(57)【要約】本発明は、細菌ＣｌｐＢタンパク質およびＣｌｐＢ発現細菌、ならびに食欲の低下、食欲の増大および／または不安に関連する疾患または障害に及ぼすそれらの影響に関する。さらに本発明は、細菌ＣｌｐＢタンパク質に関連する組成物、ならびに食欲の低下および／または不安に関連する障害に対する免疫における組成物の使用に関する。【選択図】図３
2017502000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンまたは免疫原性組成物として使用するための細菌ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物。
【請求項２】
食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に対する免疫のための、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療および／または予防のための、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記食欲の低下に関連する疾患または障害が、神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、カヘキシー、および消耗性疾患からなる群から選択される、請求項２または３に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物であって、前記少なくとも１つの抗生剤が、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する、
肥満の治療または予防に使用するための
組成物。
【請求項６】
肥満が、むちゃ食い障害または多食症の結果である、請求項５に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
対象の肥満および／または過体重を治療または発症の可能性を低下させる方法であって、前記方法が、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記少なくとも１つの抗生剤が、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、およ／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する、
方法。
【請求項８】
過体重の対象の食欲を低下させる非治療的方法であって、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの抗生剤が、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する、
請求項８に記載の非治療的方法。
【請求項１０】
対象の食欲を増進させる非治療的方法であって、抗ＣｌｐＢ抗体を含む組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌ＣｌｐＢタンパク質およびＣｌｐＢ発現細菌、ならびに食欲の低下、食欲の増進、および／または不安に関連する疾患または障害に及ぼすこれらの影響に関する。さらに本発明は、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物、ならびに食欲の低下および／または不安に関連する障害に対する免疫における当該組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
摂食障害は、過去５０年のあいだに男性および女性を問わず全世界中で増加した。特に、西欧諸国の特定の人々が摂食障害を発症するリスクが最も高く、西洋化の度合いがこのリスクを高めていることを示唆する証拠がある。近年の進歩に伴い、科学者らは、食欲の中心プロセスの理解を深めている。動機づけ、ホメオスタシス、および自己調節制御のプロセス間の相互作用が、摂食行動に関与しており、これらが摂食障害の鍵となる構成要素であることが知られている。
【０００３】
近年の科学において、さらなる調節因子であるヒトのマイクロバイオームが発見された。ハイスループットＤＮＡシークエンシング技術の進歩により、ヒトのマイクロバイオームが探索され、これにより宿主とその細菌叢との間の分子的な関係の理解は大きく進歩した。この「第２のゲノム」である、マイクロバイオームは、４〜５００万超の重複していない微生物の推定上の遺伝子、および１〜２，０００種の一般的に認められる細菌種の一覧である。各個体は、少なくとも１６０の共通の種と、個体の群を定義する多くの良好につり合いのとれた宿主‐微生物の分子的関係を有する。
【０００４】
微生物の共同体と、それらのヒト宿主との間の共生関係の本質的な特性を理解することにより、常在性の共同体の特定の特性から、健康状態などの宿主の表現型を予測することが可能であり得ると考えられる。
【０００５】
たとえば腸内細菌叢の組成は、肥満および糖尿病ならびに精神神経障害を含む宿主の代謝表現型に関連しており、腸内細菌が、脳により制御される機能および活動に影響を及ぼし得ることが示唆されている。
【０００６】
よって本明細書の文脈において、細菌叢を宿主の行動と関連づける分子的機構を決定することが、宿主の生理機能における特定の微生物の役割を定義するために必要なステップと考えられる。
【０００７】
近年の本発明者らの研究により、細菌タンパク質と、動機づけ行動および感情の調節におけるその役割が知られているペプチドホルモンとの間の分子的模倣性を介した新規の分子機構が明らかとなった。これにより分子的模倣性を介したこの新規分子機構は、腸内細菌叢を宿主の行動と関連づけ、摂食障害および肥満における新規の有望な治療上の標的の同定を可能にした。
【０００８】
本発明者らは、プロテオミクスを使用して、共生腸内細菌大腸菌Ｋ１２のＣｌｐＢシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の立体構造模倣体であることを発見した。
【０００９】
さらに本発明者らは、ＣｌｐＢ免疫マウスが、食物摂取および体重の増加、不安の減少を伴って抗ＣｌｐＢおよび抗α―ＭＳＨ抗体の両方の産生の増大を示すことを明らかにした。さらに、ラットに強制経口投与により大腸菌Ｋ１２を提供することで、ＣｌｐＢおよびα−ＭＳＨ反応性免疫グロブリンの血漿中レベルが上昇した。
【００１０】
よって、ＣｌｐＢおよび／または抗ＣｌｐＢ抗体の存在は、食欲の調節障害に関連し得る。
【００１１】
他方で、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の存在は、食欲の増進と相関する場合があり、よって、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを減少させることにより、食欲を減少させることができ、よって肥満の治療に使用することができる。
【００１２】
よって、本発明は、肥満の治療または予防に使用するための少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物に関する。
【００１３】
特に、上記組成物は、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物であって、上記少なくとも１つの抗生剤が、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する、
肥満の治療または予防に使用するための
組成物に関する。
【００１４】
一実施形態では、肥満は、むちゃ食い障害または多食症の結果である。
【００１５】
さらに本発明は、過体重の対象の食欲を低下させる非治療的方法であって、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。
【００１６】
特に、少なくとも１つの抗生剤は、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する。
さらに本発明者らは、抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に対する免疫と相関させた。
【００１７】
よって本発明はまた、ワクチンまたは免疫原性組成物として使用するための細菌ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物に関する。
【００１８】
特に、上記組成物は、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に対する免疫に使用するためのものである。
【００１９】
より具体的には、上記組成物は、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療および／または予防に使用するためのものである。
【００２０】
食欲の低下に関連する疾患または障害は、神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、カヘキシーおよび消耗性疾患からなる群から選択され得る。
【００２１】
また本発明は、対象の食欲を増進させる非治療的方法であって、抗ＣｌｐＢ抗体を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。
【００２２】
発明の詳細な説明
ＣｌｐＢ発現細菌
本明細書中で使用される「ＣｌｐＢ発現細菌」は、シャペロンタンパク質ＣｌｐＢを発現する細菌を指す。
【００２３】
「タンパク質脱凝集シャペロン」、「シャペロンタンパク質ＣｌｐＢ」、「ＣｌｐＢタンパク質」、または「ＣｌｐＢ」は、ヒートショックタンパク質Ｆ８４．１としても知られており、六量体ＡＡＡ＋−ＡＴＰアーゼのＨｓｐ１００／ＣｌｐＢファミリーのメンバーである。このファミリーは、細菌、真菌、および植物のＨｓｐ１００  ＡＴＰアーゼを含み、ＣｌｐＢは、代表的な細菌ＡＴＰアーゼである。ストレス誘導性マルチシャペロンシステムの一部として、ＣｌｐＢは、ストレス条件下で細胞が生存するための重大なプロセスであるタンパク質の脱凝集においてＨｓｐ７０システム（ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、およびＧｒｐＥ）と協調して熱誘導性損傷からの細胞の回復に関与している。
【００２４】
感染プロセスの際に、細菌病原体は、病原体を除去するために宿主防御により生成されたストレス状態に晒され、熱ショックタンパク質および他のストレスタンパク質の合成を増加させることにより、その宿主防御に応答する。本発明の文脈において、ＣｌｐＢは、熱耐性の獲得にとって必須の因子として、ならびに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのいくつかのグラム陰性およびグラム陽性の病原性細菌のビルレンスおよび感染性にとって必須の因子として説明されている。
【００２５】
大腸菌Ｋ１２では、シャペロンタンパク質ＣｌｐＢは熱ショックタンパク質Ｆ８４．１またはｈｔｐＭとしても知られている、アミノ酸８５７個のタンパク質である。
【００２６】
典型的に、シャペロンタンパク質ＣｌｐＢは、配列番号：１（ＮＣＢＩの参照番号：ＮＰ＿４１７０８３．１（２０１３年１１月１６日時点で利用可能）および／またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号：Ｐ６３２８４（２０１３年１１月１６日時点で利用可能））を有する大腸菌Ｋ１２由来のシャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列を含む、またはからなる。好ましくは、シャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と８０〜１００％同一のアミノ酸配列を含む、またはからなる。好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号１と９０〜１００％同一、より好ましくは９５〜１００％、最も好ましくは９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である。
【００２７】
よって、ＣｌｐＢ発現細菌は、上記に定義されているシャペロンタンパク質ＣｌｐＢ、または配列番号１のアミノ酸配列と８０〜１００％同一、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と９５〜１００％、最も好ましくは９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、もしくはからなるポリペプチドを発現、または過剰発現する細菌を指す。
【００２８】
本発明のクエリーアミノ酸配列とたとえば少なくとも９５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは、対象ポリペプチド配列が、クエリーアミノ酸配列のアミノ酸各１００個あたり最大５個のアミノ酸変化を含み得ることを除き、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であると意図される。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中のアミノ酸残基のうち最大５％（１００個のうち５個）が、別のアミノ酸を挿入、欠失、または置換され得る。
【００２９】
本出願の文脈において、同一性のパーセンテージは、グローバルアライメントを使用して計算される。（すなわち２つの配列を、それらの全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性を比較する方法は、当業者によく知られている。たとえば「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを使用してもよく、これは、長さ全体を考慮する場合、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を見つけ出すためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ‐Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３）を使用する。ｎｅｅｄｌｅプログラムは、たとえば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋワールドワイドウェブサイトで入手可能である。本発者に係る同一性のパーセンテージは、好ましくは、１０．０に等しい「ギャップ開始」パラメータ、０．５に等しい「ギャップ伸長」パラメータ、およびＢｌｏｓｕｍ６２行列を用いてＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ（グローバル）プログラムを使用して計算する。
【００３０】
参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である」アミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して、欠失、挿入、および／または置換などの変異を含み得る。置換の場合、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは異なる種由来の相同配列に対応し得る。
【００３１】
アミノ酸の置換は、保存的または非保存的であり得る。好ましくは、置換は保存的置換であり、ここでは１つのアミノ酸が、類似の構造および／または化学的な特性を有する別のアミノ酸に置換されている。好ましくは、置換は、以下の表に記載される保存的置換に対応する。
【表１】
2017502000.tif 000003
【００３２】
ＣｌｐＢ発現細菌は、当業者によく知られており、従来のいずれかの技術により同定され得る。
【００３３】
一実施形態では、ＣｌｐＢ発現細菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）属、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｒａｌｅｎｓｉｓ）属、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）属、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）属、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）属、大腸菌、腸内細菌科、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）属、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）属、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）属、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）属、シトロバクター  ヤンガエ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｙｏｕｎｇａｅ）属、サルモネラ・ボンゴール（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉ）属、およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）属で構成される群から選択される。
【００３４】
ＣｌｐＢタンパク質は、２つのヌクレオチド結合ドメイン（ＡＴＰ１およびＡＴＰ２）と、２つのオリゴマー形成ドメイン（ＮＢＤ１およびＮＢＤ２）とを含む。Ｎ末端ドメインは、基質識別ドメインとして機能し、凝集したタンパク質をＣｌｐＢ六量体に動員し、かつ／または結合したタンパク質を安定化させる。ＮＢＤ２ドメインは、オリゴマー形成の原因であり、一方ＮＢＤ１ドメインは、おそらくはＡＴＰ依存的に六量体を安定化させる。コイルドコイルドメインの運動は、おそらくは、機能的な六量体において隣接するＣｌｐＢサブユニットのコイルドコイルモチーフ間で結合されている大きな凝集したタンパク質を引き離すことにより、ＣｌｐＢがタンパク質を凝集状態から救出する能力にとって必須である。
【００３５】
本発明者らは、共生腸内細菌大腸菌Ｋ１２のＣｌｐＢシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の立体構造模倣体であることを同定した。
【００３６】
「α−ＭＳＨ」は、「α−メラニン細胞刺激細胞ホルモン」、「アルファ−ＭＳＨ」「α−ＭＳＨ」、「α―メラノトロピン」、「α―メラノコルチン」、または「α−インターメジン」としても知られており、トリデカペプチド構造を有するメラノコルチンファミリーの天然に存在する内在性ペプチドホルモンである。好ましくは、α−ＭＳＨのアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号：３）（Ｇｅｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ，  ＰＲＦ：２２３２７４（２０１３年１２月２日時点で利用可能））を含む、またはからなる。しかしながら、そのアセチル状態が異なる３種類のα―メラニン細胞刺激ホルモンが存在し、このうちデスアセチルα−ＭＳＨは、アセチル基を欠損しており；モノアセチルα−ＭＳＨでは、配列番号３のＳｅｒ−１のアミノ基がアセチル化されており；ジアセチルα−ＭＳＨでは、配列番号３のＳｅｒ−１のアミノ基およびヒドロキシル基の両方がアセチル化されている。本明細書において使用されるα−ＭＳＨは、デスアセチルαＭＳＨおよび／またはモノアセチル化および／またはジアセチル化の形態を指し、
特にモノアセチル化α−ＭＳＨを指す。
【００３７】
α−ＭＳＨは、中枢および末梢の両方で作用して、メラノコルチン受容体４型（ＭＣ４Ｒ）の活性化を介して、食物摂取の減少およびエネルギー消費の増大によるエネルギー収支の調節に大いに関与する。実際に、ヒトおよびマウスのいずれにおいても、α−ＭＳＨの産生およびＭＣ４Ｒの発現の原因となる遺伝子の変異が過食および肥満をもたらすが、血漿中のα−ＭＳＨレベルは体重の変化に関連する。さらにα−ＭＳＨは、不安を増大させることにより、気分および感情を調節する。
【００３８】
「模倣体」は、別のタンパク質を模倣するタンパク質を指す。タンパク質が、それが模倣するタンパク質と特定の特徴を共有する場合、このような模倣が可能である。
【００３９】
「立体構造模倣体」は、別のタンパク質と少なくとも部分的に同じ立体構造を共有するタンパク質を指す。
【００４０】
本発明者らは、ＣｌｐＢタンパク質が、α−ＭＳＨと配列番号１由来の５４２〜５４８番目のアミノ酸のあいだにアミノ酸配列「ＲＷＴＧＩＰＶ」（配列番号：２として引用）の不連続な配列相同性を共有することを証明した。理論に拘束されるものではないが。このＣｌｐＢの立体構造は、ＣｌｐＢおよびα−ＭＳＨの両方に対する抗体の産生を刺激することができる。
【００４１】
よって、本明細書中の「立体構造模倣体」は、ＣｌｐＢに対する抗体の産生およびα−ＭＳＨに対する自己抗体の刺激能を指す。
