(57)【要約】  本発明は、不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）を含有する、単離されたミクロソームを調製するための方法に関する。単離されたミクロソームは、そのシトクロムＰ４５０が不可逆的な阻害剤によって不可逆的に阻害されていることを特徴とする。本発明はまた、薬物候補の酵素反応の表現型を決定するための方法における、本発明に記載の単離されたミクロソームの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）シトクロムＰ４５０の不可逆的な阻害；
ｂ）ミクロソームタンパク質の濃縮
を含むことを特徴とする、不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）を含む単離されたミクロソームを調製する方法。
【請求項２】
１回以上の洗浄工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
洗浄工程又は工程群が、ミクロソームタンパク質の濃縮前及び／又は濃縮後に置かれることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ミクロソームの濃縮が、濾過／遠心分離又は超遠心分離によって得られることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ミクロソームが、１０mg/ml〜３０mg/mlの濃度まで濃縮されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
保存の最終工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
保存工程が凍結であることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ミクロソームがヒト肝ミクロソームであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０が、ＣＹＰ１、ＣＹＰ２及びＣＹＰ３ファミリーから選択されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
シトクロムＰ４５０が、以下のシトクロムのリスト：ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４から選択されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
シトクロムＰ４５０が不可逆的に阻害されていることを特徴とする、単離されたミクロソーム。
【請求項１２】
不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０が、ＣＹＰ１、ＣＹＰ２及びＣＹＰ３ファミリーから選択されることを特徴とする、請求項１１記載の単離されたミクロソーム。
【請求項１３】
不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０が、以下のシトクロムのリスト：ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４から選択されることを特徴とする、請求項１２記載の単離されたミクロソーム。
【請求項１４】
凍結によって保存されることを特徴とする、請求項１１〜１３の一項記載のミクロソーム。
【請求項１５】
本発明の請求項１〜１０のいずれか一項記載の調製法に従って得られることを特徴とする、単離されたミクロソーム。
【請求項１６】
以下の工程：
−活性成分と一緒の請求項１１〜１４に記載の単離されたミクロソームのインキュベーション；
−活性成分の代謝に関与する不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０の寄与の測定
を含むことを特徴とする、活性成分の代謝に関与する酵素反応の表現型を決定する方法。
【請求項１７】
−請求項１１〜１４に記載の単離されたミクロソーム；
−対照ミクロソーム
を含むことを特徴とする、表現型決定用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製品の研究及び開発の分野、並びに、新薬の場合には薬物相互作用の評価法に存する。本発明は、特定のヒトシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）について不可逆的に阻害された単離されたミクロソームを調製する方法に関し、該ミクロソームは、活性成分の代謝に対する該酵素の寄与を定量するために使用される。
【０００２】
薬物の効力及び毒性は、別の化合物、すなわち薬物、環境汚染物質、食糧の投与によって改変され得る。これらは、薬物相互作用（ＤＤＩ；薬物間相互作用）である。様々な種類の相互作用機序が存在し、最も重要なのは、薬物動態相互作用のグループに属する代謝相互作用である。
【０００３】
薬物代謝相互作用は、とりわけ、薬物Ａが、共投与された薬物Ｂの代謝を、Ｂの代謝を加速（活性化又は誘導）することによって又はＢの代謝を減少（阻害又は抑制）させることによってのいずれかによって改変し得るという事実であると理解されている。この薬物代謝相互作用は、新薬の開発計画において、一方では活性成分の代謝に関与する酵素の同定を、他方では該活性成分の可能性ある阻害剤又は誘導物質の同定を必要とするだろう。
【０００４】
肝臓は、薬物代謝のための主要な部位である。肝細胞は、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）をはじめとする、代謝のために必須な酵素を含有している。したがって、シトクロムＰ４５０は、薬物相互作用の予測における主要な標的をなす。
【０００５】
薬物相互作用のリスクを予測するために、活性成分の代謝に対する各酵素の寄与を同定及び決定することが必要であり；これが、酵素反応の表現型の決定である。
【０００６】
活性成分の代謝に対する各酵素の寄与を推定するために、代謝経路の表現型を決定する様々な方法を使用することができる。
【０００７】
特徴付けられたヒト肝ミクロソームのバンクの使用は、活性成分の代謝に関与する酵素の同定を支援し得る。この方法は、ヒト肝から得られた少なくとも１５個の個々のミクロソームのバッチから、主要なＣＹＰ４５０の酵素活性を事前に特徴付けることを必要とする。１５個のバッチのミクロソームの各々を活性成分と共にインキュベートして、その代謝速度と同ミクロソームの各シトクロムＰ４５０の活性との間の相関を決定する。しかし、ミクロソームバンクの使用は、関与する酵素の定量的な決定を可能としないので、相関付けるのは困難である。
【０００８】
活性成分の代謝に対する各シトクロムＰ４５０の相対的寄与を推定するために組換え酵素も使用される。組換え系におけるシトクロムＰ４５０の発現レベルは異なっており、しばしば天然のヒト肝ミクロソームと比較して非常に上昇しているので、ヒトミクロソームと比較して組換えミクロソームにおける各ＣＹＰ４５０の寄与を推定するために補正係数を取り入れることが必要である（補正係数＝相対活性係数）。この補正係数は、第一に天然ヒトミクロソームの存在下で、第二に組換えミクロソームの存在下で試験された各ＣＹＰ４５０の酵素活性の実験による測定によって計算されなければならない。このアプローチにより、選択的かつ半定量的に、活性成分の代謝に対する各酵素の相対的寄与を間接的に評価することが可能となる。しかし、これらの組換え酵素は、その固有の特徴から、肝ミクロソームに見られる酵素とは異なる（切断短縮されたタンパク質配列、異なる膜環境、シトクロムｂ５とＰ４５０との間の共役が異なっていること、様々なＣＹＰ４５０との間の競合が存在しないこと）。
【０００９】
活性成分の代謝の定量的な推定のために、活性成分とヒト肝ミクロソームとの共インキュベート後に、酵素に対するモノクローナル抗体などの生物学的阻害剤が使用される（これに対して、抗体を含まない対照）。しかし、使用されるかなりの数の抗体が、特異性及び阻害力の欠如を示す。最後に、この技術は、代謝経路の表現型を決定するために使用するには面倒である。
【００１０】
ＣＹＰ４５０の化学的阻害剤は、阻害が試験された酵素に対して完全かつ特異的である場合には、活性成分の代謝阻害率を用いて、各シトクロムＰ４５０の寄与を直接決定することを可能とする。該阻害剤は、酵素に可逆的に又は非可逆的に結合し得る。該組成剤は、活性成分とヒト肝ミクロソームとの共インキュベーション又はプレインキュベーションに使用され（阻害剤を含まない対照条件と比較して）、これは、活性成分の酸化的代謝経路のインビボ状況の代表的モデルである。
【００１１】
競合型の可逆的阻害剤（最も多い型）に伴う阻害レベルは、インキュベーション条件、例えばインキュベーション時間及び基質の濃度などに依存する。さらに、表現型決定試験のために一般的に使用されるＣＹＰ４５０の多くの阻害剤は、単一のＣＹＰ４５０に対して特異的ではない（例えばケトコナゾール、ケルセチンなど）。結果として、可逆的阻害剤は、シトクロムＰ４５０の表現型の決定には適していない。
【００１２】
そうした方法の欠点を是正するために、インビボ条件を表現する堅固な定量法を得るために非可逆的又は不可逆的な阻害剤を使用する。阻害は、酵素がその活性を二度と回復しない場合に不可逆的であると言われ；「自殺」阻害を指す。非可逆的阻害剤は、シトクロムＰ４５０によって酸化されて中間代謝物を形成し、これが酵素に不可逆的に結合する。この過程はＭＢＩと呼ばれ、これは機序に基づく抑制（Mechanism-Based Inhibition）を意味する。なぜなら、出発化合物は阻害性ではないが、酵素に共有結合する反応性代謝物へと活性化される前に、少なくとも１回の該酵素の触媒サイクルを必要とするからである。ＭＢＩ阻害は、試験されたシトクロムＰ４５０の不可逆的な阻害によって特徴付けられ、基質の濃度には依存しない。これらの阻害剤は、以下の定数を有する一次速度式に従う：ｋｉｎａｃｔは最大酵素不活性化速度に相当し、ＫＩは、最大不活性化速度の半分における阻害剤の濃度に相当する。
【００１３】
不可逆的阻害剤を使用してＣＹＰ４５０の完全阻害を得るためにはいくつかの条件を複合させなければならない：
１）十分な濃度の非可逆的阻害剤を使用する必要がある（そのＫＩに依存して）；
２）そのｋｉｎａｃｔに依存して、肝ミクロソームと阻害剤のプレインキュベーション時間は、十分な触媒不活性化サイクルをもたらすのに十分なものでなければならない；
