(57)【要約】本発明は、改良された組換えヒト卵胞刺激ホルモン（ｒｈＦＳＨ）を使用した、女性被験体における制御された卵巣過剰刺激の方法に関する。方法は、女性被験体に投与されたＦＳＨが少量でも、多数の受精可能な卵母細胞をもたらす。本発明者らは、最適化されたグリコシル化パターンを有する改良されたＦＳＨ調製物が、少ない全体量のＦＳＨでの投薬レジメンを使用するときでさえ、優れた卵胞成長および多数の成熟卵母細胞を誘導することができることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性被験体において複数の卵巣の卵胞の発生を刺激するための制御された卵巣過剰刺激のための方法であって、
（ａ）１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約３５〜約２５０ＩＵの平均量となる投薬レジメンを使用して、女性被験体に組換えＦＳＨ調製物を投与するステップ；
（ｂ）１２ｍｍと等しいかもしくはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞が存在するとき、および／または少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵を誘発するステップ；
（ｃ）前記女性被験体から複数の卵母細胞を得るステップであって、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５つの卵母細胞が得られる、および／または前記女性被験体から少なくとも５つの卵母細胞が得られるステップ
を含み；
前記調製物中の前記組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有する、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において、前記１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約５０〜約１２５ＩＵの平均量となる投薬レジメンが使用され；
ステップ（ｂ）において、少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発され；
ステップ（ｃ）において、少なくとも５つの卵母細胞が、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の形態で前記女性被験体から得られ、これらの卵母細胞のうち少なくとも４つが第二分裂中期卵母細胞であり；
前記調製物中の前記組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの約２５％〜約５０％の範囲のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の約５３％〜約８０％の範囲の２，６−結合シアル酸の相対量；
（ｉｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも５％の硫酸化グリカンの相対量；
（ｉｖ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの５％またはそれ未満のアウターアームフコースを保有するグリカンの相対量；
（ｖ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも３０％のコアフコースを保有するグリカンの相対量；
（ｖｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも１６％の少なくともテトラアンテナ型グリカンの相対量；
（ｖｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも８８％の１つまたは複数のシアル酸残基を保有するグリカンの相対量；および
（ｖｉｉｉ）少なくとも２１０のＺ数
を含むグリコシル化パターンを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約５０〜約１２５ＩＵの平均量となる投薬レジメンが、ステップ（ａ）において使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＦＳＨ約５０〜約１２５ＩＵが毎日投与されるか、またはＦＳＨ約１００〜約２５０ＩＵが２日毎に投与されるか、またはＦＳＨ約１５０〜約３７５ＩＵが３日毎に投与される投薬レジメンが、ステップ（ａ）において使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約７０〜約２５０ＩＵの平均量となる投薬レジメンが、ステップ（ａ）において使用され、前記女性被験体が、
−  少なくとも３５歳、好ましくは、約３７歳〜約５０歳の範囲の年齢を有する女性被験体；
−  １．５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満、好ましくは、約０．２５ｎｇ／ｍｌ〜約１．２５ｎｇ／ｍｌの範囲の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の血清レベルを有する女性被験体；
−  両方の卵巣の合計として９またはそれ未満、好ましくは、４〜８の範囲の胞状卵胞カウントを有する女性被験体；
−  少なくとも２５ｋｇ／ｍ２、好ましくは、約２８ｋｇ／ｍ２〜約４５ｋｇ／ｍ２の範囲のボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する女性被験体；および
−  ４つ未満の卵母細胞の発生が誘導された、以前の従来のＦＳＨ刺激サイクルを経験している女性被験体
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えＦＳＨ調製物が、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物、特に、Ｇｏｎａｌ−ｆについて推奨される量の７５％またはそれ未満、好ましくは、５０％またはそれ未満であるＩＵの量で投与される投薬レジメンが、ステップ（ａ）において使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１回のサイクルのみの制御された卵巣過剰刺激を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記卵母細胞が、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の形態でステップ（ｃ）において得られ、および／またはステップ（ｃ）において得られた前記卵母細胞のうち少なくとも４つが第二分裂中期卵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた少なくとも１つの卵母細胞を受精させるステップ；および
（ｅ）少なくとも１つの受精した卵母細胞またはそれに由来する胚を女性ヒト患者に移植するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｄ）の前に、ステップ（ｃ）において得られた少なくとも１つの卵母細胞を凍結するか、もしくはガラス化するステップ；またはステップ（ｅ）の前に、ステップ（ｄ）において得られた少なくとも１つの受精した卵母細胞、もしくはそれに由来する少なくとも１つの胚を凍結するか、もしくはガラス化するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）において得られた前記卵母細胞のサブセットのみが、ステップ（ｄ）において受精し、および／またはステップ（ｄ）において受精した前記卵母細胞のサブセットのみが、ステップ（ｅ）において女性ヒト患者に移植され、そしてステップ（ｄ）において受精していない前記卵母細胞、またはステップ（ｅ）において女性ヒト患者に移植されていない前記受精した卵母細胞もしくは胚が、続く使用のため、任意選択で凍結されるか、またはガラス化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）における前記組換えＦＳＨ調製物の前記投与が、ＬＨもしくはｈＣＧのような別のゴナドトロピン、または卵胞成長を誘導するか、もしくは増強する別の薬剤の同時的投与を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）における前記組換えＦＳＨ調製物の前記投与が、ＧｎＲＨアゴニストまたはＧｎＲＨアンタゴニストの先行投与および／または同時的投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記女性被験体が、特に、体外受精（ＩＶＦ）、細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）、および／または胚移植を含む、補助生殖技術（ＡＲＴ）を経験する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０７８の下で寄託されたヒト細胞株ＧＴ−５ｓ、またはそれに由来する細胞株、またはそれと同種の細胞株における産生により得ることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記グリコシル化パターンが、次の特徴：
（ｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの約２５％〜約５０％の範囲のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の約５３％〜約８０％の範囲の２，６−結合シアル酸の相対量；
（ｉｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも３％の硫酸化グリカンの相対量；
（ｉｖ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの５％またはそれ未満のアウターアームフコースを保有するグリカンの相対量；
（ｖ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも３０％のコアフコースを保有するグリカンの相対量；
（ｖｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも１６％の少なくともテトラアンテナ型グリカンの相対量；
（ｖｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも８８％の１つまたは複数のシアル酸残基を保有するグリカンの相対量；および
（ｖｉｉｉ）少なくとも２１０のＺ数
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
女性被験体において卵胞成熟化を刺激するための方法であって、
（ａ）組換えＦＳＨ調製物を投与することにより、女性被験体において卵胞成長を誘導するまたは増強するステップ；および
（ｂ）続いて排卵を誘発するステップ
を含み；
前記調製物中の前記組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有し；
ステップ（ｂ）において排卵を誘発することが、ステップ（ａ）における前記組換えＦＳＨ調製物の前記投与の終了の少なくとも４８時間後に始まる、方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）において排卵を誘発することが、ステップ（ａ）における前記組換えＦＳＨ調製物の前記投与の終了の約６０時間〜約１２０時間、好ましくは、約７２時間〜約９６時間後に始まる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）において排卵を誘発することが、ｈＣＧまたはその誘導体を投与することにより行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
女性被験体において複数の卵巣の卵胞の発生を刺激するための制御された卵巣過剰刺激のための方法であって、
（ａ）投薬レジメンを使用して、女性被験体に組換えＦＳＨ調製物を投与するステップであって、ここで前記組換えＦＳＨ調製物は、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量の８０％またはそれ未満であるＩＵの量で投与される、ステップ；
（ｂ）１２ｍｍと等しいかもしくはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞が存在するとき、および／または少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵を誘発するステップ；
（ｃ）前記女性被験体から複数の卵母細胞を得るステップであって、前記同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量での同様の処置と比較して、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５％多い卵母細胞が得られるステップ
を含み；
前記調製物中の前記組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）前記調製物中の前記ＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有する、方法。
【請求項２１】
前記組換えＦＳＨ調製物が、前記同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物、特に、Ｇｏｎａｌ−ｆについて推奨される量の５０％またはそれ未満であるＩＵの量で投与される投薬レジメンが、ステップ（ａ）において使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）において、前記同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物、特に、Ｇｏｎａｌ−ｆについて推奨される量での同様の処置と比較して、平均で少なくとも５％多い第二分裂中期卵母細胞、および／または少なくとも５％多い卵丘卵母細胞複合体が得られる、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不妊処置の分野に関する。特に、改良された組換えヒト卵胞刺激ホルモン（ｒｈＦＳＨ）を用いた制御された卵巣過剰刺激の方法が提供される。本明細書に記載される方法は、従来の処置より少ない量のＦＳＨを使用して、処置された女性においてより多くの数の受精可能な卵母細胞をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
ゴナドトロピンは、男性および女性において性腺機能を調節するタンパク質ホルモンの群であり、これにより、ヒト妊孕性において重要な役割を果たす。それらは、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）による刺激後に脊椎動物の下垂体腺の性腺刺激ホルモン分泌細胞により分泌される。ゴナドトロピンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）を含む、ヘテロダイマー糖タンパク質である。ゴナドトロピンは、同一のアルファ−サブユニットを共有するが、受容体結合特異性を確実にする異なるベータ−サブユニットを含む。
【０００３】
ＦＳＨは、ＦＳＨ受容体への特異的な結合を付与する９２個のアミノ酸アルファ−サブユニット、および１１１個のアミノ酸ベータ−サブユニットを含む。天然のタンパク質のサブユニットの両方が、グリコシル化により修飾される。アルファ−サブユニットは、Ａｓｎ５２およびＡｓｎ７８にて、ベータ−サブユニットは、Ａｓｎ７およびＡｓｎ２４にて天然でグリコシル化される。サブユニットの両方は、細胞において前駆体タンパク質として産生され、次に、プロセシンングされ、分泌される。ＦＳＨは、身体の発生、成長、思春期の成熟化、および生殖プロセスを調節する。特に、それは、生殖細胞の成熟化を刺激し、故に、精子形成および卵胞形成（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与する。
【０００４】
卵胞形成は、ＦＳＨにより、例えば、顆粒膜細胞の表面上のＦＳＨ受容体へのＦＳＨの結合により、誘導される。ＦＳＨ受容体は、ＦＳＨの結合の際に共役Ｇタンパク質を活性化するＧタンパク質共役受容体である。Ｇタンパク質は、アデニリルシクラーゼを順に活性化し、これにより、ｃＡＭＰという第２メッセンジャー分子の産生をもたらす。細胞における増大するｃＡＭＰ濃度は、いくつかの下流標的、特に、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼを活性化し、次に、プロゲステロンおよびエストラジオールの合成を導く。次に、プロゲステロンおよびエストラジオールは、顆粒膜細胞により分泌され、卵胞形成を誘導する。ＦＳＨによる顆粒膜細胞の刺激の際、それらはまた、下垂体腺においてＦＳＨの産生および分泌を阻害する、ネガティブフィードバックループを形成するインヒビン−Ｂも放出する。インヒビン−Ｂは、ＦＳＨによる卵巣刺激の良好な代替マーカーであることが示された。
【０００５】
ＦＳＨは、不妊の処置において、単独または他の薬剤、特にＬＨとの併用で広く使用される。当該技術分野において、一般に、閉経後のヒト尿から精製されるＦＳＨ（尿のＦＳＨ）、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により組換え的に産生されたＦＳＨは、ヒト処置のため使用されてきた。ＣＨＯ細胞から得られた組換えＦＳＨは、例えば、ＷＯ０３／０３５６８６Ａ２において開示される。しかしながら、存在する異なるアイソフォームに起因して、ＦＳＨ調製物と関連する相当な不均一性が存在する。個々のＦＳＨアイソフォームは、同一だが、それらのグリコシル化の程度および性質が異なる、アミノ酸配列を提示する。特定のアイソフォームは、炭水化物分岐構造の不均一性、および異なる量のシアル酸（負に荷電した末端単糖単位）組み込みにより特徴付けられ、その両方が、アイソフォームの特異的な生物活性に影響する。従って、ＦＳＨのグリコシル化パターンは、その生物学的活性に対する有意な影響を有する。
【０００６】
しかしながら、異なるドナーおよび異なる調製物由来の尿のＦＳＨは、その炭水化物構造において有意に変動し得、これにより、高いバッチ間のバリエーションをもたらす。尿産物におけるウイルスの存在に関する安全性の懸念も存在する。さらに、ＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨは、ヒトグリコシル化パターンと同一でない、これらのハムスター細胞に特異的なグリコシル化パターンを提示する。これらの相違は、得られたＦＳＨ、従って、患者に投与されるべき医薬調製物の変動する生物学的活性および有害効果をもたらす。ＦＳＨ処置に付随する有害な副作用は、例えば、卵巣嚢胞形成、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）、多胎妊娠、顔面潮紅、落ち込み（ｆｅｅｌｉｎｇ  ｄｏｗｎ）、または過敏（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ）、頭痛、不穏、吐き気、嘔吐、呼吸不足（ｓｈｏｒｔａｇｅ  ｏｆ  ｂｒｅａｔｈ）、体液の蓄積に起因した腹部膨満、腹痛、および卵巣の肥大を含む。
【０００７】
近年、ヒト骨髄性白血病細胞から得られた改良されたＦＳＨが開発され、それは、顕著な生物学的特性および医薬品特性を示す（ＷＯ２０１２／０１７０５８Ａ１を参照のこと）。このＦＳＨ調製物は、高度に活性であり、低濃度でさえ顆粒膜細胞においてプロゲステロンおよびエストラジオールの分泌を活性化する。さらに、このＦＳＨは、安全性の懸念なく、ヒト細胞株において安定的に産生される、完全ヒトグリコシル化パターンを有する。
【０００８】
