(57)【要約】  ＤＮＡ検出を最適化するためのプロセスと装置であって、様々な量で、特定のサンプルに適していると思われる試薬とプライマーで、複数の反応容器を満たすことと、各反応容器内に、対象ＤＮＡのサンプルを配置することと、各容器に同時にＰＣＲを施すことと、各反応容器内の全ＰＣＲプロセスを同時に、光学的に観察することと、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが個別に熱的に制御可能なマイクロタイター反応容器のアレイと、光源と、マルチチャネル画像化分光装置と、前記光源からのコリメートされた出力を励起し、受信し、少なくとも８個の反応容器の上で終端するマルチファイバプローブ束であって、各ファイバプローブは、実際に、複数の励起ファイバと少なくとも１個の集光ファイバとを含み、前記少なくとも１個の集光ファイバは、大面積検出器上に収束するように配置されているマルチファイバプローブ束と、を含む、PCRを含む、熱サイクリック生化学処置のための装置。
【請求項２】
前記光源は、レーザまたはレーザダイオードである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記少なくとも１個の集光ファイバは、回折格子を介して、前記検出器上に収束する、請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項４】
ファイバ束の数は、８個であり、順番に、ウェルの各列上に、分光装置を中心取りするように配置された移動シャトルが存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
束の数は、１２個であり、順番に、８個のウェルの各行上に前記分光装置を中心取りするように配置されたシャトルを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
束の数は、９６個であり、前記分光装置は、９６チャンネル画像化分光装置である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記光源は、４８８ｎｍで動作するレーザダイオードである、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記光源は、４８８ｎｍで動作するＬＥＤを利用する、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
光多重化装置を用いる、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
各ファイバ束は、６個の励起ファイバに囲まれた単一中心コア集光ファイバを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記大面積検出器は、ＣＣＤまたはＣＭＯＳである、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記分光装置は、前記ウェルからの全可視スペクトルを捕捉するように配列される、前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
・様々な量で、特定のサンプルに適していると考えられる試薬とプライマーで、複数の反応容器を満たすことと、
・各反応容器内に、対象のＤＮＡのサンプルを配置することと、
・各容器に対し、同時にＰＣＲを行うことと、
・各反応容器内の全ＰＣＲプロセスを光学的に同時に観察することと、
を含む、ＤＮＡ検出を最適化するためのプロセス。
【請求項１４】
以下のパラメータ： 
・アニール温度；
・アニーリング時間；
・変性温度；
・変性時間；
・伸長温度；
・伸長時間；
・蛍光読み取りが行われる温度；
・（全ステップについての）ランプ速度；
・塩化マグネシウム濃度；
・ｄＮＴＰ濃度；
・プライマー濃度；
・対象の濃度
のうちの少なくとも幾つかを調べるように配置された、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記パラメータは、アニール温度；伸長時間；ＭｇＣｌ２濃度；プライマー濃度を含む、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
インターカレータ色素が用いられる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
各容器内の前記プロセスのタイミングは、相互に異なる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
各容器内の温度は、相互に異なる、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
同一時間及び温度における、インターカレータ色素と、シーケンス特異的プローブの双方から放射された蛍光の分光解析を含み、このようにして、ＦＲＥＴを測定し、それによって、前記対象のハイブリッド形成状態についての情報を提供する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２０】
非常に似ているシーケンス間で区別するために、一組のプライマーが目的の領域をカバーするように設計することと、これらのプライマーを同一の反応容器に入れることとを含み、前記プライマーは、融点と蛍光ラベルの両方が異なっており、従って、アニーリングが発生する実際の温度を決定し、要求される区別を可能にする、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
反応容器の量は、９６個である、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記容器は、８×１２マイクロタイター容器アレイ内にある、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２３】
