（配列番号４７）、プローブ（５’６‐ＦＡＭ‐ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡ‐３’ＢＨＱ‐１）（配列番号４８）
ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡプライマー及びプローブのセット、標準化のための各ｃＤＮＡ試料についてＴＢＰも測定した。フォワードプライマー（５’‐ＣＡＣＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣ‐３’）（配列番号４９）、リバースプライマー（５’‐ＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＴ‐３’）（配列番号５０）、プローブ（５’ＪＯＥ‐ＴＧＴＧＣＡＣＡＧＧＡＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡ‐３’ＢＨＱ‐１）（配列番号５１）。
【００８７】
ステロイド生合成の定量。 デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、１７‐ヒドロキシプロゲステロン（１７ＯＨＰ４）、テストステロン（Ｔ）及びプロゲステロン（Ｐ４）のＥＬＩＳＡは、有機溶媒抽出せずに、ＤＲＧ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（スプリングフィールド、ニュージャージー州）製のキットを使用してメーカープロトコルに記載されているように実施し、細胞数によって標準化した。
【００８８】
エキソソームＲＮＡ抽出及び精製。ペンシルベニア州立大学医学部の治験審査委員会に承認されたプロトコルの下でインフォームドコンセントを行った後、正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞について上述した同一の臨床基準を利用して正常女性及びＰＣＯＳの女性から日中の尿試料を得た。尿試料を回収し、処置まで４℃で静置した後、１５ｍＬチューブに分注し、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｔ２１  Ｔａｂｌｅ  Ｔｏｐ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅのスイングバケット中、３００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、微粒子状物質を除去した。その後、上清を２０００ｇ、４℃で１０分間連続的に遠心分離し、細胞残屑を取り除き、上清を１７×１００ｍｍ培養チューブに移し、フロア型Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｊ‐Ｅ遠心分離機を使用して１２，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。この最終的な透明上清を−８０℃で凍結し、Ｎｏｒｇｅｎ（登録商標）（Ｔｈｏｒｏｌｄ社、カナダ）製の「尿エキソソームＲＮＡ単離キット」の改変プロトコルを利用して抽出する。得られたＲＮＡは、Ｎａｎｏ‐ｄｒｏｐを用いて定量化する。その後、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡはｑＲＴ‐ＰＣＲで定量し、５ＳのｍＲＮＡ量を用いて標準化した［３４］。
【００８９】
複製欠損アデノウイルス感染。これらの研究のため、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス（ｈＤＥＮＮＤｌＡ．Ｖ２‐ｐＡＤｅｎｏＧ）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社（バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）から入手し、これはＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２をコードするｐＣＭＶ６‐ＸＬ４プラスミドからＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２をＯｒｉｇｅｎｅ社（ロックビル、メリーランド州）製のｐＡＤｅｎｏＧにクローニングすることによって構築した［３４］。対照としての空のＮＵＬＬ非発現アデノウイルス（ｐＡｄｅｎｏＧ  Ｎｕｌｌ）もＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社（バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）から入手した［３５〜３７］。これらの組換えアデノウイルスを繁殖し、ＨＥＫ２９３Ｔの単層細胞内で増殖させ、Ｖｉｒａｂｉｎｄ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて精製し、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｔｉｔｅｒ  Ｅｌｉｓａ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で滴定した。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２及び対照としての空のＮＵＬＬ非発現アデノウイルス（ｐＡｄｅｎｏＧ  Ｎｕｌｌ）の両方を用いて、先行技術の記載の通りに正常莢膜細胞を感染させた［３４］［３８］。アデノウイルス感染には、第４継代莢膜細胞を７５％コンフルエントの状態まで培養する工程、リン酸緩衝生理食塩水で細胞をすすぐ工程、及び通常の治療量の５０％の無血清培地中で６０分間、細胞上にアデノウイルスを層形成させる工程が含まれる。次いで、示したように、処置する場合としない場合において細胞を無血清培地中で培養した。
【００９０】
正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞の一過性トランスフェクション。正常周期女性及びＰＣＯＳの女性から単離したヒト莢膜細胞を先行技術の記載の通りにトランスフェクトした［１７、２２、３９］。トランスフェクションの１時間前に、２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ及び２％の熱不活性化ウシ血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社、アトランタ、ジョージア州）を含むＤＭＥ高グルコース培地に細胞を移し、３７℃で３％ＣＯ２及び９５％周囲空気のインキュベーターに移した。リン酸カルシウム沈殿物には２μｇ／ディッシュのルシフェラーゼプラスミド、及び０．１μｇ／ディッシュのβ‐ガラクトシダーゼｐＳＶβ‐ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）の発現ベクターが含まれ、各３０ｍｍウェルに供されている。トランスフェクション後、細胞を１５&#8203;&#8203;％グリセロール／ＨＢＳＳで、続いてＰＢＳですすぎ、ビヒクル又は１０μＭのフォルスコリンを含むトランスフェクション培地で４８時間処理した。細胞を、トリプシンを用いて回収し、ペレット化し、リポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に再懸濁した。ルシフェラーゼ活性はＳｉｒｉｕｓ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｚｙｌｕｘ社、オークリッジ、テネシー州）で、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって測定した。β‐ガラクトシダーゼ活性は化学発光アッセイＧａｌａｃｔｏ‐Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｔｒｏｐｉｘ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）で測定し、トランスフェクション効率の標準化のために利用した。本実施例の文脈において特に断らない限り、４人以上の個々の正常対照患者及び４人以上の個々のＰＣＯＳ患者から単離した莢膜細胞にトランスフェクションを３重に行った。
【００９１】
統計的分析。データを提示し、３重に実施した平均値±ＳＥＭとして本実施例に記載している。個々の患者からｑＲＴ‐ＰＣＲ、ステロイド及びトランスフェクション分析の結果を収集し、Ｐｒｉｓｍ５．０ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用してＡＮＯＶＡを実施した。複数の比較のため、Ｂｏｎｉｆｅｒｒｉ法によってＰ値を求め、このとき有意差はＡＮＯＶＡにより示した［３４］。
【００９２】
ＤＮＡ抽出。個々の正常周期の女性（ｎ＝６）及びＰＣＯＳ女性（ｎ＝６）から単離して増殖させた莢膜細胞培養物からＤＮＡを抽出した。凍結莢膜細胞培養プレートを−８０℃から戻し、１Ｍのトリス‐ＨＣｌ  ｐＨ８．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）を０．１０μＬ、０．５ＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）を０．１０μＬ、１０％ＳＤＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、フェアローン、ニュージャージー州）を０．０２μＬ、５ＭのＮａＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）を０．０４μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）社、カールスバッド、カリフォルニア州）を０．０１μＬ、及び水を０．８２ｍＬ含む１ｍＬの溶菌液を各プレートに添加した［３４］。溶液中、プレートから細胞を掻き取り回収した。細胞を含む溶菌液を１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに移し、これをチューブローテーター中、５５℃で一晩インキュベートした。試料を１２，０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。約４００μＬの試料を、５００μＬのイソプロピルアルコールを含む１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、数回上下転倒した後、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを７０％エタノールで２回洗浄し、１ＸのＴｒｉｓ‐ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏｒＲｅａｇｅｎｔｓ社、フェアローン、ニュージャージー州）を４００μＬ含むマイクロ遠心チューブに移した。チューブをチューブローテーター中、５５℃で２時間インキュベートし、ＤＮＡを溶液に溶解した［３４］。
【００９３】