【００４２】
対象
本発明の文脈において、「対象」は、ヒト、またはげっ歯類（ラット、マウス、ウサギ）、霊長類（チンパンジー）、ネコ科（ネコ）、もしくはイヌ科（イヌ）などの非ヒト哺乳類を指す。好ましくは、対象はヒトである。本発明に係る対象は、具体的には、雄性または雌性であり得る。
【００４３】
好ましくは、本発明に係る対象は、１３歳超である。
【００４４】
好ましくは、対象は雌性である。
【００４５】
好ましくは、対象は食欲調節障害を罹患している。
【００４６】
「食欲」は、空腹として感じられる、食物を摂食する欲望を意味する。食欲は、すべての高等生物に存在し、代謝のニーズを維持するために適切なエネルギー摂取を調節するために役立つ。食欲は、消化管と、脂肪組織および脳の間の密接な相互作用により調節される。食欲は、摂取する食物の量を測定すること、および対象の摂食欲求を評価することにより対象において評価される。
【００４７】
「食欲の調節障害」は、持続して存在するかまたは１週間に数回再発する食欲の増進および食欲の減少を含み、それにより神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、消耗性疾患、過食、むちゃ食い障害、および多食症に関与する異常な食欲を指す。
【００４８】
「食欲の増大」は、対象が、身体が必要とするよりも多くの食物を摂取する食欲を指す。これは、体重の増加をもたらしても、もたらさなくてもよい。
【００４９】
よって、「正常な食欲」は、対象が、身体が必要とする食物の量に対応する食物を摂取することを指す。
【００５０】
「食欲の減少」および／または「食欲の低下」は、身体が必要とするよりも少ない食物を対象が摂取する食欲を指す。これは、体重の減少をもたらしても、もたらさなくてもよい。
【００５１】
１つの特定の実施形態では、対象は過体重を罹患している。
【００５２】
同一の実施形態では、対象は食欲の増大を有し得る。
【００５３】
「過体重の対象」は、本明細書中、好ましくは２５〜３０のＢＭＩを有する対象を指す。一実施形態では、対象は肥満を罹患している。
【００５４】
「肥満」は、好ましくは対象が３０超のＢＭＩを有する医学的状態を指す。
【００５５】
一実施形態では、過体重および／または肥満を有する対象は、むちゃ食い障害および／または多食症を罹患し得る。「ＢＭＩ」または「肥満度指数」は、対象の身長の２乗により対象の体重を除算することにより定義される。医療において一般的に使用される式は、ｋｇ／ｍ２の測定単位を生じる。
【００５６】
「むちゃ食い障害」または「ＢＥＤ」は、別々の期間（たとえば任意の２時間以内）で、大部分の人々が同様の期間および同様の環境で摂食する量よりも多い食物の摂食、からなるむちゃ食いを特徴とする摂食障害を指し、制御不能の感覚を伴う。このむちゃ食いは、平均して、６か月間に少なくとも１週間に２回起こる。過食症とは反対に、むちゃ食いは、不適切な代償行動の繰り返しに関連していない。ＢＥＤを罹患している対象は、むちゃ食いを深刻に心配している。さらに、ＢＥＤを罹患している対象は、身体的も不快となるまで、消費した食物量により吐き気がするまで摂食し、および／または倦怠感または不安がある場合に摂食し、および／または現実に空腹ではない場合であっても大量の食物を摂食し、および／または食物に対する困惑した感情および／またはむちゃ食い後の嫌悪感、消沈、または罪悪感により摂食が正常な期間でも１人で摂食する。むちゃ食い障害を有する対象は、衝動的に行動し、摂食に関する制御が欠如していると感じる。さらに、むちゃ食い障害を罹患している対象は、ストレス、不安、怒り、悲しみ、倦怠、および心配に対処する問題を有している。
【００５７】
本発明では、ＢＥＤを罹患している対象は、好ましくは肥満であり、３０超のＢＭＩを有する。
【００５８】
「多食症」は、「過食症」としても知られており、過剰な空腹（強迫性）または食欲の増進を指す。一実施形態では、多食症は、糖尿病、クライネ・レヴィン症候群、遺伝障害のプラダー・ウィリー症候群およびバルデ・ビードル症候群などの障害により引き起こされ得る。
【００５９】
一実施形態では、対象は食欲の低下および／または不安を有する。
【００６０】
別の実施形態では、対象は体重減少を有する。
【００６１】
さらに対象は、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に罹患し得る。
【００６２】
一実施形態では、上記対象は、食欲の低下および／または食欲の喪失を有し得る。
【００６３】
本明細書中で使用される「不安」および／または「不安障害」、または「不安に関連する疾患もしくは障害」は、主な特徴が異常または不適切な不安である多くの障害を指す。
【００６４】
一実施形態では、不安および／または不安障害は、不適切な不安に関連する。不適切な不安は、任意の認識可能な刺激、またそのような反応を正当化しない刺激がない状態での心拍数の増加、筋肉の緊張、呼吸の増加などの不安の症状の発現を指す。一実施形態では、これら症状は、不安‐回避性、強迫性、および完璧主義のタイプの気質に関連している。医学的原因が除外されると、不安障害が理由であり得る。
【００６５】
一実施形態では、不安に関連する疾患または障害は、急性ストレス障害、広場恐怖症（パニック障害の病歴を伴うまたは伴わない）、全般性不安障害（ＧＡＤ）、強迫性障害（ＯＣＤ）、パニック障害（広場恐怖症を伴うまたは伴わない）、恐怖症（社会恐怖症を含む）および外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）からなる群から選択される。
【００６６】
別の実施形態では、さらに不安は、神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、または消耗性疾患、特に神経性食欲不振症または神経性過食症に関連する不適切な不安に関連し得る。
【００６７】
よって、不安は、たとえば、体重増加の不合理な恐れ、および／または完ぺきではないことの不合理な恐れに関連し得る。
【００６８】
「食欲の低下に関連する疾患または障害」は、一般的に、おもな特性が、食物摂取量の低下および／または体重減少である疾患または障害を指す。本明細書において用語「食欲の低下に関連する疾患または障害」は、特に、神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、または消耗性疾患、特に神経性食欲不振症、および／または神経性過食症などの疾患および／または障害を指す。
【００６９】
「食欲不振」は、食欲を感じることが低下することにより、食欲が低下することを指す。多くの場合、非科学的刊行物でこの用語は、神経性食欲不振症と互換的に使用されているが、食欲の減少には多くの潜在的原因が存在しており、このうちの一部は無害であり得るが、その他は重篤な臨床病態を示し、または顕著なリスクをもたらす。
【００７０】
「神経性食欲不振症」（ＡＮ）は、本発明では、正常な体重の少なくとも８５％の体重を維持することができない極端な食物の制限を特徴とする摂食障害を指す。さらに、神経性食欲不振症を罹患している対象は、体重の増加に関する極度の恐れならびに歪んだ自己認識を有し、対象は、確かな反証があるにも関わらず彼自身／彼女自身を過体重であると考えている。
【００７１】
よって、神経性食欲不振症を罹患している人は、好ましくは、身体の不満、痩せ願望、完全主義、無力感、対人不信、社会的不安定、および快感消失からなる群から選択される心理学的な特徴のうちの少なくとも１つを有する。好ましくは、神経性食欲不振症を罹患している人は、身体の不満、痩せ願望、および完全主義からなる群から選択される心理学的な特徴のうち少なくとも１つを有する。さらに好ましくは、神経性食欲不振症を罹患している人は、無力感、対人不信、社会的な不安感、および快感消失からなる群から選択される心理学的な特徴のうち少なくとも１つを有する。
【００７２】
さらなる実施形態では、神経性食欲不振症を罹患している対象は、１７未満のＢＭＩを有する。
【００７３】
「過食症」または「神経性過食症」は、むちゃ食いと排出、または短時間での大量の食物の消費後の、典型的に嘔吐、下剤または利尿剤の摂取、および／または過剰な運動により消費した食物を自身から取り除こうとする努力（排出）を特徴とする摂食障害である。一部の対象は、神経性過食症と神経性食欲不振症とを交互に有する傾向があり得る。過食症を罹患している対象は、通常２５未満の正常なＢＭＩの範囲を特徴としてもよい。
【００７４】
「カヘキシー」は、体重減少、および／または筋萎縮症、および／または疲労、脱力、および食欲の顕著な喪失に関連する消耗性の症候群であり、癌、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、うっ血性心不全、結核、家族性アミロイドポリニューロパチー、水銀中毒（肢端疼痛症）、およびホルモンの欠損により引き起こされ得る。カヘキシーはまた消耗とも呼んでよく、ＡＩＤＳ、癌、後股関節骨折（ｐｏｓｔ  ｈｉｐ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、慢性心不全、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＬＤ）および／または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの慢性肺疾患、肝硬変、腎不全、ならびに関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、敗血症、ならびに重篤な感染症などのいくつかの疾患に伴って見られる。さらに、消耗は老化に伴い見られる。
【００７５】
一部の実施形態では、カヘキシーは癌により引き起こされる。
【００７６】
カヘキシーの主要な兆候は、脂肪組織の損失のみならず、筋肉組織、さらには骨の重量の損失である。この非脂肪性の組織は、「除脂肪体重」としても知られている。
【００７７】
さらに、食欲の喪失、脱力（無力症）、およびヘモグロビンレベルの低下（貧血）が存在する。
【００７８】
カヘキシーは、癌、感染症、ＡＩＤＳ、うっ血性心不全、関節リウマチ、結核、後股関節骨折（ｐｏｓｔ  ｈｉｐ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）、嚢胞性線維症、およびクローン病などの多くの異なる臨床病態の末期的な状態として、または慢性疾患において見出される。またカヘキシーは、疾患のいかなる明らかな症状も有さない高齢者でも起こり得る。
【００７９】
一実施形態では、本発明に係る対象は、感染症を罹患せず、菌血症を有していない。よって、本発明に係る対象は、好ましくは、１０ｍｇ／ｌ未満、特に５ｍｇ／ｌ未満の血漿中フィブリノーゲン濃度を示し、かつ／または大量の白血球尿を示さず、かつ／または抗ウイルス療法を受けておらず、かつ／または３０ｍｇ／ｌ未満のベースラインＣ反応性タンパク質の血漿中濃度を示す。
【００８０】
本明細書中使用される用語「Ｃ反応性タンパク質」または「ＣＲＰ」は、そのレベルが身体で発症する炎症プロセスの間に顕著に上昇することから、急性期反応体のクラスのメンバーであるタンパク質を指す。当業者に知られているように、ＣＲＰは、モノマーのモル質量２５１０６Ｄａを有する２２４残基のタンパク質であって、ＣＲＰ遺伝子によりコードされる。
【００８１】
本明細書中で使用される用語「フィブリノーゲン」は、血液凝固カスケードの最終段階の最中にトロンビンによりフィブリンに切断される３４００００Ｄａの血漿糖たんぱく質を指す。
【００８２】
本明細書中に使用される用語「白血球尿」は、対象の尿中の白血球の存在を指す。特に、大量の白血球尿は、尿における、分あたり１００，０００個の白血球の存在に対応する。
【００８３】
肥満の治療
本発明者らは、プロテオミクスを使用して、共生腸内細菌  大腸菌Ｋ１２のＣｌｐＢシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドであるα−メラニン細胞刺激ホルモン（α―ＭＳＨ）の立体構造上の模倣物であることを発見した。
【００８４】
さらに本発明者らは、ＣｌｐＢ免疫マウスが、高い抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの血漿中レベルを有し、抗α―ＭＳＨ反応性ＩｇＧの血漿中レベルの増加を有することを発見した。
【００８５】
さらに、ＣｌｐＢ免疫マウスは、過食に起因する食欲の増大により体重が増加した。
【００８６】
本発明の文脈では、本発明者らは、大腸菌Ｋ１２発現ＣｌｐＢを強制経口投与したラットが抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧおよび抗α―ＭＳＨ  ＩｇＭの量の増加を有することを示した。
【００８７】
よって、ＣｌｐＢ発現細菌の存在は、食欲の増大をもたらし、これが過食の一因となる。
【００８８】
よって、本発明は、肥満および／または過体重の治療または予防に使用するための、「ＣｌｐＢ発現細菌」の章で上記に定義した、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物を指す。
【００８９】
特に、本発明は、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物であって、上記少なくとも１つの抗生剤が、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する、
肥満の治療または予防に使用するための
組成物に関する。
【００９０】
本発明の文脈において、本明細書中で使用される用語「治療する」または「治療」は、当該用語が適用される当該障害または病態、または当該障害若しくは病態の１つ以上の症状の進行を反転、軽減、阻害することを意味する。
【００９１】
「予防する」は、当該用語が適用される障害または病態が発症するのを防止する、または疾患もしくは障害の初期状態で発症を防止するために取られる手段を指す。さらに予防は、当該用語が適用される障害または病態のさらなる進行の阻害を指す。
【００９２】
肥満の治療または予防は、好ましくは、本明細書において、治療される対象におけるＣｌｐＢ発現細菌の量または濃度を減少させることを指す。
【００９３】
一部の実施形態では、本組成物は、過体重および／または肥満に関連する疾患または障害の治療または予防に使用するためのものである。
【００９４】
同様に、対象の肥満および／または過体重を治療するまたは発症の機会を低下させる方法であって、上記方法が、以下に定義される少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、特に、上記少なくとも１つの抗生剤が、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する、
方法を提供する。
【００９５】
それを必要とする対象は、特にはむちゃ食い障害または多食症の結果としての肥満および／または過体重を有する対象である。
【００９６】
同様に、肥満および／または過体重の治療または予防のために意図される薬剤の製造のための、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物の使用であって、特に上記少なくとも１つの抗生剤が、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する、
使用を提供する。
【００９７】
本発明者らは、食欲の増大は、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の存在、ならびに抗α―ＭＳＨ反応性抗体、好ましくは抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ、および抗α―ＭＳＨ反応性ＩｇＧおよび／またはＩｇＭの血漿中レベルの増加に関連することを発見した。
【００９８】
一実施形態では、対象のＣｌｐＢ発現細菌の量または濃度の低下が、上記対象の食欲の低下および／または正常化をもたらす。
【００９９】
理論に拘束されるものではないが、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物は、ＣｌｐＢ発現細菌の量を減少させ、よって、抗ＣｌｐＢ抗体のレベルまたは濃度を減少させ、および／または抗α―ＭＳＨ反応性抗体のレベルを減少させ、よって、食欲の正常化および／または低下をもたらす。
【０１００】
「食欲」、「食欲の増大」、および「食欲の正常化」は、上記の「対象」節で定義されている。
【０１０１】
「食欲の低下」は、本明細書中、以前の食欲の増大と比較して減少した正常化された食欲を指す。
【０１０２】
「食物摂取量」は、たとえば、日記またはアンケートを使用した自己の記録、摂取前の食物の重量を使用した、ビュッフェ料理からのカロリー摂取の測定、またはペアにした食物の量の重量測定および分析を含む多数の技術を使用して測定することができる。食物摂取量は、食事ごとに、１日ごとに、週ごとに、または月ごとに測定してもよい。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態では、治療により、治療開始前の食物摂取量の平均値の２％の減少、より好ましくは３％または５％または７％の減少、さらにより好ましくは１０％未満の減少などの少なくとも１％の食物摂取量の減少がもたらされる。
【０１０４】
別の実施形態では、脂肪、炭水化物、およびタンパク質などの様々な食品が、食品量あたり異なる量のカロリーを含むことから、摂取した食物量が摂取したカロリー摂取量に直接関連しない場合があるため、本治療は、食物摂取量の変化に関係なくカロリー摂取量の減少をもたらす。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態では、本治療は、治療開始前のカロリー摂取量の平均値の２％の減少、より好ましくは３％、または５％または７％の減少、さらにより好ましくは１０％の減少などの少なくとも１％のカロリー摂取量の減少をもたらす。
【０１０６】
本発明の一態様では、本発明の治療または発症の機会を低下させる方法が、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物を投与することにより、体重を減少させ、または安定した体重を維持することができ、特に、上記少なくとも１つの抗生剤は、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する。
【０１０７】
また過体重は、特定の文化ではあまり魅力的ではないと考えられる容貌と考えられ得る。
【０１０８】
よって一実施形態では、本発明は、過体重の対象の食欲を低下させる、かつ／または食欲を正常化させる非治療的方法であって、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法を指す。
【０１０９】
一実施形態では、上記非治療的な法は美容上の方法である。
【０１１０】
「少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤」は、本明細書中で、ＣｌｐＢ発現細菌の増殖を阻害し、および／またはＣｌｐＢ発現細菌の量を減少させ、および「／またはＣｌｐＢ発現細菌を破壊する抗菌化合物を指す。
【０１１１】
ＣｌｐＢ発現細菌は、上記の「ＣｌｐＢ発現細菌」の節で定義されている。
【０１１２】
少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤は、好ましくは選択的または優先的にＣＬＰＢ発現細菌の増殖を阻害し、量を減少させ、かつ／または破壊する。上記抗生剤は、好ましくは、真核細胞に負の影響を与えるものではない。
【０１１３】
ＣｌｐＢ発現細胞を特異的に標的とする抗生剤は、当業者によく知られており、さらにはＭａｒｔｉｎ，  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１３，  ５６：  ７１７７−７１８９）に記載されている。
【０１１４】
少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤は、ＣｌｐＢに結合し、その活性を調節することができる。
【０１１５】
特に、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤は、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する。
【０１１６】
一実施形態では、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤は、ベンジルベンゼンをスキャフォールドとするサリチルアルデヒド誘導体であり、詳しくは５−（２−クロロベンジル）−２−ヒドロキシ−３−ニトロベンズアルデヒド（ＣＡＳ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２９２６４４−３２−７，  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）または（２−｛［（３，４−ジクロロフェニル）アミノ］チオキソメチルチオ｝エトキシ）−Ｎ−ベンズアミド（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＳＴ０３４３９８，ＴｉｍＴｅｃ）である。