光学手段が、前記反応容器からの全可視スペクトルを捕捉するように配置されている、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
光学手段が、同時に、少なくとも８個の反応容器内での反応を観察するように配置されている、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記光学的観察は、単一の検出器と回転分布ホイール、８ウェルスキャンヘッド、または、画像化分光装置のうちのいずれか１つによって実行される、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記光学手段は、分光光度計を含み、前記プロセスは、個別の成分色素を分離し、それらの全蛍光出力を比較するためのスペクトル畳み込み解消を含む、請求項１３〜２４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の装置を用いる、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２８】
マイクロタイター反応チャンバのアレイと、同時に、各反応チャンバ内のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)の温度と時間を個別に制御するための手段と、前記アレイにおける少なくとも複数のチャンバ内の反応の進行を同時に観察し、記録するための手段とを含む、ＤＮＡ検出を最適化するための装置。
【請求項２９】
４８８ｎＭレーザまたはレーザダイオード光源と、多重装置と、異なる反応チャンバに光源の光を届けるように、それぞれが配列された、前記多重装置から出る複数の励起ガラスファイバと、前記異なる反応チャンバからの光を集光するようにそれぞれ配列された複数の集光ガラスファイバと、前記集光ガラスファイバが接続される、画像化分光装置と、を有する光学手段を含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項３０】
励起光及び放射光の両方は、８個のウェルＬＥＤボードと分光装置にそれぞれ供給をするファイバによって提供される、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプロセスを実行するように配置され、単一の検出器と、８個のスペクトルを一つのセンサ上に収束するための２つの回折格子とを有する８ウェルスキャンヘッドを含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３２】
ｎを整数として、１２×８アレイ内の９６×ｎマイクロタイター反応容器のアレイを含み、そのうちの少なくとも複数個は、個別制御のために配置される、請求項１〜１２及び、２７〜３１のいずれいか１項に記載の装置。
【請求項３３】
前記光学手段は、単一検出器及び回転分布ホイールと、８ウェルスキャンヘッドと、好ましくは移動することなく、１個〜８個の反応容器を読み取ることが出来るスペクトル光度計、または、上記したように、同時に、前記反応容器の全てを見ることができる画像化分光装置とを含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３４】
前記８ウェルスキャンヘッドは、単一の検出器と、一つのセンサ上に８個のスペクトルを収束させる２つの回折格子とを含む、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
実質的に、添付図面を参照して記述したような、ＤＮＡ検出を最適化するためのプロセス。
【請求項３６】
実質的に、添付図面を参照して記述したような、ＤＮＡ検出を最適化するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの同定に関する。それは、特に、一方で、時間が本質的であり、他方で、任意の特定の対象ＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの最適化を伴う文脈における、病的ＤＮＡの同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に言うと、ＰＣＲは、ＲＮＡ種に対するＲＴ−ＰＣＲのような、存在が疑われる特定のＤＮＡをサンプルが含むか否かをチェックするために、ＤＮＡサンプルに対して実施される。通常、サンプルは、反応容器に、必要な試薬、及び、標識化プライマーを入れることにより、ＰＣＲ用に準備される。その後、サンプルＤＮＡ鎖が分離するときの変性温度まで繰り返し加熱し、分離された鎖がプライマーと結合するアニール温度まで冷却し、鎖がＤＮＡの新規な部分を生成するために伸長する伸長点まで加熱することにより、ＰＣＲが実行される。従って、各サイクルにおいては、対象ＤＮＡは、もし存在するなら、二倍になる。結果として、その量は検出のために十分となり、つまり、対象ＤＮＡが実際に存在することの確証となる。光リーダ手段は、ＤＮＡサンプルが十分増幅されたとき生成される蛍光を観察することが出来る。
【０００３】
ＰＣＲプロセスは、多くの分子診断試験に組み込まれているが、依然、突然変異により、興味のある膨大な数の分子が残っている。従って、例えば、病気の流行などの場合に、新規の試験を迅速に確立することと、特に、生命が危機にある時、検出のための時間を可能な限り短くして、既存の試験を完了することの双方に、明らかなニーズが存在する。
【０００４】
ＰＣＲプロセスの全ての特徴は、対象ＤＮＡに特化したものであることは事実である。従って、実行するときの迅速性を含む、ＰＣＲプロセスの最適化は、連続して実行される場合、多くの日数、さらには数週をもかかるかもしれない、非常に多くの繰り返しを含みうる。本発明は、これらの繰り返しを、自動動作において大規模かつ同時に実行でき、更に、同時の試験のそれぞれの結果が、対象ＤＮＡとプライマーの与えられた組み合わせに対して、最適なＰＣＲプロセスに到達するように、自動的に比較されることが出来ることを提供することを目標とする。そのようなアプローチは、検出にかかる時間を減少するのみではなく、究極的には、ＰＣＲプロセス自身の反応速度を調べる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の第１の態様によると、ＤＮＡ検出の最適化のためのプロセスは、
