(57)【要約】  本発明は、ペプチド結合を形成するステップを含む、生体高分子誘導体、好ましくはキトサン誘導体の合成方法に関する。また本発明は、生体高分子誘導体、および生体高分子誘導体、好ましくはキトサン誘導体の使用に関する。生体高分子誘導体は産業、環境保護において広い用途があり、医薬組成物および化粧品組成物において使用することができる。また本発明は、重金属、特にパラジウム、コバルト、クロムおよび金、特にニッケルによって引き起こされるアレルギー症状防止のための組成物に関する。
2017513962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサンが、ペプチド結合形成を伴って、前記ペプチド結合形成が可能な分子で修飾されることを特徴とするキトサン誘導体。
【請求項２】
前記ペプチド結合が、ポリ（２−デオキシ−２−アミノグルコース）の単位のアミン基と、ペプチド結合形成が可能な前記分子の利用可能なカルボキシル基との間に存在する請求項１に記載の誘導体。
【請求項３】
カルボキシル基を含む前記分子が、カルボン酸、アミノ酸、アミノ酸類似体、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、４つを超えるアミノ酸から構成されるペプチド、タンパク質またはこれらの任意の混合物から選択される請求項１または２のいずれかに記載の誘導体。
【請求項４】
不溶性生体高分子誘導体の合成方法であって、反応性のアミン基またはカルボキシル基を含む前記生体高分子の単位のアミン基またはカルボキシル基と、結合される分子の前記利用可能なカルボキシル基またはアミン基のうちの１つとの間のペプチド結合形成と、マイクロ波照射下でのポリ（２−デオキシ−２−アミノグルコース）の単位のアミン基と、修飾剤分子との間のペプチド結合形成を含む方法。
【請求項５】
ａ）分子とＦｍｏｃ−Ｃｌを適した溶媒、好ましくはジオキサン中で反応させるステップと、
ｂ）前記Ｆｍｏｃ−分子を溶媒、好ましくはＤＭＦに溶解し、前記Ｆｍｏｃ−分子を、ＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡの存在下で前記生体高分子と反応させるステップと、
ｃ）Ｆｍｏｃ基の除去により前記分子を脱保護するステップと、
ｄ）前記生体高分子を前記結合した分子と共に蒸留水に懸濁させ、これらを凍結乾燥するステップとを含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｆｍｏｃ保護された分子を得る前記ステップを省くことができる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ）前記生体高分子を適した溶媒中でマイクロ波で処理するステップと、
ｂ）前記活性化剤を加えて、前記生体高分子の官能基を活性化するステップと、
ｃ）前記ペプチド結合形成が可能な前記保護されていない分子を加えるステップと、
ｄ）前記反応混合物をマイクロ波で処理するステップと、
ｅ）前記得られた修飾生体高分子を洗浄し、これらを凍結乾燥するステップとを含む請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記活性化剤が、ＤＣＣおよびＨＯＰｆｐ、またはＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡのいずれかである請求項５から７に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロ波処理が１〜３０分間継続される請求項５から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記生体高分子がキトサンであり、かつ／または前記修飾剤分子が、カルボン酸、アミノ酸、アミノ酸類似体、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、４つを超えるアミノ酸から構成されるペプチド、タンパク質またはこれらの任意の混合物のうちの少なくとも１つであり、好ましくは前記トリペプチド分子がグルタチオンである請求項４から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれかに記載の生体高分子誘導体を含む化粧品組成物または医薬組成物。
【請求項１２】
キトサン誘導体がグルタチオン修飾キトサンである請求項１１に記載の化粧品組成物または医薬組成物。
【請求項１３】
軟膏、クリームまたはローションの形態の請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