全エキソーム配列決定。ＤＮＡ試料は、ＢＧＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）と共同のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００シーケンシングを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ５１Ｍキャプチャーキットを用いて、１００Ｘカバレッジで１億リード数の全エキソーム配列決定に供した。
【００９４】
エキソーム配列分析。読み取られた配列はＢＧＩの参照ゲノム（ヒトｈｇ１９）に整合させた［３４］。変異体呼び出し及びデータ作成のまとめはＢＧＩに従って行った。データの視覚化及び呼び出された変異体の同定はＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒ）ソフトウェアを用いて行った［４０］。更に分析するため、正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞試料から、マイナーアレルに関する支持体数が１５未満（独自にマッピングした塩基の数）である変異体のみを選択した。ＤＥＮＮＤ１ＡにおけるＳＮＰを同定し、それらのマイナーアレル出現頻度を計算した。データを表１に示す［３４］。
【００９５】
表１は、個々の正常周期女性（ｎ＝６）及びＰＣＯＳの女性（ｎ＝６）から抽出したＤＮＡの全エキソーム配列分析によって同定したＤＥＮＮＤ１Ａ変異体を示す：表には、以前にｄｂＳＮＰでリストされ、同定されたＳＮＰのｒｓ識別番号に付随した変異体、染色体の位置、遺伝子変異体の位置／機能、ヒト参照ゲノムＨｇ１９の参照アレルがリストされている。本発明者らの試料一式（６つの正常試料、６つのＰＣＯＳ試料）におけるＳＮＰのマイナーアレル出現頻度を計算し、存在する場合は、欧州‐米国人口におけるアレル出現頻度と比較した［３４］。
表１：個々の正常周期女性及びＰＣＯＳ女性から抽出したＤＮＡの全エキソーム配列分析によって同定したＤＥＮＮＤ１Ａ変異体
【表１】
2017501979.tif 000009
【００９６】
エキソームのデータ比較。 本発明者らのウエスタン分析によって同定されたＤＥＮＮＤ１Ａ変異体のマイナーアレル出現頻度は、オンラインデータベース  ―  Ｅｘｏｍｅ  ６５００を用いて、集団におけるこれら変異体のアレル出現頻度と比較した［３４］。本研究の莢膜細胞試料は西欧系の患者から抽出したので、欧州‐米国人口における出現頻度と比較した［３４］。
結果
【００９７】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質発現はＰＣＯＳ莢膜細胞で増加する。ＤＥＮＮＤ１Ａの代替的にスプライシングされた形態が正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞で示差的に発現されているか否かを調べるため［３４］、半コンフルエント状態になるまで培養し、無血清培地に移し、２０μＭのフォルスコリンの存在下及び非存在下で２４時間処理した正常及びＰＣＯＳ女性由来単離莢膜細胞から得た全細胞抽出物についてウエスタンブロット分析を行った。中間Ｎ末端ＤＥＮＮＤ１Ａ抗体（Ｓｉｇｍａ）を利用し、本発明者らはＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１に対応する約１１２ｋＤのバンド、及びＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に対応する６２ｋＤのバンドを予測した。図１Ａに示すように、代表的なウエスタンブロット分析から、正常莢膜細胞と比較して、基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下で処理したＰＣＯＳ莢膜細胞における６２ｋＤのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の増加が実証された。しかし、１１２ｋＤのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１はＰＣＯＳ莢膜細胞内では有意に増加しなかった。図１Ｂでは、それぞれ５人の正常及びＰＣＯＳ被検者から単離した莢膜細胞から回収した全細胞溶解物の累積的分析から、対照条件及びフォルスコリン刺激条件下の両方の正常莢膜細胞と比較して、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質はＰＣＯＳ莢膜細胞内で増加することが実証された（＊、Ｐ＜０．０１）。フォルスコリン処理は正常又はＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質蓄積に影響を与えるとは思われなかった。対照的に、正常及びＰＣＯＳの莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１の累積的分析から、正常細胞においてフォルスコリン処理によってＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質レベルが増加（＊、Ｐ＜０．０１）したことが分かった（図１Ｃ）。また、フォルスコリン刺激ＰＣＯＳ莢膜細胞において、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１は正常細胞と比較して有意に減少した。対照条件及びフォルスコリン刺激条件下の両方のＰＣＯＳ莢膜細胞でＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２／Ｖ１タンパク質の比率が減少（＊＊、Ｐ＜０．０１）した（図１Ｄ）［３４］。Ｎ末端に特異的なＡｂｃａｍ社の抗体を用いて実施したウエスタン分析で同様の結果が得られ、ＤＥＮＮＤ１Ａウエスタンデータのペプチド内配列に対するＳｉｇｍａ社の抗体を定量し、正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞において有意差がなく、フォルスコリン処理で調節もされない総ｍＴＯＲによって標準化した。アクチン及びＧＡＰＤＨは、莢膜細胞内でフォルスコリンによって調節され、正常及びＰＣＯＳ細胞内で示差的に発現するので、ウエスタンを標準化するために利用できない。
【００９８】
ウエスタン分析はまた、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的な２１アミノ酸ペプチド（ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ）（配列番号６）に対して生成されたウサギポリクローナル抗体の効果を評価するためにも行った。正常及びＰＣＯＳ女性から単離し、増殖させ、無血清培地中、２０μｍのフォルスコリンの存在下及び非存在下で２４時間処理した莢膜細胞から得た全細胞抽出物を使用してウエスタンブロット分析を行った。図１Ｅに示すように、代表的なウエスタンブロット分析から、基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下で処理したＰＣＯＳ莢膜細胞における６２ｋＤのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の増加が実証された。これらの実験では、タンパク質負荷を総ｍＴＯＲによって標準化した。これらのデータは、Ｎ末端ＤＥＮＮＤ１Ａ抗体を用いた図１Ａに示した並行したウエスタンブロット分析と一致している。図１Ｆに示すように、代表的なウエスタンブロット分析から、基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下で処理したＰＣＯＳ莢膜細胞における６２ｋＤのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の増加が実証された。図１Ｆでは、それぞれ４人の正常患者及びＰＣＯＳ患者から単離した莢膜細胞から採取した全細胞溶解物の累積的分析から、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質は対照条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下の正常莢膜細胞と比較してＰＣＯＳ莢膜細胞で優位に増加していることが実証された（＊、Ｐ＜０．０１）。フォルスコリン処理が正常又はＰＣＯＳ莢膜細胞中のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質蓄積に影響を与えるとは思われなかった。
【００９９】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２免疫組織化学染色は卵巣莢膜区分内で増強する。卵巣中のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の局在を更に検討するため、正常周期及びＰＣＯＳ患者集団から得た卵巣組織のパラフィン包埋ブロックならびにＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的な抗体を利用した［３４］。図２Ａに示すように、免疫染色は卵巣の莢膜区分内で際立ち（４Ｘ）、正常卵巣内の莢膜細胞と比較してＰＣＯＳ莢膜中で増加した（１０Ｘ）。図２Ｂでは、ＰＣＯＳ莢膜細胞及び顆粒細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２染色を示す（４０Ｘ）。図２Ｂに示すように（１００Ｘ、雑誌「Ｏｉｌ」）、主にＰＣＯＳ莢膜核、細胞質及び細胞膜で染色される［３４］。
【０１００】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ量は、正常莢膜細胞と比較してＰＣＯＳ莢膜細胞で増加し、ＰＣＯＳ莢膜細胞によって増加したアンドロゲン生成と相関する。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ量は、２０μＭのフォルスコリンの存在下及び非存在下で処理した６人の正常患者及び６人のＰＣＯＳ患者から単離した莢膜細胞において検討し（図３Ａ）、ＱＲＴ‐ＰＣＲ分析で定量し、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ｍＲＮＡを用いて標準化した。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡは、正常細胞と比較して、基本条件下及びフォルスコリン刺激条件下でＰＣＯＳ莢膜細胞において有意に増加した。フォルスコリン刺激に応答したＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ蓄積の有意な増加はなかった。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡがアンドロゲン生合成の増加に関連しているか否かを検討するため、本発明者らは、同一条件下で、適合した６つの正常莢膜細胞標本及び６つのＰＣＯＳ莢膜細胞標本中のＤＨＥＡ蓄積を調査した。図３Ｂに示すように、ＤＨＥＡ合成が低度である正常莢膜細胞はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡを減少させ、一方で、ＰＣＯＳ莢膜細胞内の基準条件及びフォルスコリン刺激条件下ＤＨＥＡ生成の増加はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ量増加と関連している［３４］。