・様々な量の、対象ＤＮＡを含む特定のサンプルに適すると思われる試薬とプライマーで、複数の反応容器を満たすことと、
・各反応容器に対象ＤＮＡを入れることと、
・各反応容器に、異なる熱サイクリングプロファイルを同時に適用することと、
・通常、蛍光によって、反応容器内のＰＣＲプロセス全体を光学的に、同時に、且つ、連続的に観察することと、
を含む。
【０００６】
各反応容器からの結果の比較から、特定のＤＮＡ対象用の最適なＰＣＲプロセスを決定することが出来る。通常、対応する蛍光信号がその中で生成されるために、反応容器の内容物に、適切な光を励起することが必要であろう。「連続的に」によって、１秒未満、好ましくは、２５ｍｓ（ミリ秒）の間隔で画像を取得することを意味する。
【０００７】
反応容器の量は、従来の８×１２マイクロタイター容器アレイ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｖｅｓｓｅｌ  ａｒｒａｙ）において、９６個が便利であり、各容器内のプロセスのタイミングは、おそらく光学装置から得られる結果によって、変化する。温度と時間の両方の完全な制御によって、装置が、前もってプログラムされたプロトコルを実行することが可能となる。したがって、装置は、おそらく、各反応容器において、温度対時間の勾配、その異なる勾配を完成することが出来る。それから、ｃＴ（サイクル閾）値と、Ｒ（直線からのずれに関する統計値）を比較することにより、これらのデータの比較により、その特定のＤＮＡのための最適な条件が決定されることが出来る。
【０００８】
更に、任意の変数について、反応の酵素的反応速度論を研究することも可能となる。例えば、２つの反応が、プライマーの濃度を別にして同一である場合、蛍光の増加が連続的に観察されるなら、従来のサイクルごとに一回のアプローチとは対照的に、プライマー濃度について、酵素のＫｍを決定することが可能となる。従って、全ての変数を固定することは一度で試験することを不可能にするため、単一のプレート上で、本質的に、段階的な方法ではあるが、反応における、これらの変数の全ての影響を研究することが可能である。
【０００９】
観察される蛍光に影響を直接与える多くの現象が発生する。インターカレータ色素を追加した後に観察するとき、これらのうちの主なものは、アニーリングと対象シーケンスの融点である。分光解析が可能なシステムは、全く同時に、同じ温度で、インターカレータ色素とシーケンス特異的プローブの両方からの発光蛍光を観察することが出来る。これにより、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を測定することが可能であり、従って、対象のハイブリッド形成状態についての情報を提供することが出来る。更に、全てのデータは、ミリ秒のタイムスケールで照合することができるので、変化または信号の観察ののち、数ミリ秒より長い期間、任意の温度でサイクルを保持する必要が無い。
【００１０】
各ウェルに同一のプライマーを有する場合と同様に、各ウェルに異なるインターカレータまたは特定のプローブを有することによるプロセスの異なる態様を研究し、そのようなものとして単一試行におけるアッセイの異なる態様についてのデータを取得することが可能になり、従って、例えば、一つウェルの融点及び、他のウェルのアニーリング点を決定することが出来る。
【００１１】
上記態様は、本質的に、特定の反応条件の下の酵素のＫｍであり本発明者が、サイクル内効率（ｉｎ−ｃｙｃｌｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）と呼ぶ、新規のパラメータを生じ、この値が高ければ高いほど、反応が早く進むことができる。今までのように、サイクル当たり一回の読み取りがある場合、リアルタイムＰＣＲ曲線は、全ＰＣＲプロセスについて生成される。しかし、本発明によると、任意の単一サイクルの全体が観察される場合、追加の、価値の高い情報が存在する。サイクルが完了したと観察される点を反映する、任意のサイクルにおいて観察されるベースライン蛍光からのみのプロットではなく、二倍化が完了したときの時点のプロットも利用可能である。従って、２つのデータ点を提供する：２つのデータ点とは、第１に、二倍化が完了した時点、及び、第２に、サイクルの全シーケンスによって記述される曲線の傾きである。この曲線の傾きをわれわれはサイクル内効率因子と呼び、二倍化が完了した点は、増幅ステップに必要とされる最小の可能な時間を表すことが理解されるだろう。
【００１２】
インターカレータ色素が用いられる場合、時間に対する変性、アニーリング、及び、伸長温度の全てを、その温度における高解像度のアニーリングで、観察することが可能である。高解像度アニーリングは、同様なシーケンス間を区別し、更に相対的存在量を定量化することができるための新しいアプローチを表す。プライマーがアニーリングする点を視覚化できる場合、これは、適切なプローブが用いられたとき、サイクル内増幅信号が、最初のスパイクを有する点であり、同様なアニール温度を有する２つのアンプリコン（増幅産物）を区別することが可能である。再び、ここでの鍵は、数ミリ秒の時間スケール内で、蛍光を測定するための、従って、毎２５ｍｓで、１℃／ｓの冷却において読み取りを実行するとき、理論的に０．０４℃の高い解像度を提供することが出来る、本発明によって与えられる能力である。これは、伸長点におけるサイクルごとに一回の従来の読み取りによっては収集できない新規のデータであるが、ＰＣＲプロトコルに追加の時間的要件を加えるものではなく、高解像度溶融などの下流での確証方法（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）の必要性を除去する。
【００１３】
本発明は、特定のＤＮＡを同定するためのプロセスの高速な因子最適化（ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ）を可能とする。最適化に敏感なパラメータは：