医薬で使用するための請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１５】
重金属、好ましくはパラジウム、コバルト、クロム、金およびニッケルによって引き起こされる、特に、ニッケルと皮膚との接触によって引き起こされるアレルギー症状の防止に使用するための請求項１１から１４に記載の組成物。
【請求項１６】
別の生体高分子を含み、好ましくは生体高分子が金属結合タンパク質である請求項１１から１５に記載の組成物。
【請求項１７】
金属、特に重金属、特にニッケルとの接触によって引き起こされる皮膚アレルギー症状の防止に使用するための請求項１から３に記載のキトサン誘導体。
【請求項１８】
医薬品または化粧品における請求項１から３のいずれかに記載の生体高分子誘導体の使用。
【請求項１９】
重金属アレルギー症状を防止または軽減するための請求項１または２に記載のキトサン誘導体および／またはキトサンの使用。
【請求項２０】
前記キトサン誘導体がグルタチオン修飾キトサンである、ニッケルアレルギー症状を防止または軽減するための請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記組成物が別の生体高分子を含み、好ましくは生体高分子が金属結合タンパク質である請求項１８から２０に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１から３のいずれかに記載の生体高分子誘導体を含む修飾剤分子を結合するための基材。
【請求項２３】
産業廃棄物および一般廃棄物の浄化のための方法であって、請求項１から３のいずれかに記載の生体高分子誘導体を前記廃棄物と接触させて汚染物質を取り込み、取り込まれた汚染物質を含む前記生体高分子誘導体が分解される方法。
【請求項２４】
金属イオンを含む材料を請求項１から３のいずれかに記載の生体高分子誘導体と接触させる、金属の回収のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子誘導体、好ましくはキトサン誘導体の合成方法に関するものであって、ペプチド結合、生体高分子誘導体の形成、および生体高分子誘導体、好ましくはキトサン誘導体の使用を含む。また本発明は、新規のキトサン誘導体を含む化粧品組成物に関するとともに、金属アレルギー症状から保護する組成物の製造にこの誘導体やキトサンを使用することにも関する。
【背景技術】
【０００２】
生体由来の非水溶性高分子、例えば、キトサンなどの多糖には、ペプチド結合が形成されやすい活性アミン基またはカルボキシル基を含む化合物が含まれる。
【０００３】
キトサンは、β−（１−４）結合したＤ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位から構成される直鎖状の多糖である。キトサンは動物または真菌のキチンから製造することができ、例えば、化粧品業界および医療において、多様な用途がある。
【０００４】
先行技術においては、固相における旧知のペプチド合成が利用されてきた。Ｆｍｏｃ／ＳＰＰＳ法によるペプチド合成のための樹脂や、最初のアミノ酸を樹脂に結合し、ペプチド結合形成でペプチドを伸長する条件は、先行技術において公知である。
【０００５】
カナダ特許出願公開第２１２６１３２号明細書には、キトサン上のペプチド合成方法が開示されている。しかし、旧知の合成、およびキトサンのアミノ基とペプチドの最初のアミノ酸の間に別の結合分子が使用されている。
【０００６】
キトサンと修飾剤分子の間に直接ペプチド結合を形成し、修飾剤を結合する樹脂として、キトサンといった完全に生分解性の生体高分子を使用する開示は先行技術にはない。旧知のペプチド合成に適用できる条件下では、反応に長い時間がかかり、満足のいく収率は得られない。
【０００７】
欧州特許第１５１２７７３号明細書には、金属製の医療用具の被覆と同時に、キトサン層内への生物活性成分の取り込みが開示されている。しかし、この方法では、特定の共有結合を形成せずに、生体分子が別の被覆層として加えられる。
【０００８】