【０１０１】
尿エキソソームＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡはＰＣＯＳ女性で増加する。エキソソームは、血液や尿中に流れ込む核酸豊富な小型の小胞であり、個別化医療及び臨床診断で使用するためのＲＮＡの安定した供給源を提供する。そこで、ＰＣＯＳ莢膜細胞内に増加したＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２が、ＰＣＯＳ女性におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡ全身蓄積の増加を反映しているか否かを検討するため、複数の正常周期女性、及び良好に特徴化されたＰＣＯＳ女性由来の日中尿試料から単離したエキソソームｍＲＮＡを調査した。「材料及び方法」に記載のように、正常周期女性及びＰＣＯＳ女性の日中の尿サンプルから尿エキソソームｍＲＮＡを単離し、調製した。図４に示すように、ＰＣＯＳ莢膜細胞でのｑＲＴ‐ＰＣＲと同様、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡは、正常周期女性と比較してＰＣＯＳから単離した尿エキソソーム中で有意に増加する［３４］。
【０１０２】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の強制的発現は、正常莢膜細胞のステロイド生成を増加させる。ヒトＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２を発現するアデノウイルスを用いて、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の発現増加によって正常莢膜細胞はアンドロゲン及びプロゲステロン生成増加のＰＣＯＳ表現型に変換されるという仮説を検証した。これらの実験では、正常莢膜細胞を、０．３、１．０、３．０及び１０ｐｆｕ／細胞の空のアデノウイルス（Ｎｕｌｌ‐ｐＡｄｅｎｏＧ）又はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現アデノウイルス（ｈＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２‐ｐＡＤｅｎｏＧ）に感染させ、無血清培地中で２０μＭのフォルスコリンの存在下又は非存在下で処理した。治療の７２時間後、培地中のＤＨＥＡを定量した。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス感染は全ての用量で、対照アデノウイルスと比較してフォルスコリン刺激ＤＨＥＡ生成を有意に増加させた（図５Ａ）。その後の実験では、数人の個々の正常女性のから得た莢膜細胞を３．０ｐｆｕの対照アデノウイルス又はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２を発現するアデノウイルスに感染させ、それによるＤＨＥＡ（図５Ｂ）、１７ＯＨＰ４（図５Ｃ）、Ｔ（図５Ｄ）及びＰ４（図５Ｅ）への効果を調べた。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス感染は、対照アデノウイルスと比較して、基本条件の１７ＯＨＰ４、Ｔ、及びＰ４蓄積を有意に増加させた。また、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス感染は、対照アデノウイルスと比較してフォルスコリン刺激したＤＨＥＡ、１７ＯＨＰ４、及びＰ４を有意に増加させた。これらの実験では、ウエスタン分析によって、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質は強制的発現後に増加することが確認された（データは示していない）［３４］。従って、通常の莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の強制的発現によって、細胞はアンドロゲン及びプロゲスチン生合成が増加するＰＣＯＳ表現型に変換された［１５、１６、３４］。
【０１０３】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の強制的発現は、正常莢膜細胞内のＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現を増加させる。ＣＹＰ１７及びＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ蓄積に対するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現の効果を検討するため、第４継代正常莢膜細胞の培養物を、３ｐｆｕのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス又はＮｕｌｌアデノウイルスに感染させ、２０μＭのフォルスコリンの存在下又は非存在下で１６時間処理した。処理後、ＲＮＡを回収し、ＣＹＰ１７及びＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ量を定量し、ＴＢＰ量によって標準化した。フォルスコリン刺激条件下での３ｐｆｕ／細胞のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２感染後、対照アデノウイルスでの感染と比較してＣＹＰ１７Ａ１のｍＲＮＡ（図６Ａ）及びＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ（図６Ｂ）の両方で蓄積が有意に増加した。これらの知見はまた、Ｏｒｉｇｅｎｅ社（ロックビル、メリーランド州）から入手したＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現プラスミド（ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２／ｐＣＭＶ‐ＸＬ４）による正常莢膜細胞のトランスフェクション［３４］、ならびにその後のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２レンチウイルス粒子感染を利用して確認した（データは示していない）。
【０１０４】
ＣＹＰ１７Ａ１転写に対するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の効果を検討するため、リン酸カルシウム法によって正常莢膜細胞を、ヒトＣＹＰ１７Ａ１遺伝子の５’隣接領域の−７７０／＋４４を含むｐＧｌ３ルシフェラーゼリポータープラスミド（−７７０  ＣＹＰ１７Ａ１／ＬＵＣ）でトランスフェクトした［１７、２２、３４］。トランスフェクション後、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス又は対照アデノウイルスで細胞を１時間かけて感染させ、無血清培地中、２０μＭフォルスコリンの存在下及び非存在下でアデニル酸シクラーゼの活性化剤で処理した。２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクションは３重に行い、β‐ガラクトシダーゼによってトランスフェクション効率について標準化した。図６Ｃから、３ｐｆｕ／細胞のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アデノウイルス感染は、対照アデノウイルスと比較して、基本条件及びフォルスコリン刺激条件両方の−７７０ＣＹＰ１７Ａ１／ＬＵＣプロモーター活性を増加させることが分かる［３４］。
【０１０５】
ＰＣＯＳ莢膜細胞においてＣＹＰ１１Ａ１発現を増加させる近位ＣＹＰ１１Ａ１プロモーターの−１６０／−９０ｂｐ要素を含むＣＹＰ１１Ａ１のｐＧｌ３リポーター構築物（−１６０／−９０  ＣＹＰ１１Ａ１／ＬＵＣ）を用いて、莢膜細胞におけるＣＹＰ１１Ａ１転写に対するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の効果を調査した。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２／ｐＣＭＶ‐ＸＬ４の存在下、又はｐＣＭＶ‐ＸＬ４の非存在下において、正常莢膜細胞を−１６０／−９０のＣＹＰ１１Ａ１／ＬＵＣプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼを測定した。図６Ｄに示すように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２は、空のプラスミドと比較して、フォルスコリンで刺激した−１６０／−９０  ＣＹＰ１１Ａ１／ＬＵＣプロモーター活性を増加させた。これらのデータから、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現増大に起因する莢膜細胞ステロイド生成の増加は、ＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子の転写活性化に少なくとも部分的に起因していることが示唆されている［３４］。
【０１０６】
ＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡのノックダウンはＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１発現、ならびにアンドロゲン及びプロゲステロン生成を減少させる。ＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡレベルに対する内因性ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡのノックダウン効果を測定するため、サイレンシングＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｓｈＲＮＡプラスミドをＰＣＯＳ莢膜細胞にトランスフェクトし、基準条件下及びフォルスコリン刺激条件下のＣＹＰ１７Ａ１のｍＲＮＡをｑＲＴ‐ＰＣＲによって評価した。これらの実験では、第４継代ＰＣＯＳ莢膜細胞をｐＲＳＶ‐スクランブルプラスミド又はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的プラスミド（ｐＳＶ‐ｓｈＲＮＡ１又はｐＲＳＶ‐ｓｈＲＮＡ２）でトランスフェクトした。 トランスフェクションから６時間後、２０ μＭのフォルスコリンの存在下及び非存在下で細胞を処理し、その２４時間後、全ＲＮＡを回収し、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１１Ａ１及びＴＢＰのｍＲＮＡ量を測定した。図７Ａに示すように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ２レトロウイルスプラスミドによって、ＰＣＯＳ莢膜細胞における基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下にあるＣＹＰ１７Ａ１のｍＲＮＡ蓄積が有意に阻害された。また、両ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｓｈＲＮＡプラスミドは、ＰＣＯＳ莢膜細胞におけるフォルスコリンで刺激したＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ（図７Ｂ）も有意に阻害した［３４］。これらの実験では、ウエスタン及びｑＲＴ‐ＰＣＲ分析から、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質はＤＥＮＮＤ１ＡのｓｈＲＮＡトランスフェクション後に有意に減少することが確認された［３４］。