天然の受精をサポートすることに加え、ＦＳＨ処置は、複数の卵巣の卵胞の発生を誘導するため使用される。制御された卵巣過剰刺激のかかる処置サイクルで、いくつかの成熟卵母細胞を、女性患者から得ることができた。卵母細胞の回収後、それらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精させ、女性の体に戻す。しかしながら、かかる補助生殖技術（ＡＲＴ）のため、有害な副作用のリスクがある高濃度ＦＳＨ投与が必要である。特に、卵巣（ｏｖｕｌａｒｙ）過剰刺激症候群は、不妊処置と関連する共通のリスクである。しかしながら、投与されるＦＳＨの量の低下はまた、処置サイクル毎に得られる卵母細胞の数も低減し、故に、成功する受精の機会、および子宮における胚の着床も低減する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００３／０３５６８６号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０１７０５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故、少量の投与されるＦＳＨで多数の誘導された卵母細胞を導く制御された卵巣過剰刺激のための改良されたＦＳＨ処置が、当該技術分野において必要である。これを考慮して、改良された不妊処置を提供することが、本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、最適化されたグリコシル化パターンを有する改良されたＦＳＨ調製物が、少ない全体量のＦＳＨでの投薬レジメンを使用するときでさえ、優れた卵胞成長および多数の成熟卵母細胞を誘導することができることを見出した。特に、改良されたＦＳＨ調製物が、通常使用される市販のＦＳＨ調製物での投薬レジメンと比較して、ＦＳＨの量の半分のみが投与される投薬レジメンにて、女性被験体において複数の卵母細胞の発生を刺激することが示された（実施例２を参照のこと）。実際に、少なくとも１２ｍｍのサイズを有する誘導された卵胞の数、患者から回収された卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の数、患者から回収された受精可能な第二分裂中期卵母細胞の数、および首尾よく受精した卵母細胞（２つの前核（２ＰＮ）卵母細胞）の数が、より多量のＧｏｎａｌ−ｆ、ＣＨＯ細胞から得られた市販のＦＳＨ調製物を与えられた患者と比較したとき、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物を与えられた患者について増大される。さらに、より多いパーセンテージ量の誘導された卵胞が、Ｇｏｎａｌ−ｆにより誘導された卵胞と比較して、首尾よく受精し得るので、誘導された卵胞の質も改良されたＦＳＨ調製物について優れていた。過剰な卵母細胞（２ＰＮ）または胚の凍結保存の現在利用可能な技法が、第１の移植が、別のＦＳＨ刺激サイクルなしでこれらの過剰な胚を解凍し、移植することにより、妊娠を導かなかった場合において、不妊治療院が続く胚移植を行うことを可能にする。従って、より多くの数の受精した卵母細胞は、移植された胚の数の増大（刺激サイクル１回当たり）、および子宮における胚の着床のより高い機会を直接もたらす。
【００１２】
さらに、２日毎またはそれ未満の頻度でのＦＳＨの投与も可能であり、良好な治療結果を導くことが見出された。より長い投与間隔は、卵胞の成長に対して負の影響を有するとみなされたＦＳＨ血清レベルの所望されないゆらぎをもたらし、卵胞の成長停止または卵胞サイズの低下でさえもたらし得るので、これらの知見は高度に予測されなかった。本発明者らは、２日毎またはそれ未満の頻度でＦＳＨを投与するとき、患者においてＦＳＨの血清レベルにおける有意なゆらぎを実際に観察した（実施例３および図４を参照のこと）。本発明により使用される改良されたＦＳＨは、ＣＨＯ細胞由来の通常使用される組換えＦＳＨに類似し、尿のＦＳＨの半減期よりさらに短い、ある程度短い循環半減期を有するので、これらのゆらぎは予測された（実施例３および図１２を参照のこと）。しかしながら、先行技術における仮定と対照的に、これらのゆらぎは、卵胞成長を停止しなかった。むしろ、同一の改良されたＦＳＨの等しい全体量の毎日の投与、または通常使用されるＦＳＨのちょうど２倍の全体量の毎日の投与と比較していっそう増強されたことが見出された（実施例３および図１〜９を参照のこと）。これらの予測されない優れた治療結果は、本明細書に記載されるヒトグリコシル化パターンを有する修飾されていないＦＳＨ調製物を使用して得られた。遺伝子操作されたＦＳＨ、またはＦＳＨコンジュゲートのような人工修飾物は使用されるべきでない。
【００１３】
上記知見を考慮して、本発明は、女性被験体において複数の卵巣の卵胞の発生を刺激するための制御された卵巣過剰刺激の方法であって、
組換えＦＳＨ調製物が女性被験体に投与され、組換えＦＳＨ調製物が、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有する、
方法を提供する。
【００１４】
第１の態様では、組換えＦＳＨ調製物は、１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約３５〜約２５０ＩＵの平均量となる投薬レジメンを使用して、女性被験体に投与される。１２ｍｍと等しいかもしくはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞が存在するとき、および／または少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。次に、複数の卵母細胞が女性被験体から得られ、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５つの卵母細胞が得られるか、および／または女性被験体から少なくとも５つの卵母細胞が得られる。
【００１５】
第２の態様では、組換えＦＳＨ調製物が、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量の８０％またはそれ未満であるＩＵの量で投与される投薬レジメンが使用される。１２ｍｍと等しいかもしくはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞が存在するとき、および／または少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。次に、複数の卵母細胞が女性被験体から得られ、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量での同様の処置と比較して、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５％多い卵母細胞が得られる。
【００１６】
さらに、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物での刺激に起因する卵胞成長は、ＦＳＨ投与の終了後有意な時間間隔にわたり、ヒト身体においてそれらのサイズを維持することが見出された（実施例３および図１１を参照のこと）。特に、卵胞は、数日間、それらの最大サイズに本質的にとどまる。対照的に、従来のＦＳＨでの刺激に起因する卵胞成長は、それらの最大サイズに到達の１または２日後急速に後退する。この後退のため、通常の処置において、最終的な成熟化および排卵は、ＦＳＨ投与の終了後、短い時間間隔にて、一般に、１日および最大で３６時間にて誘発しなければならなかった。本明細書に記載される有利な組換えＦＳＨ調製物で、最終的な成熟化および排卵は、ＦＳＨ投与の終了の最大６日間後まで誘発し得る。これは、はるかに高い柔軟性を有する不妊処置をもたらす。特に、排卵を誘発すること、および卵母細胞回収のようなその後のステップの予定を決め、計画を立て、企画することが、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物を使用して大いに改善され、単純化される。
【００１７】
これを考慮して、本発明は、第３の態様では、女性被験体において卵胞成熟化を刺激する方法であって、組換えＦＳＨ調製物を投与することにより、女性被験体において卵胞成長を誘導するまたは増強するステップ、および組換えＦＳＨ調製物の投与の終了の少なくとも４８時間後に始まる排卵を続いて誘発するステップを含み、調製物中の組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有する、方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の目的、特性、利点、および態様は、以下の記載および添付の請求の範囲から当業者に明らかになるだろう。しかしながら、以下の記載、添付の請求の範囲、および本出願の好ましい実施形態を示す具体的な実施例が説明の目的のみで与えられることは理解されるべきである。開示される発明の精神および範囲内の種々の変更ならびに修飾が、以下を読むことから当業者に容易に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＦＳＨ（本発明）の示される量の１回投与後の健常女性ボランティアにおける平均卵胞サイズの相対的変化を示す。投与前の卵胞サイズは、参照（１００％）として使用される。
【図２】図２は、プラセボ、またはＢｒａｖｅｌｌもしくはＧｏｎａｌ−ｆ  １５０ＩＵの１回投与後の健常女性ボランティアにおける平均卵胞サイズの相対的変化を示す。投与前の卵胞サイズは、参照（１００％）として使用される。
【図３】図３は、示された量のＦＳＨ（本発明）（Ａ）、またはプラセボ、Ｂｒａｖｅｌｌ  １５０ＩＵもしくはＧｏｎａｌ−ｆ  １５０ＩＵ（Ｂ）の１回投与後の全ての被験体の平均としての平均卵胞サイズの相対的変化を示す。投与前の卵胞サイズは、参照（１００％）として使用される。
【図４】図４は、ＦＳＨ（本発明）（同様に、２日毎の投与）、Ｇｏｎａｌ−ｆまたはＢｒａｖｅｌｌｅの毎日の投与での複数回用量研究中の健常女性ボランティアの血清におけるＦＳＨの濃度を示す。同様の量の投与されたＦＳＨは、比較可能なＦＳＨ血清レベルをもたらした。
【図５】図５は、ＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵを７日間毎日投薬した後の健常女性ボランティア（被験体１０人の平均）において観察された直径８．０ｍｍまたはそれ超を有する卵胞の平均数を示す。棒の着色は、卵胞サイズを示す。
【図６】図６は、Ｇｏｎａｌ−ｆ  １５０ＩＵを７日間毎日投薬した後の健常女性ボランティア（被験体１０人の平均）において観察された直径８．０ｍｍまたはそれ超を有する卵胞の平均数を示す。棒の着色は、卵胞サイズを示す。
【図７】図７は、Ｂｒａｖｅｌｌｅ  １５０ＩＵを７日間毎日投薬した後の健常女性ボランティア（被験体１０人の平均）において観察された直径８．０ｍｍまたはそれ超を有する卵胞の平均数を示す。棒の着色は、卵胞サイズを示す。
【図８】図８は、ＦＳＨ（本発明）７５ＩＵを７日間毎日投薬した後の健常女性ボランティア（被験体１０人の平均）において観察された直径８．０ｍｍまたはそれ超を有する卵胞の平均数を示す。棒の着色は、卵胞サイズを示す。
【図９】図９は、ＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵの７日間２日毎の投与の後の健常女性ボランティア（被験体１０人の平均）において観察された直径８．０ｍｍまたはそれ超を有する卵胞の平均数を示す。棒の着色は、卵胞サイズを示す。
【図１０】図１０は、ＦＳＨ（本発明）（毎日７５ＩＵ、毎日１５０ＩＵ、２日毎に１５０ＩＵ）、またはＧｏｎａｌ−ｆ（毎日１５０ＩＵ）の１〜７日の間の投与での複数回用量研究後の健常女性ボランティアの血清におけるインヒビン−Ｂ（Ａ）およびエストラジオール（Ｂ）の濃度を示す。
【図１１】図１１は、（Ａ）ＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵ、（Ｂ）Ｇｏｎａｌ−ｆ  １５０ＩＵ、または（Ｃ）毎日ＦＳＨ（本発明）７５ＩＵまたは（Ｄ）２日毎にＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵの７日間の投与後の健常女性ボランティア（被験体１０人の平均）において観察された直径１０．０ｍｍまたはそれ超を有する卵胞の平均数を示す。棒の着色は、卵胞サイズを示す。
【図１２】図１２は、皮下に投与されたＦＳＨの最後の複数回用量後の平均血漿ＦＳＨ濃度対時間を示す。
【図１３】図１３は、異なる濃度の改良された組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；調製物１：空白の四角形、調製物２：塗りつぶされた三角形）、またはＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ；塗りつぶされた菱形）で刺激された単離された顆粒膜細胞のｃＡＭＰ放出を示す。
【図１４】図１４は、異なる濃度の改良された組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；調製物１：空白の四角形、調製物２：塗りつぶされた三角形）、またはＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ；塗りつぶされた菱形）で刺激された単離された顆粒膜細胞のエストラジオール合成を示す。
【図１５】図１５は、異なる濃度の改良された組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；調製物１：空白の四角形、調製物２：塗りつぶされた三角形）、またはＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ；塗りつぶされた菱形）で刺激された単離された顆粒膜細胞のプロゲステロン合成を示す。
【図１６】図１６は、異なる濃度の改良された組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；空白の四角形）、または尿のＦＳＨ（Ｆｏｓｔｉｍｏｎ；塗りつぶされた菱形）で刺激された単離された顆粒膜細胞のｃＡＭＰ放出を示す。
【図１７】図１７は、異なる濃度の改良された組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；空白の四角形）、または尿のＦＳＨ（Ｆｏｓｔｉｍｏｎ；塗りつぶされた菱形）で刺激された単離された顆粒膜細胞のエストラジオール合成を示す。
【図１８】図１８は、異なる濃度の改良された組換えヒトＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明）；空白の四角形）、または尿のＦＳＨ（Ｆｏｓｔｉｍｏｎ；塗りつぶされた菱形）で刺激された単離された顆粒膜細胞のプロゲステロン合成を示す。
【図１９】図１９は、標準的尿のＦＳＨおよびＣＨＯ細胞から得られた標準的組換えＦＳＨとの比較における改良された組換えヒトＦＳＨを使用したＳｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイの結果を示す。３日間毎日の投与後の未成熟のメスラットにおける卵巣重量増加が、使用されたＦＳＨ濃度に対してプロットされる。
【図２０】図２０は、ＦＳＨグリコシル化部位に付着し得る複合体タイプのグリカン構造の模式図を示す。（ａ）バイアンテナ型、（ｂ）トリアンテナ型、および（ｃ）テトラアンテナ型構造が示される。シアル酸およびガラクトース残基の１つまたは複数はまた、これらの構造に不存在であってもよく、構造は、例えば、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基、フコース残基、および／またはスルフェート基をさらに含んでもよい。Ｓｉａ：シアル酸；Ｇａｌ：ガラクトース、本明細書において末端ガラクトースとも称される；ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｍａｎ：マンノース。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、改良されたグリコシル化パターンを有する本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物が、ＣＨＯ由来ＦＳＨ、例えば、Ｇｏｎａｌ−ｆのような従来のＦＳＨ調製物と比較したとき、被験体に投与されたより少量のＦＳＨにおいてでさえ、女性被験体においてより多くの数の大きな卵胞の成長を誘導する能力があるという知見に基づく。特に、ＦＳＨの量の半分で、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物は、通常の量にて使用されるＣＨＯ細胞において産生されるＦＳＨと比較して、卵胞成長の同様のまたはさらに良好な結果を導く。
【００２１】
これらの知見を考慮して、本発明は、第１の態様では、女性被験体において複数の卵巣の卵胞の発生を刺激するための制御された卵巣過剰刺激の方法であって、
（ａ）１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約３５〜約２５０ＩＵの平均量となる投薬レジメンを使用して、女性被験体に組換えＦＳＨ調製物を投与するステップ；
（ｂ）１２ｍｍと等しいかもしくはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞が存在するとき、および／または少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵を誘発するステップ；
（ｃ）複数の卵母細胞を女性被験体から得るステップであって、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５つの卵母細胞が得られる、および／または女性被験体から少なくとも５つの卵母細胞が得られるステップ
を含み；
調製物中の組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有する、方法を提供する。
【００２２】
第２の態様では、本発明は、女性被験体において複数の卵巣の卵胞の発生を刺激するための制御された卵巣過剰刺激の方法であって、
（ａ）組換えＦＳＨ調製物が、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量の８０％またはそれ未満であるＩＵの量で投与される投薬レジメンを使用して、女性被験体に組換えＦＳＨ調製物を投与するステップ；
（ｂ）１２ｍｍと等しいかもしくはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞が存在するとき、および／または少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵を誘発するステップ；
（ｃ）複数の卵母細胞を女性被験体から得るステップであって、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量での同様の処置と比較して、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５％多い卵母細胞が得られるステップ
を含み；
調製物中の組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有する、方法を提供する。
【００２３】
第３の態様では、本発明は、女性被験体において卵胞成熟化を刺激する方法であって、
（ａ）組換えＦＳＨ調製物を投与することにより、女性被験体において卵胞成長を誘導するまたは増強するステップ；および
（ｂ）続いて排卵を誘発するステップ
を含み；
調製物中の組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有し；
ステップ（ｂ）において排卵を誘発することが、ステップ（ａ）における組換えＦＳＨ調製物の投与の終了の少なくとも４８時間後に始まる、方法を提供する。
【００２４】
組換えＦＳＨ