・アニール温度；
・アニーリング時間；
・変性温度；
・変性時間；
・伸長温度；
・伸長時間；
・蛍光読み取りが行われる温度；
・（全ステップに対する）ランピング速度（ｒａｍｐｉｎｇ  ｒａｔｅ）；
・塩化マグネシウム濃度；
・ｄＮＴＰ濃度；
・プライマー濃度；
・対象の濃度；
・酵素濃度
である。
これらの中で、もっとも重要なのは、アニール温度；拡張時間；塩化マグネシウム濃度；及び、プライマー濃度であり得る。
【００１４】
これらのパラメータのいずれか一つの最適化は、他のパラメータ、及び、更に他のパラメータの影響に依存する。伸長時間が短すぎる場合には、ｃＴとＲ値を含むプロセス効率は低下し、ＤＮＡサンプルは、各サイクルで二倍化しないだろうことを意味する。
【００１５】
選択されたアニーリング温度が高すぎる場合、全てのプライミング部位がカバーされるとは限らないであろうし、再び、プロセス効率は低下する。
【００１６】
再び、塩化マグネシウムまたはプライマーの何れかの濃度が低すぎる場合、複製複合体は劣化し、従って、サイクル内効率は低下するだろう。
【００１７】
本発明による因子最適化は、上記パラメータに対する個々の変更を行うことの影響を試験し、どのパラメータの組み合わせが、最低のｃＴと、１に最も近いＲ値となるだろうかを判定するように動作する。本質的に、この酵素プロセスのＫｍである、追加のサイクル内効率因子は、また、効率を最大化し、検出時間を最小化するために利用される。
【００１８】
因子最適化のプロセスの概要は以下のとおりである：
ユーザは、消耗品として、または、どの試薬が、各位置で、どの濃度で使われるべきかの指示を有するかのいずれかの９６個の容器プレートが与えられる。好適実施形態においては、プレートは、反応内容物が、高度に再生可能で、厳しく制御されるように、消耗品として供給される。ユーザは、単に、指示されたとおり、プライマー、プローブ、及び、対象を決められた濃度で追加し、プレートは、熱サイクル用に封止される。完全に独立なウェル制御と監視を有する装置は、反応容器に渡って、予めプログラムされた熱サイクルプロファイルを動作させる。この実施形態の分光的態様については、温度及び蛍光読み取りは、密接に相互に結びついている。これは、アッセイの多くが、多重化された成分を有し、従って、ｉＰＣＲプロセスのために、同時かつ連続的に、２つの色素を取得する必要があるからである。標準的なフィルタベースのアプローチと色素を区別するための一組のフィルタは、これらの性能要件を満たすことが出来ないことは明らかであろう。装置は、その後、１秒未満の周波数で、各容器について得られた全蛍光スペクトルを記録するだろう。完了すると、装置は、生スペクトルデータを取得し、分光的に畳み込みを解消し、各個々の成分色素に帰される蛍光を分離するために、ソフトウェアにプログラミングされる。ソフトウェアは、その後、時間に対する蛍光、温度に対する蛍光、また、各個々の試薬濃度に対する効率を含む、要求されたグラフをプロットすることが出来る。例は；プロファイルが４個の同一の反応容器、同一の熱プロファイル、例えば、プライマー濃度とは異なる同一の試薬を有している場合、相対的サイクル内効率のプロットは、釣鐘曲線を与えるだろうし、ソフトウェアは、これらのデータを調べて、最適な濃度を決定することが出来る。システムは、それから、ユーザに、各アッセイの理想的な時間／温度／濃度の完全なリストを供給し、更に、理想の最適化ＰＣＲを示唆することが出来る。プロセスは、因子最適化と呼ばれ、インテリジェントなＰＣＲアプローチ、特に、熱システムの高速独立なウェル制御、及び、反応の高周波数「連続」分光解析の、鍵となる利点である。
【００１９】
拡張により、システムは、任意の既存のアッセイをすることができ、温度と時間の側面だけについて、最適化されたこの形態を実行することが出来るべきである。例えば、総反応時間は、蛍光の二倍化が観察されたとき、次のサイクルへ自動的に移すことにより、最小化されえる。更に、システムは、反応時間を減少するため、各サイクルで、異なるプロファイルを実行することにより、単一のウェルで、そのような最適化を追加的に実行することが出来るだろう。
【００２０】
まとめると、インテリジェントなＰＣＲアプローチは、サブ秒時間スケールで、同一のウェルを分光的に解析する能力と組み合わせたとき、独立して制御され、監視される熱サイクルの使用から生じる技術的利点をてこ入れするべきである。これは、既存の装置によっては得られることの出来ない新規なデータを生成し、インテリジェントなＰＣＲは、このデータの使用から生じるプロセスと方法である。
【００２１】
本発明の第２の態様によると、ＰＣＲを含むサイクリックな生化学処置のための装置が提供され、装置は、それぞれ個別に制御可能なマイクロタイター反応容器のアレイ、レーザまたはレーザダイオード光源、マルチチャンネル画像化分光装置、光源のコリメートされた出力を受け、少なくとも８個の反応容器の上で終端するマルチファイバプローブ束であって、各ファイバプローブは、実際に、複数の励起ファイバと少なくとも１つのコレクタファイバとを含み、少なくとも１つの収集ファイバは、おそらく、回折格子により、大面積検出器に収束するように配列された、マルチファイバプローブ束を含む。
【００２２】
理想的には、ファイバ束の数は９６個であり、分光装置は、９６チャネル画像化分光装置である。このように、完全なスペクトルデータは、全反応に渡って、同時に、連続的に収集されることが出来る。８個のみのファイバ束が、９６個のウェルの文脈で用いられる場合、順番に、１２個のウェルの各列にわたって、分光装置を中心決めするように配列された移動シャトルが存在し得る。または、１２個の束が用いられ、順番に、８個のウェルの各行にわたって、分光装置を中心決めするように配列されたシャトルを有しているかもしれない。
【００２３】
好ましくは、光源は、分子診断に一般的に用いられる緑色の色素の使用により、４８８ｎｍで動作するレーザまたはレーザダイオードである。同様な波長のＬＥＤを利用したより安い光源も試験された。多重化装置も用いられることが出来る。好ましくは、９６個のファイバの全束は、単一の４８８ｎｍ光源から同時に照射される。