【０１０７】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的なサイレンシングｓｈＲＮＡはＰＣＯＳ莢膜細胞でＣＹＰ１７Ａ１プロモーター機能（すなわち転写）を阻害するか否かを評価するため、並行した研究を行った。ｐＧＬ３中のルシフェラーゼ遺伝子に融合した−２３５／＋４４のＣＹＰ１７Ａ１プロモーターを含むＣＹＰ１７Ａ１ルシフェラーゼリポータープラスミド（−２３５のＣＹＰ１７Ａ１／ＬＵＣ）でＰＣＯＳ莢膜細胞をトランスフェクトした。サイレンシングＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｐＲＶ‐ｓｈＲＮＡ１又はｐＲＶ‐ｓｈＲＮＡ２をコードするスクランブルｐＲＶ発現ベクター又はプラスミドもトランスフェクション混合物に添加した。トランスフェクションから６時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、２０μＭのフォルスコリンの存在下及び非存在下、無血清培地中で処理した。２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。これらの実験の結果から、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｓｈＲＮＡ１のトランスフェクションは、スクランブルｓｈＲＮＡと比較して、ＰＣＯＳ莢膜細胞内で基本条件及びｃＡＭＰ依存条件下のＣＵＰ１７Ａ１リポーター活性を阻害することが示された。ＰＣＯＳ莢膜細胞において基本条件及びフォルスコリン刺激条件下の−２３５のＣＹＰ１７Ａ１／ＬＵＣプロモーター制御の増加が観察された。図７Ｃに示すように、−２３５ＣＹＰ１７Ａ１／ＬＵＣとサイレンシングＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｓｈＲＮＡ１又はｓｈＲＮＡ２とを同時トランスフェクションすることによって、スクランブルｓｈＲＮＡと比較して、ＰＣＯＳ莢膜細胞内のフォルスコリン依存ＣＹＰ１７Ａ１リポーター活性が有意に減少した［３４］。
【０１０８】
ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子によるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現のサイレンシングはＰＣＯＳ莢膜細胞ステロイド生成を阻害する。ステロイド生合成に対するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のノックダウンの効果を評価するため、Ｔｈｅｒｍｏ／Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製ＧＩＰＺの特注ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｓｈＲＮＡ粒子を利用した。無血清培地中、３００，０００粒子／ウェルのサイレンシングｓｈＲＮＡ  ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２レンチウイルス又は対照非サイレンシングレンチウイルスでＰＣＯＳ莢膜細胞を感染させた［３４］。６時間後、レンチウイルス混合物を除去し、細胞をフォルスコリン存在下又は非存在下の無血清培地に移し、７２時間置いた。サイレンシングｓｈＲＮＡ  ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のレンチウイルスによる感染によって、フォルスコリン刺激１７ＯＨＰ４（図７Ｄ）、ＤＨＥＡ生合成（図７Ｅ）及びＰ４（図７Ｆ）が有意に阻害された。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２レンチウイルス感染後の基本条件でのステロイド生成は阻害される傾向にあったが、レンチウイルス感染実験の計画では、基本条件でのステロイド濃度の正確な評価は除外されていた。
【０１０９】
ウサギポリクローナル抗ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧはＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＤＨＥＡ分泌及びＣＹＰ１７Ａ１のｍＲＮＡを減少させる。ＤＥＮＮＤ１Ａが、細胞外部に付加した抗体に利用できるＤＥＮＮＤ１Ａエピトープを潜在的に形成する細胞膜及びクラスリン被覆ピットに関連していることは公知である。本発明者らは、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的な２１アミノ酸ペプチド（ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ）（配列番号６）に対するウサギポリクローナル抗体を生成した（図１Ｃ〜Ｄ）。このＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧを正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞の培地に添加し、当該ＩｇＧを使用してＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２機能を遮断又は中和し、それによって正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞内のステロイド生合成を改変できるか否かを判定した。これらの実験では、２０μＭのフォルスコリンの存在下又は非存在下で、ＰＣＯＳ莢膜細胞を高濃度のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アイソフォーム特異的ＩｇＧ又は非特異的ＩｇＧで処理した。図８Ａに示すように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧは、約０．２５μｇ／ｍＬのＩＤ５０でフォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ生合成を有意に阻害する。これとは対照的に、非特異的ＩｇＧはＤＨＥＡ生合成に影響を及ぼさなかった［３４］。
【０１１０】
様々な個々の患者から得た正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞において、２０μＭのフォルスコリン存在下及び非存在下での１６時間の処理後に、ＣＹＰ１７Ａ１のｍＲＮＡ（図８Ｂ）及びＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ（図８Ｃ）蓄積に対する０．５μｇ／ｍＬのウサギポリクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ又は０．５μｇ／ｍＬの非特異的ＩｇＧの効果を検討するため、その後の実験を行った［３４］。図８Ｂのデータから、１６時間の処理後、対照条件及びフォルスコリン刺激条件下で、０．５μｇ／ｍＬのＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧはＰＣＯＳ莢膜細胞内のＣＹＰ１７Ａ１のｍＲＮＡ蓄積を有意に阻害することが実証されている。対照的に、正常莢膜細胞では、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧは基本条件下又はフォルスコリン刺激条件下のＣＹＰ１７Ａ１のｍＲＮＡには影響を及ぼさなかった（図８Ｂ）。図８Ｃに示すように、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧは、ＰＣＯＳ莢膜細胞内のフォルスコリン刺激下ＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ蓄積も有意に阻害する一方で、正常莢膜細胞内のＣＹＰ１１Ａ１のｍＲＮＡ蓄積に対しては影響を及ぼさなかった。
【０１１１】
並行した実験では、個々の患者から得た正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞を、０．５μｇ／ｍＬの親和性精製したウサギポリクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ又は０．５μｇ／ｍＬの非特異的ＩｇＧで処理し、７２時間の処理後、基本条件及びフォルスコリン刺激条件下ＤＨＥＡ（図８Ｄ）、１７ＯＨＰ４（図８Ｅ）及びＰ４（図８Ｆ）の生合成を、１細胞当りで測定した。これらの実験結果から、ウサギポリクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧは、正常莢膜細胞に影響を及ぼすことなく、ＰＣＯＳ莢膜細胞内フォルスコリン刺激ＤＨＥＡ（図８Ｄ）及び１７ＯＨＰ４（図８Ｅ）を、対照ＩｇＧと比較して５０％有意に阻害することが示された。
考察
【０１１２】
以上から、正常周期女性及びＰＣＯＳ女性から得て十分に特徴化した莢膜細胞においてＤＥＮＮＤ１Ａ発現を検討するための最初の研究が本発明者らによって実施されたことは明らかである。ＤＥＮＮＤ１ＡのｍＲＮＡのスプライス変異体であるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の発現増加はＰＣＯＳ莢膜細胞の特徴であるという発見から、莢膜細胞機能に関するこの分子の機能的因果関係に関する研究を追及するための基盤がもたらされた［３４］。
【０１１３】
正常莢膜細胞におけるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の強制発現はＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現を増加し、細胞を、増強したアンドロゲン及びプロゲスチン生合成のＰＣＯＳ表現型に変換する。対照的に、ＰＣＯＳ莢膜細胞内のサイレンシングｓｈＲＮＡプラスミド又はレンチウイルスによるＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のノックダウンによって、細胞は、減少したＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現ならびにアンドロゲン及びプロゲスチン生合成の正常表現型に戻る。これらの観察から、ＤＥＮＮＤ１Ａはステロイド生成遺伝子の転写を増強させた後にアンドロゲン生成が増加するシグナル伝達カスケードに関与していることが示唆される。