【０１１７】
一実施形態では、本発明の文脈で使用される組成物は医薬組成物であり得る。
【０１１８】
本発明の文脈で使用される組成物は、本明細書中以下の「組成物」の章で記載されるように対象に処方および投与され得る。
【０１１９】
一実施形態では、本発明の文脈で使用される、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物は、経口投与され得る。
【０１２０】
本発明の少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤の典型的な用量は、たとえば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、特に上述の要因を考慮して、この例示的な範囲より下、またはこの範囲より上の用量が、想像される。経口１日量の投与計画は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ全体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ全体重、特には、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。患者の進捗を、定期的な評価によりモニターして、用量をそれに応じて調節することができる。
【０１２１】
食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療および予防
本発明者らは、ＣｌｐＢ免疫化マウスが、抗ＣｌｐＢ抗体の高い血漿中レベルを有し、驚くべきことに、抗α―ＭＳＨ自己抗体、特にα―ＭＳＨと交差反応する抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの血漿中レベルの増加を有することを発見した。さらに本発明者らは、ＣｌｐＢ免疫化マウスが、α−ＭＳＨの食欲不振誘発性作用に対して良好な保護を有し、およびαＭＳＨ媒介型不安の低減を有することを発見した。
【０１２２】
よって、本発明は、ワクチンまたは免疫原性組成物として使用するための、細菌性ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物を指す。
【０１２３】
「免疫原性組成物」は、本発明の文脈において、個体に投与する場合に免疫応答を誘発または免疫調節（すなわち免疫抑制もしくは免疫刺激）する、または個体に投与する際に抗体の産生を誘導する細菌性ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物を意味する。
【０１２４】
「ワクチン」は、特にその作用剤により、疾病から個体を保護または治療する、免疫応答を免疫調節するために投与される本明細書中に記載される免疫原性組成物などの組成物を意味する。本発明のワクチンは、治療用ワクチン（治療ワクチン）、すなわち、疾患の進行を低減もしくは停止させることを意図して、疾患の発症の後に個体に投与するためのワクチン、または疾患の発症前に個体に投与するための予防用ワクチン（予防ワクチン）の両方の使用が意図される。
【０１２５】
特に、上記組成物は、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に対する免疫での使用のためのものである。
【０１２６】
より具体的には、上記組成物は、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療および／または予防に使用するためのものである。
【０１２７】
理論に拘束されるものではないが、一実施形態では、細菌性ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物は、抗ＣｌｐＢ抗体の血漿中レベルの増加および／または抗α−ＭＳＨ反応性抗体の血中漿レベル、特に抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの血漿中レベル、および／または抗α―ＭＳＨ反応性ＩｇＧの血漿中レベルを増加させることができる。
【０１２８】
抗ＣｌｐＢ抗体の血漿中レベルおよび／または抗α―ＭＳＨ反応性抗体の血漿中レベルを増加させる能力を保持するＣｌｐＢの誘導体、フラグメント、または変異体もまた本発明の範囲内にある。
【０１２９】
ＣｌｐＢタンパク質の「変異体」は、スプライシング、変異、アレル、およびアイソフォームなどの天然に存在する変異体であってもよく、またはこれらは組み換え手段により産生されてもよい。アミノ酸配列における変異は、タンパク質をコードする核酸配列内での１つまたは複数のコドンの置換、欠失、または挿入により導入されてもよく、それによってタンパク質のアミノ酸配列の変化が起こる。任意に、この変異は、タンパク質中他のいずれかのアミノ酸による、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸の置換によるものである。さらにまたは代替的に、変異は、タンパク質中１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４０、または５０個またはそれ以上のアミノ酸の付加または欠失によるものであってもよい。
【０１３０】
ＣｌｐＢタンパク質の「フラグメント」は、たとえば完全長タンパク質と比較する場合に、Ｎ末端またはＣ末端で切断されてもよく、または、内部残基を欠失していてもよい。特定のフラグメントは、酵素活性に必須ではないアミノ酸残基を欠失している。好ましくは、上記フラグメントは、ＣｌｐＢタンパク質と比較して少なくともアミノ酸約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０個、またはそれ以上短い。さらに、「誘導体」は、ＣｌｐＢタンパク質のＣ末端もしくはＮ末端がタグ付けされたフラグメントまたは変異体を含む。
【０１３１】
ＣｌｐＢタンパク質の変異体は、本明細書中に開示されるポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含み得る。好ましくは、変異タンパク質は、本明細書中に開示される完全長のポリペプチド配列またはポリペプチド配列のフラグメントと、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３２】
「同一性」は、上記の「ＣｌｐＢ発現細菌」の節で定義されている。
【０１３３】
本発明者らは、配列番号１の５４２〜５４８番目のアミノ酸が抗α―ＭＳＨ反応性抗体の血漿中レベルを増加させる能力に関連することを配列アライメントにより示した。
【０１３４】
よって、一実施形態では、本発明に係る誘導体、フラグメント、または変異体は、アミノ酸配列「ＲＷＴＧＩＰＶ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の下参照）を有する配列番号１の５４２〜５４８番目のアミノ酸を含み、好ましくは、当該配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３５】
「抗ＣｌｐＢ抗体」は、本発明の文脈において、本明細書中上述したＣｌｐＢタンパク質に結合する抗体を指す。
【０１３６】
好ましくは、抗ＣｌｐＢ抗体は、上記に定義されるようにα−ＭＳＨと交差反応する。
【０１３７】
よって一実施形態では、抗ＣｌｐＢ抗体は、抗α―ＭＳＨ抗体でもある。
【０１３８】
「抗体」または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに結合し、各重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に結合する天然または通常の抗体であり得る。ラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能的な活性を決定する５つの主な重鎖の分類（または同位体）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。各鎖は、別々の配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメインまたは領域、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、集合的にＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合の認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域のドメインは、抗体の鎖の会合、分泌、胎盤通過性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合などの重要な生物学的特性を有する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原性決定基との間の構造上の相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成される。特に、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、ドメイン全体の構造に影響を与え、それにより結合部位に影響を与える。相補性決定領域あるいはＣＤＲは、本来の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を共に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、ＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−Ｌ、ＣＤＲ３−ＬおよびＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈと呼ばれる３つのＣＤＲを有する。よって、通常の抗体の抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のＶ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。
【０１３９】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に介在するアミノ酸配列、すなわち、単一の種において異なる免疫グロブリン間に比較的保存されている免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域の一部を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、ＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌ、およびＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈと呼ばれる４つのＦＲを有する。
【０１４０】
本明細書中で使用される「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒトの抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％以上、特に９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一）であるフレームワーク領域である。
【０１４１】
本明細書中で使用されるように、用語「抗体」は、通常の抗体およびそのフラグメント、ならびに単一ドメイン抗体およびそのフラグメント、特に単一ドメイン抗体の可変重鎖、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性または多重特異性抗体を指す。
【０１４２】
本明細書中で使用されるように、抗体または免疫グロブリンは、最近説明されており、抗体または免疫グロブリンの相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である「単一ドメイン抗体」をも含む。単一ドメイン抗体の例として、重鎖抗体、軽鎖を天然で欠いている抗体、通常の４つの鎖の抗体に由来する単一ドメイン抗体、遺伝子操作した単一ドメイン抗体が挙げられる。単一ドメイン抗体は、限定するものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含む任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠いた重鎖抗体として知られている天然に存在する単一ドメイン抗体であってよい。特に、たとえばラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、およびグアナコなどのラクダ科は、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体を産生する。ラクダ科の重鎖抗体はまた、ＣＨ１ドメインを欠いている。
【０１４３】
軽鎖を欠いたこれら単一ドメイン抗体の可変重鎖は、「ＶＨＨ」または「ナノボディ」として当技術分野で知られている。通常のＶＨドメインと同様に、ＶＨＨは、４つのＦＲおよび３つのＣＤＲを含む。ナノボディは、通常の抗体に対して利点を有する。これらナノボディは、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さく、結果として適切にフォールディングされた機能的ナノボディを、高い収率を達成しつつｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現により産生することができる。さらにナノボディは非常に安定であり、プロテアーゼの作用に抵抗性である。ナノボディの特性および産生は、Ｈａｒｍｓｅｎ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ＨＪ  （Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７  Ｎｏｖ；  ７７（１）：  １３−２２）に概説されている。
【０１４４】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、特に、肥満の個体から単離されたポリクローナル抗体、またモノクローナル抗体であり得る。好ましくは、抗体はヒト抗体またはウサギ抗体、より好ましくはヒト抗体である。
【０１４５】
抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体、特にＩｇＧまたはＩｇＭ抗体、より具体的にはＩｇＧ抗体であってもよい。
【０１４６】
抗体はモノクローナル抗体であってもよい。上記モノクローナル抗体はヒト化されていてもよい。別の例では、抗体は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性抗体およびＶＨＨからなる群から選択されるフラグメントであってもよい。
【０１４７】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、特異的抗原に対する１つのアミノ酸組成の抗体分子であり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。モノクローナル抗体は、Ｂ細胞またはハイブリドーマの単一クローンにより産生され得るが、組み換え型、すなわちタンパク質工学により産生されてもよい。
【０１４８】
用語「キメラ抗体」は、その最も広い意味において、１つの抗体由来の１つまたは複数の領域、および１つまたは複数の他の抗体由来の１つまたは複数の領域を含む人工的な抗体を指す。特にキメラ抗体は、別の抗体、特にヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインに会合した、非ヒト動物由来の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物を使用することができる。またキメラ抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に特異性を有する多重特異性抗体を指すこともできる。一実施形態では、キメラ抗体は、マウス由来の可変ドメインとヒト由来の定常ドメインとを有する。
【０１４９】
用語「ヒト化抗体」は、ヒトの免疫応答を回避または最小限にするために、最初は全体的または部分的に非ヒト起源であり、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域中の特定のアミノ酸を置換するよう修飾されている抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、たいていの場合、ヒトのＣＨおよびＣＬドメインである。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト起源の定常ドメインを有する。
【０１５０】
（通常の）抗体の「フラグメント」は、インタクト抗体の一部、特にインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性抗体、抗体フラグメントから形成される二重特異性および多重特異性抗体が挙げられる。また、通常の抗体のフラグメントは、重鎖抗体またはＶＨＨなどの単一ドメイン抗体であり得る。
【０１５１】
用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体のフラグメントであり、プロテアーゼ、パパインでＩｇＧを処理することにより得られるフラグメントのうち、Ｈ鎖および全Ｌ鎖のＮ末端側の約半分が、ジスルフィド結合を介して共に結合されている。
【０１５２】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量を有し、およびプロテアーゼ、ペプシンでＩｇＧを処理することにより入手したフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したＦａｂよりもわずかに大きい抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指す。
【０１５３】
用語「Ｆａｂ’」は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。
【０１５４】
１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーにより結合したＶＨおよびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から通常発現される、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントは、特に遺伝子組み換え技術を使用することにより、適切な立体構造で保持されているＣＤＲを含む。二価および多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖｓの会合により自然に形成できるか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）２などのペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖｓを結合することにより作製できる。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。「（ｄｓＦｖ）２」は、ペプチドリンカーにより結合した２つのｄｓＦｖを指す。
【０１５５】
用語「二重特異性抗体」または「ＢｓＡｂ」は、１つの分子内に２つの抗体の抗原結合部位を組み合わせる抗体を指す。よって、ＢｓＡｂは、同時に２つの異なる抗原に結合することができる。遺伝子工学は、たとえば欧州特許第２０５０７６４号に記載される望ましい一連の結合特性およびエフェクター機能を有する抗体または抗原誘導体を設計、修飾、かつ産生するためにますます使用されている。
【０１５６】
用語「多重特異性抗体」は、１つの分子の中で２つ以上の抗体の抗原結合部位を組み合わせる抗体を指す。
【０１５７】
用語「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を含む小分子抗体フラグメントであって、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むフラグメントである。同じ鎖の２つのドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーを使用して、ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作製する。
【０１５８】
一実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、対象の体重増加を増大させるためのものである。
【０１５９】