従来のペプチド合成による、固相でキトサン誘導体を得る方法では、低い収率および長い反応時間といった多くの不都合が生じる。様々な要因で生じる皮膚刺激の治療にキトサンを使用することが、先行技術により知られている。ロシア特許第２３５７７３８号明細書には、白金症（ｐｌａｔｉｎｏｓｉｓ）の防止および治療のため、１％のキトサン塩酸塩を含む皮膚用製剤の使用が記載されている。国際公開第９２０９６３６号は、アレルゲンまたは毒素との接触から皮膚を保護する方法に関し、アレルゲン性物質に敏感な被験者の皮膚に、皮膚との接触前に、キトサン高分子およびキトサン誘導体から選択される多糖を塗布するステップを含む。この文書には、抗原が金属であることも、キトサン誘導体の応用の可能性、すなわちアミノ基がペプチド結合に関与することも述べられていない。さらに、欧州特許第１５１２７７３号明細書には、金属製医療機器にキトサン被覆をすることにより、医療機器に生体適合性をもたせ、医療機器に由来する金属イオンによる生体への刺激を防ぐことが開示されている。
【０００９】
ニッケルアレルギーで最も多い症状は、Ｔｈリンパ球が関与する反応で生じる接触皮膚炎（ＩＶ型過敏症）である。ニッケルは、最も多いアレルゲンのうちの１つである。欧州先進国（例えば、ドイツ、イギリス、イタリア）の１５％を超える全住民にニッケルアレルギーがある。ポーランドでは、１６〜１７才の少女の３０％にニッケルアレルギーがある［Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３，１６９：８５４−８５８；Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ２０１１，６４：１２１−１２５］。宝飾品および一般的な使用品から溶出されるニッケルの許容量をＥＵ指令９４／２７／ＥＣが規制している事実から、問題の重要性が強調される。
【００１０】
したがって、金属に対するアレルギー、特に重金属、特にニッケルに対するアレルギーからの効果的な保護の開発が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、得られた誘導体が産業用途に十分な有効性を具備する合成法の課題や、キトサンといった安全で、非毒性の生分解性化合物に基づく活性分子を工業規模で供給する課題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ペプチド結合の形成を利用して修飾剤分子に修飾される、反応性アミン基またはカルボキシル基を含む不溶性高分子誘導体を提供する。好ましくは、高分子はポリ／オリゴ糖、好ましくはキトサンである。好ましい実施形態において、ペプチド結合は、ポリ（２−デオキシ−２−アミノグルコース）のサブユニットのアミン基と、修飾剤分子の利用可能なカルボキシル基のうちの１つとの間に存在する。好ましくは、カルボキシル基を含む修飾剤分子は、カルボン酸、アミノ酸、アミノ酸類似体、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、さらに長いペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質およびタンパク質模倣体またはこれらの任意の混合物から選択される。
【００１３】
また、本発明の主題は、不溶性高分子誘導体の合成方法でもあり、本方法において、反応性アミン基またはカルボキシル基を含有する生体高分子単位のアミン基またはカルボキシル基と、結合修飾剤分子の利用可能なカルボキシル基またはアミン基との間にペプチド結合が形成される。
【００１４】
好ましい実施形態において本方法は、
ａ）修飾剤分子とＦｍｏｃ−Ｃｌを適した溶媒、好ましくはジオキサン中で反応させるステップと、
ｂ）Ｆｍｏｃ−修飾剤分子を溶媒、好ましくはＤＭＦに溶解し、これを、ＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡの存在下で生体高分子と反応させるステップと、
ｃ）Ｆｍｏｃ保護基を修飾剤分子から除去するステップと、
ｄ）生体高分子を、これに結合した修飾剤分子と共に蒸留水に懸濁させ、凍結乾燥するステップとを含む。
【００１５】
別の好ましい実施形態において本方法は、ポリ（２−デオキシ−２−アミノグルコース）の単位のアミン基の間のペプチド結合を形成するステップを含み、ここで、高分子と修飾剤分子との間のペプチド結合はマイクロ波照射下で形成される。
【００１６】
好ましくは、Ｆｍｏｃ保護されたペプチド分子を得るステップは省くことができる。
【００１７】
好ましい実施形態において本方法は、
ａ）生体高分子を適した溶媒中でマイクロ波で処理するステップと、
ｂ）活性化剤を加えて、生体高分子の官能基を活性化するステップと、
ｃ）保護されていない修飾剤分子を加えるステップと、
ｄ）反応混合物をマイクロ波で処理するステップと、
ｅ）得られた修飾生体高分子を洗浄および凍結乾燥するステップとを含む。
【００１８】
ＤＣＣおよびＨＯＰｆｐ、またはＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡが、好ましい活性化剤として使用される。好ましくは、マイクロ波での処理が１〜３０分間継続される。ただし、ペプチド結合が形成される場合はさらに長い時間も本発明の範囲内である。