【０１１４】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２は、クラスリン結合ドメインを有してエンドサイトーシスを促進すると考えられるトランケート型ｃｏｎｎｅｃｄｅｎｎ１である。漢民族のＰＣＯＳに関連する遺伝子座のうち［４１〜４３］、いくつかの遺伝子座はネットワークを定義する可能性のある遺伝子の中に、又はその近傍に位置し、これらには、原形質膜上にある受容体をコードしてクラスリン被覆ピットに内在化されたＦＳＨＲ、ＬＨＣＧＲ及びＩＮＳＲが挙げられ、ここではＤＥＮＮＤ１Ａタンパク質が配置されている［２５、４２、４４］。ＤＥＮＮＤ１ＡのＤＥＮＮドメインはＲａｂ特異的グアニンヌクレオチド交換因子として機能する［２６］。他のＰＣＯＳ  ＧＷＡＳ候補、Ｒａｓ関連タンパク質５Ｂ（ＲＡＢ５Ｂ）はＲａｂ‐ＧＴＰアーゼであり、また、エンドサイト―シスや受容体再生に関与していると考えられており、従って、ＤＥＮＮドメインと相互作用する分子であり得る［４５、４６］。ＲＡＢ５Ｂシグナル伝達はまた、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ成分が関与しているという報告もある［４４〜４７］。理論に束縛されることなく、トランケート型ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２は莢膜及び／又は顆粒膜細胞におけるインスリン又はＬＨ‐受容体代謝回転及び感受性に影響を与え、更に、ＰＣＯＳ女性の卵巣機能及びステロイド生合成に影響を与えることが可能である。ＤＥＮＮＤ１Ａはまた、脂質、特にホスホイノシトール‐３‐リン酸、及び他のエンドサイトーシス／エンドソームタンパク質［２６］に関連していることが分かっており、インスリン及びＬＨ受容体シグナル伝達に関与している可能性がある。あるいは、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２は、遺伝子発現制御において、より直接的な役割を担っている可能性がある。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２は核に転座することも可能であり、別のＧＷＡＳとしてＲＡＢ５Ｂによって簡略化し得るプロセスにより、ＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現の転写活性化に関与する可能性のあるＰＣＯＳ候補が発見された［３４］。
【０１１５】
特異的ウサギポリクローナル、ヒト及びマウスモノクローナル抗ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧを使用し、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２エピトープは細胞外抗体に利用可能であることが本明細書の実施例に示している。ＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１ＡのｍＲＮＡの増強ならびにアンドロゲン生合成はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧによって低減できるという観察から、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に対するヒト化モノクローナル抗体などの生物学的薬剤は、ＰＣＯＳに関連する高アンドロゲン血症、及びインスリン作用に関連する可能性のある他の表現型に有用な治療剤であることが示されている。
【０１１６】
これらの知見から、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子由来のスプライス変異体（ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２）は莢膜細胞ステロイド生成の制御において機能的役割を担っていることが実証されている［３４］。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の過剰発現は、正常莢膜細胞を、ＣＹＰ１７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１遺伝子発現の増加ならびにアンドロゲン及びプロゲスチン生成の増強を特徴とするＰＣＯＳ生化学的表現型に変換するのに十分な量である。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２機能を抑制すると、ＰＣＯＳ莢膜細胞がステロイド生成酵素遺伝子発現及びステロイド生成に関して正常表現型になるよう促進される。ＰＣＯＳの女性の尿中でＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のｍＲＮＡが増加し、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧはＰＣＯＳ莢膜細胞の生化学的特徴を変換してステロイド生成を減少させるという事実から、ＰＣＯＳの非侵襲性検出及びＰＣＯＳの生物学的療法に対するＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的抗体の有用性が示されている［３４］。
実施例２．ファージディスプレイライブラリから単離したＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的なヒト化モノクローナル抗体はＰＣＯＳの治療に有用である。
材料及び方法
【０１１７】
ファージディスプレイスクリーニング。ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的な機能的ヒト化ｍＡＢを得るために、新たに作製されたファージディスプレイＳｃｌ‐２ライブラリ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ニューヨーク）をスクリーニングした［４８〜５４］。抗体及び抗原結合断片はＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質の固有の３３アミノ酸Ｃ末端を標的にするよう意図されている。ＤＥＮＮＤ１Ａ変異体１と２との間で固有の３３アミノ酸ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２配列は：ＮＴＩＡＴＰＡＴＬＨＩＬＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号５）である。パニングには、固有の２１アミノ酸配列セグメント：ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）を利用した。これは、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に対する機能的ウサギポリクローナル抗体を得るために以前に使用した配列である（実施例１参照）。
ファージディスプレイに使用した材料
新たに調整したファージディスプレイＳｃｌ‐２ライブラリ
大腸菌ＴＧ１宿主株
Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ
プライマー：
Ｌ１：５’‐ＴｇｇＡＡＴＴｇＴｇＡｇＣｇｇＡＴＡＡＣＡＡＴＴ‐３’（配列番号５４）
Ｓ６：５’‐ｇＴＡＡＡＴｇＡＡＴＴＴＴＣＴｇＴＡＴｇＡｇｇ‐３’（配列番号５５）
標的：ＣＨ２２  ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２
ウサギ抗Ｍ１３ｐＡｂ‐ＨＲＰ
【０１１８】
初めに、ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）との２種のＤＥＮＮＤ１Ａ変異体２ペプチド‐タンパク質複合体［ＫＬＨ‐及びＢＳＡ‐複合体］を利用し、ファージディスプレイパニングを行い、ペプチド自体に特異的なバインダーを選択した。ペプチド‐ＢＳＡ複合体を直接被覆した後、親和性パニング及びＱＣファージＥＬＩＳＡを行った。結果から、非特異的な濃縮効果は認められないことが分かった。
【０１１９】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ペプチドのビオチン化形態（ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ；配列番号６）を合成し、ストレプトアビジンで事前に被覆したプレートで生物ペプチドを固定することによって表２に記載の通り新規に作成されたファージライブラリを利用し、新たなパニングを実施した。３回目のスクリーニング後に強力な濃縮効果が観察された。トリプシン消化溶出液又は競合溶出液のいずれかから４０個のクローンを選択し、ファージ増幅及びファージＥＬＩＳＡに供した（表３〜４）。
表２．ＣＨ２２  ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アミノ酸配列標的ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）（すなわちビオチン‐ＣＨ２２）のためのヒトファージパニングプロセス
【表２】
2017501979.tif 000010
表３．ＱＣモノクローナルファージＥＬＩＳＡ‐１。ビオチン化ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アミノ酸配列ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）（すなわちビオチン‐ＣＨ２２）に対するヒトＭ１３ＫＯ７モノクローナルファージクローンの反応性
Ｍ１３ＫＯ７ファージ：１０（３）ｃｆｕ／ｍｌ
【表３】
2017501979.tif 000011
表４．ＱＣモノクローナルファージＥＬＩＳＡ‐２。ビオチン化ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２アミノ酸配列ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）（すなわちビオチン‐ＣＨ２２）に対するヒトＭ１３ＫＯ７モノクローナルファージクローンの反応性
【表４】
2017501979.tif 000012
【０１２０】