本発明の文脈では、体重増加は、細菌タンパク質ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物の第１の投与から少なくとも１６日後、たとえば１６、１７、１８、１９、または２０日後、好ましくは２０日後の体重増加を指す。
【０１６０】
さらに体重増加は、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物の第１の投与前の体重と比較して少なくとも２％の体重の増加、好ましくは３％の増加、より好ましくは５％の体重の増加を指す。
【０１６１】
用語「治療する」、「治療」、および「予防する」は、上記の「肥満の治療」の節で定義されている。
【０１６２】
食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害は、神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、カヘキシーおよび消耗性疾患からなる群、好ましくは神経性食欲不振症（ＡＮ）および神経性過食症（ＢＮ）からなる群から選択される。
【０１６３】
「不安」および／または「不安障害」は、上記の「対象」の節で定義されている。
【０１６４】
同様に、対象の免疫またはワクチン接種の方法であって、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１６５】
特に、上記方法は、対象の食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害を治療または発症の機会を低下させるためのものである。
【０１６６】
それを必要とする対照は、食欲の低下および／もしくは不安、および／もしくは食欲の低下および／もしくは不安に関連する疾患または障害を罹患している対象であるか、または食欲の低下および／もしくは不安、および／もしくは食欲の低下および／もしくは不安に関連する疾患または障害を罹患しやすい対象である。
【０１６７】
同様に、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に対する免疫のためのワクチンまたは免疫原性組成物を製造するための、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物の使用を提供する。
【０１６８】
特に、上記組成物は、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療または予防のためのものである。
【０１６９】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、たとえば食欲を刺激するために使用してもよく、この食欲の低下は、食欲不振、神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、または消耗性疾患、特に食欲不振、神経性食欲不振症、または神経性過食症によるものである。
【０１７０】
一実施形態では、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、食欲刺激機能を有する。
【０１７１】
さらなる実施形態では、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、上記対象の食欲を増進させるためのものである。
【０１７２】
化合物は、上記化合物を投与した対象が、食物摂取および／またはカロリー摂取の刺激を示すことにより、食物摂取の増加をもたらす場合、「食欲刺激機能」を有する。
【０１７３】
本発明の文脈でのワクチンまたは免疫原性組成物の食欲刺激機能は、自由に摂食しているラットに組成物を腹腔内注射することによる投与実験で試験され得る。組成物または化合物の投与後、動物の食物摂取量を測定する。食物摂取量は、たとえば、少なくとも１日から３０日、特に、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０日目に測定できる。
【０１７４】
食物摂取量は、食事の回数および／または食事の量を測定することにより測定され得る。
【０１７５】
食欲の刺激は、たとえば、食欲を測定し、空腹感または満腹感のレベルを測定するための視覚的なアナログのスケールを使用して測定してもよい。本発明の好ましい実施形態では、刺激は、治療前と比較して少なくとも２％高い、たとえば３％高い、より好ましくは５％高い、またはさらにより好ましくは治療前と比較して６％、７％、８％、９％、または１０％高い。
【０１７６】
細菌ＣｌｐＢタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、好ましくは、食欲刺激機能を有し、食物摂取を刺激する。この機能により、本組成物は、一実施形態では、対象の食欲を増進させる食欲促進剤または食欲刺激薬と互換的に呼ぶことができる。
【０１７７】
「食物摂取」は、上記の「肥満」の節に定義されている。
【０１７８】
細菌ＣｌｐＢタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、不安をさらに低減させ得る。
【０１７９】
一態様では、本発明は、抗ＣｌｐＢ抗体を含む組成物を投与することにより、体重増加を刺激するか、または安定した体重を維持することに関する。
【０１８０】
低体重は、特定の文化ではあまり魅力的ではないと考えられる容貌と考えられ得る。
【０１８１】
よって、本発明はまた、対象の食欲を増大させる非治療的方法であって、抗ＣｌｐＢ抗体を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。
【０１８２】
さらに本発明は、対象の食物摂取および／または体重を変化させる非治療的方法であって、抗ＣｌｐＢ抗体を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１８３】
一実施形態では、本発明によると、本組成物は、体重減少、食欲の低下、またはさらには食欲の喪失を有する任意の対象に投与することができると予想される。
【０１８４】
さらなる実施形態では、上記対象は１７未満のＢＭＩを特徴とし得る。
【０１８５】
細菌ＣｌｐＢタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物を使用する、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に対する免疫は、以下の「組成物」の節に記載されるように、当技術分野で公知のいずれかの投与方法を使用して達成され得る。
【０１８６】
好ましくは、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物に関して、投与は、本明細書中に記載される投与方法のいずれかを使用して、より好ましくは、静脈内投与または皮下投与を使用して、最も好ましくは皮下投与方法を使用して行われ得る。
【０１８７】
一実施形態では、本発明は、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療または予防に使用するための、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物であって、上記食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療または予防が、上記組成物を使用して対象を免疫することにより達成される、組成物に関する。
【０１８８】
また本発明は同様に、対象の食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療または発症の機会を低下させる対応する方法であって、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物でそれを必要とする対象を免疫することを含む、方法に関する。
【０１８９】
それを必要とする対象は、上記に定義される通りである。
【０１９０】
同様に、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療または予防のためのワクチンまたは免疫原性組成物を製造するための、細菌ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物の使用であって、上記食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の治療または予防は、上記組成物を使用して対象を免疫することにより達成される、使用に関する。
【０１９１】
一実施形態では、食欲の低下および／または不安の治療または予防は、抗ＣｌｐＢ抗体を直接投与することにより達成され得る。
【０１９２】
別の実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物はまた、本明細書中に開示される細菌性ＣｌｐＢタンパク質の組み合わせを含むことができる。
【０１９３】
ワクチン組成物または免疫原性組成物を得る方法は、当技術分野で周知である。一般的に、当該方法は、超音波処理、タンパク質消化、熱処理、凍結融解処理、浸透圧ショック処理などの技術を使用して細菌調製物からタンパク質を抽出することを含む。人工的な細菌調製物の例として、合成法または組み換え法により一部または全体が得られたタンパク質調製物を含む。
【０１９４】
細菌ＣｌｐＢを含むワクチンまたは免疫原性組成物の典型的な用量は、たとえば約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり得るが、この例示的な範囲より下、または上の用量が、特に上述の要因を考慮して想定される。特に、上記用量は、特に、上記用量は、約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ全体重〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ全体重、好ましくは約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、より具体的には、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、特に０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重である。
【０１９５】
さらに当該組成物の調製を、「組成物」の節で以下にさらに説明する。
【０１９６】
組成物
好ましくは、肥満の治療のために本発明の文脈で使用される組成物は、医薬組成物である。
【０１９７】
本発明の文脈での医薬組成物は、本発明の組成物の「有効量」または「治療的有効量」または予防的有効量」を含む。
【０１９８】
「有効量」または「治療的有効量」は、望ましい治療上の結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を指す。本発明の文脈で使用される組成物の有効量または治療上有効量は、対象の疾患の状態、年齢、性別、体重などの要因により変動し得る。有効量または治療的有効量はまた、組成物の治療上有益な作用が、組成物の毒性作用または有害作用を上回る量である。
【０１９９】
「予防的有効量」は、望ましい予防上の結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を指す。典型的に、予防的用量は、疾患の前または疾患の初期段階の対象に使用されるため、予防的有効量は、治療的有効量よりも低い。
【０２００】
有効量または治療的有効量は、対象に治療上の利益を与えるために必要である活性成分の少なくとも最小用量ではあるが、毒性用量よりも少ない。言い換えると、過体重および／または肥満を治療するためのそのような量は、たとえば食物摂取量を減少させるといった対象の状態の改善を誘導、軽減、またはそうでなければ引き起こす量である。本発明に係る医薬組成物は、適切な医薬的単位投与剤形の形態で経口投与され得る。本発明の医薬組成物は、錠剤、硬ゼラチンまたは軟ゼラチンカプセル、水溶剤、懸濁剤、およびリポソーム、および成形ポリマーゲルなどの他の徐放製剤を含む多くの剤形に調製され得る。
【０２０１】
投与様式および剤形は、所定の治療用途にとって望ましく有効な治療剤または組成物の特性と密接に関連する。適切な投与剤形は、限定するものではないが、経口投与、静脈内投与、直腸投与、舌下投与、粘膜投与、経鼻投与、点眼投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、脊髄投与、髄腔内投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与、およびリンパ管投与、ならびに活性成分の全身性送達用の他の投与剤形が挙げられる。
【０２０２】
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経皮（パッチ、ゲル、クリーム、軟膏、またはイオン導入を介して受動的に）、静脈内（ボーラス、点滴）；皮下（点滴、デポー）；経粘膜的（頬側および舌下、たとえば口腔内分散錠、ウェーハ、フィルム、および発泡製剤；結膜（点眼液）；直腸（坐剤、浣腸）；または皮内（ボーラス、点滴、デポー）を含む当業者に知られたいずれかの技術により投与され得る。
【０２０３】
経口の液体医薬組成物は、たとえば、水性または油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であり得るか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提示され得る。当該液体医薬組成物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、または保存剤などの従来の添加剤を含んでもよい。
【０２０４】
本発明の医薬組成物はまた、非経口投与（たとえば注射、たとえばボーラス注射または持続点滴による投与）用に製剤化されてもよく、アンプル、充填済シリンジ、少量の注入容器、または添加保存剤を含む多回用量容器中に単位投与剤形で存在してもよい。本医薬組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、溶剤、または乳剤などの剤形をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／もしくは分散剤などの処方用薬剤を含んでもよい。あるいは、本発明の医薬組成物は、使用前に、適切なビヒクル、たとえば滅菌水、パイロジェンフリー水で構成するための、滅菌固体の無菌的単離、または溶液からの凍結乾燥によって得た粉末剤形であってもよい。
【０２０５】
キャリアーが固体である直腸投与に適した医薬組成物は、最も好ましくは単位用量の坐剤として示される。適切なキャリアーは、ココアバターおよび当技術分野において一般的に使用される他の物質を含み、坐剤は、医薬組成物を軟化または融解するキャリアーと混合後、冷却し成型することにより、従来通り形成され得る。
【０２０６】
吸入による投与では、本発明に係る医薬組成物は、吹送器、ネブライザー、または加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の簡便な手段から、従来通り送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体などの適切な推進剤を含み得る。加圧エアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより投与単位を決定してもよい。あるいは、吸入または吹送による投与では、本発明の医薬組成物は、医薬組成物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物といった、乾燥粉末組成物の形態をとってもよい。粉末組成物は、たとえば、カプセルまたはカートリッジ、またはたとえば粉末が吸入器または吹送器を用いて投与され得るゼラチンまたはブリスターパックの単位投与剤形として示されてもよい。
【０２０７】
鼻腔内投与では、本発明の医薬組成物は、プラスチックボトルのアトマイザを介するなど、液体の噴霧を介して投与され得る。これらの典型的な例は、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒｇ（イソプロテレノール吸入器‐ウィントロープ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（登録商標）（イソプロテレノール吸入器‐ライカー）がある。
【０２０８】
また、本発明の医薬組成物は、芳香剤、着色剤、抗菌剤、または保存剤などの賦形剤も含んでもよい。
【０２０９】
投与計画は、たとえば少なくとも２、３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００日の期間であってもよい。
【０２１０】
投与範囲は、投与される組成物に依存し、上記に定義されている。
【０２１１】
医学の技術分野においてよく知られているように、任意の１人の対象の用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身健康状態、ならびに同時投与される他の薬剤を含む多くの要因に依存する。
【０２１２】
ワクチンおよび免疫原性組成物に関して、注射可能な用途に適した剤形は、滅菌性の水溶液または分散液と、滅菌性の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末とを含む。すべての場合、剤形は無菌的でなければならず、容易に注射針を通過する程度の流体でなければならない。剤形は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。キャリアーは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。たとえば、適切な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールによりもたらすことができる。多くの場合、たとえば糖または塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが好ましい。注射可能組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえばステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによりもたらすことができる。
【０２１３】
水溶液の非経口投与では、たとえば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝されているべきであり、液体の希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースでまず等張にしなければならない。これら特定の水溶液は、特に、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与、および腹腔内投与に適している。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者によく知られている。たとえば、１つの用量を、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解してもよく、これを１０００ｍｌの皮下点滴療法の流体に添加、または提案される点滴部位に注射してもよい（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１  ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ２００５参照）。治療する対象の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こる。さらに、ヒトの投与では、調製物は、ＦＤＡの生物学的製剤基準部により必要とされる無菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならない。
【０２１４】
滅菌注射可能な溶液は、ろ過滅菌により適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込むことにより調製される。
【０２１５】
本明細書中に使用される「キャリアー」は、限定するものではないが、溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、キャリアー溶液、懸濁剤、コロイド、リポソームおよびＢｏｍｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３４：２６９−２８０に記載されるものなどのビロソームが挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野においてよく知られている。
【０２１６】