【００１９】
合成方法は、生体高分子としてのキトサンと修飾剤分子を含み、修飾剤分子は、カルボン酸、アミノ酸、アミノ酸類似体、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、さらに長いペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質またはタンパク質模倣体のうちの少なくとも１つから選択され、好ましくはトリペプチド分子はグルタチオンである。本発明の主題はまた、本発明による生体高分子誘導体を含有する化粧品組成物または医薬組成物である。組成物は、軟膏、クリーム、ローションの形態である。本発明による組成物は、医療、医薬品または化粧品において使用される。
【００２０】
本発明の主題はまた、重金属、好ましくはパラジウム、コバルト、クロムおよび金、最も好ましくはニッケルにより生じるアレルギー症状の防止に使用する組成物である。
【００２１】
好ましくは、組成物は別の生体高分子を含み、生体高分子は金属結合タンパク質であることが望ましい。
【００２２】
さらに、本発明の主題は、金属、好ましくは重金属、最も好ましくはニッケルとの接触で生じる皮膚アレルギー症状の防止に使用するキトサン誘導体である。
【００２３】
本発明の主題はまた、修飾剤分子を結合する基材であり、本発明による生体高分子誘導体を含有する。
【００２４】
本発明は、重金属、好ましくはニッケルで生じるアレルギー症状を防止するための、キトサン誘導体やキトサンの使用も開示する。組成物は別の生体高分子を含むことが好ましく、生体高分子は金属結合タンパク質であることが好ましい。
【００２５】
さらに、本発明の主題は、産業廃棄物や一般廃棄物の浄化方法であり、本発明の生体高分子誘導体を前記廃棄物と接触させて汚染物質を取り込み、取り込まれた汚染物質を有する前記生体高分子誘導体を分解する。本発明はまた、金属回収方法も開示しており、金属イオンを含有する材料を本発明の生体高分子誘導体と接触させる。したがって本発明は、本発明の生体高分子誘導体を産業廃棄物および一般廃棄物の浄化や金属回収に使用することを開示する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
用語「不溶性生体高分子」は、単位（マー）からなる生物起源のすべての化合物を表し、これらの化合物は、ペプチド結合が形成されやすい活性アミン基またはカルボキシル基を含有し、主に非水溶性である。不溶性生体高分子の例としてセルロースおよびキトサンが挙げられる。
【００２７】
用語「修飾剤分子」は、キトサン、またはカルボキシル部分やアミン部分を有する他の生体高分子分子とペプチド結合を形成する分子に関する。用語「ペプチド模倣体」または「タンパク質模倣体」は、直鎖状ペプチドまたはタンパク質の修飾または環化に関する。ペプチド模倣体の例としては、アミド結合サロゲート、ペプチドスルホンアミド、ホスホノペプチド、オリゴ尿素、デプシド、デプシペプチドおよびペプチドイドが挙げられる。
【００２８】
キトサンは、水やペプチド合成に適した有機溶媒に実質上不溶性だが、化学的活性を有するため、ペプチドといった有機分子を結合する基材として使用可能である。
【００２９】
本発明の主題は、ペプチド結合形成の旧知の条件下およびマイクロ波照射下で、ペプチド結合形成に適したカルボン酸基を含有する分子でキトサンを修飾することである。このような分子の例には、カルボン酸、アミノ酸、アミノ酸類似体、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、さらに長いペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質またはタンパク質模倣体あるいはこれらの任意の混合物が含まれる。
【００３０】
適切な修飾剤分子を選択することにより、修飾された生体高分子の所望の特性が得られる。例えば、金属イオンと錯体を形成するトリペプチドであるグルタチオンの分子を、高分子の単量体単位に結合させることにより、金属イオンをキレート化するキトサンの能力を大幅に向上させることが可能である。修飾剤を適切に選択すると、生体高分子多数の特性、例えば溶解性、水中懸濁後のｐＨ値、殺真菌および殺菌特性に作用することがある。
【００３１】
本発明によるグルタチオン修飾のキトサン合成方法は、市販のキトサンまたは反応性のアミン基またはカルボキシル基で特徴づけられる他の不溶性生体高分子、および修飾剤分子、例えばペプチドを使用する。