３）プレインキュベーション時間は、自殺阻害剤の枯渇をもたらすことによってその濃度が低くなりすぎてＰ４５０を完全に阻害することができなくなるようなものであってはならない。
【００１４】
ＣＹＰ４５０の阻害が完全かつ特異的（他のＰ４５０は全く阻害されない）である場合、それ故、活性成分の代謝における各シトクロムＰ４５０の関与を定量的に決定することが可能である。そこで、使用される実験体系は以下の通りである。
【００１５】
【表１】
2017501693.tif 000002
【００１６】
上記の利点にも関わらず、この実験体系に記載のＭＢＩの使用は、その利点を制限する一定数の制約を有する：
−一方で、試験される活性成分のインキュベーション条件は、非可逆的な阻害剤のプレインキュベーションのための最適な条件（ミクロソームタンパク質の濃度、有機溶媒の比率）に依存する。実際に、活性成分の代謝阻害率を正確に測定するために、該活性成分をいわゆる初期の条件下（時間とタンパク質濃度の関数としての代謝速度が直線性であること；溶媒比率は一定のレベルを超えてはならないこと）でインキュベートしなければならない。この直線性の実験体系で最大かつ特異的な阻害を得るために、阻害剤はそれ自体、活性成分のインキュベーションと適合性であるタンパク質濃度又は溶媒濃度のインビトロ条件下で事前にインキュベートされなければならない。
【００１７】
−他方で、プレインキュベーション時間は、インビトロで約７０〜９０分間の半減期を有する、ミクロソームのＣＹＰ４５０の酵素活性を変化させる。例えば、３０分間のプレインキュベーションの場合には、２６％以下の、４０分間のプレインキュベーションでは３５％以下の、６０分間のプレインキュベーションでは４６％以下のＣＹＰ２Ｄ６酵素活性の減少が観察される。結果として、実験体系によって課されたＭＢＩのプレインキュベーションと候補薬物のインキュベーションとを連続した順序で続けることは、それ故、ミクロソームのＣＹＰ４５０のインビトロでの半減期には適合しない。
【００１８】
−最後に、あるＣＹＰ４５０に対する不可逆的阻害剤は、１つ以上のＣＹＰ４５０に対する可逆的な阻害も示す場合が多い（例えば、ＣＹＰ１Ａ２のＭＢＩ阻害剤は、ＣＹＰ２Ｃ１９の競合的阻害剤でもあり、ＣＹＰ２Ｂ６のＭＢＩ阻害剤はＣＹＰ２Ａ６及び３Ａ４の競合的阻害剤でもある）。よって上記の直線状の実験体系は、インビトロにおける表現型決定の試験において、他のＣＹＰ４５０に対して競合的に作用することのできる、残留している遊離阻害剤の一部を満足に排除することができない。プレインキュベート液の希釈は遊離阻害剤の濃度を減少させることができ、その結果、非特異的で可逆的な阻害は少なくなるが、これはミクロソームタンパク質の濃度を事実上減少させ、よってインキュベーション中の活性成分の代謝が弱くなりすぎて検出することができなくなるであろう。
【００１９】
結果として、インキュベーション条件を一方では不可逆的阻害剤に適合させ、他方では活性成分に適合させることは困難であるので、そのような直線状の実験体系を使用することは殆ど不可能である。
【００２０】
さらに、そのような直線状の実験体系の場合、阻害剤の効果を検証する陽性対照として試験されるＣＹＰ４５０の特異的基質と共に、２つの一連の追加のインキュベーション（不可逆的阻害剤の存在下及び非存在下）を加えることが必要である。それ故、これは、活性成分の定量だけでなく、全ての特異的な基質の定量を必要とし、これは、試験しようとしている数だけのＣＹＰ４５０について該当し、これにより実験はかなり面倒なものとなる。
【００２１】
活性成分の代謝に関与する酵素反応の表現型決定法のそれぞれの欠点の観点から、インビトロでの酵素反応の該表現型決定試験は、様々な前記された方法の欠点が克服されることを必要とする。
【００２２】
それ故、本発明の目的は、単離され不可逆的に阻害されたミクロソームの使用によって、活性成分の代謝に関与する酵素反応の表現型決定試験を実施する際の固有の問題を克服することを可能とする、代替的な戦略を提案することである。
【００２３】
本発明は、不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）を有し、以下の工程：
−シトクロムＰ４５０の不可逆的な阻害；
−ミクロソームタンパク質の濃縮
を含む、単離されたミクロソームを調製する方法に関する。
【００２４】
非可逆的阻害剤、不可逆的阻害剤、ＭＢＩ阻害剤、不可逆的阻害、又は自殺阻害は、酵素に共有結合することのできる阻害剤を指すと理解され；そのように阻害された酵素は、その最初の機能的活性を取り戻すことができない。より具体的には、ＭＢＩ（機序に基づく抑制）阻害剤は、酵素と直接的に不可逆的な結合を形成するのではなく、むしろ、その反応中間体の代謝物の１つが酵素に共有結合する。
【００２５】
本発明に記載の濃縮の目的は、一方では、調製物に存在する他の産物、特に遊離したままである過剰な不可逆的阻害剤及び溶媒からミクロソームタンパク質を濾別することであり、他方では、プレインキュベーション工程によって希釈されたミクロソームを濃縮することである。
【００２６】
本発明に記載のミクロソームタンパク質の濃縮は、濾過、次いで遠心分離によって得ることができる。濃縮工程における濾過機能は、１０，０００ダルトンから４０，０００ダルトン、好ましくは３０，０００ダルトンのカットオフ閾値を有する膜から始めることで得られる。濃縮工程における濃縮機能は、濃縮を可能とするシステム、例えば、３０００ｇ〜４０００ｇで６０〜９０分間、好ましくは８０分間の遠心分離にかけられるセントリコン（登録商標）システムによって行なわれる。その工程の終了時に、セントリコン（登録商標）をひっくり返し、８００〜１０００ｇで２〜１０分間、好ましくは５分間遠心分離にかける。
【００２７】
ミクロソームタンパク質の分離及び濃縮を改善するために、以下の８０，０００ｇ〜１５０，０００ｇで約６０分間という条件下での超遠心分離という追加の工程を行なってもよい。
【００２８】
ミクロソームタンパク質の濃縮はまた、上記の一連のもの（濾過、次いで濃縮）を少なくとも２回繰り返すことによって改善され得る。
【００２９】
本発明に記載のミクロソームタンパク質の濃縮工程はまた、連続的な超遠心分離によってももたらすことができる。以下の８０，０００ｇ〜１５０，０００ｇで６０〜９０分間という条件下での少なくとも２回連続した超遠心分離が必要である。
【００３０】
本発明は、１回以上の洗浄工程が加えられた、単離され不可逆的に阻害されたミクロソームを調製する方法に関する。単離されたミクロソームを調製するこの方法は、ミクロソームタンパク質の濃縮工程の前及び／又は後に据えられた洗浄工程を含む。例えば、本発明に記載の方法は、以下の工程：
−シトクロムＰ４５０の不可逆的阻害；
−洗浄；
−ミクロソームタンパク質の濃縮；
−ミクロソームタンパク質の洗浄
を含む。
【００３１】
本発明に記載の方法はまた、以下の工程：
−シトクロムＰ４５０の不可逆的阻害；
−ミクロソームタンパク質の濃縮；
−ミクロソームタンパク質の洗浄；
又は以下の工程：
−シトクロムＰ４５０の不可逆的阻害；
−洗浄；
−ミクロソームタンパク質の濃縮
を含み得る。
【００３２】
洗浄は、濯ぎ、そして非ミクロソーム画分を除去する工程を意味すると理解される。洗浄工程はまた、ミクロソーム濃縮液をトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中に取り入れることからなり得る。
【００３３】
本発明に記載の単離され不可逆的に阻害されたミクロソームの調製法の終了時に、ミクロソームは、１０mg/ml〜３０mg/ml、より具体的には１７mg/ml〜２５mg/ml、好ましくは２０mg/mlの濃度であり、ミクロソームタンパク質は５〜１５倍濃縮されている。
【００３４】
本発明に記載の単離され失活させたミクロソームの調製法は、ミクロソームの保存という最終工程を含む。ミクロソームの保存工程は好ましくは、あらゆる生物学的活性を保留するために、単離され精製されたミクロソームを凍結保護溶液の存在下又は非存在下で非常に低い温度（約−１９６℃）まで冷却することからなる凍結保存工程からなる。この保存工程の目的は、本発明に記載の失活させかつ単離されたミクロソームの即時使用を容易にするためである。単離されたミクロソームのこの使用は、その調製から数日後から数か月後に行なってもよい。保存工程は、ミクロソームの構造的特性及び機能的特性を少しも変化させない。好ましくは、保存工程は凍結工程である。不可逆的に阻害されかつ単離されたミクロソームの凍結は−８０℃で行なわれる。
【００３５】
調製法の経緯に使用されるミクロソームは、ヒト、ラット、マウス、ブタ、又はサルの肝ミクロソームである。ミクロソームは好ましくは、全てのＰ４５０酵素を含有しているヒト肝から得られる。個体間のばらつきを考慮するために、ミクロソームはいくつかのドナーに由来し、これによりミクロソームのプールが形成される。
【００３６】
シトクロムＰ４５０は、１８個のサブファミリーから構成されるイソ酵素の巨大なファミリーである（ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３、ＣＹＰ４、ＣＹＰ５、ＣＹＰ７、ＣＹＰ８、ＣＹＰ１１、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ２０、ＣＹＰ２１、ＣＹＰ２４、ＣＹＰ２６、ＣＹＰ２７、ＣＹＰ３９、ＣＹＰ４６、ＣＹＰ５１）。本発明は、不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０がシトクロムファミリーＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３及びＣＹＰ４から選択される、単離されたミクロソームの調製法に関する。
【００３７】
不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０は、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５及びＣＹＰ４Ｆ２から選択される。
【００３８】
不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０は好ましくは、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ３Ａ４から選択される。
【００３９】
本発明に記載のミクロソーム調製法に使用される非可逆的阻害剤の中には以下が挙げられ得るが、説明のためであって限定する意味はない：
【００４０】
【表２】
2017501693.tif 000003
【００４１】