「ＦＳＨ調製物」は、ＦＳＨを含むか、もしくはＦＳＨからなる任意の組成物または物質であり得る。それは、固体または液体形態であってもよく、ＦＳＨに加えてさらなる成分を含んでもよい。特に、ＦＳＨ調製物は、ＦＳＨならびに水および／またはアルコールのような適当な溶媒を含む溶液、あるいは例えば、ＦＳＨを含有する溶液の凍結乾燥後に得られる粉末であってもよい。ＦＳＨ調製物の適当な例は、細胞におけるＦＳＨの発現後、特に、ＦＳＨの精製後に得られる組成物、またはＦＳＨを含む医薬組成物である。ＦＳＨ調製物は、ＦＳＨに加えて、例えば、溶媒、希釈剤、賦形剤、安定剤、保存剤、塩、アジュバント、および／または界面活性剤を含有してもよい。用語「ＦＳＨ調製物」は、特に、「ＦＳＨを含む組成物」の意味で本明細書において使用される。これらの用語は、好ましくは本明細書において同義的に使用される。
【００２５】
本明細書で使用される用語「ＦＳＨ」は、卵胞刺激ホルモンであるゴナドトロピンを指す。ＦＳＨは、アルファおよびベータサブユニットと標識される、２個のサブユニットで構成される糖タンパク質である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒトＦＳＨ、特に、配列番号１のアミノ酸配列を有するアルファサブユニット、および配列番号２のアミノ酸配列を有するベータサブユニットで構成されるヒトＦＳＨである。しかしながら、１つ、１もしくは２つ、最大３、最大５、最大１０、もしくは最大２０のような１つまたは複数のアミノ酸置換、付加、および／または欠失が、サブユニットの一方または両方に存在してもよい。好ましくは、アルファサブユニットのアミノ酸配列は、その全長にわたり、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の全体的な相同性または同一性を共有する。さらに、ベータサブユニットのアミノ酸配列は、好ましくは、その全長にわたり、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の全体的な相同性または同一性を共有する。ＦＳＨのサブユニットは、好ましくは、２つの別々のポリペプチド鎖であるが、本明細書で使用される用語「ＦＳＨ」はまた、２個のサブユニットが、例えば、架橋連結剤または連結ポリペプチド鎖により、互いに共有結合的に付着される実施形態、およびサブユニットの一方または両方が、いくつかのポリペプチド鎖にさらに分けられる実施形態も包含する。好ましくは、本発明によるＦＳＨは、ＦＳＨ受容体、好ましくは、ヒトＦＳＨ受容体に結合する、および／またはそれを活性化する能力がある。本明細書で使用される用語「ＦＳＨ」は、調製物中の全てのＦＳＨタンパク質を特に指す。従って、用語「ＦＳＨ」は、ＦＳＨ調製物または組成物中の全てのＦＳＨタンパク質の全体を特に指す。
【００２６】
本発明によるＦＳＨは、グリコシル化される、すなわち、それは、ポリペプチド鎖に付着した１つまたは複数、好ましくは、４つのオリゴ糖により修飾される。グリカン、炭水化物、または炭水化物構造とも命名される、これらのオリゴ糖はまた、直鎖もしくは分岐糖鎖であってもよく、好ましくは、複合体タイプのＮ連結オリゴ糖鎖である。分岐の数に依存して、オリゴ糖は、モノ−、バイ−、トリ−、またはテトラアンテナ型（またはさらにはペンタアンテナ型）と称される。モノアンテナ型オリゴ糖は非分岐である、すなわち、それは、分岐点を有さず、１つのアンテナのみを含み、一方、バイ−、トリ−、またはテトラアンテナ型オリゴ糖は、１、２、または３つの分岐点、故に、それぞれ、２、３、または４つのアンテナを有する。従って、より高いアンテナ性（ａｎｔｅｎｎａｒｉｔｙ）を有する糖タンパク質は、さらなるオリゴ糖エンドポイントを有し、例えば、シアル酸のようなさらなる機能的末端糖単位を保有し得る。本明細書で使用される「少なくともトリアンテナ型」は、トリアンテナ型、テトラアンテナ型、およびペンタアンテナ型オリゴ糖を含む、少なくとも３つのアンテナ性を有するオリゴ糖を指す。本明細書で使用される「少なくともテトラアンテナ型」は、テトラアンテナ型、およびペンタアンテナ型オリゴ糖を含む、少なくとも４つのアンテナ性を有するオリゴ糖を指す。複合体タイプのＮ−グリカンに関して、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基は、好ましくは、分岐またはアンテナとみなされず、従って、ＦＳＨのアンテナ性を追加しない。グリカン構造の用語「分岐」および「アンテナ」は、本明細書において同義的に使用される。
【００２７】
本明細書で言及されるＦＳＨのグリコシル化パターンは、本発明によるＦＳＨ調製物中の全てのＦＳＨタンパク質の全体的なグリコシル化パターンを特に指す。特に、ＦＳＨタンパク質に含まれた、従って、ＦＳＨ調製物中のＦＳＨポリペプチド鎖に付着した任意のグリカン構造が考慮され、グリコシル化パターンにおいて反映される。
【００２８】
好ましくは、ＦＳＨタンパク質のサブユニットの両方は、ポリペプチド鎖に付着した１つまたは複数の炭水化物構造を含む。より好ましくは、炭水化物構造は、サブユニットのアスパラギン残基に付着する。特に好ましい実施形態では、アルファサブユニットは、好ましくは、配列番号１に記載のアルファサブユニットのヒトアミノ酸配列のＡｓｎ５２およびＡｓｎ７８に対応するアスパラギン残基に付着した２つの炭水化物構造を含み、および／またはベータ−サブユニットは、好ましくは、配列番号２に記載のベータサブユニットのヒトアミノ酸配列のＡｓｎ７およびＡｓｎ２４に対応するアスパラギン残基に付着した２つの炭水化物構造を含む。ある特定の実施形態では、アルファサブユニットは、２つ以下の炭水化物鎖を含み、ベータサブユニットは、２つ以下の炭水化物鎖を含み、それらは、上述のアスパラギン残基に好ましくは付着する。この実施形態では、さらなるグリコシル化部位、特に、人工的に導入されたグリコシル化部位は、ＦＳＨのアミノ酸配列に存在しない。ヒトＦＳＨの炭水化物部分は、フコース、ガラクトース、マンノース、ガラクトサミン、（Ｎ−アセチル）グルコサミン、および／またはシアル酸残基で好ましくは構成される。特に、ヒトＦＳＨの炭水化物部分は、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトース、シアル酸、フコース、およびスルフェート残基で本質的に構成される。
【００２９】
本発明により使用されるＦＳＨは、組換え体、好ましくは、組換えヒトＦＳＨである。用語「組換えＦＳＨ」は、生きているヒトまたは動物の身体により天然に産生されず、したがってヒトあるいは動物の身体の尿、血液、または他の身体体液、糞便、または組織などに由来する試料から得られないＦＳＨを指す。好ましくは、組換えＦＳＨは、生物工学的に操作された細胞、特に、ＦＳＨ、またはＦＳＨのアルファもしくはベータサブユニットをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトされた細胞から得られる。好ましい実施形態によると、組換えＦＳＨは、ＦＳＨをコードする外因性核酸を含むヒト宿主細胞から得られる。それぞれの外因性核酸は、例えば、１つまたは複数の発現ベクターを使用することにより導入することができ、それは、例えば、トランスフェクションを介して、宿主細胞に導入することができる。タンパク質およびＦＳＨを組換え的に産生するそれぞれの方法は、先行技術分野において周知であり、従って、さらなる記載の必要はない。さらに、ＦＳＨを組換え的に産生する適当な宿主細胞は、本明細書に記載される。
【００３０】
本発明によるＦＳＨ調製物は、本ＦＳＨ調製物を、通常使用されるＦＳＨ調製物、特に、ＣＨＯ細胞において産生されるか、またはヒト尿から得られるものとも区別する、そのグリコシル化パターンにより特徴付けられる。
【００３１】
好ましい実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨは、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量を有する。ｂｉｓＧｌｃＮＡｃを保有するグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも２３％、少なくとも２５％、少なくとも２７％、または少なくとも３０％である。より好ましくは、それは、約２０％〜約５０％の範囲、特に、約２５％〜約４０％の範囲、または約２８％〜約３５％の範囲である。
【００３２】
本発明による「グリカンの相対量」は、ＦＳＨ調製物のＦＳＨ糖タンパク質に付着したグリカンの具体的なパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。特に、グリカンの相対量は、ＦＳＨタンパク質に含まれる、従って、ＦＳＨ調製物中のＦＳＨポリペプチド鎖に付着した全てのグリカンの具体的なパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。１００％のグリカンは、ＦＳＨ調製物のＦＳＨ糖タンパク質に付着した全てのグリカンを指す。例えば、６０％のバイセクティングＧｌｃＮＡｃを保有するグリカンの相対量は、ＦＳＨタンパク質に含まれ、従って、前記ＦＳＨ調製物中のＦＳＨポリペプチド鎖に付着した全てのグリカンの６０％が、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基を含み、一方、ＦＳＨタンパク質に含まれ、従って、前記ＦＳＨ調製物中のＦＳＨポリペプチド鎖に付着した全てのグリカンの４０％が、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基を含まない、ＦＳＨ調製物を指す。
【００３３】
ある特定の実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨは、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２％の硫酸化グリカンの相対量を有する。好ましくは、スルフェート基（硫酸化グリカン）を保有するグリカンの相対量は、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、または少なくとも６％、より好ましくは、少なくとも７％、または少なくとも８％である。一実施形態によると、スルフェート基を保有するグリカンの相対量は、５０％を超えず、好ましくは、それは、４０％もしくはそれ未満、３５％もしくはそれ未満、３０％もしくはそれ未満、２５％もしくはそれ未満、または２０％もしくはそれ未満である。
【００３４】
調製物中の組換えＦＳＨのグリコシル化パターンは、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも８０％の１つまたは複数のシアル酸残基を保有するグリカンの相対量を含み得る。１つまたは複数のシアル酸残基を保有するグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも８３％、少なくとも８５％、または少なくとも８８％であり、より好ましくは、１つまたは複数のシアル酸残基を保有するグリカンの相対量は、約８５％〜約９８％の範囲、または約８８％〜約９５％の範囲であり、最も好ましくは、約９０％である。用語「シアル酸」は、ノイラミン酸の任意のＮ−またはＯ−置換誘導体を特に指す。それは、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）および５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）の両方を指し得るが、好ましくは、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸のみを指す。シアル酸、特に、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、好ましくは、２，３−または２，６−連結を介して炭水化物鎖に付着する。好ましくは、本明細書に記載されるＦＳＨ調製物において、２，３−ならびに２，６−結合シアル酸の両方が存在する。
【００３５】
好ましい実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨのグリコシル化パターンは、調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量を有する。「２，６−結合シアル酸の相対量」は、２，６−結合シアル酸であるシアル酸の総量の具体的なパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。従って、１００％の２，６−結合シアル酸の相対量は、１つまたは複数のシアル酸残基を保有するグリカン上で見出される全てのシアル酸が２，６−結合シアル酸であることを意味する。例えば、６０％の２，６−結合シアル酸の相対量は、ＦＳＨタンパク質に含まれ、従って、前記ＦＳＨ調製物中のＦＳＨタンパク質のオリゴ糖鎖に付着した全てのシアル酸の６０％が、２，６−連結を介して付着し、一方ＦＳＨタンパク質に含まれ、従って、前記ＦＳＨ調製物中のＦＳＨタンパク質のオリゴ糖鎖に付着した全てのシアル酸の４０％が、２，６−連結を介して付着しないが、例えば、２，３−連結または２，８−連結を介して付着する、ＦＳＨ調製物を指す。好ましくは、調製物中の組換えＦＳＨにおける２，６−結合シアル酸の相対量は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５３％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも６５％、特に、約４０％〜約９９％、好ましくは、約４０％〜約８０％，約５０％〜約７５％、または約５３％〜約７０％の範囲である。好ましくは、２，６−結合シアル酸と２，３−結合シアル酸との比は、約２：３〜約１０：１、より好ましくは、約２：３〜約５：１、または約１：１〜約２：１、最も好ましくは、約１：１〜約３：２の範囲である。好ましい実施形態では、２，６−結合シアル酸の相対量は、２，３−結合シアル酸のものを超える。
【００３６】
ＦＳＨのシアル酸付加の程度はまた、Ｚ数として表されてもよい。Ｚ数は、糖タンパク質のグリカン構造の相対的な負電荷を示す。Ｚ数は、式：
Ｚ＝Ａ１％＊１＋Ａ２％＊２＋Ａ３％＊３＋Ａ４％＊４
【００３７】
（式中、Ａ１％は、電荷−１を有するグリカンのパーセンテージであり、Ａ２％は、電荷−２を有するグリカンのパーセンテージであり、Ａ３％は、電荷−３を有するグリカンのパーセンテージであり、Ａ４％は、電荷−４を有するグリカンのパーセンテージである）により計算される。これらのパーセンテージは、荷電ならびに非荷電グリカンを含む、ＦＳＨに付着した全てのグリカンに関して計算される。グリカンの電荷は、グリカンに含まれる任意の荷電単糖単位または置換基により、特に、シアル酸残基、および／またはスルフェート基、および／またはホスフェート基によりもたらされ得る。ＦＳＨのグリカンの電荷は、一般に、それらのシアル酸残基によってのみ決定され、ＦＳＨは、４種のグリカン構造を一般に有するので、Ｚ数は、ＦＳＨ上のシアル酸の量、またはＦＳＨの酸性度の指標である。しかしながら、ＦＳＨが有意な量の硫酸化グリカンも含むとき、Ｚ数は、シアル酸およびスルフェート基の合わせた量の指標である。
【００３８】
組成物中の組換えＦＳＨは、少なくとも２００のＺ数を好ましくは有する。Ｚ数は、好ましくは、少なくとも２１０、より好ましくは、少なくとも２１５、または少なくとも２２０である。より大きなＺ数は、例えば、酸性および／または負に荷電したＦＳＨタンパク質について、宿主細胞から得たＦＳＨ調製物を富化することにより、得ることができる。
【００３９】
ある特定の実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨのグリコシル化パターンは、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも１５％の少なくともテトラアンテナ型グリカンの相対量を含み得る。好ましくは、少なくともテトラアンテナ型グリカンの相対量は、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、または少なくとも１９％、より好ましくは、少なくとも２０％、または少なくとも２１％である。少なくともテトラアンテナ型グリカンの相対量は、例えば、１０％〜５０％、好ましくは、１２％〜４０％、より好ましくは、１５％〜３５％、または１７％〜３０％の範囲であってもよい。少なくともトリアンテナ型グリカン、特に、トリ−およびテトラアンテナ型グリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも４５％である。少なくともトリアンテナ型グリカンの相対量は、例えば、２０％〜７０％、好ましくは、３０％〜６５％、より好ましくは、３５％〜６０％、または４０％〜５５％の範囲であってもよい。
【００４０】
さらなる実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨのグリコシル化パターンは、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも９０％のガラクトースを保有するグリカンの相対量をさらに含んでもよい。ガラクトースを保有するグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも９５％、または少なくとも９７％であり、最も好ましくは、約９８％である。ガラクトースを保有するグリカンの前記相対量は、グリカン構造の少なくとも１つの分岐またはアンテナ上にガラクトース残基を保有する全てのグリカンを指す。ＦＳＨのグリカン構造は、１つより多くの分岐、特に、３または４つの分岐を通常有するので、ガラクトース単位を保有するか、または保有しない分岐の数も決定され得る。好ましくは、シアル酸残基により任意選択で修飾されたガラクトース単位を保有するグリカン分岐の相対量は、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの全てのグリカン分岐の少なくとも６５％、より好ましくは、少なくとも７０％、または少なくとも７３％である。それは、好ましくは、約６０％〜約９５％の範囲、より好ましくは、約７０％〜約８０％の範囲である。
【００４１】
ある特定の実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨのグリコシル化パターンは、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のコアフコースを保有するグリカンの相対量を含み得る。好ましくは、コアフコースを保有するグリカンの相対量は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、または少なくとも３５％である。それは、約３０％〜約６０％の範囲、特に、約３５％〜約５０％の範囲であり得る。本発明による「コアフコース」は、Ｎ−連結炭水化物鎖の還元末端にてＮ−アセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基、すなわち、ＦＳＨのポリペプチド鎖に直接付着しているＮ−アセチルガラクトサミン残基に付着したフコース残基を指す。コアフコース残基は、α１，６−連結を介してＧｌｃＮＡｃ残基に好ましくは連結する。コアフコース残基は、アウターアームフコース残基に向かい合っている。本明細書で言及される「アウターアームフコース」は、Ｎ−連結炭水化物鎖の分岐またはアンテナに付着するフコース残基を意味する。特に、アウターアームフコースは、アンテナに存在するＧｌｃＮＡｃ残基に、好ましくは、α１，３−連結を介して付着する。具体的な実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨのグリコシル化パターンは、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの５％またはそれ未満のアウターアームフコースを保有するグリカンの相対量を含み得る。好ましくは、アウターアームフコースを保有するグリカンの相対量は、４％もしくはそれ未満、３％もしくはそれ未満、２％もしくはそれ未満、または１％もしくはそれ未満である。それは、約０％〜約５％の範囲、特に、約０％〜約２％の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨは、検出可能な量のアウターアームフコースを含まない。