【００３２】
本発明によるグルタチオン修飾のキトサン合成方法において、２−デオキシ−２−アミノグルコースがキトサンの構造を形成するモノマーであるポリ（２−デオキシ−２−アミノグルコース）分子のアミン基と、グルタチオンの利用可能なカルボキシル基のうちの１つとの間で、本発明の目的のため設計した合成法に従い最適化された条件下でペプチド結合が形成される。Ｆｍｏｃ−グルタチオンが反応に使用され、実施例１に記載の手順に従って保護されたアミン官能基と共に使用される。ペプチド結合形成の手順は、実施例２に記載される。
【００３３】
本発明の方法では、マイクロ波照射下でのカップリング反応を利用して新規の誘導体を合成した。マイクロ波は、生体高分子のアミン基をさらに活性化し、また、その構造に影響を与えることにより、修飾剤分子が高分子の官能基へ接近しやすくする。
【００３４】
マイクロ波は、本発明のペプチド結合形成方法において極めて重要な役割を果たす。マイクロ波照射下でのペプチド結合の生成は、反応収率を大幅に向上（１００倍、０．３％から３０％）させ、同時に反応時間を短縮（４５０分から２０分）した。これは、修飾剤分子のアミン基を保護する困難かつ費用がかかるステップの回避にも役立つ。
【００３５】
反応の第１のステップにおいて、生体高分子はマイクロ波照射下で強く活性化され、修飾剤の官能基よりも生体高分子の官能基がはるかに活性化する。次に、修飾剤分子と、生体高分子の適切な官能基とのカップリング、および修飾剤分子と基材との結合が行われる。可能性のある副反応としては、保護されていない修飾剤の分子から構成される二量体、三量体、または高分子生成物の形成が挙げられる。生体高分子を先に活性化することにより、副反応を防ぐことができ、生体高分子の修飾剤分子との反応に利点が生じる。この活性化により、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基で修飾剤分子のアミン基を保護する必要がなく、２つの反応ステップ、すなわちアミン基を保護するステップと、カップリング反応後に保護を除去するステップを排除することができた。これは、反応に係る費用を大幅に削減し、本発明にグリーンケミストリーの側面を提供する。環境的に有害な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を反応に使用せず、生体適合性高分子、生分解性修飾剤、一般的な活性化剤および揮発性溶媒を使用して反応が行われる。
【００３６】
生体高分子、すなわちキトサンは非毒性の化合物であり、工業的規模で使用しても環境汚染を引き起こさない。この高分子の重要な特性は生体適合性である。その他の利点は、高い付着力および吸収率、高い化学反応性、および金属イオンとキレートを形成する能力であり、これらはキトサンの各単位（マー）にアミン基が存在することに由来する。水性環境でこの高分子は、配位結合を形成しながら金属イオンと相互作用する。多くの空間配座を取ることができるため、構造内に金属イオンを閉じ込めることもできる。また、キトサンの明らかな利点は、毒性がなく環境に優しい基材として修飾剤分子の結合に利用できる特性である。
【００３７】
生体高分子の操作性特性、特に金属結合強度や選択性の向上に係る特性により、化粧品業界、薬学および環境保護等において、修飾生体高分子を広い分野で多用途に使用することができる。
【００３８】
本発明の１つの実施形態は、グルタチオンをキトサンと結合させることである。好ましい実施形態では、マイクロ波照射下で合成する。この目的のため、適切な反応容器およびマイクロ波反応器を用いることができる。キトサンは、マイクロ波で２５〜１００℃および電力Ｐ＝１０〜５０Ｗで、高分子の官能基の活性化に十分な時間、好ましくは１〜３０分間処理する。
【００３９】
好ましい実施形態において、キトサンの官能基は、ＤＣＣおよびＨＯＰｆｐで活性化する。別の好ましい実施形態において、官能基の活性化に続いて、キトサンと、Ｆｍｏｃで保護されていないグルタチオンとを接触させ、生じる反応混合物を必要な時間、適切な温度でマイクロ波により再び処理する。好ましい実施形態において、キトサンは、マイクロ波で少なくとも２回処理する。好ましくは、マイクロ波への暴露は１〜２０分間、電力は１０〜２５Ｗの範囲で、反応は２０〜７０℃で起こる。生成物は、遠心分離および凍結乾燥といった標準操作で回収することができる。
【００４０】
別の好ましい実施形態において、マイクロ波照射下のグルタチオンとキトサンの結合は、ＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡを使用して実施する。キトサン官能基を活性化するよう暴露時間、電力および温度を選択する。