「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」との文言は、ヒトに投与した場合にアレルギーまたは類似の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製物は当技術分分野においてよく理解されている。典型的に、当該組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製されており、注射前に、液体の溶液または懸濁液にするために適した固体剤形もまた調製できる。
【０２１７】
本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチン組成物は、１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。
【０２１８】
本明細書中使用される用語「アジュバント」は、免疫原性組成物、特にワクチンの内容物に添加されている生成物を指し、上記組成物を投与する宿主に誘導される免疫反応の強さを増大させる。アジュバントは、特に、上記哺乳類が、上記組成物の投与後に産生できる特異的抗体の量を増加させ、よって免疫の有効性を増大させることができる。
【０２１９】
好ましくは、アジュバントは、ヒト宿主において副作用を示さない。
【０２２０】
アジュバントは、保護的免疫応答を増大させるよう作用する任意の化合物または複数の化合物を含む。アジュバントは、たとえば、乳化剤；ムラミルジペプチド；アブリジン；水酸化アルミニウムなどの水性アジュバント；酸素含有金属塩；キトサンベースのアジュバント、および様々なサポニン、油、ならびにＡｍｐｆａｉｇｅｎ、ＬＰＳ、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、ＣｐＧ配列、合成オリゴヌクレオチドおよびそれらの組み合わせ（Ｓｃｈｉｊｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １２：４５６）、Ｍｙｃｏｈａｃｔｅｒｉａｌｐｌｉｌｅｉ（ｐｈｌｅｉ）細胞壁抽出物（ＣＷＥ）（米国特許第４，７４４，９８４号）、Ｍ．ｐｈｌｅｉ  ＤＮＡ（Ｍ−Ｄ  Ａ）、およびＭ−ＤＮＡ−Ｍ  ｐｈｌｅｉ細胞壁複合体（ＭＣＣ）、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、重合化リポソーム、変異毒素、たとえばＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２、マイクロカプセル、インターロイキン（たとえばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＮＦγ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＤＦ誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ホスファゼン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ）、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）、グルカン、抗原製剤、リポソーム、ＤＤＥ、ＤＨＥＡ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＯＣ／ミョウバン複合体、不完全フロイントアジュバント、ＩＳＣＯＭｓ（登録商標）、ＬＴ経口アジュバント、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルトリペプチド、およびホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）などの当技術分野において知られている他の物質のいずれかを含むことができる。乳化剤として役立ち得る化合物として、天然および合成の乳化剤、ならびに陰イオン性、陽イオン性、および非イオン性の化合物が挙げられる。酸素含有金属塩として、硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、硝酸塩、ヨウ素酸塩、臭素酸塩、炭酸塩、水和物、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、および酒石酸塩であるＡｌ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｎａ、Ｌｉ、Ｂ、Ｂｅ、Ｆｅ、Ｓｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｇ、Ａｕ、およびＣｒの塩、ならびにその混合物が挙げられ、それらには水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、リン酸カルシウム、マーロックス（水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムの混合物）、水酸化ベリリウム、水酸化亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、および硫酸バリウムが挙げられる。合成化合物のうち、陰イオン性乳化剤は、たとえば、ラウリン酸およびオレイン酸のカリウム、ナトリウム、およびアンモニウムの塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム、およびアルミニウムの塩、ならびにラウリル硫酸ナトリウムなどの有機スルホン酸塩が挙げられる。合成陽イオン性薬剤として、たとえば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ｃｅｔｙｌｔｒｈｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｌｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）が挙げられ、合成非イオン性薬剤は、グリセリルエステル（たとえばモノステアリン酸グリセリル）、ポリオキシエチレングリコールのエステルおよびエーテル、ならびにソルビタン脂肪酸エステル（たとえばソルビタンモノパルミタート）、およびそれらのポリオキシエチレン誘導体（たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート）により例示される。天然の乳化剤として、アカシア、ゼラチン、レシチン、およびコレステロールが挙げられる。
【０２２１】
他の適切なアジュバントは、単一の油、油の混合物、油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンなどの油状成分と共に形成することができる。油は、鉱油、植物油、または動物油であり得る。鉱油は、蒸留技術を介して石油から得た液体の炭化水素であり、当技術分野において流動パラフィン、流動ワセリン、または白色鉱油とも呼ばれる。適切な動物油は、たとえば、タラ肝油、ハリバ肝油、メンヘーデン油、オレンジラフィー油、およびサメ肝油が挙げられ、これらすべては市販されている。適切な植物油として、たとえば、キャノーラ油、アーモンド油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油などが挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）は、ワクチンの調製に一般的に使用されている２つの一般的なアジュバントであり、本発明での使用にも適している。ＦＣＡおよびＦＩＡはいずれも、鉱油中水型のエマルジョンであるが、ＦＣＡは、マイコバクテリウム種の死菌をも含む。粘膜ワクチンに特に好ましいアジュバントは、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：４１７−４２５に記載されるようにガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）を含む。
【０２２２】
免疫調節性サイトカインもまた、たとえば、アジュバントとして、ワクチンの有効性を高めるためにワクチン組成物に使用することができる。当該サイトカインの非限定的な例として、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２２３】
ワクチンおよび免疫原性組成物は、静脈内投与、動脈内投与、内視鏡的投与、病変内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、随腔内投与、眼窩内投与、皮内投与、腹腔内投与、経気管投与、表皮下投与、胸骨内注射、静脈内、動脈内、皮内、経皮、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮気管内、腹腔内、または鼻腔内噴霧、または気管内経路などにより投与され得る。組成物の投与は、点滴または注射（たとえば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内、十二指腸内、腹腔内など）による投与であり得る。さらに上記組成物は、「無針」送達システムにより投与することができる。
【０２２４】
注射は、複数回の注射に分けることができ、そのような分割された接種物は、好ましくは実質的に同時に投与される。分割接種として投与する場合、免疫原の用量は、好ましくは、必ずしも必要ではないが、各分割注にと等しく配分される。アジュバントがワクチン組成物に存在する場合、アジュバントの用量は、好ましくは、必ずしも必要ではないが、各分割注射に等しく配分される。分割接種のための個別の注射は、好ましくは、患者の身体で互いに実質的に近接して投与される。一部の好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約１ｃｍ離して投与されている。一部の好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約２．５ｃｍ離して投与される。非常に好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約５ｃｍ離して投与され、一部の態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約１０ｃｍ離して投与され、一部の態様では、注射は、身体で互いに１０ｃｍ超離して投与されており、たとえば、身体で互いに少なくとも約１２．５ｃｍ、１５ｃｍ、１７．５ｃｍ、２０ｃｍ、またはそれ以上離して投与される。
【０２２５】
様々な代替的な医薬送達システムを使用してもよい。当該システムの非限定的な例として、リポソームおよびエマルジョンが挙げられる。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒を使用してもよい。さらに、タンパク質を含有する固体のポリマーの半透性マトリックスなどの徐放システムを使用して、ワクチン組成物を送達してもよい。様々な徐放物質は当業者によく知られている。徐放カプセルは、その化学的性質に応じて、数日間〜数週間〜数か月間の範囲にわたりワクチン組成物を放出することができる。
【０２２６】
予防を目的として提供する場合、本発明の組成物は、理想的には、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の証拠の前、または食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害のいずれかの症状の前に対象に投与される。免疫原性組成物の予防的投与は、食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に対して対象の保護免疫を提供するために、または食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害の進行を予防または軽減するために役立ち得る。治療を目的として提供する場合、免疫原性組成物は、食欲の低下および／または不安の症状を軽減かつ治療するために役立ち、可能な限り早く使用することが好ましい。
【０２２７】
投与は、非経口経路または経口経路を介してもよい。投与経路は、たとえば静脈内、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌ）、皮内、経皮、筋肉内、粘膜、皮下、経皮、気管内、腹腔内、灌流および洗浄を含む。たとえば、投与は、粘膜経路、たとえば経鼻、経口（消化管の粘膜を介した）、膣内、頬側、直腸、舌下、眼性、尿（ｕｒｉｎａｌ）、肺性、または耳鼻科（耳を介した）経路を介している。
【０２２８】
免疫は、様々な「単位用量」を含み得る。
【０２２９】
単位用量は、１回注射として投与される必要はないが、設定された期間にわたる持続点滴を含む。単位用量は、０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇを含み得る。特に、上記用量は、約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ全体重〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ全体重、好ましくは約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、より具体的には、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、特に０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重である。
【０２３０】
一実施形態では、ワクチン組成物は、１日１回用量で投与されてもよく、または総１日用量を、分割用量、たとえば１日に２、３、または４回に分けて投与してもよい。さらに、ワクチン組成物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所的な使用を介した鼻腔内剤形で、または当業者によく知られている経皮スキンパッチの剤形を使用して経皮経路を介して；埋め込み可能なポンプにより、または他のいずれかの適切な投与手段により投与することができる。経皮送達システムの剤形で投与する場合、用量の投与は、当然、投与計画全体を通して間欠的投与よりも持続的投与であろう。
【０２３１】
ワクチンの投与は、プライムブースト法をさらに含み得る。これらの方法では、１つまたは複数のプライミング免疫の後に１回複数回の追加免疫を行う。実際の免疫原性組成物は、それぞれの免疫および免疫原性組成物の種類に関して同じまたは異なることができ、免疫原の経路および製剤もまた変化させることができる。１つの有益なプライムブースト法は、４週間離して２回のプライミング免疫後、最後のプライミング免疫から４週間後および８週間後に２回の追加免疫を提供する。
【０２３２】
免疫スケジュール（または投与計画）は、動物（ヒトを含む）に関してよく知られており、特定の対象および組成物に関して容易に決定することができる。よって、本組成物を、対象に１回または複数回投与できる。好ましくは、免疫原性組成物の個別の投与の間には、既定の時間間隔がある。この間隔は対象ごとに変化するが、典型的に１０日から数週間の範囲であり、多くの場合、２、４、６、または８週間である。ヒトでは、この間隔は、典型的に２〜６週間である。本発明の特に好ましい実施形態では、この間隔は、より長く、好ましくは約１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、３２週間、３４週間、３６週間、３８週間、４０週間、４２週間、４４週間、４６週間、４８週間、５０週間、５２週間、５４週間、５６週間、５８週間、６０週間、６２週間、６４週間、６６週間、６８週間または７０週間である。
【０２３３】
免疫法は、典型的に本組成物の１〜６回の投与を行うが、わずか１、２、３、４、または５回であってもよい。免疫応答を誘導する方法は、組成物と共にアジュバントの投与をも含むことができる。一部の例では、年に１回、２回、または他のより長い間隔（５〜１０年）で追加免疫を行うと、最初の免疫プロトコルを補完することができる。
【０２３４】
本発明の特定の実施形態は、本発明の組成物を対象に１回または複数回投与することにより、対象の食欲の低下および／または不安に関連する疾患または障害に対する免疫応答を誘導する方法であって、細菌ＣｌｐＢタンパク質が、対象の特異的免疫応答を誘導するために十分なレベルにある、方法を提供する。当該免疫は、望ましい免疫法に従って少なくとも２、４、または６週間（またはそれ以上）の時間間隔で複数回反復することができる。
【０２３５】
本願を通して、用語「含む」は、具体的に記載したすべての特性、ならびに任意の特性、追加的な特性、特定していない特性を含むと解釈すべきである。本明細書中で使用されるように、用語「含む」の使用はまた、具体的に言及した特性以外のいかなる特性も存在しない（すなわち「〜からなる」）実施形態を開示する。
【０２３６】
本発明を、以下の図面および実施例を参照してより詳細に記載する。
【０２３７】
配列
配列番号１：ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿４１７０８３．１として参照され、Ｕｎｉ−Ｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ  Ｐ６３２８４として参照される大腸菌Ｋ１２由来のシャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号２：配列番号１の大腸菌Ｋ１２由来のシャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列の５４２〜５４８番目のアミノ酸を示す。
配列番号３：Ｇｅｎ  Ｐｅｐｔの配列ＩＤ  ＰＲＦ：２２３２７４として参照されるホモサピエンス由来のα−ＭＳＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号４：大腸菌Ｋ１２のｏｒｆ２６４を増幅させるためのヌクレオチドプライマーＫ１２−Ｒの核酸配列を示す。
配列番号５：大腸菌Ｋ１２のｏｒｆ２６４を増幅させるためのヌクレオチドプライマーＣｌｐＢの核酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】大腸菌Ｋ１２タンパク質とα−ＭＳＨとの間の分子の模倣性のプロテオミクスによる同定  ａ．大腸菌Ｋ１２の細胞質タンパク質の２次元電気泳動（２ＤＧＥ）ｂ．ウサギ抗α−ＭＳＨ  ＩｇＧで検出した大腸菌Ｋ１２タンパク質のイムノブロット。ｃ．α−ＭＳＨであらかじめ吸着させたウサギ抗α−ＭＳＨで検出した大腸菌Ｋ１２タンパク質のイムノブロット。スポット周囲の丸１〜８は、α−ＭＳＨ  ＩｇＧにより特異的に認識され、これをタンパク質同定で使用した。番号のない丸は、非特異的スポットを示す。スポット１〜４で同定されたタンパク質は、ＣｌｐＢである。強度がより低いα−ＭＳＨ様染色スポット５〜８は、それぞれ、アミノ酸５４８個のタンパク質のシャペロンＧｒｏＥＬ  ＭＷ  ５７２９３Ｄａ（ＹＰ＿００１７３２９１２．１）に関して、８８０、８７７、８７４、および８００の最高ＭＡＳＣＯＴスコアを示した。ｄ．Ｎｅｅｄｌｅを使用したα―ＭＳＨおよびＣｌｐＢのアミノ酸配列間の配列アライメント。ｅ．Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒプログラム。ｆ．ウサギ抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧで明らかにされた組み換え型ＣｌｐＢのウェスタンブロット。カラム１：ＣｌｐＢ  ２０ｍｇ、カラム２：ＣｌｐＢ  １０ｍｇ、カラム３：トリプシン消化後のＣｌｐＢ  ２０ｍｇ。
【図２】マウスにおけるＣｌｐＢの免疫  ＣｌｐＢ反応性総ＩｇＧのＥＬＩＳＡにおける吸光度（ＯＤ）で血漿中レベルを示す棒グラフ。よって、ＣｌｐＢ免疫マウス（ＣｌｐＢプラスＡｄｊ）を、アジュバント（Ａｄｋ）、ＰＢＳ、および対照（Ｃｔｒ）を投与したマウスと比較した。ｂ．解離平衡定数（ＫＤ）として示される抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの親和性を示す棒グラフ。ｃ．α―ＭＳＨ反応性総ＩｇＧの血漿レベルを示す棒グラフ。ｄ．抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧの親和性（ＫＤ）を示す棒グラフ。ｅ．３２日間の試験の間の体重変化を表すグラフ。食物摂取量および摂食パターンを、ＢｉｏＤＡＱケージで２週間試験した。ｆ．試験の最後の１０日間での１日平均食物摂取量および（ｇ）食物の量を表す棒グラフ。ｈ．Ｏ迷路のクローズドアームにおける距離および（ｉ）時間により表される不安に関連する行動を表す棒グラフ。ａ，ｂ：ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１、テューキーの事後検定  ＊＊＊ｐ＜０．００１  ＣｌｐＢ＋Ａｄｊ対他の群、ｃ．ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０００２、テューキーの事後検定  ＊＊＊ｐ＜０．００１、＊／＊０．０５；ｄ：Ｋ−Ｗ検定  ｐ＝０．００３、ダンの事後検定  ＊＊ｐ＜０．０１；ｅ：α―ＭＳＨ注射（１００ｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ）前の２元ＲＭ  ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１、ボンフェローニの事後検定＊a少なくともｐ＜０．０５  ＣｌｐＢ群対対照群、および＊ｂ少なくともｐ＜０．０５  アジュバント群対対照群、＊ｃ，  ｐ＜０．０５，  スチューデントのｔ検定  ＣｌｐＢ群対ＰＢＳ群、および＊ｄ、ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定  ＣｌｐＢ群対対照群；ｆ：ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０００２，  ’テューキーの事後検定  ＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定；ｇ：ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．００７，’テューキーの事後検定  ＊＊ｐ＜０．０１；ｈ：＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定；ｉ：＊ｐ＜０．０５，スチューデントのｔ検定，平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝８）