本発明はまた、不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０を含む、それ自体単離されたミクロソームに関する。
【００４２】
本発明に記載された単離されたミクロソームは、シトクロムファミリーＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３及びＣＹＰ４から選択された不可逆的に阻害されたシトクロムを含む。
【００４３】
本発明は、以下のリストから選択されたシトクロムが不可逆的に阻害されている、単離されたミクロソームに関する：ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５及びＣＹＰ４Ｆ２。
【００４４】
より具体的には、本発明は、以下のリストから選択されたシトクロムが不可逆的に阻害されている、単離されたミクロソームに関する：ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ３Ａ４。
【００４５】
本発明に記載の単離され不可逆的に阻害されたミクロソームは、好ましくは凍結保存又は凍結保護されている。
【００４６】
本発明はまた、解凍後の即時使用のための、凍結形の単離され不可逆的に阻害されたミクロソームに関する。
【００４７】
単離されたミクロソームは、本特許出願に記載の調製法に従って得られる。
【００４８】
本発明は、評価しようとする活性成分の代謝に関与する酵素反応の表現型決定における、単離され不可逆的に阻害されたミクロソームの使用に関する。
【００４９】
本発明はまた、活性成分の代謝に関与する酵素反応の表現型を決定する方法にも関する。この表現型決定法は以下の工程を含む：
−本発明に記載の単離され不可逆的に阻害されたミクロソームを、評価しようとする活性成分と共にインキュベーション；
−活性成分の代謝に関与する不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０の寄与の測定。
【００５０】
インキュベーションは、活性成分の存在下で、一方では、本発明に記載の単離され不可逆的に阻害された肝ミクロソームと共に、他方では、本発明に従って調製された阻害されていない単離された肝ミクロソーム（対照）と共に行なわれる。インキュベーションを、インキュベーションの最終時点で、又は動態的に、すなわちいくつかのインキュベーション時点でモニタリングする。
【００５１】
インキュベーションの各時点において、活性成分及び／又はその代謝物を定量する。
【００５２】
活性成分の代謝活性（Ａ）は、阻害された条件（活性Ａｉ）及び阻害されていない条件（活性Ａを有する対照）の２つの条件下で、固有代謝クリアランス（反応速度測定の場合）を介して、又は、未変化の活性成分の消失速度若しくは代謝物の出現速度（インキュベーションの最後の時点が選択された場合）を介してのいずれかで測定される。
【００５３】
活性成分の代謝活性の阻害率は以下のように算出される：阻害率＝（Ａ−Ａｉ）／Ａ。算出された阻害率は、活性成分の代謝に関与する不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０の寄与に直接対応する。
【００５４】
最後に、本発明は、
−本発明に記載の単離され不可逆的に阻害されたミクロソーム；
−対照ミクロソーム
を含む、表現型決定用のキットに関する。
【００５５】
対照ミクロソームは、不可逆的阻害剤の非存在下で本発明に記載の調製法にかけられているミクロソームであると理解される。
【００５６】
好ましくは、表現型決定用のキットは、一方では、不可逆的に阻害されかつ凍結保存されている単離されたミクロソーム、及び他方では、これもまた凍結保存されていてもよい対照ミクロソームを含む。
【００５７】
本発明は、以下の図面及び実施例によって説明されるが、これによって制限されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＣＹＰ１Ａ２が不可逆的に阻害されたミクロソームにおけるシトクロムＰ４５０活性の阻害率。各ＣＹＰ４５０について試験された特異的活性は、フェナセチン−Ｏ−デアセチラーゼ活性（ＣＹＰ１Ａ２、４．５μMのフェナセチンのインキュベーション）、クマリン−７−ヒドロキシラーゼ活性（ＣＹＰ２Ａ６、２μMのクマリンのインキュベーション）、ブプロピオン−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｂ６、５０μMのブプロピオンのインキュベーション）、パクリタキセル−６α−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｃ８、４μMのパクリタキセルのインキュベーション）、ジクロフェナク−４’−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｃ９、４μMのジクロフェナクのインキュベーション）、オメプラゾール−５−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｃ１９、５μMのオメプラゾールのインキュベーション）、デキストロメトルファン−Ｏ−デメチラーゼ活性（２Ｄ６、５μMのデキストロメトルファンのインキュベーション）、クロルゾキサゾン−６−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｅ１、４０μMのクロルゾキサゾンのインキュベーション）、並びにテストステロン−６β−ヒドロキシラーゼ活性、ミダゾラム−１’−ヒドロキシラーゼ活性及びニフェジピン−レダクターゼ活性（３Ａ４、３０μMのテストステロン、０．５μMのミダゾラム、１０μMのニフェジピンのインキュベーション）に対応する。阻害率は、フラフィリンによって不可逆的に阻害されたミクロソームにおけるＰ４５０活性と、対照ミクロソームにおけるＰ４５０活性の比較によって得られる。
【図２】ヒト肝ミクロソームに対する、及びＣＹＰ１Ａ２についての組換えミクロソームに対する、５μM及び１０μMのフラフィリンの影響。
【図３】ＣＹＰ３Ａ４が不可逆的に阻害されたミクロソームにおける、シトクロムＰ４５０活性の阻害率。各ＣＹＰ４５０について試験された特異的活性は図１に記載のものに対応する。阻害率は、アザムリンによって不可逆的に阻害されたミクロソームにおけるＰ４５０活性と、対照ミクロソームにおけるＰ４５０活性の比較によって得られる。
【図４】ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５（組換えミクロソーム）によるニフェジピン及びミダゾラムの代謝。
【図５】ＣＹＰ３Ａ４が不可逆的に阻害されたミクロソームにおける、Ｋｍ及びＶｍａｘにおけるミダゾラムによる活性の阻害率。
【図６】ＣＹＰ２Ｃ８が不可逆的に阻害されたミクロソームにおける、シトクロムＰ４５０活性の阻害率。各ＣＹＰ４５０について試験された特異的活性は、図１に記載のものに対応し、これにアモジアキンヒドロキシラーゼ（２Ｃ８、０．５μMのアモジアキンのインキュベーション）が加えられている。阻害率は、ゲムフィブロジルグルクロニドによって不可逆的に阻害されたミクロソームにおけるＰ４５０活性と、対照ミクロソームにおけるＰ４５０活性の比較によって得られる。
【図７】ＣＹＰ２Ｃ８が不可逆的に阻害されたミクロソームにおける、２Ｃ８依存性のアモジアキンヒドロキシル化反応のＫｍ及びＶｍａｘに対応する濃度でインキュベートされたアモジアキンによる活性の阻害率。
【図８】ＣＹＰ２Ｃ９が不可逆的に阻害されたミクロソームにおける、２Ｃ９依存性ジクロフェナク−４’−ヒドロキシル化反応のＫｍ及びＶｍａｘに対応する濃度でインキュベートされたジクロフェナクによる活性の阻害率。
【図９】ＣＹＰ２Ｃ９が不可逆的に阻害されたミクロソームにおける、シトクロムＰ４５０活性の阻害率。各ＣＹＰ４５０について試験された特異的活性は、図１に記載のものに対応する。阻害率は、チエニル酸によって不可逆的に阻害されたミクロソームにおけるＰ４５０活性と、対照ミクロソームにおけるＰ４５０活性との比較によって得られる。
【図１０】ＣＹＰ２Ｄ６が不可逆的に阻害されたミクロソームにおける、シトクロムＰ４５０活性の阻害率。各ＣＹＰ４５０について試験された特異的活性は、図１に記載のものに対応する。阻害率は、パロキセチンによって不可逆的に阻害されたミクロソームにおけるＰ４５０活性と、対照ミクロソームにおけるＰ４５０活性の比較によって得られる。
【図１１】ＣＹＰ２Ｂ６が不可逆的に阻害されたミクロソームにおける、シトクロムＰ４５０活性の阻害率。各ＣＹＰ４５０について試験された特異的活性は、フェナセチン−Ｏ−デアセチラーゼ活性（ＣＹＰ１Ａ２、２００μMのフェナセチンのインキュベーション）、クマリン−７−ヒドロキシラーゼ活性（ＣＹＰ２Ａ６、２０μMのクマリンのインキュベーション）、ブプロピオン−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｂ６、１００μMのブプロピオンのインキュベーション）、アモジアキン−デエチラーゼ活性（２Ｃ８、２０μMのアモジアキンのインキュベーション）、ジクロフェナク−４’−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｃ９、２００μMのジクロフェナクのインキュベーション）、Ｓ−メフェニトイン−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｃ１９、６０μMのＳ−メフェニトインのインキュベーション）、デキストロメトルファン−Ｏ−デメチラーゼ活性（２Ｄ６、１００μMのデキストロメトルファンのインキュベーション）、クロルゾキサゾン−６−ヒドロキシラーゼ活性（２Ｅ１、２００μMのクロルゾキサゾンのインキュベーション）、並びにテストステロン−６β−ヒドロキシラーゼ活性、ミダゾラム−１’−ヒドロキシラーゼ活性及びニフェジピン−レダクターゼ活性（３Ａ４、７５μMのテストステロン、５０μMのミダゾラム、５０μMのニフェジピンのインキュベーション）に対応する。阻害率は、チオテパによって不可逆的に阻害されたミクロソームにおけるＰ４５０活性と、対照ミクロソームにおけるＰ４５０活性の比較によって得られる。
【図１２】−８０℃での様々な保存時間の関数としての、ＣＹＰ１Ａ２活性の阻害率。
【図１３−１】単離され、ＣＹＰ１Ａ２（Ａ）、３Ａ４（Ｂ）、２Ｄ６（Ｃ）が不可逆的に阻害されたミクロソーム、及びその対照（ｎ＝３）の存在下における、ミルタザピンの消失動態。
【図１３−２】単離され、ＣＹＰ１Ａ２（Ａ）、３Ａ４（Ｂ）、２Ｄ６（Ｃ）が不可逆的に阻害されたミクロソーム、及びその対照（ｎ＝３）の存在下における、ミルタザピンの消失動態。