【００４１】
好ましい実施形態において、懸濁液の形態で存在する生成物を遠心分離し、上清を静かに移動する。得られた修飾生体高分子を、未使用のＤＭＦで少なくとも１回、好ましくは２回または３回洗浄し、遠心分離する。好ましくは、塩化メチレンでこの手順を繰り返す。
【００４２】
本発明の他の好ましい実施形態において、ＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡを使用し、マイクロ波照射下でバシトラシンまたはチカルシリンとキトサンとの結合を実施する。
【００４３】
本発明の１つの実施形態では、修飾キトサンは、金属イオン、好ましくはニッケルまたは他の重金属のイオンを捕捉する。
【００４４】
本発明による方法を以下の図の特定の実施形態に基づいてさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ペプチド結合形成の条件下で、修飾剤分子によるキトサン修飾反応を示すスキーム図である。
【図２】Ｆｍｏｃ−Ｃｌとのグルタチオンカップリング反応で得た９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−グルタチオンのＥＳＩ−ＭＳスペクトル図である。
【図３】塩化ニッケル（ＩＩ）の５０ｍＭ溶液と接触させた市販のキトサン（Ａ）およびグルタチオン修飾キトサン（Ａ［ＧＳＨ］）の挙動比較図である。（Ａ）と表示した試験管内の沈殿物は茶色であり、（Ａ［ＧＳＨ］）と表示した試験管内の沈殿物は緑色である。非修飾キトサンとのニッケル錯体は緑色であり、一方、グルタチオン修飾キトサンとのニッケル錯体は茶色である。
【図４】市販のキトサン（Ａ）およびグルタチオン修飾キトサン（Ａ［ＧＳＨ］）のニッケル結合能の比較を示すグラフである。
【実施例】
【００４６】
実施例を以下に示す。しかし、本発明の開示および記載は、特定の実験法、結果および検査手順への応用に限定されないと理解されるべきである。むしろ、実施例は単に種々の実施形態のうちの１つとして記載されており、網羅的ではなく、例示的であることを意図する。
【００４７】
［実施例１］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−グルタチオンの合成：
２００ｍｌ三つ口フラスコ内で、嫌気条件下、３ｇのグルタチオン（１０ｍｍｏｌ）を、２６ｍｌのジオキサンと６８ｍｌの１０％  ＮａＣＯ３の混合物に溶解した。滴下漏斗、撹拌マグネット、アルゴン風船およびバブラーを備えたフラスコをマグネチックスターラーの上に据えた。２．７１ｇのＦｍｏｃ−Ｃｌ（１０．５ｍｍｏｌ）を２６ｍｌのジオキサンに溶解し、１５分にわたってゆっくりと滴加した。添加中、反応物を氷浴内で保持した。次に氷浴を取り外した。反応をアルゴン下で１０時間進行させ、その間、その進行をＥＳＩ−ＭＳでモニターした。次に溶液をｐＨ≒３の酸性にした。生成した沈殿物をＳｃｈｏｔｔ製漏斗で分離した。相当量の沈殿物が生成するまで残った溶液を蒸発させた。この沈殿物をＳｃｈｏｔｔ製漏斗で分離して蒸留水で洗浄した。分子質量５２９．１７ｇ／ｍｏｌを有するＦｍｏｃ−グルタチオンが得られた（図２）。
【００４８】
［実施例２］
グルタチオンのキトサンとの結合：
固相ペプチド合成のために０．６８ｇのキトサンを反応容器に入れた。３ｇのＦｍｏｃ−グルタチオン（３モル当量）を２０ｍｌのＤＭＦに溶解した。この溶液に、２．１４ｇ（３モル当量）のＨＢＴＵ、１．２９ｇ（３モル当量）のＨＯＢＴおよび１．９８ｍｌ（６モル当量）のＤＩＰＥＡを加えた。試薬を混ぜ合わせ、キトサンを入れた反応容器に加えた。実験室用振盪機で混合物を２．５時間反応させた。この手順を３回繰り返した。次に、溶液を濾過して取り出し、残った生体高分子をＤＭＦで３回洗浄した。グルタチオンからＦｍｏｃ保護基を除去するために、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液を２回加え、続いて２０分間振盪した。Ｆｍｏｃ基除去の後、生体高分子をＤＭＦで３回洗浄した。ＤＭＦ溶液を吸い上げ、グルタチオンを含む生体高分子を蒸留水に懸濁させ、凍結乾燥した。元素分析により求めた反応収率はＹ＜０．３％である。
【００４９】
［実施例３］
ＤＣＣおよびＨＯＰｆｐを使用する方法１によるマイクロ波照射下でのグルタチオンのキトサンとの結合：