標的としてビオチン化ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ペプチドＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）を使用し、２種の強力な結合ｓｃＦｖ（クローン１６及び７９）を同定した（表３〜４）。ｓｃＦｖファージクローン１６及び７９の配列分析から、これらのクローンのヌクレオチド及びペプチド配列が同一であることが分かった（図９Ａ〜Ｂ）。ＩｇＧ１のヒト軽鎖（ｐＩｇＧ１‐Ｌ）及び重鎖（ｐＩｇＧ１‐Ｈ）を含むプラスミドにこのｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨをクローニングした（図１０Ａ〜Ｄ）。トランスフェクションの後、これらの構築物はＨＥＫ２９３細胞で発現し、得られたヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１を発現させ、精製した（図１１Ａ〜Ｃ）。要するに、プラスミドベクターを２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから９６時間後に懸濁液培養物を回収した。ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦによって生成物を精製し、０．２μｍ濾紙を使用して濾過した。その後、得られたヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ（Ｖ２  ｈｍＡＢ）（図１１Ｂ）を利用し、正常周期の女性及びＰＣＯＳの女性から単離した卵巣アンドロゲン生成ヒト莢膜細胞を用いて機能試験を実施した（図１２Ａ〜Ｂ及び図１３Ａ）。
結果
【０１２１】
ファージディスプレイの結果。表２に示されるように、強力な濃縮効果は３回目のスクリーニング後に見られた。それに応じて、更なるＱＣ  ＥＬＩＳＡアッセイのために、トリプシン消化溶出液又は競合溶出液のいずれかから４０個のクローンを選択した。トリプシン消化溶出液から得た第１の４０個のクローンをＱＣファージＥＬＩＳＡに供した。表３に示すように、１つの強力な陽性クローン、クローン１６を、いくつかの弱い陽性クローンと共に同定した。競合溶出液から得た第２の４０個のクローンもＱＣファージＥＬＩＳＡに供した。表４に示すように、第２の強力な陽性クローン、クローン７９を、いくつかの弱い陽性クローンと共に同定した。前記２つの強力な陽性クローン及びいくつかの弱い陽性結合クローンでＤＮＡ配列決定を行った。７つの固有のｓｃＦｖを同定した。２つの強力な陽性クローン（クローン１６及び７９）は、同一のｓｃＦｖ配列を有していた（図９参照）。
【０１２２】
可溶性ｓｃＦｖ発現及び可溶性ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ。更なる可溶性ｓｃＦｖ発現及び可溶性ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡのため、強力な陽性ｓｃＦｖ遺伝子（クローン１６及び７９と同一）を可溶性ｓｃＦｖ発現ベクターｐＣＤｉｓｐｌａｙ‐２にクローニングした。表５に示すように、可溶性ｓｃＦｖ‐ＡＰ融合タンパク質を含む大腸菌溶解物を直接被覆したところ、発現が良好に確認された。表６に示すように、ストレプトアビジンを事前に被覆したプレートを介し、ビオチン化ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ペプチドを固定したところ、ｓｃＦｖ‐ＡＰの陽性結合も確認された。
表５．大腸菌溶解物を直接使用する、ファージクローン１６及び７９からの可溶性ｓｃＦｖ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ分析
【表５】
2017501979.tif 000013
表６．ストレプトアビジンを事前に被覆したプレートを介した固定化ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ビオチン化ペプチドを使用するＱＣ可溶性ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡ
【表６】
2017501979.tif 000014
【０１２３】
ファージディスプレイから同定したｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨをＩｇＧ１のヒト軽鎖（ｐＩｇＧ１‐Ｌ）及び重鎖（ｐＩｇＧ１‐Ｈ）を含むプラスミドにクローニングし、配列決定した。図１０Ａ〜Ｄに示すように、これらのクローンの重鎖及び軽鎖のＶＨ及びＶＬはｓｃＦｖのものと同一であった（図９Ａ〜９Ｂ）。ＶＨ及びＶＬ両方のＣＤＲは下線及び括弧で示している。
【０１２４】
組換えヒトＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ１はＰＣＯＳ莢膜細胞におけるＤＨＥＡ生合成を機能的に阻害する。ビオチン化ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の２１アミノ酸ペプチド（ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ）（配列番号６）によるファージディスプレイスクリーニングから得た組換えヒトＩｇＧ１は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２発現の効果を中和し、ＰＣＯＳ莢膜細胞におけるステロイド生合成を減少させることが可能であるか否かを検討するため、用量応答実験を行なった（図１２）。これらの実験では、ＰＣＯＳ莢膜細胞はフォルスコリン非存在下（Ｃ）及び２０μＭのフォルスコリン存在下（Ｆ）で、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２（Ｖ２ｈｍＡＢ）に特異的なヒト組換えモノクローナルＩｇＧ１又は非特異的ＩｇＧ１を高濃度（０．０１〜６μｇ／ｍＬ）で７２時間処理された。図１２Ａに示すように、ＤＨＥ&#8203;&#8203;Ａ生合成には用量依存的減少があった。対照ＩｇＧ１と比較して、Ｖ２ｈｍＡＢはフォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ生合成を約１．８μｇ／ｍＬのＩＤ５０で有意に減少させた（＊、Ｐ＜０．０１）。ＰＣＯＳ莢膜細胞生合成に対する３．０μｇ／ｍｌ及び６．０μｇ／ｍｌの非特異的ＩｇＧ１又はＶ２ｈｍＡＢの効果の試験によって、基本条件及びフォルスコリン刺激下（＊、Ｐ＜０．１）ＤＨＥＡ生合成はＶ２ｈｍＡＢの治療後、対照ＩｇＧ１と比較して阻害されることが分かった（図１２Ｂ）。並行した予備研究では、ヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１も基本条件及びフォルスコリン刺激条件下ＣＹＰ１７ｍＲＮＡ蓄積を阻害した（データは示していない）。
【０１２５】
フォルスコリン非存在下（Ｃ）及び２０μＭのフォルスコリン存在下で７２時間処理した多様な個々の患者由来の正常及びＰＣＯＳ莢膜細胞における、アンドロゲン生合成に対する最大量のヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１（Ｖ２ｈｍＡＢ）（９μｇ／ｍｌ）及び非特異的ＩｇＧ１（９μｇ／ｍｌ）の効果を調査するため、引き続き実験を行なった。図１３Ａに示すように、最大量のＶ２ｈｍＡＢのＩｇＧ１は、ＰＣＯＳ莢膜細胞内でフォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ生合成を有意に（＊、Ｐ＜０．０１）阻害した一方で、正常莢膜細胞内ではＤＨＥＡ蓄積に対する影響は非常に少なかった。
【０１２６】
ＤＨＥＡ生合成に対するウサギＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ポリクローナル（図８）及びヒト組換えＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１（図１２Ａ〜Ｂ及び１３Ａ）の効果の比較によって、Ｃ末端ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２の２１アミノ酸ペプチドに対して生成された両抗体は、対照ＩｇＧと比較してＰＣＯＳ莢膜細胞における基本条件及びフォルスコリン刺激条件下アンドロゲン生合成を減少させることが実証された（図１３Ｂ）。
実施例３．ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的なマウスモノクローナル抗体はＰＣＯＳの治療処置のためヒト化モノクローナルを構築する機能的ＩｇＧ１のＣＤＲ配列情報を提供する。
材料及び方法
【０１２７】
ＤＥＮＮＤ１Ａペプチドに対するマウスモノクローナル抗体生成。標準的手順によって、ＤＥＮＮＤ１ＡペプチドＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ（配列番号６）に対するマウスモノクローナル抗体を調製した［５５］。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＲＩＢＩアジュバント中のＫＬＨ結合ペプチドを用いて免疫化した。免疫化は、１回の免疫化につきマウス１体当たり１箇所に０．０５ｍｌを皮下及び腹腔内の両方に行った。免疫化は隔週で３回行い、最後の追加免疫は、生理食塩水中のＫＬＨペプチドとして与えた。最終追加免疫から３日後、マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、全採血後、脾臓及びリンパ節を切除した。免疫細胞の単一細胞懸濁液を調製し、Ｐ３Ｘ６３‐Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを生成した。当該ペプチド及びＢＳＡペプチドへの反応性についてハイブリドーマ培養物の上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、陽性培養物を増殖及びクローニングするために単離した。ＥＬＩＳＡで反応性抗体を生成する陽性クローンは、Ｓｉｇｍａ社の無血清培地を使用した無血清条件に適合させ、次いでＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＣＥＬＬｉｎｅ装置を使用して高力価抗体を生成した。その後、抗体を含有する培養物をプロテインＡ／Ｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、イリノイ州）を用いて精製し、種々の抗体の検出及び機能アッセイに使用した。
【０１２８】
マウスモノクローナル抗体パネルのＥＬＩＳＡ結合活性。 融合物の一次スクリーニングで陽性と見られた選択モノクローナル抗体の結合特性を評価するためにＥＬＩＳＡを実施した。基本的な方法としては、重炭酸塩結合緩衝液（ｐＨ９．６）中の種々のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２抗原供給源（ＫＬＨペプチド；ＢＳＡペプチド、遊離ペプチド、対照ペプチド及びＢＳＡ）１ｕｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレートウェルを被覆し、その後、ハイブリドーマ細胞培養液上清の単一希釈物を二重に試験する。４０５ｎｍでの光学密度の読み取りをプレートリーダーから確立し、各抗原及び各ハイブリドーマ上清についてＯＤ読み取り値の平均±ＳＥＭをプロットした。限界希釈法によって数種の反応性ハイブリドーマをクローニングし、アイソタイプによって特徴化し、ＥＬＩＳＡで再試験した。ＥＬＩＳＡによるマウスモノクローナル抗体の結合プロファイルの例は図１４に示す。いくつかのモノクローナル抗体は、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２遊離ペプチド（配列番号６）、ならびにＰ１Ｂ２、Ｐ１Ｃ５、Ｐ４Ｆ１、Ｐ５Ｆ９及びＰ２Ｆ５などのＫＬＨ及びＢＳＡ標識化ペプチドに特異的に反応性を示すことが特定された。