【００２４】
本発明のこの態様の特徴によると、各ファイバプローブ端は、発生する増幅から生じる放射光を収集するように配列された、単一の中心コアを含むことが出来る。好ましくは、事実、同一直径のファイバ用に幾何学的に完全である、６個の励起ファイバによって囲まれた単一中心コアコレクタファイバがあり得る。放射光は、従って、光度計の第２の脚上の同様な複数ファイバ束に返送されるが、この場合、決められたアレイに組織化されており、このアレイが、ＣＣＤのような大面積の検出器上に、回折格子を介して、収束され得るようにしている。結果として、複数の個々のスペクトルは、ＣＣＤデバイス上に同時に画像化され、それゆえ、任意の可視波長の全ての放射光は、８あるいは１２の倍数の、９６個のウェルから、同時に、または、順番に、収集される。
【００２５】
まとめると、単一レーザ（または、レーザダイオード）光源は、スペクトル的にコリメートされた高パワー源、光ファイバ収集及び分配、及び、全９６個の容器の同時高速画像化を提供するように配列されることが出来る。好適実施形態においては、これは、５０ｍｗで動作する４８８ｎｍレーザダイオードであるが、用いられる色素に依存して、他の波長及び入力パワーは利用されることができるだろう。そのようなシステムの使用は、２５ミリ秒での完全な蛍光スペクトルの読み取りを可能にするが、サブ５００ｍｓの時間フレームでの任意の全スペクトル読み取りが、このアプローチを可能とする。
【００２６】
光学手段は、ウェルから、好ましくは、少なくとも一度に８個のウェルから全可視スペクトルを捕捉するために配置されることが出来る。光学機器は、単一検出器及び回転分布ホイール、８ウェルスキャンヘッド、好ましくは動かないで、１〜８個の反応容器を読み取ることの出来るスペクトル光度計、または、上記したように、同時に全ての反応容器を見ることができる画像化分光装置を含むことが出来る。この後者は、より好適な光学手段である。
【００２７】
８ウェルスキャンヘッドは、単一の検出器と、８個のスペクトルを１つのセンサに収束するための２つの回折格子を含んでもよい。励起光と放射光の両方は、それぞれ、８個のウェルＬＥＤボードと分光装置に供給するファイバによって提供されることが出来る。この手段により、スペクトルの画像が、個別の帯域を捕捉することにより形成されることが可能である。
【００２８】
９６個のウェルは、リアルタイムＰＣＲ反応の連続スペクトル解析用の新規の高速画像化分光装置を含むシステムによって、対処されてもよい。更に、この高速画像化と組み合わされた、例えば、９６（１２×８アレイ）マイクロタイター反応容器内の独立に制御された超高速熱サイクリングは、任意のアッセイの自動化された最適化と、対象ＤＮＡの検出のための時間を絶対最小に減少させること、との両方を可能とする。
【００２９】
スペクトルを捕捉するためにかかる時間を減少させるために、分光装置の数は、移動部分が必要とされないとき、１２個まで増加されることが出来る。別の実施形態は、全９６個のウェルをカメラで画像化し、レンズの前に同時に配置されることが出来るフィルタの組を有する手段を含む。
【００３０】
画像化分光装置実施形態において、各ウェルから放射される光は、スペクトルに変換され、大面積検出器上に収束される。検出器は、ＣＣＤまたは、好ましくは、ＣＭＯＳとすることが出来る。励起は、４８８ｎｍレーザによって提供されることができるが、その放射の望ましくない部分を除去するカットオフフィルタを有する、この波長を中心とするＬＥＤ（または、複数のＬＥＤ）を望ましくは用いることが出来る。これは、ここに記述した、因子最適化アプローチを含むｉＰＣＲ方法を実行する装置の好適実施形態を形成する。
【００３１】
マイクロタイターの文脈においては、光学機器に利用可能な各ウェルの上の計画空間は、最大９×９ｍｍであることが理解されるだろう。
【００３２】
この発明から得られる解決方法によると、アニーリングステップが発生する時間点と温度と、蛍光的に結合したどの分子がうまくアニールされるかの両方を見ることができる。そして、任意の与えられた場所においてスクリーニングしているＳＮＰのような、複数の対立遺伝子間の区別と、データの標準的定量化が可能である。融点と蛍光ラベルの両方が異なる目的の領域をカバーするように一組のプライマーを設計することにより、アニーリングが発生する温度の正確な決定が可能となる。これは、２つの間で微妙に異なるだろう。スペクトルの畳み込みの解消が可能なシステムにおいて、それは、分光的に色素を分離するが、要求されれば、それらの全蛍光出力を結合し、必要ならば、比較することも可能であろう。これらの手段により、ＳＮＰ異型の遺伝子型の特定が可能になったが、アンプリコン間での顕著なクロストークなしに、リアルタイムのＰＣＲプローブを設計することは出来なかった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本発明の実施形態が、添付の図面を参照して、例示により、ここに記述されるだろう。
【００３４】
【図１】個々のＰＣＲ制御を有する９６個のマイクロタイター反応容器アレイを図示する。
【図２】個々のＰＣＲ制御を有する９６個のマイクロタイター反応容器アレイを図示する。
【図３】個々のＰＣＲ制御を有する９６個のマイクロタイター反応容器アレイを図示する。
【図４】個々のＰＣＲ制御を有する９６個のマイクロタイター反応容器アレイを図示する。
【図５】光ファイバ束のアレイの模式的図である。
【図６】１つの光ファイバ束の断面図である。
【図７】「連続的」読み取りの利点を図示するグラフである。
【図８】「連続的」読み取りの利点を図示するグラフである。