【００４２】
具体的な実施形態では、調製物中の組換えＦＳＨは、多様なグリコシル化パターンを有する。用語「多様なグリコシル化パターン」は、グリコシル化パターンが複数の異なるグリカン構造を含む、調製物または組成物中のＦＳＨタンパク質のグリコシル化パターンを特に指す。異なるグリカン構造は、例えば、スルフェート残基、アセチル残基などのような、少なくとも１つの単糖単位および／または少なくとも１つの化学修飾の存在／不存在、量、および／または位置が異なる、オリゴ糖構造である。具体的な「異なるグリカン構造」は、好ましくは、その相対量が、グリコシル化パターンにおけるグリカン構造の総量の少なくとも０．０２％、より好ましくは、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．１％、少なくとも０．１５％、少なくとも０．２％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．３％、または少なくとも０．５％である場合にのみ考慮される。多様なグリコシル化パターンは、特に、少なくとも５つの異なるグリカン構造を含むグリコシル化パターンである。好ましくは、多様なグリコシル化パターンは、少なくとも７種、より好ましくは、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、少なくとも５５種、最も好ましくは、少なくとも６０種の異なるグリカン構造を含む。一実施形態によると、多様なグリコシル化パターンはまた、グリコシル化パターンが、さらに、それぞれの調製物または組成物中のＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨよりもさまざまなグリカン構造を含む、調製物または組成物中のＦＳＨのグリコシル化パターンを特に指す。特に、グリコシル化パターンは、ＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨよりも、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも１００％多いさまざまなグリカン構造を含む。特定の実施形態では、調製物中のＦＳＨは、調製物中のＦＳＨが、少なくとも４５種、または好ましくは、少なくとも５０種の異なるグリカン構造を含み、異なるグリカン構造のそれぞれ１種が、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．０５％の相対量を有する、多様なグリコシル化パターンを好ましくは有する。一実施形態によると、調製物中のＦＳＨは、少なくとも３５種、または好ましくは、少なくとも４０種の異なるグリカン構造を含み、異なるグリカン構造のそれぞれ１種が、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．１％の相対量を有し、および／または調製物中のＦＳＨが、少なくとも２０種、または好ましくは、少なくとも２５種の異なるグリカン構造を含み、異なるグリカン構造のそれぞれ１種が、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．５％の相対量を有する。さらなる実施形態では、調製物中のＦＳＨは、対応する調製物中のＣＨＯ細胞から得られたＦＳＨよりも少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも５０％多いさまざまなグリカン構造を含み、異なるグリカン構造のそれぞれ１種が、それぞれの調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．０５％、０．１％、または０．５％の相対量を有する。本明細書において使用される用語「ＣＨＯ」は、ＣＨＯ細胞株ＣＨＯｄｈｆｒ−［ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６］を好ましくは指す。
【００４３】
ある特定の実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）、または検出可能な量のＮｅｕＧｃを含まない。さらに、本発明による組換えＦＳＨ調製物はまた、ガリリ（Ｇａｌｉｌｉ）エピトープ（Ｇａｌα１，３−Ｇａｌ構造）、または検出可能な量のガリリエピトープを好ましくは含まない。
【００４４】
本発明は、ヒトグリコシル化パターンを有するＦＳＨを特に提供する。ヒトグリコシル化パターンは、特に、ヒト身体により産生される天然のヒト糖タンパク質上で同様に見出され得るグリカン構造のみを含むグリコシル化パターンである。これらのグリコシル化特性に起因して、副作用を誘導し得る外来の免疫原性非ヒト構造が不存在であり、それは、共にげっ歯類産生系もしくは例えば、酵母系由来の公知の免疫原性高マンノース構造の様な他の構造について公知である、免疫原性非ヒトシアル酸（ＮｅｕＧｃ）またはガリリエピトープ（Ｇａｌ−Ｇａｌ構造）のようなある特定の外来糖構造により引き起こされることが公知の所望されない副作用あるいは欠点が回避されることを意味する。
【００４５】
ある特定の実施形態では、本発明による調製物中の組換えＦＳＨのグリコシル化パターンは、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの約２５％〜約５０％の範囲のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも６％の硫酸化グリカンの相対量；
（ｉｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも５３％の２，６−結合シアル酸の相対量；
（ｉｖ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも８８％の１つまたは複数のシアル酸残基を保有するグリカンの相対量；
（ｖ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも１６％の少なくともテトラアンテナ型グリカンの相対量；および
（ｖｉ）ＦＳＨが少なくとも２１０のＺ数を有する
の１つもしくは複数、好ましくは、２つもしくはそれ超、または３つもしくはそれ超、最も好ましくは、全てを含む。
【００４６】
さらなる実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、次の特徴
（ｉ）それがヒト組換えＦＳＨである；および／または
（ｉｉ）それが、ヒト細胞株もしくはヒト細胞により産生される；および／または
（ｉｉｉ）それが、多様なグリコシル化パターンを有し、少なくとも２０種の異なるグリカン構造を好ましくは含み、異なるグリカン構造のそれぞれ１種が、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．１％の相対量を有する
の１つまたは複数、好ましくは、少なくとも２つ、より好ましくは、全てを含む。
【００４７】
特に、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの約２５％〜約５０％の範囲のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の約５３％〜約８０％の範囲の２，６−結合シアル酸の相対量；
（ｉｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの約６％〜約２５％の範囲のスルフェート基を保有するグリカンの相対量；
（ｉｖ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの５％もしくはそれ未満のアウターアームフコースを保有するグリカンの相対量；
（ｖ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも３０％のコアフコースを保有するグリカンの相対量；
（ｖｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも１６％の少なくともテトラアンテナ型グリカンの相対量；
（ｖｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも８８％の１つもしくは複数のシアル酸残基を保有するグリカンの相対量；
（ｖｉｉｉ）少なくとも２１０のＺ数；
（ｉｘ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも９５％のガラクトースを保有するグリカンの相対量；
（ｘ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカン分岐の少なくとも６０％のシアル酸残基により任意選択で修飾されたガラクトース単位を保有するグリカン分岐の相対量；
（ｘｉ）それが、少なくとも４５種の異なるグリカン構造を含み、異なるグリカン構造のそれぞれ１種が調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．０５％の相対量を有する；
（ｘｉｉ）それが、少なくとも３５種の異なるグリカン構造を含み、異なるグリカン構造のそれぞれ１種が、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．１％の相対量を有する；および／または
（ｘｉｉｉ）それが、少なくとも２０種の異なるグリカン構造を含み、異なるグリカン構造のそれぞれ１種が、調製物中のＦＳＨのグリカン構造の総量の少なくとも０．５％の相対量を有する
の１つもしくは複数、好ましくは、少なくとも２つ、より好ましくは、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、最も好ましくは、全てを含むグリコシル化パターンを有する。
【００４８】
ある特定の好ましい実施形態では、組換えＦＳＨ調製物は、次の表１に挙げられるグリコシル化パターンの１つを有する。
【表１】
2017513853.tif 000002
【００４９】
表１に挙げられた実施形態１〜１２では、好ましくは、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの相対量は、少なくとも２０％の代わりに少なくとも２５％であり、および／または２，６−結合シアル酸の相対量は、好ましくは、少なくとも５３％の代わりに少なくとも５５％であり、および／または硫酸化グリカンの相対量は、少なくとも２．５％の代わりに、好ましくは、少なくとも３％、より好ましくは、少なくとも８％である。表１に挙げられたグリコシル化パターンは、好ましくは、ヒトグリコシル化パターンであり、ならびに／またはＮｅｕＧｃおよびガリリエピトープを含まない。
【００５０】
ある特定の実施形態では、ＦＳＨは、非天然分子により、特に、組換え産生のため使用される宿主細胞によりそれと付着しない分子により修飾されない。好ましくは、本明細書で使用されるＦＳＨは、ポリエチレングリコールもしくはヒドロキシエチルデンプン、またはＦＳＨの半減期を引き延ばすために使用される他の分子のような分子を含まないか、あるいはコンジュゲートしない。これらの分子は、ヒト身体においてＦＳＨの循環半減期を人工的に増大するために、先行技術分野において特に使用される。しかしながら、ＦＳＨまたはそれらの消化産物に付着したポリマー物質が、例えば、毒性であること、または所望されない免疫反応を引き起こすことにより、患者において有害な反応を引き起こし得るので、これらのアプローチは問題がある。さらに、長い循環半減期は、ＦＳＨを、処置の終了後、長期間ヒト身体においてとどまらせ得る。故に、制御された処置は、長い循環半減期を有するＦＳＨを使用して達成するのが著しく難しい。ある特定の実施形態では、ＦＳＨのアミノ酸配列はまた、ヒト身体においてその循環半減期を引き延ばすように人工的に操作されない。特に、本発明によるＦＳＨは、キメラタンパク質ではなく、および／または天然のＦＳＨタンパク質に存在しないグリコシル化部位を含有しない。
【００５１】
具体的な実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、５０時間もしくはそれ未満、好ましくは、４５時間もしくはそれ未満、またはさらに４０時間もしくはそれ未満のヒトにおける循環半減期（ｔ１／２）を有する。好ましくは、本発明による組換えＦＳＨ調製物の循環半減期は、２０時間〜６０時間、より好ましくは、２５時間〜５０時間、または３０時間〜４５時間の範囲である。さらなる実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ヒト尿から得られたＦＳＨ調製物より短い循環半減期を有する。循環半減期は、特に、ヒトにおいて決定される。好ましくは、循環半減期は、ヒト尿から得られたＦＳＨ調製物のものより少なくとも５％短く、より好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％短い。ある特定の実施形態では、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、ヒト尿から得られた、および／または、ＣＨＯ細胞において、特に、ヒト、カニクイザル、ラット、および／またはマウスの１つまたは複数において発現されたＦＳＨ調製物より、低いバイオアベイラビリティを有する。好ましくは、バイオアベイラビリティは、ヒト尿から得られた、および／またはＣＨＯ細胞において発現されたＦＳＨ調製物のものより少なくとも５％低く、より好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％低い。この点におけるバイオアベイラビリティは、血清ＦＳＨ濃度が、規定の量のＦＳＨの投与後の異なる時点で決定される、薬物動態学的研究において得られる曲線下面積（ＡＵＣ）値を好ましくは指す。循環半減期およびバイオアベイラビリティは、皮下注射によるＦＳＨの投与後、特に、１回用量の投与後に好ましくは決定され、１回用量は、好ましくは、ＦＳＨ約１０〜約１０００ＩＵ、より好ましくは、ＦＳＨ約２５ＩＵ〜約５００ＩＵ、ＦＳＨ約５０ＩＵ〜約３００ＩＵ、またはＦＳＨ約７５ＩＵ〜約１５０ＩＵ、特に、ＦＳＨ約１００ＩＵを含む。特に、循環半減期およびバイオアベイラビリティは、以下の実施例４において開示される通り、決定される。
【００５２】
ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物は、特に、閉経後の女性の尿から得られる。ＣＨＯ細胞において発現させるＦＳＨ調製物は、例えば、ＣＨＯ細胞株ＣＨＯｄｈｆｒ−［ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６］において発現される。ヒト尿から得られるＦＳＨ調製物、およびＣＨＯ細胞において発現されるＦＳＨ調製物は、好ましくは、市販の、承認された医薬調製物、特に、それぞれ、ＢｒａｖｅｌｌｅおよびＧｏｎａｌ−ｆである。異なるＦＳＨ調製物の循環半減期またはバイオアベイラビリティを比較するとき、ＦＳＨ調製物は、それらを同様の被験体群に同一の投薬レジメンで同一の投与経路を使用して投与することにより、分析される。
【００５３】
ＦＳＨの産生
本発明により使用されるＦＳＨは、ヒト細胞、好ましくは、ヒト細胞株における組換え産生により得ることができる、好ましくは、ＦＳＨであり、より好ましくは、ヒトＦＳＨである。組換え産生のため宿主細胞として使用することができるヒト細胞株は、好ましくはヒト血液細胞に由来し、特に、それは、骨髄系細胞株、好ましくは、骨髄性白血病細胞株である。細胞株は、好ましくは、不死化される。好ましい実施形態では、本発明によるＦＳＨの産生のための細胞株は、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．  １０，  １３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ（ドイツ）により、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ドイツ）において、ブダペスト条約の要件に従い、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０７８の下２０１０年７月２８日に寄託された細胞株ＧＴ−５ｓ、またはそれに由来する細胞株、または同種の細胞株である。ＧＴ−５ｓは、本明細書に記載される特異的なグリコシル化パターンをもたらす能力がある不死化されたヒト骨髄性白血病細胞株である。本発明によると、用語「ＧＴ−５ｓ」および「ＧＴ−５ｓ細胞株」はまた、ＧＴ−５ｓに由来する細胞または細胞株を含む。ＧＴ−５ｓに由来する細胞株は、例えば、任意選択でそれらの変異率を増強するためにＧＴ−５ｓ細胞を処置した後、細胞の単一のクローンまたは群をＧＴ−５ｓ培養物から無作為もしくは特異的に選択することにより、またはＧＴ−５ｓ細胞株を遺伝的に変えることにより、得ることができる。細胞の選択されたクローンまたは群は、上述の通りさらに処置されてもよく、および／または選択のさらなるラウンドが行われてもよい。ＧＴ−５ｓに対し同種である細胞株は、特に、不死化されたヒト骨髄系細胞株である。好ましくは、ＧＴ−５ｓに由来する、またはそれに対し同種の細胞株は、ＧＴ−５ｓから得られるものと同様のグリコシル化パターンを有するＦＳＨをもたらす能力がある。好ましくは、ＧＴ−５ｓに由来する、またはそれに対し同種の細胞株により産生されるＦＳＨは、本明細書に記載されるグリコシル化特徴、特に、調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および／または調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも３０％のコアフコースを保有するグリカンの相対量；および／または調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量の１つまたは複数を有する。一実施形態によると、ＧＴ−５ｓに由来する、またはそれに対し同種の細胞株は、本明細書において好ましいとして記載されるグリコシル化パターン、特に、表１から選択されるグリコシル化パターンを有するＦＳＨを発現する能力がある。ＧＴ−５ｓに由来する、またはそれに対し同種の細胞株により産生されるＦＳＨの同様のグリコシル化パターンは、ＧＴ−５ｓから得られるＦＳＨのグリコシル化パターンと好ましくは同様であり、特に、ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ���相対量、シアル酸付加されたグリカンの相対量、硫酸化グリカンの相対量、２，６−結合シアル酸の相対量、フコースの相対量、テトラアンテナ型グリカンの相対量、ガラクトースを保有するグリカン分岐の相対量、およびＺ数からなる群より選択されるグリコシル化特性の１つまたは複数、好ましくは、全てにおいて、２０％以下もしくはそれ未満、より好ましくは、１５％もしくはそれ未満、１０％もしくはそれ未満、または５％もしくはそれ未満、それらと特に異なる。さらに、本発明によるＦＳＨは、本明細書において開示される１つまたは複数の特異的なグリコシル化特徴、好ましくは、表１から選択されるグリコシル化パターンを有する、好ましくは、ＦＳＨ、より好ましくは、ヒトＦＳＨである。細胞株ＧＴ−５ｓ、ならびにそれに由来する細胞株およびそれと同種の細胞株は、それらが、特に、ＦＳＨタンパク質に関して、非常に安定かつ均質なタンパク質産生をもたらすので、特に有利である。それらは、非常に良好なバッチ間の一貫性を有する、すなわち、産生されるタンパク質およびそれらのグリコシル化パターンは、異なる産生実施から得られたとき、または異なるスケールでおよび／または異なる培養手順で産生されるとき、類似する。特に、本明細書に記載される多様なグリコシル化パターンは、ＦＳＨを発現させるためこれらの細胞株を使用する異なる産生実施において高度に再生可能である。
【００５４】