【図１４】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、ミルタザピンの固有クリアランスの阻害率。
【図１５】単離され３Ａ４（Ａ）及び２Ｃ８（Ｂ）がそれぞれ不可逆的に阻害されたミクロソーム並びにその相同な対照（ｎ＝３）の存在下における、ロペラミドの消失動態。
【図１６】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、ロペラミドの固有クリアランスの阻害率。
【図１７】単離され２Ｂ６が不可逆的に阻害されたミクロソーム及びその相同な対照（ｎ＝３）の存在下における、ブプロピオンの消失動態。
【図１８】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、ブプロピオンの固有クリアランスの阻害率。
【図１９】単離され２Ｃ９が不可逆的に阻害されたミクロソーム及びその相同な対照（ｎ＝３）の存在下における、イブプロフェンの消失動態。
【図２０】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、イブプロフェンの固有クリアランスの阻害率。
【図２１】単離され２Ｃ９が不可逆的に阻害されたミクロソーム及びその相同な対照（ｎ＝３）の存在下における、セレコキシブの消失動態。
【図２２】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、セレコキシブの固有クリアランスの阻害率。
【図２３】単離され２Ｃ８が不可逆的に阻害されたミクロソーム及びその相同な対照（ｎ＝３）の存在下における、ピオグリタゾンの消失動態。
【図２４】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、ピオグリタゾンの固有クリアランスの阻害率。
【図２５】単離され３Ａ４が不可逆的に阻害されたミクロソーム及びその相同な対照（ｎ＝３）の存在下における、ボルテゾミブの消失動態。
【図２６】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、ボルテゾミブの固有クリアランスの阻害率。
【図２７】単離され２Ｃ８が不可逆的に阻害されたミクロソーム及びその相同な対照（ｎ＝３）の存在下における、レパグリニドの消失動態。
【図２８】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、レパグリニドの固有クリアランスの阻害率。
【図２９】単離され２Ｂ６が不可逆的に阻害されたミクロソーム及びその相同な対照（ｎ＝３）の存在下における、セルトラリンの消失動態。
【図３０】単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットの存在下における、その相同な対照と比較した、セルトラリンの固有クリアランスの阻害率。
【００５９】
実施例１：単離された不可逆的に失活させたミクロソームの調製
・生物学的材料
ミクロソームは、全てのＰ４５０酵素を含有しているヒト肝から得られる。それらは個体間のばらつきを考慮するためにいくつかのドナーから得られているので、ミクロソームのプールに由来する。
【００６０】
・ミクロソームのインキュベーション
不可逆的に阻害されたミクロソームのバッチの各々の調製のために、対照バッチは、不可逆的阻害剤が等容量の溶媒によって置き換えられているという差を有する同じ条件下で調製される。
【００６１】
試験されるシトクロムＰ４５０の非可逆的阻害剤（又は、対照バッチでは溶媒）を、ミクロソームと共に、トリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）及びＭｇＣｌ２中で３７℃で撹拌しながらインキュベートする。調製物を一般的に５〜１０分間予熱し、次いでＮＡＤＰＨを加えて酵素反応を開始する。ｔの時点で、反応混合物を数分間氷に入れ、その後、濃縮工程へと進む。共有結合によって接続された酵素／阻害剤の複合体は、ミクロソームを不可逆的阻害剤と共にインキュベーションする経過において形成される。試験されるシトクロムＰ４５０は、不可逆的に、完全に、特異的に阻害される。
【００６２】
・不可逆的に失活させたミクロソームの濾過及び濃縮
ミクロソームを、シトクロムＰ４５０の非可逆的阻害剤と共にインキュベーションすることから得られた試料を濾過する。このタンパク質濾過工程を、１０，０００〜４０，０００ダルトンのカットオフ閾値を有する膜を使用して行なうことができる。セントリコン（登録商標）システムを使用して、この濾過工程を行なう。
【００６３】
１回以上の洗浄工程が、時には、遊離したままである不可逆的阻害剤の除去を促進するために必要である。試料を３０００ｇ〜４０００ｇで８０分間、次いで８００〜１０００ｇで５分間遠心分離にかける。試料は連続的な遠心分離を受けることにより、ミクロソームタンパク質の濃縮を最適化させることができる。
【００６４】
適切な場合には、ミクロソームの濃縮試料をその後、超遠心分離にかけて、タンパク質の濃縮をさらに向上させる。超遠心分離は８０，０００ｇで４時間から１５０，０００ｇで４５分間、好ましくは１００，０００ｇで１時間という一連の条件下で行なわれる。
【００６５】
タンパク質濃縮液をトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にとり、次いで分注し、−８０℃で凍結させる。
【００６６】
この調製の終了時に、活性成分の代謝に関与する酵素反応の表現型決定のために即時に使用することのできる、単離された不可逆的に失活させたミクロソームが得られる。
【００６７】
実施例２：主なシトクロムＰ４５０の阻害の条件、及び、シトクロムＰ４５０の特異的基質上で不可逆的に阻害されたミクロソームの検証
・ＣＹＰ１Ａ２
フラフィリンは、シトクロムＣＹＰ１Ａ２のＭＢＩ阻害剤の１つである。ＣＹＰ１Ａ２上でのフラフィリンによる最大のＭＢＩ阻害のための実験条件は以下の通りである：
−２mg/mlのミクロソームタンパク質；
−１０μMのフラフィリン；
−３０分間のプレインキュベーション時間。
【００６８】
４．５μM（そのＫｍより低いか又はそれに等しい濃度）のＣＹＰ１Ａ２の特異的基質であるフェナセチンを、上記の条件下で事前に阻害されたミクロソームと共にインキュベーションした後、フェナセチンデアセチラーゼ活性（ＣＹＰ１Ａ１依存性／ＣＹＰ１Ａ２依存性）の阻害率は８３％である（図１）。残りの１７％の代謝は、ＣＹＰ１Ａ１に関連したフェナセチンデアセチラーゼ残留活性に起因し、ＣＹＰ１Ａ２の阻害の欠乏に起因するものではないことを注記する。実際に、不飽和条件下（５μM未満）でインキュベートされたフェナセチンは、大半がＣＹＰ１Ａ２によって代謝され、一部がＣＹＰ１Ａ１によって代謝されることが知られている。
【００６９】
ヒト組換えＣＹＰ１Ａ２と共に３０分間プレインキュベートされた５μM〜１０μMのフラフィリンは、フェナセチンの純粋なＣＹＰ１Ａ２活性の１００％の阻害をもたらし、これにより、選択された条件下でのその最大の阻害力が証明される（図２）。
【００７０】
フェナセチンを、ＣＹＰ１Ａ２に対するそのＫｍよりも非常にはるかに高い濃度で、上記の条件下で調製された不可逆的に阻害されたミクロソームの存在下及び対照バッチの存在下でインキュベートする場合、フェナセチンデアセチラーゼ活性（ＣＹＰ１Ａ１依存性／ＣＹＰ１Ａ２依存性）の阻害率は依然として約８０％である。この結果は、フラフィリンによるＣＹＰ１Ａ２の阻害が、過剰の基質によって影響を受けず、競合型の阻害は全く検出できないことを証明する。
【００７１】
他の主要なＣＹＰ４５０（ＣＹＰ２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｅ１、及び３Ａ４）の特異的な基質を、フラフィリンによって不可逆的に阻害されたヒト肝のバッチの存在下、及び上記に定義されている対照バッチの存在下でインキュベートして、フラフィリンの特異性を実証した。他の主要なＣＹＰ４５０の活性は依然として未変化であることが観察される。
【００７２】
これらの全ての結果は、本発明に従って単離されＣＹＰ１Ａ２に関して不可逆的かつ特異的に阻害されたミクロソームを、活性成分又は薬物候補の代謝に対するＣＹＰ１Ａ２の寄与を測定するために有益に使用することができることを示す。
【００７３】
・ＣＹＰ３Ａ４
アザムリンは、シトクロムＣＹＰ３Ａ４のＭＢＩ阻害剤の１つである。ＣＹＰ３Ａ４の存在下におけるアザムリンによる最大のＭＢＩ阻害のための実験条件は以下の通りである：
−２mg/mlのミクロソームタンパク質；
−５μMのアザムリン；
−１５分間のプレインキュベーション時間。
【００７４】
上記に詳述されている条件下で調製された不可逆的に阻害されたミクロソームの存在下、及び対照バッチの存在下で、ＣＹＰ３Ａ４の特異的基質である０．５μMのミダゾラム、３０μMのテストステロン、及び１０μMのニフェジピン（基質のＫｍよりも低いか又は等しい濃度）をインキュベーションした後、ミダゾラム−１’−ヒドロキシラーゼ、テストステロン−６β−ヒドロキシラーゼ及びニフェジピン−レダクターゼ（ＣＹＰ３Ａ４依存性／ＣＹＰ３Ａ５依存性）の活性の阻害率は、それぞれ８１％、９６％、及び８３％である（図３）。残りの１９％、４％及び１７％の代謝は、ＣＹＰ３Ａ５活性に起因するものであり、ＣＹＰ３Ａ４の阻害の欠如に起因するものではないことを注記する。実際に、３つの特異的な基質（より具体的にはニフェジピン及びミダゾラム）は、主に、ＣＹＰ３Ａ４によって代謝されるが、ＣＹＰ３Ａ５によっても代謝されることが知られている。図４は特に、組換えミクロソーム（バクトソーム）ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５によるニフェジピンの代謝を示す。ヒト組換えＣＹＰ３Ａ４と共に１５分間プレインキュベートされた５μMのアザムリンは、ミダゾラムの純粋なＣＹＰ３Ａ４活性の約９２％の阻害をもたらし、選択された条件下でのその最大阻害力を証明する。ＣＹＰ３Ａ４の特異的基質（ミダゾラムの例を使用）を、ＣＹＰ３Ａ４に対するそのＫｍよりも非常にはるかに高い濃度で、本発明に従って事前に調製されたミクロソームと共にインキュベートする場合、ＣＹＰ３Ａ４依存性活性の阻害率は依然として未変化である（図５）。この結果は、アザムリンによるＣＹＰ３Ａ４の阻害が過剰の基質によって影響を受けず、競合型の阻害は全く検出できないことを証明する。
【００７５】