【図９】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１０】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１１】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１２】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１３】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１４】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１５】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１６】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
標準的１２×８アレイの９６マイクロタイター反応容器ＰＣＲ装置が、他の特許明細書の中でも、英国特許第２４０４８８３号及び、同時に継続中の英国特許出願第１４０１５８４．６号の特許明細書に記述され、双方は、個々のウェル制御を記述する。後者の概要が、図１〜４を参照して、以下に記述される。
【００３６】
装置は、冷却液入り口及び出口ネック５２、５３を有する２つの端部プレート５１に挟まれた１２個の熱除去モジュールスライス１０を含む。各スライスは、上部縁に８個の反応ステーション１１、各端部における、それらを通る冷却液導入口１２及び排出口１３多岐管穴、及び、その上部から下部縁へと一面に沿って延伸する一連の溝１４を有する。熱交換液空洞は、多岐管穴１２及び１３の間に延伸する。
【００３７】
反応ステーション１１は、反応容器ホルダ４０の基盤が、その中に締りばめするようなサイズとされた円形空洞である。小さな穴１６が、各ステーション１１の基盤から溝１４に通じており、使用中、容器ホルダが入れられたとき、ステーション１１からガス（空気）が逃げられるように作用する。
【００３８】
スライスの一面上の各多岐管の周りには、Ｏリング封止用の溝１７があり、更に、位置決めブッシュ１９を有するスライド取り付け穴１８がある。
【００３９】
一面上の各底部角には、必要な場合に、スライスを分離する補助となるように配置される分離リベート２０がある。各ステーション１１の間には、各ステーション１１の間の熱的隔離を最大化するように配置された切込み２１がある。各スライス１０の一面上のリベート２２は、同様な目的で形成される。
【００４０】
印刷回路ボード（ＰＣＢ）３０は、溝１４にクリップ止めされ、スライス１０の上下に突出する。ＰＣＢ３０は、ヒータと、その上部のコネクタ３１と下部のコネクタ３２で終端するセンサ電気導管とを保持する。ＰＣＢ３０の厚さは、溝１４の深さである。
【００４１】
反応容器ホルダ４０は、反応ステーション１１のそれぞれに適合する。反応容器ホルダ４０は、反応容器受け部４１、加熱部４２及び冷却部４３を含み、後者は、ステーションを熱除去モジュールに固定するように配置される。容器受け部４１は、マイクロタイター反応容器をぴったりと受ける形状とされ、その壁には、温度センサ４４が配置される。加熱部４２は、その周りに、ヒータコイル４５が巻き込まれる螺旋状溝を有する。柔軟チューブ（不図示）は、ポンプ（不図示）を介して、ヒートシンク冷却液槽（不図示）とネック５２、５３を接続する。
【００４２】
反応容器６１は、炭素担持プラスチック材料で形成されたマイクロタイター容器であり、全長が２ｃｍである。それは、降順で、キャップ受けリム、充填部、及び、それへの基盤を有する反応チャンバを含む。充填部は、７ｍｍの最大外周直径と５ｍｍの深さを有する。反応チャンバは、３ｍｍから２．５ｍｍにテーパ状に細くなっており、全体は、０．８ｍｍの壁厚を有する。従って、反応チャンバは、実質的に、毛細管サイズである。
【００４３】
ホルダ４０のアレイは、１２×８標準マイクロタイターウェルトレイ６０をぴったり受けるように適応される。
【００４４】
導管を介した反応電力供給の間は、予め決められたプログラムにより、ウェル６１を加熱するように配置され、導管のうちの他のものは、ウェル内の温度に関連した信号を運ぶ。この装置は、各ウェル６１において、完全に独立に反応を実行するのに特に適しているので、このプログラムは各ウェル用に予め決められている。従って、反応が、例えば、ＰＣＲにおけるように、加熱−冷却サイクルを含むとき、１つのウェル６１は、加熱フェーズで、他のウェルが、冷却フェーズで、一つが停止しており、他のウェルが、完了していることが出来る。
【００４５】
加熱サイクルは、通常室温より上の温度で、加熱と冷却効率の中間点である、４０℃に固定される、ＨＲＭ５０における冷却液環境に対して生じるように配置される。
【００４６】
各反応容器内のプロセスの進行が、光学ユニット６２で監視される。
【００４７】
図５は、８×１２マイクロタイタープレートにおいて用いられる光ファイバ束のアレイを図示する。励起ファイバ７１の束は、ＣＣＤ光源７２から発し、多重ユニット７３に入り、そこから、それぞれ励起ファイバと少なくとも１つの集光ファイバを含む９６個の光ファイバ束７４が現れる。束７４は、それぞれ、各反応チャンバの上に適切に搭載されるように向けられたプローブ７５で終端する。集光ファイバは、多重ユニット７３内で、分光装置７７へとつながれた出力束７６に接続される。
【００４８】
図６は、多重ユニット７３から出て、プローブ７５で終端する束である、１つの光ファイバ束７４の断面図である。各束７４は、集光ファイバコア７８と、コアファイバ７８を囲む６本の励起ファイバ７９とを含む。標準的な保護シールドが、ファイバを囲む。
【００４９】
それは、各ウェル６１に面する１つのプローブ７５と共に搭載される、図１に示される、光学ユニット６２内に在るプローブ７５である。
【００５０】
図７及び図８は、光放射（ｙ軸）対サイクル数（ｘ軸）のグラフである。グラフは、従来のＰＣＲ光観察と、本発明のＰＣＲ光観察との間の差を図示し、図８は、図７からの詳細（４サイクル）を図示する。フィルタまたは移動可能プローブを用いる従来の光観察においては、単一の画像捕捉は、各サイクルの終わり、つまり、必然的に各伸長の後に行われる。これは、図８及び図９の点８０である。連続捕捉において、つまり、２５ｍｓごとの画像では、画像は、点８１において捕捉され、全ＰＣＲプロセスを表す、リアルタイムライン８２の形成を可能とする。特に、伸長の瞬間が捕捉でき(点８３）、傾き角度、及び、各ステップの時間長、ｃＴ及びＲが、観察され、最適化される。破線８４は、従って、サイクル内効率の測度を提供する。破線８５は、二倍化が完了する点の測定である。