【図３】ＭＣ４Ｒ発現細胞によるαＭＳＨ誘導ｃＡＭＰの放出  ａ．α―ＭＳＨペプチド単独、またはＣｌｐＢ免疫マウスまたはアジュバント対照（Ａｄｊ）マウスからプールしたＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に刺激後のＭＣ４Ｒを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰアッセイで測定したｃＡＭＰ放出（％）を表すグラフ。ｂ．抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧを枯渇させた両方のプールからのＩｇＧを用いて同じｃＡＭＰアッセイを行った。ｃＡＭＰの用量反応曲線を、最大対照反応から正規化した。ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．００５，  ’テューキーの事後検定  ＊ｐ＜０．０５；  ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０４、スチューデントのｔ検定  ＃ｐ＜０．０５，  ａＣｌｐＢ対α−ＭＳＨ、ｂＣｌｐＢ対アジュバント（平均値±ｓ．ｅ．ｍ．，  ｎ、説明文を参照されたい）
【図４】大腸菌Ｋ１２  ＤＮＡ由来の０．９７ｋｂｐのフラグメントの検出を示す電気泳動ゲル。カラム：（１）Ｒｅａｄｙ−ｌｏａｄ（商標）１００ｂｐのＤＮＡラダー；（２）培養した大腸菌Ｋ１２細菌から抽出したＤＮＡ。（３）ＬＢ培地中の１０８個の大腸菌Ｋ１２を雄性Ｗｉｓｔａｒラットに強制経口投与する前（３）および後（４）のラットの糞便のＤＮＡ。抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧ（ｂ）および抗α―ＭＳＨ  ＩｇＭ（ｃ）のＥＬＩＳＡにおける吸光度（ＯＤ）で血漿中レベルを表す棒グラフ。解離平衡定数（ｄ）、会合（ｅ）、および解離（ｆ）速度を示す大腸菌Ｋ１２および対照（Ｃｔｒ）ラットにおけるα―ＭＳＨ  ＩｇＧの親和性動態を示す棒グラフ。ｂ，ｃ：スチューデントのｔ検定  ＊ｐ＜０．０５；ｆ：Ｍ．Ｗ．−検定、＊ｐ＜０．０５、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．，  （ｎ＝１２）
【図５】マウスのＣＬｐＢ免疫  ａ．ＥＬＩＳＡにおける吸光度（ＯＤ）で血漿中の遊離ＣｌｐＢ−ＩｇＧの血漿中レベルを示す棒グラフ。よって、ＣｌｐＢ免疫マウス（ＣｌｐＢプラスＡｄｊ）を、アジュバント（Ａｄｊ）、ＰＢＳ、および対照（Ｃｔｒ）を投与したマウスと比較した。ｂ．抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの会合速度定数（Ｋａ）の差を示す棒グラフ。ｃ．抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの解離速度定数（Ｋｄ）の差を示す棒グラフ。ｄ．ＥＬＩＳＡにおける吸光度（ＯＤ）で血漿中の遊離α−ＭＳＨ−ＩｇＧの血漿中レベルを示す棒グラフ。よって、ＣｌｐＢ免疫マウス（ＣｌｐＢプラスＡｄｊ）を、アジュバント（Ａｄｊ）、ＰＢＳ、および対照（Ｃｔｒ）を投与したマウスと比較した。ｅ．抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの会合速度定数（Ｋａ）の差を示す棒グラフ。ｆ．抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの解離速度定数（Ｋｄ）の差を示す棒グラフ。ｇ．ＥＬＩＳＡにおける吸光度（ＯＤ）で血漿中の遊離α−ＭＤＨ  ＩｇＭの血漿中レベルを示す棒グラフ。よって、ＣｌｐＢ免疫マウス（ＣｌｐＢプラスＡｄｊ）を、アジュバント（Ａｄｊ）、ＰＢＳ、および対照（Ｃｔｒ）を投与したマウスと比較した。ｈ．ＥＬＩＳＡにおける吸光度ｓ（ＯＤ）で血漿中の遊離ＡＣＴＨ−ＩｇＧの血漿中レベルを示す棒グラフ。ｉ．血漿中の総ＡＣＴＨ−ＩｇＧ。よって、ＣｌｐＢ免疫マウス（ＣｌｐＢプラスＡｄｊ）を、アジュバント（Ａｄｊ）、ＰＢＳ、および対照（Ｃｔｒ）を投与したマウスと比較した。
【図６】α―ＭＳＨと抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの交差反応性  摂食障害患者および対照の天然の血漿と１０−６Ｍのα−ＭＳＨで吸収させた血漿との比較により明らかとなった総抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧ（１００％）由来のα―ＭＳＨと交差反応性の抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの血漿中レベル（％）を示す棒グラフ。ＡＮ−神経性食欲不振症、ＢＮ−神経性過食症、ＢＥＤ−むちゃ食い障害。クラスカル・ワリス検定  ｐ＝０．０００６，  ダンの事後検定  ＊＊＊ｐ＜０．００１  ，スチューデントのｔ検定  ＃＃ｐ＜０．０１。
【０２３９】
実施例
以下の実施例は、共生腸内細菌大腸菌Ｋ１２のＣｌｐＢシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の立体構造模倣体であることを例証する。
【０２４０】
以下の実施例は、ＣｌｐＢ免疫マウスが、食物摂取量および体重の増加および不安の低減を伴って抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧおよび抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧの産生の増加を示すことをさらに明らかにする。さらに、実施例は、ラットへ強制経口投与した大腸菌Ｋ１２が、ＣｌｐＢおよびα―ＭＳＨ反応性免疫グロブリンの血漿レベルを増加させたことを示す。
【０２４１】
実施例１
材料および方法
大腸菌Ｋ１２培養物およびタンパク質抽出物
この試験で使用する細菌株は大腸菌Ｋ１２であった。この細胞株は、フランスのルーアン大学のＵＭＲ  ６２７０  ＣＮＲＳ研究室のハウスコレクションより入手可能であった。凍結したストック（−８０℃）から、大腸菌Ｋ１２を、ルリアブロス（ＬＢ）液体培地（ＭＰ，  ｌｌｌｋｒｉｃｈ，  Ｆｒａｎｃｅ）２５０ｍｌに懸濁し、混入物質を検出するためにＬＢ寒天に播種した。細菌を含む培地を５０ｍｌのチューブ中３７℃で２４時間嫌気的に培養した。大腸菌の数を推定するために、細菌培養物の吸光度（ＯＤ）を分光光度計によりλ＝６００ｎｍで測定し、ＯＤ  ０．１はｍｌあたり細胞約１０８個に対応した。タンパク質の抽出のため、細菌を４，０００ｇ、４℃で３０分間遠心し、残渣をトリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）バッファー（ｐＨ７．４）２ｍｌに溶解し、室温で３分間超音波処理によりホモジナイズした。溶解していない細胞のフラグメントからタンパク質を分離するために、細菌のホモジネートを、１０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心した。上清を回収し、次に６０，０００ｇ、４℃で４５分間超遠心して、タンパク質を細胞質（上清）と膜（残渣に）の分画にさらに分離した。タンパク質の濃度を２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を使用して測定した。
【０２４２】
２次元ＰＡＧＥ
２次元（２Ｄ）ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）のために、大腸菌Ｋ１２のタンパク質抽出物４００μｇを使用して、固定したｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ（ｐＨ４−７；１８ｃｍ；ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を再水和した。次にタンパク質をＩＰＧｐｈｏｒ  等電点電気泳動システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を使用することにより合計８５，０００Ｖ−ｈでの等電点電気泳動により第１の次元で分離した。電気泳動の後、ＩＰＧストリップを平衡バッファー［６ｍｏｌの尿素／Ｌ、３０％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）グリセロール、２％（ｗｔ：ｖｏｌ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍｍｏｌのＴｒｉｓ−ＨＣＩ／Ｌ（ｐＨ８．８）、および２％（ｗｔ：ｖｏｌ）ジチオスレイトールを含む０．２５％（ｗｔ：ｖｏｌ）ブロモフェノールブルー］中で２０分間インキュベートし、次に４％（ｗｔ：ｖｏｌ）のヨードアセトアミドを含む平衡バッファー中で２０分間アルキル化した。次にＩＰＧストリップをＳＤＳ−ＰＡＧＥのために１０％のポリアシルアミド勾配ゲル（２０ｃｍ・１８ｃｍ・１ｍｍ）上に付着させた。第２の次元を、２５℃で１２ｍＡ／ゲルのＥｔｔａｎ  Ｄａｌｔｓｉｘ  ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で一晩行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、２Ｄゲルを、２％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）オルトリン酸および５０％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のメタノール中、室温で２時間固定した。次にゲルを水ですすぎ、タンパク質のスポットを、ＣＢＢ  Ｇ−２５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）染色［３４％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）メタノール、１７％（ｗｔ：ｖｏｌ）硫酸アンモニウム、２％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のオルトリン酸、および０．６６ｇのＣＢＢＧ−２５０／Ｌ］により可視化した。
【０２４３】
イムノブロッティング
２Ｄ−ＰＡＧＥの後、大腸菌の細胞質タンパク質を、ドライ転写法（Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）および膜の大きさ１平方センチメートルあたり一定の電流（０．８ｍＡ．ｃｍ−２）を使用することにより、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ  ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に２時間転写した。転写後、膜を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１０ｍｍｏｌ．ｌ−１のＴｒｉｓ（ｐＨ８）；１５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣＩ）プラス０．０５％（ｖ：ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０中５％（ｗｔ：ｖ）のミルクでブロッキングした。洗浄した後、膜を、ポリクローナルウサギ抗α−ＭＳＨ抗血清（１：１０００，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  米国カリフォルニア州  サン・カルロス）と共に４℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、次にポリクローナルブタ抗ウサギＨＲＰ結合型免疫グロブリン（１：３０００；Ｄａｋｏ，フランストラップ）と共にインキュベートした。イムノブロットを、ＥＣＬ検出システム（ＧＥ  Ｈｅ（Ｋｏｄａｋ）によって明らかにして、グレースケールマーカー（Ｋｏｄａｋ）を用いて予め較正したＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ  ＩＩ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンし、Ｌａｂｓｃａｎ  ６．００ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってデジタル化した。１０−６Ｍ  １−ＭＳＨペプチドによってウサギ抗α−ＭＳＨ抗血清を４℃で一晩吸着させた後に、同じ技法を実施した。
【０２４４】
タンパク質の同定
関心対象のタンパク質のスポットを、Ｅｔｔａｎ  Ｓｐｏｔ  Ｐｉｃｋｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＣＰＰＧ−２５０染色した２Ｄゲルから切除し、タンパク質の自動ゲル内消化を、Ｅｔｔａｎ  Ｄｉｇｅｓｔｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。次にタンパク質抽出物を、５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）アセトニトリル／０．１％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）ギ酸１０μＬに再懸濁し、次にナノスプレー源（ｎａｎｏｓｐｒａｙ  ｓｏｕｒｃｅ）およびＨＰＬＣ−チップキューブのインターフェース（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  フランス、クールタブフ）を備えた６３４０  イオントラップ質量分析器に結合したｎａｎｏ−ＬＣ１２００で分析した。簡潔に述べると、ペプチドを濃縮し、４０ｎｌのＲＰＣ１８トラップカラムで脱塩し、Ｚｏｒｂａｘ（３０−ｎｍの孔径，５−μｍの粒径）Ｃ１８カラム（４３ｍｍ長×７５μｍの内径；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離した。９分間の直線勾配（０．１％のギ酸中３〜８０％のアセトニトリル）を流速４００ｎｌ．ｍｉｎ−１）で使用し、溶離液を、イオントラップ質量分析器で分析した。タンパク質同定のため、ＭＳ／ＭＳピークのリストを抽出し、ＭＡＳＣＯＴ  Ｄａｅｍｏｎ  バージョン２．２．２（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）検索エンジンを使用することによりタンパク質データベースと比較した。この検索を、以下の特定のパラメータ：酵素の特異性、トリプシン；残った切断部位１は許容される；固定修飾なし；可変性の修飾、メチオニン酸化、システイン、カルバミドメチル化、セリン、チロシン、およびスレオニンのリン酸化；モノアイソトピック；ペプチド電荷２＋および３＋；前駆体イオンの質量許容差、０．５Ｄａ；断片化に関する質量許容差、０．６Ｄａ；機器としてのＥＳＩ−ＴＲＡＰ；分類、大腸菌；国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベース（ＮＣＢＩｎｒ  ２０１２０５３１（１８２８０２１５の配列、６２６５２７５２３３の残基）；メリーランド州ベセスダ）を用いて実施した。以下の基準：それぞれＭＡＳＣＯＴスコア５４超（ｐ＜０．０１）を有する少なくとも２つの上位にランク付けされたペプチド（赤色の太字）、またはそれぞれＭＡＳＣＯＴ  スコア４７超（p＜０．０５）を有する少なくとも２つの上位にランク付けされたペプチドによる同定のうち１つを満たす場合、タンパク質のヒットが自動的に可視化された。偽陽性の比率を評価するために、すべての初回データベース検索を、ＭＡＳＣＯＴの「デコイ」を使用して実施した。偽陽性の比率が決して１％を超えなければ、結果は適切であると考えられた。
【０２４５】
ＯＦＦＧＥＬからのタンパク質の同定
大腸菌Ｋ１２のタンパク質の２４分画への高分解能の分離を、ＯＦＦＧＥＬ  ｐＨ３−１０キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して３１００  ＯＦＦＧＥＬ  フラクショネーターで行った。タンパク質の試料（４００μｇ）の調製およびＯＦＦＧＥＬシステムのすべての部品の組み立てを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑｕｉｃｋ  ｓｔａｒｔ  Ｇｕｉｄｅに記載される手順に従って行った。ＯＦＦＧＥＬ分画を、３０時間後に６４ＫＶｈに達するまで最大制限電流パラメータ（８０００Ｖ、５０μΑ、および２００ｍＷ）を用いて標準的なプログラムＯＧ２４ＰＲＯを使用して実施した。実験の最後に、すべての画分を、０．８ｍｌのディープウェル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，フランス、イルキルシュ）に移し、−２０℃で保存した。ＯＦＦＧＥＬの中心部から回収した９個のタンパク質含有分画を、ウサギ抗α−ＭＳＨ  ポリクローナル抗血清（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するウェスタンブロットにより調べた後、上述のタンパク質を同定した。
【０２４６】
マウスにおける免疫および行動
動物のケアおよび実験は、アメリカ国立衛生研究所により確立されたガイドラインに従うものであり、フランスおよび欧州共同体の規則（欧州共同体の官報Ｌ  ３５８，  １８／１２／１９８６））の両方にまとめられている。２ヶ月齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，フランスラ・トゥーレット）を、午前７時に点灯する１２時間の明暗周期で動物施設に馴化させ、標準的なマウス保持ケージ（ｎ＝８）にそれぞれ保存した。マウスに、常時入手可能である飲料水と共に標準的なげっ歯類固形飼料（ＲＭ１  ｄｉｅｔ，ＳＤＳ，ＵＫ）を自由に与え、体重を測定した。馴化の最中にマウスを、ケージあたりのマウスあたりの平均体重が類似するように４つのケージに分けた。１週間馴化した後、各ケージのマウスを、４つの試験群のうちの１つに割り当て、以下の処置：（（ｉ）群１、ＣｌｐＢ免疫（ｎ＝８）：ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）５０μｇ／マウスを、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，米国ミズーリ州セントルイス）とＰＢＳの１：１容量の２００μｌを腹腔内（ｉ．ｐ）投与；（ｉｉ）群２、アジュバント注射対照（ｎ＝８）：ＣＦＡを含むＰＢＳ（１：１（ｖ容量、ｉ．ｐ．）混合物２００μｌ中で注射；（ｉｉｉ）群３；ＰＢＳ注射対照（ｎ＝８）：２００μｌのＰＢＳ（ｉ．ｐ）；および（ｉｖ）群４、未処置の対照（ｎ＝８）：注射をしていない）を行い、次にすべてのマウスを保持ケージに戻した。１５日後、マウスに、追加免疫を行い、以下の処置：（（ｉ）群１（ｎ＝８）、ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）５０μｇ／マウスを含む不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ）とＰＢＳの１：１混合物２００μｌのｉ．ｐ．；（ｉｉ）群２（ｎ＝８）；ＩＦＡを含むＰＢＳ２００μｌ（１：１容量、ｉ．ｐ．）；（ｉｉｉ）群３（ｎ＝８）：ＰＢＳ２００μｌ（ｉ．ｐ．）；およびｉｖ）群４（ｎ＝８）：注射なし）を行った。
【０２４７】