他の主要なＣＹＰ４５０（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６及び２Ｅ１）の特異的基質を、アザムリンによって不可逆的に阻害されたヒト肝ミクロソームのバッチの存在下、及び上記に定義された条件下の対照バッチの存在下でインキュベートし、アザムリンの特異性を実証した。図３は、他の主要なＣＹＰ４５０の活性が、不可逆的に阻害されたヒトミクロソームのバッチと対照バッチとの間で依然として未変化であることを示し、このことはアザムリンが実際にＣＹＰ３Ａ４活性に対して特異的であることを実証する。
【００７６】
これらの全ての結果は、本発明に従って単離されＣＹＰ３Ａ４に関して不可逆的かつ特異的に阻害されたミクロソームを、活性成分又は薬物候補の代謝に対するＣＹＰ３Ａ４の寄与を測定するために有益に使用することができることを示す。
【００７７】
・ＣＹＰ２Ｃ８
ゲムフィブロジルグルクロニドは、シトクロムＣＹＰ２Ｃ８のＭＢＩ阻害剤の１つである。ＣＹＰ２Ｃ８の存在下におけるゲムフィブロジルグルクロニドによる最大のＭＢＩ阻害のための実験条件は以下の通りである：
−２mg/mlのミクロソームタンパク質；
−３０μMのゲムフィブロジルグルクロニド；
−３０分間のプレインキュベーション時間。
【００７８】
本発明に従って調製された不可逆的に阻害されたミクロソームの存在下、及び対照バッチの存在下において、ＣＹＰ２Ｃ８の特異的基質である、０．５μMのアモジアキン又は４μMのパクリタキセル（ＣＹＰ２Ｃ８の２つの基質のＫｍよりも低いか又は等しい濃度）をインキュベーションした後、アモジアキン−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｃ８）及びパクリタキセル−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｃ８依存性）の活性の阻害率はそれぞれ８８％及び１００％（図６）である。
【００７９】
アモジアキンを、ＣＹＰ２Ｃ８に対するそのＫｍより非常にはるかに高い濃度で、上記したのと同じ条件下でインキュベートする場合、アモジアキンヒドロキシラーゼ活性の阻害率は依然として未変化である（図７）。この結果は、アモジアキンによるＣＹＰ２Ｃ８の阻害が、過剰の基質によって影響を受けず、競合型阻害は全く検出できないことを証明する。
【００８０】
ゲムフィブロジルグルクロニドの特異性を実証するために、他の主要なＣＹＰ４５０の特異的基質を、上記に定義された条件下でインキュベートした。図６は、他の主要なＣＹＰ４５０の活性は、不可逆的に阻害されたヒトミクロソームのバッチと対照バッチとの間では、ＣＹＰ２Ｃ１９が僅かに阻害されていることを除いて、依然として未変化であることを示し、このことは、ゲムフィブロジルグルクロニドが、実際にＣＹＰ２Ｃ８活性に対して特異的であることを実証する。
【００８１】
これらの全ての結果は、本発明に従って単離されＣＹＰ２Ｃ８に関して不可逆的に阻害されたミクロソームを、活性成分又は薬物候補の代謝に対するＣＹＰ２Ｃ８の寄与を測定するために有益に使用することができることを示す。
【００８２】
・ＣＹＰ２Ｃ９
チエニル酸は、シトクロムＣＹＰ２Ｃ９のＭＢＩ阻害剤の１つである。ＣＹＰ２Ｃ９の存在下におけるチエニル酸による最大のＭＢＩ阻害のための実験条件は、以下の通りである：
−２mg/mlのミクロソームタンパク質；
−１０μMのチエニル酸；
−２０分間のプレインキュベーション時間。
【００８３】
ＣＹＰ２Ｃ９の特異的基質である、４μM（ＣＹＰ２Ｃ９に対する基質のＫｍよりも低いか又は等しい濃度）及び１００μM（ＣＹＰ２Ｃ９に対するそのＫｍよりも非常にはるかに高い濃度）のジクロフェナクを、本発明に従って調製された不可逆的に阻害されたミクロソームの存在下及び対照バッチの存在下でインキュベートした後、ジクロフェナクヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｃ９依存性）活性の阻害は、ほぼ完全であり、すなわちそれぞれ９２％及び８８％である（図８）。この結果は、ＣＹＰ２Ｃ９の阻害が完全であるだけでなく、それは過剰の基質によっても影響を受けず、競合型阻害は全く検出できないことを証明する。
【００８４】
チエニル酸の特異性を実証するために、他の主要なＣＹＰ４５０の特異的基質を、上記に定義された条件下でインキュベートした。図９は、他の主要なＣＹＰ４５０の活性は、不可逆的に阻害されたミクロソームのバッチと対照バッチとの間で依然として未変化であり、このことは、チエニル酸が実際にＣＹＰ２Ｃ９活性に対して特異的であることを実証する。
【００８５】
これらの全ての結果は、本発明に従って単離されＣＹＰ２Ｃ９に関して不可逆的に阻害されたミクロソームを、活性成分又は薬物候補の代謝に対するＣＹＰ２Ｃ９の寄与を測定するために有益に使用することができることを示す。
【００８６】
・ＣＹＰ２Ｄ６
パロキセチンは、シトクロムＣＹＰ２Ｄ６のＭＢＩ阻害剤の１つである。ＣＹＰ２Ｄ６の存在下におけるパロキセチンによる最大のＭＢＩ阻害のための実験条件は以下の通りである：
−２mg/mlのミクロソームタンパク質；
−５０μMのパロキセチン；
−３０分間のプレインキュベーション時間。
【００８７】
ＣＹＰ２Ｄ６の特異的基質である、５μM（基質のＫｍよりも低いか又は等しい濃度）及び５０μM（ＣＹＰ２Ｄ６に対するそのＫｍよりも非常にはるかに高い濃度）のデキストロメトルファンを、本発明に従って調製された不可逆的に阻害されたミクロソームの存在下及び対照バッチの存在下でインキュベートした後、デキストロメトルファン−Ｏ−デメチラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ６依存性）活性の阻害はほぼ完全であり、すなわち９６％阻害である（図１０）。この結果は、ＣＹＰ２Ｄ６の阻害は完全であり、それは過剰な基質によって影響を受けず、競合型阻害は全く検出できないことを証明する。
【００８８】
パロキセチンの特異性を実証するために、他の主要なＣＹＰ４５０の特異的基質を、上記に定義された条件下でインキュベートした。図１０は、全ての他のＣＹＰ４５０活性の中で、ＣＹＰ２Ｄ６の他に、ＣＹＰ２Ｂ６のブプロピオンヒドロキシラーゼ依存性活性のみが９１％阻害されることを示し、このことはパロキセチンがＣＹＰ２Ｄ６活性に対して完全に特異的ではないことを実証する。
【００８９】
これらの全ての結果は、本発明に従って調製されたミクロソームが、ＣＹＰ２Ｄ６活性を完全かつほぼ特異的に阻害することを可能とすることを示す。それ故、それらを新薬候補の代謝に対するＣＹＰ２Ｄ６／ＣＹＰ２Ｂ６の寄与を測定するために使用することができる。
【００９０】
・ＣＹＰ２Ｂ６
チオテパは、シトクロムＣＹＰ２Ｂ６のＭＢＩ阻害剤の１つである。ＣＹＰ２Ｂ６の存在下におけるチオテパによる最大のＭＢＩ阻害のための実験条件は以下の通りである：
−２mg/mlのミクロソームタンパク質；
−１５μMのチオテパ；
−３０分間のプレインキュベーション時間。
【００９１】
ＣＹＰ２Ｂ６の特異的基質である１００μMのブプロピオンを、本発明に従って調製された不可逆的に阻害されたミクロソームの存在下及び対照バッチの存在下でインキュベートした後、ブプロピオンヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｂ６依存性）活性の阻害は、ほぼ完全であり、すなわち９２％阻害である（図１１）。この結果は、ＣＹＰ２Ｂ６の阻害が完全であり、それは過剰の基質によって影響を受けず、競合型阻害は全く検出できないことを証明する。
【００９２】
チオテパの特異性を実証するために、他の主要なＣＹＰ４５０の特異的基質を、上記に定義された条件下でインキュベートした。図１１は、全ての他のＣＹＰ４５０活性の中で、ＣＹＰ２Ｂ６の他に、ＣＹＰ２Ａ６のクマリンヒドロキシラーゼ依存性活性のみが６４％阻害されることを示し、このことは、チオテパがＣＹＰ２Ｂ６活性に対して完全に特異的ではないことを実証する。
【００９３】
これらの全ての結果は、本発明に従って調製されたミクロソームが、ＣＹＰ２Ｂ６活性を完全かつほぼ特異的に阻害することを可能とすることを示す。それ故、それらを新薬候補の代謝に対するＣＹＰ２Ｂ６／ＣＹＰ２Ａ６の寄与を測定するために使用することができる。
【００９４】
実施例３：単離され、不可逆的に阻害され、凍結によって保存されていたミクロソームにおけるシトクロムＰ４５０の阻害の安定性
本発明に従って濃縮され−８０℃で保存されている、ＣＹＰ１Ａ２に関して不可逆的に阻害された単離されたヒト肝ミクロソームを１mg/mLで、ＣＹＰ１Ａ２の特異的基質であるフェナセチン（４．５μM）と共に１５分間インキュベートする。本発明に従って得られ、−８０℃で４８時間、１か月間、及び１．５か月間保存されたミクロソームについての阻害率を測定した（図１２）。濃縮及び凍結／解凍の工程は、フラフィリンによるＣＹＰ１Ａ２のＭＢＩ阻害には影響を及ぼさないことが観察される。
【００９５】
凍結及び解凍の工程は、シトクロムＰ４５０の不可逆的阻害の安定性に影響を及ぼさない。
【００９６】
実施例４：生体異物の代謝経路の酵素表現型を決定するための不可逆的に阻害された単離されたミクロソームのキット
９個の活性成分（ミルタザピン、ロペラミド、ブプロピオン、イブプロフェン、セレコキシブ、ピオグリタゾン、ボルテゾミブ、レパグリニド、セルトラリン）を、９個の該生体異物の代謝経路の酵素表現型を決定するために、本発明に記載の不可逆的に阻害された単離されたミクロソームのキットで試験した。９個の活性成分は、以下の工程を含む本発明に記載の酵素反応の表現型を決定する方法による試験であった：
−本発明に従って単離され不可逆的に阻害されたミクロソームを、評価しようとする活性成分と共にインキュベート；
−活性成分の代謝に関与する不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０の寄与の測定。
【００９７】
５mMのＭｇＣｌ２の添加されたトリス／ＨＣｌ緩衝液（０．１mM、ｐＨ７．４）中０．１μMの、それぞれの活性成分を、一方ではＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｄ６及び３Ｄ４について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、他方では、本発明に従って調製された単離された阻害されていない肝ミクロソーム（相同な対照）の存在下で３７℃でインキュベートした。反応を、１mMのＮＡＤＰＨの添加によって開始する。インキュベーションは動態形でモニタリングする。７分間、１７分間、３０分間、次いで６０分間のインキュベーション時点で、インキュベーションのアリコート（１００μL）をサンプリングし、そのアリコートに、１０分間氷に入れたある容量の溶媒（メタノール １００μL）を添加することによって酵素反応を停止する。