固相ペプチド合成用反応容器に、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏが２：１の混合物５ｍｌに懸濁させた２．２７ｇのキトサンを加え、マイクロ波で処理した（ｔ＝５分、Ｐ＝２５Ｗ、Ｔ＝７５℃）。０．６１３ｇのＨＯＰｆｐおよび０．６８７ｇのＤＣＣをＤＭＦ：Ｈ２Ｏが２：１の５ｍｌ混合物に溶解し、反応容器に加えた。キトサンと活性化剤の混合物をマイクロ波で処理（ｔ＝５分、Ｐ＝２５Ｗ、Ｔ＝７５℃）し、高分子の官能基を活性化した。次に、５ｍｌＤＭＦ中、０．５６８ｇのグルタチオン（Ｆｍｏｃで保護されていない自由分子）を反応容器に加え、マイクロ波を２回かけた（ｔ＝５分、Ｐ＝１２Ｗ、Ｔ＜５０℃）。懸濁液を遠心容器に加え、遠心分離した。上清を移した。得られた修飾生体高分子を未使用のＤＭＦに３回懸濁させ、次に遠心分離し、静かに移した。この手順を、塩化メチレンを使用して繰り返した。塩化メチレンで３回洗浄した後、沈殿物を液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥した。凍結乾燥した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び凍結乾燥した。元素分析により、硫黄の存在、したがって高分子に結合したグルタチオンの存在が明らかになった。元素分析により求めた反応収率はＹ＝２３％である。
【００５０】
［実施例４］
ＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡを使用する方法２によるマイクロ波照射下でのグルタチオンのキトサンとの結合：
固相ペプチド合成用反応容器に、５ｍｌのＤＭＦに懸濁させた２．２７ｇのキトサンを加え、マイクロ波の作用を施した（ｔ＝５分、Ｐ＝２５Ｗ、Ｔ＝７５℃）。５ｍｌのＤＭＦ中、２．１４ｇのＨＢＴＵ、１．２９ｇのＨＯＢＴおよび１．９８ｍｌのＤＩＰＥＡを反応容器に加えた。キトサンと活性化剤の混合物にマイクロ波の作用を施し（ｔ＝５分、Ｐ＝２５Ｗ、Ｔ＝７５℃）、高分子の官能基を活性化した。次に、５ｍｌのＤＭＦ中、０．５６８ｇのグルタチオン（Ｆｍｏｃで保護されていない自由分子）を反応容器に加え、マイクロ波の作用を２回施した（ｔ＝５分、Ｐ＝１２Ｗ、Ｔ＜５０℃）。懸濁液を遠心容器に加え、遠心分離した。上清を移した。得られた修飾生体高分子を未使用のＤＭＦに３回懸濁させ、次に遠心分離し、静かに移した。この手順を、塩化メチレンを使用して繰り返した。塩化メチレンを用いて３回洗浄した後、沈殿物を液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥した。凍結乾燥した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び凍結乾燥した。元素分析により求めた反応収率はＹ＝３０％である。
【００５１】
［実施例５］
ＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡを使用する方法２によるマイクロ波照射下でのバシトラシンのキトサンとの結合：
固相ペプチド合成用反応容器に、５ｍｌのＤＭＦに懸濁させた２．２７ｇのキトサンを加え、マイクロ波の作用を施した（ｔ＝５分、Ｐ＝２５Ｗ、Ｔ＝７５℃）。５ｍｌのＤＭＦ中、２．１４ｇのＨＢＴＵ、１．２９ｇのＨＯＢＴおよび１．９８ｍｌのＤＩＰＥＡを反応容器に加えた。キトサンと活性化剤の混合物をマイクロ波で処理（ｔ＝５分、Ｐ＝２５Ｗ、Ｔ＝７５℃）し、高分子の官能基を活性化した。次に、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏが１：１の混合物５ｍｌに溶解した２．６３０ｇのバシトラシンを反応容器に加え、マイクロ波の作用を２回施した（ｔ＝５分、Ｐ＝１２Ｗ、Ｔ＜５０℃）。懸濁液を遠心容器に移し、遠心分離した。上清を移した。得られた修飾生体高分子を未使用のＤＭＦに３回懸濁させ、次に遠心分離し、静かに移した。この手順を、塩化メチレンを使用して繰り返した。塩化メチレンを用いて３回洗浄した後、沈殿物を液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥した。凍結乾燥した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び凍結乾燥した。元素分析により求めた反応収率はＹ＝４４％である。
【００５２】
［実施例６］
ＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＥＡを使用する方法２によるマイクロ波照射下でのチカルシリンのキトサンとの結合：