追加免疫処置の翌日に、自動給餌モニタをそれぞれ備えるＢｉｏＤＡＱマウスケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ニューブランズウィック）にマウスを個々に入れた。食料（ＳＥＲＬＡＢ，  フランスモンタテール）および飲料水を自由に入手可能な状態にし、体重を毎日測定した。ＢｉｏＤＡＱケージに３日間馴化させた後に、マウスに以下の処置：（（群１、２、および３（それぞれｎ＝８）すなわちＣｌｐＢで免疫したマウスに、アジュバントおよびＰＢＳをそれぞれ注射し、すべてのマウスにα−ＭＳＨペプチド（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ）１００μｇ／ｋｇ体重を含むＰＢＳ約１００μｌ（ｉ．ｐ．）を、午前１０時に急性的に注射した。を行った。対照のマウス（ｎ＝８）にはＰＢＳのみ（ｉ．ｐ．）を投与した。給餌データを、ＢｉｏＤＡＱ  データビューワー２．３．０７（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）を使用して連続的にモニターして分析した。食事のパターン分析のため、食事の間隔を、３００秒に設定した。
【０２４８】
給餌試験の後、マウスを、食料および水を自由に入手可能な個々のマウス保持ケージに入れ、２日間連続して行ったＯ迷路試験における自発運動活性および不安について分析した。Ｏ迷路試験から２時間後に、マウスをギロチンでの頭部切断により屠殺し、体躯の血液をＥＤＴＡ含有チューブに回収した。血漿を、３，５００ｒｐｍ（１．４ｇ）、４℃で１５分間遠心することにより分離し、アッセイするまで−８０℃で保存した。
【０２４９】
自発運動活性および不安の試験
ＢｉｏＤＡＱケージでの給餌試験の後に、マウスを、Ｖｅｒｓａｍａｘ動物活性モニター（ＡｃｃｕＳｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．，米国、オハイオ州コロンバス）を使用して自発運動活性に関して分析した。自発運動活性試験の翌日に、すべてのマウスを、高架式Ｏ迷路での不安に関して試験した。高架式Ｏ迷路は、げっ歯類の不安を試験するために薬理学的に検証されたより一般的に使用される高架式十字迷路法の変形である（Ｃｒａｗｌｅｙ，  Ｊ．  Ｎ．  ａｎｄ  Ｂａｉｌｅｙ，  Ｋ．  Ｒ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ７７−１０１  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００９））。Ｏ迷路の利点は、従来の十字迷路の曖昧な中心の四角がない点である。Ｏ迷路（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ａｌｂａｎｓ，  ＶＴ）は、床から８０ｃｍの高さの円形の赤外線プラットフォームからなり、灰色のプラスチック製の２つの開口部および２つの閉鎖部を特徴とした。閉鎖部は、迷路の表面から２０ｃｍ上に延びた壁により囲まれており、黒色の赤外線プレキシグラスのふたで覆われていた。各試験を、２つの閉鎖部の一方にマウスを配置することにより開始した。試験は５分間続行し、Ｏ迷路の上方に配置したビデオカメラおよびＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎビデオ追跡ソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ  ＩＴ、ｄオランダヴァーヘニンゲン）を使用して記録した。開口部および閉鎖部で費やした距離および時間の測定値を分析した。それぞれのマウスの試験のあいだに、Ｏ迷路を３０％のアルコールで清潔にした。
【０２５０】
ＣｌｐＢおよびα−ＭＳＨ自己抗体アッセイ
ＣｌｐＢ、α−ＭＳＨ、およびＡＣＴＨと反応する自己抗体Ａｂｓの血漿中レベルを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。簡潔に説明すると、ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、α−ＭＳＨ、またはＡＣＴＨのペプチド（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３バッファー中１００μｌおよび２μｇ／ｍｌの濃度（ＰＨ９．６）で使用して、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，  ニューヨーク州ロチェスター，ＵＳＡ）の上に４℃で７２時間コーティングした。プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２００を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で洗浄し（５分間、３回）、次にＰＢＳで１：２００に希釈したマウスのまたはラットの血漿１００μｌと共に４℃で一晩インキュベートして遊離の自己抗体のレベルを決定するか、または解離性の３ＭのＮａＣｌおよび１．５Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ８．９）で１：２００に希釈して総自己抗体のレベルを決定した。プレートを洗浄し（３回）、１００μｌのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ（１：２０００）、抗ラットＩｇＭ（１：１０００）、抗マウスＩｇＧ（１：２０００）、または抗マウスＩｇＭ（１：１０００）と共にインキュベートした。これらはすべてＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州ウェスト・グローブ）から入手した。洗浄（３回）を行った後、１００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（Ｓｉｇｍａ）を、アルカリホスファターゼの基質として添加した。室温で４０分間インキュベートした後、３ＮのＮａＯＨを添加することにより、反応を停止させた。ＯＤをマイクロプレートリーダーＭｅｔｅｒｔｅｃｈ  ９６０（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  台湾、台北市）を使用して４０５ｎｍで決定した。血漿試料を添加していないプレートの読み取りから得たブランクのＯＤの値を、試料のＯＤの値から除算した。各決定を２回の反復実験で行った。反復実験値間の変動は、５％未満であった。同様のプロトコルを使用して、対応する抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ  ＡＰコンジュゲート抗体（１：２０００，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を使用して、ヒト血漿（１：４００）中の抗ＣｌｐＢのＩｇＧおよびＩｇＭ、ならびに抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧを測定した。
【０２５１】
α−ＭＳＨによるＣｌｐＢ抗体の吸収
ＰＢＳで１：４００に希釈したヒトの血漿試料を、４℃で一晩１０−６Ｍのα−ＭＳＨペプチド（Ｂａｃｈｅｍ）と共にプレインキュベートした後、試料を、ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）でコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）に添加した。ＣｌｐＢと反応性であるＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を、対応する上述の抗ヒトＡＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用するＥＬＩＳＡにより検出した。α−ＭＳＨと交差反応性のＣｌｐＢ抗体のパーセンテージを、１００％に等しい個々のそれぞれの血漿試料中で吸収することなく検出した抗ＣｌｐＢ抗体のレベルと比較して計算した。
【０２５２】
血漿からのＩｇＧの精製
血漿グロブリンの抽出を、製造社の説明書にしたがいＣ−１８ＳＥＰカラム（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  米国カリフォルニア州バーリンゲーム）上での血漿の酸性化および分離により行った。手短に述べるとマウスまたはラットの血漿５００μｌをバッファーＡ（１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液）５００μｌと混合した。カラムを、７００ｒｐｍでの３分間の遠心により１ｍｌのバッファーＢ（１％のＴＦＡ中６０％のアセトニトリル）中で活性化し、バッファーＡ３ｍｌで３回すすいだ。希釈した血漿（バッファーＡに１：１で希釈）をカラムに添加し、溶離液（１ｍｌ）をＩｇＧのさらなる精製のため保存した（−２０℃で凍結保存）。総ＩｇＧを、製造社の説明書に従ってＭｅｌｏｎ  Ｇｅｌキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国イリノイ州ロックフォールド）を使用してラット血漿試料の溶離液から精製した。手短に述べると、キットの精製バッファーで１：４に希釈した血漿の溶離液を、カラムに沈着させた洗浄済みのｍｅｌｏｎ  ｇｅｌ上に添加した。カラムを６０００ｒｐｍで１分間スピンさせ、ＩｇＧ含有溶離液を残して−２０℃で凍結保存した後、凍結乾燥した。凍結乾燥したＩｇＧを、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）で再構成した。
【０２５３】
ｃＡＭＰの実験のため、ＣｌｐＢ群およびアジュバント対照群の８匹のマウスから精製したＩｇＧを、それぞれ、２つに分けた２つのプールにそれぞれ混合した。１つのパートをｃＡＭＰアッセイに直接使用し、もう一方を、活性化したＵｌｔｒａＬｉｎｋビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，米国イリノイ州ロックフォールド）にコーティングしたα−ＭＳＨに対するアフィニティクロマトグラフィーを使用することによりさらに精製した。α−ＭＳＨ  ＩｇＧを枯渇させたＩｇＧ溶離液を保存し、凍結乾燥し、ｃＡＭＰアッセイに使用した０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にまでＰＢＳで希釈した。
【０２５４】
親和性動態アッセイ
ＣｌｐＢおよびα−ＭＳＨに関するマウスおよびラットＩｇＧ自己抗体の親和性動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ  １０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象に基づく生体分子特異的相互作用分析（ＢＩＡ）により決定した。α−ＭＳＨ（Ｂａｃｈｅｍ）またはＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することによりセンサーチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させた。すべての測定を、同じα−ＭＳＨまたはＣｌｐＢコーティングチップで実施した。親和性動態分析では、８４０ｎｍｏｌの２回反復実験を含む、各ＩｇＧの試料の５回連続希釈液：３３６０、１６８０、８４０、４２０、および２１０（ｎｍｏｌ）ならびにブランクの試料（ＨＢＳ−ＥＰバッファーのみ）についてマルチサイクル法を実行した。各サイクルは、２分間の分析物の注射と、流速３０μｌ／分での２５℃、５分間の解離を含んだ。各試料の注射の間、結合表面を、１０ｍＭのＮａＯＨで再生し、センサーグラムの同じベースラインレベルを得た。親和性動態のデータを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１．１プログラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析した。動態データを適合させるために、Ｌａｎｇｍｕｒの１：１のモデルを使用し、ブランクの値を減算することにより、試料の値を補正した。
【０２５５】
大腸菌の強制経口投与
２か月齢の雌性Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝２４）（体重２２０〜２５０ｇ）（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）を、専用の動物施設で１２時間の明暗周期で、２４℃で維持した。ラットに標準的なげっ歯類固形飼料（ＲＭ１  ｄｉｅｔ，  ＳＤＳ，  ＵＫ）を与えて、標準的な保持ケージで１週間保持した。馴化させた後に個別の代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ，  Ｌｙｏｎ，  Ｆｒａｎｃｅ）に保存し、ここでは同一のＲＭ１ではあるが粉砕した固形試料（ＳＤＳ）を与えた。飲料水は、常に自由入手できる状態であった。体重、食物および水の摂取量を毎日測定した。大腸菌Ｋ１２をＬＢ培地中上述のように培養した。ラットを、１０８のＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２（ｎ＝１２）を含むＬＢ培地４ｍｌまたは細菌を含まないＬＢ培地４ｍｌ（対照、ｎ＝１２）を強制経口投与で胃内に投与した。強制経口投与の手順を、２１日間、午前９：００〜１０：００の間で毎日行った。強制経口投与を行った後、ラットをギロチンによる断頭により屠殺し、体躯の血液をＥＤＴＡ含有チューブ内に回収した。血漿を４℃で１０分間、３，５００ｒ．ｐ．ｍ．（１．４ｇ）での遠心により分離し、アッセイするまで−８０℃で保存した。
【０２５６】
大腸菌Ｋ１２細菌ＤＮＡアッセイ
ＱＩＡａｍｐＲ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｆｒａｎｃｅ）により、強制経口投与開始前に採取したラットの糞便から、ＤＮＡを抽出した。また、大腸菌Ｋ１２のＤＮＡを、細胞株の培養物から抽出し、細菌を水に溶解し、１００℃で５分間温め、１１，０００ｒ．ｐ．ｍで１分間遠心した後、ＤＮＡを含有する上清を−２０℃で保存した。
【０２５７】
公表された試験（Ｋｕｈｎｅｒｔ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１  ，  ４１３５−４１３９  （１９９５））に基づき、本出願人は、以下のヌクレオチドプライマー、Ｋ１２−Ｒ：５’−ＡＴＣＣＴＧＣＧＣＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）およびＫ１２−Ｆ：５’−ＣＧＣＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ，  Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、大腸菌Ｋ１２のマーカーとしてｏｒｆ２６４領域を増幅した。ＰＣＲを、ＭｉｃｒｏＡｍｐチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  Ｈａｍｂｏｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）でサーマルサイクラーにおいて実施した。反応を、Ｇｏ  Ｔａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｌ）２５μｌ、各プライマー１μｌ（２０ｐｍｏｌ）、２回蒸留水２１μｌ、細菌性ＤＮＡ１μｌを含む５０μｌの容量で行った。ＰＣＲの条件は、以下の通りであった：９４℃で３分間の後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で１．５分を３５サイクル。ＰＣＲ産物を、１％のアガロースゲル（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で分析し、この増幅産物の大きさは、０、９７ｋｂに対応した。
【０２５８】
ヒトの対象
摂食障害のエストニアの女性患者由来の血漿試料をこの試験で使用した。ＡＮ、ＢＮ、およびＢＥＤを、ＤＳＭ―ＩＶ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  第４版）に従って精神科医および臨床心理学者により診断した。健常な女性のボランティア由来の血漿試料を対照群とした。すべての試験の患者および対照が、試験への参加に関するインフォームドコンセントを提出した。患者および対照由来の血漿試料を、ＥＤＩ−２試験が完了した日に採取し、直ちに凍結し−７０℃で保存し、次にドライアイスと共に輸送して、再度分析するまで−８０℃で保存した。
【０２５９】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰアッセイ
ヒトＭＣ４Ｒを発現するヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞の安定した細胞株を、レンチウイルスの形質導入技術を使用して作製し、Ａｍｓｂｉｏ（英国オクソン）から購入した。トランスフェクトした細胞中のＭＣ４Ｒ  ｍＲＮＡの高い発現を、Ａｍｓｂｉｏおよび本出願人の研究室でのＲＴＰＣＲによりバリデートした。各実験の前に細胞中のトランスジーンの存在を、ＭＣ４Ｒレンチウイルスベクターと同じ状況ではあるが、異なるプロモーターの下で遺伝子を挿入した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光顕微鏡での可視化により確認した。α−ＭＳＨペプチド（Ｂａｃｈｅｍ  ）を、誘導バッファー：ＰＢＳ、５００μΜのＩＢＭＸ、１００μΜのＲＯ  ２０−１７２４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０ｍＭのＭｇＣｌ２中で、それぞれ、０．６、３、４．５、６、１５、３０、４５、６０および１２０ｐｍｏｌのα−ＭＳＨの用量に対応する２μＭ、１μＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭおよび１０ｎＭの最終濃度に希釈した。同様に、１つのブランクの試料を含めた。
【０２６０】
解凍した後、湿潤細胞培養インキュベーターにおいて、２５０ｍｌの組織培養フラスコ（ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  マサチューセッツ州ベドフォード）中に、（２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％のＦＣＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸および１％のペニシリン‐ストレプトアビジン）を補充したダルベッコ変法イーグル培地４．５ｇ／ｌグルコース（Ｅｕｒｏｂｉｏ，フランス、クールタブフ）で細胞を８〜１０日間、３７℃および５％のＣＯ２で培養した。実験日に、培養したＭＣ４ＲＨＥＫ２９３細胞を、０．２５％のトリプシン‐ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、細胞のペレットをＰＢＳに再懸濁して、無処置のバイオルミネセンス白色９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ，デンマークロスキレ）中に、ウェル（１０μｌ）あたり約５，０００個の細胞を得た。ＭＣ４Ｒ発現ＨＥＫ２９３細胞による環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の産生を、生物発光アッセイのｃＡＭＰ−Ｇｌｏ（商標）Ｍａｘアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造社の説明書に従って使用して測定した。簡潔に説明すると、細胞を、異なる濃度のα−ＭＳＨペプチド単独、またはＣｌｐＢ免疫群もしくはアジュバント対照群からのマウスのＩｇＧのプールとα−ＭＳＨとを共に室温で１５分間インキュベートし、これらはα−ＭＳＨの直前に細胞に添加した。ｃＡＭＰ標準物質（キットにより提供）の連続希釈液を同じマイクロプレートでアッセイした。ｃＡＭＰ検出溶液を各ウェルに添加し、次に細胞を、撹拌してホモジナイズし、２分間、１，０００ｒｐｍので遠心沈降させ、次に２３℃で２０分間インキュベートした。キナーゼ‐Ｇｌｏ試薬の基質を各ウェルに添加し、２３℃で１０分間インキュベートした後、発光を、バイオルミネセンス機器（Ｓａｆａｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、モナコ）で読み取った。各希釈液の３回の試験を、別々のウェルで実施し、別の日に２回反復し、総ＩｇＧを使用する場合のｃＡＭＰ活性化の曲線の各点でｎ＝６を得た。抗α−ＭＳＨ  ＩｇＧ画分から総ＩｇＧを枯渇させた後、同じ実験を、それぞれのα−ＭＳＨ濃度について行い、３つの別々のウェルでＩｇＧを測定した。
【０２６１】
統計分析