【００９８】
インキュベーションの各時点で、活性成分を、質量分析（ＭＳ）と連動させた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量する。
【００９９】
活性成分の代謝活性（Ａ）は、阻害された条件（活性Ａｉ）及び阻害されていない条件（活性Ａを有する対照）という２つの条件下における未変化の活性成分の固有代謝クリアランスを介して測定される。算出された阻害率（阻害率＝（Ａ−Ａｉ）／Ａ）は、活性成分の代謝に関与する不可逆的に阻害されたシトクロムＰ４５０の寄与に直接相当する。
【０１００】
・ミルタザピン
ミルタザピンを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする２mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソーム（阻害されておらず、本発明に従って調製された）の存在下で、３．９〜７．８ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｄ６、及び３Ａ４についてそれぞれ不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、ミルタザピンの固有クリアランスの４１％、３６％、及び２４％の阻害が判明した（図１３及び１４）。ＣＹＰ４５０ ２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下では、ミルタザピンの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、ミルタザピンの酸化的代謝には、それぞれ４１％、３６％及び２４％のレベルでＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｄ６及び３Ａ４が関与する。
【０１０１】
主要なヒトのＣＹＰ４５０を過剰発現している組換えミクロソームの存在下で２．５〜１０００μMのミルタザピンをインキュベートした後、及び、このような各々のＣＹＰ４５０に適した補正係数を測定した後、Stoermer et al.（Metabolism of the antidepressant mirtazapine in vitro: contribution of cytochromes P-450 1A2, 2D6 and 3A4. Drug Metab Dispos. 2000; 28(10): 1168-1175）は、ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｄ６及び３Ａ４が、それぞれ、ミルタザピンの代謝に４１％、３９％及び２３％関与していることを示した。本発明に従って単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットを用いて得られた結果は、Stoermer et al.によって得られた結果によって確証される（表１）。
【０１０２】
本発明に記載のキットは、ミルタザピンの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与を、ＣＹＰ４５０について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下における固有クリアランスと、対照ミクロソームの存在下における固有クリアランスとの単純な比較によって推定することを可能とする。
【０１０３】
これに対し、ミルタザピンの酵素経路の表現型の決定のための、ヒトＣＹＰ４５０を過剰発現している組換えミクロソームの使用は、一方ではミルタザピンの存在下で、他方では特異的な基質の存在下で、第一にヒトＣＹＰ４５０を過剰発現している組換えミクロソームにおいて、第二に補正係数を測定するためのヒト肝ミクロソームにおいて、各々のＣＹＰ４５０活性を特徴付けることを必要とする、間接的な測定を必要とする。
【０１０４】
【表３】
2017501693.tif 000004
表１：本発明に従って単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットから出発して得られた、及びヒト組換え酵素を用いて得られた（Stoermer et al.）、ミルタザピンの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率
【０１０５】
・ロペラミド
ロペラミドを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする２mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソームの存在下では（阻害されておらず、本発明に従って調製された）、１４．５〜１７．２ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、それぞれＣＹＰ４５０ ３Ａ４及び２Ｃ８について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下において、５３％及び４０％のロペラミドの固有クリアランスの阻害が判明した（図１５及び１６）。ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｄ６について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下においては、ロペラミドの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、ロペラミドの酸化的代謝には、それぞれ５３％及び４０％のレベルでＣＹＰ４５０ ３Ａ４及び２Ｃ８が関与する。
【０１０６】
健康な試験志願者の試験は、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤であるゲムフィブロジル ６００mgの経口投与が、経口で共投与されたロペラミド ４mgに対する曝露（ＡＵＣ）を２．２倍増加させることを示す（Niemi et al. Itraconazole, gemfibrozil and their combination markedly raise the plasma concentrations of loperamide. Eur J Clin Pharmacol. 2006; 62: 463-472）。このような曝露の増加は、ロペラミドの全身クリアランスにＣＹＰ２Ｃ８が５５％関与していると推定されていることに対応する。この同じインビボでの試験において、ＣＹＰ３Ａ４の阻害剤であるイトラコナゾール １００mgと、ロペラミド ４mgの共投与は、３．８倍の曝露の増加を示し、これは、ロペラミドの全身クリアランスの約７４％に相当する。
【０１０７】
さらに、Tayrouz et al.（Ritonavir increases loperamide plasma concentrations without evidence for P-glycoprotein involvement. Clin Pharmacol Ther. 2001 Nov;70(5):405-14）は、健康な試験志願者において、ＣＹＰ３Ａ４の阻害剤であるリトナビル ６００mgと、ロペラミド １６mgの共投与が、２．６５倍の曝露の増加を引き起こし、これは、ロペラミドの全身クリアランスの６２％に相当する。
【０１０８】
本発明に従って単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットを用いて得られた結果（表２）は、Niemi et al.及びTayrouz et al.による臨床状況に記載されたデータによって確証される。
【０１０９】
【表４】
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表２：本発明に従って単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットから出発して得られた、及び健康試験志願者において得られた（Niemi et al.; Tayrouz et al.）、ロペラミドの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率
【０１１０】
・ブプロピオン
ブプロピオンを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする、２mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソーム（阻害されておらず、本発明に従って調製された）の存在下で、６．７〜１０．６ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、ＣＹＰ４５０ ２Ｂ６について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、８９％のブプロピオンの固有クリアランスの阻害が判明した（図１７及び１８）。ＣＹＰ２Ｄ６について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下でも、８４％のブプロピオンの固有クリアランスの阻害が観察された。ＣＹＰ２Ｄ６のＭＢＩ阻害剤であるパロキセチンは特異的ではなく、ＣＹＰ２Ｂ６も阻害するという知識から、ＣＹＰ２Ｄ６の阻害は、現実にはＣＹＰ２Ｂ６の阻害に相当すると推定される。
【０１１１】
ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｃ８、２Ｃ９及び３Ａ４について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、ブプロピオンの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、ブプロピオンの酸化的代謝には、８９％のレベルでＣＹＰ４５０ ２Ｂ６が関与する。
【０１１２】
米国食品医薬品局は、ブプロピオンが、ヒトにおけるインビボでの相互作用試験においてＣＹＰ２Ｂ６の最も感受性である基質であると示唆する（医薬品開発と薬物相互作用に関する米国食品医薬品局のウェブサイト、http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htm及びhttp://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabelin 1277 g/ucm080499.htm）。