【００５１】
従って、リアルタイムに見ると、取得されたデータは、与えられたサイクルで増幅が完了したと観察されたときの点の測定を可能とする。このサイクルに対する如何なる追加的時間も不要である。更に、各サイクル内で、蛍光の増加の傾き（線８３）を測定することにより、サイクル内効率を視覚化することが出来る。例えば、インターカレータ色素と３’加水分解アッセイのような、異なる蛍光化学は、反応の各区分において、異なる量のデータを与えるだろう。図示された例は、３’加水分解アッセイのものである。インターカレータは、また、ＤＮＡ生成物の融点を示し、これは、自動化ソフトウェアに有利なものであるだろう。異なるプローブシステムで、同一のＤＮＡ対象を分析することにより、反応の全体、アニーリング温度、異なる化学組成の影響、最適化された温度、及び、その温度における保持時間の俯瞰図を構成することが可能である。
【００５２】
図９〜図１６は、標準的８×１２マイクロタイター反応容器アレイにおける、同時のＰＣＲ動作のパターンを図示し、示した数字は、一つの変数、例えば、アニーリング温度、伸長時間、塩化マグネシウム濃度などを表す。従って：
・図９は、４×４×３×２同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１０は、６×４×２×２同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１１は、６×４×４同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１２は、３×８×４同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１３は、１２×８同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１４は、６×１６同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１５は、２４×４同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１６は、３×３×３×３同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
【００５３】
「セットアップ」とは、当分野でプレートと呼ばれるアレイが、例えば、塩化マグネシウム、プライマー、酵素、及び、ｄＮＴＰ濃度の範囲で前もって用意されることを意味する。
【００５４】
そして、同時試験においては、図１７に示されるように、時間勾配は、例えば、列−列ベースで変更することができ、温度勾配は、行−行ベースで変更することが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月29日(2016.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
様々な量で、特定のサンプルに適していると考えられる試薬とプライマーで、複数の反応容器を満たすことと、;
各反応容器内に、対象のＤＮＡのサンプルを配置することと、;
異なる熱サイクリングプロファイルを用いて、各容器に対し、同時にＰＣＲを行うことと、
各反応容器内の全ＰＣＲプロセスを光学的に同時に観察することと、
を含む、リアルタイムＰＣＲプロセスによる、核酸検出を最適化するためのプロセス。
【請求項２】
以下のパラメータ：
・アニール温度；
・アニーリング時間；
・変性温度；
・変性時間；
・伸長温度；
・伸長時間；
・蛍光読み取りが行われる温度；
・（全ステップについての）ランプ速度；
・塩化マグネシウム濃度；
・ｄＮＴＰ濃度；
・プライマー濃度；;
・対象の濃度
のうちの少なくとも幾つかを調べるように配置された、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
同一時間及び温度における、インターカレータ色素と、シーケンス特異的プローブの双方から放射された蛍光の分光解析を含み、このようにして、ＦＲＥＴを測定し、それによって、前記対象のハイブリッド形成状態についての情報を提供する、請求項１または請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
非常に似ているシーケンス間で区別するために配置され、一組のプライマーが目的の領域をカバーするように設計することと、これらのプライマーを同一の反応容器に入れることとを含み、前記プライマーは、融点と蛍光ラベルの両方が異なっており、従って、アニーリングが発生する実際の温度を決定し、要求される区別を可能にする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
光学手段が、各前記反応容器からの全可視スペクトルを捕捉するように配置されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
各前記反応容器から発生する前記蛍光を分離し、各アッセイの時間、温度、及び、濃度に対して、前記蛍光値をプロットし、理想的な最適化ＰＣＲを示すことを更に含む、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記反応容器は、８×１２マイクロタイター容器アレイ内にある、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
各反応容器における前記結果から、与えられたＤＮＡ対象についてのもっとも高速で、効率的な同定を自動的に決定し、それを示すことを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