前記細胞株において産生されるＦＳＨは、上述のグリコシル化パターンを提示し、特に、有利な治療活性および薬理学的活性、ならびに本明細書に記載される特徴を提示することが見出された。組換えＦＳＨ調製物は、適当な細胞株、特に、上述の細胞株、好ましくは、細胞株ＧＴ−５ｓ、ＧＴ−５ｓに由来する細胞株、またはＧＴ−５ｓと同種の細胞株においてＦＳＨを組換え的に発現させることにより、産生することができる。それぞれ産生される組換えＦＳＨは、単離し、任意選択で精製することができる。
【００５５】
従って、組換えＦＳＨ調製物は、
（ｉ）ＦＳＨアルファおよびベータサブユニットをコードする核酸を含む、ヒト宿主細胞、好ましくは、細胞株ＧＴ−５ｓまたは同種の細胞株に由来するヒト宿主細胞を、ＦＳＨの発現に適当な条件下で、培養するステップ；および
（ｉｉ）ＦＳＨを単離するステップ
を含むプロセスにより好ましくは得ることができる。
【００５６】
発現のため使用されるヒト宿主細胞は、好ましくは、骨髄系細胞、特に、不死化された骨髄性白血病細胞であり、好ましくは、細胞株ＧＴ−５ｓであるか、もしくはそれに由来する、またはそれと同種の細胞株である。ヒト宿主細胞は、それらがＦＳＨを発現するように培養される。適当な培養条件は当業者に公知である。
【００５７】
用語「核酸」は、一本鎖および二本鎖核酸ならびにリボ核酸、ならびにデオキシリボ核酸、特に、デオキシリボ核酸を含む。用語「ベクター」は、その最も一般的な意味で本明細書で使用され、前記核酸が、例えば、原核生物および／または真核生物の宿主細胞に導入される、適当な場合、宿主細胞のゲノムに組み込まれることを可能にする核酸のための任意の中間のビヒクルを含む。この種のベクターは、好ましくは、宿主細胞において複製され、および／または発現される。ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための１種または複数の選択マーカーを好ましくは含む。適当な選択マーカーは、例えば、抗生物質のような、例えば、特定の薬物に対する耐性を有する宿主細胞をもたらす耐性遺伝子である。さらなる適当な選択マーカーは、例えば、ＤＨＦＲまたはＧＳのような酵素についての遺伝子である。ＦＳＨ、ならびに宿主細胞において高収量での組換えタンパク質の発現を可能にする適当な発現カセットおよび発現エレメントを含む組換えタンパク質の発現を可能にするベクターが、先行技術分野において周知であり、市販もされており、従って、ここで詳細な記載は必要ない。かかるベクターを使用して、ＦＳＨの組換え発現のため、ＦＳＨのアミノ酸配列をコードする核酸を宿主細胞に導入することができる。
【００５８】
互換的に使用される用語「細胞（ｃｅｌｌ）」および「細胞（ｃｅｌｌｓ）」および「細胞株」は、１種または複数の哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞を好ましくは指す。用語は、細胞または細胞集団の子孫を含む。当業者は、「細胞」が、単一の細胞の子孫を含み、子孫が、天然の、偶発的な、または計画的な変異および／または変更に起因して、必ずしも、オリジナルの親細胞と（形態学において、または総ＤＮＡ含量（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の）完全に同一でなくてもよいことを理解する。「細胞」は、単離された細胞、および／または生きているヒトもしくは動物の身体において組み込まれていない培養された細胞を好ましくは指す。
【００５９】
ＦＳＨの単離は、以下のさらなるステップ：
（ａ）ＦＳＨがヒト細胞により分泌される場合、培養上清を得るか、またはＦＳＨが分泌されない場合、ヒト細胞を溶解するステップ；
（ｂ）逆相クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーステップを使用して、培養上清または細胞溶解物からＦＳＨを単離するステップ；ならびに
（ｃ）任意選択で、ｐＨ約５．０、またはｐＨ約４．５、またはｐＨ約４．０での洗浄ステップのような塩基性ＦＳＨアイソフォームを除去する洗浄ステップを含む、好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することによって、塩基性ＦＳＨアイソフォームを除去することにより、ＦＳＨの酸性分画を得るステップ
を好ましくは含む。
【００６０】
好ましくは、ＦＳＨアルファサブユニットをコードする核酸、およびＦＳＨベータサブユニットをコードする核酸は、ヒト宿主細胞において発現を可能にする適当な発現ベクターに含まれる発現カセットに含まれる。ＦＳＨアルファサブユニットをコードする核酸、およびＦＳＨベータサブユニットをコードする核酸は、同一のベクターに含まれてもよいが、好ましくは、コトランスフェクションにより宿主細胞に導入することができる別々のベクターに含まれる。さらに、それらはまた、ＩＲＥＳエレメントのような適当なエレメントを使用して、１つの発現カセットから発現されてもよい。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞により分泌される。好ましい実施形態では、ヒト細胞の培養は、発酵槽において、および／または無血清条件下で行われる。
【００６１】
組換えＦＳＨの適当な精製プロセスは、例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ２０１１／０６３９４３において記載される。
【００６２】
本発明のある特定の実施形態では、組換えＦＳＨは、ヒトＦＳＨサブユニットをコードする１つまたは複数の核酸、および宿主細胞において前記１つまたは複数の核酸を発現するためのエレメントを含む、好ましくは、細胞株ＧＴ−５ｓのようなヒト細胞株における産生により得ることが可能な組換えヒトＦＳＨ（ｒｈＦＳＨ）である。好ましくは、ｒｈＦＳＨのアルファサブユニットは、配列番号１に記載のアミノ酸配列、あるいは少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の、その全体的な長さにわたる配列番号１に対する相同性、または好ましくは、同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、ｒｈＦＳＨのアルファサブユニットは、配列番号１の５２および７８位に対応する位置にてアスパラギン残基を含み、配列番号１のＡｓｎ５２およびＡｓｎ７８に対応するアスパラギン残基にてグリコシル化される。ｒｈＦＳＨのアルファサブユニットは、これらの２つのグリコシル化部位のみを好ましくは含み、任意のさらなるグリコシル化部位を含まない。ｒｈＦＳＨのベータサブユニットは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいは少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の、その全体的な長さにわたる配列番号２に対する相同性、または好ましくは、同一性を有するアミノ酸配列を好ましくは有する。好ましい実施形態では、ｒｈＦＳＨのベータサブユニットは、配列番号２の７および２４位に対応する位置にてアスパラギン残基を含み、配列番号２のＡｓｎ７およびＡｓｎ２４に対応するアスパラギン残基にてグリコシル化される。ｒｈＦＳＨのベータサブユニットは、これら２つのグリコシル化部位のみを好ましくは含み、任意のさらなるグリコシル化部位を含まない。ある特定の実施形態では、ＦＳＨは、１個のアルファサブユニット、および１個のベータサブユニットからなり、任意のさらなるアミノ酸配列を含まない。
【００６３】
ＦＳＨ組成物
組換えＦＳＨ調製物は、好ましくは、医薬組成物に存在する。用語「医薬組成物」は、ヒトまたは動物に投与するのに適当な組成物、すなわち、薬学的に許容される構成成分を含有する組成物を特に指す。好ましくは、医薬組成物は、ＦＳＨを、活性化合物、またはその塩もしくはプロドラッグとして、担体、希釈剤、または緩衝液、保存剤、および張度調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）のような医薬賦形剤と共に含む。医薬組成物は、好ましくは、皮下注射もしくは静脈注射のような、注射に適当な組成物、例えば、ＦＳＨを含む水溶液、または静脈注射に適当な組成物を調製するために使用することができる組成物、例えば、凍結乾燥されたＦＳＨ組成物である。医薬組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤、特に、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト、またはゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アンタゴニストのような、不妊処置において有用なさらなる薬剤を含んでもよい。典型的なＧｎＲＨアゴニストは、ロイプロリド、ブセレリン、ヒストレリン、ゴセレリン、デスロレリン（ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）、ナファレリン、およびトリプトレリンのような天然のＧｎＲＨデカペプチドまたは修飾されたペプチドである。典型的なＧｎＲＨアンタゴニストは、セトロレリクス、ガニレリクス、アバレリックス、およびデガレリクスを含む。あるいは、組換えＦＳＨを含む医薬組成物は、かかるさらなる薬学的に活性な薬剤と併用した使用のため設計されてもよい。好ましい実施形態では、ＦＳＨ調製物は、任意のさらなる薬学的に活性な薬剤、またはＬＨおよびＣＧのような任意の他のゴナドトロピンを含まない。
【００６４】
医薬組成物は、１回単位用量または複数の単位用量の形態であってもよい。好ましくは、医薬組成物は、水、緩衝物質、安定剤、保存剤、賦形剤、界面活性剤、および塩のような溶媒からなる群より選択される１種または複数の成分をさらに含む、本発明による組換えＦＳＨを含む無菌溶液である。複数の単位用量は、複数の１回用量、特に、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、または少なくとも５０回の１回用量を提供するのに十分なＦＳＨを含む。医薬組成物は、例えば、注射ペン（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｅｎ）の形態であってもよい。組成物の構成成分は、好ましくは、全て薬学的に許容される。組成物は、固形または流体組成物、特に、好ましくは水性の、溶液、エマルジョン、または懸濁物、または凍結乾燥粉末であってもよい。
【００６５】
医薬組成物は、１〜５０００ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは、１０〜２５００ＩＵ／ｍｌ、１００〜２０００ＩＵ／ｍｌ、または２５０〜１５００ＩＵ／ｍｌの範囲、特に、約５００ＩＵ／ｍｌ、または約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度のＦＳＨを好ましくは含む。
【００６６】
好ましくは、本発明による組換えＦＳＨ調製物は、患者への非経口投与用である。特に、組換えＦＳＨは、注射または注入により、例えば、静脈内、筋肉内、または皮下に投与されるべきである。
【００６７】
制御された卵巣過剰刺激の方法
本発明は、制御された卵巣過剰刺激の方法に関する。前記制御された卵巣過剰刺激は、女性被験体における複数の卵巣の卵胞の発生の刺激を含む。複数の卵巣の卵胞の前記発生は、単一の周期１回において同時に達成される。制御された卵巣過剰刺激は、天然に生じるより多い数の卵胞の発生の刺激を特に指す。卵巣の卵胞の発生は、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）および第二分裂中期卵母細胞の形成をとりわけ導く。卵丘卵母細胞複合体は、卵母細胞、およびそれを囲む卵丘細胞を含む細胞のクラスターである。それは、排卵前、および破裂卵胞が卵管に入る排卵中は卵巣の卵胞の一部である。第二分裂中期卵母細胞は、卵母細胞発生の第二減数分裂の分裂中期にて停止する。
【００６８】
具体的な実施形態では、制御された卵巣過剰刺激は、補助生殖技術（ＡＲＴ）の一部である。特に、それは、体外受精、例えば、細胞質内精子注射、卵母細胞および精子の同時インキュベーション、ならびに配偶子卵管内移植；および／または胚移植、例えば、接合子卵管内移植と組み合わされてもよい。
【００６９】
女性被験体において複数の卵巣の卵胞の発生を刺激するための制御された卵巣過剰刺激の方法は、
（ａ）女性被験体に組換えＦＳＨ調製物を投与するステップ；
（ｂ）排卵を誘発するステップ；および
（ｃ）複数の卵母細胞を女性被験体から得るステップ
を特に含む。
【００７０】
投薬レジメン
ステップ（ａ）において、組換えＦＳＨ調製物は、具体的な投薬レジメンを使用して女性被験体に投与される。第１の態様では、１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約３５〜約２５０ＩＵの平均量となるように、投薬レジメンは、組換えＦＳＨ調製物の投与を含む。本発明の第２の態様では、投薬レジメンは、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量の８０％またはそれ未満であるＩＵの量の組換えＦＳＨ調製物の投与を含む。
【００７１】
異なる投薬間隔が使用されてもよい。特に、組換えＦＳＨ調製物は、１日当たり４回、１日当たり３回、もしくは１日当たり２回のような１日当たり数回、毎日１回、または２日毎、３日毎、４日毎、または５日毎に投与され得る。好ましくは、組換えＦＳＨ調製物は、毎日１回、２日毎、または３日毎、特に、毎日１回、または２日毎、とりわけ、毎日１回投与される。投与の日数により割られた各１回用量におけるＦＳＨの量の合計は、１日当たりＦＳＨの平均量をもたらす。故に、１日当たりＦＳＨ  １００ＩＵの平均量は、例えば、（ａ）毎日２回のＦＳＨ  ５０ＩＵ、（ｂ）毎日ＦＳＨ  １００ＩＵ、（ｃ）２日毎にＦＳＨ  ２００ＩＵ、または（ｄ）３日毎にＦＳＨ  ３００ＩＵの１回用量を投与することにより到達され得る。
【００７２】
具体的な実施形態では、１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約３５〜約１５０ＩＵの平均量となる投薬レジメンが使用される。特に、平均量は、１日当たりＦＳＨ約４５〜約１２５ＩＵ、とりわけ、１日当たりＦＳＨ約５０〜約１１５ＩＵ、１日当たりＦＳＨ約５５〜約１００ＩＵ、または１日当たりＦＳＨ約６０〜約９０ＩＵである。ある特定の実施形態では、投薬レジメンは、ＦＳＨ約３５〜約１５０ＩＵ、好ましくは、ＦＳＨ約４５〜約１２５ＩＵ、ＦＳＨ約５０〜約１１５ＩＵ、ＦＳＨ約５５〜約１００ＩＵ、またはＦＳＨ約６０〜約９０ＩＵの１日用量を含む。さらなる実施形態では、投薬レジメンは、２日毎にＦＳＨ約７０〜約３００ＩＵ、好ましくは、２日毎にＦＳＨ約９０〜約２５０ＩＵ、２日毎にＦＳＨ約１００〜約２３０ＩＵ、２日毎にＦＳＨ約１１０〜約２００ＩＵ、または２日毎にＦＳＨ約１２０〜約１８０ＩＵの用量を含む。さらなる実施形態では、投薬レジメンは、３日毎にＦＳＨ約１０５〜約４５０ＩＵ、好ましくは、３日毎にＦＳＨ約１３５〜約３７５ＩＵ、３日毎にＦＳＨ約１５０〜約３４５ＩＵ、３日毎にＦＳＨ約１６５〜約３００ＩＵ、または３日毎にＦＳＨ約１８０〜約２７０ＩＵの用量を含む。
【００７３】
さらなる実施形態では、１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約７０〜約３００ＩＵの平均量となる投薬レジメンが使用される。特に、平均量は、１日当たりＦＳＨ約９０〜約２５０ＩＵ、とりわけ、１日当たりＦＳＨ約１１０〜約２３０ＩＵ、１日当たりＦＳＨ約１２５〜約１９０ＩＵ、または１日当たりＦＳＨ約１４０〜約１６０ＩＵである。ある特定の実施形態では、投薬レジメンは、毎日ＦＳＨ約７０〜約３００ＩＵ、好ましくは、毎日ＦＳＨ約９０〜約２５０ＩＵ、毎日ＦＳＨ約１１０〜約２３０ＩＵ、毎日ＦＳＨ約１２５〜約１９０ＩＵ、または毎日ＦＳＨ約１４０〜約１６０ＩＵの用量を含む。さらなる実施形態では、投薬レジメンは、２日毎にＦＳＨ約１４０〜約６００ＩＵ、好ましくは、２日毎にＦＳＨ約１８０〜約５００ＩＵ、２日毎にＦＳＨ約２２０〜約４６０ＩＵ、２日毎にＦＳＨ約２５０〜約３８０ＩＵ、または２日毎にＦＳＨ約２８０〜約３２０ＩＵの用量を含む。これらの実施形態では、女性被験体は、卵胞成長の刺激に対して低い応答性を特に有するか、または卵巣刺激に対する乏しい卵巣応答を示し得る。具体的には、女性被験体は、
−  少なくとも３５歳、特に、少なくとも３７歳、または少なくとも４０歳、好ましくは、約３８歳〜約５０歳の範囲の年齢を有する女性被験体；
−  １．５ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、特に、１．４ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、１．３ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、１．２ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、または１．１ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、好ましくは、約０．２５ｎｇ／ｍｌ〜約１．２５ｎｇ／ｍｌの範囲の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の血清レベルを有する女性被験体；
−  両方の卵巣の合計として９もしくはそれ未満、特に、８もしくはそれ未満、７もしくはそれ未満、または６もしくはそれ未満、好ましくは、４〜７の範囲の胞状卵胞カウントを有する女性被験体；および
−  少なくとも２５ｋｇ／ｍ２、特に、少なくとも２６ｋｇ／ｍ２、少なくとも２７ｋｇ／ｍ２、少なくとも２８ｋｇ／ｍ２、少なくとも２９ｋｇ／ｍ２、または少なくとも３０ｋｇ／ｍ２、好ましくは、約２８ｋｇ／ｍ２〜約４５ｋｇ／ｍ２の範囲のボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する女性被験体；
−  ６つ未満、特に、５つ未満、４つ未満、または３つ未満の卵母細胞の発生が誘導された、以前の従来のＦＳＨ刺激サイクルを経験している女性被験体；および
−  Ｆｅｒｒａｒｅｔｔｉら、（２０１１年）、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、２６巻（７号）、１６１６〜１６２４頁において定義される２０１１年ＥＳＨＲボローニャ判断基準に従い、乏しい卵巣応答を有する女性被験体
からなる群より選択され得る。
【００７４】
具体的な実施形態では、卵胞成長の刺激に対して低い応答性を有するか、または卵巣刺激に対して乏しい卵巣応答を示す女性被験体は、これらの判断基準の２つまたはそれ超、特に、３つまたはそれ超を満たす。
【００７５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物は、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量の７５％もしくはそれ未満、特に、６０％もしくはそれ未満、または５０％もしくはそれ未満であるＩＵの量で投与される。ＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物は、特に、Ｇｏｎａｌ−ｆである。ＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量は、ＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物の処方情報において示される投薬量であり得る。他の実施形態では、ＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量は、とりわけ、女性被験体において、複数の卵母細胞、特に、少なくとも５つの卵母細胞の発生を刺激するために、女性被験体における制御された卵巣過剰刺激に適当であると、当業者、特に、医師により、決定される量である。
【００７６】