【０１１３】
本発明に従って単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットを用いて得られた結果は、米国食品医薬品局によって記載されたデータによって確証される。
【０１１４】
【表５】
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表３：本発明に従って単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットから出発して得られた、ブプロピオンの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率
【０１１５】
・イブプロフェン
イブプロフェンを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする、０．２５mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソーム（阻害されておらず、本発明に従って調製された）の存在下で、３１〜５４ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、ＣＹＰ４５０ ２Ｃ９について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、９０％のイブプロフェンの固有クリアランスの阻害が判明した（図１９及び２０）。
【０１１６】
ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｂ６、２Ｄ６、２Ｃ８及び３Ａ４について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下においては、イブプロフェンの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、ロペラミドの酸化的代謝には、９０％のレベルでＣＹＰ４５０ ２Ｃ７が関与する。
【０１１７】
主要なヒトのＣＹＰ４５０を過剰発現している組換えミクロソームの存在下で３μMのイブプロフェンをインキュベートした後、及び、このような各々のＣＹＰ４５０に適した補正係数を測定した後、McGinnity et al.（Automated definition of the enzymology of drug oxidation by the major human drug metabolizing cytochrome P450s. Drug Metab Dispos. 2000 Nov;28(11):1327-34）は、ＣＹＰ４５０ ２Ｃ９が、イブプロフェンの代謝に９０％のレベルで関与していることを示した。本発明に従って単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットを用いて得られた結果は、McGinnity et al.によって得られたデータによって確証される（表４）。本発明に記載のキットは、イブプロフェンの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与を、本発明に記載のミクロソームの固有クリアランスと、対照ミクロソームの固有クリアランスとの間の単純な比較によって確立することが想起されるだろう。これとは対照的に、組換えミクロソームの使用は、手順の増加を必要とする間接的な測定を必要とする。
【０１１８】
さらに、健康な試験志願者における試験は、フルコナゾール ４００mgの経口投与が、経口で共投与されたイブプロフェン ４００mgに対する曝露（ＡＵＣ）を８３％増加させることを示す（Hynninen et al. Effects of the Antifungals Voriconazole and Fluconazole on the Pharmacokinetics of S-(+)- and R-(-)-Ibuprofen. Antimicrob Agents Chemother. Jun 2006; 50(6): 1967-1972）。Lazar et al.（Drug interactions with fluconazole. Rev Infect Dis. 1990 Mar-Apr;12 Suppl 3:S327-33）は、ＣＹＰ２Ｃ９の阻害剤であるフルコナゾールが、ＣＹＰ２Ｃ９に対して感受性であると認識されている基質であるトルブタミドへの１０９％の曝露の増加をもたらすことを示した（ｆｍ＝８０％、Brown et al. Prediction of in vivo drug-drug interactions from in vitrodata: impact of incorporating parallel pathways of drug elimination and inhibitor absorption rate constant. Br J Clin Pharmacol. 2005 Nov; 60(5):508-18）。イブプロフェン及びトルブタミドへの曝露の増加は、ヒトへの同阻害剤の共投与後と非常に似ているので、これらの２つの分子の代謝に対するＣＹＰ２Ｃ９の寄与は非常に似ていると結論付けることが可能である。本発明のキットを用いて得られた結果が確認され（表４）、この結果は、臨床状況と比較して、このインビトロモデルの優れた代表性を実証する。
【０１１９】
【表６】
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表４：単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットから出発して得られた、組換えヒト酵素の存在下で得られた（McGinnity et al.）、及び健康な被験者におけるインビボ状況において得られた（Hynninen et al., Lazar et al.及びBrown et al.）、イブプロフェンの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率
【０１２０】
・セレコキシブ
セレコキシブを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする、２mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソーム（阻害されておらず、本発明に従って調製された）の存在下で、１３．４〜１８．９ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、ＣＹＰ４５０ ２Ｃ９について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、８１％のセレコキシブの固有クリアランスの阻害が判明した（図２１及び２２）。ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｂ６、２Ｄ６、２Ｃ８及び３Ａ４について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下においては、セレコキシブの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、セレコキシブの酸化的代謝には、８１％のレベルでＣＹＰ４５０ ２Ｃ９が関与する。
【０１２１】
健康な試験志願者の試験は、フルコナゾール ２００mgの反復経口投与が、経口で共投与されたセレコキシブ ２００mg（新薬承認申請０２０９９８  １９８８−１２−３１、ファルマシア社）への曝露（ＡＵＣ）を１３４％増加させることを示す。
【０１２２】
セレコキシブに対する及び上記のトルブタミドに対する曝露の増加は（Lazar et al.）、ヒトへのフルコナゾールの共投与後に非常に似ているので、これらの２つの活性成分の代謝に対するＣＹＰ２Ｃ９の寄与は非常に似ていると結論付けることが可能である。Brown et al.は、トルブタミドにおけるＣＹＰ２Ｃ９の８０％の関与を示した。本発明に従って不可逆的に阻害された単離されたミクロソームのキットを用いて得られた結果は、臨床状況と比較して、このインビトロモデルの良好な代表性を実証する（表５）。
【０１２３】
【表７】
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表５：本発明に従って不可逆的に阻害された単離されたミクロソームのキットから出発して得られた、及び健康な被験者におけるインビボ状況において得られた、セレコキシブの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率（新薬承認申請０２０９９８、Lazar et al.及びBrown et al.）
【０１２４】
・ピオグリタゾン
ピオグリタゾンを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする、０．２mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソーム（阻害されておらず、本発明に従って調製された）の存在下で、４３〜７０ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、ＣＹＰ４５０ ２Ｃ８について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、６９％のピオグリタゾンの固有クリアランスの阻害が判明した（図２３及び２４）。
【０１２５】
ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｂ６、２Ｄ６、２Ｃ９及び３Ａ４について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下においては、ピオグリタゾンの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、ピオグリタゾンの酸化的代謝には、６９％のレベルでＣＹＰ４５０ ２Ｃ８が関与する。
【０１２６】