固相ペプチド合成用反応容器に、５ｍｌのＤＭＦに懸濁させた２．２７ｇのキトサンを加え、マイクロ波の作用を施した（ｔ＝５分、Ｐ＝２５Ｗ、Ｔ＝７５℃）。５ｍｌのＤＭＦ中、２．１４ｇのＨＢＴＵ、１．２９ｇのＨＯＢＴおよび１．９８ｍｌのＤＩＰＥＡを反応容器に加えた。キトサンと活性化剤の混合物をマイクロ波で処理（ｔ＝５分、Ｐ＝２５Ｗ、Ｔ＝７５℃）し、高分子の官能基を活性化した。次に、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏが１：１の混合物５ｍｌに溶解した０．７９２ｇのチカルシリンを反応容器に加え、マイクロ波の作用を２回施した（ｔ＝５分、Ｐ＝１２Ｗ、Ｔ＜５０℃）。懸濁液を遠心容器に移し、遠心分離した。上清を移した。得られた修飾生体高分子を未使用のＤＭＦに３回懸濁させ、次に遠心分離し、静かに移した。この手順を、塩化メチレンを使用して繰り返した。塩化メチレンを用いて３回洗浄した後、沈殿物を液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥した。凍結乾燥した沈殿物を蒸留水で３回洗浄し、再び凍結乾燥した。元素分析により求めた反応収率はＹ＝１８％である。
【００５３】
［実施例７］
キトサンおよびグルタチオン修飾キトサンのニッケル（ＩＩ）イオンに結合する能力の比較：
市販の非修飾キトサン３５ｍｇおよび本発明により得られたグルタチオン修飾キトサン３５ｍｇを２本の試験管に別々に分け入れ、続いて１ｍｌの５０ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液を加えた。高分子の色変化に伴い、淡緑色の塩化ニッケル（ＩＩ）溶液の変色が観察され、非修飾キトサンは緑色、グルタチオン修飾キトサンは茶色へ変化した（図３）。試験管の底には沈殿物が沈降し、上に無色透明の上清が残った。上清中のＮｉ（ＩＩ）含有量を、着色ＤＴＴ錯体を利用して分光光度法により求めた。溶液中のＮｉ（ＩＩ）濃度の変化を図４に示す。
【００５４】
［実施例８］
金属イオン、特にニッケル（ＩＩ）イオンに対するグルタチオン修飾キトサンの障壁作用：
この実験のために設計され、３Ｄプリンタで作製した３つの要素から構成される容器に２層の透析膜を取り付けた。１０ｍｌの脱イオン水とマグネチックスターラーを入れた２５ｍｌビーカー内に容器を置いた。これをマグネチックスターラーの上に置き、対照実験として用いた。別の２つの同一容器内で、８１ｍｇの市販のキトサンまたは８１ｍｇの本発明によるグルタチオン修飾キトサンを膜層の間に置いた。０．５ｍｌの１００ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）溶液を各容器の内筒に入れ、１０ｍｌの脱イオン水を入れた２５ｍｌビーカー内にそれぞれ容器を置いた。すべての装置を２４時間撹拌し、それによって、透析膜および透析膜間のキトサンまたは修飾キトサン層にＮｉ２＋イオンを拡散させた。次に、各ビーカー内の水溶液に存在するＮｉ２＋濃度を求めた。いずれの高分子も障壁作用を示し、金属イオン濃度が対照の約８分の１と検出された。結果を表１に示す。表１の最後の列の結果は、実施例４で得られた反応収率Ｙ＝３０％に基づいて計算した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
上記表１によると、キトサン誘導体の存在が、溶液へのＮｉ２＋イオン拡散を大幅に減少させ、キトサン誘導体がキトサン自体よりも４０％を超えてさらに強力にＮｉ２＋を捕捉することが明確に示されている。活性成分として本発明のキトサン誘導体を含有する化粧品組成物は同様の特性を有し、皮膚に組成物をつけた後、感作イオンの接近を制限する。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
新規の薬剤（グルタチオン修飾キトサン）の使用により、効果的で簡単に水溶液から金属を回収できる。任意の所望のキトサンの修飾剤分子を使用することにより、生体高分子の生体適合性および非毒性を維持しながら、金属キレート化特性を制御することができる。
【００５８】
皮膚炎の治療に使用される抗生物質などの修飾剤分子を結合しやすいキトサンまたは他の生体適合性生体高分子の使用は、皮膚科で使用される新規の材料を得るための基礎を提供する。化粧品業界において抗菌剤として広く使用されるペプチドＬＬ−３７、創傷治癒および若年性にきびに有用なラクトビオン酸、ＵＶＢ光防護に使用されるｐ−アミノ安息香酸をこのような修飾剤として挙げることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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