好ましくは、ＦＳＨ調製物の投与は、１回用量のＦＳＨ調製物の被験体の身体への移入を指す。特に、１回用量のＦＳＨ調製物が投与される。前記用量のＦＳＨ調製物は、好ましくは、１回用量として、例えば、１回の注射により与えられる。毎日の投与は、少なくとも１２時間、好ましくは、少なくとも１８時間、特に、約２４時間が、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にあることを特に意味する。特に、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間に暦上の全日が存在しない。２日毎の投与は、少なくとも３０時間、好ましくは、少なくとも３６時間が、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にあることを特に意味する。特に、暦上の全日は、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にある。特に、２日毎に投与するとき、続く用量のＦＳＨは、前の用量の約４２〜約５４時間、好ましくは、約４４時間〜約５２時間、より好ましくは、約４６時間〜約５０時間後に与えられる。３日毎の投与は、少なくとも５４時間、好ましくは、少なくとも６０時間が、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にあることを特に意味する。特に、暦上の全２日が、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にある。特に、３日毎に投与するとき、続く用量のＦＳＨは、前の用量の約６６〜約７８時間、好ましくは、約６８時間〜約７６時間、より好ましくは、約７０時間〜約７４時間後に与えられる。４日毎の投与は、少なくとも７８時間、好ましくは、少なくとも８４時間が、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にあることを特に意味する。特に、暦上の全３日が、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にある。特に、４日毎に投与するとき、続く用量のＦＳＨは、前の用量の約９０〜約１０２時間、好ましくは、約９２時間〜約１００時間、より好ましくは、約９４時間〜約９８時間後に与えられる。５日毎の投与は、少なくとも１０２時間、好ましくは、少なくとも１０８時間が、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にあることを特に意味する。特に、暦上の全４日が、１回の投与の終わりと次の投与の始まりの間にある。特に、５日毎に投与するとき、続く用量のＦＳＨは、前の用量の約１１４〜約１２６時間、好ましくは、約１１６時間〜約１２４時間、より好ましくは、約１１８時間〜約１２２時間後に与えられる。
【００７７】
好ましくは、本発明によるＦＳＨ調製物は、少なくとも５日間、好ましくは、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、または少なくとも９日間の時間間隔で投与される。特に、ＦＳＨ調製物は、５〜２１日の間、好ましくは、６〜１８日の間の時間間隔で投与される。
【００７８】
ある特定の好ましい実施形態では、本発明によるＦＳＨ調製物は、約４〜９日間、好ましくは、５〜７日間の時間間隔でまず投与され（初期投与レジメン）、その後、処置される被験体は、処置に対する応答について調べられる。かかる調査は、卵巣の一方または両方における誘導される卵胞の数および／またはサイズの決定を特に含む。次に、さらなる処置を調査の結果に基づき調整して、例えば、卵胞成長刺激を継続し、または卵胞成長刺激を増大しさえし得る。例えば、ＦＳＨ処置は、意図される目的のため十分に大きい卵胞が検出されるなら、停止され得るか、あるいは１回もしくは複数、好ましくは、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ超の用量のＦＳＨが、続いて投与され得る。続く投与レジメンは、調査に先立つ投与レジメンと同一であり得るか、または異なり得る。さらなるＦＳＨ用量は、調査に先立ち投与されたＦＳＨ用量と同一であり得るか、または異なり得る。例えば、投与される用量は、調査に先立ち与えられた投薬量の約５０％〜約３００％、好ましくは、約７５％〜約２００％、より好ましくは、約１００％〜約１５０％の範囲の量のＦＳＨを含有し得る。好ましい実施形態では、ＦＳＨの投与レジメンおよび用量は、調査に先立ちおよび後で同一であるか、または投与レジメンは同一であり、ＦＳＨの用量は、調査後５０％増大される。一実施形態によると、ＦＳＨは、２０日より長い間、好ましくは、１８日より長くは投与されない。
【００７９】
好ましくは、ＦＳＨは、ＦＳＨ約１０〜約２０００ＩＵの範囲の１回用量を使用する投薬レジメンにおいて投与される。各投与のために使用される１回用量は、好ましくは、ＦＳＨ約２０〜約１５００ＩＵ、より好ましくは、ＦＳＨ約２５〜約１０００ＩＵ、ＦＳＨ約３０〜約７５０ＩＵ、ＦＳＨ約３７．５〜約５００ＩＵ、ＦＳＨ約５０〜約３００ＩＵ、またはＦＳＨ約６０〜約２００ＩＵ、最も好ましくは、ＦＳＨ約７５〜約１５０ＩＵを含む。好ましい実施形態では、投与レジメンまたは少なくとも初期投与レジメンの各用量は、同一量のＦＳＨを含有し、もしくは１回用量当たりのＦＳＨの量は、１０％以下、好ましくは、５％以下で変動する。
【００８０】
ＦＳＨについての国際単位（ＩＵ）は、ヒト尿ＦＳＨおよびＬＨについての第４の国際標準（Ｓｔｏｒｒｉｎｇ，  Ｐ．Ｌ．、およびＧａｉｎｅｓ  Ｄａｓ，  Ｒ．Ｅ．、（２００１年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１７１巻、１１９〜１２９頁）を指し、増強した卵巣重量増加方法（Ｓｔｅｅｌｍａｎ，  Ｓ．Ｌ．、およびＰｏｈｌｅｙ，  Ｆ．Ｍ．、（１９５３年）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、５３巻、６０４〜６１６頁）に従い決定される。
【００８１】
制御された卵巣過剰刺激の方法は、組換えＦＳＨ調製物の投与に先立ち、および任意選択で組換えＦＳＨ調製物の投与中でも、自然月経周期のダウンレギュレーションをさらに含んでもよい。自然月経周期のダウンレギュレーションは、共に、天然の黄体形成ホルモン（ＬＨ）および天然の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の血清レベルの低減を最終的にもたらす、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨアゴニスト）またはゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト（ＧｎＲＨアンタゴニスト）のいずれかでの女性被験体の処置により達成することができる。ＧｎＲＨアゴニストは、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体に強く結合し、活性化し、故に、下垂体の一定の刺激を引き起こす。結果として、当初は、ＦＳＨおよびＬＨ分泌の増大（いわゆる、「フレア効果（ｆｌａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔ）」）が存在する。しかしながら、約１０日後、重度の性腺機能低下効果（すなわち、ＦＳＨおよびＬＨの低減）が、受容体の内部移行による受容体ダウンレギュレーションを通じて達成される。適当なＧｎＲＨアゴニストは、例えば、トリプトレリン、ロイプロリド、ブセレリン、ナファレリン、ヒストレリン、ゴセレリン、およびデスロレリンである。ＧｎＲＨアゴニストは、例えば、月経周期の２０日目または２２日目に開始して与えられ得る。ＧｎＲＨアンタゴニストは、下垂体腺におけるＧｎＲＨ受容体に競合的に結合し、これにより、それらの活性化、故に、天然の黄体形成ホルモン（ＬＨ）および天然の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の下垂体からの放出を遮断する。適当なＧｎＲＨアンタゴニストは、例えば、セトロレリクス、ガニレリクス、アバレリックス、およびデガレリクスである。組換えＦＳＨ調製物の投与は、ＦＳＨおよびＬＨレベルのダウンレギュレーションが達成された後、通常、ダウンレギュレーション処置の開始から約８〜２５日後に好ましくは開始する。ＧｎＲＨアゴニストまたはＧｎＲＨアンタゴニストでの処置は、ＦＳＨ処置中継続されてもよい。それぞれの処置は、先行技術分野において周知であり、従って、詳細な記載の必要はない。
【００８２】
ある特定の実施形態では、ステップ（ａ）における組換えＦＳＨ調製物の投与は、ＬＨもしくはＣＧのような別のゴナドトロピン、または卵胞成長を誘導するか、もしくは増強する別の薬剤の同時的投与を含まない。
【００８３】
本明細書において使用される用語「同一の治療状況」は、同様の女性被験体が、参照の状況と類似して処置される状況を指す。特に、比較される状況において、女性被験体は、年齢、抗ミュラー管ホルモンの血清レベル、胞状卵胞カウント、ボディマスインデックスのような妊孕性処置に適切な状態、および以前の従来のＦＳＨ刺激サイクルのような以前の不妊処置に関して同様である。さらに、比較される状況において、他に指示される場合を除き、好ましくは、用量スケジュール、卵母細胞を得るため使用される方法、回収された卵母細胞の続く処置、女性被験体の前処置、他の薬剤での任意の併用処置などを含む、処置は同様である。この点での同様は、２５％またはそれ未満、好ましくは、１０％またはそれ未満、特に、５％またはそれ未満の数での偏差を特に指す。数で表すことができない特性の場合では、状況は、好ましくは同一である。一般に、当業者は、２つの治療状況が同一であるかどうかを決定することができる。
【００８４】
排卵の誘導
本発明による方法のステップ（ｂ）において、女性被験体において排卵が誘発される。特に、１２ｍｍと等しいかもしくはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞が存在するとき、および／または少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。ある特定の実施形態では、１２ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する、特に、１３ｍｍもしくは１４ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する、複数の卵胞、特に、少なくとも３つ、好ましくは、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。さらなる実施形態では、少なくとも１７ｍｍの直径を有する、特に、少なくとも１８ｍｍ、少なくとも１９ｍｍ、または少なくとも２０ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。具体的な実施形態では、１２ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する、特に、１３ｍｍもしくは１４ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する、複数の卵胞、特に、少なくとも３つ、好ましくは、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの卵胞が存在するとき、および少なくとも１７ｍｍの直径を有する、特に、少なくとも１８ｍｍ、少なくとも１９ｍｍ、または少なくとも２０ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。卵胞の数およびサイズは、婦人科超音波検査のような超音波解析の手段により決定され得る。
【００８５】
排卵を誘発することは、排卵インデューサーの女性被験体への投与により特に達成される。適当な排卵インデューサーは、絨毛性ゴナドトロピン、特に、組換えｈＣＧのようなヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、組換えＬＨのような黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ＧｎＲＨアゴニスト、またはそれらの誘導体である。排卵インデューサーは、ＦＳＨでの処置が停止された後、好ましくは投与される。
【００８６】
特に、排卵インデューサーは、最後のＦＳＨ投与の６〜７２時間、好ましくは、１２〜５４時間、とりわけ、１８〜３６時間後に投与され得る。ある特定の具体的な実施形態では、排卵インデューサーの投与は、組換えＦＳＨ調製物の投与の終了の少なくとも４８時間後、とりわけ、組換えＦＳＨ調製物の投与の終了の約６０時間〜約１２０時間、または約７２時間〜約９６時間後に始まる。好ましくは、ｈＣＧまたはその誘導体約１００〜５００μｇ、より好ましくは、２００〜３００μｇ、特に、約２５０μｇが投与される。この点で排卵を誘発することは、卵母細胞の第二減数分裂の誘導、第二分裂中期の段階の卵母細胞の発生の刺激、および／または排卵自体の誘導を特に含む。
【００８７】
排卵を誘発するステップは、１つまたは複数の卵胞の実際の排卵を含む必要はない。それは、例えば、卵母細胞の最終的な成熟化を含む、排卵プロセスの誘導を特に指す。ステップ（ｃ）における卵母細胞を得ることは、具体的な実施形態では、排卵プロセスの完了前に行われる。
【００８８】
卵母細胞の回収
制御された卵巣過剰刺激の方法のステップ（ｃ）において、複数の卵母細胞は女性被験体から得られる。本発明の第１の態様では、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５つの卵母細胞が得られるか、および／または女性被験体由来の少なくとも５つの卵母細胞が得られる。本発明の第２の態様では、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量での同様の処置と比較して、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５％多い卵母細胞が得られる。
【００８９】
特定の実施形態では、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５つの卵母細胞が得られる。とりわけ、女性被験体１人当たり平均で少なくとも６つ、好ましくは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個の卵母細胞が得られる。女性被験体１人当たりの卵母細胞の平均数は、女性被験体の群から得られる全ての卵母細胞の合計を女性被験体の数により割ることにより決定される。全ての女性被験体は、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物を使用して、同一の投薬レジメンで処置される。女性被験体の群は、少なくとも２０人の被験体、好ましくは、少なくとも４０人の被験体、または少なくとも１００人の被験体を包含する。さらなる実施形態では、少なくとも５つの卵母細胞が、組換えＦＳＨ調製物がステップ（ａ）において投与される女性被験体から得られる。とりわけ、少なくとも６つ、好ましくは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個の卵母細胞が、女性被験体から得られる。
【００９０】
さらなる実施形態では、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量での同様の処置と比較して、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５％多い、特に、少なくとも６％多い、少なくとも７％多い、少なくとも８％多い、少なくとも１０％多い、または少なくとも１５％多い卵母細胞が得られる。ＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物は、特に、Ｇｏｎａｌ−ｆである。ＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量は、ＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物の処方情報において示される投薬量であり得る。他の実施形態では、ＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量は、とりわけ、女性被験体において複数の卵母細胞、特に、少なくとも５つの卵母細胞の発生を刺激するために、女性被験体における制御された卵巣過剰刺激に適当であると、当業者、特に、医師により決定される量である。ある特定の実施形態では、同一の治療状況においてＣＨＯ細胞により産生される組換えＦＳＨ調製物について推奨される量での同様の処置と比較して、女性被験体１人当たり平均で少なくとも５％多い、特に、少なくとも６％多い、少なくとも７％多い、少なくとも８％多い、少なくとも１０％多い、もしくは少なくとも１５％多いの卵丘卵母細胞複合体、および／または平均で少なくとも５％多い、特に、少なくとも６％多い、少なくとも７％多い、少なくとも８％多い、少なくとも１０％多い、または少なくとも１５％多い第二分裂中期卵母細胞が得られる。
【００９１】
卵母細胞は、外科手術により、特に、超音波ガイド穿刺のような穿刺により、女性被験体から得られ得る。卵母細胞を得る適当な方法は、経膣的卵子回収である。特に、得られた卵母細胞は、少なくとも１０ｍｍ、好ましくは、少なくとも１２ｍｍの平均直径を有する。ある特定の実施形態では、卵母細胞は、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の形態で得られる。具体的な実施形態では、得られた卵母細胞の少なくとも一部は、第二分裂中期卵母細胞、すなわち、第二減数分裂の分裂中期で停止した卵母細胞である。特に、得られた少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの卵母細胞は、第二分裂中期卵母細胞である。
【００９２】
卵母細胞は、好ましくは、排卵を誘発した約２４時間〜約３８時間後、特に、約３２時間〜約３６時間後に得られる。ある特定の実施形態では、卵母細胞は、排卵がステップ（ｂ）において誘発される後だが、排卵プロセスの完了前、特に、卵胞の破裂前に、卵胞から得られる。
【００９３】
さらなる方法ステップ
制御された卵巣過剰刺激の方法は、ある特定の実施形態では、次のさらなる方法ステップ：
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた少なくとも１つの卵母細胞を受精させるステップ；および
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた少なくとも１つの受精した卵母細胞、またはそれに由来する少なくとも１つの胚を女性患者に移植するステップ
を含んでもよい。
【００９４】
少なくとも１つの卵母細胞の受精は、細胞質内精子注射（ＩＶＦ−ＩＣＳＩ）または精子との同時インキュベーション（ＩＶＦ）での体外受精により特に達成される。卵母細胞と精子の同時インキュベーションは、配偶子卵管内移植と呼ばれる卵管において同様に生じ得る。受精は、２つの前核（２ＰＮ）卵母細胞の存在を検出することにより、モニターされ得る。具体的な実施形態では、１、２、または３つの卵母細胞が受精する。他の実施形態では、ステップ（ｃ）において得られた少なくとも４つまたは少なくとも５つ、特に、全ての卵母細胞が受精する。
【００９５】
ステップ（ｅ）において、特に、１、２、もしくは３つの受精した卵母細胞またはそれに由来する胚が、女性患者に移植される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）において受精した卵母細胞の一部のみが移植される。卵母細胞が得られる女性被験体は、受精した卵母細胞またはそれに由来する胚が移植される女性患者と同一であるか、または異なってもよい。
【００９６】