健康な試験志願者の試験は、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤であるゲムフィブロジル ６００mgの反復経口投与が、経口で共投与されたピオグリタゾン ３mgへの曝露（ＡＵＣ）を２３９％増加させることを示す（Deng et al. Effect of gemfibrozil on the pharmacokinetics of pioglitazone. Eur J Clin Pharmacol, 2005, 61, 831-6）。このような曝露の増加は、ピオグリタゾンの全身クリアランスの７１％であると推定されるＣＹＰ２Ｃ８の関与に対応する。それ故、本発明に記載のキットを用いて得られた結果は、Deng et al.による臨床状況に記載されたデータを確証する（表６）。
【０１２７】
【表８】
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表６：本発明に従って不可逆的に阻害された単離されたミクロソームのキットから出発して得られた、及びインビボ状況において得られた（Deng et al.）、ピオグリタゾンの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率
【０１２８】
・ボルテゾミブ
ボルテゾミブを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする、１．５mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソーム（阻害されておらず、本発明に従って調製された）の存在下で、６．９〜１１ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、ＣＹＰ４５０ ３Ａ４について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、７３％のボルテゾミブの固有クリアランスの阻害が判明した（図２５及び２６）。
【０１２９】
ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｂ６、２Ｄ６、２Ｃ８及び２Ｃ９について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下においては、ボルテゾミブの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、ボルテゾミブの酸化的代謝には、７３％のレベルでＣＹＰ４５０ ３Ａ４が関与する。
【０１３０】
Uttamsingh et al.（Relative contributions of the five major human cytochromes p450, 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, and 3A4, to the hepatic metabolism of the proteasome inhibitor bortezomib. Drug Metab Dipos 2005, 33 (11):1723-1728）は、抗ＣＹＰ ３Ａ４モノクローナル抗体が、ヒト肝ミクロソームによるボルテゾミブ（２μM）の代謝の７９％を阻害することを示した。それ故、本発明に記載のキットを用いて得られた結果は、Uttamsingh et al.によって記載されたデータを確証する（表７）。
【０１３１】
【表９】
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表７：本発明に従って不可逆的に阻害された単離されたミクロソームのキットから出発して得られた、及び、特異的なモノクローナル抗体によって阻害されたヒト肝ミクロソーム（Uttamsingh et al.）から出発して得られた、ボルテゾミブの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率
【０１３２】
・レパグリニド
レパグリニドを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする、２mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソーム（阻害されておらず、本発明に従って調製された）の存在下で、３８．４〜４８．９ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、ＣＹＰ４５０ ２Ｃ８について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、８０％のレパグリニドの固有クリアランスの阻害が判明した（図２７及び２８）。ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｂ６、２Ｄ６、２Ｃ９及び３Ａ４について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下においては、レパグリニドの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、レパグリニドの酸化的代謝には、８０％のレベルでＣＹＰ４５０ ２Ｃ８が関与する。
【０１３３】
健康な試験志願者の試験は、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤であるゲムフィブロジル（９００mgまで）の経口投与が、経口で共投与されたレパグリニド ０．２５mgへの曝露（ＡＵＣ）を８．３倍増加させることを示す（Honkalammi J. et al. Dose-Dependent Interaction between gemfibrozil and repaglinide in humans: strong inhibition of CYP2C8 with subtherapeutic gemfibrozil doses. Drug Metab Dispos, 2011, 39, 1977-1986）。このような曝露の増加は、レパグリニドの全身クリアランスの８８％であると推定されるＣＹＰ２Ｃ８の関与に対応する。本発明に従って不可逆的に阻害された単離されたミクロソームのキットを用いて得られた結果は、Honkalammi J. et al.による臨床状況に記載されたデータによって確証される（表８）。
【０１３４】
【表１０】
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表８：本発明に従って不可逆的に阻害された単離されたミクロソームのキットから出発して得られた、及び健康な被験者のインビボでの状況において得られた、レパグリニドの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率（Honkalammi J. et al.）
【０１３５】
・セルトラリン
セルトラリンを、その固有クリアランスの最適な測定を可能とする、０．２mg/mlの濃度のミクロソームタンパク質と共に、以前に記載された条件下でインキュベートした。対照ミクロソーム（阻害されておらず、本発明に従って調製された）の存在下で、５２．５〜７０．５ml/分/ｇ（タンパク質）の固有クリアランスが測定された。対照ミクロソームと比較して、ＣＹＰ４５０ ２Ｂ６について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、セルトラリンの固有クリアランスの５８％の阻害が判明した（図２９及び３０）。ＣＹＰ２Ｄ６について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下においては、セルトラリンの固有クリアランスの６４％の阻害も観察された。ＣＹＰ２Ｄ６のＭＢＩ阻害剤であるパロキセチンは特異的ではなくＣＹＰ２Ｂ６も阻害するという知識から、ＣＹＰ２Ｄ６の阻害は、現実にはＣＹＰ２Ｂ６の阻害に相当すると推定される。
【０１３６】
ＣＹＰ４５０ １Ａ２、２Ｃ８、２Ｃ９及び３Ａ４について不可逆的に阻害された単離された肝ミクロソームの存在下で、セルトラリンの固有クリアランスの有意な阻害は全く観察されなかった。有意な阻害とは、２５％未満の固有クリアランスであると理解され、この比率は、肝ミクロソームでのクリアランスの測定値に観察されたばらつきの閾値を示す。結果として、セルトラリンの酸化的代謝には、５８％のレベルでＣＹＰ４５０ ２Ｂ６が関与する。
【０１３７】
ヒト肝ミクロソーム及びＣＹＰ４５０の特異的阻害剤の存在下でセルトラリンをインキュベートした後、Obach S et al.（Sertraline is metabolized by multiple cytochrome P450 enzymes, monoamine oxidases, and glucuronyl transferases in human: an in vitro study. Drug Metab Dispos. 2005 Feb;33(2):262-70）は、主要なＣＹＰ４５０の中で、ＣＹＰ２Ｂ６が最もセルトラリンの代謝に寄与し、その関与は１５〜６５％であることを示した（ヒト肝のプールにおいては６０％）。本発明に記載のキットを用いて得られた結果は、Obach S et al.によって記載された結果によって確証される（表９）。
【０１３８】
【表１１】
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表９：単離され不可逆的に阻害されたミクロソームのキットから出発して得られた、及び、ＣＹＰ４５０の存在下又は非存在下におけるヒト肝ミクロソームにおいて得られた（Obach S et al.）、セルトラリンの酸化的代謝におけるＣＹＰ４５０の関与率
【０１３９】
得られた結果は、表現型決定用のキットを使用してインビトロで測定された、選択された活性成分の代謝に関与する酵素の寄与は、インビボデータ及び／又は他のインビトロモデルから得られたデータに基づいて推定又は測定されたものと非常に似ているか又は同一でさえあることを示す。臨床データと比較した生体異物の代謝経路の酵素の表現型決定の脈絡で、可逆的に阻害され単離され凍結保存されたミクロソームのキットの有効性の検証は、ヒトにおけるインビボでの状況と比較して、このインビトロモデルの代表性を実証する。
【０１４０】
さらに、活性成分の代謝に対する酵素の寄与の直接的な測定がもたらされることは、時間及び解析施設の点から恩恵が得られるだけでなく、他のインビトロモデルを行なう際の操作の増加に特有の誤差を回避することも可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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