マイクロタイター反応容器（６１）のアレイと、ポリメラーゼ連鎖反応を各反応容器内で、個別かつ同時に実行するための手段（４１、４２、４３）と、光源（７２）と、マルチチャネル画像化分光装置（７７）と、ＰＣＲの時間を制御するための手段と、前記光源（７２）のコリメートされた出力を励起し受信するように配置され、少なくとも８個の反応容器（６１）の上で終端するマルチファイバプローブ束（７１）であって、各ファイバプローブは、実際に、複数の励起ファイバと少なくとも１つの集光ファイバとを含み、前記少なくとも１つの集光ファイバは、大面積検出器上に収束するように配置されているマルチファイバプローブ束と、を含む、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセスを実行する装置。
【請求項１０】
前記反応容器の内容物に対してポリメラーゼ連鎖反応を実行させるための手段は、ヒータ（４２、４５）、熱除去モジュール（１０、５１、５２、５３、１２、１３）、ヒートシンク冷却液槽、及び、ポンプを含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記光源は、レーザまたはレーザダイオードである、請求項９または請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
光多重化装置を用いる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記分光装置は、ウェルからの全可視スペクトルを捕捉するように配置されている、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
ｎを整数として、１２×８アレイ内の９６×ｎマイクロタイター反応容器のアレイを含み、そのうちの少なくとも複数個は、個別制御のために配置され、単一の検出器と、一つのセンサ上に８個のスペクトルを収束するための２つの回折格子を含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記光学手段は、単一検出器及び回転分布ホイールと、８ウェルスキャンヘッドと、好ましくは移動することなく、１個〜８個の反応容器を読み取ることが出来るスペクトル光度計、または、上記したように、同時に、前記反応容器の全てを見ることができる画像化分光装置とを含む、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【図１】個々のＰＣＲ制御を有する９６個のマイクロタイター反応容器アレイを図示する。
【図２】個々のＰＣＲ制御を有する９６個のマイクロタイター反応容器アレイを図示する。
【図３】個々のＰＣＲ制御を有する９６個のマイクロタイター反応容器アレイを図示する。
【図４】個々のＰＣＲ制御を有する９６個のマイクロタイター反応容器アレイを図示する。
【図５】光ファイバ束のアレイの模式的図である。
【図６】１つの光ファイバ束の断面図である。
【図７】「連続的」読み取りの利点を図示するグラフである。
【図８】「連続的」読み取りの利点を図示するグラフである。
【図９】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１０】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１１】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１２】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１３】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１４】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１５】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１６】因子最適化用のプレートレイアウトの例の平面図である。
【図１７】単一の反応における最適な条件を決定するために、プライマー及びマグネシウム濃度のような、試薬成分の複数の濃度範囲が、どのように、単一の９６個の容器プレート上の温度勾配と時間変化に比較できるかを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
図９〜図１７は、標準的８×１２マイクロタイター反応容器アレイにおける、同時のＰＣＲ動作のパターンを図示し、示した数字は、一つの変数、例えば、アニーリング温度、伸長時間、塩化マグネシウム濃度などを表す。従って：
・図９は、４×４×３×２同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１０は、６×４×２×２同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１１は、６×４×４同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１２は、３×８×４同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１３は、１２×８同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１４は、６×１６同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１５は、２４×４同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１６は、３×３×３×３同時試験用にセットアップされたアレイを示す；
・図１７は、単一の反応における最適な条件を決定するために、プライマー及びマグネシウム濃度のような、試薬成分の複数の濃度範囲が、どのように、単一の９６個の容器プレート上の温度勾配と時間変化に比較できるかを示す。
【国際調査報告】
2017510796.tif 000020
2017510796.tif 000021
2017510796.tif 000022