ある特定の実施形態では、制御された卵巣過剰刺激の方法は、特に、ステップ（ｄ）の前に、ステップ（ｃ）において得られた少なくとも１つの卵母細胞を凍結するか、またはガラス化することをさらに含む。具体的な実施形態では、ステップ（ｃ）において得られた全ての卵母細胞が、凍結されるか、またはガラス化される。他の実施形態では、ステップ（ｃ）において得られた卵母細胞のサブセットのみ、特に、ステップ（ｄ）において受精していないもの、またはステップ（ｄ）において受精したもののみが、凍結されるか、またはガラス化される。得られた卵母細胞を凍結すること、またはガラス化することは、卵母細胞の安全な保存のため、および／または胚の着床の有効性を増大させるため、および／または妊娠率を増大させるため、使用することができる。あるいは、または加えて、方法は、特に、ステップ（ｅ）の前に、ステップ（ｄ）において得られた少なくとも１つの受精した卵母細胞またはそれに由来する少なくとも１つの胚を凍結すること、またはガラス化するステップをさらに含んでもよい。具体的な実施形態では、ステップ（ｄ）において得られた全ての受精した卵母細胞／胚は、凍結されるか、またはガラス化される。他の実施形態では、ステップ（ｄ）において得られた受精した卵母細胞／胚のサブセットのみ、特に、ステップ（ｅ）において女性患者に移植されていないもの、またはステップ（ｅ）において女性患者に移植したもののみが、凍結されるか、またはガラス化される。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）において得られる卵母細胞のサブセットのみが、ステップ（ｄ）において受精する、および／またはステップ（ｄ）において受精した卵母細胞のサブセットのみが、ステップ（ｅ）において女性患者に移植される。任意選択で、ステップ（ｄ）において受精していない卵母細胞、またはステップ（ｅ）において女性患者に移植されていない受精した卵母細胞もしくは胚が、続く使用のため凍結されるか、またはガラス化される。
【００９７】
具体的な実施形態では、制御された卵巣過剰刺激の方法は、ステップ（ｅ）に加えて、少なくとも１つの受精した卵母細胞またはそれに由来する少なくとも１つの胚を女性患者に移植する、１つまたは複数のさらなるステップを含む。受精した卵母細胞は、ステップ（ｄ）、またはステップ（ｃ）において得られた少なくとも１つの卵母細胞を受精させる１つもしくは複数のさらなるステップで得られ得る。異なる移植ステップの女性患者は、同一または異なる患者であってもよい。女性患者が同一である実施形態では、続く移植ステップは、以前の処置サイクルの完了後、特に、成功した妊娠、流産、または以前の移植の失敗後にかぎり行われる。特に、これらの受精および移植ステップのため使用される卵母細胞は全て、ステップ（ｃ）において得られ、方法は、制御された卵巣過剰刺激の２回目のサイクルを含まない。故に、ある特定の実施形態では、方法は、１回のサイクルのみの制御された卵巣過剰刺激を含む。
【００９８】
ある特定の実施形態では、制御された卵巣過剰刺激の方法は、得られた卵母細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟化を含まない。特に、得られた卵母細胞は、卵母細胞成熟化をさらに刺激するために、女性被験体の身体外のホルモンのような薬剤で処置されない。
【００９９】
さらなる実施形態では、制御された卵巣過剰刺激の方法は、ＬＨもしくはｈＣＧのような別のゴナドトロピン、あるいはステップ（ａ）における組換えＦＳＨ調製物の投与の前もしくはそれと同時に卵胞成長を誘導するか、または増強する別の薬剤の投与を含まない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物は、いかなるアジュバント刺激もなく、特に、クエン酸クロミフェンを用いない使用のためである。一実施形態によると、卵胞成長を刺激するために、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物と併用して経口排卵誘導剤は使用しない。一実施形態によると、組換えＦＳＨ調製物は、卵胞成長の刺激のための単剤療法において使用される。特に、卵胞成長をサポートするために、組換えＦＳＨ投与中に排卵誘導剤は与えない。しかしながら、最後のＦＳＨ投与後、ｈＣＧのような、最終の卵胞成熟化を誘導し、および／または排卵を誘発する薬剤が、特に、方法のステップ（ｂ）において、被験体に与えられてもよい。
【０１００】
女性被験体
ある特定の実施形態では、女性被験体は、生殖もしくは妊孕性に関連する機能不全または疾患に罹患している患者である。本発明による用語「被験体」または「患者」は、ヒト、非ヒト霊長類、または別の動物、特に、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコのような哺乳動物、もしくはマウスおよびラットのようなげっ歯類を指す。特に好ましい実施形態では、被験体または患者はヒトである。ヒト被験体または患者の場合では、ＦＳＨは、好ましくは、ヒトＦＳＨである。具体的な実施形態では、女性被験体または女性患者は、補助生殖技術（ＡＲＴ）を経験する。特に、関連する生殖技術は、細胞質内精子注射、卵母細胞と精子の同時インキュベーション、および配偶子卵管内移植のような体外受精；ならびに／または接合子卵管内移植のような胚移植を含む。ある特定の実施形態では、制御された卵巣過剰刺激の方法に供される女性被験体は、受精した卵母細胞または胚が移植される女性患者と異なる。これらの実施形態は、卵子ドナープログラムにおいて特に使用される。他の実施形態では、女性被験体および女性患者は、同一である。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、女性被験体は、卵胞成長の刺激に対して低い応答性を有するか、または卵巣刺激に対して乏しい卵巣応答を示す。具体的には、女性被験体は、
−  少なくとも３５歳、特に、少なくとも３７歳、または少なくとも４０歳、好ましくは、約３８歳〜約５０歳の範囲の年齢を有する女性被験体；
−  １．５ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、特に、１．４ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、１．３ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、１．２ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、または１．１ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満、好ましくは、約０．２５ｎｇ／ｍｌ〜約１．２５ｎｇ／ｍｌの範囲の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の血清レベルを有する女性被験体；
−  両方の卵巣の合計として９もしくはそれ未満、特に、８もしくはそれ未満、７もしくはそれ未満、または６もしくはそれ未満、好ましくは、４〜７の範囲の胞状卵胞カウントを有する女性被験体；
−  少なくとも２５ｋｇ／ｍ２、特に、少なくとも２６ｋｇ／ｍ２、少なくとも２７ｋｇ／ｍ２、少なくとも２８ｋｇ／ｍ２、少なくとも２９ｋｇ／ｍ２、または少なくとも３０ｋｇ／ｍ２、好ましくは、約２８ｋｇ／ｍ２〜約４５ｋｇ／ｍ２の範囲のボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する女性被験体；
−  ６つ未満、特に、５つ未満、４つ未満、または３つ未満の卵母細胞の発生が誘導された、以前の従来のＦＳＨ刺激サイクルを経験している女性被験体；および
−  Ｆｅｒｒａｒｅｔｔｉら、（２０１１年）、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、２６巻（７号）、１６１６〜１６２４頁において定義される２０１１年ＥＳＨＲボローニャ判断基準に従い、乏しい卵巣応答を有する女性被験体
からなる群より選択され得る。
【０１０２】
具体的な実施形態では、卵胞成長の刺激に対して低い応答性を有するか、または卵巣刺激に対する乏しい卵巣応答を示す女性被験体は、これらの判断基準の２つまたはそれ超、特に、３つまたはそれ超を満たす。
【０１０３】
卵胞成熟化を刺激する方法
第３の態様では、本発明は、女性被験体において卵胞成熟化を刺激する方法であって、
（ａ）組換えＦＳＨ調製物を投与することにより、女性被験体において卵胞成長を誘導するまたは増強するステップ；および
（ｂ）続いて排卵を誘発するステップ
を含み；
調製物中の組換えＦＳＨは、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも２０％のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；および
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の少なくとも４０％の２，６−結合シアル酸の相対量
を含むグリコシル化パターンを有し；
ステップ（ｂ）において排卵を誘発することが、ステップ（ａ）における組換えＦＳＨ調製物の投与の終了の少なくとも４８時間後に始まる、方法に関する。
【０１０４】
特定の実施形態では、１２ｍｍと等しいかもしくはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞が存在するとき、および／または少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。ある特定の実施形態では、１２ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する、特に、１３ｍｍもしくは１４ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する複数の卵胞、特に、少なくとも３つ、好ましくは、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。さらなる実施形態では、少なくとも１７ｍｍの直径を有する、特に、少なくとも１８ｍｍ、少なくとも１９ｍｍ、または少なくとも２０ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。具体的な実施形態では、１２ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する、特に、１３ｍｍもしくは１４ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する少なくとも３つ、好ましくは、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの卵胞が存在するとき、および少なくとも１７ｍｍの直径を有する、特に、少なくとも１８ｍｍ、少なくとも１９ｍｍ、または少なくとも２０ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発される。卵胞の数およびサイズは、婦人科超音波検査のような超音波解析の手段により決定され得る。ある特定の実施形態では、排卵を誘発するために決定的である卵胞の数およびサイズは、組換えＦＳＨ調製物の最後の投与前、その投与中、またはその投与から最大で２４時間後に決定される。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において排卵を誘発することは、ステップ（ａ）における組換えＦＳＨ調製物の投与の終了の少なくとも５４時間、特に、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間後に始まる。例えば、ステップ（ｂ）において排卵を誘発することは、ステップ（ａ）における組換えＦＳＨ調製物の投与の終了の約６０時間〜約１２０時間、好ましくは、約７２時間〜約９６時間後に始まる。
【０１０６】
排卵を誘発することは、女性被験体への排卵インデューサーの投与により、特に達成される。適当な排卵インデューサーは、絨毛性ゴナドトロピン、特に、組換えｈＣＧのようなヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、組換えＬＨのような黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ＧｎＲＨアゴニスト、またはそれらの誘導体である。排卵インデューサーは、好ましくは、ｈＧＣ、またはその誘導体である。好ましくは、ｈＣＧまたはその誘導体約１００〜５００μｇ、より好ましくは、２００〜３００μｇ、特に、約２５０μｇが投与される。この点で排卵を誘発することは、卵母細胞の第二減数分裂の誘導、第二分裂中期の段階の卵母細胞の発生の刺激、および／または排卵自体の誘導を特に含む。
【０１０７】
制御された卵巣過剰刺激の方法に関して本明細書に記載される全ての実施形態および特性はまた、卵胞成熟化を刺激する方法に同様に適用し得る。さらに、制御された卵巣過剰刺激の方法は、卵胞成熟化を刺激する方法と併用されてもよい。
【０１０８】
具体的な実施形態
女性被験体において複数の卵巣の卵胞の発生を刺激するための制御された卵巣過剰刺激の方法のある特定の実施形態では、ステップ（ａ）において、１回用量を合計すると、１日当たりＦＳＨ約５０〜約１２５ＩＵの平均量となる投薬レジメンが使用され、ステップ（ｂ）において、少なくとも１７ｍｍの直径を有する少なくとも１つの卵胞が存在するとき、排卵が誘発され、ステップ（ｃ）において、少なくとも５つの卵母細胞が、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の形態で女性被験体から得られ、これらの卵母細胞のうち少なくとも４つが第二分裂中期卵母細胞であり、調製物中の組換えＦＳＨが、次の特徴：
（ｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの約２５％〜約５０％の範囲のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を保有するグリカンの相対量；
（ｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのシアル酸残基の約５３％〜約８０％の範囲の２，６−結合シアル酸の相対量；
（ｉｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも５％の硫酸化グリカンの相対量；
（ｉｖ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの５％またはそれ未満のアウターアームフコースを保有するグリカンの相対量；
（ｖ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも３０％のコアフコースを保有するグリカンの相対量；
（ｖｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも１６％の少なくともテトラアンテナ型グリカンの相対量；
（ｖｉｉ）調製物中のＦＳＨに付着した全てのグリカンの少なくとも８８％の１つまたは複数のシアル酸残基を保有するグリカンの相対量；および
（ｖｉｉｉ）少なくとも２１０のＺ数
を含むグリコシル化パターンを有する。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組換えＦＳＨ調製物は、Ｇｏｎａｌ  ｆ（登録商標）としてＩＵの用量の半分で投与されるとき、Ｇｏｎａｌ  ｆ（登録商標）と同一の治療状況において少なくとも同一の治療効果を達成する。治療効果は、女性被験体において誘導された、１２ｍｍと等しいかまたはそれ超の平均直径を有する卵母細胞の数、女性被験体から回収した、卵母細胞、ＣＯＣおよび／または第二分裂中期卵母細胞の数、ならびに首尾よく受精した胚の数のうちの１つまたは複数を特に含む。治療効果は、好ましくは、少なくとも２０人の女性被験体、より好ましくは、少なくとも４０人の女性被験体、または少なくとも１００人の女性被験体を含む、女性被験体の群における平均として好ましくは決定される。群は、科学的標準に従い特に比較可能である。
【０１１０】
本明細書で使用される、表現「含む」はまた、その従来の意味に関わらず、表現「本質的にからなる」および「からなる」も含み、具体的に指す。従って、一実施形態によると、表現「含む」は、具体的に挙げられたエレメントを「含む」主題が、さらなるエレメントを含まない実施形態、ならびに具体的に挙げられたエレメントを「含む」主題がさらなるエレメントを包含し得るか、および／または実際に包含する実施形態を指す。一実施形態によると、方法の場合ではある特定のステップを含むとして、または組成物、溶液、および／もしくは緩衝液の場合ではある特定の成分を含むとして、本明細書に記載される主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。
【０１１１】
本明細書で与えられる数、特に、具体的なグリコシル化特性の相対量は、好ましくは、概数として理解されるべきである。特に、数は、好ましくは、最大１０％超および／または未満、特に、最大９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％超および／または未満であり得る。一実施形態によると、本明細書で与えられる数は、より大きくも小さくもない正確な数として理解されるべきである。
【０１１２】
本発明は、本明細書に開示される典型的な方法および材料により制限されない。数字範囲は、範囲を定義する数を含む。本明細書において提供される見出しは、全体として明細書を参照することによって読まれ得る本発明の種々の態様または実施形態の制限ではない。本明細書に記載される好ましい実施形態を選択し、合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組合せから生じる具体的な主題も本開示に属する。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：ＦＳＨ（本発明）の調製
ヒトＦＳＨのアルファおよびベータ鎖（アルファ鎖受託番号ＮＴ＿００７２９９．１３；ベータ鎖受託番号ＮＴ＿００９２３７．１８）を有する２つの発現構築物で安定的にトランスフェクトしたＧＴ−５ｓ細胞の培養により、ＦＳＨを産生する。ＦＳＨアルファ鎖の発現用プラスミドは、天然形態よりも高い、酵素阻害剤メトトレキサートに対する耐性を有するマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）の変異バージョンの遺伝子を保有し、ＦＳＨアルファ鎖を発現させるための第２のプラスミドは、ピューロマイシン耐性遺伝子を保有している。
【０１１４】
上記した２つの発現プラスミドを使用したヌクレオフェクションにより、ＦＳＨ（本発明）発現のための細胞株のトランスフェクションを行った。安定な抗体産生細胞クローンの選択および増幅のため、ピューロマイシンおよびメトトレキサートを増大する濃度で加えた。Ｃｌｏｎｅ  ＰｉｘＦＬ技術による単一細胞クローニング、または限界希釈による単一細胞クローニングのための半固形マトリックスにおいて、増幅させた細胞プールを播種した。インタクトなＦＳＨ分子の高い分泌について、クローンをスクリーニングした。
【０１１５】
無血清条件下で、バッチ、流加、または灌流プロセスにおける最終ＦＳＨ産生ＧＴ−５ｓクローンの発酵により、ＦＳＨを産生する。２〜３週間、発酵を通常行う。
【０１１６】
発酵後、０．２μｍフィルターを使用した無菌濾過ステップの前に、２μｍフィルターを通して上清を濾過して、細胞および細胞残屑を取り除く。精製プロセスは、捕獲ステップ、続いて濃縮ステップとして逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、その後サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を利用する。任意選択で、次に、溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）に適用して、より酸性の低いＦＳＨ含有物を取り除く。結合したＦＳＨを洗浄緩衝液でｐＨ５．０（「ｐＨ５．０での富化」）またはｐＨ４．５（「ｐＨ４．５での富化」）にて洗浄することにより、これを行い、より酸性の低いＦＳＨアイソフォームを溶出し、その後、所望のＦＳＨ分画を溶出する。ポリッシュするステップとして、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して、高い純度のＦＳＨを得る。