【０１２９】
マウスＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２モノクローナル抗体のＲＮＡ抽出及び配列分析。ＥＬＩＳＡ陽性モノクローナルハイブリドーマ細胞を遠心分離によってペレット化し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に再懸濁し、ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡを破砕物から抽出し、得られたＲＮＡペレットを１００μｌのＨｙＣｌｏｎｅ  ＨｙＰｕｒｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒａｄｅ  Ｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に溶解した。合成に使用するランダム６量体プライマー及び組換えＭ‐ＭｕＬＶ  ＲＴの両方を備えるＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、ＣｈｏｉｃｅＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）ならびにＩｇＧ１重鎖還元体及びカッパ軽鎖還元体プライマーによって増幅した［５５］［５６］。ＰＣＲ生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ＰＣＲ増幅に使用したものと同じプライマーを用い、ＰＣＲ生成物をオペロンによって直接、配列決定した。配列を分析し、ＤＮＡＭＡＮソフトウェアを使用して翻訳し、同じＰＣＲプライマーを用いて配列決定した。
【０１３０】
アンドロゲン生合成に対するマウスモノクローナル抗体の機能評価。Ｐ１Ｂ２及びＰ１Ｃ５マウスモノクローナルクローン由来のハイブリドーマ細胞を更にサブクローニングし、これらの培養物から得た培地を利用し、実施例１「材料及び方法」の記載の通りにＰＣＯＳ莢膜細胞を処理し、ＰＣＯＳ莢膜細胞内の卵巣アンドロゲン生合成に対するその効果を評価した。
【０１３１】
マウスＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２モノクローナル抗体の配列分析。Ｐ１Ｂ２及びＰ１Ｃ５ハイブリドーマクローンからＲＮＡを調製した。ｍＡＢ  Ｐ１Ｂ２の重鎖及び軽鎖ならびにＰ１Ｃ５の重鎖の部分的なヌクレオチド及びアミノ酸配列を図１６Ａ〜Ｄに示す。
結果
【０１３２】
マウスＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２ｍＡＢのＥＬＩＳＡ。選択したハイブリドーマのためにマウスモノクローナル抗体の上清をＥＬＩＳＡスキャンすることによって、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２遊離ペプチド（配列番号６）、ならびにＰ１Ｂ２、Ｐ１Ｃ５、Ｐ４Ｆ１、Ｐ５Ｆ９及びＰ２Ｆ５などのＫＬＨ及びＢＳＡ標識化ペプチドに特異的に反応性を示すいくつかのモノクローナル抗体が同定された（図１４）。
【０１３３】
アンドロゲン生合成に対するマウスモノクローナルＶ２のＩｇＧ１の阻害効果。ＫＬＨ共役ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的２１アミノ酸ペプチド（ＱＫＳＩＴＨＦＡＡＫＦＰＴＲＧＷＴＳＳＳＨ）（配列番号６）に対して生成されたマウスＰ１Ｂ２（ｍＶ２．Ａ）及びＰ１Ｃ５（ｍＶ２．Ｂ）ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２モノクローナル抗体は同様にＰＣＯＳ莢膜細胞内のＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２を中和し、アンドロゲン生合成を抑制するか否かを調査するため、複数の実験を実施した。これらの実験では、２０μＭのフォルスコリン存在下及び非存在下、ｍＶ２．Ａ及びｍＶ２．ＢマウスＩｇＧ１、又は陰性対照マウスＩｇＧ１のいずれかの４０μＬの組織培養上清でＰＣＯＳ莢膜細胞を７２時間処理した。図１４のデータから、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ｍＶ２．Ａ及びｍＶ２．Ｂの両方のマウスＩｇＧ１は、陰性対照マウスＩｇＧ１と比較して、ＰＣＯＳ莢膜細胞内フォルスコリン刺激下ＤＨＥＡ生合成を阻害することが実証されている（＊、Ｐ＜０．０５）。図１２〜１３及び１５のデータから、ヒト及びマウスの両方のＤＥＮＮＤ１Ａ／Ｖ２特異的抗体は、ＰＣＯＳ莢膜細胞内のＤＨＥＡ生合成を抑制することが実証されている。これは、ウサギＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ポリクローナル抗体を用いて得られた結果と一致している（図８）。これらのデータは更に、ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２に特異的なモノクローナル抗体はＰＣＯＳの治療法として使用可能であるという考えを支持している。
【０１３４】
ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的マウスモノクローナル抗体Ｐ１Ｂ２及びＰ１Ｃ５の配列。マウスモノクローナルＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２特異的ＩｇＧ１のＤＮＡ及びタンパク質の両配列、Ｐ１Ｂ２重鎖（図１６Ａ及びＣ；配列番号６０及び６２）、Ｐ１Ｂ２軽鎖（図１６Ｂ及びＤ；配列番号６１及び６３ ）、及びＰ１Ｃ５重鎖（図１６Ｅ〜Ｆ；配列番号６４及び６５）のヌクレオチド及びアミノ酸配列が提供されている。ＣＤＲは括弧で示している。
（参考文献）
2017501979.tif 000015
2017501979.tif 000016
2017501979.tif 000017
本発明はその好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内で改変可能に実施できることは当業者であれば認識しているものとする。従って、本発明は、上述した実施形態に限定されるべきではなく、本明細書に提供される説明の精神及び範囲内でその改変及び等価物全てを更に包含することが好ましい。
【０１３５】
（図面の用語の対応訳）
［図１Ａ］
（１）正常
［図１Ｂ］
（１）ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質（相対飽和度）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図１Ｃ］
（１）ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ１タンパク質（相対飽和度）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図１Ｄ］
（１）ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２／Ｖ１比率（相対飽和度）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図１Ｅ］
（１）正常
［図１Ｆ］
（１）ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２タンパク質（相対飽和度）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図２Ａ、２Ｂ］
（１）ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２免疫組織化学
（２）莢膜
（３）正常卵胞
（４）ＰＣＯＳ卵胞
（５）顆粒膜
（６）莢膜細胞核
（７）核
［図３Ａ］
（１）ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図３Ｂ］
（１）ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）正常  Ｃ
（３）正常  Ｆ
［図４］
（１）尿エキソソームＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）正常
［図５Ａ］
（１）細胞
［図５Ｂ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図５Ｃ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図５Ｄ］
（１）テストステロン
（２）細胞
（３）対照
（４）フォルスコリン
［図５Ｅ］
（１）プロゲステロン
（２）細胞
（３）対照
（４）フォルスコリン
［図６Ａ］
（１）ＣＹＰ１７  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図６Ｂ］
（１）ＣＹＰ１１Ａ１  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図６Ｃ］
（１）−７７０  ＣＹＰ１７Ａ１  ＬＵＣ  （相対的ルシフェラーゼ量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図６Ｄ］
（１）−１６０／−９０  ＣＹＰ１１Ａ１  ＬＵＣ  （相対的ルシフェラーゼ量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図７Ａ］
（１）ＣＹＰ１７  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）スクランブル
［図７Ｂ］
（１）ＣＹＰ１１Ａ１  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）スクランブル
［図７Ｃ］
（１）−２３５  ＣＹＰ１７Ａ１  ＬＵＣ  （相対量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）スクランブル
［図７Ｄ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図７Ｅ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図７Ｆ］
（１）プロゲステロン
（２）細胞
（３）対照
（４）フォルスコリン
［図８Ａ］
（１）細胞
（２）抗体（μｇ）
［図８Ｂ］
（１）ＣＹＰ１７  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図８Ｃ］
（１）ＣＹＰ１１Ａ１  ｍＲＮＡ  （相対量）