データを分析し、グラフを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ  ソフトウェア  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してプロットした。正規性を、コルモゴロフ‐スミルノフ検定により評価した。群の差異を、正規性の結果に従って、テューキーまたはダンの事後検定を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはノンパラメトリックのクラスカル・ワリス（Ｋ‐Ｗ）検定により分析した。体重の変化を、二元配置繰り返し測定の（ＲＭ）ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニの事後検定で分析した。個々の群を、正規性の結果に従って、スチューデントのｔ検定またはマン・ホイットニー（Ｍ‐Ｗ）検定を使用して比較した。ピアソンまたはスピアマンの相関係数を、変数の正規性に従い計算した。ｃＡＭＰの産生を、非線形回帰適合（ｌｏｇ（α‐ＭＳＨ）対正規化ｃＡＭＰ応答）を使用して分析し、この等式はＹ＝１００／（１＋１０^（ＬｏｇＥＣ５０‐Ｘ※ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）であった。データは、平均値±平均値の標準偏差（ｓ．ｅ．ｍ）として示されており、すべての検定でｐ＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。
【０２６２】
結果
大腸菌Ｋ１２のα−ＭＳＨの模倣体のプロテオミクスによる同定
総タンパク質を、培養した大腸菌Ｋ１２から抽出し、細胞質および膜の分画に分離した。２次元ゲル電気泳動（２−ＤＧＥ）を、両タンパク質分画について行い、α―ＭＳＨ分子模倣性の試験のために、細胞質分画を分析した（図１ａ）。２−ＤＧＥの後、大腸菌の細胞質タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに移し、α―ＭＳＨ様タンパク質を、抗α―ＭＳＨポリクローナルウサギＩｇＧを使用して免疫検出した。当該ポリクローナル抗血清の使用により、大腸菌タンパク質に最終的に存在する複数のα―ＭＳＨ様エピトープが検出された。本発明者らは、約１３のタンパク質スポットが、抗α−ＭＳＨ抗血清により認識されたことを見出した（図２ｂ）。免疫検出の前に結合の特異性を確認するために、抗α―ＭＳＨ抗血清を１０−６Ｍのα―ＭＳＨペプチドと共にプレインキュベートしたところ、免疫陽性スポット１〜４および５〜８が完全に消失した（図１ａ〜ｃ）。このことは、これらスポットのみがα―ＭＳＨ様エピトープを含むタンパク質を含んでいたことを示している。α―ＭＳＨ吸収実験に基づき、α―ＭＳＨ様特異的スポット１〜８（図１ａ）を、ナノスプレー源およびＨＰＬＣ−チップキューブインターフェース（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備える６３４０イオントラップ質量分光計に結合したナノ‐ＬＣ１２００システムによるタンパク質同定のために使用した。タンパク質同定のために、ＭＳ／ＭＳピークリストを抽出し、ＭＡＳＣＯＴ  Ｄａｅｍｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．２（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）検索エンジンを使用してＮＣＢＩタンパク質データベースと比較した。最も強力で特異的なα―ＭＳＨ様染色を示すタンパク質のスポット１、２、３、および４（図１）は、アミノ酸８５７個のタンパク質脱凝集シャペロンまたはＣｌｐＢ，ＭＷ  ９５５２６Ｄａ（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１；ＮＰ＿４１７０８３．１）に関して、それぞれ８１９、７２１、２９９、および７８６の最高のＭＡＳＣＯＴスコアを示した。
【０２６３】
得られた結果を確認するために、本発明者らは、タンパク質の代替的な戦略であるオフゲルを使用した。この目的のため、大腸菌の細胞質タンパク質を、ＯＦＦＧＥＬ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりその等電点（ＩＰ）に従って分離した後に、一次元ゲル電気泳動を行って、これを、α―ＭＳＨであらかじめ吸着させた同じ抗α―ＭＳＨポリクローナルウサギＩｇＧを使用するウェスタンブロットにより明らかにした。１つのバンドは、α―ＭＳＨ抗血清により特異的に認識され、上述のタンパク質の同定のために使用した。本発明者らは、このバンドにおいて、ＣｌｐＢタンパク質は、タンパク質の中で最も高いＭＡＳＣＯＴスコア（１０６５）を有することを見出し、よってこのタンパク質を、α―ＭＳＨとの分子模倣性のさらなる確認のために選択した。α−ＭＳＨとＣｌｐＢの間のアミノ酸配列の相同性を分析するために、両方の配列を、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／）のＥｍｂｏｓｓ  ＮｅｅｄｌｅおよびＳｔｒｅｔｃｈｅｒのプログラムを使用して整列させた。このアライメントにより、Ｎｅｅｄｌｅ（図１ｄ）およびＳｔｒｅｔｃｈｅｒ（図１ｅ）を使用して示されるようにα―ＭＳＨと不連続な配列相同性を示すＣｌｐＢタンパク質の２つの別個の部位が存在することが明らかとなった。
【０２６４】
組み換えＣｌｐＢタンパク質は、ＣｌｐＢ  ｃＤＮＡ合成および発現ベクターへのクローニングにより細菌性培養物中でＤｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＳＡ（Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりカスタム産生された。ＣｌｐＢの予想される９６ｋＤａの分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。抗α―ＭＳＨ抗血清で明らかとなったＣｌｐＢのウェスタンブロットは、単一の９６ｋＤａのバンドを示し、これにより、ＣｌｐＢタンパク質がα―ＭＳＨ様エピトープを含むことを確認した（図１ｆ）。ＣｌｐＢタンパク質の立体構造が、抗α―ＭＳＨ抗血清によるその検出にとって重要であるかどうかを試験するために、トリプシンによるＣｌｐＢの消化後に、同様にウェスタンブロットを行った。この条件ではバンドは検出されず（図１ｆ）、これは、ＣｌｐＢとα―ＭＳＨの間の分子的模倣性がＣｌｐＢタンパク質の立体構造を含むはずであることを示唆している。これらの結果は、分子的模倣性の概念（Ｏｌｄｓｔｏｎｅ，  Ｍ．  Ｂ．  Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １２，  １２５５−１２６５（１９９８））により提案された少なくとも５連続アミノ酸配列の相同性が、細菌タンパク質が神経ペプチドとの分子的模倣性を示すために必須の条件ではないことを示している。さらに、α―ＭＳＨとの当該連続アミノ酸相同性を示す大腸菌Ｋ１２タンパク質は、このプロテオミクスアプローチによりα―ＭＳＨ模倣体として同定されてはいない。このミスマッチは、抗α―ＭＳＨ抗血清による検出から逃れたこれらタンパク質中に立体構造上隠されていたα―ＭＳＨ様エピトープに関連する可能性がある。
【０２６５】
ＣｌｐＢによるマウスの免疫
α―ＭＳＨと交差反応性の自己抗体を誘導する大腸菌のＣｌｐＢの能力をバリデートするために、本発明者らは、２か月齢のＣ５７Ｂｌ６マウスを組み換えＣｌｐＢタンパク質で免疫した。第１に、免疫の効率を確認するために、本発明者らは、抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの血漿中レベルをアッセイし、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＣｌｐＢと血漿抽出ＩｇＧとの間の親和性動態を測定した。ＣｌｐＢ免疫マウスにおいて、本発明者らは、高いレベルのＣｌｐＢ  ＩｇＧ（図２ａおよび図５）が、他の群（図２ｂおよび図５）と比較して低い親和性を有することを見出し、このことは最近のＩｇＧの誘導とも一致する。α―ＭＳＨ反応性ＩｇＧの血漿中レベルの増加もまた、ＣｌｐＢ免疫マウス（図２ｃおよび図５）で見出され、これらＩｇＧもまた、対照と比較してα-ＭＳＨに関して低い親和性を特徴とした（図２ｄおよび図５）。α―ＭＳＨ  ＩｇＭ自己抗体の血漿中レベルは、群間で有意差はなく（図５）、マウスが天然に存在するＣｌｐＢ抗原に暴露されていることを示している。また本発明者らは、ＣｌｐＢ免疫が、α―ＭＳＨ配列を含むアミノ酸３９個のメラノコルチンペプチドである副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）に対する自己抗体を誘導し得るか否かをも分析した。血漿中ＡＣＴＨ反応性ＩｇＧには群のあいだで有意差異は群間で見出されず（図５）、ＣｌｐＢ分子の立体構造がα―ＭＳＨ反応性ＩｇＧを刺激するために特異的であることをさらに裏付けた。
【０２６６】
ＣｌｐＢおよびＣＦＡまたはＣＦＡを投与したマウスは、免疫に対して予測される炎症性の応答により、注射後数日間体重が低かった（図２ｅ）。しかしながら、実験の最後には、ＣｌｐＢ免疫マウスは対照と比較して体重が高かった（５％の差）（図２ｅ）。実験の最後の１０日間にＢｉｏＤＡＱで測定した平均１日食物摂取量もまた、他の群と比較してＣｌｐＢ免疫化マウスで高かった（１３％の差）（図２ｆ）。食事の回数は変化しなかったため、ＣｌｐＢ群の食物摂取量の増加は、単に食事量の増加によるものであり（図２ｇ）、これは、ＣｌｐＢ免疫が、空腹制御システムよりも満腹に干渉することを示唆するものである。これは、満腹を誘導する既知のα―ＭＳＨの役割と一致する（Ａｚｚａｒａ，  Ａ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ７７，  ４１１−４１６，  （２００２））。食物摂取の調節におけるα―ＭＳＨ反応性自己抗体のＣｌｐＢ誘導型の変化の関連性をさらにバリデートするために、２２日目に、ＣｌｐＢ、ＣＦＡおよびＰＢＳの群にα−ＭＳＨを１回注射（１００μｇ／ｋｇ体重、ｉ．Ｐ．）、対照群にＰＢＳを与えた。続く２４時間の食物摂取および体重は、対照と比較して差がなかったＣｌｐＢ免疫マウスと比較して非免疫マウスでは少ないことが見出され、これは、ＣｌｐＢ群がα―ＭＳＨの食欲不振誘発性作用に対して良好な保護を有することを示した。
【０２６７】
給餌実験の直後に、マウスの自発運動活性および不安関連行動を、オープンフィールドおよびＯ迷路試験で試験した。総自発運動活性およびオープン領域対境界領域で費やした時間は、群間で有意差はなかった。しかしながら、Ｏ迷路のクローズドアームでは、ＣｌｐＢ免疫マウスは、対照と比較してより短い距離を移動し（図２ｈ）、他のすべての群と比較して短い時間を費やし（図２ｉ）。これは、Ｏ迷路のオープンアームのパラメータが有意に変化しなかったことから、ＣｌｐＢ群における不安関連行動のわずかな減少を示している。これらのデータは、抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧレベルが増加したマウスにおけるα―ＭＳＨ媒介不安の減少と一致する。
【０２６８】
ＭＣ４Ｒのα―ＭＳＨ誘導型の活性に及ぼすマウスＩｇＧの作用
ＣｌｐＢ免疫によって誘導される誘導型抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧとＭＣ４Ｒシグナリングとの関連性をバリデートするために、本発明者らは、α―ＭＳＨによるＭＣ４Ｒの活性化に及ぼすマウスＩｇＧのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を試験した。ＣｌｐＢ免疫マウスおよびアジュバント対照群のマウスからプールしたＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、ＭＣ４Ｒ（Ａｍｓｂｉｏ，  Ｏｘｏｎ，  ＵＫ）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に添加した後、ＰＢＳ中の１０個の異なる濃度のα―ＭＳＨペプチドを添加した（１ｎＭ〜２μＭと、ＰＢＳのみ）。１５分間インキュベートした後、ｃＡＭＰの濃度を、生物発光アッセイのｃＡＭＰ−ＧｌｏＴＭ  Ｍａｘアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｌ）を使用して細胞上清で測定した。本発明者らは、ｃＡＭＰの濃度が、α―ＭＳＨおよびアジュバント対照由来のＩｇＧを含むα―ＭＳＨと比較して、ＣｌｐＢ免疫マウス由来のＩｇＧと共にプレインキュベートした細胞で低く、α―ＭＳＨの２つの最高濃度で１０％から８％の有意な減少を伴うことを見出した（図３ａ）。α―ＭＳＨのクロマトグラフィーを使用してα―ＭＳＨ反応性ＩｇＧからプールしたＩｇＧの枯渇後では、ＣｌｐＢ群の残りのＩｇＧは、α−ＭＳＨ誘導性のｃＡＭＰの放出を低減させる作用を全く示さず（図３ｂ）、このことは、抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧが、ＣｌｐＢ免疫マウスにおけるｃＡＭＰの阻害の原因であることを示している。よって、ＭＣ４Ｒの活性化の低減は、ＣｌｐＢ免疫マウスにおける食物摂取の増加および不安の減少の原因であり得る。しかしながら、ＣｌｐＢ誘導性の抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧがまた、たとえばＭＣ３ＲといったＭＣ４Ｒメラノコルチン受容体以外に結合するα―ＭＳＨと干渉し得ることを除外することはできない（Ｂｅｇｒｉｃｈｅ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１  １  ，  ２８６，  ４０７７１‐４０７８１）。ＭＣ４Ｒ媒介型ｃＡＭＰの産生に関するＣｌｐＢの直接的な影響は、ＡＴＰ依存ｃＡＭＰ産生と干渉するＣｌｐＢ  ＡＴＰアーゼ活性（Ｗｏｏ，  Ｋ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２，  ２６７，  ２０４２９−２０４３４）のために評価することができなかった。
【０２６９】
ラットへの大腸菌Ｋ１２の強制経口投与
免疫しなければ、大腸菌により天然に発現されるＣｌｐＢタンパク質が免疫系により感知されて、ＣｌｐＢ反応性およびα―ＭＳＨ反応性Ｉｇを刺激することができるか否かを試験するために、大腸菌Ｋ１２を、２か月齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットに胃内への強制経口投与を３週間の間毎日投与した。強制経口投与の最初の日に、大腸菌を投与したラットの体重および食物摂取量の減少が起こったが、その後対照のレベルと類似のレベルまで徐々に戻った（図４ａ、ｂ）。しかしながら大腸菌の群では再摂食期間は存在せず、これは失った体重を再度増やすために必要な食物摂取のリバウンドが観察されなかったためである。大腸菌の強制経口投与の有効性は、強制経口投与前に低かった大腸菌Ｋ１２  ｃＤＮＡが強制経口投与後に豊富にラットの糞便で検出されたことにより確認された（図４ｃ）。強制経口投与後、抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧの血漿中レベルは、対照と比較して大腸菌を投与したラットで増加したが（図４ｄ）、総ＩｇＧの濃度は変化せず、これは、大腸菌抗原に対する選択的な免疫応答を示している。血漿中抗α―ＭＳＨ  ＩｇＭ（図４ｄ）は大腸菌によって刺激されたが、抗α―ＭＳＨ  ＩｇＧは、抗ＡＣＴＨ  ＩｇＧの増加が検出されたにもかかわらず、大腸菌により刺激されなかった。α―ＭＳＨ  ＩｇＧの親和性動態分析（図４ｆ−ｈ）は、大腸菌を投与したラットの解離速度の増加を明らかにした。これらのα―ＭＳＨの自己抗体の変化は、新規抗原に対する軽度の免疫応答を反映し得る。実際に、強制経口投与前のラットの糞便中の低いＫ１２  ｃＤＮＡレベルは、この細菌種が、試験したラットにおける主要な腸内共生体ではないことを示している。大腸菌を強制経口投与したラット対ＣｌｐＢ免疫マウスで見出された異なるα―ＭＳＨ自己抗体応答は、また、投与経路およびα―ＭＳＨ様抗原の用量の両方にも関連し得る。さらに、大腸菌Ｋ１２は、いくつかのα―ＭＳＨ様抗原を含むため、累積免疫応答もまた、これらそれぞれの新規性および抗原性に依存し得る。重要なことに、この動物モデルは、大腸菌などのＣｌｐＢタンパク質発現細菌の腸内含有量の変化が、α―ＭＳＨと交差反応性である抗ＣｌｐＢ  ＩｇＧおよび自己抗体を産生する宿主の免疫システムにより生理学的に検知されることを確認した。よって、抗ＣｌｐＢ自己抗体の検出は、抗α―ＭＳＨ自己抗体の存在を説明するＣｌｐＢ発現細菌のバイオマーカーとして使用することができる。
【０２７０】
ヒトの抗ＣｌｐＢ抗体
対照において、ＣｌｐＢ  ＩｇＧは、いくつかの生理学的な特徴の正常範囲と負に相関し、ＡＮの患者において、ＣｌｐＢ  ＩｇＧは、身体の不満足および痩せ願望などの中心となる精神病理学的特徴と正に相関した（表１）。ＡＮおよびＢＥＤの患者では、精神病理学的特徴は、ＣｌｐＢ  ＩｇＭ自己抗体と逆相関する（表１）。これらの相関は、ＡＮの患者が、一部のＣｌｐＢ含有細菌に慢性的に暴露されているが、対してＢＥＤ患者は、当該細菌に伴う感染症に最近罹患したことを意味し得る。
【表２】
2017502000.tif 000004
【０２７１】
考察
これらのデータは、ＣｌｐＢとα―ＭＳＨとの間の分子的模倣性を介した、ＣｌｐＢ発現大腸菌Ｋ１２細菌とＣｌｐＢおよび宿主メラノコルチン系との間分子的関連を明らかにし、エネルギー代謝、動機づけの行動および感情の宿主制御における共生腸内細菌の関与を示した。分子的模倣性の概念は、ウイルスタンパク質により主にもたらされる自己免疫疾患の発症を説明するためにすでにバリデートされた（Ｏｌｄｓｔｏｎｅ，  Ｍ．  Ｂ．  Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １９９８，  １２，  １２５５−１２６５）。この研究は、共生腸内細菌と宿主のペプチド作動性シグナリングとの間の生理学的な相互作用にそれを関係させることによりこの概念を拡張する。しかしながら、同様に、この生理的機構の変化により、細菌におけるペプチドホルモン模倣タンパク質の不十分または過剰な存在、および対応するペプチドホルモン反応性自己抗体の産生の変化からもたらされる行動異常が起こる可能性がある。ペプチドホルモン受容体にそのような模倣タンパク質が直接結合すると、ペプチド作動性のシグナリングに影響を及ぼし得るが、宿主のペプチドホルモンと交差反応性の自己抗体の産生は、宿主の表現型に寄与する長期間の調節機構として現れる（Ｔａｋａｇｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ，２０１３）。抗ＣｌｐＢ抗体と、健康なヒトおよびＡＮおよびＢＥＤの患者の行動の特徴との間の有意な相関は、ＣｌｐＢ発現細菌が、いくつかの正常なまたは変化した行動および感情の特徴の確立に関連し得ることを示唆しており、よって、新規の治療上の標的を表し得る。将来性のある抗菌剤としてＣｌｐＢ阻害剤が最近同定されたこと（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  ＣＩｐＢ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３，  ５６，  ７１７７−７１８９）は、摂食および感情の宿主の制御に対するＣｌｐＢ含有細菌の関連性を明確にするために役立ち得る。
【０２７２】
ここでは、本発明者らは、α―ＭＳＨ模倣物として、１つの細菌性タンパク質である、大腸菌Ｋ１２のＣｌｐＢを同定して検証した。ＣｌｐＢは、細菌におけるその機能的な役割に関して十分に特徴付けられており（ＤｅＳａｎｔｉｓ，  Ｍ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１２，  １８２３，  ２９−３９）、かつ熱ショックタンパク質として細菌のストレス応答に関与しているＣｌｐＢと、ストレス関連ホルモンであり、同様に強力な鎮痛剤でもあるα―ＭＨＳとの間の分子的模倣性を発見したことは特異である（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９，  ９６，  ７１８４−７１８９，  Ｃｈａｒｍａｎｄａｒｉ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ  ２０１２，  ５；  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｍ．  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８３，  ２２１，  １９２−１９３）。そのような機能的類似性は偶発的である可能性があるが、細菌および宿主における熱ストレスに対する協調された応答の発生における系統的な関連性を示唆し得る。ＣｌｐＢタンパク質は、いくつかの細菌種に存在しているため、これらはすべてα―ＭＳＨ自己抗体を刺激することができるはずである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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