【０１１７】
実施例２：ＦＳＨ（本発明）でのフェーズＩＩ臨床研究
ＦＳＨ（本発明）および比較薬剤（Ｇｏｎａｌ−Ｆ）でのフェーズＩＩ臨床研究を行い、種々の投薬量のＦＳＨ調製物の治療有効性および安全性を調べた。
【０１１８】
細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）処置の適応症を有する無作為化女性ヒト患者２４０人を研究に登録した。それぞれが患者４０人を含む６種の異なる処置アームにおいて、ＦＳＨ（本発明）１日当たり５２．５ＩＵ、７５ＩＵ、１１２．５ＩＵ、もしくは１５０ＩＵ、２日毎にＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵ、または１日当たりＧｏｎａｌ−ｆ  １５０ＩＵで患者を処置した。
【０１１９】
各患者についての処置サイクルは、ＧｎＲＨアゴニストプロトコールを使用した内在性ホルモンレベルのダウンレギュレーション、ＦＳＨの投与による卵胞成長の刺激、卵母細胞の回収、ＩＣＳＩ、および胚移植を含んでいた。少なくとも１つの卵胞が直径少なくとも２０ｍｍに達するまで、最大１８日間、ＦＳＨでの刺激を行った。ＦＳＨ処置の平均持続期間は、約９〜１０日間であった。次に、最後のＦＳＨ用量の約１日後、１回用量のｈＣＧの投与により、卵母細胞の最終的な成熟化を誘導した。ｈＣＧ投与の３２〜３６時間後、少なくとも１２ｍｍのサイズを有する全ての卵胞を穿刺した。卵母細胞回収の２〜３日後、ＩＣＳＩにより、選択した卵母細胞を受精させ、患者１人当たり最大２つの胚を移植した。
【０１２０】
結果として、ＦＳＨ（本発明）での卵胞成長の刺激は、Ｇｏｎａｌ−ｆの用量の半分または４分の３にて、Ｇｏｎａｌ−ｆよりも多数の卵胞および回収した卵母細胞を導いた。
【表２】
2017513853.tif 000003
【０１２１】
結果は、ＦＳＨ（本発明）が、Ｇｏｎａｌ−ｆとの比較において、より少ない用量（Ｇｏｎａｌ−ｆの用量のほんの５０％まで低下した）においてでさえ、有意に増大した数の大きな卵胞の発生を誘導することを示す。同様に、回収した卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の数、第二分裂中期卵母細胞の数、および首尾よく受精した卵母細胞の数も、２倍の用量までのＧｏｎａｌ−ｆと比較したとき、本発明によるＦＳＨについて有意に大きい。これは、ＦＳＨ（本発明）の優れた活性を印象的に示す。
【０１２２】
さらに、ＦＳＨ（本発明）について、同定した発生した卵胞に基づく成功した受精の相対数も増大する。例えば、２日毎にＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵで処置した患者において、処置した患者において同定した少なくとも１２ｍｍの直径を有する全ての卵胞の５９％を首尾よく受精させ、２コア卵母細胞（２ＰＮ）を形成した。対照的に、Ｇｏｎａｌ−ｆで処置した患者において同定した１２ｍｍ以上の卵胞のうち、ほんの５０％が、首尾よく受精した。故に、ＦＳＨ（本発明）により誘導された卵胞は、Ｇｏｎａｌ−ｆにより誘導されたものより高い質を示した。
【０１２３】
実施例３：ＦＳＨ（本発明）でのフェーズＩ臨床研究
ＦＳＨ（本発明）および比較薬剤（Ｇｏｎａｌ−ＦおよびＢｒａｖｅｌｌｅ）でのフェーズＩ臨床研究を行い、ＦＳＨ調製物の治療有効性を決定した。
【０１２４】
女性ボランティアにＦＳＨを投与し、薬物動態学的および薬力学的パラメーターを決定した。第１の研究において、健常女性ボランティアは、１回の皮下用量でＦＳＨ（本発明）２５ＩＵ、７５ＩＵ、１５０ＩＵ、または３００ＩＵを与えられ、投与の４日後から毎日測定することにより、用量前サイズに対する平均卵胞サイズを決定した。対照として、ボランティアは、プラセボ、またはＢｒａｖｅｌｌｅもしくはＧｏｎａｌ−Ｆ  １００ＩＵを与えられた。図１、２、および３に示す通り、平均卵胞サイズは、１回用量のＦＳＨ（本発明）の後に有意に増大した。卵胞サイズの増大は、用量依存性であった。卵胞サイズの増大は、プラセボ、または参照ＦＳＨ調製物（ＢｒａｖｅｌｌｅおよびＧｏｎａｌ−Ｆ）と比較したとき、有意に大きかった。故に、ＦＳＨ（本発明）が、通常使用されるＦＳＨ調製物より、卵胞の成長を誘導する、はるかに高い効力を有し、１回用量の後でさえ有意な卵胞の成長を誘導する能力があることが示された。
【０１２５】
さらに、複数回用量臨床研究を行った。１５０ＩＵの毎日の用量で７日間、ＦＳＨ（本発明）、Ｇｏｎａｌ−Ｆ、およびＢｒａｖｅｌｌｅを投与した。さらなるコホートにおいて、７５ＩＵの毎日の用量で７日間、ＦＳＨ（本発明）を与えた。別のコホートにおいて、用量１５０ＩＵで２日毎にＦＳＨ（本発明）を投与した。月経周期のダウンレギュレーション後に、ＦＳＨを投与し、これが、卵胞成長の刺激をもたらした。ＦＳＨ、インヒビン−ｂ、およびエストラジオールの血清レベルをモニターし、卵胞の数およびサイズを決定した。図４に示す通り、ＦＳＨの血清レベルは、等しい用量にて投与された異なるＦＳＨ調製物に匹敵した。半分の用量にて、または２日毎に与えられたＦＳＨ（本発明）は、２日毎での投与で、ＦＳＨ血清レベルの半減をもたらし、これは、予測したゆらぎを示している（図４を参照のこと）。しかしながら、図５〜７に示す通り、ＦＳＨ（本発明）の投与は、Ｇｏｎａｌ−ＦおよびＢｒａｖｅｌｌｅと比較して、顕著に増大した数およびサイズの誘導された卵胞をもたらす。半分の用量で投与したＦＳＨ（本発明）は、Ｇｏｎａｌ−Ｆのものに匹敵する卵胞の成長をもたらす（図８を参照のこと）。さらに、２日毎のＦＳＨ（本発明）の投与は、同一用量で、だが２日毎の代わりに毎日投与したＧｏｎａｌ−Ｆと比較したとき、匹敵する数だが、顕著に増大したサイズの誘導された卵胞をもたらす（図９を参照のこと）。同一の量の投与したＦＳＨをもたらす、２日毎のＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵの投与と毎日のＦＳＨ（本発明）７５ＩＵの投与を比較するとき、卵胞サイズの同様の増大も見ることができる。故に、同一の量のＦＳＨ（本発明）は、毎日よりむしろ２日毎に与えられたとき、はるかに増大した卵胞のサイズをもたらすことができる。この相違はまた、患者血清におけるインヒビン−ｂおよびエストラジオールレベルにおいても観察され、２日毎に１５０ＩＵで与えられたＦＳＨ（本発明）は、毎日７５ＩＵで投与されたＦＳＨ（本発明）、または毎日１５０ＩＵで投与されたＧｏｎａｌ−Ｆと比較して、有意に増大したレベルを示す（図１０を参照のこと）。
【０１２６】
加えて、患者において数日間、ＦＨＳ（本発明）で誘導された多数の卵胞を観察する。特に、平均で約５日間ＦＳＨ（本発明）で処置した患者において、少なくとも１０ｍｍのサイズを有する卵胞の数を維持する（図１１を参照のこと）。例えば、大きな卵胞の数は、８／９〜１４／１５日を通じて、すなわち、ＦＳＨ投与の終了後、本質的に一定である。対照的に、Ｇｏｎａｌ−ｆは、９日および１０日にて大きな卵母細胞の数のピークを示し、その後、急激に低下する。故に、ＦＳＨ（本発明）は、長引く効果を示し、これにより、ＦＳＨ適用の終了後数日間、卵胞の発生状態を維持する。この効果は、最終的な卵母細胞成熟化の成功した誘導のためのウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を拡大するので、不妊処置に重要である。共通する処置において、ＦＳＨ投与の終了の約１日後ｈＣＧまたは他の排卵インデューサーを患者に投与しなければいけない。さもないと、誘導された大きな卵胞は後退し、卵母細胞の最終的な成熟化は、もはや可能ではない。ＦＳＨ（本発明）で、卵母細胞は、ＦＳＨ投与の終了後、達成されたサイズおよび成熟化状態で有意により長く、すなわち、約５〜６日間とどまる。故に、例えば、ｈＣＧを使用した最終的な卵母細胞成熟化の刺激および排卵の誘導は、Ｇｏｎａｌ−ｆの使用と比較して、卵胞成長の刺激のためＦＳＨ（本発明）を使用するとき、はるかに長い時間間隔の間可能である。
【０１２７】
さらに、上述の複数の投薬レジメンの後、ＦＳＨの薬物動態を分析した。このため、複数回用量の投与後、ＦＳＨの血清レベルをモニターした。図１２は、毎日投与したＦＳＨ（本発明）７５ＩＵまたは１５０ＩＵ、および２日毎に投与したＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵ、毎日均等スケール（ｌｉｎｅａｒ  ｓｃａｌｅ）で投与したＢｒａｖｅｌｌｅ  １５０ＩＵおよびＱＤ  Ｇｏｎａｌ−ｆ  １５０ＩＵの複数回の皮下注射の最後の注射後の血漿ＦＳＨについての平均濃度対時間曲線を示す。プロットは、複数回の注射の最後の皮下注射後に、血漿ＦＳＨ濃度の増大を示す。ピーク血漿ＦＳＨ濃度（Ｃｍａｘ）後、血漿ＦＳＨ濃度は、ベースラインレベルまで低減した。血漿ＦＳＨのＣｍａｘは、ＦＳＨ（本発明）の用量レベルの増大に伴い、増大した。毎日１回の代わりに２日毎に１回ＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵを投与したとき、Ｃｍａｘは低減した。毎日投与したＦＳＨ（本発明）１５０ＩＵと比較剤ＢｒａｖｅｌｌｅおよびＧｏｎａｌ−ｆの同一用量レベルの濃度対時間プロットを比較するとき（図１２）、曲線は非常に類似することがわかり得る。１５０ＩＵのＦＳＨ（本発明）（１２．９８９ｍＩＵ／ｍＬ）、Ｂｒａｖｅｌｌｅ（１３．３７０ｍＩＵ／ｍＬ）、およびＧｏｎａｌ−ｆ（１２．２８１ｍＩＵ／ｍＬ）後のＣｍａｘは比較可能であった。ＢｒａｖｅｌｌｅのＡＵＣ０−ｌａｓｔ（１１７２．０６６ｈ＊ｍＩＵ／ｍＬ）は、ＦＳＨ（本発明）のＡＵＣ０−ｌａｓｔ（８２４．８９７ｈ＊ｍＩＵ／ｍＬ）およびＧｏｎａｌ−ｆのＡＵＣ０−ｌａｓｔ（９１７．４００ｈ＊ｍＩＵ／ｍＬ）より高かった。また、異なるＦＳＨ調製物の循環半減期ｔ１／２は比較可能であり、Ｂｒａｖｅｌｌｅのものがわずかに長かった（ＦＳＨ（本発明）：約３３時間；Ｇｏｎａｌ−ｆ：約３６時間；Ｂｒａｖｅｌｌｅ：約５４時間）。Ｂｒａｖｅｌｌｅが有意により低い医薬有効性を示したので、これは注目すべきである（上記を参照のこと）。
【０１２８】
結論において、フェーズＩ臨床研究において、ＦＳＨ（本発明）が、同一の量のＧｏｎａｌ−ＦおよびＢｒａｖｅｌｌｅと比較して、卵胞の成長の点ではるかに高い治療有効性を有することが示された。さらに、ＦＳＨ（本発明）を２日毎に投与する投薬レジメンは、毎日の投与と比較して、卵胞のサイズの顕著な増大をもたらす。
【０１２９】
実施例４：顆粒膜細胞アッセイ
顆粒膜細胞アッセイを行うために、卵母細胞の採取中にＩＶＦ患者の卵胞液から、初代細胞を単離する。例えば赤血球細胞として他の細胞タイプを取り除くＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離後、２４〜９６ウェルプレートフォーマットにおいて、５〜７日間、アンドロステンジオンまたはテストステロンを含有する培養培地において、顆粒膜細胞を播種する。その期間後、ダイアグラムに示すステップにおいて１ｐｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの間の範囲のＦＳＨで細胞（１ウェル当たり２〜４＊１０４細胞）を刺激する（１ウェル当たり培地４００μｌ）。３〜４時間インキュベーション後、ｃＡＭＰアッセイを行うため、上清の半分を採取する。さらに２４時間後、残りの上清における凍結融解により、細胞を溶解する。プロゲステロンおよびエストラジオールアッセイにおいて、溶解物を適用する。
【０１３０】
ＦＳＨ（本発明）とＧｏｎａｌ  Ｆの比較
実験の第１のセットにおいて、ＦＳＨ（本発明）をＧｏｎａｌ  Ｆ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ  ＳＡ）と比較する。Ｇｏｎａｌ  Ｆは、ＣＨＯ細胞において組換え的に産生されるＦＳＨである。図１３〜１５に、結果を示す。匹敵する量のＧｏｎａｌ  ＦおよびＦＳＨ（本発明）産物の匹敵するＦＳＨ濃度で第２のメッセンジャーｃＡＭＰを産生する一方、ＣＨＯ細胞において組換え的に産生したＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ  Ｆ）と比較してＦＳＨ（本発明）産物の場合では、はるかに低いＦＳＨ濃度にてステロイドプロゲステロンおよびエストラジオールを放出する。
【０１３１】
ＦＳＨ（本発明）とＦｏｓｔｉｍｏｎの比較
別のセットの実験において、ヒト尿から単離したＦＳＨ産物であるＦｏｓｔｉｍｏｎ（ＩＢＳＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｑｕｅ  ＳＡ）に対して、ＦＳＨ（本発明）を比較した。図１６〜１８に結果を示す。両方の産物について、比較可能な用量範囲のＦＳＨにて、ｃＡＭＰレベルが同様に上昇する一方、Ｆｏｓｔｉｍｏｎと比較して有意により低い濃度のＦＳＨ（本発明）にて、性ステロイドを産生する。
【０１３２】
注意：異なるドナーを使用して、アッセイを行うので、刺激プロファイルの相違は、各アッセイにおいて使用するドナーに左右され得る。
【０１３３】
実施例５：Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイ
Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイにより、ＦＳＨの活性も決定した。薬局方に従い、アッセイを行った。特に、未熟メスラットにおける卵巣重量増加を、それぞれ３日間にわたり毎日与えられた３つの異なるＦＳＨ濃度の投与後に、測定した。並行線評価（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｌｉｎｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を使用して、効力を計算する。Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイを使用して、本発明によるＦＳＨ調製物の標準的国際単位（ＩＵ）を決定した。
【０１３４】
Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイにより示した通り、ＦＳＨ（本発明）のｉｎ  ｖｉｖｏ活性、ならびに尿および組換え標準ＦＳＨのｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、ラットにおいて同様である（図１９を参照のこと）。
【０１３５】
実施例６：糖プロファイリング（ｇｌｙｃｏｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）
グリコシル化の構造解析により、異なるＦＳＨ調製物の糖プロファイルを決定した。糖プロファイリングは、グリコシル化部位の複合体グリカン構造について情報を生じる。糖プロファイリングのため、タンパク質コアから、インタクトなＮ−グリカンを放出させ、Ｎ−グリカンの還元末端を蛍光マーカーで標識した。標識したＮ−グリカンの精製した試料をＵＰＬＣにより分離した。Ｎ−グリカン構造の相対的モル存在量の計算のため、蛍光定量的検出に基づくピーク面積を用いた。ＦＳＨについての推定データを表３において要約する。値は、興味深いタイプの単糖（例えば、フコース）を含有するＮ−グリカンの相対的モル含有量を表す。
【表３】
2017513853.tif 000004
【０１３６】
示した単位を保有するＦＳＨ上のＮ−グリカンの相対量を示す。Ｐｕｒｅｇｏｎは、ＣＨＯ細胞において産生される別の組換えヒトＦＳＨである。
【０１３７】
さらに、シアリダーゼＡ（２，３−結合シアル酸および２，６−結合シアル酸を切断する）、およびシアリダーゼＳ（２，３−結合シアル酸のみを切断する）により放出したシアル酸の量を比較することにより、ＦＳＨのグリカンにおける２，３−結合シアル酸と２，６−結合シアル酸との比を分析した。
【表４】
2017513853.tif 000005
【０１３８】
ＦＳＨ（本発明）において、２，３−結合シアル酸よりさらに多くの２，６−結合シアル酸を含む、比約１：１にて２，３−ならびに２，６−結合によりグリカンにシアル酸残基を結合し、一方尿のＦＳＨであるＢｒａｖｅｌｌｅ（Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）において、比は、２，３−連結シアル酸の方を好んで約３：１である。ＣＨＯ細胞におけるそれらの組換え産生に起因して、Ｐｕｒｅｇｏｎ（Ｏｒｇａｎｏｎ／ＥｓｓｅｘＰｈａｒｍａ）およびＧｏｎａｌ  Ｆ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）は、いかなるバイセクティングＮ−アセチルガラクトサミンも有さず、２，３−結合シアル酸しか含まない。
【０１３９】
上の測定値から、およびＦＳＨからの放出後のグリカンの電荷分布の決定により、アンテナ性、末端ガラクトース単位、およびＺ数を計算した。
【表５】
2017513853.tif 000006
【０１４０】
ＦＳＨ上のバイ−、トリ−、およびテトラアンテナ型Ｎ−グリカンの相対量を示す。
【表６】
2017513853.tif 000007
【０１４１】
ＦＳＨ調製物のＺ数、すなわち、相対的酸性度を示す。Ｚ数が大きいほど、より酸性のＦＳＨ調製物を示す。
【０１４２】
結論として、本発明によるＦＳＨ（ＦＳＨ（本発明））は、高い程度のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン、高いアンテナ性、高い程度のシアル酸付加、および高い硫酸化の程度を有する。これらの３種のグリコシル化パラメーターのうち１つまたは複数のため、ＦＳＨ（本発明）は、通常の組換えまたは尿のＦＳＨ調製物と比較して、優れた活性を有すると考えられる。
【０１４３】
さらに、ＦＳＨ（本発明）は、２，３−シアル酸付加と２，６−シアル酸付加との比約１：１、またはより多くの量の２，６−シアル酸付加を有する。
【０１４４】
さらに、放出されたグリカンの質量分析により、ＦＳＨ調製物のグリカン構造も分析した。以下の結果を得た。
【表７】
2017513853.tif 000008
【表８】
2017513853.tif 000009
【表９】
2017513853.tif 000010
【０１４５】
スルフェート基を保有するＦＳＨ上のＮ−グリカンの相対量を示す。
【図１】
2017513853.tif 000011
【図２】
2017513853.tif 000012
【図３】
2017513853.tif 000013
【図４】
2017513853.tif 000014
【図５】
2017513853.tif 000015
【図６】
2017513853.tif 000016
【図７】
2017513853.tif 000017
【図８】
2017513853.tif 000018
【図９】
2017513853.tif 000019
【図１０】
2017513853.tif 000020
【図１１】
2017513853.tif 000021
【図１２】
2017513853.tif 000022
【図１３】
2017513853.tif 000023
【図１４】
2017513853.tif 000024
【図１５】
2017513853.tif 000025
【図１６】
2017513853.tif 000026
【図１７】
2017513853.tif 000027
【図１８】
2017513853.tif 000028
【図１９】
2017513853.tif 000029
【図２０】
2017513853.tif 000030
【配列表】
2017513853000001.app
【国際調査報告】
2017513853.tif 000031
2017513853.tif 000032