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図８Ｄ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図８Ｅ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図８Ｆ］
（１）プロゲステロン
（２）細胞
（３）対照
（４）フォルスコリン
（５）正常
［図９Ａ］
（１）ｓｃＦＶ  ＤＮＡ    ＶＨ‐リンカー‐ＶＬ
［図９Ｂ］
（１）ｓｃＦｖ  タンパク質    ＶＨ‐リンカー‐ＶＬ、ＣＤＲはボックスで囲まれている
［図１０Ａ］
（１）ヒト組換えＤＥＮＮＤ１．Ｖ２のＩｇＧ１における重鎖のＤＮＡ配列
［図１０Ｂ］
（１）ヒト組換えＤＥＮＮＤ１．Ｖ２のＩｇＧ１における軽鎖のＤＮＡ配列
［図１０Ｃ］
（１）ヒト組換えＤＥＮＮＤ１．Ｖ２のＩｇＧ１における重鎖のタンパク質配列
ＶＨ‐［ＣＤＲは下線及び括弧で示している］
［図１０Ｄ］
（１）組換えＤＥＮＮＤ１．Ｖ２のＩｇＧ１における軽鎖のタンパク質配列
ＶＬ‐［ＣＤＲは下線及び括弧で示している］
［図１１Ａ］
（１）プロジェクトＩＤ：ファージディスプレイスクリーニング      ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１
（２）生成物タイプ：ＩｇＧ１
（３）ラベルＩＤ
（４）体積
（５）濃度
（６）総量
（７）生成法：プラスミドベクターを２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから９６時間後に懸濁培養物を回収した。生成物をＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦにより生成し、０．２μｍ濾紙で濾過した。
濃度測定：ＢＣＡ法
算出濃度  １２６μｇ／ｍＬ
総量：１００８μｇ        調合緩衝液：０．１Ｍのグリシン‐ＨＣｌ、０．０５ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４
［図１１Ｂ］
（１）還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
（２）レーン１：ＤＥＮＮＤ１Ａ．Ｖ２のＩｇＧ１
（３）レーン２：マーカー
［図１１Ｃ］
（１）ＥＬＩＳＡ結果
（２）項目
（３）培地
（４）被覆：Ｂｉｏ‐ＣＨ‐２２
（５）２次抗体：ＨＲＰ‐ヤギ抗ヒトＩｇＧ１
［図１２Ａ］
（１）細胞
（２）抗体（μｇ／ｍＬ）
［図１２Ｂ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
［図１３Ａ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）正常
［図１３Ｂ］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）ポリクローナル
（５）組換え
［図１４］
（１）マウスｍＡｂ  ＥＬＩＳＡ
（２）ＯＤ（平均±ＳＥＭ）４０５ｎｍ
（３）マウスモノクローナルＡｂ
（４）Ｖ２‐ペプチド
（５）Ｌ２‐ペプチド
（６）Ｖ２‐ＢＳＡ‐ペプチド
（７）Ｖ２‐ＫＬＨ‐ペプチド
［図１５］
（１）細胞
（２）対照
（３）フォルスコリン
（４）対照
［図１６Ａ］
（１）Ｐ１Ｂ２マウスｍＡＢのＤＮＡ重鎖配列
［図１６Ｂ］
（１）Ｐ１Ｂ２マウスｍＡＢのＤＮＡ軽鎖配列
［図１６Ｃ］
（１）Ｐ１Ｂ２マウスｍＡＢの重鎖タンパク質配列
ＶＨ‐［ＣＤＲは下線及び括弧で示している］
［図１６Ｄ］
（１）Ｐ１Ｂ２マウスｍＡＢの軽鎖タンパク質配列
ＶＬ‐［ＣＤＲは下線及び括弧で示している］
［図１６Ｅ］
（１）Ｐ１Ｃ５マウスｍＡＢのＤＮＡ重鎖配列
［図１６Ｆ］
（１）Ｐ１Ｃ５ｍＡＢの重鎖タンパク質配列
ＶＨ‐［ＣＤＲは下線及び括弧で示している］
（表１−表６の用語の対応訳）
［表１］
Gene : 遺伝子
Location : 配置
Position : 位置
Function : 機能
Ref Allele : 参照アレル
#Samples with SNP : ＳＮＰの試料数
Calculated minor allele freq : 計算したマイナーアレル出現頻度
Normal : 正常
Synonymous coding : 同義コーディング
ABSENT : 無し
Intron : イントロン
［表２］
Round : 各回数
Conditions : 条件
Input : インプット量
Output : アウトプット量
Enriching factor : 濃縮倍数
Target protein : 100ug/ml Biotin-CH22  標的タンパク質：１００ｕｇ／ｍｌのビオチン‐ＣＨ２２
Washing : 0.1% Tween20 PBST, 10 times  洗浄剤：０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ、１０倍
Elution : Trypsin digestion  溶出：トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS  事前カウンターセレクション：２％ＭのＰＢＳ
Target protein : 60ug/ml Biotin-CH22  標的タンパク質：６０ｕｇ／ｍｌのビオチン‐ＣＨ２２
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times  洗浄剤：０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ、１０倍
Elution : Trypsin digestion  溶出：トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS  事前カウンターセレクション：２％ＭのＰＢＳ
Target protein : No coating  標的タンパク質：被覆なし
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times  洗浄剤：０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ、１０倍
Elution : Trypsin digestion  溶出：トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS  事前カウンターセレクション：２％ＭのＰＢＳ
Target protein : 40ug/ml Biotin-CH22  標的タンパク質：４０ｕｇ／ｍｌのビオチン‐ＣＨ２２
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times  洗浄剤：０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ、１０倍
Elution : Trypsin digestion  溶出：トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS  事前カウンターセレクション：２％ＭのＰＢＳ
Target protein : No coating  標的タンパク質：被覆なし
Washing : 0.2% Tweenβ20 PBST, 10 times  洗浄剤：０．２％Ｔｗｅｅｎβ２０を含むＰＢＳＴ、１０倍
Elution : Trypsin digestion  溶出：トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS  事前カウンターセレクション：２％ＭのＰＢＳ
Target protein : 40ug/ml Biotin-CH22  標的タンパク質：４０ｕｇ／ｍｌのビオチン‐ＣＨ２２
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times  洗浄剤：０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ、１０倍
Elution : Competitive digestion   溶出：競合消化
Pre counter select : 2%M-PBS  事前カウンターセレクション：２％ＭのＰＢＳ
Target protein : No coating  標的タンパク質：被覆なし
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times  洗浄剤：０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ、１０倍
Elution : Competitive digestion   溶出：競合消化
Pre counter select : 2%M-PBS  事前カウンターセレクション：２％ＭのＰＢＳ
Enriching factor = input/output : 濃縮倍率＝インプット量／アウトプット量
［表３］
Clones : クローン
Coating : Biotin-CH22  被覆：ビオチン‐ＣＨ２２
No coating : 被覆なし
１‐Ａ：１回目の溶出液の増幅ファージ
２‐Ａ：２回目の溶出液の増幅ファージ
３‐Ａ：３回目の溶出液の増幅ファージ
［表４］
Clones : クローン
Coating : Biotin-CH22 被覆：ビオチン‐ＣＨ２２
No coating : 被覆なし
［表５］
Clones : クローン
［表６］
Clones : クローン
Temp. : 温度
Coating : Biotin-CH22  被覆：／ビオチン‐ＣＨ２２
No coating : 被覆なし
【図１Ａ−１Ｆ】
2017501979.tif 000018
【図２Ａ−２Ｂ】
2017501979.tif 000019
【図３Ａ−３Ｂ】
2017501979.tif 000020
【図４】
2017501979.tif 000021
【図５Ａ−５Ｅ】
2017501979.tif 000022
【図６Ａ−６Ｄ】
2017501979.tif 000023
【図７Ａ−７Ｆ】
2017501979.tif 000024
【図８Ａ−８Ｆ】
2017501979.tif 000025
【図９Ａ−９Ｂ】
2017501979.tif 000026
【図１０Ａ−１０Ｄ】
2017501979.tif 000027
【図１１Ａ−１１Ｃ】
2017501979.tif 000028
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2017501979.tif 000029
【図１３Ａ−１３Ｂ】
2017501979.tif 000030
【図１４】
2017501979.tif 000031
【図１５】
2017501979.tif 000032
【図１６Ａ−１６Ｆ】
2017501979.tif 000033
【配列表】
2017501979000001.app
【国際調査報告】
2017501979.tif 000034
2017501979.tif 000035
2017501979.tif 000036
2017501979.tif 000037